(57)【要約】【課題】本発明の第一の目的は、界面活性剤中でのポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性の安定化方法を提供することにある。本発明の第二の目的は、界面活性剤中での酵素活性が安定化されたポリヒドロキシアルカノエート合成酵素及びその製造方法を提供することにある。本発明の第三の目的は、前記のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成する、ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法を提供することにある。【解決手段】ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとを融合させることにより、界面活性剤中でのポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性が安定化される。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとを融合させることを特徴とする、界面活性剤中でのポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性の安定化方法。
【請求項２】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素が中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性の安定化方法。
【請求項３】
前記中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素がシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）に属する微生物に由来する中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、請求項２に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性の安定化方法。
【請求項４】
前記中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素がシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｃｈｏｒｉｉ　ＹＮ２、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７５）に由来する中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、請求項３に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性の安定化方法。
【請求項５】
前記界面活性剤がポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（商品名：Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）である、請求項１から請求項４のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性の安定化方法。
【請求項６】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとが融合されてなることを特徴とする、界面活性剤中での酵素活性が安定化された修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素。
【請求項７】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素が中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、請求項６に記載の修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素。
【請求項８】
前記中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素がシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）に属する微生物に由来する中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、請求項７に記載の修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素。
【請求項９】
前記中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素がシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｃｈｏｒｉｉ　ＹＮ２、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７５）に由来する中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、請求項８に記載の修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素。
【請求項１０】
前記界面活性剤がポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（商品名：Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）である、請求項６から請求項９のいずれかに記載の修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素。
【請求項１１】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードする遺伝子が導入されてなる形質転換体を培養して得られる培養液から、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとが融合されてなる修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を採取する工程を含むを特徴とする、界面活性剤中での酵素活性が安定化された修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の製造方法。
【請求項１２】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素が中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、請求項１１に記載の修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の製造方法。
【請求項１３】
前記中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素がシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）に属する微生物に由来する中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、請求項１２に記載の修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の製造方法。
【請求項１４】
前記中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素がシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｃｈｏｒｉｉ　ＹＮ２、ＦＥＲＭＢＰ−７３７５）に由来する中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、請求項１３に記載の修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の製造方法。
【請求項１５】
請求項６から請求項１０のいずれかに記載の修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとを融合させることを特徴とする、界面活性剤中でのポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性の安定化方法に関するものである。また、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとを融合させることを特徴とする、界面活性剤中での酵素活性が安定化された修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素及びその製造方法に関するものである。さらに、本発明は、前記の修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
高分子材料は現代の産業や生活に不可欠のものであり、安価軽量であること、成形性が良いことなどから、家電品の筐体をはじめ包装材や緩衝材、あるいは繊維材料など、多岐に渡って利用されている。一方、これら高分子材料の安定な性質を利用して、高分子の分子鎖に様々な機能を発現する置換基を配して、液晶材料やコート剤などの各種機能材料も得られている。
【０００３】
これら機能材料は構造材料としての高分子よりも付加価値が高いため、少量生産でも大きな市場ニーズが期待できる。このような高分子機能材料は、これまで高分子の合成プロセスの中で、あるいは合成した高分子を置換基で修飾することにより、有機合成化学的手法により得られている。高分子機能材料の基本骨格となる高分子はほとんどの場合、石油系原料から有機合成化学的手法によって得られている。ポリエチレン，ポリエチレンテレフタレート，ポリエステル，ポリスチレン，ポリ塩化ビニル，ポリアクリルアミドなどがその典型的な例である。
【０００４】
一方、近年、生物工学的手法によって高分子化合物を製造する研究が活発に行われてきており、また、一部で実用化されている。例えば、微生物由来の高分子化合物として、ポリ−３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸（以下、ＰＨＢと略す場合もある）や３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸と３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸との共重合体（以下、ＰＨＢ／Ｖと略す場合もある）等のポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと略す場合がある）、バクテリアセルロースやプルラン等の多糖類、ポリ−γ−グルタミン酸やポリリジン等のポリアミノ酸などが知られている。特にＰＨＡは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品に利用することができるうえ、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【０００５】
