(57)【要約】【課題】標本に強度の大きな照明光を照射することの可能な顕微鏡用光源装置を提供する。【解決手段】複数のレーザ光源１０２〜１０４と、複数のレーザ光源１０２〜１０４から出射された複数のレーザ光の光路を合成するための光学系とを有する。光学系は、複数のレーザ光源から出射されるレーザ光の光路上にそれぞれ配置され、それぞれのレーザ光を同一の光路に向けて反射するダイクロイックミラー１０７〜１０９と、レーザ光の強度を検出するための検出器１１０とを含む。検出器１１０は、ダイクロイックミラー１０７〜１０９を透過したレーザ光を受光する位置にそれぞれ配置されている。これにより、光検出のために、別途ビームスプリッタを配置する必要がない。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定波長帯のレーザ光源と、該レーザ光源から出射されたレーザ光を試料へ導く光学系とを有し、
前記光学系は、前記レーザ光源から出射されるレーザ光の光路上に配置され、前記レーザ光の所定波長帯を含む反射特性を有するダイクロイックミラーと、前記レーザ光の強度を検出するための検出器とを含み、
前記検出器は、前記ダイクロイックミラーから漏れて透過した前記レーザ光を受光する位置にそれぞれ配置されていることを特徴とする顕微鏡用光源装置。
【請求項２】
請求項１に記載の顕微鏡用光源装置において、前記レーザ光源は、所定波長帯の異なる複数のレーザ光源を有し、
前記検出器は、光強度を検出する機能と、前記レーザ光の受光位置を検出する機能とを有することを特徴とする顕微鏡用光源装置。
【請求項３】
請求項２に記載の顕微鏡用光源装置において、前記検出器の検出した前記受光位置を、予め定められた位置と比較して、両者の位置ずれを判断することにより前記レーザ光の光軸ずれを検出する制御部をさらに有することを特徴とする顕微鏡用光源装置。
【請求項４】
光源部と、前記光源部からの照明光を標本上に集光するための対物レンズと、前記標本からの光を通過させるための開口を有するピンホール部とを有する共焦点顕微鏡において、
前記光源部は、複数のレーザ光源と、該複数のレーザ光源から出射された複数のレーザ光を光路を合成し、前記照明光とするための光学系とを有し、
前記光学系は、前記複数のレーザ光源から出射されるレーザ光の光路上にそれぞれ配置され、それぞれの前記レーザ光を同一の光路に向けて反射するダイクロイックミラーと、前記レーザ光の強度を検出するための検出器とを含み、
前記検出器は、前記ダイクロイックミラーを透過した前記レーザ光を受光する位置にそれぞれ配置されていることを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項５】
請求項４に記載の共焦点顕微鏡において、前記検出器は、光強度を検出する機能と、前記レーザ光の受光位置を検出する機能とを有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項６】
請求項５に記載の共焦点顕微鏡において、前記検出器の検出した前記受光位置を、予め定められた位置と比較して、両者の位置ずれを判断することにより前記レーザ光の光軸ずれを検出する制御部をさらに有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は共焦点顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来の共焦点顕微鏡の構成を簡単に説明する。レーザ光源部からの照明光はビームエキスパンダにより必要なビーム径まで広げられ、走査レンズで一次像面に結像した後、リレーレンズ及び対物レンズによって標本上に結像される。走査型共焦点顕微鏡の場合は、ビームエキスパンダと走査レンズとの間に配置された、走査ユニットにより、照明光は、標本上で直交する２方向で走査される。
【０００３】
