(57)【要約】【課題】ＢＭＰを効率的に輸送しうる徐放性製剤を提供すること。【解決手段】ＢＭＰおよびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＭＰおよびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤。
【請求項２】
ＢＭＰおよびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤からなる、骨形成の誘導を促進するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨形成の誘導促進ならびに骨新生促進用の徐放製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨形成因子（ＢＭＰ：Bone morphogenetic protein）は、異所性の骨形成を誘導する作用を有する蛋白質である。これまでに数種類のヒトＢＭＰ遺伝子がクローニングされており、組換え型ヒトＢＭＰを用いて、骨または軟骨の欠損の修復および治療への臨床応用が研究されている。
【０００３】
一般に、ＢＭＰを用いる骨形成には、ＢＭＰを持続的に放出させて高い局所濃度を長時間にわたり維持するため、および骨形成の足場を提供するために、ＢＭＰを適当な担体中に埋入あるいは含浸させて投与する必要がある。このような担体としては、これまでに、天然高分子（コラーゲン、不溶性骨基質（ＩＢＭ：Insoluble bone matrix）、ヒアルロン酸など）、合成高分子（ポリ乳酸、Ｌ−乳酸−パラジオキサノンランダム共重合体とポリエチレングリコールからなる、ＡＢタイプのブロック共重合体など）、無機材料（ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウムなど）等が研究されている。このなかで、コラーゲンスポンジとＩＢＭとが優れた担体として、米国での臨床試験に使用されている。
【０００４】
しかし、ヒト組換えおよび天然型のＢＭＰは、マウス、ラット、ウサギなどの小動物においてはマイクログラムのオーダーで骨形成を誘導することができるが、サルのような高等哺乳動物においては、小動物の場合と比較して骨形成誘導能が低く、骨形成誘導を得るためには、通常ミリグラムオーダーのＢＭＰが必要であることが知られている。この原因として動物種の違いによりＢＭＰの細胞応答性が異なることなどが考えられるが、これに加えて、ＢＭＰを投与部位において安定かつ有効濃度を保持させるための技術が未熟であることも考えられる。大量投与では、予期できないＢＭＰの副作用の危険性があり、したがって、体内において安定かつ有効濃度を維持するための、優れた徐放特性を有し、より少ない量のＢＭＰ投与量で骨形成を誘導しうる担体の開発が求められている。
【０００５】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】
WO94/27630
【特許文献２】
特開平７−８８１７４
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＢＭＰを骨欠損部位などの体内で効率的に徐放しうる徐放性製剤を形成することにより、骨形成を誘導し、骨欠損を有効に治療しうる薬剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＢＭＰがハイドロゲル担体内に物理的に固定化され、担体の分解とともにＢＭＰを担体から放出させるというアイデアの下に、ＢＭＰを含むハイドロゲルを用いて作製したＢＭＰの徐放性製剤がモデル動物において骨形成の誘導に顕著な効果を有することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、ＢＭＰおよびゼラチンからなるハイドロゲルを含む徐放製剤を提供する。本発明にしたがって、ＢＭＰをゼラチンハイドロゲルに含浸させてて徐放させることにより、動物種に関係なく、少ないＢＭＰ投与量で骨形成の誘導の有意な促進効果が得られる。
【０００８】
