(57)【要約】【目的】ヒラタケ属の木材腐朽菌が産生するメラニン分解性物質を量産することを目的とする。【構成】特定の木材腐朽菌をＣ／Ｎ比を特定値にした培地で培養する。【効果】メラニン分解性物質が量産され、その培養処理物も高い美白効果を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
数１で表されるＣ／Ｎ比が３以下である培地で培養したことを特徴とするヒラタケ属に属する木材腐朽菌培養法。
【数１】
2004147574.tif 000006
【請求項２】
数１で表されるＣ／Ｎ比が３以下である培地で培養したことを特徴とするヒラタケ属に属する木材腐朽菌培養物。
【請求項３】
請求項２記載のヒラタケ属に属する木材腐朽菌培養物を配合したことを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項４】
請求項２記載のヒラタケ属に属する木材腐朽菌培養物を配合したことを特徴とする飲食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物、特に担子菌が産生するメラニン分解性物質を効果的に量産する培養方法、及びその利用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】メラニンは、皮膚の他に、中枢神経や網膜でも生合成され、また動物に限らず、植物から微生物に至るまで自然界に広く分布存在している。メラニンは、チロシンがチロシナーゼの作用によりドーパ、更にドーパキノンへと変換され、次いで酸化が進んでインドール−５，６−ジヒドロキノンとなり、これが重合して生成するものである。
【０００３】メラニンの生合成は、紫外線をトリガーのひとつとして、表皮の基底層に存在する細胞、メラノサイトで行われる。メラノサイトでは、メラノソームと呼ばれる顆粒中でメラニンが合成、成熟されて表皮細胞に移動、分散し、皮膚の代謝に伴って退色し、更新の際に垢となって脱落する。このように、メラニンは紫外線の悪影響から身体を守る重要な役目を担っており、医学上重要な因子である。しかしながら、メラニン量が多くなると色黒の皮膚となるし、また、その不均一な分布は、シミ（肝斑）、ソバカス（雀卵斑）となって美容上大きな問題となる。
【０００４】現在知られているシミ、ソバカス対策は、２つの予防法と１つの治療法に大別される。
【０００５】予防法には、メラニン生合成の引金となるＵＶ光をサンスクリーン剤等で遮光する方法と、メラニン生合成を阻害する薬品（例えば、グルタチオン、ビタミンＣ、システイン、アルブチン、チオ硫酸ソーダといったメラニン合成阻害剤等）を用いる方法とが知られている。
【０００６】しかしながら、一旦形成されてしまったシミ、ソバカスを治療消失せしめるための副作用のない安全な方法は未だ開発されていないのが現状である。以前、ハイドロキノン、４−イソプロピルカテコール、ハイドロキノンモノベンジルエーテルが皮膚漂白剤として用いられたこともあったが、これらは強力な美白作用を有するものの、それは色素細胞の変性、致死に基づくものである故、外用を継続すると永久的白斑となる可能性があり、その他色素異常、かぶれ等の副作用も避けられないため、現在は化粧料としては市販されていない。
【０００７】また、メラニンを分解する方法として、海藻から抽出したメラニン分解物を利用する方法（特開平３−２５１５１４）、糸状菌の培養菌体物から採取されたメラニン分解物を利用する方法（特開平７−２１３２９４）、担子菌の培養物もしくはその処理物を利用する方法（特開平６−２１９９３３）等があるが、メラニン分解の程度が十分でなかったり、安定的に量産できなかったり、刺激がある等の問題点があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような技術の現状に鑑みてなされたものであって、シミ、ソバカスの生成を予防するのではなく、既に出来てしまったシミ、ソバカスを治療する方法として、担子菌を利用してメラニンを分解する物質を安定的に量産できる方法を提供する目的でなされたものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者は、木材腐朽菌の中から、メラニン分解性を有するキノコをスクリーニングし、特定の培地で培養することで、木材腐朽菌が産生するメラニン分解性物質が量産されることを発見し、遂に本発明の完成に至った。つまり本発明は、数１で表されるＣ／Ｎ比が３以下の培地で培養されたヒラタケ属に属する木材腐朽菌の培養処理物を用いるものである。
