(57)【要約】【課題】基板上のプローブの固定面を乾燥処理する際に、プローブの固定に用いたプローブ溶液の成分が不均一にプローブ固定面に残存することを防止できるプローブ固定面の乾燥処理方法を提供すること。【解決手段】標的物質に対して特異的に結合可能なプローブが結合したプローブ結合面を有する基板の乾燥処理する際に、プローブ結合面に液体を供給し、プローブ結合面を液体と共に凍結した後に減圧環境下に置き、凍結部の溶媒成分を昇華させて除去することによりプローブ結合面を乾燥処理する。【選択図】　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質に対して特異的に結合可能なプローブが結合したプローブ結合面を有する基板の乾燥処理方法であって、該プローブ結合面に液体を供給し、該プローブ結合面を該液体と共に凍結した後に減圧環境下に置き、該凍結部の溶媒成分を昇華させて除去することにより該プローブ結合面を乾燥処理することを特徴とする基板処理方法。
【請求項２】
前記プローブ結合面に保持する液体の液厚を均一にする請求項１に記載の基板処理方法。
【請求項３】
前記基板がガラス製、樹脂製または金属製である請求項１に記載の基板処理方法。
【請求項４】
前記基板に結合したプローブがＤＮＡまたはＰＮＡである請求項１に記載の基板処理方法。
【請求項５】
前記基板に結合したプローブがペプチドまたはタンパク質である請求項１に記載の基板処理方法。
【請求項６】
前記液体が水である請求項１に記載の基板処理方法。
【請求項７】
前記液体が水を主成分とする水性媒体である請求項１に記載の基板処理方法。
【請求項８】
前記水性媒体に塩が含まれている請求項７に記載の基板処理方法。
【請求項９】
前記水性媒体が緩衝液である請求項８に記載の基板処理方法。
【請求項１０】
前記水性媒体中に糖類が含まれている請求項７に記載の基板処理方法。
【請求項１１】
前記糖類がグルコース、フルクトース及びガラクトースのうち少なくともひとつを含んでいる請求項１０に記載の基板処理方法。
【請求項１２】
前記水性媒体中にアミノ酸が含まれている請求項７に記載の基板処理方法。
【請求項１３】
前記アミノ酸がグリシン、リジン、グルタミン、グルタミン酸及びヒスチジンのうち少なくともひとつを含んでいる請求項１２に記載の基板処理方法。
【請求項１４】
前記液体が有機溶剤を主成分とする請求項１に記載の基板処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、表面にプローブが存在する基板表面の乾燥処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、バイオテクノロジーの発展に伴い、生体試料の測定、検出に関するニーズが高まっている。一般的に、生体試料は合成化学的な手法によって得られる化学物質とは異なり、
１）極めて多様性に富んでいること、
２）使用可能な検体の絶対量が少ないこと、
３）物理的な性質が類似したものを識別する必要性があること、
などから、その厳密な測定は困難であることが多い。それらの試料の測定方法としてこれまで様々な方法が考案されてきているが、中でも注目されている測定技術として固相基板を用いた測定がある。固相基板を用いた測定技術とは、ガラス基板などの固体表面上に、検出対象となる検体に特異的に結合するプローブをあらかじめ固定化した基板等を用意し、蛍光ラベルなどにより標識した検体を基板に作用させ、プローブに結合した検体の有無等により、検体の成分を調べる技術である。
【０００３】
この測定技術が注目される主な理由（長所）としては、
１）基板上に固定する検出用プローブの量（面積）を少なくすることで極めて微少量の検体の測定が可能であり、検体の絶対量も少なくて済むこと、
２）基板上の検出物質を多種並べることにより同時多項目の測定が可能であること、
３）液相ではなく固相であるため、取り扱いが容易であること
などが挙げられる。
【０００４】
固相基板を用いた試料の測定は、例えば核酸の塩基配列の検出に応用されている。様々な塩基配列の一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡプローブ）を基板上にアレイ状に多種固定しておき、それに対し蛍光色素などで標識したＤＮＡを検体として作用させる。検体中に基板上のＤＮＡプローブと相補的な配列が存在すれば、基板上に蛍光物質が吸着（ハイブリダイゼーション）した状態となり、基板上のＤＮＡプローブの塩基配列と対応させることで、検体中に含まれる塩基配列を調べることが出来るというものである。例えばＴａｋａｒａ社においては、数百種類のプローブＤＮＡをスライドガラス上に結合させたＤＮＡマイクロアレイを発売しており、様々な遺伝子の解析に応用されている。
