(57)【要約】  【課題】糖尿病性腎症等の予防・治療薬のスクリーニング等の提供。  【解決手段】配列番号：１、配列番号：５または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＥＤＧ−２受容体、ＥＤＧ−３受容体またはＥＤＧ−５受容体）またはその塩を用いることを特徴とする糖尿病性腎症等の予防・治療薬のスクリーニング方法などを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤。
【請求項２】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤。
【請求項３】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の診断剤。
【請求項４】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤。
【請求項５】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の診断剤。
【請求項６】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤。
【請求項７】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の診断剤。
【請求項８】
（ｉ）リゾフォスファチジン酸またはその塩および（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、その部分ペプチドまたはその塩を用いて、リゾフォスファチジン酸またはその塩と該ＥＤＧ−２受容体またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を選択することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
（ｉ）リゾフォスファチジン酸またはその塩および（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、その部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング用キット。
【請求項１０】
（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩および（ii）配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、その部分ペプチドまたはその塩を用いて、スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と該ＥＤＧ−３受容体またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を選択することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩および（ii）配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、その部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング用キット。
【請求項１２】
（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩および（ii）配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩を用いて、スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と該ＥＤＧ−５受容体またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を選択することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１３】
（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩および（ii）配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング用キット。
【請求項１４】
（ｉ）リゾフォスファチジン酸またはその塩と（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤。
【請求項１５】
（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と（ii）配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤。
【請求項１６】
（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と（ii）配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤。
【請求項１７】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする該ＥＤＧ−２受容体、ＥＤＧ−３受容体またはＥＤＧ−５受容体の発現量を変化させ、糖尿病性腎症疾、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫を予防・治療する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１８】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有することを特徴とする該ＥＤＧ−２受容体、ＥＤＧ−３受容体またはＥＤＧ−５受容体の発現量を変化させ、糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫を予防・治療する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１９】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤。
【請求項２０】
哺乳動物に対して、（Ｉ）（ｉ）リゾフォスファチジン酸またはその塩と（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、（II）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と（ii）配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、（III）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と（ii）配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、または（IV）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療方法。
【請求項２１】
糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤を製造するための、（Ｉ）（ｉ）リゾフォスファチジン酸またはその塩と（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、（II）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と（ii）配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、（III）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と（ii）配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、または（IV）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Endothelial Differentiation Gene（以下、ＥＤＧと略記する）−２受容体、ＥＤＧ−３受容体またはＥＤＧ−５受容体、およびそれらをコードするポリヌクレオチドの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＤＧ−２受容体（非特許文献１）、ＥＤＧ−３受容体（非特許文献２）、ＥＤＧ−５受容体（非特許文献３）が報告されており、これらレセプターが血管組織に発現していることが記載されている。
【０００３】
リゾフォスファチジン酸が腎臓メサンギウム細胞上の受容体に結合し、ＰＤＧＦと共にＭＡＰＫを活性化し、メサンギウム細胞の増殖に関与していること、ＥＤＧ−２受容体およびＥＤＧ−４受容体がリゾフォスファチジン酸に対する受容体であること、リゾフォスファチジン酸がＩｇＡ腎症に関与していることなどが知られている（非特許文献４）。
【０００４】
スフィンゴシン−１−リン酸が腎臓メサンギウム細胞に発現しているＥＤＧ−３受容体またはＥＤＧ−５受容体に結合して、メサンギウム細胞を増殖させること、ＩｇＡ腎症の腎臓でＥＤＧ−５受容体が増加していることが知られている（非特許文献５）。
【０００５】
しかしながら、これら受容体が糖尿病性腎症に関与していることは知られていなかった。
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９７  Ｆｅｂ  ２４；２３１（３）：６１９−２２
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  １９９９  Ｏｃｔ  ２９；９９（３）：３０１−１２
【非特許文献３】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９  Ｄｅｃ  １０；２７４（５０）：３５３４３−５０
【非特許文献４】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）９６，４３１−４３６
【非特許文献５】Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００１）１，２１１−２１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＥＤＧ−２受容体、ＥＤＧ−３受容体またはＥＤＧ−５受容体の機能を解明し、これらの受容体の新たな用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、ヒトＥＤＧ−２受容体、ヒトＥＤＧ−３受容体またはヒトＥＤＧ−５受容体がヒト正常メサンギウム細胞で高発現していること、さらに糖尿病性腎症モデルラットの腎臓においてＥＤＧ−２受容体、ＥＤＧ−３受容体またはＥＤＧ−５受容体が高発現していることを見出した。糖尿病性腎症は高血糖の持続を起因とした腎症であるのに対し、ＩｇＡ腎症は感染で誘発された形の高ＩｇＡ血症により誘発される腎症であり、両者は明らかにその病因が異なっている。
【０００８】
本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤、
（２）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤、
（３）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の診断剤、
（４）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤、
（５）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の診断剤、
（６）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤、
（７）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の診断剤、
（８）（ｉ）リゾフォスファチジン酸またはその塩および（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、その部分ペプチドまたはその塩を用いて、リゾフォスファチジン酸またはその塩と該ＥＤＧ−２受容体またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を選択することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング方法、
（９）（ｉ）リゾフォスファチジン酸またはその塩および（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、その部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング用キット、
（１０）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩および（ii）配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、その部分ペプチドまたはその塩を用いて、スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と該ＥＤＧ−３受容体またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を選択することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング方法、
（１１）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩および（ii）配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、その部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング用キット、
（１２）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩および（ii）配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩を用いて、スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と該ＥＤＧ−５受容体またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を選択することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング方法、
（１３）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩および（ii）配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング用キット、
（１４）（ｉ）リゾフォスファチジン酸またはその塩と（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩（特に、アンタゴニスト）を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤、
（１５）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と（ii）配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩（特に、アンタゴニスト）を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤、
（１６）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と（ii）配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩（特に、アンタゴニスト）を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤、
（１７）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする該ＥＤＧ−２受容体、ＥＤＧ−３受容体またはＥＤＧ−５受容体の発現量を変化させ、糖尿病性腎症疾、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫を予防・治療する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１８）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有することを特徴とする該ＥＤＧ−２受容体、ＥＤＧ−３受容体またはＥＤＧ−５受容体の発現量を変化させ、糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫を予防・治療する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１９）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体の発現量を変化させる化合物（特に、発現量を減少させる化合物）またはその塩を含有してなる糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤、
