(57)【要約】【課題】　アンジオテンシン変換酵素阻害活性及び動脈弛緩活性を有し、持続性のある血圧降下作用を示し、加齢した人に対しても同様の血圧降下作用を示し、さらには血中コレステロール降下作用を示す新規ペプチド及びそれを有効成分とする血圧降下剤や血中コレステロール降下剤を提供すること。【解決手段】　Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒで示される新規生理活性ペプチドで、かかるペプチドは、ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼで加水分解することより得られ、ナタネ由来の蛋白質としては、ナタネの種子から油脂を除去した油粕が好ましく、プロテアーゼとしてはズブチリシンが好ましく用いられる。また、かかるペプチドは、それを有効成分とする血圧降下剤や血中コレステロール降下剤として用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
　Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒで示されることを特徴とする新規生理活性ペプチド。
【請求項２】
　ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼで加水分解して得られたことを特徴とする請求項１記載の新規生理活性ペプチド。
【請求項３】
　ナタネ由来の蛋白質がナタネ種子から油脂を除去した油粕であることを特徴とする請求項２記載の新規生理活性ペプチド。
【請求項４】
　プロテアーゼがズブチリシンであることを特徴とする請求項２記載の新規生理活性ペプチド。
【請求項５】
　請求項１〜４いずれか記載の新規生理活性ペプチドを有効成分とする血圧降下剤。
【請求項６】
　請求項１〜４いずれか記載の新規生理活性ペプチドを有効成分とする血中コレステロール降下剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、アンジオテンシン変換酵素阻害作用や動脈弛緩作用をもち、持続性がある血圧降下作用を示し、しかも加齢した人に対しても同様に有効な血圧降下作用を示し、さらには血中コレステロール降下作用を持つ新規生理活性ペプチド及びかかるペプチドを有効成分とする血圧降下剤とコレステロール降下剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
　従来より、食品中に含まれる蛋白質は栄養効果ばかりでなく種々の生理活性を有することが知られている。
　例えば血圧を降下する活性を示すものとして、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドや動脈血管を弛緩させるペプチドが知られている。
　アンジオテンシン変換酵素は、主として肺や血管内皮細胞、腎近位尿細管に存在し、アンジオテンシンＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に作用して、アンジオテンシンＩのＣ末端よりジペプチド（Ｈｉｓ９−Ｌｅｕ１０）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有するアンジオテンシンＩＩを生成させる酵素である。また、この酵素は生体内降圧物質であるブラジキニンを破壊し不活化する作用も併有し、昇圧系に強力に関与している。したがって、かかるアンジオテンシン変換酵素の活性を阻害すれば、血圧が降下して、臨床的には高血圧症の予防、治療に有効であると考えられている。
　かかるアンジオテンシン変換酵素阻害物質としてはプロリン誘導体であるカプトプリルが合成されて、降圧活性が確認されて以来、種々のアンジオテンシン変換酵素阻害物質が合成され、近年天然物からの取得も盛んに試みられているところである。
【０００３】
　例えば、γ-ゼインをサーモリシンで加水分解してＣ末端のアミノ酸配列がＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏである重合度が３〜５のペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤（例えば、特許文献１参照。）が知られている。また、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するジペプチドが知られ、かかるペプチドの１つにＩｌｅ−Ｔｙｒ（ＩＣ５０＝３．７μＭ）が記載されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
　また、動脈弛緩ペプチドとして、例えば、Ｈ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−ＯＨで示される新規ペプチド（例えば、特許文献２参照。）が、また、Ｈ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−ＯＨで示される新規ペプチドが開示され、これらのペプチドもアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有することが記載されている（例えば、特許文献３参照。）。
