(57)【要約】【課題】脳組織や脳組織標本における超音波の音響特性の変化を利用した、ミエリンの発達障害に基づく精神分裂病及びそれに由来する痴呆症等の脳組織変性の侵襲的又は非侵襲的な診断方法を提供すること。【解決手段】走査型超音波顕微鏡（ＳＡＭ）を用いて、視床や海馬からなる中枢部位等の脳組織又は脳組織標本に周波数１００〜２００ＭＨｚの超音波ビームを照射し、反射超音波における音響特性の変化、例えば反射波の強度と位相の解析により、周波数特性から厚みを計算し減衰値を算出し、オリゴデンドログリアにおける超音波の減衰を検出して脳組織変性の診断をする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳組織又は脳組織標本に超音波を照射し、超音波の波動としての属性を利用して、音響特性の変化を検出することを特徴とする脳組織変性の診断方法。
【請求項２】
超音波の波動としての属性が、反射、屈折、散乱、減衰、伝播時間又はドップラー効果であることを特徴とする請求項１記載の脳組織変性の診断方法。
【請求項３】
音響特性の変化が、反射超音波における音響特性の変化であることを特徴とする請求項１又は２記載の脳組織変性の診断方法。
【請求項４】
反射超音波における音響特性の変化が、反射超音波のＲＦ（Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）信号の解析、及び／又はエコーのスペックル（粒状反射）パターンの変化であることを特徴とする請求項３記載の脳組織変性の診断方法。
【請求項５】
反射超音波における音響特性の変化が、反射超音波の強度と位相の変化であることを特徴とする請求項３記載の脳組織変性の診断方法。
【請求項６】
反射超音波における音響特性の変化が、オリゴデンドログリアにおける超音波の減衰であることを特徴とする請求項３〜５のいずれか記載の脳組織変性の診断方法。
【請求項７】
細径プローブを用い、得られた反射超音波における音響特性の定量的解析を行うことを特徴とする請求項３〜６のいずれか記載の脳組織変性の診断方法。
【請求項８】
パルス信号を用いて、広い帯域の反射超音波における音響特性を解析することを特徴とする請求項３〜７のいずれか記載の脳組織変性の診断方法。
【請求項９】
非侵襲的に音響特性の変化を検出することを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の脳組織変性の診断方法。
【請求項１０】
周波数２〜４５０ＭＨｚの超音波を照射することを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の脳組織変性の診断方法。
【請求項１１】
周波数１２〜２００ＭＨｚの超音波を照射することを特徴とする請求項１０記載の脳組織変性の診断方法。
【請求項１２】
周波数２０〜１４０ＭＨｚの超音波を照射することを特徴とする請求項１１記載の脳組織変性の診断方法。
【請求項１３】
脳組織が中枢部位であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の脳組織変性の診断方法。
【請求項１４】
超音波顕微鏡を用いることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の脳組織変性の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脳組織や脳組織標本における超音波の音響特性の変化を利用した、ミエリンの発達障害に基づく精神分裂病及びそれに由来する痴呆症等の脳組織変性の診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
硬化性白質脳症を伴う多発嚢胞性脂肪膜性骨異形成症、又は那須−ハコラ病（例えば、非特許文献１、２参照。）は、日本とフィンランドにおいて発見された稀な中枢神経系疾患である。那須−ハコラ病患者は、骨嚢胞組織の形成に加えて、性格変化などの精神異常の症状を経て初老期痴呆を必発する。フィンランドの患者では、５．３ｋｂのＤＡＰ１２［ＫＡＲＡＰ（Ｋｉｌｌｅｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）／ＴＹＲＯＢＰ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）］遺伝子座が欠損する変異が見られた。別の欠陥をもつ日本の患者は、遺伝子の第３エクソンで単一のヌクレオチドが欠損しており、両患者とも、主に免疫組織にみられる細胞膜アダプタータンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ；例えば、非特許文献３、４参照。）であるＤＡＰ１２の機能が失われることによるものであることが知られている（例えば、非特許文献５参照。）。
【０００３】