【０００５】
このＤＮＡマイクロアレイの製造方法は、現在様々な方法が考案されているが、プローブとなるＤＮＡを所定の液体に溶解し、鋭利な針先にＤＮＡ溶液を付着させ、しかるべき処理をしたガラス基板上に微少量のＤＮＡ溶液を供給する方法が良く用いられている。この方法で製造したＤＮＡマイクロアレイは、所定の固定化処理を行った後、乾燥処理を行う。基板表面に残留するプローブ成分を洗浄したい場合には、純水や緩衝液等により洗浄処理を行ったのち基板を乾燥処理する。
【０００６】
なお、特開２００１−０２１５５８号公報においては、スポッティングした液滴を、洗浄せずに乾燥させる方法が開示されている。また、特開２０００−２９５９９０号公報においては、スポッティング後に緩衝液により洗浄したのちエタノール洗浄を行って乾燥を行う方法が開示されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ＤＮＡマイクロアレイを作製した後に洗浄処理を行わない場合には、乾燥処理を行った後に、プローブスポッティング領域にプローブ溶液が析出し、析出物によってはプローブの機能を低下させることがある。それを避けるために基板表面を洗浄する方法がよく取られるが、緩衝液等により洗浄した直後は、その表面に洗浄液の微小な液滴が残留する。また微視的には基板表面全体に多くの水分子や緩衝液の成分が残留している。これらの残留した液滴を除去するために、高速の気流下に基板を置き液滴を吹き飛ばす方法や、遠心装置等に基板を固定し遠心力により液滴を除去する方法が取られることがあるが、この液滴除去工程において、緩衝液等に含まれる塩類が液滴の境界面等で析出することがある。この塩類等の析出は、例えばＤＮＡのハイブリダイゼーション工程における塩濃度の上昇や、検体の非特異的な吸着の要因となるなど、ＤＮＡマイクロアレイ使用においてさまざまな誤差やムラを生じる原因となる場合がある。また、微視的とはいえ高い塩濃度の環境下に基板表面のプローブが不均一にさらされることは、プローブの機能を低下させることにつながる場合があり、好ましくない。
【０００８】
これに対処するために、乾燥直前に純水による洗浄を行い残留液滴中の溶解物を出来る限り除去する方法や、エタノールなどの揮発性アルコールによる乾燥処理を行うこともある。しかしながら、析出物を完全に除去するには多大な労力かがかり、許容できる程度の析出物の残留があった場合でも、析出物の残留状態におけるムラをなくすことは困難な場合が多く、このような問題点は緩衝液等を使用した時と同様である。また、加熱した有機溶剤にプローブをさらすことはプローブの機能を低下させる危険性も高く好ましくない。また、プローブを固定化するために行った基板表面の処理方法によっては、加熱による乾燥工程後の乾燥状態での保存中にプローブと固相表面との間で相互作用をし、プローブの機能を低下させる場合もあることも考えられる。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、プローブを表面に有する基板の適当な乾燥処理方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究の結果、以下のような発明に至った。即ち、本発明による基板の処理方法は、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブが結合したプローブ結合面を有する基板の乾燥処理方法であって、該プローブ結合面に液体を供給し、該プローブ結合面を該液体と共に凍結した後に減圧環境下に置き、該凍結部の溶媒成分を昇華させて除去することにより該プローブ結合面を乾燥処理することを特徴とする基板処理方法である。
【００１１】
本発明による乾燥処理を行うことによって、基板表面から連続的に溶媒成分が除去され、ムラなどの原因となる溶質成分のプローブ結合面での不均一な残留を低減することが可能となる。また、基板表面のプローブが基板表面との相互作用をすることなく液体中における立体構造を維持したまま乾燥工程を行うため、プローブの性能の保持という観点からも好ましい。またさらには、基板表面で凍結する液体の液厚を制御することにより、液体中の溶質成分を所望する状態で基板表面に残留させて乾燥処理を行うことが可能となる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の基板乾燥処理方法についてより詳しく説明する。
