(57)【要約】【課題】臨床的状況下で、現在利用可能な分析的機器において容易にかつ迅速に実行され得るHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法、アッセイ、およびキットを提供すること。【解決手段】HIVプロテアーゼ、HIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有すると疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が検出可能な複合体を形成する；検出可能な複合体の量を測定する工程；ならびに検出可能な複合体の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法、アッセイ、ならびにHIVプロテアーゼと、HIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体とを含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するためのキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
HIVプロテアーゼ、HIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有すると疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が検出可能な複合体を形成する；検出可能な複合体の量を測定する工程；ならびに検出可能な複合体の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法。
【請求項２】
HIVプロテアーゼが固相の表面上に固定化されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
HIVプロテアーゼインヒビターがHIVプロテアーゼインヒビター化合物、抗HIVプロテアーゼ抗体、およびHIVプロテアーゼインヒビター化合物の代謝物からなる群より選択されるメンバーを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
HIVプロテアーゼインヒビターがアンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、リトナビル、およびサキナビルからなる群より選択されるメンバーを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
結合体が標識を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
標識が蛍光標識、発光化合物、放射性同位体、電気化学発光標識、酵素、および酵素基質からなる群より選択されるメンバーを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
結合体がキャリア、およびキャリアに連結された少なくとも２つのHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含み、かつ検出可能な複合体の量を測定する工程が凝集を測定する工程を含む、請求項２記載の方法。
【請求項８】
結合体が蛍光標識を含み、かつ検出可能な複合体の量を測定する工程が蛍光偏光を測定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
固相が粒子、マイクロタイタープレート、キュベット、チューブ、およびストリップからなる群より選択されるメンバーを含む、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
検出可能な複合体の量を測定する工程が、固相の分光学的特性を測定する工程を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
結合体がビオチンを含むものであり、かつ該方法が検出可能な複合体を固相の表面上に固定化する工程をさらに含み、該表面がアビジンまたはストレプトアビジンを含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
HIVプロテアーゼが標識に連結されたものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
HIVプロテアーゼ、キャリアおよび該キャリアに連結された少なくとも2つのHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有すると疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼが微小粒子の表面上に固定化されたものであり、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に凝集を受け、かつサンプルがヒト血清またはヒト血漿である；凝集を測定する工程；ならびに凝集の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法。
【請求項１４】
少なくとも2つのHIVプロテアーゼを含む多価キャリア、微小粒子およびHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有することが疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に凝集を受け、かつサンプルがヒト血清またはヒト血漿である；凝集を測定する工程；ならびに凝集の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法。
【請求項１５】
HIVプロテアーゼ、蛍光標識および該標識に連結されたHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有することが疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に検出可能な複合体を形成し、かつサンプルがヒト血清またはヒト血漿である；蛍光偏光における変化をモニタリングすることにより検出可能な複合体の量を測定する工程；ならびに検出可能な複合体の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法。
【請求項１６】
生物体に対してある用量のHIVプロテアーゼインヒビターを投与する工程；生物体から液体サンプルを得る工程；サンプルを、HIVプロテアーゼ、およびHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体と合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に検出可能な複合体を形成する；サンプル中における検出可能な複合体の量を測定する工程；ならびに検出可能な複合体の量を、生物体中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、生物体におけるHIVプロテアーゼインヒビターの濃度をモニタリングするための方法。
【請求項１７】
表面を備える粒子と、該粒子の表面上に固定化されたHIVプロテアーゼとを含み、ここで、HIVプロテアーゼがHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体と共に検出可能な複合体を形成する、請求項１に記載の方法に使用され得る、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための試薬。
【請求項１８】
表面を備える微小粒子と、該粒子の表面上に固定化されたHIVプロテアーゼとを含み、ここで、HIVプロテアーゼが、キャリアに連結された少なくとも2つのHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体と共に検出可能な複合体を形成し、かつ検出可能な複合体が、凝集を測定することによって定量され得る、請求項１３に記載の方法に使用され得る、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための試薬。
【請求項１９】
HIVプロテアーゼインヒビターアナログが分光学的標識に連結されたものである請求項１７記載の試薬。
【請求項２０】
HIVプロテアーゼインヒビターアナログが酵素に連結されたものである請求項１７記載の試薬。
【請求項２１】
HIVプロテアーゼと、HIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体とを含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するためのキット。
【請求項２２】
HIVプロテアーゼインヒビターアナログがHIVプロテアーゼインヒビター化合物、抗HIVプロテアーゼ抗体、およびHIVプロテアーゼインヒビター化合物の代謝物からなる群より選択されるメンバーのアナログを含む、請求項２１記載のキット。
【請求項２３】
結合体が微小粒子、および該微小粒子に連結された少なくとも2つのHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む、請求項２１記載のキット。
【請求項２４】
少なくとも２つのHIVプロテアーゼが多価キャリアに連結されたものである、請求項２３記載のキット。
【請求項２５】
HIVプロテアーゼが固相の表面上に固定化されたものである、請求項２１記載のキット。
【請求項２６】
固相が粒子、マイクロタイタープレート、キュベット、チューブ、およびストリップからなる群より選択されるメンバーを含む、請求項２５記載のキット。
【請求項２７】
粒子が微小粒子を含む、請求項２６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法、アッセイ、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（AIDS）を有する患者の臨床的ケアは、強力でかつ特異的なHIVプロテアーゼインヒビターとして機能する化合物の導入によって実質的に改善された。ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、AIDSを起こす原因物質であり、酵素であるHIVプロテアーゼは、HIVのgagポリペプチドおよびgag-polポリペプチドにおける特定の切断の触媒を担うと考えられる。変異的に不活性化したHIVプロテアーゼを合成するウイルスは一般に、感染性ビリオンを形成しない。従って、HIVプロテアーゼは、AIDSに対する薬物が設計され得る重要な標的である。HIVプロテアーゼインヒビターは、HIVプロテアーゼの活性の低下または停止を生じ得る。
