(57)【要約】【課題】ウイルス二本鎖ＲＮＡによって誘発されるタイプＩインターフェロンの産生を阻害することで、特定のウイルスに対する免疫応答を抑制することができる抗体および阻害剤、並びに、ウイルスベクターの感染効率を高めることなく形質転換効率を向上させることができる形質変換方法および形質変換キットを提供する。【解決手段】抗体は、ヒトトール様受容体３に対する抗体である。また、阻害剤は、二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞に対し、タイプＩインターフェロンの産生を阻害する、トール様受容体と結合する抗体、特にヒトトール様受容体３に対するモノクローナル抗体を含む。また、阻害剤を用いてタイプＩインターフェロンの産生を阻害した状態で、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターを上記細胞に感染させることで形質転換を行う。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞に対し、二本鎖ＲＮＡに対する免疫応答を抑制するための阻害剤であって、
上記トール様受容体と結合してタイプＩインターフェロンの産生を阻害する抗体を含むことを特徴とする阻害剤。
【請求項２】
上記抗体は、ヒトトール様受容体３に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする阻害剤。
【請求項３】
二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞に対し、請求項１または２に記載の阻害剤を用いてタイプＩインターフェロンの産生を阻害した状態で、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターを上記細胞に感染させることを特徴とする形質転換方法。
【請求項４】
二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞に対して形質転換を行うための形質転換キットであって、
請求項１または２に記載の阻害剤と、
目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターとを含むことを特徴とする形質転換キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
二本鎖ＲＮＡ（リボ核酸）を認識するトール様受容体（Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をその表面上で発現しタイプＩインターフェロン（インターフェロンαおよびインターフェロンβ）を産生する細胞に対し、二本鎖ＲＮＡによって誘発されるシグナル伝達を遮断して二本鎖ＲＮＡに対する免疫応答を抑制するための阻害剤、並びに、それを用いて、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターによる形質転換を行う形質転換方法並びに形質転換キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルスは生命誕生のかなり初期から存在し、生物の進化に寄与するとともに自身も発展進化してきた生命体といわれている。ウイルスにはＲＮＡを遺伝子として持つウイルス（ＲＮＡウイルス）が数多く存在し、植物ウイルスの９０％はＲＮＡウイルスである．
近年、哺乳動物の細胞に操作を加えた遺伝子を導入する方法（動物細胞の形質転換法）が集中的に研究されている。遺伝子導入法としては、形質転換効率が比較的高いことから、レトロウイルスに代表されるウイルスをベクター（ウイルスベクター）として用いて、動物細胞を形質変換する方法（ウイルス法）が広く行われている。ウイルス法では、ウイルスの遺伝子の一部を、導入しようとする遺伝子や宿主細胞内で機能するプロモータ等で組み換えたウイルスベクター（組み換えウイルス）を作製し、このウイルスベクターを宿主細胞に感染させて、遺伝子を宿主細胞に導入する。これにより、宿主細胞は、外から与えられた遺伝子（外来遺伝子）を取り込んで発現する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、ウイルス法では、十分な形質転換効率を得るためには、より感染効率の高いウイルスベクターを用いなければならない。この感染効率は、ウイルスの細胞内侵入効率、ウイルスの該当細胞での複製効率（細胞によっては使えないものもある；トロピズムとも呼ばれる）、ウイルス遺伝子の宿主細胞での発現効率（遺伝子への組込み性、コピー数など）など多数のウイルス−宿主要因によって決まる。この感染効率の向上のためには、細胞種を選ぶ、ベクターを改良する、Ｔ抗原などの副因子を加えるなどの工夫がされてきた。しかし、この点は解決されておらず、ウイルスベクターの汎用性を妨げる最大の要因となっている。より感染力の高いウイルスベクターを用いると、遺伝子組み換え体が実験室外に漏れて環境に危害を及ぼす危険性が高まる。
【０００４】
そのため、ウイルスベクター自体の感染力を高めることなく、宿主細胞を随時処理して形質転換効率を向上させる手法が望まれている。植物、昆虫、無脊椎、及び脊椎動物の細胞には、広く生体防御機構としてＲＮＡウイルスの感染を抑制する免疫機能が備わっている。そのため、免疫機能を人為的に低下させることができれば、ウイルス法における形質転換効率をさらに向上させることができると考えられる。
【０００５】
ところで、近年、植物、昆虫、無脊椎、及び脊椎動物に備わる先天性免疫（ｉｎｎａｔｅ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ；基本免疫系）系が、ウイルスの侵入をどう察知し防御するかを解明することが研究課題となっている。脊椎動物以降に現れた獲得免疫系は、抗体産生や、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）というリンパ球によりウイルス感染細胞を攻撃するしくみを発達させたが、うまく機能するためにはいずれも抗原提示細胞などの先天性免疫系の細胞の助けを必要とする。様々な生物でのゲノムプロジェクトが完成するにつれ、細菌やウイルス感染防御に重要な先天性免疫系の分子群が明らかになりつつある。先天性免疫系によるウイルス感染防御の分子機構はヒトでは長い間不明であったが、最近になってようやく分子論的解明が始まりつつある。
【０００６】
ウイルスや細菌に対する初期の免疫応答は、従来、非特異的なものであると考えられてきた。しかし、微生物受容体と呼ばれる一群の受容体が同定されたことにより、マクロファージや樹状細胞などの先天性免疫担当細胞は、受容体を介して外来異物を識別し、サイトカインの放出や副刺激分子の発現を誘導してリンパ球を活性化することが明らかとなった。
【０００７】
微生物受容体として種々の微生物構成成分を認識し宿主へ危険シグナルを伝えるトール様受容体もそのような受容体の１つであり、植物から昆虫、哺乳類まで種を超えて広く存在する。トール様受容体は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ）において発生と免疫の両者に関与する膜タンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ　Ｔｏｌｌ）のホモローグ（相同体）である。トール様受容体は、ヒトでは１１種類、マウスでは１２種類見つかっており、これらは、トール様受容体ファミリーと呼ばれる一群の受容体ファミリーを形成している。トール様受容体は、微生物受容体として近年注目を集めており、種々の微生物構成成分の認識にかかわることが明らかにされてきている。
【０００８】
そして、最近、トール様受容体の１種であるトール様受容体３（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　３；ＴＬＲ３）が、ウイルスの二本鎖ＲＮＡを認識して核因子κＢ（以下、「ＮＦ−κＢ」と略記する）を活性化することが明らかになった（Ｌ．Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，　Ａ．Ｃ．Ｈｏｌｔ，　Ｒ．Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，　Ｒ．Ａ．Ｆｌａｖｅｌｌ，　Ｎａｔｕｒｅ　４１３　（２００１）　７３２−７３８）。すなわち、トール様受容体３が、二本鎖ＲＮＡのシグナル受容体であることが見い出された。
【０００９】
一方、動物細胞の免疫応答では、サイトカインの１種であるタイプＩインターフェロン（インターフェロンαおよびインターフェロンβ）が、ウイルス感染防御に重要な役割を果たすことが知られている。そのため、タイプＩインターフェロンの産生を阻害することができれば、種々の多様なウイルスに対する免疫機能を低下させることができると考えられる。また、繊維芽細胞をウイルス二本鎖ＲＮＡ（ウイルスの産生する二本鎖ＲＮＡ）の合成アナログであるポリイノシン酸−シチジル酸（以下、「ポリ（Ｉ：Ｃ）」と略記する）で刺激すると、タイプＩインターフェロンの転写が誘導されることも知られている。
【００１０】
しかしながら、動物細胞が、ウイルス二本鎖ＲＮＡをどのように認識し、どのようなシグナル伝達経路を経てタイプＩインターフェロンを産生するのかは解明されていなかった。前記の論文では、タイプＩインターフェロンの産生に係わるシグナル伝達系がヒトトール様受容体３の下流に存在することは分かっていなかった。
