(57)【要約】　　　（修正有）【課題】染色体末端構造を制御する新規のヒストンアセチル化酵素およびヒストン脱アセチル化酵素と、それぞれをコードする遺伝子を提供する。【解決手段】染色体テロメアより遠方のヒストンをアセチル化する酵素Ｓａｓ２ｐと、この酵素をコードする酵母遺伝子ＳＡＳ２、並びに染色体テロメア近傍のヒストンを脱アセチル化する酵素Ｓｉｒ２ｐと、この酵素をコードする酵母遺伝子ＳＩＲ２。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素配列番号２のアミノ酸配列を有し、染色体テロメアより遠方のヒストンをアセチル化する酵素Ｓａｓ２ｐをコードする酵母遺伝子ＳＡＳ２。
【請求項２】
ｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有する請求項１の酵母遺伝子ＳＡＳ２。
【請求項３】
配列番号４のアミノ酸配列を有し、染色体テロメア近傍のヒストンを脱アセチル化する酵素Ｓｉｒ２ｐをコードする酵母遺伝子ＳＩＲ２。
【請求項４】
ｃＤＮＡが配列番号３の塩基配列を有する請求項３の酵母遺伝子ＳＩＲ２。
【請求項５】
請求項１の酵母遺伝子ＳＡＳ２のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３の酵母遺伝子ＳＩＲ２のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列を有し、染色体テロメアより遠方のヒストンをアセチル化する、精製されたヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐ。
【請求項８】
請求項５のポリヌクレオチドの発現産物である請求項７のヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐ。
【請求項９】
配列番号４のアミノ酸配列を有し、染色体テロメア近傍のヒストンを脱アセチル化する、精製されたヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐ。
【請求項１０】
請求項６のポリヌクレオチドの発現産物である請求項９のヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐ。
【請求項１１】
ヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐが機能欠損している変異酵母細胞。
【請求項１２】
ヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐが機能欠損している変異酵母細胞。
【請求項１３】
ヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐおよびヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐが機能欠損している変異酵母細胞。
【請求項１４】
機能欠損が、遺伝子ＳＡＳ２のタンパク質コード領域の欠失である請求項１１または１３の変異酵母細胞。
【請求項１５】
機能欠損が、配列番号２に示した酵素Ｓａｓ２ｐのアミノ酸配列における以下のアミノ酸置換：
第１０３位ＣｙｓがＡｓｐ；
第１０６位ＣｙｓがＴｈｒ；
第２１６位ＧｌｎがＧｌｕ；
第２１９位ＧｌｙがＧｌｕ；および
第２４２位ＧｌｕがＧｌｙ
の１以上に対応する遺伝子ＳＡＳ２の塩基置換である請求項１１または１３の変異酵母細胞。
【請求項１６】
機能欠損が、遺伝子ＳＩＲ２のタンパク質コード領域の欠失である請求項１２または１３の変異酵母細胞。
【請求項１７】
請求項７または８のヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐに候補因子を接触させ、酵素Ｓａｓ２ｐに結合する因子を特定することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項９または１０のヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐに候補因子を接触させ、酵素Ｓｉｒ２ｐに結合する因子を特定することを特徴とする方法。
【請求項１９】
ヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐの酵素活性に影響を及ぼす因子を特定する方法であって、請求項７または８のヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐに候補因子を接触させ、酵素Ｓａｓ２ｐの酵素活性を促進または抑制する候補因子を目的因子とすることを特徴とする方法。
【請求項２０】
ヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐの酵素活性に影響を及ぼす因子を特定する方法であって、請求項９または１０のヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐに候補因子を接触させ、酵素Ｓｉｒ２ｐの酵素活性を促進または抑制する候補因子を目的因子とすることを特徴とする方法。
【請求項２１】
ヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐの酵素活性に影響を及ぼす因子を特定する方法であって、細胞に候補因子を接触させ、酵素Ｓａｓ２ｐの酵素活性を促進または抑制する候補因子を目的因子とすることを特徴とする方法。
【請求項２２】
ヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐの酵素活性に影響を及ぼす因子を特定する方法であって、細胞に候補因子を接触させ、酵素Ｓｉｒ２ｐの酵素活性を促進または抑制する候補因子を目的因子とすることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１１、１２または１３の変異酵母細胞に候補因子を接触させ、変異酵母細胞の生育に影響を及ぼす因子を特定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ヒトをはじめとする真核生物の染色体テロメア構造を制御するヒストンアセチル化酵素、およびヒストン脱アセチル化酵素と、それらの利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒストン（ｈｉｓｔｏｎｅ）は、ヒトをはじめとする多細胞生物から真菌類（カビ・酵母）に代表される単細胞生物に至るまで、真核細胞の核内に共通に存在し、ゲノムＤＮＡとイオン結合する塩基性タンパク質である。ヒストンは通常５種類の成分（Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４）からなっており、生物種を越えて高度に類似している。例えばヒストンＨ４の場合、出芽酵母ヒストンＨ４（全長１０２アミノ酸配列）とヒトヒストンＨ４（全長１０２アミノ酸配列）では９２％のアミノ酸配列が一致し、相違はわずか８残基である。１生物中に数万種類存在すると想定されている天然タンパク質の中で、ヒストンＨ４は真核生物種間で最も高度に保存されたタンパク質であることが知られている。なお出芽酵母は遺伝学的・生化学的解析が容易な真核生物種であると同時にパン酵母とも呼称され、パンをはじめとする食品類・酒類の発酵等に広く用いられる有用微生物である。また、出芽酵母と同様に真菌属に属するカンジダ菌、アスペルギルス菌、白癬菌等の有害微生物も出芽酵母と同様にヒストンを有しており、ヒストンＨ３およびＨ４のアミノ酸配列は出芽酵母のアミノ酸配列と高い類似性を示している。
【０００３】
ゲノムＤＮＡはこのヒストンとの規則的な結合により折り畳まれており、両者の複合体は、ヌクレオソームという基本的な構造単位を形成する。そして、このヌクレオソームが凝集することによって染色体のクロマチン構造が形成され、このクロマチン構造を維持または特異的に構造変換することによって遺伝子発現、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復等の染色体ＤＮＡ上で生じる反応がコントロールされている。
【０００４】
ヒストンの翻訳後修飾は後成的な調節メカニズムであり、真核細胞の遺伝子調整に対して必須であると考えられている（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　５１，　７８６，　１９６４；　Ｎａｔｕｒｅ　３８９，　３４９，　１９９７）。一対の修飾酵素（すなわちヒストンアセチル化酵素と脱アセチル化酵素）によりヒストンの特異的な修飾パターンが確立され、これらがヒストンと染色体タンパク質との間の相互作用を調節すると考えられている（Ｃｅｌｌ　６９，　３７５，　１９９２；　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４３１，　１３１，　１９９８；　Ｎａｔｕｒｅ　４０３，　４１，２０００）。修飾に依存した方法でヒストンと相互作用する候補タンパク質には、Ｓｉｒ３ｐ（Ｃｅｌｌ　８０，　５８３，　１９９５）、Ｔｕｐ１ｐ（Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１０，　１２４７，　１９９６）、およびブロモドメイン−含有タンパク質（Ｎａｔｕｒｅ　３９９，　４９１，　１９９９）およびクロモドメイン−含有タンパク質（Ｎａｔｕｒｅ　４１０，　１１６，　２００１；　Ｎａｔｕｒｅ　４１０，　１２０，　２００１；　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９２，　１１０，　２００１）がある。ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるヒストン修飾の役割を解明するためには、この調節に関与する少なくとも４種類の成分の間の関連性を解明する必要がある。すなわち、（ｉ）特異的リジン残基において修飾されたヒストン、（ｉｉ）修飾依存性ヒストン結合タンパク質、（ｉｉｉ）修飾に関する負の制御因子、および（ｉｖ）修飾に関する正の制御因子である。
