(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸触媒を含む核酸分子内への新規ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）分子の取り込み方法。【解決手段】新規ヌクレオチド三リン酸、合成法、およびこれらのヌクレオチド三リン酸をオリゴヌクレオチド内へ取り込む方法、および新規核酸触媒（例えば、リボザイム）の単離が開示されている。オリゴヌクレオチド内に修飾ヌクレオチド三リン酸を取り込ませる方法であって、前記オリゴヌクレオチド内への修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みに適した条件下、修飾ヌクレオチド三リン酸を、核酸鋳型，ＲＮＡポリメラーゼ酵素，および修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みの促進剤を含む混合物と接触させる工程を含む方法が開示される。【選択図】  図１
2004147666.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド内に修飾ヌクレオチド三リン酸を取り込ませる方法であって、前記オリゴヌクレオチド内への修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みに適した条件下、修飾ヌクレオチド三リン酸を、核酸鋳型，ＲＮＡポリメラーゼ酵素，および修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みの促進剤を含む混合物と接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡポリメラーゼが変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡポリメラーゼがＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡポリメラーゼが変異体ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡポリメラーゼがＴ３ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡポリメラーゼが変異体Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みの促進剤が、ＬｉＣｌ，メタノール，ポリエチレングリコール，ジエチルエーテル，プロパノール，メチルアミン，およびエタノールからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが酵素的核酸分子である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドがアプタマーである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
修飾ヌクレオチド三リン酸が、式Ｉ：
【化１】
2004147666.tif 000023
［式中、Ｒは独立して、そのペントース成分の５’位を介して結合しているヌクレオシドであり、前記ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリンリボシド；２’−デオキシ−２’−アミノ−２，６−ジアミノプリンリボシド；２’−（Ｎ−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−（Ｎ−フェニルアラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−（Ｎ−β−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−（Ｎ−リシル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２’−Ｃ−アリルウリジン；２’−Ｏ−アミノ−ウリジン；２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシン；２’−Ｏ−メチルチオメチルシチジン；２’−Ｏ−メチルチオメチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルチオメチルウリジン；２’−（Ｎ−ヒスチジル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２’−アミノ−５−メチルシチジン；２’（Ｎ−β−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−グアノシン；および２’−Ｏ−アミノ−アデノシンからなる群より選択される］
を有する、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は１９９８年１１月４日に出願されたＢｅｉｇｅｌｍａｎらによるＵＳＳＮ０９／１８６，６７５号、１９９８年４月２９日に出願されたＢｅｉｇｅｌｍａｎらによるＵＳＳＮ６０／０８３，７２７号および１９９７年１１月６日に出願されたＢｅｉｇｅｌｍａｎらによるＵＳＳＮ６０／０６４，８６６号に基づく優先権を主張するものであり、これらすべての先の出願は”ヌクレオチド三リン酸およびそれらのオリゴヌクレオチド内への取り込み”と題されている。これらの出願の各々は図を含めて全文が本明細書において援用される。
【０００２】
本発明は新規ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）；ヌクレオチド三リン酸の合成法；および新規ヌクレオチド三リン酸をオリゴヌクレオチド内へ取り込むための方法に関している。本発明はさらに、いくつかの新規反応条件下、ポリメラーゼを使用する核酸分子内へのこれらのヌクレオチド三リン酸の取り込みに関している。
【背景技術】
【０００３】
以下はヌクレオチド三リン酸の簡単な説明である。本要約は完全であろうとするつもりはなく、以下の発明の理解を助けるためにのみ提供されている。本要約は以下に記載されたすべての研究が、特許請求された本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
【０００４】
ヌクレオチド三リン酸の合成およびポリメラーゼ酵素を用いる核酸内へのそれらの取り込みは核酸研究の進歩の大きな助けとなってきた。ポリメラーゼ酵素はオリゴヌクレオチドを組み立てるための前駆体分子としてヌクレオチド三リン酸を利用する。次のヌクレオチドの５’三リン酸に対するオリゴヌクレオチドの最後の３’ヒドロキシル基の求核攻撃により形成されるホスホジエステル結合により各々のヌクレオチドが結合される。ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド内に一度に一つ５’から３’の方向で取り込まれる。この過程は事実上任意のＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型からのＲＮＡの生成および増幅を可能にする。
【０００５】
ほとんどの天然ポリメラーゼ酵素は標準ヌクレオチド三リン酸を核酸内へ取り込む。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは  ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰをＤＮＡ内へ取り込み、ＲＮＡポリメラーゼは一般にＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰをＲＮＡ内へ取り込む。しかしながら、非標準ヌクレオチド三リン酸を核酸内に取り込むことができるある種のポリメラーゼが存在する（Ｊｏｙｃｅ，１９９７，ＰＮＡＳ  ９４，１６１９−１６２２，Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，８２３１−８２４２）。
【０００６】
ヌクレオシドは、ポリメラーゼ酵素を用いてＲＮＡ転写体内へ取り込ませる前に、これらの酵素が認識できるヌクレオチド三リン酸へ変換されなければならない。ＰＯＣｌ３およびトリアルキルリン酸による非保護ヌクレオシドのリン酸化によりヌクレオシド５’−ホスホロジクロリデートが得られることが示されている（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｊａｐａｎ）４２，３５０５）。アデノシンまたは２’−デオキシアデノシン５’−三リン酸は、ＤＭＦ中での過剰のトリ−ｎ−ブチルアンモニウムピロリン酸による処理、続いての加水分解から成る追加工程を加えることにより合成された（Ｌｕｄｗｉｇ，１９８１，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｈｕｎｇ．１６，１３１−１３３）。
【０００７】
非標準ヌクレオチド三リン酸は伝統的なＲＮＡポリメラーゼでは容易にはＲＮＡ転写体内へ取り込まれない。ＲＮＡ内へのデオキシリボヌクレオチドの取り込みを容易にするため、ＲＮＡポリメラーゼに突然変異が導入された（Ｓｏｕｓａ  ＆  Ｐａｄｉｌｌａ，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４，４６０９−４６２１，Ｂｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，３７６７−３７７５，Ｂｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４２，２５１２０−２５１２８，Ａｕｒｕｐ ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，９６３６−９６４１）。
【０００８】
ＭｃＧｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／３５１０２、はバクテリオファージＴ７ポリメラーゼを使用するＲＮＡ内への２’−ＮＨ２−ＮＴＰ、２’−Ｆ−ＮＴＰおよび２’−デオキシ−２’−ベンジルオキシアミノＵＴＰの取り込みを記載している。
【０００９】
Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４，９８７−９９４、はバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用するＲＮＡ転写体内への７−デアザ−アデノシン三リン酸の取り込みを記載している。
【００１０】
Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，５２２９−５２３４はバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびポリエチレングリコール含有緩衝液を使用するＲＮＡ内への２’−ＮＨ２−ＣＴＰおよび２’−ＮＨ２−ＵＴＰの取り込みを報告している。この論文はヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）に対するアプタマーのインビトロ選択におけるポリメラーゼ合成ＲＮＡの使用を記載している。
【００１１】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】WO95/35102
【特許文献２】US 4879214
【特許文献３】SU1775405
【特許文献４】WO96/18736
【特許文献５】WO95/11910
【特許文献６】WO97/26270
【特許文献７】WO95/19429
【特許文献８】WO98/50530
【非特許文献１】Lin, Y., et al., Nucleic Acids Research, Vol 22, No. 24, 1994, p5229-5234
【非特許文献２】Matulic-Adamic J. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 5, No. 22, 1995, p2721-2724
【非特許文献３】Huang, Y., et al., Biochemistry, Vol. 36, 1997, p8231-8242
【非特許文献４】Karpeisky, A., et al., Tetrahedron Letters, Vol. 39, No. 10, 1998, p1131-1134
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は新規ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）分子、および核酸触媒を含む核酸分子内へのそれらの取り込みに関している。本発明のＮＴＰは本分野で知られている他のＮＴＰとは異なっている。本発明はさらにＲＮＡポリメラーゼを使用するこれらのヌクレオチド三リン酸のオリゴヌクレオチド内への取り込みに関している；本発明はさらに核酸分子内への修飾（非標準）および非修飾ＮＴＰの取り込みのための新規転写条件にも関している。さらに、本発明は新規ＮＴＰ合成のための方法に関している。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、オリゴヌクレオチド内に修飾ヌクレオチド三リン酸を取り込ませる方法であって、前記オリゴヌクレオチド内への修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みに適した条件下、修飾ヌクレオチド三リン酸を、核酸鋳型，ＲＮＡポリメラーゼ酵素，および修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みの促進剤を含む混合物と接触させる工程を含む方法を提供する。好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、変異体ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、または変異体Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼである。また好ましくは、修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込みの促進剤は、ＬｉＣｌ，メタノール，ポリエチレングリコール，ジエチルエーテル，プロパノール，メチルアミン，およびエタノールからなる群より選択される。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、酵素的核酸分子、またはアプタマーである。
【００１４】
好ましい態様においては、修飾ヌクレオチド三リン酸は、式Ｉ：
【化２】
2004147666.tif 000003
［式中、Ｒは独立して、そのペントース成分の５’位を介して結合しているヌクレオシドであり、前記ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリンリボシド；２’−デオキシ−２’−アミノ−２，６−ジアミノプリンリボシド；２’−（Ｎ−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−（Ｎ−フェニルアラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−（Ｎ−β−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−（Ｎ−リシル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２’−Ｃ−アリルウリジン；２’−Ｏ−アミノ−ウリジン；２’−Ｏ−メチルチオメチルアデノシン；２’−Ｏ−メチルチオメチルシチジン；２’−Ｏ−メチルチオメチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルチオメチルウリジン；２’−（Ｎ−ヒスチジル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２’−アミノ−５−メチルシチジン；２’（Ｎ−β−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−グアノシン；および２’−Ｏ−アミノ−アデノシンからなる群より選択される］
を有する。
【００１５】
第一の観点において、本発明は式：三リン酸−ＯＲ（例えば、下記の式Ｉ）を有するＮＴＰを特徴としている：
【化３】
2004147666.tif 000004
式中、Ｒは任意のヌクレオシドであり；特にはヌクレオシド２’−Ｏ−メチル−２，６−ジアミノプリン  リボシド；２’−デオキシ−２’−アミノ−２，６−ジアミノプリン  リボシド；２’−（Ｎ−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−（Ｎ−フェニルアラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２’−（Ｎ−β−アラニル）アミノ；２’−デオキシ−２’−（リシル）アミノ  ウリジン；２’−Ｃ−アリルウリジン；２’−Ｏ−アミノ−ウリジン；２’−Ｏ−メチルチオメチル  アデノシン；２’−Ｏ−メチルチオメチル  シチジン；２’−Ｏ−メチルチオメチル  グアノシン；２’−Ｏ−メチルチオメチル  ウリジン；２’−デオキシ−２’−（Ｎ−ヒスチジル）アミノ  ウリジン；２’−デオキシ−２’−アミノ−５−メチル  シチジン；２’−（Ｎ−β−カルボキサミジン−β−アラニル）アミノ−２’−デオキシ−ウリジン；２’−デオキシ−２’−（Ｎ−β−アラニル）−グアノシン；２’−Ｏ−アミノ−アデノシン；２’−（Ｎ−リシル）アミノ−２’−デオキシ−シチジン；２’−デオキシ−２’−（Ｌ−ヒスチジン）アミノ  シチジン；および５−イミダゾール酢酸  ２’−デオキシ−５’−三リン酸ウリジンである。第二の観点において、本発明はピリミジンヌクレオチド三リン酸（ＵＴＰ、２’−Ｏ−ＭＴＭ−ＵＴＰ、ｄＵＴＰなどのような）の合成のための方法を特徴とする。該方法においては、ピリミジン一リン酸の形成に適した条件下、リン酸化試薬（オキシ塩化リン、ホスホ−トリス−トリアゾライド、ホスホ−トリス−トリイミダゾライドなどのような）、リン酸トリアルキル（リン酸トリエチルまたはリン酸トリメチルなどのような）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を有する混合物とピリミジンヌクレオチドを接触させる一リン酸化工程；およびピリミジン三リン酸の形成に適した条件下、ピロリン酸化試薬（ピロリン酸トリブチルアンモニウムのような）とピリミジン一リン酸を接触させるピロリン酸化工程を含む。
