(57)【要約】【課題】  従来のＧＬＰ−１ペプチドアナログは、循環半減期が短く、特性へのどのような効果によって有効性の向上が得られるかは明らかではなかった。【解決手段】  本発明は、ＩＩ型糖尿病の治療に対して改良された特徴を有する活性ＧＬＰ−１ペプチド、７−３４、７−３５、７−３６および７−３７の有効なアナログを提供することにより上記の課題を解決する。これらのアナログは、７−１０位でアミノ酸が置換され、Ｃ末端が切断され、および／または基本のペプチド中に様々な他のアミノ酸置換を含み、そしてグルカゴンと比較してインシュリン生産を刺激する能力が向上し、ＧＬＰ−１（７−３７）と比較してプラズマ中での安定性が向上され得るか、あるいはその両方である。このような特性は治療薬としてのアナログの能力を向上させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＰ−１（７−３４）の誘導体またはそのＣ末端アミド形であって、該誘導体は、
以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）２６位および／または３４位でのリシンから、中性アミノ酸、アルギニンまたはＤ形リシンへの置換、および／または３６位でのアルギニンから、中性アミノ酸、リシンまたはＤ形アルギニンへの置換；
（ｂ）３１位のトリプトファンから、酸化耐性アミノ酸への置換；
（ｃ）以下：
１６位での、ＶからＹへの置換；
１８位での、ＳからＫへの置換；
２１位での、ＥからＤへの置換；
２２位での、ＧからＳへの置換；
２３位での、ＱからＲへの置換；
２４位での、ＡからＲへの置換；および
２６位での、ＫからＱへの置換；
のうちの少なくとも１つに従う置換；
（ｄ）以下：
８位での、Ａから代替的な小中性アミノ酸への置換；
９位での、Ｅから代替的な酸性アミノ酸または中性アミノ酸への置換；
１０位での、Ｇから代替的な中性アミノ酸への置換；および
１５位での、Ｄから代替的な酸性アミノ酸への置換；
のうち少なくとも１つを含む置換
ならびに
（ｅ）７位での、ヒスチジンから、
代替的な中性アミノ酸、あるいはヒスチジンのＤアシル化形またはＮアシル化形
あるいはヒスチジンのＤアルキル化形またはＮアルキル化形
への置換、
からなる群より選択される少なくとも１つの改変を含み、
ここで、（ａ）、（ｂ）、および（ｅ）において、該置換されたアミノ酸は、必要に応じて、Ｄ形であり得、そして７位で置換されたアミノ酸は、必要に応じて、Ｎアシル化形またはＮアルキル化形であり得る、ＧＬＰ−１（７−３４）の誘導体またはそのＣ末端アミド形。
【請求項２】
ＧＬＰ−１（７−３５）の誘導体またはそのＣ末端アミド形であって、該誘導体は、
以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）２６位および／または３４位でのリシンから、中性アミノ酸、アルギニンまたはＤ形リシンへの置換、および／または３６位でのアルギニンから、中性アミノ酸、リシンまたはＤ形アルギニンへの置換；
（ｂ）３１位のトリプトファンから、酸化耐性アミノ酸への置換；
（ｃ）以下：
１６位での、ＶからＹへの置換；
１８位での、ＳからＫへの置換；
２１位での、ＥからＤへの置換；
２２位での、ＧからＳへの置換；
２３位での、ＱからＲへの置換；
２４位での、ＡからＲへの置換；および
２６位での、ＫからＱへの置換；
のうちの少なくとも１つに従う置換；
（ｄ）以下：
８位での、Ａから代替的な小中性アミノ酸への置換；
９位での、Ｅから代替的な酸性アミノ酸または中性アミノ酸への置換；
１０位での、Ｇから代替的な中性アミノ酸への置換；および
１５位での、Ｄから代替的な酸性アミノ酸への置換；
のうち少なくとも１つを含む置換
ならびに
（ｅ）７位での、ヒスチジンから、
代替的な中性アミノ酸、あるいはヒスチジンのＤアシル化形またはＮアシル化形
あるいはヒスチジンのＤアルキル化形またはＮアルキル化形
への置換、
からなる群より選択される少なくとも１つの改変を含み、
ここで、（ａ）、（ｂ）、および（ｅ）において、該置換されたアミノ酸は、必要に応じて、Ｄ形であり得、そして７位で置換されたアミノ酸は、必要に応じて、Ｎアシル化形またはＮアルキル化形であり得る、ＧＬＰ−１（７−３５）の誘導体またはそのＣ末端アミド形。
【請求項３】
ＧＬＰ−１（７−３６）の誘導体またはそのＣ末端アミド形であって、該誘導体は、
以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）２６位および／または３４位でのリシンから、中性アミノ酸、アルギニンまたはＤ形リシンへの置換、および／または３６位でのアルギニンから、中性アミノ酸、リシンまたはＤ形アルギニンへの置換；
（ｂ）３１位のトリプトファンから、酸化耐性アミノ酸への置換；
（ｃ）以下：
１６位での、ＶからＹへの置換；
１８位での、ＳからＫへの置換；
２１位での、ＥからＤへの置換；
２２位での、ＧからＳへの置換；
２３位での、ＱからＲへの置換；
２４位での、ＡからＲへの置換；および
２６位での、ＫからＱへの置換；
のうちの少なくとも１つに従う置換；
（ｄ）以下：
８位での、Ａから代替的な小中性アミノ酸への置換；
９位での、Ｅから代替的な酸性アミノ酸または中性アミノ酸への置換；
１０位での、Ｇから代替的な中性アミノ酸への置換；および
１５位での、Ｄから代替的な酸性アミノ酸への置換；
のうち少なくとも１つを含む置換
ならびに
（ｅ）７位での、ヒスチジンから、
代替的中性アミノ酸、あるいはヒスチジンのＤアシル化形またはＮアシル化形
あるいはヒスチジンのＤアルキル化形またはＮアルキル化形
への置換、
からなる群より選択される少なくとも１つの改変を含み、
ここで、（ａ）、（ｂ）、および（ｅ）において、該置換されたアミノ酸は、必要に応じて、Ｄ形であり得、そして７位で置換されたアミノ酸は、必要に応じて、Ｎアシル化形またはＮアルキル化形であり得る、ＧＬＰ−１（７−３６）の誘導体またはそのＣ末端アミド形。
【請求項４】
ＧＬＰ−１（７−３７）の誘導体またはそのＣ末端アミド形であって、該誘導体は、
以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）２６位および／または３４位でのリシンから、中性アミノ酸、アルギニンまたはＤ形リシンへの置換、および／または３６位でのアルギニンから、中性アミノ酸、リシンまたはＤ形アルギニンへの置換；
（ｂ）３１位のトリプトファンから、酸化耐性アミノ酸への置換；
（ｃ）以下：
１６位での、ＶからＹへの置換；
１８位での、ＳからＫへの置換；
２１位での、ＥからＤへの置換；
２２位での、ＧからＳへの置換；
２３位での、ＱからＲへの置換；
２４位での、ＡからＲへの置換；および
２６位での、ＫからＱへの置換；
のうちの少なくとも１つに従う置換；
（ｄ）以下：
８位での、Ａから代替的な小中性アミノ酸への置換；
９位での、Ｅから代替的な酸性アミノ酸または中性アミノ酸への置換；
１０位での、Ｇから代替的な中性アミノ酸への置換；および
１５位での、Ｄから代替的な酸性アミノ酸への置換；
のうち少なくとも１つを含む置換
ならびに
（ｅ）７位での、ヒスチジンから、
代替的な中性アミノ酸、あるいはヒスチジンのＤアシル化形またはＮアシル化形
あるいはヒスチジンのＤアルキル化形またはＮアルキル化形
への置換、
からなる群より選択される少なくとも１つの改変を含み、
ここで、（ａ）、（ｂ）、および（ｅ）において、該置換されたアミノ酸は、必要に応じて、Ｄ形であり得、そして７位で置換されたアミノ酸は、必要に応じて、Ｎアシル化形またはＮアルキル化形であり得る、ＧＬＰ−１（７−３７）の誘導体またはそのＣ末端アミド形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１９９０年１月２４日出願の米国特許出願第４６８，７３６号の一
部継続出願である。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、改良された薬学的組成物の分野に関する。詳細には、本発明は、薬
理学的特性が向上した、７〜３６位または７〜３７位のグルカゴン様ペプチドＩ
フラグメントのアナログに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
グルコースの代謝は、インスリン、グルカゴン、およびガストリック・インヒ
ビトリー・ペプチド（ＧＩＰ）を含む多くのペプチドホルモンによって調節され
る。これらのペプチドホルモンがこの代謝を調節する複雑なメカニズム、および
、これらが相互にどのように影響するかについては、少なくともその一部が解明
されている。例えば、グルカゴンは、インスリンを産生する膵臓β細胞の表面の
レセプターに結合し、インスリンの分泌を刺激する。グルカゴン様ペプチドＩが
、インスリンの分泌を刺激すると示唆されているが、これについては確認されて
いない。
【０００４】
これらのホルモンの内の数種類は、哺乳類のグルカゴン前駆体である「プログ
ルカゴン」から生じる。「プログルカゴン」は、１８０個のアミノ酸のペプチド
である。このペプチドのタンパク質分解およびプロセシングにより、これらの多
くのタンパク質ホルモンが得られる。プロセシングの結果は、プロセシングが行
われる細胞の起源に左右される。例えば、ブタおよびラットの膵臓では、プログ
ルカゴンはプロセシングによってグルカゴンとグリセンチン関連膵臓ペプチドと
を形成する。グリセンチン関連膵臓ペプチドは、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２配
列の双方を含む大型のペプチドである。ブタの小腸では、分泌物は、６９個のア
ミノ酸のグルカゴン含有ペプチドグリセンチン、ならびに別のペプチドとしての
２個のグルカゴン様配列、即ちＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２である。
【０００５】
しかし、いずれにしても、プログルカゴンの全配列は、グルカゴンの２９個の
アミノ酸配列、ＧＬＰ−１の３６個または３７個のアミノ酸配列、およびＧＬＰ
−２の３４個のアミノ酸配列を含んでいる。これらの配列間には、アミノ酸スペ
ーサー配列が介在している。
【０００６】
ＧＬＰ−１の活性パターンを解明する初期の試みでは、曖昧な見解が出されて
いたが、これに続いて得られた結論は、このペプチドの切断型が生物学的に活性
であるということである。Ｍｏｊｓｏｖ，Ｓ．らのＪ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ
