(57)【要約】【課題】新規な細胞死の抑制剤および抑制方法を提供する。【解決手段】核酸およびプロタミンを主成分とする魚類白子抽出物を含有することを特徴とする細胞死抑制剤。該細胞死抑制剤は、好ましくは鮭、鱒、鰊および鱈からなる群より選択される魚類より製造され、特に虚血により引き起こされる遅発性神経細胞死の抑制のために好適に使用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸およびプロタミンを主成分とする魚類白子抽出物の有効量を含有することを特徴とする細胞死抑制剤。
【請求項２】
前記魚類は、鮭、鱒、鰊および鱈からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１記載の細胞死抑制剤。
【請求項３】
遅発性神経細胞死の抑制のために使用されることを特徴とする、請求項１記載の細胞死抑制剤。
【請求項４】
虚血により引き起こされる遅発性神経細胞死の抑制のために使用されることを特徴とする、請求項３記載の細胞死抑制剤。
【請求項５】
請求項１ないし４に記載の細胞死抑制剤の有効量を含有することを特徴とする食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、特に虚血により引き起こされる遅発性の神経細胞死に対して抑制効果のある物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）はあらゆる生物細胞中に存在し、生物の遺伝情報を保存している高分子化合物である。これらの核酸の構成成分であるヌクレオチドは、生物のエネルギー源であるＡＴＰ、代謝調整物質であるｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ、並びに補酵素であるＮＡＤおよびＦＡＤの構成成分でもあり、生命活動において重要な役割を果たしている。にもかかわらず、核酸の栄養学的価値は最近まで殆ど注目されていなかった。しかし、近年になって、核酸またはヌクレオチドの摂取が、細胞発達、免疫機能、脳機能、脂質代謝等に影響を及ぼすことが報告されている（例えば、非特許文献１および非特許文献２参照）。
【０００３】
ところで、魚類の白子は核酸とタンパク質の複合体である核タンパク質を多量に含んでおり、非常に栄養価の高い食材であることが知られている。しかしながら魚類の白子はごく一部が鮮食用として利用されているのみで、加工の困難さ、保存性等の理由により大部分は廃棄処分されており、その利用分野は限られていた。
【０００４】
魚類の白子が有する高い栄養学的価値に着目した利用方法の一例として、白子の磨砕物および分画物を配合してなる乳幼児用栄養組成物が知られている。該栄養組成物は、それを摂取することによって、便性改善、窒素利用効率の改善、消化吸収能の向上、アレルギー発症の抑制、腸管成熟促進等の効果が期待できる（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
一方、脳は神経突起を介して互いに結合した神経細胞より構成される。そして神経細胞同士の結合が破壊された場合、時間はかかるけれども神経突起が再生・再結合して脳機能を取り戻すことができるが、神経細胞自体が障害を受けて死んでしまうと、神経細胞は他の細胞と異なり分裂増殖しないので脳機能が回復することはない。また脳の神経細胞は虚血に対して非常に弱いことが知られている。例えば、手足等の体細胞は数時間血液が流れずとも再灌流後に最終的には元通り回復するが、脳の虚血はたった５分でも神経細胞死を引き起こし、深刻な後遺症を引き起こす場合がある。
【０００６】
【特許文献１】
特開平８−２３８０７２号公報（第２頁）
【非特許文献１】
Chandra, R.K. & Kumari, S. (1994) Symposum : Dietary Nucreotides : A Recently Demonstrated Requiment for Cellar Development and Immune Function. J. Nutr. 124 : 1433S-1435S
【非特許文献２】
