(57)【要約】【課題】これまでの研究で取得してきた実用酵母の栄養要求性変異株を用いて、より簡単で新しい優良酵母取得法として、交配育種法を確立することである。異なる実用酵母同士を容易に交配させることができれば、それぞれの特性を併せもった新しい酵母の取得を達成できる。【解決手段】本発明は、いままでは取得できないと言われてきた高次倍数体の実用酵母での栄養要求性変異株を利用して、ａ型株やα型株をより簡単で新しい方法により取得し、交配育種により交配株を取得した。【選択図】　　図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる栄養要求性変異株を掛け合わせることを特徴とする、実用酵母の栄養要求性変異株を利用した交配育種法。
【請求項２】
１倍体のａ型又はα型テスター株を掛け合わせることで、ａ型株やα型株を効率的に採取できることを特徴とする請求項１に記載の交配育種法。
【請求項３】
異なる栄養要求性変異株のａ型株とα型株とを交配させることにより、２倍体以上の倍数体の交配株を採取できることを特徴とする請求項１又は２に記載の交配育種法。
【請求項４】
変異誘発法により、１倍体テスター株との交配育種に用いる栄養要求性変異株のａ型株又はα型株を効率的に採取できることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の交配育種法。
【請求項５】
ＵＶ照射により、１倍体テスター株との交配育種に用いる栄養要求性変異株のａ型株又はα型株を効率的に採取できることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の交配育種法。
【請求項６】
１倍体テスター株を用いて採取された実用酵母のａ型株又はα型株。
【請求項７】
接合型がａ型で、ロイシン要求性の菌株　ＲＡＫ１５６４（　ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８３０　）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
実用酵母の交配育種において、栄養要求性変異株の利用を特徴とする、胞子形成法よりも簡単で確実に交配を行うことができる技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
お酒やパンを作る際に用いられる実用酵母には様々な種類があり、それぞれに異なった発酵特性や香味特性を持っており、利用先が異なってくる。例えば清酒においては、協会７号をはじめとする、味や香りの特徴が異なる実用酵母が使われている。同じ実用酵母なのに味や香りに違いが出る理由として、清酒の中に含まれる成分としてアルコール類や炭酸ガスはもちろんのこと、エステル類、有機酸類、アルデヒド類、ケトン類などの数百種類もの代謝物が存在する。エステル類は果実のような芳香成分を持っていることが多く、有機酸類も味や香りの特性に関わっている。これらの成分は酵母の代謝によって作られるのだが、それぞれの生産量は生育環境などの他に、酵母の違いでも変動している。従って、味や香りがより良い優良酵母を取得することは、おいしい醸造食品や発酵食品の開発を目指すために、大変重要なことである。
【０００３】
実用酵母での優良酵母の取得手段として考えられるものは、野生からの採取、薬剤耐性突然変異株採取、遺伝子組換え、細胞融合および交配育種などが挙げられる。この中で特徴ある株間で融合又は交配させることができれば、様々な株を育種できる。
【０００４】
