(57)【要約】【課題】蛍光免疫法により、微生物、化学物質などを高感度かつ迅速、簡便に測定し測定値の確実性を図る。【解決手段】光導波路の表面において抗原抗体反応を観測する蛍光免疫測定方法であって、光導波路と検体を接触させ、光導波路の表面に検体中の測定対象物を捕捉し、捕捉された測定対象物に蛍光性発色団を有する標識抗体を結合させ、光導波路内に励起光を導入して光導波路の表面にエバネッセント波を発生させて蛍光性発色団を励起し、観測される光量のうち、検体と光導波路との接触時間に応じて増加する抗原抗体反応に基づく蛍光標識抗体からの蛍光量変化率を測定する。【選択図】        図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光導波路の表面において抗原抗体反応を観測する蛍光免疫測定方法であって、前記光導波路と検体を接触させ前記光導波路の表面に検体中の測定対象物を捕捉する捕捉工程と、該捕捉工程で捕捉された前記測定対象物に蛍光性発色団を有する標識抗体を結合させる結合工程と、前記光導波路内に励起光を導入して内部全反射光とし、前記光導波路の表面にエバネッセント波を発生させ該蛍光性発色団を励起する励起工程と、前記光導波路内を伝播して収集される光を観測する観測工程とから成る一連の工程を少なくとも２回繰り返し、前記光導波路と前記検体との接触時間に対する観測光量の変化率を測定することを特徴とする蛍光免疫測定方法。
【請求項２】
前記工程の繰り返しにおいて、前記観測工程において観測光量が単調に推移しなかった場合に、繰り返し回数を追加することを特徴とする請求項１に記載の蛍光免疫測定方法。
【請求項３】
前記一連の工程に先立ち、前記標識抗体と前記光導波路を接触させる第１の接触工程と、前記光導波路内に励起光を導入して内部全反射光とし、前記光導波路の表面にエバネッセント波を発生させる前記励起工程と、前記光導波路内を伝播して収集される光を観測する前記観測工程とから成る一連の工程を少なくとも１回行い、前記観測工程において非特異的吸着成分による観測光量を予め測定することを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光免疫測定方法。
【請求項４】
前記非特異的吸着成分による観測光量が予め設定された値よりも大きい場合に、測定を中断することを特徴とする請求項３に記載の蛍光免疫測定方法。
【請求項５】
前記一連の工程に先立ち、前記測定対象物を全く含まないブランク検体と前記光導波路を接触させる第２の接触工程と、前記標識抗体と前記光導波路を接触させる前記第１の接触工程と、前記光導波路内に励起光を導入して内部全反射光とし、前記光導波路の表面にエバネッセント波を発生させる前記励起工程と、前記光導波路内を伝播して収集される光を観測する前記観測工程とから成る一連の工程を少なくとも２回繰り返し、前記光導波路と前記ブランク検体との接触時間に対する前記観測工程における観測光量の変化率を予め測定することを特徴とする請求項１に記載の蛍光免疫測定方法。
【請求項６】
前記検体において得られた観測光量の変化率から前記ブランク検体において得られた観測光量の変化率を差し引くことを特徴とする請求項５に記載の蛍光免疫測定方法。
【請求項７】
前記一連の工程の繰り返し単位において、前記検体との接触時間と前記ブランク検体との接触時間が同一であることを特徴とする請求項６に記載の蛍光免疫測定方法。
【請求項８】
前記一連の工程の繰り返し回数が、前記検体に対する場合と前記ブランク検体に対する場合とで同一であることを特徴とする請求項６又は７に記載の蛍光免疫測定方法。
【請求項９】
前記捕捉工程は前記光導波路の表面上に予め固定された抗体による捕捉であることを特徴とする請求項１〜８の何れか１つの請求項に記載の蛍光免疫測定方法。
【請求項１０】
前記捕捉工程は、前記検体を入れた開放型容器を回転させ、該容器内の回転軸上を除いた該回転軸に平行する部分に棒状の前記光導波路を置くことを特徴とする請求項１に記載の蛍光免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品、生体試料、環境試料中の細菌、タンパク質、化学物質等を抗原抗体反応と蛍光を用いることにより、測定対象物を定性的かつ定量的に測定する蛍光免疫測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