【０００５】
テロメアおよび酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの接合型遺伝子座付近に位置する遺伝子の転写不活化は、真核細胞のヘテロクロマチン形成による遺伝子制御のモデル系である（２）。遺伝子不活化に必要な因子には、前段落で掲げたヒストンの化学修飾を介した遺伝子発現制御に関与する４種類の成分のうち３種類の候補物質が含まれている。これらは（ｉ）ヒストンＨ４、（ｉｉ）Ｓｉｒ３ｐ（Ｓｉｌｅｎｔ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　３；ヒストンＨ４結合タンパク質）、および（ｉｉｉ）Ｓｉｒ２ｐ（ヒストン脱アセチル化酵素；ＨＤＡＣ）である。テロメアおよび接合型遺伝子座付近のヒストンは、染色体内部の他の座と比較して低アセチル化されている（Ｇｅｎｅｓ　　Ｄｅｖ．　７，　５９２，　１９９３；　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１６，　４３４９，　１９９６；　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　８，　４７３，　２００１）。Ｓｉｒ３ｐは遺伝的に同定された遺伝子発現不活化（サイレンシング）因子であり、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでヒストンＨ４のＮ末端領域に対応するペプチドと相互作用する（Ｃｅｌｌ　８０，　５８３，　１９９５）。この相互作用は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでこのペプチドをアセチル化することにより減弱する（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７７，　４７７８，　２００２）。もう一つのＳＩＲタンパク質であるＳｉｒ２ｐは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるヒストン脱アセチル化酵素活性を持っている（Ｎａｔｕｒｅ　４０３，　７９５，　２０００）。これらの研究から、低アセチル化と遺伝子不活化の関連が示唆される。しかしながら、ヒストンの低アセチル化が、ｉｎ　ｖｉｖｏでのＳｉｒ３ｐの局在化および遺伝子不活化の引き金となるかどうかは明らかではない。
【０００６】
一方、ヒストンＨ４の第１６番目リジン（ヒストンＨ４−Ｋ１６）はヒストンＨ４のアセチル化部位の中で唯一、その部位の点変異により遺伝子発現不活化（サイレンシング）が解除される部位である（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７，　８４１，　１９９０；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７，　６２８６，　１９９０；　Ｃｅｌｌ　６６，　１２７９，　１９９１；　Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６）。ヒストンＨ４−Ｋ１６におけるこの点変異により生じる不活化の欠損は、ＳＩＲ３における変異により抑制される（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７，　６２８６，　１９９０）。これらの結果から、ヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化がもし存在すれば、それにより十分に遺伝子の不活化が調節されることが示唆される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、遺伝子不活化に必要な４種類の因子のうち、ヒストンＨ４、Ｓｉｒ３ｐ、およびＳｉｒ２ｐが知られている。しかしながら、ヒストンＨ４のアセチル化に対する正の制御因子（ヒストンアセチル化酵素）は知られていない。
【０００８】
従って、この出願の第１の課題は、ヒストンＨ４（特にヒストンＨ４−Ｋ１６）に対する新規のアセチル化酵素を提供することである。
【０００９】
また、ヒストン脱アセチル化酵素としてＳｉｒ２ｐが知られているが、染色体におけるアセチル化勾配（そしてＳｉｒ３ｐの分布やそれによる遺伝子不活化）に対するＳｉｒ２ｐの機能、あるいは新規のヒストン脱アセチル化酵素とＳｉｒ２ｐとの関係は知られていない。
【００１０】
従って、この出願の第２の課題は、ヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐの新たな機能を提供することである。
【００１１】
さらにこの出願は、前記のヒストンアセチル化酵素およびヒストン脱アセチル化酵素を機能欠損した酵母細胞株を提供することを課題としている。
【００１２】
またさらに、この出願は、前記のヒストンアセチル化酵素およびヒストン脱アセチル化酵素に結合する新規因子や、それらの酵素活性に影響を及ぼす新規因子を探索するための方法を提供することを課題としている。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（２３）の発明を提供する。
（１）　　酵素配列番号２のアミノ酸配列を有し、染色体テロメアより遠方のヒストンをアセチル化する酵素Ｓａｓ２ｐをコードする酵母遺伝子ＳＡＳ２。
（２）　　ｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有する前記発明（１）の酵母遺伝子ＳＡＳ２。
（３）　　配列番号４のアミノ酸配列を有し、染色体テロメア近傍のヒストンを脱アセチル化する酵素Ｓｉｒ２ｐをコードする酵母遺伝子ＳＩＲ２。
（４）　　ｃＤＮＡが配列番号３の塩基配列を有する前記発明（３）の酵母遺伝子ＳＩＲ２。
（５）　　前記発明（１）の酵母遺伝子ＳＡＳ２のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
（６）　　前記発明（３）の酵母遺伝子ＳＩＲ２のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
（７）　　配列番号２のアミノ酸配列を有し、染色体テロメアより遠方のヒストンをアセチル化する、精製されたヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐ。
（８）　　前記発明（５）のポリヌクレオチドの発現産物である前記発明（７）のヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐ。
（９）　　配列番号４のアミノ酸配列を有し、染色体テロメア近傍のヒストンを脱アセチル化する、精製されたヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐ。
（１０）　前記発明（６）のポリヌクレオチドの発現産物である前記発明（９）のヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐ。
（１１）　ヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐが機能欠損している変異酵母細胞。
（１２）　ヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐが機能欠損している変異酵母細胞。
（１３）　ヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐおよびヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐが機能欠損している変異酵母細胞。
（１４）　機能欠損が、遺伝子ＳＡＳ２のタンパク質コード領域の欠失である前記発明（１１）または（１３）の変異酵母細胞。
（１５）　機能欠損が、配列番号２に示した酵素Ｓａｓ２ｐのアミノ酸配列における以下のアミノ酸置換：
第１０３位ＣｙｓがＡｓｐ；
第１０６位ＣｙｓがＴｈｒ；
第２１６位ＧｌｎがＧｌｕ；
第２１９位ＧｌｙがＧｌｕ；および
第２４２位ＧｌｕがＧｌｙ
の１以上に対応する遺伝子ＳＡＳ２の塩基置換である前記発明（１１）または（１３）の変異酵母細胞。
（１６）　機能欠損が、遺伝子ＳＩＲ２のタンパク質コード領域の欠失である前記発明（１２）または（１３）の変異酵母細胞。
（１７）　前記発明（７）または（８）のヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐに候補因子を接触させ、酵素Ｓａｓ２ｐに結合する因子を特定することを特徴とする方法。
