(57)【要約】【課題】微量液体を送液する場合において、１：希釈されない状態で送液する。２：定量的に送液する。３：液体中の成分の吸着を防止しながら送液する。また、そのような送液方法を用いた化学反応用カートリッジを提供する。【解決手段】微量液体を、該液体とは混和せず相分離をする送液用の液体に包埋して送液する。【選択図】　図１８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微量液体の送液方法であって、該液体とは混和せず相分離をする送液用の液体を用いて送液することを特徴とする、上記送液方法。
【請求項２】
上記微量液体を上記送液用の液体によって包埋して送液する、請求項１に記載の送液方法。
【請求項３】
上記微量液体の流路を予め該液体とは混和せず相分離をする第１の送液用の液体で満たすことによって流路内壁を該第１の送液用の液体で覆い、微量液体を流路内に導入し、次いで第２の送液用の液体を導入することを特徴とする、請求項２に記載の送液方法。
【請求項４】
微量の液体状の試料、試薬、または該試料と該試薬の混合液体を、請求項１〜３のいずれか１項に記載の送液方法により流路内で送液して、該試料中、該試薬中または該混合液体中の所定成分に化学反応を適用する化学反応方法。
【請求項５】
化学反応が、核酸増幅反応を含むことを特徴とする請求項４に記載の化学反応方法。
【請求項６】
核酸増幅反応が、ポリメラーゼ・チェイン反応（ＰＣＲ）であることを特徴とする請求項５に記載の化学反応方法。
【請求項７】
該流路の少なくとも２箇所がそれぞれ加熱および／または冷却されて異なる温度に制御されていることを特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載の化学反応方法。
【請求項８】
該流路の少なくとも２箇所がそれぞれ加熱および／または冷却されて異なる温度に制御されており、該試料、該試薬または該混合液体を異なる温度に制御された流路間を往復するように送液して、該試料中、該試薬中、または該混合液体中の所定成分に化学反応を適用することを特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載の化学反応方法。
【請求項９】
少なくとも１つのリザーバー及び／または反応槽、及び少なくとも１つの流路を有し、液体状の試料、試薬、または該試料と該試薬の混合液体を、上記少なくとも１つのリザーバー及び／または反応槽から、上記少なくとも１つの流路内に流動させて、該試料中、試薬中、または該混合液体中の所定成分に化学反応を適用するカートリッジであって、微量の液体状の試料、試薬、または該試料と該試薬の混合液体を、請求項１に記載の送液方法により流路内で送液して、該試料中、該試薬中、または該混合液体中の所定成分に化学反応を適用する化学反応方法に用いる、化学反応用カートリッジ。
【請求項１０】
化学反応が、核酸増幅反応を含むことを特徴とする請求項９に記載の化学反応用カートリッジ。
【請求項１１】
核酸増幅反応が、ポリメラーゼ・チェイン反応（ＰＣＲ）であることを特徴とする請求項１０に記載の化学反応用カートリッジ。
【請求項１２】
該流路の少なくとも２箇所をそれぞれ加熱および／または冷却して異なる温度に制御することを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の化学反応用カートリッジ。
【請求項１３】
該流路の少なくとも２箇所をそれぞれ加熱および／または冷却して異なる温度に制御して、該試料、該試薬または該混合液体を異なる温度に制御された流路間を往復するように送液して、該試料中、該試薬中、または該混合液体中の所定成分に化学反応を適用することを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の化学反応用カートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学反応を流路内で行うことを特徴とする反応容器（以下「化学反応カートリッジ」と呼ぶ）における微量な液体を該液体とは混和せず相分離をする送液用の別の液体で送液する方法と、その送液方法を用いた化学反応方法、および、該化学反応を行うための化学反応用カートリッジに関する。本発明により、空気を用いた送液に比べ、定量的に送液することが可能である。また本発明により、化学反応を行う液体を送液する時に、該液体と混和する送液用の液体を用いて送液する場合に比べ、該微量な液体が送液用の液体で希釈されることがなくなり有用である。また、本発明の一態様として、該液体とは混和せず相分離をする送液用の別の液体で包埋して送液することにより、化学反応を行う液体において、該液体が化学反応カートリッジの内壁に直接接触することを避けることができ、反応に関与する物質の器壁への吸着を軽減させることができる。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医療における臨床検査の現場では、患者から採取した検体を、臨床の現場において迅速かつ簡便に検査し、結果を判断してすぐに診療に生かす、いわゆる”ポイント・オブ・ケアー・テスト”と呼ばれる診断法が求められている。また、河川、海洋や廃棄物中の有害物質の分析といった環境分野や、食品の細菌や毒物による汚染検査といった食品分野の分析についても、それぞれの現場、もしくは現場の近傍で分析・計測を行う”ポイント・オブ・フィールド・テスト”が注目されている。以下、これらの検査を”簡易迅速検査”と記載する。
【０００３】
簡易迅速検査においては、できるだけ短時間に、手動で行う操作を減らして行うことが要求される。すなわち、検体の処理から検出までの工程が１つの”カートリッジ”と呼ぶ装置の中で完結するのが望ましい。更に、このカートリッジは、安価に製造することができ”使い捨て”、または簡単に”再利用”ができるように設計されている事が望ましい。微細加工技術が発達して、このような医療診断等をカートリッジ上で完結させる技術が発達してきた。従来利用されてきた分析装置を小型化し、液体試薬を極微量反応させる”微細総合分析システム：μＴＡＳ（ｍｉｃｒｏ　ｔｏｔａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ）”の技術を簡易迅速検査へ応用する検討が進んできた。μＴＡＳでは、検体量を微量にするために、ガラスやシリコンのカートリッジ表面に溝を刻んで、その溝中に試薬溶液や検体を流して、分離、反応を行って、微量試料の分析を行っている（特開平２−２４５６５５、　特開平３−２２６６６６、特開平８−２３３７７８、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ．　６９，　２６２６−２６３０（１９９７）　Ａｃｌａｒａ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓなど）。本願出願人も、「分析装置」ＷＯ９９／６４８４６、「分析用カートリッジ及び送液制御装置」ＷＯ０１／１３１２７等のμＴＡＳ関係の発明を出願している。これらの出願明細書では、カートリッジとして樹脂製のマイクロチップを用いることが記載されている。