Sato, N., Murakami, Y., Nakano, T., Sugawara, M., Kawakami, H., Idota,T. & Nakajima, I., (1995) Effects of Dietary Nucleotides on Lipid Metabolism and Learning Ability of Rats. Biosci. Biothec. Biochem 59 : 1267-1271
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、魚類の白子抽出物が有する優れた食効は認識されているものの、その効果の詳細は未だ解明されておらず、特に細胞死の抑制効果に関して何ら検討されていなかった。白子抽出物の効果は、その主成分である核酸および核タンパク質の一種であるプロタミンに由来すると推測されるが、もし脳神経学的効果の詳細を解明することができれば、処方の対象、時期、量等を最適化でき、しかも他の薬剤との相乗効果をも期待でき、白子抽出物の有効性を格段に拡張できると考えられる。
【０００８】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、第一に、核酸およびプロタミンを主成分とする白子抽出物の脳神経学的効果の詳細を明らかにし、より有効な用途を見出すことにある。他の目的は、本明細書の記載より把握される細胞死抑制剤並びにそれを含む食品の提供にある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、鋭意研究を行った結果、核酸およびプロタミンに富んだ魚類白子抽出物が細胞死、特に神経細胞死を顕著に抑制し得ることを見出した。
従って、本願の請求項１に係る細胞死抑制剤は、核酸およびプロタミンを主成分とする魚類白子抽出物の有効量を含有することを特徴とする。
【００１０】
本願の請求項２に係る細胞死抑制剤は、請求項１の細胞死抑制剤において、前記魚類は、鮭、鱒、鰊および鱈からなる群より選択されることを特徴とする。
本発明では、核酸および核タンパク質を多量に含む魚類の白子の中でも、従来はその一部が食用に使用されるのみで、大部分は利用されることなく廃棄されていた鮭、鱒、鰊および鱈の白子より細胞死抑制剤を製造することにより、製造コストを低減することができる。
【００１１】
本願の請求項３に係る細胞死抑制剤は、請求項１の細胞死抑制剤において、遅発性神経細胞死の抑制のために使用されることを特徴とし、また本願の請求項４に係る細胞死抑制剤は、請求項３の細胞死抑制剤において、虚血により引き起こされる遅発性神経細胞死の抑制のために使用されることを特徴とする。
本発明の細胞死抑制剤は、特に虚血・再灌流により引き起こされる遅発性の神経細胞死を有効に抑制することができる。
【００１２】
本願の請求項５に係る食品は、請求項１ないし４に記載の細胞死抑制剤の有効量を含有することを特徴とする。
本発明では、魚類白子抽出物からなる細胞死抑制剤を食品に添加することにより、虚血等の原因で生じる神経細胞死等を抑制するに有効な食品を提供することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の細胞抑制剤は有効量の魚類白子抽出物を含む。そして本発明の魚類白子抽出物は核酸と核タンパク質中のタンパク質であるプロタミンとを主成分として含有する。
【００１４】
核酸にはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）があり、生物の遺伝情報を保存している。そして魚類の白子は、なかでもアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の四種のヌクレオチドを構成要素としてなるＤＮＡを多量に含む。ＤＮＡを包含する核酸の摂取が生物の健康状態の増進に役立つという報告が近年為されているが、本発明以前には、具体的にどのような効果を生物に奏するかは不明であった。
【００１５】
またプロタミンは、魚類の白子中に多く含まれる塩基性タンパク質であって、核酸と結合してヌクレオプロタミンを形成する。またアルギニン含量が高く、アルギニン由来の窒素が全窒素含量の２５〜９０％に相当する。
【００１６】
本発明の魚類白子抽出物は、例えば、魚類の白子から皮、筋、血管等を除去した後、精製することにより製造される。また、魚類としては、好ましくは鮭、鱒、鰊および鱈を挙げることができる。さらにプロテアーゼおよびヌクレアーゼでの処理を行うことにより、水溶性化することもできる。
