(57)【要約】【課題】レクチンを支持体に固定する方法を提供する。【解決手段】抗タグ抗体（一例として抗ＦＬＡＧ抗体）１４を支持体１２に固定し、レクチンに融合させたタグ抗体（一例としてＦＬＡＧ抗体）を、この抗タグ抗体（一例として抗ＦＬＡＧ抗体）１４に結合させて、レクチンを固定する方法である。【選択図】　　　　図４
2004016227.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レクチンを支持体に固定化する固定化方法であって、
レクチン及びタグ・ペプチドをベクターＤＮＡにコード化する工程と、
このコード化されたＤＮＡを使用してＬ−Ｔ複合タンパクを作らせる工程と、
前記タグ・ペプチドに対して結合性又は会合性を備える抗タグ抗体が固定されている支持体に前記Ｌ−Ｔタンパクを接触させる工程と、
を含むレクチンの固定化方法。
【請求項２】
前記レクチンがマメ科のレクチンであることを特徴とする請求項１に記載のレクチンの固定化方法。
【請求項３】
前記レクチンにおいて、そのループＣ若しくはループＤの１又はそれ以上のアミノ酸が改変された改変レクチンを前記ベクターＤＮＡにコード化したことを特徴とする請求項１又は２に記載のレクチンの固定化方法。
【請求項４】
前記タグ・ペプチドをＣ末端領域若しくはＮ末端領域に付加したアミノ酸配列を前記ベクターＤＮＡにコード化したことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のレクチンの固定化方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のレクチンの固定化方法によりレクチンを固定した支持体を含む糖鎖解析ツール。
【請求項６】
遺伝子改変操作によりタグ・ペプチドが付加されたレクチンと、
抗タグ抗体を含む固体支持体と、を含むレクチン固定化支持体。
【請求項７】
請求項６のレクチン固定化支持体を含む糖鎖解析ツール。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載された前記タグ・ペプチドをレクチンに付加するために用いられるタグ抗体ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レクチンの固定法、特に遺伝子改変レクチンの固定法、及び、この固定法を用いて固定したレクチンを含む糖鎖解析ツールに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の糖鎖工学の進歩は目ざましく、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、及び、細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等の高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは、阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が明らかにされようとしている。また、細胞表面の糖鎖や、糖鎖−レセプター間の相互作用異常による疾病の発生、あるいは、エイズなどのウイルス感染における糖鎖の役割等に関して盛んに研究されている。
【０００３】
特に、正常細胞と癌細胞、あるいは分化段階の異なる細胞など、ある細胞を他の細胞と分別し同定するために、細胞がその表面に持つ糖鎖を利用でき、例えば、癌細胞については悪性度の変化に応じて、幹細胞についてはその分化段階により変化するといったような報告が数多くなされている。以上のように、糖鎖に基づく解析（例えば、分別や同定）は、大変有意義であると考える。
【０００４】
このような糖鎖解析の手段として、レクチンは大変有用であると考えられるが、天然に存在するレクチンの種類が限られること、レクチンが利用されやすい形になっているかが重要な関心事である。即ち、多くの種類の糖鎖を識別するには、その数に見合うだけの異なる性質を持つレクチンが理論的に必要である。一方、利用しやすくするには、特定種のレクチンが単離されて担体（又は支持体）に固定されているのが望ましい。
【０００５】
従来は、レクチンを固定化する際に、基材にレクチンを単純に吸着させるか、基材に共有結合させる等の方法が用いられており、単に吸着させただけでは、レクチンを安定かつ強固に固定化することは困難であり、共有結合させる場合は、手間のかかる化学反応を経なければならない。また、固定すべきレクチンと特異的に結合する糖鎖を有する糖鎖高分子を基材に吸着させ、その糖鎖高分子を介して該レクチンを固定することが提案されている（特開平８−３１９３００号公報参照）。この方法では、本来解析に必要なレクチンの糖鎖特異性を利用してレクチンが固定されており、糖鎖に対するいわゆる活性部位が糖鎖解析に十分利用されているとはいい難い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の課題は、所定のレクチンを効率よく安定に固定する方法であって、レクチンの糖鎖解析部位を十分にその解析に役立たせることができるレクチンの固定化方法を提供することである。
【０００７】
【発明を解決するための手段】
以上のような課題に鑑みて、本発明では、所定の第１の物質又はその一部に対して、認識能力がある第１の認識部分と、所定の第２の物質又はその一部に対して、認識能力がある第２の認識部分と、を有するレクチンにおいて、第１の認識部分によりレクチンを所定の支持体に固定することを特徴とする。
【０００８】
ここで、第１の物質は、レクチンの糖鎖認識能力以外の能力により認識され、直接又は間接に結合され得る物質を含んでよく、例えば、抗タグ抗体が、この第１の物質に含まれることができ、タグ抗体が前記第１の認識部分に含まれることができる。また、前記第２の物質は、糖鎖を含んでよく、前記第２の認識部分は、当該レクチンの糖鎖識別部位を含んでよい。また、当該レクチンは、遺伝子改変により産生されたレクチンを含んでよく、天然に無い人工レクチンを含んでよい。
【０００９】
より具体的に、本発明においては、以下のようなものを提供する。
【００１０】
（１）レクチンを支持体に固定化する固定化方法であって、レクチン及びタグ・ペプチドをベクターＤＮＡにコード化する工程と、このコード化されたＤＮＡを使用してＬ−Ｔ複合タンパクを作らせる工程と、前記タグ・ペプチドに結合性又は会合性を備える抗タグ抗体が固定されている支持体に前記Ｌ−Ｔタンパクを接触させる工程と、を含むレクチンの固定化方法。
【００１１】
（２）前記レクチンがマメ科のレクチンであることを特徴とする上記（１）に記載のレクチンの固定化方法。
【００１２】
（３）前記レクチンにおいて、そのループＣ若しくはループＤの１又はそれ以上のアミノ酸が改変された改変レクチンを前記ベクターＤＮＡにコード化したことを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のレクチンの固定化方法。
【００１３】
（４）前記タグ・ペプチドをＣ末端領域若しくはＮ末端領域に付加したアミノ酸配列を前記ベクターＤＮＡにコード化したことを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載のレクチンの固定化方法。
