(57)【要約】【目的】本発明は、収穫植物や組み替え植物などのポリフェノールを含有している材料からその物質中に含まれている蛋白質を水性溶液中に抽出し精製する場合の改良方法を提供する。【構成】この方法は、水性溶液中にベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩の存在下で、抽出・精製などの処理を実施することからなる。【効果】非存在下での処理で起きるオルトキノンの重合が防止され、それによって高分子複合体と蛋白質アミノ酸残基の結合を防止でき、蛋白質の不純度の減少、障害防止を達成する。また、蛋白質収率も向上する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリフェノール含有材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出後、該抽出液から該蛋白質又は該蛋白質を含有する成分を任意の精製手段で精製する方法において、該水性溶液中にベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩を加えて該抽出・精製を実施することからなる方法。
【請求項２】
ポリフェノール含有材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出後、該抽出液から該蛋白質又は該蛋白質を含有する成分を任意の精製手段で精製する方法において、該抽出処理を低温・窒素ガス中で行い、ジチオスレイトール及びアスコルビン酸からなる還元剤及び／又はボリビニルピロリドンフェノール吸着剤の添加と共に、該水性溶液中にベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩を加えて該抽出・精製を実施することからなる方法。
【請求項３】
該任意の精製手段が、硫酸アンモニウム又は有機溶媒による蛋白質の沈殿、遠心分離、クロマトグラフィー、電気泳動、及び容器中でイオン交換樹脂などのカラム充填剤と共に蛋白質を撹拌し吸着させるバッチ法からなる群から選択される１又は２以上の組み合わせからなる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ポリフェノール含有材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出して蛋白質抽出液を得るにあたり、該水性溶液中にベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩を加えて該抽出を実施することからなる、該蛋白質抽出液中の蛋白質の純度を向上させる方法。
【請求項５】
該水溶性の塩がナトリウム塩である請求項１〜４のいずれか一に記載の方法。
【請求項６】
該ポリフェノール含有材料が植物である請求項１〜５のいずれか一に記載の方法。
【請求項７】
該ポリフェノール含有材料が、特定の蛋白質を製造するために遺伝子組み替えされた植物である請求項１〜５のいずれか一に記載の方法。
【請求項８】
該蛋白質が、ヒト血清アルブミンであり、該植物がヒト血清アルブミンを生産するように遺伝子組み替えされた植物である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
式
【化１】
2004051525.tif 000008
で表される基を有するポリフェノール化合物の存在下で、蛋白質が水性溶液中に抽出されることを含む、蛋白質含有材料からの蛋白質の精製方法に於いて、すくなくとも該抽出時に、ベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩を存在させることにより該ポリフェノール化合物の該基が６−ベンゾスルフォニル誘導体
【化２】
2004051525.tif 000009
に誘導体化された化合物を形成することを含む蛋白質の精製方法。
【請求項１０】
該基を有するポリフェノール化合物が、クロロゲン酸、カフェー酸及びプロトカテキュ酸からなる群から選択される１種以上を含む請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、収穫された植物や植物以外の蛋白質を生産するように組み替えられた植物などの、ポリフェノールを含有している材料から、その材料中に含まれている蛋白質を水性溶液中に抽出し、抽出液からその蛋白質を単離し精製する方法の改良からなる。
【０００２】
【従来の技術】
植物の諸組織には多種多様なポリフェノール系成分が含まれているが、その中のオルトジフェノール化合物は、組織が傷を受ける等のストレスが加わると、空気中の酸素、ポリフェノールオキシダーゼ（チロシナーゼ）等の酸化酵素、微量金属等の作用によりオルトキノンに酸化される。オルトキノンは不安定であり、直ちに重合し、以下に示すように水に不溶・難溶な高分子複合体を形成することが知られている。
【化３】
2004051525.tif 000002
【０００３】
植物材料から資源となる蛋白質を抽出・精製する場合に、上の式に記載される水に不溶・難溶な高分子複合体が蛋白質中のアミノ酸残基との間にしばしば共有結合を形成することが純粋な蛋白質を得る上で障害となっている。
