(57)【要約】【課題】動物体組織から、コラーゲン、ゼラチン、コラーゲンペプタイドなどの蛋白質を、収率や純度が高く、安価に製造する。【解決手段】動物蛋白質を含む動物の体組織を原料とし、原料の脱脂・脱臭処理を含む前処理工程と、該原料を酸溶液または酸および酸性プロテアーゼ溶液に浸漬して酸可溶性蛋白質を可溶化、溶解させ、酸可溶性蛋白質を含有する抽出液を得る抽出工程と、該抽出液から酸可溶性蛋白質を精製する精製・濃縮工程とを備えた動物蛋白質の製造方法において、上記抽出工程における酸溶液または酸および酸性プロテアーゼ溶液を、酸溶液濃度０．３Ｍ〜２Ｍとし、かつ抽出に供する原料との酸溶液重量比を１．５〜１０倍とする。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の蛋白質を含む組織および／または動物の皮からなる動物の体組織を原料とし、原料の脱脂・脱臭処理を含む前処理工程と、前処理した原料を酸溶液または酸および酸性プロテアーゼ溶液に浸漬して、酸可溶性蛋白質を可溶化、溶解させ、酸可溶性蛋白質を含有する抽出液を得る抽出工程と、該抽出液から酸可溶性蛋白質を精製、濃縮する精製・濃縮工程とを備えた動物蛋白質の製造方法において、抽出工程に供する原料と溶液の関係が、原料に対する酸溶液または酸および酸性プロテアーゼ溶液の重量比が１．５〜１０倍で、酸の濃度が０．３Ｍ〜２Ｍであることを特徴とする、動物蛋白質の製造方法。
【請求項２】
上記前処理工程、抽出工程および精製・濃縮工程の温度が、上記原料が、陸生動物由来では０〜４０℃、水生動物由来では０〜３０℃に保温され、また抽出工程および／または精製・濃縮工程の温度を前処理工程の温度より５℃以上低く保温する、請求項１に記載の動物蛋白質の製造方法。
【請求項３】
上記精製・濃縮工程が、限外ろ過膜を用いた精製、濃縮の方法からなり、上記抽出液を限外ろ過装置に投入して、限外ろ過膜を透過しない酸可溶性蛋白質を含む残留液を濃縮して循環液として循環させ、再度、限外ろ過するものである、請求項１または請求項２に記載の動物蛋白質の製造方法。
【請求項４】
上記精製・濃縮工程において、上記循環液の総量を検知する総量検知手段と、上記抽出工程に用いる溶液よりｐＨが中性に近い弱酸性溶液を循環液に添加する弱酸性溶液添加手段とを有し、該循環液の総量を所定の範囲に、間欠的あるいは連続的に維持、制御する、請求項３に記載の動物蛋白質の製造方法。
【請求項５】
上記精製・濃縮工程において、上記循環液が含有する酸可溶性蛋白質の濃度、酸可溶性蛋白質の純度、循環液の粘度、循環液の密度、循環液の酸性度、および循環液の電気伝導度の群から選ばれた少なくとも１種を連続的または間欠的に検知する手段ならびに循環液の循環を制御する手段を有し、該酸可溶性蛋白質の精製、濃縮を制御する、請求項３または請求項４に記載の動物蛋白質の製造方法。
【請求項６】
上記精製・濃縮工程において、限外ろ過膜の分画分子量が互いに同一あるいは異なる限外ろ過装置を複数台備え、該複数台の限外ろ過の循環液が互いに連通可能な、請求項３〜請求項５のいずれか１項に記載の動物蛋白質の製造方法。
【請求項７】
上記精製・濃縮工程において、限外ろ過に分画分子量３０，０００〜１００，０００の限外ろ過膜を用い、該限外ろ過の循環液よりコラーゲン、および／または、該限外ろ過の透過液よりゼラチンまたはコラーゲンペプタイドを得る請求項３〜請求項６のいずれか１項に記載の動物蛋白質の製造方法。
【請求項８】
上記精製・濃縮工程において、限外ろ過に分画分子量５，０００〜３０，０００の限外ろ過膜を用い、該限外ろ過の循環液よりコラーゲンまたはゼラチン、および／または、該限外ろ過の透過液よりコラーゲンペプタイドを得る請求項３〜請求項６のいずれか１項に記載の動物蛋白質の製造方法。
【請求項９】
上記精製・濃縮工程において、限外ろ過膜の分画分子量が異なる限外ろ過を二段階で構成し、第一段には分画分子量３０，０００〜１００，０００の限外ろ過膜を、第二段には分画分子量５，０００〜３０，０００の限外ろ過膜を備え、第一段の限外ろ過で得られる透過液を、第二段の限外ろ過の循環液に間欠的または連続的に投入して、第一段の循環液よりコラーゲン、第二段の循環液よりゼラチン、および／または、第二段の透過液よりコラーゲンペプタイドを得る請求項３〜請求項６のいずれか１項に記載の動物蛋白質の製造方法。
【請求項１０】
上記抽出工程において、酸溶液または酸および酸性プロテアーゼ溶液に浸漬する温度を５０〜１５０℃として１〜１０分間加熱する請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の動物蛋白質の製造方法。
【請求項１１】
上記抽出工程において、上記抽出液にて可溶化、溶解しないで残留する不溶残さ、および／または、上記脱脂・脱臭処理を含む前処理を施した原料を、温水に浸漬して温水可溶性蛋白質を可溶化、溶解させ抽出液を得、該抽出液を分画分子量５，０００〜３０，０００の限外ろ過膜からなる限外ろ過装置に投入し、限外ろ過膜を透過しない温水可溶性蛋白質を含む残留液を濃縮して循環液として循環させ、再度、限外ろ過し、循環液よりゼラチンを、および／または、透過液よりコラーゲンペプタイドを得るものである、温水可溶性蛋白質の製造工程を付加した、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の動物蛋白質の製造方法。
【請求項１２】
上記温水浸漬の温度が、陸生動物由来の原料では５０〜１００℃、水生動物由来の原料では４０〜１００℃である、請求項１１に記載の動物蛋白質の製造方法。
【請求項１３】
上記前処理工程において、動物の体組織が動物の皮である場合において、上記動物の皮が陸生由来では４０〜７０℃、水生由来では３０〜６０℃の温度範囲で１〜１０分間温水に浸漬して、表皮を剥離して真皮層を得る皮剥離工程を含むものである、請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の動物蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
上記前処理工程において、上記動物の体組織または上記真皮層を原料として、アルカリ液中に浸漬し、該浸漬の条件が、浸漬温度０〜４０℃、浸漬時間が１〜３２日間であり、温度４０℃で最短浸漬時間１日を基準として、１０℃下がるごとに最短浸漬時間が２倍以上とする、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の動物蛋白質の製造方法。
【請求項１５】
動物の蛋白質を含む組織および／または動物の皮からなる動物の体組織を原料とし、原料の脱脂・脱臭処理を含む前処理を施す前処理装置と、原料を酸溶液または酸および酸性プロテアーゼ溶液に浸漬して酸可溶性蛋白質を可溶化、溶解させ、酸可溶性蛋白質を含有する抽出液を得る抽出装置と、該抽出液から酸可溶性蛋白質を精製、濃縮する精製・濃縮装置とを備えた動物蛋白質の製造装置において、抽出工程に供する原料と溶液の関係が、原料に対する酸溶液または酸および酸性プロテアーゼ溶液の重量比が１．５〜１０倍で、酸の濃度を０．３Ｍ〜２Ｍの範囲で調整する抽出装置であることを特徴とする、動物蛋白質の製造装置。
【請求項１６】
上記精製・濃縮装置が、限外ろ過膜を用いた精製、濃縮の方法を含んでなり、上記抽出液を限外ろ過装置に投入して、該限外ろ過膜を透過しない酸可溶性蛋白質を含む残留液を濃縮して循環液として循環させ、再度、限外ろ過するものである、請求項１５に記載の動物蛋白質の製造装置。
【請求項１７】
上記精製・濃縮装置において、上記限外ろ過の循環液の総量を検知する総量検知手段と、抽出工程で用いた酸溶液よりｐＨが中性に近い弱酸性溶液を該循環液に添加する弱酸性溶液添加手段とを備えて、該循環液の総量を所定の範囲に、間欠的あるいは連続的に維持、制御する請求項１６に記載の動物蛋白質の製造装置。
【請求項１８】
上記精製・濃縮装置において、上記循環液が含有する酸可溶性蛋白質の濃度、酸可溶性蛋白質の純度、循環液の粘度、循環液の密度、循環液の酸性度、および循環液の電気伝導度の群から選ばれた少なくとも一種を検知する手段、ならびに循環液の循環制御手段を備えて、循環液の酸可溶性蛋白質の濃縮を制御する、請求項１６または請求項１７に記載の動物蛋白質の製造装置。
【請求項１９】
上記精製・濃縮装置において、限外ろ過膜の分画分子量が互いに同一あるいは異なる限外ろ過装置を複数台備え、該複数台の限外ろ過の循環液が互いに連通可能な、請求項１６〜請求項１８のいずれか１項に記載の動物蛋白質の製造装置。
【請求項２０】
上記抽出装置において、上記抽出液にて可溶化、溶解しないで残留する不溶残さ、および／または、上記脱脂・脱臭処理を含む前処理を施した原料を、温水に浸漬して温水可溶性蛋白質を可溶化、溶解させ抽出液を得る温水抽出装置と、該抽出液を分画分子量５，０００〜３０，０００の限外ろ過膜からなる限外ろ過装置に投入し、限外ろ過膜を透過しない温水可溶性蛋白質を含む残留液を濃縮して循環液として循環させ、再度、限外ろ過し、循環液よりゼラチンを、および／または、透過液よりコラーゲンペプタイドを得る精製・濃縮装置とからなる、温水可溶性蛋白質の製造装置を付設して設けるか、および／または上記酸可溶性蛋白質の製造に供する抽出装置と限外ろ過装置とを兼用、共用して温水可溶性蛋白質の製造に供する、請求項１６〜請求項１９のいずれか１項に記載の動物蛋白質の製造装置。
【請求項２１】
動物の表皮を剥離して真皮層を分離する皮剥離装置を備えた、請求項１５〜請求項２０のいずれか１項に記載の動物蛋白質の製造装置。
【請求項２２】
