(57)【要約】【課題】本発明は、塩基配列の分析時間の短縮、低コスト化が可能なＤＮＡ分析方法およびＤＮＡ分析装置を提供する。【解決手段】ＤＮＡサンプルとｄＮＴＰを結合する酵素と、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬と、ｐＨを一定に保つ働きをもつ緩衝液とを混合して混合試薬を調整する第１の手順と、水晶振動子や表面弾性波素子などの圧電素子の電極表面にＤＮＡサンプルを固定する第２の手順と、混合試薬と４種のｄＮＴＰのいずれかの混合物を電極表面に固定されたＤＮＡサンプルに順次添加・反応させる第３の手順と、ＤＮＡサンプルへのｄＮＴＰの結合によるＤＮＡサンプルの質量変化をｄＮＴＰ供給前後の圧電素子の共振周波数変化として検出することにより、供給されたｄＮＴＰがＤＮＡサンプルに結合し、プライマーが伸長したか否かを分析する第４の手順を有する。【選択図】　図１
2004016171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーが結合したＤＮＡサンプルに、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）を順次加え、前記ｄＮＴＰがＤＮＡサンプルに結合した時のプライマーの伸長を順次検出してＤＮＡの配列を１塩基単位で決定する方法において、
前記ＤＮＡサンプルと前記ｄＮＴＰを結合する酵素と、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬と、ｐＨを一定に保つ働きをもつ緩衝液とを混合して混合試薬を調整し、前記混合試薬と前記４種のｄＮＴＰのいずれかの混合物を前記ＤＮＡサンプルに順次添加・反応させ、前記ＤＮＡサンプルへの前記ｄＮＴＰの結合による前記ＤＮＡサンプルの質量変化を前記ｄＮＴＰ供給前後の前記圧電素子の共振周波数変化として検出することにより、前記供給されたｄＮＴＰが前記ＤＮＡサンプルに結合し、プライマーが伸長したか否かを分析することを特徴とするＤＮＡ分析方法。
【請求項２】
プライマーが結合したＤＮＡサンプルに、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）を順次加え、前記ｄＮＴＰがＤＮＡサンプルに結合した時のプライマーの伸長を順次検出してＤＮＡの配列を１塩基単位で決定する方法において、
前記ＤＮＡサンプルと前記ｄＮＴＰを結合する酵素と、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬と、ｐＨを一定に保つ働きをもつ緩衝液とを混合して混合試薬を調整する第１の手順と、水晶振動子や表面弾性波素子などの圧電素子の電極表面に前記ＤＮＡサンプルを固定する第２の手順と、前記混合試薬と前記４種のｄＮＴＰのいずれかの混合物を前記電極表面に固定された前記ＤＮＡサンプルに順次添加・反応させる第３の手順と、前記ＤＮＡサンプルへの前記ｄＮＴＰの結合による前記ＤＮＡサンプルの質量変化を前記ｄＮＴＰ供給前後の前記圧電素子の共振周波数変化として検出することにより、前記供給されたｄＮＴＰが前記ＤＮＡサンプルに結合し、プライマーが伸長したか否かを分析する第４の手順と、未反応のｄＮＴＰを前記混合試薬により分解する第５の手順を有し、
前記第３〜５の手順を前記４種のＮＴＰについて順次繰り返すことを特徴とするＤＮＡ分析方法。
【請求項３】
請求項２において、前記等３の手段は、前記混合試薬に、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）のいずれかを加えて混合し、該混合液の前記混合試薬と前記ｄＮＴＰを、前記ＤＮＡサンプルが固定された前記圧電素子の設置された反応流路内に供給して前記ＤＮＡサンプルと反応させることを特徴とするＤＮＡ分析方法。
【請求項４】
請求項２または３において、前記ＤＮＡと前記ｄＮＴＰを結合する酵素は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、サーモシーケナーゼのいずれかであり、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬は、ＡＴＰジホスファーゼ、ＡＴＰピロホスファーゼのいずれかであり、また緩衝液は、トリス−塩酸、ＭｇＣｌ２およびディチオスレイトールの混合液であることを特徴とするＤＮＡ分析方法。
【請求項５】
検査対象のＤＮＡサンプルが表面に固定された水晶振動子や表面弾性波素子などの圧電素子を発振する発振部と、前記圧電素子および前記発振部を収納する検出部と、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）および前記ＤＮＡサンプルと前記ｄＮＴＰを結合する酵素、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬、ｐＨをコントロールする働きをもつ緩衝液とを混合した混合試薬を検出部に供給する供給部と、検出部において前記ＤＮＡサンプルと前記ｄＮＴＰが結合した時の前記ＤＮＡサンプルの質量変化を、前記ｄＮＴＰ供給前後の前記圧電素子の共振周波数変化として検出する検出手段と、前記収納部内の温度を制御する温度制御手段とを備えることを特徴とするＤＮＡ分析装置。