【００１１】
本願発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、ウイルス二本鎖ＲＮＡによって誘発されるタイプＩインターフェロンの産生を阻害することで、特定のウイルスに対する免疫応答を抑制することができる阻害剤、並びに、ウイルスベクターの感染効率を高めることなく形質転換効率を向上させることができる形質変換方法および形質変換キットを提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、タイプＩインターフェロンの産生に係わるシグナル伝達系がＴＬＲ３の下流に存在し、このシグナル伝達系がＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって遮断できること、すなわち、ＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体が、タイプＩインターフェロンの産生を阻害する機能を持つことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明に係る阻害剤は、上記の課題を解決するために、二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞に対し、二本鎖ＲＮＡに対する免疫応答を抑制するための阻害剤であって、上記トール様受容体と結合してタイプＩインターフェロンの産生を阻害する抗体、好ましくはヒトトール様受容体３に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴としている。
【００１４】
上記の阻害剤を用いれば、二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体に抗体を結合させることで、二本鎖ＲＮＡとトール様受容体との結合を阻止することができる。これにより、二本鎖ＲＮＡに対する免疫応答に係るシグナル伝達経路の下流でタイプＩインターフェロンが産生されることを阻害でき、二本鎖ＲＮＡによって誘発される免疫応答を抑制することができる。
【００１５】
したがって、多様なＲＮＡウイルスに対する免疫応答を抑制することができ、ＲＮＡウイルスの感染を増幅することができる。この免疫応答の抑制は、一本鎖ＲＮＡウイルスの場合でも、非感染細胞中では観測されないが、遺伝子複製の過程で必ず二本鎖ＲＮＡの状態を経るので、一本鎖ＲＮＡウイルスの感染を増幅（助長）することもできる。それゆえ、例えば、センダイウイルスやレトロウイルスベクター等のＲＮＡウイルスベクターを用いた形質転換（トランスフェクション）の効率を、ウイルスベクターの感染力を高めることなしに向上させることができる。なお、ＲＮＡウイルスには、センダイウイルス等のマイナス鎖ＲＮＡ（ネガティブスストランドＲＮＡ）ウイルス、プラス鎖（ポジティブスストランドＲＮＡ）ウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルスがあるが、これらは、いずれも細胞内で二本鎖ＲＮＡを大量に複製するので、上記の阻害剤により、感染が大きく増幅される。
【００１６】
また、上記の阻害剤は、シグナル伝達経路の上流側で二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体に抗体を結合させることで免疫応答を抑制するので、ＲＮＡウイルス以外の抗原、例えばＤＮＡ（デオキシリボ核酸）ウイルスや細菌等に対する免疫機能は維持することができる。
【００１７】
また、本発明に係る形質転換方法は、上記の課題を解決するために、二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞に対し、前記の阻害剤を用いてタイプＩインターフェロンの産生を阻害した状態で、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターを上記細胞に感染させることを特徴としている。
【００１８】
また、本発明に係る形質転換キットは、二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞に対して形質転換を行うための形質転換キットであって、前記の阻害剤と、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターとを含むことを特徴としている。
【００１９】
これらによれば、前述したように、阻害剤によって一本鎖ＲＮＡウイルスおよび二本鎖ＲＮＡウイルスの感染を増幅（助長）することができるので、ウイルスベクターの感染効率を高めることなく、レトロウイルスベクター等のＲＮＡウイルスベクターを用いた形質転換の効率を向上させることができる。
【００２０】
なお、本願明細書において、「〜に対する抗体」という表現は、「〜と特異的に結合する抗体」を意味するものとする。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本願発明者等は、まず、ヒト繊維芽細胞が、その細胞表面でＴＬＲ３を選択的に発現し、ウイルス感染時、あるいは二本鎖ＲＮＡであるポリ（Ｉ：Ｃ）による処理時に、タイプＩインターフェロン、特にインターフェロンβを産生することを確認した。次に、本願発明者等が、ヒトＴＬＲ３のリガンドおよび機能を同定することを目的に、ヒトＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体を作製したところ、ポリ（Ｉ：Ｃ）によるインターフェロンβの産生が、ヒトＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体によって抑制された。したがって、結論的には、ヒトＴＬＲ３は、ＲＮＡウイルスによって生産された二本鎖ＲＮＡのための受容体であることが分かった。
【００２２】
以上の研究により、本願発明者等は、「ヒトＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体が、ヒトＴＬＲ３に結合することによって二本鎖ＲＮＡ依存性のインターフェロンβの産生を妨害でき、二本鎖ＲＮＡ依存性の細胞応答を部分的に阻害する」という独自の新たな知見を得た。
【００２３】
本発明は、上記の知見に基づいてなされたものである。本発明に係る阻害剤は、二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体（特にヒトトール様受容体３）を発現してタイプＩインターフェロン（特にインターフェロンβ）を産生する細胞に対し、二本鎖ＲＮＡに対する免疫応答（特にウイルス感染に対する免疫応答）を抑制するための阻害剤であって、上記トール様受容体と結合してタイプＩインターフェロンの産生を阻害する抗体（特にヒトトール様受容体３に対するモノクローナル抗体）を含むものである。
【００２４】
まず、トール様受容体について説明する。
【００２５】
哺乳動物のトール様受容体（以下、適宜、「ＴＬＲ」と略記する）は、様々な微生物の核酸誘導体、代謝産物、および産生物を認識し、ＮＦ−κＢの活性化および他のシグナル伝達を誘発する。現在までのところ、ヒト由来のＴＬＲファミリーには１０種類のＴＬＲが存在することが確認されており、ヒトＴＬＲ１〜ヒトＴＬＲ１０と名付けられている。
【００２６】
ＴＬＲ蛋白質は、細胞外領域がロイシンリッチリピート（ＬＲＲ；ロイシンに富んだ配列の部分）ドメインと、カルボキシル末端隣接領域（Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；ＬＲＲＣＴ）とから構成され、細胞内領域が、細胞質シグナリングドメイン、すなわちインターロイキン１受容体と相同性のあるいわゆるトール／インターロイキン１受容体ドメイン（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１Ｒドメイン；ＴＩＲドメイン）から構成されている（Ｌ．Ａ．Ｏ’Ｎｅｉｌ，　ａｎｄ　Ｃ．Ａ．Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ　２１　（２０００）　２０６−２０９参照）。典型的なＬＲＲは，保存されたアスパラギン残基とロイシン残基を含む２４個のアミノ酸からなる繰り返し構造で、細菌、酵母、植物、動物中の種々の蛋白質に含まれ、蛋白−蛋白の相互作用に働くと考えられている。
【００２７】
ＴＬＲに特異的に結合する病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれるリガンドの種類や、リガンドによって誘発される免疫応答の仕方は、全てが明確に同定されているわけではないが、ＴＬＲの種類によって異なる。
【００２８】
二本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲとしては、ヒトＴＬＲ３およびマウスＴＬＲ３が確認されている。これらＴＬＲ３が二本鎖ＲＮＡを認識することは、前述した報文（Ｌ．Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，　Ａ．Ｃ．Ｈｏｌｔ，　Ｒ．Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，　Ｒ．Ａ．Ｆｌａｖｅｌｌ，　Ｎａｔｕｒｅ　４１３　（２００１）　７３２−７３８）におけるＴＬＲ３ノックアウトマウスを用いた研究および本願発明者等の研究（後述）により確認された。
