(57)【要約】【課題】新規の安定化ＰＯＤ組成物を提供する。ＰＯＤを常温においてもより長期間安定化させ且つ廉価であるような化合物を含む組成物が特に望ましい。【解決手段】一般式（Ｉ）【化１】2004222634.tif 000006［式中、Ｒは直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキル基を示す。］で表される化合物を含有するペルオキシダーゼ組成物。【選択図】      図１
2004222634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2004222634.tif 000005
［式中、Ｒは直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキル基を示す。］
で表される化合物を含有するペルオキシダーゼ組成物。
【請求項２】
前記化合物が５−アセトアミドアントラニル酸である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ペルオキシダーゼが、抗体又は抗原とのコンジュゲートとして存在する請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物を含む免疫測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、安定化されたペルオキシダーゼ組成物に関する。該組成物は、特に、免疫測定用キットに用いる試薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
免疫測定用の試薬として抗原又は抗体とコンジュゲートしたペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」と略す。）が広く用いられている。ＰＯＤは、競合法或いは非競合法に基づく免疫学的測定法において、形成された抗原−抗体複合体の鋭敏且つ簡便な検出方法として多用される。非競合法に基づくサンドウイッチ−ＥＬＩＳＡを例に簡単に説明すると、まず、測定対象物質（抗原）と特異的に結合する一次抗体をマイクロプレートのウェル等の固体表面に固相化し、当該固相化一次抗体と測定対象物を含む試料溶液を接触させて測定対象物を前記一次抗体上に捕捉する。次いで、洗浄により一次抗体を介して固相に維持された測定対象物のみを分離し、分離された測定対象物を該測定対象物に特異的なＰＯＤ標識二次抗体で検出する。すなわち、ＰＯＤは特定の基質に作用してそれを発色させることができるので、固相化一次抗体−測定対象物（抗原）−ＰＯＤ標識二次抗体の生成量がその発色強度に比例することになり、それにより測定対象物の濃度が検出される。
【０００３】
従って、ＰＯＤの酵素活性は前記免疫測定の感度を左右する極めて重要な因子である。特に、そのような免疫測定用の試薬類はキットの形態で広く用いられており、その流通・保存の全段階において該ＰＯＤの酵素活性を維持するような条件、例えば−８０℃等の極低温を維持しなければならないとすると極めて不都合である。好ましくは、該キットは常温程度で流通させることができ、また、厳重な保存条件下に付すことなく長期間安定であるべきである。
【０００４】
このような観点から、ＰＯＤの安定性に関する多くの技術が提案されてきた。特許文献１には、安定化ＰＯＤ溶液のための血清タンパク質とパラハイドロキシフェニルカルボン酸の併用が開示されている。特許文献２には、安定化されたＰＯＤ組成物のためのアルコキシフェノール化合物の使用が開示されている。特許文献３には、安定なＰＯＤ組成物のための、特定の置換基を有するフェノール化合物の使用が開示されている。特許文献４には、安定化ＰＯＤ組成物のための特定のフェノール誘導体の使用が開示されている。特許文献５には、安定なＰＯＤ組成物のためのヒドロキシベンジルアルキルアルコール、ヒドロキシベンジルシラン類の使用が開示されている。特許文献６には、安定化されたＰＯＤ溶液におけるフェノール系化合物とアジ化ナトリウムの併用が開示されている。特許文献７には、安定なＰＯＤ組成物のためのヒドロキシフェニル−アルコキシシランの使用が開示されている。特許文献８には、安定化されたＰＯＤ活性を有する溶液のためのヒドロキシフェニル−アルキレン−カルボン酸の使用が開示されている。しかしながら、これらいずれの文献もヒドロキシル基を有さないベンゼン環化合物の使用を示唆しない。