【００１６】
本明細書において使用される場合、用語”ヌクレオチド”とは本分野で認識されているものであり、天然の塩基（標準）および本分野でよく知られている修飾塩基が含まれる。そのような塩基は一般的には糖部分の１’位に位置している。ヌクレオチドは一般的に塩基、糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは修飾されていなくてもまたは糖、リン酸および／または塩基部分で修飾されていてもよい（またヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドその他として相互交換的に示される、例えば、Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，前記文献；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９３／１５１８７号を参照されたい；すべて本明細書において援用される）。Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３、に最近要約されているような、本分野で既知の修飾核酸塩基のいくつかの例が存在する。有意には触媒活性に影響せずに核酸内へ導入できる塩基修飾のいくつかの非限定的例としては、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、プソイドウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）およびその他（Ｂｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）が挙げられる。この観点においては、”修飾塩基”とは、１’位のアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基またはそれらの均等物を意味しており；そのような塩基は酵素的核酸分子の触媒コア内におよび／またはそのような分子の基質結合領域中に使用することができる。そのような修飾ヌクレオチドには、本分野でよく知られている医薬有用性、ならびにシークエンシングのような基礎分子生物学法において有用性を有するジデオキシヌクレオチドが含まれる。
【００１７】
”非修飾ヌクレオシド”または”非修飾ヌクレオチド”とはβ−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に連結されている、塩基アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルの一つを意味している。
【００１８】
”修飾ヌクレオシド”または”修飾ヌクレオチド”とは非修飾ヌクレオチドの塩基、糖および／またはリン酸の化学構造中に修飾を含むヌクレオチド塩基を意味している。
【００１９】
”ピリミジン”とは６員ピリミジン環の修飾または非修飾誘導体を含むヌクレオチド意味している。ピリミジンの例は修飾または非修飾ウリジンである。
【００２０】
”ヌクレオチド三リン酸”または”ＮＴＰ”とは、修飾または非修飾リボースまたはデオキシリボース糖の５’ヒドロキシル基に三つの無機リン酸基が結合されているヌクレオシドを意味しており、ここで糖の１’位は核酸塩基または水素を含むことができる。三リン酸部分は、その基の機能性（即ち、ＲＮＡ分子内への取り込みを可能にする）を破壊しない化学修飾を含むように修飾されていてもよい。
【００２１】
別の好適な態様において、本発明のヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）はＲＮＡポリメラーゼ酵素を用いてオリゴヌクレオチド内に取り込まれる。ＲＮＡポリメラーゼとしては突然変異体および野生型バクテリオファージＴ７、ＳＰ６またはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。出願人はまた、本発明のＮＴＰをＴａｑポリメラーゼのようなある種のＤＮＡポリメラーゼを用いてオリゴヌクレオチド内へ取り込むことができることも発見した。
【００２２】
さらに別の好適な態様において、本発明は、オリゴヌクレオチド内へ修飾ＮＴＰを取り込むための方法を特徴とする。該方法は、オリゴヌクレオチド内への修飾ＮＴＰの取り込みに適した条件下、ＤＮＡ鋳型、ＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰおよび修飾ＮＴＰ取り込みの促進剤を含む混合物をインキュベートする工程を含む。
【００２３】
”修飾ＮＴＰ取り込みの促進剤”とはＲＮＡポリメラーゼによる核酸転写体内への修飾ヌクレオチドの取り込みを容易にする試薬を意味している。そのような試薬にはメタノール；ＬｉＣｌ；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ジエチルエーテル；プロパノール；メチルアミン；エタノールなどが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【００２４】
別の好適な態様において、修飾ヌクレオチド三リン酸は、核酸分子、例えば酵素的核酸、アンチセンス、２−５Ａアンチセンスキメラ、オリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、アプタマーなど（Ｓｔｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｌ９９５  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．１２，４６５）の中に、転写により取り込ませることができる。
【００２５】
”アンチセンス”とはＲＮＡ−ＲＮＡ  またはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｌ  ａｌ．，１９９３  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５，５６６）相互作用により標的ＲＮＡへ結合し、標的ＲＮＡの活性を変化させる非酵素的核酸分子を意味している（総説としてＳｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎｇ，１９９３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，１００４；Ａｇｒａｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５９１，７２１号；Ａｇｒａｗａｌ，米国特許第５，６５２，３５６号を参照されたい）。典型的には、アンチセンス分子は、アンチセンス分子の１つの連続配列に沿って標的配列と相補的であろう。しかしながらある種の態様では、アンチセンス分子は、基質分子がループを形成するように基質へ結合してもよいし、および／またはアンチセンス分子は、アンチセンス分子がループを形成するように基質へ結合してもよい。従って、アンチセンス分子は二つの（またはそれ以上の）非連続基質配列と相補的であるか、またはアンチセンス分子の二つの（またはそれ以上の）非連続基質配列部分が標的配列と相補的であるか、またはその両方である。
【００２６】
”２−５Ａアンチセンスキメラ”とは、５’リン酸化２’−５’結合アデニル酸部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味している。これらのキメラは配列特異的様式で標的ＲＮＡに結合し、細胞性２−５Ａ依存性リボヌクレアーゼを活性化し、それは順に標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，１３００）。
【００２７】
”三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）”とは配列特異的様式で二本鎖ＤＮＡに結合して、三本鎖らせんを形成しうるオリゴヌクレオチドを意味している。そのような三本鎖らせん構造の形成は標的遺伝子の転写を阻害することが示されている（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，５０４）。
【００２８】
本明細書で使用される場合、”オリゴヌクレオチド”とは二つまたはそれ以上のヌクレオチドを有する分子を意味している。ポリヌクレオチドは一本鎖、二本鎖または多本鎖であり、修飾または非修飾のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドまたはそれらの種々の混合物および組み合わせを有していてもよい。
【００２９】
”核酸触媒”とは、ヌクレオチド塩基配列特異的様式で他の別の核酸分子を繰り返して切断する能力（エンドヌクレアーゼ活性）を含む種々の反応を触媒する（速度および／または割合を変える）ことができる核酸分子を意味している。エンドヌクレアーゼ活性を有するそのような分子は基質結合領域において特定の遺伝子標的に対する相補性を有しており、またその標的中のＲＮＡまたはＤＮＡを特異的に切断する酵素活性を有する。即ち、エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子は分子内または分子間でＲＮＡまたはＤＮＡを切断し、それにより標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性は標的ＲＮＡまたはＲＮＡに対する酵素的ＲＮＡ分子の十分なハイブリダイゼーションを可能にし、切断が起こることを可能にする。１００％の相補性が好適ではあるが、５０−７５％の低い相補性もまた本発明では有用である。核酸は塩基、糖および／またはリン酸基が修飾されていてもよい。用語、酵素的核酸は、リボザイム、触媒的ＲＮＡ、酵素的ＲＮＡ、触媒的ＤＮＡ、触媒的オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ。ミニザイム、リードザイム、オリゴザイム、ファインデロンまたはＤＮＡ酵素のような句と相互交換的に使用される。これらすべての用語は酵素活性を有する核酸分子を記述している。本出願に記載されている特定の酵素的核酸分子は本発明を限定するものではなく、本発明の酵素的核酸分子において重要なことは、一つまたはそれ以上の標的核酸領域に相補的な特異的基質結合部位を有すること、および分子に核酸切断活性を与えるヌクレオチド配列を基質結合部位内または周辺に有すること（Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９８７，０７１号、Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，２６０  ＪＡＭＡ  ３０３０）であることを当業者は認識するであろう。
【００３０】
”酵素的部分”または”触媒ドメイン”とは核酸基質の切断に必須である酵素的核酸分子の部分／領域を意味している。
【００３１】
”基質結合アーム”または”基質結合ドメイン”とは基質の一部分と相補的な（即ち、塩基対を形成できる）酵素的核酸分子の部分／領域を意味している。一般に、そのような相補性は１００％であるが、必要に応じてそれ未満でもよい。例えば、１４の内の１０程度でも塩基対を形成しうる。即ち、これらのアームは、酵素的核酸分子中に、相補的塩基対形成相互作用により酵素的核酸分子および標的を一緒にすることが意図される配列を含む。本発明の酵素的核酸分子は連続または非連続的である、および色々な長さの結合アームを有していてもよい。結合アームの長さは好適には４ヌクレオチドより長いかまたは等しい；特には１２−１００ヌクレオチド；より特別には１４−２４ヌクレオチド長である。もし２つの結合アームが選択される場合、結合アームの長さは対称的（即ち、各々の結合アームは同じ長さである；例えば、５および５ヌクレオチド、６および６ヌクレオチドまたは７および７ヌクレオチド長）または非対称的（即ち、結合アームは異なった長さである；例えば、６および３ヌクレオチド；３および６ヌクレオチド長；４および５ヌクレオチド長；４および６ヌクレオチド長；４および７ヌクレオチド長など）であるように設計される。
【００３２】
本明細書で使用される場合、”核酸分子”とはヌクレオチドを有する分子を意味している。核酸は一本鎖、二本鎖または多本鎖であり、修飾または非修飾のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドまたはそれらの種々の混合物および組み合わせを含むであろう。本発明に従った核酸分子の例は、タンパク質のような巨大分子をコードしている遺伝子である。
【００３３】
本発明の好適な態様において、核酸分子（例えば、アンチセンス分子、三重鎖ＤＮＡまたは酵素的核酸分子）は１３から１００ヌクレオチド長であり、特定の態様においては（例えば、特定のリボザイムに対して）３５、３６、３７または３８ヌクレオチド長である。特定の態様において核酸分子は１５−１００、１７−１００、２０−１００、２１−１００、２３−１００、２５−１００、２７−１００、３０−１００、３２−１００、３５−１００、４０−１００、５０−１００、６０−１００、７０−１００または８０−１００ヌクレオチド長である。上に特定した鎖長範囲の上限である１００ヌクレオチドの代わりに、鎖長範囲の上限は例えば、３０、４０、５０、６０、７０または８０ヌクレオチドでもよい。従っていずれの鎖長範囲についても、特定の態様のための鎖長範囲は明記されたような下限を有し、および下限よりもより高い、明記されたような上限を有する。例えば特定の態様において、鎖長範囲は３５−５０ヌクレオチド長であろう。すべてのそのような範囲が明白に包含されている。また特定の態様において、核酸分子は上に特定した任意の長さ（例えば、２１ヌクレオチド長）を有することができる。
【００３４】
”相補性”とは、伝統的ワトソン−クリックまたは他の非伝統的型により、核酸が別のＲＮＡ配列と水素結合を形成できることを意味している。本発明の核酸分子に関しては、核酸分子とその標的または相補的配列との結合自由エネルギーは、核酸の適切な機能が進行するのを可能にするのに十分である（例えば、酵素的核酸切断、アンチセンスまたは三重らせん阻害）。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は本分野ではよく知られている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ  Ｓｙｒｎｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ  ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５）。パーセント相補性とは第二の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成できる核酸分子中の連続した残基のパーセントを示している（例えば、１０個の内の５、６、７、８、９、１０であれば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％の相補性である）。”完全な相補性”とは核酸配列の連続した残基のすべてが第二の核酸配列中の同数の連続した残基と水素結合するであろうことを意味している。
【００３５】
さらに別の好適な態様において、本発明の修飾ヌクレオチド三リン酸は、新規機能を有する核酸分子のコンビナトリアル化学またはインビトロ選択に使用できる。修飾オリゴヌクレオチドは酵素的に合成でき、スクリーニングのためのライブラリーを生成することができる。
【００３６】
別の好適な態様において、本発明は、本発明に記載されている方法を用いて単離される核酸（例えば、酵素的核酸分子、アンチセンス核酸、２−５Ａアンチセンスキメラ、三重鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ切断化学基含有アンチセンス核酸）に基づいた技術、および遺伝子発現の診断、下方制御または阻害のためのそれらの使用法を特徴とする。
【００３７】
”阻害する”とは標的遺伝子の活性または標的遺伝子をコードしているｍＲＮＡまたは同等なＲＮＡのレベルが本発明の核酸分子（例えば、酵素的核酸分子、アンチセンス核酸、２−５Ａアンチセンスキメラ、三重鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ切断化学基含有アンチセンス核酸）の不在下で観察されるよりも減じられることを意味している。一つの態様において、酵素的核酸分子による阻害は、好適には、ｍＲＮＡ上の同じ部位に結合できるがそのＲＮＡを切断することはできない酵素的に弱められた核酸分子の存在下で観察されるレベルよりも低い。別の態様において、核酸分子（酵素的核酸およびアンチセンス分子を含む）による阻害は、好適には、例えばスクランブル配列またはミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの存在下で観察される阻害よりもより強い。別の態様において、本発明の核酸分子による標的遺伝子の阻害は、核酸分子不在下よりも存在下の方がより強い。
【００３８】
さらに別の好適な態様において、本発明は多数の式Ｉの化合物を取り込むための方法を特徴とする。
【００３９】
さらに別の態様において、本発明は式ＩＩの触媒活性を有する核酸分子を特徴とする。
【化４】
2004147666.tif 000005
