(57)【要約】【課題】所定のターゲット物質に親和性を有する２種類以上のタンパク質、特にターゲット物質に対する親和性が大きく異なる２種類以上のタンパク質を効率よくスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】複数種類のタンパク質を含有する母集団であって、前記タンパク質は、ウイルス又は細胞の表面に提示された任意の外来タンパク質であり、前記個々のウイルス又は細胞はそれぞれ１種類の外来タンパク質を提示している母集団を調製し、前記母集団を分割して、複数個の分割ライブラリーを調製し、これらの分割ライブラリーを用いてスクリーニングを行なう。前記分割ライブラリーは、前記母集団に含まれる複数種類の外来タンパク質のうち、少なくとも１種類の外来タンパク質を含まない、偏りを持ったライブラリーであることが好ましい。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定のターゲット物質に親和性を有する２種類以上のタンパク質をスクリーニングする方法において、
複数種類のタンパク質を含有する母集団であって、前記タンパク質は、ウイルス又は細胞の表面に提示された任意の外来タンパク質であり、前記個々のウイルス又は細胞はそれぞれ１種類の外来タンパク質を提示している母集団を調製し、
前記母集団を分割して、複数個の分割ライブラリーを調製し、
これらの分割ライブラリーを用いてスクリーニングを行なうことを特徴とするタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記ターゲット物質はタンパク質結合部位を２つ以上有するものである、請求項１に記載のタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記ターゲット物質に親和性を有する２種類以上のタンパク質の解離速度が１００倍以上離れている、請求項１又は２に記載のタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記分割ライブラリーは、前記母集団に含まれる複数種類の外来タンパク質のうち、少なくとも１種類の外来タンパク質を含まない、偏りを持ったライブラリーである、請求項１〜３のいずれか一つに記載のタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記母集団を分割して、複数個の分割ライブラリーを調製する際に、その分割数（ｒ）を下記式（１）に基いて求め、前記母集団を少なくともそれ以上に分割して分割ライブラリーを調製する、請求項１〜４のいずれか一つに記載のタンパク質のスクリーニング方法。
【数１】
2004016204.tif 000009
ｍ：ターゲット物質に親和性を有するタンパク質の取得希望数（ｍ≧２の整数）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、所定のターゲット物質に親和性を有する複数のタンパク質を効率的にスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、特定のタンパク質や糖鎖等のターゲット物質に結合するタンパク質を効率よくスクリーニングする方法として、ファージディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ，　Ｇ．Ｐ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８８，　１３１５−１３１７　（１９８５））が知られている。
【０００３】
ファージディスプレイ法は、ファージの外殻タンパク質に外来タンパク質（例えば、抗体、酵素、ペプチド等）を融合タンパク質として提示させたファージのライブラリーを用いて、目的のタンパク質をスクリーニングする方法である。
【０００４】
ファージディスプレイ法においては、ターゲット物質に結合する可能性のあるタンパク質の存在確率を上げて効率よくスクリーニングを行なうために、ファージ表面に提示される外来タンパク質のバリエーションをできるだけ増やしたファージのライブラリーを用いる必要がある。
【０００５】
そして、このようなファージをターゲット物質に接触させて、選択操作（バイオパニング）を行なうことで、ターゲット物質に結合するファージ群のみを選択的に得ることができる。
【０００６】
この方法の最大の特徴は、ファージ表面に提示された外来タンパク質とそれをコードする遺伝子が一体になっていることであり、ファージのＤＮＡを解析することにより提示された外来タンパク質のアミノ酸配列を容易に同定することができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のファージディスプレイ法では、ターゲット物質と最も親和性の高いタンパク質が優先的にスクリーニングされやすく、例えば、ターゲット物質の異なる部位に対して結合する２種類以上のタンパク質や、ターゲット物質との結合部位数が異なる２種類以上のタンパク質を効率よくスクリーニングすることは困難であった。このような傾向は、ターゲット物質に結合する２種類以上のタンパク質の結合力（特に解離速度）が離れている場合に起こりやすい。