(57)【要約】【課題】シミの予防・改善等に寄与する手段を提供することを課題とする。より具体的には、シミの状況を的確に分析する方法を提供すること、さらには、シミに対する効能を有する物質を的確に見いだし、その作用・効能を的確に把握できる効能評価方法が提供することを課題とする。【解決手段】表皮部位の正常部とシミ部とサンプルを採取し、それぞれについて、ＮＴ−３、ＡＤＡＭ９またはＨＢ−ＥＧＦを検出する試験を行い、これらの検出量を指標として、シミの程度、原因、進行状況、改善状況などの様々な状況を分析する。また、評価対象となる物質を、各指標を検出可能な被試験細胞に投与した後、ＮＴ−３、ＡＤＡＭ９またはＨＢ−ＥＧＦを検出する試験を行い、これらの検出量を指標として、評価対象物質のシミに対する効能を評価する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数箇所の表皮部位についてＮＴ−３を検出し、それぞれのＮＴ−３の検出量を指標とし、表皮部位におけるシミの状況を分析する、シミの状況分析方法。
【請求項２】
経時的に表皮部位のＮＴ−３を検出し、それぞれのＮＴ−３の検出量を指標とし、表皮部位におけるシミの状況を分析する、シミの状況分析方法。
【請求項３】
複数箇所の表皮部位についてＡＤＡＭ９を検出し、それぞれのＡＤＡＭ９の検出量を指標とし、表皮部位におけるシミの状況を分析する、シミの状況分析方法。
【請求項４】
経時的に表皮部位のＡＤＡＭ９を検出し、それぞれのＡＤＡＭ９の検出量を指標とし、表皮部位におけるシミの状況を分析する、シミの状況分析方法。
【請求項５】
複数箇所の表皮部位についてＨＢ−ＥＧＦを検出し、それぞれのＨＢ−ＥＧＦの検出量を指標とし、表皮部位におけるシミの状況を分析する、シミの状況分析方法。
【請求項６】
経時的に表皮部位のＨＢ−ＥＧＦを検出し、それぞれのＨＢ−ＥＧＦの検出量を指標とし、表皮部位におけるシミの状況を分析する、シミの状況分析方法。
【請求項７】
被試験細胞に評価対象化合物を投与し、前記被試験細胞におけるＮＴ−３を検出し、ＮＴ−３の検出量を指標として、評価対象化合物のシミに対する効能を評価する、効能評価方法。
【請求項８】
ＮＴ−３を経時的に検出し、検出量の経時変化を指標とする、請求項７に記載の効能評価方法。
【請求項９】
被試験細胞に評価対象化合物を投与し、前記被試験細胞におけるＡＤＡＭ９を検出し、ＡＤＡＭ９の検出量を指標として、評価対象化合物のシミに対する効能を評価する、効能評価方法。
【請求項１０】
ＡＤＡＭ９を経時的に検出し、検出量の経時変化を指標とする、請求項９に記載の効能評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シミの状況を分析する方法、シミに対する効能を評価する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトをはじめとする全ての生体は、回りの環境から影響を受けている。しかし、ほ乳類等の高等動物は、生命を維持するために必要な各器官への環境からの影響を極力小さくするための器官を持っている。それが皮膚であり、特に紫外線等光線に対しての防御として表皮基底層上の色素細胞（メラノサイト）にて合成されるメラニン色素が表皮細胞へ伝達され細胞内の核の上に集まり遺伝情報であるＤＮＡを紫外線による損傷から防御している。従って、メラニン色素は紫外線による防御機構として重要な役割を担っている。メラノサイトでのメラニン生成は、紫外線に直接暴露される以外にも、酸化的刺激や炎症反応により活性化される。メラニン色素が必要以上に過剰産生されると、表皮内または真皮層に沈着して、シミの原因となる。
【０００３】
メラニン色素は上記のように重要な役割を担う一方、メラニン色素の沈着は肌色を黒ずませ、シミに繋がることから美容上は好ましくない場合が多い。このような状況の下、さまざまなシミ改善剤あるいは美白剤等が開発されている。従来のシミ改善剤あるいは美白剤等として用いられている物質にはメラニンの生成を抑制することによりシミの改善等を図るものが多数知られている。
【０００４】
シミの予防法に関しては、紫外線からの防御、メラニン生成の阻害、メラニンの排泄促進などについて研究が進められている（例えば、非特許文献１）。また、多細胞生物における細胞増殖因子としてＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子）の研究などがなされている（例えば、非特許文献２）。また、ＮＴ−３の発現量増加はメラノサイトの増加、集積に作用することを示唆する報告がある（例えば、非特許文献３）。また、ＨＢ−ＥＧＦの発現を誘導して表皮部位のターンオーバーを亢進することについては特許文献１に記載がある。なお、ターンオーバーとは、基底層での細胞分裂から角質層の脱離に至る表皮部位における細胞層の置き換わりのことをいう。
【０００５】
しかし、シミの原因は複雑で多岐にわたると考えられており、シミの生成機構などについて明確に解明されているわけではない。より優れたシミの予防・改善方法あるいは予防・改善剤を開発するためには、シミに関する機構をより詳細に究明することが求められていた。