【０００３】
現在のところ、AIDS患者の処置に関して、米国食品医薬品局（FDA）によって承認されたHIVプロテアーゼインヒビターとしては、アンプレナビル（anprenavir）、インジナビル（indinavir）、ロピナビル（lopinavir）、ネルフィナビル（nelfinavir）、リトナビル（ritonavir）、およびサキナビル（saquinavir）の６つがある。HIVプロテアーゼインヒビター、およびHIV逆転写酵素インヒビターを含む併用療法は、HIV感染について現在推奨される治療の基礎である。ある併用療法レジメンに対してすべてのAIDS患者が、同じ最適の応答を示すわけではない。個々の患者間の薬物応答には大きなバラツキがあり得る。プロテアーゼインヒビターに対する全身曝露と抗ウイルス効果との関係は、臨床的情報の蓄積により支持されている。ある患者に併用療法レジメンが投与されると、可能性のある薬物動態学的な薬物間の相互作用がこの処置を改善するか、または弱め得る。また、十分な薬物レベルの維持に直接関連する患者のコンプライアンスもこの処置の結果に影響し得る。
【０００４】
従って、薬物曝露がAIDS患者において抗ウイルス活性を維持するのに十分であることを保証するため、患者におけるHIVプロテアーゼインヒビターの濃度を測定することが望ましい。さらに、試験被験体由来の生物学的サンプルにおけるHIVプロテアーゼインヒビターの定量的測定は、薬物開発プロセスにおいて重大である。HIVの処置における重要な他の測定項目としては、HIVプロテアーゼインヒビターの代謝物の測定、および抗HIVプロテアーゼ抗体の測定が挙げられる。代謝物の存在および量によって、治療処置の有効性に関する情報が提供され得る。抗HIVプロテアーゼ抗体の存在は、HIVによる患者の感染を示し、従って、この抗体の検出は、潜在的な感染を診断するために用いられ得る。
【０００５】
典型的に、患者サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターは、臨床的状況下では分析の実施を困難なものとする、洗練された高価な機器を必要とするアッセイ方法によって定量されている。例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、または二重質量分析法と組み合わされたＨＰＬＣ（HPLC/MS/MS）等のクロマトグラフ方法を用いることにより、血漿サンプルを、同時に多数のHIVプロテアーゼインヒビター化合物の存在について分析することができる。例えば、非特許文献１〜３を参照のこと。血漿サンプルは典型的には、試験の前に固相抽出手順に供される。従って、血漿は、直接分析されるのではなく改変されるはずであり、これによって、分析に対して複雑性および費用が加わることになる。
【０００６】
ラジオイムノアッセイは典型的に、サンプル中における、HIVプロテアーゼインヒビターアナログを含有する放射性標識された結合体と、任意の遊離のHIVプロテアーゼインヒビターとの間の競合的相互作用を包含する。レセプターは一般に、特定のHIVプロテアーゼインヒビターについての抗体である。ラジオイムノアッセイの一例では、ヨウ素-125を用いて標識されたHIVプロテアーゼインヒビターのアナログは、抗体との結合について、患者の血漿のサンプル中の任意のHIVインヒビター化合物と競合することが報告されている。次いで、沈殿した抗体複合体を、放射能のレベルについて分析して、HIVプロテアーゼインヒビター化合物の濃度を決定する。例えば、非特許文献４を参照のこと。ラジオイムノアッセイを間接的に用いるアッセイの一例では、HIVプロテアーゼはHIVプロテアーゼについての基質と共にサンプルに添加されてもよい。次いで、この基質の切断は、この切断産物に特異的に結合する抗体を利用して、ラジオイムノアッセイにより測定され得る。切断産物の非存在は抗HIVプロテアーゼ抗体の存在を示す。例えば、特許文献１を参照のこと。
【非特許文献１】Poirier, J. M.等、Ther. Drug Moint. 22: 465-473 (2000)
【非特許文献２】Marzonlini, C.等、J. Chromatogr. 740: 43-58 (2000)
【非特許文献３】Remmel, R. P.等、Clin. Chem. 46(1): 73-81 (2000)
【非特許文献４】Wiltshire, H. R.等、Analyt. Biochem. 281: 105-114 (2000)
【特許文献１】米国特許第5,171,662号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
インヒビター、および／またはそれらの代謝物を測定するためのこれらの方法のすべてが受けた成功は完全なものではなかった。従って、生物学的サンプル中において、HIVプロテアーゼインヒビターおよび／またはそれらの代謝物を定量するための改善された方法の必要性が存在する。このような方法が、臨床的状況下で、現在利用可能な分析的機器において容易にかつ迅速に実行され得ることが所望される。すなわち、本発明は、臨床的状況下で、現在利用可能な分析的機器において容易にかつ迅速に実行され得るHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法、アッセイ、およびキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の1つの局面において、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法であって、該方法は、HIVプロテアーゼ、HIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有すると疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が検出可能な複合体を形成する；検出可能な複合体の量を測定する工程；ならびに検出可能な複合体の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む。
【０００９】
本発明の他の局面において、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法であって、該方法は、HIVプロテアーゼ、キャリアおよび該キャリアに連結された少なくとも2つのHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有すると疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼが微小粒子の表面上に固定化されたものであり、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に凝集を受ける；凝集を測定する工程；ならびに凝集の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む。
【００１０】
本発明のさらに他の局面において、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法であって、該方法は、少なくとも2つのHIVプロテアーゼ酵素を含む多価キャリア、微小粒子およびHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有することが疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に凝集を受け、かつサンプルがヒト血清またはヒト血漿である；凝集を測定する工程；ならびに凝集の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を包含する。
【００１１】
本発明のさらに他の局面において、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法であって、該方法は、HIVプロテアーゼ、蛍光標識および該標識に連結されたHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有することが疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に検出可能な複合体を形成する；蛍光偏光における変化をモニタリングすることにより検出可能な複合体の量を測定する工程；ならびに検出可能な複合体の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む。
【００１２】
本発明のさらに他の局面において、生物体におけるHIVプロテアーゼインヒビターの濃度をモニタリングするための方法であって、該方法は、生物体に対してある用量のHIVプロテアーゼインヒビターを投与する工程；生物体から液体サンプルを得る工程；サンプルを、HIVプロテアーゼ、およびHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体と合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に検出可能な複合体を形成する；サンプル中における検出可能な複合体の量を測定する工程；ならびに検出可能な複合体の量を、生物体中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む。
【００１３】
本発明のさらに他の局面において、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための試薬であって、該試薬は、表面を備える粒子と、該粒子の表面上に固定化されたHIVプロテアーゼとを含む。HIVプロテアーゼは、結合体と共に検出可能な複合体を形成し、ここで、結合体がHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む。
【００１４】
本発明のさらに他の局面において、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するためのキットであって、該キットは、HIVプロテアーゼと、HIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体とを含んでなる。
