(57)【要約】【課題】異なる蛍光色素で標識された核酸プローブと標的核酸を用いて、より正確に目的の核酸量を測定し、再現性のある核酸検出方法を提供することである。【解決手段】プローブ核酸と標的核酸との両方に蛍光共鳴エネルギー移動を起す蛍光色素を標識し、これらを反応させてハイブリッド体を形成させた際に、標的核酸がプローブ核酸とハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、ハイブリダイズしていないプローブ核酸の蛍光強度値、該標的核酸単体の蛍光強度値、蛍光共鳴エネルギー移動による標的核酸の蛍光強度値により補正処理する。【選択図】　　図１
2004016132.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質と該標的物質に特異的に結合するプローブとを反応させて得られる結合体の形成を検出することによる標的物質の検出方法において、
前記標的物質と前記プローブの両方が異なる蛍光色素で標識されており、これらの蛍光色素が互いに作用して蛍光を変化させ得るものであり、該変化を測定して前記結合体の形成を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項２】
前記プローブ及び前記標的物質が核酸であり、ハイブリダイゼーションによりこれらの結合体を形成する請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記プローブ及び前記標的物質の両方がタンパク質であり、これらの間の相互作用により前記結合体を形成するか、前記プローブ及び前記標的物質の一方がタンパク質であり他方が核酸であり、これらの間の相互作用によりこれらの結合体を形成する請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
前記プローブの一端に官能基を有して固体表面に結合し、その他端が蛍光色素で標識されている請求項２または３に記載の検出方法。
【請求項５】
前記固体表面に結合し、かつその他端が蛍光色素で標識されているプローブで、前記標的物質との結合体形成前の蛍光を測定することにより、固体表面に固定されたプローブ量のばらつきを補正する請求項２または３に記載の検出方法。
【請求項６】
前記異なる蛍光色素が、蛍光共鳴エネルギー移動におけるドナーとなる蛍光色素と、アクセプターとなる蛍光色素と、の組合せからなり、前記標的物質の蛍光色素は、結合体形成後に前記プローブ末端の蛍光色素と間で蛍光共鳴エネルギー移動をおこす位置に標識されている請求項２または３に記載の検出方法。
【請求項７】
前記蛍光共鳴エネルギー移動を起こす蛍光色素対が、フルオレセインまたはその誘導体と、ローダミンまたはその誘導体であることを特徴とする請求項２または３に記載の検出方法。
【請求項８】
請求項６に記載の検出方法に用いる蛍光色素で標識した核酸プローブと、標的核酸の標識用の蛍光色素と、を含む検出用キットにおいて、プローブに標識した蛍光色素と標的核酸の標識用の蛍光色素とがこれらの間で蛍光共鳴エネルギー移動をおこすものであることを特徴とするキット。
【請求項９】
前記核酸プローブの一端が担体に固定され、他端が前記蛍光色素で標識されている請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
遺伝子の多型または変異を、解析または測定するためのものである請求項８または９に記載のキット。
【請求項１１】
請求項６に記載の検出方法により得られる蛍光の変化に関するデータを解析する方法であって、
前記標的物質が前記プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、結合体を形成していない該プローブの蛍光強度値、該標的物質単体の蛍光強度値、蛍光共鳴エネルギー移動による該標的物質の蛍光強度値により補正処理する工程を有することを特徴とするデータ解析方法。
【請求項１２】
遺伝子の多型または変異を、解析または測定するためのものである請求項１１に記載のデータ解析方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の検出方法により得られる蛍光の変化に関するデータを解析する解析手段を有する標的物質の検出装置であって、
