(57)【要約】【課題】従来のマイクロアレイは、プローブ固定量の測定が困難であった。また、特異的配列の両端に共通配列を具備するターゲット核酸の複数を検出する際、１）ターゲット核酸が長いために分子内２次構造を形成してプローブ間とのハイブリダイズが形成されにくく、偽陰性データが出やすい。２）ターゲット核酸が長い割に、特異配列が短くハイブリダイズの安定性が低く洗浄を穏やかな条件で行う必要があり、偽陽性データが出やすかった。【解決手段】特異的配列に相補的な特異的相補配列に加え、更に共通配列の全体もしくは一部に相補的で、且つ前記特異的相補配列の鎖長より短い共通相補配列をも含む核酸を具備することを特徴とするプローブを提供する。また、固定化用支持体上に固相化したプローブの量を測定する方法を提供する。更に、試料中に存在する複数種類の前記ターゲット核酸の各々の存在量を推定する方法を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的配列の両端に共通配列を具備するターゲット核酸を測定するためのプローブであって、
該プローブは、前記特異的配列に相補的な特異的相補配列に加え、更に前記共通配列の全体もしくは一部に相補的で、且つ前記特異的相補配列の鎖長より短い共通相補配列をも含む核酸を具備することと、
該共通相補配列は、前記特異的相補配列の３’端および／または５’端に直接もしくはリンカーを介して連結していることと、並びに、
該プローブの一端が、固定化用支持体に直接もしくは固定化用リンカーを介して固相化されていることと、
を特徴とするプローブ。
【請求項２】
請求項１に記載のプローブであって、前記特異的相補配列の鎖長が１０〜５０塩基であり、前記共通相補配列の鎖長が５〜３０塩基であるプローブ。
【請求項３】
請求項１または２の何れか１項に記載のプローブであって、前記核酸が、デオキシリボ核酸、リボ核酸およびペプチド核酸からなる群から選択されるプローブ。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のプローブであって、前記リンカーが、アルキル鎖等の長鎖化合物、アデニン塩基からなる核酸、チミン塩基からなる核酸およびポリペプチド鎖からなる群から選択されるプローブ。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のプローブを、請求項１で定義した共通配列に相補的な配列を含み且つ標識物質で標識した既知量の固定量測定用核酸を使用して測定する方法であって、
１）前記プローブと、前記固定量測定用核酸とを接触させ、両者を特異的にハイブリダイズさせる工程と、
２）工程１におけるハイブリッドの生成を、前記標識物質に基づく測定手段により測定する工程と、
３）工程２で得られる測定結果に基づき、前記支持体上の前記プローブの量を計算する工程と、
を具備する方法。
【請求項６】
マイクロアレイ上に固相化された請求項１〜４の何れか１項に記載のプローブと、請求項１で定義した共通配列に相補的な配列を含み且つ標識物質Ａで標識した既知量の固定量測定用核酸とを使用して、前記マイクロアレイ上で前記ターゲット核酸の存在量を測定する方法であって、
１）前記標識物質Ａとは異なる標識物質Ｂで標識した前記ターゲット核酸を含む試料を作成する工程と、
２）前記プローブと、工程１の試料と、前記固定量測定用核酸とを接触させ、特異的にハイブリダイズさせる工程と、
３）工程２のハイブリッドの生成を、使用する標識物質に基づく測定手段により測定する工程と、
４）工程３で得られる測定結果に基づき、該試料中の前記ターゲット核酸の存在量を計算する工程と、
を具備し、
マイクロアレイ上の各々のスポット間の前記プローブの固相化量比が、標識物質Ａの測定結果から計算され（計算値Ａ）、
前記ターゲット核酸として使用される既知量のターゲット核酸の前記プローブに対するハイブリダイズ量が、標識物質Ｂの測定結果から計算され（計算値Ｂ）、
該試料中に存在する複数種類の前記ターゲット核酸の各々の存在量を計算値ＡおよびＢから外挿して推定することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸を検出するプローブの技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡマイクロアレイは多種類のプローブが不活性な支持体上に高密度に固定化されていることを構造的特長とし、同一試料中に存在する遺伝子などの多種類の核酸試料を同時に検出測定できることを機能的特徴とする核酸の分析方法である。従って、当該技術においては、多種類のプローブを同一条件下で反応させることが想定されており、一般的に各プローブは均一な反応性を有するものを使用することが好ましいとされている。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイには、支持体上に生体由来のｃＤＮＡを固定する方式と合成オリゴＤＮＡプローブを固定する方式とがある。このうち後者の方式は、ＤＮＡプローブを化学合成して作成するのでプローブの配列を任意に設定することができる。従って、上記のような均一な反応性を有する多種類のプローブ群を作成することが比較的容易に実施できる。
【０００４】
均一な反応性を有するプローブ群の設計において、各プローブのＤＮＡ配列が具備すべき好ましい条件は、（１）検出対象（ターゲット核酸）の遺伝子にのみ相補的であること、（２）融解温度（Ｔｍ）が一定の範囲に揃っていること、（３）２次構造をとりにくい配列であること、であると言われている。このような基準に従い適切な配列を選択して、遺伝子ごとの検出結果が大きく異なることがないようにしている。
【０００５】
ところが、マイクロアレイのプローブＤＮＡは、固相合成する（特許文献１）にしろ、ピンによる印刷（特許文献２）により固定するにしろ、必ず各スポット間で固定されるプローブ量が不均等となる。このような理由から、適切な配列を選択したプローブを使用して反応性を均一化しても、各スポット間の測定値を比較する方法では、試料中の各遺伝子の存在量を定量することはこれまで不可能であった。
【０００６】
次に、上記に説明したプローブによって検出されるターゲット核酸について説明する。従来技術においては、検出するターゲット核酸は生体から抽出、精製したｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換したものであった。しかしながら、タグ（特許文献３、特許文献４）、ジップコード（特許文献５）もしくは正規直交化配列（特許文献６）などと呼ばれる発明が最近出願された。これらの技術は、Ｔｍが揃っていて、且つクロスハイブリダイゼーションが少ないように設計したタグと呼ばれるオリゴＤＮＡを含有する様式に各遺伝子配列を変換して検出するという手法である。即ち、この変換により各遺伝子配列は、タグ配列及び該遺伝子特異的な遺伝子配列の双方を具備する核酸（タグ化ターゲット核酸）に変換される。この処理で複数種類のタグ配列を特定の核酸に付加し、各種のタグの情報を有する核酸を作成して比較分析することが可能となる。
【０００７】
また、タグ化ターゲット核酸が増幅される方法（特許文献７）も報告されている。この方法では、まず各遺伝子配列を適切なプライマー配列を両端に有するタグ化ターゲット核酸に変換する。次に、タグ化ターゲット核酸を前記プライマー配列に相補的なプライマーセットを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。このようにして、タグ化ターゲット核酸を増幅することができる。こうして増幅したタグ化ターゲット核酸を検出するには、検出する配列に相補的なプローブを固定した磁気マイクロビーズまたは蛍光標識マイクロビーズ（特許文献８）、或いはスライドガラス上にプローブをスポットしたマイクロアレイなどが用いられる。
【０００８】
また、前記プライマーが各タグ化ターゲット核酸に共通する共通プライマーであれば、各タグ化ターゲット核酸を共通プライマーを使用して一斉に増幅できる。
一般的に、これら共通プライマー配列にはＰＣＲに適した２０〜３０塩基程度の配列が選ばれる。
【０００９】
以上のように、タグを使用する技術においては、遺伝子配列に加えて、タグ配列、共通プライマー配列の各々に少なくとも２０塩基程度の配列が選択される。従って、被検出核酸であるタグ化ターゲット核酸の長さは短くとも６０塩基程度の比較的長い核酸にならざるを得ない。
【００１０】
しかし、各タグ化ターゲット核酸に共通する配列は、交差反応性（クロスハイブリダイゼーション）の問題から使用しない。このため対照的に、実質上プローブとして使用できる鎖長は短いものに制限される。即ち、各遺伝子の情報を取得する典型的な目的においては、タグ化ターゲット核酸中の各遺伝子に特異的な配列のみがプローブ配列として使用される。同様に、各タグの情報を取得する目的においてもタグに特異的なタグ配列のみがプローブ配列として使用される。このように、従来技術ではタグ化ターゲット核酸中のタグ配列または遺伝子配列に相補的な配列のみがプローブ配列として用いられている。
【００１１】
一般に６０塩基程度の長い鎖長を有するＤＮＡは分子内構造をとりやすいことが知られている。このため、長い鎖長を有するタグ化ターゲット核酸は、プローブに対する反応性が低く被検出核酸として最適なものとはいえない。タグ技術を利用する際の問題点の１つは、このような反応性の低さである。プローブに対する反応性を向上させる手段としてプローブ長を長く設定し、より高温でハイブリダイズさせることなどが考えられるが、上記で説明したプローブ長の制限からこれまで実施されたことはなかった。
【００１２】
【特許文献１】
特表平９−５０１５６１号公報
【００１３】
【特許文献２】
特許３２７２３６５号公報
【００１４】
【特許文献３】
特表平１０−５０７３５７号公報
【００１５】
【特許文献４】
特表２００２−５１８０６０号公報
【００１６】
【特許文献５】
特表２００１−５１９６４８号公報
【００１７】
【特許文献６】
特開２００２−１８１８１３号公報
【００１８】
【特許文献７】
特表２００１−５１４４８３号公報
【００１９】
【特許文献８】
特表平１０−５０７３５７号公報
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
従来のマイクロアレイには、次のような課題があった。
・プローブが固定される各スポット上のプローブ固定量の測定が困難であった。
また、複数のターゲット核酸において共通するプライマー配列などの共通配列を両端に備えたターゲット核酸を検出するとき、次のような課題があった。
・共通配列がプローブ配列にあるとすべてのプローブにターゲット核酸がハイブリダイズすることになり、特定のターゲット核酸を特異的に検出することができない。
・ターゲット核酸は比較的長いために比較的安定な分子内２次構造を形成する。このためターゲット核酸とプローブ間にハイブリダイズが形成されにくく、すなわち偽陰性データが出やすかった。