これまで、多くの微生物がＰＨＡを生産し菌体内に蓄積することが報告されてきた。例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス・Ｈ１６株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｕｓ　Ｈ１６、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．１７６９９）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）の微生物によるＰＨＢ／Ｖの生産が報告されている（特開平５−７４４９２号公報、特公平６−１５６０４号公報、特公平７−１４３５２号公報、特公平８−１９２２７号公報など）。
【０００６】
また、コマモナス・アシドボランス・ＩＦＯ　１３８５２株（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ　ＩＦＯ　１３８５２）が、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸と４−ヒドロキシ−ｎ−酪酸とをモノマーユニットに持つＰＨＡを生産することが開示されている（特開平９−１９１８９３号公報）。さらに、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ）により、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸との共重合体を生産することが開示されている（特開平５−９３０４９号公報、特開平７−２６５０６５号公報）。
【０００７】
これらＰＨＢやＰＨＢ／Ｖの生合成は、種々の炭素源から、生体内の様々な代謝経路を経て生成された（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素がＰＨＢ合成酵素である。なお、ＣｏＡとは補酵素Ａ（ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ）の略称であり、その化学構造は下記化学式の通りである。
【０００８】
【化１】
2004016133.tif 000003
【０００９】
また、近年、炭素数が３から１２程度までの中鎖長（ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ）の３−ヒドロキシアルカン酸ユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート（中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート、以下、ｍｃｌ−ＰＨＡと略す場合がある）についての研究が精力的に行われている。
【００１０】
例えば、特許公報第２６４２９３７号では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ　２９３４７株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ　ＡＴＣＣ　２９３４７）に非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から１２までの３−ヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットを有するＰＨＡが生産されることが開示されている。
【００１１】
また、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８，７４６（１９９２）には、シュードモナス・レジノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）が、オクタン酸を単一炭素源として、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸，３−ヒドロキシヘキサン酸，３−ヒドロキシオクタン酸，３−ヒドロキシデカン酸をモノマーユニットとするＰＨＡを生産し、また、ヘキサン酸を単一炭素源として、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸，３−ヒドロキシヘキサン酸，３−ヒドロキシオクタン酸，３−ヒドロキシデカン酸をユニットとするＰＨＡを生産することが報告されている。ここで、原料の脂肪酸よりも鎖長の長い３−ヒドロキシアルカン酸モノマーユニットの導入は、後述の脂肪酸合成経路を経由していると考えられる。
【００１２】
Ｉｎｔ．ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１６（３），１１９（１９９４）には、シュードモナスｓｐ．６１−３株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ　６１−３）が、グルコン酸ナトリウムを単一炭素源として、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸，３−ヒドロキシヘキサン酸，３−ヒドロキシオクタン酸，３−ヒドロキシデカン酸，３−ヒドロキシドデカン酸といった３−ヒドロキシアルカン酸、および、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−デセン酸，３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸といった３−ヒドロキシアルケン酸をユニットとするＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１３】
上記のＰＨＡは側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ（以下、ｕｓｕａｌ−ＰＨＡと略す場合がある）である。しかし、より広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基（例えば、フェニル基，不飽和炭化水素，エステル基，アリル基，シアノ基，ハロゲン化炭化水素，エポキシドなどなど）を側鎖に導入したＰＨＡ（以下、ｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡと略す場合がある）が極めて有用である。
【００１４】
フェニル基を有するｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの生合成の例としては、例えば、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２４，５２５６−５２６０（１９９１），Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９１，１９５７−１９６５（１９９０），Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ，３，４９２−４９４（１９９１）などで、シュードモナス・オレオボランスが、５−フェニル吉草酸から、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。
【００１５】
また、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２９，１７６２−１７６６（１９９６）で、シュードモナス・オレオボランスが、５−（４−トリル）吉草酸（５−（４−メチルフェニル）吉草酸）から、３−ヒドロキシ−５−（４−トリル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。さらに、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３２，２８８９−２８９５（１９９９）には、シュードモナス・オレオボランスが、５−（２，４−ジニトロフェニル）吉草酸から、３−ヒドロキシ−５−（２，４−ジニトロフェニル）吉草酸ユニットおよび３−ヒドロキシ−５−（４−ニトロフェニル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。
【００１６】
また、フェノキシ基を有するｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの例としては、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９５，１６６５−１６７２（１９９４）で、シュードモナス・オレオボランスが、１１−フェノキシウンデカン酸から３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットおよび３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。
【００１７】
また、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２９，３４３２−３４３５（１９９６）には、シュードモナス・オレオボランスが、６−フェノキシヘキサン酸から３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸ユニットおよび３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡを、８−フェノキシオクタン酸から３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸ユニット，３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸ユニットおよび３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸ユニットを含むＰＨＡを、１１−フェノキシウンデカン酸から３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットおよび３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸ユニットを含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００１８】
さらに、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１，３２−４３（１９９５）では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ　２９３４７株及びシュードモナス・プチダ・ＫＴ　２４４２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ　２４４２）が、ｐ−シアノフェノキシヘキサン酸またはｐ−ニトロフェノキシヘキサン酸から、３−ヒドロキシ−ｐ−シアノフェノキシヘキサン酸ユニットまたは３−ヒドロキシ−ｐ−ニトロフェノキシヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告している。
【００１９】
