(57)【要約】【課題】環境汚染物質を植物体中に蓄積するという特性を付与しうる核酸分子および当該核酸分子を含む環境修復用トランスジェニック植物体を提供する【解決手段】環境汚染物質に対して結合能を有するオリゴまたはポリペプチドおよびアポプラズマ輸送シグナルを含むポリペプチドをコードする核酸分子を構築し、これを用いてトランスジェニック植物を作成する。【選択図】　　　　図７
2004016130.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境汚染物質結合領域およびアポプラズマ輸送シグナルを含むポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２】
環境汚染物質がカドミウム、コバルト、ニッケル、銅、鉛、亜鉛、水銀、クロム、ヒ素、マンガン、鉄、セレン、スズ、アンチモンからなる群から選択される１種または２種以上である請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
環境汚染物質結合領域が、
（ａ）メタロチオネイン、フェリチン、トランスフェリン、ポリヒスチジン、ニッケリン（Ｎｉｃｋｅｌｉｎ）、ファイトキレーチン（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎ）、Ｚα４人工ペプチド、ほ乳類プラズマ金属輸送タンパク質およびこれらの金属結合性フラグメントから選択されるポリもしくはオリゴペプチド、または
（ｂ）（ａ）のポリもしくはオリゴペプチドのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、且つ金属に対して結合能を有するポリもしくはオリゴペプチド
からなる請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】
アポプラズマ輸送シグナルが、
（ａ）植物由来のインベルターゼのシグナルペプチド、アニオンペルオキシダーゼのシグナルペプチドもしくはエクステンシンのリーダーペプチド、または
（ｂ）（ａ）のポリもしくはオリゴペプチドのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、且つアポプラズマ領域への輸送能を有するポリもしくはオリゴペプチド
からなる請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項５】
転写調節エレメントに作動的に連結されている請求項１から４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子により形質転換されたトランスジェニック植物細胞。
【請求項７】
請求項６に記載のトランスジェニック植物細胞から得られる植物、その部分並びにその繁殖体および子孫。
【請求項８】
請求項５に記載の核酸分子を用いて形質転換することを特徴とする環境修復用植物の作成方法。
【請求項９】
請求項７に記載の植物を用いて、土壌中の環境汚染物質を除去することを特徴とする環境修復方法。
【請求項１０】
遺伝子操作によりアポプラズマ領域に金属結合性タンパク質またはペプチドを発現させることにより、植物体に金属を蓄積し、且つ当該金属に対する耐性を付与する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環境修復用植物の作成に有用な核酸分子および当該分子を用いて作成された環境修復用植物に関する。詳細には、重金属などの環境汚染物質結合領域およびアポプラズマ輸送シグナルを含むポリペプチドをコードする核酸分子、当該分子で形質転換したトランスジェニック植物およびその子孫に関する。本発明はまた、環境修復用植物を用いる環境修復方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自然生態系の保全や健康影響への関心の高まりから、産業や生活に伴う様々な場面における環境汚染物質の排出・蓄積の動向が注視されている。このうち、重金属類などの元素自体が有する毒性による弊害については鉱工業からの排出だけが念頭におかれ、最も古いタイプの環境汚染として過去のものと思われがちである。しかしながら、鉱工業の廃水処理だけをみても、中南米や中国等では旧来型のいわゆる「公害問題」として現在の重大な問題となっている。日本においてもカドミウムによるコメの汚染など過去に多くの例があるが、そのうち有機水銀を含む廃水で河川や内海が汚染された水俣問題などは、発生から４０年余を経た現在でも尾を引いている（Ｆｕｔａｔｓｕｋａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｒｅｓ．　８３，　ｐｐ．　８３−９２，　２０００）。また、新たに都市部の汚水処理施設からの汚泥、幹線道路沿いの粉塵による汚染土壌において重金属類の蓄積が問題となっている（Ｇｌａｓｓ，　１９７９；　Ａｙｒｅｓ，　１９９７；　Ｗｅｓｔｅｒｈｏｌｍ　ａｎｄ　Ｅｇｅｂａｃｋ，　１９９４）。さらに、天然の土壌中にヒ素やセレン、ホウ素など特定の元素が多量に含まれる地域では、これら元素による飲料水への浸出、農作物の汚染、あるいは野生動物への影響などが問題になっている　（Ａｕｂｅｒｔ　ａｎｄＰｉｎｔａ，　Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｓｏｉｌｓ．　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ｐｐ．５−１１，　１９７７）。
【０００３】
これに対して、近年、広範囲に拡散した比較的低濃度の様々な汚染物質を、長期間にわたり低コストで穏やかに処理できる新しい技術として「ファイトリメディエーション＝植物による環境修復」が注目されている。しかしながら、理論的にはハイパーアキュームレーターと呼ばれる数種類の既存の植物を用いて重金属の吸収・除去が可能であると考えられているが、実用化には様々な汚染物質に対する適用植物種の拡大、処理能力の向上が必要であることが示されている（吉原ら，「植物による環境修復（１）−現状と遺伝子工学の適用に関する調査−」、電力中央研究所報告，Ｕ０００２２，２０００年）。食用・観賞用の植物を育種してきたようにファイトリメディエーション用植物の開発が期待されている。その際、従来の育種法では困難な全く別の形質を付与しうる遺伝子組換え技術が有効であることは言うまでもない。
【０００４】