・ターゲット核酸が比較的長く構造をとりやすい割に、ターゲット核酸の中央の特異配列の長さが短くハイブリダイズの安定性が低いため検出感度が上げられない。この安定性の低さのために非特異吸着物の洗浄の段階を穏やかな条件で行う必要があり、偽陽性データが出やすかった。
本発明はこれらの点に着目し、より機能的な検出、および高感度でクロスハイブリダイゼーションが少ないターゲット核酸の検出を行うためのプローブ化合物を提供することを課題とする。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下に記載されるプローブおよび方法を提供することにより、本発明の課題を解決するものである。即ち、
特異的配列の両端に共通配列を具備するターゲット核酸を測定するためのプローブであって、
該プローブは、前記特異的配列に相補的な特異的相補配列に加え、更に前記共通配列の全体もしくは一部に相補的で、且つ前記特異的相補配列の鎖長より短い共通相補配列をも含む核酸を具備することと、
該共通相補配列は、前記特異的相補配列の３’端および／または５’端に直接もしくはリンカーを介して連結していることと、並びに、
該プローブの一端が、固定化用支持体に直接もしくは固定化用リンカーを介して固相化されていることと、
を特徴とするプローブが提供される。
【００２２】
また、前記プローブを、前記共通配列に相補的な配列を含み且つ標識物質で標識した既知量の固定量測定用核酸を使用して測定する方法であって、
１）前記プローブと、前記固定量測定用核酸とを接触させ、両者を特異的にハイブリダイズさせる工程と、
２）工程１におけるハイブリッドの生成を、前記標識物質に基づく測定手段により測定する工程と、
３）工程２で得られる測定結果に基づき、前記支持体上の前記プローブの量を計算する工程と、
を具備する方法が提供される。
【００２３】
更に、マイクロアレイ上に固相化された前記プローブと、前記共通配列に相補的な配列を含み且つ標識物質Ａで標識した既知量の固定量測定用核酸とを使用して、前記マイクロアレイ上で前記ターゲット核酸の存在量を測定する方法であって、
１）前記標識物質Ａとは異なる標識物質Ｂで標識した前記ターゲット核酸を含む試料を作成する工程と、
２）前記プローブと、工程１の試料と、前記固定量測定用核酸とを接触させ、特異的にハイブリダイズさせる工程と、
３）工程２のハイブリッドの生成を、使用する標識物質に基づく測定手段により測定する工程と、
４）工程３で得られる測定結果に基づき、該試料中の前記ターゲット核酸の存在量を計算する工程と、
を具備し、
マイクロアレイ上の各々のスポットにおける前記プローブの固相化量比が、標識物質Ａの測定結果から計算され（計算値Ａ）、
前記ターゲット核酸として使用される既知量のターゲット核酸の前記プローブに対するハイブリダイズ量が、標識物質Ｂの測定結果から計算され（計算値Ｂ）、
該試料中に存在する複数種類の前記ターゲット核酸の各々の存在量を計算値ＡおよびＢから外挿して推定することを特徴とする方法が提供される。
【００２４】
【発明の実施の形態】
特定のターゲット核酸のみを特異的に検出する目的においては、該ターゲット核酸のみに特異的に存在する配列をプローブとして用いるのが当該技術分野の技術常識である。従って、従来技術においては、複数のターゲット核酸に共通した配列に相補な配列は、プローブから排除すべきであると理解されている。
本発明は従来技術の認識とは異なる構成を採択することにより、従来技術からは予想できない有利な効果を奏するものである。
即ち、本発明は以下に説明されるプローブおよび方法を提供して本発明の課題を解決するものである。
【００２５】
［本発明で提供されるプローブ］
本発明によれば、特異的配列の両端に共通配列を具備するターゲット核酸を測定するためのプローブであって、
該プローブは、前記特異的配列に相補的な特異的相補配列に加え、更に前記共通配列の全体もしくは一部に相補的で、且つ前記特異的相補配列の鎖長より短い共通相補配列をも含む核酸を具備することと、
該共通相補配列は、前記特異的相補配列の３’端および／または５’端に直接もしくはリンカーを介して連結していることと、並びに、
該プローブの一端が、固定化用支持体に直接もしくは固定化用リンカーを介して固相化されていることと、
を特徴とするプローブが提供される。
【００２６】
以下、本発明が対象とする前記ターゲット核酸について説明する。
前記ターゲット核酸は、検出、測定を行う被検出物（被検出核酸）である。前記ターゲット核酸は、一般的には前記特異的配列、タグ配列などを具備する核酸の両端に前記共通配列を具備する核酸であるが、一端に前記共通配列を具備する核酸であってもよい。
【００２７】
前記特異的配列は、検出する試料中に存在する核酸分子のうち特定の核酸分子（群）が限定的に具備する配列のうちの一部からなる部分配列である。
一般的な適用において、前記特異的配列は、特定の遺伝子もしくは遺伝子群（遺伝子ファミリーなど）に由来する配列であり、他の遺伝子もしくは遺伝子群に由来する配列から特異的に区別される配列である。
【００２８】
前記特異的配列として使用する遺伝子の配列情報は、公共のデータバンクなどから取得可能であり、その情報のうち実際に検査する遺伝子の配列情報からマイクロアレイなどで通常用いられる手法などに従って適切に選択することができる。
【００２９】
前記共通配列は、前記特異的配列を具備する核酸の端に設けられる配列であり、多数の核酸に共通する配列である。前記共通配列は前記特異的配列以外の任意の特異的配列を使用して設計できるが、一般的な適用においてはＰＣＲに使用できるプライマー配列であることが好ましい。
【００３０】
前記共通配列に使用される配列は、当業者であれば使用する目的に応じてクロスハイブリ、Ｔｍ値などを総合的に判断して適切に設定することができる。
本発明が対象とするターゲット核酸の代表例が下記の［本発明の態様］に記載される。
【００３１】
以下、本発明のプローブの構成要素について説明する。
前記特異的相補配列は、前記特異的配列に相補的な配列である。
従って、前記特異的相補配列は、実験の目的に応じてマイクロアレイなどで通常用いられる手法などに従って前記特異的配列の全体もしくは一部から適切に選択される。
【００３２】
前記特異的相補配列が具備すべき一般的な条件は、（１）検出対象のターゲット核酸にのみ相補的であること、（２）融解温度（Ｔｍ）が一定の範囲に揃っていること、（３）２次構造をとりにくい配列であることなどである。
前記特異的相補配列の塩基数は１０〜１００もしくは１０〜５０程度の範囲であるが、より好ましくは１５〜８０、更に好ましくは２０〜６０、なお更に好ましくは２５〜４０、最も好ましくは２５塩基程度が使用される。
【００３３】
前記共通相補配列は、前記共通配列に相補的な配列である。
従って、前記共通相補配列も同様に前記共通配列の全体もしくは一部から選択されるが、その鎖長は前記特異的相補配列の鎖長よりも短い鎖長が選択される。
【００３４】
前記特異的相補配列および共通相補配列の鎖長は、使用する実験に応じて各種の「鎖長設定条件」を考慮して適切に設定できる。「鎖長設定条件」には、プローブの配列特異的に決定されるＧＣ含量、Ｔｍなどの「配列条件」、およびハイブリダイズ時の緩衝液の塩濃度、温度などの「ハイブリダイズ条件」などが含まれる。
【００３５】
当業者であれば、「鎖長設定条件」を適切に設定して本発明を実施することができる。本発明のプローブの前記特異的相補配列および共通相補配列の鎖長を決定するための一般的な手順を以下に説明する。
【００３６】
プローブの鎖長決定の手順：
一般的には、ターゲット核酸が第一に設計される、即ち、ターゲット核酸上の共通配列の配列構成及び鎖長、並びに特異的配列の配列構成及び鎖長が設計される。一般的な適用においては、前記共通配列はポリメラーゼ連鎖反応用のプライマー配列であり、前記特異的配列の両端に設定される。
続いて、このように設計されたターゲット核酸に対して適切に反応し得る本発明のプローブが第二に設計される。即ち、前記ターゲット核酸の配列に応じて、「適切な鎖長」の特異的相補配列に、「適切な鎖長」の共通相補配列を付加して設計する。
【００３７】
特異的相補配列における「適切な鎖長」は、同時に使用する複数のプローブにおいて上記の「特異的相補配列が具備すべき一般的な条件」を考慮して決定される。
【００３８】
共通相補配列における「適切な鎖長」は、以下のようにして設定できる。
即ち、用いる特異的配列が決定し、その鎖長が確定した後に、特異的相補配列および該特異的相補配列に対して鎖長が同一なミスマッチ配列を設計する。
次に、前記特異的相補配列または前記ミスマッチ配列からなるそれぞれの核酸の同側端部に数種の鎖長を具備する共通相補配列を付加する。このようにして、それぞれ同一の共通相補配列を具備する陽性および陰性コントロールプローブのペアが数種（即ち、異なるペアは異なる鎖長の共通相補配列を具備することになる）作成される。
【００３９】
次に、陽性および陰性のコントロールプローブを使用して陽性コントロールのみが前記ターゲット核酸にハイブリダイズできる、即ち特異的相補配列に依存する前記ハイブリダイズ条件を設定する。このような特異的相補配列に依存する条件は、ハイブリダイズ時の温度、塩濃度を高く設定するなどの当業者に周知の様式で条件を至適化することで達成される。このようにして「ハイブリダイズ条件」などの実験条件を最適化できる。
【００４０】
以上の手順で「鎖長設定条件」を設定できる。
しかし一般的な適用において、前記共通相補配列の塩基数は、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜１８、１〜２１もしくは１〜３０の範囲、好ましくは５〜１０、５〜１５、５〜１８、５〜２１もしくは５〜３０の範囲、より好ましくは１０〜１５、１０〜１８もしくは１０〜２１の範囲、最も好ましくは１０塩基程度が使用される。
【００４１】
また、延長型プローブにおいて、共通相補配列の核酸の塩基数は１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜１８もしくは１〜２１であり、好ましくは５〜１０、５〜１５もしくは５〜１８であり、より好ましくは１０〜１５の範囲が使用される。
【００４２】
前記延長型プローブとは、本発明のプローブの一態様であり、前記特異的相補配列の端（両端もしくは一端）に連続して前記共通相補配列が設けられている形態のプローブである。この形態のプローブの例が以下の［本発明の態様］に例示される。
【００４３】
また、末端捕捉型プローブにおいて、共通相補配列の核酸の塩基数は１〜５、１〜１０もしくは１〜１５であり、好ましくは５〜１０もしくは５〜１５であり、より好ましくは１０〜１５の範囲が使用される。
【００４４】
末端捕捉型プローブとは、本発明のプローブの一態様であり、前記特異的相補配列の端（両端もしくは一端）にリンカーを介して間接的に前記共通相補配列が設けられている形態のプローブである。この形態のプローブの例も以下の［本発明の態様］に例示される。
【００４５】
