(57)【要約】      （修正有）【課題】発明は耐熱性の向上した改良型ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ、該遺伝子ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体、および該形質転換体または形質導入体を用いたアミド化合物の製造方法を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、２４番目のフェニルアラニン残基、８９番目のイソロイシン残基、９２番目のグルタミン酸残基、９３番目のグルタミン酸残基、９６番目のヒスチジン残基、１０３番目のグルタミン酸残基、１６７番目のアスパラギン残基、及び２２５番目のチロシン残基のうち少なくとも１つのアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒダラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号２記載のアミノ酸配列において、４２番目のアスパラギン残基、８０番目のアラニン残基、１１８番目のアラニン残基、及び１３２番目のアスパラギン酸残基のうち少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒダラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも２４番目のフェニルアラニン残基がロイシンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも８９番目のイソロイシン残基がフェニルアラニンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、９２番目のグルタミン酸残基がリジンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、９３番目のグルタミン酸残基がグリシンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項７】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、９６番目のヒスチジン残基がアルギニンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項８】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、１０３番目のグルタミン酸残基がアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項９】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、１６７番目のアスパラギン残基がセリンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、２２５番目のチロシン残基がヒスチジンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
配列番号２記載のアミノ酸配列において、４２番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
配列番号２記載のアミノ酸配列において、８０番目のアラニン残基がトレオニンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１３】
配列番号２記載のアミノ酸配列において、１１８番目のアラニン残基がバリンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１４】
配列番号２記載のアミノ酸配列において、１３２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１５】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、９３番目のグルタミン酸残基がグリシンに、１０３番目のグルタミン酸残基がアスパラギン酸にそれぞれ置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１６】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、９３番目のグルタミン酸残基がグリシンに、配列番号２記載のアミノ酸配列において、１３２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１７】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、９６番目のヒスチジン残基がアルギニンに、配列番号２記載のアミノ酸配列において、４２番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸にそれぞれ置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１８】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、９２番目のグルタミン酸残基がリジンに、配列番号２記載のアミノ酸配列において、８０番目のアラニン残基がトレオニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２０】
配列番号３記載の塩基配列において、７０〜７２番目、２６５〜２６７番目、２７４〜２７６番目、２７７〜２７９番目、２８６〜２８８番目、３０７〜３０９番目、４９９〜５０１番目、６７３〜６７５番目、及び６８８〜６９０番目の塩基のうち少なくとも１つの塩基が他の異なる塩基に置換されたことを特徴とするニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号４記載の塩基配列において、１２４〜１２６番目、２３８〜２４０番目、３５２〜３５４番目、及び３９４〜３９６番目の塩基のうち少なくとも１つの塩基が他の異なる塩基に置換されたことを特徴とするニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２２】
配列番号３記載の塩基配列において、７０〜７２番目の塩基ＴＴＣがＣＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２３】
配列番号３記載の塩基配列において、７０番目の塩基チミンがシトシンに置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２４】
配列番号３記載の塩基配列において、２６５〜２６７番目の塩基ＡＴＣがＴＴＣ又はＴＴＴに置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２５】
配列番号３記載の塩基配列において、２６５番目の塩基アデニンがチミンに置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２６】
配列番号３記載の塩基配列において、２７４〜２７６番目の塩基ＧＡＡがＡＡＡ、又はＡＡＧに置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２７】
配列番号３記載の塩基配列において、２７４番目の塩基グアニンがアデニンに置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２８】
配列番号３記載の塩基配列において、２７７〜２７９番目の塩基ＧＡＧがＧＧＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２９】
配列番号３記載の塩基配列において、２７８番目の塩基アデニンがグアニンに置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３０】
配列番号３記載の塩基配列において、２８６〜２８８番目の塩基ＣＡＣがＣＧＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３１】
配列番号３記載の塩基配列において、２８７番目の塩基アデニンがグアニンに置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３２】
配列番号３記載の塩基配列において、３０７〜３０９番目の塩基ＧＡＧがＧＡＣ又はＧＡＴに置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３３】
配列番号３記載の塩基配列において、３０９番目の塩基グアニンがチミンに置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３４】