一方、本発明者らは、これまで地域振興につながる新しい作物を作るという観点から、鉄を貯蔵するタンパク質「フェリチン」を利用して、高鉄含量レタスやイネを作出してきた（吉原と羽生、「植物形質転換技術の開発動向に関する調査］，電力中央研究所報告，Ｕ９１０４４，１９９１年；吉原ら，「鉄貯蔵タンパク質フェリチン遺伝子の導入によるイネ種子中の鉄含有量の向上」，電力中央研究所報告、Ｕ９７０４２，１９９７年）。これらは、生体内において鉄の入れ物となる「フェリチン」を過剰に発現させると、ホメオスタシス効果により鉄の吸収が増加することを利用したもので、結果として形質転換植物の鉄含有量を増加させられることを初めて実験的に明らかにしたものである。この技術において、フェリチンを他の有害重金属を特異的に蓄積するタンパク質に置換することによってリメディエーション（環境修復）用の植物（重金属を蓄積する植物）を作出しうると考えられた（Ｙｏｓｈｉｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｒｅｃｅｎｔ　Ｒｅｓ．　Ｄｅｖｅｌ．　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ．　Ｉ，　ｐｐ．１６３−１８１，　２００１）。しかし、鉄とは異なり多くの有害重金属は植物にとっての必須元素ではないため、これらを積極的に植物体内に吸収しようとする機構は存在しない。このため、必須元素である鉄を蓄積するフェリチンと同様の考え方で、非必須元素の入れ物を細胞質内に産生させても、植物体中の蓄積量は期待された程ではない。実際、非必須元素であるカドミウムの生体内での入れ物として、カドミウム結合タンパク質（メタロチオネイン）を単純に細胞内に過剰発現させた場合、カドミウムに対する耐性の向上は認められるもののカドミウムの蓄積量は向上せず、むしろ減少する例も報告されている（Ｅｌｍａｙａｎ　ａｎｄ　Ｔｅｐｆｅｒ，　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　６，　ｐｐ．　４３３−４４０，　１９９４）。このため、種々の汚染物質について十分な量を蓄積しうる植物体の開発が求められている。
【０００５】
【本発明が解決すべき課題】
従って、本発明の課題は、環境汚染物質を植物体中に蓄積するという特性を付与しうる核酸分子および当該核酸分子を含む環境修復用トランスジェニック植物体を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、重金属などの環境汚染物質が細胞内に流入する前に捕捉することが植物体における当該物質の蓄積および耐性の付与に有効と考え、植物細胞に特有の空隙として知られる細胞膜と細胞壁の間の空隙（アポプラズマ領域）の利用を図った。そして、遺伝子組換え技術を用いて環境汚染物質と結合しうるタンパク質またはポリペプチドを植物体のアポプラズマ領域に発現させることにより、環境汚染物質を効率的に蓄積することができるばかりでなく、当該物質に対して耐性を有する植物体が得られることを見出した。
【０００７】
従って、本発明は、環境汚染物質結合領域およびアポプラズマ輸送シグナル（トランジットペプチド）を含むポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【０００８】
本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドは、例えばカドミウム、コバルト、ニッケル、銅、鉛、亜鉛、水銀、クロム、ヒ素、マンガン、鉄、セレン、スズおよび／またはアンチモン等の環境汚染物質となる重金属に対して結合能を有する。これらの物質と結合しうるタンパク質、オリゴまたはポリペプチドは複数知られており、これらは全て本発明において用いることができる。その例としては、（ａ）メタロチオネイン、フェリチン、トランスフェリン、ポリヒスチジン、ニッケリン（Ｎｉｃｋｅｌｉｎ）、ファイトキレーチン（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎ）、Ｚα４人工ペプチド、ヒトを含むほ乳類プラズマタンパク質およびこれらの金属結合性フラグメントからなるポリもしくはオリゴペプチドを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。また、これらのポリもしくはオリゴペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているポリもしくはオリゴペプチド、具体的にはアミノ酸配列について少なくとも６０％、好ましくは８０％のホモロジーを有し、且つ当該金属に対して結合能を有するポリもしくはオリゴペプチドもまた本発明において有用である。これらのホモロジー値は、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等を用いて決定することができる。故に、遺伝子データベース（ＧｅｎＢａｎｋ，　ＥＭＢＬ，　ＤＤＢＪなど）において前記ホモロジー値を有するものとして検索されるポリもしくはオリゴペプチドもまた、本発明における環境汚染物質結合性のポリまたはオリゴペプチドとして有用であり得る。さらに、金属と直接結合する特定のアミノ酸の配列およびこれらの配列を特定の距離に保つスペーサーのアミノ酸の配列を有するポリもしくはオリゴペプチドもまた本発明において有用である。
【０００９】
また、核酸分子によりコードされるポリペプチドは、アポプラズマ輸送シグナル（トランジットペプチド）を有する。トランジットペプチドは、植物細胞内で産生された後、これを含むタンパク質またはポリペプチドをアポプラズマ領域に輸送する機能を有するものである。このトランジットペプチドもまた複数知られており、これらは全て本発明において用いることができる。その例としては、植物由来のインベルターゼのシグナルペプチド、アニオンペルオキシダーゼのシグナルペプチド、エクステンシンのリーダーペプチドなどを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。また、これらのポリもしくはオリゴペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているポリもしくはオリゴペプチド、具体的にはアミノ酸配列について少なくとも６０％、好ましくは８０％のホモロジーを有し、且つアポプラズマ領域への輸送能を有するポリもしくはオリゴペプチドもまた本発明において有用である。これらのホモロジー値は、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等を用いて決定することができる。故に、遺伝子データベース（ＧｅｎＢａｎｋ，　ＥＭＢＬ，　ＤＤＢＪなど）において前記ホモロジー値を有するものとして検索されるポリもしくはオリゴペプチドもまた、本発明におけるトランジットペプチドとして有用であり得る。
【００１０】
故に、本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドは、（ａ）前述の環境汚染物質と結合しうる、および（ｂ）アポプラズマ領域に輸送されるという特性を有する。このため、本発明の核酸分子を含む組換え発現ベクターにより形質転換され、コードされるポリペプチドを発現しうる植物体は、高い蓄積量にて環境汚染物質を蓄積することができる。
【００１１】
本発明はまた、転写調節エレメントに作動的に連結された前記核酸分子に関する。本発明の核酸分子を細胞内で発現させるために、適する転写調節エレメントに作動的に連結する必要がある。また、本発明の核酸分子を植物細胞内に導入するために適するベクターに組込む必要がある。発現ベクターに導入するのが好ましい。このため、本発明の核酸分子を適する発現ベクターに組込むのが好ましい。
【００１２】