本発明のプローブにおける前記核酸は少なくともその特異的相補配列部分および共通相補配列でターゲット核酸とハイブリダイズ（相補鎖形成）するものであれば本発明の課題は達成できる。従って、本発明のプローブは修飾核酸などの天然には稀もしくは存在しない核酸であってもよい。しかしながら、一般的には生物において通常認められるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが好適に使用される。
【００４６】
本発明のプローブにおけるリンカーは、本発明のプローブを構成する前記共通相補配列と前記特異的相補配列とを該リンカーの両端部で連結するものである。
プローブ内の両相補配列の方向性は、プローブ全体として一定であるように設計されることが好ましい。しかしながら、プローブ内で方向性が逆となっても前記共通相補配列と前記特異的相補配列とが前記ターゲット核酸と特異的にハイブリッドを形成できればよく、リンカーの長さが十分に長く、可動性を備えた部材であればこのような構成をとり得る。
【００４７】
前記リンカーは該リンカーを連結したプローブが実質上実験に使用可能であればよく制限されるものではなく、スペーサーとなり得るものであればよいが、リンカー長（リンカーの長さ）、低反応性、可動性などを考慮して選択される。
前記リンカー長は、ターゲット核酸に共通相補配列と特異的相補配列とが相補的にハイブリッドを形成できる長さであればよい。一般的には、ターゲット核酸に共通相補配列と特異的相補配列とをそれぞれ単独でハイブリッド形成させた場合に、両配列間のとり得る距離と同程度でよい。
前記低反応性とは、本発明のプローブの前記リンカー部分が、ハイブリ時に他の物質と相互作用しない、もしくはその程度が少ないことを意味する。
前記可動性とは、液中で前記リンカー部分の運動性が高く自由に屈曲できることを意味している。
前記リンカーの具体例としては、直鎖状炭素（アルキル鎖）、好ましくはアデニン塩基からなる核酸、チミン塩基からなる核酸およびポリペプチド鎖などである。前記リンカーが核酸であり、プローブ全体が核酸のみで構成される場合にはプローブ全体として合成できる。しかし、プローブを構成する各部材が同じ合成系で合成できない場合は、各部材の適切な官能基を適切な様式で共有結合させてプローブを作成する。
【００４８】
リンカーはハイブリッドの安定化に寄与しないが、該リンカーを適切に設定することによりプローブ末端の共通相補配列がターゲット核酸のもっとも反応性の高い末端とハイブリッドを形成するように設定できる。また、リンカーに核酸を使用する場合には、配列はミスマッチに設定するので、特に大きくハイブリダイゼーション温度を上げなくてもターゲット核酸の結合を強めることができる。とくにリンカー配列にＡやＴなどの比較的ミスマッチハイブリッドが不安定な塩基を用いるとプローブが分子内構造をとりにくいままプローブ長を長くすることができる。
【００４９】
「リンカー」にＤＮＡ配列を有する核酸を使用した場合について以下に具体的に説明する。
リンカー配列（前記リンカーに使用する核酸配列）を選択する場合の一般的な注意点には、以下の１）〜２）などがある。
【００５０】
１）目的外のターゲット核酸とハイブリッドを作るクロスハイブリダイゼーションの原因になることがあるので、あまり複雑な配列やミスマッチでも比較的安定なＧやＣなどの塩基を使用しない方がよい。このような配列を採択すると、前記リンカー配列がすべてのプローブにあることから特定のターゲット核酸がすべてのプローブにつきやすくなることになる。また、
２）前記リンカー配列を完全なマッチ配列にするとプローブ長が長くなるので、よりハイブリダイゼーション温度を高くしなければならず、液の蒸発、温度管理などの面から実験が難しくなる。
【００５１】
リンカー配列は、上記のような注意点を考慮して選択されるが、リンカー配列の選択する際の例として下記に実際のＤＮＡ配列を例示してより具体的に説明する。
たとえば次のような４５ｍｅｒのターゲット核酸（ターゲット核酸  １）を検出する場合。
【００５２】
2004147597.tif 000002
（１）リンカー配列が同一塩基の連続であるプローブ
プローブ例１（ｐｒｏｂｅ  １）：
2004147597.tif 000003
プローブ例２（ｐｒｏｂｅ  ２）：
2004147597.tif 000004
リンカー配列に同一の塩基配列を選んだ例。リンカー配列にＣやＧでなくＡやＴを選ぶのは、Ｇ，Ｃ塩基同士のミスマッチ塩基Ｇ−Ｇ，  Ｃ−ＣなどよりＡ，  Ｔ塩基同士のミスマッチのＡ−Ａ，  Ｔ−Ｔの安定性の方が低いからである。また、Ａ、Ｔを選択することによりプローブが分子内構造をとりにくいようにすることができる。
【００５３】
（２）リンカー配列がすべてミスマッチになるようにしたプローブ
プローブ例３（ｐｒｏｂｅ  ３）：
2004147597.tif 000005
プローブ例４（ｐｒｏｂｅ  ４）：
2004147597.tif 000006
プローブ例５（ｐｒｏｂｅ  ５）：
2004147597.tif 000007
例３，  ４は（１）のリンカー配列で、Ａ−Ｔマッチになっている部分をＡ−ＡミスマッチかＴ−Ｔミスマッチに変えたプローブの例。例５はさらに別のミスマッチにしたもの。
ミスマッチの塩基には次の８通りの組み合わせがある。
Ａ−Ａ，  Ａ−Ｃ，  Ａ−Ｇ，  Ｃ−Ｃ，  Ｃ−Ｔ，  Ｇ−Ｇ，  Ｇ−Ｔ，  Ｔ−Ｔ
これらの中のいずれかのミスマッチになるようにリンカー配列を設計することにより、ミスマッチのリンカー配列が得られる。
以上はプローブの３’端側に共通配列に相補な配列をつけた場合であるが、これが５’端にあってもかまわない。また、３’端側、５’端側両方に存在しても良い。
【００５４】
本発明において、「マッチ」という用語は、生体内の核酸において通常認められるワトソン・クリック塩基対が特定の塩基対において形成された状況を意味する用語である。即ち、一般的な塩基対であるＡ−Ｔ、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｕのうちの何れかの対で相補鎖形成する状況を意味する。しかしながら、本用語は対応する塩基間で水素結合を形成する塩基対を広く意味しており、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ以外の塩基において塩基対が形成される場合などにおいても本用語が使用される。
【００５５】
本発明において、「パーフェクトマッチ（ＰＭ）」という用語は、形成される塩基対が前記「マッチ」する組み合わせのみからなる塩基対の状況を意味する用語である。即ち、ある鎖長の異なる２配列が「パーフェクトマッチ（ＰＭ）」である場合、２配列のうち短い配列の全体にわたり上記の「マッチ」の定義を満たす塩基対が形成されることを意味する。例えば、特定配列に対して相補となる配列（両者の鎖長は一致）、ターゲット核酸の部分配列に対して全塩基が相補であるプローブの配列（両者の鎖長は不一致）などは、互いに「パーフェクトマッチ（ＰＭ）」する配列である。
【００５６】
また本発明において、「ミスマッチ（ＭＭ）」という用語は、配列中に本来は塩基対を形成しない塩基対を有することを広く意味する用語である。「ミスマッチ（ＭＭ）」な塩基対とは、一般的にＤＮＡにおいてはＡ−Ａ、Ａ−Ｃ、Ａ−Ｇ、Ｃ−Ｃ、Ｃ−Ｔ、Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ｔ、Ｔ−Ｔのうちの何れかの組み合わせとなる塩基対である。しかしながら、本用語は対応する塩基間で水素結合を形成しない塩基対を広く意味しており、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ以外の塩基において塩基対が形成されない場合などにおいても本用語が使用される。
【００５７】
前記固定化用支持体は、ガラス、プラスチックなど材料を問わず、平板、ビーズ状など形態も問わない。また、磁気ビーズを使用すれば液中のビーズを容易に沈降させることができ洗浄操作などを簡便に行うことができる。前記マイクロアレイの場合には、スライドガラスなどの平板上の支持体が好適に使用される。
【００５８】
前記固定化用リンカーは、本発明のプローブを前記支持体上に固相化できるものであれば特に限定されず、当業者において通常使用されている公知のものが使用できるが、一般的には長鎖アルキル、アミノアルキルなどが使用できる。
【００５９】
本発明のプローブは、何れも当業者に公知の手法を用いて化学合成できる、または、合成の受託業者に委託して合成することができる。
前記プローブを使用したマイクロアレイの作成も当業者に公知の方法で作成できる。例えば、前記プローブが核酸のみからなる場合にはスライドガラス上で固相合成する方法、または合成した前記プローブをピンにより支持体上に印刷する方法などにより作成できる。
【００６０】
［本発明で提供される第一の方法］
本発明の第一の方法は、本発明のプローブを、前記共通配列に相補的な配列を含み且つ標識物質で標識した既知量の固定量測定用核酸を使用して測定する方法であって、
１）前記プローブと、前記固定量測定用核酸とを接触させ、両者を特異的にハイブリダイズさせる工程と、
２）工程１におけるハイブリッドの生成を、前記標識物質に基づく測定手段により測定する工程と、
３）工程２で得られる測定結果に基づき、前記支持体上の前記プローブの量を計算する工程と、
を具備することを特徴とするものである。
【００６１】
前記標識物質は、実験の目的に応じて任意の標識物質を使用できる。マイクロアレイを実施する場合、前記標識物質は蛍光色素であり、好ましくはシアニン  ３（Ｃｙ３；Ｃｙａｎｉｎｅ３）もしくはシアニン  ５（Ｃｙ５；Ｃｙａｎｉｎｅ５）などのシアニン色素が使用される。
【００６２】
前記固定量測定用核酸は、本発明のプローブの前記共通相補配列を特異的に測定できる核酸であり、前記共通相補配列の全体もしくは一部と相補的な配列を具備し、前記標識物質で標識された核酸である。
【００６３】
前記測定手段は、前記標識物質の存在を検出し、その存在量を測定できる機能を備える分析機器が使用される。前記標識物質が蛍光物質であれば光学的な検出装置を備えた機器が使用される。
【００６４】
前記「計算」は、既知量の前記固定量測定用核酸を使用することにより前記支持体上に固相化されたプローブの量を計算することである。１分子の前記プローブは１分子の前記固定量測定用核酸とハイブリダイズして二重鎖を形成する。従って、コントロールとして測定する既知量の前記固定量測定用核酸の値を測定し、前記プローブとハイブリダイズした前記固定量測定用核酸の値を測定し、両測定値から支持体上の前記プローブの固相化量が計算される。
【００６５】
［本発明で提供される第二の方法］
更に、本発明の第二の方法は、マイクロアレイ上に固相化された前記プローブと、前記共通配列に相補的な配列を含み且つ標識物質Ａで標識した既知量の固定量測定用核酸とを使用して、前記マイクロアレイ上で前記ターゲット核酸の存在量を測定する方法であって、
