(57)【要約】【課題】有機溶媒耐性チロシナーゼを遺伝子工学的に大量製造することができる方法を提供すること。【解決手段】有機溶媒耐性チロシナーゼおよびその遺伝子、該チロシナーゼの銅イオンの配位を制御する分子シャペロン様タンパク質およびその遺伝子、それらの遺伝子を含有する組換えべクター、該組換えべクターを有する形質転換体、該形質転換体を用いた該チロシナーゼおよび該分子シャペロン様タンパク質の製造方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのタンパク質：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質；
（１）作用：モノフェノールモノオキシゲナーゼ活性およびカテコールオキシダーゼ活性を有する
（２）有機溶媒に対して耐性を有する。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号７７５〜１５９３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾された塩基配列からなり、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（１）作用：モノフェノールモノオキシゲナーゼ活性およびカテコールオキシダーゼ活性を有する
（２）有機溶媒に対して耐性を有する。
【請求項４】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのタンパク質：
（ａ）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質の銅イオンの配位を制御するタンパク質、
（１）作用：モノフェノールモノオキシゲナーゼ活性およびカテコールオキシダーゼ活性を有する
（２）有機溶媒に対して耐性を有する。
【請求項５】
請求項４記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号３１９〜７１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾された塩基配列からなり、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質の銅イオンの配位を制御するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質の銅イオンの配位を制御するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（１）作用：モノフェノールモノオキシゲナーゼ活性およびカテコールオキシダーゼ活性を有する
（２）有機溶媒に対して耐性を有する。
【請求項７】
請求項２または３記載のＤＮＡと請求項５または６記載のＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項８】
請求項２、３または７のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えべクター。
【請求項９】
請求項８記載の組換えべクターを含む形質転換体。
【請求項１０】
請求項９記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物から請求項１記載のタンパク質を採取することを特徴とする、請求項１記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項５または６記載のＤＮＡを含有する組換えべクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換えべクターを含む形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物から請求項４記載のタンパク質を採取することを特徴とする、請求項４記載のタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機溶媒耐性チロシナーゼおよびその遺伝子、該チロシナーゼの銅イオンの配位を制御する分子シャペロン様タンパク質およびその遺伝子、それらの遺伝子を含有する組換えべクター、該組換えべクターを有する形質転換体、該形質転換体を用いた該チロシナーゼおよび該分子シャペロン様タンパク質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、水−有機溶媒混合液中での酵素反応を利用した有用高分子生産の研究が盛んに行われている。水−有機溶媒混合液中での反応は、水溶液中でのそれと比べて、（１）水難溶性物質を基質とすることができる、（２）生成物の溶解度が高まり、重合度および特性の異なる生成物が得られる、等の利点がある。水−有機溶媒系での高分子の酵素合成の報告例としては、特開平７−１２６３５４号公報、特開平８−３０２００７号公報、特開平９−１２７１０号公報等がある。これらの報告では、酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼ、大豆ペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、チロシナーゼ等の酸化還元酵素が用いられている。しかしながら、それらはいずれも従来より市販の酵素であり、水−有機溶媒中での反応を目的として開発されたものではない。そのため、これらの酵素は高濃度の有機溶媒存在下では不安定且つ低反応性となり、効率的な重合反応を行うことができない。したがって、有機溶媒中でも安定で且つ高い反応性を有する酵素の開発が要望されている。
【０００３】
有機溶媒耐性の酵素としては、細菌由来のエチルアルコール耐性プロテアーゼがこれまでに報告されているが（例えば、特開平５−２１１８６９号公報、特開平９−３７７８１号公報等）、酸化還元酵素、特にチロシナーゼについては有機溶媒耐性のものは知られていない。
【０００４】
チロシナーゼは、フェノールを分子状酸素でｏ−ジフェノール、さらにｏ−キノンに酸化する酵素で、菌類の子実体、ジャガイモ、リンゴなどの植物および動物のメラノサイト等に広く存在し、生体内ではチロシンを酸化してメラニン形成を行う。したがって、該酵素はフェノール性高分子やメラニン等の有用高分子の合成に利用することができる。
【０００５】
また、チロシナーゼは、各種フェノール性化合物を酸化する能力を有しているので、本酵素を用い、有毒なフェノール性環境汚染物質を解毒化することも可能である。
【０００６】
本発明者らは、放線菌の一種であるストレプトミセス属に属する土壌分離菌が、有機溶媒に対して耐性を有する新規チロシナーゼを菌体外に生産することを見い出し、この有機溶媒耐性チロシナーゼおよびその製造方法について特許出願した（特開２０００−１８４８８１号公報）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記の発明により、有機溶媒に対して耐性を有し、遺伝子操作や変異体の作製の容易な原核生物由来のチロシナーゼが得られ、その精製も容易に行うことが可能となった。しかしながら、生産菌の本酵素の産生が少量であり、生産効率が悪く、チロシナーゼの大量生産が困難であるという問題点があった。
【０００８】
本発明は、以上のとおりの事情を鑑みてなされたものであり、上記の有機溶媒耐性チロシナーゼを遺伝子工学的に大量製造するための遺伝子操作材料と、この材料を用いた有機溶媒耐性チロシナーゼの製造方法を提供することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、放線菌の一種であるストレプトミセス属に属する土壌分離菌が産生する有機溶媒耐性チロシナーゼの遺伝子を単離し、その遺伝子のＤＮＡ塩基配列を解明することにより、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕　以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのタンパク質：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質；
（１）作用：モノフェノールモノオキシゲナーゼ活性およびカテコールオキシダーゼ活性を有する
（２）有機溶媒に対して耐性を有する。
〔２〕　上記〔１〕記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔３〕　以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号７７５〜１５９３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾された塩基配列からなり、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（１）作用：モノフェノールモノオキシゲナーゼ活性およびカテコールオキシダーゼ活性を有する
