(57)【要約】【課題】物質のホルモン作用に関して、信頼性があり、感度が高く、簡単で廉価かつ迅速に判断を下すことのできる方法を提供する。【解決手段】物質のホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用を検査するための方法。ａ）２つのベクターで形質転換した細胞を物質に暴露し、一方のベクターが核内受容体タンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含み、他方のベクターがコモジュレーターＦＯＸＧ１Ｃまたはその断片をコードするＤＮＡを含んでおり、ｂ）コモジュレーターまたはその断片の存在下で核内受容体またはその断片が誘発する転写活性を測定し、および／または物質が受容体またはその断片とコモジュレーターまたはその断片との相互作用に与える影響を、タンパク質・タンパク質の相互作用またはタンパク質・タンパク質・ＤＮＡの相互作用により測定するようにした。さらに、アンドロゲン受容体とＦＯＸＧ１Ｃとの間のコモジュレーション機構の障害を規定する。【選択図】　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質のホルモン作用、　特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用を検査するための方法であって、
ａ）２つのベクターで形質転換した細胞を物質に暴露し、しかも一方のベクターが核内受容体タンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含み、他方のベクターがコモジュレーターＦＯＸＧ１Ｃまたはその断片をコードするＤＮＡを含んでおり、
ｂ）コモジュレーターまたはその断片の存在下で核内受容体またはその断片が誘発する転写活性を測定し、および／または物質が受容体またはその断片とコモジュレーターまたはその断片との相互作用に与える影響を、タンパク質・タンパク質の相互作用またはタンパク質・タンパク質・ＤＮＡの相互作用により測定するようにした、物質のホルモン作用を検査するための方法。
【請求項２】
コモジュレーターの断片が、ＦＯＸＧ１Ｃのアミノ酸１７５〜４８９を有している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核内受容体を、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体Ａ、プロゲステロン受容体Ｂ、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、ビタミンＤ受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体およびオーファン受容体の中から選択するようにした、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
細胞が確立された細胞株および／または真核細胞であることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
真核細胞を、前立腺細胞、神経細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、血球、骨芽細胞、砕骨細胞、肝細胞、上皮細胞または筋肉細胞の中から選択するようにした、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが真核ベクターである、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
アンドロゲン受容体とＦＯＸＧ１Ｃとの間のコモジュレーションの障害を規定するための方法であって、ＦＯＸＧ１Ｃまたはその断片および／またはアンドロゲン受容体またはその断片の濃度を測定するようにした方法。
【請求項８】
濃度測定が、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡテスト、免疫染色、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、ＤＮＡチップまたはタンパク質チップによって行われることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、物質のホルモン作用を検査するための方法、およびアンドロゲン受容体とコアクチベーターＦｏｒｋｈｅａｄ　Ｂｏｘ　Ｇ１Ｃ（ＦＯＸＧ１Ｃ）との間のコモジュレーション機構の障害を規定するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
物質が製薬目的に適しているか判定する際、当該物質がホルモン作用、特にアンドロゲン活性または抗アンドロゲン活性を有していないか調べる方法が一般的に用いられている。薬理作用のある物質を投与するに当たって、多くの場合に当該物質のホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用に関する知見が重要となる。なぜならば、これらの作用は患者に好ましくない副作用を誘発する恐れがあるからである。物質のホルモン作用を調べるためには、特にホルモン受容体を結合して、それらの転写活動を活性化する、物質の能力を測定する方法が用いられる。
