(57)【要約】【課題】選択結合性物質の反応時間を短縮でき、反応の偏りがなく効率的なハイブリダイゼーション方法を提供する。【解決手段】基材上に選択結合性物質を固定化し、該選択結合性物質と選択的に結合する対応選択結合性物質を含む被検試料溶液を前記固定化選択結合性物質と接触させ、前記選択結合性物質と前記対応選択結合性物質を結合反応させる工程において、前記選択結合性物質を固定化した固定化部位の面に垂直な軸に交差する方向で、且つ前記選択結合性物質固定化領域の両端より外側に配置した対向する２つの平行移動用電極間に交流電圧を印加し、前記基材の前記選択結合性物質を固定化した部位の直下に配設した垂直移動用下部電極と、前記被検試料溶液を介して前記選択結合性物質固定化面と対向する位置に配置した垂直移動用上部電極間に電圧を印加し、前記結合反応を行わせる選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法とハイブリダイゼーション装置および選択結合性物質固定用基材。【選択図】　図１
2004020386.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材上に選択結合性物質を固定化し、該選択結合性物質と選択的に結合する対応選択結合性物質を含む被検試料溶液を前記固定化選択結合性物質と接触させ、前記選択結合性物質と前記対応選択結合性物質を結合反応させる工程において、前記選択結合性物質を固定化した固定化部位の面に垂直な軸に交差する方向で、且つ前記選択結合性物質固定化部位の両端より外側に配置した対向する２つの平行移動用電極間に交流電圧を印加し、前記基材の前記選択結合性物質を固定化した部位の直下に配設した垂直移動用下部電極と、前記被検試料溶液を介して前記選択結合性物質固定化面と対向する位置に配置した垂直移動用上部電極間に電圧を印加し、前記結合反応を行わせる選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法。
【請求項２】
前記選択結合性物質固定化部位が複数配列された選択結合性物質配列領域が存在し、前記平行移動用電極が該選択結合性物質配列領域の両端より外側に配置される請求項１に記載の選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法。
【請求項３】
前記平行移動用電極間に交流電圧を印加する期間と、前記垂直移動用下部電極と垂直移動用上部電極間に電圧を印加する期間が交互に存在する請求項１に記載の選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法。
【請求項４】
前記垂直移動用下部電極と垂直移動用上部電極間に印加する直流電圧が、前記垂直移動用下部電極側が垂直移動用上部電極に対して正電位である請求項３に記載の選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法。
【請求項５】
前記垂直移動用下部電極と垂直移動用上部電極間に印加する電圧が、前記垂直移動用下部電極側が垂直移動用上部電極に対して正電位であり、かつ直流成分と交流成分が混在する電圧印加パターンを有する請求項３に記載の選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法。
【請求項６】
前記選択結合性物質が、核酸、タンパク質、糖類、抗体および抗原性化合物から選ばれる少なくとも１種である請求項１〜５いずれか１項に記載の選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法。
【請求項７】
前記選択結合性物質および前記対応選択結合成物質が一本鎖核酸であり、前記結合反応が核酸間のハイブリダイゼーションである請求項６に記載の選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法。
【請求項８】
基材上に選択結合性物質を固定化し、該選択結合性物質と選択的に結合する対応選択結合性物質を含む被検試料溶液を前記固定化された選択結合性物質と接触させ、前記選択結合性物質と前記対応選択結合性物質を結合反応させる装置であって、前記基材を設置する基台と、前記選択結合性物質を固定化した面の垂直軸に交差する方向で、且つ前記選択結合性物質固定化領域の両端より外側に配置した対向する２つの平行移動用電極と、該平行移動用電極間に交流電圧を印加する交流電圧印加手段と、前記基材上の前記選択結合性物質を固定化した部位の直下に配設した垂直移動用下部電極と、前記被検試料溶液を介して前記選択結合性物質固定化面と対向する位置に配置した垂直移動用上部電極と、該垂直移動用上部電極と前記垂直移動用下部電極間に直流電圧および／又は交流電圧を印加する直流・交流印加手段とを有する選択結合性物質のハイブリダイゼーション装置。
【請求項９】
前記平行移動用電極、前記垂直移動用上部電極の材質が、それぞれ白金、チタン、金、銀、アルミニウム、銅、パラジウムの金属単体あるいはそれらの合金、炭素あるいは炭素化合物、または導電性ポリマーから選ばれる少なくとも１種である請求項８に記載の選択結合性物質のハイブリダイゼーション装置。
【請求項１０】
基材上に選択結合性物質を固定化し、該選択結合性物質と選択的に結合する対応選択結合性物質を含む被検試料溶液を前記固定化された選択結合性物質と接触させ、前記選択結合性物質と前記対応選択結合性物質を結合反応させるための基材であって、基材上の選択結合性物質を固定化する、選択結合性物質固定用部位と、選択結合性物質固定用領域の両端より外側に配置された対向する２つの平行移動用電極と、前記選択結合性物質固定用部位の直下に配設した垂直移動用下部電極と、該垂直移動用下部電極につながる導電パターン配線とを有する選択結合性物質固定用基材。
【請求項１１】
前記選択結合性物質固定用部位が複数存在し、それらが配列された選択結合性物質配列領域が存在し、前記電極は、該選択結合性物質配列領域の両端より外側に配列される請求項１０に記載の選択結合性物質固定用基材。
【請求項１２】
前記選択結合性物質固定用部位が基材上に設けられた凸部又は凹部である請求項１０または１１に記載の選択結合性物質固定用基材。
【請求項１３】
前記選択結合性物質固定用部位が、前記基材に設けられた孔に挿入された繊維又は該繊維束である請求項１２に記載の選択結合性物質固定用基材。
【請求項１４】
前記選択結合性物質が、核酸、タンパク質、糖類、抗体および抗原性化合物から選ばれる少なくとも１種である請求項１０〜１３いずれか１項に記載の選択結合性物質固定用基材。
【請求項１５】
前記選択結合性物質および前記対応選択結合性物質が一本鎖核酸であり、前記結合反応が核酸間のハイブリダイゼーションである請求項１４に記載の選択結合性物質固定用基材。
【請求項１６】
前記平行移動用電極および／又は前記垂直移動用下部電極の材質が、それぞれ白金、チタン、金、銀、アルミニウム、銅、パラジウムの金属単体あるいはそれらの合金、炭素あるいは炭素化合物、または導電性ポリマーから選ばれる少なくとも１種である請求項１０〜１５いずれか１項に記載の選択結合性物質固定用基材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性物質」）と、被検物質（本明細書において「対応選択結合性物質」）との結合反応方法、そのための装置および基材に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能については、各種の方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンハイブリダイゼーション、あるいはサザンハイブリダイゼーションのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンハイブリダイゼーションに代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
【０００３】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法としてＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発され、注目を集めている。これらの方法は、いずれも核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じであり、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間のハイブリダイゼーションに基づく蛋白質や糖鎖検出・定量にも応用が可能である。これらの技術は、マイクロアレイ又はチップと呼ばれる平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を蛍光色素等でラベル後、高解像度解析装置で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。こうして、サンプル中に含まれる遺伝子の種類を迅速に推定できる。
【０００４】