【０００６】
【特許文献１】
国際公開第０１／４５６９７号パンフレット
【非特許文献１】
シミの予防：現在の美白剤のストラテジー；香粧会誌  Ｖｏｌ．２４Ｎｏ．１（２０００）  ｐ２１−２８
【非特許文献２】
Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ  ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ：  ａ  ｊｕｘｔａｃｒｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：Ｒｙｏ  Ｉｗａｍｏｔｏ，  Ｅｉｓｕｋｅ  Ｍｅｋａｄａ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１（２０００）３３５−３４４
【非特許文献３】
Ｔｈｅ  ｔｒｋ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ，  Ｙａａｒ  ｅｔ．ａｌ  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４  Ｏｃｔ；９４（４）；１５５０−１５６２
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以上のような状況の下、本発明はシミの予防・改善等に寄与する手段を提供することを課題とする。より具体的には、本発明は、シミの状況を的確に分析する方法を提供することを課題する。さらに、本発明は、シミに対する効能を有する物質を的確に見いだし、その作用・効能を的確に把握できる効能評価方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、シミの原因について詳細に研究したところ、従来表皮部位においては存在しないと考えられていた物質が実は表皮部位に存在しており、シミ部と正常部とで発現量に大きな違いを生じていることを見いだした。さらに本発明者らは、従来知られていなかったシミの生成機構を解明し、かかる知見に基づいて本発明を完成させた。すなわち、本発明は次の通りである。
【０００９】
〔１〕複数箇所の表皮部位についてＮＴ−３を検出し、それぞれのＮＴ−３の検出量を指標とし、表皮部位におけるシミの状況を分析する、シミの状況分析方法。
〔２〕経時的に表皮部位のＮＴ−３を検出し、それぞれのＮＴ−３の検出量を指標とし、表皮部位におけるシミの状況を分析する、シミの状況分析方法。
〔３〕複数箇所の表皮部位についてＡＤＡＭ９を検出し、それぞれのＡＤＡＭ９の検出量を指標とし、表皮部位におけるシミの状況を分析する、シミの状況分析方法。
〔４〕経時的に表皮部位のＡＤＡＭ９を検出し、それぞれのＡＤＡＭ９の検出量を指標とし、表皮部位におけるシミの状況を分析する、シミの状況分析方法。
〔５〕複数箇所の表皮部位についてＨＢ−ＥＧＦを検出し、それぞれのＨＢ−ＥＧＦの検出量を指標とし、表皮部位におけるシミの状況を分析する、シミの状況分析方法。
〔６〕経時的に表皮部位のＨＢ−ＥＧＦを検出し、それぞれのＨＢ−ＥＧＦの検出量を指標とし、表皮部位におけるシミの状況を分析する、シミの状況分析方法。
〔７〕被試験細胞に評価対象化合物を投与し、前記被試験細胞におけるＮＴ−３を検出し、ＮＴ−３の検出量を指標として、評価対象化合物のシミに対する効能を評価する、効能評価方法。
〔８〕ＮＴ−３を経時的に検出し、検出量の経時変化を指標とする、前記〔７〕に記載の効能評価方法。
〔９〕被試験細胞に評価対象化合物を投与し、前記被試験細胞におけるＡＤＡＭ９を検出し、ＡＤＡＭ９の検出量を指標として、評価対象化合物のシミに対する効能を評価する、効能評価方法。
〔１０〕ＡＤＡＭ９を経時的に検出し、検出量の経時変化を指標とする、前記〔９〕に記載の効能評価方法。
【００１０】
「ＮＴ−３」とは、ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３である。「ＡＤＡＭ９」とは、ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ９である。「ＨＢ−ＥＧＦ」とは、ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒであり、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子ともいう。「ＥＧＦ」とは、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒであり、上皮増殖因子ともいう。
【００１１】
皮膚の構造は、一般的には「表皮（広義）」、「真皮」、「皮下組織」の３つに大別され、「表皮（広義）」には「角質層」、「表皮（狭義）」、「基底層」が含まれる。本明細書においては広義の「表皮」について「表皮部位」といい、狭義の「表皮」を単に「表皮」という。
【００１２】
