(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常の遺伝子診断に用いる核酸プローブおよびプライマーの提供。【解決手段】ＡＢＣＧ２遺伝子における、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、特定のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、特定の配列の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなるポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ヒトＡＢＣＧ２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１中の第２０５〜２１６９ヌクレオチドで表わされるヌクレオチド配列において、配列番号１に示される第５８０番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１中の第２０５〜２１６９ヌクレオチドで表わされるヌクレオチド配列において、配列番号１に示されるチミン（Ｔ）残基がウラシル（Ｕ）残基に置換され、第５８０番目のシトシン（Ｃ）残基がウラシル（Ｕ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＡＢＣＧ２遺伝子における、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基に対応する部分を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項８】
ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常に起因する病態の予測または診断に用いるための、請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
ＡＢＣＧ２遺伝子における、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異を検出するためのプライマーペアであって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅しうる、プライマーペア。
【請求項１０】
ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常に起因する病態の予測または診断に用いるための、請求項９に記載のプライマーペア。
【請求項１１】
ＡＢＣＧ２遺伝子の変異を検出することにより、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常に起因する病態を予知または検出する方法であって、
請求項５〜８のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項９または１０に記載のプライマーペアを用いて、ＡＢＣＧ２遺伝子における、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異の有無を検出する工程を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子に関する。
【０００２】
背景技術
ＡＢＣＧ２遺伝子はＡｌｌｉｋｍｅｔｓらにより初めて単離された（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ　Ｒ，　Ｇｅｒｒａｒｄ　Ｂ，　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ　Ａ，　Ｄｅａｎ　Ｍ：　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ＡＢＣ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　２１　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇｓ　ｄａｔａｂａｓｅ．　Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　５，　１６４９−１６５５　（１９９６））。本遺伝子は染色体４ｑ２２に位置することが明らかにされ（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ　Ｒ，　Ｓｃｈｒｉｍｌ　ＬＭ，　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ　Ａ，　Ｒｏｍａｎｏ−Ｓｐｉｃａ　Ｖ，　Ｄｅａｎ　Ｍ：　Ａ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｃｅｎｔａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　ｇｅｎｅ　（ＡＢＣＰ）　ｏｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　４ｑ２２　ｔｈａｔ　ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５８，　５３３７−５３３９　（１９９８））、１６個のエクソンから構成されている。
【０００３】
さらに、抗癌剤耐性のヒト乳癌細胞などより本遺伝子をコードするｃＤＮＡが単離され、このタンパク質は薬剤耐性の原因となるトランスポータであり、抗癌剤を細胞外に排出する機能を有することが明らかにされている（Ｄｏｙｌｅ　ＬＡ，　ＹａｎｇＷ，　Ａｂｒｕｚｚｏ　ＬＶ，　Ｋｒｏｇｍａｎｎ　Ｔ，　Ｇａｏ　Ｙ，　Ｒｉｓｈｉ　ＡＫ，　Ｒｏｓｓ　ＤＤ：　Ａ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ＭＣＦ−７　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　９５，　１５６６５−１５６７０　（１９９８）；　Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ　Ｍ，　ｖａｎ　Ｇａｓｔｅｌｅｎ　ＭＡ，　Ｔｏｈｇｏ　Ａ，　Ｈａｕｓｈｅｅｒ　ＦＨ，　ｖａｎ　Ｗａａｒｄｅｎｂｕｒｇ　ＲＣＡＭ，　ｄｅ　Ｊｏｎｇ　ＬＡ，　Ｐｌｕｉｍ　Ｄ，　Ｂｅｉｊｎｅｎ　ＪＨ，　Ｓｃｈｅｌｌｅｎｓ　ＪＨＭ：　Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　（ＢＣＲＰ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｕｓｉｎｇ　ｎｏｎ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｄｒｕｇｓ　ｏｒ　ｔｈｅＢＣＲＰ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＧＦ１２０９１８．　