（１８）　前記発明（９）または（１０）のヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐに候補因子を接触させ、酵素Ｓｉｒ２ｐに結合する因子を特定することを特徴とする方法。
（１９）　ヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐの酵素活性に影響を及ぼす因子を特定する方法であって、前記発明（７）または（８）のヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐに候補因子を接触させ、酵素Ｓａｓ２ｐの酵素活性を促進または抑制する候補因子を目的因子とすることを特徴とする方法。
（２０）　ヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐの酵素活性に影響を及ぼす因子を特定する方法であって、前記発明（９）または（１０）のヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐに候補因子を接触させ、酵素Ｓｉｒ２ｐの酵素活性を促進または抑制する候補因子を目的因子とすることを特徴とする方法。
（２１）　ヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐの酵素活性に影響を及ぼす因子を特定する方法であって、細胞に候補因子を接触させ、酵素Ｓａｓ２ｐの酵素活性を促進または抑制する候補因子を目的因子とすることを特徴とする方法。
（２２）　ヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐの酵素活性に影響を及ぼす因子を特定する方法であって、細胞に候補因子を接触させ、酵素Ｓｉｒ２ｐの酵素活性を促進または抑制する候補因子を目的因子とすることを特徴とする方法。
（２３）　前記発明（１１）、（１２）または（１３）の変異酵母細胞に候補因子を接触させ、変異酵母細胞の生育に影響を及ぼす因子を特定する方法。
【００１４】
以下、この出願の発明について、実施形態を詳しく説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
発明（１）は、発明（７）のヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐをコードする酵母遺伝子ＳＡＳ２であり、この酵母遺伝子は、転写されるｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有している。
【００１６】
発明（３）は、発明（８）のヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐをコードする酵母遺伝子ＳＩＲ２であり、この酵母遺伝子は、そのｃＤＮＡが配列番号３の塩基配列を有している。
【００１７】
なお、発明（１）および（３）の酵母遺伝子には、それがコードするタンパク質の発現に対する制御領域（プロモーター／エンハンサー、リプレッサー等）も含まれる。これらの発現制御領域は、酵素Ｓａｓ２ｐおよびＳｉｒ２ｐの更なる機能を解明するためにも有用である。
【００１８】
発明（１）および（３）の遺伝子は、例えば、それぞれ配列番号１および３の塩基配列またはその一部配列からなる精製ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとして酵母ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離するすることができる。得られたゲノム遺伝子は、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００１９】
そして、このゲノム遺伝子やこの遺伝子が転写するｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡから、発明（５）および（６）の精製ポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片やＲＮＡ断片）を調製することができる。例えば、ｃＤＮＡは酵母細胞から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として、公知の方法（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２，　１６１−１７０，　１９８２；　Ｊ．　Ｇｅｎｅ　２５，　２６３−２６９，　１９８３；　Ｇｅｎｅ，　１５０，　２４３−２５０，　１９９４）を用いて合成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマ−として、酵母細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。このようにして調製されるＳＡＳ２　ｃＤＮＡは、具体的には配列番号１の塩基配列を有している。また、ＳＩＲ２　ｃＤＮＡは配列番号３の塩基配列を有している。これらのポリヌクレオチドは、例えば酵素Ｓａｓ２ｐおよびＳｉｒ２ｐの遺伝子工学的な製造に使用することができる。
【００２０】
発明（７）のヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐは、配列番号２のアミノ酸配列を有し、テロメアより遠方の染色体ヒストン、特にヒストンＨ４−Ｋ１６をアセチル化する。テロメアより「遠方」とは、テロメアより約５ｋｂ以上離れた染色体全体を意味する。また、「アセチル化」とは、ヒストンＨ４−Ｋ１６にアセチル基（ＣＨ３ＣＯ−）が導入される反応である。
【００２１】
発明（８）のヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐは、配列番号４のアミノ酸配列を有し、テロメア近傍のアセチル化されたヒストンを脱アセチル化する。ここで、「テロメア近傍」とは、テロメアから５ｋｂ以内、さらに具体的にはテロメアから１ｋｂ以内の領域を言う。また、「脱アセチル化」とは、アセチル化されたヒストンＨ４−Ｋ１６からアセチル基を離脱させる反応をいう。
【００２２】
これらの酵素Ｓａｓ２ｐおよびＳｉｒ２ｐは、酵母細胞から単離する方法、配列番号２または４のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法等によって得ることができるが、好ましくは、前記発明（５）および（６）のポリヌクレオチドをそれぞれ用いて遺伝子工学的に製造することができる。すなわち、ポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに連結することによって、インビトロ転写翻訳系や、非酵母細胞（微生物、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等）の培養物から、変異型タンパク質を単離精製する。
【００２３】
例えば、酵素Ｓａｓ２ｐまたはＳｉｒ２ｐをインビトロ転写翻訳系で発現させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作製する。このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ転写翻訳系に添加すれば、目的とする精製酵素をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７　１８、ｐＴ７／３　１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩなどが例示できる。
【００２４】
精製酵素を、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えて発現ベクターを作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、目的の酵素を発現する形質転換体細胞を得ることができ、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的酵素を大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００２５】
さらに、前記の酵素を真核細胞で発現させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成する。このベクターを真核細胞内に導入して培養すれば、目的とする酵素を発現する形質転換真核細胞を得ることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓由来細胞ＨＥＫ２９３Ｔ、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００２６】
形質転換細胞で発現させた酵素タンパク質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２７】
なお、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明の酵素タンパク質の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、メチル化などである。
【００２８】
