(57)【要約】【課題】本発明の目的は有効成分として、白頭翁から分離された抗腫瘍物質又はそれを含有する白頭翁分画を含む、固形腫瘍治療剤を提供することにある。【解決手段】本発明は、ヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシド、又はこれを含有する白頭翁抽出物を含む固形腫瘍治療剤に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、ヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシドを含有する白頭翁（Pulsatillae radix）の抽出物を含む固形腫瘍治療剤。
【請求項２】
白頭翁の抽出物が、白頭翁をエタノール水溶液で抽出した後、アセトンを加え、沈澱させて得た水溶性分画である請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
白頭翁の抽出物を１日当り２００〜３００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与する請求項２に記載の治療剤。
【請求項４】
白頭翁の抽出物が、白頭翁をエタノール水溶液で抽出した後、アセトンを加え、沈澱させて水溶性分画を得て、これをセファデックス ＬＨ２０カラムを通過させて得たＲｆが０．４８〜０．５０であり、硫酸噴霧後、加熱したとき、赤色を示した後、青色を示す分画である請求項１に記載の治療剤。
【請求項５】
白頭翁の抽出物を１日当り２０〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与する請求項４に記載の治療剤。
【請求項６】
有効成分として、ヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシドを含む固形腫瘍治療剤。
【請求項７】
ヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシドを１日当り３．５〜８．０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与する請求項６に記載の治療剤。
【請求項８】
生理食塩水、リンガー液及び栄養剤からなる群より選択される溶液に溶解させて投与する請求項１〜７の何れかに記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、下記一般式（１）で表示される、ヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシド（hederagenin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl((1→2)- [β-D-glucopyranosyl(1→4)]-α-L-arabinopyranoside）、及びそれを含有する白頭翁抽出物の固形腫瘍（solid tumors）治療剤としての用途に関するものである。
【０００２】
【化１】
2004051641.tif 000002
【０００３】
　白頭翁（Pulsatillae radix）は、キンボウゲ科（Ranunculaceae）に属するオキナグサ（Pulsatilla koreana）（BAE, Ki Hwan, 韓国の薬用植物, 1999）の根を乾燥したものである。漢方で白頭翁は清熱、養血、解毒の効能があるものと知られている。尚白頭翁は消炎、収斂、止血、下痢止め薬、熱毒性血痢、マラリア、鼻出血、歯出血、咽喉腫の治療剤として使われてきた。その花を白頭翁花といい、マラリア、天然痘の治療のために用いられ、その葉を白頭翁葉といい、腰・膝の痛み（痛風）、浮腫、心臓痛の治療のために用いられる。また、白頭翁を水で煎じた液はアミーバ赤痢菌に対する抗菌作用があり、トリコモナスに対して殺虫作用があるものと報告されている。
【０００４】
