(57)【要約】【課題】ミドリゾウリムシを用いて、試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を簡易にかつきめ細かく測定する。【解決手段】領域Ａは、試料中にアクリルアミドを多く含む領域であり、ミドリゾウリムシに対して致死効果の毒性を有する。一方、領域Ｂのアクリルアミド濃度は、ミドリゾウリムシの増殖阻害をもたらす程度の毒性であり、ミドリゾウリムシおよび共生藻は生存する。そこで、アクリルアミドを多く含む領域の毒性は、ミドリゾウリムシの生存率を測定して求め、アクリルアミドが少ない領域の毒性は、共生藻を含まない白いミドリゾウリムシの出現頻度やミドリゾウリムシ中の全共生藻の量を測定することで、簡便かつきめ細かく評価できる。【選択図】  図１
2004222608.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるアクリルアミドの毒性の測定方法であって、アクリルアミドを含む試料と、ミドリゾウリムシを含む培養液とを混合して培養し、前記培養した混合液に含まれるミドリゾウリムシの生存率から前記試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を判定する判定工程を有することを特徴とする試料中に含まれるアクリルアミドの毒性の測定方法。
【請求項２】
前記判定工程は、前記培養中の試料からその一部を定期的に抜き出し、前記抜き出した試料中に含まれる生存するミドリゾウリムシの個体数を計数する計数工程と、
前記計数したミドリゾウリムシの個体数の経時変化に基づいて、前記試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を判定する毒性判定工程と、
を有することを特徴とする請求項１に記載のアクリルアミドの毒性の測定方法。
【請求項３】
前記ミドリゾウリムシは、対数期にあるミドリゾウリムシであることを特徴とする請求項１に記載のアクリルアミドの毒性の測定方法。
【請求項４】
前記毒性判定工程は、前記抜き出した試料中に含まれる生存するミドリゾウリムシの個体数の経時変化に基づいて、前記試料中に含まれるアクリルアミドの濃度を決定する工程を含むことを特徴とする請求項２に記載の試料中に含まれるアクリルアミドの毒性の測定方法。
【請求項５】
前記抜き出した試料中に含まれるミドリゾウリムシの生存する個体数が前記培養日数と共に増加する場合には、前記試料中に含まれるアクリルアミドの濃度はほぼ０．０１５％（ｗ／ｖ）以下であると決定することを特徴とする請求項４に記載の試料中に含まれるアクリルアミド濃度の測定方法。
【請求項６】
前記抜き出した試料中に含まれるミドリゾウリムシの生存する個体数が前記培養日数に対してほぼ変化しない場合には、前記試料中に含まれるアクリルアミドの濃度はほぼ０．０５％（ｗ／ｖ）であると決定することを特徴とする請求項４に記載の試料中に含まれるアクリルアミドの測定方法。
【請求項７】
前記抜き出した試料中に含まれるミドリゾウリムシの生存する個体数が前記培養日数と共に減少する場合には、前記試料中に含まれるアクリルアミドの濃度は０．１５％（ｗ／ｖ）以上であると決定することを特徴とする請求項１に記載の試料中に含まれるアクリルアミドの測定方法。
【請求項８】
前記ミドリゾウリムシは細胞内にクロロフィルを有する共生藻を含むことを特徴とする請求項１に記載のアクリルアミドの毒性の測定方法。
【請求項９】
前記判定工程は、前記生存するミドリゾウリムシの中で、前記共生藻を含まない白いミドリゾウリムシの数を測定することにより前記試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を更に詳しく判定することを特徴とする請求項８に記載のアクリルアミドの毒性の測定方法。
【請求項１０】
前記白いミドリゾウリムシの数は、前記生存するミドリゾウリムシのうちのクロロフィル蛍光を示さないミドリゾウリムシの数であることを特徴とする請求項９に記載のアクリルアミドの毒性の測定方法。
【請求項１１】
前記判定工程は、前記生存するミドリゾウリムシに含まれる共生藻の数を測定することにより前記試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を更に詳しく判定することを特徴とする請求項８に記載のアクリルアミドの毒性の測定方法。
【請求項１２】
前記培養は、前記混合した試料を２０〜２５℃に保持し、かつ光を所定時間照射し、その後、該光を所定時間照射しないサイクルを繰り返しながら行うことを特徴とする請求項１に記載のアクリルアミドの毒性の測定方法。
【請求項１３】
試料中に含まれるアクリルアミドの毒性の測定方法であって、
アクリルアミドを含む試料と、細胞内に共生藻を有するミドリゾウリムシを含む培養液とを混合して培養し、前記培養した混合液に含まれるミドリゾウリムシの生存率から前記試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を判定する第１工程と、
前記生存するミドリゾウリムシの中で前記共生藻を含まない白いミドリゾウリムシの出現頻度からアクリルアミドの毒性を判定する第２工程と、
前記生存するミドリゾウリムシに含まれる共生藻の量からアクリルアミドの毒性を判定する第３工程と、
