(57)【要約】【課題】新規構造を有するグラニュリン関連ポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを提供すると共に、該ポリペプチドを生産する生物からの該ポリペプチドの製造方法を提供すること。【解決手段】ホタテ貝（Ｐａｔｉｎｏｐｅｃｔｅｎ　ｙｅｓｓｏｅｎｓｉｓ）由来の新規の構造を有するグラニュリン関連ポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、並びにホタテ貝から採取することによる該ポリペプチドの製造方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列からなる請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
ホタテ貝（Ｐａｔｉｎｏｐｅｃｔｅｎ　ｙｅｓｓｏｅｎｓｉｓ）から採取することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な構造を有する成長因子グラニュリン関連ポリペプチド、該ポリペプチドの遺伝子、及び該ポリペプチドの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
グラニュリン（ｇｒａｎｕｌｉｎ）は、エピセリン（ｅｐｉｔｈｅｌｉｎ）とも称され、１９９０年に、初めてヒト白血球、ラット骨髄及びラット腎臓から単離された成長因子である（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７３，１１６１−１１６８，１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，７９１２−７９１６，１９９０年）。グラニュリンは、１２個のシステイン残基を含む分子量約６，０００のポリペプチドであり、中央部分にはシステイン残基のペアが４カ所に数残基間隔で配置され、その前後に、単独のシステイン残基が２個ずつ配置された特徴的な１次構造を有している（Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１５８，１４５−１５１，１９９８年）。
【０００３】
ヒト及びラットからは、グラニュリン前駆体のｃＤＮＡが単離されており、該前駆体が約６００アミノ酸残基からなり、その中には、互いに構造の異なる７種類のグラニュリン配列が含まれていることが明らかにされている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６７，１３０７３−１３０７８，１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１７１５−１７１９，１９９２年）。コードされているグラニュリンのうち、ヒトでは５種類、ラットでは２種類のグラニュリンが実際にペプチドとして単離されており、ラットの２種類について細胞の増殖を制御する機能が見出されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７３，１１６１−１１６８，１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，７９１２−７９１６，１９９０年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６７，１３０７３−１３０７８，１９９２年、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，１０，１６９−１７４，１９９７年）。さらに、前駆体自体にも細胞増殖促進作用が報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７３，２００７８−２００８３，１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，３９９３−３９９８，２０００年）。
【０００４】
上記のグラニュリン構造を有するペプチドは、その後、魚類（コイ、金魚）の他に、節足動物のイナゴの脳に報告され、環形動物のヒルからは血液凝固阻止活性を示す成分として単離された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６８，９２３０−９２３７，１９９３年、Ｇｅｎ．Ｃｏｍｐ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，９９，２９８−３０６，１９９５年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０４，１４７−１５３，１９９２年、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，１６，３４０−３４６，１９９９年）。さらに、線形動物の線虫にもグラニュリン特有のアミノ酸配列をコードする遺伝子が見出されている（ＧｅｎｅＢａｎｋデータベース、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＣＡＢ５４３０４）。
【０００５】
グラニュリンファミリーに関連するこれらの研究結果は、該ポリペプチドの動物界における広範な分布を推測させ、同時に、細胞増殖及び個体の成長に深く関与している因子であることを示すものである。このことにより、グラニュリンは、他の成長因子と同様に、抗腫瘍剤等をはじめとする医薬品開発はもとより、農薬開発や畜産業あるいは水産業における飼育あるいは養殖技術開発においても重要な標的分子の一つになりつつあり、新規の構造もしくは新規の生理機能を有するグラニュリン関連ポリペプチドの提供が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、新規の構造を有するグラニュリン関連ポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。さらに第２の目的は、該ポリペプチドを生産する生物からの該ポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ホタテ貝（Ｐａｔｉｎｏｐｅｃｔｅｎｙｅｓｓｏｅｎｓｉｓ）の水溶性抽出物に含まれるペプチド成分の質量分析において、本発明によって提供される新規ポリペプチドを見出し、構造分析及び遺伝子解析により、該ポリペプチドが配列番号１に記載された５７アミノ酸残基からなることを決定するとともに、その１次構造の特徴から、成長因子グラニュリン関連ポリペプチドであることを明らかにし、本発明を完成するに至った。本発明は、軟体動物由来としては初めて見出された新規の構造を有するグラニュリン分子に関するものである。
