(57)【要約】【課題】ＬＯＨを簡便に検出することが可能な方法を提供する。【解決手段】（１）検出すべき変異部位を含むような標的配列を増幅するために設計された標識化プライマーを、ポリメラーゼおよび試料と反応させることと、（２）前記（１）の反応によって得られる反応液に存在する標識物質から生じる検出可能な信号について複数の経過時点で測定することと、（３）前記測定により得られたデータを解析することによって、対象における変異を検出することと、を具備する対象における変異を検出する方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）検出すべき変異部位を含むような標的配列を増幅するために設計された標識化プライマーを、ポリメラーゼおよび試料と反応させることと、
（２）前記（１）の反応によって得られる反応液に存在する標識物質から生じる検出可能な信号について複数の経過時点で測定することと、
（３）前記測定により得られたデータを解析することによって、対象における変異を検出することと、
を具備する対象における変異を検出する方法。
【請求項２】
前記標識物質が蛍光物質であり、前記（４）における複数の経過時点で測定することが蛍光相関分析装置によって行われ、且つ前記（５）におけるデータの解析することが蛍光相関分析法によってなされる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的配列がマイクロサテライト型多型部位を含む請求項１または２の何れか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーの配列には、前記標的配列が含まれない請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記変異がヘテロ接合性の消失である請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記変異が、前記標的配列における欠失、欠損および相同組換えからなる群より選択される変異である請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的配列が配列番号１および配列番号２からなる群より選択される配列に記載の塩基配列またはその相補鎖であることを特徴とする請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記プライマーが配列番号１および配列番号２からなる群より選択される少なくとも１である請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、対象に含まれる核酸における変異を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、個体の疾患を診断するに当たり、その個体由来の遺伝子情報を利用することが行われている。臨床分野においても、例えば、機能蛋白の遺伝的な欠損や、機能異常が原因とされる遺伝病などを診断するために、広範に実施されつつある。
【０００３】
これに並行して、このような診断に利用できる疾患関連遺伝子が多数報告されいる。例えば、癌については、癌遺伝子の突然変異、癌抑制遺伝子の欠失などの突然変異などが、癌化の重要な要因として報告されている。
【０００４】
例えば、癌抑制遺伝子にヘテロ接合性の消失（Ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｓ　；　以下ＬＯＨ　と記す）が生じた場合、癌化は促進する。通常では、癌抑制遺伝子は優性に作用する遺伝子である。従って、一遺伝子座位（一般的にはアレルとも称す）に存在する癌抑制遺伝子が、父由来の遺伝子と母由来の遺伝子の何れかにおいて活性であれば癌化は抑制される。しかしながら、その癌抑制遺伝子が、父由来および母由来の遺伝子の両方において共に、活性アレルが欠失した場合、即ち、ホモ型ＬＯＨとなって劣性型に変異した場合には、癌化が促進される。
【０００５】
