(57)【要約】【課題】非常に調製が容易で、目的とするターゲット物質の検出の特異性を高めると共にバックグラウンドの低減が可能なターゲットセンサー、ターゲット物質に親和性を有するペプチド又はその誘導体からなるターゲット結合性物質及びターゲット結合性材料を提供する。【解決手段】目的とするターゲット物質に対して親和性を有する少なくとも２種類以上のペプチド又はその誘導体をセンサーとして用いる。前記２種類以上のペプチド又はその誘導体の内、ターゲット物質に対する最も親和性の弱いペプチド又はその誘導体の解離速度と、ターゲット物質に対する最も親和性の強いペプチド又はその誘導体の解離速度とが２倍以上異なっていることが好ましい。また、前記ターゲット物質に対する最も親和性の弱いペプチド又はその誘導体の解離速度が１０−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であることが好ましい。これらのペプチド又はその誘導体は、試薬や医薬品等としても利用可能である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とするターゲット物質に親和性を有する少なくとも２種類以上のペプチド又はその誘導体を備えていることを特徴とするターゲットセンサー。
【請求項２】
前記２種類以上のペプチド又はその誘導体は、前記ターゲット物質に対して異なる親和性を有しており、前記ターゲット物質に対する最も親和性の弱いペプチド又はその誘導体の解離速度と、前記ターゲット物質に対する最も親和性の強いペプチド又はその誘導体の解離速度とが２倍以上異なっている、請求項１に記載のターゲットセンサー。
【請求項３】
前記ターゲット物質に対する最も親和性の弱いペプチド又はその誘導体の解離速度が１０−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上である、請求項２に記載のターゲットセンサー。
【請求項４】
目的とするターゲット物質に親和性を有し、該ターゲット物質に対する解離速度が１０−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であるペプチド又はその誘導体からなることを特徴とするターゲット結合性物質。
【請求項５】
目的とするターゲット物質に親和性を有する少なくとも２種類以上のペプチド又はその誘導体からなるターゲット結合性材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ターゲット物質に親和性を有する２種類以上のペプチド又はその誘導体を用いたターゲットセンサー、更には、ターゲットセンサー、試薬、医薬品等に利用可能なターゲット物質に親和性を有するペプチド又はその誘導体からなるターゲット結合性物質及びターゲット結合性材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、目的とするターゲット物質を検出する際には、ターゲット物質と結合する物質をセンサーとして用いることが多い。このようなセンサーとしては、ターゲット物質に対する特異性及び結合力が高いものほど好ましいとされている。
【０００３】
例えば、免疫化学的測定方法は、抗体が抗原を特異的に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原（ターゲット物質）の検出を行なう方法であり、検出方法として、酵素、放射性トレーサー、化学発光性及び蛍光性標識等の非常に多種の標識が用いられている。中でも、酵素を使用する酵素免疫（吸着）測定法（ＥＬＩＳＡ法）は、経済性及び利便性から一般に広く利用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、例えば、上記のＥＬＩＳＡ法等においてセンサーとして用いられる抗体は、ターゲット物質に対する特異性や結合力の高さの点で有用であるが、以下のような問題もあった。
【０００５】
すなわち、抗体は、抗原（ターゲット物質）で動物を免疫することにより調製されるため、▲１▼大量に調製することが困難である、▲２▼その調製に非常に手間がかかる（特にモノクローナル抗体の場合）、▲３▼ポリクローナル抗体を用いた場合、ターゲット物質に類似する構造を有するものにも結合する可能性が高く、バックグラウンドの上昇の原因となる、▲４▼生体にとって毒性の強い物質を抗原として用いることができず、また、低分子化合物に対する抗体を調製することが難しいため、検出できるターゲット物質が限定されてしまう、▲５▼分子量が大きいため利用範囲に限界がある、等の問題があった。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、非常に調製が容易で、目的とするターゲット物質の検出の特異性を高めると共にバックグラウンドの低減が可能なターゲットセンサー、ターゲット物質に親和性を有するペプチド又はその誘導体からなるターゲット結合性物質及びターゲット結合性材料を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の一つは、目的とするターゲット物質に対して親和性を有する少なくとも２種類以上のペプチド又はその誘導体を備えていることを特徴とするターゲットセンサーである。