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、所定のターゲット物質に親和性を有する２種類以上のタンパク質、特にターゲット物質に対する親和性が大きく異なる２種類以上のタンパク質を効率よくスクリーニングする方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明のタンパク質のスクリーニング方法は、所定のターゲット物質に親和性を有する２種類以上のタンパク質をスクリーニングする方法において、複数種類のタンパク質を含有する母集団であって、前記タンパク質は、ウイルス又は細胞の表面に提示された任意の外来タンパク質であり、前記個々のウイルス又は細胞はそれぞれ１種類の外来タンパク質を提示している母集団を調製し、前記母集団を分割して、複数個の分割ライブラリーを調製し、これらの分割ライブラリーを用いてスクリーニングを行なうことを特徴とする。
【００１０】
本発明のスクリーニング方法によれば、充分に多様化された複数種類のタンパク質を含む母集団を複数個に分割して分割ライブラリーを調製し、これらの分割ライブラリーを用いてスクリーニングを行なうことにより、ターゲット物質に対する親和性の異なる２種類以上のタンパク質を効率よくスクリーニングすることができる。
【００１１】
本発明のスクリーニング方法においては、前記ターゲット物質はタンパク質結合部位を２つ以上有するものであることが好ましい。
【００１２】
この態様によれば、１つのターゲット物質の異なる部位に結合するタンパク質を効率よくスクリーニングすることができる。
【００１３】
また、本発明のスクリーニング方法においては、前記ターゲット物質に親和性を有する２種類以上のタンパク質の解離速度が１００倍以上離れていることが好ましい。
【００１４】
この態様によれば、従来法ではスクリーニングすることが困難であった解離速度の離れた２種類以上のタンパク質を効率よくスクリーニングすることができる。
【００１５】
また、本発明のスクリーニング方法においては、前記分割ライブラリーは、前記母集団に含まれる複数種類の外来タンパク質のうち、少なくとも１種類の外来タンパク質を含まない、偏りを持ったライブラリーであることが好ましい。
【００１６】
この態様によれば、解離速度の離れた２種類以上のタンパク質を非常に効率よくスクリーニングすることができる。
【００１７】
また、本発明のスクリーニング方法においては、前記母集団を分割して、複数個の分割ライブラリーを調製する際に、その分割数（ｒ）を下記式（１）に基いて求め、前記母集団を少なくともそれ以上に分割して分割ライブラリーを調製することが好ましい。
【００１８】
【数２】
分割数ｒ＝ｍｍ　　…（１）
ｍ：ターゲット物質に親和性を有するタンパク質の取得希望数（ｍ≧２の整数）
この態様によれば、充分に多様化された複数種類のタンパク質を含む母集団から、前記タンパク質を偏りを持って含有する分割ライブラリーを効率よく調製できる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質のスクリーニング方法は、（１）複数種類のタンパク質を含有する母集団を調製する工程、（２）母集団を分割して、複数個の分割ライブラリーを調製する工程、（３）これらの分割ライブラリーを用いてスクリーニングを行なう工程からなる。
【００２０】
以下、本発明のスクリーニング方法の各工程について詳細に説明する。
（１）複数種類のタンパク質を含有する母集団を調製する工程
本発明のスクリーニング法において用いられる、複数種類のタンパク質を含有する母集団とは、任意の外来タンパク質を表面に提示したウイルス又は細胞（個々のウイルス又は細胞はそれぞれ１種類の外来タンパク質を提示している）の集団であって、種類（アミノ酸配列）の異なる外来タンパク質を提示したウイルス又は細胞を、それぞれほぼ均等に含有するものである。
【００２１】
そして、ウイルス又は細胞の表面に提示された外来タンパク質とは、ペプチドを含むものであり、その種類は特に限定されるものではなく、ターゲット物質によって適宜選択することができる。このような外来タンパク質としては、例えば、抗体、酵素、タンパク質受容体、ホルモン等のタンパク質やそれらの部分ペプチド、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチド等が例示できる。例えば、ペプチドの場合、通常、３〜４０程度のアミノ酸数からなるものが好ましい。
【００２２】
また、上記母集団は、ターゲット物質に結合する可能性のあるタンパク質の存在確率を上げて効率よくスクリーニングを行なうために、提示される外来タンパク質のバリエーション（アミノ酸の組み合わせ）をできるだけ増やしたものであることが好ましい。このバリエーションの数は、提示される外来タンパク質のアミノ酸数等によって変わるため一概に決定することはできない。
【００２３】
本発明において、外来タンパク質を提示させるウイルスとしては、例えば、ファージ、バキュロウイルス等が挙げられ、細胞としては、例えば、大腸菌、酵母等が挙げられる。
【００２４】