（１９８７）７９：６１６−６１９は、３１個のアミノ酸ペプチドＧＬＰ−１（
７−３７）のみが膵臓からのインスリン放出を強く刺激することを開示している
。これより以前に、切断型および完全長の３７個のアミノ酸形態の膵臓および腸
での発見はされていた。おそらくはカルボキシ末端がアミド化されたＧＬＰ−１
（７−３６）もまた、インスリン放出の強力なメディエイターである。（例えば
Ｈｏｌｓｔ，Ｊ．Ｊ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８７）２１１：１６
９−１７４を参照のこと）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以下に記載する本発明は、これらのＧＬＰ−１の切断型のアナログに関する。
これらのアナログは、グルコースにより誘導されるインスリン分泌、およびグル
コースにより誘導されるグルカゴン分泌阻害を促進する際の有効性、並びに循環
半減期に関連しており、所望の組み合わせの特徴を備えている。グルコースによ
り誘導されるインスリン分泌を促進する際の切断型の生理学的効果は、Ｈｏｌｓ
ｔ，Ｊ．Ｊ．らおよびＭｏｊｓｏｖ，Ｓら（前出）によって上記のように提示さ
れている。グルカゴン放出阻害における切断型ホルモンの活性については、Ｏｒ
ｓｋｏｖ，ＣらのＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８８）１２３：２００９−２０１
３およびＳｕｚｕｋｉ，Ｓ．らのＤｉａｂｅｔｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ：Ｃｌｉｎ
ｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （１９８８）  ５（付録１）：Ｓ３０に提示され
ている。これらの切断型の循環半減期は短く、ＫｒｅｙｍａｎｎらのＴｈｅ  Ｌ
ａｎｃｅｔ（１９８７年１２月５日）１３００〜１３０３に示されているように
、約４分である。これらの切断型ＧＬＰ−１ペプチドの改変型によって、これら
の特性が最適となる可能性が得られる。
【０００８】
肝臓および血漿中のペプチドホルモンの分解ならびに一般的なインビボでのこ
のようなホルモンの半減期の研究に関して幾つかの文献がある。ＭａｃＤｏｎａ
ｌｄ，Ｊ．Ｋ．らによる初期の文献Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９６９）２４
４：６１９９−６２０８では、ジペプチダーゼがラット肝臓中のグルカゴンの分
解の原因であることが明らかにされた。成長ホルモン放出因子、即ち一般的なグ
ルカゴンのＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２ファミリーのメンバーの研究により、こ
のメンバーが、インビトロで血漿中において急速に分解されること、およびイン
ビボでジペプチダーゼによっても急速に分解されることが明らかにされた（Ｆｒ
ｏｈｍａｎ，Ｌ．Ａ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（１９８６）７８：９０
６−９１３）。Ｍｕｒｐｈｙ，Ｗ．Ａ．らは、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ（１９８８）１：３６−４１において、全てではないが幾つかのアルキル化さ
れた成長ホルモン放出因子ペプチドがインビボでさらに高い有効性を示すことを
明らかにした。特に、例えば、トリイソプロピル化されたＧＲＦー２９は、ＧＲ
Ｆ−２９自体より１０６倍高い活性を示すことが発見された。一方、Ｎ末端がメ
チル化されたＧＲＦ−２９ではその有効性は親の僅か４０％であった。このホル
モンの２位のＤ−Ａｌａの置換によってその有効性が向上することもまた明らか
にされた。特性へのどのような効果によって有効性の向上が得られるのかは、当
然明らかではなかった。
【０００９】
他に、ＧＬＰ−１（７−３７）の幾つかの改変が試みられている。７位のヒス
チジン残基を欠失させるとこのホルモンの活性が大幅に低減されることが明らか
にされている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．ら（前出）；Ｈｅｎｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｋ．ら
、Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，
Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ（１９８８））。１個またはそれ以上のＣ末端欠
失の効果については対立する報告がなされている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．ら（前出
）；Ｙａｎａｉｈａｒａ，Ｃ．ら、Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｆｏｒ  Ａ  Ｇｌｕｃａ
ｇｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  Ｓ
ｙｍｐｏｓｉｕｍ、８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  
ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９８８年７月１５〜１６日、Ｏｓａｋａ
，Ｊａｐａｎ）。しかし、このペプチドホルモンファミリーの他のメンバー、例
えば、ＧＩＰ、グルカゴン放出因子（ＧＲＦ）、セクレチン、およびバソアクテ
ィブ・インテスティナル・ポリペプチド（ＶＩＰ）の改変に関する文献は多い。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプチドを提供し、このペプチ
ドは、島細胞からのインシュリンの放出を刺激するのに、グルカゴンよりも強力
であり、このペプチドは、実質的に、ＧＬＰ−１（７−３４）、ＧＬＰ−１（７
−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１（７−３７）あるいはその
Ｃ末端アミド形態からなり、以下よりなる群から選択される少なくとも１つの改
変を有する：
（ａ）２６位および／または３４位のリシンを、中性アミノ酸、アルギニンま
たはＤ形リシンに置換、および／または３６位のアルギニンを、中性アミノ酸、
リシンまたはＤ形アルギニンに置換；
（ｂ）３１位のトリプトファンを、酸化耐性アミノ酸に置換；
（ｃ）以下の少なくとも１つの置換：
１６位のＶをＹに；
１８位のＳをＫに；
２１位のＥをＤに；
２２位のＧをＳに；
２３位のＱをＲに；
２４位のＡをＲに；および
２６位のＫをＱに；
（ｄ）以下の少なくとも１つを含む置換：
８位のＡを、他の小中性アミノ酸に；
９位のＥを、他の酸性アミノ酸または中性アミノ酸に；
１０位のＧを、他の中性アミノ酸に；および
１５位のＤを、他の酸性アミノ酸に；ならびに
（ｅ）７位のヒスチジンを、他の中性アミノ酸、あるいはＤまたはＮアシル化
またはアルキル化形のヒスチジンに置換、
ここで、（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）において、置換するアミノ酸は
、必要に応じて、Ｄ形であり得、そして７位に置換するアミノ酸は、必要に応じ
て、Ｎアシル化またはＮアルキル化形であり得る。
【００１１】
好ましい実施態様において、本発明は、ＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペ
プチドを提供し、このペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ａ）に記載
されるものであり、２６位および／または３４位のリシンを置換するアミノ酸が
、Ｋ†、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｑ、Ｍ、ＲおよびＲ†からなる群から選択され、
そして３６位のアルギニンを置換するアミノ酸が、Ｋ、Ｋ†、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｌ、
Ｉ、Ｑ、ＭおよびＲ†からなる群から選択され、必要に応じて、上記のもう１つ
の別のパラグラフに記載の改変と組合わされる。
【００１２】
好ましい実施態様において、本発明はＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプ
チドを提供し、このペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ｂ）に記載さ
れるものであり、そして３１位のトリプトファンを置換するアミノ酸が、Ｆ、Ｖ
、Ｌ、Ｉ、ＡおよびＹからなる群から選択され、必要に応じて、上記のもう１つ
の別のパラグラフに記載の改変と組合わされる。
【００１３】
好ましい実施態様において、本発明はＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプ
チドを提供し、このペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ｃ）に記載さ
れるものであり、２２位のＧをＳに置換すること、２３位および２４位のそれぞ
れＱおよびＡをＲに置換すること、ならびに２６位のＫをＱに置換することを組
合せて行ったが、あるいは１６位のＶをＹで置換すること、および１８位のＳを
Ｋで置換することを行ったか、あるいはこれらの置換と２１位のＥをＤで置換す
ることを行っており、必要に応じて、上記のもう１つの別のパラグラフに記載の
改変と組合わされる。
【００１４】
好ましい実施態様において、本発明はＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプ
チドを提供し、このペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ｄ）に記載さ
れるものであり、８位のアラニンを置換する小さい中性アミノ酸が、Ｓ、Ｓ†、
Ｇ、Ｃ、Ｃ†、Ｓａｒ、Ａ†、ｂｅｔａ−ａｌａおよびＡｉｂからなる群から選
択され、そして９位のグルタミン酸を置換する酸性または中性アミノ酸が、Ｅ†