（２０）哺乳動物に対して、（Ｉ）（ｉ）リゾフォスファチジン酸またはその塩と（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩（特に、アンタゴニスト）、（II）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と（ii）配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩（特に、アンタゴニスト）、（III）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と（ii）配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩（特に、アンタゴニスト）、または（IV）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体の発現量を変化させる化合物（特に、発現量を減少させる化合物）またはその塩の有効量を投与することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療方法、および
（２１）糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤を製造するための、（Ｉ）（ｉ）リゾフォスファチジン酸またはその塩と（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩（特に、アンタゴニスト）、（II）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と（ii）配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩（特に、アンタゴニスト）、（III）（ｉ）スフィンゴシン−１−リン酸またはその塩と（ii）配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩（特に、アンタゴニスト）、または（IV）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体または配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体の発現量を変化させる化合物（特に、発現量を減少させる化合物）またはその塩の使用などを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
配列番号：１、配列番号：５または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＥＤＧ−２受容体、ＥＤＧ−３受容体またはＥＤＧ−５受容体）またはその塩を用いることにより、糖尿病性腎症等の予防・治療薬を効率良くスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明で用いられるＥＤＧ−２受容体は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質である。
【００１２】
本発明で用いられるＥＤＧ−３受容体は、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質である。
【００１３】
本発明で用いられるＥＤＧ−５受容体は、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質である。
【００１４】
以下、ＥＤＧ−２受容体、ＥＤＧ−３受容体およびＥＤＧ−５受容体を単にＥＤＧ受容体と略記する場合がある。
【００１５】
ＥＤＧ受容体は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞〔例えば、網膜細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、白血球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞（例、乳癌細胞株（ＧＩ−１０１）、結腸癌細胞株（ＣＸ−１、ＧＩ−１１２）、肺癌細胞株（ＬＸ−１、ＧＩ−１１７）、卵巣癌細胞株（ＧＩ−１０２）、前立腺癌細胞株など）など〕、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。ＥＤＧ受容体は特に、腎臓またはメサンギウム細胞で特に高発現している。
【００１６】
本明細書において、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、比較するアミノ酸配列に対して、例えば、約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。
【００１７】
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
【００１８】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−２受容体としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるＥＤＧ−２受容体と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
【００１９】
配列番号：５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−３受容体としては、例えば、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列からなるＥＤＧ−３受容体と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
【００２０】
配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＥＤＧ−５受容体としては、例えば、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるＥＤＧ−５受容体と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
【００２１】
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００２２】
リガンド結合活性、レセプター結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
【００２３】
ＥＤＧ受容体としては、（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（４）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。
【００２４】
本明細書におけるＥＤＧ受容体は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。ＥＤＧ受容体は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
【００２５】
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【００２６】
ＥＤＧ受容体がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明でいうＥＤＧ受容体に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
【００２７】
さらに、ＥＤＧ受容体には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００２８】
ＥＤＧ−２受容体の具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＥＤＧ−２受容体、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるラットＥＤＧ−２受容体などが挙げられる。
【００２９】
ＥＤＧ−３受容体の具体例としては、例えば、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＥＤＧ−３受容体、配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるラットＥＤＧ−３受容体（断片）などが挙げられる。
【００３０】
ＥＤＧ−５受容体の具体例としては、例えば、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＥＤＧ−５受容体、配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列からなるラットＥＤＧ−５受容体などが挙げられる。
【００３１】
ヒトＥＤＧ−２受容体は（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  番号  Ｕ８０８１１、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９７  Ｆｅｂ  ２４；２３１（３）：６１９−２２）に記載されている公知のタンパク質である。
【００３２】
ラットＥＤＧ−２受容体は（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＃  ＮＭ  ０５３９３６）に記載されている公知のタンパク質である。
【００３３】
ヒトＥＤＧ−３受容体は（Ｃｅｌｌ  １９９９  Ｏｃｔ  ２９；９９（３）：３０１−１２）に記載されている公知のタンパク質である。
【００３４】
ラットＥＤＧ−３受容体（断片）は（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＃  ＡＦ１８４９１４）に記載されている公知のタンパク質である。
【００３５】
ヒトＥＤＧ−５受容体は（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９  Ｄｅｃ  １０；２７４（５０）：３５３４３−５０）に記載されている公知のタンパク質である。
【００３６】
ラットＥＤＧ−５受容体は（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＃  ＮＭ  ０１７１９２）に記載されている公知のタンパク質である。
【００３７】
ＥＤＧ受容体またはその塩は、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から公知のレセプタータンパク質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載するＥＤＧ受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
【００３８】
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００３９】
ＥＤＧ受容体の部分ペプチド（以下、単に「部分ペプチド」と略記する場合がある）としては、上記したＥＤＧ受容体の部分アミノ酸配列を有するペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ＥＤＧ受容体の分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、ＥＤＧ受容体と実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
【００４０】
具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるＥＤＧ−２受容体、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列からなるＥＤＧ−３受容体または配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるＥＤＧ−５受容体の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
【００４１】
部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したＥＤＧ受容体の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
【００４２】
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
【００４３】
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
【００４４】
ここで、「実質的に同質のレセプター結合活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター結合活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
【００４５】
また、部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
【００４６】
また部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
【００４７】
さらに、部分ペプチドには、上記したＥＤＧ受容体と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００４８】
ＥＤＧ受容体またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００４９】
ＥＤＧ受容体の部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＥＤＧ受容体を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、ＥＤＧ受容体を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下のａ）〜ｅ）に記載された方法が挙げられる。
【００５０】
ａ）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
ｂ）SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年) 
ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
ｄ）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００５１】
ＥＤＧ受容体をコードするポリヌクレオチドとしては、上記したＥＤＧ受容体をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、ＥＤＧ受容体をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
【００５２】
ＥＤＧ受容体をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」15(7)、1997記載の公知の方法またはそれに準じた方法により、ＥＤＧ受容体のｍＲＮＡを定量することができる。
【００５３】
ＥＤＧ受容体をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞または組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
【００５４】
具体的には、ＥＤＧ−２受容体をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるＥＤＧ−２受容体と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００５５】
ＥＤＧ−３受容体をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるＥＤＧ−３受容体と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００５６】
ＥＤＧ−５受容体をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１０または配列番号：１２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：９または配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列からなるＥＤＧ−５受容体と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００５７】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００５８】
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
【００５９】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
【００６０】