【０００８】
上記発明によれば、ターゲット物質に親和性を有する２種類以上のペプチド又はその誘導体をセンサーとして用いることにより、抗体に比べて非常に調製が容易で、立体構造等の影響も受けにくく、様々なターゲット物質を検出可能なターゲットセンサーを提供できる。また、ペプチドは、抗体に比べて分子量が小さいため、ターゲット物質に対する結合力と選択性が低いという課題があったが、複数種類のペプチドを利用することで、ペプチドの弱点であったターゲット物質に対する認識率の向上が期待できる。
【０００９】
本発明のターゲットセンサーにおいては、前記２種類以上のペプチド又はその誘導体は、前記ターゲット物質に対して異なる親和性を有しており、前記ターゲット物質に対する最も親和性の弱いペプチド又はその誘導体の解離速度と、前記ターゲット物質に対する最も親和性の強いペプチド又はその誘導体の解離速度とが２倍以上異なっていることが好ましい。
【００１０】
この態様によれば、ターゲット物質の検出の特異性を高めると共にバックグラウンドの低減が可能なターゲットセンサーを提供できる。
【００１１】
本発明のターゲットセンサーにおいては、前記ターゲット物質に対する最も親和性の弱いペプチド又はその誘導体の解離速度が１０−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であることが好ましい。
【００１２】
この態様によれば、よりターゲット物質の検出の特異性を高めることができる共にバックグラウンドを低減することができる。
【００１３】
また、本発明のもう一つは、目的とするターゲット物質に親和性を有し、該ターゲット物質に対する解離速度が１０−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であるペプチド又はその誘導体からなることを特徴とするターゲット結合性物質である。
【００１４】
また、本発明のもう一つは、目的とするターゲット物質に親和性を有する少なくとも２種類以上のペプチド又はその誘導体からなるターゲット結合性材料である。
【００１５】
上記発明によれば、上記のようなターゲットセンサー以外にも試薬や医薬品等にも利用可能なターゲット結合性物質及びターゲット結合性材料を提供できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明のターゲットセンサーを構成するペプチド又はその誘導体（以下、これらをまとめてペプチド類という。）は、目的とするターゲット物質に対して親和性を有する少なくとも２種類以上のペプチド類であり、それらのアミノ酸配列及びアミノ酸数は、ターゲット物質によって変わるため一概に決定することはできないが、ターゲット物質に対して親和性を示す最少数のアミノ酸からなるアミノ酸配列であってもよく、該最少アミノ酸配列を複数個有するようなものであってもよい。本発明においては、上記最少アミノ酸配列のアミノ酸数は、通常、３〜１００個が好ましく、６〜２０個がより好ましい。
【００１７】
また、ペプチドの誘導体とは、上記のようなペプチドを、ターゲット物質に対する親和性を損わないように修飾したものを意味し、例えば、酵素、放射性トレーサー、化学発光性及び蛍光性標識等の標識で修飾したもの、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基をアシル化したもの、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基をアミド化又はエステル化したもの等が挙げられる。
【００１８】
本発明においては、上記各ペプチド類は、ターゲット物質に対する親和性が異なっていることが好ましく、具体的には、ターゲット物質に対する最も親和性の弱いペプチド類の解離速度と、最も親和性の強いペプチド類の解離速度とが２倍以上異なっていることが好ましい。すなわち、ターゲット物質に対する親和性の高いセンサーは、ターゲット物質以外にもターゲット物質に類似の構造を有する物質に結合する可能性が高いが、ターゲット物質に対する親和性の低いセンサーは、相手の構造（結合部位）が少しでも変わると結合できなくなるので、ターゲット物質に対する親和性の高いセンサーに比べてより特異性の高いセンサーであると言える。従って、これらのセンサーを用いることにより、ターゲット物質の検出の特異性を高めると共にバックグラウンドを低減することができる。
【００１９】
更に、本発明においては、最も親和性の弱いペプチド類の解離速度が１０−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であることが好ましい。このようにターゲット物質に対する親和性の低いペプチド類を用いることにより、ターゲット物質の検出の特異性をより高めると共にバックグラウンドを低減することができる。なお、解離速度が大き過ぎると、センサーとして利用しにくくなるので、最も親和性の弱いペプチド類の解離速度は、通常、１０−２〜１０−１（ｍｏｌ／ｓｅｃ）程度であることが好ましい。
【００２０】
本発明において、ターゲット物質は、特に限定されるものではなく、例えば、抗体、タンパク質受容体、ホルモン、酵素、核酸、複合糖質、低分子化合物、細胞、ウイルス等が挙げられる。