特許第２９８９１７５号公報には、３−ヒドロキシ−５−（モノフルオロフェノキシ）吉草酸ユニットあるいは３−ヒドロキシ−５−（ジフルオロフェノキシ）吉草酸ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３−ヒドロキシ−５−（モノフルオロフェノキシ）ペンタノエートユニットあるいは３−ヒドロキシ−５−（ジフルオロフェノキシ）ペンタノエートユニットを含有するコポリマーとその製造方法が記載されており、その効果として、融点が高く良好な加工性を保ちつつ、立体規則性、撥水性を付与することができるとしている。
【００２０】
また、シクロヘキシル基を有するｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの例としては、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３０，１６１１−１６１５（１９９７）に、シュードモナス・オレオボランスが、シクロヘキシル酪酸またはシクロヘキシル吉草酸から該ＰＨＡを生産するとの報告がある。
【００２１】
これらｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの生合成は、原料となる各種アルカン酸から、生体内の様々な代謝経路（例えば、β酸化系や脂肪酸合成経路）を経て生成された（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素がｍｃｌ−ＰＨＡ合成酵素である。以下に、β酸化系およびｍｃｌ−ＰＨＡ合成酵素による重合反応を経て、アルカン酸がＰＨＡとなるまでの反応を示す。
【００２２】
【化２】
2004016133.tif 000004
【００２３】
一方、脂肪酸合成経路を経る場合は、該経路中に生じた（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ（ＡＣＰとはアシルキャリアプロテインのことである）から変換された（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを基質として、同様にｍｃｌ−ＰＨＡ合成酵素によりＰＨＡが合成されると考えられる。
【００２４】
近年、上記のＰＨＢ合成酵素やｍｃｌ−ＰＨＡ合成酵素といったＰＨＡ合成酵素を菌体外に取り出して、無細胞系（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でＰＨＡを合成しようとする試みが始まっている。
【００２５】
例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６２７９−６２８３（１９９５）では、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）由来のＰＨＢ合成酵素に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットからなるＰＨＢのグラニュール（微粒子）を合成することに成功している。また、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２５，５５−６０（１９９９）では、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡや３−ヒドロキシバレリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットや３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸ユニットからなるＰＨＡの合成に成功している。さらにこの報告では、ラセミ体の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させたところ、酵素の立体選択性によって、Ｒ体の３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットのみからなるＰＨＢが合成されたとしている。Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍｕｎ．，２１，７７−８４（２０００）においても、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素を用いた細胞外でのＰＨＢグラニュールの合成が報告されている。
【００２６】
また、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６８，３１９−３２４（１９９８）では、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ　ｖｉｎｏｓｕｍ）由来のＰＨＢ合成酵素に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。
【００２７】
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４，３７−４３（２０００）では、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のｍｃｌ−ＰＨＡ合成酵素に３−ヒドロキシデカノイルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシデカン酸ユニットからなるＰＨＡのグラニュールを合成している。
【００２８】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、従来より、酵素反応を行う際に、基質の溶解性の向上や酵素の反応性の増大などを目的として、反応液中に界面活性剤を添加して酵素反応を行う手法が、広く一般的に用いられている。ＰＨＢ合成酵素やｍｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を用いたＰＨＡの合成反応においても、界面活性剤を添加することにより、基質の溶解性を向上させ、反応を効率的に進め得ると考えられる。
【００２９】
また、前記したＰＨＡをグラニュールの状態のままで取得しようとする場合、該グラニュールの分散状態をより良好に保持する目的においても、界面活性剤の添加は有効と考えられる。
【００３０】
さらに、ＰＨＡ合成酵素の基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡを合成する方法として、従来、アシルＣｏＡシンセターゼ（Ｅ．Ｃ．６．２．１．３）を用いて３−ヒドロキシアルカン酸をＣｏＡ化する手法が多く用いられているが（例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，４３２−４３９，１９９７、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４，３７−４３，２０００など）、前記反応系においては、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル）等の界面活性剤の添加によって、さらに高い反応効率を得られるとされている。従って、上記反応終了後に該界面活性剤を除去することなしに、該反応の生成物を、界面活性剤が残存したままでＰＨＡ合成酵素の反応に供することができれば、ＰＨＡの合成プロセスを大幅に簡略化することができると考えられる。
【００３１】
しかしながら、ＰＨＡ合成酵素の活性は、一部の界面活性剤により阻害されることが、いくつかの報告によって示されている。例えば、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｅｔｈ．，４１，１−８，２０００では、シュードモナス・オレオボランス・Ｇｐｏ１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ　Ｇｐｏ１）由来のＰＨＡ合成酵素の活性測定を、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｈｅｃａｍｅｇ（６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）または０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート）の存在下で行ったところ、これら界面活性剤が存在しない場合と比較して、それぞれ、９０％、６０％、５０％または　３０％の酵素活性低下が認められたとしている。また、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３４９，５９９−６０４，２０００では、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の存在下で、シュードモナス・プチダ・ＧＰｐ１０４　株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＧＰｐ１０４）由来のＰＨＡ合成酵素の活性が１００％阻害されたと報告されている。
【００３２】
従って、本発明の第一の目的は、界面活性剤中でのＰＨＡ合成酵素活性の安定化方法を提供することにある。本発明の第二の目的は、界面活性剤中での酵素活性が安定化されたＰＨＡ合成酵素及びその製造方法を提供することにある。本発明の第三の目的は、前記のＰＨＡ合成酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてＰＨＡを合成する、ＰＨＡの製造方法を提供することにある。
【００３３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、ＰＨＡ合成酵素とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴと略す場合がある）とを融合させることにより、界面活性剤中でのＰＨＡ合成酵素の活性低下を抑え、該酵素活性を安定化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００３４】
即ち本発明は、ＰＨＡ合成酵素とＧＳＴとを融合させることを特徴とする、界面活性剤中でのＰＨＡ合成酵素活性の安定化方法に関するものである。また、本発明は、ＰＨＡ合成酵素とＧＳＴとを融合させることを特徴とする、界面活性剤中での酵素活性が安定化された修飾ＰＨＡ合成酵素及びその製造方法に関するものである。さらに、本発明は、前記の修飾ＰＨＡ合成酵素により３−ヒドロキシアシルＣｏＡを重合させてＰＨＡを合成することを特徴とする、ＰＨＡの製造方法に関するものである。
【００３５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
【００３６】
＜ＰＨＡ＞
本発明におけるＰＨＡとしては、ＰＨＡの生合成反応に関わるＰＨＡ合成酵素によって合成され得るＰＨＡであれば、特に限定はされない。
【００３７】
前記の通り、ＰＨＡ合成酵素は生物体内でのＰＨＡ合成反応系における最終段階を触媒する酵素である。従って、生物体内において合成され得ることが知られているＰＨＡであれば、いずれも該酵素による触媒作用を受けて合成されていることになる。よって、所望のＰＨＡに対応する３−ヒドロキシアシルＣｏＡを、本発明における修飾ＰＨＡ合成酵素に作用させることによって、生物体内において合成され得ることが知られているあらゆる種類のＰＨＡを合成することが可能である。
【００３８】