【００１４】
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のレクチンの固定化方法によりレクチンを固定した支持体を含む糖鎖解析ツール。
【００１５】
（６）遺伝子改変操作によりタグ・ペプチドが付加されたレクチンと、抗タグ抗体を含む固体支持体と、を含むレクチン固定化支持体。
【００１６】
（７）上記（６）のレクチン固定化支持体を含む糖鎖解析ツール。
【００１７】
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載された前記タグ・タンパクを前記レクチンに付加するために用いられるタグ抗体ベクター。
【００１８】
ここで、支持体は、固体支持体を含んでよく、例えば、前記固体支持体は、ろ紙のような紙を使った試験紙を、また、ニトロセルロース、ラテックス、または、プラスチック材料等の有機物質を含んでよい。更に、前記固体支持体は、ガラスや雲母等の無機物質や、白金、銀、銅、金、アルミニウム、シリコン等の金属や、そして、ＣＣコンポジット、カーボン等の非金属材料を含んでよい。また、ゲル状の多孔質体で、比表面積の大きなものを利用すれば、結合部位を多数設けることができるので有利と考えることもできる。このような支持体としては、例えばアガロースゲル、アリルデキストランゲル等が挙げられる。また、この固体支持体の形状は、シート状、板状、球状、ビーズ状、カップ状、矩形等あらゆる形状のものを含んでよく、上述のような種々の物質や材料が複合されて作られる任意の形を含んでよい。タグ・ペプチドは、フラグとも呼ばれることもありえるフラグペプチドを含んでよく、また、フラグ抗体を含んでよい。このようにしてタグが付けられたタンパクは、抗タグ抗体と結合又は会合しうる。タンパクを接触させるということは、この抗タグ抗体との結合又は会合を生じさせうる状態に置くことを含んでよい。
【００１９】
レクチンには、種々の種類のレクチンが含まれてよいが、好ましくは、植物由来のレクチンを含む。より好ましくは、種類の豊富なマメ科レクチンを含む。例えば、図１に示すような、その他のレクチンを含んでよい。より好ましくは、Ｍａａｃｋｉａ　ａｍｕｒｅｎｓｉｓ　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（以下ＭＡＨと略）を含む。図２にＭＡＨレクチンの塩基配列と予想されるアミノ酸配列を示す。
【００２０】
一般に、マメ科レクチンでは、ループＣ及びループＤに糖鎖を挟み込むような構造となっているが（図３）、このような糖鎖を挟み込む部位を改変することが好ましい。従って、ループＣ若しくはループＤのアミノ酸を改変するというのは、このような糖鎖認識部位のアミノ酸を改変することを意味してよい。例えば、図２において、４６６〜４９８（野生型ＭＡＨのＮ末端のセリンから数えてアミノ酸配列相当では１２７〜１３７）が、ループＣのアミノ酸に対応する塩基配列で、７２１〜７８０（野生型ＭＡＨのＮ末端のセリンから数えてアミノ酸配列相当では２１２〜２３１）が、ループＤのアミノ酸に対応する塩基配列と考えられ、このような領域が改変の対象領域として含まれてよい。また、ループＤにおいて、より好ましくは、７４２〜７５６（野生型ＭＡＨのＮ末端のセリンから数えてアミノ酸配列相当では２１９〜２２３）の領域が改変の対象として含まれてよい。ここで、塩基配列は、開始コドンから数え、アミノ酸配列は、Ｎ末端アミノ酸基から数えた。これらのアミノ酸を改変するというのは、並んだアミノ酸の順序、数、又は、種類等を変更することを含んでよく、１又はそれ以上のアミノ酸を挿入することを含んでよい。
【００２１】
タグ・ペプチドが付加されるのは、Ｃ末端領域若しくはＮ末端領域でよいが、Ｃ末端及びＮ末端の両領域に付加されてもよい。Ｃ末端領域は、Ｃ末端及びその周辺領域を含んでよく、また、Ｎ末端領域は、Ｎ末端及びその周辺領域を含んでよい。タグ・ペプチドが糖鎖認識機能を有する部位に影響をあまり与えないようにすることが好ましいため、タグ・ペプチドは、影響が少ない領域に付加されてよい。
【００２２】
上述の方法により固定されたレクチンは、種々の分野において利用され得る。即ち、糖鎖識別能力を利用する糖鎖解析用の手段（ツールを含む）等においてである。例えば、糖鎖識別能力を利用した糖鎖解析により細胞の識別ができる場合は、細胞識別ツール又はキットにおいて利用される。細胞識別ツールとしては、例えば、細胞識別のためのパッドやパレット等を例示できる。このようなツールの概念を１つの例を取り上げて、模式的に図４において示す。ツールの主要素１０は、１例としてＥＬＩＳＡプレート１２（上記支持体に含まれうる１例であり、上記支持体はこれに限られない。）と、その上に固定されている抗タグ抗体１４と、その抗タグ抗体とタグ抗体で結合等したタグ融合型人工レクチン１６から構成される。このタグ融合型人工レクチン１６は、糖鎖を認識できる部位１８が、解析すべき糖鎖を挟み込めるように糖鎖との接触可能な状態でプレート１２に固定されている。ここでは、ＥＬＩＳＡプレート１２が支持体として用いられているが、このような支持体には、上述のように種々の物質や材料が適用可能であり、例えば、湿式で解析される場合は水に強い材料を選択する、化学反応が生じると解析が難しいときは、反応性の低い物質を選択するというように、その目的に応じて種々選択すべきである。識別を望む細胞２０は、その表面に細胞表面糖鎖２２を有しており、そのいくつかが、糖鎖を認識できる部位１８に挟み込まれ、糖鎖が認識され、糖鎖解析が可能となる。このように抗タグ抗体は、レクチンに組み込まれたタグ抗体と結合機能を果たすものである。従って、タグ抗体と抗タグ抗体に限られること無く、組合わせ結合性を有する２つのタンパク又はその他の物質の一方が支持体に固定され、他の一方がレクチンに組み込まれることにより、レクチンを固定化することができる。
【００２３】
ここで、「糖鎖解析」とは、糖鎖を有する細胞の同定、タンパクが含まれる生体から生じるあらゆる種類の液体及び／又は固体の中に存在するそのタンパク（尿中タンパク、唾液中タンパク、鼻水中タンパク、血清蛋白質等を含む）の糖修飾（グライコフォーム）の診断、疾病診断、その他の解析を含み、「糖鎖解析方法」は、これらのことを行う方法を含んでよい。疾病（又は健康）状態により細胞の糖鎖の構造（又は状態）や糖蛋白質の糖修飾等に違いが現れる場合であって、糖鎖解析により、疾病（又は健康）状態を判別することができるツール（診断薬、診断装置、等）を含んでよい。例えば、細胞識別を行うために選別されたレクチンを含むウェル（ｗｅｌｌ）又はスポットが、細胞識別を行うのに適切な順列で配列された場合は、視覚的にパターンを認識しやすくなるように表示させるため、予め決められた位置に配置されてよい。ここで、「表示させる」は、直接・間接のいずれであってもよい。視覚的なパターン情報であっても、その数が膨大である場合は、肉眼その他の方法での目視では不十分なことが多く、コンピュータを用いて、クラスター解析等により、細胞同定を行うことも可能である。クラスター解析では、どの部分に比較したいもの（例えば、標準と検討対象物、又は、コントロールと比較物）の違いが大きく出ているかをコンピュータを利用して調べることであってよく、一般のクラスター解析ソフトを用いることもできる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的な例を上げ、図を参照しつつ、より詳しく説明するが、１つの具体的な例として材料等が挙げられているに過ぎず、本発明はこれらの実施例に限られるものではない。
