(57)【要約】【課題】　ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体の配向が、エネルギーがドナー蛍光体とアクセプター蛍光体の間で有効に転移されるようなものであるようなエネルギー転移蛍光色素。【解決手段】　アルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環及び６員環又は縮合環構造からなる群から選ばれた官能基であって、キサンテン環構造を有し、第一波長の光を吸収し、応答して励起エネルギーを放出することができるドナー色素を含む第一置換基及びドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二波長で蛍光を発することができるアクセプター色素を含む第二置換基を有する官能基を含む化合物。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環及び６員環又は縮合環構造からなる群から選ばれた官能基であって、キサンテン環構造を有し、第一波長の光を吸収し、応答して励起エネルギーを放出することができるドナー色素を含む第一置換基及びドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二波長で蛍光を発することができるアクセプター色素を含む第二置換基を有する官能基を含む化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は蛍光色素、更に詳しくは、エネルギー転移蛍光色素及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
　サンプル中の成分を標識し、検出するための種々の蛍光色素が開発されていた。一般に、蛍光色素は高い量子収量及び大きい吸光係数を有することが好ましく、その結果、色素は少量の検出される成分を検出するのに使用し得る。また、蛍光色素は大きいストークスシフト（即ち、色素が最大吸光度を有する波長と色素が最大発光を有する波長の差）を有することが好ましく、その結果、蛍光発光が色素を励起するのに使用された光源から容易に区別される。開発された蛍光色素の一つのクラスはエネルギー転移蛍光色素である。一般に、エネルギー転移蛍光色素はドナー蛍光体とアクセプター蛍光体とを含む。これらの色素において、ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体が互いに接近して、かつ互いに対し適当な配向で位置される場合、ドナー蛍光体からのエネルギー放出がアクセプター蛍光体により吸収され、アクセプター蛍光体に蛍光を発するようにさせる。それ故、励起されたドナー蛍光体はドナー蛍光体の励起エネルギーを有効に吸収し、そのエネルギーをアクセプター蛍光体に有効に転移することができることが重要である。種々のエネルギー転移蛍光色素が文献に記載されていた。例えば、米国特許第４，９９６，１４３号及びＷＯ　９５／２１２６６は、ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体がオリゴヌクレオチド鎖により結合されているエネルギー転移蛍光色素を記載している。Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２０：１０２４７１−２４８３（１９９２）はフルオレセインの４’−アミノメチル置換基により４’−アミノメチル−５−カルボキシフルオレセインに結合された５−カルボキシローダミンを含むエネルギー転移蛍光色素を記載している。
【０００３】
　幾つかの診断アッセイ及び分析アッセイが開発されており、これらは蛍光色素を使用するサンプル中の多種成分の検出、例えば、フローサイトメトリー（Ｌａｎｉｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２　１５１−１５６（１９８４））、染色体分析（Ｇｒａｙら，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ　７３９−３７（１９７９））、及びＤＮＡ配列決定を伴う。これらのアッセイについて、２種以上のスペクトル的に分解可能な蛍光色素の組を同時に使用することが望ましく、その結果、一種より多い標的物質がサンプル中で同時に検出し得る。多種色素を使用するサンプル中の多種成分の同時検出はサンプル中の個々の成分を連続的に検出するのに必要とされる時間を短縮する。多重遺伝子座ＤＮＡプローブアッセイの場合、多種のスペクトル的に分解可能な蛍光色素の使用は必要とされる反応管の数を減少し、それにより実験プロトコルを簡素化し、用途特異性キットの製造を促進する。自動化ＤＮＡ配列決定の場合、多種のスペクトル的に分解可能な蛍光色素の使用は単一レーン中の４つの塩基の全ての分析を可能にし、それにより単色方法よりも処理量を増大し、レーン内の電気泳動移動度変化と関連する不確定要素を排除する。Ｃｏｎｎｅｌｌら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　５　３４２−３４８（１９８７）、Ｐｒｏｂｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８　３３６−３４１（１９８７）、Ｓｍｉｔｈら，Ｎａｔｕｒｅ　３２１　６７４−６７９（１９８６）、及びＡｎｓｏｒｇｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１５４５９３−４６０２（１９８９）。
【０００４】
特に、電気泳動分離及び酵素による処理を必要とする分析、例えば、ＤＮＡ配列決定について、サンプル中の多種の標的物質を同時に検出するための蛍光色素の組を得ることと関連した幾つかの難点がある。例えば、その組中の夫々の色素はその他の色素からスペクトル的に分解可能である必要がある。発光スペクトルがスペクトル的に分解される色素の収集を見出すことは困難である。何となれば、有機蛍光色素に典型的な発光バンド半幅は約４０−８０ナノメーター（ｎｍ）であり、利用可能なスペクトルの幅が励起光源により制限されるからである。色素の組に関して本明細書に使用される“スペクトル的分解”という用語は、色素の蛍光発光バンドが充分に異なり、即ち、充分に重ならないこと、夫々色素が結合される試薬、例えば、ポリヌクレオチドが通常の光検出系を使用して、例えば、米国特許第４，２３０，５５８号、同第４，８１１，２１８号、またはＷｈｅｅｌｅｓｓら，ｐｇｓ．２１−７６，Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄ　Ｄａｔａ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８５）により記載された系に例示されるような、バンドパスフィルター及び光電子増倍管の組、電荷カップリング装置及びスペクトログラフ等の系を使用して夫々の色素により生じた蛍光シグナルに基いて区別し得ることを意味する。
【０００５】
また、夫々の色素の蛍光シグナルは、夫々の成分が充分な感度で検出し得るように充分に強いものである必要がある。例えば、ＤＮＡ配列決定の場合、増大されたサンプル装填は低い蛍光効率の保証とはなり得ない（Ｐｒｉｎｇｌｅら，ＤＮＡ　ＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｉｅｓ　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，１　１５−２１（１９８８））。色素により生じた蛍光シグナルは、色素がその吸光度最大で励起される時に一般に最大である。それ故、夫々の色素はほぼその吸光度最大で励起されることが好ましい。色素の組の使用と関連する更に別の難点は、色素が一般に同じ吸光度最大を有しないことである。同じ吸光度最大を有しない色素の組が使用される場合、夫々の色素をその吸光度最大で励起するのに多光源を用意することと関連する高コストと、夫々の色素がその吸光度最大で励起されないことから生じる低感度の間に取決めが生じられる。上記の難点に加えて、色素の電荷、分子サイズ、及び配座がフラグメントの電気泳動移動度に悪影響してはならない。また、蛍光色素はフラグメントを生じ、または操作するのに使用される化学、例えば、ＤＮＡ合成溶媒及び試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素等と適合性である必要がある。特に４色ＤＮＡ配列決定の領域において、多色用途のために色素の組を開発する際の多くの束縛のために、蛍光色素の少ない組のみが開発されていた。Ｃｏｎｎｅｌｌら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　５　３４２−３４８（１９８７）、Ｐｒｏｂｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８　３３６−３４１（１９８７）及びＳｍｉｔｈら，Ｎａｔｕｒｅ　３２１　６７４−６７９（１９８６）。
【０００６】
多色用途に有益であることがわかった蛍光色素の一つのクラスはローダミン色素、例えば、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン１１０（Ｒ１１０）等である。米国特許第５，３６６，８６０号。ローダミン色素は蛍光色素に関して特に魅力的である。何となれば、（１）ローダミンは典型的にはフルオレセインより光安定性であり、（２）ローダミン標識ジデオキシヌクレオチドが熱安定性ポリメラーゼ酵素に良好な基質であり、かつ（３）ローダミン色素の発光スペクトルがフルオレセインの赤色（高い波長）に対し顕著であるからである。特に多重検出方法の状況において、現在入手し得るローダミン色素に関連する一つの欠点はローダミン色素の比較的広い発光スペクトルである。この広い発光スペクトルはスペクトル上近い色素間のスペクトル分解を制限し、このような色素組み合わせの多成分分析を困難にする。現在入手し得るローダミン色素に関連する第二の欠点は、それらの吸収スペクトルが現在入手し得るソリッドステート周波数二倍グリーンダイオードレーザー、例えば、約５３２ｎｍで発光ラインを有するネオジムソリッドステートＹＡＧレーザーの波長に適合しないことである。このようなレーザーを使用することは、それらのコンパクトなサイズ、長い有効寿命、及び出力の効率の良い使用のために非常に有利である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
　エネルギー転移蛍光色素は、それらをサンプル中の多種標的物質の同時検出、例えば、ＤＮＡ配列決定における使用に魅力的にする幾つかの特徴を有する。例えば、単色ドナー蛍光体は、夫々の色素が共通の波長で強い吸収を有するようにエネルギー転移蛍光色素の組中で使用し得る。その時、アクセプター蛍光体をエネルギー転移色素中で変化することにより、スペクトル的に分解可能な蛍光発光を有する一連のエネルギー転移色素が発生し得る。また、エネルギー転移蛍光色素は非エネルギー転移蛍光色素よりも大きい有効なストークスシフトを与える。これは、エネルギー転移蛍光色素に関するストークスシフトがドナー蛍光体が光を最大に吸収する波長とアクセプター蛍光体が光を最大に放出する波長の差に基いているからである。一般に、大きなストークスシフトを有する蛍光色素に対する要望が存する。蛍光色素を使用するアッセイの感度は、蛍光色素により生じた蛍光シグナルの強さに依存する。それ故、強い蛍光シグナルを有する蛍光色素に対する要望が存する。エネルギー転移蛍光色素に関して、これらの色素の蛍光シグナル強さは、如何に有効にアクセプター蛍光体がドナー蛍光体のエネルギー放出を吸収するかに依存する。これは、順に、アクセプター蛍光体へのドナー蛍光体の近接及びアクセプター蛍光体に対するドナー蛍光体の配向を含む種々の変数に依存する。それ故、ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体の配向が、エネルギーがドナー蛍光体とアクセプター蛍光体の間で有効に転移されるようなものであるようなエネルギー転移蛍光色素に対する要望が存する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
　項目１　第一波長の光を吸収し、応答して励起エネルギーを放出することができるドナー色素；ドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二波長で蛍光を発することができるアクセプター色素；及びドナー色素より放出された励起エネルギーをアクセプター色素が実質的にすべて吸収するようにドナー色素をアクセプター色素に結合するリンカーであって、アルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環及び６員環または縮合環構造からなる群から選ばれた置換基を含むリンカーを含むエネルギー転移色素。
　項目２　構造式　
【化ＡＡ】
2004068023.tif 000002
（式中、Ｙ１及びＹ２は夫々独立にヒドロキシル、酸素、イミニウム及びアミンからなる群から選ばれ、Ｒ１１〜Ｒ１３及びＲ１５〜Ｒ１７は夫々独立に水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる）を有する項目１に記載のエネルギー転移色素。
　項目３　エネルギー転移色素が構造式
【化ＡＢ】
2004068023.tif 000003
（式中、Ｙ１’及びＹ２’は夫々独立にヒドロキシル、酸素、イミニウム及びアミンからなる群から選ばれ、Ｒ１１’〜Ｒ１６’は夫々独立に水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、Ｘ１’〜Ｘ５’はドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二波長で蛍光を発することができるアクセプター色素に相当するように選ばれ、かつＸ３’及びＸ４’の一つはリンカーを含む）を有する項目１に記載のエネルギー転移色素。
　項目４　エネルギー転移色素が構造式
【化ＡＣ】
2004068023.tif 000004
（式中、Ｙ１、Ｙ１’、Ｙ２及びＹ２’は夫々独立にヒドロキシル、酸素、イミニウム及びアミンからなる群から選ばれ、Ｒ１１〜Ｒ１３、Ｒ１５〜Ｒ１７及びＲ１１’〜Ｒ１６’は夫々独立に水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、Ｘ１’〜Ｘ５’は夫々独立に水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、Ｙ１、Ｙ２、Ｒ１１〜Ｒ１３及びＲ１５〜Ｒ１７は第一波長の光を吸収し、応答して励起エネルギーを放出することができるドナー色素に相当するように選ばれ、Ｙ１’、Ｙ２’、Ｒ１１’〜Ｒ１６’及びＸ１’〜Ｘ５’はドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二波長で蛍光を発することができるアクセプター色素に相当するように選ばれ、かつＸ３’及びＸ４’の一つはリンカーを含む）を有する項目１に記載のエネルギー転移色素。
　項目５　構造式　
【化ＡＤ】
2004068023.tif 000005
（式中、Ｙ１、Ｙ１’、Ｙ２及びＹ２’は夫々独立にヒドロキシル、酸素、イミニウム及びアミンからなる群から選ばれ、Ｒ１１〜Ｒ１６及びＲ１１’〜Ｒ１６’は夫々独立に水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、Ｘ１〜Ｘ５及びＸ１’〜Ｘ５’は夫々独立に水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、Ｙ１、Ｙ２、Ｒ１１〜Ｒ１６及びＸ１〜Ｘ５は第一波長の光を吸収し、応答して励起エネルギーを放出することができるドナー色素に相当するように選ばれ、Ｙ１’、Ｙ２’、Ｒ１１’〜Ｒ１６’及びＸ１’〜Ｘ５’はドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二波長で蛍光を発することができるアクセプター色素に相当するように選ばれ、かつＸ３及びＸ４の一つ並びにＸ３’及びＸ４’の一つは一緒にされてリンカーを形成する）を有する項目１に記載のエネルギー転移色素。
　項目６　リンカー置換基がシクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、プラジンオキサジン、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドール及びナフタレンからなる群から選ばれた５員環または６員環を含む項目１に記載のエネルギー転移色素。
　項目７　アクセプター色素がキサンテン色素、シアニン色素、フタロシアニン色素及びスクアライン色素からなる群から選ばれた色素のクラスの一員である項目１に記載のエネルギー転移色素。
　項目８　ドナー色素が色素のキサンテンクラスの一員である項目１に記載のエネルギー転移色素。
　項目９　アクセプター色素がキサンテン色素、シアニン色素、フタロシアニン色素及びスクアライン色素からなる群から選ばれた色素のクラスの一員である項目１に記載のエネルギー転移色素。
　項目１０　ドナー色素がフルオレセイン色素、ローダミン色素及び非対称ベンゾキサンテン色素からなる群から選ばれた色素のクラスの一員である項目１に記載のエネルギー転移色素。
　項目１１　アクセプター色素がキサンテン色素、シアニン色素、フタロシアニン色素及びスクアライン色素からなる群から選ばれた色素のクラスの一員である項目１０に記載のエネルギー転移色素。
　項目１２　ドナー色素がカルボキシフルオレセイン、４，７−ジクロロフルオレセイン色素、非対称ベンゾキサンテン色素、ローダミン、４，７−ジクロロローダミン色素、カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルカルボキシローダミン、カルボキシＲ１１０、及びカルボキシＲ６Ｇからなる群から選ばれる項目１に記載のエネルギー転移色素。