配列番号３記載の塩基配列において、４９９〜５０１番目の塩基ＡＡＣがＡＧＣ又はＡＧＴに置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３５】
配列番号３記載の塩基配列において、５００番目の塩基アデニンがグアニンに置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３６】
配列番号３記載の塩基配列において、６７３〜６７５番目の塩基ＴＡＣがＣＡＣ又はＣＡＴに置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３７】
配列番号３記載の塩基配列において、６７３番目の塩基チミンがシトシンに置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３８】
配列番号４記載の塩基配列において、１２４〜１２６番目の塩基ＡＡＣがＧＡＣ又はＧＡＴに置換された請求項２１記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３９】
配列番号４記載の塩基配列において、１２４番目の塩基アデニンがグアニンに置換された請求項２１記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４０】
配列番号４記載の塩基配列において、２３８〜２４０番目の塩基ＧＣＣがＡＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に置換された請求項２１記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４１】
配列番号４記載の塩基配列において、２３８番目の塩基グアニンがアデニンに置換された請求項２１記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４２】
配列番号４記載の塩基配列において、３５２〜３５４番目の塩基ＧＣＣがＧＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に置換された請求項２１記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４３】
配列番号４記載の塩基配列において、３５３番目の塩基シトシンがチミンに置換された請求項２１記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４４】
配列番号４記載の塩基配列において、３９４〜３９６番目の塩基ＧＡＣがＡＡＣ又はＡＡＴに置換された請求項２１記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４５】
配列番号４記載の塩基配列において、３９４番目の塩基グアニンがアデニンに置換された請求項２１記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４６】
配列番号３記載の塩基配列において、２７７〜２７９番目の塩基ＧＡＧがＧＧＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に、３０７〜３０９番目の塩基ＧＡＧがＧＡＴ又はＧＡＣにそれぞれ置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４７】
配列番号３記載の塩基配列において、２７８番目の塩基アデニンがグアニンに、３０９番目の塩基グアニンがチミンにそれぞれ置換された請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４８】
配列番号３記載の塩基配列において、２７７〜２７９番目の塩基ＧＡＧがＧＧＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に、配列番号４記載の塩基配列において、３９４〜３９６番目の塩基ＧＡＣがＡＡＣ又はＡＡＴにそれぞれ置換されたニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４９】
配列番号３記載の塩基配列において、２７８番目の塩基アデニンがグアニンに、配列番号４記載の塩基配列において、３９４番目の塩基グアニンがアデニンにそれぞれ置換されたニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項５０】
配列番号３記載の塩基配列において、２８６〜２８８番目の塩基ＣＡＣがＣＧＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）  に、配列番号４記載の塩基配列において、１２４〜１２６番目の塩基ＡＡＣがＧＡＣ又はＧＡＴにそれぞれ置換されたニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項５１】
配列番号３記載の塩基配列において、２８７番目の塩基アデニンがグアニンに、配列番号４記載の塩基配列において、１２４番目の塩基アデニンがグアニンにそれぞれ置換されたニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項５２】
配列番号３記載の塩基配列において、２７４〜２７６番目の塩基ＧＡＡがＡＡＡ又はＡＡＧ  に、配列番号４記載の塩基配列において、１２４〜１２６番目の塩基ＡＡＣがＧＡＣ又はＧＡＴにそれぞれ置換されたニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項５３】
配列番号３記載の塩基配列において、２７４番目の塩基グアニンがグアデニンに、配列番号４記載の塩基配列において、１２４番目の塩基アデニンがグアニンにそれぞれ置換されたニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項５４】
請求項２０〜５３記載のいずれかに記載の遺伝子ＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組換えＤＮＡ。
【請求項５５】
請求項５４記載の組換えＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
【請求項５６】
請求項５５記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物から採取されたニトリルヒドラターゼ。
【請求項５７】
請求項５５記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とするニトリルヒドラターゼの製造方法。
【請求項５８】
請求項５５記載の形質転換体を培養して得られる培養物又は該処理物をニトリル化合物に接触させ、アミド化合物に採取することを含むアミド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は耐熱性の向上した改良型ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ、該遺伝子ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体、および該形質転換体または形質導入体を用いたアミド化合物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素または該酵素を含有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が開示されている。この製造方法は、従来の化学合成法と比較し、ニトリル化合物から対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高いことで知られている。
【０００３】
ニトリルヒドラターゼを生産する微生物としては例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、クレビシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属等を挙げることができる。中でもロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株はアクリルアミドの工業的生産に使用されており、有用性が実証されている。また、その菌株が産生するニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子も明らかとなっている（特許文献１参照）。
【０００４】
【特許文献１】
特許第３１６２０９１号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
二トリルヒドラターゼは既にアクリルアミドの工業的生産に使用されている酵素であるが、現在使用されている酵素と比較し、さらに耐熱性の向上した酵素の取得は、反応時の酵素のコスト削減の観点から有用である。よって、本発明の課題は、公知のニトリルヒドラターゼを改良し、耐熱性の向上した酵素を取得することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