請求項１〜請求項１４いずれか１項記載の動物蛋白質の製造方法によって得られるコラーゲン、ゼラチン、およびコラーゲンペプタイドの群から選ばれた少なくとも１種の動物蛋白質。
【請求項２３】
請求項２２記載のコラーゲン、ゼラチン、およびコラーゲンペプタイドの群から選ばれた少なくとも１種の動物蛋白質を含有する化粧料。
【請求項２４】
請求項２２記載のコラーゲン、ゼラチン、およびコラーゲンペプタイドの群から選ばれた少なくとも１種の動物蛋白質を含有する医薬品。
【請求項２５】
請求項２２記載のコラーゲン、ゼラチン、およびコラーゲンペプタイドの群から選ばれた少なくとも１種の動物蛋白質を含有する健康食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物の体組織から動物蛋白質を抽出し、精製するための製造方法と製造装置、およびこれにより得られる動物蛋白質に関し、特に、酸溶液による抽出方法や限外ろ過を用いる精製方法を使用する製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動物の骨や皮を原料として、それに含有される蛋白質よりゼラチンやコラーゲンが抽出され、医薬用、食用、写真用、工業用など多くの用途に使われている。
コラーゲンは、３本の分子量１０万前後のポリペプチド鎖（α鎖）の三重らせん構造である分子量約３０万のγ鎖が基本単位である。
また、ゼラチンは、“動物の骨、皮、じん帯またはけんから得たコラーゲンを加水分解して製造”すると定義付けられている（非特許文献１参照）。加水分解してゼラチンを抽出する温度は、一般に陸生動物由来では４０℃以上と言われ、コラーゲンの加水分解反応液からの抽出物は、加水分解反応の温度が比較的低い場合は、分子量１０万前後のα鎖を主成分とするゼラチンであるが、加水分解温度を上げるに伴い、さらに低分子の蛋白質であるコラーゲンペプタイドが主成分となる。
【０００３】
従来技術においては、動物の体組織から蛋白質を抽出するための前処理工程として、原料中の水溶性蛋白質、油脂分、臭い成分などを除く目的で、アルカリ溶液、酸溶液、エタノール溶液、有機溶媒に漬けたり、塩類を混合したりもしている。また、動物の体組織が皮からなる場合は、予めコラーゲンが多く含有されている真皮層を表皮から剥離し、分離した真皮層を用いて目的とする蛋白質を抽出する場合もある。
【０００４】
石灰、苛性ソーダなどを用いたアルカリ溶液処理はゼラチン抽出の前処理として広く用いられている（特許文献１参照）。また、コラーゲン抽出の前処理としてアルカリ処理および塩漬けの組合せ例があるが、アルカリ性溶液にて可溶化したいわゆるアルカリ可溶性コラーゲンの抽出に関するものであり、かつ精製方法は、抽出したコラーゲンを同時に塩析した後、脱塩するものである（特許文献２参照）。
一方、原料が水生動物由来である場合は、臭い成分の除去が大きな課題であり、エタノールなどの有機溶媒処理をしたり、塩漬けして前処理する方法が知られている（特許文献３，４参照）。
海洋生物を原料として、精製・濃縮工程を直接限外ろ過で行う方法も知られているが、その前処理工程は、有機溶媒処理と塩溶液処理を組合せたものであり（特許文献５参照）、有機溶媒の引火爆発の危険を防止するため防爆などの付加的な安全設備が必要となり設備投資が大きく、また、食用に供するコラーゲンの場合、有機物残留が如何に微量であろうと、健康問題の見地からは有機溶媒の採用は困難である。
【０００５】
脱脂・脱臭処理を含む前処理工程や抽出工程で、油脂分や臭い成分を所望の残留レベルにせず、精製・濃縮工程で最終的に所望の残留レベルにする方法も考えられる。しかしながら、このような方法では収率が落ち、結果コスト高になってしまう。また、前処理の脱脂・脱臭工程において、酸溶液浸漬を採用すると、臭気成分の除去機能はアルカリ溶液浸漬と同等だが、油脂成分の除去性は劣り、また効果を上げるため長期に漬けると、動物蛋白質は一般に弱酸性のため蛋白質の過剰の分解が起こり、収率を落とすという欠点がある。
また、アルカリ浸漬や酸浸漬、塩漬けを短期、または行わずに、界面活性剤や有機溶媒で油脂除去する方法もある。しかしながら、界面活性剤による脱脂の方法は、界面活性剤が蛋白質と吸着して、蛋白質抽出後の後処理として界面活性剤の水洗、除去に多大なコストがかかる。また、有機溶媒処理は、防爆装置の設置コストや、環境に優しい材料が求められる今の時代要求には相応しくない。
【０００６】
以上のように、従来の公知技術においては、抽出した酸可溶性コラーゲンの精製として限外ろ過を行う場合において、その原料の油脂分や臭い成分の除去をアルカリ浸漬を含む処理工程で行う事例はこれまで知られておらず、またアルカリ浸漬の場合の最適な浸漬条件は未だ明らかにされていない。
【０００７】
コラーゲンを可溶化する方法として、酸溶液に浸漬溶解するものと、蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）を酸溶液に添加して、コラーゲン末端のテロペプチド部分を切断して可溶化を促進する方法がある。さらに、可溶化させる溶液のｐＨ状態によっては、可溶化したコラーゲンの特性が一部異なるために、アルカリ溶液下で可溶化して抽出して得られるアルカリ可溶性コラーゲンや中性塩溶液下で可溶化して抽出して得られる中性塩可溶性コラーゲンもあるが、これらはコラーゲンが一部変性してゼラチン化するため、均一溶液にならないと言われている（非特許文献２参照）。
【０００８】
酸性プロテアーゼを用いた酸可溶性コラーゲンの抽出例として、塩やアルカリで前処理して原料とする動物の体組織中の水溶性蛋白質や油脂分を除去し、さらに酸性条件で抽出することが行われている（特許文献６，７参照）。また、近年においては、プロテアーゼを工業的に利用することも行われているが、コラーゲン抽出方法の基本は変わりがない。
上記抽出液からコラーゲンを回収・精製する方法としては、塩添加やｐＨ操作などの化学的な手法によりコラーゲンを沈殿析出させ、遠心分離により固液分離を行った後、分離された固形分を酸溶解して透析や限外ろ過を行ない所望のコラーゲンを得る方法が採られている（特許文献８，９参照）。また、コラーゲン抽出液を塩析やｐＨ操作を行わず、物理的な限外ろ過法により直接的にコラーゲンを回収する方法も示されている（特許文献５参照）。
なお、アルカリ可溶性コラーゲンの抽出を行なう事例でも、その回収・精製には酸可溶性コラーゲンの場合と同様、上記塩析の手法を用いている（特許文献２参照）。
【０００９】
ところで、動物の体組織からコラーゲンを可溶化させ、酸可溶性コラーゲンを抽出するための基本条件として、動物体組織と抽出に用いる酸および溶解する水の３者間の重量濃度比を最適な範囲に設定して、効率よく抽出を行う必要がある。従来技術としては、動物体組織の１重量部に対する酸溶液重量比を２０重量倍かつその酸溶液濃度は０．５Ｍとするもの（特許文献８参照）、酸溶液重量比を１０倍〜１００倍で濃度を０．１〜５Ｍとしているものがある（特許文献９参照）。
【００１０】
上記の条件では、抽出時間を効率良く短時間で行う狙いから、酸溶液重量比を多くしているが、使用済酸溶液の処分が大変であり、量産するためには大きな課題であった。また、大量の酸と接触することにより、狙いとする分子量３０万程度のγ鎖（約１０万分子量のポリペプチド鎖であるα鎖が３本組み合って構成される三重らせん構造が、可溶化して水素結合でゆるく結合している状態）が解離してα鎖やさらに低分子量のコラーゲンペプタイドに分解されるため、分子量分布がばらつき、従ってコラーゲン溶液が不均一で純度が落ちる欠点も有していた。
【００１１】
従来技術の精製段階では、塩析などにより所望のγ鎖を含む高分子量画分のものを沈殿させ、沈殿物を遠心分離して得られる固形分の脱塩のために透析や限外ろ過して純度を高める方法が用いられるが、抽出後の精製段階が複雑で、高純度コラーゲンは得られるもののその収率が低くなっている。
また、酸可溶性コラーゲンの抽出において、酸溶液に溶解しない不溶性固形物を少なくするために抽出時間を長くすると、γ鎖のα鎖への解離を促進してコラーゲン純度が低くなる。この不溶性固形物を再び酸溶液に投入して再抽出する方法もあるが（特許文献５参照）、得られるコラーゲンは、同じく純度が低くなり、再抽出の目的に適うものとは言い難い場合がある。
以上に説明したように、従来の抽出条件では必要な精製・濃縮工程を考慮すると量産上経済的に問題を有しており、純度の高いコラーゲンを安定的に低コストで抽出、精製する条件や方法の改良が求められている。
【００１２】
また、動物の体組織から分離される動物蛋白質の市場についてみると、γ鎖を含有するコラーゲンの市場は高価だが需要量は多くなく、一方α鎖を主成分とするゼラチンやさらに低分子量のコラーゲンペプタイドの市場は比較的安価だが需要量は多い。
ゼラチンの製造方法は、通常、動物の体組織を温水浴に漬けてγ鎖を分解してα鎖としてゼラチンを得る。また、コラーゲンペプタイドの製造方法は、上記γ鎖を分解した反応溶液の抽出液に蛋白分解酵素を添加して、さらに低分子量の蛋白質を抽出し、その抽出液を精密ろ過や限外ろ過を用いて所望の分子量のコラーゲンペプタイドを得る。従って、ゼラチンおよびコラーゲンペプタイドの製造方法は、コラーゲンの製造方法に比べて、抽出工程だけでなく、精製・濃縮工程でも異なる方法が採られている。
これらの点から、γ鎖を含むコラーゲンの他に、α鎖を主成分とするゼラチンないしはさらに低分子のコラーゲンペプタイドを同一の原料や同一の設備を用いて製造できれば設備コストを安くでき、精製プロセスを兼用して、目的とする動物蛋白質に対応して精製条件の変更などが行える製造方法の開発が求められている。
【００１３】
【非特許文献１】
ＪＩＳＫ６５０３−１９９６「にかわおよびゼラチン」
【非特許文献２】