、Ｄ、Ｄ†、Ｃｙａ、Ｔ、Ｔ†、Ｎ、Ｎ†、Ｑ、Ｑ†、Ｃｉｔ、ＭＳＯおよびア
セチル−Ｋからなる群から選択され、そして１０位のグリシンを置換する代替の
中性アミノ酸が、Ｓ、Ｓ†、Ｙ、Ｙ†、Ｔ、Ｔ†、Ｎ、Ｎ†、Ｑ、Ｑ†、Ｃｉｔ
、ＭＳＯ、アセチル−Ｋ、ＦおよびＦ†からなる群から選択され、必要に応じて
、上記のもう１つの別のパラグラフに記載の改変と組合わされる。
【００１５】
好ましい実施態様において、本発明はＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプ
チドを提供し、このペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ｅ）に記載さ
れるものであり、７位のヒスチジンを置換するアミノ酸が、Ｈ†、Ｙ、Ｙ†、Ｆ
、Ｆ†、Ｒ、Ｒ†、Ｏｒｎ、Ｏｒｎ†、Ｍ、Ｍ†、Ｎ−ホルミル−Ｈ、Ｎ−ホル
ミル−Ｈ†、Ｎ−アセチル−Ｈ、Ｎ−アセチル−Ｈ†、Ｎ−イソプロピル−Ｈ、
Ｎ−イソプロピル−Ｈ†、Ｎ−アセチル−Ｋ、Ｎ−アセチル−Ｋ†、ＰおよびＰ
†からなる群から選択され、必要に応じて、上記のもう１つの別のパラグラフに
記載の改変と組合わされる。
【００１６】
好ましい実施態様において、本発明はＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプ
チドを提供し、このペプチドは、以下からなる群から選択される：
（Ｈ†）7−ＧＬＰ−１（７−３７）
（Ｙ）7−ＧＬＰ−１（７−３７）
（Ｎ−アセチル−Ｈ）7−ＧＬＰ−１（７−３７）
（Ｎ−イソプロピル−Ｈ）7−ＧＬＰ−１（７−３７）
（Ａ†）8−ＧＬＰ−１（７−３７）
（Ｅ†）9−ＧＬＰ−１（７−３７）
（Ｄ）9−ＧＬＰ−１（７−３７）
（Ｄ†）9−ＧＬＰ−１（７−３７）
（Ｆ†）10−ＧＬＰ−１（７−３７）
（Ｓ）22（Ｒ）23（Ｒ）24（Ｑ）26−ＧＬＰ−１（７−３７）、および
（Ｓ）8（Ｑ）9（Ｙ）16（Ｋ）18（Ｄ）21−ＧＬＰ−１（７−３７）。
【００１７】
本発明は、ＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプチドを提供し、このペプチ
ドは、ＧＬＰ−１（７−３７）と比較して、プラズマ中での分解耐性が向上して
おり、このペプチドは、実質的に、ＧＬＰ−１（７−３４）、ＧＬＰ−１（７−
３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１（７−３７）、あるいはその
Ｃ末端アミド形からなり、以下からなる群から選択される少なくとも１つの改変
を有する：
（ａ）７位のヒスチジンを、Ｄ形中性または酸性アミノ酸、あるいはＤ形ヒス
チジンに置換；
（ｂ）８位のアラニンを、Ｄ形アミノ酸に置換；および
（ｃ）７位のヒスチジンを、Ｎアシル化（１−６Ｃ）またはＮアルキル化（１
−６Ｃ）形態の代替アミノ酸またはヒスチジンに置換。
【００１８】
好ましい実施態様において、本発明はＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプ
チドを提供し、このペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ａ）に記載さ
れるものであり、７位のヒスチジンを置換するＤ形アミノ酸が、Ｐ†、Ｄ†、Ｅ
†、Ｎ、Ｑ†、Ｌ†、Ｖ†、Ｉ†およびＨ†からなる群から選択され、必要に応
じて、上記のもう１つの別のパラグラフに記載の改変と組合わされる。
【００１９】
好ましい実施態様において、本発明はＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプ
チドを提供し、このペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ｂ）に記載さ
れるものであり、８位のＤ形アミノ酸が、Ｐ†、Ｖ†、Ｌ†、Ｉ†およびＡ†か
らなる群から選択され、必要に応じて、上記のもう１つの別のパラグラフに記載
の改変と組合わされる。
【００２０】
好ましい実施態様において、本発明はＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプ
チドを提供し、このペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ｃ）に記載さ
れるものであり、アルキル化またはアセチル化アミノ酸が、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ
、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＫおよびＨからなる群から選択され、必要に応じて、上記のもう
１つの別のパラグラフに記載の改変と組合わされる。
【００２１】
さらに好ましい実施態様において、本発明は、ＩＩ型糖尿病の治療に有用な薬
学組成物を提供し、この組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤と混合された形の
、上記ペプチドの有効量を含む。
【００２２】
別の好ましい実施態様において、本発明は、ＩＩ型糖尿病の治療方法を提供し
、この方法は、このような治療を必要とする被検体に、上記のペプチドまたはそ
の薬学組成物を有効量投与することを包含する。
【００２３】
好ましい実施態様において、本発明はＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプ
チドを提供し、このペプチドは、以下からなる群から選択される：
（Ｈ†）7−ＧＬＰ−１（７−３７）、
（Ｎ−アセチル−Ｈ）7−ＧＬＰ−１（７−３７）、
（Ｎ−イソプロピル−Ｈ）7−ＧＬＰ−１（７−３７）、
（Ｎ−アセチル−Ｋ）7−ＧＬＰ−１（７−３７）、および
（Ａ†）8−ＧＬＰ−１（７−３７）。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、７−１０位でアミノ酸が置換されており、および／またはＣ末端が
切断され、および／または基本のペプチド中に様々な他のアミノ酸置換を含む活
性ＧＬＰ−１ペプチド、７−３４、７−３５、７−３６および７−３７の有効な
アナログを提供することによって、ＩＩ型糖尿病の治療に対して改良された特徴
を有する活性ＧＬＰ−１ペプチド、７−３４、７−３５、７−３６および７−３
７の有効なアナログを提供する。本発明のアナログは、グルカゴンと比較して、
インシュリン生産を刺激する能力が向上し、ＧＬＰ−１（７−３７）と比較して
プラズマ中での安定性が向上され得るか、あるいはその両方であり、７および８
位にＤ形アミノ酸置換、および／または７位にＮアルキル化またはＮアシル化ア
ミノ酸を有するアナログは、インビボにおいて、特に分解耐性である。このよう
な特性は、治療薬としてのアナログの能力を向上させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（発明の開示）
本発明は、ＧＬＰ−１（７−３４）；（７−３５）；（７−３６）もしくは（
７−３７）ヒトペプチドの改変型またはこれらのＣ末端がアミド化された形態の
改変型を提供する。天然ペプチドは、
【００２６】
【化１】
2004196825.tif 000002
【００２７】
のアミノ酸配列を有しており、この配列中の（Ｇ）、（Ｒ）および（Ｇ）が存在
するかどうかは、指示された鎖長による。
【００２８】
改変型では、天然の構造に１箇所またはそれ以上の改変が加えられており、治
療に有用な能力が向上している。これらの改変型では、グルカゴンよりもインス
リン分泌を促進するための有効性が高いか、もしくは血漿中での安定性が向上し
ているか、またはその両方である。この有効性および向上した安定性は、以下に
記載するように分析され得る。
【００２９】
アミノ酸には標準一文字略記コードを使用する。
【００３０】
インスリン刺激特性の向上を呈する本発明のアナログは、前記の配列またはそ
のＣ末端アミド化物に、以下からなる群から選択される少なくともひとつの改変
を加えた配列を有する：
（ａ）２６位および／もしくは３４位のリシンを、中性アミノ酸、アルギニン
もしくはＤ型のリシンに、ならびに／または３６位のアルギニンを中性アミノ酸
、リシンもしくはＤ型のアルギニンに置換；
（ｂ）３１位のトリプトファンを耐酸化性アミノ酸に置換
（Ｃ）以下の内の少なくともひとつの置換：
１６位のＶをＹに；
１８位のＳをＫに；
２１位のＥをＤに；
２２位のＧをＳに；
２３位のＱをＲに；
２４位のＡをＲに；および
２６位のＫをＱに；
（ｄ）以下の内の少なくともひとつの置換：
８位のＡを他の小型中性アミノ酸に；
９位のＥを他の酸性アミノ酸または中性アミノ酸に；
１０位のＧを他の中性アミノ酸に；および
１５位のＤを他の酸性アミノ酸に；ならびに
（ｅ）７位のヒスチジンを、他の中性アミノ酸、あるいはＤあるいはＮアシル
化またはＤあるいはＮアルキル化型のヒスチジンに置換。
【００３１】
（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）の改変に関しては、置換するアミノ酸は
、Ｄ型であり得る。これは、例えばＣ†などのように上付き文字†で示される。
７位において置換するアミノ酸はＮアシル化またはＮアルキル化型でもあり得る
。
【００３２】
したがって、本発明は、そのひとつの局面において、上記のように、向上した
インスリン刺激特性を有し、上述のＧＬＰ−１（７−３４）からＧＬＰ−１（７
−３７）までの切断型と相同性のあるペプチドに関する。
【００３３】
他の局面においては、本発明は、ＧＬＰ−１（７−３７）と比較して、血漿中
での耐分解性が向上したペプチドに関する。この向上した耐分解性は、以下に記
載のように定義される。
【００３４】
これらのアナログでは、上記の切断型のＧＬＰ−１（７−３４）からＧＬＰ−
１（７−３７）またはこれらのＣ末端アミド化型の内の何れかが、以下のように
改変される。
【００３５】
（ａ）７位のＨをＤ中性もしくはＤ酸性アミノ酸に置換、または
（ｂ）８位のＡをＤアミノ酸に置換、または
（ｃ）上記の双方の置換、または
（ｄ）７位のＨを任意の自然のアミノ酸のＮアシル化型もしくはＮアルキル化
型に置換。
【００３６】
したがって、耐分解性を有する本発明のアナログとしては、（Ｎ−アシル（１
−６Ｃ）ＡＡ）７ＧＬＰ−１（７−３７）および（Ｎ−アルキル（１−６Ｃ）Ａ