　白頭翁には約９％のサポニンが含まれており、現在まで分離された成分としては下記一般式（２）に示したようなプロトアネモニン（protoanemonin）、アネモニン（anemonin）、ラヌンキュリン（ranunculin）、ヘデラゲニン（hederagenin）、ベトゥリニック酸（betulinic acid）及びオレアノール酸（oleanolic acid）誘導体とその配糖体等がある。
【０００５】
【化２】
2004051641.tif 000003
【０００６】
　これまで上記した各成分の薬効に対し、それほど多くの研究が行われていないが、プロトアネモニンは有糸分裂毒性（mitotoxicity）を持つものと報告されており、Vonderbank（非特許文献１）や、Liら（非特許文献２）はラヌンキュリンがＫＢ細胞などに対して細胞毒性を示し、その細胞毒性メカニズムはＤＮＡ重合酵素阻害と報告している。
【０００７】
　一方、ヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシドは、Shimizuら（非特許文献３）がオキナグサ（日本白頭翁；Pulsatilla cerna）と朝鮮白頭翁（P. koreana）から、Yoshihiroら（非特許文献４）がヒロハオキナグサ（中国白頭翁；P. chinensis）から、そしてEkaboら（非特許文献５）はSerjania Salzmanniana Schlechtから分離しており、Kangら（非特許文献６）が朝鮮白頭翁（P. koreana）から既に分離してその構造を再確認している。
【０００８】
　Yoshihiroらは、上記文献でヘデラゲニン誘導体及びオレアノール酸誘導体等がＨＬ−６０ヒト白血病（leukemia）細胞に対して細胞毒性を持っていると報告した。彼らは中国オキナグサ根から分離したヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシドが、ＨＬ−６０細胞に対して、ＥＤ５０＝３．８μｇ／ｍＬの弱い細胞毒性を示していると報告した。
【０００９】
　しかし、この程度の細胞毒性は、大多数のサポニンと多くの種類の天然物が示す一般的な程度のものであり、この程度では上記物質が抗腫瘍効果を持っているものとは言い難い。このように、ヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシドが抗腫瘍効果、特に固形腫瘍に対する抗腫瘍効果を持っていることは今まで全く知られていない。
【００１０】
　本発明者らはシャク（Anthriscus sylvestris Hoffman）、白頭翁をはじめとする数種の生薬からデオキシポドフィロトキシン（deoxypodophyllotoxin）を分離し、この物質が血管新生（angiogenesis）抑制によって固形腫瘍細胞の成長を抑制するという事実を見いだし、韓国特許第３１５，２００号を既に獲得している。
【００１１】
【非特許文献１】Pharmazie 5, 210, 1950
【非特許文献２】Yao Hsueh Hsueh Pao. 28, 32631, 1993
【非特許文献３】Chem. Pharm. Bull., 26, 1666, 1978
【非特許文献４】J. Nat. Pro., 62, 1279, 1999
【非特許文献５】J. Nat. Prod., 59, 431, 1996
【非特許文献６】Arch. Pharm. Res., 12(1), 42-47, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
　本発明者らは生薬から他の抗腫瘍物質を見いだすために鋭意研究中、白頭翁から有機溶媒にはよく溶けないながら水にはよく溶ける分画を得て、そこから抗腫瘍物質を分離し、本発明を完成した。
　従って、本発明の目的は有効成分として、白頭翁から分離された抗腫瘍物質又はそれを含有する白頭翁分画を含む、固形腫瘍治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