抗原抗体反応を利用する分析法は、特定の測定対象物を選択的かつ簡便に測定する方法として優れており、食品、医療、環境等の分野において普及しつつある。このような方法の１つとして、抗体に結合させた酵素により色素を発色させるＥＬＩＳＡ法が良く知られている。更に、高感度の測定方法として、抗体に結合させた蛍光色素の蛍光を観測する蛍光免疫法も知られており、幾つかの装置が市販されている。
【０００３】
蛍光測定は高感度のためにノイズ成分が含まれ易く、蛍光免疫法においても測定値の信頼性を確保するために様々な工夫が施されている。その１つの方法として、エバネッセント波（境界面からの距離に対して指数関数的に減衰しエネルギを持たなくなる光波）による励起を用いている。これは、光導波路内部で光を全反射させ、その外部表面にしみ出すエバネッセント波により蛍光色素を励起させる方法は、光導波路の表面近傍においてのみ生ずる反応を選択的に観測することができ、抗原抗体反応の観測には好適である。
【０００４】
また、上述の全反射を多重に行わせることにより、励起光をより効率良く用い、感度を向上させることができる。多重全反射を利用した蛍光免疫測定の一例として、ファイバ型光導波路を検体溶液に浸漬して用いる方式が、米国特許４５８２８０９号公報に開示されている。また、米国特許６１３６６１１号公報には、内部全反射の効率を向上させるための独特な形状部分を有するファイバ型光導波路を用いるものが開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら上述の従来例においては、測定対象物が低濃度である場合や、精密な定量性が要求される場合には、光学系における工夫、測定対象物の捕捉に関する工夫が重要となり、装置の構成が複雑となる。
【０００６】
また、使用上の利便性としては、故障が少なく、夾雑物を含むような多様な検体にも対応できることが望ましく、これらの要件を満たすこと、即ち簡潔な装置構成において測定感度、定量性、信頼性を得るためには、測定における操作手順の工夫が必要である。
【０００７】
本発明の目的は、上述の問題点を解決し、操作手順の改善を施し、高感度に定性的、定量的な測定が可能な蛍光免疫測定方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上述目的を達成するための本発明に係る蛍光免疫測定方法は、光導波路の表面において抗原抗体反応を観測する蛍光免疫測定方法であって、前記光導波路と検体を接触させ前記光導波路の表面に検体中の測定対象物を捕捉する捕捉工程と、該捕捉工程で捕捉された前記測定対象物に蛍光性発色団を有する標識抗体を結合させる結合工程と、前記光導波路内に励起光を導入して内部全反射光とし、前記光導波路の表面にエバネッセント波を発生させ該蛍光性発色団を励起する励起工程と、前記光導波路内を伝播して収集される光を観測する観測工程とから成る一連の工程を少なくとも２回繰り返し、前記光導波路と前記検体との接触時間に対する観測光量の変化率を測定することを特徴とする。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明を図示の実施の形態に基づいて詳細に説明する。
図１は本発明の測定原理の概略図を示している。光源１から出射される光束の光路上にビームスプリッタ２を配置し、ビームスプリッタ２の反射方向の光路に沿って棒状の光導波路３を配置し、光導波路３に向う光路上のビームスプリッタ２の反対側に検出器４を設ける。なお、この図１の構成は一例を模式的に示したものであり、光源１、ビームスプリッタ２、光導波路３、検出器４の相対的配置及び種類は、図１に限定されるものではない。
【００１０】
光源１から出射した光束はビームスプリッタ２で反射して、光導波路３に内部全反射光として導入され、その表面上にエバネッセント波が生成される。光導波路３の表面上で、エバネッセント波により励起された蛍光標識抗体から放出される蛍光は、光導波路３を戻りビームスプリッタ２を透過して検出器４において測光される。
