(57)【要約】      （修正有）【課題】組織の癌化の新規な検出方法、及びその方法に使用することができる新規な核酸を提供する。【解決手段】ヒト由来の特定のＥＳＴより検索される塩基配列の一部又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含み、４０乃至１０００ｂｐであることを特徴とする核酸、又は前記核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする核酸の組織における発現量の変化と前記組織の癌化とを関連づけて、生体から採取した組織の癌化を検出する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載の塩基番号４１乃至２３０８からなる塩基配列の一部又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含み、４０乃至１０００ｂｐであることを特徴とする核酸。
【請求項２】
請求項１記載の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると共に、４０乃至１０００ｂｐからなることを特徴とする核酸。
【請求項３】
ＤＮＡであることを特徴とする請求項１又は２項記載の核酸。
【請求項４】
請求項１乃至３何れか一項記載の核酸からなるプローブ。
【請求項５】
配列番号１記載の塩基配列を含むＤＮＡの、「病変組織における発現量と健常組織での発現量との差異」と、「前記病変組織の癌化」とを関連づけることを特徴とする組織の癌化の検出方法。
【請求項６】
前記病変組織が大腸由来の組織であることを特徴とする請求項５記載の癌化の検出方法。
【請求項７】
組織の癌化の検出のための請求項１乃至３何れか一項記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な「核酸」及び病変組織における該核酸の発現量の変化と当該病変組織の癌化とを関連づけることによる「組織の癌化の検出方法」、及び前記核酸の「組織の癌化の検出のための使用」に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【特許文献】特開平１１−１５７１９０号公報
従来、組織の癌化を検出する方法としては、様々な方法が知られており、例えばＸ線検査、内視鏡検査、腫瘍マーカー検査等があげられる。Ｘ線検査や内視鏡検査などでは組織を外観からしか観察できないため、確定的な診断はできず、また腫瘍マーカーも偽陽性、偽陰性が現れる点で確定的な診断には不十分であった。
【０００３】
組織の癌化の確定診断は実際に組織を生検により採取し、その組織の培養を行って確認する方法によって行われているが、この方法は組織の培養にそれなりの時間が必要とされる。
【０００４】
一方、内視鏡下で外科的手法により、生体組織の病変部を切除する手術は一般になされている。例えばそのような病変部について簡単に癌化の有無を確認する手法が存在すれば、癌化の早期発見にも繋げることができ、その後の患者の治療に役立てることができる。
【０００５】
また、特許文献にはＮ−アセチルグルコサミン転移酵素をコードするＤＮＡを検出し、その「発現の変化」と「胃癌又は膵癌」とを関連づけることで、胃癌や膵癌の検出ができることが開示されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
採取した組織からなるべく早く、信頼性の高い「組織の癌化を検出する方法」の開発が強く望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、新規な核酸を見い出し、「癌化した組織における、前記核酸の発現量」が「健常組織における発現量」よりも低下していることを発見し、これを組織の癌化検出方法に応用することで本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１）  配列番号１記載の塩基番号４１乃至２３０８からなる塩基配列の一部又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含み、４０乃至１０００ｂｐであることを特徴とする核酸。
（２）  （１）記載の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると共に、４０乃至１０００ｂｐからなることを特徴とする核酸。
（３）  ＤＮＡであることを特徴とする（１）又は（２）何れか記載の核酸。
（４）  （１）乃至（３）何れか記載の核酸からなるプローブ。
（５）  配列番号１記載の塩基配列を含むＤＮＡの、「病変組織における発現量と健常組織での発現量との差異」と、「前記病変組織の癌化」とを関連づけることを特徴とする組織の癌化の検出方法。
（６）  前記組織が大腸由来の組織であることを特徴とする（５）記載の癌化の検出方法。
（７）  組織の癌化の検出のための（１）乃至（３）何れか記載の核酸の使用。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
（１）本発明核酸
