(57)【要約】      （修正有）【課題】肝臓、脾臓などの網内系器官に捕捉されにくいドラッグデリバリーシステム用リポソームの表面修飾に有用な化合物の提供。【解決手段】リポソームの表面修飾に好適な式（Ｉ）に示すポリオキシアルキレングリコール誘導体を提供する。2004196675.tif 000019（ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、ＥＯはオキシエチレン基、Ｒ１およびＲ２は炭素数１〜７の炭化水素基、ｍとｎ、ｘとｙはそれぞれ、炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数で、０≦ｍ＋ｎ≦２００、１０≦ｘ＋ｙ≦１５００、（ｎ＋ｍ）／（ｎ＋ｍ＋ｘ＋ｙ）≦０．５を満足する数である）で示される化合物の実効ＳＨ指数（Ｐ）が８５≦Ｐ≦１１０である。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2004196675.tif 000013
（ただし、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、ＥＯはオキシエチレン基、Ｒ１およびＲ２は炭素数１〜７の炭化水素基、ｍとｎ、ｘとｙはそれぞれ、炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数で、０≦ｍ＋ｎ≦２００、１０≦ｘ＋ｙ≦１５００、（ｎ＋ｍ）／（ｎ＋ｍ＋ｘ＋ｙ）≦０．５を満足する数である。炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い）
で示される化合物の実効ＳＨ指数（Ｐ）が８５≦Ｐ≦１１０であることを特徴とする、ＳＨ基を有するポリオキシアルキレングリコール誘導体。
実効ＳＨ指数（Ｐ）＝（実測ＳＨ価／理論ＳＨ価）×１００    （数式１）
【請求項２】
ゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）により示差屈折計（ＲＩ検出器）で式（Ｉ）で示される化合物の分子量分布を測定するとき、主成分含有量（Ｒ）が８５％以上である、請求項１記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項３】
式（Ｉ）で示される化合物にジチオビスニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を反応させて、ゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）で紫外吸光検出器（ＵＶ検出器）を用いて検出器波長を３００ｎｍに固定して分子量分布を測定するとき、主成分含有量（Ｕ）が９８％以上である、請求項１または２記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項４】
Ｒ１およびＲ２がメチル基であり、ｍおよびｎが０である、請求項１〜３のいずれか一つの請求項に記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項５】
リポソーム表面修飾用であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つの請求項に記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項６】
リポソームと、前記リポソームの表面に結合した請求項１〜４のいずれか一つの請求項に記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体とを有することを特徴とする、表面修飾リポソーム。
【請求項７】
式（ＩＩ）
【化２】
2004196675.tif 000014
（ただし、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、ＥＯはオキシエチレン基、Ｒ１およびＲ２は炭素数１〜７の炭化水素基、ｍとｎ、ｘとｙはそれぞれ、炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数で、０≦ｍ＋ｎ≦２００、１０≦ｘ＋ｙ≦１５００、（ｎ＋ｍ）／（ｎ＋ｍ＋ｘ＋ｙ）≦０．５を満足する数である。炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い）
で示される化合物を主成分とし、ゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）により示差屈折計（ＲＩ検出器）で測定するとき、前記式（ＩＩ）で表される化合物より高分子量の化合物の含有量（ＲＩＩＨ）が５％以下であることを特徴とする、ポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項８】
ゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）によりＵＶ検出器で測定するとき、前記式（ＩＩ）で表される化合物より低分子量の化合物の含有量（ＵＩＩＬ）が１％以下であることを特徴とする、請求項７記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項９】
式（Ｉ）
【化３】
2004196675.tif 000015
（ただし、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、ＥＯはオキシエチレン基、Ｒ１およびＲ２は炭素数１〜７の炭化水素基、ｍとｎ、ｘとｙはそれぞれ、炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数で、０≦ｍ＋ｎ≦２００、１０≦ｘ＋ｙ≦１５００、（ｎ＋ｍ）／（ｎ＋ｍ＋ｘ＋ｙ）≦０．５を満足する数である。炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い）
で示される化合物を製造するのに際して、式（ＩＩ）
【化４】
2004196675.tif 000016
（ＡＯ、ＥＯ、Ｒ１、Ｒ２、ｍ、ｎ、ｘ、ｙは前記と同じである）
で示される化合物を主成分とする原料を使用し、この原料をゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）により示差屈折計（ＲＩ検出器）で測定するとき、前記式（ＩＩ）で表される化合物より高分子量の化合物の含有量（ＲＩＩＨ）が５％以下であることを特徴とする、ＳＨ基を有するポリオキシアルキレングリコール誘導体の製造方法。
【請求項１０】
前記原料をゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）によりＵＶ検出器で測定するとき、前記式（ＩＩ）で表される化合物より低分子量の化合物の含有量（ＵＩＩＬ）が１％以下であることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記式（ＩＩ）で示される化合物１モルに対してシステイン１．０〜１００モルをｐＨ＝７．０〜１２．０の緩衝液中で反応させる反応工程（Ａ）；および
（Ｂ）分画分子量が下記数式２で示される計算式の範囲内である限外濾過膜を用いて限外濾過する限外濾過工程（Ｂ）
（式（ＩＩ）で示される化合物の分子量−１１３．５）／２×０．５≦分画分子量≦式（ＩＩ）で示される化合物の分子量×０．８    （数式２）
を有することを特徴とする、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
前記反応工程（Ａ）によって得られた反応物をクレランド試薬を用いて還元する還元工程（Ｃ）を有しており、前記還元工程（Ｃ）で得られた還元物を前記限外濾過工程（Ｂ）に供することを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記限外濾過工程（Ｂ）を行った後に、クレランド試薬を用いて還元する還元工程（Ｄ）、および還元物を、分画分子量が下記数式３で示される計算式の範囲内である限外濾過膜を用いて限外濾過し、不純物を除去する限外濾過工程（Ｅ）を有することを特徴とする、請求項１１記載の方法。
分画分子量≦（式（ＩＩ）で示される化合物の分子量−１１３．５）／２×０．７    （数式３）
【請求項１４】
前記反応工程（Ａ）において、システインの代わりにシスチンを用いることを特徴とする、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
前記限外濾過工程（Ｂ）を行った後に、得られた濾過物から陰イオン交換樹脂を用いて非イオン性の不純物を除去する工程（Ｆ）を有しており、この後に前記還元工程（Ｄ）および前記限外濾過工程（Ｅ）を行うことを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項９〜１５のいずれか一つの請求項に記載の方法によって得られたことを特徴とする、ＳＨ基を有するポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項１７】
前記式（Ｉ）で示される化合物の実効ＳＨ指数（Ｐ）を下記数式１で計算するとき８５≦Ｐ≦１１０であることを特徴とする、請求項１６記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体。
実効ＳＨ指数（Ｐ）＝（実測ＳＨ価／理論ＳＨ価）×１００    （数式１）
【請求項１８】
ゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）により示差屈折計（ＲＩ検出器）で前記式（Ｉ）で示される化合物の分子量分布を測定するとき、主成分含有量（Ｒ）が８５％以上である、請求項１６または１７記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項１９】
前記式（Ｉ）で示される化合物にジチオビスニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を反応させて、ＧＰＣで紫外吸光検出器（ＵＶ検出器）を用いて検出器波長を３００ｎｍに固定して分子量分布を測定するとき、主成分含有量（Ｕ）が９８％以上である、請求項１６〜１８のいずれか一つの請求項に記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項２０】
Ｒ１およびＲ２がメチル基であり、ｍおよびｎが０である、請求項１６〜１９のいずれか一つの請求項に記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項２１】
リポソーム表面修飾用であることを特徴とする、請求項１６〜２０のいずれか一つの請求項に記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項２２】
リポソームと、前記リポソームの表面に結合した請求項１６〜２０のいずれか一つの請求項に記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体とを有することを特徴とする、表面修飾リポソーム。
【請求項２３】
式（ＩＩ）
【化５】
2004196675.tif 000017
（ただし、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、ＥＯはオキシエチレン基、Ｒ１およびＲ２は炭素数１〜７の炭化水素基、ｍとｎ、ｘとｙはそれぞれ、炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数で、０≦ｍ＋ｎ≦２００、１０≦ｘ＋ｙ≦１５００、（ｎ＋ｍ）／（ｎ＋ｍ＋ｘ＋ｙ）≦０．５を満足する数である。炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い）
で示される化合物を製造する方法であって、
