(57)【要約】【課題】ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ阻害剤を含有する抗癌剤を提供することを課題とする。【解決手段】３８例の肺癌由来細胞株および３例の正常繊維芽細胞株と４３例の肺癌臨床検体および６例の正常肺組織よりＲＮＡを調製、蛍光標識後７６８５種の遺伝子断片を固定化したスライドに対してハイブリダイゼーションを行った。通常行われる階層的クラスタリングを実施した結果、全ての細胞株と臨床検体とはそれぞれ異なるクラスターに分離された。培養細胞株あるいは臨床検体でそれぞれ共通して高発現あるいは発現低下している遺伝子を解析から除外する事により、各病型を反映した遺伝子発現プロファイルが得られるものと考え、これを可能とするフィルタリング法を新たに考え実施した。その結果、小細胞性肺癌に特異的に発現上昇しているものとして、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼが選別された。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有効成分として含有する、抗癌剤。
【請求項２】
癌が肺癌である、請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
肺癌が小細胞性肺癌である、請求項２に記載の抗癌剤。
【請求項４】
ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を投与することを特徴とする癌の治療方法。
【請求項５】
被験試料における、抗癌活性の有無を評価する方法であって、
（ａ）ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの活性を測定する工程、
を含み、上記ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの活性が、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌活性を有すると判定される方法。
【請求項６】
被験試料における、抗癌活性の有無を評価する方法であって、
（ａ）ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ遺伝子のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌活性を有すると判定される方法。
【請求項７】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、抗癌活性を有する試料のスクリーニング方法。
（ａ）請求項５または６に記載の評価方法により、複数の被験試料における、抗癌活性の有無を評価する工程
（ｂ）複数の被験試料から、抗癌活性を有すると評価された試料を選択する工程
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、抗癌活性を有する試料のスクリーニング方法。
（ａ）ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）請求項５または６に記載の評価方法により、該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料について、抗癌活性の有無を評価する工程
（ｅ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料から、抗癌活性を有すると評価された試料を選択する工程
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、抗癌活性を有する試料のスクリーニング方法。
（ａ）ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料を癌細胞に接触させる工程
（ｅ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料から、抗癌活性を有すると評価された試料を選択する工程
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載の工程に、さらに抗癌活性を有すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、抗癌活性を有する医薬組成物の製造方法。
【請求項１１】
癌が肺癌である、請求項４〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
肺癌が小細胞性肺癌である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ阻害剤を含有する抗癌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肺癌は全世界的に見て男女を問わず癌による死亡原因の第１位の位置を占めており、その数は増加の一途にある。また日本だけを見ても年間に５０，０００人の命が肺癌により失われている。肺癌は病理学的にはその形態から小細胞性肺癌（ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＳＣＬＣ）と非小細胞性肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＮＳＣＬＣ）に分類され、後者はさらに扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＳＣＣ）、腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＡＣ）、大細胞性癌（ｌａｒｇｅ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＬＣＣ）に分類されている。個々に分類された肺癌は悪性度、治療に対する反応性が異なる事から、正確な病型診断は治療指針を決定するうえで極めて重要である。特に小細胞性肺癌は診断が為された時点では多くの場合既に転移を伴っている理由から外科的摘除手術の対象とはならず、化学療法および放射線療法による治療が通常選択される。一般に、小細胞性肺癌の化学療法に対する反応性は良好で腫瘍の縮小効果を認めるが、多くの場合に再発を伴い、再発した癌細胞は多剤耐性を獲得して治療に抵抗性である。従って新規な作用機序に基づいた小細胞性肺癌の治療法が強く期待されている。
【０００３】
従来の化学療法剤の殆どは癌細胞と正常細胞が共通して利用している基本的な経路に帰属するターゲットに対するものであるが故に副作用との分離は困難である。一方でより癌に特異的なターゲットを見出す事を目標とした細胞癌化のメカニズムに関する研究は著しい躍進を遂げ、多くの癌抑制遺伝子が癌において変異をうけて不活性化している事が細胞癌化の主たる原因となっている事が明らかとなってきた。しかし、これらの癌抑制遺伝子産物の機能が明らかになり、その変異が惹き起こす細胞増殖あるいはアポトーシス制御の破綻が明らかになるにつれ、これらの癌抑制遺伝子産物が制御する経路は全ての細胞に共通した基本的な経路であり低分子化合物を用いてその破綻を是正する事は一般に困難で、唯一遺伝子治療による失われた癌抑制遺伝子産物の補充以外には副作用を分離した癌に特異的な治療は困難である事が明らかとなってきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、癌特異的な遺伝子を見出し、その遺伝子産物の特異的阻害剤を含有する抗癌剤を提供することにある。より詳細には、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ阻害剤を含有する抗癌剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
癌細胞における遺伝子発現の異常は広く知られた現象であり、問題となる癌が発生した臓器では発現が認められない遺伝子の異所性発現や胎生期にしか発現が認められない遺伝子の発現が知られている。これらの遺伝子産物のうち細胞表面蛋白質は抗体療法の格好のターゲットとなり得るし、また胎生期の細胞を含めた特殊な細胞集団でのみ機能している細胞周期調節機構やシグナル伝達機構をターゲットとした薬剤を開発する事により副作用との分離が可能になると考えられる。以上の考えに基づいて、本発明者らは新規な肺癌の治療ターゲットを見出すべく、各種病型肺癌の遺伝子発現プロファイル解析を実施した。個々の症例毎に異なる遺伝子発現異常はテーラーメード療法の対象とはなるが新規医薬品開発の為のターゲットとしては不適である事から、本発明者らは病型特異的な遺伝子発現に焦点を当てて解析を行った。
【０００６】