【００１５】
すなわち、本発明は、
〔１〕  HIVプロテアーゼ、HIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有すると疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が検出可能な複合体を形成する；検出可能な複合体の量を測定する工程；ならびに検出可能な複合体の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法、
〔２〕  HIVプロテアーゼが固相の表面上に固定化されたものである、前記〔１〕記載の方法、
〔３〕  HIVプロテアーゼインヒビターがHIVプロテアーゼインヒビター化合物、抗HIVプロテアーゼ抗体、およびHIVプロテアーゼインヒビター化合物の代謝物からなる群より選択されるメンバーを含む、前記〔１〕記載の方法、
〔４〕  HIVプロテアーゼインヒビターがアンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、リトナビル、およびサキナビルからなる群より選択されるメンバーを含む、前記〔１〕記載の方法、
〔５〕  結合体が標識を含む、前記〔１〕記載の方法、
〔６〕  標識が蛍光標識、発光化合物、放射性同位体、電気化学発光標識、酵素、および酵素基質からなる群より選択されるメンバーを含む、前記〔５〕記載の方法、
〔７〕  結合体がキャリア、およびキャリアに連結された少なくとも２つのHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含み、かつ検出可能な複合体の量を測定する工程が凝集を測定する工程を含む、前記〔２〕記載の方法、
〔８〕  結合体が蛍光標識を含み、かつ検出可能な複合体の量を測定する工程が蛍光偏光を測定する工程を含む、前記〔１〕記載の方法、
〔９〕  固相が粒子、マイクロタイタープレート、キュベット、チューブ、およびストリップからなる群より選択されるメンバーを含む、前記〔２〕記載の方法、
〔１０〕  検出可能な複合体の量を測定する工程が、固相の分光学的特性を測定する工程を含む、前記〔２〕記載の方法、
〔１１〕  結合体がビオチンを含むものであり、かつ該方法が検出可能な複合体を固相の表面上に固定化する工程をさらに含み、該表面がアビジンまたはストレプトアビジンを含むものである、前記〔１〕記載の方法、
〔１２〕  HIVプロテアーゼが標識に連結されたものである、前記〔１１〕記載の方法、
〔１３〕  HIVプロテアーゼ、キャリアおよび該キャリアに連結された少なくとも2つのHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有すると疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼが微小粒子の表面上に固定化されたものであり、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に凝集を受け、かつサンプルがヒト血清またはヒト血漿である；凝集を測定する工程；ならびに凝集の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法、
〔１４〕  少なくとも2つのHIVプロテアーゼを含む多価キャリア、微小粒子およびHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有することが疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に凝集を受け、かつサンプルがヒト血清またはヒト血漿である；凝集を測定する工程；ならびに凝集の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法、
〔１５〕  HIVプロテアーゼ、蛍光標識および該標識に連結されたHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有することが疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に検出可能な複合体を形成し、かつサンプルがヒト血清またはヒト血漿である；蛍光偏光における変化をモニタリングすることにより検出可能な複合体の量を測定する工程；ならびに検出可能な複合体の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法、
〔１６〕  生物体に対してある用量のHIVプロテアーゼインヒビターを投与する工程；生物体から液体サンプルを得る工程；サンプルを、HIVプロテアーゼ、およびHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体と合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に検出可能な複合体を形成する；サンプル中における検出可能な複合体の量を測定する工程；ならびに検出可能な複合体の量を、生物体中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、生物体におけるHIVプロテアーゼインヒビターの濃度をモニタリングするための方法、
〔１７〕  表面を備える粒子と、該粒子の表面上に固定化されたHIVプロテアーゼとを含み、ここで、HIVプロテアーゼがHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体と共に検出可能な複合体を形成する、前記〔１〕に記載の方法に使用され得る、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための試薬、
〔１８〕  表面を備える微小粒子と、該粒子の表面上に固定化されたHIVプロテアーゼとを含み、ここで、HIVプロテアーゼが、キャリアに連結された少なくとも2つのHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体と共に検出可能な複合体を形成し、かつ検出可能な複合体が、凝集を測定することによって定量され得る、前記〔１３〕に記載の方法に使用され得る、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための試薬、
〔１９〕  HIVプロテアーゼインヒビターアナログが分光学的標識に連結されたものである前記〔１７〕記載の試薬、
〔２０〕  HIVプロテアーゼインヒビターアナログが酵素に連結されたものである前記〔１７〕記載の試薬、
〔２１〕  HIVプロテアーゼと、HIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体とを含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するためのキット、
〔２２〕  HIVプロテアーゼインヒビターアナログがHIVプロテアーゼインヒビター化合物、抗HIVプロテアーゼ抗体、およびHIVプロテアーゼインヒビター化合物の代謝物からなる群より選択されるメンバーのアナログを含む、前記〔２１〕記載のキット、
〔２３〕  結合体が微小粒子、および該微小粒子に連結された少なくとも2つのHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む、前記〔２１〕記載のキット、
〔２４〕  少なくとも２つのHIVプロテアーゼが多価キャリアに連結されたものである、前記〔２３〕記載のキット、
〔２５〕  HIVプロテアーゼが固相の表面上に固定化されたものである、前記〔２１〕記載のキット、
〔２６〕  固相が粒子、マイクロタイタープレート、キュベット、チューブ、およびストリップからなる群より選択されるメンバーを含む、前記〔２５〕記載のキット、ならびに
〔２７〕  粒子が微小粒子を含む、前記〔２６〕記載のキット、
に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、生物学的サンプル中において、HIVプロテアーゼインヒビターおよび／またはそれらの代謝物を定量するための改善された方法が提供される。かかる方法は、臨床的状況下で、現在利用可能な分析的機器において容易にかつ迅速に実行され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビター（HIV-PI）の濃度を決定するためのアッセイ系に関する。この系は、HIVプロテアーゼ（HIV-PR）酵素と、結合体と、HIV-PIを含有することが疑われるサンプルとを含む。本発明によれば、結合体、およびサンプル中に存在するHIV-PIは、HIV-PRに対する結合に関して競合する。結合体、およびHIV-PIを含有するサンプルによるHIV-PRの接触の際、この結合体に対して結合したHIV-PRのレベルが変化し、そしてこの変化が測定され、かつサンプル中のHIV-PIの濃度に対して相関し得る。
【００１８】
「HIVプロテアーゼ」（HIV-PR）という用語は、HIVのgagポリペプチド、およびgag-polポリペプチドの翻訳後プロセシングを担う酵素を意味する。HIV-PRをコードする2つのタイプのHIVは、HIV-1およびHIV-2である。HIV-1は高度に可変性のウイルスであり、非常に容易に変異し、これによってHIV-1の多くの異なる株が生じる。これらの株はグループ（例えば、MおよびO）に従って、およびサブタイプに従って分類され得る。従って、HIVプロテアーゼとしては、HIV-1 PR、およびHIV-2 PR、ならびに操作された（engineered）HIV-PRが挙げられる。
【００１９】
「HIVプロテアーゼインヒビター（HIV protease inhibitor）」（HIV-PI）という用語は、HIVプロテアーゼインヒビター化合物、HIVプロテアーゼインヒビター化合物の活性な代謝物、および抗HIVプロテアーゼ抗体を包含する。HIVプロテアーゼインヒビター化合物、およびその代謝物としては、ペプチド、有機化合物、有機金属化合物、および金属錯体（HIVプロテアーゼの活性を減少するかまたは排除し得る）が挙げられる。HIVプロテアーゼインヒビター化合物の特定例としては、AIDS患者の処置に関してFDAにより現在承認されている化合物、すなわち、アンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、リトナビル、およびサキナビルが挙げられる。抗HIVプロテアーゼ抗体は、他の物質ではなくて、HIVプロテアーゼ酵素に関して特定の結合親和性を有する抗体である。「抗体（antibody）」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗体フラグメントを包含する。