発明（１１）は、前記のヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐが機能欠損している変異酵母細胞である。発明（１２）は、前記のヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐが機能欠損している変異酵母細胞である。さらに、発明（１３）は、前記のヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐ、および前記のヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐが共に機能欠損している変異酵母細胞である。
【００２９】
この場合の「機能欠損」とは、酵素Ｓａｓ２ｐおよび／またはＳｉｒ２ｐが正常に機能していないことを意味する。従って、例えば前記発明（１１）の変異酵母細胞の一つの態様は、細胞の染色体ゲノムに遺伝子ＳＡＳ２のタンパク質コード領域が存在していないことによって酵素Ｓａｓ２ｐを産生しない細胞である。別の態様は、ＳＡＳ２遺伝子のコード領域における１以上のヌクレオチドが欠失、付加、または他のヌクレオチドに置換していること（遺伝子変異）によって、酵素Ｓａｓ２ｐを産生しないか、または変異型酵素Ｓａｓ２ｐを産生する細胞である。また別の態様は、ＳＡＳ２遺伝子の発現制御領域が欠失または部分的に変異していることによって、ＳＡＳ２遺伝子が発現せず、その結果として酵素Ｓａｓ２ｐを産生しない細胞である。さらに別の態様は、ＳＡＳ２遺伝子からの転写産物（ｍＲＮＡ）に対するセンス鎖、アンチセンス鎖、センス・アンチセンス二重鎖、またはＳＡＳ２　ｍＲＮＡを切断するリボザイムを発現し、ｍＲＮＡから酵素Ｓａｓ２ｐが合成されない細胞である。発明（１２）および（１３）の変異酵母細胞も、同様にしてＳｉｒ２ｐ、またはＳａｓ２ｐおよびＳｉｒ２ｐを機能欠損させることによって作成することができる。
【００３０】
なお、センス鎖、アンチセンス鎖、センス・アンチセンス二重鎖やリボザイムを発現する細胞は、それらをコードするＤＮＡ断片を細胞に導入することによって作製することができるが、それぞれＳａｓ２ｐ、Ｓｉｒ２ｐ、またはＳａｓ２ｐおよびＳｉｒ２ｐを確実に機能欠損させるためには、それぞれの遺伝子のコード領域および／または発現制御領域に欠失変異を導入することが好ましい。このような遺伝子特異的な変異導入は、公知の標的遺伝子組換え法（ジーンターゲティング法：Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８８−１２９２，　１９８９）を改良した方法により行うことができる。この方法は、例えばＳＡＳ２遺伝子を対象とする場合を例にとって説明すれば以下のとおりである。先ず、ＳＡＳ２遺伝子のゲノムＤＮＡを単離し、そのＤＮＡ断片を試験管内にて遺伝子操作し、ＳＡＳ２遺伝子の開始コドンを含むＤＮＡ断片に対して改変を施すなど、ＳＡＳ２遺伝子の機能を不活性化させるような変異ＤＮＡ断片を作製する。そして、この変異遺伝子を用いて、酵母ゲノムのＳＡＳ２遺伝子に変異を導入するためのターゲティングベクターを公知の方法（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８８−１２９２，　１９８９）に準じて作製する。このターゲティングベクターを、公知の電気パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等にうって酵母細胞に導入する。そして、ターゲティングベクターを導入した各細胞のＤＮＡを抽出し、サザンブロット分析やＰＣＲアッセイ等により、染色体上に存在する野生型ＳＡＳ２遺伝子と導入した変異遺伝子断片の間で正しく相同遺伝子組換えが起こり、染色体上のＳＡＳ２遺伝子に変異が移った細胞を選択する。
【００３１】
また、発明（１１）または（１３）におけるＳａｓ２ｐ機能欠損の別の態様は、配列番号２に示した酵素Ｓａｓ２ｐのアミノ酸配列における以下のアミノ酸置換：
第１０３位ＣｙｓがＡｓｐ；
第１０６位ＣｙｓがＴｈｒ；
第２１６位ＧｌｎがＧｌｕ；
第２１９位ＧｌｙがＧｌｕ；および
第２４２位ＧｌｕがＧｌｙ
の１以上に対応する遺伝子ＳＡＳ２の塩基置換である。これらのアミノ酸置換は、後記の実施例１に示したように、ＭＹＳＴファミリータンパク質（Ｓａｓ２ｐ、Ｓａｓ３ｐ、およびＥｓａ１ｐ）のＨＡＴ活性を消失させることが報告されている変異に対応する点変異である。そして、実施例１にも示したように、これらのアミノ酸置換によってもＳａｓ２ｐのヒストンアセチル化活性が消失する。
【００３２】
ＳＡＳ２遺伝子に前記のアミノ酸置換に対応した塩基置換を導入するには、公知のＫｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２：４８８，　１９８５およびＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５４：３６７，　１９８７）や、ミューテーション・キット等を使用する方法、あるいは変異導入型のＰＣＲ法などを採用することができる。
【００３３】
発明（１７）は、前記のヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐに候補因子を接触させ、酵素Ｓａｓ２ｐに結合する因子を特定することを特徴とする方法である。酵素Ｓａｓ２ｐと候補因子との結合は、（ｉ）酵母細胞内からＳａｓ２ｐを含む高分子複合体を精製し、その成分を同定する方法、（ｉｉ）精製したＳａｓ２ｐを樹脂に固定し、そこに酵母抽出液を加えて、酵母抽出液の中でＳａｓ２ｐに結合し樹脂に吸着する因子を同定する方法、（ｉｉｉ）酵母２−ｈｙｂｒｉｄ法によりＳａｓ２ｐと相互作用しうる因子を網羅的に取得する方法、等の方法によって検出することができる。
【００３４】
この発明（１７）の方法によって特定された因子は、出芽酵母にとどまらずヒトを含む哺乳類の染色体構造の制御遺伝子を特定する手がかりとなり、癌化・老化の分子機構を解明するにあたり有用である。
【００３５】
なお、この出願の発明において、「因子」とは、未知および既知の化合物、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等を含有する。
【００３６】
発明（１８）は、前記のヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐに候補因子を接触させ、酵素Ｓｉｒ２ｐに結合する因子を特定することを特徴とする方法である。酵素Ｓｉｒ２ｐと候補因子との結合は、（ｉ）酵母細胞内からＳｉｒ２ｐを含む高分子複合体を精製し、その成分を同定する方法、（ｉｉ）精製したＳｉｒ２ｐを樹脂に固定し、そこに酵母抽出液を加えて、酵母抽出液の中でＳｉｒ２ｐに結合し樹脂に吸着する因子を同定する方法、（ｉｉｉ）酵母２−ｈｙｂｒｉｄ法によりＳｉｒ２ｐと相互作用しうる因子を網羅的に主知得する方法、等の方法によって検出することができる。
【００３７】
この発明（１８）の方法によって特定された因子は、出芽酵母にとどまらずヒトを含む哺乳類のテロメア構造の制御遺伝子を特定する手がかりとなり、癌化・老化の分子機構を解明するにあたり有用である。特に、Ｓｉｒ２ｐは出芽酵母だけでなくヒトと同じく多細胞真核生物である線虫においても老化に関わることが知られている。さらに、Ｓｉｒ２ｐはヒトにおいてｐ５３の脱アセチル化を介した活性制御にも関わっていることが知られていることから、ｐ５３の活性制御による制癌研究にも応用可能であると考える。
【００３８】
発明（１９）は、ヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐの酵素活性に影響を及ぼす因子を特定する方法であって、試験管内において前記のヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐに候補因子を接触させ、酵素Ｓａｓ２ｐの酵素活性を促進または抑制する候補因子を目的因子とすることを特徴とする方法である。
【００３９】
具体的には、例えば、試験管内において、ヒストンＨ４と精製酵素Ｓａｓ２ｐ、および候補因子を反応させ、ヒストンＨ４のリジン−１６のアセチル化を調べ、このアセチル化を促進または抑制する因子を目的因子として同定する。ヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化の程度は、アセチル化されたヒストンＨ４−Ｋ１６を特異的に認識する抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ解析によって検出することができる。
【００４０】
あるいは、Ｓａｓ２ｐの新たな機能であるサブ・テロメア領域（テロメア末端から５−２０ｋｂの染色体領域）の抗サイレンシング活性（後記の実験４参照）を指標に、遺伝学的にＳＡＳ２の機能を制御する因子をスクリーニングする方法によっても目的因子を同定することができる。
【００４１】
この発明（１９）の方法によって同定された因子は、これまで不明であったヒストンアセチル化酵素の活性制御の新たな分子機構を知るうえで重要である。特にサブ・テロメア領域での抗サイレンシング現象は新規の知見であり、ヒトなどの哺乳類でもどうような機構が存在するのか、存在する場合どのような意味を持っているのか、といったことは全くわかっていない。この因子の解析を出芽酵母はもちろん、高等真核生物でもすすめることによって、哺乳類における染色体構造のダイナミズムの研究が促進するという点で有用である。
【００４２】