【００１０】
本発明において使用可能な微生物は、メラニン分解性を有する木材腐朽菌であれば、白色（リグニン分解菌等）、褐色を問わずすべての木材腐朽菌が使用可能であるが、ヒラタケ属（ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）が特に好適に用いられる。
【００１１】
ヒラタケ属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）に属する木材腐朽菌には、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓ  （Ｊａｃｑ．：Ｆｒ．）Ｋｕｍｍｅｒ）、タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ  （Ｐａｕｌｅｔ）Ｒｏｌｌａｎｄ  ｖａｒ．  ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ（Ｓｉｎｇ．）Ｏｈｉｒａ）、トキイロヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｓａｌｍｏｎｅｏｓｔｒａｍｉｎｅｕｓ  Ｌ．
Ｖａｓｓ．）、ウスヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｐｕｌｍｏｎａｒｉｕｓ  （Ｆｒ．）  Ｑｕｅｌ，）等が挙げられる。
【００１２】
担子菌は、天然の子実体および土壌中から菌糸を誘導することができるとともに、菌株分譲機関から分譲を受けることも可能である。これら菌糸を培養することにより、培養液中にマンガンパーオキシダーゼ等のメラニン分解性物質を生産する。マンガンパーオキシダーゼとは、木材のリグニンを分解する酵素として知られており、木材糖化の前処理や染料の脱色、着色排水の脱色、難分解性物質などの分解に利用されている。
【００１３】
本発明における培地は、数１で表されるＣ／Ｎ比が３以下であればよい。
培地の炭素源成分としては、例えばグルコース、マルトース、トレハロース、ショ糖、麦芽エキス、ポテトエキス、オートミール、コムギ麦芽又はそれらの混合物等を用いることが出来る。前記培地に使用できる窒素源成分としては、例えば、アミノ酸、アンモニウム塩、硝酸塩、ペプトン、スキムミルク、イーストエキス又はそれらの混合物等を用いることが出来る。また、前記培地に使用できる無機塩類成分としては、例えば、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸塩、硫酸第一鉄、塩化カリウム又はそれらの混合物等が用いることが出来る。
【００１４】
培養条件は、温度１５〜３７℃、ｐＨ２．５〜１０．０、照光０〜２０００Ｌｕｘであり、培養は、７〜３０日間振とう培養、通気撹拌培養などの方法により好気的条件下で行うのが好ましい。最初から本培養を行うこともできるが、あらかじめ小規模な前培養を行い、これを、本培養に接種して行うのが好ましい。
【００１５】
本発明にいう培養処理物とは、培養後の培養物、菌糸体をろ過等の方法により分離した培養液、培養した木材腐朽菌の菌糸体を通常の方法により抽出した菌糸体抽出物、これらから通常の方法によりマンガンパーオキシダーゼ等のメラニン分解性物質を分離して精製したものを含む。
【００１６】