標本上に結像された照明光の像は点像となっており、対物レンズのＮＡで決まる大きさに集光されているため、この点における標本の光学的な特性により反射，吸収，蛍光，散乱光などがほぼ照射領域で起こる。落射型の場合、標本上の照射領域で発生した反射光や蛍光は再び対物レンズで集められ照明レーザ光の光路を逆に進みリレーレンズで一次像面に結像した後、走査レンズ，走査ユニットを順に通過し、ビームスプリッタにより照明光と分離される。分離された標本からの光は、光検出器レンズで開口のある遮光板（ピンホール）上に集光され、開口を通過した光のみが光検出器により検出される。ここで、開口上にできる集光点は標本上での光スポットの像となっているため、標本上の他の点から発生した光がたとえあったとしても、開口上では像を結ばず遮光板で遮られ光検出器にほとんど到達できない。この結果、走査型共焦点顕微鏡では高い横分解能のみならず、高い縦（深さ）分解能により、標本を観察できる。
【０００４】
走査型共焦点顕微鏡で蛍光観察をおこなう場合には、複数の蛍光試薬で染色したサンプルに励起光として複数の波長のレーザ光を同時に当てて観察する（多重励起観察）ことが一般的におこなわれている。図５を用いて、従来の共焦点顕微鏡でのレーザ光源部の構成を簡単に説明する。光源部は、出射波長の異なる複数のレーザ光源５０１，５０２，５０３を有する。これらから発せられたレーザ光は、各レーザ光路中に配置されたＮＤフィルタ等の調光部５０６を通過し、ビームスプリッタ等の振幅分割部５０７により２つのレーザ光束に分割される。振幅分割部５０７により分割（図５では透過）された一方のレーザ光束は、励起光として光路合成用のダイクロイックミラー５０９，５１０，５１１へと進み、これによってそれぞれ反射されることにより、３つの波長のレーザ光が多重化され
た一つのレーザ光束となる。波長が多重化されたレーザ光束は、標本へ照射されるために上記ビームエキスパンダへ進む。振幅分割部５０７で分割（図５では反射）された、もう一方のレーザ光束は、フォトダイオード等の光検出器５０８に入射し、照明光の強度測定に使われる。振幅分割部５０７で強度測定用に分割されるレーザ光は、光検出器５０８の検出感度以上の強度である必要があるため、レーザ光源５０１，５０２，５０３の出力強度によるが、通常数％〜数十％程度のレーザ光が振幅分割部５０７により分割されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
通常の共焦点顕微鏡の蛍光観察用の照明部において、各レーザ光源５０１，５０２，５０３が発するレーザ光の強度は、必ずしも余裕があるものではない。そのため、強度測定のために振幅分割部５０７で分割される光強度は、最小限にすることが望まれる。また、従来技術のように各レーザ光路ごとにビームスプリッタ等の振幅分割部５０７を設けることはコストアップにつながる。
【０００６】
本発明は、標本に強度の大きな照明光を照射することの可能な顕微鏡用光源装置を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明によれば、以下のような　顕微鏡用光源装置を提供することができる。すなわち、
所定波長帯のレーザ光源と、該レーザ光源から出射されたレーザ光を試料へ導く光学系とを有し、
前記光学系は、前記レーザ光源から出射されるレーザ光の光路上に配置され、前記レーザ光の所定波長帯を含む反射特性を有するダイクロイックミラーと、前記レーザ光の強度を検出するための検出器とを含み、
前記検出器は、前記ダイクロイックミラーから漏れて透過した前記レーザ光を受光する位置にそれぞれ配置されていることを特徴とする顕微鏡用光源装置である。
【０００８】
上記顕微鏡用光源装置において、前記レーザ光源は、所定波長帯の異なる複数のレーザ光源を有する構成にすることができ、前記検出器は、光強度を検出する機能と、前記レーザ光の受光位置を検出する機能とを有する構成にすることができる。
【０００９】
上記顕微鏡用光源装置において、前記検出器の検出した前記受光位置を、予め定められた位置と比較して、両者の位置ずれを判断することにより前記レーザ光の光軸ずれを検出する制御部をさらに有する構成にすることが可能である。
【００１０】
また、本発明によれば、下記のような共焦点顕微鏡が提供される。すなわち、光源部と、前記光源部からの照明光を標本上に集光するための対物レンズと、前記標本からの光を通過させるための開口を有するピンホール部とを有する共焦点顕微鏡において、
