(57)【要約】【解決手段】アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子を有効成分とするＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤。【効果】本発明によれば、アディポネクチンの投与により、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏでＡＭＰＫのリン酸化および活性が上昇することが明らかとなった。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子を有効成分とするＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ活性化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）は、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）活性を阻害することにより、筋における脂肪酸酸化を強く刺激するとともに、グルコース取り込みおよび乳酸産生などを含むグルコース利用も促進する（Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　６７，　８２１−８５５（１９９８）、Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２７７，　Ｅ１−Ｅ１０（１９９９））。すなわち、骨格筋の主要アイソフォームであるＡＣＣ−βアイソフォーム（ＡＣＣ−β）は、脂肪酸酸化に不可欠のレギュレーターである。筋収縮や低酸素状態で活性化されたＡＭＰＫはＡＣＣ−βをリン酸化することが示されており、これによるＡＣＣ活性阻害はマロニルＣｏＡ含量の低下を引き起こす。これは更に、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１活性を低下させ、脂肪酸燃焼を増大させる。ＡＭＰＫが活性化されると、ＡＭＰＫの脂肪酸に対する作用とは独立に、グルコース取り込みが刺激される。
従って、ＡＭＰＫの活性化は、脂肪酸燃焼等の運動と同様の効果を奏し、肥満症および２型糖尿病の治療薬として有用であり、ＡＭＰＫ活性化剤の開発が望まれている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、脂肪細胞から分泌されるホルモンの１つであり、エネルギーホメオスタシス及びグルコース・脂質代謝の調節に中心的役割を演じているアディポネクチンの薬理作用について研究してきたところ、ＡＭＰＫのリン酸化と活性化がアディポネクチンにより刺激されることを見出し、本発明を完成した。
【０００４】
すなわち、本発明はアディポネクチンのＣ末端側球状領域、アディポネクチン又はそれらの遺伝子を有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるアディポネクチンは、既にクローニングされており［Ｍａｅｄａ，Ｋ　ｅｔ　ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２１，２８６−２９６（１９９６）、Ｎａｋａｎｏ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２０，８０２−８１２（１９９６）］、既知の手段により入手できる。配列番号１にヒトアディポネクチンのアミノ酸配列及び塩基配列を示す。アディポネクチンは、Ｎ末端側のコラーゲン様配列（ｃＡｄ；４５〜１０９）とＣ末端側の球状領域（ｇＡｄ；１１０〜２４７）から構成されているが、Ｃ末端側の球状領域（ｇＡｄ）は、骨格筋において、完全長アディポネクチンよりも強力なＡＭＰＫ活性化作用を有する。また、本発明においては、配列番号１に示すアミノ酸配列及びｇＡｄ領域を示すアミノ酸配列を有する蛋白質だけでなく、これらのアミノ酸配列の一又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する蛋白質であってもアディポネクチンとしての作用を有するものであれば用いることができる。
【０００６】
本発明で用いられる遺伝子としては、配列番号１に示されるアディポネクチンをコードする遺伝子及びｇＡｄをコードする遺伝子が挙げられる。また、これらの遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列を有する遺伝子も用いることができる。
【０００７】
アディポネクチン又はその一部のポリペプチド（ｇＡｄを含む）は、それが存在する細胞から分離することもできるが、アディポネクチンをコードする遺伝子がすでにクローニングされているので、ＤＮＡ組み換え技術、すなわち、当該遺伝子を用いて調製した発現ベクターを利用し、形質転換した細胞を用いて調製してもよい。
【０００８】