【０００４】
そこで、そのような植物蛋白質を保護する方法として抽出・精製に際し、低温・窒素ガス中で処理を行うこと、防護物質を添加すること等が行われてきた。
【０００５】
防護物質としては、ジチオスレイトール、アスコルビン酸などのキノンを速やかに還元する還元剤、及びフェノール類を吸着するボリビニルピロリドンなどが知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、抽出・精製に際し上に述べた低温・窒素ガス中で処理を行うことや防護物質を添加することを行っても、純粋な蛋白質を得る上での障害は十分に克服することができなかった。本発明者は、この課題を解決すべく、より効果的な防護物質がないかどうか、既存の防護物質の機能を高める物質がないかどうかを調べるために鋭意研究を行った。
【０００７】
【課題を解決する手段】
その結果、本発明者は、ベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩、例えばナトリウム塩を加えて蛋白質の抽出・精製における処理を行った場合、その添加が抽出・精製しようとする目的の蛋白質をオルトキノンから防護する効果を有すること、そしての防護物質と共に使用すれば、防護機能が大幅に改善されることを発見し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は、「ポリフェノール含有材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出後、該抽出液から該蛋白質又は該蛋白質を含有する成分を任意の精製手段で精製する方法において、該水性溶液中にベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩を加えて該抽出・精製を実施することからなる方法」を提供するするものである。この方法は、該抽出処理を公知の蛋白質防護方法である「低温・窒素ガス中で行い、ジチオスレイトール及びアスコルビン酸からなる還元剤及び／又はボリビニルピロリドンフェノール吸着剤の添加と共に」行うことができ、蛋白質防護効果を高めることが出来る。
【０００９】
該任意の精製手段は、硫酸アンモニウム又は有機溶媒による蛋白質の沈殿、遠心分離、クロマトグラフィー、電気泳動、及び容器中でイオン交換樹脂などのカラム充填剤と共に蛋白質を撹拌し吸着させるバッチ法からなる群から選択される１又は２以上の組み合わせからなりうる。
【００１０】
また本発明は、「ポリフェノール含有材料中に含まれる蛋白質を水性溶液中に抽出して蛋白質抽出液を得るにあたり、該水性溶液中にベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩を加えて該抽出を実施することからなる、該蛋白質抽出液中の蛋白質の純度を向上させる方法」を提供するものである。
【００１１】
ポリフェノール含有材料は植物であり得、本発明は植物からその植物中に存在する蛋白質の抽出・精製方法に利用出来る。また、ポリフェノール含有材料は特定の蛋白質を製造するために遺伝子組み替えされた植物であり得る。従って、本来植物中に存在しない蛋白質を、遺伝子組み替えされた植物から抽出・精製するために本発明を利用できる。例えば、蛋白質が、ヒト血清アルブミンであり、それをヒト血清アルブミンを生産するように遺伝子組み替えされた植物から抽出・精製するのに本発明の方法を使用できる。
【００１２】
また本発明は、「式
【化４】
2004051525.tif 000003
で表される基を有するポリフェノール化合物の存在下で、蛋白質が水性溶液中に抽出されることを含む、蛋白質含有材料からの蛋白質の精製方法に於いて、すくなくとも該抽出時に、ベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩を存在させることにより該ポリフェノール化合物の該基が６−ベンゾスルフォニル誘導体
【化５】
2004051525.tif 000004
に誘導体化された化合物を形成することを含む蛋白質の精製方法」を提供するものである。上記のようなポリフェノール化合物は、クロロゲン酸、カフェー酸及びプロトカテキュ酸からなる群から選択される１種以上であり得る。
【００１３】
本発明に於いて、公知の防護物質と共に、水性溶液中にベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩を加えてポリフェノール含有材料中に含まれる蛋白質の抽出・精製を実施すると、蛋白質の収率が向上すると共に、蛋白質の不純度が飛躍的に減少することが確認され、この添加によるオルトキノンから防護効果が実証された。
【００１４】
本発明は如何なる理論にも限定されるものではないが、本発明者は上記の防護効果は、以下に示されるように、様々な酸化反応系でオルトキノン類、特に３，４−ジフェノールカルボキシレートに由来するオルトキノン類が、ベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩によって安定な誘導体に変化させられることにより、オルトキノン類の酸化重合が起こらなくなることによるものと考えており、且つこの考えが正しいことを実証するために、後の「Ｎａ−ＢＳ存在下での３，４−ジヒドロキシフェニル基を有するカルボン酸の酸化によるそのカルボン酸の６−ベンゾスルフォニル誘導体の合成例」に記載するように、反応が実際に起きることを確認している。
