(57)【要約】【課題】本発明は、短期間での細胞増殖が可能で、確実かつ短期間で真皮の再生が可能な培養真皮シートの製造方法および培養真皮シートを提供することを課題としている。【解決手段】本発明に係る培養真皮シートの製造方法は、培養液、女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養し、該培養により得られる活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中に含浸させて、人工皮膚代替材料中に活性化間葉系幹細胞が含まれた培養真皮シートを得ることを特徴としている。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液および女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養し、該培養により得られる活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中に含浸させて、人工皮膚代替材料中に活性化間葉系幹細胞が含まれた培養真皮シートを得ることを特徴とする培養真皮シートの製造方法。
【請求項２】
培養液および女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養した後、
該培養により得られる活性化間葉系幹細胞を含む活性化細胞浮遊液を人工皮膚代替材料に含浸させることを特徴とする請求項１に記載の培養真皮シートの製造方法。
【請求項３】
培養液、女性ホルモン様物質および間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液を、人工皮膚代替材料に含浸させた後、
該間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中で培養することを特徴とする請求項１に記載の培養真皮シートの製造方法。
【請求項４】
前記女性ホルモン様物質が、エストロゲン、イソフラボン、ゲニステンおよびエヌライボールからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の培養真皮シートの製造方法。
【請求項５】
前記人工皮膚代替材料が、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の培養真皮シートの製造方法。
【請求項６】
前記人工皮膚代替材料がその表面に切込みを有することを特徴とする請求項２に記載の培養真皮シートの製造方法。
【請求項７】
遠心力により活性化間葉系細胞を人工皮膚代替材料に含浸させることを特徴とする請求項２に記載の培養真皮シートの製造方法。
【請求項８】
遠心力により間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料に含浸させることを特徴とする請求項３に記載の培養真皮シートの製造方法。
【請求項９】
女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養して得られる活性化間葉系幹細胞と、人工皮膚代替材料とを含むことを特徴とする培養真皮シート。
【請求項１０】
前記女性ホルモン様物質が、エストロゲン、イソフラボン、ゲニステンおよびエヌライボールからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項９に記載の培養真皮シート。
【請求項１１】
前記人工皮膚代替材料が、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項９または１０に記載の培養真皮シート。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養真皮シートの製造方法および培養真皮シートに関する。詳しくは、女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養し、得られた活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料中に含まれた培養真皮シートを製造する方法および培養真皮シートに関する。
【０００２】
【発明の技術的背景】
近年、培養表皮細胞を用いる皮膚組織の再生治療が行われているが、真皮に達する深い創傷に対する治療では、皮弁術と呼ばれる手術が採られている。
【０００３】
しかしながら、皮弁術では、形成外科的に高度な処置技術を必要とし、被験者には大きな手術創、深い麻酔を必要とする。皮弁を採取した部位は、皮膚組織の欠損が生じるため、その欠損部位の皮膚組織の再建も必要となる。また、皮弁術は全身状態の良好な者や、体力的な問題の少ない者に適用されることが好ましいなどの制約もある。
【０００４】
