(57)【要約】【課題】ドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸の脂質過酸化反応を抑制し、酸化的に安定な膜構造にして、リポソーム中に高度不飽和脂肪酸の残存率を高くすること。【解決手段】リン脂質からなる外層と内層の二重層リポソームであって、前記リン脂質として高度不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンと非極性部位の占有容積の大きいホスファチジルコリンとを少なくとも含み、前記ホスファチジルエタノールアミンを外層に多く分布させたことよって、リポソームを酸化的に安定な膜構造に形成することができ、ドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸の脂質過酸化反応を抑制し、酸化的に安定な膜構造にして、高度不飽和脂肪酸の残存率を高くできる。【選択図】　図１
2004051538.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質からなる外層と内層の二重層リポソームであって、
前記リン脂質として高度不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンと非極性部位の占有容積の大きいホスファチジルコリンとを少なくとも含み、前記ホスファチジルエタノールアミンを外層に多く分布させたこと
を特徴とする二重層リポソーム。
【請求項２】
リポソームの粒径が２００ｎｍ以下であること
を特徴とする請求項１に記載の二重層リポソーム。
【請求項３】
リポソーム中に含有されるホスファチジルエタノールアミン　（ＰＥ）はホスファチジルコリン１に対して０＜ＰＥ＜２であること
を特徴とする請求項１に記載の二重層リポソーム。
【請求項４】
前記ホスファチジルコリンの非極性部位の占有容積は、
１，２−ジオレオイル−３−ｓｎ−ホスファチジルコンの非極性部位の占有容積と同じかそれ以上であること
を特徴とする請求項１乃至３の何れかに記載の二重層リポソーム。
【請求項５】
ホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルコリンとを含むリン脂質からなる二重層リポソームの製造方法であって、
高度不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンと非極性部位の占有容積の大きいホスファチジルコリンとを混合調整する工程と、
その調整した混合液を凍結と解凍とを複数回繰り返して行う工程と、
解凍した混合液を撹拌して懸濁液とする工程とからなること
を特徴とする二重層リポソームの製造方法。
【請求項６】
リポソームの粒径が２００ｎｍ以下になるように微細化する工程を経ること
を特徴とする請求項５に記載の二重層リポソームの製造方法。
【請求項７】
前記混合調整されるホスファチジルコリンの非極性部位の占有容積は、
１，２−ジオレオイル−３−ｓｎ−ホスファチジルコンの非極性部位の占有容積と同じかそれ以上であること
を特徴とする請求項４に記載の二重層リポソームの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等の高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含有するホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とホスファチジルコリン　（ＰＣ）とからなる栄養剤組成物または機能増強及び機能改善組成物または医薬剤封入組成物としての二重層のリポソーム及びその二重層リポソームの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、この種の二重層のリポソームに関する技術としては、例えば、特開平８−１５１３３４公報、または特開平７−６８１５７公報等に開示された技術が公知になっている。
【０００３】
この特開平８−１５１３３４公報に開示された公知技術は、ドコサヘキサエン酸が構成脂肪酸組成の１０％以上を占めるホスファチジルコリンを含むリポソームであって、該ホスファチジルコリンとしては、イカの皮から単離させたものを使用するものである。
【０００４】
この公知技術においては、ホスファチジルコリンにドコサヘキサエン酸を含有させるものであり、ホスファチジルコリンからホスファチジルエタノールアミンを分離させ、単離したホスファチジルコリンを用いるものである。
【０００５】
また、特開平７−６８１５７公報に開示された公知技術は、イカの皮から単離したホスファチジルコリンをリポソーム形成脂質として含むものである。
【０００６】
この公知技術においても、ホスファチジルコリンからホスファチジルエタノールアミンを分離させ、イカの皮から単離したホスファチジルコリンを使用するものである。一般的に、ホスファチジルエタノールアミンは、単独ではリン脂質二重層を形成できないので、所要量のホスファチジルコリンを使用するものであるが、ドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンは、その分子構造からして二重層の内層に多く分布しやすいことが確認されている。
【０００７】
このようなドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸の酸化反応速度は、Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｈｕｒｃｈ，Ｄ．Ｆ．　ａｎｄ　Ｐｒｙｏｒ，Ｗ．Ａ．（１９８７）　Ｔｈｅ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄｓ．Ｌｉｐｉｄｓ　２２，２９９−３０４　によると、二重結合に挟まれた活性メチレン基の数、１，２，３，４，５に対して１，２，３，４，５であるとされている。