上記のような母集団は、ランダム化したＤＮＡやｃＤＮＡライブラリー等を、遺伝子工学的手法を用いてウイルス又は細胞のＤＮＡに挿入し、このＤＮＡを適当な宿主に導入することにより得ることができる。例えば、ランダム化したＤＮＡを化学合成し、これをファージＤＮＡの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このＤＮＡを大腸菌に導入することにより、ファージの外殻タンパク質の先端に目的のタンパク質（外来タンパク質）が発現されたファージを得ることができる（Ｓｍｉｔｈ，　Ｇ．Ｐ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８８，　１３１５−１３１７　（１９８５）、Ｊ．Ｋ．　Ｓｃｏｔｔ　ａｎｄ　Ｇ．Ｐ．　Ｓｍｉｔｈ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４９，　３８６−３９０　（１９９０）等参照）。
【００２５】
本発明においては、上記のような公知の方法によって複数種類のタンパク質を含有する母集団を調製して用いてもよく、市販の製品を用いることもできる。市販品としては、例えば、商品名「Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔ」、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）等が挙げられる。
【００２６】
（２）母集団を分割して、複数個の分割ライブラリーを調製する工程
本発明においては、前記母集団を分割する際に、該母集団に含まれる複数種類の外来タンパク質のうち、少なくとも１種類の外来タンパク質を含まないような、偏りを持ったライブラリーに分割することが好ましい。
【００２７】
このような偏りを持った分割ライブラリーを用いることにより、ターゲット物質に親和性を有する解離速度の離れた２種類以上のタンパク質を効率よくスクリーニングすることができる。
【００２８】
本発明においては、偏りを持った分割ライブラリーを効率よく得るために、ターゲット物質に親和性を有するタンパク質の取得希望数（ｍ）に応じて、ｍ通りのタンパク質が得られるもっともらしい確率に基いて母集団の分割数（ｒ）を決定することが好ましい。具体的には、分割数を下記式（１）に基いて求め、前記母集団を少なくともそれ以上に分割して分割ライブラリーを調製することが好ましい。
【００２９】
【数３】
分割数ｒ＝ｍｍ　　…（１）
ｍ：ターゲット物質に親和性を有するタンパク質の取得希望数（ｍ≧２の整数）
したがって、例えば、ターゲット物質に親和性を有するタンパク質を少なくとも２種類取りたい場合は、前記母集団を少なくとも４つ以上に分割して、分割ライブラリーを調製すればよい。
【００３０】
なお、分割数が多過ぎると、母集団の分割が困難になったり、各分割ライブラリーのスクリーニングに手間がかかるため、通常、分割数（ｒ）は４〜２５６（２≦ｍ≦４）が好ましい。
【００３１】
上記のようにして母集団を分割して得られた各分割ライブラリーは、上記母集団と少なくとも同等数以上のウイルス又は細胞を含むように、それぞれ常法にしたがって増幅してからスクリーニングに用いることが好ましい。
【００３２】
（３）各分割ライブラリーを用いてスクリーニングを行なう工程
上記のようにして調製した分割ライブラリーを用いて、常法にしたがって選択操作（バイオパニング）を行なう。
【００３３】
すなわち、所定のターゲット物質を固相（例えば、プレート、ビーズ、磁気ビーズ等）に固定化し、好ましくはスキムミルク等のブロッキング剤で処理した後、該ターゲット物質と分割ライブラリーとを接触させる。
【００３４】
そして、前記固相を洗浄してターゲット物質に結合していないウイルス又は細胞を除去し、ターゲット物質に結合したウイルス又は細胞を溶離して回収する。
【００３５】
次いで、回収したウイルス又は細胞を常法にしたがって培養して増幅させ、次のラウンドのライブラリーとして用いる。このような操作を複数回（通常３〜４回）繰り返し、ターゲット物質に親和性を有する外来タンパク質を提示したウイルス又は細胞のスクリーニングを行ない、目的のウイルス又は細胞を単離する。
【００３６】
上記の選択操作を各分割ライブラリーについてそれぞれ行ない、目的のウイルス又は細胞を単離する。
【００３７】
そして、各分割ライブラリーから単離されたウイルス又は細胞のＤＮＡを常法にしたがって解析することにより、ターゲット物質に親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列を同定することができる。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法において、ターゲット物質は、特に限定されるものではないが、例えば、抗体、タンパク質受容体、ホルモン、酵素、核酸、複合糖質、低分子化合物、細胞、ウイルス等が挙げられる。
【００３９】
本発明のスクリーニング方法は、ある１つのターゲット物質に親和性を有するタンパク質を２種類以上取得できる確率が従来の方法に比べて非常に高く、例えば、タンパク質結合部位を２つ以上有するターゲット物質に親和性を有する２種類以上のタンパク質をスクリーニングする場合に適している。特に、該ターゲット物質に親和性を有する２種類以上のタンパク質の解離速度が１００倍以上離れている場合に、効率よくスクリーニングを行なうことができる。