【００２９】
ヒトＴＬＲ３は、９０４個のアミノ酸からなるＩ型膜蛋白質である。ＴＬＲ３の細胞外のＬＲＲドメインは、他のＴＬＲに較ベモチーフがよく保存された２３個のＬＲＲから構成されている。ＴＬＲ３の細胞内のＴＩＲドメインは、シグナル伝達に重要とされる保存された領域においてアミノ酸の違いが見られるなど、他のＴＬＲと若干異なっているのが特徴である。ＴＬＲ３は、第４染色体の長腕ｑ３５に位置する。また、ゲノム構造についてみると、他のＴＬＲが１〜２個のエクソンから構成されるのに対し、ＴＬＲ３の読み枠（オープンリーディングフレーム；ＯＲＦ）は４個のエクソンでコードされている。また、ＴＬＲ３のＴＩＲドメインのみ２個のエクソンにわかれている．
本発明に係る細胞としては、ウイルス二本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲを発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞であればよいが、ウイルス二本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲをその表面上で発現すると共に、二本鎖ＲＮＡを認識したときにタイプＩインターフェロンを産生する細胞であることが好ましい。
【００３０】
本願発明者等の研究によれば、ヒトＴＬＲ３は、様々な樹状細胞（ＤＣ）サブセットの中で発現される。また、ヒトＴＬＲ３は、ヒト腸上皮細胞の中で発現されることが報告されている（Ｍ．Ｍｕｚｉｏ，　Ｄ．Ｂｏｓｉｓｉｏ，　Ｎ．Ｐｏｌｅｎｔａｒｕｔｔｉ，　Ｇ．Ｄ’ａｍｉｃｏ，Ａ．Ｓｔｏｐｐａｃｃｉｒｏ，　Ｒ．Ｍａｎｃｉｎｅｌｌｉ　Ｃ．ｖａｎ’ｔ　Ｖｅｅｒ，　Ｇ．Ｐｅｎｔｏｎ−Ｒｏｌ，　Ｌ．Ｐ．Ｒｕｃｏ，　Ｐ．Ａｌｌａｖｅｎａ，　Ａ．Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１６４　（２０００）　５９９８−６００４およびＥ．Ｃａｒｉｏ，　Ｄ．Ｋ．Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，　Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．　６８　（２０００）　７０１０−７０１７）。このことは、その機能が、先天性免疫系における微生物核産生物に対する応答と密接に関連していることを示唆している。したがって、本発明は、ヒトＴＬＲ３を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞、特に、ヒトＴＬＲ３をその表面上で発現すると共に、ＲＮＡウイルスを認識したときにインターフェロンβを産生する細胞に対して効果的である。このような細胞としては、例えば、ヒト肺繊維芽細胞やヒト包皮繊維芽細胞等のヒト線維芽細胞、ヒト樹状細胞、ヒト腸上皮細胞等が挙げられる。特に、繊維芽細胞は、ＲＮＡウイルス感染または二本鎖ＲＮＡによる処理の際に、異なる複数のシグナル伝達経路を経てインターフェロンβを産生することが知られており、大きな効果が期待できる。また、マウスＴＬＲ３を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞としては、例えば、マウス線維芽細胞等の細胞が挙げられる。
【００３１】
なお、ヒト線維芽細胞では単にポリ（Ｉ：Ｃ）を細胞に加えるだけでインターフェロンβの産生がみられるが、一般的に、マウス胚繊維芽細胞をポリ（Ｉ：Ｃ）だけで刺激してもインターフェロンβの産生は検知できず、ＤＥＡＥ−デキストランが必須である。このことから、ヒトの繊維芽細胞とマウスの繊維芽細胞との間で、ＴＬＲ３の発現局在が異なる可能性、また、ポリ（Ｉ：Ｃ）によるインターフェロンβの産生機構が異なる可能性が示唆される。このことから、マウスＴＬＲ３を発現する細胞よりも、ヒトＴＬＲ３を細胞表面で発現する細胞の方が、本発明に係る阻害剤によってインターフェロンβの産生を効果的に阻害できると考えられる。
【００３２】
次に、ＴＬＲと結合する抗体について説明する。
【００３３】
本発明に係る抗体は、ＴＬＲと結合しうるものであればよく、ＴＬＲに対するポリクローナル抗体等でもよいが、ＴＬＲに対するモノクローナル抗体、特にヒトＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体であることが好ましい。これは、性質が均一で供給しやすい、将来的にヒト型抗体に変えうる、ハイブリドーマとして半永久的に保存ができるなどの理由による。これにより、二本鎖ＲＮＡによって誘導されるタイプＩインターフェロンの産生をより効果的に抑制できる。
【００３４】
上記モノクローナル抗体は、次の方法により作製することができる。すなわち、まず、ＴＬＲ、それらのフラグメントまたはその他の誘導体、あるいはそれらのアナログ、もしくはそれらを発現する細胞を免疫原として用いてマウス脾臓リンパ球を免疫し、免疫したマウス脾臓リンパ球とマウスのミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する。次いで、このハイブリドーマによりモノクローナル抗体を産生させる。なお、免疫操作、公知の各種方法、例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，　Ｎａｔｕｒｅ　２５６，４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４，　７２（１９８３））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，　Ａｌａｎ　Ｒ　Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，７７−９６（１９８５））などにより行なわれる。
【００３５】
なお、本発明に係る阻害剤は、上記抗体以外に、抗体の機能を阻害しない範囲で他の成分を含んでいてもよい。
【００３６】
次に、本発明に係る阻害剤を用いた形質転換について説明する。
【００３７】
本発明に係る形質転換方法は、二本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ（特にヒトＴＬＲ３）を発現してタイプＩインターフェロン（特にインターフェロンβ）を産生する細胞（特にヒト繊維芽細胞）に対し、前述した本発明に係る阻害剤を用いてタイプＩインターフェロンの産生を阻害した状態で、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターを上記細胞に感染させる方法である。
【００３８】
また、本発明に係る形質転換キットは、二本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲを発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞に対して形質転換を行うための形質転換キットであって、前述した本発明に係る阻害剤と、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターとを含むものである。
【００３９】
標的となる細胞としては、二本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲを発現してタイプＩインターフェロンを産生し、かつ、ＲＮＡウイルスベクターによって外来遺伝子を導入可能な細胞であれば、特に限定されるものではない。ただし、使用する阻害剤がヒトＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体を含む場合には、細胞は、ヒトＴＬＲ３を発現する細胞であることが好ましく、細胞表面でヒトＴＬＲ３を発現する細胞、例えば、ヒト線維芽細胞、ヒト樹状細胞、ヒト腸上皮細胞等であることがさらに好ましい。また、ヒト幹細胞を標的とすれば、有用な形質転換体が得られると考えられる。
【００４０】
組み換えＲＮＡウイルスベクターとしては、ＲＮＡを遺伝子として持つウイルスベクター（ＲＮＡウイルスベクター）に対してウイルス遺伝子に外来遺伝子（目的遺伝子）を挿入したものであればよい。ウイルス遺伝子に外来遺伝子を挿入する方法としては、特に限定されるものではなく、従来公知の種々の方法を採用することができる。
【００４１】
ＲＮＡウイルスベクターとしては、遺伝子として一本鎖ＲＮＡを持つウイルスベクター（一本鎖ＲＮＡウイルスベクター）であってもよく、遺伝子として二本鎖ＲＮＡを持つウイルスベクター（二本鎖ＲＮＡウイルスベクター）であってもよく、センダイウイルスベクターやレトロウイルスベクター等が挙げられる。これらのうち、本発明は、センダイウイルスベクター等のような二本鎖ＲＮＡを大量に産生するウイルスベクターに対して特に効果的である。また、レトロウイルスベクターは、感染性が高く、細胞内に外来遺伝子を高い効率で導入でき、また、外来遺伝子を染色体ＤＮＡ中に安定に組み込むことができる点で、特に長期にわたる遺伝子発現が望まれる遺伝子治療にとって好ましい遺伝子導入手段である。
【００４２】
