(57)【要約】　　　（修正有）【課題】分子生物学的手法を利用して、簡便で精度の高い豆類の品種判別を行う。【解決手段】豆類の品種判別に用いるためのＤＮＡプライマーを提供する。本発明のプライマーは、豆類の品種判別、望ましくは白インゲンマメの品種判別のため、および白インゲンマメとその他のマメ（たとえば、ベニバナインゲンマメおよびライマメ）とを判別するために使用可能である。さらには、豆類の品種判別、望ましくはアズキ類の品種の判別をすることができる。さらに、本発明のプライマーにより豆類の品種判別だけでなく、その加工品の原料とされた豆類の品種の判定も可能である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡからなるグループから選ばれる少なくとも一つからなる豆類の品種判別のためのＤＮＡプライマー。
【請求項２】
配列番号１および配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡの対、配列番号３および配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡの対、配列番号５および配列番号６の塩基配列を有するＤＮＡの対、配列番号７および配列番号８の塩基配列を有するＤＮＡの対、配列番号９および配列番号１０の塩基配列を有するＤＮＡの対、ならびに配列番号１１および配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡの対からなるグループから選ばれるＤＮＡの対の少なくとも１組からなる豆類の品種判別のためのＤＮＡプライマー対。
【請求項３】
白インゲンマメの品種を判別するための請求項１または２に記載のプライマー。
【請求項４】
判別する白インゲンマメの品種が、雪手亡、姫手亡、銀手亡、グレートノーザン、ピービーン、および小白芸豆からなるグループから選ばれる請求項３に記載のプライマー。
【請求項５】
白インゲンマメの品種をその他の豆類から判別するための請求項１または２に記載のプライマー。
【請求項６】
アズキの品種を判別するための請求項１または２に記載のプライマー。
【請求項７】
判別するアズキの品種がエリモショウズ、きたのおとめ、およびしゅまりからなるグループから選ばれる請求項６に記載のプライマー。
【請求項８】
請求項７に記載のアズキの品種をその他のアズキの品種から判別するための請求項６に記載のプライマー。
【請求項９】
（１）品種判別または原料品種の判定を行いたい、豆類または豆類加工品のサンプルからＤＮＡを抽出する工程、
（２）抽出したＤＮＡに請求項１に記載した１組以上のプライマー対を加えて、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：　ポリメラーゼ連鎖反応）を行う工程、
（３）ＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントを検出し、増幅断片の有無、断片が存在する場合はその大きさおよび断片のバンドの発色の濃さ（相対比）を調べる工程、
（４）検出されたＤＮＡ断片の大きさおよびそのパターンに応じて豆類の品種を判別する工程、
を含む、豆類の品種判別または豆類加工品の原料品種の判定の方法。
【請求項１０】
サンプルが、豆類の少なくとも１粒の種子、小葉または豆類の加工品である、豆類の品種判別または豆類加工品の原料品種の判定のための請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
豆類の加工品が餡、煮豆、甘納豆である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のプライマーを少なくとも一つ含む豆類の品種判別または豆類加工品の原料品種の判定のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分子生物学的手法を利用して、簡便で精度の高い豆類の品種判別法に使用するためのＤＮＡプライマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、豆類の品種判別においては、圃場栽培により品種間の特徴の違いに基づいて品種同定が行われてきた。これは豆類の長期にわたる栽培を通じてその成育過程における特徴を追跡するもので、品種の判定に少なくとも約１年を要する。
【０００３】
一方、豆類の遺伝子多型から、品種を同定する方法は迅速で簡便な判定方法となり得る。近年、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：　ポリメラーゼ連鎖反応）による遺伝子増幅法が種々の分野で活用されている。このＰＣＲ法は極微量のＤＮＡを鋳型として、目的ＤＮＡ領域を短時間に数十万倍に増幅する手法で、精度の高い診断法として医学や微生物の分野での利用が進んでいる。作物分野ではＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ：　増幅ＤＮＡ断片多型）法によるコメの品種判別法が確立された。ＤＮＡ鑑定による品種判別法は、一般に圃場栽培による品種判別法と比較して格段に迅速で明確な判別方法である。
【０００４】
ＲＡＰＤ法では１０塩基程度のごく短いランダムなプライマーを用いてサンプルＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、比較したい品種のサンプルについてＰＣＲ産物に特異断片が生じるプライマーをＲＡＰＤマーカーとして選択する。そして複数のＲＡＰＤマーカーを用いて、品種ごとに現れるＰＣＲ産物中の特異断片の有無を調べ、用いたＲＡＰＤマーカーと特異断片の有無のそれぞれの情報を統合してある品種を同定するための情報のパターンを見いだすことで品種同定を行う。ランダムなプライマーからＲＡＰＤマーカーを選択するため、同定したい品種のゲノム情報なしに、品種同定を行うことができるという利点がある一方で、１０残基程度のごく短いプライマーを用いるため、アニーリング温度が低く、ミスアニーリングによる非特異的な増幅を生じやすいという欠点もある。また、一般にＲＡＰＤマーカーを用いたＰＣＲでは判定に必要な特異断片および不必要な断片も含めて、複数のＰＣＲ産物が生じるため、再現性にやや難点があり、また判定には熟練が必要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、分子生物学的手法を利用した簡便で精度の高い、豆類の品種判別を行うことにある。形状や色などの特徴が大きく異なる豆類を区別することは目視により容易に行えるが、近縁の品種である場合など、外見上の特徴で見分けることが困難である場合には、遺伝子レベルでの多型の解析による品種判別が簡便で精度が高く、有効である。したがって、本発明が解決しようとする課題は、特に、外見上の特徴で見分けることが困難な豆類の品種判別を行うことにある。
【０００６】
本発明で解決しようとする豆類の品種判別とは、望ましくは白インゲンマメの品種；望ましくは雪手亡、姫手亡、銀手亡、グレートノーザン、ピービーン、および小白芸豆、ベニバナインゲンマメ；たとえば大白芸豆、ライマメ；たとえば、ベビーライマおよびバタービーン、を非限定的に含む品種を判別することにある。特に望ましくは、上述の白インゲンマメの品種をそれぞれ判別し、そして、その他の豆類との判別を行うことにある。
【０００７】
または、本発明で解決しようとする豆類の品種判別とは、望ましくはアズキの品種；たとえばエリモショウズ、きたのおとめ、しゅまり、十育１３０号（十系４９４号）、十系４８６号、十育１４３号、十育１３７号、十育１３８号、十系７９６号、ベニダイナゴン、カムイダイナゴン、光小豆、早生大粒１号、早生大納言、斑小粒系−１、斑小粒系−２、京都大納言、Ａｃｃ２４０２（山梨県産）、Ａｃｃ２５９（愛媛県産）、円葉（刈６３号）、赤豆（韓国産）、Ａｃｃ７２７（韓国産）、Ａｃｃ９３４（韓国産）、Ａｃｃ２２８８（ブータン産）、Ａｃｃ２３１２（ブータン産）、Ａｃｃ２２６６（ブータン産）、Ａｃｃ２１１４（米国産）Ａｃｃ２０６２（米国産）、Ａｃｃ２１１３アルゼンチン、Ａｃｃ２２４０（Ｂｌｏｏｄｗｏｏｄ）を含み、Ａｃｃ２５６５（中国産）、Ａｃｃ２１１２（中国産、宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０（中国産）、および天津小豆、ヤブツルアズキであるＡｃｃ２５１５（石川県産）、ツルアズキであるＡｃｃ２４９８（タイ産）、ヒメツルアズキであるＡｃｃ９５１（韓国産）、およびヒナアズキであるＡｃｃ２４９６（沖縄県産）を非限定的に含む品種の判別を行うことにある。特に望ましくは、上述のアズキの品種のうち、エリモショウズ、きたのおとめ、およびしゅまりをそれぞれ判別し、さらに、上述の３種のアズキと中国品種であるＡｃｃ２５６５（中国産）、Ａｃｃ２１１２（中国産、宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０（中国産）、および天津小豆、との判別を行うことである。
