(57)【要約】【課題】細胞を培養状態で凍結、融解後マイクロプレート内の細胞を損なうことなく液体交換が可能となり、かつ光学顕微鏡観察及び蛍光顕微鏡観察が可能である培養容器を提供すること。【解決手段】細胞を培養状態で凍結することができる培養容器であって、融解直後の培養液交換に際して細胞が培養面から浮遊除去されないように、培養液が通過できる多孔性構造物を有し、かつ前記多孔性構造物が脱着可能である細胞付培養容器であり、好ましくは多孔性構造物が取っ手を有し容易に取り外し可能である細胞付培養容器。【選択図】  図１
2004222545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養状態で凍結することができる培養容器であって、融解直後の培養液交換に際して細胞が培養面から浮遊除去されないように、培養液が通過できる多孔性構造物を有し、かつ前記多孔性構造物が脱着可能であることを特徴とする細胞付培養容器。
【請求項２】
多孔性構造物が取っ手を有し容易に取り外し可能である請求項１記載の細胞付培養容器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養細胞の利用法ならびに培養細胞の凍結保存と融解再利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
市販の細胞培養用９６ウェルプレートは、化合物の細胞毒性試験等、各種の生物学的試験法に汎用されている。そのウェルの位置、大きさ等が標準化されていることもあって、全自動ロボットにも適用されており、大量に消費されている。この場合、９６ウェルプレートで培養した浮遊性動物細胞はもちろん、足場依存性の付着細胞も広く利用されているものの、長期間に渡って前培養し準備してきた細胞を各試験回ごとに９６ウェルプレートに接種し、本試験に備えなければならないという煩雑さがある。もし、９６ウェルプレートにあらかじめ播種し培養された状態のまま凍結保存可能ならば、都合の良いときに前培養を行い凍結保存しておいて、随時必要な時に融解し本試験に供することができ、格段に便利になると考えられ、既に引用文献１「凍結動物細胞およびその製造法」においては、足場依存性動物細胞を培養基質上で付着培養した状態で凍結保存、融解再利用する方法が記載されている。
【０００３】
また、引用文献２においては引用文献１において問題のあった凍結融解時の足場依存性細胞の剥離を防ぐ方法として、「培養液のみが通過できる蓋または押さえまたは覆いの役割を果たす多孔性構造体により保持されている細胞」の利用が記載されている。
【０００４】
細胞を用いた毒性評価等ではこのような多孔性構造体を持ってなる培養器を用いて酵素などを実施し、反応液を別な容器に移して測定することが可能であるが、最近の細胞アッセイ系では細胞そのものを蛍光色素で染色してＣＣＤカメラで読み込み、その細胞の変異や活性を直接測定する方法が主流となっている。さらに試薬分注などのロボットによる自動化やコンピューターを用いた画像解析の技術向上により２４ウェルプレートや９６ウェルプレートといったマルチウェルプレートでの解析までもが自動で実施することが可能になって来ており、そうした場合に多孔性構造体の存在が邪魔となる場合が数多く見られる。
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３−２６７２６４号公報（第１〜２頁）
【特許文献２】特開２００２−２１８９６７号公報（第１〜２頁、図１）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、創薬やバイオテクノロジー分野などに用いられる培養細胞凍結プレートに関するもので、簡便に効率よく保持でき、試料に液性物質を供給できる容器でありかつ必要に応じて多孔性構造を容易に取り外すことのできる培養容器を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、培養状態で凍結することができる培養容器であって、融解直後の培養液交換に際して細胞が簡単に培養面から浮遊除去されないように、培養液が通過できる蓋または押さえまたは覆いの役割を果たす多孔性構造物を持ち、その多孔性構造物が容易に取り外しできることを特徴とする細胞付の培養容器である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられる容器において最も簡単な形状は、培養状態で凍結することができる培養容器と多孔性構造物の二つの要素で構成されるものである。
まず、細胞培養容器は、組織培養用のマルチウェルプレートとしての特性を必要とする。すなわち、高分子基材からなり、複数個の培養孔（ウェル）を有する形状である。組織培養用マルチウェルプレートはその複雑な形状から基材として成形性に優れたポリスチレンが使用される事が多いが、それに限定するものではない。さらに足場依存性細胞を培養する場合には、その培養表面は、コロナ放電、低温プラズマ等の親水化処理や、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞接着因子の塗布を実施することが望ましい。さらに、ウェル底面の形状は一般的には平坦面だが、半球状や、漏斗状であっても何ら問題は無い。一般的に組織培養用マルチウェルプレートは，プレート寸法、ウェルのサイズや容量といった基本的なサイズは同一であり、特に９６ウェルプレートは汎用性が高く洗浄用の装置や測定機器などプレートサイズに合わせた機器類が豊富であるのでそれに合わせて設計されていることが望ましい。