Ｃｌｉｎ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　７，　９３５−９４１　（２００１）；　Ｋａｗａｂａｔａ　Ｓ，　Ｏｋａ　Ｍ，　Ｓｈｉｏｚａｗａ　Ｋ，　Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ　Ｋ，　Ｎａｋａｔｏｍｉ　Ｋ，　Ｓｏｄａ　Ｈ，　Ｆｕｋｕｄａ　Ｍ，　ＩｋｅｇａｍｉＹ，　Ｓｕｇａｈａｒａ　Ｋ，　Ｙａｍａｄａ　Ｙ，　Ｋａｍｉｈｉｒａ　Ｓ，　Ｄｏｙｌｅ　ＬＡ，　Ｒｏｓｓ　ＤＤ，　Ｋｏｈｎｏ　Ｓ：　Ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｉｒｅｃｔｌｙ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ＳＮ−３８　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２８０，　１２１６−１２２３　（２００１）；　Ｌｉｔｍａｎ　Ｔ，　Ｂｒａｎｇ　Ｍ，　Ｈｕｄｓｏｎ　Ｅ，　Ｆｅｔｓｃｈ　Ｐ，　Ａｂａｔｉ　Ａ，　Ｒｏｓｓ　ＤＤ，　Ｍｉｙａｋｅ　Ｋ，　Ｒｅｓａｕ　ＪＨ，　Ｂａｔｅｓ　ＳＥ：　Ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ
−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｗ　ＡＢＣ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，　ＭＸＲ　（ＡＢＣＧ２）．　Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｓｃｉ．　１１３，　２０１１−２０２１　（２０００））。
【０００４】
さらに、カンプトテシンの７−位が置換された誘導体がＡＢＣＧ２の過剰発現による抗癌剤ミトキサントロン耐性を克服することが明らかにされている（Ｐｅｒｅｇｏ　Ｐ，　ｄｅ　Ｃｅｓａｒｅ　Ｍ，　ｄｅ　Ｉｓａｂｅｌｌａ　Ｐ，　Ｃａｒｅｎｉｎｉ　Ｎ，　Ｂｅｇｇｉｏｌｉｎ　Ｇ，　Ｐｅｚｚｏｎｉ　Ｇ，　Ｐａｌｕｍｂｏ　Ｍ，　Ｔａｒｔａｇｌｉａ　Ｌ，　Ｐｒａｔｅｓｉ，　Ｇ，　Ｐｉｓａｎｏ　Ｃ，　Ｃａｒｍｉｎａｔｉ　Ｐ，　Ｓｃｈｅｆｆｅｒ　ＧＬ，　Ｚｕｎｉｎｏ　Ｆ：　Ａ　ｎｏｖｅｌ　７−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ　ａｎａｌｏｇ　ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ａ　ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｃｏｌｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　６１，　６０３４−６０３７　（２００１））。
【０００５】
また、ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤とされていたＣＩ１０３３が、ＡＢＣＧ２の機能を抑制することにより７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン　（ＳＮ−３８，　イリノテカンの活性代謝産物）やトポテカン耐性を克服することが示されている（Ｅｒｌｉｃｈｍａｎ　Ｃ，　Ｂｏｅｒｎｅｒ　ＳＡ，　Ｈａｌｌｇｒｅｎ　ＣＧ，　Ｓｐｉｅｋｅｒ　Ｒ，　Ｗａｎｇ　ＸＹ，　Ｊａｍｅｓ　ＣＤ，　Ｓｃｈｅｆｆｅｒ　ＧＬ，　Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ　Ｍ，　Ｒｏｓｓ　ＤＤ，　Ｂｉｂｌｅ　ＫＣ，　Ｋａｕｆｍａｎｎ　ＳＨ：　Ｔｈｅ　ＨＥＲ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＣＩ１０３３　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　７−ｅｔｈｙｌ−１０−ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ　ａｎｄ　ｔｏｐｏｔｅｃａｎ　ｂｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄｄｒｕｇ　ｅｆｆｌｕｘ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　６１，　７３９−７４８　（２００１））。
【０００６】
これらのことより、ＡＢＣＧ２の発現により抗癌剤の細胞外排出が起こり、癌細胞が薬剤耐性を示すことが支持されている。
【０００７】
また、本トランスポータの３番目の膜貫通ドメイン上に存在する４８２番目のアルギニンがスレオニンやグリシンに変化すると、排出に関与する薬剤に変化がみられ、このことから、本タンパク質の機能に４８２番目のアミノ酸が重要であることが明らかにされている（Ｈｏｎｊｏ　Ｙ，　Ｈｒｙｃｙｎａ　ＣＡ，　Ｙａｎ　ＱＷ，　Ｍｅｄｉｎａ−Ｐｅｒｅｚ　ＷＹ，　Ｒｏｂｅｙ　ＲＷ，　ｖａｎ　ｄｅ　Ｌａａｒ　Ａ，　Ｌｉｔｍａｎ　Ｔ，　Ｄｅａｎ　Ｍ，　Ｂａｔｅｓ　ＳＥ：　Ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＭＸＲ／ＢＣＲＰ／ＡＢＣＰ　ｇｅｎｅ　ａｌｔｅｒ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ＭＸＲ／ＢＣＲＰ／ＡＢＣＰ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　６１，　６６３５−６６３９　（２００１））。
【０００８】