【０００５】
　一方、高血圧とならび高血中コレステロール血症もまた虚血性心疾患の原因となり、その予防及び治療に種々の対策が提案されている。虚心性心疾患の診断に対しては、これまで血中コレステロールが注目されてきたが、単に血中コレステロール値だけではなく、ＶＬＤＬ（超低密度リポ蛋白）コレステロール、ＬＤＬ（低密度リポ蛋白）コレステロールの降下を含めて問題にする考え方もあり、（ＬＤＬコレステロール／ＨＤＬ（高密度リポ蛋白）コレステロール）値により虚心性心疾患の発生危険度を評価する方法が注目されている。また、中性脂肪についてもＶＬＤＬと同様その濃度が注目されており、虚心性心疾患の治療にあたっては、これらの濃度を降下させる方策がとられている。
　このような中、大豆、カゼイン、卵白、食肉等の蛋白質をペプシン等の酵素で分解して得られるペプチドが血中コレステロール降下作用を持つことが明らかになり、食品由来のペプチドについても報告されている。
　例えば、上記蛋白質を酵素で加水分解して得た分子量２００乃至１５００のペプチドが血中コレステロール降下作用を持つことが示されている（例えば、特許文献４参照。）。
【０００６】
【特許文献１】特開平２−３６１２７号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（米国）（１９８０年），２５５（２）４０１
【特許文献２】特開平５−３３１１９１号公報
【特許文献３】特開平５−３３１１９２号公報
【特許文献４】特開昭６０−１１４２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
　しかしながら、上記特許文献１に開示のペプチドや非特許文献１に記載のＩｌｅ−Ｔｙｒで示されるペプチドはアンジオテンシン変換酵素阻害活性はあるものの、人の高血圧のモデル実験動物である高血圧自然発症ラット（以下ＳＨＲと称する）による経口投与実験においては、その血圧降下作用がまだまだ弱く、また血圧降下作用の持続性がなく投与後３時間以内で元の血圧にもどってしまうことがわかった。また上記特許文献２、３に開示のペプチドについてもアンジオテンシン変換酵素阻害活性や動脈弛緩活性を示すものの、経口投与実験においては、その血圧降下作用が弱く、若齢のＳＨＲに対しては有効であるが、老齢のＳＨＲに対しては血圧降下作用が減弱することもわかった。一方、血中コレステロール降下作用については、上記特許文献４に開示の酵素分解物では血中コレステロール降下作用が不十分で、また、ＶＬＤＬの降下の降下は期待できず、更に中性脂肪等の降下は見られなかった。
　すなわち、経口投与においても有意な血圧降下作用を示し、更に従来のペプチドよりも持続的な作用を示し、また加齢した人に対しても血圧降下作用を有し、かつ血中コレステロール降下作用を併せもつようなマルチファンクションのペプチドが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
　本発明者等は、かかる課題を解決すべく天然物質で血圧降下作用が持続し、血中コレステロール降下作用を示す物質を鋭意探索した結果、ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼで加水分解した組成物中にかかる活性を有する物質の存在をつきとめ、該物質がＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒで示されるペプチドであることを見出し本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００９】
　本発明の新規ペプチドは、アンジオテンシン変換酵素阻害活性及び動脈弛緩活性を有し、しかも持続的血圧降下作用を示し、加齢した人に対しても同様の血圧降下作用を示すとともに、血中コレステロール降下作用をも示すペプチドである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
　本発明のペプチドはＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒの配列で示されるもので、文献未載の新規なペプチドである。ここでいうＡｒｇはアルギニン、Ｉｌｅはイソロイシン、Ｔｙｒはチロシンを意味しかかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。
　本発明のペプチドを製造するにあたっては、特に制限されるものではないが、ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼによって加水分解したり、ペプチド合成の常套手段を適用して合成することによって製造することもでき、これらの方法について説明する。尚、安価な原料を使用できる点では前者の方が好ましい。
【００１１】
　まず、ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼによって加水分解する方法について説明をする。