なお、医学的見地からは、シミは肝斑、老人性色素斑などに分類され、ソバカスは雀卵斑などと詳細に分類される場合があるが、本明細書において「シミ」という場合、これらの詳細な分類にはよらず、メラニンなどの色素が沈着または停滞した色素斑を広く含む意味として用いる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明者らの研究により、ＮＴ−３、ＡＤＡＭ９、ＨＢ−ＥＧＦが、表皮部位の正常部とシミ部とで発現量に顕著な差が生じていることを見いだされた。具体的には、ＮＴ−３は正常部に比べシミ部のほうが顕著に増えることが認められる。ＡＤＡＭ９は、正常部に比べシミ部のほうが顕著に減少することが認められる。また、ＨＢ−ＥＧＦは、正常部に比べシミ部のほうが顕著に減少することが認められる。皮膚の表皮部位における正常部とシミ部とで、ＮＴ−３、ＡＤＡＭ９、ＨＢ−ＥＧＦの発現に顕著な違いが生じていることは、本発明者らが初めて見いだしたものである。
【００１４】
また、ＮＴ−３、ＡＤＡＭ９、ＨＢ−ＥＧＦ、メラノサイト、ケラチノサイトなどの関連から、シミの形成・停滞には図１に示すような生体反応機構が介在することが推定された。すなわち、ＮＴ−３が増加することにより２種の生体反応機構に影響が生じるものと推定される。その一方は、ＮＴ−３が増加するとメラノサイトが増加し、これによりメラニンの生成が増え、シミ形成に至るルートである。すなわち、メラニンの過剰生成がシミの原因となるルートである。もう一つは、ＮＴ−３が増加し、ＡＤＡＭ９が減少し、ＨＢ−ＥＧＦが減少して、ケラチノサイト分裂が低下し、表皮部位におけるターンオーバーが遅延するルートである。ターンオーバーが遅くなることにより、シミの排泄が円滑に進まず、シミが停滞しやすくなる。従来、メラニン抑制作用を有する物質を投与してもシミの改善が十分満足のいく結果とならない場合があったが、上記の機構からすると、単にシミの新たな生成を抑制するだけではなく、表皮部位のターンオーバーを促進する系についても改善しなければシミの改善が困難となる場合があることが、機構上の観点から明らかとなった。すなわち、シミを予防・改善、特に改善を図る場合には、上記の２つの系について適切な分析と対処が行われることがより望ましいことが明らかとなった。
【００１５】
本発明は、上記の知見に基づく、所定の物質を検出してシミの状況を的確に分析する方法、所定の評価対象物質のシミに対する効能を的確に評価する方法である。以下、それぞれ順に説明する。
【００１６】
（１）シミ状況分析方法
本発明のシミ状況分析方法では、表皮部位におけるＮＴ−３等を検出する。検出の対象物としては、ＮＴ−３、ＡＤＡＭ９、ＨＢ−ＥＧＦが挙げられ、これらのうちの１種のみを検出して状況分析してもよいし、２種以上について検出して状況の分析を行ってもよい。
【００１７】
ＮＴ−３等を検出する方法は、ＮＴ−３等について何らかの形態で量的に検出可能な方法であれば特に制限はない。検出量は、数値化して表してもよいし、顕微鏡写真などにおける染色された細胞組織の面積、濃さなどとして把握してもよい。ＮＴ−３、ＡＤＡＭ９、ＨＢ−ＥＧＦの検出は、例えば、それぞれについて特異的に染色する染色物質などのシグナル因子を用いてもよいし、また、それぞれに特異的に結合する抗体を調製し、当該抗体に、染色物質、蛍光物質、発光物質、放射性同位体など検出可能なシグナル因子を結合させて、抗体−シグナル因子複合体を調製し、当該複合体を、細胞組織サンプル（以下「サンプル」という）に接触させてシグナル因子を測定する方法などにより行うことができる。より具体的には、例えばＡＢＣ抗体染色法により行うことができ、ＡＢＣ抗体染色法は例えばベクター社ＡＢＣキット付属の標準プロトコールの記載に沿って行うことができる。
【００１８】
また、さらに別の項目を検出してもよく、例えば、メラノサイトなどの検出を併せて行うことも好ましい形態である。メラノサイトは、例えば、メラノサイトに特異的なマーカーを染色することにより検出することができる。検出の程度は、シグナル因子に応じて測定される。メラノサイトに特異的なマーカーとしては、例えば、ＭＡＲＴ−１などが挙げられる。ＭＡＲＴ−１は、ＡＢＣ抗体染色法により染色でき、染色された細胞の数、染色の濃さなどを顕微鏡下で観察して評価することができる。
【００１９】
ＮＴ−３等を検出するに際しては、被験者、被験動物等の被検体からサンプルを採取する。サンプルの採取のやり方により、ＮＴ−３の検出量を指標として様々なシミの状況分析が可能である。状況分析の具体的な形態としては、例えばシミの重軽度などの程度およびその分布、原因の推定、シミの進行状況、シミの改善状況、シミ形成の予測、シミ形成の潜在性などが挙げられる。
【００２０】
サンプル採取の方法を大きく２種に分類すると、空間的に異なる複数の箇所からサンプルを取得する形態と、経時的に異なる複数のサンプルを取得する形態とが挙げられる。「空間的に異なる」とは、複数の箇所、すなわち、位置・場所が異なることである。「経時的に異なる」とは、サンプルを採取する時間を変えることである。「複数」とは、少なくとも２箇所から採取すればよいことを意味し、同一被検体から採取することのみに限られるものではない。