一方、最近、コラーゲンスポンジ等の人工真皮が開発され、真皮様の線維脂肪組織の再生治療に用いられている。しかしながら、このようなコラーゲンスポンジ等は、感染に対する耐性が大きくなく、また、人工材料のみでは、修復速度などの修復能力に限界があるという問題があった。
【０００５】
このため、コラーゲンスポンジ等に、細胞を組み込むことにより、再生能力を向上させる試みがなされている。たとえば、真皮の再生処置のための細胞として、線維芽細胞を用いた方法が提供されている。このような線維芽細胞は、同種細胞では免疫的な問題があるため、自家の線維芽細胞を採取することが必要となることが多いが、この場合、自家の組織を損傷させる場合があり、また、組織からの細胞の単離には長時間の酵素処理あるいはフィルター処理など煩雑な手続きを要するという問題があった。さらに、線維芽細胞は線維組織を再生することはできるが、皮下組織に含まれる線維組織以外の組織、たとえば、脂肪組織、血管組織などの再生には不向きであるというという問題があり、真皮の再生には適していない。
【０００６】
このため、細胞として、骨髄細胞を用いる方法が提供されている。骨髄細胞の場合、骨髄穿針で細胞浮遊液の状態で細胞の採取が可能であり、線維芽細胞のような複雑な採取方法を採る必要がない。さらに、骨髄細胞には、線維芽細胞、脂肪細胞、幹細胞など各種の細胞を含み、線維、脂肪、血管組織の再生に優れるという利点もあった。本願発明者らは、既に、培養骨髄細胞が皮膚損傷の再生を促進することを見出している（たとえば、非特許文献１および非特許文献２参照。）。しかしながら、骨髄細胞の培養には長期間を要し、その間被験者は、たとえば皮膚欠損の状態で、感染の危険に曝される場合があるなどの問題があった。また、被験者が高齢等の場合、骨髄細胞の数が少ない上に、細胞活性が低く培養増殖能力が低い場合があり、細胞培養に更なる時間を要するという問題があった。
【０００７】
一方、人工真皮の足場となるコラーゲンスポンジは気孔率や気孔径の大きさが小さく、細胞浮遊液を速やかにコラーゲンスポンジの内部に浸透させることが困難な場合があるという問題があった。
すなわち、コラーゲンスポンジに培養骨髄細胞浮遊液を含浸させる際、細胞浮遊液は、コラーゲンスポンジのごく表層にしか含浸されず、含浸されるのは培養骨髄細胞浮遊液の水分であり、培養細胞自体はコラーゲンスポンジの表層付近で目詰まりし、コラーゲンスポンジ全体に浸透しにくいという問題があった。
【０００８】
このため、短期間で細胞の増殖を可能とするとともに、短期間で真皮再生が可能な培養真皮シートおよびその製造方法の出現が望まれていた。さらに、高活性な細胞による単時間での培養を一層効率的に行うため、培養細胞を組み込みやすい構造を有する培養真皮シートおよびその製造方法の出現が望まれていた。
【非特許文献１】
奈良医学雑誌、ＶＯＬ５０第５０巻第６号、１９９９年１２月３１日、ｐ．５４３〜５５０
【非特許文献２】
ＥｘｐｅｒｔＮｕｒｓｅ  ＶＯＬ１８  Ｎｏ．９、２００２年７月、ｐ．１８〜２１
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような背景技術に基づきなされたものであって、短期間で細胞活性の高い細胞培養が可能で、確実かつ短期間で真皮の再生が可能な培養真皮シートを提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究し、女性ホルモン様物質の存在下に、間葉系幹細胞を培養することにより、短期間で間葉系幹細胞の増殖をすることが可能で、このように女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養して得られる活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料中に含まれた培養真皮シートが、高い真皮再生能力を有し、確実かつ短期間に真皮の再生が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の概要は以下のとおりである。
【００１２】
本発明に係る培養真皮シートの製造方法は、培養液および女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養し、該培養により得られる活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中に含浸させて、人工皮膚代替材料中に活性化間葉系幹細胞が含まれた培養真皮シートを得ることを特徴としている。
【００１３】
前記培養真皮シートの製造方法は、培養液および女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養した後、
該培養により得られる活性化間葉系幹細胞を含む活性化細胞浮遊液を人工皮膚代替材料に含浸させることが好ましい。
【００１４】
前記培養真皮シートの製造方法は、培養液、女性ホルモン様物質および間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液を、人工皮膚代替材料に含浸させた後、
