(57)【要約】【課題】本発明は、新免疫療法においてＤＣ意義を見出すことによって、新免疫療法の完成を課題とする。【課題解決手段】白血球中のＤＣ（樹状細胞）のＤＣ１〔ＣＤ１１ｃ（＋）〕を測定し、マーカーとするガンの検査手段、ＤＣ１とＩＬ−１２誘導量又はＩＦＮγの相関を検査する前項１のガンの検査手段、白血球中のＤＣ（樹状細胞）のＤＣ２〔ＣＤ１１ｃ（−）〕をも測定し、ＤＣ１／ＤＣ２比を検定し、マーカーとする前項１のガンの検査手段、ガンの免疫治療剤のスクリーニング方法であって、ＤＣ１を検定し又はＤＣ１／ＤＣ２比を検定し、ＤＣ１優位をもって有効と判定するガンの免疫治療剤のスクリーニング方法を提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球中のＤＣ（樹状細胞）のＤＣ１〔ＣＤ１１ｃ（＋）〕を測定し、マーカーとするガンの検査手段。
【請求項２】
ＤＣ１とＩＬ−１２誘導量又はＩＦＮγの相関を検査する請求項１のガンの検査手段。
【請求項３】
白血球中のＤＣ（樹状細胞）のＤＣ２〔ＣＤ１１ｃ（−）〕をも測定し、ＤＣ１／ＤＣ２比を検定し、マーカーとする請求項１のガンの検査手段。
【請求項４】
ガンの免疫治療剤のスクリーニング方法であって、ＤＣ１を検定し又はＤＣ１／ＤＣ２比を検定し、ＤＣ１優位をもって有効と判定するガンの免疫治療剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１〜３の何れか一に記載の情報を自然法則を利用した媒体に担持した商業用媒体。
【請求項６】
請求項５の商業用媒体を利用した商業方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、新免疫療法のための新規な手段の提供に関する。特に、白血球中のＤＣ（樹状細胞）をマーカーにした癌治療における又は癌治療剤の有効性の判定のための手段を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
ガン（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）（ｃａｎｃｅｒ）の予防または治療のために有用な物質の選別には、従来、ガン細胞へのその直接的作用が重要視されていた。免疫賦活剤がガン治療に有用であることは認められていたが、免疫賦活剤として得られた化合物はいずれもその抗ガン効果が微弱であり、免疫療法単独または化学療法との併用治療によってもガンの十分な治療効果は達成されていない。
【０００３】
本発明者の医学博士、八木田は、先にガン治療における画期的な手法として、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）を生体内で誘発する物質の有用性に着目し、キノコ菌糸体加工物がその機能を有することを発見し、新免疫療法（Ｎｏｖｅｌ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　ｆｏｒ　ｃａｎｃｅｒ）（ＮＩＴＣ）ともいうべきガン治療法を確立した。従来ＩＬ−１２は、抗ガン効果があるものの生体内にＩＬ−１２自体を直接投与した場合には副作用を生じるために患者が治療に耐えられないという事実があり、それ自体を抗ガン剤として使用できなかった。しかし、八木田が報告したキノコ菌糸体加工物を含む製剤は、ガンの治療において著しい治癒・延命効果を達成した。つまり八木田は、ＩＬ−１２を生体内で誘発できる有効量のキノコ菌糸体加工物を投与することにより、ガンの治療目的を達成した（特開平１０−１３９６７０号公報）。
【０００４】
ＩＬ−１２は、ＴＮＦα→ＩＦＮγ→ＩＬ−１２→ＣＴＬ活性というルートでキラーＴ細胞の活性化効果と増強効果をもつ。つまりＩＬ−１２の産生増強は、キラーＴ細胞の活性化と増強により抗ガン効果が期待される。
【０００５】
八木田は、ＩＬ−１２の産生増強の系とは別にＮＫＴ細胞の活性化が抗ガン効果に有用であることを報告している。谷口等は、ＮＫＴ細胞が有するＶα２４Ｖβ１１という特異的なＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）が認識する特異的な糖脂質抗原を発見し、この抗原が、αガラクトシルセラミドであることを報告している。更に、αガラクトシルセラミドを投与した担ガンマウスでは、ＮＫＴ細胞が活性化され、ガンの消失はみられないものの転移が抑制されることを証明した。
ＮＫＴ細胞には、もう一つの受容体としてＮＫ細胞抗原受容体（ＮＫＲ−Ｐ１；ナチュラルキラー受容体Ｐ１）があることは報告されている（特集　ＮＫＴ細胞の基礎と臨床：最新医学５５巻４号２０００年８１８〜８２３ページ）。ＮＫＲ−Ｐ１もＮＫＴ細胞の活性化に関与し、この活性化が抗ガン効果がより優位であることを八木田は見出している。
【０００６】