細胞融合とは、酵母の細胞壁を消化して、細胞中の核を融合させる方法である。全酵母市場（酒類、パン、醤油、味噌、食酢等）の中で、実際に市場に出回っている細胞融合株もあるが、実験手法が複雑であり、融合株の取得率も低いため、簡単には取得できないのが欠点である。ここでもし交配育種が容易に行えるのであれば、これに勝る手段はない。異なる酵母同士を交配させるには、まず、通常は２倍体の実用酵母を胞子形成させて、１倍体のａ型株やα型株を取得する必要がある。そうすることでａ型株とα型株が交配して新しい酵母ができる。しかし実用酵母は胞子形成能や発芽能が低いため、１倍体株の分離に大きな労力と時間が必要であり、交配は困難と考えられてきた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで今回の発明の目的は、これまでの研究で取得してきた実用酵母の栄養要求性変異株（特願２００１−５８０５６）を用いて、より簡単で新しい優良酵母取得法として、交配育種法を確立することである。異なる実用酵母同士を容易に交配させることができれば、それぞれの特性を併せもった新しい酵母の取得を達成できる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、いままでは取得できないと言われてきた高次倍数体の実用酵母での栄養要求性変異株と１倍体のａ型又はα型のテスター株とを利用して、実用酵母のａ型株やα型株をより簡単で確実に取得する。さらに得られた株を混合させ、要求性の栄養のない培地で選択することで、交配育種により交配株を取得する。
【０００７】
まず、本発明における実用酵母の栄養要求性変異株は、交配育種を行うには異なる栄養要求性変異株を、それぞれの酵母が持っていなくてはならない。栄養要求性変異株を得るためには、数千個のコロニーをスクリーニングすればよい（特願２００１−５８０５６）。従って最少培地を使用し、多くの栄養要求性株を取得する。他にもＦＯＡ（５−ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ　ａｃｉｄ）培地でウラシル要求性株を得ることもできる。
【０００８】
実用酵母の胞子形成能は通常低いため、１倍体は取得しにくい。１倍体もまったくできないわけではないが、交配育種するということになると、確率の低く、無理に作成した１倍体同士を交配させても、それがもとの実用酵母特性をもっているとは限らない。よって、従来の胞子形成させて１倍体を採取する方法は有効ではない。
【０００９】
本発明の特徴は、１倍体を胞子形成等で採取するのではなく、１倍体のａ型又はα型で栄養要求性変異を持つ１倍体テスター株との交配テストによる選択により、ａ型株やα型株を取得していく所にある。ここで、ａ型株やα型株の取得に際して、変異誘発させてａ型株やα型株を採取すると、変異誘発処理をしなかった時よりも多くのａ型株やα型株を取得することができることも見出した。変異誘発法としては、紫外線（ＵＶ）照射やエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）およびニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）などの化学物質も用いることができる。
【００１０】
取得できたそれぞれの実用酵母のａ型株やα型株を交配させることにより、倍数体の交配株を取得することも可能である。取得した交配株が４倍体であったなら、通常２倍体の実用酵母に対して高い発酵特性を持っている可能性がある。さらに、得られた交配株を再び交配させて８倍体にできる可能性もある。
【００１１】
取得した、それぞれの実用酵母の栄養要求性変異をもつａ型株やα型株さえ保存、用意しておけば、確実に、そして簡単に交配育種を行うことが可能になる。例えば、本発明の交配育種で使用した協会７号、７０１号、９号、９０１号、１０号の栄養要求性をもつａ型株又はα型株は、今後同様に取得したあらゆる実用酵母との栄養要求性変異をもつα型株やａ型株と、単に混合し、最少培地で選択するだけで交配育種株が得られるのである。この交配育種の容易性と確実性を考えると、生合成経路に関する種々の栄養要求性遺伝子の変異をもっている状況である本方法は、今までにはなかった方法である。
【００１２】
本発明により、今まで様々な栄養要求性変異を得られないと考えられていた実用酵母において栄養要求性変異株を得、テスター株と掛け合わせ、最少培地で選択することで、ａ型株やα型株を容易に取得でき、異なる種類の実用酵母との交配育種に成功した。この交配育種法で、それぞれのａ型株やα型株を保存しておけば、いつでも簡単に、しかも確実に交配を行うことができる。これにより、現在の優良酵母取得に代わる、新しい手法として用いることができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