【０００３】
しかし、物質のホルモン作用に関する知見は、可能な医薬物質においてだけでなく、非医薬物質においても重要である。なぜならば、環境中に存在している多くの物質について、一部の住民の間でアンドロゲン活性もしくは抗アンドロゲン活性またはエストロゲン活性もしくは抗エストロゲン活性を有する可能性が推定されているからである。その結果として好ましくない有害な作用が引き起こされる恐れがある。
【０００４】
それゆえ、物質のホルモン作用に関して、信頼性があり、感度が高く、簡単で廉価かつ迅速に判断を下すことのできる方法が非常に強く求められている。従来公知の方法では、この必要性を満たすことができない。
【非特許文献１】
Ｂｅａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００，　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．　Ｕｐｄａｔｅ，　６，　２２５−２３６
【非特許文献２】
Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ　＆　Ｅｖａｎｓ，　１９９５；Ｃｅｌｌ，　８３，　８４１−８５０
【非特許文献３】
Ｒｏｂｙｒ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００，　Ｍｏｌ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，　１４，　３２９−３４７
【非特許文献４】
Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　Ｊ．　Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ａｎｄ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　６９，　３０７−３１３
【非特許文献５】
ＭｃＫｅｎｎａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　Ｅｎｄｏｃｒ．　Ｒｅｖ．，　２０，　３２１−３４７
【非特許文献６】
Ｄｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８，　Ｍｏｌ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，　１２，　３０２−３１３
【非特許文献７】
Ｌｉ＆Ｖｏｇｔ，　１９９３，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　９０，　４４９０−４４９４
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、物質のホルモン作用に関して、信頼性があり、感度が高く、簡単で廉価かつ迅速に判断を下すことのできる方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は本発明により驚くべきことに、物質のホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用を検査するための方法であって、ａ）２つのベクターで形質転換した細胞を物質に暴露し、しかも一方のベクターが核内受容体タンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含み、他方のベクターがコモジュレーターＦＯＸＧ１Ｃまたはその断片をコードするＤＮＡを含んでおり、ｂ）コモジュレーターまたはその断片の存在下で核内受容体またはその断片が誘発する転写活性を測定し、および／または物質が受容体またはその断片とコモジュレーターまたはその断片との相互作用に与える影響を、タンパク質・タンパク質の相互作用またはタンパク質・タンパク質・ＤＮＡの相互作用により測定するようにした、物質のホルモン作用を検査するための方法によって解決される。
【０００７】
本発明の方法によって驚くべきことに、たとえば環境に関連して、または薬理学的に関心の対象となり得る物質が、ホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用を発揮するか否かについて、高い信頼性と感度をもって、簡単で廉価かつ迅速にテストできることが分かった。
【０００８】
本発明による方法ではベクターで形質転換された細胞を使用するが、ベクターは核内受容体タンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含んでいる。