【０００５】
【特許文献１】
特開昭６１−２３９８９０号公報
【特許文献２】
特開昭６４−６３３８０号公報
【特許文献３】
特開平２−４２９８２号公報
【特許文献４】
特開平６−１２１６８３号公報
【特許文献５】
特開平７−７５５７４公報
【特許文献６】
特開平７−１３５９７５号公報
【特許文献７】
特開平７−１４０１４６号公報
【特許文献８】
特開平９−２９９０８５号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な安定化ＰＯＤ組成物を提供する。ＰＯＤを常温においても長期間安定化させ、且つ廉価であるような化合物を含む組成物が特に望ましい。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
今や、フェノール（或いはヒドロキシフェニル／ヒドロキシベンジル）骨格を有さない特定の化合物が極めて有効にＰＯＤを安定化することが見出された。
【０００８】
すなわち、本発明の第１は、
（１）一般式（Ｉ）
【０００９】
【化２】
2004222634.tif 000003
［式中、Ｒは直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキル基を示す。］
で表される化合物を含有するペルオキシダーゼ組成物である。
【００１０】
上記化合物としては、５−アセトアミドアントラニル酸が、その入手の容易性等を考慮しても特に好ましい。従って、本発明の第２は、
（２）前記化合物が５−アセトアミドアントラニル酸である上記（１）の組成物である。
【００１１】
また、本発明のＰＯＤ組成物は、特に免疫測定用の試薬に好適に用いることができ、また、当該試薬を含むキットは、長期化安定に保存し得るので極めて有用である。従って、本発明の第３乃至第４は、
（３）ペルオキシダーゼが、抗体又は抗原とのコンジュゲートとして存在する上記（１）又は（２）の組成物であり、
（４）上記（３）の組成物を含む免疫測定用キットである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のＰＯＤ組成物は、少なくともＰＯＤと前記一般式（Ｉ）で表されるアントラニル酸誘導体を含む。
【００１３】
ＰＯＤ（ＥＣ  １．１１．１．７）は、一般にＨ２Ｏ２＋ＡＨ２→２Ｈ２Ｏ＋Ａの反応を触媒する酵素であり、動物、植物或いは微生物界にも広く存在する酵素である。ＥＬＩＳＡやウェスタンブロット等の実験技法において用いられる場合は、西洋ワサビペルオキシダーゼが特に有用である。これらの実験技法で用いられる場合、例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等を基質として用いることで、ＰＯＤによる検出可能な発色が得られる。
【００１４】
免疫学的測定方法においては、ＰＯＤを特定の抗原又は抗体にコンジュゲートすることが好ましい。当該コンジュゲート及びその作製方法は当業者に公知である。各種の抗原又は抗体がＰＯＤとコンジュゲートされ得る。抗体では、抗ＡＩＤＳウイルス抗体、抗肝炎ウイルス抗体、抗インシュリン抗体、抗食物アレルゲン抗体、抗ステロイドホルモン抗体或いはこれらの抗体の抗原特異的結合性部位等が例示されるがこれに限定されない。同様に抗原も各種ウイルスの抗原タンパク質や糖鎖、食物アレルゲンタンパク質、各種ホルモン等がＰＯＤとコンジュゲートされてよい。勿論、他の実験技法等に用いる場合はＰＯＤが核酸、レセプター、糖鎖又はレクチン等とコンジュゲートしていてもよく、或いは全くコンジュゲートしていない単体のＰＯＤであってもよい。
【００１５】
組成物中に含有されるＰＯＤの量には特に制限がなく、当該組成物の形態、用途や該組成物の他の成分等も勘案して適宜変更できるが、免疫測定用の試薬に用いる場合は、典型的に最終溶液の形態で０．０１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲であってよい。
【００１６】
本発明の組成物のもう一方の必須成分であるアントラニル酸誘導体は、その５位にアルキルアミド基を有する。該アルキルの例としては、メチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル等が上げられる。
【００１７】
