(57)【要約】  【課題】  内分泌撹乱化学物質の測定を簡単、迅速、正確、かつ経済的に行う。  【解決手段】  試料中の内分泌撹乱化学物質と、酵素標識抗原とを固相調製した固相抗体に競合させて免疫反応させ、発光試薬を加えることにより起こる固相抗体により固相に固定された酵素標識抗原の酵素反応の発光量を求め、検量線を用いて間接的に試料中の内分泌撹乱物質の濃度を求める。  【選択図】  図１
2004205504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を固相調製した後、前記固相に酵素標識抗原、および内分泌撹乱化学物質を添加して免疫反応を行わせ、
免疫反応終了後、前記固相を洗浄してから発光試薬を添加して、酵素反応による発光量から前記内分泌撹乱化学物質を測定することを特徴とする内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項２】
前記内分泌撹乱化学物質が１７β−エストラジオールであることを特徴とする請求項１に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項３】
前記抗体は１７β−エストラジオールに牛血清アルブミンを結合し、ウサギに免疫して調製したものであることを特徴とする請求項２に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項４】
前記抗体の濃度が０．７５μｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項３に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項５】
前記抗体１ｍＬに対して添加する前記酵素標識抗原および１７β−エストラジオールの混合溶液の体積が１００μＬであることを特徴とする請求項４に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項６】
前記混合溶液中の酵素標識抗原の濃度が０．１２５〜０．２５μｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項４に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項７】
前記免疫反応を２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら行うことを特徴とする請求項５または６に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項８】
前記免疫反応を１時間以上行うことを特徴とする請求項５乃至７に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項９】
第1抗体を固相調製した後、固相に酵素標識抗原、内分泌撹乱化学物質、および第2抗体を添加して免疫反応を行わせ、
免疫反応終了後、前記固相を洗浄してから発光試薬を添加して、酵素反応による発光量から前記内分泌撹乱化学物質を測定することを特徴とする内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項１０】
前記内分泌撹乱化学物質が１７β−エストラジオールであることを特徴とする請求項９に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項１１】
前記第１抗体が抗ウサギＩｇＧヤギ抗体であり、前記第２抗体が抗１７β−エストラジオールウサギ抗体であることを特徴とする請求項１０に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項１２】
前記抗ウサギＩｇＧヤギ抗体の濃度が１．０μｇ／ｍＬであり、前記抗１７β−エストラジオールウサギ抗体の濃度が０．７５μｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項１１に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【請求項１３】
免疫反応を２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら行うことを特徴とする請求項１１または１２に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内分泌撹乱化学物質である１７β−エストラジオールを測定する酵素免疫測定法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
内分泌撹乱化学物質(以下、環境ホルモンと称す。)は、アメリカのシーア・コルボーンらが発刊した「奪われし未来」によって、地球規模の環境問題の一つとして注目を集め、幅広い関心を呼ぶこととなった。それ以来、環境ホルモン問題に対して我が国では、科学的に未解明な点が多いことから、関係行政機関や各種研究機関が様々な視点から調査、研究に取り組んでいる。
【０００３】
内分泌撹乱作用を有すると疑われる化学物質は多数あるが、我が国においては、１９９８年に環境省が６７物質をリストアップしている。(SPEED98：Strategic programs on Enviromental Endocrine Disruptors)そして、下記表１に示すとおり、その中から２４物質に絞り込んでいる。
【０００４】
【表１】
2004205504.tif 000003
【０００５】
環境ホルモンは、女性ホルモンと同様の働きを有し、微量でも生殖機能に悪影響を与えることから問題になっている。
【０００６】
従来の環境ホルモンの測定方法として、高分解能のＧＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等による機器分析法(環境省暫定マニュアル等)がある。しかし高分解能のＧＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等の分析装置は高額であるため、自前で測定可能な研究室はごく僅かしかなく、煩雑な濃縮操作、抽出操作、及びクリーンアップ操作が必要である等の問題を有している。
