(57)【要約】【課題】  全体的もしくは部分的な切除後の脳腫瘍、またはその位置のため切除不可能な腫瘍に対する局所的なタウロリジン治療方法を提供する。【解決手段】  癌細胞の成長を防止または抑制するための治療方法であって、生体対象の組織に付着可能な生体分解性付着物と組合せて、抗新生物効果がある量のメチロール移送剤（ＭＴＡ）を含む抗新生物性組成物を使用する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体対象の組織に付着可能な生体分解性付着物と組合せた、抗新生物効果がある量のメチロール移送剤（ＭＴＡ）を含む抗新生物性組成物。
【請求項２】
前記ＭＴＡはタウロリジン、タウルルタムまたはその混合物であり、前記組成物は最初流体または半流体の状態にあり、前記ＭＴＡは約０．５〜８０重量％の範囲内の濃度であり、前記組織への前記付着の後、前記付着物は、前記組織に付着している間にその粘度を上昇させる、または少なくとも部分的に固体化する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は最初、液体、半液体または懸濁の状態にあり、前記ＭＴＡはタウロリジン、タウルルタムまたはその混合物であり、かつ約０．１〜１６０ｍｇ／ｍｌの範囲内の濃度であり、前記組織への前記付着の後、前記付着物は、前記組織に付着している間にその粘度を上昇させる、または少なくとも部分的に固体化する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記付着物はフィブリンシーラントマトリックスを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記濃度は約２０〜１００ｍｇ／ｍｌである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記濃度は約５０〜８０ｍｇ／ｍｌである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
癌細胞の成長を防止または抑制するための治療方法であって、前記治療が必要な生体対象の組織に対し、請求項１に記載の抗新生物性組成物を適用するステップを含む、方法。
【請求項８】
前記ＭＴＡはタウロリジン、タウルルタムまたはその混合物であり、前記組成物は流体または半流体の状態で前記組織に対して適用され、前記ＭＴＡは約０．５〜８０重量％の範囲内の濃度であり、前記組成物を適用した後、前記付着物は、前記組織に付着している間にその粘度を上昇させる、または少なくとも部分的に固体化する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記状態は液体、半液体または懸濁の状態であり、前記ＭＴＡはタウロリジン、タウルルタムまたはその混合物であり、かつ約０．１〜１６０ｍｇ／ｍｌの範囲内の濃度であり、前記組成物を適用した後、前記付着物は、前記組織に付着している間にその粘度を上昇させる、または少なくとも部分的に固体化する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記付着物はフィブリンシーラントマトリックスを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記濃度は約２０〜１００ｍｇ／ｍｌである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記濃度は約５０〜８０ｍｇ／ｍｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記適用の前に腫瘍が前記組織の区域から除去される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物は層として前記区域に対して適用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記層は約０．１〜１０ｍｍの厚みを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記層は約１〜５ｍｍの厚みを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記層は約１．５〜２．５ｍｍの厚みを有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記層は、前記組成物を前記区域に対して噴霧することによって適用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記層の適用後、前記層は、前記ＭＴＡを含有しない密封用の第２の層で覆われ密封される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