を有することを特徴とする試料中に含まれるアクリルアミドの毒性の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に含まれるアクリルアミドの毒性の測定方法に関し、特に、試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を細胞質内に多量の共生藻を有する繊毛虫ミドリゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ  ｂｕｒｓａｒｉａ）を用いて測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アクリルアミド（ＣＨ２ＣＨＣＯＮＨ２）の重合体であるアクリルアミドポリマーは、工業的には、接着剤、分散剤、塗料、紙などの仕上げ剤として用いられている比較的毒性の低い物質である。
【０００３】
しかしながら、アクリルアミド（アクリルアミドモノマー）は有毒物質であり、例えば、ラットやマウスへ投与されると癌を引き起こすことや、皮膚から吸収されると中枢神経の麻痺症状を引き起こすことなどが知られている。また、アクリルアミドの代謝産物グリシドアミドはＤＮＡに直接結合することが知られていることから、アクリルアミドは遺伝毒性を示す物質と考えられている。
【０００４】
一方、アクリルアミド（アクリルアミドモノマー）が調理などを通じて食品中に生成することが平成１４年４月に世界保健機関（ＷＨＯ）に報告された。そのため、平成１４年６月、世界保健機関（ＷＨＯ）による緊急の専門家会議が開催され、アクリルアミドの人体への影響の調査や研究が進められることとなった（非特許文献１）。
【０００５】
また、平成１４年５月、スウェーデンの研究グループによって澱粉を含む食品を高温で加熱処理すると食品中にアクリルアミドが生成されることが報告され、その後、ＭｏｔｔｒａｎとＳｔａｄｌｅｒによって高温で食品を加熱すると食品中に含まれるアミノ酸（アスパラギン）と糖（ブドウ糖）との間でメイラード反応が起こってアクリルアミドが生成されることが明らかにされた。
【０００６】
世界保健機関（ＷＨＯ）の勧告を受けて、厚生労働省は、発ガン性が指摘されるアクリルアミドが国内の食品にどの位含まれているのかについての調査結果を平成１４年１０月３１日発表した（非特許文献２）。
【０００７】
それによると、国立医薬品食品衛生研究所で食品中のアクリルアミドを測定した結果、ポテトチップス、かりんとう、フライドポテトなど高温で加熱処理された食品からアクリルアミドが検出され、最も多く検出されたポテトチップスでは最高で３５４４μｇ／ｋｇ、かりんとうでは最高で１８９５μｇ／ｋｇ、フライドポテトでは最高で７８４μｇ／ｋｇのアクリルアミドを含むことわかった。
【０００８】
このように、食品中にはアクリルアミドを含むものがあるが、食品から人体にどの位のアクリルアミドが摂取されるのか、あるいは、摂取されたアクリルアミドが健康にどれだけ影響を及ぼすかについての評価は現在はまだ定まっていない。そのため、厚生労働省では、アクリルアミドを多く含む食品の摂取量を減らす努力や調理法の工夫などを呼びかけている。
【０００９】
このように、食品に含まれるアクリルアミドからの摂取量を減らすことは重要であるが、その研究に欠かせないものとして、食品中に含まれるアクリルアミドの毒性の影響を簡易に、かつ、きめ細かく測定する方法の確立が必要である。その方法を確立することによって、アクリルアミドの毒性を緩和する物質や方法などの研究に多大な寄与が可能となる。
【００１０】
ところで、本発明者らは以前から原生動物であるミドリゾウリムシについて研究を進めてきている（特許文献１）。
【００１１】
細胞質内に共生藻を有する繊毛虫ミドリゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ  ｂｕｒｓａｒｉａ、以下、ミドリゾウリムシと称す）は、その細胞質内に多数のクロレラ属に属する藻（以下、共生藻と呼ぶ）を含んでおり、宿主であるミドリゾウリムシの特殊な膜内に個々に封入されている共生藻は、ミドリゾウリムシの細胞分裂において両娘細胞に伝達される。また共生藻は、光合成により光合成産物を生産することができる。
【００１２】
このように、ミドリゾウリムシは、細胞質内に多数含まれる共生藻から得られる光合成産物を利用して増殖することができるため、ミドリゾウリムシに光を当てておくだけで簡単に大量培養することができる。
【００１３】
また、ミドリゾウリムシは、大量の個体数を容易に提供できるため、生物への毒性が懸念される物質の毒性評価試験を行う際に、大量の個体数を必要とする試験を行う場合には、大量の個体数を用いる実験が難しいラットやマウスの代わりに使用することができるという利点を有する。またミドリゾウリムシを用いて生物への毒性が懸念される物質の毒性評価試験をする場合は、簡単な実験設備で行うことができる。
【００１４】
【非特許文献１】
Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ，Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  Ｊｏｉｎｔ  ＦＡＯ／ＷＨＯ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ，ＷＨＯ  Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，２５−２７，  Ｊｕｎｅ  ２００２
【非特許文献２】
朝日新聞  平成１４年１１月１日朝刊３８面
【特許文献１】
特許第２８９６９４号公報