１）前記標識物質Ａとは異なる標識物質Ｂで標識した前記ターゲット核酸を含む試料を作成する工程と、
２）前記プローブと、工程１の試料と、前記固定量測定用核酸とを接触させ、特異的にハイブリダイズさせる工程と、
３）工程２のハイブリッドの生成を、使用する標識物質に基づく測定手段により測定する工程と、
４）工程３で得られる測定結果に基づき、該試料中の前記ターゲット核酸の存在量を計算する工程と、
を具備し、
マイクロアレイ上の各々のスポット間の前記プローブの固相化量比が、標識物質Ａの測定結果から計算され（計算値Ａ）、
前記ターゲット核酸として使用される既知量のターゲット核酸の前記プローブに対するハイブリダイズ量が、標識物質Ｂの測定結果から計算され（計算値Ｂ）、
該試料中に存在する複数種類の前記ターゲット核酸の各々の存在量を計算値ＡおよびＢから外挿して推定することを特徴とするものである。
【００６６】
前記固定量測定用核酸は、上記の第一の方法で定義した固定量測定用核酸と同義である。
前記マイクロアレイは、当業者に公知の方法で本発明のプローブをマイクロアレイ上に固相化して作成できる。しかし、前記方法は、１支持体上に多種類のプローブが固相化される様式であればマイクロアレイ以外の方式であっても実施できる。従って、各種マイクロプレートに前記プローブを固相化して測定することもできる。また、例えば前記ビーズに多種類のプローブが固相化されている場合には、各々のプローブをマイクロプレートに播種して本方法を実施することもできる。
【００６７】
前記試料は、一般的な適用においては各種の核酸（例えば、生体から抽出したｍＲＮＡ若しくはゲノムのＤＮＡなど）を前記ターゲット核酸に転換したものを含む混合物である。しかし、生体の核酸に由来する核酸だけでなく、人工的に設計された配列を有しても、前記ターゲット核酸の定義を満たす核酸であれば前記試料として使用できる。本発明で好適に使用される前記ターゲット核酸の態様を以下の［本発明の態様］において説明する。
【００６８】
標識物質Ａおよび標識物質Ｂは互いに異なる標識物質であり、互いに影響せず各々の存在量を別個に測定し得るものであればよい。好ましくは、双方にはＣｙ３もしくはＣｙ５のどちらかが使用される。即ち、標識物質ＡがＣｙ５の場合には標識物質ＢはＣｙ３が使用され、その逆の組み合わせであってもいい。
【００６９】
前記計算値Ａは、標識物質Ａの測定結果から計算される計算値である。この計算値から、マイクロアレイ上の各々のスポット間の前記プローブの固相化量比が算出される。計算値Ａは標識物質Ａの測定値から第一の方法の「計算」について説明した通りに計算できる。
【００７０】
前記計算値Ｂは、標識物質Ｂの測定結果から計算される計算値である。この計算値から、前記ターゲット核酸として使用される既知量のターゲット核酸の前記プローブ（ここで使用する既知量のターゲット核酸に対応する前記プローブである、従って該ターゲットに対する特異的相補配列を有するプローブである）に対するハイブリダイズ量が算出される。
【００７１】
計算値Ｂは、例えば下記のように測定できる。
１）同一マイクロアレイ上に内部標準物質として既知量のターゲット核酸をスポットして測定する。
２）同時に対応する前記プローブへの既知量のターゲット核酸のハイブリダイズした量を測定する。
３）１）の測定値を基に内部標準物質の量と測定値との関係から検量線を作成し、２）の測定値と前記検量線から前記プローブに結合したターゲット核酸量が算出される。
【００７２】
同一スポット上の前記計算値ＡおよびＢを算出して計算値Ｂをスポット毎に固相化量比を表す計算値Ａにより補正して別種類の前記プローブが固相化されたスポットの測定値に外挿することにより試料中の全てのターゲット核酸の絶対量が測定できる。
【００７３】
以下、本発明の代表的な実施態様について本願に添付される図面を参照して説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら具体的な態様に限定されるものではない。
［本発明の態様］
＜本発明のターゲット核酸：図１〜２＞
以下に本発明が主に対象とするターゲット核酸について説明する。
図１〜２は共通プライマー配列をそなえたターゲット核酸の遺伝子検出への使用例を説明する図である。これらの図により、本発明のプローブが対象とするターゲット核酸の作成の手順が例示される。
【００７４】
核酸の構造（図１、Ａ）は、ターゲット核酸を作成する際に使用される共通プライマー配列（共通配列１および２）を具備する核酸である（右側が３’末端）。
このような組を検出遺伝子に応じて多種類合成する。共通配列１，  ２は検出対象にかかわらず同一の配列を有するものである（図１、Ｂ）。
検出対象の一本鎖ＤＮＡの多数を含有する試料中でハイブリダイゼーションし、リガーゼ反応する（図１、Ｃ）。
検出対象が前記試料中に存在していた場合、連結される（図１、Ｃ）が、検出対象が存在しなかった場合、連結されずそのままになる（図１、Ｄ）。
【００７５】
図２において、連結されたターゲット核酸（図１、Ｃ）を処理する手順を説明する。
ターゲット核酸の配列構成は図２の（Ａ）に示すようなものであり、中央部に連結された特異的配列を有している（この鎖は検出プローブに相補な側を示す）。
【００７６】
以下に説明する工程（図２Ｂの１〜３）で図２の（Ａ）の核酸が増幅され且つ同時に標識付けされ、単鎖抽出される。即ち、
（１）ターゲット核酸ライブラリを標識した共通プライマーでＰＣＲ増幅する工程。
（２）工程（１）のＰＣＲ産物をストレプトアビジンのついた磁気ビーズに捕獲する工程。
（３）捕獲したターゲット核酸から蛍光標識した単鎖ＤＮＡを抽出する工程。
このようにして本発明のターゲット核酸を作成できる。
【００７７】
以下に従来型プローブと比較した本発明のプローブの特徴を態様ごとに例示する。
＜従来型プローブの説明：図３＞
図３にターゲット核酸検出のためのプローブの従来例を説明する。
ターゲット核酸の特異的配列に特異的にハイブリッドを形成する配列を具備する単鎖のＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡなどの化合物をプローブに用いる。たとえば図２の（３）のターゲット核酸の特異的配列に相補的なプローブで検出する場合、図３のようなハイブリッドを形成することになる。
【００７８】
＜本発明のプローブの実施態様：図４〜５＞
《プローブ態様１（延長型プローブ）》
図４に本発明の一態様である、延長型プローブを用いた際のハイブリッド形成の例を説明する。
（１）にターゲット核酸の特異的配列に相補な配列（特異的相補配列）  ＋  ターゲット核酸５’側共通プライマー配列の３’側の一部に相補な配列（共通相補配列）を備えたプローブの例を示す。
（２）にターゲット核酸の特異的配列に相補な配列（特異的相補配列）  ＋  ターゲット核酸３’側共通プライマー配列の５’側の一部に相補な配列（共通相補配列）を備えたプローブの例を示す。
（３）ターゲット核酸の特異的配列に相補な配列（特異的相補配列）  ＋  ターゲット核酸５’側共通プライマー配列の３’側の一部に相補な配列（共通相補配列）  ＋  ターゲット核酸３’側共通プライマー配列の５’側の一部に相補な配列（共通相補配列）を備えたプローブの例を示す。
以上のようなプローブを使用することによってプローブ長を長く設定することができる。
【００７９】
《プローブ態様２（末端捕捉型プローブ）》
図５に本発明の一態様である、末端捕捉型プローブを用いた際のハイブリッド形成の例を説明する。
（１）にターゲット核酸の特異的配列に相補な配列（特異的相補配列）  ＋  リンカー配列  ＋  ターゲット核酸５’側共通プライマー配列の５’末端側の一部に相補な配列（共通相補配列）を備えたプローブの例を示す。
（２）にターゲット核酸の特異的配列に相補な配列（特異的相補配列）  ＋  リンカー配列  ＋  ターゲット核酸３’側共通プライマー配列の３’末端側の一部に相補な配列（共通相補配列）を備えたプローブの例を示す。
（３）にターゲット核酸の特異的配列の両側にリンカー配列をもつプローブの例を示す。
上記で説明した各態様のように、本発明のプローブはターゲット核酸に対して様々に設定できるが、好ましくはプローブの末端でターゲット核酸の末端を捕捉するように設定することが好ましい。このように設定することにより、ハイブリ効率を上げることができる。
【００８０】
この理由を図７を参照して以下に説明する。
図７は矢印で示された鎖状分子のそれぞれの部位が持つ局在化した運動エネルギを「横への広がり」として表現している。
図７の右側のプローブ分子では５’が固相化されているため運動量は小さく，３次元的に自由な３’末端に向けて運動量が大きくなる。もっとも大きな運動量を持つのは３’末端である。
左側のターゲット核酸分子については，対称中心となる鎖状分子中央で運動量が最も小さい。分子中央が運動する場合，両末端を引っ張らなくてはならないため抵抗が大きく，周囲の分子（溶媒など）も２次元的な衝突をするに過ぎない。運動量がもっとも大きいのは５’及び３’両末端である。末端では運動する際の分子内での抵抗が小さい上に，周囲の分子が３次元的に衝突する。
【００８１】
化学反応は正しい方向から，ある一定以上のエネルギをもって，衝突することによって生じる。ハイブリダイゼーション反応についても例外ではなく，まずは分子同士が衝突しなければならない。つまりは衝突頻度が重要となる。
【００８２】
上記のような反応系の場合，局所的な分子間衝突確率がもっとも高い部分はプローブの３’末端とターゲット核酸の５’末端，３’末端である。
【００８３】
ただし，プローブの３’末端とターゲット核酸の３’末端が衝突した場合ではハイブリダイゼーションは行なわれない。したがって，もっとも反応効率が高いのはプローブの３’端でターゲット核酸の５’端を捕捉する形となる。
【００８４】
＜本発明のプローブを使用する核酸の測定方法：図６＞
図６において本発明のプローブ固定量の測定方法を説明する。
マイクロアレイに本発明のプローブを用いる場合、各プローブの固定量の測定ができ、各スポットに捕獲されたターゲット核酸の絶対量測定に使える。
たとえば図６（１）のように本発明のプローブが固定されている場合。
図６（２）のように、Ｃｙ３で蛍光標識したターゲット核酸をハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションを阻害しない程度の量のＣｙ５で蛍光標識した固定量測定用核酸も同時にハイブリダイズさせる。
【００８５】
次にハイブリダイゼーションの済んだマイクロアレイを蛍光スキャナで読み取る。Ｃｙ５の蛍光波長とＣｙ３の蛍光波長の２つの画像が得られるが、Ｃｙ５画像から各プローブの固定量比を反映した蛍光強度が分かり、Ｃｙ３画像は各ターゲット核酸の量比に応じた蛍光強度が得られる（３）。ここで量が既知のＣｙ３で標識したターゲット核酸を混ぜておくと、すべてのターゲット核酸の絶対量が測定できる。
【００８６】