ウイルスベクターは、遺伝子導入された生物に悪影響を与えないように様々な工夫が施されていることが好ましい。例えば、遺伝子導入に用いられたウイルスベクター自体が細胞内で複製を行い、無制限な感染（遺伝子導入）を繰り返さないよう、ベクター中の複製機能を欠損させてあることが好ましい。このような複製機能を欠損させたウイルスベクターは、一般的には、ウイルス産生細胞（パッケージング細胞）を使用してウイルス粒子に包まれたウイルスベクターを調製する方法で作製できる。
【００４３】
本発明に係る形質転換方法において、細胞に対し、前記阻害剤を用いてタイプＩインターフェロンの産生を阻害する方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、培地上で培養した細胞に対して前記阻害剤を添加すればよい。
【００４４】
また、前記阻害剤は、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターを上記細胞に感染させる前に使用することが、タイプＩインターフェロンの産生を阻害することができる点でより好ましいが、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターを上記細胞に感染させるときに同時に使用してもよい。同時に使用する場合、例えば、培地上で培養した細胞に対して、前記阻害剤と、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターとを、混合した状態で、あるいは別々に添加すればよい。
【００４５】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４６】
〔細胞培養〕
以下の実施例では、ヒト繊維芽細胞として、理化学研究所（茨城県つくば市高野台３−１−１）のＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋに寄託されている正常なヒト肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５を用いた。また、このヒト肺繊維芽細胞は、１０％の熱失活ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｃａｌｆ　Ｓｅｒｕｍ；ＪＲＨバイオサイエンス社製）および抗生物質を添加したＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；改良イーグル培地）培地中で培養した。
【００４７】
また、以下の実施例で用いたヒト包皮繊維芽細胞ＦＳ−４（Ｊ．Ｖｉｌｃｅｋ，　Ｍ．Ｋｏｈａｓｅ，　Ｄ．Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ−ＤｅＳｔｅｆａｎｏ，　Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１３０　（１９８７）　３７−４３参照）およびヒト胚腎臓（ＨＥＫ；Ｈｕｍａｎ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｋｉｄｎｅｙ）２９３細胞は、１０％のＦＣＳおよび抗生物質を添加したＭＥＭ培地中で培養したものである。
【００４８】
また、以下の実施例で用い　　　　たインターロイキン３（ＩＬ−３）依存性のマウス細胞株Ｂａ／Ｆ３は、１０％のＦＣＳと、５ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−３（インターロイキン３）と、１００μＭの２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）と、抗生物質とを含むＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地中で培養したものである。
【００４９】
〔試薬〕
ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリシチジル酸（ポリ（Ｃ））、ポリウリジル酸（ポリ（Ｕ））、およびポリデオキシシチジル酸−デオキシシチジル酸（ポリ（ｄＩ：ｄＣ））は、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒａｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社から購入した。ポリミキシンＢ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ血清型０１１１：Ｂ４）由来のリポ多糖（ＬＰＳ）、およびマウスＩｇＧ１は、Ｓｉｇｍａ社から購入した。マイコプラズマリポペプチドＭＡＬＰ−２は、Ｍ．Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ，　Ｍ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，　Ｔ．Ｔａｋａｏ，　Ｍ．Ｈｏｓｈｉｎｏ，　Ｙ．Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ，　Ｓ．Ｔｓｕｊｉ，　Ｎ．Ａ．Ｂｅｇｕｍ，　Ｏ．Ｔａｋｕｃｈｉ，　Ｓ．Ａｋｉｒａ，　Ｋ．Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，　Ｔ．Ｓｅｙａ，　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１６６　（２００１）　２６１０−２６１６に記載の方法で調製した。なお、マイコプラズマリポペプチドＭＡＬＰ−２は、Ｍ１６１ＡｇのＮ末端１４個のアミノ酸からなるリポペプチドである。
【００５０】
これら試薬は、ＬＰＳを除いて、細胞の刺激の前にポリミキシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）によって３７℃で１時間処理した。
【００５１】
〔ヒトＴＬＲ４に対するモノクローナル抗体〕
ヒトＴＬＲ４に対するモノクローナル抗体ＨＴＡ１２５は、東京大学医化学研究所の三宅健介教授から供与して頂いたものである（作製法については、Ｒ．Ｓｈｉｍａｚｕ，　Ｓ．Ａｋａｓｈｉ，　Ｈ．Ｏｇａｔａ，　Ｙ．Ｎａｇａｉ，　Ｋ．Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，　Ｋ．Ｍｉｙａｋｅ，　Ｍ．Ｋｉｍｏｔｏ，　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．　１８９　（１９９９）　１７７７−１７８２参照）。
【００５２】
〔ヒトＴＬＲをコードする相補ＤＮＡ発現ベクター〕
ヒトＴＬＲ１、ヒトＴＬＲ２、およびヒトＴＬＲ３をコードする相補ＤＮＡ発現ベクター（ｐＥＦＢＯＳ発現ベクター）は、以下の方法で作製した。まず、ヒト単球を、組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）の存在下で培養し、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーを得た。次いで、得られたｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によってヒトＴＬＲ１、ヒトＴＬＲ２、およびヒトＴＬＲ３を生成し、プラスミドｐＥＦＢＯＳ中でクローニングして、３種のｃＤＮＡ発現ベクター、すなわちヒトＴＬＲ１をコードするｐＥＦＢＯＳ発現ベクター（ヒトＴＬＲ１発現ベクター）、ヒトＴＬＲ２をコードするｐＥＦＢＯＳ発現ベクター（ヒトＴＬＲ２発現ベクター）、およびヒトＴＬＲ３をコードするｐＥＦＢＯＳ発現ベクター（ヒトＴＬＲ３発現ベクター）を得た。なお、プラスミドｐＥＦＢＯＳは、大阪大学の長田重一教授から供与して頂いたものである。ヒトＴＬＲ４発現ベクターは、東京大学医化学研究所の三宅健介教授から供与して頂いたものである（Ｒ．Ｓｈｉｍａｚｕ，　Ｓ．Ａｋａｓｈｉ，　Ｈ．Ｏｇａｔａ，　Ｙ．Ｎａｇａｉ，　Ｋ．Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，　Ｋ．Ｍｉｙａｋｅ，　Ｍ．Ｋｉｍｏｔｏ，　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．　１８９　（１９９９）　１７７７−１７８２参照）。これらのプラスミドは、Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）により調製した。
【００５３】
〔安定トランスフェクタント〕
マウス細胞Ｂａ／Ｆ３を、ヒトＴＬＲ２またはヒトＴＬＲ３をコードするｐＥＦＢＯＳ発現ベクターと、ｐＳＶ２ｎｅｏプラスミド（理化学研究所のＲＩＫＥＮ　ＧｅｎＢａｎｋに登録済み）とで、エレクトロポレーション法によりトランスフェクション（形質導入）し、ヒトＴＬＲ２が導入されたトランスフェクタント（形質導入体）とヒトＴＬＲ３が導入されたトランスフェクタントとを得た。これらのトランスフェクタントについてＧ４１８を用いて１０日間かけて選別を行い、ヒトＴＬＲ２を安定的に発現するマウス細胞Ｂａ／Ｆ３（安定トランスフェクタント）、およびヒトＴＬＲ３を安定的に発現するマウス細胞Ｂａ／Ｆ３（安定トランスフェクタント）を得た。各ＴＬＲの発現は、各ＴＬＲのカルボキシル末端（ＣＯＯＨ末端）に付けた標識抗原決定基（エピトープ）に対する細胞内染色によって確認した。
【００５４】
〔実施例１〕
ＴＬＲ３の蛋白レベルでの発現や局在を調べてリガンドを同定することを目的に、本発明に係る阻害剤としての、ヒトＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体を作製した。