【００２０】
「分析物（analyte）」という用語は、サンプル中におけるその存在または量が検出されるべき物質または物質の群を意味し、これには、任意の薬物または薬物誘導体、ホルモン、タンパク質抗原、またはオリゴヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない。本アッセイ系において、この分析物はHIVプロテアーゼインヒビターであり、このHIVプロテアーゼインヒビターとしては、HIVプロテアーゼインヒビター化合物、HIVプロテアーゼインヒビター化合物の代謝物、または抗HIVプロテアーゼ抗体が挙げられる。
【００２１】
「レセプター（receptor）」という用語は、分析物の特定の結合パートナーを意味し、そして他の物質ではなく、この分析物に対して特定の結合親和性を有する任意の物質、または物質の群を包含することを意味する。レセプターとしては、酵素および抗体が挙げられる。本アッセイ系においては、HIVプロテアーゼは、ＨＩＶ-ＰＩについて、および／またはHIV-PIアナログを含む結合体についてのレセプターとして機能する。
【００２２】
「HIV-PIアナログ（HIV-PI analog）」という用語は、HIVプロテアーゼについての結合親和性に関してHIVプロテアーゼインヒビターと本質的に同じく挙動する、物質または物質の群を意味する。HIV-PIアナログとは典型的には、HIV-PIとHIV-PRとの相互作用を模倣するように改変または誘導体化されているHIV-PIである。従って、HIV-PIアナログは、HIV-PIの任意の改変を包含する。例えば、HIV-PIアナログは、HIV-PIと別の物質、例えば、原子、連結基、標識、またはキャリア物質との間の結合（linkage）の存在を除けば、HIV-PIに同一であり得る。HIV-PIアナログとしては、HIVプロテアーゼインヒビター化合物のアナログ、HIVプロテアーゼインヒビター化合物の代謝物のアナログ、および抗HIVプロテアーゼ抗体のアナログが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２３】
「結合体（conjugate）」という用語は、別の物質、例えば、キャリア、標識、または固相に連結されたHIV-PIアナログの複合物を意味し、これは、レセプターに特異的に結合し得る。例えば、HIV-PIアナログを含有する結合体は、アナログを通じて、HIV-PRと特異的に結合し得る。HIV-PIアナログを含有する結合体は、例えば、本明細書において参照により組み込まれる、同時係属中の2002年7月7日出願の出願番号第10/192,052号に記載の通り調製され得る。
【００２４】
「標識（label）」という用語は、結合体の一部としてHIV-PIアナログに結合された場合、適切なレセプターとのこの結合体の結合を検出するために用いられ得る、同定タグ（identifying tag）を意味する。標識は、直接または、連結部分もしくは架橋部分によって間接的に、HIV-PIアナログに結合され得る。一般に用いられる標識としては、フルオレセインおよびローダミン等のような蛍光標識、ジオキセタンおよびルシフェリン等の発光化合物、125I等の放射性同位体、アクリジニウムエステル等の化学発光標識、ルテニウムビピリジル（bipyridyl）等の電気化学発光標識、ペルオキシダーゼおよびbガラクトシダーゼ等の酵素、および酵素基質標識が挙げられる。
【００２５】
「キャリア（carrier）」という用語は、1つ以上のHIV-PIアナログと結合し得、これによってHIV-PIアナログとレセプターとの任意の結合の検出を可能にする物質であって、通常タンパク質を意味する。キャリアとしては、ウシ血清アルブミン（BSA）等のタンパク質、合成ポリサッカライド、または天然のポリサッカライド、およびアミノデキストラン（AMD）等のポリマーが挙げられる。
【００２６】
「検出可能な複合体（detectable complex）」という用語は、レセプターおよび結合体によって形成された複合体であって、その量が、その複合体、および／またはその周囲からのシグナルの変化をモニタリングすることによって測定され得る複合体を意味する。シグナルの変化は、例えば、測定可能な沈殿物の形成、分光学的な吸光度、放射、発光、もしくは蛍光の特徴における変化、または電気的特性における変化であり得る。
【００２７】
「ペプチド（peptide）」という用語は、アミド（ペプチド）結合による2つ以上のアミノ酸の連結によって形成される任意の化合物、通常、α−アミノ酸のポリマーを意味する。ここで各々のアミノ酸残基のα−アミノ基（NH2末端を除く）は、直鎖において次の残基のα−カルボキシル基に連結されている。用語、ペプチド、ポリペプチド、およびポリ（アミノ酸）は本明細書において同意語として用いられて、サイズに関して限定されることなく、このクラスの化合物のことをいう。このクラスの最大のメンバーは、タンパク質と呼ばれる。
【００２８】
「共有結合（covalent bond）」という用語は、2つの種の間の化学結合を意味し、そして単結合を含んでも、多重結合を含んでもよい。対照的に、「非共有結合（non-covalent bond）」という用語は、化学結合を形成しない化学的相互作用または物理的相互作用を意味する。従って、非共有結合としては、疎水性相互作用／親水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、ならびにイオン性相互作用および金属性相互作用が挙げられる。例えば、ある表面に対する物質の吸着は非共有であるが、ある表面に対する物質のカップリング（例えば、カルボジイミドまたはN−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）カップリングを通じたカップリング）は共有である。
【００２９】
「生物学的サンプル（biological sample）」という用語は、生存している生物体から得られた体液を意味する。生物学的サンプルは、好ましくは水性混合物、例えば、尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、排泄物、喀痰、脳脊髄液、涙液、粘液などであるが、好ましくは血漿または血清であり、そしてより好ましくはヒト血漿またはヒト血清である。HIV-PIを含有することが疑われる任意のサンプルは、本発明の方法により分析され得る。サンプルは、所望の場合、前処理されてもよい、この前処理には、希釈、濾過、および／または遠心分離による前処理が挙げられる。サンプルは、アッセイを妨害しない任意の好都合な媒体中で調製され得、水性媒体が好ましい。
【００３０】
「較正材料（calibration material）」という用語は、測定されるべき既知の量の分析物を含有する、任意の標準材料または参照材料を意味する。分析物を含有することが疑われるサンプルおよび較正材料は、できるだけ同一の条件下でアッセイされる。次いで、分析物の濃度を、未知のサンプルについて得られた結果を、標準について得られた結果と比較することによって算出する。
【００３１】
「固相（solid phase）」という用語は液体でない物質を意味し、これには、ポリマー、金属（常磁性粒子、強磁性粒子）、ガラス、およびセラミック等の材料から作製された粒子（微小粒子およびビーズを含む）、シリカ、アルミナ、およびポリマーゲル等のゲル物質、ポリマー、金属、ガラス、および／またはセラミックから作製され得るキャピラリー（毛細管）、ゼオライト（沸石）および他の多孔性物質、電極、マイクロタイタープレート、固体ストリップ、ならびにキュベット、チューブ（試験管）、または他の分光計のサンプル容器が挙げられる。あるアッセイの固相の構成要素は、「固相」が、その表面上に、そのアッセイ混合物の1つ以上の構成要素と相互作用することを意図する、少なくとも1つの部分を含むという点で、このアッセイが接触され得る不活性な固体表面とは区別される。
【００３２】
あるサンプル中のHIVプロテアーゼインヒビター（HIV-PI）の濃度を決定するためのアッセイ系は、HIV-PRと、HIV-PIアナログを含む結合体とを含み得る。この結合体はHIV-PRに結合して、検出可能な複合体を形成し得るが、任意のHIV-PIの存在がまたHIV-PRに結合し得、従ってこの結合体と競合する。HIV-PRと、この結合体、およびHIV-PIを含むサンプルとの接触の際、この結合体に結合したHIV-PRのレベルは変化し、そしてこの変化が測定されてこのサンプル中のHIV-PIの濃度に相関され得る。
【００３３】
このアッセイ形式において、HIVプロテアーゼ酵素は、このサンプル中においてこの結合体についてのレセプターとして、およびこのHIVプロテアーゼインヒビターについてのレセプターとして機能する。典型的には、従来のイムノアッセイは、分析物、および結合体の分析物アナログ部分に特異的に結合する抗体を用いる。例えば、本明細書において参照により組み込まれる、欧州特許公開第1207394号を参照のこと。本方法は、分析されるべきHIV-PIの各々の多様性に関して、特有の抗体の調製を必要とし得る。レセプターとしてHIV-PRを用いることによって、任意のタイプのHIV-PIが単一のアッセイ系を用いて定量され得る。なぜなら、HIV-PRは、サンプル中の任意のHIV-PIによって阻害されるからである。この形式は、有利な診断アッセイ特徴を提供し得る。例えば、種々の異なるHIV-PIを含有するサンプルは単一アッセイにおいて分析され得、これによってサンプル中の全体的なHIV-PIレベルの簡便な定量が可能になる。また、単一のタイプの結合体が多様なHIV-PIについて分析するために用いられ得、さらにこのアッセイの単純性に貢献する。
【００３４】
HIV-PRは遊離の酵素としてアッセイ混合物中で存在してもよいし、またはHIV-PRは別の物質に、例えば、固相の表面またはキャリアに結合されてもよい。レセプターとしてのHIV-PRの使用は、均一系アッセイおよび不均一系アッセイの両方に適用され得る。不均一系アッセイにおいて、このアッセイの固相の構成要素は液体アッセイ混合物の残りから分離され、その後に目的の測定が実施される。対照的に、均一系アッセイによって、このサンプルを含む完全なアッセイ混合物から測定値を得ることが可能になる。
【００３５】