別の観点においては、本発明は、ＢＭＰおよびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤からなることを特徴とする、骨形成の誘導を促進するための医薬組成物を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明で使用されるゼラチンは、牛、豚、魚類などを始めとする各種の動物種の皮膚、骨、腱などの身体のあらゆる部位から採取できるコラーゲン、あるいはコラーゲンとして用いられている物質から、アルカリ加水分解、酸加水分解、および酵素分解等の種々の処理によって変性させて得ることができる。遺伝子組換え型コラーゲンの変性体であるゼラチンを用いてもよい。ゼラチンの性質は、用いる材料および処理方法により様々であるが、そのいずれの性質をもつゼラチンも本発明においてＢＭＰの徐放のためのハイドロゲル材料として利用することができる。
【００１０】
本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルとは、上記ゼラチンを用いて種々の化学的架橋剤とゼラチン分子間に化学架橋を形成させて得られるハイドロゲルのことである。化学的架橋剤としては、ＥＤＣ等の水溶性カルボジイミド、プロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、イミダゾール基などの間に化学結合を作る縮合剤を用いることができる。好ましいものは、グルタルアルデヒドである。また、ゼラチンは、熱処理又は紫外線照射によっても化学架橋することができる。また、これらの架橋処理を組み合わせて用いることもできる。さらに、塩架橋、静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用などを利用した物理架橋によりハイドロゲルを作製することも可能である。
【００１１】
ゼラチンの架橋度は、所望の含水率、すなわちハイドロゲルの生体吸収性のレベルに応じて適宜選択することができる。ゼラチンハイドロゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度の好ましい範囲は、ゼラチン濃度１〜２０ｗ／ｗ％、架橋剤濃度０．０１〜１ｗ／ｗ％である。架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、０〜４０℃、１〜４８時間で行うことができる。一般に、ゼラチンおよび架橋剤の濃度、架橋時間が増大するとともにハイドロゲルの架橋度は増加し、生体吸収性は低くなる。
【００１２】
ゼラチンハイドロゲルの形状は、特に制限はないが、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、粒子状などがある。円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のものは、埋込片として用いるのに適しており、あるいは細かく砕いて粒子状にして用いることも可能である。また、球状、粒子状、ペースト状のものは注射投与も可能である。
【００１３】
円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のゼラチンハイドロゲルは、ゼラチン水溶液に架橋剤水溶液を添加するか、あるいは、架橋剤水溶液にゼラチンを添加し、所望の形状の鋳型に流し込んで、架橋反応させることにより調製することができる。また、成形したゼラチンゲルにそのまま、あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加してもよい。架橋反応を停止させるには、エタノールアミン、グリシン等のアミノ基を有する低分子物質に接触させるか、あるいは、ｐＨ２．５以下の水溶液を添加する。反応に用いられた架橋剤および低分子物質を完全に除去する目的で、得られたゼラチンハイドロゲルは、蒸留水、エタノール、２−プロパノール、アセトン等により洗浄し、製剤調製に供される。
【００１４】
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルは、例えば、三口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例えば、新東科学社製、スリーワンモーター、EYELA miniD.C. スターラー等）とテフロン（登録商標）用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装置にゼラチン溶液を入れ、ここにオリーブ油等の油を加えて２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンとし、これに架橋剤水溶液を添加するか、ゼラチン水溶液を予めオリーブ油中にて前乳化（例えば、ボルテックスミキサーAdvantec TME-21、ホモジナイザー、polytron PT10-35等を用いて）しておいたものをオリーブ油中に滴下し、微粒子化したＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶液を添加して架橋反応させ、遠心分離によりゼラチンハイドロゲルを回収した後、アセトン、酢酸エチル等で洗浄し、さらに２−プロパノール、エタノール等に浸漬して架橋反応を停止させることにより、調製することができる。