　項目１３　アクセプター色素が４，７−ジクロロフルオレセイン色素、非対称ベンゾキサンテン色素、ローダミン、４，７−ジクロロローダミン色素、カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルカルボキシローダミン、カルボキシＲ１１０、カルボキシＲ６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン及びＣｙ５　からなる群から選ばれる項目１に記載のエネルギー転移色素。
　項目１４　アクセプター色素がＤＲ１１０−２、ＤＲ６Ｇ−２、ＤＴＭＲ及びＤＲＯＸからなる群から選ばれる項目１に記載のエネルギー転移色素。
　項目１５　エネルギー転移蛍光色素に結合されるように修飾された、ヌクレオシド、ヌクレオシドモノホスフェート、ヌクレオシドジホスフェート、ヌクレオシドトリホスフェート、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類縁体からなる群から選ばれた試薬と、試薬に結合された項目１〜１４のいずれか１項に記載のエネルギー転移蛍光色素とを含む蛍光標識された試薬。
　項目１６　試薬がデオキシヌクレオシド、デオキシヌクレオシドモノホスフェート、デオキシヌクレオシドジホスフェート及びデオキシヌクレオシドトリホスフェートからなる群から選ばれる項目１５に記載の蛍光標識された試薬。
　項目１７　デオキシヌクレオチドがデオキシシトシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、及びデオキシチミジンからなる群から選ばれる項目１６に記載の蛍光標識された試薬。
　項目１８　試薬がジデオキシヌクレオシド、ジデオキシヌクレオシドモノホスフェート、ジデオキシヌクレオシドジホスフェート及びジデオキシヌクレオシドトリホスフェートからなる群から選ばれる項目１５に記載の蛍光標識された試薬。
　項目１９　ジデオキシヌクレオチドがジデオキシシトシン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシグアノシン、及びジデオキシチミジンからなる群から選ばれる項目１８に記載の蛍光標識された試薬。
　項目２０　試薬がオリゴヌクレオチドである項目１５に記載の蛍光標識された試薬。
　項目２１　オリゴヌクレオチドがポリメラーゼを使用することにより延長可能である３’末端を有する項目１５に記載の蛍光標識された試薬。
　項目２２　核酸配列をデオキシヌクレオシドトリホスフェート、少なくとも一種のジデオキシヌクレオシドトリホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリッドを形成することにより延長された標識されたプライマーの混合物を生成し（そのＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの延長を終止するジデオキシヌクレオシドトリホスフェートがとり込まれるまでデオキシヌクレオシドトリホスフェートでプライマーを延長する）、延長されたプライマーの混合物を分離し、そして生成された延長されたプライマーの混合物を蛍光測定することにより核酸配列の配列を決定することを含む核酸配列の配列決定方法であって、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプライマーが配列決定され、ポリメラーゼにより延長可能な３’末端を有する核酸配列の一部に相補性のオリゴヌクレオチド配列と、オリゴヌクレオチドに結合された項目１〜１４のいずれか１項に記載のエネルギー転移蛍光色素とを含む該方法。
　項目２３　核酸配列をデオキシヌクレオシドトリホスフェート、少なくとも一種の蛍光標識されたジデオキシヌクレオシドトリホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼの存在下でプライマーとハイブリッドを形成することにより延長されたプライマーの混合物を生成し（そのＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの延長を終止する蛍光標識されたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートが延長されたプライマーにとり込まれるまでデオキシヌクレオシドトリホスフェートでプライマーを延長する）、延長されたプライマーの混合物を分離し、そして延長されたプライマーの分離された混合物に結合された蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドを検出することにより核酸配列の配列を決定することを含む核酸配列の配列決定方法であって、蛍光標識されたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートがジデオキシヌクレオシドトリホスフェートと、オリゴヌクレオチドに結合された項目１〜１４のいずれか１項に記載のエネルギー転移蛍光色素とを含む該方法。
【発明の効果】
【０００９】
　本発明によって、ドナー蛍光体とアクセプター蛍光体の配向が、エネルギーがドナー蛍光体とアクセプター蛍光体の間で有効に転移されるようなものであるようなエネルギー転移蛍光色素が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
　本発明はドナー色素をエネルギー転移蛍光色素中でアクセプター色素に結合するためのリンカーに関する。また、本発明は増強された蛍光を有するエネルギー転移蛍光色素に関する。また、本発明は本発明のエネルギー転移色素を含む試薬、色素及び試薬の使用方法、並びに色素及び試薬が含まれるキットに関する。ドナー色素をエネルギー転移蛍光色素中でアクセプター色素に結合するための本発明の一つのリンカーは、以下に説明されるような一般構造式Ｒ２１Ｚ１Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２８（式中、Ｒ２１はドナー色素に結合されたＣ１−５アルキルであり、Ｃ（Ｏ）はカボニル基であり、Ｚ１はＮＨ、硫黄または酸素であり、Ｒ２２はアルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環または６員環または縮合環構造であってもよいカルボニル炭素に結合された置換基であり、かつＲ２８はリンカーをアクセプター色素に結合する官能基を含む）を有する。
【化２３】
2004068023.tif 000006
　リンカー中に使用されるＲ２８基は、Ｒ２２基をアクセプター色素に結合するのに使用し得る当業界で知られているあらゆる基であってもよい。典型的には、Ｒ２８基はアクセプター色素のベンゼン環またはその他の芳香族環構造に結合されるであろう。それ故、Ｒ２８はアクセプター色素のベンゼン環またはその他の芳香族環構造に親電子官能基、例えば、カルボン酸、酸ハライド、スルホン酸、エステル、アルデヒド、チオ、ジスルフィド、イソチオシアネート、イソシアネート、スルホニルハライド、マレイミド、ヒドロキシスクシンイミドエステル、ハロアセチル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、及びアジドを形成することにより形成されることが好ましい。その時、Ｒ２２基は、アクセプター色素の親電子剤を求核体、例えば、アミノ、ヒドロキシルまたはスルフヒドリル求核体と反応させることにより、Ｒ２２基へのドナー色素の結合の前または後にアクセプター色素に付加し得る。
【００１１】
　例えば、以下に説明される実施態様において、リンカーは一般構造式Ｒ２１Ｚ１Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２９Ｚ２Ｃ（Ｏ）（式中、Ｒ２１及びＲ２２は上記のとおりであり、Ｚ１及びＺ２は夫々独立にＮＨ、硫黄または酸素であり、Ｒ２９はＣ１−５アルキルであり、末端カルボニル基はアクセプター色素の環構造に結合されている）を有する。Ｚ２が窒素である変化において、Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２９Ｚ２サブユニットはアミノ酸サブユニットを形成する。
【００１２】
【化２４】
2004068023.tif 000007
【００１３】
　この実施態様において、リンカーは活性化カルボニル基（ＮＨＳエステル）とアミン基、ヒドロキシル基またはチオール基の反応により生成されてもよい。Ｒ２２基をアクセプター色素に結合するための多種のその他のメカニズムが考えられ、本発明の範囲内に入ることが意図されていることが注目される。リンカー中でＲ２２として使用し得る５員環または６員環の特別な例として、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、プラジン及びオキサジンが挙げられるが、これらに限定されない。縮合環構造の例として、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドール及びナフタレンが挙げられるが、これらに限定されない。このリンカーの好ましい実施態様は、以下に示されるように、Ｒ２１及びＲ２９がメチレンであり、Ｚ１及びＺ２がＮＨであり、かつＲ２２がベンゼンである場合である。
【００１４】
【化２５】
2004068023.tif 000008
【００１５】
　本発明のエネルギー転移蛍光色素の一つのクラスは４’環位置に下記のキサンテン環構造を有するドナー色素を含む。
【００１６】
【化２６】
2004068023.tif 000009
【００１７】
　式中、Ｙ１及びＹ２は別々にされてヒドロキシル、酸素、イミニウムまたはアミンであり、イミニウム及びアミンは三級のイミニウムまたはアミンであることが好ましい。Ｒ１１−Ｒ１７は本発明のエネルギー転移色素と適合性であるあらゆる置換基であってもよく、Ｒ１１−Ｒ１７は色素のスペクトル特性及び移動度特性を変化するために広く変化されてもよいことが注目される。この実施態様によれば、エネルギー転移色素はまたドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二波長で蛍光を発するアクセプター色素を含む。また、エネルギー転移色素はドナー色素をアクセプター色素に結合するリンカーを含む。エネルギー転移色素のこの実施態様の一つの変化において、リンカーは上記のように一般構造式Ｒ２１Ｚ１Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２８（式中、Ｒ２１はキサンテンドナー色素の４’位に結合されたＣ１−５アルキルであり、Ｃ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｚ１はＮＨ、硫黄または酸素であり、Ｒ２２はアルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環もしくは６員環または縮合環構造であってもよいカルボニル炭素に結合された置換基であり、かつＲ２８はリンカーをアクセプター色素に結合する官能基を含む）を有する。エネルギー転移色素のこの実施態様の更に別の変化において、リンカーは上記のように一般構造式Ｒ２１Ｚ１Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２９Ｚ２Ｃ（Ｏ）（式中、Ｒ２１及びＲ２２は上記のとおりであり、Ｚ１及びＺ２は夫々独立にＮＨ、硫黄または酸素であり、Ｒ２９はＣ１−５アルキルであり、末端カルボニル基はアクセプター色素の環構造に結合れている）を有する。Ｚ２が窒素である変化において、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２９Ｚ２−はアミノ酸サブユニットを形成する。エネルギー転移色素のこの実施態様の更に別の好ましい変化において、リンカーは以下に示されるように、Ｒ２１及びＲ２９がメチレンであり、Ｚ１及びＺ２がＮＨであり、かつＲ２２がベンゼンである場合である。
【００１８】
【化２７】
2004068023.tif 000010
【００１９】
　ドナー色素は必要によりＲ１７がフェニルまたは置換フェニルである色素のクラスの一員であってもよい。Ｙ１がヒドロキシルであり、かつＹ２が酸素であり、かつＲ１７がフェニルまたは置換フェニルである場合、その色素は色素のフルオレセインクラスの一員である。Ｙ１がアミンであり、かつＹ２がイミニウムであり、かつＲ１７がフェニルまたは置換フェニルである場合、その色素は色素のローダミンクラスの一員である。更にこの実施態様によれば、アクセプター色素は必要により色素のキサンテンクラス、シアニンクラス、フタロシアニンクラス及びスクアラインクラスの一員であってもよい。別の実施態様において、エネルギー転移蛍光色素は一般構造式
【００２０】
【化２８】
2004068023.tif 000011
【００２１】
を有するドナー色素及びアクセプター色素を有する。式中、Ｙ１及びＹ２は別々にされてヒドロキシル、酸素、イミニウムまたはアミンであり、イミニウム及びアミンは三級のイミニウムまたはアミンであることが好ましく、かつＲ１１−Ｒ１６は本発明のエネルギー転移色素と適合性であるあらゆる置換基である。この実施態様によれば、以下に説明されるように、リンカーがドナー色素及びアクセプター色素の夫々のＸ３置換基及びＸ４置換基の一つ、好ましくはドナー色素及びアクセプター色素のＸ３置換基に結合される。この実施態様において、リンカーは短く、かつ／または硬質であることが好ましい。何となれば、これがドナー色素とアクセプター色素の間のエネルギーの転移を増進することがわかったからである。
【００２２】
【化２９】
2004068023.tif 000012
【００２３】
　別の実施態様において、エネルギー転移蛍光色素は色素のキサンテンクラスの一員であるドナー色素、ドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二波長で蛍光を発することができる色素のキサンテンクラス、シアニンクラス、フタロシアニンクラス及びスクアラインクラスの一員であるアクセプター色素、及びドナー色素をアクセプター色素に結合するリンカーを含む。この実施態様によれば、アクセプターは約６００ｎｍより大きく、またはドナー色素の吸光度最大よりも少なくとも約１００ｎｍ大きい発光最大を有する。上記の新規なエネルギー転移蛍光色素に加えて、本発明はまたエネルギー転移蛍光色素を含む蛍光試薬に関する。一般に、これらの試薬は、本発明のエネルギー転移色素が結合でき、エネルギー転移色素の蛍光に基いて試薬の存在を検出するのに使用し得るあらゆる分子または物質を含む。一実施態様において、エネルギー転移蛍光色素で標識された、ヌクレオシドまたはモノ−、ジ−もしくはトリホスフェートヌクレオチドを含む蛍光試薬が提供される。ヌクレオチドは、例えば、色素標識オリゴヌクレオチドの調製に使用し得るデオキシヌクレオチドであってもよい。また、ヌクレオチドは、例えば、色素ターミネーター配列決定に使用し得るジデオキシヌクレオシドであってもよい。別の実施態様において、蛍光試薬はエネルギー転移蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを含む。これらの試薬は、例えば、色素プライマー配列決定に使用し得る。
【００２４】
　また、本発明は本発明のエネルギー転移色素及び試薬を使用する方法に関する。一実施態様において、その方法は本発明のエネルギー転移色素で標識された一連の異なるサイズのオリゴヌクレオチドを生成し、サイズに基いて一連の標識されたオリゴヌクレオチドを分離し、エネルギー転移色素の蛍光に基いて分離された標識されたオリゴヌクレオチドを検出することを含む。この方法の一実施態様において、延長された標識されたプライマーの混合物がデオキシヌクレオチドトリホスフェート、及び少なくとも一種の色素標識されたジデオキシヌクレオチドトリホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で核酸配列をオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリッドを形成することにより生成される。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの延長を終止するジデオキシヌクレオチドトリホスフェートがとり込まれるまでプライマーをデオキシヌクレオチドトリホスフェートで延長するのに利用できる。一旦終止されると、延長されたプライマーの混合物が分離され、ジデオキシヌクレオシドの色素の蛍光に基いて検出される。この実施態様の変化において、４種の異なる蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドトリホスフェート、即ち、蛍光標識されたジデオキシシトシントリホスフェート、蛍光標識されたジデオキシアデノシントリホスフェート、蛍光標識されたジデオキシグアノシントリホスフェート、及び蛍光標識されたジデオキシチミジントリホスフェートが使用される。この方法の別の実施態様において、オリゴヌクレオチドプライマーはデオキシヌクレオシドトリホスフェートとは反対に蛍光標識される。また、本発明は本発明の色素及び試薬を使用してＤＮＡ配列決定を行うための色素及び試薬を含むキットに関する。
【００２５】
　Ｉ．本発明のエネルギー転移色素リンカー
　本発明はドナー色素をエネルギー転移蛍光色素中でアクセプター色素に結合するための新規なリンカーに関する。また、本発明はこれらのリンカーを含むエネルギー転移蛍光色素に関する。これらのリンカーはエネルギー転移色素中でドナー色素とアクセプター色素の間のエネルギーの有効な転移を増進することがわかった。ドナー色素をエネルギー転移蛍光色素中でアクセプター色素に結合するための本発明の一つのリンカーは以下に説明されるような一般構造式Ｒ２１Ｚ１Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２８（式中、Ｒ２１はドナー色素に結合されたＣ１−５アルキルであり、Ｃ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｚ１はＮＨ、硫黄または酸素であり、Ｒ２２はアルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環及び６員環またはカルボニル炭素に結合されている縮合環構造を含む置換基であり、かつＲ２８はリンカーをアクセプター色素に結合する官能基を含む）を有する。