【０００４】
しかし、これらの化学反応をカートリッジ上で行う場合、化学反応液の体積が小さくなるほど、該化学反応液に対するカートリッジの内壁の相対的な接触面積が大きくなる。このため、器壁に化学反応物質が吸着して反応を阻害する要因になっている。また、反応液を送液するには、一般的には気体、あるいは液体による送液が考えられる。しかし、気体による送液は、圧力の変化によって体積が大きく変化するために、定量的な送液が難しい。一方、液体での送液の方が、圧力の変化による体積変化が少なく、定量性が増すが、化学反応を適用する液体と、送液に用いる液体の組成が異なる場合、境界面上での混合や、さらに流路内での送液に伴う壁面と中心部での送液速度の差から、反応液の希釈がおこることになる。これは、化学反応を定量的に行う阻害要因となる。
【０００５】
また、遺伝子工学分野の進歩によって、遺伝子を用いた医療診断や微生物検査が一般的に行われるようになった。特に、ポリメラーゼ・チェイン反応法（ＰＣＲ法、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１３５０−１３５４、１９８５、日本国特許第２５４６５７６号、第２５０２０４１号、第２６１３８７７号）をはじめとした様々な核酸増幅方法の開発は、遺伝子を用いた医療診断や微生物検査を大きく伸展させた。すなわち、これらの核酸増幅法によって、核酸を配列特異的に増幅することが可能なため、例えば、臨床検体中に存在する可能性のある病原体について、その病原体固有の配列の核酸を増幅する事によって、より高感度に検出することが可能になっている。
【０００６】
ポリメラーゼ・チェイン反応は、通常プラスチック製のチューブの中に、ポリメラーゼという酵素、プローブと呼ばれる一般的には化学合成される２種のオリゴ核酸、基質、ｐＨを至適な状態に保つ為の緩衝液、増幅反応の対象となる一般的には生体由来の核酸を入れ、３つの温度をサイクルさせることにより達成される。このような核酸を利用した検出についても、ＰＯＣシステムとして利用することが考えられている。例えば、特表平１１−５０９１００（ＷＯ９７／０３３４８）などがあげられる。またポリメラーゼ・チェイン反応においては、カートリッジ上で該反応を達成するために、様々な方法が提案されている。主な方法としては、一カ所のセル内で、温度を上下させる方法がとられている。更に温度を一定にした複数箇所を反応液が通るようにして、流路内で反応を行わせる事も考えられている（ＷＯ９６／１０４５６、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８０，１０４６−１０４８，１９９８、Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ＶＯＬ．５８，３４９−３５２，１９９４）。しかし、このような反応を行う場合、酵素の濃度が低く、生成物が器壁に吸着して充分な増幅効果を得られない事が多い。また、液体による送液では、反応液が該液体で希釈されてしまう。実際、中野らの報告（Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ＶＯＬ．５８，２３４９−２３５２，１９９４）では、吸着を防ぐ目的で、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）と界面活性剤を添加し、希釈を防ぐ目的で、送液する液体の前後を気体で挟む工夫がなされている。しかし、気体で挟んだ場合、温度の上下に伴って、体積変化を生じて、定量的な送液は難しくなる。
以上のように、簡易迅速検査に求められる、「短時間に簡便に核酸をカートリッジ内で増幅反応を行う」のは難しく、解決すべき課題が非常に多い。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決するためのものであり、上記のような微細加工技術を利用したカートリッジで化学反応を行うシステムにおいて、化学反応させる液体のカートリッジ上での送液における問題点を解決することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、これらの課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）微量液体の送液方法であって、該液体とは混和せず相分離をする送液用の液体を用いて送液することを特徴とする送液方法、に関する。
また、本発明は（２）上記微量液体を上記送液用の液体によって包埋して送液する、上記（１）に記載の送液方法、に関する。
【０００９】
更に本発明は（３）上記微量液体の流路を予め該液体とは混和せず相分離をする第１の送液用の液体で満たすことによって流路内壁を該第１の送液用の液体で覆い、微量液体を流路内に導入し、次いで第２の送液用の液体を導入することを特徴とする、上記（２）に記載の送液方法、に関する。
【００１０】
ここで、微量とは、１０ｍｌ以下、望ましくは１ｍｌ以下、より好ましくは１００μｌ以下の体積を意味している。また、相分離とは、例えば送液されるべき液体が水溶液である場合、送液用の液体として、水溶液と混じらない油溶性の液体のことを意味している。油溶性の液体としては、例えば、食用油、鉱物油、シリコン油、炭化水素からなる溶媒（ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の飽和炭化水素溶媒などやベンゼン、トルエン、キシレン等のベンゼン環を含む溶媒など）、酸素原子を含む溶媒（ジエチルエーテル、ブタノール、酢酸エチルなど）、塩素原子を含む溶媒（四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロメタンなど）、水溶液と混じらない液体は全て可能である。本発明によって、空気を用いた送液に比べ、定量的に送液する事が可能である。また、本発明により、化学反応を行う液体を送液する時に、該液体と混和する送液用の液体を用いて送液する場合に比べ、該反応液体が送液用の液体で希釈されなくなり有用である。送液の方法としては、送液すべき流路内にまず送液されるべき液体を注入した後に送液用の液体をポンプ等を介して送り込めばよく、特に限定するものではないが、例えば送液されるべき液体を送液用の液体に包埋することが好ましい。