ＮＫ細胞についても生体の抗ガン作用に係わるという報告がなされているが、これまでＮＫ細胞の活性と臨床的な抗ガン効果とが相関せず、ＩＬ−１２の産生誘発量とＮＫ細胞の活性とが完全な逆相関を示すことが八木田により証明されており、ヒトにおける抗ガン作用についてのＮＫ細胞の関与は疑問視されていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新免疫療法において、ＣＴＬ活性（ＩＬ−１２の誘導産生能、ＩＦＮγの誘導産生能）、ＮＫＴ活性、ＮＫ活性、血管新生阻害作用〔−ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦ（血管新生増生因子）の逆数（ＶＥＧＦ測定数値にマイナス１を掛けて算出したパラメーター数値）〕の測定に加えて、新たにＤＣ（樹状細胞）をも測定し、その測定値を使い各測定結果の検定の意味するところを分析し、ＣＴＬ活性、ＮＫＴ活性、ＮＫ活性及び−ＶＥＧＦに加えてＤＣのガン治療における意義を見出すことによって、新免疫療法の完成を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＤＣの動態とガンへの効果には相関性が存在することを見出し、本発明からなる新免疫療法のあらたな手段を達成した。
【０００９】
すなわち本発明は、
１．白血球中のＤＣ（樹状細胞）のＤＣ１〔ＣＤ１１ｃ（＋）〕を測定し、マーカーとするガンの検査手段。
２．ＤＣ１とＩＬ−１２誘導量又はＩＦＮγの相関を検査する前項１のガンの検査手段。
３．白血球中のＤＣ（樹状細胞）のＤＣ２〔ＣＤ１１ｃ（−）〕をも測定し、ＤＣ１／ＤＣ２比を検定し、マーカーとする前項１のガンの検査手段。
４．ガンの免疫治療剤のスクリーニング方法であって、ＤＣ１を検定し又はＤＣ１／ＤＣ２比を検定し、ＤＣ１優位をもって有効と判定するガンの免疫治療剤のスクリーニング方法。
５．前項１〜３の何れか一に記載の情報を自然法則を利用した媒体に担持した商業用媒体。
６．前項５の商業用媒体を利用した商業方法。
からなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳しく説明するが、本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者により普通に理解される意味を持つ。
【００１１】
本発明者の医学博士八木田のガン新免疫療法とは４つの異なる作用機序を組み合わせることからなる治療手段である。
第一の作用機序は、血管新生阻害物質（ベターシャーク）を投与してガンへの血流を障害してガン縮小をはかる方法である。これは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を測定することでその効果は判定が可能である。血管新生阻害作用はＶＥＧＦ値のマイナス値（−ＶＥＧＦ）で評価できる。このＶＥＧＦ値の替わりにＦＧＦ、ＨＧＦなどのその他の血管増殖因子を用いることも血管新生阻害能を評価することが可能である。またＶＥＧＦの替わりに血管新生阻害因子の正数値でもその評価が可能である（例えばエンドスタチン値）。
【００１２】
他の一つの作用機序は、β１，３グルカン構造を担持する化合物を投与してＴｈ１サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２）を誘導してＣＴＬを活性化する方法である。ＣＴＬ活性はＣＤ８（＋）パーフォリン産生能力で判定が可能であるが、このＣＤ８（＋）パーフォリン値には細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）と免疫抑制性Ｔ細胞（ＳＴＣ；　Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　Ｔ　ｃｅｌｌ）とがあり、前者はガン細胞を障害し、後者はガンの増殖に作用する。したがってその絶体値では評価はできない。しかし前者はＩＦＮγが１０　ＩＵ／ｍｌ以上かもしくはＩＬ−１２値が７．８　ｐｇ／ｍｌ以上であればＣＴＬであり、ＩＦＮγとＩＬ−１２が低値であればＳＴＣと判定される。そこでＣＴＬ活性は、ＩＦＮγ産生能力（ＩＦＮγ値）もしくはＩＬ−１２産生能力（ＩＬ−１２値）で評価が可能である。
【００１３】
第三及び第四の作用機序であるα１，３グルカン構造を担持する化合物の投与によって活性化されるｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞はＮＫ細胞とＮＫＴ細胞である。このＮＫとＮＫＴ細胞とはＮＫＲ−Ｐ１（ＮＫ細胞受容体ＣＤ１６１（＋））を共有しており、前者はＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）の表面マーカーでＮＫ細胞数は測定可能であり、その活性化はＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）パーフォリン産生能力で判定が可能である。一方後者のＮＫＴ細胞はＣＤ３（＋）ＣＤ１６１（＋）でその細胞数は測定が可能となり、そのパーフォリン産生能力でＮＫＴ細胞の活性化は測定可能である。