（２）有機溶媒に対して耐性を有する。
〔４〕　以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのタンパク質：
（ａ）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質の銅イオンの配位を制御するタンパク質、
（１）作用：モノフェノールモノオキシゲナーゼ活性およびカテコールオキシダーゼ活性を有する
（２）有機溶媒に対して耐性を有する。
〔５〕　上記〔４〕記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔６〕　以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号３１９〜７１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾された塩基配列からなり、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質の銅イオンの配位を制御するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質の銅イオンの配位を制御するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（１）作用：モノフェノールモノオキシゲナーゼ活性およびカテコールオキシダーゼ活性を有する
（２）有機溶媒に対して耐性を有する。
〔７〕　上記〔２〕または〔３〕記載のＤＮＡと上記〔５〕または〔６〕記載のＤＮＡを含有するＤＮＡ。
〔８〕　上記〔２〕、〔３〕または〔７〕のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えべクター。
〔９〕　上記〔８〕記載の組換えべクターを含む形質転換体。
〔１０〕　上記〔９〕記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物から上記〔１〕記載のタンパク質を採取することを特徴とする、上記〔１〕記載のタンパク質の製造方法。
〔１１〕　上記〔５〕または〔６〕記載のＤＮＡを含有する組換えべクター。
〔１２〕　上記〔１１〕記載の組換えべクターを含む形質転換体。
〔１３〕　上記〔１２〕記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物から上記〔４〕記載のタンパク質を採取することを特徴とする、上記〔４〕記載のタンパク質の製造方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼは、モノフェノールモノオキシゲナーゼ活性およびカテコールオキシダーゼ活性を有し、かつ有機溶媒に対して耐性を有する、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列（または後記の該アミノ酸配列と実質的に等価のアミノ酸配列）からなるタンパク質である。
ここでいう「有機溶媒に対して耐性である」とは、２０％有機溶媒の条件下でのカテコールオキシダーゼ活性が、有機溶媒非存在下での活性の約５０％以上であり、かつ２０％有機溶媒（ｐＨ７．０）の条件下で３０℃、２０時間保持した後の残存カテコールオキシダーゼ活性が約８０％以上であることを意味する。
本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼとしては、好ましくは２０％有機溶媒の条件下でのカテコールオキシダーゼ活性が、有機溶媒非存在下での活性の約６０％以上であり、且つ２０％有機溶媒（ｐＨ７．０）の条件下で３０℃、２０時間保持した後の残存カテコールオキシダーゼ活性が約９０％以上であるものが挙げられる。
【００１２】
上記有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、ＤＭＳＯ、アセトン、２−プロパノールが挙げられる。
本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼとしては、好ましくはメタノール、エタノール、１−プロパノール、ＤＭＳＯおよびアセトンのうち少なくとも１つの有機溶媒に対して耐性を有するもの、より好ましくはメタノール、エタノール、１−プロパノール、ＤＭＳＯおよびアセトンのすべてに対して耐性を有するもの、特に好ましくはメタノール、エタノール、１−プロパノール、ＤＭＳＯおよびアセトンに加えてさらに２−プロパノールに対しても耐性を有するものが挙げられる。
【００１３】
また、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中Ｎ末端のメチオニン残基（Ｍｅｔ）は、天然型チロシナーゼには存在しない。したがって、該チロシナーゼは、Ｍｅｔが切断されることにより成熟型になると考えられる。
【００１４】
本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼは、モノフェノールモノオキシゲナーゼ活性およびカテコールオキシダーゼ活性を有し、かつ有機溶媒に対して耐性を有する限り、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に等価のアミノ酸配列、すなわち、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。このような変異体は、自然または人工の突然変異により生じた突然変異体の中からスクリーニングすることができ、或いは有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子を用いて部位特異的突然変異誘発を導入することによって得ることができる。当業者であれば、部位特異的突然変異誘発に際して有機溶媒耐性チロシナーゼ活性を保持する変異を容易に予測することができる。例えば、保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）として知られるアミノ酸置換（例えば、アラニンからセリン、アルギニンからリシンへの置換等）等が挙げられる。
【００１５】
上記配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列としては、例えば、
（１）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中Ｎ末端のメチオニン残基（Ｍｅｔ）が欠損したもの、
（２）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮまたはＣ末端にＨｉｓ・ｔａｇ配列が付加したもの、
（３）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端にＧＳＴ・ｔａｇ配列が付加したもの、
などが挙げられる。
【００１６】
本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼは、そのアミノ酸組成の違いにより異なる分子量を有していてもよいが、好ましくは約３２，０００Ｄａの分子量（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ））を有する。
【００１７】
本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼは、その活性中心に２つの銅イオン（Ｃｕ２＋）を有する。すなわち、有機溶媒耐性チロシナーゼが活性型となるには２つのＣｕ２＋が配位することが必要であると考えられる。該Ｃｕ２＋が配位する位置は、他のチロシナーゼのアミノ酸配列との比較により、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中、１つのＣｕ２＋が３８、５４、６３番目のヒスチジン残基（Ｈｉｓ）、もう１つが１９１、１９５、２１７番目のヒスチジン残基であると推定される。また、該Ｃｕ２＋の配位は、後述する分子シャペロン様タンパク質によって制御されていると考えられる。したがって、有機溶媒耐性チロシナーゼが活性型となるには、Ｃｕ２＋のみならず分子シャペロン様タンパク質の存在も必要と考えられる。
【００１８】
本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼは、好ましくは以下の酵素学的性質を有する。
【００１９】
（ａ）至適ｐＨ
３０℃で反応させたときのカテコールオキシダーゼ活性を指標とした際に好適なｐＨが６．０〜８．５であり、至適ｐＨが約７．０である。
【００２０】
（ｂ）安定ｐＨ範囲
３０℃で１６時間保持した後の残存活性を指標とした際に安定ｐＨ範囲が７．０〜８．０である。
【００２１】
（ｃ）至適温度
ｐＨ７．０の緩衝液中で反応させたときのカテコールオキシダーゼ活性を指標とした際に好適な温度が３０〜４０℃、至適温度が約３５℃である。
【００２２】
（ｄ）熱安定性
ｐＨ７．０の緩衝液中で１０分間保持した後の残存活性を指標とした際に約５５℃まで安定である。