【化６】
2004051525.tif 000005
【００１５】
即ち、本発明は、この反応を、水性溶液中にベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩を加えてポリフェノール含有材料中に含まれる蛋白質の抽出・精製を実施する際に適用すれば、意外にも著しい蛋白質の防護効果・著しい不純度の減少効果が得られることを発見し、それを確認したものである。
【００１６】
ベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩としては、例えばアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が含まれるが、ナトリウム塩が市販されており、容易に入手出来好ましい。
【００１７】
【実施例】
以下本発明を具体例を挙げて説明する。
実施例１　種々の植物試料からの蛋白質の抽出・精製におけるベンゼンスルフィン酸ナトリウムの、オルトキノンによる傷害に対する防護効果
５種類の野菜（ホウレンソウ、レタス、コマツナ、ブロッコリ−及びモロヘイヤ）及び２種類の果実（リンゴ及びバナナ）より、以下のように可溶性蛋白質を精製した。
【００１８】
植物組織（３−１９ｇ）を、５倍量の、各々異なる２種類の氷冷された緩衝液系の中で摩砕した。２つの緩衝液系は、いずれもｐＨ７．５の５０ｍＭトリス−塩酸をベ−スに、一方（コントロ−ル）には１ｍＭのＥＤＴＡ（キレ−ト作用により、ポリフェノ−ルオキシダ−ゼ等の金属酵素を阻害する）の他、野菜の場合には１ｍＭのジチオスレイト−ル（ＤＴＴ；生成したキノンを還元する作用が有る）、果実の場合には材料の１／１０の重量のポリクラール（登録商標）ＡＴ（＝不溶性ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）＝フェノール吸着剤）を添加した。これらはいずれも、植物蛋白質の抽出・精製におけるオルトキノンによる傷害に対する防護物質として現在使用されているものである。他方には、それらに加えて５ｍＭのベンゼンスルフィン酸ナトリウム（Ｎａ−ＢＳ）をも溶解させた。両方の抽出液から濾過と遠心分離で固形物を除き、又、野菜類の場合は、更に上澄みに硫酸アンモニウムを３５％飽和になるように加えて葉緑体の破片を沈殿させ、遠心分離で除去した。最後に上澄みに硫酸アンモニウムを７０％飽和になるように加え、遠心分離により得られた粗蛋白質画分を、一定量のもとの緩衝液に溶解し脱塩後、蛋白質の定量を行って可溶性蛋白質の収率を求めた。また、オルトキノンの重合により形成されたメラニン様複合体によって吸収される４７０ｎｍの波長における吸光度（Ａ４７０ｎｍ）を測定し、それらの値より計算した蛋白質の単位含量当りのＡ４７０ｎｍ値をその不純度の指標とした。各材料におけるコントロ−ル（Ｎａ−ＢＳなしの緩衝液系で処理した方）における収率と不純度を各々１．００とした場合の、Ｎａ−ＢＳありの緩衝液系で処理した方におけるそれらの値を評価した。その結果を次の表１にまとめてある。
【００１９】
2004051525.tif 000006
【００２０】
表１に示されるように、Ｎａ−ＢＳの添加は、蛋白質の不純度の大幅な低下をもたらした。
【００２１】
Ｎａ−ＢＳは、ポリフェノ−ル類の中で、特にクロロゲン酸、カフェー酸、プロトカテキュ酸その他の３，４−ジフェノールカルボン酸類（３，４−ジヒドロキシフェニル基を有するカルボン酸）の酸化によって生じたオルトキノン類と反応し、元の化合物の６−ベンゾスルフォニル誘導体を生じさせることが証明されている（後で述べる６−ベンゾスルフォニル誘導体の合成例を参照：詳細は２００２年８月４−９日にスイス・バ−ゼルで開催される１０ｔｈ　ＩＵＰＡＣ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｗｏｒｌｄ　Ｃｒｏｐ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎにて発表予定）ので、誘導体化によるそれらの化合物の重合阻止が蛋白質を保護したと思われる。
【００２２】
又、収率も若干増加しているが、これは、上記の誘導体化でタンニン成分を形成するポリフェノ−ル類の酸化重合も阻止された分、タンニン成分と結合・沈殿してタンニン成分の一部をなしていた蛋白質が、タンニン形成が抑止されたため減らなかったためであろう。なお、いずれの材料においても、Ｎａ−ＢＳを含む系にのみ検出された生成物の主成分は、６−ベンゾスルフォニルクロロゲン酸であった。
【００２３】
以上より、種々の植物材料からの蛋白質の精製の障害となる褐変の主な原因物質はクロロゲン酸であり、又、Ｎａ−ＢＳがその影響を封じる上で非常に有効であることが示された。
【００２４】
実施例２　クロロゲン酸の酵素酸化が共存するヒト血清アルブミンに及ぼす影響に対するＮａ−ＢＳの防護効果