【０００９】
次に多孔性構造物にも必要な特性がいくつか考えられる。
まず、足場依存性細胞が素通りしないようなポアサイズのメッシュやメンブランで構成される必要がある。ポアサイズに関しては当然、細胞が素通りしない必要があるので細胞の直径の２０μｍ以下である必要があるが、足場依存性細胞は通常、培養状態ではコロニーを形成し集団としてのサイズが単細胞状態と比べ大きくなっている状態なので５０μｍ程度のサイズでも十分である。または、不織布などポアサイズは規定できないが、入り組んだ繊維で構成されている形状のものであればそれも細胞の容易な透過を妨げることが十分に可能である。
【００１０】
さらに、細胞の流出を抑える必要があるが、直接細胞に触れて細胞に圧力がかかる状態では、繊細な細胞組織等がダメージを受ける可能性が非常に高く、上から圧力をかけて押さえることは好ましくない。従って細胞培養容器とその押さえのための多孔性構造体の間にはある程度の間隙が必要である。一般的に生物試料や細胞の最小の単位は細胞の直径の２０μｍと考えられるので最小で２０μｍの隙間が存在すればよく、好ましくは５０μｍから２ｍｍの範囲であることが望ましい。
【００１１】
こうした多孔性構造体としては、９６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートのウェルのサイズにあわせて切断した、もしくは成形した樹脂製のスポンジ状シートや、市販されている不織布ベースのＦｉｂｒｏ−Ｃｅｌ  Ｄｉｓｋ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）が簡便に用いることができる。
【００１２】
こうした多孔性構造物をウェルの底に入れる際に、簡単に除去できるように取っ手をつけておくことや、マルチウェルプレートにすっぽり収まる骨組みを作製しそれに多孔性構造物を取り付ける方法などが考えられる。
多孔性構造物を含む培養容器は、細胞の抑えの必要が無くなった時点で細胞にダメージを与えることなく取り外せるようにしておくことで、光学顕微鏡観察や蛍光顕微鏡観察を可能にすることができる。
【００１３】
【実施例】
（実施例１）
細胞培養用９６ウェルプレート（住友ベークライト製  ＭＳ−８０９６Ｆ）の内側に挿入でき、挿入した場合に外側になる細胞培養用９６ウェルプレートの底面から１００μｍの高さになるように作成したカップ状のポリスチレン成形品の底面部分を直径４ｍｍくりぬき、その部分に細胞培養用フィルターとして市販されているメッシュで構成されたＦｉｂｒａ−Ｃｅｌ  Ｄｅｓｋ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を接着し、放射線滅菌したものを準備した。
接着細胞であるＨｅｐＧ細胞を５ｘ１０５細胞／１ｍＬの濃度で１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地に分散させた細胞分散液を播種した後、先に準備したメッシュを取り付けたカップ状の形成品を取り付け３７℃、５％炭酸ガス条件で培養。翌日プレートごとー８０℃のフリーザーで凍結し、１週間後、取り出して３７℃雰囲気化で解凍、培地交換を行い、そこで除去される細胞を調べた。
【００１４】
（比較例１）
接着細胞であるＨｅｐＧ細胞を５ｘ１０５細胞／１ｍＬの濃度で１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地に分散させた細胞分散液を播種した後、３７℃、５％炭酸ガス条件で培養。翌日プレートごとー８０℃のフリーザーで凍結し、１週間後、取り出して３７℃雰囲気化で解凍、培地交換を行い、そこで除去される細胞を調べた。
【００１５】
結果を表１に示す。
結果より明らかなように、押さえとなる多孔性構造物を備えた実施例１の方がプレート内に残る細胞、すなわち吸引操作によって除去されない細胞が圧倒的に多いことが確認された。
【００１６】
【表１】
2004222545.tif 000003
【００１７】
【発明の効果】
本発明の容器の使用により、細胞を培養状態で凍結、融解後マイクロプレート内の細胞を損なうことなく液体交換が可能となり、簡単に多孔性構造体を取り外すことにより光学顕微鏡観察及び蛍光顕微鏡観察が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細胞付培養容器における培養容器、細胞、多孔性構造体の関係の概略図。
【符号の簡単な説明】
１１  培養容器
１２  細胞
１３  多孔性構造物
１４  取っ手
【図１】
2004222545.tif 000004