上記の式において、Ｘ、ＹおよびＺは独立してヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを表し、それらは同じでも異なっていても良い；・は二つの隣接するヌクレオチド間の水素結合形成を示しており；Ｙ’はＹに相補的なヌクレオチドであり；Ｚ’はＺに相補的なヌクレオチドであり；ｌは３と等しいかまたはそれより大きな整数であり、好適には２０未満、より特別には４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１５であり；ｍは１より大きな整数であり、好適には１０未満、より特別には２，３、４、５、６または７であり；ｎは１より大きな整数であり、好適には１０未満、より特別には３、４、５、６または７であり；ｏは３と等しいかまたはそれより大きな整数であり、好適には２０未満、より特別には３，４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１５であり；ｌおよびｏは同じ長さでもよいし（ｌ＝ｏ）または異なった長さでもよい（ｌ≠ｏ）；各Ｘ（ｌ）およびＸ（ｏ）は独立して標的核酸配列（標的はＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ混合ポリマーでありうる）と安定した相互作用をするのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；Ｗは≧２ヌクレオチドの長さのリンカーであるかまたは非ヌクレオチドリンカーであってもよく；Ａ、Ｕ、ＣおよびＧはヌクレオチドを表し；Ｇはヌクレオチドであり、好適には２’−Ｏ−メチルであり；Ｃはヌクレオチドを表し、好適には２’−アミノ（例えば、２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２）であり；および＿は化学結合を表す（例えば、リン酸エステル結合、アミド結合、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本分野で知られている他の結合）。
【００４０】
式ＩＩの酵素的核酸分子は独立してキャップ構造を含んでいてもよく、それは独立して存在してもまたは存在しなくてもよい。
【００４１】
”十分な長さ”とはとは３ヌクレオチドと等しいかまたはそれより大きなオリゴヌクレオチドを意味している。
【００４２】
”安定に相互作用する”とはオリゴヌクレオチドと標的核酸との相互作用を意味している（例えば、生理学的条件下での標的中の相補的ヌクレオチドとの水素結合形成により）。
【００４３】
”キメラ核酸分子”または”キメラオリゴヌクレオチド”とは、分子が修飾または非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡの両方から成っていてもよいことを意味している。
【００４４】
”キャップ構造”とはオリゴヌクレオチドの末端に取り込まれている化学修飾を意味している。これらの末端修飾は核酸をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内の送達および／または局在化を助けるであろう。キャップは５’末端（５’−キャップ）または３’末端（３’−キャップ）に存在してもよく、両方の末端に存在してもよい。非制限的例において：５’−キャップは反転無塩基部分、４’５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’−４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分；３’−３’−反転無塩基部分；３’−２’−反転ヌクレオチド部分；３’−２’−反転無塩基部分；リン酸１，４−ブタンジオール；３’−ホスホルアミデート；リン酸ヘキシル；リン酸アミノヘキシル；３’−リン酸；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋または非架橋メチルホスホネート部分から成る群より選択される（より詳細にはＢｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９７／２６２７０号を参照されたい、本明細書において援用される）。さらに別の好適な態様において、３’−キャップは、４’５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；リン酸５’−アミノアルキル；リン酸１，３−ジアミノ−２−プロピル；リン酸３−アミノプロピル；リン酸６−アミノヘキシル；リン酸１，２−アミノドデシル；リン酸ヒドロキシプロピル；１，５−アンヒドロヘキシトール；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部分；５’，５’−反転無塩基部分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；リン酸１，４−ブタンジオール；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミデート；ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分から成る群より選択される（より詳細にはＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９，１９２５を参照されたい；本明細書において援用される）。用語”非ヌクレオチド”とは一つまたはそれ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖内へ取り込ませることができる任意の基または化合物を意味しており、糖および／またはリン酸置換を含み、残っている塩基が酵素活性を示すことが可能である。該基または化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンのような普通に認識されるヌクレオチド塩基��含まない点において無塩基である。本明細書で使用される場合、用語”無塩基”または”無塩基ヌクレオチド”とは塩基を欠くかまたは１’位に塩基の代わりに他の化学基を有する糖部分を包含している。
【００４５】
本発明に記載されているような２’−修飾ヌクレオチドに関連して、”アミノ”とは２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２を意味しており、それは修飾されていてもいなくてもよい。そのように修飾された基は例えば、各々Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６７２，６９５号およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９８／２８３１７に記載されており、それらは全体が本明細書において援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
図面
図１はヌクレオシド基質を使用するＮＴＰ合成のスキームを示している。
【００４７】
図２はインビトロ選択法のためのスキームを示している。無作為コア領域および一つまたはそれ以上の規定された配列の領域を有する核酸分子のプールを発生させる。これらの核酸分子を規定された配列を有する固定化オリゴヌクレオチドを含むカラムへ結合させ、ここで規定された配列はプール中の核酸分子の規定された配列の領域と相補的である。カラム中の固定化オリゴヌクレオチド（標的）を切断できる核酸分子を単離し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換し、続いてＮＴＰを用いる転写により新しい核酸プールを形成させる。
【００４８】
図３は二カラムインビトロ選択法のスキームを示している。無作為コアおよび規定された配列の二つの隣接領域（領域Ａおよび領域Ｂ）を有する核酸分子のプールを発生させる。このプールは、各々プール中の核酸分子の領域ＡおよびＢと相補的である、領域Ａ’およびＢ’を有する固定化オリゴヌクレオチドを含むカラムを通過させる。カラムを固定化オリゴヌクレオチド標的が容易に切断されるのに十分な条件にする。標的を切断するプール中の分子（活性分子）はそのＡ領域に結合している標的のＡ’領域を有し、一方Ｂ領域はフリーである。カラムを洗浄して、結合した標的のＡ’領域を有する活性分子を単離する。この活性分子のプールはまた、標的を切断する活性がないが（不活性分子）カラムから解離されたある種の分子も含むであろう。混入した不活性分子を活性分子から分離するため、プールを、Ａ’配列を含むがＢ’配列を含まない固定化オリゴヌクレオチドを含む第二のカラムを通過させる。不活性分子はカラム２に結合するが、活性分子はカラム２に結合しない（なぜなら、それらのＡ領域はカラム１からの標的オリゴヌクレオチドのＡ’領域により占領されている）。カラム２を洗浄して活性分子を単離し、図２に示したような次の処理に進む。
【００４９】
図４は新規な４８ヌクレオチドの酵素的核酸モチーフの図解であり、これは本発明に記載されているインビトロ法を用いて同定された。示されている分子は単なる例示である。５’および３’末端ヌクレオチド（５’および３’末端上の単なる単一の末端ヌクレオチドではなく基質結合アームのヌクレオチドを指す）はこれらの部分が標的基質配列と塩基対形成しうる限り変更することができる。加えて、基質の切断部位に示されているグアノシン（Ｇ）は、その変更が標的配列を切断する酵素的核酸分子の能力を排除しない限り、他のヌクレオチドに変更することができる。核酸分子および／または基質配列中の置換は、例えば本明細書に記載したように容易に試験できる。
【００５０】
図５はクラスＩ酵素的核酸分子モチーフの効力を示すために使用されたＨＣＶルシフェラーゼアッセイのスキームを示している。
【００５１】
図６はＨＣＶ  ＲＮＡ上の部位１４６を標的とする酵素的核酸分子の用量曲線を示しているグラフである。
【００５２】
図７はＨＣＶ  ＲＮＡ内の４つの部位を標的とする酵素的核酸分子が細胞中のＲＮＡレベルを減少させうることを示している棒グラフである。
【００５３】
図８は特徴付けられたクラスＩＩ酵素的核酸モチーフの二次構造および切断速度を示している。
【００５４】
ヌクレオチド合成
本分野で知られているリン酸化プロトコールへのジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の添加は反応時間を短くすると同時にヌクレオチド一リン酸の収率を非常に増加させることができる（図１）。本発明のヌクレオシドの合成はいくつかの論文および出願人の以前の出願に記載されている（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９６／１８７３６号；Ｄｕｄｚｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９５１１１９１０号；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９５／１３３７８号；Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｒｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８，２０３，Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｒｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８，１６６９；これらはすべて本明細書において援用される）。これらのヌクレオシドをリン酸トリエチルに溶解し、氷浴で冷却した。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）を加え、続いてＤＭＡＰを導入した。次に反応液を室温まで温めて５時間放置した。この反応はヌクレオチド一リン酸を形成させ、それは次にヌクレオチド三リン酸の形成に使用できる。トリブチルアミンを加え、続いて無水アセトニトリルおよびピロリン酸トリブチルアンモニウムを添加した。反応をＴＥＡＢで停止させ、室温（約２０℃）で一夜撹拌した。三リン酸はカラム精製およびＨＰＬＣを使用して精製され、化学構造はＮＭＲ分析により確認した。当業者は反応の試薬、温度および精製法は容易に代替物および均等物で変えることができ、それにもかかわらず所望の生成物が得られることを認識するであろう。
【００５５】
ヌクレオチド三リン酸
本発明は多数の異なった機能に使用できるヌクレオチド三リン酸を提供する。表Ｉのヌクレオシドから形成されたヌクレオチド三リン酸は本分野で知られている他のヌクレオチド三リン酸と比較して独特で性質が異なっている。ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド内への修飾ヌクレオチドの取り込みにより分子の特性を変えることができる。例えば、修飾ヌクレオチドはヌクレアーゼの結合を妨害し、したがって分子の化学的半減期を延長する。もし分子が細胞培養またはインビボで使用されるならば、このことは特に重要である。本分野において、これらの分子内への修飾ヌクレオチドの導入は、分子の安定性を、およびそれによりその有効性を非常に増加させうることが知られている（Ｂｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，１４０９０−１４０９７；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６，５２７−５３３）。
【００５６】
修飾ヌクレオチドは野生型かまたは突然変異体ポリメラーゼを使用して取り込まれる。例えば、突然変異体Ｔ７ポリメラーゼは修飾ヌクレオチド三リン酸、ＤＮＡ鋳型および適した緩衝液存在下で使用される。他のポリメラーゼおよびそれらの各々の突然変異変異体もまた本発明のＮＴＰの取り込みに利用できることを当業者は認識するであろう。核酸転写体は放射性標識ヌクレオチド（α−３２Ｐ  ＮＴＰ）の取り込みにより検出できる。放射性標識ＮＴＰは試験されている修飾三リン酸と同じ塩基を含む。メタノール、ＰＥＧおよびＬｉＣｌの影響が、これらの化合物を独立してまたは組み合わせて添加することにより試験された。核酸転写体の検出および定量はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを使用して実施された。転写の効率は修飾ヌクレオチド三リン酸取り込みと全リボヌクレオチド取り込み対照を比較することにより評価された。野生型ポリメラーゼは製造元（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｒｎ）の緩衝液および使用説明書を用いてＮＴＰの取り込みに使用された。
【００５７】
転写条件
オリゴヌクレオチド内への修飾ヌクレオチド三リン酸の取り込み速度は、従来の緩衝液条件に、修飾ＮＴＰ取り込みのいくつかの異なった促進剤を加えることにより促進できる。出願人はＲＮＡポリメラーゼを用いるｄＮＴＰの取り込み速度を高めるためにメタノールおよびＬｉＣｌを利用した。これらの修飾ＮＴＰ取り込みの促進剤は転写を最適にするために異なった組み合わせおよび比率で使用できる。最適反応条件はヌクレオチド三リン酸間で異なり、標準実験により容易に決定できる。しかしながら総合的にいえば、メタノールまたは塩化リチウムのような無機化合物のような修飾ＮＴＰ取り込みの促進剤の存在は、平均転写速度を速めることが示された。
【００５８】
本発明の核酸分子の作用機構
アンチセンス：アンチセンス分子は修飾または非修飾のＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマーオリゴヌクレオチドであり、マッチする配列へ特異的に結合してペプチド合成を阻害することにより主として機能する（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，Ｎｏｖ  １９９４，ＢｉｏＰｈａｒｍ，２０−３３）。アンチセンスオリゴヌクレオチドはワトソンクリック塩基対形成により標的ＲＮＡへ結合し、立体的阻止かまたはＲＮａｓｅ  Ｈ酵素の活性化により結合した配列のリボソーム翻訳を妨害することにより遺伝子発現を阻止する。アンチセンス分子はまたＲＮＡプロセッシングまたは核から細胞質内への輸送を妨害することによってもタンパク質合成を変化させる（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ＆Ｒｏｔｈ，１９９６，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  ７，１５１−１９０）。
【００５９】
加えて、ＲＮＡへの一本鎖ＤＮＡの結合はヘテロ二重鎖のヌクレアーゼ分解を生じる（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ、前記文献；Ｃｒｏｏｋｅ、前記文献）。現在まで、ＲＮａｓｅ  Ｈの基質として働くであろう唯一の主鎖修飾ＤＮＡはホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートである。最近、２’−アラビノおよび２’−フルオロアラビノ含有オリゴもまたＲＮａｓｅ  Ｈ活性を活性化することが報告されている。
【００６０】
化学的に修飾されたヌクレオチド、二次構造および／またはＲＮａｓｅ  Ｈ基質ドメインの新規コンフィギュレーションを利用する多数のアンチセンス分子が報告されている（Ｗｏｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９８／ｌ３５２６；１９９８年４月２０日に出願されたＴｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳＳＮ  ６０／０８２，４０４；１９９８年９月２１日に出願されたＨａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳＳＮ  ６０／１０１，１７４、これらのすべては全体が本明細書において援用される）。
【００６１】
三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）：一本鎖ＤＮＡをゲノムＤＮＡへ配列特異的様式で結合するように設計することができる。ＴＦＯはフーグスティーン塩基対形成によりＤＮＡらせんを結合するピリミジンに富んだオリゴヌクレオチドを含む（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ、前記文献）。生じた三重らせんはＤＮＡセンス、ＤＮＡアンチセンスおよびＴＦＯから構成されており、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成を破壊する。ＴＦＯ機構は結合が不可逆的であるので遺伝子発現または細胞死を生じる（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ＆Ｒｏｔｈ、前記文献）。