【０００８】
即ち、請求項１に記載の本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに関する。
請求項２に記載の本発明は、請求項１に記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡに関する。
請求項３に記載の本発明は、配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列からなる請求項２に記載のＤＮＡに関する。
請求項４に記載の本発明は、ホタテ貝から採取することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドの製造方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明による配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ホタテ貝抽出物中に含まれるペプチド成分の質量分析において、５，８２９．４の分子量を有する新規のポリペプチドとして見出されたものである。本発明による該ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する限りは、その由来は特に限定されない。生物起源のもの、あるいは化学合成によって得られるもの等も全て包含される。該ポリペプチドは、例えば、好適な起源であるホタテ貝から採取することができる。以下に、その製造方法について説明する。
【００１０】
該ポリペプチドの原料としては、ホタテ貝の貝殻を除く内臓をそのまま用いても差し支えないが、中腸腺のみを原料として用いることによっても目的ペプチドを得ることができる。また、内臓は、冷凍保存した貝から採取したものであっても良いが、好ましくは生貝から採取した内臓を用いる。さらに、採取した内臓は、−２０℃以下、好ましくは−８０℃に保存することによって、適宜、該ポリペプチドの原料として用いることができる。
該ポリペプチドは、公知の酵素あるいはペプチドの精製方法、例えば、各種クロマトグラフィー法、限外濾過法、電気泳動法等を適宜組み合わせて用いることにより、これらの原料から、分離、精製することができる。例えば、採取したホタテ内臓を、希酢酸中で破砕、懸濁した後、遠心分離することにより、上清に該ポリペプチドを含む粗抽出物が得られる。この粗抽出物を、Ｃ１８逆相樹脂に吸着させて、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む２０〜６０％アセトニトリル、好ましくは２０％アセトニトリルで溶出することにより、該ポリペプチドを含む溶出液が得られる。この溶出液を凍結乾燥後、イオン交換クロマトグラフィー、次いで逆相クロマトグラフィーに供することによって、該ポリペプチドを精製することができる。これらの分離、精製過程では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ）質量分析法によって、該ポリペプチドに由来するシグナルを指標に、該ポリペプチドの含有画分を検出することができる。尚、本発明による該ポリペプチドは、内部標準法によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析において、５，８３０．４（［Ｍ＋Ｈ］＋）のシグナルを与える。
【００１１】
本発明による配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、以下に述べる構造分析並びに遺伝子解析によって、その１次構造が決定され、新規のグラニュリン関連ポリペプチドであることが明らかにされた。
即ち、上記の製造方法によって得られる該ポリペプチドを、常法に従って、還元ピリジルエチル化反応に供し、質量分析を行った結果、１２個のピリジルエチル基の導入が認められた。また、この修飾反応において、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）還元のみを施した場合には、同じく、質量分析により、１２個の水素原子の付加が認められた。これらの結果から、本発明による該ポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖からなり、１２個のシステイン残基を含み、しかも全てのシステイン残基が分子内においてジスルフィド結合により架橋していることが明かとなった。さらに、精製したピリジルエチル化物について、気相エドマン法によるアミノ酸配列分析に供し、アミノ末端から１６残基のアミノ酸配列（配列番号４）を決定した。
【００１２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡは、ホタテ貝由来ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号４に記載の該ポリペプチドのアミノ末端領域のうち３残基目から１０残基目の配列（Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）に対応する塩基配列からなる混合塩基を含むセンスプライマー（配列番号５）を用いて、ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ）法により、該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの下流側領域の増幅を行い、クローン化することによって得られた。
上記手法により、配列番号４のアミノ酸配列がコードされている目的のｃＤＮＡクローンとして、鎖長の異なる種々のクローンが単離された。これらの塩基配列を解析した結果、何れのクローンも、配列番号２または３に記載の１７１塩基対の配列を含んだ２３７塩基対からなる極めて相同性の高い配列が、直列に複数回繰り返された配列を有していることがわかった。即ち、この２３７塩基対からなる繰り返し単位の塩基配列は、配列番号２または３に記載のＤＮＡにコードされた配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む全長７９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列をコードしたものである。
【００１３】