かかる状況下、鋭意研究を行った結果、本発明者らはロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基を天然アミノ酸のグループから選択される残基で置換することにより、該酵素の耐熱性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本願は以下の発明を提供するものである。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００８】
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列において、２４番目のフェニルアラニン残基、８９番目のイソロイシン残基、９２番目のグルタミン酸残基、９３番目のグルタミン酸残基、９６番目のヒスチジン残基、１０３番目のグルタミン酸残基、１６７番目のアスパラギン残基、及び２２５番目のチロシン残基のうち少なくとも１つのアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒダラターゼ活性を有するタンパク質。
【０００９】
（２）配列番号２記載のアミノ酸配列において、４２番目のアスパラギン残基、８０番目のアラニン残基、１１８番目のアラニン残基、及び１３２番目のアスパラギン酸残基のうち少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒダラターゼ活性を有するタンパク質。
【００１０】
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも２４番目のフェニルアラニン残基がロイシンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００１１】
（４）配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも８９番目のイソロイシン残基がフェニルアラニンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００１２】
（５）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、９２番目のグルタミン酸残基がリジンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００１３】
（６）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、９３番目のグルタミン酸残基がグリシンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００１４】
（７）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、９６番目のヒスチジン残基がアルギニンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００１５】
（８）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、１０３番目のグルタミン酸残基がアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００１６】
（９）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、１６７番目のアスパラギン残基がセリンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００１７】
（１０）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、２２５番目のチロシン残基がヒスチジンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００１８】
（１１）  配列番号２記載のアミノ酸配列において、４２番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００１９】
（１２）  配列番号２記載のアミノ酸配列において、８０番目のアラニン残基がトレオニンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００２０】
（１３）  配列番号２記載のアミノ酸配列において、１１８番目のアラニン残基がバリンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００２１】
（１４）  配列番号２記載のアミノ酸配列において、１３２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００２２】
（１５）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、９３番目のグルタミン酸残基がグリシンに、１０３番目のグルタミン酸残基がアスパラギン酸にそれぞれ置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００２３】
（１６）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、９３番目のグルタミン酸残基がグリシンに、配列番号２記載のアミノ酸配列において、１３２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００２４】
（１７）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、９６番目のヒスチジン残基がアルギニンに、配列番号２記載のアミノ酸配列において、４２番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸にそれぞれ置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００２５】
（１８）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、９２番目のグルタミン酸残基がリジンに、配列番号２記載のアミノ酸配列において、８０番目のアラニン残基がトレオニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を含み、且つ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００２６】
（１９）  １〜１８のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【００２７】
（２０）  配列番号３記載の塩基配列において、７０〜７２番目、２６５〜２６７番目、２７４〜２７６番目、２７７〜２７９番目、２８６〜２８８番目、３０７〜３０９番目、４９９〜５０１番目、６７３〜６７５番目、及び６８８〜６９０番目の塩基のうち少なくとも１つの塩基が他の異なる塩基に置換されたことを特徴とするニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【００２８】
（２１）  配列番号４記載の塩基配列において、１２４〜１２６番目、２３８〜２４０番目、３５２〜３５４番目、及び３９４〜３９６番目の塩基のうち少なくとも１つの塩基が他の異なる塩基に置換されたことを特徴とするニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【００２９】
（２２）  配列番号３記載の塩基配列において、７０〜７２番目の塩基ＴＴＣがＣＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００３０】
（２３）  配列番号３記載の塩基配列において、７０番目の塩基チミンがシトシンに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００３１】
（２４）  配列番号３記載の塩基配列において、２６５〜２６７番目の塩基ＡＴＣがＴＴＣ又はＴＴＴに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００３２】
（２５）  配列番号３記載の塩基配列において、２６５番目の塩基アデニンがチミンに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００３３】
（２６）  配列番号３記載の塩基配列において、２７４〜２７６番目の塩基ＧＡＡがＡＡＡ、又はＡＡＧに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００３４】
