(57)【要約】      （修正有）【課題】イヌリンネオシリーズ型フルクタンをより効率よく合成する能力も持つフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を提供する。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡから成るフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子である。（ａ）特定の塩基配列から成るＤＮＡ（ｂ）特定のアミノ酸配列から成るタンパク質、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成りフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡこの遺伝子により形質転換された植物は耐寒性等のストレス耐性に優れ、また発現ベクターを用いてこの遺伝子を発現させて得た酵素を用いれば３糖以上のイヌリンネオシリーズ型のフルクタンを製造することができる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡから成るフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１の塩基配列から成るＤＮＡ
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列から成るタンパク質、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成りフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子が導入されたトランスジェニック植物。
【請求項５】
前記ベクターがプラスミドであり、宿主が大腸菌又は酵母である請求項３に記載の形質転換体を発現させることにより、フルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼを製造する方法。
【請求項６】
請求項１に記載の遺伝子を発現させて得られるフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ。
【請求項７】
請求項４に記載のトランスジェニック植物を培養又は栽培して得られるフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ。
【請求項８】
請求項５に記載の方法により得られるフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載のフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ用いて、３糖以上のβ−２，１結合のイヌリン型フルクタンを基質として酵素反応を行うことにより、３糖以上のイヌリンネオシリーズ型フルクタンを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、植物の耐凍性、乾燥耐性をはじめとする環境ストレス耐性に作用し、さらには人間の健康上有用な機能性糖として働くフルクタンの代謝に関わる遺伝子に関し、より詳細には、イヌリンネオシリーズフルクタンを効率よく合成するアスパラガス由来の新規フルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フルクタン（ポリフルクトシルスクロース）は、スクロースにフルクトースが重合した多糖であり、イネ科の小麦や大麦、キク科のチコリやキクイモ、ユリ科のタマネギやアスパラガスのような植物の重要な貯蔵炭水化物である。これらの植物の中で、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌ．）とタマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ  Ｌ．）はその構造から互いに区別される２種類のフルクタンを含んでいることが良く知られている。ひとつはβ−２，１結合したフルクトースオリゴマーやポリマーの末端にグルコースが結合しているイヌリン型フルクタンである。もう一つはイヌリン型フルクタンの末端グルコシル残基のＣ６位に、β−２，６結合で１個のフルクトシル残基が結合している、またはさらにそのフルクトシル残基にβ−２，１結合で１個以上のフルクトース残基が結合しているイヌリンネオシリーズフルクタンである。これらのフルクタンは貯蔵炭水化物であることに加えて、乾燥や低温に対する耐性において重要であると考えられている。
【０００３】
イヌリンネオシリーズフルクタンを生成する植物中におけるフルクタンの生合成には少なくとも３種類の酵素が関係している。
１つ目は、スクロース−スクロース−１−フルクトシルトランスフェラーゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ：ｓｕｃｒｏｓｅ  １−ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（１−ＳＳＴ）は２分子のスクロースから１−ケストース（３糖）とグルコースを生成する反応を触媒することによりフルクタン合成を開始する。この酵素の性質はアスパラガス根（Ｓｈｉｏｍｉ  ａｎｄ  Ｉｚａｗａ，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ４４，  ６０３−６１４  （１９８０））とキクイモ塊茎（Ｋｏｏｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１０：  １１６７−１１７５  （１９９６））より精製された酵素によって明らかにされてきた。