【０００８】
即ち、脂質の酸化されやすさの指標である　Ｐｅｒｏｘｉｄｉｚａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎｄｅｘ　は、Ｈｕ，Ｍ−Ｌ．，Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｅ．Ｎ．，Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ，Ｂ．Ｅ．　ａｎｄ　Ｔａｐｐｅｌ，　Ａ．Ｌ．（１９８９）　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｅｔａｒｙｌｉｐｉｄｓ　ａｎｄ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｅ　ｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔ　ｌｉｖｅｒ　ａｎｄ　ｋｉｄｎｅｙ　ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ．　Ｊ．Ｎｕｔｒ．１１９，　１５７４−１５８２　によると、式１から算出される。
【式１】
Ｐ−ｉｎｄｅｘ　＝　（％　ｄｉｅｎｏｉｃ×１）　＋　（％　ｔｒｉｅｎｏｉｃ×２）　＋　（％　ｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ×３）＋（％　ｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ×４）　＋　（％　ｈｅｘａｅｎｏｉｃ×５）
（但し、Ｐ−ｉｎｄｅｘは、Ｐｅｒｏｘｉｄｉｚａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎｄｅｘを表す）
【０００９】
この式１から明らかなように、高度不飽和脂肪酸、特に、ドコサヘキサエン酸は、極めて酸化されやすいことが分かる。この酸化を抑制する生体膜の主要な抗酸化物質としては、ビタミンＥが著名である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、ドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸を二重リポソームに包含させて薬品または食品に添加して摂取しようとしても、ホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルコリンとの分布において、脂質過酸化反応に対する酸化抑制の効果が少なく、酸化し易いという問題点を有している。
【００１１】
従って、二重リポソームにおいて、ドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸の脂質過酸化反応を抑制し、酸化的に安定な膜構造にして、高度不飽和脂肪酸の残存率を高くするということに解決しなければならない課題を有する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記従来例の課題を解決する具体的手段として本発明に係る第１の発明は、リン脂質からなる外層と内層の二重層リポソームであって、前記リン脂質として高度不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンと非極性部位の占有容積の大きいホスファチジルコリンとを少なくとも含み、前記ホスファチジルエタノールアミンを外層に多く分布させたことを特徴とする二重層リポソームを提供するものである。
【００１３】
この第１の発明において、リポソームの粒径が２００ｎｍ以下であること；リポソーム中に含有されるホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）はホスファチジルコリン１に対して０＜ＰＥ＜２であること；及び前記ホスファチジルコリンの非極性部位の占有容積は、１，２−ジオレオイル−３−ｓｎ−ホスファチジルコンの非極性部位の占有容積と同じかそれ以上であること；を付加的な要件として含むものである。
【００１４】
本発明に係る第２の発明は、ホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルコリンとを含むリン脂質からなる二重層リポソームの製造方法であって、高度不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンと非極性部位の占有容積の大きいホスファチジルコリンとを混合調整する工程と、その調整した混合液を凍結と解凍とを複数回繰り返して行う工程と、解凍した混合液を撹拌して懸濁液とする工程とからなることを特徴とする二重層リポソームの製造方法を提供するものである。
【００１５】
この第２の発明において、リポソームの粒径が２００ｎｍ以下になるように微細化する工程を経ること；及び前記混合調整されるホスファチジルコリンの非極性部位の占有容積は、１，２−ジオレオイル−３−ｓｎ−ホスファチジルコンの非極性部位の占有容積と同じかそれ以上であること；を付加的な要件として含むものである。
【００１６】
本発明に係る二重層リポソームは、リン脂質として少なくとも高度不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンと非極性部位の占有容積の大きいホスファチジルコリンとからなり、前記ホスファチジルエタノールアミンを外層に多く分布させることによって、ホスファチジルエタノールアミンの極性基が外側に向いて分布または配列すると推定され、高度不飽和脂肪酸を内側に包有して酸化的に安定な膜構造にすることができると認められるので、例えば、ドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸の脂質過酸化反応を抑制して、酸化されにくくしたので、高度不飽和脂肪酸の残存率を高くすることができるのである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