【０００７】
近年は、特別な設備を必要とせず、比較的短時間で高感度に測定対象を検出でき、さらに目的物質を特異的に検出でき、しかも経済的であるため環境中に残存する環境物質を監視するモニタリングに適している酵素免疫測定法により環境ホルモンの測定が行われている。
【０００８】
例えば、環境ホルモンを抗原とし、抗原を酵素で標識した標識抗原と競合法、または非競合により抗体との免疫反応を行い、反応終了後に発光基質試薬を添加して酵素と化学発光反応させ、発光量から環境ホルモンを測定する酵素免疫測定法が行われている(例えば、特許文献１参照。)。
【特許文献１】特開２００１−６６３１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
環境ホルモンの測定に際して、高分解能のＧＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等の分析装置を用いて測定を行う場合は、装置が非常に高額であり、濃縮操作、抽出操作、及びクリーンアップ操作等の前準備を必要とし、簡単で速やかな測定が困難である。
【００１０】
女性及び雌の動物の生殖器官の発育や性的特徴維持、機能調整等を司る女性ホルモンは、卵巣濾胞から分泌されるエストロゲンと卵巣黄体から分泌される黄体ホルモンとに大別される。エストロゲンは、主として生殖器官の発育や性的特徴の保持を司るのに対して、黄体ホルモンは、エストロゲンと協力して性周期を起こさせ、妊娠を継続させるものである。
【００１１】
動物のエストロゲンの主要なものは、エストロン、１７β−エストラジオール、エストリオールの３種類で、この３種類の中で１７β−エストラジオールの作用が最も強い。
【００１２】
１７β−エストラジオールは環境ホルモンの中でも特に女性ホルモン作用が強く、１７β−エストラジオールの実用的な測定方法の確立が急務である。
【００１３】
本発明は、かかる事情に鑑みなされたもので、その目的は１７β−エストラジオールを経済的に、誤差なく、簡単、迅速に測定できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題を解決するために、請求項１に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、抗体を固相調製した後、前記固相に酵素標識抗原、および内分泌撹乱化学物質を添加して免疫反応を行わせ、免疫反応終了後、前記固相を洗浄してから発光試薬を添加して、酵素反応による発光量から前記内分泌撹乱化学物質を測定することを特徴とする。
【００１５】
請求項２に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項１において、前記内分泌撹乱化学物質が１７β−エストラジオールであることを特徴とする。
【００１６】
請求項３に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項２において、前記抗体は１７β−エストラジオールに牛血清アルブミンを結合し、ウサギに免疫して調製したものであることを特徴とする。
【００１７】
請求項４に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項３において、前記抗体の濃度が０．７５μｇ／ｍＬであることを特徴とする。
【００１８】
請求項５に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項４において、前記抗体１ｍＬに対して添加する前記酵素標識抗原および１７β−エストラジオールの混合溶液の体積が１００μＬであることを特徴とする。
【００１９】
請求項６に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項４において、前記混合溶液中の酵素標識抗原の濃度が０．１２５〜０．２５μｇ／ｍＬであることを特徴とする。
【００２０】
請求項７に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項５または６において、前記免疫反応を２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら行うことを特徴とする。
【００２１】
請求項８に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項５乃至７において、前記免疫反応を１時間以上行うことを特徴とする。
【００２２】
請求項９に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、第1抗体を固相調製した後、固相に酵素標識抗原、内分泌撹乱化学物質、および第2抗体を添加して免疫反応を行わせ、免疫反応終了後、前記固相を洗浄してから発光試薬を添加して、酵素反応による発光量から前記内分泌撹乱化学物質を測定することを特徴とする。
【００２３】
請求項１０に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項９において、前記内分泌撹乱化学物質が１７β−エストラジオールであることを特徴とする。
【００２４】
請求項１１に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項１０において、前記第１抗体が抗ウサギＩｇＧヤギ抗体であり、前記第２抗体が抗１７β−エストラジオールウサギ抗体であることを特徴とする。
【００２５】
請求項１２に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項１１において、前記抗ウサギＩｇＧヤギ抗体の濃度が１．０μｇ／ｍＬであり、前記抗１７β−エストラジオールウサギ抗体の濃度が０．７５μｇ／ｍＬであることを特徴とする。
【００２６】
請求項１３に記載の内分泌撹乱化学物質の酵素免疫測定方法は、請求項１１または１２において、免疫反応を２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら行うことを特徴とする。