この発明は抗新生物性組成物および治療方法の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術の説明
タウロリジン（taurolidine）（ビス−（１，１−ジオキソペルヒドロ−１，２，４−チアジアジニル−４）メタン）はガイストリヒ・ファルマ（Geistlich Pharma）により開発されたものである。これは白色で結晶質の物質であり、２％までの水溶性を有する。タウロリジンは、タウンリアミドの２分子およびホルムアルデヒドの３分子からなり、メチレン基でつながれた二環構造を形成する。
【０００３】
タウロリジンの効果は主に抗生作用および抗内毒素作用である。タウロリジンは化学反応によって作用するため、微生物の耐性はまだ観察されていない。このタウロリジンの効果は、その活性の代謝物質すなわち活性のメチロール基の供与体（メチロール−タウルルタム（taurultam）およびメチロール−タウリンアミド）によって媒介される。活性のメチロール基は、バクテリアの細胞壁および内毒素の第一級アミノ基と反応することでこれを不活性化する。
【０００４】
タウロリジンにはさらなる効果が過去に報告されている。すなわち、単核細胞内のＴＮＦおよびＩＬ−１ベータの抑制（非特許文献１）、腫瘍壊死因子の毒性の抑制、および、腹膜鏡を用いた手術時の腹膜腫瘍細胞の成長の抑制（非特許文献２）である。
【０００５】
タウロリジン溶液は、腹膜炎の場合に腹腔の洗浄溶液または点滴液として用いられてきた。手術後の点滴においては、意識のある患者が刺激およびしばしば灼熱感を副作用として報告している。
【０００６】
モンソン（Monson）他による特許文献１では、いくつかの種類の人体腫瘍に対するタウロリジンおよび／またはタウルルタムの選択的な直接抑制効果が開示されている（非特許文献３）。また、生体内マウスモデルにおけるＢ１６黒色腫細胞およびMeth−Ａ肉腫細胞に対する効果、さらにはインビトロの繊維芽細胞性腫瘍細胞ＬＳ１７４Ｔ（結腸）癌腫細胞およびジャーカット（白血病）細胞に対する効果もある（特許文献２）。
【０００７】
全身性化学療法においては、抗新生物剤は循環によって非特異的に全身に行き渡らせられる。したがって健康な臓器にある増殖性細胞もまた腫瘍細胞と同じ薬剤濃度に晒される。さらに、腫瘍の中のさまざまな血流力学的要因によって薬剤の腫瘍内分布が妨げられるおそれがある。ほとんどの化学療法剤の抗新生物作用は、正常細胞と腫瘍細胞との増殖速度の差異に依存する。この速度が同じである場合、投与量の制限を迫るような副作用が生じるおそれがある。化学療法の有効性は、腫瘍内の薬剤濃度およびこれに晒す期間に伴って増加すると一般に考えられている。しかし一方で、全身性の投与は副作用の重大さのため制限される。
【０００８】
この問題を克服する方策として化学療法剤の局所的投与が挙げられ、その分布には拡散に依存する。この局所的療法では、抗新生物剤を腫瘍それ自体または腫瘍周辺区域に導入する。その結果得られる圧力勾配によって抗新生物剤が腫瘍内へと拡散する。この態様の投与は全身性投与と比較して腫瘍内の薬剤の濃度を増加させるだけでなく、結果として他
の組織内での濃度もまたはるかに低くなる。
【０００９】
この局所的薬物送達システムでは、コラーゲンまたは生物分解性のポリマーもしくはシリコンなどさまざまな物質が用いられる。これらの物質は、ＢＣＮＵ、ミトキサントロンまたはシスプラチンなど埋込まれる局所的細胞増殖抑制剤を腫瘍切除腔内に導入するのに用いるマトリックスとして働く。さらに、抗新生物剤の局所的送達にはシリコン樹脂が用いられる。この態様の薬物投与に潜在的に伴う問題としては、担体マトリックスの含有する成分が非常に長時間の後初めて完全に分解する、または全く分解しない場合が挙げられる。別の危険要因として、ＣＳＦ内で抗腫瘍剤が制御されずに分布されることが挙げられ、このため標的における濃度を正確に定めることがさらに困難となる。また、手術後に水腫形成に関連して腫瘍切除腔の形状およびサイズが変化すると、薬物を運ぶオブラートを切除腔に完全に満たすことが妨げられるおそれがある。結果として、薬剤の分布が不均質になって薬物濃度が局所的に劇的に増加する可能性があり、これは隣接する健康な組織に対し有害な影響を及ぼすおそれがある。
【００１０】
局所的な腫瘍治療のもう一つの方策としては、薬物を脳内で腫瘍またはその周囲に注入するいわゆる対流増強薬物送達（ＣＥＥＤ）がある。薬物は対流による輸送で分布する。しかしこの態様の投与ではほとんどの場合にカテーテルを設置する必要があり、このため感染の危険性や、術後ＣＳＦ瘻形成の発生率が上昇する。さらにこの態様の投与はむしろ非切除の腫瘍の場合に適したものである。腫瘍を切除した後にこれを適用することはほぼ不可能である。