後記実施例に示すように、ＡＭＰＫのリン酸化と活性化が、骨格筋では球状アディポネクチンにより、また肝では完全長アディポネクチンにより刺激される。また、アディポネクチンはＡＭＰＫの活性化と平行して、ＡＣＣのリン酸化、脂肪酸燃焼、筋細胞のグルコース取り込みと乳酸産生、肝におけるＡＣＣのリン酸化と糖新生関連分子の低下、およびｉｎ　ｖｉｖｏのグルコースレベルの低下も刺激する。ドミナントネガティブ変異体でＡＭＰＫをブロックすると、これらの作用がいずれも阻害されることから、アディポネクチンによるグルコース利用と脂肪酸燃焼はＡＭＰＫの活性化を介して生じることが判明した。これらの結果、脂肪細胞由来のホルモンのひとつであるアディポネクチンが、ＡＭＰＫを活性化することにより、ｉｎ　ｖｉｔｒｏとｉｎ　ｖｉｖｏのグルコース代謝とインスリン感受性を直接調節するという新規のパラダイムを示すものである。
【０００９】
本発明の医薬をヒトを含む哺乳類に投与するには、前記有効成分に薬学的に許容される担体を加えて、種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。かかる投与形態としては経口投与剤、注射用剤が挙げられるが、注射用剤が好ましい。また薬学的に許容される担体としては、蒸留水、溶解補助剤、安定化剤、乳化剤、緩衝剤等が挙げられる。また、これら医薬の投与量は、疾患、性別、体重等により変化するが、アディポネクチン又はｇＡｄ量として０．１μｇ〜１００ｍｇ／日程度であろう。
【００１０】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００１１】
Ａ．方法
（１）動物
オスＣ５７ＢＬ６マウス（週齢８〜１０）はＪａｐａｎ　ＣＲＥＡから購入した。ｉｎ　ｖｉｖｏのＡＭＰＫ活性測定には、指定量の組換えネズミアディポネクチン、または１ｇ／ｋｇ（体重）のＡＩＣＡＲを下大静脈カテーテルからマウスに静注した。各タイムポイントで骨格筋と肝を速やかに切除し液体窒素中で凍結した。
【００１２】
（２）組換えアディポネクチンの作成
細菌で発現されたネズミ完全長アディポネクチン（Ａｄ）および球状アディポネクチン（ｇＡｄ）はすでに報告された方法（Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　７，　９４１−９４６（２００１））で精製した。哺乳類発現システムで産生されたＡｄとｇＡｄは、ＡｄとｇＡｄを安定して発現しているＮＩＨ−３Ｔ３細胞から、すでに述べた方法（Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　７，　９４７−９５３（２００１））で単離・精製した。混入の可能性のあるエンドトキシンを除去するためにＡｎｔｉＣｌｅａｎ　Ｅｔｏｘアフィニティカラム（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ　Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を使用した。Ｃ２Ｃ１２筋細胞と単離肝細胞のＡＭＰＫおよびＡＣＣリン酸化、およびＣ２Ｃ１２筋細胞の脂肪酸酸化、グルコース取り込み、ないし乳酸産生に対する刺激作用については、細菌発現ｇＡｄ・Ａｄと哺乳類発現システムで産生されたｇＡｄ・Ａｄの間には、有意の差は見られなかった。
【００１３】
（３）ＡＭＰＫ活性測定
骨格筋ないし肝のアイソフォーム特異的ＡＭＰＫ活性を測定するために、プロテインＧ／セファロースビーズに結合したα１またはα２触媒サブユニットに対する特異抗体（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　３９７，　３４７−３５１（１９９６））を使用して、筋または肝細胞溶解液（タンパク量１００μｇ）からＡＭＰＫを免疫沈降させた。キナーゼ活性は、合成「ＳＡＭＳ」ペプチドと［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて測定した（Ｄｉａｂｅｔｅｓ．　４９，　５２７−５３１（２０００））。
【００１４】
（４）ウエスタンブロット解析
ヒラメ筋、肝または細胞溶解液（タンパク量４０μｇ）中のＡＭＰＫα１およびα２サブユニットとＡＣＣのリン酸化は、濃度勾配４〜１５％のＳＤＳアクリルアミドゲルと、ヒトＡＭＰＫαサブユニットのＴｈｒ１７２周辺（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびラットＡＣＣのＳｅｒ７９周辺（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）のアミノ酸配列に基づくリン酸化ペプチドに対する抗体を用いて測定した。ＤＮ−ＡＭＰＫの発現レベルは、抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０；「ペンシルバニア大学医学部細胞センター」）を用いて測定した。
【００１５】
（５）ＲＮＡ調製とノーザンブロット解析