【００２７】
酵素免疫測定法とは、酵素で標識した抗原または抗体を用いて抗原抗体反応を行い、酵素活性を測定することにより抗原抗体反応を検出して抗原または抗体の量を決定する方法である。
【００２８】
請求項１乃至８に記載の発明は、試料中の内分泌撹乱化学物質と、酵素標識抗原とを固相調製した抗体に競合させて免疫反応させ、発光試薬を加えることにより起こる固相抗体に固定された酵素標識抗原の発光反応の発光量を求め、検量線を用いて間接的に試料中の内分泌撹乱化学物質の測定を行うことができる。
【００２９】
また、請求項９乃至１３に記載の発明は、試料中の内分泌撹乱化学物質と、酵素標識抗原と、を固相調製した第１抗体に反応されうる第２抗体に競合させて免疫反応させ、第2抗体と、第1抗体と、により固相に固定された酵素標識抗原を発光試薬を加えることにより起こる発光反応の発光量から測定することにより、試料中の内分泌撹乱化学物質の測定を行うことができる。
【００３０】
なお、酵素標識１７β−エストラジオールの標識酵素は生物又は化学発光反応を触媒しうる限り、特に限定されないが、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシターゼ、グルコースオキシターゼ、ウレアーゼ等がある。
【００３１】
また、抗体についてはポリクロナール抗体、モノクロナール抗体のどちらを用いてもよい。
【発明の効果】
【００３２】
以上の説明から明らかなように、本発明は以下の効果を奏する。
【００３３】
高価なＧＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等による機器分析装置を使用せず、１７β−エストラジオールを酵素免疫測定法により、安価な装置で、簡単、迅速に測定することが可能である。
【００３４】
１７β−エストラジオールの測定に用いる抗体の濃度、酵素標識抗原の濃度、振とう効果、および反応時間について最適値を検討しているので、正確な測定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
【００３６】
(第１実施の形態)
図１は本発明の第１実施の形態に係る、酵素免疫測定法の測定プロセスを示す測定操作の模式図である。図１において、まずポリスチレン製の試験管に１７β−エストラジオール抗体を希釈緩衝液により希釈し、１ｍＬずつ分注し、冷蔵庫で１晩保存し固相抗体の調製を固相１１にて行う。
【００３７】
１７β−エストラジオール抗体(固相抗体)は、１７β−エストラジオールに牛血清アルブミン(ＢＳＡ)を結合し、ウサギに免疫して調製する。また、固相抗体の希釈緩衝液は０．９％塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．０５mol／Ｌのホウ酸緩衝液(ｐＨ＝８．０)を用いる。
【００３８】
次に、１７β−エストラジオールにペルオキシダーゼ(酵素)を標識した酵素標識抗原(酵素標識１７β−エストラジオール)と所望の濃度に調製した１７β−エストラジオールとを試験管に添加し、２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら１時間免疫反応を行う。
【００３９】
酵素標識抗原はＳＩＧＭＡ社製のＥＳＴＲＡＤＩＯＬ−ＰＥＲＯＸＩＤＡＺＥを購入して、０．１mol／Ｌのリン酸緩衝液(ｐＨ＝６．０)で１００μｇ／ｍＬに調製する。ＥＳＴＲＡＤＩＯＬ−ＰＥＲＯＸＩＤＡＺＥを希釈して所望の濃度に調製するときは、２％ポリエチレングリコール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．９％塩化ナトリウムを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液(ｐＨ＝８．０)を調製して使用する。
【００４０】
前記のようにして得られた抗原抗体液１２について、蒸留水を用いて試験管を５回洗浄する。洗浄後、発光試薬を添加して発光反応液１３を得、この発光反応液１３を発光測定装置で０〜３０秒間の発光量を測定して、その測定データをデータ処理１４にて処理する。
【００４１】
なお、発光試薬は６ｍｍｏｌ／Ｌルミノール、１０ｍｏｌ／Ｌ過酸化水素、１８．２ｍｍｏｌ／Ｌパラヨードフェノールを含むトリス塩酸緩衝液(ｐＨ＝８．５)からなる試薬である。
【００４２】
以下の実施例により、第１実施の形態を具体的に説明する。
【００４３】
(実施例１)  固相抗体濃度の検討
固相抗体濃度を緩衝液で、０．３７５、０．７５、１．５、３．０、および６．０μｇ／ｍＬの各濃度に調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより固相チューブを調製した。
【００４４】
前記固相チューブに１．０μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を１００μＬずつ添加し、２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら１時間免疫反応を行った。
【００４５】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【００４６】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。
【００４７】
その測定結果を図２に示す。図２は、１．０μｇ／ｍＬの酵素標識抗原濃度に対して前記固相抗体濃度範囲であれば、固相抗体濃度は充分であることを示している。
【００４８】
固相抗体は動物に免疫して作製するので、作製した抗体を多くの測定回数に供するようにするのが好ましい。そのためには、固相抗体濃度はできる限り低濃度であることが好ましいので、固相抗体濃度は、０．７５μｇ／ｍＬが最もよいと判断した。
【００４９】
(実施例２)  酵素標識抗原濃度の検討
固相抗体濃度を緩衝液で０．７５μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。
【００５０】
