(57)【要約】【課題】生体膜への透過性を有するルシゲニンの誘導体を提供する。【解決手段】式（１）【化１】2004051490.tif 000023［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｃ１−１２アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、ベンジル基、アリール基又はハロゲン化アリール基を意味し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、アリール基又はアリーロキシ基を意味し、Ｑｑ−は、ＣＬｏｇＰが０．５〜７であり且つｐＫａが１．５〜６であるカルボン酸のｑ価の陰イオンを意味し、ｑは、該カルボン酸の価数を意味する。］で表される生体膜への透過性を有する化学発光化合物、該化合物を含有する化学発光試薬、該化合物を含有する活性酸素測定用キット及び該化合物の製造法に関するものである。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
2004051490.tif 000017
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｃ１−１２アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、ベンジル基、アリール基又はハロゲン化アリール基を意味し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、アリール基又はアリーロキシ基を意味し、Ｑｑ−は、ＣＬｏｇＰが０．５〜７であり且つｐＫａが１．５〜６であるカルボン酸のｑ価の陰イオンを意味し、ｑは、該カルボン酸の価数を意味する。］で表される生体膜への透過性を有する化学発光化合物。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２がメチル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が水素原子である請求項１記載の生体膜への透過性を有する化学発光化合物。
【請求項３】
式（２）
【化２】
2004051490.tif 000018
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｃ１−１２アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、ベンジル基、アリール基又はハロゲン化アリール基を意味し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、アリール基又はアリーロキシ基を意味し、Ｚ−は、ラウリン酸イオン、安息香酸イオン又はパラシアノ安息香酸イオンを意味する。］で表される化合物。
【請求項４】
Ｒ１及びＲ２がメチル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が水素原子である請求項１記載の化合物。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載の化学発光化合物。
【請求項６】
請求項３又は請求項４に記載の生体膜への透過性を有する化学発光化合物
【請求項７】
請求項１、請求項２、請求項３又は請求項４記載の化合物を含有する化学発光試薬。
【請求項８】
請求項１、請求項２、請求項３又は請求項４記載の化合物を含有する活性酸素測定用キット。
【請求項９】
式（３）
【化３】
2004051490.tif 000019
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｃ１−１２アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、ベンジル基、アリール基又はハロゲン化アリール基を意味し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、アリール基又はアリーロキシ基を意味し、Ｘｎ−は、ｎ価の陰イオンを意味し、ｎは、１又は２を表す。］で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＹｍ＋ｑＱｑ−ｍ（式中、Ｑｑ−は、ＣＬｏｇＰが０．５〜７であり且つｐＫａが１．５〜６であるカルボン酸のｑ価の陰イオンを意味し、ｑは、該カルボン酸の価数を意味し、Ｙｍ＋は、アルカリ金属イオン又はアルカリ土類金属イオンを意味し、ｍは、Ｙがアルカリ金属の場合１を、アルカリ土類金属の場合２を意味する。）で表される化合物を混合し、加温することを特徴とする式（１）
【化４】
2004051490.tif 000020
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｑｑ−及びｑは前記と同じ意味を表す。］で表される化合物の製造法。
【請求項１０】
Ｙｍ＋ｑＱｑ−ｍの使用量が、式（３）で表される化合物に対して２当量以上である請求項９記載の化合物の製造法。
【請求項１１】
加温の温度が５０℃〜１００℃の範囲である請求項１０記載の化合物の製造法。
【請求項１２】