【００２６】
【化３０】
2004068023.tif 000013
【００２７】
　このリンカーの一実施態様において、以下に説明されるように、リンカーは一般構造式Ｒ２１Ｚ１Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２９Ｚ２Ｃ（Ｏ）（式中、Ｒ２１及びＲ２２は上記のとおであり、Ｚ１及びＺ２は夫々独立にＮＨ、硫黄または酸素であり、Ｒ２９はＣ１−５アルキルであり、末端カルボニル基はアクセプター色素の環構造に結合されている）を有する。Ｚ２が窒素である変化において、Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２９Ｚ２サブユニットはアミノ酸サブユニットを形成する。
【００２８】
【化３１】
2004068023.tif 000014
【００２９】
　リンカー中でＲ２２として使用し得る５員環または６員環の特別な例として、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、プラジン及びオキサジンが挙げられるが、これらに限定されない。縮合環構造の例として、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドール及びナフタレンが挙げられるが、これらに限定されない。このリンカーの好ましい実施態様は、以下に示されるように、Ｒ２１及びＲ２９がメチレンであり、Ｚ１及びＺ２がＮＨであり、かつＲ２２がベンゼンである場合である。
【００３０】
【化３２】
2004068023.tif 000015
【００３１】
　表３は本発明のリンカー中に使用し得るリンカーの−Ｃ（Ｏ）Ｒ２２−サブユニットの例を示す。
　ＩＩ．　本発明のエネルギー転移色素　
一般に、本発明のエネルギー転移色素は第一波長の光を吸収し、応答して励起エネルギーを放出するドナー色素、ドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二波長で蛍光を発することができるアクセプター色素、及びドナー色素をアクセプター色素に結合するリンカーを含む。本明細書に示された分子構造の全てに関して、これらの分子構造は示された正確な電子構造を含むだけでなく、その全ての共鳴構造及びプロトン化状態を含むことが意図されている。本発明のエネルギー転移蛍光色素の一つのクラスは色素のキサンテンクラスの一員であるドナー色素、アクセプター色素及び節Ｉに記載されたリンカーのグループの一員であるリンカーを含む。本明細書に使用されるキサンテン色素は一般構造式
【００３２】
【化３３】
2004068023.tif 000016
【００３３】
を有する全ての分子を含む。式中、Ｙ１及びＹ２は別々にされてヒドロキシル、酸素、イミニウムまたはアミンであり、イミニウム及びアミンは三級のイミニウムまたはアミンであることが好ましい。Ｙ１がヒドロキシルであり、かつＹ２が酸素であり、かつＲ１７がフェニルまたは置換フェニルである場合、その色素は色素のフルオレセインクラスの一員である。Ｙ１がアミンである、かつＹ２がイミニウムであり、かつＲ１７がフェニルまたは置換フェニルである場合、その色素は色素のローダミンクラスの一員である。Ｒ１１−Ｒ１７は本発明のエネルギー転移色素と適合性であるあらゆる置換基であってもよく、Ｒ１１−Ｒ１７は色素のスペクトル特性及び移動度特性を変化するために広く変化されてもよいことが注目される。環構造中に示された番号はキサンテン環構造の４’位を示す。リンカーがキサンテン環構造の４’位に結合されている本発明のエネルギー転移色素について、Ｒ１４サブユニットがリンカーに相当する。Ｒ１１−Ｒ１７置換基の例として、水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施態様において、Ｒ１５及びＲ１６は一緒にされて置換または未置換ベンゼン環を形成する。キサンテン色素のこのクラスは本明細書中非対称ベンゾキサンテン色素と称され、ＳｃｏｔｔＣ．Ｂｅｎｓｏｎらにより１９９６年４月１日に出願された米国特許出願第０８／６２６，０８５号（発明の名称：非対称ベンゾキサンテン色素）に記載されており、この特許が参考として本明細書に含まれる。別の実施態様において、Ｒ１７は一般式
【００３４】
【化３４】
2004068023.tif 000017
【００３５】
を有するフェニルまたは置換フェニルである。フェニル環の置換基Ｘ１−Ｘ５として、水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせが挙げられる。一実施態様において、ドナー色素は、本明細書中４，７−ジクロロローダミン色素と称される、Ｙ１がアミンであり、Ｙ２がイミニウムであり、かつＸ２及びＸ５が塩素である色素のクラスの一員である。色素の４，７−ジクロロローダミンクラス内に入る色素及びそれらの合成が本明細書並びに１９９６年６月２７日に出願された米国特許出願第０８／６７２，１９６号（発明の名称発明の名称：４，７−ジクロロローダミン色素）に記載されており、この特許が参考として本明細書に含まれる。
【００３６】
　ここで使用されるアルキルは直鎖及び分岐炭化水素部分、即ち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル等を表す。置換アルキルはヒドロキシ、アミノ、チオ、シアノ、ニトロ、スルホ、等を含むが、これらに限定されない種々の置換基のいずれか一つで置換されたアルキル部分を表す。ハロアルキルは一つ以上のハロゲン原子置換基、通常フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを有する置換アルキルを表す。アルケンは炭素−炭素結合の一つ以上が二重結合であり、かつ非二重結合炭素がアルキルまたは置換アルキルである炭化水素を表す。アルキンは炭素の一つ以上が三重結合で結合されており、非三重結合炭素がアルキル部分または置換アルキル部分である炭化水素を表す。スルホネートは３個の酸素原子に結合された硫黄原子を含む部分（そのモノ−及びジ−塩を含む）、例えば、ナトリウムスルホネート、カリウムスルホネート、ジナトリウムスルホネート、等を表す。アミノは２個の水素原子、アルキル部分、またはこれらのあらゆる組み合わせに結合された窒素原子を含む部分を表す。アミドは酸素原子に二重結合され、アミノ部分に単結合された炭素原子を含む部分を表す。ニトリルは窒素原子に三重結合された炭素原子を含む部分を表す。アルコキシは酸素原子に単結合されたアルキル部分を含む部分を表す。アリールは単一または多数のフェニルまたは置換フェニル、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル等を表す。
【００３７】
　Ｒ１１〜Ｒ１７はまた夫々独立にエネルギー転移色素を試薬、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドに結合するのに使用し得る結合部分であってもよい。結合部分の例として、相補官能基が常にアミンである場合、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、スクシンイミジルエステル、またはその他の活性カルボキシレートが挙げられる。相補官能基が常にスルフヒドリルである場合、結合基はマレイミド、ハロアセチル、またはヨードアセトアミドであることが好ましい。Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。特に好ましい実施態様において、図１に示されるように、結合基はアミノヘキシル−オリゴマーと反応させられて色素標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを生成し得るドナー色素またはアクセプター色素のいずれかのカルボキシル基から生成された活性化ＮＨＳエステルである。この実施態様のエネルギー転移蛍光色素はまたドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二波長で蛍光を発することができるアクセプター色素、及びドナー色素をアクセプター色素に結合するリンカーを含む。エネルギー転移色素の第一クラスにおいて、リンカーは節Ｉに記載されたリンカーのクラスの一員であり、キサンテン環構造の４’位でドナー色素に結合される。この第一クラスのエネルギー転移色素はアクセプター蛍光体それ自体及び同じドナー−アクセプター対を有するエネルギー転移蛍光色素（この場合、ドナー−アクセプター対の間の結合が異なる）と比較して増強された蛍光強さを示す。また、本発明は、ドナー色素及びアクセプター色素が夫々一般構造式
【００３８】
【化３５】
2004068023.tif 000018
【００３９】
（式中、Ｙ１、Ｙ２、Ｒ１１〜Ｒ１６及びＸ１〜Ｘ５は先に特定されたとおりである）を有するエネルギー転移蛍光色素の第二クラスに関する。色素のこのクラスの中で、リンカーはドナー色素及びアクセプター色素の夫々のＸ３置換基及びＸ４置換基の一つによりドナー色素及びアクセプター色素に結合される。
【００４０】
【化３６】
2004068023.tif 000019
【００４１】
　色素のこのクラスの好ましい実施態様において、リンカーはドナー色素及びアクセプター色素の夫々のＸ３置換基によりドナー色素及びアクセプター色素に結合される。色素のこのクラスの中で、リンカーは短く、かつ／または硬質であることが好ましい。何となれば、これがドナー色素とアクセプター色素の間のエネルギーの転移を増進することがわかったからである。また、本発明は、アクセプター色素が色素の４，７−ジクロロローダミンクラスの一員であるエネルギー転移蛍光色素の第三クラスに関するものであり、即ち、その色素は一般構造式
【００４２】
【化３７】
2004068023.tif 000020
【００４３】
を有する。式中、Ｒ１〜Ｒ４は夫々独立に水素、アルキル、またはＲ１とＲ５、Ｒ２とＲ６、Ｒ３とＲ８、Ｒ４とＲ９が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせであり、Ｒ５〜Ｒ１０は夫々独立に水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、フェニル、もしくは置換フェニル、または隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせであり、Ｘ１、Ｘ３及びＸ４は夫々独立に水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、もしくはアルコキシ、または隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせであり、Ｘ２及びＸ５は塩素である。Ｒ１〜Ｒ１０、Ｘ３及びＸ４に関して、Ｒ１とＲ５、Ｒ２とＲ６、Ｒ３とＲ８、Ｒ４とＲ９、及びＸ３とＸ４は夫々独立に一緒にされて５員環、６員環、または７員環を形成してもよい。環構造中に示された番号（４’、５、６）はローダミン環構造の４’、５、６の環の位置を示す。本明細書に説明されるように、４’及び５の環の位置はドナー蛍光体をアクセプター蛍光体に結合する本発明のエネルギー転移色素中に使用されたリンカーの結合に好ましい部位である。４’、５、６の環の位置はまたエネルギー転移色素への生物分子、例えば、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの結合に好ましい部位である。
【００４４】
　エネルギー転移色素のこのクラス中のドナー色素は励起エネルギーを放出するあらゆる色素を含んでいてもよく、その４，７−ジクロロローダミン色素がエネルギーを吸収し、応答してエネルギー放出を生じることができる。一実施態様において、ドナー色素は、４，７−ジクロロローダミンアクセプター色素がキサンテン色素の４’環位に結合されているリンカーによりドナー色素に結合される４’環位でキサンテン環構造を有する。リンカーは４，７−ジクロロローダミンアクセプター色素の５環位または６環位に結合されることが好ましい。色素のこの第三クラス（即ち、４，７−ジクロロローダミンがアクセプター色素である場合）のエネルギー転移色素はその他のローダミン色素に較べて比較的狭い放出スペクトルを有するという利点を与える。この狭い放出スペクトルはこれらの色素の組により得られるスペクトル分解を増進し、それによりこれらの色素を使用する多成分分析を促進する。また、本発明はエネルギー転移蛍光色素の第四クラスに関するものであり、この場合、ドナー色素が色素のキサンテンクラスの一員であり、アクセプター色素が色素のキサンテンクラス、シアニンクラス、フタロシアニンクラス及びスクアラインクラスの一員であり、アクセプターが約６００ｎｍより大きい放出最大を有し、かつ／または好ましくはドナー色素の吸光度最大よりも少なくとも約１００ｎｍ大きい放出最大を有する。色素のこのクラスの中で、ドナーは色素のフルオレセインクラスの一員であることが好ましい。本発明のエネルギー転移色素の第四クラスは、ドナーの吸収びアクセプターの放出の差により測定して、大きいストークスシフトを通常示す。加えて、これらの色素は、最小のドナー蛍光が観察される点で有効なエネルギー転移を示す。本発明のエネルギー転移色素の第四クラスが本明細書に更に詳しく記載される。
【００４５】
【化３８】
2004068023.tif 000021
【００４６】
【化３９】
2004068023.tif 000022
【００４７】
【化４０】
2004068023.tif 000023
【００４８】
Ａ．エネルギー転移色素の第一クラス　上記のように、本発明のエネルギー転移色素の第一クラスは色素のキサンテンクラスの一員であり、それ故４’環位でキサンテン環構造を有するドナー色素を含む。色素のこのクラス中で、アクセプター色素はドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二波長で蛍光を発することができる色素である。この実施態様によれば、ドナーは色素のフルオレセインクラス、ローダミンクラスまたは非対称ベンゾキサンテンクラスの一員であってもよく、これらの色素の夫々は色素の更に広いキサンテンクラスの員である。これらのキサンテン色素の一般構造式が以下に示される。これらの色素に関して説明された置換基は色素のこれらの異なるクラスに含まれてもよい多種の置換基から選ばれてもよい。何となれば、一般のキサンテン環構造、フルオレセイン環構造、ローダミン環構造、及び非対称環ベンゾキサンテン構造を有する全ての色素が本発明の範囲内に入ることが意図されているからである。
【００４９】
【化４１】
2004068023.tif 000024
【００５０】
この実施態様のエネルギー転移蛍光色素中に使用し得るアクセプター色素のクラスの例として、キサンテン色素、シアニン色素、フタロシアニン色素及びスクアライン色素が挙げられるが、これらに限定されない。これらの色素の一般構造式が表１Ａに示される。これらの色素について説明された置換基は色素のこれらの異なるクラスに含まれてもよい多種の置換基から選ばれてもよい。何となれば、一般のキサンテン環構造、フルオレセイン環構造、ローダミン環構造、非対称ベンゾキサンテン環構造、シアニン環構造、フタロシアニン環構造及びスクアライン環構造を有する全ての色素が本発明の範囲内に入ることが意図されているからである。この実施態様に使用し得るドナー色素の例として、フルオレセイン、カルボキシフルオレセインの異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、カルボキシ−ＨＥＸの異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、ＮＡＮ、Ｃｌ−ＦＬＡＮ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＺＯＥ、ローダミン、カルボキシローダミンの異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、カルボキシＲ１１０の異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、カルボキシＲ６Ｇの異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、４．７−ジクロロフルオレセイン（米国特許第５，１８８，９３４　号を参照のこと）、４．７−ジクロロローダミン（１９９６年６月２７日に出願された米国特許出願第０８／６７２，１９６号を参照のこと）、非対称ベンゾキサンテン色素（１９９６年４月１日に出願された米国特許出願第０８／６２６，０８５号を参照のこと）、及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−カルボキシローダミン（ＴＭＡＲＡ）の異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
　この実施例に使用し得るアクセプター色素の例として、カルボキシフルオレセインの異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、４．７−ジクロロフルオレセイン、４．７−ジクロロローダミン、フルオレセイン、非対称ベンゾキサンテン色素、カルボキシ−ＨＥＸの異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、ＮＡＮ、Ｃｌ−ＦＬＡＮ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＺＯＥ、ローダミン、カルボキシローダミンの異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、カルボキシＲ１１０の異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、カルボキシＲ６Ｇの異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−カルボキシローダミン（ＴＭＡＲＡ）の異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）の異性体（例えば、５カルボキシ及び６カルボキシ）及びＣｙ５が挙げられるが、これらに限定されない。これらの色素の構造式が表２に示される。本発明のエネルギー転移色素の第一クラスにおいて、リンカーはキサンテン環構造の４’位でドナー色素に結合される。一実施態様において、リンカーは以下に示されるような一般構造式Ｒ２１Ｚ１Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２８（式中、Ｒ２１はドナーキサンテン色素の４’環位に結合されているＣ１−５アルキルであり、Ｚ１はＮＨ、硫黄または酸素であり、Ｃ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ２２はアルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環及び６員環またはカルボニル炭素に結合されている縮合環構造を含む置換基であり、かつＲ２８はリンカーをアクセプター色素に結合する官能基である）を有する。