【特許文献１】ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／００７４３
【特許文献２】国際特許ＰＣＴ番号ＰＣＴ／ＥＰ９１／０１２６９、国際公開番号ＷＯ９２／００７４３ＰＣＴ「腫瘍の治療におけるタウロリジンおよび／またはタウルルタムの使用（Use of Taurolidine and/or Taurultam for the treatment of tumors）」
【非特許文献１】ベドロージアン（Bedrosian）、１９９１年
【非特許文献２】ヤコービ（Jacobi）、１９９７年
【非特許文献３】モンソン  ＪＲＴ、ラムジー（Ramsey）ＰＳ、ドノヒュー（Donohue）ＪＨ、「タウロリジンが抗新生物性なおかつ抗内毒素性および抗菌性であることについての予備的証拠（Preliminary evidence that taurolidine is anti-neoplastic as well as anti-endotoxin and anti-microbial）、摘要、英国外科学報（Br Ｊ Surg）７７（６）、１９９０年、Ａ７１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、腫瘍の治療における新たな方法および組成物に対する要求が当該技術になお存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
この発明により或る抗新生物性組成物が提供される。この抗新生物性組成物は、生体対象の組織に付着可能な生体分解性付着物と組合せた、抗新生物効果がある量のメチロール移送剤（methylol transfer agent：ＭＡＴ）を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
メチロール移送剤、たとえば抗菌・抗毒素薬であるタウロリジン、およびこれに関係した生成物であるタウルルタムは、主に腫瘍の治療に用いられる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の毒性を緩和する効果を発揮することがわかっている。さらに、メチロール移送剤の作用は
、正常な細胞株の成長が顕著に抑制されないという点で選択的であることがわかっている。
【００１４】
タウロリジンは３個のメチロール基を作用部位に移送するよう働く。タウルルタムはその中間代謝物質であってそれ自体単一のメチロール基を移送し、極めてよく耐えられる化合物であるタウリンアミドそして最終的にタウリンを遊離する。タウリンは人体内で大量に存在するアミノ酸であり、これは特に心臓および脳に言えることである。
【００１５】
なおメチロール移送は、多くの高い毒性の抗腫瘍薬を特徴付けるメチル移送とは対照的なものである。タウロリジンおよびタウルルタムは毒性が低く、正常細胞に対して細胞障害性がない。
【００１６】
この方法の実施においては、対象たとえば癌に罹った哺乳動物に対し、活性のメチロール含有化合物を含有する組成物を、新生物細胞のアポトーシスによる死を誘発するのに十分な用量で投与する。「メチロール含有化合物」または「メチロール移送剤」とは、生理的条件下でメチロール分子を含有またはこれを生成可能な化合物のことである。メチロール含有化合物はＲ−Ｎ−ＣＨ２−ＯＨ基を有するものとして特徴付けられ、ここでＲはアルキル基、アリール基またはヘテロ基である。この発明はまた、Ｒ−Ｎ−ＣＨ２−ＯＨ構造を含有する化合物を生成し得る、またはこれへと転換され得る化合物の使用を含む。
【００１７】
メチロール移送剤は、タウロリジンおよびタウルルタム、その誘導体、ならびにその有機塩または無機塩などのメチロール含有化合物を含む。化合物タウロリジンおよびタウルルタムは米国特許第５，２１０，０８３号に記載されている。その他好適なメチロール含有化合物には、タウリン誘導体、タウリンアミド誘導体、尿素誘導体、その有機塩または無機塩が含まれる。この発明で用いられ得るタウロリジン、タウルルタム、タウンリアミドおよび尿素の誘導体のいくつかの例がＷＯ０１／３９７６３Ａ２に記載されている。この発明で使用される特に好ましいメチロール移送剤は、タウロリジン、タウルルタム、その生物学的に活性な誘導体およびその混合物である。
【００１８】
これに代えて、化合物はタウリンアミド誘導体または尿素誘導体である。この発明で用いられ得るタウロリジン、タウルルタム、タウリンアミドおよび尿素の誘導体のいくつかの例がＷＯ０１／３９７６３Ａ２に記載されている。
【００１９】