【００１３】
本発明は以下に示す工程によりなされる。
（１）表面にプローブが結合もしくは吸着した基板を作製する工程、
（２）適当な液体により基板表面を洗浄した後、基板表面に液体を供給し保持する工程、
（３）基板と液体を冷却し液体を凍結させる工程、及び
（４）基板及び凍結した液体を減圧環境下に置き、液体中の溶媒成分だけを除去する工程。
【００１４】
本発明の最初の工程である、プローブが結合した基板の作製は、例えばＤＮＡマイクロアレイなどの作製がその代表的な例である。ＤＮＡアレイの構成としては、ガラス基板の表面を適当に処理しプローブとなる各種のＤＮＡを吸着させたタイプ、共有結合等の強固な結合によりプローブＤＮＡを固定させたタイプ等が一般的であるが、樹脂製のタイプの基板や、基板表面を金属薄膜でコーティングしたタイプの基板等もある。基板作製工程上、洗浄工程を必要とする基板であれば本発明の乾燥処理方法が適用可能である。
【００１５】
プローブは核酸の検出を目的としたＤＮＡが最も一般的であるが、ＤＮＡ以外の例としては、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）や、タンパク質の検出を目的としてペプチド、タンパク質などでも適用可能である。
【００１６】
次の工程である基板の洗浄においては、プローブ結合基板の作製工程上、適当な方法により洗浄を行うことができる。すなわち基板表面に結合したプローブの剥離や機能低下の避けて、結合せずに残留した遊離のプローブ成分を除去する洗浄方法を行えばよく、一般にはプローブとプローブを基板表面に供給するために用いた液体が共に溶解する液体が用いられる。揮発性の高い液体や、洗浄に伴って基板表面に痕跡を残すような液体は避けることが望ましい。
【００１７】
続く基板表面に液体を供給し保持する工程において供給する液体としては水、水を主成分とする液媒体、塩類が溶解した水溶液、緩衝液等が利用でき、また基板乾燥後のプローブ保護の観点から、プローブに親和性のある糖類やアミノ酸が含まれている溶液や、有機溶剤または有機溶剤を主成分とする液体等も利用することが出来る。有機溶剤としては、例えばジメチルスルホキシドなどを用いることが出来る。
【００１８】
供給される液体が塩類や糖類、アミノ酸等を含んだ水溶液の場合、その濃度は制限されるものではないが、重量濃度として０．００１％から５％の範囲であることが望ましく、さらには０．００１％から１％の範囲であることが望ましい。
【００１９】
液体の供給形態としては、供給する液体中に基板全体を沈めてしまう方法が最も容易であるが、液量及び液厚を制御するためにプローブ結合面上部に適当な空間を設け、その空間に液体を供給することも出来る。例えば、一定の液厚を保持できるよう工夫されたギャップカバーガラスを用いることにより、基板のプローブ結合面上部に厚さを一定にした空間を形成することが可能となる。この場合は空間に液体を満たし、そのまま液体を凍結させればよい。この結果、使用する液体の液量を低減させる利点があるほか、液体中に溶質成分が含まれている場合、乾燥処理後、これら溶質成分を均一に基板表面に残留させることが可能となる。例えば、核酸の安定化に寄与する水酸基を豊富に有する糖類を均一に残留させることも可能である。糖類としてはグルコース、フルクトース、ガラクトースなどがその代表例である。また糖類以外でも、グリシン、リジン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジンなどのアミノ酸類も、プローブの種類によっては安定性に寄与することから用いることが出来る。
【００２０】
次の工程である液体を凍結させる工程においては、基板全体が液体中に沈めてある場合には、液体の入った容器を基板を沈めたまま液体の凝固点以下まで冷却し、液体を凍結させればよい。また、液厚を制御するために基板表面上部に空間が形成されている場合も、全体を冷却することで液体を凍結すればよいが、凍結後の液厚を均一にしたい場合には、凍結による液体の体積膨張の影響を避けるため、カバーガラスを固定するなどの対策をとることも可能である。
【００２１】
最後の工程である凍結した液体の溶媒成分を除去する工程においては、一般的に使用されている凍結乾燥機を用いることが可能である。この場合、凍結乾燥機に付属する試料室の温度を液体の凝固点以下に設定しておくことが望ましい。また、凍結乾燥機を用いず、通常利用される真空ポンプと減圧用のデシケーターを用いて乾燥処理を行うことも可能である。