酵素標識抗原を０．０１μｇ／ｍＬの濃度に調製し、これを複数のサンプルに分割した。また、１７β−エストラジオールについて８×１０-7〜５×１０-4ｇ／Ｌの濃度範囲で少なくとも７以上のサンプルを調製した。前記酵素標識抗原のサンプルと１７β−エストラジオールのサンプルとを１対１の割合(体積比)で混合し、各混合液から１００μＬを分取して前記固相チューブに添加した。
【００５１】
添加後、２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら１時間免疫反応を行った。
【００５２】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【００５３】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。
【００５４】
また、酵素標識抗原濃度が０．１、０．２５、０．５、０．７５、および１．０μｇ／ｍＬのものについても前記と同様の測定を行った。
【００５５】
その測定結果を図３〜図８に示す。図３〜図８の結果から、図５および図６が１７β−エストラジオール濃度と発光量との相関関係がよいことを確認し、酵素標識抗原の濃度範囲は０．２５〜０．５μｇ／ｍＬがよいと判断した。
【００５６】
(実施例３)  酵素標識抗原濃度の検討２
前記実施例２では、酵素標識抗原と１７β−エストラジオールとを１対１の割合で混合し、その混合液から１００μＬを分取して固相チューブに添加しているので、最終的な酵素標識抗原の濃度は、始めに調製した濃度の１／２になっている。実施例３では前記１対１の混合割合を変えたとき、前記実施例２と同様の結果が得られるかを検証した。
【００５７】
固相抗体濃度を緩衝液で０．７５μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。
【００５８】
酵素標識抗原を０．５μｇ／ｍＬの濃度に調製し、これを複数のサンプルに分割した。また、１７β−エストラジオールについて、８×１０-7〜５×１０-4ｇ／Ｌの濃度範囲で少なくとも６以上のサンプルを調製した。
【００５９】
０．５μｇ／ｍＬの濃度に調製した酵素標識抗原のサンプル５００μＬと１７β−エストラジオールのサンプル５００μＬとを混合し、各混合液から１００μＬを分取して前記固相チューブに添加した。
【００６０】
添加後、２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら１時間免疫反応を行った。
【００６１】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【００６２】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。
【００６３】
また、酵素標識抗原を１．０、および２．０μｇ／ｍＬの各濃度に調製し、これらを少なくとも６以上のサンプルに分割した。１．０μｇ／ｍＬの濃度に調製した酵素標識抗原のサンプル０．５ｍＬと１７β−エストラジオールのサンプル１．５ｍＬとを混合した各混合溶液、および、２．０μｇ／ｍＬの濃度に調製した酵素標識抗原のサンプル０．２５ｍＬと１７β−エストラジオールのサンプル１．７５ｍＬとを混合した各混合溶液についても前記と同様の測定を行った。
【００６４】
その測定結果を図９〜図１１に示す。実施例３では最終的な酵素標識抗原の濃度はすべて０．２５μｇ／ｍＬであり、前記結果からこの酵素標識抗原の濃度であれば、混合比が１対１ではなくてもよいことを確認した。さらに、前記実施例２の結果と実施例３の結果とから、最終的な酵素標識抗原の濃度が０．１２５〜０．２５μｇ／ｍＬであればよいと判断した。
【００６５】
(実施例４)  液量の検討
固相抗体濃度を緩衝液で０．７５μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。
【００６６】
酵素標識抗原を０．５μｇ／ｍＬの濃度に調製し、これを複数のサンプルに分割した。また、１７β−エストラジオールを８×１０-7、および４×１０-6ｇ／Ｌの各濃度に調製し、酵素標識抗原のサンプルと１７β−エストラジオールのサンプルとを１対１の割合で混合した。各混合溶液から１００、３００、および５００μＬを分取して固相チューブに添加した。
【００６７】
添加後、２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら１時間免疫反応を行った。
【００６８】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【００６９】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。
【００７０】
その測定結果を図１２に示す。図１２から、固相チューブに添加する酵素標識抗原と１７β−エストラジオールとの混合溶液量は１００μＬがよいということを確認した。また、１００μＬ以下の液量では、分注精度が悪くなるので、１００μＬが適量であると判断した。
【００７１】
(実施例５)  免疫反応順序の検討
実施例５では、免疫反応を行う際に、酵素標識抗原と１７β−エストラジオールとの混合溶液を固相チューブに１００μＬ添加して１時間免疫反応を行う第１方法と、１７β−エストラジオールを１００μＬ固相チューブに添加して３０分間免疫反応を行った後に酵素標識抗原を１００μＬ添加して３０分間免疫反応を行う第２方法と、酵素標識抗原を固相チューブに１００μＬ添加して３０分間免疫反応を行った後に１７β−エストラジオールを１００μＬ添加して３０分間免疫反応を行う第３方法とを行い、どの方法が適しているかを検討した。なお、酵素標識抗原と１７β−エストラジオールとの混合比および添加比はすべて１対１とした。
【００７２】
固相抗体濃度を緩衝液で０．７５μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。
【００７３】
１７β−エストラジオールを８×１０-7〜５×１０-4ｇ／Ｌの濃度範囲で５倍ずつ希釈して少なくとも６以上のサンプルを調製した。また、酵素標識抗原を０．５μｇ／ｍＬの濃度に調製し、複数のサンプルに分割した。
【００７４】
