(57)【要約】【課題】ネプリライシンの活性測定法の提供。【解決手段】神経細胞におけるネプリライシンの活性を測定する方法、ネプリライシンの活性を測定することにより神経細胞のネプリライシンの活性または発現を増強させるタンパク質、ペプチド、化合物のスクリーニング方法、ネプリライシンの活性または発現を増強させる方法等の提供。【効果】本発明のネプリライシン活性測定法を用いることを特徴とするスクリーニング方法から得られるネプリライシン活性および／または発現を増強する化合物はアルツハイマー病の予防および／または治療剤として有用である。また、本発明の活性測定法はアルツハイマー病の発症前の診断に用いることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光物質を用いるネプリライシンの活性の測定法であって、単離された神経細胞または固定された神経細胞を用いることを特徴とするネプリライシンの活性測定法。
【請求項２】
単離され、固定された神経細胞を用いる請求項１記載のネプリライシンの活性測定法。
【請求項３】
パラホルムアルデヒドを用いて固定された神経細胞を用いる請求項１記載のネプリライシンの活性測定法。
【請求項４】
前記神経細胞が培養細胞である請求項１記載の測定法。
【請求項５】
前記培養細胞が初代培養細胞である請求項４記載の測定法。
【請求項６】
前記神経細胞の樹状突起を用いることを特徴とする請求項１記載の測定法。
【請求項７】
前記神経細胞の軸索を用いることを特徴とする請求項１記載の測定法。
【請求項８】
前記神経細胞のシナプス終末を用いることを特徴とする請求項１記載の測定法。
【請求項９】
前記神経細胞のシナプス小胞を用いることを特徴とする請求項１記載の測定法。
【請求項１０】
大脳皮質または海馬から調製された神経細胞を用いることを特徴とする請求項１記載の測定法。
【請求項１１】
前記蛍光物質が４−メトキシ−２−ナフチルアミドとニトロサリチルアルデヒドとの反応生成物である請求項１記載の測定法。
【請求項１２】
４−メトキシ−２−ナフチルアミドがネプリライシンの基質から誘導されることを特徴とする請求項１１記載の測定法。
【請求項１３】
ネプリライシンの基質がグルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミドである請求項１２記載の測定法。
【請求項１４】
４−メトキシ−２−ナフチルアミドが、グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミドをネプリライシンで処理し、次いでアミノペプチダーゼで処理することにより得られることを特徴とする請求項１１記載の測定法。
【請求項１５】
前記蛍光物質が７−アミノ−４−メチルクマリンである請求項１記載の測定法。
【請求項１６】
７−アミノ−４−メチルクマリンが、サクシニル−アラニル−アラニル−フェニルアラニン  ４−メチルクマリン−７−アミドをネプリライシンで処理することにより得られることを特徴とする請求項１５記載の測定法。
【請求項１７】
請求項１記載の測定法を用いることを特徴とする、ネプリライシンの活性を増強する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１７記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、ネプリライシンの活性を増強する化合物またはその塩。
【請求項１９】
請求項１８記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項２０】
アルツハイマー病の予防および／または治療剤、症状改善剤または進展抑制剤である請求項１９記載の医薬。
【請求項２１】
請求項１記載の測定法を用いることを特徴とする、ネプリライシンの発現を増強する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２２】
請求項２１記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、ネプリライシンの発現を増強する化合物またはその塩。
【請求項２３】
請求項２２記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項２４】
アルツハイマー病の予防および／または治療剤、症状改善剤または進展抑制剤である請求項２３記載の医薬。
【請求項２５】
請求項１記載の活性測定法を用いることを特徴とする、アルツハイマー病の診断方法。
【請求項２６】
ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの活性の増強剤。
【請求項２７】
ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの発現の増強剤。
【請求項２８】
哺乳動物に対して、ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの活性の増強方法。
【請求項２９】
哺乳動物に対して、ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの発現の増強方法。
【請求項３０】
哺乳動物において、ソマトスタチンレセプターの活性を促進することを特徴とするネプリライシンの活性または発現の増強方法。
【請求項３１】
ネプリライシンの活性または発現の増強剤を製造するためのソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩の使用。
【請求項３２】
サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの活性の増強剤。
【請求項３３】
サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの発現の増強剤。
【請求項３４】
哺乳動物に対して、サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの活性の増強方法。
【請求項３５】
哺乳動物に対して、サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの発現の増強方法。
【請求項３６】
哺乳動物において、サブスタンスＰレセプターの活性を促進することを特徴とするネプリライシンの活性または発現の増強方法。
【請求項３７】
ネプリライシンの活性または発現の増強剤を製造するためのサブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩の使用。
【請求項３８】
下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの活性の増強剤。
【請求項３９】
下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの発現の増強剤。
【請求項４０】
哺乳動物に対して、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの活性の増強方法。
【請求項４１】
哺乳動物に対して、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの発現の増強方法。
【請求項４２】
哺乳動物において、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターの活性を阻害することを特徴とするネプリライシンの活性または発現の増強方法。
【請求項４３】
ネプリライシンの活性または発現の増強剤を製造するための下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の使用。
【請求項４４】
バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの活性の増強剤。
【請求項４５】
バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの発現の増強剤。
【請求項４６】
哺乳動物に対して、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの活性の増強方法。
【請求項４７】
哺乳動物に対して、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの発現の増強方法。
【請求項４８】
哺乳動物において、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターの活性を阻害することを特徴とするネプリライシンの活性または発現の増強方法。
【請求項４９】
ネプリライシンの活性または発現の増強剤を製造するためのバソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルツハイマー病の発症・進展に深くかかわっているアミロイドβタンパク質（Ａβ）の分解を促進して、脳内Ａβ量を低下させ、アルツハイマー病の病状を改善する方法に関する。すなわち、本発明は、脳内でＡβの分解を担っている酵素であるネプリライシンの活性または発現を増強させる方法、神経細胞におけるネプリライシンの活性を測定する方法、および、ネプリライシンの活性を測定することにより神経細胞のネプリライシンの活性または発現を増強させるタンパク質、ペプチド、化合物のスクリーニング方法に関する。また、本発明は、このスクリーニング方法により見出されたＡβの分解を制御するタンパク質、ペプチド、化合物を含有する医薬組成物、疾病の治療方法および予防方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病は痴呆を主症状とする神経変性疾患である。アルツハイマー病患者では大脳皮質の萎縮が見られ、病理学的には高度の神経細胞脱落に加え、老人斑や神経原線維変化などの特徴的病変が観察される。これらのうち、比較的早い段階から見られる病理変化は老人斑の形成であり、その主要構成成分がアミロイドβタンパク質（Ａβ）であることから、Ａβの産生あるいは分解の異常がアルツハイマー病の発症・進展に深く関わっていると考えられている。Ａβは、前駆体タンパク質（βＡＰＰ）からアスパラギン酸プロテアーゼに属するβ−セクレターゼ（非特許文献１参照）とγ−セクレターゼにより切断され産生される。γ−セクレターゼについては、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）原因遺伝子、プレセニリンあるいはプレセニリンを含む複合体がその活性発現に関与していることが明らかにされている（非特許文献２および非特許文献３参照）。
このＡβは定常的に体内で合成・分泌されており、正常状態では速やかに分解されて蓄積されないと考えられている。この分解能力が何らかの原因により低下すればＡβが蓄積され、逆に、分解能力を増強すればＡβ蓄積を抑制することができる。最近、Ａβの分解に関わる主要酵素は中性エンドペプチダーゼであるネプリライシンであることが明らかにされた（非特許文献４参照）。ネプリライシンのノックアウトマウスでは脳内Ａβレベルが上昇しており、その上昇は海馬において最も顕著であった（非特許文献５参照）。また、実際に、アルツハイマー病患者の脳においてネプリライシンの発現が低下していることが明らかになっている（非特許文献６参照）。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６，  ７３５−７４１，  １９９９
【非特許文献２】
Ｎａｔｕｒｅ  ３９８，  ５１３−５１７，  １９９９
