(57)【要約】【課題】血液中の測定対象物質を迅速、簡便かつ高感度に測定する方法を提供する。【解決手段】本発明によれば、血液試料中に存在する測定対象物質を測定する方法において、測定対象物質と、該測定対象物質と特異的に結合する標識体との結合体を該試料中で形成させた後、該試料から該結合体または未反応の標識体を取り出すことなく、５９５〜１０００ｎｍの吸光または５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起される５９５〜１０００ｎｍの蛍光を検出することにより、該測定対象物質を測定する方法が提供される。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料中に存在する測定対象物質を測定する方法において、測定対象物質と、該測定対象物質と特異的に結合する標識体との結合体を該試料中で形成させた後、該試料から該結合体または未反応の標識体を取り出すことなく、５９５〜１０００ｎｍの吸光または５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起される５９５〜１０００ｎｍの蛍光を検出することにより、該測定対象物質を測定する方法。
【請求項２】
以下の工程を含む血液中の物質の測定方法。
［１］被検血液試料に、測定対象物質と反応する第一抗体を担持させた担体と測定対象物質と反応する第二抗体を担持させた標識体とを添加し、測定対象試料、第一抗体を担持させた担体および第二抗体を担持させた標識体の複合体を形成させる工程
［２］該血液試料中において該複合体と未反応の標識体とを分離する工程
［３］５９５〜１０００ｎｍの吸光または５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起される５９５〜１０００ｎｍの蛍光を測定する工程
【請求項３】
以下の工程を含む血液中の物質の測定方法。
［１］被検血液試料に、測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた担体または測定対象物質である抗体と反応する抗原を担持させた担体を添加し、測定対象物質と第一抗体を担持させた担体との複合体または測定対象物質と抗原を担持させた担体との複合体を形成させる工程
［２］［１］の工程で得られる試料に、測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた標識体、または測定対象物質である抗原を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた標識体を添加し、測定対象試料、第一抗体を担持させた担体若しくは抗原を担持させた担体および第二抗体を担持させた標識体若しくは抗原を担持させた標識体の複合体、または第一抗体を担持させた担体と測定対象物質である抗原を担持させた標識体若しくは測定対象物質に反応する抗原を担持させた担体と測定対象物質である抗体を担持させた標識体との複合体を形成させる工程
［３］該血液試料中において該複合体と未反応の標識体とを分離する工程、
［４］５９５〜１０００ｎｍの吸光または５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起される５９５〜１０００ｎｍの蛍光を測定する工程
【請求項４】
以下の工程を含む血液中の物質の測定方法。
［１］被検血液試料に、測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた標識体を添加し、測定対象物質と第一抗体を担持させた標識体または測定対象物質と抗原を担持させた標識体との複合体を形成させる工程
［２］［１］の工程で得られる試料に、測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた担体、または測定対象物質である抗原を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた担体を添加し、測定対象試料、第一抗体を担持させた標識体若しくは抗原を担持させた標識体、および第二抗体を担持させた担体若しくは抗原を担持させた担体の複合体、または第一抗体を担持させた標識体と測定対象物質である抗原を担持させた担体との複合体若しくは測定対象物質と反応する抗原を担持させた標識体と測定対象物質である抗体を担持させた担体との複合体を形成させる工程
［３］該血液試料中において該複合体と未反応の標識体とを分離する工程、
［４］５９５〜１０００ｎｍの吸光または５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起される５９５〜１０００ｎｍの蛍光を測定する工程
【請求項５】
以下の工程を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の血液中の物質の測定方法。
［１］被験血液試料中に存在する５９５〜１０００ｎｍの波長範囲にある光を吸収または散乱させる測定対象物質以外の物質を含有する血清標準試料を用いて、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法に使用される標識体に固有の励起光を照射した際の５９５〜１０００ｎｍのいずれかの波長における該標準試料の散乱光または吸光、および該励起光で励起される該標識体に固有の波長の蛍光を測定し、標準曲線を作製する工程
［２］上記［１］の標準曲線から、散乱光強度または吸光度と蛍光強度の関係式を導く工程
［３］請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法において、励起光を照射した際に上記［１］で測定した波長の散乱光または吸光を測定する工程
［４］上記［２］の工程で得られる関係式と上記［３］で得られる散乱光または吸光の測定値とから、被験血液試料中に存在する５９５〜１０００ｎｍの波長範囲にある光を吸収または散乱させる測定対象物質以外の物質に起因する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で得られる蛍光強度の減少分を算出する工程
［５］上記［４］の算出値を用いて請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で得られる測定値を補正する工程
【請求項６】
５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起され５９５〜１０００ｎｍの蛍光を発する血液中の成分が、脂質である請求項５記載の方法。
【請求項７】
測定対象物質が２種類以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
以下の［１］および［２］記載の物質を２種類以上用いることを特徴とする請求項２、５または６記載の方法。
［１］測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた担体
［２］測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた標識体
【請求項９】
以下の［１］および［２］記載の物質を２種類以上用いることを特徴とする請求項３、５または６記載の方法。
［１］測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた担体または測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた担体
［２］測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体と反応する抗原を担持させた担体、または測定対象物質である抗原を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた標識体