発明（２０）は、ヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐの酵素活性に影響を及ぼす因子を特定する方法であって、前記のヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐに候補因子を接触させ、酵素Ｓｉｒ２ｐの酵素活性を促進または抑制する候補因子を目的因子とすることを特徴とする方法である。
【００４３】
具体的には、例えば、試験管内において、アセチル化したヒストンＨ４と精製酵素Ｓｉｒ２ｐ、および候補因子を反応させ、アセチル化ヒストンＨ４の脱アセチル化の程度を調べ、この脱アセチル化を促進または抑制する因子を目的因子として同定する。ヒストンＨ４の脱アセチル化の程度は、アセチル化されたヒストンＨ４−Ｋ１６を特異的に認識する抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ解析によって検出することができる。
【００４４】
あるいは、Ｓｉｒ２ｐがＮＡＤ依存のヒストン脱アセチル化酵素であるという知見に着目して、ＮＡＤと結合する因子のＳｉｒ２ｐに対する影響を網羅的に検討するという方法によっても目的因子を同定することができる。
【００４５】
この発明（２０）の方法によって同定された因子は、テロメア領域の染色体構造のダイナミズムの解析に有効なばかりでなく、老化・癌化の研究への応用展開に有用である。とくに、エネルギー代謝、老化にともなってＳｉｒ２ｐの活性が制御されていることが知られていることから、同定された因子は直接寿命の制御に関与している可能性が大きい。
【００４６】
発明（２１）は、ヒストンアセチル化酵素Ｓａｓ２ｐの酵素活性に影響を及ぼす因子を特定する方法であって、細胞に候補因子を接触させ、酵素Ｓａｓ２ｐの酵素活性を促進または抑制する候補因子を目的因子とすることを特徴とする方法である。
【００４７】
具体的には、酵母細胞に候補因子を導入し、染色体のテロメアから５ｋｂ以上離れた領域のクロマチンのアセチル化を調べることによって、酵素Ｓａｓ２ｐの活性を促進または抑制する目的因子を同定することができる。あるいは、染色体のテロメアから５ｋｂ以上離れた領域の染色体凝集タンパク質Ｓｉｒ３ｐの量を定量化することや、あるいはテロメアから約２０ｋｂまでの領域の任意の遺伝子の発現レベルを測定する方法等によっても目的因子を同定することができる。さらには、このテロメア末端から５−２０ｋｂの染色体領域にマーカー遺伝子を組み込み、そのマーカー遺伝子の発現を指標に目的因子を網羅的にスクリーニングすることもできる。
【００４８】
発明（２２）は、ヒストン脱アセチル化酵素Ｓｉｒ２ｐの酵素活性に影響を及ぼす因子を特定する方法であって、細胞に候補因子を接触させ、酵素Ｓｉｒ２ｐの酵素活性を促進または抑制する候補因子を目的因子とすることを特徴とする方法である。
【００４９】
具体的には、酵母細胞に候補因子を導入し、染色体のテロメアから約５ｋｂ以内、好ましくは約１ｋｂ以内クロマチンのアセチル化を調べることによって、酵素Ｓｉｒ２ｐの活性を促進または抑制する目的因子を同定することができる。あるいは、このテロメア末端から１ｋｂ以内の染色体領域にマーカー遺伝子を組み込み、そのマーカー遺伝子の発現を指標に目的因子を網羅的にスクリーニングすることもできる。
【００５０】
なお、前記発明（２１）および（２２）の方法では、細胞として酵母細胞を使用することができるが、「非酵母細胞」を対象とすることもできる。これは、前記のとおりヒストンの構造（アミノ酸配列）が種間を越えて高度に保存されており、酵母以外の種においても酵母での知見が確実に適用できるためである。さらに、非酵母細胞は、培養細胞（インビトロ）だけでなく、生物個体内の生細胞（インビボ）をも対象とすることができる。
【００５１】
発明（２３）は、前記発明（１１）、（１２）または（１３）の変異酵母細胞に候補因子を接触させ、変異酵母細胞の生育に影響を及ぼす因子を特定する方法である。
【００５２】
具体的には、これらの変異酵母細胞は後記の実験結果からも明らかな通り、染色体上のヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化パターン、テロメア蛋白質Ｓｉｒ３ｐの局在パターン、遺伝子発現のパターンが野生型酵母細胞と、それぞれ異なる。従って、これらの変異酵母細胞を用いれば、このパターンを野生型酵母細胞と同様のものに戻す「抑圧変異遺伝子」および、このパターンをさらに変化させる「増強変異遺伝子」を取得することが可能である。
【００５３】
この発明（２３）の方法によって同定された因子は、染色体構造のダイナミックな制御に重要な役割を果たしていることが示唆され、染色体構造のダイナミズムの研究だけでなく、老化・癌化のメカニズムを知り、新たな医薬品のターゲットとなる得るという点で有用である。
【００５４】
以下、この発明の酵素の同定と、その機能解析のために行った実験を示し、この発明についてさらに詳細に説明する。
１．　新規のヒストンアセチル化酵素の同定
ＭＹＳＴファミリータンパク質（Ｓａｓ２ｐ、Ｓａｓ３ｐ、およびＥｓａ１ｐ）は酵母におけるヒストンＨ４−Ｋ１６アセチル化酵素の有力な候補であるが、これには３つの理由がある。第１には、このファミリーの構成タンパク質はヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）活性があり、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでヒストンＨ４−Ｋ１６をアセチル化する（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９５，　３５６１，　１９９８；　Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　３，　７８９，　１９９８）。第２に、ショウジョウバエ（ｍｏｆ）においてＭＹＳＴファミリーの構成タンパク質の一つを変異させると、ショウジョウバエオスＸ染色体のヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化が消失する（ＥＭＢＯ　Ｊ．　１６，　２０５４，　１９９７）。第３に、ＳＡＳ２およびＳＡＳ３は遺伝子不活化に関与する遺伝子として単離されている（ＳＡＳ；Ｓｏｍｅｔｈｉｎｇ　Ａｂｏｕｔ　Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）（Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　１４，　４２，　１９９６；　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１４５，　９２３，　１９９７）。
【００５５】
そこで、ＭＹＳＴファミリーの構成タンパク質がｉｎ　ｖｉｖｏにおいてヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化を行う場合の要件を、ウェスタンブロット分析を用いて調べた。
１．１．　手続
ウェスタンブロッティングに用いる酵母抽出物を次のように調製した。液体培養より回収した酵母細胞沈殿を０．２５Ｍ　ＮａＯＨ／１％　β−メルカプトエタノール中に懸濁した。トリクロロ酢酸を添加して最終濃度を７％とし、抽出物を沈殿させ、アセトンによる洗浄後にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の試料緩衝液中に懸濁した。レーンあたり２×１０６個の細胞由来抽出物を充填した。ヒストンに対するイムノブロッティングは、Ｃｌａｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１９，　２５１５，　１９９９）の方法に従い行った。アセチル化ヒストンＨ４−Ｋ５および−Ｋ１６に対する抗血清はＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）より、抗Ｈ４ＡｃＫ８および抗Ｈ４ＡｃＫ１２抗血清はＵｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌａｋｅ　Ｐｌａｃｉｄ，　ＮＹ，　ＵＳＡ）よりそれぞれ購入した。ｓａｓ２、ｓａｓ３およびｓｉｒ２の遺伝子変異体は、オープンリーディングフレーム全体を置換することにより構築した。
１．２．　結果
ウェスタンブロット分析の結果は図１に示したとおりである。ヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化に対応するシグナルは、ＳＡＳ２欠損変異体において劇的に減少した（レーン１，２）。ＳＡＳ２の変異はヒストンＨ４−Ｋ５、−Ｋ８または−Ｋ１２におけるアセチル化に影響を与えなかったため、Ｓａｓ２によるこの影響は、ヒストンＨ４においてアセチル化されるすべてのリジン残基の中でＫ１６に特異的である（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１６，　４３４９，　１９９６）。対照的に、ＥＳＡ１における温度感受性変異により、制限温度下においてヒストンＨ４−Ｋ５（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１９，　２５１５，　１９９９）、−Ｋ８および−Ｋ１２のアセチル化が減少したが、ヒストンＨ４−Ｋ１６においては生じなかった（レーン４−６）。ＳＡＳ３の欠損はヒストンＨ４における３種類のリジンのアセチル化には検出可能な影響を及ぼさなかった（レーン３）。以上の結果は、酵母細胞中のヒストンＨ４−Ｋ１６におけるアセチル化の正の調節因子に関する初めての発見であり、Ｓａｓ２とヒストンアセチル化を初めて関連づけるものである。