【００６２】
２−５Ａアンチセンスキメラ：２−５Ａシステムは高等脊椎動物で発見されたＲＮＡ分解のインターフェロン仲介機構である（Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３，６７８０−６７８５）。二つの型の酵素、２−５Ａ合成酵素およびＲＮａｓｅ  ＬがＲＮＡ切断に必要とされる。２−５Ａ合成酵素は２’−５’オリゴアデニレート（２−５Ａ）を形成するために二本鎖ＲＮＡを必要とする。２−５Ａは次に、一本鎖ＲＮＡを切断する能力を有するＲＮａｓｅ  Ｌを利用するためのアロステリックエフェクターとして働く。二本鎖ＲＮＡを有する２−５Ａを形成する能力は、ウイルス複製の阻害にこの系を特に有用なものにしている。
【００６３】
（２’−５’）オリゴアデニレート構造はアンチセンス分子に共有結合で連結され、ＲＮＡ切断が可能なキメラオリゴヌクレオチドが形成される（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ、前記文献）。これらの分子は２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに結合して活性化し、オリゴヌクレオチド／酵素複合体は次に標的ＲＮＡ分子に結合し、それはＲＮａｓｅ酵素により分解されることができると推定されている。
【００６４】
酵素的核酸：一般に、酵素的核酸は最初に標的ＲＮＡに結合することにより作用する。そのような結合は標的を切断するために作用する分子の酵素的部分に近接して保たれている酵素的核酸の標的結合部分を通して起こる。従って、酵素的核酸は最初に標的ＲＮＡを認識し、次に相補的塩基対生成を通して標的ＲＮＡに結合し、一度正しい部位に結合されたら標的ＲＮＡを切断するように作用する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされているタンパク質の合成を指示するその能力を破壊するであろう。酵素的核酸がその標的に結合して切断した後は、別の標的を探すためにそのＲＮＡから放出され、新しい標的に繰り返して結合して切断できる。
【００６５】
治療的処置に影響する酵素的核酸の濃度はより低いので、酵素的核酸の酵素特性は著しい利点である。この利点は酵素的核酸が酵素的に作用するという能力を反映している。従って、一つの酵素的核酸分子は標的ＲＮＡの多くの分子を切断できる。加えて、酵素的核酸分子は高度に特異的な阻害剤であり、阻害の特異性は標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成機構のみでなく標的ＲＮＡ切断の機構にも依存している。切断部位近くの１つのミスマッチまたは塩基置換を選択して、酵素的核酸分子の触媒活性を完全に除去することができる。
【００６６】
エンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸分子は、ヌクレオチド塩基配列特異的様式で他の別のＲＮＡ分子を繰り返して切断できる。そのような酵素的核酸分子は実質的に任意のＲＮＡ転写体を標的にでき、インビトロで効果的な切断が達成される（Ｚａｕｇ  ｅｔ  ａｌ．，３２４，Ｎａｔｕｒｅ  ４２９  １９８６；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８７  Ｎａｔｕｒｅ  ３２８，５９６；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，８４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７８８，１９８７；Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，６，９２；Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，３３４  Ｎａｔｕｒｅ  ５８５，１９８８；Ｃｅｃｈ，２６０  ＪＡＭＡ  ３０３０，１９８８；およびＪｅｆｆｅｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１７  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３７１，１９８９；Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  前記文献）。
【００６７】
その配列特異性のため、トランス切断酵素的核酸分子はヒト疾患に対する治療剤として期待されている（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５  Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｒ，１９９５  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７）。酵素的核酸分子は細胞ＲＮＡのバックグラウンド内の特異的ＲＮＡ標的を切断するように設計できる。そのような切断はＲＮＡを非機能性とし、そのＲＮＡから発現されるタンパク質を消滅させる。この様式で、疾患状態に関連するタンパク質の合成が選択的に阻害される。
【００６８】
核酸触媒活性の最適化
本発明の方法を使用して記載および同定された酵素的核酸分子の触媒活性はＤｒａｐｅｒら（前記文献）により説明されているようにおよび本分野でよく知られた方法を使用して最適化できる。詳細はここでは繰り返されないが、酵素的核酸分子の結合アームの長さを変化させること、または血清リボヌクレアーゼによる分解を阻害しおよび／または酵素活性を促進する修飾（塩基、糖および／またはリン酸）を有する酵素的核酸分子を化学的に合成すること（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開番号第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開番号第ＷＯ９３／１５１８７号；Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開番号第ＷＯ９１／０３１６２号；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許番号第５，３３４，７１１号；およびＢｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，前記文献；これらはすべて酵素的核酸分子の塩基、リン酸および／または糖部分に行うことができる種々の化学修飾を記載している）を含む。細胞内における効力を促進する修飾、合成時間を短くし化学的要求性を低くするためのステムループ構造からの塩基の除去が望ましい。（これらのすべての文献は本明細書において援用される）。
【００６９】
有意に触媒に影響することなくおよび有意にヌクレアーゼ安定性および効力を促進することなく、核酸分子（例えば、酵素的核酸分子）内へ導入できる糖、塩基およびリン酸修飾を記載しているいくつかの例が本分野に存在する。酵素的核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基修飾（総説としてＵｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２  ＴＩＢＳ  １７，３４；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，１４０９０を参照されたい）による修飾により安定性を促進および／または触媒活性を促進するように修飾される。酵素的核酸分子の糖修飾は広範囲にわたって本分野で記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＰＣＴ番号第ＷＯ９２／０７０６５号；ＰｅｒＴａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際公開ＰＣＴ番号第ＷＯ９３／１５１８７号；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許番号第５，３３４，７１１号およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２；すべての参照文献は全体が本明細書において援用される、を参照されたい）。そのような論文は、触媒を阻害することなく、糖、塩基および／またはリン酸修飾などを取り込む位置を決定するための一般法および戦略を記載しており、本明細書において援用される。そのような教示を考慮すると、同様な修飾が本発明の核酸触媒を修飾するために本明細書に説明したように使用できる。
【００７０】
酵素活性を維持または促進する化学修飾を有する核酸触媒が提供される。そのような核酸分子は一般的に非修飾核酸よりもヌクレアーゼに対して高い耐性を有する。従って、細胞および／またはインビボにおいて、活性は有意に低くならない。本明細書で例示したように、そのような酵素的核酸分子は、たとえ全体の活性が１０分の１になっても細胞および／またはインビボにおいて有用である（Ｂｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）。そのような酵素的核酸分子は本明細書では酵素活性を”維持している”と記述される。
【００７１】
外から送達された治療的核酸分子（例えば、酵素的核酸分子およびアンチセンス核酸分子）は、望ましくないタンパク質のレベルが減少するように、最適には標的ＲＮＡの翻訳を十分長く阻害するまで細胞内で安定でなければならない。この時間は疾患状態に依存して数時間から数日の間で変化する。明らかに、これらの核酸分子は有効な細胞内治療剤として機能するためにヌクレアーゼに対して耐性でなければならない。本発明および本分野で記載されている核酸分子の化学合成の改良は、前記のようにヌクレアーゼ安定性を促進するためのヌクレオチド修飾の導入により、修飾核酸分子の能力を拡大した。
【００７２】
”促進された酵素活性”とは、活性が触媒活性および酵素的核酸分子安定性の両方を反映している、細胞および／またはインビボで測定された活性を含む。本発明において、これらの特性の積は、非修飾酵素的核酸分子と比較して、インビボで増加するかまたは有意に（１０分の１以下）減少しなかった。
【００７３】
さらに別の好適な態様において、酵素活性を維持または促進する化学修飾を有する核酸触媒が提供される。そのような核酸はまた一般的に非修飾核酸よりもヌクレアーゼに対して耐性が高い。従って、細胞および／またはインビボにおいて活性は有意に低下しないであろう。本明細書で例示したようにそのような酵素的核酸分子は、たとえ全体の活性が１０分の１になっても細胞および／またはインビボにおいて有用である（Ｂｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）。そのような酵素的核酸分子は本明細書では全ＲＮＡの酵素的核酸分子の酵素活性を”維持している”と記述される。
【００７４】
これらの分子の使用は併用療法の可能性を与えることにより疾患進行のより良好な処置を導くであろう（例えば、異なった遺伝子を標的にした多数の酵素的核酸分子、既知の小分子阻害剤と結合された酵素的核酸分子、または酵素的核酸分子（異なった酵素的核酸分子モチーフを含む）および／または他の化学または生物学的分子と組み合わせた間欠性処置）。核酸分子による患者の処置は、異なった型の核酸分子の組み合わせも含むであろう。疾患の徴候を軽減するために一つまたはそれ以上の標的に対する酵素的核酸分子（異なった酵素的核酸分子モチーフを含む）、アンチセンスおよび／または２−５Ａキメラ分子の混合物を含む治療が工夫されるであろう。
【００７５】
ヌクレオチド一、二または三リン酸および核酸分子の投与
本発明のヌクレオチド一リン酸、二リン酸または三リン酸または核酸分子は、単独でまたは他の医薬成分と組み合わせて治療薬として使用できる。本発明のこれらの分子はＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５；Ａｌｃｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２，１３９；およびアンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬の送達法、Ａｋｈｔａｒ編，１９９５（本明細書において援用される）の方法を使用して患者に投与できる。本発明の分子は当業者には知られている種々の方法により細胞に投与され、例えばリポソームへのカプセル化、イオン導入法により、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセルおよび生物接着性ミクロスフェアーのような他の賦形剤内に取り込ませることなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの適用では、酵素的核酸分子は前記の賦形剤と共に、または無しでエクスビボで細胞または組織に直接送達される。もしくは、修飾ヌクレオチド三リン酸、二リン酸または一リン酸／賦形剤の組み合わせが直接注射またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により局所的に送達される。送達の他の経路には、血管内、筋肉内、皮下または関節注射、エアロゾル吸入、経口（錠剤またはピル剤の形で）、局所的、全身的、眼内、腹腔内および／またはクモ膜下送達が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。より詳細な送達および投与の記述は本明細書において援用されるＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，前記文献およびＤｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ  ＷＯ９３／２３５６９に提供されている。
【００７６】
本発明の分子は医薬として使用できる。医薬は患者の疾患状態を防止し、発生を阻害し、または治療する（徴候をある程度、好適にはすべての徴候を軽減する）。
【００７７】
陰性に荷電した本発明のヌクレオチド一リン酸、二リン酸または三リン酸は、安定化剤、緩衝液などと（または無しで）医薬組成物を形成させ、任意の標準的手段で患者に投与または導入できる。リポソーム送達機構の使用が望まれる場合、リポソーム形成のための標準プロトコールに従うことができる。本発明の組成物はまた経口投与のための錠剤、カプセルまたはエリキシル；直腸投与のための座剤；滅菌溶液；注射可能な投与のための懸濁剤；などとして処方および使用されるであろう。
【００７８】
本発明はまた記載された化合物の医薬として受容可能な処方を含む。これらの処方には前記の化合物の塩、例えば、アンモニウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リチウムおよびカリウム塩が含まれる。
【００７９】
医薬組成物または処方とは、細胞または患者（好適にはヒト）への投与（例えば、全身投与）に適した形の組成物または処方を意味している。適した形は、一部は、例えば経口、経皮または注射によるような使用または投与経路に依存している。そのような形は、組成物または処方が標的細胞（即ち、陰性に荷電したポリマーが送達されるべきと望まれている細胞）に到達することを妨げてはならない。例えば、血流内へ注射される医薬組成物は可溶性であるべきである。他の因子は本分野で知られており、毒性および組成物または処方がその効果を果たすのを妨げる形のような考慮が含まれている。
【００８０】
”全身投与”とはインビボでの全身吸収または血流での薬剤の蓄積に続く全身を通しての分布を意味している。全身吸収を導く投与経路には静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内および筋肉内が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。これらの投与経路の各々は所望の陰性に荷電したポリマー（例えば、ＮＴＰ）を接近可能な疾患組織へ暴露させる。循環系内への薬剤の入り込み速度は分子量または大きさに関係している。本発明の化合物を含むリポソームまたは他の薬剤担体の使用は、例えば、網膜内皮系（ＲＥＳ）の組織のようなある種の組織型に薬剤を局在化させることができる可能性がある。リンパ球およびマクロファージのような、薬剤の細胞表面との結合を容易にできるリポソーム処方もまた有用である。この方法は、マクロファージまたはリンパ球による癌細胞のような異常細胞の免疫認識特異性を利用することにより標的細胞への薬剤送達を促進させる。
【００８１】
本発明はまたポリ（エチレングリコール）脂質を含む表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾、または長期循環リポソームまたはステルスリポソーム）から成る組成物の使用も特徴とする。これらの処方は標的細胞における薬剤の蓄積を増加させるための方法を提供する。この類の薬剤担体は単球食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および除去に抵抗し、それにより封入された薬剤のより長期の血流循環時間および促進された組織暴露を可能にしている（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームはおそらく血管新生化標的組織における血管外遊出および捕捉により、腫瘍に選択的に蓄積されることが示されている（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２６７，１２７５−１２７６；Ｏｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期循環リポソームは、ＭＰＳの組織に蓄積することが知られている通常の陽イオン性リポソームと比較すると特に、薬剤の薬物動態および薬力学を促進する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９６／１０３９１号；Ａｎｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９６／１０３９０号；Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９６／１０３９２；これらはすべて本明細書において援用される）。長期循環リポソームはまた、肝臓および脾臓のような代謝的に活動的なＭＰＳ組織での蓄積を避けるそれらの能力に基づき、陽イオン性リポソームと比較して非常にヌクレアーゼ分解から薬剤を保護しているようである。これらの参照文献のすべては本明細書において援用される。