【００４０】
また、本発明のスクリーニング方法で同定されたタンパク質は、例えば、ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）に用いられる抗体等の代替品、医薬品等への利用可能性がある。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、スクリーニングで得られた各ペプチドの解離定数及び解離速度は、ＢＩＡＣＯＲＥ　２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて表面プラズモン共鳴法により求めた。
【００４２】
実施例１
ターゲット物質として、ヒトの抗体の一部であるＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｈＦｃと略記する）を用い、ｈＦｃに結合する２種類のペプチドのスクリーニングを以下の方法により行なった。
【００４３】
（１）ターゲット物質の固定化
ターゲットｈＦｃは、常法にしたがってビオチン標識し、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（商品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ２８０　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」、Ｄｙａｎａｌ社製）に、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用して固定化した後、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液に懸濁してブロッキングを行なった。
【００４４】
（２）ペプチドのライブラリーを提示しているファージの調製
ランダムなアミノ酸配列（アミノ酸数１２個）のペプチドが表面に提示されたファージを含むペプチドライブラリー（ファージ数１０１０ｐｆｕ／１０μＬ、商品名「Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔ」、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）１０μＬを４分割し、分割したペプチドライブラリー（２．５μＬ）に含まれるファージを常法にしたがって大腸菌に感染させて、それぞれ増幅、精製し、４つの分割ペプチドライブラリー（ファージ数：１０１０ｐｆｕ／１０μＬ）を調製した。
【００４５】
そして、各分割ペプチドライブラリー１０μＬを、それぞれ０．２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液１ｍＬに加えて室温で１５分間放置し、これらを用いて以下のパニングを行なった。
【００４６】
（３）パニング
上記のｈＦｃを固定化した磁気ビーズを懸濁したスキムミルク溶液１０００μＬと、上記分割ペプチドライブラリーを含むスキムミルク溶液１００μＬを混合して、２５℃で１時間放置した後、マグネットを用いて磁気ビーズを回収した。回収した磁気ビーズをＴＢＳ（０．１％　Ｔｗｅｅｎ）で洗浄して、未結合のファージを除去した後、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）でターゲットｈＦｃに結合したファージを溶離して回収し、ＴＢＳ（１Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ９）で中和した後、常法にしたがって大腸菌に感染させてファージを増幅し、ＰＥＧ沈殿法によりファージを精製した。このファージ群を次のラウンドのペプチドライブラリーとして用いた。
【００４７】
そして、前記操作を１ラウンドとして、４ラウンド目で得られたファージを大腸菌に感染させてプラークを形成させ、ファージクローンを単離した。なお、パニングは、上記４つの分割ペプチドライブラリーについてそれぞれ行ない、各分割ペプチドライブラリーからファージクローンを単離した。
【００４８】
（４）解析
上記のようにして単離したファージの中から、各分割ライブラリーについて３個のクローンを任意に選び（合計１２個）、各ファージを常法にしたがって大腸菌に感染させて増幅し、精製後、ＥＬＩＳＡ法によってｈＦｃへの結合活性を調べた。
【００４９】
ＥＬＩＳＡ法は、９６穴プレートにストレプトアビジンを固定化して、スキムミルクでブロッキングした後、ビオチン標識したｈＦｃを加えて、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用してプレートに固定化した。このプレートに各ファージを加えて２５℃、１時間反応させた後、プレートをＰＢＳ−Ｔ（１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０、以下同じ）で洗浄した。そして、ＨＲＰ標識した抗Ｍ１３ファージ抗体を用いて、プレートに結合したファージの有無をＡＢＴＳの発色反応によって４０５ｎｍの吸光度で解析した。
【００５０】
比較例１（従来法）