前記光源部は、複数のレーザ光源と、該複数のレーザ光源から出射された複数のレーザ光を光路を合成し、前記照明光とするための光学系とを有し、
前記光学系は、前記複数のレーザ光源から出射されるレーザ光の光路上にそれぞれ配置され、それぞれの前記レーザ光を同一の光路に向けて反射するダイクロイックミラーと、前記レーザ光の強度を検出するための検出器とを含み、
前記検出器は、前記ダイクロイックミラーを透過した前記レーザ光を受光する位置にそれぞれ配置されていることを特徴とする共焦点顕微鏡である。
【００１１】
上記共焦点顕微鏡において、前記検出器は、光強度を検出する機能と、前記レーザ光の受光位置を検出する機能とを有する構成にすることができる。
【００１２】
上記共焦点顕微鏡において、前記検出器の検出した前記受光位置を、予め定められた位置と比較して、両者の位置ずれを判断することにより前記レーザ光の光軸ずれを検出する制御部をさらに有することを構成にすることができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の一実施の形態について説明する。
（第１の実施の形態）
本発明の第１の実施の形態の共焦点顕微鏡について説明する。
【００１４】
第１の実施の形態の共焦点顕微鏡は、図４のように、光源部１０１と、光源１０１の光路上に順に配置された、ビームエキスパンダ４０２、走査ユニット４０４と、走査レンズ４０６，リレーレンズ４０８、ミラー４０９、対物レンズ４１０、標本ステージ５０とを有している。また、ビームスプリッタ４０３で、分離される光路側には、光検出器レンズ４１２、開口４１３を備えた遮光板（ピンホール板）４１４、光検出器４１５が配置されている。
【００１５】
光源部１０１の構成を図１を用いてさらに説明する。光源部１０１は、出射波長の異なるレーザ光源１０２，１０３，１０４と、各レーザ光源１０２，１０３，１０４から発せられたレーザ光の光路上にそれぞれ配置された、ＮＤフィルタ等の調光部１０６と、ダイクロイックミラー１０７，１０８，１０９と、フォトダイオード等の光検出器１１０とを含んでいる。ここではレーザ光源１０２として、空冷Ａｒレーザ（波長４８８ｎｍ）、レーザ光源１０３として、Ｇ／Ｈｅ−Ｎｅレーザ（波長５４３ｎｍ）、レーザ光源１０４として、Ｒ／Ｈｅ−Ｎｅレーザ（６３３ｎｍ）を用いている。
【００１６】
ダイクロイックミラー１０７，１０８，１０９は、図２（ａ），（ｂ），（ｃ）に示すような反射特性を有する一般的なダイクロイックミラーを用いる。一般的に、ダイクロイックミラーは、所望の波長を反射することにより分離させるためのものであるが、実際は所望の波長を１００％反射できるものではなく、通常数％から１０％程度の光が透過してしまう。反射させる波長が異なる場合でも、その反射率はそれほど大きく変わらない。そこで、本実施の形態では、ダイクロイックミラー１０７，１０８，１０９を透過する光を利用し、透過光を光検出器１１０により検出することにより、レーザ光の強度をモニタする構成とした。すなわち、３つの光検出器１１０を、各ダイクロイックミラー１０７，１０８，１０９の裏側にそれぞれ配置することにより、ダイクロイックミラー１０７，１０８，１０９を透過したレーザ光を受光する構成としている。
【００１７】
なお、ダイクロイックミラー１０７，１０８，１０９は、反射した各波長のレーザ光を同一の光路に向けて反射し、一つのレーザ光束に光路を合成するようにその配置が調整されている。また、レーザ光源１０２，１０３，１０４のレーザ光の光路上には、開閉可能なシャッタ１０５がそれぞれ配置されている。
【００１８】
光源部１０１には、３つの光検出器１１０の出力をそれぞれ増幅するためのアンプ１１１が接続されている。また、アンプ１１１の出力は、Ａ／Ｄ変換器１１２を介して、ＣＰＵ１１３に入力され、処理される。ＣＰＵ１１３には不図示の表示部が接続されている。また、上述の光検出器４１５の出力も、不図示のＡ／Ｄ変換器１１２を介して、ＣＰＵ１１３に入力され、処理される。
【００１９】
第１の実施の形態の共焦点顕微鏡の動作について説明する。
【００２０】