不純物である式（ＩＩＩ）化合物の含有量が５％以下である式（ＩＶ）の化合物を原料とし、塩化シアヌルと反応させることを特徴とする、式（ＩＩ）で示されるポリオキシアルキレングリコール誘導体の製造方法。
ＨＯ｛（ＥＯ）ｄ（ＡＯ）２Ｃ（ＥＯ）ｄ｝Ｈ    式（ＩＩＩ）
ＲＯ｛（ＡＯ）ｃ（ＥＯ）ｄ｝Ｈ      式（ＩＶ）
（ＥＯはオキシエチレン基、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、Ｒは炭素数１〜７の炭化水素基、ｃとｄはそれぞれ、炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数で、０≦ｃ≦２００、１０≦ｄ≦１５００、ｃ／（ｃ＋ｄ）≦０．５を満足する数である。炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い。）
【請求項２４】
反応希釈溶剤として芳香族炭化水素、触媒として窒素原子含有複素環化合物を用い、式（ＩＶ）の化合物１モルに対して塩化シアヌル０．４〜０．６モルを反応させることを特徴とする、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）  式（ＩＶ）の化合物と前記芳香族炭化水素との混合溶液に、塩化シアヌルを入れ、５０〜１１０℃で１〜５時間攪拌する工程を行う反応工程、および
（ｂ）  前記窒素原子含有複素環化合物を前記芳香族炭化水素で５〜１００重量倍に希釈して前記（Ｉ）の反応系に入れる工程を有することを特徴とする、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれか一つの請求項に記載の方法によって得られたことを特徴とする、ポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項２７】
ゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）により示差屈折計（ＲＩ検出器）で測定するとき、前記式（ＩＩ）で表される化合物より高分子量の化合物の含有量（ＲＩＩＨ）が５％以下であることを特徴とする、請求項２６記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項２８】
ゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）によりＵＶ検出器で測定するとき、前記式（ＩＩ）で表される化合物より低分子量の化合物の含有量（ＵＩＩＬ）が１％以下であることを特徴とする、請求項２７記載のポリオキシアルキレングリコール誘導体。
【請求項２９】
リポソームと、前記リポソームの表面に結合したポリオキシアルキレングリコール誘導体とを有する表面修飾リポソームを製造する方法であって、
前記リポソームとポリオキシアルキレングリコール誘導体原料とを反応させる前に、式（Ｉ）
【化６】
2004196675.tif 000018
（ただし、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、ＥＯはオキシエチレン基、Ｒ１およびＲ２は炭素数１〜７の炭化水素基、ｍとｎ、ｘとｙはそれぞれ、炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数で、０≦ｍ＋ｎ≦２００、１０≦ｘ＋ｙ≦１５００、（ｎ＋ｍ）／（ｎ＋ｍ＋ｘ＋ｙ）≦０．５を満足する数である。炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い）
で示される化合物の下記数式１による実効ＳＨ指数（Ｐ）を測定することを特徴とする、表面修飾リポソームの製造方法。
実効ＳＨ指数（Ｐ）＝（実測ＳＨ価／理論ＳＨ価）×１００    （数式１）
【請求項３０】
前記実効ＳＨ指数（Ｐ）が８５〜１１０となるように前記ポリオキシアルキレングリコール誘導体原料を管理することを特徴とする、請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はドラッグデリバリーシステム用リポソームの表面修飾に有用な新規チオール基含有ポリエチレングリコール誘導体とその新規製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
リポソームは生体膜の構成成分であるリン脂質を用いて作成される人工脂質小胞体であり、１９６５年にＢａｎｈａｍによって発見された。リポソームは、脂溶性および水溶性物質を封入することができる微粒子であり、当初からＤＤＳ製剤として使用するとき、リポソーム自身が肝臓、脾臓等の細網内皮系組織（ＲＥＳ）に取り込まれやすいため、血中滞留時間が短くＲＥＳ以外の組織をターゲットする場合には有効に利用できないという問題点があった。
また、タンパク質の反応性、特に抗原−抗体反応を利用して薬剤を必要とされる作用部位に集積させるミサイル療法剤として、リポソームに薬剤を封入しその表面に抗体を結合する方法、すなわち抗体結合リポソームが提案されている。しかし、リポソームの一般的性質、すなわち内封物のもれ、凝集および肝臓や脾臓などの網内径器官での捕捉などの性質から、投与した抗体結合リポソームの多くが肝臓、脾臓などの網内系器官に捕捉され、十分な効果が発揮されにくいという問題がある（非特許文献１）。
【非特許文献１】
（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４７  ４４７１，１９８７）。
【０００３】
この細網内皮系細胞への捕捉を回避するための方法としてリポソームにポリエチレングリコールを結合させる方法が知られている（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。しかし、この方法はリポソームの表面にポリエチレングリコールを結合させることにより細網内皮系への小胞体の捕捉を回避する方法であるため、薬剤の血中滞留性を上げることは出来るが、前述のミサイル療法剤のように薬物をＲＥＳ以外の特定の部位に集積させることは出来なかった。
【特許文献１】
特開平１−２４９７１７号公報
【特許文献２】
特開平２−１４９５１２号公報
【特許文献３】
特表平５−５０５１７３号公報
【０００４】
このため、これらの解決手段としてリポソームの表面にポリエチレングリコール鎖を導入して血中滞留性をあげつつ、さらに表面に抗体を導入し特定部位へ薬剤を運搬することを可能にしたリポソーム（特許文献４）が提案されている。この方法は、リポソームの表面に抗体と反応可能なマレイミド基を導入し、そこに抗体のチオール基を部分的に反応させ、さらにその後余ったマレイミド基にチオール基を持つ２鎖型ポリエチレングリコール誘導体を反応させるものである。ＲＥＳへの取り込みを回避しつつ薬剤を特定の部位に集中的に運搬できる非常に有用な方法である。
【特許文献４】
特開平４−３４６９１８号公報
また、特許文献４には、チオール基含有２鎖型ポリエチレングリコール誘導体の合成方法について記載されているが、純度については記載もなく、方法もごく少量のサンプルを合成する方法であり、非常に多くの工程を要するため、工業的に生産することが困難なものである。
【０００５】
一方、特許文献４では、チオール基含有２鎖型ポリエチレングリコール誘導体の出発原料として、２，４−ビスーメトキシポリエチレングリコール−６−クロロ−ｓ−トリアジン（以下ＰＥＧ２−Ｃｌと略す）を用いている。この化合物は酵素などの生理活性蛋白質と反応させるための誘導体として知られるもので（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）、その製法については特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９等に記載されており、これらはすべて酵素修飾用のＰＥＧ２−Ｃｌをいかに高純度に製造するかについて検討されたものである。
【非特許文献２】
Ｅｎｚｙｍｅ  ２６：４９−５３，  Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  ＮＩｓｈｉｍｕｒａｅｔａｌ，  １９８１
【非特許文献３】
Ｇａｎｎ，  ７３，４７０−４７４，  ＹｏｓｈｉｎｏｒｉＫａｍｉｓａｋａｅｔ  ａｌ，  １９８２
【非特許文献４】
Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｖｏｌ  ３３，，Ｎｏ１５，  １４６７−１４７３，  Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔａｌ，１９８３
【非特許文献５】
Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （Ｇａｎｎ），  ７７，１２６４−１２７０；Ｔａｋａｙｕｋｉ  Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔａｌ，  １９８６
【特許文献５】
特願昭６３−１４９００４号公報
【特許文献６】
特願平１−７９７４８号公報
【特許文献７】
特願昭６３−１１９２７７号公報
【特許文献８】
特開昭６３−１２６９００号公報
【特許文献９】
特開昭６２−１１５２８０号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、チオール基含有２鎖型ポリエチレングリコールのような特定の化合物の出発物質としてＰＥＧ２−Ｃｌを用いる場合、酵素修飾用途では問題にならない量のＰＥＧ２−Ｃｌ中の少量不純物も、そこから目的物と類似の化合物が生成する。
そして、公知のチオール基含有２鎖型ポリエチレングリコールによってリポソームを修飾した場合に、例えば製造スケールや製造時のポリエチレングリコール原料の仕込み量が変化すると、リポソームの力価が変化する可能性があった。医療用途では、薬品の力価を一定に保持することが、所望の効能を確保し、副作用の発現を抑制する上できわめて重要である。それにも関わらず、これまでチオール基含有２鎖型ポリエチレングリコール原料について、いかなる管理を行えば、最終的に得られるリポソームの力価を、医薬品として許認可可能な水準の安定性をもって製造できるのかは検討されてこなかった。このため、この種の表面修飾リポソームは、多様な効能を期待されながらも、医薬品として許認可可能かつ量産可能な体制を構築することが不可能であり、ブレークスルーが求められていた。
【０００７】
本発明の課題は、リポソームのような生体物質の表面修飾に有用であり、生体物質の力価の安定性を向上させ得るような、ＳＨ基含有ポリオキシアルキレングリコール誘導体を提供することである。
【０００８】
また、本発明の課題は、リポソームのような生体物質の表面修飾に有用であり、生体物質の力価の安定性を向上させ得るような、ＳＨ基含有ポリオキシアルキレングリコール誘導体を製造するのに好適な方法を提供することである。
また、本発明の課題は、リポソームのような生体物質の表面修飾に有用であり、生体物質の力価の安定性を向上させ得るようなＳＨ基含有ポリオキシアルキレングリコール誘導体を製造するのに適した中間体を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、式（Ｉ）
【化７】
2004196675.tif 000002
（ただし、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、ＥＯはオキシエチレン基、Ｒ１およびＲ２は炭素数１〜７の炭化水素基、ｍとｎ、ｘとｙはそれぞれ、炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数で、０≦ｍ＋ｎ≦２００、１０≦ｘ＋ｙ≦１５００、（ｎ＋ｍ）／（ｎ＋ｍ＋ｘ＋ｙ）≦０．５を満足する数である。炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い）
