(57)【要約】【課題】微妙な糖鎖の違いを区別する糖鎖解析に役立つレクチンを準備する方法であって、短時間に簡単に準備できるレクチンの製造方法を提供することである。【解決手段】あるレクチンの糖鎖認識部位を該レクチンの三次元構造解析から割り出し、その部位に含まれる少なくとも１つのアミノ酸の配列位置を特定し、その特定されたアミノ酸配列位置の前又は後のアミノ酸配列位置に１のアミノ酸が挿入されたレクチンをベクターＤＮＡにコード化し、このコード化されたＤＮＡを使用してタンパクを作らせること、を含むレクチンの製造方法を提供する。【選択図】　　図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変した遺伝子を利用して改変レクチンを製造する方法であって、
１のレクチンの糖鎖認識部位を該１のレクチンの三次元構造解析から割り出す工程と、
その部位に含まれる少なくとも１つのアミノ酸の配列位置を特定する工程と、
前記特定されたアミノ酸配列位置の前又は後のアミノ酸配列位置に１のアミノ酸が挿入された改変レクチンをベクターＤＮＡにコード化する工程と、
このコード化されたＤＮＡを使用してタンパクを作らせる工程と、を含む改変レクチンの製造方法。
【請求項２】
前記１のレクチンがマメ科のレクチンであることを特徴とする請求項１に記載の改変レクチンの製造方法。
【請求項３】
前記糖鎖認識部位がループＣ若しくはループＤを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の改変レクチンの製造方法。
【請求項４】
改変した遺伝子を利用して改変レクチン群を製造する方法であって、
（１）１のレクチンの糖鎖認識部位を該１のレクチンの三次元構造解析から割り出す工程と、
（２）その部位に含まれる１つのアミノ酸の配列位置を選択する工程と、
（３）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンから１のアミノ酸を順に選択する工程と、
（４）前記選択されたアミノ酸配列位置の前又は後のアミノ酸配列位置に、前記選択された１のアミノ酸が挿入された改変レクチンをベクターＤＮＡにコード化する工程と、
（５）前記（３）において選択しなかったアミノ酸がある場合は、前記（３）の工程に戻る工程と、を含む改変レクチン群の製造方法。
【請求項５】
改変した遺伝子を利用して改変レクチン群を製造する方法であって、
（１）１のレクチンの糖鎖認識部位を該１のレクチンの三次元構造解析から割り出す工程と、
（２）前記糖鎖認識部位に含まれる複数のアミノ酸の配列位置を特定する工程と、
（２）前記特定された複数のアミノ酸の配列位置から１のアミノ酸の配列位置を順に選択する工程と、
（３）前記選択されたアミノ酸配列位置の前の配列位置に所定のアミノ酸が挿入された改変レクチンをベクターＤＮＡにコード化化する工程と、
（４）前記（２）において、前記特定されたアミノ酸配列位置であって、未だ選択されていない配列位置がある場合は、前記（２）の工程に戻る工程と、を含む改変レクチン群の製造方法。
【請求項６】
請求項４又は５の方法で製造された改変レクチン群。
【請求項７】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする改変レクチン。
（ａ）アミノ酸配列表１（ＭＡＨ）において３０番目に相当する、野生型ＭＡＨのＮ末端であるセリンから数えたアミノ酸配列番号１２７〜１３８又は２１９〜２２４のいずれかの位置の前に、１のアミノ酸が挿入された、ポリペブチド。
（ｂ）（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加され、所定の糖鎖との結合活性を有する、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリペプチドをコードする、遺伝子。
【請求項９】
改変した遺伝子を利用して改変レクチンを製造する方法であって、
マメ科レクチンのループＤの遺伝子を改変する工程と、
この改変された遺伝子を使用してタンパクを作らせる工程と、を含む改変レクチンの製造方法。
【請求項１０】
以下の（ｃ）または（ｄ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする改変レクチン。
（ｃ）アミノ酸配列表１（ＭＡＨ）において３０番目に相当する、野生型ＭＡＨのＮ末端であるセリンから数えたアミノ酸配列番号２１９〜２２４のいずれかの位置の前に１のアミノ酸が挿入された、若しくは、Ｎ末端から数えたアミノ酸配列番号２１９〜２２３の少なくとも１つのアミノ酸の種類を改変した、ポリペブチド。
（ｄ）（ｃ）の一部が欠損、置換若しくは付加され、所定の糖鎖との結合活性を有する、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドをコードする、遺伝子。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法で製造された改変レクチン又は請求項４〜６のいずれかに記載の改変レクチン群又は請求項７若しくは９に記載の方法で製造された改変レクチンを含む糖鎖解析ツール。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レクチンの製造方法、特に遺伝子改変レクチンの製造法、及び、この製造法を用いて製造した改変レクチンを含む糖鎖解析ツールに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の糖鎖工学の進歩は目ざましく、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、及び、細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等の高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは、阻害し合いながら高度で精密な生体反応を制御する機構が明らかにされようとしている。また、細胞表面の糖鎖や、糖鎖−レセプター間の相互作用異常による疾病の発生、あるいは、エイズなどのウイルス感染における糖鎖の役割等に関して盛んに研究されている。
【０００３】
特に、正常細胞と癌細胞、あるいは分化段階の異なる細胞など、ある細胞を他の細胞と分別し同定するために、細胞がその表面に持つ糖鎖を利用でき、例えば、癌細胞については悪性度の変化に応じて、幹細胞についてはその分化段階により変化するといったような報告が数多くなされている。以上のように、糖鎖に基づく解析（例えば、分別や同定）は、大変有意義であると考える。
【０００４】
このような糖鎖解析の手段として、レクチンは大変有用であると考えられるが、天然に存在するレクチンの種類が限られること、レクチンが利用されやすい形になっているかが重要な関心事である。即ち、多くの種類の糖鎖を識別するには、その数に見合うだけの異なる性質を持つレクチンが理論的に必要である。一方、利用しやすくするには、特定種のレクチンが単離されて担体（又は支持体）に固定されているのが望ましい。
【０００５】
天然に存在するレクチン又は市販のレクチンを複数取り混ぜ、既知の糖鎖を利用してそれぞれの糖鎖認識性を調べ、未知の糖鎖の解析をすることができる。しかし、仮に識別すべき糖鎖の種類が、１００００あったとすれば、理論的には、少なくとも１４種類以上のレクチンが必要である（ここで、１種のレクチンに付き結合性有り又は無しの２種類の判定がされると仮定した）。しかし、異なる糖鎖に対し同じ糖鎖特異性を持つ異なる複数のレクチンが存在する可能性を考慮すれば、更にその数倍の数の種類のレクチンが必要になると考えられる。更に、糖鎖解析で大きく期待されているのは、上述の細胞の判別でもわかるような、微妙な違いを見分けることである。天然に存在するレクチン等は、種類が少ないばかりでなく、微妙な違い（グラディエーション）をもって段階的にレクチンが準備されているとは限らず、単なる絶対数を増やせばよいとは限らない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の課題は、微妙な糖鎖の違いを区別する糖鎖解析に役立つレクチンを準備する方法であって、短時間に簡単に準備できるレクチンの製造方法を提供することである。
【０００７】
【発明を解決するための手段】
上記課題に鑑みて、本発明では、あるレクチンの糖鎖認識部位を該レクチンの三次元構造解析から割り出し、その部位に含まれる少なくとも１つのアミノ酸の配列位置を特定し、その特定されたアミノ酸配列位置の前又は後のアミノ酸配列位置に１のアミノ酸が挿入されたレクチンをベクターＤＮＡにコード化し、このコード化されたＤＮＡを使用してタンパクを作らせること、を含むレクチンの製造方法を提供する。
【０００８】
ここで、「あるレクチン」とは、例えば、天然のレクチンでよく、また、人工のレクチンでもよい。「糖鎖認識部位」は、ある糖鎖に対して結合性を有する部位を含んでよい。「三次元構造解析」としたのは、立体構造において糖鎖を認識するからであり、この「解析」には、模型による解析やコンピュータシミュレーションによる解析を含んでよい。「特定されたアミノ酸配列位置」とは、主鎖における位置を含んでよく、側鎖の位置や側鎖内の位置を含んでよい。「その前後」とは、その位置の隣の位置を意味してよく、必ずしも序列を必要とするものではない。「１のアミノ酸」は、２０種類の基礎アミノ酸を含んでよく、また、それ以外のアミノ酸を含むことを妨げない。アミノ酸が挿入されるため、主鎖又は側鎖が１つ長くなることを含む。このような改変を受けたレクチンは人工のレクチンであるが、天然に存在することを否定するものでない。「ベクターＤＮＡ」は、このようなアミノ酸配列に関する情報がコード化されるもので、いわゆる遺伝子操作に一般に用いられるものを含んでよい。この「コード化されたＤＮＡを使用して」とは、いわゆる遺伝子工学的にタンパク（タンパク質を含んでよい）が作られることを含んでよい。