【０００８】
さらに、本発明が解決しようとする課題は上記の豆類の品種判別だけでなく、その加工品の原料となった豆類の品種の判定をも含む。
本発明は、上記の課題を解決することを目的とした、ＤＮＡプライマーを設計し、それを用いた豆類およびその加工品の品種判別方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明のプライマーはＳＰ０１ｆ（配列番号１）、ＳＰ０１ｒ（配列番号２）、ＳＰ０２ｆ（配列番号３）、ＳＰ０２ｒ（配列番号４）、ＳＰ０３ｆ（配列番号５）、ＳＰ０３ｒ（配列番号６）、ＳＶ０１ｆ（配列番号７）、ＳＶ０１ｒ（配列番号８）、ＳＶ０２ｆ（配列番号９）、ＳＶ０２ｒ（配列番号１０）、ＳＶ０３ｆ（配列番号１１）、およびＳＶ０３ｒ（配列番号１２）であり、配列表においてそれぞれの配列番号に示した配列を有する。
【００１０】
これらプライマーは後述の実施例に示すように、ランダムな１０塩基程度のプライマー群の中から、ＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ：ｒａｎｄｏｍ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ）マーカーと成り得るプライマーを選択し、選択したＲＡＰＤマーカーとなるプライマーを用いたＰＣＲによるＰＣＲ産物中の特異断片をクローニングし、塩基配列を決定し、その特異断片の一部を特異的に増幅するプライマーを設計することで得られた。本発明のプライマーは当業者に既知の化学合成法、たとえばホスホルアミダイト法によるＤＮＡ合成技術によって入手可能である。
【００１１】
本発明の一つの態様では、本発明はＳＰ０１ｆ（配列番号１）およびＳＰ０１ｒ（配列番号２）をプライマー対ＳＰ０１として、ＳＰ０２ｆ（配列番号３）およびＳＰ０２ｒ（配列番号４）をプライマー対ＳＰ０２として、ＳＰ０３ｆ（配列番号５）およびＳＰ０３ｒ（配列番号６）をプライマー対ＳＰ０３として、ＳＶ０１ｆ（配列番号７）およびＳＶ０１ｒ（配列番号８）をプライマー対ＳＶ０１として、ＳＶ０２ｆ（配列番号９）およびＳＶ０２ｒ（配列番号１０）をプライマー対ＳＶ０２として、およびＳＶ０３ｆ（配列番号１１）およびＳＶ０３ｒ（配列番号１２）をプライマー対ＳＶ０３としてこれらのプライマー対の少なくとも一つを用いる。
【００１２】
本発明のプライマーを用いて豆類の品種のうち、白インゲンマメの品種；雪手亡、姫手亡、銀手亡、グレートノーザン、ピービーン、および小白芸豆、を判別することができ、および、上記白インゲンマメの品種と、ベニバナインゲンマメ；たとえば大白芸豆、およびライマメ；たとえば、ベビーライマおよびバタービーン、とを判別することができる。また、本発明のプライマーを用いて豆類の品種のうち、アズキの品種；エリモショウズ、きたのおとめ、および、しゅまり、の品種を判別し、および、この３種のアズキと中国産の品種、特にＡｃｃ２５６５（中国産）、Ａｃｃ２１１２（中国産、宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０（中国産）、および天津小豆（中国産）とを判別することができる。
【００１３】
本発明のプライマーを用いた豆類の品種判別の方法は、次の工程からなる：
（ｉ）品種判別または原料品種の判定を行いたい、豆類または豆類加工品ののサ
ンプルからＤＮＡを抽出する工程、
（ｉｉ）抽出したＤＮＡに本発明のプライマー対を少なくとも１組の、望ましくは２組以上のプライマー対を加えてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）を行う工程、
（ｉｉｉ）ＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントを検出し、増幅断片の有無、断片が存在する場合はその大きさおよび断片のバンドの発色の濃さ（相対比）を調べる工程、
（ｉｖ）検出されたＤＮＡ断片の大きさおよびそのパターンに応じて豆類の品種を判別する工程、を含む。
【００１４】
本発明のプライマーを用いて品種を判別する豆類サンプルにはたとえば種子、小葉、および豆類からの加工品（例えば餡）が含まれるが、これらには限定されない。
【００１５】
また、本発明のプライマーは豆類の品種判別のためのキットとして提供することもできる。
本発明のプライマーを用いた豆類の品種判別の工程におけるＤＮＡの抽出は当業者に既知の方法で行うことができる。たとえば、ＣＴＡＢ法（Ｍ．Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ　ａｎｄ　Ｓ．Ｒｏｇｅｒｓ，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２．３．３−２．３．７、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９４）でＤＮＡの抽出を行ってもよい。ＣＴＡＢ法による豆類のＤＮＡの抽出では、抽出用のサンプルとして豆類の小葉または子実を用いてもよく、望ましくは豆類の小葉０．１ｇ−０．５ｇ（生鮮重）または子実０．０１ｇ−０．３ｇを用いてもよく、さらに望ましくは豆類の小葉０．３ｇ（生鮮重）または子実０．０５ｇを用いてもよい。破砕したサンプルに対して２ｘＣＴＡＢ液（２％ＣＴＡＢ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．４Ｍ　ＮａＣｌ、１％ＰＶＰ）およびメルカプトエタノールを、たとえば、２ｘＣＴＡＢ液０．５ｍｌ〜２ｍｌ、メルカプトエタノール０．０１ｍｌ〜０．１ｍｌ、望ましくは２ｘＣＴＡＢ液約０．８ｍｌ、メルカプトエタノール約０．０２ｍｌを加え、さらに磨砕する。適当な大きさのマイクロテストチューブに移し、約５５〜６５℃で約２０〜６０分間、望ましくは約５５℃で約３０分間加温した後、クロロホルム／イソアミルアルコール（約２４：１）を等量、望ましくは０．８ｍｌ加え、２０分〜６０分間、望ましくは約３０分間振とうする。その後、テストチューブを遠心し、たとえば１２０００ｒｐｍ〜１４０００ｒｐｍで５〜２０分間、望ましくは約１２０００ｒｐｍ（１００００ｘｇ）で約１５分間遠心し、上清を新しいテストチューブに移し、１０％ＣＴＡＢ（１０％ＣＴＡＢ、０．７Ｍ　ＮａＣｌ）および沈殿バッファー（１％ＣＴＡＢ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）を、たとえば１０％ＣＴＡＢ　０．１倍量および沈殿バッファー１〜１．５倍量、望ましくは１０％ＣＴＡＢ約０．０８ｍｌおよび沈殿バッファー約１．２ｍｌを加え、軽く撹拌する。テストチューブを遠心し、たとえば１２０００ｒｐｍ〜１４０００ｒｐｍで５分〜２０分間、望ましくは約１２０００ｒｐｍ（１００００ｘｇ）で約１５分間遠心し、上清を捨て、ＲＮａｓｅ　Ａを加えた１Ｍ　ＮａＣｌ−ＴＥバッファー（１Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）をたとえば、０．２ｍｌ〜１ｍｌ、望ましくは約０．５ｍｌをテストチューブに加える。テストチューブを約５０〜６５℃で約２０〜６０分間、望ましくは５５℃で３０分間加温した後、イソプロパノールをたとえば０．５〜２倍量、望ましくは約１ｍｌ加え、軽く撹拌し、たとえば１２０００ｒｐｍ〜１４０００ｒｐｍで５分〜２０分間、望ましくは約１２０００ｒｐｍ（１００００ｘｇ）で約１５分間遠心する。上清を捨て、新たに７０％エタノールを０．３ｍｌ〜１ｍｌ、望ましくは約０．５ｍｌ加え、テストチューブの内壁を軽く洗い、たとえば１２０００ｒｐｍ〜１４０００ｒｐｍで５分〜１０分間、約１２０００ｒｐｍ（１００００ｘｇ）で約５分間遠心する。沈殿物（ＤＮＡ）が落ちないようにエタノールを捨て、テストチューブを風乾する。エタノールが完全に乾燥したら、蒸留水を０．０５ｍｌ〜０．５ｍｌ、望ましくは約０．１ｍｌ加え、ＤＮＡを溶解する。ＤＮＡ溶液の一部を希釈し、分光高度計で濃度を測定する。ＤＮＡを約３０ｎｇ／μｌの濃度にしてＰＣＲの鋳型ＤＮＡとする。
【００１６】
