(57)【要約】【解決手段】アミラーゼからなる感染防御剤又は上皮細胞への細菌付着抑制剤、及びアミラーゼを含有する口腔用組成物。【効果】上皮細胞への細菌の付着を抑制でき、該細菌による上下気道感染等を防御することができる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミラーゼからなる感染防御剤。
【請求項２】
アミラーゼからなる上皮細胞への細菌付着抑制剤。
【請求項３】
アミラーゼを含有する口腔用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、風邪等の発症と重症化に関与する病原菌の体内への侵入を抑える感染防御剤に関する。
【０００２】
ヒトの口腔内の環境を支えている成分に唾液がある。唾液は３大唾液腺（耳下腺、顎下腺、舌下腺）及び小唾液腺から分泌され、１日の総分泌量はおよそ１．５Ｌにも達する。その機能としては、食物の湿潤化、円滑化による咀嚼及び嚥下、洗浄、抗菌作用や口腔粘膜の保護作用がある。唾液の９９．５％は水であるが、残りの成分は極めて複雑で、蛋白質、脂質、糖質等の有機成分と、電解質、塩等の無機成分、粘膜から剥離した上皮や白血球等の細胞成分及び口腔内に常在する微生物からなる。
【０００３】
これらのうち、唾液中の蛋白成分はポリペプチドも含めて電気泳動的に４０種以上が知られており、様々な生理機能を有している。例えば、口腔内の抗菌系成分であるリゾチーム、ラクトフェリン、ペルオキシダーゼ、ｓＩｇＡ、炎症反応を媒介するケミカルメディエーターであるヒスタミン、プロスタグランディン、ＰＡＦ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、粘膜防御機構及び菌の凝集反応を有する唾液ムチン（ＭＧ１やＭＧ２）、組織修復に関与していると予想されるＥＧＦ、ＮＧＦ、フィブロネクチン、感染防御的に働くものとしてプロテアーゼインヒビターであるシスタチン、口腔内のリン酸カルシウムの結晶化を抑制して歯垢の形成を抑制するスタテリンやプロリンリッチプロテイン等が知られており、いずれの成分も、消化管や下気道の入り口である口腔を細菌感染や外傷等の傷害性刺激から防御し、組織の修復を促進する役割を有している。
【０００４】
一方、肺炎や気管支炎等の上下気道感染症が、咽頭への病原菌の感染（一次感染）を介してが引き起こされることが知られており、特に風邪、ウイルスに続発する呼吸器感染症の主原因菌であるインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）等は咽頭上皮細胞の受容体成分であるガングリオシドＤ２に接着することで咽頭上皮細胞に付着して増殖することが報告されている。
従って、上下気道感染症の予防策として、病原菌の口腔内又は咽頭内での増殖を抑えるのには、病原菌の口腔内又は咽頭内の上皮細胞への付着を阻害することが有効である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、病原菌の上皮細胞への付着を抑制し、上下気道感染等の感染症を予防するための剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アミラーゼが上皮細胞への細菌の付着を抑制し、咽頭を介した感染症の予防に有用であることを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、アミラーゼからなる感染防御剤及び上皮細胞への細菌付着抑制を提供するものである。
【０００８】
また本発明は、アミラーゼを含有する口腔用組成物を提供するものである。
【発明の実施の形態】
アミラーゼはデンプンに作用してグルコース、マルトース、オリゴ糖を生成する酵素の総称であり、澱粉中のα−１，４−グルコシド結合をランダムに分解しオリゴ糖を生成するα−アミラーゼ、澱粉中のα−１，４−グルコシド結合鎖の非還元性末端よりマルトース単位で逐次分解するβ−アミラーゼ、澱粉中の非還元性末端よりグルコースを生成するグルコアミラーゼ、澱粉中のα−１，６−グルコシド結合鎖を分解するプルラナーゼやイソアミラーゼといった枝切り酵素等がある。