発明の実施の形態を、実施例にもとづき図面を参照して説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００１４】
【実施例１】
実験方法は、１倍体テスター株でａ型株のＮ４３５−１Ａ（　ＭＡＴａ　ａｒｇ１　ｈｉｓ７　ｌｙｓ７　ｍｅｔ６　）、または１倍体テスター株でα型株のＮ４３５−２Ａ（　ＭＡＴα　ａｒｇ１　ｈｉｓ７　ｌｙｓ７　ｍｅｔ６　）と交配させることで、どれだけ交配が行われているかを見た。テスター株と交配して栄養要求性が相補されるため、結果として最少培地でも生育できることとなる。そこで最少培地上に成長したコロニー数を、テスター株と交配を行った１倍体株の数とみなして計数した。
【００１５】
ＹＰＤ培地の調製は、酵母エキス１０．０ｇ、ポリペプトン２０．０ｇ、グルコース２０．０ｇを脱イオン水に溶かして１０００ｍｌにメスアップした後、寒天２０．０ｇを加え、オートクレーブにより１２０℃、２０分間の加圧蒸気滅菌を行い、滅菌シャーレに分注した。その後、約２〜３日間、室温乾燥させた。また、液体培地の場合は寒天を加えずに試薬ビンに入れてオートクレーブにかけて、室温保存した。なお、最少培地の調製は、ＹＮＢ　（Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ　ｗｉｔｈｏｕｔ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｓｕｌｆａｔｅ）　１．７ｇ、硫酸アンモニウム５．０　ｇ、グルコース２０．０　ｇを脱イオン水に溶かして１０００ｍｌにメスアップした後、寒天２０．０ｇを加え、オートクレーブにより１２０℃、２０分間の加圧蒸気滅菌を行い、滅菌シャーレに分注した。その後、約２〜３日間、室温乾燥させた。
【００１６】
【実施例２】
栄養要求性変異株の取得は、特願２００１−５８０５６　の方法に従って行った。交配株を作成する際に、確実に交配株のみを選択できるように何らかのマーカーが必要となる。そこで本発明では、まず最初に、交配させたい実用酵母の栄養要求性変異株を取得することから始めた。栄養要求性変異株を用いることで、後に行う交配育種の時に交配株のみを容易に選択することができて、交配しなかった株を除去できるメリットがある。
【００１７】
栄養要求性変異株の取得方法は、実用酵母にＵＶ照射することで変異を誘発させて変異株をスクリーニングすることで取得した。ＵＶによる変異誘発方法は、以下の通りである。シングルコロニーにした実用酵母を脱イオン水で懸濁して細胞数を顕微鏡で測定した後、目的の細胞数（約１０００〜３０００個）に希釈してＹＰＤ培地に２００μｌまき、ガラス棒で広げた。次にクリーンベンチの中でそのプレートの蓋を開き、１５ｃｍ上にあるＵＶランプで２０秒間ＵＶ照射を行った。その後、クリーンベンチから取り出して、２８　℃で３日間培養した。細胞数希釈の調整は、ＵＶ照射時の酵母の生存率を出した後、ＵＶ照射後の培養時に約３００コロニー生育してくるように計算して脱イオン水で希釈した。
【００１８】
栄養要求性変異株のスクリーニングは、以下の通りである。ＵＶ照射することで変異を誘発した後、３日間培養したＹＰＤ培地プレートを最少培地とＹＰＤ培地にレプリカして、２８℃で２日間培養した。ここで、栄養に富んだＹＰＤ培地に生育できて、生育するために必要最小限の栄養分しかない最少培地で生育できなかったコロニーを、栄養要求性変異株の可能性がある株として採取した。さらにシングルコロニーにしてクローン化した後、栄養要求性を調べた。
【００１９】
５−ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ　ａｃｉｄ　を使用して、ウラシル要求性も取得した（小田佳緒子，北本勝ひこ，五味勝也，高橋康次郎，　醗酵工学会誌，６８巻５号，　３９９−４０３，　１９９０　）。ＵＶ照射後に３日間培養したＹＰＤ培地プレート上のコロニーをＦＯＡ培地にレプリカして、２８℃で２日間培養した。ここで生育してきたコロニーを、ウラシル要求性変異株の可能性がある株として採取した。