【００５６】
Ｓａｓ２ｐにはＭＹＳＴドメインと呼ばれる種間で高度に保存されている一次構造上の領域が存在している。他の因子のＭＹＳＴドメインはＨＡＴ活性を担うことが明らかとなっている（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７２，　３０５９５，　１９９７）が、Ｓａｓ２ｐについてはマルチサブユニット複合体を用いた場合ですら、ｉｎ　ｖｉｔｒｏのＨＡＴ活性に関する報告は全く存在しない（Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１５，　３１５５，　２００１；　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１５，　３１６９，　２００１）。そこで次に、Ｓａｓ２変異により引き起こされるｉｎ　ｖｉｖｏ低アセチル化が、このタンパク質の一次構造から予想されるように、推定ＨＡＴ活性に対して関連を持つかどうかという問題に関する見通しを得るために、他のＭＹＳＴファミリータンパク質のＨＡＴ活性を消失させることが報告されている変異に対応する点変異体を作成した。
【００５７】
Ｓａｓ２のＥ２４２（配列番号１の第２４２Ｇｌｕ）における変異（ｓａｓ２−Ｅ２４２Ｇ：配列番号２の第２４２ＧｌｕをＧｌｙに置換）はＥｓａ１のＥ３３８における変異（ｅｓａ１−Ｅ３３８Ｇ）に対応しているが、このＥ３３８ＥはＥｓａ１の結晶構造解析により予測される推定触媒残基である（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　６，　１１９５，　２０００）。Ｃ１０３ＤおよびＣ１０６ＴはＳａｓ２のジンクフィンガードメインである可能性を持つ部位における変異であり、Ｑ２１６ＥおよびＧ２１９Ｅはこのタンパク質の推定アセチル補酵素Ａ結合ドメインにおける変異である。Ｅｓａ１ｐ、Ｓａｓ３ｐまたはヒトのＴｉｐ６０（Ｅｓａ１に対応）における対応する変異は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＨＡＴ活性を消失させることが報告されている（各々、Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　６，　１１９５，　２０００；　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２６６，　４０５，　１９９９；　Ｃｅｌｌ　１０２，　４６３，　２０００）。
【００５８】
結果は図２に示したとおりである。野生型Ｓａｓ２とは異なり、これらのＳａｓ２変異体はｓａｓ２破壊により生じるヒストンＨ４−Ｋ１６の低アセチル化を補うことがない。これらの結果から、Ｓａｓ２自らが持つアセチル化活性を介してヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化に関与していることが示唆された。
２．　Ｓａｓ２ｐおよびＳｉｒ２ｐにより確立される染色体に沿ったアセチル化勾配
Ｓａｓ２ｐがｉｎ　ｖｉｖｏにおけるヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化に対するポジティブな調節因子であることが同定されたことから、さらに、テロメアのクロマチンに沿ったヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化に対して変異性ＳＡＳ２が及ぼす影響を調べた。すなわち、クロマチン免疫沈降（Ｃｈｒ−ＩＰ）アッセイ（Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６；　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１１，　８３，　１９９７）を用いてリジン−１６においてアセチル化されたヒストンＨ４の局在化を評価した。
２．１　　方法
クロマチンの免疫沈殿（Ｃｈｒ−ＩＰ）アッセイの手順は、Ｄｒ．　Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎのグループによる方法（Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６；　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１１，　８３，　１９９７；　Ｎａｔｕｒｅ　３９２，８３１，　１９９８）に基づいて、次のように修正を加えた。アセチル化ヒストンＨ４−Ｋ１６に対するＩＰのためには、ヒストンＨ４−アセチル化リジン−１６残基に対する抗血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）５μｌを用いて、１．２５×１０　８個の細胞より調製した全細胞抽出物から、Ｋ１６がアセチル化されたヒストンＨ４を特異的に沈殿させたが、これはＲｕｎｄｌｅｔｔ　ｅｔａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ　３９２，　８３１，　１９９８）の方法に従っている。ＰＣＲ増幅は、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ，　ＵＳＡ）および対応する緩衝液を用い、１／３００量の免疫沈殿物と２４サイクルの増幅により行った（Ｎａｔｕｒｅ　３９２，　８３１，　１９９８）。ＰＣＲ産物の２０％を６％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、０．１μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて可視化した。任意のＤＮＡ配列の定量は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を用いた定量ＰＣＲにより行い、各サンプルについて免疫沈降に用いた出発材料中の目的ＤＮＡ配列の量と沈降物中の目的ＤＮＡ配列の量の比を算出した。Ｓｉｒ３ｐに対するＩＰのためには、Ｗ３０３−１ａ株のＳＩＲ３のＣ末端にＭｙｃエピトープを標識したが、これはＫｎｏｐ　ｅｔ　ａｌ．（Ｙｅａｓｔ　１５，　９６３，　１９９９）の方法による。０．３μｇの抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１１，　ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ，　Ｆｒｅｍｏｎｔ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を用い、５×１０８細胞から調製した全細胞抽出物より、Ｍｙｃ−タグ化タンパク質の沈殿を行った（Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６；　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１１，　８３，　１９９７）。沈殿物の臭化エチジウムを用いた可視化の際には、沈殿物の１／１００に対して、２６サイクルのＰＣＲ増幅（Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１１，　８３，　１９９７）を用いた。
２．２　　結果
様々な酵母菌株（野生型、ｓａｓ２およびｓｉｒ２変異体）に由来する細胞をホルムアルデヒドを用いて架橋結合し、次にこれをリジン−１６においてアセチル化されたヒストンＨ４に対する抗血清を用いて免疫沈降させた。その後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ＶＩ染色体の右腕のテロメアからの様々な距離にある領域が、この免疫沈降により沈降されているかどうかを視覚化した（Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６；　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１１，　８３，　１９９７）。ＶＩ染色体の右腕のテロメア近傍領域には反復性Ｙ’およびＸシーケンスが存在しないため、テロメア末端からの距離はこの領域のＤＮＡシーケンスより同定できる（Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６；　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１１，　８３，　１９９７）。臭化エチジウム染色されたＰＣＲ産物（図３）の観察から、Ｋ１６においてアセチル化されたヒストンＨ４とともに沈降したＤＮＡがｓａｓ２変異体では少ないことがわかり、ｓａｓ２が染色体上のヒストンＨ４のＫ１６をアセチル化していることがわかる。
【００５９】