【００２３】
（ｅ）基質特異性
Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）、Ｌ−チロシン、エピカテキンを特異的に酸化する一方、Ｄ−ＤＯＰＡ、Ｄ−チロシンはあまり酸化せず、光学異性体をよく認識する。また、フェノール、カテコールをほとんど酸化しない。
【００２４】
本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼの由来は特に限定されない。例えば、天然に存在する生物起源のものの他、自然もしくは人工の突然変異体、あるいは異種（すなわち、外来の）有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子を導入して得られる形質転換体由来のものが挙げられる。好ましくは放線菌、より好ましくはストレプトミセス属に属する細菌、特に好ましくはストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）、就中ストレプトミセス・エスピー　ＲＥＮ−２１株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１７０５３）由来のもの（これらの細菌から単離される有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子が導入された形質転換体由来のものも包含する）である。
【００２５】
本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼの好ましい起源であるストレプトミセス・エスピー　ＲＥＮ−２１株は、本発明者によって土壌から分離された細菌であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、住所：茨城県つくば市東１−１−１　中央第６）に１９９８年１１月１２日付で国内寄託され、受託番号として、生命研菌寄第１７０５３号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１７０５３）を付されている菌株である（特開２０００−１８４８８１号公報）。
【００２６】
人工的に突然変異体を作製する方法としては、例えば、部位特異的突然変異誘発が挙げられる。当該方法を用いて配列表配列番号１に示される塩基配列に任意の変異をもたらすことによって、上記特徴を具備する変異有機溶媒耐性チロシナーゼを得ることができる。
【００２７】
本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼは、（１）該酵素を産生する組織または細胞を原料として抽出精製する方法、（２）化学的に合成する方法または（３）遺伝子組換え技術により有機溶媒耐性チロシナーゼを発現するように操作された細胞から精製する方法等を適宜用いることによって取得することができる。
【００２８】
天然の有機溶媒耐性チロシナーゼ産生細胞からの有機溶媒耐性チロシナーゼの単離精製は、例えば以下のようにして行うことができる。天然の有機溶媒耐性チロシナーゼ産生菌（例えば、ストレプトミセス・エスピー　ＲＥＮ−２１株）を、適当な培地、好ましくはポリペプトン−酵母エキス培地〔ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．１％、硫酸鉄０．００１％、硫酸銅０．０００１％（ｐＨ７．０）〕中で培養し、対数増殖期にある菌体の培養液から有機溶媒耐性チロシナーゼ活性画分（ストレプトミセス・エスピー　ＲＥＮ−２１株のように有機溶媒耐性チロシナーゼを分泌する細胞の場合は培養上清、有機溶媒耐性チロシナーゼを菌体内に蓄積する細胞の場合は細胞を適当な緩衝液中、超音波処理や界面活性剤処理によって破砕した後、遠心分離等を行うことにより得られる可溶性画分）を分離回収して、該画分からタンパク質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより、有機溶媒耐性チロシナーゼを精製することができる。このような分離技術としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
化学合成による本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼの製造は、例えば、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列を基にして、配列の全部または一部をペプチド合成機を用いて合成し、得られるポリペプチドを適当な条件下で再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させることにより行うことができる。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様においては、本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼは、該酵素をコードするＤＮＡをクローニングし、該ＤＮＡを担持する発現ベクターを含む形質転換体の培養物から単離精製することにより製造することができる。
【００３１】
有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子のクローニングは、以下の方法により行うことができる。まず、所望の酵素を産生する細胞または組織より、上記のような手段により該酵素を完全または部分精製し、そのＮ末端アミノ酸配列をエドマン分解法を用いて決定する。あるいはペプチドを配列特異的に切断するプロテアーゼや化学物質で該酵素を部分分解して得られるオリゴペプチドのアミノ酸配列を同様にエドマン分解法により決定する。決定された部分アミノ酸配列に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これらのオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、該酵素を産生する細胞または組織より調製された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡライブラリーから、コロニー（若しくはプラーク）ハイブリダイゼーション法などによって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングする。
【００３２】
また、完全または部分精製された酵素の全部または一部を抗原として該酵素に対する抗体を常法にしたがって作製し、該酵素を産生する細胞または組織より調製されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから、抗体スクリーニング法によって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングすることもできる。
【００３３】
目的の酵素と酵素学的性質の類似する酵素の遺伝子が公知である場合、ＥＭＢＬやＧｅｎＢａｎｋなどの一般に利用可能なデータベース上に登録されたＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ）クローンなどのＤＮＡ断片の中から、該公知遺伝子の塩基配列とホモロジーを有するクローンを検索し、抽出されたクローンの塩基配列を基にして、上記のようにプローブを作製し、コロニー（若しくはプラーク）ハイブリダイゼーション法によって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングすることもできる。
【００３４】
また、上記のストラテジーとは別に、本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼをコードするＤＮＡは、ＰＣＲ法を用いて直接クローニングすることができる。すなわち、該酵素活性を有する細胞または組織由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ（若しくはｍＲＮＡ）を鋳型とし、増幅断片が有機溶媒耐性チロシナーゼのコード領域をカバーするような適当なオリゴヌクレオチドの対をプライマーとして用いて、常法に従ってＰＣＲを行うことにより、有機溶媒耐性チロシナーゼのコード領域を含むＤＮＡ断片を増幅することができる。このような方法は、配列既知の有機溶媒耐性チロシナーゼと分子進化上、同一の起源を有する有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子のクローニングにおいて特に有用である。例えば、ストレプトミセス・エスピー　ＲＥＮ−２１株由来の有機溶媒耐性チロシナーゼと分子進化上、同一の起源を有すると推定される他の細菌由来の有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子をクローニングする場合、配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号７７５〜１５９３を含むＤＮＡ断片と高度に相同性を有するＤＮＡ断片を増幅し得るようなセンスおよびアンチセンスプライマーを構築してＰＣＲ法を実施すればよい。
