(57)【要約】　　【構成】膣分泌液又は頸管粘液中のサイトカイン量を測定する切迫早産妊婦の膣分泌液又は頸管粘液の鑑別法。　　【効果】切迫早産妊婦の膣分泌液等を感度良く鑑別することができ、早産の検出、治療などに有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　切迫早産のトコライシス治療の前後において妊婦の膣分泌液中のインターロイキン−８濃度を測定し、比較することを特徴とする、切迫早産妊婦のトコライシス治療の効果を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、早産の検出に有用な、切迫早産妊婦の膣分泌液又は頸管粘液の鑑別法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　妊娠に伴う異常として早産があり、その原因は多岐にわたるが、主に上行感染、子宮内感染、絨毛羊膜炎や胎盤早期剥離とされている。
　感染症や絨毛羊膜炎が原因の場合、母体血液中の血中Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）濃度や、白血球数が増加するため、これらを測定することにより、早産の検査が実施されている。
【０００３】
　しかしながら、ＣＲＰ濃度や白血球数は血液由来であるため、早産以外の別の因子によっても上昇してしまい、早産にのみ特異的なものとは言い難かった。またＣＲＰは血液中に微量にしか検出されず、測定の感度は低いという問題もあった。このように、血液中のＣＲＰ濃度や白血球数を測定し、早期に早産を診断することは困難であった。
【０００４】
　これに対し、最近、血液中のインターロイキン−６（ＩＬ−６）を測定することにより流早産を診断する方法が報告されている（特許文献１）。しかしながら、この方法においても、検体が母体血液であるため、感度や特異性などの点で充分満足できるものではなかった。
【特許文献１】特願平５−２０９８８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　従って、本発明の目的は、早産の指標となる物質を検索し、その鑑別法を確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
　斯かる実状に鑑み、本発明者らは鋭意研究を行った結果、膣分泌液又は頸管粘液中のサイトカイン濃度上昇が、切迫早産妊婦に特異的であり、このサイトカイン量を測定すれば、切迫早産妊婦の膣分泌液等を鑑別できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、切迫早産のトコライシス治療の前後において妊婦の膣分泌液中のインターロイキン−８濃度を測定し、比較することを特徴とする、切迫早産妊婦のトコライシス治療の効果を判定する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
　本発明によれば、切迫早産妊婦の膣分泌液又は頸管粘液を感度良く鑑別することができ、早産の検出や診断、治療などに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
　本発明において使用する検体は、膣分泌液又は頸管粘液のいずれであってもよい。これらを採取する方法としては、膣や子宮頸管等にダメージを与えないように採取できる方法であれば特に制限されず、例えば注射筒の先にシリコンチューブ等のチューブや注射針などをつけ、これらを膣に挿入して採取する方法；注射筒自体を膣に挿入して採取する方法；後膣部円蓋に綿棒等の吸収材を挿入し、これに頸管粘液等を吸収させる方法などが挙げられる。これらのうち、綿棒を用いる方法が簡便であり好ましく、特にダクロン綿棒を用いると、抽出効率も良くなりより好ましい。綿棒を用いて検体を採取する場合には、まず綿球等で膣内の不純物を取り除き、膣鏡で確認しながら行うのが好ましい。
【０００９】
　このようにして採取した検体は、そのまま測定に用いることもできるが、膣分泌液や頸管粘液の原液は粘性が非常に高く、ゾル状であったり、クロット化している場合が多いので、これらを希釈又は抽出して用いるのが好ましい。希釈又は抽出には、pH６〜８の緩衝液を用いるのが好ましく、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グット緩衝液などが挙げられ、緩衝液のpHはpH７．２〜７．８の範囲であるのがより好ましい。
【００１０】
　これらの緩衝液を用いて検体を希釈又は抽出するには、例えば注射筒を用いて検体を採取した場合には、検体を裁断するようにつぶし、これと緩衝液を混合することにより、ゾル状又はクロット状の検体中のサイトカインを緩衝液中に抽出するのが好ましい。この場合、用いる緩衝液は、検体の約５倍量以上であるのが、充分な抽出を行うために好ましい。
　また、綿棒を用いて検体を採取した場合には、検体を吸収させた綿棒を緩衝液に浸し、この綿棒で緩衝液を攪拌することによって、緩衝液中に検体を抽出するのが好ましい。
【００１１】
　膣分泌液又は頸管粘液中のサイトカイン量を測定する方法としては、バイオアッセイ法、免疫学的測定法など、サイトカイン量を測定できる方法であれば、公知の方法のいずれでもよいが、特に免疫学的に定量する方法を用いるのが好ましい。なお、ここで測定するサイトカインとしては、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を測定することにより、切迫早産妊婦の膣分泌液等を鑑別することができる。これらのサイトカインのうち、特にＩＬ−６、ＩＬ−８を測定するのが好ましい。