以上、本発明のプローブの５’末端側が支持体上に固相化されている態様について説明した。しかしながら、本発明のプローブの３’末端側が支持体上に固相化される別態様についても同様に実施でき、且つ同様の効果を奏することは当業者に容易に理解されるであろう。従って、３’末端側が支持体上に固相化されるプローブおよび該プローブを使用する方法も、同様に本発明に含まれるものである。
【００８７】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００８８】
【実施例】
［実施例１］
《ターゲット核酸中央でのハイブリダイゼーションとターゲット核酸  ５’末端でのハイブリダイゼーションとの比較》
＜実験方法＞
▲１▼ターゲット核酸として、５’末端をＣｙ３標識したｒＥ２４３配列７５  ｍｅｒを使用した。ｒＥ２４３配列は、それぞれ２５  ｍｅｒの３’部、中央部、５’部の３つの部分配列からなる全長７５  ｍｅｒの配列である。
▲２▼前記▲１▼のターゲット核酸に対するプローブとして、ｒＥ２４３の中央部２５  ｍｅｒに相補な  ＣＤ２４３プローブ，ｒＥ２４３の５’部２５  ｍｅｒに相補なＣＤ１４７プローブを使用した。
【００８９】
前記ターゲット核酸及び前記プローブが固相化されたマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションにより該プローブを評価した。実験に使用した装置、器具、試薬の詳細を実験結果の後に記載する。
【００９０】
まず，５’末端をＣｙ３標識したｒＥ２４３が２．５ｐｍｏｌ含まれるように１  ｘ  ＳＳＣ（０．２％ＳＤＳ含有）  １００μｌ中に調製し，これをターゲット核酸  溶液とした。このターゲット核酸  溶液をハイブリ前に９４℃で５分間加熱し，前処理を行なった。
【００９１】
ＣＤ２４３プローブ，ＣＤ１４７プローブを固相化した検出用マイクロアレイにハイブリウェル（後述）を装着した。ハイブリ直前に前処理したターゲット核酸  溶液  １００μｌをハイブリウェルにインジェクトし，このマイクロアレイを４０℃のインキュベータ中でハイブリダイゼーション反応を６０分間行なった。
【００９２】
次にハイブリ後のマイクロアレイをインキュベータから取り出し，ハイブリウェルを剥離した後すみやかに１  ｘ  ＳＳＣで満たした染色バットに投入し，スライドラックとスライドウオッシャーを使用して１０分間揺動洗浄した。つづいて同様に０．１  ｘ  ＳＳＣで５分間揺動洗浄した後，フロンガス（ＨＦＣ１３４ａ）を使用したブロアーで乾燥させた。これをＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００を用いて観察し，スキャン画像を市販の定量化ソフトウェアをもちいて定量した。
【００９３】
＜実験結果＞
以下に示す結果は各プローブ，４スポットの定量値を平均化した値である。
【００９４】
【表１】
2004147597.tif 000008
【００９５】
以上の結果から７５ｍｅｒのターゲット核酸中央部２５ｍｅｒに相補なＣＤ２４３プローブよりも、ターゲット核酸の５’末端から２５ｍｅｒに相補なＣＤ１４７プローブを使用した場合にシグナル強度が高いことが明らかになった。つまり，ターゲット核酸の５’末端に相補的な配列をプローブとして使用してハイブリさせると効率が高いと言える。
【００９６】
＜実験条件の詳細＞
・検出用チップ：
アミノ基標識した合成オリゴＤＮＡを市販の白板スライドガラス基板と共有結合させる当業者に通常用いられる方法により作成した。スポッティングは１５０μｍのピンヘッドを持つ市販のスポッタ（ピンピッチ４．５ｍｍ，スポットピッチ０．５ｍｍ）をもちいて，各プローブを４スポットずつ点着した。
【００９７】
・検出ターゲット核酸：
検出する配列と同じ配列をもつ合成オリゴＤＮＡをテンプレートとして，ビオチン化したｆｗｄプライマ及びＣｙ３標識したｒｅｖプライマを使用してＰＣＲ反応をおこなった。そのＰＣＲ産物をストレプトアビジン磁気ビーズにより精製した。
【００９８】
ストレプトアビジン磁気ビーズは高温度条件下においてもビオチンと比較的安定した結合を形成することを利用してＣｙ３化単鎖ＤＮＡ（ｓｓ−ＤＮＡ）を単離する。即ち、磁気ビーズにＰＣＲ産物を捕獲し、それを熱水中でデハイブリダイゼーションして、Ｃｙ３化されたｓｓ−ＤＮＡ  ターゲット核酸のみを単離した（図２を参照）。
【００９９】
・ハイブリダイゼーション条件：
ターゲット核酸  ：  Ｃｙ３標識ｒＥ２４３  ２．５  ｐｍｏｌ
反応溶液  ：  ０．２％  ＳＤＳ  １  ｘ  ＳＳＣ  １００μｌ
ハイブリウェル  ：  Ｇｒａｃｅ  ＢＩＯ−ＬＡＢＳ製Ｈｙｂｒｉｗｅｌｌ（ＨＢＷ７５）
反応温度  ：  ４０℃
前処理  ：  ９４℃  ５分間
・洗浄後処理：
スライドウオッシャー（十条フィールド株式会社ＳＷ−４）
・観察条件：
ＧＳＩ  ｌｕｍｏｎｉｃｓ社ｓｃａｎａｒｒａｙ４０００を使用し，ＬＡＳＥＲ  ／  ＰＭＴの設定はそれぞれ１００％  ／１００％とした。解像度は５μｍに設定している。
・定量方法：
市販のマイクロアレイ定量ソフトウェア（ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ）にて定量した。
【０１００】
＜配列の詳細情報＞
以下に使用した配列について記載する。配列設計にはクロスハイブリ特性，Ｔｍ値を考慮して人工的に設計した配列を使用している。
（表記は５’→３’）
▲１▼ターゲット核酸配列
・５’末端Ｃｙ３標識ｒＥ２４３  ７５ｍｅｒ
ＴｇＡＡｇＴＴＣＣｇＣＴＴＴｇｇＡｇＴｇｇＣＴＡＡｇｇｇＡｇＣＡＡＡＴＡＴＡＡＡＴｇＣｇＡＴｇｇＣＴＴＴｇｇＴＴＡＡＣＴｇＣＣＴＴＣＣＣＣＴＣＡＣＡＡ（配列番号７）
▲２▼プローブ配列
・５’末端アミノ基標識ＣＤ１４７  プローブ（ターゲット核酸の５’端側２５ｍｅｒに相補）
ＴＴＡｇＣＣＡＣＴＣＣＡＡＡｇＣｇｇＡＡＣＴＴＣＡ（配列番号８）
・５’末端アミノ基標識ＣＤ２４３  プローブ（ターゲット核酸の中央２５ｍｅｒに相補）
ＡｇＣＣＡＴＣｇＣＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴｇＣＴＣＣＣ（配列番号９）
［実施例２］
《プローブの反応特異性と共通相補配列の延長方向に関する実施例》
＜実験方法＞
▲１▼ターゲット核酸として、５’末端をＣｙ３標識したｒＣ２４３配列７５  ｍｅｒを使用した。ｒＣ２４３配列は、それぞれ２５  ｍｅｒの３’部、中央部、５’部の３つの部分配列からなる全長７５  ｍｅｒの配列である。
【０１０１】
▲２▼前記▲１▼のターゲット核酸に対するプローブとして、ｒＣ２４３にパーフェクトマッチするＣ２４３  プローブ  ７５  ｍｅｒ，ｒＣ２４３の両末端から２５  ｍｅｒはマッチするが中央部２５  ｍｅｒがミスマッチとなっているＣ０３７  プローブ  ７５  ｍｅｒ，ｒＣ２４３の５’末端から５０ｍｅｒまでに相補な２４３＋ＣＥＤ  プローブ  ５０  ｍｅｒ，ｒＣ２４３の５’末端から２５ｍｅｒまで相補であるがｒＣ２４３の中央部２５  ｍｅｒとはミスマッチな０３７＋ＣＥＤ  プローブ  ５０  ｍｅｒ，ｒＣ２４３の３’末端から５０ｍｅｒに相補である０１４ＳＤ＋２４３  プローブ  ５０ｍｅｒおよびｒＣ２４３の中央部２５  ｍｅｒに相補であるＣＤ２４３  プローブを使用した。
【０１０２】
前記ターゲット核酸及び前記プローブが固相化されたマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションにより該プローブを評価した。実験に使用した装置、器具、試薬の詳細を実験結果の後に記載する。
【０１０３】
まず，５’末端をＣｙ３標識したｒＣ２４３が５ｐｍｏｌ含まれるように１  ｘ  ＳＳＣ（０．２％  ＳＤＳ含有）  １００μｌ中に調製し，これをターゲット核酸  溶液とした。このターゲット核酸  溶液をハイブリ前に９４℃で５分間加熱し，前処理を行なった。
【０１０４】
プローブを固相化した検出用マイクロアレイにハイブリウェルを装着した。直前に前処理したターゲット核酸  溶液  １００μｌをハイブリウェルにインジェクトし，このマイクロアレイを４０℃のインキュベータ中で６０分間のハイブリダイゼーション反応を行なった。
【０１０５】
次にハイブリ後のマイクロアレイをインキュベータから取り出し，ハイブリウェルを剥離した後すばやく０．１  ｘ  ＳＳＣで満たした染色バットに投入し，ラックとスライドウオッシャーを使用して５分間揺動洗浄した後，フロンガス（ＨＦＣ１３４ａ）を使用したブロアーで乾燥させた。これをＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００を用いて観察し，ｓｃａｎ画像を市販の定量化ソフトウェアをもちいて定量した。
【０１０６】
＜実験結果＞
以下に示す結果は各プローブ，４スポットの定量値を平均化した値である。
【０１０７】
【表２】
2004147597.tif 000009
【０１０８】
以上の結果から５’末端固相化プローブ（ターゲット核酸の５’末端との相補性を利用してハイブリするプローブ）は、ターゲット核酸に対してマッチする配列の鎖長にかかわらずハイブリ効率が高いことが明らかになった。しかし，  ５’末端部分２５ｍｅｒのみがマッチすれば、中央２５ｍｅｒ部分での反応特異性がなくとも反応することが明らかとなった（０３７＋ＣＥＤ  プローブ）。つまりＰＭ／ＭＭ比（パーフェクトマッチ／ミスマッチ比）が小さいため、中央２５ｍｅｒ部分での反応特異性を判別出来ないことが明らかとなった。
【０１０９】
また，３’末端捕捉型プローブ（同じターゲット核酸末端を利用する５０ｍｅｒのプローブであるが、ターゲット核酸の３’末端を捕捉する形のプローブ；０１４ＳＤ＋２４３  プローブ）のハイブリ効率が格段に低いことが明らかになった。中央２５ｍｅｒ部分のみと相補なＣＤ２４３プローブのハイブリ効率は更に低いものであった。
【０１１０】
＜実験条件の詳細＞
・検出用チップ：
アミノ基標識した合成オリゴＤＮＡを市販のスライドガラス基板と共有結合させる当業者に通常用いられる方法により作成した。基材は通常の白板のスライドガラスを使用した。スポッティングは１５０μｍのピンヘッドを持つ市販のスポッタ（ピンピッチ４．５ｍｍ，スポットピッチ０．５ｍｍ）をもちいて，各プローブを前記基材上に４スポットずつ点着した。
【０１１１】
・検出ターゲット核酸：
検出する配列と同じ配列をもつ合成オリゴＤＮＡをテンプレートとして，ビオチン化したｆｗｄプライマ及びＣｙ３標識したｒｅｖプライマを使用してＰＣＲ反応をおこなった。そのＰＣＲ産物をストレプトアビジン磁気ビーズにより精製した。
【０１１２】
ストレプトアビジン磁気ビーズは高温度条件下においてもビオチンと比較的安定した結合を形成することを利用してＣｙ３化単鎖ＤＮＡ（ｓｓ−ＤＮＡ）を単離する。即ち、磁気ビーズにＰＣＲ産物を捕獲し、それを熱水中でデハイブリダイゼーションして、Ｃｙ３化されたｓｓ−ＤＮＡ  ターゲット核酸のみを単離した（図２を参照）。
【０１１３】
・ハイブリダイゼーション条件：
ターゲット核酸  ：  Ｃｙ３標識ｒＣ２４３  ５  ｐｍｏｌ