従来では、このようなＬＯＨの解析は、主に、染色体レベル（ＣバンドやＦＩＳＨ）による染色体レベルでの解析、並びにＳＮＰｓの解析などＤＮＡレベルでの解析により行われる。また、ＬＯＨのＤＮＡレベルでの解析では、主にポリメラーゼチェーンリアクション（以下、ＰＣＲと記す）による遺伝子の増幅が行われた後で、更に種々の解析方法によってＰＣＲ増幅産物が展開され解析されている（特開平６−２０５７００）。
【０００６】
また、現在行われているＬＯＨの分子的な解析方法は、１本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎａｌｙｓｉｓ：　ＳＳＣＰ）や制限酵素切断超多型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：　ＲＥＬＰ）である（特開平９−２０１１９９）。これらの方法は、抽出したＤＮＡについて、放射性物質などで標識したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、そのＰＣＲ増幅産物を熱処理等で１本鎖に変性させる。更に、１本鎖に変性されたサンプルは、予め作成しておいたポリアクリルアミドゲルでの電気泳動法によって分類される。電気泳動終了後、そのゲルをオートラジオグラフィ（放射性同位元素）処理やエチジウムブロマイド（蛍光色素）染色が施され、サンプル中のＤＮＡ断片が可視化される。以上の操作により、抽出されたＤＮＡにおける遺伝子変位や欠損の部位が判定される方法である。
【０００７】
このような従来の方法は何れも、煩雑な操作が必要であり、且つＬＯＨを検出するまでには長時間が要される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
以上の状況に鑑み、本発明の目的は、ＬＯＨを簡便に検出することが可能な方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究の結果、下記の手段により上記課題を解決し、目的を達成することを見い出した。即ち、
（１）検出すべき変異部位を含むような標的配列を増幅するために設計された標識化プライマーを、ポリメラーゼおよび試料と反応させることと、
（２）前記（１）の反応によって得られる反応液に存在する標識物質から生じる検出可能な信号について複数の経過時点で測定することと、
（３）前記測定により得られたデータを解析することによって、対象における変異を検出することと、
を具備する対象における変異を検出する方法である。
【００１０】
係る構成によれば、ＬＯＨを検出することが可能である。また、ＬＯＨの検出を基に、部位点突然変異、欠失、欠損、塩基の挿入、増幅および相同組換えなどが生じたことを間接的に検出することが可能である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
ここで使用される「対象」の語は、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラットおよびマウスを含む任意の哺乳動物、爬虫類、魚類および昆虫などの個体、並びに遺伝子を発現し得るその他の生物個体、並びに個体から採取した細胞および組織等であってもよい。
【００１２】
ここで使用される「試料」の語は、対象に由来する組織、血液、細胞および体液等から抽出した核酸断片、およびそれらの断片を鋳型として適当な領域のみをＰＣＲなどで増幅した核酸断片を意味する。
【００１３】
ここで使用される「変異」とは、ＬＯＨ、並びにＬＯＨ型の突然変異をもたらすような変異、即ち、特定部位における欠失、欠損、塩基の挿入、増幅および相同組換えなどの変異をいう。
【００１４】
ここで使用される「標的配列」の語は、検出されるべき核酸の塩基配列であり、好ましくは対象のゲノム核酸に含まれる配列であればよく、マイクロサテライト型多型および／または単一ヌクレオチド多型（以下、ＳＮＰと記す）などが存在する部位を含むことがより好ましい。例えば、癌の診断や発症の予測、並びに化学物質の発癌性などを試験することを目的とする場合には、標的配列は、癌抑制遺伝子や発癌に関連する遺伝子を対象に選択すればよい。
【００１５】
また、標的配列の決定は、データベースなどに登録されている公知の配列より任意に選択してよい。また、標的配列は、少なくとも１つの遺伝子多型を含む範囲であれば特に制限はないが、ＰＣＲなどの増幅手段によって増幅させ易い長さと範囲を選ぶことが望ましい。長さは通常１００〜２００塩基対（以下ｂｐと記す）であることが好ましい。