【００２１】
ターゲットセンサーを構成する上記のようなターゲット物質に親和性を有するペプチド類は、例えば、ファージディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ，　Ｇ．Ｐ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８８，１３１５−１３１７　（１９８５））によってスクリーニングすることにより得ることができる。本発明においては、ターゲット物質に親和性を有する２種類以上のペプチド類をより効率よく得るために、以下のようにしてスクリーニングを行なうことが好ましい。
【００２２】
（１）ファージライブラリーを調製する工程
スクリーニングに用いられるファージライブラリーは、任意のペプチドを表面に提示したファージの集団であって、種類（アミノ酸配列）の異なるペプチドを提示したファージをそれぞれほぼ均等に含有するものである。そして、ターゲット物質に結合する可能性のあるペプチドの存在確率を上げて効率よくスクリーニングを行なうために、提示されるペプチドのバリエーション（アミノ酸の組み合わせ）をできるだけ増やしたものを用いることが好ましい。このバリエーションの数は、提示されるペプチドのアミノ酸数によって変わるため一概に決定することはできない。
【００２３】
上記のようなファージライブラリーは、ランダム化したＤＮＡやｃＤＮＡライブラリー等を遺伝子工学的手法を用いてファージのＤＮＡに挿入し、このＤＮＡを適当な宿主に導入することにより得ることができる。例えば、ランダム化したＤＮＡを化学合成し、これをファージＤＮＡの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このＤＮＡを大腸菌に導入することにより、ファージの外殻タンパク質の先端に目的のペプチドが発現されたファージを得ることができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８８，　１３１５−１３１７　（１９８５）、Ｊ．Ｋ．　Ｓｃｏｔｔ　ａｎｄ　Ｇ．Ｐ．　Ｓｍｉｔｈ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４９，　３８６−３９０　（１９９０）等参照）。
【００２４】
本発明においては、上記のような公知の方法によってファージライブラリーを調製して用いてもよく、市販の製品を用いることもできる。市販品としては、例えば、商品名「Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔ」（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）等が挙げられる。
【００２５】
（２）ファージライブラリーを分割して、複数個の分割ライブラリーを調製する工程
ファージライブラリーを分割する際に、該ライブラリーに含まれる複数種類のペプチドのうち、少なくとも１種類のペプチドを含まないような、偏りを持ったライブラリーに分割することが好ましい。このような偏りを持った分割ライブラリーを用いることにより、ターゲット物質に対する親和性の異なる２種類以上のペプチド、特に、ターゲット物質に対する親和性の弱いペプチド（解離速度１０−２ｍｏｌ／ｓｅｃ以上）を含む２種類以上のペプチドを効率よくスクリーニングすることができる。
【００２６】
そして、偏りを持った分割ライブラリーを効率よく得るために、ターゲット物質に親和性を有するタンパク質の取得希望数（ｍ）に応じて、ｍ通りのタンパク質が得られるもっともらしい確率に基いて母集団の分割数（ｒ）を決定することが好ましい。具体的には、分割数を下記式（１）に基いて求め、前記ファージライブラリーを少なくともそれ以上に分割して分割ライブラリーを調製することが好ましい。
【００２７】
【数１】
分割数ｒ＝ｍｍ…（１）
ｍ：ターゲット物質に親和性を有するタンパク質の取得希望数（ｍ≧２の整数）
したがって、例えば、ターゲット物質に親和性を有するペプチドを２種類取りたい場合は、前記ファージライブラリーを少なくとも４つ以上に分割することにより、偏りを持った分割ライブラリーを効率よく調製することができる。なお、分割数が多過ぎると、ファージライブラリーの分割が困難になったり、各分割ライブラリーのスクリーニングに手間がかかるため、通常、分割数（ｒ）は４〜２５６（２≦ｍ≦４）が好ましい。
【００２８】
上記のようにしてファージライブラリーを分割して得られた各分割ライブラリーは、上記ファージライブラリーと少なくとも同等数以上のファージを含むように、それぞれ常法にしたがって増幅してからスクリーニングに用いることが好ましい。
【００２９】
（３）各分割ライブラリーを用いてスクリーニングを行なう工程
上記のようにして調製した分割ライブラリーを用いて、常法にしたがって選択操作（バイオパニング）を行なう。
【００３０】
すなわち、所定のターゲット物質を固相（例えば、プレート、ビーズ、磁気ビーズ等）に固定化し、好ましくはスキムミルク等のブロッキング剤で処理した後、該ターゲット物質と分割ライブラリーとを接触させる。そして、前記固相を洗浄してターゲット物質に結合していないファージを除去し、ターゲット物質に結合したファージを溶離して回収する。