【００２２】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。これら実施例は、本発明の最良の実施の形態の一例ではあるものの、本発明は、これら実施例により限定を受けるものではない。
【００２３】
（実施例１）
ＤＮＡプローブアレイの作製
［１］ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ：１インチ×１インチ×０．５ｍｍ）を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で２０分超音波洗浄をおこなった。次に８０℃に加熱した１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の石英ガラス基板を用意した。
【００２４】
［２］表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークしシランカップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）（以下ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３　ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述の混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００２５】
［３］プローブＤＮＡの合成
定法に従って、５’末端をチオール化した下記配列を有する１８ｍｅｒのプローブＤＮＡを合成した。
配列番号１：
５’　ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ　３’
合成したＤＮＡは高速液体クロマトグラフィーにより精製した後、脱塩し乾燥させ、以下の実験に用いた。
【００２６】
［４］ＢＪプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、先に合成した配列番号１の一本鎖ＤＮＡを最終濃度が５０マイクログラム／ｍｌとなるよう上記の混合溶媒に溶解した。
【００２７】
得られたＤＮＡ溶液をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪ　Ｆ８５０　　キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００２８】
なお、ここで用いたバブルジェットプリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液を約１２０マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。続いてこの改造バブルジェットプリンターを用いて、１枚のガラス基板に対して、縦横１２個ずつ計１４４個のスポットをスポッティングした。
【００２９】
印字が確実に行われていることを確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
【００３０】
［５］洗浄
３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）　　（以下緩衝液▲１▼とする）により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面にＤＮＡが固定したＤＮＡプローブアレイを得た。
【００３１】
（実施例２）
［１］緩衝液中での保管
実施例１で得られたＤＮＡプローブアレイをプローブの結合したガラス表面が充分浸るように緩衝液▲１▼に入れ、４℃に設定した冷蔵庫中で１４日間保管した。
【００３２】
［２］ブロッキング
シグマ社製のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を２％の濃度となるように、緩衝液▲１▼に溶解させた。完全に溶解したことを確認した後、４℃の緩衝液中に保管しておいたＤＮＡプローブアレイを、ＢＳＡ溶液中に室温で２時間浸し、ＢＳＡによるブロッキング反応を行った。
【００３３】
［３］ハイブリダイゼーション
配列番号１のＤＮＡと相補的な配列を有し、５’末端にローダミン標識をした一本鎖ＤＮＡを合成した。プローブＤＮＡと同様に高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、標識化一本鎖ＤＮＡを得た。この標識化ＤＮＡを最終濃度が５　ｎｍｏｌ／ｌとなるよう緩衝液▲１▼に溶解し、ハイブリダイゼーション用の溶液２５ｍｌを得た。
