(57)【要約】  本発明は、病因物質に対する抗原をコードする遺伝子をゲノムまたはその一部中に取り込んでいる組み換えウイルスと、病因物質に対する免疫応答を刺激する目的のための免疫分子をコードする遺伝子をゲノムまたはその一部中に取り込んでいる組み換えウイルスとの組成物である。癌または病原性微生物によって引き起こる疾患などの疾患の治療方法が、上記組成物を使用することによって提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
病的状態の抗原をコードする１以上の遺伝子またはその一部をウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいるポックスウィルスを除く第１の組換えウイルスと、Ｂ７．１、Ｂ７．２、またはＢ７．１とＢ７．２をコードする１以上の遺伝子またはその一部をウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいるポックスウィルスを除く第２の組換えポックスウイルスとを単独で含むか、または外因の免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗ウイルス薬または抗菌薬と組み合わせて含む組成物であって、当該第１および第２の組換えウィルスが宿主細胞に同時感染して、病的状態の抗原をコードする遺伝子と、Ｂ７．１、Ｂ７．２、またはＢ７．１とＢ７．２をコードする遺伝子との同時発現を生じることができる上記の組成物。
【請求項２】
第１の組換えウイルス、第２の組換えウイルス、または第１および第２の組換えウイルスが、アデノウイルス、およびポリオウイルスから成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
病的状態が癌または病原性微生物である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
病原性微生物がウイルス、細菌、原生動物、または酵母である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
病原性ウイルスが、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ウマ脳炎ウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはインフルエンザウイルスである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
抗原が腫瘍関連抗原である、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
腫瘍関連抗原が、癌胎児性抗原、ＭＡＲＴ−１、Ｍａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−３、ｇｐ１００、チロシナーゼ，ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５、ｅｒｂ−２、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−２、点変異ｒａｓ癌遺伝子、点変異ｐ５３癌遺伝子、およびＴＡＧ−７２から成る群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
第２の組換えウイルスが、免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝子またはその一部をさらに含み、該免疫刺激分子が、ＩＬ−２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物を使用して感染させた宿主細胞。
【請求項１１】
抗原提示細胞、腫瘍細胞、病原性微生物が感染した細胞、または遺伝的欠損細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
抗原提示細胞が樹状細胞またはマクロファージである、請求項１０または１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
病的状態の抗原をコードする１以上の遺伝子またはその一部と、Ｂ７．１、Ｂ７．２、あるいはＢ７．１とＢ７．２をコードする遺伝子またはその一部とをウイルスゲノムまたはその一部中に取り込み、そして場合によりＩＬ−２、ＩＣＡＭ−１，ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６およびそれらの組み合わせから成る群から選択される免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝子またはその一部を取り込んでいる、ポックスウィルスを除く組換えウイルスであって、当該組換えウィルスが抗原提示細胞に感染して、病的状態の抗原の発現、Ｂ７．１、Ｂ７．２、またはＢ７．１とＢ７．２をコードする遺伝子の発現と、そして場合によりいずれかの免疫刺激分子の遺伝子またはその一部の発現とを生じることができる上記の組換えウィルス。
【請求項１４】
抗原が、腫瘍関連抗原、ＨＩＶ抗原、肝炎ウィルス抗原、ヒトパピローマウイルス抗原、ウマ脳炎ウイルス抗原、単純ヘルペスウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、非ホジキンリンパ腫抗原、白血病抗原、ホジキンリンパ腫抗原、肺癌抗原、肝臓癌抗原、黒色腫抗原、腺癌抗原、胸腺腫抗原または肉腫抗原である、請求項１３に記載の組換えウィルス。
【請求項１５】
腫瘍関連抗原が、癌胎児性抗原、ＭＡＲＴ−１、Ｍａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−３、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５、ｅｒｂ−２、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−２、点変異ｒａｓ癌遺伝子、点変異ｐ５３癌遺伝子、およびＴＡＧ−７２から成る群から選択される、請求項１４に記載の組換えウイルス。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組換えウイルスを単独で、または外因の免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗ウイルス薬または抗菌薬と組み合わせて含み、そして薬学的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組換えウィルスを使用して感染させた宿主細胞。
【請求項１８】
抗原提示細胞、腫瘍細胞、病原性微生物が感染した細胞、または遺伝的欠損細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
抗原提示細胞が樹状細胞またはマクロファージである、請求項１７または１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
病的状態の抗原に類似する抗原結合部位を有する抗体をコードする１以上の遺伝子またはその一部をウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいるポックスウィルスを除く第１の組換えウイルスと、Ｂ７．１、Ｂ７．２またはＢ７．１とＢ７．２をコードする１以上の遺伝子またはその一部をウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいるポックスウィルスを除く第２の組換えウイルスとを単独で、または外因の免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗ウイルス薬または抗菌薬と組み合わせて含む組成物であって、当該第１および第２の組換えウィルスがが宿主細胞に同時感染して、病的状態の抗原に類似する抗原結合部位を有する抗体をコードする遺伝子と、Ｂ７．１、Ｂ７．２、またはＢ７．１とＢ７．２をコードする遺伝子との同時発現を生じることができる上記の組成物。
【請求項２１】
病的状態の抗原に類似する抗原結合部位を有する抗体をコードする１以上の遺伝子またはその一部と、Ｂ７．１、Ｂ７．２またはＢ７．１とＢ７．２をコードする１以上の遺伝子またはその一部とをウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいるポックスウィルスを除く組換えウイルスであって、当該組換えウィルスが抗原提示細胞に感染して、抗体の発現と、Ｂ７．１、Ｂ７．２、またはＢ７．１とＢ７．２をコードする遺伝子の発現とを生じることができる上記の組換えウィルス。
【請求項２２】
請求項２１に記載の組換えウイルスを単独で、あるいは外因の免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗ウイルス薬または抗菌薬と組み合わせて含み、そして薬学的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２１に記載の組換えウイルスを使用して感染させた宿主細胞。
【請求項２４】
抗原提示細胞、腫瘍細胞、病原性微生物が感染した細胞、または遺伝的欠損細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野
本発明は病原性疾患及び癌の予防と治療のための組換えウイルスベクターワクチンの組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は抗原（単数又は複数）をコードする遺伝子を含む組換えウイルスベクターと、免疫刺激性分子（単数又は複数）をコードする遺伝子（単数又は複数）を含む組換えウイルスベクターとの組成物に関する。これらの遺伝子は１つの組換えベクターに又は別々のウイルスベクターに挿入されることができる。本発明の他の態様は、免疫刺激性遺伝子（単数又は複数）を含有する組換えウイルスによるｉｎ  ｓｉｔｕ若しくはインビトロにおける疾患細胞の感染及び感染した細胞の宿主中への再導入によって、哺乳動物における疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）に対する免疫応答を強化することである。
【０００２】発明の背景
癌患者における活性免疫反応を刺激する現在までの試みは“非特異的”（即ち、ＢＣＧの使用）又は“特異的”（即ち、腫瘍細胞、腫瘍細胞抽出物、細胞培養上澄み液からの抗原混合物又は腫瘍細胞の溶解産物（ｏｎｃｏｌｙｓａｔｅ）の使用）として分類することができる。これらの努力の殆どが転移性黒色腫を有する患者において続けられている。組換えワクチンの開発は、免疫原又は免疫刺激性分子の特異的な、規定された遺伝子産物又はエピトープの使用を含む。後者のアプローチが特定の患者からの細胞を用いて、これらの細胞に例えばＢ７．１、Ｂ７．２、ＩＬ−２又はＧＭ−ＣＳＦのような免疫刺激性分子の遺伝子を現場で挿入するか又は培養した細胞を患者に再び投与することを必要とするという点で、組換えワクチンは“遺伝子療法”にも用いることができる。
組換えワクチンは多くの形態をとることができる。例えばバキュロウイルス（昆虫ベクター）のようなベクターによって又は真核細胞におけるように、組換えタンパク質を合成することができる。合成ペプチドが免疫原として役立つことができる。９〜数ダースのアミノ酸から成るペプチドワクチンは２種類の形態をとることができる。これらはアジュバントと混合するか又は患者に再注入するための抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）（ＡＰＣ）として末梢血管細胞をパルスする（ｐｕｌｓｅ）ために用いることができる。特定腫瘍関連抗原をコードする遺伝子をベクターに挿入することによっても、組換えワクチンを構築することができる。用いられる共通ベクター（ｃｏｍｍｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）の一部はワクシニアウイルス、例えば鶏痘又はカナリヤ痘（ポックス）のようなトリポックス（ａｖｉａｎ  ｐｏｘ）ウイルス、ＢＣＧ、アデノウイルス及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である。これらのベクターは、各々がそれらの利点と欠点を有するが、それらの構成タンパク質の免疫原性のために通常用いられ、挿入された遺伝子のタンパク質又はエピトープをより大きく免疫原性にする。組換えワクチンは、特定腫瘍関連抗原に対して産生されるモノクローナル抗体に向けられる抗イディオタイプ抗体の形態をとることもできる。最も最近では、プロモーター遺伝子を含有するプラスミド中の腫瘍関連遺伝子のネーキッド（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡから成るポリヌクレオチドワクチンが製造されている。上記の全ては動物モデルにおいて分析されているが、１つのアプローチの他のアプローチに対する相対的効率を調べた研究は殆どない。臨床試験は現在これらのアプローチの幾つかを胸部癌及び他の癌患者に用い始めており、他の臨床試験も近い将来開始する見込みが大きい。
現在、癌治療用の組換えワクチンに用いられうると見なされている幾つかの抗原が存在する。これらの最初の抗原は、胸部腫瘍の約２０〜３０％に過度に発現することが判明しているｃ−ｅｒｂＢ／２癌遺伝子である（Ｐｉｅｔｒａｓ  ＲＪ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：１８２９〜１８３８，１９９４）。ラットにおける点突然変異したｃ−ｅｒｂＢ／２癌遺伝子が、ワクシニアウイルスに挿入されたときに、免疫原性になり、抗腫瘍効果を生じることができることが判明している（Ｂｅｒｎａｒｄｓ  Ｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６８５４〜６８５８，１９８７）。しかし、ヒトｃ−ｅｒｂＢ／２は突然変異させられない。この遺伝子が、インビトロでヒトＴ細胞反応を生じるように思われる幾つかのエピトープを含有することが最近判明している（Ｄｉｓｉｓ  ＭＬ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０７１〜１０７６，１９９４）。やはり多くのヒト胸部腫瘍中に見い出される点突然変異したｐ５３癌遺伝子は細胞毒性Ｔ細胞の可能な標的であることが判明している（Ｙａｎｕｃｋ，Ｍ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３２５７〜３２６１，１９９３）。特異的な点突然変異を示すペプチドがヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）によってパルスされて、患者に再投与される臨床研究も現在開始されている。胸部癌ムチン，ＭＵＣ−１又はＤＦ３は胸部の分化抗原（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）を表す（Ａｂｅ  Ｍ．とＫｕｆｅ  Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９：２８２〜２８６，１９９３）。ＭＵＣ−１はある種類の正常上皮組織中に発現されるが、これは胸部癌組織中では特有にグリコシル化されるように思われる。ＭＵＣ−１ムチンのコアタンパク質のタンデム反復（ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ）は、胸部癌患者のリンパ節が非ＭＨＣ制限的にＭＵＣ−１ペプチドによって活性化されうるＴ細胞を含有すると言う点で、ヒトにおいて免疫原性であると報告されている（ＢａｒｎｄＤＬ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７１５９〜７１６３，１９８９）。卵巣癌患者がこの領域に対して抗体反応を示すことができることも判明している（Ｒｕｇｈｅｔｔｉ  Ａ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２４５７〜２４５９，１９９３）。ＭＵＣ−１遺伝子がワクシニアウイルスに挿入されている動物モデルが報告されている（Ｈａｒｅｕｖｅｎｉ  Ｍ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９４９８〜９５０２，１９９０；Ｈａｒｅｕｖｅｎｉ等，Ｖａｃｃｉｎｅ，９：６１８〜６２６，１９９１）。ＭＵＣ−１ペプチドがヒトＰＢＬによってパルスされる臨床試験は現在、胸部癌患者において行われている。癌療法の可能な標的を表す他のムチンは、ヒト胸部癌患者の約７０〜８０％に見い出されるＴＡＧ−７２である（Ｔｈｏｒ  Ａ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：３１１８〜３１２４，１９８６）。
癌抗原に対する有効な免疫感作の大抵の試みは全腫瘍細胞又は腫瘍細胞フラグメントを含んでいるが、悪性細胞を正常細胞から区別する特有の腫瘍抗原に対して特異的に免疫感作することが最も望ましい。Ｔリンパ球によって認識される腫瘍関連抗原の分子性質は充分に理解されていない。エピトープ又は完全（ｉｎｔａｃｔ）タンパク質を認識する抗体とは対照的に、Ｔ細胞は細胞表面のクラスＩ又はＩＩ主要組織適合（ＭＨＣ）分子上に存在する短鎖ペプチドフラグメント（８〜１８アミノ酸）を認識し、このようにして腫瘍関連抗原は提示され、Ｔ細胞によって認識されると思われる。
ＨＬＡ−Ａ２クラスＩ分子に関連してＴＩＬによって認識される黒色腫の腫瘍抗原をコードする幾つかの遺伝子が同定されている（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３５１５〜３５１９，１９９４；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３１２４〜３１２６，１９９４）。
ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）も、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌及び非スモール（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ）細胞癌を包含する、ある範囲のヒト癌の免疫療法の可能な標的分子を表す（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＰＦ等，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５３：８９２〜８９７，１９９３；Ｅｓｔｅｂａｎ  ＪＭ等，Ｃａｎｃｅｒ  ７４：１５７５〜１５８３，１９９４）。実験研究は、抗−ＣＥＡモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体がマウスにおいて免疫応答を誘出することができることを実証している（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｍ．等，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ．７：２８９〜３０２，１９９１）。この抗イディオタイプ抗体を用いる臨床研究は現在進行中である。ＣＥＡ遺伝子がワクシニアウイルス中に挿入されている組換えワクチンも開発されている（Ｋａｎｔｏｒ  Ｊ．等，Ｊ．Ｎａｔｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８４：１０８４〜１０９１，１９９２）。このワクチンを含むフェイズＩ臨床試験は丁度完成されたところである。
特有の腫瘍抗原を表す免疫優生ペプチドの同定は癌に対する免疫感作の新しい可能性を開示している。免疫優生ウイルスペプチドによる免疫感作がウイルス感染に対する保護を与えることができるウイルス特異的ＣＴＬを誘導することができることの実質的な証拠が動物モデルに存在する。純粋なペプチドのみではＴ細胞応答を刺激するのに効果がないが、アジュバント中に乳化した又は脂質と複合体化した（ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）ペプチドが新しいウイルスによるチャレンジに対してマウスをプライミングする（ｐｒｉｍｉｎｇ）ことが実証されており、このようなペプチドが、致死的なウイルス接種物からマウスを保護するウイルス特異的ＣＴＬを誘導することができる（Ｋａｓｔ，Ｗ．Ｍ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：２２８３〜２２８７，１９９１；Ｄｅｒｅｓ，Ｋ等，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：５６１〜５６４，１９８９；Ｇａｏ，Ｘ．Ｍ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３２６８〜３２７３，１９９１；Ａｉｃｈｅｌｅ，．Ｐ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：１８１５〜１８２０．１９９０；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｄ．Ｓ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３３３６〜３３４１，１９９２）。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓペプチドエピトープによって被覆された脾臓細胞に対するマウスの免疫感作も、培養中にエキスパンドされ（ｅｘｐａｎｄｅｄ）うるＬｉｓｔｅｒｉａ特異的ＣＴＬの形成を生じる。これらのＣＴＬの養子移入もマウスを致死的細胞チャレンジから保護することができる（Ｈａｒｔｙ，Ｊ．Ｔ．等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１５３１〜１５３８，１９９２）。完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中で乳化されたＨＩＶｇｐ１２０とｇｐ１６０の抗原エピトープを表すペプチドも特異的ＣＴＬ応答をプライミングすることができる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：３１０５〜３１０９，１９８８；Ｈａｒｔ，Ｍ．Ｋ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９４４８〜９４５２，１９９１）。
アジュバント中の又は脂質と複合体化したペプチドによる免疫感作はマウスにおけるＴ細胞応答を生じるが、この反応は一次脾臓細胞にＴ反応性細胞を誘導するほど強力であることは稀である。感作リンパ球の検出は殆ど常に二次インビトロ刺激を必要とする。
Ｂ７遺伝子ファミリーの発現はマウスとヒトの両方における抗腫瘍応答の重要な機構であることが実証されている。少なくとも２種類のシグナルが抗原担持標的細胞による未使用（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞の活性化のために必要であることが現在明らかになりつつある：Ｔ細胞受容体から供給される抗原特異的シグナルと、リンホカイン産物を生じる抗原独立性又は同時刺激性シグナル（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｋ．Ｅ．等，Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９０：２２５〜２３０，１９９３）。２種類の重要な同時刺激性分子は、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２８とＣＴＬＡ４のリガンドであるＢ７−１（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．Ｃｅｌｌ，７１：１０６５〜１０６８，１９９２；Ｃｈｅｎ，Ｌ．等，Ｃｅｌｌ，７１：１０９３〜１１０２，１９９２；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２７１４〜２７２２，１９８９；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６２５〜６３１，１９９１）と、ＣＴＬＡ４の代替リガンドであるＢ７−２（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：８１３〜９６０，１９９３）とである。現在までに、ネズミＢ７−１とＢ７−２（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６２５〜６３１，１９９１；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：８１３〜９６０，１９９５）とヒトＢ７−１とＢ７−２の両方が述べられている（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２７１４〜２７２２，１９８９；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：９０９〜９１１，１９９３）。Ｂ７−１とＢ７−２によって与えられる同時刺激性シグナルがＴ細胞活性化の機能的に異質の機構であるか又は余分な（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）機構であるのかはこの時点では不明である（Ｈａｔｈｃｏｃｋ，Ｋ．Ｓ．等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：６３１〜６４０，１９９４）。ネズミとヒトの大抵の腫瘍はＢ７−１又はＢ７−２を発現せず、このことは、腫瘍が可能な拒絶抗原（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）を発現する場合にも、抗腫瘍Ｔ細胞応答を活性化する見込みがないことを意味する。（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｋ．Ｅ．等，Ａｎｎａｌｓ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９０：２２５〜２３０，１９９３；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．等，Ａｎｎａｌｓ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９０：２４〜３１，１９９３）。実際に、１種類のみのシグナルがＴ細胞によって受容されることに起因してアネルギーが生じる可能性がある（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｋ．Ｅ．等，Ａｎｎａｌｓ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９０：２２５〜２３０，１９９３）。黒色腫細胞中へのＢ７のトランスフェクションはインビボにおいてネズミ黒色腫の拒絶を誘導することが判明した（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｓ．Ｅ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：３６８〜３７０，１９９３）。
ワクシニアウイルスはヒトに広範囲に用いられており、天然痘に対するワクチンに基づくワクシナ（ｖａｃｃｉｎａ）の使用はこの疾患の世界的な規模の根絶を生じている（参考文献のＭｏｓｓ，Ｂ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６６２〜１６６７，１９９１において調査）。ワクシニアウイルスは低コスト、熱安定性及び簡単な投与方法と言う利点を有する。他の疾患の予防のためにワクシニアウイルスベクターを開発しようと試みられている。
ワクシニアウイルスは細胞質ＤＮＡウイルスのポックス（ｐｏｘ）ウイルスファミリーの要素である。ＤＮＡ組換えはポックスウイルスの複製中に生じ、ＤＮＡをウイルスゲノムに挿入するために用いられている。組換えワクシニアウイルス発現ベクターは広範囲で述べられている。これらのベクターは多様な外来遺伝子産物に対して細胞免疫性を与えることができ、幾つかの動物モデルにおいて感染性疾患を予防することができる。組換えワクシニアウイルスは発現ベクターはヒトの臨床試験にも同様に用いられている。Ｃｏｏｎｅｙ等は３５人の健康なＨＩＶ血清陰性男性にＨＩＶのｇｐ１６０エンベロープ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスによって免疫感作した（Ｃｏｏｎｅｙ，Ｅ．，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３３７：５６７〜５７２，１９９１）。Ｇｒａｈａｍ等はｇｐ１６０ＨＩＶエンブロープタンパク質を含有する組換えワクシニアウイルス又は対照ワクシニアウイルスのいずれかを受容するように３６人の被験者を無作為に選別した（Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．Ｓ．等，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６６：２４４〜２５２，１９９２）。組換えワクシニアウイルスを用いたフェイズＩ研究が転移性黒色腫を有する患者においてｐ９７黒色腫抗原を発現する組換えウイルスを用いて開始されていて（Ｅｓｔｉｎ，Ｃ．Ｄ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：１０５２〜１０５６，１９８８）、進行した胸部癌、肺癌又は結腸直腸癌を有する患者におけるヒト癌胎児性抗原を発現する組換えワクシニアウイルスを用いるフェイズＩ試験は丁度完了したところである。これらの試験において、ワクシニアウイルスは皮内乱刺法によって投与され、局所皮膚刺激状態、リンパ節症及び一過性インフルエンザ様症状を含めた副作用は最小であった。
鶏痘及びカナリヤ痘（ポックス）はポックスウイルスファミリー（トリポックスウイルス遺伝子）の要素である。これらのウイルスはトリ細胞においてのみ複製することができ、ヒト細胞では複製することができない。これらは、宿主ゲノムに結合しない細胞質ウイルスであるが、真核細胞において多数の組換え遺伝子を発現することができる。
狂犬病糖タンパク質を発現する組換えトリポックスウイルスはマウス、ネコ及びイヌを生狂犬病ウイルスチャレンジから保護するのに用いられている。鶏と七面鳥のインフルエンザＨＡ抗原を発現する組換えトリポックスによる免疫感作は、インフルエンザウイルスによる致死的なチャレンジから保護した（Ｔａｙｌｏｒ等，Ｖａｃｃｉｎｅ，６：５０４〜５０８，１９８８）。カナリヤポックス被験者は１０５．５感染単位までの用量を受容した（Ｃａｄｏｚ  Ｍ．，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，３３９：１４２９〜１４３２，１９９２）。ＮＩＡＩＤによって支持された最近の試験（プロトコール０１２Ａ：ＨＩＶ−１非感染成人における生組換えカナリヤポックスーｇｐ１６０ＭＮ（ＡＬＶＡＣ  ＶＣＰ１２５  ＨＩＶ−１ｇｐ１６０ＭＮＯ）のフェイズＩ安全性及び免疫原性試験）では、患者はＨＩＶｇｐ１６０遺伝子を含有する組換えカナリヤポックスウイルスを筋肉内注射によって１０５．５ｐｆｕまでの用量で受容して、殆ど又は全く中毒を示さなかった（個人的な通信，Ｐ．Ｆａｓｔ．ＮＩＡＩＤ）。。
このように、トリポックスウイルスは体液免疫と細胞免疫の両方を刺激することができ、高い抗体価（１０９ｐｆｕ／ｍｌ）で経済的に製造されることができ、しかもヒト細胞を生産的に感染させることができず、それらの使用の安全性をかなり高めるので、トリポックスウイルスは免疫感作のために魅力的なビヒクルである。
トリポックスウイルスの他のかなりの利点は、ワクシニアウイルスとの交差反応性が殆ど又は全くなく、したがって、予めワクチン接種されたヒトが鶏痘ウイルスタンパク質に対して既存の免疫反応性を有さないことである。
【０００３】発明の概要
本発明は病原性疾患及び癌の予防と治療のための組換えウイルスベクターワクチンの組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は抗原（単数又は複数）をコードする遺伝子を含む組換えウイルスベクターと、免疫刺激性分子（単数又は複数）をコードする遺伝子（単数又は複数）を含む組換えウイルスベクターとの組成物に関する。これらの遺伝子は１つの組換えベクターに又は別々のウイルスベクターに挿入されることができる。本発明の他の態様は、免疫刺激性遺伝子（単数又は複数）を含有する組換えウイルスによるｉｎ  ｓｉｔｕ若しくはインビトロにおける疾患細胞の感染及び感染した細胞の宿主中への再導入によって、哺乳動物における疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）に対する免疫応答を強化することである。
【０００４】発明の詳細な説明
本発明は、疾患原因（病因）物質（ｄｉｓｅａｓｅ  ｃａｕｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）又は疾患状態からの抗原（単数又は複数）を発現する新規な組換えウィルスと、免疫刺激性分子（単数又は複数）を発現する組換えウィルスとの組成物であり、又は同じベクター組成物中に挿入された両分子をコードする遺伝子は、疾患を予防又は治療するためにＴ依存性抗原又は抗体に対する哺乳動物における免疫応答を誘出する及び／又はアップレギュレーティング（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）することができる。本発明の組成物は細胞仲介免疫性並びに抗体のアップレギュレーティングに特に重要である。
細胞仲介免疫性は癌及び病原性微生物、特に、ウィルスその他の細胞内微生物によって惹起される疾患に耐えるために非常に重要である。本発明の組成物は疾患状態の細胞からの抗原をコードする遺伝子をそのゲノムに又はその一部に組み入れた第１の組換えウィルスと、１以上の免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝子または同じベクター中に挿入された両分子をコードする遺伝子を有する第２の組換えウイルスとを有する。両方の組換えウィルスによって感染された宿主細胞は、疾患原因物質からの両抗原（単数または複数）を発現し、免疫刺激性分子（単数又は複数）を発現する。この抗原は感染宿主細胞の細胞表面に発現されることができる。免疫刺激性分子は細胞表面に発現されるか又は宿主細胞によって実際に分泌されることができる。
抗原と免疫刺激性分子の両方の発現は、特異的Ｔ細胞に対して必要なＭＨＣ制限ペプチドを与え、Ｔ細胞に適当なシグナルを与えて、抗原特異性Ｔ細胞の抗原認識、増殖又はクローンエキスパンジョン（ｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を助成する。総合的な結果は免疫系のアップレギュレーション（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）である。好ましい実施態様では、免疫応答のアップレギュレーションは、疾患原因物質又は疾患原因物質によって感染した細胞を殺すか又はその成長を抑制することができる抗原特異性Ｔヘルパーリンパ球及び／又は細胞毒性リンパ球の増加である。
１実施態様では、この組成物はウイルスゲノム又はその一部及び病原性微生物からの抗原をコードする核酸配列を含む組換えウイルスと、１種以上の免疫刺激性分子をコードする１種以上の核酸配列をコードする組換えウイルスとを含む。