【００１１】
包埋の方法としては、特に限定するものではないが、例えば上記微量液体の流路を予め該液体とは混和せず相分離をする第１の送液用の液体で満たすことによって流路内壁を該第１の送液用の液体で覆い、微量液体を流路内に導入し、次いで第２の送液用の液体を導入することによって容易に達成される。第１の送液用の液体及び第２の送液用の液体は、上記の範囲内に有り、互いに反応性がない限りにおいて、同じであっても異なっていても良い。
【００１２】
送液されるべき液体を送液用の液体に包埋することにより、化学反応を行う液体（送液されるべき液体）において、該液体が化学反応用カートリッジの内壁に直接接触することを避けることができ、反応に関与するタンパク質等の物質の器壁への吸着を軽減させることができる。送液されるべき微量液体が、送液用の液体に包埋される形で送液されるには、器壁の表面が、該微量液体よりも送液用の液体に対して親和性が高いことが要求される。例えば、微量液体が水溶液、送液用液体が油溶性液体の場合、器壁の表面が疎水性の高いものであれば良い。
【００１３】
また、本発明は（４）微量の液体状の試料、試薬、または該試料と該試薬の混合液体を、（１）〜（３）のいずれかに記載の送液方法により流路内で送液して、該試料中、該試薬中または該混合液体中の所定成分に化学反応を適用する化学反応方法、に関する。本発明により、化学反応を行う液体において、空気による送液に比べ、定量的に送液することができ、また、送液用の液体によって希釈されることを防ぐことができ、また、該液体が容器や流路の内壁に直接接触することを避けることで、反応に関与する物質の器壁への吸着を軽減させることができる。
【００１４】
また、本発明は、（５）化学反応が、核酸増幅反応を含むことを特徴とする（４）に記載の化学反応方法に関する。
更に本発明は、（６）核酸増幅反応が、ポリメラーゼ・チェイン反応（ＰＣＲ）であることを特徴とする（５）に記載の化学反応方法に関する。
【００１５】
本発明の化学反応の一態様である核酸増幅反応の対象となる核酸を含有する材料としては、例えば人の疾患の診断に用いる臨床検体である喀痰、唾液、尿、便、精液、血液、組織、臓器、その他の体液、またはこれらの体液の分画、微生物汚染の検査に用いる食品、飲料水、土壌、排水、河川水、海水、ふき取り液、ふき取り綿などが挙げられる。また、菌体の培養液や、固形培地上に培養された菌体（コロニー）を使用することができる。
【００１６】
上記（５）〜（６）の発明によって、化学反応カートリッジ上の流路内で核酸の増幅反応、特にポリメラーゼ・チェイン反応を行うことができるようになる。なお、ポリメラーゼ・チェイン反応においては、反応液の上層に、鉱物油や、ワックス（蝋）等の反応液とは相分離する物質を重層して反応させることが一般的に行われている。しかし、これらの反応液と相分離する液体は、該反応液の加熱により、反応液が蒸発することを防ぐ目的で上層部に添加されているものであり、流路内反応系での吸着防止を目的としたものではない。実際、現在は、反応液を入れたチューブを密閉し、チューブ全体の温度を変化させることで、反応液の蒸発を防ぐことにより、該油を添加しないでポリメラーゼ・チェイン反応を行う方法が普及している。また、当然、そのような反応は、流路内で行う反応ではないので、カートリッジ内の送液の為に用いているものではなく、本発明とは明らかに区別される。
また、本発明は（７）該流路の少なくとも２箇所がそれぞれ加熱および／または冷却されて異なる温度に制御されていることを特徴とする（４）〜（６）のいずれかに記載の化学反応方法に関する。
【００１７】
更に本発明は（８）該流路の少なくとも２箇所がそれぞれ加熱および／または冷却されて異なる温度に制御されており、該試料、該試薬または該混合液体を異なる温度に制御された流路間を往復させるように送液して、該試料中、該試薬中、または該混合液体中の所定成分に化学反応を適用することを特徴とする（４）〜（６）のいずれか１項に記載の化学反応方法に関する。
【００１８】
また本発明は、（９）少なくとも１つのリザーバー及び／または反応槽、及び少なくとも１つの流路を有し、液体状の試料、試薬、または該試料と該試薬の混合液体を、上記少なくとも１つのリザーバー及び／または反応槽から、上記少なくとも１つの流路内に流動させて、該試料中、試薬中、または該混合液体中の所定成分に化学反応を適用するカートリッジであって、微量の液体状の試料、試薬、または該試料と該試薬の混合液体を、（１）に記載の送液方法により流路内で送液して、該試料中、該試薬中、または該混合液体中の所定成分に化学反応を適用する化学反応方法に用いる化学反応用カートリッジ、に関する。
本発明により、化学反応カートリッジ上での送液において、定量的な送液を達成することができ、また、送液用の液体による化学反応試薬の希釈を防ぐことができる。
【００１９】
更に本発明は、（１０）化学反応が、核酸増幅反応を含むことを特徴とする（９）に記載の化学反応用カートリッジに関する。
更に本発明は（１１）核酸増幅反応が、ポリメラーゼ・チェイン反応（ＰＣＲ）であることを特徴とする（１０）に記載の化学反応用カートリッジに関する。
【００２０】
本発明の化学反応用カートリッジを用いて行うことができる核酸増幅反応としては、ポリメラーゼ・チェイン反応、リガーゼ・チェイン反応（ＬＣＲ：Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４１：１０７７−１０８０、　１９８８）、ＲＮＡ特異増幅法（ＮＡＳＢＡ法：Ｎａｔｕｒｅ、　３５０：９１−９２、　１９９１）、ＳＤＡ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、　８９：３９２−３９６、　１９９２）等が挙げられるが、極微量の核酸の増幅効率に優れていること、短時間で信頼性のある結果が得られること等から、世の中で広く利用されているポリメラーゼ・チェイン反応が特に好ましい。ポリメラーゼ・チェイン反応は、当分野において通常使用される核酸増幅手段であり、その手順は例えばＳｃｉｅｎｃｅ、　２３０：１３５０−１３５４、　１９８５等に記載されており、当業者であれば、上記文献の記載等に基づいて実験条件などを適宜改変して行うことができる。増幅産物の確認は、例えば増幅反応物を適当な条件下で電気泳動にかけ、例えばエチジウムブロマイド処理の後に紫外線照射により検出することができるが、検出手段は特に限定されるものではない。