　本発明の第１の発明は、有効成分として、ヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシドを含有する白頭翁抽出物を含む固形腫瘍治療剤に関するものである。
【００１４】
　本発明で、「固形腫瘍」とは、血液癌を除いたあらゆる塊りからなる腫瘍を言い、その代表的な例としては肺腫瘍が挙げられる。
【００１５】
　本発明において、ヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシドを含有する白頭翁抽出物は、白頭翁をエタノール水溶液で抽出した後、アセトンを加え、沈澱させて水溶性分画（ＷＴ）を収得することにより得ることが出来る。。
【００１６】
　また、白頭翁をエタノール水溶液で抽出した後、アセトンを加え、沈澱させて水溶性分画を得て、これをセファデックス ＬＨ２０カラムを通過させて、Ｒｆが０．４８〜０．５０であり、硫酸噴霧後、加熱したとき、赤色を示した後、青色を示す分画（ＳＰＸ３）を採取することにより得ることができる。
【００１７】
　本発明の第２の発明は、有効成分として、ヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシドを含む固形腫瘍治療剤に関するものである。
【００１８】
　以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
　本発明では、白頭翁を５０％エタノールで抽出してアセトンに殆ど溶解しないＷＴ分画を得、これをセファデックス ＬＨ２０上でさらに精製してＳＰＸ３分画を得、得られた分画から最終的に純粋物質であるＳＢ３６５を得た。この物質は、ヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシドであり、マウス肺腫瘍細胞であるンＬＬＣ細胞（ルイス肺癌細胞）またはヒト肺腫瘍細胞であるＮＣＩ−Ｈ２３細胞によって発生させた固形腫瘍に対して、臨床薬物であるアドリアマイシン（adriamycin）よりも優れた抗腫瘍活性を示す。
【００２０】
　以上のように、白頭翁から抗腫瘍分画を製造し、この分画から抗腫瘍物質を分離するためには、次のような過程を経る。
【００２１】
（１）白頭翁から抗腫瘍分画ＷＴの製造
　白頭翁粉末を５０％エタノール水溶液で抽出し、減圧下で乾燥した。得られた乾燥物に５〜１０倍量のアセトンを加えて振った後、混合物を３０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄液を除去して沈澱物を得た。この沈澱物に対して上記操作を２回繰り返した。最終的に得られた沈澱物は水によく溶解されるので、“分画ＷＴ”として標示した。この分画は、ＬＬＣ細胞を移植したＢＤＦ１マウス及びＮＣＩ−Ｈ２３を移植したヌードマウスに対して、比較的高い抗腫瘍活性を示した。
【００２２】
（２）分画ＷＴから分画ＳＰＸ３の製造
　分画ＷＴから一定量を採って、様々な濃度のメタノール水溶液の一定量に溶解させた後、同じ溶媒で安定化させたセファデックス　ＬＨ２０カラムに加えて分画を行った。この時、８０％メタノール水溶液を使用したとき、分離効果が最も良く、分画ＷＴ　５００ｍｇを採った場合、カラムの充填サイズは６０×４ｃｍが好適であった。その結果、分画ＳＰＸ１（試験管番号　２６−６６）、ＳＰＸ２（試験管番号　６６−９１）、ＳＰＸ３（試験管番号　９１−１１１）及びＳＰＸ４（試験管番号　１１１−１３８）をそれぞれ得た。その中、ＳＰＸ３は硫酸噴霧後、加熱した時、最初は赤色を示したが、時間の経過と共に青色を示し、主構成成分としてＲｆ値が０．４８〜０．５０の化合物を含み、ＬＬＣ細胞を移植したＢＤＦ１マウス及びＮＣＩ−Ｈ２３を移植したヌードマウスに対して高い抗腫瘍性活性を有していることが判った。
【００２３】
（３）分画ＳＰＸ３から活性物質ＳＢ３６５の単離