【０００９】
より具体的に、本発明においては、以下のようなものを提供する。
【００１０】
（１）改変した遺伝子を利用して改変レクチンを製造する方法であって、１のレクチンの糖鎖認識部位を該１のレクチンの三次元構造解析から割り出す工程と、その部位に含まれる少なくとも１つのアミノ酸の配列位置を特定する工程と、前記特定されたアミノ酸配列位置の前又は後のアミノ酸配列位置に１のアミノ酸が挿入された改変レクチンをベクターＤＮＡにコード化する工程と、このコード化されたＤＮＡを使用してタンパクを作らせる工程と、を含む改変レクチンの製造方法。
【００１１】
（２）前記１のレクチンがマメ科のレクチンであることを特徴とする上記（１）に記載の改変レクチンの製造方法。
【００１２】
（３）前記糖鎖認識部位がループＣ若しくはループＤを含むことを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の改変レクチンの製造方法。
【００１３】
（４）改変した遺伝子を利用して改変レクチン群を製造する方法であって；　［１］１のレクチンの糖鎖認識部位を該１のレクチンの三次元構造解析から割り出す工程と；　［２］その部位に含まれる１つのアミノ酸の配列位置を選択する工程と；　［３］グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンから１のアミノ酸を順に選択する工程と；　［４］前記選択されたアミノ酸配列位置の前又は後のアミノ酸配列位置に、前記選択された１のアミノ酸が挿入された改変レクチンをベクターＤＮＡにコード化する工程と；　［５］前記［３］において選択しなかったアミノ酸がある場合は、前記［３］の工程に戻る工程と；　を含む改変レクチン群の製造方法。
【００１４】
（５）改変した遺伝子を利用して改変レクチン群を製造する方法であって；　［１］１のレクチンの糖鎖認識部位を該１のレクチンの三次元構造解析から割り出す工程と；　［２］前記糖鎖認識部位に含まれる複数のアミノ酸の配列位置を特定する工程と；　［２］前記特定された複数のアミノ酸の配列位置から１のアミノ酸の配列位置を順に選択する工程と；　［３］前記選択されたアミノ酸配列位置の前の配列位置に所定のアミノ酸が挿入された改変レクチンをベクターＤＮＡにコード化化する工程と；　［４］前記［２］において、前記特定されたアミノ酸配列位置であって、未だ選択されていない配列位置がある場合は、前記［２］の工程に戻る工程と；　を含む改変レクチン群の製造方法。
【００１５】
（６）上記（４）又は（５）の方法で製造された改変レクチン群。
【００１６】
（７）以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする改変レクチン。（ａ）アミノ酸配列表１（ＭＡＨ）において３０番目に相当する、野生型ＭＡＨのＮ末端であるセリンから数えたアミノ酸配列番号１２７〜１３８又は２１９〜２２４のいずれかの位置の前に、１のアミノ酸が挿入された、ポリペブチド。（ｂ）（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加され、所定の糖鎖との結合活性を有する、ポリペプチド。
【００１７】
（８）上記（７）に記載のポリペプチドをコードする、遺伝子。
【００１８】
（９）改変した遺伝子を利用して改変レクチンを製造する方法であって、マメ科レクチンのループＤの遺伝子を改変する工程と、この改変された遺伝子を使用してタンパクを作らせる工程と、を含む改変レクチンの製造方法。
【００１９】
（１０）以下の（ｃ）または（ｄ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする改変レクチン。（ｃ）アミノ酸配列表１（ＭＡＨ）において３０番目に相当する、野生型ＭＡＨのＮ末端であるセリンから数えたアミノ酸配列番号２１９〜２２４のいずれかの位置の前に１のアミノ酸が挿入された、若しくは、Ｎ末端から数えたアミノ酸配列番号２１９〜２２４の少なくとも１つのアミノ酸の種類を改変した、ポリペブチド。（ｄ）（ｃ）の一部が欠損、置換若しくは付加され、所定の糖鎖との結合活性を有する、ポリペプチド。
【００２０】
（１１）請求項１０に記載のポリペプチドをコードする、遺伝子。
【００２１】
（１２）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法で製造された改変レクチン又は請求項４〜６のいずれかに記載の改変レクチン群又は請求項７若しくは９に記載の方法で製造された改変レクチンを含む糖鎖解析ツール。
【００２２】
ここで、「改変した遺伝子」は、元となるレクチンの遺伝子を遺伝子工学的に改変した遺伝子を含んでよい。「改変」とは、遺伝子の基本的構造は変えずに、変更を加えることを含んでよい。より具体的には、遺伝子を長くする遺伝子の挿入、遺伝子を短くする遺伝子の抜出、遺伝子の長さは変らない遺伝子の種類を変える遺伝子の変更又は改変（ランダム、任意的、恣意的なものを含む。以下「変更」。）等を含んでよい。前記「１のレクチン」は、天然のレクチン又は人工のレクチンを含んでよく、植物若しくは植物由来の又は動物若しくは動物由来のレクチンを含んでよい。前記「糖鎖認識部位」は、何らかの方法で糖鎖の異同を区別できる部位を含んでよく、特に、立体的な構造に基づいて糖鎖の異同を区別できる部位を含んでよい。また、この「部位」は、１又はそれ以上の箇所に分かれて存在してよい。別の箇所に分かれて存在する場合は、１箇所だけで糖鎖の異同を区別してよく、また、２箇所又はそれ以上の部位が共同して糖鎖の異同を区別してもよい。ここで、１箇所に存在することは、その部位が実質的に連続して存在していることを含んでよい。前記「三次元構造」とは、立体的な構造を含んでよく、前記「三次元構造解析」は、図表による解析、模型による解析、コンピュータシミュレーションによる解析、及び、その他の解析を含んでよい。「糖鎖認識部位を割り出す」とは、そのような部位を見つけだすことを含んでよく、具体的には、１又はそれ以上のアミノ酸の配置位置を特定することを含んでよく、そのようなアミノ酸の配列をコードした塩基配列の配列位置を特定することを含んでよい。
【００２３】
例えば、三次元構造の例を図１のモデルによって考えることができる。図１Ａは、そのモデルの立体構造を示すものであり、図１Ｂは、それをより模式的に示したものである。図１Ｃは、更に、糖鎖との結合の様子を示している。この図から、ループＣとＤは、その間に糖鎖を挟み込み、所定の糖鎖に結合性を示すことにより、糖鎖の異同を認識すると考えられる。このような解析から、糖鎖認識部位として、ループＣ及びＤを見出すことができるが、このような解析に限らず、その他の如何なる解析をも含んでよい。
【００２４】
従って、上述の改変レクチン又は改変レクチン群を製造する方法に含まれてよい「１のレクチンの糖鎖認識部位を該１のレクチンの三次元構造解析から割り出す工程」は、コンピュータ解析に限らず、あらゆる方法が適用できることになり、このような工程を省いた「改変した遺伝子を利用して改変レクチンを製造する方法であって、糖鎖認識部位に含まれる少なくとも１つのアミノ酸の配列位置を特定する工程と、　前記特定されたアミノ酸配列位置の前又は後のアミノ酸配列位置に１のアミノ酸が挿入された改変レクチンをベクターＤＮＡにコード化する工程と、このコード化されたＤＮＡを使用してタンパクを作らせる工程と、を含む改変レクチンの製造方法」も実質的に含むと考えることができる。同様に、「改変した遺伝子を利用して改変レクチン群を製造する方法であって、［１］糖鎖認識部位に含まれる１つのアミノ酸の配列位置を選択する工程と；　［２］グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンから１のアミノ酸を順に選択する工程と；　［３］前記選択されたアミノ酸配列位置の前又は後のアミノ酸配列位置に、前記選択された１のアミノ酸が挿入された改変レクチンをベクターＤＮＡにコード化する工程と；　［４］前記［２］において選択しなかったアミノ酸がある場合は、前記［２］の工程に戻る工程と；　を含む改変レクチン群の製造方法」とすることも可能と考えられる。また、「改変した遺伝子を利用して改変レクチン群を製造する方法であって；　［１］糖鎖認識部位に含まれる複数のアミノ酸の配列位置を特定する工程と；　［２］前記特定された複数のアミノ酸の配列位置から１のアミノ酸の配列位置を順に選択する工程と；　［３］前記選択されたアミノ酸配列位置の前の配列位置に所定のアミノ酸が挿入された改変レクチンをベクターＤＮＡにコード化化する工程と；　［４］前記［２］において、前記特定されたアミノ酸配列位置であって、未だ選択されていない配列位置がある場合は、前記［２］の工程に戻る工程と；　を含む改変レクチン群の製造方法」とすることが可能と考えられる。
【００２５】
前記「その部位に含まれる少なくとも１つのアミノ酸配列位置を特定する」とは、上述のように割り出された糖鎖認識部位から、好ましい１又はそれ以上のアミノ酸を特定することを含んでよい。ここで、「好ましい」とは、本発明の目的に照らして好ましいことを意味してよく、具体的には、糖鎖認識能力が、改変前のレクチンとは異なるような改変レクチンを生じる結果となることを含んでよい。
【００２６】