今日、ヒトの蛋白質を含む多くの非植物起原蛋白質が、遺伝子組み替え技術により植物に生産させることが可能になっているが、本格的に工業化されるには至っていない。その諸原因の一つは、材料に含まれるクロロゲン酸等のポリフェノ−ルが、ポリフェノ−ルオキシダ−ゼ等の酸化酵素及び空気中の酸素による酸化によってオルトキノンに変化し、その重合生成物の作用（タンニン形成・蛋白質との結合による蛋白質の不溶化及び不純化等）が目的蛋白質の精製に悪影響を及ぼすからである。植物に生産させることに成功したという報告のあるヒト蛋白質のうち、血液蛋白の主成分で医療分野で汎用性のあるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、他の物質と結合する性質が非常に強いので、抽出・精製の過程でオルトキノンの重合と関連した褐変の影響を特に受け易い。
【００２５】
ＨＳＡ及びクロロゲン酸をｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液に、各々２ｍｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。それを等分割し、一方には１ｍＭの可溶性ＰＶＰを、他方には、それに加えて５００μｇ／ｍｌのＮａ−ＢＳを添加した。両者各５ｍｌに、シグマのマッシュル−ムのチロシナ−ゼ（ポリフェノ−ルオキシダ−ゼ）２５０単位（５０μｌ）を加え、室温で一晩放置して塩酸で反応停止後、セファデックス（登録商標）Ｇ−１００を用いるゲル濾過にかけて粗ＨＳＡ画分を得た．粗ＨＳＡ画分を限外ろ過で濃縮し、蛋白質の定量とＡ４７０ｎｍの測定を行って、ＨＳＡの回収率及び不純度（単位含量当りのＡ４７０ｎｍ値）を求め、植物材料の場合と同様に、コントロ−ル（Ｎａ−ＢＳ無し）とＮａ−ＢＳありの比較を行った（表２）。
【００２６】
2004051525.tif 000007
【００２７】
表２に示されるように、Ｎａ−ＢＳ添加は、不純度の顕著な低下をもたらしたが、それは、クロロゲン酸の酵素酸化によって生じたキノンの誘導体化による重合停止によるのであろう。又、クロロゲン酸自体のみではタンニン活性は弱く、ＨＳＡと不溶性複合体をほとんど形成しないにもかかわらず、ＨＳＡの回収率を若干向上させた。これは、反応性に富むオルトキノンが速やかに除去されたことにより、ＨＳＡの２量体化反応が抑制されためと思われる。
【００２８】
Ｎａ−ＢＳ存在下での３，４−ジヒドロキシフェニル基を有するカルボン酸の酸化によるそのカルボン酸の６−ベンゾスルフォニル誘導体の合成例
合成：
クロロゲン酸、カフェー酸及びプロトカテキュ酸を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に各々１ｍＭの濃度にそれぞれ個別に溶解した。それらを、５ｍＭのベンゼンスルフィン酸ナトリウムの存在下、２５ユニット／ｍｌのマッシル−ム・チロシナ−ゼ（シグマ）で、３０℃に放置して酸化した。各反応混合物を、経時的にＨＰＬＣ（逆相系カラム使用、移動層はアセトニトリル：水：ギ酸＝３０：１７０：１）で分析すると、３種の物質のいずれも２−３時間で、７０％以上が主要生成物に転換した。生成物を、各々ＨＰＬＣで単離し、機器分析（ＦＡＢ−ＭＳ及びプロトンＮＭＲ）で以下のように同定した。
同定：
代表例として、クロロゲン酸より合成された６−ベンゾスルフォニルクロロゲン酸の場合を示す。
重メタノ−ル中のＮＭＲにおけるＨのピ−クのｐｐｍ値は、各々２．１８（キナ酸部分の２位及び６位、４個分）、３．７６（同４位、１個分）、４．１８（同５位、１個分）、５．３７（同３位、１個分）、６．１３（カフェ−酸部分の側鎖アルファ位、１個分）、８．４２（同ベ−タ位、１個分）、７．１４（カフェ−酸部分のベンゼン環の２位、１個分）、７．６９（同５位）、及び７．４−８．１（ベンゾスルフォニル基の部分のＨ５個分）であった。又、ＭＳにおける（分子イオン＋１）を示すピ−クのｍ／ｚ値より得られた分子量は４９４（＝Ｃ２２，Ｈ２２，Ｏ１１，Ｓ１）であった。以上より、本生成物の構造を６−ベンズスルフォニルクロロゲン酸と同定した。
【００２９】
【効果】
１）ベンゼンスルフィン酸の水溶性塩の添加により、オルトキノンが重合し水に不溶・難溶な高分子複合体を形成することが防止される。それにより、そのような高分子複合体と蛋白質中のアミノ酸残基との共有結合が生じることが防止される。
２）従って、ポリフェノール含有材料中に含まれる蛋白質を抽出・精製するに際し、純粋な蛋白質を得る上での障害が大幅に克服され、収量も向上する。
３）ジチオスレイトール、アスコルビン酸などのキノンを速やかに還元する還元剤、及びフェノール類を吸着するボリビニルピロリドンなどの既存の防護物質と共にベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩を使用すると、蛋白質の防護機能を大幅に高めることが出来、蛋白質の純度が飛躍的に向上する。
４）ベンゼンスルフィン酸の水溶性の塩がポリフェノール化合物と反応することにより、タンニン生成の原料が少なくなるから、タンニン生成が減り、蛋白質の収率が向上する。