「該ハイストリンジェントな条件」とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００６１】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＥＤＧ−２受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
【００６２】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるラットＥＤＧ−２受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
【００６３】
配列番号：５で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＥＤＧ−３受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
【００６４】
配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるラットＥＤＧ−３受容体（断片）をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
【００６５】
配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＥＤＧ−５受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１０で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
【００６６】
配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列からなるラットＥＤＧ−５受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
【００６７】
本発明の「ＥＤＧ受容体をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチド」とは、下記のＥＤＧ受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
【００６８】
本発明に従えば、ＥＤＧ受容体遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたＥＤＧ受容体をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、ＥＤＧ受容体遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいはＥＤＧ受容体関連ＲＮＡとの相互作用を介してＥＤＧ受容体遺伝子の発現を調節・制御することができる。ＥＤＧ受容体関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およびＥＤＧ受容体関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外でＥＤＧ受容体遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸を通常指している。レセプタータンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、レセプタータンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００６９】
ＥＤＧ受容体またはその部分ペプチド（以下、包括的にＥＤＧ受容体と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、ＥＤＧ受容体の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡをＥＤＧ受容体の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
（アンチセンス・ポリヌクレオチド）
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質、核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００７０】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
【００７１】
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
【００７２】
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００７３】
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはレセプタータンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００７４】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、生体内におけるＥＤＧ受容体または本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の機能を抑制することができるので、例えば、ＥＤＧ受容体の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤として用いることができる。さらに、本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできるので、ＥＤＧ受容体の機能不全に関連する疾患の診断に用いることができる。
（ｓｉＲＮＡ）
ＥＤＧ受容体をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ（以下、本発明のｓｉＲＮＡ）は、ＥＤＧ受容体をコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡを含有する二重鎖ＲＮＡである。
【００７５】
ｓｉＲＮＡは、公知の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
【００７６】
ＥＤＧ受容体をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムは、公知の方法（例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、公知のリボザイムの配列の一部をＥＤＧ受容体をコードするＲＮＡの一部に置換することによって製造することができる。ＥＤＧ受容体をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得るコンセンサス配列ＮＵＸ（式中、Ｎはすべての塩基を、ＸはＧ以外の塩基を示す）の近傍の配列などが挙げられる。
（部分ペプチドをコードするＤＮＡ）
ＥＤＧ受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記したＥＤＧ受容体の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞または組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
【００７７】
具体的には、ＥＤＧ−２受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
（１）配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、
（２）配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるＥＤＧ−２受容体と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
【００７８】
ＥＤＧ−３受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
（１）配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、
（２）配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるＥＤＧ−３受容体と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
【００７９】
ＥＤＧ−５受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
（１）配列番号：１０または配列番号：１２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、
（２）配列番号：１０または配列番号：１２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：９または配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列からなるＥＤＧ−５受容体と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
【００８０】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００８１】
塩基配列の相同性は、前記した相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、同様の条件にて計算することができる。
【００８２】
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様である。
【００８３】
ＥＤＧ受容体もしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、ＥＤＧ受容体と略記する場合がある）に対する抗体は、ＥＤＧ受容体、あるいはＥＤＧ受容体を含有する細胞を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
【００８４】
ＥＤＧ受容体に対する抗体は、ＥＤＧ受容体を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００８５】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
ＥＤＧ受容体は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
【００８６】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプタータンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【００８７】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００８８】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプタータンパク質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したレセプタータンパク質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
【００８９】
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００９０】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００９１】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（ＥＤＧ受容体等の抗原）とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物からＥＤＧ受容体等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
【００９２】
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
【００９３】
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
【００９４】
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
【００９５】
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
【００９６】
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
[レセプタータンパク質、ＤＮＡなどの用途]
ＥＤＧ受容体、ＥＤＧ受容体をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、ＥＤＧ受容体に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ（以下、本発明のアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）などは、以下の用途を有している。
（１）ＥＤＧ受容体の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤
ＥＤＧ受容体はメサンギウム細胞や糖尿病性腎症モデルラットで高発現していることから、ａ）ＥＤＧ受容体、またはｂ）ＥＤＧ受容体をコードするＤＮＡを、ＥＤＧ受容体の機能不全に関連する疾患、特に糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
【００９７】
例えば、生体内においてＥＤＧ受容体が減少しているために、ＥＤＧ受容体またはそれに対するリガンドの生理作用が期待できない（ＥＤＧ受容体の欠乏症）患者がいる場合に、ａ）ＥＤＧ受容体を該患者に投与し、ＥＤＧ受容体の量を補充したり、ｂ）（イ）ＥＤＧ受容体をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞にＥＤＧ受容体をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるＥＤＧ受容体の量を増加させ、ＥＤＧ受容体またはリガンドの作用を充分に発揮させることができる。
【００９８】
すなわち、ＥＤＧ受容体または本発明のＤＮＡは、安全で低毒性な該ＥＤＧ受容体の機能不全に関連する疾患、特に糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤として有用である。
【００９９】
ＥＤＧ受容体を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
【０１００】
一方、本発明のＤＮＡを上記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
【０１０１】
例えば、ａ）ＥＤＧ受容体、またはｂ）本発明のＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、ａ）ＥＤＧ受容体、またはｂ）本発明のＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【０１０２】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【０１０３】
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
【０１０４】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【０１０５】
ＥＤＧ受容体の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、糖尿病性腎症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病性腎症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１０６】
本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、糖尿病性腎症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病性腎症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（２）本発明のＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡを用いる診断剤及び診断方法
本発明のＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡは、プローブとして使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）におけるＥＤＧ受容体またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
【０１０７】
例えば、本発明のＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡは、糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の診断剤として使用することができる。