　かかる蛋白質として、ナタネ種子、その他のナタネの構成成分、ナタネの組織培養物等を直接用いてもよいが、ナタネ種子から油脂を除去した油粕を用いることが加水分解や精製が容易で、しかも食品としては未利用な資源である油粕を有効利用できる点で好ましい。
　油脂を除去する方法は特に制限されるものではないが、通常溶剤による抽出、圧搾等により油脂が除去される。
【００１２】
　プロテアーゼとしてはズブチリシン、トリプシン、キモトリプシン、パンクレアチン、サーモリシン、ペプシン、パパイン、アルカリプロテアーゼ等が挙げられるがズブチリシン、ペプシンが好ましく、中でもズブチリシンが好ましい。
【００１３】
　かかる油粕をプロテアーゼで加水分解するにあたり、油粕を水に分散させてそのまま加水分解を行っても良いが、１Ｍ程度の塩化ナトリウム水溶液で蛋白質を抽出後、必要に応じて透析、膜処理、カラムクロマトグラフィー等によりグリオキシレート等の低分子物質を除く前処理を行うのが、加水分解物からペプチドを精製するのが容易となり好ましい。
　加水分解を行うにあたっては、油粕の分散液好ましくは、上記前処理をした抽出蛋白質の水溶液を蛋白質濃度が０．１〜２０重量％となるように調整し、プロテアーゼを蛋白質に対して０．１〜１重量％程度添加して行うのが好ましい。かかる添加量が０．１重量％未満では加水分解が十分行われず、１重量％を超えても収率の向上は望めない。このときプロテアーゼは粉末のまま添加してもよいが、水溶液として添加してもよい。プロテアーゼを添加した後、温度１０〜８５℃程度、好ましくは３０〜６０℃で０．１〜４８時間、好ましくは１〜１０時間加水分解を行う。この時のｐＨも特に制限されず１〜９程度で実施されるが、ズブチリシンの場合は６〜８程度、ペプシンの場合は１〜３で実施するのが好ましい。加水分解開始後は蛋白質の分解率を目安にして反応を行った後、分解液に塩酸等の酸水溶液を添加したり、あるいは煮沸することにより加水分解を停止させる。
【００１４】
　上記の加水分解により得られた加水分解液は、本発明の新規ペプチドやその他のペプチドを含む混合物であり、これから本発明のペプチドを精製、単離することによって目的物を得る。但し、実用にあたっては混合物をそのまま用いることも可能である。
　該加水分解液から本発明のペプチドを精製するにあたっては、加水分解液をそのままあるいは、加水分解液を遠心分離等の公知の操作で濾過し、その後抽出、濃縮、乾固などを行った後、種々の吸着剤に対する吸着親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あるいは溶解度の差、２種の混ざり合わない液相間における分配の差、分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液からの析出性あるいは析出速度の差などを利用する精製手段を適宜選択して本発明のペプチドを精製するのが好ましく、これらの精製手段は必要に応じて、単独あるいは任意の順序に組合せ、また反覆して適用される。
【００１５】
　次に、本発明のペプチドをペプチド合成法で製造する方法について説明する。
　かかる方法は液相法または固相法で行われ、いずれの場合でもペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とを２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ　ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＨＢＴＵ）等の活性エステルを用いた方法またはカルボジイミドを用いた方法等で縮合させる。
【００１６】
　この縮合において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護基としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。
【００１７】
　縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断し、通常の方法に従い精製される。かかる精製については例えば逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法が挙げられる。
　合成したペプチドの分析は、エドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、ＬＣ−ＭＳ等の方法で行われる。
【００１８】
　かくして得られた本発明の新規なペプチドは、血圧降下作用と血中コレステロール降下作用を併せもつ医薬品、機能性食品等として有用であり、以下医薬品として用いる場合について説明する。