３８例の肺癌由来細胞株および３例の正常繊維芽細胞株と４３例の肺癌臨床検体および６例の正常肺組織よりＲＮＡを調製、蛍光標識後７６８５種の遺伝子断片を固定化したスライドに対してハイブリダイゼーションを行った。通常行われるｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ（階層的）クラスタリングを実施した結果、全ての細胞株と臨床検体とはそれぞれ異なるクラスターに分離された。細胞株のクラスターは培養系に特有の要因により細胞株に共通した遺伝子発現により形成されたものと考えられ、一方臨床検体クラスターでは腫瘍検体に混在する正常組織の影響を強く受けているものと考えられた。そこで、これら培養細胞株あるいは臨床検体でそれぞれ共通して高発現あるいは発現低下している遺伝子を解析から除外する事により、各病型を反映した遺伝子発現プロファイルが得られるものと考え、これを可能とするフィルタリング法（Ｂｉｎａｒｙ　Ｓｔｒｉｎｇ　Ｓｅａｒｃｈ）を新たに考えた。該フィルタリング法により、細胞株あるいは臨床検体に共通して発現亢進している遺伝子を解析から除外することができ、病型特異的な遺伝子発現プロファイルを得る事ができた。病型特異的に高発現している遺伝子の中には全ての細胞に共通した基本的経路の構成成分は殆ど含まれていなかった。これらの病型特異的遺伝子には既知の病型特異的マーカー（例、小細胞性肺癌のｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅマーカーや扁平上皮癌のケラチン等）が数多く含まれており、これらを除いた残りの遺伝子から新規医薬品開発の為のターゲットとしての可能性が想定されるものを検索した。
【０００７】
その結果、小細胞性肺癌に特異的に発現上昇しているものとして、Ｎ６２２４５　（ＣＤＣ７Ｌ１）、ＡＡ４５６６０８　（ＭＣＭ３）、およびＷ７４０７１　（ＭＣＭ４）が選別された。
【０００８】
小細胞性肺癌ではＥ２Ｆ１の発現が亢進している事が知られており、比較的頻繁にＲＢの発現の消失が報告されている。またｎｅｕｒｏｅｎｄｃｒｉｎｅマーカーの代表であるｐｒｏｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎの小細胞性肺癌における発現にＥ２Ｆが関与している事が報告されている。一方でＣＤＣ７Ｌ１あるいはＭＣＭ３の発現がＥ２Ｆで制御されている事が示唆されている。さらにＣＤＣ７Ｌ１によるＭＣＭ２、ＭＣＭ３のリン酸化がＳ期の開始に重要でありリン酸化されたＭＣＭ２、ＭＣＭ３は他のＭＣＭ蛋白と複製起点で複合体を形成してｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ　ＤＮＡ　ｈｅｌｉｃａｓｅとして制御されたＤＮＡの複製に寄与している事が示唆されている。上記フィルタリングの結果、他のＥ２Ｆで制御される事が知られる遺伝子が全く選択されていない事から、小細胞性肺癌では恐らくＥ２Ｆに加えて別の転写調節メカニズムが協同的に作用した結果、小細胞性肺癌に特異的な発現亢進を示した事が強く示唆される。従ってＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの特異的阻害剤は癌の特異的な治療剤となる事が期待される。
【０００９】
即ち、本発明は、
〔１〕ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有効成分として含有する、抗癌剤、
〔２〕癌が肺癌である、〔１〕に記載の抗癌剤、
〔３〕肺癌が小細胞性肺癌である、〔２〕に記載の抗癌剤、
〔４〕ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を投与することを特徴とする癌の治療方法、
〔５〕被験試料における、抗癌活性の有無を評価する方法であって、
（ａ）ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの活性を測定する工程、
を含み、上記ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの活性が、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌活性を有すると判定される方法、
〔６〕被験試料における、抗癌活性の有無を評価する方法であって、
（ａ）ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ遺伝子のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌活性を有すると判定される方法、
〔７〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、抗癌活性を有する試料のスクリーニング方法、
（ａ）〔５〕または〔６〕に記載の評価方法により、複数の被験試料における、抗癌活性の有無を評価する工程
（ｂ）複数の被験試料から、抗癌活性を有すると評価された試料を選択する工程〔８〕以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、抗癌活性を有する試料のスクリーニング方法、
（ａ）ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）〔５〕または〔６〕に記載の評価方法により、該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料について、抗癌活性の有無を評価する工程
（ｅ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料から、抗癌活性を有すると評価された試料を選択する工程
〔９〕以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、抗癌活性を有する試料のスクリーニング方法、
（ａ）ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料を癌細胞に接触させる工程
（ｅ）該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料から、抗癌活性を有すると評価された試料を選択する工程
〔１０〕〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載の工程に、さらに抗癌活性を有すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、抗癌活性を有する医薬組成物の製造方法、
〔１１〕癌が肺癌である、〔４〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法、
〔１２〕肺癌が小細胞性肺癌である、〔１１〕に記載の方法、
を、提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの特異的阻害剤が癌の特異的な治療剤になりうることを見出した。本発明は、この知見に基づき、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有効成分として含有する抗癌剤を提供する。
【００１１】
本発明において、癌としては、好ましくは肺癌であり、より好ましくは小細胞性肺癌が挙げられる。
【００１２】
また、本発明において、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体としては、特に制限はなく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体が挙げられる。
【００１３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼをコードするＤＮＡ配列（例えば、アクセッションＮ６２２４５）中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはＣＤＣ７Ｌ１キナーゼＤＮＡ配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
【００１５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとがＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１　又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
【００１６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの産生細胞に作用して、該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの発現を抑制することにより、結果的にＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの作用を抑制する効果を有する。