Ａ）７ＧＬＰ−１（７−３７）がある。ここでＡＡは、リシル残基であり、１つ
または両方の窒素がアルキル化またはアシル化され得る。ＡＡは、インスリン刺
激活性の保持に対応する任意のアミノ酸を示す。
【００３７】
７位および８位のＤ型アミノ酸の置換には、任意の酸性または中性アミノ酸の
Ｄ残基を７位に、そして、任意のアミノ酸のＤ残基を８位に使用し得る。これら
もまた、インスリン刺激活性に対応するものである。７位および８位の何れか一
方または両方をＤアミノ酸に置換することができる；７位のＤアミノ酸を上記の
ようにアシル化またはアルキル化することもできる。これらの改変型は、上記の
ように、ＧＬＰ−１（７−３７）だけではなく、さらに短い切断型のアナログに
も適用可能である。
【００３８】
他の局面では、本発明は、１種類またはそれ以上のこれらのペプチドを活性成
分として含む薬学的組成物、およびこれらのペプチドまたはその組成物を用いて
ＩＩ型糖尿病を治療する方法に関する。
【００３９】
（発明を実施するための形態）
本発明のアナログは、ＧＬＰ−１（７−３４）、（７−３５）、（７−３６）
または（７−３７）の改変型であって、その特徴は、培養物中の単離されたラッ
ト島細胞からのインスリン放出を測定するインビトロでのアッセイでグルカゴン
よりも高い有効性を呈すること、もしくは、血漿中での安定性の向上を示すこと
、またはこれらの両方である。
【００４０】
（向上したインスリン放出刺激特性を有するアナログのアッセイ）
本発明のアナログのひとつのグループは、島細胞からのインスリン放出を刺激
するに際してグルカゴンよりも強力である。「島細胞からのインスリン放出を刺
激するのにグルカゴンよりも強力」であるとは、言及するアナログが、以下の記
述から選択されるインビトロでのアッセイにおいて、より高い有効性を呈するこ
とを意味する：これらのアッセイのためのラット島は、本明細書に援用されるＳ
ｕｔｔｏｎ，Ｒ．らのＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９８６）４２：６８
９−６９１に記載の方法によって単離される。簡潔に記載すれば、ＳＤ雄ラット
に麻酔をかけて、その総胆管の下端に、適切な位置に固定した２ＦＧカニューレ
を挿入する。次に、膵管の胆管ツリー（ｂｉｌｉａｒｙ  ｔｒｅｅ）への入口領
域の上方で左右の肝管を各々別個に結紮する。ラットを放血により殺して、７．
５ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液および１〜６ｍｇ／ｍＬのＩ
型コラゲナーゼを含有する３ｍＬのハンクス液を、カニューレ中に流入させて、
膵臓を均一に膨張させる。次いで、膵臓を摘出し、氷上のビーカーに入れた後に
、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を含有するハンクス液中で３７℃にてインキュベ
ーションを行う。
【００４１】
インキュベーションを１３〜２５分間行った後に、膵臓を取り出し、５ｇ／ｌ
のウシ血清アルブミンおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を含有する４℃のハン
クス液中に入れる。
【００４２】
そして、全ての膵臓組織を１４ＦＧ針を用いて静かにシリンジにとり、さらに
、ＨＥＰＥＳを上記のように含有するハンクス液中に懸濁させて、１０秒間５０
ｇで遠心分離した後に、上澄みを廃棄する。この組織ペレットを再度懸濁させて
、再度静かに、シリンジにとり、その後さらに洗浄を行う。その後に、分散した
組織を孔サイズ５００μのナイロンメッシュフィルターを通過させる。濾過した
組織を３５０ｇで５秒間遠心分離し、上澄みを廃棄した後に、この組織を、ＨＥ
ＰＥＳを上記のように含有するハンクス液に溶解して得た２５％のフィコール中
に懸濁させる。このフィコール溶液には、２３％、２０％および１１％の不連続
密度勾配の層が形成される。この密度勾配層を４℃にて１０分間７５０ｇで回転
させる。そして、上の２つの界面から得られる組織をハンクス液中で３回洗浄し
た後に、切開用の顕微鏡で見て、島を手操作で採取する。
【００４３】
ひとつの方法では、次に、これらの島からの分泌を促進するＧＬＰ−１アナロ
グの能力を、本明細書に援用される、Ｓｃｈａｔｚ，Ｈらの“Ｍｅｔｈｏｄｓ  
ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”（１９８４）のＶｏｌｕｍｅ  １
、Ｐａｒｔ  Ｃ：２９１〜３０７ページに記載の方法によって決定する。この方
法では、１本の試験管当り５個〜１０個の島を１ｍＬのクレブス−リンガー−バ
イカーボネート緩衝液（ＫＲＢ緩衝液）中でインキュベートする。試験を行うた
めに、グルカゴンまたは本発明の改変型アナログを５〜１０μｇ／ｍＬの割合で
加える。放出されたインスリンのレベルは、本明細書に援用されるＪｅｎｓｅｎ
，Ｓ．Ｌ．らのＭ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９７８）２３５：Ｅ３８１−Ｅ３８
６に記載の方法で測定され得る。
【００４４】
以下のプロトコールは、インスリン分泌刺激を測定するのに好ましい方法であ
る。コラゲナーゼ消化の後に、島を、ＤＭＥＭ（ダルベッコの変法イーグル培地
、１６ｗ／ｏグルコース）、２．８ｍＭグルコースおよび１０％のウシ胎児血清
（ＦＢＳ）中で、５％のＣＯ２存在下で、３７℃にて一晩インキュベートするこ
とにより、回収した。
【００４５】
翌日、実験に使用する島を、グルコースを含まず、０．２％のＢＳＡ（Ａｒｍ
ｏｕｒ、臨床グレード、５％ストックで作製）を含有するＤＭＥＭに移し、血清
およびグルコースを含まない培地で６０分間プレインキュベートした。エッペン
ドルフピペットを用いて小島を採取し、８．０ｍＬの培地を含有する６０ｍｍの
ＴＣプレートに移して、インキュベーターに戻して６０分間インキュベートする
。この島を移す際に、その数を数える。（注：各データ点は、５個の島によるも
のであり、通常各４回の実験を行う。したがって、各データ点に対して２０個の
島を使用する。）典型的には、各膵臓に対して１５０〜２００個の小島を回収す
る。疑わしい島（崩れすぎているかまたは崩壊したもの）は使用されない。
【００４６】
この６０分のプレインキュベーションの間に、実験準備を行うため、プレイン
キュベーション終了時には、島を５個づつのグループにして実験条件下に移すだ
けでよい。実験の準備は、４８個のウェルを有するＴＣプレートにおいて各ウェ
ルにつき０．５ｍＬの培地を用いて行う。０．２％のＢＳＡを含有するＤＭＥＭ
に、グルコースを所望の濃度になるように（通常低血糖条件で２．８ｍＭ、中血
糖で５．６ｍＭのグルコース、または高血糖で１６．７ｍＭのグルコース）加え
、さらに、試験化合物を種々の用量範囲（典型的には１ｐＭ〜１００ｎＭ）で加
える。試験化合物を、−８０℃で保存されたストックから、０．２％のＢＳＡを
含有する燐酸緩衝塩水（ＰＢＳ）で〜０．３ｍＭまで系列希釈する。これは、管
の側面上における損失を防止するためである。培地と試験化合物とを混合した後
に、各４回の実験によるデータ点を得るための４個のウェルの各々に０．５ｍＬ
を加える。
【００４７】
プレインキュベーション期間終了後、各ウェルに５個の島を加える。島を容量
２５μｌでエッペンドルフピペットを用いて採取する。インキュベーションをさ
らに６０分間継続し、その時点で、島を取り出さないように注意深く各ウェルか
ら０．３ｍＬを採取する。そして、ウェルを再度調べて、島の数を確認する。次
に、インスリン含有量を調べるためにインスリンＲＩＡを用いて培地をアッセイ
する。培地を直ちにアッセイしない場合には、アッセイ時までー２０℃で保存さ
れる。インスリン分泌に対する用量応答曲線を作成して、これらの曲線からＥＤ
５０を計算する。
【００４８】
グルカゴンより高い有効性の定義は、同じ濃度のグルカゴンとアナログとを用
いた場合にアナログからのインスリン放出レベルの方が高いこと、あるいは、グ
ルカゴンよりも低濃度のアナログを用いた場合に同じインスリン放出レベルが得
られることであるとされる。
【００４９】
上記のアッセイは、向上した有効性の判断のために特異的な基準を提供するが
、上記のものに代わる他のアッセイを使用することもできる。
【００５０】
本発明の化合物の有効性を調べる追加の試験では、ＲＩＮ１０４６−３８細胞
中のｃＡＭＰ産生を刺激するこれらの化合物の能力を測定する。このアッセイは
、以下のように行われ得る。
【００５１】
第１日目に、５×１０５のＲＩＮ１０４６−３８細胞（Ｄｒｕｃｋｅｒ，Ｄ．
Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８７）８４：３
４３４−３４３８）を、２．５ｍＬのＭ１９９培地を入れた６個のウェル付きの
ディッシュの各ウェルに植え付ける。第４日目に、細胞に新しい培地を与えて、
第５日に、アッセイを行う。
【００５２】
この時、各ウェルには〜２．０〜２．５×１０6個の細胞が存在する。アッセ
イは、継代が２４回以下の細胞でのみ行われる。
【００５３】
開始６０分前に、単分子層を２．５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、培地を、４．
５ｇ／ｌのグルコースおよび０．１％のＢＳＡを加えたＤＭＥＭ培地（アッセイ
培地）１．０ｍｌに変える。開始０時の時点で、培地を吸引して、試験化合物を
含有する１．０ｍＬの新しいアッセイ培地を加える。試験化合物は、０．１％の
ＢＳＡを加えた５０μｌのＰＢＳ中に加えられ、コントロールは賦形剤のみに加
えられる。インキュベーションを０〜６０分間継続する。
【００５４】
終了時に、馴化培地および単分子層を採取して、細胞内および細胞外のｃＡＭ
Ｐ含有量を測定する。細胞外測定では、培地を取り出して遠心分離し、細胞残留
物を全て除去する。細胞内測定では、培地を取り出した後に、１．０ｍＬの氷冷
９５％エタノールを単分子層に加える。細胞をかき取って回収し、液体Ｎ２を用
いて２回の高速凍結／解凍サイクルにより溶解させる。次いで遠心分離によって
細胞残留物を除去する。馴化培地の等分量部分（ウェルの内容量の１／４０）お
よびエタノールによる細胞抽出物について、ＲＩＡキットを用いてアセチル化プ
ロトコールにより２回測定を行い、ｃＡＭＰレベルを調べる。
【００５５】
上記と同様に、グルカゴンより高い有効性の定義は、同じ濃度のアナログおよ
びグルカゴンを用いた場合に高いｃＡＭＰ刺激が得られること、または、アナロ