このようなＰＨＡとして、具体的には、下記化学式［１］から［１０］で表されるモノマーユニットを少なくとも含むＰＨＡを例示することができる。
【００３９】
【化３】
2004016133.tif 000005
【００４０】
（ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１およびａの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
【００４１】
Ｒ１が水素原子（Ｈ）でありａが０から１０の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１がハロゲン原子でありａが１から１０の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が発色団でありａが１から１０の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が　カルボキシル基あるいはその塩でありａが１から１０の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が、
【００４２】
【化４】
2004016133.tif 000006
【００４３】
でありａが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【００４４】
【化５】
2004016133.tif 000007
【００４５】
（ただし、式中ｂは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００４６】
【化６】
2004016133.tif 000008
【００４７】
（ただし、式中ｃは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００４８】
【化７】
2004016133.tif 000009
【００４９】
（ただし、式中ｄは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５０】
【化８】
2004016133.tif 000010
【００５１】
（ただし、式中ｅは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ３Ｈ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５２】
【化９】
2004016133.tif 000011
【００５３】
（ただし、式中ｆは０から７の整数のいずれかを表す。）
【００５４】
【化１０】
2004016133.tif 000012
【００５５】
（ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表す。）
【００５６】
【化１１】
2004016133.tif 000013
【００５７】
（ただし、式中ｈは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＯＯＲ’，−ＳＯ２Ｒ”，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ３Ｈ７，−ＣＨ（ＣＨ３）２，−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ），Ｎａ，Ｋ，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ”は−ＯＨ，−ＯＮａ，−ＯＫ，ハロゲン原子，−ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００５８】
【化１２】
2004016133.tif 000014
【００５９】
（ただし、式中ｉは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＯＯＲ’，−ＳＯ２Ｒ”からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ），Ｎａ，Ｋ，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ”は−ＯＨ，−ＯＮａ，−ＯＫ，ハロゲン原子，−ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００６０】
【化１３】
2004016133.tif 000015
【００６１】
（ただし、式中ｊは１から９の整数のいずれかを表す。）
なお、前記のハロゲン原子の具体例としては、フッ素，塩素，臭素などを挙げることができる。
【００６２】
また、前記の発色団としては、その３−ヒドロキシアシルＣｏＡ　体がＰＨＡ合成酵素の触媒作用を受け得るものである限り特に限定はされないが、高分子合成時の立体障害などを考慮すると、３−ヒドロキシアシルＣｏＡ分子内において、ＣｏＡの結合したカルボキシル基と発色団との間に炭素数１から５のメチレン鎖があるほうが望ましい。また、発色団の光吸収波長が可視域にあれば着色した構造体が得られ、可視域以外に光吸収波長があっても種々の電子材料として利用することができる。
【００６３】
このような発色団の例として、ニトロソ、ニトロ、アゾ、ジアリールメタン、トリアリールメタン、キサンテン、アクリジン、キノリン、メチン、チアゾール、インダミン、インドフェノール、ラクトン、アミノケトン、ヒドロキシケトン、スチルベン、アジン、オカサジン、チアジン、アントラキノン、フタロシアニン、インジゴイドなどを挙げることができる。
【００６４】
本発明において用いられるＰＨＡとしては上記モノマーユニットを複数含むランダム共重合体やブロック共重合体を用いることも可能であり、各モノマーユニットや含まれる官能基の特性を利用したＰＨＡの物性制御や複数の機能の付与、官能基間の相互作用を利用した新たな機能の発現等が可能となる。
【００６５】
なお、本発明の構造体に用いる、ＰＨＡ合成酵素により合成されるＰＨＡは、一般にＲ体のみから構成されるアイソタクチックなポリマーである。
【００６６】
＜３−ヒドロキシアシルＣｏＡ＞
ＰＨＡの合成基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡは、例えば、酵素を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成法、微生物や植物などの生物体を用いたｉｎ　ｖｉｖｏ合成法、化学合成法等の中から適宜選択した方法で合成して用いることができる。特に、酵素合成法は該基質の合成に一般に用いられている方法であり、市販のアシルＣｏＡシンセターゼを用いた下記反応、
【００６７】
【化１４】
2004016133.tif 000016
【００６８】
を用いた方法などが知られている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，４３２−４３９，１９９７、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４，３７−４３，２０００など）。酵素や生物体を用いた合成工程には、バッチ式の合成方法を用いても良く、また、固定化酵素や固定化細胞を用いて連続生産してもよい。
【００６９】
本発明のＰＨＡ合成酵素の基質として用いる３−ヒドロキシアシルＣｏＡとして、具体的には、下記化学式［１１］から［２０］で表される３−ヒドロキシアシルＣｏＡを例示することができる。
【００７０】
【化１５】
2004016133.tif 000017
【００７１】
（ただし、前記化学式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、式中Ｒ１およびａの組合せが下記のいずれかである群より選択される少なくとも一つであり、かつ、前記化学式［１］で表されるモノマーユニットにおけるＲ１およびａと対応する。
【００７２】
Ｒ１が　水素原子（Ｈ）でありａが０から１０の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が　ハロゲン原子でありａが１から１０の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が　発色団でありａが１から１０の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が　カルボキシル基あるいはその塩でありａが１から１０の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が、
【００７３】
【化１６】
2004016133.tif 000018
【００７４】
でありａが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【００７５】
【化１７】
2004016133.tif 000019
【００７６】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｂは前記化学式［２］で表されるモノマーユニットにおけるｂと対応する０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は前記化学式［２］で表されるモノマーユニットにおけるＲ２と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００７７】
【化１８】
2004016133.tif 000020
【００７８】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｃは前記化学式［３］で表されるモノマーユニットにおけるｃと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は前記化学式［３］で表されるモノマーユニットにおけるＲ３と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００７９】
【化１９】
2004016133.tif 000021
【００８０】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｄは前記化学式［４］で表されるモノマーユニットにおけるｄと対応する０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は前記化学式［４］で表されるモノマーユニットにおけるＲ４と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００８１】
【化２０】
2004016133.tif 000022
【００８２】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｅは前記化学式［５］で表されるモノマーユニットにおけるｅと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は前記化学式［５］で表されるモノマーユニットにおけるＲ５と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ３Ｈ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００８３】
【化２１】
2004016133.tif 000023