【請求項６】
請求項５において、前記ＤＮＡサンプルと前記ｄＮＴＰを結合する酵素と、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬と、ｐＨを一定に保つ働きをもつ緩衝液とを混合した混合試薬を保管する混合試薬槽と、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）のうちのそれぞれを個別に保管する４つのｄＮＴＰ槽と、前記混合試薬槽に接続された反応流路と、該反応流路と前記４つのｄＮＴＰ槽とをそれぞれ接続する４本のｄＮＴＰ流路と、前記各槽に保管された流体を前記反応流路にそれぞれ供給するポンプと、前記圧電素子の周波数変化を出力する機器とを有し、前記検出部は、前記反応流路の天井部に設けられ、前記ＤＮＡサンプルが固定された圧電素子と該圧電素子を発振する回路を有することを特徴とするＤＮＡ分析装置。
【請求項７】
シリコン基板上に、少なくとも１本の反応流路を有し、該反応流路はｄＡＴＰ注入口、ｄＣＴＰ注入口、ｄＧＴＰ注入口、ｄＴＴＰ注入口を介して前記４種類のｄＮＴＰ注入口に対応するｄＡＴＰ流路、ｄＣＴＰ流路、ｄＧＴＰ流路、ｄＴＴＰ流路に連通しており、更に、前記４種類のｄＮＴＰ注入口の下流側にＤＮＡサンプルと前記４種類のｄＮＴＰを順次添加してＤＮＡサンプルとｄＮＴＰの結合を検出する検出部および排出口を有することを特徴とする反応流路部品。
【請求項８】
請求項７において、反応流路は断面形状が幅０．１〜５ｍｍ、深さ０．０５〜０．５ｍｍであり、流路長が１０〜１００ｍｍ、流路内容積が１００μＬ以下であることを特徴とする反応流路部品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の塩基配列決定を行うＤＮＡ分析方法およびＤＮＡ分析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノム解析を中心に、ＤＮＡ塩基配列決定の高効率化のニーズが高まっている。従来のＤＮＡ分析方法の一つとして、プライマーが結合したＤＮＡサンプルのプライマー以降の塩基配列を分析する手法がＰＣＴＷＯ９８／２８４４０号に開示されている。具体的には、ＤＮＡサンプルを構成する４種の塩基、すなわちアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）に対して、それぞれ相補性を有する４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、すなわちデオキシチミン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシグアニジン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシトシン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシアデニン三リン酸（ｄＡＴＰ）を前記ＤＮＡサンプルに順次加え、その都度結合の有無を検出することにより、ＤＮＡサンプルのプライマー以降の塩基配列を１塩基単位で読み取る分析方法である。
この方法では、前記ｄＮＴＰが前記ＤＮＡサンプルに結合した時のプライマーの伸長に伴い、前記ｄＮＴＰからピロリン酸（ＰＰｉ）が遊離する。
【０００３】
（ＤＮＡ）ｎ＋ｄＮＴＰ→（ＤＮＡ）ｎ＋１＋ＰＰｉ　…（１）
ＰＰｉはアデノシン三リン酸スルフリラーゼ（ＡＴＰスルフリラーゼ）の存在下、アデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）と反応することで、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）へと変換される。
【０００４】
ＰＰｉ＋ＡＰＳ→ＡＴＰ＋ＳＯ４２−　…（２）
生成したＡＴＰの濃度は、以下のルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応により検出される。
【０００５】
ＡＴＰ＋ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ＋Ｏ２→ＡＭＰ＋ＰＰｉ＋ｏｘｙｌｕｃｉｆｅｒｉｎ＋ＣＯ２＋光　…（３）
なお、未反応の前記ｄＮＴＰと余剰ＡＴＰは、アピラーゼ等の核酸分解酵素により分解される。
【０００６】
ｄＮＴＰ→ｄＮＤＰ＋ＰＰｉ→ｄＮＭＰ＋ＰＰｉ　…（４）
ＡＴＰ→ＡＤＰ＋ＰＰｉ→ＡＭＰ＋ＰＰｉ　…（５）
【０００７】