【００３５】
また、目的の有機溶媒耐性チロシナーゼと高度な相同性を有する有機溶媒耐性チロシナーゼのＤＮＡ配列が未知の場合でも、例えば、５’上流領域の比較的保存されている幾つかの配列をセンスプライマー、３’下流領域の比較的保存されている幾つかの相補鎖配列をアンチセンスプライマーとして、ＰＣＲを行うことにより、該有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子をクローニングすることができる。この際、有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子全部をコードするＤＮＡの増幅断片ではなく、その一部を含むＤＮＡの増幅断片が得られることもあるが、この場合、当該有機溶媒耐性チロシナーゼ活性を有する細胞または組織由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ（もしくはｍＲＮＡ）を鋳型とし、該増幅断片をプローブとして用いて、サザン法等のハイブリダイゼーション法により、該酵素をコードするＤＮＡを直接クローニングすることができる。
【００３６】
上記のようにして得られたＤＮＡの塩基配列は、マキサム・ギルバート法やジデオキシ法などの公知のシークエンス技術を用いて決定することができる。
【００３７】
本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼをコードするＤＮＡとしては、
（ａ）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号７７５〜１５９３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾された塩基配列からなり、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（１）作用：モノフェノールモノオキシゲナーゼ活性およびカテコールオキシダーゼ活性を有する
（２）有機溶媒に対して耐性を有する、
などが挙げられる。
【００３８】
上記「ストリンジェントな条件」とは、塩基配列において約６０％以上の同一性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいう。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション反応や洗浄の際の塩濃度および温度等を適宜変化させることにより調節することができる。
【００３９】
上記（ｂ）のＤＮＡとしては、例えば、
（１）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号７７８〜１５９３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）上記（１）のＤＮＡの５’または３’末端にＨｉｓ・ｔａｇ配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡが付加したもの、
（３）上記（１）のＤＮＡの５’末端にＧＳＴ・ｔａｇ配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡが付加したもの、
などが挙げられる。
【００４０】
上記（ｃ）のＤＮＡとしては、例えば、
（１）細菌由来のチロシナーゼをコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）放線菌由来のチロシナーゼをコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（３）ストレプトミセス属由来のチロシナーゼをコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
などが挙げられる。
【００４１】
本発明の遺伝子はいかなる方法で得られるものであってもよい。例えば、ｍＲＮＡから調製されるｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリーから調製されるゲノムＤＮＡ、化学的に合成されるＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅させて得られるＤＮＡ及びこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるＤＮＡ等が挙げられる。
【００４２】
また、本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼをコードするＤＮＡは、配列表配列番号３に示される塩基配列（特にその塩基番号７７５〜１５９３に示される塩基配列）を基にして、化学的に合成されるＤＮＡであってもよい。
【００４３】
本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼは、上述したように、その活性中心に２つのＣｕ２＋を有し、該Ｃｕ２＋の配位は分子シャペロン様タンパク質によって制御されていると考えられる。したがって、活性型の有機溶媒耐性チロシナーゼを製造するためには該分子シャペロン様タンパク質が必要であると考えられる。したがって、活性型の有機溶媒耐性チロシナーゼを、有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子を含有する発現ベクターを用いる方法などの遺伝子組換え技術により製造する場合には、該発現ベクターに該分子シャペロン様タンパク質の遺伝子も組み込むことなどによって該分子シャペロン様タンパク質も発現・共存させる必要があると考えられる。
【００４４】
本発明の分子シャペロン様タンパク質は、上記有機溶媒耐性チロシナーゼにおけるＣｕ２＋の配位を制御する活性を有する、配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列（または後記の該アミノ酸配列と実質的に等価のアミノ酸配列）からなるタンパク質である。
【００４５】
上記分子シャペロン様タンパク質は、上記有機溶媒耐性チロシナーゼにおけるＣｕ２＋の配位を制御する活性を有する限り、配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列と実質的に等価のアミノ酸配列、すなわち、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。このような変異体は、上記有機溶媒耐性チロシナーゼの変異体と同様にして得ることができる。
【００４６】
上記配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾されたアミノ酸配列としては、例えば、
（１）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮまたはＣ末端にＨｉｓ・ｔａｇ配列が付加したもの、
（２）配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端にＧＳＴ・ｔａｇ配列が付加したもの、
などが挙げられる。
【００４７】
上記分子シャペロン様タンパク質の由来としては、上記有機溶媒耐性チロシナーゼと同様のものが挙げられ、また、その製造方法としては、上記有機溶媒耐性チロシナーゼと同様の方法が挙げられる。
【００４８】
本発明の分子シャペロン様タンパク質をコードするＤＮＡとしては、
（ａ）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号３１９〜７１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠損、置換、挿入、付加もしくは修飾された塩基配列からなり、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質の銅イオンの配位を制御するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ以下の（１）および（２）の性質を有するタンパク質の銅イオンの配位を制御するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（１）作用：モノフェノールモノオキシゲナーゼ活性およびカテコールオキシダーゼ活性を有する
（２）有機溶媒に対して耐性を有する、
などが挙げられる。
【００４９】
上記「ストリンジェントな条件」とは、塩基配列において約６０％以上の同一性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいう。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション反応や洗浄の際の塩濃度および温度等を適宜変化させることにより調節することができる。