５０種類以上のタンパク質が属している核内受容体（ＮＲｓ）のスーパーファミリーは、それぞれの標的遺伝子の転写を、特異的なリガンド、たとえばホルモンに対する反応として制御する、類似した転写因子のグループである。このファミリーは、特定の特徴、たとえば二量化状態、リガンドの種類またはＤＮＡ応答配列の構造によって幾つかのサブファミリーに区分できる（Ｂｅａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００，　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．　Ｕｐｄａｔｅ，６，２２５−２３６　）。ＮＲｓの特徴は機能ドメイン（Ａ〜Ｆで表示）の構造が、自律的な構成的活性化機能（ＡＦ−１）を有する、著しく可変的で保存性の低いＮ末端可変領域と、特異的なＤＮＡ応答配列の認識を受け持ち、２つの亜鉛フィンガーモチーフからなる保存性の高い結合ドメイン（ＤＢＤ）と、可変なヒンジドメインと、そして二量化およびリガンドに依存したトランス活性化機能（ＡＦ−２）を有する、保存された多機能Ｃ末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）と一致していることである。この後に最も遠位のＣ末端領域が続くが、その機能は知られておらず、ＰＲ（プロゲステロン受容体）、ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体）およびＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）などの受容体には欠如している（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ　＆　Ｅｖａｎｓ，　１９９５；　Ｃｅｌｌ，８３，８４１−８５０；Ｒｏｂｙｒ　ｅｔ　ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１４，３２９−３４７　）。若干のＮＲｓ（たとえばアンドロゲン受容体（ＡＲ））　について、Ｎ末端領域は、Ｃ末端領域と相互作用できることが証明された（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ａｎｄ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９，．３０７−３１３）。ステロイドホルモン受容体、たとえばエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ）およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）は、プレグネノロンから導かれるステロイドリガンド、たとえばプロゲスチン、エストロゲン、グルココルチコイドおよびミネラルコルチコイドおよびアンドロゲンを結合する。リガンド結合は受容体を活性化し、相応の標的遺伝子の発現を制御する。
【０００９】
上述したように、本発明の方法の段階ａ）で使用する細胞は、さらにコモジュレーターＦＯＸＧ１Ｃまたはその断片をコードするＤＮＡを含むベクターを有している。
【００１０】
いわゆるコモジュレーターは、遺伝子転写の活性化（コアクチベーター）もしくは抑制（コリプレッサー）の際に、転写開始複合体とＮＲｓとの間の橋渡し分子として働くタンパク質のクラスである（ＭｃＫｅｎｎａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，　２０，３２１−３４７）。コアクチベーターは受容体機能を強化し、アゴニストの存在下でＮＲｓの活性化ドメインと直接相互作用できなければならない。それはまた基本転写装置とも相互作用しなければならず、最終的にそれ自身で基本転写活性を強化してはならない。ほとんどのコモジュレーターは１つ以上のＬＸＸＬＬモチーフ（ＮＲボックス）を用いてＮＲｓのＡＦ−２ドメインと相互作用するが、他のＮＲ領域と相互作用する若干のコモジュレーターも記載されている（Ｄｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１２，３０２−３１３　）。さらに、類似の仕方で複数の種類のＮＲｓと相互作用する多くのコモジュレーターが同定されており、それぞれのコモジュレーターの特異性を検査することが望ましい。
【００１１】
本発明による方法において、ＦＯＸＧ１Ｃと呼ぶコモジュレーターまたはアミノ酸１７５〜４８９を有するＦＯＸＧ１Ｃの断片を使用する。ｃＤＮＡ配列が登録され（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＸＭ＿００７２３３　）、４８９アミノ酸がコードされた（Ｌｉ＆Ｖｏｇｔ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，４４９０−４４９４　）。ＦＯＸＧ１Ｃのアミノ酸１７５〜４８９をコードするプラスミドを含んでいるＤＨ５α大腸菌は、２００２年６月５日、ドイツ微生物・培地コレクションにＤＳＭ１５０４３の番号で登録された。
【００１２】