で示される化合物の実効ＳＨ指数（Ｐ）が８５≦Ｐ≦１１０であることを特徴とする、ＳＨ基を有するポリオキシアルキレングリコール誘導体に係るものである。
【００１０】
このような特定の実効ＳＨ指数を有するポリオキシアルキレングリコール誘導体は、リポソームのような生体物質の表面修飾に使用したときに、生体物質の力価の安定性を向上させることが可能である。例えば、製造ロット、製造スケールが変動したときや、生体物質に対するポリオキシアルキレングリコール誘導体原料の仕込み量の比率が変動したときに、生体物質の力価の変動を抑制できる。このように実効ＳＨ指数を管理することで、最終的に得られるリポソームの力価を、医薬品として許認可可能な水準の安定性をもって製造できる。この結果、医薬品として許認可可能かつ量産可能な体制を構築することが可能になり、産業上の寄与は大きい。
【００１１】
また、本発明は、リポソームと、リポソームの表面に結合したポリオキシアルキレングリコール誘導体とを有する表面修飾リポソームを製造する方法であって、
リポソームとポリオキシアルキレングリコール誘導体原料とを反応させる前に、前記式（Ｉ）で示される化合物の下記数式１による実効ＳＨ指数（Ｐ）を測定することを特徴とする、表面修飾リポソームの製造方法に係るものである。
【００１２】
実効ＳＨ指数（Ｐ）について述べる。実効ＳＨ指数（Ｐ）は、生体物質の原料となるポリオキシアルキレングリコール誘導体について、得られた修飾後の生体物質の力価に対して与える影響の観点から、本発明者が開発した管理指標である。
【００１３】
以下、式（Ｉ）の化合物の概要について説明し、次いで実効ＳＨ指数（Ｐ）の技術的意味について述べることとする。
（式（Ｉ）の化合物の説明）
式（Ｉ）において、ＡＯで示される炭素数３〜４のオキシアルキレン基としてはオキシプロピレン基、オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基が挙げられる。
Ｒ１およびＲ２で示される炭素数１〜７の炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第三ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、フェニル基、ベンジル基などが挙げられる。Ｒ１およびＲ２の炭素数が７より大きくなると界面活性能が出てくるため、細胞毒性等が出やすくなるので好ましくない。Ｒ１およびＲ２の炭素数が７以下であればエチレンオキシドの付加モル数にもよるが界面活性の影響は少ないので特に使用上問題とはならないが、好ましくは炭素数１〜４の炭化水素基、特に好ましくはメチル基である。
【００１４】
式（Ｉ）で示される炭素数３〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数は０≦ｍ＋ｎ≦２００であり、オキシエチレン基の平均付加モル数は１０≦ｘ＋ｙ≦１５００であり、全ポリエーテル鎖中のオキシアルキレン鎖の割合である（ｍ＋ｎ）／（ｎ＋ｍ＋ｘ＋ｙ）は（ｍ＋ｎ）／（ｎ＋ｍ＋ｘ＋ｙ）≦０．５である。
エチレンオキシドの平均付加モル数であるが１５００を超えると粘度が高くなりすぎ、ハンドリングが困難になるので好ましくなく、１０より少なくなるとＲＥＳ回避性能が悪くなるので好ましくない。好ましい範囲は８０≦ｘ＋ｙ≦１０００である。
炭素数３〜４のオキシアルキレン基は、リポソーム表面の親水性と疎水性のバランスを調整するために導入しても良いが、多すぎると親油性が高くなりすぎ、またプロペニル化合物の副生の無いものが得られにくくなるため好ましくなく、炭素数３〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数であるｍとｎは、０≦ｍ＋ｎ≦２００、かつ全ポリエーテル鎖中のオキシアルキレン鎖の割合である（ｎ＋ｍ）／（ｎ＋ｍ＋ｘ＋ｙ）が０≦（ｎ＋ｍ）／（ｎ＋ｍ＋ｘ＋ｙ）≦０．５であることが必要である。好ましくは、０≦ｍ＋ｎ≦１００、かつ（ｍ＋ｎ）／（ｎ＋ｍ＋ｘ＋ｙ）≦０．３である。
【００１５】
（実効ＳＨ指数（Ｐ））
実効ＳＨ指数（Ｐ）は８５≦Ｐ≦１１０であり、好ましくは９０≦Ｐ≦１１０であり、特に好ましくは９５≦Ｐ≦１００である。式（Ｉ）で示される化合物において、チオール基の含有率を基準とした実効ＳＨ指数（Ｐ）は数式１により計算する。
実効ＳＨ指数（Ｐ）＝（実測ＳＨ価／理論ＳＨ価）×１００    （数式１）
【００１６】
数式１で使用する「実測ＳＨ価」は、式（Ｉ）で示される化合物に４，４−ジチオピリジン（４−ＰＤＳ）を反応させ、生成する４−チオピリドンを分光光度計を用いて定量することにより求めることができる。具体的には以下のプロセスによって測定できる。
【００１７】
（希釈液の調整）
リン酸二水素ナトリウム１５．６ｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム０．３７ｇをイオン交換水９００ｍｌに加え完全に溶解する。つづいて３０％ＮａＯＨを用いてｐＨを６．０に調整した後、再びイオン交換水を加えて全量を１リットルにする。
（４−ＰＤＳ溶液）
４，４’−ジチオピリジン（４−ＰＤＳ）１０ｍｇに２ｍｌのエタノールを加え溶解させ、１００ｍｌのメスフラスコを用いて、溶解液を加えて１００ｍｌとする。
【００１８】
（「実測ＳＨ価」の測定）
式（Ｉ）で示される化合物約１００ｍｇを５０ｍｌのメスフラスコに精密に量りとり、よく脱気した溶解液を加え正確に５０ｍｌとする。この液１０ｍｌと４−ＰＤＳ試液１０ｍｌを正確にとり５０ｍｌメスフラスコ中でよく混ぜ合わせ、室温で５〜３０分間放置した後、溶解液を加えて正確に５０ｍｌとして試料溶液とする。試料溶液につき、３２４ｎｍの吸収極大波長における吸光度Ａ（サンプル）を測定する。
別に溶解液１０ｍｌおよび４−ＰＤＳ試液１０ｍｌを試料溶液と同様に操作した液をブランク液とし、試料溶液と同じ３２４ｎｍの吸収極大波長における吸光度Ａ（ブランク）を測定する。
次式によりチオール化ポリエチレングリコールのＳＨ価を求める。
ＳＨ価（μｍｏｌ／ｇ）＝｛［Ａ（サンプル）−Ａ（ブランク）］×５×１００００００｝／［２２５００×サンプル濃度（ｍｇ／ｍｌ）］
２２５００：３２４ｎｍの吸収極大波長における４−チオピリドンのモル吸光係数
「理論ＳＨ価」は式（１）化合物の理論分子量から次式により計算できる。
理論ＳＨ価＝１／式（Ｉ）で示される化合物の理論分子量＊１０６
【００１９】
（実効ＳＨ指数（Ｐ）の限定の技術的意義）
実効ＳＨ指数（Ｐ）は、実測ＳＨ価の理論ＳＨ価に対する比率である。これは、式（Ｉ）の化合物系原料について、生体物質の力価への影響を考慮して本発明者が開発した指標である。
式（Ｉ）の化合物は、ピリジン環の３つのパラ位置に、２つのアルキレングリコール側鎖と、１つの末端ＳＨ側鎖とを有する構造である。この構造を単純化して下に表記する。
【００２０】
【化８】
2004196675.tif 000003
【００２１】
上式では、アルキレングリコール鎖を「グリコール鎖」と表記し、末端がＳＨ基の側鎖を「側鎖ＳＨ」と表記した。これが例えばリポソーム（Ｌ）と反応すると、リポソーム表面の脂質二重膜には、ピリジン環を介して２つのグリコール鎖が広がる形となる。このような形態が生理活性を発現するものと期待される。
これに対して、ポリオキシアルキレングリコール誘導体原料中には、不可避的に式（Ｗ）のように、一つのグリコール鎖と二つの側鎖ＳＨ基とを有する化合物が混合されている。式（Ｗ）の化合物の具体的な構造を式に示す。
【００２２】
【化９】
2004196675.tif 000004
【００２３】
この化合物（Ｗ）がリポソーム（Ｌ）と反応すると、反応後にもピリジン環には一つの側鎖ＳＨ基が残留する。この構造ではリポソーム表面に所望の形態が導入されていないので、生理活性が得られない。その上、ピリジン環に残留する側鎖ＳＨ基が、他のリポソームと反応する可能性もある。
一方、式（Ｖ）のように、ピリジン環に３個のグリコール鎖が結合した化合物も生じやすい。この化合物はリポソームと反応しない。この化合物の構造を下に示す。
【００２４】
【化１０】
2004196675.tif 000005
【００２５】
ポリオキシアルキレングリコール誘導体原料には、例えば上記のような種々の化合物が含有されている。ここで、式（Ｗ）（Ｖ）を徹底的に取り除くといった考え方もあり得るが、そのためには複雑な限外濾過工程を繰り返すことが必要であり、実際上は困難と考えられる。また、このような複雑な限外濾過による生成プロセスを行ったものとしても、得られた原料を利用して最終的に製造された生体物質、例えば表面修飾リポソームが、所望の力価を有するかどうかは不明瞭であり、製造ロット、製造スケール、原料化合物の仕込み量などに応じて変動する可能性がある。
【００２６】
本発明者は、上記の観点から、原料のＳＨ価を実測し、式（Ｉ）から算出される理論ＳＨ価で除することによって実効ＳＨ指数（Ｐ）を算出し、実効ＳＨ指数（Ｐ）を管理指標とすることを想到した。
これによって、最終的に得られるリポソームの力価を、医薬品としても許認可可能かつ量産可能な体制を構築することが可能となった。
【００２７】
実効ＳＨ指数（Ｐ）が８５未満ということは、チオール基を持たない不純物（例えば式（Ｖ））が多いということを示しており、例えばリポソームの表面のマレイミド基と結合できる式（Ｉ）化合物の量が減るため、血中滞留性が落ちたり、リポソームと結合させた後にこれらの不純物を除去するために多大の精製工程を必要とする可能性がある。
【００２８】
実効ＳＨ指数（Ｐ）が１１０を超えるということは、原料として使用するシステインやシスチンから誘導される低分子のチオール基を含有する不純物や、原料として使用する式（ＩＩ）化合物に含まれる式（ＩＩ−１）化合物から誘導される高分子チオール化合物を多く含んでいるということを示している。これらの不純物はリポソームの表面のマレイミド基と式（ＩＩ）で示される化合物の代わりに結合する。こうした不純物がリポソームに結合する結果、リポソームの力価が低下するものと思われる。
【００２９】
【化１１】
2004196675.tif 000006
【００３０】
なお、実効ＳＨ指数（Ｐ）は、単なる式（Ｉ）の化合物の純度とは異なるものである。例えば化８を参照して説明する。式（Ｉ）の純度が一定値であってとしても、式（Ｗ）化合物が多く、式（Ｖ）化合物がその分少ない場合には、側鎖ＳＨ基が多いわけであるから、実効ＳＨ指数（Ｐ）は上昇する。また、式（Ｗ）化合物が少なく、式（Ｖ）化合物がその分多くなった場合には、側鎖ＳＨ基が少なくなるわけであるから、実効ＳＨ指数（Ｐ）は低下する。
【００３１】
好適な実施形態においては、ゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）により示差屈折計（ＲＩ検出器）で式（Ｉ）で示される化合物の分子量分布を測定するとき、主成分含有量（Ｒ）が８５％以上である。Ｒは、特に好ましくは９０％以上である。
主成分含有量（Ｒ）が８５％未満であることは、式（ＩＩ）で示される化合物中に含まれる式（ＩＶ）化合物（後述）や、式（ＩＩ−１）化合物から誘導されるチオール化合物、下記式（ＩＩ−２）に示されるような目的物より高分子の化合物を多く含んでいることを示している。これらの不純物は除去することが困難であるため、医薬品として使用するには問題がある。
【００３２】
【化１２】
2004196675.tif 000007
【００３３】
主成分含有量（Ｒ）は以下の方法で測定を行うことができる。
装置：Alliance（waters）
検出器（ＲＩ）：waters 410
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ４０００ＨＸＬ＋ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＨＸＬ  （東ソー）
展開液：ＴＨＦ
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
サンプル濃度（インジェクション量）：50ｍｇ／10ｍｌ（１０μｌ）