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、以上説明した従来技術の問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を簡易に、かつ、きめ細かく評価する方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態の試料中に含まれるアクリルアミドの毒性の測定方法は、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれるアクリルアミドの毒性の測定方法であって、アクリルアミドを含む試料と、ミドリゾウリムシを含む培養液とを混合して培養し、前記培養した混合液に含まれるミドリゾウリムシの生存率から前記試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を判定する判定工程を有することを特徴とする。
【００１７】
ここで、例えば、前記判定工程は、前記培養中の試料からその一部を定期的に抜き出し、前記抜き出した試料中に含まれる生存するミドリゾウリムシの個体数を計数する計数工程と、前記計数したミドリゾウリムシの個体数の経時変化に基づいて、前記試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を判定する毒性判定工程と、を有することが好ましい。
【００１８】
ここで、例えば、前記ミドリゾウリムシは、対数期にあるミドリゾウリムシであることが好ましい。
【００１９】
ここで、例えば、前記毒性判定工程は、前記抜き出した試料中に含まれる生存するミドリゾウリムシの個体数の経時変化に基づいて、前記試料中に含まれるアクリルアミドの濃度を決定する工程を含むことが好ましい。
【００２０】
ここで、例えば、前記抜き出した試料中に含まれるミドリゾウリムシの生存する個体数が前記培養日数と共に増加する場合には、前記試料中に含まれるアクリルアミドの濃度はほぼ０．０１５％（ｗ／ｖ）以下であると決定することが好ましい。
【００２１】
ここで、例えば、前記抜き出した試料中に含まれるミドリゾウリムシの生存する個体数が前記培養日数に対してほぼ変化しない場合には、前記試料中に含まれるアクリルアミドの濃度はほぼ０．０５％（ｗ／ｖ）であると決定することが好ましい。
【００２２】
ここで、例えば、前記抜き出した試料中に含まれるミドリゾウリムシの生存する個体数が前記培養日数と共に減少する場合には、前記試料中に含まれるアクリルアミドの濃度は０．１５％（ｗ／ｖ）以上であると決定することが好ましい。
【００２３】
ここで、例えば、前記ミドリゾウリムシは細胞内にクロロフィルを有する共生藻を含むことが好ましい。
【００２４】
ここで、例えば、前記判定工程は、前記生存するミドリゾウリムシの中で、前記共生藻を含まない白いミドリゾウリムシの数を測定することにより前記試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を更に詳しく判定することが好ましい。
【００２５】
ここで、例えば、前記白いミドリゾウリムシの数は、前記生存するミドリゾウリムシのうちのクロロフィル蛍光を示さないミドリゾウリムシの数であることが好ましい。
【００２６】
ここで、例えば、前記判定工程は、前記生存するミドリゾウリムシに含まれる共生藻の数を測定することにより前記試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を更に詳しく判定することが好ましい。
【００２７】
ここで、例えば、前記培養は、前記混合した試料を２０〜２５℃に保持し、かつ光を所定時間照射し、その後、該光を所定時間照射しないサイクルを繰り返しながら行うことが好ましい。
【００２８】
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態の試料中に含まれるアクリルアミドの毒性の測定方法は、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれるアクリルアミドの毒性の測定方法であって、アクリルアミドを含む試料と、細胞内に共生藻を有するミドリゾウリムシを含む培養液とを混合して培養し、前記培養した混合液に含まれるミドリゾウリムシの生存率から前記試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を判定する第１工程と、前記生存するミドリゾウリムシの中で前記共生藻を含まない白いミドリゾウリムシの出現頻度からアクリルアミドの毒性を判定する第２工程と、前記生存するミドリゾウリムシに含まれる共生藻の量からアクリルアミドの毒性を判定する第３工程と、を有することを特徴とする。
【００２９】
【発明の実施形態】
以下に図面を参照して、本発明に係る好適な実施形態である試料中に含まれるアクリルアミドの毒性の測定方法を例示的に詳しく説明する。ただし、この実施形態に記載されている構成要素、数値などは、特に特定的な記載がない限りは、この発明をそれらのみに限定する趣旨のものではない。
【００３０】
なお、本実施形態の測定法で使用するミドリゾウリムシは、細胞内に共生藻を含むものが好ましいが、細胞内に共生藻を含んでいないミドリゾウリムシを使用することもできる。
【００３１】
＜試料中に含まれるアクリルアミドの毒性の評価方法の概要：図１＞
まず、本実施形態の細胞内にクロロフィルを有する共生藻を含むミドリゾウリムシを用いて、試料中に含まれるアクリルアミドの毒性の評価方法の概要について図１を用いて説明する。
【００３２】
本実施形態のアクリルアミドの毒性の評価方法は、試料中に含まれるアクリルアミド濃度が比較的高い場合に、アクリルアミドの毒性をミドリゾウリムシを用いて測定し、試料中に含まれるアクリルアミド濃度が低い場合にアクリルアミドの毒性を共生藻を用いて測定することによりアクリルアミドの毒性をきめ細かく評価する方法である。