【００１７】
本発明の細胞死抑制剤は様々な剤型とすることが可能である。定法により加工することにより、粉末、顆粒、錠剤またはカプセル剤等の剤型をとることができる。また、水溶性化されたものは溶液等とすることもできる。
【００１８】
本発明の細胞抑制剤は、様々な要因により引き起こされる細胞死を有効に抑制することができる。特に、細胞に血液が流れなくなる現象である虚血により様々な部位の細胞で生じる細胞死を、本発明の細胞抑制剤は有効に抑制することができる。該部位としては、例えば心臓、指先等の末端部位、腎臓、陰茎等を挙げることができ、本発明の細胞死抑制剤は、これらの部位の細胞中の血流を増加させることで、虚血による細胞死を抑制する。なかんずく、脳卒中等における虚血・再灌流後に脳で生じる遅発性の神経細胞死、心筋梗塞等における虚血により心臓で生じる細胞死に対して、本発明の細胞死抑制剤は有効である。実際の投薬時には、１日当り位０．１〜１０ｇ、好ましくは０．２〜５ｇの量で細胞死抑制剤を投与することが好ましく、１日１〜３回に分けて投与されるが、年齢、体重、症状等により投与量が増減する。
【００１９】
【実施例】
以下の例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２０】
実施例１：
鮭の白子より白子抽出物を以下のように精製した。
１．  鮭白子の前処理
鮭白子１０００ｇをとり、血抜きおよび水洗を行った。水切りした後３００ｍｌの水を加え、磨砕、攪拌して懸濁液を得た。
２．  粉化処理
次ぎに、この懸濁液を濾過し白子の皮等の固形分を取り除いた後、スプレードライヤーで噴霧乾燥し、粉状の物質を得た。
３．  洗浄、回収
この粉状の物質をエタノール洗浄して、エタノール可溶物と水分を除き、減圧乾燥し、粉末状物として、白子抽出物１８０ｇを得た。
かくして得られた白子抽出物は淡黄色の粉末であって、その化学的、物理的性質を以下に示す。
核酸含有量：  ２５〜５０％
タンパク質含有量：  ２５〜６０％
灰分含有量：  ５〜１５％
ニンヒドリン反応：  陽性
【００２１】
実施例２：
水溶性の白子抽出物を以下のように製造した。
１．  プロテアーゼ処理
実施例１の１．で得た懸濁液を５０℃に昇温した後、白子の０．１％であるプロテアーゼ［ノボノルディスクバイオインダストリー株式会社製、ＰＹＮ３．０Ｓ、主成分：ブタ膵臓からのトリプシン、微量のキモトリプシンを含む。］１ｇを添加し、攪拌しながら４時間反応させた。反応の間、反応液のｐＨを６．０〜６．３に保持した。反応の間には加熱を行わず、４時間経過後の反応液の温度は４４．７℃に低下した。反応終了後、反応液の温度を７０℃に昇温してプロテアーゼを失活させた。
２．  ヌクレアーゼ処理
７０℃の温度の反応液に、白子の０．１％であるヌクレアーゼ［天野製薬株式会社製、ヌクレアーゼ「アマノ」、Penicillium citrinum菌より単離。］１ｇを添加し、攪拌しながら４時間反応させた。反応の間、反応液のｐＨを５．０〜５．５に保持した。反応終了後、反応液の温度を８５℃に昇温してヌクレアーゼを失活させた。
３．  酵素処理品からの回収
反応液を３５℃に冷却し、ｐＨを７．０に調節した。反応液を連続的にデカンターに送液してその上澄液を分離し、分離した上澄液をスプレードライヤーにて噴霧して乾燥し、粉末状の白子抽出物１３０ｇを得た。
【００２２】
以下の実験により、白子抽出物を投与しない群（ＮＦ群）と比較して、実施例１の白子抽出物を投与した群（ＮＰ群）の神経細胞死抑制効果を評価した。この効果は、実施例１の白子抽出物に限定されるものではなく、プロテアーゼおよびヌクレアーゼの酵素処理をすることにより水溶性化された実施例２の白子抽出物についても当てはまる。
各群に与えた飼料の組成を表１に示す。
【表１】
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該実験には７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを用いた。該マウスを先ず１２時間明暗サイクル、２３±２℃、４０±１５％の相対湿度で通常の飼料を与えて飼育し、次いで各実験群に対応した上記の飼料を与えて７日間飼育し、その後に実験を行った。
対象とした神経細胞死は、脳の虚血・再灌流後に発症する海馬の遅発性神経細胞死であり、マウスの両総頚動脈を一定時間閉塞し、その後再灌流させて発生させた。