実施例１と同じペプチドライブラリー１０μＬを分割せずにそのまま用いた以外は実施例１と同様にしてパニングを行なった。そして、単離したファージの中から１２個のクローンを任意に選び、実施例１と同様にして解析を行なった。
【００５１】
その結果、実施例１では、４つの分割ライブラリー中、２つの分割ライブラリーから選んだ６クローンで強い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝２．２前後）が見られ、１つの分割ライブラリーから選んだ３クローンでやや弱い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝０．８〜１．４前後）が見られ、残りの１つの分割ライブラリーから選んだクローンでは発色は見られなかった。一方、比較例１では、１２クローン中、１１クローンで強い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝２．２前後）が見られ、１クローンは発色が見られなかった。
【００５２】
そして、発色したクローンのＤＮＡをダイターミネータ法により解析し、ファージに提示されたペプチドのアミノ酸配列を決定したところ、実施例１で強い発色の見られた６クローンのうち、３クローン（同じ１つの分割ライブラリーから得られたもの）のペプチドは全て配列番号１に示されるアミノ酸配列であり、残りの３クローン（もう一つの分割ライブラリーから得られたもの）のペプチドは全て配列番号２に示されるアミノ酸配列であった。また、やや弱い発色の見られた分割ライブラリーから得られた３クローンのペプチドは配列番号３〜５に示されるアミノ酸配列であり、Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｘａａ　Ｌｅｕ（４番目のＸａａ：Ｔｙｒ又はＴｒｐ、５番目のＸａａ：Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＭｅｔ、８番目のＸａａ：Ａｌａ、Ｇｌｙ又はＳｅｒ）の共通するアミノ酸配列を有していた。
【００５３】
一方、比較例１の１１クローンのアミノ酸配列は全て配列番号６に示されるアミノ酸配列であった。
【００５４】
更に、上記の各ペプチドの解離定数及び解離速度を求め、その結果を表１に示した。
【００５５】
【表１】
2004016204.tif 000002
【００５６】
以上の結果から、比較例１の方法（従来の方法）では１種類のペプチドしか得られなかったのに対して、実施例１の方法（本発明の方法）ではターゲットｈＦｃに対する解離速度が異なる３種類のペプチドが得られ、効率よく複数のペプチドのスクリーニングが行なえることが分かる。
【００５７】
実施例２
ターゲット物質として、蛍の発光酵素ルシフェラーゼを用い、ルシフェラーゼに結合する２種類のペプチドのスクリーニングを以下の方法により行なった。
【００５８】
（１）ターゲット物質の固定化
ターゲットルシフェラーゼは、常法にしたがってビオチン標識し、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（商品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ２８０　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」、Ｄｙａｎａｌ社製）に、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用して固定化した後、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液に懸濁してブロッキングを行なった。
【００５９】
（２）ペプチドのライブラリーを提示しているファージの調製
ランダムなアミノ酸配列（アミノ酸数７個）のペプチドが表面に提示されたファージを含むペプチドライブラリー（ファージ数１０１０ｐｆｕ／１０μＬ、商品名「Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔ」、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）１０μＬを４分割し、実施例１と同様にして分割ペプチドライブラリーをそれぞれ調製した。
【００６０】
そして、各分割ペプチドライブラリー１０μＬを、それぞれ０．２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液１ｍＬに加えて室温で１５分間放置し、これらを用いてパニングを行なった。
【００６１】
（３）パニング
上記のルシフェラーゼを固定化した磁気ビーズを懸濁したスキムミルク溶液１０００μＬと、上記分割ペプチドライブラリーを含むスキムミルク溶液１００μＬを混合して、２５℃で１時間放置した後、マグネットを用いて磁気ビーズを回収した。回収した磁気ビーズをＴＢＳ（０．１％　Ｔｗｅｅｎ）で洗浄後、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）でターゲットルシフェラーゼに結合したファージを溶離して回収し、ＴＢＳ（１Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ９）で中和した後、常法にしたがって大腸菌に感染させてファージを増幅し、ＰＥＧ沈殿法によりファージを精製した。このファージ群を次のラウンドのペプチドライブラリーとして用いた。