２／ｎＸｎ−が２ＮＯ３−である請求項９、請求項１０又は請求項１１に記載の化合物の製造法。
【請求項１３】
Ｙｍ＋がアルカリ金属イオンである請求項１２記載の化合物の製造法。
【請求項１４】
式（４）
【化５】
2004051490.tif 000021
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｃ１−１２アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、ベンジル基、アリール基又はハロゲン化アリール基を意味し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、アリール基又はアリーロキシ基を意味する。］で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビアクリデン類とＨ＋ｑＱｑ−（式中、Ｑｑ−は、ＣＬｏｇＰが０．５〜７であり且つｐＫａが１．５〜６であるカルボン酸のイオンを意味し、ｑは、該カルボン酸の価数を意味する。）を酸素の存在下反応させることを特徴とする式（１）
【化６】
2004051490.tif 000022
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｑｑ−及びｑは前記と同じ意味を表す。］で表される化合物の製造法。
【請求項１５】
酸素として空気を使用する請求項１４記載の化合物の製造法。
【請求項１６】
Ｒ１及びＲ２がメチル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が水素原子である請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４又は請求項１５記載の化合物の製造法。
【請求項１７】
Ｑｑ−がラウリン酸イオン、安息香酸イオン又はパラシアノ安息香酸イオンである請求項１６に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な、生体膜への透過性を有する化学発光化合物、該化合物を含有する化学発光試薬、該化合物を含有する活性酸素分析用キット及び該化合物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート）は、アルカリ性水溶液中で微光を呈し、過酸化水素を加えると強く発光することが知られており、古くから化学発光試薬として用いられてきた。
【０００３】
又、ルシゲニンは、上記の特性を利用して、細胞から放出される活性酸素の定量法や、発光イムノアッセイ法に利用されており、その有用性を拡大している。
【０００４】
しかし、ルシゲニン及びその誘導体（Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類）の中で、生体膜（主に細胞膜）に対する透過性を有する化合物は見出されておらず、そのため細胞内における活性酸素の定量等の細胞内における測定法には利用することはできなかった。
【０００５】
そのため、生体膜に対する透過性を有するルシゲニンの誘導体が望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を克服するために鋭意検討した結果、ルシゲニンの有機酸塩の中に生体膜に透過性を有する化合物を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、式（１）
【０００８】
【化７】
2004051490.tif 000002
【０００９】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｃ１−１２アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、ベンジル基、アリール基又はハロゲン化アリール基を意味し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、アリール基又はアリーロキシ基を意味し、Ｑｑ−は、ＣＬｏｇＰが０．５〜７であり且つｐＫａが１．５〜６であるカルボン酸のｑ価の陰イオンを意味し、ｑは、該カルボン酸の価数を意味する。］で表される生体膜への透過性を有する化学発光化合物、式（２）
【００１０】
【化８】
2004051490.tif 000003
【００１１】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｃ１−１２アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、ベンジル基、アリール基又はハロゲン化アリール基を意味し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、アリール基又はアリーロキシ基を意味し、Ｚ−は、ラウリン酸イオン、安息香酸イオン又はパラシアノ安息香酸イオンを意味する。］で表される化合物、該化合物を含有する化学発光試薬、該化合物を含有する活性酸素測定用キット、　式（３）
【００１２】
【化９】
2004051490.tif 000004