日本にかわ・ゼラチン工業組合、「にかわとゼラチン」、丸善出版、昭和６２年１月（ｐ．１３３〜ｐ１４１）
【特許文献１】
特開平７−２４７４６５号公報（第３頁）
【特許文献２】
特公昭４６−１５０３３号公報（第３頁）
【特許文献３】
特開２０００−５０８１１号公報（第２頁）
【特許文献４】
特開２０００−２５６３９８号公報（第６頁）
【特許文献５】
特開２００１−２０００００号公報（第５−７頁）
【特許文献６】
特公昭４４−１１０３７号公報（第１−２頁）
【特許文献７】
特公昭４４−１１７５号公報（第１−２頁）
【特許文献８】
特開平５−９３０００号公報（第２−３頁）
【特許文献９】
特開平１１−２４６５９８号公報（第３頁）
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来技術の問題点に鑑みてなされたもので、動物の体組織からコラーゲン、ゼラチン、コラーゲンペプタイドなどの蛋白質を製造するにあたり、収率や純度が高く、安価に生産できる製造方法を提供する目的でなされたものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、動物の蛋白質を含む組織および／または動物の皮からなる動物の体組織を原料とし、該原料に含有の蛋白質の抽出に供する前処理を行う前処理工程と、該前処理を施した原料を、酸溶液または酸性プロテアーゼ溶液に浸漬して、酸可溶性蛋白質を可溶化、溶解させ、上記酸可溶性蛋白質を主成分とした抽出液を得る抽出工程と、該抽出液を濃縮して上記酸可溶性蛋白質を精製する精製・濃縮工程とを備えた動物蛋白質の製造方法において、上記抽出工程における酸溶液または酸および酸性プロテアーゼ溶液を、酸溶液濃度０．３Ｍ〜２Ｍとし、かつ抽出に供する原料との酸溶液重量比を１．５〜１０倍とすることを特徴とする、動物蛋白質の製造方法に関する。
次に、本発明は、動物の蛋白質を含む組織および／または動物の皮からなる動物の体組織を原料とし、該原料含有の蛋白質の抽出に供する前処理を施す前処理装置と、該前処理を施した原料を、重量比が１．５〜１０倍で、濃度が０．３Ｍ〜２Ｍである酸溶液または酸性プロテアーゼ溶液に浸漬し、酸可溶性蛋白質を主成分とした抽出液を得る抽出装置と、該抽出液を限外ろ過に投入して、該限外ろ過の循環液を濃縮して上記酸可溶性蛋白質を精製する精製・濃縮装置とを備えた、動物蛋白質の製造装置に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられる原料の動物体組織としては、牛、豚などの陸生動物や魚、鮫、鮭、鯨などの水生動物の骨、皮などが挙げられ、陸生動物では他にじん帯またはけんなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
コラーゲン、ゼラチンやコラーゲンペプタイドの抽出に供する原料は、通常、予め粉砕あるいはミンチ状にホモジネートする。動物の皮の場合は、ミンチ状にホモジネートするか、あるいは５ｍｍ角〜５０ｍｍ角前後に細断しておく場合もある。
【００１７】
動物の皮を原料として、動物蛋白質を抽出、精製・濃縮する場合、皮そのものを原料として抽出に供する場合もあるが、皮を構成する真皮層と表皮とを分離して、コラーゲンを多く含有する真皮層を抽出工程に供するのが一般である。
動物の皮から真皮層を剥ぎ取る方法は機械的、物理的に剥ぐ方法などあるが、本発明では、動物の皮を短い時間の間、温水に浸漬して、表皮と真皮層の組織間の結合力を弱め、効率的に真皮層を分離することができる。
【００１８】
陸生動物由来の皮を用いる場合は、好ましくは４０〜７０℃、さらに好ましくは５０〜６０℃の温水に１分間〜１０分間浸漬する。水生動物由来の皮の場合は、好ましくは３０〜６０℃、さらに好ましくは４０〜５０℃の温水に、好ましくは１〜１０分、さらに好ましくは３〜５分浸漬することで、真皮層が容易に表皮と分離し易くなる。上記温度範囲は、組織間の結合を弱めるのに充分な高温であり、かつ蛋白質の熱変性が許容できる程度の温度範囲である。なお、浸漬時間は、真皮層中心部では熱変性が生じない程度の時間が好ましい。
真皮層を分離するには、上記温水浸漬後に手作業で表皮を剥離することも可能であるが、浸漬、水洗後、凍結させ、例えば、スライサー（田崎製作所製ＡＣ−３００）などにより行うことができる。
なお、脱脂・脱臭工程前に真皮層を分離せずに、動物の皮そのものを用いて下記アルカリ浸漬を高温寄りで行った後に真皮層を分離すると、表皮と真皮層が分離し易くなる。
【００１９】
本発明の前処理工程は、原料の脱脂・脱臭を施す脱脂・脱臭工程を含み、例えば、脱脂・脱臭工程として原料の油脂分や臭い成分、さらには水溶性蛋白質を除去するために、メタノール浸漬、エタノール浸漬、アルカリ浸漬、酸溶液浸漬、塩漬けやさらに界面活性剤、有機溶媒処理など幾つかの工程を含んでも良いが、アルカリ処理工程を含んでもよい。
なお、メタノール浸漬、エタノール浸漬は、有機溶媒処理に含まれる場合もある。
【００２０】
アルカリ浸漬に使用するアルカリ剤としては、石灰、生石灰や水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどが挙げられる。
アルカリ浸漬は、原料の２倍重量以上、好ましくは２〜２０倍重量のアルカリ水溶液に漬け、ｐＨを１０以上、好ましくはｐＨ１０〜１３に保って行う。アルカリ水溶液の濃度は、用いるアルカリ剤の種類によっても異なるが、通常、０．００１〜５重量％、好ましくは０．０１〜１重量％程度である。なお、石灰を用いて飽和沈殿状態で行うとｐＨ管理が容易となる。
密閉状態で浸漬処理することも可能であるが、適宜、液交換や爆気、あるいはまた攪拌することで、油脂分の除去と共に臭い成分の除去が効率的に行える。
浸漬温度は、陸生動物由来の原料の場合は、好ましくは０〜４０℃、さらに好ましくは５〜２０℃、熱変性温度が低い水生動物由来の原料の場合は、好ましくは０〜３０℃、さらに好ましくは０〜１０℃である。浸漬期間は４０℃の場合で好ましくは１〜３日、さらに好ましくは１〜２日であり、保持温度が４０℃から１０℃下がる毎に浸漬期間を２倍以上とすることが好ましい。
なお、脱脂・脱臭の浸漬処理する装置は、上記の温度範囲で温調できる付加設備を備えていることが望ましく、あるいはまた原料、浸漬液、装置を含む部屋全体を温調することが好ましい。
上記アルカリ浸漬された材料は、アルカリ溶液をデカント、ろ過、遠心分離などにより固液分離した後、必要に合わせ、適宜水洗など洗浄して、次の工程にかけられる。また、前処理を施した材料は、必要に合わせ、さらに細かく粉砕あるいは細断して、次の工程である抽出の効果を高めるのが望ましい。
【００２１】
本発明の前処理工程においては、水溶性蛋白質、油脂、臭い成分などの除去のための脱脂・脱臭工程、および／または皮から真皮層を取り出す皮剥離工程を含み、これらの工程は、抽出工程の前段に設けることが好ましいが、抽出工程と精製・濃縮工程との間に設けることも可能である。
また、プロセス上の制約、都合などで、工程の異なる複数の工場を用いて、前処理工程、抽出工程、精製・濃縮工程を行う場合もある。この場合、各工程間を材料の熱変性防止や運搬費用の削減などの観点から凍結固化、解凍など付加的な工程が追加されるが、本発明はこのような場合にも同様に使うことができる。すなわち、本発明は連続生産プロセスでもあるいは分散生産プロセスでもよい。
【００２２】
通常、動物蛋白質の残留油脂分や臭い成分（例えば残留アンモニア濃度）の許容限界値は、使われる製品用途により変わるが、調味料用途を除いた、実験、医療、化粧液、リンス、トリートメントや工業用途では、精製後に含まれる蛋白質の残留油脂分を０．１％以下（ドライ重量比）、残留アンモニア濃度を２ｐｐｍ以下（ドライ重量比）にすることが望まれる。
本発明は、上記前処理工程により、原料の素性にもよるが、残留油脂分を０．１％以下（ドライ重量比）にし、なおかつ残留アンモニア濃度を１ｐｐｍ以下（ドライ重量比）にすることが可能になる。
【００２３】
本発明の抽出方法では、酸可溶性コラーゲンおよび酸性プロテアーゼ可溶性コラーゲンを主な対象とする。ここで、酸性プロテアーゼ可溶性コラーゲンとは、酸溶液下でペプシンなどの蛋白分解酵素のプロテアーゼを添加してγ鎖の分子末端のテロペプチド部分を可溶化させて得られるゼラチンおよびコラーゲンペプタイドを含むものである。本発明では、特に区別が必要でない限り、総称して酸可溶性コラーゲンと呼ぶ。
【００２４】
酸溶液としては、酢酸、クエン酸、乳酸などの有機酸の他に、塩酸、硫酸などの無機酸が挙げられる。
酸性プロテアーゼとしては、動物胃粘膜由来のペプシンの他、工業用として市販されている酸性プロテアーゼ〔天野エンザイム（株）製商品名ニューラーゼ、キッコーマン（株）製商品名モルシンＦ、（株）ヤクルト製商品名プロテアーゼＹＰ−ＳＳなど〕が挙げられる。
【００２５】
本発明の抽出工程では、動物の体組織、抽出に用いる酸および溶媒として使用する水の３者間の重量濃度比、すなわち材料に対する酸溶液または酸および酸性プロテアーゼ溶液の重量比と酸の濃度を最適な範囲に設定して、効率よく抽出を行うことが好ましい。
本発明では、材料に対し好ましくは１．５倍〜１０倍の重量比、さらに好ましくは２〜８倍の重量比で、酸溶液濃度を好ましくは０．３Ｍ〜２Ｍ、さらに好ましくは０．５〜２Ｍとする。この範囲内において、γ鎖含量が高く純度が高い酸可溶性コラーゲンが得られ、従って精製・濃縮工程においてコラーゲン純度が低い従来の抽出方法では必要とした塩析、沈殿、遠心分離、塩除去のための透析または限外ろ過工程などの複雑なプロセスを採らずに、精密ろ過または限外ろ過などのみでよいという利点もある。