【００２１】
複数箇所からサンプルを採取するより具体的な形態について例示すると次のようなものが挙げられる。例えば、一つの実施形態としては、正常部およびシミ部の双方を採取し、各検出対象物について正常部とシミ部とで検出結果を対照させるようにする。ＮＴ−３の検出量を指標として正常部とシミ部とを対比することにより、正常部とシミ部との状況の相違に関する最も基本的なデータを取得することができる。正常部、シミ部について複数の被検体、複数のサンプルによる検出試験データを積み上げることにより、統計的な基準データを得ることもできる。なお、予め正常部でのデータまたはシミ部でのデータを取得しておくことも、結果として、複数箇所の表皮部位からサンプルを採取したことに含まれる。したがって、被検体からシミ部のサンプルを採取し、既知のデータと比較することも本発明の実施形態に含まれる。
【００２２】
また、別の実施形態としては、同一被検体においてシミ部から正常部にかけて複数箇所、好ましくは３箇所以上のサンプルを採取し、シミ部から正常部にかけてのＮＴ−３の分布状況を直線的または領域的に把握することにより、シミの軽度・重度など程度の差を直線的または領域的に分析することもできる。また、別の実施形態としては、シミ部内で複数箇所を採取してＮＴ−３を検出する形態も挙げられる。シミ部内でのＮＴ−３の検出量の差を判別し、シミ部内におけるシミの軽度または重度の差を分析する形態が挙げられる。また別の形態としては、予め集積したシミ部のデータと、特定の被験者から採取したサンプルについてのＮＴ−３の検出量を比較し、その特定の被験者のシミが、重度のシミであるか軽度のシミであるかを客観的に分析することができる。さらに、外見上正常であってもＮＴ−３の検出量からシミ化するおそれを予測できる場合もあり得る。
【００２３】
次に、経時的に複数のサンプルを採取する形態例について説明する。経時的に複数回、ＮＴ−３等の検出を行うことにより、外見のみならず表皮部位内部の状態についての経時的な変化を判別し、シミの進行状況やシミの改善状況を分析することができる。例えば、経時的にＮＴ−３が増加していることが確認されれば、シミの形成が進行状態にあることが推定される。逆にＮＴ−３が減少していることが示されれば、シミは解消の方向に向かっているものと推定される。また、他の実施形態としては、シミの改善剤などを患者の皮膚に塗布し、その改善状況を経時的に分析するという形態などが例示される。
【００２４】
また、複数箇所の検出と、経時的な複数回の検出とを組み合わせることにより、より詳細なシミの状況分析が可能である。
【００２５】
さらに、ＮＴ−３等の検出量を指標とすることによりシミの原因に関する状況を分析することもできる。すなわち、ＮＴ−３が過剰であればメラニン生成過剰およびターンオーバーの遅延の双方が生じている蓋然性が高いことがわかる。ＡＤＡＭ９、ＨＢ−ＥＧＦが減少していれば、ターンオーバーが遅延している蓋然性が高いことがわかる。さらに別の検出対象物についても検出し、より詳細にシミの原因を分析してもよい。他の検出対象物としては例えば、メラノサイト、増殖細胞マーカーであるＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）、Ｋｉ６７、ｃｙｃｌｉｎなどが挙げられる。例えば、メラノサイトが過剰であれば、メラニンの生成過剰が生じている蓋然性が高いことがわかる。シミの形成・停滞に関する状況を的確に把握することにより、シミの予防・改善を図るための処置を的確に判断することが可能である。
【００２６】
表皮部位からサンプルを採取する方法は、検出対象物や検出方法の種類に応じて定法に従って採取すればよく、好ましくはバイオプシーの手法に準じて採取する。
【００２７】
（２）シミに対する効能評価方法
本発明の効能評価方法では、評価対象化合物を、被試験細胞に投与する。評価対象化合物は、シミに対する効能を評価しようとする対象となる化合物のことであり、試験者が任意に選択してよい。本発明の効能評価方法は新規なシミ改善・予防剤の開発に好適であり、評価対象化合物としては、シミ予防・改善剤の候補化合物となる化合物などが好適なものとして例示される。
【００２８】
評価対象化合物を投与する被試験細胞は、ＮＴ−３、ＡＤＡＭ９の各試験対象物質を検出可能な細胞であれば特に限定はない。ＮＴ−３を指標とする場合に好適な細胞としては、ＮＴ−３を含有する細胞或いはＮＴ−３を発現する細胞などが挙げられる。ＮＴ−３を含有する細胞或いはＮＴ−３を発現する細胞としては、具体例としては、活性化Ｔ細胞、繊維芽細胞、神経由来の細胞群、メラノサイト、メラノーマ、ＮＴ−３を発現するように組み換えられた形質転換細胞、またＮＴ−３の発現調節領域およびレポーター遺伝子が導入されレポーター遺伝子がコードするポリペプチドを発現する形質転換細胞などが好ましいものとして例示され、シミへの関与・影響が大きいと考えられることから、より好ましいものとしては、メラノサイト、メラノーマ、ＮＴ−３を発現する形質転換細胞などが例示され、特に好ましくはメラノサイト、メラノーマなどが例示される。レポーター遺伝子を組み込む例としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子などの検出可能な蛍光物質関連遺伝子等を導入した形質転換細胞などが例示される。形質転換体の作製などの分子生物学的な基本的手法については、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（１９９２）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（１９９９）など、多くの標準的な実験マニュアルがある。