【００１６】
本発明において使用されるプライマーは、標的配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドであればよい。本発明においては、プライマー自身の配列に、標的配列が含まれても含まれていなくてもよいが、プライマーの配列に標的配列が含まれないことが好ましい。即ち、フォワードおよびリバースの二種類のプライマーにより標的配列を挟み込むことにより、標的配列を増幅する配列であることが好ましい。
【００１７】
本発明において使用されるプライマーの長さは、２０塩基長から５００塩基長であればよい。また、当該プライマーは、１種類のプライマーセット（即ち、フォワードおよびリバース）が用いられた場合に、野生型および変異型の両方の核酸が増幅されるように設計されることが好ましい。また、そのようなプライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅され産生される野生型の核酸に由来する核酸断片と、変異型の核酸に由来する核酸断片との長さの違いは、複数の経過時点で測定することによって、５０塩基以上であれば検出でき、好ましくは７５塩基以上であれば精度が向上し、概して、１００塩基以上であればよいが、９０〜１５０塩基で充分な感度に達するということが判明した。
【００１８】
ここで使用される「標識物質」の語は、検出可能な信号を生じることが可能な物質をいい、例えば、蛍光物質、放射性物質および化学発光物質などであってよいが、ＦＣＳを用いる場合には、例えば、ＧＦＰ、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＴＡＭＲＡなどの蛍光物質が好ましい。標識物質は、試料中に存在する核酸断片を検出するために、その核酸断片を標識する物質である。例えば、使用するプライマーに予め蛍光物質を標識し、これを用いてＰＣＲ反応を実施すれば、蛍光物質が標識化された核酸断片がＰＣＲ増幅産物として生成される。
【００１９】
遺伝子多型とは、ヒト染色体の遺伝的多型であり、遺伝子上の塩基配列の個体差に由来するものである。この遺伝子多型を解析することにより、遺伝子座位（一般的にはアレルとも称す）を構成する遺伝子を、更に父方由来の染色体の遺伝子座位と母方由来の遺伝子座位として区別することができる。そのような遺伝子多型を利用すれば、ヘテロ接合体の一方の染色体の遺伝子座位の消失（即ち、ＬＯＨ）が測定でき、それにより遺伝子の変異が検出できる。
【００２０】
特に、一遺伝子内に存在する父方由来の縦列反復配列と母方由来の縦列反復配列とにおけるそれぞれの反復回数は、遺伝子多型部位の遺伝子型の違いによって異なる。従って、縦列反復配列の領域を標的として、ＰＣＲによって増幅すれば、ＰＣＲ増幅産物として得られた核酸断片の分子量の違いとして、そのような遺伝子多型や変異を容易に検出することが可能である。
【００２１】
父方と母方の大きさ（即ち、塩基長）の異なる２種類のＰＣＲ増幅産物が溶液中に存在した場合、それぞれのＰＣＲ増幅産物は、ブラウン運動を行う際には異なる移動スピード（即ち、拡散時間）を示す。従って、このような拡散時間を測定すれば、そのような遺伝子型や変異を簡便に検出することが可能である。
【００２２】
本発明を更に説明する。まず、特定の配列を標的配列として選択し、その標的配列を選択的に増幅することが可能なプライマーを作製する。次に、そのプライマーに蛍光標識を施し、得られた標識化プライマーを用いて試料中に含まれる被検核酸についてＰＣＲ反応を行う。この反応中または反応後に、反応液中に存在する標識物質から生じる蛍光信号の変化を複数の時点で継時的に測定する。得られた複数の経過時点での蛍光信号の変化は、例えば、蛍光相関分光法によって解析することができる。その解析結果から、それぞれのＰＣＲ増幅産物の長さを求め、その情報を基に、試料中に含まれる被検核酸の標的配列の遺伝子型を決定し、対象における変異を検出する。
【００２３】