これらのサンプルについて前記第１〜３方法により免疫反応を行った。
【００７５】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【００７６】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。
【００７７】
その測定結果を図１３に示す。第１方法と第２方法とはほぼ同等の結果を示しているが、第３方法は感度が悪いことを確認した。
【００７８】
(実施例６)  反応時間の検討１
固相抗体濃度を緩衝液で０．７５μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。
【００７９】
１７β−エストラジオールを２×１０-5ｇ／Ｌの濃度に調製し、また、酵素標識抗原を０．２５μｇ／ｍＬの濃度に調製し、１７β−エストラジオールのサンプルと酵素標識抗原のサンプルとを１対１の割合で混合し、混合液を１００μＬずつ分取して、固相チューブに添加した。
【００８０】
添加後、２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら、それぞれ、０分間、１５分間、３０分間、６０分間、９０分間、および１２０分間免疫反応を行った。
【００８１】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【００８２】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。
【００８３】
その測定結果を図１４に示す。図１４から、６０分間反応させた後は発光量の増加はほとんど無いことが確認でき、６０分間以上免疫反応を行えば充分であると判断した。
【００８４】
(実施例７)  反応時間の検討２
前記実施例６では２×１０-5ｇ／Ｌの濃度の１７β−エストラジオールについて反応時間を検討したが、濃度によって反応性が異なってくることが考えられる。そこで実施例７では、１７β−エストラジオールの濃度を変えて、免疫反応時間の検討を行った。
【００８５】
固相抗体濃度を緩衝液で０．７５μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。
【００８６】
１７β−エストラジオールを８×１０-7〜５×１０-4ｇ／Ｌの濃度範囲で５倍ずつ希釈して少なくとも６以上のサンプルを調製した。また、酵素標識抗原を０．２５μｇ／ｍＬの濃度に調製し、複数のサンプルに分割した。１７β−エストラジオールのサンプルと酵素標識抗原のサンプルとを１対１の割合で混合し、混合液を１００μＬずつ分取して、固相チューブに添加した。
【００８７】
添加後、２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら、それぞれ、３０分間、４５分間、および６０分間免疫反応を行った。
【００８８】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【００８９】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。
【００９０】
その測定結果を図１５〜図１７に示す。図１５〜図１７の結果から、反応時間が６０分間のものが濃度と発光量との相関関係がよいということを確認し、免疫反応時間３０分間〜６０分間の範囲では、６０分間が最もよいと判断した。
【００９１】
(実施例８)  振とうの効果についての検討
免疫反応を静置して行う場合と、２００ｒｐｍで振とうしながら行う場合との相違について検討した。
【００９２】
固相抗体濃度を緩衝液で０．７５μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより複数の固相チューブを調製した。
【００９３】
１７β−エストラジオールを８×１０-7〜５×１０-4ｇ／Ｌの濃度範囲で５倍ずつ希釈して少なくとも６以上のサンプルを調製し、また、酵素標識抗原を０．２５μｇ／ｍＬの濃度に調製し複数のサンプルに分割した。１７β−エストラジオールのサンプルと酵素標識抗原のサンプルとを１対１の割合で混合し、混合液を１００μＬずつ分取して、固相チューブに添加した。
【００９４】
添加後、それぞれ、静置して１時間、および２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら１時間、免疫反応を行った。
【００９５】
その測定結果を図１８、図１９に示す。図１８および図１９の結果から免疫反応時間が１時間の場合には、２００ｒｐｍの回転数で振とうするのがよいことを確認した。
【００９６】
(第２実施の形態)
図２０は本発明の第２実施の形態に係る、酵素免疫測定法の測定プロセスを示す測定操作の模式図である。図２０において、まずポリスチレン製の試験管に第１抗体である抗ウサギＩｇＧヤギ抗体(固相抗体)を希釈緩衝液により希釈し、１ｍＬずつ分注し、冷蔵庫で１晩保存し固相抗体の調製を固相２１にて行う。抗ウサギＩｇＧヤギ抗体は日本バイオテスト研究所の市販品を購入して使用し、固相抗体の希釈緩衝液は０．９％塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウムを含む、０．０５moｌ/Ｌのホウ酸緩衝液(ｐＨ＝８．０)を調製して使用する。
【００９７】
次に、１７β−エストラジオールにペルオキシダーゼ(酵素)を標識した酵素標識抗原(酵素標識１７β−エストラジオール)、所望の濃度に調製した１７β−エストラジオール、第２抗体である抗１７β−エストラジオールウサギ抗体の順に固相抗体の調製を行った試験管に添加し、２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら１時間免疫反応を行う。抗１７β−エストラジオールウサギ抗体は、１７β−エストラジオールに牛血清アルブミン(ＢＳＡ)を結合し、ウサギに免疫して調製する。酵素標識抗原はＳＩＧＭＡ社製のＥＳＴＲＡＤＩＯＬ−ＰＥＲＯＸＩＤＡＺＥを購入して使用する。
【００９８】