【００５５】
すなわち、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、標識（蛍光標識）付けしたヒトＴＬＲ３を安定的に発現するＢａ／Ｆ３細胞で免疫化した後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞をＮＳ−１ミエローマ細胞と融合し、抗体産生ハイブリドーマを得た。この抗体産生ハイブリドーマに対し、免疫化に用いたのと同じＴＬＲ３トランスフェクタントの細胞表面染色によって選別を行い、ＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体を確立した。このモノクローナル抗体をＴＬＲ３．７と名付けた。モノクローナル抗体ＴＬＲ３．７は、免疫グロブリンサブクラスがＩｇＧ１であり、Ｌ鎖のタイプがκ鎖であった。
【００５６】
また、対照として、モノクローナル抗体ＴＬＲ３．７の作製方法と同様の方法で、ＴＬＲ２に対するモノクローナル抗体を作製した。このモノクローナル抗体をＴＬＲ２．４５と名付けた。モノクローナル抗体ＴＬＲ２．４５は、免疫グロブリンサブクラスがＩｇＧ１であり、Ｌ鎖のタイプがκ鎖であった。
【００５７】
次に、モノクローナル抗体ＴＬＲ３．７がヒトＴＬＲ３を認識することを、ハイブリドーマの上清中で２つの評価基準を用いて確認した。
【００５８】
第１の評価として、モノクローナル抗体ＴＬＲ３．７をフローサイトメトリーによってスクリーニングした。
【００５９】
フローサイトメトリーは、以下のようにして行った。標識（蛍光標識）を付けたヒトＴＬＲ２およびヒトＴＬＲ３を安定的に発現するマウス細胞Ｂａ／Ｆ３を、ＴＬＲに対するモノクローナル抗体（１μｇ）およびヒトＩｇＧ（１０μｇ）と共に、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）バッファ内で、４℃、３０分間インキュベートした。また、上記ＦＡＣＳバッファは、０．５％のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ）および０．１％のアジ化ナトリウムを含むＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）である。次いで、上記細胞を、インキュベートに用いたのと同じＦＡＣＳバッファで２回洗浄した後、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）でラベルした二次抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社製）を添加し、さらに４℃で３０分間インキュベートした。その後、上記細胞を、フローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製の”ＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒ”）を用いて分析した。
【００６０】
フローサイトメトリーの結果を図１に示す。図１（ｂ）および（ｃ）の黒部分は、それぞれ、標識を付けたヒトＴＬＲ２およびヒトＴＬＲ３を安定的に発現するマウス細胞Ｂａ／Ｆ３を、抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体（ＴＬＲ３．７）とＦＩＴＣでラベルした二次抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社製）とで染色した結果である。また、図１（ｃ）の白部分は、同基準のコントロール抗体でラベルした結果である。また、図１（ａ）は、コントロールとしてマウス細胞Ｂａ／Ｆ３（図中では「ＢＡＦ３」と記す）を、抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体とＦＩＴＣでラベルした二次抗体とで染色した結果である。
【００６１】
モノクローナル抗体ＴＬＲ３．７は、図１（ｂ）に示すように、標識を付けたヒトＴＬＲ３を安定的に発現するマウス細胞Ｂａ／Ｆ３（図中では「ＢＡＦ３／ＴＬＲ３−Ｆｌａｇ」と記す）の蛍光ピークをシフトさせた。したがって、モノクローナル抗体ＴＬＲ３．７は、ヒトＴＬＲ３を安定的に発現するマウス細胞Ｂａ／Ｆ３と反応することが分かった。
【００６２】
一方、モノクローナル抗体ＴＬＲ３．７は、図１（ｃ）に示すように、標識を付けたヒトＴＬＲ２を安定的に発現するマウス細胞Ｂａ／Ｆ３（図中では「ＢＡＦ３／ＴＬＲ３−Ｆｌａｇ」と記す）の蛍光ピークを変化させなかった。したがって、モノクローナル抗体ＴＬＲ３．７は、ヒトＴＬＲ２を安定的に発現するマウス細胞Ｂａ／Ｆ３と反応しないことが分かった。
【００６３】
したがって、モノクローナル抗体ＴＬＲ３．７は、トランスフェクション実験において、ＴＬＲ３に対する特異性を示し、ＴＬＲ２を安定的に発現するマウス細胞Ｂａ／Ｆ３とは反応しないことが分かった。
【００６４】
第２の評価として、モノクローナル抗体を、標識を付けたヒトＴＬＲ３を発現するマウス細胞Ｂａ／Ｆ３の溶解物を用いた免疫沈降法によって選別した。すなわち、以下のようにしてトランスフェクタント中でヒトＴＬＲ３の免疫沈降を行い、標識を付けたＴＬＲ３の発現を、抗フラグ抗体で判定した。まず、標識を付けたヒトＴＬＲ２を安定的に発現するマウス細胞Ｂａ／Ｆ３を、リーシスバッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で溶解した。次いで、ＴＬＲ３を、抗フラグモノクローナル抗体（Ｍ２；図中では「ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ　Ｍ２」と記す）または抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体（ＴＬＲ３．７）で免疫沈降し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を施し、次いで、抗フラグモノクローナル抗体により免疫ブロット（ウエスタンブロット）した。また、免疫沈降には負のコントロールとして抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体（ＴＬＲ２．４５）を用いた。図２における矢印は、１１６ｋＤａの分子量を持つＴＬＲ３を示している。免疫ブロットの結果を図２に示す。その結果、免疫沈降法による分析でも、モノクローナル抗体ＴＬＲ３．７の特異性が確認された。
【００６５】
なお、本願発明者等は、多くの試みの後、ようやく１１６ｋＤａのＴＬＲ３蛋白質を認識する、ヒトＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体を確立することができた。これは、ヒトＴＬＲ３が、図１に示すようにマウスＢａ／Ｆ３細胞上における発現レベルが低く、スクリーニングが困難であったためである。
【００６６】
次に、各種ＴＬＲに対するモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリー（流動細胞計測法）によって、ＴＬＲ３陽性である（細胞表面でＴＬＲ３を発現する）ヒト細胞／細胞株を探索した。
【００６７】
フローサイトメトリーは、以下のようにして行った。正常ヒト肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５、および正常ヒト包皮繊維芽細胞ＦＳ−４を、ＴＬＲに対するモノクローナル抗体（１μｇ）およびヒトＩｇＧ（１０μｇ）と共に、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）バッファ内で、４℃、３０分間インキュベートした。また、上記ＦＡＣＳバッファは、０．５％のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ）および０．１％のアジ化ナトリウムを含むＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）である。
【００６８】
次いで、上記細胞を、インキュベートに用いたのと同じＦＡＣＳバッファで２回洗浄した後、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）でラベルした二次抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社製）を添加し、さらに４℃で３０分間インキュベートした。その後、上記細胞を、フローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製の”ＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒ”）を用いて分析した。結果を図３に示す。図３（ａ）は、ヒトＴＬＲ２に対するモノクローナル抗体ＴＬＲ２．４５を用いたフローサイトメトリーにより細胞ＭＲＣ−５およびＦＳ−４中におけるＴＬＲ２の発現を分析した結果である。図３（ｂ）は、ヒトＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体ＴＬＲ３．７を用いたフローサイトメトリーにより細胞ＭＲＣ−５およびＦＳ−４中におけるＴＬＲ３の発現を分析した結果である。図３（ｂ）は、ヒトＴＬＲ４に対するモノクローナル抗体ＨＴＡ１２５を用いたフローサイトメトリーにより細胞ＭＲＣ−５およびＦＳ−４中におけるＴＬＲ４の発現を分析した結果である。