前記「前記特定されたアミノ酸配列位置の前又は後のアミノ酸配列位置に１のアミノ酸が挿入された改変レクチンをベクターＤＮＡにコード化する工程」に換えて、「前記特定されたアミノ酸配列位置の前又は後のアミノ酸配列位置に１又はそれ以上のアミノ酸が挿入された改変レクチンをベクターＤＮＡにコード化する工程」としてよいが、複数のアミノ酸が挿入される場合は、結果として得られるレクチンの糖鎖認識能力を失わせないように挿入することが望ましい。挿入されるアミノ酸は、所謂タンパク質を構成する２０種のアミノ酸を含んでよく、それ以外のアミノ酸を除外するものではない。「２０種類のアミノ酸」とは、タンパク質を作っているアミノ酸で、より具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンをいってよい。「ベクターＤＮＡ」は、遺伝子工学において用いられるＤＮＡで、これをホストに組み込むことにより、コードされたポリペプチドを産生させることができるものを含んでよい。
【００２７】
上記「マメ科のレクチン」は、図３に挙げられるような複数のレクチンを含んでよい。特に、Ｍａａｃｋｉａ　ａｍｕｒｅｎｓｉｓ　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＭＡＨ）を含むことが好ましい。図２に、このＭＡＨレクチンの塩基配列及びアミノ酸配列を示す。Ｍａａｃｋｉａ　ａｍｕｒｅｎｓｉｓ　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＭＡＨ）において、塩基配列の配列位置が４６６〜４９８（野生型ＭＡＨのＮ末端のセリンから数えてアミノ酸配列相当では１２７〜１３７）が、ループＣのアミノ酸に対応する塩基配列位置で、塩基配列の配列位置が７２１〜７８０（野生型ＭＡＨのＮ末端のセリンから数えてアミノ酸配列相当では２１２〜２３１）が、ループＤのアミノ酸に対応する塩基配列と考えられ、このような領域が改変の対象領域として含まれてよい。また、ループＤにおいて、より好ましくは、塩基配列の配列位置が７４２〜７５６（野生型ＭＡＨのＮ末端のセリンから数えてアミノ酸配列相当では２１９〜２２３）の領域が改変の対象として含まれてよい。例えば、図４に示すようなＭＡＨのループＣの場合では、上述のような野生型ＭＡＨのＮ末端のセリンから数えてアミノ酸配列相当で、１２７〜１３７の位置の前に、１〜１１の挿入位置が示されており、仮に９の位置にＸが挿入されると同図の　ｅｘ．　のような配列となる。また、図５に示すようなＭＡＨのループＤの場合では、上述のような野生型ＭＡＨのＮ末端のセリンから数えてアミノ酸配列相当で、２１９〜２２４の位置の前に、１〜６の挿入位置が示されておいる。ここで、塩基配列は、開始コドンから数え、アミノ酸配列は、Ｎ末端アミノ酸基から数えた。また、図１４に示すようなＭＡＨのループＤのアミノ酸の種類の変更（又は遺伝子の変更）の場合では、上述のような野生型ＭＡＨのＮ末端のセリンから数えてアミノ酸配列相当で、２１９〜２２３の位置で少なくとも１の種類の変更を行うこともできる。
【００２８】
ＭＡＨ以外のマメ科のレクチンでは、図３のようなアミノ酸配列により各ループが規定される。これらループの中で、上記ループＣとループＤが糖鎖認識に関与しているといわれる。このように他の種類のレクチンのループのアミノ酸配列を見比べると、ＭＡＨのループＣは比較的アミノ酸が詰まっているのに対し、ループＤのアミノ酸は、図３からわかるように割とすいており、アミノ酸を挿入するループとしてより好ましいとも考えられる。また、図２のＭＡＨのアミノ酸の配列表で、ループＤの位置が、３番目（一番下）の下線によって示されているが、その中でも、糖鎖との結合性に大きな影響を及ぼすと思われる５つのアミノ酸が四角で囲われている。尚、図中マル１は、Ｘｈｏ　Ｉ　（ｃｔｃｇａｇ）　制限酵素部位を、図中マル２は、Ｂｇｌ　ＩＩ　（ａｇａｔｃｔ）　制限酵素部位を、図中マル３は、Ｓｐｅ　Ｉ　（ａｃｔａｇｔ）　制限酵素部位を、示している。
【００２９】
上記（１）において、「前記特定されたアミノ酸配列位置の前又は後のアミノ酸配列位置に１のアミノ酸が挿入された改変レクチンをベクターＤＮＡにコード化する工程」では、前記「１のアミノ酸」の代わりに、「グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンからランダムに選択された１のアミノ酸」としてもよい。ここで、「ランダムに」は、恣意的に選択しないことを含んでよい。ここに列挙されたアミノ酸は、所謂タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸である。
【００３０】
上記「グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンから１のアミノ酸を順に選択する工程」において「順に」とは、挙げられたアミノ酸を重複しないように選択することを意味してよく、特にその順序が、列挙された順である必要はなく、いかなる順序であってもよい。また、上記「グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンから１のアミノ酸を順に選択する工程」に換えて、「グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンから選ばれる所定のアミノ酸集合から、１のアミノ酸を順に選択する工程」としてもよい。このとき「所定のアミノ酸集合」は、２以上であって２０種に満たないアミノ酸の集合であり、その組合わせは、得られるレクチン群が糖鎖認識において所定の効果が発揮されるあらゆる場合を含んでよい。この所定の効果は、糖鎖を認識する能力が、少しずつ異なっており、複数のレクチンを組合わせると、糖鎖又は糖鎖の種若しくは属を判別できる効果である。
【００３１】
また、「前記選択されたアミノ酸配列位置の前の配列位置に所定のアミノ酸が挿入された改変レクチンをベクターＤＮＡにコード化する工程」の後に、「このコード化されたＤＮＡを使用してタンパクを作らせる工程」を更に含んでよい。
【００３２】
上記の「糖鎖との結合活性」とは、所定の糖鎖に対して結合性、会合性、及び、その他の親和的な性質を含んでよく、この性質を利用することにより、糖鎖認識をすることもできる。
【００３３】
上記「マメ科レクチンのループＤの遺伝子を改変する」とは、マメ科レクチンのループＤの遺伝子に改変を加えることで、より具体的には、遺伝子を長くする遺伝子の挿入、遺伝子を短くする遺伝子の抜出、遺伝子の長さは変らない遺伝子の変更（ランダム、任意的、恣意的を含む。）等を含んでよい。このとき、遺伝子全てを変更することも含まれるが、より好ましくは、糖鎖認識能力が十分担保されるように、変更する遺伝子の数と位置を特定し、その特定された遺伝子を変更することである。このような特定は、アミノ酸の立体構造を解析して行うことにより、実験により、又は、その他の方法により合目的的に行われてよい。また、ループＤは、上述のように、図２又は３に示すようなアミノ酸の位置によって規定でき、特に、このループＤから糖結合性に関与するアミノ酸の位置を特定してよい。「この改変された遺伝子を使用してタンパクを作らせる」とは、遺伝子工学的にタンパクを作らせることを含み、そのために必要なあらゆる手段を含むことができる。
【００３４】
上記「糖鎖解析ツール」とは、例えば、ウェスタ−ンブロット法における分離成分が移し取られる膜や、カラム等の分析又は分離ツールを含んでよく、また、診断薬、治療薬等の薬を含んでよい。これらのツールには、１又はそれ以上の改変レクチンを糖鎖識別を行うのに適切な順列で配列して固定化された固体支持体を含んでよい。この適切な順列の配列には、視覚的にパターンを認識しやすくなるように表示させるため、予め決められた位置に選別されたレクチンを含むウェル（ｗｅｌｌ）又はスポットを配列することを含んでよい。また、標準パターンを作成した場合は、その標準パターンに準じた位置に上記ウェル又はスポットを配列することを含んでよい。ここで、「表示させる」は、直接・間接のいずれであってもよい。また、同チップを用い視覚的にいうなれば、パターン情報に該当する情報を得、それを基に細胞同定をすることができる。但し、視覚的にいうなればパターン情報であっても、その数が膨大である場合は、肉眼その他の方法での目視では不十分なことが多く、比較したい検体のそれぞれについて糖鎖結合強度順に直線回帰したり、コンピュータを用いて、クラスター解析等により、細胞同定を行ってもよい。クラスター解析では、どの部分に比較したいもの（例えば、標準と検討対象物、又は、コントロールと比較物）の違いが大きく出ているかをコンピュータを利用して調べることであってよく、一般のクラスター解析ソフトを用いることもできる。
【００３５】
解析ツールとして、例えば、細胞表面の糖鎖に対して特異的に結合し得る異なる種類のレクチンを所定の分布で固定した糖鎖解析用試験プレートがあげられる。このとき、異なる種類のレクチンを固定する位置は、目的の細胞若しくは疾病診断により決めてよい。目的の細胞若しくは疾病診断により適切な配列が種々存在していてもよく、目的の細胞若しくは疾病診断に合わせて配列を最適化すると好ましい。糖鎖解析用試験プレートは、ろ紙のような紙を使った試験紙を含み、ガラス板やその他の材質の基材の上に所定のレクチンを固定したものも含んでよい。ここで、その他の材質の基材は、プラスチック（合成樹脂を含む）、金属（白金、銀、銅、金、シリコン、等を含む）、雲母、及び、これらの混合物を含んでよい。また、これらの材料や物質からなる基材の形状は、シート状、板状等の平面的形状、球状（例えばビーズ）、箱状等の３次元的形状、その他のあらゆる形状を含んでよい。このような「糖鎖解析用試験プレート」は、診断薬としても用いることが可能である。