【非特許文献３】
Ｎａｔｕｒｅ  ４０５，  ６８９−６９４，  ２０００
【非特許文献４】
Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ６，  １４３−１５１，  ２０００
【非特許文献５】
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２，  １５５０−１５５２，  ２００１
【非特許文献６】
Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔ  ２９７，９７−１００，  ２００１
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ネプリライシンの活性または発現を増加させＡβの分解能を上昇させると、脳内のＡβのクリアランスが亢進し、Ａβの蓄積が抑制されると考えられる。しかしながら、ネプリライシンの発現制御に関するメカニズムは良くわかっていない。ネプリライシンは中性エンドペプチダーゼであり、種々の脳内ペプチドを分解する作用を有している。脳内には数多くの生理活性ペプチドが存在するが、その中にはレセプターであるＧＰＣＲ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）あるいは核内レセプターを介してネプリライシンの発現を制御しているペプチドが存在する可能性がある。ネプリライシンの発現を制御する脳内ペプチドが発見できれば、Ａβの分解を促進する新しい薬剤の探索方法を提供することができ、さらに、アルツハイマー病の治療薬、予防薬など、新しい医薬への応用を図ることができる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、神経細胞におけるネプリライシンの活性を制御する脳内ペプチドを探索するために、まず、マウスの初代神経細胞におけるネプリライシンの活性を蛍光基質によって視覚化する方法を考案した。この測定系を用いて、種々の脳内ペプチドを作用させて、ネプリライシンの活性に影響を与えるものを探索した結果、ソマトスタチンが初代神経細胞のネプリライシン活性を上昇させることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は
（１）蛍光物質を用いるネプリライシンの活性の測定法であって、単離された神経細胞または固定された神経細胞を用いることを特徴とするネプリライシンの活性測定法、
（２）単離され、固定された神経細胞を用いる上記（１）記載のネプリライシンの活性測定法、
（３）パラホルムアルデヒドを用いて固定された神経細胞を用いる上記（１）記載のネプリライシンの活性測定法、
（４）前記神経細胞が培養細胞である上記（１）記載の測定法、
（５）前記培養細胞が初代培養細胞である上記（４）記載の測定法、
（６）前記神経細胞の樹状突起を用いることを特徴とする上記（１）記載の測定法、
（７）前記神経細胞の軸索を用いることを特徴とする上記（１）記載の測定法、
（８）前記神経細胞のシナプス終末を用いることを特徴とする上記（１）記載の測定法、
（９）前記神経細胞のシナプス小胞を用いることを特徴とする上記（１）記載の測定法、
（１０）大脳皮質または海馬から調製された神経細胞を用いることを特徴とする上記（１）記載の測定法、
（１１）前記蛍光物質が４−メトキシ−２−ナフチルアミドとニトロサリチルアルデヒドとの反応生成物である上記（１）記載の測定法、
（１２）４−メトキシ−２−ナフチルアミドがネプリライシンの基質から誘導されることを特徴とする上記（１１）記載の測定法、
（１３）ネプリライシンの基質がグルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミドである上記（１２）記載の測定法、
（１４）４−メトキシ−２−ナフチルアミドが、グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミドをネプリライシンで処理し、次いでアミノペプチダーゼで処理することにより得られることを特徴とする上記（１１）記載の測定法、
（１５）前記蛍光物質が７−アミノ−４−メチルクマリンである上記（１）記載の測定法、
（１６）７−アミノ−４−メチルクマリンが、サクシニル−アラニル−アラニル−フェニルアラニン  ４−メチルクマリン−７−アミドをネプリライシンで処理することにより得られることを特徴とする上記（１５）記載の測定法、
（１７）上記（１）記載の測定法を用いることを特徴とする、ネプリライシンの活性を増強する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１８）上記（１７）記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、ネプリライシンの活性を増強する化合物またはその塩、
（１９）上記（１８）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２０）アルツハイマー病の予防および／または治療剤、症状改善剤または進展抑制剤である上記（１９）記載の医薬、
（２１）上記（１）記載の測定法を用いることを特徴とする、ネプリライシンの発現を増強する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２２）上記（２１）記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、ネプリライシンの発現を増強する化合物またはその塩、
（２３）上記（２２）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２４）アルツハイマー病の予防および／または治療剤、症状改善剤または進展抑制剤である上記（２３）記載の医薬、