２つ目は、フルクタン−フルクタン−１−フルクトシルトランスフェラーゼ（Ｆｒｕｃｔａｎ：ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（以下「１−ＦＦＴ」という。）であり、β−２，１結合でフルクトシル残基を付加することによりフルクタン鎖の伸長反応を触媒する。これらの反応はアスパラガス根（Ｓｈｉｏｍｉ，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ９９  （１９８２）  １５７−１６９））とキクイモ塊茎より精製された酵素によって明らかにされてきた。
【０００４】
３つ目は、フルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ（又は６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ、以下「６Ｇ−ＦＦＴ」という。）であり、１−ケストースやニストースなどのイヌリン型フルクタンからスクロースやイヌリン型フルクタンへのフルクトシル転移反応を触媒する。この６Ｇ−ＦＦＴは、主に１−ケストース（３糖）以上のイヌリンタイプのフルクタンを基質として、フルクタンの末端グルコースの６位炭素にフルクトースを転移しイヌリンネオシリーズ型フルクタンを合成する活性と、フルクタンの末端フルクトースにフルクトースを転移させイヌリンの重合度を高める活性とを併せ持つことが示されてきた（非特許文献１）。この研究により６Ｇ−ＦＦＴはイヌリンネオシリーズのフルクタン合成において鍵となる酵素であることが確認された。しかし、今までアスパラガスからこの酵素活性を示すタンパク質は単離されておらず、そのアミノ酸配列も知られていなかった。
【０００５】
一方、既にタマネギ由来の６Ｇ−ＦＦＴ遺伝子は単離されて、その性質が明らかにされるとともに、タバコとチコリに導入されている（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｙ０７８７３、非特許文献２）。この論文においては、形質転換タバコの植物体から抽出した粗酵素液を１−ケストース及びスクロースを反応させたところネオケストースと重合度６までのイヌリンネオシリーズのフルクタンが生成することが解明されている。更に、チコリへの遺伝子導入により、直鎖型のイヌリンに加えイヌリンネオシリーズフルクタンが合成されている。この遺伝子組換えタンパクは６Ｇ−ＦＦＴ活性とほぼ同じレベルの１−ＦＦＴ活性をも持つことが明らかになっているが、本発明の遺伝子と比べると−ＦＴの活性がかなり高いデータとなっている。更に、タマネギのフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入した植物細胞を用いてスクロースからオリゴ糖を製造する方法が知られている（特許文献１）。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｎｏｒｉｏ  Ｓｈｉｏｍｉ，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ９６  （１９８１）  ２８１−２９２
【非特許文献２】
Ｖｉｊｉｎ  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １１（３），  ３８７−３９８  （１９９７）
【特許文献１】
特表平１０−５０４７１１
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、イヌリンネオシリーズ型フルクタンをより効率よく合成する能力を有するフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を提供する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、温室で育成したアスパラガス品種ズイユウの茎葉部から単離精製したｍＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーを作製した。ついでこのｃＤＮＡを鋳型として、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤＢＪデータバンクにおいて公開されているフルクタン代謝酵素遺伝子及びインベルターゼ遺伝子の塩基配列（Ｙ０７３８３，  ＡＦ００２６５６，  ＡＪ００６０６７，  ＡＪ００６０６６及び  ＡＹ０９８４４２）を詳細に解析し、高度に保存されている塩基配列部分を参考に設計したプライマーを利用してＰＣＲを行い、フルクタン代謝酵素遺伝子に相同性の高いＤＮＡ増幅断片を得た。その断片をプロープとして上記のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしそれぞれのクローンの塩基配列を解析することにより、フルクタン代謝酵素遺伝子に対し相同性の高く、かつ遺伝子の全長を含むと思われるクローンを単離した。単離したｃＤＮＡクローンを組み込んだ酵母を利用して得られた当該遺伝子由来のタンパク質を解析することにより、アスパラガスでは新規のフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡであることを決定した。
【０００９】
本発明のアスパラガス由来の遺伝子がコードする酵素（フルクトシルトランスフェラーゼ）は、タマネギ由来の酵素と比べ上記に示した酵素活性のうちイヌリンネオシリーズ型フルクタン合成活性が極めて高いことが解明され、より効率的にイヌリンネオシリーズ型フルクタンを合成する能力があることがわかった。このアミノ酸配列は、タマネギ由来の同名酵素遺伝子と相同性が６８％であり、アスパラガス由来の本遺伝子はこれと異なる新規なものと考えられる。
【００１０】
即ち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡから成るフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子である。