故に、本発明は、前記核酸分子を含み、且つ転写調節エレメントに作動的に連結されている組換え発現ベクターに関する。さらに、本発明は、当該組換え発現ベクターを用いて植物細胞を形質転換してトランスジェニック植物細胞を得て、場合により植物体まで再生させることからなる、トランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物の作成方法に関する。また、当該方法により得られる本発明の核酸分子を発現しうるトランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物細胞から得られる植物体、その部分並びにその繁殖体および子孫に関する。さらに、本発明は、遺伝子操作によりアポプラズマ領域に金属結合性タンパク質またはペプチドを発現させることにより、植物体に金属を蓄積し、且つ当該金属に対する耐性を付与する方法に関する。この方法における遺伝子操作は、例えば本願発明の核酸分子を用いてトランスフェクションまたは形質転換させることからなる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
汚染物質結合領域：
除去すべき環境汚染物質と結合しうるタンパク質、オリゴまたはポリペプチドの例としてメタロチオネイン、フェリチン、ポリヒスチジン、ニッケリン（Ｎｉｃｋｅｌｉｎ）、フィテート（Ｐｈｙｔａｔｅ）もしくはフィチン（Ｐｈｙｔｉｎ）、ファイトキレーチン（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎ）もしくはそのアナログペプチド、Ｚα４人工ペプチド、ヒトを含むほ乳類プラズマ金属輸送タンパク質などが含まれる。
【００１４】
▲１▼メタロチオネイン
メタロチオネインは脊椎動物、ウニなどの棘皮動物、貝などの軟体動物、昆虫などの甲殻類、植物、細菌などの多くの生物種に存在し、約６０アミノ酸のうち１／３がシステインであるサイズの小さなタンパク質である。メタロチオネインには、大きくタイプＩ、タイプＩＩに分類されるが、各タイプには多くのサブタイプ（例えばＩＡ〜Ｍなど、ＩＩＡ、ＩＩＢなど）が知られている。メタロチオネインが結合する重金属にはカドミウム、亜鉛、銅、水銀、金、銀が含まれるが、その結合にはシステイン単位（例えばＣ−Ｘ−Ｃ、Ｃ−Ｘ２−Ｃ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１］、Ｃ−Ｃ−Ｘ−Ｃ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２］、Ｃ−Ｃ−Ｘ−Ｃ−Ｃ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３］など）が関与している。さらに、重金属に対して結合能を有するメタロチオネイン様タンパク質も知られており、これらも含めて全てのメタロチオネインおよびその金属結合性フラグメントが本発明において用いることができる。
【００１５】
▲２▼フェリチン、トランスフェリン
フェリチン（アポフェリチン）は、分子量約４５０，０００の水溶性タンパク質であり、１分子当たり約２５００個の３価の鉄と結合しうる。また、トランスフェリンは分子量が約７５，０００のタンパク質であり、フェリチンと同様に鉄と結合しうる。このため、フェリチン、トランスフェリンおよびその金属結合性フラグメントが本発明において用いることができる。
▲３▼ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ）
ヒスチジンが少なくとも６〜１２残基のみからなるペプチド、またヒスチジン（少なくとも６〜１２残基）と他の任意のアミノ酸数残基を含むペプチドである。このようなペプチドは、ニッケルと結合しうる（Ｃ．　Ｓｏｕｓａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　１４，　ｐｐ．１０１７−１０２０，　１９９６）。
【００１６】
▲４▼ニッケリン（Ｎｉｃｋｅｌｉｎ）
ポリヒスチジンと同様に、ヒスチジン数残基とグリシン、アスパラギン酸などの他のアミノ酸数残基を含み、ニッケルと結合しうるペプチドである（Ｊ．　Ｗ．　Ｏｌｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒ．　Ｊ．　Ｍａｉｅｒ，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１８２，　ｐｐ．１７０２−１７０５，　２０００）。そのアミノ酸配列として、例えばＨＨＨＨｇＨｄＨＨＨＨｅＨ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　４］が挙げられる。
▲５▼銅結合プリオン
銅結合プリオンは、銅の代謝において重要な役割を果たしている。銅結合プリオンは、ヒスチジンおよびグリシンを中心とした数残基のペプチド単位ＰＨＧＧＧＷＧＱ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　５］を有しており、これを介して銅と結合することが報告されている（Ｊ．　Ｈ．　Ｖｉｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　９６，　ｐｐ．　２０４２−２０４７，　１９９９）。本発明においては、（ＰＨＧＧＧＷＧＱ）１〜ｎ、例えばＰＨＧＧＧＷＧＱまたは（ＰＨＧＧＧＷＧＱ）４を用いることができる。
【００１７】
▲６▼フィトキレーチン（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎ）およびそのアナログ
フィトキレーチンおよびそのアナログ、例えばフィイトキレーチンに基づいて作成した人工ペプチドは、カドミウム、鉛などを結合することができる。特に、人工ペプチドは、グルタミン酸、システイン、グリシンからなるペプチド　（ＥＣ）ｎＧ、例えば（ＥＣ）２Ｇ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　６］からなる（Ｗ．　Ｂａｅ　ａｎｄ　Ｒ．　Ｋ．　Ｍｅｂｒａ，　Ｊ．　Ｉｎｏｒｇ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　６８，　ｐｐ．　２０１−２１０，　１９９７）。
▲７▼Ｚα４人工ペプチド
システインおよびヒスチジンを中心とした４残基のペプチド（Ｃ−Ｃ−Ｈ−Ｈ）を有するへリックスループへリックス構造の人工ペプチドであり、カドミウム、コバルト、亜鉛などと結合しうる（Ｍ．　Ｋｌｅｍｂａ　ａｎｄ　Ｌ．　Ｒｅｇａｎ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　３４，　ｐｐ．　１００９４−１０１００，　１９９５）。
【００１８】
▲８▼ほ乳類プラズマ金属輸送タンパク質
ほ乳類プラズマ金属輸送タンパク質は複数知られているが、特にその金属結合性フラグメントを本発明において用いることができる。そのフラグメントは、グリシンおよびヒスチジンを中心とした数残基、例えばＧＨＨＰＧＧ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　７］、ＧＨＨＰＧＧＨＨＰＧＧ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　８］またはＧＨＨＰＧＧＨＨＰＧＧＨＨＰＧＧ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　９］からなり、銅、亜鉛などに対して結合性を有する（Ｔ．　Ｗ．　Ｈｕｔｃｈｅｎｓ　ａｎｄ　Ｔａｉ−Ｔｕｎｇ　Ｙｉｐ，　Ｊ．　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　６０４，　ｐｐ．　１３３−１４１，　１９９２）。