【００１４】
したがってガン治療における新免疫療法（ＮＩＴＣ）であっても一般的な免疫療法であっても以下の測定項目でそれぞれのｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞もしくは血管新生阻害作用を評価することが可能である。具体的には、ＣＴＬ活性はＩＦＮγあるいはＩＬ−１２の誘導産生能力で評価が可能である。ＮＫ細胞の活性化はＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）もしくはＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）パーフォリン値でも評価可能である。ＮＫＴ細胞の活性化はＣＤ３（＋）ＣＤ１６１（＋）もしくはＣＤ３（＋）ＣＤ１６１（＋）パーフォリン値でも評価が可能である。
【００１５】
本発明は、臨床における結果と、ＮＫ細胞の活性化能、ＮＫＴ細胞の活性化能、血管新生阻害能、ＩＬ−１２の誘導産生能、及びＩＦＮγの誘導産生能の相関性に加えて、ＤＣ（樹状細胞）動態を検討することにより行われた。本発明者は、新免疫療法（ＮＩＴＣ）として、ガン患者にα１，３グルカン構造を担持する化合物、β１，３グルカン構造を担持する化合物と血管新生阻害作用物質（サメ軟骨）を併用し、ＩＬ−１２、ＩＦＮγ他の各種サイトカイン、ＤＣを測定した。その結果、ＤＣ１〔ＣＤ１１ｃ（＋）〕、ＤＣ２〔ＣＤ１１ｃ（−）〕を測定し、又そのＤＣ１／ＤＣ２比を検定し、マーカーとすることはガンの検査手段として意義があることを見出した。
【００１６】
この意義を見出したことによりＤＣ１〔ＣＤ１１ｃ（＋）〕、ＤＣ２〔ＣＤ１１ｃ（−）〕の測定は、有用なＣＴＬ活性化剤のスクリーニング方法に適用可能であり、このスクリーニング方法を利用すればＣＴＬ活性化能を担持する新規β１，３グルカンの特定が可能であることも見出した。本発明では、β１，３グルカン構造を持つ茸菌糸体組成物製剤（例えばＩＬＸ、ＩＬＹ：東西医薬品）が、ＣＤ８ーフォリン産生能の測定を組み合わせれば当業者は容易にＣＴＬ活性化剤を特定可能である。
【００１７】
以上のような情報は、自然法則を利用した媒体に担持すれば有用な商業用媒体となり、またその商業用媒体は有用な商業方法を提供する。
【００１８】
本発明においてＣＴＬ活性化剤（ＩＬ−１２産生誘導剤、ＩＮＦγ産生誘導剤）は、本発明の測定法による結果を指標として、その活性化を誘導または増強し、さらに活性化を維持できる処方にて用いられる。すなわち、指標をもとに、その活性化を誘導または増強し、さらに活性化を維持できる投与量、ならびに投与期間を選択して用いられる。具体的には、その投与量は、ＣＴＬ活性化剤（ＩＬ−１２産生誘導剤、ＩＮＦγ産生誘導剤）であるβ−１，３グルカン構造を持つ化合物は１ｇ〜１０ｇ／日程度、好ましくは３ｇ〜６ｇ／日程度である。また、投与期間は一般的には１０日間〜２４ヶ月間、投与頻度は１〜３回／日で、好ましくは連日投与である。当該ＣＴＬ活性化剤（ＩＬ−１２産生誘導剤、ＩＮＦγ産生誘導剤）は、好適には経口摂取される。無論、投与量を減少させ、これらを非経口に耐え得る品質に調製することで、非経口摂取（静脈内または筋肉内投与などを含む）も可能である。
【００１９】
細胞および各サイトカインの測定方法を以下に例示する。
ＤＣ（樹状細胞）の測定は、全白血球の中からＤＣ（樹状細胞）を選択する目的で、ＨＬＡ−ＤＲ（＋）でＣｏｃｋｔａｉｌ（−）［ＣＤ３（−）、ＣＤ１４（−）、ＣＤ１６（−）、ＣＤ１９（−）、ＣＤ２０（−）、ＣＤ５６（−）］の細胞にゲートをかける。さらに、この細胞集団の中で（Ａ）ＤＣ１：ＣＤ１１ｃ（＋）と（Ｂ）ＤＣ２：ＣＤ１１ｃ（−）とに分ける。（図１）にその詳細を提示した。何れも既知繁用手段によった。
【００２０】
実施例ではガン患者の血液を用いて、血中細胞について細胞表面抗原であるＣＤ１１ｃについて陽性・陰性で区別し、各細胞の割合を、フローサイトメトリーを用いたＴｗｏ　Ｃｏｌｏｒ検査により常法通り測定した。
【００２１】
（サイトカインを測定するための試料の調製）
まず、血液より単核球画分を分離調製する。ヘパリン加末梢血をリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ）で２倍に希釈して混和した後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ液（比重１．０７７）上に重層し、４００Ｇで２０分間遠沈後、単核球画分を採取する。洗浄後、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地を加え、細胞数を１×１０６個となるように調製する。得られた細胞浮遊液２００μｌにフィトヘマグルチニン（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＤＩＦＣＯ社製）を２０μｇ／ｍｌの濃度となるように加え、９６穴マイクロプレートにて５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養し、該培養した細胞溶液中のサイトカインを測定する試料とする。