（ａ）配列番号１の塩基配列から成るＤＮＡ
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列から成るタンパク質、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成りフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
このフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ活性（以下「６Ｇ−ＦＦＴ活性」という。）とは、主に１−ケストース（３糖）以上のイヌリンタイプのフルクタンを基質として、フルクタンの末端グルコースの６位炭素にフルクトースを転移しイヌリンネオシリーズ型フルクタンを合成する活性を有することをいい、例えば、後述の実施例２に示す方法により知ることが出来る。
【００１１】
また、本発明は、この遺伝子を含む組換えベクターであり、この組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。このベクターは、この遺伝子以外に、プロモーターやエンハンサー等の転写開始シグナル、更にターミネ−ター配列を有してもよい。更に、本発明は、上記ベクターがプラスミドであり、宿主が大腸菌又は酵母である上記形質転換体を発現させることにより、フルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼを製造する方法である。
また、本発明は、上記遺伝子が導入されたトランスジェニック植物である。
また、本発明は、上記本発明の遺伝子を発現させて得られるフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼであり、上記トランスジェニック植物を培養又は栽培して、この植物から得られるフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼであり、更に上記の方法により得られるフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼである。
更に、本発明は、上記で得られたフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ用いて、３糖以上のβ−２，１結合のイヌリン型フルクタンを基質として酵素反応を行うことにより、３糖以上のイヌリンネオシリーズ型フルクタンを製造する方法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の形質転換体の宿主としては植物や微生物が好ましい。
宿主が植物の場合には、このベクターとして、Ｔｉプラスミド、ｐＢＩ−１２１プラスミド等のバイナリーベクターが挙げられる。またプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、熱ショックプロモーター、化学物質誘導性プロモーター等が挙げられる。ターミネ−ター配列としてはノパリン・シンターゼ遺伝子終止配列等が挙げられる。これらと上記遺伝子の結合方法に特に制限は無く、通常の遺伝子工学的手法に従って適宜行えばよい。
【００１３】
この植物としては、ナス、トマト、ピーマン、トウガラシ、タバコ等のナス科植物、シロイヌナズナ、アブラナ、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、ナタネ等のアブラナ科植物、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ等のイネ科植物、ダイズ、アズキ、インゲン、ソラマメ等のマメ科植物、キュウリ、メロン、スイカ、カボチャ等のウリ科植物、サツマイモ等のヒルガオ科植物、ネギ、タマネギ、ニラ、ニンニク、アスパラガス等のユリ科植物、シソ等のシソ科植物、キク、シュンギク、レタス等のキク科植物、バラ、イチゴ等のバラ科植物、ミカン、サンショウ等のミカン科植物、ユーカリ等のフトモモ科植物、ポプラ等のヤナギ科植物、ホウレンソウ、テンサイ等のアカザ科植物、リンドウ等のリンドウ科植物、カーネーション等のナデシコ科植物が挙げられる。
上記組換えベクターは、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等の公知の形質転換方法によりこれらの植物に導入すればよい。１−ケストース合成能力を持たない植物は、スクロース−スクロース−１−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を同時に導入すればよい。
このようにして本発明のフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が導入された植物は、植物体内でネオシリーズ型のフルクタンが合成されるまたは増加することにより、耐寒性、耐凍性、耐雪性、耐乾燥性、貧栄養耐性、耐霜性、耐病性などのストレス耐性、特に耐寒性が強化されうる。
【００１４】
更に、上記本発明の遺伝子を発現させることによりフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼが得られる。具体的には、本発明の遺伝子を組み込んだ適当な発現ベクターを用いることにより、フルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼを得ることができる。