【００２５】
【実施例】
［実験例１：　改変レクチンの作製］
シアル酸を含む糖鎖に特異的なマメ科レクチンであるＭａａｃｋｉ　ａｍｕｒｅｎｓｉｓ　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＭＡＨ）を用いた。このレクチンは、炭水化物の鎖がシアル酸残基、即ち、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（５）からなる炭化水素配列を認識することができる。この糖結合部位に関連すると思われる部分の少なくとも一部を遺伝子工学的手法でランダムに改変し、ランダムに改変したレクチンから複数の種類の異なる糖鎖のバリエーションを見分けられる人工のレクチンのライブラリを作製した。ＭＡＨは、相対分子量（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ）２９，０００であり、サブユニットのダイマーからなる。
【００２６】
ＭＡＨにエンコードされたｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びそれから導き出されたアミノ酸配列では、ＭＡＨは２８７のアミノ酸からなり、３０のアミノ酸シングルペプチドを含んでいる。図５のＡ、Ｂは、ＭＡＨ糖鎖認識ドメインの変異の生成を示す図である。Ａは、変異を導入する部分的重複延長法（ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）を示す概略図である。Ｂは、ＭＡＨの糖鎖認識ドメインの変異の生成を示す図である。即ち、ＭＡＨレクチンの２８５個のアミノ酸のうち、糖結合部位である１２７番目から１３７番目の部分の塩基配列を合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲによりランダム化した。ただし、シアル酸との相互作用に必須と考えられるアスパラギン酸１３５、また金属イオンとの配位に必須と考えられるアスパラギン酸１２７とヒスチジン１３２は固定した（図５）。作製されうるレクチンの種類は膨大であるので、以下のパニングによりレクチン及びファージを選別・回収した。
【００２７】
ここで、パニングとは、ファージ上に発現した蛋白質を、その蛋白質が結合する物質（例えば抗原と抗体、レクチンと糖鎖、レセプターとリガント、等）との結合能を利用してファージを回収する手法のことをいい、例えば、ファージに発現させた蛋白質との結合する相手物質を加えて、発現した蛋白質、ファージ、その他の物質を結合させ、前記ファージ溶液を流し出した後に、結合した発現した蛋白質、ファージ、その他の物質を回収する方法である。この回収したファージを大腸菌に感染させて増幅し、再びパニング（上述）を行って結合性の高いファージを回収していくことができる。ここで用いたパニングは、特に、結合性を基準にしてライブラリーから特定のクローンを濃縮し選別する手法である。従って、パニングの回数が少ないと、結合性の低い人工レクチンがまだ十分排除されていないと懸念され、多すぎるとパニングで濃縮が進み、結合の強いごく限られた種類のレクチンしか回収できないことになる。従って、パニング操作の回数には、最適な数があると考えられる。本実施例では、丁度よいと思われる３回のパニングを採用した。
【００２８】
［ファージ形成用ＶＣＳＭ（ヘルパーファージ）の準備］
ファージ形成用ＶＣＳＭ（ヘルパーファージ）は、表１に示す材料を用いて準備した。
【００２９】
【表１】
2004016227.tif 000003
【００３０】
［ファージ形成用ＶＣＳＭの作製］
ＳＢ培地（テトラサイクリン最終濃度４０μｇ／ｍｌ添加）で一晩培養しておいたＸＬ−１　Ｂｌｕｅ　２００μｌとＳＢ培地１０ｍｌを３７℃で１時間振とう培養した。ＶＣＳＭ原液を１μｌ加えてから３７℃の湯浴で３０分間温めてファージを感染させ、カナマイシン（最終濃度７０μｇ／ｍｌ）を加えてさらに３７℃で８時間振とう培養した。培養液を４℃、３５００ｒｐｍで２０分間遠心して、回収した上清を６５℃の湯浴で１５分間温めた。もう一度、４℃、３５００ｒｐｍで２０分間遠心して、回収した上清をファージ形成用ＶＣＳＭ（以下ヘルパーファージと略）とした（−８０℃保存）。
【００３１】
［ヘルパーファージのタイターチェック］
ヘルパーファージの濃度を計算するために、以下に述べる方法でタイターチェックを行った。まず、ヘルパーファージ１／１０６μｌをＸＬ−１　Ｂｌｕｅ　１００μｌに混ぜて、３７℃の湯浴で３０分間温めてファージを感染させた。一度電子レンジで加熱し溶かしてから十分に冷ましたトップアガー５ｍｌとファージを感染させたＸＬ−１　Ｂｌｕｅをよく混ぜて２×ＹＴプレートに流し込み、３７℃で一晩培養した。形成されたプラーク数からヘルパーファージの濃度を計算した。
【００３２】
［分化型Ｃａｃｏ−２細胞を用いたパニング操作］
表２に示す材料を用いて、パニングを行った。
【００３３】
【表２】
2004016227.tif 000004
【００３４】
［パニング用ファージの調製］
乾熱滅菌済み坂口フラスコ（１ｌ）で、以下の試薬を３７℃で４０分間振とう培養した：　ＨＥＭ培地（ｐＨ６．９）（２００ｍｌ）、カルベニシリン（８０μｌ（最終濃度２０μｇ／ｍｌ））、テトラサイクリン（４００μｌ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ））、ＣａＣｌ２（２００μｌ（最終濃度１ｍＭ））、ＭｎＣｌ２（２００μｌ（最終濃度１ｍＭ））、パニング用改変レクチン（１ｍｌ）。生成物に、ヘルパーファージ（１ｍｌ（約１０１２ｐｆｕ／ｍｌ））を加えて３７℃で３０分間振とう培養し、さらにカルベニシリン（１２０μｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ））、カナマイシン（５００μｌ（最終濃度２５μｇ／ｍｌ））を加えて、３７℃で１２時間振とう培養した。培養液を５０ｍｌチューブ６本に分注して、４℃、３５００ｒｐｍで３０分間遠心して、上清を回収した（計３回繰り返した）。回収した上清３０ｍｌにＰＥＧ／ＮａＣｌを６ｍｌずつ加え、低温室で氷浴に入れて一晩静置した。４℃、９５００ｒｐｍで５０分間遠心して上清を除き、再び８分間遠心して上清を完全に除いてから、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ　１．２ｍｌで全チューブの沈殿を懸濁した。最後に４℃、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心して、回収した上清をパニング用ファージとした（計３回繰り返した）。
【００３５】
［パニング用ファージのタイターチェック］
パニング用ファージの濃度を計算するために、以下の方法でタイターチェックを行った。まず、Ｓｕｒｅ２（２００μｌ）にパニング用ファージを加え（１／１０８〜１／１０６μｌ）、３７℃の湯浴で３０分間温めてから２×ＹＴＣプレートにまき、３７℃で一晩培養して形成されたコロニー数からファージの濃度を計算した。