【００５２】
【化４２】
2004068023.tif 000025
【００５３】
　Ｒ２２中に使用し得る５員環または６員環の例として、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、プラジン及びオキサジンが挙げられるが、これらに限定されない。縮合環構造の例として、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドール及びナフタレンが挙げられるが、これらに限定されない。この実施態様の一つの変化において、以下に示されるように、リンカーは一般構造式Ｒ２１Ｚ１Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２９Ｚ２Ｃ（Ｏ）（式中、Ｒ２１はドナーキサンテン色素の４’環位に結合されているＣ１−５アルキルであり、Ｚ１及びＺ２は夫々独立にＮＨ、硫黄または酸素であり、Ｃ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ２２はアルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環及び６員環またはカルボニル炭素に結合されている縮合環構造を含む置換基であり、Ｒ２９はＣ１−５アルキルであり、末端カルボニル基はアクセプター色素の環構造に結合されている）を有する。
【００５４】
【化４３】
2004068023.tif 000026
【００５５】
このリンカーの好ましい実施態様は、以下に示されるように、Ｒ２１及びＲ２９がメチレンであり、Ｚ１及びＺ２がＮＨであり、かつＲ２２がベンゼンである場合である。
【００５６】
【化４４】
2004068023.tif 000027
【００５７】
【化４５】
2004068023.tif 000028
【００５８】
【化４６】
2004068023.tif 000029
【００５９】
【化４７】
2004068023.tif 000030
【００６０】
実施例４及び図２に示されるように、先に特定されたようなドナー、アクセプター及びリンカーを含む、５−ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦの如きエネルギー転移色素は、アクセプターそれ自体並びにドナー−アクセプター対の間のリンカーが異なる場合の同じドナー−アクセプター対を有するエネルギー転移蛍光色素に較べて増強された蛍光を示す。理論により縛られないで、観察された増強された蛍光強さはリンカーの比較的硬質なＲ２２部分により得られ、維持されるドナー色素とアクセプター色素の間の改良されたエネルギー転移配向のためであると考えられる。その結果として、本発明のエネルギー転移蛍光色素はアクセプター蛍光体それ自体並びにドナー−アクセプター対の間のリンカーが異なる場合の同じドナー−アクセプター対を有するエネルギー転移蛍光色素に較べて増強された蛍光強さを示す。これらの色素の増強された蛍光強さは色素スタッキングを低下するのに利用できる８Ｍ尿素の存在下で特に明らかである。この実施態様の一つの変化において、アクセプターは一般構造式
【００６１】
【化４８】
2004068023.tif 000031
【００６２】
（式中、Ｙ１、Ｙ２、Ｒ１１〜Ｒ１６及びＸ１〜Ｘ５は先に特定されたとおりである）を有する色素のキサンテンクラスの一員である。この変化によれば、上記リンカーの如きリンカーはアクセプターキサンテン色素のＸ３またはＸ４置換基を介してアクセプターキサンテン色素に結合されることが好ましい。以下に示されるような好ましい実施態様において、リンカーはアクセプターキサンテン色素のＸ３置換基に結合される。
【００６３】
【化４９】
2004068023.tif 000032
【００６４】
　表４は本発明のこの実施態様の上記エネルギー転移色素の例を示す。表４中に示された色素は５−カルボキシフルオレセインドナー色素及びＴＡＭＲＡアクセプター色素を含むが、多種のその他のキサンテン色素がドナー色素として容易に置換し得ることが理解されるべきであることが注目される。また、多種のその他のキサンテン色素、並びにシアニン色素、フタロシアニン色素及びアクアライン色素が上記されたＴＡＭＲＡアクセプター色素に代えて容易に置換し得ることが理解されるべきであり、ドナー色素及びアクセプター色素に関するこれらの変化の全てが本発明の範囲内に入る。
【００６５】
【化５０】
2004068023.tif 000033
【００６６】
【化５１】
2004068023.tif 000034
【００６７】
　Ｂ．エネルギー転移色素の第二クラス　
本発明はまたドナー色素及びアクセプター色素が一般構造式　
【００６８】
【化５２】
2004068023.tif 000035
【００６９】
（式中、Ｙ１、Ｙ２、Ｒ１１〜Ｒ１６及びＸ１〜Ｘ５は先に特定されたとおりである）を有する色素のキサンテンクラスの員である、以下に示されるようなエネルギー転移蛍光色素の第二クラスに関する。この実施態様によれば、リンカーは以下に示されるようにドナー色素及びアクセプター色素の両方のＸ３またはＸ４置換基に結合される。
【００７０】
【化５３】
2004068023.tif 000036
【００７１】
この実施態様において、リンカーは短く、かつ／または硬質であることが好ましい。何となれば、これがドナー色素とアクセプター色素の間のエネルギーの転移を増進することがわかったからである。例えば、この実施態様の一つの変化において、リンカーは長さが９原子未満であるドナーをアクセプターに結合する主鎖を有することが好ましい。この実施態様の別の変化において、リンカーはリンカーに或る程度の構造上の剛性を与える官能基、例えば、アルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環及び６員環または縮合環構造を含む。更に別の変化において、リンカーは一般式Ｒ２５Ｚ３Ｃ（Ｏ）またはＲ２５Ｚ３Ｃ（Ｏ）Ｒ２６Ｚ４Ｃ（Ｏ）（式中、Ｒ２５はドナー色素に結合されており、Ｃ（Ｏ）はカルボニ基であり、末端カルボニル基はアクセプター色素に結合されており、Ｒ２５及びＲ２６は夫々Ｃ１−４アルキルの群から選ばれ、かつＺ３及びＺ４は夫々独立にＮＨ、ＯまたはＳである）を有する。この実施態様に使用し得るドナー色素及びアクセプター色素の例として、フルオレセイン、５または６カルボキシフルオレセイン、５または６カルボキシ−ＨＥＸ、ＮＡＮ、Ｃｌ−ＦＬＡＮ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＺＯＥ、４．７−ジクロロフルオレセイン、非対称ベンゾキサンテン色素、ローダミン、５または６カルボキシローダミン、５または６カルボキシ−Ｒ１１０、５または６カルボキシ−Ｒ６Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル（５または６）−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、５または６カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）及び４．７−ジクロロローダミンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの色素の構造式が表２に示される。
【００７２】
この実施態様の別の変化において、リンカーはＲ２７Ｚ５Ｃ（Ｏ）基（式中、Ｒ２７はドナー色素に結合されたＣ１−５アルキルであり、Ｚ５はＮＨ、硫黄または酸素であり、かつＣ（Ｏ）はアクセプター色素に結合されたカルボニル基である）を含む。表５は本発明のエネルギー転移色素の第二クラスの例を示す。表５に示された色素は５−アミノメチルフルオレセインドナー色素を含むが、多種のその他のキサンテン色素がドナー色素として容易に置換し得ることが理解されるべきであることが注目される。また、多種のその他のキサンテン色素、並びにシアニン色素、フタロシアニン色素及びアクアライン色素が上記されたＴＡＭＲＡアクセプター色素に代えて容易に置換し得ることが理解されるべきであり、ドナー色素及びアクセプター色素に関するこれらの変化の全てが本発明の範囲内に入る。
【００７３】
【化５４】
2004068023.tif 000037
【００７４】
【化５５】
2004068023.tif 000038
【００７５】
【化５６】
2004068023.tif 000039
【００７６】
Ｃ．エネルギー転移色素の第三クラス
　エネルギー転移蛍光色素の第三クラスはアクセプター色素としての４．７−ジクロロローダミン色素及びドナー色素としての４．７−ジクロロローダミン色素が吸収することができる放出を生じる色素を含む。これらの色素はアクセプター色素単独に較べて増強された蛍光強さを示す。加えて、４．７−ジクロロローダミン色素はその他のローダミン色素よりも狭い発光スペクトルを示し、これが多成分分析におけるそれらの使用を促進する。好ましい実施態様において、これらのエネルギー転移色素は色素の第一クラス及び第二クラスに記載の色素を含み、この場合、アクセプターは４．７−ジクロロローダミン色素である。
１．４．７−ジクロロローダミン色素
４．７−ジクロロローダミン色素化合物は一般構造式　
【００７７】
【化５７】
2004068023.tif 000040
【００７８】
を有する。式中、Ｒ１〜Ｒ４は夫々独立に水素、アルキル、またはＲ１とＲ５、Ｒ２とＲ６、Ｒ３とＲ８、Ｒ４とＲ９が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせであり、Ｒ５〜Ｒ１０は夫々独立に水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、フェニルもしくは置換フェニル、または隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせであり、Ｘ１、Ｘ３及びＸ４は夫々独立に水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、もしくはアルコキシ、または隣接置換基が一緒にされて環を形成する場合、及びこれらの組み合わせであり、かつＸ２及びＸ５は塩素である。
【００７９】
色素の４．７−ジクロロローダミンクラスの中に入る色素及びそれらの合成が“４．７−ジクロロローダミン色素”という発明の名称の１９９６年６月２７日に出願された米国特許出願第０８／６７２，１９６号に記載されており、その特許が参考として本明細書に含まれる。Ｒ１〜Ｒ４に関して、アルキル置換基は約１〜８個の炭素原子を含んでもよく（即ち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル等）、直鎖炭化水素部分及び分岐炭化水素部分であってもよい。好ましい実施態様において、Ｒ１〜Ｒ４は夫々独立に水素、メチル、またはエチルであり、更に好ましくは水素またはメチルである。Ｒ５〜Ｒ１０に関して、アルキル置換基、アルケン置換基、アルキン置換基及びアルコキシ置換基は好ましくは約１〜８個の炭素原子を含んでもよく（即ち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル等）、直鎖炭化水素部分及び分岐炭化水素部分であってもよい。Ｒ１〜Ｒ１０に関して、Ｒ１とＲ５、Ｒ２とＲ６、Ｒ３とＲ８、Ｒ４とＲ９は夫々独立に一緒にされて５員環、６員環、または７員環を形成してもよい。
【００８０】
一実施態様において、Ｒ６及びＲ７はベンゾであり、かつ／またはＲ９及びＲ１０はベンゾである。好ましい実施態様において、Ｒ５〜Ｒ１０は夫々独立に水素、メチル、またはエチルであり、更に好ましくは水素またはメチルである。Ｘ１、Ｘ３及びＸ４に関して、Ｘ１は好ましくはカルボキシレートであり、かつＸ３及びＸ４の一つは４．７−ジクロロローダミンアクセプター色素をドナー色素に結合し、またはヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドをエネルギー転移色素に結合するのに使用される置換基を含んでいてもよい。４’環位にあるＲ８置換基はまたアクセプターをドナー色素またはヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの如き生物分子に結合するのに使用し得る。本明細書中ＤＲ１１０−２と称される、本発明に使用し得る一つの特に好ましいアクセプター色素において、Ｒ１〜Ｒ１０は別々にされて水素であり、Ｘ１はカルボキシレートであり、Ｘ３及びＸ４の一方は結合基（Ｌ）であり、他方は水素である。ＤＲ１１０−２の構造が以下に示される。
【００８１】
【化５８】
2004068023.tif 000041
【００８２】
本明細書中ＤＲ６Ｇ−２と称される、本発明に使用し得る第二の特に好ましいアクセプター色素において、Ｒ１及びＲ２の一方はエチルであり、他方は水素であり、Ｒ３及びＲ４の一方はエチルであり、他方は水素であり、Ｒ５及びＲ８は別々にされてメチルであり、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、及びＲ１０は水素であり、Ｘ１はカルボキシレートであり、Ｘ３及びＸ４の一方は結合基であり、他方は水素である。ＤＲ６Ｇ−２の構造が以下に示される。
【００８３】
【化５９】
2004068023.tif 000042
【００８４】
本明細書中ＤＴＭＲと称される、本発明に使用し得る第三の特に好ましいアクセプター色素において、Ｒ１〜Ｒ６は別々にされて水素であり、Ｙ１〜Ｙ４は別々にされてメチルであり、Ｘ１はカルボキシレートであり、Ｘ２及びＸ３の一方は結合基であり、他方は水素である。ＤＴＭＲの構造が以下に示される。
【００８５】
【化６０】
2004068023.tif 000043
【００８６】
本明細書中ＤＲＯＸと称される、本発明に使用し得る第四の特に好ましいアクセプター色素において、Ｒ１及びＲ６は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ２及びＲ５は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ３及びＲ７は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ４及びＲ８は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ５及びＲ６は水素であり、Ｘ１はカルボキシレートであり、Ｘ３及びＸ４の一方は結合基であり、他方は水素である。ＤＲＯＸの構造が以下に示される。
【００８７】
【化６１】
2004068023.tif 000044
【００８８】
　図３及び４は本発明のエネルギー転移色素中に使用し得る４，７−ジクロロローダミン色素の幾つかの付加的な好ましい実施態様を示す。化合物３Ａ−Ａにおいて、Ｒ１及びＲ２の一方はエチルであり、他方は水素であり、Ｒ３及びＲ４は別々にされて水素であり、Ｒ６はメチルであり、Ｒ５及びＲ７〜Ｒ１０は別々にされて水素であり、Ｘ１はカルボキシレートであり、Ｘ３及びＸ４の一方は結合基であり、他方は水素である。化合物３Ａ−Ｂにおいて、Ｒ１及びＲ２の一方はエチルであり、他方は水素であり、Ｒ３及びＲ４は別々にされてメチルであり、Ｒ６はメチルであり、Ｒ５及びＲ７〜Ｒ１０は別々にされて水素であり、Ｘ１はカルボキシレートであり、Ｘ３及びＸ４の一方は結合基であり、他方は水素である。化合物３Ａ−Ｃにおいて、Ｒ１及びＲ２　は別々にされてメチルであり、Ｒ３及びＲ９は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ４及びＲ８は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ１０は別々にされて水素であり、Ｘ１はカルボキシレートであり、Ｘ３及びＸ４の一方は結合基であり、他方は水素である。化合物３Ｂ−Ｄにおいて、Ｒ１及びＲ２は別々にされて水素であり、Ｒ３及びＲ９は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ４及びＲ８は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ１０は別々にされて水素であり、Ｘ１はカルボキシレートであり、Ｘ３及びＸ４の一方は結合基であり、他方は水素である。化合物３Ｂ−Ｅにおいて、Ｒ１及びＲ２の一方はエチルであり、他方は水素であり、Ｒ３及びＲ９は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ４及びＲ８は一緒にされて６員環を形成し、Ｒ６はメチルであり、Ｒ５、Ｒ７及びＲ１０は別々にされて水素であり、Ｘ１はカルボキシレートであり、Ｘ３及びＸ４の一方は結合基であり、他方は水素である。化合物３Ｂ−Ｆにおいて、Ｒ１及びＲ２は別々にされて水素であり、Ｒ３及びＲ４は別々にされてメチルであり、Ｒ５〜Ｒ１０は別々にされて水素であり、Ｘ１はカルボキシレートであり、Ｘ３及びＸ４の一方は結合基であり、他方は水素である。
【００８９】