一方、核酸／核酸間ハイブリダイゼーションに使用される核酸溶液は貴重であるため、できるだけ核酸の量を少なくしてハイブリダイゼーション反応を行わせることが望ましく、その為に核酸溶液の核酸濃度を低くすることが考えられ、低濃度の核酸溶液とのハイブリダイゼーションにおいて効率を良くすることが必要となる。しかしながら従来用いられている、平面基板片上に多数のＤＮＡ断片やタンパク質、糖鎖などの選択結合性物質が高密度に整列固定化されたマイクロアレイ、あるいは前記選択結合性物質が多孔質中空繊維内部に固定化された該多孔質中空繊維を結束固定し、配列体の繊維軸と交差する方向に切断して薄片とし、前記選択結合性物質を繊維内部に固定した二次元高密度繊維配列体としたマイクロアレイ、あるいは繊維表面に前記選択結合性物質が高密度に整列固定化され、繊維を三次元構造体として配列したマイクロアレイなどにおいては、ハイブリダイゼーション反応を選択結合性物質の自然拡散に依存しており、少量の選択結合性物質を含む溶液を用いて効率よくハイブリダイゼーション反応を起こさせ、貴重な選択結合性物質を有効に利用することが困難である。
【０００５】
そこで、前記マイクロアレイの基板上に導電体層を有する標本核酸固定部位を配設し、該標本核酸固定部位にプラス電位を印加して電場をつくり、前記核酸溶液中の検体核酸を前記標本核酸固定部位近傍に引き寄せ、標本核酸固定部位近傍の核酸濃度を局所的に高め、ハイブリダイゼーション効率を上げる試みもなされている（特開平８−１５４６５６号公報）。
【０００６】
蛋白質や糖鎖を用いたマイクロアレイについても、これら核酸を用いたマイクロアレイ同様の効果が期待される。
【０００７】
しかしながら、前記導電体層を用いた方法では検体核酸および標本核酸固定部位に固定された標本核酸が標本核酸固定部位に電気的に吸着されてしまうため、核酸の移動が制限され、ハイブリダイゼーションは検体核酸が標本核酸固定部位に引き寄せられる期間に起こる核酸間の衝突で飽和し、ハイブリダイゼーション時間を長くしても未反応の核酸が多数残り、ハイブリダイゼーション反応に少量の検体核酸を有効に利用することに限界がある。したがって、この非効率性を解消すべく発明された電気的吸引による選択結合性物質のハイブリダイゼーション反応の効率化方法においても効率化は十分ではなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況下、高価な核酸、蛋白、糖鎖、抗体、抗原などの高分子体試料を少量でかつ有効に利用できるハイブリダイゼーションの方法を確立することは、今後重要性を増すと考えられる高分子体解析に強く求められるものである。
【０００９】
本発明は以上説明したような従来の欠点を解消し、少量の選択結合性物質を有効に利用してハイブリダイゼーション反応を短時間で行わせるハイブリダイゼーション方法、ハイブリダイゼーション装置および選択結合性物質固定用基材を提供することをその目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上述の如き課題を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、ハイブリダイゼーション反応期間中、対応選択結合性物質をマイクロアレイ基板、あるいは繊維上に固定した前記選択結合性物質近傍で常時移動させ、前記選択結合性物質と前記対応選択結合性物質の衝突確率を高めることによりハイブリダイゼーション反応の効率を高め、結合反応の均一性を向上させ得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）基材上に選択結合性物質を固定化し、該選択結合性物質と選択的に結合する対応選択結合性物質を含む被検試料溶液を前記固定化選択結合性物質と接触させ、前記選択結合性物質と前記対応選択結合性物質を結合反応させる工程において、前記選択結合性物質を固定化した固定化部位の面に垂直な軸に交差する方向で、且つ前記選択結合性物質固定化部位の両端より外側に配置した対向する２つの平行移動用電極間に交流電圧を印加し、前記基材の前記選択結合性物質を固定化した部位の直下に配設した垂直移動用下部電極と、前記被検試料溶液を介して前記選択結合性物質固定化面と対向する位置に配置した垂直移動用上部電極間に電圧を印加し、前記結合反応を行わせる選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法、
（２）基材上に選択結合性物質を固定化し、該選択結合性物質と選択的に結合する対応選択結合性物質を含む被検試料溶液を前記固定化された選択結合性物質と接触させ、前記選択結合性物質と前記対応選択結合性物質を結合反応させる装置であって、前記基材を設置する基台と、前記選択結合性物質を固定化した面の垂直軸に交差する方向で、且つ前記選択結合性物質固定化領域の両端より外側に配置した対向する２つの平行移動用電極と、該平行移動用電極間に交流電圧を印加する交流電圧印加手段と、前記基材上の前記選択結合性物質を固定化した部位の直下に配設した垂直移動用下部電極と、前記被検試料溶液を介して前記選択結合性物質固定化面と対向する位置に配置した垂直移動用上部電極と、該垂直移動用上部電極と前記垂直移動用下部電極間に直流電圧および／又は交流電圧を印加する直流・交流印加手段とを有する選択結合性物質のハイブリダイゼーション装置、
（３）基材上に選択結合性物質を固定化し、該選択結合性物質と選択的に結合する対応選択結合性物質を含む被検試料溶液を前記固定化された選択結合性物質と接触させ、前記選択結合性物質と前記対応選択結合性物質を結合反応させるための基材であって、基材上の選択結合性物質を固定化する、選択結合性物質固定用部位と、選択結合性物質固定用領域の両端より外側に配置された対向する２つの平行移動用電極と、前記選択結合性物質固定用部位の直下に配設した垂直移動用下部電極と、該垂直移動用下部電極につながる導電パターン配線とを有する選択結合性物質固定用基材である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法は、ハイブリダイゼーション反応期間中、対応選択結合性物質を固定した選択結合性物質近傍で常時移動させ、選択結合性物質と対応選択結合性物質の衝突確率を高めることで効率よくハイブリダイゼーション反応を行うものであり、選択結合性物質を固定化した固定化部位の面に垂直な軸に交差する方向で、且つ選択結合性物質固定化部位の両端より外側に配置した対向する２つの平行移動用電極間に交流電圧を印加し、選択結合性物質を固定化した部位の直下に配設した垂直移動用下部電極と、被検試料溶液を介して選択結合性物質固定化面と対向する位置に配置した垂直移動用上部電極間に電圧を印加することが重要である。
【００１３】
また、本発明のハイブリダイゼーション装置は、上記方法を遂行するために好ましい装置であり、基材を設置する基台と、選択結合性物質を固定化した面の垂直軸に交差する方向で、且つ選択結合性物質固定化領域の両端より外側に配置した対向する２つの平行移動用電極と、該平行移動用電極間に交流電圧を印加する交流電圧印加手段と、基材上の選択結合性物質を固定化した部位の直下に配設した垂直移動用下部電極と、被検試料溶液を介して選択結合性物質固定化面と対向する位置に配置した垂直移動用上部電極と、該垂直移動用上部電極と垂直移動用下部電極間に直流電圧および／又は交流電圧を印加する直流・交流印加手段とを有するものである。
【００１４】
本発明において、前記平行移動用電極、垂直移動用上部電極、垂直移動用下部電極（以下、後者２つを指称する場合、垂直移動用電極と言う）に用いることができる材質としては、白金、金、銀、クロム、チタン、ニッケル、アルミニウム、銅、パラジウム等の金属単体、またはこれらの金属の酸化物、窒化物あるいはそれらの合金、炭素あるいは炭素化合物、または導電性ポリマー等が挙げられ、これらの中から選ばれる少なくとも１種が含まれていればよい。
【００１５】
金属単体またはこれらの金属の酸化物、窒化物あるいはそれらの合金の特性としては、これらの材質を用いて配設した平行移動用電極間および／又は垂直移動用電極間に電圧を印加することにより前記対応選択結合性物質を含む被検試料溶液を介して該平行移動用電極間および／又は該垂直移動用電極間に電流が流れる為、被検試料溶液と反応し、被検試料溶液中に金属イオンが溶出し難い材質が好ましい。
【００１６】
炭素化合物の代表例としては、グラファイト、フラーレン等が挙げられる。
【００１７】
導電性ポリマーの代表例としては、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン等が挙げられ、これらの導電性ポリマーと前記金属、炭素化合物などを混ぜ合わせ、導電特性を改良した複合導電性プラスチック等も挙げられる。
【００１８】
前記平行移動用電極および／又は前記垂直移動用上部・下部電極の材質が、それぞれ白金、チタン、金、銀、アルミニウム、銅、パラジウムの金属単体あるいはそれらの合金、炭素あるいは炭素化合物、または導電性ポリマーから選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００１９】
平行移動用電極は後述する理由により、予め選択結合性物質固定用基材上に形成されることが好ましいが、ハイブリダイゼーション装置側に電極を有し、ハイブリダイゼーション準備段階で選択結合性物質固定用基材上に電極を装着する形態でも構わない。
【００２０】
従って、本発明において好ましく使用される選択結合性物質固定用基材として、基材上の選択結合性物質を固定化する選択結合性物質固定用部位と、選択結合性物質固定用領域の両端より外側に配置された対向する２つの平行移動用電極と、前記選択結合性物質固定用部位の直下に配設した垂直移動用下部電極と、該垂直移動用下部電極につながる導電パターン配線とを有するものが挙げられる。