【００３６】
［ファージ感染用Ｓｕｒｅ２の培養］
Ｓｕｒｅ２をＨＥＭ培地（ｐＨ７．０、テトラサイクリン最終濃度４０μｇ／ｍｌ添加）を用いて、３７℃で一晩培養したものをファージ感染用に使用した。
【００３７】
パニング用改変レクチンのパニングには、Ｃａｃｏ−２細胞を用いた。ここでは、その細胞の培養について述べる。同細胞の培養は、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＥＡＧＬＥ　ＭＥＤＩＵＭ▲２▼（日水社製＃０５９１９）４．７５ｇ／５００ｍｌ）において、オートクレーブ滅菌してから行った。その他の条件は、表３に示す。
【００３８】
【表３】
2004016227.tif 000005
【００３９】
以下に述べるＣａｃｏ−２細胞培養に関する操作は、クリーンベンチ内で無菌的に行った。実験に用いるチップやスギウラなどは全て、オートクレーブ滅菌あるいは乾熱滅菌済みのものを使用した。Ｃａｃｏ−２用培地は、ＤＭＥＭ培地（５００ｍｌ）、３０％グルコース（１０ｍｌ）、３％Ｌ−グルタミン（７．５ｍｌ）、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ（５ｍｌ）、１０％ＮａＨＣＯ３（１０ｍｌ）、をよく混ぜた後、５０ｍｌ分の培地を捨て、非働化ＦＣＳ　５０ｍｌを加えることにより調整した。
【００４０】
次に、細胞を１０ｃｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製＃３５−３００３）に撒き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。細胞の継代はサブコンフルエントまで増えた時点で行った。まず細胞をＰＢＳで２回洗いトリプシン−ＥＤＴＡをスギウラ半分ほど加えて、３７℃で５分間処理して細胞を剥がした。剥がした細胞を培地で懸濁して４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を回収し、２０倍希釈でシャーレに撒きなおした（継代間隔は約５日間）。培地の交換は継代の翌日、および１日おきに行った。
【００４１】
［Ｃａｃｏ−２細胞の分化誘導とパニング用の細胞の準備］
Ｃａｃｏ−２細胞を完全にコンフルエントになるまで培養し、最終濃度２ｍＭの酪酸ナトリウムを含む培地に交換して、さらに５日間培養を続けて分化させた。これを回収してパニング用分化型Ｃａｃｏ−２細胞として用いた。継代の時と同じ方法で分化型Ｃａｃｏ−２細胞を回収した。３回目のパニング用のみ、０．２５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳで室温、３０分間振とうして固定した後、ＴＢＳで５回洗ったものを使用した。１回目、２回目のパニングでは非固定のまま使用した。細胞はパニング前に、約１０６ｃｅｌｌｓを３％ＢＳＡ／ＴＢＳで懸濁し、室温で３時間ブロッキングを行った。
【００４２】
［分化型Ｃａｃｏ−２細胞を用いたパニング操作］
ブロッキングした分化型Ｃａｃｏ−２細胞約１０６個とパニング用ファージ１０１２ｃｆｕ（これがパニング操作におけるファージのｉｎｐｕｔ数）を１４ｍｌ（ＩＷＡＫＩ＃２３２４−０１５）チューブに入れ、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ　１４ｍｌを加え、４℃で２時間（１、２回目のパニング）または４℃で一晩（３回目のパニング）チューブを回転させながら反応させた。細胞をＴＢＳで３回洗い未結合ファージを除き、細胞の沈殿にファージ感染用Ｓｕｒｅ２を１０ｍｌ直接加えて、３７℃の湯浴で３０分間温めてファージを感染させた。ファージを感染させたＳｕｒｅ２溶液の一部でタイターチェックを行いファージの回収率を計算した（後述）。残りはＨＥＭＣプレート（ＳＵＭＩＬＯＮプレート）に１ｍｌずつまいて３７℃で培養し、コロニーがかすかに見えてきた時点（平均８〜９時間）で４℃に移して培養を止めた。ここまでを１回のパニング操作とした。１、２回目のパニング後は、各プレートにＨＥＭ培地（ｐＨ７．０）を２０ｍｌずつ加えてコロニーを回収し、この溶液を回収ライブラリーとして再びパニング用ファージの調製操作に戻った。３回目のパニング後、形成されたコロニーをランダムに拾って、回収レクチンの塩基配列の解析に進んだ。ランダムにクローニングした６４個のクローンの解析の結果、３５個のレクチンクローンが、ストップコドンなどを含まずに完全長のレクチンをコードしている、改変部位を持つ改変ＭＡＨレクチンクローンであることがわかった（図６）。また、３５個のクローンで同一の改変部位を有するクローンは存在せず、これら３５個のクローンが３５種類の新規人工レクチンであることが明らかとなった。これら３５個の改変部位の配列は、野生型ＭＡＨの配列や、ヒト赤血球を用いたパニングにより回収された新規人工レクチンの改変部位の配列（図７）と全て異なっていた。また、この回収レクチン（「回収改変レクチン」）は、次のレクチンの固定化に用いられた。
【００４３】
［実験例２　回収改変レクチン等のタグ抗体付加と検証］
本発明の１つの実施例であるレクチン固定化法は、Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法と呼ばれる方法に適用することができる。このＲｅｖｅｒｓｅ　ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法は、ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法を参考にしつつ、新たに開発した測定法である。ここでのレクチン固定化法は、レクチンをＥＬＴＳＡプレートに固定化するところに適用されるものである。Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法において、レクチンをＥＬＩＳＡプレートに固定化するためには、まず、予めＥＬＩＳＡプレート上に抗ＦＬＡＧ抗体を固定する。次に、この抗ＦＬＡＧ抗体に結合するタグ・ペプチド（タグ抗体、フラグ抗体、フラグ配列、又は、ＦＬＡＧ抗体等）が導入されたレクチンを含むライセートをこのプレート上に加える。すると、ＦＬＡＧ配列が抗ＦＬＡＧ抗体に結合しレクチンがプレート上に固定される。この過程では、ライセート中のＦＬＡＧが付加されたレクチンのみが選択的に抗体に結合されるので、レクチンの精製と定量が可能となる。これは、抗体の特異性によるもので、結合する部位が選択的にＦＬＡＧと結合し、その量が結合部位の量によって規定されるからである。
【００４４】
［ＦＬＡＧ融合型レクチン遺伝子の作製とクローニング］
この実施例においては、上記回収改変レクチンの遺伝子および野生型ＭＡＨ遺伝子が用いられた。タグを融合するために、ベクターとして、ｐＦＬＡＧ−ＡＴＳ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ（ＳＩＧＭＡ社製、部品番号＃Ｅ−５７６９）が用いられた。表４のプライマーや試薬等が使用された。
【００４５】
【表４】
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【００４６】
［回収レクチン遺伝子のインサート側断片の作製］