【００３３】
通常、細胞内にクロロフィルを有する共生藻を含むミドリゾウリムシは、培養液中で培養すると増殖するため、培養日数の増加と共にミドリゾウリムシの個体数は増加する。
【００３４】
しかしながら、ミドリゾウリムシを含む培養液中にアクリルアミドを含む試料を添加してから培養すると、培養日数の増加と共にミドリゾウリムシの個体数が試料中に含まれるアクリルアミド濃度に応じて変化する。さらに、ミドリゾウリムシの個体数の増加量が変化しない場合でもミドリゾウリムシ中に含まれる共生藻を全く含まない白いミドリゾウリムシが出現したり、共生藻の個体数が減少したりする。
【００３５】
図１は、共生藻を含むミドリゾウリムシに対するアクリルアミドの毒性の影響をまとめたものである。
【００３６】
すなわち、図１の領域Ａは、試料中に比較的高濃度のアクリルアミドを含む領域であり、この領域Ａのアクリルアミド濃度（０．１５％（ｗ／ｖ）程度以上）は、全ミドリゾウリムシに対して致死効果の毒性を有する。すなわち、領域Ａでは、アクリルアミドの毒性によって全てのミドリゾウリムシは生存できず死滅する。
【００３７】
一方、図１の領域Ｂは、試料中に領域Ａより少ない濃度のアクリルアミドを含む領域であり、この領域Ｂのアクリルアミド濃度（０．００１５％（ｗ／ｖ）程度〜０．１５％（ｗ／ｖ）未満）は、ミドリゾウリムシの増殖阻害をもたらす程度の毒性であるため、全ミドリゾウリムシは死滅せず、その一部がアクリルアミド共存下で生存する領域である。なお、図１に示すように領域Ｂにおけるミドリゾウリムシの生存率は、アクリルアミド濃度と共に変化し、アクリルアミド濃度が高いほどミドリゾウリムシの生存率が低下する。
【００３８】
また、図１に示す領域Ｂのアクリルアミド濃度は、上記のようにミドリゾウリムシの増殖阻害をもたらす程度の毒性ではあるが、ミドリゾウリムシ中に含まれる共生藻に対しても増殖阻害や致死効果をもたらす毒性を有する。そのため、領域Ｂにおける共生藻の量は、アクリルアミド濃度に応じて変化する。
【００３９】
すなわち、領域Ｂ中のアクリルアミド濃度が低い領域（図１中の０．００１５％（ｗ／ｖ）付近）では、アクリルアミド濃度は共生藻に対して増殖阻害を有するため、生存するミドリゾウリムシ中に含まれる共生藻の量はアクリルアミドを含まない場合に比べて低下する。ただし、生存するミドリゾウリムシ中の共生藻は死滅しないため、共生藻を含むミドリゾウリムシがアクリルアミド共存下で生存することができる。
【００４０】
一方、領域Ｂ中のアクリルアミド濃度が比較的高い領域（図１中の０．０５％（ｗ／ｖ）付近）では、アクリルアミド濃度は共生藻に対して致死効果を有するため、生存するミドリゾウリムシ中に含まれる共生藻は全て死滅する場合がある。このため、共生藻を含まない白いミドリゾウリムシが生じる。
【００４１】
また、領域Ｂのアクリルアミド濃度が中間の領域（例えば、図１中の０．００５％（ｗ／ｖ）、０．０１５％（ｗ／ｖ）付近）では、アクリルアミド濃度はミドリゾウリムシおよび共生藻に対して増殖阻害をもたらす毒性を有するため、共生藻を含むミドリゾウリムシと共生藻を含まない白いミドリゾウリムシとが混在して生存する。
【００４２】
なお、図１の領域Ｃは、試料中に領域Ｂより少ない濃度のアクリルアミドを含む領域であり、この領域Ｃのアクリルアミド濃度（０．００１５％（ｗ／ｖ）程度未満）は、ミドリゾウリムシ中に含まれる共生藻に対してのみ増殖阻害をもたらすが、決して白いミドリゾウリムシが出現しない程度の毒性である。したがって、本実施形態の測定方法では、領域Ｃのアクリルアミド濃度は測定できない。
【００４３】
以上説明したように、試料中に含まれるアクリルアミド濃度が比較的多い場合のアクリルアミドの毒性は、ミドリゾウリムシの生存率を測定することにより（第１の評価方法）、また、試料中に含まれるアクリルアミド濃度が少ない場合のアクリルアミドの毒性は、共生藻を含まない白いミドリゾウリムシの出現量（第２の評価方法）、白いミドリゾウリムシが出現しない毒性の場合は、ミドリゾウリムシ中に含まれる全共生藻の量（第３の評価方法）を測定することにより、簡便かつきめ細かく評価することができる。
【００４４】
そこで、以下に示す本実施形態の説明では、上記説明した第１〜第３評価方法を用いて、試料中に含まれるアクリルアミドの濃度を簡便かつきめ細かく評価する方法について詳細に説明する。
【００４５】
＜使用する材料＞
まず、第１〜第３評価方法で使用する材料について説明する。
【００４６】
［ミドリゾウリムシ］
ミドリゾウリムシは、各地の池や河川などから採取されるいかなる種類のミドリゾウリムシを使用することができる。例えば、広島県東広島市奥田大池から１９９１年に採取したミドリゾウリムシ（株ＯＫ−３１２）、広島県賀茂郡の白竜湖から１９９４年に採集したミドリゾウリムシ（株Ｈ−４）、２００１年に琵琶湖守山で採集され単離したミドリゾウリムシ（株ＭＢ−１）、あるいは株ＯＫ−３１２と株Ｈ−４から本発明者がハイブリッド形成で新たに生成した株ＨＫ−４８などを使用することができる。
【００４７】
なお、上記のミドリゾウリムシは、細胞内に共生藻を含んだものであり、本測定法で使用するのに適したものであるが、細胞内に共生藻を含んでいないミドリゾウリムシを使用することもできる。
【００４８】
また、ミドリゾウリムシは、増殖の段階に応じて対数期や定常期に分類されるものがあり、それらすべてのミドリゾウリムシを使用できるが、本測定法で使用するのにより好ましいのは、対数期のミドリゾウリムシである。
