(57)【要約】【課題】アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有し、しかも持続性のある血圧降下作用を示す新規生理活性ペプチドを提供すること。【解決手段】Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒで示される新規生理活性ペプチドであり、より詳しくはナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼで加水分解することより得られ、ナタネ由来の蛋白質としては、ナタネの種子から油脂を除去した油粕が好ましく、プロテアーゼとしてはズブチリシンが好ましく用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒで示されることを特徴とする新規生理活性ペプチド。
【請求項２】
ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼで加水分解して得られたことを特徴とする請求項１記載の新規生理活性ペプチド。
【請求項３】
ナタネ由来の蛋白質がナタネ種子から油脂を除去した油粕であることを特徴とする請求項２記載の新規生理活性ペプチド。
【請求項４】
プロテアーゼがズブチリシンであることを特徴とする請求項２記載の新規生理活性ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素阻害作用をもち、しかも持続性のある血圧降下剤として有用な新規ペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、食品中に含まれる蛋白質は栄養効果ばかりでなく種々の生理活性を有することが知られている。
例えば血圧を降下する活性を示すものとして、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドや動脈血管を弛緩させるペプチドが知られている。
アンジオテンシン変換酵素は、主として肺や血管内皮細胞、腎近位尿細管に存在し、アンジオテンシンＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に作用して、アンジオテンシンＩのＣ末端よりジペプチド（Ｈｉｓ９−Ｌｅｕ１０）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有するアンジオテンシンＩＩを生成させる酵素である。また、この酵素は生体内降圧物質であるブラジキニンを破壊し不活化する作用も併有し、昇圧系に強力に関与している。したがって、かかるアンジオテンシン変換酵素の活性を阻害すれば、血圧が降下して、臨床的には高血圧症の予防、治療に有効であると考えられている。
かかるアンジオテンシン変換酵素阻害物質としてはプロリン誘導体であるカプトプリルが合成されて、降圧活性が確認されて以来、種々のアンジオテンシン変換酵素阻害物質が合成され、近年天然物からの取得も盛んに試みられているところである。
【０００３】
例えば▲１▼特開平２−３６１２７号公報には、γ−ゼインをサーモリシンで加水分解してＣ末端のアミノ酸配列がＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏである重合度が３〜５のペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤が報告されている。また、▲２▼Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５（２）４０１（１９８０）には、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するジペプチドが報告され、かかるペプチドの１つにＶａｌ−Ｔｒｐ（ＩＣ５０＝１．６μＭ）が記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記▲１▼に開示のペプチドや▲２▼に記載のＶａｌ−Ｔｒｐで示されるペプチドはアンジオテンシン変換酵素阻害活性はあるものの、高血圧自然発症ラット（以下ＳＨＲと称する）に経口投与すると、血圧降下作用の持続性がなく投与後３時間以内で元の血圧にもどってしまうことがわかった。
昨今では経口投与においても有意な血圧降下作用を示し、更に従来のペプチドよりも血圧降下を示す時間が長くなる血圧降下の持続性のあるペプチドが求められている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、かかる課題を解決すべく天然物質で血圧降下作用が持続する物質を鋭意探索した結果、ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼで加水分解した組成物中にかかる活性を有する物質の存在をつきとめ、該物質がＶａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒで示されるペプチドであることを見出し本発明を完成した。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチドはＶａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒの配列で示されるもので、文献未載の新規なペプチドである。ここでいうＶａｌはバリン、Ｔｒｐはトリプトファン、Ｉｌｅはイソロイシン、Ｓｅｒはセリンを意味しかかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。
【０００７】
本発明のペプチドを製造するにあたっては、特に制限されるものではないが、ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼによって加水分解したり、ペプチド合成の常套手段を適用して合成することによって製造することもでき、これらの方法について説明する。尚、安価な原料を使用できる点では前者の方が好ましい。
【０００８】
まず、ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼによって加水分解する方法について説明をする。
かかる蛋白質として、ナタネ種子、その他のナタネの構成成分、ナタネの組織培養物等を直接用いてもよいが、ナタネ種子から油脂を除去した油粕を用いることが加水分解や精製が容易で、しかも食品としては未利用な資源である油粕を有効利用できる点で好ましい。
油脂を除去する方法は特に制限されるものではないが、通常溶剤による抽出、圧搾等により油脂が除去される。
【０００９】