【請求項１０】
以下の［１］および［２］記載の物質を２種類以上用いることを特徴とする請求項４、５または６記載の方法。
［１］測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた標識体
［２］測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた担体、または測定対象物質である抗原を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた担体
【請求項１１】
標識体が、５９５〜１０００ｎｍの範囲にある励起光で励起され、かつ５９５〜１０００ｎｍにある蛍光を発する標識物質を含有する標識体である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
血液中の測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた担体を含む試薬、および該測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた５９５〜１０００ｎｍの範囲に吸光または励起および蛍光波長を有する標識体を含む試薬を含有する、血液中の物質を測定するためのキット。
【請求項１３】
血液中の測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体と反応する抗原を担持させた担体を含む試薬、および測定対象物質である抗原と反応する第二抗体若しくは測定対象物質である抗体と反応する抗原を担持させた５９５〜１０００ｎｍの範囲に吸光または励起および蛍光波長を有する標識物質または測定対象物質である抗原若しくは測定対象物質である抗体を担持させた５９５〜１０００ｎｍの範囲に吸光または励起および蛍光波長を有する標識体を含む試薬を含有する、血液中の物質を測定するためのキット。
【請求項１４】
血液中の測定対象物質である抗原と反応する第一抗体若しくは測定対象物質である抗体と反応する抗原を担持させた５９５〜１０００ｎｍの範囲に吸光または励起および蛍光波長を有する標識物質を含む試薬、および測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体と反応する抗原を担持させた担体または測定対象物質である抗原を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた担体を含む試薬を含有する、血液中の物質を測定するためのキット。
【請求項１５】
測定対象物質である抗原と反応する第一抗体若しくは第二抗体を担持させた担体若しくは標識体および測定対象物質である抗原を担持させた担体若しくは標識体、または測定対象物質である抗体に反応する抗原若しくは測定対象物質である抗体を担持させた担体若しくは標識体を含む試薬を、２種類以上含有することを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液試料中に存在する測定対象物質を測定する方法およびキットに関する。
【０００２】
【従来技術】
血液中に存在する測定対象物質を測定する方法としては、抗体または抗原を担持する磁性粒子及び抗原または抗体を担持する標識体を用いる免疫測定法が知られている（例えば、特許文献１および２参照）。
すなわち、特許文献１には、▲１▼測定対象物質に反応する抗体または抗原を担持させた磁性粒子と、▲２▼該抗体または抗原を担持させた不溶性担体粒子を、▲３▼測定対象物質である抗原または抗体を含有する被検試料に添加し、▲４▼該抗原または抗体と該磁性粒子および該不溶性担体とを反応させて凝集体を形成させ、該凝集体を反応液から分離した後、▲５▼反応液中に残存する不溶性担体粒子の量を吸光度または散乱光で測定することにより、定性的または定量的に該測定対処物質を測定する方法が開示されている。
【０００３】
特許文献２には、測定対象物質と免疫学的に結合する物質を担持させた磁性粒子と、測定対象物質を担持させた非磁性着色粒子を用いて、検体と反応させた後、未反応の磁性粒子および磁性粒子と結合して形成された免疫複合体を集磁し、反応液中に残存する着色粒子の吸光度を測定する方法が開示されている。
また、測定対象物質である抗原または抗体と測定対象物質に反応する抗体または抗原を担持させた磁性粒子とを反応させた後、測定対象物質と磁性体の複合体および未反応の磁性体を集磁した後、反応液の上清を除去し、続いて添加される不溶性蛍光標識体と反応させ、未反応の不溶性蛍光標識体を除いた後に、磁性体粒子と反応した不溶性蛍光標識体の強度を測定することを特徴とする免疫測定法が知られている（例えば、特許文献３、４、５および６参照。）。
【０００４】
２種以上の標識体と磁性粒子を用いて同時に多項目測定を行う、洗浄工程を含んだ方法は、例えば特許文献７などで開示されている。
これらの方法では各々の測定対象物質とそれぞれ相補的に結合する免疫反応体を担持する２種類以上の磁性粒子、および該免疫反応体と相補的に結合する、それぞれに異なる２種類以上の標識体を用いて、免疫抗体反応を行った後、未反応の標識体を除去してからそれぞれの標識体の標識強度を測定する。
【０００５】
上記した磁性粒子と標識体を用いた免疫測定方法においては、反応系外に未反応の標識体を取り出すことなく測定対象物の濃度を測定するために、標識体として不溶性粒子を用い、磁性粒子を集磁後、反応系中に残留した不溶性粒子の吸光度または散乱光を測定している。しかし不溶性粒子の吸光度や散乱光を測定する方法では測定感度が低い他、検体中の高脂血清などにより生じる光の散乱により測定精度が低下するため、結局未反応の標識体を反応系外に取り出す工程が不可欠となり、結果として迅速性に欠く方法であった。
【０００６】
上記の蛍光標識体を用いる方法においては、標識体として励起光および蛍光の波長が２５０〜４００ｎｍにある蛍光物質を用いているため、▲１▼励起光もしくは蛍光の一部が試料中の光学的妨害物質によって吸収され、その吸収される光の割合が個々の試料によって異なる、▲２▼試料中の蛍光性物質も同時に励起され、ブランクの蛍光を発する、▲３▼試料中に含まれる夾雑物、脂質などにより光の散乱が生じ、励起光及び蛍光の妨害となる。即ち、光の散乱は励起光を減衰させるほか、励起波長及び蛍光波長が近い場合には蛍光波長にも励起光の影響がおよび、ブランクの値が上昇する原因となる、等の問題点があった。特に、ヘモグロビン、ビリルビン等の血液中に存在する生体成分は測定感度や測定精度に悪影響を及ぼすことから、ヘモグロビン、ビリルビン等に反応する抗体を担持させた磁性粒子を用いて、上記測定妨害物質を除去する必要があった（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、全ての妨害物質について除去するのは操作が煩雑である。
【０００７】
【特許文献１】
特許第２６０３８４３号公報
【０００８】
【特許文献２】
特開平８−２６２０２４号公報
【０００９】
【特許文献３】
特開平７−７２１５５号公報
【００１０】
【特許文献４】
特開平７−１５１７５５号公報
【００１１】
【特許文献５】
特開平６−１６０３８７号公報
【００１２】
【特許文献６】
特開平７−１５１７５６号公報
【００１３】
【特許文献７】
特開２０００−３４６８４３号公報