【００６２】
そして、前記操作を１ラウンドとして、４ラウンド目で得られたファージを大腸菌に感染させてプラークを形成させ、ファージクローンを単離した。なお、パニングは、上記４つの分割ペプチドライブラリーについてそれぞれ行ない、各分割ペプチドライブラリーからファージクローンを単離した。
【００６３】
（４）解析
上記のようにして単離したファージの中から、各分割ライブラリーについて３個のクローンを任意に選び（合計１２個）、各ファージを常法にしたがって大腸菌に感染させて増幅し、精製後、ＥＬＩＳＡ法によってルシフェラーゼへの結合活性を調べた。
【００６４】
ＥＬＩＳＡ法は、９６穴プレートにストレプトアビジンを固定化して、スキムミルクでブロッキングした後、ビオチン標識したルシフェラーゼを加えて、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用してプレートに固定化した。このプレートにファージを加えて２５℃、１時間反応させた後、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。そして、ＨＲＰ標識した抗Ｍ１３ファージ抗体を用いて、プレートに結合したファージの有無をＡＢＴＳの発色反応によって４０５ｎｍの吸光度で解析した。
【００６５】
比較例２（従来法）
実施例２と同じペプチドライブラリー１０μＬを分割せずにそのまま用いた以外は実施例２と同様にしてパニングを行なった。そして、単離したファージの中から１２個のクローンを任意に選び、実施例２と同様にして解析を行なった。
【００６６】
その結果、実施例２では、４つの分割ライブラリー中、１つの分割ライブラリーから選んだ３クローンで強い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝１．３前後）が見られ、１つの分割ライブラリーから選んだ３クローンでやや弱い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝０．９５前後）が見られ、残りの２つの分割ライブラリーからは選んだクローンでは発色は見られなかった。一方、比較例２では、１２クローン中、８クローンで強い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝１．４前後）が見られ、４つは発色が見られなかった。
【００６７】
そして、発色したクローンのＤＮＡをダイターミネータ法により解析し、ファージに提示されたペプチドのアミノ酸配列を決定したところ、実施例２で強い発色の見られた分割ライブラリーから得られた３クローンのペプチドは全て配列番号７に示されるアミノ酸配列であった。また、やや弱い発色の見られた分割ライブラリーから得られた３クローンのペプチドは全て配列番号８に示されるアミノ酸配列であった。一方、比較例２の８クローンのペプチドは全て上記配列番号７に示されるアミノ酸配列と同じであった。
【００６８】
更に、上記の各ペプチドの解離定数及び解離速度を求め、その結果を表２に示した。
【００６９】
【表２】
2004016204.tif 000003
【００７０】
以上の結果から、比較例２の方法（従来の方法）では、１種類のペプチドしか得られなかったのに対して、実施例２の方法（本発明の方法）では、ターゲットルシフェラーゼに対する解離速度が異なる２種類のペプチドが得られ、効率よく複数のペプチドのスクリーニングが行なえることが分かる。
【００７１】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号２：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号３：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号４：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号５：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号６：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号７：ルシフェラーゼと親和性を有するペプチド。
配列番号８：ルシフェラーゼと親和性を有するペプチド。
【００７２】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、充分に多様化された複数種類のタンパク質を含む母集団を複数個に分割して、前記タンパク質を偏りを持って含有する複数個の分割ライブラリーを調製し、これらの分割ライブラリーを用いてスクリーニングを行なうことにより、ターゲット物質に対する親和性の異なる２種類以上のタンパク質を効率よくスクリーニングすることができる。
【００７３】
【配列表】
2004016204.tif 000004
2004016204.tif 000005
2004016204.tif 000006
2004016204.tif 000007
2004016204.tif 000008