全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用いて、製造者の指示に従って組織から調製した。各グループ５〜１０匹のマウスからの全ＲＮＡをプールし、一部をマウスＰＥＰＣＫおよびＧ６Ｐａｓｅプローブを使用するノーザンブロット解析（Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　７，　９４１−９４６（２００１））に用いた。各バンドの放射活性を定量し、２８Ｓ　ｒＲＮＡ量測定によりロード量の違いを補正したのち、各ｍＲＮＡの変化倍数を計算した。３回の独立した実験のうち１つのデータを代表として示す。
【００１６】
（６）脂質およびグルコース代謝
［１−１４Ｃ］パルミチン酸からの［１４Ｃ］ＣＯ２産生量の測定は、細胞溶解液を用いて、すでに述べた方法（Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　７，　９４１−９４６（２００１））で行った。乳酸濃度は比色法（Ｌａｃｔａｔｅ　Ｃ；　和光純薬）で測定した。グルコース取り込みはすでに述べた方法（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１６，　３０７４−３０８４（１９９６））で測定した。
【００１７】
（７）Ｃ２Ｃ１２筋細胞と単離肝細胞を用いる検討
残基１５７のアスパラギン酸からアラニンへの変異を含むα１ＡＭＰＫをコードするｃＤＮＡをＤＮ−α１ＡＭＰＫ（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　２０，　６７０４−６７１１（２０００））として使用した。この変異はキナーゼ活性を不活化するものの、複合体内部でのβおよびγサブユニットとの結合能には影響を与えないからである。残基４５のリジンからアルギニンへの変化を含むα２ＡＭＰＫをコードするｃＤＮＡをＤＮ−α２ＡＭＰＫ（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　７，　１０８５−１０９４（２０００））として使用した。この変異もキナーゼ活性を不活化する。
【００１８】
レトロウイルスを介する遺伝子導入のためのＤＮ−α２ＡＭＰＫ（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　７，　１０８５−１０９４（２０００））発現ベクターは、ｐＭＸ−ｐｕｒｏのＥＣｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位にライゲーションして構築した（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１８，　３８７１−３８７９（１９９６））。すでに述べた方法（Ｃｅｌｌ．　７９，　１１４７−１１５６（１９９４））に若干の変更を加えて、対照を挿入したレトロウイルス（Ｍｏｃｋベクター）もしくはＤＮ−α２ＡＭＰＫ（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　７，　１０８５−１０９４（２０００））挿入レトロウイルスを、同一力価でＣ２Ｃ１２細胞に感染させた。分化誘導はすでに述べた方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　９８，　２００５−２０１０（２００１））に従って実施した。５日後に、細胞を指定濃度のアディポネクチンで処理し、ＡＭＰＫとＡＣＣのリン酸化、脂肪酸燃焼、グルコース取り込み、および乳酸産生について検討した。単離肝細胞（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　２０，　６７０４−６７１１（２０００））にはＬａｃＺまたはＤＮ−α１ＡＭＰＫ（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　２０，　６７０４−６７１１（２０００））を挿入したアデノウイルスをトランスフェクションした。細胞を指定濃度のアディポネクチンで処理し、ＡＭＰＫとＡＣＣのリン酸化について検討した。
【００１９】
（８）アデノウイルスを介するｉｎ　ｖｉｖｏの遺伝子導入とアディポネクチン耐性試験
すでに述べたように（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　１０５，　１４３７−１４４５（２０００））、ＬａｃＺまたはＤＮ−α１ＡＭＰＫ（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　２０，　６７０４−６７１１（２０００））を挿入したアデノウイルスを、グラム体重あたり３×１０８プラーク形成単位（ｐｆｕ）の濃度でマウスに注入した。ＰＢＳ２００μＬにウイルスを懸濁した溶液を腹腔内注入した。注入から３〜５日後、試験前３時間マウスを絶食とした。アディポネクチン（８４μｇ／ｇ体重）を腹腔内投与して０、４、８および１２時間後、もしくは４時間後にグルコースを測定し、マウス組織を採取してノーザンブロット解析に使用した。アデノウイルスを注入したマウスの肝には、形態を含め有意の変化は見られなかった。