反応溶液  ：  ０．２％  ＳＤＳ  １  ｘ  ＳＳＣ  １００μｌ
ハイブリウェル  ：  Ｇｒａｃｅ  ＢＩＯ−ＬＡＢＳ製Ｈｙｂｒｉｗｅｌｌ（ＨＢＷ７５）
反応温度  ：  ４０℃
前処理  ：  ９４℃  ５分間
・洗浄後処理：
スライドウオッシャー（十条フィールド株式会社ＳＷ−４）
・観察条件：
ＧＳＩ  ｌｕｍｏｎｉｃｓ社ｓｃａｎａｒｒａｙ４０００を使用し，ＬＡＳＥＲ  ／  ＰＭＴの設定はそれぞれ１００％  ／１００％とした。解像度は５μｍに設定している。
・定量方法：
市販のマイクロアレイ定量ソフトウェア（ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ）にて定量した。
【０１１４】
＜配列情報の詳細＞
以下に使用した配列について記載する。配列設計にはクロスハイブリ，Ｔｍ値を考慮して人工的に設計した配列を使用している。
（表記は５’→３’）
▲１▼ターゲット核酸配列
・５’末端Ｃｙ３標識ｒＣ２４３  ７５ｍｅｒ
ｇＡＴＴＣｇＴＣｇＴｇＴｇＣＣＴＴＴｇＡＣＴｇＴＴｇｇｇＡｇＣＡＡＡＴＡＴＡＡＡＴｇＣｇＡＴｇｇＣＴＴＴｇｇＴＴＡＡＣＴｇＣＣＴＴＣＣＣＣＴＣＡＣＡＡ（配列番号１０）
▲２▼プローブ配列
・５’末端アミノ基標識Ｃ２４３  プローブ  ７５  ｍｅｒ  （ターゲット核酸にパーフェクトマッチ）
ＴＴｇＴｇＡｇｇｇｇＡＡｇｇｃＡｇＴＴＡＡｃｃＡＡＡｇｃｃＡＴｃｇｃＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴｇｃＴｃｃｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃＡｃｇＡｃｇＡＡＴｃ（配列番号１１）
・５’末端アミノ基標識ＣＤ０３７  プローブ  ７５  ｍｅｒ（ターゲット核酸の中央部２５ｍｅｒのみミスマッチ）
ＴＴｇＴｇＡｇｇｇｇＡＡｇｇｃＡｇＴＴＡＡｃｃＡＡＴＴＡＡＴｃＡｃｃｇＡｃＴｇＴｃＴＴｃｇＴＴｇｃｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃＡｃｇＡｃｇＡＡＴｃ（配列番号１２）
・５’末端アミノ基標識  ２４３＋ＣＥＤ  プローブ  ５０  ｍｅｒ（ターゲット核酸５’末端から５０ｍｅｒに相補）
ＡｇｃｃＡＴｃｇｃＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴｇｃＴｃｃｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃＡｃｇＡｃｇＡＡＴｃ（配列番号１３）
・５’末端アミノ基標識  ０３７＋ＣＥＤ  プローブ  ５０  ｍｅｒ（ターゲット核酸５’末端から２５ｍｅｒにマッチ，ターゲット核酸の中央部２５ｍｅｒにはミスマッチ）
ＴＴＡＡＴｃＡｃｃｇＡｃＴｇＴｃＴＴｃｇＴＴｇｃｃＡＡｃｃＴｃｃｃＡＴＴｃＡｃｃＡＴＴｇＴｃＡｇＡｇ（配列番号１４）
・５’末端アミノ基標識  ０１４ＳＤ＋２４３  プローブ  ５０  ｍｅｒ（ターゲット核酸３’末端から５０ｍｅｒに相補）
ＴＴｇＴｇＡｇｇｇｇＡＡｇｇｃＡｇＴＴＡＡｃｃＡＡＡｇｃｃＡＴｃｇｃＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴｇｃＴｃｃｃ（配列番号１５）
・５’末端アミノ基標識  ＣＤ２４３  プローブ  ２５  ｍｅｒ（ターゲット核酸の中央部２５ｍｅｒに相補）
ＡｇＣＣＡＴＣｇＣＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴｇＣＴＣＣＣ（配列番号１６）
［実施例３］
《ＥＤ延長型プローブとターゲット核酸５’末端捕捉型プローブ》
＜実験方法＞
▲１▼ターゲット核酸として、５’末端をＣｙ３標識したｒＣ２１９配列７５ｍｅｒを使用した。ｒＣ２１９配列は、それぞれ２５  ｍｅｒの３’部、中央部、５’部の３つの部分配列からなる全長７５  ｍｅｒの配列である。
【０１１５】
▲２▼前記▲１▼のターゲット核酸に対するプローブとして、以下のＡ〜Ｈにグループ分けされるプローブ、即ち、
（Ａ）    ：コントロールプローブ；
ターゲット核酸の中央部２５ｍｅｒに対応する配列を具備するプローブ。
（Ｂ〜Ｅ）：ＥＤ延長型プローブ；
ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒに対応する配列に加え、該配列の３’末端に連続的に、対応するターゲット核酸の配列に相補となるように１０，  １５，  １８，  ２１  ｍｅｒと延長した配列を更に具備する、それぞれ３５，  ４０，  ４３，  ４６  ｍｅｒのプローブ，
（Ｆ〜Ｈ）：ターゲット核酸５’末端捕捉型プローブ；
ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒに対応する配列に加え、該配列の３’末端側にミスマッチ配列をはさみ、更にターゲット核酸の５’末端から５，  １０，  １５  ｍｅｒの配列に相補な配列を具備する５０  ｍｅｒのプローブ，
を使用した。
【０１１６】
上述のＡ〜Ｈの各々のプローブ群は、前記「ターゲット核酸の中央部２５ｍｅｒに対応する配列」が、ターゲット核酸中央部と相補になるよう設計された「中央部ＰＭプローブ」、及びターゲット核酸中央部とミスマッチになるよう設計された「中央部ＭＭプローブ」とに更に分けられる。このような２種類のプローブの反応性を比較検討することによって、上述した各種プローブのターゲット核酸中央部２５ｍｅｒへの反応特異性を評価することができる。
【０１１７】
上記の（１）のターゲット核酸及び（２）のプローブが固相化されたマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションにより該プローブを評価した。実験に使用した装置、器具、試薬の詳細を実験結果の後に記載する。
【０１１８】
まず，市販のハイブリダイゼーションバッファ１００μｌ中に５’末端をＣｙ３標識したｒＣ２１９が５ｐｍｏｌ含まれるように調製し，これをターゲット核酸  溶液とした。
【０１１９】
前記プローブが固相化された検出用マイクロアレイにハイブリウェルを装着した。ハイブリ直前に前処理したターゲット核酸  溶液  １００μｌをハイブリウェルにインジェクトし，このマイクロアレイを５０℃のインキュベータ中でハイブリダイゼーション反応を３時間行なった。
【０１２０】
次にハイブリ後のマイクロアレイをインキュベータから取り出し，ハイブリウェルを剥離した後すばやく１  ｘ  ＳＳＣで満たした染色バットに投入し，ラックとスライドウオッシャーを使用して１０ｍｉｎ揺動洗浄した。つづいて同様に０．１  ｘ  ＳＳＣで５ｍｉｎ揺動洗浄した後，ＨＦＣ１３４ａを使用したブロアーで乾燥させた。
【０１２１】
これをＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００を用いて観察し，スキャン画像を市販の定量化ソフトウェアをもちいて定量した。
【０１２２】
＜実験結果＞
以下に示す結果は各プローブ，４スポットの定量値を平均化した値である。
【０１２３】
【表３】
2004147597.tif 000010
【０１２４】
【表４】
2004147597.tif 000011
【０１２５】
表３及び表４中のＣＤはターゲット核酸  ７５  ｍｅｒ中央部２５ｍｅｒの配列名を示し，該ＣＤは本実施例で使用したターゲット核酸であるｒＣ２１９配列中の２１９  プローブに対して相補な配列を意味する。
ターゲット核酸５’端方向延長型プローブでは，プローブ長が各プローブで異なり，＋  １０  ｍｅｒ，＋  １５ｍｅｒ，＋  １８  ｍｅｒ，＋  ２１  ｍｅｒはそれぞれ全長が３５  ｍｅｒ，  ４０  ｍｅｒ，  ４３  ｍｅｒ，  ４６  ｍｅｒとなる。
【０１２６】
ターゲット核酸５’末端捕捉型プローブについてはコントロール  ２５  ｍｅｒはＣＤ（ターゲット核酸の中央部２５  ｍｅｒのみ），＋  ５  ｍｅｒ，  ＋  １０  ｍｅｒ，  ＋  １５  ｍｅｒはそれぞれＣＤ  ２５  ｍｅｒに加え２０  ｍｅｒ，  １５  ｍｅｒ，  １０  ｍｅｒのミスマッチ領域をはさみターゲット核酸の５’端から相補な配列を５  ｍｅｒ，  １０  ｍｅｒ，  １５  ｍｅｒもつ５０  ｍｅｒのプローブとなっている。
また，表３及び４は同一のマイクロアレイ上で得た結果であり，相互間で直接的な比較が可能である。
【０１２７】
結果については，以下のようにまとめられる。
（１）ターゲット核酸  ５’端方向延長型プローブにおいては＋  １０  ｍｅｒでＰＭのプローブはシグナルが約２倍に上昇したのに対しＭＭのプローブではほとんどシグナルの上昇が見られなかった。
【０１２８】
（２）ターゲット核酸  ５’端方向延長型プローブにおいては＋  １５  ｍｅｒ以上でＰＭのシグナル上昇とともにＭ  Ｍのシグナル上昇も見られ始め配列特異性が失われ始めた。
【０１２９】
（３）ターゲット核酸  ５’末端捕捉型プローブにおいてはターゲット核酸  ５’末端捕捉長５  ｍｅｒにおいて既にシグナル増強が観察され，１０  ｍｅｒまではＰＭのシグナルのみが上昇しＭＭのシグナルはほとんど変化しない。
【０１３０】
（４）ターゲット核酸  ５’末端捕捉型プローブにおいてはターゲット核酸  ５’末端捕捉長１５  ｍｅｒにおいてＭＭのシグナル増強が見られる。
【０１３１】
（５）ターゲット核酸  ５’端方向延長型プローブとターゲット核酸  ５’末端捕捉型プローブを比較した場合，ターゲット核酸  ５’端方向延長型プローブの  ＋１０  ｍｅｒ（マッチ長３５  ｍｅｒ）とターゲット核酸  ５’末端捕捉型プローブの  ＋  ５ｍｅｒ（マッチ長３０  ｍｅｒ）でほぼ同等のハイブリ強度を示し，ターゲット核酸  ５’末端捕捉型プローブ  ＋  １０  ｍｅｒ（マッチ長３５  ｍｅｒ）ではマッチ長はターゲット核酸  ５’端方向延長型プローブの  ＋  １０  ｍｅｒと変わらないが，ターゲット核酸  ５’末端捕捉型の方がシグナルが強い（該条件における末端捕捉型の測定値は飽和しているので実際には更に強いシグナル強度である）。
【０１３２】
・検出用チップ：
アミノ基標識した合成オリゴＤＮＡを市販のスライドガラス基板と共有結合させる当業者に通常用いられる方法により作成した。基材は通常の白板のスライドガラスを使用した。スポッティングは１５０μｍのピンヘッドを持つ市販のスポッタ（ピンピッチ４．５ｍｍ，スポットピッチ０．５ｍｍ）をもちいて，各プローブを前記基材上に４スポットずつ点着した。
【０１３３】
・検出ターゲット核酸：
検出する配列と同じ配列をもつ合成オリゴＤＮＡをテンプレートとして，ビオチン化したｆｗｄプライマ及びＣｙ３標識したｒｅｖプライマを使用してＰＣＲ反応をおこなった。そのＰＣＲ産物をストレプトアビジン磁気ビーズにより精製した。
【０１３４】
