(57)【要約】【課題】農薬の使用量を飛躍的に減少させる可能性のある、植物に対して病害抵抗性を増幅する作用の物質を提供すること。【解決手段】植物によって異物と認識され、植物抵抗性遺伝子群を起動し病原菌・病害虫に対する抵抗性増大を促す作用を有する希少糖。希少糖は好ましくはＤ−プシコースである。上記の希少糖の植物病害抵抗性増幅剤としての使用。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物によって異物と認識され、植物抵抗性遺伝子群を起動し病原菌・病害虫に対する抵抗性増大を促す作用を有する希少糖。
【請求項２】
希少糖がＤ−プシコースである請求項１の希少糖。
【請求項３】
請求項１または２の希少糖の植物病害抵抗性増幅剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業の属する技術分野】
本発明は、希少糖による植物病害抵抗性増幅剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物に対する病原体感染を防ぐためには一般に殺菌剤の散布が行われるが、病原菌が植物体内に侵入した際、植物はこれを識別して、抗菌性物質であるファイトアレキシン合成等の植物防御システムを起動して自己防衛する。植物の二次代謝系を活性化してこのような抵抗性反応を誘導する物質はエリシター（特許文献１、２、非特許文献１）と呼ばれる。植物の二次代謝系が複雑であったり、酵素の活性化が短時間に生じるため、エリシターによる植物防御システムを起動のメカニズムは、これまでのところ、ほとんど明らかにされていない。
【０００３】
【特許文献１】
特開平７−６７６８１号公報
【特許文献２】
特開平７−１０９０１号公報
【非特許文献１】
植物細胞工学、第２巻、補１、第３９９頁、１９９０年
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
一般に行なわれている農薬散布による病害防除は、作物に残留した農薬による人体への影響、環境に対する汚染等、安全性に関する問題が多い。さらに、農薬の効果の面でも、いったん病原体が植物に侵入してしまうと、農薬はもはや殺菌効果を発揮できないという問題点がある。このように従来の農薬はその安全性等が強く指摘されているところであり、本発明は、農薬の使用量を飛躍的に減少させる可能性のある、植物に対して病害抵抗性を増幅する作用の物質を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、植物によって異物と認識され、植物抵抗性遺伝子群を起動し病原菌・病害虫に対する抵抗性増大を促す作用を有する希少糖、好ましくはＤ−プシコースを要旨とする。
【０００６】
植物によって異物と認識され、植物抵抗性遺伝子群を起動し病原菌・病害虫に対する抵抗性増大を促す作用を有する希少糖、好ましくはＤ−プシコースを植物病害抵抗性増幅剤としての使用を要旨とする。
【０００７】
【発明の実施の形態】
近年、異物認識が植物抵抗性遺伝子群の起動に関与する例が多々報告され、この異物認識され抵抗性遺伝子を誘導する因子をエリシター（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）と呼ぶようになっている。本発明は希少糖が植物の病害抵抗性を増強する作用を発見したものであり、希少糖による全く新しい現象である。従来の農薬はその安全性が強く指摘されているところであるが、本発明は農薬の使用量を飛躍的に減少させる可能性のある発明である。すなわち、植物に対して希少糖が反応し、植物体内に病害抵抗性を付与する各種タンパク質を作り出す現象であり、植物活性増強剤、その他環境にやさしい農薬等としての用途が広がる基本的に重要な研究成果である。
【０００８】
一般に物質は、その構造あるいは性質によって定義されるが希少糖はこの方法によらずに定義されている。希少糖は、その構造や性質によらず、自然界の存在量によって定義されるのである。すなわち、希少糖は自然界に少量しか存在しない単糖および糖アルコールと定義づけられている。自然界に多量に存在する単糖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース等であるが、それ以外の多くの自然界に存在量が少ない単糖は全て希少糖である。また糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはＤ−ソルビトールおよびＤ−マンニトールが比較的多く存在するがそれ以外のものは量的には少ないので、これらも希少糖と定義されている。