【００８４】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｆは前記化学式［６］で表されるモノマーユニットにおけるｆと対応する０から７の整数のいずれかを表す。）
【００８５】
【化２２】
2004016133.tif 000024
【００８６】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｇは前記化学式［７］で表されるモノマーユニットにおけるｇと対応する１から８の整数のいずれかを表す。）
【００８７】
【化２３】
2004016133.tif 000025
【００８８】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｈは前記化学式［８］で表されるモノマーユニットにおけるｈと対応する１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は前記化学式［８］で表されるモノマーユニットにおけるＲ６と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＯＯＲ’，−ＳＯ２Ｒ”，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ３Ｈ７，−ＣＨ（ＣＨ３）２，−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、
ここでＲ’は水素原子（Ｈ），Ｎａ，Ｋ，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ”は−ＯＨ，−ＯＮａ，−ＯＫ，ハロゲン原子，−ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００８９】
【化２４】
2004016133.tif 000026
【００９０】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｉは前記化学式［９］で表されるモノマーユニットにおけるｉと対応する１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は前記化学式［９］で表されるモノマーユニットにおけるＲ７と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＯＯＲ’，−ＳＯ２Ｒ”からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、
ここでＲ’は水素原子（Ｈ），Ｎａ，Ｋ，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ”は−ＯＨ，−ＯＮａ，−ＯＫ，ハロゲン原子，−ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００９１】
【化２５】
2004016133.tif 000027
【００９２】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｊは前記化学式［１０］で表されるモノマーユニットにおけるｊと対応する１から９の整数のいずれかを表す。）
＜ＰＨＡ合成酵素およびその生産菌＞
本発明に用いるＰＨＡ合成酵素は、該酵素を生産する微生物から適宜選択された微生物、あるいは、それら微生物のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体により生産されたものを用いることができる。
【００９３】
ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物としては、例えば、炭素数が３から１２程度までの中鎖長（ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ）の３−ヒドロキシアルカン酸ユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート（中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート、ｍｃｌ−ＰＨＡ）やｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの生産菌を用いることができ、このような微生物として、前述のシュードモナス・オレオボランス，シュードモナス・レジノボランス，シュードモナス属６１−３株，シュードモナス・プチダ・ＫＴ　２４４２株，シュードモナス・アエルギノーサなどのほかに、本発明者らにより分離された、特開２００１−２８８２５６号公報に記載のシュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｐ９１、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７３），シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｃｈｏｒｉｉ　Ｈ４５、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７４），シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｃｈｏｒｉｉ　ＹＮ２、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７５），シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｊｅｓｓｅｎｉｉ　Ｐ１６１、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７６）等のシュードモナス属微生物や、特開２００１−７８７５３号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ３株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．ＯＫ３、ＦＥＲＭ　Ｐ−１７３７０），特開２００１−６９９６８号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．ＯＫ４、ＦＥＲＭ　Ｐ−１７３７１）などのバークホルデリア属微生物を用いることができる。
【００９４】
また、これら微生物に加えて、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．），コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐ．）などに属し、ｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡを生産する微生物を用いることも可能である。
【００９５】
本発明にかかるＰＨＡ合成酵素の生産に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡ合成酵素の生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地（肉汁培地，酵母エキスなど）や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【００９６】
培養は液体培養や固体培養等、該微生物が増殖する方法であればいかなる方法をも用いることができる。さらに、バッチ培養，フェドバッチ培養，半連続培養，連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【００９７】
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば１４℃から４０℃、好ましくは２０℃から３５℃程度が適当である。
【００９８】
（修飾ＰＨＡ合成酵素の生産）
ＧＳＴが融合した修飾ＰＨＡ合成酵素は、前述のＰＨＡ生産菌の持つＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体を用いて生産することが可能である。ＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング、発現ベクターの作製、および、形質転換体の作製は、定法に従って行うことができる。
【００９９】
大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体においては、培養に用いる培地として、天然培地あるいは合成培地、例えば、ＬＢ培地，Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は２５℃から３７℃の範囲で、好気的に８時間から２７時間培養することにより、微生物の増殖を図る。その後集菌し、菌体内に蓄積された修飾ＰＨＡ合成酵素の回収を行うことができる。
【０１００】
培地には、必要に応じて、カナマイシン，アンピシリン，テトラサイクリン，クロラムフェニコール，ストレプトマイシン等の抗生物質を添加しても良い。また、発現ベクターにおいて、誘導性のプロモーターを用いている場合は、形質転換体を培養する際に、該プロモーターの対応する誘導物質を培地に添加して発現を促しても良い。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ），テトラサイクリン，インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等が誘導物質として挙げられる。
【０１０１】
修飾ＰＨＡ合成酵素は、微生物の菌体破砕液や、硫酸アンモニウム等によりタンパク質成分を沈殿・回収した硫安塩析物などの粗酵素として用いても良く、また、各種方法で精製した精製酵素として用いても良い。該酵素には必要に応じて、金属塩，グリセリン，ジチオスレイトール，ＥＤＴＡ，ウシ血清アルブミンなどの安定化剤，付活剤を適宜添加して用いることができる。
【０１０２】
ＰＨＡ合成酵素の分離・精製方法は、ＰＨＡ合成酵素の酵素活性が保持される方法であればいかなる方法をも用いることができる。例えば、得られた微生物菌体を、フレンチプレス，超音波破砕機，リゾチームや各種界面活性剤等を用いて破砕したのち、遠心分離して得られた粗酵素液、またはここから調製した硫安塩析物について、アフィニティクロマトグラフィー，陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー，ゲル濾過等の手段を単独または適宜組み合わせることによって精製酵素を得ることができる。
【０１０３】
特に、本発明の修飾酵素は、Ｎ末端やＣ末端にＧＳＴの「タグ」を結合した融合タンパク質であるので、このタグを介してＧＳＴ親和性レジンに結合させることによって、より簡便に精製することができる。
【０１０４】
無論、ＧＳＴ以外のタグを用いることもでき、例えば、アフィニティクロマトグラフィーによる精製を可能とする融合タンパク質としては、ヒスチジン，キチン結合ドメイン，マルトース結合タンパク，あるいはチオレドキシン等が公知である。これらの融合タンパク質から目的のタンパク質を分離するには、トロンビン，血液凝固因子Ｘａ等のプロテアーゼで切断する、ｐＨを低下せしめる、結合競合剤として高濃度のイミダゾールを添加する等の方法を用いると良い。あるいは、発現ベクターとしてｐＴＹＢ１（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ　Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いた場合のようにタグがインテインを含む場合はｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌなどで還元条件として切断する。