ストレプトアビジン磁気ビーズは高温度条件下においてもビオチンと比較的安定した結合を形成することを利用してＣｙ３化単鎖ＤＮＡ（ｓｓ−ＤＮＡ）を単離する。即ち、磁気ビーズにＰＣＲ産物を捕獲し、それを熱水中でデハイブリダイゼーションして、Ｃｙ３化されたｓｓ−ＤＮＡ  ターゲット核酸のみを単離した（図２を参照）。
【０１３５】
・ハイブリダイゼーション条件：
ターゲット核酸  ：  Ｃｙ３標識ｒＣ２１９  ５  ｐｍｏｌ
反応溶液  ：  ＧｌａｓｓＨｙｂ  ハイブリダイゼーション  溶液  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）
ハイブリウェル  ：  Ｇｒａｃｅ  ＢＩＯ−ＬＡＢＳ製Ｈｙｂｒｉｗｅｌｌ（ＨＢＷ７５）
反応温度  ：  ５０℃
・洗浄後処理：
スライドウオッシャー（十条フィールド株式会社ＳＷ−４）
・観察条件：
ＧＳＩ  ｌｕｍｏｎｉｃｓ社ｓｃａｎａｒｒａｙ４０００を使用し，ＬＡＳＥＲ  ／  ＰＭＴの設定はそれぞれ１００％  ／１００％とした。解像度は５μｍに設定した。
・定量方法：
市販のマイクロアレイ定量ソフトウェア（ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ）により定量を行った。
【０１３６】
＜配列情報の詳細＞
以下に使用した配列について記載する。配列設計にはクロスハイブリ，Ｔｍ値を考慮して人工的に設計した配列を使用している。
（表記は５’→３’）
▲１▼ターゲット核酸配列
・５’末端Ｃｙ３標識ｒＣ２１９  ７５ｍｅｒ
ｇＡＴＴＣｇＴＣｇＴｇＴｇＣＣＴＴＴｇＡＣＴｇＴＴＡＣＴｇＡＡＣＴＴＴＴＴＣＣＡＴｇＣＣｇｇＴＣＡＡＴＴｇｇＴＴＡＡＣＴｇＣＣＴＴＣＣＣＣＴＣＡＣＡＡ（配列番号１７）
▲２▼プローブ配列
コントロールプローブ；
（Ａ）ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒに対応するプローブ
・５’末端アミノ基標識ＣＤ０３２  プローブ  ２５  ｍｅｒ  （ミスマッチプローブ）
ＡＴＴＡＣｇＣＡＣｇＡＡＡＴＴＡＣＡＣＣｇｇＴＡＣ（配列番号１８）
・５’末端アミノ基標識ＣＤ０３７  プローブ  ２５  ｍｅｒ  （ミスマッチプローブ）
ＴＴＡＡＴＣＡＣＣｇＡＣＴｇＴＣＴＴＣｇＴＴｇＣＣ（配列番号１９）
・５’末端アミノ基標識ＣＤ２１９  プローブ  ２５  ｍｅｒ  （ターゲット核酸の中央部２５ｍｅｒに相補）
ＴＴｇＡＣＣｇｇＣＡＴｇｇＡＡＡＡＡｇＴＴＣＡｇＴ（配列番号２０）
・５’末端アミノ基標識ＣＤ２４３  プローブ  ２５  ｍｅｒ  （ミスマッチプローブ）
ＡｇＣＣＡＴＣｇＣＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴｇＣＴＣＣＣ（配列番号２１）
ＥＤ延長型プローブ；
（Ｂ）  ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒに加えターゲット核酸  ５’末端方向に１０  ｍｅｒ延長した配列に対応するプローブ
・５’末端アミノ基標識０３２  ＋  １０  ｍｅｒ  プローブ  ３５  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒミスマッチ，ターゲット核酸５’側１０ｍｅｒ相補）
ＡＴＴＡｃｇｃＡｃｇＡＡＡＴＴＡｃＡｃｃｇｇＴＡｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡ（配列番号２２）
・５’末端アミノ基標識０３７  ＋  １０  ｍｅｒ  プローブ  ３５  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒミスマッチ，ターゲット核酸５’側１０ｍｅｒ相補）
ＴＴＡＡＴｃＡｃｃｇＡｃＴｇＴｃＴＴｃｇＴＴｇｃｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡ（配列番号２３）
・５’末端アミノ基標識２１９  ＋  １０  ｍｅｒ  プローブ  ３５  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒに相補，ターゲット核酸  ５’側１０ｍｅｒ相補）
ＴＴｇＡｃｃｇｇｃＡＴｇｇＡＡＡＡＡｇＴＴｃＡｇＴＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡ（配列番号２４）
・５’末端アミノ基標識２４３  ＋  １０  ｍｅｒ  プローブ  ３５  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒミスマッチ，ターゲット核酸５’側１０ｍｅｒ相補）
ＡｇｃｃＡＴｃｇｃＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴｇｃＴｃｃｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡ（配列番号２５）
（Ｃ）ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒに加えターゲット核酸  ５’末端方向に１５  ｍｅｒ延長した配列に対応するプローブ
・５’末端アミノ基標識０３２  ＋  １５  ｍｅｒ  プローブ  ４０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒミスマッチ，ターゲット核酸５’側１５ｍｅｒ相補）
ＡＴＴＡｃｇｃＡｃｇＡＡＡＴＴＡｃＡｃｃｇｇＴＡｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃ（配列番号２６）
・５’末端アミノ基標識０３７  ＋  １５  ｍｅｒ  プローブ  ４０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒミスマッチ，ターゲット核酸５’側１５ｍｅｒ相補）
ＴＴＡＡＴｃＡｃｃｇＡｃＴｇＴｃＴＴｃｇＴＴｇｃｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃ（配列番号２７）
・５’末端アミノ基標識２１９  ＋  １５  ｍｅｒ  プローブ  ４０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒに相補，ターゲット核酸  ５’側１５ｍｅｒ相補）
ＴＴｇＡｃｃｇｇｃＡＴｇｇＡＡＡＡＡｇＴＴｃＡｇＴＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃ（配列番号２８）
・５’末端アミノ基標識２４３  ＋  １５  ｍｅｒ  プローブ  ４０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒミスマッチ，ターゲット核酸５’側１５ｍｅｒ相補）
ＡｇｃｃＡＴｃｇｃＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴｇｃＴｃｃｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃ（配列番号２９）
（Ｄ）  ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒに加えターゲット核酸  ５’末端方向に１８  ｍｅｒ延長した配列に対応するプローブ
・５’末端アミノ基標識０３２  ＋  １８  ｍｅｒ  プローブ  ４３  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒミスマッチ，ターゲット核酸５’側１８ｍｅｒ相補）
ＡＴＴＡｃｇｃＡｃｇＡＡＡＴＴＡｃＡｃｃｇｇＴＡｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃＡｃｇ（配列番号３０）
・５’末端アミノ基標識０３７  ＋  １８  ｍｅｒ  プローブ  ４３  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒミスマッチ，ターゲット核酸５’側１８ｍｅｒ相補）
ＴＴＡＡＴｃＡｃｃｇＡｃＴｇＴｃＴＴｃｇＴＴｇｃｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃＡｃｇ（配列番号３１）
・５’末端アミノ基標識２１９  ＋  １８  ｍｅｒ  プローブ  ４３  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒに相補，ターゲット核酸  ５’  側１８ｍｅｒに相補）
ＴＴｇＡｃｃｇｇｃＡＴｇｇＡＡＡＡＡｇＴＴｃＡｇＴＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃＡｃｇ（配列番号３２）
・５’末端アミノ基標識２４３  ＋  １８  ｍｅｒ  プローブ  ４３  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒミスマッチ，ターゲット核酸５’側１８ｍｅｒ相補）
ＡｇｃｃＡＴｃｇｃＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴｇｃＴｃｃｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃＡｃｇ（配列番号３３）
（Ｅ）  ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒに加えターゲット核酸  ５’末端方向に２１  ｍｅｒ延長した配列に対応するプローブ
・５’末端アミノ基標識０３２  ＋  ２１  ｍｅｒ  プローブ  ４６  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒミスマッチ，ターゲット核酸５’側２１  ｍｅｒ相補）
ＡＴＴＡｃｇｃＡｃｇＡＡＡＴＴＡｃＡｃｃｇｇＴＡｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃＡｃｇＡｃｇ（配列番号３４）
・５’末端アミノ基標識０３７  ＋  ２１  ｍｅｒ  プローブ  ４６  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒミスマッチ，ターゲット核酸５’側２１  ｍｅｒ相補）
ＴＴＡＡＴｃＡｃｃｇＡｃＴｇＴｃＴＴｃｇＴＴｇｃｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃＡｃｇＡｃｇ（配列番号３５）
・５’末端アミノ基標識２１９  ＋  ２１  ｍｅｒ  プローブ  ４６  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒに相補，ターゲット核酸  ５’側２１  ｍｅｒ相補）
ＴＴｇＡｃｃｇｇｃＡＴｇｇＡＡＡＡＡｇＴＴｃＡｇＴＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃＡｃｇＡｃｇ（配列番号３６）