【００２１】
更に本発明は（１２）該流路の少なくとも２箇所をそれぞれ加熱および／または冷却して異なる温度に制御することを特徴とする（９）〜（１１）のいずれかに記載の化学反応用カートリッジに関する。
【００２２】
更に本発明は（１３）該流路の少なくとも２箇所をそれぞれ加熱および／または冷却して異なる温度に制御して、該試料、該試薬または該混合液体を異なる温度にし制御された該流路間を往復するように送液して、該試料中、該試薬中、または該混合液体中の所定成分に化学反応を適用することを特徴とする（９）〜（１１）のいずれかに記載の化学反応用カートリッジに関する。
【００２３】
温度制御のための手段は特に限定するものではなく、例えば温度を設定した水浴を行っても良く、また各種の加熱装置や冷却装置を用いても良い。上記の発明により、化学反応カートリッジ上で、加熱や冷却を必要とする化学反応を行うことが可能となり、カートリッジ上で適応できる化学反応の範囲が広がる。なお、本発明において、加熱を行う場合には、その加熱部分が設定した温度において、機械的強度を維持し、液体及び／または気体の流路を維持できる材質でなければならない。
【００２４】
本発明に用いることができる化学反応カートリッジの構成として、特に限定するものではないが、例えば弾性材料からなる少なくとも１枚の気密用平板状部材を、該弾性材料よりも低い弾性と高い硬度を有する材料からなる少なくとも２枚の基板用平板状部材が交互に挟み圧着して構成される３層以上の積層構造を有し、該流路は、
（ｉ）　　該基板用平板状部材に設けられた溝及び／または穴、
（ｉｉ）　該気密用平板状部材に設けられた溝及び／または穴、あるいは、
（ｉｉｉ）該試料、該試薬及び／または該混合流体の圧力によって気密用平板状部材の部分が変形することにより形成される空隙、
からなる群より選択される少なくとも１つにより構成され、該リザーバー及び／または反応槽は、該気密用平板状部材及び／または該基板用平板状部材に設けられた溝及び／または穴により構成されることを特徴とする化学反応用カートリッジ、を用いることができる。
【００２５】
上記空隙は、該試料、該試薬及び／または該混合流体の圧力によって、気密用平板状部材の部分が、該気密用平板状部材に圧着された１つの基板用平板状部材に設けられた該流路とは異なる溝及び／または穴の方向に変形することにより形成される、該気密用平板状部材と該１つの基板用平板状部材とは反対の側の基板用平板状部材との間に形成される空隙である。
【００２６】
ここで、気密用平板状部材（以下気密板と記す）に用いる弾性を有する材料としては、天然ゴム、ブタジエンゴム、スチレンゴム、ブチルゴム、エチレン・プロピレンゴム、ニトリルゴム、アクリルゴム、ウレタンゴム、シリコンゴム、フッ素ゴム等のゴム類、軟質塩化ビニール樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ塩化ビニリデン樹脂、ポリウレタン樹脂、フッ素樹脂、ナイロン樹脂等があげられる。
【００２７】
また、基板用平板状部材（以下基板と記す）に用いられる材料としては、硬質塩化ビニール樹脂、ポリスチレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ナイロン樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、メチルペンテン樹脂、ポリウレタン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂等のプラスチックや、アルミニウム、真鍮、鉄、銅、ステンレス、チタン合金、マグネシウム合金、ジュラルミン等の金属、ガラス、セラミックス、があげられる。
【００２８】
ここで、気密板は基板より弾性率が高く、逆に基板は気密板より硬度が高いという組合せが重要である。例えば、気密板にシリコンゴム、基板にフッ素樹脂の組合せでも、気密板にフッ素樹脂、基板にステンレスという組合せでも良い。また、気密板、基板共に、目的の化学反応を行わせる状態において、該化学反応に影響を及ぼさない材料であることが必須である。また、液体中の反応を行う場合には、反応を行う間、実質的に液体を通さない材料であることが、気体の反応を行わせる場合には、反応を行う間、実質的に気体を通さない材料である必要がある。
【００２９】
カートリッジ内の流路は、気密板を加工して作成しても、基板を加工して作成しても良い。流路の大きさとしては、該気密板と該基板を圧着しても、その圧力による該気密板と該基板の変形によって流路がふさがれない幅と深さが必要である。気密板及び基板に使用する材料の弾性率及び該気密板と該基板を積層構造にする際の圧着の力によって、作製される流路の幅と深さは変化する。実質的にはカートリッジの流路として機能を果たす為に深さ１０ミクロン、幅１０ミクロン以上の大きさの溝が必要である。一連の反応を１つのカートリッジの内部で完結させるためには、あまりにも大きな流路は、μＴＡＳの利点を失うことになる。実用的な流路の大きさの上限は、幅５ｍｍ、深さ１ｃｍ程度である。なお、カートリッジ内の反応液等を保存しておくリザーバー部分としては、これより深くて幅のある溝や穴を使うことも可能である。反応液の保存場所としてリザーバーの大きさの上限は、幅１０ｃｍ、深さ１０ｃｍ程度である。
【００３０】
上記構成を用いれば、溝や穴を加工した基板あるいは気密板を用いて、張り合わせ等の高度な技術を用いずに簡便に化学反応を行うカートリッジを作成することが可能になる。更に該カートリッジは、接着等の不可逆的な加工を必要としないので、一度加工したカートリッジを分解して洗浄し再利用することも可能である。本発明において、基板と気密板からなる積層構造を作るため、圧着する方法としては、流路、リザーバー、反応槽、弁を形成する積層構造に干渉しない必要がある。従って該方法としては、流路、リザーバー、反応槽、弁を形成する該積層構造に干渉しない部分において、貫通する穴を空けビスとナットで、あるいは、貫通する穴を空けリベットによって、あるいは、貫通しない穴を空けネジによって、あるいは積層構造の外側からのバネによって、あるいは積層構造の外側部分の接着によって圧着する方法等があげられるが、これらの方法に限定されるものではない。
