(57)【要約】【課題】  Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２よりなる群から選択される組換え蛋白を精製する方法等を提供する。【解決手段】  本発明は、Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２よりなる群から選択される組換え蛋白を精製する方法に関する。本発明はまた、このような方法により単離された組成物に関する。本発明はまた、これらの組成物の診断用及び治療用の応用に関する。更に、本発明は、ＨＣＶ治療の臨床的有効性及び／又は臨床的結果を予知及び監視するための、ＨＣＶのＥ１蛋白及びペプチドの使用に関する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換宿主細胞を溶解して組換えにより発現された蛋白を単離する際に、ジスルフィド結合切断剤によりジスルフィド結合切断又は還元工程を行うことを特徴とする、Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２よりなる群から選択される組換えＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白を精製する方法。
【請求項２】
ジスルフィド結合切断又は還元工程を、部分的切断又は還元条件下で行う、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
ジスルフィド結合切断剤が、好適には０．１〜５０mM、好適には０．１〜２０mM、更に好適には０．５〜１０mMの範囲の濃度の、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
【請求項４】
ジスルフィド結合切断剤が、界面活性剤である、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】
界面活性剤が、好適には１〜１０％の濃度、更に好適には３．５％の濃度の、エンピゲン−ＢＢ（Empigen-BB）である、請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
ジスルフィド結合切断剤が、ＤＴＴのような古典的ジスルフィド結合切断剤と、エンピゲン−ＢＢのような界面活性剤との組合せを含む、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
【請求項７】
ＳＨ基保護剤によりジスルフィド結合の再形成を阻止する工程を更に含む、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ＳＨ基保護剤が、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）又はその誘導体である、請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項９】
ジスルフィド結合の再形成を阻止する工程を、低ｐＨ条件により達成する、請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも以下の工程：
−  組換えＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２発現宿主細胞を、場合によりＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）のようなＳＨ基保護剤の存在下で、溶解し、
−  レンチルレクチンクロマトグラフィーのようなレクチンクロマトグラフィー、あるいは抗Ｅ１及び／又は抗Ｅ２特異的モノクローナル抗体を用いる免疫親和性などの親和性精製により、上記ＨＣＶエンベロープ蛋白を回収し、
−  ＤＴＴのようなジスルフィド結合切断剤を用いて、好適にはＮＥＭ又はビオチン−ＮＥＭのようなＳＨ基保護剤の存在下で、ジスルフィド結合を還元又は切断して、そして
−  還元されたＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２エンベロープ蛋白を、ゲル濾過、及び場合によりこれに続くＮｉ2+−ＩＭＡＣクロマトグラフィーと脱塩工程により回収する工程、
により更に特徴づけられる、請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか１項記載の方法により単離されることを特徴とする、Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２よりなる群から選択される実質的に精製された組換えＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーの組換えエンベロープ蛋白を含む組成物。
【請求項１２】
更に、組換えＨＣＶエンベロープ蛋白が、ワクシニアのような組換え哺乳動物細胞から発現されることを特徴とする、請求の範囲第１１項記載の組成物。
【請求項１３】
更に、組換えＨＣＶエンベロープ蛋白が、組換え酵母細胞から発現されることを特徴とする、請求の範囲第１１項記載の組成物。
【請求項１４】
ベクター配列、適切な原核生物性、真核生物性又はウイルス性プロモーター配列及びその後に続く単一の又は特定オリゴマーのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白の発現を可能にするヌクレオチド配列を含む組換えベクター。
【請求項１５】
ヌクレオチド配列が、更に、アミノ酸１位と１９２位の間の領域で開始し、アミノ酸２５０位と４００位の間の領域で終わるか、より好適には２５０位と３４１位の間の領域で終わるか、更により好適には２９０位と３４１位の間の領域で終わる単一のＨＣＶのＥ１蛋白をコードすることを特徴とする、請求の範囲第１４項記載の組換えベクター。
【請求項１６】
ヌクレオチド配列が、更に、アミノ酸１１７位と１９２位の間の領域で開始し、アミノ酸２６３位と４００位の間の領域で終わるか、より好適には２５０位と３２６位の間の領域で終わる単一のＨＣＶのＥ１蛋白をコードすることを特徴とする、請求の範囲第１５項記載の組換えベクター。
【請求項１７】
ヌクレオチド配列が、更に、２６４〜２９３位プラスマイナス８アミノ酸の間の最初の疎水性ドメインが欠失している単一のＨＣＶのＥ１蛋白をコードすることを特徴とする、請求の範囲第１５項又は第１６項記載の組換えベクター。
【請求項１８】
ヌクレオチド配列が、更に、アミノ酸２９０位と４０６位の間の領域で開始し、アミノ酸６００位と８２０位の間の領域で終わるか、より好適には３２２位と４０６位の間の領域で開始するか、更により好適には３４７位と４０６位の間の領域で開始するか、そして最も好適には３６４位と４０６位の間の領域で開始する単一のＨＣＶのＥ２蛋白をコードすることを特徴とする、請求の範囲第１４項記載の組換えベクター。
【請求項１９】
ヌクレオチド配列が、更に、アミノ酸６２３、６５０、６６１、６７３、７１０、７１５、７２０、７４６又は８０９位のいずれかの位置で終わることを特徴とする、請求の範囲第１８項記載の組換えベクター。
【請求項２０】
ヌクレオチド配列が、更に、それに５’末端ＡＴＧコドン及び３’末端停止コドンを加えられていることを特徴とする、請求の範囲第１５項〜第１９項のいずれか１項記載の組換えベクター。
【請求項２１】
ヌクレオチド配列が、更に、コード領域の３’末端に第Ｘａ因子切断部位及び／又は３〜１０個、好適には６個のヒスチジンコドンを加えられていることを特徴とする、請求の範囲第１５項〜第２０項のいずれか１項記載の組換えベクター。
【請求項２２】
配列番号３、５、７、９、１１、１３、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７及び４９に示されるいずれかの配列又はこれらの部分を含む核酸。
【請求項２３】
請求の範囲第２２項記載の組換え核酸を有する組換えベクター。
【請求項２４】
更に、組換えＨＣＶエンベロープ蛋白が、請求の範囲第１４項〜第２３項のいずれか１項記載の少なくとも１つの組換えベクターの発現生成物であることを特徴とする、請求の範囲第１１項記載の組成物。
【請求項２５】
更に、上記Ｅ１又はＥ２蛋白に存在する少なくとも１つのグリコシル化部位が、核酸レベルで除去されていることを特徴とする、請求の範囲第１４項〜第２３項のいずれか１項記載の組換えベクター。
【請求項２６】
ベクターが、宿主細胞中で機能することが可能、かつＨＣＶのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白の発現を制御することが可能な制御配列に加えて、請求の範囲第１４項〜第２２項のいずれか１項記載のＨＣＶのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白をコードするヌクレオチド配列を含む、請求の範囲第１４項〜第２５項のいずれか１項記載の少なくとも１つの組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２７】
請求の範囲第２６項記載の宿主細胞により発現された組換えＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白。
【請求項２８】
少なくとも以下の工程：
−  請求の範囲第１４項〜第２５項のいずれか１項記載の組換えベクターで形質転換された請求の範囲第２６項記載の宿主細胞を、適切な培地中で増殖させ、
−  適切な条件下で請求の範囲第１５項〜第２５項のいずれか１項記載のベクター配列を発現させ、そして
−  好適にはＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）のようなＳＨ基保護剤の存在下で、上記形質転換細胞を溶解し、
−  例えばレクチンクロマトグラフィーあるいは抗Ｅ１及び／又は抗Ｅ２特異的モノクローナル抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーのような親和
性精製（上記レクチンは好適にはレンチルレクチンである）により、上記
ＨＣＶエンベロープ蛋白を回収し、次に
−  前工程の溶出液を、ＤＴＴのようなジスルフィド結合切断剤と、好適には
ＮＥＭ又はビオチン−ＮＥＭのようなＳＨ基保護剤の存在下で、インキュベートして、そして
−  ゲル濾過、及び場合により更にＮｉ2+−ＩＭＡＣクロマトグラフィーと脱塩工程により、ＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白を単離する工程、
を含むことを更に特徴とする、請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの下記のＥ１及び／又はＥ２ペプチド：
コア／Ｅ１Ｖ１領域のアミノ酸１８１〜２００位にわたるＥ１−３１（配列番号５６）、
Ｅ１領域のアミノ酸１９３〜２１２位にわたるＥ１−３３（配列番号５７）、
Ｅ１Ｖ２領域のアミノ酸２０５〜２２４位にわたるＥ１−３５（配列番号５８）（エピトープＢ）、
Ｅ１Ｖ２領域のアミノ酸２０８〜２２７位にわたるＥ１−３５Ａ（配列番号５９）（エピトープＢ）、
Ｅ１領域〔Ｖ１、Ｃ１及びＶ２領域（エピトープＢを含有する）〕のアミノ酸１９２〜２２８位にわたる１ｂＥ１（配列番号５３）、
Ｅ１領域のアミノ酸３０１〜３２０位にわたるＥ１−５１（配列番号６６）、
Ｅ１Ｃ４領域のアミノ酸３１３〜３３２位にわたるＥ１−５３（配列番号６７）（エピトープＡ）、
Ｅ１領域のアミノ酸３２５〜３４４位にわたるＥ１−５５（配列番号６８）、
Ｅ２領域のアミノ酸３９７〜４１６位にわたるＥｎｖ６７即ちＥ２−６７（配列番号７２）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域のアミノ酸４０９〜４２８位にわたるＥｎｖ６９即ちＥ２−６９（配列番号７３）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域の５８３〜６０２位にわたるＥｎｖ２３即ちＥ２−２３（配列番号８６）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の５９５〜６１４位にわたるＥｎｖ２５即ちＥ２−２５（配列番号８７）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の６０７〜６２６位にわたるＥｎｖ２７即ちＥ２−２７（配列番号８８）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の５４７〜５６６位にわたるＥｎｖ１７Ｂ即ちＥ２−１７Ｂ（配列番号８３）（エピトープＤ）、
Ｅ２領域の５２３〜５４２位にわたるＥｎｖ１３Ｂ即ちＥ２−１３Ｂ（配列番号８２）（エピトープＣ）、
を含む組成物。
【請求項３０】
少なくとも１つの下記のコンフォメーション性エピトープ：
モノクローナル抗体１５Ｃ８Ｃ１、１２Ｄ１１Ｆ１、及び８Ｇ１０Ｄ１Ｈ９により認識されるエピトープＦ、
モノクローナル抗体９Ｇ３Ｅ６により認識されるエピトープＧ、
モノクローナル抗体１０Ｄ３Ｃ４及び４Ｈ６Ｂ２により認識されるエピトープＨ（又はＣ）、
モノクローナル抗体１７Ｆ２Ｃ２により認識されるエピトープＩ、
を含む組成物。
【請求項３１】
請求の範囲第１１項〜第１３項、第２４項又は第２９項〜第３０項のいずれか１項記載の組成物で免疫して作成されるＥ１及び／又はＥ２特異的モノクローナル抗体。
【請求項３２】
薬剤としての使用のための、更に詳しくはＨＣＶのＥ１又はＥ２抗原の存在の検出のための免疫測定用キットに組み込むため、疾患の予知／監視のため、又はＨＣＶ治療のための、請求の範囲第３１項記載のＥ１及び／又はＥ２特異的モノクローナル抗体。
【請求項３３】
ＨＣＶのＥ１又はＥ２抗原の検出のための免疫測定用キットの調製のための、ＨＣＶ疾患の予知／監視のためのキットの調製のための、又はＨＣＶ薬剤の調製のための、請求の範囲第３１項記載のＥ１及び／又はＥ２特異的モノクローナル抗体の用途。
【請求項３４】
少なくとも下記の工程：
（ｉ）免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で、好適には固定化された形で、請求の範囲第３１項記載のＥ１及び／又はＥ２特異的モノクローナル抗体に、生物学的試料を接触させ、
（ii）結合しなかった成分を除去し、
（iii)形成された免疫複合体を、適切な条件下で検出可能な標識物に結合されている異種抗体とインキュベートし、
（iv）該免疫複合体の存在を視覚的又は機械的に検出する工程
を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原のインビトロ診断の方法。
【請求項３５】
以下のもの：
−  好適には固体基材上に固定された形の、請求の範囲第３１項記載の少なくとも１つのＥ１及び／又はＥ２特異的モノクローナル抗体、
−  これらの抗体と、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原との間の結合反応を可能にする緩衝液又は前記緩衝液を生成するのに必要な成分、
−  前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原の存在を測定するためのキット。
【請求項３６】
薬剤として使用するための、請求の範囲第１１項〜第１３項、第２４項又は第２９項〜第３０項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３７】
免疫応答を起こすために、場合により薬剤学的に許容しうる助剤と一緒にして、請求の範囲第１１項〜第１３項、第２４項又は第２９項〜第３０項のいずれか１項記載の有効量の組成物を投与することを特徴とする、ＨＣＶに対する哺乳動物（好適にはヒト）の免疫のためのワクチンとして使用するための、前記組成物。
【請求項３８】
免疫応答を起こすために、場合により薬剤学的に許容しうる助剤と一緒にして、請求の範囲第１１項〜第１３項、第２４項又は第２９項〜第３０項のいずれか１項記載の有効量の組成物を投与することを特徴とする、ＨＣＶに対する哺乳動物（好適にはヒト）の免疫のためのワクチンを調製するための、前記組成物の用途。
【請求項３９】
場合により薬剤学的に許容しうる助剤と一緒にした、請求の範囲第１１項〜第１３項、第２４項又は第２９項〜第３０項のいずれか１項記載の有効量の組成物を含む、ＨＣＶに対して哺乳動物（好適にはヒト）を免疫するためのワクチン組成物。
【請求項４０】
生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体のインビトロ検出のための、請求の範囲第１１項〜第１３項、第２４項又は第２９項〜第３０項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４１】
生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体の検出のための免疫測定用キットの調製のための、請求の範囲第１１項〜第１３項、第２４項又は第２９項〜第３０項のいずれか１項記載の組成物の用途。
【請求項４２】
少なくとも以下の工程：
（ｉ）免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で、好適には固定化された形で、請求の範囲第１１項〜第１３項、第２４項又は第２９項〜第３０項のいずれか１項記載の組成物に、生物学的試料を接触させ、
（ii）結合しなかった成分を除去し、
（iii)形成された免疫複合体を、適切な条件下で検出可能な標識物に結合されている異種抗体とインキュベートし、
（iv）該免疫複合体の存在を視覚的又は機械的に検出する工程、
を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体のインビトロ診断の方法。
【請求項４３】
以下のもの：
−  好適には固体基材上に固定された形の、請求の範囲第１１項〜第１３項、第２４項又は第２９項〜第３０項のいずれか１項記載の少なくとも１つのペプチド又は蛋白組成物、
−  これらの蛋白又はペプチドと、生物学的試料中に存在するＨＣＶに対する抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液又は前記緩衝液を生成するのに必要な成分、
−  前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体の存在を測定するためのキット。
【請求項４４】
以下の工程：
−  ＨＣＶ感染患者からの生物学的試料を、Ｅ１蛋白又はその好適な部分と、免疫学的複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートし、
−  結合しなかった成分を除去し、
−  治療の開始時及び治療中の上記試料中の抗Ｅ１力価を計算し、
−  治療の開始時及び／又は治療中の上記試料中の抗Ｅ１力価に基づき、ＨＣＶ疾患の自然の経過を監視するか、又は上記患者の治療に対する応答を予知する工程、
を含む、ＨＣＶ感染に罹っている患者のＨＣＶ疾患のインビトロ監視、又は、特にインターフェロンによる、治療に対する応答を予知するための、請求の範囲第１１項〜第１３項又は第２４項のいずれか１項記載のＥ１蛋白又は請求の範囲第２９項記載のその部分、更に詳しくはＨＣＶの単一のＥ１蛋白又はＥ１ペプチドを含む組成物の用途。
【請求項４５】
以下のもの：
−  少なくとも１つのＥ１蛋白又はＥ１ペプチド、更に詳しくは請求の範囲第１１項〜第１３項、第２４項又は第２９項のいずれか１項記載のＥ１蛋白又はＥ１ペプチド、
−  これらの蛋白又はペプチドと、生物学的試料中に存在する抗Ｅ１抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液又は前記緩衝液を生成するのに必要な成分、
−  前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
−  場合により治療の進行中の抗Ｅ１力価の低下を推定するための自動走査及び解釈装置、
を含む、ＨＣＶ感染に罹っている患者のＨＣＶ疾患の監視、又は、特にインターフェロンによる、治療に対する応答を予知するためのキット。
【請求項４６】
少なくとも以下の工程：
（ｉ）免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で、好適には固定化された形で、請求の範囲第１１項〜第１３項又は第２４項のいずれか１項記載の少なくとも１つのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白組成物、あるいは請求の範囲第２９項記載の少なくとも１つのＥ１又はＥ２ペプチド組成物に、１つ又はそれ以上の血清型のＨＣＶ抗体の存在について分析すべき生物学的試料を接触させ、
（ii）結合しなかった成分を除去し、
（iii)形成された免疫複合体を、適切な条件下で検出可能な標識物に結合されている異種抗体とインキュベートし、
（iv）該免疫複合体の存在を視覚的又は機械的に（例えば、デンシトメーター、蛍光測定、比色法により）検出し、観察された結合パターンから１つ又はそれ以上のＨＣＶ血清型の存在を推定する工程、
を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶの１つまたはそれ以上の血清型を検出するための、更に詳しくは検出すべきＨＣＶの異なる型の抗体を検出するため
の、１つの測定フォーマットに組合せた血清型測定法。
【請求項４７】
以下のもの：
−  請求の範囲第１１項〜第１３項、第２４項のいずれか１項記載の少なくとも１つのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白、あるいは請求の範囲第２９項記載のＥ１又はＥ２ペプチド、
−  これらの蛋白又はペプチドと、生物学的試料中に存在する抗Ｅ１抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液又は前記緩衝液を生成するのに必要な成分、
−  前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
−  場合により、観察された結合パターンから１つ又はそれ以上の血清型の存在を検出するための自動走査及び解釈装置、
を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶの１つ又はそれ以上の血清型を分類する（serotyping）ための、更に詳しくはＨＣＶのこれらの血清型に対する抗体を検出するためのキット。
【請求項４８】
請求の範囲第４２項〜第４６項のいずれか１項記載の方法によりＨＣＶの有無又は遺伝子型を決定するために、固体基材上に固定化するための、及び逆相ハイブリダイゼーション測定法に取り込むための、好適には膜ストリップのような固体支持体上に平行線状に固定化するための、請求の範囲第１１項〜第１３項、第２４項又は第２９項のいずれか１項記載のペプチド又は蛋白組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え蛋白発現、組換え蛋白の精製、合成ペプチド、ＨＣＶ感染の診断、ＨＣＶ感染に対する予防的処置の一般的分野、及び慢性肝炎患者の治療の臨床的有効性の予後／監視、又は自然の疾患の予後／監視に関する。
【０００２】
更に詳しくは、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープ蛋白の精製方法、診断、予防又は治療における本発明に記載の方法により精製されたＨＣＶエンベロープ蛋白の使用、疾患を監視するための測定法、及び／又は疾患の診断、及び／又は疾患の治療における単一の又は特定オリゴマーのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２エンベロープ蛋白の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明に記載の方法により細胞溶解物（ライセート）から精製されたＥ２蛋白は、患者血清の約９５％と反応する。この反応性は、ＣＨＯ細胞から分泌されたＥ２の反応性と同様である（Spaeteら、1992）。しかし、細胞内で発現された形態のＥ２は、マンノース炭水化物モチーフの含量が多いため、より密接に未変性のウイルスエンベロープ蛋白に類似しており、一方、ＣＨＯ細胞から分泌されたＥ２蛋白は、ガラクトース及びシアル酸糖残基で更に修飾されている。Ｅ２のアミノ末端側の半分がバキュロウイルス系で発現されると、幾つかの患者群の血清のわずかに約１３〜２１％のみしか検出できない（Inoue ら、1992）。大腸菌（E. coli)からＥ２を発現させると、ＨＣＶ血清の反応性は更に低く、１４％（Yokosukaら、1992）〜１７％（Mitaら、1992）の範囲であった。
【０００４】
本発明のワクシニアで発現させた精製した組換えＥ１蛋白を用いると、ＨＣＶ血清の約７５％（及び慢性患者の約９５％）は抗Ｅ１陽性であり、Koharaら（1992）及びHsu ら（1993）の結果とは全く異なる。Koharaらは、ワクシニアウイルス発現Ｅ１蛋白を使用し、患者の７〜２３％に抗Ｅ１抗体を検出し、一方、Hsu らは、バキュロウイルス発現Ｅ１を使用して、わずかに１４／５０（２８％）の血清のみを検出した。
【０００５】