【００３１】
次いで、回収したファージを常法にしたがって培養して増幅させ、次のラウンドのライブラリーとして用いる。このような操作を複数回（通常３〜４回）繰り返し、ターゲット物質に親和性を有するペプチドを提示したファージのスクリーニングを行ない、目的のファージを単離する。
【００３２】
上記の選択操作を各分割ライブラリーについてそれぞれ行ない、目的のファージを単離し、各分割ライブラリーから単離されたファージのＤＮＡを常法にしたがって解析することにより、ターゲット物質に親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列を同定することができる。
【００３３】
このようにして同定したアミノ酸配列に基いて常法によりペプチドを合成し、必要に応じて標識物質等を結合させるなどして修飾することにより、目的のペプチド類を得ることができる。
【００３４】
なお、本発明においては、上記のようにして得られたターゲット物質に親和性を有する２種類以上のペプチド類は、ターゲットセンサーとしての用途以外にも試薬や医薬品等への利用可能である。特に、目的とするターゲット物質に対する解離速度が１０−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であるペプチド類は、ターゲット物質に対する特異性が高いので、試薬や医薬品等への利用可能性が高いものと考えられる。
【００３５】
本発明のターゲットセンサーを構成するペプチド類は、抗体と異なりターゲット物質に制限がなく、生体にとって毒性の強い物質等もターゲット物質とすることができる。また、人工的に合成することが可能であるため、大量調製が非常に容易であり、更に、分子量が小さく、立体構造等の影響を受けにくいため、利用範囲も広い。従って、例えば、ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）に用いる抗体の代替品等の各種センサーとして好適に用いることができる。
【００３６】
図１には、本発明のターゲットセンサーをサンドイッチ法に用いた場合の作用原理が示されている。図１（ａ）は、プラスチックプレート等の固相１上に、目的とするターゲット物質２に対する親和性の高いペプチド類３を固定し、このペプチド類３に結合したターゲット物質２を、ターゲット物質２に対する親和性の低いペプチド類４で検出するものである。この場合、固相上に固定されたペプチド類３には、目的とするターゲット物質２以外にも、それに類似する構造を有する夾雑物質６、７も結合する。しかし、これらの夾雑物質は、上記ペプチド類４とは結合することができないので、このペプチド類４に結合した標識物質５を利用して、目的とするターゲット物質を精度よく検出することが可能となる。
【００３７】
一方、図１（ｂ）は、上記（ａ）の場合とは逆に、固相１上に、目的とするターゲット物質２に対する親和性の低いペプチド類４を固定し、このペプチド類４に結合したターゲット物質２を、ターゲット物質２に対する親和性の高いペプチド類３で検出するものである。この場合、固相上に固定されたペプチド類４には、目的とするターゲット物質２に類似する構造を有する夾雑物質６、７は結合することができず、目的のターゲット物質２だけを特異的に結合させることができるので、これを上記ペプチド類３を用いて精度よく検出することが可能となる。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、スクリーニングで得られた各ペプチドの解離定数及び解離速度は、ＢＩＡＣＯＲＥ　２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて表面プラズモン共鳴法により求めた。
【００３９】
実施例１
ターゲット物質として、ヒトの抗体の一部であるＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｈＦｃと略記する）を用い、ｈＦｃに結合する２種類のペプチドのスクリーニングを以下の方法により行なった。
【００４０】
（１）ターゲット物質の固定化
ターゲットｈＦｃは、常法にしたがってビオチン標識し、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（商品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ２８０　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」、Ｄｙａｎａｌ社製）に、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用して固定化した後、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液に懸濁してブロッキングを行なった。
【００４１】
（２）ペプチドのライブラリーを提示しているファージの調製