【００５０】
上記（ｂ）のＤＮＡとしては、例えば、
（１）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号３１９〜７１１に示される塩基配列からなるＤＮＡの５’または３’末端にＨｉｓ・ｔａｇ配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡが付加したもの、
（２）配列表配列番号３に示される塩基配列中塩基番号３１９〜７１１に示される塩基配列からなるＤＮＡの５’末端にＧＳＴ・ｔａｇ配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡが付加したもの、
などが挙げられる。
【００５１】
上記（ｃ）のＤＮＡとしては、例えば、
（１）細菌由来の分子シャペロン様タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（２）放線菌由来の分子シャペロン様タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（３）ストレプトミセス属由来の分子シャペロン様タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
などが挙げられる。
【００５２】
上記分子シャペロン様タンパク質の遺伝子は、有機溶媒耐性チロシナーゼの遺伝子と同様の方法によりクローニングおよび製造することができる。
【００５３】
遺伝子組換え技術により有機溶媒耐性チロシナーゼを製造する場合には、有機溶媒耐性チロシナーゼの遺伝子と共に分子シャペロン様タンパク質の遺伝子も発現ベクターに組み込むことが好ましいが、これには例えば上記有機溶媒耐性チロシナーゼをコードするＤＮＡと上記分子シャペロン様タンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ（例えば、配列表配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡなど）として発現ベクターに組み込むこと、有機溶媒耐性チロシナーゼをコードするＤＮＡと分子シャペロン様タンパク質をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込むこと、有機溶媒耐性チロシナーゼをコードするＤＮＡと分子シャペロン様タンパク質をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに組み込むことなどが含まれる。
【００５４】
本発明はまた、上記有機溶媒耐性チロシナーゼをコードするＤＮＡおよび／または上記分子シャペロン様タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。本発明の組換えベクターは原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターやウイルスベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡便には当該技術分野において入手可能な公知のクローニングベクターまたは発現ベクターに、上記有機溶媒耐性チロシナーゼをコードするＤＮＡおよび／または上記分子シャペロン様タンパク質をコードするＤＮＡを適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより調製することができる。このようなベクターとしては、宿主が細菌の場合、大腸菌由来のｐＧＥＸ−６Ｐ−１等のｐＧＥＸ系ベクター、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）等のｐＥＴ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５等のｐＢＲ系ベクター、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等のｐＵＣ系ベクター等、枯草菌由来のｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等、放線菌由来のｐＩＪ７０２、ｐＳＫ１、ｐＳＫ２、ＳＣＰ２、ＳＣＰ１．２、ｐＧＡ４８２、ｐＭＣＸｐｒｅｓｓ、または酵母由来のｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等が例示される。また、ウイルスベクターとしては、λファージなどのバクテリオファージや、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）などのパポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）などのレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニヤウイルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイルスが例示される。
【００５５】
特に、本発明の組換えベクターは、上記有機溶媒耐性チロシナーゼをコードする遺伝子および／または上記分子シャペロン様タンパク質をコードする遺伝子を機能的に含む発現ベクターである。ここで「機能的に」とは、そのベクターに適合する宿主細胞内で該遺伝子（ＤＮＡ）が転写され、それにコードされるタンパク質が産生され得るように該遺伝子が配置されていることを意味する。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、上記分子シャペロン様タンパク質またはその各サブユニットをコードする遺伝子、有機溶媒耐性チロシナーゼまたはその各サブユニットをコードする遺伝子、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列された発現カセットを有するベクターである。使用されるベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得るプロモーター領域（例えば宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｅｃＡプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等、宿主が哺乳動物細胞の場合、ＳＶ４０由来初期プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ由来ロングターミナルリピート、アデノウイルス由来初期プロモーターなどのウイルスプロモーター）と、該遺伝子の転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが、少なくとも１つの制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターをその箇所のみで切断するユニークな制限部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシンなどの薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有していることが好ましい。さらに、挿入される有機溶媒耐性チロシナーゼをコードするＤＮＡおよび／または上記分子シャペロン様タンパク質をコードするＤＮＡが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含むベクターが好ましく使用される。
【００５６】
宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を包含する。
【００５７】
宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは、エンハンサー配列、分子シャペロン様タンパク質　ｍＲＮＡの５’側および３’側の非翻訳領域、有機溶媒耐性チロシナーゼ　ｍＲＮＡの５’側および３’側の非翻訳領域、ポリアデニレーション部位等をさらに含むことが好ましい。
【００５８】
また、形質転換体の培地中に有機溶媒耐性チロシナーゼまたは分子シャペロン様タンパク質を分泌させる場合において、挿入される有機溶媒耐性チロシナーゼをコードするＤＮＡまたは分子シャペロン様タンパク質をコードするＤＮＡがシグナルペプチドのコード配列を含まない場合は、ベクターとして、開始コドンに続いて適当なシグナルコドンをさらに含む分泌発現用ベクターが好ましく使用される。取得を目的として有機溶媒耐性チロシナーゼまたは分子シャペロン様タンパク質を培地中へ分泌させるためには本発明の発現ベクターはシグナル配列を機能的に含有していることが好ましい。当該シグナル配列は宿主細胞のタンパク質の分泌機構が認識できるものであれば特に限定されないが、宿主細胞が放線菌の場合、本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼをコードする遺伝子または分子シャペロン様タンパク質をコードする遺伝子とその由来を同じくするストレプトマイセス属のものが好ましい。該シグナル配列は細胞内のプロテアーゼにより切断除去されて成熟タンパク質が細胞外に分泌される。