【００１３】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｃ１−１２アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、ベンジル基、アリール基又はハロゲン化アリール基を意味し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、アリール基又はアリーロキシ基を意味し、Ｘｎ−は、ｎ価の陰イオンを意味し、ｎは、１又は２を表す。］で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＹｍ＋ｑＱｑ−ｍ（式中、Ｑｑ−は、ＣＬｏｇＰが０．５〜７であり且つｐＫａが１．５〜６であるカルボン酸のｑ価の陰イオンを意味し、ｑは、該カルボン酸の価数を意味し、Ｙｍ＋は、アルカリ金属イオン又はアルカリ土類金属イオンを意味し、ｍは、Ｙがアルカリ金属の場合１を、アルカリ土類金属の場合２を意味する。）で表される化合物を混合し、加温することを特徴とする式（１）
【００１４】
【化１０】
2004051490.tif 000005
【００１５】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｑｑ−及びｑは前記と同じ意味を表す。］で表される化合物の製造法及び式（４）
【００１６】
【化１１】
2004051490.tif 000006
【００１７】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｃ１−１２アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、ベンジル基、アリール基又はハロゲン化アリール基を意味し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルコキシ基、アリール基又はアリーロキシ基を意味する。］で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビアクリデン類とＨ＋ｑＱｑ−（式中、Ｑｑ−は、ＣＬｏｇＰが０．５〜７であり且つｐＫａが１．５〜６であるカルボン酸のイオンを意味し、ｑは、該カルボン酸の価数を意味する。）を酸素の存在下反応させることを特徴とする式（１）
【００１８】
【化１２】
2004051490.tif 000007
【００１９】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｑｑ−及びｑは前記と同じ意味を表す。］で表される化合物の製造に関するものである。
【００２０】
尚、本明細書中、ｐＫａは、酸性度を意味し、ＣＬｏｇＰは、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｈｍｉｓｔｒｙ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　（ＡＣＤ）　Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｓｏｌａｒｉｓ　Ｖ４．６７を用いたＬｏｇＰの計算値を意味する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、更に詳細に本発明を説明する。
【００２２】
まず、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＹｍ＋の各置換基における語句について説明する。
【００２３】
尚、本明細書中「ｎ」はノルマルを、「ｉ」はイソを、「ｓ」はセカンダリーを、「ｔ」はターシャリーを、「ｃ」はシクロを、「ｏ」はオルトを、「ｍ」はメタを、「ｐ」はパラを意味する。
【００２４】
Ｃ１−１０アルキル基としては、直鎖、分枝及び環状のアルキル基が含まれ、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｃ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｃ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｃ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｃ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｃ−オクチル基、ｎ−ノニル基及びｎ−デシル基等が挙げられ、Ｃ１−１２アルキル基としては、これらに加え、ｎ−ウンデシル基及びｎ−ドデシル基等が挙げられる。
【００２５】
Ｃ２−６アルケニル基としては、直鎖、分枝及び環状のアルケニル基が含まれ、ビニル基、アリル基、２−プロぺニル基、１−メチルビニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、１−メチル−１−プロぺニル基、１−メチル−２−プロぺニル基、２−メチル−２−プロぺニル基、１−エチル−２−ビニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１，２−ジメチル−１−プロぺニル基、１，２−ジメチル−２−プロぺニル基、１−エチル−１−プロぺニル基、１−エチル−２−プロぺニル基、１−メチル−１−ブテニル基、１−メチル−２−ブテニル基、２−メチル−１−ブテニル基、１−ｉ−プロピルビニル基、２，４−ペンタジエニル基、１−ヘキセニル基、２−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、４−ヘキセニル基、５−ヘキセニル基、２，４−ヘキサジエニル基、１−メチル−１−ペンテニル基、１−ｃ−ペンテニル基及び１−ｃ−ヘキセニル基等が挙げられる。