ランダムなアミノ酸配列（アミノ酸数１２個）のペプチドが表面に提示されたファージを含むペプチドライブラリー（ファージ数１０１０ｐｆｕ／１０μＬ、商品名「Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔ」、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）１０μＬを４分割し、分割したペプチドライブラリー（２．５μＬ）に含まれるファージを常法にしたがって大腸菌に感染させて、それぞれ増幅、精製し、４つの分割ペプチドライブラリー（ファージ数：１０１０ｐｆｕ／１０μＬ）を調製した。
【００４２】
そして、各分割ペプチドライブラリー１０μＬを、それぞれ０．２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液１ｍＬに加えて室温で１５分間放置し、これらを用いて以下のパニングを行なった。
【００４３】
（３）パニング
上記のｈＦｃを固定化した磁気ビーズを懸濁したスキムミルク溶液１０００μＬと、上記分割ペプチドライブラリーを含むスキムミルク溶液１００μＬを混合して、２５℃で１時間放置した後、マグネットを用いて磁気ビーズを回収した。回収した磁気ビーズをＴＢＳ（０．１％　Ｔｗｅｅｎ）で洗浄して、未結合のファージを除去した後、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）でターゲットｈＦｃに結合したファージを溶離して回収し、ＴＢＳ（１Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ９）で中和した後、常法にしたがって大腸菌に感染させてファージを増幅し、ＰＥＧ沈殿法によりファージを精製した。このファージ群を次のラウンドのペプチドライブラリーとして用いた。
【００４４】
そして、前記操作を１ラウンドとして、４ラウンド目で得られたファージを大腸菌に感染させてプラークを形成させ、ファージクローンを単離した。なお、パニングは、上記４つの分割ペプチドライブラリーについてそれぞれ行ない、各分割ペプチドライブラリーからファージクローンを単離した。
【００４５】
（４）解析
上記のようにして単離したファージの中から、各分割ライブラリーについて３個のクローンを任意に選び（合計１２個）、各ファージを常法にしたがって大腸菌に感染させて増幅し、精製後、ＥＬＩＳＡ法によってｈＦｃへの結合活性を調べた。
【００４６】
ＥＬＩＳＡ法は、９６穴プレートにストレプトアビジンを固定化して、スキムミルクでブロッキングした後、ビオチン標識したｈＦｃを加えて、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用してプレートに固定化した。このプレートに各ファージを加えて２５℃、１時間反応させた後、プレートをＰＢＳ−Ｔ（１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０、以下同じ）で洗浄した。そして、ＨＲＰ標識した抗Ｍ１３ファージ抗体を用いて、プレートに結合したファージの有無をＡＢＴＳの発色反応によって４０５ｎｍの吸光度で解析した。
【００４７】
比較例１（従来法）
実施例１と同じペプチドライブラリー１０μＬを分割せずにそのまま用いた以外は実施例１と同様にしてパニングを行なった。そして、単離したファージの中から１２個のクローンを任意に選び、実施例１と同様にして解析を行なった。
【００４８】
その結果、実施例１では、４つの分割ライブラリー中、２つの分割ライブラリーから選んだ６クローンで強い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝２．２前後）が見られ、１つの分割ライブラリーから選んだ３クローンでやや弱い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝０．８〜１．４前後）が見られ、残りの１つの分割ライブラリーから選んだクローンでは発色は見られなかった。一方、比較例１では、１２クローン中、１１クローンで強い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝２．２前後）が見られ、１クローンは発色が見られなかった。
【００４９】
そして、発色したクローンのＤＮＡをダイターミネータ法により解析し、ファージに提示されたペプチドのアミノ酸配列を決定したところ、実施例１で強い発色の見られた６クローンのうち、３クローン（同じ１つの分割ライブラリーから得られたもの）のペプチドは全て配列番号１に示されるアミノ酸配列であり、残りの３クローン（もう一つの分割ライブラリーから得られたもの）のペプチドは全て配列番号２に示されるアミノ酸配列であった。また、やや弱い発色の見られた分割ライブラリーから得られた３クローンのペプチドは配列番号３〜５に示されるアミノ酸配列であり、Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｘａａ　Ｌｅｕ（４番目のＸａａ：Ｔｙｒ又はＴｒｐ、５番目のＸａａ：Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＭｅｔ、８番目のＸａａ：Ａｌａ、Ｇｌｙ又はＳｅｒ）の共通するアミノ酸配列を有していた。
【００５０】