【００８２】
本発明はまた、医薬として受容可能な担体または希釈剤中に医薬として有効量の所望の化合物を含む、貯蔵または投与のために製造された組成物も含む。治療的使用のために受容可能な担体または希釈剤は薬学分野ではよく知られており、例えば、本明細書において援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。例えば、保存剤、安定化剤、色素および芳香化剤が提供されるであろう（上掲、１４４９）。これらには安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。加えて、抗酸化剤および懸濁化剤を使用してもよい。
【００８３】
”患者”とは外殖細胞の供与者または受容者である生物体または細胞それ自体を意味している。”患者”とはまた、本発明の化合物が投与される生物体も意味している。好適には、患者は哺乳動物（例えば、ヒト）、霊長類または齧歯動物である。
【００８４】
薬理学的有効量とは、疾患状態を防止する、発生を阻害する、または処置する（徴候をある程度、好適にはすべての徴候を軽減する）のに必要とされる用量である。薬理学的有効量は疾患の型、使用される組成物、投与経路、処置されている哺乳動物の型、考慮されている特別な哺乳動物の生理学的特性、同時に行う薬物療法および当業者により認識されるであろうその他の因子に依存している。一般に、陰性に荷電したポリマーの効力に依存して、０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の量が許容される。一つの態様において、本発明は必要に応じ特定の細胞へ外来的に送達できる酵素的核酸分子を提供する。
【００８５】
本発明の核酸分子はまた、全体の治療効果を増加させるため、他の治療化合物と組み合わせて患者に投与される。適応症を処置するための多数の化合物の使用は有益な効果を増加させ、一方副作用を減少させるであろう。
【実施例１】
【００８６】
以下は非制限的な例であり、本発明のヌクレオチド三リン酸の合成、取り込み、および分析、そして酵素的核酸の活性を示す。
【００８７】
出願人はＤＭＡＰを反応に使用してピリミジンヌクレオチド三リン酸を合成した。プリンには当該分野で既に報告されている標準的なプロトコールを使用した（Yoshikawaら, 上記；Ludwig, 上記）。以下に記載するのはピリミジンヌクレオチド三リン酸およびプリンヌクレオチド三リン酸の合成の一例である。
【００８８】
実施例１：プリンヌクレオチド三リン酸の合成：２’−Ｏ−メチル−グアノシン−５’−三リン酸
２’−Ｏ−メチルグアノシンヌクレオシド（０．２５グラム、０．８４ｍｍｏｌ）をリン酸トリエチル（５．０ｍｌ）に、１００℃まで５分間加熱して溶解した。得られた無色透明の溶液を、氷浴を使用してアルゴン雰囲気下で０℃まで冷却した。次いでオキシ塩化リン（１．８当量、０．１４１ｍｌ）を激しく攪拌しながら反応混液に添加した。反応液をＨＰＬＣ（過塩素酸ナトリウムのグラジエントを使用）でモニタリングした。０℃で５時間後、トリブチルアミン（０．６５ｍｌ）を添加し、次いで無水アセトニトリル（１０．０ｍｌ）を添加し、５分後（０℃に再平衡化）ピロリン酸トリブチルアンモニウム（４．０当量、１．５３ｇ）を添加した。０℃で１５分後、反応混液を２０ｍｌの２Ｍ  ＴＥＡＢでクエンチングし（上記条件でのＨＰＬＣ分析は、１０分で一リン酸が消費されたことを示した）、その後室温で一晩攪拌し、混合液を減圧下でメタノールと共蒸発（４ｘ）させた後、５０ｍｌの０．０５Ｍ  ＴＥＡＢで希釈した。ＤＥＡＥセファデックス精製（０．０５から０．６ＭのＴＥＡＢグラジエント）を行い、純粋な三リン酸（０．５２ｇ、収率６６．０％）（０．３Ｍ  ＴＥＡＢ付近で溶出）を得た；純度はＨＰＬＣおよびＮＭＲ分析で確認した。
【実施例２】
【００８９】
実施例２：ピリミジンヌクレオチド三リン酸の合成：２’−Ｏ−メチルチオメチル−ウリジン−５’−三リン酸
２’−Ｏ−メチルチオメチル−ウリジンヌクレオシド（０．２７グラム、１．０ｍｍｏｌ）をリン酸トリエチル（５．０ｍｌ）に溶解した。得られた無色透明の溶液を、氷浴を使用してアルゴン雰囲気下で０℃まで冷却した。次いでオキシ塩化リン（２．０当量、０．１９０ｍｌ）を激しく攪拌しながら反応混液に添加した。ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．２当量、２５ｍｇ）を添加し、溶液を室温まで加温し、反応をＨＰＬＣ（過塩素酸ナトリウムのグラジエントを使用）でモニタリングした。２０℃で５時間後、トリブチルアミン（１．０ｍｌ）を添加し、次いで無水アセトニトリル（１０．０ｍｌ）を添加し、５分後ピロリン酸トリブチルアンモニウム（４．０当量、１．８ｇ）を添加した。２０℃で１５分後、反応混液を２０ｍｌの２Ｍ  ＴＥＡＢでクエンチングし（上記条件でのＨＰＬＣ分析は、１０分で一リン酸が消費されたことを示した）、その後室温で一晩攪拌した。混合液を減圧下でメタノールと共蒸発（４ｘ）させた後、５０ｍｌの０．０５Ｍ  ＴＥＡＢで希釈した。ＤＥＡＥ高速セファロース精製（０．０５から１．０ＭのＴＥＡＢグラジエント）を行い、ＨＰＬＣおよびＮＭＲ分析で確認したところ、純粋な三リン酸（０．４０ｇ、収率４４％）（０．３Ｍ  ＴＥＡＢ付近で溶出）を得た。
【実施例３】
【００９０】
実施例３：ウリジン５’−三リン酸合成におけるＤＭＡＰの使用
反応は、２０ｍｇアリコートのヌクレオシドを１ｍｌのリン酸トリエチルおよび１９μｌのオキシ塩化リンに溶解したもので実施した。反応を４０分間隔でＨＰＬＣで自動的にモニタリングし、１８時間までの時間に対する収量曲線を作成した。逆相カラムおよび酢酸アンモニウム／酢酸ナトリウムバッファー系（それぞれ５０ｍＭおよび１００ｍＭ、ｐＨ４．２）を使用して５’、３’、２’−一リン酸（一リン酸はこの順序で溶出する）を５’−三リン酸および出発ヌクレオシドから分離した。データを表２に示す。これらの条件により収量は２倍となり、最大収量が得られるまでの反応時間は１０倍改善した（９０％の収率を得るのに１２００分から１２０分に短縮）。５’−一リン酸化の選択性が全ての反応で観察された。その後の三リン酸化はほぼ同量の収率で発生した。
【００９１】
バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ反応に使用する物質
バッファー１：試薬を混合してバッファー１の１０Ｘストック溶液を調製する（４００ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．１）、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  スペルミジン、および０．１％  トリトンＸ−１００）。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、メタノール、ＬｉＣｌを添加してバッファーを希釈し、バッファー１の最終の反応液の条件が以下から成るようにする：４０ｍＭ  トリスｐＨ（８．１）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  スペルミジン、０．０１％  トリトンＸ−１００、１０％  メタノール、および１ｍＭ  ＬｉＣｌ。
【００９２】
バッファー２：試薬を混合してバッファー２の１０Ｘストック溶液を調製する（４００ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．１）、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  スペルミジン、および０．１％  トリトンＸ−１００）。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、ＰＥＧ、ＬｉＣｌを添加してバッファーを希釈し、バッファー２の最終の反応液の条件が以下から成るようにする：４０ｍＭ  トリスｐＨ（８．１）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  スペルミジン、０．０１％  トリトンＸ−１００、４％  ＰＥＧ、および１ｍＭ  ＬｉＣｌ。
【００９３】
バッファー３：試薬を混合してバッファー３の１０Ｘストック溶液を調製する（４００ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  スペルミジン、および０．０２％  トリトンＸ−１００）。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、ＰＥＧを添加してバッファーを希釈し、バッファー３の最終の反応液の条件が以下から成るようにする：４０ｍＭ  トリスｐＨ（８．０）、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  スペルミジン、０．００２％  トリトンＸ−１００、および４％  ＰＥＧ。
【００９４】
バッファー４：試薬を混合してバッファー４の１０Ｘストック溶液を調製する（４００ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  スペルミジン、および０．０２％  トリトンＸ−１００）。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、ＰＥＧ、メタノールを添加してバッファーを希釈し、バッファー４の最終の反応液の条件が以下から成るようにする：４０ｍＭ  トリスｐＨ（８．０）、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  スペルミジン、０．００２％  トリトンＸ−１００、１０％  メタノール、および４％  ＰＥＧ。
【００９５】
バッファー５：試薬を混合してバッファー５の１０Ｘストック溶液を調製する（４００ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  スペルミジン、および０．０２％  トリトンＸ−１００）。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、ＰＥＧ、ＬｉＣｌを添加してバッファーを希釈し、バッファー５の最終の反応液の条件が以下から成るようにする：４０ｍＭ  トリスｐＨ（８．０）、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  スペルミジン、０．００２％  トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＬｉＣｌ、および４％  ＰＥＧ。
【００９６】
バッファー６：試薬を混合してバッファー６の１０Ｘストック溶液を調製する（４００ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  スペルミジン、および０．０２％  トリトンＸ−１００）。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、ＰＥＧ、メタノールを添加してバッファーを希釈し、バッファー６の最終の反応液の条件が以下から成るようにする：４０ｍＭ  トリスｐＨ（８．０）、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  スペルミジン、０．００２％  トリトンＸ−１００、１０％  メタノール、および４％  ＰＥＧ。
【００９７】
バッファー７：試薬を混合してバッファー７の１０Ｘストック溶液を調製する（４００ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  スペルミジン、および０．０２％  トリトンＸ−１００）。ポリメラーゼ反応の開始に先立ち、ＰＥＧ、メタノール、およびＬｉＣｌを添加してバッファーを希釈し、バッファー７の最終の反応液の条件が以下から成るようにする：４０ｍＭ  トリスｐＨ（８．０）、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  スペルミジン、０．００２％  トリトンＸ−１００、１０％  メタノール、４％  ＰＥＧ、および１ｍＭ  ＬｉＣｌ。
【実施例４】
【００９８】
実施例４：変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる修飾型ヌクレオチド三リン酸のスクリーニング
それぞれの修飾型ヌクレオチド三リン酸をバッファー１から６中で、２つの異なる温度（２５および３７℃）で個々に試験した。２５℃で試験したバッファー１−６を条件１−６とし、３７℃で試験したバッファー１−６を条件７−１２とした（表３）。それぞれの条件で、Ｙ６３９Ｆ変異体Ｔ７ポリメラーゼ（SousaおよびPadilla、上記）（０．３−２ｍｇ／２０ｍｌ反応液）、ＮＴＰ（各２ｍＭ）、ＤＮＡテンプレート（１０ｐｍｏｌ）、無機ピロホスファターゼ（５Ｕ／ｍｌ）、およびα−32Ｐ  ＮＴＰ（０．８ｍＣｉ／ｐｍｏｌテンプレート）を合一し、表示した温度で１−２時間加熱した。使用した放射能標識したＮＴＰは試験する修飾型三リン酸と異なるものである。サンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。PhosphorImager（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を使用して完全長の転写産物の量を定量し、全ＲＮＡ対照反応液と比較した。データを表４に示す；それぞれの反応の結果を、全リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）対照に対するパーセントで表す。対照は変異体Ｔ７ポリメラーゼで、市販のポリメラーゼバッファー（Boehringer Mannheim, Indianapolis IN）を使用して行った。
【実施例５】
【００９９】
実施例５：野生型Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼを使用する修飾型ＮＴＰの取り込み
バクテリオファージＴ７  ＲＮＡをBoehringer Mannheimから０．４Ｕ／μＬの濃度で購入した。出願人は、反応液５０μＬに混合した酵素および０．２μＣｉ  アルファ−32Ｐ  ＮＴＰを市販のバッファーに補充したものを２ｍＭずつのヌクレオチド三リン酸と共に使用した。テンプレートは２本鎖ＰＣＲフラグメントであり、これは前のスクリーニングに使用したものである。反応は３７℃で１時間実施した。１０μＬのサンプルを７．５％分析用ＰＡＧＥで泳動し、PhosphorImagerを使用してバンドを定量した。“全リボ”対照（非修飾型ヌクレオチド三リン酸）と比較して結果を算出し、結果を表５に示す。
【実施例６】
【０１００】
実施例６：複数の修飾型ヌクレオチド三リン酸のオリゴヌクレオチドへの取り込み
修飾型ヌクレオチド三リン酸の組み合わせを実施例４に記載する転写プロトコールで試験し、２つ以上のこれらの三リン酸の取り込みの割合を測定した。２’−デオキシ−２’−（Ｌ−ヒスチジン）アミノウリジン（２’−ｈｉｓ−ＮＨ2−ＵＴＰ）の取り込みを、反応条件９番で非修飾型シチジンヌクレオチド三リン酸、γＡＴＰ、およびγＧＴＰを用いて試験した。データを全γＮＴＰ対照に対する修飾型ＮＴＰの取り込みのパーセンテージで表し、表６ａに示す。
【０１０１】
２つの修飾型シチジン（２’−ＮＨ2−ＣＴＰまたは２’ｄＣＴＰ）が２’−ｈｉｓ−ＮＨ2−ＵＴＰと共に同じ割合で取り込まれた。次いで２’−ｈｉｓ−ＮＨ2−ＵＴＰおよび２’−ＮＨ2−ＣＴＰを種々の非修飾型および修飾型アデノシン三リン酸を用いて同じバッファー中で試験した（表６ｂ）。２’−ｈｉｓ−ＮＨ2−ＵＴＰおよび２’−ＮＨ2−ＣＴＰの両方との取り込みに最良の修飾型アデノシン三リン酸は２’−ＮＨ2−ＤＡＰＴＰであった。
【実施例７】
【０１０２】
実施例７：修飾型ヌクレオチド三リン酸の取り込みのための反応条件の最適化
２’−ｈｉｓ−ＮＨ2−ＵＴＰ、２’−ＮＨ2−ＣＴＰ、２’−ＮＨ2−ＤＡＰ、およびγＧＴＰの組み合わせをいくつかの反応条件で（表７）、実施例９に記載する取り込みプロトコールを使用して試験した。結果が示すところによれば、試験したバッファー条件のうち、これらの修飾型ヌクレオチド三リン酸の取り込みはメタノールおよびＬｉＣｌの両方の存在下で起こる。
【実施例８】
【０１０３】
実施例８：２’−デオキシ−２’−アミノ修飾したＧＴＰおよびＣＴＰを使用する新規の酵素的核酸分子モチーフの選択
新規の酵素的核酸分子モチーフの選択のために、酵素的核酸分子のプールを、２つの基質結合アーム（５および１６ヌクレオチド長）および中間のランダムな領域を有するように設計した。基質は５’−末端のビオチン、プールの短い結合アームに相補的な５個のヌクレオチド、不対のＧ（所望の開裂部位）、およびプールの長い結合アームに相補的な１６個のヌクレオチドを有する。基質はアビジン−ビオチン複合体によってカラム樹脂に結合する。選択の一般的な過程を図２に示す。以下に記載するプロトコールは酵素的核酸分子の選択に使用しうる１つの可能な方法を表し、コンビナトリアル・ライブラリーを用いる酵素的核酸分子の選択の非制限的例として提供する。
【０１０４】
ライブラリーの構築：以下に挙げるオリゴヌクレオチドをOperon Technologies（Alameda, CA）によって合成した。テンプレートをゲル精製した後、製造者のプロトコールに従ってＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Waters, Millford MA）を通過させた。プライマー（ＭＳＴ３、ＭＳＴ７ｃ、ＭＳＴ３ｄｅｌ）は精製せずに使用した。