【００２１】
前記選択結合性物質固定部位の直下に配設する垂直移動用下部電極は、垂直移動用上部電極との間に電流を流すことにより前記対応選択結合性物質を前記選択結合性物質固定部位に引きつける機能を持たせるため、予め選択結合性物質固定用基材上に形成される必要がある。
【００２２】
これらの材料を用いて基材上に電極を設置する手段として、電極材料に金属を用いる場合は基材上に平行移動用電極および／又は垂直移動用下部電極の形状の開口を有するマスクを配置し、スパッタ法、蒸着法により電極を形成する、あるいはメッキ法を用いて厚膜の電極を形成する、さらには金属箔または金属薄板を接着剤で基材に接着することにより電極を形成する等の方法が挙げられる。炭素化合物を用いる場合は、基材上に電極の形状の開口を有するマスクを配置し、スパッタ法を用いて電極を形成することができる。導電性ポリマーを用いる場合は、シルクスクリーン印刷等の印刷法を用いてペースト状の導電性ポリマーを塗布し、紫外線による光硬化法を用いてペーストを硬化させ、電極を形成することができる。
【００２３】
また、平行移動用電極を、予めハイブリダイゼーション装置側に配する場合は、前記金属材料、炭素化合物、導電性ポリマーを用いて作製した薄板状の電極板をハイブリダイゼーション装置の基台上部に配し、基台状に選択結合性物質固定用基材を裁置した後、該電極板を選択結合性物質固定用基材上に装着することにより、電極を形成することが出来る。
【００２４】
次に本発明のハイブリダイゼーション方法とハイブリダイゼーション装置および選択結合性物質固定用基材について図面を用いて説明する。
【００２５】
本発明のハイブリダイゼーション装置の一態様の断面図を図１（ａ）に、平面図を図１（ｂ）に示す。また、図２は本発明における選択結合性物質の動作を示す原理図である。なお本発明はこの例に限定されるものではない。
【００２６】
図１、図２に示す様に、本発明のハイブリダイゼーション装置は、基台１４の上に裁置された選択結合性物質固定用基材１と、カバー基材６と、交流電圧印加手段９と、、前記カバー基材６上に装着した垂直移動用上部電極７と、直流および交流電圧印加手段１２とを備える。選択結合性物質固定用基材１上に設けられた垂直移動用下部電極４上には選択結合性物質固定部位５が配設され、該選択結合性物質固定部位５上に選択結合性物質１５が固定され、選択結合性物質１５が複数ある選択結合性固定化領域がアレイ状に配列された選択結合性物質配列領域８を形成する。さらに、選択結合性物質固定用基材１上には選択結合性物質配列領域８の両側に平行移動用電極２、３が配設され、これに導電パターン配線１０が接続されており、前記平行移動用電極２、３の上にカバー基材６が架設されている。前記平行移動用電極２、３を介して選択結合性物質固定用基材１とカバー基材６に挟まれた空間には前記対応選択結合性物質１６を含む被検試料溶液１３が満たされる。各垂直移動用下部電極４は、導電パターン配線１０とコネクタ１１の接触により前記直流電圧および交流電圧印加手段１２へ接続される。同様に、垂直移動用上部電極７も前記直流電圧および交流電圧印加手段１２へ接続され、平行移動用電極２、３は交流電圧印加手段９に接続される。
【００２７】
選択結合性物質固定用基材１としては、ガラス基板やＰＭＭＡ、ポリカーボネート等の樹脂を用いることができ、特にハイブリダイゼーションの結果を蛍光で検出するシステムに用いる場合は無蛍光ガラスや自家蛍光が低いＰＭＭＡ等が望ましい。またカバー基材６としては、ハイブリダイゼーションに用いる溶液に対する耐薬品性が良好な材料であれば特に限定はしないが、ガラス、ポリプロピレン、ポリカーボネート等を用いることができる。
【００２８】
本発明においては、上記したように選択結合性固定化部位が複数配列された選択結合性物質配列領域８が存在し、前記平行移動用電極２、３は該選択結合性物質配列領域８の両端より外側に配置されることが好ましい。
【００２９】
前記選択結合性物質配列領域８に選択結合性物質１５が配列される形態は２次元平面の格子点上に配列されることが好ましいが、２次元平面の格子点からずれた位置、直線状、あるいは選択結合性物質固定部位５の位置が選択結合性物質固定用基材１の表面に対して高さが異なることにより、３次元的な配列形態であっても構わない。
【００３０】
次に上記ハイブリダイゼージョン装置を用いた本発明の選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法について説明する。被検試料溶液１３を満たした後、直流電圧および交流電圧印加手段１２を用いて垂直移動用下部電極４と垂直移動用上部電極７の間に電圧を印加する。ここで印加する電圧は、前記垂直移動用下部電極側４が垂直移動用上部電極７に対して正電位であること、あるいは前記垂直移動用下部電極４側が垂直移動用上部電極７に対して正電位であり、かつ直流成分と交流成分が混在する電圧印加パターンを有することが好ましい。これにより、垂直移動用上部電極７と垂直移動用下部電極４の間に電界が発生し、被検試料溶液１３中に自然拡散している対応選択結合性物質１６は負電荷を有するため、正電位を有する垂直移動用下部電極４の方向に引き寄せられる。
【００３１】
ここで、図５を用いて各電極への電圧印加とハイブリダイゼーション効果の関係について説明する。図５は本発明における各電極への電圧印可パターンを示す。前記直流電圧および交流電圧印加手段１２の直流および交流電圧ＯＮ区間２８に両垂直移動用電極に印可する電圧が直流電位の場合、前記対応選択結合性物質１６は、垂直移動用下部電極４の方向に引き寄せられ、垂直移動用下部電極４の上に配設した選択結合性物質固定部位５近傍の前記対応選択結合性物質１６の濃度が局所的に上昇し、該選択結合性物質固定部位５に固定化した前記選択結合性物質１５と前記対応選択結合性物質１６との衝突確率が上昇することにより、ハイブリダイゼーションの効率が向上する。しかしながら、この場合は常時、垂直移動用下部電極４の方向への静電引力が働いているため、直流電圧印加時間が長くなると前記対応選択結合性物質１６の多くは前記選択結合性物質固定部位５に吸着し、動作の自由度が小さくなることがあり、徐々にハイブリダイゼーションの効率が低下する。これを緩和する策として、本発明においては、直流および交流電圧印加パターン２６に示すように前記垂直移動用下部電極４側が垂直移動用上部電極７に対して正電位であり、かつ直流成分と交流成分が混在するパターンで電圧を印加することにより、高い直流電圧区間に強い引力で前記選択結合性物質固定部位５近傍に前記対応選択結合性物質１６を引きつけ、選択結合性物質固定部位５近傍の対応選択結合性物質１６の濃度を高くしつつ、選択結合物質１５および対応選択結合物質１６の動作の自由度が損なわれるのを避けることができる。従って、電圧印加時間が長くなってもハイブリダイゼーションの効率が低下することはない。
【００３２】
以上説明したように、前記直流電圧および交流電圧印加手段１２を用いて前記選択結合性物質固定部位５近傍の前記対応選択結合性物質１６の濃度を局所的に高くすることに加え、本発明においては、交流電圧印加手段ＯＮ区間２９において、交流電圧印加手段９を用いて平行移動用電極２、３の間に、前記選択結合性物質を固定化した面の垂直軸に交差する方向で、交流電圧を印加する（交流電圧印加パターン２７）。これにより平行移動用電極２、３間に電界が発生し、対応選択結合性物質１６は平行移動用電極２、３間に発生した電界の方向に応じて前記選択結合性物質配列領域８を横切る方向に移動を繰り返す。具体的には、平行移動用電極２がプラス電位、平行移動用電極３がマイナス電位の場合、前記対応選択結合性物質１６は平行移動用電極２に引き寄せられ、平行移動用電極２がマイナス電位、平行移動用電極３がプラス電位の場合、前記対応選択結合性物質１６は平行移動用電極３に引き寄せられる。このように対応選択結合性物質１６を前記選択結合性物質配列領域８を横切って移動させることにより、選択結合性物質固定部位５上に固定された選択結合性物質１５と対応選択結合性物質１６が領域内で場所による偏りが少なく接触し、ハイブリダイゼーションが均一に起こる。
【００３３】
このように、ゲート信号２５を交流電圧印加手段９と直流電圧および交流電圧印加手段１２へ入力し、直流電圧および交流電圧印加手段ＯＮ区間２８と交流電圧印加手段ＯＮ区間２９を交互に発生させることにより、低い濃度の前記被検試料溶液１３を用いても、高い効率でかつ均一なハイブリダイゼーションを実現でき好ましい。
【００３４】
尚、電極に印加する電圧が高いほど、負電荷を有する選択結合性物質１５および対応選択結合性物質１６が電極から受ける電気的吸引力あるいは電気的斥力は強くなり、対応選択結合性物質１６の移動による選択結合性物質１５との接触の効果が高まることは言うまでもないが、高電圧を長時間印加させると、選択結合性物質１５および対応選択結合性物質１６が損傷を受けることがある為、本発明においては電極間隔１ｃｍ当たり５Ｖから５０Ｖの間に設定することが好ましく、より安定なハイブリダイゼーション結果を得る為には、電極間隔１ｃｍ当たり１０Ｖから２５Ｖとすることがさらに好ましい。
【００３５】
