(57)【要約】【課題】ベヘン酸などの長鎖飽和脂肪酸を高収率かつ高純度に精製する方法を提供する。【解決手段】ベヘン酸などの長鎖飽和脂肪酸の製造方法であって、下記の工程：（Ａ）リパーゼの存在下で飽和脂肪酸混合物と例えば炭素数２から７の直鎖低級アルコールとのエステル化を行う工程；及び（Ｂ）工程（Ａ）で得られた反応混合物から長鎖飽和脂肪酸を分離する工程を含む方法。飽和脂肪酸混合物としては、例えばナタネ油の水素添加及び加水分解により得られる飽和脂肪酸混合物などを用いることができ、リパーゼとしては、例えばセライトなどに固定化されたリパーゼなどを用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
長鎖飽和脂肪酸の製造方法であって、下記の工程：
（Ａ）リパーゼの存在下で飽和脂肪酸混合物と直鎖低級アルコールとのエステル化を行う工程；及び
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた反応混合物から長鎖飽和脂肪酸を分離する工程
を含む方法。
【請求項２】
飽和脂肪酸混合物がナタネ油の水素添加及び加水分解により得られる飽和脂肪酸混合物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応混合物から炭素数２０以上の長鎖飽和脂肪酸を結晶として分離する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
固定化されたリパーゼを用いる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
セライトに固定化されたリパーゼである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
長鎖飽和脂肪酸がベヘン酸である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
直鎖低級アルコールが炭素数２から７の直鎖アルコールである請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
有機溶媒の非存在下でエステル化を行う請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ベヘン酸などの長鎖飽和脂肪酸を高収率かつ高純度に精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ベヘン酸に代表される長鎖飽和脂肪酸は熱現像感光材料の非感光性有機銀塩の原料としての利用（特開２００３−４３６１４号公報など）、チョコレートのブルーミング防止剤等の食品添加剤の中間原料としての利用（ＷＯ  ０２／００３２、特開２００１−２６９１２１号公報など）、ディスプレイ材料としての利用など、産業上広く用いられている重要な化合物である。これらの用途で長鎖飽和脂肪酸を使用する場合、極めて高純度の脂肪酸を安価に供給することが要求される。
【０００３】
一般的に、ベヘン酸等の長鎖飽和脂肪酸は動植物油（ナタネ油、魚油など）に含まれる不飽和脂肪酸を接触水素添加により硬化油とし、この硬化油を加水分解して得られる飽和脂肪酸混合物を（１）分子蒸留又は（２）再結晶によって精製することにより製造される。しかし、分子蒸留による方法では目的とする脂肪酸と炭素鎖長が近い脂肪酸を完全に分離することが困難である。また、目的物が炭素数２０を越える飽和脂肪酸の場合、室温で固体化するため蒸留の操作性が悪いという欠点があり、目的とするフラクションの回収率があまり高くないという問題点もある。再結晶による方法では、目的物よりも長鎖長の飽和脂肪酸が優先して結晶化する傾向があるため、分子蒸留法と同様に、目的とする脂肪酸と炭素鎖長が近い脂肪酸を完全に分離することが困難である。再結晶を複数回繰り返すことで高純度化を達成できるものの、回収率が著しく低下してしまい低コスト生産が困難になるという問題がある。
【０００４】
一方、ＤＨＡやＥＰＡなどの高度不飽和脂肪酸を精製する方法として、常温、常圧下で反応が進行するリパーゼを用いた方法が注目されている。リパーゼによる高度不飽和脂肪酸の精製方法としては、油脂をリパーゼで加水分解して未分解のグリセリド画分中に濃縮する方法（選択的加水分解反応）、及び高度不飽和脂肪酸を含有する脂肪酸混合物とアルコールとからなる反応混液にリパーゼを作用させ、長鎖飽和脂肪酸以外の脂肪酸をエステル化し、高度不飽和脂肪酸を遊離脂肪酸画分として精製する方法（選択的エステル化反応）等が知られている。医薬品原料として高度不飽和脂肪酸を高純度に精製する場合には選択的エステル化反応のほうが有利である。
【０００５】
