(57)【要約】【課題】安定な核酸結合体をより確実に形成することができる核酸結合体の形成方法、そのキット、安定な核酸結合体、及び、核酸検出方法を提供すること。【解決手段】核酸結合体の形成方法は、第１特定塩基配列と第２特定塩基配列と第３特定塩基配列とを有する第１一本鎖ＤＮＡ、第１特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ、並びに、組換えタンパク質を反応させて、第１の複合体を形成する工程と、この複合体、第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２一本鎖ＤＮＡ、並びに、ライゲースを反応させて、第２の複合体を形成する工程と、タンパク質を失活させて、第１一本鎖ＤＮＡと第２一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとが結合してなる核酸結合体を形成する工程とを備える。【選択図】        図３
2004222631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
既知の第１特定塩基配列を有すると共に、５’末端に既知の第２特定塩基配列を有し、かつ、３’末端に既知の第３特定塩基配列を有する直鎖状の第１一本鎖ＤＮＡ、
上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ、並びに、
相同的組換えタンパク質及びこの相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかである組換えタンパク質、
を反応させて、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列と、上記二本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、上記組換えタンパク質が関与した状態で結合してなる第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、
上記第１ＤＮＡ−タンパク質複合体、
上記第２特定塩基配列と上記第３特定塩基配列とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２一本鎖ＤＮＡ、及び、
ライゲース、
を反応させて、上記第１ＤＮＡ−タンパク質複合体のうち上記第１一本鎖ＤＮＡの上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列と、上記第２一本鎖ＤＮＡのうち上記第２特定塩基配列と上記第３特定塩基配列とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなるとともに、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち５’末端と３’末端とがリン酸エステル結合してなる第２ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、
上記組換えタンパク質及び上記ライゲースを失活させて、上記第１一本鎖ＤＮＡと上記第２一本鎖ＤＮＡと上記二本鎖ＤＮＡとが結合してなる核酸結合体を形成するタンパク質失活工程と、
を備えることを特長とする核酸結合体の形成方法。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸結合体の形成方法であって、
前記第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、前記第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程とを同時に行う
ことを特徴とする核酸結合体の形成方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の核酸結合体の形成方法であって、
前記第１特定塩基配列は、１０ｍｅｒ以上の配列からなる
ことを特長とする核酸結合体の形成方法。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の核酸結合体の形成方法であって、
前記第２特定塩基配列及び前記第３特定塩基配列は、それぞれ、４ｍｅｒ以上の配列からなる
ことを特長とする核酸結合体の形成方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の核酸結合体の形成方法であって、
前記組換えタンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＡタンパク質、及び、これらのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこれらのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質、の少なくともいずれかである
ことを特長とする核酸結合体の形成方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の核酸結合体の形成方法であって、
第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程は、ヌクレオシド三リン酸及びデオキシヌクレオシド三リン酸の少なくともいずれかの存在下で行う
ことを特長とする核酸結合体の形成方法。
【請求項７】
既知の第１特定塩基配列を有すると共に、連続した既知の第２特定塩基配列と既知の第３特定塩基配列とを有する環状の第１一本鎖ＤＮＡと、
上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡと、
連続した上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２一本鎖ＤＮＡと、
からなり、
上記第１一本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列と、上記二本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなると共に、
上記第１一本鎖ＤＮＡのうち連続した上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列と、上記第２一本鎖ＤＮＡのうち上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなる
核酸結合体の形成用キットであって、
相同的組換えタンパク質及びこの相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかである組換えタンパク質と、
ヌクレオシド三リン酸及びデオキシヌクレオシド三リン酸の少なくともいずれかと、
ライゲースと、
緩衝剤と、
を備えることを特徴とする核酸結合体形成用キット。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸結合体形成用キットであって、
前記緩衝剤として、前記第１一本鎖ＤＮＡと前記２本鎖ＤＮＡと前記組換えタンパク質とからなる第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成するための第１緩衝剤と、上記第１ＤＮＡ−タンパク質結合体と前記第２一本鎖ＤＮＡとからなる第２ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成するための第２緩衝剤と、を有する
ことを特徴とする核酸結合体形成用キット。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の核酸結合体形成用キットであって、
前記組換えタンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＡタンパク質、及び、これらのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこれらのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質、の少なくともいずれかである
ことを特長とする核酸結合体形成用キット。
【請求項１０】
既知の第１特定塩基配列を有すると共に、連続した既知の第２特定塩基配列と既知の第３特定塩基配列とを有する環状の第１一本鎖ＤＮＡと、
上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡと、
連続した上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２一本鎖ＤＮＡと、
からなり、
上記第１一本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列と、上記二本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなると共に、
上記第１一本鎖ＤＮＡのうち連続した上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列と、上記第２一本鎖ＤＮＡのうち上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなる
ことを特長とする核酸結合体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸結合体であって、
前記第１特定塩基配列は、１０ｍｅｒ以上の配列からなる
ことを特長とする核酸結合体。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１に記載の核酸結合体であって、
前記第２特定塩基配列及び前記第３特定塩基配列は、それぞれ、４ｍｅｒ以上の配列からなる
ことを特長とする核酸結合体。
【請求項１３】
既知の第１特定塩基配列を有すると共に、連続した既知の第２特定塩基配列と既知の第３特定塩基配列を有する環状の第１一本鎖ＤＮＡと、
上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡと、
連続した上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２一本鎖ＤＮＡと、
からなり、
上記第１一本鎖ＤＮＡ及び上記第２一本鎖ＤＮＡの少なくともいずれかは、標識されてなり、
上記第１一本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列と、上記二本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなると共に、
上記第１一本鎖ＤＮＡのうち連続した上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列と、上記第２一本鎖ＤＮＡのうち上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなる
核酸結合体について、ゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、
上記の標識された一本鎖ＤＮＡを検出することにより、上記核酸結合体を検出する検出工程と、
を備えることを特長とする核酸検出方法。
【請求項１４】
既知の第１特定塩基配列を有すると共に、５’末端に既知の第２特定塩基配列を有し、かつ、３’末端に既知の第３特定塩基配列を有する直鎖状の第１一本鎖ＤＮＡ、
上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ、並びに、
相同的組換えタンパク質及びこの相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかである組換えタンパク質、
を反応させて、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列と、上記二本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、上記組換えタンパク質が関与した状態で結合してなる第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、
上記第１ＤＮＡ−タンパク質複合体、
上記第２特定塩基配列と上記第３特定塩基配列とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２一本鎖ＤＮＡ、及び、
ライゲース、
を反応させて、上記第１ＤＮＡ−タンパク質複合体のうち上記第１一本鎖ＤＮＡの上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列と、上記第２一本鎖ＤＮＡのうち上記第２特定塩基配列と上記第３特定塩基配列とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなるとともに、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち５’末端と３’末端とがリン酸エステル結合してなる第２ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、
上記組換えタンパク質及び上記ライゲースを失活させて、上記第１一本鎖ＤＮＡと上記第２一本鎖ＤＮＡと上記二本鎖ＤＮＡとが結合してなる核酸結合体を形成するタンパク質失活工程と、
上記核酸結合体について、ゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、
上記第１一本鎖ＤＮＡ及び上記第２一本鎖ＤＮＡの少なくともいずれかは、予め標識されてなり、この標識された一本鎖ＤＮＡを検出することにより、上記核酸結合体を検出する検出工程と、
を備えることを特長とする核酸検出方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸検出方法であって、
前記第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、前記第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程とを同時に行う
ことを特徴とする核酸検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとを有する核酸結合体の形成方法、核酸結合体を形成するための核酸結合体形成用キット、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとを有する核酸結合体、及び、標識された一本鎖ＤＮＡを検出することにより核酸を検出する核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとを有する核酸結合体の形成方法が知られている。例えば、特許文献１には、次のような方法が開示されている。即ち、既知の特定塩基配列を５’末端及び３’末端の双方に分断して設けてなる一本鎖ＤＮＡと、ＲｅｃＡタンパク質とを混合した溶液に、その特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを加え、さらに、ライゲースを加える。そして、二本鎖ＤＮＡの該塩基配列上に、一本鎖ＤＮＡの両末端に設けた特定塩基配列を重ね合わせると共に、一本鎖ＤＮＡの両末端同士を結合させて環状ＤＮＡとする。その後、ＲｅｃＡタンパク質を除去して、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとが結合してなるハイブリッドＤＮＡ（核酸結合体）を得る。
【０００３】
【特許文献１】
特開平９−２２００９９
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような方法では、例えば、一本鎖ＤＮＡの特定塩基配列とそれに対応する二本鎖ＤＮＡの塩基配列との相同性が低い場合、一本鎖ＤＮＡの両末端同士を結合できないことがある。このような場合にＲｅｃＡタンパク質を失活させれば、核酸とタンパク質との複合体からＲｅｃＡタンパク質が除去されるだけでなく、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの結合も解消される。つまり、安定な核酸結合体が得られない。