斯かるアミラーゼは、繊維の糊抜き、異性糖の生産やパンの老化防止等の食品加工、診断用酵素等として利用されているが、アミラーゼに感染防御作用があり、感染防御のための医薬品や食品として利用できることは全く知られていない。
【０００９】
本発明におけるアミラーゼとしては、上記のアミラーゼを用いることができ、ヒト唾液、微生物、植物等、各種起源のものが利用できる。
このうち、感染防御効果の点から、α−アミラーゼが好ましく、特にヒト唾液由来のα−アミラーゼが好ましい。
【００１０】
斯かるアミラーゼは、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属微生物、大麦の麦芽、或いはヒト唾液から、常法に従って抽出、分離、精製することにより得ることができ、市販品では、ＴｙｐｅＩＩ−Ａ、ＴｙｐｅＶＩＩＩ−Ａ、ＴｙｐｅＩＸ−Ａ、ＴｙｐｅＸ−Ａ、ＴｙｐｅＸＩＩＩ−Ａ（以上、Ｓｉｇｍａ社製）等のα−アミラーゼを使用することができる。
また、合成アミラーゼとして、真核生物よりアミラーゼ遺伝子を抽出し、プラスミドを作製し、枯草菌、酵母菌等に導入し、遺伝子組換え菌で生産することにより得ることもできる。
【００１１】
斯かるアミラーゼは、後記実施例で示されるように、細菌に付着してこれをトラップし、細菌のヒト上皮細胞組織における細胞外マトリックスのフィブロネクチンへの付着を抑制する効果を有する。
フィブロネクチンは、正常繊維芽細胞や内皮細胞の表面、腸管上皮細胞の基底膜面他、種々の細胞同士の接着面に存在する糖タンパク質であるが、口腔内にも存在し、細菌の口腔内への付着にも関与していると考えられていることから（Ａ．Ｌｊｕｎｇｈら；１９９６．　ＦＥＭＳ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｄ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１６，　１１７−１２６）、細菌のフィブロネクチンへの付着を抑制・制御できれば上下気道感染を有効に防止できる。
【００１２】
本発明のアミラーゼによって防御できる細菌としては、フィブロネクチンに付着・定着して感染する細菌、例えばインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎａｓａ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ等が挙げられ、このうち本発明の感染防御剤及び細菌付着抑制剤は、上下気道感染症の起炎菌であるインフルエンザ菌、黄色ブドウ球菌に対して特に効果的である。
【００１３】
本発明のアミラーゼは、感染防御剤又は上皮細胞への細菌付着抑制剤として単独でヒトを含む動物に適用することができる。
斯かる感染防御剤及び上皮細胞への細菌付着抑制剤は、各種飲食品、医薬品及び動物の飼料として使用することができるが、飲食品として使用する場合には、アミラーゼを適宜常法に従って、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状、スプレー剤又は懸濁状にし、必要に応じて甘味料、酸味料、ビタミン剤等の飲食品の製造に通常使用される各種成分を添加して、キャンディー、チューインガム、トローチ等の口腔用組成物、清涼飲料水、菓子類等として製剤化することができる。特に、キャンディー、チューインガム、トローチ等の口腔内に比較的長く滞留するする口腔用組成物の形態が、感染防御効果がより有効に発揮されることから好ましい。
【００１４】
また、医薬品として使用する場合、種々の形態で投与することができるが、好ましくは錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与のほか経管投与、経腸投与を挙げることができる。これらの製剤は、常法に従い適宜賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等を配合して製剤化することができる。
【００１５】
上記製剤又は飲食品の１日当たりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なるが、アミラーゼとして通常成人１日当たり約５０ｍｇ〜５ｇ、好ましくは約０．２〜２ｇとすれば良く、これを１日１回又は２〜４回程度に分け適用するのが好ましい。