プロテアーゼとしてはズブチリシン、トリプシン、キモトリプシン、パンクレアチン、サーモリシン、ペプシン、パパイン、アルカリプロテアーゼ等が挙げられるがズブチリシン、ペプシンが好ましく、中でもズブチリシンが好ましい。
【００１０】
かかる油粕をプロテアーゼで加水分解するにあたり、油粕を水に分散させてそのまま加水分解を行っても良いが、１Ｍ程度の塩化ナトリウム水溶液で蛋白質を抽出後、必要に応じて透析、膜処理、カラムクロマトグラフィー等によりグリオキシレート等の低分子物質を除く前処理を行うのが、加水分解物からペプチドを精製するのが容易となり好ましい。
加水分解を行うにあたっては、油粕の分散液好ましくは、上記前処理をした抽出蛋白質の水溶液を蛋白質濃度が０．１〜２０重量％となるように調整し、プロテアーゼを蛋白質に対して０．１〜１重量％程度添加して行うのが好ましい。かかる添加量が０．１重量％未満では加水分解が十分行われず、１重量％を超えても収率の向上は望めない。このときプロテアーゼは粉末のまま添加してもよいが、水溶液として添加してもよい。プロテアーゼを添加した後、温度１０〜８５℃程度、好ましくは３０〜６０℃で０．１〜４８時間、好ましくは１〜１０時間加水分解を行う。この時のｐＨも特に制限されず１〜９程度で実施されるが、ズブチリシンの場合は６〜８程度、ペプシンの場合は１〜３で実施するのが好ましい。加水分解開始後は蛋白質の分解率を目安にして反応を行った後、分解液に塩酸等の酸水溶液を添加したり、あるいは煮沸することにより加水分解を停止させる。
【００１１】
上記の加水分解により得られた加水分解液は、本発明の新規ペプチドやその他のペプチドを含む混合物であり、これから本発明のペプチドを精製、単離することによって目的物を得る。但し、実用にあたっては混合物をそのまま用いることも可能である。
該加水分解液から本発明のペプチドを精製するにあたっては、加水分解液をそのままあるいは、加水分解液を遠心分離等の公知の操作で濾過し、その後抽出、濃縮、乾固などを行った後、種々の吸着剤に対する吸着親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あるいは溶解度の差、２種の混ざり合わない液相間における分配の差、分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液からの析出性あるいは析出速度の差などを利用する精製手段を適宜選択して本発明のペプチドを精製するのが好ましく、これらの精製手段は必要に応じて、単独あるいは任意の順序に組合せ、また反覆して適用される。
【００１２】
次に、本発明のペプチドをペプチド合成法で製造する方法について説明する。かかる方法は液相法または固相法で行われ、いずれの場合でもペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とを２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ　ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＨＢＴＵ）等の活性エステルを用いた方法またはカルボジイミドを用いた方法等で縮合させる。
【００１３】
この縮合において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護基としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。
【００１４】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合は更にペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断し、通常の方法に従い精製される。かかる精製については例えば逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法が挙げられる。
合成したペプチドの分析は、エドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、ＬＣ−ＭＳ等の方法で行われる。
【００１５】
かくして得られた本発明の新規なペプチドは、医薬品、機能性をもつ食品等として有用であり、以下医薬品として用いる場合について説明する。
本発明のペプチドの投与経路としては、経口投与、血管内投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。本発明のペプチドの人に対する投与量は、投与方法、患者の症状・年令等により一概に言えないが、通常は１回０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇを１日当たり１〜３回とすることが好ましい。本発明のペプチドは通常、製剤の形で投与される。製剤に用いられる担体や助剤としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００１６】
具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール等が挙げられる。
【００１７】
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用いる時水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００１８】
これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１重量％以上、好ましくは０．５〜７０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００１９】
【実施例】
次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
実施例１
〔ペプチドの製造及び精製〕
ナタネ種子をヘキサンで抽出して油脂を除去した油粕１０ｇを１Ｍの塩化ナトリウム水溶液１００ｍｌに加えた水分散液を充分撹拌し、遠心分離して固形分を沈殿せしめた後、上澄み液を水に対して充分透析後、凍結乾燥して粉末状の蛋白質を得た。次いで得られた蛋白質１ｇを２重量％濃度となるように水に溶解させ、それにズブチリシン（シグマ社製、バシラス　リチェニフォルミス由来、タイプＶＩＩＩ）を、０．０１ｇ添加してｐＨ７．５、３７℃の条件で５時間加水分解を行った。加水分解後１０分間煮沸して加水分解を停止させた。
上記で得られた加水分解液を冷却後、遠心分離して水不溶分を濃縮し、高速液体クロマトグラフィーで精製した。かかる高速液体クロマトグラフィーにおいては、まずＯＤＳ−カラムで阻害活性のあるフラクションを分取して、そのフラクションを更にＣＮ、カラムで精製し、更に５ＰＥ−ＭＳ、５ＮＰＥのカラムで阻害活性フラクションを順次精製し、単一のペプチド０．０１５ｍｇを得た。