【００２０】
（９）アディポネクチンとＣ２Ｃ１２筋細胞ないし単離肝細胞の結合
組換え球状（ｇＡｄ）または完全長（Ａｄ）アディポネクチンをＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）にてビオチン化した。Ｃ２Ｃ１２筋細胞ないし単離肝細胞（９６穴プレート中で、５×１０４細胞／ウエル）は、指定濃度のビオチン化ｇＡｄまたはＡｄとともに、３７℃で１時間インキュベートした。ストレプトアビジン結合セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびｏ−フェニレンジアミン・２塩酸塩を用いるＥＬＩＳＡで、ビオチン化ｇＡｄまたはＡｄの細胞表面結合量を定量した。吸光度は４９２ｎｍで測定した。データは、非標識ｇＡｄまたはＡｄの１００倍過剰存在下での結合量濃度を全結合量から差し引いて示した。
【００２１】
（１０）ＡＭＰ、ＡＤＰおよびＡＴＰ含量の測定
アディポネクチンを投与したヒラメ筋またはＣ２Ｃ１２筋細胞を、氷冷したＨＣｌＯ４を含むＫＲＢ緩衝液中でホモジナイズしたのち、ＮａＯＨを加えて細胞溶解液を中和した。上清中のＡＭＰ、ＡＤＰおよびＡＴＰ含量は、すでに述べたように（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６，　２９７９−２９８５（２００１））生物発光アッセイキットを用いて測定した。
【００２２】
Ｂ，結果
（１）ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるアディポネクチンの作用
Ｃ２Ｃ１２筋細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏでアディポネクチンとともにインキュベートした。Ｃ２Ｃ１２筋細胞をアディポネクチンで６０分間処理すると、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの脂肪酸酸化が刺激された（図１）。アクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍｌ）は、ＰＰＡＲαアゴニストであるＷｙ−１４，６４３（１０−５Ｍ）刺激による脂肪酸酸化を抑制したが、アディポネクチン処理細胞に見られる脂肪酸酸化上昇には影響を与えず（図１）、アディポネクチンのこれらの作用は転写調節とは無関係である可能性が示唆された。Ｃ２Ｃ１２筋細胞をアディポネクチンで処理すると、ｉｎ　ｖｉｔｒｏのグルコース取り込みも上昇した（図２）。更に、インスリン刺激によるグルコース取り込みは麦芽マンニン（１００ｍＭ）で阻害されたが、アディポネクチンによるグルコース取り込み上昇はほとんど影響されなかった（図２）。これらの結果は、アディポネクチンのこれらの作用が、ホスファチジルイノシトール３（ＰＩ３）キナーゼとは独立の経路を介して発現することを示す。
【００２３】
ＡＭＰ類似物ＺＭＰに変換される細胞透過性ＡＭＰＫ活性化剤ＡＩＣＡＲ（５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド　１−Ｄ−リボフラノシド）でＣ２Ｃ１２筋細胞を処理すると、ＡＭＰＫのαサブユニット内のＴｈｒ１７２の持続的なリン酸化が生じた。これに対して、球状アディポネクチンないし完全長アディポネクチン処理では、急速に強力で一時的なＡＭＰＫリン酸化上昇が生じた（図３ａ）。生理的濃度範囲に近い０．１および０．５μｇ／ｍｌの球状アディポネクチンおよび１０および２５μｇ／ｍｌの完全長アディポネクチンは、連続的（図３ｂ）かつ用量依存的（図３ｃ）にＡＭＰＫリン酸化を増強した。次に、アディポネクチンがＡＭＰＫリン酸化に続いてＡＣＣリン酸化も刺激するか否かについて検討した。Ｃ２Ｃ１２筋細胞を球状アディポネクチンまたは完全長アディポネクチンで処理すると、ＡＣＣのリン酸化は連続的（図３ｄ）かつ用量依存的（図３ｅ）に上昇した。２５μｇ／ｍｌ濃度の完全長アディポネクチンでは、作用は１５分後に２．２倍と最大値に達し、これはＡＩＣＡＲによる上昇と同程度であり（図３ｅ）、６０分までにベースライン値に復帰した（図３ｄ）。
【００２４】
（２）ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるアディポネクチンの作用
骨格筋のＡＭＰＫリン酸化をアディポネクチンがｉｎ　ｖｉｖｏで刺激しうるか否かを検討するために、マウスにアディポネクチンを投与した。球状アディポネクチンないし完全長アディポネクチンをマウスに投与したところ、ヒラメ筋におけるＡＭＰＫリン酸化は用量依存的に上昇した（図４ａ，ｂ）。作用は５分後に２倍と最大値に達し、６０分までにベースライン値に復帰した（図４ｂ）。ＡＭＰＫリン酸化に対するアディポネクチンの作用は、白筋（即筋、解糖による）よりも、脂肪酸酸化速度の大きい赤筋（遅筋、酸化的リン酸化による）で顕著だったが、白色腓腹筋におけるＡＭＰＫリン酸化は、アディポネクチン投与５分後には上昇する傾向が見られた。