【００２６】
Ｃ１−１０アルコキシ基としては、直鎖、分枝及び環状のアルコキシ基が含まれ、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｃ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｃ−ブトキシ基、ｎ−ペントキシ基、ｃ−ペントキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、ｃ−ヘキシルオキシ基、ｎ−ヘプチルオキシ基、ｃ−ヘプチルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ｃ−オクチルオキシ基、ｎ−ノニルオキシ基及びｎ−デシルオキシ基等が挙げられる。
【００２７】
アリール基としては、フェニル基、ｏ−メチルフェニル基、ｍ−メチルフェニル基、ｐ−メチルフェニル基、α−ナフチル基及びβ−ナフチル基等が挙げられる。
【００２８】
ハロゲン化アリール基としては、ｏ−フルオロフェニル基、ｍ−フルオロフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、ｏ−クロロフェニル基、ｍ−クロロフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｏ−ブロモフェニル基、ｍ−ブロモフェニル基、ｐ−ブロモフェニル基、ｏ−ヨードフェニル基、ｍ−ヨードフェニル基及びｐ−ヨードフェニル基等が挙げられる。
【００２９】
アリーロキシ基としては、フェノキシ基、ｏ−メチルフェノキシ基、ｍ−メチルフェノキシ基、ｐ−メチルフェノキシ基、α−ナフトキシ基及びβ−ナフトキシ基等が挙げられる。
【００３０】
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素が挙げられる。
【００３１】
アルカリ金属イオンのとしては、リチウムイオン、ナトリウムイオン及びカリウムイオン等が挙げられる。
【００３２】
アルカリ土類金属イオンとしては、カルシウムイオン及びマグネシウムイオン等が挙げられる。
【００３３】
次に、好ましいＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７の具体例について説明する。
【００３４】
好ましいＲ１の具体例としてはメチル基、エチル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ドデシル基、アリル基及びベンジル基等が挙げられ、より好ましくはメチル基が挙げられる。
【００３５】
好ましいＲ２の具体例としてはメチル基、エチル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ドデシル基、アリル基及びベンジル基等が挙げられ、より好ましくはメチル基が挙げられる。
【００３６】
好ましいＲ３の具体例としては水素原子及びメチル基等が挙げられ、より好ましくは水素原子が挙げられる。
【００３７】
好ましいＲ４の具体例としては水素原子及びメチル基等が挙げられ、より好ましくは水素原子が挙げられる。
【００３８】
好ましいＲ５の具体例としては水素原子及びメチル基等が挙げられ、より好ましくは水素原子が挙げられる。
【００３９】
好ましいＲ６の具体例としては水素原子及びメチル基等が挙げられ、より好ましくは水素原子が挙げられる。
【００４０】
好ましいＲ７の具体例としては例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｃ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｃ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基及びｃ−ヘキシル基等が挙げられ、又、例えば、メチル等が挙げられる。
【００４１】
式（１）で表される化合物のうち、好ましい化合物を以下に示す。
１．Ｒ１及びＲ２がメチル基である式（１）で表される化合物。
２．Ｒ１及びＲ２がメチル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が水素原子である式（１）で表される化合物。
３．Ｒ１及びＲ２がメチル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が水素原子であり、Ｑｑ−がラウリン酸イオン、安息香酸イオン又はパラシアノ安息香酸イオンである式（１）で表される化合物。
【００４２】
Ｘｎ−の具体例としては、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−、ＮＣＳ−、ＳＯ４２−及びＣＯ３２−等の無機イオン並びにＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＨ３ＳＯ４−、Ｃ２Ｈ５ＳＯ４−及びｐ−トルエンスルホン酸イオン等の有機イオンを挙げることができ、好ましくは無機イオンを挙げることができ、より好ましくは、ヨウ化物イオン、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−及びＮＣＳ−等を挙げることができ、更に好ましくは、ＮＯ３−を挙げることができる。