次に、本発明を具体的な実施の形態に基づいて詳しく説明する。
本発明の実施の形態に係るリポソーム１（脂質二重層膜閉鎖小胞）の略図を図１に示す。リポソーム１は、リン脂質によって形成されており、外層２と内層３とが対になって二重層を呈している。
【００１８】
このリン脂質には、少なくともホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とホスファチジルコリン（ＰＣ）とを用い、その粒径が３００ｎｍ以下であれば一応有用であるが、好ましくは２００ｎｍ以下、更に好ましくは３０ｎｍ以下の前記リン脂質によって二重層のリポソーム１を形成させた方が利用度が更に高いものとなる。
【００１９】
この場合に、前記ホスファチジルエタノールアミンに、例えば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等の高度不飽和脂肪酸を含有させたもの（ＰＥ−ＤＨＡ）と極性部位に結合している脂肪酸鎖等、つまり非極性部位の占有容積の大きいホスファチジルコリン（ＰＣ）とのリン脂質を使用して二重層のリポソーム１を形成するものである。
【００２０】
このように非極性部位の占有容積の大きいホスファチジルコリンを使用することによって、前記ホスファチジルエタノールアミンの極性基が外側に分布または配列され、包有する高度不飽和脂肪酸が内側に分布する形態になると推定され、それによってラジカル４による該高度不飽和脂肪酸の脂質過酸化反応を抑制することができるようになり、酸化的に安定な膜構造の二重層リポソーム１となって、高度不飽和脂肪酸の残存率を高くすることができるのである。
【００２１】
また、二重層のリポソーム１を２００ｎｍ以下の粒径に形成させることによっても、ラジカル４による該高度不飽和脂肪酸の脂質過酸化反応を更に抑制することができるようになり、酸化的に安定な膜構造の二重層リポソーム１となって、高度不飽和脂肪酸の残存率を更に高くすることができる。
【００２２】
このホスファチジルエタノールアミンにドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸を含有させる方法としては、実験のために、例えば、ラット等にドコサヘキサエン酸を含有させた飼料を与え、前記ラット等の肝臓から高度不飽和脂肪酸含有ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ−ＤＨＡ）を得ることができる。
【００２３】
このように、高度不飽和脂肪酸含有ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ−ＤＨＡ）を得ることができれば良いのであるから、高度不飽和脂肪酸含有ホスファチジルエタノールアミンを得る方法としては、これに限定されるものではなく、他の方法を用いて得られた高度不飽和脂肪酸含有ホスファチジルエタノールアミンを用いても良い。例えば、魚油または大豆油等の動植物油を使用することができる。
【００２４】
また、ホスファチジルエタノールアミンは、一般的に、ホスファチジルコリンと比較して酸化安定性が低いことが知られており、例えば、ドコサヘキサエン酸をホスファチジルエタノールアミンに含有させたもの（ＰＥ−ＤＨＡ）を外層２に分布させ、内層３にホスファチジルコリンを分布させた二重層のリポソーム１とするために、より大きな占有容積の非極性部位を有するホスファチジルコリンを用いてこれが内層３に分布することにより、ホスファチジルエタノールアミンを外層２に分布しやすくさせる、つまり、リポソーム１における内層３と外層２との分布を非対称にして、酸化されにくくでき、高度不飽和脂肪酸の残存率を高くすることができるようになるのである。
【００２５】
これについて、詳しいメカニズムは解明していないが、非極性部位の占有容積の大きいホスファチジルコリンを使用することによって、ホスファチジルエタノールアミンにドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸を含有させた場合、ホスファチジルエタノールアミンが外層２に分布されると共に、該ホスファチジルエタノールアミンの極性基が外側、即ち、リポソーム１の外周縁に配列され、内層３のホスファチジルコリンとの間で非対称に分布すると推定され、このことがホスファチジルエタノールアミンを酸化的に安定にして、高度不飽和脂肪酸の残存率を高くしているものと推定される。
【００２６】
更に、リポソーム１中に含有されるホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルコリンとの比を略１：２にし、このホスファチジルコリン（ＰＣ）として、ジオレオイルＰＣ（ＰＣ１８：１）等の非極性部位の容積が異なるホスファチジルコリンを用いることにより、ＰＣ１８：１等の非極性部位の容積が異なるホスファチジルコリンがリポソーム１の内層に分布しやすい性質を有するため、ホスファチジルエタノールアミンの分布をより多く変化させて、リポソーム１の外層２におけるホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の割合をより多くすることができ、それによって内層３との間で非対称の分布を実現させ、高度不飽和脂肪酸の残存率をより高くすることができるようになるのである。
【００２７】
以下に、実施例と比較例とに使用した材料を示す。
ホスファチジルエタノールアミンの種類としての、ドコサヘキサエン酸を含有したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ−ＤＨＡ）は、７８％の純粋なＤＨＡエチル・エステルを含ませたドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ［２２：６（ｎ−３）］）含有の飼料を与えたラットの肝臓から得た。この７８％の純粋なＤＨＡエチル・エステルとしては、マルハ（株）より提供された太ったマグロから得た。また、前記ラットは、独立行政法人国立健康・栄養研究所の規定に基づいて飼育された１年齢ＳＤ系雄ラットを用いた。