【００２０】
ＦＯＡ培地の調製法は、以下の通りである。Ａ液は、ＹＮＢ　１．７ｇ、硫酸アンモニウム５．０ｇ、グルコース２０．０ｇ、−Ｕ　Ｄｒｏｐ　ｏｕｔ　ｍｉｘ　０．６ｇ、Ｕｒａｃｉｌ　５０ｍｇ及び　５−ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ　ａｃｉｄ　７５０ｍｇを脱イオン水に溶かして１０００ｍｌにメスアップした後、６５℃の高温槽で完全に溶かしてフィルター滅菌を行い、これをＡ液とした。Ａ液の調製に並行して、Ｂ液を調製した。Ｂ液は、脱イオン水５００ｍｌに寒天２０．０ｇを加え、オートクレーブにより１２０℃、２０分間の加圧蒸気滅菌を行った後、約６５℃まで冷まし、これをＢ液とした。その後に、Ｂ液にＡ液を加えて、滅菌シャーレに分注した。その後、約２〜３日間、室温乾燥させた。ＦＯＡ培地を使用したスクリーニングの結果、それぞれの酵母でウラシル要求性を示す変異株が取得できた。
【００２１】
最少培地でレプリカして採取した株が、どのような栄養要求性を有しているかを調べるため、最初にアミノ酸プール培地と最少培地に、滅菌処理した爪楊枝で植菌して２８　℃で２日間培養し、どのプールのナンバーの時に得られた変異株が生育できたかにより栄養要求性を予想した。次に、予想した栄養要求性のアミノ酸をまいたアミノ酸培地に爪楊枝で植菌して２８　℃で２日間培養し、予想が正しいかどうかを確認した。確認できた栄養要求性変異株はＹＰＤ培地上に植菌し、２８　℃で２日間培養した後に冷凍保存した。
【００２２】
【実施例３】
次に、ＵＶ照射により酵母に栄養要求性変異を誘発させて、栄養要求性変異を有するａ型株やα型株を取得することにした。まず栄養要求性変異株ＲＡＫ１７６３を用いて、ＵＶ照射した時とＵＶ照射しなかった時のそれぞれの場合で、ａ型株又はα型株が取得できるかどうかを見ていった。
【００２３】
栄養要求性変異を有するａ型株又はα型株のスクリーニングは、以下のように行った。取得した栄養要求性変異株の菌体をシングルコロニーにして、脱イオン水で懸濁した後に細胞数を顕鏡法で測定した後、目的の細胞数になるように希釈してＹＰＤ培地にまいた。次にクリーンベンチの中でそのプレートの蓋を開き、１５ｃｍ上にあるＵＶランプで２０秒間ＵＶ照射を行った。その後、クリーンベンチから取り出して、２８　℃で３日間培養した。培養した栄養要求性変異株を、１倍体テスター株として細胞数１．０×１０７個に脱イオン水で希釈したａ型株のＮ４３５−１Ａ又はα型株のＮ４３５−２Ａを２００　μｌまいてガラス棒で広げ、２８　℃で２日間培養したＹＰＤ培地にレプリカして２８　℃で２日間培養した。次に最少培地にレプリカして、２８　℃で２日間培養した。ここでａ型株又はα型株ができていれば、テスター株と交配して栄養要求性が相補され、結果として最少培地でも生育できたということになる。そこで、生育してきたコロニーと同じ位置に生育していた、元の栄養要求性変異株に変異を誘発したプレートのコロニーをａ型株又はα型株の可能性のある株として採取した（図１）。
【００２４】
採取したａ型株およびα型株の候補を一度シングルコロニーにして、各株５つずつのコロニーをＹＰＤ培地上で２８　℃、２日間培養した後、最少培地にレプリカしてリバータントの可能性のある株を除去した。次にそれらを、脱イオン水で希釈して細胞数１．０×１０７個に調整したａ型テスター株Ｎ４３５−１Ａ又はα型テスター株Ｎ４３５−２Ａを、それぞれ２００μｌずつまいてガラス棒で広げ、２８　℃で２日間培養したＹＰＤ培地にレプリカして２８　℃で２日間培養し、最少培地にレプリカした。そこで、ａ型テスター株Ｎ４３５−１Ａとは交配して最少培地上で成長していて、α型テスター株Ｎ４３５−２Ａとは交配しなかったために最少培地上では成長できなかった株をα型株として採取した。また、α型テスター株Ｎ４３５−２Ａとは交配して最少培地上で成長していて、ａ型テスター株Ｎ４３５−１Ａとは交配しなかったために最少培地上では成長できなかった株をａ型株として採取した（図２のＲＡＫ１７６３のデータ）。得られたａ型株またはα型の菌株は、１５　％グリセロール１ｍｌを入れたマイクロチューブに菌体を懸濁した後、−８０　℃で冷凍保存した。表１に、ＲＡＫ１７６３のＵＶ照射による生存率、およびａ型株やα型株のコロニー数を示した。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