上記ＤＡＰ１２（ＤＮＡＸ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １２）は活性化モチーフＩＴＡＭを有する膜貫通タンパク質であり、リン酸化によりＺＡＰ−７０やＳｙｋと結合することが示唆されており、ヒトにおいて１９ｑ１３．１に位置する１コピー遺伝子にコードされ、マウスにおいても存在することが知られている。かかるＤＡＰ１２のｍＲＮＡは単球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞などに多く発現され、ＤＡＰ１２は単にＫＡＲ群の活性化シグナリングに関与するだけではなく、ヒトｓｉｇｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＩＲＰ）ｂｅｔａ１、ヒトやマウスのｍｙｅｌｏｉｄ  ＤＡＰ１２−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｌｅｃｔｉｎ（ＭＤＬ）−１、ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ（ＴＲＥＭ）と会合することも知られている。また、ＤＡＰ１２がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃなど、Ｃタイプレクチンファミリーに属するＫＡＲ分子とも会合し、機能していることが報告されている（例えば、非特許文献６〜８参照。）。
【０００４】
従来、中枢神経系疾患の器質的診断には、ＣＴ（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＭＲＩ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ）、ＰＥＴ（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）などの画像診断が行われてきた。ＣＴやＭＲＩは癌やその他の病変を視覚的に診断することができることから、医療においてなくてはならない検査機器となっているが、ＣＴはＸ線及び放射性同位元素を使用するため、これらＸ線や放射性同位元素が生体に与える影響を無視することはできず、ＭＲＩは非常に強力な磁気及び電波を使用するため、強力な磁気及び電波が生体に与える影響を無視することはできない。また、ＰＥＴは、アイソトープ化されている薬剤（ＦＤＧ；１８Ｆ−２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース）を使用することにより、腫瘍のように細胞活動の活発な箇所、すなわちグルコースの取り込み量が多く、放射活性の高い部位、組織についての情報を得ることができ、発病部位を特定する能力に優れているが、診断できる対象疾患が癌や一部の細胞活性の高い疾患に限られる。さらに、上記のいずれの画像診断方法においても診断対象は、臓器・器官レベルの、視覚で捕らえることのできる大きさに限られ、視覚で捕らえることのできない大きさの異変を対象にして画像診断することはできなかった。
【０００５】
他方、超音波は、現在医療界において臨床的な診断等に用いられている。超音波診断装置では２〜１５ＭＨｚ、血管内超音波では２０〜４０ＭＨｚ、眼科領域では１２〜１００ＭＨｚの周波数帯の超音波が用いられており、特に、眼科領域で６０ＭＨｚ以上の高周波数のものは生体超音波顕微鏡（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｂｉｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＵＢＭ）と呼ばれている。ＵＢＭは通常の超音波診断装置と同じＢモード（断層像）で、かつ高周波数、高解像度のものの総称で、このＵＢＭを用いると定性的診断が可能となる。超音波顕微鏡（Ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）は、試料面を機械的に走査しながら、集束型の超音波プローブによって試料に超音波を照射し、試料表面に表面波を励起させて、試料からの反射超音波の振幅や位相の分布を画像化することにより、試料の表面及び内部の情報や試料の弾性的性質を取得できるとされている。一般的には１００ＭＨｚ〜数ＧＨｚの周波数を使用し、Ｃモード（平らに置いたものを上から見た画像）で、高精度の定量的診断が可能となる。液体カプラには純水が多く使われているため、非常に高価である。そのため、周波数３０〜５０ＭＨｚの低周波センサが考案されている。
【０００６】
本発明者らも、医学及び生物学において超音波顕微鏡を応用してきた（例えば、非特許文献９、１０参照。）。また本発明者らは、聴覚パラメータを定量測定するための線収束型超音波顕微鏡を開発し（例えば、非特許文献１１参照。）、生物組織の定量聴覚測定に応用してきた。そして、超音波顕微鏡が胃ガン（例えば、非特許文献１２参照。）、腎臓（例えば、非特許文献１３参照。）におけるガンの種類を分析できることを報告している。
【０００７】
【非特許文献１】
Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｊｐｎ．  ２３，  ５３９−５５８，  １９７３
【非特許文献２】
Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３４，  ７５３−７５７，  １９９７