【００２８】
１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ　（ジパルミトイルＰＣ（ＰＣ１６：０））　と、Ｈｅｐｅｓ　と、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００　とは、Ｓｉｇｍａ（アメリカ合衆国のセントルイス）から購入した。
【００２９】
１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ（ジオレオイルＰＣ（ＰＣ１８：１））　と、２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　（ＴＮＢＳ）　と、水溶性ラジカル発生剤（ＡＡＰＨ）とは、和光純薬工業（株）から購入した。
【００３０】
以下に、本発明に係るリポソームのより具体的な実施例を比較例と共に示す。
（実施例１）
この実施例１において、１年齢ＳＤ系雄ラットを複数匹用い、該ラットに与えた飼料に、ＡＩＮ−７６（ＡＩＮ（１９７７）Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　Ａｄ　Ｈｏｃ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｎ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ｆｏｒ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　Ｓｔｕｄｉｅｓ．　Ｊ．Ｎｕｔｒ．　１０７，１３４０−１３４８　と、ＡＩＮ（１９８０）Ｓｅｃｏｎｄ　ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｄ　Ｈｏｃ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｎ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ｆｏｒＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　Ｓｔｕｄｉｅｓ．　Ｊ．Ｎｕｔｒ．　１１０，　１７２６）　に準じて脂質と脂肪酸とを調整した飼料組成を与えた。その脂質と脂肪酸との組成を表１に示す。この表１のうち、実施例１においては、ホスファチジルコリンＰＣ１８：１　を使用した。
【００３１】
【表１】
2004051538.tif 000003
【００３２】
前記複数ラットには、表１の飼料をそれぞれ１種ずつ与えて３０日間飼育し、その後、これらＤＨＡを摂取したそれぞれのラットの肝臓を摘出し、氷冷した生理食塩水で灌流した。
【００３３】
そして、Ｆｏｌｃｈ法（Ｆｏｌｃｈ．　Ｊ．，Ｌｅｅｓ，　Ｍ．　ａｎｄ　Ｓｌｏａｎ−Ｓｔａｎｌｅｙ，　Ｇ．Ａ．（１９５７）　Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｌｉｐｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ａｎｉｍａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ．　Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２２６，　４９７−５０７）により、表１の前記ＤＨＡ等を摂取したラットの肝臓からリン脂質を抽出した。
【００３４】
このリン脂質からＳｅｐ−Ｐａｋ　カラム（３５ｃｃ，　１０ｇ，　Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，　Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，　Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて非リン脂質を除去し、クロロホルム／メタノール（１：２）を用いてドコサヘキサエン酸含有ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ−ＤＨＡ）を分画した。
【００３５】
得られたリン脂質は、０．２５ｍｍのＴＬＣ（Ｍｅｒｋ　ｔｙｐｅ　６０　ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　ｐｌａｔｅｓ，　５×２０　ｃｍ　（Ｍｅｒｃｋ　Ａ．Ｇ．，Ｄａｒｍｓｔａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて確認した。このとき、ＨＰＬＣ（Ｓａｉｔｏ，　Ｍ．，　Ｎａｋａｔｓｕｇａｗａ，　Ｋ．，　Ｏｈ−ｈａｓｈｉ，　Ａ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｔａ，　Ｍ．　ａｎｄ　Ｋｏｄａｍａ，　Ｎ．　（１９９２）　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｓｍａ，　ｒｅｄ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌｓ，　ａｎｄ　ｐｌａｔｅｌｅｔｓ　　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｖａｒｙｉｎｇ　ｉｎｔａｋｅｓ　ｏｆ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｅ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｎｕｔｒ．　１２，　５９−６８）を用いてリン脂質溶液中の　α−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ　レベルの測定も行ったが、検出されなかった。
