(57)【要約】【課題】Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、特にβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼを安価に且つ効率的に供給することを可能にする。【解決手段】糖結合性蛋白質、特にマルトース結合性蛋白質とＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、特にβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーとの融合蛋白質として大腸菌に発現させることにより、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼを効率よく製造するための方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖結合性蛋白質とＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとの組換え融合蛋白質。
【請求項２】
Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼがβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼである請求項１記載の組換え融合蛋白質。
【請求項３】
β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼがマウス由来である請求項２記載の組換え融合蛋白質。
【請求項４】
β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが、（ａ）または（ｂ）に記載される蛋白質である請求項２又は３に記載の組換え融合蛋白質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）（ａ）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
【請求項５】
糖結合性蛋白質がマルトース結合性蛋白質である請求項１〜４のいずれかに記載の組換え融合蛋白質。
【請求項６】
糖結合性蛋白質とβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとの間にプロテアーゼ認識配列を含む請求項２〜４のいずれかに記載の組換え融合蛋白質。
【請求項７】
プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子である請求項６記載の組換え融合蛋白質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の組換え融合蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８記載のＤＮＡを含んでなるベクター。
【請求項１０】
請求項９記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むことを特徴とする請求項３〜７のいずれかに記載の組換え融合蛋白質の製造方法。
（Ａ）大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合性蛋白質をコードするＤＮＡとβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを、該両蛋白質の融合蛋白質として発現するように連結した発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換し、
（Ｂ）得られた形質転換体を培養して、糖結合性蛋白質とβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとの融合蛋白質を生成させ、
（Ｃ）得られた培養物から、該融合蛋白質を分離する
【請求項１２】
糖結合性蛋白質がマルトース結合性蛋白質である請求項１１記載の組換え融合蛋白質の製造方法。
【請求項１３】
マルトース結合性蛋白質をコードするＤＮＡが、ｐＭＡＬ−ｐ２もしくはｐＭＡＬ−ｃ２に由来する請求項１２記載の組換え融合蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法により得られる融合蛋白質から、糖結合性蛋白質部分を除去してβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼを採取する工程を含む、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項１５】
糖結合性蛋白質部分の除去に際してプロテアーゼを用いる請求項１４記載のβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項１６】
プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子である請求項１５記載のβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖転移酵素であるＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、特にβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（β１，４−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性を有する融合蛋白質及びその製造方法に関する。より具体的には、マルトース結合性蛋白質（以下、ＭＢＰと略することもある）とβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋白質及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の単糖がグリコシド結合により連結した糖鎖は、細胞において、細胞内オルガネラ成分、細胞表層成分、分泌糖蛋白質成分などとして存在している。これら糖鎖の構造は、生物種や組織特異的に異なっているが、同一生物種や同一組織内でもその発生時期や疾病等によっても異なることから、従来考えられていた蛋白質の熱安定性、親水性、電荷、プロテアーゼ耐性等の蛋白質に対する物理的性質の付与といった機能の他に、発生・分化、神経系、免疫系、ガンの転移等の細胞間認識に糖鎖が関与していることが明らかになり、医薬品等の種々の分野への応用という点から近年非常に注目されるようになった。