「本発明核酸」は配列番号１記載の塩基番号４１乃至２３０８からなる塩基配列の一部又は該塩基配列に相補的な塩基配列を含み、４０乃至１０００ｂｐであることを特徴とする核酸。
【００１０】
「本発明核酸」における、「配列番号１記載の塩基番号４１乃至２３０８からなる塩基配列からなる核酸の塩基配列の一部」とは、４０乃至１０００ｂｐ、好ましくは５０乃至５００ｂｐ、より好ましくは６０乃至４００ｂｐ、最も好ましくは７０乃至３００ｂｐの長さからなることが好ましく、例えば配列番号１記載の塩基番号９２０乃至１０１８からなる塩基配列からなる核酸などが例示される。このような核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸は、後述の「本発明検出方法」へ使用することができ、特にこのような長さの核酸は、殊にハイブリダイズ能と取り扱いやすさの双方を兼ね備えているため、プローブとして優れている。上記で例示される核酸以外の核酸であっても、上記例示した長さの範囲内で、配列番号１記載の塩基番号４１乃至２３０８の範囲内から適宜選択することができる。
【００１１】
なお、本明細書で核酸の長さを表す単位「ｂｐ」とは、核酸が二本鎖となっている場合にその二本鎖を形成する塩基対の数、一本鎖となっている場合には、その核酸に相補的な塩基配列からなる一本鎖がハイブリダイズした二本鎖の塩基対数に相当する数に換算した核酸の長さである。従って例えば「１０００ｂｐ」の一本鎖のＤＮＡは１０００個のヌクレオチドで形成されていることになり、「１０００ｂｐ」の二本鎖のＤＮＡは２０００個のヌクレオチド（１０００対のヌクレオチド）で形成されていることになるが、双方とも同じ「１０００個のヌクレオチドからなる鎖長」のＤＮＡを表すことになる。
【００１２】
また、配列番号１記載の塩基配列からなる核酸又は当該塩基配列のうち塩基番号４１乃至２３０８を含む塩基配列からなる核酸は、タンパク質合成における終止コドンに相当する塩基配列を含むため、「配列番号２記載のアミノ酸番号１乃至７５５からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」を遺伝子工学的に調製するために使用することができ、有用である。
【００１３】
「本発明核酸」は、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても良いが、後述の「癌化検出方法」にプローブ等として使用する場合や、ベクターや組換体の調製時に安定である点で優れるため、ＤＮＡであることが好ましい。
【００１４】
また、上記「配列番号１記載の塩基番号４１乃至２３０８からなる塩基配列からなる核酸の塩基配列の一部を有する核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸」に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（特にＤＮＡ）も、例えば配列番号１記載の塩基配列を有する核酸の生体内での発現状況などを検査するためのプローブとして使用することができ、医学研究用の試薬又は診断薬として極めて有用である。
【００１５】
なお、ここで「ストリンジェントな条件下」とは、一般に「核酸のハイブリダイズを使用する実験手法（例えばノザンブロットハイブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイゼーション）」等で用いられる条件が挙げられ、好ましくは３７．５％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、５×デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、０．５％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下での４２℃の条件が例示される。
【００１６】
「本発明核酸」は例えば以下の方法により調製することが可能である。
公知のコンドロイチン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素（Ｃ６ＳＴ）の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ  ００４２７３）をクエリーとしてＢＬＡＳＴにより塩基配列を検索を行ない、配列番号１の全配列を含むクローン（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＫ０２１５３９）を得ることができる。この相補配列を基にポリメラーゼチェイン反応（以下「ＰＣＲ法」とも記載する）などを用いてｃＤＮＡライブラリーなどから本発明核酸（例えば本発明ＤＮＡ）をＰＣＲ法等の公知の方法により増幅して調製することができる。
【００１７】