【００２９】
ＡＤＡＭ９を指標とする場合に好適な被試験細胞としては、ＡＤＡＭ９を含有する細胞或いはＡＤＡＭ９を発現する細胞が挙げられる。ＡＤＡＭ９を含有する細胞或いはＡＤＡＭ９を発現する細胞の具体例としては、単球細胞、表皮細胞、ＡＤＡＭ９を発現するように組み換えられた形質転換細胞、またＡＤＡＭ９の発現調節領域およびレポーター遺伝子が導入されレポーター遺伝子がコードするポリペプチドを発現する形質転換細胞などが好ましいものとして例示され、より好ましいものとしてはシミへの関与・影響が大きいと考えられる表皮細胞、ＡＤＡＭ９を発現する形質転換細胞などが例示され、特に好ましくは表皮細胞などが例示される。形質転換細胞の作製については上記ＮＴ−３の場合同様の操作を行えばよい。
【００３０】
また、被試験細胞は、シミを含む表皮などから採取してくることもできる。採取に当たっては、由来・採取部位などは限定されないが、ヒトのシミ部に由来することがシミ予防・改善剤の開発上は好適である。また、ヒトなどのシミ部に由来する培養細胞なども好適に用いることができる。この時、被試験細胞は単一細胞に限らず、複数種類の細胞を混合してもよい。また、細胞の培養法は単層培養系、重層培養系、および３次元培養系など特に制限することなく用いることができる。またこれに限らず、器官培養系を用いても構わない。さらに、被試験細胞とし得る細胞としては、培養色素細胞、培養表皮細胞、皮膚再構築モデルなどの市販品を用いてもよい。
【００３１】
評価対象化合物を被試験細胞に添加し所定の時間が経過した後、ＮＴ−３等を検出する。添加量、添加回数、時間などの条件は、評価対象化合物の種類などに応じて適宜定めてよい。ＮＴ−３等の検出方法は、上記（１）と同様にして行うことができる。
【００３２】
本発明の効能評価方法では、ＮＴ−３、ＡＤＡＭ９の検出量を指標として、評価対象化合物のシミに対する効能を評価する。ＮＴ−３等は、１種について検出してもよいし、複数の項目について検出してもよい。ＮＴ−３等を指標として評価する具体的な実施形態には様々なものがある。具体的な評価形態としては、例えば、次のようなものが挙げられる。
【００３３】
まずＮＴ−３を検出する場合を例として説明する。一つの評価形態としては、評価対象化合物の投与前において、ＮＴ−３を含有する被試験細胞のＮＴ−３を予め検出しておき、投与後の検出量と比較して評価する形態が挙げられる。評価対象化合物の投与後ＮＴ−３の検出量が減少した場合には、評価対象化合物がシミを予防または改善する効能を有することがわかる。また、別な評価形態としては、シミを有しない組織細胞におけるＮＴ−３を検出しておきその検出量を正常値とし、評価対象化合物投与後のＮＴ−３の検出量と比較して評価する形態が挙げられる。評価対象化合物の投与後ＮＴ−３の検出量が正常値に近づけば、その評価対象化合物がシミを予防または改善する効能を有することがわかる。さらに別の評価形態としては、ＮＴ−３を経時的に検出し、検出量の経時変化を指標とする形態が挙げられる。経時的に検出することにより、シミに対する作用の速さなどを評価することができ、即効性、持続性などの性質を評価することができる。さらに別の評価形態としては、他の物質、例えば、シミに対する効能が既に知られている物質等とＮＴ−３の検出量を比較することにより、従来品等と比較して評価対象化合物の効能を評価することができる。
【００３４】
ＡＤＡＭ９については、ＡＤＡＭ９の検出量の増減の関係と評価対象物質の効能評価の有無とが、ＮＴ−３の場合とは反対となる。すなわち、ＡＤＡＭ９の検出量が増加した場合に、評価対象物質がシミを予防または改善する効能を有することがわかる。この点を除き、ＡＤＡＭ９についても、上記ＮＴ−３の場合に準じた実施形態を採用することができる。
【００３５】
また、ＨＢ−ＥＧＦ、メラノサイト、メラニン、ＰＣＮＡなどシミに関連する他の因子について検出し、その検出結果と共に評価対象物質の効能を評価することにより、より詳細な効能評価が可能である。
【００３６】
本発明の評価方法は、従来とはまったく異なる指標を用いるものであり、複雑な機構により生じると考えられているシミに対する予防剤または改善剤などの開発をより的確に行うことが可能である。
【００３７】
【実施例】
以下、本発明について具体的な実施例にそってより詳細に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３８】