【０１０５】
ＰＨＡ合成酵素の活性測定は、既報の各種方法を用いることができるが、例えば、３−ヒドロキシアシルＣｏＡがＰＨＡ合成酵素の触媒作用により重合してＰＨＡになる過程で放出されるＣｏＡを、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）で発色させて測定することを測定原理とする、以下に示す方法によって測定することができる。
【０１０６】
試薬１：ウシ血清アルブミンを０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に３．０ｍｇ／ｍＬ溶解、
試薬２：３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に３．０ｍｍｏｌ／Ｌ溶解、
試薬３：トリクロロ酢酸を０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に１０ｍｇ／ｍＬ溶解、
試薬４：５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に２．０ｍｍｏｌ／Ｌ溶解。
【０１０７】
第１反応（ＰＨＡ合成反応）：試料（酵素）溶液１００μＬに試薬１を１００μＬ添加して混合し、３０℃で１分間プレインキュベートする。ここに、試薬２を１００μＬ添加して混合し、３０℃で１〜１２０分間インキュベートしたのち、試薬３を添加して反応を停止させる。
【０１０８】
第２反応（遊離ＣｏＡの発色反応）：反応停止した第１反応液を遠心分離（１４７，０００ｍ／ｓ２（１５，０００Ｇ）、１０分間）し、この上清５５０μＬに試薬４を５５０μＬ添加し、３０℃で３〜１０分間インキュベートしたのち、４１２ｎｍの吸光度を測定する。酵素活性の算出：１分間に１μｍｏｌのＣｏＡを放出させる酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【０１０９】
＜ＰＨＡの製造＞
前記のＰＨＡ合成酵素は所望のＰＨＡの原料となる３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む水系反応液中に投入され、ＰＨＡが合成される。上記水系反応液は、ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る条件に調整された反応系として構成されるべきであり、例えば通常、ｐＨ５．５〜９．０、好ましくはｐＨ７．０〜８．５となるよう、緩衝液により調整する。ただし、使用するＰＨＡ合成酵素の至適ｐＨやｐＨ安定性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。
【０１１０】
緩衝液の種類は、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば、設定するｐＨ領域等に応じて適宜選択して用いることができるが、例えば、一般の生化学反応に用いられる緩衝液、具体的には、酢酸バッファー，リン酸バッファー，リン酸カリウムバッファー，３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルフォン酸（ＭＯＰＳ）バッファー，Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸（ＴＡＰＳ）バッファー，トリス塩酸バッファー，グリシンバッファー，２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（ＣＨＥＳ）バッファーなどを用いると良い。
【０１１１】
緩衝液の濃度も、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば特に限定はされないが、通常５．０ｍｍｏｌ／Ｌから１．０ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１ｍｏｌ／Ｌから０．２ｍｏｌ／Ｌの濃度のものを使用すると良い。反応温度は、使用するＰＨＡ合成酵素の特性に応じて適宜設定するものであるが、通常、４℃から５０℃、好ましくは　２０℃から　４０℃に設定すると良い。ただし、使用するＰＨＡ合成酵素の至適温度や耐熱性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。
【０１１２】
本発明のＰＨＡ合成酵素は界面活性剤中での安定性が改善されているため、必要に応じて、界面活性剤を反応系中に添加して用いることができる。
【０１１３】
界面活性剤の例としては、オレイン酸ナトリウム，ドデシルスルホン酸ナトリウム，ドデシル硫酸ナトリウム，ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム，コール酸ナトリウム，デオキシコール酸ナトリウム，タウロデオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド，ドデシルピリジニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤、３−〔（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ），３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ），パルミトイルリゾレシチン，ドデシル−β−アラニン等の両性イオン界面活性剤、オクチルグルコシド，オクチルチオグルコシド，ヘプチルチオグルコシド，デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０），ポリオキシエチレンドデシルエーテル（Ｂｒｉｊ、Ｌｕｂｒｏｌ），ポリオキシエチレン−ｉ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ），ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｎ），ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（Ｓｐａｎ），ポリオキシエチレンソリビトールエステル（Ｔｗｅｅｎ）等の非イオン界面活性剤等を挙げることができる。
【０１１４】
添加できる界面活性剤の濃度は、該界面活性剤と本発明のＰＨＡ合成酵素との関係において規定されるものであるが、例えば、前記したＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の場合は、反応液中濃度として０％（ｖ／ｖ）から１％（ｖ／ｖ）、好ましくは０％（ｖ／ｖ）から０．３％（ｖ／ｖ）の範囲内で添加することができる。
【０１１５】
酵素反応時間は、使用するＰＨＡ合成酵素の安定性等にもよるが、通常、１分間から　２４時間、好ましくは　３０分間から３時間の範囲内で適宜選択して設定する。反応液中の３−ヒドロキシアシルＣｏＡ濃度は、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る範囲内で適宜設定するものであるが、通常、０．１ｍｍｏｌ／Ｌから１．０ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌから０．２ｍｏｌ／Ｌの範囲内で設定すると良い。なお、反応液中における３−ヒドロキシアシルＣｏＡ濃度が高い場合、一般に、反応系のｐＨが低下する傾向にあるため、３−ヒドロキシアシルＣｏＡ濃度を高く設定する場合は、前記の緩衝液濃度も高めに設定することが好ましい。
【０１１６】
なお、本発明の、界面活性剤中でのＰＨＡ合成酵素活性の安定化方法、界面活性剤中での酵素活性が安定化された修飾ＰＨＡ合成酵素及びその製造方法、前記のＰＨＡ合成酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてＰＨＡを合成するＰＨＡの製造方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は本発明の最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。なお、以下における「％」は特に標記した以外は重量基準である。
【０１１８】
（実施例１）　　修飾ＰＨＡ合成酵素の生産
ＹＮ２株を１００ｍＬのＬＢ培地（１％ポリペプトン（日本製薬社製）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で　３０℃、一晩培養後、マーマーらの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全分解した。
【０１１９】
ベクターにはｐＵＣ１８を使用し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。末端の脱リン酸処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，１，５７２，１９８９、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）ののち、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造社製）を用いて、ベクターの切断部位（クローニングサイト）と染色体ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ完全分解断片とを連結した。この染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドベクターを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株を形質転換し、ＹＮ２株のＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１２０】
次に、ＹＮ２株のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を選択するため、コロニー・ハイブリダイズ用のプローブ調製を行った。配列番号：１および配列番号：２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し（アマシャムファルマシア・バイオテク社）、このオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅されてきたＤＮＡ断片をプローブとして用いた。プローブの標識化は、市販の標識酵素系ＡｌｋＰｈｏｓＤｉｒｅｃｔ（アマシャムファルマシア・バイオテク社製）を利用して行った。
【０１２１】
得られた標識化プローブを用いて、ＹＮ２株の染色体ＤＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション法によってＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを有する大腸菌菌株を選抜した。選抜した菌株から、アルカリ法によってプラスミドを回収することで、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。