「本発明核酸」は、例えば配列番号３記載の配列を５’プライマー、配列番号４記載の配列を３’プライマーとして使用し、例えばヒトゲノムｃＤＮＡライブラリーを鋳型として常法に従ってＰＣＲ法を行うことで調製することができる。配列番号１記載の塩基配列のうちポリペプチドをコードしていると考えられる領域（塩基番号４１乃至２３０８）は、５’プライマーとして配列番号５の塩基配列からなるプライマー及び３’プライマーとして配列番号６の塩基配列からなるプライマーを使用してＰＣＲ法で調製することができ、配列番号１記載の全塩基配列からなる核酸の調製は、例えば配列番号７の配列を５’プライマー、配列番号８記載の配列を３’プライマーとして使用して、上記ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法により調製することができる。
【００１８】
この場合、配列番号３及び配列番号４のプライマーを使用したＰＣＲ法においては産物として約１００ｂｐのＤＮＡ断片が得られ、配列番号５及び配列番号６のプライマーを使用したＰＣＲ法においては産物として約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られ、配列番号７及び配列番号８のプライマーを使用したＰＣＲ法において産物として約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られる。これらを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりＤＮＡ断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離して「本発明核酸」を得ることができる。
【００１９】
このようにして単離した「本発明核酸」から、それがコードする「ポリペプチド」を発現する組換体を調製するために使用することができる。すなわち、「本発明核酸」の両端に制限末端（粘着末端又は平滑末端）を常法より連結し、発現ベクターに挿入することができる。当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、「本発明核酸がコードするタンパク質を発現させたい宿主細胞」に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このような発現ベクターには、上記「本発明核酸」を目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域（プロモータ領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに「本発明核酸」が適切に発現するように構築されていることが好ましい。
【００２０】
上記「本発明核酸を含む発現ベクター」を宿主細胞に組み込み、組換体を得ることができる。上記「宿主細胞」として真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。宿主細胞として真核細胞を使用する場合には「本発明核酸を含む発現ベクター」の元となるベクター（以下「基本ベクター」とも記載する）として「真核細胞用の発現ベクター」を選択し、宿主細胞として原核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「原核細胞用の発現ベクター」を選択する。
【００２１】
ところで「本発明核酸」はヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、本発明においては真核細胞を組換体の宿主細胞として用いるとより天然物に近い性質を有した「本発明酵素」が得られる（例えば糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、「宿主細胞」としては真核細胞、特にほ乳類細胞を選択することが好ましく、「本発明核酸を含む発現ベクター」の基本ベクターは真核細胞、特にほ乳類細胞用のベクターを選択することが好ましい。
【００２２】
近年、遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させてその培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。「本発明核酸を含む発現ベクター」はその「本発明核酸」がコードする「ポリペプチド」の単離・精製が容易となるように構築されていることが好ましい。特に上記「ポリペプチド」を「標識ペプチド」との「融合タンパク質」の形態で発現するように構築した「本発明核酸を含む発現ベクター」を構築して遺伝子工学的に「ポリペプチド」を調製すると、単離・精製が容易となるため好ましい。
【００２３】
上記「標識ペプチド」の例としては、「本発明核酸がコードするポリペプチド」を遺伝子組み換えによって調製する際に、該「ポリペプチド」を「標識ペプチド」と結合した「融合タンパク質」として発現させることにより、形質転換体の生育物から「本発明核酸がコードするポリペプチド」の分泌・分離・精製又は検出を容易にすることを可能とする機能を有したペプチドが例示される。