　抗腫瘍活性を示したＳＰＸ３分画から抗腫瘍物質を単離するために、ＨＰＬＣ処理を行って純粋な物質ＳＢ３６５を得た。ＳＢ３６５の構造を確認するために、リーベルマン・バーチャード（Lieberman-Burchard）反応、ＩＲ、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及びエタノール／硫酸加水分解を実施した結果、ＳＢ３６５は白頭翁で既に分離された、サポニン成分であるヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシドであることが明らかになった。
【００２４】
　本発明に係る白頭翁抽出物やこの抽出物から分離された純粋物質ＳＢ３６５は固形腫瘍細胞に対して、細胞毒性を殆ど示していないにもかかわらず、動物実験で優れた抗腫瘍活性を示していることを特徴とする。したがって、臨床で使用している既存の抗腫瘍剤が血液細胞減少を引き起こして免疫機能を低下させる問題点を改善でき、且つ造血細胞等のように細胞分裂速度が速い細胞に対して低い毒性を示すことが期待される。
【００２５】
　本発明の白頭翁抽出物とＳＢ３６５は、薬剤学的分野から通常的へ許容される担体を配合して薬剤学的分野で通常的な製剤、例えば、液剤、懸濁剤などの経口投与用製剤、注射用溶液または懸濁液、または注射時の注射用蒸留水で再調剤して使用することができる直時使用型の注射用乾燥粉末等のような形態の注射用製剤、軟膏剤、クリーム剤、液剤などの局所適用型の製剤等の多様な製剤に剤形化することができる。特に、本発明の活性成分は水溶性であるため、生理食塩水、リンガー液、栄養剤などの多様な溶液に溶解させて簡便に使うことが出来る。このような薬剤学的製剤は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内投与または局所適用できる。
【００２６】
　本活性成分のヒトに対する所用投与量は、ＳＢ３６５の場合　３．５〜８．０ｍｇ／ｋｇ体重、ＳＰＸ３の場合　２０〜４０ｍｇ／ｋｇ体重、ＷＴの場合　２００〜３００ｍｇ／ｋｇ体重である。最適の用量は、ＷＴの場合　２５０ｍｇ／ｋｇ体重、ＳＰＸ３の場合　２５ｍｇ／ｋｇ体重、ＳＢ３６５の場合　６．５ｍｇ／ｋｇ体重である。しかし、上記投与用量は投与対象の年齢、体重、食餌、健康状態、疾患の重症度などを考慮して適宜増減できる。
【発明の効果】
【００２７】
　本発明に係る白頭翁分画ＷＴ及びＳＰＸ３、及びそこから分離されたＳＢ３６５、ヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシドは、固形腫瘍細胞に対して高い腫瘍成長抑制率を示すだけでなく、水溶性であるため生理食塩水、リンガー液または栄養剤のような多様な溶液に溶解させて間単に使用できる。細胞毒性が低く、既存の抗腫瘍剤の副作用を軽減させることができ、固形腫瘍に対する治療剤として非常に有用であることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
　本発明は下記実施例により一層理解されるであろう。当業者は記載された具体的な物質及び結果が単に例示的なものであり、請求範囲に広範囲に記載されている本発明を限定しようとするものではなく、限定すべきでないことを容易に理解出来るであろう。
【実施例１】
【００２９】
ＷＴ分画の製造
　白頭翁粉末５０ｇを５０％エタノール水溶液５００ｍＬで３回抽出し、減圧下で乾燥して乾燥物２２gを得た。この乾燥物にアセトン３００ｍＬを加えて振盪した後、３０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄液を除去して沈澱物を得た。この沈澱物に対してアセトン処理を２回繰返した後、アセトン層は捨て、不溶分を乾燥して乾燥物（ＷＴ分画）１７．８gを得た。得られたＷＴ分画に対してシリカゲルＴＬＣを実施し（展開溶媒；ブタノール：酢酸：水＝４：１：１、呈色反応；硫酸を噴霧した後、加熱する）、その結果を図１に示した。図１で、Ｒｆ値が０．４８〜０．５０の間にある青色スポットが後述する本発明の有効成分に該当する。ＷＴ分画は下記実験例１に示す通りに、ＬＬＣ細胞を移植したＢＤＦ１マウスに対して比較的高い抗腫瘍活性（腫瘍成長抑制率（inhibition rate of tumor growth）：５７％）を示した。