【００５９】
本発明の形質転換体は、本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼをコードするＤＮＡおよび／または分子シャペロン様タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞である。宿主細胞は使用する組換えベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、当分野で通常使用される天然に存在する細胞あるいは人工的に作製された変異体細胞若しくは組換え体細胞等種々の細胞が利用できる。本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞あるいは人工的に樹立された変異細胞または組換え細胞等種々の細胞が利用できる。好ましくは細菌、特に大腸菌（例えばＢＬ２１、ＪＭ１０９、ＤＨ５、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等）、枯草菌、シュードモナス属細菌（例えばシュードモナス・フルオレセンス等）、ストレプトミセス属細菌（例えばストレプトミセス・リビダンス等）、シュードストレプトミセス属細菌、アセトバクター属細菌等が挙げられる。
【００６０】
発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌の場合は、Ｃｏｈｅｎ　らの方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　６９，２１１０　（１９７２））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　１６８、　１１１　（１９７９）　）、コンピテント法（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　５６，　２０９　（１９７１）　）等によって、酵母の場合は、Ｈｉｎｎｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　７５，　１９２７　（１９７８））、リチウム法（Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１５３，　１６３　（１９８３））等によって、動物細胞の場合は、Ｇｒａｈａｍの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　５２，　４５６　（１９７３））等によって、また昆虫細胞の場合は、Ｓｕｍｍｅｒｓ　らの方法（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．３，　２１５６−２１６５　（１９８３））等によって、それぞれ形質転換することができる。
【００６１】
本発明の有機溶媒耐性チロシナーゼまたは分子シャペロン様タンパク質は、好ましくは上記のようにして調製される有機溶媒耐性チロシナーゼおよび／または分子シャペロン様タンパク質発現ベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から有機溶媒耐性チロシナーゼまたは分子シャペロン様タンパク質を回収することによって製造することができる。
【００６２】
使用される培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖等が、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等が例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）等〕を含んでいてもよい。
【００６３】
培養は当分野において知られている方法により行われる。下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、本発明における培養条件はこれらに何ら限定されるものではない。
【００６４】
宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌等である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒ．　Ｊ．，　Ｅｘｐ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ，　ｐ．４３１，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７２））等が例示される。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常１４〜４３℃で約３〜２４時間行うことができる。宿主が枯草菌の場合、必要により通気・攪拌をしながら、通常３０〜４０℃で約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母の場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最少培地（Ｂｏｓｔｉａｎ．　Ｋ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７７，　４５０５　（１９８０））が挙げられ、そのｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行われ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００６５】
宿主が動物細胞の場合、培地として、例えば約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１２２，　５０１　（１９５２））、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　８，　３９６　（１９５９））、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．　Ａｍ．　Ｍｅｄ．　Ａｓｓｏｃ．，　１９９、　５１９　（１９６７））、１９９培地（ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｅｘｐ．　Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，　７３，　１　（１９５０））等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行われ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００６６】
宿主が昆虫細胞の場合、培地として、例えばウシ胎仔血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ　培地（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８２，　８４０４　（１９８５）　）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行われ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００６７】
有機溶媒耐性チロシナーゼまたは分子シャペロン様タンパク質の精製は、有機溶媒耐性チロシナーゼ活性または分子シャペロン活性の存在する画分に応じて、通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００６８】
培養物の培地中に存在する有機溶媒耐性チロシナーゼまたは分子シャペロン様タンパク質は、培養物を遠心または濾過して培養上清（濾液）を得、該培養上清から、例えば、塩析、溶媒沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことにより得ることができる。
【００６９】
一方、細胞質に存在する有機溶媒耐性チロシナーゼまたは分子シャペロン様タンパク質は、培養物を遠心または濾過して細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解、浸透圧ショック、および／またはトライトン−Ｘ１００などの界面活性剤処理等により、細胞およびオルガネラ膜を破砕（溶解）した後、遠心分離や濾過等によりデブリスを除去して可溶性画分を得、該可溶性画分を、上記と同様の方法で処理することにより単離精製することができる。
【００７０】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって何ら本発明の範囲を限定するものではない。