菌糸体の抽出物の調製は特に限定されないが、例えば種々の適当な有機溶媒を用いて低温下から加温下で抽出される。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることが出来る。とりわけ、水、エチルアルコール、１，３−ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適である。
【００１７】
菌糸体の抽出物については、それぞれの菌糸体を乾燥した後、細かく粉砕したものを重量比で１〜１０００倍量、特に１０〜１００倍量の溶媒を用い、常温抽出の場合には、０℃以上、特に２０℃〜３０℃で１時間以上、特に３〜４時間行うのが好ましい。
【００１８】
以上のような条件で得られる培養物、培養液、菌糸体抽出物は、そのまま用いても良いが、さらに必要により、濾過等の処理をして濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることが出来る。そのまま利用する場合の配合量は、０．０１〜１００重量％の範囲で利用でき、好ましくは１０．０〜５０．０重量％の範囲が最適である。
【００１９】
また、メラニン分解性物質を培養液中に存在するパーオキシダーゼ類を分離して利用する場合は、硫酸アンモニウムなどの塩類により塩析する。塩析により析出した物質は、乾燥しそのまま利用しても良いが、必要に応じて、さらに精製処理して使用することが出来る。本発明における精製したパーオキシダーゼ類の配合量は、０．００００１〜１０．０重量％が好ましく、特に０．００１〜０．１重量％の範囲が最適である。
【００２０】
本発明に係る培養処理物の他に、水性成分、油性成分、植物抽出物、動物抽出物、粉末、賦形剤、界面活性剤、油剤、アルコール、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、増粘剤、甘味剤、色素、香料等を必要に応じて混合して適宜配合することにより調製される。本発明の化粧料の剤型は特に限定されず、化粧水、乳液、クリーム、パック、パウダー、スプレー、軟膏、分散液、洗浄料等種々の剤型とすることができる。飲食物として用いる場合の剤型としては、打錠、カプセル、飲料、ガム、キャンディ等の剤型とすることができる。
【００２１】
以下、本発明に関する実施例を示すと共にその素材を用いた皮膚外用剤及び飲食物への応用処方例等について述べるが、ここに記載された実施例に限定されないのは言うまでもない。
【００２２】木材腐朽菌の培養
ヒラタケ属の木材腐朽菌としては、財団法人発酵研究所より購入した菌株：ヒラタケ（ＩＦＯ：Ｎｏ．３０７７６）を用いた。炭素源としてグルコースを使用し、窒素源としてポリペプトンを使用した。Ｃ／Ｎ比を変えた培地を使用し、メラニン分解性物質の量産される培地のスクリーニングを行った。その他の成分の影響を避ける為、無機成分等は加えずスクリーニングを行なった。
培養は、２００ｍｌの三角フラスコに培養液１００ｍｌを添加し、滅菌後、菌糸を植え付け、２４℃、１５０ｒｐｍで１０日間、回転培養を行った。
【００２３】培養液の調整方法
前記方法で培養した培養物をろ過し、菌糸体を取り除いたものを培養液とした。
【００２４】マンガンパーオキシダーゼの力価の測定
２，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌ（２，６−ＤＭＰ）１％水溶液１ｍｌに培養液を２ｍｌと、０．２Ｍ−クエン酸−ＮａＯＨでＰＨ４．５に調製した緩衝液０．３ｍｌと、精製水０．７ｍｌを添加し、１０分後の４７５ｎｍにおける吸光度変化を測定した。
【００２５】
【表１】
2004147574.tif 000002
【００２６】
表１の結果から分かる通り、Ｃ／Ｎ比が３以下である培地で培養した培養液において、メラニン分解性物質であるマンガンパーオキシダーゼが量産される事が分かる。また、培養物、菌糸体の抽出物についても同様の傾向を示した。
【００２７】メラニンの分解