【００１６】
【発明の効果】
本発明によれば、上皮細胞への細菌の付着を抑制でき、該細菌による上下気道感染等を防御することができる。また、本発明のアミラーゼは唾液等の成分であることから極めて安全であり無害である。
【００１７】
【実施例】
実施例１　ＲＩラベル化菌体の唾液アミラーゼへの付着作用
（１）ＲＩラベル化菌体の調製
黄色ブドウ球菌の調製は、凍結保存している購入菌株Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ（ＩＦＯ１３２７６）をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天培地に画線し、９５％空気及び５％二酸化炭素の湿潤空気中で３７℃でインキュベートし、１晩培養を行なった。生育したコロニーをＢＨＩ液体培地（１０ｍＬ）で培養し、対数増殖期の菌体（ＯＤ６００ｎｍで２〜３）１ｍＬを細胞標識［３５Ｓ］アミノ酸｛７０％［３５Ｓ］メチオニン、３０％［３５Ｓ］システイン｝（アマシャムファルマシア社製）を５．３ＭＢｑ添加したＢＨＩ液体培地（１０ｍＬ）で１８時間培養しラベル化を行なった。ラベル化菌体は、ＫＣｌバッファー（＊ＫＣｌ）で遠心洗浄（２８００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，２０℃）を３回行ない集菌した。このラベル化菌体を＊＊１％ＢＳＡ−ＫＣｌで５×１０８個／ｍＬ（ＯＤ６００ｎｍで０．５）に調製し付着実験に用いた。
＊ＫＣｌ：５０ｍＭ　ＫＣｌ，１ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．０），　１ｍＭ　ＣａＣｌ２，０．１ｍＭ　ＭｇＣｌ２
＊＊１％ＢＳＡ−ＫＣｌ：最終濃度１％Ｂｏｖｉｎｅ　Ａｌｂｕｍｉｎの＊ＫＣｌ溶液
【００１８】
（２）サンプルの調製
唾液サンプルとして、ヒト全唾液を５ｍＬ集め、２８００ｒｐｍ，　１０ｍｉｎ，　４℃で遠心分離した上清（Ｕ）、唾液アミラーゼとして、ＴｙｐｅＩＸ−Ａ（Ｓｉｇｍａ社製）及びＴｙｐｅＸＩＩＩ−Ａ（Ｓｉｇｍａ社製）を１ｍＭ　ＣａＣｌ２水溶液にタンパク濃度０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬになるように溶解した溶液（ＩＸ−Ａ、ＸＩＩＩ−Ａ）を調製した。
【００１９】
（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（バイオラッド社製）９８０μＬに２−メルカプトエタノール２０μＬ添加しサンプルバッファーを調製した。サンプル：サンプルバッファーを１：２で混合し、５分間１００℃で煮た後、レディーゲル１０％、７コーム（バイオラッド社製）に３０μＬアプライし、ゲル１枚当り２０ｍＡ定電流で９０分電気泳動を行なった。
【００２０】
（４）ウエスタンブロット
ブロッティングバッファーにＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを入れ、１０〜３０分振盪し、Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ　ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜をメタノールに３０秒浸漬した後、ブロッティングバッファーに浸漬し１０分以上振盪した。ろ紙Ｎｏ．５２６｛８枚＋ゲルの大きさを切り取った１枚｝（アドバンテック社製）をブロッティングバッファーに浸漬した。４枚のろ紙を気泡が入らないように、ミリブロット（ミリポア社製）を電極板の上に重ね、さらに中抜きのろ紙をセットし、くりぬいた穴の部分にＰＶＤＦ膜を置き、ブロッティングバッファーを十分かけてから平衡化したゲルを重ねた。残りの４枚のろ紙を、最初の４枚と同様に重ね、ブロッティングバッファーを一番上のろ紙に少量かけ、上側の電極板を取り付け、下＋、上−、定電流２．３ｍＡ／ｃｍ２、６０分転写した。転写後、１％ＢＳＡ−ＫＣｌで１時間以上ゆるやかに振盪した。
【００２１】
（５）付着実験