【００６９】
図３（ｂ）のフローサイトメトリーの結果、ＴＬＲ３が、ヒト肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５およびヒト包皮繊維芽細胞ＦＳ−４において、細胞表面に存在していることが分かった。したがって、ＴＬＲ３は、繊維芽細胞において細胞表面及び細胞内部に発現することが分かった（この知見は、この研究で初めて得られた独自の知見である）。
【００７０】
一方、図３（ａ）および（ｂ）に示すように、ＴＬＲ２もＴＬＲ４も、ヒト肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５およびヒト包皮繊維芽細胞ＦＳ−４においては、細胞表面上で検出されなかった。ただし、これら細胞株は、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）によってＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ５、およびＴＬＲ６のｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）の発現が確認された。しかしながら、これらＴＬＲの発現は、フローサイトメトリーでは殆ど検出されなかった。
【００７１】
ヒト繊維芽細胞は、その表面上でＴＬＲ３を自然に発現し、ウイルス感染あるいは二本鎖ＲＮＡの合成アナログであるポリ（Ｉ：Ｃ）刺激によりインターフェロンβを産生する。このことから、二本鎖ＲＮＡ認識によるインターフェロンβ産生の阻害実験として、ヒト繊維芽細胞においてポリ（Ｉ：Ｃ）刺激によるインターフェロンβの産生が抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体によって阻害されるか否かを調べる実験を行った。
【００７２】
すなわち、まず、２４ウェルプレート（７．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌｓ）内に入れたヒト肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５を、２０μｇ／ｍｌの抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体（ＴＬＲ２．４５；図中では「抗ＴＬＲ２　ｍＡｂ」と記す）または抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体（ＴＬＲ３．７；図中では「抗ＴＬＲ３　ｍＡｂ」と記す）で、３７℃、１時間、前処理した後、ポリミキシンＢ処理したポリ（Ｉ：Ｃ）（５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。培養液の上清中におけるインターフェロンβの濃度を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着定量法）測定装置（ＴＦＢ　Ｉｎｃ．製）で測定した。測定結果を図４に示す。
【００７３】
図４から明らかように、抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体によるヒト肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５の前処理は、明らかに、ポリ（Ｉ：Ｃ）によるインターフェロンβ産生を阻害した。一方、抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体によるヒト肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５の処理では、インターフェロンβ産生の誘導の抑制は起こらなかった。これは、細胞表面で発現するＴＬＲ３が二本鎖ＲＮＡの認識に関与し、インターフェロンβ産生を引き起こす下流へのシグナル伝達を誘発することを示している。このモノクローナル抗体は、結果としてＴＬＲ３の機能低下を引き起こす。この結果は、別のアプローチによる前の報告（Ｌ．Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，　Ａ．Ｃ．Ｈｏｌｔ，　Ｒ．Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，　Ｒ．Ａ．Ｆｌａｖｅｌｌ，　Ｎａｔｕｒｅ　４１３　（２００１）　７３２−７３８）と整合している。さらに、この結果は、ポリ（Ｉ：Ｃ）依存性のインターフェロンβ誘導が、抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体によって直接遮断されている可能性を示すものである。
【００７４】
以上の結果から、直接的な結合であるか間接的な結合であるかにかかわらずＴＬＲ３と二本鎖ＲＮＡとが相互に結び付く、細胞外のＴＬＲ３による二本鎖ＲＮＡの特異的な認識は、タイプＩインターフェロンの誘導に不可欠であることが分かる。また、ＴＬＲ３に付けられたモノクローナル抗体によって、この細胞外のＴＬＲ３による二本鎖ＲＮＡの特異的な認識が妨害され、その結果としてタイプＩインターフェロンの産生が阻害されることが分かる。
【００７５】
したがって、ＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体は、宿主細胞に起こり得る二本鎖ＲＮＡ−ＴＬＲ３認識に係わる別経路を介したウイルス依存性の細胞応答を抑制する阻害剤としての機能を果たすことができることが分かる。
【００７６】
〔ポリ（Ｉ：Ｃ）による機能増幅の検証〕
繊維芽細胞は、ウイルス感染、あるいは二本鎖ＲＮＡの合成アナログであるポリ（Ｉ：Ｃ）による刺激の下で、インターフェロンβを産生する。それゆえ、二本鎖ＲＮＡの認識時にＴＬＲの果たし得る役割を調査するために、まず、ヒト繊維芽細胞が、ポリ（Ｉ：Ｃ）による刺激の下でインターフェロンβを産生することを確認した。具体的には、ヒト肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５（細胞数７．５×１０４）を、０〜２０μｇ／ｍｌまでの各種濃度のポリＩ：Ｃで４時間または２４時間刺激した。また、ヒト包皮繊維芽細胞ＦＳ−４（細胞数７．５×１０４）を、０〜２０μｇ／ｍｌまでの各種濃度のポリＩ：Ｃで４時間刺激した。インターフェロンβの産生量を測定した結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
2004016021.tif 000002
【００７８】
表１から明らかなように、ポリ（Ｉ：Ｃ）によるヒト肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５およびヒト包皮繊維芽細胞ＦＳ−４の刺激は、インターフェロンβの分泌を誘導した。
【００７９】
エピセリウム細胞では、ポリ（Ｉ：Ｃ）が、ウイルスの二本鎖ＲＮＡに類似した役割を果たし、ウイルス感染に対する宿主の防衛に重要なインターフェロンβ、およびサイトカインの分泌に続いて起こるＮＦ−κＢの活性化を誘導することが知られている。
【００８０】
そこで、次に、種々のＴＬＲを発現するヒト細胞株を用いて、二本鎖ＲＮＡの認識によってＮＦ−κＢおよびインターフェロンβプロモータが活性化される免疫応答機構において、ＴＬＲ３がどのように関与しているかを調べる研究の一環として、機能増幅の研究を行った。すなわち、種々のヒトＴＬＲを発現するベクターを用いてトランスフェクションされたヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を用いて、ＮＦ−κＢまたはインターフェロンβとを用いたレポータ遺伝子アッセイにより、ポリ（Ｉ：Ｃ）によって免疫機能が増幅されるかを検証した。
【００８１】
レポータ遺伝子アッセイは、以下のようにして行った。まず、ＨＥＫ２９３細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌｓ）を、６ウェルプレート内で、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）　２０００試薬（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ製；遺伝子導入用カチオン性脂質）を、ヒトＴＬＲ１発現ベクター、ヒトＴＬＲ２発現ベクター、ヒトＴＬＲ３発現ベクター、ヒトＴＬＲ４発現ベクター（これら４種は０．５μｇまたは１μｇ）、および空ベクターの何れかと、レポータ遺伝子とによって、過渡的にトランスフェクトした。
【００８２】