別の実施態様では、この組成物はウイルスゲノム又はその一部及び腫瘍関連抗原をコードする核酸配列を含む組換えウイルスと、１種以上の免疫刺激性分子をコードする１種以上の核酸配列をコードする組換えウイルスとを含む。
１実施態様では、これらの組換えウイルスはサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−２）と同時刺激性及び補助的分子（Ｂ７−１、Ｂ７−２）とを単独で又は多様な組合せで発現するように構築されている。免疫刺激性分子とモデルＴＡＡとをウイルス複製／感染の部位（いずれにせよ、ＴＡＡ産生部位）で同時に産生することは特異的エフェクターの発生を増強する。これらの特異的免疫刺激性分子に依存して、種々な機構が免疫原性強化：ヘルプシグナル（ＩＬ−２）の増強、プロフェッショナルＡＰＣ（ＧＭ−ＣＳＦ）の補充、ＣＴＬ頻度（ＩＬ−２）の増加、抗原プロセッシング（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）経路及びＭＨＣ発現（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）への影響等の原因になると考えられる。少なくとも１種の免疫刺激性分子と一緒のモデル抗原の同時発現は動物モデルにおいて抗腫瘍効果を実証するために有効である。
場合によっては、多価ワクチンを得るために問題の抗原を１種類より多く含む組換えウイルスを形成することが有利である。例えば、組換えウイルスはウイルスゲノム又はその一部と、ＧＰ１２０（ＨＩＶから）をコードする核酸配列と、Ｈｅｐ  Ｂ表面抗原をコードする核酸配列とを含むことができる。
１実施態様では、この組成物はワクシニアウイルスゲノム又はその一部と、ＣＥＡをコードする核酸配列とを含む組換えウイルスと、免疫刺激性分子、Ｂ７．１をコードする核酸配列を単独で又は免疫刺激性分子、Ｂ７．２をコードする核酸配列と組合せて含む組換えウイルス、又は腫瘍抗原の遺伝子と免疫刺激性分子の両方を含有する組換えウイルスとを含む。
本発明はまた、ウイルスゲノム又はその一部と、１種以上のＢ７分子をコードする１種以上の核酸配列とを含む組換えウイルス、好ましくはＢ７−１及び／又はＢ７−２を発現する組換えワクシニアウイルスをも含む。これらの組換えウイルスによる腫瘍細胞の迅速な感染は、ワクシニアがこれらのタンパク質を確実に発現することができ、機能的な分子であることを実証する。これらの組換え分子を発現する弱免疫原性シンゲニック（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）腫瘍は免疫適格性宿主によって拒絶される。
特定の実施態様では、組換えウイルスはＢ７．１を含有する組換えワクシニアウイルスと、Ｂ７．２を含有する組換えワクシニアウイルスである（それぞれ、ｒＶ−Ｂ７−１とｒＶ−Ｂ７−２と名付けられる）。
１実施態様では、この組成物はｒＶ−Ｂ７−１および／またはｒＶ−Ｂ７−２とをｒＶ−ＣＥＡと組み合わせて含む。Ｂ８７分子は、非限定的に、Ｂ７−１、Ｂ７−２等と、これらの類似体を包含する。Ｂ７遺伝子は非限定的に、好ましくはネズミ又はヒト供給源から、哺乳動物組織、ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを含めた、哺乳動物供給源からクローン化されることができる。
【０００５】ウイルスベクター
本発明に使用可能であるウイルスは、ゲノムの一部が欠失して、ウイルスの伝染力を損なわずに、新しい遺伝子を導入することができるようなウイルスである。本発明のウイルスベクターは非病原性ウイルスである。１実施態様では、ウイルスベクターは哺乳動物の特定の細胞タイプに対する向性を有する。他の実施態様では、本発明のウイルスベクターは例えば樹枝状細胞及びマクロファージのようなプロフェッショナル抗原提示細胞を感染させることができる。本発明のさらに他の実施態様では、ウイルスベクターは哺乳動物の任意の細胞を感染させることができる。ウイルスベクターは腫瘍細胞をも感染させることができる。
本発明のウイルスは非限定的に例えばワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、非常に弱められたワクシニアウイルス（ＭＶＡ）、アデノウイルス、バキュロウイルス等を包含する。
ワクシニアウイルスゲノムは技術上周知である。これはＨＩＮＤ  Ｆ１３Ｌ領域と、ＴＫ領域と、ＨＡ領域とから成る。組換えワクシニアウイルスは外因性遺伝子産物の発現のために外因性遺伝子を組み込むために当該技術分野で用いられている（Ｐｅｒｋｕｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：９８１〜９８４，１９８５；Ｋａｕｆｍａｎ等，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４８：９００〜９０７，１９９１；Ｍｏｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６６２，１９９１）。
疾患状態又は疾患原因物質の抗原をコードする遺伝子をＨＩＮＤ  Ｆ１３Ｌ領域に組み入れるか、又はこの代わりに、組換えワクシニアウイルスベクターのＴＫ領域又はワクシニアウイルスゲノムの非本質的領域に組み入れることができる。同様に、免疫刺激性分子をコードする遺伝子をＨＩＮＤ  Ｆ１３Ｌ領域に又は組換えワクシニアウイルスベクターのＴＫ領域に組み入れることができる。
ＳｕｔｔｅｒとＭｏｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：１０８４７〜１０８５１，１９９２）とＳｕｔｔｅｒ等（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９４）とは、本発明にウイルスベクターとして使用可能である、非複製組換えＡｎｋａｒａウイルス（ＭＶＡ、修飾ワクシニアＡｎｋａｒａ）の構成とベクターとしての使用とを開示している。
ＢａｘｙとＰａｏｌｅｔｔｉ（Ｖａｃｃｉｎｅ，１０：８〜９，１９９２）は本発明にウイルスベクターとして使用可能である、カナリヤポックスウイルス、鶏痘ウイルス及び他のトリ種を包含する非複製ポックスウイルスの構成とベクターとしての使用とを開示している。
本発明における使用に適切な発現ベクターは、機能的に核酸配列に連結した少なくとも１種の発現制御要素を含む。この発現制御要素は核酸配列の発現を制御し、調節するためにベクターに挿入される。発現制御要素の例は、非限定的に、ｌａｃ系、ファージラムダのオペレーター領域とプロモーター領域、酵母プロモーター及びポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス又はＳＶ４０に由来するプロモーターを包含する。付加的な好ましい又は必要とされる機能的要素の例は、非限定的に、リーダー配列、停止コドン、ポリアデニル化シグナル、及び宿主系の核酸配列の適当な転写とその後の翻訳のために必要な又は好ましい他の配列を包含する。必要な又は好ましい発現制御要素の適切な組合せが選択された宿主系に依存することは理解されるであろう。さらに、発現ベクターが宿主系の核酸配列含有発現ベクターの転移とその後の複製のために必要な付加的要素を含有すべきであることは当業者により理解されるであろう。このような要素の例は、非限定的に、複製起点と選択可能なマーカーを包含する。このようなベクターが慣用的な方法［“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州，ニューヨーク）におけるＡｕｓｕｂｅｌ等（１９８７）］を用いて容易に構築されるか又は商業的に入手可能であることは、当業者によって理解されるであろう。
【０００６】疾患原因物質
本発明の組み換えウイルスは、疾患原因物質によって惹起される疾患の治療と予防に有用である。各疾患原因物質又は疾患状態は、それと共に抗原又は抗原上の免疫優生エピトープを付随しており、これらは免疫認識と、宿主における疾患誘発因子又は疾患状態の究極的な除去と制御とに非常に重要であり、時には当該技術分野で保護抗原と呼ばれる。宿主免疫系は、関連する疾患原因物質に対する体液及び／又は細胞の免疫応答を開始させるために、抗原又は抗原上の免疫優生エピトープと接触しなければならない。
本発明の組成物は、１種以上の単離抗原又は免疫優生エピトープをコードする１種以上の核酸配列を含む本発明の組換えウイルスと、１種以上の免疫刺激性分子を含む第２の組換えウイルスとを含む。
このような疾患誘発因子は、非限定的に、癌及び病原性微生物を包含する。本発明の組換えウイルスを用いて治療することができる癌は、非限定的に、原発性又は転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホドキンス（Ｈｏｄｇｋｉｎｓ）リンパ腫、ホドキンス（Ｈｏｄｇｋｉｎｓ）リンパ腫、白血病、子宮癌、例えば胸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌等のような腺癌を包含する。
上記癌は本出願に述べた方法によって評価し、又は治療することができる。癌の場合には、癌に関連した抗原をコードする遺伝子を組換えウイルスゲノム又はその一部に、１種以上の免疫刺激性分子をコードする遺伝子と共に組み入れる。或いは、癌に関連した抗原をコードする遺伝子と、１種以上の免疫刺激性分子をコードする遺伝子とを別々の組換えウイルス中に組み入れる。癌に関連した抗原は癌細胞の表面に発現されるか又は内部抗原であることもできる。１実施態様では、癌に関連した抗原は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又はその一部である。本発明に使用可能であるＴＡＡの例は、非限定的に、黒色腫ＴＡＡを包含し、これは非限定的にＭＡＲＴ−１（Ｋａｗａｋａｍｉ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７〜３５２，１９９４）、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＰ−１００（Ｋａｗａｋａｍｉ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：６４５８〜６４６２，１９９４）、ＣＥＡ及びチロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ等，Ｊ．Ｅｘｄ．Ｍｅｄ．１７８：４８９，１９９３）を包含する。
他の実施態様では、ＴＡＡはＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、点突然変異ｒａｓ癌遺伝子、点突然変異ｐ５３癌遺伝子（膵臓癌）、ＣＡ−１２５（卵巣癌）、ＰＳＡ（前立腺癌）、ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２（胸部癌）等（Ｂｏｏｎ等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：３３７，１９９４）である。
本発明は、上でリストされたＴＡＡをコードする遺伝子に決して限定されない。例えば米国特許第４，５１４，５０６号に記載される公知の方法により、他のＴＡＡを同定、単離、およびクローン化してよい。
病原性微生物である疾患原因（病因）物質の抗原をコードする遺伝子は、ウイルス、例えばＨＩＶ（ＧＰ−１２０，ｐ１７，ＧＰ−１６０抗原）、インフルエンザ（ＮＰ，ＨＡ抗原）、単純ヘルペス（ＨＳＶｄＤ抗原）、ヒトパピローマウィルス、ウマ脳炎ウイルス、肝炎（Ｈｅｐ  Ｂ表面抗原）等を含む。病原性細菌は、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、レジュネラ（Ｌｅｇｉｏｎｉｅｌｌａ）等を含むが限定されない。病原性原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａｎｓ）は、マラリア、バベシア、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ）等を含むが限定されない。病原性酵母はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、侵入性カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）等を含むが限定されない。好ましい態様において、病原性微生物は細胞内生物である。
免疫刺激分子：共同刺激／アクセサリー分子およびサイトカイン
共同刺激／アクセサリー分子からの遺伝子および／またはサイトカインをコードする遺伝子を組換え体ウイルスのゲノムに挿入する。共同刺激分子の例は、Ｂ７−１，Ｂ７−２，ＩＣＡＭ−１，ＬＦＡ−３，ＣＤ７２等を含むが限定されない。本発明により包含されるサイトカインの例は、ＩＬ−２，ＧＭ−ＣＳＦ，ＴＮＦα，ＩＦＮγ，ＩＬ−１２，ＲＡＮＴＥＳ等を含むが限定されない。
ＩＬ−２コンストラクト
本発明のＩＬ−２遺伝子は、タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）ら（Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：３０５，１９８３）により開示されるとおりにして作成した。
Ｂ７コンストラクト
Ｂ７ファミリー（例えばＢ７．１，Ｂ７．２およびたぶんＢ７．３）の共同刺激性分子は、より最近に発見された重要なグループの分子を意味する。Ｂ７．１およびＢ７．２は共にＩｇ遺伝子スーパーファミリーの一員である。これらの分子は、マクロファージ、樹状細胞、単球、即ち抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在する。白血球が抗原のみと遭遇して、Ｂ７．１による共同刺激を伴えば、アネルギーまたはアポトーシス（プログラムされた細胞死）のいずれかを伴い応答し；共同刺激シグナルが提供されたなら、標的抗原に対するクローンの増殖と共に応答する。与えられた抗原に対する免疫応答の顕著な増大は共同刺激なしでは生じない（ジュン（Ｊｕｎｅ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １５：３２１−３３１，１９９４；チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １４：４８３−４８６；タウンゼンド（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：３６８−３７０）。フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２７１４−２７２２，１９８９）は、Ｂ７．１遺伝子のクローニングおよび配列決定を報告する。アズマ（Ａｚｕｍａ）ら（Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：７６−７９，１９９３）は、Ｂ７．２遺伝子のクローニングおよび配列決定を報告する。
ひとつの態様において、Ｂ７．１遺伝子またはＢ７．２遺伝子をワクシニアウイルスに挿入した。もうひとつの態様において、ＣＥＡ遺伝子およびＩＬ−２遺伝子を共に単一のワクシニアウイルスに挿入した。ｒＶ−ＣＥＡ／ｎＩＬ−２（ＡＴＣＣ名称ＶＲ  ２４８０），ｒＶ−ＣＥＡ−Ｔ１０８（ＡＴＣＣ名称Ｎｏ．ＶＲ２４８１），ｒＶ−ｍＢ７−２（ＡＴＣＣ名称ＶＲ２４８２）；およびｒＶ−ｍＢ７−１（ＡＴＣＣ名称ＶＲ２４８３）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ），１２３０１  パークロウンドライブ、ロックビル、メリーランドに１９９４年１０月３日ブダペスト条約の条件下で寄託した。
本発明は、本明細書に開示された疾患原因（病因）物質により引き起こされた疾患または疾患状態を治療または予防するための方法も包含する。
治療法において、本発明の組換えウイルスまたは組換えウイルスの組成物の投与は、「予防」または「治療」目的のいずれかでありうる。予防を提供する場合、本発明の組換えウイルスまたは本発明の組換えウイルスの組成物は、あらゆる兆候に先立って提供される。組換えウイルスまたは組換えウイルス組成物の予防投与は続いて起こるあらゆる感染または疾患を予防または改良するように作用する。治療を提供する場合、組換えウイルスまたは１より多くの組換えウイルスの組成物を感染または疾患の兆候の開始時（または直後）に提供する。即ち、本発明は疾患原因因子への予想される暴露または疾患状態前、または感染または疾患の開始後のいずれかに提供されうる。
腫瘍特異的抗原の遺伝的定義は癌治療のための標的抗原特異的ワクチンの開発につながる。免疫刺激性分子を含む組換えウイルスと組み合わせてウイルスゲノム中に腫瘍抗原遺伝子を挿入することは、癌の進行の危険が増大した患者における予防（予防免疫）、最初の外科手術後の疾患再発の予防（抗−転移予防接種）に関して、またはインビボにおいてＣＴＬの数を増やして、即ち拡散性腫瘍の根絶に関する効果を改良するための（確立された疾患の治療）道具として、特定の免疫応答を引き出すための強力なシステムである。最終的に、本発明の組換えウイルスまたは組成物は、腫瘍運搬物に戻される前にエクスビボにおいて高められた患者の免疫応答を引き出すことができる（養子免疫治療）。
接種物に関する単語「ユニット投薬量」は、哺乳動物のための単位投薬量として適切な物理的に別個のユニットを意味し、各ユニットは必要な希釈剤との関連において所望の免疫効果を生ずるように計算された予め決定された量の組換えウイルスを含む。本発明の接種物の新規なユニット投薬量に関する詳細は、組換えウイルスの独特な特徴および達成される特定の免疫効果により指令され、そしてそれに依存する。
接種物は、典型的には許容される（受容可能な）希釈剤、例えば、塩水、リン酸緩衝食塩水または他の生理学上許容される希釈剤等中の溶液として調製されて、水性薬剤組成物を形成する。
接種のルートは、静脈（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、皮下（Ｓ．Ｃ．）、内皮（Ｉ．Ｄ．）等でありえ、疾患原因物質に対する保守的免疫応答を引き出す。投薬量は少なくとも一回投与される。次の投薬量は示唆されたとおりに投与される。