該解析手段が、前記標的物質が前記プローブと結合体を形成したときの反応系の蛍光強度値、結合体を形成していない該プローブの蛍光強度値、該標的物質単体の蛍光強度値及び蛍光共鳴エネルギー移動による該標的物質の蛍光強度値をそれぞれ測定するための測定手段と、前記反応系の蛍光強度値を、結合体を形成していない該プローブの蛍光強度値、該標的物質単体の蛍光強度値及び蛍光共鳴エネルギー移動による該標的物質の蛍光強度値により補正する手段と、を有することを特徴とする標的物質の検出装置。
【請求項１４】
遺伝子の多型または変異を、解析または測定するためのものである請求項１３に記載の検出装置。
【請求項１５】
請求項１１または１２に記載のデータ解析方法に用いるプローブ担体であって、前記プローブの固体化領域の多数を担体表面に所定の配列で配置したことを特徴とするプローブ担体。
【請求項１６】
標的物質と結合体を形成しないことが確認されている蛍光標識されたプローブの固定化領域を更に設け、そこから得られる蛍光強度値を前記補正処理の際に利用する請求項１５に記載のプローブ担体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の検出、測定方法及びその方法によって得られるデータを解析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて核酸量を測定する方法としては、多くの方法が知られている。それは例えば、ドットブロッティング法や、インターカレーターを用いる方法，　ＦＲＥＴを利用する方法、分子ビーコン法、特定の塩基の種類または塩基配列を発光の減少に利用する方法などがあげられる。
【０００３】
具体的には、ドットブロッテリング法とは、未反応の核酸プローブを洗い流し、標的核酸とハイブリダイゼーションした核酸プローブに標識された蛍光色素分子のみの蛍光強度を測定する方法である。また、インターカレーター法とは、インターカレーターと呼ばれるある種の蛍光色素が、核酸の二重鎖内にはまり込んだときに発する蛍光強度を利用する方法である（Ｇｌａｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３５９：９５９，１９９２）。また、ＦＲＥＴ法とは、標的核酸にハイブリダイズする、蛍光共鳴エネルギー移動のドナーとアクセプターとなる、各々異なった蛍光色素で標識されている二つの核酸プローブからなり、この２つのプローブが、蛍光色素が向き合うように、かつ１〜９塩基離れてハイブリダイズするように設計されていて、二つの核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズするとアクセプターからの発光が起こることを利用する方法（Ｍｅｒｇｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，　２２：　９２０，１９９４　）である。分子ビーコン法とは、両端部が塩基配列において相補性があり、プローブ全体としてヘアピン構造を形成するように設計された核酸プローブで、かつその一端がレポーター色素、他端がクエンチャー色素によって標識されているような核酸プローブからなり、標的核酸にハイブリダイズしているときにはレポーター色素の発光が起こるが、ハイブリダイズしていないときには、ヘアピン構造により距離の近くなったレポーター色素とクエンチャー間でエネルギーの移動がおこり、発光が抑制されることを利用する方法である（Ｔｙａｇｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，　１４：　３０３，　１９９６）。
【０００４】
一方、特定の塩基の種類または塩基配列を発光の減少に利用した方法としては、特開２００１−２８６３００号公報に、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素の発光が減少するという現象（蛍光消光現象）があり、特定の色素においてはその減少が顕著であり、かつその減少の程度は、蛍光色素が結合した部分の塩基の種類又は塩基配列に依存するということを利用した方法が記載されている。
【０００５】
これらの方法は現在一般的に使用されているが、ハイブリダイズを行う核酸プローブもしくは標的核酸のどちらか一方にのみを蛍光色素で標識したものであり、両者ともに標識したものはなかった。また蛍光強度値のばらつきに基づく測定値の不確定さにより、各測定間の比較や、日差やロット差によるばらつきの補正を行うことが困難であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、異なる蛍光色素で標識されたプローブと標的物質を用いて、より正確に目的の標的物質量を測定し、再現性のある標的物質の検出方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明にかかる標的物質の検出方法は、標的物質と該標的物質に特異的に結合するプローブとを反応させて得られる結合体の形成を検出することによる標的物質の検出方法において、前記標的物質と前記プローブの両方が異なる蛍光色素で標識されており、これらの蛍光色素が互いに作用して蛍光を変化させ得るものであり、該変化を測定して前記結合体の形成を検出することを特徴とする標的物質の検出方法である。