炭素数が６の六炭糖については、単糖および糖アルコールの総数は３４存在するが、その存在量から希少糖は、Ｄ−プシコース、Ｄ−タガトース、Ｄ−ソルボース、Ｄ−アロース等２８種類が存在する。
【０００９】
現在の地球上に存在する有機物は、ほぼ全てが生物によって生産される。この事実から、自然界に少量しか存在しない希少糖は、生物は合成する能力も分解する能力も低い有機物であると考えられる。しかし、自然界に多量に存在する単糖の構造と極わずかの違いしかない。そのため、生物が希少糖に接触した場合に全く予期しない反応を示すことが期待される。本発明は希少糖に対する高等生物である植物の全く新しい反応を示したものである。
【００１０】
本発明の実施例で用いたＤ−プシコースによって、植物の病原菌・ストレス応答遺伝子経路を起動し、病原菌・病害虫に対する抵抗性増大を促す可能性が示された。希少糖は自然界に大量に存在する天然型単糖と類似構造を持ちながら、微量しか自然界に存在しない。そのため植物にとって完全に初めて出会う化合物である場合がほとんどであるため、代謝分解する経路が確立しておらず、希少糖を異物認識して抵抗反応系への伝達機構（ストレス−シグナリング）を刺激している可能性が高いと考える。他の希少糖についても、Ｄ−プシコースと同様の検定を用いて、様々な植物で試すことにより、興味深い作用を示したり、また各植物毎に作用が異なる希少糖を選抜検定できると考える。
【００１１】
本発明の対象とする植物は、希少糖を異物と認識し、その抵抗性遺伝子群を起動し病原菌・病害虫に対する抵抗性増大を促す作用を呈する植物であれば何でもよい。実施例のＤ−プシコースが発現誘導した抵抗性関連遺伝子は、いずれも幅広い植物種において共通の植物防御システムに関与する遺伝子であり、カンキツで見られた作用は他の植物に対しても同様の作用を及ぼす可能性が高い。様々な植物についても、カンキツと同様の検定を用いて試すことにより興味深い作用を示したり、また各植物毎に作用が異なる希少糖を選抜検定できると考える。
【００１２】
希少糖のうち、現在大量生産ができているＤ−プシコースという希少糖について説明する。
プシコースは、単糖類の中で、ケトン基を持つ六炭糖の一つである。このプシコースには光学異性体としてＤ体とＬ体とが有ることが知られている。ここで、Ｄ−プシコースは既知物質であるが自然界に希にしか存在しないので、国際希少糖学会の定義によれば「希少糖」と定義されている。本発明で使用するＤ−プシコースは、ケトースに分類されるプシコースのＤ体であり六炭糖（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）である。このようなＤ−プシコースは、自然界から抽出されたもの、化学的またはバイオ的な合成法により合成されたもの等を含めて、どのような手段により入手してもよい。比較的容易には、例えば、エピメラーゼを用いた手法（例えば、特開平６−１２５７７６号公報参照）により調製されたものでもよい。得られたＤ−プシコース液は、必要により、例えば、除蛋白、脱色、脱塩などの方法で精製され、濃縮してシラップ状のＤ−プシコース製品を採取することができ、更に、カラムクロマトグラフィーで分画、精製することにより９９％以上の高純度の標品も容易に得ることができる。このようなＤ−プシコースは単糖としてそのまま利用できるほか、必要に応じて各種の誘導体として用いることも期待される。
【００１３】
本発明は、希少糖を植物に接触させることにより、病原体に対する植物の抵抗性を増大させることが可能である。希少糖を植物に接触させる手段には、特に制限はなく、たとえば、植物体への注入、種子への塗布、その物質溶液への種子の浸漬、葉面への散布、栽培土壌への添加、水耕栽培における液体肥料への添加およびウイルス・フリー苗の馴化培地への添加などが可能である。
【００１４】
【作用】
希少糖を、植物に対して病害抵抗性を増幅する作用の物質として用いる場合の利点について説明する。
（１）  低濃度（１００  μｇ／ｍｌ）の希少糖水溶液が、展着剤なしで、抵抗性遺伝子を迅速に起動する。
（２）  希少糖は自然界に微量しか存在しないが、「天然物」であるため、安全性の高い散布剤であることが期待される。
（３）  希少糖は病原菌に対する作用は強い殺菌作用ではないので、耐性菌の発生を考慮する必要がない。
（４）  希少糖単独の剤としてのみならず、殺菌剤との混合商品等としての開発が期待される。植物病害抵抗性増幅剤は殺菌剤にとって変わるタイプの薬剤ではない。例えば９５％の殺菌性を持つ剤の防除価を、より１００％に近いところまで高めるために、植物サイドの防御機構を応用するための剤としての開発が期待される。