以上説明したように、水平方向に発生する交流電界と、垂直方向に発生する交流および直流電界によってハイブリダイゼーションの効率化を図る本発明の方法では、選択結合性物質１５と対応選択結合性物質１６がハイブリダイゼーションの期間中、常時相対的に移動し、衝突、接触を繰り返す為、ハイブリダイゼーションの効率が高まる。
【００３６】
ここで、選択結合性物質固定部位としては、通常基材上に設けた平面上の位置、基材上に設けた凹凸を好ましく用いられるが、選択結合性物質固定用基材１を貫通する孔に棒状の樹脂、ガラス、金属、繊維等を挿嵌し、該樹脂、ガラス、金属、繊維の先端を選択結合性物質固定部位として用いても同様の効果が期待でき、特に基材に設けられた孔に挿入された繊維又は該繊維束であることが好ましい。
【００３７】
また、高価な被検試料溶液１３の量を少なくする為には前記平行移動用電極２、３はできるだけ薄くすることが好ましく、５μｍから２００μｍが好ましい。このように非常に薄く厚みムラの少ない電極を形成するために、前記電極は予め選択結合性物質固定用基材上に形成されていることが好ましいが、ハイブリダイゼーション装置側に電極を有し、ハイブリダイゼーション準備段階で選択結合性物質固定用基材１上に電極を装着する形態でも構わない。
【００３８】
次に図３、図４を用いて従来のハイブリダイゼーション方法および装置について説明する。図３は従来のハイブリダイゼーション装置の断面図であり、図４は従来のハイブリダイゼーション装置における選択結合性物質の動作を示す原理図である。
【００３９】
前記したように、従来の方法においては、ハイブリダイゼーション反応は選択結合性物質の自然拡散に依存しているため、前記選択結合性物質と対応選択結合性物質の接触確率は低く、従ってハイブリダイゼーション反応の効率は低かった。そこで、この非効率性を解消すべく提案されたものが図３、図４に示すように電気的吸引による選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法である。
【００４０】
図３、図４において、選択結合性物質固定用基材１７上に設けられた選択結合性物質固定部位２０上に選択結合性物質１５’が固定される。選択結合性物質固定用基材１７上には、さらに、選択結合性物質１５’が配列された領域の外側に支持材１８が配設され、支持材１８の上にカバー基材２１が架設される。前記支持材１８を介して選択結合性物質固定用基材１７とカバー基材２１に挟まれた空間には対応選択結合性物質１６’を含む被検試料溶液２３が満たされる。被検試料溶液２３を満たした後、電圧印加手段２４を用いて、垂直移動用上部電極２２に負電位を、選択結合性物質固定部位２０の直下に配設した垂直移動用下部電極１９に正電位を印加することにより、両電極の間に電界が発生し、被検試料溶液２３中に自然拡散している対応選択結合性物質１６’は負電荷を有するため、前記選択結合性物質固定部位２０の方向に吸引される。これにより選択結合性物質固定部位２０近傍の対応選択結合性物質１６’の濃度が高くなり、あるいは選択結合性物質固定部位２０に対応選択結合性物質１６’が吸着する過程で選択結合性物質１５’と対応選択結合性物質１６’が接触し、ハイブリダイゼーションが起こる。
【００４１】
しかし、図３に示す方法では、対応選択結合性物質１６’は電気力により選択結合性物質固定部位２０に吸着されてしまい、さらには対応選択結合性物質１６’と同じ負電荷を持つ選択結合性物質１５’も選択結合性物質固定部位２０の表面に吸着されてしまい、選択結合性物質１５’と対応選択結合性物質１６’の間で相対的な動きが無くなる為、本発明と比べて選択結合性物質と対応選択結合性物質の動的な接触確率が低く、十分なハイブリダイゼーション反応の効率化が得られない。
【００４２】
本発明において、「選択結合性物質」とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。また、タンパク質としては、抗体およびＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質（抗原性化合物）を固定化することもできる。「選択結合性物質」としては、核酸、タンパク質、糖類、抗体および抗原性化合物から選ばれる少なくとも１種が好ましく、特に好ましいものは、核酸、抗体及び抗原である。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。
【００４３】
生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（　Ｂｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　３：　２３０３　（１９７６））等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（　Ｆａｖａｌｏｒｏ　ｅｔａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：　７１８　（１９８０））等により行うことができる。固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【００４４】
本発明において、前記選択結合性物質および前記対応選択結合性物質が一本鎖核酸であり、前記結合反応が核酸間のハイブリダイゼーションであることが好ましい。
【００４５】
個々の選択結合性物質固定部位には、通常、１種類の選択結合性物質が固定されるが、例えば、変異を有する複数種類の遺伝子を同一の選択結合性物質固定部位に結合させたい場合等には、１個の選択結合性物質固定部位に複数種類の選択結合性物質を固定することも可能である。
【００４６】
また、複数の選択結合性物質固定部位に固定される選択結合性物質は、それぞれ異なる種類の選択結合性物質としても、同一の選択結合性物質としても構わない。また、複数の選択結合性物質固定部位のうち、一部の複数の選択結合性物質固定部位に１種類の選択結合性物質を固定化し、他の一部の複数の選択結合性物質固定部位に他の１種類の選択結合性物質を固定化することもできる。選択結合性物質の種類、順序は選択結合性物質配列領域の中の位置によって限定されるものでない。同一の選択結合性物質を複数の選択結合性物質固定部位に固定しておき、測定感度をより高くすることも有効である。
【００４７】
選択結合性物質の選択結合性物質固定部位への固定は、公知の方法により行うことができる。無修飾の選択結合性物質を選択結合性物質固定部位に固定する場合には、選択結合性物質と選択結合性物質固定部位とを作用させた後、ベーキングや紫外線照射により固定できる。後述の実施例では、この方法によりＤＮＡをスライドガラス基材に固定している。また、アミノ基で修飾された選択結合性物質を選択結合性物質固定部位に固定する場合には、グルタルアルデヒドや１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等の架橋剤を用いて選択結合性物質固定部位の官能基と結合させることができる。選択結合性物質を含む試料を選択結合性物質固定部位に作用させる際の温度は、５℃〜９５℃が好ましく、１５℃〜６５℃が更に好ましい。
【００４８】
本発明では、選択結合性物質をそのまま選択結合性物質固定部位に固定してもよく、また、選択結合性物質に化学的修飾を施した誘導体や、必要に応じて変性させた核酸を固定化してもよい。核酸の化学的修飾には、アミノ化、ビオチン化、ディゴキシゲニン化等が知られており［Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｅｄ．；　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）、脱アイソトープ実験プロトコール（１）ＤＩＧハイブリダイゼーション（秀潤社）］、本発明ではこれらの修飾法を採用することができる。
【００４９】
一例として、核酸へのアミノ基導入に関して説明する。アミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖と一本鎖核酸との結合位置は特に限定されるものではなく、核酸の５’末端または３’末端のみならず核酸の鎖中（例えば、リン酸ジエステル結合部位または塩基部位）であってもよい。この一本鎖核酸誘導体は、特公平３−７４２３９号公報、米国特許４，６６７，０２５号、米国特許４，７８９，７３７号等に記載の方法にしたがって調製することができる。この方法以外にも、例えば、市販のアミノ基導入用試薬［例えば、アミノリンクＩＩ（商標名）；ＰＥバイオシステムズジャパン社、Ａｍｉｎｏ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ（商標名）；クロンテック社］などを用いて、又はＤＮＡの５’末端のリン酸にアミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖を導入する周知の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１１（１８），６５１３−（１９８３）　）にしたがって調製することができる。
【００５０】
上述の方法により得られた選択結合性物質固定用基材は、選択結合性物質を選択結合性物質固定領域に固定した後、適当な処理をすることができる。例えば、熱処理、アルカリ処理、界面活性剤処理などを行うことにより、固定された選択結合性物質を変性させることもできる。あるいは、細胞、菌体などの生体材料から得られた選択結合性物質を使用する場合は、不要な細胞成分などを除去してもよい。そして、処理後の選択結合性物質固定用基材を選択結合性物質の検出材料として用いることができる。なお、これらの処理は別々に実施してもよく、同時に実施してもよい。また、選択結合性物質を含む試料を選択結合性物質固定領域に固定する前に適宜実施してもよい。