特に５位の置換基としてアセトアミド基を有する化合物、すなわち５−アセトアミドアントラニル酸は市販されており、例えば東京化成工業株式会社から容易且つ廉価に入手することができる。
【００１８】
該アントラニル酸誘導体の組成物への添加量も、当該組成物の形態、用途等を勘案して適宜変更できるが、典型的には最終溶液の形態で０．０１乃至１ｗ／ｖ％、好ましくは０．０５〜０．５ｗ／ｖ％程度の範囲で添加されてよい。
【００１９】
本発明のＰＯＤ組成物には上記の２成分以外の付加的な成分を含み得る。例えば、組成物のｐＨ調製のための緩衝剤や牛血清アルブミン等の血清タンパク質、各種無機塩類、界面活性剤等を更に含んでよく、また所望によりラクトースやデキストラン、アスパラギン酸マグネシウム等の追加的安定剤を含んでもよい。
【００２０】
組成物が溶液形態である場合、当該組成物のｐＨは４乃至９程度に維持されることが好ましい。また、組成物を凍結乾燥物形態として調製する場合も、当該凍結乾燥形態の組成物が水に再溶解された際のｐＨは、やはり４乃至９程度となるように上記各種成分を組成すべきである。
【００２１】
本発明のＰＯＤ組成物は免疫測定用キットの試薬として好適に利用できる。サンドウィッチ法に基づくＥＬＩＳＡ用キットの例では、キャプチャー用としての一次抗体からなる試薬と、本発明のＰＯＤ組成物、すなわち本発明のアントラニル酸誘導体を含むＰＯＤ標識抗体含有検出用試薬、及び適切な酵素基質が該キットに含まれ得る。洗浄用の緩衝液や、ウェルへの非特異的吸着を抑制するブロッキング用試薬等が更に含まれてもよい。そのようなキットの構成及びその製造方法は当業者にとって公知であろう。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明が当該実施例に限定されないことはいうまでもない。なお、以下において、特にことわりのない限り濃度（％）は、ｗ／ｖ％をさす。
【００２２】
【実施例】
以下の方法により本発明のＰＯＤ組成物の安定性を試験した。
【００２３】
すなわち、ＰＯＤ組成物としてＰＯＤ標識抗体溶液（ＰＯＤ標識抗グリアジン抗体、０．１％ＢＳＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）を用い、これに０．１％の５−アセトアミドアントラニル酸を添加した溶液（実施例）及び無添加の溶液（比較例）を調製した。３７℃で３、７、１０及び１４日間保存後のＰＯＤの活性を以下の測定プロトコールに従って評価した。
【００２４】
測定プロトコール
１．抗グリアジン抗体（一次抗体）を固相化したマイクロプレートに１００μｌのサンプル溶液（それぞれ、グリアジン：０、１、３２及び６４ｎｇ／ｍｌを含む）を分注する。
２．室温で一時間静置して反応させる。
３．３００μｌの洗浄液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で６回洗浄する。
４．ＰＯＤ標識抗体溶液を１００μｌずつ分注する。
５．室温で３０分静置して反応させる。
６．３００μｌの洗浄液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で６回洗浄する。
７．発色基質（ＴＭＢ：３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン）を１００μｌずつ分注し、遮光下、室温で１０分間反応させる。
８．１Ｎ硫酸、１００μｌで反応を停止する。
９．波長４５０ｎｍの吸光度を測定する。
【００２５】
評価試験結果
上記試験の結果（２連）を表１に示した。
【００２６】
【表１】
2004222634.tif 000004
【００２７】
また、上記の結果のうち、抗原（グリアジン）濃度が６４ｎｇ／ｍｌのサンプルについての２連の平均値を、５−アセトアミドアントラニル酸添加（実施例）と無添加（比較例）の場合で、試験開始後０日目の測定値を１００％として標準化し、作成したグラフを図１に示した。
【００２８】
表１及び図１から明らかなように、本発明のアントラニル酸誘導体は組成物中のＰＯＤ活性を極めて有効に安定化した。
【図面の簡単な説明】
【図１】５−アセトアミドアントラニル酸添加ＰＯＤ組成物（実施例）と無添加ＰＯＤ組成物（比較例）における３７℃でのＰＯＤ酵素活性の経時的変化を示す。縦軸は０日目の酵素活性を１００％とした時の相対活性（％）。横軸は日数。
【図１】
2004222634.tif 000007