【０００８】
上記のプローブ及び標的物質としては核酸やタンパク質が代表的である。プローブ及び標的物質の両方がタンパク質である場合は、これらのタンパク質‐タンパク質相互作用により結合体が形成される。これらの両方がタンパク質である場合の例としては、抗原と抗体の組合せなどを挙げることができる。また、プローブと標的物質の組合せとして、核酸とタンパク質との組合せもあり、これらの相互作用による結合体の形成を利用することができる。核酸の場合は、核酸同士のハイブリダイゼーションにより結合体（ハイブリッド体）が形成される。プローブは、好ましくは、その一端に官能基を有して固体表面に結合し、その他端が蛍光色素で標識されている状態で用いられる。このような形態において、固体表面に結合し、かつその他端が蛍光色素で標識されているプローブで、標的物質との結合体形成前の蛍光を測定することにより、固体表面に固定されたプローブ量のばらつきを補正することができる。
【０００９】
異なる蛍光色素には、蛍光共鳴エネルギー移動におけるドナーとなる蛍光色素と、アクセプターとなる蛍光色素と、の組合せが利用でき、標的物質の蛍光色素は、結合体形成後にプローブ末端の蛍光色素と間で蛍光共鳴エネルギー移動をおこす位置に標識されていることが好ましい。異なる蛍光色素対としては、フルオレセインまたはその誘導体と、ローダミンまたはその誘導体と、の組合せを挙げることができる。
【００１０】
本発明にかかる標識核酸検出用のキットは、上記の検出方法に用いる蛍光色素で標識した核酸プローブと、標的核酸の標識用の蛍光色素と、を含む検出用キットにおいて、プローブに標識した蛍光色素と標的核酸の標識用の蛍光色素とがこれらの間で蛍光共鳴エネルギー移動をおこすものであることを特徴とするキットである。このキットにおいては、核酸プローブを担体に固定したプローブ担体の状態で供給することが好ましく、その際核酸プローブはその一端が担体に固定され、他端が蛍光色素で標識されていることが好ましい。かかるキットは、遺伝子の多型または変異を、解析または測定するためのものとして好適である。
【００１１】
本発明にかかる上記の検出方法により得られる蛍光の変化に関するデータを解析する方法は、前記標的物質が前記プローブと結合体を形成したときの反応系の蛍光強度値を、結合体を形成していない該プローブの蛍光強度値、該標的物質単体の蛍光強度値、蛍光共鳴エネルギー移動による該標的物質の蛍光強度値により補正処理する工程を有することを特徴とするデータ解析方法である。この方法も、遺伝子の多型または変異を、解析または測定するために好適に利用し得るものである。
【００１２】
本発明にかかる上記の検出方法により得られる蛍光の変化に関するデータを解析する解析手段を有する標的物質の検出装置は、該解析手段が、前記標的物質が前記プローブと結合体を形成したときの反応系の蛍光強度値、結合体を形成していない該プローブの蛍光強度値、該標的物質単体の蛍光強度値及び蛍光共鳴エネルギー移動による該標的物質の蛍光強度値をそれぞれ測定するための測定手段と、前記反応系の蛍光強度値を、結合体を形成していない該プローブの蛍光強度値、該標的物質単体の蛍光強度値及び蛍光共鳴エネルギー移動による該標的物質の蛍光強度値により補正する手段と、を有することを特徴とする標的物質の検出装置である。この装置も、遺伝子の多型または変異を、解析または測定するために好適に使用し得るものである。
【００１３】
本発明にかかるプローブ担体は、上記のデータ解析方法に用いるプローブ担体であって、前記プローブの固体化領域の多数を担体表面に所定の配列で配置したことを特徴とするプローブ担体である。このプローブ担体には、標的物質と結合体を形成しないことが確認されている蛍光標識されたプローブの固定化領域を更に設けることができ、そこから得られる蛍光強度値を前記補正処理の際に利用することができる。
【００１４】