診断アッセイにおける固相の使用によって、目的の測定値が得られ得るようにアッセイ混合物の特定の構成要素を局在化および／または分離する、簡便な方法が提供され得る。固相の構成要素の使用を包含する、広範な種々のアッセイ構成が公知であって、それらは、不均一系または均一系のいずれかに大まかに分類され得る。均一系形式または不均一系形式のいずれかの固相の構成要素は、その固相表面上に活性部分としてHIV-PRを含有してもよい。従って、HIV-PRは、HIV-PIおよび検出可能な結合体の両方に結合し得るレセプターとして機能し得る。
【００３６】
所定の固相の構成要素の表面は、種々の方法によってHIV-PRを含むように改変され得る。例えば、HIV-PRは、表面と、HIV-PR酵素を含有する液体混合物とを接触させることによりこの表面に吸着され得る。他の例では、酵素の重要な結合部位を覆い隠すことなくHIV-PRに結合する抗体がこの表面に吸着または結合され得、そしてHIV-PRは引き続いて、抗体とのその相互作用によってその表面上に固定され得る。さらに他の例では、適切な結合パートナーを含有する改変されたHIV-PRを固定するために、ビオチン、アビジン、またはストレプトアビジンが用いられ得る。この例において、より小さいビオチン部分を用いてHIV-PRを改変すること、およびアビジンまたはストレプトアビジンを用いてこの固体表面を改変することが好都合であり得る。さらに他の例において、HIV-PRはカルボジイミドカップリング、N−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルカップリング、または他の化学的カップリング技術等の共有結合によって固定化されてもよい。例えば、本明細書において参照により組み込まれる、Markgren, P. O.等、Analytical Biochemistry 265, 340-350 (1998)を参照のこと。
【００３７】
不均一系アッセイのための固相の構成要素は、静止している構成要素、例えば、チューブ（試験管）、ストリップ、キュベット、またはマイクロタイタープレートであってもよいし、または静止していない構成要素、例えば、ビーズ、および微小粒子であってもよい。微小粒子はまた、不均一系アッセイ様式のための固相として用いられてもよい。タンパク質および他の物質の、非共有結合または共有結合のいずれかを可能にする種々の微小粒子が用いられてもよい。このような粒子としては、ポリスチレン、およびポリ（メチルメタクリラート）等のポリマー粒子、金ナノ粒子および金コロイド等の金粒子、ならびにシリカ、ガラス、および金属酸化物粒子等のセラミック粒子が挙げられる。例えば、本明細書において参照により組み込まれる、C. R. Martin等、Analytical Chemistry-News & Features, May 1, 1998, 322A-327Aを参照のこと。
【００３８】
例えば、有用な微小粒子試薬は、微小粒子の表面上へのHIV-PRの吸着によって形成され得る。好ましい微小粒子としては、0.1〜1.0マイクロメートル（mm）の直径を有するポリスチレンベースのラテックス微小粒子が挙げられる。この微小粒子の表面は、カルボン酸基（−COO−、および−COOH）を含み得る。カルボン酸基は、例えば、加水分解反応によって、カルボキシル化試薬による処理によって、またはカルボン酸基を含む自己組織化単層膜（SAM）の形成によって表面に導入され得る。例えば、本明細書において参照により組み込まれる、J. G. Chapman等、J. Am. Chem. Soc., 122, 8303-8304 (2000)を参照のこと。例えば、この微小粒子は、5〜200Å2、好ましくは10〜120Å2のカルボン酸塩表面の駐留面積（parking area）（この表面上のカルボン酸基の総数で割った、この微小粒子の表面積として規定される）を提供する濃度でカルボン酸基を含んでもよい。
【００３９】
HIV-PRの固定化の例においては、酵素は、カルボキシル化改変されたラテックス微小粒子上に吸着される。次いで、結合されたHIV-PRを含有する微小粒子を、吸着混合物から分離して、洗浄および遠心分離の反復サイクルに供する。これらの改変された粒子は、低下した温度、例えば、4°Cで2週間まで保管されてもよい。ストック混合物を吸着、洗浄または調製するために用いられる水性混合物を、好ましくはpH3.5〜6.5の間で緩衝化する。より頑丈であれば、操作されたHIV-PRが用いられ、この取扱いおよび保管の条件はより柔軟であってもよい。
【００４０】
その表面に結合したHIV-PRを有する固相材料は、静止したものでも静止したものでなくても、サンプル中のHIV-PIを定量するために競合アッセイにおいて用いられ得る。このような競合アッセイ形式では、サンプル中のHIV-PIは、固定化されたHIV-PI（レセプターとして機能する）との結合について結合体と競合する。HIV-PRとこの結合体との結合によって、検出可能な複合体の形成が生じる。HIV-PIの存在下における結合の量と比較した、この酵素と結合体単独との結合の量の測定値は、この結合体と競合している、このサンプル中のHIV-PIの量に相関し得る。
【００４１】
レセプターとして遊離のHIV-PR酵素を利用する均一系アッセイの1つの例は、蛍光偏光（fluorescence polarization）である。蛍光偏光アッセイにおいて、結合体は、HIV-PIアナログに連結された蛍光トレーサーを含む。この蛍光結合体は、HIV-PRに対する結合についてサンプル中のHIV-PIと競合する。HIV-PRと結合した結合体は、未結合の結合体によって示される蛍光偏光とは異なる蛍光偏光を示す。従って、検出可能な複合体は、アッセイ混合物の蛍光偏光における変化をモニタリングすることによって定量または測定される。HIV-PIの存在に起因する、蛍光偏光シグナルにおける変化は、サンプル中のHIV-PIの量に相関し得る。例えば、本明細書において参照により組み込まれるBiochem. Biophys. Res. Comm. 5:299, 1961を参照のこと。
【００４２】
一般に、蛍光偏光技術は、フルオレセイン標識した化合物が、直線的に偏光された光によって励起される場合、その旋光の程度に反比例した偏光の程度を有する蛍光を放射するという原理に基づく。いくつかのフルオレセイン誘導体であって、それからフルイレセイン標識されたトレーサーが調製され得るフルオレセイン誘導体が公知であり、かつ市販されている。大部分のフルオレセイン誘導体は、フルオレセインの5位または6位に由来し（5位についてはアイソマーIと、そして6位についてはアイソマーIIともいう）、そして5-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルボキシフルオレセインまたは6-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルボキシフルオレセイン、5−アミノメチル−フルオレセイン、および5−ジクロロ-1,3,5-トリアジン-2-イルアミノフルオレセイン（DTAF）または6−ジクロロ-1,3,5-トリアジン-2-イルアミノフルオレセイン（DTAF）が挙げられる。フルオレセイン偏光イムノアッセイのシグナルは、ミリ偏光単位（mP）として定量され得、これから較正曲線が決定され得る。蛍光の偏光は、分析物の濃度が増大するにつれて一定の様式で減少し、そしてサンプル中の分析物の濃度は、標準の較正曲線に対する比較によって決定され得る。蛍光偏光アッセイは、手順、機器、および試薬を含めて、本明細書において参照により組み込まれる米国特許第5,986,094号、同第5,070,025号、同第4,868,132号において、および欧州特許公開第0745602号において記載されている。
【００４３】
HIV-PIの蛍光偏光アッセイにおいて、蛍光偏光は分析物濃度の関数であり、従ってHIVプロテアーゼインヒビター化合物、HIVプロテアーゼインヒビター化合物の代謝物、および抗HIVプロテアーゼ抗体を定量するために適切である。結合体およびHIV-PRが、遊離のHIV-PIの非存在下で共に混合される場合、ほとんどの結合体はHIV-PRに結合する。結果として、結合されたトレーサーが吸収波長において偏光を用いて励起される場合、放射波長（発光波長）において放射された光は高度に偏光されたままである。しかし、HIV-PIがこのサンプル中に存在する場合、HIV-PIはこの粒子に対して結合したHIV-PRに対する結合についてこの結合体と競合する。従って、より多くのトレーサーが未結合で残るほど、放射された光は偏光されなくなる。HIV-PIについての蛍光偏光アッセイの1つの例において、この結合体はフルオレセインに連結されたHIV-PIアナログを含む。HIV-PRおよびこの結合体の複合体の検出は、489nmの光を用いてこのサンプルを照射する工程と、520nmで放射された光の偏光を測定する工程とを包含する。
【００４４】
HIV-PRレセプターが固相の表面として結合される均一系アッセイの一例は、微小粒子凝集である。微小粒子凝集アッセイにおいて、この結合体はキャリア物質に連結された複数のHIV-PIアナログを含む。この多価結合体は、微小粒子に結合された限られた量のHIV-PRに対する結合について、サンプル中の任意のHIV-PIと競合する。キャリアに連結された同じ起源または異なる起源のいずれかの、わずか２つのHIV-PIアナログが用いられ得るが、増大した量のHIV-PIアナログもまたこのキャリアに連結され得る。異なるHIV-PIに起源するHIV-PIアナログは、サンプル中のHIV-PIに対する競合物でなければならない。この結合体の多価の性質によって、この結合体が固定化されたHIV-PRに結合する場合、微小粒子の架橋が生じ、そしてこれによって微小粒子の凝集が生じる。従って、HIV-PIの非存在下で生じる微小粒子凝集の量は、サンプル中の任意のHIV-PIの存在によって減少する。従って、検出可能な複合体は種々の凝集定量技術によって測定または定量され得る。この技術としては、例えば、濁度、比濁分析、角異方性、および準弾性光散乱が挙げられる。例えば、単純な分光光度計で実施され得る濁度測定によって、凝集の程度に関連した微小粒子のサイズにおける変化に起因する吸光度の変化が検出される。例えば、米国特許第4,480,042号、および欧州特許公開第1207394号（両方とも本明細書において参照により組み込まれる）を参照のこと。
【００４５】