【０００５】
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、安定な核酸結合体をより確実に形成することができる核酸結合体の形成方法、より安定な核酸結合体を形成するための核酸結合体形成用キット、より安定な核酸結合体、及び、より安定な核酸結合体を利用した核酸検出方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段、作用及び効果】
その解決手段は、既知の第１特定塩基配列を有すると共に、５’末端に既知の第２特定塩基配列を有し、かつ、３’末端に既知の第３特定塩基配列を有する直鎖状の第１一本鎖ＤＮＡ、上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ、並びに、相同的組換えタンパク質及びこの相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかである組換えタンパク質、を反応させて、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列と、上記二本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、上記組換えタンパク質が関与した状態で結合してなる第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、上記第１ＤＮＡ−タンパク質複合体、上記第２特定塩基配列と上記第３特定塩基配列とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２一本鎖ＤＮＡ、及び、ライゲース、を反応させて、上記第１ＤＮＡ−タンパク質複合体のうち上記第１一本鎖ＤＮＡの上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列と、上記第２一本鎖ＤＮＡのうち上記第２特定塩基配列と上記第３特定塩基配列とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなるとともに、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち５’末端と３’末端とがリン酸エステル結合してなる第２ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、上記組換えタンパク質及び上記ライゲースを失活させて、上記第１一本鎖ＤＮＡと上記第２一本鎖ＤＮＡと上記二本鎖ＤＮＡとが結合してなる核酸結合体を形成するタンパク質失活工程と、を備えることを特長とする核酸結合体の形成方法である。
【０００７】
本発明によれば、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、第１一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡと組換えタンパク質とから、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する。この第１ＤＮＡ−タンパク質複合体は、第１一本鎖ＤＮＡの第１特定塩基配列と、二本鎖ＤＮＡのうちこの第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、組換えタンパク質が関与した状態で結合している。
その後、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体と第２一本鎖ＤＮＡとライゲースを反応させて、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する。この第２ＤＮＡ−タンパク質複合体は、さらに、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体のうち第１一本鎖ＤＮＡの第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列と、第２一本鎖ＤＮＡのうちこれらを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合している。また、第１一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端とがリン酸エステル結合して環状となっている。
そしてその後、タンパク質失活工程において、組換えタンパク質及びライゲースを失活させて、第１一本鎖ＤＮＡと第２一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとが結合してなる核酸結合体を形成する。
【０００８】
このような核酸結合体は、その構造を安定化させるための特別なタンパク質等が存在しなくても、多少の熱を加えるなどしても解離することなく、安定な状態を維持することができる。また、前述の特開平９−２２００９９で開示された方法よりも、第１一本鎖ＤＮＡの末端同士のライゲーションを効率よく行うことができる。さらに、得られた核酸結合体を後に適当な制限酵素で切断すれば、ＤＮＡ同士の結合を解消させることもできる。また、第１一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡの相補性が比較的低い場合であっても、安定な核酸結合体を形成できる場合が多い。
【０００９】
このような核酸結合体の形成方法は、例えば、核酸の検出において利用可能である。
従来の核酸検出方法は、例えば、次のように行う。即ち、ターゲットＤＮＡとして、二本鎖ＤＮＡを用意すると共に、プローブＤＮＡとして、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅと［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、５’末端を３２Ｐで標識した一本鎖ＤＮＡを用意する。そして、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）について、ゲル電気泳動を行う。その後、ゲルをメンブレン上に載せて吸引等を行い、ゲル中のターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）をメンブレン上に移す。その後、熱処理等を行って、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）をメンブレンに固定すると共に、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）を解離させて一本鎖の状態にする。次に、このメンブレンをプローブＤＮＡ溶液（標識した一本鎖ＤＮＡの溶液）に浸して、ハイブリダイゼーションを行う。その後、メンブレンを洗浄する。その後は、このメンブレンのオートラジオグラムをとり、標識プローブＤＮＡ（標識した一本鎖ＤＮＡ）からのシグナルをＸ線フィルム上に記録する。
【００１０】
これに対し、本発明を利用した核酸検出方法は、例えば、次のように行うことができる。即ち、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）と標識した１次プローブＤＮＡ（標識した第１一本鎖ＤＮＡ）と２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ）を用意する。そして、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）と標識した１次プローブＤＮＡ（標識した第１一本鎖ＤＮＡ）と組換えタンパク質により、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する（第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程）。続いて、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体と２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ）とライゲースにより、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する（第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程）。その後、組換えタンパク質及びライゲースを失活させて、安定な核酸結合体を形成する（タンパク質失活工程）。次に、この核酸結合体について、ゲル電気泳動を行う。電気泳動後は、ゲルを濾紙等の上に載せてゲル乾燥機で乾燥させた後、ゲルのオートラジオグラムをとり、標識した１次プローブＤＮＡ（標識した第１一本鎖ＤＮＡ）からのシグナルをＸ線フィルム上に記録する。
【００１１】
このように、核酸の検出に本発明を適用した場合、従来と比較すれば、容易かつ短時間で核酸の検出を行うことができる。ゲル中のＤＮＡをメンブレンに移す作業や、このメンブレンをプローブＤＮＡ溶液に浸す作業、また、メンブレンを洗浄する作業など、熟練を要する作業や比較的長い時間を要する作業がなくなるからである。
なお、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ）ではなく、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ）を標識する場合や、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ）と２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ）の双方を標識する場合にも、同様なことが言える。また、標識したプローブＤＮＡとして、蛍光物質等で化学的に標識した一本鎖ＤＮＡを利用する場合においても、同様なことが言える。
【００１２】
ここで、核酸結合体のうち、第１一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの結合は、第１一本鎖ＤＮＡの第１特定塩基配列と二本鎖ＤＮＡのうちのこれに相補的な塩基配列とが結合したものであれば、その結合形態は問われない。第１一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの間で、必ずしも、ワトソン・クリック型塩基対やフーグスティーン型塩基対のような特定の構造をとっている必要はなく、何らかの特異的な相互作用によって三本鎖領域が形成されていればよい。
【００１３】
二本鎖ＤＮＡは、第１特定塩基配列に相補的な塩基配列を有するものであれば、いかなるものを用いてもよい。ここでいう相補的な配列とは、第１特定塩基配列に対し１００％相補的な配列に限られず、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において第１ＤＮＡ−タンパク質結合体を形成できる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。実質的に相補的な程度は、一般的には、およそ５０％以上の相補性を有することが必要とされ、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは１００％の相補性を有することである。相補性が高いほど、より安定な三本鎖形成領域を形成することができるからである。但し、必要とされる相補性の程度は、第１特定塩基配列の長さによって変動する。また、相補性の程度は、第１特定塩基配列の相補性は同じ（例えば６０％）であっても、その領域内全体でほぼ等しい相補性（６０％）を有する場合と、その領域内に相補性が高い領域（例えば９０％）と低い領域（例えば５０％）が偏在する場合とによっても変動する。
【００１４】
また、この二本鎖ＤＮＡは、直鎖状の形態でも環状の形態でも構わない。また、第１特定塩基配列に相補的な配列を有するものであればよいから、二本鎖ＤＮＡ全体がこの相補的配列からなるものであっても、あるいは、この相補的配列にさらに他の塩基配列が付加されたものであっても構わない。また、理論上その鎖長に上限は存在しない。従って、例えば、３０００Ｍｂｐといわれるヒトゲノムの全長を持つような巨大なＤＮＡであっても構わない。勿論、二本鎖ＤＮＡの由来は問われない。従って、ウィルスや微生物、動植物のゲノム由来のＤＮＡやそれらを改変したＤＮＡであっても、微生物等のもつプラスミドＤＮＡ等やプラスミドＤＮＡ等に異種のＤＮＡ断片を挿入したキメラＤＮＡ等であっても、あるいは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドなどであっても構わない。
【００１５】
第１一本鎖ＤＮＡは、第１特定塩基配列を有すると共に、５’末端に第２特定塩基配列を有し、かつ、３’末端に第３特定塩基配列を有する直鎖状のものであれば、いかなるものであってもよい。即ち、この条件を満たす限り、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、理論上その鎖長に上限は存在しない。また、その由来も問われない。これらの点は、二本鎖ＤＮＡと同様である。
また、第１一本鎖ＤＮＡは、第１特定塩基配列と第２特定塩基配列と第３特定塩基配列を有するものであればよいから、一本鎖ＤＮＡ全体がこれらの配列のみからなるものであっても、あるいは、これらの配列にさらに他の塩基配列が付加されたものであっても構わない。
【００１６】
第２一本鎖ＤＮＡは、第２特定塩基配列と第３特定塩基配列とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。ここでいう相補的配列も、第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列に対し１００％相補的な配列に限られず、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において第２ＤＮＡ−タンパク質結合体を形成できる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。実質的に相補的な程度は、一般的には、およそ６０〜８０％以上の相補性を有することが必要とされ、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは１００％の相補性を有することである。相補性が高いほど、より安定に第１一本鎖ＤＮＡと結合できるからである。但し、必要とされる相補性の程度は、第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列の長さによって変動する。また、相補性の程度は、第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列に対しての相補性は同じ（例えば７０％）であっても、その領域内全体でほぼ等しい相補性（７０％）を有する場合と、その領域内に相補性が高い領域（例えば９０％）と低い領域（例えば５０％）が偏在する場合とによっても変動する。
【００１７】
また、この第２一本鎖ＤＮＡは、直鎖状の形態でも環状の形態でも構わない。また、上記の条件を満たす限り、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、理論上その鎖長に上限は存在しない。また、その由来も問われない。これらの点は、二本鎖ＤＮＡや第１一本鎖ＤＮＡと同様である。
【００１８】