調製した［３５Ｓ］ラベル化菌体溶液と転写後のＰＶＤＦ膜を６０分間ゆるやかに振盪反応行なった。付着反応後、１％ＢＳＡ−ＫＣｌでゆるやかに振盪洗浄５分間５回行なった。風乾後、ＢＡＳ−ＭＳ２０４０イメージングプレート（富士フィルム社製）と付着反応側のメンブレンを密着させ３〜４日後、ＢＡＳ２５００イメージリーダーで解析した。
【００２２】
その結果、ヒト唾液アミラーゼにおいて、［３５Ｓ］ラベル化菌体が付着することが確認された（図１）。
【００２３】
実施例２　蛍光ラベル化菌体に対するトラップ効果
（１）菌の調製：
黄色ブドウ球菌の調製は、凍結保存している菌株Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ（ＩＦＯ１３２７６）をブレインハートインフュージョン寒天培地に画線し、９５％空気及び５％二酸化炭素の湿潤空気中で３７℃でインキュベートし、１晩培養を行なった。生育したコロニーをブレインハートインフュージョン液体培地で培養し、対数増殖期の菌体（ＯＤ６００ｎｍで２〜３）６ｍＬをリン酸バッファー（ＰＢＳ：ＫＨ２ＰＯ４　０．１４４ｇ／Ｎ，　ＮａＣｌ　９．０ｇ／Ｌ，　Ｎａ２ＨＰＯ４　０．７９５ｇ／Ｌ）で３回遠心洗浄（１００００ｒｐｍ，３ｍｉｎ，４℃）行い集菌した。この菌体に、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８Ｃ５　ｍａｌｅｉｍｉｄｅ，ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製）１ｍｇ／ＰＢＳ５ｍＬ溶液を１ｍＬ添加し、攪拌後４℃で１晩遮光保存した。この反応菌体をＰＢＳで３回遠心洗浄（１００００ｒｐｍ，３ｍｉｎ，４℃）することにより蛍光ラベル化した菌体を得、１０８個／ｍＬに調製した。
【００２４】
インフルエンザ菌の調製は、凍結保存している長崎大学熱帯医学研究所分離菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈ９５−１３５）をチョコレート寒天培地に画線し、９５％空気及び５％二酸化炭素の湿潤空気中で３７℃でインキュベートし、１晩培養を行なった。チョコレート寒天培地４枚に生育した菌体をかき取り、ＰＢＳで３回遠心洗（１００００ｒｐｍ，３ｍｉｎ，４℃）行い集菌した。この菌体に、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８Ｃ５　ｍａｌｅｉｍｉｄｅ，ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製）１ｍｇ／ＰＢＳ５ｍＬ溶液を１ｍＬ添加し、攪拌後室温で３時間遮光保存した。この反応菌体をＰＢＳで３回遠心洗浄（１００００ｒｐｍ，３ｍｉｎ，４℃）することにより蛍光ラベル化した菌体を得、１０８個／ｍＬに調製した。
【００２５】
（２）トラップ試験
ヒト唾液アミラーゼＴｙｐｅＩＸ−Ａ（Ｓｉｇｍａ社製）の０．５％水溶液と蛍光ラベル標識した菌体を１：１で混合反応した。１時間混合反応後、ヒト上皮細胞モデルであるヒトフィブロネクチンコート２４穴プレートに反応液を接触した。１時間接触後、ＰＢＳで５回洗浄し、蛍光度を測定することにより病原菌の付着率を測定した。付着率は対照としてアミラーゼ０．５％水溶液の代わりにＰＢＳで反応したサンプルを１００％として算出した。
【００２６】
その結果、アミラーゼで黄色ブドウ球菌をトラップしたときには黄色ブドウ球菌の付着率が４２％であり（図２ａ）、インフルエンザ菌をトラップしたときにはインフルエンザ菌の付着率が１２％であり（図２ｂ）、アミラーゼが黄色ブドウ球菌及びインフルエンザ菌の付着を抑制することが確認された。
【００２７】
【図面の簡単な説明】
【図１】［３５Ｓ］ラベル化菌体の唾液アミラーゼへの付着作用を示す図である。
【図２】（ａ）：黄色ブドウ球菌の付着抑制効果（トラップ試験）を示す図である。
（ｂ）：インフルエンザ菌の付着抑制効果（トラップ試験）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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