ＵＶ照射した方がａ型株又はα型株と思われるコロニーの取得率がよかったので、次にそれぞれの協会酵母や野生酵母にＵＶ照射することでａ型株又はα型株の候補と思われるコロニーを取得した。そして、その株が本当にａ型株又はα型株を示すかどうかを確認した。その結果、複数のａ型株およびα型株を取得することができた。表２に、それぞれの酵母のＵＶ照射の生存率、ａ型やα型株の取得数を示した。また図２に、種々の協会酵母から取得できた、ａ型株およびα型株とテスター株との交配株が、最少培地で生育する状態を示した。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
取得できたそれぞれの酵母のａ型株又はα型株をＹＰＤ培地上に植菌し、２８℃で２日間培養した後に、冷凍保存した。代表的なａ型又はα型の実用酵母のリストを、表３に示した。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
【実施例４】
得られた実用酵母のａ型株およびα型株を用いて、交配育種を行った。方法は、まず一枚のＹＰＤ培地上に実用酵母のａ型株のみを直線でそれぞれ平行になるように滅菌処理した爪楊枝で植菌していった。もう一枚のＹＰＤ培地上には実用酵母のα型株のみを同様に直線でそれぞれ平行になるように滅菌した爪楊枝で植菌していき、これらを２８　℃で２日間培養した。次に、これら二つのプレート上に生育した直線上の植菌の筋が、互いに格子状になるように新しいＹＰＤ培地にレプリカして、２８　℃で２日間培養した。そして、さらに最少培地にレプリカして２８℃で１日間培養した。そうすると交差した部分だけが、ａ型株とα型株との交配が可能となり、最少培地上に成長するはずである（図３）。その結果、直線状の植菌の筋が交差した個所に菌の生育が見られた場合、これは酵母のａ型株とα型株が交配して、その結果、栄養要求性が相補されあって最少培地でも生育できるようになったものと考えられる。この時の実用酵母同士でのａ型株とα型株の掛け合わせによる生育状態を図４に示した。
【００３１】
ここで、取得することのできた実用酵母同士の交配株、また実用酵母と野生酵母との交配株をＹＰＤ培地上でシングルにして、２８　℃で３日間培養した。次にそれぞれの交配株から３個のシングルコロニーをＹＰＤ培地上に植菌して２８℃で２日間培養した。その後、それぞれの交配株を冷凍保存した。ここで代表的な交配株のリストを、表４に示した。
【００３２】
【表４】
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【００３３】
これら実用酵母を全ての組み合わせで掛け合わせた結果、栄養要求性が同じ（ｔｒｐ３）であった協会９０１号由来と協会１０号由来のａ型株とα型株との組み合わせ以外は全ての株で交配株を取得することができた。
【００３４】
【発明の効果】
本発明により、実用酵母の交配育種において、従来の胞子形成法よりも簡単で確実に交配を行うことができる、栄養要求性変異株とテスター株の利用を特徴とする新規な交配育種法が確立できた。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵母からのａ型株又はα型株の取得手順を示す図である。
【図２】実用酵母のａ型株又はα型株とテスター株との交配株のみが、最少培地で増殖することを示す図である。
【図３】実用酵母のａ型株とα型株との掛け合わせ手順を示す図である。
【図４】実用酵母同士の掛け合わせの結果の一例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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