【００１９】
アポプラズマ輸送シグナル（トランジットペプチド）：
また、核酸分子によりコードされるポリペプチドは、インベルターゼのシグナルペプチド、アニオンペルオキシダーゼのシグナルペプチド、エクステンシンのリーダーペプチドなどのアポプラズマ輸送シグナルペプチド含む。トランジットペプチドは、植物細胞内で産生された後、これを含むタンパク質またはポリペプチドをアポプラズマ領域に輸送する機能を有するものである。このトランジットペプチドもまた複数知られており、これらは全て本発明において用いることができる。
【００２０】
▲１▼インベルターゼのシグナルペプチド
インベルターゼは、ショ糖などの二糖類を単糖に転化する酵素であり、植物由来のものとしてはブドウ糖末端から分解するグルコシダーゼ、果糖末端から分解するフラノシダーゼなどが含まれる。これら植物由来のインベルターゼは、シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシなど多く高等植物において見出されており、これらに含まれるシグナル配列は、本発明の目的においていずれも用いることができる。例えば、タバコ由来のシグナル配列は、ＭＫＮＬＩＦＬＴＭＦＬＴＩＬＬＱＴＮＡ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１０］からなる。
【００２１】
▲２▼エクステンシンのリーダーペプチド
エクステンシンは、植物の細胞壁を構成するタンパク質成分の１つであり、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、ニンジンなど多くの植物種において見出されている。例えばニンジンのエクステンシンのリーダーペプチドは３２アミノ酸残基：ＭＧＲＩＡＲＧＳＫＭＳＳＬＩＶＳＬＬＶＶＬＶＳＬＮＬＡＳＥＴＴＡ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１１］からなる。また、エクステンシン様タンパク質も複数報告されており、これら全てのリーダーペプチドを本発明の目的に使用することができる。
【００２２】
▲３▼アニオンペルオキシダーゼのシグナルペプチド
植物由来のアニオンペルオキシダーゼは、ズッキーニ、西洋ワサビなどの植物種で見出されており、例えばズッキーニ由来のアニオンペルオキシダーゼのシグナルペプチドペプチドは、１６アミノ酸残基：ＭＡＬＬＦＦＬＡＬＬＦＧＡＳＹＡ［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１２］からなる（Ｓ．　Ｃａｒｐｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１２０，　ｐｐ．　７９９−８１０，　１９９９）。
【００２３】
▲４▼α−グルコシダーゼのシグナルペプチド
植物由来のα−グリコシダーゼは、シロイヌナズナやブロッコリーなど種々の植物において複数種（例えばＡｇｌｕ−１［アクセッションナンバー：Ｔ０４３３３］，Ａｇｌｕ−２［アクセッションナンバー：Ｗ４３８９２］，Ａｇｌｕ−３［アクセッションナンバー：Ｔ１４１１７］など）報告されている（Ｊ．　Ｄ．　Ｍｏｎｒｏｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１１９，　ｐｐ．　３８５−３９７，　１９９９）。これらのα−グルコシダーゼのシグナルペプチドは、本発明の目的に使用することができる。
【００２４】
発現調節エレメント：
本発明の核酸分子を発現させるための発現調節エレメント（プロモーター／エンハンサー）として、植物細胞において本発明の遺伝子を発現しうる任意のもの、例えばアグロバクテリウムまたはリゾビウムのような植物細胞内で発現する遺伝子を含む、植物、植物ウイルス、細菌由来のプロモーターを用いることができる。そのようなプロモーターの例には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ由来のプロモーター、Ｓｍａｓプロモーター、桂皮アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、Ｎｏｓプロモーター、リブロース二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）プロモーター、ＧＲＰ１−８プロモーター、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、植物由来のアクチンやヒストン等のプロモーター／エンハンサーおよび公知である種々の植物遺伝子からのその他の転写開始領域が包含される。例えば、植物由来のプロモーター／エンハンサーを適宜選択することにより、本発明の核酸分子を植物全体、または特定の器官（例えば、葉、根など）において発現させることができる。
【００２５】
また、本発明の遺伝子を効率よく発現させるために、遺伝子のコード領域のポリヌクレオチドコーディング領域の３′末端にポリ（Ａ）＋配列を包含させるのが好ましい。ポリ（Ａ）＋配列は、種々の植物遺伝子またはＴ−ＤＮＡ由来のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、所望の遺伝子を高レベルにて発現させるのに有用な他の配列、例えば特定の遺伝子のイントロン配列、５′不翻訳領域の配列などを本願発明の組換え発現ベクターに包含させることができる。
【００２６】
発現ベクター：
本発明の組換え発現ベクターは、選択マーカー遺伝子として種々の抗生物質耐性遺伝子や他のマーカー遺伝子をコードする配列を包含させるのが好ましい。マーカー遺伝子の例には、抗スペクチノマイシン遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子（ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）遺伝子）、カナマイシンまたはジェネティシン耐性のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシン耐性のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）を阻害する除草剤に対する耐性遺伝子、グルタミン合成酵素を阻害する除草剤に対する耐性遺伝子（例えばｂａｒ　遺伝子）、β−グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等が包含される。
【００２７】