　図５及び６は本発明のエネルギー転移色素中に使用される４，７−ジクロロローダミン色素の調製の好ましい一般化された合成スキームを示す。夫々の図に示された可変置換基は先に定義されたとおりである。図５は置換基Ｘ１がカルボキシレート以外であり得る一般化された合成を示す。図中、Ｘ’はＸ１の前駆体である部分を示す。図５に示された方法において、２当量の３−アミノフェノール誘導体４Ａ−Ａ／４Ａ−Ｂ、例えば、３−ジメチルアミノフェノールが１当量のジクロロベンゼン誘導体４Ａ−Ｃ、例えば、４−カルボキシ−３，６ジクロロ−２−スルホ安息香酸環状酸無水物（即ち、４ｃのＸ１’部分が一緒にされて−ＣＯ−Ｏ−ＳＯ２−である）と反応させられる。
【００９０】
　次いで反応体が強酸、例えば、ポリリン酸または硫酸中で１８０℃で１２時間加熱される。粗色素４Ａ−Ｄが水への添加により沈殿され、遠心分離により単離される。対称生成物を生成するために、反応体４Ａ−Ａ及び４Ａ−Ｂの置換基は同じであるが、非対称生成物を生成するために、置換基は異なる。図６は置換基Ｘ１がカルボキシレートである一般化された合成を示す。図６の方法において、２当量の３−アミノフェノール誘導体４Ｂ−Ａ／４Ｂ−Ｂ、例えば、３−ジメチルアミノフェノールが１当量の無水フタル酸誘導体４Ｂ−Ｅ、例えば、３，６−ジクロロ無水トリメリット酸と反応させられる。次いで反応体が強酸、例えば、ポリリン酸または硫酸中で１８０℃で１２時間加熱される。粗色素４Ｂ−Ｄが水への添加により沈殿され、遠心分離により単離される。対称生成物を生成するために、反応体４Ｂ−Ａ及び４Ｂ−Ｂの置換基は同じであるが、非対称生成物を生成するために、置換基は異なる。
２．アクセプターとしての４，７−ジクロロローダミンを含むエネルギー転移色素
　一般に、本発明のエネルギー転移色素は第一波長の光を吸収し、応答して励起エネルギーを放出するドナー色素、ドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し、応答して第二波長の蛍光を発することができる４，７−ジクロロローダミンアクセプター色素、及びドナー色素をアクセプター色素に形成するリンカーを含む。４，７−ジクロロローダミン色素をアクセプター色素として使用する色素のこのクラスの好ましい例が表１に示される。色素のこのクラス中に使用し得るアクセプター色素の例として、先に説明されたようなＤＲ１１０−２、ＤＲ６Ｇ−２、ＤＴＭＲ、ＤＲＯＸ、並びに図３及び４に示された色素が挙げられるが、これらに限定されない。これらのエネルギー転移蛍光色素の一つのサブクラスは、アクセプター色素が４，７−ジクロロローダミン色素である本発明の色素の第一クラスの色素である。これらの色素の一般構造式が以下に示される。
【００９１】
【化６２】
2004068023.tif 000045
【００９２】
　表４は４，７−ジクロロローダミンがアクセプター色素として使用される色素の第一クラスに属するエネルギー転移色素の例を示す。表４に示された色素は５−カルボキシフルオレセインドナー色素及びアクセプター色素としての５または６カルボキシＤＴＭＲを含むが、多種のその他のキサンテン色素がドナー色素として容易に置換でき、多種のその他の４，７−ジクロロローダミン色素がＤＴＭＲアクセプター色素に代えて容易に置換し得ることが理解されるべきであることが注目され、ドナー色素及びアクセプター色素に関するこれらの変化の全てが本発明の範囲内に入ることが意図されている。これらのエネルギー転移蛍光色素の別のサブクラスは、アクセプター色素が４，７−ジクロロローダミン色素である本発明の色素の第二クラスの色素である。ドナーキサンテン色素及びアクセプター４，７−ジクロロローダミン色素がドナー色素及びアクセプター色素の５環位または６環位で互いに結合されるこれらの色素の一般構造式が以下に示される。
【００９３】
【化６３】
2004068023.tif 000046
【００９４】
　上記のように、この実施態様において、ドナーをアクセプター色素に結合するリンカーは短く、かつ／または硬質であることが好ましい。何となれば、これがドナー色素とアクセプター色素の間のエネルギーの転移を増進することがわかったからである。先に示された置換基ラベルは、その他の色素に関して特定された置換基の同じグループに相当する。表５は４，７−ジクロロローダミンがアクセプター色素として使用される本発明のエネルギー転移色素の第二クラスの例を示す。表５に示された色素は５−アミノメチルフルオレセインドナー色素を含むが、多種のその他のキサンテン色素がドナー色素として容易に置換し得ることが理解されるべきであることが注目される。また、多種のその他の４，７−ジクロロローダミン色素が表５に示された色素に代えて容易に置換し得ることが理解されるべきである。何となれば、上記されたように、ドナー色素及びアクセプター色素に関するこれらの変化の全てが本発明の範囲内に入ることが意図されているからである。
　Ｄ．エネルギー転移色素の第四クラス
本発明はまたドナー色素が色素のキサンテンクラスの一員であり、かつアクセプター色素が色素のキサンテンクラス、シアニンクラス、フタロシアニンクラスまたはスクアラインクラスの一員であるエネルギー転移蛍光色素の第四クラスに関する。エネルギー転移色素のこのクラス中で、ドナーは色素のフルオレセインクラスの一員であり、かつアクセプター色素が約６００ｎｍより大きい発光最大及び／またはドナー色素の吸光度最大よりも少なくとも約１００ｎｍ　大きい発光最大を有することが好ましい。
【００９５】
本発明の色素の第四クラスは、ドナーの吸光度とアクセプターの発光の差により測定して、大きいストークスシフトを通常示す。加えて、これらの色素は、最小ドナー蛍光が観察される点で有効なエネルギー転移を示す。重要なことに、アクセプター色素の吸収スペクトルがドナー色素の発光スペクトルと重ならないとしても、エネルギーはこのクラスに属する色素の幾つかにおいてドナーからアクセプターに転移される。この実施態様に使用し得るアクセプター色素の例として、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）及びＣｙ５が挙げられるが、これらに限定されない。この実施態様のエネルギー転移色素はまたドナーをアクセプターに結合するリンカーを含む。ドナーをアクセプター色素に結合するのに使用されるリンカーは色素の第一クラス及び第二クラスのあらゆるリンカーであってもよい。しかしながら、別のリンカーが色素のこのクラス中に使用されてもよいことが予知される。
【００９６】
　色素のこのクラスの一実施態様において、リンカーはドナー色素のキサンテン環構造の４’位に結合される。リンカーは上記の一般構造式Ｒ２１Ｚ１Ｃ（Ｏ）Ｒ２２Ｒ２８（式中、Ｒ２１はドナーキサンテン色素の４’環位に結合されているＣ１−５アルキルであり、Ｚ１はＮＨ、硫黄または酸素であり、Ｃ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ２２はアルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合を有する５員環及び６員環またはカルボニル炭素に結合されている縮合環構造を含む置換基であり、かつＲ２８はリンカーをアクセプター色素に結合する官能基である）を有することが好ましい。アクセプター色素が色素のキサンテンクラスの一員である場合、リンカーはキサンテン環構造の５位でアクセプターに結合されることが好ましい。表６は本発明の上記のエネルギー転移色素の例を示す。表６に示された色素は５−カルボキシフルオレセインドナー色素を含むが、多種のその他のキサンテン色素がドナー色素として容易に置換し得ることが理解されるべきであることが注目される。また、多種のその他のキサンテン色素、並びにシアニン色素、フタロシアニン色素及びスクアライン色素が上記された５−カルボキシＲＯＸ及びＣｙ５　アクセプター色素に代えて容易に置換し得ることが理解されるべきである。ドナー色素及びアクセプター色素に関するこれらの変化の全てが本発明の範囲内に入る。この実施態様のエネルギー転移色素は、これらの色素を４色素ＤＮＡ配列決定において小さいストークスシフトを有する色素との使用に特に良く適しているようにする大きいストークスシフトを通常示す。例えば、図７及び８は互いにスペクトル的に分解可能である４色素の２組を示す。図７中、５ＲＯＸ−ＣＦは上記色素の第四クラスの範囲内に入る色素である。一方、図８は両方とも上記色素の第四クラスの範囲内に入る５ＲＯＸ−ＣＦ　及びＣｙ５−ＣＦを含む。
【００９７】
　図８に示された５ＲＯＸ−ＣＦ　及びＣｙ５−ＣＦの発光スペクトルからわかるように、ドナー色素（５−カルボキシフルオレセイン、５２０ｎｍ）からの非常に小さい蛍光がこれらの色素中で観察される。これはドナー色素（フルオレセイン）の発光最大とアクセプター色素（ＲＯＸ、５９０ｎｍ、Ｃｙ５、６４０ｎｍ）の吸光度最大の大きな差に鑑みて予期しない結果である。
【００９８】
【化６４】
2004068023.tif 000047
【００９９】
　ＩＩ．　本発明のエネルギー転移色素を含む試薬　
また、本発明は本発明のエネルギー転移蛍光色素を含む蛍光試薬に関する。節ＩＩＩに詳しく記載されるように、これらの試薬はサンプル中の成分の存在を検出するための多種の方法に使用し得る。本発明の蛍光試薬は、本発明のエネルギー転移色素が結合されて、エネルギー転移色素の蛍光に基いて試薬の存在を検出するのに使用し得るあらゆる分子または物質を含む。本発明の色素が試薬を生成するのに結合し得る分子及び物質の型として、タンパク質、ポリペプチド、多糖、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類縁体（例えば、ペプチド核酸）、脂質、固体担体、有機ポリマー及び無機ポリマー、並びにこれらの組み合わせ及び群がり、例えば、染色体、核、生細胞、例えば、バクテリア、その他の微生物、哺乳類細胞、及び組織が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の試薬の好ましいクラスはヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類縁体（これらは本発明のエネルギー転移色素を含むように修飾されていた）である。ヌクレオチド試薬及びヌクレオシド試薬に関する用途の例として、酵素合成により生成されたオリゴヌクレオチド標識、例えば、ＰＣＲ増幅の状況で使用されるヌクレオシドトリホスフェート、サンガー型オリゴヌクレオチド配列決定、及びｎｉｃｋ翻訳反応が挙げられるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチド試薬に関する用途の例として、ＤＮＡ配列決定プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ等としての使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
　試薬の一つの特別な実施態様は標識されたヌクレオシド（ＮＴＰ）、例えば、本発明のエネルギー転移蛍光色素で標識された、シトシン、アデノシン、グアノシン、及びチミジンである。これらの試薬はオリゴヌクレオチド合成を伴う多種の方法に使用し得る。別の関連実施態様は標識されたヌクレオチド、例えば、モノ−、ジ−及びトリホスフェートヌクレオシドホスフェートエステルである。これらの試薬として、特に、本発明のエネルギー転移蛍光色素で標識された、デオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、例えば、デオキシシトシントリホスフェート、デオキシアデノシントリホスフェート、デオキシグアノシントリホスフェート、及びデオキシチミジントリホスフェートが挙げられる。これらの試薬は、例えば、色素標識されたオリゴヌクレオチドの調製においてポリメラーゼ基質として使用し得る。また、これらの試薬として、本発明のエネルギー転移蛍光色素で標識された、ジデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）、例えば、ジデオキシシトシントリホスフェート、ジデオキシアデノシントリホスフェート、ジデオキシグアノシントリホスフェート、及びジデオキシチミジントリホスフェートが挙げられる。これらの試薬は、例えば、色素終止配列決定に使用し得る。
【０１０１】
　試薬の別の実施態様は本発明のエネルギー転移蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドである。これらの試薬は、例えば、色素プライマー配列決定に使用し得る。本明細書に使用される“ヌクレオシド”は、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ及びＢａｋｅｒ，ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第二編（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載されたような２’−デオキシ形態及び２’−ヒドロキシル形態を含む、１’位でペントースに結合された、プリン、デアザプリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン等からなる化合物を表す。本明細書に使用される“ヌクレオチド”という用語はヌクレオチドのホスフェートエステル、例えば、モノ、ジ及びトリホスフェートエステルを表し、エステル化の最も普通の部位はペントースのＣ−５位に結合されたヒドロキシル基である。ヌクレオチドに関する“類縁体”として、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ａｎａｌｏｇｓ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８０）により一般に記載された、修飾塩基部分及び／または修飾糖部分を有する合成ヌクレオシドが挙げられる。“標識されたヌクレオシド”及び“標識されたヌクレオチド”という用語は結合によりエネルギー転移色素に共有結合されているヌクレオシド及びヌクレオチドを表す。
【０１０２】
　本明細書に使用される“オリゴヌクレオチド”という用語は、二本鎖及び一本鎖のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、これらのα−アノマー形態等を含む、天然または修飾ヌクレオシドモノマーの線状ポリマーを表す。通常、ヌクレオシドモノマーはホスホジエステル結合により結合されており、本明細書に使用される場合、“ホスホジエステル結合”は、会合された対イオン、例えば、Ｈ、ＮＨ４、Ｎａ等を含む（このような対イオンが存在する場合）、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート等を含む、ホスホジエステル結合またはこれらの類縁体を表す。オリゴヌクレオチドはサイズが少ないモノマー単位、例えば、８−４０から数千のモノマー単位までの範囲である。オリゴヌクレオチドが文字の配列、例えば、“ＡＴＧＣＣＴＧ”により表される時はいつも、特にことわらない限り、ヌクレオチドが左から右に５’→３’の順序であり、“Ａ”はデオキシアデノシンを表し、“Ｃ”はデオキシシチジンを表し、“Ｇ”はデオキシグアノシンを表し、また“Ｔ”はチミジンを表すことが理解されるであろう。ヌクレオシド標識は、既知の結合、結合基、及び関連相補性官能基を使用して多数の既知のヌクレオシド標識技術のいずれかを使用して行い得る。色素及びヌクレオシドを結合する結合は（ｉ）オリゴヌクレオチド合成条件に安定であり、（ｉｉ）オリゴヌクレオチド−標的ハイブリダイゼーションに干渉せず、（ｉｉｉ）関係する酵素、例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ等と適合性であり、かつ（ｉｖ）色素の蛍光を消光しないものであるべきである。
【０１０３】
色素はピリミジン塩基の５−炭素及び７−デアザプリン塩基の７−炭素に共有結合されることが好ましい。本発明に使用し得る幾つかの好適な塩基標識操作が、例えば、Ｇｉｂｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５　６４５５−６４６７（１９８７）、Ｇｅｂｅｙｅｈｕら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５　４５１３−４５３５（１９８７）、Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５　４８５６−４８７６（１９８７）、Ｎｅｌｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，５（３）２３３−２４１（１９８６）、Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍら，ＪＡＣＳ，１１１　３７４−３７５（１９８９）、米国特許第４，８５５，２２５号、同第５，２３１，１９１号、及び同第５，４４９，７６７号に報告されており、これらの夫々が参考として本明細書に含まれる。結合はアセチレンアミド結合またはアルケンアミド結合であることが好ましく、色素とヌクレオチド塩基の結合は色素の活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルをヌクレオチドのアルキニルアミノ−、アルキニルエトキシアミノ−またはアルケニルアミノ−誘導体化塩基と反応させることにより形成される。得られる結合はプロパルギル−１−エトキシアミド（３−（アミノ）エトキシ−１−プロピニル）、３−（カルボキシ）アミノ−１−プロピニルまたは３−アミノ−１−プロピン−１−イルであることが更に好ましい。本発明の色素をヌクレオシド塩基に結合するのに好ましい幾つかの結合が以下に示される。
2004068023.tif 000048
【０１０４】
【化６５】
2004068023.tif 000049
【０１０５】