（１）シミ状況、原因の調査
シミの原因を調査するため、以下の方法によりヒト背中部におけるシミ組織を採取し、抗体染色法により評価した。
【００３９】
（１−１）実験材料
インフォームドコンセントを行ったボランティアのうち、医師診断が老人性色素斑であった１０名の背中より、シミ部および正常部の皮膚をそれぞれ３ｍｍバイオプシーを用いて採取した。
【００４０】
（１−２）実験方法
得られた皮膚組織を速やかにＯＣＴ樹脂（Ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）包埋後、液体窒素で凍結し、凍結ブロックを作製した。この凍結ブロックをクリオスタットで薄切して５μｍの凍結切片を作製した。凍結切片を２０分間室温で風乾した後、アセトンまたは４％ＰＦＡ（パラフォルムアルデヒド）により固定し、１０分間１００％エタノールに浸漬した後、ＡＢＣ抗体染色法を行い、ペルオキシダーゼ発色により、下記（１−３）から（１−７）の各項目について試験を行い、シミの状況・原因を調査した。ＡＢＣ抗体染色法は定法、例えばベクター社ＡＢＣキット付属の標準プロトコールの記載に従って行った。
【００４１】
（１−３）ＭＡＲＴ−１染色によるメラノサイト数の測定
メラノサイト特異的マーカーであるＭＡＲＴ−１を染色し、メラノサイト数の評価を行った。メラノサイトの測定は、一定長（１ｍｍ）に存在するメラノサイトの数を測定した。結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2004205246.tif 000002
【００４３】
以上の結果からシミ部においては、メラノサイトの数が増加していることが明らかとなり、細胞数の増加に伴うメラニン合成増加が色素沈着の原因の一つであることが示された。
【００４４】
（１−４）ＮＴ−３染色による発現細胞数の測定
ＮＴ−３を染色して、発現細胞数の評価を行った。発現細胞数の測定は一定長（１ｍｍ）に存在する染色細胞数とした。結果を表２に示す。
【００４５】
【表２】
2004205246.tif 000003
【００４６】
以上の結果により、ＮＴ−３の発現細胞が表皮内に存在すること、またシミ部で発現量が増加していることが明らかになった。ＮＴ−３は、これまで表皮内では発現しないとされてきたが、今回の検討によりその発現が確認された。また、ＮＴ−３の発現量増加は、Ｙａａｒらの報告（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４  Ｏｃｔ；９４（４）；１５５０−１５６２）によりメラノサイトの増加、集積に作用すると考えられるので、このようなＮＴ−３のシミ部での増加がメラノサイトの増加を担っている可能性が非常に高いと考えられる。
【００４７】
（１−５）ＰＣＮＡ染色による表皮分裂細胞数の評価
増殖細胞マーカーであるＰＣＮＡの染色により、表皮分裂細胞数の評価を行った。発現細胞数として一定長（１ｍｍ）の表皮中でのＰＣＮＡ染色陽性細胞数を数えた。結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
2004205246.tif 000004
【００４９】
以上の結果より、ＰＣＮＡ発現細胞がシミ部で低下すること、すなわち、表皮細胞のターンオーバーがヒトのシミ部においては、細胞の増殖が周辺部に比較して低下していることがわかる。このことから、シミ部においてはメラノサイトの増加によりメラニン合成が増加しているだけでなく、表皮細胞の増殖の低下が生じ、メラニンが排泄されず滞留した状態が生じ得ることが示された。
【００５０】
（１−６）ＨＢ−ＥＧＦ発現レベル測定
ＨＢ−ＥＧＦの発現を染色により評価した。図２に正常部位およびシミ部位での発現状態を示す。
【００５１】
図２に示されるように、シミ部でＨＢ−ＥＧＦの染色性の明らかな低下が認められ、ＨＢ−ＥＧＦの発現レベルが低下することがわかった。このことからシミ部においてＨＢ−ＥＧＦの発現レベルの低下により表皮細胞の増殖の低下が生じていることが推定された。
【００５２】
（１−７）ＡＤＡＭ９発現レベル測定
表皮細胞のターンオーバーに関与していると考えられるＡＤＡＭ９の発現を染色により評価した。図３に正常部位およびシミ部位での発現状態を示す。
【００５３】
図３に示されるように、シミ部においてＡＤＡＭ９の染色性の明らかな低下が認められ、ＨＢ−ＥＧＦの発現レベル低下のみでなく（上記（１−６））、その切断酵素であるＡＤＡＭ９の発現レベルもシミ部において低下していることが明らかとなった。ＡＤＡＭ９がＨＢ−ＥＧＦの作用レベルを規定すると考えられるので、シミ部位におけるＨＢ−ＥＧＦの発現低下はＡＤＡＭ９の低下により引き起こされると推察された。
【００５４】
（２）ＮＴ−３添加によるＡＤＡＭ９の発現レベル測定
（２−１）実験材料
上記（１−１）と同じである。
【００５５】
（２−２）実験方法