これらの結果は、エンベロープ蛋白のヒト患者血清との高い反応性を得るには、良好な発現系のみならず良好な精製プロトコールが必要であることを示している。これは、蛋白の本来の折りたたみの保存を保証する本発明の適正な発現系及び／又は精製プロトコールを用い、夾雑蛋白の排除を保証し、コンフォメーションを保ち、及びこれによりＨＣＶエンベロープ蛋白の反応性を保持する本発明の精製プロトコールを用いることにより、達成される。診断的スクリーニング測定法に必要な精製ＨＣＶエンベロープ蛋白の量は、１年間に数グラムの範囲である。ワクチンとして使用するには、更に多量のエンベロープ蛋白が必要であろう。したがって、最適の発現構築物の選択及び小規模のスケールアップにはワクシニアウイルス系が使用でき、高マンノース炭水化物を含有する単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白の大規模発現と精製は、数種の酵母株から発現される場合に達成されうる。例えばＢ型肝炎の場合は、哺乳動物細胞からのＨＢｓＡｇの製造は、酵母由来のＢ型肝炎ワクチンと比較して、はるかに費用がかさむ。
【０００６】
発明の目的
本発明の目的は、組換えにより発現させたＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白を、凝集物ではなく、夾雑物を含まない単一の又は特定オリゴマーの組換え蛋白として、診断用及びワクチンに直接使用できるように、該組換え蛋白の新規の精製方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、ＨＣＶのＥ１及び／又はＥ２ドメインからのコンフォメーション性エピトープを含む精製（単一の又は特定オリゴマーの）組換えＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２糖蛋白を含む組成物を提供することである。
【０００８】
本発明の更に別の目的は、Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白を組換えにより発現させるための新規な組換えベクター構築物、及び該ベクター構築物で形質転換された宿主細胞を提供することである。
【０００９】
本発明の目的はまた、組換えＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白の製造方法及び精製方法を提供することである。
【００１０】
本発明の目的はまた、本発明の組換えＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白の診断及び免疫原用の用途を提供すると共に、本発明の組換えＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白のいずれかを含む、診断用キット、ワクチン又は治療剤を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、ＨＣＶ感染に罹っている患者の（例えば、インターフェロンによる）治療に対する応答を監視／予知するための、Ｅ１、Ｅ２、及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白、又はその好適な部分の新規な用途を提供することである。
【００１２】
本発明の目的はまた、ＨＣＶスクリーニング及び確認抗体試験における本発明の組換えＥ１、Ｅ２、及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白の用途を提供することである。
【００１３】
本発明の目的はまた、ＨＣＶ感染の診断、及び抗体の作成に使用できるＥ１及び／又はＥ２ペプチドを提供することである。このようなペプチドは、ヒトのモノクローナル抗体を単離するために使用することもできる。
【００１４】
本発明の目的はまた、Ｅ１及び／又はＥ２エピトープ（組換え蛋白中に含有されているペプチド又はコンフォメーション性エピトープ中に含有されている）と特異的に反応する、モノクローナル抗体、更に詳しくはヒトモノクローナル抗体又はヒト化されたマウスモノクローナル抗体を提供することである。
【００１５】
本発明の目的はまた、ＨＣＶ抗原の検出又は慢性ＨＣＶ感染の治療のための、抗Ｅ１又は抗Ｅ２モノクローナル抗体の可能な用途を提供することである。
【００１６】
本発明の目的はまた、ＨＣＶ感染に罹っている患者の（例えば、インターフェロンによ
る）治療に対する応答を監視／予知するための、又は該疾患の予後を監視／予知するためのキットを提供することである。
【００１７】
本発明の全ての目的は、後述する実施態様により達成されたと考えられる。
【００１８】
定義
以下の定義は、本発明に使用される異なる用語や表現を例示する。
【００１９】
「Ｃ型肝炎ウイルス単一エンベロープ蛋白」という用語は、Ｅ１又はＥ２領域の少なくとも１つのＨＣＶエピトープを定義するアミノ酸配列（及び／又はアミノ酸類似体）を含む、ポリペプチド又はその類似体〔例えば、ミモトープ（mimotopes)〕を意味する。これらの単一のエンベロープ蛋白は、広義には、組換えにより発現されたエンベロープ蛋白のモノマー形態でもホモオリゴマー形態でもよい。典型的には、エピトープを規定する配列は、ＨＣＶのＥ１又はＥ２領域のアミノ酸配列に対応する（同一であるか、又はエピトープを破壊しない本来のアミノ酸残基の類似体の置換による）。一般に、エピトープを規定する配列の長さは、３個以上のアミノ酸、更に典型的には５個以上のアミノ酸、更に典型的には８個以上のアミノ酸、そして更に典型的には１０個以上のアミノ酸である。コンフォメーション性エピトープは、抗原の三次元構造（例えば、折りたたみ）により形成されると考えられるため、エピトープを規定する配列の長さは大きく変動しうる。すなわち、エピトープを規定するアミノ酸は、数は比較的少ないが、折りたたみにより正しいエピトープのコンフォメーションとなる分子の長さに沿って広く散在している。エピトープを規定する残基間の抗原の部分は、エピトープのコンフォメーション構造に決定的に重要ではない可能性がある。例えば、エピトープコンフォメーションに決定的に重要な配列（例えば、ジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位など）が維持されるならば、これらの介在配列を欠失又は置換させても、コンフォメーション性エピトープは影響を受けないことがある。コンフォメーション性エピトープはまた、ホモオリゴマー又はヘテロオリゴマーのサブユニットの２個以上の基本的領域により形成されてもよい。
【００２０】
本発明のＨＣＶ抗原は、ＨＣＶのＥ１及び／又はＥ２（エンベロープ）ドメインからのコンフォメーション性エピトープを含む。ウイルスのエンベロープ蛋白に対応すると考えられているＥ１ドメインは、現在、ＨＣＶポリ蛋白のアミノ酸１９２〜３８３にまたがっていると推定されている（Hijikataら、1991）。哺乳動物系で発現される（グリコシル化される）と、３５kDa の概算分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）を有すると考えられている。Ｅ２蛋白（以前はＮＳ１と呼ばれていた）は、ＨＣＶポリ蛋白のアミノ酸３８４〜８０９又は３８４〜７４６にまたがっており（Grakoui ら、1993）、これもまたエンベロープ蛋白であると考えられている。ワクシニア系で発現される（グリコシル化される）と、見かけのゲル分子量約７２kDa を有すると考えられている。これらの蛋白の終点は近似的なものであると理解される（例えば、Ｅ２のカルボキシ末端は、大体７３０〜８２０アミノ酸領域のどこかであることができ、例えばアミノ酸７３０、７３５、７４０、７４２、７４４、７４５、好適には７４６、７４７、７４８、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８０９、８１０、８２０で終わる）。Ｅ２蛋白はまた、Ｅ１、Ｐ７（アミノ酸７４７〜８０９）、ＮＳ２（アミノ酸８１０〜１０２６）、ＮＳ４Ａ（アミノ酸１６５８〜１７１１）又はＮＳ４Ｂ（アミノ酸１７１２〜１９７２）と一緒に発現されてもよい。正しい蛋白の折りたたみを得るために、これらの他のＨＣＶ蛋白と一緒に発現されることが重要なことがある。
【００２１】
また、本発明の実施例の項で使用される単離株は、本発明の範囲を限定するものではなく、ＨＣＶの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０型、又は他の任意の新規の遺伝子型からのＨＣＶ単離株は、本発明の実施のためのＥ１及び／又はＥ２配列の好適な供給源である、と理解される。
【００２２】
本発明で使用されるＥ１及びＥ２抗原は、全長ウイルス蛋白、その実質的全長型、又はその機能性断片（例えば、エピトープの形成又は保持に必須な配列を失なっていない断片）であってよい。更に、本発明のＨＣＶ抗原はまた、目的のコンフォメーション性エピトープの形成を阻止又は妨害しない他の配列も含んでよい。コンフォメーション性エピトープの有無は、目的の抗原を抗体（そのコンフォメーション性エピトープに対するポリクローナル血清又はモノクローナル抗体）でスクリーニングし、その反応性を、その抗原の変性したもの（たとえあるとしても、直鎖のエピトープのみを保持する）の反応性と比較することにより、容易に決定できる。このようなスクリーニングでポリクローナル抗体を用いる場合は、ポリクローナル血清をまず変性抗原で吸収して、目的の抗原に対する抗体が保持されているか否かを調べることが有利である可能性がある。
【００２３】
本発明のＨＣＶ抗原は、目的のエピトープを与える任意の組換え法により作成できる。例えば、哺乳動物細胞又は昆虫細胞での組換え細胞内発現は、天然のＨＣＶ抗原の場合のように「未変性の」コンフォメーションでグリコシル化されたＥ１及び／又はＥ２抗原を提供するための好ましい方法である。酵母細胞及び突然変異酵母株〔例えば、ｍｎｎ９突然変異体（Kniskernら、1994）、又はバナジン酸耐性選択（Ballouら、1991）により得られるグリコシル化突然変異体〕は、分泌される高マンノース型の糖の産生に理想的に適しており、一方、哺乳動物細胞から分泌された蛋白は、幾つかの診断用途又はワクチン用途には不適である可能性があるガラクトース又はシアル酸を含有するなどの修飾を受けていることがある。しかし、ある用途には、蛋白について公知であるように、他の組換え宿主（例えば、大腸菌）中で抗原を発現させて、回収後蛋白を復元することも、可能であり、充分である。
【００２４】
「融合ポリペプチド」という用語は、ＨＣＶ抗原が１つの連続的なアミノ酸鎖（この鎖は天然には存在しない）の一部であるポリペプチドを意味する。ＨＣＶ抗原は、互いにペプチド結合により直接連結しているか、又は介在するアミノ酸配列により分離していてよい。融合ポリペプチドはまた、ＨＣＶにとって外来性のアミノ酸配列を含有してもよい。
【００２５】
「固相」という用語は、各ＨＣＶ抗原又はＨＣＶ抗原を含む融合ポリペプチドが、共有結合又は疎水性吸着のような非共有結合により結合する固体を意味する。
【００２６】
「生物学的試料」という用語は、個体により産生された抗体、更に詳しくはＨＣＶに対する抗体を通常含有する、哺乳動物個体（例えば、類人猿、ヒト）の体液又は組織を意味する。体液又は組織はまた、ＨＣＶ抗原をも含有してもよい。このような成分は当該分野で公知であり、血液、血漿、血清、尿、脊髄液、リンパ液、呼吸器系・腸管又は尿生殖路の分泌物、涙、唾液、乳、白血球及び骨髄腫細胞などがあるが、これらに限定されない。身体成分には、生物学的液体が含まれる。「生物学的液体」という用語は、生物から得られる液体を意味する。幾つかの生物学的液体は、他の生成物（例えば、第VIII：Ｃ因子のような凝固因子、血清アルブミン、成長ホルモンなど）の供給源として使用される。このような場合、生物学的液体の供給源が、ＨＣＶのようなウイルスで汚染されていないことが重要である。
【００２７】
「免疫学的に反応性」という用語は、問題の抗原が、ＨＣＶに感染した個体からの身体成分に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応することを意味する。
【００２８】
「免疫複合体」という用語は、抗原上のエピトープに抗体が結合すると形成される組合せを意味する。
【００２９】
本明細書で使用される「Ｅ１」は、ＨＣＶポリ蛋白の最初の４００アミノ酸内で発現される蛋白又はポリペプチドを意味し、時にＥ、ＥＮＶ又はＳ蛋白と呼ばれる。この天然の形態は、膜に強く結合して存在する３５kDa の糖蛋白である。ほとんどの天然のＨＣＶ株では、Ｅ１蛋白は、Ｃ（コア）蛋白の後に続いてウイルスポリ蛋白中にコードされている。Ｅ１蛋白は、全長ポリ蛋白のおよそアミノ酸（ａａ）１９２から約ａａ３８３まで広がっている。
【００３０】
本明細書で使用される「Ｅ１」という用語は、天然のＥ１と免疫学的に交差反応する類似体及び端を切り取った（短縮）形態も含み、遺伝子型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は他の新たに同定されたあらゆるＨＣＶタイプ若しくはサブタイプのＥ１蛋白を含む。
【００３１】
本明細書で使用される「Ｅ２」は、ＨＣＶポリ蛋白の最初の９００アミノ酸内で発現される蛋白又はポリペプチドを意味し、時にＮＳ１蛋白と呼ばれる。この天然の形態は、膜に強く結合して存在する７２kDa の糖蛋白である。ほとんどの天然のＨＣＶ株では、Ｅ２蛋白はＥ１蛋白の後に続いてウイルスポリ蛋白中にコードされている。Ｅ２蛋白は、およそアミノ酸３８４位からアミノ酸７４６位まで広がっており、別の形態のＥ２は、アミノ酸８０９位まで広がっている。本明細書で使用される「Ｅ２」という用語は、天然のＥ２と免疫学的に交差反応する類似体及び端を切り取った形態も含む。例えば、コドン３８３と３８４の間への複数のコドンの挿入、及びアミノ酸３８４〜３８７の欠失が、Katoら（1992）により報告されている。
【００３２】
本明細書で使用される「Ｅ１／Ｅ２」は、少なくとも１つのＥ１成分と少なくとも１つのＥ２成分とを含有するオリゴマー形態のエンベロープ蛋白を意味する。
【００３３】
「特定オリゴマーの」Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２エンベロープ蛋白という用語は、凝集物ではない、全ての可能なオリゴマー形態の、組換えにより発現されたＥ１及び／又はＥ２エンベロープ蛋白を意味する。Ｅ１及び／又はＥ２特定オリゴマーのエンベロープ蛋白はまた、ホモオリゴマーのＥ１又はＥ２エンベロープ蛋白（後述）とも呼ばれる。
【００３４】
「単一の又は特定オリゴマーの」Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２エンベロープ蛋白という用語は、単一のモノマー性Ｅ１又はＥ２蛋白（単語の厳密な意味において単一）、及び特定オリゴマーのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２組換え発現蛋白を意味する。本発明のこれらの単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白は、更に、以下の式（Ｅ１)x（Ｅ２)y〔式中、ｘは０と１００の間の数であり、ｙは０と１００の間の数であるが、ただし、ｘとｙの両方が０であることはない〕により定義される。ｘ＝１でｙ＝０の時、該エンベロープ蛋白はモノマー性Ｅ１を含む。
【００３５】
本明細書で使用される「ホモオリゴマー」という用語は、２つ以上のＥ１又はＥ２モノマーを含有するＥ１及び／又はＥ２の複合体を意味し、例えば、Ｅ１／Ｅ１二量体、Ｅ１／Ｅ１／Ｅ１三量体又はＥ１／Ｅ１／Ｅ１／Ｅ１四量体、及びＥ２／Ｅ２二量体、Ｅ２／Ｅ２／Ｅ２三量体又はＥ２／Ｅ２／Ｅ２／Ｅ２四量体、Ｅ１五量体及び六量体、Ｅ２五量体及び六量体、又はＥ１若しくはＥ２の任意のより高次のホモオリゴマーは、本明細書の定義の範囲内で全て「ホモオリゴマー」である。このオリゴマーは、Ｃ型肝炎ウイルスの異なるタイプ又はサブタイプから得られるＥ１又はＥ２の、１つ、２つ又は数個の異なるモノマーを含有してもよく、例えば、ＷＯ  ９４／２５６０１として公開された国際出願及びヨーロッパ特許出願第94870166.9号（両者とも本出願人による）に記載のものを含む。このような混合オリゴマーも本発明の範囲内でホモオリゴマーであり、ＨＣＶのより普遍的な診断、予防又は治療を可能にしうる。
【００３６】
本明細書に記載の蛋白に適用される「精製された」という用語は、目的の蛋白が、組成物中の総蛋白成分の少なくとも３５％を構成している組成物を意味する。目的の蛋白は、好適には総蛋白成分の少なくとも４０％、より好適には少なくとも約５０％、より好適には少なくとも約６０％、更により好適には少なくとも約７０％、更により好適には少なくとも約８０％、更により好適には少なくとも約９０％、最も好適には少なくとも約９５％を構成する。該組成物は、本発明で使用される純度（％）の測定に影響しない他の化合物（例えば、炭水化物、塩、脂質、溶媒など）を含有してもよい。「単離された」ＨＣＶ蛋白は、少なくとも３５％の純度のＨＣＶ蛋白組成物を意味する。
【００３７】
「実質的に精製された蛋白」という用語は、インビトロの診断方法及び治療用化合物として使用できるように精製された蛋白を意味する。これらの蛋白は、実質的に細胞性蛋白、ベクター由来蛋白、又は他のＨＣＶウイルス成分を含まない。これらの蛋白は、通常均質（少なくとも純度８０％、好適には９０％、より好適には９５％、より好適には９７％、より好適には９８％、より好適には９９％、更に好適には９９．５％、そして最も好適には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥや銀染色のような従来法により、夾雑蛋白が検出されない）になるまで精製される。
【００３８】
本発明に関連して使用される「組換えにより発現された（組換え発現）」という用語は、以下に詳述するように、本発明の蛋白が、原核生物であれ、又は下等若しくは高等真核生物中であれ、組換え発現方法で産生されたことを意味する。
「下等真核生物」という用語は、酵母、真菌などのような宿主細胞を意味する。下等真核生物は、一般に（必ずしもそうとは限らないが）単細胞である。好ましい下等真核生物は、酵母であり、特にサッカロミセス（Saccharomyces)、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces)、クルベロミセス（Kluveromyces）、ピヒア（Pichia）〔例えば、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris)〕、ハンゼヌラ（Hansenula)〔例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）〕、ヤロウィア（Yarowia)、シュワニオミセス（Schwaniomyces)、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces)、チゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces)などに属する種がある。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、Ｓ・カールスベルゲンシス（S. carlsbergensis)及びＫ・ラクチス（K. lactis)は、最も一般的に使用される酵母宿主であり、好都合な真菌宿主である。
【００３９】
「原核生物」という用語は、大腸菌（E. coli)、乳酸桿菌（Lactobacillus)、ラクトコッカス（Lactococcus)、サルモネラ（Salmonella）、連鎖球菌（Streptococcus)、枯草菌（Bacillus subtilis)、又はストレプトミセス（Streptomyces）のような宿主を意味する。これらの宿主もまた、本発明中で考慮される。
「高等真核生物」という用語は、高等動物（例えば、哺乳動物、は虫類、昆虫など）に由来する宿主細胞を意味する。現在好適な高等真核生物宿主細胞は、チャイニーズハムスター（例えば、ＣＨＯ）、サル（例えば、ＣＯＳ及びＶｅｒｏ細胞）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）、ブタ腎（ＰＫ１５）、ウサギ腎１３細胞（ＲＫ１３）、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ヒト細胞株ＨｅＬａ及びヒト肝癌細胞株（例えばＨｅｐＧ２）、及び昆虫細胞株〔例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda)〕から得られる。宿主細胞は、浮遊又はフラスコ培養、組織培養、器官培養などで提供されてもよい。あるいは、宿主細胞は、トランスジェニック動物であってもよい。
【００４０】
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーを意味し、生成物の特定の長さを意味しない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、及び蛋白は、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、ポリペプチドの発現後の修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）も排除しない。この定義に含まれるものは、例えば、アミノ酸の１つまたはそれ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸、ＰＮＡなどを含む）を含有するポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチド、及び当業者に公知の他の修飾物（天然に存在するものも存在しないものも含む）がある。
【００４１】
「組換えポリヌクレオチド又は核酸」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成又は合成由来のポリヌクレオチド又は核酸を意味し、これは、その起源又は操作により、（１）天然の状態で結合しているポリヌクレオチドの全て又は一部と結合していない、（２）天然の状態で結合しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに結合している、又は（３）天然には存在しない。
【００４２】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」という用語、及び単細胞として培養された微生物又は高等真核生物細胞株を意味する他の類似の用語は、組換えベクター又は他の移入（transfer）ポリヌクレオチドの受容者として使用できるか又は使用されている細胞を意味し、トランスフェクションされた元々の細胞の子孫を包含する。自然の、偶然の又は意図的な突然変異があるため、１つの親細胞の子孫は、形態又はゲノムＤＮＡ若しくは総ＤＮＡの相補性において必ずしも元々の親と完全に同一でなくてもよいと理解される。
【００４３】
「レプリコン」という用語は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律的単位として機能する（すなわち、自らの制御下で複製できる）任意の遺伝要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、コスミドなど）である。
【００４４】
「ベクター」という用語は、目的の読みとり枠（open reading frame）の発現及び／又は複製を提供する配列を更に含むレプリコンである。
【００４５】
「調節配列」という用語は、これに連結しているコード配列を発現させるのに必要なポリヌクレオチド配列である。このような調節配列の本質は、宿主生物に依存して異なる。すなわち、原核生物では、このような調節配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結部（ターミネーター）を含み、真核生物では、このような調節配列は、一般に、プロモーター、ターミネーター、及びある場合にはエンハンサーを含む。「調節配列」という用語は、少なくともその存在が発現に必要な全ての成分を包含し、また、その存在が有利である付加的成分（例えば、分泌を制御するリーダー配列）も包含してよい。
【００４６】
「プロモーター」という用語は、隣接する構造遺伝子の正常な転写開始部位でｍＲＮＡ産生が開始するように、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鋳型に結合することを可能にする共通配列を含むヌクレオチド配列である。
【００４７】
「作動可能に連結した」という用語は、このように記載された成分が、その目的とする方法で機能することを可能にする関係にある近接関係を意味する。コード配列に「作動可能に連結した」調節配列は、調節配列と適合性のある条件下でコード配列の発現が達成される方法で連結している。
【００４８】
「読みとり枠」（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをコードし、停止コドンを含まないポリヌクレオチド配列の領域である。この領域は、コード配列の一部又は全コード配列であってもよい。
【００４９】