本発明の組換えウイルスの哺乳動物、好ましくはヒトへの提供において、投与された組換えウイルスの投薬量は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、通常の医学的条件、以前の病歴、疾患の進行、腫瘍の重さ等の因子に依存して変更される。
通常、約１０５から約１０１０プラーク形成ユニット／ｍｇ哺乳動物の範囲の投薬量で組成物中の各組換えウイルスを受容者に提供するのが望ましいが、より低いかまたは高い投薬量を投与してよい。
組換えウイルスベクターの組成物は、癌例えば黒色腫（メラノーマ）のあらゆる兆候に先立つか、または癌例えば黒色腫（メラノーマ）に悩まされる哺乳動物における疾患の間接（ｍｅｄｉａｔｅ）退向に先立って、哺乳動物に導入されうる。哺乳動物に組成物を投与するための方法の例は、エクスビボにおける組換えウイルスへの細胞の暴露、または影響された組織への組成物の注射またはウイルスの皮下、Ｓ．Ｃ．，Ｉ．Ｄ．またはＩ．Ｍ．投与を含むが限定されない。別法として、組換えウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターの組み合わせは、癌様病巣への直接の注射かまたは薬学上受容可能なキャリアー中での局所適用により局在投与してよい。投与されるひとつまたはそれ以上のＴＡＡの核酸配列を運ぶ組換えウイルスベクターの量はウイルス粒子の力価に基づく。投与される免疫原の好ましい範囲は哺乳動物、好ましくはヒトあたり１０５から１０１０ウイルス粒子である。
ひとつまたはそれ以上のＴＡＡの核酸配列を運ぶ第１の組換えウイルスベクターとひとつまたはそれ以上の免疫刺激性分子の核酸配列を運ぶ第２の組換えウイルスベクターの組み合わせを用いる場合、哺乳動物は異なる比の第１および第２組換えウイルスベクターで免疫されてよい。一つの態様において、第１ベクターの第２ベクターに対する比は、約１：１、または約１：３、または約１：５である。第２ベクターに対する第１ベクターの最適な比は本明細書に記載される方法を用いて力価測定される。
免疫後、ワクチンの効果は特異的溶解活性または特異的サイトカイン生成によるかまたは腫瘍退向により評価されるとおり、抗原を認識する抗体または免疫細胞の生成により評価されうる。当業者であれば、上記パラメーターを評価するための慣用的方法を知るはずである。免疫される哺乳動物が既に癌または転移性癌に罹患しているなら、他の治療処置と共にワクチンを投与することができる。
一つの処置法において、自己の細胞毒性白血球または腫瘍浸潤白血球を癌患者から得てよい。白血球を培養により成長させて、特異的抗原およびサイトカインの存在下で培養することにより抗原特異的白血球を増やす。次に、抗原特異的白血球を自己輸血により患者に戻す。
本発明は、組換えウイルス中の免疫刺激性分子例えばＢ７と共に、組換えウイルス中の効果的な量の抗原を哺乳動物に投与することにより、抗原特異的Ｔ−細胞応答を高めるための方法を包含する。この免疫アプローチは、Ｂ７共同刺激性分子により共同刺激と共に抗原により生じた免疫応答を増加させるかまたは増大する。抗原を含有する組換えウイルスおよびＢ７を含有する組換えウイルスの投与法は、増加した抗原特異的白血球増殖、高められた細胞溶解活性およびいずれかの組み換えウイルス単独のみの使用との比較の上での抗原に対する免疫性の延長をもたらす。抗原特異的Ｔ−細胞応答を増大させる方法のひとつの態様において、哺乳動物、好ましくはヒトをｒＶ−ＴＡＡおよびｒＶ−Ｂ７で免疫する。ｒＶ−Ｂ７に対するｒＶ−ＴＡＡの比は、抗原特異的Ｔ−細胞応答を最大にするために変更されうる。ｒＶ−ＴＡＡのｒＶ−Ｂ７に対する比は１：１、２：１、３：１、４：１等を含むが限定されない。治療の効果はインビトロおよび／またはインビボにおいて抗原特異的白血球増殖、抗原特異的細胞溶解活性、腫瘍退向等により監視されうる。
任意の量のｒＶ−Ｂ７の抗原への添加は比にかかわらず改良された細胞免疫をもたらす。しかしながら、ｒＶ−Ｂ７に対する抗原の最適な比は興味のある抗原各々に関して決定される。ひとつの態様において、ｒＶ−Ｂ７にｒＶ−ＣＥＡを用いた場合、抗原特異的白血球増殖性、細胞溶解性かつ腫瘍退向性のＣＥＡ特異的応答において最大の増加をもたらす比は３：１であった。
抗原特異的Ｔ−細胞応答を増大させる方法はあらゆる抗原に関して使用される。特に興味があるのは、腫瘍関連抗原および感染性因子の抗原である。抗原特異的Ｔ−細胞応答を増大させるためのひとつの方法において、ｒＶ−ＣＥＡおよびｒＶ−ヒトＢ７−１を最適比でＣＥＡ陽性癌腫（カルシノーマ）を有する患者に投与して、ＣＥＡ陽性癌腫（カルシノーマ）の軽減または排除をもたらすＣＥＡ特異的Ｔ−細胞応答を刺激する。抗原特異的Ｔ−細胞応答を増大させるためのもうひとつの方法において、ｒＶ−ｇｐ１２０またはその一部およびｒＶ−ヒトＢ７−１を、ｇｐ１２０陽性細胞の減少または排除をもたらすｇｐ１２０特異的Ｔ−細胞応答を刺激する比で、ｇｐ１２０陽性細胞を有する患者に投与する。
本発明は、組み合わせ治療も包含する。組み合わせ治療によりとは、ひとつまたはそれ以上の疾患因子に関連したひとつまたはそれ以上の抗原をコードするひとつまたはそれ以上の遺伝子を含む組換えウイルスおよびひとつまたはそれ以上の免疫刺激性分子をコードするひとつまたはそれ以上の遺伝子を含む組換えウイルスまたは同じベクターに挿入された両タイプの遺伝子の組成物を、他の外因性免疫変調剤または免疫刺激性分子、化学療法薬剤、抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス薬等の単独またはその組み合わせと共に患者に投与することを意味する。他の外因的に付加される因子の例は、外因性ＩＬ−２、ＩＬ−６、インターフェロン、腫瘍壊死因子、シクロホスファミドおよびシスプラチナム、ガンシクロビア、アンフォテリシンＢ等を含む。
本発明の他の側面は、ｉｎ  ｓｉｔｕまたはインビトロにおいて癌細胞が組換えウイルスまたは組換えウイルスの組み合わせに感染した場合の癌の治療法である。免疫刺激性分子と共に腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞を、癌罹患哺乳動物において腫瘍の減少または除去をもたらすのに効果的な量で哺乳動物に投与する。
本発明は、さらに、本発明の組換えウイルスを用いた免疫により引き出されたひとつまたは複数の抗体を含む。抗体は、興味のある抗原に特異性を有し、そして反応または結合する。本発明のこの態様において、抗体はモノクローナルまたはポリクローナル起源である。
例示される抗体分子は、完全なイムノグロブリン分子、実質的に完全なイムノグロブリン分子、またはＦ（ａｂ），Ｆ（ａｂ’）；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として当業界において知られているイムノグロブリン分子の部分を含む、抗原結合部位を含むイムノグロブリン分子の部分である。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、当業界において公知の方法により生成される（コーラーとミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７；キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）「モノクローナル抗体技術、げっ歯類およびヒトのハイブリドーマの生成および特徴」、バードン（Ｂｕｒｄｏｎ）ら編（１９８５）「生化学および分子生物学における実験室技術」、１３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，アムステルダム）。抗体または抗原結合断片は遺伝子工学により生成してもよい。大腸菌における重鎖および軽鎖両者の発現技術はＰＣＴ特許出願：国際公開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３およびＷＯ９０１４４２４およびヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１の主題である。
一つの態様において、本発明の抗体はイムノアッセイに使用することにより生物学上のサンプル中の興味ある新規抗原を検出する。
一つの態様において、ＣＥＡ発現組換えワクシニアウィルスおよびＢ７．１発現組換えワクシニアウイルスを含む組成物を用いた免疫により生じた本発明のＣＥＡ抗体を使用することにより、免疫細胞化学を用いてＣＥＡ発現癌に罹患した哺乳動物の組織検体からのＣＥＡ抗原の存在を評価する。疾患組織中のＣＥＡ抗原の描写のそのような評価を用いることにより、疾患に罹患した哺乳動物における疾患の進行または免疫治療の効果を予測することができる。免疫組織化学に関する慣用的方法は、ハローとレーン（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ）（編）（１９８８）「抗体実験室マニュアル」中、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク；アウスベル（Ａｕｓｂｅｌ）ら（編）（１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（ニューヨーク、ニューヨーク）に記載されている。
他の態様において、本発明の抗体は免疫治療に用いられる。本発明の抗体は受動免疫治療に用いられる。
抗体または抗原結合断片を受容哺乳動物好ましくはヒトに提供する際、投与された抗体または抗原結合断片の投薬量は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、通常の医学的条件、以前の医学的条件等の因子に依存して変更される。
本発明の抗体または抗原結合断片は、疾患または感染の重度、範囲または期間を予防し、減らし、または弱めるのに十分な量で受容者に提供されることを意図する。
抗イディオタイプ抗体は、通常は免疫応答の途中にでき、そしてその抗イディオタイプ抗体の一部分は、元の免疫応答を誘発したエピトープに似ている。本発明においては、その結合部位が疾患状態の抗原を反映している抗体のイムノグロブリン遺伝子又はその一部分が、ウイルスゲノムのゲノム又はその一部分の中に、単独で又は免疫刺激性分子の遺伝子若しくはその一部分と組み合わさって組み込まれているので、その結果できた組換えウイルスは、その抗原への細胞性及び体液性免疫応答を引き出すことができる。
【０００７】                    実施例１
ｒＶ−Ｂ７−１及びｒＶ−Ｂ７−２の
構築及び構築体の特性決定
材料及び方法
組換えワクシニアウイルス
マウスＢ７−１の全縁オープンリーディングフレームをコードする１，１２５ｂｐＤＮＡ断片及びマウスＢ７−２の全縁オープンリーディングフレームをコードする９４２ｂｐＤＮＡ断片を、逆転写酵素ＰＣＲ（Ｇｅｎｅａｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）により、マウスＢ細胞系，Ａ２０（ＴＩＢ２０８，ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から抽出した全ＲＮＡから増幅した。それらＢ７挿入物の配列は、公表された配列と同一であることが分かった（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６２５−６３１，１９９１；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：８１３−９６０，１９９３）。それらＤＮＡ断片を、組換えウイルスの選択のための大腸菌ＬａｃＺ遺伝子を含有する、Ｔｈｅｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）により提供されたワクシニアウイルス運搬ベクターＰＴ１１６のＫｐｎ−１／Ｘｈｏ−１制限酵素部位に別々に連結した。組換えウイルスを先に記載された通りに誘導した（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｈ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ４８：９００−９０７，１９９１）。組換えクローンを５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−Ｇａｌ）の存在下でのＢＳＣ−１細胞（ＣＣ１２６，ＡＴＣＣ）での増殖により選択した。適切な青色の組換えクローンを５ラウンドのプラーク精製により精製してより高い力価の溶解産物の中に増殖させた。接種用のウイルスをＨｅＬａ細胞の攪拌培養液中で増殖させ、遠心分離により直接沈澱させ、そして２０％〜４０％ショ糖勾配で精製した（Ｍｏｓｓ，Ｂ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２．１６．１５．１−１６．１８．９，１９９３）。
【０００８】組換えウイルスの特性決定
ＤＮＡ組換えのサザーン分析
組換えワクシニアゲノムを、ウイルスＤＮＡ抽出、ＨｉｎｄＩＩＩでの制限エンドヌクレアーゼ消化、及びサザーンブロッティングにより、先に記載された通りに分析した（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｈ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４８：９００−９０７，１９９１）。
【０００９】タンパク質発現のウェスタン分析
集密ＢＳＣ−１細胞に野生型ワクシニアウイルス又はマウスＢ７−１若しくはＢ７−２遺伝子を含有する組換えワクシニアウイルス（Ｖ−Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ−Ｂ７−１又はｒＶ−Ｂ７−２と命名した）のいずれかを１０のＭＯＩで４時間感染させた。タンパク質を抽出して先に記載された通りに分析した（Ｋａｎｔｏｒ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８４：１０８４−１０９１，１９９２）。ウェスタンブロットを抗Ｂ７−１（精製ラット抗マウスＢ７／ＢＢ１）又は抗Ｂ７−２（ラット抗マウスＢ７−２（ＧＬ−１））モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共にインキュベートしてから、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ，Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と結合したヤギ抗ラットと共にインキュベートし、そしてメーカーの使用説明書に従って発色させることにより、組換えＢ７−１又はＢ７−２タンパク質を検出した。
【００１０】タンパク質発現の蛍光分析
集密ＢＳＣ−１細胞にＶ−Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ−Ｂ７−１又はｒＶ−Ｂ７−２のいずれかを１０ＭＯＩで２時間感染させた。感染後３〜６時間で細胞を採取して精製ラット抗マウスＢ７／ＢＢ１−ＦＩＴＣ又はラット抗マウスＢ７−２（ＧＬ−１）−ＦＩＴＣモノクローナル抗体で免疫染色した。細胞をフローサイトメトリ（ＦＡＣＳＣＡＮ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）により分析した。
【００１１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
ＭＣ３８マウス間代性（ｃｌｏｎｉｃ）アデノカルチノーマ細胞系（Ｆｏｘ，Ｂ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  ９：４９９−５１１，１９９０）をＤｒ．Ｓｔｅｖｅ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）の研究室により供与された。ＭＣ３８細胞にＶ−Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ−Ｂ７−１又はｒＶ−Ｂ７−２のいずれかを０．２５ＭＯＩで１時間感染させ、洗浄し、そしてＨＢＳＳ中に３×１０６細胞／ｍｌの濃度で懸濁させた。メスＣ５７ＢＬ／６マウスをＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から得た。６〜８週齢のマウスに１００μｌ（３×１０５感染細胞）の皮下注射を右側腹部に行った。対照マウスには、未感染ＭＣ３８細胞を注射した。少なくとも４０日間腫瘍ができなかったマウスに３×１０５未感染細胞で反対の側腹部を誘発した。平行実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをγ線照射（５００ｒａｄ）して、２４時間後に未感染ＭＣ３８細胞、又は０．２５ＭＯＩ  Ｖ−Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ−Ｂ７−１若しくはｒＶ−Ｂ７−２のいずれかを感染させた細胞を注射した。腫瘍をハサミ尺により２次元で測定して、先に記載された通りにその体積を計算した（Ｋａｎｔｏｒ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔ．８４：１０８４−１０９１，１９９２）。
【００１２】                                実施例２組換えウイルスの発生及び特性決定