【００４３】
Ｙｍ＋の具体例としては、リチウムイオン（Ｌｉ＋）、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）及びカリウムイオン（Ｋ＋）等のアルカリ金属イオン並びにカルシウムイオン（１／２Ｃａ２＋）及びマグネシウムイオン（１／２Ｍｇ２＋）等のアルカリ土類金属イオンが挙げられ、好ましくは、アルカリ金属イオンが挙げられ、より好ましくは、ナトリウムイオン及びカリウムイオン等が挙げられ、更に好ましくは、カリウムイオンが挙げられる。
【００４４】
生体膜とは、生体内に存在する、原形質に接する表面膜及びそれに類する膜を意味し、具体的には、細胞膜及び細胞内小器官の限界膜等を意味する。
【００４５】
式（１）中で、Ｑｑ−は、カルボン酸のｑ価の陰イオンを意味しているが、該カルボン酸の脂溶性が低すぎると、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類として生体膜を透過する事ができず、高すぎると水に溶解しなくなるため、使用できなくなる。
【００４６】
上記カルボン酸の脂溶性を、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｈｍｉｓｔｒｙ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　（ＡＣＤ）　Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｓｏｌａｒｉｓ　Ｖ４．６７を用いたＬｏｇ　Ｐの計算値（ＣＬｏｇＰ）で表すと、通常、０．５〜７の範囲であり、好ましくは、例えば、１〜７の範囲、例えば、１〜６の範囲、例えば、１．５〜５．５の範囲を挙げることができる。
【００４７】
ここで、ＣＬｏｇＰ　値とは、化学物質の１−オクタノール／水分配係数の１０を底とする対数（ＬｏｇＰ）をｆ値法（疎水性フラグメント定数法）により計算で求めた値をいう。具体的には化学物質をその構成要素に分解し、各フラグメントの有する疎水性フラグメント定数（ｆ値）を積算することにより求めることができるが、本願記載のＣＬｏｇＰ　値は、上記のようにＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｈｍｉｓｔｒｙ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　（ＡＣＤ）　Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｓｏｌａｒｉｓ　Ｖ４．６７を用いた値を使用した。
【００４８】
又、上記カルボン酸の酸性度も生体膜の透過性には重要であり、酸性度をｐＫａで表すと、通常、１．５〜６の範囲であり、好ましくは、例えば、２〜６の範囲、例えば、２〜５．５の範囲、例えば、３〜５の範囲を挙げることができる。
【００４９】
上記カルボン酸のｑ価の陰イオンである、Ｑｑ−の具体例としては、２−メチル−３−エチルペンタン酸イオン、２，２−ジメチルヘキサン酸イオン、３−メチルヘプタン酸イオン、カプリル酸イオン、ペラルゴン酸イオン、カプリン酸イオン、ウンデカン酸イオン及びラウリン酸イオン等の脂肪族カルボン酸イオン、安息香酸イオン、オルトフルオロ安息香酸イオン、メタフルオロ安息香酸イオン、パラフルオロ安息香酸イオン、オルトクロロ安息香酸イオン、メタクロロ安息香酸イオン、パラクロロ安息香酸イオン、オルトブロモ安息香酸イオン、メタブロモ安息香酸イオン、パラブロモ安息香酸イオン、オルトシアノ安息香酸イオン、メタシアノ安息香酸イオン、パラシアノ安息香酸イオン、オルトフタル酸イオン、メタフタル酸イオン及びテレフタル酸イオン等の芳香族カルボン酸イオンが挙げられ、好ましくは、ラウリン酸イオン、安息香酸イオン及びパラシアノ安息香酸イオン等が挙げられる。
【００５０】
次に、式（１）で表される化合物の製造法について説明する。
【００５１】
式（１）で表される化合物の製造法をスキーム１に示した。
スキーム１
【００５２】
【化１３】
2004051490.tif 000008
【００５３】
即ち、式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＹｍ＋ｑＱｑ−ｍで表されるカルボン酸塩を溶媒中加温して塩交換を行うことにより、式（１）で表される化合物を製造する事ができる。
【００５４】
式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、合成品を用いることができるが、市販品を用いてもよい。
【００５５】
Ｙｍ＋ｑＱｑ−ｍで表されるカルボン酸塩の使用量としては、式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対して、通常、２当量以上を使用することができ、好ましくは、４〜１２当量の範囲である。
【００５６】