【００３６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的な例を上げ、図を参照しつつ、より詳しく説明するが、１つの具体的な例として材料や構造等が挙げられているに過ぎず、本発明はこれらの実施例に限られるものではない。
【００３７】
【実施例】
［実施例１　ループＣにおける延長］
元となるレクチンは、Ｍａａｃｋｉａ　ａｍｕｒｅｎｓｉｓ　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＭＡＨ）を用い、テンプレートとしてＭＡＨのｃＤＮＡを使用してＰＣＲ法によりループＣの延長をした。また、このとき、表１に示すのプライマー等も用いた。
【００３８】
【表１】
2004016149.tif 000003
【００３９】
［回収レクチン遺伝子のインサート側断片の作製］
野生型ＭＡＨ遺伝子を鋳型にして、以下の表２の試薬・条件でＰＣＲを行い、インサート側断片を作製した。
【００４０】
【表２】
2004016149.tif 000004
【００４１】
ＰＣＲ終了後、ＤｐｎＩを１μｌずつ添加し、３７℃で２時間反応させた。反応産物はＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で回収された。生成物は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ　及び　ＢａｍＨＩで処理された。そして再び、反応産物はＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で回収された。そして、生成物は、制限酵素で処理をした野生型ＭＡＨ組込みファージ（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗ．ｔ．ＭＡＨ−ｐＣｏｍｂ３　（ｐＣｏｍｂ３　ｐｈａｇｅｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ　ｈａｖｉｎｇ　ｗ．ｔ．ＭＡＨ　ｃＤＮＡ））にライゲーションされた。ここで、ｗ．ｔ．ＭＡＨ−ｐＣｏｍｂ３は、ｐＧＥＸ−２Ｔにおいて、野生型ＭＡＨ（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ（ｗ．ｔ．）　ＭＡＨ）をコードしたｃＤＮＡ　断片が制限酵素　ＳｐｅＩ　と　ＸｈｏＩにより処理され、ｐＣｏｍｂ３にライゲーションされた。
【００４２】
［遺伝子組み替えＭＡＨのクローニングと配列の検証］
改変ＭＡＨ　ｃＤＮＡ−ｐＣｏｍｂ３　プラスミド（ＭＡＨ　ｃＤＮＡ−ｐＣｏｍｂ３　ｐｈａｇｍｉｄ）は、一晩３７℃でＥ．Ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に組み込まれた。適当な発現ファージミド（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｈａｇｍｉｄ）を含む。大腸菌　ＪＭ１０９は、５０　μｇ／ｍｌのカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）とが補充されたＨＥＭ　（２４ｇ／Ｌ　トリプトン（ｔｒｙｐｔｏｎ）と、４８ｇ／Ｌ　イースト抽出（ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）と、１０ｇ／Ｌ　ＭＯＰＳ．ｐＨ７．０とからなる）　で育てられた。そして、得られたコロニーは、取り出され、３７℃で５０　μｇ／ｍｌのカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）を含むＨＥＭの１ｍｌの培地で一晩培養された。．Ｐｈａｇｅｍｉｄ　ＤＮＡは、ＣＯＮＣＥＲＴＴＭ　Ｒａｐｉｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｒｅｍｓ　（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）により回収され、ＤＮＡ配列は、プライマー　５’−ＴＴＣＴＴＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＴＴＣＴＣ−３’　によって、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，　ＦＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，　ＣＡ，ＵＳＡ）　及び　３１００ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を使って決定された。
【００４３】
［フラグ融合型タンパクの発現］
各改変ＭＡＨ　ｃＤＮＡ−ｐＣｏｍｂ３　は、センス・プライマー及びアンチ・センス・プライマーを用いてＰＣＲ処理された。得られたＰＣＲ生成物は、ＰＣＲ浄化キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）により回収され、ＸｈｏＩ　及び　ＢｇｌＩＩで処理された。そして、生成物は、　ＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｐＦｌａｇ−ＡＴＳ　（Ｓｉｇｍａ社製）にライゲーションされた。各プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に組み込まれた。コロニーは、３７℃で一晩５０　μｇ／ｍｌ　カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）を含む２ＸＹＴの１ｍｌの中で培養された。Ｐｈａｇｅｍｉｄ　ＤＮＡは、ＣＯＮＣＥＲＴＴＭ　Ｒａｐｉｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｒｅｍｓ　（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いて回収された。各クローンのＤＮＡ配列は、プライマーＮ−２６　Ｓｅｑｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ　（５’−ＣＡＴＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣ−３’）　及び　ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，　ＦＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，　ＣＡ，ＵＳＡ）　及び　３１００　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を用いて決定された。各特定された発現プラスミドを含む大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０９　は、３７℃で３時間５０　μｇ／ｍｌ　ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎが補充されたＨＥＭ中で培養された。フラグ融合型タンパク発現は、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ　（ＩＰＴＧ：ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　１ｍＭ））によって導入され、３７℃のインキュベーションが３時間継続した。培養生成物は、９６００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、バクテリア・セル・ペレットは、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）中で再び懸濁された。得られたバクテリア・セル懸濁液は、液体窒素での凍結及び３７℃のウォーター・バスでの解凍サイクルを５回繰り返した。そして、懸濁液は、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離され、上澄みが取り出され、ＢＣＡプロテイン・アッセイ・キット（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いてプロテイン・アッセイ処理された。
【００４４】
［ウェスタ−ンブロット解析によるフラグ融合タンパクの検出］
フラグ融合プロテインを含む上澄みは、ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　によって分離され、ニトロセルロース膜に移された。その膜は、ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ−ＭＡＨ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｏｒ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（ＳＩＧＭＡ社製）によって検出され、ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　又は　ａｎｔｉ−ｒａｔ　ＩｇＧ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（ＺＹＭＥＤ社製，　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）　によってインキュベートされた。アルカリ・フォスフォターゼ基板キットＩＩ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．，社製　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，　ＣＡ）よって、抗体が可視化された。