【００２５】
ＡＭＰＫαサブユニット内のＴｈｒ１７２のリン酸化は、α１およびα２両者のＡＭＰＫ活性化を伴う。マウスへの球状アディポネクチン投与は、α１およびα２ＡＭＰＫ活性を有意に上昇させ、完全長アディポネクチンもヒラメ筋のα２ＡＭＰＫ活性を有意に上昇させた（図５ａ，ｂ）。筋細胞表面への結合親和性がより高い球状アディポネクチン（図１４参照）の方が、完全長アディポネクチンよりも、骨格筋のＡＭＰＫ活性化に対する作用は顕著だった（図５ａ，ｂ）。次に、アディポネクチンがｉｎ　ｖｉｖｏで骨格筋ＡＭＰＫリン酸化に続いてＡＣＣリン酸化も刺激するか否かについて検討した。球状ないし完全長のアディポネクチンを投与すると、ヒラメ筋のＡＣＣリン酸化は１５分で上昇した（図６ａ，ｂ）。濃度約５０μｇ／ｍｌの球状アディポネクチンでは、１５分で２．２倍と最大値に達し、これはＡＩＣＡＲによる上昇よりも大きく（図６ｂ）、６０分までにベースライン値に復帰した（図６ｂ）。
【００２６】
アディポネクチンがＡＭＰＫを活性化するメカニズムを解明するために、ＡＭＰＫの活性化剤として知られているＡＭＰの細胞内濃度を測定した。Ｃ２Ｃ１２筋細胞（図７）とヒラメ筋（図８）のＡＭＰ含量は、アディポネクチン投与から５分後に約２倍に増加した。ＡＴＰないしＡＤＰの濃度は、アディポネクチンを投与しても変化しなかった。従って、アディポネクチン投与５分後に生じたＡＭＰＫの活性化は、細胞内ＡＭＰ濃度の上昇によるものと考えられる。
【００２７】
α２ＡＭＰＫは骨格筋における主要アイソフォームである。筋細胞のＡＣＣリン酸化、脂肪酸代謝、およびグルコース代謝に対するアディポネクチンの作用に、ＡＭＰＫ経路が必要かどうかを検討するために、骨格筋のα１およびα２ＡＭＰＫ活性に対してドミナントネガティブ作用をもつ（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　７，　１０８５−１０９４（２０００））、触媒作用の欠失したＡＭＰＫα２サブユニットでＡＭＰＫ活性化をブロックした。球状および完全長のアディポネクチンは、いずれも対照のＣ２Ｃ１２筋細胞には１．８倍のＡＭＰＫリン酸化上昇をもたらした（図９、中段）。これらの作用は、ドミナントネガティブ（ＤＮ）−α２ＡＭＰＫにより明らかにブロックされた（図９、中段）。球状および完全長のアディポネクチンは、いずれもＣ２Ｃ１２筋細胞のＡＣＣリン酸化を２．３倍（図９、下段）、脂肪酸燃焼を１．８倍（図１０）、グルコース取り込みを２倍（図１１）、更に乳酸産生を１．３倍（図１２）上昇させた。これらの作用はＤＮ−α２ＡＭＰＫでブロックされた。従って、アディポネクチンによる、筋細胞のＡＣＣリン酸化、脂肪酸燃焼、グルコース取り込みおよび乳酸産生刺激には、ＡＭＰＫの活性化が必要である。
【００２８】
次にアディポネクチンが肝細胞のＡＭＰＫも活性化するか否かを検討するために、単離した肝細胞のＡＭＰＫとＡＣＣのリン酸化についても検索を行った。単離肝細胞のＡＭＰＫ（図１３、中段）とＡＣＣ（図１３、下段）リン酸化刺激作用をもつのは完全長アディポネクチンのみで、球状アディポネクチンにはこの作用はなかった。
【００２９】
α１ＡＭＰＫは肝における主要なアイソフォームである。単離肝細胞のＡＣＣリン酸化に対するアディポネクチンの作用には、ＡＭＰＫ経路が必要かどうかを検討するために、肝細胞のα１およびα２両者のＡＭＰＫ活性に対してドミナントネガティブ作用をもつ、触媒作用の欠失したＡＭＰＫα１サブユニットでＡＭＰＫ活性化をブロックした。完全長アディポネクチンは、対照の単離肝細胞には２．３倍のＡＭＰＫリン酸化上昇をもたらした（図１３、中段）。これらの作用は、アデノウイルスを介する遺伝子導入によりＤＮ−α１ＡＭＰＫを発現させると明らかにブロックされた（図１３、上段および中段）。完全長アディポネクチンは、対照の単離肝細胞に１．７倍のＡＣＣリン酸化上昇をもたらした（図１３、下段）。これらの作用はＤＮ−α１ＡＭＰＫでは著明に低下した（図１３、下段）。従って、アディポネクチンによる単離肝細胞のＡＣＣリン酸化刺激には、ＡＭＰＫの活性化が必要である。
【００３０】
異なるフォームのアディポネクチンが肝と筋で有効に作用するメカニズムを明らかにするために、われわれは、Ｃ２Ｃ１２筋細胞ないし肝細胞表面に対する球状および完全長アディポネクチンの結合親和性を測定した。Ｃ２Ｃ１２筋細胞表面に対する結合親和性は、完全長アディポネクチンよりも球状アディポネクチンの方が高く（図１４）、肝細胞表面に対しては、球状アディポネクチンよりも完全長アディポネクチンの方が結合親和性が高かった（図１５）。これらは、肝および筋細胞におけるＡＭＰＫのリン酸化および活性に関するデータと矛盾しない。
【００３１】