【００１２】
　例えば、検体中のＩＬ−６をＥＬＩＳＡ法で測定するには、通常の方法に従って行えばよく、例えば９６穴のマイクロタイタープレートに第一抗体すなわちＩＬ−６に特異的なモノクローナル、又はポリクローナル抗体を感作したものを固相とし、これと検体を反応させることによって、固相上の抗体と検体中のＩＬ−６を結合させる。次いで洗浄操作によって未反応の蛋白を除去した後、第二抗体、すなわちＩＬ−６に特異的な酵素標識モノクローナル、又はポリクローナル抗体を反応させて、ＩＬ−６を介した抗原抗体反応によるサンドウィッチを形成させる。余剰の第二抗体を洗浄によって除去した後、第二抗体の標識酵素に対する基質溶液を加えて発色させ、停止液で酵素反応を停止させる。そして吸光度を吸光度計により測定し、標準品の検量線から試料中のＩＬ−６濃度を換算すればよい。
【００１３】
　また、インターロイキン−８（ＩＬ−８）及び他のサイトカインについてもＩＬ−６の測定法と同様にして測定することができる。また、市販のＩＬ−６、ＩＬ−８濃度測定用のサンドウィッチＥＬＩＳＡキットなどを用いることもできる。
【００１４】
　このようにして測定したサイトカイン量により切迫早産妊婦の膣分泌液又は頸管粘液を鑑別することができ、具体的には、正常妊婦のサイトカイン量と対比して、高い値を示したものを切迫早産妊婦の膣分泌液等であるとすることができる。
　このように、妊婦の膣分泌液又は頸管粘液中のサイトカインを測定することで、正常妊婦と切迫早産妊婦の鑑別ができる。
【実施例】
【００１５】
　以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
　妊娠週齢の異なる正常妊婦８例、切迫早産と診断された妊婦８例の膣分泌液中のＩＬ−６、ＩＬ−８量及び血清中のＣＲＰ濃度と血液中の白血球数を下記の如く測定した。これらの結果を表１、表２、図１及び図２に示す。
【００１７】
検体採取法：
　妊婦の後膣部円蓋にダクロン綿棒を挿入し、１０秒間程度綿棒を回転しながら膣分泌液を吸収させ、これを１mlの抽出液（５０mM　２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、１％　ＢＳＡ、０．８９％　塩化ナトリウム、０．２％　エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、１μｌ／ml　アプロチニン、１μｌ／ml　ジメチルスルホキシド、０．１７mg／ml　フェニルメチルスルホニルフルオライド、１μｌ／ml　ポリオキシエチレノクチルフェニルエーテル、０．５mg／ml　アジ化ナトリウム；pH７．５）に浸し、ダクロン綿棒で抽出液を攪拌することによって、ダクロン綿棒に吸収された膣分泌液を抽出した。これを試料とした。尚、必要に応じて、抽出液で希釈して用いた。
【００１８】
ＩＬ−６測定法：
　Ｒ＆Ｄ社Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅの測定方法に従って、以下のように膣分泌液中のＩＬ−６を測定した。すなわち、まずマウス抗ＩＬ−６モノクローナル抗体を感作してあるマイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌずつアッセイ希釈液を分注した後に、試料を１００μｌずつ加えた。次いで室温で２時間静置反応させた後、洗浄液各ウェル４００μｌずつで３回洗浄した。洗浄液を除去後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体溶液を各ウェルに２００μｌずつ加え、室温で２時間静置反応させた。洗浄液４００μｌずつで３回洗浄後、テトラメチルベンチジンを基質とした発色溶液を各ウェル２００μｌずつ加え、室温で２０分間静置反応させた後、２Ｎの硫酸を停止液として各ウェルに５０μｌずつ加えて酵素反応を停止した。マイクロタイタープレートリーダーの測定波長を４５０nmと５５０nmの２波長に設定し、吸光度を測定した。試料中のＩＬ−６濃度は、標準品の検量線から換算した。
【００１９】
ＩＬ−８測定法：
　Ｒ＆Ｄ社Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅの測定方法に従って、以下のように膣分泌液中のＩＬ−８を測定した。すなわち、まずマウス抗ＩＬ−８モノクローナル抗体を感作してあるマイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌずつアッセイ希釈液を分注した後に、試料を１００μｌずつ加えた。次いで室温で２時間静置反応させた後、洗浄液各ウェル４００μｌずつで３回洗浄した。洗浄液を除去後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ＩＬ−８ポリクローナル抗体溶液を各ウェルに２００μｌずつ加え、室温で２時間静置反応させた。洗浄液４００μｌずつで３回洗浄後、テトラメチルベンチジンを基質とした発色溶液を各ウェル２００μｌずつ加え、室温で２０分間静置反応させた後、２Ｎの硫酸を停止液として各ウェルに５０μｌずつ加えて酵素反応を停止した。マイクロタイタープレートリーダーの測定波長を４５０nmと５５０nmの２波長に設定し、吸光度を測定した。試料中のＩＬ−８濃度は、標準品の検量線から換算した。
【００２０】
　一方、ＣＲＰ濃度は、妊婦の血清を試料として市販のキット（ヤトロン社製、ラテックス凝集法）で測定した。白血球数は、妊婦血液を用いてシスメックス社製自動血球計算機で測定した。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