実施例中、チロシナーゼ活性は下記の酸素電極法で測定した。また、塩基配列解析は、以下の方法で行った。
【００７１】
（酸素電極法）
全容量が５ｍｌの基質溶液（４ｍＭ　Ｌ−ＤＯＰＡを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））を３０℃で１０分間保持して温度を均一にした後、適当に希釈した酵素液（２０〜５０μｌ）を加えて反応を開始した。活性は、反応の進行に伴う酸素消費量の初速度より求めた。溶存酸素量の測定は、クラーク型酸素電極（ＹＳＩ　ｍｏｄｅｌ　５３００　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｏｘｙｇｅｎ　ｍｏｎｉｔｏｒ）を用いて行った。３０℃で空気と平衡状態にある水中の溶存酸素量は２２８μＭとした。以上の条件で１分間に１μｍｏｌの酸素を消費する酵素活性を１単位とした。
【００７２】
（塩基配列解析）
プラスミド０．２〜０．５μｇを鋳型とし、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃２４０秒のＰＣＲ反応を行った。上記反応物をＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列を解析した。
【００７３】
実施例１　有機溶媒耐性チロシナーゼ意伝子のクローニング
（１）ストレプトミセス・エスピーＲＥＮ−２１株ゲノムＤＮＡの調製
ストレプトミセス・エスピー　ＲＥＮ−２１株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１７０５３）を培養し、培養液からろ過によって菌体約１ｇを回収し、ゲノムＤＮＡを公知の方法（Ｄ．Ａ．　Ｈｏｐｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　ｐｐｌ０，　Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　（１９８５））により調製した。
【００７４】
（２）ＰＣＲによる有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子の部分増幅
種々のチロシナーゼ間で保存性の高いアミノ酸配列より、表１に示すセンスプライマー（Ｆ１：配列表配列番号４）、アンチセンスプライマー（Ｒ２：配列表配列番号５）を合成した。
【００７５】
【表１】
2004016147.tif 000002
【００７６】
ストレプトミセス・エスピー　ＲＥＮ−２１株ゲノムＤＮＡ５０ｎｇを鋳型とし、表１のＦ１、Ｒ２およびＫＯＤ　ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９７℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃９０秒、３０サイクルのＰＣＲを行った。増幅された約４００ｂｐのＤＮＡ断片をリン酸化した後、アガロースゲル電気泳動で分離し、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いて抽出精製した。得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９（東洋紡績社製）のＳｍａ　Ｉサイトに挿入し、それを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行った。形質転換した大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液より、菌体を集菌した後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐ１ａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いてプラスミドを抽出精製し、塩基配列解析を行った。その結果、得られた塩基配列より推測されるアミノ酸配列が、既知のチロシナーゼのアミノ酸配列と相同性を示した。このことより、増幅されたＤＮＡ断片は、有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子の一部であると推測された。
【００７７】
（３）サザンブロット解析
（２）のＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片１００ｎｇをＤＩＧ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて、ＤＩＧ標識した。
【００７８】
（１）で調製したゲノムＤＮＡ５μｇを制限酵素Ｓｍａ　Ｉ、Ｓｐｈ　ＩまたはＢａｍ　ＨＩ（ニッポンジーン社製）で完全消化し、アガロースゲルで電気泳動した後、ＶａｃｕＧｅｎｅ　ＸＬ　Ｖａｃｕｕｍ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。この膜に、上述のＤＩＧ標識したプローブを加え、常法により検出した結果、Ｓｍａ　Ｉで約１．５ｋｂｐ、Ｓｐｈ　Ｉで約３．５ｋｂｐ、Ｂａｍ　ＨＩで約７．５ｋｂｐの陽性バンドを得た。
【００７９】
（４）Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲによる有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子全長の解析
（１）で調製したゲノムＤＮＡ１０μｇを制限酵素Ｓｍａ　ＩまたはＳｐｈ　Ｉで完全消化し、アガロースゲルで電気泳動した後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いて、Ｓｍａ　Ｉは１．５ｋｂｐ、ＳｐｈＩは３．５ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片を抽出精製した。これにＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を加え、１６℃、２時間インキュベートした。これらのセルフライゲーションさせたＤＮＡ断片２０ｎｇを鋳型とし、表１に示したプライマー（Ｉｎｖ−Ｆ３：配列表配列番号６、Ｉｎｖ−Ｒ４：配列表配列番号７）およびＫＯＤ　ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９７℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃２４０秒、３０サイクルのＰＣＲを行った。
【００８０】
得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＳｍａ　Ｉサイトに挿入し、それを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行った。形質転換した大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。培養液より菌体を集菌した後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐ１ａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いてプラスミドを抽出精製し、塩基配列解析を行った。その結果得られた部分制限酵素地図および配列を決定した領域を図１に示す。
【００８１】
この塩基配列を決定した領域には、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見い出され、それぞれＯＲＦ１、ＯＲＦ２とした。ＯＲＦ１は、３９３塩基からなり、１３１残基のアミノ酸（分子量：１３，７４３）をコードしていた（配列表配列番号２および３）。本遺伝子に対応するアミノ酸配列のホモロジー検索を行ったところ、既知のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属由来のチロシナーゼの銅イオンの配位に必須な分子シャペロン様タンパク質と５０〜３０％の相同性を示した。このことより、ＯＲＦ１は、チロシナーゼの銅イオンの配位に必須な分子シャペロン様タンパク質遺伝子であると判明した。ＯＲＦ２は、８１９塩基からなり、２７３残基のアミノ酸（分子量：３０，８６０）をコードしていた（配列表配列番号１および３）。ホモロジー検索を行ったところ、既知のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属由来のチロシナーゼと６０〜４０％の相同性を示した。また、このアミノ酸配列中アミノ酸番号２のＡｌａからアミノ酸番号１４のＧｌｕまでが別途決定した天然型有機溶媒耐性チロシナーゼのＮ末端アミノ酸配列（特開２０００−１８４８８１号公報）と完全に一致したことから、ＯＲＦ２は、有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子であることが判明した。
【００８２】