【００５１】
選択結合性物質をアレイ状に配列した本発明の選択結合性物質固定用基材は、固定化された選択結合性物質をプローブとして被検物質と相互作用させることにより、検体中の特定の被検物質を検出することができる。２種類の被検試料に対して、下記に示す標識化（区別が付くように）を行い、その差異を比較することもできる。
【００５２】
選択結合性物質と選択的に結合する、被検試料中の対応選択結合性物質の検出には、結合を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、検体中の対応選択結合性物質に、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープなどの標識体を結合し、選択結合反応および洗浄後、この標識体を検出することができる。これら標識体の種類や標識体の導入方法に関しては、免疫測定や核酸のハイブリタイゼーションの測定のために用いられる蛍光物質や発光物質は、この分野において周知であり、種々のものが市販されているので、これらの市販の蛍光物質や発光物質を用いることができる。
【００５３】
また、選択結合性物質固定部位に固定された選択結合性物質と、被検試料中の対応選択結合性物質との結合反応後、若しくは結合反応と同時に、対応選択結合性物質と選択的に結合する、標識化された遊離の測定用物質をさらに反応させ、洗浄後、対応選択結合性物質と選択結合性物質を介して選択結合性物質固定部位に結合された該測定用物質の標識を測定することによっても検出可能である。例えば、選択結合性物質として特定の塩基配列を有する核酸を選択結合性物質固定部位に固定し、対応選択結合性物質が該核酸と相補的な領域を含む核酸である場合に、対応選択結合性物質である該核酸中の、上記選択結合性物質と相補的な領域以外の領域と相補的な核酸を標識して測定用物質として用いることができる。また、選択結合性物質として抗原を選択結合性物質固定部位に固定し、対応選択性結合物質が該抗原と抗原抗体反応する抗体である場合に、該抗体と抗原抗体反応する第２抗体を標識したものを測定用物質として用いることができる。
【００５４】
また、選択結合性物質固定部位に電気伝導性を有する材料を用いた場合、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法を用いることができる。この場合、電極となる選択結合性物質固定部位に固定した選択結合性物質と対応選択結合性物質を、両者の反応を促進、抑制する反応溶液中で反応させ、かつ、この材料の全部または一部が、結合した選択結合性物質と対応選択結合性物質の中に含有され、反応した後の電極、すなわち選択結合性物質固定部位に流れる電流値を測定することにより、選択結合性物質と対応選択結合性物質の結合の有無、結合の程度を検出できるものである。
【００５５】
本発明のハイブリダイゼーション装置に適用する選択結合性物質固定用基材を用いた測定方法に、選択結合物質および対応選択結合性物質として供せられる被検物質としては、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、選択結合性物質を固定した選択結合性物質固定部位を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、被検物質である抗原又は抗体とハイブリダイズすることで選択結合性物質固定部位に結合した標識を測定することもできる。
【００５６】
固定化した選択結合性物質と被検物質を相互作用させる工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、５０℃〜７０℃程度で１分間〜数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。
【００５７】
上記方法により、固定化された選択結合性物質と選択的に結合する核酸や抗体、抗原等の被検物質を測定することができる。すなわち、選択結合性物質として核酸を固定化した場合には、この核酸又はその一部と相補的な配列を有する核酸を測定することができる。また、選択結合性物質として抗体又は抗原を固定化した場合には、この抗体又は抗原と免疫反応する抗原又は抗体を測定することができる。なお、本明細書でいう「測定」には検出と定量の両者が包含される。
【００５８】
本発明を用いることにより、各種生物における、遺伝子や蛋白質、糖鎖の発現を効率的、迅速かつ簡便に調べることができる。例えば、正常ヒト肝臓および肝炎ウイルス感染肝臓から抽出した核酸を標識後、本発明の選択結合性物質固定用基材上に各種既知のヒト遺伝子を固定化した選択結合性物質固定部位のおのおのにハイブリダイゼーションを行う。正常肝臓核酸と肝炎肝臓核酸の前記各種既知のヒト遺伝子への結合の程度を比較することにより、肝炎肝臓での遺伝子発現の変化を調べることができる。
【００５９】
同様に、蛋白質である各種モノクローナル抗体を結合させた繊維配列体に、標識した正常脳抽出蛋白質およびアルツハイマー脳抽出蛋白質を結合させ、結合した蛋白質を正常と比較することによりアルツハイマー脳における蛋白質の異常発現を調べることができる。
【００６０】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００６１】
実施例１
本発明の実施例で用いる図１に示すハイブリダイゼーション装置を用いてガラス基材上で核酸の固定およびハイブリダイゼーションが確実に行えることを確認する為に、生物試料に対して交叉反応をせず、熱的にも安定でハイブリダイゼーション時に加える熱で分解しないディゴキシゲニンを標識体として用いた実験を行った。
【００６２】
アクチン遺伝子の核酸液（宝酒造株式会社製）（該核酸濃度１０μｇ／ｍｌ）をアミノ基導入スライドガラス基材（７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）（松浪硝子工業（株）製）上に個々の固定部位のサイズが直径２００μｍ程度となるようにスポッティングし、空気中で乾燥後、紫外線処理（ストラタジーン社製ＵＶクロスリンカーを使用）を行い、核酸が固定化された基材を得た。用いた核酸配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、ディゴキシゲニン（ＤＩＧ：　Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で標識した。
【００６３】
末端アミノ化されたオリゴヌクレオチドをそれぞれ１００　ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に終濃度２　ｍＭになるように溶かした。等量のジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−α−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル　（２６ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミド溶液）を加え、室温にて一晩静置した。グリコーゲン（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）をキャリアーとしてエタノール沈殿を行い、沈殿を風乾後、１００μｍｏｌの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．５），１　ｍＭ　ＥＤＴＡに溶かした。こうして得られたＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドを試料核酸のモデルとして用いた。
【００６４】
作製した核酸固定基材を核酸固定部位が上向きになるように図１に示すハイブリダイゼーション装置の基台に裁置し、前記ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドをＥＤＴＡに溶かした溶液を該核酸固定基材上に滴下し、カバー基材で封止し、前記上下移動用電極、平行移動用電極に電圧を印加せずに、定法により（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、製品マニュアルに準じて実施）ハイブリダイゼーションを行った。
【００６５】
ハイブリダイゼーション終了後、核酸固定基材を洗浄後、抗ＤＩＧ酵素標識抗体溶液を加え抗原抗体反応を行わせた。反応後、核酸固定基材を洗浄し未結合の抗体を除去した。ＤＩＧ検出試薬を添加し、平衡化した。水分を切り、光シグナルの検出を行ったところ核酸の固定化に応じてシグナルが検出された。
【００６６】
これにより、交流電界を印加しない従来方法で本発明のハイブリダイゼーション装置が構造的、あるいは機能上の問題が無く、ハイブリダイゼーション装置として確実に使用出来ることを確認した。
【００６７】
実施例２
選択結合性物質固定基材の前処理