【００３６】
このドコサヘキサエン酸含有ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ−ＤＨＡ）と、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ（ジオレオイルＰＣ（ＰＣ１８：１））とを混合させた。この際、Ｂａｒｔｌｅｔｔ　法（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，　Ｇ．　Ｒ．　（１９５９）　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ａｓｓａｙ　ｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２３４，　４６６−４６８．）を改良したミクロ法（Ｍａｒｉｎｅｔｔｉ，　Ｇ．　Ｖ．　（１９６２）　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｅｓ．　Ｊ．　ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．　３，　１−２０）によって、前記リン脂質の濃度を求め、ホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルコリンとの比（ＰＥ／ＰＣ比）を略１：２に調整し、このミクスチャーを窒素ガスを用いて薄膜化させた。
【００３７】
このミクスチャーの薄膜に、０．１　Ｍ　Ｋ　＋／Ｈｅｐｅｓ　ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ　７．６　を加えた後、前記薄膜を液体窒素を用いて凍結させ、その後バス型ソニケーターを用いて解凍させた。薄膜に　０．１　Ｍ　Ｋ　＋／Ｈｅｐｅｓ　ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ　７．６　を加えた後、凍結及び解凍させるこれらの工程は、１０回程度行った。
【００３８】
こうして得られた前記ミクスチャーの懸濁液は、略３０秒程度撹拌し、Ｗａｎｇ，　Ｊ．，　Ｍｉｙａｚａｗａ，　Ｔ．，　Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，　Ｋ．，　Ｗａｎｇ，　Ｚ．　ａｎｄ　Ｎｏｚａｗａ，　Ｔ．　（１９９２）　Ｔｈｅ　ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｈｅｘａｇｏｎａｌ　ｐｈａｓｅ　ｉｓ　ｍｏｒｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｐｈａｓｅ　ｉｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　３１０，　１０６−１１０　によってＭＬＶｓを作製した。
【００３９】
また、ポリカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ，　Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，　ＣＡ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）と、ｍｉｎｉ−ｅｘｔｒｕｄｅｒ用に改良した１．０ｍｌ容のマイクロシリンジ（Ｉｔｏ，　Ｃｏ．，）２本とを、ｍｉｎｉ−ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ，　Ｉｎｃ．，　Ａｌａｂａｓｔｅｒ，　ＡＬ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）にセットして複合するフィルターとした。この際、このフィルターはポアサイズ（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ）が略３０ｎｍになるものであって、このフィルターに前記ＭＬＶｓを１１回程度通過させて、リポソームを作製した。
【００４０】
（実施例２）
この実施例２においては、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ（ジオレオイルＰＣ（ＰＣ１８：１））を用い、フィルターのポアサイズ（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ）が略１００ｎｍになるようにしたものを用いた。その他については、実施例１のリポソームと同様にして作製した。
【００４１】
（比較例１）
この比較例１においては、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ（ジオレオイルＰＣ（ＰＣ１８：１））を用い、フィルターのポアサイズ（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ）が略４００ｎｍになるようにしたものを使用し、その他については、実施例１のリポソームと同様にして作製した。
【００４２】
（比較例２）
この比較例２においては、１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ　（ジパルミトイルＰＣ（ＰＣ１６：０））　を用い、フィルターのポアサイズ（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ）が略３０ｎｍになるようにしたものを用い、その他については、実施例１のリポソームと同様にして作製した。
【００４３】
（比較例３）