また、本発明に用いる化学反応用カートリッジは、該流路の開閉を制御する少なくとも１つの弁を備えるものであっても良い。
【００３１】
該弁の構成としては、化学反応用カートリッジが棒状部材を有し、該棒状部材が該カートリッジ上の流路に対して移動可能であり、該棒状部材は、開区間と閉区間を有し、該開区間は、該閉区間よりも移動方向に対する垂直な面への投影面積が小さい構造であり、該棒状部材の移動によって該カートリッジ上の流路と、該棒状部材の開区間が連通することで、該弁が開となり、該棒状部材の移動によって該カートリッジ上の流路が該棒状部材の閉区間によってふさがれることで、該弁が閉となり、それによって該カートリッジ上の流路の開閉を制御する弁として機能するものとすることができる。
【００３２】
ここで、「該開区間は、該閉区間よりも移動方向に対する垂直な面への投影面積が小さい構造である」という事は、例えば、該棒状部材に切り欠き、溝、穴等の加工を加えて、これらを該棒状部材の開区間とする事である。
あるいは、該弁は、該試料、該試薬または該混合流体の圧力によって気密用平板状部材の部分が変形することにより形成される空隙の形成を制御することによって、該流路の開閉を制御する弁として機能するものであっても良い。
【００３３】
上記弁は、例えば、該試料、該試薬または該混合流体の圧力によって、気密用平板状部材の部分が、該気密用平板状部材に圧着された１つの基板用平板状部材に設けられた該流路とは異なる溝及び／または穴の方向に変形することにより形成される、該気密用平板状部材と該１つの基板用平板状部材とは反対の側の基板用平板状部材との間の空隙により構成される流路において、該流路とは異なる該溝及び／または穴の側から該気密用平板状部材の部分に押力を与えて該空隙の形成を抑制することにより該流路を閉塞し、または該押力を減じて該抑制を解除することにより該流路を開放して、それによって該流路の開閉を制御する弁として機能するものであれば良いが、特に限定するものではない。
更に、本発明に用いる化学反応用カートリッジにおいて、該弁の少なくとも１つの開閉をアクチュエーターにより制御する制御装置を備えることもできる。
【００３４】
上記の構成により、化学反応用カートリッジに簡便な構造の弁を取り入れることが可能になる。従って、化学反応を行わせる場合に、液体または気体の取扱いにおいて弁によって反応を避けたい物質同士の混合を防ぐことや、液体あるいは気体の逆流等を防止することが可能になり、容易にカートリッジ上での化学反応を制御することが可能になる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、何らこれに限定されるものではない。なお、実施例および図面中に記載された長さ、深さ、直径等の数字は単なる例示であって、本発明はこれらの数値に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１
図１に示した基板（１）を、縦２０ｍｍ、横２０ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社（現アマシャムバイオサイエンス社）製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（２）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３）が加工されている。
【００３７】
図２に示した基板（４）を、縦１５０ｍｍ、横１５５ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図２に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（５）、圧着に用いるステンレス製の１．６ｍｍのナベネジが貫通できるような直径１．６ｍｍの穴（６）、流路として幅０．５ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（７）、流路として直径１ｍｍの穴（８）が加工されている。
【００３８】
図３に示した基板（９）を、縦１５０ｍｍ、横１５５ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図３に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１０）、圧着に用いるステンレス製の１．６ｍｍのナベネジが貫通できるような直径１．６ｍｍの穴（１１）、流路として幅０．５ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（１２）、流路として直径１ｍｍの穴（１３）が加工されている。
【００３９】
図４に示した気密板（１４）を、縦２０ｍｍ、横２０ｍｍ、厚さ１ｍｍのテフロン板で作成した。該気密板は、図４に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１５）、流路として直径２ｍｍの穴（１６）が加工されている。
【００４０】
図５に示した気密板（１７）を、縦１５０ｍｍ、横１５５ｍｍ、厚さ１ｍｍのテフロン板で作成した。該気密板は図５に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（１８）、圧着に用いるステンレス製の１．６ｍｍのナベネジが貫通できるような直径１．６ｍｍの穴（１９）、流路として直径１ｍｍの穴（２０）が加工されている。
【００４１】
これらの部品とビス（直径２ｍｍ、長さ２０ｍｍおよび直径１．６ｍｍ長さ８ｍｍ）とナット（Ｍ２、Ｍ１．６）の各組を用いて図６に示したカートリッジを組み立てた。次に、ポリメラーゼ・チェイン反応における２温度間の往復反応が４０回できるように、図６に示したカートリッジを２枚組合せ、更に、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）（２１）、テフロンチューブ（内径０．５ｍｍ、外径１．７ｍｍ）（２２）、２方向変換バルブ（ファルマシア社製）（２３）、ポンプ（Ｐ−５００、ファルマシア社製）（２４）、注射筒（２５）を接合して、図７に示した装置を作成した。カートリッジ部分は、加熱装置（２６、２７）によって、９２℃と６５℃の２つの温度に加熱されるようになっている。
【００４２】