一方、水晶振動子や表面弾性波素子などの圧電素子は、その電極上に付着した重さを発振周波数の変化に定量的に変換することから、微量な質量変化を反応雰囲気下で連続的に測定する手法として広く利用されている。例えば、特開平６−２４５７５４号には予め塩基配列が既知のヌクレオチドを水晶振動子に固定し、これと読み取り目的のＤＮＡを結合させた時に生ずる周波数変化を測定することにより、固定したヌクレオチドと相補的なＤＮＡの配列を読み取りが可能であることの開示がある。すなわち、特定の塩基配列を有しているかどうかを測定している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記の従来技術は、反応行程；前記反応式（１）〜（５）および使用する試薬の種類が多いため、試薬調整が煩雑で、試薬濃度の経時変化による発光信号に乱れが生じ、分析コストが高い原因となっている。
また、未反応物質（ｄＮＴＰ）および中間生成物（ＡＴＰ）の分解（反応式（４）、（５））に長時間を要し分析時間が長くかかること、試薬の使用量を微量にすると検出物質の十分な発光量が得られない問題があった。
【０００９】
本発明は、反応行程を短縮して試薬の種類および使用量の低減が可能なＤＮＡ分析方法およびＤＮＡ分析装置を提供する。
さらに、本発明は、未反応物質および中間生成物の分解時間を短縮して塩基配列の分析時間を短縮できるＤＮＡ分析方法およびＤＮＡ分析装置を提供する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する本発明の要旨は次のとおりである。
［１］　プライマーが結合したＤＮＡサンプルに、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）を順次加え、前記ｄＮＴＰがＤＮＡサンプルに結合した時のプライマーの伸長を順次検出してＤＮＡの配列を１塩基単位で決定する方法において、前記ＤＮＡサンプルと前記ｄＮＴＰを結合する酵素と、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬と、ｐＨを一定に保つ働きをもつ緩衝液とを混合して混合試薬を調整する第１の手順と、水晶振動子や表面弾性波素子などの圧電素子の電極表面に前記ＤＮＡサンプルを固定する第２の手順と、前記混合試薬と前記４種のｄＮＴＰのいずれかの混合物を前記電極表面に固定された前記ＤＮＡサンプルに順次添加・反応させる第３の手順と、前記ＤＮＡサンプルへの前記ｄＮＴＰの結合による前記ＤＮＡサンプルの質量変化を前記ｄＮＴＰ供給前後の前記圧電素子の共振周波数変化として検出することにより、前記供給されたｄＮＴＰが前記ＤＮＡサンプルに結合し、プライマーが伸長したか否かを分析する第４の手順と、未反応のｄＮＴＰを前記混合試薬により分解する第５の手順を有し、前記第３〜５の手順を前記４種のＮＴＰについて順次繰り返すＤＮＡ分析方法である。
【００１１】
［２］　前記ＤＮＡサンプルと前記ｄＮＴＰを結合する酵素と、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬と、ｐＨを一定に保つ働きをもつ緩衝液とを混合して混合試薬を調整する第１の手順と、水晶振動子や表面弾性波素子などの圧電素子の電極表面に前記ＤＮＡサンプルを固定する第２の手順と、前記混合試薬に、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）のいずれかを加えて混合し、該混合液の前記混合試薬と前記ｄＮＴＰを、前記ＤＮＡサンプルが固定された前記圧電素子の設置された反応流路内に供給して前記ＤＮＡサンプルと反応させる第３の手順と、前記ＤＮＡサンプルへの前記ｄＮＴＰの結合による前記ＤＮＡサンプルの質量変化を前記ｄＮＴＰ供給前後の前記圧電素子の共振周波数変化として検出することにより、前記供給されたｄＮＴＰが前記ＤＮＡサンプルに結合し、プライマーが伸長したか否かを分析する第４の手順と、前記混合試薬のみを前記反応流路に流して未反応のｄＮＴＰを前記混合試薬により分解する第５の手順を有し、前記第３〜５の手順を前記４種のＮＴＰについて順次繰り返すＤＮＡ分析方法である。
【００１２】
前記項［１］または［２］において、前記ｄＮＴＰを前記ＤＮＡサンプルに添加した後、前記圧電素子の共振周波数変化を測定する間、前記ｄＮＴＰと前記ＤＮＡサンプルが反応する領域の温度を少なくとも２５〜４０℃に制御されることが好ましく、３５〜４０℃に制御するとより好ましい。さらに、３６〜３８℃に温度制御されると最もよい。
また前記項［１］または［２］において、ｄＡＴＰとｄＴＴＰ、或いはｄＣＴＰとｄＧＴＰが連続しない順序で供給されることが好ましい。
さらに、前記ＤＮＡと前記ｄＮＴＰを結合する酵素は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、サーモシーケナーゼのいずれかであり、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬は、ＡＴＰジホスファーゼ、ＡＴＰピロホスファーゼのいずれかであり、また緩衝液は、トリス−塩酸、ＭｇＣｌ２およびディチオスレイトールの混合液であることが好ましい。