本発明の態様に従ってＰＣＲ増幅産物の長さを求めるためには、例えば、蛍光相関分光法（以下、ＦＣＳと記す）による蛍光分子の計測方法により、２種類の物質動きを拡散時間として検出することで、２種類または１種類の物質の存在を判定すればよい。その結果、同一の物質のみが検出される場合には、父方若しくは母方のどちらかの一方の染色体（またはアレル）の消失、即ち、ＬＯＨが生じたことが判定される。
【００２４】
本発明に従うと、次のようにヘテロ接合性の消失が解析されてもよい。以下、図１を用いて説明する。
【００２５】
まず、ステップ１において、最初に対象となる遺伝子構造からプライマー領域を設定する（１ａ）。その設定は、マイクロサテライト（縦列反復配列とも称す）多型を含むことによって、ＰＣＲにより増幅した産物が核酸鎖長の違いとして検出できるように決定する。
【００２６】
次に、ステップ２において、設計され合成されたプライマーを蛍光色素で標識する（１ｂ）。
【００２７】
続いて、ステップ３において、試料の核酸断片と蛍光標識プライマーとをＰＣＲ反応を行うことによって増幅する（１ｃ）。
【００２８】
更にステップ４において、前記ステップ３において行ったＰＣＲ反応によって得たＰＣＲ増幅産物の一部を測定プレートに分注し、蛍光相関分析装置（以下、ＦＣＳと記す）にて計測を行う（１ｄ）。
【００２９】
最後に、ステップ５において、前記ステップ４で行った蛍光相関分析解析の結果を基に、得られた拡散時間が一峰性であればＬＯＨ状態であり、二峰性であれば、ＬＯＨ状態ではないと、判定する（１ｅ）。
【００３０】
例
１．Ｌ５１７８Ｙマウスリンホーマ細胞におけるヘテロ接合性の消失の検出
チロシンキナーゼ（以下、Ｔｋと記す）遺伝子のＬ５１７８Ｙマウスリンホーマ細胞におけるヘテロ接合性の消失を検出する例を、本発明の１態様として以下に説明する。
【００３１】
Ｔｋ遺伝子は、Ｌ５１７８Ｙマウスリンホーマ細胞の１１番染色体上に位置する。図２に示すようにｔｋ遺伝子は、７のエクソンとＡからＦの６のイントロンを含み、イントロンＦにマイクロサテライト多型（ＣＡ）ｎが存在する（Ｍｅｌｉｓｓａ　Ｃ．　Ｌｉｅｃｈｔｙ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　３７１（１９９６）２６５−２７１）。図３には野生型のｔｋ遺伝子の一部、即ち、イントロンＥの一部（最初の小文字の部分）、エクソン６（最初の大文字の部分）、イントロンＦ（２つ目の小文字の部分）およびエクソン７の一部（最後の大文字の部分）を示す。ここで右側の数字はｔｋ遺伝子の転写開始部位を＋１とした場合の位置を示す。図３に示すように野生型のイントロンＦには、非繰り返し配列を挟んで２つの繰り返し配列（ＣＡ）４８と（ＣＡ）１４が存在する。これに対して、変異型のｔｋ遺伝子は、図３に示す１８６０位から２０９１位が２箇所に亘って欠失している。
【００３２】
一方、上述した通り、一遺伝子内に存在する父方由来のマイクロサテライトと母方由来のマイクロサテライトの反復配列数は、遺伝的多型によって異なる。従って、１細胞に含まれる当該多型を解析することによって、ヘテロ接合性であるのか否かを検出することが可能である。従って、以下の試験では標的配列として、配列番号１に記載の塩基配列と配列番号２に記載の塩基配列を選択した。
【００３３】
Ｌ５１７８Ｙマウスリンホーマ細胞から、フェノール抽出およびクロロホルム抽出にしてゲノムＤＮＡを抽出した。フォワードプライマーとして、配列番号１の塩基配列（Ｆ５’ＣＴＧ−ＧＧＣ−ＣＴＧ−ＧＡＧ−ＡＡＡ−ＧＡＧ−ＧＴＡ−３’）を含むオリゴヌクレオチドと、リバースプライマーとして、配列番号２（Ｒ５’−ＧＧＧ−ＣＴＧ−ＡＡＧ−ＡＣＴ−ＴＣＴ−ＴＡＡ−ＡＧＴ−ＡＧＣ−Ａ−３’）を含むオリゴヌクレオチドをサイマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製モデル９６００）を用いて合成した。更に配列番号１の５’末端側に５４３ｎＭ波長の蛍光物質を標識した。この蛍光標識したプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応の条件は、９５℃、（９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒）３０サイクル、７２℃１分、４℃で行った。ここで使用可能な５４３ｎｍ波長の標識物質は、例えば、ＴＡＭＲＡやＣｙ３などの蛍光物質でよく、また、５４３ｎｍの波長に換えてＣｙ５などの６３３ｎｍの波長の蛍光物質を使用してもよい。