また、高等植物の遺伝子発現に有用な代表的なベクターは当該技術分野においてよく知られており、　Ｒｏｇｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１５３：　ｐｐ．２５３−２７７　（１９８７）に記載されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミド由来のベクターなどのベクターＤＮＡの一部を植物細胞に導入した際に宿主植物のゲノムに組込みうるベクター、例えばＴｉプラスミド由来のｐＫＹＬＸ６、ｐＫＹＬＸ７、ｐＢＩ１０１、ｐＢＨ２１１３、ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ）およびこれらから当該技術分野における標準的技術を用いて誘導し得る組換えプラスミドが含まれる。
【００２８】
トランスフェクション：
本発明の組換え発現ベクターは、外来性遺伝子を植物細胞に導入するための公知の方法、例えばパーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、リポフェクション法およびアグロバクテリウム法などの微生物媒介トランスフェクション法を用いて所望の植物細胞に導入することができる。植物細胞においては、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法およびアグロバクテリウム法が好ましく、アグロバクテリウム法が特に好ましい（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ　Ｎ．　＆　Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ　Ｇ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　８２，　ｐｐ．２５９−２６６，　１９９８）。
【００２９】
また、上述のように植物に導入された本発明の核酸分子は、宿主の植物細胞のゲノムに組み込まれ、後の世代まで安定的に保持される。故に、本発明は、上記トランスジェニック植物細胞から再生される植物体、その部分並びにその繁殖体（例えば種子や無性生殖体）および子孫を包含する。
【００３０】
上述のように本発明の核酸分子または組換え発現ベクターを用いて作成されたトランスジェニック植物は、重金属などの環境汚染物質を細胞内に積極的にを取り込む機構がなくても、そのような物質を効率的に蓄積させることが可能となり、植物体全体として蓄積量を増加させられることができる。環境汚染物質をアポプラズマ領域に蓄積するために、そのような物質に対して耐性を有する。このため、本発明の核酸分子を含まない植物と比較して、植物の発芽・生長について環境汚染物質の影響を受けないか、顕著に低減されている。このため、本発明の環境修復用植物は、土壌中に環境汚染物質が高濃度に存在してもその生長においてその影響を受けることが少ないため、その環境修復に非常に有用である。
【００３１】
なお、本明細書にて使用する用語「植物」は、植物全体、植物器官（例えば葉、幹、根など）、種子および植物細胞およびその子孫を包含する。また、「植物細胞」は種子懸濁培養物、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉および根由来の細胞、並びに配偶体（胚、花粉）およびその前駆体細胞が包含される。本発明の方法で使用され得る植物は、一般に形質転換技術に従う高度な植物と同じように広く、単子葉および双子葉植物の両方を含む。
【００３２】
本発明を下記の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
【実施例】
実施例１　フェリチン遺伝子およびアポプラズマ輸送シグナル遺伝子（ＴＰ）からなる融合遺伝子の構築と発現解析
（１）融合遺伝子の構築
フェリチンタンパク質がアポプラズマ領域に輸送されるように、フェリチン遺伝子（後藤と吉原、Ｕ９５０３５）の翻訳開始点下流から１４４ｂｐまでのＤＮＡ配列を除き、Ｇｒｅｉｎｅｒら（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１１６，　ｐｐ．　７３３−７４２，　１９８８）の示す配列を元に合成したタバコ由来のインベルターゼ遺伝子のＴＰ部分（ｉｎｈ−ｔｐ；５７ｂｐ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１３）を接続した。具体的には、タバコインベルターゼ遺伝子のＴＰ部分のＤＮＡ配列は、タバコ葉より抽出したｔＲＮＡと、既知の塩基配列（Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１１６，　ｐｐ．　７３３−７４２，　１９９８）からデザインしたオリゴヌクレオチド（前方プライマー［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１４］），後方プライマー［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１５］）を用いて合成した（図１）。次いで、フュージョンＰＣＲ法（Ｙｏｎ　ａｎｄ　Ｆｒｉｅｄ，　Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　１７，　ｐｐ．　４８９５，　１９８９）を用いて、ｉｎｈ−ｔｐとフェリチン遺伝子を連結した（図２）。
【００３４】
得られた融合遺伝子の塩基配列をシーケンサー（ＡＢＩ３１０，アプライド　バイオシステムズ社製）を用いて確認した後、融合遺伝子が植物体全体で発現されるように発現プラスミドｐＢＩ１２１中でカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５ｐ）とノパリンシンテターゼターミネーター（ｐＡｎｏｓ）との間に挿入して、発現プラスミドｐＢＩ１２１／ＩＮＨ−Ｆｅｒを構築した（図２）。なお、このプラスミドベクターには、組換え体の選択のために、ノパリンシンテターゼプロモーター（ＮＯＳｐ）、およびｐＡｎｏｓによって制御されるカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴ　ＩＩ）がコードされている（図２）。
【００３５】
（２）融合遺伝子のタバコへの導入と発現の確認
（１）にて構築したフェリチン遺伝子を含む発現プラスミドｐＢＩ１２１／ＩＮＨ−Ｆｅｒは、エレクトロポレーション法によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）ＬＢＡ４４０４株に導入した。さらに、融合遺伝子を導入したアグロバクテリウムは、定法に従ってタバコのリーフディスクに感染させて、タバコへ導入した（吉原と後藤，「有用植物作出に関する検討−イネ種子貯蔵タンパク質グルテリン遺伝子における発現制御領域の解析−」，電力中央研究所報告，Ｕ９４０２８，１９９４年）。次いで、カナマイシン耐性により遺伝子導入体を選択した後、バーミキュライトや黒土、腐葉土などからなる人工培土をつめた１万分の１ａワグネルポットにおいて２８℃、１６時間明期の条件で栽培し、Ｔ１（形質転換第２世代）の種子を得た。これらのＴ１世代の形質転換系統について、ノーザンハイブリダイゼーション法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，　＆　Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，　ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ．　ｐｐ１２．３−１２．４４，　１９８９年）により、導入した融合遺伝子の発現を解析した。なお、プローブとしてプラスミドプラスミドｐＢＩ１２１／ＩＮＨ−ＦｅｒをテンプレートとしたＰＣＲ法によってＤＩＧ（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）でラベルした（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ　Ｒｏｃｈｅ　Ｌｔｄ．，　Ｇｅｒｍａｎｙ）ものを用いた。