気相プロテインシーケンサー（アプライド　バイオシステムズ社製「４９２型」）を用いる自動エドマン分解法を適用して得られたペプチドのアミノ酸配列を分析した結果、下記で示される配列であることが確認された。
Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ
【００２０】
〔ペプチドの化学合成〕
市販のＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）樹脂（置換率０．５ｍｅｑ／ｇ）０．６ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の反応槽に分取し、以下のように新規ペプチドの合成を行った。
まず、上記の樹脂を反応容器に入れて、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｉｌｅと、活性化剤として１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを１０ｍｌの０．４Ｍ　Ｎ−メチルモルフォリンを含むジメチルフォルムアミドに溶解したものを反応槽に加え、室温にて２０分撹拌反応させた。
【００２１】
得られた樹脂を２０容量％ピペリジンを含むジメチルフォルムアミド２０ｍｌ中で、Ｆｍｏｃ基を除去し、ついで上記のＦｍｏｃ−Ｉｌｅをカップリングさせた方法と同様にＣ末端から順次Ｆｍｏｃ−アミノ酸をカップルさせて、Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）樹脂を得た。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（９０容量％トリフルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％エタンジチオール、２容量％エチルメチルスルフィド、１容量％メチルインドールの混合液）中で室温にて１時間撹拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。
【００２２】
ここに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペプチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄して粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ、２０×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒの配列を有するペプチドを得た。尚、本品をプロテインシーケンサー（アプライド　バイオシステムズ社製「４９２型」）により分析して、上記の配列であることを確認した。
【００２３】
（アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定）
上記のペプチドのアンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定を、ＣｈｅｕｎｇＣｕｓｈｍａｎの方法の山本らの改良法〔日本胸部疾患会誌，（１８），１２９７（１９８０）〕に準じて以下の要領で行った。
酵素基質；Ｂｚ（ベンジル）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
酵　素；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製）
最終濃度；１００ｍＭ硼酸、塩化ナトリウム４００ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．３）、　　　　　　上記酵素基質５ｍＭ、酵素３μＵ
【００２４】
上記の最終濃度になるように緩衝液、酵素基質、酵素を混合し、水で全体を２００μｌとした後、３７℃で３０分間反応を行った。反応は１Ｎ−塩酸２００μｌを用いて終了させた。反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れＶｏｒｔｅｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。酢酸エチル層から１．０ｍｌをとり出して、酢酸エチルを留去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し、抽出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（ＯＤ２２８）を測定した。
【００２５】
阻害率はペプチドなしで反応したときのＯＤ２２８を１００％とし、反応時間０分のときのＯＤ２２８を０％として求めた。阻害率５０％の時のペプチドの濃度ＩＣ５０は３０μＭであった。
【００２６】
（血圧降下作用の測定）
２０週齢のＳＨＲ（ｎ＝４）に上記のペプチドを２５μｍｏｌ／ｋｇの割合でゾンデ針を使用して経口投与して、尾動脈部の血圧をｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法にて経時的に測定し、収縮期血圧における最大降圧値を調べた。
その結果、投与後２及び４時間で有意な血圧降下作用〔２時間後：１２．５±２．８７ｍｍＨｇ（Ｐ＜０．０１）、４時間後：９．５±２．５ｍｍＨｇ（Ｐ＜０．０１）〕を示し、６時間でも７ｍｍＨｇの血圧降下が認められ持続性のある血圧降下作用が見られた（表１）。
【００２７】
比較例１
市販のＶａｌ−Ｔｒｐ〔Ｂａｃｈｅｍ社製〕を用いて実施例１と同様に評価した。
その結果、かかるペプチドのＩＣ５０は１．６μＭであった。
また、かかるペプチドを経口投与した場合、投与後２時間で有意な血圧降下作用〔２時間後：１０．７５±２．６９ｍｍＨｇ（Ｐ＜０．０１）〕を示したが、４時間後には７ｍｍＨｇ程度の血圧降下を示して、また６時間後には３．５ｍｍＨｇ程度の血圧降下となり、持続性のある血圧降下作用が見られなかった（表１）。
【００２８】
〔表１〕
2004051529.tif 000002
＊Ｐ＜０．０１：ペプチドを含まない同量の生理食塩水を投与した場合の血圧の変化の平均値（ｎ＝４）に対して有意水準１％で有意性を示した。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の新規ペプチドは、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有し、しかも持続性のある血圧降下作用を示す。