【００３４】
配列番号２と配列番号３の塩基配列を有するプライマーセットを用いて増幅した場合、ヘテロ接合性を有していれば、ＰＣＲ増幅産物は５５０ｂｐと４２０ｂｐの２つの核酸断片を含んでいると考えられる。
【００３５】
続いて、ＰＣＲ増幅産物について以下の装置を用いて、後述する方法に従って、ＦＣＳ解析を行った。
【００３６】
２．蛍光相関分析装置
以下、ＦＣＳ解析に用いた蛍光相関分析装置について、図４を参照して説明する。
【００３７】
図に示すように、本態様における蛍光相関分析装置は、レーザ光源と、前記レーザ光源１からの光ビームの強度を減弱する光強度調節手段２と適切な光強度調節手段２を設定する光減衰選択装置３と、前記レーザ光源１からの光ビームを前記試料に集光し共焦点領域を形成するための光学系４および５と、蛍光分子を含有するサンプルを乗せたステージ６と、前記サンプルからの蛍光を集光する光学系７〜１１と、集光した蛍光を検出する光検出器１２と、蛍光強度の変化を記録する蛍光強度検出手段１３と蛍光強度の減衰率を検出する蛍光強度減衰率検出手段１４と、光ビームを照射する時間を制御するコントローラ１５を具備する。
【００３８】
本態様における蛍光相関分析装置は、共焦点レーザ顕微鏡を利用したものである。なお、本態様では、蛍光強度記録手段１３と蛍光強度減衰率検出１４を別の装置としたが、１台のコンピュータ内に２つの手段の機能を同時に持たせてもよい。
【００３９】
本態様では、光源としてＨｅ−Ｎｅを用いて、５４３ｎｍと６３３ｎｍの波長を使用した。なお、レーザ光源１から放射されるレーザは、アルゴンイオンレーザ、ヘリウムネオンレーザ、クリプトンレーザ、ヘリウム−カドミウムレーザ等の何れであってもよい。また、図４では、レーザ光源から照射、集光および検出などの対象とされる光の軌跡を光路として矢印で示している。
【００４０】
本態様では、レーザ光源１からレーザ照射量を、最適なレーザ出力となるよう減弱するために、光強度調節手段２としてレーザ減弱フィルタ（即ち、ＮＤフィルタ）を使用したが、これに限定するものではない。なお、レーザ強度の減弱度が異なる数種類のフィルタを使用することによってレーザ強度を調節することも可能である。
【００４１】
適切な蛍光強度調節手段２の選択および設定は、光減衰選択装置３によって行った。光減衰選択装置３は、コンピュータの制御によって、最適なレーザ出力となるように蛍光強度調節手段２を選択し、設定する手段である。本態様では、蛍光強度調節手段２としてＮＤフィルタを用いたので、光減衰選択装置３として、ＮＤフィルタチェンジャーを用いた。
【００４２】
図４において、サンプルに対してレーザ光源から照射される光ビームを集光し、共焦点領域を形成する手段は、図４中の矢印で示される光路上に配置される光学系を用いればよい。本態様では、そのような光学系として、ダイクロイックミラー４および対物レンズ５を用いた。
【００４３】
次に、本態様の装置を用いた測定について説明する。
【００４４】
まず、レーザ光源１からの光ビームは、蛍光強度調節手段２の減弱度に従って、光ビームの度合が減弱されて、ダイクロイックミラー４に照射される。ダイクロイックミラー４によってレーザは、入射光に対して９０度に反射され、ステージの方向に屈折され、対物レンズ５を通り、ステージ６上のサンプルに照射される。このような照射により光ビームは、微小な一点で前記サンプルに集光され共焦点領域が形成される。
【００４５】
ステージ６上のサンプルは、蛍光分子を標識したＤＮＡ断片が懸濁された溶液である。
【００４６】
本態様では、サンプルに対して所定時間に亘って光ビームが励起光として照射された後、そのサンプルから放射される蛍光が検出され、蛍光相関分析を行った。また、このレーザ光源が光ビームの照射を所定時間に亘って行うように、コントローラ１５によってレーザ光源の照射時間を制御した。ここで「所定時間」とは、解析したい蛍光分子が励起光を受けてから安定に蛍光を発するまでに必要な時間であって、且つＦＣＳ計測不能なまでに蛍光が減衰しない時間をいう。本態様では、解析したい蛍光分子が、蛍光標識したＤＮＡであるので、この所定時間は、好ましくは５秒間であり、これを３回程度繰り返して測定した。なお、所定時間は、測定対象となる蛍光分子の種類によって選択してよい。