【０００３】
これら糖鎖は、生体内においては糖転移酵素によって合成されている。糖転移酵素は、糖ヌクレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖伸長を行う酵素であり、また、その糖受容体の糖鎖構造に対する特異性は厳密であり、通常、１つのグリコシド結合は対応する１つの糖転移酵素によって形成されると言われている。これら糖転移酵素は、糖鎖研究、特に有用糖鎖の簡便な合成、天然の糖鎖の修飾に利用されるという点で重要な酵素である。しかしながら、天然に存在する糖転移酵素の量は極僅かであり、大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。
【０００４】
糖転移酵素の中でも、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、特にβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（以下、β１，４ＧａｌＮＡｃＴと示すこともある。）は、ガングリオシドの中でも、特に糖脂質の代謝機能や糖脂質代謝異常性疾患の診断や研究において有用であるＧＭ２の合成に関与する糖転移酵素である（図１）。β１，４ＧａｌＮＡｃＴはその重要性ゆえに、安定した供給が強く望まれていた。β１，４ＧａｌＮＡｃＴは、ヒトガン細胞（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．第５３巻、第５３９５〜５４００頁（１９９３年））やマウスの胸腺腫細胞株であるＥＬ４細胞（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．第３５８巻、第７９〜８３頁（１９９５年））などから単離されることが報告されている。しかしながら、大量且つ安定した細胞の確保が困難であることや、単一の酵素に精製するとなれば非常に手間を要することから、遺伝子組換え技術によるβ１，４ＧａｌＮＡｃＴの生産が要望されている。β１，４ＧａｌＮＡｃＴをコードする遺伝子は、例えば上述したマウスＥＬ４細胞より単離されたものが報告されている。
【０００５】
組換え蛋白質の大量生産には、コスト的な点を考慮すれば、細菌や酵母などの微生物に発現させる方法が有利である。しかしながら、微生物の発現系では、発現した蛋白質の多くが不溶性の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）として存在することがあり、精製に際して可溶化・再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）の工程を必要とするので、効率的とは言えなかった。さらに、一部可溶性蛋白質として発現した酵素についても、高純度に得るためには、各種クロマトグラフィ処理を含む多くの精製工程が必要であり、多大な時間及びコストがかかるために、商業的生産用の発現系としては十分ではなかった。
【０００６】
一方、目的とする遺伝子を大量に発現させ、且つ発現産物の精製を容易にする方法として、目的蛋白質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やプロテインＡなどとの融合蛋白質として発現させる方法がある。これらの方法では、ＧＳＴとの融合蛋白質はグルタチオンをリガンドとするアフィニティカラムクロマトグラフィにより、また、プロテインＡとの融合蛋白質はＩｇＧをリガンドとするアフィニティカラムクロマトグラフィにより、それぞれ容易に精製することができる。しかしながら、この方法を用いた場合、前記と同様に、封入体を生成する可能性が高い。このような理由から、β１，４ＧａｌＮＡｃＴを大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、特にβ１，４ＧａｌＮＡｃＴを安価に且つ効率的に供給せしめることを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述したような事情に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組換え技術により、β１，４ＧａｌＮＡｃＴを糖結合性蛋白質との融合蛋白質として宿主に発現させると、β１，４ＧａｌＮＡｃＴを可溶性蛋白質として得ることができ、さらに該糖結合性蛋白質の特異的親和性を利用したアフィニティクロマトグラフィにより容易に精製することが可能であり、得られた融合蛋白質がβ１，４ＧａｌＮＡｃＴの活性を有していることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．糖結合性蛋白質とＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとの組換え融合蛋白質。
項２．Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼがβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼである項１記載の組換え融合蛋白質。
項３．β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼがマウス由来である項２記載の組換え融合蛋白質。
項４．β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが、（ａ）または（ｂ）に記載される蛋白質である項２又は３に記載の組換え融合蛋白質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）（ａ）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
項５．糖結合性蛋白質がマルトース結合性蛋白質である項１〜４のいずれかに記載の組換え融合蛋白質。
項６．糖結合性蛋白質とβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとの間にプロテアーゼ認識配列を含む項２〜４のいずれかに記載の組換え融合蛋白質。
項７．プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子である項６記載の組換え融合蛋白質。
項８．項１〜７のいずれかに記載の組換え融合蛋白質をコードするＤＮＡ。
項９．項８記載のＤＮＡを含んでなるベクター。
項１０．項９記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