【０１２２】
ここで取得した遺伝子ＤＮＡ断片を、不和合性グループであるＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ、あるいはＩｎｃＷの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターｐＢＢＲ　１２２（Ｍｏ　Ｂｉ　Ｔｅｃ）に組み換えた。この組み換えプラスミドをシュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株（ＰＨＡ合成能欠損株）にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、ＹＮ２ｍｌ株のＰＨＡ合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子ＤＮＡ断片は、シュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株内において、ＰＨＡ合成酵素に翻訳可能な、ＰＨＡ合成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。
【０１２３】
このＤＮＡ断片について、サンガー法により塩基配列を決定した。その結果、決定された塩基配列中には、ペプチド鎖をコードする、配列番号：３で示される塩基配列が存在することが確認された。このＰＨＡ合成酵素遺伝子について、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。
【０１２４】
即ち、配列番号：３で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー（配列番号：４）および下流側プライマー（配列番号：５）を合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク社）。
【０１２５】
これらのプライマーを用いて、配列番号：３で示される塩基配列それぞれについてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造社製）。次に、得られたＰＣＲ増幅断片および発現ベクターｐＴｒｃ　９９Ａを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、脱リン酸化処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，１，５７２，１９８９、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）したのち、この発現ベクターｐＴｒｃ　９９Ａの切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造社製）を用いて連結した。
【０１２６】
得られた組換えプラスミドで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１：宝酒造社製）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドを回収した。この組換えプラスミドで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１ｆＢ　：　ｆａｄＢ欠損株）を塩化カルシウム法により形質転換し、組換えプラスミドを保持する組換え大腸菌株を得た。
【０１２７】
前記の組換えプラスミドに対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：６）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：７）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク社）。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、前記の組換えプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造社製）。
【０１２８】
精製したＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシア・バイオテク社製）の対応する部位に挿入した。これらのベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで処理して得られるＤＮＡ断片により行った。
【０１２９】
得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍＬを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加（終濃度　１ｍｍｏｌ／Ｌ）し、３７℃で４から１２時間培養を続けた。
【０１３０】
ＩＰＴＧ誘導した大腸菌を集菌（７８，０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、２分、４℃）し、１／１０量の　４℃　リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；８ｇ　ＮａＣｌ，１．４４ｇ　Ｎａ２ＨＰＯ４，０．２４ｇ　ＫＨ２ＰＯ４，０．２ｇ　ＫＣｌ，１，０００ｍＬ精製水）に再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心（７８，０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。
【０１３１】
目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂ（アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で精製した。使用するグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（７８，０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、１分、４℃）した後、４％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。
【０１３２】
前処理したグルタチオンセファロース４０μＬを、無細胞抽出液１ｍＬに添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質をグルタチオンセファロースに吸着させた。吸着後、遠心（７８，０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、１分、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌグルタチオン　４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心（７８，０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、２分、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質（即ち、ＧＳＴが融合したＰＨＡ合成酵素）を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを確認した。
【０１３３】
（比較例１）　　非修飾ＰＨＡ合成酵素の生産
ＹＮ２株を１００ｍＬのＬＢ培地（１％ポリペプトン（日本製薬社製）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で３０℃、一晩培養後、マーマーらの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全分解した。
【０１３４】
ベクターにはｐＵＣ１８を使用し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。末端の脱リン酸処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，１，５７２，１９８９、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）ののち、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造社製）を用いて、ベクターの切断部位（クローニングサイト）と染色体ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ完全分解断片とを連結した。この染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドベクターを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株を形質転換し、ＹＮ２株のＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１３５】
次に、ＹＮ２株のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を選択するため、コロニー・ハイブリダイズ用のプローブ調製を行った。配列番号：１および配列番号：２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し（アマシャムファルマシア・バイオテク社）、このオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅されてきたＤＮＡ断片をプローブとして用いた。プローブの標識化は、市販の標識酵素系ＡｌｋＰｈｏｓＤｉｒｅｃｔ（アマシャムファルマシア・バイオテク社製）を利用して行った。
【０１３６】
得られた標識化プローブを用いて、ＹＮ２株の染色体ＤＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション法によってＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを有する大腸菌菌株を選抜した。選抜した菌株から、アルカリ法によってプラスミドを回収することで、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。
【０１３７】
ここで取得した遺伝子ＤＮＡ断片を、不和合性グループであるＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ、あるいはＩｎｃＷの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターｐＢＢＲ　１２２（Ｍｏ　Ｂｉ　Ｔｅｃ）に組み換えた。この組み換えプラスミドをシュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株（ＰＨＡ合成能欠損株）にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、ＹＮ２ｍｌ株のＰＨＡ合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子ＤＮＡ断片は、シュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株内において、ＰＨＡ合成酵素に翻訳可能な、ＰＨＡ合成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。