式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＹｍ＋ｑＱｑ−ｍで表されるカルボン酸塩を混合する際の温度は、特に限定はしないが、通常０℃〜溶媒の沸点が使用され、好ましくは２０〜１１０℃の範囲である。
【００５７】
加温する際の温度は、式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類及びＹｍ＋ｑＱｑ−ｍで表されるカルボン酸塩が完全に溶解する温度であれば特に限定はしないが、通常２０〜１００℃の範囲を使用することができ、好ましくは、５０℃〜１００℃の範囲である。
【００５８】
加温する時間は、加温する際の温度等により変化するため、一概に決定できないが、例えば加温する際の温度が９０℃の場合、０．１時間以上の範囲を使用することができ、好ましくは、０．５〜５時間加温すれば充分である。
【００５９】
本反応で使用する溶媒としては、反応に関与せず、且つＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類及びＹｍ＋ｑＱｑ−ｍで表されるカルボン酸塩を溶解しうるものであれば特に限定はしないが、例えばメタノール及びエタノール等のアルコール系溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒及び水等が挙げられ、好ましい溶媒としては、水が挙げられる。
【００６０】
更に、これらの反応溶媒は、単独又は組み合わせて使用することもできる。
【００６１】
次に、式（１）で表される化合物の別の製造法について説明する。
【００６２】
式（１）で表される化合物の別の製造法をスキーム２に示した。
スキーム２
【００６３】
【化１４】
2004051490.tif 000009
【００６４】
即ち、式（４）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビアクリデン類とＨ＋ｑＱｑ−で表されるカルボン酸を酸素の存在下で、溶媒中反応させることにより、式（１）で表される化合物を製造する事ができる。
【００６５】
Ｈ＋ｑＱｑ−で表されるカルボン酸の使用量としては、式（４）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビアクリデン類に対して、通常、０．５〜１０当量を使用することができ、好ましくは、０．８〜３当量の範囲である。
【００６６】
酸素源としては、酸素ガス、酸素と不活性ガスとの混合ガス及び空気等を使用することができるが、簡便性から空気が好ましい。
【００６７】
酸素圧は、常圧下で反応を行うことができるが、加圧条件下でも反応を行うことができる。
【００６８】
反応する際の温度は、式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビアクリデン類及びＨ＋ｑＱｑ−で表されるカルボン酸が完全に溶解する温度であれば特に限定はしないが、通常０〜１００℃の範囲を使用することができ、好ましくは、２０℃〜５０℃の範囲である。
【００６９】
反応する時間は、加温する際の温度等により変化するため、一概に決定できないが、例えば反応する際の温度が室温の場合、１０〜１００時間反応させれば充分である。
【００７０】
本反応で使用する溶媒としては、反応に関与せず、且つＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビアクリデン類及びＨ＋ｑＱｑ−で表されるカルボン酸を溶解しうるものであれば特に限定はしないが、通常、水と有機溶剤の混合溶媒系で行うのが好ましい。この際に使用する有機溶剤としては例えばジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒が好ましい。
【００７１】
更に、これらの反応溶媒は、単独又は組み合わせて使用することもできる。
【００７２】
反応終了後、冷却による結晶化、クロマトグラフィー（担体としては、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ２０等を用いることができ、溶離液としては、例えば、メタノール等を用いることができる。）による精製、再結晶による精製等により、純度の高い式（１）で表される化合物を得ることができる。
【００７３】
次に、式（１）で表される化合物を含有する化学発光試薬について説明する。
【００７４】
式（１）で表される化合物を化学発光試薬として使用する場合、結晶状態及び適当な溶剤に溶解した溶液状態を使用する事ができ、溶剤としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、緩衝溶液及びそれらの混合溶媒を挙げることができる。
【００７５】
次に、式（１）で表される化合物を含有する活性酸素測定用キットについて説明する。
【００７６】
式（１）で表される化合物を活性酸素測定用キットに使用する場合、結晶状態及び適当な溶剤に溶解した溶液状態等で使用する事ができる。
【００７７】
活性酸素測定用キットの構成としては、本発明の化合物の結晶及び結晶に類する状態のもののみでも使用できるが、これに溶剤として適当な溶媒を加えてもよく、又、適当な溶剤に溶解した溶液のみの構成でもよい。
【００７８】