【実施例２】
【００３０】
ＳＰＸ分画の製造
　分画ＷＴ５６０ｍｇをメタノール：水＝８０：２０を使用してセファデックス ＬＨ２０カラム（２００ｇ，６０×４ｃｍ）で、流出速度を１分当り１ｍＬ、分画量を1分当たり０．５ｍＬ／チューブにして分画を行った。これらの分画を順次シリカゲル薄層上にスポットした後、展開して分画を分けた（展開溶媒；ブタノール：酢酸：水＝４：１：１、呈色反応；硫酸を噴霧した後、加熱する）。その結果を図２に示した。図２で、ＳＰＸ１（１３９ｍｇ，２４．８％）は試験管番号２６〜６６を集めたものであり、主なスポットは４個で、下部のスポットは硫酸に対して黄色反応を示した。ＳＰＸ２（３４４ｍｇ，６１．４％）は試験管番号６６〜９１を集めたものであり、２個の主たるスポットで構成される分画である。ＳＰＸ３（６１ｍｇ，１０．９％）は試験管９１〜１１１を集めたものであり、硫酸噴霧後、加熱した時、最初は赤色を示したが時間が経過と共に青色を示した。ＳＰＸ３分画は、Ｒｆ値が０．４８〜０．５０の間にあるスポットを主物質とする分画である。ＳＰＸ４（１５．７ｍｇ，２．８％）は試験管１１１〜１３８を集めた分画であり、ＳＰＸ３とＳＰＸ４は薄層上では１個のスポットを示す比較的純度が高い分画である。
【００３１】
　下記実験例１に示す通りに、ＳＰＸ３は投薬後１５日目に腫瘍成長抑制率６０％を示すことによって、強い抗腫瘍性を示しており、ＳＰＸ１、ＳＰＸ２及びＳＰＸ４は作用がないことから、硫酸に対して青色反応を示す物質が抗腫瘍活性を有する成分であると推測することが出来る。このようなＳＰＸ３分画はそれ自体で抗腫瘍剤として使用できる。
【実施例３】
【００３２】
ＳＢ３６５の単離
　ＳＰＸ３分画から純粋物質を分離するために、下記のようにＨＰＬＣを行なった。
　固定相としてはシリカゲル（ＲＰ−Ｃ１８，２５０×１０ｍｍ，Metachem社）を、移動相としてはメタノール：水＝８０：２０を使用し、検出波長は２１０ｎｍ、流速は１ｍＬ／分であった。その結果を図３に示した。図３に示す通りに、ＳＰＸ３は３個の主物質で構成されている。実際の分画量からすると、Ｒｔ８．５分、１０．４分のピークは少量の物質を含有しており、Ｒｔ＝２３．３分のピークに該当する物質が主物質であった。したがって、後者が抗腫瘍活性を有している可能性が大きいと考えられた。このように活性成分である可能性が高く、硫酸に対して青色反応するＲｔ２３．３分の分画を採取し、ＳＰＸ３ ３１ｍｇからＳＢ３６５ ２．８ｍｇを得た。採取したＲｔ＝２３．３分の分画を乾燥した後、純度を確認するために同じ条件下で再びＨＰＬＣを行った。その結果を図４に示した。これによりＳＢ３６５が純粋な物質であることが確認された。このようにして得たＳＢ３６５を下記構造同定及び抗腫瘍実験に直接用いた。
【００３３】
　下記実験例１及び２に示す通りに、ＳＢ３６５はＬＬＣ細胞を移植したＢＤＦ１マウス及びＮＣＩ−Ｈ２３細胞を移植したヌードマウスで、それぞれ８１％及び８２．１％の腫瘍成長抑制率を示し、優れた抗腫瘍活性を示した。
【実施例４】
【００３４】
活性物質ＳＢ３６５の構造同定及び確認
　上記で分離した物質ＳＢ３６５は、ｍ．ｐ．２３９〜２４１℃、［α］Ｄ＝＋２３．６゜（ｃ，０．２，ＭｅＯＨ）の白色無定形であり、リーベルマン・バーチャード反応（陽性）により配糖体として確認された。また、ＩＲ（ｃｍ−１）では３４００（ｂｒ，−ＯＨ），２９４０（ｂｒ，Ｃ−Ｈ），１６９５（Ｃ＝Ｏ），１４５５，１０４０（Ｃ−Ｏ）で観察され、１０００−１１００，３０００−３４００の範囲での吸収ピークを示すことから、配糖体である可能性が大きいと推測された。
【００３５】