【００３６】
また、融合遺伝子の発現を確認するため、ウェスタンブロット法を行った。まず、ウェスタンブロット法に先立ち、アポプラズマ領域におけるタンパク質画分を下記の方法により抽出した。具体的には、適当な大きさのタバコ葉から中肋と周縁部を取り除いて５〜８ｍｍ角の細片とし、この細片を緩衝液（０．６ｍＭ　ＣＨＡＰＳ、１５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５）に浸漬し、減圧処理して緩衝液を細胞間隙、即ちアポプラズマ領域に取りこませた。次に、この細片を５００×ｇで１５分間遠心処理して、取り込ませた緩衝液とともにアポプラズマ領域中のタンパク質画分を回収した（Ｒｏｈｒｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｂｏｔ．　３４，　ｐｐ．１５８９−１６０５，　１９８３）。得られたタンパク質画分について、抗フェリチン抗体を用いたウェスタンブロット法（吉原と後藤、Ｕ９７０４２）により融合タンパク質の発現を解析をした。
【００３７】
ウエスタンブロット解析の結果、導入されたフェリチン遺伝子は正常に転写・翻訳されて、かつアポプラズマ領域に輸送されていることが示された（図３Ａ，Ｂ）。ポジティブコントロールに用いた大腸菌で産生されたフェリチンは、トランジットペプチドが切断されずに３２ｋＤａの位置にバンドを示しているが、アポプラズマ領域に輸送されたフェリチンはトランジットペプチドが切断されて、正常なフェリチンと同じ２６．５ｋＤａにバンドを示している（図３Ｂ）。また、各形質転換植物における発現量（ｍＲＮＡ）は、これまでタバコやレタスにおいて観察された場合と同様に一様ではなかった（図３Ａ）。このため、以下の実験については比較的発現量の大きかった系統（ＡＦ２，ＡＦ３，ＡＦ６，ＡＦ７，ＡＦ１０，ＡＦ１３，ＡＦ１４，ＡＦ１６，ＡＦ１７，ＡＦ１９）のうち、特に発現量の高かったＡＦ２，ＡＦ３，ＡＦ７，ＡＦ１３，ＡＦ１７）を用いた。
【００３８】
（３）形質転換系統の発芽率と生育量
（２）で選択された系統について、カナマイシン（１００μＭ）含有ＭＳ寒天培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ，　Ｎａｔｕｒｅ　２７９，　ｐｐ．４０９−４１１，　１９６２）、またはこれに過剰量のＥＤＴＡ鉄（０．５ｍＭまたは１ｍＭ；以下、「鉄」と表記する）を添加した同ＭＳ寒天培地に播種した後、１ヶ月間栽培した。これらの植物体について、発芽率、生育量を測定し、その値を非形質転換系統（ネガティブコントロールとして、本実施例ではｐＢＩ１２１を導入した系統を用いた）と比較した。また、選択用のカナマイシンの影響を除くためと、ある程度生育した植物体を用いることを目的として、カナマイシンによって選択した播種後１ヶ月の幼植物体を、ＭＳ液体培地（通常の組成のものと、過剰な鉄を添加したもの）に浮かべたメンブレンラフト（Ｓｉｇｍａ，　ＵＳＡ）上に移植してさらに１ヶ月間無菌的に栽培し、同様の項目について検討を行った。
【００３９】
播種後１ヶ月における発芽率、生育量を測定の結果、発芽率については、通常の組成のＭＳ培地（鉄濃度０．１ｍＭ）を用いた場合、アポプラズマにおけるフェリチン発現系統（ＡＦ）が６２〜９６％であったのに対して、従来型のフェリチン発現系統（Ｆ）では８３〜１００％、非形質転換系統（ＮＴ）では平均７３％と系統毎にばらつきがあるものの、ほぼ同程度の値を示した（表１）。一方、過剰量の鉄（０．５ｍＭ）を添加したＭＳ培地における発芽率は、それぞれ、１３〜２２％（ＡＦ）、６〜１４％（Ｆ）、１０％（ＮＴ）、また、さらに過剰な１．０ｍＭの鉄を添加したＭＳ培地における発芽率は、それぞれ、０〜１２％（ＡＦ）、０〜７％（Ｆ）、０％（ＮＴ）であった（表１、図４）。カナマイシンによる劣性ホモ系統のスクリーニングの影響を除くために、過剰量の鉄を添加した培地における結果を通常の鉄濃度での結果を分母にとって換算し直すと、０．５ｍＭの場合はそれぞれ、１７〜２６％（ＡＦ）、７〜１５％（Ｆ）、１４％（ＮＴ）、１．０ｍＭの場合はそれぞれ、０〜１４％（ＡＦ）、０〜７％（Ｆ）、０％（ＮＴ）となった（表１）。
【００４０】
また、生育量については、通常の組成のＭＳ培地（鉄濃度０．１ｍＭ）を用いた場合、アポプラズマにおけるフェリチン発現系統（ＡＦ）が７．２〜１２．３ｍｇ（生鮮重−以下同様）であったのに対して、従来型のフェリチン発現系統（Ｆ）では７．４〜１０．５ｍｇ、非形質転換系統（ＮＴ）では９．５ｍｇとフェリチン導入系統において生育量がやや増加する傾向が示された（表２）。これらの傾向は、過剰量の０．５ｍＭの鉄を添加したＭＳ培地において生育させた場合に、より顕著となり、それぞれ、９．２〜１４．２ｍｇ（ＡＦ）、８．９〜１３．４ｍｇ（Ｆ）、７．１ｍｇ（ＮＴ）であった。このとき、ＮＴの平均値に対する有意差（Ｐ＜０．０５）を求めると、ほとんどのフェリチン遺伝子導入系統において生育量が有意に増加していることが示された。一方、さらに過剰な１．０ｍＭの鉄を添加したＭＳ培地における生育量は、非形質転換系統（ＮＴ）では発芽しなかったためデータが得られず、フェリチン遺伝子導入系統においても４．２〜７．４ｍｇ（ＡＦ）、５．２ｍｇ（Ｆ）と、通常の鉄濃度や５倍量の鉄濃度で生育させた場合に比べ相当に少なかった（表２）。
さらに、播種後１ヶ月目の幼植物体を無菌的な水耕条件下（通常の組成のＭＳ培地＝鉄濃度０．１ｍＭを使用）に移して生育させた場合について、地上部と根部にわけて生育量の調査を行った（表３）。その結果、地上部生鮮重がそれぞれ、０．６０４〜０．７１４ｇ（ＡＦ）、０．５７９〜０．６６２ｇ（Ｆ）、０．４０９ｇ（ＮＴ）、根部生鮮重がそれぞれ、０．０３４〜０．０４０ｇ（ＡＦ）、０．０２９〜０．０３３ｇ（Ｆ）、０．０２８ｇ（ＮＴ）と、先の播種後１ヶ月の結果と同様に、フェリチン遺伝子導入系統において有意に大きかった。
【００４１】
【表１】
2004016130.tif 000003
【００４２】
【表２】
2004016130.tif 000004
【００４３】
【表３】
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【００４４】
（４）金属元素濃度の測定
（３）の発芽率と生育量を測定すると同時に、以下の方法に従ってＩＣＰによる測定によって植物体中の鉄の含有量を測定し、その値を非形質転換系統（ネガティブコントロールとして、本実施例ではｐＢＩ１２１を導入した系統を用いた）と比較した。