該間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中で培養することが好ましい。
【００１５】
前記女性ホルモン様物質は、エストロゲン、イソフラボン、ゲニステンおよびエヌライボールからなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００１６】
前記人工皮膚代替材料は、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００１７】
前記人工皮膚代替材料は、その表面に切込みを有することが好ましい。
【００１８】
前記培養真皮シートの製造方法は、遠心力により活性化間葉系細胞を人工皮膚代替材料に含浸させることができる。
【００１９】
前記培養真皮シートの製造方法は、遠心力により間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料に含浸させることができる。
【００２０】
本発明に係る培養真皮シートは、女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養して得られる活性化間葉系幹細胞と、人工皮膚代替材料とを含むことを特徴としている。
【００２１】
前記女性ホルモン様物質は、エストロゲン、イソフラボン、ゲニステンおよびエヌライボールからなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００２２】
前記人工皮膚代替材料は、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ポリ乳酸およびポリグリコール酸からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【発明の実施の形態】
本発明に係る培養真皮シートは、女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養して得られる活性化間葉系幹細胞と、人工皮膚代替材料とを含む。以下、女性ホルモン様物質、間葉系幹細胞、人工皮膚代替材料について説明する。
【００２３】
間葉系幹細胞
本発明に係る培養真皮シートを形成するために用いる細胞は、間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞は、骨髄細胞、末梢血の幹細胞などに含まれる。このような間葉系幹細胞は、皮膚皮下組織に分化可能である。
【００２４】
間葉系幹細胞は、自己由来、同種異系由来または異種由来のものを用いることができる。これらのうちでは同種異系由来および異種由来の間葉系幹細胞は、免疫反応および感染性合併症の可能性を有する場合があり、培養真皮シートをヒトなどに適用する場合、自己由来の間葉系幹細胞を用いることが好ましい。このような間葉系幹細胞は、胚あるいは生後からのものを用いることができる。培養真皮シートをヒトに適用する場合は、ヒト由来の間葉系幹細胞を用いることが好ましい。
【００２５】
本発明では、間葉系幹細胞を含有する骨髄細胞あるいは末梢血の幹細胞をそのまま用いてもよいし、間葉系幹細胞を骨髄などから分離して用いてもよい。
【００２６】
このような間葉系幹細胞を含む骨髄細胞等は、生体から採取により入手することができる。たとえば、間葉系幹細胞を含む骨髄細胞は、部分麻酔下で腸骨から骨髄液を採取することにより入手できる。
【００２７】
このような間葉系幹細胞は、後述する女性ホルモン様物質を添加して培養することにより、細胞増殖能や分化能が向上した活性化間葉系幹細胞とすることができる。またこのような活性化間葉系幹細胞は、真皮への分化誘導に優れ、確実かつ短期間で真皮の再生を可能とする。
【００２８】
女性ホルモン様物質
本発明で用いられる女性ホルモン様物質は、女性ホルモン様活性を示す物質であれば限定されない。女性ホルモン様活性を示す物質とは、卵巣や胎盤から分泌され、雌特有の生殖機能を維持するため必要なホルモンを意味する。
【００２９】
このような女性ホルモン様物質としては、たとえば、エストロゲン、イソフラボン、ゲニステン、エヌライボールなどが挙げられ、これらのうちの少なくとも１種を用いることが好ましい。
これらは、公知の方法により合成することができる。また、市販のものを用いることもできる。
【００３０】
これらのうちでは、エストロゲンを好ましく用いることができる。エストロゲンとしては、エストロン、エストラジオール、エストリオールなどが挙げられ、これらのうちでは、エストリオールを好ましく用いることができる。
【００３１】