【非特許文献３】
Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８，  ５０８３−５０８６，  １９９７
【非特許文献４】
Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，  ７０３−７０７，  １９９８
【非特許文献５】
Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２５，  ３５７−３６１，  ２０００
【非特許文献６】
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８，  ６９３−７０１，  １９９８
【非特許文献７】
Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１，  ７−１０，  １９９８
【非特許文献８】
Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０，  ４１４８−５２，  １９９８
【非特許文献９】
ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｓｏｎｉｃｓ  Ｕｌｔｒａｓｏｎ，  ＳＵ−３２，  １３２−１３５，  １９８５
【非特許文献１０】
Ｊｐｎ  Ｊ  ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓ，  ２６，  ５２−５４，  １９８７
【非特許文献１１】
Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ，  ２６，  Ｓ３０−Ｓ３２，  ２０００
【非特許文献１２】
Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ，  １７，  ７０９−７１４，  １９９１
【非特許文献１３】
Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ，  ２２，  １２６１−１２６５，  １９９６
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、精神分裂病及びそれに引き続く若年性痴呆を必発する那須−ハコラ病では、免疫系受容体シグナルアダプター分子であるＤＡＰ１２遺伝子の欠損が、その病因であると証明された。また、精神分裂病の脳組織所見として、視床及び海馬におけるミエリン形成不全、つまりオリゴデンドログリア発達障害が特徴的であることが示され、病因遺伝子と組織異常の相関が解明されつつある。したがって、ＤＡＰ１２欠損マウスの脳組織におけるミエリン形成不全の検出は、ＤＡＰ１２欠損マウスが痴呆モデルであることを示すと同時に、痴呆の早期診断方法開発の鍵となる。特に、ミエリンの発達障害（形成不全）に基づく精神分裂病及びそれに由来する若年性痴呆は、１００〜１０００人に１人とも言われ、その早期診断による的確な病態評価と診断を基礎にした治療が、ＱＯＬの観点から強く望まれている。
【０００９】
一方、超音波を利用し、正常細胞と異常細胞の音響特性変化（超音波の減衰）を検出することにより、これまでの画像診断によってはこれらを判別することが不可能であった通常のＣＴやＭＲＩでは一見して正常な組織形態を有する病変や、視覚によっては捕らえることのできないほどの大きさの病変までも臨床的に検出できることは知られていなかった。特に、これまで脳組織におけるミエリン形成不全や、それに伴う精神分裂病或いは痴呆、及び那須−ハコラ病を超音波の音響特性の変化によって、検出できることは知られていなかった。本発明の課題は、脳組織や脳組織標本における超音波の音響特性の変化を利用した、ミエリンの発達障害に基づく精神分裂病及びそれに由来する痴呆症等の脳組織変性の診断方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、使用周波数２００ＭＨｚの超音波顕微鏡を用いて、ミエリンの鞘状構造の形成が不全であるＤＡＰ１２欠損マウスの脳組織における音響特性の変化を、反射波の強度と位相の解析により検出したところ、ミエリンの形成不全を示す部位では超音波が減衰することを観察し、高周波数超音波を用いることで、通常の光学顕微鏡では検出されない脳組織の異常が検出可能であり、脳のＧｅｏｍｅｔｒｙに異常のない変性疾患の診断に、臨床的にも超音波が有用であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、脳組織又は脳組織標本に超音波を照射し、超音波の波動としての属性を利用して、音響特性の変化を検出することを特徴とする脳組織変性の診断方法（請求項１）や、超音波の波動としての属性が、反射、屈折、散乱、減衰、伝播時間又はドップラー効果であることを特徴とする請求項１記載の脳組織変性の診断方法（請求項２）や、音響特性の変化が、反射超音波における音響特性の変化であることを特徴とする請求項１又は２記載の脳組織変性の診断方法（請求項３）や、反射超音波における音響特性の変化が、反射超音波のＲＦ（Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）信号の解析、及び／又はエコーのスペックル（粒状反射）パターンの変化であることを特徴とする請求項３記載の脳組織変性の診断方法（請求項４）や、反射超音波における音響特性の変化が、反射超音波の強度と位相の変化であることを特徴とする請求項３記載の脳組織変性の診断方法（請求項５）に関する。