【０１０８】
本発明のＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
【０１０９】
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりＥＤＧ受容体の発現低下または発現過多が検出された場合は、例えば、ＥＤＧ受容体の機能不全または過剰発現に起因する疾患、特に糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫等に罹患している可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
（３）本発明のアンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを含有してなる医薬
本発明のアンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ＥＤＧ受容体の過剰発現などに起因する疾患（例えば、糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫）などの疾患の予防・治療薬として用いることができる。
【０１１０】
例えば、該アンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
【０１１１】
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
（４）ＥＤＧ受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡは、プローブとして用いることにより、ＥＤＧ受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングに用いることができる。
【０１１２】
すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物の（１）血液、（２）特定の臓器、（３）臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ｉｉ）形質転換体等に含まれるＥＤＧ受容体のｍＲＮＡ量を測定することによる、ＥＤＧ受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【０１１３】
ＥＤＧ受容体のｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
【０１１４】
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗癌剤など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肺、大腸、前立腺など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。
【０１１５】
得られた細胞に含まれる本発明のタンパク質のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、公知の手段によりノーザンブロットを行うことにより解析することもできる。
【０１１６】
（ii）ＥＤＧ受容体を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれるＥＤＧ受容体のｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
【０１１７】
ＥＤＧ受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞に含まれるＥＤＧ受容体のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれるＥＤＧ受容体のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができる。
【０１１８】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【０１１９】
試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０１２０】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、ＥＤＧ受容体の発現量を変化させる作用を有する化合物またはその塩であり、具体的には、（イ）ＥＤＧ受容体の発現量を増加させることにより、ＥＤＧ受容体を介する細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩、（ロ）ＥＤＧ受容体の発現量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩である。
【０１２１】
細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、細胞増殖、一酸化炭素産生、遊走活性、低分子量Ｇタンパク質ＲｈｏやＲａｃの活性化、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３キナーゼ活性、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、好ましくはこれらを促進する活性などが挙げられる。
【０１２２】
ＥＤＧ受容体の発現量を増加させ、該細胞刺激活性を増強させる化合物は、ＥＤＧ受容体の生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
【０１２３】
ＥＤＧ受容体の発現量を減少させ、該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、ＥＤＧ受容体の生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
【０１２４】
上記スクリーニング方法で得られるＥＤＧ受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩は、糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫などの予防・治療剤として用いることができる。
（５）ＥＤＧ受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有する各種疾病の予防・治療剤
ＥＤＧ受容体の発現量を変化させる化合物またはその塩は、ＥＤＧ受容体の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤として用いることができる。
【０１２５】
該化合物またはその塩を前記したＥＤＧ受容体の機能不全に関連する疾患、例えば糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
（６）ＥＤＧ受容体とリガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法及びスクリーニングキット
ＥＤＧ受容体等を用いるか、または組換え型レセプタータンパク質等の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、リガンドとＥＤＧ受容体等との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
【０１２６】
ＥＤＧ−２受容体に対するリガンドとしては、ＥＤＧ−２受容体に結合する化合物であれば特に限定されないが、例えば、リゾフォスファチジン酸（lysophosphatidic acid（ＬＰＡ））またはその塩などが用いられる。
【０１２７】
ＥＤＧ−３受容体に対するリガンドとしては、ＥＤＧ−３受容体に結合する化合物であれば特に限定されないが、例えば、スフィンゴシン−１−リン酸（phingosine-1-phosphate（Ｓ１Ｐ））またはその塩などが用いられる。
【０１２８】
ＥＤＧ−５受容体に対するリガンドとしては、ＥＤＧ−５受容体に結合する化合物であれば特に限定されないが、例えば、スフィンゴシン−１−リン酸（phingosine-1-phosphate（Ｓ１Ｐ））またはその塩などが用いられる。
【０１２９】
さらに、リガンドとしては、各ＥＤＧ受容体とそれに対するリガンドとの結合性を変化させる化合物（例えば、低分子合成アゴニストなど）またはその塩を用いることもできる。この各ＥＤＧ受容体とそれに対するリガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩は、例えば、リガンドとしてリゾフォスファチジン酸またはその塩あるいはスフィンゴシン−１−リン酸またはその塩を用いて、後述する本発明のスクーニング方法を実施することによって得ることができる。
【０１３０】
ＥＤＧ受容体とそれに対するリガンドとの結合性を変化させる化合物としては、例えば、ＦＴＹ７２０（2-amino-2-(2-[4-octylphenyl]ethyl)-1,3-propanediol hydrochloride）またはそのリン酸化体、ＷＯ０２／２９００１に記載の化合物、ＷＯ０３／０７３９８６に記載の化合物、ＷＯ０３／０６２２４８に記載の化合物、ＷＯ０３／０６２２５２に記載の化合物、Mol Pharmacol (2003)64,994-1005に記載の化合物（例、Ｋｉ１６４３）、J Med Chem (2002)45m,4629-4638に記載の化合物（例、2-alkylthiazolidine-4-carboxylic acids、2-(m- or p-heptylphenyl)thiazolidine-4-carboxylic acid。）、ＷＯ０３／０２４４０２に記載の化合物、ＵＳ２００３／００２７８００に記載の化合物などが用いられ、なかでもＦＴＹ７２０またはそのリン酸化体、ＷＯ０２／２９００１に記載の化合物、ＷＯ０３／０７３９８６に記載の化合物、ＷＯ０３／０６２２４８に記載の化合物、ＷＯ０３／０６２２５２に記載の化合物、ＷＯ０３／０２４４０２に記載の化合物、ＵＳ２００３／００２７８００に記載の化合物などのアゴニストが好ましく用いられる。
【０１３１】
以下、それぞれの受容体に対するリガンド（ＥＤＧ受容体とそれに対するリガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩を含む）を単にリガンドと略記する。
【０１３２】
リガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる化合物には、（イ）レセプターを介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆる、ＥＤＧ受容体に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、ＥＤＧ受容体に対するアンタゴニスト）、（ハ）リガンドとＥＤＧ受容体との結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）リガンドとＥＤＧ受容体との結合力を減少させる化合物などが含まれる。
【０１３３】
すなわち、本発明は、リガンドおよびＥＤＧ受容体もしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、ＥＤＧ受容体等）を用いて、リガンドとＥＤＧ受容体等との結合性を変化させる化合物またはその塩を選択することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング方法を提供する。具体的には、（ｉ）ＥＤＧ受容体等とリガンドとを接触させた場合と（ii）ＥＤＧ受容体等とリガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行ない、リガンドとＥＤＧ受容体等との結合性を変化させる化合物またはその塩を選択することを特徴とする糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【０１３４】
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合における、例えば、該レセプタータンパク質等に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
【０１３５】
細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、細胞増殖、一酸化炭素産生、遊走活性、低分子量Ｇタンパク質ＲｈｏやＲａｃの活性化、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３キナーゼ活性、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、特にこれらの活性を促進する活性が挙げられる。
【０１３６】
より具体的には、本発明は、
（i）標識したリガンドを、ＥＤＧ受容体等に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物をＥＤＧ受容体等に接触させた場合における、標識したリガンドのＥＤＧ受容体等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ii）標識したリガンドを、ＥＤＧ受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物をＥＤＧ受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（iii）標識したリガンドを、本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＥＤＧ受容体に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＥＤＧ受容体に接触させた場合における、標識したリガンドのＥＤＧ受容体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（iv）ＥＤＧ受容体を活性化する化合物またはその塩（例えば、リガンドなど）をＥＤＧ受容体を含有する細胞に接触させた場合と、ＥＤＧ受容体を活性化する化合物またはその塩および試験化合物をＥＤＧ受容体を含有する細胞に接触させた場合における、ＥＤＧ受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（v）ＥＤＧ受容体を活性化する化合物またはその塩（例えば、リガンドなど）を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＥＤＧ受容体に接触させた場合と、ＥＤＧ受容体を活性化する化合物またはその塩および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＥＤＧ受容体に接触させた場合における、ＥＤＧ受容体を介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【０１３７】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
【０１３８】
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＥＤＧ受容体としては、上記したＥＤＧ受容体を含有するものであれば何れのものであってもよいが、ＥＤＧ受容体を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のレセプタータンパク質等などが適している。
【０１３９】
ＥＤＧ受容体を製造するには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とするタンパク質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。ＥＤＧ受容体をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行なうことができる。
【０１４０】
なお、本発明のスクリーニング方法において、ＥＤＧ受容体を含有するものとしては、公知の方法に従って精製したＥＤＧ受容体であってもよいし、ＥＤＧ受容体を含有する細胞を用いてもよく、またＥＤＧ受容体を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【０１４１】
本発明のスクリーニング方法において、ＥＤＧ受容体を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
【０１４２】
ＥＤＧ受容体を含有する細胞としては、ＥＤＧ受容体を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。
【０１４３】
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＥＤＧ受容体と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
【０１４４】
ＥＤＧ受容体を含有する細胞や膜画分中のＥＤＧ受容体の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【０１４５】
リガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングする上記の（ｉ）〜（iii）を実施するためには、例えば、適当なＥＤＧ受容体画分と、標識したリガンドが必要である。
【０１４６】
ＥＤＧ受容体画分としては、天然型のＥＤＧ受容体画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＥＤＧ受容体画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
【０１４７】
標識したリガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。例えば〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識されたリガンドなどが用いられる。
【０１４８】
具体的には、リガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングを行なうには、まずＥＤＧ受容体を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりＥＤＧ受容体標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとＥＤＧ受容体との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔween−８０TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるＥＤＧ受容体やリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１〜１０ｍｌのＥＤＧ受容体溶液に、一定量（５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識したリガンドを添加し、同時に１０-4Ｍ〜１０-10Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は約０〜５０℃、望ましくは約４〜３７℃で、約２０分〜２４時間、望ましくは約３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ0）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【０１４９】
リガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングする上記の（iv）〜（v）の方法を実施するためには、例えば、レセプタータンパク質を介する細胞刺激活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
【０１５０】
具体的には、まず、ＥＤＧ受容体を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸、ｃＡＭＰなど）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
【０１５１】
試験化合物としては、前記と同様のものが用いられる。
【０１５２】
また、試験化合物としては、ＥＤＧ受容体の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物が好ましく用いられる。ＥＤＧ受容体の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置の測定は、公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行うことができる。
【０１５３】
ＥＤＧ受容体に対するアゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（１）または（２）に従えばよい。
（１）前記（ｉ）〜（iii）のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、リガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物またはその塩を得た後、該化合物またはその塩が上記した細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＥＤＧ受容体に対するアゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩はＥＤＧ受容体に対するアンタゴニストである。
（２）（ａ）試験化合物をＥＤＧ受容体を含有する細胞に接触させ、上記した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＥＤＧ受容体に対するアゴニストである。
（ｂ）ＥＤＧ受容体を活性化する化合物またはその塩（例えば、リガンド）をＥＤＧ受容体を含有する細胞に接触させた場合と、ＥＤＧ受容体を活性化する化合物またはその塩および試験化合物をＥＤＧ受容体を含有する細胞に接触させた場合における、ＥＤＧ受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。ＥＤＧ受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はＥＤＧ受容体に対するアンタゴニストである。
【０１５４】
リガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、ＥＤＧ受容体、ＥＤＧ受容体を含有する細胞またはその膜画分を含有するものなどである。
【０１５５】
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
【０１５６】
１．スクリーニング用試薬
(1)測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
【０１５７】
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
【０１５８】
(2)ＥＤＧ受容体標品
ＥＤＧ受容体を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
【０１５９】
(3)標識リガンド
市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識したリガンド
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
【０１６０】
(4)リガンド標準液
リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【０１６１】
２．測定法
(1)１２穴組織培養用プレートにて培養したＥＤＧ受容体発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
【０１６２】
(2)１０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０-3Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。
【０１６３】
(3)反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ  ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
【０１６４】
(4)液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式で求める。
【０１６５】
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ0−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ    ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ0   ：最大結合量
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩は、リガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる作用を有する化合物またはその塩であり、具体的には、（１）ＥＤＧ受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆる、ＥＤＧ受容体に対するアゴニスト）、（２）該細胞刺激活性を有しない化合物またはその塩（いわゆる、ＥＤＧ受容体に対するアンタゴニスト）、（３）リガンドとＥＤＧ受容体との結合力を増強する化合物またはその塩、あるいは（４）リガンドとＥＤＧ受容体との結合力を減少させる化合物またはその塩である。
【０１６６】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【０１６７】
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０１６８】
ＥＤＧ受容体に対するアゴニストは、ＥＤＧ受容体に対するリガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
【０１６９】
ＥＤＧ受容体に対するアンタゴニストは、ＥＤＧ受容体に対するリガンドが有する生理活性を抑制することができるので、該生理活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
【０１７０】
リガンドとＥＤＧ受容体との結合力を増強する化合物またはその塩は、ＥＤＧ受容体に対するリガンドが有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
【０１７１】
リガンドとＥＤＧ受容体との結合力を減少させる化合物またはその塩は、ＥＤＧ受容体に対するリガンドが有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
【０１７２】
リガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる化合物としては、例えば、ＦＴＹ７２０またはそのリン酸化体、ＷＯ０２／２９００１に記載の化合物、ＷＯ０３／０７３９８６に記載の化合物、ＷＯ０３／０６２２４８に記載の化合物、ＷＯ０３／０６２２５２に記載の化合物、Mol Pharmacol (2003)64,994-1005に記載の化合物、J Med Chem (2002)45m,4629-4638に記載の化合物、ＷＯ０３／０２４４０２に記載の化合物、ＵＳ２００３／００２７８００に記載の化合物などが用いられる。
【０１７３】
なかでもＥＤＧ受容体に対するアゴニストとしては、ＦＴＹ７２０またはそのリン酸化体、ＷＯ０２／２９００１に記載の化合物、ＷＯ０３／０７３９８６に記載の化合物、ＷＯ０３／０６２２４８に記載の化合物、ＷＯ０３／０６２２５２に記載の化合物、ＷＯ０３／０２４４０２に記載の化合物、ＵＳ２００３／００２７８００に記載の化合物などが用いられる。
【０１７４】
ＥＤＧ受容体に対するアンタゴニストとしては、ＷＯ０２／２９００１に記載の化合物、Mol Pharmacol (2003)64,994-1005に記載の化合物、J Med Chem (2002)45m,4629-4638に記載の化合物、ＷＯ０３／０２４４０２に記載の化合物、ＵＳ２００３／００２７８００に記載の化合物などが用いられる。
（７）ＥＤＧ受容体とリガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩（アゴニスト、アンタゴニストなど）を含有する各種疾病の予防・治療剤）
リガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩（アゴニスト、アンタゴニスト）やリガンド、特にアンタゴニストは、ＥＤＧ受容体の機能不全に関連する疾患、例えば、糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫に対する予防・治療剤として用いることができる。
【０１７５】
該化合物またはその塩やリガンドをＥＤＧ受容体の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤として使用する場合は、上述したような常套手段に従って製剤化することができる。
（８）本発明の抗体を用いるタンパク質などの定量、本発明の抗体を含有する診断剤およびそれを用いる診断方法
本発明の抗体は、ＥＤＧ受容体を特異的に認識することができるので、被検液中のＥＤＧ受容体の定量、特にサンドイッチ免疫測定法、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどによる定量などに使用することができる。
【０１７６】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＥＤＧ受容体またはその塩の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エンジモノジー」（Methods in ENZYMOLOGY）Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
【０１７７】
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、ＥＤＧ受容体を感度良く定量することができる。
【０１７８】
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内でのＥＤＧ受容体を定量することによって、ＥＤＧ受容体の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。
【０１７９】
例えば、本発明の抗体を用いてＥＤＧ受容体の濃度を定量することによって、ＥＤＧ受容体の濃度の増加または減少が検出された場合、例えば、ＥＤＧ受容体の機能不全または過剰発現に起因する疾患、特に糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫に罹患している可能性が高い、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【０１８０】
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するＥＤＧ受容体を特異的に検出するために使用することができる。また、ＥＤＧ受容体を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のＥＤＧ受容体の検出、被検細胞内におけるＥＤＧ受容体の挙動の分析などのために使用することができる。
（９）細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法
本発明の抗体は、ＥＤＧ受容体を特異的に認識することができるので、細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングに用いることができる。
【０１８１】
すなわち本発明は、例えば、
（ｉ）非ヒト哺乳動物の（ａ）血液、（ｂ）特定の臓器、（ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＥＤＧ受容体またはその部分ペプチドを定量することによる、細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ii）ＥＤＧ受容体を発現する形質転換体を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＥＤＧ受容体を定量することによる、細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（iii）非ヒト哺乳動物の（ａ）血液、（ｂ）特定の臓器、（ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層でのＥＤＧ受容体の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上のＥＤＧ受容体を確認することによる、細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【０１８２】
（iv）ＥＤＧ受容体を発現する形質転換体を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層でのＥＤＧ受容体の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上のＥＤＧ受容体を確認することによる、細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【０１８３】
細胞膜画分に含まれるＥＤＧ受容体の定量は具体的には以下のようにして行なう。
【０１８４】
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗癌剤など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肺、大腸、前立腺など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸濁し、臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００TM、ツイーン２０TMなど）などを用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