得られたゼラチンハイドロゲル粒子は、２−プロパノール、Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水、蒸留水等で順次洗浄し、製剤調製に供される。ゼラチンハイドロゲル粒子が凝集する場合には、例えば、界面活性剤などの添加あるいは超音波処理（冷却下、１分以内程度が好ましい）等を行ってもよい。
【００１５】
得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は、上述の粒子作製時におけるゼラチン濃度、ゼラチン水溶液とオリーブ油との体積比、および撹拌スピードなどにより変化する。一般には粒径は１〜１０００μｍであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けて使用すればよい。さらに、前乳化することによって、粒子サイズが２０μ以下の微粒子状のゼラチンハイドロゲルを得ることができる。
【００１６】
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルを調製する別法として以下の方法も挙げられる。上記の方法と同様の装置にオリーブ油を入れ、２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、ここにゼラチン水溶液を滴下してＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これを冷却後、アセトン、酢酸エチル等を加えて攪拌し、遠心分離により未架橋ゼラチン粒子を回収する。回収したゼラチン粒子を、さらにアセトン、酢酸エチル等、次いで２−プロパノール、エタノール等で洗浄後、乾燥させる。この乾燥ゼラチン粒子を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む架橋剤水溶液に懸濁させ、緩やかに攪拌しながら架橋反応させ、使用した架橋剤に応じて０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１００mMグリシン水溶液又は０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．００４Ｎ  ＨＣ１等にて洗浄し、架橋反応を停止することによりゼラチンハイドロゲル粒子を調製することができる。本法で得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は上記の方法の場合と同様である。
【００１７】
本発明のゼラチンハイドロゲルは適宜、適当な大きさ及び形に切断後凍結乾燥し滅菌して使用することができる。凍結乾燥は、例えば、ゼラチンハイドロゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で３０分以上、又は−８０℃で１時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で１〜３日間乾燥させることにより行うことができる。
【００１８】
本発明において徐放性製剤を製造するために使用されるＢＭＰの構造は（Wozney, et al., Science 1988 Dec 16;242(4885):1528-34）に記載されている。ＢＭＰは、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。例えば、遺伝子工学的手法によりＢＭＰをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＢＭＰを得ることができる。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、昆虫、かいこ、または動物細胞などを用いることができる。ＢＭＰ蛋白質は、骨形成を誘導する活性を有する限り、そのアミノ酸配列中の1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。
【００１９】