マウスＢ７−１及びＢ７−２のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡ断片を、Ｂ７−１特異性オリゴヌクレオチドプライマー５’ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＴＴＧＣＡＡＴＴＧＴＣＡＧＴＴＧ３’（配列番号：１）、５’ＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＣＴＧ３’（配列番号：２）、及びＢ７−２特異性プライマー５’ＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣＡＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣ３’（配列番号：３）、５’ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣ３’（配列番号：４）を用いる逆転写酵素ＰＣＲにより得て、ワクシニアウイルス運搬ベクターＰＴ１１６内に連結した。このベクターは、挿入した遺伝子産物の合成を誘発するために多クローニング部位の上流に強力なワクシニアウイルス即時初期プロモーター（Ｐ４０と命名した）を含有する。Ｂ７ＤＮＡ断片の連結及び方向、並びにプロモーター位置をＰＣＲ及び配列決定法により確かめた。このキメラベクター構築体をワクシニアゲノミックＨｉｎｄＩＩＩＭ部位内に先に報告された通りの相同組換えにより挿入し（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｈ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４８：９００−９０７，１９９１）、そしてプローブとしての３２Ｐ放射標識Ｂ７−１又はＢ７−２ＤＮＡでのサザーン分析により確認した（データは示していない）。ワクシニアウイルスクローン内のＢ７−１及びＢ７−２の全縁ｃＤＮＡ配列は、公表された配列と同一であることが分かった（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ，Ｍｅｄ．１７４：６２５−６３１，１９９１；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：８１３−９６０，１９９３）。
組換えタンパク質の発現をｒＶ−Ｂ７−１又はｒＶ−Ｂ７−２感染ＢＳＣ−１細胞からのタンパク質抽出物のウェスタン分析により確認した。これら細胞は、組換えワクシニア産物の評価用に定型的に用いられる（Ｍｏｓｓ，Ｂ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２．１６．１５．１−１６．１８．９，１９９３）。ラット抗マウスモノクローナル抗体Ｂ７−ＢＢ１とのｒＶ−Ｂ７−１感染細胞からのタンパク質抽出物ブロットのインキュベーションで、幅広い５０〜９０ｋＤバンドが現れた。同じく、ラット抗マウスモノクローナル抗体Ｂ７−２（ＧＬ−１）とのｒＶ−Ｂ７−２感染細胞からのタンパク質抽出物ブロットのインキュベーションで、６５〜１００ｋＤの範囲のバンドが現れた（データは示していない）。これは、Ｎ−結合グリコシル化の結果としての雑多な糖タンパク質として現れるこれら分子の見掛けの分子量を示す報告と一致している（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．Ｃｅｌｌ  ７１：１０６５−１０６８，１９９２；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６２５−６３１，１９９１；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：８１３−９６０，１９９３）。未感染又はＶ−Ｗｙｅｔｈ感染細胞は、Ｂ７−１及びＢ７−２の両方の発現について陰性であった。
Ｂ７−１又はＢ７−２組換えタンパク質の細胞表面発現をフローサイトメトリにより検査した。図１Ａは、未感染ＢＳＣ−１細胞（図１Ａ）がＢ−７（ＢＢ１）又はＢ７−２（ＧＬ−１）抗体のいずれとも反応しないことを示している（９８．５％の細胞が５．２２の平均蛍光で陰性である）。同じく、野生型ワクシニアを感染させた細胞（Ｖ−Ｗｙｅｔｈ、図１Ｂ）も、これら２種の抗体のいずれとも反応しなかった（９７．７％の細胞が５．４３の平均蛍光で陰性である）。ｒＶ−Ｂ７−１を感染させたＢＳＣ−１細胞（図１Ｃ）は、Ｂ７／ＢＢ１抗体と強く反応する（９７．５％の細胞が２５１３．６８の平均蛍光で陽性である）。ｒＶ−Ｂ７−２を感染させた細胞（図１Ｄ）は、Ｂ７−２（ＧＬ−１）抗体と強く反応する（９８．８％の細胞が１８０２．３０の平均蛍光で陽性である）。抗体Ｂ７／ＢＢ１とｒＶ−Ｂ７−２を感染させた細胞との間には反応性がなく、抗体ＧＬ−ｌとｒＶ−Ｂ７−１を感染させた細胞との反応性もなかった。かくして、これら検討は、組換えワクシニアウイルスが感染後３〜６時間で細胞表面上でＢ７−１及びＢ７−２分子を発現できることを証明している。感染細胞の溶解は、通常は２４〜４８時間の間は起こらない（Ｍｏｓｓ，Ｂ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２．１６．１５．１−１６．１８．９，１９９３）。
同系のＣ５７ＢＬ／６マウス内に３×１０５ＭＣ３８マウスアデノカルチノーマ細胞を皮下注射すると、定型的には、７〜１４日以内に触知可能な腫瘍が生じた後、急速に増殖してついには致命的となることが以前に示されている（Ｋａｎｔｏｒ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８４：１０８４−１０９１，１９９２）。これら腫瘍細胞も、Ｂ７の発現について陰性であることが分かっている（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：５２３−５３２，１９９２）。Ｂ７の機能的発現についてこれら組換えワクシニア構築体を試験するために、ＭＣ３８腫瘍細胞の増殖を、ｒＶ−Ｂ７−１、ｒＶ−Ｂ７−２、及び野生型Ｖ−Ｗｙｅｔｈを感染させたＭＣ３８の増殖と比較した（図２Ａ〜２Ｄ）。未感染ＭＣ３８細胞の注射で（図２Ａ）、全てのマウスに７日以内に触知可能な腫瘍が生じた。腫瘍増殖は、この実験の全期間を通して進行性であった。あらゆる腫瘍の測定値（長さ又は幅）が２０ｍｍを超えたときに、全実験において動物を殺した。０．２５ＭＯＩＶ−Ｗｙｅｔｈを１時間感染させたＭＣ３８細胞の注射（図２Ｂ）で、触知可能な腫瘍の発生に僅かな遅れがあり、そして全ての動物は、ついには腫瘍について陽性となった（図２Ｂにおける一匹の動物で腹腔内腫瘍が増殖したが測定できなかった）。全てのグループについて０．２５のＭＯＩを選んだ。というのは、それよりも大きな量で感染させると、より高いレベルの非特異的細胞死が起こって腫瘍の増殖が遅くなるからである。０．２５ＭＯＩのｒＶ−Ｂ７−１（図２Ｃ）又はｒＶ−Ｂ７−２（図２Ｄ）を感染させたＭＣ３８細胞の注射では、どのマウスにも腫瘍が誘発されず、この実験のあいだ腫瘍がないままであった。
このＭＯＩを感染させた細胞の組換えタンパク質発現をフローサイトメトリにより確認した。０．２５ＭＯＩ組換えウイルスを感染させた後は、約３５％のＭＣ３８細胞が、組換えＢ７−１又はＢ７−２のいずれかについて平均蛍光が４１７〜５８５の陽性であった。未感染であるか又は０．２５ＭＯＩ  Ｗｙｅｔｈを感染させたＭＣ３８細胞は、Ｂ７−１又はＢ７−２の発現について陰性のままであった。これらＭＣ３８細胞は、感染前及び感染後の両方でＩ型ＭＨＣ抗原の発現について陽性であった。これらいずれの動物においても４０日間の観察パネルのあいだ目立った毒作用は認められなかった。動物の体重は、正常な相応週齢マウスの標準偏差の範囲内であった。これら実験を更に３回繰り返したが同様な結果であった。
腫瘍拒絶が無傷免疫系に依存性であるか否かを確認するために検討を行った。これら検討において、マウスを照射により免疫抑制（実施例１の材料及び方法を参照のこと）して感染ＭＣ３８腫瘍細胞を投与した（表１）。Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ−Ｂ７−１又はｒＶ−Ｂ７−２を感染させた照射マウスにおける腫瘍は、腫瘍移植後１４日で測定可能となり、腫瘍体積の差は認められなかった。これは、組換えＢ７分子に応答するには無傷免疫系が必要であることを示すものである。
【００１３】
【表１】
2004222726.tif 000002
免疫無防備状態動物におけるＭＣ３８腫瘍の増殖。マウスをγ線照射して０．２５ＭＯＩのＷｙｅｔｈ、ｒＶ−Ｂ７−１、又はｒＶ−Ｂ７−２のいずれかを１時間感染させたＭＣ３８細胞を注射した。
【００１４】  Ｂ７遺伝子の導入のためにレトロウイルスベクターを用いる系においては、マウスの一方の側腹部へのＢ７発現性腫瘍細胞の投与及び反対の側腹部へのＢ７陰性腫瘍細胞の同時投与は、両方の腫瘍集団の増殖を阻止するであろうということが分かっている（Ｃｈｅｎ，Ｌ，ら，Ｃｅｌｌ  ７１：１０９３−１１０２，１９９２）。他の検討では、Ｂ７陰性細胞への抗腫瘍活性は、Ｂ７陰性一次腫瘍の皮下投与後１０日のＢ７発現性腫瘍細胞の多数回腹腔内注射により確認された（Ｌｉ，Ｙ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４２１−４２８，１９９４）。ここに記載した検討は、腫瘍細胞への長期持続性免疫がｒＶ−Ｂ７感染腫瘍細胞での感作によって誘発されるか否かを確認するためにデザインされたものである。ｒＶ−Ｂ７−１又はｒＶ−Ｂ７−２を感染させたＭＣ３８細胞を投与されたマウスは、少なくとも４０日間は腫瘍がないままであった（図２Ｃ及び２Ｄ）ので、次にその反対の側腹部を３×１０５未感染（Ｂ７陰性）ＭＣ３８細胞で誘発した（図３Ｂ及び３Ｃ）。未感作マウスにこれらＭＣ３８細胞を注射すると（図３Ａ）、全ての動物に７日以内に触知可能な腫瘍形成があり、この実験の全期間を通して進行性の腫瘍増殖があった。腫瘍移植後２１日におけるこの対照グループの平均腫瘍体積は、２４３６±８５８ｍｍ３であった。ｒＶ−Ｂ７−１を感染させた腫瘍を４０日前に投与しておいたマウスも、未感染ＭＣ３８細胞で誘発した（図３Ｂ）。これら腫瘍の形成は遅れたため、増殖速度は平均腫瘍体積が２１日目で３７２±１０６ｍｍ３と実質的に低下した。同じく、ｒＶ−Ｂ７−２感染腫瘍を投与しておいたマウスは、ＭＣ３８細胞で誘発すると、腫瘍細胞の増殖の実質的な低下を示した。このグループにおける平均腫瘍体積は、２１日目で１９７±１６１ｍｍ３であった。かくして、腫瘍発現性Ｂ７−１又はＢ７−２を予め投与された動物においては、組換えワクシニアウイルス感染により腫瘍増殖が＞９０％低下した。これは、腫瘍誘発の４０日前に一回感作しただけであるという事実、及びマウスを比較的大きな腫瘍量で誘発したという事実からみて興味深かった。これは、ＭＣ３８腫瘍細胞上の拒絶抗原に対する記憶免疫応答がｒＶ−Ｂ７感染腫瘍細胞の注射によって誘発されていることを暗に示す。上記処理方法に手を加えて、Ｂ７発現性腫瘍細胞での多数回接種、及びＩＬ−２のようなサイトカインを含む免疫刺激性分子でのＴ細胞活性化の増大を含めてもよい。
これまでの研究では、ＰＬＮＳＸ、ＰＬＮＣＸ又はＰＬＸＳＮのようなレトロウイルスベクターでの形質導入による腫瘍細胞内へのＢ７の導入で、それら腫瘍に免疫原性を付与できることが証明されている（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：５２３−５３２，１９９２；Ｄｏｈｒｉｎｇ，Ｃ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５７：７５４−７５９，１９９４）。これらＢ７導入の方法は、レトロウイルスベクターの比較的低い感染効率並びに薬剤選択及びＢ７陽性腫瘍細胞の拡大に要求される必然的な長い時間のために、臨床的応用に潜在的な限界を有している。代わりとして、ここに報告した検討は、同時刺激性分子Ｂ７−１及びＢ７−２の遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスの発生を証明した。これら組換えワクシニア構築体は、腫瘍細胞を速やかに感染し（１〜４時間）そして高い効率で組換えタンパク質を発現する（９７％を超える細胞、それぞれ図１Ｃ及びＩＤ）。感染された細胞は、確実に組換えタンパク質を合成し、抗腫瘍作用をもたらすことが分かった。かくして、これら検討は、ワクシニアウイルスベクター内へのＢ７遺伝子の挿入のための実験系にデータを提示するものであり、潜在的な免疫療法的応用についての暗示を有している。
【００１５】                                  実施例３
腫瘍関連抗原を発現する組換えワクシニアウイルスとＢ７共刺激分子を
発現する組換えワクシニアウイルスを混合することによる、
ヒト腫瘍関連抗原に対するＴ細胞免疫応答の増強の誘導
本発明は、ｒＶ−Ｂ７をヒト腫瘍関連抗原を発現する組換えワクシニアウイルスとともに含む組成物を含む。本発明の組成物は、宿主に共接種されると、ヒト腫瘍関連抗原に対する全身性Ｔ細胞免疫応答を増強する。
今や、数種のヒト腫瘍関連抗原が同定されている。そのうちの一つはヒト癌胚抗原（ＣＥＡ）であり、これは結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、および非小細胞肺癌を含む広範囲のヒトの癌に発現するものである。ｒＶ−ＣＥＡと呼ばれる組換えワクシニアＣＥＡ構築物をマウスおよびアカゲザルの双方に投与して、双方のモデル系においてＣＥＡに特異的なＴ細胞反応を誘導することができる、ということが最近示された（Ｋａｎｔｏｒ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓ．８４：１０８４−１０９１，１９９２；Ｋａｎｔｏｒ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：６９１７−６９２５，１９９２）。さらに、どちらの系においても全く毒性は観察されなかった。最近、転移性の胃腸癌、乳癌または肺癌を伴う患者にｒＶ−ＣＥＡを投与する臨床実験が終了した。段階１研究では、天然痘ワクチンを投与した場合に観察されるような状態以外は、全く毒性は観察されなかった。
一つの態様は、Ｂ７およびＣＥＡの遺伝子を同一の組換えワクシニア構築物に挿入することである。なぜなら、双方の分子が同じ細胞上に同じ時に発現する必要があるからである。別の態様は、ｒＶ−ＣＥＡをｒＶ−Ｂ７と混合してＣＥＡに対するＴ細胞免疫反応を特異的に高めることである。この後者の手段の利点はいくつもある：（ａ）最大免疫反応のための割合を決定するために、ｒＶ−ＣＥＡとｒＶ−Ｂ７の異なる割合を調べることができる（ｂ）ｒＶ−ＣＥＡとｒＶ−Ｂ７の投与時期を変化させることができる（ｃ）ｒＶ−Ｂ７構築物は１種類のみ製造すればよい、即ち、ｒＶ−ＣＥＡと共に使用されるｒＶ−Ｂ７は、別の腫瘍関連抗原に対するｒＶ構築物と使用することもでき、実際、免疫反応強化のための薬剤に関連する他のいかなる抗原とも使用することができる。
一つの態様において、単にｒＶ−ＣＥＡをｒＶ−Ｂ７と混合して宿主に共投与するだけで、ＣＥＡに特異的なＴ細胞免疫応答の強化が誘導されることが示された。さらに、ｒＶ−Ｂ７に対するｒＶ−ＣＥＡの割合が免疫応答の強度における重要な因子であった。
第一の研究において、ｒＶ−ＣＥＡとｒＶ−Ｂ７は１対１の割合で混合された。即ち、５×１０６ｐｆｕのＢ７と５×１０６ｐｆｕのｒＶ−ＣＥＡとを混合し、尾乱切によって３匹のマウスのグループに共投与した。免疫から１４日後に脾臓を切除して、リンパ球の供給源とした。対照としてマウスの他の３つのグループを使用した：（ａ）非ワクチン接種マウス（ｂ）５×１０６ｐｆｕのｒＶ−ＣＥＡと５×１０６ｐｆｕの野生型ワクシニア（「Ｖ−Ｗｙｅｔｈ」と呼ぶ）を受けるマウス、および（ｃ）５×１０６ｐｆｕのＶ−Ｗｙｅｔｈと５×１０６ｐｆｕのｒＶ−Ｂ７受けるマウス。従って、全てのワクチン接種マウスは合計１０７ｐｆｕのワクシニアウイルスを与えられ、３つのグループ全てにおいて、ワクシニアウイルスの割合は１：１であった。図４に見られるように、ｒＶ−ＣＥＡ＋Ｖ−Ｗｙｅｔｈを１回投与した後、マウスはＣＥＡに特異的な免疫反応が、低レベルではあるとしても、確かに高まった。使用された免疫分析は、以前から記載されているリンパ球増殖分析であり（Ｋａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ，，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８４：１０８４−１０９２，１９９２）、使用された標的抗原は、バキュロウイルスに由来する組換えＣＥＡであった。図４に示されるように、ｒＶ−Ｂ７のｒＶ−ＣＥＡへの追加は、特異的免疫反応を数倍増強させた。対照的に、ｒＶ−Ｂ７の対照Ｖ−Ｗｙｅｔｈへの追加は、ＣＥＡ特異的免疫反応の増強に何ら影響しなかった。
次の実験において、ｒＶ−ＣＥＡのｒＶ−Ｂ７に対する割合を、１：３に修飾した。図５に示されるように、１：３の割合のｒＶ−ＣＥＡ＋ｒＶ−Ｂ７の投与は、ｒＶ−ＣＥＡ＋Ｖ−Ｗｙｅｔｈと比較してＣＥＡ特異的Ｔ細胞反応を増強させ、しかも、その程度は二つの構築物（ｒＶ−Ｂ７＋ｒＶ−ＣＥＡ）を１：１の割合で混合させた場合よりも大きかった。前回と同様に、２つの対照群、即ち、非ワクチン接種の群およびｒＶ−Ｂ７をＶ−Ｗｙｅｔｈと混合させた群は、ＣＥＡにたいして免疫反応を示さなかった。
これらの結果は、ヒト腫瘍関連抗原に関する特異的なＴ細胞反応を増強させるために、ｒＶ−含有ヒト関連遺伝子をｒＶ−Ｂ７と単に混合させるだけで、抗原提示細胞上に共感染および共発現を誘導させることができることを示唆している。さらに、使用されたｒＶ−Ｂ７およびｒＶ−含有ヒト関連遺伝子の割合は、ヒト腫瘍関連遺伝子産物、あるいは実際、誘導させたい若しくは免疫性を高めたいと望むその他の全ての遺伝子産物に対するＴ細胞活性化を最適化させるために重要な因子であるかもしれない。
【００１６】                                実施例４
ｒＶ−ＣＥＡ＋ｒＶ−Ｂ７による免疫化後の
ＣＥＡに対するマウスＴ細胞のリンパ球増殖反応
リンパ球増殖反応