グの濃度をより低くした場合に同じｃＡＭＰ刺激が得られることとされる。
【００５６】
インスリン放出を媒介する向上した有効性を測定するための他のアッセイが、
使用され得る。
【００５７】
インスリン放出を促進する化合物の能力は、インビトロおよびインビボの両方
で試験され得る。放出されたインスリンを標準抗体アッセイを用いて検出できる
。このアッセイは、インビボでの研究で血漿を分析すること、および、インビト
ロで培地または潅流液を分析することによって行う。
【００５８】
例えば、有用なインビトロでのアッセイに、Ｐｅｎｈｏｓ，Ｊ．ＣらのＤｉａ
ｂｅｔｅｓ（１９６９）１８：７３３−７３８に記載の膵臓温浸アッセイ法（ｐ
ａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｅｄ）が使用さ
れる。これは、Ｗｅｉｒ，Ｇ．Ｃ．らのＪ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｒｓｔｉｇａｔ
（１９７４）５４：１４０３−１４１２に記載の方法で使用されているように行
われる。インスリン分泌は、Ｈｏｌｓｔ，Ｊ．Ｊ．らのＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ（１９８７）２１１：１６９−１７４（前出）に記載の方法によっても測定さ
れ得る。インスリン刺激効果を調べるアッセイとして有用なものとして、ＲＩＮ
１０４６−３８細胞系中のアデニル酸シクラーゼ刺激の測定がある。Ｄｒｕｃｋ
ｅｒ，Ｄ．Ｊ．らのＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８７
）８４：３４３４−３４３８（前出）。
【００５９】
グルカゴン放出の阻害は、Ｏｒｓｔｏｖ，ＣらのＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９
８８）１２３：２００９−２０１３；Ｓｕｚｕｋｉ，ＳらのＤｉａｂｅｔｅｓ  
Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８８）５（付録
１）：Ｓ３０（双方とも前出）に記載のように、明らかにされ得る。
【００６０】
（分解に対する向上した安定性を調べるアッセイ）
本発明のＧＬＰ−１アナログの治療効率は、アナログのインビボでの半減期を
増加させることによっても向上させ得る。「増加したインビボでの半減期」とは
、以下に記載のものからなる群から選択されるアッセイに従って血漿存在下での
分解に耐えると実証された能力を意味する。全てのアッセイにおいて、血液をヘ
パリン処理した管に集めて、これらの管を氷上に静置し、約３，０００ｒｐｍで
１０分間、卓上遠心分離機で遠心分離することによって、血漿を調製する。単離
した血漿を４℃で保存する。
【００６１】
（Ａ．ラジオラベルシーケンシング）
ＧＬＰアナログを、標準ラジオラベリング法を用いて、１９位における放射性
ヨウ素化によって標識する。ＲＩＡ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４のＮａＨＰＯ
4、０．２５％のＢＳＡ（ＡｒｍｏｕｒインスリンおよびＦＦＡを含まない）、
０．５％のＢＭＥ、０．００２％のポリリシン（Ｓｉｇｍａ  １５．０００ｍｗ
）、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、および０．１％のＮａＮ3）に移した後に、
放射性ヨウ素化ペプチド（約１０5ｃｐｍ／５０ｍＬ）およびコールド（放射性
物質を含まない）非ヨウ素化ペプチド（２０μｌ  １００ｎＭ）を、２ｍｌの血
漿に加えて、最終的に濃度を１ｎＭとして、循環水浴中で所定の時間インキュベ
ートする。血漿に加えたＲＩＡバッファーの総量は、必ず総体積の５％以下であ
る。インキュベーション終了時に、水中の１０％のバシトラシン（ｗ／ｖ）を最
終濃度が０．１％になるように加えて反応を停止させる。
【００６２】
次に、Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋを用いてこの血漿を抽出して、血漿タンパク質の
バルクからアナログと全てのフラグメントを分離する。Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリ
ッジ（Ｗａｔｅｒｓ）を、２ｍＬの１−プロパノールで洗浄し、次いで２ｍＬの
水で洗浄して、その後に、２ｍＬの、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を
含有する２０％のＣＨ3ＣＮ（緩衝液Ａ）で平衡化する。
【００６３】
バシトラシンで処理された血漿を、０．１％のＴＦＡを含有するＣＨ3ＣＮを
用いて２０％のＣＨ3ＣＮで得る。そして、これを３ｍＬのプラスチック注射器
を介してカートリッジを通して穏やかに通過させる。次に、カートリッジを、１
ｍＬの緩衝液Ａを各々洗浄液として用いて２回洗浄し、そして、２ｍＬの、０．
１％ＴＦＡを含有する５０％ＣＨ3ＣＮ（緩衝液Ｂ）を洗浄液として用いて溶出
し、これを、シリコーン処理をした１２×７５のガラス管に流入させる。アナロ
グまたはフラグメントの回収率は、９０％を越える。
【００６４】
溶出液を、Ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ中で１００μｌまで濃縮して、もとの管の１ｍ
ＬのＲＩＡ緩衝液の洗浄液を加えた１．５ｍＬのエッペンドルフ管に移す。
【００６５】
ＧＬＰ−１（７−３７）のアナログを使用する場合に任意のアナログまたはそ
のフラグメントを精製するために、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１（７−３７）を認識
するがＧＬＰ−１（７−３６）を認識しない、２４〜３７位の残基に対応する合
成ペプチドに対して調製された、５μｌの抗血清で濃縮物を、処理する。より短
い型のアナログを使用する場合には、他のカルボキシ末端特異的抗血清（同様に
して調製されるが、免疫原として２４〜３４位、２４〜３５位または２４〜３６
位の残基に対応するペプチドが用いられる）を使用する。これに、ＰＢＳ中に１
０％（ｗ／ｖ）のタンパク質Ａ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を溶解し
た１００μｌの溶液を加え、この混合物を静かに揺り動かしつつ４℃にて一晩か
けてインキュベートした。次いで、セファロースを、エッペンドルフ遠心分離機
中で５秒間４℃にて回転させて、ペレット状にして、その後にこのペレットを、
冷ＲＩＡ緩衝液を用いて２回、冷ＰＢＳを用いて４回洗浄する。
【００６６】
ニュージーランドホワイトラビットの体内で、ＧＬＰ−１（７−３７）の２４
〜３７位の残基に対応する合成ペプチドフラグメントに対するポリクローナル抗
体を誘起させた。この誘起には、Ｍｏｓｊｏｙ，ＳらのＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ
（１９８６）２６１：１１８８０−１１８８９に記載の方法を用いた。初期免疫
感作を、鼠径部リンパ節中に行い、完全フロイントアジュバントを使用した。初
期免疫感作の後に、１週間毎に皮下追加免疫注射（ｂｏｏｓｔｓ）を２回行い、
不完全フロイントアジュバントを使用した。１回の免疫感作または追加免疫注射
のために、１００μｇのペプチドおよび１００μｇのメチル化されたＢＳＡを０
．３ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解し、これを０．９ｍＬのア
ジュバントで乳化させた。初期免疫感作から６週間後に、採血（５０ｍＬ）を開
始し、その後、１ヶ月ごとに行った。力価が前回の採血時に比べて顕著に低下し
た場合には、追加免疫注射を再度上記のように行った。
【００６７】
血液を４℃で一晩かけて凝結させることによって、血清を調製した。血餅を、
２０００ｇで１５分間遠心分離することによってペレット状にして、血清を取り
出した。血清を、各々同じ量になるように分割し、−２０℃または−８０℃で保
存する。
【００６８】
次に、各１００μｌの緩衝液Ｂの洗浄液を用いて、抗体タンパク質−Ａセファ
ロース複合体からのペプチドの溶出を３回行う。次に、全体で３００μｌとなっ
た洗浄液をＡＢＩ型４７７Ａシーケンサーに直接かける。シーケンサーは、製造
者の指示書に従って使用される。その後、各サイクルで得られる画分を取って、
カウントを行う。カウントは、４ｍＬのシンチレーション水溶液（ＡＣＳ，Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）中で行われ得る。
【００６９】
標識が出現するサイクルは、Ｎ末端からの分解の程度を示す。ＧＬＰ−１（７
−３７）アナログにおいてＮ末端からの分解が生じない場合には、１９位のチロ
シンに対応する１３番目のサイクルで全ての標識が出現する。分解が生じると、
標識はこれより前のサイクルに出現する。
【００７０】
（Ｂ．ＲＰ−ＨＰＬＣによるアッセイ）
上記の方法は、血漿中でのより長い半減期を示すための明らかな基準となるが
、この特性を調べるための他のアッセイ形態を使用することもできる。ある好適
なアッセイでは、逆相−ＨＰＬＣを使用してアナログを分析することによってフ
ラグメントへの分解を調べることができる。なぜならば、フラグメントがアナロ
グ自体とは異なる保持時間を有するからである。このアッセイでは、アナログを
血漿中に加え、これを放置する時間を様々に変えて、ラジオラベルシーケンシン
グ分析に使用される上記の方法と類似の態様でアナログを回収する。具体的には
、ＲＩＡ緩衝液中の１００ｎＭの濃度のアナログを１ｍＬの血漿中に入れて、最
終的な濃度を１ｎＭとし、これを３７℃の循環水浴中で設定時間を様々に変えて
インキュベートする。その後に、血漿をバシトラシン中で濃度０．１％（ｗ／ｖ
）にすることによって、反応を停止させる。
【００７１】
次いで、ペプチドを上記のようにＳｅｐ−Ｐａｋ抽出によって精製する。溶出
液をＳｐｅｅｄ−ｖａｃ上で約１ｍＬまで濃縮し、１ｍＬの蒸留水で希釈し、８
０℃で凍結させて、一晩凍結乾燥させる。この粉体を、１ｍＬの出発血漿当り０
．５ｍＬの緩衝液Ｃ（０．１％のＴＦＡ水溶液）中で、再度懸濁させた後に、０
．２５ｍＬをＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  １０９ＯＬ液体クロマトグラフ