本発明の一実施態様によれば、蛍光共鳴エネルギー移動のドナーとなりうる色素で標識された核酸プローブが、そのアクセプターとなりうる色素で標識された標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、ドナーからの発光量の減少、アクセプターからの蛍光共鳴エネルギーによる発光、バックグラウンド発光等を利用して、反応系からの蛍光強度値を補正することにより、信頼性が高く再現性のある標的核酸の検出方法を提供することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
次にこのましい実施の形態を挙げて本発明を更に詳細に説明する。本発明において蛍光色素とは、一般に核酸プローブ及び標的核酸に標識して、核酸の測定、検出に用いられるものであり、２つの蛍光色素間で蛍光共鳴エネルギー移動を起こす蛍光色素のペアが好適に用いられる。
【００１６】
本発明におけるプローブとは、検出対象としての標的物質と特異的に結合し得るものであり、核酸の場合には、相補配列の存在により標的核酸とハイブリダイズし得る配列を有するものである。核酸の場合には、その末端を蛍光共鳴エネルギー移動のドナーとなる蛍光色素で標識された核酸プローブであり、かつその他端に官能基を有している。上記該プローブはその官能基によって固体表面、たとえばスライドガラスの表面に固定され、核酸測定用デバイス（マイクロアレイ）として使用することができる。
【００１７】
なお、本発明のプローブ担体にはプローブの複数種を、それぞれ独立した固定化領域、例えばドット状スポットとして担体表面に固定した形態のものをいい、所定の間隔で固定化領域を配列されたプローブ・アレイの形態を含む。このプローブ担体には、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、プローブ・アレイと一般的に呼ばれている検査用等のプレートやチップが含まれる。
【００１８】
本発明における標的核酸とは、プローブ及びそれを標識している蛍光色素に対して、蛍光共鳴エネルギー移動によって効果的にアクセプターとなりうる蛍光色素を、ハイブリダイゼーション後に該プローブ末端の蛍光色素と効果的に蛍光共鳴エネルギー移動をおこす位置に標識してあることを特徴とするものである。
【００１９】
本発明にかかるプローブ担体（標的核酸測定用デバイス）は、塩基配列の異なる多くのプローブを個別に同一担体表面上に結合させる形態することで、同時に多種類の遺伝子を検出定量する方法に適用できる。そして、プローブを標的核酸とハイブリダイズさせることにより、単に核酸測定だけではなく、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、１塩基多型などの多型解析等に利用できる。
【００２０】
本発明にかかる標的核酸測定用デバイスは、標的核酸とハイブリダイズする以前にその蛍光強度値を測定することにより、担体上に固定されたプローブ数のばらつきを知ることができる。そしてその測定値を、ハイブリダイズ後の蛍光強度値の補正に用いることができる。
【００２１】
本発明にかかる標的核酸測定用デバイスには、同一固体表面上に結合されたプローブの中に、標的核酸の中にハイブリダイズする塩基配列がないことがわかっているプローブを含めることができる。このプローブからのハイブリダイゼーション前後の蛍光強度値を、それ以外のプローブに対応する標的核酸の蛍光強度値の測定値に対する補正として用いることができる。
【００２２】
本発明において用いられるプローブは、標的核酸とハイブリダイズした後、効果的に蛍光共鳴エネルギー移動を起こすように設計されている。そのため、プローブを標識しているドナー色素の励起波長で励起した場合に、ドナー色素の蛍光波長と同時に、アクセプター色素の蛍光波長が観測される。ハイブリダイズしている標的核酸の量が多くなるほど、蛍光強度値は、ハイブリダイズ前に比べて大きく変化する。次に、アクセプター色素の励起波長で励起し蛍光強度値を観察することで、ドナー色素の励起は非常に低いレベルに抑え、標的核酸のみを測定することができる。
【００２３】
蛍光強度値の値をｆａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｅｍｉｓｓｉｏｎのように表現する。ここでａｂｓｏｒｐｔｉｏｎとはドナー、もしくはアクセプタ―の励起波長を表し、ｅｍｉｓｓｉｏｎとは、ドナーもしくはアクセプタ―の蛍光波長を表している。つまり、ｆｄｄ　とはドナーの励起波長で励起し、ドナーの蛍光波長周辺を選択的にフィルタリングして得られた蛍光強度値であり、ｆｄａは同様にドナーの励起波長で励起するが、蛍光強度値はアクセプタ―の蛍光波長周辺をフィルタリングして得られた値をしめす。ｆａａも同様である。また、同様の測定をハイブリダイゼーション前にも行い、ハイブリダイゼーション後の測定値を補正するのに用いる。それらの値を、ｒｄｄ、　ｒｄａ、　ｒａａ、と表す。ハイブリダイゼーション前にはアクセプタ―色素は存在しないために、ｒｄａ，　ｒａａ　はほとんどゼロになることが期待される、もしくはそのようなドナー色素とアクセプタ―色素のペアを選択できることが望ましい。