本発明のプライマーを用いた豆類の品種判別の工程におけるＤＮＡの抽出はＳＤＳ−フェノール法（Ｗ．Ｍ．Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２．３．１−２．３．３、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９８）で行ってもよい。ＳＤＳ−フェノール法による豆類のＤＮＡの抽出では、抽出用のサンプルとして豆類の加工品、たとえば餡、煮豆、甘納豆を用いてもよい。サンプルはたとえば０．１ｇ〜０．５ｇ、望ましくは約０．３ｇを用いてもよい。抽出操作は、サンプルに抽出液（０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、０．２５Ｍ　ＮａＣｌ、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）をたとえば０．５ｍｌ〜２ｍｌ、望ましくは１　ｍｌを加え撹拌し、５５℃〜６５℃で２０分〜６０分間、望ましくは約５５℃で約３０分間加温する。１２０００ｒｐｍ〜１４０００ｒｐｍで５分〜２０分間、望ましくは約１４０００ｒｐｍ（１５０００ｘｇ）で約５分間遠心し、上清を新しいテストチューブに移す。テストチューブに約等量のフェノール／クロロホルム（ＴＥ−バッファー飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール＝約２５：２４：１（ｖ／ｖ／ｖ））を加え、振とうする。テストチューブを、１２０００ｒｐｍ〜１４０００ｒｐｍで５分〜２０分間、望ましくは約１４０００ｒｐｍ（１５０００ｘｇ）で約５分間遠心し、上清を新しいテストチューブに移す。上清に０．５〜２倍量、望ましくは約０．６〜０．７倍量のイソプロパノールを加え、撹拌した後、１２０００ｒｐｍ〜１４０００ｒｐｍで５分〜２０分間、望ましくは約１４０００ｒｐｍ（１５０００ｘｇ）で約５分間遠心する。イソプロパノールを捨てて沈殿物を風乾し、抽出ＤＮＡを得る。抽出したＤＮＡは精製し、精製後のＤＮＡ溶液をＰＣＲの鋳型ＤＮＡとする。
【００１７】
本発明の一つの態様において、本発明のプライマーを用いた豆類の品種判別の工程におけるＰＣＲは以下に示すように行ってよい。本発明のプライマーは一組以上のプライマー対を用いてもよく、反応液中のプライマー濃度はそれぞれ０．１μＭ〜２μＭ、望ましくは約０．１５μＭである。反応液組成は、たとえば、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ　９．０）、５８０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　各ｄＮＴＰ、ならびに反応液量１５μｌあたり０．５〜１ユニット望ましくは約０．７５ユニットの合成酵素（たとえばＴａｑポリメラーゼ）である。ＰＣＲの温度サイクルは、約９４℃；約２分の後、約９４℃；約３０秒、約５５℃；約３０秒、約７２℃；約３０秒を３０回〜４５回繰り返し、望ましくは約３５回繰り返した後、約７２℃；約５分を付加して行ってもよい。または、ＰＣＲの温度サイクルは、９４℃；１５分の後、９４℃；３０秒、５５℃；３０秒、７２℃；１分を繰り返し、望ましくは４５回繰り返した後、７２℃；５分を付加して行ってもよい。
【００１８】
本発明の一つの態様において、本発明のプライマーを用いた豆類の品種判別の工程におけるＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントの検出はゲル電気泳動により行ってよい。ゲル電気泳動は、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルで行ってもよく、アガロースゲルは１％〜２％、望ましくは約１．５％アガロースゲルで行ってもよい。染色剤、たとえばエチジウムブロマイドまたはＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（和光純薬）、特に望ましくはＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉで染色した後、ＵＶ照射下で増幅断片の有無、断片が存在する場合はその大きさおよび断片のバンドの発色の濃さ（相対比）を確認する。ＵＶ照射下で写真撮影により記録してもよい。得られた写真を画像データとしてスキャンし記録してもよい。または、ＵＶ照射下でゲル中のバンドの状態を画像として直接スキャンして画像データとして記録してもよい。断片の有無および断片の大きさは目視により確認する。断片のバンドの発色の濃さ（相対比）は、目視で確認してもよく、または、イメージ解析ソフトウェア等を用いてほぼ定量的に解析してもよい。
【００１９】
本発明のプライマーを用いた豆類の品種判別の工程における、検出されたＤＮＡの大きさ、および、用いたプライマーとその検出されたＤＮＡ断片の有無の情報を統合して、ある品種を同定するための情報のパターンを見いだすことで、それに応じて白インゲンマメ類の品種を判別する工程は、以下のように行うことができる：
（ｉ）プライマー対ＳＰ０１（配列番号１および２）を白インゲンマメ（たとえば雪手亡、姫手亡、銀手亡、グレートノーザン、ピービーン、あるいは小白芸豆）、ベニバナインゲン（たとえば大白芸豆）、およびライマメ（たとえば、ベビーライマあるいはバタービーン）についてＰＣＲに供試すると、雪手亡および姫手亡にのみ２８６塩基対の増幅断片が生じる（表１）。したがって、プライマー対ＳＰ０１を含むプライマー対を供試した際に約２９０塩基対の増幅断片を確認したときは、その豆の品種は雪手亡または姫手亡である。
【００２０】
（ｉｉ）プライマー対ＳＰ０２（配列番号３および４）を白インゲンマメ（たとえば雪手亡、姫手亡、銀手亡、グレートノーザン、ピービーン、あるいは小白芸豆）、ベニバナインゲン（たとえば大白芸豆）、およびライマメ（たとえば、ベビーライマあるいはバタービーン）についてＰＣＲに供試すると、雪手亡および白小芸豆に３８９塩基対、姫手亡、銀手亡、グレートノーザン、およびピービーンに５６４塩基対の増幅断片が生じる（表１）。また、ピービーンおよびグレートノーザンには約８００塩基対の増幅断片も生じる。したがって、プライマー対ＳＰ０２を含むプライマー対を供試した際に約３９０塩基対の増幅断片を確認したときは、その豆の品種は雪手亡または白小芸豆であり、約５６０塩基対の増幅断片を一つ確認したときはその豆の品種は姫手亡または銀手亡であり、約５６０塩基対および約８００塩基対のバンドを二つ確認したときはその豆の品種はピービーンまたはグレートノーザンである。
【００２１】
（ｉｉｉ）プライマー対ＳＰ０３（配列番号５および６）を白インゲンマメ（たとえば雪手亡、姫手亡、銀手亡、グレートノーザン、ピービーン、あるいは小白芸豆）、ベニバナインゲン（たとえば大白芸豆）、およびライマメ（たとえば、ベビーライマあるいはバタービーン）についてＰＣＲに供試すると、雪手亡、姫手亡、およびピービーンに約４５０塩基対の増幅断片が生じる（表１）。したがって、プライマー対ＳＰ０３を含むプライマー対を供試した際に約４５０塩基対の増幅断片を確認したときはその豆の品種は雪手亡、姫手亡またはピービーンのいずれかである。
【００２２】
（ｉｖ）一つのプライマー対を供試するだけでは、品種の判別が達成できない場合は、同一のサンプルに複数のプライマー対を逐次、または同時に導入してＰＣＲを行う。そして、あるプライマー対に対して得られる増幅断片の有無を解析し、複数のプライマーにより得られた増幅断片の組み合わせから作製できるパターンに基づいて品種判別を行うことができる。
【００２３】
たとえば、この例は本発明を限定するものではないが、ある豆類のＤＮＡサンプルについてプライマー対ＳＰ０１（配列番号１および２）およびＳＰ０２（配列番号３および４）を同時に用いて、約２９０塩基対のバンドおよび約３９０塩基対のバンドが生じた場合を例にして考える。約２９０塩基対のバンドはプライマー対ＳＰ０１による増幅断片であるので、このサンプルは雪手亡または姫手亡の可能性がある。また、約３９０塩基対のバンドはプライマー対ＳＰ０２による増幅断片であるので、このサンプルは雪手亡または小白芸豆の可能性がある。したがって、この二つの条件を満たす雪手亡がこのサンプルの品種であることが判別できる。
【００２４】
（ｖ）豆の加工品のように、複数の品種の豆が混合されている可能性があるサンプルの原料の各品種の同定を行う場合は、ＰＣＲ産物の有無およびその大きさだけでなく、検出されたバンドの発色の濃さに基づいて行うことができる。
【００２５】
