(57)【要約】【課題】グルコ−ス一分子を分子内に有する少糖類糖アルコールを製造する。【解決手段】糖アルコ−ルおよびα−グルコ−ス−１−リン酸にセロビオ−スホスホリラ−ゼを作用させることを特徴とする少糖類糖アルコ−ルの製造法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖アルコ−ルおよびα−グルコ−ス−１−リン酸にセロビオ−スホスホリラ−ゼを作用させ、グルコ−ス一分子がβ−グリコシド結合している少糖類糖アルコ−ルを生成させることを特徴とする少糖類糖アルコ−ルの製造方法。
【請求項２】
糖アルコ−ルがエリスリト−ル、ＤＬ−スレイト−ル、Ｄ−アラビト−ル、Ｌ−アラビト−ル、キシリト−ル、リビトール、イノシト−ル、ガラクチト−ル、グルシト−ル、マンニト−ル、セロビト−ル、マルチト−ルおよびラクチト−ルなどから選ばれたものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖アルコ−ルおよび／またはα−グルコ−ス−１−リン酸が、反応系に連続的にまたは断続的に追加される請求項１および請求項２に記載の方法。
【請求項４】
セロビオ−スホスホリラ−ゼの起源がセルビブリオ・ギルバス（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）  、クロストリディウム・サ−モセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリディウム・ステロコラリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）  、サ−モトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、サ−モトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、ルミノコッカス・フラボファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、フォメス・アノス（Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属およびエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）  属の微生物の中から選ばれたものである請求項１〜請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項４に記載の方法にて製造された、少糖類糖アルコ−ルを含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
少糖類糖アルコ−ルの製造法に関し、詳しくは糖アルコ−ルおよびα−グルコ−ス−１−リン酸に、セロビオ−スホスホリラ−ゼを作用させることを特徴とする少糖類糖アルコ−ルの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
少糖類糖アルコ−ルの合成に用いられる酵素として、グルコシダ−ゼ、ガラクトシダ−ゼ、アミラ−ゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラ−ゼまたはフラクトシルトランスフェラ−ゼなどが知られている。一般的に、これら加水分解が触媒する縮合反応や糖転移酵素が触媒する転移反応を利用して糖類を合成する場合、反応生成糖の結合部位および／または重合度が均一ではなく、従って、純度の高い生成物を得にくいという問題点がある。
【０００３】
この問題を解決する一法として、転移酵素の一種であるスクロ−スホスホリラ−ゼを利用してグルコ−ス−１−リン酸またはスクロ−スと、糖アルコ−ルとから、グルコ−スと糖アルコ−ルが結合した糖化合物、詳しくはα−Ｄ−グルコピラノシル−キシリト−ル、α−Ｄ−グルコピラノシル−アラビト−ル、α−Ｄ−グルコピラノシル−リビトールを効率良く高純度に製造する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。しかし、この方法ではβ−グリコシド結合を有する二糖類糖アルコ−ルを製造することはできなかった。
【０００４】
セロビオ−スホスホリラ−ゼは、セロビオ−ス分子中のβ−１，４−グルコシド結合の加リン酸分解を触媒する酵素であり、グルコ−スとα−グルコ−ス−１−リン酸を生成する（例えば、非特許文献１参照。）。このセロビオ−スホスホリラ−ゼが触媒する反応は可逆的であり、グルコシル基受容体の基質特異性の低さを利用し、α−グルコ−ス−１−リン酸と種々の糖類から、多用なヘテロオリゴ糖が合成されている（例えば、特許文献２、特許文献３、非特許文献２および非特許文献３参照。）。しかし、当該酵素が糖アルコ−ルをグルコシル基受容体とすることは知られていない。