【００４７】
前記共焦点領域内の蛍光分子から放射された蛍光を、光学系により集光した後に、光検出器１２によって検出した。本態様においては、光検出器に蛍光を集光するための光学系として、フィルタ７、チューブレンズ８、反射鏡９，ピンホール１０およびレンズ１１を使用した。なお、このような光学系は光検出器に蛍光を集光できるような設計であればどのように変更してもよい。
【００４８】
サンプルに含まれる蛍光分子から放射された蛍光は、図４に示す矢印のように、対物レンズ５を通り、ダイクロイックミラー４を光進行方向に透過し、フィルター７、チューブレンズ８を経て、反射鏡９に達する。反射鏡９に照射された蛍光は、屈折されてピンホール１０に結像され、その後、レンズ１１を通過して光検出器１２に集光される。
【００４９】
集光された蛍光は、光検出器１２によって光信号から電気信号に変換され、コンピュータなどの蛍光強度記録手段１３に送信される。本態様では、蛍光強度記録手段１３としてアパランシャルフォトダイオードを使用した。
【００５０】
蛍光強度の変化を記録する蛍光強度記録手段１３において、伝達された蛍光強度データを記録し解析した。この蛍光強度データの解析によって自己相関関数を設定し、分子の大きさに依存する蛍光分子の動きを、この自己相関関数の変化によって検出した。なお、蛍光物質の種類を増やす等を行った場合には、自己（オート）相関関数以外に、相互（クロス）相関関数によるデータ解析を行うように変更してもよい。
【００５１】
３．蛍光相関分析方法
本態様において使用される蛍光相関分析方法は、蛍光分子を含むサンプルに対してレーザ光源から光ビームを集光し共焦点領域を形成することと、前記共焦点領域を形成するための光ビームを前記サンプルに対して所定時間に亘り照射することと、前記共焦点領域内に存在する蛍光物質からの蛍光強度を分子毎に検出することと、検出された蛍光強度について蛍光相関分析を行うこととを具備する。
【００５２】
本態様では、上述したようにサンプルは、蛍光相関分析装置のステージ６上の基板の上に置かれた。このような任意のサンプルに対して、レーザ光源１から光ビームが集光されて照射され、共焦点領域が形成された。
【００５３】
共焦点領域は、レーザ光源１から照射された光ビームが、対物レンズを介してステージ上の基板に載せられたサンプル内の微小な一点に集中して照射されることにより形成される。ＦＣＳ計測において計測領域となるこの共焦点領域は、容積は約０．２４ｆＬ（約０．２５〜１．７μｍ３）である。
【００５４】
本態様では、サンプルに対して、このような共焦点領域を形成した上で、所定時間光ビームを照射し、蛍光が安定した後で、共焦点領域内の蛍光分子からの蛍光強度を検出して蛍光相関分析を行った。
【００５５】
４．結果
上記１において得られたＰＣＲ増幅産物に含まれる核酸断片について、上記２の装置を用いて前記３に示した解析を行った結果は、拡散時間は二峰性であった。従って、試験を行った試料はヘテロ接合性であると判定された。
【００５６】
これに対して、１つの細胞から１つの長さの核酸断片のみが検出された場合には、即ち、拡散時間が一峰性である場合には、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）の状態であると判断すればよい。このように、ＰＣＲ増幅産物の配列の長さを指標にＬＯＨが検出される。
【００５７】
この方法により、ＬＯＨの検出を簡便且つ高感度に行うことができる。このような方法は、癌および化学物質の変異原試験を有利に行うことが可能である。
【００５８】