【００１３】
［３］　検査対象のＤＮＡサンプルが表面に固定された水晶振動子や表面弾性波素子などの圧電素子を発振する発振部と、前記圧電素子および前記発振部を収納する検出部と、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）および前記ＤＮＡサンプルと前記ｄＮＴＰを結合する酵素、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬、ｐＨを一定に保つ働きをもつ緩衝液とを混合した混合試薬を検出部に供給する供給部と、検出部において前記ＤＮＡサンプルと前記ｄＮＴＰが結合した時の前記ＤＮＡサンプルの質量変化を、前記ｄＮＴＰ供給前後の前記圧電素子の共振周波数変化として検出する検出手段と、前記収納部内の温度を制御する温度制御手段とを備えるＤＮＡ分析装置である。
【００１４】
［４］　前記ＤＮＡサンプルと前記ｄＮＴＰを結合する酵素と、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬と、ｐＨを一定に保つ働きをもつ緩衝液とを混合した混合試薬を保管する混合試薬槽と、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）のうちのそれぞれを個別に保管する４つのｄＮＴＰ槽と、前記混合試薬槽に接続された反応流路と、該反応流路と前記４つのｄＮＴＰ槽とをそれぞれ接続する４本のｄＮＴＰ流路と、前記各槽に保管された流体を前記反応流路にそれぞれ供給するポンプと、前記反応流路の天井部に設けられ、前記ＤＮＡサンプルが固定された圧電素子と該圧電素子を発振する回路とから成る検出部と、前記検出部内部の温度を制御する温度制御手段と、前記圧電素子の周波数変化を出力する機器と、前記反応流路の下流側に設けられる混合試薬あるいはｄＮＴＰを排出するための排出口とを備えているＤＮＡ分析装置である。
【００１５】
前記項［３］または［４］において、前記検査部の圧電素子は、クロムかチタンの電極を有し、該電極の表面にはＳｉＯ２を主成分とするガラスの薄膜が形成され、該ガラス薄膜にアミノ基を介してＤＮＡサンプルが固定されているのが好ましい。前記電極と前記ガラス薄膜の厚みがそれぞれ０．１〜１μｍであることが好ましい。また前記圧電素子は、複数に区画された電極に異なるＤＮＡサンプルが固定されていることが好ましい。
前記項［４］において、検出部は、反応流路に対し脱着可能に構成されていることが好ましい。
【００１６】
［５］　シリコン基板上に、少なくとも１本の反応流路を有し、該反応流路はｄＡＴＰ注入口、ｄＣＴＰ注入口、ｄＧＴＰ注入口、ｄＴＴＰ注入口を介して前記４種類のｄＮＴＰ注入口に対応するｄＡＴＰ流路、ｄＣＴＰ流路、ｄＧＴＰ流路、ｄＴＴＰ流路に連通しており、更に、前記４種類のｄＮＴＰ注入口の下流側にＤＮＡサンプルと前記４種類のｄＮＴＰを順次添加してＤＮＡサンプルとｄＮＴＰの結合を検出する検出部および排出口を有することを特徴とする反応流路部品である。
【００１７】
前記項［５］において、反応流路は断面形状が幅０．１〜５ｍｍ、深さ０．０５〜０．５ｍｍであり、流路長が１０〜１００ｍｍ、流路内容積が１００μＬ以下であることが好ましく、ｄＮＴＰ流路は断面形状が幅０．５ｍｍ、深さ０．２ｍｍであり、流路長が１０ｍｍ、流路内容積が１μＬであることが好ましい。
【００１８】
【発明の実施の形態】
［実施例１］
以下、圧電素子として水晶振動子を使用する場合の実施例を、図１を参照しながら説明する。図１は、分析方法の手順を示すフローチャート図である。
初めに、ＤＮＡサンプルを作成する。塩基配列を分析したい一本鎖ＤＮＡサンプルに、塩基数１５〜２０のプライマーを加え、９５℃で５分間アニールした後に室温で３０分間静置する。これにより、一本鎖ＤＮＡサンプルとプライマーは結合する。この時結合しなかったプライマーは洗浄して流す（ステップ１０１）。
【００１９】
ＤＮＡサンプルの作成が済んだら、ＤＮＡサンプルとｄＮＴＰを結合する酵素とｄＮＴＰ分解試薬を混合した試薬を調整する。ＤＮＡサンプルとｄＮＴＰを結合する酵素として、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、サーモシーケナーゼのいずれかを用いることができる。またｄＮＴＰ分解試薬として、ＡＴＰジホスファーゼ、ＡＴＰピロホスファーゼのいずれかを用いることができる。
【００２０】
さらに、プライマーの伸長が円滑に進むように、混合試薬に緩衝液を付加することが好ましい。緩衝液はｐＨをコントロールする働きを有し、ｐＨを一定に保つ働きを有する。該緩衝液としては、ｐＨ緩衝液としてのトリス−塩酸等、プライマーの伸長反応の基質となる錯体（ｄＮＴＰとＭｇ２＋）を作成するためのＭｇＣｌ２、酵素タンパク質を酸化変性から保護するためのディチオスレイトールを混合して用いることが好ましい（ステップ１０２）。
【００２１】