【００４９】
［ミドリゾウリムシの培地（培養液）］
本発明に用いるミドリゾウリムシの培養用の培地は、野菜の浸出液や少量の無機成分を含み、更にミドリゾウリムシの有機栄養源となるバクテリアを予め接種したものが適している。
【００５０】
この培地に接種されるバクテリアはミドリゾウリムシの有機栄養源となるものであればどのようなものであってもよいが、特に、クレブシエラ・ニューモニアイ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が好適である。
【００５１】
また、野菜の浸出液としては、緑色野菜の浸出液が好ましく、特に、レタス浸出液が最も好ましい。また無機成分としては各種ミネラルを使用できるが、特に、炭酸カルシウム等のカルシウムを用いるのが好ましい。この無機成分を含む野菜浸出液は、例えば、乾葉レタス粉末に少量のＣａＣＯ３を加え、約１０００〜１５００倍容の水で数分間煮沸浸出し、濾過し、オートクレーブ処理して得る。また、この野菜浸出液に、酵母抽出物、ペプトン、グルコース等、微生物用培地に慣用される有機成分を適宜添加してもよい。
【００５２】
なお、ＣａＣＯ３を含む野菜浸出液の作製方法の一例を下記に示す。レタスの葉を洗浄し、３０〜６０秒間煮沸し、６０〜８０℃で乾燥した後、粉末となし、デシケーターに貯蔵し、この乾燥レタス粉末０．５ｇをＣａＣＯ３  （片山化学）２ｍｇと共に再蒸留水０．７リットル中で５〜１０分煮沸して浸出液を調製し、室温まで冷却後濾過し、濾液に再蒸留水を加えて全容１０００ｍｌとし、オートクレーブ処理（約１５分）して、野菜浸出液を得る。
【００５３】
［毒性試験に用いるミドリゾウリムシの前処理］
毒性試験に用いるミドリゾウリムシは、上記のバクテリアと緑色野菜の浸出液を含む培地中で、所定条件、例えば、２３±１℃、昼光色蛍光ランプの人工照明（４００〜５０００ルックス）を１日当たり８〜１２時間照射（残りは暗黒）の条件で、２４〜４８時間培養したものを使用する。この時期のミドリゾウリムシを対数期にあるミドリゾウリムシと呼び、その増殖が対数的に起こる本測定方法が好適に実施できる時期である。なお、毒性試験に用いるミドリゾウリムシの前処理は上記に限定されるものではなく、必要に応じて培養条件や培養期間を変更することができる。
【００５４】
［アクリルアミドを含む試料の調製］
本実施形態では、アクリルアミドを含む試料の一例として、アクリルアミドを所定量ずつ蒸留水に溶解し、アクリルアミド溶液（０．０３〜３０％（ｗ／ｖ））としたものを用いる。しかしながら、アクリルアミドを含む試料は上記に限定されるものではなく、必要に応じて上記溶液中に各種の有機または無機成分を添加してもよい。またさらに、アクリルアミドを含む試料としては、食品中に含まれるアクリルアミドを各種の公知の技術を用いて蒸留水中に溶解させて試料としたものを使用してもよい。
【００５５】
上記作製した各アクリルアミド溶液を１００μｌずつとり、対数期のミドリゾウリムシ（例えば、ＭＢ−１株）を４０個体含む培養液（培地）１．９ｍｌと混合してアクリルアミドの濃度を０．００１５〜１．５％（ｗ／ｖ）となるように調製する。
【００５６】
本実施形態で使用するアクリルアミドの濃度は、例えば、０，０．００１５％（ｗ／ｖ）、０．００５％（ｗ／ｖ）、０．０１５％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．１５％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）および１．５％（ｗ／ｖ）の８種類とするが、アクリルアミドの濃度は上記に限定されるものではなく、任意の濃度をとることができる。
【００５７】
次に、第１〜第３評価方法について説明する。
【００５８】
＜第１の評価方法：ミドリゾウリムシの生存率の測定＞
まず、第１の評価方法（ミドリゾウリムシの生存率の測定）について説明する。
【００５９】
すなわち、第１の評価方法では、ミドリゾウリムシを含む培養液にアクリルアミドを多く含む試料を添加して培養すると、培養日数と共にミドリゾウリムシの生存率が下降してやがて死滅することを利用して、試料中に含まれるアクリルアミドの毒性が大きい領域（０．１５％（ｗ／ｖ）程度以上）であると評価する。
【００６０】
同様にしてに、アクリルアミドをそれほど多く含まない試料を添加して培養すると、培養日数を増やしてもミドリゾウリムシの生存率が上昇も下降もしないことを利用して、試料中に含まれるアクリルアミドの毒性が中くらいの領域（０．０５％（ｗ／ｖ）前後）であると評価する。
【００６１】
また同様にして、アクリルアミドを少し含む試料を添加して培養すると、培養日数を増やすにつれてミドリゾウリムシの生存率が上昇することを利用して、試料中に含まれるアクリルアミドの毒性がないまたは小さい領域（０．０１５％（ｗ／ｖ）程度以下）であると評価する。
【００６２】
このように、第１の評価方法では、培養液中に含まれるミドリゾウリムシの個体数を所定期間ごとに数え、得られるミドリゾウリムシの個体数の経時変化からアクリルアミドの毒性を３段階すなわち、アクリルアミドの毒性が、大きい領域、中くらいの領域、小さい領域で評価することができる。
【００６３】
［第１の評価試験］
次に、第１の評価方法の試験方法の一例を説明する。
【００６４】
第１の評価試験では、対数期のミドリゾウリムシ（例えば、４０個体のミドリゾウリムシ／１．９ｃｃ）を含む培養液（培地）に各種濃度のアクリルアミドを含む水溶液（濃度として上記の０〜１．５％（ｗ／ｖ）となる８種類）を混合後、ガラスシャーレに入れて所定条件、例えば、２３±１℃、昼光色蛍光ランプの人工照明（４００〜５０００ルックス）を１日当たり８〜１２時間照射（残りは暗黒）の条件下で、ミドリゾウリムシを７日間培養する。