【００１１】
図１に示す光学系は、センサ部分である光導波路３において、励起光の導光と蛍光の収集を併せて行うことにより、全体の光学系が小型化可能となり、安定性を確保し易く保守も容易となる。
【００１２】
また、検体が光導波路３の外側に位置するために、光導波路３の浸漬、洗浄等の各種操作も行い易い。しかし、励起光の反射光、散乱光が蛍光に混在して収集され易いという短所もある。この短所は、光導波路３の非観測側端面に黒色体を配置したり、光学フィルタの導入等によりかなり解決することできるが、微量な蛍光量を扱う場合には実質的に問題になることが多い。
【００１３】
本実施の形態では、不要成分を分離する方法として、抗原抗体反応の経時変化を利用する。即ち、観測される光量の内、抗原抗体反応に基づいて増加する蛍光標識抗体からの蛍光量だけが、検体との接触時間に応じて増加することを利用する。
【００１４】
図２は上述の測定手順の一例をフローチャート図を示しており、図３は実測定、バッググラウンド測定、ブランク測定における操作フローチャート図を示している。基本的な測定手順として図２に示すように、先ずステップＳ１において光導波路３と検体を接触させ、光導波路３の表面に検体中の測定対象物を接触して捕捉した後に、ステップＳ２においてその接触を解除する。捕捉された測定対象物に、ステップＳ３において蛍光性発色団を有する標識抗体を接触させて結合し、その後にステップＳ４において接触を解除する。
【００１５】
続いて、ステップＳ５において光導波路３内に励起光を導入して内部全反射光とし、光導波路３の表面にエバネッセント波を発生させ、蛍光性発色団を励起させた後に、ステップＳ６において光導波路３内を伝播して収集される光を測定する。続いて、ステップＳ７において信号処理を施した後に、ステップＳ８においてメモリに記憶する。
【００１６】
図３は各測定の組み合わせ方、即ち測定全体の流れを示している。図中の「傾き比較演算」とは、実測定及びブランク測定における変化率をそれぞれ求め、実測定の変化率からブランク測定の変化率を引く演算である。実測定とブランク測定においては、検体の違いだけで操作は同一である。バッググラウンド測定では、検体に関わる操作が省略されるが、その他は同様である。光導波路３と各検体又は標識抗体溶液との接触後に、次の操作に進む前に適当な液体による洗浄を行うことができるが、必ずしも必須条件ではない。
【００１７】
この一連の工程を少なくとも２回繰り返し、光導波路３と検体との接触時間に対する観測光量の変化率を測定値とする。上述の繰り返し工程において、観測光量が単調に増加せず、例えば或る点から減少を始めた場合等には、これを異常としてオペレータに警告を発する。
【００１８】
また、上述の測定手順は、標識抗体の抗原抗体反応によらない非特異的吸着が強い場合には、これによる蛍光増加を観測してしまう場合がある。このような虞れがある場合には、実測定に先立って標識抗体のみとの接触を行い、予め非特異的吸着を飽和させておくことが望ましく、ステップＳ１１におけるバッググラウンド測定を行う。続いてステップＳ１２において、非特異的吸着による蛍光増加を判断し、著しく大きい場合には、測定を中断してオペレータに警告を発する。
【００１９】
また、検体中に蛍光性の不純物が存在する可能性があるような場合には、ステップＳ１３において実測定に先立って、実測定と同様な測定手順を経て、測定対象物を含まない参照検体であるブランク検体の測定、即ちブランク測定を行った後に、ステップＳ１４において実測定を行う。この操作は、一旦結合した非特異的吸着成分が何らかの原因で溶出するような場合にも有効である。
【００２０】
更にステップＳ１５において、ブランク測定において得られる蛍光量の接触時間に対する変化率を、実測定において得られる接触時間に対する変化率から差し引くことによって、傾き比較演算して正味の蛍光量変化率を求め、ステップＳ１６において表示する。上述のブランク測定は、統計的観点から実測定と同一の接触時間、接触回数つまり繰り返しを行う。
【００２１】
光導波路３の表面への測定対象物の捕捉方法は、直接的な物理吸着や予め表面に準備された吸着剤による捕捉を用いることができるが、特に予め表面に固定された抗体による捕捉が、より選択性の高い方法として望ましい。