スライドガラス（７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）（松浪硝子工業（株）製）を純水、エタノール、ＮａＯＨの混合溶液でクリーニングした後、純水で洗浄した。さらに、該スライドガラス上に選択結合成物質固定部位を形成するために、孔径２００μｍの円形孔を５００μｍ間隔で５ｍｍ×５ｍｍの領域に格子状に配列し、それぞれの開口部を幅１０μｍの開口パターンで接続し、前記ハイブリダイゼーション装置に設けられた電極に接続する電極部を形成するための開口部に前記開口パターンを集束したステンレス製マスクを該スライドガラス上に近接させて装着し、スパッタ法により前記マスクの開口部形状に相当する金電極をスライドガラス上に設けた。電極パターンを配設した面を純水、ポリ−Ｌ−リシンの混合溶液（組成：１０％　ポリ−Ｌ−リシン）に浸し、前記選択結合成物質固定用部位を含むスライドガラスの表面にアミノ基を導入した。
【００６８】
核酸溶液２種類（宝酒造（株）製　「λＣｏｎｔｒｏｌ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　＆　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ−Ａ」；製品番号ＴＸ８０３（約１０００ｂｐのλ　ＤＮＡ断片）、および、宝酒造（株）製　「Ｈｕｍａｎ　ＴＦＲ（１ｋｂ）　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　＆　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ」；製品番号ＴＸ８０６（約１０００ｂｐのヒトトランスフェリンレセプターＤＮＡ断片））を元に、それぞれの核酸をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ法で用いたプライマーは、それぞれの製品に同梱されているものを用いた。これを精製し、精製した核酸溶液をえた。スライドガラスの前記選択結合成物質固定用部位に精製した２種類の核酸溶液をスポッティングし、空気中で乾燥後、ＵＶクロスリンク（１２０ｍＪ）を行い、２種類の核酸が核酸固定部位に固定された核酸固定基材をえた。次に、核酸と反応していないスライドガラス表面の余分なアミノ基をブロックするため、ホウ酸、純水、ｐＨ調整用ＮａＯＨ、無水コハク酸、１―メチル−２−ピロリドンを混合した溶液（無水コハク酸　３ｇを１８７ｍｌ　１―メチル−２−ピロリドンに溶解し、使用直前に１７ｍｌ　１Ｍ　Ｎａ−ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ８．０）　　溶液を加えたもの）に核酸が固定された面を浸し、振とうした。その後、洗浄した。
【００６９】
ＲＮＡの処理
ＲＮＡ溶液（宝酒造（株）製　「λｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ−Ａ」；製品番号ＴＸ８０２）を用意した。これは上記核酸の１つ（ＴＸ８０３）と相補的な塩基配列を有している。これを、逆転写酵素「Ｓｕｐｅｒ　ｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ」（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製；製品番号１８０６４−０７１）、２．５ｍＭ　ｄＡＴＰ、２．５ｍＭ　ｄＣＴＰ、２．５ｍＭ　ｄＧＴＰ、１．０ｍＭ　ｄＴＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャム・ファルマシア製；製品番号ＰＡ５５０２２）と混合し、４２℃で１時間インキュベートして逆転写し、Ｃｙ５色素が取り込まれたｃＤＮＡ溶液を得た。
【００７０】
同様にＲＮＡ溶液（宝酒造（株）製　「Ｈｕｍａｎ　ＴＦＲ　ＲＮＡ（１ｋｂ）」；製品番号ＴＸ８０５）を用意し、Ｃｙ５−ｄＵＴＰをＣｙ３−ｄＵＴＰ（アマシャム・ファルマシア製；製品番号ＰＡ５３０２２）と変えた以外は、上記と同じ条件で逆転写し、Ｃｙ３色素が取り込まれたｃＤＮＡ溶液を得た。このＣｙ３色素の取り込まれたｃＤＮＡは上記核酸の１つ（ＴＸ８０６）と相補的な塩基配列を有している。
【００７１】
上記の色素が取り込まれた２種類のｃＤＮＡ溶液を混合、精製し、さらにバッファー（３．４×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ）に溶解してハイブリタイゼーション溶液を得た。
【００７２】
ハイブリタイゼーション
２種類の核酸が表面に固定された核酸固定基材をハイブリダイゼーション装置の基台上に固定し、核酸を固定した領域の両側にハイブリダイゼーション装置の交流電圧印加手段に接続された平行移動用電極を配設した。本実施例では厚さ２００μｍの金薄板を電極として用いた。平行移動用電極の間隔は１ｃｍとした。２種類の核酸を固定した部位に２０μｌの前記ハイブリダイゼーション溶液を滴下し、核酸固定部位の両側の平行移動用電極上に垂直移動用上部電極を装着したカバー基材を架設し、ハイブリダイゼーション溶液が蒸発しないように密閉した。
【００７３】
先ず、垂直移動用電極間に、図５の直流電圧および交流電圧印加手段ＯＮ区間２８における直流および交流電圧印加パターン２６に示す電圧パターンを１分間印加し、核酸固定部位近傍のｃＤＮＡ濃度を高めた。ここで印加する電圧は、最高値が１Ｖ、最低値が０Ｖ、周波数１Ｈｚとした。
【００７４】
その後、０．１Ｈｚのゲート信号（Ｄｕｔｙ５０％）に合わせて直流および交流混合電圧を垂直移動用両電極間に、交流電圧を平行移動用電極間に図５に示す電圧印加パターンで印加した。ここで印加する電圧は、垂直移動用両電極間には最高値が１Ｖ、最低値が０Ｖ、周波数１Ｈｚの直流交流混合パターンで、垂直移動用下部電極側が正電位にとなるように、また、平行移動用電極間には１０Ｖ、１０Ｈｚの交流電圧を印加し、６５℃の条件に１０分間静置した後、カバー基材、平行移動用電極を取り外し、洗浄した。
【００７５】
また、垂直移動用電極間に印加する電圧パターンの効果を確認するために、垂直移動用両電極間には最高値が１Ｖ、最低値が０Ｖの直流パターン、平行移動用電極間には１０Ｖ、１０Ｈｚの交流電圧を印加し、６５℃の条件に１０分間静置した後、カバー基材、平行移動用電極を取り外し、洗浄したサンプルを用意した。
【００７６】
さらに従来法と比較する為に、平行移動用電極間および垂直移動用電極間に電圧を印加しない状態で６５℃の条件で１６時間放置したサンプルを用意した。その後、該サンプルのカバー基材、電極を取り外し、洗浄した。
【００７７】
蛍光検出
Ｃｙ５からの蛍光を測定するために、光学系を以下のようにした。まず、蛍光の励起光としてはレーザー（波長６３５ｎｍ）を用いた。まず、バンドパスフィルター（オメガオプティカル製；製品番号Ｘ１０６９）を光軸と垂直に配置し、励起光以外の余計な光を取り除いた。さらに、レーザービームの光軸と４５度の角度になるように、ダイクロイックミラー（オメガオプティカル製；製品番号ＸＦ２０３５）を配置し、この集光したビームをＤＮＡ溶液に浸した端面と反対のスライドガラス端面に照射した。さらに、ＤＮＡ溶液に浸した端面から戻ってきた蛍光を、励起光を照射する側の端面側で集光し、先に述べた、ダイクロイックミラー（オメガオプティカル製；製品番号ＸＦ２０３５）を通し、さらにバンドパスフィルター（オメガオプティカル製；製品番号ＸＦ３０７６）を通して、余分な励起光をカットした。
【００７８】
Ｃｙ３からの蛍光は、ダイクロイックミラーとバンドパスフィルターをＣｙ３用のものにし（それぞれオメガオプティカル製；製品番号ＸＦ１０７４、ＸＦ２０１７、ＸＦ３０８３）、照射するレーザーの波長を５３２ｎｍとした以外は上記と同じ方法で検出した。
【００７９】
このような方法で、上記のハイブリダイゼーション後の２種類核酸固定部位からの蛍光をＣｙ５、Ｃｙ３のそれぞれについて測定した。ＴＸ８０３の核酸溶液をスポッティングした核酸固定部位からは、Ｃｙ５の蛍光のみが観察され、Ｃｙ３の蛍光は検出されなかった。ＴＸ８０６の核酸溶液をスポッティングした核酸固定部位からは、Ｃｙ３だけの蛍光が観察され、Ｃｙ５からの蛍光は検出されなかった。
【００８０】
また、このときの電圧を印加した核酸固定基材から得られた蛍光強度は電圧を印加しない従来の方法に比べて同等であった。また、各核酸固定部位内の蛍光強度分布を詳細に観察すると、従来法に比べて本発明の方法の方が均一な強度分布を示した。このように、スライドガラスに導電性パターンを配設し、核酸固定部位近傍の核酸濃度を高くするための電界と、プローブ核酸とターゲット核酸を相対的に移動させ、衝突確率を高めるための電圧を印加することにより、わずか１０分のハイブリダイゼーションの時間でも十分な結合反応が行われ、かつ場所による偏りの少ない均一な結合反応状態が得られることが分かった。
【００８１】
実施例３
選択結合性物質固定基材の前処理
実施例２で用意した、スパッタ法によりスライドガラス上に選択結合成物質固定用部位、それらを接続する導電パターン、電極部を金で配設した基板を用意した。該基板上に、平行移動用電極を形成するために設けた１０ｍｍ×５ｍｍの開口の１０ｍｍの辺が１０ｍｍの間隔を隔てて平行に対向するように、２つの開口部と、垂直移動用下部電極と導電パターン配線を形成する為に開口パターンを配置したステンレス製マスクをスライドガラス上に近接させて装着し、スパッタ法により前記マスクの開口部形状に相当する金電極をスライドガラス上に設けた。