実施例２　有機溶媒耐性チロシナーゼ発現プラスミドの構築
実施例１（１）で調製したゲノムＤＮＡ１０μｇを制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ（ニッポンジーン社製）で完全消化し、アガロースゲルで電気泳動した後、ＧｅｎＥｌｕｔｅＧｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いて約７．５ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片１０ｎｇを鋳型として、表１に示したプライマー（Ｆ５：配列表配列番号８、Ｒ６：配列表配列番号９）およびＫＯＤ　ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９７℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行った。
【００８３】
得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＳｍａ　Ｉサイトに挿入し、それを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行った。形質転換した大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。培養液より菌体を集菌した後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐ１ａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いてプラスミドを抽出精製した。このＯＲＦ１およびＯＲＦ２を含むプラスミドをｐＵＣ−ＯＳＲＴとした。
【００８４】
このｐＵＣ−ＯＳＲＴを鋳型として、表１に示したプライマー（ｅｘ−Ｆ７Ｎｄｅ：配列表配列番号１０、ｅｘ−Ｒ８Ｅｃｏ：配列表配列番号１１）およびＫＯＤ　ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９７℃１５秒、５０℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行った。なお、ｅｘ−Ｆ７Ｎｄｅは、Ｎｄｅ　Ｉ切断サイトを含み、ｅｘ−Ｒ８Ｅｃｏは、Ｅｃｏ　ＲＩ切断サイトを含む。得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＳｍａＩサイトに挿入し、それを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行った。形質転換した大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。培養液より菌体を集菌した後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐ１ａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いてプラスミドを抽出精製した。このプラスミドを制限酵素Ｎｄｅ　ＩとＥｃｏ　ＲＩで切断し、アガロースゲルで電気泳動した後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いて約１．３ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片を抽出精製した。得られたＤＮＡ断片をｐＥＴ−２０ｂ（＋）（宝酒造社製）のＮｄｅ　ＩとＥｃｏ　ＲＩの切断サイトに挿入し、有機溶媒耐性チロシナーゼ発現用プラスミドｐＥＴ−ＯＳＲＴとした。このプラスミドを用い大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（宝酒造社製）を形質転換させ、これをｐＥＴ−ＯＳＲＴ／ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳとした。
【００８５】
実施例３　大腸菌での有機溶媒耐性チロシナーゼの製造
実施例２で作成した形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭの硫酸銅を含むＬＢ培地に植菌後、３０℃で１０時間前培養を行った。前培養液から１ｍｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭの硫酸銅を含むＬＢ培地１００ｍｌに植菌後、２５℃で１６時間培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収し、２０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕した。遠心分離により菌体残さを取り除き、上清を粗酵素液とした。この粗抽出液中に含まれるチロシナーゼ活性を上述の酸素電極法により測定したところ、培養液１リットル当たり７，０００単位であった。この値は、培養液１リットル当たり約５４ｍｇの有機溶媒耐性チロシナーゼを生産していることを示している。
【００８６】
この遺伝子細み換えにより作製した有機溶媒耐性チロシナーゼの性質を特開２０００−１８４８８１号公報に記載の方法に従って決定したところ、もとの菌であるストレプトマイセス・ヱスピーＲＥＮ−２１株の生産する酵素の性質（特開２０００−１８４８８１号公報）と同様に以下の性質を示した。
【００８７】
（ａ）至適ｐＨ
３０℃で反応させたときのカテコールオキシダーゼ活性を指標としたところ、上記酵素の好適ｐＨ範囲は６．０〜８．５であり、至適ｐＨは約７．０であった。
【００８８】
（ｂ）安定ｐＨ範囲
３０℃で１６時間保持した後の残存活性を指標としたところ、上記酵素の安定ｐＨ範囲は７．０〜８．０であった。
【００８９】
（ｃ）作用適温の範囲
ｐＨ７．０の緩衝液中で反応させたときのカテコールオキシダーゼ活性を指標としたところ、上記酵素の好適反応温度は３０〜４０℃であり、至適温度は約３５℃であった。
【００９０】
（ｄ）熱安定性
上記酵素は、ｐＨ７．０の緩衝液中で１０分間保持した後の残存活性を指標としたところ、５５℃まで安定であった。
【００９１】
（ｅ）有機溶媒存在下での活性
上記酵素は、２０％有機溶媒（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ＤＭＳＯおよび／またはアセトン）（ｐＨ７．０）の条件下でのカテコールオキシダーゼ活性が、有機溶媒非存在下での活性の約５０％以上であった。
【００９２】
（ｆ）有機溶媒存在下での安定性
上記酵素は、２０％有機溶媒（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ＤＭＳＯおよび／またはアセトン）（ｐＨ７．０）の条件下で３０℃、２０時間保持した後の残存カテコールオキシダーゼ活性が約８０％以上であった。
【００９３】
（ｇ）分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより上記酵素の分子量を測定したところ、分子量は約３２，０００であった。
【００９４】
（ｈ）基質特異性
上記酵素はＬ−ＤＯＰＡ、Ｌ−チロシン、エピカテキンをよく酸化する一方、Ｄ−ＤＯＰＡ、Ｄ−チロシンをあまり酸化しなかった。
【００９５】
（ｉ）阻害剤の影響
上記酵素の活性は、コウジ酸、システイン塩酸塩、ＤＬ−ジチオスレイトール、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムによって阻害されるが、アルブチン、アジ化ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムによっては阻害されなかった。
【００９６】
（ｊ）金属塩の影響
上記酵素の活性は、ＣｕＣｌ２　、ＦｅＣｌ３　、ＺｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２　、ＭｎＣｌ２　、ＣａＣｌ２　、ＫＣｌ、ＮａＣｌのいずれの金属塩によっても大きな影響を受けなかった。
【００９７】
【発明の効果】
本発明によれば、有機溶媒耐性チロシナーゼを遺伝子工学的に大量製造することができる。
【００９８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号４：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：ＰＣＲ用プライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
【００９９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】有機溶媒耐性チロシナーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す図である。
【図１】
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