項１１．以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むことを特徴とする項３〜７のいずれかに記載の組換え融合蛋白質の製造方法。
（Ａ）大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合性蛋白質をコードするＤＮＡとβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを、該両蛋白質の融合蛋白質として発現するように連結した発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換し、
（Ｂ）得られた形質転換体を培養して、糖結合性蛋白質とβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとの融合蛋白質を生成させ、
（Ｃ）得られた培養物から、該融合蛋白質を分離する
項１２．糖結合性蛋白質がマルトース結合性蛋白質である項１１記載の組換え融合蛋白質の製造方法。
項１３．マルトース結合性蛋白質をコードするＤＮＡが、ｐＭＡＬ−ｐ２もしくはｐＭＡＬ−ｃ２に由来する項１２記載の組換え融合蛋白質の製造方法。
項１４．項１１〜１３のいずれかに記載の方法により得られる融合蛋白質から、糖結合性蛋白質部分を除去してβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼを採取する工程を含む、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの製造方法。
項１５．糖結合性蛋白質部分の除去に際してプロテアーゼを用いる項１４記載のβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの製造方法。
項１６．プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子である項１５記載のβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの製造方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明は、β１，４ＧａｌＮＡｃＴ活性を有する蛋白質を、β１，４ＧａｌＮＡｃＴと糖結合性蛋白質との融合蛋白質としたこと、該融合蛋白質は可溶性蛋白質であることを特徴とする。
さらに、本発明は、β１，４ＧａｌＮＡｃＴを糖結合性蛋白質との融合蛋白質として大腸菌に発現させることにより、β１，４ＧａｌＮＡｃＴを可溶性融合蛋白質として生成させることを可能としたこと、並びに、糖結合性蛋白質の有する特異的親和性を利用することにより、融合蛋白質及びβ１，４ＧａｌＮＡｃＴを容易且つ大量に精製することを可能ならしめたことを特徴とするものである。
【００１１】
本発明において、糖結合性蛋白質とは、糖もしくは糖残基を有する少糖類及び多糖類に対して高い親和性を保持する蛋白質である。該糖結合性蛋白質は、いかなる生物種に由来するものであってもよいが、好ましくは細菌等の原核生物に由来するものであり、より好ましくは大腸菌に由来するものである。
具体的には、各種レクチン、マルトース結合性蛋白質、セルロース結合性蛋白質、キチン結合性蛋白質などが例示される。なかでも、マルトース結合性蛋白質（以下、ＭＢＰと示すこともある。）が特に好ましい。
【００１２】
ＭＢＰは、マルトース又はマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有していれば、必ずしもその全配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであってもよい。したがって、公知のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列からなり、マルトース又はマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有する蛋白質も、本発明におけるＭＢＰに含めることができる。
【００１３】
本発明において、ＭＢＰをコードする遺伝子としてはその由来は特に限定されるものではないが、ｐＭＡＬ−ｐ２もしくはｐＭＡＬ−ｃ２（いずれも、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ製）に由来するものが挙げられる。
【００１４】
本発明における糖結合性蛋白質は、そのＣ末端側に配列特異性の高いプロテアーゼにより認識され切断されるアミノ酸配列を含むことが特に好ましい。該プロテアーゼとしては、血液凝固第Ｘａ因子（以下、Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａと示すこともある。）、トロンビン、レニン等を例示することができるが、好ましくはＦａｃｔｏｒ　Ｘａ認識配列、すなわち、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３）である。こうしたプロテアーゼ認識配列を糖結合性蛋白質のＣ末端側に導入することにより、例えば、ＭＢＰ融合β１，４ＧａｌＮＡｃＴ（以下、ＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴと示すこともある。）の精製後に、上記のようなプロテアーゼを作用させることによりＭＢＰ部分を容易に除去することも可能である。
【００１５】
また、より好ましい態様としては、糖結合性蛋白質は、糖結合蛋白質部位とプロテアーゼ認識部位の間に、５〜１５アミノ酸残基程度のスペーサー配列を含むものが挙げられる。該スペーサー配列の存在により、糖結合性蛋白質はβ１，４ＧａｌＮＡｃＴから遠ざかるために融合蛋白質における分子内相互作用の可能性が減じ、ＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴ融合蛋白質の場合、ＭＢＰ部分のマルトースやアミロースに対する特異的親和性が増大する。本発明においては、配列番号７のスペーサー配列を含むｐＭＡＬ−ｐ２もしくはｐＭＡＬ−ｃ２（いずれも、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ製）を用いることができる。
【００１６】