組換えタンパク質は、相同的組換えタンパク質及びこれと類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかであって、それが関与した状態で第１一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとが安定な複合体を形成できるものであれば、いかなるものであってもよい。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するＲｅｃＡタンパク質やサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの耐熱性細菌に由来するＲｅｃＡタンパク質の他、腸内細菌においてＲｅｃＡ遺伝子によりコードされている多機能タンパク質、あるいは、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、メチロフィルス  メチロトローファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウスティラゴ  メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）等に由来するＲｅｃＡ類似タンパク質などが挙げられる。また、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やヒトなど真核生物に由来するＲｅｃＡ類似タンパク質もこれに含まれる。
【００１９】
また、これらのタンパク質と類似する機能を有するものであれば、これらのタンパク質を改変した改変タンパク質であってもよい。改変タンパク質としては、例えば、相同的組換えタンパク質をコードする遺伝子から、部位特異的変異誘発等により作出された遺伝子の産物であって、１または数個のアミノ酸が欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。また、相同的組換えタンパク質をコードする遺伝子を改変した遺伝子の産物であって、相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するタンパク質断片からなるものでもよい。また、ＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡタンパク質のタンパク質断片（ＲｅｃＡフラグメント）など、相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するタンパク質断片であってもよい。
【００２０】
ライゲースは、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、第１一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端とをリン酸エステル結合できるものであれば、いずれを利用してもよい。入手容易性、安全性、機能性などの点から、例えば、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ等を利用するのがよい。
【００２１】
第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程は、適当な緩衝液中で行うのが好ましい。効率よく、安定な第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成することができるからである。
緩衝液は、使用する組換えタンパク質等により、反応の最適条件を得るため適宜変更することできる。例えば、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）と酢酸や塩酸等の適当な酸とにより、ｐＨを４．０〜９．０、より好ましくは、６．０〜８．０に調節したトリス系の緩衝液を使用すればよい。
【００２２】
反応液中の核酸（第１一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡ）の濃度は、核酸が十分に溶解できる濃度であればよく、適宜変更することができる。二本鎖ＤＮＡに対する第１一本鎖ＤＮＡの割合は、モル比で１倍〜１０倍とするのが好ましい。また、組換えタンパク質は、第１一本鎖ＤＮＡの３塩基当たり１分子に相当するように加えるのが好ましい。但し、使用する組換えタンパク質によってその最適量は若干変動する。
このように調製した反応液は、１０℃〜５０℃、好ましくは、３５℃〜４５℃において、５分間以上、好ましくは３０分間以上保温することにより、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する。
【００２３】
第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程も、適当な緩衝液中で行うのが好ましい。効率よく、安定な第２ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成することができるからである。
緩衝液は、使用するライゲース等により、反応の最適条件を得るため適宜変更することできる。例えば、トリスと酢酸や塩酸等の適当な酸とにより、ｐＨを４．０〜９．０、より好ましくは、６．０〜８．０に調節したトリス系の緩衝液を使用すればよい。
【００２４】
この工程における反応液中の核酸（第２一本鎖ＤＮＡ）の濃度も、核酸が十分に溶解できる濃度であればよく、適宜変更することができる。第１一本鎖ＤＮＡに対する第２一本鎖ＤＮＡの割合は、モル比で１倍〜１００倍とするのが好ましい。また、使用するライゲースの濃度は、その種類や反応温度によって適宜変更すればよい。
このように調製した反応液は、１０℃〜５０℃、好ましくは、３５℃〜４５℃、特に好ましくは約３７℃において反応させるのがよい。また、反応時間は、５分間以上、好ましくは３０分間以上とするのがよい。これにより、第１一本鎖ＤＮＡの両末端でリン酸エステル結合を形成し、第１一本鎖ＤＮＡの環状化を促進させることができる。なお、反応温度が４５℃未満の場合には、二本鎖ＤＮＡが直鎖状の場合、二本鎖ＤＮＡの末端同志でアニーリングし、二本鎖ＤＮＡの末端同志でリン酸エステル結合を形成してしまう恐れがある。一方、反応温度が５０℃を越える場合には、ＤＮＡ同士の結合が不安定になり、第２ＤＮＡ−タンパク質結合体の形成が困難となる恐れがある。また、ライゲーションの反応速度が低下する恐れもある。
【００２５】
タンパク質失活工程で、タンパク質を失活させるには、反応液にキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）を加えるか、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えるか、または、タンパク質分解酵素（例えば、プロティナーゼＫ）を加え、あるいは、これらの処理を組み合わせて行った後、例えば、約３７℃で１０分間以上保温すればよい。こうして得られる反応液から核酸結合体だけを回収するには、フェノール、クロロホルム等の溶媒抽出により除タンパク処理を行った後、適当なカラムクロマトグラフィーで回収する方法を利用したり、あるいは、エタノール沈殿で一旦核酸結合体を析出させる方法を利用すればよい。
【００２６】
さらに、上記の核酸結合体の形成方法であって、前記第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、前記第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程とを同時に行うことを特徴とする核酸結合体の形成方法とすると良い。
【００２７】
本発明によれば、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程とを同時に行う。
このように２つの工程を同時に行えば、より効率よく短時間で、核酸結合体を形成することができる。
【００２８】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸結合体の形成方法であって、前記第１特定塩基配列は、１０ｍｅｒ以上の配列からなることを特長とする核酸結合体の形成方法とすると良い。
【００２９】
第１特定塩基配列は、理論上短くても、第１一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとが結合して三本鎖形成領域を形成することができる。しかし、第１特定塩基配列が短いと、具体的には、１０ｍｅｒよりも短いと、三本鎖形成領域が不安定になりやすい。つまり、核酸結合体が不安定になりやすい。
これに対し、本発明では、第１特定塩基配列が１０ｍｅｒ以上の配列からなる。従って、第１一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡはより強く結合して安定な三本鎖形成領域を形成することができる。よって、より安定な核酸結合体を形成することができる。
なお、さらに好ましくは、第１特定塩基配列を２０ｍｅｒ以上とするのがよい。さらに安定な核酸結合体を形成できるからである。
【００３０】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸結合体の形成方法であって、前記第２特定塩基配列及び前記第３特定塩基配列は、それぞれ、４ｍｅｒ以上の配列からなることを特長とする核酸結合体の形成方法とすると良い。
【００３１】
第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列は、それぞれ理論上短くても、第１一本鎖ＤＮＡと第２一本鎖ＤＮＡが結合することができる。しかし、第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列が短いと、具体的には、それぞれ４ｍｅｒよりも短いと、第１一本鎖ＤＮＡと第２一本鎖ＤＮＡの結合が不安定になりやすい。つまり、核酸結合体が不安定になりやすい。
これに対し、本発明では、第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列は、それぞれ、４ｍｅｒ以上の配列からなる。従って、第１一本鎖ＤＮＡと第２一本鎖ＤＮＡはより強く結合することができる。よって、より安定な核酸結合体を形成することができる。
なお、さらに好ましくは、第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列を、それぞれ、７ｍｅｒ以上とするのがよい。さらに安定な核酸結合体を形成できるからである。
【００３２】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸結合体の形成方法であって、前記組換えタンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＡタンパク質、及び、これらのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこれらのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質、の少なくともいずれかであることを特長とする核酸結合体の形成方法とすると良い。
【００３３】
前述したように、組換えタンパク質には、様々なものを適宜選択することができる。これらのうち、入手容易性、安全性、機能性を考えると、大腸菌に由来するＲｅｃＡタンパク質あるいはサーマス・サーモフィルスに由来するＲｅｃＡタンパク質を用いるのが好ましい。また、これらのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であり、かつ、これらのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有する改変タンパク質でもよい。このような改変タンパク質としては、例えば、これらのＲｅｃＡ遺伝子から部位特異的変異誘発等により作出されたＲｅｃＡ遺伝子の産物であって、１または数個のアミノ酸が欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、これらのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。また、これらのＲｅｃＡ遺伝子を改変した遺伝子の産物であって、これらのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するタンパク質断片からなるものでもよい。また、これらのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡタンパク質のタンパク質断片（ＲｅｃＡフラグメント）であってもよい。
【００３４】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸結合体の形成方法であって、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程は、ヌクレオシド三リン酸及びデオキシヌクレオシド三リン酸の少なくともいずれかの存在下で行うことを特長とする核酸結合体の形成方法とすると良い。
【００３５】
本発明によれば、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程は、ヌクレオシド三リン酸やデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で行う。このようにすれば、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を効率よく形成することができる。その結果、核酸結合体も効率よく形成することができる。
ヌクレオシド三リン酸としては、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）、ＵＴＰ、ＣＴＰが挙げられる。また、デオキシヌクレオシド三リン酸としては、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰが挙げられる。これらのうち、特にＡＴＰを使用するのが好ましい。効率よく安定な第１ＤＮＡ−タンパク質結合体を形成できるからである。なお、ヌクレオシド三リン酸やデオキシヌクレオシド三リン酸は、ヌクレオシド二リン酸（例えば、ＡＤＰ）などと組み合わせて使用することもできる。ヌクレオシド三リン酸やデオキシヌクレオシド三リン酸は、０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは、１ｍＭ〜１０ｍＭで使用する。
【００３６】
また、他の解決手段は、既知の第１特定塩基配列を有すると共に、連続した既知の第２特定塩基配列と既知の第３特定塩基配列とを有する環状の第１一本鎖ＤＮＡと、上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡと、連続した上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２一本鎖ＤＮＡと、からなり、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列と、上記二本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなると共に、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち連続した上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列と、上記第２一本鎖ＤＮＡのうち上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなる核酸結合体の形成用キットであって、相同的組換えタンパク質及びこの相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかである組換えタンパク質と、ヌクレオシド三リン酸及びデオキシヌクレオシド三リン酸の少なくともいずれかと、ライゲースと、緩衝剤と、を備えることを特徴とする核酸結合体形成用キットである。
【００３７】
本発明によれば、核酸結合体形成用キットは、組換えタンパク質と、ヌクレオシド三リン酸等と、ライゲースと、緩衝剤とを備える。
このようなキットを利用すれば、ヌクレオシド三リン酸等を加えた緩衝液中で、第１一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡと組換えタンパク質とライゲースとを反応させることにより、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体を、容易に形成することができる。そして、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体中のタンパク質（組換えタンパク質及びライゲース）を失活させることにより、安定な核酸結合体を形成することができる。