「コード配列」は、適切な制御配列の支配下に置くと、ｍＲＮＡに転写され、及び／又はポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンと、３’末端の翻訳停止コドンとにより決定される。コード配列は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、及び組換えポリヌクレオチド配列を包含しうるが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書で使用される「エピトープ」又は「抗原決定基」は、免疫反応性のあるアミノ酸配列を意味する。一般的に、エピトープは、少なくとも３〜４個のアミノ酸、更に一般的には少なくとも５又は６個のアミノ酸よりなり、時にエピトープは約７〜８個、又は更には約１０個のアミノ酸よりなる。本明細書において、指定されたポリペプチドのエピトープは、指定されたポリペプチド中のエピトープと同じアミノ酸配列を有するエピトープ、及びその免疫学的等価物を意味する。このような等価物には、例えば、遺伝子型１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、４ｋ、４ｌ、５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂ、６ｃ、７ａ、７ｂ、７ｃ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、１０ａに属する、現在公知の配列又は株などの、又は他の新たに定義される任意のＨＣＶ（サブ）タイプの、株、サブタイプ（＝遺伝子型）、又はタイプ（群）特異的変異体も包含される。エピトープを構成するアミノ酸は直鎖の配列の一部である必要はなく、任意の数のアミノ酸が散在していてコンフォメーション性エピトープを形成してもよいと理解すべきである。
【００５１】
「免疫原性」という用語は、単独で又は担体と結合して、アジュバントの存在下又は非存在下で、体液性及び／又は細胞性応答を引き起こす、物質の能力を意味する。「中和」とは、部分的又は完全に、感染性因子の感染性を阻止する免疫応答を意味する。「ワクチン」は、部分的又は完全な、ＨＣＶに対する防御を誘導することができる免疫原性組成物である。ワクチンはまた、個体の治療に有用であることがあり、この場合、これは治療用ワクチンと呼ばれる。
【００５２】
「治療薬」という用語は、ＨＣＶ感染を治療することができる組成物を意味する。
【００５３】
「有効量」という用語は、それが投与された個体の免疫原性応答を誘導するか又は目的の系（例えば、免疫測定法）において検出できる程度に免疫反応するのに充分な、エピトープ含有ポリペプチドの量を意味する。好適には、この有効量は、前記で定義したように、治療をするのに充分である。必要な正確な量は、用途に応じて異なる。例えば、ワクチンとしての応用、又はポリクローナル抗血清／抗体の産生のためには、有効量は、個体の種、年齢及び一般的状態、治療すべき疾患の重篤度、選択された特定のポリペプチド及び投与方法などにより異なりうる。また、有効量は、比較的広い、決定的に重要ではない範囲にあると考えられる。適切な有効量は、通常の実験のみにより容易に決定することができる。ＨＣＶ疾患の予防のためのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白の好適な範囲は、０．０１〜１００μg/用量、好適には０．１〜５０μg/用量である。充分な免疫応答とその後のＨＣＶ疾患に対する防御のために、個体当たり数回の用量が必要な場合もある。
【００５４】
発明の詳細な説明
更に詳しくは、本発明は、形質転換された宿主細胞を溶解して組換えにより発現された蛋白を単離する場合に、ジスルフィド結合切断剤によりジスルフィド結合切断又は還元工程を行うことを特徴とする、Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２よりなる群から選択される組換えＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白を単離又は精製する方法に関する。
【００５５】
本発明のこれらの「単一の又は特定オリゴマーの」エンベロープ蛋白の本質は、これらには夾雑蛋白が含まれず、かつ夾雑物質とジスルフィド結合で結合していないということである。
【００５６】
本発明の蛋白は、下等又は高等真核生物細胞あるいは原核生物細胞中で組換え技術で発現される。本発明の組換え蛋白は、好適にはグリコシル化されており、高マンノース型の、ハイブリッドの、又は複合のグリコシル化を受けていてもよい。好適には、該蛋白は、実施例の項で詳述されるように哺乳動物の細胞株から、又はこれも実施例の項で詳述されるように突然変異酵母株のような酵母中で発現される。
【００５７】
本発明の蛋白は、小胞体又はゴルジ装置のような細胞成分内で発現されてもよく又は分泌されてもよい。しかし好適には、本発明の蛋白は、高マンノース型のグリコシル化を受けており、哺乳動物細胞の小胞体又はゴルジ装置中に保持されるか、又は酵母細胞中に保持されるか又はそこから分泌され、好適には、ｍｎｎ９突然変異体（Kniskernら、1994）のような酵母突然変異株又はバナジン酸耐性（Ballouら、1991）により選択された突然変異体から分泌される。
【００５８】
ＨＣＶエンベロープ蛋白の発現に際し、本発明者らは、分子内又は分子間ジスルフィド架橋に関与していないシステインの遊離チオール基の幾つかが、宿主又は発現系由来（例えばワクシニア）蛋白あるいは他のＨＣＶエンベロープ蛋白（単一の又はオリゴマーの）のシステインと反応して、非特異的分子間架橋を形成することを示すことができた。これにより、夾雑蛋白と共にＨＣＶエンベロープ蛋白の「凝集物」が形成される。ＷＯ  ９２／０８７３４において、精製後に「凝集物」が得られたことが示されていたが、どの蛋白相互作用が関与していたかは記載されなかった。ＰＣＴ特許ＷＯ  ９２／０８７３４において、ワクシニアウイルス系で発現された組換えＥ１／Ｅ２蛋白は、凝集物として部分的に精製され、その純度はわずかに７０％であることが見出されたため、精製された凝集物は、診断、予防又は治療の目的に有用ではなかった。
【００５９】
したがって、本発明の主要な目的は、単一の又は特定オリゴマーのＨＣＶエンベロープ蛋白を夾雑蛋白から分離し、精製した蛋白（純度＞９５％）を診断、予防及び治療の目的に使用することである。これらの目的のために、本発明者らは、凝集した蛋白複合体（「凝集物」）はジスルフィド架橋と非共有結合的蛋白−蛋白相互作用とに基づいて形成されるという証拠を提供することができた。したがって、本発明は、特異的条件下でジスルフィド結合を選択的に切断するための手段、及び診断、予防及び治療上の利用を大きく妨害する夾雑蛋白から、切断された蛋白を分離するための手段を提供する。ジスルフィド架橋の再形成を防止するために、遊離のチオール基をブロック（可逆的に又は不可逆的に）してもよく、又は放置して酸化させ、他のエンベロープ蛋白とオリゴマーを形成させてもよい（ホモオリゴマーの定義を参照）。夾雑蛋白のレベルが検出不能であるため、このような蛋白オリゴマーは、ＷＯ  ９２／０８７３４及びＷＯ  ９４／０１７７８に記載の「凝集物」とは本質的に異なることは理解されるべきである。
【００６０】
該ジスルフィド結合の切断は、以下の方法によっても達成される。
【００６１】
（１）システイン残基がシステイン酸に修飾される、システイン酸による過ギ酸酸化（Moore ら、1963）。
【００６２】
（２）例えば妥当な酸化剤（例えば、Ｃｕ2+）と共に亜硫酸塩（ＳＯ32-)を用いる、システインがＳ−スルホシステインに修飾される、亜硫酸分解（Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ  →  ２Ｒ−ＳＯ3-）（Bailey and Cole 、1959）。
【００６３】
（３）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、システイン、グルタチオンレッド、ε−メルカプトエチルアミン、又はチオグリコール酸のようなメルカプタンによる還元〔このうち、ＤＴＴとβ−メルカプトエタノールが通常使用される（Cleland, 1964)〕は、水環境で実施することができ、システインが修飾を受けないため、本発明の好適な方法である。
【００６４】
（４）ホスフィン（例えば、Ｂｕ3 Ｐ）による還元（Ruegg and Rudinger、1977）。
【００６５】
したがって、これらの化合物は全て、本発明のジスルフィド結合を切断するための物質又は手段と見なされる。
【００６６】
本発明の該ジスルフィド結合切断（又は還元）工程は、好適には部分的ジスルフィド結合切断（還元）工程である（部分的切断又は還元条件下で実施される）。
【００６７】
本発明の好適なジスルフィド結合切断又は還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。低濃度の該還元剤（すなわち、例えばＤＴＴの場合は、約０．１〜約５０mM、好適には約０．１〜約２０mM、好適には約０．５〜約１０mM、好適には１mM以上、２mM以上、又は５mM以上の範囲、更に好適には約１．５mM、約２．０mM、約２．５mM、約５mM又は約７．５mMである）を使用して部分的還元が得られる。
【００６８】
該ジスルフィド結合切断工程は、発現された蛋白を解離することができる適当な界面活性剤（ジスルフィド結合切断の手段の一例として、又は切断剤と組合せて）、例えば、デシルＰＥＧ（Decyl PEG)、エンピゲン−ＢＢ（EMPIGEN-BB）、ＮＰ−４０、コール酸ナトリウム、トリトンＸ−１００の存在下で実施することもできる。
【００６９】
該還元又は切断工程（好適には部分的還元又は切断工程）は、好適には界面活性剤の存在下で（界面活性剤と共に）実施される。本発明の好適な界面活性剤は、エンピゲン−ＢＢである。使用される界面活性剤の量は、好適にはエンピゲン−ＢＢのような界面活性剤１〜１０％の範囲、好適には３％以上、より好適には約３．５％である。
【００７０】
ジスルフィド結合を切断するための特に好適な方法は、前記で詳述した古典的なジスルフィド結合切断剤と界面活性剤（これも前記で詳述した）の組合せである。実施例の項に記載されるように、低濃度のＤＴＴ（１．５〜７．５mM）と約３．５％のエンピゲン−ＢＢとの特定の組合せは、組換えにより発現されたＥ１及びＥ２蛋白の精製のための、還元剤と界面活性剤の特に好適な組合せであることが示された。ゲル濾過クロマトグラフィーにより、該部分的還元によって、場合により二量体状のＥ１蛋白の生成、及び免疫測定法において擬反応性を引き起こす夾雑蛋白からのこのＥ１蛋白の分離がもたらされることが示されている。
【００７１】
しかし、システインをより近づきやすくする、当該分野で公知の任意の還元剤と、当該分野で公知の任意の界面活性剤又は他の手段との、他の任意の組合せもまた、そのような組合せが、本発明で例示された好適な組合せと同じ、ジスルフィド架橋切断という目標を達成するかぎり、本発明の範囲内にあると理解すべきである。
【００７２】
本発明のジスルフィド結合切断手段は、ジスルフィド結合の還元以外に、以下のタイプの反応を引き起こす当該分野で公知の任意のジスルフィド架橋交換物質（有機性又は蛋白性の競合的物質、例えばCreighton 、1988を参照）を含んでもよい：
Ｒ１Ｓ−ＳＲ２＋Ｒ３ＳＨ→Ｒ１Ｓ−ＳＲ３＋Ｒ２ＳＨ
＊Ｒ１、Ｒ２：蛋白凝集物の化合物
＊Ｒ３ＳＨ：競合的物質（有機性、蛋白性）
【００７３】
「ジスルフィド架橋交換物質」という用語は、ジスルフィド結合再形成物質及びジスルフィド結合阻止物質を包含すると解釈すべきである。
【００７４】
本発明はまた、以下のリストから選択される当該分野で公知の任意のＳＨ基保護又は結合試薬の使用を更に包含する、前述のＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白を精製又は単離する方法にも関する：
−  グルタチオン
−  ５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）又はビス−（３−カルボキシ−４−ニトロフェニル）−ジスルフィド〔ＤＴＮＢ又はエルマン試薬（Ellman's reagent）〕（Elmann、1959）
−  Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ；Benesch ら、1956）
−  Ｎ−（４−ジメチルアミノ−３，５−ジニトロフェニル）マレイミド又はタピーの（Tuppy's)マレイミド（これは、蛋白を着色する）
−  Ｐ−クロロメルクリ安息香酸（Grassetti ら、1969）
−  ４−ビニルピリジン（Friedman and Krull、1969）は、酸加水分解反応後に放出されうる
−  アクリロニトリル、これは酸加水分解反応後に放出されうる（Weil and Seibles、1961）
−  ＮＥＭ−ビオチン〔例えば、シグマ（Sigma)Ｂ１２６７から入手できる〕
−  ２，２’−ジチオピリジン（Grassetti and Murray、1967）
−  ４，４’−ジチオピリジン（Grassetti and Murray、1967）
−  ６，６’−ジチオジニコチン酸（ＤＴＤＮＡ；Brown and Cunnigham、1970)
−  ２，２’−ジチオビス−（５’−ニトロピリジン）（ＤＴＮＰ；米国特許第３５９７１６０号）又は他のジチオビス（複素環誘導体）化合物（Grassetti and Murray、1969）
【００７５】
引用した文献を調査すると、スルフヒドリル基に対する異なる試薬が、しばしば同じ蛋白又は酵素分子の異なる数のチオール基と反応することがわかる。このチオール基の反応性の変動は、分子の形、周りの原子の群及びその電荷、ならびに試薬分子又はイオンの大きさ、形及び電荷などの、これらの基の立体環境によると結論されうる。しばしば、適当な濃度の変性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、尿素又は塩酸グアニジン）の存在により、蛋白分子に充分な変性（unfolding)が引き起こされ、チオール基が全ての試薬へ均等に近づくことが可能になる。変性剤の濃度を変化させることにより、変性の程度を調節することができ、こうして反応性の程度の異なるチオール基が露出されうる。現在までに報告されている研究のほとんどは、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、Ｎ−エチルマレイミド及びＤＴＮＢを用いて行われているが、最近開発された他の試薬も同じく有効である可能性がある。これらは、構造が異なるため、実際、チオール基の立体環境の変化に対して異なる応答を示しうる可能性がある。
【００７６】
あるいは、Ｅ１及びＥ２（エンベロープ）蛋白の組換え発現及び精製に際して、遊離ＳＨ基の酸化を防ぎ、したがって大きな分子間凝集物の形成を防ぐための、低ｐＨ（好適にはpH６未満）のような条件も、本発明の範囲内に包含される。
【００７７】
本発明の好適な精製されたＳＨ基保護剤は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）である。該ＳＨ基保護試薬は、組換え宿主細胞の溶解時、及び前述の部分的還元操作の後、又はジスルフィド架橋切断の任意の他の操作の後に使用されうる。該ＳＨ基保護試薬はまた、検出可能な標識物を提供することができる任意の基、及び／又は該組換え蛋白を固体基材に固定化することを助ける任意の基（例えば、ビオチン化ＮＥＭ）により、修飾することもできる。
【００７８】
システイン架橋を切断し、遊離のシステインを保護する方法は、Darbre（1987）、Means and Feeney（1971）、及びWong（1993）によっても記載されている。
【００７９】
前記で定義した本発明の単一の又は特定オリゴマーの組換えＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白を精製する方法は、更に、以下の工程を含むことを特徴とする：
−  組換えＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２発現宿主細胞を、好適にはＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）のようなＳＨ基保護剤及び場合により適切な界面活性剤（好適にはエンピゲン−ＢＢ）の存在下で、溶解し、
−  例えばレクチンクロマトグラフィー〔例えばレンチル（lentil）レクチンクロマトグラフィー〕あるいは抗Ｅ１及び／又は抗Ｅ２特異的モノクローナル抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーなどの親和性精製により、該ＨＣＶエンベロープ蛋白を回収し、次に
−  ジスルフィド結合切断剤（例えばＤＴＴ）を用いて、好適にはＳＨ基保護剤（例えばＮＥＭ又はビオチン−ＮＥＭ）の存在下で、ジスルフィド結合を還元又は切断して、そして
−  還元したＨＣＶのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２エンベロープ蛋白を、例えばゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィー又は分子ふるい）により及び場合により付加的なＮｉ2+−ＩＭＡＣクロマトグラフィー及び脱塩工程により、回収する。
【００８０】
前述の回収工程は、当業者に公知の他の任意の適当な方法を用いて実施してもよいと理解すべきである。
【００８１】
好適なレクチンクロマトグラフィー系としては、実施例に例示されているように、ガランタス・ニバリス（Galanthus nivalis)凝集素（ＧＮＡ）クロマトグラフィー、又はレンス・クリナリス（Lens culinaris）凝集素（ＬＣＡ）〔レンチル（lentil）〕レクチンクロマトグラフィーが挙げられる。他の有用なレクチンとしては、高マンノース型の糖を認識するもの、例えばナルシサス・シュードナルシサス（Narcissus pseudonarcissus)凝集素（ＮＰＡ）、ピサム・サチバム（Pisum sativum)凝集素（ＰＳＡ）、又はアリウム・ウルシヌム（Allium ursinum）凝集素（ＡＵＡ）が含まれる。
【００８２】
前記方法は、好適には、前述のように細胞内で産生された単一の又は特定オリゴマーのＨＣＶエンベロープ蛋白の精製に使用することができる。
【００８３】
分泌されたＥ１又はＥ２又はＥ１／Ｅ２オリゴマーについては、リシヌス・コムニス（Ricinus communis）凝集素Ｉ（ＲＣＡＩ）のような複合糖質を結合するレクチンが好適なレクチンである。
【００８４】
更に詳しくは本発明は、前記で定義された方法により単離又は精製されていることを特徴とする、Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２よりなる群から選択される、実質的に精製された組換えＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白に関する。
【００８５】
更に詳しくは、本発明は、ワクシニアのような組換え哺乳動物細胞から発現された組換えエンベロープ蛋白の精製又は単離に関する。
【００８６】
本発明はまた、組換え酵母細胞から発現された組換えエンベロープ蛋白の精製又は単離に関する。
【００８７】
本発明は同様に、組換え細菌（原核生物）細胞から発現された組換えエンベロープ蛋白の精製又は単離に関する。
【００８８】
本発明はまた、ベクター配列、適切な原核生物性、真核生物性もしくはウイルス性又は合成プロモーター配列、その後に続く本発明の単一の又は特定オリゴマーのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２の発現を可能にするヌクレオチド配列を含む組換えベクターにも関する。
【００８９】
特に、本発明は、ベクター配列、適切な原核生物性、真核生物性もしくはウイルス性又は合成プロモーター配列、その後に続く本発明の単一のＥ１又はＥ１の発現を可能にするヌクレオチド配列を含む組換えベクターに関する。
【００９０】
特に、本発明は、ベクター配列、適切な原核生物性、真核生物性もしくはウイルス性又は合成プロモーター配列、その後に続く本発明の単一のＥ１又はＥ２の発現を可能にするヌクレオチド配列を含む組換えベクターに関する。
【００９１】
ベクター配列に挿入される目的のＥ１及び／又はＥ２配列をコードするＨＣＶ  ｃＤＮＡセグメントは、シグナル配列に結合させてもよい。該シグナル配列は、非ＨＣＶ供給源由来のもの（例えば哺乳動物細胞中で発現させるためのＩｇＧ又は組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔｐａ）リーダー配列、又は酵母細胞で発現させるためのα−接合因子配列）でもよいが、本発明の特に好ましい構築物は、ＨＣＶゲノム中でＥ１及びＥ２蛋白の各開始点の前に現れるシグナル配列を含有する。ベクターに挿入される目的のＥ１及び／又はＥ２配列をコードするＨＣＶ  ｃＤＮＡセグメントはまた、例えば実施例に例示されたような疎水性ドメイン、又はＥ２超可変領域Ｉに欠失を有していてもよい。
【００９２】
更に詳しくは、本発明の組換えベクターは、ＨＣＶポリ蛋白のアミノ酸１位と１９２位の間の領域で開始し、２５０位と４００位の間の領域で終わる、より好適には２５０位と３４１位の間の領域で終わる、更により好適には２９０位と３４１位の間の領域で終わる、ポリ蛋白をコードするＨＣＶ  ｃＤＮＡセグメントを有する、ＨＣＶの単一のＥ１蛋白の発現のための核酸を包含する。最も好適には、本発明の組換えベクターは、１１７位と１９２位の間の領域で開始し、２６３位と３２６位の間の領域中のいずれかの位置で終わる、ＨＣＶポリ蛋白の一部をコードするＨＣＶ  ｃＤＮＡセグメントを有する、ＨＣＶの単一のＥ１蛋白の発現のための組換え核酸を包含する。また本発明の範囲には、最初の疎水性ドメイン（２６４位〜２９３位プラス又はマイナス８アミノ酸）が欠失した形態、又は５’末端ＡＴＧコドンと３’末端停止コドンが加えられた形態、又は、第Ｘａ因子切断部位を有し、及び／又は３〜１０個、好適には６個のヒスチジンコドンが加えられた形態も含まれる。
【００９３】
更に詳しくは、本発明の組換えベクターは、ＨＣＶポリ蛋白のアミノ酸２９０位と４０６位の間の領域で開始し、６００位と８２０位の間の領域で終わる、より好適には３２２位と４０６位の間の領域で開始する、更により好適には３４７位と４０６位の間の領域で開始する、更に尚好適には３６４位と４０６位の間の領域で開始する、ポリ蛋白をコードするＨＣＶ  ｃＤＮＡセグメントを有する、ＨＣＶの単一のＥ２蛋白の発現のための核酸を包含する。最も好適には、本発明の組換えベクターは、２９０位と４０６位の間の領域で開始し、６２３、６５０、６６１、６７３、７１０、７１５、７２０、７４６又は８０９位のいずれかの位置で終わるポリ蛋白をコードするＨＣＶ  ｃＤＮＡセグメントを有する、ＨＣＶの単一のＥ２蛋白の発現のための組換え核酸を包含する。また本発明の範囲には、５’末端ＡＴＧコドンと３’末端停止コドンが加えられた形態、又は、第Ｘａ因子切断部位を有し、及び／又は３〜１０個、好適には６個のヒスチジンコドンが加えられた形態も含まれる。
【００９４】
本発明のＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白の組換え発現のために、種々のベクターが使用されうる。酵母及びグリコシル化突然変異株のような下等真核生物は、典型的には、プラスミド又は組換えウイルスで形質転換される。ベクターは、宿主内で独立に複製してもよく、又は宿主細胞ゲノム中に組み込まれてもよい。
【００９５】
高等真核生物は、ベクターで形質転換してもよく、又は組換えウイルス（例えば、組換えワクシニアウイルス）に感染させてもよい。ワクシニアウイルスへの外来ＤＮＡの挿入のための技術及びベクターは、当該分野で周知であり、例えば相同組換えが利用される。広範囲のウイルスプロモーター配列、おそらくターミネーター配列及びポリ（Ａ）付加配列、場合によりエンハンサー配列及び増幅配列は、全て哺乳動物での発現に必要であるが、当該分野で利用可能である。ワクシニアは、宿主細胞蛋白の発現を停止させるため、ワクシニアは特に好適である。ワクシニアはまた、生きた組換えワクシニアウイルスで免疫した細胞又は個体中で、ＨＣＶのＥ１及びＥ２の発現を可能にするため、大変好ましい。ヒトの予防接種には、アビポックス（avipox）やアンカラ修飾ウイルス（Ankara Modified Virus)（ＡＭＶ）が特に有用なベクターである。
【００９６】
バキュロウイルスのオートグラファ・カリホルニカ核多角体病ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)（ＡｃＮＰＶ）由来の昆虫発現移入ベクターも、公知であり、これは、ヘルパー非依存性ウイルス発現ベクターである。この系に由来する発現ベクターは、通常、異種遺伝子を発現させるのに、強力なウイルス性ポリヘドリン遺伝子プロモーターを使用する。バキュロウイルスでの発現のために、バキュロウイルスの目的の部位へ異種ＤＮＡを導入するための異なるベクター及び方法が、当業者に公知である。また、昆虫細胞に認識される翻訳後修飾の異なるシグナルも、当該分野で公知である。