また、本発明の抽出を行った後に、塩析・透析などの従来プロセスで精製・濃縮した場合も利点がある。本発明の抽出条件では、比較的簡単にγ鎖含量の高いコラーゲンが可溶化、抽出でき、塩析〜透析を何回も繰り返し行って、所望の純度のコラーゲンに精製・濃縮する従来プロセスに供した場合にも、その繰り返し回数を少なくすることができ、従って従来のコラーゲンの精製プロセスにおける製造コストが安く、高純度で高品質になる。
重量比が１．５倍未満では、原料が酸溶液に充分に分散せず、酸可溶性コラーゲンの抽出がうまく進行しない。一方、重量比が１０倍を超えると、γ鎖が分解してα鎖に解離し易くなり、コラーゲン純度が落ちる。酸溶液濃度が０．３Ｍ未満であると酸濃度が薄く抽出が十分に行われない。一方、２Ｍを超えると、γ鎖の可溶化のみならず、γ鎖が分解してα鎖への解離が進行すると共に、酸溶液のｐＨが２．０以下になり易いので、抽出の後に行われる工程でｐＨを中性寄りに近づける調整が困難になる。
【００２６】
酸性プロテアーゼの添加量は、抽出に供する原料基質の乾燥重量１００ｇに対し、好ましくは０．１〜１０ｇ、さらに好ましくは０．８〜１．２ｇである。０．１ｇ未満であると酸性プロテアーゼが十分に作用せず、一方、１０ｇを超えると、テロペプチド切断反応のみならず、コラーゲンそのものの分解反応も平行して進行し、コラーゲン純度が落ちる。
抽出液として酸および酸性プロテアーゼ溶液を使用した場合の抽出条件も、上記酸溶液による抽出条件と同様である。
なお、本発明は、中性塩可溶性コラーゲンやアルカリ可溶性コラーゲンの場合にも同様に適用することができる。具体的には、中性塩可溶性コラーゲンの場合は、酸を中性塩に置き換え、またアルカリ可溶性コラーゲンの場合は酸をアルカリに置き換えればよい。
【００２７】
本発明の抽出において、陸生動物由来の原料では、抽出温度を好ましくは０〜４０℃、さらに好ましくは０〜３５℃に保持し、水生動物由来の原料では抽出温度を好ましくは０〜３０℃、さらに好ましくは０〜２５℃に保持する。上記温度範囲未満では抽出が進まない。一方、上記温度範囲を超えるとコラーゲンの熱変性が起こり易くなる。
抽出時間は、好ましくは１日〜３日、さらに好ましくは２〜３日である。１日未満では抽出が不十分であり、一方、３日を超えるとγ鎖のα鎖への解離が進み、その結果純度が低下する。
なお、抽出容器を含む抽出装置および酸溶液タンクなどの付帯装置は、上記の温度範囲で温調できる付加設備を備えていることが望ましく、あるいはまた原料、溶液、装置を含む部屋全体を温調することが好ましい。
なお、可溶化、抽出したコラーゲンは３本のポリペプチド鎖の分子鎖間が水素結合で結ばれている緩い結合なので、高い純度のコラーゲンを抽出したい場合は特に、抽出温度は前処理工程での保持温度よりも５℃以上下げて、抽出時の酸可溶性コラーゲンの熱変性によるα鎖への解離（ゼラチン化）を極力起こさせないようにするのが望ましい。材料を細かく粉砕あるいは細断して、抽出効果を高くする目的と両立することも可能となり、微細化、微粉化の副作用として懸念される、熱変性の恐れや分子量分布のバラツキ拡大の可能性を、低減、抑えることができる。
【００２８】
また、抽出日数の短縮を目的に、上記条件の抽出工程においては、抽出条件に高温加熱抽出を付加することも可能である。加熱温度は好ましくは５０℃〜１５０℃、さらに好ましくは８０〜１００℃、加熱時間は好ましくは１分〜１０分、さらに好ましくは１〜２分である。数分程度の時間のため、大きな熱変性も起こさせず、純度の低下も余り起こさせずに酸可溶性コラーゲンの抽出ができる。時間が１分未満では、可溶化、溶解が行われずに、残留する抽出残さが多くなり、一方、時間が１０分を超えると、熱変性が促進され、γ鎖のα鎖への解離、あるいは更に低分子蛋白質への分解が促進され、目的とするコラーゲンの抽出には適合しなくなる。
例えば、数Ｋｇ程度の水生動物由来の原料を用いて、酸溶液あるいは酸性プロテアーゼ溶液中にて保持温度０〜４０℃で、仮に３日間かけて浸漬して抽出処理する場合を想定すると、始めの１〜２日間は０〜４０℃で浸漬するが、この浸漬期間の間に粉砕原料内の組織が緩い結合になり、更なる微細化、微粉化が進み、また原料の単位重量当たりの酸溶液との接触する表面積が大きくなるので、残りの浸漬温度と時間を、例えば、１００℃で５分間程度のフラッシュ的な加熱を与えることで、蛋白質コラーゲンの可溶化、溶解が促進され、かつ変性が少なく行うことができる。
酸性プロテアーゼ溶液を用いて、供試原料から蛋白質コラーゲンを抽出する場合、プロテアーゼである蛋白分解酵素は一般に６０℃以上で死活し、６０℃以上に浸漬温度を上げると、プロテアーゼによる抽出効果は低下するが、短時間のフラッシュ加熱を付与するもので、抽出工程の後半に付加することと併せ、大きな影響は受けにくい。
なお、ビーカ試験レベルではあるが、数ｇ程度の原料を用いて、予めペースト状に０．１ｍｍオーダ以下に微細化した原料を、抽出処理に供する場合は、１００℃で数分程度の加熱浸漬を直接行っても、γ鎖を含有した蛋白質が可溶化、溶解し、抽出できることを確認している。これは、ペースト状に微細化することで、上記説明の抽出前半での作用、効果と類似の作用が予め与えられ、かつ原料の重量、容積が少ないので加熱付与が、酸溶液および、酸溶液中に分散する微細な原料に、均等にバラツキ少なく行われるためと理解できる。
【００２９】
また、本発明の抽出工程では可溶化しないで残留する不溶性固形物、いわゆる抽出残滓が少なからず発生する場合がある。このような不溶性固形物を少なくし、かつ可溶化が均一に行われるように、抽出に供する材料はミートチョッパーなどで予め粉砕しておくことが好ましい。粉砕物の最大長は、好ましくは１ｃｍ以下、さらに好ましくは２ｍｍ以下である。原料の粉砕、微細化の加工時に、加工熱を発生させない、あるいは供試原料に加工熱を伝達しにくくするのが望ましく、冷却しながら行うのが好ましい。発熱を与えないようにすれば、ペースト状の０．１ｍｍオーダ以下に粉砕、微細化しても良い。また、製造コストは上がるが、原料を予め凍結乾燥して微粉砕し、抽出処理に供することもできる。
本発明の酸溶液重量比と濃度の組合せの範囲内では、上記粉砕処理をしておけば、抽出残滓が少なく、かつ高収率、高純度で酸可溶性コラーゲンを得ることができる。
また、抽出操作において、原料を酸溶液または酸および酸性プロテアーゼ溶液に浸漬して、攪拌や振盪（しんとう）を伴う抽出容器を用いるのが望ましく、原料と酸溶液の混合物を攪拌や振盪しながら、粉砕物原料と溶液の分散、浸透を均等に行わせ、粉砕原料からの酸可溶性蛋白質の可溶化、溶解が、抽出容器内での場所的なムラ、バラツキが少なく均等に図られるように、抽出操作をすることが好ましい。ここで、攪拌としては、機械式攪拌のほかにエア攪拌などが挙げられ、比較的抽出処理容量が少ない場合は、抽出容器全体をシェイクして振盪する方法もとることができる。
【００３０】
なお、上記好ましい抽出条件では、抽出液中の酸可溶性コラーゲンの濃度が高く抽出液粘度が高くなるため、抽出液からの不溶性固形物である抽出残さのろ過や精製・濃縮工程において取り扱い性にやや劣るが、抽出に使用する酸溶液を従来実施例のように予め多くして溶液粘度を低くすると、得られるコラーゲンの純度が低下する。溶液粘度の高い抽出液の取り扱い性を改善するためには、抽出液からの抽出残さのろ過の段階や精製・濃縮工程において、必要に応じ中性に近い弱酸性溶液を添加すればよい。なお、精製・濃縮工程において弱酸性溶液を添加しても、精製・濃縮工程は抽出工程に比べて短時間であり、さらに添加する弱酸性溶液は粘性の適正化が目的であるので中性に近くてもよいため、コラーゲンのγ鎖からα鎖またはコラーゲンペプタイドへの解離は余り促進されない。また後の製品用途を考えると、酸可溶性コラーゲンはできるだけ中性寄りに近い弱酸性が望まれるので、本発明の上記製造方法は製品用途上も都合が良い。
抽出での不溶性固形物である抽出残さを、得られた抽出液から、次の工程の精製、濃縮に掛ける前に、予め除去するのが望ましく、固液分離の方法として通常用いられる、デカント、ろ過、減圧ろ過、遠心分離などが挙げられる。本発明では、限外ろ過方式を用いた精製、濃縮を行うので、限外ろ過膜の目詰まり防止の為にも、抽出残さを生じにくくさせる前処理工程、抽出工程での条件の設定と共に、発生した抽出残さのろ過、除去には、十分に注意するのが望ましい。
このように、本発明は、酸可溶性コラーゲンが高純度・高品質でかつ高収率で抽出、精製が容易にでき、高い生産性を得ることができる。
【００３１】
上記の抽出方法により得られた酸可溶性コラーゲン溶液から、コラーゲンを精製するために、本発明では限外ろ過処理を行なう。
抽出した酸可溶性コラーゲン溶液は、酸溶液とこれに可溶化、溶解したコラーゲンに加えて、少なからずゼラチンやコラーゲンペプタイドを含むので、上記限外ろ過に分画分子量を３０，０００〜１００，０００とする限外ろ過膜を用いると、分子量３０万のγ鎖を多く含むコラーゲンが透過されずに循環液側で濃縮でき、また透過液より分子量１０万のゼラチンおよび分子量１０万以下のコラーゲンペプタイドの混合物を得ることができる。また、分画分子量が５，０００〜３０，０００の限外ろ過膜を用いて限外ろ過すると、コラーゲンやゼラチンが透過されずに循環液側で濃縮でき、透過液よりコラーゲンペプタイドを得ることもできる。
【００３２】
本発明の限外ろ過工程においては、精製・濃縮工程が、抽出液を限外ろ過装置にかけ、限外ろ過膜を透過しない酸可溶性蛋白質を含む残留液を必要に応じて濃縮して循環液として循環させ再度限外ろ過するものであってもよい。このように残留液を循環させることにより、連続的に濃縮することが可能となるという効果が得られる。
【００３３】