【００２２】
（ＩＬ−１２の測定）
ＩＬ−１２量の測定は自体公知の臨床、生化学的検査を利用できるが、Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社やＭＢＬ社より入手することのできる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による測定キットが使用される。ここではＲ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社の測定キットを用いた。実際には９６穴マイクロプレートの各穴に測定用希釈液Ａｓｓａｙ　Ｄｉｌｕｅｎｔ　ＲＤ１Ｆを５０μｌ、標準液（ｓｔａｎｄａｒｄ）または実施例１で調製した試料を２００μｌずつ分注した後、室温にて静置して２時間反応させた。その後、西洋わさびパーオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）標識抗ＩＬ−１２抗体を２００μｌずつ分注し２時間室温で静置した。各穴の反応液を除去し３回洗浄後、発色基質溶液を２００μｌずつ分注し、２０分間室温静置後、酵素反応停止溶液を５０μｌずつ分注した。５５０ｎｍを対照として４５０ｎｍにおける各穴の吸光度をＥｍａｘ（和光純薬株式会社製）にて測定した。ＩＬ−１２量は、ｐｇ／ｍｌとして表される。ここでＩＬ−１２産生誘発能とは、末梢血単核球画分が刺激により産生するＩＬ−１２量を、７．８ｐｇ／ｍｌ以上に増強せしめる機能、またはある物質を投与する前のＩＬ−１２産生量より増強せしめる機能を意味する。
【００２３】
（ＩＦＮγの測定）
ＩＦＮγの測定は、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ　Ｅｕｒｏｐｅ　Ｓ．社のＩＦＮγ　ＥＡＳＩＡキットを用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）で測定した。実際には９６穴マイクロプレートの各穴に標準液（ｓｔａｎｄａｒｄ）または上記調製した試料を２倍希釈したものを５０μｌずつ分注し、ＨＲＰ標識抗ＩＦＮ−γ抗体を５０μｌずつ分注し更に振盪しながら２時間室温で反応させた。各穴の反応液を除去し３回洗浄後、発色基質溶液を２００μｌずつ分注し、振盪しながら１５分間室温で反応させ、酵素反応停止溶液を５０μｌずつ分注した。６３０ｎｍを対照として４５０ｎｍおよび４９０ｎｍにおける各穴の吸光度をＥｍａｘ（和光純薬株式会社製）にて測定した。ＩＦＮγ量は、ＩＵ／ｍｌとして表される。
【００２４】
【実施例】
以下に、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。
【００２５】
【実施例１】
患者には、ＩＬ−Ｘ（東西医薬）、さめ軟骨（セイシン企業）、及びα１，３構造をもつ糖類が、各推奨処方により投与された。処置患者群の有効例（ＣＲ／完治、ＰＲ／部分治癒、ＬＮＣ／長期ガン増殖無）と無効例（ＳＮＣ／短期ガン増殖無、ＰＤ／無効）で、ＩＬ−１２の誘導産生能、ＩＦＮγ誘導産生能、及びＤＣ１〔ＣＤ１１ｃ（＋）〕、ＤＣ２〔ＣＤ１１ｃ（−）〕の寄与の関係を分析した。
【００２６】
図２はＤＣ１とＩＬ−１２の関係を示し、有効例及び無効例のいずれとも正の相関を示す。図３はＤＣ１とＩＦＮγの関係を示し、有効例及び無効例のいずれとも正の相関を示す。図４はＤＣ１／ＤＣ２比とＩＦＮγの関係を示し、有効例で正の相関を示し、無効例で逆相関を示した。また、ＤＣ１／ＤＣ２比とＩＬ−１２の関係でも、有効例で正の相関を示し、無効例で逆相関を示した。
【００２７】
【発明の効果】
以上の結果によれば、ＤＣ１、ＤＣ２及びＤＣ１／ＤＣ２比は、癌治療におけるマーカーとして有用であり、新規な意義を提供するものであり、ガン治療における画期的な成果を達成した。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＣ分離法の説明図。
【図２】ＤＣ１とＩＬ−１２の相関図。
【図３】ＤＣ１とＩＦＮγの相関図。
【図４】ＤＣ１／ＤＣ２比とＩＦＮγの相関図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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