たとえば、この例は本発明を限定するものではないが、ある加工品のＤＮＡサンプルについてプライマー対ＳＰ０１（配列番号１および２）およびＳＰ０２（配列番号３および４）を同時に用いて、約２９０塩基対のもっとも濃いバンド、約３９０塩基対の次いで濃いバンド、および約５６０塩基対のもっとも薄いバンドが得られた場合を例にして考える。約２９０塩基対のバンドはプライマー対ＳＰ０１により増幅された断片であるので、該サンプルは雪手亡あるいは、姫手亡を含む。また、約３９０塩基対のバンドはプライマー対ＳＶ０２により雪手亡由来のＤＮＡが増幅された断片であるので、該サンプルは雪手亡を含む。さらに、約５６０塩基対のバンドはプライマー対ＳＰ０２により姫手亡由来のＤＮＡが増幅された断片であるので、該サンプルは姫手亡を含む。また、約３９０塩基対のバンドと約５６０塩基対のバンドを比較すると、約３９０塩基対のバンドの方が濃く発色しているので、該サンプルは雪手亡が主原料であり、姫手亡も原料として含まれていると判別できる。
【００２６】
【表１】
2004016008.tif 000002
【００２７】
本発明のプライマーを用いた豆類の品種判別の工程における、検出されたＤＮＡの大きさ、および、用いたプライマーとその検出されたＤＮＡ断片の有無の情報を統合してある品種を同定するための情報のパターンを見いだすことで、それに応じてアズキ類の品種を判別する工程は、以下のように行うことができる：
（ｉ）プライマー対ＳＶ０１（配列番号７および８）をアズキ（たとえば、エリモショウズ、きたのおとめ、しゅまり、Ａｃｃ２５６５（中国産）、Ａｃｃ２１１２（中国産、宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０（中国産）、または天津小豆）についてＰＣＲに供試すると、きたのおとめ、Ａｃｃ２５６５（中国産）、Ａｃｃ２１１２（中国産、宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０（中国産）、および天津小豆について５６０塩基対の増幅断片が生じる（表２）。したがって、プライマーＳＶ０１を含むプライマー対を供試した際に約５５０塩基対の増幅断片を確認したときはそのアズキの品種はきたのおとめ、Ａｃｃ２５６５（中国産）、Ａｃｃ２１１２（中国産、宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０（中国産）、または天津小豆のいずれかである。
【００２８】
（ｉｉ）プライマー対ＳＶ０２（配列番号９および１０）をアズキ（たとえば、エリモショウズ、きたのおとめ、しゅまり、Ａｃｃ２５６５（中国産）、Ａｃｃ２１１２（中国産、宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０（中国産）、または天津小豆）についてＰＣＲに供試すると、エリモショウズおよびきたのおとめについて４２９塩基対の増幅断片が生じる（表２）。したがって、プライマー対ＳＶ０２を含むプライマー対を供試した際に約４３０塩基対の増幅断片を確認したときはそのアズキの品種はエリモショウズまたはきたのおとめのいずれかである。
【００２９】
（ｉｉｉ）プライマー対ＳＶ０３（配列番号１１および１２）をアズキ（たとえば、エリモショウズ、きたのおとめ、しゅまり、Ａｃｃ２５６５（中国産）、Ａｃｃ２１１２（中国産、宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０（中国産）、または天津小豆）についてＰＣＲに供試すると、きたのおとめ、しゅまり、Ａｃｃ２５６５（中国産）、Ａｃｃ２１１２（中国産、宝清小豆）、および天津小豆について３４３塩基対の増幅断片が生じる（表２）。したがって、プライマー対ＳＶ０３を含むプライマー対を供試した際に約３４０塩基対の増幅断片を確認したときはそのアズキの品種はきたのおとめ、しゅまり、Ａｃｃ２５６５（中国産）、Ａｃｃ２１１２（中国産、宝清小豆）、または天津小豆である。
【００３０】
（ｉｖ）一つのプライマー対を供試するだけでは、品種の判別が達成できない場合は、同一のサンプルに複数のプライマー対を逐次、または同時に導入してＰＣＲを行う。そして、あるプライマー対に対して得られる増幅断片の有無を解析し、複数のプライマーにより得られた増幅断片の組み合わせから作製できるパターンに基づいて品種判別を行うことができる。
【００３１】
たとえば、この例は本発明を限定するものではないが、ある豆類のＤＮＡサンプルについてプライマー対ＳＶ０１（配列番号７および８）およびＳＶ０２（配列番号９および１０）を同時に用いて、約５５０塩基対のバンドおよび約４３０塩基対のバンドが生じた場合を例にして考える。約５５０塩基対のバンドはプライマー対ＳＶ０１による増幅断片であるので、このサンプルはきたのおとめ、Ａｃｃ２５６５、Ａｃｃ２１１２（宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０または天津小豆の可能性がある。また、約４３０塩基対のバンドはプライマー対ＳＶ０２による増幅断片であるので、このサンプルはエリモショウズ、または、きたのおとめの可能性がある。したがって、この二つの条件を満たすきたのおとめがこのサンプルの品種であることが判別できる。
【００３２】
（ｖ）豆の加工品のように、複数の品種の豆が混合されている可能性があるサンプルの原料の各品種の同定を行う場合は、ＰＣＲ産物の有無およびその大きさだけでなく、検出されたバンドの発色の濃さに基づいて行うことができる。たとえば、この例は本発明を限定するものではないが、ある加工品のＤＮＡサンプルについてプライマー対ＳＶ０１（配列番号７および８）およびＳＶ０２（配列番号９および１０）を同時に用いて、約５５０塩基対のもっとも濃いバンド、および約４３０塩基対の薄いバンドが得られた場合を例にして考える。約５５０塩基対のバンドはプライマー対ＳＶ０１により増幅された断片であるので、該サンプルはきたのおとめ、Ａｃｃ２５６５（中国産）、Ａｃｃ２１１２（中国産、宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０（中国産）、または天津小豆を含む。また、約４３０塩基対のバンドはプライマー対ＳＶ０２により増幅された断片であるので、該サンプルはエリモショウズまたはきたのおとめを含む。さらに、約５５０塩基対のバンドと約４３０塩基対のバンドを比較すると、約４３０塩基対のバンドの方が濃く発色しているので、該サンプルはエリモショウズが主原料であると判別できる。
【００３３】
【表２】
2004016008.tif 000003
【００３４】
【発明の効果】
本発明のプライマーを用いて試験する豆類のＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、試験する豆類に特異的な増幅断片の生じるパターンに基づいて、簡便で精度の高い豆類の品種判別を行うことができる。また、本発明のプライマーは目的の断片を特異的に増幅し、その他のバンドを増幅することはないので、一度のＰＣＲに２種以上のプライマー対を導入するマルチプレックスＰＣＲにも適用することができる。このことは、試験時間の短縮に貢献する。さらに、本発明のプライマーはゲノム中の比較的短い、１０００塩基対以下の断片を特異的に増幅するため、ゲノムが切断されているような加工品に対しても、特異的な断片を増幅することができ、したがって、豆類あるいはその加工品のどちらにも適用できる方法を提供できる。
【００３５】
以下の実施例は本発明を実施するに当たっての参考にするための具体例であり、本発明を限定するものではない。
【００３６】
【実施例】
実施例１：白インゲンマメ品種判別用ＲＡＰＤマーカーの選抜。