このような女性ホルモン様物質を添加して、間葉系幹細胞を培養すると、間葉系幹細胞の増殖が活性化されるので、たとえば、高齢者の細胞など、増殖活性の低い細胞であっても、充分な細胞増殖をさせることができる。女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養して得られる活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料に含浸された培養真皮シートは、真皮への分化誘導が促進されて真皮の再生速度が向上し、従来の人工真皮と比較して創傷治癒能力が向上している。このような培養真皮シートが生体に移植された場合、短期間で確実に損傷した皮膚組織を作製することが可能である。
【００３２】
なおこれまで、女性ホルモンが血管内皮細胞を活性化して血管の形成を促進するということが知られているが（文献：Ｅｎｄｏｃｌｉｎｏｌｏｇｙ  ２００２，１４３：３７８５−３７９５）、真皮再生のための間葉系幹細胞にこのような女性ホルモン様物質を添加して培養することにより、間葉系幹細胞の増殖が活性化されるとともに、真皮細胞への増殖、分化が促進され、真皮の再生速度が向上することはこれまで知られていない。
【００３３】
このような女性ホルモン様物質の使用量は、間葉系幹細胞の培養に用いる培養液に対して、好ましくは１０−６モル／リットル〜１０−８モル／リットル、さらに好ましくは１０−７モル／リットル〜１０−８モル／リットルの範囲にあることが望ましい。
このような量の女性ホルモン様物質を添加して間葉系幹細胞の培養を行うと、細胞の増殖速度を著しく向上（たとえば約２倍強）させることができるとともに、得られる活性化間葉系幹細胞は、真皮細胞への分化誘導が促進されて、真皮細胞の再生速度が向上している。
【００３４】
また、特に、女性ホルモン様物質の添加により、細胞膜の酵素であるアルカリフォスファターゼが高い活性を示す（たとえば女性ホルモン様物質を添加しない場合と比較して２〜３倍のアルカリフォスファターゼ活性を示す）ことが、本願発明者らの研究により明らかとなっており、細胞膜形成速度の向上が間葉系幹細胞の増殖活性の向上および真皮細胞への分化誘導促進に寄与しているものと推測される。
【００３５】
人工皮膚代替材料
本発明で用いられる人工皮膚代替材料は、本発明に係る培養真皮シートを生体に適用した場合に、生体の免疫機能によって拒絶されず、生体適合性に優れた材質であることが好ましい。また、生体吸収性あるいは性分解性の材料であれば適用後に異物として取り除く必要がなく、人工皮膚代替材料として適用可能である。人工皮膚代替材料は、間葉系幹細胞或いは活性化間葉系幹細胞が増殖して皮膚皮下組織を形成するための足場としても機能し得るものである。
【００３６】
このような人工皮膚代替材料としては、たとえば、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、フィブリンなどの生体由来材料、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの合成高分子材料などが挙げられる。
これらは１種単独でまたは複数を組み合わせて用いることができる。
【００３７】
これらのうちではコラーゲン、アテロコラーゲンを好ましく用いることができ、コラーゲンを用いることがより好ましい。コラーゲンまたはアテロコラーゲンとしては、動物由来、魚由来のものが好ましく、哺乳類由来のものがより好ましい。コラーゲンとしてはＩ型コラーゲンまたはＩＩＩ型コラーゲンを用いることが好ましい。
このようなコラーゲンは、市販のものまたは動物、魚から抽出して得ることができる。アテロコラーゲンは、常法により、コラーゲンから主たる抗原性部位であるテロペプチド領域を酵素等を用いて除去して得ることができる。
【００３８】
人工皮膚代替材料の形態は特に限定されず、フィルム状、ゲル状、スポンジ状のいずれも用いることができる。これらのうちでは、間葉系幹細胞あるいは活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料中に浸透して含浸しやすいように、スポンジ状の形態であることが好ましい。
【００３９】
なお、本明細書において、間葉系幹細胞あるいは活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料中に含浸するとは、間葉系幹細胞あるいは活性化間葉系幹細胞が、人工皮膚代替材料の組織中あるいは構造中の間隙に入り込んで、組織中あるいは構造中に保持させることを意味している。
【００４０】
したがって、本発明で用いられる人工皮膚代替材料としては、コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンスポンジなどを用いることが好ましい。
【００４１】
このようなコラーゲンスポンジあるいはアテロコラーゲンスポンジの孔径は、好ましくは１０μｍ〜１０００μｍ、さらに好ましくは１００μｍ〜５００μｍの範囲にあることが望ましい。
【００４２】
スポンジの孔径が上記範囲にあると、間葉系幹細胞をより容易にスポンジの内部に浸透して含浸させることができる。
人工皮膚代替材料の厚さは、適用される真皮の部位などにより異なり限定されないが、たとえば、好ましくは１ｍｍ〜１０ｍｍの範囲にあることが望ましい。