以上のような本発明の態様に従うと、縦列反復配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドを蛍光標識し、これをプライマーとして用いて試料に含まれる核酸断片についてＰＣＲ反応を行い、それにより得られたＰＣＲ増幅産物の長さの違いを、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）によって検出し、それにより対象における変異を検出する方法が提供される。これによって、サンプルを予め１本鎖に変性する必要もなく、特定部位における欠失、欠損、塩基の挿入、増幅および相同組換えなどの変異や、ＬＯＨを簡便に且つ高感度に検出することが可能である。
【００５９】
上述の例では、核酸断片として複製しようとする標的配列として、縦列反復配列（即ち、マイクロサテライト）による遺伝子多型を選択し、複製され増幅された核酸断片から、その標的配列についてのヘテロ接合性の消失を検出する方法を示した。即ち、縦列反復配列欠失変異を検出するために、その欠失領域をカバーするプライマーを用いて増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物の分子量の差を検出した。
【００６０】
一塩基多型（即ち、ＳＮＰｓ）は対象において存在する数が非常に多い。従って、現状では、その検出が困難である。また、ＳＮＰｓは塩基毎の多型性は低く、それに対してマイクロサテライト多型の方が多型性は高いとされている。例えば、ＳＮＰ部位の野生型がＡだとして、それがＣの変異型になり、更に、別の塩基（即ち、ＧやＴ）に変わり得るのは、人類史年代的に事実上あり得ず、１箇所のＳＮＰの多型は殆どの場合が２種類（即ち、野生型と変異型）に留まっている。一方、マイクロサテライトは、繰り返し単位の数がＤＮＡ複製時の滑り込みエラーによって変わるもので、変異の種類が非常に多いとされている。従って、本発明において、標的配列として特定のマイクロサテライト配列を選択して用いることは、ＳＮＰを標的配列とするよりも好ましく、且つＬＯＨを検出するのに有利である。
【００６１】
本発明の方法により、部位点突然変異、欠失、欠損および相同組換えなどによって生じたＬＯＨを検出することが可能である。従って、ＬＯＨを検出することによって、その原因となった特定の領域において部位点突然変異、欠失、欠損、塩基の挿入、増幅および相同組換えなどが生じたことが推測でき、従って、本発明により間接的に部位点突然変異、欠失、欠損、塩基の挿入、増幅および相同組換えなどの変異が検出できる。
【００６２】
また、本発明の方法は、癌および遺伝子病の発症予測および診断などに有効に利用することが可能である。
【００６３】
また、上述のようなＬ５１７８Ｙマウスリンホーマ細胞を用いたヘテロ接合性の消失の検出を、それぞれ化学物質を処理した細胞について行えば、化学物質の変異原性を検査するために利用することも可能である。その場合、Ｌ５１７８Ｙマウスリンホーマ細胞以外にも、ｔｋ遺伝子をターゲットとした試験系に一般的に使用される他の細胞であってもよく、また、ｐ５３遺伝子などの癌抑制遺伝子の活性について試験するために一般的に使用される細胞などであってもよい。そのような方法は、上述した本発明に従って、適切な標的配列とプライマーとを設計し、ＰＣＲを行い、ＦＣＳによって解析することによって実施することが可能である。
【００６４】
【発明の効果】
本発明によって、ＬＯＨを簡便に検出することが可能な方法が提供された。
【００６５】
【配列表】
2004016195.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の１例である方法を示すフローチャート。
【図２】チロシンキナーゼ遺伝子を示す遺伝子地図。
【図３】マイクロサテライト配列を示す図。
【図４】蛍光相関分析装置の１例を示すブロック図。
【符号の説明】
１．レーザ光源　　２．光強度調節手段　　３．光減衰選択装置　　４．対物レンズ　　５．対物レンズ　　６．ステージ　　７．フィルター　　８．チューブレンズ　　９．反射鏡　　１０．ピンホール　　１１．レンズ　　１２．光検出器　　１３．蛍光強度記録手段　　１４．蛍光強度減衰率検出手段　　１５．コントローラ
【図１】
2004016195.tif 000003
【図２】
2004016195.tif 000004
【図３】
2004016195.tif 000005
【図４】
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