（２７）  配列番号３記載の塩基配列において、２７４番目の塩基グアニンがアデニンに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００３５】
（２８）  配列番号３記載の塩基配列において、２７７〜２７９番目の塩基ＧＡＧがＧＧＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００３６】
（２９）  配列番号３記載の塩基配列において、２７８番目の塩基アデニンがグアニンに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００３７】
（３０）  配列番号３記載の塩基配列において、２８６〜２８８番目の塩基ＣＡＣがＣＧＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００３８】
（３１）  配列番号３記載の塩基配列において、２８７番目の塩基アデニンがグアニンに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００３９】
（３２）  配列番号３記載の塩基配列において、３０７〜３０９番目の塩基ＧＡＧがＧＡＣ又はＧＡＴに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００４０】
（３３）  配列番号３記載の塩基配列において、３０９番目の塩基グアニンがチミンに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００４１】
（３４）  配列番号３記載の塩基配列において、４９９〜５０１番目の塩基ＡＡＣがＡＧＣ又はＡＧＴに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００４２】
（３５）  配列番号３記載の塩基配列において、５００番目の塩基アデニンがグアニンに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００４３】
（３６）  配列番号３記載の塩基配列において、６７３〜６７５番目の塩基ＴＡＣがＣＡＣ又はＣＡＴに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００４４】
（３７）  配列番号３記載の塩基配列において、６７３番目の塩基チミンがシトシンに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００４５】
（３８）  配列番号４記載の塩基配列において、１２４〜１２６番目の塩基ＡＡＣがＧＡＣ又はＧＡＴに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００４６】
（３９）  配列番号４記載の塩基配列において、１２４番目の塩基アデニンがグアニンに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００４７】
（４０）  配列番号４記載の塩基配列において、２３８〜２４０番目の塩基ＧＣＣがＡＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００４８】
（４１）  配列番号４記載の塩基配列において、２３８番目の塩基グアニンがアデニンに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００４９】
（４２）  配列番号４記載の塩基配列において、３５２〜３５４番目の塩基ＧＣＣがＧＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００５０】
（４３）  配列番号４記載の塩基配列において、３５３番目の塩基シトシンがチミンに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００５１】
（４４）  配列番号４記載の塩基配列において、３９４〜３９６番目の塩基ＧＡＣがＡＡＣ又はＡＡＴに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００５２】
（４５）  配列番号４記載の塩基配列において、３９４番目の塩基グアニンがアデニンに置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００５３】
（４６）  配列番号３記載の塩基配列において、２７７〜２７９番目の塩基ＧＡＧがＧＧＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に、３０７〜３０９番目の塩基ＧＡＧがＧＡＴ又はＧＡＣにそれぞれ置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００５４】
（４７）  配列番号３記載の塩基配列において、２７８番目の塩基アデニンがグアニンに、３０９番目の塩基グアニンがチミンにそれぞれ置換された遺伝子ＤＮＡ。
【００５５】
（４８）  配列番号３記載の塩基配列において、２７７〜２７９番目の塩基ＧＡＧがＧＧＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す）に、配列番号４記載の塩基配列において、３９４〜３９６番目の塩基ＧＡＣがＡＡＣ又はＡＡＴにそれぞれ置換されたニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【００５６】
（４９）  配列番号３記載の塩基配列において、２７８番目の塩基アデニンがグアニンに、配列番号４記載の塩基配列において、３９４番目の塩基グアニンがアデニンにそれぞれ置換されたニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【００５７】
（５０）  配列番号３記載の塩基配列において、２８６〜２８８番目の塩基ＣＡＣがＣＧＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）  に、配列番号４記載の塩基配列において、１２４〜１２６番目の塩基ＡＡＣがＧＡＣ又はＧＡＴにそれぞれ置換されたニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【００５８】
（５１）  配列番号３記載の塩基配列において、２８７番目の塩基アデニンがグアニンに、配列番号４記載の塩基配列において、１２４番目の塩基アデニンがグアニンにそれぞれ置換されたニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【００５９】
（５２）  配列番号３記載の塩基配列において、２７４〜２７６番目の塩基ＧＡＡがＡＡＡ又はＡＡＧ  に、配列番号４記載の塩基配列において、１２４〜１２６番目の塩基ＡＡＣがＧＡＣ又はＧＡＴにそれぞれ置換されたニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【００６０】
（５３）  配列番号３記載の塩基配列において、２７４番目の塩基グアニンがグアデニンに、配列番号４記載の塩基配列において、１２４番目の塩基アデニンがグアニンにそれぞれ置換されたニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ。
【００６１】
（５４）  前記２０〜５３のいずれかに記載の遺伝子ＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組換えＤＮＡ。
【００６２】
（５５）  前記５４の組換えＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
【００６３】
（５６）  前記５５の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物から採取されたニトリルヒドラターゼ。
【００６４】
（５７）  前記５５の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とするニトリルヒドラターゼの製造方法。
【００６５】
（５８）  前記５５の形質転換体を培養して得られる培養物又は該処理物をニトリル化合物に接触させ、アミド化合物に採取することを含むアミド化合物の製造方法。
【００６６】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００６７】
本発明は、耐熱性の向上したニトリルヒドラターゼの改良型ニトリルヒドラターゼを提供するものである。「ニトリルヒドラターゼ」とは、ニトリル化合物を対応するアミド化合物に変換する水和反応（ＲＣＮ＋２Ｈ２Ｏ→ＲＣＯＮＨ２）を触媒する酵素である。
【００６８】
ここで「耐熱性の向上したニトリルヒドラターゼ」とは、野生型ニトリルヒドラターゼが失活する温度範囲においても、酵素活性を保持できる性質を有する酵素を意味する。具体的には、変異体又は適当な変異遺伝子で形質転換を行った宿主内で発現したニトリルヒドラターゼにおいて、該変異体又は宿主を５５℃以上で１０分間以上、熱処理し、該処理後の酵素活性が、熱処理前の酵素活性と比較し、５０％以上の残存しているものを意味する。