一方、比較例１の１１クローンのアミノ酸配列は全て配列番号６に示されるアミノ酸配列であった。
【００５１】
更に、上記の各ペプチドの解離定数及び解離速度を求め、その結果を表１に示した。
【００５２】
【表１】
2004020547.tif 000002
【００５３】
表１に示されるように、実施例１で得られたターゲットｈＦｃに対する解離速度の異なる３種類のペプチドのうち、最も親和性の低いペプチド（配列番号３〜５に示されるペプチド）と、最も親和性の高いペプチド（配列番号２に示されるペプチド）の解離速度とは約２．５倍異なっており、ヒトＩｇＧを検出する際のターゲットセンサーに利用可能なペプチドを得ることができた。一方、比較例１では、１種類のペプチドしか得ることができなかった。
【００５４】
実施例２
ターゲット物質として、蛍の発光酵素ルシフェラーゼを用い、ルシフェラーゼに結合する２種類のペプチドのスクリーニングを以下の方法により行なった。
【００５５】
（１）ターゲット物質の固定化
ターゲットルシフェラーゼは、常法にしたがってビオチン標識し、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（商品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ２８０　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」、Ｄｙａｎａｌ社製）に、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用して固定化した後、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液に懸濁してブロッキングを行なった。
【００５６】
（２）ペプチドのライブラリーを提示しているファージの調製
ランダムなアミノ酸配列（アミノ酸数７個）のペプチドが表面に提示されたファージを含むペプチドライブラリー（ファージ数１０１０ｐｆｕ／１０μＬ、商品名「Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔ」、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）１０μＬを４分割し、実施例１と同様にして分割ペプチドライブラリーをそれぞれ調製した。
【００５７】
そして、各分割ペプチドライブラリー１０μＬを、それぞれ０．２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液１ｍＬに加えて室温で１５分間放置し、これらを用いてパニングを行なった。
【００５８】
（３）パニング
上記のルシフェラーゼを固定化した磁気ビーズを懸濁したスキムミルク溶液１０００μＬと、上記分割ペプチドライブラリーを含むスキムミルク溶液１００μＬを混合して、２５℃で１時間放置した後、マグネットを用いて磁気ビーズを回収した。回収した磁気ビーズをＴＢＳ（０．１％　Ｔｗｅｅｎ）で洗浄後、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）でターゲットルシフェラーゼに結合したファージを溶離して回収し、ＴＢＳ（１Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ９）で中和した後、常法にしたがって大腸菌に感染させてファージを増幅し、ＰＥＧ沈殿法によりファージを精製した。このファージ群を次のラウンドのペプチドライブラリーとして用いた。
【００５９】
そして、前記操作を１ラウンドとして、４ラウンド目で得られたファージを大腸菌に感染させてプラークを形成させ、ファージクローンを単離した。なお、パニングは、上記４つの分割ペプチドライブラリーについてそれぞれ行ない、各分割ペプチドライブラリーからファージクローンを単離した。
【００６０】
（４）解析
上記のようにして単離したファージの中から、各分割ライブラリーについて３個のクローンを任意に選び（合計１２個）、各ファージを常法にしたがって大腸菌に感染させて増幅し、精製後、ＥＬＩＳＡ法によってルシフェラーゼへの結合活性を調べた。
【００６１】
ＥＬＩＳＡ法は、９６穴プレートにストレプトアビジンを固定化して、スキムミルクでブロッキングした後、ビオチン標識したルシフェラーゼを加えて、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用してプレートに固定化した。このプレートにファージを加えて２５℃、１時間反応させた後、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。そして、ＨＲＰ標識した抗Ｍ１３ファージ抗体を用いて、プレートに結合したファージの有無をＡＢＴＳの発色反応によって４０５ｎｍの吸光度で解析した。
【００６２】
比較例２（従来法）
実施例２と同じペプチドライブラリー１０μＬを分割せずにそのまま用いた以外は実施例２と同様にしてパニングを行なった。そして、単離したファージの中から１２個のクローンを任意に選び、実施例２と同様にして解析を行なった。
【００６３】