　１Ｈ−ＮＭＲを見ると、典型的なサポニンのＮＭＲパターンを持っており、６個のＣＨ３基らが０．９１，０．９２，０．９８，１．００，１．０７，１．２１ｐｐｍで観察され、もう一つの−ＣＨ３基が１．６４ｐｐｍでダブレット（doublet）として観察され、これにより構成糖中１個のラムノースが存在するものと推定された。アノマープロトンが６．２５（ｂｒ．）、５．１１（１Ｈ，Ｊ＝７．８０　Ｈｚ）及び４．９７ｐｐｍ（１Ｈ，Ｊ＝６．６６　Ｈｚ）で観察された。従って、ＳＢ３６５は３個の糖が結合された配糖体であることが確認された。
【００３６】
　１３Ｃ−ＮＭＲでは６５．４ｐｐｍ（Ｃ−２３）でヒドロキシメチル基が観察され、３個のアノマー炭素シグナルが、それぞれ１４０．２（Ｃ−１’）、１０６．７（Ｃ−１’’’）及び１０１．７ｐｐｍ（Ｃ−１’）で、また、二つのオレフィン炭素が１２２．５ｐｐｍ（Ｃ−１２）と１４４．８ｐｐｍ（Ｃ−１３）で観察され、一つのカルボキシ炭素が１８０．２ｐｐｍ（Ｃ−２８）で観察された。通常的に２８位に糖が結合するとき、約４Ｈｚのグリコシル化高磁場シフト（glycosylation upfield shift）が示されるが（１８０．２ｐｐｍ→１７６．２ｐｐｍ）、この化合物では上記のような現象が観察されないことから、２８位に糖が結合された配糖体でないものと確信することが出来た。
【００３７】
　次に糖の構成とアグリコン（aglycone）の構造を確認するために、エタノール／硫酸で加水分解を行った。加水分解産物であるアグリコンの物理化学的データと１３Ｃ−ＮＭＲと１Ｈ−ＮＭＲとを比較した結果、ＳＢ４６５がヘデラゲニンであることを確認した。また、加水分解された糖は比較ＴＬＣによってラムノース、アラビノース及びグルコースとして確認された。
【００３８】
　以上の結果と公知文献のデータを総合分析した結果、ＳＢ３６５は本植物から既に分離されたことのあるサポニンである、ヘデラゲニン３−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）］−α−Ｌ−アラビノピラノシドであることが確認された。
【００３９】
　ＳＢ３６５の１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲデータは下記表１に示す通りである。
【００４０】
【表１】
2004051641.tif 000004
【００４１】
実験例１：ＬＬＣ細胞を移植したＢＤＦ１マウスに対する抗腫瘍活性
　この実験に使用したマウスの種はＢＤＦ１マウスで、雄性の体重１８〜２５ｇに属する健康なマウスであった。この動物を２３〜２４℃に温度調節された所で水と餌を制限無く供給し、飼料は抗生剤無添加マウス用を使用して飼育した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮下に１４日間培養されたＬＬＣ細胞を含有した組職を採取した後、組織１ｇ当たり５ｍＬの滅菌された冷生理食塩水を加えて細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液　０．２ｍＬをＢＤＦ１マウスの鼠径部に皮下移植した。
【００４２】
　移植２４時間後から各群を５匹に分けた後、試料を生理食塩水に溶解させた後、ＷＴは２８０ｍｇ／ｋｇ、ＳＰＸ分画はそれぞれ７０ｍｇ／ｋｇ（ＳＰＸ１）、１７１ｍｇ／ｋｇ（ＳＰＸ２）、３０．５ｍｇ／ｋｇ（ＳＰＸ３）及び８．１ｍｇ／ｋｇ（ＳＰＸ４）、ＳＢ３６５は６．４ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。陰性対照群には生理食塩水だけを、陽性対対照群にはアドリアマイシン（０．５ｍｇ／ｋｇ体重）を注射した。注射日程は腫瘍移植２４時間後から１日１回、７日間投与した後、１日休薬し、再び６日間連続的に投与した。
【００４３】
　マウスに対するＳＢ３６５の毒性を測定するために週２回体重を測定し、抗腫瘍活性は薬物投与１４日及び１５日目に対照群と薬物処置群の腫瘍体積を測定した後、次のように計算した。
　腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ（ｍｍ）×幅２（ｍｍ２）／２
　腫瘍成長抑制率（％）＝（Ｃ−Ｔ）×１００／Ｃ
　（Ｃ；対照群の平均腫瘍体積、Ｔ；投薬群の平均腫瘍体積）
その結果を表２に示した。
【００４４】
【表２】
2004051641.tif 000005
【００４５】
　表２に示すように、本発明のＷＴとＳＰＸ３分画は、腫瘍細胞移植後１５日目に５５％及び６０％の腫瘍成長抑制率を示し、ＳＢ３６５はアドリアマイシンの６４％よりも高い７９％の腫瘍成長抑制率を示した。
【００４６】
実験例２：ＮＣＩ−Ｈ２３細胞を移植したヌードマウスに対する抗腫瘍活性
　実験動物としては、５週齢の体重１６〜２５g、米国Ｈａｒｌａｎ社の雌性ヌードマウスを使用した。実験動物は１週間以上無菌動物室で適応させた後、実験に使用した。動物室の温度は２２±２℃、湿度は５５±５％、明暗は１２時間周期で自動調節した。実験動物用の固体飼料は放射線滅菌製品であり、飲水は高圧蒸気滅菌器で滅菌した。飼料と飲水は自由に摂取させた。細胞株は米国国立腫瘍研究所（ＮＣＩ）から供給を受け、韓国生命工学研究所で保存中のヒト腫瘍細胞株を使用した。
【００４７】
　ヒト腫瘍細胞の中の肺腫瘍細胞であるＮＣＩ−Ｈ２３をヌードマウスに移植した。３×１０７細胞／ｍＬの腫瘍細胞をマウス　２０ｇ当たり０．３ｍＬずつ皮下移植した。試料は１．６，３．２，６．４ｍｇ／ｋｇの濃度（０．０３２，０．０６４，０．１２８ｍｇ／２０g体重）で処理した。腫瘍細胞移植後８日目を除いては、１日から１４日目まで１３日間、毎日腹腔注射した。処理期間中形成された腫瘍の大きさは個体別に測定し、処理動物の体重変化も測定した。腫瘍細胞移植後１６日目にヌードマウスを犠牲にして、腫瘍を分離し、重量を測定した。陽性対照群にはアドリアマイシンを０．５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で初日から１，５，９及び１４日目の日に腹腔投与した。その結果を下記表３に示した。
【００４８】
【表３】
2004051641.tif 000006
【００４９】
　表３に示すように、ＳＢ３６５は６．４ｍｇ／ｋｇで投与したとき、腫瘍細胞移植後１６日目に８２．１％に達する高い腫瘍成長抑制率を示した。
【００５０】
実験例３：細胞毒性実験
　実験に使用した腫瘍細胞であるＡ５４９、ＳＫ−ＭＥＬ−２及びＭＣＦ７は韓国生命工学研究所から分譲を受けて使用した。培養液は滅菌注射用蒸留水にＬ−グルタミンが含まれたＲＰＭＩ １６４０培地１パック、５０℃水槽で３０分間加熱して不活性化させた牛胎児血清（ＦＢＳ）１００ｍＬ、ＮａＨＣＯ３　　２ｇ、ペニシリン １０万ユニット、ストレプトマイシン　１００ｍｇを加えて溶解させた後、０．１Ｎ塩酸でｐＨを調節して全体を１Ｌとなるようにし、細菌濾過して製造し、４℃で保管しながら使用した。細胞は３日に一回ずつ増殖させて維持し、細胞を付着面から分離するためにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に０．５％トリプシンと２％ＥＤＴＡを溶解した溶液を使用した。
【００５１】
　腫瘍細胞に対する毒性実験は、１９８９年に米国国立腫瘍研究所で薬物のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性を測定するために開発されたスルフォローダミンＢ（ＳＲＢ）法を使用した。実験に使用する細胞を０．５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で付着面から分離させ、３〜５×１０４細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した後、９６ウェルプレートの各ウェルに１８０μＬずつ加えて３７℃、５％　ＣＯ２培養器で２４時間培養した。