【００６９】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）  Ｊ１株（以下、Ｊ１菌）由来のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列を改変し、親株のそれと比較し耐熱性の向上した酵素を選択することにより得られる。その改変方法としては、Ｊ１菌にハイドロキシルアミンや亜硝酸等の変異源となる薬剤を接触・作用させる方法、紫外線照射のより変異を誘発する方法、Ｊ１菌由来のニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子（以下、ニトリルヒドラターゼ遺伝子）にＰＣＲを用いてランダムに変異を導入する方法等を採用することができる。
【００７０】
その選択方法は、上記「耐熱性」の定義に該当する変異体（変異遺伝子）を選抜する。
【００７１】
このようにして得られた酵素としては、配列番号１（βサブユニット）のアミノ酸配列において、２４番目のフェニルアラニン残基、８９番目のイソロイシン残基、９２番目のグルタミン酸残基、９３番目のグルタミン酸残基、９６番目のヒスチジン残基、１０３番目のグルタミン酸残基、１６７番目のアスパラギン残基、及び２２５番目のチロシン残基のうち少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００７２】
また、配列番号２（αサブユニット）のアミノ酸配列において、４２番目のアスパラギン残基、８０番目のアラニン残基、１１８番目のアラニン残基、及び１３２番目のアスパラギン酸残基のうち少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００７３】
さらに、上記の変異の複数を組み合わせ、複合変異体とすることにより、単変異体よりもさらに耐熱性の向上した変異酵素を創製することもできる。その際、上記１２箇所のアミノ酸変異は、任意の変異の組み合わせで良い。
【００７４】
複合変異体を作製する手段は如何なる方法でもよく、例えば、合成一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて部位特異的な置換を生じさせる方法、複数の異なる単変異個所を含むＤＮＡ断片を制限酵素で切断して連結させる方法により作成することができる。
【００７５】
耐熱性を損なわない限り、上記の変異に加えて、配列の欠失、置換、付加等が起こっていても構わない。例えば、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【００７６】
次に、好ましいアミノ酸変異の態様を示す。例えば、Ｆβ２４Ｌという表記は、「βサブユニット（配列番号１）の２４番目のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換される変異」を意味する。なおアミノ酸は１文字表記で記載している。
【００７７】
＜変異と置換の態様＞
単変異
１．  Ｆβ２４Ｌ
２．  Ｉβ８９Ｆ
３．  Ｅβ９２Ｋ
４．  Ｅβ９３Ｇ
５．  Ｈβ９６Ｒ
６．  Ｅβ１０３Ｄ
７．  Ｎβ１６７Ｓ
８．  Ｙβ２２５Ｈ
９．  Ｎα４２Ｄ
１０．  Ａα８０Ｔ
１１．  Ａα１１８Ｖ
１２．  Ｄα１３２Ｎ
複合変異
１．  Ｅβ９３Ｇ、Ｅβ１０３Ｄ
２．  Ｅβ９３Ｇ、Ｄα１３２Ｎ
３．  Ｈβ９６Ｒ、Ｎα４２Ｄ
４．  Ｅβ９２Ｋ、Ａα８０Ｔ
上記のアミノ酸置換を生じさせるときの塩基置換は以下の通りである。
【００７８】
単変異１：配列番号３において、７０〜７２番目の塩基配列「ＴＴＣ」をＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ又はＣＴＧとなるように塩基を置換させる。特に、７０番目のＴをＣに置換すること（ＴＴＣ→ＣＴＣ）が好ましい。
【００７９】
単変異２：配列番号３に示す塩基配列において２６５〜２６７番目の塩基配列「ＡＴＣ」を、ＴＴＴ又はＴＴＣに置換させる。特に、２６５番目のＡをＴに置換させること（ＡＴＣ→ＴＴＣ）が好ましい。
【００８０】
単変異３：配列番号３に示す塩基配列において２７４〜２７６番目の塩基配列「ＧＡＡ」を、ＡＡＡ又はＡＡＧに置換させる。特に、２７４番目のＧをＡに置換させること（ＧＡＡ→ＡＡＡ）が好ましい。
【００８１】
単変異４：配列番号３に示す塩基配列において２７７〜２７９番目の塩基配列「ＧＡＧ」を、ＧＧＧ、ＧＧＣ、ＧＧＡ又はＧＧＴに置換させる。特に、２７８番目のＡをＧに置換させること（ＧＡＧ→ＧＧＧ）が好ましい。
【００８２】
単変異５：配列番号３に示す塩基配列において２８６〜２８８番目の塩基配列「ＣＡＣ」を、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＡ又はＣＧＴに置換させる。特に、２８７番目のＡをＧに置換させること（ＣＡＣ→ＣＧＣ）が好ましい。
【００８３】
単変異６：配列番号３に示す塩基配列において３０７〜３０９番目の塩基配列「ＧＡＧ」を、ＧＡＣ又はＧＡＴに置換させる。特に、３０９番目のＧをＴに置換させること（ＧＡＧ→ＧＡＴ）が好ましい。
【００８４】
単変異７：配列番号３に示す塩基配列において４９９〜５０１番目の塩基配列「ＡＡＣ」を、ＡＧＣ又はＡＧＴに置換させる。特に、５００番目のＡをＧに置換させること（ＡＡＣ→ＡＧＣ）が好ましい。
【００８５】
単変異８：配列番号３に示す塩基配列において６７３〜６７５番目の塩基配列「ＴＡＣ」を、ＣＡＣ又はＣＡＴに置換させる。特に、６７３番目のＴをＣに置換させること（ＴＡＣ→ＣＡＣ）が好ましい。
【００８６】
単変異９：配列番号４に示す塩基配列において１２４〜１２６番目の塩基配列「ＡＡＣ」を、ＧＡＣ又はＧＡＴに置換させる。特に、１２４番目のＡをＧに置換させること（ＡＡＣ→ＧＡＣ）が好ましい。
【００８７】
単変異１０：配列番号４に示す塩基配列において２３８〜２４０番目の塩基配列「ＧＣＣ」を、ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＡ又はＡＣＴに置換させる。特に、２３８番目のＧをＡに置換させること（ＧＣＣ→ＡＣＣ）が好ましい。
【００８８】
単変異１１：配列番号４に示す塩基配列において３５２〜３５４番目の塩基配列「ＧＣＣ」を、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＡ又はＧＴＴに置換させる。特に、３５３番目のＣをＴに置換させること（ＧＣＣ→ＧＴＣ）が好ましい。
【００８９】
単変異１２：配列番号４に示す塩基配列において３９４〜３９６番目の塩基配列「ＧＡＣ」を、ＡＡＣ又はＡＡＴに置換させる。特に、３９４番目のＧをＡに置換させること（ＧＡＣ→ＡＡＣ）が好ましい。
【００９０】
複合変異１〜４の塩基配列の置換に関しては、単変異のそれと同様である。
【００９１】
上記の単変異又は多重変異が導入されたニトリルヒドラターゼ遺伝子（の調製は、例えば、部位特異的変異誘発法を使用すればよい〔Ｎｕｃｌｅｉｃ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  １０，  ６４８７  （１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕。
【００９２】
次にニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡ及び形質転換（導入）体の調製方法に関して説明する。
【００９３】
組換えＤＮＡは、ニトリルヒドラターゼ遺伝子で形質転換又は形質導入される宿主生物において、発現可能なように、ベクターに組み込むことが必要である。
【００９４】
例えば、ベクターとしてはプラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。
【００９５】
宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を用いることができる。
【００９６】
大腸菌を宿主とする場合、発現効率の高い発現ベクター、例えばｔｒｃプロモーターを有する発現ベクターｐＫＫ２３３−２（アマシャムバイオサイエンス社製）、又はｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス社製）などを用いることが好ましい。
【００９７】
ベクターには、ニトリルヒドラターゼ遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００９８】
以下、宿主の種類及び宿主への組換えベクター導入方法に関して説明する。
【００９９】