【００１７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
【００１８】
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
【００１９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
【００２０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。
【００２１】
また、本発明は、被験試料における抗癌活性の有無を評価する方法、並びに、抗癌活性を有する試料のスクリーニング方法を提供する。
【００２２】
本発明の方法における「被検試料」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、「複数の被験試料」としては、特に制限はなく、例えば、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。
【００２３】
本発明の方法において、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼが由来する生物種としては、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられる。
【００２４】
また、本発明の方法において、「抑制されている」とは、完全に阻害されている場合だけでなく、減少している場合も含む。
【００２５】
本発明の評価方法の第一の態様としては、まず、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに被験試料を接触させる。第一の態様に用いられるＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
【００２６】
ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの精製は周知の方法で行うことができる（Ｍｏｎｔａｇｎｏｌｉ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．；　ＥＭＢＯ　Ｊ．　２００２，　２１（１２）：　３１７１−８１）。
【００２７】
また、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼが発現している細胞としては、内在性のＣＤＣ７Ｌ１キナーゼを発現している細胞、または外来性のＣＤＣ７Ｌ１キナーゼを発現している細胞が挙げられる。上記内在性のＣＤＣ７Ｌ１キナーゼを発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなく、例えば、ＭＳ−１、Ｌｕ１３０、Ｌｕ１３４Ａ、等を用いることが可能である。
【００２８】
また、上記外来性のＣＤＣ７Ｌ１キナーゼを発現している細胞は、例えば、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼをコードするＤＮＡを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、当業者に一般的な方法によって実施することができる。また、上記外来性のＣＤＣ７Ｌ１キナーゼを有する細胞は、例えば、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼをコードするＤＮＡを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のＣＤＣ７Ｌ１キナーゼが導入される細胞が由来する生物種としては、特に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
【００２９】
また、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼが発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼをコードするＤＮＡを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
【００３０】
また、本発明において「接触」は、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの状態に応じて行う。例えば、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼが精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼが発現している細胞へ導入する、または該ベクターをＣＤＣ７Ｌ１キナーゼが発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた２ハイブリッド法を利用することも可能である。
【００３１】
第一の態様では、次いで、上記ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの活性を測定する。ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの活性としては、リン酸化活性などが挙げられる（Ｍｏｎｔａｇｎｏｌｉ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．；　ＥＭＢＯ　Ｊ．　２００２，　２１（１２）：　３１７１−８１）。
【００３２】
第一の態様においては、上記ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの活性が、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌活性を有すると判定される。
【００３３】
本発明の評価方法の第二の態様としては、まず、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ遺伝子のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。
【００３４】
第二の態様において、「機能的に結合した」とは、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ遺伝子のプロモータ―領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ遺伝子のプロモータ―領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ遺伝子のプロモータ―領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【００３５】
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼをコードするＤＮＡもまた含まれる。
【００３６】
第二の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被験試料を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。
【００３７】
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【００３８】
また、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
【００３９】
また、該遺伝子からコードされるＣＤＣ７Ｌ１キナーゼを含む画分を定法に従って回収し、該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法などを実施し、該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
【００４０】
第二の態様においては、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌活性を有すると判定される。
【００４１】
さらに、本発明は、抗癌活性を有する試料を効率的にスクリーニングする方法を提供する。本発明の抗癌活性を有する試料のスクリーニング方法の一つの態様においては、上記評価方法を利用して、複数の被験試料について、抗癌活性の有無を評価し、抗癌活性を有すると評価された試料を選択する。
【００４２】
上記スクリーニング方法の他の態様においては、まず、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに複数の被験試料を接触させる。次いで、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと被験試料との結合を検出する。次いで、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料を選択する。