　本発明のペプチドの投与経路としては、経口投与、血管内投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。本発明のペプチドの人に対する投与量は、投与方法、患者の症状・年令等により一概に言えないが、通常は１回０.１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇを１日当たり１〜３回とすることが好ましい。本発明のペプチドは通常製剤の形で投与される。製剤に用いられる担体や助剤としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００１９】
　具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール等が挙げられる。
【００２０】
　剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００２１】
　これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１重量％以上、好ましくは０．５〜７０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【実施例】
【００２２】
　次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。なお、試験群はコントロール群に対して有意水準１％で有意な場合はＰ＜０．０１、有意水準５％で有意な場合はＰ＜０．０５と表記した。
実施例１
〔ペプチドの製造及び精製〕
ナタネ種子をヘキサンで抽出して油脂を除去した油粕１０ｇを１Ｍの塩化ナトリウム水溶液１００ｍｌに加えた水分散液を充分撹拌し、遠心分離して固形分を沈殿せしめた後、上澄み液を水に対して充分透析後、凍結乾燥して粉末状の蛋白質を得た。次いで得られた蛋白質１ｇを２重量％濃度となるように水に溶解させ、それにズブチリシン（シグマ社製、バシラス　リチェニフォルミス由来、タイプVIII）を、０．０１ｇ添加してｐＨ７．５、３７℃の条件で５時間加水分解を行った。加水分解後１０分間煮沸して加水分解を停止させた。
　上記で得られた加水分解液を冷却後、遠心分離して水不溶分を濃縮し、高速液体クロマトグラフィーで精製した。かかる高速液体クロマトグラフィーにおいては、まずＯＤＳ−カラムで阻害活性のあるフラクションを分取して、そのフラクションを更にＣＮ、カラムで精製し、更に５ＰＥ−ＭＳ、５ＮＰＥのカラムで阻害活性フラクションを順次精製し、単一のペプチド０．９６ｍｇを得た。
　かかるペプチドの成分を気相プロテインシーケンサー（アプライド　バイオシステムズ社製「４９２型」を用いる自動エドマン分解法を適用してアミノ酸配列を分析し、下記で示される配列であることが確認された。
　Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ
【００２３】
〔ペプチドの化学合成〕
　市販のＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）樹脂（置換率０．５ｍｅｑ／ｇ）０．６ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の反応槽に分取し、以下のように新規ペプチドの合成を行った。
　まず、上記の樹脂を反応容器に入れて、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｉｌｅと、活性化剤として１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを１０ｍｌの０．４Ｍ　Ｎ−メチルモルフォリンを含むジメチルフォルムアミドに溶解したものを反応槽に加え、室温にて２０分撹拌反応させた。
　得られた樹脂を２０容量％ピペリジンを含むジメチルフォルムアミド２０ｍｌ中で、Ｆｍｏｃ基を除去し、ついで上記のＦｍｏｃ−Ｉｌｅをカップリングさせた方法と同様にＣ末端から順次Ｆｍｏｃ−アミノ酸をカップルさせて、Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）樹脂を得た。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（８２容量％トリフルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％エタンジチオール、２容量％エチルメチルスルフィド、３容量％フェノール、５容量％水の混合液）中で室温にて４時間撹拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。
【００２４】
　ここに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペプチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄して粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　５Ｃ１８−ＡＲII、２０×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒの配列を有するペプチドを得た。尚、本品をプロテインシーケンサー（アプライド　バイオシステムズ社製「４９２型」）により分析して、上記の配列であることを確認した。