【００２３】
試験例１
２５分間閉塞により神経細胞死を生じさせたマウスのＮＦ群およびＮＰ群について、閉塞７日後までの生存率を比較した。結果を図１に図示する。
図１から明らかなように、双方の群共に虚血２０分後から死亡数が増加し始め、２５分間の虚血による生存率はそれぞれＮＦ群が６０％そしてＮＰ群が７７．８％であり、ＮＦ群の生存率はＮＰ群より低かった。双方の群における生存率の差異は虚血１日後にはより顕著となり、ＮＦ群が２０％、ＮＰ群が５５．６％となった。
【００２４】
試験例２
１５分間閉塞により遅発性神経細胞死を生じさせたマウスのＮＦ群およびＮＰ群について、神経細胞死の抑制効果を比較した。
虚血２日後にマウスを安楽死させてその海馬の断面を、トルイジンブルー染色した試料およびＴＵＮＥＬ染色した試料について光学顕微鏡により観察した。トルイジンブルー染色は、大きな円形で透明の核を有する未損傷の細胞を染色するものであり、一方、ＴＵＮＥＬ染色はアポトーシスのように損傷を受けた細胞を染色するものである。図２は、トルイジンブルー染色による光学顕微鏡写真であり、図２Ａおよび図２ＣがＮＦ群、また図２Ｂおよび図２ＤがＮＰ群を示す。スケールバーは、図２Ａおよび図２Ｂが４００μｍ、また図２Ｃおよび２Ｄが１００μｍである。また図３は、ＴＵＮＥＬ染色による光学顕微鏡写真であり、図３Ａおよび図３ＣがＮＦ群、また図３Ｂおよび図３ＤがＮＰ群を示す。スケールバーは図２と同様である。
図２から明らかなように、ＮＦ群のマウスの海馬では、細胞核が収縮して異常な形状となり、核小体は明瞭に観察できなかった。それに対して、ＮＰ群では虚血２日後であっても多くの細胞が損傷を受けないままであった。図３に図示される結果は、図２のものと一致しており、ＮＦ群では多数の細胞が損傷しており、一方、ＮＰ群では僅かな細胞の損傷しか生じなかった。
次いで、未損傷のトルイジン染色された細胞の数と損傷を受けＴＵＮＥＬ染色された細胞の数とを双方の群について比較した。細胞数の計測は双方の半球体について二つづつである合計四つの海馬ＣＡ１領域について行い、各領域の寸法はそれぞれ２６０μｍ×１８０μｍであった（図４参照）。
計測の結果、ＮＦ群のトルイジンブルー染色された細胞数は平均１８．４個であり、またＴＵＮＥＬ染色された細胞数は平均２９．２個であった。一方、ＮＰ群では、トルイジンブルー染色された細胞数は平均３５．７個であり、またＴＵＮＥＬ染色された細胞数は平均９．３個であった。この結果は、実施例１の白子抽出物が有する神経細胞死抑制効果を裏付けるものである。
またＮＦ群とＮＰ群について、虚血の間での大脳血流の変化を観察したところ、ＮＰ群ではＮＦ群と比較して血流量が顕著に多かった。これは、実施例１の白子抽出物が細胞中の血流を促進する効果を有することを示す。
【００２５】
【発明の効果】
本発明では、今までその効果が一切知られていなかった魚類白子抽出物が細胞死の抑制に有用であることを見出したことにより、魚類白子抽出物の一つの効果が明らかとなり、該効果に基づいて処方の対象、時期、量等の最適化、および他の薬剤との併用が可能となり、白子抽出物の有効性が格段に増大する。
【００２６】
また、本発明の白子抽出物は、細胞の血流を促進する効果をも有することから、脳の神経細胞のみならず、心臓、指先、腎臓、陰茎等における血流の増大にも役立つ。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、試験例１に従い、２５分間虚血７日後までの生存率をＮＦ群およびＮＰ群について図示するグラフである。
【図２】図２は、試験例２に従い、未損傷細胞をトルイジンブルー染色して示す海馬の光学顕微鏡写真であり、図２Ａおよび図２ＣがＮＦ群、また図２Ｂおよび図２ＤがＮＰ群を示す。
【図３】図３は、試験例２に従い、アポトーシスの様に損傷を受けた細胞をＴＵＮＥＬ染色して示す海馬の光学顕微鏡写真であり、図３Ａおよび図３ＣがＮＦ群、また図３Ｂおよび図３ＤがＮＰ群を示す。
【図４】図４は、試験例２において、細胞数の計測を行った領域を図示する海馬の断面模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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