【００２４】
ハイブリダイゼーション前の蛍光強度値ｒｄｄ　は、マイクロアレイ状に配列された各核酸プローブに対応するスポットに対して、ある程度のばらつきが存在する。これらはマイクロアレイ作成過程におけるプローブ数のばらつき等によるものだが、それらのばらつきはハイブリダイゼーション後も変化しないことが予想されるので、各スポットｉに対応する蛍光強度値　ｒｄｄ（ｉ）　は、ハイブリダイゼーション後の蛍光強度値ｆｄｄ（ｉ）の補正に用いられる。
【００２５】
マイクロアレイ上には、ハイブリダイゼーション後も標的核酸とハイブリダイズしないことがわかっている核酸プローブが固定されている。これらをマーカーと呼び、それらのプローブからの蛍光強度値はｒｄｄｍのように表す。マーカーの蛍光強度値も、ハイブリダイゼーションの前後で変化する。それには時間の経過等の要因が考えられるが、その変化をｆｄｄｍ　＝αｒｄｄｍ　のように表す。マーカーが複数存在する場合には、各スポットから得られるαの平均を取る。このαを、ハイブリダイゼーション前後での蛍光強度変化の補正値とする。
【００２６】
ハイブリダイゼーション後は、プローブ末端に標識されたドナー色素から、標的核酸に標識されたアクセプター色素へ、蛍光共鳴エネルギー移動が起こる。そのため、ドナーからの発光量ｆｄｄは減少し、変わってアクセプターからの発光ｆｄａが観測される。各スポットｉ　に対して、ドナー色素の蛍光の減少βｉと、アクセプタ―色素の蛍光の増加γｉ　を以下のように定義する。
【００２７】
【数１】
2004016132.tif 000003
【００２８】
ここで、ｒｄａ　はほぼゼロであるとする近似を行った。
【００２９】
その後、今度はアクセプター色素の励起波長で励起して、アクセプター色素の蛍光波長付近のみを選択するようにフィルターをかけて蛍光強度値を測定する。このアクセプター色素の蛍光量δｉ　を以下のように定義する。
【００３０】
【数２】
2004016132.tif 000004
【００３１】
ここで、ｒａａ　はほぼゼロであるとする近似を行った。
【００３２】
これらβｉ、γｉ、δｉはいずれも、固体表面上に固定されたプローブ量のばらつきによる補正を行った、該プローブにハイブリダイズしている標的核酸量を表していると考えられる。これらの値の間の比は、理想的には全スポットで一定になることが期待される。実際には測定誤差等の原因によるばらつきが存在するが、他のスポットからのずれが非常に大きいスポットが存在するならば、そのプローブ配列に関する特別な考察が必要となる。
【００３３】
また、マイクロアレイ上に固定されたプローブに対して、濃度のわかっている標的核酸をハイブリダイズさせ、その蛍光強度値βｉ、γｉ、δｉ　を測って参照グラフを作っておくことにより、測定結果から、未知の標的核酸の濃度を推定することも可能になる。
【００３４】
効率的な蛍光共鳴エネルギー移動を起こせないような色素ペアを用いた場合には、上記のβｉ、γｉの値は非常に小さくなり、有効な標的核酸量を推定する指標としては使えなくなるが、δｉはその場合にもハイブリダイズした標的核酸量を示す値として用いることができる。
【００３５】
本発明の標的核酸測定用デバイスを用いた標的核酸の検出において、上記のような補正処理過程を設けると、処理されたデータは信頼性の高いものになり、本発明によれば、遺伝子の多型や変異等を解析もしくは測定する方法のための信頼性が高いデータ解析方法を提供することができる。
【００３６】
本発明にかかる蛍光強度値補正処理を可能とする構成を有する標的核酸測定用デバイスは、遺伝子の多型や変異等を解析もしくは測定するキットに含有されることにより、解析もしくは測定用のキットとして好適に使用することができる。また、本発明にかかる蛍光強度値補正処理を可能とする構成を有する標的核酸測定用デバイスは、遺伝子の多型や変異等を解析もしくは測定する測定装置と組み合わせることにより、解析もしくは測定用の装置として好適に使用することができる。
【００３７】