上記の繰り返し単位の塩基配列にコードされているアミノ酸配列からなるポリペプチドの分子量を検討した結果、配列番号２または３に記載の配列にコードされる配列番号１に記載のアミノ酸配列が、配列番号４に記載の配列をアミノ末端とする５７アミノ酸残基からなり、しかも分子量５，８４１．５（計算値）のポリペプチドに相当する配列であることがわかった。即ち、配列番号１に記載のアミノ酸配列中には１２個のシステイン残基が含まれており、全システイン残基がジスルフィド結合によって架橋した場合、分子量５，８２９．４（計算値）を与え、本発明による該ポリペプチドの分子量測定値に一致する。これらは、前記のピリジルエチル化物の質量分析において得られた結果とも矛盾しない。以上の構造分析及び遺伝子解析の結果から、本発明による新規ポリペプチドは、配列番号２または３に記載のＤＮＡにコードされた配列番号１に記載のアミノ酸配列からなることが決定された。尚、配列番号２及び３に記載されている塩基配列は、塩基番号４５番のみが互いに異なるが、当該部位にコードされているアミノ酸残基は同一（トレオニン）である。
【００１４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列について、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ）によって提供されているＦＡＳＴＡ検索プログラムを利用して、相同性検索を行った結果、成長因子グラニュリンファミリーとの相同性が高い新規のアミノ酸配列であることが判明した。さらに、分子量、システイン残基数及びシステイン残基の配置などグラニュリンのアミノ酸配列の特徴も保持されていた。このことから、本発明による配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する新規ポリペプチドは、成長因子グラニュリンファミリーに属する新規のポリペプチドであることが明かとなった。現在までのところ、軟体動物由来のグラニュリン分子に関する報告はない。
【００１５】
本発明による配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、もしくは配列番号２及び３に記載されている塩基配列からなるＤＮＡは、上記のように天然から採取されるものの他、公知の手法である化学合成法、あるいは化学合成法にポリメラーゼやリガーゼ等の酵素反応を併用することによって得られるもの等も全て包含される。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡは、該アミノ酸配列をコードするものであれば、その塩基配列は特に限定されない。
【００１６】
【実施例】
以下に、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００１７】
尚、実施例中に記載の質量分析は、全て、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（機種名Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ　ＳＴＲ、アプライドバイオシステムズ社製）を用い、同社マニュアルに従って測定した。マトリックスとしては、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を用いた。副腎皮質刺激ホルモンのペプチド断片であるＡＣＴＨ（１８−３９）及びウシインスリンを質量校正用標準ペプチドとし、リニアモードにより測定した。
【００１８】
実施例１（ホタテ貝中腸腺からのポリペプチドの抽出）
２〜４齢のホタテ貝から、氷冷しながら中腸腺を採取し、直ちに−８０℃に保存して、適宜、抽出に用いた。
中腸腺（７９．６ｇ）に、氷冷した５倍量の１Ｍ酢酸を加え、ワーリングブレンダー（１０，０００ｒｐｍ、３０秒間×３、４℃）で破砕後、４℃で１時間撹拌抽出した。懸濁液を遠心分離（８，０００×ｇ、３０分間、４℃）して上清を粗抽出物として回収した。この粗抽出物を０．１％ＴＦＡで平衡化したＣ１８逆相樹脂のカラム（４×４０ｃｍ、ワコーゲル５０Ｃ１８、和光純薬工業社製）に供し、０．１％ＴＦＡ（１０００ｍｌ）で洗浄後、２０％アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡ（１０００ｍｌ）で溶出した。溶出液を凍結乾燥し、目的のポリペプチドを含む１．１７ｇの乾燥粉末を得た。
【００１９】
実施例２（ポリペプチドの精製）
実施例１において得られた凍結乾燥粉末（５００ｍｇ）を２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）３０ｍｌに溶解して、同緩衝液で平衡化したＣＭ−セファロースのカラム（２．５×４０ｃｍ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、同緩衝液（１０００ｍｌ）で洗浄後、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を溶離液として展開した。溶出液を１０ｍｌずつ分画し、各画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に供し、該ポリペプチドに由来するシグナルを与える画分を目的のポリペプチド含有画分として回収した。該ポリペプチドは、およそ４５０ｍｌの上記溶離液の添加によって溶出された。
上記のポリペプチド含有画分を、さらに逆相クロマトグラフィー（ＰｏｒｏｓＲ２／Ｍカラム、４．６×１００ｍｍ、アプライドバイオシステムズ社）に供することにより精製した。流速５ｍｌ／ｍｉｎで、５−４０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡの直線濃度勾配で展開した。溶出液は１ｍｌずつ分画した。各画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に供し、およそ１８％のアセトニトリル濃度で溶出される該ポリペプチドに由来するシグナルを与える画分を目的ポリペプチド含有画分として回収した。回収画分を凍結乾燥することにより、０．６５ｍｇの無色粉末として該ポリペプチドを得た。このことから、本発明による新規ポリペプチドは、ホタテ中腸腺１ｇ当たり少なくとも１９μｇの精製標品として得られることがわかった。精製ポリペプチドは、２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（機種名、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）により、分子量約６，０００の単一のバンドを示した。また、該精製ポリペプチドを、ＡＣＴＨ（１８−３９）及びウシインスリンを内部標準としてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に供した結果、５，８３０．４（［Ｍ＋Ｈ］＋）のシグナルを観測した。即ち、本発明による新規ポリペプチドは、分子量５，８２９．４（測定値）であることがわかった。