循環液を循環させる場合、予め循環液中の酸可溶性蛋白質の濃度（循環液の粘度）を適正な上限以下に調整することが望ましい。適性な上限は、使用する限外ろ過膜が作動可能な透過抵抗の範囲、ろ過膜の目詰まりの起こりやすさ、使用する循環液の循環ポンプ（送液ポンプとも呼ぶ）の性能などを考慮して選択できる。
調整は、抽出液との混合手段や、下記循環液の総量制御のための弱酸性溶液添加手段を使用することもできる。なお、上記循環液中の酸可溶性蛋白質の濃度（循環液の粘度）の検知および／またはその調整は、間欠的に行なってもよく連続的に行なってもよい。
【００３４】
本発明の限外ろ過方式を採る精製・濃縮工程では、抽出液中の酸溶液が限外ろ過膜を透過して透過液として排出されるため、動物蛋白質を循環液側で濃縮して純度を上げる操作を継続すると循環液側の酸溶液が少なくなる。しかしながら、精製、濃縮の操作上、循環液は一定の総量を保持することが望ましく、また循環液のｐＨは、後の製品用途を考えると、できるだけ中性寄りに近い弱酸性が望まれる。
このため、本発明では、循環液の総量を検知する総量検知工程と、抽出液とは独立して、精製・濃縮工程の直前に行われた工程で用いた酸溶液よりｐＨが中性に近い弱酸性溶液を循環液に添加する弱酸性溶液添加工程を有し、循環液の総量を所定の範囲に維持、制御することが好ましい。上記総量検知および／または弱酸性溶液添加は、連続的に行なっても間欠的に行なってもよい。これらの工程を有することにより、循環液中での動物蛋白質の濃縮と同時に濃縮後の循環液のｐＨを弱酸性状態にすることができる。
総液量の検知手段として具体的にはレベル計が挙げられる。弱酸性溶液添加手段としては弱酸性溶液補充タンクが挙げられる。
【００３５】
また、本発明の精製・濃縮工程においては、循環液に含有される酸可溶性蛋白質の濃度、酸可溶性蛋白質の純度、循環液の粘度、および循環液の密度の群から選ばれた少なくとも１種を検知する工程とを有し、循環液の循環を制御し、目的とする純度となった時点で精製操作を終了することが好ましい。
酸可溶性蛋白質の濃度や純度の検知には、循環液に含有される酸可溶性蛋白質の濃度や純度を直接検知してもよく、また循環液の粘度や密度を検知して、循環液中に含有される酸可溶性蛋白質の純度を換算推定することもできる。循環液の循環の制御は、抽出液との混合操作、循環液の圧力（循環液の排出口、流入口の液圧差）の調整などにより行うことができる。上記要素の検知および循環制御は、連続的に行なっても間欠的に行なってもよい。なお、製品の製造ロット毎のデータと参照しながら精製・濃縮工程の制御精度、安定性を高めることは当然である。
酸可溶性蛋白質の濃度の検知手段としては、紫外線吸収測定機、示差屈折率検出器、光散乱検出器などが挙げられる。酸可溶性蛋白質の純度の検知手段としては、旋光度計（例えば堀場製作所製ＳＥＰＡ−２００）、円二色性測定装置などが挙げられる。循環液の粘度の検知手段としては、回転式粘度計、落球式粘度計などが挙げられる。循環液の密度の検知手段としては、振動式密度計、浮ひょう式比重計などが挙げられる。
【００３６】
なお、循環液中の酸溶液が弱酸性溶液に置換されるに伴い、循環液中の酸可溶性蛋白質も所望の純度レベルに精製・濃縮され、溶液の酸性度と純度とは互いに高い相関関係を示す。そのため、循環液のｐＨまたは電気伝導度が変化して一定になることを検知するためｐＨ計または電気伝導度計を用いることにより、動物蛋白質の純度の換算、推定ができる。上記換算、推定は、動物蛋白質の製造量がロット毎で同一の場合は特に、限外ろ過の開始からの時間変化に応じて得られた製品の純度データと参照することで行うことができる。
これら検知手段は、動物蛋白質の精製・濃縮装置にビルトインして、連続的に循環液の状態を検知、制御する装置の構成とすることが望ましいが、間欠的な循環液のサンプル抜き取り、計測による検知によっても、所望の目的に対して代用可能であれば、それでもかまわない。
【００３７】
限外ろ過を用いた精製では、限外ろ過膜の目詰まりが量産上の大きな問題であり、この防止のために、不溶性残さのろ過、精密ろ過による抽出液からの分離、除去が一般に行われるが、本発明では、目詰まりによる精製・濃縮の運転操作の停止を回避する方法として、複数台の限外ろ過装置を設けて、各々の限外ろ過の循環液を連通させる構成をとることができる。この構成により、コンパクトで安価で、かつ目詰まりのし難いプロセスとすることができる。
各々の限外ろ過膜の分画分子量は、目的とする動物蛋白質により選択することができ同一でもあるいは異なっていても良い。
複数台の限外ろ過装置を使用する場合、全ての装置が同時に目詰まりを起こす頻度は少ない。また、一台の装置が目詰まりを起こした場合は、適宜循環液を短絡して残りの装置で運転し、その間に目詰まりを除去して復帰させることができるため、運転停止の必要が少なく連続大量生産には好適なプロセスとなる。
なお、目詰まりの検知は、限外ろ過装置の循環液投入口および循環液出口の圧力差を、各々検知しながら行うことが好ましい。
【００３８】
また、限外ろ過膜の分画分子量が異なる限外ろ過を二段階で構成し、第一段には、分画分子量３０，０００〜１００，０００の限外ろ過膜、第二段には、分画分子量５，０００〜３０，０００の限外ろ過膜を備え、第一段の限外ろ過で得られる透過液を第二段の限外ろ過の循環液に投入することで、第一段の循環液よりγ鎖を含むコラーゲンを、第一段の透過液、すなわち第二段の循環液よりα鎖を主成分とするゼラチンを、第二段の透過液よりα鎖よりさらに低分子量のコラーゲンペプタイドを生産することができる。ここで、第一段の限外ろ過への抽出液の投入および／または第二段の限外ろ過への第一段の透過液の投入は、間欠的に行なってもよく連続的に行なってもよい。
なお、コラーゲンペプタイドを多量に作る場合には、ゼラチンを多く含有する第一段の透過液および／または第二段の循環液に、蛋白質分解酵素を添加して加水分解する方法が挙げられる。
【００３９】
精製、濃縮工程の保持温度は、抽出工程の保持温度と基本的に同じであり、陸生動物由来の原料では、好ましくは０〜４０℃、さらに好ましくは０〜３５℃に保持し、水生動物由来の原料では好ましくは０〜３０℃、さらに好ましくは０〜２５℃に保持する。また前処理工程での保持温度よりも５℃以上下げるのが好ましい。精製に供する抽出液や精製・濃縮装置は、上記の温度範囲で温調できる付加設備を備えていることが望ましく、あるいはまた抽出液、装置および精製した酸可溶性蛋白質溶液の保存漕、さらには精製後の後工程にて、必要に合わせて適宜使用される滅菌装置や乾燥装置、製品素材の保存庫および、これらを含む部屋全体を温調することが好ましい。
【００４０】
酸溶液または酸性プロテアーゼ溶液に溶解しない不溶性固形物が発生する場合があるが、本発明においては、上記不溶性固形物からは加水分解性のゼラチンおよびコラーゲンペプタイドを温水浸漬にて抽出することができる。
また、得られる動物蛋白質の製品市場の見地からは、コラーゲンの需要量は少ないが、ゼラチンやコラーゲンペプタイドの需要量は多いので、酸可溶性蛋白質の抽出において不溶性固形物が残留する程度に留め、積極的に残留した不溶性固形物を温水浸漬してゼラチンやコラーゲンペプタイドを多量に抽出、精製した方が生産上都合が良い場合もある。
【００４１】
あるいはまた、脱脂・脱臭を含む前処理を施した原料を、予め二つの群に分け、一つの群は酸溶液または酸および酸性プロテアーゼ溶液に浸漬して得る酸可溶性蛋白質の抽出、精製に供し、また他の一つの群は、上記酸抽出の不溶性残さと共に、温水に浸漬して抽出、精製を行い、加水分解性のゼラチンやコラーゲンペプタイドを得るように、生産配分し、なおかつ、抽出や精製・濃縮に用いる装置、設備は、両者で兼用、共用する製造プロセスをとることもできる。
【００４２】
なお、本発明では、温水浴に浸漬して加水分解により抽出したゼラチン、コラーゲンペプタイドを、酸溶液または酸および酸性プロテアーゼ溶液に浸漬して得られる酸可溶性蛋白質のコラーゲン、ゼラチン、コラーゲンペプタイドと区別するため、温水浸漬により得られる動物蛋白質を温水可溶性蛋白質と呼ぶ。
例えば、上記酸可溶性蛋白質の抽出液からデカント、ろ過、遠心分離などで単離した不溶性固形分、および／または脱脂・脱臭処理を含む前処理を施した原料を、必要に応じて適宜洗浄してから、温水浴に温水浸漬し、温水可溶性蛋白質を可溶化、溶解し抽出する。温水抽出の温度は、陸生動物由来の原料では好ましくは５０℃〜１００℃、さらに好ましくは８０〜９０℃、水生動物由来では好ましくは４０℃〜１００℃、さらに好ましくは８０〜９０℃である。温水抽出時間は、好ましくは１〜２０時間、さらに好ましくは２〜５時間である。
温水浸漬して得られる温水可溶性蛋白質の抽出液を、分画分子量５，０００〜３０，０００の限外ろ過膜を備えた限外ろ過装置に投入することにより、限外ろ過膜を透過しないゼラチンおよびろ過膜を透過するコラーゲンペプタイドをそれぞれ精製することができる。なお、上記と同様に、限外ろ過膜を透過しない温水可溶性蛋白質を含む残留液を濃縮して循環液として循環させ再度限外ろ過し、循環液よりゼラチンを、透過液よりコラーゲンペプタイドを得ることもできる。
【００４３】