次に、水晶振動子にプライマーが結合したＤＮＡサンプルを固定する。水晶振動子は、取り扱い易さと測定感度の点から共振周波数５〜１０ＭＨｚで発振するものが好ましい。まず、水晶振動子の両面にスパッタリング、蒸着などの薄膜形成方法で電極を形成する。電極に使用する金属は、水晶やガラスとの接着性がよく剥離しにくいクロムあるいはチタンを使用するのが好ましい。ここで、水晶振動子の構成の一例を図２に示す。図２（ａ）は水晶振動子上面の平面図、図２（ｂ）は水晶振動子下面の平面図、図２（ｃ）は水晶振動子の断面図である。水晶振動子１２０の上面から発振器へと導通させるため、水晶振動子１２０の裏電極１２２は水晶振動子１２０の上面にもかかる構成となっている。
【００２２】
次に、裏電極１２２の上にスパッタリング、蒸着などの方法でガラス薄膜を形成する。ガラスとしては、電極素材であるクロムやチタンと最も接着性のよいＳｉＯ２を主成分としたものが好ましい。このガラス薄膜にアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）を添加し、１２０〜１６０℃程度でベークすると、ガラス薄膜の表面にアミノ基が固定される。ここで、電極とガラス薄膜の厚みがそれぞれ０．１〜１μｍであることが好ましい。双方の厚みが１μｍを超えると、水晶振動子の周波数応答が悪くなるためである。
【００２３】
さらに、アミノ基がコーティングされたガラス薄膜にＤＮＡサンプルを塗布し、恒温恒湿槽内で３７℃、湿度９０％で１時間保温する。その後、ＵＶクロスリンカーを用いて６０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を水晶振動子１２０に照射することで、ＤＮＡサンプルは水晶振動子１２０に強固に固定される（ステップ１０３）。
【００２４】
次いで、ＤＮＡサンプルに混合試薬と１種類のｄＮＴＰ，例えばｄＡＴＰを加える。混合試薬を触媒としてｄＡＴＰがＤＮＡサンプルに結合した時、プライマーは伸長する（ステップ１０４）。
【００２５】
（ＤＮＡ）ｎ＋ｄＡＴＰ→（ＤＮＡ）ｎ＋１＋ＰＰｉ　…（６）
ＤＮＡサンプルにｄＡＴＰが結合した場合、ＤＮＡサンプルが固定された水晶振動子に質量荷重（ΔＷ）が生じ、共振周波数（ｆ０）で振動させた水晶振動子に共振周波数の変化（Δｆ）が生じる。
【００２６】
Δｆ＝（−ｆ０２／ＮＡρ）・ΔＷ　…（７）
（式中の、Δｆは共振周波数の変化量、ｆ０は使用した水晶振動子の共振周波数、Ｎは水晶の周波数定数、Ａは電極面積、ρは水晶の密度、ΔＷは水晶電極部の質量変化である。）
【００２７】
例えば６ＭＨｚの水晶振動子を使用した場合、１Ｈｚの周波数変化は１．２×１０−８（ｇ／ｃｍ２）の質量変化に相当する。一方、ＤＮＡサンプルが水晶振動子上のガラス薄膜表面に８．３×１０−１０（ｍｏｌ／ｃｍ２）存在し（大場洋一：ガラス表面設計、ｐｐ．７５、近代編集社（１９８９））、ｄＡＴＰの質量を５７０（ｇ／ｍｏｌ）とすると、ｄＡＴＰがＤＮＡサンプルに結合した場合の質量変化は４．７×１０−７（ｇ／ｃｍ２）となる。この質量変化は４０Ｈｚの周波数変化に相当することから、水晶振動子の周波数変化を測定することにより、ＤＮＡサンプルとｄＡＴＰの結合が検出できる。この周波数変化を測定する際、ＤＮＡサンプルとｄＮＴＰを温度制御するのが好ましい。液中で水晶振動子を使用した場合、液温が１℃変化すると周波数は１５〜３０Ｈｚ変化し、正確な測定が困難になるためである。本実施例で使用する試薬の活性が最も高くなるのは３７℃付近であることから、設定温度としては３６〜３８℃が最も好ましい。３５℃〜４０℃に設定しても効果的であり、また２５℃〜４０℃に設定しても分析可能である（ステップ１０５）。
【００２８】
このあと、結合しなかったｄＡＴＰを、混合試薬により分解・洗浄する（ステップ１０６）。
【００２９】
ｄＡＴＰ→ｄＡＤＰ＋ＰＰｉ→ｄＡＭＰ＋ＰＰｉ　…（８）
本実施例によれば反応行程を従来の５（反応式（１）〜（５））から２（反応式（６）、（８））に短縮できるために、試薬の使用量を大幅に低減できる。
【００３０】
次に、ＤＮＡサンプルに混合試薬とｄＣＴＰを加える。混合試薬を触媒としてｄＣＴＰがＤＮＡサンプルに結合した時、プライマーは伸長する（ステップ１０７）。
【００３１】
上記により、ＤＮＡサンプルにｄＣＴＰが結合した場合、水晶振動子の周波数変化を測定することにより、プライマーの伸長が検出される。その際、温度制御を行う（ステップ１０８）。
【００３２】
このあと、結合しなかったｄＣＴＰを、混合試薬により分解・洗浄する（ステップ１０９）。
【００３３】
さらに、ＤＮＡサンプルに混合試薬とｄＴＴＰを加える。混合試薬を触媒としてｄＴＴＰがＤＮＡサンプルに結合した時、プライマーは伸長する（ステップ１１０）。
【００３４】
上記により、ＤＮＡサンプルにｄＴＴＰが結合した場合、水晶振動子の周波数変化を測定することにより、プライマーの伸長が検出される。その際、温度制御を行う（ステップ１１１）。
【００３５】