（２５）上記（１）記載の活性測定法を用いることを特徴とする、アルツハイマー病の診断方法、
（２６）ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの活性の増強剤、
（２７）ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの発現の増強剤、
（２８）哺乳動物に対して、ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの活性の増強方法、
（２９）哺乳動物に対して、ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの発現の増強方法、
（３０）哺乳動物において、ソマトスタチンレセプターの活性を促進することを特徴とするネプリライシンの活性または発現の増強方法、
（３１）ネプリライシンの活性または発現の増強剤を製造するためのソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩の使用、
（３２）サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの活性の増強剤、
（３３）サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの発現の増強剤、
（３４）哺乳動物に対して、サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの活性の増強方法、
（３５）哺乳動物に対して、サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの発現の増強方法、
（３６）哺乳動物において、サブスタンスＰレセプターの活性を促進することを特徴とするネプリライシンの活性または発現の増強方法、
（３７）ネプリライシンの活性または発現の増強剤を製造するためのサブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩の使用、
（３８）下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの活性の増強剤、
（３９）下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの発現の増強剤、
（４０）哺乳動物に対して、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの活性の増強方法、
（４１）哺乳動物に対して、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの発現の増強方法、
（４２）哺乳動物において、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターの活性を阻害することを特徴とするネプリライシンの活性または発現の増強方法、
（４３）ネプリライシンの活性または発現の増強剤を製造するための下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の使用、
（４４）バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの活性の増強剤、
（４５）バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩を含有してなるネプリライシンの発現の増強剤、
（４６）哺乳動物に対して、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの活性の増強方法、
（４７）哺乳動物に対して、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の有効量を投与することを特徴とするネプリライシンの発現の増強方法、
（４８）哺乳動物において、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターの活性を阻害することを特徴とするネプリライシンの活性または発現の増強方法、
（４９）ネプリライシンの活性または発現の増強剤を製造するためのバソアクティブ・インテスティナル・ペプチドレセプターのアンタゴニストまたはその塩の使用、等に関する。
また、本発明は
（５０）ネプリライシンの活性または発現を増強することによるアルツハイマー病の予防および／または治療方法を提供する。
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明の実施の形態】
（１）ネプリライシンの活性測定法
本発明の第１の態様によれば、蛍光物質を用いるネプリライシンの活性の測定法であって、単離された神経細胞（生細胞）または固定された神経細胞（好ましくは、単離され、固定された神経細胞）を用いることを特徴とするネプリライシンの活性測定法が提供される。
本発明の測定法において使用する神経細胞は、通常、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）から公知の方法（例えば、Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｎｅｒｖｅ  Ｃｅｌｌｓ（Ｔｈｅ  ＭＩＴ  ｐｒｅｓｓ，  １９９１）などに記載の方法）を用いて採取される。本発明においては、好ましくは、大脳皮質または海馬から採取した神経細胞を用いる。
【０００７】
本発明においては、上記のようにして採取・単離される神経細胞をそのまま用いることもできるが、通常は、採取した細胞を培養して得られる培養細胞を用いる。培養することにより細胞の性質が安定化し付着性になるので、好ましくは、初代培養細胞が用いられる。また、神経細胞の機能の点から、神経細胞全体ではなく、神経細胞の樹状突起、あるいは軸索、シナプス終末、シナプス小胞などを用いることが好ましい。