形質転換系統の植物体から得られた葉、根、または植物全体を６５℃／３昼夜以上乾燥して、乾燥重量を測定後、湿式灰化を行った（吉原ら、Ｕ９７０４２）。蒸発乾固後、沈殿に１５ｍＬの１Ｎ塩酸を加えて溶解し、全量を試料液とした。
金属元素濃度（Ｆｅ）の測定は、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｐｌａｓｍａ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，　Ｐ４０００，　Ｈｉｔａｃｈｉ，　Ｊａｐａｎ）を用いて行った（吉原ら、Ｕ９７０４２）。なお、元素濃度の測定では、播種後１ヶ月の植物体を用いた試験においては、系統毎に起源を異にする十数個体を１グループとして３グループについて平均値を求めた。また、無菌的水耕栽培により生育させた植物体を用いた試験においては、系統毎に起源を異にする８個体について平均値を求めた。求めた各形質転換系統における平均値は、対照区である非形質転換系統の平均値と、個々の分散が等しくない場合を想定したｔ検定法によって有意差を検定した。
【００４５】
その結果、通常の組成のＭＳ培地（鉄濃度０．１ｍＭ）において生育させた場合、それぞれ２５１〜８１４μｇ−Ｆｅ／ｇ乾重（ＡＦ）、３９０〜４４２μｇ−Ｆｅ／ｇ乾重（Ｆ）、３２０μｇ−Ｆｅ／ｇ乾重（ＮＴ）と、系統毎にばらつきがあるものの、フェリチン導入系統（ＡＦ、およびＦ）において高い値を示す傾向が認められた（表４）。これに対し、過剰量の０．５ｍＭの鉄を添加したＭＳ培地において生育させた場合には、それぞれ１９９〜５４３μｇ−Ｆｅ／ｇ乾重（ＡＦ）、４０２〜４３９μｇ−Ｆｅ／ｇ乾重（Ｆ）、４５２μｇ−Ｆｅ／ｇ乾重（ＮＴ）と、フェリチン遺伝子導入系統と非形質転換系統との間に有意な差は認められなかった。
【００４６】
一方、播種後１ヶ月目の幼植物体を無菌的な水耕条件下（通常の組成のＭＳ培地＝鉄濃度０．１ｍＭを使用）に移してさらに１ヶ月生育させた場合について、地上部と根部に分けて鉄含有量の測定を行ったところ、地上部においては、それぞれ、９４〜１２２μｇ−Ｆｅ／ｇ乾重（ＡＦ）、１１７〜１４０μｇ−Ｆｅ／ｇ乾重（Ｆ）、５０μｇ−Ｆｅ／ｇ乾重（ＮＴ）と、フェリチン導入系統において有意に高い値を示した（表５）。なお、アポプラズマにおける発現系統（ＡＦ）よりも従来型のフェリチン発現系統の方が、やや高い鉄含有量を示す傾向があったが、統計的な有意差は認められなかった。これに対し、根部においては、それぞれ、３４０〜４２６μｇ−Ｆｅ／ｇ乾重（ＡＦ）、２０５〜３０６μｇ−Ｆｅ／ｇ乾重（Ｆ）、４０３μｇ−Ｆｅ／ｇ乾重（ＮＴ）と、いずれの系統間にも有意な差は認められなかった。
【００４７】
【表４】
2004016130.tif 000006
【００４８】
【表５】
2004016130.tif 000007
【００４９】
実施例２　メタロチオネイン遺伝子およびアポプラズマ輸送シグナル遺伝子（ＴＰ）からなる融合遺伝子の構築と発現解析
（１）融合遺伝子の構築
実施例１−（１）と同様にオリゴヌクレオチド（前方プライマー［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１６］），後方プライマー［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１７］）を用いて合成したタバコインベルターゼ遺伝子のＴＰ部分のＤＮＡ配列（ｉｎｈ−ＴＰ）を合成した（図５）。また、Ｐａｎら（Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２４２，　ｐｐ．　６６６−６７４，　１９９４）とＬｉら（Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，　１６，　ｐｐ．　２１１−２１９，　２０００）に示されるメタロチオネイン遺伝子のＤＮＡ配列情報を元に、カドミウム元素を結合するαドメイン（３４アミノ酸残基　［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１９］）をコードするＤＮＡ配列（連結用制限酵素部位を含め、合計１１２ｂｐ［ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１８］）を合成した（ｈＭＴ；図６）。次いで、タバコインベルターゼ遺伝子のＴＰ部分のＤＮＡ配列（ｉｎｈ−ＴＰ、および接続用制限酵素サイト＋終結コドン；合計８１ｂｐ）とメタロチオネインαドメインのＤＮＡ配列を連結した（ｉｎｈ−ｈＭＴ；図７）。この連結にはｆｕｓｉｏｎ−ＰＣＲ法は用いず、ＴＰ部分を合成する際に挿入しておいた制限酵素サイト（ＢａｍＨＩ）に同酵素サイトを持つ断片として通常のリガーゼ（ＤＮＡ−ｌｉｇａｓｅ）による方法を用いて連結した。次いで、実施例１−（１）と同様にｐＢＩ１２１中に挿入し、発現プラスミドｐＢＩ１２１／ＩＮＨ−ｈＭＴを構築した（図７）。
【００５０】
（２）融合遺伝子のタバコへの導入と発現の確認
メタロチオネイン遺伝子を含むプラスミドｐＢＩ１２１／ＩＮＨ−ｈＭＴを、実施例１−（２）と同様にしてタバコへ導入し、カナマイシン耐性により遺伝子導入植物体を選抜して栽培し、Ｔ１（形質転換第２世代）の種子を得た。これらのＴ１世代の形質転換系統を用いて、メタロチオネイン遺伝子の発現について、ノーザンハイブリダイゼーション法によって解析を行った。なお、プローブは、ｐＢＩ１２１／ＩＮＨ−ｈＭＴをテンプレートにＰＣＲ法によってＤＩＧでラベルしたものを用いた。
【００５１】
また、アポプラズマ領域におけるタンパク質画分は、実施例１−（２）と同様に抽出し、抗メタロチオネイン抗体を用いたウェスタン部ロット法（吉原と後藤、Ｕ９７０４２）により、アポプラズマ領域におけるタンパク質の発現を解析した。
その結果、導入されたメタロチオネイン遺伝子が転写されていることが示された（図８）。しかし、各形質転換系統における発現量は、フェリチン遺伝子と同様にばらつきが観察された。このため、以下の実験については比較的発現量の大きかった系統（ｈＭＴ３，ｈＭＴ５，ｈＭＴ６，ｈＭＴ７，ｈＭＴ８，ｈＭＴ９，ｈＭＴ１１）のうち特に発現量の高いｈＭＴ５，ｈＭＴ７，ｈＭＴ１１を用いた。
【００５２】
（３）形質転換系統の発芽率と生育量
（２）で選択された系統について、カナマイシン（１００μＭ）含有ＭＳ寒天培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ，　Ｎａｔｕｒｅ　２７９，　ｐｐ．４０９−４１１，　１９６２）、またはこれに過剰量の硫酸カドミウム（１０μＭ〜２００μＭ；以下、「カドミウム」と表記する）を添加した同ＭＳ寒天培地に播種し、実施例１−（３）と同様に発芽率と生育量を測定した。
【００５３】
その結果、発芽率については、カドミウムを含まない通常の組成のＭＳ培地を用いた場合、メタロチオネイン発現系統（ｈＭＴ）においても、非形質転換系統（ＮＴ）においても系統毎にばらつきがあるものの、ほぼ同程度の値を示した（表６）。また、カドミウムを添加した培地（０〜２００μＭ）における発芽率についても、培地のカドミウム濃度や形質転換の有無に関わらず、どの系統においてもそれぞれのカドミウムを添加しない培地における結果とほぼ同程度の値であった。カドミウムを添加した培地における結果に対して、通常のＭＳ培地（カドミウム０μＭ）における結果を１００として換算し直したところ（ただし、１００を超える値については、便宜的に１００として示した）、非形質転換系統を含むほぼ全ての系統において１００となっており、発芽率がこのレベルでのカドミウムの添加にほとんど影響を受けていないことがより鮮明に示された（表６）。