【００４５】
［改変ＭＡＨレクチン］
ランダムに選ばれた１つのアミノ酸が、ＭＡＨのループＣ（図４参照）のアミノ酸の間に挿入された。ＰＣＲがアミノ酸を挿入するのに用いられた。改変レクチンＭＡＨのｃＤＮＡ（８００ｂｐあたり）は、アガロース・ゲル（ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により確認された。改変ＭＡＨのｃＤＮＡを含むファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）の大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）への組込みがされ、１８０個の改変レクチンが生じた。
【００４６】
［抗ＭＡＨ抗体、抗フラグ抗体によるフラグ融合プロテインの検出］
クローンされた改変ＭＡＨのｃＤＮＡは、挿入位置の上流にフラグを持つＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｐＦｌａｇ−ＡＴＳに挿入された。フラグ改変レクチン融合プロテインは、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０９　をホストとして用いて、生産された。各クローンは、抗ＭＡＨ抗体（ａｎｔｉ−ＭＡＨ　ｐＡｂ）及び　抗フラグ抗体（ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ　ｍＡｂ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ　やウェスタ−ンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により解析された。フラグ改変レクチン融合プロテインは、３０　ｋＤａあたりの対応する位置にあり、このことは、フラグ改変レクチン融合生成物と一致していた（図６）。このことより、フラグ改変レクチンは、フラグ蛋白としても、ＭＡＨとしても発現が確認できた。また、各フラグ改変レクチンの抗ＭＡＨ抗体（ａｎｔｉ−ＭＡＨ　ｐＡｂ）及び　抗フラグ抗体（ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ　ｍＡｂ）への結合性はほぼ同じであると考えられる。
【００４７】
［改変ＭＡＨクローンの特徴］
ＥＬＩＳＡにより、ここの改変ＭＡＨレクチンの結合性が評価された。まず、抗フラグ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）が、一晩、４℃でＴＢＳ中において５００　ｎｇ　／ｗｅｌｌの濃度で、マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ　（Ｓｍｉｒｏｎ　ｃａｔ．　＃　ＭＳ−８８９６Ｆ））に適用された。ＴＢＳで３回洗浄した後、ウェルは、ＴＢＳ中の３％ボビン血清アルブミンで満たされ、次に、改変ＭＡＨクローンを含む５０　μｇ／ｗｅｌｌ　の大腸菌ライセート抽出物（Ｅ．ｃｏｌｉ　ｌｙｓａｔｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ）は、追加され、室温で２時間インキュベートされた。各クローンのプロテインが固定されているか、抗ＭＡＨ抗体によって予め調べられた。洗浄後、５０　μｌ　の　２％　のヒト（ｈｕｍａｎ（ＡＢ−ｔｙｐｅ）），　ウシ（ｂｏｖｉｎｅ），　ウマ（ｅｑｕｉｎｅ），　ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ），　ニワトリ（ｃｈｉｃｋｅｎ），　ウサギ（ｒａｂｂｉｔ），　ネズミ（ｃａｖｙ）の赤血球を適用した。２時間のインキュベーション後、ウェルは３回０．０１％　Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳで洗浄された。これらの動物の赤血球は、ＮＩＰＰＯＮ　ＢＩＯＳＵＰＰ．　ＣＥＮＴＥＲ　Ｃｏ．ＬＴＤ．　Ｔｏｋｙｏより購入した。ＡＢＴＳとＨ２Ｏ２の発色により改変レクチンの赤血球との結合性が調べられた。抗ＭＡＨ抗体を利用し、各クローンのレクチンプロテインが各ウェルにおいて同量固定されていることが確認された。図７及び８に、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ニワトリ、ウサギ、ネズミの赤血球に対する結合結果示す。図７では、野生型のＭＡＨレクチンに対する相対値がプロットされている。クローン７Ｇｌｙ（Ｇｌｙアミノ酸をループＣの７番目のアミノ酸配列に有するもの）は、ウマにのみ強い結合性を示した。しかし、他の動物の赤血球には結合しなかった。特異性は、野生型ＭＡＨとは異なっていた。他のクローンは野生型ほど強い結合性を示さなかった。図８は、最も強い結合性を持つものを１として相対値をプロットしたものである。このグラフは、改変レクチン間に大きな違いがあることを示している。ガラクトースを用いたインヒビッション・アッセイは、改変レクチンの赤血球に対する結合が一部糖質を介して行われていることを示していた。
【００４８】
［実施例２　ループＤにおける延長］
ＭＡＨのループＤの中央部６箇所（アミノ酸配列２１９〜２２４の前）に１アミノ酸を挿入することにより、糖鎖認識特異性の異なる多様なレクチンを含むライブラリーを作製した。ベクターにＮ末にＦＬＡＧタグを付加するｐＦＬＡＧ−ＡＴＳを用いたが、マルチクローニングサイトにはＭＡＨを組み込むのに都合の良い制限酵素部位が無かったので、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓのプロトコールに従い、Ｂｇｌ　ＩＩ　ｓｉｔｅをＳｐｅ　Ｉ　ｓｉｔｅ　に作り変えた。まず、改変したい部位を含むプライマーをｓｅｎｓｅ側、ａｎｔｉ側でまったく相補的になるように設計した。次にＰＣＲを行い、Ｄｐｎ　Ｉ　１　μｌ　を加え、３７℃で１時間インキュベートした。このＤＮＡ溶液をそのまま用いてＸＬ１−Ｂｌｕｅ　にトランスフォーメーションした。再度に、得られたコロニーをショートカルチャーしてプラスミドを回収し、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　によりそのＤＮＡ配列を読んで、改ｐＦＬＡＧ−ＡＴＳを同定した。（表３参照）
【００４９】
【表３】
2004016149.tif 000005
【００５０】
［ベクターの移しかえ］
野生型ＭＡＨ　ｃＤＮＡとＭＡＨ由来の人工のｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ−ＣＴＳからＰＣＲで増幅して制限消化（Ｘｈｏ　Ｉ　ｃｏｎｃ．　と　Ｓｐｅ　Ｉ　ｃｏｎｃ．　（ロッシュ社製））し、改ｐＦＬＡＧ−ＡＴＳに組み込んだ。これをＪＭ１０９にトランスフォーメーションし、得られたクローンをＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　により同定した。（表４参照）
【００５１】
【表４】
2004016149.tif 000006
【００５２】
［ループＤの伸張］
制限酵素として（Ｘｈｏ　Ｉ　．ｃｏｎｃ　及び　Ｂｇｌ　ＩＩ．ｃｏｎｃ）を用いて上記と同様にクローンを作成し、単離・同定した。ランダムにアミノ酸を挿入するプライマーを用いた改変では、単離できなかったクローンについては、個別にプライマーを設計して同じように単離・同定した。（表５参照）
【００５３】
［改変ＭＡＨ　ｃＤＮＡを持つクローンの単離・同定］
マルチクローニングサイトのＢｇｌ　ＩＩ　ｓｉｔｅ　をＳｐｅ　Ｉ　ｓｉｔｅ　に変換することができた。目的の部分以外には変異は存在しなかった（図９参照）。理論上予測される１２０種類の改変ＭＡＨを単離・同定することができた（図１０参照）。
【００５４】
【表５】
2004016149.tif 000007
【００５５】
［ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　プロトコールの変更］
今回のシーケンスでは、既知のプロトコールを変更して行っているので、その変更点を箇条書きにして表６に示す。
【００５６】
【表６】
2004016149.tif 000008
【００５７】
［大腸菌溶解物（ライセートの作製）］
カルベニシリンを入れたＨＥＭ（Ｈｉｇｈｌｙ　Ｅｎｒｉｃｈｅｄ　Ｍｅｄｉｕｍ）で単離してある大腸菌を一晩短期培養（ｓｍａｌｌ−ｃｕｌｔｕｒｅ　（ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔ））した。翌日、ＨＥＭ　２０　ｍｌ，　ＣａＣｌ２　（１Ｍ）　２０　μｌ，　ＭｎＣｌ２　（１Ｍ）　２０　μｌ，　ＭｇＣｌ２　（４．９Ｍ）　８１．７　μｌ　からなる培地に短期培養（ｓｍａｌｌ−ｃｕｌｔｕｒｅ）した大腸菌を　２００　μｌ　加えて、３時間予備的培養（ｐｒｅ−ｃｕｌｔｕｒｅ）した。ここへ、１００　ｍＭ　ＩＰＴＧを２００μｌ　加えて、３時間培養し誘導をかけた。次に９，５００　ｒｐｍ　で１０分間遠心して大腸菌を回収し、ＴＢＳ　２００　μｌ　に懸濁して　−８０℃に保存した。後日、大腸菌を凍結（液体窒素）と融解（３７℃湯浴）を５回繰り返し、１５，０００　ｒｐｍ　で２０分間遠心して上清をライセートとして回収した。このライセートは、タンパク定量を行った後に−８０℃に保存し、これを使用する準備が整ってからタンパク濃度　１　ｍｇ／ｍｌ　に希釈して　４　℃保存した。