例えば、これまでにγ−リノレン酸を濃縮する方法として、ボラージオイル（γ−リノレン酸含量２５％）の脂肪酸混合物からゲオトリカム属の糸状菌が生産するリパーゼ及び低級アルコールとｎ−ヘキサンとを含む反応液を用いて、遊離脂肪酸画分中にγ−リノレン酸を７０％の濃度まで精製する方法が知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （ＪＡＯＣＳ），  Ｖｏｌ．７１，  Ｎｏ．６，  ｐ．５６３  （１９９４）、ＪＡＯＣＳ，  Ｖｏｌ．７２，  Ｎｏ．４，  ｐ．４１７  （１９９５））  。また、ＤＨＡを濃縮する方法としては、魚油（ＥＰＡ  １１％、ＤＨＡ  含量８％）の脂肪酸混合物を尿素付加法によりＤＨＡ  ２７％（ＥＰＡ  ２７％）に濃縮した脂肪酸混合物及びそのメチルエステル体と低級アルコールとからなる反応混合物に、ｎ−ヘキサンを加えた系でリゾムコール属の微生物が生産するリパーゼを用いてエステル化することにより（この反応では、メチルエステルとアルコールとの間でアルコリシス反応も進行している）、遊離脂肪酸画分中にＤＨＡを７２％まで濃縮する方法も知られている（ＪＡＯＣＳ，  Ｖｏｌ．６６，  Ｎｏ．８，  ｐ．１１２０（１９８９））  。しかしながら、これらの方法はいずれも溶解性に優れた不飽和脂肪酸においては有効であるものの、極めて結晶性の高い長鎖飽和脂肪酸への適用には溶媒量の増加や反応の不均一化による再現性低下などの問題があり、製造コストを下げることが困難であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の課題は、長鎖飽和脂肪酸を高収率で高純度に精製できる方法を提供することにある。本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、リパーゼによる選択的エステル化反応におけるリパーゼの脂肪酸特異性を検討した結果、有機溶剤中で市販のリパーゼを用いて飽和脂肪酸を含有する脂肪酸混合物と炭素数２から７の直鎖低級アルコールとのエステル化反応を行うと、炭素数１８以下の飽和脂肪酸が優先的にエステル化され、その結果、炭素数１８以下の飽和脂肪酸の融点が下がって可溶化し、炭素数２０以上の長鎖飽和脂肪酸が結晶として析出することを見出した。また、市販のリパーゼをセライトに固定化して反応に用いると有機溶媒を含まない反応系でも選択的エステル化反応が可能であることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、長鎖飽和脂肪酸の製造方法であって、下記の工程：
（Ａ）リパーゼの存在下で飽和脂肪酸混合物と直鎖低級アルコールとのエステル化を行う工程；及び
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた反応混合物から長鎖飽和脂肪酸を分離する工程
を含む方法を提供するものである。
【０００８】
この発明の好ましい態様によれば、飽和脂肪酸混合物がナタネ油の水素添加及び加水分解により得られる飽和脂肪酸混合物である上記の方法；反応混合物から炭素数２０以上の長鎖飽和脂肪酸を結晶として分離する上記の方法；固定化されたリパーゼを用いる上記の方法；セライトに固定化されたリパーゼを用いる上記の方法；長鎖飽和脂肪酸がベヘン酸である上記の方法；直鎖低級アルコールが炭素数２から７の直鎖アルコールである上記の方法；及び有機溶媒の非存在下でエステル化を行う上記の方法が提供される。
【０００９】
別の観点からは、上記の方法により製造された長鎖飽和脂肪酸、好ましくはベヘン酸が本発明により提供される。また、本発明により、リパーゼの存在下で飽和脂肪酸混合物と直鎖低級アルコールとのエステル化を行うことにより得られ、炭素数１８以下の飽和脂肪酸のエステルと炭素数２０以上の長鎖飽和脂肪酸とを含む混合物が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の方法で用いられる直鎖低級アルコールとしては、例えば、炭素数２から７の直鎖アルコールを挙げることができる。好ましくは炭素数３から７であり、さらに好ましくは炭素数５から７である。使用するリパーゼの種類によってはエタノール等の低級アルコールでは生成する脂肪酸エチルエステルがリパーゼの基質になる可能性があり、平衡がエステル化の方向に進まない場合がある。そのような場合は炭素数５以上のアルコールを用いることが好ましい。
【００１１】