ＭＡＨ由来の人工レクチン遺伝子および野生型ＭＡＨ遺伝子を鋳型にして、以下の表５の試薬・条件でＰＣＲを行い、インサート側断片を作製した。
【００４７】
【表５】
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【００４８】
ＰＣＲ終了後、ＤｐｎＩを１μｌずつ添加し、３７℃で３時間反応させた。反応産物はＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔで回収し、表６に示すように制限酵素処理を行った。
【００４９】
【表６】
2004016227.tif 000008
【００５０】
最後に再びＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔで回収して、電気泳動で確認したものをインサート側断片とした。
【００５１】
［ＦＬＡＧ発現ベクターのベクター側断片の作製］
表７に示すようにｐＦＬＡＧ−ＡＴＳ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒを制限酵素処理した。この条件で得られたものをＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔで回収して、電気泳動でベクター側断片となることを確認した。
【００５２】
【表７】
2004016227.tif 000009
【００５３】
［ライゲーションと大腸菌へのトランスフォーメーション］
ＴａＫａＲａ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２を用いて、表８の試薬等を用いてライゲーションを行った。即ち、１６℃で３時間ライゲーション反応を行い、このうち２μｌをＪＭ１０９にトランスフォーメーションして、２×ＹＴＣプレートに撒いた。
【００５４】
【表８】
2004016227.tif 000010
【００５５】
［塩基配列の確認］
形成されたコロニーを拾って一晩培養した培養液からプラスミドを回収した。表４の解析用プライマーを用いて正しい塩基配列を有しているかどうかをＧｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａ１ｙｚｅｒ　３１００で確認した。さらに、回収したプラスミドを制限酵素ＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩで切断し、生成するバンドの大きさが正しいかどうか電気泳動で確認した。正しくクローニングできたものは、グリセロールストックを作製して−８０℃で保存した。
【００５６】
［ＦＬＡＧ融合型レクチンのライセート作製］
ＦＬＡＧ融合型レクチンのライセート作製には、表９の材料を用いた。
【００５７】
【表９】
2004016227.tif 000011
【００５８】
［ＦＬＡＧ融合型レクチンクローンの予備培養］
ＨＥＭ培地（カルベニシリン最終濃度５０μｇ／ｍｌ添加）４ｍｌにＦＬＡＧ融合型レクチンクローンのグリセロールストック４μｌを加え、３７℃で一晩培養した。ＨＥＭ培地（カルベニシリン最終濃度５０μｇ／ｍｌ）４ｍｌに培養液４μｌを加えて、もう一度３７℃で一晩培養した。
【００５９】
［ライセート回収用の培養とＩＰＴＧ誘導］
５０ｍｌチューブに表１０に示すような試薬を準備し、３７℃、２００ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後、ＩＰＴＧを２００μｌ添加し（最終濃度１ｍＭ）、さらに３７℃、２００ｒｐｍで３時間振とう培養して、タンパク質の発現誘導を行った。
【００６０】
【表１０】
2004016227.tif 000012
【００６１】
［ライセート回収］
誘導後の培養液を、９５００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心して大腸菌を回収した。ライセート作製用バッファー２００μｌで大腸菌を懸濁し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。液体窒素と３７℃の湯浴を使い、懸濁液を計５回凍結融解して、大腸菌を粉砕した。１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心して、上清をライセートとして回収した。回収したライセートはＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔでタンパク定量を行い、１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製して分注し、回収レクチンのライセートとして−８０℃で保存した。
【００６２】
［回収したライセート中のＦＬＡＧ融合型レクチンの確認］
表１１に示すような材料を用いて回収したライセート中のＦＬＡＧ融合型レクチンの確認を行った。
【００６３】
【表１１】
2004016227.tif 000013
【００６４】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
ライセートに１／３量の４×Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（＋２ＭＥ）を加え、１００℃で５分間加熱して熱変成させた。各ライセートを１０μｇずつ用いて、電気泳動を行った。
【００６５】
［ウェスタンブロッティングによるＦＬＡＧ融合型レクチンの検出］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜にタンパク質をブロッティングした。一次抗体として、抗ＦＬＡＧ抗体または抗ＭＡＨ抗体を１時間反応させた。ＴＢＳＴで洗った後、二次抗体としてＡＰ標識−抗マウスＩｇＧ抗体またはＡＰ標識−抗ウサギＩｇＧ抗体を３０分間反応させた。ＴＢＳＴで洗った後、ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｋｉｔで発色させて確認した。
【００６６】
作製したＦＬＡＧ融合型野生型ＭＡＨレクチン遺伝子を制限酵素ＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩで切断し、電気泳動で確認したところ、インサート側断片とベクター側断片に対応する、正しい大きさのバンドが確認された（図８）。この遺伝子については、ＤＮＡシークエンサーによる塩基配列解析によっても、正しくＦＬＡＧ配列を導入できたことが確認された。
【００６７】
ＦＬＡＧ融合したＭＡＨ由来の人工レクチン（Ｃ１及びＣ３５）及び野生型ＭＡＨレクチンにおいて、抗ＦＬＡＧ抗体および抗ＭＡＨ抗体を用いたウェスタンブロッティングによって、ＭＡＨの分子量である約３０ｋＤａ付近に、抗ＭＡＨ抗体と抗ＦＬＡＧ抗体の両方で共通して検出されたバンド現れることがわかった（図９）。従って、ＦＬＡＧ配列を導入した人工レクチンが正しく発現していることが、タンパク質レベルでも確認された。
【００６８】
［実験例３　回収改変レクチン等の固定化］
［人工レクチンを含むライセートの準備］