【００５８】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタン・ブロッテイングによるフラグ融合プロテインの検出］
ライセート中に改変ＦＬＡＧ−ＭＡＨが存在しているのか調べるために、適当にサンプルを選んでＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び、ウェスターン・ブロットを行った。抗体染色では、１次抗体として、ａｎｔｉ−ＭＡＨ　ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　抗体、又は、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ　Ｍ２　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　抗体を用い、２次抗体にはそれぞれＡＰ−ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　抗体と、ＡＰ−ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　抗体を用いてＡＢＣキットで発色させた。フラグ改変レクチンは、フラグ融合タンパクとしてもＭＡＨとしても発現が確認できた。
【００５９】
［Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ　法による改変ＭＡＨの細胞に対する結合性解析］
９６　ｗｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ　用プレートに　ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ　（１μｇ／ｗｅｌｌ）　をひき（３７℃で３０分間インキュベート）、細胞溶液（１０５　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；　Ｃｏｌｌｏｎ−３８，　ＳＬ−４，　Ｃａｃｏ−２，　分化型　Ｃａｃｏ−２）を加え、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ　（２５％））　（１　μｇ／ｗｅｌｌ）　によりこれをプレートへ固定（室温で３０分間静置）した。細胞を固定したプレートはＴＢＳを入れて４℃保存し、更に、３％ＢＳＡ／ＴＢＳでブロッキング（室温で３時間振盪）して、上で作製した改変ＭＡＨレクチンを含むライセート（５０μｇ／ｗｅｌｌ）を加えた（室温で２時間振盪）。１次抗体には、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ　Ｍ２　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ抗体（１０００倍希釈を５０μｌ／ｗｅｌｌ）、２次抗体には、ＨＲＰ−ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　抗体（１０００倍希釈を５０μｌ／ｗｅｌｌ）を用いた（共に室温で３０分間振盪）。ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２（５０μｌ／ｗｅｌｌ）で発色させ、ＯＤ４０５／４９０を測定した。
【００６０】
［Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法による改変ＭＡＨの性質の異なる細胞への結合性の解析］
図１１は、各細胞（Ｃｏｌｏｎ−３８、ＳＬ−４、未分化型Ｃａｃｏ−２、分化型Ｃａｃｏ−２）の野生型及び改変ＭＡＨの結合強度を示す。ここで、Ｃｏｌｏｎ３８、ＳＬ４は同じ起源であるが、転移性の異なる２つの癌細胞セルラインである。真上に野生型ＭＡＨを置き、そこから時計回りに１Ａ、１Ｃ、１Ｄ、・・・、６Ｖ、６Ｗ、６Ｙという順番に並んでいる。この円状のグラフの一番外側の目盛りは０．２で、中心から離れるほど大きく（結合性が強く）なる。図１２は、ある改変レクチンの各細胞（Ｃｏｌｏｎ−３８、ＳＬ−４、Ｃａｃｏ−２、分化型Ｃａｃｏ−２）に対する結合性違いを示したものである。各改変レクチン（１Ｑ，２Ｃ，３Ｄ，３Ｓ，４Ｎ）毎に、性質の異なる４種類の細胞との結合性がそれぞれ違っていることがわかる。ここで、１Ｑとは、図５において、１の位置にグルタミンが入ることを意味し、２Ｃとは、２の位置にシステイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）が入ることを意味し、３Ｄとは、３の位置にアスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ）が入ることを意味し、３Ｓとは、３の位置にセリン（Ｓｅｒｉｎｅ）が入ることを意味し、４Ｎとは、４の位置にアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）が入ることを意味する。即ち、一般には、”ｎＸ”とは、図５の”ｎ”の位置に”Ｘ”というアミノ酸が挿入されたことを意味する。上述のように性質の異なる細胞との結合性が異なるのは、細胞表面の糖鎖の違いによるものと考えられ、従って、これらのレクチン群を用いれば、糖鎖若しくは細胞の特徴を判別できることになる。従って、最初に既知の糖鎖により、これらの改変レクチン群を分類し、それぞれの類を解析するための改変したレクチンの種類を選択しておけば、既知の糖鎖に基づいた糖鎖マッピングにおける未知の糖鎖の位置が判明すると考えられる。特に、Ｃｏｌｏｎ３８とＳＬ−４、又は、分化型Ｃａｃｏ−２と未分化型Ｃａｃｏ−２のように起源が同じ細胞等においても、それぞれ結合性が異なるレクチンが存在し、その差異を明確にできると考えられる。
【００６１】
図１３に、１２０種類の改変レクチンとＣｏｌｏｎ−３８又はＳＬ−４との結合性を示す。この図で、数字とアルファベットで示されているものは、上述のように、改変位置と改変の種類を示すものである。このように、１２０種の改変レクチンを全て使って糖鎖解析をすることは、類似する糖鎖認識機能を有しながら、少しずつ異なると考えられるこれらのレクチンの集合により、多面的に未知の糖鎖を解析することができるだけでなく、この中から、さらに、別の切り口（例えば、挿入箇所を固定し、アミノ酸種を変えたもの、アミノ酸種を固定し挿入箇所を変えたもの、別の基準（例えば、パニング）により選択したもの等）で集めたレクチンの集合体は、より的確に糖鎖を解析できるものと考える。
【００６２】
［実施例３　ループＤにおける改変］
ＭＡＨレクチンのループＤにおける改変（アミノ酸配列の長さを変えない改変又はアミノ酸種類を変更する改変）を行った。ＭＡＨのループＤには、図１４に示すように、野生型ＭＡＨのＮ末端のセリンから数えてアミノ酸配列相当では２１９から２２３番までのアミノ酸配列が含まれ、野生型ＭＡＨレクチンでは、ＡＰＫＡＶというアミノ酸が並んでいる。ここでは、これらのアミノ酸の種類を変えることによりアミノ酸の改変を行った。即ち、図１４において前後のＧとＦに挟まれたＡＰＫＡＶをランダムなアミノ酸（ＸＸＸＸＸ）に改変した。
【００６３】
［ループＤ改変ＭＡＨの作製］
ＭＡＨのループＤ改変は、ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製））によって、パーキン・エルマー２４００又は９７００熱サイクル装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　２４００　ｏｒ　９７００　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）の中で行われた。このとき用いた、プライマー及びリバース・プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ）を表７に示す。
【００６４】
【表７】
2004016149.tif 000009
【００６５】
ＰＣＲ生成物を得るために次のようなプロトコールが用いられた。まず、９５℃で９分間、（９４℃で１分間、５４℃で１分間、７２℃で２分間）のサイクルを３０回、そして、７２℃１０分間である。得られたＰＣＲ生成物は、制限酵素ＤｐｎＩによって３７℃で２時間処理された。生成物は、ＰＣＲピュアリフィケーションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）により回収された。それから、生成物は、過剰な制限酵素　ＥｃｏＲＩ　及び　ＢｇｌＩＩ　によって処理され、アガロース・ゲルの電気泳動にかけられて、ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）によって回収された。生成物は、それから、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ処理野生型ＭＡＨ−ｐＣｏｍｂ３（ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗ．ｔ．ＭＡＨ−ｐＣｏｍｂ３　（ｐＣｏｍｂ３　ｐｈａｇｅｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ　ｈａｖｉｎｇ　ｗ．ｔ．ＭＡＨ　ｃＤＮＡ））にライゲートされた。
【００６６】
［ファージの準備］