表皮細胞を、増殖因子としてＢＰＥ（牛脳下垂体）、インスリンを添加したＭＣＤＢ１５３培地にて１５０×１０4個／ｍＬに調製し、６０ｍｍプレート（ファルコン社製）に４ｍＬずつ播種し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で１日間静置培養した。
【００５６】
培養上清を吸引除去し、最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬのＮＴ−３を含むＭＣＤＢ１５３培地（含インシュリン）に培地交換した。このプレートを９５％空気（Ｖ／Ｖ）−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で２４時間静置培養した。ＱＩＡＧＥＮ社製のＲＮＡキットにより総ｍＲＮＡを抽出し、ノザンブロッティング解析により総ｍＲＮＡ当たりのＡＤＡＭ９の発現量およびＧ３ＰＤＨ（glycel aldehyde-3-phosphate dehydrogenase）の発現量をそれぞれ調べ、対照サンプルに対する割合（％）で表示した。対照サンプルは、ＮＴ−３無添加としたものであり、この場合のそれぞれのｍＲＮＡの総ｍＲＮＡ発現量を１００％とした。
【００５７】
（２−３）結果
結果を表４に示す。
【００５８】
【表４】
2004205246.tif 000005
【００５９】
本試験の結果からＮＴ−３の添加によりＡＤＡＭ９の発現が抑制されたことがわかる。コントロールであるＧ３ＰＤＨのｍＲＮＡ量が変化しないことから、ＮＴ−３によるｍＲＮＡの発現抑制作用がＡＤＡＭ９に特異的であることがわかる。このことから、シミ部におけるＮＴ−３発現増加がＡＤＡＭ９の発現低下を引き起こし、ＨＢ−ＥＧＦの低下と表皮細胞の増殖低下を引き起こしたと推察された。
【００６０】
（３）フマル酸ジエステル誘導体添加時のＮＴ−３の発現レベル測定
フマル酸ジエステル誘導体をヒト色素細胞に投与したときのＮＴ−３発現量を次の方法により調べた。
【００６１】
（３−１）実験材料
クラボウ社より販売されているヒト包皮由来の培養色素細胞（メラノサイト）を用いた。
【００６２】
（３−２）実験方法
培養色素細胞を増殖因子としてＢＰＥ（牛脳下垂体）、インスリン、ハイドロコーチゾン、塩基性繊維芽細胞増殖因子、フォルボールエステルを添加したＭＣＤＢ１５３培地にて４５０×１０3個／ｍＬに調製し、１０ｍｍプレート（ファルコン社製）に１０ｍＬずつ播種し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３７℃で１日静置培養した。その後、培地をＭＣＤＢ１５３（含インシュリン）に交換し、更に同じ条件で２日間静置培養した。
【００６３】
培養上清を吸引除去し、最終濃度７０μｍｏｌ／Ｌのジメチルフマレートあるいは３００μｍｏｌ／Ｌのビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートを含むＭＣＤＢ１５３培地（含インシュリン）に培地交換した。このプレートを９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で２４時間静置培養した。ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮＡキットにより総ｍＲＮＡを抽出し、ノザンブロッティング解析により総ｍＲＮＡ当たりのＡＤＡＭ９の発現量およびＧ３ＰＤＨの発現量をそれぞれ調べ、対照サンプルに対する割合（％）で表示した。対照サンプルは、フマル酸ジエステル誘導体を無添加としたものであり、この場合のそれぞれのｍＲＮＡの総ｍＲＮＡ発現量を１００％とした。
【００６４】
（３−３）結果
結果を表５に示す。
【００６５】
【表５】
2004205246.tif 000006
【００６６】
本試験の結果から、フマル酸ジエステル誘導体の添加によりＮＴ−３の発現が抑制されたことがわかる。コントロールであるＧ３ＰＤＨのｍＲＮＡ発現量が変化しないことから、フマル酸ジエステル誘導体によるｍＲＮＡの発現抑制作用がＮＴ−３に特異的であることがわかる。
【００６７】
また、上記のようにビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートおよびジメチルフマレートは、ＮＴ−３を抑制することから、メラニンの過剰生成の抑制および表皮部位のターンオーバーを促進し、シミの予防または改善剤とし得る可能性が示された。
【００６８】
（４）フマル酸ジエステル誘導体添加時のＨＢ−ＥＧＦ発現レベル測定
フマル酸ジエステル誘導体を表皮細胞に投与したときのＨＢ−ＥＧＦ発現量を次の試験法により調べた。
【００６９】
（４−１）実験材料
クラボウ社より販売されているヒト包皮由来の培養表皮細胞を用いた。
【００７０】
（４−２）実験方法
表皮細胞を増殖因子としてＢＰＥ（牛脳下垂体）、インスリン、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、ハイドロコーチゾンを添加したＭＣＤＢ１５３培地にて１５０×１０4個／ｍＬに調製し、６０ｍｍプレート（ファルコン社製）に４ｍＬずつ播種し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で１日静置培養した。