タウロリジンまたはタウルルタムの誘導体とは、それぞれタウロリジンまたはタウルルタムの新生物性の活性のうち少なくとも１０％を有するスルホンアミド化合物を意味する。スルホンアミド化合物としては、Ｒ２Ｎ−ＳＯ２Ｒ′の化学式を有するものがある。ここに記載される化合物の誘導体はタウロリジンまたはタウルルタムなどの基準化合物とは構造的に異なり得るが、アポトーシスによる細胞死の誘発などの生物学的活性について基準化合物の少なくとも５０％を保持することが好ましい。好ましくは、誘導体の生物学的活性は基準化合物の少なくとも７５％、８５％、９５％、９９％または１００％である。場合によっては、誘導体の生物学的活性は基準化合物の活性レベルを超えることもある。誘導体はまた基準化合物にはない特徴または活性を有することもある。たとえば誘導体は毒性が低かったり、臨床的半減期が長かったり、または血液脳関門を超える能力が向上されていたりする。
【００２０】
この発明が適用され得る癌には、再発性神経膠芽腫、神経膠腫、神経芽腫、星状細胞腫、癌性髄膜炎、卵巣癌、前立腺癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、肺癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、白血病、中皮腫、リンパ腫、黒色腫、腎細胞癌、およびその転移したものが含まれる。その他この発明の方法が効果的な癌には、その他の癌腫、肉腫またはリンパ腫、頭部および頚部の癌、肝臓癌、乳癌および膵臓癌が含まれる。
【００２１】
特に好ましい実施形態は、中枢神経系（ＣＮＳ）癌の治療およびその癌転移の抑制に関わるものである。
【００２２】
この発明は、癌細胞の成長を防止または抑制するための治療方法を提供するものであり、このような治療を必要としている生体対象の組織に対して抗新生物性組成物を適用するステップを含む。この抗新生物性組成物は、生体対象の組織に付着可能な生体分解性付着物と組合せた、抗新生物効果がある量のメチロール移送剤（ＭＴＡ）を含む。ここで用いられる生体分解性という用語は、生体吸収性または腐食性の付着物をも包含することが意図される。好ましい実施形態では、この発明の組成物は最初流体または半流体の状態にあり、最も好ましくは液体または半液体の状態にある。
【００２３】
好ましい実施形態では、この発明の組成物は、原発性および／または二次性脳腫瘍またはその他の中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍を少なくとも部分的に摘出した後に適用される。その他好ましい用途としては、皮膚腫瘍、口／あご／顔の領域の腫瘍、鱗状細胞癌腫、泌尿生殖器区域の腫瘍、外眼およびまぶたの腫瘍、骨腫瘍、実質性臓器の腫瘍、および消化管の腫瘍の治療がある。
【００２４】
好ましい実施形態では、生体対象の組織の或る区域から腫瘍を少なくとも部分的に除去した後にこの発明の組成物を層として該組織区域に対して適用し、これは好ましくは、腫瘍を除去した結果生じた腔の表面区域に対してこの組成物を噴霧またはブラッシングすることによって行なわれる。
【００２５】
上述のように、この発明の組成物は最初、腫瘍を除去した組織区域に対し適用されて付着するときに液体または半液体の状態にあることが好ましい。特に好ましい実施形態では、適用後にこの付着物は組織に付着している間にその粘度を増す、または少なくとも部分的に固体化する。
【００２６】
上述のように、一局面に従うと、この発明の組成物は層として該区域に対して適用され、これは最も好ましくは噴霧またはブラシによる。一実施形態に従うと、層の厚みは約０．１〜１０ｍｍ、好ましくは約１〜５ｍｍ、最も好ましくは約１．５〜２．５ｍｍである。
【００２７】
好ましい実施形態では、この発明の組成物内のメチロール移送剤の濃度は約０．１〜９９重量％、より好ましくは約０．５〜８０重量％、さらにより好ましくは約２〜８０重量％、さらにより好ましくは約３〜８０重量％の範囲内である。他の実施形態では、この発明の組成物内のＭＴＡ濃度は約０．１〜１６０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは約２０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは約５０〜８０ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【００２８】