【００９７】
本発明の範囲には、精製された組換えの単一の又は特定オリゴマーのＨＣＶのＥ１又はＥ２又はＥ１／Ｅ２蛋白を生産するための方法も包含され、ここでは、凝集物形成に関与するシステイン残基は、凝集物形成が防止されるように核酸配列のレベルで他の残基で置換されている。このような突然変異したＥ１及び／又はＥ２蛋白をコードする核酸を有する組換えベクターにより発現される組換え蛋白もまた、本発明の範囲内にある。
【００９８】
本発明はまた、少なくとも１つのグリコシル化部位が除去されており、そのためグリコシル化突然変異体と呼ばれることを特徴とする、組換えＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白にも関する。実施例で例示されるように、問題の患者のＨＣＶ疾患を診断（スクリーニング、確認、予後など）及び防止するのに、異なるグリコシル化突然変異体が望まれることがある。例えば、ＧＬＹ４の欠如したＥ２蛋白グリコシル化突然変異体は、診断における幾つかの血清の反応性を改良することが見いだされた。これらのグリコシル化突然変異体は、好適には本発明に開示された方法により精製される。本発明にはまた、このようなＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２グリコシル化突然変異体をコードする核酸挿入物（インサート）を有する組換えベクター、及びこのような組換えベクターにより形質転換された宿主細胞も、包含される。
【００９９】
本発明はまた、同様に本発明の一部を構成するポリヌクレオチドを含む組換えベクターにも関する。本発明は、更に詳しくは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７及び４９に示される組換え核酸、又はこれらの部分に関する。
【０１００】
本発明はまた、前記で定義された組換えベクターで形質転換された宿主細胞をも包含し、ここで該ベクターは、前記で定義されたＨＣＶのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白をコードするヌクレオチド配列を、該ＨＣＶのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２配列に作動可能に連結し、該ＨＣＶのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白の発現を調節することができる制御配列に加えて含む。
【０１０１】
真核生物宿主としては、定義の項に記載した下等又は高等真核生物が挙げられる。下等真核生物宿主は、当該分野で周知の酵母細胞を含む。高等真核生物宿主としては、主に当該分野で公知の哺乳動物細胞株があり、ＡＴＣＣから入手できる多くの不死化した細胞株（例えばＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＰＫ１５、ＲＫ１３及び多くの他の細胞株）を含む。
【０１０２】
本発明は、特に、前記で定義した組換えベクターを含有する前記で定義した宿主細胞により発現される組換えＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白に関する。これらの組換え蛋白は、特に、本発明の方法により精製される。
【０１０３】
前記で定義したＨＣＶエンベロープ蛋白を単離又は精製する好適な方法は、少なくとも以下の工程を含むことを更に特徴とする：
−  Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２ＨＣＶエンベロープ蛋白を発現する、本発明の組換えベクター又は公知の組換えベクターで形質転換した、前記で定義した宿主細胞を、適切な培地中で生育させ、
−  適切な条件下で、前記で定義した該ベクター配列を発現させ、
−  好適にはＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）のようなＳＨ基保護剤、及び場合により（好適にはエンピゲン−ＢＢである）適切な界面活性剤の存在下で、該形質転換宿主細胞を溶解し、
−  レクチンクロマトグラフィーあるいは抗Ｅ１及び／又は抗Ｅ２特異的モノクローナル抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィー（該レクチンは好適にはレンチルレクチン又はＧＮＡである）のような親和性精製により、該ＨＣＶエンベロープ蛋白を回収し、次に
−  前工程の溶出液をジスルフィド結合切断手段（例えば、ＤＴＴ）とインキュベートし、好適には、引き続きＳＨ基保護剤（例えば、ＮＥＭ又はビオチン−ＮＥＭ）とインキュベートして、そして
−  ゲル濾過、及び場合により引き続きＮｉ2+−ＩＭＡＣクロマトグラフィー及び脱塩工程のような手段により、ＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白を単離する。
【０１０４】
前述の方法の結果として、実施例の項に記載のように、Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白は、ゲル濾過カラム又はＩＭＡＣカラムのボイド容積中のベクター由来の成分及び／又は細胞成分を含有する大きな凝集物とは別に溶出する形態で生産されうる。ジスルフィド架橋切断工程は、有利にも、宿主及び／又は発現系由来の蛋白の存在に由来する擬反応性をも排除する。細胞の溶解の際のＮＥＭ及び適切な界面活性剤の存在は、ＨＣＶエンベロープ蛋白と夾雑物との凝集を、既に部分的に又は完全に防止しうる。
【０１０５】
Janknecht ら、1991、及びHochuli ら、1988、が記載した（Ｈｉｓ）6 を有する構築物には、好適には、Ｎｉ2+−ＩＭＡＣクロマトグラフィー及びそれに続いて脱塩工程が使用される。
【０１０６】
本発明はまた、本発明のＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白を用いる、マウス又はラットのような小動物でモノクローナル抗体を生産する方法、及び抗ＨＣＶ抗体を認識するヒトＢ細胞をスクリーニング及び単離する方法にも関する。
【０１０７】
本発明は更に、第３表に記載の以下のＥ１ペプチドの少なくとも１つを含む組成物に関する：
コア／Ｅ１Ｖ１領域のアミノ酸１８１〜２００位にわたるＥ１−３１（配列番号５６）、
Ｅ１領域のアミノ酸１９３〜２１２位にわたるＥ１−３３（配列番号５７）、
Ｅ１Ｖ２領域のアミノ酸２０５〜２２４位にわたるＥ１−３５（配列番号５８）（エピトープＢ）、
Ｅ１Ｖ２領域のアミノ酸２０８〜２２７位にわたるＥ１−３５Ａ（配列番号５９）（エピトープＢ）、
Ｅ１領域〔Ｖ１、Ｃ１及びＶ２領域（エピトープＢを含有する）〕のアミノ酸１９２〜２２８位にわたる１ｂＥ１（配列番号５３）、
Ｅ１領域のアミノ酸３０１〜３２０位にわたるＥ１−５１（配列番号６６）、
Ｅ１Ｃ４領域のアミノ酸３１３〜３３２位にわたるＥ１−５３（配列番号６７）（エピトープＡ）、
Ｅ１領域のアミノ酸３２５〜３４４位にわたるＥ１−５５（配列番号６８）。
【０１０８】
本発明はまた、第３表に記載の以下のＥ２ペプチドの少なくとも１つを含む組成物に関する：
Ｅ２領域のアミノ酸３９７〜４１６位にわたるＥｎｖ６７すなわちＥ２−６７（配列番号７２）（エピトープＡ、モノクローナル抗体２Ｆ１０Ｈ１０に認識される、第１９図を参照）、
Ｅ２領域のアミノ酸４０９〜４２８位にわたるＥｎｖ６９すなわちＥ２−６９（配列番号７３）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域の５８３〜６０２位にわたるＥｎｖ２３すなわちＥ２−２３（配列番号８６）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の５９５〜６１４位にわたるＥｎｖ２５すなわちＥ２−２５（配列番号８７）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の６０７〜６２６位にわたるＥｎｖ２７すなわちＥ２−２７（配列番号８８）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の５４７〜５６６位にわたるＥｎｖ１７ＢすなわちＥ２−１７Ｂ（配列番号８３）（エピトープＤ）、
Ｅ２領域の５２３〜５４２位にわたるＥｎｖ１３ＢすなわちＥ２−１３Ｂ（配列番号８２）（エピトープＣ、モノクローナル抗体１６Ａ６Ｅ７に認識される、第１９図を参照）。
【０１０９】
本発明はまた、以下のＥ２コンフォメーション性エピトープの少なくとも１つを含む組成物に関する：
モノクローナル抗体１５Ｃ８Ｃ１、１２Ｄ１１Ｆ１及び８Ｇ１０Ｄ１Ｈ９により認識されるエピトープＦ、
モノクローナル抗体９Ｇ３Ｅ６に認識されるエピトープＧ、
モノクローナル抗体１０Ｄ３Ｃ４及び４Ｈ６Ｂ２により認識されるエピトープＨ（又はＣ）、又は、
モノクローナル抗体１７Ｆ２Ｃ２に認識されるエピトープＩ。
【０１１０】
本発明はまた、ペプチド又は蛋白組成物で免疫して作成されるＥ１又はＥ２特異的抗体にも関し、該抗体は、前記で定義したいずれかのポリペプチド又はペプチドと特異的に反応性であり、かつ該抗体は、好適にはモノクローナル抗体である。
【０１１１】
本発明はまた、プラスミド若しくはファージの可変鎖ライブラリー又はヒトＢ細胞集団から、当該分野で公知の方法によりスクリーニングされたＥ１又はＥ２特異的抗体に関し、該抗体は、前記で定義した任意のポリペプチド又はペプチドと特異的に反応性であり、かつ該抗体は、好適にはモノクローナル抗体である。
【０１１２】
本発明のＥ１又はＥ２特異的モノクローナル抗体は、前記で定義した本発明のＨＣＶポリペプチド又はペプチドに対して免疫した動物（特に、マウス又はラット）の脾臓細胞を一方とし、そしてミエローマ細胞株の細胞を他方として、古典的な方法で作成され得、そして最初に動物の免疫に使用されたポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの能力により選択されうる、任意のハイブリドーマにより生産することができる。
【０１１３】
本発明の抗体は、酵素型、蛍光型又は放射能型の適切な標識物により標識することができる。
【０１１４】
本発明の好適な本実施態様のモノクローナル抗体は、マウス及び／又はヒトのｃＤＮＡからのＨ及びＬ鎖をコードするゲノムＤＮＡ配列あるいはＨ及びＬ鎖をコードするゲノムクローンの一部から出発して、組換えＤＮＡ技法により作成されるマウスモノクローナル抗体のヒト化型であってよい。
【０１１５】
あるいは、本発明の好適な本実施態様のモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってよい。本発明の本実施態様のこれらの抗体はまた、ＨＣＶに感染した患者又はＨＣＶに対する予防接種を受けた患者のヒト末梢血リンパ球からも得られうる。このようなヒトモノクローナル抗体は、例えば重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）再集団（repopulation）により、調製される（最近の総説については、Duchosalら、1992を参照）。
【０１１６】
本発明はまた、レパートリークローニング（repertoire cloning）法（Persson ら、1991）による組換え抗体の選択のための、本発明の蛋白又はペプチドの使用に関する。
【０１１７】
ある遺伝子型由来のペプチド又は単一の若しくは特定オリゴマーのエンベロープ蛋白に対する抗体は、薬剤（medicament) として使用することができ、更に詳しくは、ＨＣＶ遺伝子型の検出（ＨＣＶのＥ１又はＥ２抗原の存在の検出）のための免疫測定法に組み込むために、ＨＣＶ疾患の予知／監視のために、又は治療剤として、使用することができる。
【０１１８】
あるいは、本発明はまた、生物学的試料中のＥ１又はＥ２抗原の存在の検出のための免疫測定法キットの調製、ＨＣＶ疾患の予知／監視のためのキットの調製又はＨＣＶ薬剤の調製のための、前述の任意のＥ１又はＥ２特異的モノクローナル抗体の使用に関する。
【０１１９】
本発明はまた、少なくとも以下の工程を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原のインビトロ診断又は検出の方法に関する：
（ｉ）免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で、好適には固定化された形で、前記で定義したＥ１及び／又はＥ２特異的モノクローナル抗体の任意のものに、該生物学的試料を接触させ、
（ii）結合しなかった成分を除去し、
（iii)形成された免疫複合体を、分析される試料中に存在する抗体に特異的に結合する異種抗体（この異種抗体は、適切な条件下で検出可能な標識物に結合されている）とインキュベートし、
（iv）該免疫複合体の存在を、視覚的又は機械的に（例えば、デンシトメーター、蛍光測定、比色法により）検出する。
【０１２０】
本発明はまた、
−  好適には固体基材上に固定された、前記で定義した少なくとも１つのモノクローナル抗体、
−  これらの抗体と、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原との間の結合反応を可能にする緩衝液又は前記緩衝液を作成するのに必要な成分、
−  前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
−  場合により観察された結合パターンから試料中に存在するＨＣＶ抗原を推定するための自動走査及び解釈装置、
を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原のインビトロ診断のためのキットに関する。
【０１２１】
本発明はまた、本発明の方法により精製されたＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２組換えＨＣＶ蛋白を含む組成物、又は薬剤として使用するための前述の少なくとも１つのペプチドを含む組成物に関する。
【０１２２】
更に詳しくは、本発明は、場合により薬剤学的に許容しうる助剤（アジュバント）と一緒に、免疫応答を起こすのに充分な量の組成物を投与することを含む、ＨＣＶに対して哺乳動物（好適にはヒト）を免疫するワクチンとしての使用のための、前述のエンベロープペプチドの少なくとも１つを含む組成物又は前記で定義した組換えエンベロープ蛋白組成物に関する。
【０１２３】
更に詳しくは、本発明は、前述のワクチンを調製するための、前述の任意の組成物の使用に関する。
【０１２４】
また本発明は、前述のＥ１及び／又はＥ２領域から得られるＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーの蛋白又はペプチドを含む、ＨＣＶに対して哺乳動物（好適にはヒト）を免疫するためのワクチン組成物に関する。
【０１２５】
免疫原性組成物は、当該分野で公知の方法により調製することができる。本組成物は、通常、薬剤学的に許容しうる担体と一緒になった、好適には助剤を更に含有する、免疫原性量の、前記で定義した組換えＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２の単一の又は特定オリゴマーの蛋白、又は前記で定義したＥ１又はＥ２ペプチドを含む。
【０１２６】
Ｅ１又はＥ２に対する抗体の形成は、他のエンベロープ蛋白に対するものよりも好ましい可能性があるため、また、Ｅ２蛋白はＨＣＶタイプ間で交差反応性があり、Ｅ１蛋白はタイプ特異的であるため、本発明の単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白は、Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２のいずれであっても、特に有用なワクチン抗原になると予想される。１型のＥ２蛋白と幾つかの遺伝子型から得られるＥ１蛋白を含有するカクテルが、特に有利なことがある。Ｅ２に対してモル過剰のＥ１、又はＥ１に対してモル過剰のＥ２を含有するカクテルが、特に有利なこともある。免疫原性組成物は、抗体産生を誘導するため（抗体の供給源にするために、又は動物の防御免疫を誘導するため）に動物に投与してもよい。
【０１２７】
薬剤学的に許容しうる担体は、組成物を投与される個体に対して有害な抗体の産生をそれ自体は誘導しない任意の担体を含む。好適な担体は、典型的には、大きくてゆっくり代謝される巨大分子（例えば、蛋白、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー）、及び不活性なウイルス粒子である。このような担体は、当業者に周知である。
【０１２８】
本組成物の効力を増強させる好適な助剤としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：水酸化アルミニウム（みょうばん）、米国特許第４，６０６，９１８号記載のＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）及びＲＩＢＩ〔これは、２％スクアレン／ツイーン（Tween)８０エマルジョン中に、細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリルリピッドＡ、トレハロースジミコラート、及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有する〕。この３つの成分（ＭＰＬ、ＴＤＭ又はＣＷＳ）は、いずれかを単独で使用してもよいし、２つずつを組合せて使用してもよい。更に、スチムロン（Stimulon）〔ケンブリッジ・バイオサイエンス（Cambridge Bioscience）、マサチューセッツ州ウォーセスター（Worcester)〕、又はＳＡＦ−１〔シンテックス（Syntex）〕のような助剤を使用してもよい。更に、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）は、ヒト以外での使用や研究目的に使用してもよい。
【０１２９】
本免疫原性組成物は、典型的には、薬剤学的に許容しうる賦形剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含有する。更に、このような賦形剤は、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝化物質、保存剤などの補助物質を含有してもよい。
【０１３０】
典型的には、本免疫原性組成物は、注射剤として（液剤又は懸濁剤として）調製される。注射の前に、液体賦形剤へ溶解又は懸濁するのに適した固体形態を調製してもよい。この調製物はまた、助剤の効果を上げるために、乳化させるか、リポソーム中にカプセル化させてもよい。Ｅ１及びＥ２蛋白はまた、例えばＱｕｉｌ  Ａ（ＩＳＣＯＭＳ）のようなサポニンと共に免疫刺激性複合体（Immune Stimulating Complexes）に取り込ませてもよい。
【０１３１】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、「充分な量」又は「免疫学的に有効な量」の本発明のエンベロープ蛋白、及び必要に応じて任意の他の前述の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、その量が、個体に投与されたとき（単一用量であれ、一連の用量の一部であれ）、前記で定義したように治療に有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康及び肉体的状態、治療される個体の分類学的位置（例えば、ヒトでない霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、目的とする防御の程度、ワクチンの処方、担当医師による医学的状況の評価、感染ＨＣＶの株、及び他の関連因子により変わる。この量は、比較的広い範囲にあり、これは通常の試験により決定することができる。通常、この量は、０．０１〜１，０００μg/用量、特に０．１〜１００μg/用量の間である。
【０１３２】
単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白は、Ｂ型肝炎表面抗原（ヨーロッパ特許出願第１７４，４４４号を参照）と同じように、同種（例えば、コア、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４又はＮＳ５領域からのＴ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープ）又は異種（非ＨＣＶ）ハプテンを提示するためのワクチン担体として役立ててもよい。こうして使用する場合、エンベロープ蛋白は、凝集物に結合したハプテン又は抗原に対する免疫応答を刺激することができる免疫原性担体となる。抗原は、蛋白の親水性領域に対応する位置で、Ｅ１及び／又はＥ２をコードする遺伝子中にクローン化してもよく、従来法の化学的方法で結合させてもよい。このような親水性領域としては、Ｖ１領域（アミノ酸１９１〜２０２位にわたる）、Ｖ２領域（アミノ酸２１３〜２２３位にわたる）、Ｖ３領域（アミノ酸２３０〜２４２位にわたる）、Ｖ４領域（アミノ酸２３０〜２４２位にわたる）、Ｖ５領域（アミノ酸２９４〜３０３位にわたる）、及びＶ６領域（アミノ酸３２９〜３３６位にわたる）がある。ハプテンの挿入のための他の有用な位置は、疎水性領域（およそアミノ酸２６４〜２９３位にわたる）である。この領域は、ここに欠失を有するＥ１蛋白と抗血清との反応性に影響を与えずに欠失させうることが、本発明で示されている。したがって、ハプテンを欠失の部位に挿入してもよい。
【０１３３】
本免疫原性組成物は、従来法の非経口投与、典型的には、例えば皮下又は筋内への注射により投与される。他の投与法に適した更なる製剤としては、経口製剤や坐剤が挙げられる。投与法は、単一用量スケジュール又は複数用量スケジュールでもよい。ワクチンは、他の免疫調節性の物質と共に投与してもよい。
【０１３４】
本発明はまた、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体のインビトロ検出のための、前記のペプチド又はポリペプチドを含む組成物に関する。
【０１３５】
本発明はまた、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体を検出するための免疫測定キットの調製のための、前述の組成物の使用に関する。
【０１３６】
本発明はまた、少なくとも以下の工程を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体のインビトロ診断方法に関する：
（ｉ）免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で、好適には固定化された形で、前記で定義したエンベロープペプチド又は蛋白の任意のものを含む組成物に、該生物学的試料を接触させ（ここで、該ペプチド又は蛋白は、ストレプトアビジン又はアビジン複合体により固体基材に共有結合したビオチン化ペプチド又は蛋白であってもよい）、
（ii）結合しなかった成分を除去し、
（iii)形成された免疫複合体を、適切な条件下で検出可能な標識物に結合されている異種抗体とインキュベートし、
（iv）該免疫複合体の存在を、視覚的又は機械的に（例えば、デンシトメーター、蛍光測定、比色法により）検出する。
【０１３７】
あるいは、本発明はまた、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体に関して競合するように、前記で開示した、組換えにより生産し精製した単一の又は特定オリゴマーの蛋白Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白を、Ｅ１及び／又はＥ２ペプチドと組合せて使用する、競合免疫測定法（フォーマット）に関する。
【０１３８】
本発明はまた、
−  場合によりＨＣＶ又は他のタイプのＨＣＶからの他のポリペプチド又はペプチドと組合せた、好適には固体基材上に、より好適には同じＥＬＩＳＡプレートの異なるマイクロウェル上に、更により好適には同じ膜ストリップ上に固定化された、前記で定義した少なくとも１つのペプチド又は蛋白組成物、
−  これらのポリペプチド又はペプチドと、生物学的試料中に存在するＨＣＶに対する抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液又は前記緩衝液を作成するのに必要な成分、
−  前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
−  場合により、観察された結合パターンから試料中に存在するＨＣＶ遺伝子型を推定するための自動走査及び解釈装置、
を含む、生物学的試料中のＨＣＶ抗体の存在を測定するためのキットに関する。
【０１３９】