【００４３】
ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼを用いて、これに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼをコードするＤＮＡを、ｐＳＶ２ｎｅｏ，　ｐｃＤＮＡ　Ｉ，　ｐＣＤ８　などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしては　ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　（Ｒｉｇｂｙ　Ｉｎ　Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ　（ｅｄ．），　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｖｏｌ．３．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｌｏｎｄｏｎ，　ｐ．８３−１４１（１９８２）），　ＥＦ−１　α　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　（Ｋｉｍら　Ｇｅｎｅ　９１，　ｐ．２１７−２２３　（１９９０）），　ＣＡＧ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　（Ｎｉｗａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　１０８，　ｐ．１９３−２００　（１９９１）），　ＲＳＶ　ＬＴＲ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　（Ｃｕｌｌｅｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５２，　ｐ．６８４−７０４　（１９８７），　ＳＲ　α　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　（Ｔａｋｅｂｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　８，　ｐ．４６６　（１９８８）），　ＣＭＶ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　（Ｓｅｅｄ　ａｎｄ　Ａｒｕｆｆｏ　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８４，　ｐ．３３６５−３３６９　（１９８７）），　ＳＶ４０　ｌａｔｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　（Ｇｈｅｙｓｅｎ　ａｎｄ　Ｆｉｅｒｓ　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　１，　ｐ．３８５−３９４　（１９８２）），　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｌａｔｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　（Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　９，　ｐ．　９４６　（１９８９）），　ＨＳＶ　ＴＫ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
【００４４】
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法　（Ｃｈｕ，　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　１５，　１３１１−１３２６　（１９８７））、リン酸カルシウム法　（Ｃｈｅｎ，　Ｃ　ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ，　Ｈ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　７，　２７４５−２７５２　（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法　（Ｌｏｐａｔａ，　Ｍ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　５７０７−５７１７　（１９８４）；　Ｓｕｓｓｍａｎ，　Ｄ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ，　Ｇ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　４，　１６４２−１６４３　（１９８５））、リポフェクチン法　（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，　Ｂ．　Ｃｅｌｌ　７，　１０２５−１０３７　（１９９４）；　Ｌａｍｂ，　Ｂ．　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　５，　２２−３０　（１９９３）；　Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，　Ｓ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９，　２３０−２３４　（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
【００４５】
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をＣＤＣ７Ｌ１キナーゼのＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとしてＣＤＣ７Ｌ１キナーゼを発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学　１３，　８５−９０　（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。また、融合ポリペプチドにすることによりＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素　ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７　ｇｅｎｅ１０　タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学　１３，　８５−９０　（１９９５））。
【００４６】
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに対する抗体は、例えば、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼをコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成したＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
【００４７】
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ　抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼを、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
【００４８】
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．　ａｎｄ　Ｌａｎｅ，　Ｄ．：　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，　ｐｐ．５１１−５５２，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８８）　）記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
【００４９】
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的にはＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。ポリペプチドの分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のポリペプチドを精製し、その配列を決定することもできる。
【００５０】