これらのタンパク質を使用すると、本発明による方法は特に高い信頼性と感度で、簡単かつ廉価にして迅速に実施できる。さらにＦＯＸＧ１Ｃ断片、特にアミノ酸１７５〜４８９を有するＦＯＸＧ１Ｃの断片は、取り扱いが簡単で、クローン化できるが、それでもなおＦＯＸＧ１Ｃの機能的性質を持つという長所を有する。
【００１３】
ＦＯＸＧ１Ｃとは、ヒト・アンドロゲン受容体およびその他の核内受容体に対するコアクチベーターであり、アンドロゲンと受容体との相互作用を強める。ＦＯＸＧ１Ｃの配列はすでにＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＸＭ＿００７２３３　に登録されている。しかしここには核内受容体、特にＡＲとの相互作用は記述されてない。本発明は、核内受容体、特にＡＲとＦＯＸＧ１Ｃとの間に相互作用が存在し、さらにＡＲに媒介されたトランス活性化の強化を確認できたという驚くべき認識に基づいている。ＦＯＸＧ１Ｃは、ステロイドを核内受容体に結合した後、転写作用を強化または抑制し、さらには以前ホルモン作用が認められなかった分子への核内受容体の結合および活性化を促進することによって、コメディエーターとして機能するタンパク質である。
【００１４】
タンパク質ＦＯＸＧ１Ｃはアンドロゲン受容体およびその他の核内受容体、たとえばエストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β、プロゲステロン受容体Ａ、プロゲステロン受容体Ｂ、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、ビタミンＤ受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体およびオーファン受容体に対するコアクチベーターである。本発明による方法において、これらの受容体を使用することが好ましい。なぜならば、それによって、上述した本発明による方法の利点を特に好都合に達成できるからである。
【００１５】
本発明による方法では、上記のタンパク質の断片をコードするベクターも使用できる。上記のタンパク質に関連した「断片」という表現は、全長がタンパク質よりも短い１つ以上のアミノ酸を有しながら、なおも核内受容体またはコモジュレーターの機能的性質を有しているタンパク質を意味する。
【００１６】
上述したように、本発明による方法において、段階ａ）では特殊なタンパク質をコードする２つのベクターで形質転換した細胞を使用する。したがってこれらの細胞は、２種類のタンパク質を発現することができる。
【００１７】
細胞が確立された細胞株および／または真核細胞、特に前立腺細胞、神経細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、血球、骨芽細胞、砕骨細胞、肝細胞、上皮細胞または筋肉細胞であることが好ましい。本発明による方法は、確立された細胞株により特に廉価かつ迅速に実施できる。本発明による方法で、真核細胞、特に上述した真核細胞を使用すると、好都合にも非常に信憑性の高い結果が得られる。
【００１８】
本発明による方法の好ましい実施形態において、真核発現ベクター、たとえばｐＣＭＸまたはｐＳＧ５を使用する。これらのベクターを使用すると、特に上記の確立された細胞株および／または真核細胞と組み合わせると、本発明による方法は特に有利かつ迅速に実施でき、非常に信憑性の高い結果が得られる。
【００１９】
当業者にとって、上記のタンパク質をコードするＤＮＡをベクターに挿入し、次いでこのベクターを細胞内に入れ、こうして得られた細胞を適当な培養条件のもとで培養し、それによってこれらのタンパク質を発現できるようにする方法およびそれに必要な材料は公知である。
【００２０】
本発明による段階ｂ）に従い、コモジュレーターまたはその断片の存在下で核内受容体またはその断片が誘発する転写活性を測定できる。これはたとえばレポーター遺伝子の検出によって行うことができる。
【００２１】
レポーター遺伝子とは、他の遺伝子または調節配列と結合して、この配列の活性を証明できるようにした遺伝子または遺伝子断片である。レポーター遺伝子は遺伝子生成物を生むが、それらはたとえば測光法を用いた色反応によって極めて簡単に検出可能である。よく用いられるレポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼに対する遺伝子、アルカリ性ホスファターゼに対する遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼに対する遺伝子、カテコール・ジオキシゲナーゼに対する遺伝子、緑色蛍光タンパク質に対する遺伝子、および細胞を発光させることができる種々のルシフェラーゼ遺伝子である。
【００２２】
このようなレポーター遺伝子も同様にベクター、特に真核発現ベクターによって細胞内に導入できる。レポーター遺伝子をコードするＤＮＡを含んでいるベクターの例は、物質のアンドロゲン作用の測定に用いられるベクターＭＭＴＶルシフェラーゼである。
【００２３】
この場合、ホルモン作用、特にアンドロゲン作用／抗アンドロゲン作用を有する物質は、レポーター遺伝子の活性が増大しているか、または減少しているかによって認識できる。