本発明の免疫測定法は、ＨＣＶに感染した個体の血清中の抗体により認識される、直鎖エピトープ（ペプチドの場合）及びコンフォメーション性エピトープ（単一の又は特定オリゴマーの蛋白）を保持するＥ１及び／又はＥ２ドメインからの、単一の又は特定オリゴマーの抗原を用いる。例えば単一の又は特定オリゴマーの抗原、二量体性抗原、及び単一の又は特定オリゴマーの抗原の組合せを使用することは、本発明の範囲内である。本発明のＨＣＶのＥ１及びＥ２抗原は、抗体の検出のために既知の抗原を用いる、実質的にあらゆる測定フォーマットに使用することができる。もちろん、ＨＣＶのコンフォメーション性エピトープを変性させるようなフォーマットは、避けるか又は適合させるべきである。これらの測定法の全てに共通の特徴は、ＨＣＶ抗体を含有することが疑われる体成分に、抗原を、体成分中に存在する任意のそのような抗体への抗原の結合を可能にする条件下で接触させることである。このような条件は、典型的には、生理学的温度、ｐＨ及びイオン強度であり、過剰の抗原を使用する。試料と抗原とのインキュベーションの後に、抗原を含有する免疫複合体を検出する。
【０１４０】
免疫測定法の設計は広い範囲の変更が可能であり、多くのフォーマットが当該分野で公知である。例えば、プロトコールは、固体支持体、又は免疫沈降法を用いることもある。ほとんどの測定法では、標識抗体又はポリペプチドを使用し、標識物は、例えば酵素、蛍光、化学発光、放射能、又は色素分子でもよい。免疫複合体からのシグナルを増幅する測定法も知られており、例としては、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジンを使用する測定法、及び酵素標識及び酵素介在免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ）などがある。
【０１４１】
免疫測定法は、不均一系又は均一系フォーマットでもよく、及び標準型又は競合型でもよいが、これらに限定されない。不均一系フォーマットでは、インキュベート後のポリペプチドからの試料の分離を容易にするため、ポリペプチドは、典型的には固体マトリックス又は支持体に結合している。使用できる固体支持体の例としては、ニトロセルロース（例えば、膜又はマイクロタイターウェルの形態で）、塩化ポリビニル（例えば、シート又はマイクロタイターウェルで）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレートで）、フッ化ポリビニリデン〔イムノロン（登録商標）（Immunolon)として知られている〕、ジアゾ化ペーパー、ナイロン膜、活性化ビーズ、及びプロテインＡビーズなどがある。例えば、不均一系フォーマットで、ダイナテック（Dynatech）イムノロン（登録商標）（Immunolon)１又はイムノロン（登録商標）（Immunolon)２マイクロタイタープレート、又は０．２５インチのポリスチレンビーズ〔プレシジョンプラスチックボール（Precision Plastic Ball）〕が使用できる。抗原性ポリペプチドを含有する固体支持体は、典型的には、被験試料から分離した後、かつ結合した抗体の検出の前に洗浄される。標準型フォーマット及び競合型フォーマットの両方が当該分野で公知である。
【０１４２】
均一系フォーマットでは、被験試料は、溶液中で抗原の組合せとインキュベートされる。例えば、これは形成されるあらゆる抗原−抗体複合体を沈降させる条件下であってもよい。標準型フォーマット及び競合型フォーマットの両方が当該分野で公知である。
【０１４３】
標準型フォーマットでは、抗体−抗原複合体中のＨＣＶ抗体の量を直接監視する。これは、抗ＨＣＶ抗体上のエピトープを認識する標識した抗異種（例えば、抗ヒト）抗体が、複合体形成により結合するか否かを測定することにより行ってもよい。競合型フォーマットでは、試料中のＨＣＶ抗体の量は、複合体中の既知量の標識抗体（又は他の競合性リガンド）の結合への競合的影響を監視することにより推定される。
【０１４４】
抗ＨＣＶ抗体を含む形成された複合体（又は、競合的測定法の場合は、競合抗体の量）は、フォーマットに依存して、多くの既知の方法の任意のものにより検出される。例えば、複合体中の非標識ＨＣＶ抗体は、標識物（例えば、酵素標識）と複合体を形成した抗異種Ｉｇのコンジュゲートを用いて検出することができる。
【０１４５】
免疫沈降又は凝集測定フォーマットでは、ＨＣＶ抗原と抗体との間の反応により、溶液又は懸濁液から沈殿するネットワークが形成され、肉眼で見える沈殿物の層又はフィルムが形成される。被験試料中に抗ＨＣＶ抗体が存在しない場合は、肉眼で見える沈殿物が形成されない。
【０１４６】
現在、３つの具体的な型の粒子凝集（ＰＡ）測定法が存在する。これらの測定法は、支持体にコーティングされて、種々の抗原に対する抗体の検出に使用される。この測定法の１つの型は、赤血球（ＲＢＣ）に受動的に吸着している抗原（又は抗体）により感作された赤血球を使用する血球凝集測定法である。体成分中に存在する特異的な抗原抗体を添加すると（もし存在する場合）、精製抗原でコーティングされた赤血球の凝集が引き起こされる。
【０１４７】
血球凝集測定法において非特異的反応の可能性を排除するために、ＰＡでは赤血球の代わりに２つの人工担体を使用してもよい。これらのうち最も一般的なものは、ラテックス粒子である。しかし、ゼラチン粒子を使用してもよい。これらの担体のいずれかを使用する測定法は、精製した抗原でコーティングされた粒子の受動的凝集に基づいている。
【０１４８】
コンフォメーション性エピトープを含む本発明のＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２抗原は、典型的には、これらの免疫測定法に使用するためのキットの形で包装される。キットは、通常、別々の容器に、未変性のＨＣＶ抗原、対照抗体調製物（陽性及び／又は陰性）、測定フォーマットに必要な場合には標識抗体、そして標識物が直接シグナルを生成しない場合にはシグナル生成試薬（例えば、酵素基質）を含有する。未変性の（ネイティブ）ＨＣＶ抗原は、既に固体マトリックスに結合していてもよく、又はこれをマトリックスに結合させるために試薬と共に分離してあってもよい。測定法を実施するための取り扱い説明（例えば、印刷物、テープ、ＣＤ−ＲＯＭなど）は、通常、キットに含まれている。
【０１４９】
未変性のＨＣＶ抗原を使用する免疫測定法は、感染の危険のあるＨＣＶを含まない供給血液の調製のために、血液をスクリーニングするのに有用である。供給血液の調製法は、以下の工程を含む。供血者の体成分（好適には血液又は血液成分）を、本発明のＨＣＶのＥ１及び／又はＥ２蛋白と反応させて、ＨＣＶ抗体（もし存在すれば）とＨＣＶ抗原との間の免疫学的反応を起こさせる。反応の結果として抗ＨＣＶ抗体−ＨＣＶ抗原複合体が形成されるか否かを検出する。供給血液に使用される血液は、未変性のＨＣＶ抗原であるＥ１又はＥ２に対する抗体を示さない供血者からのものである。
【０１５０】
ＨＣＶ抗原に対する反応性が陽性である時は、擬陽性の可能性を減らすために免疫測定を繰り返すことが好ましい。例えば、血液製剤（例えば、輸血、血漿、第VIII因子、免疫グロブリンなど）の生産のための血液の大規模なスクリーニングでは、特異性を犠牲にして感度を上げる（汚染された血液が決して見逃されることがないようにするため）ようなフォーマットの「スクリーニング」試験が典型的に行われる。すなわち、擬陽性率は上昇する。したがって、典型的には、これらの供血者が「繰り返し反応性」（すなわち、提供された血液について２回以上の免疫測定の試験で陽性であること）であるかどうかという更なる試験に委ねる。しかし、ＨＣＶ陽性の確認のためには、「確認」試験は、感度を犠牲にして特異性を上げる（擬陽性試料が陽性と判定されないようにするため）ようなフォーマットである。したがって、Ｅ１及びＥ２について本発明で記載した精製法は、ＨＣＶ診断測定法に単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白を含めるのに非常に有用である。
【０１５１】
選択される固相としては、ポリマービーズ又はガラスビーズ、ニトロセルロース、微粒子、反応トレイのマイクロウェル、試験管及び磁性粒子などが挙げられる。シグナル生成化合物としては、酵素、発光化合物、色原体、放射性元素及び化学発光化合物が挙げられる。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びベータガラクトシダーゼがある。増強化合物としては、ビオチン、抗ビオチン及びアビジンが挙げられる。増強化合物を結合する化合物の例には、ビオチン、抗ビオチン及びアビジンがある。リウマチ因子様物質の影響を阻止するために、被験試料は、リウマチ因子様物質の影響を阻止するのに充分な条件に付される。これらの条件は、被験試料を一定量の抗ヒトＩｇＧに接触させて混合物を生成させ、反応混合物からリウマチ因子様物質が実質的になくなるのに充分な時間と条件下で混合物をインキュベートすることを含む。
【０１５２】
本発明は、更に、ＨＣＶ感染患者のＨＣＶ疾患のインビトロ監視、又は治療（例えば、インターフェロンによる）に対する応答を予知するための、Ｅ１蛋白又はその部分、更に詳しくは前記で定義したＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーのＥ１蛋白の使用に関し、これは：
−  Ｃ型肝炎感染患者からの生物学的試料を、Ｅ１蛋白又はその好適な部分と、免疫学的複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートし、
−  結合しなかった成分を除去し、
−  該試料中〔例えば、（インターフェロン）治療の開始時及び／又は治療中の〕に存在する抗Ｅ１力価を計算し、
−  治療の開始時及び／又は治療中の該試料中の抗Ｅ１力価に基づき、ＨＣＶ疾患の自然の経過を監視し、又は治療に対する患者の応答を予知する、
ことを含む。
【０１５３】
開始時の２倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍、１５倍、又は好適には２０倍以上の抗Ｅ１力価の低下を示す患者は、ＨＣＶ療法（更に詳しくは、インターフェロン療法）に対する、長期の持続性レスポンダー（応答者）と結論できるであろう。実施例には、抗Ｅ１測定法は、ＩＦＮ治療又はＣ型肝炎ウイルス疾患一般の治療に対する長期の応答を予知するために非常に有用であることが示されている。
【０１５４】
更に詳しくは、第３表に列挙した以下のＥ１ペプチドは、ＨＣＶ感染患者のＨＣＶ疾患のインビトロ監視、又はインターフェロン治療に対する応答の予知に有用であることがわかった：
コア／Ｅ１Ｖ１領域のアミノ酸１８１〜２００位にわたるＥ１−３１（配列番号５６）、
Ｅ１領域のアミノ酸１９３〜２１２位にわたるＥ１−３３（配列番号５７）、
Ｅ１Ｖ２領域のアミノ酸２０５〜２２４位にわたるＥ１−３５（配列番号５８）（エピトープＢ）、
Ｅ１Ｖ２領域のアミノ酸２０８〜２２７位にわたるＥ１−３５Ａ（配列番号５９）（エピトープＢ）、
Ｅ１領域〔Ｖ１、Ｃ１及びＶ２領域（エピトープＢを含有する）〕のアミノ酸１９２〜２２８位にわたる１ｂＥ１（配列番号５３）、
Ｅ１領域のアミノ酸３０１〜３２０位にわたるＥ１−５１（配列番号６６）、
Ｅ１Ｃ４領域のアミノ酸３１３〜３３２位にわたるＥ１−５３（配列番号６７）（エピトープＡ）、
Ｅ１領域のアミノ酸３２５〜３４４位にわたるＥ１−５５（配列番号６８）。
【０１５５】
前述のペプチドの小さい断片も、本発明の範囲内にあると理解すべきである。このような小さい断片は、化学合成により容易に調製することができ、前述のように及び実施例に記載のように、測定法に使用できる能力について試験することができる。
【０１５６】
本発明はまた：
−  少なくとも１つのＥ１蛋白又はＥ１ペプチド、更に詳しくは前記で定義したＥ１蛋白又はＥ１ペプチド、
−  これらの蛋白又はペプチドと、生物学的試料中に存在する抗Ｅ１抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液を作成するのに必要な成分又は緩衝剤、
−  前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
−  場合により、治療の進行中の抗Ｅ１力価の低下を推定するための自動走査及び解釈装置、
を含む、ＨＣＶ感染患者のＨＣＶ疾患を監視、又は治療（例えばインターフェロン治療）に対する応答を予知するためのキットに関する。
【０１５７】
他のＨＣＶ抗原に対する抗体に比較して抗Ｅ２レベルも低下するため、Ｅ１蛋白又はペプチドについて前記したように、本発明のＥ２蛋白及びペプチドも、ＨＣＶ治療の監視／予知にある程度まで使用できると理解すべきである。しかし、ＨＣＶ疾患の監視／予知のための試験に使用するのにも適したＥ２領域中の幾つかのエピトープを決定することは可能であることを理解すべきである。
【０１５８】
本発明はまた、生物学的試料中に存在するＨＣＶの１つ又はそれ以上の血清型を検出する、更に詳しくは検出すべきＨＣＶの異なる型の抗体を検出するための、１つの測定フォーマットに組合せた血清型測定法に関し、これは、少なくとも以下の工程を含む：
（ｉ）免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で、好適には固定化された形で、Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白組成物の少なくとも１つ、あるいは前述のＥ１又はＥ２ペプチド組成物の少なくとも１つのものに、１つまたはそれ以上の血清型のＨＣＶ抗体の存在について分析すべき生物学的試料を接触させ、
（ii）結合しなかった成分を除去し、
（iii)形成された免疫複合体を、異種抗体（該異種抗体は、適切な条件下で検出可能な標識物に結合されている）とインキュベートし、
（iv）該免疫複合体の存在を、視覚的又は機械的に（例えば、デンシトメーター、蛍光測定、比色法により）検出し、観察された結合パターンから１つ又はそれ以上のＨＣＶ血清型の存在を推定する。
【０１５９】
この方法で使用される蛋白又はペプチドの組成物は、組換えにより発現された型特異的エンベロープ蛋白又は型特異的ペプチドであると理解すべきである。
【０１６０】
本発明は、更に、
−  前記で定義した少なくとも１つのＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２蛋白あるいはＥ１又はＥ２ペプチド
−  これらの蛋白又はペプチドと、生物学的試料中に存在する抗Ｅ１抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液を作成するのに必要な成分又は緩衝剤、
−  前述の結合反応で形成された免疫複合体を検出する手段、
−  場合により、観察された結合パターンから１つ又はそれ以上の血清型の存在を検出するための自動走査及び解釈装置、
を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶの１つ又はそれ以上の血清型を分類する（serotyping）ための、更に詳しくはＨＣＶのこれらの血清型に対する抗体を検出するためのキットに関する。
【０１６１】
本発明はまた、前記で定義した方法によりＨＣＶの有無又は遺伝子型を決定するために、固体基材上に固定化するための、及び逆相ハイブリダイゼーション測定法に取り込むための、好適には膜ストリップのような固体支持体上に平行の線状に固定化するための、前記で定義したペプチド又は蛋白組成物の使用に関する。他のＨＣＶポリ蛋白領域からの他の型特異的抗原との組合せもまた、本発明の範囲内にある。
【０１６２】
表の凡例
第１表：実施例１に記載したＥ１蛋白の異なる形態を作成するための増幅に使用した各クローン及びプライマーの特徴。
第２表：抗Ｅ１試験の要約。
第３表：競合試験用の合成ペプチド。
第４表：エンベロープ抗体レベルの経時変化。
第５表：ＬＴＲとＮＲの差。
第６表：マウスＥ２モノクローナル抗体間の競合実験。
第７表：Ｅ１グリコシル化突然変異体の構築のためのプライマー。
第８表：Ｅ１グリコシル化突然変異体のＥＬＩＳＡによる分析。
【０１６３】
実施例１：Ｃ型肝炎ウイルスＥ１蛋白のクローニングと発現
１．ワクシニアウイルス組換えベクターの構築
ｐｇｐｔＡＴＡ１８ワクシニア組換えプラスミドは、ｐＡＴＡ１８（Stunnenberg ら、1988）を改変したものであり、ワクシニアウイルスＩ３中間プロモーターの制御下に大腸菌（E. coli)キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する付加的な挿入体（インサート）を有する（第１図）。プラスミドｐｇｓＡＴＡ１８は、３つの読み枠中に停止コドンを含有する配列番号１／９４のオリゴヌクレオチドリンカーを、ＰｓｔＩとＨｉｎｄIIIで切断したｐＡＴＡ１８ベクターに挿入して構築した。これにより余分のＰａｃＩ制限部位が作成された（第２図）。元々のＨｉｎｄIII部位は保存されなかった。
配列番号１／９４を有するオリゴヌクレオチドリンカー：
【０１６４】
【表１】
2004222729.tif 000002
【０１６５】
組換え蛋白に融合した設計されたヒスチジンストレッチのＮｉ2+キレート化により、迅速かつ効率的な精製を容易にするために、付加的なカルボキシ末端のヒスチジン付加部分（タッグ）を有する分泌蛋白を発現するように、ワクシニア組換えベクターｐＭＳ６６を設計した。平滑末端を生成する３つの制限酵素（ＳｍａＩ、ＳｔｕＩ及びＰｍｌＩ／ＢｂｒＰＩ）のユニーク（単一）部位を含有する配列番号２／９５のオリゴヌクレオチドリンカーを、任意のｃＤＮＡのカルボキシ末端が、蛋白分解酵素第Ｘａ因子切断部位をコードする配列の後に６つのヒスチジンと２つの停止コドンをコードするヌクレオチド配列が続く枠（フレーム）に挿入されうるように合成した（３’末端の下流に、新しいＰａｃＩ制限部位も導入された）。配列番号２／９５を有するこのオリゴヌクレオチドを、ｐｇｐｔＡＴＡ１８のＸｍａＩ部位とＰｓｔＩ部位の間に導入した（第３図）。
配列番号２／９５を有するオリゴヌクレオチドリンカー：
【０１６６】
【表２】
2004222729.tif 000003
【０１６７】
実施例２．ＨＣＶ組換えプラスミドの構築
２．１．異なる形態のＥ１蛋白をコードする構築物
血清試料から、既に記載されている（Stuyver ら、1993b ）ように、ＲＮＡを調製し、次に逆転写とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、ＰＣＲ生成物を得た。第１表に、増幅に使用した各クローン及びプライマーの特徴を示す。ＰＣＲ断片を、ＳｍａＩで切断したｐＳＰ７２〔プロメガ（Promega)〕プラスミドにクローン化した。ワクシニア組換えベクターへの挿入のために、以下のクローンを選択した：ＨＣＣｌ９Ａ（配列番号３）、ＨＣＣｌ１０Ａ（配列番号５）、ＨＣＣｌ１１Ａ（配列番号７）、ＨＣＣｌ１２Ａ（配列番号９）、ＨＣＣｌ１３Ａ（配列番号１１）及びＨＣＣｌ１７Ａ（配列番号１３）（第２１図に記載した）。各ｐＳＰ７２プラスミドから、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII制限酵素切断により、Ｅ１コード領域を含有するｃＤＮＡ断片を切断し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで切断したｐｇｐｔＡＴＡ−１８ワクシニア組換えベクター（実施例１に記載）中に、１１Ｋワクシニアウイルス後期プロモーターの下流に挿入した。各プラスミドを、ｐｖＨＣＶ−９Ａ、ｐｖＨＣＶ−１０Ａ、ｐｖＨＣＶ−１１Ａ、ｐｖＨＣＶ−１２Ａ、ｐｖＨＣＶ−１３Ａ及びｐｖＨＣＶ−１７Ａと命名した。このうち、ｐｖＨＣＶ−１１Ａを第４図に示す。
【０１６８】
２．２．疎水性領域Ｅ１欠失突然変異体
コドンＡｓｐ  ２６４〜Ｖａｌ  ２８７（ヌクレオチド７９０〜８６１、疎水性ドメインＩをコードする領域）が欠失しているクローンＨＣＣｌ３７を、以下のように作成した：ＨＣＰｒ５２（配列番号１６）／ＨＣＰｒ１０７（配列番号１９）とＨＣＰｒ１０８（配列番号２０）／ＨＣＰＲ５４（配列番号１８）のプライマーセットを用いて、クローンＨＣＣｌ１０Ａから２つのＰＣＲ断片を作成した。これらのプライマーを第２１図に示す。この２つのＰＣＲ断片を、電気泳動後、アガロースゲルから精製し、各断片１ngをプライマーＨＣＰｒ５２（配列番号１６）とＨＣＰｒ５４（配列番号１８）を用いるＰＣＲの鋳型として一緒に使用した。得られた断片を、ＳｍａＩで切断したｐＳＰ７２ベクターにクローン化し、欠失を有するクローンは、２４コドン（７２塩基対）が欠失しているために容易に同定できた。クローンＨＣＣｌ３７（配列番号１５）を含有するプラスミドｐＳＰ７２ＨＣＣｌ３７を選択した。欠失のまわりのＨＣＶ配列（ベクターｐＳＰ７２−ＨＣＣｌ３７からＸｍａＩとＢａｍＨＩにより切断された断片）を、ワクシニアプラスミドｐｖＨＣＶ−１０ＡのＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、疎水性ドメインＩの欠如した全長Ｅ１ｃＤＮＡを含有する組換えワクシニアプラスミドを構築した。得られたプラスミドを、ｐｖＨＣＶ−３７と命名した。確認のための配列決定の後、内部欠失を有するアミノ末端領域を、このベクターｐｖＨＣＶ−３７から単離（ＥｃｏＲＩとＢｓｔＥIIにより切断）し、ＥｃｏＲＩとＢｓｔＥIIで切断したｐｖＨＣＶ−１１Ａプラスミドに再挿入した。この構築物は、両方の疎水性ドメインが欠失したＥ１蛋白を発現すると予測され、ｐｖＨＣＶ−３８と命名した。クローンＨＣＣｌ３８のＥ１をコードする領域を、配列番号２３に示す。
【０１６９】
Ｅ１カルボキシ末端の親水性領域（理論的にはアミノ酸３３７〜３４０辺りまで伸びている）は、構築物ｐｖＨＣＶ−３８に完全には含まれていないため、ｐｖＨＣＶ−３７プラスミドからＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断により疎水性ドメインＩの欠如した大きなＥ１領域を単離し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐｇｓＡＴＡ−１８ベクター中にクローン化した。得られたプラスミドを、ｐｖＨＣＶ−３９と命名した。これはクローンＨＣＣｌ３９（配列番号２５）を含有していた。ＢａｍＨＩによりｐｖＨＣＶ−３７ベクターから同じ断片を切断し〔その粘着末端はクレノウＤＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガー（Boehringer））で充填した〕、そして次にＥｃｏＲＩ（５’粘着末端）で切断した。この配列を、ＥｃｏＲＩとＢｂｒＰＩで切断したベクターｐＭＳ−６６に挿入した。こうして、カルボキシ末端に６つのヒスチジンのテールを含有する、プラスミドｐｖＨＣＶ−４０中のクローンＨＣＣｌ４０（配列番号２７）を得た。
【０１７０】
２．３．他の遺伝子型のＥ１
慢性Ｃ型肝炎の３ａ型感染患者（血清ＢＲ３６、クローンＢＲ３６−９−１３、ＷＯ  ９４／２５６０１中の配列番号１９、及びStuyver ら、1993a も参照）からクローンＨＣＣｌ６２（配列番号２９）を得、輸血後肝炎の５ａ型感染小児（血清ＢＥ９５、クローンＰＣ−４−１、ＷＯ  ９４／２５６０１中の配列番号４５）からＨＣＣｌ６３（配列番号３１）を得た。
【０１７１】
２．４．Ｅ２構築物
血清ＢＥ１１（遺伝子型１ｂ）から、プライマーＨＣＰｒ１０９（配列番号３３）とＨＣＰｒ７２（配列番号３４）により、Stuyver ら、1993b に記載されたようにＲＮＡ調製、逆転写及びＰＣＲ法を用いて、ＨＣＶのＥ２ＰＣＲ断片２２を得、この断片をＳｍａＩで切断したｐＳＰ７２ベクターにクローン化した。クローンＨＣＣｌ２２Ａ（配列番号３５）をＮｃｏＩ／ＡｌｗＮＩ又はＢａｍＨＩ／ＡｌｗＮＩで切断し、断片の粘着末端を平滑末端にした〔ＮｃｏＩ部位及びＢａｍＨＩ部位はクレノウＤＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガー（Boehringer）で、ＡｌｗＮＩ部位はＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー（Boehringer））で〕。次に、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIでの切断により線状にし、粘着末端をクレノウＤＮＡポリメラーゼ〔ベーリンガー（Boehringer）〕で充填したワクシニアｐｇｓＡＴＡ−１８ベクターに、このＢａｍＨＩ／ＡｌｗＮＩ  ｃＤＮＡ断片を挿入した。得られたプラスミドを、ｐｖＨＣＶ−４１と命名した。これは、シグナル配列として作用しうるＥ１蛋白の３７アミノ酸（Ｍｅｔ  ３４７〜Ｇｌｙ  ３８３）を含有する、アミノ酸Ｍｅｔ  ３４７〜Ｇｌｎ  ６７３のＥ２領域をコードしていた。ＥｃｏＲＩと  ＢｂｒＰＩで切断した後、クレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端としたベクターｐＭＳ６６に、同じＨＣＶ  ｃＤＮＡを挿入した。得られたプラスミドをｐｖＨＣＶ−４２と命名した。これはアミノ酸３４７〜６８３をコードしていた。ＮｃｏＩ／ＡｌｗＮＩ断片を、同様の方法で、ｐｇｓＡＴＡ−１８（ｐｖＨＣＶ−４３）又はｐＭＳ−６６ワクシニアベクター（ｐｖＨＣＶ−４４）の同じ部位に挿入した。ｐｖＨＣＶ−４３とｐｖＨＣＶ−４４は、ＨＣＶポリ蛋白のアミノ酸３６４〜６７３をコードしており、このうちアミノ酸３６４〜３８３は、Ｅ２のシグナル配列をコードするＥ１蛋白の天然のカルボキシ末端領域由来であり、アミノ酸３８４〜６７３は、成熟Ｅ２蛋白由来である。
【０１７２】
２．５．組換えＨＣＶ−ワクシニアウイルスの作成