試料はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かし、実験に必要な濃度まで培養培地または３次蒸留水で希釈し、最終ＤＭＳＯの濃度が０．２％以下となるように段階希釈した。９６ウェルプレートの各ウェルに段階希釈した試料をそれぞれ２０μＬずつ加えた後、３７℃、５％　ＣＯ２培養器で４８時間培養した。試料を加えた時点でＴｉｍｅ　ｚｅｒｏ（Ｔｚ）プレートを収集した。Ｔｚプレート及び培養が終わった後、各プレートの培地を除去して１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を各１ウェル当たり５０μＬずつ加え、４℃で１時間間放置して細胞をプレートの底面に固定させた。細胞の固定が終わった後、プレートを水で５〜６回洗浄し、残っているＴＣＡ溶液を完全に除去し、室温で残った水気がないように乾燥させた。完全に乾燥されたプレートは１ウェル当たり５０μＬの１％酢酸溶液に０．４％ＳＲＢを溶かした染色溶液を加え、３０分間細胞を染色し、再び１％酢酸溶液で数回洗浄し、細胞に結合しないＳＲＢを全て除去した。このように染色した後、プレートをまた室温で乾燥させた。ここに１０ｍＭトリス溶液１００μＬを加えて染料を溶かし、マイクロプレートリーダで５２０ｍＭで光学密度（Ｏ．Ｄ．）値を測定した。腫瘍細胞に対するＥＤ５０（５０％効果量）値は次のように計算した。試料を加えて培養を始める時間に収集し、ＳＲＢ蛋白質量を測定し、その値をＴｚとして決めた。即ち、初期の生きている細胞数を初期値（Ｔｚ）として決めた。試料を処理せずに培養したＯ．Ｄ．値を対照群（Ｃ）とし、試料を処理して培養したウェルのＯ．Ｄ．値を薬物処理された実験値（Ｔ）とした。Ｔｚ、Ｃ及びＴから次の数式により物質等の細胞毒性程度を測定した。即ち、Ｔｚ≧Ｔの場合には、（Ｔ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）×１００の数式で計算し、Ｔｚ＜Ｔの場合には、（Ｔ−Ｔｚ）／Ｔｚ×１００の数式で計算した。このように計算された値からロータスプログラムのデータ回帰機能を利用して薬物の腫瘍細胞成長を５０％抑制する濃度であるＥＤ５０値を計算し、各物質等の細胞毒性程度を比較した。
【００５２】
　分離した物質はＡ５４９ヒト肺腫瘍細胞に対しては、ＥＤ５０＞２０μｇ／ｍＬ、ヒトメラノーマ細胞であるＳＫ−ＭＥＬ−２に対しては、ＥＤ５０＞１０μｇ／ｍＬ、及びヒト乳腫瘍細胞であるＭＣＦ７に対しては、ＥＤ５０＞１０μｇ／ｍＬを示し、事実上固形腫瘍細胞に対する細胞毒性はないものと判断された。
【００５３】
製剤例１：ＷＴ分画を含有する注射用溶液の製造
　実施例１で得たＷＴ分画２５０ｍｇを生理食塩水１０ｍＬに溶解させて注射用溶液を製造した。
【００５４】
製剤例２：ＳＰＸ３分画を含有する注射用乾燥粉末の製造
　実施例２で得たＳＰＸ３分画２５ｍｇをリンガー液１０ｍＬに溶解させた後、凍結乾燥して直時使用型の注射用乾燥粉末を製造した。この粉末は注射時、注射用蒸留水で再調剤して使用する。
【００５５】
製剤例３：ＳＢ３６５を含有する注射用溶液の製造
　実施例３で得たＳＢ３６５ ６．５ｍｇをリンガー液１０ｍＬに溶解し、注射用溶液を製造した。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】分画ＷＴのシリカゲルＴＬＣパターンを示す図である。
【図２】セファデックス ＬＨ２０カラム分画ＳＰＸ３のシリカゲルＴＬＣパターンを示す図である。
【図３】分画ＳＰＸ３のＨＰＬＣクロマトグラムでる。
【図４】ＳＢ３６５のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１】
2004051641.tif 000007
【図２】
2004051641.tif 000008
【図３】
2004051641.tif 000009
【図４】
2004051641.tif 000010