好ましい実施形態では、この発明で用いられる付着物はフィブリンシーラントマトリックス（フィブリン接着剤）である。フィブリン接着剤は、フィブリノーゲンおよびトロンビン／カルシウムの別個の溶液の２成分系である。これら２溶液を組合せた結果得られる混合物は、フィブリン凝固物を形成する凝固カスケードの最終段階によく似ている。フィブリノーゲン成分は自己由来もしくは単一ドナーの血液またはプール血液からその場で調製され得る。フィブリン接着剤はヨーロッパにおいてはベリプラスト（Beriplast）、ティッセル（Tissel）およびテッシュコル（Tissucol）の商標名で入手可能である。フィブリン接着剤は、広範囲にわたるさまざまな手術において、さまざまな解剖学的部位の組織を修復、密封および付着させるのに用いられている。
【００２９】
特に好ましい実施形態では、治療する区域の上にこの発明の組成物の層を適用した後、
この層を、メチロール移送剤を含有しない密封用の第２の層で覆って密封する。この密封用の第２の層は、この発明の組成物で用いるのと同じ生体分解性付着物、たとえばフィブリンシーラントマトリックスであり得る。
【００３０】
その他の実施形態では、この発明の組成物で用いられる生体分解性付着物は、ゲル（たとえば付着性コラーゲンゲル）、ゲル／フィブリン混合物、粉末などである。たとえばＭＴＡを付着性フィブリン粒子内に封じ込めてＭＴＡを持続的に放出させることがあり得る。これに代えて、ＭＴＡ含有のマイクロカプセルを付着物内に懸濁させることもある。
【００３１】
悪性神経膠腫は大半の症例において再発する傾向を有する。再発性神経膠腫は切除縁まわりの領域に存在する生きた腫瘍細胞から生じ得る。再発性神経膠腫の成長は極めて速く、たちまちにして患者の死に至る。この発明では、腫瘍切除と、抗新生物性であって毒性でない薬物を用いた局所化学療法とを組合せることができる。タウロリジンは、プログラムされた細胞死を誘発させることにより選択的な抗新生物効果を発揮し、抗脈管形成活性を有する。フィブリンシーラントは完全に分解可能であり、脳組織にしっかりと付着し、脳腫瘍の局所治療におけるタウロリジン伝達のためのマトリックスすなわちタウロリジンフィブリンシーラントマトリックス（ＴＦＭ）となる。
【００３２】
タウロリジンまたはその他のＭＴＡは、フィブリンシーラントにおけるトロンビンおよび凝血促進性タンパク質成分の両方の中で均質に懸濁され得る。フィブリンシーラントマトリックスは、治療効果のある量の薬物がインビトロで２週間までまたはそれ以上の期間にわたり確実に放出されるような濃度でタウロリジンまたはその他のＭＴＡを懸濁させるのに好適な担体である。タウロリジンの抗新生物作用はフィブリンシーラントマトリックス内に埋込まれることによって影響を受けない。
【００３３】
この発明の薬物送達システムは、全体的もしくは部分的な切除後の脳腫瘍、またはその位置のため切除不可能な腫瘍に対する、手術間に局所的なタウロリジン治療に好適であり得る。
【００３４】
悪性神経膠腫は周囲の組織に侵入するため、一見完全な全体切除後ですら大半の症例において再発する傾向を有する。神経膠腫の再発はその８０〜９０％の症例において元の切除縁の２ｃｍ内で起こる。したがって再発性神経膠腫は、切除縁まわりのこの領域内に存在する生きた腫瘍細胞から生じ得る。腫瘍切除の範囲は術後生存率と相互に関係する。さらに、悪性神経膠腫からの転移は極めて稀であり、その場所は主に脳の外である。
【００３５】
一実施形態に従うと、全体的または部分的な腫瘍切除と、正常な脳組織に損傷を与えない選択的な抗新生物活性のある薬剤を用いた局所化学療法とを組合せる。一実施形態に従うと、薬物を脳内へ伝達させる方法により、腫瘍または切除腔壁との高い密着性が得られる。この方法により、健康な脳組織に対する毒性の影響を最小限にしながら、治療効果がある濃度で薬物を伝達させることが可能となる。さらにこの伝達方法には感染の危険がなく、局所合併症を引起こし得る残留物が残らない。
【００３６】
さらに、神経膠芽腫の患者においては脳内のタウリンの存在量が異常に低いため、タウロリジンおよび／またはタウルルタムの投与のさらなる利点として脳内タウリンレベルの上昇があるが、それは両方の化合物が最終的に代謝されてタウリンになるからである。
【００３７】
タウロリジンには腫瘍に対する二重の効果がある。タウロリジンはプログラムされた腫瘍細胞死（アポトーシス）の誘発を引起こすだけでなく、ＶＥＧＦおよびＴＧＦベータを抑制することで抗脈管形成活性もある。また、神経膠芽腫の患者にタウロリジンなどのＭＴＡを同時に静脈投与する処置も利用され得る。
【００３８】
実施例
ティッセル・キット（オーストリア・ウイーン（Vienna）のインムーノ・アクチェンゲゼルシャフト（Immuno AG）製で、ドイツ・ハイデルベルグ（Heidelberg）のバックスター・ドイッチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング（Baxter Deutschland GmbH）の好意により提供されたもの）を用い、製造業者の指示に従ってフィブリンシーラントマトリックスを調製した。タウロリジン（超高純度）はスイス・ボルフーゼン（Wolhusen）のガイストリヒ・ファルマ・アクチェンゲゼルシャフト（Geistlich Pharma AG）の好意により提供されたものである。