上記ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの抗体を作成するには、まず、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ又はその断片をコードするＤＮＡを公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外からＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。
【００５１】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
【００５２】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。次いで、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
【００５３】
ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明の蛋白質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明の蛋白質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。
【００５４】
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
【００５５】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９８１）　７３，　３−４６）等に準じて行うことができる。
【００５６】
細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
【００５７】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで蛋白質、蛋白質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、蛋白質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
【００５８】
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼをカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。
【００５９】
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，　Ｃ．　Ａ．　Ｋ．ａｎｄ　Ｌａｒｒｉｃｋ，　Ｊ．　Ｗ．，　ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅＵｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ　ｂｙ　ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ　ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ　ＬＴＤ，　１９９０　参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。
【００６０】
さらに、上記抗体は、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）　（Ｈｕｓｔｏｎ，　Ｊ．　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　（１９８８）　８５，　５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，　Ｍ．　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　（１９９４）　１５２，　２９６８−２９７６　；　Ｂｅｔｔｅｒ，　Ｍ．　ａｎｄ　Ｈｏｒｗｉｔｚ，　Ａ．　Ｈ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９８９）　１７８，　４７６−４９６　；　Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，　Ａ．　ａｎｄ　Ｓｋｅｒｒａ，　Ａ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９８９）　１７８，　４９７−５１５　；　Ｌａｍｏｙｉ，　Ｅ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９８６）　１２１，　６５２−６６３　；　Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９８６）　１２１，　６６３−６６９　；Ｂｉｒｄ，　Ｒ．　Ｅ．　ａｎｄ　Ｗａｌｋｅｒ，　Ｂ．　Ｗ．，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　（１９９１）　９，　１３２−１３７参照）。
【００６１】
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
【００６２】
また、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに対する抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
【００６３】
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　１９８８）　が、これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
【００６４】
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ　Ｄ，　ＰＯＲＯＳ，　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆ．　Ｆ．　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
【００６５】
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｅｄ　Ｄａｎｉｅｌ　Ｒ．　Ｍａｒｓｈａｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【００６６】
また、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼを用いて、該ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに結合するポリペプチドを単離する方法としては、例えば、Ｓｋｏｌｎｉｋらの方法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，　Ｅ．　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　（１９９１）　６５，　８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞、組織よりファージベクター（λｇｔ１１，　ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたポリペプチドを固定し、精製して標識したＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと上記フィルターとを反応させ、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合したポリペプチドを発現するプラークを標識により検出すればよい。ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼを標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼ又はＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに融合したポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
【００６７】