また、温水抽出時にプロテアーゼを添加して加水分解し、積極的にコラーゲンペプタイドを得ることも可能である。プロテアーゼとしては、既述の酸性プロテアーゼのほか、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼも使用可能で、例えば天野エンザイム（株）製商品名プロテアーゼアマノ、合同酒精（株）製商品名ＧＯＬＤ−ＢＮＰ、新日本化学工業（株）製商品名スミチーム、大和化成（株）製商品名プロチン、同デスキン、同サモアーゼ、エイチビイアイ（株）製商品名オリエンターゼ、（株）ヤクルト製商品名パンチダーゼ、ノボザイムス（株）製商品名ＰＮＴ、同ノボザイム、ナガセケムテックス（株）製ビオプラーゼなどが挙げられる。プロテアーゼの添加量は、基質の乾燥重量１００ｇに対し、好ましくは０．１〜１０ｇ、さらに好ましくは０．８〜１．２ｇである。加水分解条件は、基質濃度は水溶液中に好ましくは０．１〜５０重量％、さらに好ましくは１〜３０重量％である。蛋白分解酵素プロテアーゼの活性を過剰にさせない目的と、また酵素は一般に６０℃以上で死活するので、上記のプロテアーゼを添加しない単純な温水抽出時の温度よりも低めに制御するのが望ましく、純度や分子量分布のバラツキなど品質を高める目的で、温度は好ましくは１０〜６０℃、さらに好ましくは２５〜５０℃であり、時間は好ましくは１〜５０時間、さらに好ましく２〜１０時間である。
【００４４】
上記のとおり、温水可溶性蛋白質の抽出は、酸可溶性蛋白質の抽出と比べると、抽出に用いる酸溶液の代わりに温水を用いて原料を浸漬し、可溶化、溶解するので、抽出容器や装置は新たに付設しても、あるいは、酸可溶性蛋白質の抽出容器、装置と兼用、共用してもよい。兼用、共用する場合は、抽出容器に供給する酸溶液の貯蔵タンクを温水供給タンクに切り替えて使用してもよいが、望ましくは酸溶液貯蔵タンクの他に温水供給タンクあるいは温水供給源を別に付設しておくのが望ましい。
【００４５】
また、温水浸漬して得られる抽出液の精製・濃縮に用いる限外ろ過装置は、装置仕様的に、上記の酸可溶性蛋白質のゼラチン、コラーゲンペプタイドの精製、濃縮に用いる限外ろ過膜、装置と、同一であるので、温水可溶性蛋白質を精製、濃縮する設備は新たに付設しても、あるいは、酸可溶性蛋白質の精製に供する限外ろ過装置と兼用、共用してもよい。これらは生産上、製造コスト上の都合で判断される。
【００４６】
このようにすることで、例えば、前処理を施した原料を二つの群に分け、一つの群の原料を、まず酸可溶性蛋白質の抽出、精製の製造に供し、用いた装置を水洗、洗浄してから、上記酸抽出液から分離、回収した不溶性残さおよび／または他の一つの群の原料を用いて、次に温水可溶性蛋白質の抽出、精製の製造に供するプロセスをとることができ、生産コスト上、都合がよい。なお、酸可溶性蛋白質の抽出液から固液分離して得られる不溶性残さは比較的少量なので、低温で回収、保存して、生産ロット毎の不溶性残さが蓄積した時点で、まとめて温水浸漬し、温水可溶性蛋白質の抽出と精製・濃縮を行うことも当然考えられる。
【００４７】
本発明の酸可溶性コラーゲン溶液の精製・濃縮装置の一例を図１に示す。図１において、精製・濃縮装置１０は、限外ろ過装置１に限外ろ過膜を備えており、循環液供給タンク２に投入された抽出液は、送液ポンプ５により限外ろ過装置１に流入し、絞り４による送液抵抗の付与により、限外ろ過された透過液１１が回収され、透過されないコラーゲン含有溶液は限外ろ過装置１を通過して適宜濃縮され、循環液１２となり循環液供給タンク２に循環される。循環液供給タンク２中の循環液の総量はレベル計６により検知され、必要に応じて弱酸性溶液添加タンク３より弱酸性溶液１３が循環液供給タンク２へ投入される。
【００４８】
コラーゲンの純度目安として、電気泳動法を用いた分子量分布の測定において、少なくとも、γ鎖の３０万分子量に相当する位置にバンドがあることがコラーゲンの判定基準として一般に用いられる。
また物性的には、旋光物質をＮａＤ線が通過する時の偏光面の回転角度（いわゆる比旋光度、理化年表、物理化学部、物１０２，１９８０年）が、コラーゲン溶液の場合は負方向に生じ、ゼラチン溶液よりも負方向の角度が大きくなることを利用して、コラーゲンの純度を分子量分布に加えて、比旋光度で評価する場合もある。本発明では、比旋光度［α］２０Ｄが−３６０°より負方向に大きい場合を、純度の高いコラーゲンの目安に考えている。
【００４９】
上記の精製、濃縮された酸可溶性蛋白質溶液および温水可溶性蛋白質溶液は、製品用途や保存の必要度などに合わせて、殺菌、除菌の工程を伴う場合もあり、また液状保存や乾燥保存などの形態を、適宜とる。また、細胞培養などの生化学バイオ分野や医薬カプセル用途では精製された動物蛋白質のアレルゲン除去も併せて行う場合がある。食用や医療用の用途では、衛生管理の上から、無菌室にて行う場合もある。
除菌、滅菌としては、０．２μｍ程度のフィルターろ過が一般であり、また殺菌を目的にした紫外線照射、γ線などの放射線照射の方法もある。
液状で保存する場合は、希有機酸や希無機酸で適宜希釈して、コラーゲン溶液の場合は、０．００５％〜１％程度の濃度状態で、通常、保存する。化粧品用途では、コラーゲン濃度０．１％程度で、グリセリンを添加してγ鎖間の会合防止と保湿性向上を図る場合がある。
ゼラチンは一般に乾燥保存されるが、コラーゲンの場合も長期保存が必要な場合は、品質劣化や菌増殖の恐れが少ない乾燥処理をとる場合がある。乾燥方法としては、凍結乾燥やスプレードライ法がある。スプレードライ法では、溶液濃度１０％程度の溶液から粉末化する方法も知られており、減圧蒸気下で行うなどの熱変性を避ける工夫を加えれば、凍結乾燥に比べ、生産効率が良い。また、溶液を押し出し法を利用して、多列のペレット状、ヌードル麺状に押出し、表面積を大きくして、効果的に乾燥する方法もとることができる。
【００５０】
最終製品の用途としては、動物蛋白質の幾つかの特性を利用して、医薬品、医療品、化粧品、リンス、トリートメント、健康食品、調味料、工業用途など多くの用途に使うことができる。例えば、医薬、医療用としては、消化管粘膜保護作用、骨形成促進作用、血圧上昇抑制作用、発育、免疫能向上作用などがあることが知られ、胃潰瘍出血予防、骨粗鬆症や高脂血症予防などを目的とした医薬品や健康食品に用いることができる。化粧品用途では、保湿作用を利用した皮膚の美容促進効果を目的に、また化粧品の一部のリンス、トリートメント用途では、頭皮、頭髪の保水、保湿性効果と併せ、高粘性を利用した起泡性効果を目的に使うことができる。
【００５１】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明の効果を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５２】
参考例１
原料としてサメ生皮６．０ｋｇ〔湿重量、水分８３％、油脂分０．４％、アンモニア８８ｐｐｍ（油脂分、アンモニアはドライ重量比）〕を、ｐＨ１１．５の石灰液１２ｋｇに５℃で保温して３週間アルカリ浸漬した。石灰液のｐＨはｐＨ計（堀場製作所（株）製カスタニーＬＡＢ−Ｆ２０  ＩＩ）により毎日計測し、適宜石灰または水を加えることにより１１．５に保ち、浸漬期間中は毎日液交換を行った。浸漬後、サメ皮を水洗した後、凍結させ、スライサー（田崎製作所（株）製ＡＣ−３００）にて表皮を剥いで、サメ皮の真皮層１．１１ｋｇ（水分含有量８６．３％）を得た。
【００５３】
参考例２
参考例１と同様の原料および石灰液を使用し、同様の温度、期間にて浸漬を行ない、サメ皮の真皮層１．０５ｋｇ（水分含有量８５．７％）ｋｇを得た。浸漬期間中はｐＨ調整のみで、参考例１と異なり密閉して液交換は行わなかった。
【００５４】
参考例３
参考例１と同様の原料を使用し、ｐＨ４．０の酢酸溶液を使用して、同様の温度、期間で浸漬を行ない、サメ皮の真皮層２．１２ｋｇを得た。ｐＨはｐＨ計（堀場製作所製（株）カスタニーＬＡＢ−Ｆ２０  ＩＩ）により計測し適宜水または酢酸を添加することによりｐＨ３．９〜４．１の範囲に保ち、浸漬期間中はｐＨ調整のみで、密閉して液交換は行わなかった。
【００５５】
参考例１〜３で得られた真皮層に含まれる残留油脂分、残留アンモニアを測定し、結果を表１に示した。
なお、残留油脂分量の測定は、熱塩酸処理後のヘキサン抽出物重量を測定することにより行った（上記非特許文献１参照）。残留アンモニア量の測定は、皮から過塩素酸により抽出して得られた溶液について、Ｒｕｓｓｅｌの方法により比色定量行った（菅原・副島著、「蛋白質の定量法」、学会出版センター、東京、１９７１年９月、ｐ．５１−５２参照）。
油脂分は、参考例１，２のアルカリ浸漬の方が参考例３の酸浸漬より減少効果が大きかった。特に、参考例１で液交換しながらアルカリ浸漬を行うと、２１日目で０．０９％まで減少した。アンモニアも、参考例１では２０．５ｐｐｍから２．９ｐｐｍまで減少した。同様の効果は参考例３の酸浸漬でも見られ（２０．５ｐｐｍから３．１ｐｐｍ）、長期浸漬が脱臭作用も持つことが示されたが、脱脂の面では効果が少かった。また浸漬処理後のサメ皮の乾燥重量では、アルカリ浸漬がいずれも９８％だったのに対し、酸浸漬では６５％と低下しており、浸漬液に既に溶解していることが判る。
なお、アルカリ漬けで爆気を追加して行うことは十分可能であり、この場合には、請求項の範囲の下限に近い日数で行えることを確認した。
【００５６】
【表１】
2004300109.tif 000002
【００５７】
実施例１
図２（Ａ）に例示する本発明の動物蛋白質の一例である製造工程を用い、コラーゲンを製造した。
すなわち、参考例１と同様の原料を使用してアルカリ浸漬後、サメ皮の表皮を剥いで、サメ皮の真皮層１．１１ｋｇを得た。得られた真皮層１．１１ｋｇ（湿重量）の水分含有量は８６．３％であり、油脂分は０．１％へ、アンモニアは２．２ｐｐｍまで減少していた（いずれもドライ重量比）。これにより、残留油脂分は目標（０．１％以下）を達成し、アンモニア残留分も目標（２ｐｐｍ以下）にほぼ近づいた。