このあと、結合しなかった蛍光標識ｄＴＴＰを、混合試薬により分解・洗浄する（ステップ１１２）。
【００３６】
最後に、ＤＮＡサンプルに混合試薬とｄＧＴＰを加える。混合試薬を触媒としてｄＧＴＰがＤＮＡサンプルに結合した時、プライマーは伸長する（ステップ１１３）。
【００３７】
上記により、ＤＮＡサンプルにｄＧＴＰが結合した場合、水晶振動子の周波数変化を測定することにより、プライマーの伸長が検出される。その際、温度制御を行う（ステップ１１４）。
【００３８】
このあと、結合しなかったｄＧＴＰを、混合試薬により分解・洗浄する（ステップ１１５）。
【００３９】
以上の行程を、４種類のｄＮＴＰについて繰り返して、ＤＮＡサンプルの配列を一塩基ずつ決定する（ステップ１１６）。
【００４０】
なお、ｄＡＴＰとｄＴＴＰ、或いはｄＣＴＰとｄＧＴＰとはそれぞれ結合する可能性があり、上述のようにｄＡＴＰとｄＴＴＰ、或いはｄＣＴＰとｄＧＴＰが連続しない順序でｄＮＴＰを反応させるのが望ましい。これにより各ｄＮＴＰ間の汚染を防止して、ｄＮＴＰとＤＮＡサンプルとの確実な結合を図ることができる。
【００４１】
次に、ＤＮＡサンプルとｄＮＴＰとの具体的な結合について、図３を用いて説明する。図３は、ＤＮＡサンプルとｄＮＴＰとの結合を示す模式図である。
ＤＮＡサンプル２０１は、一本鎖ＤＮＡサンプル２０２と、この一本鎖ＤＮＡサンプル２０２に結合しているプライマー２０３とから成っている。該ＤＮＡサンプル２０１の初期状態は、図３（ａ）に示すように、一本鎖ＤＮＡサンプル２０２にプライマー２０３が結合し、一本鎖ＤＮＡサンプル２０２のプライマー２０３以降の塩基配列がわからない場合の例である。なお、塩基配列の記号は、Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミンである。
【００４２】
この初期状態で、混合試薬の存在下、ｄＡＴＰ２１１を添加すると、図３（ｂ）に示されるように、ＤＮＡサンプル２０１とｄＡＴＰ２１１が結合する。そして、水晶振動子の周波数変化を測定することにより１塩基分の質量変化が計測される。その後、未反応のｄＡＴＰ２１１を混合試薬により分解・洗浄する。
【００４３】
次に、混合試薬の存在下、ｄＣＴＰ２１２を添加すると、図３（ｃ）に示されるように、ＤＮＡサンプル２０１とｄＣＴＰ２１２が結合しない。よって、水晶振動子の周波数変化を測定しても、質量変化は計測されない。その後、未反応のｄＣＴＰ２１２を混合試薬により分解・洗浄する。
【００４４】
さらに、混合試薬の存在下、ｄＴＴＰ２１３を添加すると、図３（ｄ）に示されるように、ＤＮＡサンプル２０１と２つのｄＴＴＰ２１３が続けて結合する。そして、水晶振動子の周波数変化を測定することにより２塩基分の質量変化が計測される。その後、未反応のｄＴＴＰ２１３を混合試薬により分解・洗浄する。
【００４５】
最後に、混合試薬の存在下、ｄＧＴＰ２１４を添加すると、図３（ｅ）に示されるように、ＤＮＡサンプル２０１とｄＧＴＰ２１４が結合する。
そして、水晶振動子の周波数変化を測定することにより１塩基分の質量変化が計測される。その後、未反応の蛍光標識ｄＧＴＰ２１４を混合試薬により分解・洗浄する。
以上の行程により、計測された蛍光強度のプロファイルはｄＡＴＰ２１１で１塩基分、ｄＴＴＰ２１３で２塩基分、ｄＧＴＰ２１４で１塩基分の順序であるから、ＤＮＡサンプル２０１のプライマー２０３以降の塩基配列がＴＡＡＣであることが分析される。
【００４６】
以上のように、本実施例によれば、プライマーが結合したＤＮＡサンプルに、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）を順次加え、前記ｄＮＴＰがＤＮＡサンプルに結合した時のプライマーの伸長を順次検出してＤＮＡの配列を１塩基単位で決定する方法において、前記ＤＮＡサンプルと前記ｄＮＴＰを結合する酵素と、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬と、ｐＨを一定に保つ働きをもつ緩衝液とを混合して混合試薬を調整し、前記混合試薬と前記４種のｄＮＴＰのいずれかの混合物を前記ＤＮＡサンプルに順次添加・反応させ、前記ＤＮＡサンプルへの前記ｄＮＴＰの結合による前記ＤＮＡサンプルの質量変化を前記ｄＮＴＰ供給前後の前記圧電素子の共振周波数変化として検出することにより、前記供給されたｄＮＴＰが前記ＤＮＡサンプルに結合し、プライマーが伸長したか否かを分析するＤＮＡ分析方法が構成される。
【００４７】
次に、本実施例のＤＮＡ分析装置を図４、図５、図６および図７を用いて説明する。図４は装置構成の一例を示す斜視図、図５は反応流路部分の構成を拡大した斜視図、図６は水晶発振器の周辺を示す断面図、図７はポンプの構成を示す断面図である。
【００４８】