【００４３】
本発明で用いる人工皮膚代替材料は、長方形、楕円状等疾患の部位に対応して各種のシート状の形状を採ることができるが、表面と裏面とを有する該シート状の人工皮膚代替材料の片側の表面に切込みを有することが好ましい。切込みは、たとえば、平行に一方向のみに設けられていてもよいし、平行でなくてもよい。また、たとえば、ほぼ平行な切込みが、縦と横に直交するように設けることもできる。平行に切込みを入れる場合、その間隔はたとえば、好ましくは１ｍｍ〜５ｍｍ間隔、より好ましくは２ｍｍ〜３ｍｍ間隔で設けることができる。碁盤目状に切込みを入れる場合、縦と横の切り込み間隔は同じ間隔であってもよいし、異なる間隔であってもよい。図１は、人工皮膚代替材料１の片側面に碁盤目状の切込み２を入れた模式図である。この例では、切込み２は、縦と横がほぼ等間隔に、平行に設けられている。
【００４４】
このような切り込みは人工皮膚代替材料の片側の表面に設けられていることが望ましい。
切り込みの深さは人工皮膚代替材料の厚さにより異なり特に限定されないが、好ましくは厚みの９０以上１００％未満、より好ましくは厚みの９５〜９９％の深さとすることが望ましい。
【００４５】
このような切込みを人工皮膚代替材料の片側面に設けることにより、間葉系幹細胞または活性化間葉系幹細胞が含まれる細胞浮遊液と人工皮膚代替材料との接触面積が増大し、人工皮膚代替材料に短時間で、しかも深部にまで、間葉系幹細胞または活性化間葉系幹細胞を含浸させることができる。
【００４６】
本発明で用いる人工皮膚代替材料は、その片側面の全部又は一部がシリコーン膜で被覆されていてもよい。シリコーン膜を有する培養真皮シートは、疾患への適用の際は、外層がシリコーン膜となるよう疾患部位に貼り付けられる。シリコーン膜があると、間葉系幹細胞あるいは活性化間葉系幹細胞の分化増殖がより安定的に進行する。切込みを入れる場合は、切込みを入れた面と反対側の表面にシリコーン膜を被覆することが望ましい。シリコーン膜の厚さは限定されないが、たとえば、１００μｍ〜５００μｍ程度であればよい。
【００４７】
図２に示すように、切込みを入れない人工皮膚代替材料１を用いる場合は、間葉系幹細胞または活性化間葉系幹細胞４が含まれる細胞浮遊液３が人工皮膚代替材料１の表面６のみから浸透するしかないが、図３に示すとおり、切込み２を入れることで、細胞浮遊液３と人工皮膚代替材料１との接触が増大し、間葉系幹細胞または活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料の深部にまで含浸させることができる。
【００４８】
培養真皮シートの製造方法
本発明に係る培養真皮シートは、培養液と女性ホルモン様物質の存在下に間葉系幹細胞を培養し、この培養により得られる活性化間葉系幹細胞を、人工皮膚代替材料中に含浸させることにより得ることができる。
【００４９】
女性ホルモン様物質による間葉系幹細胞の活性化は、間葉系幹細胞の増殖や分化を誘導することが可能な任意に時期に行うことができる。
【００５０】
具体的には、（ｉ）人工皮膚代替材料に間葉系幹細胞を接着させる前に、あらかじめ女性ホルモン様物質を添加した培養液で間葉系幹細胞を培養（初期培養という）し、この後、得られた活性化間葉系幹細胞を含む活性化細胞浮遊液を人工皮膚代替材料に含浸させることができる。
【００５１】
また、（ｉｉ）女性ホルモン様物質を添加した培養液を用いて人工皮膚代替材料中で間葉系幹細胞を直接培養することにより、活性化間葉系幹細胞を得るとともに、該培養による細胞の増殖を通じて、活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中に含浸させることもできる。この場合は、初期培養を実施しなくてもよい。
【００５２】
これらのうちでは、初期培養を要しないで、人工皮膚代替材料中で間葉系幹細胞を培養する際に、女性ホルモン様物質を添加する、前記（ｉｉ）の方法を用いることが好ましい。
【００５３】
前記培養液としては、液体状のものに加え、ゲル状の培地を用いることもできる。公知のものを用いることができ特に限定されず、たとえば、ＭＥＭ（イーグルの最小必須培地）、牛胎児血清やヒト結成などを用いることができる。なお、本明細書では、このような培養液と間葉系幹細胞を含むものを細胞浮遊液という。また培養液と活性化間葉系幹細胞とを含むものを活性化細胞浮遊液をいう。これらの浮遊液は、女性ホルモン様物質などを含むことができる。
【００５４】
このような細胞浮遊液中の間葉系幹細胞の培養期間中の細胞密度は特に限定されないが、好ましくは１×１０２〜１×１０７個／ｍｌ、さらに好ましくは好ましくは１×１０５〜１×１０６個／ｍｌ程度であればよい。
【００５５】
また活性化細胞浮遊液中の活性化間葉系幹細胞の培養期間中の細胞密度は特に限定されないが、好ましくは１×１０２〜１×１０７個／ｍｌ、さらに好ましくは好ましくは１×１０５〜１×１０６個／ｍｌ程度であればよい。