細菌を宿主とする場合、大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等が挙げられ、ロドコッカス菌としては、例えばロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ１２６７４、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ１７８９５、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ１９１４０等が挙げられる。
【０１００】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【０１０１】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【０１０２】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【０１０３】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が用いられる。
【０１０４】
植物細胞を宿主とする場合は、タバコＢＹ−２細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等が用いられる。
【０１０５】
次にニトリルヒドラターゼの製造方法に関して説明する。
【０１０６】
ニトリルヒドラターゼの製造は、上記方法で調製されたニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む形質転換（導入）体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。
【０１０７】
ここで「培養物」とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
【０１０８】
本発明の形質転換（導入）体を培養する方法は、以下に例示した宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【０１０９】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３０〜４０℃で行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１１０】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには  ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはＩＡＡ等を培地に添加することができる。
【０１１１】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１１２】
形質転換体が植物細胞又は植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えばＭＳ基本培地、ＬＳ基本培地等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法、液体培養法のいずれをも採用することができる。
【０１１３】
培養物からのニトリルヒドラターゼの採取方法は、まず、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により細胞を破壊する。次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去し、粗タンパク質溶液を得る。上記粗溶液から本発明のタンパク質を精製するには、塩析、各種クロマトグラフィー（例えばゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等を単独で又は適宜組み合わせて実施する。
【０１１４】
また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【０１１５】
次に形質転換（導入）体を利用したアミド化合物の製造方法に関して説明する。
【０１１６】
上記の培養法で得られた培養物、酵素等は、ニトリル化合物を対応するアミド化合物に変換する際の生体触媒として使用される。変換反応の基質として使用するニトリル化合物としては、生体触媒の基質特異性により適宜選択される。例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｌｒｏｕｓ）Ｊ−１株由来のニトリルヒドラターゼであれば、好適な基質はアクリロニトリルである。
【０１１７】
生体触媒の使用形態、反応様式は、生体触媒の種類等により適宜選択される。
【０１１８】
例えば、生体触媒の使用形態としては、上記の培養物、精製酵素をそのまま使用しても良いし、それらを適当な担体に保持し固定化酵素として使用することもできる。
【０１１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。なお、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８として寄託されている。
【０１２０】
＜実施例１＞  改良型ニトリルヒドラターゼ遺伝子の取得
（１）染色体ＤＮＡの調整
ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株を１００ｍｌのＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、１％  グルコース、０．２％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）中、３０℃にて７２時間振盪培養した。
【０１２１】
培養後、集菌し、集菌された菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁した。懸濁液にリゾチーム８ｍｇを加えて３７℃で１〜２時間振盪した後、−２０℃で凍結した。
【０１２２】
次に、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（メルク社）（終濃度０．１ｍｇ）を加え３７℃で１時間振盪した。
【０１２３】
次に、等量のＴＥ飽和フェノールを加え撹拌後（ＴＥ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））遠心し、上層をとり２倍量のエタノールを加えたのちガラス棒でＤＮＡを巻きとり、９０％、８０％、７０％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
【０１２４】
次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃、１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるよう加え３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加え遠心し上層と下層に分離させた。
【０１２５】
上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え同様の抽出操作を繰り返した（以後この操作をフェノール処理と呼ぶ）。その後、上層に２倍量のエタノールを加えガラス棒でＤＮＡを巻きとり回収し、染色体ＤＮＡ標品を得た。
【０１２６】
（２）プラスミドの構築
まず、耐熱性評価のコントロールとして用いるため、通常のＰＣＲにて野生型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を増幅した。
【０１２７】
以下のような組成のＰＣＲ反応液１００μｌを調製した。
【０１２８】
なお、プライマーＪＨ１−０２（配列番号５）およびプライマーＮＨ−１７（配列番号６）の各々には、制限酵素ＮｃｏＩ切断認識部位および制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断認識部位が導入されており、増幅ＤＮＡ産物を両制限酵素で切断することにより、後述する発現ベクターｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ部位−ＨｉｎｄＩＩＩ部位間に容易に挿入することが可能となる。
【０１２９】
＜反応溶液組成＞
鋳型ＤＮＡ（染色体ＤＮＡ）  １μｌ
１０×  ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）  １０μｌ
プライマーＪＨ１−０２  １μｌ
プライマーＮＨ−１７  １μｌ
５ｍＭ  ｄＮＴＰ  各々２μｌ
滅菌水  ７８μｌ
ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）  １μｌ
＜プライマー＞
ＪＨ１−０２：ＧＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣ（配列番号３）
ＮＨ−１７：ＧＣＧＴＡＡＧＣＴＴＣＣＧＣＧＡＧＡＴＣＡＧＴＡＴＣＣＡＣＣＧ（配列番号４）