【００２４】
検査物質が受容体またはその断片とコモジュレーターまたはその断片との相互作用に与える影響の測定は、タンパク質・タンパク質の相互作用を、たとえばツーハイブリッド系、免疫沈降、ＧＳＴプルダウンアッセイ、ＦＲＥＴ分析およびＡＢＣＤアッセイによって規定することによって、およびまたタンパク質・ＤＮＡの相互作用を、たとえばゲル遅延アッセイによって規定することによって行うことができる。
【００２５】
さらに、ＦＯＸＧ１Ｃはアンドロゲン由来疾患の指示薬として非常に効果的に使用できることが分かった。該当するアンドロゲン由来疾患は、たとえば前立腺癌、勃起不全、不妊症、脱毛症、アクネまたは性機能低下、およびアンドロゲン抵抗症候群、たとえば睾丸性女性化症が、リビドー障害、感情障害および認知障害と同じくＡＲとＦＯＸＧ１Ｃとのコモジュレーション機構の欠陥に基づいている。そのような障害を持った患者の場合、ＡＲとＦＯＸＧ１Ｃの相対的濃度を測定する方法が可能である。この場合、測定は体液、体細胞または体組織において体外的に行うと好都合である。これはそれぞれの患者に、両分子の相対量を測定するための定量法を適用することによって可能であり、たとえばＡＲおよびＦＯＸＧ１Ｃに対する抗体、またはそれらのｍＲＮＡに対して核酸プローブを患者に使用できる。この比較量を測定するための幾つかの方法は、当業者に公知である。またこれに適した材料および装置、たとえばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡテスト、免疫染色、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、ＤＮＡチップまたはタンパク質チップも当業者に知られている。さらに、ＦＯＸＧ１Ｃ−ｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲアッセイ用のプローブを構成することも可能であり、これにより特定の患者において正常なＤＮＡ配列の突然変異を検出したり、ノーザンブロットアッセイ用の転写もしくはｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ用のＤＮＡを生成できる。
【００２６】
この場合、ＡＲ対ＦＯＸＧ１Ｃの測定比は、健康体におけるよりも高いか、または低いことがある。健康体における正常値は、たとえば多数の健康な被験者でＡＲ対ＦＯＸＧ１Ｃの比の平均を求めることによって簡単に規定できる。被験患者で求めたＡＲ対ＦＯＸＧ１Ｃの比と正常値とを比較することによって、求めた比の値が正常値よりも高いか低いかを確認できる。
【００２７】
組織中のＦＯＸＧ１Ｃおよび／またはＡＲの濃度は、ばらつきがあり得る。たとえば脳と睾丸ではＦＯＸＧ１Ｃの濃度は非常に高いが、他の器官、たとえば肝臓、心臓、胸腺および前立腺では非常に低いので、評価する際は組織によって濃度が異なることを考慮しなければならない。すなわち検査値と正常値は、同じ組織のものでなければならない。濃度については種の相違もあり得るので、評価の際はこれも考慮しなければならない。
【００２８】
ＡＲとＦＯＸＧ１Ｃとのコモジュレーション機構の欠陥を規定する別の可能性は、ＦＯＸＧ１Ｃの濃度だけを測定することである。この場合、ＦＯＸＧ１Ｃ濃度は少なくともほぼ一定であることが前提となっている。もし正常なＦＯＸＧ１Ｃ濃度よりも低い濃度が測定されたら、ＡＲ対ＦＯＸＧ１Ｃの比が変化したことを意味しており、それはまたコモジュレーション機構に障害があることを示唆するものである。
【００２９】
ＦＯＸＧ１Ｃに特異的なプローブを使って、ＦＯＸＧ１Ｃ発現における変化、ひいてはＡＲとの比を規定することが可能である。そのような変化は、種々の病像で原因に関与しているか、または随伴症状として生じることがある。
【００３０】
ＡＲ／ＦＯＸＧ１Ｃ比のこのような測定は、ＦＯＸＧ１Ｃの検出と特性把握に基づく次のような知見を基礎としている。すなわち、たとえばアンドロゲン抵抗症候群はＡＲ優勢とＦＯＸＧ１Ｃ優勢の平衡状態の障害に起因することがある。ＦＯＸＧ１Ｃが過度に高いと、ＡＲ系の過敏症を招き、通常はアンドロゲン作用を有していない分子に反応することがある。反対に、ＦＯＸＧ１Ｃが欠如しているか、あるいはあらゆるレベルの機能不全の場合にアンドロゲン抵抗を招来する。患者から過度のＦＯＸＧ１Ｃが検出されたら、臨床条件下でそれぞれの患者のＦＯＸＧ１Ｃ力価濃度を下げるために、ダウンレギュレーションのための薬剤、たとえばアンチセンス薬やこれに類似の薬剤を使用すべきであろう。同じことは、ＡＲとＦＯＸＧ１Ｃとの相互作用を抑制することのできる分子によって達成できる。ある患者のＦＯＸＧ１Ｃが不足している場合、それ自体公知の種々の機構を介してＦＯＸＧ１Ｃ−ｃＤＮＡ、ＦＯＸＧ１Ｃタンパク質またはＦＯＸＧ１Ｃ−ＤＮＡを患者に供給することによって、活性ＦＯＸＧ１Ｃの力価濃度を高めることができる。低分子薬剤により、または特異的なＦＯＸＧ１Ｃプロモータータンパク質を用いて自家合成を刺激することによってＦＯＸＧ１Ｃの濃度または活性を高めることも可能である。