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、血液中に存在する測定対象物質を測定する方法において、測定対象物質と、該測定対象物質と特異的に結合する標識体との結合体を該試料中で形成させた後、該試料から該結合体または未反応の標識体を取り出すことなく、迅速、簡便かつ高感度に該測定対象物質を測定する方法およびキットを提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）　血液試料中に存在する測定対象物質を測定する方法において、測定対象物質と、該測定対象物質と特異的に結合する標識体との結合体を該試料中で形成させた後、該試料から該結合体または未反応の標識体を取り出すことなく、５９５〜１０００ｎｍの吸光または５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起される５９５〜１０００ｎｍの蛍光を検出することにより、該測定対象物質を測定する方法。
【００１６】
（２）　以下の工程を含む血液中の物質の測定方法。
［１］被検血液試料に、測定対象物質と反応する第一抗体を担持させた担体と測定対象物質と反応する第二抗体を担持させた標識体とを添加し、測定対象試料、第一抗体を担持させた担体および第二抗体を担持させた標識体の複合体を形成させる工程
［２］該血液試料中において該複合体と未反応の標識体とを分離する工程
［３］５９５〜１０００ｎｍの吸光または５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起される５９５〜１０００ｎｍの蛍光を測定する工程
（３）　以下の工程を含む血液中の物質の測定方法。
［１］被検血液試料に、測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた担体または測定対象物質である抗体と反応する抗原を担持させた担体を添加し、測定対象物質と第一抗体を担持させた担体との複合体または測定対象物質と抗原を担持させた担体との複合体を形成させる工程
［２］［１］の工程で得られる試料に、測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた標識体、または測定対象物質である抗原を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた標識体を添加し、測定対象試料、第一抗体を担持させた担体若しくは抗原を担持させた担体および第二抗体を担持させた標識体若しくは抗原を担持させた標識体の複合体、または第一抗体を担持させた担体と測定対象物質である抗原を担持させた標識体若しくは測定対象物質に反応する抗原を担持させた担体と測定対象物質である抗体を担持させた標識体との複合体を形成させる工程
［３］該血液試料中において該複合体と未反応の標識体とを分離する工程、
［４］５９５〜１０００ｎｍの吸光または５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起される５９５〜１０００ｎｍの蛍光を測定する工程
（４）　以下の工程を含む血液中の物質の測定方法。
［１］被検血液試料に、測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた標識体を添加し、測定対象物質と第一抗体を担持させた標識体または測定対象物質と抗原を担持させた標識体との複合体を形成させる工程
［２］［１］の工程で得られる試料に、測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた担体、または測定対象物質である抗原を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた担体を添加し、測定対象試料、第一抗体を担持させた標識体若しくは抗原を担持させた標識体、および第二抗体を担持させた担体若しくは抗原を担持させた担体の複合体、または第一抗体を担持させた標識体と測定対象物質である抗原を担持させた担体との複合体若しくは測定対象物質と反応する抗原を担持させた標識体と測定対象物質である抗体を担持させた担体との複合体を形成させる工程
［３］該血液試料中において該複合体と未反応の標識体とを分離する工程、
［４］５９５〜１０００ｎｍの吸光または５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起される５９５〜１０００ｎｍの蛍光を測定する工程
（５）　以下の工程を含む上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の血液中の物質の測定方法。
［１］被験血液試料中に存在する５９５〜１０００ｎｍの波長範囲にある光を吸収または散乱させる測定対象物質以外の物質を含有する血清標準試料を用いて、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法に使用される標識体に固有の励起光を照射した際の５９５〜１０００ｎｍのいずれかの波長における該標準試料の散乱光または吸光、および該励起光で励起される該標識体に固有の波長の蛍光を測定し、標準曲線を作製する工程
［２］上記［１］の標準曲線から、散乱光強度または吸光度と蛍光強度の関係式を導く工程
［３］上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法において、励起光を照射した際に上記［１］で測定した波長の散乱光または吸光を測定する工程
［４］上記［２］の工程で得られる関係式と上記［３］で得られる散乱光または吸光の測定値とから、被験血液試料中に存在する５９５〜１０００ｎｍの波長範囲にある光を吸収または散乱させる測定対象物質以外の物質に起因する上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法で得られる蛍光強度の減少分を算出する工程
［５］上記［４］の算出値を用いて上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法で得られる測定値を補正する工程
（６）　５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起され５９５〜１０００ｎｍの蛍光を発する血液中の成分が、脂質である上記（５）の方法。
【００１７】
（７）　測定対象物質が２種類以上であることを特徴とする上記（１）の方法。
（８）　以下の［１］および［２］記載の物質を２種類以上用いることを特徴とする上記（２）、（５）または（６）の方法。
［１］測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた担体
［２］測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた標識体
（９）　以下の［１］および［２］記載の物質を２種類以上用いることを特徴とする上記（３）、（５）または（６）の方法。
［１］測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた担体または測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた担体
［２］測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体と反応する抗原を担持させた担体、または測定対象物質である抗原を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた標識体
（１０）　以下の［１］および［２］記載の物質を２種類以上用いることを特徴とする上記（４）、（５）または（６）の方法。
［１］測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた標識体
［２］測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた担体、または測定対象物質である抗原を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた担体