この遺伝子を発現させる宿主として、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の動物細胞、植物細胞が挙げられるが、大腸菌又は酵母が好ましい。本発明の遺伝子及び、必要に応じて上記のプロモーターやエンハンサー等の転写開始シグナル、更にターミネ−ター配列を組み込んだプラスミドにより、通常の遺伝子工学的手法に従って、この宿主細胞を形質転換すればよい。この細胞を培養し、その培地若しくはその上清から、又はこれらを精製して、フルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼを得ることができる。
【００１５】
このようにして得られたフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼを用いて、３糖以上のβ−２，１結合のイヌリン型フルクタンを基質として酵素反応を行うことにより、３糖以上のイヌリンネオシリーズ型のフルクタンを合成することができる。この基質として、１−ケストース、ニストース、５糖以上のイヌリン等が挙げられる。得られるフルクタンとしてはネオケストース、１Ｆ、６Ｇ−Ｄｉ−β−Ｄ−フルクトシルスクロース、５糖以上のイヌリンネオシリーズ型フルクタンである。この酵素は２０〜４０℃で十分な酵素活性示す。この酵素反応は公知の方法（例えば、特開２０００−２３２８７８に記載の方法）を用いて行うことができる。
【００１６】
【発明の効果】
本発明は、既知のタマネギフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼとは異なるアスパラガス由来の新規フルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を提供する。
本発明のフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、イヌリンネオシリーズのフルクタンをより効率よく合成する能力も持つことから、生物工学的手法を用いて生物にイヌリンネオシリーズ型フルクタンの高い合成機能を付与することを可能とし、フルクタン分子種の中でも希少種のイヌリンネオシリーズ型フルクタンを大量に製造することを可能とする。またフルクタン蓄積量が作物の耐寒性、耐乾性等の環境ストレス耐性の向上に関与することが明らかとなっており、かつフルクタンは人間にとって整腸作用等の機能性糖として作用することが知られている。従って、アスパラガスをはじめとする植物に本発明の遺伝子を導入することにより、導入植物の環境ストレス耐性の向上のみならず、可食部に対する新規機能性の付与及び増進に貢献することができる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌ．）品種ズイユウの種（北海道農業研究センターより入手）を、３月下旬にポットに播種し、温室で８月上旬まで生育させ、その茎葉部よりｍＲＮＡを常法により抽出した。得られたｍＲＮＡ５μｇを用いてｃＤＮＡ合成キット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を利用してｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡの両末端にアダプターを接続後、λＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、約６×１０６ｐｆｕのｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００１８】
次に、このようにして合成されたｃＤＮＡを鋳型として、既知のフルクタン代謝酵素遺伝子間で高度に保存された領域に基ずく下記配列
（Ｆｏｒｗａｒｄ）  ：  ５’  ＣＣＩ  ＧＴＩ  ＳＣＲ  ＴＴＲ  ＴＴＲ  ＡＡ  （配列番号３）
（Ｒｅｖｅｒｓｅ）  ：  ５’  ＧＴＩ  ＧＧＩ  ＡＴＧ  ＴＧＧ  ＧＡＲ  ＴＧ  （配列番号４）
（但し、Ｉ：  ｉｎｏｓｉｎｅ，  Ｒ＝Ａ  ｏｒ  Ｇ，  Ｓ＝Ｃ  ｏｒ  Ｇ）を有する１組のプライマーを用いてＰＣＲを行った。増幅された断片をクローニングし、その塩基配列を解析して、配列番号５の塩基配列を得た。この断片をデータベース上で相同性検索すると、フルクタン合成遺伝子類が相同性の高い遺伝子として見出された。即ち、この断片が、アスパラガスから単離されたフルクタン代謝関連酵素遺伝子の相同断片であることが確認された。
【００１９】
次に、上記で得られたｃＤＮＡライブラリーのうち、およそ１０万クローンをブロットしたフィルターを利用した。上記により単離されたフルクタン代謝酵素遺伝子増幅断片（配列番号５）をアイソトープで標識したプローブを用いて、上記フィルターとハイブリダイゼーションアッセイを行った。
この結果得られた陽性クローンについてそれぞれＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を決定した。その結果、植物由来フルクタン代謝関連酵素と高い相同性を示すＯＲＦを含む２２０１ｂｐのｃＤＮＡ（配列番号６）であることがわかった。
【００２０】
フルクタン合成酵素はインベルターゼの進化形と考えられており、インベルターゼと遺伝子の構造が非常に似通っていることが知られている。その遺伝子解析からこれらすべてのフルクタン合成酵素とインベルターゼに酵素活性を司るアミノ酸モチーフとして２つのアミノ酸配列（Ｎ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｇ、Ｗ−Ｅ−Ｃ−Ｐ／Ｖ−Ｄ）に類似する配列が存在することが証明されている（Ｖｉｊｉｎ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｍｅｅｋｅｎｓ  Ｓ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２０，  ３５１−３５９  （１９９９））。当該ｃＤＮＡの推定コードタンパク質（配列番号２）は、これらのモチーフの類似配列（Ｎ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｇ（配列番号２の８１〜８５位）、Ｗ−Ｅ−Ｃ−Ｖ−Ｄ（配列番号２の２６５〜２６９位））を保持していた。