【００３９】
フィブリンシーラントの２成分内にさまざまな濃度のタウロリジンを均質に懸濁させた。次にこれら２成分を２４マルチウェルプレートのウェル内で混合し、最終的なタウロリジン濃度１０，２０，４０，８０ｍｇ／ｍｌを含有するウェル当り４００μｌの同一の合計体積のマトリックスを調製した。結果として得られたマトリックスの厚みは２ｍｍ±０．４ｍｍであった。さらに、マトリックスのサイズがタウロリジンの放出に対して及ぼす影響を調べるために、１０ｍｇ／ｍｌまたは４０ｍｇ／ｍｌのタウロリジンを含有する体積４００μｌおよび８００μｌのマトリックスを調整した。８００μｌのマトリックスの厚みは４ｍｍ±０．３ｍｍであった。タウロリジンを含まない同一の体積および厚みのマトリックスをコントロールとした。固体化の後に各々のウェルにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を４００μｌ、上澄液として加えた。マルチウェルプレートを３７℃でインキュベートした。７日間にわたり２４時間間隔で上澄液をピペットで取り、代わりに同一量の新たなＰＢＳを加えた。
【００４０】
長期間のタウロリジン放出力学を調べるために、フィブリンシーラントの２成分内に異なる濃度のタウロリジンを均質に懸濁させ、１４日間にわたり２４時間間隔で４００μｌの新たなＰＢＳ当りで最終的な濃度（ｍｇ／ｍｌ）が１０，４０，８０ｍｇ／ｍｌに達するようにした。同一のタウロリジン濃度を含有するウェルからの上澄液をプールした。上澄液内のタウロリジン濃度を測定した。
【００４１】
タウロリジンの抗新生物活性がマトリックス内へ埋込まれたことによって影響されたかどうかを判断するために、神経膠腫瘍細胞株ＬＮ１８，ＬＮ２２９，Ｕ８７ＭＧ、および新たに単離した神経膠芽腫からのエクスビボ細胞をインキュベートし、タウロリジンを異なる期間でマトリックスから放出させた。
【００４２】
ＬＮ１８，ＬＮ２２９およびＵ８７ＭＧ腫瘍細胞、ならびに神経膠芽腫からのエクスビボ細胞を１５０ｃｍ3のプラスチック細胞培養フラスコ内に播種し、これを細胞密集度が８０％に達するまで行なった。その結果得られた細胞懸濁液を遠心分離機により１２００ｒｐｍで５分間処理してから希釈し、１ｍｌ当り５×１０４個の細胞を含有する細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液のうち２００μｌの部分標本をピペットで９６マルチウェルプレートの各ウェル内に入れた。
【００４３】
１２時間後、細胞が付着性になったときに、媒質を除去して代わりに新たな媒質を入れた。細胞を２４時間インキュベートし、異なるタウロリジン濃度を充填したマトリックスから異なる時間間隔でタウロリジン溶液を放出させた。タウロリジンを含まないフィブリンシーラントマトリックスからの同じ体積の上澄液とともにインキュベートした腫瘍細胞を否定的コントロールとして用いた。同一の処理がなされた細胞であって濃度２５％のFasリガンドを加えたものを肯定的コントロールとして用いた。
【００４４】
２４時間のインキュベート後、上澄液を除去して１００μｌのクリスタルバイオレット染色液（１９．５％メタノールおよび８０％蒸留水中に０．５％クリスタルバイオレット
）を加えた。この溶液を１０分後に除去し、残留色素を水道水で洗い流した。次にプレートを１２時間空気乾燥させ、その後マイクロプレートカウンタにより５４０ｎｍで計数した。
【００４５】
フィブリンシーラントマトリックスからのタウロリジンの拡散制御放出の基盤をなす理論的仮定について検討した。局所タウロリジン代謝の一モデルを使用して、マトリックスからのタウロリジンの拡散制御放出に影響を与える要因について調べた。
【００４６】
懸濁したタウロリジンを含有するフィブリンシーラントの２成分を、フィルタ殺菌した圧縮空気を用いて１．５バールで単一のノズルから噴霧した。マトリックス内で可能な最高タウロリジン濃度を調べた。ＴＦＭの均一な分布が達成され得たかどうか判断した。
【００４７】
１週間にわたりフィブリンシーラントマトリックスからのタウロリジンの放出を調べた結果、放出されたタウロリジンの累積量が指数関数的に増加することが示された。
【００４８】