プライマー：
ＭＳＴ３（３０量体）：５’−ＣＡＣＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＧＴ−３’
ＭＳＴ７ｃ（３３量体）：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＡＣＣ−３’
ＭＳＴ３ｄｅｌ（１８量体）：５’−ＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＧＴ−３’
テンプレート：
ＭＳＮ６０ｃ（９３量体）：５’−ＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＧＴ（Ｎ）60ＧＧＴＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＴＧ−３’
ＭＳＮ４０ｃ（７３量体）：５’−ＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＧＴ（Ｎ）40ＧＧＴＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＴＧ−３’
ＭＳＮ２０ｃ（５３量体）：５’−ＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＧＴ（Ｎ）20ＧＧＴＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＴＧ−３’
【０１０５】
Ｎ６０ライブラリーはＭＳＮ６０ｃをテンプレート、ＭＳＴ３／ＭＳＴ７ｃをプライマーとして使用して構築した。Ｎ４０およびＮ２０ライブラリーはＭＳＮ４０ｃ（またはＭＳＮ２０ｃ）をテンプレート、ＭＳＴ３ｄｅｌ／ＭＳＴ７ｃをプライマーとして使用して構築した。
【０１０６】
１本鎖のテンプレートを以下のプロトコールによって２本鎖ＤＮＡに変換した：標準ＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ、およびｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した反応溶液１０ｍｌ中に５ｎｍｏｌのテンプレート、１０ｎｍｏｌの各プライマーを混合（試薬は全てBoerhinger Mannheimより入手）。合成サイクルの条件は９４℃、４分間；（９４℃、１分間；４２℃、１分間；７２℃、２分間）ｘ４；７２℃、１０分間。生成物をアガロースゲルでチェックし、それぞれのフラグメントの長さを確認し（Ｎ６０＝１２３ｂｐ、Ｎ４０＝９１ｂｐ、Ｎ２０＝７１ｂｐ）、その後フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行った。２本鎖生成物の濃度は２５μＭであった。
【０１０７】
最初のプールの転写は以下を含有する１ｍｌ容量中：５００ｐｍｏｌの２本鎖テンプレート（３ｘ１０14分子）、４０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．００２％  トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＬｉＣｌ、４％  ＰＥＧ８０００、１０％  メタノール、２ｍＭ  ＡＴＰ（Pharmacia）、２ｍＭ  ＧＴＰ（Pharmacia）、２ｍＭ  ２’−デオキシ−２’−アミノ−ＣＴＰ（ＵＳＢ）、２ｍＭ  ２’−デオキシ−２’−アミノ−ＵＴＰ（ＵＳＢ）、５Ｕ／ｍｌ  無機ピロホスファターゼ（Sigma）、５Ｕ／μｌ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ；場合によって、Ｙ６３９Ｆ変異体を０．１ｍｇ／ｍｌで使用した（SousaおよびPadilla、上記））、３７℃で２時間実施した。転写したライブラリーを変性ＰＡＧＥで精製し（Ｎ６０＝１０６ヌクレオチド、Ｎ４０＝７４、Ｎ２０＝５４）、得られた生成物をＳｅｐ−Ｐａｋカラムを使用して脱塩した後、エタノール沈殿を行った。
【０１０８】
最初のカラム選択：以下のビオチン化した基質を標準的なプロトコールを使用して合成した（Usmanら, 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845；Scaringeら, 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433；およびWincottら, 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2677−2684）：
５’−ビオチン−Ｃ１８スペーサー−GCC GUG GGU UGC ACA CCU UUC C−Ｃ１８スペーサー−チオール・モディファイアーＣ６Ｓ−Ｓ反転無塩基−３’
【０１０９】
基質を変性ＰＡＧＥおよびエタノール沈殿で精製した。１０ｎｍｏｌの基質を以下のプロトコールを使用してNeutrAvidinカラムに結合させた：４００μｌ  UltraLink固定化NeutrAvidinスラリー（２００μｌ  ビーズ、Pierce, Rockford, IL）をポリスチレンカラム（Pierce）に充填した。カラムを１ｍｌの結合バッファー（２０ｍＭ  ＮａＰＯ4（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で２回洗浄した後、キャップを閉じた（すなわちキャップをカラムの底に付けて流出を止めた）。結合バッファーに懸濁した基質２００μｌを適用し、溶液が樹脂に均一に結合および分配されるように時々ボルテックスで攪拌しながら室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、キャップを除去し、カラムを１ｍｌの結合バッファー、次いで１ｍｌのカラムバッファー（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ）で洗浄した。これでカラムはすぐに使用できる状態となり、キャップを閉じた。１ｎｍｏｌの最初のＲＮＡプールを２００μｌのカラムバッファーでカラムに負荷した。時々ボルテックスで攪拌しながら室温で３０分間インキュベートし、基質を結合させた。インキュベーション後、キャップを除去し、カラムを１ｍｌのカラムバッファーで２回洗浄してキャップを閉じた。２００μｌの溶出バッファー（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）をカラムに適用し、時々ボルテックスで攪拌しながら室温で３０分間インキュベートした。キャップを除去して４つの２００μｌ画分を、溶出バッファーを使用して回収した。
【０１１０】
第二のカラム（逆選択）：第二のカラムにおける事象の図式を一般的に図３に示し、使用される基質オリゴヌクレオチドを以下に示す：
５’−GGU UGC ACA CCU UUC C−Ｃ１８スペーサー−ビオチン反転無塩基−３’
【０１１１】
このカラム基質を前述のようにUltraLink NeutrAvidin樹脂に結合させ（４０ｐｍｏｌ）、溶出バッファーで２回洗浄した。第一のカラム精製からの溶出物を第二のカラムに適用した。このカラムを使用することにより、第一のカラムから非特異的に溶出された（diluted）ＲＮＡが結合し、一方、触媒事象を起こしてそれに結合した生成物を有するＲＮＡは、第二のカラムを通過して流出する。キャリアーとしてグリコーゲンを使用して画分をエタノールで沈殿させ、増幅のために無菌水で再水和させた。
【０１１２】
増幅：ＲＮＡおよびプライマーＭＳＴ３（１０−１００ｐｍｏｌ）を水中で、９０℃で３分間変性させ、その後氷上で１分間急冷した。以下の試薬を試験管に添加した（最終濃度を示す）：１Ｘ  ＰＣＲバッファー（Boerhinger Mannheim）、１ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＰＣＲのために。Boerhinger Mannheim）、２Ｕ／μｌ  ＲＮアーゼ−阻害剤（Boerhinger Mannheim）、１０Ｕ／μｌ  Superscript II逆転写酵素（BRL）。反応液を４２℃で１時間インキュベートし、その後９５℃で５分間インキュベートしてSuperscriptを破壊した。次いで以下の試薬を試験管に添加し、ＰＣＲ段階のために容量を５倍に増加させた（最終濃度／量を示す）：ＭＳＴ７ｃプライマー（１０−１００ｐｍｏｌ、ＲＴ段階と同じ量）、１Ｘ  ＰＣＲバッファー、ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．０２５−０．０５  Ｕ／μｌ、Boerhinger Mannheim）。反応は以下のようなサイクルで行った：９４℃、４分間；（９４℃、３０秒間；４２−５４℃、３０秒間；７２℃、１分間）ｘ４−３０サイクル；７２℃、５分間；３０℃、３０分間。サイクル数およびアニール温度はラウンド毎に決定した。ヘテロデュプレックスが観察された場合、反応液をフレッシュな試薬で５倍に希釈し、更に２回の増幅サイクルを進行させた。得られた生成物をアガロースゲルでサイズについて分析し（Ｎ６０＝１２３ｂｐ、Ｎ４０＝１０３ｂｐ、Ｎ２０=８３ｂｐ）、その後エタノール沈殿を行った。
【０１１３】
転写：増幅産物の転写は上記の条件に以下の変更を加えたものを使用して行った：１０−２０％の増幅反応液をテンプレートとして使用し、反応容量は１００−５００μｌであり、生成物のサイズはわずかに異なった（Ｎ６０＝１０６ヌクレオチド、Ｎ４０＝８６、Ｎ２０＝６６）。少量の32Ｐ−ＧＴＰを定量目的で反応液に添加した。
【０１１４】
以降のラウンド：以降の選択ラウンドには２０ｐｍｏｌのインプットＲＮＡおよび４０ｐｍｏｌの２２ヌクレオチド基質をカラムに使用した。
【０１１５】
プールの活性：プールの活性を、３から４ラウンド毎に１回転（turnover）の条件下でアッセイした。活性アッセイ条件は以下の通りである：５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、痕跡量の32Ｐ標識した基質、１０ｎＭ  ＲＮＡプール。バッファーに混合した２Ｘプール、およびバッファーに混合した２Ｘ基質を別々に９０℃で３分間、次いで３７℃で３分間インキュベートした。その後、等量の２Ｘ基質を２Ｘプールの試験管に添加した（ｔ＝０）。最初のアッセイの時点は４および２４時間とした：５μｌを除去し、８μｌの冷ＳＴＯＰバッファー（９６％  ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  ブロムフェニルブルー／キシレンシアノール）。サンプルを９０℃で３分間加熱し、２０％シーケンシング・ゲルに負荷した。Molecular Dynamics PhosphorimagerおよびImageQuaNTソフトウェアを使用して定量を行った。データを表８に示す。
【０１１６】
オリゴヌクレオチドのプールからのサンプルをベクター中にクローニングし、標準的なプロトコールを使用してシーケンシングした（Sambrookら, 分子クローニング：実験マニュアル, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。本出願に記載する方法を使用して、酵素的核酸分子を代表数のこれらのクローンから転写した。それぞれのプールからの個体をＮ６０およびＮ４０からのＲＮＡ開裂について試験するために、クローンからの酵素的核酸分子を、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＫＣｌに混合した５／１６基質と共に３７℃でインキュベートした。表１０のデータは、プールから単離された酵素的核酸分子がそれぞれに活性を有することを示している。
【０１１７】
動力学活性：表１０に示す酵素的核酸分子の動力学活性の測定は、酵素的核酸分子（１０ｎＭ）を開裂バッファー（ｐＨ８．５、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ）中で基質と共に３７℃でインキュベートして行った。
【０１１８】
マグネシウム依存性：Ｎ２０の１５ラウンド目のマグネシウム依存性を、ＭｇＣｌ2を変化させ、他の条件は一定に保持して（５０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１回転、１０ｎＭ  プール）試験した。データを表１１に示すが、マグネシウム濃度が増加するほど活性が増加することを示している。
【実施例９】
【０１１９】
実施例９：２’−デオキシ−２’−（Ｎ−ヒスチジル）アミノＵＴＰ、２’−フルオロ−ＡＴＰ、そして２’−デオキシ−２’−アミノＣＴＰおよびＧＴＰを使用する新規の酵素的核酸分子モチーフの選択
実施例８に記載した方法を、２’−デオキシ−２’−（Ｎ−ヒスチジル）アミノＵＴＰ、２’−フルオロ−ＡＴＰ、そして２’−デオキシ−２’−アミノＣＴＰおよびＧＴＰを使用して反復した。しかしながら、最初のカラムにおいてＭｇＣｌ2で開裂を誘引するのではなく、最初の無作為な修飾型ＲＮＡプールを以下のバッファー中で基質−樹脂に負荷した：５ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．２、１Ｍ  ＮａＣｌ、４℃。アンプルの洗浄後、樹脂を２２℃とし、バッファーを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2に変更した。Ｎ６０オリゴヌクレオチドのある選択では、２価のカチオン（ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2）を使用しなかった。樹脂を１０分間インキュベートして反応させ、溶出物を回収した。
【０１２０】
酵素的核酸分子プールは２価のカチオンの非存在下でも、存在する基質の１−３％を開裂する能力があり、バックグラウンド（修飾されたプールの非存在下）は０．２−０．４％であった。
【実施例１０】
【０１２１】
実施例１０：５−イミダゾ−ル酢酸２’−デオキシ−５’−三リン酸ウリジンの合成
５−ジニトロフェニルイミダゾール酢酸２’−デオキシウリジンヌクレオシド（８０ｍｇ）を５ｍｌのトリエチルリン酸にアルゴン下で攪拌しながら溶解し、反応混液を０℃まで冷却した。オキシ塩化リン（１．８当量、２２ｍｌ）を０℃で反応混液に添加し、更に３アリコートを４８時間の過程にわたって室温で添加した。次いで反応混液を無水ＭｅＣＮ（５ｍｌ）で希釈して０℃まで冷却し、その後トリブチルアミン（０．６５ｍｌ）およびピロリン酸トリブチルアンモニウム（４．０当量、０．２４ｇ）を添加した。４５分後、反応液を１０ｍｌのメチルアミン水で４時間クエンチングした。ＭｅＯＨ（３ｘ）と共蒸発させた後、物質をＤＥＡＥセファデックス、次いでＲＰクロマトグラフィーで精製し、１５ｍｇの三リン酸を得た。
【実施例１１】
【０１２２】
実施例１１：２’−（Ｎ−リシル）アミノ−２’−デオキシ−シチジン三リン酸の合成
２’−（Ｎ−リシル）アミノ−２’−デオキシ−シチジン（０．１８０ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をリン酸トリエチル（２．００ｍｌ）にアルゴン下で溶解した。溶液を氷浴中で０℃まで冷却した。オキシ塩化リン（９９．９９９％、３当量、０．０６７２ｍＬ）を溶液に添加し、反応液を０℃で２時間攪拌した。ピロリン酸トリブチルアンモニウム（４当量、０．４００ｇ）を３．４２ｍＬのアセトニトリルおよびトリブチルアミン（０．１６５ｍＬ）に溶解した。アセトニトリル（１ｍＬ）を一リン酸溶液に添加し、次いでピロリン酸溶液を滴加した。溶液は透明であった。反応液を室温まで温まらせた。４５分間の攪拌後、メチルアミン（５ｍＬ）を添加し、反応液を室温で２時間攪拌した。２層の混合物となった（フラスコの底部に小さいビーズが存在した）。ＴＬＣ（７：１：２  ｉＰｒＯＨ：ＮＨ4ＯＨ：Ｈ2Ｏ）は三リン酸物質の様相を示した。溶液を濃縮し、水に溶解し、新たに調製したＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラムに負荷した。カラムを０．６ＭまでのＴＥＡＢバッファーのグラジエントで洗浄し、生成物は画分９０−９５に溶出した。画分をイオン交換ＨＰＬＣで分析した。それぞれの画分は１つの三リン酸のピーク（約４．０００分に溶出）を示した。画分を合一し、メタノールからポンプダウン（pumped down）してバッファー塩を除去し、１５．７ｍｇの生成物を得た。
【実施例１２】
【０１２３】
実施例１２：２’−デオキシ−２’−（Ｌ−ヒスチジン）アミノシチジン三リン酸
２’−［Ｎ−Ｆｍｏｃ，Ｎimid−ジニトロフェニル−ヒスチジル］アミノ−２’−シチジン（０．３１０ｇ、４．０４ｍｍｏｌ）をアルゴン下でリン酸トリエチル（３ｍｌ）に溶解した。溶液を０℃まで冷却した。オキシ塩化リン（１．８当量、０．０６８ｍＬ）を溶液に添加し、冷凍庫で一晩保存した。翌朝ＴＬＣ（１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）は多くの出発物質を示したため、更に１当量のＰＯＣｌ3を添加した。２時間後、ＴＬＣはなおも出発物質を示した。トリブチルアミン（０．３０３ｍＬ）およびピロリン酸トリブチルアンモニウム（４当量、０．７３４ｇ）を６．３ｍＬのアセトニトリルに溶解したもの（滴加した）を一リン酸溶液に添加した。反応液を室温まで温まらせた。１５分間の攪拌後、メチルアミン（１０ｍＬ）を室温で添加し、攪拌を２時間継続した。ＴＬＣ  ７：１：２  ｉＰｒＯＨ：ＮＨ4ＯＨ：Ｈ2Ｏ）は三リン酸物質の様相を示した。溶液を濃縮し、水に溶解し、ＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラムに負荷した。カラムを０．６ＭまでのＴＥＡＢバッファーのグラジエントで洗浄し、生成物は画分１７０−１７９に溶出した。画分をイオン交換ＨＰＬＣで分析した。それぞれの画分は１つの三リン酸のピーク（−６．７７分に溶出）を示した。画分を合一し、メタノールからポンプダウンしてバッファー塩を除去し、１７ｍｇの生成物を得た。
【実施例１３】
【０１２４】
実施例１３：修飾したＮＴＰ（クラスＩモチーフ）を使用する新規の酵素的核酸分子モチーフのスクリーニング