さらに、ＡＢＣＧ２の正常細胞における機能について、胎盤に存在し、血液−胎盤関門を構成することで胎児を脂溶性化合物より保護しているとの報告がある（Ｊｏｎｋｅｒ　ＪＷ，　Ｓｍｉｔ　ＪＷ，　Ｂｒｉｎｋｈｕｉｓ　ＲＦ，　Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ　Ｍ，　Ｂｅｉｊｎｅｎ　ＪＨ，　Ｓｃｈｅｌｌｅｎｓ　ＪＨ，　Ｓｃｈｉｎｋｅｌ　ＡＨ：　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｆｅｔａｌ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｐｏｔｅｃａｎ．　Ｊ．　Ｎａｔｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．　９２，　１６５１−１６５６　（２０００））。他に、ヒト小腸上皮細胞や、血液幹細胞におけるＡＢＣＧ２の発現の報告がある（Ｔａｉｐａｌｅｎｓｕｕ　Ｊ，　Ｔｏｒｎｂｌｏｍ　Ｈ，　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ　Ｇ，　Ｅｉｎａｒｓｓｏｎ　Ｃ，　Ｓｊｏｑｖｉｓｔ　Ｆ，　Ｍｅｌｈｕｓ　Ｈ，　Ｇａｒｂｅｒｇ　Ｐ，　Ｓｊｏｓｔｒｏｍ　Ｂ，　Ｌｕｎｄｇｒｅｎ　Ｂ，　Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ　Ｐ：　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｅｎ　ｄｒｕｇ　ｅｆｆｌｕｘ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｈｕｍａｎ　ｊｅｊｕｎｕｍ　ａｎｄ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｃａｃｏ−２　ｃｅｌｌ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　２９９，　１６４−１７０　（２００１）；　Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ　Ｍ，　Ｓｃｈｅｆｆｅｒ　ＧＬ，　Ｇａｎｅｙｔｅ　ＩＦ，　ｖａｎ　Ｇａｓｔｅｌｅｎ　ＭＡ，　Ｐｉｊｎｅｎｂｏｒｇ　ＡＣＬＭ，　Ｓｃｈｉｎｋｅｌ　ＡＨ，　ｖａｎ　ｄｅ　Ｖｉｊｖｅｒ　ＭＪ，　Ｓｃｈｅｐｅｒ　ＲＪ，　ＳｃｈｅｌｌｅｎｓＪＨＭ：　Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｈｕｍａｎ　ｔｉｓｓｕｅｓ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　６１，　３４５８−３４６４　（２００１）；　Ｋｉｍ　Ｍ，　Ｔｕｒｎｑｕｉｓｔ　Ｈ，Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｊ，　Ｓｇａｇｉａｓ　Ｍ，　Ｙａｎ　Ｙ，　Ｇｏｎｇ　Ｍ，　Ｄｅａｎ　Ｍ，　Ｓｈａｒｐ　ＪＧ，　Ｃｏｗａｎ　Ｋ：　Ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ＡＢＣＧ２　（ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１）　ｅｆｆｌｕｘｅｓ　Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２　ａｎｄ　ｉｓ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．　Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　８，　２２−２８　（２００２））。これらの文献によれば、特にヒト小腸でのＡＢＣＧ２の発現は経口摂取した薬物吸収に対する障壁になっていると考えられている。
【０００９】
【発明の概要】
本発明者らは、薬物輸送体ＡＢＣＧ２遺伝子において、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンが翻訳終止コドンとなり、ＡＢＣＧ２タンパク質の活性が欠失する遺伝子多型を見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１０】
従って、本発明は、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子の提供を目的とする。
【００１１】
そして、本発明による変異型ポリヌクレオチドは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなる、ポリヌクレオチドである。
【００１２】
さらに、本発明による核酸分子は、ＡＢＣＧ２遺伝子における、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子である。
【００１３】
【発明の具体的説明】
本発明によれば、ＡＢＣＧ２遺伝子における、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンが終止コドンとなる変異（本発明において「Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異」という）を検出することができる。
【００１４】
ＡＢＣＧ２タンパク質は、ＡＢＣファミリー輸送体の一種であり、そのアミノ酸配列は配列番号２に示されている。ＡＢＣファミリー輸送体は、一般に、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを用いて、様々な物質を、細胞膜の外側から内側へ、または内側から外側へ能動輸送する。ＡＢＣＧ２タンパク質は、いくつかの薬物の、細胞膜内側から外側への輸送に関与している。従って、ＡＢＣＧ２タンパク質の機能が失われると、これらの薬物を投与されている患者においてその薬物の吸収が過剰となり、有害な副作用が起こるものと考えられる。ＡＢＣＧ２タンパク質がその輸送に関与している薬物には、イリノテカン、ミトキサントロン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、およびトポテカン（いずれも抗癌剤）がある。
【００１５】
本発明により検出されるＡＢＣＧ２遺伝子中の変異は、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンが終止コドンとなるものである。このような変異としては、例えば、翻訳開始コドンから数えて第３７６番目（配列番号１中では第５８０番目）のシトシン残基のチミン残基への変異が挙げられる。ＡＢＣＧ２タンパク質は６５５個のアミノ酸残基を含んでなるため、第１２６番目のグルタミン残基以降のアミノ酸が欠失すると、約８０％のアミノ酸が失われることになる。このため、上記のＡＢＣＧ２遺伝子中の変異により、ＡＢＣＧ２タンパク質の機能は失われる。従って、上記の変異を検出することにより、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常に起因する病態の予測または診断が可能となる。