【００２５】
（アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定）
　上記のペプチドのアンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定を、Ｃｈｅｕｎｇ　Ｃｕｓｈｍａｎの方法の山本らの改良法〔日本胸部疾患会誌，（１８），１２９７（１９８０）〕に準じて以下の要領で行った。
　酵素基質；Ｂｚ（ベンジル）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
　酵　素　；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製）
　最終濃度；１００ｍＭ硼酸、塩化ナトリウム４００ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．３）、上記酵素基質５ｍＭ、酵素３μＵ
【００２６】
　上記の最終濃度になるように緩衝液、酵素基質、酵素を混合し、水で全体を２００μｌとした後、３７℃で３０分間反応を行った。反応は１Ｎ−塩酸２００μｌを用いて終了させた。反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れＶｏｒｔｅｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。酢酸エチル層から１．０ｍｌをとり出して、酢酸エチルを留去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し、抽出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（ＯＤ２２８）を測定した。
　阻害率はペプチドなしで反応したときのＯＤ２２８を１００％とし、反応時間０分のときのＯＤ２２８を０％として求めた。阻害率５０％の時のペプチドの濃度ＩＣ５０は２８μＭであった。
【００２７】
（血圧降下作用の測定）
（１）試験群
　２０週齢のＳＨＲ（ｎ＝４）および３０週齢のＳＨＲ（ｎ＝４）に上記のペプチドを７．５ｍｇ／ｋｇの割合でゾンデ針を使用して経口投与し、尾動脈部の血圧をｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法にて経時的に測定し、収縮期血圧における降圧値を調べた。
（２）コントロール群　
　ペプチドを含まない同量の生理食塩水を試験群と同様にＳＨＲに経口投与して、同様に降圧値を調べた。
（３）評価
　その結果、２０週齢のＳＨＲでは、コントロール群に対して試験群は、投与後２及び４時間で有意な血圧降下作用〔２時間後：１０．７５±０．８５ｍｍＨｇ（Ｐ＜０．０１）、４時間後：１１．２５±３．９４ｍｍＨｇ（Ｐ＜０．０１）〕を示し、６時間でも４ｍｍＨｇの血圧降下が認められ持続性のある血圧降下作用が見られた（表１参照）。
　さらに、３０週齢のＳＨＲでは、コントロール群に対して試験群は、投与後２時間及び４時間で有意な血圧降下作用〔２時間後：１０．３２±０．８２ｍｍＨｇ（Ｐ＜０．０１）、４時間後：１０．８２±３．５４ｍｍＨｇ（Ｐ＜０．０１）〕を示し、６時間でも３．３ｍｍＨｇの血圧降下が認められ持続性のある血圧降下作用が見られ、２０週齢の場合と比較してほぼ同等の効果が得られた（表２参照）。
【００２８】
（ＳＨＲ腸間膜動脈弛緩作用の測定）
　ＳＨＲより摘出した腸間膜動脈のリング状片を高木等の方法（高木等編、薬物学実験、９４〜９９ペ−ジ、南山堂）に従って処理し、標本をマグナス管中で等張性トランスジュ−サ−に接続して張力を測定して弛緩の割合を以下の３種の方法で調べた。
　イ）０．５μＭのプロスタグランジンＦ２αによって収縮させた腸間膜動脈に対してＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒを添加して、その際の５０％弛緩を示す時の濃度（ＥＤ５０）を求めた。
　ロ）０．５μＭプロスタグランジンＦ２αに替えて０．５μＭフェニレフリンを用いて上記イ）の場合と同様にしてＥＤ５０を求めた。
　ハ）プロスタグランジンＦ２αに替えて３０ｍＭの塩化カリウムを用いて上記イ）の場合と同様にしてＥＤ５０を求めた。
　その結果、イ）の場合のＥＤ５０は１．３×１０−４Ｍ、ロ）の場合のＥＤ５０は１．５×１０−４Ｍで、ハ）の場合のＥＤ５０は１．６×１０−４Ｍであった。
【００２９】
（血中コレステロールの測定）
　血中コレステロールの測定は、マウスにペプチドを与えた群（試験群）と与えなかった群（コントロール群）について、総コレステロールを測定した。
（１）試験群
　ｄｄＹ種マウス（雄４週齢、体重約１３〜１５ｇ、１群７匹）にＡＩＮ−７６処方に高コレステロール添加食（椰子油１０％、コレステロール１％、コール酸０．５％）を７日間与えた。
　本発明のペプチドを、上記７日間の飼育中、６日目と７日目に、ペプチドを溶解した生理食塩水をゾンデ針で経口投与した（３０，１００ｍｇ／ｋｇ投与）。なおペプチド投与中も高コレステロール食を与え、２回目のペプチド投与後２４時間絶食させた後、心臓採血法により血液を採取した。