【００１２】
また本発明は、反射超音波における音響特性の変化が、オリゴデンドログリアにおける超音波の減衰であることを特徴とする請求項３〜５のいずれか記載の脳組織変性の診断方法（請求項６）や、細径プローブを用い、得られた反射超音波における音響特性の定量的解析を行うことを特徴とする請求項３〜６のいずれか記載の脳組織変性の診断方法（請求項７）や、パルス信号を用いて、広い帯域の反射超音波における音響特性を解析することを特徴とする請求項３〜７のいずれか記載の脳組織変性の診断方法（請求項８）や、非侵襲的に音響特性の変化を検出することを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の脳組織変性の診断方法（請求項９）や、周波数２〜４５０ＭＨｚの超音波を照射することを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の脳組織変性の診断方法（請求項１０）や、周波数１２〜２００ＭＨｚの超音波を照射することを特徴とする請求項１０記載の脳組織変性の診断方法（請求項１１）や、周波数２０〜１４０ＭＨｚの超音波を照射することを特徴とする請求項１１記載の脳組織変性の診断方法（請求項１２）や、脳組織が中枢部位であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の脳組織変性の診断方法（請求項１３）や、超音波顕微鏡を用いることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の脳組織変性の診断方法（請求項１４）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の脳組織変性の診断方法としては、脳組織又は脳組織標本に超音波を照射し、反射超音波における音響特性の変化を検出する診断方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、超音波診断装置、ＣＴスキャン、超音波顕微鏡等を用いて、これら機器の発信装置から超音波を脳組織（患部）又は脳組織標本に向け照射し、反射して得られる超音波の音響特性の変化（相違）を測定・検出し、データ化し、評価・判定する方法を挙げることができるが、光波や電子線を通さない試料でも表面又は表面下の構造を通常数μｍの分解能で検出できる点で超音波顕微鏡を用いることが好ましい。上記脳組織としては、視床、海馬等からなる中枢部位を好適に例示することができる。また、上記脳組織標本としては、脳組織を固定・包埋した後の薄片物を具体的に例示することができる。
【００１４】
また、上記反射超音波の音響特性の変化を検出する方法としては、反射超音波の音響特性の相違を測定することのできる検出方法であれば特に限定されるものではないが、反射超音波のＲＦ（Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）信号の解析を行い、音響特性の相違を測定する検出方法や、エコーのスペックル（粒状反射）パターンの相違を測定することにより音響特性の変化を検出する方法や、反射超音波の強度と位相の変化を検出する方法などを列挙することができる。例えば、視床におけるミエリン形成不全、すなわちオリゴデンドログリア発達障害を超音波の減衰という音響特性の変化で検出することにより、痴呆の早期診断が可能となる。
【００１５】
本発明の脳組織変性の診断方法において使用する超音波としては、周波数が可聴周波領域を越える１ＭＨｚから１ＧＨｚの弾性波であればどのようなものでもよく、超音波の周波数帯として２〜４５０ＭＨｚの超音波を用いることが好ましく、特に１２〜２００ＭＨｚの周波数帯の超音波を用いることが好ましく、中でも２０〜１４０ＭＨｚの周波数帯の超音波を用いることが特に望ましい。
【００１６】
被験者の生体脳組織に超音波を照射して脳組織における器質的診断を非侵襲的に行う場合は、単一の周波数ではなく、パルス信号を用いて、例えば２０〜１４０ＭＨｚの広い帯域の超音波の音響特性の変化を解析することが好ましく、また、血管内超音波のような細径プローブによって得られた信号の定量的解析により、微細構造の判定を行うことが好ましい。他方、脳組織標本に超音波を照射する場合は、超音波素子と標本対象との距離を一定にして精密な計測をしうることから、１００〜４５０ＭＨｚ、例えば２００ＭＨｚの高周波数の超音波を用いることにより、音響特性の変化を検出することが好ましい。
【００１７】
上記細径プローブとしては、上記の超音波周波数帯の超音波を発信及び受信することができ、且つ、生体内に挿入し得る細径のプローブであれば、特に限定されるものではないが、直径２ｍｍ以下、特に１ｍｍ程度のものを用いることが好ましく、また、プローブの表面は生体に反応しない材質に覆われていることが望ましい。