【００８２】
このように金電極を配置したスライドガラス（７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）（松浪硝子工業（株）製）を純水、エタノール、ＮａＯＨの混合溶液でクリーニングした後、純水で洗浄した。さらに、クリーニングした面を純水、ポリ−Ｌ−リシンの混合溶液（組成：１０％　ポリ−Ｌ−リシン）に浸し、スライドガラスの表面にアミノ基を導入した。
【００８３】
核酸溶液２種類（宝酒造（株）製　「λＣｏｎｔｒｏｌ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　＆　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ−Ａ」；製品番号ＴＸ８０３（約１０００ｂｐのλ　ＤＮＡ断片）、および、宝酒造（株）製　「Ｈｕｍａｎ　ＴＦＲ（１ｋｂ）　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　＆　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ」；製品番号ＴＸ８０６（約１０００ｂｐのヒトトランスフェリンレセプターＤＮＡ断片））を元に、それぞれの核酸をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ法で用いたプライマーは、それぞれの製品に同梱されているものを用いた。これを精製し、精製した核酸溶液をえた。スライドガラスの前記金電極の間のアミノ基を導入した面に精製した２種類の核酸溶液をスポッティングし、空気中で乾燥後、ＵＶクロスリンク（１２０ｍＪ）を行い、２種類の核酸が核酸固定部位に固定された核酸固定基材をえた。次に、核酸と反応していないスライドガラス表面の余分なアミノ基をブロックするため、ホウ酸、純水、ｐＨ調整用ＮａＯＨ、無水コハク酸、１―メチル−２−ピロリドンを混合した溶液（無水コハク酸　３ｇを１８７ｍｌ　１―メチル−２−ピロリドンに溶解し、使用直前に１７ｍｌ　１Ｍ　Ｎａ−ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ８．０）　　溶液を加えたもの）に核酸が固定された面を浸し、振とうした。その後、洗浄した。
【００８４】
ＲＮＡの処理
ＲＮＡ溶液（宝酒造（株）製　「λｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ−Ａ」；製品番号ＴＸ８０２）を用意し、実施例２のＲＮＡ処理と同様に行い、Ｃｙ５色素が取り込まれたｃＤＮＡ溶液、Ｃｙ３色素が取り込まれたｃＤＮＡ溶液およびハイブリタイゼーション溶液を得た。
【００８５】
ハイブリタイゼーション
２種類の核酸が表面に固定された核酸固定基材をハイブリダイゼーション装置の基台上に固定し、核酸固定部位の両側に配置された金電極とハイブリダイゼーション装置の交流電圧印加手段を接続した。さらに、垂直移動用下部電極につながる導電パターン配線に直流電圧および交流電圧印加手段を接続した。２種類の核酸を固定した部位に２μｌの前記ハイブリダイゼーション溶液を滴下し、核酸固定部位の両側の電極上にカバー基材を架設し、ハイブリダイゼーション溶液が蒸発しないように密閉した。その後、実施例２と同様に各電極間に電圧を印加し、ハイブリダイゼーションを行った後、カバー基材、電極を取り外し、洗浄した。
【００８６】
さらに、従来法と比較する為に、平行移動用電極間および垂直移動用電極間に電圧を印加しない状態で６５℃の条件で１６時間放置したサンプルを用意した。その後、該サンプルのカバー基材、電極を取り外し、洗浄した。
【００８７】
蛍光検出
Ｃｙ５およびＣｙ３からの蛍光を測定するために、光学系は実施例２の光学系と同様にし、Ｃｙ５およびＣｙ３からの蛍光を検出した。
【００８８】
このような方法で、上記のハイブリダイゼーション後の２種類核酸固定部位からの蛍光をＣｙ５、Ｃｙ３のそれぞれについて測定した。ＴＸ８０３の核酸溶液をスポッティングした核酸固定部位からは、Ｃｙ５の蛍光のみが観察され、Ｃｙ３の蛍光は検出されなかった。ＴＸ８０６の核酸溶液をスポッティングした核酸固定部位からは、Ｃｙ３だけの蛍光が観察され、Ｃｙ５からの蛍光は検出されなかった。
【００８９】
また、このときの電圧を印加した核酸固定基材から得られた蛍光強度は電圧を印加しない従来の方法に比べて同等であった。また、各核酸固定部位内の蛍光強度分布を詳細に観察すると、従来法に比べて本発明の方法の方が均一な強度分布を示した。このように、スライドガラスに導電性パターンを配設し、核酸固定部位近傍の核酸濃度を高くするための電界と、プローブ核酸とターゲット核酸を相対的に移動させ、衝突確率を高めるための電圧を印加することにより、わずか１０分のハイブリダイゼーションの時間でも十分な結合反応が行われ、かつ場所による偏りの少ない均一な結合反応状態が得られることが分かった。
【００９０】
実施例４
選択結合成物質固定基材の前処理
ガラス成形により７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍのガラス基板上に直径２００μｍ、高さ２００μｍの円柱状の凸部が５００μｍ間隔で５ｍｍ×５ｍｍの領域に格子状に配列した凸部配列基板を用意した。該凸部の配列に対応する開口部と、それぞれの開口部を幅１０μｍの開口パターンで接続し、前記ハイブリダイゼーション装置に設けられた電極に接続する電極部を形成するための開口部に前記開口パターンを集束したステンレス製マスクを前記凸部配列基板状に該凸部と該凸部に対応する開口部が嵌合するように装着し、スパッタ法により凸部端面に垂直移動用下部電極、および前記開口部形状に相当する金電極を設けた。さらに、平行移動用電極を形成するために設けた１０ｍｍ×５ｍｍの開口の１０ｍｍの辺が１０ｍｍの間隔を隔てて平行に対向するように、２つの開口部と、垂直移動用下部電極と導電パターン配線を形成する為に開口パターンを配置したステンレス製マスクをスライドガラス上に近接させて装着し、スパッタ法により前記マスクの開口部形状に相当する金電極を前記凸部配列基板上の前記凸部が配列された領域の両側に設けた。
【００９１】
このように金電極を配置したスライドガラス（７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）（松浪硝子工業（株）製）を純水、エタノール、ＮａＯＨの混合溶液でクリーニングした後、純水で洗浄した。さらに、クリーニングした面を純水、ポリ−Ｌ−リシンの混合溶液（組成：１０％　ポリ−Ｌ−リシン）に浸し、スライドガラスの表面にアミノ基を導入した。
【００９２】
核酸溶液２種類（宝酒造（株）製　「λＣｏｎｔｒｏｌ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　＆　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ−Ａ」；製品番号ＴＸ８０３（約１０００ｂｐのλ　ＤＮＡ断片）、および、宝酒造（株）製　「Ｈｕｍａｎ　ＴＦＲ（１ｋｂ）　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　＆　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ」；製品番号ＴＸ８０６（約１０００ｂｐのヒトトランスフェリンレセプターＤＮＡ断片））を元に、それぞれの核酸をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ法で用いたプライマーは、それぞれの製品に同梱されているものを用いた。これを精製し、精製した核酸溶液をえた。スライドガラスの前記金電極の間のアミノ基を導入した面に精製した２種類の核酸溶液をスポッティングし、空気中で乾燥後、ＵＶクロスリンク（１２０ｍＪ）を行い、２種類の核酸が核酸固定部位に固定された核酸固定基材をえた。次に、核酸と反応していないスライドガラス表面の余分なアミノ基をブロックするため、ホウ酸、純水、ｐＨ調整用ＮａＯＨ、無水コハク酸、１―メチル−２−ピロリドンを混合した溶液（無水コハク酸　３ｇを１８７ｍｌ　１―メチル−２−ピロリドンに溶解し、使用直前に１７ｍｌ　１Ｍ　Ｎａ−ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ８．０）　　溶液を加えたもの）に核酸が固定された面を浸し、振とうした。その後、洗浄した。
【００９３】
ＲＮＡの処理
ＲＮＡ溶液（宝酒造（株）製　「λｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ−Ａ」；製品番号ＴＸ８０２）を用意し、実施例２のＲＮＡ処理と同様に行い、Ｃｙ５色素が取り込まれたｃＤＮＡ溶液、Ｃｙ３色素が取り込まれたｃＤＮＡ溶液およびハイブリダイゼーション溶液を得た。
【００９４】
ハイブリダイゼーション
２種類の核酸が表面に固定された凸部配列基板をハイブリダイゼーション装置の基台上に固定し、核酸固定部位の両側に配置された金電極とハイブリダイゼーション装置の交流電圧印加手段を接続した。さらに、垂直移動用下部電極につながる導電パターン配線に直流電圧および交流電圧印加手段を接続した。２種類の核酸を固定した部位に２μｌの前記ハイブリダイゼーション溶液を滴下し、核酸固定部位の両側の電極上にカバー基材を架設し、ハイブリダイゼーション溶液が蒸発しないように密閉した。その後、実施例２と同様に各電極間に電圧を印加し、ハイブリダイゼーションを行った後、カバー基材、電極を取り外し、洗浄した。