（５）  上記の（４）に加え、展着剤へ混合するための剤としての開発が期待される。これまで展着剤は農薬を散布葉上に付着される役割以外考えてこられなかった。希少糖の作用は葉表面との接触が不可欠であり、希少糖を展着剤に混在させることにより、より付加価値の高い商品になると考える。
（６）  本発明者らの発明により希少糖を大量に安価に生産できる可能性が高い。
【００１５】
【実施例】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
［材料］
供試したカンキツ品種にはラフレモン（Ｃｉｔｒｕｓ ｊａｍｂｈｉｒｉ  Ｌｕｓｈ）を用いた。種子を温室でバーミキュライトの中にて約２週間で発芽させ、幼苗木（約１０−１５ｃｍ）をポットに移植し、自然日長条件下のガラス室で生育させた。本実施例に用いた幼葉（約２−２．５ｃｍ）は１００−１５０ｃｍ丈のラフレモン植物体から採取した。
［処理法］
Ｄ−プシコース水溶液（１００μｇ／ｍｌ）を定着剤なしでラフレモンの切り取り葉に噴霧処理し、２４度暗下湿室条件で２時間静置し、ただちにｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出して、各種カンキツ抵抗性関連遺伝子をプローブとしたノーザンブロット解析を行った。
（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出法）
ラフレモン葉は処理後直ちに乳鉢中で液体窒素中（約５ｍｌ）にて磨砕した。組織の磨砕粉末からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出にはＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。
（ノーザンブロット解析）
ノーザンブロットには、ＤＩＧ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＳＰ６／Ｔ７）（Ｒｏｃｈｅ）を用いて標識したＲＮＡプローブを用いた。ＲＮＡサンプルは，１〜５μｌのｔｏｔａｌＲＮＡ、１μｌの２０×ＭＯＰＳ、３．５μｌの３７％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド、１０μｌのホルムアミドをよく混合し、ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ  で、全量２０μｌになるように調製した。調製したサンプルを６５℃で１０分間加熱して変性させ、３μｌの１０×色素溶液を加えて、直ちに１００Ｖで６０分間電気泳動した。泳動後、ゲルを１０×ＳＳＣ中で１５分間×２回洗浄し、キャピラリー法でＨｙｂｏｎｄ−ＮメンブレンへＲＮＡを転写した。転写後、メンブレンを８０℃で２時間静置してＲＮＡを固定した。メチレンブルー染色によってＲＮＡ量の検定を行ったメンブレンをハイブリダイゼーションボトルに移し、約１０ｍｌのノーザンブロット用の標準ハイブリダイゼーションバッファー［５×ＳＳＣ，  ０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン，  ０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，  ０．２％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ），  ５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド］中で６８℃，  ３時間以上振盪（５回転／分；Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＶＥＮ／ＳＨＡＫＥＲ  ＲＰＮ２５１０）させ、プレハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーション後、１００μｌ  のＲＮＡプローブ溶液を１０分間煮沸して変性し、同ハイブリダイゼーションバッファーに加えて、６８℃で一晩メンブレンを振盪（５回転／分）させ、ハイブリダイゼーションを行った。シグナルの検出は、ＤＩＧシステムによりアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ）（７５０Ｕ／ｍｌ）とＣＳＰＤ液を用いて行い、３７℃で化学発光反応を進行させた後、Ｘ線フィルム（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ）に感光させた。
【００１７】
［研究結果および考察］