カラム温度：４０℃
主成分含有量（Ｒ）は、ＧＰＣの溶出曲線を下記のように定義する時（図１参照）、次のように計算できる。
主成分含有量（Ｒ）＝主成分ａｒｅａ／全ａｒｅａ＊１００
この時、溶剤由来のピークは除いて計算する。
頂点：溶出曲線の屈折率最大点
変曲点Ａ：頂点から溶出開始点に向かっていくとき屈折率が減少していき最初の上昇に変わる点を変曲点Ａとする。ただし、変曲点より屈折率の大きいピークがない場合、溶出開始点を変曲点Ａとする。
変曲点Ｂ：頂点から溶出終了点に向かっていくとき屈折率が減少していき最初の上昇に変わる点を変曲点Ｂとする。ただし、変曲点より屈折率の大きいピークがない場合、溶出終了点を変曲点Ｂとする。
ベースライン：溶出開始点と溶出終了点を結ぶ直線
Ａ‘：変曲点Ａからベースラインに向かっておろした垂線とベースラインとの交点
Ｂ‘：変曲点Ｂからベースラインに向かっておろした垂線とベースラインとの交点
主成分ａｒｅａ：Ａ‘変曲点Ａ，頂点，変曲点Ｂ，Ｂ’で囲まれる面積
全ａｒｅａ：ベースラインと溶出曲線で囲まれる面積
【００３４】
好適な実施形態においては、式（Ｉ）で示される化合物にジチオビスニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を反応させて、ＧＰＣで紫外吸光検出器（ＵＶ検出器）を用いて検出器波長を３００ｎｍに固定して分子量分布を測定するとき、主成分含有量（Ｕ）が９８％以上である。特に好ましくは９９％以上である。
【００３５】
主成分含有量（Ｕ）が９８％より低いと、式（ＩＩ）で示される化合物中に含まれる式（ＩＩ−１）化合物から誘導されるチオール化合物や、チオール基を持つ式（Ｉ）で示される化合物より高分子の化合物を多く含んでいることを示している。特にこれらのチオール基をもった化合物はリポソーム表面のマレイミド基と式（Ｉ）で示される化合物を反応させる際に、式（Ｉ）で示される化合物の代わりに反応してしまうので好ましくない。
【００３６】
主成分含有量（Ｕ）は以下の方法で測定することができる。
（サンプル溶液の調整）
式（Ｉ）で示される化合物２５ｍｇを５０ｍｌスクリュー管に正確に秤取り、ＴＨＦ５ｍｌを加え加温し溶解させる。次いでジチオビスニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を１０ｍｇ加え密栓し５０℃、１時間スターラーで攪拌する（この溶液をサンプル溶液とする）。
（測定条件）
装置：Alliance（waters）
検出器（ＵＶ）：waters 2487  （測定波長：３００ｎｍ）
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ４０００ＨＸＬ＋ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＨＸＬ  （東ソー）
展開液：ＴＨＦ
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
サンプル濃度（インジェクション量）：２５ｍｇ／５ｍｌ（１０μｌ）
カラム温度：４０℃
主成分含有量（Ｕ）は、ＧＰＣの溶出曲線を下記のように定義する時（図１参照）、次のように計算できる。
主成分含有量（Ｕ）＝主成分ａｒｅａ／全ａｒｅａ＊１００
この時、溶剤や未反応ＤＴＮＢ由来のピークは除いて計算する。
頂点：溶出曲線の屈折率最大点
変曲点Ａ：頂点から溶出開始点に向かっていくとき屈折率が減少していき最初の上昇に変わる点を変曲点Ａとする。ただし、変曲点より屈折率の大きいピークがない場合、溶出開始点を変曲点Ａとする。
変曲点Ｂ：頂点から溶出終了点に向かっていくとき屈折率が減少していき最初の上昇に変わる点を変曲点Ｂとする。ただし、変曲点より屈折率の大きいピークがない場合、溶出終了点を変曲点Ｂとする。
ベースライン：溶出開始点と溶出終了点を結ぶ直線
Ａ‘：変曲点Ａからベースラインに向かっておろした垂線とベースラインとの交点
Ｂ‘：変曲点Ｂからベースラインに向かっておろした垂線とベースラインとの交点
主成分ａｒｅａ：Ａ‘、変曲点Ａ，頂点，変曲点Ｂ，Ｂ’で囲まれる面積
全ａｒｅａ：ベースラインと溶出曲線で囲まれる面積
【００３７】
（式（ＩＩ）の化合物）
また、本発明は、式（ＩＩ）
【化１３】
2004196675.tif 000008
（ただし、ＡＯ、ＥＯ、Ｒ１、Ｒ２、ｍ、ｎ、ｘ、ｙは前述したものと同じである）で示される化合物を主成分とするポリオキシアルキレングリコール誘導体であって、ゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）により示差屈折計（ＲＩ検出器）で測定するとき、式（ＩＩ）で表される化合物より高分子量の化合物の含有量（ＲＩＩＨ）が５％以下であることを特徴とする、ポリオキシアルキレングリコール誘導体に係るものである。
【００３８】
また、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物を製造するのに際して、式（ＩＩ）で示される化合物を主成分とする原料を使用し、この原料をゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）により示差屈折計（ＲＩ検出器）で測定するとき、式（ＩＩ）で表される化合物より高分子量の化合物の含有量（ＲＩＩＨ）が５％以下であることを特徴とする、ポリオキシアルキレングリコール誘導体の製造方法に係るものである。また、本発明は、本方法によって得られた、ＳＨ基を有するポリオキシアルキレングリコール誘導体に係るものである。
【００３９】
即ち、式（Ｉ）で示されるポリオキシアルキレングリコール誘導体を得るためには、原料として式（ＩＩ）で示される化合物を用いることが好ましい。
ここで、式（ＩＩ）で示される化合物は、下記条件で示差屈折計を用いてＧＰＣを測定するとき、主成分より高分子の化合物の含有量（ＲＩＩＨ）が５％以下であることが好ましい。特に好ましくは３％以下である。
主成分より高分子の化合物が５％より多いと、精製により式（Ｉ）で示される化合物の実効ＳＨ指数を上げることが難しくなるので好ましくない。
【００４０】
主成分より高分子の化合物の含有量（ＲＩＩＨ）は以下の方法で測定することができる。
装置：SHODEX GPC System-11（昭和電工）
検出器（ＲＩ）：RI-71  （昭和電工）
カラム：  SHODEX KF-804L×３  （昭和電工）
展開液：ＴＨＦ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
サンプル濃度（インジェクション量）：10ｍｇ／10ｍｌ（１00μｌ）
カラム温度：４０℃
【００４１】
主成分より高分子量の化合物の含有量は以下のように定義できる。（図１参照）。
高分子量化合物含有量（ＲＩＩＨ）＝高分子化合物ａｒｅａ／全ａｒｅａ＊１００
この時、溶剤由来のピークは除いて計算する。
頂点：溶出曲線の屈折率最大点
変曲点Ａ：頂点から溶出開始点に向かっていくとき屈折率が減少していき最初の上昇に変わる点を変曲点Ａとする。ただし、変曲点より屈折率の大きいピークがない場合、溶出開始点を変曲点Ａとする。
ベースライン：溶出開始点と溶出終了点を結ぶ直線
Ａ‘：変曲点Ａからベースラインに向かっておろした垂線とベースラインとの交点
高分子量化合物ａｒｅａ：溶出開始点，変曲点Ａ，Ａ‘で囲まれる面積
全ａｒｅａ：ベースラインと溶出曲線で囲まれる面積
【００４２】
好適な実施形態においては、原料として用いる式（ＩＩ）で示される化合物の分子量分布を、紫外吸収検出器を用いて波長を２５４ｎｍに固定して測定するとき、主成分より低分子の化合物の含有量（ＵＩＩＬ）が１％以下である。
紫外吸収を持つ化合物が１％より多いということは、式（ＩＩ−１）のような化合物を多く含んでいることを示している。このような化合物が多いと、式（Ｉ）で示される化合物を得る反応の際に目的物と異なるチオール基を持つ化合物が多くなり精製に困難を伴うので好ましくない。
【００４３】
【化１４】
2004196675.tif 000009
【００４４】
主成分より低分子の化合物の含有量（ＵＩＩＬ）は以下の方法で測定することができる。
装置：Shodex GPC System-11（昭和電工）
検出器（ＵＶ）：UV−４１  （昭和電工，測定波長：２５４ｎｍ）
カラム：SHODEX KF-804L×3
展開液：ＴＨＦ
流速：1.0 ｍｌ／ｍｉｎ
サンプル濃度（インジェクション量）：10ｍｇ／10ｍｌ（１０μｌ）
カラム温度：４０℃
低分子量化合物含有量（ＵＩＩＬ）＝低分子量ａｒｅａ／全ａｒｅａ＊１００
この時、溶剤由来のピークは除いて計算する。
頂点：溶出曲線の屈折率最大点
変曲点Ｂ：頂点から溶出終了点に向かっていくとき屈折率が減少していき最初の上昇に変わる点を変曲点Ｂとする。ただし、変曲点より屈折率の大きいピークがない場合、溶出終了点を変曲点Ｂとする。
ベースライン：溶出開始点と溶出終了点を結ぶ直線
Ｂ‘：変曲点Ｂからベースラインに向かっておろした垂線とベースラインとの交点
低分子量ａｒｅａ：変曲点Ｂ，Ｂ’溶出終了点で囲まれる面積
全ａｒｅａ：ベースラインと溶出曲線で囲まれる面積
【００４５】
（式（ＩＩ）の化合物の好適な製造法）
また，本発明は、式（ＩＩ）で示される化合物を製造する方法であって、
不純物である式（ＩＩＩ）の化合物の含有量が５％以下である式（ＩＶ）化合物を原料とし、塩化シアヌルとを反応させることを特徴とする方法に係るものである。
ＨＯ｛（ＥＯ）ｄ（ＡＯ）２Ｃ（ＥＯ）ｄ｝Ｈ    式（ＩＩＩ）
ＲＯ｛（ＡＯ）ｃ（ＥＯ）ｄ｝Ｈ      式（ＩＶ）
（ＥＯはオキシエチレン基、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、Ｒは炭素数１〜７の炭化水素基、ｃとｄはそれぞれ、炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基の平均付加モル数で、０≦ｃ≦２００、１０≦ｄ≦１５００、ｃ／（ｃ＋ｄ）≦０．５を満足する数である。炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していても良い。）
【００４６】
式（ＩＩ）で示される化合物を前述のように高実効ＳＨ指数の形で得るためには、原料として、不純物である式（ＩＩＩ）化合物の含有量が５％以下である式（IV）化合物を使用し、これを塩化シアヌルと反応させることが好ましい。
式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）において、ＡＯで示される炭素数３〜４のオキシアルキレン基としてはオキシプロピレン基、オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基が挙げられる。
【００４７】
また、Ｒで示される炭素数１〜７の炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第三ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、フェニル基、ベンジル基などが挙げられる。Ｒの炭素数が７より大きくなると界面活性能が出てくるため、細胞毒性等が出やすくなるので好ましくない。Ｒの炭素数が７以下であればエチレンオキシドの付加モル数にもよるが界面活性の影響は少ないので特に使用上問題とはならないが、好ましくは炭素数１〜４の炭化水素基、特に好ましくはメチル基である。
エチレンオキシドの平均付加モル数であるｄは１０≦ｄ≦１５００であり、１５００を超えると粘度が高くなりすぎハンドリングが困難になるので好ましくなく、１０より少なくなるとＲＥＳ回避性能が悪くなるので好ましくない。好ましい範囲は８０≦ｄ≦１０００である。