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，　Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．　Ｇｅｎｅｔ．　（１９９４）　１０，　２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ　Ｓ，　ａｎｄ　Ｔｒｅｉｓｍａｎ　Ｒ　（１９９２）　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＡＰ−１，　ａｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ　ｂｙ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃ−ｆｏｓ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ．　Ｃｅｌｌ　６８，　５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ　Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ」，「ＭａｍｍａｌｉａｎＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ　Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ　Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ　Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。
【００６８】
２−ハイブリッドシステムにおいては、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼまたはその部分ペプチドをＳＲＦ　ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４　ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内でＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合するポリペプチドが発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドを得ることができる。これによりＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに結合するポリペプチドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
【００６９】
２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
【００７０】
ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼをアフィニティーカラムの担体に固定し、ここにＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合するポリペプチドを発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに結合したポリペプチドを調製することができる。
【００７１】
得られたポリペプチドは、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００７２】
また、ポリペプチドに限らず、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定したＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼに結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ　ＮＣ；　Ｆａｒｒｅｌｌ　ＦＸ；　Ｃｈａｎｇ　Ｒ；　Ｋａｓｈｙａｐ　ＡＫ；　Ｂａｒｂｏｎｅ　ＦＰ；　Ｍｕｌｃａｈｙ　ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ　ＤＬ；　Ｂａｒｒｅｔｔ　ＲＷ；　Ｊｏｌｌｉｆｆｅ　ＬＫ；　Ｄｏｗｅｒ　ＷＪ．，　Ｓｍａｌｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｓ　ｐｏｔｅｎｔ　ｍｉｍｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（ＵＮＩＴＥＤ　ＳＴＡＴＥＳ）　Ｊｕｌ　２６　１９９６，２７３　ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ　ＧＬ．，　Ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｎａｔｕｒｅ．　Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）　Ｎｏｖ　７　１９９６，　３８４　ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ　ＪＣ　Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　Ｎａｔｕｒｅ　（ＥＮＧＬＡＮＤ）　Ｎｏｖ　７　１９９６，　３８４　ｐ１７−９）が当業者に公知である。
【００７３】
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと被験試料との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることによりＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと被験試料との結合を評価することが可能である。
【００７４】
本発明のスクリーニング方法においては、上記方法により得られたＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料について、本発明の評価方法により、抗癌活性の有無を評価する。次いで、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料から抗癌活性を有すると評価された試料を選択する。また、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼと結合する被験試料を癌細胞に接触させ、例えば該癌細胞の増殖を測定することで、抗癌活性を有する試料を選択することが可能である。上記癌細胞としては、特に制限はなく、臨床検体、培養細胞株などが例示できる。
【００７５】
さらに、本発明においては、抗癌活性を有する医薬組成物の製造方法を提供する。該製造方法においては、上記スクリーニング方法によって抗癌活性を有すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する。該担体としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００７６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］　アレイスライドの作成
スライドグラスに貼り付ける７６８５遺伝子のうち６７３４はＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社より購入したＩＭＡＧＥクローン、６９９は癌への関与が知られた、あるいは想定される中外所有のクローンに由来し、残る２５２は陰性コントロールとして加えた（Ａｌｕ配列、ルシフェラーゼ等）ものでデータ解析からは除外した。スライド作成はＨｅｇｄｅ，Ｐ．等の方法（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　（２００１）　６１：　７７９２−７７９７）に準じて行い、Ｍｉｃｒｏｇｒｉｄ　ＩＩ　（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ社製）を用いて１枚のスライドに７６８５遺伝子をｄｕｐｌｉｃａｔｅで貼り付けた。
【００７７】
［実施例２］　プローブの調製、ハイブリダイゼーション及び測定
３８株のヒト肺癌由来細胞株、３株の正常ヒト繊維芽細胞株（表１）、４３例の各種病型肺癌臨床検体および６例の正常肺組織（表２）を材料とした。
【００７８】
【表１】
2004051559.tif 000002
【００７９】
【表２】
2004051559.tif 000003
【００８０】