実験例２のＣａｃｏ２細胞を用いたパニングと同様に、ヒト赤血球を用いたパニングにより実験例１のパニング用改変レクチンから、回収改変レクチンとして１０種類の新規人工レクチンを回収した。この回収改変レクチンについては、実験例２と同様にして、タグ抗体を付加させた。このようなタグ抗体付きの人工レクチンと野生型ＭＡＨ、さらに人工レクチンを含まないコントロールとして、空ベクターであるｐＦＬＡＧ−ＡＴＳについて実験例２と同様の方法でライセートを調製した。以下の実験は、表１２に示す材料を用いて行った。
【００６９】
【表１２】
2004016227.tif 000014
【００７０】
［人工レクチンの抗ＦＬＡＧ抗体への結合］
９６ｗｅｌｌ−ＥＬＩＳＡプレートに抗ＦＬＡＧ抗体を５０μｌずつ入れ（０．２５μｇ／ｗｅｌｌ）、４℃で一晩静置して抗体をｗｅｌｌに固定した。ｗｅｌｌをＴＢＳで３回洗い、３％ＢＳＡ／ＴＢＳ　１７０μｌを加え、室温で３時間ブロッキングを行った。ｗｅｌｌをＴＢＳで３回洗い、各ライセートを５０μｇずつ入れ（５０μｇ／ｗｅｌｌ）、室温で２時間揺らしてライセート中の人工レクチンを結合させた。
【００７１】
［人工レクチンの抗ＦＬＡＧ抗体への結合量の確認］
ライセート中の人工レクチンを結合させた後、ｗｅｌｌをＴＢＳＴで３回洗い、抗ＭＡＨ抗体を５０μｌずつ加え、室温で３０分間反応させた。ｗｅｌｌをＴＢＳＴで３回洗い、ＨＲＰ標識−抗ウサギＩｇＧ抗体を５０μずつ加え、室温で３０分間反応させた。ｗｅｌｌをＴＢＳＴで３回洗い、各ｗｅｌｌにＡＢＴＳ／Ｈ２０２を５０μｌずつ加え発色させ、０Ｄ４０５／４９０を測定した。
【００７２】
［抗ＦＬＡＧ抗体に結合させたレクチンの活性の確認］
ライセート中の人工レクチンを結合させた後、ｗｅｌｌをＴＢＳＴで３回洗い、ビオチン化シアリルＴを５０μｌずつ加え、室温で２時間反応させた。ｗｅｌｌをＴＢＳＴで３回洗い、ＨＲＰ標識−ストレプトアビジンを５０μｌずつ加え、室温で３０分間反応させた。ｗｅｌｌをＴＢＳＴで３回洗い、各ｗｅｌｌにＡＢＴＳ／Ｈ２０２を５０μｌずつ加え発色させ、０Ｄ４０５／４９０を測定した。
【００７３】
［ヒト赤血球等を用いたＲｅｖｅｒｓｅ　ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法による測定］
表１３に示すような材料を用いて、Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法による測定を行った。まず、実験例２と同様の方法により人工レクチンを含むライセートの準備を行った。
【００７４】
【表１３】
2004016227.tif 000015
【００７５】
［赤血球の準備］
ヒト赤血球はヒトＡ型末梢血、又は、４種類の異なる動物赤血球（ニワトリ、ウシ、ウマ、若しくは、ウサギ）を１０００ｇ、４℃で５分間遠心して赤血球画分を沈殿させ上清を除き、ＰＢＳで懸濁して再び遠心を行う洗いの操作を５回繰り返したものを使用した。測定に用いる際は、５×１０６個／５０μｌになるよう１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴで希釈した。
【００７６】
［赤血球を用いたＲｅｖｅｒｓｅ　ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法による測定］
上述と同様の方法により、ライセート中の人工レクチンを抗ＦＬＡＧ抗体に結合させた。結合後、ｗｅｌｌをＴＢＳＴで３回洗い、赤血球を５０μｌずつ加え（５×１０６個／ｗｅｌｌ）、室温で２時間結合させた。ｗｅｌｌをＴＢＳＴで３回洗い、各ｗｅｌｌにＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２を５０μｌずつ加え発色させ、０Ｄ４０５／４９０を測定した。
【００７７】
まず各人工レクチンをできるだけ多く固相化できるように、各ｗｅｌｌに最大量固定できる抗ＦＬＡＧ抗体の量と、人工レクチンの抗体への結合量を最大化できるライセート量について条件検討を行った。そして、抗ＦＬＡＧ抗体を０．２５μｇ／ｗｅｌｌずつ４℃で一晩固定し、各ライセートを総タンパク質量で５０μｇ分、室温で２時間結合させるという条件を確定した。この条件のもと人工レクチンの結合を行うと、各人工レクチンごとの結合量がほぼ一定になることが明らかとなった。またｐＦＬＡＧ−ＡＴＳをトランスフォーメーションした大腸菌から回収したレクチンを含まないライセートでは、シグナルがほとんど検出されないことより、ライセート中の人工レクチンが特異的に結合していることが明らかとなった（図１０）。また、それぞれ親和性は異なるものの、各レクチンがそれぞれ結合することが分かっているビオチン化シアリルＴ糖鎖を用いた活性の確認では、各レクチンのシアリルＴに対する結合が確認されたことから、活性も保持されていることが確認された（図１１）。以上の結果より、Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法を採用することで、ライセート中に含まれる各人工レクチンの活性を保持しつつ、精製および結合量の標準化が達成されることが明らかとなり、多数の人工レクチンライセートを用いても定量的な測定が行えることがわかる。
【００７８】
ヒト赤血球を用いたＲｅｖｅｒｓｅ　ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法による測定を行ない、各人工レクチンについてヒト赤血球の結合が確認された（図１２）。ヒト赤血球表面に存在するシアリルＴに対する各レクチンの結合性と、ヒト赤血球に対する結合性が完全には相関しなかったが、これは各レクチンが認識できるシアリルＴ以外の糖鎖が、赤血球表面に発現していることなどが理由として考えられる。このような比較が行えるのも、Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法においてはライセートを用いても定量的な議論が可能なためであり、今後Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法が実際の細胞の分別や同定に有用であることが期待される。
【００７９】
ヒト赤血球と同様の方法で、４種類の異なる動物赤血球についてもＲｅｖｅｒｓｅ　ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法による測定を行った。測定の結果、各動物赤血球に対応する結合パターンを描くことに成功した（図１３）。この測定では、ヒトＡ型、ニワトリ、ウマ、ウサギの赤血球は、ある程度似通った結合パターンを示したが、ウシの赤血球は明らかに異なる結合パターンを示した。これらの赤血球がこのような方法により見分けられることがわかる。特に、ウシの赤血球は明確に見分けられる。
【００８０】
［実験例４　回収改変レクチン等のタグ付加］
この実験例では、ＭＡＨのループＤのアミノ酸を改変して、作った人工レクチンを生成し、その人工レクチンにタグ抗体を付けたタグ付き人工レクチンを作った。このタグ付き人工レクチンは、上記実験例３の方法と同様にして、固定化されることができる。
【００８１】
［ループＤの伸長］