なお、本発明の組換えタンパク質、ヌクレオシド三リン酸等、ライゲース、及び、緩衝剤は、前述したものと同様である。
【００３８】
さらに、上記の核酸結合体形成用キットであって、前記緩衝剤として、前記第１一本鎖ＤＮＡと前記２本鎖ＤＮＡと前記組換えタンパク質とからなる第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成するための第１緩衝剤と、上記第１ＤＮＡ−タンパク質結合体と前記第２一本鎖ＤＮＡとからなる第２ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成するための第２緩衝剤と、を有することを特徴とする核酸結合体形成用キットとすると良い。
【００３９】
本発明によれば、緩衝剤として、第１緩衝剤と第２緩衝剤とを有する。このようなキットを利用すれば、ヌクレオシド三リン酸等を加えた第１緩衝液中で、第１一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡと組換えタンパク質とを反応させることにより、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を、容易に形成することができる。さらに、第２緩衝液中で、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体と第２一本鎖ＤＮＡとライゲースとを反応させることにより、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体を、容易に形成することができる。そして、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体中のタンパク質（組換えタンパク質及びライゲース）を失活させることで、安定な核酸結合体を形成することができる。
なお、第１，第２緩衝剤は、前述したものと同様である。
【００４０】
さらに、上記の核酸結合体形成用キットであって、前記組換えタンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＡタンパク質、及び、これらのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこれらのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質、の少なくともいずれかであることを特長とする核酸結合体形成用キットとすると良い。
【００４１】
前述したように、入手容易性、安全性、機能性を考えると、組換えタンパク質は、大腸菌に由来するＲｅｃＡタンパク質あるいはサーマス・サーモフィルスに由来するＲｅｃＡタンパク質であるのが好ましい。また、これらのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であり、かつ、これらのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有する改変タンパク質でもよい。このような改変タンパク質としては、例えば、これらのＲｅｃＡ遺伝子から部位特異的変異誘発等により作出されたＲｅｃＡ遺伝子の産物であって、１または数個のアミノ酸が欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、これらのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。また、これらのＲｅｃＡ遺伝子を改変した遺伝子の産物であって、これらのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するタンパク質断片からなるものでもよい。また、これらのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡタンパク質のタンパク質断片（ＲｅｃＡフラグメント）であってもよい。
【００４２】
また、他の解決手段は、既知の第１特定塩基配列を有すると共に、連続した既知の第２特定塩基配列と既知の第３特定塩基配列とを有する環状の第１一本鎖ＤＮＡと、上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡと、連続した上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２一本鎖ＤＮＡと、からなり、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列と、上記二本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなると共に、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち連続した上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列と、上記第２一本鎖ＤＮＡのうち上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなることを特長とする核酸結合体である。
【００４３】
本発明によれば、核酸結合体は、環状の第１一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡと第２一本鎖ＤＮＡとからなる。そして、第１一本鎖ＤＮＡのうち第１特定塩基配列と、二本鎖ＤＮＡのうち第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが結合してなる。また、第１一本鎖ＤＮＡのうち連続した第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列と、第２一本鎖ＤＮＡのうち第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列に相補的な塩基配列とが結合してなる。
【００４４】
このような核酸結合体は、その構造を安定化させるための特別なタンパク質等（例えば、前述したＲｅｃＡタンパク質）が存在しなくても、多少の熱を加えるなどしても解離することなく、安定な状態を維持することができる。また、前述の特開平９−２２００９９で得られる核酸結合体と比較すると、核酸結合体を後に適当な制限酵素で切断すれば、ＤＮＡ同士の結合を解消させることができる。また、第１一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡの相補性が比較的低い場合であっても、核酸結合体が安定である場合が多い。
【００４５】
このような核酸結合体は、例えば、核酸の検出において利用可能である。
即ち、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）と、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅと［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて５’末端を３２Ｐで標識した１次プローブＤＮＡ（標識した第１一本鎖ＤＮＡ）と、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ）を用意する。そして、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）と標識した１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ）と組換えタンパク質により、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する。続いて、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体と２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ）とライゲースにより、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する。その後、組換えタンパク質及びライゲースを失活させ、安定な核酸結合体を形成する。次に、この核酸結合体について、ゲル電気泳動を行う。電気泳動後は、ゲルを濾紙等の上に載せてゲル乾燥機で乾燥させた後、ゲルのオートラジオグラムをとり、標識した１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ）からのシグナルをＸ線フィルム上に記録する。
【００４６】
このように、核酸検出方法に本発明を適用した場合、従来と比較すれば、容易かつ短時間で核酸の検出を行うことができる。ゲル中のＤＮＡをメンブレンに移す作業や、このメンブレンをプローブＤＮＡ溶液に浸す作業、また、メンブレンを洗浄する作業など、熟練を要する作業や比較的長い時間を要する作業がなくなるからである。
なお、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ）ではなく、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ）を標識する場合や、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ）と２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ）の双方を標識する場合にも、同様なことが言える。また、標識したプローブＤＮＡとして、蛍光物質等で化学的に標識した一本鎖ＤＮＡを利用する場合においても、同様なことが言える。
【００４７】
さらに、上記の核酸結合体であって、前記第１特定塩基配列は、１０ｍｅｒ以上の配列からなることを特長とする核酸結合体とすると良い。
【００４８】
第１特定塩基配列は、理論上短くてもよいが、極端に短いと、具体的には、１０ｍｅｒよりも短いと、第１一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとで形成される三本鎖形成領域が不安定になりやすい。つまり、核酸結合体が不安定になりやすい。
これに対し、本発明では、第１特定塩基配列が１０ｍｅｒ以上の塩基配列からなるので、三本鎖形成領域が安定であり、核酸結合体も安定である。
なお、さらに好ましくは、第１特定塩基配列を２０ｍｅｒ以上とするのがよい。さらに安定な核酸結合体を形成できるからである。
【００４９】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸結合体であって、前記第２特定塩基配列及び前記第３特定塩基配列は、それぞれ、４ｍｅｒ以上の配列からなることを特長とする核酸結合体とすると良い。
【００５０】
第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列は、理論上短くてもよいが、極端に短いと、具体的には、それぞれ４ｍｅｒよりも短いと、第１一本鎖ＤＮＡと第２一本鎖ＤＮＡとの結合が不安定になりやすい。つまり、核酸結合体が不安定になりやすい。
これに対し、本発明では、第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列がそれぞれ４ｍｅｒ以上の塩基配列からなるので、第１一本鎖ＤＮＡと第２一本鎖ＤＮＡとの結合が安定であり、核酸結合体も安定である。
なお、さらに好ましくは、第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列をそれぞれ７ｍｅｒ以上とするのがよい。さらに安定な核酸結合体を形成できるからである。
【００５１】
また、他の解決手段は、既知の第１特定塩基配列を有すると共に、連続した既知の第２特定塩基配列と既知の第３特定塩基配列を有する環状の第１一本鎖ＤＮＡと、上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡと、連続した上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２一本鎖ＤＮＡと、からなり、上記第１一本鎖ＤＮＡ及び上記第２一本鎖ＤＮＡの少なくともいずれかは、標識されてなり、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列と、上記二本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなると共に、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち連続した上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列と、上記第２一本鎖ＤＮＡのうち上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなる核酸結合体について、ゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、上記の標識された一本鎖ＤＮＡを検出することにより、上記核酸結合体を検出する検出工程と、を備えることを特長とする核酸検出方法である。
【００５２】
本発明によれば、核酸結合体は、環状の第１一本鎖ＤＮＡ（１次プローブＤＮＡ）と二本鎖ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）と第２一本鎖ＤＮＡ（２次プローブＤＮＡ）とからなる。そして、第１一本鎖ＤＮＡ（１次プローブＤＮＡ）のうち第１特定塩基配列と、二本鎖ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）のうち第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが結合してなる。さらに、第１一本鎖ＤＮＡ（１次プローブＤＮＡ）のうち連続した第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列と、第２一本鎖ＤＮＡ（２次プローブＤＮＡ）のうち第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列に相補的な塩基配列とが結合してなる。なお、第１一本鎖ＤＮＡ（１次プローブＤＮＡ）及び第２一本鎖ＤＮＡ（２次プローブＤＮＡ）の少なくともいずれかは、標識されている。
そして、このような核酸結合体について、アガロース電気泳動等のゲル電気泳動を行う（電気泳動工程）。電気泳動後は、検出工程において、標識された一本鎖ＤＮＡ（プローブＤＮＡ）を検出することにより、核酸結合体を検出する。例えば、ゲルを濾紙等の上に載せてゲル乾燥機等で乾燥させた後、ゲルから標識された一本鎖ＤＮＡ（プローブＤＮＡ）由来のシグナルを検出する。
【００５３】
このような核酸検出方法は、従来の方法（サザンハイブリダイゼーション）と比較すれば、ゲル中のＤＮＡをメンブレンに移す作業や、このメンブレンをプローブＤＮＡ溶液に浸す作業、また、メンブレンを洗浄する作業など、熟練を要する作業や比較的長い時間を要する作業がなくなる。従って、核酸の検出を容易かつ短時間で行うことができる。
なお、標識した一本鎖ＤＮＡ（プローブＤＮＡ）は、放射性元素を用いて標識したものであっても、蛍光物質等の化学物質を用いて標識したものであってもよい。放射性元素を用いて標識すれば、核酸の検出能力を向上させることができる。一方、化学物質を用いて標識すれば、核酸検出方法の各工程をより安全に行うことができる。また、ロボット等により各工程を自動化することも可能である。
【００５４】