白インゲンマメの品種のうち、雪手亡、姫手亡および銀手亡の小葉０．３　ｇ（生鮮重）または子実０．０５ｇ（直径２．５ｍｍのドリルで試料を削りだした）から、ＣＴＡＢ法によりＤＮＡを抽出した。ＣＴＡＢ法による抽出はほぼ以下のように行った。豆類の小葉または子実を乳鉢で磨砕し、２ｘＣＴＡＢ液（２％ＣＴＡＢ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．４Ｍ　ＮａＣｌ、１％ＰＶＰ）０．８ｍｌ、およびメルカプトエタノール０．０２ｍｌを加え、さらに磨砕した。２．２ｍｌのマイクロテストチューブに移し、５５℃で３０分加温した後、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４　：１）を０．８ｍｌ加え、３０分間振とうした。その後、テストチューブを１２０００ｒｐｍ（１００００ｘｇ）で１５分間遠心し、上清を新しいテストチューブに移し、１０％ＣＴＡＢ（１０％ＣＴＡＢ、０．７Ｍ　ＮａＣｌ）を０．０８ｍｌと沈殿バッファー（１％ＣＴＡＢ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）１．２ｍｌを加え、軽く撹拌した。テストチューブを１２０００ｒｐｍ（１００００ｘｇ）で１５分間遠心し、沈殿物が流れ落ちないように上清を捨て、ＲＮａｓｅＡを加えた１Ｍ　ＮａＣｌ−ＴＥバッファー（１Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を０．５ｍｌテストチューブに加えた。テストチューブを５５℃で３０分間加温した後、１ｍｌのイソプロパノールを加え、軽く撹拌し、１２０００ｒｐｍ（１００００ｘｇ）で１５分間遠心した。沈殿物が落ちないように上清を捨て、新たに０．５ｍｌの７０％エタノールを加え、テストチューブの内壁を軽く洗い、１２０００ｒｐｍ（１００００ｘｇ）で５分間遠心した。沈殿物（ＤＮＡ）が流れ落ちないようにエタノールを捨て、テストチューブを風乾した。エタノールが完全に乾燥したら、０．１ｍｌの蒸留水を加え、ＤＮＡを溶解した。ＤＮＡ溶液の一部を希釈し、分光光度計で濃度を測定した。ＤＮＡを３０ｎｇ／μｌの濃度にして続くＰＣＲの鋳型ＤＮＡサンプルとした。
【００３７】
この鋳型ＤＮＡサンプルについて、ｕｂｃプライマー（ｓｅｔ＃１−７；ブリティッシュコロンビア大学ＮＡＰＳユニット（カナダ）より購入）７００種を供試してＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。反応液量は１５μｌとし、鋳型ＤＮＡは３０ｎｇ（１μｌ）を、プライマー濃度は各０．２μＭとした。合成酵素はＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステム社）を０．５ｕｎｉｔｓを用い、その他の反応液組成は酵素添付のバッファーで最終濃度が１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ９．０）、　５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　各ｄＮＴＰｓとなるように調製した。温度制御にはＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（アプライドバイオシステム社）のサーマルサイクラーを用い、９５℃；７分の後、９４℃；１分、３６℃；１分、７２℃；２分のサイクルを４５回繰り返し、最後に７２℃；７分を付加した温度サイクルで反応を行った。
【００３８】
ＰＣＲ産物は４μｌをＴＡＥ（０．０４Ｍ　Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）バッファー中で１．５％アガロースゲルを用い、１００Ｖで約２０分間電気泳動した。電気泳動後のゲルをＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩ（和光純薬）で染色後、ＵＶ照射下で写真撮影し、多型断片の有無および断片が存在する場合はその大きさを確認した。
【００３９】
供試した７００種のプライマーのうち、ｕｂｃ１０５（１０００ｂｐ）、ｕｂｃ１５７（５００ｂｐ）、ｕｂｃ２１８（１５００ｂｐ）、ｕｂｃ２４５（５００ｂｐ）、ｕｂｃ２７６（１３００ｂｐ）、およびｕｂｃ２８９（１９００ｂｐ）、の６種のプライマーは雪手亡、姫手亡と銀手亡の間に多型が生じた（括弧内は多型が生じる断片の大きさ）のでこれらを選抜し、ｕｂｃ３５５（１２００ｂｐ）およびｕｂｃ３７５（１２００ｂｐ）の２種のプライマーは雪手亡と姫手亡、銀手亡の間に多型が生じた（括弧内は多型が生じる断片の大きさ）ので選抜した（表３）。これら８種の選抜したプライマーをＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ；ランダム増幅多型ＤＮＡ）マーカーとした。
【００４０】
【表３】
2004016008.tif 000004
【００４１】
実施例２：ＲＡＰＤマーカーによる品種判別および特異プライマーの設計。実施例１で選抜した８種のＲＡＰＤマーカーを用いて白インゲンマメ（雪手亡、姫手亡、銀手亡、グレートノーザン、ピービーン、および白芸豆）、ベニバナインゲン（大白芸豆）、およびライマメ（ベビーライマおよびバタービーン）由来のＤＮＡについて検定した。鋳型ＤＮＡサンプルは実施例１に示したようにＣＴＡＢ法で抽出し、ＰＣＲ条件ならびにＰＣＲ産物の解析も実施例１に示したように行った。
【００４２】
それぞれの品種についてＲＡＰＤマーカーによる多型を表４に示した。
【００４３】
【表４】
2004016008.tif 000005
【００４４】
ここで、ｕｂｃ２１８（１５００ｂｐ）、ｕｂｃ３７５（１２００ｂｐ）、およびｕｂｃ２８９（１９００ｂｐ）の３種のマーカーを用いることで白インゲンマメの品種の判別ができることから、これらのマーカーによる多型の特異断片の配列をクローニングし、当業者に既知の方法により配列解析を行った。ｕｂｃ２１８（１５００ｂｐ）、ｕｂｃ３７５（１２００ｂｐ）、およびｕｂｃ２８９（１９００ｂｐ）の特異断片の配列はそれぞれ配列番号２１、２２，２３に示した。配列の解析の結果から、これらの特異断片の一部の配列を特異的に増幅するプライマーを設計した。
【００４５】
雪手亡および姫手亡で増幅されるｕｂｃ２１８（１５００ｂｐ）の特異断片１５４８塩基のうち、９７塩基目から２１塩基を上流プライマーＳＰ０１ｆ（配列番号１）、３８２塩基目までの２１塩基に相補的な配列を下流プライマーＳＰ０１ｒ（配列番号２）として設計した。上記の二つのプライマーはプライマー対ＳＰ０１として利用した。
【００４６】
雪手亡で増幅されるｕｂｃ３７５（１２００ｂｐ）の特異断片１０６８塩基のうち、２３５塩基目からの２０塩基を上流プライマーＳＰ０２ｆ（配列番号３）、６２３塩基目までの２１塩基に相補的な配列を下流プライマーＳＰ０２ｒ（配列番号４）として設計した。上記の二つのプライマーはプライマー対ＳＰ０２として利用した。
【００４７】
雪手亡および姫手亡で増幅されるｕｂｃ２８９（１９００ｂｐ）の特異断片１８５０塩基のうち、７７８塩基目からの１９塩基を上流プライマーＳＰ０３ｆ（配列番号５）、１２２４塩基目までの１９塩基に相補的な配列を下流プライマーＳＰ０３ｒ（配列番号６）として設計した。上記の二つのプライマーはプライマー対ＳＰ０３として利用した。
【００４８】
実施例３：ＰＣＲによる白インゲンマメ（手亡類）の品種判別。
白インゲンマメ類（雪手亡、姫手亡、銀手亡、小白芸豆、およびピービーン）、ベニバナインゲン（大白芸豆）、および、ライマメ（ベビーライマおよびバタービーン）の小葉０．３ｇ（生鮮重）または子実０．０５ｇ（直径２．５ｍｍのドリルで試料を削りだした）から、ＣＴＡＢ法によりＤＮＡを抽出した。ＣＴＡＢ法による抽出は実施例１に示したのと同様に行った。
【００４９】
それぞれのＤＮＡサンプルについて、プライマーＳＰ０１ｆ（配列番号１）およびプライマーＳＰ０１ｒ（配列番号２）の対（ＳＰ０１）、プライマーＳＰ０２ｆ（配列番号３）およびプライマーＳＰ０２ｒ（配列番号４）の対（ＳＰ０２）、またはプライマーＳＰ０３ｆ（配列番号５）およびプライマーＳＰ０３ｒ（配列番号６）の対（ＳＰ０３）、をそれぞれ用いてＰＣＲ増幅を行った。
【００５０】
反応液量は１５μｌとし、鋳型ＤＮＡは３０ｎｇ（１μｌ）を、プライマー濃度は上流、下流各０．１５μＭとした。合成酵素はＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステム社）を０．７５ｕｎｉｔｓを用い、その他の反応液組成は酵素添付のバッファーで最終濃度が１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ９．０）、　５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　各ｄＮＴＰｓとなるように調製した。温度制御にはＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（アプライドバイオシステム社）のサーマルサイクラーを用い、９４℃；２分の後、９４℃；３０秒、５５℃；３０秒、７２℃；１分のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃；５分を付加した温度サイクルで反応を行った。
【００５１】