その結果、実施例２では、４つの分割ライブラリー中、１つの分割ライブラリーから選んだ３クローンで強い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝１．３前後）が見られ、１つの分割ライブラリーから選んだ３クローンでやや弱い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝０．９５前後）が見られ、残りの２つの分割ライブラリーからは選んだクローンでは発色は見られなかった。一方、比較例２では、１２クローン中、８クローンで強い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝１．４前後）が見られ、４つは発色が見られなかった。
【００６４】
そして、発色したクローンのＤＮＡをダイターミネータ法により解析し、ファージに提示されたペプチドのアミノ酸配列を決定したところ、実施例２で強い発色の見られた分割ライブラリーから得られた３クローンのペプチドは全て配列番号７に示されるアミノ酸配列であった。また、やや弱い発色の見られた分割ライブラリーから得られた３クローンのペプチドは全て配列番号８に示されるアミノ酸配列であった。一方、比較例２の８クローンのペプチドは全て上記配列番号７に示されるアミノ酸配列と同じであった。
【００６５】
更に、上記の各ペプチドの解離定数及び解離速度を求め、その結果を表２に示した。
【００６６】
【表２】
2004020547.tif 000003
【００６７】
表２に示されるように、実施例２で得られたターゲットルシフェラーゼに対する解離速度の異なる２種類のペプチドは、最も親和性の低いペプチド（配列番号８に示されるペプチド）と、最も親和性の高いペプチド（配列番号７に示されるペプチド）の解離速度とは約２７倍異なっており、ルシフェラーゼを検出する際のターゲットセンサーに利用可能なペプチドを得ることができた。特に、配列番号８に示されるペプチドは、ターゲットルシフェラーゼに対する解離速度が１０−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であり、ルシフェラーゼに対する特異性が高いペプチドである。一方、比較例２では、１種類のペプチドしか得ることができなかった。
【００６８】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号２：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号３：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号４：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号５：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号６：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号７：ルシフェラーゼと親和性を有するペプチド。
配列番号８：ルシフェラーゼと親和性を有するペプチド。
【００６９】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、目的とするターゲット物質に親和性を有する少なくとも２種類以上のペプチド類をセンサーとして用いることにより、抗体に比べて非常に調製が容易で、立体構造等の影響も受けにくく、様々なターゲット物質を検出可能な利用範囲の広いターゲットセンサーを提供できる。ペプチドは、抗体に比べて分子量が小さいため、ターゲット物質に対する結合力と選択性が低いという課題があったが、本発明のように、複数種類のペプチドを利用することで、ペプチドの弱点であったターゲット物質に対する認識率の向上が期待できる。そして、前記ターゲット物質に対する最も親和性の弱いペプチド類の解離速度と、前記ターゲット物質に対する最も親和性の強いペプチド類の解離速度とが２倍以上異なっている少なくとも２種類以上のペプチド類を用いることにより、ターゲット物質の検出の特異性を高めると共にバックグラウンドの低減が可能なターゲットセンサーを得ることができる。
【００７０】
また、目的とするターゲット物質に親和性を有する少なくとも２種類以上のペプチド類、特に、ターゲット物質に対する解離速度が１０−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であるペプチド類は、ターゲット物質に対する特異性が高いので、上記のようなセンサーとしてだけでなく、試薬や医薬品等への利用可能性もある。
【００７１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のターゲットセンサーをサンドイッチ法に用いた場合の作用原理を模式的に示した説明図である。
【符号の説明】
１．固相
２．ターゲット物質
３．ターゲット物質に対する親和性の高いペプチド類
４．ターゲット物質に対する親和性の低いペプチド類
５．標識物質
６、７．ターゲット物質と類似の構造を有する夾雑物質
【図１】
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