ヒラタケ（ＩＦＯ：Ｎｏ．３０７７６）をＣ／Ｎ比１．０の培地で培養した培養液１００ｍｌに、硫酸アンモニウム５６ｇを加え、溶解させる。４℃で１昼夜放置し、沈殿を生じさせる。３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離により、沈殿を回収し、乾燥して粗酵素粉末を得る。この粉末を精製水１０ｍｌに溶解し、酵素溶液とする。調製した酵素溶液５ｍｌに０．１ｇ／ｍｌイカスミメラニン（グリコ栄養食品社製）分散水溶液を５０μｌを添加し、室温で３日間放置した。その後、メラニンをろ過した溶液の４０５ｎｍの吸光度を測定し、メラニンの分解度を測定した。
【００２８】
【表２】
2004147574.tif 000003
【００２９】
表２に示したように、Ｃ／Ｎ比１．０で培養した培養液より調製した酵素溶液はメラニンを分解し、４０５ｎｍにおける吸光度の値が上昇していることがわかった。陰性対象として酵素液の代わりに精製水を用いたものは、４０５ｎｍの吸光度値の増加は全く認められなかった。
【００３０】
次に、本発明の培養処理物を配合した処方例を示すが、本発明はこれに限定されるものでない。
化粧料の処方例
【００３１】
（１）化粧用クリーム
（重量％）
ａ）ミツロウ・・・２．０
ｂ）ステアリルアルコール・・・５．０
ｃ）ステアリン酸・・・８．０
ｄ）スクワラン・・・１０．０
ｅ）自己乳化型グリセリルモノステアレート・・・３．０
ｆ）ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
ｇ）ヒラタケ培養液（Ｃ／Ｎ比０．２）・・・１０．０
ｈ）１，３−ブチレングリコール・・・５．０
ｉ）水酸化カリウム・・・０．３
ｊ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｋ）精製水・・・残部
製法
ａ）〜ｆ）までを加熱溶解し、８０℃に保つ。ｈ）〜ｋ）までを加熱溶解し、８０℃に保ち、ａ）〜ｆ）に加えて乳化し、４０℃まで撹拌しながら冷却する。その後、ｇ）を加え、攪拌し均一に溶解する。
【００３２】
（２）乳液              （重量％）
ａ）ミツロウ・・・０．５
ｂ）ワセリン・・・２．０
ｃ）スクワラン・・・８．０
ｄ）ソルビタンセスキオレエート・・・０．８
ｅ）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．２
ｆ）タモギタケ菌糸体抽出物（Ｃ／Ｎ比０．０４）・・・１５．０
ｇ）１，３−ブチレングリコール・・・７．０
ｈ）カルボキシビニルポリマー・・・０．２
ｉ）水酸化カリウム・・・０．１
ｊ）精製水・・・残部
ｋ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｌ）エタノール・・・７．０
製法
ａ）〜ｅ）までを加熱溶解し、８０℃に保つ。ｇ）〜ｋ）までを加熱溶解し、８０℃に保ち、ａ）〜ｅ）に加えて乳化し、５０℃まで撹拌しながら冷却する。５０℃でｆ）、ｌ）を添加し、４０℃まで攪拌、冷却する。
【００３３】
（３）化粧水
（重量％）
ａ）マンガンパーオキシダーゼ（Ｃ／Ｎ比１．０）・・・０．０１
ｂ）グリセリン・・・５．０
ｃ）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
ｄ）エタノール・・・６．０
ｅ）香料・・・適量
ｆ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｇ）精製水・・・残部
製法
ｃ）〜ｇ）までを混合し、均一に溶解する。使用時にａ）、ｂ）を混合して使用する。
【００３４】
（４）洗顔料                  （重量％）
ａ）ステアリン酸・・・１２．０
ｂ）ミリスチン酸・・・１４．０
ｃ）ラウリン酸・・・５．０
ｄ）ホホバ油・・・３．０
ｅ）グリセリン・・・１０．０
ｆ）ソルビトール・・・１５．０
ｇ）１，３−ブチレングリコール・・・１０．０
ｈ）ＰＯＥ（２０）グリセロールモノステアリン酸・・・２．０
ｉ）水酸化カリウム・・・５．０
ｊ）水・・・残部
ｋ）キレート剤・・・適量
ｌ）香料・・・適量
ｍ）ウスヒラタケ培養液乾燥物（Ｃ／Ｎ比３．０）・・・０．１