【００６５】
なお、上記の培養条件は一例であり、ミドリゾウリムシは本来野外で生息している生物であるから、ミドリゾウリムシが生息可能な条件であれば、どのような条件であってもよい。また、アクリルアミドの濃度は上記に限定されるものではなく、任意の濃度をとることができる。
【００６６】
次に、培養液中に含まれるミドリゾウリムシの個体数を定期的（例えば、１日ごと）に数えることにより、ミドリゾウリムシ量の経時変化（増加量、減少量など）を測定する。
【００６７】
すなわち、培養中のミドリゾウリムシは、所定のサンプリング時間ごと（例えば、１日ごと）に、培養液を含むガラスシャーレを振動させて培養液内の細胞の分布を一様にした後、マイクロピペットで培養液０．１５ｍｌを窪みスライドに取り、捕集したミドリゾウリムシ個体を一体ずつガラスシャーレに戻しながらその個体数を測定する。ここで、ミドリゾウリムシの個体数のカウントは、実体顕微鏡下で実験者の目視観察で行う。この操作を３回繰り返し、その平均値を０．１５ｍｌ中のミドリゾウリムシの個体数とし、この平均値を１ｍｌに換算してそのサンプリング時間における細胞密度（個数／ｍｌ）とする。
【００６８】
なお、各種濃度のアクリルアミドを添加したミドリゾウリムシの個体数の変化を測定する際には、生存するミドリゾウリムのみがカウントされ、死滅したミドリゾウリムはカウントされない。（ミドリゾウリムシは死滅すると細胞が破裂し、形が残らないため、死滅したミドリゾウリムシをカウントすることはない。）
最後に、定期的に測定されたミドリゾウリムシの量から、培養日数に対するミドリゾウリムシの量の経時変化を求めることにより、アクリルアミドの毒性を、大きい領域（０．１５％（ｗ／ｖ）程度以上）、中くらいの領域（０．０５％（ｗ／ｖ）前後）、無いまたは小さい領域（０．０１５％（ｗ／ｖ）程度以下）の３段階で評価する。
【００６９】
＜第２の評価方法：白いミドリゾウリムシの測定＞
次に、第２の評価方法について説明する。
【００７０】
第２の評価方法は、第１の評価方法でアクリルアミドの毒性がないまたは小さいと判定された領域（０．０１５％（ｗ／ｖ）程度以下）におけるアクリルアミドの毒性を更に詳細に評価する方法である。
【００７１】
すなわち、第１の評価方法において、アクリルアミドの毒性が無いまたは小さいと判定された領域（０．０１５％（ｗ／ｖ）程度以下）において、生存するミドリゾウリムシの中に共生藻を全く含まない白いミドリゾウリムシが出現する領域がある。
【００７２】
そこで、第２の評価方法では、この白いミドリゾウリムシの出現頻度を測定することにより、第１の評価方法でアクリルアミドの毒性が無いまたは小さいと判定された領域（０．００１５〜０．０１５％（ｗ／ｖ）程度）におけるアクリルアミドの毒性をきめ細かく評価することができる。
【００７３】
［第２の評価試験］
次に、第２の評価試験の一例について説明する。
【００７４】
第２の評価試験では、第１の評価試験で説明したのと同様の条件で、アクリルアミドを含む対数期のミドリゾウリムシを７日間培養し、生存するミドリゾウリムシの中で、共生藻を全く含まない白いミドリゾウリムシの個体数を測定する。例えば、培養５日目および７日目の培養液に含まれる白いミドリゾウリムシの個体数を測定する。
【００７５】
本実施形態で使用するミドリゾウリムシはクロロフィルを有する共生藻を含んでいるため、ミドリゾウリムシに励起光を照射すると、共生藻のクロロフィルに由来する蛍光（クロロフィル蛍光）を発生する。しかしながら、アクリルアミドの毒性によって共生藻由来のクロロフィル蛍光を完全に失ったミドリゾウリムシ、すなわち共生藻を含まないミドリゾウリムシが出現する。
【００７６】
そこで、以下、共生藻由来のクロロフィル蛍光を完全に失ったミドリゾウリムシ（共生藻を含まないミドリゾウリムシ）を「白いミドリゾウリムシ」と定義して、クロロフィル蛍光を発生する通常のミドリゾウリムシ（「共生藻を含むミドリゾウリムシ」）と区別する。
【００７７】
［白いミドリゾウリムシのカウント方法］
ここで、共生藻を全く含まない白いミドリゾウリムシの個体数の測定方法について以下詳細説明する。
【００７８】
まず、生存するミドリゾウリムシのなかで、「白いミドリゾウリムシ」と「共生藻を含むミドリゾウリムシ」の識別する方法について説明する。
【００７９】
ミドリゾウリムシのうちで、クロロフィルを含まない白い細胞とクロロフィルを含む細胞とは、ニコン社製ノマルスキー（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）微分干渉コントラスト顕微鏡（ＤＩＣ）等の光学器機を用いて得られる蛍光像と微分干渉像を用いて識別することができる。
【００８０】
まず、クロロフィルを含む細胞部分の測定では、ミドリゾウリムシに水素ランプを照明すると、ミドリゾウリムシ中の共生藻に含まれるクロロフィルは放射線を吸収して励起し、より長い波長の放射線を再放射する。そこで、試料と接眼レンズとの間にＢ２フィルターをおいて紫外光を除き、共生藻中のクロロフィルから発せられる蛍光（赤色）のみによって得られる蛍光像（赤色像）が得られる。この蛍光像から共生藻を含むミドリゾウリムシの数をカウントできる。
【００８１】
一方、微分干渉コントラスト顕微鏡の微分干渉像からは、クロロフィルを含まない（共生藻を含まない）白いミドリゾウリムシと、クロロフィルを含むミドリゾウリムシ（「共生藻を含むミドリゾウリムシ」）とを合わせた、全ミドリゾウリムシ数をカウントできる。