【００２２】
なお、上述の測定手順を適用するに当って、検体及びブランク検体との接触は、検体を入れた開放型容器を回転させ、容器内の回転軸上を除いて回転軸に平行する部分に棒状の光導波路３を置くという装置構成が好ましい。
【００２３】
次に、本発明の更に具体的な実施の形態を説明する。図４は米国特許６１３６６１１号公報に記載のものと同様の形状に、ポリスチレン樹脂を射出成形したレンズ付きファイバ型光導波路である光学プローブの側面図、図５は正面図を示し、図６は測定方法の説明図、図７は検出部の構成図を示している。
【００２４】
光導波路３を有する光学プローブ１０において、光導波路３の一端にフランジ１１が設けられ、フランジ１１の中心に凸レンズ１２が配置され、凸レンズ１２の光軸は光導波路３の中心軸と一致している。また、光導波路３の他端には端面反射を抑制するための光吸収部位１３が設けられている。
【００２５】
光学プローブ１０は待機部２１、検体作用部２２、標識抗体容器２３、検体容器２４、測定容器２５の間をフランジ１１を利用して、空気吸引式のパッドを先端に有するロボットアーム２６により移動される。検体作用部２２では、検体容器２４に注入された検体中に光学プローブ１０が懸垂され、測定対象物の捕捉を行う。この際に、検体容器２４をモータにより回転させて、捕捉を促進することが好ましい。
【００２６】
光量測定は光学プローブ１０がセットされた測定容器２５の上部に検出部２７の光学系を嵌合して行われる。この測定容器２５では、光学プローブ１０の洗浄、半導体レーザー光源による６３５ｎｍのレーザー光の導入、蛍光の集光を行う。測定容器２５の側部の上下には、緩衝液リザーバタンク２８、送液ポンプ２９が接続された給水管３０と、排水管３１が接続されている。
【００２７】
検出部２７には、光学プローブ１０側から、図示しない半導体レーザー光源からの光を導光し先端を４５度カットした光ファイバ３２、色素フィルタ３３、レンズ３４、ダイクロイックフィルタ３５、レンズ３６、フォトダイオード３７が配列されている。
【００２８】
光ファイバ３２から導光された半導体レーザー光により励起され、光学プローブ１０に捕捉された測定対象物で発生した蛍光は、光学プローブ１０の凸レンズ１２から検出部２７に入射し、光学系を通過してフォトダイオード３７で検出される。得られた電気信号は、信号処理部３８において増幅、デジタル化がなされ、パーソナルコンピュータ３９で記憶演算される。ロボットアーム２６、半導体レーザー光源、送液ポンプ２９への各駆動指令もパーソナルコンピュータ３９により行われる。
【００２９】
［実験例１］  光学プローブ１０の表面にEscherichia coli Ｏ１５７：Ｈ７抗体（Kirkegaard & Perry Lab.Inc社製）を固定し、光学プローブ１０の表面の抗体の未結合部を０．４％カゼインを含む緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）を含む０．０１Ｍりん酸緩衝液）によりブロックしたものを用い、上述の測定方法により以下の操作を行った。
【００３０】
始めに、非特異的吸着分による信号を得るために、光学プローブ１０を、（１）２μg／ｍｌの蛍光標識抗体（Amersham Biosciences社製：Ｃｙ５bisfunctional reactive dye により前記抗体を標識）を含む緩衝液に浸漬して、２５℃で５分間静置し、（２）緩衝液２ｍｌにより洗浄し、（３）再び緩衝液で測定容器２５を満たして蛍光信号を３回測定した。これにより、非特異的吸着分による僅かな信号増加と飽和を予め確認した。
【００３１】
引き続き、抗原抗体反応による信号を得るために、検体容器２４に８．２×１０3ＣＦＵ／ｍｌの不活化したEscherichia coli Ｏ１５７：Ｈ７を含む緩衝液１０ｍｌを注入し、光学プローブ１０を、（１）検体（菌液）に浸漬させ、検体容器２４を１００ｒｐｍで５分間回転し、（２）緩衝液２ｍｌにより洗浄し、（３）２μg／ｍｌの蛍光標識抗体を含む緩衝液に浸漬して、２５℃で５分間静置し、（４）緩衝液２ｍｌにより洗浄し、（５）再び緩衝液で測定容器２５を満たして蛍光信号を測定した。
【００３２】