本発明の、蛍光強度値を補正する処理は、各測定値の読み取り手段からのデータに基づいて補正処理のための上記の演算処理を記録させたコンピューターによりデータ解析手段を構成してこれを用いて行うことができる。演算のフローチャートの一例を図２に示す。その際、各測定値の読み取り手段からのデータは、コンピューター内のメモリーや外部の各種メモリー媒体に保存して、そこから取り出すようにしてもよい。このようにコンピュータを用いた補正処理を行うことで、多種、大量のサンプルの解析を効率良く行うことができ、遺伝子の多型や変異等を解析もしくは測定する方法に好適に利用できる。また、このデータ解析手段は、プローブと標的物質との反応を行うための反応装置を必要に応じて備える反応後の各蛍光強度の測定手段に一体化して組み込む態様としてもよい。
【００３８】
【実施例】
次に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例や具体的な説明に限定されるものではない。以下に、本実施例に用いられたＤＮＡマイクロアレイの製造過程の概略を示す。
１）基板洗浄
１インチ角のガラス板をラックに入れ、あらかじめ加温してあった１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に１０分間浸した。蒸留水ですすいだ後、蒸留水のはいった容器中でさらに超音波処理を１０分間行った。引き続き水洗、蒸留水洗浄を行った。
２）表面処理
１％シランカップリング剤水溶液（信越化学工業社製、商品名ＫＢＭ６０３）に室温で２０分浸し、その後、スピンドライ法により水分を飛ばし、乾燥させた。１６０℃に加熱したオーブンで１時間ベークしシランカップリング処理を完結させた。続いて、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：Ｄｏｊｉｎ社製）を２．７ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ／エタノールの１：１溶液に溶解した（最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）。シランカップリング剤処理を行ったガラス基板をこのＥＭＣＳ溶液に３０分間浸し、シランカップリング剤のアミノ基とＥＭＣＳ溶液のカルボキシル基を反応させた。この状態でガラス表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が表面に存在することになる。ＥＭＣＳ溶液と反応させたガラス板は蒸留水で洗浄後、ＤＮＡとの結合反応に用いられる。
３）ガラス基板固定用ＤＮＡの合成
ガラス基板と第１のＤＮＡとの反応は、ＤＮＡの末端にＳＨ基を導入することによりなされる。ＳＨ基の導入はＤＮＡ自動合成機上Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いる事によりなされる。続いて通常の脱保護を行いＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製した後、以下の実験に用いた。
４）ＢＪプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
上記第１のＤＮＡをＳＧクリアに溶解し、最終濃度８μＭになるよう調整してカートリッジに充填した。１２０ｄｐｉになるように印字パターンを構成し、第１のＤＮＡを含む溶液吐出した。その後、３０分加湿チャンバー中に放置し、基板と第１のＤＮＡとの反応を行った。
５）ブロッキング反応
反応終了後、１ＭＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて基板を洗い、ガラス表面のＤＮＡ溶液を完全に洗い流した。その後、２％ウシ血清アルブミン水溶液中に浸し、２時間放置し、ブロッキング反応を行った。
６）ハイブリダイゼーション反応
第１のＤＮＡと相補的な配列を有し、その５’末端にローダミンを結合させた第２のＤＮＡを合成した。この標識ＤＮＡを１ＭＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に最終濃度１μＭとなるように溶解し、ハイブリダイゼーション反応を３時間行った。その後、標識ＤＮＡを１ＭＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて洗い流し、画像解析装置ＡＲＧＵＳ（浜松ホトニクス社製）にて蛍光量を定量した。
【００３９】
実施例１