得られた真皮層をミートチョッパー（日本キャリア工業製＃２２ＧＭ−Ｄ）にて最大２ｍｍ角程度に粉砕した。抽出は、３０Ｌ容積の攪拌式容器を用い、粉砕物１．１１ｋｇ（湿重量）に、０．５Ｍ酢酸水溶液８．８８ｋｇ（真皮層重量に対し８倍量）、ペプシン（ブタ胃粘膜由来、シグマ社製）１．５２ｇ（真皮層固形分乾燥重量に対して１％）を添加し、４℃で１２０回転／分、３日間攪拌して酸可溶性コラーゲンの抽出液９．９８ｋｇを得た。なお、得られた抽出液中の固形分乾燥重量は、抽出操作前の、アルカリ浸漬後の真皮層の乾燥重量を１００％としたとき９８％であり、抽出液固形分に含まれる残留油脂分は０．１％、アンモニアは１．４ｐｐｍであった（いずれもドライ重量比）。
得られた抽出液は粘性が高く不溶性残さの測定には不向きなので、１００ｇを採りだし、この抽出液へ、粘度が高いため透過抵抗を低くするために１ｍＭ酢酸５００ｇを加え、ろ紙〔アドバンテック東洋（株）製Ｎｏ．５Ａ、２枚重ね〕にて不溶性残さを減圧ろ過した。不溶性残さはほとんどトレースのみであった。ｐＨは２．６程度であった。
【００５８】
同じく抽出液１００ｇに１ｍＭ酢酸５００ｇを加えて、希釈した抽出液６００ｇについて、図１に示す精製・濃縮装置を使用して限外ろ過操作を行なった。精製・濃縮装置は、限外ろ過装置に（株）ミリポア製ペリコンＸＬバイオマックス−３０（分画分子量３０，０００）を膜モジュールとして備えており、循環液流速２５ｍＬ／分となるように送液ポンプおよび出口側に設けた絞り４を調節し、透過液速度２〜３ｍＬ／分で運転した。図示していないが、限外ろ過装置には、循環液のｐＨおよび電気伝導度を検知するｐＨメータ（例えば堀場製作所製（株）カスタニーＬＡＢ−Ｆ２０ＩＩ）および電気伝導度計（例えば堀場製作所製（株）カスタニーＬＡＢ−ＤＳ）が備えられている。
限外ろ過装置中のチューブなどに循環液が約１００ｍＬ存在するため、循環液供給タンク中の液量は当初約５００ｍＬになっていた。このため、循環液供給タンク中の液量は、常に４００〜５００ｍＬになるよう弱酸性溶液添加タンクより適宜１ｍＭ酢酸（ｐＨ４．０）を循環液に加えて限外ろ過を行ない、約６時間経過後、循環液のｐＨの上昇および塩濃度を示す電気伝導度（測定単位μＳ／ｃｍ２）の減少が見られなくなった。その後、約１２時間経過時まで限外ろ過を継続したが、循環液のｐＨおよび電気伝導度の変化が見られず、またコーラゲンの純度も所望のレベルに達したので、限外ろ過を終了した。限外ろ過を終了して、得られた循環液中の固形分乾燥重量は、限外ろ過操作前の抽出液中の固形分ドライ重量を１００％として、９９％であり、アンモニア濃度は１．４ｐｐｍから０．８ｐｐｍ（ドライ重量比）へと減少していた。
得られた循環液を−８０℃にて凍結させ、１０Ｐａ、２０℃の条件で１２時間凍結乾燥し、乾燥コラーゲン１０７ｇ（水分０．１％）を得た。収率は、アルカリ浸漬後の真皮層の乾燥重量基準で７０．０％であった。
【００５９】
本実施例で得られた乾燥コラーゲンを１ｍＭ酢酸にて再溶解して、電気泳動法で分子量分布を調べたところ、γ鎖を多く含んでいることを確認した。使用した機器は、アトー（株）製ラピダス・ミニスラブにより、アクリルアミドゲル濃度が７．５％のゲルで泳動した。
また得られた乾燥コラーゲンの比旋光度を測定した。乾燥コラーゲンを０．００５Ｍ酢酸で希釈した０．１％溶液を、４℃にて１２時間スターラ攪拌溶解し、１８，０００ｒｐｍ（重力加速度３６，０００ｇ）、４℃にて４０分程度遠心分離（日立製作所製高速冷却遠心機、２ＯＰＲ−５２０）にかけ、その上清液１０ｍＬについて、比旋光度を測定した（堀場製作所（株）製ＳＥＰＡ−２００、使用条件２０℃）。比旋光度の値は、コラーゲンの純度目安と考える［α］２０Ｄ−３６０°〜−４２０°の間にあった。
【００６０】
なお、１０分間当たり５℃変化させる時間−温度直線勾配での比旋光度の測定においても、５℃から３０℃にかけては、ほぼ−３７０°前後であったが、３０℃近辺から急激に低下し、３５℃では−１５０°前後の値を示した。４０℃より再び温度を低下させても、２０℃の比旋光度［α］２０Ｄは−３６０°には戻らず、−１５０°のままであり、強制的に６０℃温水浴加熱を与えたゼラチンの場合の測定値とおよそ変わらなくなった。既に熱変性によりゼラチンに変性したものと見られる。
また、得られた乾燥コラーゲンの残留油脂分、塩分、アンモニアの含量は、それぞれ０．１％、０．１％、０．５ｐｐｍであり、トリメチルアミンは検出されず、臭い官能評価の結果も、パネラーの７５％が無臭と判定した。
なお、塩分量の測定は強熱残分として得られた灰分として測定した（上記非特許文献１参照）。トリメチルアミン量の測定は、皮から過塩素酸により抽出して得られた溶液について、ピクラート法により比色定量行った（日本食品工業学会・食品分析法編集委員会編、「食品分析法」、光琳、東京、１９８２年１０月、ｐ．６７３−６８１参照）。
臭い官能評価は、パネラーとして２０人使用して下記評価基準で行なった。
○；無臭
△；わずかに臭気あり
×；有臭
【００６１】
実施例２
実施例１と同様に０．５Ｍ酢酸８倍量の酸溶液抽出条件にて得られた酸可溶性蛋白質の抽出液を用いて、精製、濃縮の方法として、実施例１の限外ろ過に代わり、塩析、透析でも行った。得られた抽出液１００ｇに、塩化ナトリウムおよび酢酸がそれぞれ１モル／Ｌおよび０．５モル／Ｌとなるよう加え、析出した沈殿物を１８，０００ｒｐｍ（重力加速度３６，０００ｇ）、４℃にて遠心分離にかけ、固液分離した。分離した沈殿物を１ｍＭ酢酸中に再溶解し、２０倍量の１ｍＭ酢酸中で透析を行い脱塩した。透析外液の塩化ナトリウム濃度が一定の値を示すまでに３時間を要し、その度に透析外液の交換を行い、透析外液の交換は４回行った。従って１回の透析操作に要した時間は１２時間である。透析を終了したコラーゲン溶液に、上記と同様に、再び塩化ナトリウムを１Ｍになるよう加え、塩析による沈殿、遠心分離による固形分の分離、固形分の再溶解、透析して脱塩する、塩析、透析の操作を５回繰り返して、精製を終了した。従って、塩析、透析の正味の所要時間は１２×５＝６０時間（約２．５日）であった。
本実施例の塩析、透析による方法においては、実施例１の限外ろ過と比べて、精製、濃縮の日数はかかるが、同様に、比較的純度の高いコラーゲン溶液が得られることを確認できた。なお、抽出処理投入前の真皮層の乾燥重量基準で、得られたコラーゲン収率は５０％程度であった。
また、従来公知例の酸溶液２０倍量の抽出条件で抽出液を得て、精製操作を塩析、透析で行った場合を、後述する比較例３に示しているが、これと比べると、本実施例の０．５Ｍ酢酸溶液８倍量の酸抽出条件で得られた抽出液を用いることで、塩析、透析の回数が少なくても、比較的純度の高いコラーゲン溶液が精製できることを示している。
【００６２】
実施例３
実施例１〜２と同様に、サメ生皮をアルカリ浸漬し、表皮を剥いで真皮層１．０５ｋｇを得た。真皮層の水分含有量は８７％であり、油脂分は０．１％、アンモニアは２．５ｐｐｍであった。
得られた真皮層をミートチョッパー（日本キャリア工業製＃２２ＧＭ−Ｄ）にて最大長２ｍｍ程度に粉砕した。容積３０Ｌの攪拌式容器を用いて、粉砕物１．０５ｋｇ（湿重量）に、０．５Ｍ酢酸水溶液２１ｋｇ（真皮層重量に対し２０倍量）、ペプシン（ブタ胃粘膜由来、シグマ社製）１．３７ｇ（真皮層固形分重量に対して１％）を添加し、４℃で１２０回転／分、３日間攪拌して抽出液２２．０ｋｇを得た。得られた抽出液中の固形分乾燥重量は、抽出操作前のアルカリ浸漬後の真皮層の乾燥重量を１００％としたとき９７％であり、油脂分は０．１％、アンモニアは１．６ｐｐｍであった（いずれもドライ重量比）。
実施例１と異なり、１ｍＭ酢酸で希釈しないで、直接、不溶性残さをろ過し、抽出液２２．０Ｋｇを得た。ｐＨは２．５程度であった。不溶性残さはトレースであった。限外ろ過は、実施例１と同じ装置、同じ条件で行なった。循環液のｐＨおよび電気伝導度の変化が見られなくなり、またコラーゲンの純度も所望のレベルに達するまでの時間は４０時間（実施例１の３倍以上）であった。これは、抽出操作において、０．５Ｍ酢酸水溶液を真皮層重量に対し２０倍量と実施例１に比べ多くして行った為に、抽出液中の分子量分布がバラツキ、即ちコラーゲン純度が低下し、従って循環液中のコラーゲン濃度も薄いため、所望のレベルに達するまでの限外ろ過操作による循環液側の精製、濃縮の時間が長くなったものと思われる。限外ろ過を終了して、得られた循環液中の固形分乾燥重量は、限外ろ過操作前の抽出液中の固形分ドライ重量を１００％として、７５％であり、アンモニア濃度は１．６ｐｐｍから０．９ｐｐｍ（ドライ重量比）へと減少していた。
【００６３】
得られた循環液を実施例１と同様に凍結乾燥し、乾燥コラーゲン０．３７２ｇ（水分０．１％）を得た。アルカリ浸漬後の真皮層の乾燥重量基準での収率は６０％であった。
得られた乾燥コラーゲンを１ｍＭ酢酸にて再溶解して、電気泳動法で分子量分布を調べたところ、α鎖、β鎖、γ鎖を確認したが、実施例１で得られたコラーゲンに比べるとα鎖のバンドは強いのに対し、γ鎖のバンドは弱かった。また、比旋光度は［α］２０Ｄ−２８０であり、コラーゲン純度の低いものであった。この純度が低かった理由として、抽出工程においてγ鎖の可溶化のみならず、γ鎖が分解され低分子のα鎖になったためと考えられる。γ鎖の分解が促進された理由としては、抽出に供した酸溶液の重量がサメ真皮層に対し２０倍重量とかなり大きいため、酵素反応や加水分解が進みやすい環境であったためと考えられる。
【００６４】
比較例１
比較のため、図２（Ｂ）に例示する従来プロセスの一例によるサメ皮コラーゲンの製造方法を示す。
まず、サメ皮の表皮を剥離して、膨潤処理を施して、コラーゲンが可溶化し易いように含有水分を高めた真皮層４ｋｇ（水分９５．２６％）を使用した。