（１１）　標識体が、５９５〜１０００ｎｍの範囲にある励起光で励起され、かつ５９５〜１０００ｎｍにある蛍光を発する標識物質を含有する標識体である上記（１）〜（１０）のいずれか１つに記載の方法。
【００１８】
（１２）　血液中の測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた担体を含む試薬、および該測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた５９５〜１０００ｎｍの範囲に吸光または励起および蛍光波長を有する標識体を含む試薬を含有する、血液中の物質を測定するためのキット。
（１３）　血液中の測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体と反応する抗原を担持させた担体を含む試薬、および測定対象物質である抗原と反応する第二抗体若しくは測定対象物質である抗体と反応する抗原を担持させた５９５〜１０００ｎｍの範囲に吸光または励起および蛍光波長を有する標識物質または測定対象物質である抗原若しくは測定対象物質である抗体を担持させた５９５〜１０００ｎｍの範囲に吸光または励起および蛍光波長を有する標識体を含む試薬を含有する、血液中の物質を測定するためのキット。
【００１９】
（１４）　血液中の測定対象物質である抗原と反応する第一抗体若しくは測定対象物質である抗体と反応する抗原を担持させた５９５〜１０００ｎｍの範囲に吸光または励起および蛍光波長を有する標識物質を含む試薬、および測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体と反応する抗原を担持させた担体または測定対象物質である抗原を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた担体を含む試薬を含有する、血液中の物質を測定するためのキット。
【００２０】
（１５）　測定対象物質である抗原と反応する第一抗体若しくは第二抗体を担持させた担体若しくは標識体および測定対象物質である抗原を担持させた担体若しくは標識体、または測定対象物質である抗体に反応する抗原若しくは測定対象物質である抗体を担持させた担体若しくは標識体を含む試薬を、２種類以上含有することを特徴とする上記（１２）〜（１４）のいずれか１つに記載のキット。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の方法で測定することができる測定対象物質は、血液中に存在する物質であれば特に限定されないが、具体的には抗原、抗体、薬物、核酸、蛋白質およびペプチドなどをあげることができる。測定対象物質と特異的に結合する標識体としては、▲１▼測定対象物質が抗原若しくは抗体である場合、該抗原若しくは抗体に反応する抗体または抗原と標識物質との結合体、▲２▼測定対処物質が核酸である場合、該核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡと標識物質との結合体、▲３▼測定対象物質がリガンドである場合、該リガンドと結合する受容体と標識物質との結合体、▲４▼測定対象物質が酵素の基質である場合、該酵素と標識物質との結合体、などをあげることができる。したがって、血液試料中に存在する測定対象物質に合わせて、いずれかの標識体を選択することができる。
【００２２】
本発明に用いられる標識物質としては、５９５〜１０００ｎｍに吸収または励起および蛍光波長を有する物質をあげることができる。５９５〜１０００ｎｍに吸収を有する物質としては、例えば６−（（（４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５−（２−ｔｈｉｅｎｙｌ）−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ　−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｙｌ）ｓｔｙｒｙｌｏｘｙ）ａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、Ｎ−［４−［［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］（４−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］−　２，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｄｉｅｎ−１−ｙｌｉｄｅｎｅ］−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−，　ｃｈｌｏｒｉｄｅ（以上、　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製）などをあげることができ、５９５〜１０００ｎｍに励起および蛍光波長を有する物質としては、例えば、有機化合物や無機キレートからなる蛍光色素があげられる。具体的には例えばテキサスレッドＴＭ［Ｊ．　Ｉｍｍｎｏｌ．　Ｍｅｔｈ．，　５０，　１９３（１９８２）］、インドシアニン色素、および希土類キレートなどをあげることができる。
【００２３】
希土類のうち、アップコンバージョン特性を有する物質は、その励起光および蛍光の波長が通常の蛍光物質に比べ長波長側にあるため、血液中の夾雑物によって該励起光および蛍光が減衰される等の影響を受けにくいことから、本発明に用いられる標識物質として特に好ましい。アップコンバージョン特性を有する物質としては、具体的には例えばイットリウム、エルビウムなどをあげることができる。
【００２４】
本発明で用いられる担体としては、抗原、抗体または標識体を結合させることができる担体であればいかなる担体も用いることができる。好ましくは、抗原、抗体または標識体と化学反応により結合することができる官能基を担体表面に有し、かつ蛋白質等の非特異的吸着が少なく、操作性が優れた担体が望ましい。
具体的には、担体の材質としては、例えばアガロース、デキストラン、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン等の疎水性あるいは親水性重合体をあげることができる。担体の大きさとしては、直径０．０５μｍ〜５０μｍ、好ましくは０．１μｍ〜１μｍである。担体の形状としては、多孔質、貫通孔質、無孔質などをあげることができる。具体的な担体としては、例えばポリスチレンラテックス粒子をあげることができる。
【００２５】
本発明の測定方法において、測定対象物質と、該測定対象物質と特異的に結合する標識体との結合体を試料中で形成させた後、試料中から該結合体または未反応の標識体を取り出すことなく測定対象物質を測定する方法としては、該結合体と未反応の標識体とを該試料中で分離し、反応液上清に残存する未反応の標識体を測定する方法をあげることができる。具体的な分離方法としては、例えば測定対象物質と標識体を結合させた後、該測定対象物質と特異的に結合する物質を結合させた担体を添加し、測定対象物質、標識体および担体の複合体を形成させ、該複合体を反応容器中で集める方法をあげることができる。
【００２６】
より具体的には、担体としてラテックス粒子に代表される微粒子を用い、測定物質対象物質と標識体を結合させた後、該微粒子を添加して測定対象物質、標識体および微粒子からなる複合体を形成させ、一定時間反応液を放置することにより反応容器底部に該複合体を沈澱させる方法、該反応液を遠心分離することにより該複合体を沈澱させる方法などをあげることができる。微粒子として磁性粒子を用いる場合、反応容器の外部に磁石等の磁性体をおき、該複合体を反応容器の任意の場所に集磁することにより、該複合体と未反応の標識体を試料中で分離することができる。