【０００８】
培養は、当業者によって適宜選択される条件で行われる。例えば、上記のような部位から採取した細胞を、マイクロタイタープレートあるいはチャンバースライド等を用いて、血清を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）、血清を添加したＤＥＭＥ、血清を添加したＭＥＭなどのような培地中で、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で、４から６日間培養する。あるいは、２１から２８日間程度まで培養してもよい。後述するように、本発明の測定法では、通常、顕微鏡で細胞を観察するために、得られた神経細胞をチャンバースライド上で培養すると都合がよい。
【０００９】
本発明の測定法においては、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を固定化剤を用いて固定することが好ましい。本発明で用いられる細胞固定化剤としては、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、アセトンなどが用いられる。本発明において好適に用いられる細胞固定化剤は、パラホルムアルデヒドである。固定化の条件は、当業者によって適宜選択することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＩＨ）などの文献参照）。例えば、パラホルムアルデヒド溶液（１．５％  パラホルムアルデヒド／５０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ６．８）中で１０から４０分間細胞を処理することにより固定化を行う。
【００１０】
本発明の測定法の一態様によれば、上記のようにして単離・固定された細胞に、試験化合物と基質溶液を反応させ、さらにアミノペプチダーゼ・ホスホラミドン混合液およびニトロサリチルアルデヒド溶液を添加、反応させる。ここで用いられる基質としては、例えば、グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミド、グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−２−ナフチルアミド、サクシニル−アラニル−アラニル−フェニルアラニン  ４−メチルクマリン−７−アミド等の合成基質が挙げられる。好ましい基質は、グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミドである。上記反応の反応条件は、使用する細胞、基質、試験化合物の種類・量などに応じて当業者が適宜選択できる。例えば、細胞と試験化合物と基質溶液との反応は、細胞として大脳皮質、海馬等から調製された神経細胞を用い、基質としてグルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミドを用いる場合は、０〜２０℃で、１〜７２時間反応させる。その後のアミノペプチダーゼ・ホスホラミドン混合液とニトロサリチルアルデヒド溶液との反応は、例えば、２０〜４０℃で１０〜６０分間行う。
【００１１】
上記反応において、ネプリライシンおよびアミノペプチダーゼ処理により、基質として用いる化合物が分解され、分解して得られる化合物が、例えば、ニトロサリチルアルデヒドと反応し、蛍光物質を生じる。基質としてグルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミドが用いられた場合は、これが分解され、遊離の４−メトキシ−２−ナフチルアミン（ＭＮＡ）が生成される。この遊離のＭＮＡがニトロサリチルアルデヒドと反応し、不溶性の黄色蛍光物質を生ずる。一方、基質としてサクシニル−アラニル−アラニル−フェニルアラニン  ４−メチルクマリン−７−アミドが用いられた場合は、これが分解され、７−アミノ−４−メチルクマリンが生成される。
本発明の測定法においては、上記のような反応を行い、例えば、共焦点レーザー顕微鏡下でアルゴンレーザーとローダミン用のフィルターを用いて、生成された蛍光物質による陽性染色像を観察する。
【００１２】
ネプリライシンの活性または遺伝子発現の増強は、上記の活性測定により得られる染色像から、画像解析のためのソフトウェアを用いてその蛍光強度を数値化することにより定量できる。該ソフトウェアとしては、日本ローパー社のＭｅｔａＶｕｅなどが用いられる。
【００１３】
（２）ネプリライシン活性染色を用いたネプリライシンの活性および／または発現を増強する化合物のスクリーニング方法
本発明の他の態様によれば、上記ネプリライシン活性の測定法を用いることを特徴とする、ネプリライシンの活性を増強する化合物またはその塩のスクリーニング方法が提供される。すなわち、本発明のネプリライシン活性染色を用いることにより、ネプリライシンの活性および／または発現を増強する化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、（イ）ネプリライシン活性を促進（あるいは増強）する効果を有する化合物、（ロ）ネプリライシン遺伝子の発現を上昇（あるいは増強）する効果を有する化合物等が含まれる。
具体的には、本発明のスクリーニング法においては、（ｉ）試験化合物を用いずに神経細胞のみを用いた場合と（ｉｉ）神経細胞を試験化合物で処理した場合で、ネプリライシン活性（例えば、ネプリライシンの特異的酵素阻害剤であるチオルファンで阻害を受ける分から測定される活性など）の比較を行なうことを特徴とするネプリライシンの活性または発現を増強する化合物またはその塩をスクリーニングする。
【００１４】