従って、得られた陽性クローンの塩基配列（配列番号１、配列番号６の４９〜１８８１位の塩基配列）は、６１０アミノ酸からなるタンパク（配列番号２）をコードする、１８３０塩基からなる、フルクトシルトランスフェラーゼまたはインベルターゼ遺伝子であると結論された。
この遺伝子は、タマネギ由来のフルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｙ０７８７３、非特許文献２）と６８％（アミノ酸配列ベース）の相同性を持つ、アスパラガス由来の新規遺伝子であることが明らかとなった。
【００２１】
実施例２
実施例１にて単離したｃＤＮＡを発現ベクターｐＰＩＣＺαＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ）にクローニングし、定法に従いエレクトロポレーション法により酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にベクターを組み込んだ。利用したベクターは、酵母用液体培地中のメタノールに特異的に反応して、当該ベクターにクローニングした遺伝子の発現を誘導するＡＯＸＩプロモーター配列、及び酵母内で発現した組み換えタンパクを酵母外つまり培地中に分泌するために必要となるαファクターと呼ばれる分泌因子配列を含む。
この酵母は、メタノールを炭素源として利用できる酵母であるため、当該ｃＤＮＡを組み込んだベクターで形質転換した酵母をメタノールを炭素源とした培地で液体培養することにより、培地中に組み換えタンパクが酵母から分泌される。このようにして形質転換した酵母を、メタノールを炭素源とした液体培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のマニュアルに従う）中で４日間培養後、その培養液を分離し、限外濾過型フィルター（ビバサイエンス社製、ビバスピン２０）により約３０倍に濃縮した。その濃縮液を粗酵素液として基質となる１−ケストース（３糖）（和光純薬製）と混ぜ、３０℃で１時間反応させた。この反応生成物を高速液体クロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ社製、ＤＸ５００）によって分析し、培養液に含まれる各組み換えタンパクの酵素活性について解析した。
【００２２】
酵素活性を検出したクロマトグラムを図２に示す。ＨＰＬＣクロマト条件は以下のとうりである。分離カラムはＤｉｏｎｅｘ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１を用い、パルスドアンピロメトリー検出法で測定した。溶離液は、１５０ｍＭ  水酸化ナトリウム溶液をＡ液、０．５Ｍ酢酸ナトリウムを含む１５０ｍＭ  水酸化ナトリウム溶液をＢ液とし、０分から１分までをＡ液９５％、Ｂ液５％で流し、２分までにＡ液９０％、Ｂ液１０％、２０分までにＡ液６０％、Ｂ液４０％に達するように濃度勾配をかけて、流速を毎分１ｍｌで流した。
図２（１）から、（ｃ）ネオケストース（３糖）と（ｅ）１Ｆ、６Ｇ−Ｄｉ−ベータ−Ｄ−フルクトシルスクロース（４糖）が主として生成され、（ｄ）ニストース（４糖）の生成量は（ｅ）１Ｆ、６Ｇ−Ｄｉ−ベータ−Ｄ−フルクトシルスクロースの生成量の約１／１２以下であることが分かる。
酵素が、フルクタン基質の末端グルコースの６位炭素にフルクトースを転移する活性（６Ｇ−ＦＦＴ活性）を有する場合には、ネオケストースと１Ｆ、６Ｇ−Ｄｉ−ベータ−Ｄ−フルクトシルスクロースが生成され、一方、酵素が、基質末端フルクトースにフルクトースを転移させイヌリンの重合度を高める活性（１−ＦＦＴ活性）を有する場合にはニストースが生成される。従って、本実施例の単離ｃＤＮＡを組み込んだ酵母の培養液中では、イヌリンネオシリーズ型フルクタンである４糖の１Ｆ、６Ｇ−Ｄｉ−ベータ−フルクトフラノシルスクロースが主として合成されたため、６Ｇ−ＦＦＴ活性が検出されたといえる。一方、１−ＦＦＴ活性も検出されたが、６Ｇ−ＦＦＴ活性の１／１２以下であった。このことから、当該遺伝子は６Ｇ−ＦＦＴをコードしていることが決定された。
【００２３】
公知のタマネギ由来の６Ｇ−ＦＦＴ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｙ０７８７３）の発現により得られる組換えタンパクは６Ｇ−ＦＦＴ活性とほぼ同じレベルの１−ＦＦＴ活性を持つことから（非特許文献２）、本発明においては、これら従来の６Ｇ−ＦＦＴ遺伝子とは異なる、アスパラガス由来の新規フルクタン−フルクタン−６Ｇ−β−Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が単離されたことが明らかとなった。
【００２４】
【配列表】
2004222573.tif 000002
2004222573.tif 000003
2004222573.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２で得られた組換えタンパク質の高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す図である。横軸は保持時間（分）を表す。（１）は本発明の遺伝子を含むプラスミドで形質転換された酵母培養液を用いた酵素反応液、（２）は本発明の遺伝子を含まないプラスミドで形質転換された酵母培養液を用いた酵素反応液、（３）は基質（１−ケストース）のみのものを示す。また各ピークについて、ａはスクロース、ｂは１−ケストース、ｃはネオケストース、ｄはニストース、ｅは１Ｆ、６Ｇ−Ｄｉ−ベータ−フルクトフラノシルスクロース（４糖）のものを示す。
【図１】
2004222573.tif 000010