【００８２】
そこで、上記の蛍光像と微分干渉像とを比較することにより、ミドリゾウリムの中で共生藻を全く含まない「白いミドリゾウリムシ」をカウントできる。
【００８３】
＜第３の評価方法：共生藻の測定＞
次に、第３の評価方法について説明する。
【００８４】
第３の評価方法（共生藻の測定）は、第２の評価方法ではアクリルアミドの毒性が認められなかった領域（白いミドリゾウリムシが全くあるいはほとんど出現しない領域；０．００５％（ｗ／ｖ）未満）におけるアクリルアミドの毒性を更に詳しく評価する方法である。
【００８５】
すなわち、第２の評価方法において、白いミドリゾウリムシが出現しないが、ミドリゾウリムシ中に含まれる共生藻が減少する領域がある。
【００８６】
そこで、第３の評価方法では、ミドリゾウリムシ中に含まれる共生藻の数を測定することにより、第２の評価方法で白いミドリゾウリムシが全くあるいはほとんど出現しない領域（０．００５％（ｗ／ｖ）未満、特に０．００１５％（ｗ／ｖ）以下）におけるアクリルアミドの毒性をきめ細かく評価することができる。
【００８７】
［第３の評価試験］
次に、第３の評価試験の一例について説明する。
【００８８】
第３の評価試験では、第１の評価試験で説明したのと同様の条件で、アクリルアミドを含む対数期のミドリゾウリムシを７日間培養し、生存するミドリゾウリムシ中に含まれる共生藻の個体数を測定する。
【００８９】
次に、例えば、培養５日目または７日目におけるミドリゾウリムシ中に含まれる共生藻の数を測定する。
【００９０】
ここで、ミドリゾウリムシ中に含まれる共生藻数の測定方法を以下詳細に説明する。
【００９１】
第３の評価試験では用いるフローサイトメーターは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）又は同様の機器であり、測定したデータの解析は、ＣＥＬＬ  Ｑｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）又は同様の機能を持つソフトウエアを用いて行う。
【００９２】
フローサイトメトリーにおいて、サンプル中の顆粒サイズのパラメーターであるＦｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳＣ）を細胞サイズとして測定し、また６５０ｎｍの波長の蛍光を検出する赤色蛍光チャネル（ＦＬ３）で共生藻由来のクロロフィル蛍光強度を測定する。またフローサイトメーターに取り込ませた顆粒全ての数は自動的にカウントされるので、共生藻の個体数はフローサイトメーターのカウンターを用いて測定する。
【００９３】
なお、フローサイトメトリーの測定において、共生藻と他のクロロフィルを含まない顆粒（ミドリゾウリムシの膜の破片など）とを区別するためにある程度以上のＦＬ３蛍光強度、例えば相対蛍光強度３０以上を持つ顆粒のみを共生藻としてカウントする。
【００９４】
フローサイトメトリーの測定では、サンプル（例えば、各種濃度のアクリルアミドを含む試料をミドリゾウリムシを含む培養液に添加後５日間または７日間培養したミドリゾウリムシを含む培養液５００μｌ）中に含まれるミドリゾウリムシを超音波破砕し、ミドリゾウリムシの細胞内共生藻を培養液中に出したものを用い、上述の方法で共生藻数をカウントし、カウントされた共生藻数を１ｍｌあたりに換算することにより、ミドリゾウリムシ中に含まれる共生藻数とする。
【００９５】
【実施例】
［実施例１：第１の評価試験］
図２に、第１の評価試験による測定結果を示す。
【００９６】
図２は、アクリルアミド存在下で対数期のミドリゾウリムシを７日間培養したときのミドリゾウリムシの個体数密度変化、即ちミドリゾウリムシの生存率の経時変化の測定結果である。横軸は、培養日数であり、縦軸は、ミドリゾウリムシの個体数密度である。なお、図２には、比較例として、アクリルアミドを含まない場合のミドリゾウリムシの生存率の経時変化を併せて示してある。
【００９７】
図２より、アクリルアミドの濃度が０．１５％（ｗ／ｖ）以上存在する場合は、培養３日以内にミドリゾウリムシが死滅することが確認され、アクリルアミドの濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）程度存在する場合は、ミドリゾウリムシの個体数密度がほとんど変化しないことが確認され、アクリルアミドの濃度が０．０１５％（ｗ／ｖ）以下しか存在しない場合は、アクリルアミドを含まない場合と同じように個体数密度が増加するかあるいはそれに近い増加曲線を示しながら個体数密度が増加することが確認された。
【００９８】
図２に示す第１の評価試験では、アクリルアミドの毒性の影響を、１）ミドリゾウリムシを死滅させる毒性、２）ミドリゾウリムシの個体数密度が余り変化しない程度の毒性、３）ミドリゾウリムシが増殖できる程度の毒性、に分類できることから、試料中に含まれるアクリルアミドの濃度を３段階に分類することができる。
【００９９】
すなわち、ミドリゾウリムシが死滅させるアクリルアミドの濃度は０．１５％（ｗ／ｖ）以上であり、ミドリゾウリムシの個体数密度が余り変化しない程度のアクリルアミドの濃度は０．５％（ｗ／ｖ）〜０．０１５％（ｗ／ｖ）程度（特に０．０５％（ｗ／ｖ）程度）であり、ミドリゾウリムシが増殖できる程度のアクリルアミドの濃度は０．０１５％（ｗ／ｖ）以下である。
【０１００】
［実施例２：第２の評価試験］
図３および図４に、第２の評価試験による測定結果を示す。
【０１０１】