【００１８】
超音波顕微鏡は走査型超音波顕微鏡（ＳＡＭ）ともいわれ、細く絞った超音波ビームを２次元走査しながら照射し、反射波や透過波を解析し得るものであればどのようなものでもよいが、微小領域の測定精度に優れ、深さ方向に焦点位置を変化させて３次元像を得ることができることから、反射波を解析する反射型のＳＡＭが好ましい。また、１２〜１００ＭＨｚの周波数帯の超音波を用いる場合、通常のエコー装置と同様にＢモード表示（超音波のビーム方向と平行な平面の断面像；断面表示モード）とすることが、１００ＭＨｚ以上の周波数帯の超音波を用いる場合、Ｃモード表示（超音波のビーム方向と垂直な平面の画像；平面表示モード）とすることが好ましい。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例等により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
参考例（ＤＡＰ１２ノックアウト−／−マウスの作製）
ＤＡＰ１２ノックアウトマウスは、文献（Ｃｅｌｌ  ７６，  ５１９−５２９，  １９９４）記載の方法により、１２９／ＳｖＪ（Ｈ−２ｂ）とＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６、Ｈ−２ｂ）とのハイブリッドにより作製した。１２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリー（ストラタジーン社製）からＤＡＰ１２ゲノムＤＮＡを単離し、プロモーター領域及びＤＡＰ１２遺伝子のエクソン１〜３を含む５．１ｋｂのＢａｍ  ＨＩ断片を、ｎｅｏｒカセット（ストラタジーン社製）に置換し、負の選択マーカーとして単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を挿入することにより構築した（図１ａ）。なお、ｎｅｏｒカセットは、５．１及び１．２ｋｂの相同配列をフランキング配列として有していた。このベクターを線状化し、エレクトロポレーションすることによってＥＳ細胞（ＲＷ４）に導入し相同的組換えを行った結果、７．１％の頻度でＥＳ細胞の相同的組換え体を得ることができた。
【００２０】
上記の相同的組換え体からＥＳクローンを単離し、Ｇ４１８及びＧＡＮＣ（ガンシクロビア）に対してネオマイシン耐性ＥＳクローンをスクリーニングし、サザンブロット法によって相同的組換え体を確認した。かかる相同的組換え体からゲノムＤＮＡを単離して、Ｋｐｎ  Ｉでダイジェストし、ｎｅｏｒカセットを含むターゲッティングアレルを含んでいることを確認した。かかる確認されたＥＳクローンを胚盤胞中にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製し、作製されたマウスを野生型のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社製）とインタークロスさせ、コントロールされた環境下で特異的病原体を遮断した施設において飼育することによってヘテロ接合体マウスを得た。また、ホモ接合体マウスを得るために、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせ、ＤＡＰ１２遺伝子が染色体上で欠損した欠損マウス及びその野生型マウスを作製した。このようにして作製された本発明のＤＡＰ１２ノックアウトマウスは少なくとも１０ヶ月齢までは、文献（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３，  ３４５−３５３，  ２０００、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３，  ３５５−３６４，  ２０００）記載のように特段の異常を示すことなく、健康に成長した。この得られたＤＡＰ１２ノックアウトマウスにおいてＤＡＰ１２発現能が欠失しているかどうかの確認は、ＤＡＰ１２＋／＋、ＤＡＰ１２＋／−、ＤＡＰ１２−／−等のマウスの尾から得たゲノムＤＮＡをＫｐｎ  Ｉで消化し、図１ａに示されている領域のプローブを用いたサザンブロット法により調べた（図１ｂ）。
【００２１】
また、文献（Ｃｅｌｌ  ７６，  ５１９−５２９，  １９９４）記載の方法によりＤＡＰ１２＋／＋及びＤＡＰ１２−／−マウスから骨髄マスト細胞（ＢＭＭＣ）を調製し、かかるマスト細胞（各レーン２．５×１０５細胞相当）から抽出したタンパク質と、文献（Ｃｅｌｌ  ７０，  ３５１，  １９９２）記載の方法により調製した抗ウサギＤＡＰ１２抗血清（１：５００で希釈）とを用いたイムノブロット分析においても調べた（図１ｃ）。その結果、ＤＡＰ１２−／−マウス由来の細胞においてＤＡＰ１２タンパク質が検出されなかった。
【００２２】
実施例（痴呆モデルマウスにおける脳組織変性の音響特性）
