(57)【要約】【課題】蛍光測定時間を短縮できる蛍光測定装置を提供すること。【解決手段】ウエルＷ６に溶液を注入する分注器１５と、前記蛍光を集光する対物レンズ１８を含み、前記対物レンズで集光した前記蛍光を受光素子上に結像して前記蛍光を検出する検出光学系４０と、前記対物レンズを通して前記ウエル内の標本に照明光を照射する照明光学系３０と、前記対物レンズの焦点位置を検出する焦点検出光学系２０と、前記焦点検出光学系からの信号を用いて前記対物レンズの焦点位置を調整し、前記標本に合焦する合焦手段１９とを有し、前記分注器は、前記溶液を分注するための分注準備動作を行った後、前記ウエルに前記溶液を注入する分注動作を行い、前記分注準備動作と、前記対物レンズの焦点位置を調整する合焦動作もしくは前記標本からの前記蛍光を測定する蛍光測定動作とが時間的に並行して実行されること。【選択図】  図１
2004205343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウエル内の標本から発生する蛍光を測定する蛍光測定装置において、
前記ウエルに溶液を注入する分注器と、
前記蛍光を集光する対物レンズを含み、前記対物レンズで集光した前記蛍光を受光素子上に結像して前記蛍光を検出する検出光学系と、
前記対物レンズを通して前記ウエル内の標本に照明光を照射する照明光学系と、
前記対物レンズの焦点位置を検出する焦点検出光学系と、
前記焦点検出光学系からの信号を用いて前記対物レンズの焦点位置を調整し、前記標本に合焦する合焦手段とを有し、
前記分注器は、前記ウエルに注入する前記溶液を吸引する分注準備動作を行った後、前記ウエルに前記溶液を注入する分注動作を行い、
前記分注準備動作と、前記対物レンズの焦点位置を調整する合焦動作もしくは前記標本からの前記蛍光を測定する蛍光測定動作とが時間的に並行して実行されることを特徴とする蛍光測定装置。
【請求項２】
前記焦点検出光学系は、光源と、前記光源からの光を前記対物レンズに導くミラーを有し、
前記ミラーは、前記対物レンズの光軸に挿脱可能に設けられていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定装置。
【請求項３】
前記光源は、半導体素子を用いた光源であることを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光測定装置。
【請求項４】
前記分注準備動作は、前記分注器が準備位置に移動するステップと、前記溶液を吸引するステップと、前記ウエル位置に移動し待機するステップとからなり、
前記合焦動作は、前記対物レンズの光軸に前記ミラーを挿入するステップと、前記光源を点灯するステップと、前記対物レンズを通して前記対物レンズの焦点位置の検出を行い前記標本に合焦させるステップと、前記光源を消灯するステップと、前記ミラーを光軸から外すステップとからなり、
前記蛍光測定動作は、前記照明光を前記標本に照射し第１の蛍光を前記検出光学系で測定するステップと、前記ウエルに前記分注器により溶液を注入するステップと、前記溶液を注入後第２の蛍光を前記検出光学系で測定するステップとから構成されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の蛍光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プレートに設けられた複数のウエル（凹部）内の標本に励起光を照射したときに発生する蛍光を測定する蛍光測定装置に関するものであり、特に、ウエルに試薬を注入する分注器と、標本に焦点を合わせる自動合焦機構とを備えた蛍光測定装置に関する。
【０００２】
【従来技術】
従来、複数のウエルが設けられたウエルプレートを用い、各ウエルに入れられた標本（例えば、細胞や溶液など）に試薬を注入し、標本が発する蛍光を測定する蛍光測定装置がある。標本が細胞の細胞の場合には、細胞が発する蛍光を対物光学系によってＣＣＤのような二次元撮像素子に結像して蛍光像を撮像する装置が知られている。この装置では、標本である細胞の蛍光像を試薬注入前と試薬注入後で測定し、細胞内の蛍光の分布の変化や蛍光強度の変化を解析することによって細胞の応答を解析する。
【０００３】