ＰＣＲ産物は４μｌをＴＡＥ（０．０４Ｍ　Ｔｒｉｓ−酢酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）バッファー中で１．５％アガロースゲルを用い、１００Ｖで約２０分間電気泳動し、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（和光純薬）で染色後、ＵＶ照射下で写真撮影し、増幅断片の有無および断片が存在する場合はその大きさを確認した。
【００５２】
ＰＣＲ産物の電気泳動による解析の結果を表１に示した。ＳＰ０１のプライマー対を用いた場合には雪手亡および姫手亡に２８６ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認でき、一方でその他の豆には増幅断片は現れなかった。ＳＰ０２のプライマー対を用いた場合には、雪手亡および小白芸豆に３８９ｂｐ、姫手亡、銀手亡、グレートノーザンおよびピービーンに５６４ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認でき、グレートノーザンおよびピービーンには約８００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認できた。ＳＰ０３のプライマー対を用いた場合には雪手亡、姫手亡およびピービーンに約４５０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認でき、一方でその他の豆には増幅断片は現れなかった。
【００５３】
したがって、ＳＰ０１およびＳＰ０２のプライマー対を併用することにより白インゲンマメの判別ができることが明らかとなった。さらに、ＳＰ０３のプライマー対を併用するとより精度の高い判別を行うことができる。
【００５４】
実施例４：マルチプレックスＰＣＲによる白インゲンマメ品種判別。
実施例２に示したプライマー対ＳＰ０１（配列番号１および２）およびプライマー対ＳＰ０２（配列番号３および４）を用いて、それぞれのプライマー対を混合して同時にＰＣＲ反応を行うマルチプレックスＰＣＲにより一度の反応での白インゲンマメの品種判別を行った。
【００５５】
判別に用いた品種は白インゲンマメ類（雪手亡、姫手亡、銀手亡、グレートノーザン、ピービーン、小白芸豆）、ベビーライマ、およびバタービーンであり、ＤＮＡの抽出法は上述の実施例１に記載したとおりである。
【００５６】
ＰＣＲは、２種のプライマー対をＰＣＲ反応溶液中に混合させた他は実施例１に示したのと同様に行った。ＰＣＲ産物は実施例１に記載したように１．５％アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を分離し、増幅断片の有無、断片が存在する場合はその大きさおよび断片のバンドの発色の濃さ（相対比）を確認した。
【００５７】
アガロースゲル電気泳動の結果を図１に示す。雪手亡（レーン１）では、約２９０ｂｐおよび約３９０ｂｐに二つの増幅断片のバンドを確認した（プライマー対ＳＰ０１による２８６ｂｐの増幅断片およびプライマー対ＳＰ０２による３８９ｂｐの増幅断片によるもの）。姫手亡（レーン２）では、約２９０ｂｐおよび約５６０ｂｐに二つの増幅断片のバンドを確認した（プライマー対ＳＰ０１による２８６ｂｐの増幅断片およびプライマー対ＳＰ０２による５６４ｂｐの増幅断片）。銀手亡（レーン３）では、約５６０ｂｐに一つの増幅断片のバンドを確認した（プライマー対ＳＰ０２による５６４ｂｐの増幅断片）。グレートノーザン（レーン４）およびピービーン（レーン５）では、約５６０ｂｐおよび約８００ｂｐに二つの増幅断片のバンドを確認した。小白芸豆（レーン６）では、約３９０ｂｐに一つの増幅断片のバンドを確認した（プライマー対ＳＰ０２による３８９ｂｐの増幅断片）。ベビーライマ（レーン７）、バタービーン（レーン８）、およびネガティブコントロール（レーン９）では増幅断片のバンドは確認されなかった。
【００５８】
したがって、本発明のプライマー２種を用いたマルチプレックスＰＣＲによって白インゲンマメの品種判別が一度のＰＣＲ反応で可能となった。特に、雪手亡、姫手亡および銀手亡と他の品種との判別が可能となった。
【００５９】
実施例５：ＰＣＲによる白餡原料の判定。
本発明のプライマー対ＳＰ０１（配列番号１および２）、ＳＰ０２（配列番号３および４）、またはＳＰ０３（配列番号５および６）の中から一組のプライマー対を一組用いたＰＣＲによる白餡原料の判別を行った。
【００６０】
白餡に含まれるＤＮＡは、白餡０．３ｇを採取し、一般的なＳＤＳ−フェノール法により抽出した。抽出操作は具体的には、餡０．３ｇに抽出液（０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、０．２５Ｍ　ＮａＣｌ、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）１ｍｌを加え撹拌し、５５℃で３０分間加温した。１４０００ｒｐｍ（１５０００ｘｇ）で５分間遠心し、上清を新しいテストチューブに移した。テストチューブに等量のフェノール／クロロホルム（ＴＥ−バッファー飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール＝２５：２４：１（ｖ／ｖ／ｖ））を加え、振とうした。テストチューブを、１４０００ｒｐｍ（１５０００ｘｇ）で５分間遠心し、上清を新しいテストチューブに移した。上清に０．６から０．７倍量のイソプロパノールを加え、撹拌した後、１４０００ｒｐｍ（１５０００ｘｇ）で５分間遠心した。イソプロパノールを捨てて沈殿物を風乾し、抽出ＤＮＡを得た。抽出したＤＮＡはＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて添付のプロトコルに従って精製した。ＤＮＡは５０μｌの溶出液として得て、このうち１μｌを用いてＰＣＲを行った。
【００６１】
反応液量は１５μｌとし、鋳型ＤＮＡはＤＮＡ溶出液１μｌを、一組のプライマーを混合し、プライマー濃度は上流、下流各０．１５μＭとした。合成酵素はＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステム社）を０．７５ｕｎｉｔｓを用い、その他の反応液組成は酵素添付のバッファーで最終濃度が１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ９．０）、　５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　各ｄＮＴＰｓとなるように調製した。温度制御にはＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（アプライドバイオシステム社）のサーマルサイクラーを用い、９５℃；１５分の後、９４℃；３０秒、５５℃；３０秒、７２℃；１分のサイクルを４５回繰り返し、最後に７２℃；５分を付加した温度サイクルで反応を行った。
【００６２】
ＰＣＲ産物の分子量の解析は実施例３に記載したようにアガロースゲル電気泳動により行った。
実施例６：マルチプレックスＰＣＲによる白餡原料の判定。
【００６３】
本発明のプライマー対ＳＰ０１（配列番号１および２）、ＳＰ０２（配列番号３および４）、またはＳＰ０３（配列番号５および６）の中から二組以上のプライマー対を用いた、マルチプレックスＰＣＲによる白餡原料の判別を行った。鋳型ＤＮＡは実施例３に示したように白餡より抽出し、精製したＤＮＡ溶出液を用いた。
【００６４】
反応液量は１５μｌとし、鋳型ＤＮＡはＤＮＡ溶出液１μｌを、プライマー対はＳＰ０１（配列番号１および２）およびＳＰ０２（配列番号３および４）を用い、プライマー濃度は上流、下流各０．１５μＭとした。合成酵素はＱｉａｇｅｎ　ＨｏｔＳｔａｒ　Ｔａｑ（キアゲン社）を０．７５ｕｎｉｔｓを用い、その他の反応液組成は酵素添付のバッファーで最終濃度が１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ９．０）、　５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　各ｄＮＴＰｓとなるように調製した。温度制御にはＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（アプライドバイオシステム社）のサーマルサイクラーを用い、９５℃；１５分の後、９４℃；３０秒、５５℃；３０秒、７２℃；１分のサイクルを４５回繰り返し、最後に７２℃；５分を付加した温度サイクルで反応を行った。
【００６５】
ＰＣＲ産物の分子量の解析は実施例１に示したようにアガロースゲル電気泳動により行った。