【表２】
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【００２３】
　以上の結果から、ＩＬ−６の膣分泌液中濃度は、正常妊婦の場合、８例中６例が測定検出限界（０．０３ng／ml）以下であるが、切迫早産群では０．４２〜１３．０ng／mlとＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｅｎｅｙ検定で有意（ｐ＜０．００１）に高値を示し、膣分泌液中のＩＬ−６量を測定することで切迫早産妊婦の膣分泌液を鑑別することができ、早産の検出が可能であることが判る（表１、表２、図１）。
　また、ＩＬ−８の膣分泌液中濃度は、正常妊婦の場合１．５〜１２．１ng／mlであるが、切迫早産群では４１．５〜１６８０ng／mlとＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｅｎｅｙ検定で有意（ｐ＜０．００１）に高値を示し、膣分泌液中のＩＬ−８量を測定することで切迫早産妊婦の膣分泌液を鑑別することができ、早産の検出が可能であることが判る。（表１、表２、図２）。
【００２４】
　また、血清中のＣＲＰ濃度が異常（０．８mg／dl以上）とならなかった例が、切迫早産群８例中６例存在し、血液中ＣＲＰ濃度では効果的に早産が検出されなかった。
　血液中白血球数は正常値（４０００〜８０００ケ／mm3）を切迫早産群８例中３例が示し、白血球数の検査では、全ての切迫早産を検出しえなかった。
【００２５】
実施例２
　妊娠２５週で切迫早産と診断されトコライシス治療を行ったが、５日目に早産に至った症例を図３に示した。縦軸に膣分泌液中のＩＬ−６、ＩＬ−８濃度及び血清中ＣＲＰ濃度を示し、横軸を初診日からの日数とした。
　妊婦膣分泌液中のＩＬ−６、ＩＬ−８濃度は、実施例１と同様に試料を採取し、抽出して測定した。ＩＬ−６濃度はＩＬ−６測定用ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社製）を、ＩＬ−８濃度はＩＬ−８測定用ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社製）を用いて行った。
　その結果、ＩＬ−６とＩＬ−８濃度はともに上昇し続けて早産に至っており、膣分泌液中のＩＬ−６、ＩＬ−８の濃度の増加は臨床症状と一致した。しかし、従来法である血清中ＣＲＰ濃度では早産の直前にならなければ異常値とならなかった。
【００２６】
実施例３
　妊娠３０週で切迫早産と診断され、トコライシス治療により満期産に至った例を図４に示した。縦軸に膣分泌液中のＩＬ−６、ＩＬ−８濃度及び血清中ＣＲＰを示し、横軸を初診日からの日数とした。妊婦膣分泌液中のＩＬ−６、ＩＬ−８濃度は、実施例１と同様に検体を採取、抽出して測定した。
　症状が安定するに従い、ＩＬ−６、ＩＬ−８濃度は低下傾向を示した。治療の効果判定をモニタリングするのに膣分泌液中のＩＬ−６、ＩＬ−８濃度の測定は有効であった。
【００２７】
実施例４
　切迫早産群の血清中のＩＬ−６及びＩＬ−８並びに膣分泌液中のＩＬ−６及びＩＬ−８の濃度変化を実施例１に準じて測定した。この結果を表３に示す。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
　血清中のＩＬ−６、ＩＬ−８量は少量であり、測定範囲下限付近であるが、膣分泌液にはＩＬ−６、ＩＬ−８は測定十分量存在する。従って局所に近い膣分泌液を試料とすることで、少量の試料で切迫早産妊婦の膣分泌液を鑑別することが可能であり、血清、血漿及び血液よりも感度よく早産を検出できる。
【００３０】
実施例５
　妊娠３０週で切迫早産と診断されトコライシス治療を行ったが、２０日目に帝王切開で早産に至った例について、実施例１と同様にしてＩＬ−６及びＩＬ−８を測定した。この結果を表４に示す。
【００３１】
【表４】
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【００３２】
　初診日の検査結果から、膣分泌液中のＩＬ−６とＩＬ−８は異常と判断できる高濃度を示したが、血清中ＣＲＰ濃度と血液中白血球数は正常範囲であった。その後もＩＬ−６とＩＬ−８は高値を維持して早産に至ったが、白血球数は初診から１０日目に異常を示し、ＣＲＰ濃度においては早産直前に異常となった。このように、膣分泌液中のＩＬ−６及びＩＬ−８濃度を測定することにより、切迫早産妊婦の膣分泌液を鑑別することができ、血清中ＣＲＰ濃度や血液中の白血球数を測定するよりも早期に早産を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】膣分泌液中のＩＬ−６濃度を、正常妊婦群（左）と切迫早産群（右）で比較した図である。
【図２】膣分泌液中のＩＬ−８濃度を、正常妊婦群（左）と切迫早産群（右）で比較した図である。
【図３】切迫早産と診断され、治療を実施したが早産に至った妊婦の膣分泌液中のＩＬ−６、ＩＬ−８濃度及び血清中ＣＲＰ濃度の変化を示す図である。
【図４】切迫早産と診断され、治療により快復し満期に正常分娩した妊婦の膣分泌液中のＩＬ−６、ＩＬ−８濃度及び血清中ＣＲＰ濃度の変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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