このような細胞の蛍光像を検出する蛍光測定装置には、標本の蛍光像を鮮明に測定するためにウエル内の標本に焦点を合わせる自動焦点調整機構と、ウエル内の標本に試薬を注入する分注器が設けられていることが多い。自動焦点調整機構としては、焦点面前後で標本の信号を検出し、そのコントラストから焦点検出を行う方法が知られている。この場合の標本の信号としては、標本に照明した光の反射、標本を透過した光、標本が発する蛍光などが使用される。一方、分注器には様々な種類のものがあるが、移動機構を備えたマイクロピペットを使用し、容器に満たされた溶液を吸引し、測定光学系上に配置されたウエルプレートの指定されたウエルの上方に移動して、ウエルに溶液を注入するものがある（特許文献１参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特表２０００−５０９８２７号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述した自動焦点調整機構において、標本が発する蛍光を検出して焦点位置を検出するタイプのものは、反射光や透過光に比べて、蛍光の強度が弱いため焦点を検出するための信号を得るためには数秒程度の間蛍光を蓄積して検出しなければならず、合焦動作に時間がかかってしまう。さらに分注器は、溶液を吸引し、指定されたウエルの上方に移動する準備動作に通常２０秒から３０秒程度の時間を要する。したがって、分注準備動作と合焦動作を合わせると、一般的な９６個のウエルが設けられたウエルプレートを測定する場合、９６ウエルの測定を完了するのに最低でも４８分程度の時間がかかってしまい、スループットが低下してしまうという問題があった。
【０００６】
本発明は、上記問題に鑑みて行われたものであり、分注準備動作と合焦動作を時間的に並行して行うことによりウエルプレート全体の蛍光測定時間を短縮できる蛍光測定装置を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明では、ウエル内の標本から発生する蛍光を測定する蛍光測定装置において、前記ウエルに溶液を注入する分注器と、前記蛍光を集光する対物レンズを含み、前記対物レンズで集光した前記蛍光を受光素子上に結像して前記蛍光を検出する検出光学系と、前記対物レンズを通して前記ウエル内の標本に照明光を照射する照明光学系と、前記対物レンズの焦点位置を検出する焦点検出光学系と、前記焦点検出光学系からの信号を用いて前記対物レンズの焦点位置を調整し、前記標本に合焦する合焦手段とを有し、前記分注器は、前記ウエルに注入する前記溶液を吸引して前記ウエルに前記溶液を分注するための分注動作を行った後、前記ウエルに前記溶液を注入する分注動作を行い、前記分注準備動作と、前記対物レンズの焦点位置を調整する合焦動作若しくは前記標本からの前記蛍光を測定する蛍光測定動作とが時間的に並行して実行されることを特徴とする蛍光測定装置を提供する。
【０００８】
また、本発明の蛍光測定装置では、前記焦点検出光学系は、光源と、前記光源からの光を前記対物レンズに導くミラーを有し、前記ミラーは、前記対物レンズの光軸に挿脱可能に設けられていることが好ましい。
【０００９】
また、本発明の蛍光測定装置では、前記光源は、半導体素子を用いた光源であることが好ましい。
【００１０】
また、本発明の蛍光測定装置では、前記分注準備動作は、前記分注器が準備位置に移動するステップと、前記溶液を吸引するステップと、前記ウエル位置に移動し待機するステップとからなり、前記合焦動作は、対物レンズの光軸に前記ミラーを挿入するステップと、前記光源を点灯するステップと、前記対物レンズを通して前記対物レンズの焦点位置の検出を行い前記標本に合焦させるステップと、記光源を消灯するステップと、前記ミラーを光軸から外すステップとからなり、前記蛍光測定動作は、前記照明光を前記標本に照射し第１の蛍光を前記検出光学系で測定するステップと、前記ウエルに前記分注器により溶液を注入するステップと、前記溶液を注入後第２の蛍光を前記検出光学系で測定するステップとから構成されていることが好ましい。
【００１１】
【発明の実施形態】
本発明の一実施の形態を図面を参照しつつ説明する。
【００１２】
図１は本発明に係る蛍光測定装置の全体を模式的に示す図であり、図２は本発明に係る蛍光測定装置の測定手順を示すフロー図である。
【００１３】
図１に示すように、本発明に係る蛍光測定装置１は、標本の注入されたウエルプレート等を支持し、遮光部材で覆われた標本部２と、指定されたウエルに合焦し標本からの蛍光を測定する測定光学系３と、分注、合焦、蛍光測定及び解析等を行うコントローラ及びドライバ等を含む制御装置４とから構成されている。以下、それぞれについて詳説する。
【００１４】