そこで各サンプルについて定量ＰＣＲを行い、Ｋ１６においてアセチル化されたヒストンＨ４とともに沈降するＤＮＡの出発材料に対する相対量の形で評価した（図４）。野生型細胞では（図４の菱形）、クロマチンはテロメアより１ｋｂ以内の位置で低アセチル化されている。このテロメア近傍領域における低アセチル化はＳｉｒ２に依存していることが、ｓｉｒ２欠損体ではこの低アセチル化が消失していることから明らかとなった（図４の三角形）。対照的に、野生型のテロメア遠位領域（５ｋｂ以上）のクロマチンにおいては、テロメア近傍領域と比較して高アセチル化が生じている。またｓａｓ２欠損体では（図４の四角形）、野生型（図４の菱形）にみられるアセチル化の劇的な増加と比べて、クロマチンに沿ってテロメア近傍領域からテロメア遠位領域に到るわずかなアセチル化の増加が見られるのみである。これらの結果から示されるのは、ヒストンＨ４−Ｋ１６に対するアセチル化の急勾配が、テロメアより１−５ｋｂの領域において、野生型細胞におけるＳａｓ２とＳｉｒ２の協調機能によって確立されるという事実である。
【００６０】
野生型においてヒストンＨ４−Ｋ１６の低アセチル化がみられる領域（図４）は、既存の研究（Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６）からテロメア近傍でＳｉｒ３ｐが局在化している領域と一致することが予想された。Ｓｉｒ３ｐはＨ４−Ｋ１６のアセチル化に依存する方法でクロマチンと結合すると提唱されているため（Ｃｅｌｌ　８０，　５８３，　１９９５）、次の疑問としては、Ｓａｓ２およびＳｉｒ２の協調機能により確立されるアセチル化の急勾配が、染色体に沿ったＳｉｒ３ｐの局在化に対して役割を果たしているかどうかという点が挙げられる。
３．　ｓａｓ２変異体におけるＳｉｒ３ｐの局在化
ＶＩ染色体上のＳｉｒ３ｐの局在化を評価するため、Ｍｙｃ標識化Ｓｉｒ３ｐと挙動を供にするＤＮＡの免疫沈降を抗−Ｍｙｃ抗体を用いて行うことにより、前記２と同様のＣｈｒ−ＩＰアッセイを行った。臭化エチジウム染色したＰＣＲ産物（図５）の観察から、野生株においてＳｉｒ３ｐがテロメア周辺にのみ局在していることがわかったが、これは既に報告されている知見（Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６）と合致していた。さらに、ｓａｓ２変異株で、全体的にＳｉｒ３ｐの局在が上昇していることが初めてわかった。
【００６１】
そこで各サンプルについて定量ＰＣＲを行い、Ｓｉｒ３ｐが局在している染色体領域の相対量を得た（図６）。野生型細胞におけるＳｉｒ３ｐ関連ＤＮＡの総量は、テロメアから距離が離れるほど減少した（図６の菱形）。Ｓｉｒ２変異体（図６の三角形）では、染色体全体のクロマチンに対するＳｉｒ３ｐの結合レベルが低くなったが、これは染色体全体のヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化のレベルが高かったことと相関している。
【００６２】
ｓａｓ２変異体においては、テロメアから５−２０ｋｂ離れた領域におけるＳｉｒ３ｐ関連ＤＮＡの総量の増加が見られた（図６の四角形）。テロメア近傍領域内のＳｉｒ３ｐの局在化は、２つのプロセスにより確立されると考えられる（Ｃｅｌｌ　８０，　５８３，　１９９５；　Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６）。すなわち、（ｉ）まずＳｉｒ３ｐがテロメア結合タンパク質Ｒａｐ１との相互作用を介してテロメアに結合し、（ｉｉ）それに続いてＳｉｒ３ｐがＳｉｒ３ｐのポリマー化により染色体に沿って広がる、というものである。ヒストンＨ４−Ｋ１６においてアセチル化の急勾配が存在しない点と、Ｓｉｒ３ｐがテロメア遠位領域まで局在している点の間の関連から、ｓａｓ２変異体ではヒストンＨ４−Ｋ１６の低アセチル化が生じた結果、Ｓｉｒ３ｐがクロマチン上に広がっていると考えられる。
【００６３】
細胞内Ｓｉｒ３ｐ用量の増加により、テロメア近傍領域からのＳｉｒ３ｐの広がりが促進することが知られているため（Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６）、ここではｓａｓ２変異体におけるＳｉｒ３ｐの広がりが、細胞内Ｓｉｒ３ｐのタンパク質レベルの増加に起因するものであるかどうかを調べた。全細胞抽出液に対するウェスタンブロット分析の結果、ｓａｓ２変異体においてＳｉｒ３ｐのタンパク質レベルは増加しておらず（図７）、この事実からｓａｓ２変異体におけるＳｉｒ３ｐの広がりはＳｉｒ３ｐのタンパク質レベルの増加に起因するものではないことが示されている。ここで得た知見は、特異的なクロマチン部位におけるアセチル化の減少が、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいてヒストン結合タンパク質（Ｓｉｒ３ｐ）の局在化の増加に伴って生じることを示した初めての結果である。
４．　ｓａｓ２変異体のゲノムワイド発現分析
ｓａｓ２変異体におけるヒストンＨ４−Ｋ１６の全般的な低アセチル化と、それに伴うＳｉｒ３ｐの広がりの機能的な意味合いを調べるため、ｓａｓ２変異体および対応する野生株における全ゲノムの遺伝子発現レベルを、ＤＮＡマイクロアレイ分析を用いて調べた。
４．１　　方法
ｓａｓ２遺伝子破壊株および対応する野生型株（Ｗ３０３−１ａ）に対する包括的遺伝子発現プロファイリングの手順は、基本的には文献（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１５，　１３５９，　１９９７）の記載に従った。概略として、ｐｏｌｙ（Ａ）＋　ＲＮＡをそれぞれの株から調製し、これらを鋳型としてｃＲＮＡを合成した。得られたｃＲＮＡをＧｅｎｅＣｈｉｐ　ＹＧ　Ｓ９８アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，　Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）にハイブリダイゼーションし、ＧｅｎｅＣｈｉｐソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いてデータを取得し、各遺伝子の転写レベルを決定した。各アレイのデータはチップ上のコントロールの値を用いて補正した。この段階で２つの独立した実験で同一サンプルでも２倍以上の発現変動がある遺伝子を排除した。残りの５１０４プローブセットに対して、各変異体で野生株に比較して２倍以上の発現量の変動がある遺伝子を数え上げた。各遺伝子の染色体上の位置については、遺伝子の開始コドンと近いほうの染色体末端との距離を出芽酵母ゲノムデータベース（Ｓｔａｎｆｏｒｄ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）の情報を元に計算した。
４．２　　結果
ｓａｓ２変異体において最低２倍の変化を持つ遺伝子比率を、テロメア末端からの遺伝子距離に照らし合わせて評価した（図８、表１；χ２検定［Ｎａｔｕｒｅ　４０２，　４１８，　１９９９］）。ｓａｓ２破壊株においてはテロメア末端から２０ｋｂ以内の遺伝子が有意な割合で抑制されていた（図８上段の太線、表１）。対照的に、ｓａｓ２変異体において活性化されていた遺伝子の比率（図８下段の太線、表１）は、各領域にわたり劇的な変化を示さなかった。テロメア遠位領域（５−２０ｋｂ）におけるこの顕著かつ特異的な抑制から、この領域依存的な抑制は、染色体に沿ってテロメア近傍領域からテロメア遠位領域に到る、転写における不活化状態の広がりを反映していると考えられる。
【００６４】
このような染色体に沿った転写における不活化状態の広がりはＳＩＲ３の過剰発現により誘導される可能性があり（Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　７，　１１３３，　１９９３）、これと同時にＳｉｒ３ｐの物理的な広がりが生じる（Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６）。ここでの観察によれば、ｓａｓ２変異体ではテロメア遠位領域におけるＳｉｒ３ｐの局在化に増加が生じていたため（図５−８、表１）、この領域依存的な抑制には染色体に広がったＳｉｒ３ｐの影響が含まれていると考えられる。この考えはｓａｓ２ｓｉｒ３の二重破壊株を使った実験によって明確に示された。すなわち、ｓａｓ２破壊株で見られたテロメア末端から２０ｋｂ以内の遺伝子抑制が、さらにｓｉｒ３を破壊することによって全く失われた。このことは、ｓａｓ２破壊株で見られた遺伝子抑制はＳｉｒ３ｐの存在に完全に依存していることを示している。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
５．　染色体に沿ったアセチル化勾配の機能的役割
以上の１−４の結果から、ヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化が染色体の活性および不活性領域をに果たす役割について、以下のとおりに考察することができる。
【００６７】
まず、Ｓａｓ２ｐはｉｎ　ｖｉｖｏにおけるヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化に対する正の制御因子であり（図１−５）、染色体に沿ったアセチル化の勾配は、Ｓａｓ２によるテロメアから２０ｋｂ以内のアセチル化の促進と、Ｓｉｒ２によるテロメア近傍領域の脱アセチル化により確立される（図３−５、図９）。そして、ＳＡＳ２変異により生じるヒストンＨ４−Ｋ１６の低アセチル化が、Ｓｉｒ３ｐのテロメア遠位領域への広がりと（図５−８、表１）、テロメア遠位領域における遺伝子発現ピークの抑制（図８、表２）と共に生じている。