この比較例３においては、１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ　（ジパルミトイルＰＣ（ＰＣ１６：０））　を用い、フィルターのポアサイズ（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ）が略１００ｎｍになるようにしたものを用い、その他については、実施例１のリポソームと同様にして作製した。
【００４４】
（比較例４）
この比較例４においては、１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ　（ジパルミトイルＰＣ（ＰＣ１６：０））　を用い、フィルターのポアサイズ（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ）が略４００ｎｍになるようにしたものを用い、その他については、実施例１のリポソームと同様にして作製した。
【００４５】
これら実施例１、２と比較例１乃至４とのリポソームを　０．１　Ｍ　Ｋ　＋／Ｈｅｐｅｓ　ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ　７．６　にそれぞれ分散させた。また、ホスファチジルエタノールアミンの全アミノ基の測定においては、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　２．７％）を用いて、リポソームを溶解させた。
【００４６】
ホスファチジルエタノールアミンのプローブには、２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　（ＴＮＢＳ）（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　２ｍＭ）　を用い、これをバッファーに溶解して用事調整を行った。
【００４７】
ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ（ＴＮＰ）生成物の吸光度（４２０ｎｍ）は、ＢＥＣＫＭＡＮ　ＤＵ６５０　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，　ＣＡ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてホスファチジルエタノールアミンの分布を測定した。
【００４８】
この測定において、実施例１及び比較例２のホスファチジルエタノールアミンの分布率（ＰＥｅｘｔｅｒｎａｌ％）を図２に示し、実施例２及び比較例３のＰＥｅｘｔｅｒｎａｌ％を図３に示し、比較例１、４のＰＥｅｘｔｅｒｎａｌ％を図４に示す。
【００４９】
なお、このリポソームの外層におけるホスファチジルエタノールアミンの分布率ＰＥｅｘｔｅｒｎａｌ％は、前記用事調整したＴＮＢＳとＰＥとの反応開始から３０分後における、リポソーム中に含有されるホスファチジルエタノールアミンの総量と、前記リポソームの外層におけるホスファチジルエタノールアミンの含有量とから算出したものである。
【００５０】
これら図２乃至図４から明らかなように、フィルターのポアサイズ（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ）が略１００ｎｍ以下の略３０ｎｍまたは略１００ｎｍのポアサイズを用いた方が、フィルターのポアサイズ（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ）が略１００ｎｍよりも大きい略４００ｎｍのものを用いた場合よりも、リポソームの外層におけるホスファチジルエタノールアミンの分布率が高いことが分かる。
【００５１】
また、ホスファチジルコリンとして、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ（ジオレオイルＰＣ（ＰＣ１８：１））　を用いた方が、１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ　（ジパルミトイルＰＣ（ＰＣ１６：０））を用いた場合よりも、リポソームの外層におけるホスファチジルエタノールアミンの分布率が高いことが分かる。
【００５２】
このように、ホスファチジルコリンとして、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ（ジオレオイルＰＣ（ＰＣ１８：１））を用い、フィルターのポアサイズ（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ）が略１００ｎｍ以下のものを用いた実施例１、２は、リポソームの外層におけるホスファチジルエタノールアミンの分布率を高くできることが理解できる。
【００５３】
これら実施例１、２と比較例１乃至４のリポソームを略２５℃程度の温度の暗下で、略２０時間、略４０時間、略６８時間及び略９２時間インキュベートし、これらに水溶性ラジカル発生剤（ＡＡＰＨ、ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　２ｍＭ）を添加して、リポソームにおけるドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸の残存率を測定した。
【００５４】
この測定において、実施例１及び比較例２の非酸化ＤＨＡの残存率（Ｕｎｏｘｉｄｉｚｅｄ　ＤＨＡ％）を図５に示し、実施例２及び比較例３のＵｎｏｘｉｄｉｚｅｄ　ＤＨＡ％を図６に示し、比較例１、４のＵｎｏｘｉｄｉｚｅｄ　ＤＨＡ％を図７に示す。
【００５５】
これら図５乃至図７から明らかなように、フィルターのポアサイズ（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ）が略１００ｎｍ以下の略３０ｎｍまたは略１００ｎｍのポアサイズを用いた方が、フィルターのポアサイズ（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ）が略１００ｎｍよりも大きい略４００ｎｍのものを用いた場合よりも、非酸化ＤＨＡの残存率（Ｕｎｏｘｉｄｉｚｅｄ　ＤＨＡ％）が高いことが分かる。