図１において、標本が入れられたウエルプレートＡ２に注入する試薬又は溶液（以後、溶液と記す）が入れられたウエルプレートＡ１はステージ１１上に支持されている。ウエルプレートＡ２はＸ−Ｙステージ１２上に支持されており、Ｘ−Ｙステージ１２にはステージ１２の位置を検出するための不図示の位置検出装置（例えば、光エンコーダ等）が内蔵されたモータ１３、１４が設けられており、ウエルプレートＡ２の位置決めを行っている。Ｘ−Ｙステージ１２のモータ１３、１４は制御装置４に設けられたドライバＤ２により駆動されている。Ｘ―Ｙステージ１２が載置されたステージ１１には光学系への開口部Ｈが設けられており、標本からの蛍光を測定するために使用される。
【００１５】
また、標本部２にはウエルプレートＡ１から溶液を吸引してウエルプレートＡ２の指定されたウエルに溶液を注入する分注器１５が設けられている。分注器１５は制御装置４に設けられたドライバＤ１によってウエルプレートＡ１とＡ２との間を往復するように不図示の駆動装置によって駆動されている。これらウエルプレートＡ１、Ａ２及び分注器１５等は遮光部材１６によって覆われている。遮光部材１６は内部を暗室に保ち蛍光測定時の迷光を防ぐと共に、二酸化炭素などの雰囲気での測定や測定環境温度を一定に保つ機能を兼ねている。
【００１６】
ウエルプレートＡ１、Ａ２には複数（例えば、９６個）のウエルＷ１・・・Ｗ６・・・Ｗ９６がマトリックス状に配置されている。各ウエルＷ１・・・Ｗ６・・・Ｗ９６の深さはウエルプレートＡ１、Ａ２の厚さ方向に略等しく（深さ約５ｍｍ）形成されている。ウエルプレートＡ１、Ａ２はプラスチックやガラス等で形成されており、ウエルプレートＡ２の底部は透明なプラスチックやガラスで形成されている。例えば、ウエルプレートＡ１、Ａ２の大きさは凡そ８０ｍｍ×１２０ｍｍである。
【００１７】
ウエルプレートＡ２の各ウエルＷ１・・・Ｗ６・・・の中には測定対象物である標本（例えば、細胞）が入っている。ウエルプレートＡ１の各ウエルＷ１・・・Ｗ６・・・の中には標本に注入する溶液が入れられている。
【００１８】
分注器１５は準備位置（ウエルプレートＡ１の位置上方）に配置されている。分注器１５はウエルプレートＡ１に準備された溶液をウエルプレートＡ２のそれぞれのウエルＷ１・・・Ｗ６・・・に溶液を注入する装置で、ウエルプレートＡ１の指定されたウエルの溶液をウエルプレートＡ２の指定されたウエル（以後、ウエルＷ６を代表として説明）に溶液を注入するために、分注器１５の不図示の位置検出装置からの信号に基づき、制御装置４のコントローラＣ１とドライバＤ１によって駆動制御されている。このようにして標本部２が構成されている。
【００１９】
次に、測定光学系３に付いて詳述する。図１において、標本部２のＸ−Ｙステージ１２の位置に設けられたステージ１１の開口部Ｈに自動焦点検出光学系２０と照明光学系３０と蛍光検出光学系４０とを一体に構成した測定光学系３が配置されている。
【００２０】
開口部Ｈの下方には開口部Ｈ上に置かれたウエルプレートＡ２ウエル中の標本に合焦し、照明光を照射し標本から発生する蛍光を集光する対物レンズ１８が配置されている。対物レンズ１８には焦点制御のための合焦手段１９が設けられており、制御装置４のドライバＤ４によって駆動され自動焦点検出光学系２０にて焦点検出が行われる。
【００２１】
自動焦点検出光学系２０には、第１の焦点検出用の光源である発光ダイオード（ＬＥＤ）２１が設けられている。ＬＥＤ２１からの光はレンズ２２で光路中に配置された絞り２３の開口部に集光され、レンズ２４で略平行光にされて、自動焦点検出の際に対物レンズ１８の光軸Ｉ中に挿入される焦点検出用のミラー２５で反射されて、対物レンズ１８に入射する。対物レンズ１８から出射したＬＥＤ光はウエルプレートＡ２のウエル（Ｗ６）に入った標本に照射される。標本らの光は対物レンズ１８で集光され、ミラー２５で反射されて検出器２６（例えば、フォトダイオードや電子増倍管）に入射する。検出器２６からの出力信号を用いて制御装置４によって自動焦点検出が行われ、合焦手段１９を用いて対物レンズ１８が軸方向に移動し合焦動作が行われる。ウエル（Ｗ６）における対物レンズ１８の合焦位置は制御装置４のＣＰＵ内に記憶されると共に、対物レンズ１８の位置が固定される。指定されたウエルの底部又は標本の自動焦点検出が終了するとミラー２５は光軸Ｉから外される。このようにして、ウエル中の標本への合焦動作が行われる。ＬＥＤ２１のＯＮ／ＯＦＦ、ミラー２５の光軸Ｉへの挿脱及び検出器２６の結像信号等はドライバＤ３を介して制御装置により制御及び信号処理されている。