ウサギ腎ＲＫ１３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３７）、ヒト骨肉腫１４３Ｂチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ- ）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８３０３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）及びＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ８０６５）細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、メリーランド州、アメリカ合衆国）から得た。ＲＫ１３と１４３Ｂ（ＴＫ- ）についてはアールの塩類（Earle's salts)（ＥＭＥＭ）と共に、ＨｅｐＧ２についてはグルコース（４g/l)と共に、１０％ウシ胎児血清を補足したダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、細胞を生育させた。既に記載されている（Panicali & Paoletti 、1982；Piccini ら、1987；Mackett ら、1982、1984、及び1986）ように、ワクシニアウイルスＷＲ株〔ウェスタンリザーブ（Western Reserve)、ＡＴＣＣ  ＶＲ１１９〕を、１４３Ｂ又はＲＫ１３細胞中で通常通り増殖させた。１４３Ｂ細胞のコンフルエントな単層に、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）０．１〔＝０．１プラーク形成単位（ＰＦＵ）／細胞〕で野性型ワクシニアウイルスを感染させた。２時間後、５００ngのプラスミドＤＮＡを含有するリン酸カルシウム共沈殿物の形で、ワクシニア組換えプラスミドを感染細胞にトランスフェクションして、相同組換えを起こさせた（Graham & van der Eb 、1973；Mackett ら、1985）。選択培地〔ミコフェノール酸（mycophenolic acid)（ＭＰＡ）２５μg/ml、キサンチン２５０μg/ml、及びヒポキサンチン１５μg/mlを含有するＥＭＥＭ；Falkner and Moss、1988；Janknecht ら、1991〕中でインキュベートしたウサギ腎ＲＫ１３細胞上で、大腸菌（Escherichia coli）キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）を発現する組換えウイルスを選択した。選択培地中で０．９％アガロース重層下で、ＲＫ１３細胞の新鮮な単層上で単一の組換えウイルスを精製した。チミジンキナーゼ欠損（ＴＫ- ）組換えウイルスを選択し、次に５−ブロモ−２’−デオキシウリジン２５μg/mlの存在下で、ヒト１４３Ｂ細胞（ＴＫ- ）の新鮮な単層上でプラークを精製した。精製した組換えＨＣＶ−ワクシニアウイルスの原液を、ｍ．ｏ．ｉ．０．０５でヒト１４３Ｂ細胞又はウサギＲＫ１３細胞に感染させることにより調製した（Mackett ら、1988）。組換えワクシニアウイルス中のＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片の挿入は、各ＨＣＶ断片（第１表を参照）をクローン化するために使用したプライマーを用いるＰＣＲにより、ＭＰＡ選択後の細胞溶解物の一定分量（５０μl ）で確認した。組換えワクシニア−ＨＣＶウイルスを、ワクシニア組換えプラスミド番号に従って命名した。例えば、組換えワクシニアウイルスｖｖＨＣＶ−１０Ａは、野性型ＷＲ株をｐｖＨＣＶ−１０Ａプラスミドで組換えすることにより得た。
【０１７３】
実施例３：組換えワクシニアウイルスによる細胞の感染
ＲＫ１３細胞のコンフルエントな単層を、実施例２に記載したようにｍ．ｏ．ｉ．３で組換えＨＣＶ−ワクシニアウイルスに感染させた。感染のためには、細胞単層をリン酸緩衝化生理食塩水、pH７．４（ＰＢＳ）で２回洗浄し、組換えワクシニアウイルス原液をＭＥＭ培地で希釈した。ｍ．ｏ．ｉ．が３になるように、１０6 個の細胞につきウイルス溶液２００μl を添加し、２４℃で４５分間インキュベートした。ウイルス溶液を吸引し、１０6 個の細胞につき完全増殖培地２ml（実施例２を参照）を加えた。細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、この間にＨＣＶ蛋白を発現させた。
【０１７４】
実施例４：ウェスタンブロッティングによる組換え蛋白の分析
感染細胞をＰＢＳで２回洗浄し、溶解緩衝液〔５０mMトリス−塩酸、pH７．５、１５０mM  ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、５mM  ＭｇＣｌ2 、１μg/mlアプロチニン（シグマ（Sigma)、ボルネム（Bornem）、ベルギー）〕で直接溶解するか、又は５０mMトリス−塩酸、pH７．５／１０mM  ＥＤＴＡ／１５０mM  ＮａＣｌ中で５分間インキュベートしてフラスコからはがして、遠心分離（１０００ｇで５分間）により回収した。次に、細胞ペレットを、１０6 個の細胞につき２００μl の溶解緩衝液（５０mMトリス−塩酸、pH８．０、２mM  ＥＤＴＡ、１５０mM  ＮａＣｌ、５mM  ＭｇＣｌ2 、アプロチニン、１％トリトンＸ−１００）に再懸濁した。エッペンドルフ遠心分離機で１４，０００rpm で５分間遠心分離して、細胞溶解物から不溶性の破片を除去して清澄にした。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、２０μl の溶解物の蛋白を分離した。次に、トランスファー緩衝液〔２５mMトリス−塩酸、pH８．０、１９２mMグリシン、２０％（ｖ／ｖ）メタノール〕中で、４℃に冷却したヘーファー（Hoefer）ＨＳＩトランスファー装置を用いて１００Ｖ（定電圧）で２時間、蛋白をゲルからニトロセルロースシート〔アマーシャム（Amersham）〕に電気的にトランスファーした。ニトロセルロースフィルターをブロット液（Blotto）〔ＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂インスタントミルク粉末；Johnson ら、1981〕でブロッキング処理し、ブロット液／０．１％ツイーン（Tween)２０で希釈した一次抗体とインキュベートした。非特異結合を減らすために、通常、ヒト陰性対照血清又はＨＣＶ感染患者血清を２００倍希釈し、２００倍希釈した野性型ワクシニアウイルス感染細胞溶解物と室温で１時間プレインキュベートした。ブロット液／０．１％ツイーン２０で洗浄後、ニトロセルロースフィルターを、ブロット液／０．１％ツイーン２０で希釈したアルカリホスファターゼ基質溶液とインキュベートした。ＰＢＳ中の０．１％ツイーン２０で洗浄後、フィルターをアルカリホスファターゼ基質溶液（１００mMトリス−塩酸、pH９．５、１００mM  ＮａＣｌ、５mM  ＭｇＣｌ2 、０．３８μg/mlニトロブルーテトラゾリウム、０．１６５μg/ml  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）とインキュベートした。電気的トランスファー以外の全ての操作は、室温で行った。
【０１７５】
実施例５：組換えＥ１又はＥ２蛋白の精製
５．１．溶解
感染したＲＫ１３細胞（Ｅ１又はＥ２構築物を有する）をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０mM  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中でインキュベートして培養レシピエントからはがした。はがした細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４℃で、１０5 個の細胞につき、２mM  ビオチン化Ｎ−エチルマレイミド（ビオチン−ＮＥＭ）〔シグマ（Sigma)〕を含有する溶解緩衝液〔５０mMトリス−塩酸、pH７．５、１５０mM  ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、５mM  ＭｇＣｌ2 、１μg/mlアプロチニン（シグマ（Sigma 、ボルネム（Bornem）、ベルギー）〕１mlを加えた。この溶解物を、Ｂ型ダウンサー（douncer)でホモゲナイズし、室温で０．５時間放置した。一次溶解物に、１０mM  Ｎ−エチルマレイミド〔ＮＥＭ、アルドリッチ（Aldrich)、ボルネム（Bornem）、ベルギー〕を含有する溶解緩衝液５倍量を更に加え、この混合物を室温で１５分間放置した。ベックマンＪＡ−１４ローター中で１４，０００rpm （ｒmax で３０，１００ｇ）で４℃で１時間遠心分離して、溶液から不溶性細胞破片を除去して清澄にした。
【０１７６】
５．２．レクチンクロマトグラフィー
カラムの５倍量の溶解緩衝液で流速１ ml/分で平衡化させた０．８×１０cmのレンチルレクチンセファロース４Ｂカラム〔ファルマシア（Pharmacia)〕に、清澄化した細胞溶解物を流速１ ml/分でのせた。レンチルレクチンカラムをカラムの５〜１０倍量の緩衝液１〔０．１M リン酸カリウム、pH７．３、５００mM  ＫＣｌ、５％グリセロール、１mM  ６−ＮＨ2 −ヘキサン酸、１mM  ＭｇＣｌ2 、及び１％デシルＰＥＧ（DecylPEG）（クワント（KWANT)、ベヅム（Bedum)、オランダ）〕で洗浄した。ある実験では、次にカラムを、１％デシルＰＥＧ（DecylPEG）の代わりに０．５％エンピゲン−ＢＢ〔カルビオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州サンディエゴ、米国〕を含有するカラムの１０倍量の緩衝液１で洗浄した。溶出緩衝液（１０mMリン酸カリウム、pH７．３、５％グリセロール、１mMヘキサン酸、１mM  ＭｇＣｌ2 、０．５％エンピゲン−ＢＢ、及び０．５Ｍ  α−メチル−マンノピラノシド）を適用して、結合物質を溶出した。溶出した物質を分画し、実施例６に記載のようにＥＬＩＳＡを用いて、画分を、Ｅ１又はＥ２の存在についてスクリーニングした。第２２図に、ｖｖＨＣＶ３９（１ｂ型）、ｖｖＨＣＶ４０（１ｂ型）、ｖｖＨＣＶ６２（３ａ型）、及びｖｖＨＣＶ６３（５ａ型）で感染させた細胞溶解物の４つの異なるＥ１精製物の、レンチルレクチン溶出画分から得られたＥＬＩＳＡ結果を示す。第２３図に、第２２図に示した値から得られたプロフィールを示す。これらの結果は、異なる型のＨＣＶのエンベロープ蛋白についてレクチン親和性カラムを使用できることを示している。
【０１７７】
５．３．濃縮及び部分的還元
Ｅ１陽性又はＥ２陽性画分をプールし、ベックマンＪＡ−２０ローター中で４℃で５，０００rpm で３時間遠心分離し、セントリコン（Centricon)３０kDa 〔アミコン（Amicon）〕で濃縮した。ある実験では、Ｅ１陽性又はＥ２陽性画分をプールし、窒素蒸発により濃縮した。３×１０8 個の細胞相当量を約２００μl に濃縮した。部分的還元のために、この２００μl に、最終濃度３．５％になるように３０％エンピゲン−ＢＢ〔カルビオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州サンディエゴ、米国〕を加え、次に最終濃度１．５〜７．５mMになるように１M   ＤＴＴ水溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、ＮＥＭ（ジメチルスルホキシド中、１M)を最終濃度５０mMになるように加え、更に３７℃で３０分間反応させて遊離のスルフヒドリル基をブロックした。
【０１７８】
５．４．ゲル濾過クロマトグラフィー
スーパーデックス（Superdex）−２００ＨＲ１０／２０カラム〔ファルマシア（Pharmacia)〕を、カラムの３倍量のＰＢＳ／３％エンピゲン−ＢＢで平衡化させた。還元混合物をスマートシステム（Smart System）〔ファルマシア（Pharmacia)〕の５００μl 試料ループに注入し、ＰＢＳ／３％エンピゲン−ＢＢ緩衝液を加えてゲル濾過した。Ｖ0 からＶt まで２５０μl の画分を集めた。実施例６に記載のように、画分をＥ１蛋白又はＥ２蛋白の存在についてスクリーニングした。
【０１７９】
第２４図に、ｖｖＨＣＶ３９（１ｂ型）、ｖｖＨＣＶ４０（１ｂ型）、ｖｖＨＣＶ６２（３ａ型）、及びｖｖＨＣＶ６３（５ａ型）で感染させた細胞溶解物の４つの異なるＥ１精製物の、ゲル濾過クロマトグラフィー後に得られた画分から得られたＥＬＩＳＡ結果を示す。第２５図に、１ｂ型、３ａ型及び５ａ型（それぞれ、ｖｖＨＣＶ３９、ｖｖＨＣＶ６２及びｖｖＨＣＶ６３で感染させたＲＫ１３細胞からのもの；レンチルレクチンで精製し、前記実施例のように還元した）のＥ１蛋白の精製物から得られたプロフィールを示す。「１」、「２」、「３」で示したピークは、純粋なＥ１蛋白ピークを示す（Ｅ１反応性は主に画分２６〜３０にあった）。これらのピークは、二量体性Ｅ１蛋白に対応する約７０kDa の非常に似通った分子量を示した。３つのプロフィール中の他のピークは、実施例５．３．に概説した還元工程によってのみ、また適正な界面活性剤の存在下での以後のゲル濾過工程によってのみ、Ｅ１から分離することができた、ワクシニアウイルス及び／又は細胞性蛋白である。第２６図に示すように、プール１（画分１０〜１７を示す）とプール２（画分１８〜２５を示す）は、Ｅ１プール（画分２６〜３０）には存在しない夾雑蛋白を含有する。Ｅ１ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、実施例４に記載のようにブロッティングした。第２７図に示すように、ＮＥＭ−ビオチンで標識した蛋白をストレプトアビジン−アルカリホスファターゼにより検出した。特にゲル濾過クロマトグラフィーの前に存在する２９kDa と４５kDa の夾雑蛋白（レーン１）が、画分２６〜３０では非常に低レベルでしか存在しないことが、容易に観察することができる。約６５kDa のバンドは、完全にはモノマーＥ１形態には分解されないＥ１二量体形態を示す。３ａ型Ｅ１蛋白（レーン１０〜１５）について同様の結果が得られた。これは、６個の炭水化物ではなく５個の炭水化物のみしか存在しないため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでより速い移動度を示す。第２８図に、第２６図と同一条件下で実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験の銀染色を示す。精製操作の全体像を第２９図に示す。
【０１８０】
精製したＥ１蛋白の存在を、実施例４に記載のようにウェスタンブロッティングにより更に確認した。二量体性Ｅ１蛋白は、凝集せず、夾雑物質がないように見える。前述のスキームに従ってｖｖＨＣＶ４０感染細胞から精製したサブタイプ１ｂのＥ１蛋白を、４７７パーキンエルマー（Perkins-Elmer)シーケンサーでアミノ末端から配列決定して、最初の残基としてチロシンを含有しているらしいことが判った。このことにより、Ｅ１蛋白が正しい位置（Ａ１９１とＹ１９２の間）でシグナルペプチダーゼによりそのシグナル配列から切断されたことが確認された。これにより、成熟Ｅ１蛋白のアミノ末端はアミノ酸１９２位で開始するというHijikataら（1991）の知見が確認される。
【０１８１】
５．５．Ｅ２蛋白の精製
実施例５．１．〜５．４．に示すように、ｖｖＨＣＶ４４に感染したＲＫ１３細胞から、Ｅ２蛋白（アミノ酸３８４〜６７３）を精製した。第３０図に、レンチルレクチンクロマトグラフィーのＯＤ280 プロフィール（連続線）を示す。点線は、ＥＬＩＳＡ（実施例６を参照）で検出されたＥ２反応性を示す。第３１図に、レンチルレクチンＥ２プール（第３０図を参照）（その一部は実施例５．３．に記載の方法に従い還元してブロックしたものであり、また一部は直ちにカラムに適用したものである）のゲル濾過クロマトグラフィーから得られた同じプロフィールを示す。Ｅ２プールの両方の部分を別々のゲル濾過カラムにかけた。還元をしない場合、Ｅ２は夾雑蛋白と共有結合凝集物を生成することが証明できた。還元とブロッキングの後、夾雑蛋白の大部分はＶ0 画分に集まった。Ｅ２蛋白と一緒に精製された他の夾雑蛋白は、以後の工程で除去できたため、もはやＥ２蛋白に共有結合していなかった。第３２図に、Ｅ２蛋白精製について実施した付加的なＮｉ2+−ＩＭＡＣ精製工程を示す。この親和性精製工程では、ｖｖＨＣＶ４４から発現されたＥ２蛋白に付加された６個のヒスチジン残基を使用した。夾雑蛋白は、カラムから流れ出すか、又は３０mMイミダゾール洗浄により除去することができた。第３３図に、０．５μg の精製Ｅ２蛋白と３０mMイミダゾール洗浄物の銀染色したＳＤＳ／ＰＡＧＥを示す。純粋なＥ２蛋白は、２００mMイミダゾール溶出工程により容易に回収することができた。第３４図に、イミダゾールを除去して目的の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、炭酸緩衝液、生理食塩水）に変更することができることを目的とした付加的な脱塩工程を示す。
【０１８２】
Ｅ１の産生のためにｖｖＨＣＶ１１Ａ（又はｖｖＨＣＶ４０）で、又はＥ２蛋白の産生のためにｖｖＨＣＶ４１、ｖｖＨＣＶ４２、ｖｖＨＣＶ４３若しくはｖｖＨＣＶ４４で感染させた、約５０，０００cm2 のＲＫ１３細胞から出発して、実施例５．１〜５．５に記載の方法により、約１．３mgのＥ１蛋白と０．６mgのＥ２蛋白を得ることができた。
【０１８３】
（予想に反して）分泌されたＥ２蛋白（約３０〜４０％を構成し、６０〜７０％は細胞内形態である）は、凝集物を形成したことで特徴付けられることにも注目すべきである。したがって、分泌されたＥ２を精製するにも同じ問題があった。分泌されたＥ２は前述のように精製することができた。
【０１８４】
実施例６：抗Ｅ１若しくは抗Ｅ２抗体の検出又はＥ１若しくはＥ２蛋白の検出のためのＥＬＩＳＡ
マクシソルブ（Maxisorb）マイクロウェルプレート〔ヌンク（Nunc）、ロスキルデ（Roskilde）、デンマーク〕を、１ウェル当たりＰＢＳ中５μg/mlのストレプトアビジン〔ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim)〕溶液１部（例えば、５０μl 又は１００μl 又は２００μl)で、４℃で１６時間又は３７℃で１時間、コーティングした。あるいは、ウェルを、５０mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH９．６中５μg/mlガランタス・ニバリス・アグルチニン（Galanthus nivalis agglutinin）（ＧＮＡ）１部で、４℃で１６時間又は３７℃で１時間、コーティングした。ＧＮＡによるコーティングの場合は、プレートをイノテスト（Innotest）ＨＣＶ  ＡｂIIIキット〔インノジェネティックス（Innogenetics）、ズウィジンドレヒト（Zwijndrecht)、ベルギー〕の洗浄液（Washing Solution）４００μl で２回洗浄した。非結合コーティング表面は、１．５〜２部のブロッキング溶液（ＰＢＳ中０．１％カゼイン及び０．１％ＮａＮ3)で、３７℃で１時間又は４℃で１６時間、ブロッキングした。ブロッキング溶液を吸引した。精製したＥ１又はＥ２は１００〜１，０００ng/ml （濃度はＡ＝２８０nmで測定した）に希釈し、あるいはＥ１若しくはＥ２についてスクリーニングすべきカラム画分（実施例５を参照）又は精製していない細胞溶解物（実施例５．１．）中のＥ１若しくはＥ２は、ブロッキング溶液で２０倍希釈し、各ウェルに１部のＥ１又はＥ２溶液を加え、ストレプトアビジン又はＧＮＡでコーティングしたプレート上で、３７℃で１時間インキュベートした。マイクロウェルをイノテスト（Innotest）ＨＣＶ  ＡｂIIIキット〔インノジェネティックス（Innogenetics）、ズウィジンドレヒト（Zwijndrecht)、ベルギー〕の洗浄液１部で３回洗浄した。イノテスト（Innotest）ＨＣＶ  ＡｂIIIキットの試料希釈液（Sample Diluent）で、血清試料は２０倍希釈し、又はモノクローナル抗Ｅ１若しくは抗Ｅ２抗体は２０ng/ml の濃度に希釈し、この溶液１部をＥ１又はＥ２蛋白と３７℃で１時間反応させた。マイクロウェルを、イノテスト（Innotest）ＨＣＶ  ＡｂIIIキット〔インノジェネティックス（Innogenetics）、ズウィジンドレヒト（Zwijndrecht)、ベルギー〕の洗浄液４００μl で５回洗浄した。イノテスト（Innotest）ＨＣＶ  ＡｂIIIキット〔インノジェネティックス（Innogenetics）、ズウィジンドレヒト（Zwijndrecht)、ベルギー〕のコンジュゲート希釈液（Conjugate Diluent)１部で、１／８０，０００希釈したヤギ抗ヒト又は抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ結合二次抗体〔ダコ（DAKO）、グロストルップ（Glostrup）、デンマーク〕で、３７℃で１時間インキュベートし、プレートを、イノテスト（Innotest）ＨＣＶ  ＡｂIIIキット〔インノジェネティックス（Innogenetics）、ズウィジンドレヒト（Zwijndrecht)、ベルギー〕の洗浄液４００μl で３回洗浄後、イノテスト（Innotest）ＨＣＶ  ＡｂIIIキット〔インノジェネティックス（Innogenetics）、ズウィジンドレヒト（Zwijndrecht)、ベルギー〕の基質溶液（Substrate Solution）１部で１００倍希釈した、イノテスト（Innotest）ＨＣＶ  ＡｂIIIキット〔インノジェネティックス（Innogenetics）、ズウィジンドレヒト（Zwijndrecht)、ベルギー〕の基質を２４℃で３０分間添加して得られた発色により、結合した抗体を検出した。
【０１８５】
実施例７：異なる臨床プロフィールを有する患者群の追跡
７．１．抗Ｅ１及び抗Ｅ２抗体の監視
現在のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）診断方法は、ＨＣＶ抗体の存在のスクリーニングと確認のために開発された。このような測定法は、治療の監視や疾患の予後の予知のために有用な情報を与えないようである。しかし、Ｂ型肝炎の場合のように、臨床の場においては抗エンベロープ抗体の検出及び定量がより有用なことがある。Ｃ型肝炎ウイルス疾患の予後の予知マーカーとしての抗Ｅ１抗体力価及び抗Ｅ２抗体力価の使用の可能性を探るために、ＩＦＮ−α治療で長期持続性の応答を示す一連の患者〔治療後少なくとも１年の期間、血液中のトランスアミナーゼレベルは正常であり、ＨＣＶ−ＲＮＡ試験（５’非コード領域のＰＣＲ）が陰性である患者と定義する〕を、応答を示さないか又は治療の最後に再発の生化学的応答を示す患者と比較した。
【０１８６】
ＩＦＮ−α治療で長期持続性の応答を示す一群８名の患者（ＬＴＲ、１〜３．５年追跡、３ａ型が３名と１ｂ型が５名）を、治療に完全には応答しない９名の患者（ＮＲ、１〜４年追跡、１ｂ型が６名、３ａ型が３名）と比較した。１ｂ型（ｖｖＨＣＶ−３９、実施例２．５．参照）と３ａ型（ｖｖＨＣＶ−６２、実施例２．５．参照）のＥ１蛋白を、ワクシニアウイルス系（実施例３及び４を参照）で発現させ、均一になるまで精製した（実施例５）。実施例６に記載のＥＬＩＳＡで、１ｂ型Ｃ型肝炎ウイルスに感染している患者から得られた試料を、精製した１ｂ型Ｅ１蛋白との反応性について試験し、一方、３ａ型感染の試料を抗３ａ型Ｅ１抗体の反応性について試験した。異なる患者に感染しているＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型を、イノリパ（Inno-LiPA ）遺伝子型測定法〔インノジェネティックス（Innogenetics）、ズウィジンドレヒト（Zwijndrecht)、ベルギー〕により測定した。第５図に、インターフェロン治療中及び治療後の追跡期間中の、これらの患者の抗Ｅ１シグナル対ノイズ比を示す。ＬＴＲ症例では抗Ｅ１レベルが一貫して急速に低下している（３症例では完全に陰性化）が、一方、ＮＲ症例の抗Ｅ１レベルはほぼ一定値のままだった。得られた抗Ｅ１データの一部を、平均Ｓ／Ｎ比±ＳＤ（平均抗Ｅ１力価）として第２表に示す。第５、第６、第７及び第８図に示すように、抗Ｅ１力価を、シグナル対ノイズ比から求めることができた。
【０１８７】
２つの群の間には、既に治療の最後の段階で著しい差が認められた。ＬＴＲでは抗Ｅ１抗体力価は６．９倍低下したが、ＮＲではわずかに１．５倍の低下であった。追跡の最後の段階では、持続性応答の患者では抗Ｅ１力価は２２．５倍低下したが、ＮＲではわずかながら上昇した。したがって、これらの結果に基づくと、ＩＦＮ−α治療の監視中の抗Ｅ１抗体レベルの低下は、治療に対する長期の持続性応答と相関した。抗Ｅ１測定法は、ＩＦＮ治療、又はＣ型肝炎疾患の治療一般に対する長期応答の予知に非常に有用でありうる。
【０１８８】
この知見は予測しないことだった。これに反して、本発明者らは、長期応答患者ではＩＦＮ治療中に抗Ｅ１抗体レベルが上昇することを予測していた。Ｂ型肝炎の場合には、抗ＨＢｓＡｇ抗体についての血清変換の結果としてウイルスが消失する。また他の多くのウイルス感染では、抗エンベロープ抗体が生成されるとウイルスが排除される。しかし、本発明の実験では、治療に対する長期応答患者では抗Ｅ１抗体は明らかに低下し、一方、非応答患者ではこの抗体レベルはほぼ一定値を維持した。これらの実験の結果は予測されていなかったが、この明白ではない結果は、ＨＣＶ感染の臨床診断に非常に重要かつ有用である可能性がある。第９、第１０、第１１及び第１２図に示すように、抗Ｅ２レベルは、試験した同じ患者でも非常に異なって挙動し、抗Ｅ１抗体のように明白な力価の低下は観察されなかった。第３５図には、このパイロット試験の全体像を示す。