また、他の解決手段は、既知の第１特定塩基配列を有すると共に、５’末端に既知の第２特定塩基配列を有し、かつ、３’末端に既知の第３特定塩基配列を有する直鎖状の第１一本鎖ＤＮＡ、上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ、並びに、相同的組換えタンパク質及びこの相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかである組換えタンパク質、を反応させて、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列と、上記二本鎖ＤＮＡのうち上記第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、上記組換えタンパク質が関与した状態で結合してなる第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、上記第１ＤＮＡ−タンパク質複合体、上記第２特定塩基配列と上記第３特定塩基配列とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２一本鎖ＤＮＡ、及び、ライゲース、を反応させて、上記第１ＤＮＡ−タンパク質複合体のうち上記第１一本鎖ＤＮＡの上記第２特定塩基配列及び上記第３特定塩基配列と、上記第２一本鎖ＤＮＡのうち上記第２特定塩基配列と上記第３特定塩基配列とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列とが、結合してなるとともに、上記第１一本鎖ＤＮＡのうち５’末端と３’末端とがリン酸エステル結合してなる第２ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、上記組換えタンパク質及び上記ライゲースを失活させて、上記第１一本鎖ＤＮＡと上記第２一本鎖ＤＮＡと上記二本鎖ＤＮＡとが結合してなる核酸結合体を形成するタンパク質失活工程と、上記核酸結合体について、ゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、上記第１一本鎖ＤＮＡ及び上記第２一本鎖ＤＮＡの少なくともいずれかは、予め標識されてなり、この標識された一本鎖ＤＮＡを検出することにより、上記核酸結合体を検出する検出工程と、を備えることを特長とする核酸検出方法である。
【００５５】
本発明によれば、まず、直鎖状の第１一本鎖ＤＮＡ（１次プローブＤＮＡ）と二本鎖ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）と組換えタンパク質を反応させる。そして、第１一本鎖ＤＮＡ（１次プローブＤＮＡ）のうち第１特定塩基配列と、二本鎖ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）のうち第１特定塩基配列に相補的な塩基配列とが、組換えタンパク質が関与した状態で結合してなる第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する（第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程）。続いて、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体と第２一本鎖ＤＮＡ（２次プローブＤＮＡ）とライゲースを反応させる。そして、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体のうち第１一本鎖ＤＮＡ（１次プローブＤＮＡ）の第２特定塩基配列及び第３特定塩基配列と、第２一本鎖ＤＮＡ（２次プローブＤＮＡ）のうち第２特定塩基配列と第３特定塩基配列とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列とが結合してなるとともに、第１一本鎖ＤＮＡ（１次プローブＤＮＡ）のうち５’末端と３’末端とがリン酸エステル結合してなる第２ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する（第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程）。なお、第１一本鎖ＤＮＡ（１次プローブＤＮＡ）及び第２一本鎖ＤＮＡ（２次プローブＤＮＡ）の少なくともいずれかは、予め標識されている。その後、組換えタンパク質及びライゲースを失活させて、第１一本鎖ＤＮＡ（１次プローブＤＮＡ）と第２一本鎖ＤＮＡ（２次プローブＤＮＡ）と二本鎖ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）とが結合してなる核酸結合体を形成する（タンパク質失活工程）。その後、この核酸結合体について、ゲル電気泳動を行う（電気泳動工程）。その後、標識された一本鎖ＤＮＡ（プローブＤＮＡ）を検出することにより、核酸結合体を検出する（検出工程）。
【００５６】
このような核酸検出方法は、従来の方法（サザンハイブリダイゼーション）と比較すれば、ゲル中のＤＮＡをメンブレンに移す作業や、このメンブレンをプローブＤＮＡ溶液に浸す作業、また、メンブレンを洗浄する作業など、熟練を要する作業や比較的長い時間を要する作業がなくなる。従って、核酸検出方法を容易かつ短時間で行うことができる。
なお、標識した一本鎖ＤＮＡ（プローブＤＮＡ）は、上述の通り、放射性元素を用いて標識したものであっても、蛍光物質等の化学物質を用いて標識したものであってもよい。
【００５７】
さらに、上記の核酸検出方法であって、前記第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、前記第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程とを同時に行うことを特徴とする核酸検出方法とすると良い。
【００５８】
本発明によれば、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程とを同時に行う。
このように２つの工程を同時に行えば、より効率よく短時間のうちに、核酸結合体を形成することができる。従って、より効率よく短時間で核酸の検出を行うことができる。
【００５９】
【発明の実施の形態】
（実施例１）
以下、本発明の実施例を、図を参照しつつ説明する。
まず、核酸結合体の形成方法及びこの方法により形成される核酸結合体について説明する。
【００６０】
まず、図１に示すように、１次プローブＤＮＡとして、既知の第１特定塩基配１２を有すると共に、５’末端に既知の第２特定塩基配列１３を有し、かつ、３’末端に既知の第３特定塩基配列１４を有する直鎖状の第１一本鎖ＤＮＡ１１を用意する。
本実施例では、１次プローブＤＮＡとして、２０ｍｅｒからなる既知の第１特定塩基配列１２（５’−ａｇｔａａｇａｇａａ  ｔｔａｔｇｃａｇｔｇ−３’）を有すると共に、５’末端に１０ｍｅｒからなる既知の第２特定塩基配列１３（５’−ｃｇｔａｃｇｇｔｃｇ−３’）を有し、かつ、３’末端に７ｍｅｒからなる既知の第３特定塩基配列１４（５’−ｃｇｇａｔｃｃ−３’）を有する６０ｍｅｒの直鎖状の第１一本鎖ＤＮＡ１１を用意した（図３参照）。この１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）は、オリゴヌクレオチド１からなる。オリゴヌクレオチド１は、公知の手法により合成すればよい。
また、この１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）は、標識されている。
本実施例では、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社）と［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、３２Ｐで１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）の５’末端を標識した。
【００６１】
オリゴヌクレオチド１：
５’−ｃｇｔａｃｇｇｔｃｇ  ａｃｇｃａｇｃｔｔｔ  ａｇｔａａｇａｇａａ  ｔｔａｔｇｃａｇｔｇ  ｔｔｃａｃｇｔｇｇａ  ｇｃｔｃｇｇａｔｃｃ−３’
【００６２】
また、図１に示すように、ターゲットＤＮＡとして、上記の第１特定塩基配列１２に相補的な塩基配列２２を有する二本鎖ＤＮＡ２１を含む複数種類の二本鎖ＤＮＡを用意する。
本実施例では、環状プラスミドＤＮＡの１つであるｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）＋  ＤＮＡ（約３０３０ｂｐ）を制限酵素ＮｓｐＩで切断し、さらに、それぞれのＤＮＡの５’末端のリン酸基をＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ酵素で脱リン酸化したものを用意した。このターゲットＤＮＡには、長さ１９１７ｂｐと長さ８７６ｂｐと長さ２３７ｂｐの３種類の直鎖状のＤＮＡ断片が含まれる。これらのうち１９１７ｂｐのＤＮＡ断片が、第１特定塩基配列１２に相補的な２０ｍｅｒの塩基配列２２（５’−ｃａｃｔｇｃａｔａａ  ｔｔｃｔｃｔｔａｃｔ−３’）を有する二本鎖ＤＮＡ２１である（図３参照）。第１特定塩基配列１２とこれに対する相補的な塩基配列２２とは、１００％相補的な関係にある。なお、ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）＋  ＤＮＡの塩基配列については、ＧｅｎｅＢａｎｋ及びＥＭＢＬのアクセションナンバー  Ｘ６５３２８  を参照されたい。
【００６３】
また、組換えタンパク質として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を用意した。さらに、ヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸として、ＡＴＰを、また、緩衝剤として、酢酸マグネシウムと酢酸トリスからなるものを用意した。
【００６４】
次に、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）とターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）と組換えタンパク質とを反応させる。そして、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）のうち第１特定塩基配列１２と、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）のうち第１特定塩基配列１２に相補的な塩基配列２２とが、組換えタンパク質が関与した状態で結合してなる第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１を形成する（図１参照）。なお、図１の模式図においては、組換えタンパク質は省略してある。
即ち、本実施例では、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）と、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１を含む３種類のＤＮＡ断片）と、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質とを反応させて、これらが結合した第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１を形成した（図３参照）。具体的には、次のような反応液を作製し、３７℃で３０分間保温して、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１を形成した。
【００６５】
2004222631.tif 000003
【００６６】
この反応は、まず、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）に大腸菌のＲｅｃＡタンパク質が結合してプローブＤＮＡ−ＲｅｃＡタンパク質複合体を形成する。続いて、このプローブＤＮＡ−ＲｅｃＡタンパク質複合体とターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）が結合して、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１を形成すると考えられる。
このような第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１は、三本鎖形成領域を有するにも拘わらず、比較的安定なものである。
【００６７】
次に、図２に示すように、２次プローブＤＮＡとして、第２特定塩基配列１３と第３特定塩基配列１４とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列４２を有する第２一本鎖ＤＮＡ４１を用意する。
本実施例では、２次プローブＤＮＡとして、１７ｍｅｒの上記の相補的な塩基配列（５’−ｃｇａｃｃｇｔａｃｇ  ｇｇａｔｃｃｇ−３’）からなる直鎖状の第２一本鎖ＤＮＡを用意した（図３参照）。第１一本鎖ＤＮＡ１１の第２特定塩基配列１３は、５’−ｃｇｔａｃｇｇｔｃｇ−３’であり、第３特定塩基配列１４は、５’−ｃｇｇａｔｃｃ−３’であるので、これを繋ぎ合わせた塩基配列は、ｇｃｔｇｇｃａｔｇｃ  ｃｃｔａｇｇｃ  であり、この配列に相補的な塩基配列は、ｃｇａｃｃｇｔａｃｇ  ｇｇａｔｃｃｇ  である。従って、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）は、第２特定塩基配列１３と第３特定塩基配列１４とを繋ぎ合わせた塩基配列に、１００％相補的な塩基配列のみからなる。この２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチド２からなる。このオリゴヌクレオチド２も、公知の手法により合成すればよい。
【００６８】
オリゴヌクレオチド２：
５’−ｃｇａｃｃｇｔａｃｇ  ｇｇａｔｃｃｇ−３’
【００６９】
また、ライゲースとして、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  を用意した。また、緩衝剤として、塩化マグネシウムと塩酸トリスからなるものを用意した。さらに、ＡＴＰ  と  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ  と  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  を用意した。
【００７０】
次に、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１と、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）と、ライゲース（Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ）とを反応させる。そして、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１のうち１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）の第２特定塩基配列１３及び第３特定塩基配列１４と、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）のうち第２特定塩基配列１３と第３特定塩基配列１４とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列４２とが、結合してなるとともに、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）のうち５’末端と３’末端とがリン酸エステル結合してなる第２ＤＮＡ−タンパク質複合体５１を形成する（図２参照）。
即ち、本実施例は、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１と２次プローブＤＮＡ（第２二本鎖ＤＮＡ４１）と  Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  とを反応させて、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１と２次プローブＤＮＡ（第２二本鎖ＤＮＡ４１）とが結合した第２ＤＮＡ−タンパク質複合体５１を形成した（図３参照）。具体的には、次のような反応液を作製し、３７℃で３０分間保温して、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体５１を形成した。