【００２２】
照明光学系３０は、照明用の光源である水銀ランプ３１からの照明光をコレクターレンズ３２とリレーレンズ３３及び対物レンズ１８の光軸Ｉ中に設けられたフィルタボックス３４介して対物レンズ１８に入射し、標本（Ｗ６）へと照射する。フィルタボックス３４は水銀ランプ４１の光から所定の波長の光を選択する不図示の励起フィルタと、励起フィルタを透過した光を反射し対物レンズ１８に導くための波長分割ミラー３５（ダイクロイックミラー）と、標本からの蛍光を分離し、結像レンズ４１及び受光素子４２に導くためのバンドパスフィルタ３６とから構成されている。照明光学系３０には、シャッター３７がコレクターレンズ３２とリレーレンズ３３との間に設けられており、制御装置４に設けられたドライバＤ５により必要に応じてシャッター３５を開閉するように制御されている。
【００２３】
標本で発生した蛍光は対物レンズ１８で集光されフィルタボックス３４と検出光学系４０の結像レンズ４１とを介して受光素子４２（例えば、ＣＣＤ）に結像される。検出光学系４０の受光素子４２に導かれた蛍光はコントローラＣ２を介してモニターＭＴＲで観察すると共に、不図示の記録装置に記憶される。
【００２４】
この際、合焦動作検出が自動焦点検出光学系２０と合焦手段１９とで行われており、且つ対物レンズ１８の物体側の焦点位置と受光素子４２とは光学的に共役な関係にあるため、再度焦点検出動作を行う必要はない。このようにして、標本からの蛍光が測定される。
【００２５】
制御装置４は、主制御装置ＣＰＵと、分注器の駆動制御をするコントローラＣ１及びドライバＤ１と、Ｘ−Ｙステージ１２の駆動制御をするドライバＤ２と、自動焦点検出光学系２０の発光ダイオード２１のＯＮ／ＯＦＦ制御及びミラー２５の光軸Ｉへの挿脱制御及び検出器２６からの信号を受信するドライバＤ３と、対物レンズ１８を光軸方向に移動させて合焦動作を制御するドライバＤ４と、照明光学系３０のシャッター３７の開閉を制御するドライバＤ５と、蛍光を受光する受光素子４２の信号を制御するコントローラＣ２とコントローラＣ２に接続されたモニターＭＴＲとから構成されている。それぞれのコントローラ及びドライバの制御は主制御装置ＣＰＵで行われ、後述する蛍光測定手順が実行されている。上述のような構成で本発明の蛍光測定装置１は構成されている。
【００２６】
次に、図２を参照して本発明に係る蛍光測定装置の測定手順に関し説明する。図２は測定手順の時間的な流れを示す図である。図２（ａ）は動作ステップの詳細と時間を、（ｂ）は経過時間を模式的に示している。
【００２７】
図２に示すように、本発明の蛍光測定装置１は、主に３つの動作から構成されている。第１の動作は指定されたウエル（Ｗ６）の底部又は標本に対物レンズ１８を合焦させるための合焦動作５０であり、第２の動作は指定されたウエル（Ｗ６）にウエルプレートＡ１から分注器１５を用いて溶液をウエルプレートＡ２に分注する分注準備動作６０であり、第３の動作は標本に溶液を注入し標本からの蛍光を測定する蛍光測定動作７０である。以下、詳述する。
【００２８】
蛍光測定装置１は測定開始指令（時間ｔ0）により、指定されたウエル（Ｗ６）が測定位置にＸ−Ｙステージ１２によって移動し位置決めする。標本が入っているウエルの標本に対物レンズ１８の焦点を合焦するための合焦動作５０が始まる。光軸Ｉにミラー２５が挿入され（ステップＳ１、時間ｔi1）、照明用の発光ダイオード２１が点灯されて（ステップＳ２、時間ｔi2）、焦点検出光学系２０と合焦手段１９によって対物レンズ１８の合焦が前述のようにして行われる（ステップＳ３、時間ｔi3）。合焦動作終了後、発光ダイオード２１は消灯され（ステップＳ４、時間ｔi4）、ミラー２５が光軸Ｉから外される（ステップＳ５、時間ｔi5）。
【００２９】
一方、合焦動作５０と平行して、溶液の分注のための分注準備動作６０が行われる。分注準備動作６０は、分注器１５がウエルプレートＡ１上方の準備位置に移動し（ステップＳ６、時間ｔp1）、指定されたウエル（Ｗ６）に注入される溶液を分注器１５に吸引して（ステップＳ７、時間ｔp2）、ウエルプレートＡ２の指定されたウエル（Ｗ６）上方の準備位置に移動して待機する（ステップＳ８、時間ｔp3）。
【００３０】
図２（ａ）に示すように、ステップＳ１（時間ｔi1）からステップＳ５（時間ｔi5）とステップＳ６（時間ｔp1）からステップＳ８（時間ｔp3）は、時間的に並行して行われる。
【００３１】