出願人の最初のプールは３ｘ１０14の２’−アミノ−ｄＣＴＰ／２’−アミノ−ｄＵＴＰ  ＲＮＡの個別配列を含有した。出願人は転写条件を最適化して、メタノールおよび塩化リチウムを含ませることによってＲＮＡ生成物の量を増加させた。２’−アミノ−デオキシヌクレオチドは選択の逆転写および増幅段階に干渉せずにヌクレアーゼ耐性を与える。出願人は、無作為な４０ヌクレオチド領域で分離された、基質に相補的な２つの結合アームを有するようにプールを設計した。１６量体の基質は５および１０ヌクレオチド長の２つのドメインを有し、これらはプールに結合し、不対のグアノシンで分離されている。基質の５’−末端にはＣ１８リンカーで結合したビオチンがある。これによって、カラム・フォーマットのNeutrAvidin樹脂への基質の結合が可能となった。所望の反応液は、マグネシウム補助因子の添加時に不対のＧで開裂し、次いで５塩基対へリックスの不安定性によってカラムから解離させることである。詳細なプロトコールは以下の通りである：
【０１２５】
酵素的核酸分子プールの調製：最初のプールのＤＮＡを調製するために、以下のテンプレート・オリゴヌクレオチドをｔａｑポリメラーゼで充填して２本鎖ＤＮＡに変換した。（テンプレート＝5'−ACC CTC ACT AAA GGC CGT(N)40 GGT TGC ACA CCT TTC−3'；プライマー１＝5'−CAC TTA GCA TTA ACC CTC ACT AAA GGC CGT−3'；プライマー２＝5'−TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA AGG TGT GCA ACC−3'）。全てのＤＮＡオリゴヌクレオチドはオペロン法によって合成した。テンプレートオリゴを変性ＰＡＧＥおよびＳｅｐ−Ｐａｋクロマトグラフィーカラム（Waters）で精製した。ＲＮＡ基質オリゴは標準的な固相化学を使用し、変性ＰＡＧＥ、次いでエタノール沈殿で精製した。インビトロでの開裂アッセイのための基質は５’−末端をガンマ−32Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識し、変性ＰＡＧＥ精製、次いでエタノール沈殿を行った。
【０１２６】
５ｎｍｏｌのテンプレート、１０ｎｍｏｌの各プライマー、および２５０Ｕのｔａｑポリメラーゼを、１Ｘ  ＰＣＲバッファー（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌ）および０．２ｍＭの各ｄＮＴＰと共に１０ｍｌ容量中で以下のようにインキュベートした：９４℃、４分間；（９４℃、１分間；４２℃、１分間；７２℃、２分間）を４サイクル；そして７２℃、１０分間。生成物を２％  Ｓｅｐａｒｉｄｅアガロースゲルでサイズについて分析した後、フェノール緩衝液で２回、次いでクロロホルム−イソアミルアルコールで抽出し、エタノール沈殿を行った。５００ｐモル（３ｘ１０14分子）のこのＤＮＡを以下のように転写して最初のＲＮＡプールを生成した。テンプレートＤＮＡを４０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ  スペルミジン、０．００２％  トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＬｉＣｌ、４％  ＰＥＧ−８０００、１０％  メタノール、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＧＴＰ、２ｍＭ  ２’−アミノ−ｄＣＴＰ、２ｍＭ  ２’−アミノ−ｄＵＴＰ、５Ｕ／ｍｌ  無機ピロホスファターゼ、および５Ｕ／μｌ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに室温で添加し、総容量を１ｍｌとした。個々の反応液に痕跡量のアルファ−32Ｐ−ＧＴＰを検出のために含有させた。転写反応液を３７℃で２時間インキュベートし、次いで等量のＳＴＯＰバッファー（９４％  ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  ブロモフェノールブルー）を添加した。得られたＲＮＡを６％変性ＰＡＧＥゲル、Ｓｅｐ−Ｐａｋクロマトグラフィー、そしてエタノール沈殿で精製した。
【０１２７】
最初の選択：２ｎｍｏｌの１６量体５’−ビオチン化基質（５’−ビオチン−Ｃ１８リンカー−GCC GUG GGU UGC ACA C−３’）を、結合バッファー（２０ｍＭ  ＮａＰＯ4（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に混合したUltraLink固定化NeutrAvidin樹脂（４００μｌスラリー、Pierce）２００μｌに室温で３０分間結合させた。得られた基質カラムを２ｍｌの結合バッファー、次いで２ｍｌのカラムバッファー（５０ｍＭ  トリスーＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ）で洗浄した。キャップして流出を止め、１０００ｐｍｏｌの最初のプールＲＮＡを２００μｌのカラムバッファーに混合したものをカラムに添加し、室温で３０分間インキュベートした。カラムのキャップを除去し、２ｍｌのカラムバッファーで洗浄した後、キャップをして流出を止めた。２００μｌの溶出バッファー（＝カラムバッファー＋２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）をカラムに添加し、室温で３０分間インキュベートした。カラムのキャップを除去し、溶出物を回収した後、２００μｌの溶出バッファーで３回洗浄した。溶出物／洗浄液を、キャリアーとしてグリコーゲンを使用してエタノール沈殿し、５０μｌの無菌Ｈ2Ｏで再度水和した。溶出したＲＮＡを標準的な逆転写／ＰＣＲ増幅法で増幅した。５−３１μｌのＲＮＡを２０ｐｍｏｌのプライマー１と共に１４μｌ容量で９０℃３分間インキュベートした後、氷上に１分間放置した。以下の試薬を添加した（最終濃度を示す）：１Ｘ  ＰＣＲバッファー、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２Ｕ／μｌ  ＲＮアーゼ阻害剤、１０Ｕ／μｌ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  II  逆転写酵素。反応液を４２℃で１時間、次いで９５℃で５分間インキュベートし、逆転写酵素を不活性化した。次いで容量を１００μｌに増加させるために水およびＰＣＲのための試薬（１Ｘ  ＰＣＲバッファー、２０ｐｍｏｌ  プライマー２、および２．５Ｕ  ｔａｑＤＮＡポリメラーゼ）を添加した。Hybaid熱サイクラーで反応を行った：９４℃、４分間；（９４℃、３０秒間；５４℃、３０秒間；７２℃、１分間）ｘ２５；７２℃、５分間。生成物をアガロースゲルでサイズによって分析し、エタノール沈殿を行った。ＰＣＲ  ＤＮＡの１／３から１／５を使用して、次の世代の転写を１００μｌ容量で上記のように実施した。４０ｐｍｏｌの基質を含有するカラムに２０ｐｍｏｌのＲＮＡを使用して連続ラウンドを行った。
【０１２８】
２カラム選択：８世代目（Ｇ８）で、カラム選択を２カラム・フォーマットに変更した。２００ｐｍｏｌの２２量体５’−ビオチン化基質（５’−ビオチン−Ｃ１８リンカー−GCC GUG GGU UGC ACA CCU UUC C−Ｃ１８リンカー−チオール・モディフィアーＣ６  Ｓ−Ｓ反転無塩基−３’）を上記のように選択カラムに使用した。溶出を２００μｌの溶出バッファーで行い、次いで１ｍｌの溶出バッファーで洗浄した。１２００μｌの溶出物を重力によって生成物トラップカラムを通過させた。生成物トラップカラムは以下のように調製した：２００ｐｍｏｌ  １６量体５’−ビオチン化“生成物”（５’−GGU UGC ACA CCU UUC C−Ｃ１８リンカー−ビオチン−３’）を上記のようにカラムに結合させ、カラムを溶出バッファーで平衡化した。生成物カラムからの溶出物を前記のように沈殿させた。生成物を上記のように増幅したが、ただし２．５倍多い容量で１００ｐｍｏｌの各プライマーを使用した。１００μｌのＰＣＲ反応液をサイクル過程に使用した；残りの画分を、生成物に必要な最小限のサイクル回数で増幅した。３ラウンド後（Ｇ１１）、１回転の開裂アッセイで明らかな活性があった。１３世代目までに、４５％の基質が４時間で開裂した；プールのｋobsは２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2中で０．０３７分-1であった。出願人は１３世代目をサブクローニングおよびシーケンシングした；プールはまだ非常に多様であった。出願人の目的は生理学的条件下で作用する酵素的核酸分子なので、Ｇ１３を網羅的に分析するのではなく選択圧を変化することにした。
【０１２９】
Ｎ４０プールの再選択を、Ｇ１２  ＤＮＡから開始した。Ｇ１２  ＤＮＡの一部を超変異導入ＰＣＲに適用し（Vartanianら, 1996, Nucleic Acids Research 24, 2627−2631）、部位当たり１０％の頻度の変異を導入し、これをＮ４０Ｈとした。１９ラウンド目で、ＤＮＡの一部に再び超変異を導入し、Ｎ４０ＭおよびＮ４０ＨＭを得た（計４つの平行するプール）。カラム基質は同じままであった：バッファーを変更し、結合および溶出の温度を３７℃に上昇させた。カラムバッファーを生理学的バッファー（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ）で置き換え、溶出バッファーを１ｍＭ  Ｍｇバッファー（生理学的バッファー＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）で置き換えた。プールをカラムに結合させる時間は最終的に１０分間まで短縮し、溶出時間は徐々に３０分から２０秒に短縮した。１８ラウンド目と２３ラウンド目の間では、Ｎ４０プールのｋobsは0.035−0.04分-1で相対的に一定のままであった。４プールのそれぞれからの２２世代目をクローニングおよびシーケンシングした。
【０１３０】
クローニングおよびシーケンシング：１３世代目および２２世代目を、NovagenのPerfectly Blunt Cloningキット（ｐＴ７Ｂｌｕｅ−３ベクター）を使用してキットのプロトコールに従ってクローニングした。ベクター特異的プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、挿入物についてクローンをスクリーニングした。ABI Prism 7700配列検出システムおよびベクター特異的プライマーを使用して陽性クローンをシーケンシングした。配列はMacVectorソフトウェアを使用してアラインメントした；２次元の折りたたみはMulfoldソフトウェアを使用して行った（Zuker, 1989, Science 244, 48−52；Jaegerら, 1989, Biochemistry 86, 7706−7710；Jaegerら, 1989, R. F. Doolittle編, Methods in Enzymology, 183, 281−306）。個々のクローン転写ユニットをＰＣＲ増幅によって構築したが、これには５０ｐｍｏｌのプライマー１およびプライマー２のそれぞれを１ＸＰＣＲバッファーに混合したもの、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、そして２．５Ｕのｔａｑポリメラーゼを使用し、１００μｌ容量で以下のようなサイクルで行った：９４℃、４分間；（９４℃、３０秒間；５４℃、３０秒間；７２℃、１分間）Ｘ２０；７２℃、５分間。転写ユニットをエタノール沈殿し、３０μｌのＨ2Ｏに再度水和し、１０μｌを１００μｌ容量で転写し、前記のように精製した。
【０１３１】
各プールからの３６個のクローンをシーケンシングし、同じコンセンサス・モチーフの変種であることが観察された。独特なクローンを、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2および生理学的条件下で活性についてアッセイした；９個のクローンはコンセンサス配列を示し、その後の実験に使用した。活性が有意に上昇した変異は無かった；変異のほとんどはデュプレックスであると考えられる領域内であり、これは提案される２次構造に基づく。モチーフをより短くするために、出願人は増幅のためのプライマーに結合するのに必要な３’−末端の２５ヌクレオチドを削除した。完全長の分子および端を切断した分子の速度を測定したところ、どちらも０．０４分-1であった；従ってモチーフのサイズを８６から６１ヌクレオチドに減少させることができた。分子を更に一層短くするためにステム・ループ構造並びに基質認識アームの塩基対を切断し、４８ヌクレオチドの分子を得た。更に、多くのリボヌクレオチドを２−Ｏ−メチル修飾型ヌクレオチドで置換して分子を安定化した。新しいモチーフの例を図４に示す。当業者に認識されるように、分子は図に示す化学修飾に限定されず、図は１つの可能性のある化学修飾型分子を示しているにすぎない。
【０１３２】
反応速度分析
一回転の反応速度を、痕跡量の５’−32Ｐ−標識した基質および１０−１０００ｎＭの酵素的核酸分子のプールで行った。１Ｘ  バッファーに混合した２Ｘ  基質および１Ｘ  バッファーに混合した２Ｘ  プール／酵素的核酸分子を別々に９０℃で３分間インキュベートした後、３７℃まで３分間平衡化した。等量の２Ｘ  基質をプール／酵素的核酸分子にｔ0で添加し、反応液を３７℃でインキュベートした。各時点において、氷上、１．２容量のＳＴＯＰバッファー中でクエンチングした。サンプルを９０℃で３分間加熱した後、１５％シーケンシング・ゲルで分離した。PhosphorImagerを使用してゲルをイメージ化し、ImageQuantソフトウェア（Molecular Dynamics）を使用して定量した。曲線はほとんどの場合、二重指数減衰（double−exponential decay）に適合したが、いくつかの曲線は直線への適合が必要であった。
【０１３３】
安定性：血清安定性アッセイを先に記載されているように実施した（Beigelmanら, 1995, J. Biol. Chem. 270, 25702−25708）。１μｇの５’−32Ｐ−標識した合成の酵素的核酸分子を１３μｌの非標識物質に添加し、ヒト血清における減衰についてアッセイした。ゲルおよび定量は反応速度の項に記載した通りである。
【実施例１４】
【０１３４】
実施例１４：新しいモチーフを使用するＨＣＶの阻害
ＨＣＶ感染の際、ウィルスＲＮＡはいくつかの過程、すなわち、脱外被、翻訳、ＲＮＡの複製、およびパッケージングにおいて、酵素的核酸分子開裂の潜在的な標的として存在する。標的ＲＮＡは、これらの段階のいずれか一つで酵素的核酸分子開裂により高度に、またはより少なく利用されうる。ＨＣＶの開始リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と翻訳装置との会合はＨＣＶの５’ＵＴＲ／ルシフェラーゼ・レポーター系において擬態されるが（実施例９）、これらの他のウィルスの過程はＯＳＴ７系に表れない。得られるＲＮＡ／タンパク質複合体が標的ウィルスＲＮＡと会合したものも存在しない。更に、これらの過程はＨＣＶ感染細胞において連結し、標的ＲＮＡの利用のしやすさに強い影響を与えるであろう。従って、出願人はＨＣＶの５’−ＵＴＲを開裂するように設計した酵素的核酸分子がウィルスの複製システムに影響を与えるかどうかを試験した。
【０１３５】
近年、LuおよびWimmerはＨＣＶ−ポリオウィルス・キメラを特性決定したが、これはポリオウィルスのＩＲＥＳがＨＣＶ由来のＩＲＥＳで置換されたものである（LuおよびWimmer, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 1412−1417）。ポリオウィルス（ＰＶ）はＨＣＶと同様、ポジティブ鎖ＲＮＡウィルスであるが、ＨＣＶとは異なり、エンベロープを有さず、培養細胞中で効率的に複製する。ＨＣＶ−ＰＶキメラは、野生型ＰＶに比較して安定な小型プラークの表現型を発現する。
【０１３６】
新規の酵素的核酸分子モチーフが細胞内でＨＣＶ  ＲＮＡを阻害する能力を試験するために、ホタルおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼの両方を利用するデュアル・レポーター・システムを使用した（図５）。新規のクラスＩモチーフを有する多くの酵素的核酸分子を設計し、試験した（表XII）。５’ＨＣＶ  ＵＴＲ領域を標的とする新規の酵素的核酸分子モチーフは、開裂の際に転写産物のルシフェラーゼへの翻訳を阻害しうる。ＯＳＴ−７細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％  ペニシリン／ストレプトマイシン、および１％  Ｌ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ培養液中、黒色９６ウェルプレート（Packard）にウェル当たり１２，５００細胞で播種し、３７℃で一晩インキュベートした。５’−ＨＣＶ  ＵＴＲを発現するＴ７プロモーターおよびホタル・ルシフェラーゼを含有するプラスミド（Ｔ７Ｃ１−３４１（Wangら, 1993, J. of Virol. 67, 3338−3344））をｐＲＬＳＶ４０  ウミシイタケ対照プラスミド（Promega社）と、次いで酵素的核酸分子およびカチオン脂質と混合し、５Ｘ濃度の試薬を調製した（Ｔ７Ｃ１−３４１（４μｇ／ｍｌ）、ｐＲＬＳＶ４０  ウミシイタケ・ルシフェラーゼ対照（６μｇ／ｍｌ）、酵素的核酸分子（２５０ｎＭ）、トランスフェクション試薬（２８．５μｇ／ｍｌ）。
【０１３７】
複合体混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。培地を細胞から除去し、１２０μｌのOpti−mem培地をウェルに添加し、次いで３０μｌの５Ｘ  複合体混合物を添加した。１５０μｌのOpti−memを、未処理の細胞の入ったウェルに添加した。複合体混合物をＯＳＴ−７細胞上で４時間インキュベートし、受動溶菌バッファー（Promega社）で溶菌し、デュアル・ルシフェラーゼ・アッセイキットを使用し、製造者のプロトコールを使用して（Promega社）蛍光シグナルを定量した。図６に示すデータはＨＣＶ  ＲＮＡの部位１４６を標的とする酵素的核酸分子の用量曲線であり、ホタルおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼ蛍光間の比として表している。酵素的核酸分子は全ての酵素的核酸分子濃度でＨＣＶ  ＲＮＡの量を低下することができ、ＩＣ50は約５ｎＭとなった。他の部位も有効であり（図７）、特に１３３、２０９、および２７３を標的とする酵素的核酸分子は無関係な（ＩＲＲ）対照に比較してＨＣＶ  ＲＮＡを低下させることができた。