本発明のＢＭＰ含有徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、例えば、上記の凍結乾燥したゼラチンハイドロゲルにＢＭＰ水溶液を滴下するか、あるいはゼラチンをＢＭＰ水溶液中に浸漬させ、ハイドロゲル内にＢＭＰを含浸させることにより得ることができる。この含浸操作は、通常、４−３７℃で１５分間−１時間、好ましくは４−２５℃で１５−３０分間で終了し、その間にハイドロゲルはＢＭＰ水溶液で膨潤し、このプロセスの間にＢＭＰがゼラチン分子と相互作用することによって、ＢＭＰがゼラチン分子と複合体を形成し、ＢＭＰがゼラチンハイドロゲル内に物理的相互作用によって固定される。ＢＭＰとゼラチンとの間の複合体の形成には、両者の間の静電的、疎水結合、水素結合等の多くの種類の相互作用が寄与していると考えられる。
【００２０】
ゼラチン（乾燥重量）に対するＢＭＰの重量比は約１倍から約１００００倍の範囲内であることが好ましい。より好ましくは、ゼラチンに対してＢＭＰは約２倍から約５０００倍の重量比であり、さらに好ましくは約１０倍から約１０００倍の重量比である。
【００２１】
本発明のＢＭＰ徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、ＢＭＰの徐放性効果と安定化効果を持つため、ＢＭＰの機能を少量で長時間にわたって発揮し得る。そのため、局所投与した部位において、ＢＭＰによる骨形成の誘導が効果的に発揮される。現在、ＢＭＰの徐放化担体としてはコラーゲンが利用されているが、本発明のゼラチンハイドロゲルはコラーゲンと比較して、ハイドロゲルの生体吸収性をより容易にコントロールすることができる点において利点を有する。
【００２２】
ハイドロゲルにおける徐放のメカニズムは、ＢＭＰが、ハイドロゲル内のゼラチンに物理的に固定化されていることに基づく。本発明者らは、これまで、成長因子、サイトカイン、モノカイン、リンホカイン、その他の生理活性物質などの生体吸収性高分子ハイドロゲルを用いた徐放化を試み、これにより他の材料では達成できない生理活性を有した有効成分の徐放化とその徐放期間のコントロールに成功してきた。本発明においては、ＢＭＰが同様のメカニズムによってハイドロゲルから徐放されると考えられる。ゼラチンハイドロゲルに固定化され、ハイドロゲルが水に不溶である状態では、ＢＭＰはハイドロゲルから放出されない。生体内でハイドロゲルが分解されるにつれて、ゼラチン分子が水可溶性となり、それに伴って、ゼラチン分子に固定化されているＢＭＰはハイドロゲルから放出されるようになる。すなわち、ハイドロゲルの分解によって、ＢＭＰの徐放性を制御することができる。ハイドロゲルの分解性は、ハイドロゲル作製時における架橋程度を調節することにより変えることができる。また、ＢＭＰがゼラチンと相互作用することによって、これらの生体内での安定性、例えば酵素分解抵抗性などが向上する。
【００２３】
本発明のゼラチンハイドロゲルの分解速度の指標として含水率がある。これは膨潤ハイドロゲルの重量に対するハイドロゲル中の水の重量パーセントである。含水率が大きければハイドロゲルの架橋度は低くなり、分解されやすくなる。つまり、この含水率の値がＢＭＰの徐放（徐々に放出）を左右する。ハイドロゲルの生体内での酵素分解性は、この含水率によって変化する。体内の場所、動物の種類によって多少の差はあるが、分解期間が５日間から３か月間で分解するハイドロゲルの含水率は９９−８５ｗｔ％である。ハイドロゲルの分解期間はＢＭＰの徐放期間と一致するため、この場合の徐放期間も５日間から３か月の間で変化する。好ましい徐放性効果を示す含水率としては約８０〜９９ｗ／ｗ％であり、さらに好ましいものとしては、約９５〜９８ｗ／ｗ％のものが挙げられる。
【００２４】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１
ＢＭＰ含浸ゼラチンハイドロゲルの作製
等電点９．０の塩基性ゼラチン（新田ゼラチン社製）水溶液へ種々の濃度のグルタルアルデヒドを加えた。この混合液をポリプロピレン製秤量皿（１４×１４ｃｍ2）に流延後、４℃にて１２時間静置することによって、化学架橋したゼラチンシート（厚さ２ｍｍ）を得た。架橋ハイドロゲルを直径６ｍｍのディスク状に打ち抜いた後、１００ｍＭ濃度のグリシン水溶液で３７℃にて３時間処理し、未反応のグルタルアルデヒドあるいはアルデヒド基を不活性化した。次に、蒸留水にて数回洗浄し、凍結乾燥することによって架橋ゼラチンハイドロゲルを得た。凍結乾燥したハイドロゲルはエチレンオキシドガスを用いて滅菌した。凍結乾燥前後のハイドロゲルの重量を測定し、膨潤ハイドロゲルの重量に対する含水重量の比としてハイドロゲルの含水率を算出した。ハイドロゲル作製条件と含水率を表１に示す。