【００７１】
2004222631.tif 000004
【００７２】
この反応は、まず、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１のうち、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）の第２特定塩基配列１３及び第３特定塩基配列１４と、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）のうち、第２特定塩基配列１３と第３特定塩基配列１４とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列４２とが、結合する。続いて、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）の５’末端と３’末端がリン酸エステル結合して、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体５１を形成すると考えられる。
このような第２ＤＮＡ−タンパク質複合体５１は、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）とターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）とが結合した三本鎖形成領域を有すると共に、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）と２次プローブＤＮＡ（第２二本鎖ＤＮＡ４１）とが結合した二本鎖形成領域を有しているにも拘わらず、比較的安定なものである。
【００７３】
次に、タンパク質失活工程において、組換えタンパク質及びライゲースを失活させて、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）と２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）とターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）とが結合してなる核酸結合体を形成する。即ち、既知の第１特定塩基配列１２を有すると共に、連続した既知の第２特定塩基配列１３と既知の第３特定塩基配列１４とを有する環状の１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）と、第１特定塩基配列１２に相補的な塩基配列２２を有するターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）と、連続した第２特定塩基配列１３及び第３特定塩基配列１４に相補的な塩基配列４２を有する２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）と、からなり、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）のうち第１特定塩基配列１２と、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）のうち第１特定塩基配列１２に相補的な塩基配列２２とが、結合してなると共に、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）のうち連続した第２特定塩基配列１３及び第３特定塩基配列１４と、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）のうち第２特定塩基配列１３及び第３特定塩基配列１４に相補的な塩基配列４２とが、結合してなる核酸結合体を形成する。
【００７４】
本実施例では、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程の反応液４０μｌに、２．５ｍＭのＥＤＴＡと、０．５％（Ｗ／Ｖｏｌ）のＳＤＳと、０．７ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫを加え、３７℃で６０分間保温することにより、除タンパクを行った。これにより、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）と２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）とターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）とが結合してなる核酸結合体を形成した。
【００７５】
このような核酸結合体は、ＲｅｃＡタンパク質が存在しないにも拘わらず、安定であり、多少の熱を加えるなどしても、安定な状態を維持することができる。また、上記の第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）の末端同士のライゲーションを、効率よく行うことができる。さらに、この核酸結合体を後に適当な制限酵素で切断すれば、ＤＮＡ同士の結合を解消させることができる。また、本実施例では、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）の第１特定塩基配列１２とターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）のこれに相補的な塩基配列２２の相補性が１００％であるが、仮にこの相補性がやや低いときであっても、比較的安定な核酸結合体を形成できる場合が多い。
【００７６】
また、本実施例では、第１特定塩基配列１２（２０ｍｅｒ）が１０ｍｅｒ以上の配列からなる。従って、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）とターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）はより強く結合して安定な三本鎖形成領域を形成することができる。よって、より安定な核酸結合体を形成することができる。
また、第２特定塩基配列１３（１０ｍｅｒ）及び第３特定塩基配列１４（７ｍｅｒ）は、それぞれ４ｍｅｒ以上の配列からなる。従って、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）と２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）はより強く結合することができる。よって、より安定な核酸結合体を形成することができる。
【００７７】
また、本実施例では、組換えタンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質であるため、入手容易性、安全性、機能性などの点で有利である。
また、本実施例では、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程は、ＡＴＰ（ヌクレオシド三リン酸等）の存在下で行う。このようにすれば、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体を効率よく形成することができる。その結果、核酸結合体も効率よく形成することができる。
【００７８】
なお、組換えタンパク質と、ヌクレオシド三リン酸等と、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１を形成するための第１緩衝剤と、ライゲースと、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体５１を形成するための第２緩衝剤とは、核酸結合体形成用キットとして用意しておくと便利である。このようなキットを利用すれば、ターゲットＤＮＡや１次，２次プローブＤＮＡの種類が変わっても、容易に核酸結合体を形成することができるからである。特に、組換えタンパク質としては、入手容易性、安全性、機能性などの点から、上記の大腸菌に由来するＲｅｃＡタンパク質や後述するサーマス・サーモフィルスに由来するＲｅｃＡタンパク質を利用するのが好ましい。
【００７９】
次いで、上記の核酸結合体を利用した核酸検出方法について説明する。
上述したように、まず、既知の第１特定塩基配列１２を有すると共に、５’末端に既知の第２特定塩基配列１３を有し、かつ、３’末端に既知の第３特定塩基配列１４を有する直鎖状の１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）と、第１特定塩基配列１２に相補的な塩基配列２２を有するターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）と、相同的組換えタンパク質及びこの相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかである組換えタンパク質とを反応させる。そして、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）のうち第１特定塩基配列１２と、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）のうち第１特定塩基配列１２に相補的な塩基配列２２とが、組換えタンパク質が関与した状態で結合してなる第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１を形成する（第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程）。
続いて、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１と、第２特定塩基配列１３と第３特定塩基配列１４とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列４２を有する２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）と、ライゲースとを反応させる。そして、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１のうち１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）の第２特定塩基配列１３及び第３特定塩基配列１４と、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）のうち第２特定塩基配列１３と第３特定塩基配列１４とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列４２とが、結合してなるとともに、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）のうち５’末端と３’末端とがリン酸エステル結合してなる第２ＤＮＡ−タンパク質複合体５１を形成する（第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程）。
その後、組換えタンパク質及びライゲースを失活させて、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）と２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）とターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）とが結合してなる核酸結合体を形成する（タンパク質失活工程）。
【００８０】
次に、電気泳動工程において、核酸結合体について、ゲル電気泳動を行う。
本実施例では、上記反応液の１／４量（約１０μｌ）について、１％のアガロースゲルで電気泳動を行った。そして、電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してアガロースゲル中のＤＮＡを染色し、その後、染色されたＤＮＡの写真を記録した。その結果を図４（Ｂ）のレーン５に示す。
ターゲットＤＮＡは、３種類のＤＮＡ断片からなり、そのうちの約１．９ｋｂｐの断片が上記の核酸結合体となっている。
【００８１】
次に、検出工程において、標識された一本鎖ＤＮＡを検出することにより、核酸結合体を検出する。
本実施例では、電気泳動を行ったアガロースゲルを濾紙の上に載せてゲル乾燥機で完全に乾燥させた。そして、この乾燥させたアガロースゲルのオートラジオグラムをとり、標識された１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録した。その結果を図４（Ａ）のレーン５に示す。
図４（Ａ）において、約１．９ｋｂｐ付近に検出されたシグナルは、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）と２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）とターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）が結合した核酸結合体によるものである。
【００８２】
このような核酸検出方法は、アガロースゲル中のＤＮＡをメンブレンに移す作業や、このメンブレンをプローブＤＮＡ溶液に浸す作業、また、メンブレンを洗浄する作業など、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業がなくなる。従って、核酸の検出を容易かつ短時間で行うことができる。
【００８３】
次いで、図４に結果を示した比較実験について説明する。
レーン１は、上述の第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰを加えないで、レーン５と同じ反応を行った結果を示す。それ以外の各工程は、上述したレーン５と同じである。
レーン２は、上述の第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン５と同じ反応を行った結果を示す。それ以外の各工程は、上述したレーン５と同じである。
レーン３は、上述の第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  を加えないで、レーン５と同じ反応を行った結果を示す。それ以外の各工程は、上述したレーン５と同じである。
レーン４は、上述の第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）を加えないで、レーン５と同じ反応を行った結果を示す。それ以外の各工程は、上述したレーン５と同じである。
【００８４】
図４（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１とレーン２とレーン５でシグナルが検出されたが、レーン１とレーン２のシグナルの強度は、レーン５の２０分の１程度の弱いものであった。一方、レーン３とレーン４にはシグナルが検出されなかった。
レーン３の結果より、安定な核酸結合体の形成には、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅが必要であることが判る。また、レーン４の結果より、  安定な核酸結合体の形成には、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）が必要であることが判る。また、レーン１の結果より、効率よく、より安定な核酸結合体を形成するには、ＡＴＰが必要であることが判る。また、レーン２の結果より、効率よく、より安定な核酸結合体を形成するには、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質が必要であることが判る。
【００８５】