【０１８５】
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＥＤＧ受容体と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
【０１８６】
細胞膜画分に含まれるＥＤＧ受容体は、例えば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。
【０１８７】
かかるサンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、ウエスタンブロットは公知の手段により行なうことができる。
【０１８８】
（ii）ＥＤＧ受容体を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、細胞膜画分に含まれるＥＤＧ受容体を定量することができる。
【０１８９】
細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を定量することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を定量することにより行なうことができる。
【０１９０】
細胞膜画分に含まれるＥＤＧ受容体またはその部分ペプチドの確認は具体的には以下のようにして行なう。
【０１９１】
（iii）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肺、大腸など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層での該レセプタータンパク質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該タンパク質を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を確認することができる。
【０１９２】
（iv）ＥＤＧ受容体を発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
【０１９３】
試験化合物としては、前記と同様のものが用いられる。
【０１９４】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を変化させる作用を有する化合物またはその塩であり、具体的には、（イ）細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を増加させることにより、レセプターを介する細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩、（ロ）細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩である。
【０１９５】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【０１９６】
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０１９７】
細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を増加させ、該細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩は、ＥＤＧ受容体の生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
【０１９８】
細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を減少させ、該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、ＥＤＧ受容体の生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
（１０）細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を変化させる化合物またはその塩、及びその化合物またはその塩を含有する各種疾病の予防・治療剤
ＥＤＧ受容体は上記のとおり、例えば、生体内で重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を変化させる化合物またはその塩は、ＥＤＧ受容体の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤として用いることができる。
【０１９９】
例えば、細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を変化させる化合物、特に細胞膜におけるＥＤＧ受容体の量を減少させる化合物は、ＥＤＧ受容体の機能不全または過剰発現などに起因する疾患（例えば、糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫）の予防・治療薬として用いることができる。
【０２００】
該化合物またはその塩をＥＤＧ受容体の機能不全または過剰発現に関連する疾患の予防・治療剤として使用する場合は、上述した常套手段に従って製剤化することができる。
（１１）本発明の抗体を含有する医薬
ＥＤＧ受容体に対する中和抗体は、ＥＤＧ受容体の関与する活性、例えばシグナル伝達機能を不活性化する活性を有している。従って、本発明の抗体が中和活性を有する場合は、ＥＤＧ受容体の関与するシグナル伝達、例えば、ＥＤＧ受容体を介する細胞刺激活性を不活性化することができる。したがって、このような抗体は、ＥＤＧ受容体の過剰発現などに起因する疾患の予防・治療に用いることができる。
【０２０１】
例えば、ＥＤＧ受容体に対する抗体（例、中和抗体）は、ＥＤＧ受容体の過剰発現などに起因する疾患（例えば、糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫）の予防・治療薬として用いることができる。
【０２０２】
本発明の予防・治療剤の製剤化は、前述のＥＤＧ受容体を含有する製剤と同様に製剤化することができる。
（１２）本発明のＤＮＡ導入動物の作製
本発明は、外来性の本発明のＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
【０２０３】
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物、および
〔４〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
【０２０４】
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ導入動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを導入することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ導入動物を作出することもできる。
【０２０５】
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ1系統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
【０２０６】
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【０２０７】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
【０２０８】
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
【０２０９】
該異常ＤＮＡとしては、異常なＥＤＧ受容体を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常なＥＤＧ受容体の機能を抑制するレセプタータンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
【０２１０】
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に導入させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを導入させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ導入哺乳動物を作出することができる。
【０２１１】
ＥＤＧ受容体の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
【０２１２】
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（ａ）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ｂ）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
【０２１３】
上記ベクターは、ＤＮＡ導入哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【０２１４】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３'下流 に連結することも目的により可能である。
【０２１５】
正常なＥＤＧ受容体の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なＥＤＧ受容体の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
【０２１６】
該翻訳領域は導入動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
【０２１７】
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
【０２１８】
本発明の外来性正常ＤＮＡを導入させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
【０２１９】
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
【０２２０】
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【０２２１】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的にＥＤＧ受容体の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ導入動物を用いて、ＥＤＧ受容体の機能亢進症や、ＥＤＧ受容体が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
【０２２２】
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを導入させた哺乳動物は、遊離したＥＤＧ受容体の増加症状を有することから、ＥＤＧ受容体に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
【０２２３】
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【０２２４】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的にＥＤＧ受容体の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ導入動物を用いて、ＥＤＧ受容体の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
【０２２５】
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、ＥＤＧ受容体の機能不活性型不応症における本発明の異常レセプタータンパク質による正常レセプタータンパク質の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
【０２２６】
また、本発明の外来異常ＤＮＡを導入させた哺乳動物は、遊離したＥＤＧ受容体の増加症状を有することから、ＥＤＧ受容体の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
【０２２７】
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ導入動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ａ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ｂ）本発明のＤＮＡ導入動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたＥＤＧ受容体を分析することによる、ＥＤＧ受容体により特異的に発現あるいは活性化するＥＤＧ受容体との関連性についての解析、
（ｃ）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（ｄ）上記（ｃ）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｅ）本発明の変異レセプタータンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
【０２２８】
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、ＥＤＧ受容体の機能不活性型不応症などを含む、ＥＤＧ受容体に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、ＥＤＧ受容体に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
【０２２９】
また、本発明のＤＮＡ導入動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ導入細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、ＥＤＧ受容体産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、ＥＤＧ受容体およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
【０２３０】
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、ＥＤＧ受容体の機能不活性型不応症を含む、ＥＤＧ受容体に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ導入動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、ＥＤＧ受容体が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
（１３）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
【０２３１】
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔２〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔３〕ネオマイシン耐性である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔４〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔５〕ゲッ歯動物がマウスである第〔４〕項記載の胚幹細胞、
〔６〕本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
〔７〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔８〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔９〕ゲッ歯動物がマウスである第〔８〕項記載の非ヒト哺乳動物、および
〔１０〕第〔７〕項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【０２３２】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしているＥＤＧ受容体の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的にＥＤＧ受容体の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
【０２３３】
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【０２３４】
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【０２３５】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【０２３６】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