微小粒子凝集アッセイはまた、複数のHIV-PR酵素に連結されたキャリアと組み合わせて、微小粒子表面に連結されたHIV-PIアナログを用いて実行され得る。本アッセイにおける結合体は微小粒子に結合したHIV-PIアナログを含み、そしてこの結合体は、多価キャリア上のHIV-PR酵素に対する結合について、このサンプル中の任意のHIV-PIと競合する。ここで、多価キャリアとは、複数のHIV-PR酵素が結合するキャリアをいう。検出可能な複合体は、上記のような凝集技術によって測定され得る。HIV-PIアナログは、例えば、共有結合によって、およびキャリア、例えば、ウシ血清アルブミンに連結されたHIV-PIアナログの吸着によって固相表面に連結され得る。HIV-PIに連結したキャリア、および結合体を形成するための固相表面に対するこのようなキャリアの吸着は、例えば、本明細書において参照により組み込まれる、2000年11月14日出願の同時係属中の出願番号09/712,525号に記載されている。
【００４６】
微小粒子凝集を用いるHIV-PIの均一系アッセイのために、pH3.5〜6.5、好ましくは4.5〜5.5を有する水性の緩衝液を用いることが有用であり得る。有用な緩衝液は、0.1モル濃度（M）〜1M、または0.2M〜0.8Mの濃度の塩化ナトリウムを含んでもよく、そしてまた凝集促進剤を含んでもよい。凝集促進剤としては、例えば、ポリ（アクリル酸）（PAA）、ポリビニルピロリドン（PVP）、およびデキストラン硫酸ナトリウムが挙げられ、そして凝集促進剤は0.5%〜3%、好ましくは0.8%〜2.5%の濃度で存在し得る。
【００４７】
不均一系アッセイがまた、HIV-IPを定量するために用いられ得る。好ましい不均一系様式としては酵素結合固相レセプターアッセイが挙げられ、ここでは、結合体は酵素に連結されたHIV-PIアナログを含む。酵素結合固相レセプターアッセイは、競合形式または非競合形式で実施され得る。競合形式では、酵素結合インヒビターアナログは、固相上に固定化された限られた量のレセプターに対する結合について、サンプル中の任意の分析物と競合する。次いで、種々の技術が、酵素標識の検出のために用いられ得る。典型的には、酵素は、ある産物であって、その色によって、または別の分光学的特性、例えば、蛍光、または発光を通じてのいずれかで、容易に検出され得る産物への基質の変換を担う。1つの例において、アルカリホスファターゼを、酵素標識として用いてもよく、そしてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）を検出可能基質として用いてもよい。
【００４８】
HIV-PIについての酵素結合固相レセプターアッセイの1つの例において、この固相は微小粒子であり得る。HIV-PIを含有することが疑われるサンプルを、結合体および微小粒子（固定化されたHIV-PRを含有する）と共にインキュベートする。この結合体と、結合したHIV-PRとの間の結合（HIV-PIの非存在下において生じる）の量は、このサンプル中の任意の競合するHIV-PIの存在の結果として減少する。次いで、このサンプルおよび結合体の未結合の構成要素を、例えば、遠心分離およびデカンテーションにより除去する。微小粒子はまた、グラスファイバーマトリックスを含有するフィルターまたは選択性膜によって捕獲され得る。さらに、強磁性粒子は、この粒子をチューブの側面または底面に引き付ける磁場の使用によって分離され得る。上清の溶液は、吸引またはデカンテーションによって除去され得る。次いで、アッセイ混合物から単離された微小粒子は、連結された酵素標識についての基質で処理され得る。そしてこの粒子に結合した酵素の量が測定されて、もとのサンプル中のHIV-PIの濃度に関連付けられ得る。
【００４９】
HIV-PIについての酵素結合固相レセプターアッセイの他の例において、固相は、静止している相、例えば、マイクロタイタープレートであってもよい。固相材料はガラス、金属、ポリマー、プラスチック、紙、または膜であってもよい。好ましい材料は、ポリスチレン等のプラスチックである。本例において、HIV-PIを含有することが疑われるサンプルを、マイクロタイタープレート上に固定化されたHIV-PRの存在下で結合体と共にインキュベートする。HIV-PRの非存在下で生じるHIV-PR結合の量は、このサンプル中の競合するHIV-PIの結果として減少する。次いで、このサンプルの未結合部分（任意の未結合の結合体を含む）を吸引、その後の数回の洗浄およびそれらの引き続く吸引によって取り除く。次いで、マイクロタイタープレートを、連結された酵素標識についての基質を用いて処理し得る。そして、このプレートに結合した酵素の量を測定して、もとのサンプル中におけるHIV-PIの濃度に対して関連付けることができる。
【００５０】
HIV-PIを定量するための不均一系アッセイのさらに他の例では、HIV-PRは、固相表面上に固定化されることなく、レセプターとして機能し得る。例えば、直接（共有結合または接着性の結合を介して）、または間接的に（例えば、アビジン／ビオチン複合体生成によって）のいずれかで固定化され得る結合体は、アッセイ混合物中の遊離のHIV-PRに対する結合について、サンプル中の任意の遊離のHIV-PIと競合し得る。次いで、このアッセイ混合物を固体表面と合わせて、これに対して結合体を直接または間接的に固定化し得る。このように、この結合体に対して結合した任意のHIV-PRはこの固体表面上に固定化されて、残りのアッセイ混合物から分離され得る。
【００５１】
このタイプの不均一系アッセイの例においては、ビオチンに連結されたHIV-PIアナログが、アッセイ混合物中の遊離のHIV-PRに対する結合についてサンプル中の任意の遊離のHIV-PIと競合し得る。この表面に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを含有する微小粒子はこのアッセイ混合物と合わせられ得、これによってこのビオチンと、結合したアビジンまたはストレプトアビジンとの複合体形成が可能になる。従って、このアナログに結合されたあらゆるHIV-PRがこの微小粒子上に固定化される。同様に、この表面に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを有する静止している固相は、このアッセイ混合物と合わされ得、これによって、ビオチンと、アビジンまたはストレプトアビジンとの複合体形成を通じてHIV-PRが固定化される。次いで、標準的な不均一系アッセイ技術を用いて、固相に結合しないサンプルの構成要素（これは、遊離のHIV-PIによって競合的に阻害されたあらゆるHIV-PRを含む）が除去される。HIV−PIアナログが標識に連結される場合、単離された固相は分光学的技術を用いて分析され得る。HIV-PIアナログが標識に連結されない場合、単離された固相は、分光学的分析を提供するために、標識された抗HIVプロテアーゼ抗体と接触され得る。遊離のHIV−PRはまた、例えば、分光学的な標識、または電気化学発光標識を含むように、アッセイの前に改変されてもよい。例えば、ルテニウムビプリジル（bypridyl）部分に連結されたHIV-PRは、ビオチンおよびHIV-PIアナログを含む結合体との相互作用によって、ストレプトアビジンを含む電極表面に結合されてもよい。次いで、この電極は分離され、トリプロピルアミンで処理され、そして電気化学発光分析に用いられ得る。
【００５２】
好ましくは、HIV-PIについての均一系アッセイおよび不均一系アッセイの両方とも、迅速な臨床分析を提供するために、市販の自動化された分光学的分析器で実施され得る。現在利用可能な自動化された分光学的分析器としては、COBAS/HITACHI、およびCOBASINTEGRA（ROCHE DIAGNOSTICS SYSTEMS，Indianapolis）が挙げられる。一旦、分光学的分析器を目的の１つ以上のHIV-PIについて較正すれば、未知濃度の１つ以上のHIV-PIを有するサンプルを分析することが可能であり、得られた分光学的シグナルは、サンプル中の１又は複数のHIV-PIの濃度と相関し得る。分光学的な分析器としては、UV（紫外）可視分光光度計、蛍光光度計、照度計、およびNMR装置が挙げられる。好ましくは、サンプル中の１又は複数のHIV-PIの測定された濃度は、較正のために用いた最低濃度と最高濃度の間の値を有する。
【００５３】
本発明の方法は、生物学的サンプル中のHIV-PIを定量するために用いられ得る。生物学的サンプルとしては、生物体由来の液体サンプル、例えば、尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、排泄物、喀痰、脳脊髄液、涙液、粘液などが挙げられる。このような液体は典型的には、水分および目的のHIV-PIに加えて種々の成分を含む。この種々の成分としては、種々のペプチド、脂質、塩、ならびに他の化合物、および／または抗体が挙げられる。これらの無関係な構成要素は、HIV-PRと、結合体およびHIV-PIのいずれかまたは両方との間の相互作用を妨害し得る。例えば、この結合体、および／またはHIV-PIは、１つ以上の無関係な構成要素に吸着するか、またはそれと反応し得る。HIV-PRはまた、この液体中の他のペプチドによって非特異的に阻害され得る。体液のアッセイにおける妨害の可能性を考慮すれば、HIV-PIがレセプターとしてのHIV-PRの使用によって生物学的サンプル中で定量され得ることは驚くべきことであり、かつ予想されないことである。
【００５４】
従って、本発明の方法は、治療用量が投与された患者において、HIVプロテアーゼインヒビター化合物のレベルをモニターするために用いられ得る。HIVプロテアーゼインヒビター化合物のレベルの評価、および陽性症状または陰性症状に対する相関を用いて、AIDS患者の処置を変更することができる。HIVプロテアーゼインヒビター化合物の測定はまた、このような化合物の有効性、またはこのような化合物の併用（組み合わせ）の有効性を評価するために用いられ得る。本発明の方法はまた、患者における抗HIVプロテアーゼ抗体のレベルをモニタリングするために用いられ得る。抗体の存在の決定は、HIVによる感染を診断するのに有益であり得る。そして抗体のレベルの決定はウイルスに対する患者の応答、または抗ウイルス療法に対する患者の応答を評価するのに有益であり得る。
【００５５】