抗１７β−エストラジオールウサギ抗体、及びＥＳＴＲＡＤＩＯＬ−ＰＥＲＯＸＩＤＡＺＥを希釈して所望の濃度に調製するときは、２％ポリエチレングリコール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．９％塩化ナトリウムを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液(ｐＨ＝８．０)を調製して使用する。
【００９９】
上記のようにして得られた抗原抗体液２２と固相抗体との免疫反応終了後、蒸留水を用いて試験管を５回洗浄する。洗浄後、発光試薬を添加して発光反応液２３を得、この発光反応液２３を発光測定装置で０〜３０秒間の発光量を測定して、その測定データをデータ処理２４にて処理する。
【０１００】
なお、発光試薬は６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度に調製し、１０ｍｏｌ／Ｌ過酸化水素、１８．２ｍｍｏｌ／Ｌパラヨードフェノールを含むトリス塩酸緩衝液(ｐＨ＝８．５)を調製して使用する。
【０１０１】
以下の実施例により、第２実施の形態を具体的に説明する。
【０１０２】
(実施例９)  固相抗体濃度の検討
固相は、固相抗体濃度を緩衝液で、１．０、２．０、および３．０μｇ／ｍＬの各濃度に調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより固相チューブを調製した。
【０１０３】
前記固相チューブに０．７５μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を１００μＬずつ添加した。その後、抗１７β−エストラジオールウサギ抗体を０．７５、１．５、３．０、および６．０μｇ／ｍＬの各濃度に調製し、これらを前記固相チューブに１００μＬずつ添加し、２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら１時間免疫反応を行った。
【０１０４】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【０１０５】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。その測定結果を図２１に示す。
【０１０６】
図２１に示すとおり、固相抗体濃度は１μｇ／ｍＬが良いことが判明した。
【０１０７】
(実施例１０)  抗１７β−エストラジオールウサギ抗体濃度の検討
固相は、固相抗体濃度を緩衝液で１．０μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより固相チューブを調製した。
【０１０８】
前記固相チューブに０．５μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を１００μＬずつ添加した。その後、０．７５、１．５、３．０、および６．０μｇ／ｍＬに調製した抗１７β−エストラジオールウサギ抗体を前記固相チューブに１００μＬずつ添加し、２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。
【０１０９】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【０１１０】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。その測定結果を図２２に示す。
【０１１１】
図２２に示すとおり、抗１７β−エストラジオールウサギ抗体濃度は０．７５μｇ／ｍＬが良いことが判明した。
【０１１２】
(実施例１１)  免疫反応時間の検討１
固相は、固相抗体濃度を緩衝液で１．０μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより固相チューブを調製した。
【０１１３】
前記固相チューブに０．７５μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を２００μＬずつ添加し、さらに１７β−エストラジオールの希釈緩衝液を１００μＬ添加した。その後、０．７５μｇ／ｍＬに調製した抗１７β−エストラジオールウサギ抗体を前記固相チューブに１００μＬずつ添加した。
【０１１４】
添加後、２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら０分間、１５分間、３０分間、４５分間、６０分間、９０分間、１２０分間、１５０分間、１８０分間、２１０分間、および２４０分間免疫反応を行った。
【０１１５】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【０１１６】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。その測定結果を図２３に示す。
【０１１７】
図２３から、免疫反応は反応開始直後から徐々に進行し、９０分過ぎからはそれほど大きな免疫反応の進行はないことが判明した。
【０１１８】
（実施例１２）  免疫反応時間の検討２
実施例１１では、１７β−エストラジオールの希釈緩衝液で最適反応時間について検討したが、濃度によって１７β−エストラジオールの反応性が異なることも考えられるので、１７β−エストラジオールの濃度を６．４０×１０−９〜１．０×１０−４ｇ／Ｌの濃度範囲に５倍ずつ希釈調製して最適反応時間について検討した。
【０１１９】
固相は、固相抗体濃度を緩衝液で１．０μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより固相チューブを調製した。
【０１２０】
前記固相チューブに０．７５μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を２００μＬずつ添加し、これに、６．４０×１０−９〜１．０×１０−４ｇ／Ｌの濃度範囲に５倍ずつ希釈調製した１７β−エストラジオールを１００μＬずつ添加した。その後、０．７５μｇ／ｍＬに調製した抗１７β−エストラジオールウサギ抗体をを２００μＬずつ添加した。
【０１２１】
添加後、２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら、３０分間、６０分間、および９０分間免疫反応を行った。