【０２３７】
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
【０２３８】
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【０２３９】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【０２４０】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
【０２４１】
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１〜０.５％トリプシン／０.１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
【０２４２】
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin  プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおけるＥＤＧ受容体またはＥＤＧ受容体の細胞生物学的検討において有用である。
【０２４３】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
【０２４４】
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【０２４５】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
【０２４６】
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
【０２４７】
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、ＥＤＧ受容体のヘテロ発現不全個体であり、ＥＤＧ受容体のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔からＥＤＧ受容体のホモ発現不全個体を得ることができる。
【０２４８】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
【０２４９】
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
【０２５０】
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
【０２５１】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
【０２５２】
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ＥＤＧ受容体により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、ＥＤＧ受容体の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
（１４ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
【０２５３】
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【０２５４】
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
【０２５５】
試験化合物としては、前記と同様のものが用いられる。
【０２５６】
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
【０２５７】
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【０２５８】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の疾患症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善した場合、該試験化合物を糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
【０２５９】
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、ＥＤＧ受容体の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患（例えば、糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫）に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物またはその塩から誘導される化合物またはその塩も同様に用いることができる。
【０２６０】
該スクリーニング方法で得られた化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０２６１】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＥＤＧ受容体とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
【０２６２】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【０２６３】
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に例えば、糖尿病性腎症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病性腎症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（１４ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【０２６４】
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
【０２６５】
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
【０２６６】
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
【０２６７】
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
【０２６８】
例えば、ＥＤＧ受容体をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、ＥＤＧ受容体の発現する組織で、ＥＤＧ受容体の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便にＥＤＧ受容体の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、ＥＤＧ受容体欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
【０２６９】
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
【０２７０】
該スクリーニング方法で得られた化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０２７１】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、ＥＤＧ受容体の発現を促進し、ＥＤＧ受容体の機能を促進することができるので、例えば、ＥＤＧ受容体の機能不全に関連する疾患などの予防・治療薬などの医薬として有用である。
【０２７２】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、ＥＤＧ受容体の発現を阻害し、該レセプタータンパク質の機能を阻害することができるので、例えば、ＥＤＧ受容体の発現過多に関連する疾患などの予防・治療薬などの医薬として有用である。
【０２７３】
具体的には、ＥＤＧ受容体をコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物、特にＥＤＧ受容体をコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物は、例えば、糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫などの予防・治療薬として有用である。
【０２７４】
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物またはその塩から誘導される化合物またはその塩も同様に用いることができる。
【０２７５】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＥＤＧ受容体またはその塩とリガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
【０２７６】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【０２７７】
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に例えば、糖尿病性腎症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病性腎症患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０２７８】
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
【０２７９】
また、ＥＤＧ受容体のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのレセプタータンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポータ遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、ＥＤＧ受容体そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
（１５）各種薬物の作用メカニズムの解明方法
ＥＤＧ受容体を用いることによって、各種薬物がＥＤＧ受容体を介して薬理効果を発揮しているか否かを確認することができる。
【０２８０】
すなわち、本発明は、
（ｉ）ＥＤＧ受容体を用いることを特徴とする、糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬がＥＤＧ受容体に結合することを確認する方法、
（ii）ＥＤＧ受容体を用いることを特徴とする、糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬がＥＤＧ受容体に対するアゴニストであることを確認する方法、
（iii）ＥＤＧ受容体を用いることを特徴とする、糖尿病性腎症、慢性腎不全、腎炎、糸球体腎炎、間質性腎疾患または腎性浮腫の予防・治療薬がＥＤＧ受容体に対するアンタゴニストであることを確認する方法、
（iv）各薬をＥＤＧ受容体に接触させた場合における、各薬とＥＤＧ受容体との結合量を測定することを特徴とする上記（ｉ）〜（iii）記載のスクリーニング方法を提供する。
【０２８１】
この確認方法は、前記したリガンドとＥＤＧ受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法において、試験化合物に代えて、上記の薬物を使用することによって実施することができる。
【０２８２】
また、本発明の確認方法用キットは、前記したリガンドとＥＤＧ受容体の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットにおいて、試験化合物に代えて、上記の薬物を含有するものである。
【０２８３】
このように、本発明の確認方法を用いることによって、市販または開発途中の各種薬物がＥＤＧ受容体を介して薬理効果を発揮していることを確認することができる。
（略号の表示）
本明細書において、塩基、アミノ酸、化合物等を略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づき表示を行い、その例を以下に記載する。またアミノ酸が光学異性体を取りうる場合、特に明示しなければＬ体を表す。
【０２８４】
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
ａまたはＡ      ：アデニン
ｔまたはＴ      ：チミン
ｇまたはＧ      ：グアニン
ｃまたはＣ      ：シトシン
ｕまたはＵ      ：ウラシル
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
本明細書の配列表記載の配列は以下のとおりである。
〔配列番号：１〕
ヒトＥＤＧ−２受容体のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：２〕
ヒトＥＤＧ−２受容体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：３〕
ラットＥＤＧ−２受容体のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：４〕
ラットＥＤＧ−２受容体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：５〕
ヒトＥＤＧ−３受容体のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：６〕
ヒトＥＤＧ−３受容体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：７〕
ラットＥＤＧ−３受容体の部分アミノ酸配列を表す。
〔配列番号：８〕
ラットＥＤＧ−３受容体の部分アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：９〕
ヒトＥＤＧ−５受容体のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１０〕
ヒトＥＤＧ−５受容体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：１１〕
ラットＥＤＧ−５受容体のアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１２〕
ラットＥＤＧ−５受容体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：１３〕
実施例１で用いたＥＤＧ−１受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１４〕
実施例１で用いたＥＤＧ−１受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１５〕
実施例１で用いたＥＤＧ−１受容体用プローブの塩基配列を表す。
〔配列番号：１６〕
実施例１で用いたＥＤＧ−２受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１７〕
実施例１で用いたＥＤＧ−２受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：１８〕
実施例１で用いたＥＤＧ−２受容体用プローブの塩基配列を表す。
〔配列番号：１９〕
実施例１で用いたＥＤＧ−３受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２０〕
実施例１で用いたＥＤＧ−３受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２１〕
実施例１で用いたＥＤＧ−３受容体用プローブの塩基配列を表す。
〔配列番号：２２〕
実施例１で用いたＥＤＧ−４受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２３〕
実施例１で用いたＥＤＧ−４受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２４〕
実施例１で用いたＥＤＧ−４受容体用プローブの塩基配列を表す。
〔配列番号：２５〕
実施例１で用いたＥＤＧ−５受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２６〕
実施例１で用いたＥＤＧ−５受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２７〕
実施例１で用いたＥＤＧ−５受容体用プローブの塩基配列を表す。
〔配列番号：２８〕
実施例１で用いたＥＤＧ−６受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：２９〕
実施例１で用いたＥＤＧ−６受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３０〕
実施例１で用いたＥＤＧ−６受容体用プローブの塩基配列を表す。