表１  種々の含水率を有するゼラチンハイドロゲル
【表１】
2004203829.tif 000002
【００２５】
実施例２
ＢＭＰ−２のインビボにおける徐放性
ヒト組換えＢＭＰ−２（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄらの方法にしたがって125Ｉラベル化した。凍結乾燥ゼラチンハイドロゲルディスク上に、125Ｉラベル化ＢＭＰ−２を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，ＰＢＳ）２０μｌを滴下し、４℃にて１２時間静置し、125Ｉラベル化ＢＭＰ−２をゼラチンハイドロゲルに含浸させた。125Ｉラベル化ＢＭＰ−２を含浸したゼラチンハイドロゲルをｄｄＹマウス（６週齢、メス）の背部皮下に埋入した。所定時間ごとにハイドロゲルを摘出し、その残存放射活性をガンマーカウンタ（ＡＲＣ−３０１Ｂ、Ａｌｏｋａ）を用いて測定することによって、インビボにおけるゼラチンハイドロゲルからのＢＭＰ−２の徐放挙動を評価した。コントロールとして、125Ｉラベル化ＢＭＰ−２の水溶液をマウス背部皮下に投与した後、同様に投与部位の残存放射活性を測定した。
【００２６】
図１にゼラチンハイドロゲルからのＢＭＰ−２のインビボにおける徐放挙動を示す。図から明らかなように、いずれのハイドロゲルを用いた場合にも、ＢＭＰ−２の水溶液投与と比較して、ＢＭＰ−２がより長く生体内に残存していた。ＢＭＰ−２の残存期間はハイドロゲルによって異なり、ＢＭＰ−２は含水率の低いハイドロゲル内により長く残存していることがわかった。
【００２７】
次に、それぞれのハイドロゲルの生体内での分解挙動を調べたところ、ハイドロゲルの含水率が低くなるとともに、ハイドロゲルがより長く生体内で残存することがわかった（データ示さず）。また、ハイドロゲル内でのＢＭＰ−２の残存がハイドロゲルの残存とよく相関していた。これらの結果から、ＢＭＰ−２が主としてハイドロゲルの分解にともなって徐放化されていることが示唆される。
【００２８】
実施例３
骨欠損部における骨形成誘導
滅菌したハイドロゲルに５μｇ／２０μｌ、５０μｇ／２０μｌまたは２００μｇ／２０μｌのＢＭＰ−２水溶液を滴下し、４℃で１２時間放置して、ＢＭＰ−２含浸ゼラチンハイドロゲルを得た。一方、不溶性骨基質（ＩＢＭ）（５０ｍｇ）に５μｇ／２０μｌまたは２００μｇ／２０μｌのＢＭＰ−２水溶液を滴下し、４℃で１２時間放置して、ＩＢＭにＢＭＰ−２を包含させた。ＩＢＭは骨を脱灰処理して得たものであり、通常、ＢＭＰの最も有効な担体として知られている。ＢＭＰ水溶液投与群は、２００μｇ／１００μｌのＢＭＰ−２水溶液を用いた。
【００２９】
実験動物としては、６匹のカニクイザル（雄、４−５歳、体重４−６ｋｇ、中国産、アニマルケア社より）を用いた。キシラジン（セラクタール（登録商標）、バイエルジャパン）の約０．０５ｍＬ／Ｋｇを筋肉内投与した後、塩酸ケタミン（動物用ケタラール（登録商標）５０、三共株式会社）の約０．２ｍＬ／Ｋｇを筋肉内投与して麻酔した。あるいはペントバルビタールナトリウム（ネンブタール（登録商標）、アボットラボラトリーズ）の静注で麻酔した。サルの左側頭部の頭蓋骨を露出し、直径６ｍｍの円形の骨欠損部を５箇所作製した。作製した骨欠損部へ上述の埋入物を充填した後、筋肉、皮膚をそれぞれ縫合した。
【００３０】
上述のようにして６匹のサルの頭蓋骨に計３０箇所の骨欠損部を作製し、以下の実験グループを設定した（ｎ＝３、１０グループ）。
グループ１：欠損
グループ２：ハイドロゲルのみ（含水率９７．８％）
グループ３：ＢＭＰ溶液（ＢＭＰ２００μｇ）
グループ４：ＩＢＭ（ＢＭＰ５μｇ）
グループ５：ＢＭＰ含浸ハイドロゲル（含水率９３．８％、ＢＭＰ５μｇ）
グループ６：ＢＭＰ含浸ハイドロゲル（含水率９７．８％、ＢＭＰ５μｇ）
グループ７：ＢＭＰ含浸ハイドロゲル（含水率９９．１％、ＢＭＰ５μｇ）
グループ８：ＢＭＰ含浸ハイドロゲル（含水率９７．８％、ＢＭＰ５０μｇ）
グループ９：ＢＭＰ含浸ハイドロゲル（含水率９７．８％、ＢＭＰ２００μｇ）
グループ１０：ＩＢＭ（ＢＭＰ２００μｇ）
【００３１】
骨形成の誘導はＸ線撮影により以下の条件で観察した。
撮影方法：Ｘ線撮影装置を用いて側頭部を撮影する。撮影は麻酔下（塩酸ケタミン）で行う。
撮影条件：１００Ｖ、１０ｍＡ、２．７５ｓｅｃ（骨欠損部が鮮明に撮影できる条件に設定する）