【０００５】
【特許文献１】
特開平０５−０９１８９１号公報
【特許文献２】
特公平０５−３３０３５号公報
【特許文献３】
特開２００１−２０４４８９号公報
【非特許文献１】
ティ−．・ササキ（Ｔ．  Ｓａｓａｋｉ）、他、「ザジャ−ナルオブバイオケミストリ−（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９２年、２０９、ｐ．８０３−８０７
【０００６】
【非特許文献２】
エ−．・パ−シ−（Ａ．  Ｐｅｒｃｙ）、他、「カルボハイドレ−トリサ−チ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９８年、第３０５巻、ｐ．５４３−５４８
【非特許文献３】
エ−．・パ−シ−（Ａ．  Ｐｅｒｃｙ）、他、「カルボハイドレ−トリサ−チ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９８年、第３０８巻、ｐ．４２３−４２９
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは糖アルコ−ルおよびα−グルコ−ス−１−リン酸にセロビオ−スホスホリラ−ゼを作用させ、得られた少糖類糖アルコ−ルの構造を精査し、この知見に基づいて本発明を完成した。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明について具体例を挙げて更に詳細に説明する。本発明は、グルコ−ス一分子がβ−グリコシド結合している少糖類糖アルコ−ルの製造方法に関する。
また、本発明は前記方法にて製造された、少糖類糖アルコ−ルを含有する組成物に関する。
【０００９】
本発明で用いるセロビオ−スホスホリラ−ゼは、セルビブリオ・ギルバス（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）  、クロストリディウム・サ−モセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリディウム・ステロコラリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）  、サ−モトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、サ−モトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、ルミノコッカス・フラボファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、フォメス・アノス（Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）  属などの微生物起源の酵素が利用可能である。特に、セルビブリオ・ギルバス、サ−モトガ・マリティマ、クロストリディウム・サ−モセラム起源の当該酵素に関する情報量は豊富であり、また、取り扱いが容易であるため好ましい。本発明で用いるセロビオ−スホスホリラ−ゼの形態は特に限定されるものではなく、精製酵素の他に、粗酵素、酵素含有菌体、固定化酵素、遺伝子組み換え酵素などいかなる形態のものでも用いることができる。セロビオ−スホスホリラ−ゼの使用量は特に限定されるものではないが、好ましくは反応液１ｍＬあたり０．０００１単位以上１０００単位以下であり、より好ましくは反応液１ｍＬあたり０．００１単位以上１００単位以下である。なお、セロビオ−スホスホリラ−ゼ１単位とは、３０℃、ｐＨ７．０においてセロビオ−ス、オルトリン酸塩から毎分１μｍｏｌのα−グルコ−ス−１−リン酸を生成する酵素量と定義する。
【００１０】
本発明において原料として使用されるα−グルコ−ス−１−リン酸および糖アルコ−ルは、その起源に制限はなく、天然に存在するものであっても、化学的に合成されたものであってもよい。反応系におけるα−グルコ−ス−１−リン酸の濃度については、特に限定はないが、通常下限は１ｍＭ、好ましくは１０ｍＭである。
【００１１】
もう一方の原料である糖アルコ−ルについても特に制限はないが、好ましくは単糖類糖アルコール、さらに好ましくはＤＬ−スレイト−ル、  Ｌ−アラビト−ル、キシリト−ル、イノシト−ルおよびグルシトールなどを用いる。これらの濃度についても、特に限定はないが、本来の受容体基質であるグルコ−スに比し、高濃度に設定することが可能である。
【００１２】