本発明において、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、上述したβ１，４ＧａｌＮＡｃＴであることが特に好ましいが、Ｎ−アセチルガラクトサミンを生成する反応を触媒するものであれば限定されるものではなく、広く種々のいかなるＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼにも適用することが可能である。β１，４ＧａｌＮＡｃＴ以外のものとして、例えば、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｏ−ＧａｌＮＡｃＴ（ポリペプチド　α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ）、ＣＴ抗原転移酵素等が挙げられる。
【００１７】
β１，４ＧａｌＮＡｃＴについては、いかなる生物種に由来するものであってもよいが、好ましくは哺乳動物由来、より好ましくはマウス由来である。また、本発明においては、β１，４ＧａｌＮＡｃＴは、その活性を保持する限りにおいては必ずしもβ１，４ＧａｌＮＡｃＴ全長配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであってもよい。例えば、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質や、（ｂ）（ａ）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質であってもよい。
【００１８】
本発明において、糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴは、糖結合性蛋白質をコードするＤＮＡと、β１，４ＧａｌＮＡｃＴをコードするＤＮＡを、結果的に上記の性質を有する融合蛋白質として翻訳されるように、すなわち、イン・フレームに（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）連結したキメラＤＮＡを含む発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を適当な培地中で培養することにより取得される。
【００１９】
β１，４ＧａｌＮＡｃＴをコードするＤＮＡは、公知の遺伝子配列（例えば、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．第３５８巻、第７９〜８３頁（１９９５年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７巻、第１２０８２〜１２０８９頁（１９９２年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻、第２０８３６〜２０８４４頁（１９９６年）など）の配列等に基づいて、公知のいかなる手法によっても調製することができる。例えば、公知のβ１，４ＧａｌＮＡｃＴ遺伝子配列を基に、β１，４ＧａｌＮＡｃＴのコード領域の全部又は一部をカバーする適当なオリゴヌクレオチドプライマー対を合成し、β１，４ＧａｌＮＡｃＴを発現する細胞又は組織から抽出した全ＲＮＡ若しくはポリＡ＋ＲＮＡあるいは染色体ＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲを行うことによりクローニングすることが可能である。この際、その後のベクターへのクローニングを容易にするために、用いるオリゴヌクレオチドプライマーの末端に適当な制限酵素認識配列を付加してもよい。
【００２０】
あるいは、公知のβ１，４ＧａｌＮＡｃＴ遺伝子配列を基に適当なオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いてβ１，４ＧａｌＮＡｃＴを発現する細胞若しくは組織から常法により調製されたｃＤＮＡライブラリーをプラーク（又はコロニー）ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることによってもクローニングをすることができる。
【００２１】
さらに、β１，４ＧａｌＮＡｃＴをコードするＤＮＡは、部分又は完全精製されたβ１，４ＧａｌＮＡｃＴの全部又は一部を抗原として常法により調製されたｃＤＮＡライブラリーを抗体スクリーニングすることによってもクローニングをすることができる。
【００２２】
あるいは、当該ＤＮＡは、公知のβ１，４ＧａｌＮＡｃＴ遺伝子配列を基にＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いて、センス鎖の部分配列とアンチセンス鎖の部分配列を一部がオーバーラップするように合成し、ＰＣＲによってより長い部分配列を二本鎖ＤＮＡとして得るという操作を繰り返すことによって、所望のＤＮＡ配列を得ることもできる。
【００２３】
本発明において、β１，４ＧａｌＮＡｃＴをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全て若しくは一部をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、好ましくは配列番号１に示される塩基配列の全て若しくは一部を含むＤＮＡが挙げられる。
【００２４】
ところで、大腸菌に由来するＭＢＰは、ペリプラズムに存在する分泌蛋白質であり、初期翻訳産物はそのＮ末端にシグナルペプチドを含む。本発明のＭＢＰをコードするＤＮＡは、宿主大腸菌で機能し得るシグナルペプチドをコードする塩基配列（シグナルコドン）を含むものであってもよい。大腸菌は細胞壁の外側に外膜を有するグラム陰性細菌であるから、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナルコドンを含む場合があっても、発現したＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴが培地中にまで分泌される可能性は低い。しかしながら、ＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴがペリプラズム空間に蓄積すれば、菌体を完全に破砕せずにスフェロプラスト化することにより該融合蛋白質を回収することができるので、その後の精製を容易に行うことができる。但し、この場合には、特にβ１，４ＧａｌＮＡｃＴの膜貫通ドメインを削除しておくことが好ましい。該ドメインが存在すると、ＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴはペリプラズム空間に到達せずに内膜に留まる可能性があり、該融合蛋白質の回収が困難になる。
【００２５】