【実施例１５】
【０１３８】
実施例１５：完全に修飾したオリゴヌクレオチドを使用する基質の開裂
すべての２’位を修飾した酵素的核酸分子が標的ＲＮＡを開裂する能力を試験し、いずれのリボヌクレオチド部位が必要であるのかどうかを確認した。リボザイムを２’−Ｏ−メチルおよび２’−アミノ（ＮＨ2）修飾したヌクレオチドで構築し（表１２；遺伝子名：リボなし）、反応速度分析を実施例１３に記載するようにして行った。１００ｎＭの酵素的核酸を痕跡量の基質と、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2の存在下で生理学的条件（３７℃）で混合した。リボなしヌクレオチドはリボヌクレオチドを含有する表１２（リボ）に示す酵素的核酸分子に比較して０．１３のＫrelを有する。
【実施例１６】
【０１３９】
実施例１６：新規の酵素的核酸分子モチーフ（クラスIIモチーフ）のスクリーニング
選択は＞１０14の以下の配列の修飾型ＲＮＡのプールで開始した：５’−GGGAGGAGGAAGUGCCU(N)35UGCCGCGCUCGCUCCCAGUCC−３’。Rui Souzaによって調製された変異体Ｔ７  Ｙ６３９Ｆ  ＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡを酵素的に生成した。以下の修飾型ＮＴＰを導入した：２’−デオキシ−２’−フルオロ−アデニン三リン酸、２’−デオキシ−２’−フルオロ−ウリジン三リン酸または２’−デオキシ−２’−フルオロ−５−［（Ｎ−イミダゾール−４−アセチル）プロピルアミン］ウリジン三リン酸、および２’−デオキシ−２’−アミノ−シチジン三リン酸；天然型グアニジン三リン酸を全ての選択に使用し、アルファ−32Ｐ−ＧＴＰを使用してプールのＲＮＡを標識できるようにした。ＲＮＡプールを、変性ゲル電気泳動（８％  ポリアクリルアミド  ７Ｍ  尿素）で精製した。
【０１４０】
以下の標的ＲＮＡ（樹脂Ａ）を合成し、Iodoacetyl Ultralink樹脂（Pierce）に製造者の方法に従って結合させた：５’−b−L−GGACUGGGAGCGAGCGCGGCGCAGGCACUGAAG−L−S−B３’；式中、bはビオチン（Glenn Research カタログ＃10−1953−nn）、Lはポリエチレングリコール・スペーサー（Glenn Research カタログ＃10−1918−nn）、Sはチオール・モディファイアーＣ６  Ｓ−Ｓ（Glenn Research カタログ＃10−1936−nn）、Bは標準的な反転デオキシ無塩基。
【０１４１】
バッファーＡ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ）に混合した５μＭの樹脂Ａ  １００μｌにＲＮＡプールを添加し、２２℃で５分間インキュベートした。次いで温度を３７℃まで１０分間上昇させた。樹脂を５ｍｌのバッファーＡで洗浄した。バッファーＢ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＣａＣｌ2）を添加して反応を開始させた。第一世代で２０分間インキュベーションを継続し、逐次低下させて最終世代で１分間とした；合計１３世代。反応溶出物を５Ｍ  ＮａＣｌ中に回収し、最終濃度２ＭのＮａＣｌを得た。これに１００μｌの５０％  スラリーUltralink NeutraAvidin（Pierce）を添加した。２２℃で２０分間インキュベートし、開裂したビオチン生成物をアビジン樹脂に結合させた。次いで樹脂を５ｍｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、２Ｍ  ＮａＣｌで洗浄した。１．２ｍｌの変性洗浄液  １Ｍ  ＮａＣｌ、１０Ｍ  尿素により、９４℃で１０分間にわたって所望のＲＮＡを除去した。ＲＮＡを０．３Ｍ酢酸ナトリウム中で２回沈殿させ、逆転写を阻害するＣｌ-イオンを除去した。標準的なプロトコールの逆転写およびＰＣＲ増幅を実施した。ＲＮＡを上記の修飾型ＮＴＰで再び転写した。１３世代後、クローニングおよびシーケンシングにより、標的基質を開裂できる１４の配列を得た。６配列を特性決定し、二次構造および開裂反応速度を求めた。構造および反応速度のデータを図８に示す。他の８個の酵素的核酸分子の配列を表XIIIに示す。これらの分子のサイズ、配列、および化学組成は、上記の実施例１３および当業者に周知のように修飾することができる。
【０１４２】
核酸触媒の操作
クラスＩおよびクラスII酵素的核酸分子の配列、化学、および構造変異体を、本出願に示す方法および当該分野で知られる方法を使用して操作および再操作することができる。例えばクラスＩおよびクラスII酵素的核酸分子のサイズは当該分野で知られる方法（Zaugら, 1986, Nature, 324, 429；Ruffnerら, 1990, Biochem, 29, 10695；Beaudryら, 1990, Biochem., 29, 6534；McCallら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5710；Longら, 1994, 上記；Hendryら, 1994, BBA 1219, 405；Benselerら, 1993, JACS, 115, 8483；Thompsonら, 1996, Nucl. Acids Res., 24, 4401；Michelsら, 1995, Biochem., 34, 2965；Beenら, 1992, Biochem., 31, 11843；Guoら, 1995, EMBO. J., 14,368；Panら, 1994, Biochem., 33, 9561；Cech, 1992, Curr. Op. Struc. Bio., 2, 605；Sugiyamaら, 1996, FEBS Lett., 392, 215；Beigelmanら, 1994, Bioorg. Med. Chem., 4, 1715；Santoroら, 1997, PNAS 94, 4262；全て、その全体を本明細書の一部としてここに引用する）によって、リボザイムの全触媒活性が有意に低下しない程度まで小さく、あるいは大きくすることができる。
【０１４３】
当業者はここに記載するインビトロ選択戦略の更なるラウンドおよびその変法を使用して更なる核酸触媒を得ることができ、そのような新規の触媒も本発明の範囲内である。
【０１４４】
適用
本発明に記載するＮＴＰの使用法にはいくつかの研究および市販への適用がある。これらの修飾型ヌクレオチド三リン酸を、新規の機能を有するオリゴヌクレオチドのインビトロ選択（発展）に使用できる。インビトロ選択プロトコールの例を本明細書の一部としてここに引用する（Joyce, 1989, Gene, 82, 83−87；Beaudryら, 1992, Science 257, 635−641；Joyce, 1992, Scientific American 267, 90−97；Breakerら, 1994, TIBTECH 12, 268；Bartelら, 1993, Science 261:1411−1418；Szostak, 1993, TIBS 17, 89−93；Kumarら, 1995, FASEB J., 9, 1183；Breaker, 1996, Curr. Op. Biotech., 7, 442）。
【０１４５】
更に、これらの修飾型ヌクレオチド三リン酸を使用して修飾型オリゴヌクレオチドのコンビナトリアル化学ライブラリーを作成することができる。この技術に関するいくつかの文献があり（Brennerら, 1992, PNAS 89, 5381−5383, Eaton, 1997, Curr. Opin. Chem. Biol., 1, 10−16）、それらは全て本明細書の一部としてここに引用する。
【０１４６】
診断用途
本発明の酵素的核酸分子を診断手段として使用し、疾病に罹患した細胞内の遺伝的浮動および変異を検査する、または細胞において特定のＲＮＡの存在を検出してもよい。酵素的核酸分子の活性と標的ＲＮＡの構造間の密接な関係により、分子のいずれの領域においても、標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を変更する変異を検出することができる。本発明に記載する酵素的核酸分子を複数使用することにより、インビトロ並びに細胞および組織におけるＲＮＡの構造および機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングしうる。酵素的核酸分子による標的ＲＮＡの開裂を使用して遺伝子の発現を阻害し、疾病の進行における特定の遺伝子産物の役割を（本質的に）明らかにしうる。このような方法で、他の遺伝子標的を疾病の重要な介在物として明らかにしうる。これらの実験により、併用療法の可能性を与えることによって疾病の進行のよりよい治療ができるようになる（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数の酵素的核酸分子、既知の小型分子阻害剤に結合させた酵素的核酸分子、酵素的核酸分子および／または他の化学もしくは生物分子の組み合わせによる放射線もしくは間欠治療）。本発明の酵素的核酸分子の他のインビトロにおける使用は当業者に周知であり、関連する症状に関係するｍＲＮＡの存在の検出がある。そのようなＲＮＡの検出は、標準的な方法論を使用して酵素的核酸分子で処理した後、開裂産物の存在を確認することによって行う。
【０１４７】
特定の例では、標的ＲＮＡの野生型または変異型のみしか開裂できない酵素的核酸分子をアッセイに使用する。第一の酵素的核酸分子を使用してサンプル中の野生型ＲＮＡの存在を確認し、第二の酵素的核酸分子はサンプル中の変異型ＲＮＡを同定するのに使用する。反応対照として野生型および変異型の両方のＲＮＡの合成基質を両方の酵素的核酸分子で開裂し、反応における酵素的核酸分子の相対効率および“非標的”ＲＮＡ種を開裂しないことを明らかにする。合成基質からの開裂産物はサンプル集団中の野生型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーの生成にも役立つ。従ってそれぞれの分析は２つの酵素的核酸分子、２つの基質、および１つの未知のサンプルを必要とし、これらを組み合わせて６つの反応を行う。開裂産物の存在をＲＮアーゼ・プロテクション・アッセイを使用して確認し、各ＲＮＡの完全長および開裂フラグメントをポリアクリルアミドゲルの１レーンで分析できるようにする。標的細胞における変異体ＲＮＡの発現および所望の表現型の変化の推定されるリスクへの洞察を得るために、結果を必ずしも定量する必要はない。そのタンパク質産物が表現型の発生に関係するようなｍＲＮＡの発現はリスクを確立するのに十分である。同等の比活性のプローブを両方の転写産物に使用すれば、ＲＮＡレベルの定性的比較で十分であり、初期の診断のコストが低減する。ＲＮＡレベルを定性的に比較するにしても定量的に比較するにしても、より高い変異型と野生型の比率はより高いリスクと相関関係がある。
【０１４８】
更なる使用法
本発明の配列特異的酵素的核酸分子の潜在的な有用性は、ＲＮＡの研究のための多くの同様の適用を有し、これはＤＮＡ制限ヌクレアーゼがＤＮＡの研究のために有するものである（Nathansら, 1975 Ann. Rev. Biochem. 44:273）。例えば、制限フラグメントのパターンを使用して２つの関連するＲＮＡ間の配列の関係を確立することができ、大型のＲＮＡは研究のために有用なサイズのフラグメントに特異的に開裂できる。酵素的核酸分子の配列特異性を操作できることは未知の配列のＲＮＡの開裂に理想的である。出願人は、細菌、微生物、真菌、ウィルス、および真核系（植物または哺乳動物細胞を含む）における標的遺伝子の遺伝子発現を抑制的に調節するための核酸分子の使用について記載する。
【０１４９】
本明細書で言及する特許および出版物は全て、本発明が属する分野の技術者のレベルを示すものである。本明細書で引用する参考文献は全て、それぞれの参考文献が個別にその全体を参照によって組み込まれたように同じ程度まで、参照により本明細書の一部として組み込まれる。
【０１５０】
当業者に容易に評価されるように、本発明は目的を実施し、言及した結果及び利点、並びにそれに固有のものを得るために十分である。現在の好ましい態様の代表例としてここに記載する方法および組成物は例証であり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。その変更および他の使用法が当業者に着想されるであろうが、これは本発明の意図に含まれ、請求項の範囲で定義される。
【０１５１】
当業者に容易に明らかなように、種々の置換および修飾を、本発明の範囲および意図から逸脱することなくここに開示する本発明に施与してもよい。従ってそのような更なる態様は本発明および上記の請求項の範囲内である。
【０１５２】
ここに適切に例証的に記載する本発明を、要素、制限（ここに特に記載はしない）の非存在下で実施してもよい。従って、例えばここでのそれぞれの例で、“を含む”、“本質的に・・・から成る”、および“から成る”という用語のいずれかを他の２つのいずれかで置き換えてもよい。使用した用語および表現は説明に関係して使用するものであり、制限ではなく、そのような用語および表現の使用において表示および記載される特徴の同等物またはその一部を除外することを意図するものではなく、理解されるように種々の修飾が請求する本発明の範囲内で可能である。従って、本発明は好ましい態様で明確に開示したが、ここに開示するコンセプトの任意の特性、修飾、および変法に当業者が頼ってもよく、そのような修飾および変法が明細書および付帯の請求項に定義されるような本発明の範囲内であると考慮されることは理解されるべきである。
【０１５３】
更に、本発明の特徴または観点をマーカッシュのグループまたはそれに代わる他のグループの見地から記載する場合、当業者に認識されるように本発明はマーカッシュのグループまたは他のグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの見地からも記載される。
【０１５４】
従って更なる態様は本発明の範囲および上記の請求項に含まれる。
【０１５５】
【表１】
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【０１５６】
【表２】
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【０１５７】
【表３】
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【０１５８】
【表４】
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【０１５９】
【表５】
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【０１６０】
【表６】
2004147666.tif 000011
【０１６１】
【表７】
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【０１６２】
【表８】
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【０１６３】
【表９】
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【０１６４】
【表１０】
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【０１６５】
【表１１】
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【０１６６】
【表１２】
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【０１６７】
【表１３】
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【０１６８】
【表１４】
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【０１６９】
【表１５】
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【０１７０】
【表１６】
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【０１７１】
【表１７】
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【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１はヌクレオシド基質を使用するＮＴＰ合成のスキームを示している。
【図２】図２はインビトロ選択法のためのスキームを示している。
【図３】図３は二カラムインビトロ選択法のスキームを示している。
【図４】図４は新規な４８ヌクレオチドの酵素的核酸モチーフの図解である。
【図５】図５はクラスＩ酵素的核酸分子モチーフの効力を示すために使用されたＨＣＶルシフェラーゼアッセイのスキームを示している。
【図６】図６はＨＣＶ  ＲＮＡ上の部位１４６を標的とする酵素的核酸分子の用量曲線を示しているグラフである。
【図７】図７はＨＣＶ  ＲＮＡ内の４つの部位を標的とする酵素的核酸分子が細胞中のＲＮＡレベルを減少させうることを示している棒グラフである。
【図８】図８は特徴付けられたクラスＩＩ酵素的核酸モチーフの二次構造および切断速度を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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