ＤＮＡ分析装置は、ＤＮＡサンプルとｄＮＴＰを結合する酵素とｄＮＴＰ分解試薬と緩衝液とから構成される混合試薬２１０を保管する混合試薬槽３００と、４種のｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ２１１、ｄＣＴＰ２１２、ｄＴＴＰ２１３、ｄＧＴＰ２１４をそれぞれ保管する４つのｄＮＴＰ槽、すなわちｄＡＴＰ槽３０１、ｄＣＴＰ槽３０２、ｄＴＴＰ槽３０３、ｄＧＴＰ槽３０４と、反応流路３１０と、各ｄＮＴＰ槽（３０１〜３０４）と反応流路３１０とを結ぶ４本のｄＮＴＰ流路、すなわちｄＡＴＰ流路３１１、ｄＣＴＰ流路３１２、ｄＴＴＰ流路３１３、ｄＧＴＰ流路３１４と、混合試薬２１０を混合試薬槽３００から吸引して反応流路３１０に吐出する混合試薬ポンプ３２０と、各ｄＮＴＰ（２１１〜２１４）を各ｄＮＴＰ槽（３０１〜３０４）から吸引して反応流路３１０に吐出する４つのｄＮＴＰポンプ、すなわちｄＡＴＰポンプ３２１、ｄＣＴＰポンプ３２２、ｄＴＴＰポンプ３２３、ｄＧＴＰポンプ３２４と、ＤＮＡサンプル２０１を固定した水晶振動子１２０を発振する水晶発振器３５０、周波数測定時にＤＮＡサンプル２０１とｄＮＴＰの温度を制御する温度制御機構３３０、温度制御機構用電源３３１、水晶発振器用電源３３２と記録計３３３等から成っている。
【００４９】
シリコン製の反応流路３１０は、８０ｍｍ×８０ｍｍ程度のシリコン基板上に、マイクロファブリケーションを用いて制作されている。流路の途中に４つのｄＮＴＰ注入口、すなわちｄＡＴＰ注入口３４１、ｄＣＴＰ注入口３４２、ｄＴＴＰ注入口３４３、ｄＧＴＰ注入口３４４を有している。ここで、ｄＡＴＰ注入口３４１、ｄＣＴＰ注入口３４２、ｄＴＴＰ注入口３４３、ｄＧＴＰ注入口３４４はそれぞれ、ｄＡＴＰ流路３１１、ｄＣＴＰ流路３１２、ｄＴＴＰ流路３１３、ｄＧＴＰ流路３１４に連通している。さらに、反応流路３１０は、ｄＮＴＰ注入口（３４１〜３４４）の下流側で、試薬の排出口３４５を有している。反応流路３１０は断面形状が幅１ｍｍ、深さ０．２ｍｍであり、流路長が５０ｍｍ、流路内容積が１０μＬである。また、ｄＮＴＰ流路（３１１〜３１４）は断面形状が幅０．５ｍｍ、深さ０．２ｍｍであり、流路長が１０ｍｍ、流路内容積が１μＬである。さらには、混合試薬槽３００およびｄＮＴＰ槽（３０１〜３０４）の直径は１０ｍｍ、深さが１０ｍｍ、容積が７８５μＬである。また、ｄＮＴＰ注入口（３４１〜３４４）と水晶発振器３５０との間隔は１０〜３０ｍｍである。
【００５０】
図６は検出部分の概要を示している。反応流路３１０を流れる４種のｄＮＴＰ（２１１〜２１４）と水晶振動子１２０の裏電極１２２に固定されたＤＮＡサンプル２０１との結合を、水晶発振器３５０発振された水晶振動子１２０の周波数変化から検出する。反応流路３１０を構成する下部部材３５３の上面にＯ−リング等のシール部材３５４を介して設置された水晶振動子１２０は、反応流路３１０の蓋となる上部部材３５２により固定される。上部部材３５２には水晶発振器３５０と水晶振動子１２０の表電極１２１および裏電極１２２を接触させるための電気接点３５１が埋め込まれている。上部部材３５２と下部部材３５３は分析対象のＤＮＡサンプル２０１毎に脱着可能であるため、サンプル間の汚染を確実に防ぎ、ＤＮＡサンプル２０１の交換を容易に行うことができる。
【００５１】
周波数測定の際の温度制御は、下部部材３５３の下に設置した温度制御機構３３０により行う。温度制御機構３３０として、電流の流す方向により昇温・冷却の変換が容易に行えるペルチェ素子等を用いることができる。反応流路３１０の構成材料であるシリコンは熱伝導が極めて良好であり、かつ流路内の液量は微量であるから熱応答性がよい。ペルチェ素子の作動時間を予め実験的に定めておくことで、検出部分の温度を容易に制御することができる。
【００５２】
混合試薬ポンプ３２０および４つのｄＮＴＰポンプ（３２１〜３２４）は、図７に示されるように厚さ１．５ｍｍ程度のシリコン製容積型ポンプであり、マイクロファブリケーションにより吸入口３６１、吐出口３６２、ダイアフラム３６３、ポンプ室３６４、吸入弁３６５および吐出弁３６６等の加工が施されている。ポンプの駆動は、外部のアクチュエーター３６７でダイアフラム３６３を変形させることにより行う。すなわち、ダイアフラム３６３が上方に膨らんだ時はポンプ室３６４の内部が減圧されるため、吐出弁３６６が閉じて吸入弁３６５が開き、吸入口３６１からポンプ室３６４に液体が吸入される。次に、ダイアフラム３６３が下方に凹むとポンプ室３６４の内部が加圧されるため、吸入弁３６５が閉じて吐出弁３６６が開き、吐出口３６２からポンプ室３６４の外部へと液体が吐出される。
【００５３】
次に、ＤＮＡ分析装置の動作手順について、図４を用いて説明する。まず、混合試薬ポンプ３２０を駆動して、反応流路３１０の内部を混合試薬２１０で充填する。この状態で、ｄＡＴＰポンプ３２１を一定時間（本実施例では１ｓ）駆動することにより、ｄＡＴＰ２１１がｄＡＴＰ槽３０１からｄＡＴＰ流路３１１を通って反応流路３１０に一定量（本実施例では０．５μＬ）注入され、混合試薬２１０と混合される。混合試薬２１０とｄＡＴＰ３１１の混合液は、流速２．５ｍｍ／ｓで水晶発振器３５０に達した後、この混合液は水晶発振器３５０に設置された水晶振動子１２０上のＤＮＡサンプル２０１と反応する。この時、温度制御機構３３０により反応温度を最適化する。