【０１８９】
第２表から推定できるように、治療に対する不完全応答者に比較して、長期応答者では、治療の開始時に、抗Ｅ１力価は平均で少なくとも２倍高かった。したがって、治療の開始時に抗Ｅ１抗体の力価を測定すること、又は感染の間に患者を監視し、抗Ｅ１力価を測定することは、Ｃ型肝炎の臨床診断の有用なマーカーとなり得る。更に、実施例７．３．に示すように、Ｅ１又はＥ２蛋白のより規定された領域の使用が好ましい可能性がある。
【０１９０】
７．２．より大きな患者コホートにおけるＥ１及びＥ２抗体の解析
このパイロット試験から、本発明者らは、感染が完全に消失した場合、ＨＣＶエンベロープ蛋白に対する抗体は、より通常試験されるＨＣＶ抗原に対する抗体より急速に変化し、Ｅ１抗体が最も激しく変化する、と結論した。したがって、我々は、より多くの１ｂ型及び３ａ型感染ＬＴＲを入れ、さらに対応する（マッチさせた）シリーズのＮＲをコホートに補足して、両群に１４名ずつの患者が含まれるようにした。数名の部分的応答者（ＰＲ）と再発を有する応答者（ＲＲ）も解析した。
【０１９１】
第３６図に、ＬＴＲ群及びＮＲ群の平均Ｅ１抗体（Ｅ１Ａｂ）及びＥ２抗体（Ｅ２Ａｂ）レベルを示し、第４及び第５表に統計解析を示す。この大きなコホートにおいて、ＩＦＮ−α治療前の高いＥ１Ａｂレベルは、ＬＴＲに関連していた（Ｐ＜０．０３）。３ａ型感染患者においては１ｂ型感染患者群よりはるかに高いＥ１抗体レベルが観察された（第３７図）ため、遺伝子型を考慮した（第４表）。１ｂ型感染群では、治療の開始時にもＬＴＲはＮＲよりＥ１抗体レベルが高かった〔Ｐ＜０．０５〕。３ａ型感染ＮＲの数は少ないため、統計解析ができなかった。
【０１９２】
１．５年の追跡期間中、ＬＴＲで監視した抗体レベルのうち、Ｅ１抗体のみが、治療の開始時に測定したレベルに比較して急速に消失した〔治療の終了時、Ｐ＝０．００５８；治療後６月目及び１２月目、それぞれＰ＝０．００４７及びＰ＝０．００５１〕。この消失は、１型感染又は３型感染ＬＴＲにおいて有意であった（平均Ｐ値＜０．０５）。これらのデータにより、Ｅ１Ａｂレベルは回復の初期に急速に低下するという当初の知見を確認した。この特徴は、ウイルスの遺伝子型には依存しないようである。ＮＲ、ＰＲ又はＲＲでは、追跡期間を通して、測定したいずれの抗体においても変化が認められなかった。治療中にＡＬＴレベルが正常化し、ＨＣＶ−ＲＮＡが陰性化して、治療に良好に応答した患者では、持続性応答者（ＬＴＲ）と再発を有する応答者（ＰＰ）との間で著しい差があった。ＬＴＲとは異なり、ＲＲではＥ１抗体レベルの低下を示さず、これは、ＰＣＲ、又はＨＣＶ−ＲＮＡの古典的な検出技術によっても、ＡＬＴレベルの上昇によっても、明らかにされない潜伏性のＨＣＶ感染の存在を示していた。治療中にＲＲ群になお存在しているこの微量のウイルスＲＮＡは、抗Ｅ１  Ｂ細胞の刺激が可能なようであった。したがって、抗Ｅ１の監視は、ＮＲからＬＴＲを区別できるのみでなく、ＲＲからも区別できる可能性がある。
【０１９３】
７．３．Ｅ１蛋白の規定された領域の抗体の監視
ＨＣＶ抗原同定のための分子生物学的アプローチにより、ウイルス診断薬の開発において驚くべき進展がもたらされたが、λｇｔ１１ライブラリーの免疫スクリーニング法では、主に、コア及び非構造領域全体に分散した直鎖のエピトープが得られ、エンベロープ領域の解析のためには、哺乳動物細胞におけるＥ１／Ｅ２領域のクローニング及び発現を待たなければならなかった。このアプローチは、ゲノム構造の解読のかなり前から既にエンベロープ領域にそのエピトープがマッピングされていた、他の多くのウイルス感染とは著しく異なる。このようなエピトープ及び対応する抗体は、しばしば、ワクチンの開発に有用な中和活性を有し、及び／又は臨床的若しくは予知的意義のある診断用検定法の開発を可能にした（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体）。今日ＨＣＶワクチン又はＣ型肝炎疾患の臨床診断及び予知を可能にする検査がないため、免疫監視機構に暴露されたウイルスエンベロープ領域の性状解析は、ＨＣＶの診断と予防における新しい方向付けに大きく貢献しうる。
【０１９４】
ＨＣ−Ｊ１配列（Okamoto ら、1990）に基づき、既に記載された方法（EP-A-0 489 968）に従って、８アミノ酸ずつ重複する２０量体（第３表）を幾つか合成した。ｅｎｖ３５ペプチド（Ｅ１−３５とも呼ぶ）以外は、いずれによっても、約２００のＨＣＶ症例の血清中の抗体を検出できなかった。２つの血清のみが、ｅｎｖ３５ペプチドとわずかに反応した。しかし、実施例６に記載の抗Ｅ１−ＥＬＩＳＡを用いて、以下のように追加のエピトープを発見することができた：実施例６に記載の抗Ｅ１−ＥＬＩＳＡに、５０μg/mlのＥ１ペプチドを、試料希釈液で１／２０倍希釈したヒト血清と混合することで変更を加えた。第１３図に、単一の又は混合物のＥ１ペプチドの存在下での、組換えＥ１（ｖｖＨＣＶ−４０から発現された）蛋白に対するヒト血清の反応性の結果を示す。ライン免疫測定フォーマット（Line Immunoassay format)でストリップ上にコーティングされたＥ１ペプチドを用いることにより、血清の２％のみが検出されたが、半分以上の血清は、組換えＥ１蛋白で試験したとき、同じペプチドにより競合可能な抗Ｅ１抗体を含有していた。精製したＥ１蛋白を注射したＢａｌｂ／ｃマウスから得たマウスモノクローナル抗体の幾つかを、次にＥ１に対する反応性について単一のペプチドと競合させた（第１４図）。ｅｎｖ５３の添加により幾つかの血清のＥ１との反応性を実質的に競合させることができたため、ｅｎｖ５３の領域は明らかに優勢なエピトープを含有しており、ｅｎｖ３１領域に対する抗体も検出された。ｅｎｖ５３及びｅｎｖ３１ペプチドは、直接固相にコーティングしたときは全く反応性を示さなかったため、この知見は驚くべきことであった。
【０１９５】
したがって、本出願人が既に（ＷＯ  ９３／１８０５４中に）記載した方法を用いて、ペプチドを合成した。以下のペプチド：
ペプチドｅｎｖ３５Ａ−ビオチン
ＮＨ2 −ＳＮＳＳＥＡＡＤＭＩＭＨＴＰＧＣＶ−ＧＫビオチン（配列番号５１）
Ｅ１領域のＨＣＶポリ蛋白のアミノ酸２０８〜２２７にわたる
ペプチドビオチン−ｅｎｖ５３（「エピトープＡ」）
ビオチン−ＧＧ−ＩＴＧＨＲＭＡＷＤＭＭＭＮＷＳＰＴＴＡＬ−ＣＯＯＨ（配列番号５２）
Ｅ１領域のＨＣＶポリ蛋白のアミノ酸３１３〜３３２にわたるペプチド１ｂＥ１（「エピトープＢ」）
Ｈ2 Ｎ−ＹＥＶＲＮＶＳＧＩＹＨＶＴＮＤＣＳＮＳＳＩＶＹＥＡＡＤＭＩＭＨＴＰＧＣＧＫ−ビオチン（配列番号５３）
Ｅ１領域のＨＣＶポリ蛋白のアミノ酸１９２〜２２８にわたる
を合成し、ペプチドＥ１ａ−ＢＢ（ビオチン−ＧＧ−ＴＰＴＶＡＴＲＤＧＫＬＰＡＴＱＬＲＲＨＩＤＬＬ、配列番号５４）及びＥ１ｂ−ＢＢ（ビオチン−ＧＧ−ＴＰＴＬＡＡＲＤＡＳＶＰＴＴＴＩＲＲＨＶＤＬＬ、配列番号５５）〔これらは、それぞれ遺伝子型１ａ及び１ｂの配列の同一領域から得られ、また第９回国際ウイルス学会（the IXth international virology meeting)（グラスゴー、1993）で記載された（「エピトープＣ」 ）〕の反応性と比較した。ＨＣＶ血清のパネルの反応性を、エピトープＡ、Ｂ及びＣで試験し、エピトープＢは、ｅｎｖ３５Ａとも比較した（４７個のＨＣＶ陽性血清のうち、８個はエピトープＢで陽性であったが、ｅｎｖ３５Ａと反応するものはなかった）。エピトープＡ、Ｂ及びＣに対する反応性は、実施例６に記載のようにストレプトアビジンでコーティングしたプレートに結合したビオチン化ペプチド（５０μg/ml）に対して、直接、試験した。明らかに、エピトープＡ及びＢが最も反応性が高く、エピトープＣ及びｅｎｖ３５Ａは、はるかに反応性が低かった。完全なＥ１蛋白に対する反応性を監視したのと同じシリーズの患者（実施例７．１．）で、エピトープＡ、Ｂ及びＣに対する反応性を試験した。エピトープＣについてはほとんど反応性が見られず、一方、第１５、第１６、第１７及び第１８図に示すように、エピトープＡ及びＢは大部分の血清と反応した。しかし、最も反応性のエピトープ（エピトープＡ）に対する抗体でも疾患の緩解を予測するようには見えず、一方、抗１ｂＥ１抗体（エピトープＢ）は、ＩＦＮ治療の開始時に、ほとんど長期応答者にのみ存在した。したがって、抗１ｂＥ１（エピトープＢ）抗体及び抗ｅｎｖ５３（エピトープＡ）抗体が、Ｃ型肝炎疾患の予後の有用なマーカーであることが示された。ｅｎｖ５３エピトープは、交差反応性抗体（主要な遺伝子型と交差反応する抗体）の検出に使用することが有利であり、ｅｎｖ５３領域に対する抗体は、血清又は肝臓組織中の普遍的なＥ１抗原の検出に対して非常に有用である可能性がある。ｅｎｖ５３領域を認識するモノクローナル抗体を、ランダムエピトープライブラリーと反応させた。免疫スクリーニングでモノクローナル抗体５Ｅ１Ａ１０と反応した４つのクローンには、配列−ＧＷＤ−が存在していた。配列ＡＷＤは、全てのＨＣＶ変異株のｅｎｖ５３領域に存在する普遍的なＨＣＶ配列に類似しているため、ｅｎｖ５３交差反応性のマウスのエピトープの基本的な配列を含有すると考えられる。ｅｎｖ３１も、アミノ末端配列−ＹＱＶＲＮＳＴＧＬ−（配列番号９３）中にエピトープを含有する可能性のある可変領域を明らかに含有し、診断に有用でありうる。第３表に示したｅｎｖ３１又はＥ１−３１は、ペプチド１ｂＥ１の一部である。ペプチドＥ１−３３及びＥ１−５１もまた、マウス抗体とある程度反応し、ペプチドＥ１−５５〔可変領域６（Ｖ６）を含有する；アミノ酸３２９〜３３６位にわたる〕もまた、患者血清のあるものと反応した。
【０１９６】
抗Ｅ２抗体は、抗Ｅ１抗体と明らかに異なるパターンをたどり、特に治療に対する長期応答を有する患者では異なっていた。したがって、抗エンベロープ抗体の低下は、組換えＥ１／Ｅ２蛋白を用いる測定法では、単一の抗Ｅ１蛋白又は抗Ｅ２蛋白を用いる場合のようには効率的に測定できなかったことは明らかである。両抗体を同時に測定する測定法では、抗Ｅ２応答は明らかに抗Ｅ１応答を不明瞭にしてしまうであろう。したがって、単一のＥ１蛋白及びＥ２蛋白に対する抗エンベロープ抗体を試験する能力が有用であることが示された。
【０１９７】
７．４．抗Ｅ２抗体のマッピング
２４個の抗Ｅ２ＭＡｂのうち、３個のみが組換えＥ２に対する反応性についてペプチドによる競合を受け得、そのうち２個は、ＨＶＲＩ領域（ペプチドＥ２−６７及びＥ２−６９、エピトープＡと呼ぶ）と反応し、エピトープを認識した１個は、ペプチドＥ２−１３Ｂ（エピトープＣ）による競合を受けた。大多数のマウス抗体は、コンフォメーション性抗Ｅ２エピトープを認識した（第１９図）。ＨＶＲＩ（エピトープＡ）、及びＨＶＲII（エピトープＢ）（これは少ない）、及び３番目の直鎖エピトープ領域（ペプチドＥ２−２３、Ｅ２−２５又はＥ２−２７による競合を受ける、エピトープＥと呼ぶ）、及び４番目の直鎖エピトープ領域（ペプチドＥ２−１７Ｂによる競合を受ける、エピトープＤ）に対するヒトの応答も、しばしば観察できたが、大部分の血清はコンフォメーション性エピトープと反応した（第２０図）。これらのコンフォメーション性エピトープは、その相対的位置により以下のように分類されうる：コンフォメーション性エピトープを認識する、ハイブリドーマ１５Ｃ８Ｃ１、１２Ｄ１１Ｆ１、９Ｇ３Ｅ６、８Ｇ１０Ｄ１Ｈ９、１０Ｄ３Ｃ４、４Ｈ６Ｂ２、１７Ｆ２Ｃ２、５Ｈ６Ａ７、１５Ｂ７Ａ２の上澄液中のＩｇＧ抗体を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製し、得られたＩｇＧを１mg/ml にし、ビオチン存在下でホウ酸緩衝液中でビオチン化した。ゲル濾過クロマトグラフィーにより、ビオチン化抗体を遊離のビオチンから分離した。プールしたビオチン化抗体画分を、１００〜１０，０００倍希釈した。固相に結合したＥ２蛋白を、非ビオチン化競合抗体の１００倍量の存在下でビオチン化ＩｇＧにより検出し、次にアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンにより検出した。
【０１９８】
競合の百分率を第６表に示す。これらの結果に基づき、４つのコンフォメーション性抗Ｅ２エピトープ領域（エピトープＦ、Ｇ、Ｈ及びＩ）を表すことができた（第３８図）。あるいは、これらのＭＡｂは、本試験で使用したペプチドでは表されない突然変異直鎖エピトープを認識する可能性がある。モノクローナル抗体４Ｈ６Ｂ２及び１０Ｄ３Ｃ４は、１６Ａ６Ｅ７の反応性と競合したが、１６Ａ６Ｅ７とは異なり、ペプチドＥ２−１３Ｂを認識しなかった。これらのＭＡｂは、同じ直鎖エピトープ（エピトープＣ）の変異株を認識するか、あるいは立体障害があるか又はＥ２−１３Ｂ領域（エピトープＨ）への１６Ａ６Ｅ７の結合後コンフォメーションを変化させるコンフォメーション性エピトープを認識する可能性がある。
【０１９９】
実施例８：Ｅ１グリコシル化突然変異体
８．１．緒言
哺乳動物細胞から発現される、ｖｖＨＣＶ１０ＡにコードされるＥ１蛋白及びｖｖＨＣＶ４１〜４４にコードされるＥ２蛋白は、それぞれ６個及び１１個の炭水化物部分を含有する。これは、ｖｖＨＣＶ１０Ａ感染又はｖｖＨＣＶ４４感染ＲＫ１３細胞の溶解物を、溶解物中の蛋白（Ｅ１を含む）が部分的に脱グリコシル化されるように、低下する濃度のグリコシダーゼ〔ＰＮＧａｓｅＦ又はエンドグリコシダーゼＨ、（ベーリンガー・マンハイム・ビオケミカ（Boehringer Mannhein Biochemica）、製造業者の取り扱い説明書による〕とインキュベートすることにより、示すことができた（それぞれ第３９及び第４０図）。
【０２００】
幾つかのグリコシル化部位の欠如した突然変異体は、免疫学的反応性が改良されたエンベロープ蛋白の選択を可能にした。例えばＨＩＶについては、幾つかの選択された糖付加モチーフが欠如したｇｐ１２０蛋白が、診断的目的及びワクチンとしての目的に特に有用であることが見いだされた。Ａ／ホンコン／３／６８（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザウイルスのエスケープ突然変異体の血球凝集素蛋白中の新しいオリゴ糖側鎖の付加は、中和モノクローナル抗体との反応性を妨害する（Skehelら、1984）。インフルエンザ血球凝集素蛋白中に、部位特異的突然変異誘発により新規なグリコシル化部位を導入すると、劇的な抗原性変化が観察され、炭水化物が抗原性の調節物質であることが示唆された（Gallagher ら、1988）。別の分析では、フレンドマウス白血病ウイルスの表面蛋白ｇｐ７０の８個の炭水化物付加モチーフを欠失させた。この突然変異のうち７つはウイルス感染性に影響を与えなかったが、アミノ末端に関して４番目のグリコシル化シグナルの突然変異により、非感染性表現型が得られた（Kaymanら、1991）。更に、Ｎ−結合炭水化物鎖の付加は、折りたたみ中間体の安定化、したがって効率的折りたたみ、正しくない折りたたみ及び小胞体での分解の防止、オリゴマー化、生物学的活性、及び糖蛋白の輸送に重要であることが、当該分野で公知である（Roseら、1988；Domsら、1993；Helenius、1994の総説を参照）。
【０２０１】
ＨＣＶ遺伝子型の、異なるエンベロープ蛋白配列の整列から、ＨＣＶサブタイプ１ｂＥ１蛋白上の６個のグリコシル化部位は、ある（サブ）タイプでは幾つかは欠如しているため、正しい折りたたみと反応性のために必ずしも全てが必要ではない、と推測されうる。１ｂ、６ａ、７、８及び９型に存在する４番目の炭水化物モチーフ（Ａｓｎ２５１上）は、今日知られている他の全ての型では欠如している。この糖付加モチーフは、突然変異させて、反応性が改善された１ｂＥ１型蛋白を生成しうる。また、２ｂ型配列は、Ｖ５領域（Ａｓｎ２９９上）に余分のグリコシル化部位を示す。遺伝子型２ｃに属する単離株Ｓ８３は、Ｖ１領域（Ａｓｎ上）の最初の炭水化物モチーフさえ欠如しているが、これは他の全ての単離株には存在している（Stuyver 、1994）。しかし、完全に保存された糖付加モチーフの中でも、炭水化物の存在は、折りたたみには必要でない可能性もあり、免疫監視機構を逃れるのに一役買っている可能性がある。したがって、正しい折りたたみ（及び反応性）に必要とされない炭水化物付加モチーフの同定は明白ではなく、各突然変異体を分析し、反応性について試験しなければならない。グリコシル化モチーフ（ＮＸＳ又はＮＸＴ配列）の突然変異誘発は、これらのコドンが、Ｎの場合はＮと異なるアミノ酸をコードし、及び／又はＳの場合及びＴの場合はＳ又はＴと異なるアミノ酸をコードするように、Ｎ、Ｓ、又はＴのコドンを突然変異させることにより達成されうる。あるいは、ＮＰＳ又はＮＰＴが炭水化物によって度々修飾されるわけではないことが知られているため、Ｘ位をＰに突然変異させてもよい。どの炭水化物付加モチーフが折りたたみ及び／又は反応性に必要で、どれが必要でないかを確立した後、そのような突然変異の組合せを作成してもよい。
【０２０２】
８．２．Ｅ１蛋白の突然変異誘発
全ての突然変異はクローンＨＣＣｌ１０Ａ（配列番号５）のＥ１配列上に行なった。第１回目のＰＣＲを、ワクシニア１１Ｋ後期プロモーターの上流に位置するＧＰＴ配列をターゲットとしたセンスプライマー「ＧＰＴ」（第７表を参照）と、突然変異誘発を得るために目的の塩基変化を含有するアンチセンスプライマー（ＧＬＹ＃と命名、＃はグリコシル化部位の数を示す。第４１図を参照）とを使用して行なった。６つのＧＬＹ＃プライマー（それぞれ特定のグリコシル化部位に対して特異的）を以下のように設計した：
−  Ｎ−グリコシル化Ａｓｎをコードするコドン（ＡＡＣ又はＡＡＴ）を、Ｇｌｎコドン（ＣＡＡ又はＣＡＧ）に変更。アスパラギンに非常に似ていることからグルタミンを選択した〔２つのアミノ酸は共に中性であり、非極性残基を含有する。グルタミンの側鎖の方が長い（−ＣＨ2 −基が１つ余分にある）〕。
【０２０３】
−  新しいユニーク（単一）又は稀な制限酵素部位（例えば、Ｅ１Ｇｌｙ５の第２のＳｍａＩ部位）を作成するために、グリコシル化部位の下流のコドンの１つ又は幾つかに、サイレント変異を導入。アミノ酸配列を変更することなく、この突然変異は、突然変異配列を元々のＥ１配列（ｐｖＨＣＶ−１０Ａ）から又は互いに区別する方法を与える（第４１図）。この追加の制限部位は、新しいハイブリッド（２重、３重、など）グリコシル化突然変異体の構築にも有用でありうる。
【０２０４】
−  最初のミスマッチのヌクレオチドの５’に１８ヌクレオチドを、そして３’末端に１２〜１６ヌクレオチドを伸長させる。第７表に、Ｎ−結合グリコシル化部位の配列と重複する６つのＧＬＹ＃プライマーの配列を示す。
【０２０５】
部位特異的突然変異誘発のために「ミスプライミング（mispriming）」又は「重複伸長（overlap extension ）」（Horton、1993）を使用した。この考え方を、第４２と第４３図に例示する。まず、２つの別個の断片を、各突然変異部位について標的遺伝子から増幅した。５’末端から得られたＰＣＲ生成物（生成物ＧＬＹ＃）を、５’センスＧＰＴプライマー（第７表を参照）、及び各３’アンチセンスＧＬＹ＃プライマーで増幅した。第２の断片（生成物ＯＶＲ＃）を、３’アンチセンスＴＫR プライマーと、各５’センスプライマー（ＯＶＲ＃プライマー、第７表、第４３図を参照）で増幅した。
【０２０６】
ＯＶＲ＃プライマーは、ＧＬＹ＃プライマー配列の一部を標的とする。したがって、２群のＰＣＲ生成物は、同一配列の重複領域を共有する。これらの中間体生成物を混合し（ＧＬＹ−１とＯＶＲ−１、ＧＬＹ−２とＯＶＲ−２など）、高温で融解させ、再アニーリングさせると、生成物ＧＬＹ＃の最初のセンス鎖は、生成物ＯＶＲ＃のアンチセンス鎖と、２つの鎖が互いのプライマーとして作用するようにアニーリングすることができる（この逆もある）（第４２．Ｂ．図を参照）。アニーリングした重複部分を２回のＰＣＲサイクル中、Ｔａｑポリメラーゼで伸長すると、全長突然変異体分子Ｅ１ＧＬＹ＃が生成し、これはグリコシル化部位数＃を破壊する突然変異を有していた。２つの内部ネストプライマー（nested primer)の共通のセットを用いて、３回目のＰＣＲで、クローニングのための充分量のＥ１ＧＬＹ＃生成物を生成した。これら２つの新規なプライマーは、それぞれワクシニア１１Ｋプロモーターの３’部位（センスＧＰＴ−２プライマー）と、ワクシニアのチミジンキナーゼ遺伝子座の５’末端（アンチセンスＴＫR −２プライマー、第７表を参照）が重複していた。全てのＰＣＲ条件は、Stuyver ら（1993）が記載したとおりに行った。
【０２０７】
これらの各ＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断して、元々のＥ１配列（ｐｖＨＣＶ−１０Ａ）を含有するＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断したワクシニアウイルスにクローン化した。
【０２０８】
選択されたクローンを、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断により挿入体の長さについて、及び新しい各制限部位の存在について分析した。突然変異した部位を重複している配列を、２本鎖配列決定により確認した。
【０２０９】
８．３．Ｅ１グリコシル化突然変異体の解析
実施例８．２に記載の突然変異Ｅ１配列を含有する６つのプラスミドから出発して、実施例２．５に記載の野性型ワクシニアウイルスとの組換えを行って、組換えワクシニアウイルスを作成した。簡単に説明すると、サブコンフルエントなＲＫ１３細胞の１７５cm2 フラスコを、突然変異Ｅ１配列を有する６つの組換えワクシニアウイルスで、及びｖｖＨＣＶ−１０Ａ（非突然変異Ｅ１配列を有する）と野性型ワクシニアウイルスとで、感染させた。感染の２４時間後、細胞を溶解して、実施例４に記載のウェスタンブロッティングで分析した（第４４Ａ図を参照）。全ての突然変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、元々のＥ１蛋白より速い移動度を示し（約２〜３kDa 小さい分子量に相当する）、これにより炭水化物部分が１つ付加されなかったことを確認した。また、組換えウイルスをＰＣＲと制限酵素分析で解析して、異なる突然変異体の同一性を確認した。第４４Ｂ図に、全ての突然変異体（第４１図に記載）が予測された追加の制限部位を含有することを示す。細胞溶解物の別の部分を、ＥＬＩＳＡにより異なる突然変異体の反応性を試験するために使用した。溶解物を２０倍希釈し、実施例６に記載のようにレクチンＧＮＡでコーティングしたマイクロウェルプレートに添加した。捕捉された（突然変異）Ｅ１糖蛋白を、実施例６に記載の２４名のＨＣＶ感染患者の２０倍希釈血清と反応させた。６つの突然変異体及びＥ１のシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）値（ＧＬＹ＃のＯＤ／野性型のＯＤ）を、第８表に示す。この表にはまた、ＧＬＹ＃及びＥ１蛋白のＳ／Ｎ値の比を示す。患者血清との反応性の比較のために異なる突然変異体の細胞溶解物を使用するアプローチにより、反応性レベルではなく異なる発現レベルの結果が観察される可能性があることを理解すべきである。このような困難さは、実施例５に記載のように異なる突然変異体を精製し、全ての異なるＥ１蛋白の同一量を試験することにより解決できた。しかし、第５表に示した結果は、第１（ＧＬＹ１）、第３（ＧＬＹ３）、及び第６（ＧＬＹ６）のグリコシル化モチーフの除去により、幾つかの血清の反応性が低下するが、第２と第５の部位の除去ではそうではないことを、既に示している。ＧＬＹ４の除去は、幾つかの血清の反応性を改良するようであった。これらのデータは、異なる患者は、本発明のグリコシル化突然変異体に対して異なって反応することを示す。すなわち、このような突然変異体Ｅ１蛋白は、ＨＣＶ疾患の診断（スクリーニング、確認、予知など）と予防に有用でありうる。
【０２１０】
実施例９：グリコシル化欠損酵母中でのＨＣＶのＥ２蛋白の発現
クローンＨＣＣＬ４１に対応するＥ２配列に、α−接合因子プレ／プロシグナル配列を付加し、酵母発現ベクターに挿入した。この構築物で形質転換したＳ・セレビシエ（S. cerevisiae)細胞は、増殖培地中にＥ２蛋白を分泌した。S. cerevisiae 株中でのこのような構築物の発現の際に、ほとんどのグリコシル化部位は、高マンノース型グリコシル化で修飾されていたことが観察された（第４５図）。このため、不均一性のレベルが高くなりすぎ、反応性が妨害され、このことはワクチンにも診断目的にも不適であった。この問題を解決するために、バナジン酸耐性クローンの選択により、改変されたグリコシル化経路を有する S. cerevisiae突然変異体を作成した。このクローンを、分子量の分析及び糖蛋白インベルターゼの不均一性の分析により、改変グリコシル化経路について解析した。これにより、異なるグリコシル化欠損 S. cerevisiae突然変異体が同定できた。次に、選択された突然変異体の幾つかでＥ２蛋白を発現させ、実施例４に記載のウェスタンブロッティング上で、実施例７に記載のモノクローナル抗体と反応させた（第４６図）。