【００２７】
上記の測定対象物質と特異的に結合する物質を結合させた担体としては、例えば、標識体として測定対象物質と特異的に結合する第一抗体を担持させた標識物質を用いる場合、測定対象物質と特異的に反応する第二抗体を担持させた担体をあげることができる。
本発明に用いられる第一抗体と第二抗体は同一の抗体であってもよいし、異なるエピトープを認識する異なる抗体であってもよい。
【００２８】
また、標識体として測定対象物質である核酸の一部の塩基配列と相補的配列を有する核酸（第一核酸）を用いる場合、担体として該第一核酸とは異なる塩基配列において該測定対象物質である核酸と二本鎖を形成する第二核酸を結合させた担体をあげることができる。
本発明の方法の一形態として、測定対象物質が抗原または抗体である場合は、以下の方法をあげることができる。
方法１：下記の工程からなる抗原−抗体反応を用いた血液試料中の物質の測定方法。
（ａ）測定対象物質を適当な緩衝液等で数段階に希釈することで、標準試料溶液を作製し、下記（ｂ）〜（ｄ）と同様な方法により各標準試料の蛍光強度を測定して標準曲線を作製する
（ｂ）被検血液試料に、測定対象物質である抗原に反応する第一抗体を担持させた磁性粒子または測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた磁性粒子、該測定対象物質である抗原に反応する第二抗体を担持させた標識体または測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた標識体を添加し、反応液中で測定対象物質と接触させ、標識体−測定対象物質−磁性粒子の複合体を形成させる
（ｃ）反応液中で該複合体を集磁することにより、未反応の標識体を分離する
（ｄ）反応液上清の５９５〜１０００ｎｍの吸光または５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起される５９５〜１０００ｎｍの蛍光を測定する
（ｅ）上記（ｄ）で得られた測定値を、上記（ａ）で作製した標準曲線に外挿し、試料中の測定対象物質の濃度を求める
【００２９】
方法２：下記の工程からなる抗原−抗体反応を用いた血液試料中の物質の測定方法。
（ａ）測定対象物質を適当な緩衝液等で数段階に希釈することで、標準試料溶液を作製し、下記（ｂ）〜（ｄ）と同様な方法により各標準試料の蛍光強度を測定して標準曲線を作製する
（ｂ）被検血液試料に、測定対象物質である抗原に反応する第一抗体を担持させた磁性粒子または測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた磁性粒子を添加し、測定対象物質−磁性粒子の複合体を形成させる
（ｃ）一定時間経過後、測定対象物質である抗原に反応する第二抗体を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた標識体、または測定対象物質である抗原を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた標識体を工程（ｂ）の反応液に添加し、標識体−測定対象物質−磁性粒子の複合体、または磁性粒子−標識体の複合体を形成させる
（ｄ）反応液中で該複合体を集磁することにより未反応の標識体を分離する
（ｅ）反応液上清の５９５〜１０００ｎｍの吸光または５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起される５９５〜１０００ｎｍの蛍光を測定する
（ｆ）上記（ｅ）で得られた測定値を、上記（ａ）で作製した標準曲線に外挿し、該試料中の測定対象物質の濃度を求める
【００３０】
方法３：下記の工程からなる抗原−抗体反応を用いた血液試料中の物質の測定方法。
（ａ）測定対象物質を適当な緩衝液等で数段階に希釈することで、標準試料溶液を作製し、下記（ｂ）〜（ｅ）と同様な方法により各標準試料の蛍光強度を測定して標準曲線を作製する
（ｂ）被検血液試料に測定対象物質である抗原に反応する第一抗体を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた標識体を添加し、測定対象物質−標識体の複合体を形成させる
（ｃ）一定時間経過後、測定対象である抗原に反応する第二抗体を担持させた磁性粒子若しくは測定対象である抗体に反応する抗原を担持させた磁性粒子、または測定対象物質である抗原を担持させた磁性粒子若しくは測定対象物質である抗体を担持させた磁性粒子を、工程（ｂ）の反応液中で反応させ、磁性粒子−測定対象物質−標識体の複合体、または標識体−磁性粒子の複合体を形成させる
（ｄ）反応液中で該複合体を集磁し未反応の標識体を分離する
（ｅ）反応液上清の５９５〜１０００ｎｍの吸光または５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起される該波長範囲の蛍光を測定する
（ｆ）上記（ｅ）で得られた測定値を、上記（ａ）で作製した標準曲線に外挿し、該試料中の測定対象物質の濃度を求める
本発明の方法で使用される磁性粒子としては、例えば、鉄、四三酸化鉄（Ｆｅ３　Ｏ４　）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２　Ｏ３　）などの鉄を含有する化合物、各種フェライト、マンガン、ニッケル、クロム、コバルトなどの金属、または合金からなる微粒子があげられる。また、磁性粒子を内部に含んだポリスチレンなどの疎水性重合体や、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールなどを架橋した親水性重合体もあげられる。さらに上記磁性粒子をラテックス、リポソーム、ゼラチンなどの表面に固定化した粒子などもあげることができる。
【００３１】
本発明の方法で使用される磁性粒子の粒径としては、好ましくは０．０５μｍ〜５０μｍ、より好ましくは０．１μｍ〜１μｍである。
本発明の方法で用いられる担体及び標識体に抗体を担持させる場合、抗体としては、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥをあげることができるが、特にＩｇＧが好ましい。また、測定対象物質と特異的に結合する能力を有する限りにおいて、ペプシン、パパインなどの消化酵素あるいはジチオスレイトール、メルカプトエタノールなどの還元剤を用いて抗体を低分子化して得られる、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′、Ｆａｂなどの抗体フラグメントも抗体として本発明の方法に用いることができる。
【００３２】
抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれも本発明の方法に用いることができる。モノクローナル抗体を用いる場合、通常、エピトープの異なる第一抗体を担持させた標識体と第二抗体を担持させた担体、または第一抗体を担持させた担体と第二抗体を担持させた標識体を組み合わせて使用する。同一抗原上にエピトープを複数持つ抗原に対しては第一抗体と第二抗体は同一の抗体であってもよい。
【００３３】
本発明の方法において、
▲１▼以下の［１］および［２］記載の物質を２種類以上用いることを特徴とする方法
［１］測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた担体
［２］測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた標識体、
▲２▼以下の［３］および［４］記載の物質を２種類以上用いることを特徴とする方法