【０１２２】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【０１２３】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。その測定結果を図２４に示す。
【０１２４】
図２４に示す結果から、免疫反応時間が３０分間〜９０分間の範囲でそれほど大きな差異は観測されなかったが、低濃度領域の測定では６０分間以上免疫反応を行ったほうが良いことが判明した。
【０１２５】
（実施例１３）  攪拌効果の検討
免疫反応を静置で行う場合と、２００ｒｐｍで行う場合の相違について検討した。
【０１２６】
固相は、固相抗体濃度を緩衝液で１．０μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより固相チューブを調製した。
【０１２７】
前記固相チューブに０．７５μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を２００μＬずつ添加し、これに、６．４０×１０−９〜１．０×１０−４ｇ／Ｌの濃度範囲に５倍ずつ希釈調製した１７β−エストラジオールを１００μＬずつ添加した。その後、０．７５μｇ／ｍＬに調製した抗１７β−エストラジオールウサギ抗体をを２００μＬずつ添加した。
【０１２８】
添加後、静置で1時間、および２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。
【０１２９】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【０１３０】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。測定結果を図２５に示す。
【０１３１】
図２５の測定結果から、、免疫時間が1時間の場合には２００ｒｐｍの回転数で行った方が良いことが判明した。
【０１３２】
（実施例１４）  実試料（下水処理水）の測定１
いろいろな夾雑物が混入する下水処理水や河川水中に含まれる環境ホルモン(１７β−エストラジオール)の測定に適応できるかを検討するために、都内下水処理場の流入下水および放流水に１７β−エストラジオールを添加して、添加回収試験を行った。
【０１３３】
固相は、固相抗体濃度を緩衝液で１．０μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより固相チューブを調製した。
【０１３４】
前記固相チューブに０．７５μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を２００μＬずつ添加し、これに、５．０×１０−８〜５．０×１０−４ｇ／Ｌの濃度範囲に希釈調製した１７β−エストラジオールと下水処理水（Ｓ浄水場の曝気槽入口水と放流水）に１７β−エストラジオール濃度が５．０×１０−７ｇ／Ｌ、５．０×１０−５ｇ／Ｌになるように調製した処理水を添加した。その後、０．７５μｇ／ｍＬに調製した抗１７β−エストラジオールウサギ抗体を２００μＬずつ添加した。
【０１３５】
添加後２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。
【０１３６】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【０１３７】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。測定結果を図２６に示す。
【０１３８】
図２６の測定結果から、本発明の酵素免疫測定法は非常に特異的な反応であるために、いろいろな夾雑物が混入する下水処理水であっても、交差反応性の影響をあまり受けずに測定できることが判明した。
【０１３９】
（実施例１５）  実試料（下水処理水）の測定２
下水処理場の処理水は、下水処理場によって処理水質が異なる。例えば、汚泥処理設備を有する処理上では、汚泥処理からの返流水があり、その返流水中には比較的多くの硫化物が含まれている。その意味で、実施例１４とは異なる都内下水処理場の流入下水および放流水に１７β−エストラジオールを添加して、添加回収試験を行った。
【０１４０】
固相は、固相抗体濃度を緩衝液で１．０μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより固相チューブを調製した。
【０１４１】
前記固相チューブに０．７５μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を２００μＬずつ添加し、これに、５．０×１０−８〜５．０×１０−４ｇ／Ｌの濃度範囲に希釈調製した１７β−エストラジオールと下水処理水（Ｃ処理場の一沈流出水と放流水）に１７β−エストラジオール濃度が５．０×１０−７ｇ／Ｌ、５．０×１０−５ｇ／Ｌになるように調製した処理水を添加した。その後、０．７５μｇ／ｍＬに調製した抗１７β−エストラジオールウサギ抗体を２００μＬずつ添加した。
【０１４２】
添加後２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。
【０１４３】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【０１４４】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。測定結果を図２７に示す。
【０１４５】
図２７の測定結果から、、本発明の酵素免疫測定法は非常に特異的な反応であるために、いろいろな夾雑物が混入する下水処理水であっても、交差反応性の影響をあまり受けずに測定できることが判明した。
【０１４６】
（実施例１６）  実試料（河川水）の測定３
いろいろな夾雑物が混入する下水処理水や河川水中に含まれる１７β−エストラジオールの測定に適応できるかを検討するために、都内の河川水に１７β−エストラジオールを添加して、添加回収試験を行った。
【０１４７】