生後１２週齢及び５０週齢のＤＡＰ１２ノックアウトマウス（−／−）又は野生型マウス（＋／＋）を麻酔した後、ホルマリン溶液で潅流し、かかるマウスから脳を単離した後、ホルマリン溶液で１晩固定し、固定した脳を標準プロトコルによりパラフィン処理（１００％エタノール、メチルベンゾアート、キシレン、キシレンパラフィン又はパラフィン溶液で各１〜２時間ずつ処理する操作）を施しパラフィン包埋した。包埋した脳をミクロトームで４μｍの厚さにスライスし、スライドガラス上に載せ、標準プロトコルにより脱パラフィン処理（キシレン、１００％エタノール、９０％エタノール、７０％エタノール、ＰＢＳ）を施して、超音波顕微鏡用試料を作製した。超音波顕微鏡のトランスデューサと試料の間に脱気水を注入して音響カプラとし、周波数１００〜２００ＭＨｚの超音波ビームを発信して、反射波を受信し、既報（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｍｅｄ．  ＆  Ｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．２６，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，  ｐｐ．Ｓ３０−Ｓ３２，  ２０００）のごとく、反射波の強度と位相の解析により、周波数特性から厚みを計算し減衰値を算出し、超音波の減衰を定量的にカラー表示した。１２週齢における結果を図２（参考写真１）に、５０週齢における結果を図３（参考写真２）に示す。
【００２３】
図２及び図３に示されるように、正常マウス（右、１２週齢及び５０週齢）の視床ではオリゴデンドログリアと考えられる部分の減衰が高く、ＤＡＰ１２欠損マウス（左、１２週齢及び５０週齢）では同部位の減衰は周囲と同様であった。超音波の減衰は、組織の微細構造を強く反映するため、ミエリンの形成不全を示す部位では減衰が低いものと考えられた。高周波数超音波を用いることで、通常の光学顕微鏡では検出されない脳組織の異常が検出可能であり、脳のジオメトリーに異常のない変性疾患の診断に、臨床的にも超音波が有用であることが示された。
【００２４】
比較例（光学顕微鏡や電子顕微鏡における脳組織変性の所見）
脳組織変性の音響特性変化の検出方法の有効性を検証するために、光学顕微鏡や電子顕微鏡における脳組織変性の所見について調べてみた。それぞれ可視光で判別できるＨＥ染色試料、ミエリンの主要かつ特異的な構成要素であるミエリン塩基性タンパク（ＭＢＰ）抗体染色試料を常法により作製し、光学顕微鏡にて観察し、また、電子顕微鏡にてオリゴデンドログリアの発達状況を観察し、これらの所見を超音波顕微鏡の所見と対比した。ＨＥ染色の結果を図４（参考写真３）に、ＭＢＰ抗体を用いた免疫染色の結果を図５（参考写真４）に、電子顕微鏡の撮像結果（×２０００、×１００００、×５００００）を図６（参考写真５）にそれぞれ示す。
【００２５】
ＨＥ染色組織においては、ＤＡＰ１２欠損マウスと正常マウスの組織所見上の相違は観察されなかった（図４）。ＭＢＰ抗体染色では、ＤＡＰ１２欠損マウスの視床において特にミエリン形成不全が顕著であった（図５）。視床中心部について電子顕微鏡によりミエリン構造を微細に観察すると、正常では鞘状の構造が多数認められるのに対し、ＤＡＰ１２欠損マウスでは鞘状構造の形成が不全であった（図６）。なお広範な脱髄ではなく、有髄線維の数が低下し（×２，０００倍拡大画像）、髄鞘を持たない神経線維が多く見られるという点が特徴的であり（×１０，０００倍拡大像）、しかも×５０，０００倍の拡大像ではシナプスに小胞が異常に蓄積している個所が数多く観察された。
【００２６】
【発明の効果】
本発明の脳組織変性の診断方法によると、方法脳組織や脳組織標本における超音波の音響特性の変化を検出することにより、例えばミエリンの発達障害に基づく精神分裂病及びそれに由来する痴呆症等の診断、特に器質的診断が非侵襲的且つ簡便に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】痴呆モデルＤＡＰ１２ノックアウトマウスと野生型マウスの遺伝子地図と、各マウスにおけるＰＣＲ法及びサザンブロット法の結果を示す図である。
【図２】本発明の、オリゴデンドロサイト発達障害モデルマウス（１２週齢）における脳組織変性の音響特性変化の検出方法による当該モデルマウスの脳切片の超音波顕微鏡写真を示す図である。
【図３】本発明の、オリゴデンドロサイト発達障害モデルマウス（５０週齢）における脳組織変性の音響特性変化の検出方法による当該モデルマウスの脳切片の超音波顕微鏡写真を示す図である。
【図４】オリゴデンドロサイト発達障害モデルマウスにおける脳組織変性の音響特性変化の検出方法と対比するための、ＨＥ染色した当該モデルマウスの脳切片の光学顕微鏡写真を示す図である。
【図５】オリゴデンドロサイト発達障害モデルマウスにおける脳組織変性の音響特性変化の検出方法と対比するための、当該モデルマウスの脳切片のＭＢＰ抗体染色の結果を示す図である。
【図６】オリゴデンドロサイト発達障害モデルマウスにおける脳組織変性の音響特性変化の検出方法と対比するための、当該モデルマウスの脳切片の電子顕微鏡写真を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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