【００１６】
変異型ポリヌクレオチド
Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するためには、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなるポリヌクレオチドを標的とすることができる。すなわち、このような変異型ポリヌクレオチドの存在を確認することにより、Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。
【００１７】
Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際には、ゲノム中の上記変異型ポリヌクレオチドを標的とすることができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、ヒトＡＢＣＧ２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンの終止コドンへの変異を有してなるポリヌクレオチドとされる。ヒトＡＢＣＧ２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質を発現しうる限り、特に限定されないが、好ましくは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列中のチミン（Ｔ）残基がウラシル（Ｕ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるｍＲＮＡを生体内において生産しうるヌクレオチド配列とされ、例えば、ＮＣＢＩデータベースに登録番号ＮＴ０２２９５９として登録されているゲノム配列中のＡＢＣＧ２遺伝子配列が挙げられる。ＮＴ０２２９５９のゲノム配列中におけるＡＢＣＧ２遺伝子には１６個のエクソンが含まれる。ＡＢＣＧ２遺伝子の両末端部位は当業者にとって明らかであるが、好ましくはＡＢＣＧ２遺伝子のエクソン１の５’末端からエクソン１６の３’末端までとする。
【００１８】
また、Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際に、ゲノムにおける上記変異型ポリヌクレオチドの転写産物であるｍＲＮＡを標的とすることもできる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列（特に、第２０５〜２１６９ヌクレオチドで表わされるヌクレオチド配列）において、配列番号１に示される第５８０番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００１９】
さらに、Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際に、上記ｍＲＮＡに対して生成させたｃＤＮＡを標的とすることもできる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列（特に、第２０５〜２１６９ヌクレオチドで表わされるヌクレオチド配列）において、配列番号１に示される第５８０番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００２０】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。
【００２１】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、既述の通り、Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際の標的として有用であるが、さらには、ＡＢＣＧ２タンパク質の活性を増強する化合物をスクリーニングするためにも有用である。
【００２２】
核酸分子およびこれを用いた病態予知／検出方法
本発明による核酸分子は、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出しうるものであり、該核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる。
【００２３】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとする。
【００２４】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２５】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、検出の標的をゲノムとする場合には、本発明による核酸分子は、エクソンにハイブリダイズする部分だけでなく、イントロンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【００２６】
本発明による核酸分子は、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異の検出において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基に対応する部分を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【００２７】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドとする。
【００２８】
また、本発明による核酸分子は、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異の検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００２９】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜５０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとする。
【００３０】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１８〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料から上記Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する上で好ましいものである。