より具体的には、まず、上記のようにして調製される神経細胞をチャンバースライド上で培養する。細胞を培養後、試験化合物の種類および濃度に依存するが、該化合物が細胞と十分反応できる程度に、添加して一定時間（例えば、後述するソマトスタチンの場合、終濃度１μＭで２４時間）インキュベートした後、細胞をパラホルムアルデヒドを用いて固定する。固定した細胞と基質溶液（グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミド）を反応させ、さらにアミノペプチダーゼ・ホスホラミドン混合液およびニトロサリチルアルデヒド溶液を添加、反応させる。これらの反応の反応条件などは、上述した通りである。反応後、共焦点レーザー顕微鏡下でアルゴンレーザーとローダミン用のフィルターを用いて陽性染色像を観察する。
本発明のスクリーニング方法において、試験化合物としては、例えば、ペプチド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、サブスタンスＰ、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、パンクレアスタチン、トロンボキサン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン）、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられる。これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。また、これらの化合物の２種以上の混合物を試料として供することもできる。また、後述する、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩、あるいはサブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩、ＰＡＣＡＰおよびＶＩＰのレセプターアンタゴニストまたはその塩は、本発明におけるスクリーニング方法における好ましい試験化合物である。
該スクリーニング方法において、神経細胞を試験化合物で処理した場合、例えば、ネプリライシン活性が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇した場合、該試験化合物をネプリライシン活性またはその発現を増強する効果を有する化合物として選択することができる。
【００１５】
（３）スクリーニングの結果得られる化合物を含んでなる医薬
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、ネプリライシン活性またはその発現を増強する効果を有するので、アルツハイマー病に対する安全で低毒性な予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００１６】
（４）アルツハイマー病の診断方法
本発明の活性測定法を用いることによりアルツハイマー病の発症前診断を行うことができる。すなわち、本発明の活性測定法により得られた結果を定量化し、定量値をコントロールから得られたものと比較することにより、その個体でのアルツハイマー病の発症リスクを予測することが可能となる。
【００１７】
（５）ネプリライシン活性の増強剤
本発明の別の態様によれば、ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなる、ネプリライシンの活性の増強剤又はネプリライシンの発現の増強剤が提供される。ソマトスタチンは、１４個のアミノ酸（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ）からなる公知のタンパク質（ペプチド）であり、例えば、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０，  ６９３２−６９３６，  １９８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，  １６８−１７１，  １９８４などに開示されている。
ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、比較するアミノ酸配列に対して、例えば、約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。また、「部分ペプチド」とは、ソマトスタチンの部分ペプチドであればいずれのペプチドでもかまわないが、構成アミノ酸配列のうち少なくとも３個以上、好ましくは５個以上、より好ましくは７個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
ソマトスタチン、ソマトスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、ソマトスタチンレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することによって、対象哺乳動物のネプリライシン活性を増強あるいはネプリライシンの発現を増強することができる。
【００１８】
また本発明の別の態様によれば、サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩を含有してなる、ネプリライシンの活性の増強剤又はネプリライシンの発現の増強剤が提供される。サブスタンスＰは、１１個のアミノ酸（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）からなる公知のペプチドであり、例えば、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，  （Ｆｌｅｕｒ  Ｌ．  Ｓｔｒａｎｄ，  ｅｄ），  Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，  １９９９などに開示されている。
ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、比較するアミノ酸配列に対して、例えば、約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。また、「部分ペプチド」とは、サブスタンスＰの部分ペプチドであればいずれのペプチドでもかまわないが、構成アミノ酸配列のうち少なくとも３個以上、好ましくは５個以上、より好ましくは７個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
サブスタンスＰ、サブスタンスＰと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド、サブスタンスＰレセプターのアゴニストまたはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することによって、対象哺乳動物のネプリライシン活性を増強あるいはネプリライシンの発現を増強することができる。
【００１９】
さらに本発明の別の態様によれば、ＰＡＣＡＰレセプター、ＶＩＰレセプター等のアンタゴニストまたはその塩を含有してなる、ネプリライシンの活性の増強剤又はネプリライシンの発現の増強剤が提供される。これらは、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，  （Ｆｌｅｕｒ  Ｌ．  Ｓｔｒａｎｄ，  ｅｄ），  Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，  １９９９などに開示される公知のペプチドである。ＰＡＣＡＰあるいはＶＩＰがネプリライシン活性あるいはその遺伝子発現に対して抑制的に作用するので、ＰＡＣＡＰレセプター、ＶＩＰレセプター等のアンタゴニストまたはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することによって、対象哺乳動物のネプリライシン活性を増強あるいはネプリライシンの発現を増強することができる。
【００２０】
本発明ではまた、上記の既知のネプリライシン活性あるいは発現の増強剤をプローブとして、新規なネプリライシン活性あるいは発現の増強剤をスクリーニングできる。すなわち、ソマトスタチン、ソマトスタチンレセプターのアゴニスト、サブスタンスＰ、サブスタンスＰレセプターのアゴニスト、ＰＡＣＡＰおよびＶＩＰレセプターのアンタゴニスト等により活性あるいは発現を増強したネプリライシンに、試験化合物を加えた場合のネプリライシン活性あるいは発現の量と、試験化合物を加えない場合のネプリライシン活性あるいは発現の量とを比較することにより、新規のネプリライシン活性あるいは発現の増強剤をスクリーニングできる。あるいは、ソマトスタチン、ソマトスタチンレセプターのアゴニスト、サブスタンスＰ、サブスタンスＰレセプターのアゴニスト、ＰＡＣＡＰおよびＶＩＰレセプターのアンタゴニスト等により増強したネプリライシン活性あるいは発現の量と、試験化合物により増強するネプリライシン活性あるいは発現の量とを比較することにより、新規のネプリライシン活性あるいは発現の増強剤をスクリーニングできる。試験化合物としては、例えば、ペプチド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、サブスタンスＰ、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、パンクレアスタチン、トロンボキサン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン）、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられる。これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。また、これらの化合物の２種以上の混合物を試料として供することもできる。
【００２１】
（６）製剤化、投与量、投与方法など
本発明の活性測定法を用いたスクリーニング方法により得られた化合物を、ネプリライシン活性を利用することによるＡβの分解促進剤または除去剤ひいてはアルツハイマー病の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
上記化合物が、製薬学的に許容できる塩を形成できるときは、そのような塩を形成していてもよい。そのような塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
上記化合物（その塩も含む）は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、上記活性化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００２２】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００２３】
また、上記予防および／または治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
本発明において得られる化合物の投与量は、投与対象、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このようにして得られる製剤は例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【００２４】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものである。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００２５】