【００７１】
培養上清を吸引除去し、最終濃度７０μｍｏｌ／Ｌのジメチルフマレートあるいは３００μｍｏｌ／Ｌのビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートを含むＭＣＤＢ１５３培地（含インシュリン）に培地交換した。このプレートを９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で２４時間静置培養した。ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮＡキットにより総ｍＲＮＡを抽出し、ノザンブロッティング解析により総ｍＲＮＡ当たりのＨＢ−ＥＧＦの発現量およびＧ３ＰＤＨの発現量をそれぞれ調べ、対照サンプルに対する割合（％）で表示した。対照サンプルは、フマル酸ジエステル誘導体を無添加としたものであり、この場合のそれぞれのｍＲＮＡの総ｍＲＮＡ発現量を１００％とした。
【００７２】
（４−３）結果
結果を表６に示す。
【００７３】
【表６】
2004205246.tif 000007
【００７４】
本試験の結果から、フマル酸ジエステル誘導体の添加により、ＨＢ−ＥＧＦの発現が誘導されたことがわかる。コントロールであるＧ３ＰＤＨのｍＲＮＡ量が変化しないことから、フマル酸ジエステル誘導体によるｍＲＮＡの発現誘導作用がＨＢ−ＥＧＦに特異的であることがわかる。
【００７５】
また、上記のようにビス（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）フマレートおよびジメチルフマレートは、ＨＢ−ＥＧＦの発現量を増加させることから、少なくとも表皮部位のターンオーバーを促進し、シミの予防または改善剤とし得る可能性が示された。
【００７６】
（５）フマル酸ジエステル誘導体添加時のＡＤＡＭ９発現レベル測定
フマル酸ジエステル誘導体を表皮細胞に投与したときのＡＤＡＭ９の発現量を次の方法で調べた。
（５−１）実験材料
クラボウ社より販売されているヒト包皮由来の培養表皮細胞を用いた。
【００７７】
（５−２）実験方法
表皮細胞を、増殖因子としてＢＰＥ（牛脳下垂体）、インスリン、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、ハイドロコーチゾンを添加したＭＣＤＢ１５３培地にて１５０×１０4個／ｍＬに調製し、６０ｍｍプレート（ファルコン社製）に４ｍＬずつ播種し、９５％空気（Ｖ／Ｖ）−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で１日静置培養した。
【００７８】
培養上清を吸引除去し、最終濃度７０μｍｏｌ／Ｌのジメチルフマレートを含むＭＣＤＢ１５３培地（含インシュリン）に培地交換した。このプレートを９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で１日静置培養した。ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮＡキットにより総ｍＲＮＡを抽出し、ノザンブロッティング解析により総ｍＲＮＡ当たりのＡＤＡＭ９の発現量およびＧ３ＰＤＨの発現量をそれぞれ調べ、対照サンプルに対する割合（％）で表示した。対照サンプルは、フマル酸ジエステル誘導体を無添加としたものであり、この場合のそれぞれのｍＲＮＡの総ｍＲＮＡ発現量を１００％とした。
【００７９】
（５−３）結果
結果を表７に示す。
【００８０】
【表７】
2004205246.tif 000008
【００８１】
本試験の結果から、フマル酸ジエステル誘導体の添加によりＡＤＡＭ９の発現が誘導されたことがわかる。コントロールであるＧ３ＰＤＨのｍＲＮＡ量が変化しないことから、フマル酸ジエステル誘導体によるｍＲＮＡの発現誘導作用がＡＤＡＭ９に特異的であることがわかる。
【００８２】
また、上記のようにフマル酸誘導体は、ＡＤＡＭ９の発現量を増加させることから、少なくとも表皮部位のターンオーバーを促進し、シミの予防または改善剤とし得る可能性が示された。
【００８３】
【発明の効果】
本発明によれば、シミの様々な状況を把握することができる。また、本発明によれば、シミに対する効能を有する物質を的確に見いだし、その作用・効能を的確に把握できる効能評価方法が提供される。本発明によりシミの予防・改善の処方のための貴重な情報を得ることができる。また本発明は、シミの予防・改善方法もしくは予防・改善剤の開発等にも大きく貢献することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】シミの生成機構を示す図である。
【図２】ＨＢ−ＥＧＦの発現を示す図である。
【図３】ＡＤＡＭ９の発現を示す図である。
【図１】
2004205246.tif 000009
【図２】
2004205246.tif 000010
【図３】
2004205246.tif 000011