【００３１】
核酸増幅法は通常プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するためのプライマーペアであって、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅しうるプライマーペアが提供される。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００３２】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異の有無を検出することができ、これにより、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常に起因する病態を予知または検出することができる。
【００３３】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができ、より具体的には、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第１２６番目のグルタミン残基に対応する部分を含む領域を増幅するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する工程を含んでなる、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常に起因する病態の予知法もしくは検出法または診断法が提供される。
【００３４】
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。核酸増幅法およびこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としては、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とする場合には通常のＰＣＲ法等を用いることができ、ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。
【００３５】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００３６】
本発明による診断法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、プライマーの一方を変異部位に対合できるように設計し、他方を変異部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に変異が存在する場合には増幅産物が得られ、変異が存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより変異の有無を判定することができる。
【００３７】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等による変異の検出にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常に起因する病態の予知法もしくは検出法または診断法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異の存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００３８】
この方法による診断に当たっては、例えば、被検者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）を参照することができる。
【００３９】
ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。この方法は、Ｑ１２６ＳＴＯＰ変異が一塩基多型である場合において特に好ましい。このような一塩基多型としては、例えば、翻訳開始コドンから数えて第３７６番目（配列番号１中では第５８０番目）のシトシン残基のチミン残基への変異が挙げられる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００４１】
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、一塩基多型の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基多型の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４２】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４３】
本発明による予知法、検出法および診断法において、ＡＢＣＧ２遺伝子におけるＱ１２６ＳＴＯＰ変異が存在すると評価されたサンプルは、ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常に起因する病態を有するものと、あるいは将来においてその可能性があると診断することができる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００４４】
【実施例】
例１：ヒトゲノムＤＮＡ中のＡＢＣＧ２（ＢＣＲＰ）のエクソンおよびその周辺配列の解析
ヒトゲノムＤＮＡを用い、ＡＢＣＧ２遺伝子のエクソンおよびその周辺の塩基配列を解読した。ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてエクソン及び周辺領域を増幅する段階から、最終的に塩基配列の解読を行ない、変異を検出するまでを記述した。
【００４５】
材料および試薬
日本人由来樹立細胞株８４系
タカラ　Ｅｘ−Ｔａｑ　（ＰＣＲ増幅用試薬キット）
ＰＣＲ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ　（ＵＳＢ　Ｃｏ．，　Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，　ＯＨ）：ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ　（１０　Ｕ／μＬ）およびＳｈｒｉｍｐ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　（２Ｕ／μＬ）が別々に含まれている。
ＡＢＩ　ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ）