次に、肝のＡＭＰＫリン酸化と活性化をアディポネクチンがｉｎ　ｖｉｖｏで刺激しうるか否かを検討するために、マウスにアディポネクチンを投与した。球状アディポネクチンではなく、肝細胞表面に対する結合親和性がより高い完全長アディポネクチン（図１５）のみが、肝のα１（図１７）およびα２ＡＭＰＫ（図１８）の活性化とリン酸化（図１６ａ，ｂ）刺激作用を有していた。作用は５分後に２．５倍と最大値に達し、６０分までにベースライン値に復帰した（図１６ｂ）。次いでアディポネクチンが、肝におけるＡＭＰＫ活性化に続くＡＣＣリン酸化をｉｎ　ｖｉｖｏで刺激するかどうかを検討した。球状アディポネクチンではなく、完全長アディポネクチンのみが、肝のＡＣＣリン酸化を上昇させる機能を有していた（図１９ａ，ｂ）。作用は１５分後に２．２倍と最大値に達し、６０分までにベースライン値に復帰した（図１９ｂ）。
【００３２】
グルコース代謝に対するｉｎ　ｖｉｖｏのアディポネクチン作用に、ＡＭＰＫ経路が必要か否かを調べるために、われわれはＬａｃＺもしくはＤＮ−α１ＡＭＰＫを挿入したアデノウイルスをマウス腹腔内に注入し、アディポネクチンのグルコース低下作用を両者で比較した。完全長アディポネクチンの投与は、ＬａｃＺ挿入アデノウイルス注入マウスのグルコースレベルを、ｉｎ　ｖｉｖｏでリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を投与した場合に比べて３０％低下させた（図２０）。ＤＮ−α１ＡＭＰＫ挿入アデノウイルスの注入は、アディポネクチンのグルコース低下作用を部分的ではあるが有意に減弱させ、アディポネクチンのグルコース低下作用の少なくとも一部はＡＭＰＫ依存性であることが示唆された。マウスへの、ＤＮ−α１ＡＭＰＫ挿入アデノウイルスの注入がアディポネクチンのグルコース低下作用を減弱させるメカニズムを明らかにするために、まずＤＮ−α１ＡＭＰＫの発現部位を検索した。肝ではＤＮ−α１ＡＭＰＫの発現が検出されたが（図２１、上段）、骨格筋など検討した他の組織では発現は検出されなかった（図２１、下段）。
【００３３】
次に、肝におけるＤＮ−α１ＡＭＰＫ発現が、アディポネクチンのグルコース低下作用を減弱させるメカニズムについて検討した。完全長のアディポネクチンは、すでに報告されているように、ＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ）やＧ６Ｐａｓｅ（グルコース−６−ホスファターゼ）など、肝の糖新生関連分子の発現レベルを低下させた（図２２）。肝でのＤＮ−α１ＡＭＰＫ発現は、アディポネクチンのこれらの作用をブロックしたが（図２２）、これは、ＡＭＰＫの活性化によりＰＥＰＣＫとＧ６Ｐａｓｅの発現レベルが低下するとした以前の報告（Ｎａｔｕｒｅ　４０４，　６３２−６３４（２０００））とも一致する。従って、アディポネクチンが、肝の糖新生関連分子の発現レベルを低下させ、ｉｎ　ｖｉｖｏのグルコースレベルの低下を引き起こすためには、肝におけるＡＭＰＫの活性化が必要である。
【００３４】
以上の結果は、アディポネクチンが、Ｃ２Ｃ１２筋細胞とｉｎ　ｖｉｖｏの骨格筋におけるグルコース取り込みと乳酸産生を増加させ、肝における糖新生関連分子の発現を低下させ、ｉｎ　ｖｉｖｏのグルコースレベルを低下させつつ、ＡＭＰＫのリン酸化および活性を上昇させることを明確に示している。更に、アディポネクチンは、Ｃ２Ｃ１２筋細胞と単離肝細胞におけるＡＣＣのリン酸化と脂肪酸燃焼も増強する。ドミナントネガティブＡＭＰＫが、筋細胞のアディポネクチン刺激グルコース取り込み、乳酸産生、ＡＣＣリン酸化および脂肪酸燃焼をブロックするとともに、肝細胞のＡＣＣリン酸化、肝の糖新生関連分子の抑制、およびｉｎ　ｖｉｖｏのグルコースレベルの低下もブロックすることから、これらの作用はＡＭＰＫを介するものと考えられる。すなわち、以上の結果は、脂肪細胞由来ホルモンであるアディポネクチンは、ＡＭＰＫを活性化し、それによりグルコース代謝とインスリン感受性を直接的に調節することを初めて示したものである。レプチンもＡＭＰＫを活性化しうるが、グルコース代謝へのＡＭＰＫの関与はレプチンでは示されていない。
【００３５】
更に以上の結果は、骨格筋では、完全長アディポネクチンよりも球状アディポネクチンの方がＡＭＰＫをより活性化し、グルコース取り込みと脂肪酸酸化をより強力に刺激するのに対し、肝ではＡＭＰＫを活性化するのはもっぱら完全長アディポネクチンのみであることも示している。これらの結果は、球状アディポネクチンは完全長アディポネクチンよりも筋細胞表面に対する結合親和性が高いのに対し（図１４）、肝細胞表面に対する結合親和性は、球状アディポネクチンよりも完全長アディポネクチンの方が高い（図１５）というデータから明らかである。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、アディポネクチンの投与により、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏでＡＭＰＫのリン酸化および活性が上昇することが明らかとなった。