本発明の方法の使用は、HIV-PIの濃度を測定するための試験キットを提供することによって容易にされ得る。例えば、試験キットは、表面に結合したHIV-PRを含有する微小粒子およびHIV-PRについての結合体を、包装された組み合わせとして備え得る。他の例では、試験キットは、固体表面に結合したHIV-PRを含む静止している固相、例えば、マイクロタイタープレートまたはキュベット、およびHIV-PRについての結合体を、包装された組み合わせとして備え得る。好ましくは、結合したHIV-PRを含む固相は、特に競合アッセイ形式では、結合体とは別に包装される。このキットの結合体の構成要素は、液体形態であっても、凍結乾燥形態であってもよい。好ましくは、この成分は、試薬の割合が、この方法およびアッセイの実質的な最適化をもたらすような量で提供される。このキットはまた、既知の量のHIV-PIを含有する１つ以上の標準物質（calibrators）を備えてもよい。このキットはまた、本発明の方法を実行するための説明書を備えてもよい。例えば、このキットは、結合したHIV-PR、および結合体と、生物学的サンプルとを組み合わせ、かつこのアッセイ混合物から検出可能シグナルを測定するための説明書を備えてもよい。この説明書はまた、サンプル中のHIV-PIの濃度の簡便な算出を可能にする適切な式を提供し得る。
【００５６】
この試験キットは、特定の目的について最適化され得る。例えば、固定化されたHIV-PRの量、ならびに結合体のタイプおよび量は、HIV感染の診断のために抗HIVプロテアーゼ抗体に対する最適の感度を提供するように変化されてもよい。他の例では、結合されたHIV-PRの量、ならびに結合体のタイプおよび量は、１つの特定のHIVプロテアーゼインヒビター化合物に対して最適の感度を提供するように変化されてもよい。なお別の例において、結合されたHIV-PRの量、ならびに結合体のタイプおよび量は、HIVプロテアーゼインヒビター化合物の組み合わせに対して最適の感度を提供するように変化され得、これによってこの化合物の個々の濃度が測定され得る。なお他の例において、結合されたHIV-PRの量、ならびに結合体のタイプおよび量は、HIVプロテアーゼ化合物の代謝物に対して最適の感度を提供するように変化されてもよい。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例は例示の目的で提供されるものであって、本発明の範囲を限定すると理解されるべきではない。
【００５８】
（材料）
酵素であるHIV-1プロテアーゼ（1ミリリットルあたり0.65ミリグラム（mg/mL）、1ミリグラムあたり16国際単位（IU/mg））を、BACHEM AMERICAS（King of Prussia, PA）から入手した。
【００５９】
実施例１−結合体合成
アンプレナビルアナログを含有するHIV-PI結合体を、本明細書において参照により組み込まれる、2002年7月10日提出の同時係属特許出願第10/192,052号に記載される通り調製した。
【００６０】
1．  N-（スクシンイミド−オキシカルボニル−ブチリル）−アンプレナビルの合成
アンプレナビル（0.1517g）、およびスクシンイミド−オキシカルボニルブチリルクロライド（0.0817g）を、無水ジメチルホルムアミド（DMF）（3mL）中、５０°Cで一晩撹拌した。その混合物を、減圧下で乾燥するまでエバポレートして、シリカゲルクロマトグラフィー（１５%テトラヒドロフラン（THF）を含有する酢酸エチル溶出液）によって直接精製して、白色固体としてN-（スクシンイミド−オキシカルボニル−ブチリル）−アンプレナビルを得た（0.1395g、61%）。質量分析はM+Na 739.2。スペクトルデータ（1H-NMR）は、アニリン窒素での機能化に適合した。
【００６１】
2．  N-（スクシンイミジル−オキシカルボニル−プロピルアミノ−coグリシル−グリシル−グルタリル）−アンプレナビルの合成
（ａ）N-（スクシンイミド−オキシカルボニル−ブチリル）−アンプレナビル（131.5mg）、およびグリシル−グリシル−4−アミノ酪酸（43.4mg，Bachem California Inc., CA）を、THF（5mL）に含有される25%ホウ酸塩水溶液（pH10）中で7時間撹拌した。その混合物を、減圧下で乾燥するまでエバポレートして、分取逆相HPLC（0.1%トリフルオロ酢酸を含有する45%アセトニトリル−水）によって直接精製して、白色固体としてN-（3−カルボキシプロピルアミノ−coグリシル−グリシル−グルタリル）−アンプレナビルを得た（98.2mg、65%）。質量分析はM+H 817.4。
【００６２】
（ｂ）N-（3−カルボキシプロピルアミノ−coグリシル−グリシル−グルタリル）−アンプレナビル（40.9mg）、N-ヒドロキシスクシンイミド（11.5mg）、およびエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（19.2mg）を、20%無水DMFを含有する塩化メチレン（2.5mL）中で５時間、撹拌した。その混合物を、減圧下で乾燥するまでエバポレートして、シリカゲルクロマトグラフィー（12%メタノールを含有するクロロホルム溶出液）によって直接精製して、白色泡状物としてN-（スクシンイミジル−オキシカルボニル−プロピルアミノ−coグリシル−グリシル−グルタリル）−アンプレナビルを得た（37.9mg、83%）。質量分析はM+H 938.4。
【００６３】
実施例２−アンプレナビル試薬の調製
1．  結合体調製
結合体調製において用いたAPV誘導体は、以下の構造を有するN-（スクシンイミジル−オキシカルボニル−プロピルアミノ−コ−グリシル−グリシル−グルタリル）−アンプレナビルであった。
【００６４】
【化１】
2004147655.tif 000002
【００６５】
キャリアであるアミノデキストラン（AMD; MW 40kDa、1分子あたり5.7アミン）のストック溶液を、80mgのAMDを4mLのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解することにより、最終濃度20mg/mLに調製した。20mg/mLのAPV誘導体のストック溶液を、22mgのAPV誘導体を1.1mLのDMSOに溶解することにより調製した。0.183mLのAPV誘導体のストック溶液（AMDに対するAPV誘導体のモル比が4:1）、または0.366mLのAPV誘導体のストック溶液（AMDに対するAPV誘導体のモル比が8:1）を、撹拌しながら、室温で2mLのAMDストック溶液に滴下することにより、凍結乾燥した生成物を調製した。次いで、この反応混合物を室温で２４時間撹拌させた。この反応溶液を次に、80%、60%、40%、20%のDMSO、および脱イオン水に対して透析した。透析した溶液を凍結乾燥し、次いで-20°Cに保持した。
【００６６】
4mLの20mMリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）（pH7.2）中に2mgの凍結乾燥した生成物を溶解することにより、0.5mg/mLの結合体のストック溶液を調製した。同じ緩衝液に、最終容積2mLで2倍ごとの段階希釈を行い、0.25mg/mLおよび0.125mg/mLの濃度を有する結合体溶液を得た。同じ濃度のストック溶液、および段階希釈をAMDについて行った。較正用ブランクとして、対応する濃度でAMD溶液を用いて、種々の濃度の結合体について、264nmでの吸光度測定値を得た。負荷（load）および平均負荷のデータおよび算出結果を表１に示す。
【００６７】
【表１】
2004147655.tif 000003
【００６８】
2．  微小粒子試薬調製
Ａ）ラテックス微小粒子の前洗浄
5mLの10%固体のカルボン酸修飾ラテックス微小粒子懸濁液（0.198mm、41平方オングストロームの駐留面積（parking area）、SERADYN, INC.（Indianapolis, IN）製）を、脱イオン水を用いて1%固体に希釈した。この懸濁液を4°Cで、1時間、32,600×gで遠心分離した。そのペレットを保存して、脱イオン水中での超音波処理によって再懸濁させた。その懸濁液を、4°Cで、1時間、32,600×gで遠心分離した。そのペレットを保存して、50mMの2-（N-モルホリノ）−エタンスルホン酸（MES）（pH5.5）中での超音波処理により再懸濁させた。そのラテックス微小粒子を4°Cで保管した。
【００６９】
B）ラテックス微小粒子上へのHIV-PRの吸着
0.33mLの50mM MES（pH5.5）、および0.33mLの前洗浄した1.18%固体のラテックス懸濁液を、撹拌しながら、1.7mLの微量遠心分離管に添加し、続いて0.33mLの0.3mg/mL HIV-1 PR（0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）、10%（v/v）グリセロール、および5%（v/v）エチレングリコール中で提供される）を添加した。この反応溶液を十分混合して、4°Cで一晩インキュベートさせた。翌日、この混合物を、4°Cで、1時間、32,600×gで遠心分離した。そのペレットを保存して、0.5mLの50mM MES（pH5.5）中での超音波処理によって再懸濁させた。0.5mLの2%ウシ血清アルブミン（BSA）（50mM MES（pH5.5）、0.09% NaN3中に新たに溶解した）を、この再懸濁した溶液に添加した。この溶液を十分混合して、4°Cで一晩インキュベートした。翌日、この混合物を、4°Cで、1時間、32,600×gで遠心分離した。そのペレットを保存して、1mLのHIV-PRアッセイ緩衝液（50mM酢酸ナトリウム（NaOAc）、（pH4.9）、200mM塩化ナトリウム（NaCl）、5mMジチオスレイトール（DTT）、10%（v/v）グリセロール）中での超音波処理によって再懸濁させた。次に、この混合物を、4°Cで、1時間、32,600×gで遠心分離した。そのペレットを保存して、上記のように、HIV-PRアッセイ緩衝液を用いて洗浄した。最終洗浄後、そのペレットを、1mLのHIV-PRアッセイ緩衝液中に再懸濁させた。最後に、ROCHE COBAS MIRA（ROCHE DIAGNOSTICS, Indianapolis, IN）での、5つの異なる波長（340、405、500、550、および600nm）での標準曲線に対する、ラテックス微小粒子の比較によって、ラテックス微小粒子の最終濃度を決定した。
【００７０】
実施例３−混合体結合の分析
上記の通り調製したラテックス微小粒子試薬を、HIV-PRアッセイ緩衝液を用いて、0.08%固体のラテックス懸濁液に希釈した。９つの異なる濃度（0、0.4、0.8、1、2、3、4、5、6mg/mL）の2.15:1、および3.75:1のAPV-AMD結合体を、各々、HIV-PRアッセイ緩衝液、および2.5%ポリアクリル酸（PAA）と混合した。ROCHE ZERO CALIBRATOR（ROCHE DIAGNOSTICS、Indianapolis，IN）（正常ヒト血清）を、血清サンプルとして用いた。図1および2は、それぞれ、3.75:1、および2.15:1の結合体について得られた結果のグラフである。これらの凝集試験は、ROCHE COBAS MIRAで実行した。ROCHE COBAS MIRAでのアッセイパラメータを、表2に示す。