３’末端にチオール基を持ち、５’末端にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）をもつような１８　ｍｅｒ　のＤＮＡ（５’ＡＣＴｇｇＣＣｇＴＣｇＴＴＴＴＡＣＡ　３’）を（株）ベックスから購入した。これをプローブＢと呼ぶ。またこれに相補的な配列（５’ＴｇＴＡＡＡＡＣｇＡＣｇｇＣＣＡｇＴ　３’）で、３’末端にテトラメチルローダミンを持つようなものも用意した。これを標的Ａと呼ぶ。またマーカーとして、上記テトラメチルローダミン標識された標的核酸とハイブリダイズしない配列を用意し、配列Ｂ同様、３’末端をチオール基で、５’末端をＦＩＴＣで標識した。これをプローブＣと呼ぶ。
【００４０】
ガラス基板上に、上記の操作に従いプローブＢとプローブＣをそれぞれ吐出して結合させ、図１に示すようなスポットの配列を有するマイクロアレイを作成した。つづいて標的Ａとハイブリダイズさせ、４７７ｎｍの波長をもつアルゴンレーザーを使って蛍光強度値を測定した。またアクセプタ―であるテトラメチルローダミンの励起波長として、ヘリウムネオンレーザーの５４３ｎｍの波長を用いて、蛍光強度値を測定した。
【００４１】
なお、標的Ａ、プローブＢ及びＣの配列をまとめると以下のとおりである。
プローブＢ：（５）　ｆｉｔｃ−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ−ＳＨ（配列番号：２）
プローブＣ：（５）　ｆｉｔｃ−ＴＧＡＧＴＣＴＡＧＣＴＡＡＧＴＣＡＧ−ＳＨ（配列番号：３）
標的Ａ：（５）　ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−Ｒｈｏｄａｍｉｎ（配列番号：１）
実施例２
実施例１に示したプローブＢとプローブＣを、１対０、０．７５対０．２５、０．５対０．５、０．２５対０．７５、０対１の割合で混ぜたものを、それぞれ吐出して結合させ、マイクロアレイを作成した。つづいて標的Ａとハイブリダイズさせ、実施例１と同様の方法で蛍光強度値を測定した。
【００４２】
実施例３
ガラス基板上に、実施例１に示したプローブＢとプローブＣをそれぞれ吐出して結合させ、マイクロアレイを作成した。つづいて標的Ａの濃度を変化させたもの（実施例１，２の濃度を１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍に薄めたもの）を同様の操作にしたがってハイブリダイズさせ、実施例１と同様の方法で蛍光強度値を測定した。
【００４３】
以上実施例１〜３において得られた結果を見ると、実施例１の方法により、ガラス基板上に固定された核酸プローブの密度にも、相応のばらつきがあることがわかった。またハイブリダイゼーション前と後では、マーカーの蛍光強度値は減少することがわかった。実施例１では、ハイブリダイズさせる標的核酸の濃度は十分高いので、ハイブリダイズは十分に行われていると考えられる。そのような状況で、蛍光共鳴エネルギー移動の効果が観測され、プローブＢをもつスポットの蛍光強度値は約７割に変化し、またハイブリダイゼーション前にはみられなかった、５７０ｎｍ　付近の蛍光強度値の増加が見られた。これらの測定値を上記の方法により補正した結果、各スポット間のばらつきの分散を約半分程度に抑えることができた。実施例２の方法により、ガラス基板上に固定するプローブの密度を変化させた実験の結果は、その密度にほぼ比例する標的核酸量に対応する蛍光強度が観測された。実施例３の方法により、ハイブリダイズする標的核酸の濃度を変化させた実験の結果は、２倍、５倍はその濃度にほぼ比例する標的核酸量に対応する蛍光強度値が測定された。しかし１０倍、２０倍に関しては、５倍に薄めたものよりも低いことは確認されたが、大きな違いはみられなかった。
【００４４】
【発明の効果】
本発明の方法により、ハイブリダイゼーション前のプローブ量のばらつきを補正する手段が得られたため、スポット間の量的比較や、異なるロット、異なる日時による測定結果を比較することが可能になった。また、ハイブリダイズした核酸量を見積もる方法として、標的核酸に標識された色素からの蛍光強度のみではなく、蛍光共鳴エネルギー移動による、プローブや標的核酸からの蛍光強度値の変化をも考慮にいれて補正を行うために、より正確な核酸量の見積もりを行うことが可能になった。
【００４５】
【配列表】
2004016132.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で用いられた核酸プローブを固定させて構成したアレイのプローブの配置を示す。
【図２】演算のフォローチャートの一例を示す図である。
【図１】
2004016132.tif 000006
【図２】
2004016132.tif 000007