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、以下のものを様々の割合で含む総計１×１０７ＰＦＵのウイルスで免疫化した：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ；ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ；Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７；またはｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７。そして、上述したようにＣＥＡ特異的リンパ球増殖を分析した（Ｋａｎｔｏｒ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８４：１０８４−１０９１，  １９９２）。簡単には、脾臓を免疫化から１４日後に切除し、７０μｍ細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を通して機械的に分散させ、単細胞の懸濁液を得た。赤血球および死んだ細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（密度＝１．１１９ｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上で遠心することによって除去した。脾臓の単核細胞をナイロンウールカラム（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上を通すことによって約９５％のＴ細胞からなる集団を得た。ＣＥＡ特異的リンパ球増殖を評価するために、Ｔ細胞を１０５／ウェルの濃度で９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中に加えた。抗原提示細胞は、５×１０５／ウェルの濃度で加えられた被放射（２０００ｒａｄ）の未処理（ｎａｉｖｅ）同系脾臓細胞から構成された。刺激されたウェルは以下のものを与えられた：精製ヒトＣＥＡ（１００−１２．５μｇ／ｍｌ）（Ｖｉｔｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）；陰性コントロールとしてオバルブミン（１００μｇ／ｍｌ）；再現抗原としてＵＶ−不活性化Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（２×１０７ＰＦＵ／ｍｌ）またはＴ細胞陽性コントロールとしてＣｏｎ−Ａ（２μｇ／ｍｌ）。コントロールは、Ｔ細胞、ＡＰＣおよび培地のみを与えられた。全てのウェルの細胞は、全容量２００μｌの完全培地（ＣＭ）［ウシ胎児血清（１０％）；グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ（７ｍＭ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、２−メルカプトエタノール（５０μＭ）および非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）を含むＲＰＭＩ  １６４０（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）］中で５日間培養された。細胞を１μＣｉ／ウェル［３Ｈ］−チミジン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）と共に総計１２−１８時間インキュベーションすることにより標識し、ＰＨＤ細胞回収器（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて回収した。取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＬＳ  ６０００ＩＣ；Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｄｕａｒｔｅ，ＣＡ）によって測定した。三重のウェルからの結果を平均化して、以下のように計算された刺激指数（ＳＩ）：
ＳＩ＝［ＣＰＭ（刺激されたウェル）］／［ＣＰＭ（コントロールウェル）］
として報告した。
【００１７】リンパ球増殖分析
ｒＶ−ＣＥＡとｒＶ−Ｂ７との混合物による免疫化が、増強されたＣＥＡ特異的リンパ球増殖反応を引き起こし得るか否かを調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、総計１０７ＰＦＵのｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ、Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７またはｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７を１：１、１：３また３：１の割合（表２を御覧いただきたい）で使用して同時に免疫化し、１４日後にリンパ球増殖反応を分析した。表２は、全く免疫化を受けなかったマウスからのＴ細胞は精製ＣＥＡに対して反応しないのに対し、ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈで免疫化されたマウスからのＴ細胞は弱く反応した（１．９−２．５の刺激指数［ＳＩ］）ことを示す。ＣＥＡに対する反応は、免疫化の際に与えられたｒＶ−ＣＥＡの用量に関連するようであった。Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７はどの割合でも免疫化したマウスからのＴ細胞はＣＥＡに対して反応しなかった。対照的に、ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７はどの割合の場合で免疫した場合でもそのマウスからのＴ細胞は、免疫化としてｒＶ−Ｂ７を与えられなかった群と比較して、ＣＥＡに対する増強された反応を有するようであった（表２）。ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）の免疫化は、本実験において最大のリンパ球増殖の誘導を示した（ＳＩ  １２．３）。ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７の割合を変えた（３：１、１：１、１：３）実験を４回行ったが、各場合において３：１の割合がＣＥＡ特異的Ｔ細胞反応を最も増強させた。ＣＥＡ特異的細胞免疫応答の程度をさらに調べるために、マウスを  ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１）、Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）またはｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）で１回免疫化し、そして前述ようにリンパ球増殖反応を分析した。
【００１８】
【表２】
2004222726.tif 000003
【００１９】ａ５Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、示されたように一回免疫化された。プールされた脾臓Ｔ細胞からのリンパ球増殖反応は、免疫化後１４日目に分析された。
ｂ抗原の濃度は以下の通りである：ＣｏｎＡ（２μｇ／ｍｌ）；オバルブミン（１００μｇ／ｍｌ）；およびＣＥＡ（１００μｇ／ｍｌ）。各値は、三重試料の培地に対する平均ＣＰＭの刺激指数を示す。標準偏差は１０％を越えることはなかった。
ｃＮＡ、不適用
ｄ太字の数値は、各々の培地コントロールの値と比較した場合有意である（ｐ＜０．００１）。
【００２０】  表３は、免疫化を受けていないマウスからのＴ細胞は、いかなる濃度の精製ＣＥＡにも、ＵＶ−不活性化Ｖ−Ｗｙｅｔｈにも反応しないことを示す。Ｖ−Ｗｙｅｔｈで免疫化したマウスからのＴ細胞は強い刺激指数（３１．７）でＵＶ−Ｖ−Ｗｙｅｔｈに反応するが、ＣＥＡに応答して増殖することはなかった。対照的に、ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１）で免疫化したマウスからのＴ細胞は、ＣＥＡと共に増殖させた場合用量依存的に増殖した（刺激指数４．５−１．６）。ｒＶ−Ｂ７のみで免疫化した（Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７）マウスからのＴ細胞は、ＣＥＡに反応しなかった。最後に、ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）の組み合わせで免疫化したマウスからのＴ細胞は、ＣＥＡ抗原に反応して用量依存的に増殖した（ＳＩ＝１８．６−３．０）。この刺激指数は、ｒＶ−Ｂ７の追加によってＣＥＡ特異的増殖反応が４倍以上増加することを示す。全ての群からのＴ細胞はコントロールリンパ球マイトゲンＣｏｎＡに反応し、陰性コントロール抗原オバルブミンとは反応しなかった。
【００２１】
【表３】
2004222726.tif 000004
【００２２】ａ５Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、示されたように一回免疫化された。プールされた脾臓Ｔ細胞からのリンパ球増殖反応は、免疫化後１４日目に分析された。
ｂ抗原の濃度は以下の通りである：ＣｏｎＡ（２μｇ／ｍｌ）；オバルブミン（１００μｇ／ｍｌ）；ＵＶ−Ｗｙｅｔｈ（２×１０７ｐｆｕ／ｍｌ）；およびＣＥＡ（１００〜１２．５μｇ／ｍｌ）。各値は、三重試料の培地に対する平均ＣＰＭの刺激指数を示す。標準偏差は１０％を越えることはなかった。
ｃＮＡ、不適用
ｄ太字の数値は、各々の培地コントロールの値と比較した場合有意である（ｐ＜０．００１）。
【００２３】実施例５
ｒＶ−ＣＥＡおよびｒＶ−Ｂ７で感染させた細胞におけるＣＥＡおよびＢ７−１の二重発現
フローサイトメトリー法
２色フローサイトメトリー法を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｒＶ−ＣＥＡおよびｒＶ−Ｂ７で細胞が二重に感染していることを示すために使用した。集密のＢＳＣ−１細胞（ＣＣＩ２６，ＡＴＣＣ，ロックバイル、メリーランド州）を、全ＭＯＩが５となるように、ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７、ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ，Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７の３：１の混合物，またはＶ−Ｗｙｅｔｈのみで２時間にわたって感染させた。細胞は、感染後、１８時間目に回収し、ＰＥ結合ラット抗マウスＢ７−１モロクローナル抗体（ファルミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア州）およびＦＩＴＣ結合抗ＣＥＡモロクローナル抗体ＣＯＬ−１（３６）またはＦＩＴＣおよびＰＥ結合アイソタイプのコントロールモロクローナル抗体（ファルミンゲン）を組み合わせて染色した。ＣＯＬ−１モロクローナル抗体は、標準的な手法を用いてＦＩＴＣに結合した（３７）。細胞の蛍光は、ＬｙｓｉｓＩＩソフトを用いたＦＡＣＳＣＡＮ（ベクトンディキンソン、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を使用して解析した。
【００２４】フローサイトメトリーによる解析：組換えＣＥＡおよびＢ７の二重発現
抗原およびＢ７−１の両方が、Ｔ細胞とＣＤ２８受容体を正しく結合させるために、互いに極めて隣接した位置に発現されなければならないとこれまで考えられていたために（ジェンキンズ、Ｍ．Ｋ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：３６１−３６７，１９９３；ハスコック、Ｋ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：６３１−６４０，１９９４；ヘルストローム、Ｋ．Ｅ．ら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９０：２２５−２３０，１９９３：ハーヂング，Ｆ．Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１７９１−１７９６，１９９３）、ｒＶ−ＣＥＡおよびｒＶ−Ｂ７の混合物を細胞に感染させると、細胞表面にＣＥＡおよびＢ７−１の両方の二重発現が起こるかどうかについて決定した。二重発現について決定するために、ＢＳＣ−１細胞をｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ，Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７，またはｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７の３：１の混合物、またはＶ−Ｗｙｅｔｈのみで感染させ、二色フローサイトメトリーによって解析した。Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈで感染させた細胞は、バックグランド程度の染色のみ示したが（図６Ａ）；ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈで感染させた細胞は、主としてＣＥＡに対して陽性を示した（図６Ｂ）。同様に、Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７の混合物で感染させた細胞は、主としてＢ７−１に陽性を示した（図６Ｃ）。しかし、ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７で共感染させた細胞は、ＣＥＡおよびＢ７の両方に陽性を示した（図６Ｄ）。
【００２５】実施例６
ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７で免疫した後のＣＥＡ特異的な細胞傷害性の上昇
細胞溶解反応の方法：
マウスを実施例４に記載したように免疫し、ＣＥＡ特異的細胞溶解活性を上記に記載したように解析した（カンター．Ｊ．ら、Ｊ．Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８４：１０８４−１０９１，１９９２）。簡単にいえば、脾臓を免疫後１４日目に除去し、これを細胞１つ１つの懸濁液にして、フィコール−ハイパク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配にかけた。ＭＣ３８マウスコロニー形成能がある腺癌細胞系列（フォックス，Ｂ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  ９：４９９−５１１，１９９０）を、スティーブローゼンバーグ博士の研究室より（国立癌研究所、ベセスダ、メリーランド州）入手した。ヒトＣＥＡ、ＭＣ３８−ＣＥＡ−２を発現する誘導細胞系列については、すでに記載されている（ロビンス、Ｐ．Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３６５７−３６６２，１９９１）。これらの腫瘍細胞は、１１１Ｉｎを使用した標準的な細胞溶解測定（ウンダーリッヒ、Ｊ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、コリガンＪ．Ｅ．ら（編集）３．１１．１−３．１１．１４，１９９４）における標的として使用するために調製した。簡単に言えば、腫瘍細胞（１−２×１０６）を、５０μＣｉの１１１Ｉｎオキシキノリン溶液（アマシャム、アリングトンハイツ、イリノイ州）で３７℃にて２０分間放射性標識し、それから取り込まれなかった放射性標識されている核酸を除くために洗浄した。脾臓のリンパ細胞および標的細胞（５×１０３細胞／ウエル）を、ＣＴＬ培地に懸濁し（ＲＰＭＩ−１６４０のかわりに、ＲＰＭＩ−１６４０：ＥＨＡＡ  ５０：５０を含む完全培地、バイオウィッタカー、ウオーカースバイル、メリーランド州）、およびＵ底９６穴プレート（コスター）中にてエフェクター対標的の比率が１００：１から１２．５：１にて結合させて、１６時間３７℃にて５％ＣＯ２とともにインキュベートした。インキュベーションの後、上清回収システム（Ｓｋａｎｔｒｏｎ，スターリング、バージニア州）を使用して上清を回収し、放射活性をガンマカウンターを使用して定量化した（コブラオートガンマ、パッカード、ダウナーズグルーブ、イリノイ州）。１１１Ｉｎの特異的な放出の比率は、標準式によって決定した：特異的な溶解％＝［（実験において自然に起こる数）／（自然に起こる最大数）］ｘ１００。
【００２６】細胞傷害性Ｔ細胞の解析：ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７で免疫した後のＣＥＡ特異的な細胞傷害性の増加
ｒＶ−ＣＥＡにｒＶ−Ｂ７を添加した場合のＣＥＡ特異的細胞傷害活性に対する効果を解析するために、ｒＶ−Ｂ７およびｒＶ−ＣＥＡの混合物で免疫したマウス由来の脾臓リンパ細胞を、ＣＥＡに陰性なマウス腺癌細胞（ＭＣ３８）または、ヒトＣＥＡを発現するレトロウイルスベクターを使用してＣＥＡで形質転換した同一細胞（ＭＣ３８−ＣＥＡ−２）に対する溶解活性について試験した。図７は、ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１）で一度免疫したマウス由来のＴ細胞は、ＣＥＡ陰性ＭＣ３８標的細胞（黒三角）を溶解しないが、ＣＥＡ陽性ＭＣ３８−ＣＥＡ−２標的細胞（白三角）は低レベルにもかかわらず、溶解した。このＣＥＡ特異的な溶解は、Ｅ：Ｔ比に依存しており、Ｅ：Ｔ比が１２．５：１では１０％まで溶解は減少した。免疫源であるｒＶ−ＣＥＡにｒＶ−Ｂ７を添加すると（ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７；３：１）、ＭＣ３８細胞の溶解には何の影響も与えないが（黒丸）、ＭＣ３８−ＣＥＡ−２標的細胞のＣＥＡ特異的な溶解には実質的な影響を及ぼした。溶解単位についてのデータの変換に基づくと、ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）で免疫したマウスのＣＴＬ活性は、ｒＶ−ＣＥＡのみで免疫したマウスに比較して２．８倍増加していた。