臨床検体は（財）癌研究会癌研究所にて患者のｉｎｆｏｒｍｅｄ　ｃｏｎｓｅｎｔおよび倫理委員会の承認のもとで外科的摘除時に採取したものである。レファレンスサンプルとしては可能な限り多くの遺伝子について情報が得られる事を考慮して、２０％の正常肺組織にＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＥＫＶＸ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ｌｕ−１３４Ａ、ＭＲＣ５、ＳＱ５、Ｈ２３、ＰＣ１４、ＭＳ１の１０種の細胞株を夫々８％ずつ加えたものを用いた。全ての細胞株はＲＮＡｌａｔｅｒ　（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて細胞浮遊液とした。臨床検体はＲＮＡの分解を最小限にすべく採取後液体窒素にて瞬時に凍結せしめた。Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いてＲＮＡを抽出後、Ｌｕｏ，　Ｌ．等の方法（Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　（１９９９）　５　：　１１７−１２２）に従ってｃＲＮＡ合成を行った。プローブ合成はＨｕｇｈｅｓ，　ＴＲ等の方法（Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）　１９　：　３４２−３４７）に従って２ｕｇのｃＲＮＡを鋳型として行った。レファレンスサンプルはＣｙ３にてテストサンプルはＣｙ５にて蛍光標識した。ハイブリダイゼーションとその後の洗浄はＨｅｇｄｅ，　Ｐ．等の方法（前出）に従った。ハイブリダイズしたシグナルの測定と定量はＳｃａｎｎａｒｒａｙ　４０００スキャナーとＱｕａｎｔａｒｒａｙ　（何れもＰａｃｋａｒｄ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて行った。
【００８１】
［実施例３］　データ解析
全てのｃＲＮＡサンプルはｄｕｐｌｉｃａｔｅにて蛍光標識を行った。標識後のプローブを７６８５個のＤＮＡスポットがｄｕｐｌｉｃａｔｅで貼り付けてあるスライドにハイブリダイズさせる事により、個々の遺伝子について４回の独立した測定を行った。スポットした７６８５　ｅｌｅｍｅｎｔ中２５２はｃｏｎｔｒｏｌとして加えたもの（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、Ａｌｕ等）で残る７４３３のうち６３８４は５６２２個のＵｎｉＧｅｎｅクラスターに相当し、１０４９はＵｎｉＧｅｎｅクラスターに一致しない事から全体で６６７１個のユニークな遺伝子がスポットされている事になる。さらに初期の検討結果から、このうち２８５は全ての臨床検体・細胞株を含めた異なる検体間で同様な発現パターンを示した事から以後の解析から除外した。この初期フィルタリングの結果、６３８６のユニークな遺伝子が以下の解析の対象として残った（図１）。１回のアレイ実験内でのデータの標準化はｌｏｗｅｓｓ　ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　（２００２），　３０　：　ｅ１５）に準拠し、標準化されたシグナル強度をレファレンスサンプルのシグナル強度で割る事により値を得た後に、Ｔｓｅｎｇ等のプログラム（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．（２００１），　２９　：　２５４９−２５５７）を用いてＣＶ値が９６％信頼区間から外れるデータをｏｕｔｌｉｅｒとして以後の解析から除外した。得られたデータセットはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を用いてクラスター解析、視覚化を行った（図２）。腫瘍臨床検体と細胞株のデータの直接比較をした場合に異なる病型に関わらず臨床検体に共通して高い発現を示す遺伝子、逆に細胞株に共通して高い発現を示す遺伝子が認められた。これらの遺伝子を選別する目的でＢｉｎａｒｙ　Ｓｅａｒｃｈ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍを新たに考えた。すなはち、個々の遺伝子について全てのサンプルでのシグナルの平均値を求めこれより高い値を示すものに”１”、低い値を示すものに”０”の値を与える事により個々のサンプルのプロファイルをＢｉｎａｒｙ　Ｓｔｒｉｎｇｓとして表現した。これをｉｄｅａｌ　ｓｔａｔｅ（臨床検体で全て”１”／細胞株で全て”０”あるいはその逆）のｓｔｒｉｎｇと比較して６６％以上のサンプルで”１”の場合、”ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ”、６６％以上のサンプルで”０”の場合、”ｕｎｄｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ”とした。この処理により６３８６のユニークな遺伝子中２２１８が臨床検体で細胞株と比較して発現が高い（１３１３）あるいは低い（９０５）ものとして選別された（図３）。さらにこれら２２１８遺伝子のクラスタリングの結果を目で見て確認した結果、２９９の遺伝子は臨床検体と細胞株間で際立った発現の差を認めなかった事から残る１９１９を以下の検討からは除去する事とした（図４）。全てのフィルタリングの結果最終的に４２４０の遺伝子が解析の対象として残った。Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇの結果（図５、図６）、９０の検体（肺癌臨床検体４３、正常肺臨床検体６、肺癌細胞株３８、正常胎児繊維芽細胞株３）は４つの大きなｂｒａｎｃｈに分かれた（表３）。
【００８２】
【表３】
2004051559.tif 000004
ＳＣＬＣは小細胞性肺癌、ＳＣＣは扁平上皮癌、ＮＳＣＬＣは非小細胞性肺癌、ＡＣは腺癌、ＬＣＣは大細胞性癌を示す。また、＊は、非小細胞性肺癌由来細胞株（病型分類不明）を示す。
【００８３】
Ｂｒａｎｃｈ　１は殆ど全ての小細胞性肺癌由来細胞株と全ての小細胞性肺癌とカルチノイドの臨床検体を含む。Ｂｒａｎｃｈ　２には扁平上皮癌の臨床検体と細胞株が多く含まれ、Ｂｒａｎｃｈ　３は細胞株のｂｒａｎｃｈで胎児由来正常繊維芽細胞株は全てこのｂｒａｎｃｈに含まれる。Ｂｒａｎｃｈ　４には全ての腺癌、大細胞癌と正常肺の臨床検体が含まれる。２株の非小細胞性肺癌由来細胞株（病型分類不明）は上記４つのｂｒａｎｃｈからは独立したｂｒａｎｃｈを形成している。Ｂｉｎａｒｙ　Ｓｅａｒｃｈ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍを適用して、細胞株全般に固有の遺伝子発現プロファイルおよび臨床検体全般に固有の遺伝子発現プロファイルを除去する事により、それまで困難であった臨床検体と細胞株を直接比較する事が可能となった。特に小細胞性肺癌由来細胞株の大部分（１１／１３）と扁平上皮癌由来細胞株の一部（４／８）は夫々の細胞株が由来する病型の臨床検体クラスターに帰属された事からこれらの細胞株はもとの腫瘍の形質をよく保持していると考えられた。腺癌については今回実施したフィルタリング・クラスタリングでは正常肺組織との分離が不充分でかつ腺癌由来細胞株の帰属は得られなかった（０／１１）。この理由として、腺癌臨床検体が異なる分化度の症例からなっており、正常肺組織の混入度が高い為正常肺組織とのクラスター分離が不充分であったと考えられる一方、腺癌由来細胞株は由来する癌組織中の最も未分化な細胞が株化の過程で選択された事によると考えられた。
【００８４】
以下に、各種病型肺癌で病型特異的に発現変化を示す遺伝子一覧を示す。
（１）正常肺組織で高発現していて癌化で低下するもの（表４）
【表４】
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【００８５】
（２）小細胞性肺癌で高発現を示すもの（表５）
【表５】
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【００８６】
（３）扁平上皮癌で高発現を示すもの（表６）
【表６】
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【００８７】
（４）カルチノイドで高発現を示すもの（表７）
【表７】
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【００８８】
（５）腺癌および正常肺組織で高発現を示すもの（表８）
【表８】
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【００８９】
上記フィルタリング法により、細胞株あるいは臨床検体に共通して発現亢進している遺伝子を解析から除外する事により病型特異的な遺伝子発現プロファイルを得る事ができた。病型特異的に高発現している遺伝子の中には全ての細胞に共通した基本的経路の構成成分は殆ど含まれていない事から、フィルタリングが予想通りの効果を発揮したものと考えられた。
【００９０】
［実施例４］　　抗癌剤のターゲット分子の探索