【００７１】
【表２】
2004147655.tif 000004
【００７２】
実施例４−アンプレナビルについての較正曲線の作成
1mg/mLのAPVのストック溶液を、1mLのDMSOに1mgのAPVを溶解することによって調製した。APVストックを、ROCHE ZERO CALIBRATOR内にスパイク（spiked）して、0.5、1.5、2.5、3.5、および5mg/mLの濃度で、一連の血清サンプルを得た。実施例1に記載のように微小粒子試薬を調製した。この結合体試薬は、HIV-PRアッセイ緩衝液、および2.5%PAA中に、5mg/mLの結合体APV:AMD（3.75:1）を含んだ。正常ヒト血清中で調製した種々の濃度のAPVを用いてROCHE COBAS MIRA上で凝集阻害／置換試験を実施した。ROCHE COBAS MIRAについて用いたアッセイパラメータは、実施例2におけるパラメータと同じである。種々の濃度のAPVでの微小粒子凝集によって測定された競合阻害アッセイの結果を図3に示す。
【００７３】
実施例５−対照被験体におけるHIV-PIレベルの決定
結合体、および微小粒子に結合したHIV-PRを含むストック溶液を、実施例１に記載の通り調製する。プロテアーゼインヒビター（硫酸インジナビル、メシル酸ネルフィナビル、リトナビル、およびサキナビル）を含有するストック溶液を、Remmel等に記載の通り、メタノール中で調製する。最終濃度範囲が、インディナビルについて0.05〜19.4mg/ml、ネルフィナビルについて0.02〜8.6mg/ml、リトナビルについて0.05〜20.0mg/ml、そしてサキナビルについて0.02〜8.8mg/mlになるように、ストック溶液からの希釈によって、異なる較正溶液を調製する（Remmel等）。品質管理ストック溶液を、メタノール中で別々に調製した。血清サンプルまたは血漿サンプルを、健康なヒトボランティアから入手し、次いでHIVプロテアーゼインヒビターのストック溶液の一部で補充する。次いで、HIV-PIを用いて補充したこれらのサンプルを、HIV-PRおよび結合体を有する微小粒子溶液と共にインキュベートする。血清サンプルまたは血漿サンプル中のHIV-PIの微小粒子凝集をモニタリングすることにより、プロテアーゼインヒビターの濃度を確認する。凝集に由来する微小粒子サイズの増大に起因して増大した吸光度を、分光光度計によって測定する。
【００７４】
HIVプロテアーゼインヒビターの濃度は、測定された吸光度の低下に対して反比例するので、血清または血漿におけるプロテアーゼインヒビターの濃度が算出される。
【００７５】
実施例６−AIDS患者におけるHIV-PIレベルの決定
結合体、および微小粒子に結合したHIV PRを含有するストック溶液を、実施例１に記載の通り調製する。経口用量のプロテアーゼインヒビター（HIV-PI）での処置の８時間後に、AIDS患者から血清サンプルまたは血漿サンプルを得る。次いで、AIDS患者由来の血清サンプルまたは血漿サンプルを、HIV-PRおよび結合体を含有する微小粒子溶液と共にインキュベートする。そして血清サンプルまたは血漿サンプル中のHIV-PIの微小粒子凝集を測定することにより、HIV-PIの濃度を確認する。凝集に由来する微小粒子サイズの増大に起因して増大した吸光度を、分光光度計によって測定する。
【００７６】
HIVプロテアーゼインヒビターの濃度は測定された吸光度の低下に対して反比例するので、血清または血漿におけるプロテアーゼインヒビターの濃度が算出される。
【００７７】
実施例７−生物学的サンプルにおける抗HIVプロテアーゼ抗体レベルの決定
結合体、および微小粒子に結合したHIV PRを含むストック溶液を、実施例1に記載の通り調製する。AIDSの診断から1年以内のAIDS患者から、血清サンプルまたは血漿サンプルを得て、次にこのサンプルを、HIV PRを含有する微小粒子溶液および結合体とともにインキュベートする。そして血清サンプルまたは血漿サンプル中のHIV-PIの微小粒子凝集を測定することにより、HIV-PIの濃度を確認する。凝集に由来する微小粒子サイズの増大に起因して増大した吸光度を、分光光度計によって測定する。
【００７８】
抗HIVプロテアーゼ抗体の濃度は測定された吸光度の低下に対して反比例するので、血清または血漿における抗HIVプロテアーゼ抗体の濃度が算出される。
【００７９】
本発明は、その特定の例示的な実施形態を参照して記載され、かつ例示されているが、それらの例示的実施形態に本発明が限定されるとは解釈されない。添付の特許請求の範囲によって規定されるような、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、バリエーションおよび改変がなされ得ることを、当業者は認識する。従って、このようなバリエーションおよび改変の全ては、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内におさまるように、本発明内に包含されると解釈される。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明により、臨床的状況下で、現在利用可能な分析的機器において容易にかつ迅速に実行され得るHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法、アッセイ、およびキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、1アミノデキストラン当たり平均3.75のアンプレナビルアナログ部分を含有するアンプレナビル／アミノデキストラン結合体の濃度の関数としての吸光度のグラフである。
【図２】図２は、1アミノデキストラン当たり平均2.15のアンプレナビルアナログ部分を含有するアンプレナビル／アミノデキストラン結合体の濃度の関数としての吸光度のグラフである。
【図３】図３は、図1の結合体を含む競合アッセイを用いる、正常なヒト血清中の種々の濃度における、アンプレナビルの濃度の関数としての吸光度のグラフである。
【図１】
2004147655.tif 000005
【図２】
2004147655.tif 000006
【図３】
2004147655.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月26日(2003.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HIVプロテアーゼ、HIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有すると疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が検出可能な複合体を形成する；検出可能な複合体の量を測定する工程；ならびに検出可能な複合体の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法。 
【請求項２】
HIVプロテアーゼ、キャリアおよび該キャリアに連結された少なくとも2つのHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有すると疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼが微小粒子の表面上に固定化されたものであり、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に凝集を受け、かつサンプルがヒト血清またはヒト血漿である；凝集を測定する工程；ならびに凝集の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法。
【請求項３】
少なくとも2つのHIVプロテアーゼを含む多価キャリア、微小粒子およびHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有することが疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に凝集を受け、かつサンプルがヒト血清またはヒト血漿である；凝集を測定する工程；ならびに凝集の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法。
【請求項４】
HIVプロテアーゼ、蛍光標識および該標識に連結されたHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有することが疑われるサンプルを合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に検出可能な複合体を形成し、かつサンプルがヒト血清またはヒト血漿である；蛍光偏光における変化をモニタリングすることにより検出可能な複合体の量を測定する工程；ならびに検出可能な複合体の量を、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための方法。
【請求項５】
生物体に対してある用量のHIVプロテアーゼインヒビターを投与する工程；生物体から液体サンプルを得る工程；サンプルを、HIVプロテアーゼ、およびHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体と合わせる工程、ここで、HIVプロテアーゼおよび結合体が共に検出可能な複合体を形成する；サンプル中における検出可能な複合体の量を測定する工程；ならびに検出可能な複合体の量を、生物体中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に対して関連付ける工程を含む、生物体におけるHIVプロテアーゼインヒビターの濃度をモニタリングするための方法。
【請求項６】
表面を備える粒子と、該粒子の表面上に固定化されたHIVプロテアーゼとを含み、ここで、HIVプロテアーゼがHIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体と共に検出可能な複合体を形成する、請求項１に記載の方法に使用され得る、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するための試薬。 
【請求項７】
HIVプロテアーゼと、HIVプロテアーゼインヒビターアナログを含む結合体とを含む、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量するためのキット。