撮影時期：手術後１ヶ月までは１週ごとに、その後は２週ごとに撮影を行う。
【００３２】
手術後約３ヶ月に、塩酸ケタミンおよびペントバルビタール麻酔下で放血致死させて、頭部を摘出した。埋入部を含む頭蓋骨を切り出し、以下の条件で軟エックス線観察した。
撮影条件：５６ｋＶｐ，２．５ｍＡ，２０ｓｅｃ
撮影装置：ＨＩＴＥＸ  ＨＸ−１００
その結果、含水率９７．８％のハイドロゲルを用いた場合には、５μｇのＢＭＰ−２で有意に骨形成の誘導が認められた。一般に、サルなどの霊長類において、骨形成を誘導するために、多量の骨形成因子が必要であると考えられている。ところが、本発明のゼラチンハイドロゲルを用いることにより、これまでの担体では不可能であったような低いＢＭＰ−２投与量においてもサル頭蓋骨欠損部における骨形成が認められた。このＢＭＰ投与量は、マウスあるいはウサギの骨形成実験で使用する担体の単位体積あたりのＢＭＰ−２量（３５μｇ／ｃｍ3）に匹敵するものであり、ゼラチンハイドロゲルを用いたＢＭＰの徐放化により、動物種に関係なく、ＢＭＰの生物活性を効率よく発現させることが可能となった。
【００３３】
また、以下のようにして埋入部の骨密度を測定した。
測定方法：Dual-Energy X-ray Absorptometry（ＤＥＸＡ）法
測定装置：Ａｌｏｋａ  ＤＣＳ６００
測定条件：骨欠損部に２×２ｍｍ２のエリアを３つ設定し、それぞれのエリアの骨密度を測定し、各サンプルの平均値をデータとして採用した。
【００３４】
図２に示すように、５μｇのＢＭＰ−２を本発明のゼラチンハイドロゲルで徐放化することにより骨形成を有意に誘導することができ、その骨形成能は、現在最も骨形成誘導能が高いとされている不溶性骨基質（ＩＢＭ）に匹敵するものであった。含水率９７．８ｗｔ％のハイドロゲルが最も高い骨形成誘導能を示した。また、骨形成因子の用量依存性が見られた（図３）。
【００３５】
実施例４
コラーゲンスポンジとの比較
本発明のゼラチンハイドロゲルと、骨形成因子の担体として臨床応用されているコラーゲンスポンジとの骨形成能を比較した。コラーゲンスポンジはグンゼ株式会社より購入した。実施例２に記載のハイドロゲルの場合と同様にして、ＢＭＰ−２をコラーゲンスポンジに含浸させた。これを実施例２と同様にしてマウス背部皮下に埋入し、一定時間ごとに残存放射活性を測定した。結果を図４に示す。本発明のハイドロゲルを担体として用いた場合、コラーゲンスポンジと比較して、ＢＭＰ−２がより長く徐放化されることがわかる。
【００３６】
次に、本発明のゼラチンハイドロゲルと、コラーゲンスポンジのマウスにおける骨形成誘導能を測定した。ＢＭＰ含有ゼラチンハイドロゲルおよびコラーゲンスポンジをマウス背部皮下に埋入し、１週間、２週間または４週間後に埋入部周辺の組織を取り出し、乾燥させた後に、骨芽細胞の活性の指標であるＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）活性を測定した。ＢＭＰ−２は、強力な骨分化誘導性を有しており、筋肉内に存在する骨分化に感受性をもつ幹細胞あるいは前駆細胞に働きかけて、それらの細胞を骨芽細胞へ分化させる。この分化の程度を示す尺度がＡＬＰであり、この活性が高いほど骨形成能が高いことを示す。結果を図５に示す。本発明のハイドロゲルを担体として用いた場合、コラーゲンスポンジを用いた場合より高い骨形成誘導能が得られた。特に本発明のハイドロゲルを用いた場合、２週間後のＡＬＰ活性が有意に高く、このことは、コラーゲンスポンジと比較して、本発明のハイドロゲルはＢＭＰ−２の生物活性をより効率よく高めていることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ゼラチンハイドロゲルからのＢＭＰ−２のインビボにおける徐放を示す。
【図２】図２は、ゼラチンハイドロゲルに含浸させたＢＭＰ−２による骨形成誘導を示す。
【図３】図３は、骨形成因子の投与量が骨形成に与える影響を示す。
【図４】図４は、ゼラチンハイドロゲルおよびコラーゲンスポンジからのＢＭＰ−２のインビボにおける徐放を示す。
【図５】図５は、ゼラチンハイドロゲルまたはコラーゲンスポンジに含浸させたＢＭＰ−２のマウスにおける骨形成誘導能を示す。
【図１】
2004203829.tif 000003
【図２】
2004203829.tif 000004
【図３】
2004203829.tif 000005
【図４】
2004203829.tif 000006
【図５】
2004203829.tif 000007