（式中、Ｒ１及びＲ２は別々にされてＨ、アルキル、保護基または蛍光色素である）アルキニルアミノ−誘導体化ヌクレオシドの合成がＨｏｂｂｓ　らの欧州特許出願第８７３０５８４４．０号、及びＨｏｂｂｓら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５４　３４２０（１９８９）により教示されており、これが参考として本明細書に含まれる。簡単に言えば、アルキニルアミノ−誘導体化ヌクレオチドが、適当なハロジデオキシヌクレオシド（通常、Ｈｏｂｂｓら（先に引用した）により教示されたような５−ヨードピリミジン及び７−ヨード−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシド）及びＣｕ（Ｉ）をフラスコに入れ、アルゴンでフラッシして空気を除去し、乾燥ＤＭＦを添加し、続いてアルキニルアミン、トリエチルアミン及びＰｄ（０）を添加することにより生成される。その反応混合物は数時間にわたって、または薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、攪拌し得る。保護されていないアルキニルアミンが使用される場合、アルキニルアミノ−ヌクレオシドは、反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生じたヒドロハライドを中和するために水酸化アンモニウムを含む溶離溶媒を使用してシリカゲルによるクロマトグラフィーにかけることにより単離し得る。保護されたアルキニルアミンが使用される場合、メタノール／塩化メチレンが反応混合物に添加でき、続いて強塩基性陰イオン交換樹脂の重炭酸塩形態が添加し得る。次いでスラリーが約４５分間にわたって攪拌され、濾過され、樹脂が追加のメタノール／塩化メチレンですすがれる。合わせた濾液が濃縮され、メタノール−塩化メチレン勾配を使用してシリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し得る。トリホスフェートが通常の技術により得られる。
【０１０６】
　本発明のエネルギー転移色素で標識されたオリゴヌクレオチドの合成は、既知の結合、結合基、及び関連相補性官能基を使用する多数の既知のオリゴヌクレオチド標識技術のいずれかを使用して行い得る。例えば、標識されたオリゴヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼを使用して酵素合成でき（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４章，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８１））、または化学合成、例えば、ホスホルアミジト方法、ホスファイト−トリエステル方法等（例えば、Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ（１９９０））により合成し得る。標識は酵素合成中に標識されたヌクレオシドトリホスフェートモノマーを使用して導入されてもよく、または化学合成中に標識された非ヌクレオチドまたはヌクレオチドホスホルアミジトを使用して導入されてもよく、または合成後に導入されてもよい。一般に、標識されたオリゴヌクレオチドが酵素合成を使用してつくられる場合、下記の操作が使用し得る。鋳型ＤＮＡが変性され、オリゴヌクレオチドプライマーが鋳型ＤＮＡにアニールされる。デオキシヌクレオシドトリホスフェートの混合物がｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰを含む反応液に添加され、デオキシヌクレオチドの一種の少なくとも一部が上記の本発明の色素化合物で標識される。次に、ポリメラーゼ酵素がポリメラーゼ酵素が活性である条件下で添加される。標識されたポリヌクレオチドがポリメラーゼストランド合成中に標識されたデオキシヌクレオチドのとり込みにより生成される。別の酵素合成方法において、２種のプライマー、即ち、＋ストランドに相補性の一種のプライマー及び標的の−ストランドに相補性の別のプライマーが一種に代えて使用され、ポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼであり、反応温度が変性温度と延長温度の間でサイクルされ、それによりＰＣＲ、例えば、ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｎｎｉｓら編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９０）により標的配列の標識された補体を指数的に合成する。
【０１０７】
　一般に、標識されたオリゴヌクレオチドが化学合成を使用してつくられる場合、ホスホルアミジト方法が使用されることが好ましい。ホスホルアミジト化合物及びポリヌクレオチド合成のホスホルアミジト方法は、有効かつ迅速なカップリング並びに出発物質の安定性のためにオリゴヌクレオチドを合成するのに好ましい。その合成は固体担体に結合された成長するオリゴヌクレオチド鎖で行われ、その結果、液相中にある過剰の試薬が濾過により容易に除去でき、それによりサイクル間の精製工程の必要をなくす。ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドを標識する際のホスホルアミジト試薬の実用性に鑑みて、本発明はまた本発明のエネルギー転移色素を含むホスホルアミジト化合物に関する。ホスホルアミジト方法によりオリゴヌクレオチドを生成するのに使用される化学の詳細な説明がＣａｒｕｔｈｅｒｓらの米国特許第４，４５８，０６６　号、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　らの米国特許第４，４１５，７３２　号、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４　１−１７（１９８２）、Ｕｓｅｒｓ　Ｍａｎｕａｌ　Ｍｏｄｅｌ　３９２及び３９４　ＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ，６−１〜６−２２頁、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐａｒｔ　Ｎｏ．９０１２３７（１９９１）に示されており、これらの夫々が参考としてそのまま含まれる。
【０１０８】
　以下に、ホスホルアミジト方法を使用する典型的なオリゴヌクレオチド合成サイクルの工程を簡単に記載する。まず、保護されたヌクレオチドモノマーを含む固体担体を酸、例えば、トリクロロ酢酸で処理して５’−ヒドロキシル保護基を除去し、その後のカップリング反応のためにヒドロキシルを遊離する。次いで保護されたホスホルアミジトヌクレオシドモノマー及び弱酸、例えば、テトラゾールをその反応に同時に添加することにより活性化中間体を生成する。弱酸はホスホルアミジトの窒素をプロトン化して反応性中間体を生成する。ヌクレオシド添加は３０秒以内に完結する。次に、ヌクレオシド付加を受けなかったポリヌクレオチド鎖を終端するキャッピング工程を行う。キャッピングは無水酢酸及び１−メチルイミダゾールを用いて行われることが好ましい。次いでヌクレオチド内結合を、好ましい酸化剤としてヨウ素を使用し、酸素ドナーとして水を使用する酸化によりホスファイトから更に安定なホスホトリエステルに変換する。酸化後、ヒドロキシル保護基をプロトン酸、例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸で除去し、鎖伸長が完結するまでそのサイクルを繰り返す。合成後、塩基、例えば、水酸化アンモニウムまたはｔ−ブチルアミンを使用してポリヌクレオチド鎖を担体から開裂する。また、開裂反応はホスフェート保護基、例えば、シアノエチルを除去する。最後に、塩基のエキソ環アミンの保護基及び色素のヒドロキシル保護基を、そのポリヌクレオチド溶液を高温、例えば、５５℃で塩基中で処理することにより除去する。
【０１０９】
　ホスホルアミジトヌクレオシドモノマーのいずれかは色素標識されたホスホルアミジトであってもよい。ヌクレオチドの５’−　末端位置が標識される場合、本発明の標識された非ヌクレオチドホスホルアミジトが最終縮合工程中に使用し得る。オリゴヌクレオチドの内部位置が標識される場合、本発明の標識されたヌクレオチドホスホルアミジトが縮合工程のいずれか中に使用し得る。それらの合成に続いて、オリゴヌクレオチドは５’末端を含む幾つかの位置で標識し得る。Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｓ，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編集，８　章，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ（１９９１）及びＯｒｇｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ１１（１８）６５１３（１９８３）、米国特許第５，１１８，８００　号を参照のこと。これらの文献の夫々が参考として含まれる。オリゴヌクレオチドはまたそれらのホスホジエステル主鎖（ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｓ，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ　編集，９　章）または３’末端（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２０（２３）６２５３−６２５９、及び米国特許第５，４０１，８３７　号及び同第５，１４１，８１３　号）で標識されてもよく、両方の特許が参考として本明細書に含まれる。オリゴヌクレオチド標識操作の総説について、Ｒ．ＨａｕｇｌａｎｄＥｘｃｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｓｔｅｉｎｅｒ　編集，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８３）を参照のこと。一つの好ましい合成後の化学標識方法において、オリゴヌクレオチドは以下のようにして標識される。約１当量の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び約３当量のｎ−ヒドロキシスクシンイミドを乾燥酢酸エチル中で室温で３時間反応させることにより、カルボキシ結合基を含む色素をｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換する。反応混合物を５％のＨＣｌで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、固体に濃縮し、これをＤＭＳＯ中に再度懸濁させる。次いでＤＭＳＯ色素原液をｐＨ９．４の０．２５Ｍの重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中のアミノヘキシル誘導体化オリゴヌクレオチドに過剰（１０−２０ｘ）に添加し、６時間反応させる（例えば、米国特許第４，７５７，１４１号）。色素標識されたオリゴヌクレオチドをサイズ排除クロマトグラフィーカラム中の通過により未反応色素から分離し、緩衝液、例えば、０．１モルのトリエチルアミンアセテート（ＴＥＡＡ）で溶離する。粗標識オリゴヌクレオチドを含むフラクションを勾配溶離を使用して逆相ＨＰＬＣにより更に精製する。
【０１１０】
ＩＩＩ．本発明の色素及び試薬を使用する方法
　本発明のエネルギー転移色素及び試薬は、サンプル中の成分を色素を含む試薬で標識することによりサンプル中の成分を検出する多種の方法に使用し得る。特に、本発明のエネルギー転移色素及び試薬は、分離技術及び蛍光検出技術を組み合わせる方法、特に多種の空間上重なる分析物の同時検出を必要とする方法における使用に良く適している。例えば、色素及び試薬は生化学的分離操作、例えば、電気泳動にかけられたオリゴヌクレオチドのクラスを検出するのに特に良く適しており、この場合、同様の物理化学的性質、例えば、サイズ、配座、電荷、疎水性等を有する標的物質の一連のバンドまたはスポットが線形配列または平面配列で存在する。本明細書に使用される“バンド”という用語は同様または同一の物理化学的性質に基く分析物の空間上のグルーピングまたは凝集を含む。通常バンドは電気泳動による色素−オリゴヌクレオチド接合体の分離において生じる。オリゴヌクレオチドのクラスは種々の状況で生じ得る。本明細書中“フラグメント分析”方法または“遺伝子分析”方法と称される方法の好ましいカテゴリーにおいて、標識されたオリゴヌクレオチドフラグメントは、例えば、結合またはポリメラーゼ誘導プライマー延長により、標識されたプライマーまたはヌクレオチドを使用する鋳型誘導酵素合成により生成される。フラグメントはサイズ依存性分離方法、例えば、電気泳動またはクロマトグラフィーにかけられ、分離されたフラグメントが分離に続いて、例えば、レーザー誘導蛍光により検出される。特に好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドの多種のクラスが同時に分離され、異なるクラスがスペクトル的に分解可能な標識により区別される。
【０１１１】
一つのこのようなフラグメント分析方法は増幅されたフラグメント長さ多形性検出（ＡｍｐＦＬＰ）であり、増幅されたフラグメント長さ多形性、即ち、ＰＣＲ　により増幅される制限フラグメント長さ多形性に基いている。種々のサイズのこれらの増幅されたフラグメントはファミリー中の変異体遺伝子を追跡するための結合されたマーカーとして利用できる。増幅されたフラグメントが染色体に関して変異体遺伝子に近似している程、連鎖相関関係が高い。多くの遺伝子疾患の遺伝子は同定されていなかったので、これらの連鎖マーカーは疾患のリスクまたは起源を評価することを助けるのに利用できる。ＡｍｐＦＬＰ技術において、ポリヌクレオチドは標識されたオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを使用することにより、または標識されたヌクレオチドトリホスフェートをＰＣＲ　で使用することにより標識し得る。別のフラグメント分析方法はｎｉｃｋ翻訳である。ｎｉｃｋ翻訳は二本鎖ＤＮＡ分子中の未標識ヌクレオチドトリホスフェートを標識されたヌクレオチドトリホスフェートで置換する反応を伴う。遊離３’−ヒドロキシル基がデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮＡａｓｅＩ）処理により生じた“ｎｃｋ”により未標識ＤＮＡ内に生成される。次いでＤＮＡポリメラーゼＩはｎｉｃｋの３’−ヒドロキシル末端への標識されたヌクレオチドの付加を触媒する。同時に、この酵素の５’ｔｏ３’−エキソヌクレアーゼ活性がｎｉｃｋの５’−ホスホリル末端からヌクレオチド単位を排除する。遊離３’−ＯＨ基を有する新しいヌクレオチドが初期の切除されたヌクレオチドの位置にとり込まれ、ｎｉｃｋが３’方向に一つのヌクレオチド単位だけシフトされる。この３’シフトが既存の未標識ヌクレオチドの除去によりＤＮＡへの新しい標識されたヌクレオチドの連続的付加をもたらすであろう。次いでｎｉｃｋ翻訳されたポリヌクレオチドが分離方法、例えば、電気泳動を使用して分析される。
【０１１２】
別の例示のフラグメント分析方法は可変数のタンデムリピート、またはＶＮＴＲに基いている。ＶＮＴＲは特別な配列の隣接多重コピーを含む二本鎖ＤＮＡの領域であり、反復単位の数が可変である。ＶＮＴＲ遺伝子座の例はｐＹＮＺ２２、ｐＭＣＴ１１８、及びＡｐｏ　Ｂである。ＶＮＴＲ方法のサブセットはミクロサテライトリピート、または短いタンデムリピート（ＳＴＲ）、即ち、短い（２−４塩基）反復配列を特徴とするＤＮＡのタンデムリピートの検出に基く方法である。ヒトにおける最も多い点在された反復ＤＮＡファミリーの一つは（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−（ｄＧ−ｄＴ）ｎジヌクレオチドリピートファミリー（また（ＣＡ）ｎジヌクレオチドリピートファミリーと称される）である。これらはヒトゲノム中の５０，０００〜１００，０００程度の多い（ＣＡ）ｎリピート領域であると考えられ、典型的にはブロック当たり１５〜３０のリピートを有する。これらのリピートの多くは長さが多形性であり、それ故、有益な遺伝子マーカーとして利用できる。ＶＮＴＲ方法またはＳＴＲ方法において、標識は色素標識されたＰＣＲ　プライマーを使用することによりポリヌクレオチドフラグメントに導入されることが好ましい。別の例示のフラグメント分析方法はＤＮＡ配列決定である。一般に、ＤＮＡ配列決定はオリゴヌクレオチドプライマーの延長／終止反応を伴う。プライマーを延長するのに使用されるデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）が反応混合物中に含まれる。また、延長されたプライマーにとり込まれた時に、プライマーの更なる延長を阻止する少なくとも一種のジデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）が反応混合物中に含まれる。延長反応が停止された後、異なるヌクレオシドの位置決めを測定するために、生成される異なる終止生成物が分離され、分析される。
【０１１３】
蛍光ＤＮＡ配列決定は一般に二つのカテゴリー、“色素プライマー配列決定”と“色素ターミネーター配列決定”に分けられる。色素プライマー配列決定において、蛍光色素は延長されるプライマーにとり込まれる。次いで４つの別々の延長／終止反応が平行して行われ、夫々の延長反応は延長反応を終止するための異なるジデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）を含む。終止後に、反応生成物がゲル電気泳動により分離され、分析される。例えば、Ａｎｓｏｒｇｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１５４５９３−４６０２（１９８７）を参照のこと。色素プライマー配列決定の一つの変化において、異なるプライマーが４つの別々の延長／終止反応に使用され、夫々のプライマーが異なるスペクトル的に分解可能な色素を含む。終止後に、４つの延長／終止反応からの反応生成物が溜められ、電気泳動により分離され、単一レーン中で検出される。例えば、Ｓｍｉｔｈら，Ｎａｔｕｒｅ　３２１　６７４−６７９（１９８６）を参照のこと。こうして、色素プライマー配列決定のこの変化において、スペクトル的に分解可能な色素の組を含むプライマーを使用することにより、一つより多い延長／終止反応からの生成物が同時に検出し得る。色素ターミネーター配列決定において、蛍光色素はジデオキシヌクレオシドトリホスフェートの夫々に結合される。次いで延長／終止反応が行われ、この場合、プライマーは、標識されたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートが延長されたプライマーにとり込まれてプライマーの更なる延長を阻止するまで、デオキシヌクレオシドトリホスフェートを使用して延長される。一旦終止されると、夫々のジデオキシヌクレオシドトリホスフェートに関する反応生成物が分離され、検出される。一実施態様において、別々の延長／終止反応が４種のジデオキシヌクレオシドトリホスフェートの夫々について行われる。別の実施態様において、単一の延長／終止反応が行われ、これは４種のジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを含み、夫々が異なるスペクトル的に分解可能な蛍光色素で標識されている。