〔配列番号：３１〕
実施例１で用いたＥＤＧ−７受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３２〕
実施例１で用いたＥＤＧ−７受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３３〕
実施例１で用いたＥＤＧ−７受容体用プローブの塩基配列を表す。
〔配列番号：３４〕
実施例１で用いたＥＤＧ−８受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３５〕
実施例１で用いたＥＤＧ−８受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３６〕
実施例１で用いたＥＤＧ−８受容体用プローブの塩基配列を表す。
〔配列番号：３７〕
実施例２で用いたＥＤＧ−２受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３８〕
実施例２で用いたＥＤＧ−２受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：３９〕
実施例２で用いたＥＤＧ−２受容体用プローブの塩基配列を表す。
〔配列番号：４０〕
実施例２で用いたＥＤＧ−３受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：４１〕
実施例２で用いたＥＤＧ−３受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：４２〕
実施例２で用いたＥＤＧ−３受容体用プローブの塩基配列を表す。
〔配列番号：４３〕
実施例２で用いたＥＤＧ−５受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：４４〕
実施例２で用いたＥＤＧ−５受容体用プライマーの塩基配列を表す。
〔配列番号：４５〕
実施例２で用いたＥＤＧ−５受容体用プローブの塩基配列を表す。
【０２８５】
以下に参考例および実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
参考例１  遺伝子発現解析方法
以下の実施例においては、ヒト成人正常脳由来のｍＲＮＡ試料を用い、ＴａｑＭａｎ法によって、この試料中の標的Ｇタンパク質共役型レセプター、チロシンリン酸化酵素型レセプター、イオンチャネルなどのファミリーに属する遺伝子由来ｍＲＮＡの有無及びその産生量を定量し、標的Ｇタンパク質共役型レセプター、チロシンリン酸化酵素型レセプター、イオンチャネルなどのファミリーに属する遺伝子の発現レベルを解析する。本例においては、３８４穴プレートを用いて、標的Ｇタンパク質共役型レセプター（３５４種）、チロシンリン酸化酵素型レセプター、イオンチャネルなどのファミリーに属する遺伝子の発現を解析する。標的ＧＰＣＲ遺伝子として、例えばＯＲＬ；  Ｍ１；  Ｍ２；  Ｍ３；  Ｍ４；  Ｍ５；  Ａ１；  Ａ２Ａ；  Ａ２Ｂ；  Ａ３；α１Ａ；  α１Ｂ；  α１Ｄ；  α２Ａ；  α２Ｂ；  α２Ｃ；  β１；  β２；  β３；ＡＴ１；  ＡＴ２；ＢＢ１；  ＢＢ２；ｂｂ３；Ｂ１；  Ｂ２；ＣＢ１；ＣＢ２；ＣＣＲ１；  ＣＣＲ２；  ＣＣＲ３；  ＣＣＲ４；  ＣＣＲ５；  ＣＣＲ６；  ＣＣＲ７；  ＣＣＲ８；  ＣＣＲ９；  ＣＣＲ１０；  ＣＸＣＲ１；  ＣＸＣＲ２；  ＣＸＣＲ３；  ＣＸＣＲ４；  ＣＸＣＲ５；  ＣＸ３ＣＲ１；  ＸＣＲ１；  Ｃ３ａ；  Ｃ５ａ；  ｆＭＬＰ；ＣＣＫ１；  ＣＣＫ２；ＣＲＦ１；  ＣＲＦ２；Ｄ１；  Ｄ２；  Ｄ３；  Ｄ４；  Ｄ５；ＥＴＡ；  ＥＴＢ；ＧＡＬ１；  ＧＡＬ２；  ＧＡＬ３；ｍｇｌｕ１；  ｍｇｌｕ２；  ｍｇｌｕ３；  ｍｇｌｕ４；  ｍｇｌｕ５；  ｍｇｌｕ６；  ｍｇｌｕ７；  ｍｇｌｕ８；ＦＳＨ；  ＬＳＨ；  ＴＳＨ；Ｈ１；  Ｈ２；  Ｈ３；  Ｈ４；５−ＨＴ１Ａ；  ５−ＨＴ１Ｂ；  ５−ＨＴ１Ｄ；  ５−ｈｔ１Ｂ；  ５−ｈｔ１Ｆ；５−ＨＴ２Ａ；  ５−ＨＴ２Ｆ；  ５−ＨＴ２Ｃ；  ５−ＨＴ３；  ５−ＨＴ４；  ５−ｈｔ５Ａ；  ５−ｈｔ５Ｂ；  ５−ＨＴ６；  ５−ＨＴ７；  ＢＬＴ：  ＣｙｓＬＴ１；  ＣｙｓＬＴ２；ｅｄｇ１；  ｅｄｇ２；  ｅｄｇ３；  ｅｄｇ４；  ＭＣ１；  ＭＣ２；  ＭＣ３；  ＭＣ４；  ＭＣ５；ＭＴ１；  ＭＴ２；  ＭＴ３；Ｙ１；  Ｙ２；  Ｙ４；  Ｙ５；  Ｙ６；ＮＴＳ１；  ＮＴＳ２；ＤＯＰ；  ＫＯＰ；  ＭＯＰ；  ＮＯＰ；  Ｐ２Ｙ１；  Ｐ２Ｙ２；  Ｐ２Ｙ４；  Ｐ２Ｙ６；Ｐ２Ｙ１１；  Ｐ２Ｙ１２；ＰＰＡＲ−α；  ＰＰＡＲ−β；  ＰＰＡＲ−γ；ＤＰ；  ＦＰ；  ＩＰ；  ＴＰ；  ＥＰ１；  ＥＰ２；  ＥＰ３；ＥＰ４；ＰＡＲ１；  ＰＡＲ２；  ＰＡＲ３；  ＰＡＲ４；ｓｓｔ１；  ｓｓｔ２；  ｓｓｔ３；  ｓｓｔ４；  ｓｓｔ５；ＮＫ１；  ＮＫ２；  ＮＫ３；ＴＲＨ１；  ＴＲＨ２；ＶＰＡＣ１；  ＶＰＡＣ２；  ＰＡＣ１；Ｖ１ａ；  Ｖ１ｂ；  Ｖ２；  ＯＴ；  Ｎａ＋チャネル（タイプＩ；  タイプＩＩ／タイプＩＩＡ；  タイプＩＩＩ；  ＳＣＬ１１／ＮａＧ；  ＰＮ１；  ＮａＣｈ６；  ＮａＤＲＧ；  ＳｋＭ１／μ１，  ＳｋＭ２）；Ｋ＋チャネル（Ｋｖ；  ＥＡＧ；  ＫＱＴ；  ＩＲＫ；  ＲＯＭＫ；  ＧＩＲＫ；  ＫＡＴＰ等）；Ｃａ２＋チャネル（α１Ｇ；  α１Ｅ；  α１Ｓ：  α１Ｃ；  α１Ｄ；  α１Ｂ；  α１Ａ；  ＩＰ３；  リアノジンレセプターなど）；Ｃｌ−チャネル（ＧＡＢＡＡ；  ＧＡＢＡＣ；  グリシンレセプター；Ｃ１Ｃ０；  Ｃ１Ｃ１；  ＣＦＴＲなど）；非選択性カチオンチャネル（ｎＡＣｈＲ；  ５−ＨＴ３；  ＮＭＤＡ；  ＡＭＰＡ；  Ｐ２ＸＡＴＰ；  ＣＮＧなど）などから選択される。
実施例１  ヒト正常メサンギウム細胞におけるＧタンパク質共役型レセプターＥＤＧファミリーのｍＲＮＡの発現 
正常ヒトメサンギウム細胞（旭テクノグラス社より購入）から、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）のマニュアルにしたがってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。このＲＮＡ１μｇから逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従って４２℃で反応を行い、反応終了後にエタノール沈殿してＴＥに溶解した（ＲＮＡ １００ｎｇ／μｌ相当）。ＥＤＧファミリーのｍＲＮＡ発現量はＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴシステム（アプライドバイオシステムズ社）を用いて定量した。それぞれのレセプター発現量定量のために、それぞれのレセプターを特異的認識するＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーをＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ソフトウエアー）を用いて設計し合成した。
【０２８６】
ＥＤＧ−１受容体の検出用には、
5'- CCACCGACCCATGTACTATTTT -3'（配列番号：１３）,5'-TGTAGGCTACTCCTGCCAACAG -3'（配列番号：１４）およびTaqMan  probeとして5'-(Fam)- TTGGCAATCTGGCCCTCTCAGA -(Tamra)-3'（配列番号：１５）を使用した。
【０２８７】
ＥＤＧ−２受容体検出用には5'- ACTGTCAGCACATGGCTCCTT -3'（配列番号：１６）, 5'-ACCGTAATGTGCCTCTCGATT -3'（配列番号：１７）およびTaqMan  probeとして5'-(Fam)- ATTGACACCAGCCTGACGGCAT -(Tamra)-3'（配列番号：１８）を使用した。
【０２８８】
ＥＤＧ−３受容体検出用には5'- CCGTGCTCTTCTTGGTCAT-3' （配列番号：１９）, 5'- CCAGATGGCAATCAAAACC -3'（配列番号：２０）およびTaqMan  probeとして5'-(Fam)- TGCAGCTTCATCGTCTTGGAGAACCT -(Tamra)-3' （配列番号：２１）を使用した。
【０２８９】
ＥＤＧ−４受容体検出用には5'- CCTGGTCAAGACTGTTGTCATC-3'（配列番号：２２）, 5'- CAGGACATTGCAGGACTCA -3'（配列番号：２３）およびTaqMan  probeとして5'-(Fam)- TGGTACTGCTCCTGGATGGTTTAGGCT -(Tamra)-3'（配列番号：２４）を使用した。
【０２９０】
ＥＤＧ−５受容体検出用には5'- CCAACAAGGTCCAGGAACA-3'（配列番号：２５）, 5'- AGGTTTTCCACCACAATGG -3'（配列番号：２６）およびTaqMan  probeとして5'-(Fam)- AATTATACCAAGGAGACGCTGGAAACGC -(Tamra)-3'（配列番号：２７）を使用した。
【０２９１】
ＥＤＧ−６受容体検出用には5'- GAACTGCCTGTGCGCCTTT-3'（配列番号：２８）, 5'- CCATAGAGGCCCATGATGGT -3'（配列番号：２９）およびTaqMan  probeとして5'-(Fam)- TCTGCCCCTCTACTCCAAGCGCTACATC-(Tamra)-3'（配列番号：３０）を使用した。
【０２９２】
ＥＤＧ−７受容体検出用には5'- TGACTGCTTCCCTCACCAA-3'（配列番号：３１）, 5'- GCATCCTCATGATTGACATGTG -3'（配列番号：３２）およびTaqMan  probeとして5'-(Fam)- TTGCTGGTTATCGCCGTGGAGA-(Tamra)-3'（配列番号：３３）を使用した。
【０２９３】
ＥＤＧ−８受容体検出用には5'- CTTGCTCCACTGTCTTGCC-3'（配列番号：３４）, 5'- TAGAGTGCACAGATCGCGG -3'（配列番号：３５）およびTaqMan  probeとして5'-(Fam)- CTCTACGCCAAGGCCTACGTGCTCTTCT-(Tamra)-3'（配列番号：３６）を使用した。
【０２９４】
定量のための反応液はＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）のマニュアルに従い、それぞれのＧタンパク質共役型レセプターのプライマー（０．９μＭ）、プローブ（０．２５μＭ）、ｃＤＮＡをｔｏｔａｌＲＮＡ２５ｎｇ相当加えて調製した。ＰＣＲ反応は５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。その結果、ヒト正常メサンギウム細胞ではＥＤＧ−１受容体が３４、４２０コピー／２５ｎｇ  ｔｏｔａｌＲＮＡ、ＥＤＧ−２受容体が６２４、７２６コピー／２５ｎｇ  ｔｏｔａｌＲＮＡ、ＥＤＧ−３受容体が１７６、５３１コピー／２５ｎｇ  ｔｏｔａｌＲＮＡ、ＥＤＧ−４受容体が３９６コピー／２５ｎｇ  ｔｏｔａｌＲＮＡ、ＥＤＧ−５受容体が１６、４６８コピー／２５ｎｇ  ｔｏｔａｌＲＮＡ、ＥＤＧ−６受容体が２８コピー／２５ｎｇ  ｔｏｔａｌＲＮＡ、ＥＤＧ−７受容体が７２２コピー／２５ｎｇ  ｔｏｔａｌＲＮＡ、ＥＤＧ−８受容体が４，４８０コピー／２５ｎｇ  ｔｏｔａｌＲＮＡであった。このことはＥＤＧ受容体ファミリー、特にＥＤＧ−１受容体，ＥＤＧ−２受容体，ＥＤＧ−３受容体，ＥＤＧ−５受容体がメサンギウム細胞の増殖、糖の取り込み、アポトーシス、遊走などの調節を介して糖尿病性腎症などの腎臓疾患に関与していることを示すものであった。
実施例２  糖尿病性腎症モデルラットの腎臓におけるＥＤＧ受容体ｍＲＮＡ発現量解析
４２週齢、６８週齢のＷｉｓｔａｒ  ＦａｔｔｙおよびＷｉｓｔａｒ  Ｌｅａｎラットより腎臓を摘出し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）を用いてマニュアルにしたがって調製した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇからランダムプライマーを用いて逆転写反応した。逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を使用し、添付のプロトコールにしたがって反応させ、エタノール沈殿して４０μｌのＴＥに溶解した。ｍＲＮＡの発現量の定量にはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（アプライドバイオシステムズ社）を使用した。増幅と検出のためのプライマーとＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅをＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓの配列を（アプライドバイオシステムズ社）を利用してデザインした。
その配列を以下に示す。
〔ＥＤＧ−２受容体用〕
5’-TGTCCCTAGACCCAAGAGACTTTAG-3’（配列番号：３７）、
5’-GGTCCCCTTCTCTTTTCCAAA-3’（配列番号：３８）、
5’-(Fam)-ATGAACTTGCTTGGTAGCCCCCATCTTC-(Tamra)-3’（配列番号：３９）。
〔ＥＤＧ−３受容体用〕
5’-ATCTTGTACGCGCGCATCTA-3’（配列番号：４０）、
5’-TGGATCTCTCGGAGTTGTGGTT-3’（配列番号：４１）、
5’-(Fam)-TGGTCAAGTCCAGCAGCCGCAG-(Tamra)-3’（配列番号：４２）。
〔ＥＤＧ−５受容体用〕
5’-GTTTGCCCGAGAGGGTTCA-3’（配列番号：４３）、
5’-CTTGTCTCTCGATGGCAATGG-3’（配列番号：４４）、
5’-(Fam)-CTTCATCACGCTCTCTGCCTCGGTCTT-(Tamra)-3’（配列番号：４５）。
【０２９５】
定量のための反応液はＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）のプロトコールにしたがって、プライマー（０．９μＭ）、プローブ（０．２５μＭ）、サンプルｃＤＮＡを１μｌを反応液に加えて１  ｗｅｌｌあたり２０μｌとして調製した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴでの反応は、５０℃（２分）、９５℃（１０分）後、９５℃（１５秒）、６０℃（１分）のサイクルを４０回行なった。
【０２９６】
ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの定量は、ＴａｑＭａｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  ＧＡＰＤＨ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＶＩＣ  ｐｒｏｂｅ）  （アプライドバイオシステムズ社）を用いて、プロトコールにしたがって測定した。
【０２９７】
得られた各ＧＰＣＲのｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨの発現量で補正した。その結果、糖尿病性腎症モデルＷｉｓｔａｒ  Ｆａｔｔｙラットの腎臓において、ＥＤＧ−２受容体、ＥＤＧ−３受容体およびＥＤＧ−５受容体の発現量が高いことが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【０２９８】
【図１】糖尿病性腎症モデルラット（Ｗｉｓｔｅｒ）の腎臓におけるＥＤＧ−２受容体ｍＲＮＡの発現を示す。横軸のＬｅａｎはＷｉｓｔｅｒ  Ｌｅａｎを、ＦａｔｔｙはＷｉｓｔｅｒ  Ｆａｔｔｙを、４２ｗｋｓは４２週齢を、６８ｗｋｓは６８週齢を示す。縦軸はＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現量に対するＥＤＧ−２受容体  ｍＲＮＡ発現量の相対値を示す。
【図２】糖尿病性腎症モデルラット（Ｗｉｓｔｅｒ）の腎臓におけるＥＤＧ−３受容体ｍＲＮＡの発現を示す。横軸のＬｅａｎはＷｉｓｔｅｒ  Ｌｅａｎを、ＦａｔｔｙはＷｉｓｔｅｒ  Ｆａｔｔｙを、４２ｗｋｓは４２週齢を、６８ｗｋｓは６８週齢を示す。縦軸はＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現量に対するＥＤＧ−３受容体  ｍＲＮＡ発現量の相対値を示す。
【図３】糖尿病性腎症モデルラット（Ｗｉｓｔｅｒ）の腎臓におけるＥＤＧ−５受容体ｍＲＮＡの発現を示す。横軸のＬｅａｎはＷｉｓｔｅｒ  Ｌｅａｎを、ＦａｔｔｙはＷｉｓｔｅｒ  Ｆａｔｔｙを、４２ｗｋｓは４２週齢を、６８ｗｋｓは６８週齢を示す。縦軸はＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現量に対するＥＤＧ−５受容体  ｍＲＮＡ発現量の相対値を示す。
【図１】
2004203868.tif 000002
【図２】
2004203868.tif 000003
【図３】
2004203868.tif 000004
【配列表】
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