［３］測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた担体または測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた担体
［４］測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体と反応する抗原を担持させた担体、または測定対象物質である抗原を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた標識体、および
▲３▼以下の［５］および［６］記載の物質を２種類以上用いることを特徴とする方法
［５］測定対象物質である抗原と反応する第一抗体を担持させた標識体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた標識体
［６］測定対象物質である抗原と反応する第二抗体を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体に反応する抗原を担持させた担体、または測定対象物質である抗原を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた担体、とは、被検血液試料中に測定対象物質が複数ある場合、各々の測定対象物質に反応する上記担体、および標識体をそれぞれ２種類以上用いる方法を意味する。すなわち、各々の測定対象物質に結合する担体および標識体等を用いることで、１度の反応で複数の測定対象物質を測定することができる。
【００３４】
担体および標識物質に抗原または抗体を担持させる方法としては、これらの物質を物理的に吸着させるか、あるいは化学的に結合させる方法をあげることができる。物理的に吸着させる方法としては、担体および標識物質に抗原または抗体を疎水結合などで直接固定化する方法をあげることができる。また抗原または抗体をアルブミンなどの他の蛋白質に一旦化学的に結合させたものを、上記のように固定化することもできる。
【００３５】
化学的に結合させる方法としては、担体および標識物質に存在するアミノ基、カルボキシル基などを化学的に修飾することにより、抗原または抗体分子上のカルボキシル基、アミノ基などの官能基を介して、担体及び標識物質と抗原または抗体とを直接結合させる方法をあげることができる。また、スペーサー分子やアルブミンなどの他の蛋白質を介して担体および標識物質と抗原または抗体とを化学結合させることもできる。担体に担持される抗原または抗体の量は、用いる担体の表面積、官能基量等により異なるが、担体として磁性粒子を用いる場合、磁性粒子１ｇあたり１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜２００ｍｇである。また抗体または抗原に担持される標識物質は、反応官能基の種類によっても異なるが、１抗体または１抗原分子あたり１〜５０個、好ましくは５〜２０個となるように調製される。
【００３６】
また、本発明において担体および標識体と抗原または抗体とは、ビオチンおよびストレプトアビジン等の相互に結合する物質、その他、化学的な相互作用を有する物質を介して結合させることもできる。
その他、特定の抗原または抗体と結合しうる物質、例えば抗体、プロテインＡなどを用いて、担体および標識体と抗原または抗体とを結合させることもできる。
【００３７】
以下に、抗原−抗体反応を利用し、担体として磁性粒子、標識体として抗体と蛍光物質の結合体を用いた場合の本発明の方法について、詳細に説明する。
反応は測定対象物質である抗原を含む試料溶液と、該抗原に反応する第一抗体と蛍光物質を結合させた標識体、及び該抗原に反応する第二抗体を担持させた磁性粒子を反応容器中で速やかに混合し、２℃〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で反応させる。反応液が均一に混合された後は静置反応させてもよい。反応時間は、通常２〜６０分間である。磁性粒子は反応液に対して０．００１〜２．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５〜０．２ｍｇ／ｍＬとなるように使用される。
【００３８】
反応時のｐＨは、反応が進行するｐＨであれば特に制限されないが、ｐＨ７〜９が好ましい。目的のｐＨを維持するために使用される緩衝液としては、例えばリン酸、トリス（ヒドロキシメチル）　アミノメタン等が用いられるが、目的のｐＨで緩衝能を有するものであればいずれも使用することができる。また非特異反応を避けるために、塩化ナトリウム等の塩類及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の蛋白質を反応液に添加してもよい。
【００３９】
磁性粒子と標識体とを被験試料溶液に添加すると、該溶液中の抗原が磁性粒子上の抗体及び蛍光標識した抗体と免疫複合体を形成する。次いで免疫複合体に含まれる磁性粒子を磁力により反応液中の容器側面または底面に付着させる。その後、反応液中に存在する未反応の標識体の量を、蛍光物質に固有の励起光を照射し、放出される蛍光強度を計測することにより定量する。例えば蛍光物質としてインドシアニン化合物を用いる場合、６４０ｎｍで励起し６６０ｎｍの蛍光を測定する。
【００４０】
本発明の方法には、被験血液試料中に存在する５９５〜１０００ｎｍの波長範囲にある光を吸収または散乱させる測定対象物質以外の物質、すなわち試料中の夾雑物質により、照射した励起光の減弱および標識体由来の蛍光の強度の減衰が生ずることが予測される場合、該夾雑物質に起因する励起光の減弱量および蛍光強度の減衰量を、該夾雑物質を含有する標準試料を用いて、あらかじめ測定しておき、上記の本発明の方法で得られる測定値を補正する方法も含まれる。
【００４１】
試料中の夾雑物質としては、赤血球、ヘモグロビン、ビリルビン、蛋白質、脂質などの生体内成分および薬物などがあげられる。該夾雑物質が、５９５〜１０００ｎｍの励起光および５９５〜１０００ｎｍの標識体由来の蛍光を吸収若しくは散乱させる場合、試料中に含まれる該夾雑物質の濃度を含む一定の濃度範囲を有する該夾雑物質含有標準試料を用いて、下記の方法により測定値を補正することができる。
【００４２】
該標準試料は、健常人の血清に該夾雑物質を添加して作製することができる。該標準試料に、上記の本発明の方法において使用される標識体に固有の励起光を照射し、５９５〜１０００ｎｍのいずれかの波長における該標準試料の散乱光または吸光、および該励起光で励起される該標識体に固有の波長の蛍光を測定することにより、散乱光強度または吸光度−夾雑物質濃度、および蛍光強度−夾雑物質濃度の標準曲線を作製する。該２つの標準曲線から、常法に従い散乱光強度または吸光度と蛍光強度との関係式を導くことができる。
【００４３】
次に、被験血液試料に、上記の本発明において使用される標識体に固有の励起光を照射した際の、散乱光または吸収を測定する。測定する散乱光または吸収の波長は、上記した夾雑物質含有標準試料の散乱光または吸収を測定する際に用いた波長である。
上記関係式と被験血液試料の散乱光または吸収の測定値から、夾雑物質が存在していることに起因する被験血液試料の蛍光強度の減少分を算出することができる。
【００４４】
具体的には、夾雑物質として脂質を含有する試料の測定対象物質を本発明の方法で測定する場合、蛍光物質としてインドシアニン化合物を用いるときは、ホルマリン濁度にして０〜１９６００度の脂質含有標準試料に対し、６４０ｎｍの励起光を照射し、インドシアニン化合物の励起や蛍光に影響のない７２０ｎｍの散乱光を蛍光測定法で測定するとともに、６６０ｎｍの励起光を測定することで、散乱光強度−濁度および６６０ｎｍの励起光強度−濁度の相関曲線を作製することができる。
【００４５】