この真皮層４ｋｇ（乾燥重量１８９．６ｇ）を上記と同様にミートチョッパーにて粉砕し、脱脂を目的に界面活性剤（Ｂａｙｅｒ社製、ＰＲＯＤＵＣＴ  Ａ）の１％水溶液を加え、４℃で１２時間撹拌した。脱脂終了後、８，０００回転（重力加速度１３，０００ｇ）、３０分の遠心分離により真皮層を沈殿させ、上清に含まれる界面活性剤溶液を除いた。さらに回収した真皮層に、約２重量倍量（約８ｋｇ）の水を加え撹拌後に上記と同条件で遠心分離して、水洗を行った。水洗後の真皮層重量は３．９６ｋｇ（水分９３．４６％、乾燥重量２５８．９ｇ）であった。原料とした真皮層に対する回収率は、乾燥重量基準では１３７％となり、見掛け上増える結果となった。これは、脱脂後の水洗が不充分で界面活性剤を完全には除去できなかったためと考えられる。
【００６５】
脱脂水洗操作後の真皮層３．９６ｋｇに、０．５Ｍ酢酸水溶液７．９３ｋｇ（真皮層重量に対し２倍量）、さらにペプシン（ブタ胃粘膜由来、シグマ社製）１．９ｇ（真皮層固形分重量の１％）を添加し、４℃で１２０回転／分、３日間攪拌してコラーゲンの可溶化および抽出を行った。この後、不溶性残さを８，０００回転（重力加速度１３，０００ｇ）、３０分の遠心分離により除き、抽出液１０．２ｋｇを得た。不溶性残さはトレースであった。
【００６６】
得られた抽出液１０．２ｋｇへ塩化ナトリウムおよび酢酸がそれぞれ１モル／Ｌおよび０．５モル／Ｌとなるよう加え、析出した沈殿物を８，０００回転（重力加速度１３，０００ｇ）、３０分の遠心分離にかけて分離した。分離した沈殿物を１ｍＭ酢酸中に再溶解し、２０倍量の１ｍＭ酢酸中で透析を行い脱塩した。透析外液の塩化ナトリウム濃度が一定の値を示すまでに３時間を要し、その度に透析外液の交換を行い、透析外液の交換は４回行った。従って１回の透析操作に要した時間は１２時間である。透析を終了したコラーゲン溶液に、上記と同様に、再び塩化ナトリウムを１Ｍになるよう加え、塩析による沈殿、遠心分離による固形分の分離、固形分の再溶解、透析して脱塩する、塩析、透析の操作を５回繰り返して、精製を終了した。従って、塩析、透析の正味の所要時間は１２×５＝６０時間であった。
その後、実施例１と同様に凍結乾燥し、乾燥コラーゲン１０８．８ｇ（水分１２．１２％）を得た。アルカリ浸漬後の真皮層の乾燥重量基準で収率は５０．４２％であったが、混在している塩分および油分を除去すると収率は４９．１８％であった。残留油脂分、塩分、アンモニアの濃度は、それぞれ０．４７％、２．０％、３ｐｐｍと不純物含量が高く、また０．１％溶液（０．００５Ｍ酢酸中）の比旋光度も［α］２０Ｄ−２５６°と低くコラーゲン純度も低かった。
【００６７】
比較例２
前処理および抽出処理は実施例３２と同様に行ない、得られた抽出液１００ｇを比較例１と同様に塩析、透析を行い脱塩した。透析は、４回の外液交換を行いながら１２時間を要して行った。さらに塩析、透析の操作を５回繰り返して、精製を終了した。
その後、実施例１と同様に凍結乾燥し、乾燥コラーゲン０．２９９ｇ（水分０．１％）を得た。アルカリ浸漬後のサメ皮真皮層の乾燥重量基準で収率は４８．２０％であった。残留油脂分、塩分、アンモニアの濃度は、それぞれ０．１％、２．０％、１．５ｐｐｍであり、１％溶液（０．００５Ｍ酢酸中）の比旋光度も［α］２０Ｄ−２５０°であった。
【００６８】
比較例３
実施例３と同様に処理を行ない、得られた抽出液に対し比較例１と同様に塩析・透析により精製操作を行ったが、比較例１や比較例２に対して２倍となる１０回行なった。
得られた乾燥コラーゲンを１ｍＭ酢酸にて再溶解して、電気泳動法で分子量分布を調べたところ、α鎖、β鎖、γ鎖を確認した。比較例２で得られたコラーゲンよりもさらにα鎖のバンドは弱く、実施例１と同程度にγ鎖のバンドが強かった。
得られた乾燥コラーゲンの比旋光度は［α］２０Ｄ−３６０°となり、純度の高いコラーゲンの所望のレベルに入った。このとき、残留油脂分、塩分、アンモニアの濃度も、それぞれ０．１％、０．１％、０．５ｐｐｍと低下していたが、収率は３０．０％に低下していた。
【００６９】
実施例３で得られたコラーゲンは、比較例１に比べれば残留油脂分が低い点では優れるが、これは前処理工程を界面活性剤による脱脂ではなくアルカリ浸漬で行った効果の寄与が大きい。実施例３２では精製・濃縮工程で塩析、透析に代わり限外ろ過を用いているため、元々塩分が少なく残留塩分を減らすことができたが、比旋光度で示されるコラーゲン純度や、電気泳動で示されるγ鎖の比率は、同じ限外ろ過法で精製を行った実施例１よりも低かった。これは抽出工程における酸溶液の重量比が２０倍と過剰であったためと考えられる。また、比較例２，３で精製を塩析、透析で行った場合には、分子量分布のγ鎖のバンドや、比旋光度を純度の高いコラーゲンの所望のレベルにするためには、１０回以上の塩析、透析を必要とした。
実施例１〜３および比較例１〜３により得られたコラーゲンの諸性質を、表２に示した。
【００７０】
実施例４
サメ生皮を原料に、表皮を剥離して真皮層を得るための温度および時間を検討した。生皮２００ｇ（湿重量、水分含量８３％）を、表３に示す温度に設定した温水約５Ｌに投じ、表３に示す時間で浸漬した。浸漬後は手指および包丁を用いて手作業で表皮を剥離し真皮層を回収し、得られた真皮層を、１１０℃で乾燥させた後の乾燥重量を測定した。
３０℃×１分以下の浸漬では、浸漬前の性状との差異が見られなかった。浸漬の温度および時間の上昇に伴い、真皮層の回収率が向上した。特に、４０℃×５分、または５０℃×３分の浸漬で、手指にて多くの部分を剥離可能であった。６０℃×５分の浸漬を超えると、コラーゲンがゼラチンへ変性し、温水への溶解が起こるため、真皮層の回収率が低下した。
【００７１】
実施例５
実施例４で用いたものと同じサメ生皮を原料に、アルカリ処理工程における浸漬時間および温度の影響を検討した。生皮２００ｇ（湿重量、水分含量８３％）を、１Ｌの石灰の飽和溶液（ｐＨ１１．５）中で、表４に示す温度および日数で浸漬し、表皮を除去した真皮層に含まれる油脂分、アンモニア含量を測定した。
その結果を表４に示した。
５℃で浸漬を行った場合、１４日後に、抽出・精製前の工程で所望とするレベルである油脂分０．２％以下、アンモニア１０ｐｐｍ以下に達し、さらに２１日後に油脂分０．０９％、アンモニア２．９ｐｐｍまで減少した。浸漬の温度を変えた場合、所望のレベルに達するまでに、２０℃では８日、３０℃では２日、４０℃では１日であった。高温であれば短期間で油脂分、アンモニアを除去することができるが、コラーゲンの熱変性を起こさないようにするためには、できるだけ低温で行うことが望ましい。
【００７２】
実施例６
参考例１で得たサメ皮真皮層を原料として、抽出日数の短縮を目的に、高温での加熱抽出を行った。
ビーカ試験レベルではミンチ粉砕の更に細かいペースト状にした原料を用いた場合は、真皮層１ｇ（湿重量、水分含量は８６．３％）に、９ｍＬの０．５モル／Ｌの酢酸水溶液を加え、１００℃で１分間、５分間、１０分間、２０分間加熱し、その後実施例１と同様に抽出、精製し、電気泳動法で分子量分布を調べた。但し少ない材料なので、抽出の浸漬処理には、振盪式のマルチシェーカ（東京理科器械製ＭＭＳ）を用いた。１〜５分の加熱では、実施例１とほぼ同比率でγ鎖が見られたが、１０分間加熱ではγ鎖のバンドが薄くなり、一方２０分間加熱すると電気泳動のバンド測定では、分子量５０，０００以下が多く、γ鎖は全く見られず、分子量１０万のα鎖のバンドもほとんど見られなかった。このことから、１００℃×１〜１０分程度の加熱に抑えれば、γ鎖の解離やゼラチンへの変性が許容できる範囲にあることが判る。
さらに、参考例１で得たサメ皮真皮層１．０ｋｇを原料とした試験では、実施例１に示した方法と同様に、０．５Ｍ酢酸水溶液８．０ｋｇおよびペプシン１．３７ｇを加え、４℃で１２０回転／分の撹拌速度で抽出を行った。ただし、抽出の日数は半分の１．５日に留め、この後、１００℃で５分間の短時間加熱抽出を付加した。その後も実施例１と同様に、残さのろ過分別、限外ろ過による精製、凍結乾燥を行ったところ、乾燥コラーゲン９６ｇ（水分０．１％）を得た。得られたコラーゲンは、実施例１で得られたコラーゲンとほぼ同量のγ鎖を含んでおり、比旋光度、残留油脂分、残留アンモニアともに、純度の高いコラーゲンの所望のレベルに達していた。本短時間加熱工程を付加することで、実施例１で３日要した抽出工程が、半分で済んだ。
【００７３】
【表２】
2004300109.tif 000003
【００７４】
＊１：膨潤済・表皮なし真皮の乾燥重量基準
＊２：０．１％溶液（５ｍＭ酢酸中）
【００７５】
【表３】
2004300109.tif 000004
【００７６】
【表４】
2004300109.tif 000005
【００７７】
【発明の効果】
本発明により、品質、純度が高いコラーゲン、ゼラチン、コラーゲンペプタイドなどの動物蛋白質を、動物の体組織から低コストで収率が高く、かつ多量に分離回収できる製造方法と製造装置を提供することができる。また、本発明により得られる動物蛋白質は、医薬品、化粧液、リンス、トリートメント、工業用途、健康食品、調味料などに好適な材料として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の精製・濃縮装置の一例の構成概略図である。
【図２】（Ａ）は本発明の動物蛋白質の製造方法の一例を示す全体工程図の例示であり、（Ｂ）は従来プロセスの動物蛋白質の製造方法の一例を示す全体工程図の例示である。
【符号の説明】
１：限外ろ過装置
２：循環液供給タンク
３：弱酸性液補充タンク
４：絞り
５：送液ポンプ
６：レベル計
１０：精製・濃縮装置
１１：透過液の流れ
１２：循環液の流れ
１３：弱酸性液の流れ
【図１】
2004300109.tif 000006
【図２】
2004300109.tif 000007