このことから、効率よく、安定な核酸結合体を形成するためには、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質などの組換えタンパク質及びＡＴＰなどのヌクレオシド三リン酸やデオキシヌクレオシド酸リン酸が必要であり、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅなどのライゲース及び２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ）が必要であると考えられる。
【００８６】
（実施例２）
次いで、第２の実施例について説明する。なお、上記実施例１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程とを同時に行った点が、上記実施例１と異なる。また、タンパク質失活工程は、３７℃６０分間ではなく、４５℃で３０分間行った。
【００８７】
具体的には、上記実施例１と同様に、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）と、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）と、組換えタンパク質（大腸菌のＲｅｃＡタンパク質）と、ヌクレオシド三リン酸等（ＡＴＰ）と、第１緩衝剤（酢酸マグネシウムと酢酸トリスからなるもの）を用意した。また、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）と、ライゲース（Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ）と、第２緩衝剤（塩化マグネシウムと塩酸トリスからなるもの）と、ＡＴＰと、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌと、ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  を用意した。
【００８８】
そして、次に示す２つの反応液を調製し、それらを混合して３７℃で６０分間保温することにより、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程とを同時に行った。
【００８９】
2004222631.tif 000005
【００９０】
2004222631.tif 000006
【００９１】
このように反応させた場合でも、まず、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）にＲｅｃＡタンパク質が結合してプローブＤＮＡ−ＲｅｃＡタンパク質複合体を形成する。続いて、このプローブＤＮＡ−ＲｅｃＡタンパク質複合体が、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）に結合し、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１を形成する。続いて、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１のうち、第１一本鎖ＤＮＡ１１の第２特定塩基配列１３及び第３特定塩基配列１４と、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）のうち、第２特定塩基配列１３と第３特定塩基配列１４とを繋ぎ合わせた塩基配列に相補的な塩基配列４２とが、結合する。続いて、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）の５’末端と３’末端がリン酸エステル結合し、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体５１を形成する、と考えられる。
【００９２】
このようにして形成した第２ＤＮＡ−タンパク質複合体５１も、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）とターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）とが結合した三本鎖形成領域を有し、また、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）と２次プローブＤＮＡ（第２二本鎖ＤＮＡ４１）とが結合した二本鎖形成領域を有しているにも拘わらず、比較的安定なものである。
本実施例のように、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程とを同時に行えば、より効率よく短時間のうちに、核酸結合体を形成することができる。
【００９３】
この反応後は、上記実施例１と同様に、電気泳動工程と検出工程を行った。電気泳動工程後の染色されたＤＮＡの写真を記録したものを図５（Ｂ）のレーン１に示す。また、検出工程における標識された１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録したものを図５（Ａ）のレーン１に示す。
【００９４】
また、図５に示す比較実験についても、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程を同時に行った。
レーン２は、反応液１にＡＴＰを加えないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
レーン３は、反応液１に大腸菌のＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
レーン４は、反応液２にＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  を加えないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
レーン５は、反応液２に２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）を加えないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
レーン６は、３７℃で６０分間行う反応を３７℃で０分間としたこと以外は、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
【００９５】
図５（Ａ）の結果から明らかなように、上記実施例１及びその比較例と同様に、レーン１とレーン２とレーン３でシグナルが検出されたが、レーン２とレーン３のシグナルの強度は、レーン５の２０分の１程度の弱いものであった。一方、レーン４とレーン５とレーン６にはシグナルが検出されなかった。
まず、レーン１の結果より、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程とを同時に行っても、核酸結合体が形成されることが判る。
また、レーン４の結果より、安定な核酸結合体の形成には、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  が必要であることが判る。また、レーン５の結果より、  安定な核酸結合体の形成には、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）が必要であることが判る。また、レーン６の結果より、安定な核酸結合体の形成には、ある程度の反応時間を要することが判る。
さらに、レーン２の結果より、効率よく、より安定な核酸結合体を形成するには、ＡＴＰが必要であることが判る。また、レーン３の結果より、効率よく、より安定な核酸結合体を形成するには、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質が必要であることが判る。
【００９６】
このことから、核酸結合体の形成には、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程とを同時に行うこともできる。しかし、効率よく安定な核酸結合体を形成するためには、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質等の組換えタンパク質及びＡＴＰ等のヌクレオシド三リン酸やデオキシヌクレオシド三リン酸が必要であり、また、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  などのライゲース及び２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）が必要であると考えられる。さらに、核酸結合体を形成するのに、ある程度の時間を要すると考えられる。
【００９７】
（実施例３）
次いで、第３の実施例について説明する。なお、上記実施例１または２と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例は、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程とを別途行った場合と、これらの工程を同時に行った場合を比較したものである。即ち、基本的には、上記実施例１と実施例２を比較したものである。但し、上記実施例１では、タンパク質失活工程を３７℃で６０分間行っているが、本実施例では、実施例２と同様に、タンパク質失活工程を４５℃で３０分間行った。
【００９８】
タンパク質失活工程以外は、上記実施例１と同様に行った結果について、電気泳動工程後の染色されたＤＮＡの写真を記録したものを図６（Ｂ）のレーン１に示す。また、検出工程における標識された第１一本鎖ＤＮＡ由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録したものを図６（Ａ）のレーン１に示す。
一方、上記実施例２と同様に行った結果について、電気泳動工程後の染色されたＤＮＡの写真を記録したものを図６（Ｂ）のレーン２に示す。また、検出工程における標識された第１一本鎖ＤＮＡ由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録したものを図６（Ａ）のレーン２に示す。
【００９９】
図６（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１もレーン２も強いシグナルが検出されているが、レーン１よりもレーン２の方がより強くシグナルが検出されている。
この結果より、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程を別途行う（実施例１）よりも、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程を同時に行う方（実施例２）が、より効率よく、安定な核酸結合体が形成されることが判る。
このことから、少なくとも上述の反応条件下においては、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程を別途行うよりも、これら２つの工程を同時に行う方が、より効率よく、安定な核酸結合体が形成されると考えられる。
【０１００】
（実施例４）
次いで、第４の実施例について説明する。なお、上記実施例１〜３のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、組換えタンパク質として、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質の代わりに、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＲｅｃＡタンパク質（以下、単にＴ．ｔｈ．のＲｅｃＡタンパク質とも言う。）を使用したこと以外は、上記実施例３のレーン１の場合と同様に各工程を行った。
【０１０１】
組換えタンパク質としてＴ．ｔｈ．のＲｅｃＡタンパク質の使用し、上記実施例３のレーン１の場合と同様に各工程を行った結果のうち、電気泳動工程後の染色されたＤＮＡの写真を記録したものを図７（Ｂ）のレーン５に示す。また、検出工程における標識された第１一本鎖ＤＮＡ由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録したものを図７（Ａ）のレーン５に示す。
【０１０２】
また、図７に示す比較実験についても、組換えタンパク質としてＴ．ｔｈ．のＲｅｃＡタンパク質と使用した。
レーン１は、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰを加えないで、レーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン２は、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、Ｔ．ｔｈ．のＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン３は、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  を加えないで、レーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン４は、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）を加えないで、レーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン６は、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程を５５℃で行い、それ以外は、レーン５と同じ反応を行った結果を示す。
【０１０３】
図７（Ａ）の結果から明らかなように、レーン５で強いシグナルが検出された。また、レーン１でごく弱いシグナルが検出された。
レーン１の結果より、効率よく、より安定な核酸結合体を形成するには、ＡＴＰが必要であることが判る。また、レーン２の結果より、安定な核酸結合体を形成するには、Ｔ．ｔｈ．のＲｅｃＡタンパク質が必要であることが判る。また、レーン３の結果より、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  が必要であることが判る。また、レーン４の結果より、  安定な核酸結合体の形成には、２次プローブ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）が必要であることが判る。
さらに、レーン６の結果より、上記の反応条件下において、安定な核酸結合体の形成には、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程におけて、５５℃という反応温度は高すぎることが判る。この結果は、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程における反応温度が５５℃と高いために、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体がほとんど形成されなかったものと考えられる。従って、効率よく安定な核酸結合体を形成するためには、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、反応温度を５５℃よりも低くする必要があると考えられる。なお、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程における反応温度が高くても、第１特定塩基配列が長ければ（本実施例では２０ｂｐ）、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１が形成でき、最終的には、核酸結合体を形成できるものと考えられる。
【０１０４】
このことから、効率よく、安定な核酸結合体を形成するためには、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、Ｔ．ｔｈ．のＲｅｃＡタンパク質等の組換えタンパク質及びＡＴＰ等のヌクレオシド三リン酸等が必要であり、第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  等のライゲース及び２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ）が必要であると考えられる。また、効率よく、安定な核酸結合体を形成するためには、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程における反応温度を適宜選択する必要があると考えられる。