又、更に発光増強剤や添加剤を加えることもできる。
【００７９】
溶剤としては、生体膜に損傷を与えないものであれば特に限定はしないが、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、緩衝溶液及びそれらの混合溶媒を挙げることができる。
【００８０】
緩衝溶液としては、通常塩基性緩衝液が用いられ、具体的には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液及びグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等が挙げられる。
【００８１】
発光増強剤としては、フェノール性化合物等が挙げられ、具体的には、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール及びホタルルシフェリン等が挙げられ、好ましくは、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノール及び６−ヒドロキシベンゾチアゾール等が挙げられる。
【００８２】
上記発光増強剤は、単独で使用してもよく、又二種以上の発光増強剤を組み合わせて使用することもできる。
【００８３】
添加剤としては、界面活性剤やキレート剤を挙げることができる。
【００８４】
次に、式（１）で表される化合物の原料である、式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の製造法について説明する。
【００８５】
式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類のうち、硝酸塩である化合物（３−ａ）の製造法をスキーム３に示した。
スキーム３
【００８６】
【化１５】
2004051490.tif 000010
【００８７】
即ち、化合物（４）を希硝酸（ｄｉｌ．ＨＮＯ３）で処理することにより目的の（３−ａ）を製造することができる。
【００８８】
尚、式（３）で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類のうち、硝酸塩以外の塩は、（３−ａ）の塩交換により製造することができる。
【００８９】
次に、原料である化合物（４）の製造法を説明する。
【００９０】
式（４）で表される化合物のうち、アクリジン環の４つの置換基のうち、（４−ａ）及び（４−ｂ）で表される化合物の製造法をスキーム４に示した。
スキーム４
【００９１】
【化１６】
2004051490.tif 000011
【００９２】
即ち、酸化第１銅（Ｃｕ２Ｏ）及び炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）の存在下、化合物（５）と化合物を（６）をカップリングさせ、化合物（７）とした後、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）で閉環してアクリドン誘導体（８）とし、窒素原子上に置換基を導入して、（９）とした後、亜鉛−塩酸（Ｚｎ／ＨＣｌ）で、（９）の２分子を還元的にカップリングさせることにより、目的の（４−ａ）及び（４−ｂ）を製造することができる。
【００９３】
尚、式（４）で表される化合物のうち、（４−ａ）及び（４−ｂ）で表される化合物以外の化合物は、それぞれ置換基の異なる２種類の（９）をカップリングさせることにより製造することができる。
【００９４】
本願発明の化合物は、活性酸素で発光し、且つ生体膜への透過性を有するため、その発光強度を測定することにより、細胞内や組織内における活性酸素量を直接測定することを可能とする。
【００９５】
本願発明の化合物は、大型の装置を用いることなく細胞内や組織内における活性酸素量を直接測定することを可能とするため、簡便で安価な測定方法を提供しうる。
【００９６】
本願発明の化合物は、細胞や組織における活性酸素量と相関が深いとされる疾患、例えば癌、虚血性臓器障害、動脈硬化、炎症、老化等の機序解明のためのツールとして、新規探索化合物の評価用ツールとして、又、該疾患の検査薬として利用することが可能である。
【００９７】
【実施例】
以下、実施例により更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９８】
参考例１（Ｎ−メチルアクリドンの合成）
【００９９】
【化１７】
2004051490.tif 000012
【０１００】
アクリドン（８．２０ｇ，４２ｍｍｏｌ）（市販品）に水酸化ナトリウムのエタノール溶液（２．７２ｇ，６８ｍｍｏｌ／１００ｍＬ）を加え、８０℃で１．５時間加熱還流し、減圧下溶媒を留去した後、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド、８０ｍＬ）を加えて溶液とした。ヨウ化メチル（４．３２ｍＬ，４０ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で１時間加熱した後、反応用液を水に注ぎ入れた。析出した固体を濾取し、エタノールから再結晶することにより、目的物７．８５ｇを８９．５％の収率で得た。
【０１０１】
参考例２（Ｎ，Ｎ’−ジメチルビアクリデンの合成）
【０１０２】
【化１８】
2004051490.tif 000013