タウロリジンの充填濃度が異なる場合に上澄液内に放出されたタウロリジンの累積量は統計的に有意に異なるものであった（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、クラスカル・ワリス（Kruskal-Wallis）検定；ｐ＜０．００１）。マトリックスからの累積タウロリジン放出量が指数関数的に経過する結果として、最初の数日間に最大量のタウロリジンが放出された。
【００４９】
百分率でのタウロリジン放出についての時間経過を、マトリックスの初期タウロリジン充填量との関係で求めた。その結果、タウロリジンの初期濃度にかかわらず、最初の２日間でマトリックスから全タウロリジンのうち約５０％（５４．７±１．４４％）が放出され、６日間で約７５％（７５．２±６．６４％）が放出されたことが示唆された。ＴＦＭ内でタウロリジン充填濃度が異なっても百分率での放出レートは有意に異ならなかった（ＡＮＯＶＡ、クラスカル・ワリス検定；ｐ＝０．５２２）。
【００５０】
タウロリジン濃度が一定かつマトリックス体積が異なる場合、累積タウロリジン放出量は有意に異なった（ＡＮＯＶＡおよびホルム・サイダック（Holm-Sidak）検定；ｐ＜０．００１）が、マトリックス体積が異なりタウロリジンの初期量が同一である場合、累積タウロリジン放出量には統計的に有意の差は見られなかった（分散分析およびホルム・サイダック検定；ｐ＝０．９３４（初期量８ｍｇ）およびｐ＝０．１５９（初期量３２ｍｇ））。
【００５１】
放出においては、マトリックス内に充填されたタウロリジン量が重要な決定要因であると考えられる。一方、マトリックスの厚みはタウロリジン放出の制御に重要な役割を果たしてはいないと思われる。この観察結果はフィブリンシーラントマトリックスの実際の適用において極めて重要である。すべての場合において確実に均一なマトリックス厚みを得ることが不可能なこともあるからである。
【００５２】
適当な期間にわたって局所療法を確実なものにするにはＴＦＭの寿命が長いことが望ましい。フィブリンマトリックスの寿命はフィブリン溶解の発現によって制限される。現在入手可能なデータからは、アプロチニンなどの抗フィブリン溶解薬を加えた場合には生体内寿命を最大１２〜１４日まで延長可能であることが示唆されている。さらに、フィブリンシーラントマトリックスが分解する速度は、適用部位でのタンパク分解活性に伴って異なる。
【００５３】
これに従い発明者は、タウロリジンがマトリックスの最大寿命である１４日を通じて放出されるかどうかを調べた。ここで用いられた実験モデルでは、タウロリジンの充填濃度が２５ｍｇ／ｍｌ以上の場合、抗新生物効果がある量のタウロリジンが１４日の観察期間
全体を通じて放出された。充填濃度が５０ｍｇ／ｍｌ以上の場合、結果として１４日目に１００μｇ／ｍｌを上回るタウロリジンが放出された。このタウロリジンレベルは、これまでタウロリジンで検定したほとんどの細胞株での急性細胞障害性のＥＣ50を上回る。
【００５４】
マトリックス内のタウロリジン充填量が異なる場合のタウロリジン放出量の時間経過を１４日間にわたり調べた。充填濃度にかかわらず、１０日後にはマトリックスから９８．９３％±０．３３のタウロリジンが放出され、１４日後にはほぼ１００％（９９．９９％±０．０２）が放出された。タウロリジン充填濃度が異なっても百分率での放出量は変らなかった（ＡＮＯＶＡ、クラスカル・ワリス検定；ｐ＝０．８３０）。
【００５５】
調べた腫瘍細胞株すべておよびエクスビボ神経膠芽腫細胞の増殖は濃度に依存して抑制された。初期タウロリジン充填濃度が１０ｍｇ／ｍｌのＴＦＭから１３日目に放出されたタウロリジンは腫瘍細胞増殖に対してもはや効果がなかった。これはこの時点でマトリックスから放出されたタウロリジンの濃度に対応している。対照的に、充填濃度１００ｍｇ／ｍｌで３日目に放出されたタウロリジンは細胞数を少なくとも６０％減少させることがわかった。
【００５６】
腫瘍を切除した後、手術中にタウロリジン充填フィブリンシーラントマトリックスを適用し、確実に切除腔の壁に対し密に結合させて表面凹凸すべてを塞いだ。次にタウロリジンをマトリックスコンパートメントから脳コンパートメントへ拡散勾配に沿って拡散させた。拡散勾配はタウロリジン放出を可能にする主な力である。同時に、脳のうちマトリックスに隣接する区域からタウロリジンをなくすプロセスが開始する。これは一方で代謝によるものであり、他方では脳のより深い区域への拡散によるものである。
【００５７】
これらのプロセスに加え、タウロリジンは脳脊髄液（ＣＳＦ）空間に入って分布されることがあり得る。この分布は、切除腔側のマトリックス表面を通る拡散によって駆動され、特に切除腔が「開いた」ままであるときにＣＳＦ対流によって増強される。このような不所望の損失に対抗するために、タウロリジンを有さないフィブリンシーラントを含む最上層を備えた多層マトリックスを適用した。この追加的な層を設けることで、ＣＳＦ内への拡散およびその対流による薬物損失が減少した。タウロリジン伝達を算出する際に或る安全係数を用いることで途中の薬物損失を勘案した。