固相は、固相抗体濃度を緩衝液で１．０μｇ／ｍＬに調製し、ポリスチレン製の試験管に１ｍＬずつ分注して、冷蔵庫で１晩保存することにより固相チューブを調製した。
【０１４８】
前記固相チューブに０．７５μｇ／ｍＬに調製した酵素標識抗原を２００μＬずつ添加し、これに、５．０×１０−８〜５．０×１０−４ｇ／Ｌの濃度範囲に希釈調製した１７β−エストラジオールと河川水（Ｍ川）に１７β−エストラジオール濃度が５．０×１０−７ｇ／Ｌ、５．０×１０−５ｇ／Ｌになるように調製した処理水を添加した。その後、０．７５μｇ／ｍＬに調製した抗１７β−エストラジオールウサギ抗体を２００μＬずつ添加した。
【０１４９】
添加後２００ｒｐｍの回転数で振とうしながら1時間免疫反応を行った。
【０１５０】
免疫反応終了後、蒸留水で５回洗浄した。
【０１５１】
洗浄後、６ｍＭのルミノールを主成分とする発光試薬を添加して、発光測定装置(明電舎製のルミノメータＵＰＤ−４０００)で０〜３０秒間の発光量を測定した。測定結果を図２８に示す。
【０１５２】
図２８の測定結果から、本発明の酵素免疫測定法は非常に特異的な反応であるために、いろいろな夾雑物が混入する河川水であっても、交差反応性の影響をあまり受けずに測定できることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】本発明の第１実施の形態の測定操作の模式図である。
【図２】本発明の実施例１の結果を示す特性図である。
【図３】本発明の実施例２の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が０．０１μｇ／ｍｌ)である。
【図４】本発明の実施例２の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が０．１μｇ／ｍｌ)である。
【図５】本発明の実施例２の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が０．２５μｇ／ｍｌ)である。
【図６】本発明の実施例２の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が０．５μｇ／ｍｌ)である。
【図７】本発明の実施例２の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が０．７５μｇ／ｍｌ)である。
【図８】本発明の実施例２の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が１．０μｇ／ｍｌ)である。
【図９】本発明の実施例３の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が０．５μｇ／ｍＬ)である。
【図１０】本発明の実施例３の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が１．０μｇ／ｍＬ)である。
【図１１】本発明の実施例３の結果を示す特性図(酵素標識抗原濃度が２．０μｇ／ｍＬ)である。
【図１２】本発明の実施例４の結果を示す特性図である。
【図１３】本発明の実施例５の結果を示す特性図である。
【図１４】本発明の実施例６の結果を示す特性図である。
【図１５】本発明の実施例７の結果を示す特性図(免疫反応時間が３０分間)である。
【図１６】本発明の実施例７の結果を示す特性図(免疫反応時間が４５分間)である。
【図１７】本発明の実施例７の結果を示す特性図(免疫反応時間が６０分間)である。
【図１８】本発明の実施例８の結果を示す特性図(静置して１時間反応)である。
【図１９】本発明の実施例８の結果を示す特性図(２００ｒｐｍの振とうで１時間反応)である。
【図２０】本発明の第２実施の形態の測定操作の模式図である。
【図２１】本発明の実施例９の結果を示す特性図である。
【図２２】本発明の実施例１０の結果を示す特性図である。
【図２３】本発明の実施例１１の結果を示す特性図である。
【図２４】本発明の実施例１２の結果を示す特性図である。
【図２５】本発明の実施例１３の結果を示す特性図である。
【図２６】本発明の実施例１４の結果を示す特性図である。
【図２７】本発明の実施例１５の結果を示す特性図である。
【図２８】本発明の実施例１６の結果を示す特性図である。
【符号の説明】
【０１５４】
１１、２１…固相
１２、２２…抗原抗体液
１３、２３…発光反応液
１４、２４…データ処理
【図１】
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【図２】
2004205504.tif 000005
【図３】
2004205504.tif 000006
【図４】
2004205504.tif 000007
【図５】
2004205504.tif 000008
【図６】
2004205504.tif 000009
【図７】
2004205504.tif 000010
【図８】
2004205504.tif 000011
【図９】
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【図１０】
2004205504.tif 000013
【図１１】
2004205504.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
2004205504.tif 000016
【図１４】
2004205504.tif 000017
【図１５】
2004205504.tif 000018
【図１６】
2004205504.tif 000019
【図１７】
2004205504.tif 000020
【図１８】
2004205504.tif 000021
【図１９】
2004205504.tif 000022
【図２０】
2004205504.tif 000023
【図２１】
2004205504.tif 000024
【図２２】
2004205504.tif 000025
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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