【００５６】
また、ホスファチジルコリンとして、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ（ジオレオイルＰＣ（ＰＣ１８：１））を用いた方が、１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ　（ジパルミトイルＰＣ（ＰＣ１６：０））　を用いた場合よりも、非酸化ＤＨＡの残存率が高いことが分かる。
【００５７】
このように、ホスファチジルコリンとして、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ（ジオレオイルＰＣ（ＰＣ１８：１））を用い、フィルターのポアサイズ（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ）が略１００ｎｍ以下のものを用いた実施例１、２は、リポソームにおけるドコサヘキサエン酸の非酸化ＤＨＡの残存率を高くできることが理解できる。
【００５８】
なお、本発明に係る具体的な実施例としては、ホスファチジルコリンとして、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｓｎ−ＰＣ（ジオレオイルＰＣ（ＰＣ１８：１））　を用いた例を示したが、他の非極性部位の容積が異なるホスファチジルコリンを用いた場合であっても、同様にリポソームにおけるドコサヘキサエン酸の非酸化ＤＨＡの残存率を高くすることができるのは勿論である。
【００５９】
また、リポソームの粒径を微細化するためにポリカーボネートのフィルターを使用した例を示したが、微細化の工程としては、エクストルージョンの他に例えば、超音波処理、高速撹拌処理等が適用できるものである。そして、リポソームの粒径を１００ｎｍまたは３０ｎｍ以下について説明したが、実際には、３００ｎｍ程度までは実用的であるが、本発明においては、例えば、医薬関係において、薬品をリポソーム内に封じ込めて使用できるものとして、２００ｎｍ以下が好ましい範囲であることが確認されたのである。
【００６０】
更に、前記説明において、ホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルコリンとの混合比率を略１：２に調整することについて述べたが、逆に２：１であっても適合できることが確認されたのである。要するに、ドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンが存在し、特定したホスファチジルコリンとで分布に特徴をもち、且つ酸化的に安定な膜構造もった二重層リポソームを形成させることが重要なのである。
【００６１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係る二重層リポソームは、リン脂質からなる外層と内層の二重層リポソームであって、前記リン脂質として高度不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンと非極性部位の占有容積の大きいホスファチジルコリンとを少なくとも含み、前記ホスファチジルエタノールアミンを外層に多く分布させた構成とすることによって、リポソームを酸化的に安定な膜構造に形成することができ、ドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸の脂質過酸化反応を抑制し、酸化的に安定な膜構造にして、高度不飽和脂肪酸の残存率を高くできるという優れた効果を奏する。
【００６２】
また、本発明に係る二重層リポソームの製造方法は、高度不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンと非極性部位の占有容積の大きいホスファチジルコリンとを混合調整する工程と、その調整した混合液を凍結と解凍とを複数回繰り返して行う工程と、解凍した混合液を撹拌して懸濁液とする工程とからなるものであって、非極性部位の占有容積の大きいホスファチジルコリンを使用することによって、リポソームの外層にホスファチジルエタノールアミンを多く分布させ、且つ、ホスファチジルエタノールアミンの極性基を外側にして、リポソームにおける内層と外層との分布の状態を非対称にし、高度不飽和脂肪酸の脂質過酸化反応を抑制し、酸化的に安定な膜構造を有するリポソームを効率よく生産することができるという優れた効果を奏する。
【００６３】
更に、リポソームの粒径を２００ｎｍ以下にすることによって、より一層高度不飽和脂肪酸の脂質過酸化反応を抑制し、酸化的に安定な二重リポソームとすることができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係るリポソームの略図である。
【図２】本発明の具体的実施例１と、比較例２のホスファチジルエタノールアミンの分布率を示すグラフである。
【図３】本発明の具体的実施例２と、比較例３のホスファチジルエタノールアミンの分布率を示すグラフである。
【図４】本発明に係る実施例と比較するための、比較例１及び４のホスファチジルエタノールアミンの分布率を示すグラフである。
【図５】本発明の具体的実施例１と、比較例２の非酸化ＤＨＡの残存率を示すグラフである。
【図６】本発明の具体的実施例２と、比較例３の非酸化ＤＨＡの残存率を示すグラフである。
【図７】本発明に係る実施例と比較するための、比較例１及び４の非酸化ＤＨＡの残存率を示すグラフである。
【符号の説明】
１　リポソーム
２　外層
３　内層
４　ラジカル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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