【００９５】
さらに、従来法と比較する為に、平行移動用電極間および垂直移動用電極間に電圧を印可しない状態で６５℃の条件で１６時間放置したサンプルを用意した。これを、６５℃の条件で１６時間放置した後、カバー基材を取り外し、洗浄した。
【００９６】
蛍光検出
Ｃｙ５およびＣｙ３からの蛍光を測定するために、光学系は実施例２の光学系と同様にし、Ｃｙ５およびＣｙ３からの蛍光を検出した。
【００９７】
このような方法で、上記のハイブリダイゼーション後の２種類核酸固定部位からの蛍光をＣｙ５、Ｃｙ３のそれぞれについて測定した。ＴＸ８０３の核酸溶液をスポッティングした核酸固定部位からは、Ｃｙ５の蛍光のみが観察され、Ｃｙ３の蛍光は検出されなかった。ＴＸ８０６の核酸溶液をスポッティングした核酸固定部位からは、Ｃｙ３だけの蛍光が観察され、Ｃｙ５からの蛍光は検出されなかった。
【００９８】
また、このときの電圧を印加した核酸固定基材から得られた蛍光強度は電圧を印加しない従来の方法に比べて同等であった。また、各核酸固定部位内の蛍光強度分布を詳細に観察すると、従来法に比べて本発明の方法の方が均一な強度分布を示した。このように、スライドガラスに導電性パターンを配設し、核酸固定部位近傍の核酸濃度を高くするための電界と、プローブ核酸とターゲット核酸を相対的に移動させ、衝突確率を高めるための電圧を印加することにより、わずか１０分のハイブリダイゼーションの時間でも十分な結合反応が行われ、かつ場所による偏りの少ない均一な結合反応状態が得られることが分かった。
【００９９】
実施例５
ガラス加工により７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍのガラス基板に、直径約２００μｍの貫通孔を５００μｍ間隔で５ｍｍ×５ｍｍの領域に格子状に配列したガラス基板を用意した。該ガラス基板の貫通孔に、直径２００μｍの光ファイバーを貫通させ、ガラス基板の表面から該光ファイバーが２００μｍの高さまで突出した位置で光ファイバーを固定し、突出した面と反対面の端面で切断した。これにより、実施例４で用いた凸部配列基板と同等の外観形状を有する光ファイバー貫通型基板を得た。これに、実施例４で用いた前記ステンレス製マスクを用いて、スパッタ法により、光ファイバー端面に垂直移動用下部電極、前記光ファイバーが配列された領域の両側に平行移動用電極、および前記光ファイバー配列を接続する導電パターンを設けた。
【０１００】
このように金電極を配置した光ファイバー貫通型基板を純水、エタノール、ＮａＯＨの混合溶液でクリーニングした後、純水で洗浄した。さらに、クリーニングした面を純水、ポリ−Ｌ−リシンの混合溶液（組成：１０％　ポリ−Ｌ−リシン）に浸し、該光ファイバー貫通型基板の表面にアミノ基を導入した。
【０１０１】
核酸溶液２種類（宝酒造（株）製　「λＣｏｎｔｒｏｌ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　＆　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ−Ａ」；製品番号ＴＸ８０３（約１０００ｂｐのλ　ＤＮＡ断片）、および、宝酒造（株）製　「Ｈｕｍａｎ　ＴＦＲ（１ｋｂ）　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　＆　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ」；製品番号ＴＸ８０６（約１０００ｂｐのヒトトランスフェリンレセプターＤＮＡ断片））を元に、それぞれの核酸をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ法で用いたプライマーは、それぞれの製品に同梱されているものを用いた。これを精製し、精製した核酸溶液を得た。前記光ファイバー貫通型基板の突出した光ファイバー端面に精製した２種類の核酸溶液をスポッティングし、空気中で乾燥後、ＵＶクロスリンク（１２０ｍＪ）を行い、２種類の核酸が核酸固定部位に固定された核酸固定基材をえた。次に、核酸と反応していない光ファイバー端面の余分なアミノ基をブロックするため、ホウ酸、純水、ｐＨ調整用ＮａＯＨ、無水コハク酸、１―メチル−２−ピロリドンを混合した溶液（無水コハク酸　３ｇを１８７ｍｌ　１―メチル−２−ピロリドンに溶解し、使用直前に１７ｍｌ　１Ｍ　Ｎａ−ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ８．０）　　溶液を加えたもの）に核酸が固定された面を浸し、振とうした。その後、洗浄した。
【０１０２】
ＲＮＡの処理
ＲＮＡ溶液（宝酒造（株）製　「λｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ−Ａ」；製品番号ＴＸ８０２）を用意し、実施例２のＲＮＡ処理と同様に行い、Ｃｙ５色素が取り込まれたｃＤＮＡ溶液、Ｃｙ３色素が取り込まれたｃＤＮＡ溶液およびハイブリダイゼーション溶液を得た。
【０１０３】
ハイブリタイゼーション
２種類の核酸が表面に固定された光ファイバー貫通型基板をハイブリダイゼーション装置の基台上に固定し、核酸固定部位の両側に配置された金電極とハイブリダイゼーション装置の交流電圧印加手段を接続した。さらに、垂直移動用下部電極につながる導電パターン配線に直流電圧および交流電圧印加手段を接続した。２種類の核酸を固定した部位に２μｌの前記ハイブリダイゼーション溶液を滴下し、核酸固定部位の両側の電極上にカバー基材を架設し、ハイブリダイゼーション溶液が蒸発しないように密閉した。その後、実施例２と同様に各電極間に電圧を印加し、ハイブリダイゼーションを行った後、カバー基材、電極を取り外し、洗浄した。
【０１０４】
さらに、従来法と比較する為に、平行移動用電極間および垂直移動用電極間に電圧を印加しない状態で６５℃の条件で１６時間放置したサンプルを用意した。その後、該サンプルのカバー基材、電極を取り外し、洗浄した。
【０１０５】
蛍光検出
Ｃｙ５およびＣｙ３からの蛍光を測定するために、光学系は実施例２の光学系と同様にし、Ｃｙ５およびＣｙ３からの蛍光を検出した。
【０１０６】
このような方法で、上記のハイブリダイゼーション後の２種類核酸固定部位からの蛍光をＣｙ５、Ｃｙ３のそれぞれについて測定した。ＴＸ８０３の核酸溶液をスポッティングした核酸固定部位からは、Ｃｙ５の蛍光のみが観察され、Ｃｙ３の蛍光は検出されなかった。ＴＸ８０６の核酸溶液をスポッティングした核酸固定部位からは、Ｃｙ３だけの蛍光が観察され、Ｃｙ５からの蛍光は検出されなかった。
【０１０７】
また、このときの電圧を印加した核酸固定基材から得られた蛍光強度は電圧を印加しない従来の方法に比べて同等であった。また、各核酸固定部位内の蛍光強度分布を詳細に観察すると、従来法に比べて本発明の方法の方が均一な強度分布を示した。このように、スライドガラスに導電性パターンを配設し、核酸固定部位近傍の核酸濃度を高くするための電界と、プローブ核酸とターゲット核酸を相対的に移動させ、衝突確率を高めるための電圧を印加することにより、わずか１０分のハイブリダイゼーションの時間でも十分な結合反応が行われ、かつ場所による偏りの少ない均一な結合反応状態が得られることが分かった。
【０１０８】
【発明の効果】
本発明の選択結合性物質のハイブリダイゼーション方法、ハイブリダイゼーション装置および選択結合性物質固定用基材を用いることにより、ハイブリダイゼーション効率が向上し、かつ結合反応部位における反応の偏りが緩和され、短時間でハイブリダイゼーション工程を完了し、均一なハイブリダイゼーション結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のハイブリダイゼーション装置の断面図（ａ）および平面図（ｂ）である。
【図２】本発明における選択結合性物質の動作を示す原理図である。
【図３】従来のハイブリダイゼーション装置の断面図である。
【図４】従来のハイブリダイゼーション装置における選択結合性物質の動作を示す原理図である。
【図５】本発明における各電極への電圧印加パターンである。
【符号の説明】
１　　選択結合性物質固定用基材
２　　平行移動用電極
３　　平行移動用電極
４　　垂直移動用下部電極
５　　選択結合性物質固定部位
６　　カバー基材
７　　垂直移動用上部電極
８　　選択結合性物質配列領域
９　　交流電圧印加手段
１０　導電パターン
１１　コネクタ
１２　直流電圧および交流電圧印加手段
１３　被検試料溶液
１４　基台
１５、１５’　選択結合性物質
１６、１６’　対応選択結合性物質
１７　選択結合性物質固定用基材
１８　支持材
１９　垂直移動用下部電極
２０　選択結合性物質固定部位
２１　カバー基材
２２　垂直移動用上部電極
２３　被検試料溶液
２４　電圧印加手段
２５　ゲート信号
２６　直流および交流電圧印加パターン
２７　交流電圧印加パターン
２８　直流電圧および交流電圧印加手段ＯＮ区間
２９　交流電圧印加手段ＯＮ区間
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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