テンプレートとしてＭＡＨのｃＤＮＡを使用してＰＣＲ法によりループＤが延長された（図１４）。具体的には、野生型ＭＡＨ遺伝子（２μｌ）、インサート断片作製用プライマー（２種）（１μｌずつ（各１００ｐｍｏｌ））、１０×ｄＮＴＰ（１０μｌ）、１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（１０μｌ）、ミリＱ（７５μｌ）、ａｍｐｌｉ　Ｔａｑ　Ｇｏｌｄ（１μｌ）の混合物を、９５℃×９分に保ち、（９４℃×１分、５４℃×２分、そして、７２℃×２分）のサイクルを３０サイクル、そして、７２℃×１０分保持の後、４℃に冷やした。　ＰＣＲ終了後、ＤｐｎＩを１μｌずつ添加し、３７℃で２時間反応させた。反応産物はＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥ社製）で回収された。生成物は、制限酵素ＸｈｏＩ．ｃｏｎｃ及びＢｇｌＩＩ．ｃｏｎｃで処理された。そして再び、反応産物はＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥ社製）で回収された（Ｄ改変レクチン）。
【００８２】
【表１４】
2004016227.tif 000016
【００８３】
［タグ用のベクター」
ここでは、上述の方法により、ループＤが改変されたレクチンの塩基配列のＮ末端にタグを付加するために、ｐＦＬＡＧ−ＡＴＳを用いることにした。このベクターのマルチクローニングサイトにはＭＡＨを組み込むのに都合の良い制限酵素部位がなかったので、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓのプロトコールに従い、ＢｇｌＩＩｓｉｔｅをＳｐｅＩｓｉｔｅに作り変えた。まず、改変したい部位を含むプライマーをｓｅｎｓｅ側、ａｎｔｉ側でまったく相補的になるように設計した。次にＰＣＲを行い、ＤｐｎＩ　１ｍｌを加え３７℃で１時間インキュベートした。このＤＮＡ溶液をそのまま用いてＸＬ１−Ｂｌｕｅにトランスフォーメーションした。最後に、得られたコロニーをショートカルチャーしてプラスミドを回収し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇによりそのＤＮＡ配列を読んで、改ｐＦＬＡＧ−ＡＴＳを同定した。このとき、ＰＣＲ反応液の組成は、［ｔｅｍｐｌａｔｅ（ｐＦＬＡＧ−ＡＴＳ）１μｌ、ｐｒｉｍｅｒ（ｐＦＬＡＧ−ＳｐｅＩ−ｓｅｎｓｅ１００ｎｇ／ｍｌ，ｐＦＬＡＧ−ＳｐｅＩ−ａｎｔｉ　１００ｎｇ／ｍｌ）各１．２５ｍｌ、１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　５ｍｌ、ｄＮＴＰ　１ｍｌ、ＭｉｌｌｉＱ　４０．５ｍｌ、ｐｆｕ　ｔｕｒｂｏ　１ｍｌ］であった。また、ＰＣＲの反応条件は［９５℃３０ｓｅｃ，１２ｃｙｃｌｅｓ　ｏｆ（９５℃３０ｓｅｃ，５５℃１ｍｉｎ，６８℃１０ｍｉｎ）］であった。また、プライマーの配列は、表１５に示す。
【００８４】
【表１５】
2004016227.tif 000017
【００８５】
［ベクターの移しかえ］
上記Ｄ改変レクチンと野生型ＭＡＨのｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ−ＣＴＳからＰＣＲで増幅して制限消化（ＸｈｏＩｃｏｎｃ．とＳｐｅＩｃｏｎｃ．（ロッシュ））し、改ｐＦＬＡＧ−ＡＴＳに組み込んだ。これをＪＭ１０９にトランスフォーメーションし、得られたクローンをＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより同定した。このとき、ＰＣＲ反応液の組成は、［ｔｅｍｐｌａｔｅ　０．５ｍｌ、ｐｒｉｍｅｒ（Ｎ−Ｆｌａｇ−ＸｈｏＩ　１００ｎｇ／ｍｌ，ＭＡＨ−ＳｐｅＩ−ａｎｔｉ　１００ｎｇ／ｍｌ）各０．５ｍｌ、ｄＮＴＰ　４ｍｌ、１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　５ｍｌ、ＴａｑＧｏｌｄ　１ｍｌ、ＭｉｌｌｉＱ　３８．５ｍｌ］であった。また、ＰＣＲの反応条件は一般的なもの［９６℃５ｍｉｎ，３０ｃｙｃｌｅｓ　ｏｆ（９６℃１ｍｉｎ，５５℃１ｍｉｎ，７２℃２ｍｉｎ），７２℃５ｍｉｎ］であった。また、プライマーの配列は、表１６に示す。
【００８６】
【表１６】
2004016227.tif 000018
【００８７】
［ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇプロトコールの変更点］
ここでは既存のプロトコールを変更して行った。ＰＣＲ反応液の組成は、５ｘＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　２ｍｌから１０ｘ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２ｍｌへと、また、エタノール沈殿により調整後のシーケンスサンプルを溶かす溶媒は、Ｈｉ−Ｄｉ　Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ　２０ｍｌからＭｉｌｌｉＱ　２０ｍｌへと変更した。
【００８８】
上記により得られた大腸菌を、カルベニシリンを入れたＨＥＭ（ＨｉｇｈｌｙＥｎｒｉｃｈｅｄ　Ｍｅｄｉｕｍ）で単離して、ｓｍａｌｌ−ｃｕｌｔｕｒｅ（ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔ）した。翌日、ＨＥＭ２０ｍｌ，ＣａＣｌ２（１Ｍ）２０ｍｌ，ＭｎＣｌ２（１Ｍ）２０ｍｌ，ＭｇＣｌ２（４．９Ｍ）８１．７ｍｌからなる培地にｓｍａｌｌ−ｃｕｌｔｕｒｅした大腸菌液を２００ｍｌ加えて３時間ｐｒｅ−ｃｕｌｔｕｒｅした。ここへ１００ｍＭ　ＩＰＴＧを２００ｍｌ加えて３時間培養し誘導をかけた。次に９，５００ｒｐｍで１０分間遠心して大腸菌を回収し、ＴＢＳ２００ｍｌに懸濁して−８０℃に保存した。後日、大腸菌の凍結（液体窒素）と融解（３７℃湯浴）を５回繰り返し、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心して上清をライセートとして回収した。このライセートはタンパク定量を行った後に−８０℃保存し、これを使用する準備が整ってからタンパク濃度１ｍｇ／ｍｌに希釈して４℃保存した。
【００８９】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＆Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ］
上記ライセート中にＤ改変レクチンのフラッグ付き（改変ＦＬＡＧ−ＭＡＨ）が存在しているのか調べるために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。抗体染色では、１次抗体としてａｎｔｉ−ＭＡＨ　ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ抗体（当室で準備）またはａｎｔｉ−ＦＬＡＧ　Ｍ２　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ抗体を用い、２次抗体にはそれぞれＡＰ−ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ抗体とＡＰ−ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ抗体を用いてＡＢＣ　Ｋｉｔで発色させて、確認した。このようにタグ付きのＤ改変レクチンが得られ、上述と同様な方法により、固定化することができる。