本発明においては、原料として用いる糖アルコ−ルにそれぞれグルコシル基が結合した少糖類糖アルコ−ルが製造される。糖アルコ−ルとして、例えばＤＬ−スレイト−ル、  Ｌ−アラビト−ル、キシリト−ル、リビトール、イノシト−ルおよびグルシトールを用いた場合には、それぞれβ１−グルコシル→１−スレイト−ル、β１−グルコシル→４−アラビト−ル、β１−グルコシル→２ｏｒ４−キシリト−ル、β１−グルコシル→  ２ｏｒ４−リビトール、β１−グルコシル→１−イノシト−ルおよびβ１−グルコシル→４−グルシトール（セロビトール）が製造される。
【００１３】
酵素反応は任意の形態で行うことができるが、通常は純水あるいは緩衝液、例えばトリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、３−（Ｎ−モノホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液等の水溶液中で実施する。糖アルコール、α−グルコ−ス−１−リン酸および酵素は、いかなる方法で反応液に添加しても差し支えないが、通常は酵素以外のものを溶解した反応液に酵素を加えることにより、反応を開始する。当該反応液を上記酵素が失活しない程度の温度範囲に維持し、反応を行う。反応温度は、著しく酵素活性が低下しない限り特に限定されないが、通常０℃以上１００℃以下、好ましくは１０℃以上９０℃以下である。また、反応液のｐＨについても酵素が失活しない範囲内であればよく、通常ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ５〜９の範囲で行う。
【００１４】
反応時間についても特に限定されないが、目的とする少糖類糖アルコ−ルの収率が最大になったところで終了すればよく、通常は１分〜数百時間の範囲で糖アルコール、α−グルコ−ス−１−リン酸の濃度および酵素濃度を考慮して適宜決定すればよい。酵素反応終了後、必要に応じて生成した少糖類糖アルコ−ルを既知の方法により分離することができる。
【００１５】
【実施例】
本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００１６】
実施例１〜３に共通の反応条件は以下のとおりである。
５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中に、最終濃度が２０ｍＭのα−グルコ−ス−１−リン酸、各種糖アルコ−ル水溶液（エリスリト−ル、ＤＬ−スレイト−ル、Ｄ−アラビト−ル、Ｌ−アラビト−ル、キシリト−ル、リビトール、イノシト−ル、グルシト−ル、マンニト−ル、セロビト−ル、マルチト−ルおよびラクチト−ルは最終濃度１００ｍＭに調製、ガラクチト−ルは飽和水溶液）、精製セロビオ−スホスホリラ−ゼ標品（セルビブリオ・ギルバスもしくはサ−モトガ・マリティマもしくはクロストリディウム・サ−モセラム起源）および安定化剤として終濃度２．０ｍｇ／ｍＬの牛血清アルブミンを添加し、４８時間反応させた。反応終了後、反応液を適宜希釈し、モリブデン−青法にて遊離リン酸量を測定した。これを生成少糖類糖アルコ−ル量とした。
【００１７】
（実施例１）
０．０９８  単位  ／ｍＬのセロビオ−スホスホリラ−ゼ（セルビブリオ・ギルバス起源）を用い、３７℃にて反応させた。
【００１８】
（実施例２）
０．０５０単位／ｍＬのセロビオ−スホスホリラ−ゼ（サ−モトガ・マリティマ起源）を用い、６０℃にて反応させた。
【００１９】
（実施例３）
０．１８１単位／ｍＬのセロビオ−スホスホリラ−ゼ（クロストリディウム・サ−モセラム起源）を用い、６０℃にて反応させた。
【００２０】
実施例１〜３で得られた結果を図１に示す。
【００２１】
【図１】
2004222507.tif 000002
【００２２】
（実施例４）
実施例２で、当該酵素をＤＬ−スレイト−ル、Ｌ−アラビト−ル、キシリト−ル、リビトール、イノシト−ルおよびグルシトールへ作用させた際に反応液中に生成した二糖類糖アルコ−ルの構造を調べるため、これらの反応液を脱塩・脱タンパク質後、凍結乾燥させたものを、１３Ｃ−ＮＭＲ分析へ供した。得られた結果を表１に示す。得られたこれらの二糖類糖アルコ−ルは、化１に示されるように単糖類糖アルコ−ルにグルコ−ス一分子がβ−グリコシド結合している構造を有することが判明した。実施例２の他の生成物、実施例１および３で得られた他の生成物の構造は未解析であるが、化１に示されるような構造に類するものと推測される。
【００２３】
【表１】
2004222507.tif 000003
【００２４】
【化１】
2004222507.tif 000004
【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、これまで製造が困難であったβ−グリコシド結合を有する少糖類糖アルコ−ルを簡便に製造することが可能となった。