続いて、標本からの蛍光を測定する蛍光測定動作７０が行われる。照明光学系３０のシャッター３７が開放されて、水銀ランプ３１の照明光が標本に照射され、標本から発せられる蛍光をフィルタボックス３４のバンドパスフィルタ３６を介し、結像レンズ４１で受光素子４２に結像させて測定し（ステップＳ９、時間ｔi6）、コントローラＣ２を介して不図示の記録装置に保存する。次いで、シャッター３７を閉じて分注器１５から溶液を指定されたウエル（Ｗ６）に注入し（ステップＳ１０、時間ｔp4）、注入後任意の時間にシャッター３７を開放し標本からの蛍光が受光素子４２によって測定され（ステップＳ１１、時間ｔi7）コントローラＣ２を介して不図示の記録装置に保存される。分注前後の標本からの蛍光は、目的によりＣＰＵで解析され比較される。ステップＳ１０において、溶液を分注し終わった分注器１５は蛍光測定中にウエルプレートＡ１上方に移動して待機する。なお、分注器１５が複数回分の溶液を吸引している場合には、準備位置に移動せずウエルプレートＡ２の上方に待機していても良い。
【００３２】
図２（ｂ）に示すように、上記ステップＳ１（時間ｔi1）からステップＳ１１（時間ｔi7）は時系列的に行われても良い。
【００３３】
以上の各ステップで１つの標本の蛍光測定が終了し、次の測定のためにＸ−Ｙステージ１２が駆動されウエルプレートＡ２が移動し、次の標本が対物レンズ１８のもとに配置される。以後、ステップＳ１からステップＳ１１の動作を繰り返して標本からの蛍光が測定される。これを全ての標本に対して行いウエルプレートＡ２のウエルに入れられた全標本の蛍光測定を完了する。測定結果は、不図示の記録装置から適時取り出され、モニター（ＭＴＲ）に表示したり、不図示のプリンタから出力される。
【００３４】
以上、本発明に係る蛍光測定装置１では、指定されたウエル中の標本に対する合焦動作５０と、指定されたウエルに溶液を分注するための分注準備動作６０が平行して行われる。さらに分注後、分注器が準備位置に戻る動作（これも分注準備動作の一部である）が蛍光の測定動作中に平行して行われるため、従来に比べ蛍光測定時間を大幅に短縮することが可能となる。
【００３５】
また、ウエルの底面又は標本に対する合焦動作がウエルに溶液を分注する前に完了しているため、ウエルに溶液を分注した瞬間から蛍光の測定を開始することができ、合焦動作に要していた時間の間に生ずる退色現象等を回避することができる。
【００３６】
また、照明光学系のシャッターの開閉時間と受光素子の測定タイミングを制御することにより、任意の時間における標本からの蛍光を測定することもできる。
【００３７】
なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【００３８】
【発明の効果】
上述のように、本発明では、分注準備動作と合焦動作を時間的に並行して行うことによりウエルプレート全体の蛍光測定時間を短縮できる蛍光測定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る蛍光測定装置の全体を模式的に示す図。
【図２】本発明に係る蛍光測定装置の測定手順を示す図。
【符号の説明】
１          蛍光想定装置
２          標本部
３          測定光学系
４          制御装置
１１        ステージ
１２        Ｘ−Ｙステージ
１３、１４  モータ
１５        分注器
１６        遮光部材
１８        対物レンズ
１９        合焦手段
２０        自動焦点検出光学系
２１        発光ダイオード（ＬＥＤ）
２２        レンズ
２３        絞り
２４        レンズ
２５        ミラー
２６        検出器（ＣＣＤ）
３０        照明光学系
３１        水銀ランプ
３２、３３  リレーレンズ
３４        フィルタボックス
３５        波長分割ミラー
３６        バンドパスフィルタ
３７        シャッター
４０        検出光学系
４１        結像レンズ
４２        受光素子
Ａ１、Ａ２  ウエルプレート
Ｃ１、Ｃ２  コントローラ
ＣＰＵ      主制御装置
Ｄ１〜Ｄ５  ドライバ
Ｈ          開口部
Ｉ          光軸
Ｗ          ウエル
ＭＴＲ      モニター
【図１】
2004205343.tif 000003
【図２】
2004205343.tif 000004