【００５４】
一方、生育量については、通常の組成のＭＳ培地を用いた場合、メタロチオネイン発現系統（ｈＭＴ）が１２．８〜２２．０ｍｇ（生鮮重／１個体−以下同様）であったのに対して、非形質転換系統（ＮＴ）では１０．０ｍｇと形質転換系統の方が有意に大きかった（表７）。この傾向は、培地に２０〜２００μＭのカドミウムを添加した培地において生育させた場合にも同様であった（２０μＭ−Ｃｄのとき、１１．７〜２８．３ｍｇ（ｈＭＴ）と８．７ｍｇ（ＮＴ）；５０μＭ−Ｃｄのとき、１１．７〜２８．１ｍｇ（ｈＭＴ）と１２．０ｍｇ（ＮＴ）；１００μＭ−Ｃｄのとき、１１．４〜１９．０ｍｇ（ｈＭＴ）と１１．１ｍｇ（ＮＴ）；２００μＭ−Ｃｄのとき、１０．４〜１８．１ｍｇ（ｈＭＴ）と９．３ｍｇ（ＮＴ））。また、系統毎にカドミウム添加の生育量に及ぼす影響を比較すると、カドミウム添加量が増すと生育が劣り、黄変がひどくなる傾向が認められた（図９）。この傾向は、特に形質転換系統において顕著で、カドミウム添加量が増すと非形質転換系統とメタロチオネイン発現系統の差が縮まった。
【００５５】
無菌的な水耕条件下（０〜２００μＭのカドミウムを添加したＭＳ液体培地）に移してさらに１ヶ月生育させた場合についても地上部と根部にわけて生育量の調査を行った。この結果、培地に添加したカドミウムが低濃度の場合（０〜２０μＭ）には、先の播種後１ヶ月目の結果と同様に、特に地上部においてメタロチオネイン遺伝子導入系統の方が有意に大きかったが、添加したカドミウムが高濃度の場合（５０〜２００μＭ）にはその差は縮小し、有意差はなくなった（表８）。
【００５６】
【表６】
2004016130.tif 000008
【００５７】
【表７】
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【００５８】
【表８】
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【００５９】
（４）金属元素濃度の測定
（３）の発芽率と生育量を測定すると同時に、実施例１−（４）の方法に従ってＩＣＰによる測定によって植物体中のカドミウム（Ｃｄ）の含有量を測定し、その値を非形質転換系統（ネガティブコントロールとして、本実施例ではｐＢＩ１２１を導入した系統を用いた）と比較した。
【００６０】
その結果、カドミウム形質転換の有無に関わりなく、培地中のカドミウム添加濃度（０〜２００μＭ）に依存的して植物体に取り込まれるカドミウム量も増加する蛍光が観察された。このとき、メタロチオネイン遺伝子導入系統の方が非形質転換系統よりもカドミウム含有量が高かった。これらの差は、最大で約２倍程度（培地のカドミウム濃度が２０μＭのとき１．０〜１．７倍；５０μＭのとき０．９〜１．５倍；１００μＭのとき１．１〜１．７倍；２００μＭのとき１．３〜２．３倍）であり、統計的に有意な差を示していた（表９）。
【００６１】
【表９】
2004016130.tif 000011
【００６２】
また、無菌的な水耕条件下（ＭＳ培地に０〜５０μＭの濃度でカドミウムを添加）でも同様に、形質転換の有無に関わりなく、培地カドミウム添加濃度に依存して植物体に取り込まれるカドミウム量も増加した。このとき、いずれの培地中のカドミウム濃度においても、地上部、根部ともにメタロチオネイン遺伝子導入系統（ｈＭＴ）の方が非形質転換系統（ＮＴ）よりも有意にカドミウム含有量が高かった。具体的には、地上部におけるこれらの差は、培地中のカドミウム濃度が１０μＭのときには２．２倍、同２０μＭのときには１．６倍、同５０μＭのときには１．４倍であった。また、根部におけるこれらの差は、培地中のカドミウム濃度が１０μＭのときには、２．５倍、同２０μＭのときには２．３倍、同５０μＭのときには１．９倍であった。さらに興味深いことに、形質転換系統においては、根におけるカドミウムの蓄積量が多い系統（例：ｈＭＴ５）ほど、地上部におけるカドミウムの蓄積量が少ない傾向が認められた（図１０）。
【００６３】
【発明の効果】
本発明によれば、環境修復用植物の作成に有用な核酸分子および当該分子を用いて作成された環境修復用植物が提供される。また、前記環境修復用植物を用いることからなる環境修復方法が提供される。本発明のトランスジェニック植物は、重金属などの環境汚染物質を細胞内に積極的にを取り込む機構がなくても、そのような物質を効率的に蓄積させることができる。即ち、特定の品種に限られない。また、環境汚染物質をアポプラズマ領域に蓄積するために、そのような物質に対して耐性を有しているため、植物の発芽・生長について環境汚染物質の影響を受けないか、顕著に低減されている。このため、本発明の環境修復用植物は、土壌中に環境汚染物質を含む環境の修復に非常に有用である。さらに、本発明によれば、遺伝子操作によりアポプラズマ領域に金属結合性タンパク質またはペプチドを発現させることにより、植物体に金属を蓄積し、且つ当該金属に対する耐性を付与する方法が提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＮＨ−Ｆｅｒ作成用のインベルターゼ遺伝子のＴＰ部分（ＩＮＨ−ＴＰ）の合成を説明する図である。
【図２】フュージョンＰＣＲ法によるフェリチン遺伝子およびアポプラズマ輸送シグナル遺伝子（ＴＰ）を含む発現プラスミドｐＢＩ１２１／ＩＮＨ−Ｆｅｒの構築を概略的に説明する図である。
【図３】ＩＮＨ−ｆｅｒ融合遺伝子の発現を示す図であり、Ａはノーザンハイブリダイゼーション法による遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）の検出、Ｂはウエスタンブロット法によるアポプラズマ領域における融合タンパク質の検出を示す。
【図４】ＩＮＨ−ｆｅｒ融合遺伝子導入系統（ＡＦ）、従来型フェリチン導入系統（Ｆ）および非形質転換系統（ＮＴ）の発芽率の比較を示す図である。
【図５】ＩＮＨ−ｈＭＴ作成用のインベルターゼ遺伝子のＴＰ部分（ＩＮＨ−ＴＰ）の合成を説明する図である。
【図６】メタロチオネインのαドメインをコードするＤＮＡ配列の合成を説明する図である。
【図７】メタロチオネイン遺伝子およびアポプラズマ輸送シグナル遺伝子（ＴＰ）を含む発現プラスミドｐＢＩ１２１／ＩＮＨ−ｈＭＴの構築を概略的に説明する図である。
【図８】ノーザンハイブリダイゼーション法によるＩＮＨ−ｈＭＴ融合遺伝子の発現を示す図である。
【図９】カドミウム混合培地におけるＩＮＨ−ｈＭＴ融合遺伝子導入系統（ｈＭＴ）と非形質転換系統（ＮＴ）の生育を示す図である。
【図１０】ＩＮＨ−ｈＭＴ融合遺伝子導入系統（ｈＭＴ）と非形質転換系統（ＮＴ）のカドミウム含有量の比較を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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