ＤｙｅＥｘ９６　ｐｌａｔｅ　（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｈｉｌｄｅｎ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）
【００４６】
装置および機器
ＰＣＲ９７００　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ）
冷却遠心機（Ｓａｋｕｍａ　Ｍ２００−ＩＶＤ）
ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
【００４７】
作業手順
ＡＢＣＧ２のゲノム配列（ＮＣＢＩ，　登録番号　ＮＴ　０２２９５９）に基づき、ＡＢＣＧ２遺伝子の各エクソン増幅用（表１）およびシークエンス用（表２）のプライマーセットを、イントロン中にＡＢＣＧ２特異的となるよう設計した。
【００４８】
【表１】
2004016042.tif 000002
【００４９】
【表２】
2004016042.tif 000003
【００５０】
シークエンス手順としては、まず、各エクソン増幅用のプライマーセット（表１、各０．５μＭ）全てとＥｘ−Ｔａｑ（０．６２５ｕｎｉｔｓ；　Ｔａｋａｒａ　Ｓｈｕｚｏ，　Ｋｙｏｔｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡ（４００　ｎｇ）よりＡＢＣＧ２遺伝子の各エクソンを全て増幅した。この際の反応液の全量は５０μＬで、８００μＭの　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（通常の４倍量）を加え、下記表３に示す組成とした。
【００５１】
【表３】
2004016042.tif 000004
【００５２】
ＰＣＲの条件は、９４℃で５分処理後、「９４℃で３０秒、５５℃で１分および７２℃で２分」を３０サイクル行い、その後７２℃で７分処理した。その反応液にＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔに含まれるＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＩとＳｈｒｉｍｐ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを２０μＬずつ加えて３７℃で１５分、ついで８０℃で１５分反応させ、４℃に冷却した。
【００５３】
次に各エクソンのＰＣＲ増幅用プライマーセット（表１、各０．５μＭ）を用いて、ＡＢＣＧ２遺伝子の全エクソンを含むＤＮＡ断片（前記、ＰＣＲ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔによる処理を行った反応液を３μｌ用いる）より、各エクソンを含むＤＮＡ断片をＥｘ−Ｔａｑ（０．６２５ｕｎｉｔｓ；　Ｔａｋａｒａ　Ｓｈｕｚｏ，　Ｋｙｏｔｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて増幅した。この際の反応液の全量は５０μＬで、下記表４に示す組成とした。
【００５４】
【表４】
2004016042.tif 000005
【００５５】
ＰＣＲの条件は、９４℃で５分処理後、「９４℃で３０秒、５５℃で１分および７２℃で２分」を３０サイクル行い、その後７２℃で７分処理した。その後、ＰＣＲ増幅産物のうち５μＬにＰＣＲ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＵＳＢ　Ｃｏ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，　ＯＨ）に含まれるＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉを０．２μＬ、Ｓｈｒｉｍｐ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを０．２μＬ、精製水を１．６μＬ加えて３７℃で１５分、８０℃で１５分処理し、その後４℃に冷却した。このような処理を行ったＰＣＲ産物を両鎖につき表２のプライマーを用いて、ＡＢＩ　ＢｉｇＤｙｅ　ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｖｅｒｓｉｏｎ　３，　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ）により直接塩基配列決定した。そのため、計７μＬのＰＣＲ増幅産物に１μＭのプライマー１．６μＬ、ＢｉｇＤｙｅ（Ｖｅｒ．　３）を２μＬ、５ｘ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを３μＬ、精製水６．４μＬを加え合計２０μＬとして「９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分」を２５サイクル行い、その後、４℃に冷却した。過剰な色素をＤｙｅＥｘ９６　ｐｌａｔｅ（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｈｉｌｄｅｎ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて除去し、溶出液２０μＬをＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。その際、溶出液に精製水２５μＬを加え、９４℃で２分間、ヒートショックを行った。
【００５６】
結果および考察
上述のように、日本人由来樹立細胞株８４系からのＡＢＣＧ２遺伝子のエクソン領域を中心に配列決定し、これを参照配列（ＮＣＢＩ，　登録番号：ＮＴ　０２２９５９）と比較したところ、エクソン４内に存在する、翻訳開始コドンから数えて第３７６番目（配列番号１中では第５８０番目）のシトシン残基のチミン残基への変異が検出された。この変異により、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目のグルタミン残基をコードするコドンは終止コドンとなるため、ＡＢＣＧ２タンパク質の第１２６番目以降のアミノ酸は欠失することとなる。完全なＡＢＣＧ２タンパク質は６５５個のアミノ酸残基からなるため、この変異により、ＡＢＣＧ２タンパク質の約８０％が欠失し、従って、ＡＢＣＧ２タンパク質の機能は失われる。ＡＢＣＧ２タンパク質の機能不全は、薬物吸収の異常、特に薬物の過剰吸収を引き起こすため、薬物による副作用を増強する。
【配列表】
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