このような「標識ペプチド」としては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のＮ末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内で機能している１５〜３０アミノ酸残基からなるペプチド：例えばＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、Ｄｓｂ等）、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約４２，０００のタンパク質）、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ（ヒスチジン残基を６乃至１０個並べて配した配列）、ｍｙｃタグ（ｃＭｙｃタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、ＦＬＡＧペプチド（８アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、Ｔ７タグ（ｇｅｎｅ１０タンパク質の最初の１１アミノ酸残基からなる）、Ｓタグ（膵臓ＲＮａｓｅＡ由来の１５アミノ酸残基からなる）、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ（大腸菌外膜タンパク質ｐｅｌＢの２２アミノ酸配列）、ＨＡタグ（ヘマグルチニン由来の１０アミノ酸残基からなる）、Ｔｒｘタグ（チオレドキシン配列）、ＣＢＰタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＣＢＤタグ（セルロース結合ドメイン）、ＣＢＲタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β−ｌａｃ／ｂｌｕ（βラクタマーゼ）、β−ｇａｌ（βガラクトシダーゼ）、ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）、ＨＰ−Ｔｈｉｏ（Ｈｉｓ−ｐａｔｃｈチオレドキシン）、ＨＳＰ（熱ショックペプチド）、Ｌｎγ（ラミニンγペプチド）、Ｆｎ（フィブロネクチン部分ペプチド）、ＧＦＰ（緑色蛍光ペプチド）、ＹＦＰ（黄色蛍光ペプチド）、ＣＦＰ（シアン蛍光ペプチド）、ＢＦＰ（青色蛍光ペプチド）、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２（赤色蛍光ペプチド）、ＭＢＰ（マルトース結合ペプチド）、ＬａｃＺ（ラクトースオペレーター）、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）、アビジン、プロテインＧ等のペプチドが挙げられ、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧペプチド、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ又はＨＡタグが、遺伝子工学的手法による本発明酵素の発現、精製がより容易となることから好ましく、特にＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として「本発明核酸がコードするポリペプチド」を得るのが、取扱面が極めて優れるため好ましい。
【００２４】
ほ乳類細胞で発現可能であって、かつ上述のＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として「本発明核酸がコードするポリペプチド」を得ることができる基本ベクターとしては例えばｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１（シグマ社）、ｐＦＢＩＦ（ｐＦａｓｔＢａｃ（インビトロジェン社）にＦＬＡＧペプチドをコードする領域を組み込んだベクター）等が例示されるが、当業者であれば「本発明核酸がコードするポリペプチド」の発現に使用する宿主細胞、制限酵素、識別ペプチドなどから判断して適当な基本ベクターを選択することが可能である。
【００２５】
なお、本発明によって「本発明核酸の塩基配列」が開示されたため、当業者であれば目的とする「本発明核酸」や調製したい「本発明核酸の一部の領域」の両端の塩基配列を基に適宜プライマーを作成し、それを用いてＰＣＲ法などによって目的の領域を増幅して調製することが容易である。
【００２６】
（２）本発明検出方法
「本発明検出方法」は、配列番号１記載の塩基配列を含むＤＮＡの、「病変組織における発現量と健常組織における発現量の差異」と「前記病変組織の癌化」とを関連づけることを特徴とする組織の癌化の検出方法である。
【００２７】
「本発明検出方法」における検出は「配列番号１記載の塩基番号９２０乃至１０１８を含むＤＮＡの発現量の変化」を測定することによって行なう。
【００２８】
これらのＤＮＡの発現量は、例えば上記で例示したＤＮＡの５’末端と３’末端の塩基配列を基に作成したプライマーと、蛍光色素と消光物質を結合させたプローブとを用いた定量的リアルタイムＰＣＲ法（以下「定量的ＲＴ−ＰＣＲ法」とも記載する）等を用いることで定量することが可能である。
【００２９】
「本発明検出方法」で用いる組織としては、何れの組織であっても使用することが可能であるが、食道、胃、肺、膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、小腸、大腸、直腸、結腸などが挙げられ、好ましくは大腸、直腸、及び結腸が例示され、最も好ましくは大腸が例示される。