市販の核酸精製用キット（ＤＮｅａｓｙＴＭ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ、キアゲン社）を用いて大腸菌由来の核酸を精製した。その精製した大腸菌ＤＮＡ溶液５０μｌに、２種類の２０μＭのオリゴ核酸（大腸菌のリボゾーム蛋白質　Ｌ２５をコードする遺伝子の、塩基配列４４９番目のｃから４７２番目のｔまでの配列（配列番号１）、同遺伝子の塩基配列６２８番目のａから６５０番目のａまでの相補鎖の配列（配列番号２）：シグマ社に依頼して化学的に合成したもの）各１０μｌ、基質（ｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ：ＴＡＫＡＲＡ社製、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを各２．５ｍＭ含むもの）２０μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ溶液（Ｚ−ＴａｑＴＭ、２．５Ｕ／μｌ、ＴＡＫＡＲＡ社製）２５μｌ、緩衝液（２．５Ｗ／Ｖ％ＢＳＡ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＴＭ−Ｘ１００、３００ｍＭトリス−塩酸、１７．５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ９．５）５０μｌを添加し、更に蒸留水を添加して全量を２５０μｌにした。この試料を、注射筒（２５）に注入した。
【００４３】
ポンプ（２４）を用いて、あらかじめ鉱物油（シグマ社製）をカートリッジの流路内に満たすことで、流路内部の器壁を鉱物油で覆った。つぎにバルブ（２３）を回転させた後、注射筒（２５）の試料をカートリッジ内に導入した。ついでバルブ（２３）を回転させて、再びポンプ（２４）から鉱物油を９ｍｌ／時の流速でカートリッジ内に送液してＰＣＲ反応を行い、回収口（２８）から反応液を回収した。
【００４４】
回収口から回収した反応液１０μｌにサンプル処理液（１０×　Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ：ＴＡＫＡＲＡ製）１μｌを添加し、それを、３％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅＴＭ３：１　ａｇａｒｏｓｅをＴＡＥ（トリス／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解し固めたもの）中で電気泳動（ＭｕｐｉｄＴＭ：ＡＤＶＡＮＣＥ社製）した。電気泳動後、アガロースゲルをエチジウムブロマイド水溶液（１μｇ／ｍｌ）に１５分間浸した。次にアガロースゲルを取り出し紫外線を当てて、電気泳動されたＤＮＡを検出した。その結果、図８に示したように、マーカーのＤＮＡ（２９）の２００ｂｐとほぼ同じ位置に、本ポリメラーゼ・チェイン反応によって増幅されたＤＮＡが、塩基配列から予想される大きさのバンド（３０）として検出された。従って本発明の手法を用いて、核酸の増幅反応が達成された。
【００４５】
実施例２
図９に示した棒状部材（３１）を、直径２ｍｍ、長さ２７ｍｍのステンレス棒で作成した。該棒状部材は、図に示したように、棒の中央付近（３２）が、長さ方向に幅２ｍｍにわたって、直径が１ｍｍとなるように加工されている。
【００４６】
図１０に示した基板（３３）は、縦４２．５ｍｍ、横２００ｍｍ、厚さ５ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１０に示したように、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）が入るような６ｍｍの雌ネジ（３４）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３５）、棒状部材（３１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（３６）、が加工されている。
【００４７】
図１１に示した基板（３７）を、縦９０ｍｍ、横２００ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１１に示したように、流路として直径２ｍｍの穴（３８）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（３９）、圧着に用いるステンレス製の１．６ｍｍのナベネジが貫通できるような直径１．６ｍｍの穴（４０）、棒状部材（３１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（４１）、流路として幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（４２）、が加工されている。
【００４８】
図１２に示した基板（４３）を、縦９０ｍｍ、横２００ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１２に示したように、流路として直径２ｍｍの穴（４４）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（４５）、圧着に用いるステンレス製の１．６ｍｍのナベネジが貫通できるような直径１．６ｍｍの穴（４６）、棒状部材（３１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（４７）、流路として幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（４８）、が加工されている。
【００４９】
図１３に示した基板（４９）を、縦５７．５ｍｍ、横２００ｍｍ、厚さ２ｍｍのポリカーボナイト板で作成した。該基板は、図１３に示したように、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（５０）、圧着に用いるステンレス製の１．６ｍｍのナベネジが貫通できるような直径１．６ｍｍの穴（５１）、棒状部材（３１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（５２）、流路として幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（５３）、が加工されている。
【００５０】