製法  ａ）〜ｈ）までを加熱溶解し７０℃に保つ。ｊ）にｉ）を溶解後ａ）〜ｈ）に加えケン化する。その後ｋ）、ｌ）を入れ攪拌しながら冷却する。５０℃でｍ）を添加し、４０℃まで攪拌、冷却する。
【００３５】
（５）ドリンク剤        （重量％）
ａ）トキイロヒラタケ菌糸体抽出物（Ｃ／Ｎ比０．２）・・・２０．０
ｂ）防腐剤・・・適量
ｃ）砂糖・・・１０．０
ｄ）酸化防止剤・・適量
ｅ）精製水・・・残部
製法  ａ）〜ｅ）までを混合攪拌し、よく分散させ均一にする。
【００３６】
（６）錠剤          （重量％）か
ａ）ヒラタケ培養物乾燥物（Ｃ／Ｎ比２．０）・・・２０．０
ｂ）ショ糖・・・８０．０
製法  ａ）ｂ）を混合し、よく攪拌分散させ均一にする。その後適量毎に打錠する。
【００３７】
【効果確認試験】
（１）塗布によるヒトでの効果確認試験
被験者として、２０〜５０歳の女性１５名に１日２回（朝、夜）連続２ヵ月間、本発明品と比較品のそれぞれを使用させ、塗布部位の状態を試験前後で比較し、改善効果を調べた。本試験には、実施例１として処方例中の（１）化粧用クリームで示した化粧料を用い、比較例  １  には実施例１からヒラタケ培養液を除き、代わりにＣ／Ｎ比２５．７で培養したヒラタケ培養液を配合した化粧料、比較例  ２には実施例１からヒラタケ培養液を除いた化粧料を作成し、その使用による効果について調べた。本発明の有効成分を配合した化粧料を毎日使用しながら肌の美白効果及び使用後の肌の感触について塗布開始前及び２ヶ月塗布後におけるアンケートで集計し、効果の確認を行った。
【００３８】評価基準
＜美白効果＞
著効：しみ・ソバカスが消えた部分がある。
有効：しみ・ソバカスが目立たなくなった。
やや有効：しみ・ソバカスがやや目立たなくなった。
変化なし：なんら変化なし。
【００３９】
【表３】
2004147574.tif 000004
【００４０】
表３より、比較例１にもやや美白効果が見られるが、Ｃ／Ｎ比０．２の培地で培養した培養液を配合した実施例１は、非常に高い美白効果があることがわかる。また、使用後の肌感触についてはしっとり・つるつるになった人が半数以上にのぼり、使用後の肌感触が良くなっていることがわかる。実施例１と比較例１を比較すると、実施例１の方が比較例１よりはるかにこれらの効果が高いことから、これらの効果は培地のＣ／Ｎ比を３．０以下に設定したことに起因していることが明らかになった。
尚、本試験において実施例１を使用して何らかの刺激があったと答えた人はいなかった。
【００４１】
（２）服用によるヒトでの効果確認試験
被験者として、２０〜５０歳の女性１５名に１日１回（夜）連続２ヵ月間、本発明品と比較品のそれぞれを服用させ、肌の状態を試験前後で比較し、改善効果を調べた。本試験には、実施例２として処方例で示した（６）錠剤を用い、比較例３には実施例２からヒラタケ培養物乾燥物を除き、代わりにＣ／Ｎ比４．０で培養したヒラタケ培養物乾燥物を配合した錠剤、比較例４には実施例２からヒラタケ培養物乾燥物を除きショ糖のみとした錠剤を作成し、その使用による効果について調べた。本発明の有効成分を配合した錠剤を毎日服用しながら肌の美白効果の有無を服用開始前及び２ヶ月服用後におけるアンケートで集計し、効果の確認を行った。尚、評価基準は連続塗布による美白効果で行なった基準と同様である。
【００４２】
【表４】
2004147574.tif 000005
【００４３】
表４より、比較例３にもやや美白効果が見られるが、Ｃ／Ｎ比２の培地で培養した培養物乾燥物を配合した実施例２は、非常に高い美白効果があることがわかる。美白効果が培地のＣ／Ｎ比を３．０以下設定したことに起因していることが明らかになった。
尚、本試験において実施例２を使用して何らかの体調不良があったと答えた人はいなかった。
【発明の効果】
以上詳述したごとく、本発明の培養法によれば、安定的にメラニン分解性物質を量産でき、それを利用したものは、角質中のメラニンを分解し、高い美白効果を有するとともに安全性の高いものである。