本発明の方法で用いられるリパーゼの種類は特に限定はされないが、リゾプス属由来のリパーゼ、例えばリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）由来のリパーゼ、シュードモナス属由来のリパーゼ、あるいはペニシリウム属、リゾムコール属、フザリウム属、又はフミコーラ属等に属する微生物由来のリパーゼなどを用いることができる。リパーゼの使用量は、エステル化活性や所望の長鎖飽和脂肪酸の濃縮度などの条件に応じて適宜選択することができるが、脂肪酸と直鎖低級アルコールを含む水性の反応混合物１  ｇ当たり例えば３０から２，０００  ユニット、好ましくは１００から１，０００  ユニット程度である。リパーゼとしては市販のリパーゼをそのまま用いることもできる。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のリパーゼＰＳアマノ、Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ由来のリパーゼＧ「アマノ」５０、リパーゼＡＫ「アマノ」２０などが反応活性及び反応選択性の観点から有用である。
【００１２】
本発明に方法において原料として用いられる飽和脂肪酸混合物を調製するための原料としては、魚油又は植物油などの油脂を用いることができ、好ましくは植物油、さらに好ましくはナタネ油を用いることができる。油脂をニッケル系又は銅系など既知の接触水素添加用の触媒の存在下で、一般には加熱及び加圧条件下で水素添加を行い、油脂中の脂肪酸部分の不飽和結合を飽和結合に変換した硬化油を調製し、得られた硬化油を水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム等の強アルカリを用いて常法に従って加水分解して飽和脂肪酸塩を得た後、塩酸又は硫酸等の強酸により中和して十分に水洗することにより飽和脂肪酸混合物を得ることができる。もっとも、飽和脂肪酸混合物の調製方法は上記に例示した方法に限定されるものではなく、当業者が適宜の方法により調製できることは言うまでもない。
【００１３】
本明細書において飽和脂肪酸混合物とは、１種又は２種以上の飽和脂肪酸を主成分として含む混合物を意味しており、飽和脂肪酸以外の化合物が１種又は２種以上含まれていることを排除するものではない。好ましくは、炭素数１８以上の飽和脂肪酸の１種又は２種以上の総質量が混合物全質量の５０％以上、さらに好ましくは６０％以上である。飽和脂肪酸混合物に含まれる脂肪酸のアルキル鎖は直鎖又は分枝鎖のいずれであってもよい。本発明の方法で製造される長鎖飽和脂肪酸のアルキル鎖は直鎖又は分枝鎖のいずれであってよいが、アルキル鎖が直鎖であることが好ましい。長鎖飽和脂肪酸のアルキル鎖の長さは特に限定されないが、通常は炭素数１８以上であり、好ましくは炭素数２０以上であり、さらに好ましくは炭素数２２以上である。最も好ましい長鎖飽和脂肪酸はベヘン酸である。
【００１４】
エステル化反応を行うための反応液中の飽和脂肪酸混合物と直鎖低級アルコールとの比（モル比）は特に限定されないが、反応溶媒として有機溶剤を使用する場合には１：１から１：１０、好ましくは１：１から１：８、さらに好ましくは１：１から１：５程度である。エステル化反応は完全な脱水系よりも水を微量存在させた系で行うことが好ましい。反応液中の含水量は特に限定されないが、基質となる長鎖飽和脂肪酸に対して０．０１  から１００モル％であり、好ましくは０．０１から５０モル％、さらに好ましくは０．０１から１０モル％である。
【００１５】
反応に有機溶媒を用いる場合、有機溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数５から１０の炭化水素系有機溶媒（ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−へプタン、ｎ−オクタンなど）、エーテル系有機溶媒（ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなど）、芳香族系有機溶媒（トルエン、ベンゼンなど）、ニトリル系有機溶媒（アセトニトリル等）などを用いることができる。有機溶媒として好ましくは炭化水素系有機溶媒および芳香族系有機溶媒であり、さらに好ましくは炭化水素系有機溶媒である。反応は有機溶媒の非存在下で反応を行うこともできる。有機溶媒の非存在下で反応を行う場合には、飽和脂肪酸混合物、直鎖低級アルコール、水、及びリパーゼを含む反応液により反応を行うことができる。
【００１６】
リパーゼは固定化してエステル化反応に用いてもよい。リパーゼを固定化する方法は種々知られており、適宜の方法を採用することができる。例えば、固定化のための担体の種類は特に限定されないが、例えばセライト（高純度ケイソウ土）などを用いることができ、これらのうちセライトを用いることが好ましい。例えば、リパーゼをセライトに固定化する方法は文献に記載の方法（ＪＡＯＣＳ，  ７６，  ｐｐ．１４７−１５２  （１９９９））に従って行うことができる。固定化リパーゼを用いて選択的エステル化反応を行う場合の反応温度は、例えば、１５から８０℃の範囲、好ましくは３０から８０℃、さらに好ましくは４０℃から６０℃である。リパーゼを固定化して反応に用いる場合には、有機溶媒の非存在下で反応を行うことが好ましい。リパーゼを固定化しないで反応を行う場合の反応温度は、有機溶剤の存在下又は非存在下のいずれの場合についても１５から６０℃の範囲、好ましくは２０から６０℃、さらに好ましくは３０℃から６０℃である。