【００９０】
［タグ付きＤ改変レクチンの固定化］
ＳＵＭＩＬＯＮ　Ｈ　タイププレートに希釈したａｎｔｉ−ＦＬＡＧ　Ｍ２　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ抗体を５０ｍｌずつ入れて（０．２５ｍｇ／ｗｅｌｌ）、４℃で一晩静置した。翌日ＴＢＳで３回洗ったあとに３％ＢＳＡ／ＴＢＳ　１７０ｍｌで３時間ブロッキングした。これをＴＢＳで３回洗い、希釈分注してある上述のライセートを５０ｍｌずつ加えて２時間振とうした。このことにより、タグ付きのＤ改変レクチンがこのタイププレートに固定されることになる。次にＴＢＳＴで洗ってから、ビオチン化糖ポリマーを希釈して５０ｍｌずつ（０．２ｍｇ／ｗｅｌｌ）加えて２時間振とうした。ＴＢＳＴで洗った後に、１０００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを５０ｍｌずつ加えて３０分間振とうし、ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２　５０ｍｌで発色させてＯＤ４０５／４９０を測定し、Ｄ改変レクチンが固定されていることを確認した。
【００９１】
［ＩｇＡグライコフォームの識別への適用］
以下、本発明のレクチン固定化法を適用した例を示す。改変レクチンライブラリをＩｇＡグライコフォーム識別法に適用には、（１）改変レクチンライブラリーを作成する。（２）ＩｇＡ腎症患者ＩｇＡに親和性の高いレクチンをパニング法により選択し、レクチンサブライブラリーを作製する。（３）上記の（２）で得られたレクチンサブライブラリーの中から必要に応じＩｇＡ腎症患者と健常人のＩｇＡの違いをよく反映する改変レクチンを選び、タグを付ける。（４）このタグ付き改変レクチンをマイクロタイタープレートに本発明の方法で固定し、レクチンプレートを作製する（図１５）。（５）ＩｇＡのグライコフォームのレクチンライブラリーによる識別ＩｇＡ腎症患者と健常人の血清ＩｇＡのレクチンプレートへの結合パターンの比較・解析を行う。（６）血清診断アッセイ条件の検討市販健常人ＩｇＡに糖鎖を酵素的・化学的に付加し、人工ＩｇＡを作製する。健常人血清に人工ＩｇＡを混合し、レクチンプレートを用いたパターン解析を行う。血清中に存在する他の血清蛋白質の影響を検討し、アッセイ条件の最適化を行う。
【００９２】
［骨芽細胞亜集団の識別方法への適用］
まず、（１）改変レクチンライブラリーを作成する。次に（２）レクチンライブラリーの作製骨芽細胞に親和性の高いレクチンをパニング法等により選択し、レクチンサブライブラリーを作製する。このとき、タグの選別機能を使うこともできる。（３）上記の（２）で得られたレクチンサブライブラリーの中から必要に応じ分化のステージをよく反映するレクチンを選び、タグを付けてマイクロタイタープレートに本発明の方法で固定化し、レクチンプレートを作製する。（４）骨芽細胞の分化誘導とレクチンライブラリーによる識別培養した間葉系幹細胞を培養・分離する。より具体的には、間葉系幹細胞を培養後、骨芽細胞に分化させ、分化開始から５日目、１０日目、１５日目、２０日目の細胞を分離する。（５）分化過程の各時点で分離した細胞をレクチンプレートにて分析し、細胞表面糖鎖構造と骨形成能との相関を検討する。骨形性能の測定には骨型アルカリフォスファターゼ活性の測定およびオステオカルシン含有量の測定を行う（標準の作成）。即ち、分離した細胞を骨芽細胞を足場となるｂ−ＴＣＰブロックとの複合体の形でラット背部皮下に移植し、移植後４週、８週において摘出後、（ｉ）オステオカルシン含有量と（ｉｉ）骨型アルカリファスファターゼ活性を測定する。（６）分化過程が不明の細胞をレクチンプレートで分析し、標準と比較する（図１６参照）。
【００９３】
ここで、間葉系幹細胞とは、組織や臓器に成長する元となる細胞である幹細胞のうち、骨髄の中に存在するものをいい、間葉系幹細胞は骨、軟骨、脂肪、心臓、神経、肝臓などの細胞に分化することが確認されており、ほとんどすべての組織にも分化することのできる胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に近い能力を秘めている。間葉系幹細胞は、β−ＴＣＰ（β−ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）というリン酸カルシウムを主成分として生体内に優れた親和性、吸収性および骨伝導性を有する人工材料を培養する足場として用いる。
【００９４】
【発明の効果】
以上のような本発明によれば、糖鎖解析に主要な機能を発揮する糖鎖認識部位を阻害することなく、レクチンを支持体に固定することができ、糖鎖解析の効率が向上されるばかりでなく、糖鎖解析条件と異なる条件でレクチンが固定できるという利点がある。また、糖鎖解析用のレクチンの濃度や糖鎖解析部位の濃度が均一にすることができる。更に、特にレクチン及びその他の物質を含むライセート等から直接レクチンを固定できるという利点がある。
【００９５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】種々のレクチンのアミノ酸配列。
【図２】ＭＡＨの塩基配列と予想されるアミノ酸配列を示した図である。
【図３】ＭＡＨの立体構造の予測図である。
【図４】本発明の１つの実施例となるレクチンを固定する方法を用いたツールを示す概念図である。
【図５】ＭＡＨレクチンの遺伝子改変方法を表した図である。
【図６】Ｃａｃｏ２によるパニングにより回収された改変ＭＡＨレクチンのアミノ酸配列（Ｃループ）を示した図である。
【図７】ヒト赤血球を用いたパニングにより回収されてきたレクチンの改変部位のアミノ酸配列を示す図である。
【図８】ＦＬＡＧ融合型レクチン遺伝子の制限酵素処理による確認の例を示した図である。
【図９】ウェスタンブロッティングによるＦＬＡＧ融合型レクチンの発現の確認を示す図である。
【図１０】抗ＦＬＡＧ抗体への各人工レクチンの結合量に対応する発色状態を示す図である。
【図１１】抗ＦＬＡＧ抗体に結合した各レクチンのシアリルＴへの結合活性に対応する発色状態を示す図である。
【図１２】ヒト赤血球に対するＲｅｖｅｒｓｅ　Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法による測定結果を示す図である。
【図１３】種々の赤血球に対するＲｅｖｅｒｓｅ　Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法による測定結果を示す図である。
【図１４】ＭＡＨレクチンのループＤへのアミノ酸挿入位置を示す図である。
【図１５】レクチンチップの一例およびその使用方法（ＩｇＡについて）を示す図である。
【図１６】レクチンチップの一例およびその使用方法（骨芽細胞の分化度プロファイリングについて）を示す図である。
【符号の説明】
１０　糖鎖解析ツールの一例
１２　ＥＬＩＳＡプレート
１４　抗ＦＬＡＧ抗体
１６　ＦＬＡＧ融合型人工レクチン
１８　糖鎖認識部位
２０　解析対象の細胞
２２　細胞表面糖鎖
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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