【０１１４】
こうして、本発明の一局面によれば、本発明の一種以上のオリゴヌクレオチド試薬を使用して色素プライマー配列決定を行う方法が提供される。この方法によれば、延長された標識されたプライマーの混合物が核酸配列をデオキシヌクレオシドトリホスフェート、少なくとも一種のジデオキシヌクレオシドトリホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリッドを形成することにより生成される。蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプライマーは配列決定される核酸配列の一部に相補性のオリゴヌクレオチド配列と、オリゴヌクレオチドに結合されたエネルギー転移蛍光色素とを含む。その方法によれば、ＤＮＡポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートがとり込まれて、これがプライマーの延長を終止するまで、デオキシヌクレオシドトリホスフェートでプライマーを延長する。終止後、延長されたプライマーの混合物が分離される。次いで核酸の配列が、生成された延長されたプライマーの混合物を蛍光検出することにより測定される。この方法の更に別の実施態様において、４つの色素プライマー配列決定反応が行われ、夫々のプライマー配列決定反応が異なる蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプライマーと異なるジデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ　及びｄｄＴＴＰ）を含む。４つの色素プライマー配列決定反応が行われた後、延長されたプライマーの得られる混合物が溜められてもよい。次いで延長されたプライマーの混合物が、例えば、電気泳動により分離され、核酸配列の配列を決定するために４種の異なる蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプライマーの夫々からの蛍光シグナルが検出される。
【０１１５】
本発明の更に別の局面によれば、本発明のエネルギー転移色素で標識された一種以上のジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを使用して色素ターミネーター配列決定を行う方法が提供される。この方法によれば、延長されたプライマーの混合物が、核酸配列をデオキシヌクレオシドトリホスフェート、少なくとも一種の蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドトリホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼの存在下でオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリッドを形成することにより生成される。蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドトリホスフェートは本発明のエネルギー転移蛍光色素で標識されたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを含む。この方法によれば、ＤＮＡポリメラーゼは、標識されたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートが延長されたプライマーにとり込まれるまでプライマーをデオキシヌクレオシドトリホスフェートで延長する。終止後、延長されたプライマーの混合物が分離される。次いで核酸配列の配列が延長されたプライマーに結合された蛍光標識されたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを検出することにより決定される。この方法の更に別の実施態様において、延長されたプライマーの混合物を生成する工程が、核酸配列を４種の異なる蛍光標識されたジデオキシヌクレオシドトリホスフェート、即ち、蛍光標識されたジデオキシシトシントリホスフェート、蛍光標識されたジデオキシアデノシントリホスフェート、蛍光標識されたジデオキシグアノシントリホスフェート、及び蛍光標識されたジデオキシチミジントリホスフェートとハイブリッドを形成することを含む。
【０１１６】
上記フラグメント分析方法の夫々において、標識されたオリゴヌクレオチドは電気泳動操作により分離されることが好ましい。例えば、先に引用されたＧｏｕｌｄ及びＭａｔｔｈｅｗｓ、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ及びＨａｍｅｓ，編集，Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ；　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，（ＩＲＬ　ＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８１）、またはＯｓｔｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，１　巻　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９８４）を参照のこと。電気泳動マトリックスの型は約２〜２０重量％の濃度（重量対容積）を有する架橋または未架橋ポリアクリルアミドである。ポリアクリルアミド濃度は約４〜８％であることが更に好ましい。好ましくは特にＤＮＡ配列決定の状況下で、電気泳動マトリックスはストランド分離剤または変性剤、例えば、尿素、ホルムアルデヒド等を含む。このようなマトリックスをつくるための詳細な操作がＭａｎｉａｔｉｓら，“９８％のホルムアルデヒドまたは７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル中の低分子量ＤＮＡ及びＲＮＡの分別”，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５　２９９−３０５（１９８０）、Ｍａｎｉａｔｉｓら，“ポリアクリルアミドゲル電気泳動による小さい二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ分子の鎖長測定”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４３７８７−３７９４（１９７５）、Ｍａｎｉａｔｉｓら，分子クローニング：実験マニュアル（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８２），１７９−１８５頁、及びＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７　ＤＮＡ　ＳｅｑｕｅｎｃｅｒＵｓｅｒ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｖ．Ａ，１９９５年１月，２　章（ｐ／ｎ　９０３４３３，Ｔｈｅ　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により示されており、これらの夫々が参考として含まれる。特別な分離に使用される最適のポリマー濃度、ｐＨ、温度、変性剤の濃度等は、分離すべき核酸のサイズ範囲、それらの塩基組成（それらが一本鎖または二本鎖であるかを問わない）、及び情報が電気泳動により探究されるクラスの性質を含む、多くの因子に依存する。それ故、本発明の適用は特別な分離の条件を最適化するために通常の予備試験を必要とし得る。例えば、約２０〜３００塩基の範囲のサイズを有するオリゴヌクレオチドが以下のマトリックス中で本発明に従って分離され、検出された。トリス−ボレートＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８．３　中で生成された、１９部対１部のアクリルアミド対ビス−アクリルアミドからつくられた６％のポリアクリルアミド。
【０１１７】
電気泳動分離後、色素−オリゴヌクレオチド接合体が色素標識されたポリヌクレオチドからの蛍光放出を測定することにより検出される。このような検出を行うために、標識されたポリヌクレオチドが通常の手段、例えば、強力水銀蒸気ランプ、レーザー等により照射される。照射手段は４８８〜５５０ｎｍ　の波長の照射ビームを有するレーザーであることが好ましい。色素−ポリヌクレオチドはアルゴンイオンレーザーにより生じたレーザー光、特にアルゴンイオンレーザーの４８８及び５１４ｎｍ　の放出線、またはネオジムソリッドステートＹＡＧ　レーザーの５３２　放出線により照射されることが更に好ましい。これらの線で同時にレーザーとして使える幾つかのアルゴンイオンレーザーが市販されており、例えば、Ｃｙｏｎｉｃｓ，Ｌｔｄ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）のモデル２００１等が市販されている。次いで蛍光が感光性検出器、例えば、光電子増倍管、充電されたカップリング装置等により検出される。
【０１１８】
ＩＶ．　エネルギー転移色素を含むキット
　また、本発明はエネルギー転移蛍光色素及び／または試薬の組み合わせを有するキットに関する。一実施態様において、キットは本発明の少なくとも２種のスペクトル的に分解可能なエネルギー転移色素を含む。このキットにおいて、エネルギー転移色素は、単一光源が色素を励起するのに必要とされるように同じドナー色素を含むことが好ましい。別の実施態様において、キットはジデオキシシトシントリホスフェート、ジデオキシアデノシントリホスフェート、ジデオキシグアノシントリホスフェート、及びジデオキシチミジントリホスフェートを含み、夫々のジデオキシヌクレオチドトリホスフェートが本発明のエネルギー転移色素で標識される。一実施態様において、夫々のエネルギー転移色素はその他のジデオキシヌクレオチドトリホスフェートに結合されたその他のエネルギー転移色素からスペクトル的に分解可能である。このキットにおいて、エネルギー転移色素は同じ第一キサンテン色素を含むことが好ましい。更に別の実施態様において、キットは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、夫々のオリゴヌクレオチドが本発明のエネルギー転移色素を含む。一実施態様において、夫々のオリゴヌクレオチドはその他のオリゴヌクレオチドに結合されたエネルギー転移色素からスペクトル的に分解可能であるエネルギー転移色素を含む。別の実施態様において、キットは少なくとも４種のオリゴヌクレオチドを含み、これらが夫々スペクトル的に分解可能であるエネルギー転移色素を含む。エネルギー転移蛍光色素及びＤＮＡ配列決定におけるそれらの使用が以下の実施例により説明される。上記の目的及び利点以外の目的及び利点がこれらの実施例から明らかになるであろう。
【実施例】
【０１１９】
１．５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦ　の合成
【０１２０】
【化６６】
2004068023.tif 000050
【０１２１】
５−ＴＭＲ　ＮＨＳ　及び４’−アミノメチル−５−カルボキシフルオレセインから実施例１Ａ−Ｃに記載された反応順序に従って５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦを合成した。次いで５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦを１Ｄに記載された反応順序に従って５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦ−ＮＨＳに変換し、その結果、色素をヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーにカップリングすることができた。
Ａ．５−ＴＭＲ−Ｂの合成
【０１２２】
【化６７】
2004068023.tif 000051
【０１２３】
４−アミノメチル安息香酸（３ｍｇ、１９μモル）、５−ＴＭＲ　ＮＨＳ（５ｍｇ、９μモル）及びトリエチルアミン（２０μＬ）の混合物を１．５ｍＬのエッペンドルフ管中でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２００μＬ）中に懸濁させた。その混合物を１０分間にわたって６０℃に加熱した。反応の進行をジクロロメタン、メタノール及び酢酸の４００／３０／１０混合物で溶離してシリカゲルによる薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により監視した。不溶性４−アミノメチル安息香酸を遠心分離により分離し、ＤＭＦ溶液を５％のＨＣｌ（１ｍＬ）にデカントした。不溶性５ＴＭＲ−Ｂを遠心分離により分離し、５％のＨＣｌ（２ｘ１ｍＬ）で洗浄し、真空遠心分離機中で乾燥させた。生成物をＤＭＦ（２００　μＬ）に溶解し、５ＴＭＲ−Ｂ−ＮＨＳを調製するのに使用した。
Ｂ．５−ＴＭＲ−Ｂ−ＮＨＳの合成　
【０１２４】
【化６８】
2004068023.tif 000052
【０１２５】
ＤＭＦ（１２５μＬ）中の５ＴＭＲ−Ｂの溶液、ジイソプロピルエチルアミン（１０μＬ）及びジスクシンイミジルカーボネート（１０ｍｇ）を１．５ｍＬのエッペンドルフ管中で合わせ、６０℃に加熱した。反応の進行をジクロロメタン、メタノール及び酢酸の６００／６０／１６混合物で溶離してシリカゲルによるＴＬＣにより監視した。５分後、反応は完結したことが明らかであった。その溶液を塩化メチレン（３ｍＬ）中で希釈し、２５０ｍＭの炭酸塩／重炭酸緩衝液（ｐＨ９、４ｘ１ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真遠心分離機で濃縮、乾燥させた。固体をＤＭＦ（１００μＬ）に溶解した。アリコートをｐＨ９　の緩衝液中で希釈し、５５２ｎｍ　における吸光度を測定することにより収率を測定した。５０，０００ｃｍ−１Ｍ−１の吸光率を使用して、５ＴＭＲ−Ｂ−ＮＨＳの濃度は４．８ｍＭであった。５ＴＭＲ　ＮＨＳからの収率は８％であった。
Ｃ．５−ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦの合成
【０１２６】
【化６９】
2004068023.tif 000053
【０１２７】
５ＴＭＲ−Ｂ−ＮＨＳの溶液（２５０　μＬ　のＤＭＦ　中１μモル）を１．５ｍＬのエッペンドルフ管中で４’−アミノメチル−５−カルボキシフルオレセインの溶液（ＣＦ、１００μＬのＤＭＳＯ中２．２μモル）及びトリエチルアミン（２０μＬ）と合わせた。１５％〜３５％のアセトニトリル対０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテートの勾配溶離によりＣ８逆相カラムを使用するＨＰＬＣにより反応を監視した。ＨＰＬＣ分析は、５ＴＭＲ−Ｂ−ＮＨＳが消費され、過剰の未反応のＣＦを残したことを示した。反応を５％のＨＣｌ（１ｍＬ）で希釈し、生成物を遠心分離により分離し、未反応のＣＦを水相中に残した。固体を５％のＨＣｌ（４ｘ１ｍＬ）で洗浄し、真空遠心分離機中で乾燥させ、ＤＭＦ（３００μＬ）に吸収させた。収率は定量的であった。
Ｄ．５−ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦ−ＮＨＳの合成
【０１２８】
【化７０】
2004068023.tif 000054
【０１２９】
５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦ　の溶液（１００μＬのＤＭＦ中０．６μモル）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＤＥＣ、２ｍｇ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４ｍｇ）を１．５ｍＬのエッペンドルフ管中で合わせた。その混合物を素早く音波処理し、６０℃に加熱した。反応をジクロロメタン、メタノール及び酢酸の６００／６０／１６混合物で溶離してシリカゲルによるＴＬＣにより監視した。反応は３０分間で完結し、５％のＨＣｌで希釈した。生成物を遠心分離により分離し、真空遠心分離機中で乾燥させた。活性化色素をＤＭＦ（２０μＬ）に溶解した。
２．５ＲＯＸ−ＣＦの合成
【０１３０】
【化７１】
2004068023.tif 000055
【０１３１】
５ＲＯＸ　ＮＨＳの溶液（１００μＬのＤＭＳＯ中２μモル）をＣＦ（１００μＬのＤＭＳＯ中２μモル）及びトリエチルアミン（１０μＬ）と混合した。２０％〜４０％のアセトニトリル対０．１ＭのＴＥＡＡの勾配溶離によりＣ８逆相カラムによるＨＰＬＣにより反応を追跡した。反応液を５％のＨＣｌ（１ｍＬ）中で希釈し、生成物を遠心分離により回収し、５％のＨＣｌ（１ｘ１ｍＬ）で洗浄し、真空遠心分離機中で乾燥させた。生成物をＤＭＦ（２００μＬ）に吸収させた。
３．Ｃｙ５の合成　
【０１３２】
【化７２】
2004068023.tif 000056
【０１３３】
ＣＦの溶液（２０μＬのＣＭＳＯ中０．４μモル）及びトリエチルアミン（２μＬ）をモノＣｙ５　ＮＨＳ（約０．３　μモル）に添加した。１０％〜３０％のアセトニトリル対０．１ＭのＴＥＡＡの勾配溶離を使用してＣ８逆相カラムによるＨＰＬＣにより反応を追跡した。反応液を５％のＨＣｌ（１ｍＬ）中で希釈し、生成物を遠心分離により回収し、５％のＨＣｌ（１ｘ１ｍＬ）で洗浄し、真空遠心分離機中で乾燥させた。生成物をＤＭＦ（１００μＬ）に吸収させた。