炭素数３〜４のオキシアルキレン基はリポソーム表面の親水性と疎水性のバランスを調整するために導入しても良いが、多すぎると親油性が高くなりすぎ、またプロペニル化合物の副生の無いものが得られにくくなるので炭素数３〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数であるｃは０≦ｃ≦２００、かつ全ポリエーテル鎖中のオキシアルキレン鎖の割合であるｃ／（ｃ＋ｄ）が０≦ｃ／（ｃ＋ｄ）≦０．５であることが必要である。好ましくは、０≦ｃ≦１００、かつｃ／（ｃ＋ｄ）≦０．３である。
【００４８】
式（ＩＶ）の化合物は、通常アルコールにアルキレンオキシドやエチレンオキシドを付加して得ることができる。このとき、原料アルコールや触媒、反応系中に水分が存在すると、水に炭素数３〜４のアルキレンオキシドやエチレンオキシドが付加した式（ＩＩＩ）化合物が不純物として存在することになる。このような式（ＩＩＩ）化合物は、式（ＩＶ）化合物の分子量分布をゲルパーミュエーションクロトグラフィで測定するとき、通常式（ＩＩＩ）化合物の分子量の２倍の分子量の化合物として測定される。この式（ＩＩＩ）化合物が５％を超えると、高純度な式（ＩＩＩ）で示される化合物が得にくくなるので好ましくない。
【００４９】
ゲルパーミュエーションクロマトグラフィの条件は、次の通りである。
装置：  LC-10A  （島津製作所）
カラム：Plgel  MIXED−D  ×２  （ポリマーラボラトリ）
展開液：DMF
流速：０．７ml/min
サンプル濃度：０．１３ｗｔ％
注入量：１００μｌ
カラム温度：６５℃
【００５０】
式（ＩＩＩ）化合物の含有量（ＲＩＩＩＨ）は次のような定義より算出することができる。
式（ＩＩＩ）化合物含有量（ＲＩIＩＨ）＝式（III）化合物ａｒｅａ／全ａｒｅａ＊１００
この時、溶剤由来のピークは除いて計算する。
頂点：溶出曲線の屈折率最大点
変曲点Ａ：頂点から溶出開始点に向かっていくとき屈折率が減少していき最初の上昇に変わる点を変曲点Ａとする。ただし、変曲点より屈折率の大きいピークがない場合、溶出開始点を変曲点Ａとする。
ベースライン：溶出開始点と溶出終了点を結ぶ直線
Ａ‘：変曲点Ａからベースラインに向かっておろした垂線とベースラインとの交点
式（III）化合物ａｒｅａ：溶出開始点，変曲点Ａ，Ａ‘で囲まれる面積
全ａｒｅａ：ベースラインと溶出曲線で囲まれる面積
【００５１】
好適な実施形態においては、反応希釈溶剤として芳香族炭化水素（好ましくは沸点５０〜１５０℃）、触媒として窒素原子含有複素環化合物を用い、式（ＩＶ）化合物１モルに対して塩化シアヌル０．４〜０．６モルを反応させる。この方法は、式（ＩＩ）の化合物を高純度で得る上で好適である。
【００５２】
芳香族炭化水素の量は、式（ＩＶ）化合物の５０〜２０００重量％であることが好ましい。窒素原子含有複素環化合物の量は、式（ＩＶ）化合物１モルに対して１〜３モルであることが好ましい。
芳香族炭化水素としては、トルエンが好ましい。
【００５３】
窒素原子含有複素環化合物としては、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、イミダゾールなどが挙げられ、特に好ましくはピリジンである。
この時、芳香族炭化水素の量が１００重量％より少ないと、式（ＩＶ）化合物が高分子量である場合に粘度が高くなる。芳香族炭化水素量が多くても反応に関しては特に問題は無いが、あまりに多すぎると反応終了後の脱溶剤時に時間が掛かりすぎたり、収率が落ちる等の問題が出る可能性があるので、現実的範囲は２０００重量％以下である。好ましい範囲は１００重量％〜５００重量％である。
触媒として使用する前記窒素原子含有複素環化合物の量が、式（ＩＶ）化合物１モルに対して１モルより少ないと反応がうまく進まず、式（ＩＩ−１）化合物および未反応式（IV）化合物の量が増加する傾向がある。また３モルより多くなると、反応が進みすぎて、式（ＩＩ）で示される化合物より高分子量の式（Ｖ）のような化合物が増える傾向がある。一層好ましい範囲は、式（ＩＶ）化合物に対して１．５〜２．５モル、特に好ましくは１．８〜２．２モルの範囲である。
【００５４】
【化１５】
2004196675.tif 000010
【００５５】
塩化シアヌルは式（ＩＶ）化合物１モルに対して、０．４モルより少ないと、式（Ｖ）化合物のような式（ＩＩ）で示される化合物より高分子量の化合物が増える傾向がある。０．６モルより多いと、式（ＩＩ−１）化合物が増える傾向がある。一層好ましくは０．４３モル〜０．５７モル、特に好ましくは０．５０モル〜０．５４モルである。
【００５６】
好適な実施形態においては、（ａ）  式（ＩＶ）の化合物と芳香族炭化水素との混合溶液に、塩化シアヌルを入れ、５０〜１１０℃で１〜５時間攪拌する工程を行う反応工程、および（ｂ）  窒素原子含有複素環化合物を芳香族炭化水素で５〜１００重量倍に希釈して（Ｉ）の反応系に入れる工程を行う。これは、式（ＩＩ）で示される化合物の実効ＳＨ指数を高くするという観点から好適である。
【００５７】
温度が５０℃より低いと、無触媒での１次反応が起こりにくく、１００℃を越えると式（Ｖ）化合物が出来やすくなる。更に好ましい温度は６０〜９０℃、特に好ましくは７０〜８０℃である。無触媒反応を充分に進行させるためには、工程は少なくとも１時間以上必要である。１時間未満では反応が充分に進行しないので好ましくない。無触媒反応の時間は１時間以上であれば何時間でも良いが、あまり長くなると作業効率が落ちるので、好ましくは１〜５時間、特に好ましくは２〜３時間である。
触媒である前記窒素原子含有複素環化合物は、そのまま原体を直接添加すると、反応系のなかで添加直後に触媒濃度の不均一が起こりやすくなり、式（Ｖ）化合物ができやすくなることがある。触媒を反応系に均一に分散させるためには、触媒を反応希釈溶剤である芳香族炭化水素で５〜１００重量倍に希釈して滴下することが好ましい。希釈倍率が５倍より小さいと希釈の効果がえられにくい。希釈倍率が多くても反応系での式（ＩＶ）化合物と塩化シアヌルと芳香族炭化水素の濃度に影響を与えない範囲であれば特に問題は無いが、希釈倍率が１００倍を超えると滴下量が多くなりすぎ作業効率がおちるので適当な範囲は５〜１００重量倍である。好ましくは１０〜５０重量倍、特に好ましくは１５〜３０重量倍である。
【００５８】
式（ＩＩ）で示される化合物の精製は、反応液を減圧下脱溶剤したり、ヘキサンやエーテルなどの非極性溶剤とクロロホルムやイソプロピルアルコールなどの極性溶剤を用いて公知の方法で晶析および乾燥することによって行なうことができる。
【００５９】
（式（ＩＩ）の化合物から式（Ｉ）の化合物の合成）
式（ＩＩ）で示される化合物を用いて、式（Ｉ）で示される化合物をたとえば以下のようにして得ることができる。
【００６０】
（合成法１：式（ＩＩ）で示される化合物とシステインとの反応）
好適な実施形態においては、式（ＩＩ）で示される化合物１モルに対してシステイン１．０〜１００モルをｐＨ＝７．０〜１２．０の緩衝液中で反応させる反応工程（Ａ）、および（Ｂ）分画分子量が下記数式２で示される計算式の範囲内である限外濾過膜を用いて限外濾過する限外濾過工程（Ｂ）
（式（ＩＩ）で示される化合物の分子量−１１３．５）／２×０．５≦分画分子量≦式（ＩＩ）で示される化合物の分子量×０．８    （数式２）
を実施する。
【００６１】
（Ａ）工程においては、式（ＩＩ）で示される化合物の１．０〜１００倍モルのシステインをｐＨ７．０〜１２．０の緩衝液に溶解させ、式（ＩＩ）で示される化合物をそのままあるいは０．５〜５倍に水で希釈して加えることによって反応を行なうことが出来る。
この時、システインの量は、式（ＩＩ）で示される化合物と充分に反応するだけあればよい。システインが式（ＩＩ）で示される化合物の１．０倍モルより少ないと未反応の式（ＩＩ）で示される化合物が多くなり好ましく無く、あまり多くなると未反応システインの除去に困難を伴うので、１．０〜１００倍モルが適当である。好ましい範囲としては５〜５０倍モル、特に好ましくは１０〜２０倍モルである。
【００６２】
（反応物の精製）
（Ａ）の反応系中には、未反応の原料や式（ＩＩ）で示される化合物中に存在した式（ＩＶ）などで示される不純物や式（ＩＩ−１）などの不純物に由来する主成分より低分子量の副生物、反応に使用した緩衝液に由来する無機塩などが存在する。これらの不純物は、限外濾過膜を用いて限外濾過することにより除くことができる。このとき、使用する限外濾過膜の分画分子量は下記数式２の範囲であることが好ましい。
（式（ＩＩ）で示される化合物の分子量―１１３．５）／２×０．５≦分画分子量≦式（ＩＩ）で示される化合物の分子量×０．８    （数式２）
数式２において、（式（ＩＩ）で示される化合物の分子量―１１３．５）／２は、式（ＩＩ）で示される化合物を製造するときに使用した式（IV）化合物の分子量を示している。
【００６３】
分画分子量が（式（ＩＩ）で示される化合物の分子量―１１３．５）／２×０．５より小さいと、未反応のシステインや無機塩などは除去することができるが、式（ＩＩ）で示される化合物中に存在した式（IV）などで示される不純物や式（ＩＩ−１）などの不純物に由来する主成分より低分子の副生物などの化合物は除去することが困難になるので好ましくない。また、分画分子量が式（ＩＩ）で示される化合物の分子量×０．８より大きいと、前述の不純物を除去することはできるが、同時に目的物である式（Ｉ）で示される化合物も膜を通り抜けてしまうので、収率が落ちるだけではなく、相対的に式（Ｖ）化合物が濃縮されることになり目的物の純度も低下するで好ましくない。
【００６４】
また、限外濾過に際しての初期サンプル濃度および限外濾過での濃縮率は、使用する式（ＩＩ）で示される化合物の分子量や限外濾過回数によっても異なるので規定できないが、あまり初期濃度が高いと濃縮率を上げることが困難になり、その結果濃縮率が低くなると不純物の除去効率が悪くなる。また濃縮率を上げるために最終濃度をあげると溶液粘度があがり目的物も不純物と一緒に限外濾過膜から抜けやすくなるので好ましくない。目安としては、反応に使用した式（ＩＩ）で示される化合物を基準として、初期濃度を１〜５％としたものを、２〜８倍濃縮するのが好ましい。特に好ましくは、初期濃度２〜４％で、３〜５倍濃縮である。
【００６５】
好適な実施形態においては、反応工程（Ａ）によって得られた反応物をクレランド試薬を用いて還元する還元工程（Ｃ）を有しており、還元工程（Ｃ）で得られた還元物を前記限外濾過工程（Ｂ）に供する。この方法は、一層高実効ＳＨ指数の（Ｉ）化合物を得るという観点から好適である。
工程（Ｃ）および（Ｄ）においては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）などのクレランド試薬を用いて、反応中に若干副生する式（Ｉ）で示される化合物をジスルフイド結合させ、２量化した化合物を還元する。この時の反応条件としてはｐＨ５〜１０、反応温度−５〜６０℃の範囲である。好ましい範囲としてはｐＨ６〜８、反応温度０〜３０℃である。未反応のクレランド試薬や、クレランド試薬の分解物は限外濾過工程で除去することができる。クレランド試薬の添加量は、原料あるいは反応系中に含まれるジスルフィド結合を還元する量であればよく、あるいは反応中に副生するジスルフィド結合を還元する量を用いれば良く、またこれらのジスルフィド結合の量に対して過剰であってもよい。
【００６６】
また、好適な実施形態においては、限外濾過工程（Ｂ）を行った後に、得られた濾過物をクレランド試薬を用いて還元する還元工程（Ｄ）、および還元物を、分画分子量が下記数式３で示される計算式の範囲内である限外濾過膜を用いて限外濾過し、不純物を除去する限外濾過工程（Ｅ）を行う。
分画分子量≦
（式（ＩＩ）で示される化合物の分子量−１１３．５）／２×０．７  （数式３）
【００６７】
工程（Ｅ）で行う限外濾過による精製は、未反応クレランド試薬やクレランド試薬の分解物、系中の塩などを除去する目的であるので、分画分子量は数式３の範囲である必要がある。分画分子量が大きすぎると、前述の式（Ｉ）で示される化合物の漏れが起こり、その結果式（Ｖ）化合物が濃縮され、目的物の純度が低下するので好ましくない。
【００６８】