【００３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるアディポネクチンによる脂肪燃焼作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝５〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体との比較、または示された２群間での比較）。
【図２】Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるアディポネクチンによるグルコース取り込み作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝５〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体との比較、または示された２群間での比較）。
【図３】Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるアディポネクチンによるＡＭＰＫ及びＡＣＣのリン酸化に及ぼす作用を示す図である（ａ、ｂ、ｃ；ＡＰＭＫのリン酸化、ｄ、ｅ；ＡＣＣのリン酸化）。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝８〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体との比較）。
【図４】ヒラメ筋におけるアディポネクチンによるＡＭＰＫαサブユニットのリン酸化に及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝８〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体との比較）。
【図５】ヒラメ筋におけるアディポネクチンによるα１ＡＭＰＫ（ａ）及びα２ＡＭＰＫ（ｂ）のリン酸化に及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝８〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体との比較）。
【図６】ヒラメ筋におけるアディポネクチンによるＡＣＣのリン酸化に及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝８〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体との比較）。
【図７】Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるアディポネクチン刺激によるＡＭＰ濃度に及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝８〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体との比較）。
【図８】ヒラメ筋におけるアディポネクチン刺激によるＡＭＰ濃度に及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝８〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体との比較）。
【図９】Ｍｏｃｋ又はＤＮ−α２ＡＭＰＫ挿入レトロウイルス感染Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるアディポネクチンによるＡＭＰＫ及びＡＣＣリン酸化に及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝５〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；示された２群間での比較、もしくはｇＡｄとＡｄの比較）。
【図１０】Ｍｏｃｋ又はＤＮ−α２ＡＭＰＫ挿入レトロウイルス感染Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるアディポネクチンによる脂肪酸燃焼作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝５〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；示された２群間での比較、もしくはｇＡｄとＡｄの比較）。
【図１１】Ｍｏｃｋ又はＤＮ−α２ＡＭＰＫ挿入レトロウイルス感染Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるアディポネクチンによるグルコース取り込みに及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝５〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；示された２群間での比較、もしくはｇＡｄとＡｄの比較）。