【００５６】
培養は公知の方法により行うことができ限定されない。たとえば前記（ｉ）の方法による場合は、培養液に細胞、女性ホルモン様物質を添加して、好ましくは常温（３７℃）程度、湿度８０％〜１００％程度の範囲で、３〜７％二酸化炭素濃度の雰囲気下で、好ましくは１〜３週間の期間培養することができる。得られた活性化間葉系幹細胞は、通常培養フラスコなどに付着しているので、必要に応じトリプシン処理してフラスコ等から剥がし、活性化間葉系幹細胞を含む活性化細胞浮遊液を、人工皮膚代替材料に滴下して、活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中に含浸させる。これにより、活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料中に含浸した培養真皮シートを得ることができる。
【００５７】
また、たとえば、（ｉｉ）の方法による場合は、培養液、女性ホルモン様物質および細胞を含む細胞浮遊液を、人工皮膚代替材料に添加して、好ましくは常温（３７℃）程度、湿度８０％〜１００％程度の範囲で、３〜７％二酸化炭素濃度の雰囲気下で、好ましくは１〜３週間の期間、人工皮膚代替材料中で細胞を培養する。これにより、女性ホルモン様物質により活性化された活性化間葉系幹細胞が人工皮膚代替材料中に含浸した培養真皮シートを得ることができる。
【００５８】
培養真皮シート中の活性化間葉系幹細胞の存在密度は特に限定されないが、好ましくは１×１０２〜１×１０７個／ｍｌ、さらに好ましくは好ましくは１×１０５〜１×１０６個／ｍｌ程度であればよい。
【００５９】
また本発明では、前記（ｉ）の方法による場合、活性化間葉系幹細胞を含む活性化細胞浮遊液を人工皮膚代替材料に滴下した後、これらに遠心力をかけて、前記活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中により深くかつ効率的に含浸させることができる。遠心力は、間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液が滴下された人工皮膚代替材を遠心器等にかけて付与することができる。遠心力の大きさは好ましくは０を超え９００×ｇ以下であることが望ましい。力の大きさが上記範囲を超えると、活性化間葉系幹細胞に損傷を与える場合がある。
【００６０】
また本発明では、前記（ｉｉ）の方法による場合、間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液を人工皮膚代替材料に滴下した後、これらに遠心力をかけて、前記間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料中により深くかつ効率的に含浸させることができる。遠心力は、間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液が滴下された人工皮膚代替材を遠心器等にかけて付与することができる。力の大きさは好ましくは０を超え９００×ｇ以下であることが望ましい。力の大きさが上記範囲を超えると、間葉系幹細胞に損傷を与える場合がある。
【００６１】
培養真皮シートの製造方法として、より具体的な例として、たとえば図４（（ｉ）の方法の一例）に示すように、たとえば間葉系幹細胞を含む骨髄細胞を用いる場合、まず、骨髄液７を採取し、培養フラスコ８に移し、たとえば女性ホルモン様物質、骨髄細胞を加えたＭＥＭ系培地９などで、一定期間培養する。次に、培養液をトリプシン処理して、間葉系幹細胞又は活性化間葉系幹細胞を培養フラスコ８から剥がして、細胞浮遊液１０を作成し、これを注射器１１へ封入する。次に、必要に応じて切込みを入れた人工皮膚代替材料１２に細胞浮遊液１０を滴下（切込みがある場合は切込みが存在する面に滴下）し、さらに、必要に応じ、これを遠心分離機にかけて、間葉系幹細胞又は活性化間葉系幹細胞を人工皮膚代替材料の深部にまで含浸させることにより、本発明に係る培養真皮シートを得ることができる。
【００６２】
得られた培養真皮シートは、そのまま臨床に使用することができる。臨床に使用するまでに時間がある場合は、好ましくは０℃〜−１９６℃、さらに好ましくは−２０℃〜−５０℃で保存すればよい。低温で保存した場合には、室温に戻してから臨床に使用ればよい。
【００６３】
【発明の効果】
本発明に係る培養真皮シートの製造方法は、間葉系幹細胞を女性ホルモン様物質の存在下に培養するので、細胞増殖能が向上している。また、細胞の分化誘導能、細胞の再生速度が向上している。さらに、人工皮膚代替材料に切込みを入れることで、間葉系幹細胞或いは活性化間葉系幹細胞との接触面積が増大し、人工皮膚代替材料に、短時間で深部にまで間葉系幹細胞または活性化間葉系幹細胞を含浸させることができる。本発明に係る培養真皮シートの製造方法または真皮培養シートによれば、体力的に課題のある患者などにも容易に適用可能で、適用部位によっては入院を不用とせず、外来通院のみでの治癒も期待できる。