本発明において、ＭＢＰをコードするＤＮＡは、該蛋白質のＣ末端側に配列特異性の高いプロテアーゼにより認識され切断されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが特に好ましい。該プロテアーゼとしては、血液凝固第Ｘａ因子（Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ）、トロンビン、レニン等を例示することができるが、好ましくはＦａｃｔｏｒ　Ｘａ認識配列、すなわち、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３）である。このようなプロテアーゼ認識配列を糖結合性蛋白質のＣ末端側に導入することにより、例えば、ＭＢＰ融合β１，４ＧａｌＮＡｃＴ（以下、ＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴと示すこともある。）の精製後に、上記のようなプロテアーゼを作用させることによりＭＢＰ部分を容易に除去することができる
【００２６】
より好ましい態様としては、糖結合性蛋白質をコードするＤＮＡは糖結合性蛋白質コード領域とプロテアーゼ認識部位の間に５〜１５アミノ酸残基程度のスペーサー配列をコードする塩基配列を含む。該スペーサー配列の存在により、糖結合性蛋白質はβ１，４ＧａｌＮＡｃＴから遠ざかるために融合蛋白質の分子内相互作用の可能性が減じ、ＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴ融合蛋白質の場合、ＭＢＰ部分のマルトースやアミロースに対する特異的親和性が増大する。
【００２７】
ＭＢＰをコードするＤＮＡは、公知のＭＢＰ遺伝子配列（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５９巻、第１０６０６〜１０６１３頁（１９８４年）等）を基に、β１，４ＧａｌＮＡｃＴをコードするＤＮＡについて例示したと同様の公知の手法を用いてクローニングすることができ、また、常法によりＭＢＰのＣ末端側に上記のプロテアーゼ認識配列及びスペーサー配列を導入することができる。本発明においては、配列番号６のスペーサー配列を含むことが好ましい。
【００２８】
大腸菌由来のＭＢＰをコードするＤＮＡは、例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製のｐＭＡＬｐ２（シグナルコドンを含む）、若しくはｐＭＡＬｃ２（シグナルコドンを欠失する）のような市販のベクターから得ることも可能である。
【００２９】
糖結合性蛋白質とβ１，４ＧａｌＮＡｃＴとの融合蛋白質（以下、糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴと示すこともある）をコードするキメラＤＮＡの構築を容易にするために、糖結合性蛋白質をコードするＤＮＡの末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することができる。β１，４ＧａｌＮＡｃＴをコードするＤＮＡをベクター中にクローニングする際に、β１，４ＧａｌＮＡｃＴのＮ末端側に制限酵素認識部位を付加した場合は、糖結合性蛋白質をコードするＤＮＡにも同じ制限酵素認識部位（若しくは同じ粘着末端を生じる別の制限酵素認識部位）を導入すればよい。
【００３０】
本発明の発現ベクターは、上記の糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴをコードするキメラＤＮＡが、大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下におかれた、任意の発現ベクターである。該プロモーター領域には、ＲＮＡポリメラーゼの結合位置を決定するコンセンサス配列である−３５領域及び−１０領域が含まれる。所望の組換え蛋白質を大量に発現させる系として、誘導酵素のプロモーター領域を使用することがより好ましい。このようなプロモーター領域として、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーター領域は、リプレッサー蛋白質が結合するオペレーターをさらに含む。誘導物質（例えば、ｌａｃプロモーターではラクトースやＩＰＴＧ）を添加するとリプレッサー蛋白質のオペレーターへの結合が抑制され、プロモーターの制御下におかれた遺伝子が大量に発現する。また、該発現ベクターは、翻訳開始コドンの上流にコンセンサスなＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を含む。さらに、該発現ベクターは、糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴをコードするキメラＤＮＡの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。ターミネーター領域としては、通常使用されている天然又は合成のターミネーターを用いることができる。本発明の発現ベクターは、上記のプロモーター領域及びターミネーター領域に加えて、宿主大腸菌内で自律複製し得る複製起点を含む必要がある。このような複製起点としては、ＣｏｌＥｌ　ｏｒｉ、Ｍ１３　ｏｒｉ等が挙げられる。
【００３１】
本発明の発現ベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。また、宿主大腸菌が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
【００３２】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより調製することができる。宿主細胞は、特に限定されるものではなく、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞、植物細胞など一般的に用いられているものであれがいずれも用いることができるが、なかでも、大腸菌が特に好ましい。大腸菌の場合、その菌株は特に限定されず、例えば、市販のＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＢＬ−２１株、ＪＭ１０７株、ＴＢ１株、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株等が挙げられる。
【００３３】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　第６９巻、第２１１０頁（１９７２年））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．　第１６８巻、第１１１頁（１９７９年））、コンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　第５６巻、第２０９頁（１９７１年））、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００３４】
糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴは、上記キメラＤＮＡを含む発現ベクターを発現する形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物から糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴを回収することにより得ることができる。
【００３５】
用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものである。また無機もしくは有機窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物等）を含んでいてもよい。これらの炭素源及び窒素源は、純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養素を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、他の栄養源（例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウム又は二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１）、抗生物質（例えば、アンピシリン、カナマイシン）など）を培地中に添加してもよい。
【００３６】
形質転換体の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５、好適には６〜８、通常１８〜４０℃、好適には２０〜３５℃で１〜１５０時間行われるが、これらは培養条件及び培養規模により適宜変更することができる。
【００３７】
培養を大型タンク内で行う場合は、目的蛋白質の生産工程における生育遅延を回避するために、菌体を少量の培地に接種して１〜２４時間前培養した後、得られた種培養を大型タンク中に接種するのが好ましい。
【００３８】
糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴが、誘導蛋白質遺伝子のプロモーター系により制御される場合、誘導物質は培養開始時から添加しておいてもよいが、対数増殖期初期に添加するのがより好ましい。菌の増殖は、培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定することによってモニタリングできる。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用する場合、６６０ｎｍにおける吸光度が０．４〜０．６になった時点で、誘導物質としてイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、ＩＰＴＧと示す）を、例えば０．１〜１．０ｍＭとなるように添加することができる。誘導物質の添加時期や添加速度は、培養条件、培養規模、誘導物質の種類等によって適宜変更することができる。
【００３９】
本発明の方法では、糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴの精製は、該融合蛋白質の存在する画分を、その糖結合性蛋白質と特異的に結合する各種糖残基を含むリガンドを結合した不溶性担体を用いたアフィニティクロマトグラフィに供することにより、一段階で容易に達成することができる。また。リガンドとして該糖結合性蛋白質に特異的な抗体（モノクロナール抗体若しくはポリクロナール抗体）を用いてもよい。
【００４０】
例えば、該糖結合性蛋白質がＭＢＰの場合、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナルコドンを欠失している場合、ＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴは菌体の可溶性画分に局在するので、その場合、培養終了後に培養物を濾過もしくは遠心分離して菌体を回収し、リゾチーム処理及び界面活性剤処理、超音波処理、あるいは浸透圧ショック等によって細胞を破砕して、得られる菌体抽出液をアフィニティクロマトグラフィに用いる。
【００４１】
一方、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナルコドンを有する場合、発現したＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴは分泌されてペリプラズム空間に蓄積している可能性が高い。したがって、その場合、リゾチーム処理等によって菌体をスフェロプラスト化してＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴを溶液中に遊離させ、濾過もしくは遠心分離して菌体を除去した後、得られる上清をアフィニティクロマトグラフィに用いる。
【００４２】
本発明において、糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴ含有画分は、２価金属イオンの存在下上記精製を行うのが好ましい。具体的には、培養終了後２価金属イオンの存在下で、培養物から菌体を集め、菌体破砕等を行って、糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴ含有画分を得るのがよい。２価金属としては、マンガン、マグネシウムなどが例示されるが、好ましくはマンガンである。
【００４３】
アフィニティクロマトグラフィの吸着体としては、例えばＭＢＰの場合には、アミロースをアガロースビーズに固定化したアミロース樹脂（例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製Ａｍｙｌｏｓｅ　ｒｅｓｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ等）を使用することができるが、他のＭＢＰに対するリガンド及び他の不溶性マトリックス基（例えば、セルロース、デキストラン、合成ポリマー等）を使用してもよい。
【００４４】
糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴは上記のように調製されたそれを含む画分に該吸着体を加えて適当な時間攪拌した後、濾過して、吸着体を洗浄し、さらに適当な濃度の糖結合性蛋白質と吸着体の結合を阻害する糖（例えばＭＢＰの場合には、マルトース）を含む溶離液を加えて適当な時間攪拌した後濾過することにより、濾液中に精製される。あるいは、該吸着体をカラムに充填して糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴ画分をアプライし、適当な緩衝液で洗浄した後、適当な濃度の上記溶離液をアプライしてカラムに吸着した糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴを溶出させることにより得ることもできる。このようにして得られた糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴは、β１，４ＧａｌＮＡｃＴ活性を有するので、このまま酵素として使用することができる。
【００４５】
上述のように、本発明の好ましい態様においては、糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴはその融合部位に配列特異的なプロテアーゼによって認識切断されるアミノ酸配列を含むので、上記のようにして精製された糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴに、該プロテアーゼを作用させることにより糖結合性蛋白質部分が除去されて、所望のβ１，４ＧａｌＮＡｃＴが生成する。好ましくは、該プロテアーゼは血液凝固第Ｘａ因子（Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ）である。本発明においては、配列番号３のＦａｃｔｏｒ　Ｘａ認識配列を含むｐＭＡＬ−ｐ２若しくはｐＭＡＬ−ｃ２（いずれも、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ製）を使用することができる。糖結合性蛋白質−β１，４ＧａｌＮＡｃＴにプロテアーゼを作用させる際の反応温度、溶液のｐＨ、反応時間等は、用いるプロテアーゼの種類に応じて適宜選択することができるが、例えばＦａｃｔｏｒ　Ｘａの場合、中性緩衝液中、４〜４０℃で１〜２５時間反応させることにより、糖結合性蛋白質とβ１，４ＧａｌＮＡｃＴとを開裂させることができる。反応終了後、反応液に上記の吸着体を加えて適当な時間攪拌することにより、遊離した糖結合性蛋白質のみが該吸着体に吸着するので、該吸着体を濾過することによりβ１，４ＧａｌＮＡｃＴのみを精製することができる。あるいは、該吸着体を充填したカラムに反応液をアプライして素通り画分を回収することによってもβ１，４ＧａｌＮＡｃＴを精製することができる。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例を挙げることにより、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００４７】
実施例１：ＰＣＲによるβ１，４ＧａｌＮＡｃＴ　ｃＤＮＡ断片の取得
まず、マウスＥＬ４細胞（理化学研究所より入手）を、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地にて培養し、２０ｍｌの培養液から細胞を遠心分離により集め、ＰＢＳで２回遠心洗浄を行った。得られた細胞塊から、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ（キアゲン製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｔ−２５フラスコ１枚に換算して２５．３ｇの収率であった。この全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ　ｈｉｇｈ（東洋紡績製）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを調製した。条件は、７０℃で１０分の処理後、３０℃・１０分、４２℃・３０分、９９℃・５分で行った。
【００４８】
配列番号１に記載のマウスＥＬ４細胞に由来するβ１，４ＧａｌＮＡｃＴのｃＤＮＡの塩基配列を基に、配列番号４及び５に示されるオリゴヌクレオチドを合成した。前者は配列番号１に示される塩基配列の塩基番号７９〜９２で示される塩基配列であり、ＢａｍＨＩの認識部位を付加している。後者は配列番号１に示される塩基配列の塩基番号１５８７〜１６０２で示される塩基配列に対するアンチセンス配列であり、ＸｂａＩの認識部位を付加している。これらのオリゴヌクレオチドをプライマー対として用いて、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を用いて、上記一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（９８℃・３０秒、６７℃・３０秒、７４℃・３０秒を４サイクル後、９８℃・３０秒、７１℃・３０秒、７４℃・３０秒を２８サイクル）を行った。このＰＣＲ産物を１．５％アガロース電気泳動に供したところ、目的遺伝子と同サイズである約１５００ｂｐのＤＮＡ断片を得ることができた。
【００４９】
得られた上記ＤＮＡ断片を、ＱＩＡ　Ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製し、さらにＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（寶酒造製）を用いて、このＤＮＡ断片の末端平滑化、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）ベクターへの挿入を行い、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選抜した。
得られた白色コロニーより該ＤＮＡ断片を保持するプラスミドを調製した。プラスミド調製は、ＱＩＡ　ｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて行った。該ＤＮＡ断片の塩基配列を、Ｔ３プライマー及びＴ７プライマーをシーケンシング用プライマーとしてシーケンス反応を行い、オートシーケンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３１０；Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ；アプライドバイオシステムズ製）を用いて常法により決定した。その結果、所望の遺伝子がクローニングできたことが確認された。
【００５０】
実施例２：発現ベクターの構築