【０２１１】
実施例１０．一般的有用性
これら結果は、ＨＣＶエンベロープ蛋白とヒト患者血清との高い反応性を得るには、良好な発現系のみならず良好な精製プロトコールが必要であることを示している。これは、蛋白の本来の折りたたみの保存を保証する本発明の適正なＨＣＶエンベロープ蛋白発現系及び／又は精製プロトコールを用い、夾雑蛋白の排除を保証し、コンフォメーション（したがって、ＨＣＶエンベロープ蛋白の反応性）を保持する本発明の精製プロトコールを用いることにより達成される。診断的スクリーニング測定法に必要な精製ＨＣＶエンベロープ蛋白の量は、１年間に数グラムの範囲である。ワクチンとして使用するには、更に多量のエンベロープ蛋白が必要であろう。したがって、最適の発現構築物の選択及び小規模のスケールアップにはワクシニアウイルス系が使用でき、数種の酵母株から発現させる場合、高マンノース炭水化物を含有する単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白の大規模発現と精製が達成されうる。例えば、Ｂ型肝炎の場合は、哺乳動物細胞からのＨＢｓＡｇの製造は、酵母由来のＢ型肝炎ワクチンと比較してはるかに費用がかさむ。
【０２１２】
本発明に開示した精製方法は、「ウイルスエンベロープ蛋白」一般にも使用できる。例としては、フラビウイルス、新たに発見されたＧＢ−Ａ、ＧＢ−Ｂ及びＧＢ−Ｃ肝炎ウイルス、ペスチウイルス〔例えばウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ブタコレラウイルス（ＨＣＶ）、ボーダー病ウイルス（Border Disease Virus）（ＢＤＶ）〕、そしてこれらより少し関連は少ないがＢ型肝炎ウイルスのようなウイルス（主にＨＢｓＡｇの精製）から得られるものがある。
【０２１３】
本発明のエンベロープ蛋白精製方法は、詳細な説明の項に記載したように、下等又は高等真核生物細胞あるいは原核生物で、細胞内及び細胞外に発現される蛋白について使用することができる。
【０２１４】
【表３】
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【０２１５】
【表４】
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【０２１６】
【表５】
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【０２１７】
【表６】
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【０２１８】
【表７】
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【０２１９】
【表８】
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【０２２０】
【表９】
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【０２２１】
【表１０】
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【０２２２】
【表１１】
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【０２２３】
【表１２】
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【０２２４】
【表１３】
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【０２２５】
【表１４】
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【０２２６】
【表１５】
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【０２２７】
【表１６】
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【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】プラスミドｐｇｐｔＡＴＡ１８の制限地図。
【図２】プラスミドｐｇｓＡＴＡ１８の制限地図。
【図３】プラスミドｐＭＳ６６の制限地図。
【図４】プラスミドｐｖＨＣＶ−１１Ａの制限地図。
【図５】ＩＦＮ治療に対する無応答者の抗Ｅ１レベル。
【図６】ＩＦＮ治療に対する応答者の抗Ｅ１レベル。
【図７】ＩＦＮ治療に完全に応答した患者の抗Ｅ１レベル。
【図８】ＩＦＮ治療に対する不完全応答者の抗Ｅ１レベル。
【図９】ＩＦＮ治療に対する無応答者の抗Ｅ２レベル。
【図１０】ＩＦＮ治療に対する応答者の抗Ｅ２レベル。
【図１１】ＩＦＮ治療に対する不完全応答者の抗Ｅ２レベル。
【図１２】ＩＦＮ治療に対する完全応答者の抗Ｅ２レベル。
【図１３】ペプチドと競合したヒト抗Ｅ１反応性。
【図１４】抗Ｅ１モノクローナル抗体の、ペプチドとの反応性の競合。
【図１５】ＩＦＮ治療に対する無応答者の抗Ｅ１（エピトープ１）レベル。
【図１６】ＩＦＮ治療に対する応答者の抗Ｅ１（エピトープ１）レベル。
【図１７】ＩＦＮ治療に対する無応答者の抗Ｅ１（エピトープ２）レベル。
【図１８】ＩＦＮ治療に対する応答者の抗Ｅ１（エピトープ２）レベル。
【図１９】抗Ｅ２モノクローナル抗体の、ペプチドとの反応性の競合。
【図２０】ペプチドと競合したヒト抗Ｅ２反応性。
【図２１Ａ】本発明の核酸配列。本発明のＥ１又はＥ２蛋白をコードする核酸配列は、配列表に示すように、各Ｅ１又はＥ２蛋白のアミノ酸配列に翻訳されうる（配列番号３〜１３、２１〜３１、３５及び４１〜４９は、残基番号１から開始する読み枠で翻訳され、配列番号３７〜３９は、残基番号２から開始する読み枠で翻訳される）。
【図２１Ｂ】本発明の核酸配列。本発明のＥ１又はＥ２蛋白をコードする核酸配列は、配列表に示すように、各Ｅ１又はＥ２蛋白のアミノ酸配列に翻訳されうる（配列番号３〜１３、２１〜３１、３５及び４１〜４９は、残基番号１から開始する読み枠で翻訳され、配列番号３７〜３９は、残基番号２から開始する読み枠で翻訳される）。
【図２１Ｃ】本発明の核酸配列。本発明のＥ１又はＥ２蛋白をコードする核酸配列は、配列表に示すように、各Ｅ１又はＥ２蛋白のアミノ酸配列に翻訳されうる（配列番号３〜１３、２１〜３１、３５及び４１〜４９は、残基番号１から開始する読み枠で翻訳され、配列番号３７〜３９は、残基番号２から開始する読み枠で翻訳される）。
【図２１Ｄ】本発明の核酸配列。本発明のＥ１又はＥ２蛋白をコードする核酸配列は、配列表に示すように、各Ｅ１又はＥ２蛋白のアミノ酸配列に翻訳されうる（配列番号３〜１３、２１〜３１、３５及び４１〜４９は、残基番号１から開始する読み枠で翻訳され、配列番号３７〜３９は、残基番号２から開始する読み枠で翻訳される）。
【図２１Ｅ】本発明の核酸配列。本発明のＥ１又はＥ２蛋白をコードする核酸配列は、配列表に示すように、各Ｅ１又はＥ２蛋白のアミノ酸配列に翻訳されうる（配列番号３〜１３、２１〜３１、３５及び４１〜４９は、残基番号１から開始する読み枠で翻訳され、配列番号３７〜３９は、残基番号２から開始する読み枠で翻訳される）。
【図２１Ｆ】本発明の核酸配列。本発明のＥ１又はＥ２蛋白をコードする核酸配列は、配列表に示すように、各Ｅ１又はＥ２蛋白のアミノ酸配列に翻訳されうる（配列番号３〜１３、２１〜３１、３５及び４１〜４９は、残基番号１から開始する読み枠で翻訳され、配列番号３７〜３９は、残基番号２から開始する読み枠で翻訳される）。
【図２１Ｇ】本発明の核酸配列。本発明のＥ１又はＥ２蛋白をコードする核酸配列は、配列表に示すように、各Ｅ１又はＥ２蛋白のアミノ酸配列に翻訳されうる（配列番号３〜１３、２１〜３１、３５及び４１〜４９は、残基番号１から開始する読み枠で翻訳され、配列番号３７〜３９は、残基番号２から開始する読み枠で翻訳される）。
【図２１Ｈ】本発明の核酸配列。本発明のＥ１又はＥ２蛋白をコードする核酸配列は、配列表に示すように、各Ｅ１又はＥ２蛋白のアミノ酸配列に翻訳されうる（配列番号３〜１３、２１〜３１、３５及び４１〜４９は、残基番号１から開始する読み枠で翻訳され、配列番号３７〜３９は、残基番号２から開始する読み枠で翻訳される）。
【図２１Ｉ】本発明の核酸配列。本発明のＥ１又はＥ２蛋白をコードする核酸配列は、配列表に示すように、各Ｅ１又はＥ２蛋白のアミノ酸配列に翻訳されうる（配列番号３〜１３、２１〜３１、３５及び４１〜４９は、残基番号１から開始する読み枠で翻訳され、配列番号３７〜３９は、残基番号２から開始する読み枠で翻訳される）。
【図２１Ｊ】本発明の核酸配列。本発明のＥ１又はＥ２蛋白をコードする核酸配列は、配列表に示すように、各Ｅ１又はＥ２蛋白のアミノ酸配列に翻訳されうる（配列番号３〜１３、２１〜３１、３５及び４１〜４９は、残基番号１から開始する読み枠で翻訳され、配列番号３７〜３９は、残基番号２から開始する読み枠で翻訳される）。
【図２１Ｋ】本発明の核酸配列。本発明のＥ１又はＥ２蛋白をコードする核酸配列は、配列表に示すように、各Ｅ１又はＥ２蛋白のアミノ酸配列に翻訳されうる（配列番号３〜１３、２１〜３１、３５及び４１〜４９は、残基番号１から開始する読み枠で翻訳され、配列番号３７〜３９は、残基番号２から開始する読み枠で翻訳される）。
【図２１Ｌ】本発明の核酸配列。本発明のＥ１又はＥ２蛋白をコードする核酸配列は、配列表に示すように、各Ｅ１又はＥ２蛋白のアミノ酸配列に翻訳されうる（配列番号３〜１３、２１〜３１、３５及び４１〜４９は、残基番号１から開始する読み枠で翻訳され、配列番号３７〜３９は、残基番号２から開始する読み枠で翻訳される）。
【図２２】ｖｖＨＣＶ３９（１ｂ型）、ｖｖＨＣＶ４０（１ｂ型）、ｖｖＨＣＶ６２（３ａ型）、及びｖｖＨＣＶ６３（５ａ型）に感染した細胞溶解物の４つの異なるＥ１精製物の、レンチルレクチンクロマトグラフィー溶出画分から得られたＥＬＩＳＡ結果。
【図２３】第２２図に示した値に基づく、４つの異なるＥ１構築物の、レンチルレクチンクロマトグラフィーから得られた溶出プロフィール。
【図２４】第  ｖｖＨＣＶ３９（１ｂ型）、ｖｖＨＣＶ４０（１ｂ型）、ｖｖＨＣＶ６２（３ａ型）、及びｖｖＨＣＶ６３（５ａ型）に感染した細胞溶解物の４つの異なるＥ１精製物の、ゲル濾過クロマトグラフィー後に得られた画分のＥＬＩＳＡ結果。
【図２５】１ｂ型（１）、３ａ型（２）及び５ａ（３）型（それぞれｖｖＨＣＶ３９、ｖｖＨＣＶ６２及びｖｖＨＣＶ６３に感染したＲＫ１３細胞からのもの；レンチルレクチンで精製し、実施例５．２〜５．３のように還元した）のＥ１蛋白の精製物、及び標準物質（４）から得られたプロフィール。「１」、「２」、「３」と記したピークは、純粋なＥ１蛋白ピークを示す（第２４図を参照、主に画分２６〜３０にＥ１反応性）。
【図２６】Ｅ１ｖｖＨＣＶ４０（１ｂ型）（レーン１）、第２５図に示す画分１０〜１７を示すｖｖＨＣＶ４０のゲル濾過のプール１（レーン２）、第２５図に示す画分１８〜２５を示すｖｖＨＣＶ４０のゲル濾過のプール２（レーン３）及びＥ１プール（画分２６〜３０）（レーン４）の未処理溶解物の、実施例４に記載したＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色。
【図２７】Ｅ１構築物３９（１ｂ型）及び６２（３ａ型）のゲル濾過の画分のストレプトアビジン−アルカリホスファターゼブロット。蛋白はＮＥＭ−ビオチンで標識した。レーン１：開始ゲル濾過構築物３９、レーン２：画分２６構築物３９、レーン３：画分２７構築物３９、レーン４：画分２８構築物３９、レーン５：画分２９構築物３９、レーン６：画分３０構築物３９、レーン７：画分３１構築物３９、レーン８：分子量マーカー、レーン９：開始ゲル濾過構築物６２、レーン１０：画分２６構築物６２、レーン１１：画分２７構築物６２、レーン１２：画分２８構築物６２、レーン１３：画分２９構築物６２、レーン１４：画分３０構築物６２、レーン１５：画分３１構築物６２。
【図２８】第２６図と同一条件下で実施したｖｖＨＣＶ−３９（Ｅ１ｓ、１ｂ型）及びｖｖＨＣＶ−６２（Ｅ１ｓ、３ａ型）のゲル濾過画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色。レーン１：開始ゲル濾過構築物３９、レーン２：画分２６構築物３９、レーン３：画分２７構築物３９、レーン４：画分２８構築物３９、レーン５：画分２９構築物３９、レーン６：画分３０構築物３９、レーン７：画分３１構築物３９、レーン８：分子量マーカー、レーン９：開始ゲル濾過構築物６２、レーン１０：画分２６構築物６２、レーン１１：画分２７構築物６２、レーン１２：画分２８構築物６２、レーン１３：画分２９構築物６２、レーン１４：画分３０構築物６２、レーン１５：画分３１構築物６２。
【図２９】精製操作の完全な概要を与える、抗Ｅ１マウスモノクローナル抗体５Ｅ１Ａ１０によるウェスタンブロット解析。レーン１：粗溶解物、レーン２：レンチルクロマトグラフィーのフロースルー（flow through）、レーン３：レンチルクロマトグラフィー後のエンピゲンＢＢによる洗浄物、レーン４：レンチルクロマトグラフィーの溶出物、レーン５：レンチル溶出物の濃縮中のフロースルー（flow through）、レーン６：サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過）後のＥ１のプール。
【図３０】ｖｖＨＣＶ４４に感染したＲＫ１３細胞からのＥ２蛋白のレンチルレクチンクロマトグラフィーのＯＤ280 プロフィール（連続の線）。点線は、ＥＬＩＳＡで検出したＥ２反応性を示す（実施例６のように）。
【図３１Ａ】ｖｖＨＣＶ４４に感染したＲＫ１３細胞からのＥ２蛋白プールのレンチルレクチンゲル濾過クロマトグラフィーのＯＤ280 プロフィール（連続の線）。Ｅ２プールは、直ちにゲル濾過カラムに適用した（非還元条件）。点線は、ＥＬＩＳＡで検出したＥ２反応性を示す（実施例６のように）。
【図３１Ｂ】ｖｖＨＣＶ４４に感染したＲＫ１３細胞からのＥ２蛋白プールのレンチルレクチンゲル濾過クロマトグラフィーのＯＤ280 プロフィール（連続の線）。Ｅ２プールは、実施例５．３に示すように還元し、保護した（還元条件）。点線は、ＥＬＩＳＡで検出したＥ２反応性を示す（実施例６のように）。
【図３２】第３１Ｂ図に示す還元条件下でゲル濾過後の、ｖｖＨＣＶ４４から発現されたＥ２蛋白のＮｉ2+−ＩＭＡＣクロマトグラフィー及びＥＬＩＳＡ反応性。
【図３３】第３２図に示すＮｉ2+−ＩＭＡＣクロマトグラフィーの、２００mMイミダゾール溶出工程（レーン２）と３０mMイミダゾール洗浄（レーン１）により回収された、精製されたＥ２蛋白０．５μg のＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色。
【図３４】イミダゾールを除去することを目的とした、第３３図に示す２００mMイミダゾールにより回収した精製Ｅ２蛋白の脱塩工程のＯＤプロフィール。
【図３５Ａ】治療中及び治療後６〜１２カ月間にわたり追跡した、ＬＩＡスキャン（LIA scan）法で測定した、ＮＲとＬＴＲの異なるＨＣＶ抗原（コア１、コア２、Ｅ２ＨＣＶＲ、ＮＳ３）に対する抗体レベル。平均値は、白四角の曲線で示してある。
【図３５Ｂ】治療中及び治療後６〜１２カ月間にわたり追跡した、ＬＩＡスキャン（LIA scan）法で測定した、ＮＲとＬＴＲの異なるＨＣＶ抗原（ＮＳ４、ＮＳ５、Ｅ１及びＥ２）に対する抗体レベル。平均値は、白四角の曲線で示してある。
【図３６】ＬＴＲ群及びＮＲ群の平均Ｅ１抗体（Ｅ１Ａｂ）及びＥ２抗体（Ｅ２Ａｂ）レベル。
【図３７】無応答者（ＮＲ）及び長期応答者（ＬＴＲ）の１ｂ型及び３ａ型の平均Ｅ１抗体（Ｅ１Ａｂ）レベル。
【図３８】抗Ｅ２モノクローナル抗体の地図上の相対的位置。
【図３９】ＨＣＶのＥ１エンベロープ蛋白の部分的グリコシル化。製造業者の指示に従い、ｖｖＨＣＶ１０Ａ感染ＲＫ１３細胞の溶解物を、異なる濃度のグリコシダーゼとインキュベートした。右のパネル：グリコペプチダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）。左のパネル：エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）。
【図４０】ＨＣＶのＥ２エンベロープ蛋白の部分的グリコシル化。製造業者の指示に従い、ｖｖＨＣＶ６４感染（Ｅ２）及びｖｖＨＣＶ４１感染（Ｅ２ｓ）ＲＫ１３細胞の溶解物を、異なる濃度のグリコペプチダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）とインキュベートした。
【図４１】ＨＣＶのＥ１糖蛋白のインビトロ突然変異誘発。突然変異した配列の地図と、新しい制限部位の作成。
【図４２Ａ】ＨＣＶのＥ１糖蛋白のインビトロ突然変異誘発（第１部）。ＰＣＲ増幅の第１段階。
【図４２Ｂ】ＨＣＶのＥ１糖蛋白のインビトロ突然変異誘発（第２部）。重複伸長とネストＰＣＲ（nested PCR）。
【図４３】ＨＣＶのＥ１糖蛋白のインビトロ突然変異誘発。増幅の第１段階で合成されたＰＣＲで突然変異させた断片（ＧＬＹ−＃及びＯＶＲ−＃）の地図。
【図４４Ａ】ＨｅＬａ細胞（左）及びＲＫ１３細胞（右）中で発現されたＥ１糖蛋白突然変異体のウェスタンブロット解析。レーン１：野性型ＶＶ（ワクシニアウイルス）、レーン２：元々のＥ１蛋白（ｖｖＨＣＶ−１０Ａ）、レーン３：Ｅ１突然変異体Ｇｌｙ−１（ｖｖＨＣＶ−８１）、レーン４：Ｅ１突然変異体Ｇｌｙ−２（ｖｖＨＣＶ−８２）、レーン５：Ｅ１突然変異体Ｇｌｙ−３（ｖｖＨＣＶ−８３）、レーン６：Ｅ１突然変異体Ｇｌｙ−４（ｖｖＨＣＶ−８４）、レーン７：Ｅ１突然変異体Ｇｌｙ−５（ｖｖＨＣＶ−８５）、レーン８：Ｅ１突然変異体Ｇｌｙ−６（ｖｖＨＣＶ−８６）。
【図４４Ｂ】ＰＣＲ増幅／制限切断によるＥ１グリコシル化突然変異体ワクシニアウイルスの分析。レーン１：Ｅ１（ｖｖＨＣＶ−１０Ａ）、ＢｓｐＥＩ、レーン２：Ｅ１．Ｇｌｙ−１（ｖｖＨＣＶ−８１）、ＢｓｐＥＩ、レーン４：Ｅ１（ｖｖＨＣＶ−１０Ａ）、ＳａｃＩ、レーン５：Ｅ１．Ｇｌｙ−２（ｖｖＨＣＶ−８２）、ＳａｃＩ、レーン７：Ｅ１（ｖｖＨＣＶ−１０Ａ）、ＳａｃＩ、レーン８：Ｅ１．Ｇｌｙ−３（ｖｖＨＣＶ−８３）、ＳａｃＩ、レーン１０：Ｅ１（ｖｖＨＣＶ−１０Ａ）、ＳｔｕＩ、レーン１１：Ｅ１．Ｇｌｙ−４（ｖｖＨＣＶ−８４）、ＳｔｕＩ、レーン１３：Ｅ１（ｖｖＨＣＶ−１０Ａ）、ＳｍａＩ、レーン１４：Ｅ１．Ｇｌｙ−５（ｖｖＨＣＶ−８５）、ＳｍａＩ、レーン１６：Ｅ１（ｖｖＨＣＶ−１０Ａ）、ＳｔｕＩ、レーン１７：Ｅ１．Ｇｌｙ−６（ｖｖＨＣＶ−８６）、ＳｔｕＩ、レーン３−６−９−１２−１５：低分子量マーカー、pBluescript ＳＫ＋、ＭｓｐＩ。
【図４５】Ｓ・セレビシエ（S. cerevisiae)で発現させた組換えＥ２のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。接種物は、ロイシン選択培地中で７２時間増殖させ、完全培地で１／１５希釈した。２８℃で１０日間培養後、培地試料を採取した。スピードバック（speedvac）で濃縮した培養上澄液２００μl の相当量をゲルにのせた。２つの独立の形質転換体を分析した。
【図４６】グリコシル化欠損Ｓ・セレビシエ（S. cerevisiae)突然変異体で発現させた組換えＥ２のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動。接種物は、ロイシン選択培地中で７２時間増殖させ、完全培地で１／１５希釈した。２８℃で１０日間培養後、培地試料を採取した。イオン交換クロマトグラフィーで濃縮した培養上澄液の３５０μl の相当量をゲルにのせた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２１Ｇ】
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【図２１Ｈ】
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【図２１Ｉ】
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【図２１Ｊ】
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【図２１Ｋ】
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【図２１Ｌ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５】
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【図４６】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月26日(2004.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換宿主細胞を溶解して組換えにより発現された蛋白を単離する際に、ジスルフィド結合切断剤によりジスルフィド結合切断又は還元工程を行うことを特徴とする、Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２よりなる群から選択される組換えＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーのエンベロープ蛋白を精製する方法。
【請求項２】
ジスルフィド結合切断又は還元工程を、部分的切断又は還元条件下で行う、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
ジスルフィド結合切断剤が、好適には０．１〜５０mM、好適には０．１〜２０mM、更に好適には０．５〜１０mMの範囲の濃度の、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
【請求項４】
ジスルフィド結合切断剤が、界面活性剤である、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】
界面活性剤が、好適には１〜１０％の濃度、更に好適には３．５％の濃度の、エンピゲン−ＢＢ（Empigen-BB）である、請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
ジスルフィド結合切断剤が、ＤＴＴのような古典的ジスルフィド結合切断剤と、エンピゲン−ＢＢのような界面活性剤との組合せを含む、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
【請求項７】
ＳＨ基保護剤によりジスルフィド結合の再形成を阻止する工程を更に含む、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ＳＨ基保護剤が、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）又はその誘導体である、請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項９】
ジスルフィド結合の再形成を阻止する工程を、低ｐＨ条件により達成する、請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも以下の工程：
−  組換えＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２発現宿主細胞を、場合によりＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）のようなＳＨ基保護剤の存在下で、溶解し、
−  レンチルレクチンクロマトグラフィーのようなレクチンクロマトグラフィー、あるいは抗Ｅ１及び／又は抗Ｅ２特異的モノクローナル抗体を用いる免疫親和性などの親和性精製により、上記ＨＣＶエンベロープ蛋白を回収し、
−  ＤＴＴのようなジスルフィド結合切断剤を用いて、好適にはＮＥＭ又はビオチン−ＮＥＭのようなＳＨ基保護剤の存在下で、ジスルフィド結合を還元又は切断して、そして
−  還元されたＥ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２エンベロープ蛋白を、ゲル濾過、及び場合によりこれに続くＮｉ2+−ＩＭＡＣクロマトグラフィーと脱塩工程により回収する工程、
により更に特徴づけられる、請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか１項記載の方法により単離されることを特徴とする、Ｅ１及び／又はＥ２及び／又はＥ１／Ｅ２よりなる群から選択される実質的に精製された組換えＨＣＶの単一の又は特定オリゴマーの組換えエンベロープ蛋白を含む組成物。
【請求項１２】
更に、組換えＨＣＶエンベロープ蛋白が、ワクシニアのような組換え哺乳動物細胞から発現されることを特徴とする、請求の範囲第１１項記載の組成物。
【請求項１３】
更に、組換えＨＣＶエンベロープ蛋白が、組換え酵母細胞から発現されることを特徴とする、請求の範囲第１１項記載の組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月26日(2004.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2004222729000001.app