【０１０５】
（実施例５）
次いで、第５の実施例について説明する。なお、上記実施例１〜４のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、ヌクレオシド三リン酸等として、ＡＴＰ以外のものも使用した。それ以外は、上記実施例３の第１，第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程を別途行った場合と同様である。
【０１０６】
それらの結果のうち、電気泳動工程後の染色されたＤＮＡの写真を記録したものを図８（Ｂ）に示す。また、検出工程における標識された第１一本鎖ＤＮＡ由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録したものを図８（Ａ）に示す。
【０１０７】
レーン１は、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰを加えて反応を行った結果である。即ち、上記実施例３の図６のレーン１と同じものである。
レーン２は、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰの代わりにＣＴＰを加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
レーン３は、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰの代わりにＧＴＰを加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
レーン４は、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰの代わりにＵＴＰを加えて、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。
【０１０８】
図８（Ａ）の結果から明らかなように、いずれのレーンにおいてもシグナルが検出されたが、レーン１のシグナルに比べ、レーン２〜レーン４のシグナルは、弱いものであった。
これらの結果より、効率よく、安定な核酸結合体を形成するためには、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰよりもＡＴＰを用いるのが好ましいことが判る。
【０１０９】
このことから、効率よく安定な核酸結合体を形成するためには、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸等として、ＡＴＰを用いるのが好適であると考えられる。
【０１１０】
（実施例６）
次いで、第６の実施例について説明する。なお、上記実施例１〜５のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、ターゲットＤＮＡとして、環状プラスミドＤＮＡである上記のｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）＋  ＤＮＡ（約３．０ｋｂｐ）を、制限酵素で切断しないで環状のまま用いた。
【０１１１】
その結果のうち、電気泳動工程後の染色されたＤＮＡの写真を記録したものを図９（Ｂ）に示す。また、検出工程における標識された１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録したものを図９（Ａ）に示す。
【０１１２】
レーン１は、ターゲットＤＮＡとして環状プラスミドＤＮＡを用いた以外は、上記実施例３のレーン１と同様である。即ち、組換えタンパク質として大腸菌のＲｅｃＡタンパク質を使用し、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程を別々に行ったものである。
レーン２は、ターゲットＤＮＡとして環状プラスミドＤＮＡを用いた以外は、上記実施例４のレーン５と同様である。即ち、組換えタンパク質としてＴ．ｔｈ．のＲｅｃＡタンパク質を使用し、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程を別々に行ったものである。
【０１１３】
レーン３は、比較実験である。レーン３は、ターゲットＤＮＡとして環状プラスミドＤＮＡを用いた以外は、上記実施例４のレーン６と同様である。即ち、組換えタンパク質としてＴ．ｔｈ．のＲｅｃＡタンパク質を使用し、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と第２ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程を別々に行ったものである。また、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程は、５５℃で１５分間反応させている。
【０１１４】
図９（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１とレーン２でシグナルが検出されたが、レーン３ではシグナルが検出されなかった。
レーン１及びレーン２の結果より、ターゲットＤＮＡが環状であっても、核酸結合体を形成できることが判る。また、ターゲットＤＮＡが環状である場合に、組換えタンパク質として、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質を使用しても、Ｔ．ｔｈ．のＲｅｃＡタンパク質を使用を使用しても、安定な核酸結合体を形成できることが判る。
一方、レーン３の結果より、この反応条件下において、安定な核酸結合体の形成には、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程における５５℃という反応温度は高すぎることが判る。この結果は、上述したように、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程における反応温度が５５℃と高いために、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体がほとんど形成されなかったものと考えられる。従って、効率よく安定な核酸結合体を形成するためには、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、反応温度を５５℃よりも低くする必要があると考えられる。なお、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程における反応温度が高くても、第１特定塩基配列が長ければ（本実施例では２０ｂｐ）、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体３１が形成でき、最終的には、核酸結合体を形成できるものと考えられる。
【０１１５】
このことから、ターゲットＤＮＡは、環状でも、安定な核酸結合体を形成することができると考えられる。また、組換えタンパク質の種類を問わず、安定な核酸結合体が形成できると考えられる。また、効率よく、安定な核酸結合体を形成するためには、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程における反応温度を適宜選択する必要があると考えられる。
【０１１６】
（実施例７）
次いで、第７の実施例について説明する。なお、上記実施例１〜６のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、実施例２及びその比較実験と同じサンプルを、電気泳動する直前に、それぞれ８０℃で１０分間熱処理した。それ以外の各工程は、上記実施例２及びその比較実験とそれぞれ同様である。
【０１１７】
その結果のうち、電気泳動工程後の染色されたＤＮＡの写真を記録したものを図１０（Ｂ）のレーン１に示す。また、検出工程における標識された第１一本鎖ＤＮＡ由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録したものを図１０（Ａ）のレーン１に示す。
【０１１８】
レーン２〜レーン６は、比較実験である。
レーン２は、電気泳動直前に加熱処理をしたこと以外は、上記実施例２のレーン２と同じである。即ち、ＡＴＰを添加していないものである。
レーン３は、電気泳動直前に加熱処理をしたこと以外は、上記実施例２のレーン３と同じである。即ち、ＲｅｃＡタンパク質を添加していないものである。
レーン４は、電気泳動直前に加熱処理をしたこと以外は、上記実施例２のレーン４と同じである。即ち、ライゲースを添加していないものである。
レーン５は、電気泳動直前に加熱処理をしたこと以外は、上記実施例２のレーン５と同じである。即ち、２次プローブＤＮＡを添加していないものである。
レーン６は、電気泳動直前に加熱処理をしたこと以外は、上記実施例２のレーン６と同じである。即ち、反応時間を３７℃０分間としたものである。
【０１１９】
図１０（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１で強いシグナルが検出され、また、レーン２でごく弱いシグナルが検出された。しかし、レーン３〜レーン６ではシグナルが検出されなかった。
レーン１の結果より、核酸結合体を８０℃という高温で熱処理しても、容易には分解しないことが判る。
一方、レーン２の結果より、効率よく、安定な核酸結合体を形成するには、ＡＴＰが必要であることが判る。また、レーン３の結果より、安定な核酸結合体の形成には、ＲｅｃＡタンパク質が必要であることが判る。また、レーン４の結果より、安定な核酸結合体の形成には、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  が必要であることが判る。また、レーン５の結果より、安定な核酸結合体の形成には、２次プローブＤＮＡが必要であることが判る。また、レーン６の結果より、安定な核酸結合体の形成には、ある程度の反応時間を要することが判る。
【０１２０】
このことから、形成された核酸結合体は、高温下においても安定であるものと考えられる。一方、上記実施例２で述べたように、安定な核酸結合体を形成するためには、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質等の組換えタンパク質、ＡＴＰ等のヌクレオシド酸リン酸等、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ等のライゲース及び２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）が必要であると考えられる。さらに、核酸結合体を形成するのに、ある程度の時間を要すると考えられる。
【０１２１】
以上において、本発明の実施の形態を実施例に即して説明したが、本発明は上記各実施例１〜７に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることは言うまでもない。
例えば、上記各実施例では、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）の第１特定塩基配列１２と、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ２１）のそれに相補的な塩基配列２２とが、１００％相補的である場合を示したが、１次プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとが結合可能であれば、１００％相補的でなくても実質的に相補的であればよい。
また、上記各実施例では、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）の第２特定塩基配列１３及び第３特定塩基配列１４と、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）のそれに相補的な塩基配列４２とが、１００％相補的である場合を示したが、１次プローブＤＮＡと２次プローブＤＮＡとが結合可能であれば、１００％相補的でなくても実質的に相補的であればよい。
【０１２２】
また、上記各実施例では、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）を標識したが、２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）を標識する場合や、１次プローブＤＮＡ（第１一本鎖ＤＮＡ１１）と２次プローブＤＮＡ（第２一本鎖ＤＮＡ４１）の双方を標識する場合にも、同様な効果を得ることができる。また、標識したプローブＤＮＡとして、蛍光物質等で化学的に標識した一本鎖ＤＮＡを利用する場合においても、同様なことが言える。
【０１２３】
また、上記各実施例では、組換えタンパク質として大腸菌またはＴ．ｔｈ．のＲｅｃＡタンパク質を使用したが、前述したように、それ以外のものを使用することも可能である。但し、入手容易性、安全性、機能性を考慮すると、大腸菌やＴ．ｔｈ．のＲｅｃＡタンパク質が適していると思われる。
また、上記各実施例では、タンパク質失活工程において、タンパク質を失活させるために、ＳＤＳとプロティナーゼＫを加えているが、前述したように、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤を利用してもよい。このようなものでも、タンパク質を失活させ、核酸結合体をできるからである。
【０１２４】
【配列表】
2004222631.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１に関し、核酸結合体の形成方法のうち、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体の形成について示す説明図である。
【図２】実施例１に関し、核酸結合体の形成方法のうち、第１ＤＮＡ−タンパク質複合体から核酸結合体を形成するまでについて示す説明図である。
【図３】実施例１に関し、核酸結合体の形成方法について示す説明図である。
【図４】実施例１に関し、核酸結合体を利用した核酸検出方法の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図５】実施例２に関し、核酸結合体を利用した核酸検出方法の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図６】実施例３に関し、核酸結合体を利用した核酸検出方法の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図７】実施例４に関し、核酸結合体を利用した核酸検出方法の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図８】実施例５に関し、核酸結合体を利用した核酸検出方法の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図９】実施例６に関し、核酸結合体を利用した核酸検出方法の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１０】実施例７に関し、核酸結合体を利用した核酸検出方法の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１】
2004222631.tif 000008
【図２】
2004222631.tif 000009
【図３】
2004222631.tif 000010
【図４】
2004222631.tif 000011
【図５】
2004222631.tif 000012
【図６】
2004222631.tif 000013
【図７】
2004222631.tif 000014
【図８】
2004222631.tif 000015
【図９】
2004222631.tif 000016
【図１０】
2004222631.tif 000017