また、本発明に示す式（Ｉ）の化合物は、システインの代わりにシスチンを式（ＩＩ）で示される化合物に反応させ式（ＶＩ）の化合物とした後、クレランド試薬によりシスチン中のジスルフィド結合を還元により切断することによっても得ることが出来る。
シスチンを用いる場合は、反応終了後ｐＨを４〜７の弱酸性に調節して等電点沈殿を行うことにより、多量の未反応シスチンを除去するとその後の精製の効率が上がるので好ましい。
【００６９】
好適な実施形態においては、限外濾過工程（Ｂ）を行った後に、得られた濾過物から陰イオン交換樹脂を用いて非イオン性の不純物を除去する工程（Ｆ）を有しており、この後に前記還元工程（Ｄ）および前記限外濾過工程（Ｅ）を行う。これによって、一層高実効ＳＨ指数の式（Ｉ）の化合物が得られる。
即ち、さらに高実効ＳＨ指数の化合物を得たい場合は、（Ａ）シスチンを式（ＩＩ）で示される化合物と反応させ、式（ＶＩ）の化合物とした後、（Ｂ）分画分子量が数式２の範囲内の限外濾過膜を用いて、未反応のシスチンや式（ＩＩ）で示される化合物中に存在した式（ＩＶ）などで示される不純物や式（ＩＩ−１）などの不純物に由来する主成分より低分子の副生物、反応に使用した緩衝液に由来する無機塩などを除去する。次いで、（Ｆ）限外濾過では取りきれない式（Ｖ）化合物や式（ＩＩ）で示される化合物から副生した式（ＩＩ−２）などの目的物と同等以上の分子量を持つ非イオン性の化合物を、ＤＥＡＥ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどの弱陰イオン交換樹脂に式（ＶＩ）化合物を吸着させてから洗浄することにより除去する。次いで、式（ＶＩ）の化合物を食塩水などの無機塩水溶液で溶出させて、（Ｄ）クレランド試薬で還元し、（Ｅ）イオン交換工程や還元工程で使用した無機塩類や、還元工程で還元により発生するシステインを数式３で示される範囲の分画分子量の限外濾過膜を用いて限外濾過することにより除去する。
【００７０】
【化１６】
2004196675.tif 000011
【００７１】
（イオン交換樹脂を用いた精製）
工程（Ｆ）で行うイオン交換による精製は、たとえば次の条件で行うことができる。
（イオン交換樹脂の前処理）
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等の弱陰イオン交換樹脂はカラムに詰め、使用前に０．０１〜２ＮのＮａＯＨ水溶液を充分に流して前処理を行った後、イオン交換水で充分に洗浄しておく。この時、使用する樹脂量は使用する弱イオン交換樹脂の種類やそのイオン交換容量、式（ＶＩ）化合物の分子量等によっても異なるため特に規定できないが、目安としては式（ＶＩ）化合物の重量の１０〜１００倍量である。好ましい範囲としては２０〜５０倍量である。
【００７２】
（式（ＶＩ）化合物の吸着処理）
式（ＶＩ）化合物は、（Ｂ）の限外濾過後の水溶液をそのまま用いても良いが、一旦凍結乾燥、あるいはジクロロメタンやクロロホルムなどの塩素系溶剤を用いて抽出した後、減圧下脱溶剤するなどの方法で水分を除去した後、再度イオン交換水で一定比率に希釈して用いても良い。このときの希釈比率としては式（ＶＩ）化合物の分子量によっても異なるので特に規定されないが、濃度が高いと粘度が高くなりハンドリングが困難になるばかりではなく、イオン交換樹脂への式（ＶＩ）化合物の吸着が起こりにくくなるので好ましくなく、また極端に薄すぎると式（ＶＩ）化合物を全量イオン交換樹脂へ吸着させるために多量の水溶液を流さなければならなくなるので現実的ではない。希釈の目安としては、１〜２０重量％である。
（洗浄）
洗浄にはイオン交換水を用いる。イオン交換水を流すことにより、弱陰イオン交換樹脂に吸着しなかった化合物を洗い落とすことができる。この時使用するイオン交換水の量は、樹脂全体を充分に洗浄できる量であれば特に規定されないが、少なすぎると洗浄効果が充分でなく、多すぎると品質的には特に問題は無いが実質的には洗浄時間が長くなる等の問題が発生するので好ましくない。目安としては使用した樹脂量の１．５〜１０倍量である。
（溶出）
陰イオン交換樹脂に吸着しなかった物質を充分に洗い流したのち、ＮａＣｌやＫＣｌなどの強陽イオンを含む中性塩の水溶液を流し、イオン交換樹脂に吸着した目的物を脱離させる。この時、使用する中性塩の水溶液濃度は使用する塩の種類によっても異なるので特に限定されないが、薄すぎると水溶液を多量に流さなければならなくり現実的ではなく、濃すぎると塩の析出などの問題があり好ましくない。好ましい範囲は０．０１〜３モル／Ｌである。脱離効果を充分にするためには、最初に０．０２モル／Ｌ程度の薄い水溶液を流した後、徐々に濃度をあげると効果的である。
溶出した目的物を含む水溶液は、そのままＣ工程およびＤ工程に使用できる。
【００７３】
本発明による式（Ｉ）の化合物、あるいは本発明の製法によって得られた式（Ｉ）の化合物は医療材料に好適である。このような用途としては、リポソームの表面修飾、酵素等の生理活性蛋白質の化学修飾、細胞の表面修飾、ウィルスの化学修飾、高分子ミセル等のドラッグデリバリーシステム用の基材などが挙げられ、この中でもリポソームの表面修飾に特に好適である。この表面修飾リポソームには、更に抗体、好ましくはチオール化抗体が結合されていてよい。
【００７４】
【実施例】
以下に、製造例、実施例、比較例により本発明を詳しく説明する。
【００７５】
（製造例１：式（ＩＩ）化合物の合成）
（出発物質）
出発物質として、高純度メトキシポリエチレングリコール５０００（商品名：サンブライトMEH-50H，日本油脂株式会社製品，ピークトップ分子量5144：  CH3O（CH2CH2O）116OH）を使用した。使用した高純度メトキシポリエチレングリコ−ルのゲルパーミュエーションクロマトグラフィを図１に示す。図１より使用した高純度メトキシポリエチレングリコール中には不純物である式（ＩＩＩ）化合物がNDであることが分かる。
全area：715001
式（III）化合物area：0
式（III）化合物含有量（RIIIH）=0/715001×100=0
攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を取り付けた４つ口フラスコに、メトキシポリエチレングリコール５０００を308.7ｇ（0.06mol）を入れ、１０〜５０ｍｍHgの減圧下、窒素ガスを吹き込みながら120±10℃で2hr脱水した。ついで60℃まで冷却後窒素ガスで反応系を大気圧に戻し、300gの脱水トルエン（試薬：関東化学）をすばやく注ぎ込んで、窒素ガスをゆっくりと吹き込みながら７0±10℃で均一になるまで攪拌した。次に、塩化シアヌル（試薬：東京化成）5.7ｇ（0.031mol）を加え、70±2℃で窒素気流下3hr攪拌した。
次に、ビ−カーにピリジン（試薬：関東化学）9.48g（0.12mol）をとり脱水トルエン270gと混合した後、全量を滴下ロートに入れ、4つ口フラスコに１hrかけて滴下した。全量滴下後さらに７０±２℃で２hr攪拌した。
温度を室温まで下げ、クロロホルム300gおよびトルエン900gを加えて均一になるまで攪拌した後、全量をビーカーに移し変え攪拌しながら、ヘキサン2400gをゆっくりと注ぎ込んだ。析出する結晶を加圧濾過して取り出し、再度ビーカーに入れ、再びクロロホルム300gとトルエン900gを加えて均一になるまで攪拌した後、ヘキサン2400gを入れ１hr攪拌した。析出した結晶を加圧濾過して取り出した後、室温で真空下乾燥して、297.6gの２，４-ビス-メトキシポリエチレングリコール-6-クロロ-トリアジン：MPEG２−Cl-10000）を得た。
図２にMPEG-Cl-10000のGPC（RI）チャートを示す。図２より、得られたMPEG２−Cl−10000には目的物より高分子の化合物の含有量がＮＤであることがわかる。
全area  ：  628023      （低分子area  ：  98489）
RIIH  area  ：  0            RIIH＝0
図３にMPEG-Cl-10000のGPC（ＵＶ）チャートを示す。図３より、得られたMPEG２−Cl−10000には目的物より低分子の化合物の含有量がＮＤであることがわかる。
全area  ：  76036
UIIL  ：  0 UIIL=0
【００７６】
（製造例２：式（ＩＩ）化合物の合成）
（出発物質）
出発物質として、高純度メトキシポリエチレングリコール２０００（商品名：サンブライトMEH-２0H，日本油脂株式会社製品，ピークトップ分子量1952  ：CH3O（CH2CH2O）44OH）を使用した。使用した高純度メトキシポリエチレングリコ−ルのゲルパーミュエーションクロマトグラフィを図４に示す。図４より使用した高純度メトキシポリエチレングリコール中には不純物である式（ＩＩＩ）化合物がNDであることが分かる。
全area  ：  1048843
式（III）化合物area：0
式（III）化合物含有量（RIIIH）=0/1048843×100=0
攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を取り付けた４つ口フラスコに、メトキシポリエチレングリコール２０００を97.6ｇ（0.05mol）を入れ、１０〜５０ｍｍHgの減圧下、窒素ガスを吹き込みながら120±10℃で2hr脱水した。ついで60℃まで冷却後窒素ガスで反応系を大気圧に戻し、100gの脱水トルエン（試薬：関東化学）をすばやく注ぎ込んで、窒素ガスをゆっくりと吹き込みながら７0±10℃で均一になるまで攪拌した。次に、塩化シアヌル（試薬：東京化成）4.79ｇ（0.026mol）を加え、続いて、ビ−カーにピリジン（試薬：関東化学）7.9g（0.10mol）をとり脱水トルエン90gと混合した後、全量を滴下ロートに入れ、4つ口フラスコに１hrかけて滴下した。全量滴下後さらに同温度で２hr攪拌した。
温度を室温まで下げ、トルエン100gを加えて均一になるまで攪拌した後、全量をビーカーに移し変え攪拌しながら、ヘキサン500gをゆっくりと注ぎ込んだ。析出する結晶を加圧濾過して取り出し、再度ビーカーに入れ、再びトルエン300gを加えて均一になるまで攪拌した後、ヘキサン500gを入れ１hr攪拌した。析出した結晶を加圧濾過して取り出した後、室温で真空下乾燥して、89.8gの２，４-ビス-メトキシポリエチレングリコール-6-クロロ-トリアジン：MPEG２−Cl-4000）を得た。
得られたMPEG2-Cl-4000のGPCからRI検出器における目的物より高分子量の化合物の量は０．０７％であり、UV検出器における目的物より低分子の化合物の含有量は０．２％であった。
図５にMPEG2-Cl-4000のGPC（RI）を示す。
全area  ：  728752  （低分子area  ：  87450）
RIIHarea  ：  523
RIIH=523/728752×100=0.07
図６にMPEG2-Cl-4000のGPC（UV）を示す。
全area  ：  96868
UIILarea  ：  193
UIIL  ：  193/96868×100=0.2
【００７７】
（比較製造例１）
製造例１で原料として使用した高純度メトキシポリエチレングリコール５０００の代わりに、市販のメトキシポリエチレングリコール５０００（試薬：poly（ethylene glycol）methyl ether:型番20,251-7,Mw=5000: Aldrich製、ピークトップ分子量：４９７４  ：CH3O（CH2CH2O）112OH）を使用して、実施例１と同様の方法でM−PEG2-Cl−10000の製造を行った。
使用した市販メトキシポリエチレングリコール５０００のGPCチャートを図７に示す。
図７より、使用した市販メトキシポリエチレングリコール中には、11.8％の高分子量化合物を含んでいることがわかる。
全area  ：  1091678
式III化合物area  ：  129190 RIIIH＝129190/1091678×100=11.8
得られたMPEG2-Cｌ-10000のGPCチャート（RI）を図８に示す。
全area  ：  988592 （低分子area  ：  160488）