図８は上述の動作を３回繰り返した計１５分間の測定結果を示している。光学プローブ１０と検体との接触時間と信号強度には相関関係があり、傾き１３．６ｐＡ／ｍｉｎの直線が得られた。
【００３３】
［実験例２］  実験例１と同様に、光学プローブ１０の表面にＯ１５７抗体を固定し、光学プローブ１０の表面の抗体の未結合部を０．４％カゼインを含む緩衝液によりブロックしたものを用い、以下の操作を行った。
【００３４】
始めに、ブランク信号を得るために、検体容器２４に緩衝液１０ｍｌを注入し、光学プローブ１０を、（１）検体（緩衝液）に浸漬させ、検体容器２４を１００ｒｐｍで５分間回転し、（２）２μg／ｍｌの蛍光標識抗体を含む緩衝液に浸漬して、２５℃で５分間静置し、（３）緩衝液２ｍｌにより洗浄し、（４）再び緩衝液で測定容器２５を満たして蛍光信号を測定した。これらの動作を３回繰り返した。
【００３５】
引き続き、抗原抗体反応による信号を得るために、検体容器２４に８．２×１０3ＣＦＵ／ｍｌの不活化したEscherichia coli Ｏ１５７：Ｈ７を含む緩衝液１０ｍｌを注入し、光学プローブ１０を、（１）検体（菌液）に浸漬させ、検体容器２４を１００ｒｐｍで５分間回転し、（２）２μg／ｍｌの蛍光標識抗体を含む緩衝液に浸漬して、２５℃で５分間静置し、（３）緩衝液２ｍｌにより洗浄し、（４）再び緩衝液で測定容器２５を満たして蛍光信号を測定した。これらの動作を３回繰り返した。
【００３６】
図９はブランク及び検体の計３０分間の測定結果を示している。光学プローブ１０と検体との接触時間と信号強度には相関関係があり、ブランクの補正をすることにより１７．１ｐＡ／ｍｉｎの傾きが得られた。
【００３７】
［実験例３］  実験例１と同様に、光学プローブ１０の表面にＯ１５７抗体を固定し、光学プローブ１０の表面の抗体の未結合部を０．４％カゼインを含む緩衝液によりブロックしたものを用い、以下の操作を行った。
【００３８】
始めに、実験例１と同様な方法で非特異的吸着分による信号増加と飽和を予め確認した。引き続き、実験例１と同様な方法で抗原抗体反応による信号を、４×１０2ＣＦＵ／ｍｌの不活化したEscherichia coli Ｏ１５７：Ｈ７を含む緩衝液１０ｍｌに対して得た。ただし、光学プローブ１０と検体の接触時間は２分間とし、繰り返し回数は５回とした。更に、同様の非特異的吸着分測定と５回繰り返し測定を、１０3ＣＦＵ／ｍｌ、１０4ＣＦＵ／ｍｌの濃度に対し行った。
【００３９】
図１０は各抗原濃度における計１０分間の測定での傾き[ｐＡ／ｍｉｎ]を抗原濃度に対してプロットしたものを示している。本測定範囲において、定量性がある応答が得られた。
【００４０】
【発明の効果】
以上説明したように本発明に係る蛍光免疫測定方法は、蛍光免疫法によって微生物、化学物質などを測定する場合において、迅速、簡便かつ高感度に定性・定量性を測定し、測定値の確実性を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】測定原理の概略図である。
【図２】測定手順のフローチャート図である。
【図３】実測定、バックグラウンド測定、ブランク測定の操作フローチャート図である。
【図４】光学プローブの側面図である。
【図５】正面図である。
【図６】測定方法の説明図である。
【図７】測定方法の検出部の構成図である。
【図８】実験例１の測定データのグラフ図である。
【図９】実験例２の測定データのグラフ図である。
【図１０】実験例３の測定データのグラフ図である。
【符号の説明】
１  光源
２  ビームスプリッタ
３  光導波路
４  検出器
５  凸レンズ
１０  光学プローブ
１１  フランジ
１２  凸レンズ
２１  待機部
２２  検体作用部
２３  標識抗体容器
２４  検体容器
２５  測定容器
２６  ロボットアーム
２７  検出部
３２  光ファイバ
３７  フォトダイオード
３９  パーソナルコンピュータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2004205286.tif 000011
【図１０】
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