図３は、アクリルアミド存在下で対数期のミドリゾウリムシを５日間または７日間培養したときのミドリゾウリムシ１個体の微分干渉コントラスト顕微鏡像（以下、微分干渉像という）と蛍光顕微鏡像（以下、蛍光像という）である。
【０１０２】
図２に示す第１の評価試験では、ミドリゾウリムシの個体数による区別はできるが、０．０５％（ｗ／ｖ）以下の生存する個体数に差がない範囲ではアクリルアミド濃度を明確に分離できなかった。
【０１０３】
しかしながら、図３に示す第２の評価試験における５日間培養したときのミドリゾウリムシの微分干渉像と蛍光像とを比較すると、微分干渉像により検出されるミドリゾウリムシの個体数の合計数は、ほぼ同じであるものの（図４参照）、蛍光像により検出される各ミドリゾウリムシ中に含まれる共生藻がアクリルアミド濃度の増加とともに減少（クロロフィル蛍光が減少）していることから、アクリルアミド濃度が０．００１５〜０．０５％（ｗ／ｖ）の範囲でもアクリルアミドの毒性が共生藻に影響することが明らかである。
【０１０４】
同様に、図３に示す第２の評価試験における７日間培養したときのミドリゾウリムシの微分干渉像と蛍光像とを比較すると、微分干渉像により検出されるミドリゾウリムシの個体数の合計数は、ほぼ同じであるものの（図４参照）、蛍光像により検出される各ミドリゾウリムシ中に含まれる共生藻がアクリルアミド濃度の増加とともに減少し、アクリルアミド濃度が０．００５〜０．０５％（ｗ／ｖ）の範囲では、完全に共生藻が無くなった（クロロフィル蛍光がない）白いミドリゾウリムシが出現することが観察される。
【０１０５】
そこで、図４に、クロロフィル蛍光を失った白いミドリゾウリムシがどれくらい出現するのかを測定した結果を示す。図４の横軸は、アクリルアミド濃度であり、縦軸は、ミドリゾウリムシの数（細胞密度）または白いミドリゾウリムシの数（細胞密度）であり、図４の折れ線グラフがアクリルアミド濃度とミドリゾウリムシの数（細胞密度）との関係を、図４の棒グラフが、アクリルアミド濃度と白いミドリゾウリムシの個体数との関係を示す。
【０１０６】
図４より、アクリルアミド濃度が０．００５％（ｗ／ｖ）や０．０１５％（ｗ／ｖ）のとき、培養５日または７日で生存するミドリゾウリムシの一部にクロロフィル蛍光を失った白いミドリゾウリムシが出現することがわかる。
【０１０７】
従って、第２の評価試験は、第１の評価試験で判別できなかったアクリルアミドの毒性（アクリルアミド濃度０．００１５％（ｗ／ｖ）〜０．０１５％（ｗ／ｖ）程度、特に０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０１５％（ｗ／ｖ）程度）を判別することができる。
【０１０８】
［実施例３：第３の評価試験］
図５および図６に、第３の評価試験による測定結果を示す。
【０１０９】
図５は、共生藻に対するアクリルアミドの影響を定量化するためにフローサイトメーターを使って各アクリルアミド濃度を含む共生藻の分布パターンを測定した結果を示す。ここで測定に用いたサンプルは、培養５日目と７日目のミドリゾウリムシを含む培養液であり、この培養液中のミドリゾウリムシを超音波破砕し、ミドリゾウリムシの細胞内共生藻を培養液中に出したものを測定し、得られた測定結果から、共生藻と、その他の顆粒とを区別するために蛍光強度３０以上の顆粒のみを共生藻とした。図５に示すように、アクリルアミド濃度によって共生藻の分布パターンが変化する。そこで、この結果に基づいて、アクリルアミド濃度と共生藻の個体数の関係を解析した結果を図６に示す。
【０１１０】
図６は、培養５日目と７日目のミドリゾウリムシの個体数およびミドリゾウリムシ中に共生する共生藻の個体数を示したものである。図６より、白いミドリゾウリムシがほとんど出現しなかったアクリルアミド濃度０．００１５％（ｗ／ｖ）以下を含む培養液でもアクリルアミドを含まない培養液に比べて共生藻の個体数が減少していることがわかる。
【０１１１】
したがって、共生藻の個体数を測定することにより、第２の評価試験で判別できなかったアクリルアミドの毒性（アクリルアミド濃度０．００１５％（ｗ／ｖ）以下）を更に詳しく判別することができる。
【０１１２】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、ミドリゾウリムシを用いて、試料中に含まれるアクリルアミドの毒性を、この試料中に添加して培養したミドリゾウリムシの増殖量から、簡易にかつ、きめ細かく評価する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ミドリゾウリムシと共生藻を用いて試料中に含まれるアクリルアミドの毒性をきめ細かく評価する方法について説明する図である。
【図２】ミドリゾウリムシを含む培地にアクリルアミドを含む試料を添加して培養したときのミドリゾウリムシの個体数の変化に関係を示す図である。
【図３】ミドリゾウリムシを含む培地にアクリルアミドを含む試料を添加して培養した時のミドリゾウリムシ中の共生藻（クロロフィル蛍光）の変化を示す図である。
【図４】ミドリゾウリムシを含む培地にアクリルアミドを含む試料を添加して培養した時の白いミドリゾウリムシの出現頻度を示す図である。
【図５】ミドリゾウリムシを含む培地にアクリルアミドを含む試料を添加して培養した時の共生藻の分布パターンの変化を示す図である。
【図６】ミドリゾウリムシを含む培地にアクリルアミドを含む試料を添加して培養した時の共生藻の数の変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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