上に注入する。液体クロマトグラフには、Ｂｒｏｗｎｌｅｅの２ｃｍのＣ１８ガ
ードカラムと共にＡｌｌｔｅｃｈ  Ｃ１８カラム（０．４５×２５ｃｍ；粒径１
０μｍ）を使用する。実験中ずっとＯＤ２１４において抽出をモニターする。溶
媒の流速は１ｍＬ／分であった。緩衝液Ｃと緩衝液Ｄ（アセトニトリル中の０．
１％のＴＦＡ）との間の勾配を４０分間の実験時間に渡って設定する。勾配は、
開始時に３５％Ｄとし、注入後２分間はこれを維持し、その後の２４分間で４２
％Ｄまで増加させる。勾配を、次の２分間で６０％Ｄまで増加させて、２分間こ
のレベルを維持し、その次の２分間で３５％Ｄに戻す。実験の残りの８分間は３
５％Ｄに維持する。各実験の最初の３０分間に、画分を０．５分毎に回収して、
Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ中で乾燥する。試料を、ＲＩＡ（Ｃ末端特異的抗血清に対す
る結合のための、標識されたＧＬＰ−１（７−３７位）との競合を測定する）に
よって、または、従来のもしくは好適な他の何れかの方法で分析して、アナログ
またはフラグメントの存在を調べることができる。
【００７２】
ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ末端もしくはカルボキシル末端を調べるため
のラジオイムノアッセイでは、シングルの抗体置換フォーマットを使用する。抗
体への１２５ＩーＧＬＰー１（７−３７）の結合が、溶液中の非標識ペプチドの
濃度を増加させることによって、徐々に置換される。抗体と結合したヨウ素化ペ
プチドを、溶液中の遊離ヨウ素化ペプチドから分離する。この分離は、Ｐａｎｓ
ｏｒｂｉｎＴＭ（Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて抗体−ペ
プチド複合体を沈澱させることによって行われる。次いで、得られたペレットを
、γカウンタによってカウントする。
【００７３】
（Ｃ．Ｎ末端特異的抗体との結合の消失）
血漿中での半減期を評価する第３の方法では、ポリクローナルもしくはモノク
ローナル抗体が用いられる。これらの抗体は、Ｎ末端に対して特異的に調製され
、分解したアナログには結合しない。これらの抗血清は、ＧＬＰ−１（７−２２
）に対応する合成ペプチドに対して誘起された。このＧＬＰ−１（７−２２）は
、カルボキシル末端に付加的なシステイン残基を含有し、しかも、このシステイ
ンを介してＫＬＨに特異的に結合する。この結合は、Ａｌｄｗｉｎ，Ｌ．らのＡ
ｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８７）１６４：４９４−５０１に記
載されているように、ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＳＮＡを用いて行われる。ポリクロー
ナル抗体は、ニュージーランドホワイトラビットの体内で生成された。この生成
のために、完全フロイントアジュバントで乳化させた５００μｇの複合体を用い
て一次免疫感作を鼠径部リンパ節中に行い、その後に、２週間毎に不完全フロイ
ントアジュバント中の各２００μｇの追加免疫注射を２回行った。その後に、１
ヶ月毎に採血（５０ｍＬ）を行い、力価が低い場合には、追加免疫注射を行う。
モノクローナル抗体の生成では、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０．５ｍｌの完全フロ
イントアジュバント中の２００μｇの複合体を腹膜を介して注入して免疫処置し
た。０．５ｍｌの不完全フロイントアジュバント中の１００μｇの複合体を隔週
でマウスに追加免疫注射した。これらのマウスの脾臓から単離した細胞をＦｏｘ
−ＮＹ細胞と融合させて、モノクローナル細胞系を産生した。モノクローナル分
泌細胞系は、標準ケーラー−ミルシュタイン技術を用いて産生される。モノクロ
ーナル上澄みおよびポリクローナル血清を、ＥＬＩＳＡ法を用いてふるい分けす
ることによって、ＧＬＰ−１（７−３７）と結合しているがＧＬＰ−１（８−３
７）と結合していないものを得る。この特異性は、標準溶液相ＲＩＡによって確
認される。
【００７４】
ＧＬＰ−１（７−３７）の分解速度の評価を、ＲＩＡ緩衝液中のヒト血漿にこ
のアナログを加えることによって行う。一般に、１００倍に濃縮された１０μＬ
のペプチドを１ｍＬの血漿に加えて所望の濃度とする。次いで、この試料を３７
℃の湯浴中でインキュベートし、様々な時点で各５０μＬの試料部分を３回づつ
取り出す。これらの試料部分を、直ちにエタノールを用いて沈澱させて、ラジオ
イムノアッセイを行う。ラジオイムノアッセイでは、Ｎ末端特異的抗体の、放射
性ヨウ素化されたＧＬＰ−１（７−３７）との結合のための競合を用いる。放射
性ヨウ素化されたＧＬＰ−１（７−３７）ペプチドと競合する能力の消失は、ア
ナログの分離を示す。
【００７５】
これらの何れのアッセイにおいても、試験されるアナログの分解速度がＧＬＰ
−１（７−３７）に比べて小さい場合には、そのアナログは向上した安定性を有
している。
【００７６】
（アナログ）
本発明のアナログは、グルカゴンに比べて高い有効性を有するか、あるいは向
上した耐分解性を有しており、ＧＬＰ−１（７−３４）からＧＬＰ−１（７−３
７）の改変型である。これらのアナログのいくつかの例では、あるクラスのアミ
ノ酸が天然の残基の代わりに置換される。
【００７７】
アミノ酸残基は、以下のように、および図１に示すように、一般的に４つの主
要なサブクラスに分類され得る。
【００７８】
酸性：この残基は生理学的ｐＨにおいてＨイオンが消失しているために負の電
荷を有する。この残基を含むペプチドが生理学的ｐＨで水性溶媒中に存在してい
る時には、この残基はペプチドのコンフォメーション中の表面位置を求めて水溶
液側に引き付けられる。
【００７９】
塩基性：この残基は生理学的ｐＨにおいてＨイオンと結合しているために正の
電荷を有する。この残基を含むペプチドが生理学的ｐＨで水性溶媒中に存在して
いる時には、この残基はペプチドのコンフォメーション中の表面位置を求めて水
溶液側に引き付けられる。
【００８０】
中性／非極性：これらの残基は生理学的ｐＨにおいて帯電していない。この残
基を含むペプチドが水性溶媒中に存在している時に、この残基はペプチドのコン
フォメーション中の内側の位置を求めて水溶液と反発する。これらの残基は、本
明細書中では「疎水性」とも称する。
【００８１】
中性／極性：これらの残基は生理学的ｐＨにおいて帯電していない。しかし、
この残基を含むペプチドが水性溶媒中に存在している時には、この残基はペプチ
ドのコンフォメーション中の外側の位置を求めて水溶液側に引き付けられる。
【００８２】
個々の残基分子の統計的な集合の中には、帯電しているものも帯電していない
ものもあり、水性溶媒に引き付けられるかまたはこれと反発する程度が大きい場
合あるいは小さい場合があることは、当然理解されるものである。「帯電してい
る」の定義に適合するには、かなりの割合（少なくとも約２５％）の個々の分子
が生理学的ｐＨで帯電している。極性または非極性の分類に必要な引き付けまた
は反発の程度は任意のものであり、したがって、本発明により特異的に考案され
たアミノ酸は、極性または非極性の何れかに特異的に分類された。特に挙げられ
ていない殆どのアミノ酸は、既知の性質に基づいて分類され得る。
【００８３】
アミノ酸残基は、さらに、環式または非環式、芳香族または非芳香族、および
小型または大型として分類される。環式または非環式、および芳香族または非芳
香族という分類は、残基の側鎖置換基に関する独特な分類である。残基が、カル
ボキシルの炭素を含む合計４個以下の炭素原子を含有する場合には、小型と考え
られる。小型の残基は、当然、常に非芳香族である。
【００８４】
天然のタンパク質アミノ酸については、上記の理論大系に従う下位分類は以下
の通りである（図１も参照のこと）。
【００８５】
酸性：アスパラギン酸およびグルタミン酸；
塩基性／非環式：アルギニン、リシン；
塩基性／環式：ヒスチジン；
中性／極性／小型：グリシン、セリンおよびシステイン；
中性／極性／大型／非芳香族：トレオニン、アスパラギン、グルタミン；
中性／極性／大型／芳香族：チロシン；
中性／非極性／小型：アラニン；
中性／非極性／大型／非芳香族：バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニ
ン；
中性／非極性／大型／芳香族：フェニルアラニンおよびトリプトファン。
【００８６】
遺伝子にコードされたアミノ酸プロリンは、技術的には中性／非極性／大型／
環式および非芳香族のグループに入る。しかし、ペプチド鎖の２次コンホメーシ
ョンへのこのアミノ酸の既知の効果のために特殊なケースとなり、したがって、
この特定の定義されたグループには入らない。
【００８７】
ある種のよく見られるアミノ酸は、遺伝子コードでコードされない。
【００８８】
このようなアミノ酸としては、例えば、β−アラニン（β−ａｌａ）、または
３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸などの他のω−アミノ酸、α−アミノ
イソ酪酸（Ａｉｂ）、サルコシン（Ｓａｒ）、オルニシン（Ｏｒｎ）、シトルリ
ン（Ｃｉｔ）、ホモアルギニン（Ｈａｒ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）
、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌ
ｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、およびシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）
、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）並びにメチオニンスルホキ
シド（ＭＳＯ）がある。これらもまた、適切に特定のカテゴリーに属する。
【００８９】
上記の定義に基づいて、
Ｓａｒおよびβ−ａｌａは中性／非極性／小型であり；
ｔ−ＢｕＡ、ｔ−ＢｕＧ、Ｎ−ＭｅＩｌｅ、ＮｌｅおよびＣｈａは、中性／非
極性／大型／非芳香族であり；
ＨａｒおよびＯｒｎは塩基性／非環式であり；
Ｃｙａは酸性であり；
Ｃｉｔ、アセチルＬｙｓ、およびＭＳＯは、中性／極性／大型／非芳香族であ
り；そして、