Ｄ−プシコース噴霧処理による植物抵抗性関連遺伝子群の起動
１００μｇ／ｍｌのＤ−プシコースを定着剤なしで切り取り葉（カンキツ）に噴霧処理し、植物抵抗性関連遺伝子の発現を調べたところ、本処理２時間後に各種植物抵抗性関連遺伝子の発現が誘導された（図１）。今回使用した植物抵抗性関連遺伝子の中で、リポキシゲナーゼ  （ＬＯＸ）  遺伝子、ａｌｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  （ＡＯＳ）  遺伝子，  Ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｌｙａｓｅ  （ＨＰＬ）  遺伝子はいずれも脂質過酸化経路の酵素遺伝子である。本発明者らの研究により、カンキツは病原菌や傷害等のストレスにより、この脂質過酸化経路が極めて初期（３０分以内）に作動し、その結果サリチル酸やジャスモン酸等のシグナル伝達物質の合成を介して、防御機能を活性化することが明らかとなっている。これらの遺伝子がＤ−プシコースにより起動したことは、カンキツによるＤ−プシコースの認識が、ストレス応答反応経路の活性化につながっていることを意味する。また、ＰＲタンパクとして、植物の防御機構に直結することが知られるプロテアーゼ阻害蛋白  （ＭＬＰ２）  遺伝子もＤ−プシコースにより起動した。また、ＰＲタンパク型のプロテアーゼ阻害蛋白は、一般に植物において害虫等に対して消化不良を誘起することによる防御作用を持つことも知られている。このＭＬＰ２遺伝子も病原菌や傷害等のストレスにより誘導されることが本発明者らの研究で既に明らかとなっている。ｅｐｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  （ＥＨ）  遺伝子も病原菌や傷害等のストレスにより誘導されることが知られ、本遺伝子産物はクチクラの合成に関与し、細胞壁の強化により植物防御に携わると考えられている。本遺伝子の起動は、各種環境ストレス（水ストレス等）にも誘導されるという報告もある。
【００１８】
本結果はすべて、Ｄ−プシコースが植物の病原菌・ストレス応答遺伝子経路を起動し、病原菌・病害虫に対する抵抗性増大を促す可能性を示す。希少糖は自然界に大量に存在する天然型単糖と類似構造を持ちながら、微量しか自然界に存在しない。そのため植物にとって完全に初めて出会う化合物ではないが、代謝分解する経路が確立しておらず、希少糖を異物認識して抵抗反応系への伝達機構（ストレス−シグナリング）を刺激している可能性が高いと考える。また、Ｄ−プシコースが発現誘導した抵抗性関連遺伝子は、いずれも幅広い植物種において共通の植物防御システムに関与する遺伝子であり、カンキツで見られた作用は他の植物に対しても同様の作用を及ぼす可能性が高い。また、本実験と同様の検定を他の希少糖を用いて、様々な植物で試すことにより、特定の希少糖がより興味深い作用を示したり、また各植物毎に作用が異なる希少糖を選抜検定できると考える。
近年、この異物認識が植物抵抗性遺伝子群の起動に関与する例が多々報告され、この異物認識され抵抗性遺伝子を誘導する因子をエリシター（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）と呼ぶようになっている。本実施例の希少糖は、該希少糖をエリシターとして用いた植物病害抵抗性増幅剤としての用途に向けられる結果である。
【００１９】
【発明の効果】
農薬の使用量を飛躍的に減少させる可能性のある、植物に対して病害抵抗性を増幅する作用の希少糖を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｄ−プシコース処理後２時間で誘導された植物病害抵抗性遺伝子群のノーザンブロットによる発現解析の図面（Ｄ−プシコースが異物と認識され植物病害抵抗性遺伝子群の発現が起動されたことを示す図面）に代わる写真である。図１中、ＭＬＰ２：プロテアーゼ阻害蛋白遺伝子、ＬＯＸ：リポキシゲナーゼ遺伝子、ＡＯＳ：  ａｌｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子、ＥＨ：ｅｐｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ遺伝子，  ＨＰＬ：  Ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｌｙａｓｅ遺伝子で、いずれの遺伝子も本発明者らが単離した。
【図１】
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