ＰＣＲは、Ｔｈｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ  ｐｅｒｓｏｎａｌ（宝酒造）を用いて（９４℃  ３０秒、６５℃  ３０秒、７２℃  ３分）を３０サイクル行った。
【０１３０】
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲルにより電気泳動を行って、３ｋｂの増幅断片の検出を行った。反応終了液をＧＦＸ  ｃｏｌｕｍｎ（アマシャムファルマシア）で精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩで切断を行った。制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物は０．７％アガロースゲルで電気泳動を行い、３ｋｂ付近のバンドを回収した。回収したＰＣＲ産物はＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造）を用いてベクター（ｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩ部位）に結合し、ＪＭ１０９へ形質転換を行った。得られた形質転換体コロニーより数クローンをＬＢ−Ａｍｐ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃で１２時間振盪培養した。培養後、この培養物を遠心分離により集菌した後、Ｆｌｅｘｉ  Ｐｒｅｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いることにより、プラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、０．７％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子断片（１．６ｋｂ）が正しく連結されているクローンを選んでｐＪＨ６０１（図１）と命名した。ｐＪＨ６０１はＪＭ１０９へ形質転換を行った（ＪＭ１０９／ｐＪＨ６０１）。
【０１３１】
なお、ｐＪＨ６０１はＦＥＲＭ  Ｐ−１９１７５として産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【０１３２】
（２）        変異遺伝子ライブラリーの構築
（１）で得られたプラスミドｐＪＨ６０１を基に、野生型ニトリルヒドラターゼ遺伝子へのランダム変異導入を行った。変異導入は、ＰＣＲにおけるヌクレオチドの誤取り込みによる塩基置換を利用した。使用したＰＣＲ反応液の組成とプライマーを以下に記す。
【０１３３】
＜反応液組成＞
鋳型ＤＮＡ（上記工程で調製したｐＪＨ６０１）  １μｌ
１０×  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＩＢＣＯ社製）  １０μｌ
５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ＧＩＢＣＯ社製）  ３μｌ
プライマーＴｒｃ−０２  １μｌ
プライマーＴｒｃ−０３  １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  各々２μｌ
１０ｍＭ  ｄＩＴＰ  ２μｌ
１０ｍＭ  ｄＢｒａＵＴＰ  ２μｌ
滅菌水  ７１μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ社製）  １μｌ
＜プライマー＞
ＴＲＣ−０２：ＧＧＡＡＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣ（配列番号７）
ＴＲＣ−０３：ＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣ（配列番号８）
ＰＣＲはＴｈｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ  ｐｅｒｓｏｎａｌ（宝酒造）を用いて（９４℃  ３０秒、６５℃  ３０秒、７２℃  ３分）を３０サイクル行った。
【０１３４】
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲルにより電気泳動を行って、３ｋｂの増幅断片の検出を行った。反応終了液をＧＦＸ  ｃｏｌｕｍｎ（アマシャムファルマシア）で精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断を行った。制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物は０．７％アガロースゲルで電気泳動し、３Ｋｂ付近のバンドを回収した。回収したＰＣＲ産物はＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造）を用いてベクター（ｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩ部位）に結合し、ＪＭ１０９へ形質転換を行った。
【０１３５】
（４）耐熱性ニトリルヒドラターゼのスクリーニング及び変異箇所の同定
工程（３）で得られた変異ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むＪＭ１０９形質転換体およびＪＭ１０９／ｐＨＪ６０１を、ＬＢ−Ａｍｐ培地（１ｍＭ  ＩＰＴＧ、５μｇ／ｍｌ  ＣｏＣｌ２含有）を１ｍｌずつ入れた９６穴ディープウェルプレートにそれぞれ接種し、３７℃にて１２時間液体培養した。得られた培養物を、５５℃の温度下、３０分間の熱処理に供した後、残存ニトリルヒドラターゼ活性の測定を行った。
【０１３６】
活性測定は５％  アクリロニトリル／５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ  ７．７を菌液に対して等量加え、３０℃で３０分反応させた。反応終了後、０．１Ｍリン酸を反応液と等量加え遠心分離し、その上清を適宜希釈しＨＰＬＣに供し、生成したアクリルアミド濃度を分析した（ＷＡＫＯＳＩＬ  ５Ｃ８（和光純薬）、５ｍＭリン酸を含んだ１０％アセトニトリル）。比較対照として熱処理を行わず４℃で保冷したものをそれぞれの相対コントロールとして残活性を求めた。
【０１３７】
数千株の形質転換体についてスクリーニングを行った結果、野生株と比較して高い残活性を示す株が１６株得られた。また、それら菌株を培養してプラスミドを回収し、塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定はＢｅｃｋｍａｎＣＥＱ−２０００ＸＬを使用した。結果を表１に示した。
【０１３８】
【表１】
2004222538.tif 000003
＜実施例２＞  改良型ニトリルヒドラターゼの性質
実施例１で得られたプラスミドｐ３をＪＭ１０９に再形質転換し（ＪＭ１０９／ｐ３）、得られたコロニーをＬＢ培地（アンピシリン、コバルト含有）で３７℃、一晩培養した。菌体を遠心分離によって回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液で２回洗浄し、菌体懸濁液とした。
【０１３９】
得られた菌体懸濁液０．５ｍｌを試験管に入れ、５０℃〜６０℃の各温度の水浴中で５〜２０分間保温し、その後氷中で冷却した。
【０１４０】
菌体の活性測定は以下の方法で行った。５％アクリロニトリルを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．０を菌体溶液と等量加え、３０℃で３０分反応させた。０．１Ｍリン酸を等量加え反応を停止し、遠心分離によって菌体を除去し、上清をＨＰＬＣで分析した。
【０１４１】
比較対照としてＪＭ１０９／ｐＪＨ６０１を用いた。残活性は、熱処理を行わず４℃で保冷したもの（無処理区）の初期活性を１００％とした相対活性で示した。結果を表２に示す。
【０１４２】
【表２】
2004222538.tif 000004
親株では６０℃、５分の熱処理で残活性が５％に対し、変異酵素ではほぼ１００％の残活性を保持していることから、変異酵素で耐熱性が向上していることが認められた。
【０１４３】
＜実施例３＞  ロドコッカス組換え体の作製
実施例１で取得した変異酵素の性質をロドコッカス菌組換え体で確認した。
【０１４４】
（１）        ロドコッカス菌導入用プラスミドの構築
以下の方法でｐ３の変異（Ｅβ９３Ｇ）を有するロドコッカス菌導入用プラスミドを作製した。変異の導入は部位特異的変異導入法を用い、市販キット：ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用した。実験は操作マニュアルに従った。変異を導入する鋳型プラスミドとしてｐＳＪ０３４を使用した。ｐＳＪ０３４はロドコッカス菌においてニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドであり、ｐＳＪ０３４はｐＳＪ０２３より特開平１０−３３７１８５号公報に示す方法で作製した。ｐＳＪ０２３は形質転換体ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６１０８）として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている。