【００３１】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
以下の例を用いた説明は本発明を制限するものではない。
例１：
胎児の脳から採取したｃＤＮＡライブラリー（クローンテク社マッチメーカー）と、アミノ酸３２５〜９１９をコードするヒトＡＲ断片をプローブとして使用し（図１）、アンドロゲン１０−８Ｍ　　ＤＨＴの存在下で通常のツーハイブリッド酵母系を用いてスクリーニングを行った。メーカー（クローンテク社）の指示に従い、スクリーニングしたクローンの数は２×１０７であった。独立クローンの数はメーカーの申告によれば、３．５×１０６であった。このうち３００個のポジティブクローンを選別し、βガラクトシダーゼアッセイでテストした結果、４０個がｌａｃＺポジティブクローンであることが確認された。これらのクローンのインサートをＰＣＲによって増幅した。制限断片分析と配列決定により、少なくとも３９種類のクローンを同定した。そのうち１つは１５５３ｂｐ（７３９ｂｐ−２２９２ｂｐ）を含むクローンであった。これはＦＯＸＧ１ＣのＯＲＦ（Ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　Ｆｒａｍｅ）をコードする（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＸＭ＿００７２３３）。
【００３２】
ＦＯＸＧ１Ｃ−ｃＤＮＡ配列の１２５５ｂｐからなる断片（９６３ｂｐ−２２１８ｂｐ）は、ヒト・ノーザンブロットに対するプローブとして用いられた。転写（３．２ｋｂ）は種々の組織で発見された（図２−４）。場合によってノーザンブロットをβアクチン・プローブによってハイブリダイズして、ゲルの統一的な負荷を確証した。
【００３３】
図２−４は、ノーザンブロット分析によりそれ自体公知の仕方で検査したＦＯＸＧ１Ｃの組織分布を示している。種々のヒト組織から単離されたポリＡ＋ＲＮＡ（２μｇ）を、ホルムアルデヒド含有アガロースゲルで分離し、ナイロン膜でブロットして、標識したＦＯＸＧ１Ｃ−ｃＤＮＡ断片（９６３ｂｐ−２２１８ｂｐ）でハイブリダイズした。洗浄後、この膜をフィルムに当て露光してから現像した。図２に見られるように、人間の脳と睾丸ではＦＯＸＧ１Ｃの非常に強い発現が確認されたが、齧歯類（ラットとマウス）ではＦＯＸＧ１Ｃの発現はほぼ脳に限定されていた。さらに、ＦＯＸＧ１Ｃの発現は人間の脳部位によってばらつきが見られる（図３）。図４では１０μｇＲＮＡ（レーン１−３）または０．２μｇポリＡ＋−ＲＮＡ（レーン４−６）をラットの脳からゲル上で分離し、膜に移し、標識したＦＯＸＧ１Ｃ−ｃＤＮＡ断片（９６３ｂｐ−２２１８ｂｐ）でハイブリダイズした。ラットの脳は生後３週間（レーン１と４）、６週間（レーン２と５）および２年（レーン３と６）の動物から採取した。その結果、ＦＯＸＧ１Ｃ遺伝子発現と年齢との間に関係のあることが見いだされた。
【００３４】
図５に見られるように、ＰＣ３−ＡＲｗｔ細胞においてＶｐ１６のトランス活性化ドメインとインフレームで融合したＦＯＸＧ１Ｃ−ｃＤＮＡの一過性トランスフェクションは、ＡＲシグナル活動の強い共役活性化を招いた。そのために、凹部当たり３×１０５の細胞が入る細胞培養シャーレに、ＣＭＸ−Ｖｐ１６における上記構成物０．４３μｇもしくはネガティブ対照群として０．３２μｇＣＭＸ−Ｖｐ１６、またはポジティブ対照群として０．５μｇＳＲＣ１ａ−Ｖｐ１６、対照群プラスミドとして１．０μｇＭＭＴＶルシフェラーゼプラスミドでトランスフェクションし、２４時間後にアンドロゲンとして上記濃度のジヒドロキシテストステロン（ＤＨＴ）で処理した。さらに２４時間後にトランスフェクションされた細胞を収穫し、レポーター遺伝子ルシフェラーゼの活性を測定した。さらに標準化のために全細胞タンパク質量を規定した。トランスフェクションバッチおよび物質濃度当たり、２回の実験と、それぞれ３回の測定を行った。誤差をＳＤで示した。活性は相対的単位で示した。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば、物質のホルモン作用に関して、信頼性があり、感度が高く、簡単で廉価かつ迅速に判断を下すことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アンドロゲンの存在下でＦＯＸＧ１Ｃと相互作用できる、アミノ酸３２５〜９１９に達するアンドロゲン受容体ドメイン（ＡＲ２）を表示したアンドロゲン受容体の概念図。
【図２】種々の異なる組織（ヒトと齧歯類）におけるＦＯＸＧ１Ｃの組織分布を示す図。
【図３】ヒトの種々異なる脳領域におけるＦＯＸＧ１Ｃの組織分布を示す図。
【図４】老ラットと若ラットの脳におけるＦＯＸＧ１Ｃの組織分布を示す図。
【図５】ＰＣ３−ＡＲｗｔ細胞におけるＦＯＸＧ１ＣまたはＳＲＣ−１ａとアンドロゲン受容体との相互作用を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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