【実施例】
実施例１  初代培養神経細胞のネプリライシン活性染色
マウス胎仔大脳皮質および海馬から神経細胞を調製し、ポリ−Ｌ−リジンをコートしたチャンバースライド（８チャンバー、ＩＷＡＫＩ  ４７３０−０４０）に１×１０５細胞／チャンバーの濃度で播種し７日間培養した。培養終了後、細胞をＴＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、パラホルムアルデヒド溶液（１．５％  パラホルムアルデヒド／５０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ６．８）により１２．５分間、２０℃で細胞を固定した。細胞をＴＢＳで２回洗浄した後、０．２ｍｌの基質溶液（グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミド、Ｓｉｇｍａ  Ｇ３７６９、最終濃度０．５ｍＭ；０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４（４℃でｐＨを７．４に調整））を加え、４℃で４８時間反応させた。反応終了後、さらに２５μｌのアミノペプチダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｌ−５００６、最終濃度２０．４μｇ／ｍｌ）・ホスホラミドン（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔ．  ４０８２、最終濃度１０μＭ）混合液および２５μｌのニトロサリチルアルデヒド溶液（６ｍＭ）を順次添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応はＴＢＳで２回細胞を洗浄することで完結し、共焦点レーザー顕微鏡下でアルゴンレーザーとローダミン用のフィルターを用いて陽性染色像を観察した（図１）。ネプリライシンにより基質が分解されると不溶性の蛍光反応物が形成され、ネプリライシンの存在部位が黄色に視覚化される。この方法により、マウス胎仔大脳皮質および海馬の初代培養神経細胞にはネプリライシンの酵素活性が存在することが確認された。ネプリライシンの存在部位は神経細胞の突起部分で顕著であった。
【００２６】
実施例２  ソマトスタチンによるネプリライシン酵素活性の誘導
マウス胎仔大脳皮質および海馬から神経細胞を調製し、実施例１と同様に培養した。培養７日目に、ソマトスタチン（ソマトスタチン１４および２８、最終濃度１μＭ）を添加し、さらに２４時間培養した。培養終了後、実施例１で示した方法により、マウス初代培養神経細胞のネプリライシン活性を視覚化して観察した（図２）。ソマトスタチンの添加により神経細胞のネプリライシン活性はソマトスタチン非添加コントロールに比較して顕著に増加した。また、このネプリライシン酵素活性は、ネプリライシンに特異的な酵素阻害剤チオルファン（Ｓｉｇｍａ  Ｔ６０３１、最終濃度１０μＭ）を基質溶液に添加することによりほぼ完全に消失することから、ネプリライシンに特異的であることが確認された。さらに、詳細に検討するために、これらの染色像を画像解析ソフトウェア（日本ローパー社、ＭｅｔａＶｕｅ）により定量化して検討した結果、ソマトスタチンによりネプリライシンの酵素活性は約２．５倍に増加していることが確認された（図３）。
【００２７】
実施例３  神経ペプチドによるネプリライシン酵素活性の調節
マウス胎仔大脳皮質および海馬から神経細胞を調製し、実施例１と同様に培養する。培養７日目に、サブスタンスＰ、ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰなどの各種神経ペプチド（最終濃度１μＭ）を添加し、さらに２４時間培養する。培養終了後、実施例１で示した方法により、マウス初代培養神経細胞のネプリライシン活性を視覚化して観察する。ペプチド非添加コントロールに比較して、ペプチドの添加により神経細胞のネプリライシン活性が顕著に変化（増強または抑制）するものを選択する。
ＰＡＣＡＰ（ＰＡＣＡＰ３８、最終濃度１μＭ）を添加し、実施例２と同様に処理した結果を図４に示す。ＰＡＣＡＰの添加により神経細胞のネプリライシン活性はＰＡＣＡＰ非添加コントロールに比較して顕著に減少した。また、このネプリライシン酵素活性は、ネプリライシンに特異的な酵素阻害剤チオルファン（Ｓｉｇｍａ  Ｔ６０３１、最終濃度１０μＭ）を基質溶液に添加することによりほぼ完全に消失することから、ネプリライシンに特異的であることが確認された。
【００２８】
【発明の効果】
本発明のネプリライシン活性測定法を用いることを特徴とするスクリーニング方法から得られるネプリライシン活性および／または発現を増強する化合物はネプリライシン活性を利用することによるＡβの分解促進剤または除去剤ひいてはアルツハイマー病の予防および／または治療剤として有用である。また、本発明の活性測定法はアルツハイマー病の発症前の診断に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウス初代培養神経細胞のネプリライシン活性の活性染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２】マウス初代培養神経細胞のネプリライシン活性に対するソマトスタチンおよびチオルファンの効果を示す顕微鏡写真である。
【図３】実施例２で得られた染色像を画像解析ソフトウェアにより定量化した結果を示す。
【図４】マウス初代培養神経細胞のネプリライシン活性に対するＰＡＣＡＰおよびチオルファンの効果を示す顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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