その表面に改変ＭＡＨレクチンを発現するファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）粒子を発生させるために、改変レクチン−ｐＣｏｍｂ３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＵＲＥ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に組み込まれた。この細胞は、５０　μｇ／ｍｌ　カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）を含むＨＥＭ　プレート　（２４　ｇ／Ｌ　ｔｒｙｐｔｏｎｅ，　４８　ｇ／Ｌ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，　１０　ｇ／Ｌ　ＭＯＰＳ，　ｐＨ７．０）に置かれ、３７℃で８−９時間培養された。細胞は、プレートを１０ｍｌ　ＨＥＭに浸して、はがすことにより回収された。細胞を含むＨＥＭ媒体は、１００　ｍｌ　ＨＥＭ　（ｐＨ　６．９，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１ｍＭ　ＣａＣｌ２　ａｎｄ　１ｍＭ　ＭｎＣｌ２）／ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）に集められ、１−２時間培養された。Ａ６００が約０．３になると、細胞培養を、ＶＳＣＭ１３　ｈｅｌｐｅｒ　ｐｈａｇｅ　（約１０１２　ｐｆｕ；　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に感染させた。感染されたものは、３０℃で１２時間振盪して培養され、ファージは、ポリエチレン・グリコール８０００及びとＮａＣｌ沈殿によって一晩かけ４℃で、培養物から単離された。遠心分離した後、ファージ・ペレットは、トリス緩衝整理食塩水（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ：５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ　７．５　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）＋１％　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）　）に懸濁された。
【００６７】
［Ｃａｃｏ−２細胞によるパニング］
パニングには、Ｃａｃｏ−２細胞が用いられた。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得たＣａｃｏ−２細胞が培養された。分化のため、２ｍＭ酪酸ナトリウム（２　ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒａｔｅ）（和光純薬（株）社製）が加えられた。各パニングにおいて、約１０８　ｐｆｕ　のファージが、　１％　ＢＳＡを含む１０ｍｌのＴＢＳの中にある分化型Ｃａｃｏ−２　の懸濁液に加えられた。４℃で一晩の回転式培養の後、細胞はペレット状にされ、５ｍｌのＴＢＳで４℃で３回洗浄された。ファージを含む最終細胞ペレットは、　２ｍｌ　の　（ＯＤ６００＝１）　Ｓｕｒｅ　ｃｅｌｌｓと共に培養された。３７℃で１５分間培養された後、細胞は、ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ＨＥＭ　（ｐＨ　７．０）／ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　ｐｌａｔｅｓ　に置かれ、３７℃で８時間培養された。ファージ懸濁液は、上述のようにバクテリア上澄から準備され、ファージの濃度が滴定された。
【００６８】
［改変レクチンのＤＮＡ配列］
３回目のパニングの後、ＨＥＭプレートの３０コロニーは、集められ、ファージミドＤＮＡ（ｐｈａｇｅｍｉｄ　ＤＮＡ）は、ＣＯＮＣＥＲＴＴＭ　Ｒａｐｉｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｒｅｍｓ　（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）によって回収され、１２種類の新規人工改変レクチンを得た。そして、ＤＮＡ配列は、プライマー：ｌｏｏｐＤ−Ｓｅｑ　５’−ＧＴＴＡＡＴＡＧＣＡＴＣＴＣＴＡＧＴＴＴＡＣＣＣ−３’　と、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　と、ＦＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，　ＣＡ，ＵＳＡ）　と、　３１００　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製，　ＣＡ，　ＵＳＡ）　とを用いて決定された。そのアミノ酸配列を図１５に示す。
【００６９】
［フラグ融合プロテインの発現］
各改変ＭＡＨ　ｃＤＮＡ−ｐＣｏｍｂ３　は、センス・プライマー（ｓｅｎｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ）Ｎ−Ｆｌａｇ−ＸｈｏＩ：５’−ＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＡＴＧ−３’　を用い、また、アンチセンス・プライマー（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ）　Ｆｌａｇ−ＳａｌＩ：　５’−ＧＴＧＧＴＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＴＡＡＣＧＴＧ−３’　を用いて、ＰＣＲされた。得られたＰＣＲ生成物は、ＰＣＲ回収キット（ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製））を用いて回収され、制限酵素ＸｈｏＩ　及び　ＳａｌＩ　によって処理された。処理されたものは、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｐＦｌａｇ−ＡＴＳ（Ｓｉｇｍａ社製）によりライゲートされた。得られた各プラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０９　に組み込まれた。バクテリア・コロニーは、５０　μｇ／ｍｌ　ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　を含む２ＸＹＴ（１６　ｇ／ｌ　Ｔｒｙｐｔｏｎ，　１０ｇ／ｌ　Ｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ，　５ｇ／ｌ　ＮａＣｌ）　プレート　に置かれ、３７℃で一晩培養された。各プレートのコロニーは、取り上げられ、３７℃で５０　μｇ／ｍｌ　ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎを含む２ＸＹＴの１　ｍｌ　の培養物の中で一晩培養された。ファージミドＤＮＡ（ｐｈａｇｅｍｉｄ　ＤＮＡ）は、ＣＯＮＣＥＲＴＴＭ　Ｒａｐｉｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｒｅｍｓ（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）．によって回収された。そして、各クローンのＤＮＡ配列は、プライマーのＮ−２６　Ｓｅｑｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ　（５’−ＣＡＴＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣ−３’）を用い、　ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　と、　ＦＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，　ＣＡ，ＵＳＡ）　と、　３１００　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製，　ＣＡ，　ＵＳＡ）　を用いて、決定された。既知の発現プラスミドを含む大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）　Ｓｕｒｅ．は、３７℃で３時間、５０　μｇ／ｍｌ　ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　を含むＨＥＭ媒体において培養され、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ　（ＩＰＴＧ：ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　１ｍＭ）　を加えてフラグ融合プロテイン発現が誘起され、上述の３７℃での培養がやはり同じ温度で３時間継続された。培養されたものは、９６００ｒｐｍで遠心分離され、バクテリア細胞ペレットは、ＴＢＳ　（Ｔｒｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）によって再び懸濁された。そして、このバクテリア細胞懸濁液について、液体窒素と３７℃のウォーターバスを用いた凍結と解凍のサイクルを５回行った。そして、懸濁液は、０℃で３０分間１５０００ｒｐｍで遠心分離された。上澄を取り出し、ＢＣＡプロテイン・アッセイ・キット（ＢＣＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ　（ＰＩＥＲＣＥ社製））によってプロテイン・アッセイが行われた。
【００７０】
［フラグ融合プロテインの検出］