【００６８】
酵母におけるテロメアのヘテロクロマチンは、転写的には不活性であり、ＳＩＲ遺伝子産物のテロメア近傍領域への局在化により定義される（Ｃｅｌｌ　８０，　５８３，　１９９５；　Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６）。ＳＩＲ３遺伝子量の増加により、染色体に沿ったＳｉｒ３ｐの物理的な広がり（Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６）と、転写的不活化状態の広がり（Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　７，　１１３３，　１９９３）の両方が共に生じることが示されている。ここでの観察結果によれば、ｓａｓ２変異細胞におけるＳｉｒ３ｐの広がりはＳＩＲ３遺伝子産物レベルが増大しない状態で生じていたため、野生型細胞においてはＳｉｒ３ｐの広がりの程度がヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化状態により調節されていることが示唆される。また、ｓａｓ２変異体ではテロメア遠位領域において遺伝子抑制のピークが観察された。このことからＳａｓ２ｐの機能によって境界が作られ、転写的に不活化された染色体のテロメア遠位領域への広がりが妨げられていることが示される（図１０）。Ｓａｓ２ｐの機能によりヘテロクロマチンの広がりが妨げられるという考え方によれば、人工的に挿入されたＧａｌ４／Ｓａｓ２ｐにより接合型遺伝子座のサイレンサーＤＮＡエレメントの影響をブロックすることができるという結果を説明することができるが、この遺伝子座はＳｉｒ−およびヒストンＨ４−Ｋ１６依存性の不活化の影響を受けるもう一つの領域である（ＥＭＢＯ　Ｊ．　２０，　５２０，　２００１）。ｓａｓ２欠損体のテロメア遠位領域においてみられるＳｉｒ３ｐの局在化の増大と、ヒストンＨ４−Ｋ１６の低アセチル化との関連から、この領域においてＳａｓ２ｐがヒストンＨ４−Ｋ１６をアセチル化することによりＳｉｒ３ｐの局在化を妨げていることが強く示唆される。このようなＳａｓ２の境界機能が無ければ、染色体において転写的活性化領域と比活性領域との間にさらに長い間隔が必要になると考えられる。
【００６９】
ここで提唱するのは、ＭＹＳＴタイプのヒストンアセチル化酵素ファミリーの一員であるＳａｓ２ｐが、やはり進化的に保存されているヒストン脱アセチル化酵素ファミリの一員であるＳｉｒ２ｐと共同で機能することにより、酵母においてヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化−脱アセチル化を介して広範な染色体領域に印をつけるという考えである。ヒストンＨ４−Ｋ１６は真核生物において完全に保存されている残基である。ヒストンＨ４−Ｋ１６の高アセチル化は活性化染色体の普遍的な印であると考えられるが、その理由としては、ショウジョウバエのオスＸ染色体はメスＸ染色体と比べて非常に活性化されており、これは染色体全般にわたりヒストンＨ４−Ｋ１６において高アセチル化されていることと相関しているという事実が挙げられる（Ｃｅｌｌ　６９，３７５，　１９９２）。このアセチル化は、ＭＹＳＴファミリーの一員であるｍｏｆによっても調節されている（ＥＭＢＯ　Ｊ．　１６，　２０５４，　１９９７）。このため、ＭＹＳＴおよびＳｉｒ２のタンパク質ファミリーは、Ｈ４−Ｋ１６部位を含むヒストンのアセチル化−脱アセチル化により、真核細胞全体にわたって転写を調節している可能性がある。
【００７０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、新規のヒストンアセチル化酵素およびヒストン脱アセチル化酵素が提供される。またそのアセチル化−脱アセチル化の機能を利用することにより、真核生物の染色体構造のダイナミズムを制御する因子、個体・細胞老化を制御する因子、染色体融合やｐ５３の活性制御を介した癌化の制御因子等の因子を探索することが可能となる。
【００７１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＹＳＴ変異体の間のアセチル化レベルの比較を調べたウェスタンブロット分析の結果である。野生型（ＬＰＹ３４９８；第１、第４レーン）、ｓａｓ２−欠損型（ＬＰＹ３４９８Δｓａｓ２；第２レーン）、ｓａｓ３−欠損型（ＬＰＹ３４９８Δｓａｓ３；第３レーン）、およびｅｓａ１温度感受性変異体（ＬＰＹ３２９１；第５レーン、ＬＰＹ３５００；第６レーン）の菌株で、２７℃（第１−３レーン）または４時間にわたり３７℃にシフトした条件（第４−６レーン）で生育したものに由来する全細胞抽出物を、ＳＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に転写し、図中左に示すアセチル化ヒストンアイソフォームに対して誘導された抗血清を用いてプローブ処理を行った。
【図２】ＳＡＳ２の点変異がｉｎ　ｖｉｖｏアセチル化に及ぼす影響を調べたウェスタンブロット分析の結果である。野生型（ＵＣＣ１８［Ｃｅｌｌ　６６，　１２７９，　１９９１］；第１、２レーン）およびｓａｓ２−欠損型（ＵＣＣ１８Δｓａｓ２；第３−７レーン）の菌株で、酵母の単一コピープラスミド（ｐＲＳ３１５；第１、３レーン）、野生型ＳＡＳ２遺伝子（第２、４レーン）、あるいは変異型ｓａｓ２遺伝子（Ｅ２４２Ｇ；第５レーン；Ｃ１０３Ｄ／Ｃ１０６Ｔ、第６レーン；Ｑ２１６Ｅ／Ｇ２１９Ｅ、第７レーン）を持つｐＲＳ３１５導入細胞の抽出物を、図１と同様にウェスタンブロット分析に供した。プラスミド内のＳＡＳ２遺伝子フラグメントには、ＳＡＳ２のオープンリーディングフレーム全体に加え、イニシエーターであるメチオニンの１４３３ｂｐ上流、およびストップコドンの５７７ｂｐ下流を含めた。
【図３】ＶＩ染色体の右腕に沿った、リジン−１６がアセチル化されたヒストンＨ４の局在化を調べた結果である。リジン−１６がアセチル化されたヒストンＨ４のアイソフォームは、野生型（Ｗ３０３−１ａ；第５、６レーン）、ｓａｓ２−欠損型（第７、８レーン）、およびｓｉｒ２−欠損型（第９、１０レーン）の菌株より調製した、ホルムアルデヒドにより架橋された全細胞抽出物より沈殿させた。免疫沈降させたＤＮＡの分析は、ＶＩ染色体の右腕の様々な領域に対して誘導したプライマ対を用いたＰＣＲにより行った（Ｎａｔｕｒｅ　３８３，　９２，　１９９６；　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１１，　８３，　１９９７）。２種類の独立した実験の結果を示す。野生型に由来する入力物質の連続希釈を第１−３レーンに示す。第４レーンはＰＣＲにおいてＤＮＡを入れない場合である。
【図４】定量ＰＣＲ解析によりＶＩ染色体（右腕）に由来する抗ヒストンＨ４−ＡｃＫ１６抗体により免疫沈降した領域の相対量を示したグラフである。野生型（菱形）、ｓａｓ２−欠損型（四角形）、ｓｉｒ２−欠損型（三角形）。矢印はｓａｓ２およびｓｉｒ２に依存したヒストンアセチル化の勾配が見られる領域である。
【図５】Ｓｉｒ３ｐのＶＩ染色体右腕に沿った局在を調べた結果である。野生型（Ｗ３０３−１ａ；第５、６レーン）、ｓａｓ２−欠損型（第７、８レーン）、またはｓｉｒ２−欠損型（第９、１０レーン）の菌株より調製した、ホルムアルデヒドにより架橋した全細胞抽出物から、Ｍｙｃタグ化されたＳｉｒ３ｐを沈殿させた。結果は図３と同様に示す。野生型に由来する入力物質の連続希釈を第１−４レーンに示す。
【図６】定量ＰＣＲ解析によりＶＩ染色体（右腕）に由来する抗Ｍｙｃ−Ｓｉｒ３ｐ抗体により免疫沈降した領域の相対的量を示したグラフである。野生型（菱形）、ｓａｓ２−欠損型（四角形）、ｓｉｒ２−欠損型（三角形）。
【図７】Ｓｉｒ３ｐのタンパク質発現レベルを調べた結果である。野生型（Ｗ３０３−１ａ；第１、２レーン）、ｓａｓ２−欠損型（第３、４レーン）、およびｓｉｒ２−欠損型（第５、６レーン）の菌株に由来する全細胞抽出物を図中左に示した抗体で検出した。
【図８】野生型と比較して、ｓａｓ２単独（太線）、ｓｉｒ３単独（細線）およびｓａｓ２ｓｉｒ３二重（点線）変異体においてその遺伝子の転写が２倍以上抑制（上段）または活性化（下段）されている遺伝子の比率を、染色体末端から近い順番に１００遺伝子をプールし、変動遺伝子の割合を１００遺伝子の平均距離に対してプロットした。
【図９】Ｓｉｒ３ｐとヒストンＨ４の相互作用の調節を示す模式図である。この相互作用は、染色体領域に依存した、Ｓａｓ２ｐおよびＳｉｒ２ｐによるヒストンＨ４−Ｋ１６の可逆性アセチル化によるものである。
【図１０】染色体の勾配が境界の役割を持ち、不活化タンパク質の広がりを妨げる機能のモデルである。野生型（上段の図）では、テロメア末端からテロメア近傍領域に到って、ヒストンＨ４−Ｋ１６のアセチル化が劇的に増大することにより、急勾配の「坂」のように働き、Ｓｉｒ３ｐ（図中の球体）が染色体全体に拡散するためにはこれを乗り越えなければならない。Ｓａｓ２が存在しない場合には（中段の図）、テロメア近傍領域のアセチル化レベルが減少し、Ｓｉｒ３ｐの拡散が可能になる。Ｓｉｒ２が存在しない場合には（下段の図）、テロメア末端の脱アセチル化が生じないため、Ｓｉｒ３ｐはこの領域に保持されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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