・５’末端アミノ基標識２４３  ＋  ２１  ｍｅｒ  プローブ  ４６  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒミスマッチ，ターゲット核酸５’側２１  ｍｅｒ相補）
ＡｇｃｃＡＴｃｇｃＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴｇｃＴｃｃｃＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃＡｃｇＡｃｇ（配列番号３７）
ターゲット核酸５’末端捕捉型プローブ；
（Ｆ）ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒに対応する配列と、ターゲット核酸  ５’末端から５ｍｅｒに相補的な配列とが、ミスマッチ領域２０ｍｅｒを介して連結されているプローブ
このミスマッチを意図した部分には，この領域に含まれる４種類の塩基のうちで最も含有量の少ないＴで置換することにした。
【０１３７】
＊参考  ＣＥＤのプローブ配列：  ＡＡｃＡｇＴｃＡＡＡｇｇｃＡｃＡｃｇＡｃｇＡＡＴｃ  （配列番号３８）の左から２０塩基の部分において
Ａ：９  ４５％
Ｔ：１  ５％
ｃ：６  ３０％
ｇ：４  ２０％
・５’末端アミノ基標識０３２  ＋  ５’  ５  ｍｅｒ  プローブ  ５０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒミスマッチ，Ｔ  ｘ  ２０のミスマッチ領域を介して  ターゲット核酸５’末端から５  ｍｅｒ相補）
ＡＴＴＡｃｇｃＡｃｇＡＡＡＴＴＡｃＡｃｃｇｇＴＡｃＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｇＡＡＴｃ（配列番号３９）
・５’末端アミノ基標識０３７  ＋  ５’  ５  ｍｅｒ  プローブ  ５０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒミスマッチ，Ｔ  ｘ  ２０のミスマッチ領域を介してターゲット核酸５’末端から５  ｍｅｒ相補）
ＴＴＡＡＴｃＡｃｃｇＡｃＴｇＴｃＴＴｃｇＴＴｇｃｃＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｇＡＡＴｃ（配列番号４０）
・５’末端アミノ基標識２１９  ＋  ５’  ５  ｍｅｒ  プローブ  ５０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒに相補，Ｔ  ｘ  ２０のミスマッチ領域を介してターゲット核酸５’末端から５  ｍｅｒ相補）
ＴＴｇＡｃｃｇｇｃＡＴｇｇＡＡＡＡＡｇＴＴｃＡｇＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｇＡＡＴｃ（配列番号４１）
・５’末端アミノ基標識２４３  ＋  ５’  ５  ｍｅｒ  プローブ  ５０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒミスマッチ，Ｔ  ｘ  ２０のミスマッチ領域を介してターゲット核酸５’末端から５  ｍｅｒ相補）
ＡｇｃｃＡＴｃｇｃＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴｇｃＴｃｃｃＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｇＡＡＴｃ（配列番号４２）
（Ｇ）．  ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒに対応する配列と、ターゲット核酸５’末端から１０  ｍｅｒに相補な配列とが、とミスマッチ領域１５  ｍｅｒを介して連結されているプローブ
・５’末端アミノ基標識０３２  ＋  ５’  １０  ｍｅｒ  プローブ  ５０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒミスマッチ，Ｔ  ｘ  １５のミスマッチ領域を介して  ターゲット核酸５’末端から１０  ｍｅｒ相補）
ＡＴＴＡｃｇｃＡｃｇＡＡＡＴＴＡｃＡｃｃｇｇＴＡｃＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡｃｇＡｃｇＡＡＴｃ（配列番号４３）
・５’末端アミノ基標識０３７  ＋  ５’  １０  ｍｅｒ  プローブ  ５０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒミスマッチ，Ｔ  ｘ  １５のミスマッチ領域を介してターゲット核酸５’末端から１０  ｍｅｒ相補）
ＴＴＡＡＴｃＡｃｃｇＡｃＴｇＴｃＴＴｃｇＴＴｇｃｃＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡｃｇＡｃｇＡＡＴｃ（配列番号４４）
・５’末端アミノ基標識２１９  ＋  ５’  １０  ｍｅｒ  プローブ  ５０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒに相補，Ｔ  ｘ  １５のミスマッチ領域を介してターゲット核酸５’末端から１０  ｍｅｒ相補）
ＴＴｇＡｃｃｇｇｃＡＴｇｇＡＡＡＡＡｇＴＴｃＡｇＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡｃｇＡｃｇＡＡＴｃ（配列番号４５）
・５’末端アミノ基標識２４３  ＋  ５’  １０  ｍｅｒ  プローブ  ５０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒミスマッチ，Ｔ  ｘ  １５のミスマッチ領域を介してターゲット核酸５’末端から１０  ｍｅｒ相補）
ＡｇｃｃＡＴｃｇｃＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴｇｃＴｃｃｃＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡｃｇＡｃｇＡＡＴｃ（配列番号４６）
（Ｈ）ターゲット核酸中央部２５ｍｅｒに対応する配列と、ターゲット核酸  ５’末端から１５  ｍｅｒに相補な配列とが、ミスマッチ領域１０  ｍｅｒを介して連結されているプローブ
・５’末端アミノ基標識０３２  ＋  ５’  １５  ｍｅｒ  プローブ  ５０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒミスマッチ，Ｔ  ｘ  １０のミスマッチ領域を介して  ターゲット核酸５’末端から１５  ｍｅｒ相補）
ＡＴＴＡｃｇｃＡｃｇＡＡＡＴＴＡｃＡｃｃｇｇＴＡｃＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｇｇｃＡｃＡｃｇＡｃｇＡＡＴｃ（配列番号４７）
・５’末端アミノ基標識０３７  ＋  ５’  １５  ｍｅｒ  プローブ  ５０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒミスマッチ，Ｔ  ｘ  １０のミスマッチ領域を介してターゲット核酸５’末端から１５  ｍｅｒ相補）
ＴＴＡＡＴｃＡｃｃｇＡｃＴｇＴｃＴＴｃｇＴＴｇｃｃＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｇｇｃＡｃＡｃｇＡｃｇＡＡＴｃ（配列番号４８）
・５’末端アミノ基標識２１９  ＋  ５’  １５  ｍｅｒ  プローブ  ５０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒに相補，Ｔ  ｘ  １０のミスマッチ領域を介してターゲット核酸５’末端から１５  ｍｅｒ相補）
ＴＴｇＡｃｃｇｇｃＡＴｇｇＡＡＡＡＡｇＴＴｃＡｇＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｇｇｃＡｃＡｃｇＡｃｇＡＡＴｃ（配列番号４９）
・５’末端アミノ基標識２４３  ＋  ５’  １５  ｍｅｒ  プローブ  ５０  ｍｅｒ  （ターゲット核酸中央部２５  ｍｅｒミスマッチ，Ｔ  ｘ  １０のミスマッチ領域を介してターゲット核酸５’末端から１５  ｍｅｒ相補）
ＡｇｃｃＡＴｃｇｃＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴｇｃＴｃｃｃＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｇｇｃＡｃＡｃｇＡｃｇＡＡＴｃ（配列番号５０）
【０１３８】
【発明の効果】
プローブがターゲット核酸に特異的な配列以外に、共通配列に相補的な配列を備えるので、
１）プローブ長を長く設定できる。このことからより高温でハイブリダイゼーション反応を実施できる。従って、ハイブリダイゼーション反応中にターゲット核酸が安定な構造をとりにくくなり、ターゲット核酸の反応性が高まる。
【０１３９】
２）すべての検出用プローブが共通な配列をそなえることになる。これに対してプローブの共通相補配列部分にハイブリダイズする検出用の標識をした核酸を準備する。この標識をした核酸をハイブリダイズさせ、プローブの固定量を計測できる。
【０１４０】
３）各プローブの固定化量の比を計測することができ、さらに絶対量を決めた標準検体を用いればすべてのプローブで検出しているターゲット核酸の量を計測することができる。
【０１４１】
また、前記プローブに更にリンカー配列を備えたプローブを使用することにより、よりハイブリダイゼーションがおきやすく、反応速度が上がる。長さの割に、分子内構造をとりにくい、低温で反応できるプローブが得られる。また、高感度な核酸検出ができる。
【０１４２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】共通プライマー配列をそなえたターゲット核酸の遺伝子検出への使用例を示す図である。
【図２】ターゲット核酸の配列構成を示す図である。
【図３】ターゲット核酸検出のための従来のプローブの例を示す図である。
【図４】延長型プローブによるハイブリッド形成の形態を説明する図である。
【図５】末端捕捉型プローブによるハイブリッド形成の形態を説明する図である。
【図６】プローブ固定量の測定方法を説明する図である。
【図７】ターゲット核酸の末端を捕捉するとハイブリ効率が向上する理由を説明する図である。
【図８】ターゲット核酸の中央部でのハイブリと５’末端部でのハイブリの比較実験の概略を説明する図である。
【図９】プローブの反応特異性と共通相補配列の延長方向に関する比較実験の概略を説明する図である。
【図１０】ＥＤ延長型プローブと末端捕捉型プローブに関する比較実験の概略を説明する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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