【００３０】
「本発明検出方法」は、「組織から分離した組織片」を使用して行うことが好ましい。すなわち生検などによって得られた組織に含まれる病変部分における上記ＤＮＡの発現量と、病変部分の周辺の健常部分における上記ＤＮＡの発現量とを対比することで、発現量を検出することができ、癌の診断、癌治療における経過観察等に有用である。
【００３１】
また、「本発明検出方法」における「ＤＮＡの発現量の定量」は、「ＤＮＡ」又は「ＤＮＡから転写されて生ずるｍＲＮＡ」を増幅してその量を測定するＰＣＲ法などの方法などがあるが、必ずしも「ＤＮＡ」又は「ＤＮＡから転写されて生ずるｍＲＮＡ」を定量して行なうことに限定はされず、例えば上記ＤＮＡが転写・翻訳されて生ずる「本発明核酸がコードするポリペプチド」を定量して行なうことも可能である。このような「ポリペプチドの定量」は、例えば精製した「本発明核酸がコードするポリペプチド」を使用して常法によって調製した抗体などを用いて常法（ウエスタンブロッティング、エンザイムイムノアッセイ等）に従って行なうことができる。この中でも特にＰＣＲ法が好ましく、ＲＴ−ＰＣＲ法が最も好ましい。
【００３２】
組織の癌化は、好ましくは健常組織と比して病変組織における上記ＤＮＡの発現量が低下している場合に当該病変組織が癌化していると判定することが好ましく、特にＲＴ−ＰＣＲ法によって癌化を検出する場合には、健常組織と比して病変組織が上記ＤＮＡの発現量で半分以下、好ましくは１／３以下となっている場合に癌化していると判定することができる。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
（実施例１）本発明核酸の調製方法
ヒトコンドロイチン６−Ｏ−硫酸基転移酵素（Ｃ６ＳＴ）の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ  ００４２７３）をクエリーとして、ＢＬＡＳＴ検索を行った。その結果、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ  （ＥＳＴ：ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＫ  ０２１５３９）の相補配列がＣ６ＳＴとホモロジーを有することが判明し、その塩基配列は配列番号１の通りであった。この塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号２）はＮ末端に膜貫通領域を有することが予測された。
【００３４】
（実施例２）大腸癌組織における本発明ＤＮＡ発現量の変化
定量的リアルタイムＰＣＲ法を用いてヒト大腸癌組織と同一患者の健常大腸組織での本発明ＤＮＡの発現量を比較した。ヒト大腸癌組織及び健常大腸組織のＲＮＡを、ＲＮｅａｓｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）で抽出し、Ｓｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロゲン社製）を用いたｏｌｉｇｏ（ｄＴ）法によりｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡとした。このＤＮＡを鋳型として用いてプライマー（５’プライマー：配列番号３、３’プライマー：配列番号４）及びＴａｑＭａｎプローブ（配列番号９）を用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（アプライドバイオシステムス社製）により定量的リアルタイムＰＣＲ法を行なった。ＰＣＲ反応の条件は、５０℃で２分、９５℃で１０分で反応を行った後、９５℃で１５秒、６０℃１分のサイクルを５０回繰り返して行なった（表１）。
【００３５】
【表１】
2004147505.tif 000002
【００３６】
その結果、癌化した組織における本発明ＤＮＡの発現量は平均で７分の１以下に減少していることが明かとなった。この結果から、健常組織における本発明ＤＮＡの発現量と比して、発現量が減少している大腸の病態組織は、癌化しているおそれが高いことが示唆され、本発明ＤＮＡの発現量は癌化の検出に役立つことが示唆された。
【配列表】
2004147505.tif 000003
2004147505.tif 000004
2004147505.tif 000005
2004147505.tif 000006
2004147505.tif 000007
2004147505.tif 000008
2004147505.tif 000009
2004147505.tif 000010
2004147505.tif 000011
2004147505.tif 000012
2004147505.tif 000013
2004147505.tif 000014
2004147505.tif 000015
2004147505.tif 000016
2004147505.tif 000017
2004147505.tif 000018
【００３７】
【発明の効果】本発明により新規核酸、及び組織の癌化の新規な検出方法が提供される。