ここでは、北海道産お菓子Ａ、Ｂ、およびＣの３種の白餡について試験を行った。その結果、お菓子Ａ、およびＢでは約２９０ｂｐおよび約５６０ｂｐに強い強度のバンドが現れ、約３９０ｂｐに相対的に弱いバンドが生じた（図１：レーン１０、および１１、表５）。したがって、これらのお菓子の原料は姫手亡主体と判定した。一方でお菓子ＣではＰＣＲ産物は検出されなかったため、原料は手亡類以外の豆であることを判定した。
【００６６】
【表５】
2004016008.tif 000006
【００６７】
実施例７：アズキ品種判別用ＲＡＰＤマーカーの選抜。
アズキの品種のうち、エリモショウズ、きたのおとめ、しゅまりの小葉０．３ｇ（生鮮重）または子実０．０５ｇ（直径２．５ｍｍのドリルで試料を削りだした）から、当業者に既知のＣＴＡＢ法によりＤＮＡを抽出した。ＣＴＡＢ法による抽出は実施例１に示したように行った。
【００６８】
得られた鋳型ＤＮＡサンプルについて、ｕｂｃプライマー（ｓｅｔ＃１−８；ブリティッシュコロンビア大学ＮＡＰＳユニット（カナダ）より購入）８００種を供試してＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。反応条件およびＰＣＲ産物の検出は実施例１に示したように行った。
【００６９】
供試した８００種のプライマーのうち、ｕｂｃ０３３（７００ｂｐ）、ｕｂｃ０７２（１０００ｂｐ）、ｕｂｃ３２７（２０００ｂｐ）、ｕｂｃ４６８（９５０ｂｐ）、ｕｂｃ５１６（７００ｂｐ）、ｕｂｃ５６９（７００ｂｐ）、ｕｂｃ７７７（１４００ｂｐ）、およびｕｂｃ７９１（６００ｂｐ）の８種のプライマーはアズキの品種間に多型が生じた（括弧内は多型が生じる断片の大きさ）ので選抜した（表６）。これら８種の選抜したプライマーをＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ；ランダム増幅多型ＤＮＡ）マーカーとした。
【００７０】
【表６】
2004016008.tif 000007
【００７１】
実施例８：ＲＡＰＤマーカーによる品種判別および特異プライマーの設計。実施例７で選抜した８種のＲＡＰＤマーカーを用いてアズキの品種；エリモショウズ、きたのおとめ、しゅまり、十育１３０号（十系４９４号）、十系４８６号、十育１４３号、十育１３７号、十育１３８号、十系７９６号、ベニダイナゴン、カムイダイナゴン、光小豆、早生大粒１号、早生大納言、斑小粒系−１、斑小粒系−２、京都大納言、Ａｃｃ２４０２（山梨県産）、Ａｃｃ２５９（愛媛県産）、円葉（刈６３号）、赤豆（韓国産）、Ａｃｃ７２７（韓国産）、Ａｃｃ９３４（韓国産）、Ａｃｃ２２８８（ブータン産）、Ａｃｃ２３１２（ブータン産）、Ａｃｃ２２６６（ブータン産）、Ａｃｃ２１１４（米国産）Ａｃｃ２０６２（米国産）、Ａｃｃ２１１３アルゼンチン、Ａｃｃ２２４０（Ｂｌｏｏｄｗｏｏｄ）を含み、Ａｃｃ２５６５（中国産）、Ａｃｃ２１１２（宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０（中国産）、および天津小豆、ヤブツルアズキであるＡｃｃ２５１５（石川県産）、ツルアズキであるＡｃｃ２４９８（タイ産）、ヒメツルアズキであるＡｃｃ９５１（韓国産）、およびヒナアズキであるＡｃｃ２４９６（沖縄県産）由来のＤＮＡについて検定した。鋳型ＤＮＡサンプルは実施例１に示したようにＣＴＡＢ法で抽出し、ＰＣＲ条件ならびにＰＣＲ産物の解析も実施例１に示したように行った。
【００７２】
それぞれの品種についてＲＡＰＤマーカーによる多型を表７に示した。
【００７３】
【表７】
2004016008.tif 000008
【００７４】
2004016008.tif 000009
【００７５】
ここで、ｕｂｃ５１６（７００ｂｐ）、ｕｂｃ７７７（１４００ｂｐ）、およびｕｂｃ５６９（７００ｂｐ）の３種のマーカーを用いることでアズキ、特にエリモショウズ、きたのおとめ、およびしゅまりとその他の品種の判別ができることから、これらのマーカーによる多型の特異断片の配列をクローニングし、当業者に既知の方法により配列解析を行った。ｕｂｃ５１６（７００ｂｐ）、ｕｂｃ７７７（１４００ｂｐ）、およびｕｂｃ５６９（７００ｂｐ）の特異断片の配列はそれぞれ配列番号３２、配列番号３３の６４９塩基から１９０２塩基、および配列番号３４に示した。配列の解析の結果から、これらの特異断片の一部の配列を特異的に増幅するプライマーを設計した。
【００７６】
きたのおとめで増幅されるｕｂｃ５１６（７００ｂｐ）の特異断片７１４塩基のうち、１１塩基目からの２２塩基を上流プライマーＳＶ０１ｆ（配列番号７）、５８０塩基目までの２１塩基に相補的な配列を下流プライマーＳＶ０１ｒ（配列番号８）として設計した。上記の二つのプライマーはプライマー対ＳＶ０１として利用した。
【００７７】
エリモショウズおよびきたのおとめで増幅されるｕｂｃ７７７（１４００ｂｐ）の特異断片１２５４塩基の内部では、その断片の一部を特異的に増幅するプライマーが得られなかったため、インバースＰＣＲにより外側の領域の塩基配列も解読し、２０４０塩基分の断片を得た（配列番号３３）。この断片の、６４０塩基目からの１８塩基を上流プライマーＳＶ０２ｆ（配列番号９）、１０６８塩基目までの２０塩基に相補的な配列を下流プライマーＳＶＰ０２ｒ（配列番号１０）として設計した。上記の二つのプライマーはプライマー対ＳＶ０２として利用した。
【００７８】
きたのおとめおよびしゅまりで増幅されるｕｂｃ５６９（７００ｂｐ）の特異断片８６０塩基のうち、７塩基目からの２０塩基を上流プライマーＳＶ０３ｆ（配列番号１１）、３４９塩基目までの２０塩基に相補的な配列を下流プライマーＳＶ０３ｒ（配列番号１２）として設計した。上記の二つのプライマーはプライマー対ＳＶ０３として利用した。
【００７９】
実施例９：ＰＣＲによるアズキの品種判別。
アズキ（日本産エリモショウズ、日本産きたのおとめ、日本産しゅまり、中国産Ａｃｃ２５６５、中国産Ａｃｃ２１１２（宝清小豆）、中国産Ａｃｃ２５５０、中国産天津小豆Ａ、および中国産天津小豆Ｂ）の小葉０．３ｇ（生鮮重）または子実０．０５ｇから、実施例１に示したように当業者に既知のＣＴＡＢ法によりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡは蒸留水に溶解し、３０ｎｇ／μｌの濃度にして続くＰＣＲの鋳型ＤＮＡサンプルとした。それぞれのＤＮＡサンプルについて、プライマーＳＶ０１ｆ（配列番号７）およびプライマーＳＶ０１ｒ（配列番号８）の対（ＳＶ０１）、プライマーＳＶ０２ｆ（配列番号９）およびプライマーＳＶ０２ｒ（配列番号１０）の対（ＳＶ０２）、またはプライマーＳＶ０３ｆ（配列番号１１）およびプライマーＳＶ０３ｒ（配列番号１２）の対（ＳＶ０３）、をそれぞれ用いてＰＣＲ増幅を行った。
【００８０】
反応液量は１５μｌとし、鋳型ＤＮＡは３０ｎｇ（１μｌ）を、プライマー濃度は上流、下流各０．１５μＭとした。合成酵素はＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステム社）を０．７５ｕｎｉｔｓを用い、その他の反応液組成は酵素添付のバッファーで最終濃度が１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ９．０）、　５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　各ｄＮＴＰｓとなるように調製した。温度制御にはＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（アプライドバイオシステム社）のサーマルサイクラーを用い、９４℃；２分の後、９４℃；３０秒、５５℃；３０秒、７２℃；１分のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃；５分を付加した温度サイクルで反応を行った。
【００８１】
ＰＣＲ産物は４μｌをＴＡＥ（０．０４Ｍ　Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、１　ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）バッファー中で１．５％アガロースゲルを用い、１００Ｖで約２０分間電気泳動し、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（和光純薬）で染色後、ＵＶ照射下で写真撮影し、増幅断片の有無および断片が存在した場合はその大きさを確認した。
【００８２】