Ｐｈｇは、中性／非極性／大型／芳香族である。
【００９０】
図１も参照のこと。
【００９１】
種々のω−アミノ酸は、サイズによって、中性／非極性／小型（β−ａｌａ、
即ち、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸）または大型（その他全てのω
−アミノ酸）に分類される。
【００９２】
遺伝子にコードされたアミノ酸に代わる他のアミノ酸置換物もまた、本発明の
範囲のペプチド化合物に含まれ、この一般理論大系の範囲で分類され得る。
【００９３】
本発明のＧＬＰ−１アナログ化合物の記載に使用する命名は、ペプチド中の各
アミノ酸の左にアミノ基、右にカルボキシ基があると仮定する従来の命名法に従
う。本発明の選択された特異的な実施態様を表示する式において、アミノおよび
カルボキシ末端基は、多くの場合特に示していないが、他に明示していない限り
、生理学的ｐＨ値において呈するであろう形態をとることは理解される。したが
って、生理学的ｐＨにおけるＮ末端Ｈ+2およびＣ末端Ｏ-は、必ずしも明示およ
び図示されているわけではないが、特定の実施例または一般式中で存在すると理
解される。
【００９４】
上記の説明は、中性ｐＨでの末端の状態に関するものであるが、ペプチドの酸
性付加塩または塩基性塩もまた本発明の範囲に含まれる。高いｐＨでは、Ｃ末端
およびカルボキシルを含有する側鎖の塩基性塩が、毒性のない薬学的に許容可能
な塩基から形成され得る。適切な逆のイオンとして、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ++
などがある。適切な薬学的に許容可能な毒性のない有機陽イオンもまた、逆のイ
オンとして使用できる。さらに、上記のように、ペプチドが、対応するアミドと
して調製され得る。
【００９５】
Ｎ末端またはアミノ基含有側鎖に関する適切な酸性付加塩としては、塩酸、硫
酸、もしくははリン酸などの無機酸から形成される塩、および、酢酸、クエン酸
などの有機酸または他の薬学的に許容可能な毒性のない酸から形成される塩があ
る。
【００９６】
提示されるペプチドでは、コードされた各残基は、適切な位置で、以下の従来
の表に従って、アミノ酸の慣用名に対応する一文字表記によって表示される。
【００９７】
アミノ酸 一文字記号
アラニン                    Ａ
アルギニン                  Ｒ
アスパラギン                Ｎ
アスパラギン酸              Ｄ
システイン                  Ｃ
グルタミン                  Ｑ
グルタミン酸                Ｅ
グリシン                    Ｇ
ヒスチジン                  Ｈ
イソロイシン                Ｉ
ロイシン                    Ｌ
リシン                      Ｋ
メチオニン                  Ｍ
フェニルアラニン            Ｆ
プロリン                    Ｐ
セリン                      Ｓ
トレオニン                  Ｔ
トリプトファン              Ｗ
チロシン                    Ｙ
バリン                      Ｖ。
【００９８】
遺伝子的にコードされていないアミノ酸は、前述のように略記される。
【００９９】
本出願の特異的なペプチドは、上付き文字のダガー（†）によって他に明示し
ない限りは、光学異性体を有するＬ型の何れかのアミノ酸残基を意味するものと
する。本発明のペプチドのアナログ中の残基は、通常、天然Ｌ光学異性体型であ
る。ただし、１個または２個の、好ましくは１個のアミノ酸が、天然のアミノ酸
に代わって置換される特定の「同一アミノ酸のＤ型」の他に、Ｄ配置となり得る
。
【０１００】
特異的なアナログの指定に使用する表記法では、改変された位置を、置換アミ
ノ酸に対する上付き文字として示す。したがって、（Ｈ†）7−ＧＬＰ−１（７
〜３７）は、表示されたＧＬＰ−１（７〜３７）において、７位がＤ型のヒスチ
ジンに置換された形態である。（Ｓ）22（Ｒ）23（Ｒ）24（Ｑ）26−ＧＬＰ−１
（７〜３７）は、７〜３７のＧＬＰにおいて、２２位でセリンに、２３位および
２４位でアルギニンに、さらに２６位でグルタミンに置換された形態である。
【０１０１】
（好ましい実施態様）
（Ａ．向上した刺激性を有するアナログ）
向上したインスリン刺激活性を有するアナログに関して、本発明の特に好まし
いアナログ組成物は、ＧＬＰ−１の切断型に比べて、限られた数の改変または置
換が行われているのみのものである。したがって、好ましいアナログは、発明の
開示の節で上述した段落（ａ）〜（ｅ）の内の僅か１つまたは２つの段落に記載
の改変が行われているものである。
【０１０２】
したがって、本発明の好ましいアナログとしては、（７〜３４）、（７〜３５
）、（７〜３６）または（７〜３７）の形態のＧＬＰ−１において、２６位およ
び／もしくは３４位のリシンを中性アミノ酸、アルギニンもしくはＤ型のリシン
に、並びに／または３６位のアルギニンを中性アミノ酸、リシンもしくはＤ型の
アルギニンに置換した（段落（ａ））だけのものがある。特に好ましいものでは
、２６位および３４位のリシンに代わって置換されるアミノ酸が、Ｋ†、Ｇ、Ｓ
、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｑ、Ｒ、Ｒ†およびＭからなる群より選択され、かつ３６位のア
ルギニンに代わって置換されるアミノ酸が、Ｋ、Ｋ†、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｑ
、ＭおよびＲ†からなる群より選択される。
【０１０３】
３１位のトリプトファンに代えて耐酸化性アミノ酸に置換することのみによっ
て改変したアナログもまた好ましい（段落（ｂ））。特に好ましい置換アミノ酸
は、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＡおよびＹからなる群より選択される。
【０１０４】
段落（ｃ）に記載の特異的な置換のうちの少なくとも１種類による改変のみを
行ったアナログもまた好ましい。特に好ましいアナログでは、２２位のＧがＳに
、２３位のＱおよび２４位のＡがＲに、かつ２６位のＫがＱに全て置換されてい
るか、または、１６位のＶがＹに、かつ１８位のＳがＫに置換されているか、あ
るいは、これらの置換に加えて２１位のＥがＤに置換されている。
【０１０５】
段落（ｄ）に記載の改変のみを行ったアナログもまた好ましい。これらのアナ
ログの内の特に好ましいものにおいては、８位のアラニンに代えて置換される小
型の中性アミノ酸が、Ｓ、Ｓ†、Ｇ、Ｃ、Ｃ†、Ｓａｒ、Ａ†、β−ａｌａおよ
びＡｉｂからなる群より選択され；並びに／または、９位のグラタミン酸に代え
て置換される酸性もしくは中性アミノ酸が、Ｅ†、Ｄ、Ｄ†、Ｃｙａ、Ｔ、Ｔ†
、Ｎ、Ｎ†、Ｑ、Ｑ†、Ｃｉｔ、ＭＳＯおよびアセチル−Ｋからなる群より選択
され；並びに／または、１０位のグリシンに代えて置換される他の中性アミノ酸
が、Ｓ、Ｓ†、Ｙ、Ｙ†、Ｔ、Ｔ†、Ｎ、Ｎ†、Ｑ、Ｑ†、Ｃｉｔ、ＭＳＯ、ア
セチル−Ｋ、ＦおよびＦ  からなる群より選択され；並びに／または、１５位の
ＥがＤに置換される。
【０１０６】
７位のみが改変された（段落（ｅ））アナログもまた好ましい。好ましい置換
では、７位のヒスチジンに代えて置換されるアミノ酸が、Ｈ†、Ｙ、Ｙ†、Ｆ、
Ｆ†、Ｒ、Ｒ†、Ｏｒｎ、Ｏｒｎ†、Ｍ、Ｍ†、Ｎ−ホルミル−Ｈ、Ｎ−ホルミ
ル−Ｈ†、Ｎ−アセチル−Ｈ、Ｎ−アセチル−Ｈ†、Ｎ−イソプロピル−Ｈ、Ｎ
−イソプロピル−Ｈ†、Ｎ−アセチル−Ｋ、Ｎ−アセチル−Ｋ†、ＰおよびＰ†
からなる群より選択される。
【０１０７】
以下の特異的な実施態様に加えて、上記の改変型のクラスの僅か２種類の組み
合わせを有する実施態様もまた好ましい。
【０１０８】
以下の特異的なアナログが好ましい。
【０１０９】
（Ｈ†）7−ＧＬＰ−１（７〜３７）；
（Ｙ）7−ＧＬＰ−１（７〜３７）；
（Ｎ−アセチル−Ｈ）7−ＧＬＰ−１（７〜３７）；
（Ｎ−イソプロピル−Ｈ）7−ＧＬＰ−１（７〜３７）；
（Ａ†）8−ＧＬＰ−１（７〜３７）；
（Ｅ†）9−ＧＬＰ−１（７〜３７）；
（Ｄ）9−ＧＬＰ−１（７〜３７）；
（Ｄ†）9−ＧＬＰ−１（７〜３７）；
（Ｆ†）10−ＧＬＰ−１（７〜３７）；
（Ｓ）22（Ｒ）23（Ｒ）24（Ｑ）26−ＧＬＰ−１（７〜３７）；および
（Ｓ）8（Ｑ）9（Ｙ）16（Ｋ）18（Ｄ）21−ＧＬＰ−１（７〜３７）。
【０１１０】
（Ｂ．向上した安定性を有するアナログ）
向上した安定性を有するアナログの好ましい形態においてもまた、僅か１種類
、または多くとも２種類のアミノ酸改変が行われている。
【０１１１】
７位のヒスチジンに代えて置換される好ましいものとしては、Ｄ型の酸性もし
くは中性アミノ酸またはＤ型のヒスチジンがある。Ｐ†、Ｄ†、Ｅ†、Ｎ†、Ｑ
†、Ｌ†、Ｖ†、Ｉ†およびＨ†が好ましい。
【０１１２】
７位のヒスチジン、またはこれと置換されたアミノ酸（ＤもしくはＬ）もまた
、Ｎアルキル化（１−６Ｃ）またはＮアシル化（１−６Ｃ）され得る。
【０１１３】
アルキル基は、Ｃで示されたメンバーの、直鎖または枝分かれ鎖（環式を含む
）のヒドロカルビル（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｙｌ）残基である。アシル基は、式Ｒ
ＣＯ−で示され、式中、Ｒは上に定義したように、アルキルである。好ましいア
ルキル基は、ι−プロピル、α−プロピルおよびエチルであり、好ましいアシル
は、アセチルおよびプロピオニルである。アルキル化もしくはアシル化され得る
好ましい残基としては、ＤもしくはＬ型の、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、
ＫおよびＨがある。
【０１１４】
８位のアラニンに代えて置換される好ましいものとしては、Ｄ型のＰ、Ｖ、Ｌ
、ＩおよびＡがある。Ｄ型のＤ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｔ、ＳおよびＨもまた好まし
い。
【０１１５】
以下に実証されるように、ある特定のアナログの中には向上したインスリン放