これらの病型特異的遺伝子には既知の病型特異的マーカー（例、小細胞性肺癌のｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅマーカーや扁平上皮癌のケラチン等）が数多く含まれており、これらを除いた残りの遺伝子から細胞増殖、アポトーシス等、癌の進展に直接関与が想定されるものを検索した。その結果小細胞性肺癌に特異的に発現上昇しているものとして、Ｎ６２２４５　（ＣＤＣ７Ｌ１）、ＡＡ４５６６０８　（ＭＣＭ３）、およびＷ７４０７１　（ＭＣＭ４）が選別された。小細胞性肺癌ではＥ２Ｆ１の発現が亢進している事が知られており（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　２００１　Ｍａｒ　２９；２０（１４）：１６７８−８７）、比較的頻繁にＲＢの発現の消失が報告されている（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　１９９０　Ｓｅｐ　１；５０（１７）：５３１２−７）。またｎｅｕｒｏｅｎｄｃｒｉｎｅマーカーの代表であるｐｒｏｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎの小細胞性肺癌における発現にＥ２Ｆが関与している事が報告されている（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１９９９　Ａｐｒ　２２；１８（１６）：２６２７−３３）。一方でＣＤＣ７Ｌ１あるいはＭＣＭ３の発現がＥ２Ｆで制御されている事が示唆されている（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９８　Ｓｅｐ　４；　２７３（３６）：２３２４８−５７，　Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．　１９９８　１２：２１２０−３０）。さらにＣＤＣ７Ｌ１によるＭＣＭ２、ＭＣＭ３のリン酸化がＳ期の開始に重要でありリン酸化されたＭＣＭ２、ＭＣＭ３は他のＭＣＭ蛋白と複製起点で複合体を形成してｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ　ＤＮＡ　ｈｅｌｉｃａｓｅとして制御されたＤＮＡの複製に寄与している事が示唆されている（Ｍａｓａｉ　Ｈ．　ａｎｄ　Ａｒａｉ　Ｋ．，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２００２　Ｍａｒ；１９０（３）：２８７−９６）。今回実施したフィルタリングの結果、他のＥ２Ｆで制御される事が知られる遺伝子が全く選択されていない事から、小細胞性肺癌では恐らくＥ２Ｆに加えて別の転写調節メカニズムが協同的に作用した結果、小細胞性肺癌に特異的な発現亢進を示した事が強く示唆される。従ってＣＤＣ７Ｌ１キナーゼの特異的阻害剤は小細胞性肺癌の特異的な治療剤となる事が期待される。
【００９１】
【発明の効果】
本発明によって、ＣＤＣ７Ｌ１キナーゼを発現した癌を治療可能な抗癌剤が提供できるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】６３８６の遺伝子の２次元階層的クラスター化の樹状図を示す写真である。タイプに応じて着色された標本が、左側に示され、赤はＡＣ、緑はＳＣＣ、紫は正常、青はＳＣＬＣ、黒はＬＣＣ；　オレンジ色はカルチノイド、茶色は線維芽細胞、ピンクはＮＳＬＣを表わしている。各欄は、特定の遺伝子を表わす。正方形は、４つの複製にわたる対数平均発現比率に従って着色されている。基準標本との関係において、赤は１より大きい発現比率（過剰発現）、緑は１未満（過小発現）、黒はほぼ１に等しい比率（発現変化無し）を表わしている。
【図２】本文中に記述されているように統計的にろ過することによって得られた細胞系統中の５２５５の遺伝子の２次元階層的クラスター化の樹状図を示す写真である。タイプに応じて着色された標本が左側に示され、赤はＡＣ、緑はＳＣＣ、青はＳＣＬＣ、茶色は線維芽細胞、ピンクはＮＳＬＣを表わしている。各欄は、特定の遺伝子を表わす。正方形は４つの複製にわたる対数平均発現比率に従って着色されている。基準標本との関係において、赤は１より大きい発現比率（過剰発現）、緑は１未満（過小発現）、黒はほぼ１に等しい比率（発現変化無し）を表わしている。
【図３】腫瘍及び細胞系統の間で示差的に調節された遺伝子の同定を示す図および写真である。（Ａ）新鮮な標本に比べ細胞系統標本内で一般に過剰発現された９０５の遺伝子及び（Ｂ）新鮮な標本に比べて細胞系統標本中で一般に過小発現された１３１３の遺伝子についての全ての標本にわたる発現変化。（Ｃ）新鮮な標本と細胞系統標本の間で示差的に調節されている１９１９の遺伝子の２次元階層的クラスター化。左側の樹状図は、細胞系統標本と新鮮な標本のクラスター化を示す。分岐色は、図１に示されたとおりである。上部樹状図は、遺伝子のクラスター化を示している。
【図４】新鮮な標本と細胞系統標本の間で示差的に調節されるＢｉｎａｒｙ　Ｓｅａｒｃｈ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍによって選択され２２１８の遺伝子の２次元階層的クラスター化の樹状図を示す写真である。左側の樹状図は、細胞系統標本と新鮮な標本のクラスター化を示す。上部樹状図は、遺伝子のクラスター化を示す。新鮮な標本中でアップレギュレートされた遺伝子は右に向かってクラスター化している状態で示され、細胞系統標本中でアップレギュレートされた遺伝子は、左に向かってクラスター化している状態で示されている。主要データセットに内含させるのに、新鮮な標本と細胞系統標本の間で著しい対比を示さない遺伝子分岐（合計２９９）が選定された。
【図５】新鮮な標本又は細胞系統標本内の一般的に調節された遺伝子についてろ過した後の４２４０の遺伝子の削減されたデータセットの樹状図を示す写真である。標本は、図１の場合と同様に着色されている。左側に示されたグループは、特定の癌腫タイプの全く異なるクラスターを表わす。ｃｌ：細胞系統標本；　ｆｒ：新鮮な腫瘍標本。
【図６】全く異なる発現パターンを示す、図５からの８つの選択された遺伝子クラスターの全ての標本にわたる発現プロファイルを示す写真である。図５からの樹状図及び強調されたクラスターは、参考として底部に沿って及び個々の遺伝子クラスターの間に示されている。（Ａ）カルチノイド内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｂ）正常組織内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｃ）ＡＣ及びＬＣＣ内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｄ〜Ｅ）ＳＣＣ内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｆ〜Ｈ）ＳＣＬＣ内でアップレギュレートされた遺伝子。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年9月26日(2002.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
臨床検体は（財）癌研究会にて患者のｉｎｆｏｒｍｅｄ　ｃｏｎｓｅｎｔおよび倫理委員会の承認のもとで外科的摘除時に採取したものである。レファレンスサンプルとしては可能な限り多くの遺伝子について情報が得られる事を考慮して、２０％の正常肺組織にＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＥＫＶＸ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ｌｕ−１３４Ａ、ＭＲＣ５、ＳＱ５、Ｈ２３、ＰＣ１４、ＭＳ１の１０種の細胞株を夫々８％ずつ加えたものを用いた。全ての細胞株はＲＮＡｌａｔｅｒ　（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて細胞浮遊液とした。臨床検体はＲＮＡの分解を最小限にすべく採取後液体窒素にて瞬時に凍結せしめた。Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いてＲＮＡを抽出後、Ｌｕｏ，　Ｌ．等の方法（Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　（１９９９）　５　：　１１７−１２２）に従ってｃＲＮＡ合成を行った。プローブ合成はＨｕｇｈｅｓ，　ＴＲ等の方法（Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　（２００１）　１９　：　３４２−３４７）に従って２ｕｇのｃＲＮＡを鋳型として行った。レファレンスサンプルはＣｙ３にてテストサンプルはＣｙ５にて蛍光標識した。ハイブリダイゼーションとその後の洗浄はＨｅｇｄｅ，　Ｐ．等の方法（前出）に従った。ハイブリダイズしたシグナルの測定と定量はＳｃａｎｎａｒｒａｙ　４０００スキャナーとＱｕａｎｔａｒｒａｙ　（何れもＰａｃｋａｒｄ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて行った。