４．エネルギー転移色素の蛍光強さの比較
　以下の実施例は本発明の一連のエネルギー転移色素の蛍光放出強さを比較する。５ＴＭＲ、６ＴＭＲ−ＣＦ、５ＴＭＲ−ｇｌｙ−ＣＦ、５ＴＭＲ−ＣＦ、５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦ、５ＴＭＲ−ｇｌｙ−５ＡＭＦ、５ＴＭＲ−５ＡＭＦ及び５ＴＭＲ−ｌｙｓ−５ＦＡＭの色素溶液を１ｘＴＢＥ／８Ｍ尿素中で測定した。夫々の色素溶液は５６０ｎｍで０．１の光学密度を有し、４８８ｎｍで励起された。
【０１３４】
【化７３】
2004068023.tif 000057
【０１３５】
これらの色素の夫々の構造を表７に示す。図２はこれらの色素の夫々の相対蛍光の棒グラフを示す。図２からわかるように、リンカーが５環位でアクセプターに結合されているエネルギー転移色素（５ＴＭＲ−ＣＦ及び５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦ）は、アクセプター色素それ自体またはアクセプター色素が６環位で結合されている場合（６ＴＭＲ−ＣＦ）よりもかなり強い蛍光を示すことがわかった。また、図２からわかるように、リンカーが式Ｒ１ＸＣ（Ｏ）Ｒ２（式中、Ｒ２はベンゼンである）を有するエネルギー転移色素（５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦ）は、リンカーが式−ＣＨ２ＮＨＣＯ−（５ＴＭＲ−ＣＦ）または−ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＮＨＣＯ−（５ＴＭＲ−ｇＭＦ）を有する色素と比較してかなり増強された蛍光を有することがわかった。また、図２からわかるように、リンカーが５環位でドナー及びアクセプターの両方に結合されているエネルギー転移色素（５ＴＭＲ−５ＡＭＦ及び５ＴＭＲ−ｇｌｙ−５ＡＭＦ）はかなりの蛍光を有することがわかった。重要なことに、リシンリンカーの使用はドナーとアクセプターの間の認められるエネルギー転移をもたらさないことがわかった。
【０１３６】
　５．エネルギー転移色素を使用する色素プライマー配列決定
　この実施例において、５ＴＭＲ−ＣＦ標識されたオリゴヌクレオチド及び５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦ標識されたオリゴヌクレオチドの相対的明度を比較するために色素プライマー配列決定をＭ１３（配列番号１）について行った。この実施例において、色素プライマー配列決定をＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　Ｕｓｅｒ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｖ．Ｂ，１９９５年１月，２章（ｐ／ｎ　４０２１１４，Ｔｈｅ　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に従って行った。５ＴＭＲ−ＣＦ　及び５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦの夫々をＭ１３−２１プライマー（配列番号２）の５’末端に結合した。夫々のプライマーの等モル溶液をＭ１３（配列番号１）と混合し、単一ジデオキシヌクレオチド混合物（ｄｄＡ／ｄＮＴＰ）及びＴａｑＦＳで配列決定した。５ＴＭＲ−ＣＦ標識されたプライマー及び５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦ　標識されたプライマーを使用して検出されたオリゴヌクレオチドの得られる混合物のプロットを図９に示す。図９からわかるように、５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦで標識されたオリゴヌクレオチドは５ＴＭＲ−ＣＦ　で標識されたオリゴヌクレオチドよりも明るい。また、図９からわかるように、５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦで標識されたオリゴヌクレオチドの移動度は５ＴＭＲ−ＣＦで標識されたオリゴヌクレオチドよりも約１ヌクレオチド遅かった。
【０１３７】
　６．４種の色素を使用する色素プライマー配列決定
　実施例５に記載されたＭ１３−２１プライマー（配列番号２）に結合された４種の色素の組を使用して、色素プライマー配列決定をＭ１３（配列番号１）について行った。図１０は配列決定から生成された色素標識されたオリゴヌクレオチドの４色プロットである。シトシンに関するピークは５−カルボキシ−Ｒ１１０の蛍光に相当する。アデノシンに関するピークは５−カルボキシ−Ｒ６Ｇの蛍光に相当する。グアノシンに関するピークはＴＭＲ−Ｂ−ＣＦの蛍光に相当する。チミジンに関するピークはＲＯＸ−ＣＦの蛍光に相当する。図１０からわかるように、色素標識されたオリゴヌクレオチドの夫々がかなりの蛍光強さを示す。加えて、異なる色素標識されたオリゴヌクレオチドは、一連のピークの良好な分解が得られる程に充分に同様の移動度を示す。
　７．６−ＣＦＢ−ＤＴＭＲ−２−ＮＨＳの合成
【０１３８】
【化７４】
2004068023.tif 000058
【０１３９】
　実施例１Ａ−Ｂに記載された反応順序に従って６−ＣＦＢ−ＤＴＭＲ−２をＤＴＭＲ−２及び６−ＣＦＢ　から合成した。次いで６−ＣＦＢ−ＤＴＭＲ−２を１Ｃに記載された反応順序に従って６−ＣＦＢ−ＤＴＭＲ−２−ＮＨＳに変換し、その結果、色素をヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーにカップリングすることができた。
　Ａ．ＤＴＭＲ−２−ＮＨＳの合成
【０１４０】
【化７５】
2004068023.tif 000059
【０１４１】
ＤＭＦ　中のＤＴＭＲ−２の溶液、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩をエッペンドルフ管中で合わせ、６０℃に加熱した。反応の進行をシリカゲルによるＴＬＣにより監視した。反応が完結したことが明らかになった後、その溶液を塩化メチレン中で希釈し、２５０　ｍＭの炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９、４ｘ１ｍＬ）で洗浄し、次いでＨＣｌ溶液（５％、１ｘ１ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空遠心分離機で濃縮、乾燥せた。
　Ｂ．６−ＣＦ−Ｂ−ＤＴＭＲ−２の合成　
【０１４２】
【化７６】
2004068023.tif 000060
【０１４３】
　ジメチルスルホキシド中の６−ＣＦＢ　の溶液（１００μＬ、１１ｍＭ）をジメチルホルムアミド中のＤＴＭＲ−２スクシドイミジルエステルの溶液（１００μＬ、２２ｍＭ）及びトリエチルアミン（２０μＬ）と合わせた。その反応液を塩酸（５％、１ｍＬ）の溶液に添加し、固体を遠心分離により分離した。赤色固体を炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ９、１００μＬ）に溶解し、希ＨＣｌで再度沈殿させた。固体を真空遠心分離機中で乾燥させ、ジメチルホルムアミド（２００μＬ）に溶解した。色素溶液の濃度を、アリコートを４０％のアセトニトリル／０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７）中で希釈することにより測定した。フルオレセインについて８０，０００ｃｍ−１ｍ−１の吸光率を仮定して、６−ＣＦ−Ｂ−ＤＴＭＲ−２溶液は４ｍＭ（収率７０％）であることがわかった。
　Ｃ．６−ＣＦ−Ｂ−ＤＴＭＲ−ＮＨＳの合成
【０１４４】
【化７７】
2004068023.tif 000061
【０１４５】
　ジメチルホルムアミド中の６−ＣＦ−Ｂ−ＤＴＭＲ−２の溶液（２００μＬ、４ｍＭ）にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１０ｍｇ）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（５μｇ）を添加した。追加のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１０ｍｇ）を添加した。反応の進行を６００：６０：１６の混合物中のジクロロメタン：メタノール：酢酸で溶離してシリカゲルによる薄層クロマトグラフィーにより監視した。反応が完結した時、希ＨＣｌ（５％、１ｍＬ）を添加し、生成物を遠心分離により分離した。固体を真空遠心分離機中で乾燥させ、ジメチルホルムアミド（１００μＬ）に溶解した。色素溶液の濃度を、アリコートを４０％のアセトニトリル／０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７）中で希釈することにより測定した。フルオレセインについて８０，０００ｃｍ−１ｍ−１の吸光率を仮定して、６−ＣＦ−Ｂ−ＤＴＭＲ−ＮＨＳ　溶液は５．４ｍＭ（収率６８％）であることがわかった。
【０１４６】
　８．色素の蛍光強さの比較　以下の実施例は相当するアクセプター色素に対する本発明の一連のエネルギー転移色素の蛍光放出強さを比較する。この実施例によれば、夫々の色素を５’末端でアミノヘキシル結合により２１プライマー配列（５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）（配列番号１）に結合した。１８０，０００ｃｍ−１Ｍ−１の吸光率を仮定して、オリゴヌクレオチドを２６０ｎｍにおける吸光度に基いて定量した。スペクトルを４８８ｎｍ励起により８Ｍ尿素、１Ｘトリス／ボレート／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中０．４μＭのプライマー濃度で得た。図１１Ａ　は５−ＣＦＢ−ＤＲ１１０−２　及びＤＲ１１０−２　の重なったスペクトルを示す。図１１Ｂ　は５−ＣＦＢ−ＤＲ６Ｇ−２及びＤＲ６Ｇ−２の重なったスペクトルを示す。図１２Ｃは６−ＣＦＢ−ＤＴＭＲ−２及びＤＴＭＲ−２の重なったスペクトルを示す。図１２Ｄは６−ＣＦＢ−ＤＲＯＸ−２及びＤＲＯＸ−２の重なったスペクトルを示す。これらの色素の構造を表１に示す。図１１Ａ〜図１２Ｄ　からわかるように、エネルギー転移色素はアクセプター色素それ自体よりもかなり強い蛍光を示すことがわかった。図１３は４種の色素標識されたオリゴヌクレオチドの基準化された蛍光放出スペクトルを示す。スペクトルを４８８ｎｍ励起により８Ｍ尿素、１Ｘトリス／ボレート／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中０．４μＭのプライマー濃度で得た。図１３に示された色素は５−ＣＦＢ−ＤＲ１１０−２、５−ＣＦＢ−ＤＲ６Ｇ−２、６−ＣＦＢ−ＤＴＭＲ−２、及び６−ＣＦＢ−ＤＲＯＸ−２を含む。図１３からわかるように、全ての４種のエネルギー転移色素は互いに対し良く分解される。
【０１４７】
　９．エネルギー転移色素を使用する色素プライマー配列決定
　この実施例において、５−ＣＦ−ＴＭＲ−２標識されたプライマー、５−ＣＦ−Ｂ−ＴＭＲ−２標識されたプライマー、６−ＣＦ−Ｂ−ＤＴＭＲ−２標識されたプライマー及びＤＴＭＲ−２標識されたプライマーを使用して、色素プライマー配列決定をＭ１３（配列番号２）について行った。この実施例において、色素プライマー配列決定をＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　Ｕｓｅｒ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｖ．Ｂ，１９９５年１月，２　章（ｐ／ｎ　４０２１１４，ＴｈｅＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に従って行った。色素をＭ１３−２１プライマー（配列番号３）の５’末端に結合した。夫々のプライマーの等モル溶液をＭ１３（配列番号２）と混合し、単一ジデオキシヌクレオチド混合（ｄｄＡ／ｄＮＴＰ）及びＴａｑＦＳで配列決定した。５−ＣＦ−ＴＭＲ−２標識されたプライマー及び５−ＣＦ−Ｂ−ＴＭＲ−２標識されたプライマーを使用して検出されたオリゴヌクレオチドの得られる混合物のプロットを図１４に示す。この図からわかるように、５−ＣＦ−Ｂ−ＴＭＲ−２は５−ＣＦ−ＴＭＲ−２よりもかなり強いシグナルを示し、５−ＣＦ−Ｂ−ＴＭＲ−２中に使用されたリンカーにより与えられた蛍光増強を示す。６−ＣＦ−Ｂ−ＤＴＭＲ−２標識されたプライマー及びＤＴＭＲ−２標識されたプライマーを使用して検出されたオリゴヌクレオチドの得られる混合物のプロットを図１５に示す。この図からわかるように、６−ＣＦ−Ｂ−ＤＴＭＲ−２はＤＴＭＲ−２よりもかなり強いシグナルを示し、そのエネルギー転移色素により与えられた蛍光増強を示す。
【０１４８】
１０．　４種の色素を使用する色素プライマー配列決定
　実施例５に記載されたＭ１３−２１プライマー（配列番号３）に結合された４種の色素の組を使用して、色素プライマー配列決定をＭ１３（配列番号２）について行った。図１６及び１７は配列決定から生成された色素標識されたオリゴヌクレオチドの４色プロットである。シトシンに関するピークは５−ＣＦＢ−ＤＲ１１０−２の蛍光に相当する。アデノシンに関するピークは６−ＣＦＢ−ＤＲ６ｇ−２の蛍光に相当する。グアノシンに関するピークは５−ＣＦＢ−ＤＴＭＲ−２の蛍光に相当する。チミジンに関するピークは５−ＣＦＢ−ＤＲＯＸ−２の蛍光に相当する。図１６及び１７からわかるように、色素標識されたオリゴヌクレオチドの夫々がかなりの蛍光強さを示す。加えて、異なる色素標識されたオリゴヌクレオチドは、一連のピークの良好な分解が得られる程に充分に同様の移動度を示す。本発明の好ましい実施態様の以上の記載は説明及び記載の目的で示された。排他的であること、または本発明を開示された正確な形態に限定することは意図されていない。明らかに、多くの改良及び変化が当業者に明らかであり、本発明の範囲内に入ることが意図されている。
【０１４９】
（配列表）
【数ＡＡ】
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【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】活性化されたＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル（これは次いでアミノヘキシル−オリゴマーと反応させられて色素標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを生成する）へのエネルギー転移色素のカルボキシ置換基の修飾を示す。
【図２】本発明の一連のエネルギー転移色素の蛍光放出強さをその他のエネルギー転移色素及びアクセプター色素単独と比較する。
【図３】本発明のエネルギー転移色素中に使用し得る４，７−ジクロロローダミン色素化合物の幾つかの特に好ましい実施態様を示す。
【図４】本発明のエネルギー転移色素中に使用し得る４，７−ジクロロローダミン色素化合物の幾つかの特に好ましい実施態様を示す。
【図５】本発明の４，７−ジクロロローダミン色素（置換基Ｘ１　がカルボキシレート以外であり得る）の調製の好ましい一般化された合成スキームを示す。
【図６】本発明の４，７−ジクロロローダミン色素（置換基Ｘ１がカルボキシレートである）の調製の好ましい一般化された合成スキームを示す。
【図７】互いにスペクトル的に分解可能である４種の色素（３−カルボキシ−Ｒ１１０、５−カルボキシ−Ｒ６Ｇ、５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦ　及び５ＲＯＸ−ＣＦ）の組を示す。
【図８】互いにスペクトル的に分解可能である４種の色素（３−カルボキシ−Ｒ１１０、５−カルボキシ−Ｒ６Ｇ、５ＲＯＸ−ＣＦ　及びＣｙ５−ＣＦ）の組を示す。
【図９】５ＴＭＲ−ＣＦ　標識されたプライマー及び５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦ　標識されたプライマーを使用する色素プライマー配列決定中に生成された標識されたオリゴヌクレオチドの混合物のプロットである。
【図１０】３−カルボキシ−Ｒ１１０、５−カルボキシ−Ｒ６Ｇ、５ＴＭＲ−ＣＦ　及び５ＴＭＲ−Ｂ−ＣＦ　を含む４色素の組を使用する色素プライマー配列決定の４色プロットである。
【図１１】６−ＣＦＢ−ＤＲ１１０−２　及びＤＲ１１０−２　の重なったスペクトル並びに５−ＣＦＢ−ＤＲ６Ｇ−２及びＤＲ６Ｇ−２の重なったスペクトルを示す。
【図１２】６−ＣＦＢ−ＤＴＭＲ−２及びＤＴＭＲ−２の重なったスペクトル並びに６−ＣＦＢ−ＤＲＯＸ−２及びＤＲＯＸ−２の重なったスペクトルを示す。
【図１３】互いにスペクトル的に分解可能である４種の色素（５−ＣＦＢ−ＤＲ１１０−２、５ＣＦＢ−ＤＲ６Ｇ−２、６−ＣＦＢ−ＤＴＭＲ−２、及び６−ＣＦＢ−ＤＲＯＸ−２）の組を示す。
【図１４】６−ＣＦＢ−ＤＴＭＲ−２標識されたプライマー及びＤＴＭＲ−２標識されたプライマーを使用する色素プライマー配列決定中に生成された標識されたオリゴヌクレオチドの混合物のプロットである。
【図１５】５−ＣＦ−ＴＭＲ−２標識されたプライマー及び５−ＣＦ−Ｂ−ＴＭＲ−２標識されたプライマーを使用する色素プライマー配列決定中に生成された標識されたオリゴヌクレオチドの混合物のプロットである。
【図１６】５−ＣＦＢ−ＤＲ１１０−２、６−ＣＦＢ−ＤＲ６ｇ−２、５−ＣＦＢ−ＤＴＭＲ−２、及び５−ＣＦＢ−ＤＲＯＸ−２を含む４種の色素の組を使用する色素プライマー配列決定の４色プロットである。
【図１７】５−ＣＦＢ−ＤＲ１１０−２、６−ＣＦＢ−ＤＲ６ｇ−２、５−ＣＦＢ−ＤＴＭＲ−２、及び５−ＣＦＢ−ＤＲＯＸ−２を含む４種の色素の組を使用する色素プライマー配列決定の４色プロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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