RIIIHarea  ：  197075 RIIH=187075/988592×100=18.9
得られたMPEG2-Cl-10000のGPCチャート（UV）を図９に示す。
全area  ：  102312
UIILarea  ：  1443  UIIL＝5443/102312×100=1.4
得られたMPEG2-Cl-10000のGPCからRI検出器における目的物より高分子量の化合物の量は１８．９２％であり、UV検出器における目的物より低分子の化合物の含有量は１．４％であった。
【００７８】
（比較製造例２）
特許第２９３１６３２２号公報記載の方法で、式（ＩＩ）化合物の合成を試みた。
市販のメトキシポリエチレングリコール５０００（試薬：poly（ethylene glycol）methyl ether:型番20,251-7,Mw=5000: Aldrich製、ピークトップ分子量４９７４）１０９．４ｇ（０．０２２モル）を、モレキュラーシーブ４A２５ｇをベンゼン５００ｍｌ中に入れ、80℃で6時間還流した。室温まで冷却後、酸化亜鉛５０ｇと塩化シアヌル１．８５ｇ（0.01モル）を加え、８０℃で５３時間還流した。室温まで冷却後、ベンゼン５００ｍｌを加えて濾過した後、濾液を濃縮乾固し、２，４-ビス-メトキシポリエチレングリコール-6-クロロ-トリアジン：MPEG２−Cl-10000を１０６ｇ得た。
得られたMPEG2-Cl-10000のGPCチャート（RI）を図１０に示す。
全area  ：  1037885 （低分子area  ：  61809）
RIIHarea  ：  319730 RIIH=319730/1037885×100=30.8
得られたMPEG2-Cl-10000のGPCチャート（UV）を図１１に示す。
全area  ：  115832
UIILarea  ：  3864  UIIL=3864/115832×100=3.3
得られたMPEG２-Cl-10000は多くの不純物特に高分子量の化合物が多いことがわかる。
【００７９】
（実施例１）
攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を取り付けた５L４つ口フラスコに、システイン４８．５ｇ（０．４mol）とｐＨ９．５の０．１Ｍ ホウ酸−水酸化ナトリウム系緩衝液９００ｍｌを入れ、窒素気流下室温で溶解するまで攪拌した。ついで製造例１で製造した１０４．０ｇ（０．０１mol）のM-PEG２-Cl-10000を入れ、１８±２℃、窒素気流下で２時間攪拌し反応を行った。反応終了後、９％塩酸水溶液を用いて水溶液のｐＨを７．２±０．２に調整後、ジチオスレイトール（試薬：関東化学）３．１ｇ（０．０２mol）を加えて、再び窒素気流下室温で２時間攪拌を続けた。次に蒸留水を加えて全量を５Lにし、分画分子量が５０００である限外濾過膜（型番：オメガ膜５K）を用いて５℃で限外濾過（装置型番：日本ポール株式会社製、ポール・フィルトロン限外ろ過システムミニセット）を行った。
数式１の左辺：数１Left＝２５７１    数１の右辺：数１Right＝８３２０
限外濾過は５０００ｍｌの水溶液を１０００ｍｌ間で濃縮する工程を１０回繰り返すことにより行い、限外濾過終了後に濃縮液をナスフラスコに２００ｍｌずつ取り、凍結乾燥器で２０時間乾燥して、目的化合物を５２．７ｇ得た。得られた化合物のチオール価は８６．８であり、理論SH価９５．４より求めた実効ＳＨ指数（P）は９１．０であった。
得られた化合物のRI検出器を用いたGPC測定結果を図１２に示す。主成分含有量（R）は８９．９％であった。
全area  ：  1601247 （高分子area：  22626，  低分子area：  139541）
主成分area  ：  1439080  R=1439080/1601247×100=89.9
得られた化合物のUV検出器を用いたGPC測定結果を図１３に示す。主成分含有量（U）は９９．２％であった。
全area  ：  2704965 （高分子area：  21222）
主成分area  ：  2683743  U=2683743/2704965×100=99.2
【００８０】
（実施例２）
攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を取り付けた５L４つ口フラスコに、ｐＨ１０．０の０．１Ｍ ホウ酸−水酸化ナトリウム系緩衝液１５００ｍLを入れ、シスチン２８．８ｇ（０．１２mol）を入れ１０分間攪拌した。続いて１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを９．７に調整し、窒素気流下２５±２℃で２時間攪拌した。ついで製造例１で製造した１０４．０ｇ（０．０１mol）のM-PEG２-Cl-10000を入れ、窒素気流下、室温で２時間攪拌し反応を行った。反応終了後、攪拌を続けながら９％塩酸水溶液を用いて水溶液のｐＨを５．５に調整し、氷冷しながらさらに１時間攪拌を続けた。ついで、ガラス繊維ろ紙を用いて等電点沈殿した未反応のシスチンを加圧ろ過により除去した。精製水を用いてろ液の全量を５０００ｍＬにし、分画分子量が５０００である限外濾過膜（型番：オメガ膜５K）を用いて５℃で限外濾過（装置型番：日本ポール株式会社製、ポール・フィルトロン限外ろ過システムミニセット）を行った。
数式１の左辺：数１Left＝２５７１    数１の右辺：数１Right＝８３２０
限外濾過は５０００ｍｌの水溶液を１０００ｍｌ間で濃縮する工程を６回繰り返すことにより行った。
限外ろ過終了後、濃縮液の全量をDEAE-Sepharose Fast Flow （ファルマシア社製）2500mlを入れたカラムに少量づつ通した。なお、DEAE-Sepharose  Fast  Flowを詰めたカラムは使用前に次の処理を行っている。
（イオン交換カラムの前処理）
▲１▼  カラムにDEAE-Sepharose  Fast  Flow ２５００ｍｌを詰めた後、イオン交換水を７．５L少量づつ流した。
▲２▼ついで、０．５N−NaOH水溶液  ７．５Lを少量づつ流した。
▲３▼再びイオン交換水１０Lを流して、過剰のNaOHを洗い流した。
限外ろ過後の濃縮液を全量流した後、イオン交換水７．５Lを２回流し、吸着されなかった成分を十分に洗い流した。
次に、０．０５M−NaCl水溶液７．５Lを流して、イオン交換樹脂に吸着した成分を溶出させた。溶出液全量を１０L４つ口フラスコに取り、窒素気流下、１N-りん酸を用いてｐHを７．３に調整した。ついで、ジチオスレイトール（試薬：関東化学）３．１ｇ（０．０２mol）を加えて、再び窒素気流下室温で２時間攪拌を続けた。
攪拌終了後、分画分子量が３０００である限外濾過膜（型番：オメガ膜３K）を用いて５℃で限外濾過（装置型番：日本ポール株式会社製、ポール・フィルトロン限外ろ過システムミニセット）を行い、全量を１Lまで濃縮した。
数２の右辺：数２Right＝３６００
その後、濃縮液を精製水で５Lに希釈し限外ろ過で１Lまで濃縮する工程を５回繰り返した。
最終濃縮液をナスフラスコに２００ｍｌずつ取り、凍結乾燥器で２０時間乾燥して、目的化合物を５４．２ｇ得た。得られた化合物のチオール価は９４．０であり、理論SH価は９５．４より求めた実効ＳＨ指数（P）は９８．５であった。
得られた化合物のRI検出器を用いたGPC測定結果を図１４に示す。主成分含有量（R）は９５．５％であった。
全area  ：  1690780 （高分子area：  13864，  低分子area：  61883）
主成分area  ：  1615033  R=1615033/1690780×100=95.5
得られた化合物のUV検出器を用いたGPC測定結果を図１５に示す。主成分含有量（U）は９９．９％であった。
全area  ：  2420059 （高分子area：  2142）
主成分area  ：  2417917  U=2417917/2420059×100=99.9
【００８１】
（実施例３）
攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を取り付けた５L４つ口フラスコに、ｐＨ１０．０の０．１Ｍ ホウ酸−水酸化ナトリウム系緩衝液１５００ｍLを入れ、シスチン２８．８ｇ（０．１２mol）を入れ１０分間攪拌した。続いて１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを９．７に調整し、窒素気流下２５±２℃で２時間攪拌した。ついで製造例１で製造した１０４．０ｇ（０．０１mol）のM-PEG２-Cl-10000を入れ、窒素気流下、室温で２時間攪拌し反応を行った。反応終了後、攪拌を続けながら９％塩酸水溶液を用いて水溶液のｐＨを５．５に調整し、氷冷しながらさらに１時間攪拌を続けた。ついで、ガラス繊維ろ紙を用いて等電点沈殿した未反応のシスチンを加圧ろ過により除去した。精製水を用いてろ液の全量を５０００ｍＬにし、分画分子量が５０００である限外濾過膜（型番：オメガ膜５K）を用いて５℃で限外濾過（装置型番：日本ポール株式会社製、ポール・フィルトロン限外ろ過システムミニセット）を行った。
数式１の左辺：数１Left＝２５７１    数１の右辺：数１Right＝８３２０
限外濾過は５０００ｍｌの水溶液を１０００ｍｌ間で濃縮する工程を６回繰り返すことにより行った。
限外ろ過終了後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを７．５に調整し、ジチオスレイトール（試薬：関東化学）３．１ｇ（０．０２mol）を加えて、再び窒素気流下室温で２時間攪拌を続けた。次に蒸留水を加えて全量を５０００ｍLにし、分画分子量が３０００である限外濾過膜（型番：オメガ膜３K）を用いて５℃で再び限外濾過（装置型番：日本ポール株式会社製、ポール・フィルトロン限外ろ過システムミニセット）を行った。
数２の右辺：数２Right＝３６００
限外濾過は５０００ｍｌの水溶液を１０００ｍｌ間で濃縮する工程を６回繰り返すことにより行い、限外濾過終了後に濃縮液をナスフラスコに２００ｍｌずつ取り、凍結乾燥器で２０時間乾燥して、目的化合物を６６．３ｇ得た。得られた化合物のチオール価は９２．５であり、理論SH価は９５．４より求めた実効ＳＨ指数（P）は９７．０であった。
得られた化合物のRI検出器を用いたGPC測定結果を図１６に示す。主成分含有量（R）は９２．６％であった。
全area  ：  2566967 （高分子area：  73908，  低分子area：  114777）
主成分area  ：  2378282  R=2378282/2566967×100=92.6
得られた化合物のUV検出器を用いたGPC測定結果を図１７に示す。主成分含有量（U）は９８．９％であった。
全area  ：  2722268 （高分子area：  31273）
主成分area  ：  2690995  U=2690995/2722268×100=98.9
【００８２】
（実施例４）
攪拌装置、温度計、窒素吹き込み管を取り付けた５L４つ口フラスコに、システイン１０９．０ｇ（０．９mol）とｐＨ１０．０の０．１Ｍ ホウ酸−水酸化ナトリウム系緩衝液１５００ｍｌを入れ、窒素気流下室温で溶解するまで攪拌した。ついで製造例２で製造した１２０．５ｇ（０．０３mol）のM-PEG２-Cl-4000（Mw=4015.5）を入れ、１８±２℃、窒素気流下で２時間攪拌し反応を行った。反応終了後、蒸留水を加えて全量を７Lにし、分画分子量が３０００である限外濾過膜（型番：オメガ膜３K）を用いて５℃で限外濾過（装置型番：日本ポール株式会社製、ポール・フィルトロン限外ろ過システムミニセット）を行った。
数式１の左辺：数１Left＝９７５．５    数１の右辺：数１Right＝３２１２．４
限外濾過は７０００ｍｌの水溶液を１０００ｍｌに濃縮する工程を３回繰り返すことにより行った。
濃縮液のｐHを７．５に調整し、ジチオスレイトール４．６ｇ（0.03mol）を加えて、再び窒素気流下室温で２時間攪拌を続けた。ついで精製水を用いて、全量を５Lにし、分画分子量が１０００である限外ろ過膜（型番：オメガ膜１K）を用いて５℃で限外ろ過を行った。