ソジウム・ドデシル・サルフェイト−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって、フラグ融合プロテインを含む上澄が分離され、ニトロセルロースの膜に移された。そして、この膜は、ポリクロナール・抗ＭＡＨ抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ−ＭＡＨ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）又は、モノクロナール・抗フラグ抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（ＳＩＧＭＡ社製））によって、そして、次に、ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　又は、　ａｎｔｉ−ｒａｔ　ＩｇＧ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（ＺＹＭＥＤ社製，　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）によって検証された。結合抗体は、アルカリ・フォスフォターゼ基板キットＳＫ−５２００（ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｋｉｔ　ＳＫ−５２００　（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．社製，　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，　ＣＡ）　）によって、視覚化された。フラグ改変レクチンは、フラグ融合タンパクとしてもＭＡＨとしても発現が確認できた。
【００７１】
［ループＤ改変ＭＡＨクローンの糖結合特異性］
各改変ＭＡＨレクチンの結合特性がＥＬＩＳＡによって評価された。まず、抗フラグ抗体（ａｎｔｉ−ｆｌａｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（Ｓｉｇｍａ社製））が、一晩４℃でＴＢＳ中で　５００　ｎｇ　／ｗｅｌｌの濃度でマイクロタイター・プレート（Ｓｍｉｒｏｎ社製）に付けられた。ＴＢＳで３回洗浄された後、ＴＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ）でウェルがブロックされた。次に、改変ＭＡＨクローンを含む　５０　μｇ／ｗｅｌｌ　大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセート抽出物（５０　μｇ／ｗｅｌｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｌｙｓａｔｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ）が加えられ、室温で培養された。各クローンのプロテインが各ウェルのプレートに付いていることは、抗ＭＡＨ抗体によりあらかじめ確認された。洗浄後、ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ、Ｇａｌａｃｔｏｓｅ（Ｇａｌ）−ｓｐ−ｂｉｏｔｉｎ、Ｍａｎｎｏｓｅ（Ｍａｎ）−ｓｐ−ｂｉｏｔｉｎ、Ｇｌｃｏｓｅ（Ｇｌｃ）−ｓｐ−ｂｉｏｔｉｎ、ＧａｌＮＡｃ−ｓｐ−ｂｉｏｔｉｎ、　ＧｌｃＮＡｃ−ｓｐ−ｂｉｏｔｉｎ、　ＮｅｕＡｃ−ｓｐ−ｂｉｏｔｉｎ、　Ｌｅｘ−ｓｐ−ｂｉｏｔｉｎ、　ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅｘ−ｓｐ−ｂｉｏｔｉｎ、　Ｌｅａ−ｓｐ−ｂｉｏｔｉｎ、　Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅａ−ｓｐ−ｂｉｏｔｉｎ、　Ｌｅｃ−ｓｐ−ｂｉｏｔｉｎ、　ＬａｃＮＡｃ−ｓｐ−ｂｉｏｔｉｎ、　及び、ｓｉａｌｙｌ　Ｔ−ｓｐ−ｂｉｏｔｉｎ　（Ｎｉｃｏｌａｉ博士によるもの）のビオチン化ポリアクリルアミド・ポリマーのパネルが、ＴＢＳ中で、１，　０．５，０．２５，　０．１２５　μｇ／ｗｅｌｌ　の濃度で、そのプレートに付けられた。室温で２時間の培養の後、ウェル（ｗｅｌｌ）は、０．０１％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）を含むＴＢＳで３回洗浄された。また、オリゴ糖と結合したビオチン化ポリアクリルアミド・ポリマーのプレートに対しては、洗浄後、ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｚｙｍｅｄ社製）　が３０分間ウェルに加えられた。ウェルは、０．０１％ツィーンを含むＴＢＳで３回洗浄され、プレートは上述のように処理された。また、図１７には、改変レクチンと一連のビオチン化した糖ポリマーとの結合性を示している。
【００７２】
［ループＤ改変ＭＡＨクローンの異種動物赤血球への結合性］
各改変ＭＡＨレクチンの結合特性がＥＬＩＳＡによって評価された。まず、抗フラグ抗体（ａｎｔｉ−ｆｌａｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（Ｓｉｇｍａ社製））が、一晩４℃でＴＢＳ中で　５００　ｎｇ　／ｗｅｌｌの濃度でマイクロタイター・プレート（Ｓｍｉｒｏｎ社製）に付けられた。ＴＢＳで３回洗浄された後、ＴＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ）でウェルがブロックされた。次に、改変ＭＡＨクローンを含む　５０　μｇ／ｗｅｌｌ　大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセート抽出物（５０　μｇ／ｗｅｌｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｌｙｓａｔｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ）が加えられ、室温で培養された。各クローンのプロテインが各ウェルのプレートに付いていることは、抗ＭＡＨ抗体によりあらかじめ確認された。洗浄後、ヒト（ＡＢ型）（　ｈｕｍａｎ（ＡＢ−ｔｙｐｅ））、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ニワトリ（ｃｈｉｃｋｅｎ）、ウサギ（ｒａｂｂｉｔ）、そして、ネズミ（ｃａｖｙ）の５０　μｌ　の　２％　赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）が、ＴＢＳ中でウェルに付けられた。改変レクチンと赤血球との結合は、ＡＢＴＳとＨ２Ｏ２を適用し、プレート・リーダーを用いて検証された。図１６に、作られた改変レクチンのヒト及び６種類の動物の赤血球への結合性を表す。図中色が濃いものは結合性がより強い。この図から、各赤血球は、これら複数種類のレクチンに対して、異なる結合性を示していることがかわる。従って、今回選んだレクチンの組み合わせからなるレクチン群を用いて、糖鎖解析をすることができることがわかる。ここでも、各ポリマーは、複数種の改変レクチンに対して異なる結合性を持っており、このパターンにより、糖鎖解析ができることがわかる。
【００７３】
【発明の効果】
以上のように、本発明の改変レクチン又は改変レクチン群及びそれらの製造方法によると、糖鎖認識特性が似つつも、異なる改変レクチンを製造でき、これらのレクチン又はレクチン群による糖鎖解析がより好ましく行われると期待される。また、天然に得られるレクチンは、その種類が限られるばかりでなく、量的にも不安定になりやすいが、本発明によれば、そのようなことが容易に解決できるという効果がある。
【００７４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＡＨの立体構造の予測図である。
【図２】ＭＡＨをコードしたｃＤＮＡの塩基配列と予想されるアミノ酸配列を示した図である。
【図３】マメ科レクチンの種類と各ループのアミノ酸配列を示す図である。
【図４】ＭＡＨのループＣのアミノ酸配列を示し、改変によるアミノ酸の挿入位置を示した図である。
【図５】ＭＡＨのループＤのアミノ酸配列を示し、改変によるアミノ酸の挿入位置を示した図である。
【図６】改変ＭＡＨレクチンのウェスターンブロット解析結果を示した図である。
【図７】ヒト等の赤血球に対する改変ＭＡＨレクチンの結合性を示した図である。
【図８】ヒト等の赤血球に対する改変ＭＡＨレクチンの結合性を示した図である。
【図９】新しいベクターの作製において、マルチクローニングサイト変更が行われたことを示す図である。
【図１０】改変レクチンの分離・同定できたことを示す図である。
【図１１】各種細胞への改変レクチンの結合強度を示す図である。
【図１２】各種細胞と選択された改変レクチンの結合強度を示す図である。
【図１３】ＳＬ−４とＣｏｌｏｎ−３８の細胞の改変レクチンへの結合強度を示す図である。
【図１４】ＭＡＨのループＤのアミノ酸配列を示し、挿入によらない改変によるアミノ酸の改変位置を示した図である。
【図１５】改変ＭＡＨ（挿入によらない）のループＤのアミノ酸配列を示した図である。
【図１６】ループＤ改変ＭＡＨ（挿入によらない）ヒト等の赤血球との結合性を示した図である。
【図１７】ループＤ改変ＭＡＨ（挿入によらない）ヒト等のビオチン化糖ポリマーとの結合性を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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