【０１４５】
変異を導入するための２種のプライマーを合成した。下線部は変異導入部位を示す。
【０１４６】
ＮＨＭ−Ｆ：ｇａｔｃａｔｃａｃｃｇａａｇａａｇｇｇｃｇａａａｇｃａｃｃｇｔｇｔｇｃ  （配列番号９）
ＮＨＭ−Ｒ：ｇｃａｃａｃｇｇｔｇｃｔｔｔｃｇｃｃｃｔｔｃｔｔｃｇｇｔｇａｔｇａｔｃ  （配列番号１０）
変異を導入するためのＰＣＲは以下の条件で、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＰＥバイオサイエンス社）を用いて９５℃  １分、（９５℃  ５０秒、６０℃  ５０秒、６８℃  ２０分）×１８サイクル、６８℃  ７分  の反応を行った。
【０１４７】
ｐＳＪ０３４（１０ｎｇ）                      ２μｌ
１０×  反応Ｂｕｆｆｅｒ                  ５μｌ
プライマーＮＨＭ−Ｆ（１００ｎｇ／μｌ）        １μｌ
プライマーＮＨＭ−Ｒ（１００ｎｇ／μｌ）        １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｍｉｘ                              １μｌ
滅菌水                              ３６μｌ
ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ                      ３μｌ
Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                  １μｌ
ＰＣＲ終了後、反応液１０μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、約１１ｋｂの増幅断片の検出を行った。増幅断片を確認した後、１μｌ  のＤｐｎＩ（キットに付属）をＰＣＲ反応液に添加して３７℃で１時間反応し、鋳型ＤＮＡの除去を行った。
【０１４８】
次に、ＸＬ−１０  ｕｌｔｒａｃｏｎｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ（キットに付属）を用いて形質転換を行った。２μｌのＤｐｎＩ処理済みのＰＣＲ反応液と４５μｌのコンピテントセルを混ぜ４℃で３０分保温し、４２℃で３０秒ヒートショックを行った後、０．５ｍｌのＮＺＹ＋培地（１％  ＮＺアミン、０．５％  酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．４％  グルコース、ｐＨ７．５）を添加し、さらに３７℃で１時間培養した。この培養液２５０μｌをＬＢプレート（１％  ＮａＣｌ、１％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、２％  寒天、５０ｍｇ／Ｌアンピシリン）にプレーティングし、３７℃で１日培養した。
【０１４９】
得られたコロニー数個をＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌアンピシリン）で培養し、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐＫｉｔ（アマシャムバイオサイエンス）を使用しプラスミドを調製した。最後に、得られたプラスミドの塩基配列の決定を行い、目的の変異が導入されていることを確認した。このようにしてＥβ９３Ｇの変異導入プラスミド：ｐ３Ｒを得た。
【０１５０】
（２）変異酵素遺伝子を導入したロドコッカス菌組換え体の取得
ロドコッカス  ロドクロウス  ＡＴＣＣ  １２６７４  株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。（１）で調製したプラスミド  ｐ３Ｒ  １μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷した。キュベットにＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  （ＢＩＯ  ＲＡＤ）により２．０ＫＶ、２００  ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置し、３７℃で１０分間ヒートショクを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２  ＨＰＯ４  、０．２％  ＫＨ２  ＰＯ４  ）５００μｌ  を加え、３０℃、５時間静置した後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃、３日間培養した。このようにして得られたロドコッカス属細菌組換え体（ＡＴＣＣ  １２６７４／ｐ３Ｒ）をＭＹＫ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有）１０ｍｌに接種し、３０℃で７２時間前培養した。本培養はＭＹＫ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有）１００ｍｌで行い、前培養から１％接種し、３０℃で９６時時間培養した。遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で菌体を洗浄し、最後に少量の緩衝液に懸濁した。
【０１５１】
（３）ロドコッカス菌組換え体の耐熱性確認
得られたロドコッカス菌組換え体を用いて実施例２の方法と同様に耐熱性を調べた。比較対照として野生型ニトリルヒドラターゼを有するＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０３４を用意した。
【０１５２】
得られた菌体懸濁液０．５ｍｌを試験管に入れ、６５℃、７０の各温度の水浴中で１０分間保温し、その後氷中で冷却した。残活性は、熱処理を行わず４℃で保冷したもの（無処理区）の初期活性を１００％とした相対活性で示した。結果を表３に示す。
【０１５３】
このようにＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０３４では７０℃、１０分の熱処理で残活性が４％に対し、ＡＴＣＣ  １２６７４／ｐ３Ｒでは４６％の残活性を保持していることから、変異酵素で耐熱性が向上していることが認められた。
【０１５４】
【表３】
2004222538.tif 000005
【０１５５】
【発明の効果】
本発明により野生型ロドコッカス属ロドクロウスＪ−１株由来のニトリルヒドラターゼより耐熱性の向上した改良型ニトリルヒドラターゼの塩基配列およびアミノ酸配列が提供される。さらには、野生型および改変型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを含む形質転換（導入）体、該形質転換（導入）体を用いたアミド化合物の製造法が提供される。本発明により、効率よくアクリルアミドを製造することが可能となる。
【０１５６】
【配列表】
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【０１５７】
【配列表フリーテキスト】
配列番号５：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ
配列番号６：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ
配列番号７：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ
配列番号８：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ
配列番号９：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ
配列番号１０：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ
配列番号１１：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ
配列番号１２：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＪＨ６０１の制限酵素地図である。
【図２】プラスミドｐ３Ｒの制限酵素地図である。
【図１】
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【図２】
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