ＰＣＲ産物の電気泳動による解析の結果を表２に示した。ＳＶ０１のプライマー対を用いた場合にはきたのおとめ、Ａｃｃ２５６５、Ａｃｃ２１１２（宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０、天津小豆Ａ、および天津小豆Ｂに５６０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認でき、一方でエリモショウズおよびしゅまりには増幅断片は現れなかった。ＳＶ０２のプライマー対を用いた場合には、エリモショウズ、きたのおとめに４２９ｂｐＤＮＡ断片の増幅が確認でき、一方でしゅまり、Ａｃｃ２５６５、Ａｃｃ２１１２（宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０、天津小豆Ａ、および天津小豆Ｂには増幅断片は現れなかった。ＳＶ０３のプライマー対を用いた場合にはきたのおとめ、しゅまり、Ａｃｃ２５６５、Ａｃｃ２１１２（宝清小豆）、天津小豆Ａ、および天津小豆Ｂに３４３ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認でき、一方でエリモショウズおよびＡｃｃ２５５０は増幅断片は現れなかった。
【００８３】
したがって、ＳＶ０１、ＳＶ０２、およびＳＶ０３のプライマー対を併用することによりアズキの判別ができることが明らかとなった。
実施例１０：マルチプレックスＰＣＲによるアズキ品種判別。
【００８４】
実施例８に示したプライマー対ＳＶ０１（配列番号７および８）およびプライマー対ＳＶ０２（配列番号９および１０）を用いて、それぞれのプライマー対を混合して同時にＰＣＲ反応を行うマルチプレックスＰＣＲにより一度の反応でアズキの品種判別を行った。
【００８５】
判別に用いたアズキ品種は日本産エリモショウズ、日本産きたのおとめ、日本産しゅまり、中国産Ａｃｃ２５６５、中国産Ａｃｃ２１１２（宝清小豆）、中国産Ａｃｃ２５５０、中国産天津小豆Ａ、および中国産天津小豆Ｂであり、ＤＮＡの抽出法は上述の実施例５に記載したとおりである。
【００８６】
ＰＣＲは、２種のプライマー対をＰＣＲ反応溶液中に混合させた他は実施例５に示したのと同様に行った。ＰＣＲ産物は実施例３に記載したように１．５％アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を分離し、増幅断片の有無、断片が存在する場合はその大きさおよび断片のバンドの発色の濃さ（相対比）を確認する。
【００８７】
アガロースゲル電気泳動の結果を図２および表８に示す。エリモショウズ（図２；レーン１）では、約４３０ｂｐに一つの増幅断片のバンドを確認した（プライマー対ＳＶ０２による４２９ｂｐの増幅断片によるもの）。きたのおとめ（図２；レーン２）では、約４３０ｂｐおよび約５５０ｂｐに二つの増幅断片のバンドを確認した（プライマー対ＳＶ０２による４２９ｂｐの増幅断片およびプライマー対ＳＶ０１による５６０ｂｐの増幅断片によるもの）。しゅまり（図２；レーン３）では、増幅断片のバンドは検出されなかった。Ａｃｃ２５６５、Ａｃｃ２１１２（宝清小豆）、Ａｃｃ２５５０、天津小豆Ａ、および天津小豆Ｂの中国産の小豆（図２；レーン４から８）では、約５５０ｂｐに一つの増幅断片のバンドを確認した（ＳＶ０１による５６０ｂｐの増幅断片によるもの）。ネガティブコントロール（図２；レーン９）では増幅断片のバンドは確認されなかった。
【００８８】
したがって、本発明のプライマー２種を用いたマルチプレックスＰＣＲによってアズキの品種判別、特に日本産と中国産のアズキの判別、および日本産の品種の判別が一度のＰＣＲ反応で可能となった。
【００８９】
【表８】
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【００９０】
実施例１１：ＰＣＲによる小豆餡原料の判定。
本発明のプライマー対ＳＶ０１（配列番号７および８）、ＳＶ０２（配列番号９および１０）、またはＳＶ０３（配列番号１１および１２）の中から一組のプライマー対を用いたＰＣＲによる小豆餡原料の判別を行った。
【００９１】
小豆餡に含まれるＤＮＡは、小豆餡０．３ｇを採取し、実施例５に示したようにＳＤＳ−フェノール法により抽出し、抽出したＤＮＡはＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて添付のプロトコルに従って精製した。ＤＮＡは５０μｌの溶出液として得て、このうち１μｌを用いてＰＣＲを行った。
【００９２】
反応液量は１５μｌとし、鋳型ＤＮＡはＤＮＡ溶出液１μｌを、一組のプライマーを混合し、プライマー濃度は上流、下流各０．１５　μＭとした。合成酵素はＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（アプライドバイオシステム社）を０．７５ｕｎｉｔｓを用い、その他の反応液組成は酵素添付のバッファーで最終濃度が１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ９．０）、　５０　ｍＭＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　各ｄＮＴＰｓとなるように調製した。温度制御にはＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（アプライドバイオシステム社）のサーマルサイクラーを用い、９５℃；１５分の後、９４℃；３０秒、５５℃；３０秒、７２℃；１分のサイクルを４５回繰り返し、最後に７２℃；５分を付加した温度サイクルで反応を行った。
【００９３】
ＰＣＲ産物の分子量の解析は実施例６に記載したようにアガロースゲル電気泳動により行った。
実施例１２：マルチプレックスＰＣＲによる小豆餡原料の判定。
【００９４】
本発明のプライマー対ＳＶ０１（配列番号７および８）、ＳＶ０２（配列番号９および１０）、またはＳＶ０３（配列番号１１および１２）の中から二組以上のプライマー対を用いた、マルチプレックスＰＣＲによる小豆餡原料の判別を行った。鋳型ＤＮＡは実施例１１に示したように小豆餡より抽出し、精製したＤＮＡ溶出液を用いた。
【００９５】
反応液量は１５μｌとし、鋳型ＤＮＡはＤＮＡ溶出液１μｌを、プライマー対はＳＶ０１（配列番号７および８）およびＳＶ０２（配列番号９および１０）を用い、プライマー濃度は上流、下流各０．１５　μＭとした。合成酵素はＱｉａｇｅｎ　ＨｏｔＳｔａｒ　Ｔａｑ（キアゲン社）を０．７５ｕｎｉｔｓを用い、その他の反応液組成は酵素添付のバッファーで最終濃度が１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ９．０）、　５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　各ｄＮＴＰｓとなるように調製した。温度制御にはＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（アプライドバイオシステム社）のサーマルサイクラーを用い、９５℃；１５分の後、９４℃；３０秒、５５℃；３０秒、７２℃；１分のサイクルを４５回繰り返し、最後に７２℃；５分を付加した温度サイクルで反応を行った。
【００９６】
ＰＣＲ産物の分子量の解析は実施例５に示したようにアガロースゲル電気泳動により行った。
ここでは、北海道産お菓子ＤおよびＥの２種の小豆餡について試験を行った。その結果、お菓子Ｄでは約４３０ｂｐに強い強度のバンド、および約５５０　ｂｐに弱い強度のバンドが現れた（図２；レーン１０、表９）。したがってお菓子Ｄはエリモショウズ主体であることが判定できた。また、お菓子Ｅでは約４３０ｂｐおよび約５５０ｂｐにバンドが現れた。したがって、お菓子Ｅの原料はきたのおとめであると判定した。
【００９７】
【表９】
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【００９８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】マルチプレックスＰＣＲによる白インゲンマメの品種判別の際のアガロースゲル電気泳動図である。
【図２】マルチプレックスＰＣＲによるアズキの品種判別の際のアガロースゲル電気泳動図である。
【図１】
2004016008.tif 000036
【図２】
2004016008.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】平成14年10月22日(2002.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
【表２】
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