図１４に示した気密板（５４）を、縦４２．５ｍｍ、横２００ｍｍ、厚さ１ｍｍのテフロン板で作成した。該気密板は、図１４に示したように、流路として直径２ｍｍの穴（５５）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（５６）、棒状部材（３１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（５７）が加工されている。
【００５１】
図１５に示した気密板（５８）を、縦９０ｍｍ、横２００ｍｍ、厚さ１ｍｍのテフロン板で作成した。該気密板は、図１５に示したように、流路として直径２ｍｍの穴（５９）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（６０）、棒状部材（３１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（６１）が加工されている。
【００５２】
図１６に示した気密板（６２）を、縦５７．５ｍｍ、横２００ｍｍ、厚さ１ｍｍのテフロン板で作成した。該気密板は、図１６に示したように、流路として直径２ｍｍの穴（６３）、圧着に用いるステンレス製の２ｍｍのナベネジが貫通できるような直径２ｍｍの穴（６４）、棒状部材（３１）が挿入され移動可能なクリアランスを持つ直径２ｍｍの穴（６５）が加工されている。
これらの部品とナベビス（直径２ｍｍ、長さ２０ｍｍおよび直径１．６ｍｍ長さ８ｍｍ）とナット（Ｍ２、Ｍ１．６）の各組（６６、６７）を用いて図１７に示したカートリッジを組み立てた。
【００５３】
図１７に示したカートリッジを、更に、液体クロマトグラフィーに用いられるチューブの接合部品（ファルマシア社製）（６８）、テフロンチューブ（内径０．５ｍｍ、外径１．７ｍｍ）（６９）、２方向変換バルブ１（７０）及びバルブ２（７１）（ファルマシア社製）、ポンプ（Ｐ−５００、ファルマシア社製）（７２）、注射筒（７３）を接合して、図１８に示した装置を作成した。カートリッジ部分は、加熱装置（７４、７５）によって、９２℃と６５℃の２つの温度に加熱されるようになっている。
【００５４】
あらかじめ、ポンプ（７２）から鉱物油（シグマ社製）を送液し、バルブ１（７６）、バルブ２（７７）の開閉、および２方向変換バルブ１（７０）、２（７１）の操作で、カートリッジの流路内に、鉱物油を満たして、流路内部の器壁を鉱物油で覆った。
【００５５】
実施例１に従って精製した大腸菌ＤＮＡ溶液５０μｌに、２種類の２０μＭのオリゴ核酸（大腸菌のリボゾーム蛋白質　Ｌ２５をコードする遺伝子の、塩基配列４４９番目のｃから４７２番目のｔまでの配列（配列番号１）、同遺伝子の塩基配列６２８番目のａから６５０番目のａまでの相補鎖の配列（配列番号２）：シグマ社に依頼して化学的に合成したもの）各１０μｌ、基質（ｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ：ＴＡＫＡＲＡ社製、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを各２．５ｍＭ含むもの）２０μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ溶液（Ｚ−ＴａｑＴＭ、２．５Ｕ／μｌ、ＴＡＫＡＲＡ社製）２５μｌ、緩衝液（２．５Ｗ／Ｖ％ＢＳＡ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＴＭ−Ｘ１００、３００ｍＭトリス−塩酸、１７．５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ９．５）５０μｌを添加し、更に蒸留水を添加して全量を２５０μｌにした。この試料を、注射筒（７３）に注入した。
【００５６】
バルブ１、２（７６、７７）、を開にして、注射筒（７３）の試料をカートリッジ内に導入した後、バルブ１、２（７６、７７）を閉じた。加熱装置（７４、７５）でカートリッジを９５℃、および６５℃にそれぞれ加熱した。ついで、２方向変換バルブ１、２（７０、７１）の方向変換と、ポンプ（７２）による鉱物油の送液（１ｍｌ／分）の開始と終了を組み合わせて、１つの周期が、１：ポンプ接合口１（７８）から１ｍｌ／分の送液とポンプ接合口２（７９）からの廃液を６秒間、２：休止を１２秒間、３：ポンプ接合口２（７９）から１ｍｌ／分の送液とポンプ接合口１（７８）からの廃液を６秒間、４：休止１２秒間の４つの段階からなる操作を４０回行った。この操作によって、試料溶液がカートリッジ内の９５℃の部分と６５℃の部分を４０回往復し、それによってポリメラーゼ・チェイン反応が達成される。反応後、バルブ２（７７）を開にし、ポンプ接合口１（７８）およびポンプ接合口２（７９）から、１ｍｌ／分の送液を行い、反応液を、回収口（８１）から容器（８２）に回収した。
【００５７】
回収した反応液を、実施例１と同一の方法で、アガロースゲル電気泳動を実施し、反応液中の増幅されたＤＮＡを検出した。その結果、図１９に示したように、マーカーのＤＮＡ（８３）の２００ｂｐとほぼ同じ位置に、本ポリメラーゼ・チェイン反応によって増幅されたＤＮＡが、塩基配列から予想される大きさのバンド（８４）として検出された。従って本発明の手法を用いて、核酸の増幅反応が達成されたことがわかった。
【００５８】
参考例１
実施例１で使用したカートリッジにおいて、注射筒（２５）に試料溶液の代わりに青色に着色した水溶液２５０μｌを用いて以下の実験を行った。まず、実施例１と同様に、ポンプ（２４）を用いて、あらかじめ鉱物油（シグマ社製）をカートリッジの流路内に満たすことで、流路内部の器壁を鉱物油で覆った。つぎにバルブ（２３）を回転させた後、注射筒（２５）の試料をチップ内に導入した。ついでバルブ（２３）を回転させて、再びポンプ（２４）から鉱物油を９ｍｌ／時の流速でチップ内に送液し、回収口（２８）から反応液を回収した。その結果、着色した水溶液は、およそ２００μｌが回収され、着色液の濃度は変化が無かった。一方、ポンプ（２４）の送液を鉱物油から蒸留水に変更して同様の送液を行った。その結果、回収口からの液体は、送液する蒸留水によって希釈された状態で回収され、肉眼で観察するかぎり、約１ｍｌの体積まで希釈されていた。
【００５９】
【発明の効果】
本発明による微量液体の送液方法は、微量液体の送液を希釈されない状態で定量的に、また液体中の成分の吸着を防止しながら行うことを可能にする。また該送液方法を利用した化学反応カートリッジを用いることで、医療診断、化学分析、食品分析、等が容易に達成できる。特にカートリッジでの核酸の増幅反応において有用である。