【００２０】
実施例３（還元ピリジルエチル化）
実施例２において得られた精製ポリペプチド１０μｇに３００μｌの反応用緩衝液（７Ｍグアニジン塩酸、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．５）を加え、窒素置換後、１ｍｇのＤＴＴを加えて室温で２時間放置した。還元後、２μｌの４−ビニルピリジンを加えて室温でさらに４時間放置した。反応終了後、ピリジルエチル化反応液に、終濃度２％のギ酸を加えて、逆相クロマトグラフィー（Ｐｏｒｏｓ　Ｒ２／Ｍカラム、４．６×１００ｍｍ、アプライドバイオシステムズ社）に供した。流速５ｍｌ／ｍｉｎで、５−６０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡの直線濃度勾配で展開した。溶出液の２５５ｎｍの吸光度を測定し、およそ３０％のアセトニトリル濃度で溶出される２５５ｎｍの吸光度のピークを与える画分を、該ポリペプチドのピリジルエチル化物の画分として回収した。回収物を凍結乾燥し、以後の分析に用いた。
この精製ピリジルエチル化物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に供した結果、７，１０４．２（［Ｍ＋Ｈ］＋）のシグナルを与えた。このことから、該ポリペプチドは、還元ピリジルエチル化によって、１２個のピリジルエチル基が付加されることがわかった。
さらに、上記反応で４−ビニルピリジンを添加せず還元のみを行った試料、即ち、実施例２において得られた精製ポリペプチド１０μｇに３００μｌの反応用緩衝液（７Ｍグアニジン塩酸、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．５）を加え、窒素置換後、１ｍｇのＤＴＴを加えて室温で４時間放置した試料について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に供した結果、該ポリペプチドの還元物は、５，８４２．６（［Ｍ＋Ｈ］＋）のシグナルを与えた。このことから、該ポリペプチドは、還元処理によって、１２個の水素原子が付加されることがわかった。
以上の結果から、本発明による該ポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖からなり、１２個のシステイン残基を含み、しかも全てのシステイン残基が分子内においてジスルフィド結合により架橋していることが明かとなった。
【００２１】
実施例４（アミノ酸配列分析）
実施例３で得られたピリジルエチル化物のアミノ末端配列を気相シーケンサー（型式ＰＰＳＱ−１０、島津製作所製）によって解析した。その結果、配列番号４に記載のアミノ末端から１６残基の配列が決定された。
【００２２】
実施例５（ＲＮＡの調製）
ホタテ貝の稚貝（殻径約１〜４ｍｍ）を液体窒素で凍結し、ＲＮＡの抽出に用いた。ホタテ全ＲＮＡの調製は、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ　Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ　Ｐｈｅｎｏｌ　Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法を用い、以下のように行なった。
凍結した稚貝（２．６ｇ）に、２６ｍｌの細胞破砕溶液（４Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、０．１Ｍ２−メルカプトエタノール）を加え、直ちにポリトロンにて破砕（１０秒間×３）した。懸濁液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間、室温）して不溶物を除去し、上清に２．６ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を加えて撹拌した後、２６ｍｌの水飽和フェノールを加えて撹拌した。この混合液に５．２ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（４９：１、ｖ／ｖ）を加えて撹拌し、氷中に１５分間静置後、遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）した。水層を回収し、水層に２６ｍｌのイソプロパノールを加えて、−２０℃で３０分間静置した後、生じたＲＮＡの沈殿を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）により回収した。沈殿を１．４ｍｌの細胞破砕溶液に溶解し、等量のイソプロパノールを加えて−２０℃に３０分間静置後、遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）により沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールに懸濁、遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）によって再度沈殿を回収し、風乾した結果、２．６ｍｇのＲＮＡが得られた（収率０．１％）。得られたＲＮＡ（５００μｇ）から、オリゴｄＴセルロースによるｍＲＮＡ精製キット（商品名ｍＲＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ、商品コード２７−９２５８−０２、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、同社マニュアルに従って、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。その結果、９．６μｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡが得られた（収率１．９％）。
【００２３】
実施例６（ｃＤＮＡの調製）