【００５４】
そして発振回路３５０により発振された水晶振動子１２０の周波数変化から、ＤＮＡサンプル２０１とｄＡＴＰ３１１との結合が検出される。その後、混合試薬ポンプ３２０を一定時間（本実施例では５ｓ）駆動することにより、混合試薬２１０が一定量（本実施例では２．５μＬ）反応流路３１０に注入され、該混合試薬２１０は反応流路３１０内部に残留した未反応のｄＡＴＰ２１１を分解・洗浄して排出口３４５へと排出する。以下、ｄＣＴＰ２１２、ｄＴＴＰ２１３、ｄＧＴＰ２１４についても同様の操作を繰り返すことで、ＤＮＡサンプル２０１の塩基配列が分析される。
【００５５】
本実施例によれば装置がフロー式であるため、混合試薬２１０により分解・洗浄された未反応のｄＮＴＰが反応流路３１０に滞留することなく排出される。よって、未反応のｄＮＴＰの分解・洗浄時間が大幅に短縮され、分析時間の短縮が可能である。
【００５６】
［実施例２］
実施例１と基本構成は同一であり、異なっている構成について説明する。実施例１では、水晶発振器３５０に設置した水晶振動子１２０に１種類のＤＮＡサンプル２０１を固定したが、本実施例では水晶振動子１２０を複数に区画してそれぞれのコンパートメントに異なるＤＮＡサンプル２０１を固定し、該ＤＮＡサンプル２０１に対応した電極と発振回路を設けることにより、多種のＤＮＡサンプル２０１を同時に配列決定することができる。
【００５７】
［実施例３］
実施例１あるいは実施例２と基本構成は同一である。
実施例１および２の装置がフロー式であるが、本発明においてフロー式に特定されない。例えばバッチ式の反応槽を使用した場合について説明する。
まず、実施例１と同様の方法で水晶振動子にＤＮＡサンプル２０１を固定し、該水晶振動子をガラス容器の内側底部に設置する。そして水晶振動子とガラス容器の外側にある発振回路とをガラス容器の底部を介して導通させる。次に、ＤＮＡサンプルとｄＮＴＰを結合する酵素と、未反応ｄＮＴＰを分解する試薬と、ｐＨを一定に保つ働きをもつ緩衝液とから成る混合試薬２１０をガラス容器に加えた後、４類類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）のいずれかをさらにガラス容器に加える。そして、発振回路により発振された水晶振動子の周波数変化を測定することで、前記実施例と同様にＤＮＡサンプル２０１の塩基配列を決定する事ができる。
【００５８】
【発明の効果】
本発明によれば、ｄＮＴＰとＤＮＡサンプルの結合およびそれに伴うプライマー伸長の有無を、水晶振動子の周波数変化から検出できるため、反応行程を短縮して試薬の使用量を低減できる。
【００５９】
また、本発明によれば、装置をフロー式とすることによって、混合試薬により分解・洗浄された未反応のｄＮＴＰを検出部に滞留させることなく排出できるような構成とでき、未反応のｄＮＴＰの分解・洗浄時間を短縮して塩基配列の分析時間を短縮できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１の分析手順を示すフローチャート図である。
【図２】図１の水晶振動子の一例を示す平面図と断面図である。
【図３】図１のＤＮＡサンプルとｄＮＴＰとの結合状態を説明する模式図である。
【図４】図１の装置構成の一例を示す斜視図である。
【図５】図４の反応流路部分の構成を拡大した斜視図である。
【図６】図４、５に示す水晶発振器の周辺を示す断面図である。
【図７】図４のポンプの構成を示す断面図である。
【符号の説明】
１２０…水晶振動子、１２１…表電極、１２２…裏電極、２０１…ＤＮＡサンプル、２０２…一本鎖ＤＮＡサンプル、２０３…プライマー、２１０…混合試薬、２１１…ｄＡＴＰ、２１２…ｄＣＴＰ、２１３…ｄＴＴＰ、２１４…ｄＧＴＰ、３００…混合試薬槽、３０１…ｄＡＴＰ槽、３０２…ｄＣＴＰ槽、３０３…ｄＴＴＰ槽、３０４…ＧＴＰ槽、３１０…反応流路、３１１…ｄＡＴＰ流路、３１２…ｄＣＴＰ流路、３１３…ｄＴＴＰ流路、３１４…ｄＧＴＰ流路、３２０…混合試薬ポンプ、３２１…ｄＡＴＰポンプ、３２２…ｄＣＴＰポンプ、３２３…ｄＴＴＰポンプ、３２４…ｄＧＴＰポンプ、３３０…温度制御機構、３３１…温度制御機構用電源、３３２…発振器用電源、３３３…記録計、３４１…ｄＡＴＰ注入口、３４２…ｄＣＴＰ注入口、３４３…ｄＴＴＰ注入口、３４４…ｄＧＴＰ注入口、３４５…排出口、３５０…水晶発振器、３５１…電気接点、３５２…上部部材、３５３…下部部材、３５４…シール部材、３６１…吸入口、３６２…吐出口、３６３…ダイアフラム、３６４…ポンプ室、３６５…吸入弁、３６６…吐出弁、３６７…アクチュエーター。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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