レポータ遺伝子としては、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を連結したＮＦ−κＢレポータ遺伝子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、０．５μｇ）、あるいはｐ−１２５　ｌｕｃレポータプラスミド（０．５μｇ）を用いた。ｐ−１２５　ｌｕｃレポータプラスミドは、東京大学大学院医学系研究科の谷口維紹教授から供与して頂いたものである（Ｔ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，　Ｋ．Ｏｇａｓａｗａｒａ，　Ａ．Ｔａｋａｏｋａ，　Ｎ．Ｔａｎａｋａ，　Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９　（２００１）　６２３−６５５参照）。ｐ−１２５　ｌｕｃレポータプラスミドは、「ピッカジーン（Ｐｉｃａｇｅｎｅ）」ルシフェラーゼレポータプラスミド（東洋インキ株式会社製）内に挿入されたヒトインターフェロンβプロモータ領域（−１２５から＋１９）を含有している。したがって、ｐ−１２５　ｌｕｃレポータプラスミドは、インターフェロンβレポータ遺伝子として使用できる。
【００８３】
トランスフェクトされたＤＮＡの総量は、空のベクターを添加することによって一定に保った。また、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製，０．０２５μｇ）を内部コントロールとして使用した。
【００８４】
トランスフェクションから２４時間後に、細胞を収穫し、２４ウェルプレート（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）上に接種し、培地のみ、ポリミキシンＢ由来のリポ多糖（ＬＰＳ；濃度１００ｎｇ／ｍｌ）、ポリミキシンＢ処理したマイコプラズマリポペプチドＭＡＬＰ−２（濃度１００ｎＭ）、またはポリミキシンＢ処理したポリ（Ｉ：Ｃ）（濃度５０μｇ／ｍｌ）で、６時間刺激した。
【００８５】
この細胞を、リーシスバッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で溶解し、ルシフェラーゼ活性およびβーガラクトシダーゼ活性を製造メーカーの取扱説明書にしたがって測定し、ＮＦ−κＢおよびインターフェロンβプロモータの活性化度を評価した。
【００８６】
レポータ遺伝子としてＮＦ−κＢレポータ遺伝子を用いた場合の測定結果を図５に、レポータ遺伝子としてインターフェロンβレポータ遺伝子を用いた場合の測定結果を図６にそれぞれ示す。図５および図６のデータは、相対的な刺激の平均値を表す。
【００８７】
ヒトＴＬＲ３によってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、図５に示すように、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答してＮＦ−κＢを活性化した。一方、他のヒトＴＬＲ（ヒトＴＬＲ１、ヒトＴＬＲ２、およびヒトＴＬＲ４）によってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞では、図５に示すように、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答してＮＦ−κＢを活性化することはなかった。ただし、ヒトＴＬＲ２発現細胞は、図５に示すように、コントロールリガンドであるマイコプラズマリポペプチドＭＡＬＰ−２に対して応答した。
【００８８】
また、ヒトＴＬＲ３を発現する細胞は、図６に示すように、ポリ（Ｉ：Ｃ）に対して著しく応答し、インターフェロンβプロモータを活性化した。したがって、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＴＬＲ３を介してＮＦ−κＢおよびインターフェロンβプロモータの両方の活性化を誘導した。対照的に、ヒトＴＬＲ２やヒトＴＬＲ４を発現する細胞は、図６に示すように、ＬＰＳ、マイコプラズマリポペプチドＭＡＬＰ−２、およびポリ（Ｉ：Ｃ）のいずれにも応答せず、インターフェロンβプロモータを活性化させなかった。
【００８９】
次に、ポリ（Ｉ：Ｃ）のＴＬＲ３に対する特異性を調べた。
【００９０】
まず、前述したのと同様のＨＥＫ２９３細胞に対するレポータ遺伝子によるトランスフェクションを、ヒトＴＬＲ３発現ベクター（０．５μｇまたは１μｇ）または空ベクターを用いて行った。トランスフェクションから２４時間後に、細胞を収穫し、２４ウェルプレート（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）上に接種し、培地のみ、ポリ（Ｉ：Ｃ）（濃度５０μｇ／ｍｌ）、ポリ（Ｕ）、ポリ（Ｃ）、またはポリ（ｄＩ：ｄＣ）（濃度５０μｇ／ｍｌ）で、６時間刺激した。
【００９１】
この細胞を、リーシスバッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で溶解し、ルシフェラーゼ活性およびβーガラクトシダーゼ活性を製造メーカーの取扱説明書にしたがって測定し、ＮＦ−κＢおよびインターフェロンβプロモータの活性化度を評価した。
【００９２】
レポータ遺伝子としてＮＦ−κＢレポータ遺伝子を用いた場合の測定結果を図７に、レポータ遺伝子としてインターフェロンβレポータ遺伝子を用いた場合の測定結果を図８にそれぞれ示す。図７および図８のデータは、３つの個別の実験の最小値から計算した標準偏差による畳み込み演算を行った数値で表している。
【００９３】
ＴＬＲ３を介したＮＦ−κＢおよびインターフェロンβプロモータの活性化は、図７および図８に示すように、ポリ（Ｉ：Ｃ）によってのみ誘導され、一本鎖ＲＮＡのポリ（Ｕ）およびポリ（Ｃ）のいずれによっても、また、二本鎖ＤＮＡのポリ（ｄＩ：ｄＣ）によっても誘導されなかった。
【００９４】
以上のように、ＴＬＲ３は、二本鎖ＲＮＡを認識して、ポリ（Ｉ：Ｃ）刺激によるＮＦ−κＢおよびインターフェロンβプロモータの活性化を媒介した一方、ＴＬＲ３を介したシグナル伝達は、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの何れによっても誘発されなかった。
【００９５】
したがって、ＴＬＲ３は、二本鎖ＲＮＡの極めて特異的な構造的特徴、例えば、β−Ｄ−リボース内の２’炭素に結合した水酸基の有無を認識することで、ウイルスに固有の二本鎖ＲＮＡを選択的に認識し、シグナルを伝達すると考えられる。
【００９６】
このようにして、本願発明者等の研究により、ＴＬＲ３が、二本鎖ＲＮＡを認識してＮＦ−κＢおよびインターフェロンβプロモータを活性化し、インターフェロンβの産生を促進することが明らかとなった。それゆえ、ＴＬＲ３を介したシグナル伝達を何らかの方法で促進することによって、インターフェロンβの産生を促進し、ウイルス感染を抑制できることが期待される。また、このシグナル伝達を促進する薬剤を探索することにより、新規なウイルス感染抑制剤の創製が期待できる。多くの難治性疾患がウイルスによって媒介されるので、ウイルス感染を抑制することで多くの難治性疾患の治療が期待できる。
【００９７】
【発明の効果】
本発明に係る阻害剤は、以上のように、トール様受容体と結合してタイプＩインターフェロンの産生を阻害する抗体に対するモノクローナル抗体を含む構成である。
【００９８】
これにより、二本鎖ＲＮＡに対する免疫応答に係るシグナル伝達経路の下流でタイプＩインターフェロンが産生されることを阻害でき、二本鎖ＲＮＡによって誘発される免疫応答を抑制することができる。したがって、二本鎖ＲＮＡウイルスの感染を増幅することができると共に、遺伝子複製の過程で二本鎖ＲＮＡの状態を経る一本鎖ＲＮＡウイルスの感染を増幅することができる。それゆえ、例えば、レトロウイルスベクター等のＲＮＡウイルスベクターを用いた形質転換の効率を、ウイルスベクターの感染力を高めることなしに向上させることができる。また、上記構成では、選択的な免疫応答の抑制ができるので、ＲＮＡウイルス以外の抗原、例えばＤＮＡ（デオキシリボ核酸）ウイルスや細菌等に対する免疫機能を維持することができる。
【００９９】
また、本発明に係る形質転換方法は、以上のように、二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞に対し、請求項１または２に記載の阻害剤を用いてタイプＩインターフェロンの産生を阻害した状態で、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターを上記細胞に感染させる方法である。また、本発明に係る形質転換キットは、前記の阻害剤と、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターとを含む構成である。
【０１００】
これらによれば、阻害剤によって一本鎖ＲＮＡウイルスおよび二本鎖ＲＮＡウイルスの感染を増幅（助長）することができるので、ウイルスベクターの感染効率を高めることなく、レトロウイルスベクター等のＲＮＡウイルスベクターを用いた形質転換の効率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウス細胞を用いた、ＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体のフローサイトメトリー分析結果を示すグラフであり、（ａ）はコントロールとしてのマウス細胞の場合、（ｂ）はＴＬＲ２を発現するマウス細胞の場合、（ｃ）はＴＬＲ３を発現するマウス細胞の場合である。
【図２】ＴＬＲ３を、抗フラグモノクローナル抗体、抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体、または抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体で免疫沈降した後、免疫ブロットした結果を示す図である。