数式２の右辺：１３６５．７
限外ろ過は５Lの水溶液を１Lに濃縮する工程を５回繰り返すことによって行った。
限外濾過終了後に濃縮液をナスフラスコに２００ｍｌずつ取り、凍結乾燥器で２０時間乾燥して、目的化合物９４．１ｇを得た。
得られた化合物のSH価は２２４．６であり、理論SH価は２４３．９より求めた実効ＳＨ指数（P）は９２．１％であった。
得られた化合物のRI検出器を用いたGPCの測定結果より、主成分含有量（R）は９０．８％
全area  ：  1602560 （高分子area：  15302，  低分子area：  132455）
主成分area  ：  1454803  R=1454803/1602560×100=90.8
得られた化合物のUV検出器を用いたGPC測定結果より、主成分含有量（U）は９９．４％であった。
全area  ：  2533064 （高分子area：  15832）
主成分area  ：  2517232  U=2517232/2533064×100=99.4
【００８３】
（比較例１）
比較製造例１で製造したM-PEG-Cl-10000を用いて、実施例１と同様の方法により式（Ｉ）化合物の合成を試み、目的化合物を５９．５ｇ得た。
得られた化合物の分析結果は次の通りである。
得られた化合物のSH価は８０．５であり、理論SH価は９５．４より求めた実効ＳＨ指数（P）は８４．４であった。
得られた化合物のRI検出器を用いたGPC測定結果を図１８に示す。主成分含有量（R）は７６．８％であった。
全area  ：  2247963 （高分子area：  437903，  低分子area：  82949）
主成分area  ：  1727111  R=1727111/2247963×100=76.8
得られた化合物のUV検出器を用いたGPC測定結果を図１９に示す。主成分含有量（U）は９５．６％であった。
全area  ：  2398749 （高分子area：  104585）
主成分area  ：  2294164  U=2294164/2398749×100=95.6
【００８４】
（比較例２）
比較製造例２で製造したM-PEG-Cl-10000を用いて、実施例１と同様の方法により式（Ｉ）化合物の合成を試み、目的化合物を６４．３ｇ得た。
得られた化合物の分析結果は次の通りである。
得られた化合物のSH価は７５．１であり、理論SH価は９５．４より求めた実効ＳＨ指数（P）は７８．７であった。
得られた化合物のRI検出器を用いたGPC測定結果を図２０に示す。主成分含有量（R）は５６．９％であった。
全area  ：  548431 （高分子area：  213175    低分子area：  23363）
主成分area  ：  311893  R=311893/548431×100=56.9
得られた化合物のUV検出器を用いたGPC測定結果を図２１に示す。主成分含有量（U）は７７．５％であった。
全area  ：  2172762 （高分子area：  438680,  低分子area：  49974）
主成分area  ：  1684108  U=1684108/2172762×100=77.5
【００８５】
（比較例３）
比較製造例２で製造したM-pEG-Cl-10000を用いて特開平４−３４６９１８の方法に準じて式（Ｉ）化合物の合成をおこなった。
シスチン２４０mg（０．００１mol）をｐH９．５の０．４M-ホウ酸水酸化ナトリウム緩衝液５０ｍｌに溶解し、比較製造例２で製造したM-PEG-Cl-10000を1000mg（0.0001mol）加えて室温で攪拌しながら１８時間反応した。ついでジチオスレイトール310mg（0.002mol）を加えて、３７℃で攪拌を6時間続けることで反応を行った。反応終了後、反応液をゲルろ過（生化学工業製：GH-25）にかけて脱塩を行った。得られた脱塩溶液をｐH７．４の１０mM-燐酸−0.15M-NaCl緩衝液（PBS）に置換した後、PBSで平衡化したチオプロピルセファロースCL6B（ファルマシア）35mlを詰めたカラムに少しづつ流しこんで吸着させた。非吸着物を100mlのPBSをカラムに流して洗浄したのち、50mM-ジチオスレイトールを含むPBS溶液50mlをカラムに流し吸着した目的物を脱離溶出させた。得られた溶出液を再びゲルろ過にかけ脱塩したのち、凍結乾燥することにより2１0mgの目的物を得た。
得られた化合物のSH価は８２．３であり、理論SH価は９５．４より求めた実効ＳＨ指数（P）は８６．３であった。
得られた化合物のRI検出器を用いたGPC測定結果を図２２に示す。主成分含有量（R）は８１．１％であった。
全area  ：  2161172 （高分子area：  372219    低分子area：  36091）
主成分area  ：   1752862   R=1752862/2161172×100=81.1
得られた化合物のUV検出器を用いたGPC測定結果を図２３に示す。主成分含有量（U）は９３．６％であった。
全area  ：  2653678 （高分子area：  162936，  低分子area：  6634）
主成分area  ：  2484108  U=2484108/2653678×100=93.6
【００８６】
（リポソームの表面修飾）
ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）／コレステロール／ε−マレイミドカプロイルジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＭＣ−ＤＰＰＥ）（１８／１０／０．５モル比）からなる脂質混合物（２５０ｇ）をあらかじめ７２℃に加温した０．３Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）２５００ｍＬを添加し、ハイフレックスディスパーサー（ＳＭＴ社）で１０分間攪拌し水和し、マルチラメラリポソームを作製した。さらにポリカーボネート製の４００ｎｍフィルター、２００ｎｍ、１００ｎｍフィルターを順次通過させることにより０．１μｍに整粒した。そして、このリポソーム溶液に１ＭＮａＯＨを滴下してｐＨを６．６に調整した後、６０℃に加温し、同じく６２℃に加温した２０ｍｇ／ｍＬのドキソルビシン（ＤＸＲ、別名アドリアマイシン、ＡＤＭ）水溶液を脂質１００ｍｇあたり０．５ｍＬ添加して封入した。
一方、１０ｍＭＥＤＴＡを含む１Ｍリン酸緩衝液及び１ＭＮａＯＨを用いｐＨ７．５に調整したＧＡＨ抗体（特開平４−３４６９１８号公報、特開平５−３０４９８７号公報、各公報参照。３ｍｇ／ｍＬ、１９４２ｍＬ）に３ｍｇ／ｍＬのイミノチオランを１２．７ｍＬ添加し、３７℃で１時間反応させてチオール基を導入し、チオール化抗体を作製した（Biochemistry, 12, 3206, 1973参照）。
上記のドキソルビシン封入リポソームに対して、ドキソルビシン１ｍｇあたり０．２１ｍｇの上記のチオール化抗体（４．９４ｇ、１．７ｍｇ／ｍＬ）を加え、２５℃で１時間反応させ、抗体結合リポソームを作製した。
【００８７】
さらにこの抗体結合リポソームに対して、実施例１、２、３で得られた各々の化合物、および実施例５の化合物を、１０℃で結合反応させることにより、抗体及びＰＥＧを表面に結合させたリポソームを作製した。
得られた各リポソームについて、実測ＳＨ価、実効ＳＨ指数（Ｐ）、主成分含有量（Ｒ）（Ｕ）、製造スケール、化合物の仕込み量、化合物の結合量を測定し、表１に示した。
【００８８】
【表１】
2004196675.tif 000012
【００８９】
本発明によれば、仕込み量や製造スケールに関わらず、リポソーム脂質へのポリオキシアルキレングリコール化合物の結合量を安定して維持できた。
【００９０】
【発明の効果】
本発明のＳＨ基を有するポリオキシアルキレングリコール誘導体は、リポソームのような生体物質の表面修飾に有用であり、生体物質の力価の安定性を向上させ得るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】製造例１で使用したメトキシポリエチレングリコールのゲルパーミュエーションクロマトグラム
【図２】製造例１で製造した式（II）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（RI）
【図３】製造例１で製造した式（II）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（UV）
【図４】製造例２で使用したメトキシポリエチレングリコールのゲルパーミュエーションクロマトグラム
【図５】製造例２で製造した式（II）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（RI）
【図６】製造例２で製造した式（II）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（UV）
【図７】比較製造例１で使用した市販のメトキシポリエチレングリコールのゲルパーミュエーションクロマトグラム
【図８】比較製造例１で製造した式（II）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（RI）
【図９】比較製造例１で製造した式（II）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（UV）
【図１０】比較製造例２で製造した式（II）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（RI）
【図１１】比較製造例２で製造した式（II）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（UV）
【図１２】実施例１で製造した式（I）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（RI）
【図１３】実施例１で製造した式（I）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（UV）
【図１４】実施例２で製造した式（I）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（RI）
【図１５】実施例２で製造した式（I）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（UV）
【図１６】実施例３で製造した式（I）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（RI）
【図１７】実施例３で製造した式（I）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（UV）
【図１８】比較例１で製造した式（I）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（RI）
【図１９】比較例１で製造した式（I）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（UV）
【図２０】比較例２で製造した式（I）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（RI）
【図２１】比較例２で製造した式（I）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（UV）
【図２２】比較例２で製造した式（I）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（RI）
【図２３】比較例２で製造した式（I）化合物のゲルパーミュエーションクロマトグラム（UV）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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