上記のように、目的遺伝子の挿入が確認できた形質転換体を培養し、ＱＩＡ　ｐｒｅｐＳｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いてプラスミドの抽出を行った。このプラスミドを、ＢａｍＨＩで３７℃、２時間処理した後、１．５％アガロース電気泳動に供し、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出して、ＱＩＡ　Ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。一方、ベクターであるｐＭＡＬｐ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）についても、ＢａｍＨＩで３７℃、２時間処理した後、１．５％アガロース電気泳動に供し、同様に精製を行った。上記ＤＮＡ断片と制限酵素処理した上記ベクターをＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡績製）を用いて、１６℃、１時間のライゲーション反応を行った。さらに、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で選抜した。得られたコロニーをさらに液体培養して、ＱＩＡ　ｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いてプラスミドの抽出を行った。インサート確認、その方向確認をそれぞれ、プラスミドをＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで処理することにより行い、正しい方向に目的遺伝子を含むＤＮＡ断片の挿入されているプラスミドを得た。
【００５１】
実施例３：組換え大腸菌によるＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴの調製
上記発現ベクターにより形質転換されたクローン１白金耳を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．２％グルコースを含むＬＢ液体培地１０ｍｌ中にて、３７℃で終夜培養を行い、さらにこの培養液２５０μｌを、同培地２５ｍｌに接種して３７℃、４時間の培養を行い、２５℃に温度を下げた後、０．３Ｍ　ＩＰＴＧ２５μｌを加えて、終夜培養を行った。菌体を遠心分離により集め、緩衝液（１００ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ６．５）−２０ｍＭ　ＭｎＣｌ２−５０ｍＭ　ＮａＣｌ−１ｍＭ　２−メルカプトエタノール）８０μｌ（培養液１ｍｌ分あたり）で懸濁した。この懸濁液を３０分間の超音波処理を行い、１４０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離を行い、その培養上清を酵素溶液とした。この酵素溶液についてウエスタンブロッティングを行ったところ、ＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴと思われる分子量約９００００のバンドを確認することができた。
【００５２】
実施例４：β１，４ＧａｌＮＡｃＴ活性の確認
上記酵素液を用いて、ＴＬＣによるβ１，４ＧａｌＮＡｃＴ活性の確認を行った。表１に示すような組成で、上記酵素溶液の酵素反応を行った。基質にはＬｙｓｏ−ＧＭ３（寶酒造製）をＮＢＤ（同仁化学製）で標識したものを用いた。糖供与体としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを用い、これを加えない系を対照とした。酵素反応は３７℃で行い、反応後２．５時間、６時間、２４時間で０．５μｌを採取してＴＬＣに供した。ＴＬＣには、展開層としてＳｉｌｉｃａ　ｇｅｌ６０　Ｆ２５４（メルク製）を用いた。展開溶媒には、クロロホルム−メタノール−０．２％塩化カルシウム溶液（５：４：１；容積比）を用いた。
【００５３】
【表１】
2004016116.tif 000002
【００５４】
ＴＬＣの結果は図２に示す通りである。糖供与体の存在する場合においてのみ、生成物であるＧＭ２のスポットを確認することができ、しかも反応時間が進むにつれ、そのスポットは強くなってきた。したがって、β１，４ＧａｌＮＡｃＴ活性を確認することができた。
【００５５】
実施例５：ＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴの精製
上記酵素溶液を、アミロースのアガロースビーズに固定化された樹脂である、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製Ａｍｙｌｏｓｅ　ｒｅｓｉｎ　ｃｏｌｕｍｎを用いて精製を行った。得られた溶出画分について、実施例４と同様にして、β１，４ＧａｌＮＡｃＴ活性を確認することができた。また、精製されたＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、電気泳動的にもほぼ単一に精製されていることが確認された。
【００５６】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、糖結合性蛋白質とＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとの組換え融合蛋白質、特にＭＢＰ−β１，４ＧａｌＮＡｃＴを低コストで、しかも効率の優れた製造を実現することが可能となった。
【００５７】
【配列表】
2004016116.tif 000003
2004016116.tif 000004
2004016116.tif 000005
2004016116.tif 000006
2004016116.tif 000007
2004016116.tif 000008
2004016116.tif 000009
2004016116.tif 000010
2004016116.tif 000011
2004016116.tif 000012
2004016116.tif 000013
2004016116.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【図１】β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの反応式を示す図である。
【図２】ＴＬＣにより、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性を確認した結果を示す図である。
【図１】
2004016116.tif 000015
【図２】
2004016116.tif 000016