実施例５で調製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを調製した。反応は、ＲＴ−ＰＣＲ反応キット（商品名ＲＮＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ、商品コードＲＯ１９Ａ、宝酒造社製）を用い、同社の添付資料の方法に従って行った。即ち、２００ｎｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ、１２．５ｐｍｏｌのキット添付のオリゴｄＴ−アダプタープライマー、２５ユニットのＡＭＶ由来逆転写酵素（Ａｖｉａｎ　ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ由来Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ＸＬ）、１００ユニットのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム及び５ｍＭ塩化マグネシウムからなる総量１００μｌの反応液とし、５０℃で３０分間保温して１本鎖ｃＤＮＡを調製した。反応後、９９℃で５分間加熱し、氷冷後、以後の実験に用いた。
【００２４】
実施例７（ｃＤＮＡの増幅及びクローニング）
実施例６で調製されたｃＤＮＡを鋳型として、ＲＡＣＥ法により該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの下流側領域の増幅を行った。プライマーとして、実施例４において決定されたポリペプチドのアミノ末端配列（配列番号４）のうち３残基目から１０残基目の配列（Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）に対応する塩基配列からなる混合塩基を含むセンスプライマー（配列番号５）、及び前記オリゴｄＴ−アダプタープライマー中のアダプター領域の配列からなるアダプタープライマー（配列番号６）を用いた。
【００２５】
反応は、実施例６で調製した逆転写反応液を鋳型ＤＮＡ溶液とし、ＰＣＲキット（商品名ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、商品コード２０３２０３、キアゲン社製）を用いて、同社の添付資料の方法に従って行った。即ち、２μｌの前記の逆転写反応液、１μＭの混合塩基を含むセンスプライマー（配列番号５）、２００ｎＭのアダプタープライマー（配列番号６）、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼ（ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びキット添付の反応緩衝液からなる全量５０μｌの反応溶液を調製した。これを、９５℃で１５分間加熱処理後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で３分間の反応サイクルを４０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間の反応を行った後、４℃に冷却して反応を終了した。増幅されたｃＤＮＡを、リガーゼを用いて大腸菌プラスミド（商品名ｐＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ、ノバジーン社製）に連結し、得られた組換えＤＮＡを用いて、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換することによりｃＤＮＡクローンを得た。
【００２６】
ｃＤＮＡクローンの塩基配列は、ＤＮＡシーケンサー（型式ＳＱ−５５００、日立製作所製）を用いて分析した。反応は、サイクルシーケンシング反応キット（商品名Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ｐｒｅ−ｍｉｘｅｄ　ｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ、日立計測器サービス社より購入）を用い、同社の添付資料の方法に従って行った。その結果、配列番号４に記載の目的アミノ酸配列をコードした鎖長の異なる数種のｃＤＮＡクローンを得た。これらの目的ｃＤＮＡクローンは、２３７塩基対からなる極めて相同性の高い配列が、直列に複数回繰り返された配列を有していることがわかった。
【００２７】
本発明による配列番号２または３に記載の１７１塩基対の配列は、実施例４において得られたアミノ酸配列（配列番号４）をアミノ末端とする配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、上記２３７塩基対からなる繰り返し単位の配列中に見出された。即ち、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、分子量５，８４１．５（計算値）のポリペプチドに相当し、しかも該配列中に含まれる１２個のシステイン残基がジスルフィド結合によって架橋した場合、分子量５，８２９．４（計算値）を与える。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、分子量７，１０３．２（計算値）のピリジルエチル化物を与える。即ち、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、実施例２において得られた精製ポリペプチドの分子量測定値に一致し、また、実施例３において得られた、該ポリペプチドのＤＴＴ還元物及び該ポリペプチドのピリジルエチル化物の質量分析結果によっても支持される配列である。以上の結果から、本発明による新規ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなることが明らかとなった。
【００２８】
【発明の効果】
本発明は、新規構造を有する軟体動物由来の成長因子グラニュリン並びにそれをコードするＤＮＡを提供する。このことにより、医薬、農薬開発の他、畜産業あるいは水産業における飼育あるいは養殖技術開発に有用な手段を提供するものである。さらに、本発明によれば、水産加工廃棄物等から成長因子グラニュリンを容易に製造でき、しかも該廃棄物が有効に活用されることによって環境保全にも貢献する。
【００２９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（ＲＡＣＥに用いた混合塩基を含むセンスプライマー配列、位置（６）、（１２）及び（１８）はａ、ｃ、ｇまたはｔ。配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（ＲＡＣＥに用いたアダプタープライマー配列）。
【００３０】
【配列表】
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