該２つの相関曲線から、散乱光強度と蛍光強度との関係式を導くことができる。
次に、被験血液試料に６４０ｎｍの励起光を照射した際の７２０ｎｍの散乱光を蛍光測定法により測定して得られる測定値を、上記関係式に代入することで、脂質に起因する６６０ｎｍの励起光強度の減少分を計算することができる。
【００４６】
磁性粒子の分離に際しては、磁性粒子を約１〜３分間程度で分離できるような磁場の強度及び反応容器を用いることが好ましい。磁石には、永久磁石、電磁石等を使用する。分離は速やかに行われることが望ましく、このため反応容器の大きさは比較的小さい方が好ましい。反応容器としては、ポリスチレン、アクリルなどのプラスチックや、ガラスを材質とするチューブ、キュベットなどをあげることができる。
【００４７】
本発明の血液試料中の物質を測定するためのキットとしては、例えば▲１▼測定対象物質と反応する第一抗体を担持させた担体を含む試薬と測定対象物質と反応する第二抗体と５９５〜１０００ｎｍの波長の範囲に吸光を有する標識物質、または５９５〜１０００ｎｍの励起光で励起され、かつ５９５〜１０００ｎｍの蛍光を発する標識物質との結合体である標識体を含む試薬をそれぞれ１種以上含有する免疫測定用キット、▲２▼測定対象物質と反応する第一抗体を担持させた担体または測定対象物質に対する抗原を担持させた担体を含む試薬、および測定対象物質と反応する第二抗体若しくは測定対象物質と反応する抗原を担持させた５９５〜１０００ｎｍの範囲に吸光または励起および蛍光波長を有する標識物質を含む試薬または測定対象物質である抗原若しくは測定対象物質である抗体を担持させた５９５〜１０００ｎｍの範囲に吸光または励起および蛍光波長を有する標識体を含む試薬をそれぞれ１種以上含有する免疫測定用キット、▲３▼測定対象物質と反応する第一抗体若しくは測定対象物質と反応する抗原を担持させた５９５〜１０００ｎｍの範囲に吸光または励起および蛍光波長を有する標識物質を含む試薬、および測定対象物質と反応する第二抗体を担持させた担体若しくは測定対象物質と反応する抗原を担持させた担体または測定対象物質である抗原を担持させた担体若しくは測定対象物質である抗体を担持させた担体を含む試薬をそれぞれ１種類以上含有する免疫測定用キットなどをあげることができる。
【００４８】
さらに該免疫測定用キットには、標準試料および該標準試料希釈用の水溶液、試料中の夾雑物に起因する蛍光の減衰を補正するための補正標準曲線作製用の標準試料および該標準試料希釈用の水溶液を含んでいてもよい。補正標準試料としては、赤血球、ヘモグロビン、ビリルビン、蛋白質、脂質などの生体内成分および薬物などをあげることができるが、好ましくは脂質をあげることができる。
上記した測定対象物質と反応する第一抗体若しくは第二抗体を担持させた担体若しくは標識体および測定対象物質である抗原を担持させた担体若しくは標識体、または測定対象物質に反応する抗原若しくは測定対象物質である抗体を担持させた担体若しくは標識体を含む試薬を１種類以上含有する免疫測定用キットとは、被検血液資料中に測定対象物質が複数ある場合は、各々の測定対象物質に特異的に反応する担体、標識体を含有する免疫測定用キットを意味する。すなわち、本発明のキットには該測定対象物質の数に応じて、各々の測定対象物質の測定に必要な担体および標識体を含有させることができる。
【００４９】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
【００５０】
【実施例】
実施例１　ヒト血清、および血清成分の吸収特性
ヒトのプール血清、血清中で主要な光学的影響物質であると考えられるビリルビンおよびヘモグロビンの吸収特性を解析した（図１）。
ビリルビンおよびヘモグロビンは、紫外域から５９５ｎｍ未満の波長域に吸収特性をもち、５９５〜１０００ｎｍには顕著な吸収はないことが確認された。
【００５１】
実施例２　蛍光物質としてテキサスレッドＴＭを用いたインスリンの測定
５９５ｎｍ以上で励起及び蛍光測定が可能なテキサスレッドＴＭを標識物質として用いた。
インスリン標識試薬は、以下のように調製した。すなわち、抗インスリンモノクロナール抗体（ロッシュ社製）を１００ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に１．０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、テキサスレッドＴＭ（ＰＩＥＲＣＥ社製）のＤＭＳＯ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを加え、室温で１時間反応させた。該テキサスレッドＴＭはアミン反応性プローブとなっているため、混合するだけで抗体との化学結合が可能である。反応後、セファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーによって未反応の標識体を除き、テキサスレッドＴＭ標識抗インスリン抗体を得た。これを０．１％ＢＳＡ及び０．１％　ＮａＮ３　を含むｐＨ７．４の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ＢＳＡ／ＰＢＳ）に０．０１ｍｇ／ｍＬとなるよう加え、標識試薬とした。
【００５２】
インスリン固相試薬は、以下のように調製した。すなわち、磁性粒子にはダイナビーズ（Ｍ２８０、日本ダイナル社製）を使用し、抗インスリン抗体を該磁性粒子に固定化した。該磁性粒子は活性化された状態で販売されており、抗体と混合するだけで共有結合による固定化が可能である。また固定化する抗体には標識抗体と異なるエピトープを認識する抗インスリンモノクローナル抗体（国際バイオ社製）を使用した。
【００５３】
抗体は０．５ｍｏｌ／Ｌ　ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）に１５０μｇ／ｍＬとなるように溶解し、これに３０ｍｇ／ｍＬの活性化磁性粒子を等量添加して、１晩放置した。磁石で磁性粒子を集め、上清を吸引除去することにより過剰な抗体を除去し、抗インスリン抗体固定化磁性粒子を得た。これをＢＳＡ／ＰＢＳに０．１ｍｇ／ｍＬとなるよう加え、固相試薬とした。
【００５４】
次に測定試薬及び標準抗原溶液を以下の手順で調製し、標準抗原を測定した。測定試薬は５ｍＬのＢＳＡ／ＰＢＳに５ｍＬの固相試薬を混合し、さらに３００μＬの標識試薬を加えることで調製した。またインスリン標準抗原溶液にはＢＳＡ／ＰＢＳにインスリン国際規格品（ＮＩＢＳＣ　Ｃｏｄｅ　６６／３０４　１ＳＴ　ＩＲＰ）を添加して０，２５，５０，７５，１５０，３００μＵ／ｍＬに調製した溶液を使用した。
【００５５】
反応は蛍光測定用セルに測定試薬１ｍＬと標準抗原溶液５０μＬを混合させることにより行い、１０分後に永久磁石をセル下面に配して磁性粒子を分離した。さらにこの反応液中に残留した蛍光標識体を分光蛍光光度計（Ｆ−４０００；日立製作所製）を用いて、標識体に固有の励起光（Ｅｘ）５９６ｎｍ及び蛍光（Ｅｍ）６１５ｎｍで測定した。この結果、測定可能なインスリンの濃度範囲は２５〜３００μＵ／ｍＬであり、０．１７ｐｍｏｌ／ｍＬの感度であった（図２）。
【００５６】
実施例３　テキサスレッドＴＭ蛍光標識を用いたＣ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）の測定
実施例２と同様にテキサスレッドＴＭを用いてＣＲＰを測定した。