各レーザ光源１０２，１０３，１０４から発せられたレーザ光は、それぞれ調光部１０６を通過し、ダイクロイックミラー１０７，１０８，１０９に入射すし、図２（ａ），（ｂ），（ｃ）に示したような反射特性により、その大部分が反射される。反射されたレーザ光は、光路が合成され、波長が多重化された一つのレーザ光束となって、ビームエキスパンダ４０２に入射する。一方、ダイクロイックミラー１０７，１０８，１０９を透過した数％〜１０％程度のレーザ光は、光検出器１１０によりそれぞれ受光され、その強度がモニタされる。光検出器１１０の出力は、アンプ１１１で増幅され、Ａ／Ｄ変換器１１２でデジタル信号に変換されて、ＣＰＵ１１３に入射する。ＣＰＵ１１３は、受け取った光検出器１１０の出力を、予め定めておいた演算式により、波長ごとに補正して、補正結果を表示部に表示させる。これにより、ユーザは、レーザ光の強度を波長ごとに把握することができる。
【００２１】
光源部１０１からビームエキスパンダ４０２に向けて出射されたレーザ光束は、ビームエキスパンダ４０２で必要なビーム径まで広げられ、走査ユニット４０４に入る。走査ユニットは、２組の可動式のミラー４０５からなり、ステージ５０上で直交する２方向に光を走査させるために偏向する。走査ユニット４０４を出たレーザ光束は、走査レンズ４０６で一次像面４０７に結像した後、リレーレンズ４０８および対物レンズ４１０によって、ステージ５０上の標本４１１上に結像される。なお、ミラー４０９は、単純に光の方向を変化させているだけである。
【００２２】
標本４１１上に結像されたレーザ光の像は点像となっており、対物レンズ４１０のＮＡで決まる大きさに集光されているため、この点における標本の光学的な特性により反射，吸収，蛍光の発光，散乱などがほぼ照射領域で起こる。図４に示した顕微鏡の構成は、落射型であるため、標本の照射領域から発せられた反射光束や蛍光光束が、再び対物レンズ４１０で集められ、照明レーザ光束の光路を逆に進み、リレーレンズ４０８で一次像面に結像した後、走査レンズ４０６，走査ユニット４０４を通りビームスプリッタ４０３に到達する。
【００２３】
ビームスプリッタ４０３において、標本からの反射光束や蛍光光束は反射され、光検出器レンズ４１２で開口４１３のある遮光板４１４上に集光される。この開口４１３を通過できた光のみが、光検出器４１５に到達し、受光される。開口４１３上にできる集光点は、標本４１１上でのレーザ光束の集光点と共焦点となっているため、標本４１１上の横方向および深さ方向について他の点から発生した光がたとえあったとしても、開口４１３上では像を結ばず遮光板で遮られ、光検出器４１５にほとんど到達できない。この結果、走査型共焦点顕微鏡では高い横分解能と高い縦（深さ）分解能とにより、標本４１１を観察できる。光検出器４１５の出力は、ＣＰＵ１１３により画像に合成され、表示部に標本画像が表示される。
【００２４】
このように、本実施の形態の共焦点顕微鏡では、光源部１０１において、ダイクロイックミラー１０７，１０８，１０９がすべての光が反射されないことを利用し、ダイクロイックミラー１０７，１０８，１０９を透過した光を光検出器１１０で検出することにより、光強度をモニタしている。したがって、従来のように光強度のモニタのために、別途ビームスプリッタ等により光束を分割する必要がないため、レーザ光源１０２，１０３，１０４の出射強度が同じであれば、従来と比較して、強度の大きなレーザ光をビームエキスパンダ４０２に向けて出射することができる。また、光源部１０１の部品数が、従来よりも少なくできるため、コストを低減することも可能である。
【００２５】
これにより、走査型共焦点顕微鏡で蛍光観察をおこなう場合に、強度の大きな励起レーザ光により標本４１１を励起できるため、強度の大きな蛍光を生じさせることが可能である。これにより、標本４１１について明るい蛍光像を観察することが可能である。
（第２の実施の形態）
本発明の第２の実施の形態の共焦点顕微鏡について説明する。
【００２６】
第２の実施の形態の共焦点顕微鏡は、光源部１０１の構造が、第１の実施の形態の共焦点顕微鏡とは異なっている。第２の実施の形態の共焦点顕微鏡の光源部１０１は、図３に示したように、第１の実施の形態の図１の光源部１０１の光検出器１１０に代えて、半導体位置検出器（ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｄｅｖｉｃｅ：ＰＳＤ）３０１を用いる。他の構成は、第１の実施の形態と同様である。