【００５８】
ＴＦＭの受ける溶解または腐食はかなり小さいため、これが運ぶ懸濁薬物の放出は主に拡散によるものであった。この放出は、マトリックスから周囲の組織への薬物の拡散速度によって支配された。これらの条件下での放出レートは時間の平方根に対して線形の関係にある。
【００５９】
マトリックスから放出されるタウロリジンの量は拡散面積に直接比例する。したがって、マトリックス内の異なる初期タウロリジン濃度についての比例定数を求め、次にこれを用いて時間と拡散面積との関数としてタウロリジン放出量を算出できる。
【００６０】
実験結果および算出データでは、調べた初期タウロリジン濃度のいずれについても統計的に有意な差が見られなかった。
【００６１】
タウロリジンのＴＦＭ放出の濃度は、１４日間にわたり抗腫瘍活性を発揮するのに十分なものであった。インビトロでの実験の結果から、８０ｍｇ／ｍｌの初期タウロリジン濃度が適当であることが示唆される。
【００６２】
放出されるタウロリジンの量および初期タウロリジン濃度ｃ0から、以下の式に従い必要マトリックス体積を算出した。
【００６３】
【数１】
2004300154.tif 000002
【００６４】
ここで、ＶTFM＝必要ＴＦＭ体積［ｍｌ］、Ｍ＝放出されるタウロリジン累積量［ｍｇ］、ｋs＝安全係数、ｃ0＝ＴＦＭ内の初期タウロリジン濃度［ｍｇ／ｍｌ］である。安全係数は、フィブリンシーラントカバー層への拡散損失およびその後の対流による損失を補償するために導入されたものである。ここで選択した安全係数は１である。
【００６５】
ＴＦＭを噴霧により切除腔に適用した。噴霧での適用により、切除腔の壁にマトリックスを均一に分布することが容易となる。フィブリンシーラントの２成分内のタウロリジンの懸濁および薬物送達システムでの噴霧は、初期タウロリジン充填濃度８０ｍｇ／ｍｌまでの場合いかなる問題も引起こさなかった。凝固時間が短いため、ＴＭＦを、多数の層においても極めて均質に適用することが可能であった。
【００６６】
先行技術の局所薬物投与の制約は、ここに開示した付着物でのＭＴＡ（たとえばタウロリジン）投与方法により克服され得る。全体的または部分的な腫瘍切除後にこのマトリックスを切除腔の壁にわたって噴霧する。凝固の間にフィブリノーゲンはフィブリンに転換され、周囲のタンパク質と共有結合を形成し、その結果止血作用のあるシーラントの層が生じ、これはその後タンパク質分解活性によって分解される。このマトリックスは術後に必要な止血効果を有する。一方、周囲のタンパク質との共有結合によって、マトリックスが適用されたところに正しく留まることが確実となる。これは極めて重要なことであるが、それは、腫瘍切除後の脳構造の変位および術後の水腫形成によって切除腔のサイズおよび形状が変るからである。
【００６７】
実験結果からは、ここで調べた腫瘍細胞株およびエクスビボ腫瘍細胞に対して決定的な抗新生物効果がある濃度でタウロリジンが無限シンク条件下で２週間にわたってＴＦＭから放出されることがわかる。フィブリンマトリックスからの抗生物質の放出を調べた研究において、生体内条件を記述するには有限シンクモデルが最も適していることが示唆されている。異なる腫瘍細胞株およびエクスビボ神経膠芽腫細胞を用いた実験では、タウロリジンの抗腫瘍活性が、フィブリンシーラントマトリックスに埋込まれたことによって影響を受けないことがわかる。タウロリジンには正常な細胞に対する細胞障害性の影響がないことが知られている。妊娠１５日目のネズミの胎児から採取した脳の神経細胞および神経膠細胞を用いた以前の細胞培養実験では、タウロリジンはこれらの細胞に対して細胞障害性の影響を及ぼさないことがわかっている。タウロリジン濃度がフィブリンシーラントの１ｍｌ当り８０ｍｇであればマトリックス内で均質に懸濁可能である。
【００６８】
フィブリンマトリックスは、インビトロで２週間にわたり治療効果がある量の薬物が確実に放出されるような濃度でタウロリジンを懸濁させるのに好適な担体である。タウロリジンの抗新生物作用は、フィブリンシーラントマトリックス内に埋込まれここから放出されることによって影響を受けない。マトリックスからの薬物放出についてのヒグチ（Higuchi）のモデルは、フィブリンシーラントマトリックスからのタウロリジンの拡散制御放出量を記述するのに好適な近似法を提供している。
【００６９】
ここに記載の薬物送達システムは、全体的もしくは部分的な切除後の脳腫瘍、またはその位置のため切除不可能な腫瘍に対する局所的なタウロリジン治療に好適である。
【外国語明細書】
2004300154000001.pdf