【００６０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（１）の平面図及び断面図を示す。
【図２】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（４）の平面図及び断面図を示す。
【図３】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（９）の平面図及び断面図を示す。
【図４】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（１４）の平面図及び断面図を示す。
【図５】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（１７）の平面図及び断面図を示す。
【図６】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジの平面図及び断面図を示す。
【図７】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを用いた増幅反応を行う装置の構成を示す概念図を示す。
【図８】実施例１のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図９】本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジを構成する棒状部材（３１）の平面図及び断面図を示す。
【図１０】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（３３）の平面図及び断面図を示す。
【図１１】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（３７）の平面図及び断面図を示す。
【図１２】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（４３）の平面図及び断面図を示す。
【図１３】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する基板（４９）の平面図及び断面図を示す。
【図１４】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（５４）の平面図及び断面図を示す。
【図１５】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（５８）の平面図及び断面図を示す。
【図１６】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板（６２）の平面図及び断面図を示す。
【図１７】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジの平面図及び断面図を示す。
【図１８】本発明の核酸増幅反応を行う化学反応用カートリッジを用いた増幅反応を行う装置の構成を示す概念図を示す。
【図１９】実施例２の結果を示すアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【符号の説明】
１：本発明のカートリッジを構成する基板、２：雌ネジ、３：穴、
４：本発明のカートリッジを構成する基板、５：穴、６：穴、７：溝、８：穴、９：本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジを構成する基板、
１０：穴、１１：穴、１２：溝、１３：穴、
１４：本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジを構成する基板、
１５：穴、１６：穴、
１７：本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板、
１８：穴、１９：穴、２０：穴、
２１：接合部品、２２：テフロンチューブ、２３：２方向変換バルブ、
２４：ポンプ、２５：注射筒、２６：加温装置、２７：加温装置、２８：回収口、
２９：ＤＮＡ分子量マーカー、３０：本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジによって増幅されたＤＮＡ断片、
３１：本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジを構成する棒状部材、
３２：中央部分、
３３：本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジを構成する基板、
３４：雌ネジ、３５：穴、３６：穴、
３７：本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジを構成する基板、
３８：穴、３９：穴、４０：穴、４１：穴、４２：溝、
４３：本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジを構成する基板、
４４：穴、４５：穴、４６：穴、４７：穴、４８：溝、
４９：本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジを構成する基板、
５０：穴、５１：穴、５２：穴、５３：溝、
５４：本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板、
５５：穴、５６：穴、５７：穴、
５８：本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板、
５９：穴、６０：穴、６１：穴、
６２：本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジを構成する気密板、
６３：穴、６４：穴、６５：穴、
６６：ネジとナットの組、６７：ネジとナットの組、
６８：接合部品、６９：テフロンチューブ、７０：２方向変換バルブ、
７１：２方向変換バルブ、７２：ポンプ、７３：注射筒、７４：加熱装置、
７５：加熱装置、７６：バルブ１、７７：バルブ２、７８：接合口１
７９：接合口２、８０：注入口、８１：回収口、８２：回収容器、
８３：ＤＮＡ分子量マーカー、
８４：本発明の核酸増幅を行う化学反応用カートリッジによって増幅されたＤＮＡ断片、
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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