　回収した血液を３７℃で３０分間インキュベーションした後、３０００ｇで１０分間遠心し上澄みに血清を得た。得られた血清を酵素法により処理し、総コレステロールの濃度を測定キット（和光純薬工業株式会社製、コレステロール　Ｅ−テストワコー及びＨＤＬコレステロール沈殿試薬セット）により６００ｎｍの吸光度を測定することにより測定した。
（２）コントロール群
　ｄｄＹ種マウス（雄４週齢、体重約１３〜１５ｇ、１群７匹）にＡＩＮ−７６処方に高コレステロール添加食（椰子油１０％、コレステロール１％、コール酸０．５％）で７日間飼育し、２４時間絶食させた後、心臓採血法により血液を採取し、同様にして総コレステロールの濃度を求めた。
（３）評価
　試験群とコントロール群の総コレステロールの濃度の平均値を求め、降下率（％）を算出した。なお降下率（％）はコントロール群の平均値から試験群の平均値を引いた値をコントロール群の平均値で割って百分率（％）で表した。
　その結果、表３に示したとおり、かかるペプチドは、コントロール群に対して３０ｍｇ／ｋｇで１９．８％の降下率、１００ｍｇ／ｋｇで２７．７％の降下率を示し、用量依存的な血中コレステロール降下作用を示した。
【００３０】
比較例１
　市販のＩｌｅ−Ｔｙｒ〔Ｂａｃｈｅｍ社製〕を用いて実施例１と同様に評価した。
　その結果、かかるペプチドのＩＣ５０は３．７μＭであった。
　また、かかるペプチドを２０週齢のＳＨＲ（ｎ＝４）に経口投与した場合、コントロール群（ｎ＝４）に対して投与後２時間で有意な血圧降下作用〔２時間後：９．７５±２．１４ｍｍＨｇ（Ｐ＜０．０１）〕を示したが、４時間後には２ｍｍＨｇ程度の血圧降下となり、持続性のある血圧降下作用が見られなかった（表１参照）。
　また、３０週齢のＳＨＲ（ｎ＝４）に経口投与した場合には、コントロール群（ｎ＝４）に対して投与後２時間で有意な血圧降下作用〔２時間後：６．０１±１．５５ｍｍＨｇ（Ｐ＜０．０１）〕を示したが、２０週齢の場合と比較して、降下値が６１％に減少していた。また、４時間後には２ｍｍＨｇ程度の血圧降下となり、持続性のある血圧降下作用が見られなかった（表２参照）。
　また、動脈弛緩活性については、かかるペプチドは上記のイ）、ロ）、ハ）の何れの方法においても１．０×１０−３Ｍで使用しても動脈弛緩作用を示さず、ＥＤ５０は求められなかった。
　さらに、血中コレステロール降下作用についても、かかるペプチドは１００ｍｇ／ｋｇの投与でコントロール群に対して２．１％の降下しか示さず、有意な降下作用を示さなかった（表３参照）。
【００３１】
〔表１〕
　　　　　　　　　　　　　　　　　　血圧降下値（ｍｍＨｇ）　　　　　　　
　　　　　投与量　  ２時間後 　　  ４時間後　　　６時間後　   ８時間後
　　　　　(mg/kg) 　　    　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
実施例１　７．５ 　10.75±0.85*  　11.25±3.94*  　4.00±1.58    0.25±0.48
比較例１　７．５ 　 9.75±2.14*     2.00±3.03   　0.25±4.60    0.75±0.75　
＊Ｐ＜０．０１：ペプチドを含まない同量の生理食塩水を投与した場合の血圧の変化の平均値（ｎ＝４）に対して有意水準１％で有意性を示した。
【００３２】
〔表２〕
　　　　　　　　　　　　　　　　　　血圧降下値（ｍｍＨｇ）　　　　　　　　
　　　　　投与量　  ２時間後 　　  ４時間後　　　６時間後　   ８時間後
　　　　　(mg/kg) 　　    　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
実施例１　７．５ 　10.32±0.82*  　10.82±3.54*  　3.30±1.78    0.20±0.33
比較例１　７．５ 　 6.01±1.55*     0.95±3.51   　0.21±3.62    0.63±1.22 　
＊Ｐ＜０．０１：ペプチドを含まない同量の生理食塩水を投与した場合の血圧の変化の平均値（ｎ＝４）に対して有意水準１％で有意性を示した。
【００３３】
〔表３〕
　　　　　　　　　　　　　　　　　　降下率（％）　　　　　
　　　　　　投与量　　　　　　　　総コレステロール
　　　　　（ｍｇ／ｋｇ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　
実施例１　　　３０　　　　　　　　　１９．８
　　　　　　１００　　　　　　　　　２７．７
比較例１　　１００　　　　　　　　　　２．１　　　　　　　　
【産業上の利用可能性】
【００３４】
　本発明の活用例として、アンジオテンシン変換酵素阻害作用や動脈弛緩作用を示して、持続性のある血圧降下剤、特に加齢した人に対しても持続性のある血圧降下剤として、さらに血中コレステロール降下剤としても有用である。
【配列表】
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