【図３】２種類のヒト繊維芽細胞を用いた、各種ＴＬＲに対するモノクローナル抗体のフローサイトメトリー分析結果を示すグラフであり、（ａ）はヒトＴＬＲ２に対するモノクローナル抗体を用いた場合、（ｂ）はヒトＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体を用いた場合、（ｃ）はヒトＴＬＲ４に対するモノクローナル抗体を用いた場合を示す。
【図４】ヒト肺繊維芽細胞を抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体または抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体で前処理した後、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したときのインターフェロンβの濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図５】各種のＴＬＲを介在してポリ（Ｉ：Ｃ）刺激によるＮＦ−κＢの活性化が起こるか否かを分析した結果を表すグラフである。
【図６】各種のＴＬＲを介在してポリ（Ｉ：Ｃ）刺激によるインターフェロンβプロモータの活性化が起こるか否かを分析した結果を表すグラフである。
【図７】ポリ（Ｉ：Ｃ）、一本鎖ＲＮＡ、および二本鎖ＤＮＡのそれぞれによって、ＴＬＲ３を介したＮＦ−κＢの活性化が起こるか否かを分析した結果を表すグラフである。
【図８】ポリ（Ｉ：Ｃ）、一本鎖ＲＮＡ、および二本鎖ＤＮＡのそれぞれによって、ＴＬＲ３を介したインターフェロンβプロモータの活性化が起こるか否かを分析した結果を表すグラフである。
【図１】
2004016021.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
2004016021.tif 000006
【図５】
2004016021.tif 000007
【図６】
2004016021.tif 000008
【図７】
2004016021.tif 000009
【図８】
2004016021.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成14年12月13日(2002.12.13)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトトール様受容体３と特異的に結合する抗体。
【請求項２】
二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞に対し、二本鎖ＲＮＡに対する免疫応答を抑制するための阻害剤であって、
上記トール様受容体と結合してタイプＩインターフェロンの産生を阻害する抗体を含むことを特徴とする阻害剤。
【請求項３】
上記抗体は、ヒトトール様受容体３に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする阻害剤。
【請求項４】
二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞に対し、請求項１または２に記載の阻害剤を用いてタイプＩインターフェロンの産生を阻害した状態で、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターを上記細胞に感染させることを特徴とする形質転換方法。
【請求項５】
二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞に対して形質転換を行うための形質転換キットであって、
請求項２または３に記載の阻害剤と、
目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターとを含むことを特徴とする形質転換キット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
ヒトトール様受容体（Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）３と特異的に結合する抗体、および二本鎖ＲＮＡ（リボ核酸）を認識するトール様受容体をその表面上で発現しタイプＩインターフェロン（インターフェロンαおよびインターフェロンβ）を産生する細胞に対し、二本鎖ＲＮＡによって誘発されるシグナル伝達を遮断して二本鎖ＲＮＡに対する免疫応答を抑制するための阻害剤、並びに、それを用いて、目的遺伝子を挿入した組み換えＲＮＡウイルスベクターによる形質転換を行う形質転換方法並びに形質転換キットに関するものである。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本願発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、ウイルス二本鎖ＲＮＡによって誘発されるタイプＩインターフェロンの産生を阻害する機能を持つトール様受容体に対する抗体、およびウイルス二本鎖ＲＮＡによって誘発されるタイプＩインターフェロンの産生を阻害することで、特定のウイルスに対する免疫応答を抑制することができる阻害剤、並びに、ウイルスベクターの感染効率を高めることなく形質転換効率を向上させることができる形質変換方法および形質変換キットを提供することにある。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、ＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製すると共に、タイプＩインターフェロンの産生に係わるシグナル伝達系がＴＬＲ３の下流に存在し、このシグナル伝達系がＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって遮断できること、すなわち、ＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体が、タイプＩインターフェロンの産生を阻害する機能を持つことを見出し、本発明を完成するに至った。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
すなわち、本発明に係る抗体は、ヒトトール様受容体３と特異的に結合する抗体である。また、本発明に係る阻害剤は、上記の課題を解決するために、二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞に対し、二本鎖ＲＮＡに対する免疫応答を抑制するための阻害剤であって、上記トール様受容体と結合してタイプＩインターフェロンの産生を阻害する抗体、好ましくはヒトトール様受容体３に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴としている。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
上記の抗体または阻害剤を用いれば、二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体に抗体を結合させることで、二本鎖ＲＮＡとトール様受容体との結合を阻止することができる。これにより、二本鎖ＲＮＡに対する免疫応答に係るシグナル伝達経路の下流でタイプＩインターフェロンが産生されることを阻害でき、二本鎖ＲＮＡによって誘発される免疫応答を抑制することができる。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
したがって、多様なＲＮＡウイルスに対する免疫応答を抑制することができ、ＲＮＡウイルスの感染を増幅することができる。この免疫応答の抑制は、一本鎖ＲＮＡウイルスの場合でも、非感染細胞中では観測されないが、遺伝子複製の過程で必ず二本鎖ＲＮＡの状態を経るので、一本鎖ＲＮＡウイルスの感染を増幅（助長）することもできる。それゆえ、例えば、センダイウイルスやレトロウイルスベクター等のＲＮＡウイルスベクターを用いた形質転換（トランスフェクション）の効率を、ウイルスベクターの感染力を高めることなしに向上させることができる。なお、ＲＮＡウイルスには、センダイウイルス等のマイナス鎖ＲＮＡ（ネガティブスストランドＲＮＡ）ウイルス、プラス鎖（ポジティブスストランドＲＮＡ）ウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルスがあるが、これらは、いずれも細胞内で二本鎖ＲＮＡを大量に複製するので、上記の抗体または阻害剤により、感染が大きく増幅される。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
また、上記の抗体または阻害剤は、シグナル伝達経路の上流側で二本鎖ＲＮＡを認識するトール様受容体に抗体を結合させることで免疫応答を抑制するので、ＲＮＡウイルス以外の抗原、例えばＤＮＡ（デオキシリボ核酸）ウイルスや細菌等に対する免疫機能は維持することができる。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
【発明の効果】
本発明に係る抗体は、以上のように、ヒトトール様受容体３と特異的に結合する抗体である。また、本発明に係る阻害剤は、以上のように、トール様受容体と結合してタイプＩインターフェロンの産生を阻害する抗体、特にトール様受容体３に対するモノクローナル抗体を含む構成である。