【０１３８】
このＤＮＡ断片について、サンガー法により塩基配列を決定した。その結果、決定された塩基配列中には、ペプチド鎖をコードする、配列番号：３で示される塩基配列が存在することが確認された。このＰＨＡ合成酵素遺伝子について、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。
【０１３９】
即ち、配列番号：３で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー（配列番号：４）および下流側プライマー（配列番号：５）を合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク社）。
【０１４０】
これらのプライマーを用いて、配列番号：３で示される塩基配列それぞれについてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造社製）。次に、得られたＰＣＲ増幅断片および発現ベクターｐＴｒｃ　９９Ａを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、脱リン酸化処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，１，５７２，１９８９、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）したのち、この発現ベクターｐＴｒｃ　９９Ａの切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造社製）を用いて連結した。
【０１４１】
得られた組換えプラスミドで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１：宝酒造社製）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドを回収した。この組換えプラスミドで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１ｆＢ：ｆａｄＢ欠損株）を塩化カルシウム法により形質転換し、組換えプラスミドを保持する組換え大腸菌株を得た。
【０１４２】
前記の組換えプラスミドに対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：６）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：７）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク社）。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、前記の組換えプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造社製）。
【０１４３】
精製したＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシア・バイオテク社製）の対応する部位に挿入した。これらのベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで処理して得られるＤＮＡ断片により行った。
【０１４４】
得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍＬを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加（終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌ）し、３７℃で４から１２時間培養を続けた。
【０１４５】
ＩＰＴＧ誘導した大腸菌を集菌（７８，０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、２分、４℃）し、１／１０　量の　４℃　リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；８ｇ　ＮａＣｌ，１．４４ｇ　Ｎａ２ＨＰＯ４，０．２４ｇ　ＫＨ２ＰＯ４，０．２ｇ　ＫＣｌ，１，０００ｍＬ精製水）に再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心（７８，０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。
【０１４６】
目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂ（アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で精製した。使用するグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（７８，０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、１分、４℃）した後、４％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。
【０１４７】
前処理したグルタチオンセファロース４０μＬを、無細胞抽出液１ｍＬに添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質をグルタチオンセファロースに吸着させた。
【０１４８】
吸着後、遠心（７８，０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、１分、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌグルタチオン４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心（７８，０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、２分、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを確認した。
【０１４９】
前記の融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク社製、５Ｕ）で消化し、融合タンパク質中のＰＨＡ合成酵素をＧＳＴから切り離した後、グルタチオンセファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴとを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ　２００カラムにかけ、発現タンパク質の最終精製物（即ち、ＧＳＴが融合していないＰＨＡ合成酵素）を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそれぞれ６０．８ｋＤａ、および６１．５ｋＤａのシングルバンドを確認した。
【０１５０】
（実施例２）　　界面活性剤の影響の評価
ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）を所定濃度のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（キシダ化学社製）を含む０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に３．０ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解して試薬１とした。３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に３．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう溶解して試薬２とした。トリクロロ酢酸を０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に１０ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解して試薬３とした。５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に２．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう溶解して試薬４とした。
【０１５１】
実施例１または比較例１の酵素の溶液１００μＬに試薬１を１００μＬ添加して混合し、３０℃で１分間プレインキュベートした。ここに、試薬２を１００μＬ添加して混合し、３０℃で　３０分間および６０分間インキュベートした。この時点での反応液中のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の濃度を、のちの結果に示す「Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００終濃度」とした。試薬３を添加して反応を停止させたのち、第１反応液を遠心分離（１４７，０００ｍ／ｓ２（１５，０００Ｇ）、１０分間）した。この上清５５０μＬに試薬４を５５０μＬ添加し、３０℃で１０分間インキュベートしたのち、４１２ｎｍの吸光度を測定した。
【０１５２】
３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを含まない試薬２を用いて、上記と同様に測定した結果をブランクとして、前記の測定値から差引いた。ＰＨＡ酵素活性は前記反応時間　３０分間から６０分間の間の吸光度変化より算出した。
【０１５３】
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００終濃度を０％、０．０１％、０．０３％、０．１％および０．３％に調製し、それぞれの酵素活性を調べた結果、図１に示す通り、実施例１の修飾ＰＨＡ合成酵素は界面活性剤中での酵素活性の安定性が改善されていることがわかった。
【０１５４】
【発明の効果】
本発明により、界面活性剤中でのポリヒドロキシアルカノエート合成酵素活性の安定化方法が提供される。また、本発明により、界面活性剤中での酵素活性が安定化された修飾ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素及びその製造方法、及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエートの製造方法が提供される。
【０１５５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２の界面活性剤の影響の評価結果を示す図。
【図１】
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