出刺激活性と向上した安定性との両方を呈するものがあることは理解される。
【０１１６】
（調製）
本発明のアナログは、ペプチド合成のための標準固相技術を用いて調製され得
る。一般に知られているように、必要な長さのペプチドは、市販の器具および試
薬を用いて調製され得る。その際には、製造業者の指示書に従って、妨害基の阻
止、反応するアミノ酸の保護、反応しない残基のカップリング、脱保護、および
キャッピングが行われる。適切な器具は、例えば、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉａのＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓまたはＳａｎ  Ｒ
ａｐｈａｅｌ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎから入手され得る。
【０１１７】
好ましい方法では、標準自動固相合成プロトコルを用いてペプチドが合成され
、その際には、適切に側鎖を保護されたｔ−ブトキシカルボニル−α−アミノ酸
を使用する。完成したペプチドを、標準フッ化水素法を用いて、固相支持体から
除去し、同時に側鎖の脱保護を行う。粗ペプチドを、さらに、半予備逆相−ＨＰ
ＬＣ（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８）によって、
０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリル勾配を用いて精製す
る。ペプチドを真空乾燥させることによりアセトニトリルを除去し、そして、０
．１％ＴＦＡ水溶液から凍結乾燥させる。純度を分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって確
認する。ペプチドを、凍結乾燥させて、水または０．０１Ｍの酢酸中に重量１〜
２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させ得る。
【０１１８】
上記の合成方法の使用は、コードされていないアミノ酸またはＤ型のアミノ酸
がペプチド中にある場合に必要となる。しかし、遺伝子にコードされたペプチド
に関しては、市販の発現システムで容易に合成されたＤＮＡ配列を使用する組換
え技術を用いることもできる。
【０１１９】
（処方および投与）
本発明のアナログはＩＩ型糖尿病の治療に有用である。アナログは、当該分野
で一般に知られているように種々の処方で全身に投与され得る。ペプチド投与の
特定の形態に適切な処方は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍ
ｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの最新版に記載されている
。一般的に、処方では、効果的な量のアナログまたは複数種類のアナログの混合
物、および少なくとも１種類の薬学的に許容可能な賦形剤が使用される。
【０１２０】
種々の投与形態が、全身治療に効果的である。投与形態には、例えば、静脈注
射、筋肉注射、皮下注射および腹腔内注射などの注射、適切な坐薬またはスプレ
ーを用いる経膜または経皮投与、並びに、適切に処方される場合には、経口投与
がある。注射のための適切な賦形剤としては、ハンクス液およびリンガー液など
の種々の生理学的緩衝剤がある。適切な経膜または経皮処方は、胆汁酸塩（ｂｉ
ｌｅ  ｓａｌｔ）またはフシデート（ｆｕｓｉｄａｔｅｓ）などの浸透剤を含有
する。典型的な経口処方は、活性成分の消化を阻害する保護剤を含有する。ピロ
ドリンおよびメチルセルロースなどの高分子マトリックスを用いる種々の遅延性
処方もまた利用可能である。他の薬剤送達システムには、リポソームおよびマイ
クロエマルションがある。種々の処方が実施可能であり、選択されたペプチドの
ための適切な処方および投与経路の提供は、一般に実施者によって理解される。
【０１２１】
本発明の化合物の典型的な投与量は、約１ｐｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ（体重）
である。但し、この投与量は概算であり、アナログの有効性、循環半減期、被験
体の個々の特徴などの多くの要因に左右される。各個体の糖尿病治療におけるイ
ンスリン投与の最適化は、充分に確立されており、類似の最適化プロトコルがこ
こで使用される。
【実施例】
【０１２２】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、限定するものではない
。
【０１２３】
（実施例１）
（本発明のアナログにより向上したインスリン刺激）
図２に示すように、天然の構造を改変する種々の置換基を有する本発明のアナ
ログが調製された。これらのアナログの内の幾つかを上記のアデニル酸シクラー
ゼアッセイで試験した。その結果を表１に示す。
【０１２４】
【表１】
2004196825.tif 000003
【０１２５】
従って、本発明の様々なアナログが、インスリンに対する挙動を調べるアッセ
イにおいて、有用な範囲の有効性を示している。
【０１２６】
（実施例２）
（ＧＬＰ−１アナログの向上した安定性）
（Ａ．不活性化形態の証明）
ＧＬＰ−１（７−３７）切断型のホルモンをラジオヨウ素化し、精製したペプ
チドを血漿とともにインキュベートし、上記のように、ラジオラベルシーケンシ
ングによってアッセイした。０分後、１５分後、および６０分後に、サンプルの
シーケンシングを行った。０分時では、サイクル１３で、放射能の単一ピークが
発見され、分解がないことが示された。１５分後では、サイクル１３で、放射能
の量が減少し、サイクル１１で増加した。インキュベーションの６０分後、実質
的にすべてのカウントが、サイクル１１で現れた。
【０１２７】
従って、単一のジペプチジルアミノペプチダーゼ開裂が、ＧＬＰ−１（７−３
７）ペプチドの分解に関与していると思われる。
【０１２８】
上記の結果は、Ｎ末端特異的およびＣ末端特異的抗血清を使用するＲＩＡによ
って測定されるような分解と一致している。上記のように血漿とともにインキュ
ベートし、ＲＩＡでテストしたところ、回収したフラグメントがラジオラベルさ
れたＧＬＰ−１（７−３７）のカルボキシ末端特異的抗体への結合を阻害する、
の能力は減少していなかった。しかし、１時間後には、アミノ末端特異的抗体へ
の結合を阻害する能力は、ほとんど０まで減少した。
【０１２９】
（Ｂ．ラジオラベルシーケンシングによりテストされたＧＬＰ−１（７−３７
）アナログ）
９位にＤ−Ａｓｐまたは８位にＤ−Ａｌａを含むＧＬＰ−１（７−３７）アナ
ログを使用して、分解分析のラジオラベルシーケンシングを行った。このアッセ
イの結果を図３に示す。図３Ａは、（Ｄ†）9−ＧＬＰ−１（７−３７）の結果
を示し、図３Ｂは、（Ａ†）8−ＧＬＰ−１（７−３７）の結果を示す。これら
の図に示されるように、（Ｄ†）9アナログは、ＧＬＰ−１（７−３７）と同様
に分解する。一方、（Ａ†）8アナログは、６０分後には、ほとんど分解を示さ
なかった。
【０１３０】
（Ｃ．ＲＩＡによりテストされたアナログ）
Ｎ末端特異的抗体は、アナログの分解を測定するのに使用され得る。但し、こ
の抗体が、Ｎ末端に改変を含むこれらのアナログと交差反応する能力をもつ場合
に限られる。図４は、７位、８位、および９位で改変されたアナログの結果を示
す。（Ｙ）7、（Ｈ†）7、および（Ａ†）8は、高濃度でではあるが、交差反応
が可能であり、（Ｄ†）9は可能でない。交差反応ペプチドを高濃度（１０−１
００  ｎＭ）で６０分間、血漿とともにインキュベートし、Ｎ末端特異的抗体に
対するＲＩＡを使用するＲＩＡでテストした。パラグラフＢの結果に一致して、
（Ａ†）8アナログは、６０分後には分解せず、（Ｈ†）7アナログも分解しなか
った。しかし、（Ｙ）７アナログは分解した。
【０１３１】
（Ｄ．ＨＰＬＣによる、アナログのプロテアーゼ耐性）
ＧＬＰ−１（７−３７）と比較した場合の、様々なアナログの分解耐性もまた
、上記のように、ＨＰＬＣによってテストした。血漿中でのインキュベーション
を６０分間行い、この後、分解は観察されなかった。すなわち分解は完了した。
その結果を表２に示す。
【０１３２】
【表２】
2004196825.tif 000004
【０１３３】
本発明は、ＩＩ型糖尿病の治療に対して改良された特徴を有する、活性ＧＬＰ
−１ペプチド、７−３４、７−３５、７−３６および７−３７の有効なアナログ
を提供する。これらのアナログは、７−１０位でアミノ酸が置換されており、お
よび／またはＣ末端が切断され、および／または基本のペプチド中に様々な他の
アミノ酸置換を含む。アナログは、グルカゴンと比較して、インシュリン生産を
刺激する能力が向上し、ＧＬＰ−１（７−３７）と比較してプラズマ中での安定
性が向上され得るか、あるいはその両方である。このような特性は、治療薬とし
てのアナログの能力を向上させる。７および８位にＤ形アミノ酸置換、および／
または７位にＮアルキル化またはＮアシル化アミノ酸を有するアナログは、イン
ビボにおいて、特に分解耐性である。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は、本明細書で使用するアミノ酸の分類の概略を模式的に示したものである。
【図２−１】図２は、本発明の種々の化合物を表に示したものである。
【図２−２】図２は、本発明の種々の化合物を表に示したものである。
【図３Ａ】図３Ａは、血漿中の２種類のアナログの血漿中での分解を調べるためのラジオラベルシーケンシング分析の結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、血漿中の２種類のアナログの血漿中での分解を調べるためのラジオラベルシーケンシング分析の結果を示す。
【図４】図４は、アミノ末端領域に改変を加えたＧＬＰ−１（７−３７）のアナログによる、アミノ末端特異的抗血清からの１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（７−３９）の置換の結果を示す。
【図１】
2004196825.tif 000005
【図２−１】
2004196825.tif 000006
【図２−２】
2004196825.tif 000007
【図３Ａ】
2004196825.tif 000008
【図３Ｂ】
2004196825.tif 000009
【図４】
2004196825.tif 000010