【００１７】
エステル化の後、反応混合物から長鎖飽和脂肪酸を分離する方法は特に限定されないが、例えば、通常行われているアルカリによる抽出法（反応混合物にアルカリを添加して脂肪酸アルカリ塩とした後、水層別に分画する方法）、溶剤液−液分配による方法、クロマトグラフィーによる方法、低温結晶化分別による方法、分子蒸留による方法、精密真空蒸留による方法等が挙げられるが、低温結晶化分別による方法が最も好ましい。
【００１８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。
例１：有機溶媒系でのベヘン酸の製造
（Ａ）飽和脂肪酸混合物の調製
ナタネ油硬化油（日本化成）１００  ｇをエタノール  １  Ｌに加え、１０％水酸化カリウム水溶液５００  ｍｌを添加して４時間加熱還流した。反応液を水冷して析出する脂肪酸カリウム塩を濾取し、この塩をエーテルに溶解して５Ｎ塩酸を加えて飽和脂肪酸混合物を抽出した。得られた飽和脂肪酸の組成を表１に示す。
【００１９】
【表１】
2004300276.tif 000002
【００２０】
（Ｂ）選択的エステル化
上記飽和脂肪酸混合物１００  ｇをｎ−オクタン（基質に対して１モル％の水を添加）３００    ｍｌに添加し、１−ペンタノール６６  ｍｌ（２当量）とリパーゼＧ「アマノ」５０（１０  ｇ）を加えて４５℃にて５時間振とうした。リパーゼＰＳアマノ、リパーゼＡＫ「アマノ」２０についても同様の添加量で反応を行った。反応液中の飽和脂肪酸の組成をガスクロマトグラフィーで分析した結果を表２に示す。
【００２１】
【表２】
2004300276.tif 000003
【００２２】
最も良好な結果を与えたリパーゼＧ「アマノ」５０を含む反応混合物を用いて次の工程を行った。リパーゼをセライトろ過により除去し、反応液を１／２量に濃縮して氷冷し、析出した結晶を濾取した。結晶中の飽和脂肪酸の組成をガスクロマトグラフィーで分析した結果を表３に示す。この方法により純度９１．８％のベヘン酸が収率４５％で得られることがわかった。
【００２３】
【表３】
2004300276.tif 000004
【００２４】
例２：無溶媒系でのベヘン酸の製造
例１で得た飽和脂肪酸混合物５００  ｇに１−ペンタノール３３０  ｍｌ（２当量）とリパーゼＡＫ「アマノ」２０（５０  ｇ）を加えて４５℃で２１時間振とうした。反応終了後、ｎ−ヘキサン（１  Ｌ）を添加して反応液を５０℃に加熱してリパーゼを熱時ろ過した。溶液を氷冷して析出した結晶を濾取した。結晶中の飽和脂肪酸の組成をガスクロマトグラフィーで分析した結果を表４に示す。この方法により、純度９３．１％のベヘン酸が収率６１％で得られることがわかった。
【００２５】
【表４】
2004300276.tif 000005
【００２６】
例３：セライト固定化リパーゼを用いたベヘン酸の製造
（Ａ）固定化リパーゼの調製
リパーゼＧ「アマノ」５０：５００ｍｇを０．１Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ７．０）１０  ｍｌに溶解し、セライト（和光純薬製、Ｎｏ．５４５）５．０  ｇを添加して室温で２時間穏やかに攪拌した。反応液にヘキサン２０  ｍｌを添加してさらに３０分間攪拌したのちリパーゼが固定化されたセライトを濾取し、１２時間減圧乾燥してセライト固定化リパーゼを得た。リパーゼＰＳアマノの場合には、リン酸バッファー（ｐＨ７．０）に不溶な成分をマイクロフィルターでろ別した後に上記方法に従って固定化した。
【００２７】
飽和脂肪酸混合物１００  ｇをｎ−へプタン（基質に対して１モル％の水を添加）１００  ｍｌに添加し、１−ペンタノール６６  ｍｌ（２当量）とセライト固定化リパーゼＧ「アマノ」５０（１０  ｇ）を加えて６０℃で３時間振とうした。固定化リパーゼを熱時ろ過した後に反応液を氷冷し、析出した結晶を濾取した。結晶中の飽和脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで分析した結果を表５に示す。固定化セライトを用いることで高温でもリパーゼの活性が保持された。高温で反応させることで難溶性である長鎖飽和脂肪酸を高濃度で反応させることが可能になり、かつ触媒の濾別、氷冷、ろ過という簡便な操作で高純度ベヘン酸が得られることがわかった。
【００２８】
【表５】
2004300276.tif 000006
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、高純度な長鎖飽和脂肪酸を簡便かつ高収率に製造することができる。