【００３４】
続いてブロッキングしたＤＮＡプローブアレイ１枚をあらかじめ４５℃に加熱しておいたハイブリダイゼーション用の溶液２５ｍｌに浸し、ハイブリダイゼーション反応を２時間行った。その後基板を取り出し、緩衝液▲１▼にてＤＮＡプローブアレイを適当に洗浄した後、マイクロアレイ専用のスキャナー　ＧｅｎｅＰｉｘ（ＡＸＯＮ社製）４０００Ｂにより観察した。ＧｅｎｅＰｉｘによる測定は、フォトマル感度４００Ｖ、レーザー出力１００％に設定して行った。
【００３５】
［４］結果
ＤＮＡプローブアレイ上の１４４点のスポット全ての蛍光強度を所定の方法により測定した。１４４点の蛍光量を平均した結果、４４００の蛍光量が得られた。
【００３６】
（実施例３）
凍結乾燥処理後の保管
実施例１で得られたＤＮＡプローブアレイ表面を純水中で洗浄したのち、純水５ｍｌを入れた容器（容器内底面３ｃｍ×３ｃｍ）にＤＮＡプローブ結合面が上に向くようにＤＮＡプローブアレイを入れた。純水中に浸した基板を容器ごと−２５℃の冷凍庫に入れ、ＤＮＡプローブアレイを浸潤させたまま容器内の純水を完全に凍結させた。続いて、あらかじめ乾燥機の試料室内を−２５℃に冷却した凍結乾燥機に容器ごと移し、凍結した純水が溶解していないことを確認した後、真空ポンプの電源を入れ、減圧乾燥を行った。６時間後、容器内の純水が全て昇華し、ＤＮＡプローブアレイのみが容器内に残っていることを確認した後、乾燥機チャンバー内の温度を室温まで上げた。ＤＮＡプローブアレイの温度が室温に戻るまでさらに１時間減圧乾燥を続けた後、真空ポンプを停止しＤＮＡプローブアレイを取り出した。
【００３７】
凍結乾燥処理したＤＮＡプローブアレイを、５％以下の湿度に調整されたデシケーター中に室温で１４日間保管した。
【００３８】
その後、実施例２と全く同じ条件で、ブロッキング反応以降の処理を行い、蛍光強度を測定した。実施例２と同様に、基板上の１４４点のスポット全ての蛍光強度を所定の方法により測定し蛍光量を平均した結果、４２００の蛍光量が得られた。
【００３９】
（実施例４）
凍結乾燥
実施例１で得られたＤＮＡプローブアレイ表面を純水中で洗浄したのち、アレイ部がその中に入るように松浪硝子社製のギャップカバーガラス（大きさ２４ｍｍ×２５ｍｍ、ギャップ厚２０マイクロメーター）をＤＮＡプローブアレイ表面にかぶせ、離脱しないように固定した。続いてグルコースの１％水溶液を用意し、ＤＮＡプローブアレイとカバーガラスの間の空間に溶液を入れた。図１にその概略図を示した。空間内を充分グルコース溶液が満たしていることを確認した後、−２５℃の冷凍庫に入れ、空間内のグルコース溶液を完全に凍結させた。続いて実施例３と同様に、−２５℃のチャンバーに移し凍結乾燥を行った。約２４時間後に、グルコース水溶液の溶媒成分が完全に昇華したことを確認し、ＤＮＡプローブアレイの温度が室温に戻るまでさらに１時間減圧乾燥を続けた後、真空ポンプを停止しＤＮＡプローブアレイを取り出した。
【００４０】
表面に残ったギャップカバーガラスを取り除き、ＤＮＡプローブアレイを５％以下の湿度に調整されたデシケーター中に室温で１４日間保管した。
【００４１】
その後、実施例２と全く同じ条件で、ブロッキング反応以降の処理を行い、蛍光強度を測定した。実施例２と同様に、基板上の１４４点のスポット全ての蛍光強度を所定の方法により測定し蛍光量を平均した結果、３９５０の蛍光量が得られた。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の基板乾燥処理方法は、基板上にプローブを有するプローブアレイ作製後の乾燥処理工程において、ムラなどの原因となる溶質成分の局所的な析出や、乾燥処理に伴うプローブの機能低下を回避するという利点を持つ。また、本発明による基板乾燥方法を適用することにより、プローブの機能維持などを目的として基板表面に糖類などの物質を均一に供給することも可能となる。
【００４３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４において、ＤＮＡプローブアレイにギャップカバーガラスを取り付け、アレイ表面の上部に空間を形成し、空間にグルコース水溶液を入れた状態を概念的に示す図である。
【符号の説明】
１０１：基板
１０２：プローブ
１０３：ギャップカバーガラス
１０４：スペーサー
１０５：グルコース水溶液
【図１】
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