ＣＲＰ標識試薬は、以下のように調製した。すなわち、抗ＣＲＰモノクロナール抗体（以下、抗ＣＲＰ抗体と称す）を１００ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に１．０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、テキサスレッドＴＭ（ＰＩＥＲＣＥ社製）のＤＭＳＯ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを加え、室温で１時間反応させた。反応後、実施例２と同様のカラムクロマトグラフィーによって未反応の標識体を除き、テキサスレッドＴＭ標識抗ＣＲＰ抗体を得た。これをＢＳＡ／ＰＢＳに０．０１ｍｇ／ｍＬとなるよう加え、標識試薬とした。
【００５７】
ＣＲＰ固相試薬は、以下のように調製した。すなわち、抗体を０．５ｍｏｌ／Ｌ　ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）に１５０μｇ／ｍＬで溶解し、３０ｍｇ／ｍＬの活性化磁性粒子を等量添加することにより抗ＣＲＰ抗体固定化磁性粒子を得た。これをＢＳＡ／ＰＢＳに０．１ｍｇ／ｍＬとなるよう加え、固相試薬とした。次に、標準抗原溶液の測定を行った。測定試薬は、５ｍＬのＢＳＡ／ＰＢＳに５ｍＬの固相試薬を混合し、さらに３００μＬの標識試薬を加えることで調製した。また標準のＣＲＰ抗原溶液はＣＲＰリコンビナント（ｒＣＲＰ；オリエンタル酵母工業社製）を２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム及び０．１％のＢＳＡを含むｐＨ７．２のリン酸緩衝液で希釈した溶液を使用した。
【００５８】
反応は実施例２と同様に行った。この結果、測定可能なＣＲＰの濃度範囲は、０．００１〜５．０ｍｇ／ｄＬであった（図３）。また同測定系は標識試薬の濃度を調整することにより、高濃度域の応答を高めることも可能である。
またＣＲＰを添加した健常人血清３種（ＣＲＰ濃度：０．５０、１．０、２．０ｍｇ／ｄＬ）を測定し、上記蛍光強度と抗原濃度の関係からそれぞれの濃度を算出したところ、各濃度値は同等の数値を示した（表１）。
【００５９】
【表１】
2004144687.tif 000002
【００６０】
実施例４　ヘモグロビン・ビリルビン添加試料の測定
健常人血清にヘモグロビン及びビリルビンを添加した試料を、フルオレッセン標識の試薬とテキサスレッドＴＭ標識の試薬を用いて測定した。
ＣＲＰ標識試薬は、以下のように調製した。すなわち、フルオレッセン標識抗ＣＲＰ抗体を実施例２と同様に作製した。抗ＣＲＰ抗体は１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に１．０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、ＮＨＳ−フルオレッセン（ＰＩＥＲＣＥ社製）のＤＭＳＯ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを加え、室温で２時間反応させた。反応後、実施例２と同様にカラムクロマトグラフィーで未反応の標識体を除き、フルオレッセン標識抗ＣＲＰ抗体を得た。これをＢＳＡ／ＰＢＳに０．０１ｍｇ／ｍＬとなるよう加え、標識試薬とした。
【００６１】
また測定試薬は実施例３で調製した固相試薬を用いて、５ｍＬのＢＳＡ／ＰＢＳに５ｍＬの固相試薬を混合し、これに３００μＬのフルオレッセン標識の標識試薬を加えることで調製した。
光学的妨害物質の評価用試料は、ＣＲＰを０，０．５、１．０ｍｇ／ｄＬ含む健常人血清３種にヘモグロビン（干渉チェック；国際試薬社製）を最終濃度で１００及び３００ｍｇ／ｄＬ、またビリルビン（干渉チェック；国際試薬社製）を最終濃度で１０及び２０ｍｇ／ｄＬとなるよう調製した。
【００６２】
次に実施例３で調製したテキサスレッドＴＭ標識の試薬とフルオレッセン標識の試薬を用いて上記ヘモグロビン・ビリルビン含有試薬を測定し、実施例２と同様に試料中ＣＲＰ濃度を算出した。このときフルオレッセンの検出はＥｘ４９０ｎｍ／Ｅｍ５２４ｎｍで行った。この結果、表２に示すようにフルオレッセン標識のみ大幅に値が変化する傾向が認められた。
【００６３】
【表２】
2004144687.tif 000003
【００６４】
これは励起光及び蛍光の一部がヘモグロビンやビリルビンによって吸収され、蛍光強度が弱まったためと考えられる。本系では抗原濃度の増加に伴い蛍光強度が低くなる特徴を有するため、ヘモグロビンやビリルビンによる吸収は測定値を増加させる結果となる。一方、テキサスレッドＴＭ標識で値の増加が認められなかったのは、その励起及び蛍光波長がヘモグロビンやビリルビンによって吸収されない領域にあるためと考えられる。通常の血液検体中にはこのような溶血検体および高ビリルビン検体は数多く存在しているため、５９５ｎｍから１０００ｎｍの波長領域の吸収または蛍光を検出することにより血液中の物質の測定を行うことはこれらの影響を回避するために有効であることが明らかとなった。
【００６５】
実施例５　高脂血清試料中のＣＲＰの測定
高脂血清試料中の測定対象物質は、試料中の脂質に由来する散乱光強度と蛍光強度に基づき、実測値を補正することにより、正確に測定できることを示すため、健常人血清に脂質を添加した試料を、実施例３で作製したテキサスレッドＴＭ標識の試薬を用いて測定した。
【００６６】
脂質希釈試料を、ＣＲＰ濃度０ｍｇ／ｄＬの健常人血清に脂質（干渉チェック「乳び」；国際試薬社製）を最終濃度で０から１９６００度（ホルマジン濁度）になるように添加して調製した。この各脂質希釈試料５０μＬとテキサスレッドＴＭ標識の試薬１ｍＬとを混合し、Ｅｘ５９６ｎｍ／Ｅｍ６１５ｎｍにおける蛍光強度を測定した。同時に脂質による散乱光の測定を７００ｎｍで行った。得られた蛍光強度と散乱光の関係を図４に示した。該結果は、高脂血清が励起光を散乱させ標識体の励起を弱める現象を示すものであり、また蛍光強度と散乱光強度には一定の関係があることが示された。すなわち、上記測定条件における蛍光強度と散乱光強度には以下の式に示す関係が成立することがわかった。
【００６７】
【数１】
2004144687.tif 000004
【００６８】
よって、上記の式から血清の濁度に由来する蛍光強度減衰分を補正することにより、血清中のＣＲＰの正確な濃度を算出できることが明らかとなった。
次に脂質が１２５０，５０００，９８００，１９６０００度となるように調製したＣＲＰ添加血清をテキサスレッドＴＭ標識の試薬を用いて、Ｅｘ５９６ｎｍ／Ｅｍ６１５ｎｍにおける蛍光強度を測定するとともに、Ｅｘ５９６ｎｍ／７００ｎｍにおける散乱光の測定を行い、上記式から得られる値を用いて実測値を補正し、ＣＲＰ濃度を算出した。表３に示す結果のとおり、脂質による濁度が増加しても上記補正によりＣＲＰ抗原濃度を正確に算出できることが示された。
【００６９】
【表３】
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【００７０】
【発明の効果】
本発明により、血液中の測定対象物質を迅速、簡便かつ高感度に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】血清、ヘモグロビンおよびビリルビンによる光の吸収を示す図である。縦軸は吸光度、横軸は波長である。
【図２】インスリン濃度を変化させたときのテキサスレッドＴＭの蛍光強度を示す図である。縦軸は蛍光強度、横軸はインスリン濃度である。
【図３】ＣＲＰ濃度とテキサスレッドＴＭの蛍光強度を示す図である。縦軸は蛍光強度、横軸はＣＲＰ濃度である。
【図４】脂質含有試料における蛍光の減衰と散乱光の関係を示す図である。左縦軸は蛍光強度、右縦軸は散乱光強度、横軸はホルマジン濁度である。図中、◆は蛍光、◇は散乱光を表す。また、実線は蛍光および散乱光のそれぞれの測定値を用いて計算される線形を表し、該線形の式を図中に示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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