【図１２】Ｍｏｃｋ又はＤＮ−α２ＡＭＰＫ挿入レトロウイルス感染Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるアディポネクチンによる乳酸産生に及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝５〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；示された２群間での比較、もしくはｇＡｄとＡｄの比較）。
【図１３】ＬａｃＺ又はＤＮ−α１ＡＭＰＫ挿入アデノウイルスでトランスフェクション単離肝細胞におけるＡＭＰＫ及びＡＣＣのリン酸化に及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝５〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；示された２群間での比較、もしくはｇＡｄとＡｄの比較）。
【図１４】アディポネクチンのＣ２Ｃ１２筋細胞との結合性を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝５〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；示された２群間での比較、もしくはｇＡｄとＡｄの比較）。
【図１５】アディポネクチンの単離肝細胞との結合性を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝５〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；示された２群間での比較、もしくはｇＡｄとＡｄの比較）。
【図１６】ＬａｃＺ又はＤＮ−α１ＡＭＰＫ挿入アデノウイルスでトランスフェクションしたマウスの肝におけるアディポネクチンによるＡＭＰＫαサブニユットのリン酸化に及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝８〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体のみとの比較）。
【図１７】ＬａｃＺ又はＤＮ−α１ＡＭＰＫ挿入アデノウイルスでトランスフェクションしたマウス肝における、アディポネクチンによるα１ＡＭＰＫ活性に及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝８〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体のみとの比較）。
【図１８】ＬａｃＺ又はＤＮ−α１ＡＭＰＫ挿入アデノウイルスでトランスフェクションしたマウス肝における、アディポネクチンによるα２ＡＭＰＫ活性に及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝８〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体のみとの比較）。
【図１９】ＬａｃＺ又はＤＮ−α１ＡＭＰＫ挿入アデノウイルスでトランスフェクションしたマウスの肝におけるアディポネクチンによるＡＣＣのリン酸化に及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝８〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体のみとの比較）。
【図２０】ＬａｃＺ又はＤＮ−α１ＡＭＰＫ挿入アデノウイルスでトランスフェクションしたマウスを指定時間、アディポネクチンで処理（１８４μｇ／ｇ体重）した場合のアディポネクチン耐性試験時の血漿グルコースレベルを示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝８〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体のみとの比較）。
【図２１】ＬａｃＺ又はＤＮ−α１ＡＭＰＫ挿入アデノウイルスでトランスフェクションしたマウスをアディポネクチンで４時間処理（８４μｇ／ｇ体重）した場合の肝（上段）及び骨格筋（下段）のＤＮ−α１ＡＭＰＫ活性に及ぼす作用を示す図である。各バーは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝８〜１０）を示す。（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；媒体のみとの比較）。
【図２２】ＬａｃＺ又はＤＮ−α１ＡＭＰＫ挿入アデノウイルスでトランスフェクションしたマウスを、アディポネクチンで４時間処理（８４μｇ／ｇ体重）した場合の、肝中のＰＥＰＣＫおよびＧ６Ｐａｓｅ　ｍＲＮＡ量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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