【００２７】実施例７
ｒＶ−ＣＥＡと混合したｒＶ−Ｂ７の抗癌効果
方法
１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを、全部で１×１０７ＰＦＵのウイルスで免疫した。免疫した後１４日後に、マウスを３×１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ−２細胞を右わきばらに皮下注射した。少なくとも６０日のあいだ腫瘍がみられなかったｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）のグループのマウスを、３×１０５個のＭＣ３８−ＣＲＡ−２細胞を反対側のわきばらに接種した。腫瘍は、二方向カリパスで測定し、以前に記載したように、体積を計算した（カンター，Ｊ．ら、Ｊ．Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８４：１０８４−１０９１，１９９２）。腫瘍が２０ｍｍを越えたら（長さまたは幅）、すべての実験において、動物を殺した。
【００２８】ｒＶ−ＣＥＡと混合したｒＶ−Ｂ７の抗癌効果
先天的なＣ５７ＢＬ／６マウスに３×１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ−２マウスの腺癌細胞を皮下注射によって投与すると、７−１４日の間に明らかな腫瘍が生じてきて、それから急速に腫瘍が発達して最終的に致命的となるということが以前に示されていた（カンター，Ｊ．ら、Ｊ．Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８４：１０８４−１０９１，１９９２）。１×１０７ＰＦＵのｒＶ−ＣＥＡを３回免疫することが、マウスをこの腫瘍の接種から１００％保護するために必要であることもまた、示されていた（カンター，Ｊ．ら、Ｊ．Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８４：１０８４−１０９１，１９９２）。３：１の比率のｒＶ−ＣＥＡおよびｒＶ−Ｂ７で免疫して、動物を腫瘍の接種から保護することが可能であるかについて決定するために、我々は全部で１０７ＰＦＵのＶ−Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１）；Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）；またはｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）のいずれかで一度だけ免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣ３８−ＣＥＡ−２腫瘍細胞の増殖を比較した。ＭＣ３８−ＣＥＡ−２細胞を接種すると（図８Ａ）、１４日以内に、１０匹のＶ−Ｗｙｅｔｈで免疫した動物すべてにおいて明らかな腫瘍が生じた。腫瘍の増殖は、この実験を行っている間じゅう、発育し続けた。ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１；図８Ｂ）で免疫した動物にＭＣ３８−ＣＥＡ−２細胞を接種すると、明らかな腫瘍がみられはじめる時期が少し遅れて、結果的に、動物の７０％が腫瘍に陽性になった。Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７（３：１；図８Ｃ）で免疫した動物にＭＣ３８−ＣＥＡ−２細胞を接種すると、Ｖ−Ｗｙｅｔｈで免疫したコントロールの集団の腫瘍増殖と同じように、明らかな腫瘍が１４日以内に生じた（図８Ａ）。反対に、ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１；図８Ｄ）で一度免疫したマウスの８０％は、腫瘍を形成しなかった。腫瘍陰性マウス（ｎ＝８）は、この実験の間じゅう、腫瘍をつくらなかった（６０日）。著しい毒性効果は、観察期間のあいだはこれらの動物に観察されなかった。動物の体重は、年齢に相当する正常なマウスの標準偏差の中におさまった。これらの実験はさらに３回繰り返し行って、同じ結果を得た。
腫瘍細胞に対する長い期間の継続的な免疫は、ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）の組み合わせで免疫することによって誘導されるかどうかを決定するために、組換えウイルスをこの比率で免疫し、少なくとも６０日間は腫瘍が形成されない（図８Ｄ）マウスに、３×１０５個のＭＣ３８−ＣＥＡ−２細胞を反対のわきばらに接種した（図９Ｂ）。コントロールの正常なマウスにＭＣ３８−ＣＥＡ−２細胞を接種すると（図９Ａ）、１４日以内にすべての動物において明らかな腫瘍が形成され、この実験を行っている間、腫瘍の増殖が進行する一方で、先にｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）を投与したマウスは、さらに４９日間観察しても、腫瘍はみられなかった（図９Ｂ）。
【００２９】実施例８
ｒＶ−ＰＳＡの構築および特性
組換えワクシニアウイルス
ヒト前立腺特異的抗原の全オープンリーディングフレームをコードする７８６ｂｐのＤＮＡ断片を、ヒト転移性前立腺腺癌細胞系列、ＬＮＣａＰＦＧＣ（ＣＲＬ１７４０，アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ），ロックバイル、メリーランド州）から抽出した全ＲＮＡより、逆転写ＰＣＲ（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ノルウォーク、コネチカット州）によって増幅した。ＰＳＡコード配列から予測されるアミノ酸配列は、２２０番目の残基がアスパラギンからチロシンに置換していたことだけが異なるが、既に報告された配列と同一であることが示された（ルンドウエルら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１４：３１７−３２２，１９８７）。ＰＳＡの全コード配列、５’非翻訳領域の４１ヌクレオチド、および３’非翻訳領域の５２０ヌクレオチドを含むＰＳＡのＤＮＡ断片を、ワクシニアウイルストランスファーベクターｐＴ１１６のＸｂａＩ制限酵素部位にライゲーションした。生じたプラスミドは、ｐＴ１００１と命名され、ワクシニアウイルス４０Ｋプロモーターの制御下にあるＰＳＡ遺伝子（グリッツら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６４：５９４８−５９５７，１９９０）および鶏痘ウイルスＣ１プロモーターの制御下にある大腸菌ＬａｃＺ遺伝子（ジェンキンズら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、７：９９１−９９８，１９９１）を含む。外来遺伝子は、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩＭ領域由来のＤＮＡ配列に結合させた。ワクシニアのＷｙｅｔｈ（ニューヨーク衛生局）株からプラーク精製した単離物を、組換えワクシニアウイルスの構築において親ウイルスとして使用した。組換えウイルスの作製は、Ｗｙｅｔｈワクシニアゲノムのワクシニア配列と、ｐＴ１００１で形質転換したワクシニアに感染したＲＫ１３細胞（ＣＣＬ３７，ＡＴＣＣ）中のｐＴ１００１のこれに相当する配列のあいだでの相同組換えによって生じた。組換えクローンは、以前に記載したように（パニカリら、Ｇｅｎｅ４７：１９３−１９９，１９８６；カウフマンら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４８：９００−９０７，１９９１）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）の存在下においてＲＫ１３細胞（ＣＣＬ３７，ＡＴＣＣ）の増殖によって同定し、選別した。適切な青い組換えをおこしたコロニーを、４回プラーク精製することによって精製した。ウイルスのストックは、感染したＲＫ１３細胞抽出液を、３６％ショ糖クッションによって遠心して精製することによって調製した。
【００３０】ＤＮＡ組換えのサザン解析
組み換えワクシニアゲノムを、ウイルスＤＮＡの抽出、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩでの制限酵素消化、および以前に記載したようなサザンブロット（カウフマンら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４８：９００−９０７，１９９１）によって解析した。
【００３１】ＰＳＡタンパク質発現のウエスタン解析
集密のＢＳＣ−４０細胞を、野生型親株ワクシニアウイルス（Ｖ−Ｗｙｅｔｈと呼ばれている）または組み換えワクシニアＰＳＡ（ｒＶ−ＰＳＡと呼ばれている）のいずれかをＭＯＩが１として２％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーゲル培地中で感染させた。一晩感染させた後、細胞から培地を除去し、アリコートをメタノール沈澱して分泌されたＰＳＡの存在を測定した。感染した細胞は、低張の溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  ＥＤＴＡ，１０ｍＭＫＣｌ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中に溶解し、それから超音波処理をした。細胞抽出物と培養用培地を、ＳＤＳ１０％アクリルアミドゲルで電気泳動した。タンパク質を、ニトロセルロース上にトランスブロットし、ブロットしたものを室温で４時間、ＰＳＡに特異的なウサギ抗体（ＰＯ７９８，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＯ．，セントルイス、ミズーリ州）とインキュベーションし、洗浄し、それからヤギ抗ウサギホスファターゼ標識二次抗体（ＡＰ，Ｋｉｒｋｅｇａａｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ガイザースバーグ、メリーランド州）と共にインキュベートし、製造業者の手法に従って現像した。
【００３２】組換えウイルス（ｒＶ−ＰＳＡ）の特性
ヒトＰＳＡのオープンリーディングフレームをコードしているｃＤＮＡ断片を、ＰＳＡ特異的オリゴヌクレオチドプライマー５’ＴＣＴＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡ３’（配列番号：５），５’ＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＧＧＴＴＧＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＣＡＣＴ３’（配列番号：６）を使用して逆転写ＰＣＲによって得て、ワクシニアウイルストランスファーベクターｐＴ１１６中にラーゲーションした。このベクターは、挿入された遺伝子産物の合成を引き起こすように、マルチクローニング部位の上流に強力なワクシニアウイルス初期／後期プロモーター（４０Ｋと呼ばれている）を含む。プロモーターの部位と同様に、ＰＳＡのＤＮＡ断片のライゲーションおよび方向は、ＰＣＲおよび塩基配列決定によって確認された。キメラのベクター構築物を、以前に報告されたように、相同組換えによってワクシニアウイルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩＭ部位中に挿入し（カウフマンら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４８：９００−９０７，１９９１）、ＰＳＡ配列およびＨｉｎｄＩＩＩＭ領域中のワクシニア配列に相当する３２Ｐで放射性標識したＤＮＡをプローブにしたサザン解析によって確認した（データは示さない）。
組換えＰＳＡタンパク質の発現は、上清およびｒＶ−ＰＳＡを感染させたＢＳＣ４０細胞から抽出したタンパク質のウエスタンブロット解析によって確認した。
これらの細胞は、組換えワクシニア産物を確認するのに日常的に使用している
（エールら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．，２．１６．１５．１−１６．１８．９，１９９３）。ｒＶ−ＰＳＡを感染させた細胞由来の細胞上清をブロットしたものをウサギ抗ＰＳＡ抗体と共にインキュベーションすると、およそ３３，０００ダルトンの一本の免疫反応するペプチドが現れた（データは示さない）。同様に、ｒＶ−ＰＳＡを感染させた細胞由来のタンパク質抽出物をブロットしたものをインキュベーションすると、同じ分子量の一本のバンドが現れた（データは示さない）。これは、ＰＳＡ分子の予測される大きさと一致する（アルムブラスターら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：１８１−１９５，１９９３；ワングら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９：１７９−１９７，１９８２）。親株Ｖ−Ｗｙｅｔｈを感染させた細胞由来の上清のブロットおよびタンパク質ブロットは、ＰＳＡの発現は陰性であった。したがって、これらの結果は、組換えワクシニアウイルスは、ヒトＰＳＡ遺伝子産物を忠実に発現することが可能であることを示している。
【００３３】実施例９
ｒＶ−ＰＳＡ：ｒＶ−Ｂ７での免疫によるＰＳＡ特異的細胞傷害性の増加
細胞系列
コロニー形成能のあるマウス腺癌細胞系列であるＭＣ−３８（フォックス、Ｂ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．９：４９９−５１１，１９９０）を、バーナードフォクス博士より入手した（国立癌研究所、国立衛生研究所、ベネスダ、メリーランド州）。ＬＮＣａＰヒト前立腺腺癌細胞系列（ヘルスコビッツ、Ｊ．Ｓ．ら、マーフィー，Ｇ．Ｐ．（編集）前立腺癌のモデル、ｐｐ．１１５−１３２，ニューヨーク：Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，１９８０）を、アメリカンカルチャータイプコレクション（ロックバイル、メリーランド州）より入手した。モロニーマウス肉腫ウイルスレトロウイルスベクターｐＬＮＳＣ（ミラー、Ａ．Ｄ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０，１９８９）を、Ａ．ダスティーミラー博士より入手した（フレッドハッチンソン癌研究所、シアトル、ワシントン州）。マウスのエコトロピック（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルスを保持している細胞系列ＧＰ＋Ｅ−８６（ヘスドルファー、Ｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．，５（３）：４２３−４３２，１９９１）、ＭＣ−３８，ＰＳＡ／ＭＣ−３８およびｐＬＮＳＸ／ＭＣ−３８を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，ガイザーバーグ、メリーランド州）にて維持した。ＰＳＡ／ＭＣ−３８およびｐＬＮＳＸ／ＭＣ−３８細胞系列は、１ｍｌあたり１ｍｇのＧ４１８硫酸塩（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）の選択圧を常に与えている状況下において維持した。ＬＮＣａＰは、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で維持した。
【００３４】ＰＳＡｃＤＮＡのクローニング
相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ヒト前立腺癌細胞系列であるＬＮＣａＰ由来の全ＲＮＡよりＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．，ノルウォーク、コネチカット州）を使用して合成した。ヒトＰＳＡに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ４．１．４．コンピュータープログラム（Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，ロチェスター，ニューヨーク州）を使用してヒトｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０７７３０）に基ずいて選択した。ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含む５’（５’ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＣＡ３’）（配列番号：７）および３’（５’ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＡＧＴ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＡＴ３’）（配列番号：８）を、ＰＣＲによって全長のＰＳＡｃＤＮＡを合成するのに使用した。１．５ｋｂのＰＳＡ遺伝子を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＬＮＳＸ  ＤＮＡとラーゲーションし、コンピテントＣＨα大腸菌細胞（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を形質転換するのに使用した。アンピシリン耐性なコロニーについて、ベクター特異的な５’オリゴヌクレオチドプライマー（５’ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＴＧＣ  ＡＡＡ３’）（配列番号：９）および上述したＰＳＡに特異的な３’プライマーを使用してＰＣＲによってｃＤＮＡインサートの方向を調べた。ＰＳＡｃＤＮＡがセンス方向を向いている形質転換体を選択し、制限酵素消化によって同定し、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｌ  Ｃｏｒｐ．，クリーブランド、オハイオ州）を使用したジデオキシ法によって塩基配列を決定した。ＰＣＲによって回収された遺伝子の塩基配列の解析により、この遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにあるヒトＰＳＡ遺伝子配列と同一であることが確証された。