【００２７】
本実施の形態では、ＣＰＵ１１３が、各ＰＳＤ３０１についての両端の出力の和から、光強度をそれぞれ検出するとともに、各ＰＳＤ３０１についての両端の出力の比からレーザ光の入射位置情報を検出する。
【００２８】
ＰＳＤ３０１により検出された光強度については、第１の実施の形態と同様に、演算により補正して、レーザ光の強度のモニタ結果として表示装置に表示させる。また、ＰＳＤ３０１により検出されたレーザ光の入射位置情報は、レーザ光源１０２、１０３，１０４の使用中に生じた光軸ずれの検出に用いる。すなわち、予め３本のレーザ光源１０２，１０３，１０４の出射したレーザ光を、ダイクロイックミラー１０７，１０８，１０９により同一光路に合成することができるように光軸調整した状態で、各ＰＳＤ３０１の検出した位置情報をＣＰＵ１１３内のメモリに保存しておく。そして、使用中の各ＰＳＤ３０１の検出した位置情報を、メモリに保存されている位置情報とＣＰＵ１１３が比較することにより、レーザ光源１０２、１０３，１０４の光軸のアライメントに狂いが生じた場合に、それを検出することができる。アライメントの狂いを検出した場合には、ＣＰＵ１１３は、そのことを表示装置に表示し、ユーザに報知するように構成されている。
【００２９】
第２の実施の形態の場合も、光源部１０１は、強度検出および位置検出のために、レーザ光を分割する必要がないため、強度の大きなレーザ光を出射することができる。よって、標本４１１について明るい像を観察することが可能である。また、第１の実施の形態と同様の部品点数で、レーザ光の強度検出と位置検出とが両方実現できる。
【００３０】
なお、上述の第１および第２の実施の形態では、落射型の共焦点顕微鏡について説明したが、本実施の形態の光源部１０１は、透過型の共焦点顕微鏡に用いることが可能である。
【００３１】
なお、上述の第１および第２の実施の形態では、光源部１０１を共焦点顕微鏡の光源部として用いているが、他の顕微鏡の光源部として用いることも可能である。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、標本に強度の大きな照明光を照射することの可能な顕微鏡用光源装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の第１の実施の形態の共焦点顕微鏡の光源部の構成を示すブロック図である。
【図２】図２（ａ），（ｂ）は、本発明の第１の実施の形態の共焦点顕微鏡の全体構成を示すブロック図である。
【図３】図３は、本発明の第２の実施の形態の共焦点顕微鏡の光源部の構成を示すブロック図である。
【図４】図３（ａ），（ｂ），（ｃ）は、それぞれ、本発明の第１の実施の形態の共焦点顕微鏡の光源部のダイクロイックミラー１０７，１０８，１０９の反射特性を示すグラフである。
【図５】図５は、従来の共焦点顕微鏡の光源部の構成を示すブロック図である。
【符号の説明】
５０：ステージ
１０１：光源部
１０２：空冷Ａｒレーザ（４８８ｎｍ）
１０３：Ｇ／Ｈｅ−Ｎｅレーザ（５４３ｎｍ）
１０４：Ｒ／Ｈｅ−Ｎｅレーザ（６３３ｎｍ）
１０５：電動シャッタ
１０６：調光部
１０７〜１０９：光路合成用ダイクロイックミラー
１１０：光検出器
１１１：アンプ
１１２：ＡＤ変換器
１１３：ＣＰＵ
３０１：ＰＳＤ
４０２：ビームエキスパンダ
４０３：ビームスプリッタ
４０４：走査ユニット
４０５：可動ミラー
４０６：走査レンズ
４０７：一次像面
４０８：リレーレンズ
４０９：ミラー
４１０：対物レンズ
４１１：標本
４１２：光検出器レンズ
４１３：開口
４１４：遮光板
４１５：光検出器
５０１：光源部
５０２〜５０４：レーザ光源
５０６：調光部
５０７：振幅分割部
５０８：光検出器
５０９〜５１１：光路合成用ダイクロイックミラー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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