【０１０３】
Ｎ−メチルアクリドン（９００ｍｇ，４．３１ｍｍｏｌ）をエタノール５０ｍＬに溶解し、そこに活性亜鉛（２．８ｇ，４３ｍｍｏｌ）を添加し、激しく攪拌した。そこに３５％塩酸−エタノール溶液（１０／５０ｍＬ）をゆっくり滴下した。２時間加熱した後、反応用液を水に注ぎ入れた。析出した固体を濾取し、エタノールから再結晶することにより、目的物を４５％の収率で得た。
【０１０４】
実施例１（１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　パラシアノ安息香酸塩の合成）
【０１０５】
【化１９】
2004051490.tif 000014
【０１０６】
Ｎ，Ｎ’−ジメチルビアクリデン（２１ｍｇ，０．０５３ｍｍｏｌ）及びパラシアノ安息香酸（１４．７ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２０ｍＬに加え、溶解するまで攪拌した。水２０ｍＬを加え、空気存在下、室温で数日間激しく攪拌した。水層を分取し、更に有機相を水で抽出した。得られた水層を減圧下で水を留去する事により、目的の１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　パラシアノ安息香酸塩の粗物３４ｍｇ（収率９４．５％）を得た。得られた粗物をセファデックスＬＨ−２０のカラムクロマトグラフィーにより精製した。
外観：黄土色固体、融点：１４２℃〜黄土色から茶色に分解
【０１０７】
実施例２（１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　安息香酸塩の合成）
【０１０８】
【化２０】
2004051490.tif 000015
【０１０９】
パラシアノ安息香酸の代わりに安息香酸を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行うことにより、目的の１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　安息香酸塩の粗物を収率２４％で得た。得られた粗物をセファデックスＬＨ−２０のカラムクロマトグラフィーにより精製した。
外観：深緑色固体、融点：１３７℃〜深緑色から黒色に分解
【０１１０】
実施例３（１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　ラウリン酸塩の合成）
【０１１１】
【化２１】
2004051490.tif 000016
【０１１２】
パラシアノ安息香酸の代わりにラウリン酸を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行うことにより、目的の１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　ラウリン酸塩の粗物を得た。得られた粗物をセファデックスＬＨ−２０のカラムクロマトグラフィーにより精製した。
外観：黄土色固体、融点：１３４℃〜黄土色から茶色に分解
【０１１３】
実施例４（１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　パラシアノ安息香酸塩の膜透過性試験）
マウスの腹腔から採取した好中球のＰＢＳ希釈液に、１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　パラシアノ安息香酸塩のジメチルスルホキシド溶液を添加し、３７℃で２０分培養後、蛍光顕微鏡で観察した結果、細胞内での蛍光が観測されたため、膜透過性を示すことが確認された。
【０１１４】
実施例５（１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　安息香酸塩の膜透過性試験）
マウスの腹腔から採取した好中球のＰＢＳ希釈液に、１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　安息香酸塩のジメチルスルホキシド溶液を添加し、３７℃で２０分培養後、蛍光顕微鏡で観察した結果、細胞内での蛍光が観測されたため、膜透過性を示すことが確認された。
【０１１５】
実施例６（１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　ラウリン酸塩の膜透過性試験）
マウスの腹腔から採取した好中球のＰＢＳ希釈液に、１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　ラウリン酸塩のジメチルスルホキシド溶液を添加し、３７℃で２０分培養後、蛍光顕微鏡で観察した結果、細胞内での蛍光が観測されたため、膜透過性を示すことが確認された。
【０１１６】
比較例１
１０，１０’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム　パラシアノ安息香酸塩をルシゲニンに替えた以外は、実施例４と同様の操作を行った結果、細胞内での蛍光は観測されず、膜透過性を示さなかった。
【０１１７】
【発明の効果】
本発明のルシゲニンの誘導体は、生体膜に対する透過性を有するため、例えば細胞内の活性酸素測定用の化学発光試薬として有用であり、又、有用な細胞内の活性酸素測定用キットを提供する。