【００６４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は、これらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００６５】
【比較例１】
図７に示すように、９１歳女性脳梗塞の寝たきりの臀部にじょく創を有する患者に、本人の骨盤から骨髄液を採取し、採取した骨髄液をＴ７５フラスコで、標準培地（牛胎児血清、抗生剤を含むＭＥＭ）にて培養した。
【００６６】
当初の細胞密度は、数百個程度であった（Ｔ７５フラスコの使用培地は約１０ｍｌ）。３週間培養したが、肉眼で確認したところ細胞は充分に増殖していなかった。その後培養後の培養液をトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商品名）、ナカライ株式会社製）で処理し、遠心分離機により細胞を溶液中に沈殿させたが、わずかの細胞しか肉眼で確認できなかった。
【００６７】
培養した細胞を含む細胞浮遊液を、厚さ３ｍｍ、直径約３ｃｍのコラーゲンスポンジ（ペルナック（商品名）、グンゼ株式会社製）に、図５に示すように注射器で滴下してコラーゲンスポンジ中に含ませた。表面に細胞浮遊液が滴状になり、しみ込みが不十分であった。この細胞浮遊液を含んだコラーゲンスポンジを患者に移植した。移植後１週間で肉芽細胞の形成が軽度見られ、さらに皮膚移植を追加したが、移植皮膚片は生体に生着せず、図８に示すように移植して約２ヶ月後においても創部を治癒させることができなかった。
【００６８】
【実施例１】
比較例１の図８の状態にある９１歳女性脳梗塞の寝たきりの臀部にじょく創を有する患者に、本人の骨盤から骨髄液を採取し、採取した骨髄液をＴ７５フラスコで、標準培地（牛胎児血清、抗生剤を含むＭＥＭ）に添加するとともに、エストリオール（ｅｓｔｒｉｏｌ（商品名）、ナカライ株式会社製）を培地の量に対して１００ｎモル／リットル添加した。当初の細胞密度は、数百個／フラスコ程度であった。
【００６９】
３週間培養し、トリプシン処理したところ、細胞数は約１×１０６個得られ、肉眼で見ても充分量の細胞が得られた。
【００７０】
図６に示すように、厚さ３ｍｍ、直径約１０ｃｍのコラーゲンスポンジ（ペルナック（商品名）、グンゼ株式会社製）に、５ｍｍ間隔で、碁盤目状に、厚さ９９％程度の深さの切込みを入れ、切込みを入れた側に、培養した細胞を含む細胞浮遊液を含ませた。細胞浮遊液は速やかにコラーゲンスポンジ全体に広がった。
【００７１】
この培養真皮シートを、患者に移植した。移植後１週間で肉芽細胞の形成がかなり観察され、さらに皮膚移植を追加したところ、移植皮膚片も生着した。図９に示すように、移植して約２ヶ月後、肉芽組織および皮膚が再生され、じょく創はほぼ治癒したことが確認された。
【００７２】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、切込みのない人工皮膚代替材料に、切込みをいれたことを示す模式図の一例である。
【図２】図２は、切込みのない人工皮膚代替材料に間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液を滴下した際の断面図を示す模式図である。
【図３】図３は、切込みを有する人工皮膚代替材料に間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液を滴下した際の断面図を示す模式図である。
【図４】図４は、培養真皮シートの製造方法の一例を示す模式図である。
【図５】図５は、コラーゲンスポンジに、間葉系幹細胞を含む細胞浮遊液を滴下する例を示す写真である。
【図６】図６は、切込みを有するコラーゲンスポンジの一例を示す写真である。
【図７】図７は、治療前の患者のじょく創部の一例を示す写真である。
【図８】図８は、女性ホルモン様物質を添加していない状態で間葉系幹細胞を培養して得られる細胞浮遊液および切込みのないコラーゲンスポンジを用いた場合の治癒の状態の一例を示す写真である。
【図９】図９は、女性ホルモン様物質を添加して間葉系幹細胞を培養して得られる細胞浮遊液および切込みを有するコラーゲンスポンジを用いた場合の治癒の状態の一例を示す写真である。
【符号の説明】
１  人工皮膚代替材料
２  切込み
３  細胞浮遊液および／または活性化細胞浮遊液
４  間葉系幹細胞および／または活性化間葉系幹細胞
５  シリコンシート
６  人工皮膚代替材料の表面
７  骨髄液
８  培養フラスコ
９  ＭＥＭ培地
１０  活性化間葉系幹細胞を含む活性化細胞浮遊液
１１  注射器
１２  活性化間葉系幹細胞を含む人工皮膚代替材料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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