【００３５】ＭＣ−３８標的細胞へのＤＮＡの形質転換および形質導入
ＰＳＡ／ｐＬＮＳＸプラスミド（５μｇ）を、形質転換試薬（ＤＯＴＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，インディアナポリス、イリノイ州）を使用して製造業者の手法に従ってＭＣ−３８細胞に形質転換した。２４時間後に、Ｇ４１８を１００μｇ／ｍｌ（重量／体積）含む選択培地を細胞に添加した。選択圧は、１０％ＦＢＳおよび濃度勾配のＧ４１８を（１ｍｇ／ｍｌまで）含むＤＭＥＭ中において継続的に培養することによって維持した。薬剤耐性の細胞を制限希釈によりクローニングした。クローニング壁から得た馴化培地を、固相の二重決定タンデムＲＰＳＡ免疫放射分析（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して試験した。ＰＳＡを最も効率良く分泌するクローンを、制限希釈によって２回クローン化した。ＰＳＡ／ＭＣ−３８と命名された１つのクローンは、およそ１０ｎｇＰＳＡ／ｍｌを生産した。
ベクターを形質導入したＰＳＡ陰性なＭＣ−３８細胞は、以下のようにして作製した。マウスのエコトロピック（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルスを保持している細胞系列ＧＰ＋Ｅ＋８６を、上記に記載したように、ＤＯＴＡＰ形質導入試薬を使用して２μｇのｐＬＮＳＸベクターＤＮＡで形質導入した。２４時間後に、形質導入した細胞を植えかえて選択培地上で増殖した（１ｍｌあたり１．０ｍｇのＧ４１８）。Ｇ４１８による選択を生き延びて、ｐＬＮＳＸを持っている細胞は、Ｇ４１８が存在しない培地中でも増殖し、この培地を８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，セントルイス、ミズーリ州）存在下にてＭＣ−３８細胞に添加した。形質導入したＭＣ−３８細胞は、Ｇ４１８存在下において３週間成育した。個々の薬剤耐性コロニーを無菌的なクローニングリングによって単離し、ｐＬＮＳＸの存在をＰＣＲによって同定した。１つのクローンがｐＬＮＳＸ／ＭＣ−３８であり、これをさらなる実験に使用した。
【００３６】細胞傷害反応の方法
マウスを、実施例６に記載した基本的な手法を使用してｒＶ−ＰＳＡで免疫した。実施例８に記載したように作製したｒＶ−ＰＳＡは、Ｔｈｅｒｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ケンブリッジ、マサチューセッツ州から入手した。上記およびカール，Ｊ．Ｆ．ら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ，印刷中）に記載されているのヒトＰＳＡを発現するコロニー形成能のあるＭＣ３８マウス腺癌細胞系列（ＭＣ３８−ＰＳＡ）を、抗原特異的な標的として使用した。
【００３７】細胞傷害性Ｔ細胞の解析：ｒＶ−ＰＳＡ：ｒＶ−Ｂ７で免疫したことによるＰＳＡ特異的な細胞傷害性の増加
ｒＶ−ＰＳＡにｒＶ−Ｂ７を添加した場合のＰＳＡ特異的細胞傷害性活性に対する効果を解析するために、ｒＶ−Ｂ７およびｒＶ−ＰＳＡの混合物で免疫したマウス由来の脾臓リンパ細胞を、ＰＳＡに陰性なマウス腺癌細胞（ＭＣ３８）またはＰＳＡで形質導入した同じ細胞（ＭＣ３８−ＰＳＡ）について溶解活性を試験した。図１０は、ｒＶ−ＰＳＡで一度免疫したマウス由来のＴ細胞は、ＰＳＡ陰性なＭＣ３８標的細胞を溶解しないが、ＰＳＡ陽性なＭＣ３８−ＰＳＡ標的細胞は溶解することを示している。免疫源であるｒＶ−ＰＳＡにｒＶ−Ｂ７を添加しても、ＭＣ３８細胞の溶解には影響を及ぼさないが、ＭＣ３８−ＰＳＡ標的細胞のＰＳＡ特異的な溶解に対しては実際に影響を及ぼす（図１０）。溶解の特異性は、異なる抗原であるｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７で免疫したマウスのＴ細胞は、ＭＣ３８−ＰＳＡ標的細胞を溶解しないということからもさらに示された。
【００３８】実施例１０
癌にかかっている哺乳動物を治療するためのＣＥＡ抗原に由来する免疫原性ペプチドに感作したリンパ細胞の使用
前もってＣＥＡ抗原に感作させたＴリンパ細胞は、癌にかかっている哺乳動物を治療するのに効果的である場合がある。Ｔリンパ細胞は、末梢血液または腫瘍懸濁液由来で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した（カワカミ、Ｙ，ら（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３−２１９１）。Ｔリンパ細胞は、濃度が１−１０ＭＯＩでおよそ１−１６時間のあいだ、ＣＥＡ関連抗原を発現する組換えウイルスおよび／またはＢ７．１および／またはＢ７．２を発現する組換えウイルスを感染させた細胞にさらす。抗原にさらされたＴリンパ細胞を、哺乳動物、好適にはヒトにおよそ１０７−１０１２個のリンパ細胞を投与する。リンパ細胞は、静脈内、腹膜内、または病気の部分に投与される。この処置は、Ｔリンパ細胞治療と組み合わせて、サイトカイン、放射治療、腫瘍部分の外科的除去および化学治療薬剤のような他の治療的処置と同時に投与できる。
本発明はある特定の態様に関連して上記に記載したが、さまざまに改変することが可能で、別の材料および試薬を本発明から逸脱しないように使用することが可能である。ある場合には、このような改変および代用は、いくらか実験を必要とするかも知れないが、日常的な実験のみ含むと考えられる。
特定の態様の詳細な記載は、本発明の一般的な特性を十分に明らかにしており、最新の知識を適応することによって研究者は遺伝学的な概念から逸脱することなくこのような特定の態様を容易に改変および／またはさまざまな応用に適応させることが可能であり、それゆえ、このような適応および改変は、記載した態様に相当する内容および範囲内において理解されると考えられる。
参照したすべての参考文献および特許は、本明細書中に参考文献として取り入れている。
【図面の簡単な説明】
【００４０】  本発明の上記その他の目的、特徴及び幾つかの付随的な利点は、発明の詳細な説明を読んで、検討するならばさらに良好に理解されるであろう。【図１】  図１Ａ〜１ＤはｒＶ−Ｂ７タンパク質を発現するＢＳＣ−１細胞の蛍光分析を示す。ＢＳＣ−１細胞は、Ｂ７−１又はＢ７−２表面タンパク質に関して、感染前に（図１Ａ）、１０  ＭＯＩ  Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（図１Ｂ）、ｒＶ−Ｂ７−１（図１Ｃ）又はｒＶ−Ｂ７−２（図１Ｄ）による感染後に染色した。図１Ａと１Ｂは正常ＢＳＣ−１細胞又はｒＶ−Ｂ７−１とｒＶ−Ｂ７−２との構築に用いた親ワクシニア菌株によって感染させた細胞のＢ７染色を典型的に示すが、図１Ｃと１ＤはｒＶ−Ｂ７−１とｒＶ−Ｂ７−２による感染後の組換えＢ７タンパク質の強い発現を、これらの分子に特異的なモノクローナル抗体をそれぞれ用いて説明する。
【図２】  図２Ａ〜２ＤはｒＶ−Ｂ７タンパク質を発現する移植されたマウス腺癌の成長を示す。１群あたり５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、感染させない（図２Ａ）、０．２５  ＭＯＩ  Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（図２Ｂ）、ｒＶ−Ｂ７−１（図２Ｃ）又はｒＶ−Ｂ７−２（図２Ｄ）によって感染させた３×１０５ＭＣ３８細胞を注入した。図２Ａと２ＢはＭＣ３８細胞の正常な成長速度を示し、図２Ｃと２Ｄは組換えＢ７タンパク質を発現するＭＣ３８細胞の成長速度を示す。腫瘍は２種類のサイズで測定された。これらの実験をさらに３回繰り返して、同様な結果を得た。＊動物は腹腔内腫瘍を増殖させたが、これは測定することができなかった。
【図３】  図３Ａ〜３Ｄ。図３Ａは未使用Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける非感染ＭＣ３８腫瘍の成長を示す。図３ＢはｒＶ−Ｂ７−１で予め感染させたＭＣ３８細胞を予め投与され（４０日目）、３×１０５ＭＣ３８細胞によってチャレンジされたＭＣ３８腫瘍の成長を示す。図３ＣはｒＶ−Ｂ７−２で感染させたＭＣ３８細胞を予め投与され（４０日目）、３×１０５ＭＣ３８細胞によってチャレンジされたＭＣ３８腫瘍の成長を示す。
【図４】  図４は、ヒト癌胎児性抗原遺伝子（ｒＶ−ＣＥＡ）、ネズミＢ７−２（ｒＶ−Ｂ７）、又はワクシニアウイルスの野生型菌株（Ｖ−Ｗｙｅｔｈ）の遺伝子をコードする組換えワクシニアウイルスで免疫感作された５  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの各処置群を示す。各マウスには、下記比：１：１ｒＶ−ＣＥＡ／ｒＶ−Ｂ７（５×１０６ＰＦＵｒＶ−ＣＥＡ＋５×１０６ＰＦＵｒＶ−Ｂ７）；１：１Ｖ−Ｗｙｅｔｈ／ｒＶ−Ｂ７（５×１０６ＰＦＵＶ−Ｗｙｅｔｈ＋５×ｌ０６ＰＦＵｒＶ−Ｂ７）；又は１：１ｒＶ−ＣＥＡ／Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（５×１０６ＰＦＵｒＶ−ＣＥＡ＋５×１０６ＰＦＵＶ−Ｗｙｅｔｈ）での尾乱刺法によって１×１０７プラーク形成単位を投与した。免疫感作後１４日目に各処置群から３個の脾臓を摘出し、プールし、標準５日リンパ球増殖分析（ｓｔａｎｄａｒｄ  ５  ｄａｙ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ）を既述されたように実施した（Ｋａｎｔｏｒ等、ＪＮＣＩ，８４：１０８４，１９９２）。精製Ｔ細胞をそれらの増殖能力に関して１００μｇ／ｍｌのバキュロウイルス産生組換えＣＥＡに対して試験した。培地に対する細胞反応性（バックグランド）に関連して刺激指数を算出した。
【図５】  図５は、ヒト癌胎児性抗原遺伝子（ｒＶ−ＣＥＡ）、ネズミＢ７−２（ｒＶ−Ｂ７）、又はワクシニアウイルスの野生型菌株（Ｖ−Ｗｙｅｔｈ）の遺伝子をコードする組換えワクシニアウイルスで免疫感作された５Ｃ５７ＢＬ／６マウスの各処置群を示す。各マウスには、下記比：１：３ｒＶ−ＣＥＡ／ｒＶ−Ｂ７（２．５×１０６ＰＦＵｒＶ−ＣＥＡ＋７．５×１０６ＰＦＵｒＶ−Ｂ７）；１：３Ｖ−Ｗｙｅｔｈ／ｒＶ−Ｂ７（２．５×１０６ＰＦＵＶ−Ｗｙｅｔｈ＋７．５×１０６ＰＦＵｒＶ−Ｂ７）；又は１：３ｒＶ−ＣＥＡ／Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（２．５×１０６ＰＦＵｒＶ−ＣＥＡ＋７．５×１０６ＰＦＵＶ−Ｗｙｅｔｈ）での尾乱刺法によって１×１０７プラーク形成単位を投与した。免疫感作後１４日目に３個の脾臓を摘出し、プールし、標準５日リンパ球増殖分析を既述されたように実施した（Ｋａｎｔｏｒ等、ＪＮＣＩ，８４：１０８４，１９９２）。精製Ｔ細胞をそれらの増殖能力に関して１００μｇ／ｍｌのバキュロウイルス産生組換えＣＥＡに対して試験した。培地に対する細胞反応性（バックグランド）に関連して刺激指数を算出した。
【図６Ａ】  図６Ａ〜６Ｄは、ｒＶ−ＣＥＡとｒＶ−Ｂ７とによって同時感染されたＢＳＣ−１の蛍光分析を示す。ＢＳＣ−１細胞に下記：（６Ａ）Ｖ−Ｗｙｅｔｈ；（６Ｂ）ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１）；（６Ｃ）Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）；又は（６Ｄ）ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）のいずれかの比で５のＭＯＩにおいてウイルスによって同時感染させ、ＭＡｂｓ  ＰＥ−Ｂ７−１とＦＴＴＣ−ＣＯＬ−１によって染色した。ＸおよびＹ軸は、各々ＣＥＡおよびＢ７−１蛍光を示し、Ｚ軸は細胞数を示す。各座標における陽性細胞の％を挿入パネルに示す。図６Ａは親ワクシニア菌株で感染された正常ＢＳＣ−１細胞の染色を示す。
【図６Ｂ】  図６Ａ〜６Ｄは、ｒＶ−ＣＥＡとｒＶ−Ｂ７とによって同時感染されたＢＳＣ−１の蛍光分析を示す。ＢＳＣ−１細胞に下記：（６Ａ）Ｖ−Ｗｙｅｔｈ；（６Ｂ）ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１）；（６Ｃ）Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）；又は（６Ｄ）ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）のいずれかの比で５のＭＯＩにおいてウイルスによって同時感染させ、ＭＡｂｓ  ＰＥ−Ｂ７−１とＦＴＴＣ−ＣＯＬ−１によって染色した。ＸおよびＹ軸は、各々ＣＥＡおよびＢ７−１蛍光を示し、Ｚ軸は細胞数を示す。各座標における陽性細胞の％を挿入パネルに示す。図６Ｂは単独感染中のＣＥＡ又はＢ７−１の発現を示す。
【図６Ｃ】  図６Ａ〜６Ｄは、ｒＶ−ＣＥＡとｒＶ−Ｂ７とによって同時感染されたＢＳＣ−１の蛍光分析を示す。ＢＳＣ−１細胞に下記：（６Ａ）Ｖ−Ｗｙｅｔｈ；（６Ｂ）ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１）；（６Ｃ）Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）；又は（６Ｄ）ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）のいずれかの比で５のＭＯＩにおいてウイルスによって同時感染させ、ＭＡｂｓ  ＰＥ−Ｂ７−１とＦＴＴＣ−ＣＯＬ−１によって染色した。ＸおよびＹ軸は、各々ＣＥＡおよびＢ７−１蛍光を示し、Ｚ軸は細胞数を示す。各座標における陽性細胞の％を挿入パネルに示す。図６Ｃは単独感染中のＣＥＡ又はＢ７−１の発現を示す。
【図６Ｄ】  図６Ａ〜６Ｄは、ｒＶ−ＣＥＡとｒＶ−Ｂ７とによって同時感染されたＢＳＣ−１の蛍光分析を示す。ＢＳＣ−１細胞に下記：（６Ａ）Ｖ−Ｗｙｅｔｈ；（６Ｂ）ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１）；（６Ｃ）Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）；又は（６Ｄ）ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）のいずれかの比で５のＭＯＩにおいてウイルスによって同時感染させ、ＭＡｂｓ  ＰＥ−Ｂ７−１とＦＴＴＣ−ＣＯＬ−１によって染色した。ＸおよびＹ軸は、各々ＣＥＡおよびＢ７−１蛍光を示し、Ｚ軸は細胞数を示す。各座標における陽性細胞の％を挿入パネルに示す。図６ＤはｒＶ−ＣＥＡとｒＶ−Ｂ７の両方による感染後に両方の組換え分子の同時発現を示す。
【図７】  図７は、ｒＶ−ＣＥＡ及び／又はｒＶ−Ｂ７による免疫感作後の一次ＣＴＬ活性の増強を示す。ＣＥＡに特異的な細胞毒性活性を全体で１×１０７ＰＦＵのｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１；三角形）又はｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１；円形）による感作後１０日目に分析した。各群からの脾臓Ｔ細胞を１６時間細胞毒性分析においてＭＣ３８細胞（ＣＥＡ陰性；閉鎖記号）又はＭＣ３８−ＣＥＡ２細胞（ＣＥＡ陽性；開放記号）と共にインキュベートした。抗Ｖ−ＷｙｅｔｈＣＴＬ活性は全てのサンプルにおいて＞５０％であった。
【図８】  図８Ａ〜８Ｄは、ｒＶ−ＣＥＡ及びｒＶ−Ｂ７によって免疫感作されたマウスにおける移植されたＣＥＡ発現マウス腺癌細胞の成長を示す。１群にあたり１０Ｃ５７ＢＬ／６マウスを（８Ａ）Ｖ−Ｗｙｅｔｈ；（８Ｂ）ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１）；（８Ｃ）Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）；又は（８Ｄ）ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）のいずれかの全体で１０７ＰＦＵで一回に免疫感作し、１４日間後に３×１０６ＭＣ−３８−ＣＥＡ−２−細胞を皮下に注射した。
【図９】  図９Ａ〜９Ｂは、ｒＶ−Ｂ７とｒＶ−ＣＥＡとの混合物を予め投与されたマウスにおける抗腫瘍免疫性を示す。図９Ａは未使用Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣ−３８−ＣＥＡ−２−腫瘍の成長を示し、予め腫瘍チャレンジを受けて生残したマウスにおける腫瘍成長を示す（図９Ｂ）。マウスをｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）によって免疫感作し、１４日後に腫瘍によるチャレンジを受けさせた。６０日間後に無腫瘍で留まるマウス（図８Ｄ）を反対側フランクで再チャレンジさせた（図９Ｂ）。
【図１０】  図１０は、ｒＶ−ＰＳＡ及びｒＶ−Ｂ７−１による免疫感作後の一次ＣＴＬ活性の増強を示す。ＰＳＡに特異的な細胞毒性活性を全体で１×１０７ＰＦＵのｒＶ−ＰＳＡ、ｒＶ−ＰＳＡ：ｒＶ−Ｂ７−１又はｒＶ−ＣＥＡ：ｒ−Ｂ７−１による感作後１０日目に分析した。各群からの脾臓Ｔ細胞を１６時間細胞毒性分析においてＭＣ３８細胞又はＭＣ３８−ＰＳＡ細胞と共にインキュベートした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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