(57)【要約】【課題】認証用途にＤＮＡを使用するには通常のＤＮＡではその安定性（熱、光、ｐＨ等）の点で不充分で実際に使用するには困難である。本発明では、物品認証及び本人認証において重要な、認証用途に適した安定な核酸、特に認証用途に適した安定なＤＮＡを提供するものである。【解決手段】アプタマー構造をとった核酸、チミンダイマーを生成しない配列である核酸、ペプチド核酸及びＺ型ＤＮＡが安定性の点で優れた認証用途に用いることのできる核酸である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定な構造を有する認証用途に用いられる核酸。
【請求項２】
認証用途に用いられる核酸がアプタマーである請求項１記載の核酸。
【請求項３】
前記アプタマーがＤＮＡアプタマーである請求項２記載の核酸。
【請求項４】
認証用途に用いられる核酸がチミンダイマーを生成しないＤＮＡ配列である請求項１記載の核酸。
【請求項５】
認証用途に用いられる核酸がペプチド核酸である請求項１記載の核酸。
【請求項６】
認証用途に用いられる核酸がＺ型ＤＮＡである請求項１記載の核酸。
【請求項７】
合成法で作製した請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸。
【請求項８】
微生物にプラスミドを導入して作製した１〜４のいずれか１項記載の核酸。
【請求項９】
認証用途に用いられる化合物を認識する請求項３記載の核酸。
【請求項１０】
認証用途に用いられる化合物がスルフォローダミンBである請求項９記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は物品および人物等個体の確認をするための、生体情報を用いる認証技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現代世界では、物品の製造においても、芸術品の世界においても、あるいは人物等個体の確認においても、真偽の立証が必要な場面が多く存在している。そのために物品等認証の市場は世界でも急速に増大してきている。物品の製造及び芸術の世界での認証は物品認証技術が必要になり、人物等個体の確認においては、いわゆる本人認証技術が必要とされる。
【０００３】
物品認証が必要なものとしては、クレジットカードや紙幣をはじめとする有価証券、パスポート等政府発行証明書類、ブランド製品やグッズ、飼料等の食品、工業用・科学用・農業用の化学品、医療用機械器具及び医療用品、貴金属製品、玩具・遊戯用具・運動用具、自動車等の乗り物その他移動用の装置及びその部品、芸術作品等幅広い分野の物品がある。
【０００４】
人物等個体の確認が必要なものとは、人、イヌ・ネコ等のペット、家畜やその他の動物、植物がある。
【０００５】
本人認証法としては、ＩＤカード・パスワード・鍵・身分証明書等のような非生体情報による方法と、生体情報を用いた方法に大きく分けられる。生体情報を用いた本人認証法としてはバイオメトリクスがある。バイオメトリクスは自分の体の一部を鍵とすることから、本人しか持ち得ず、ＩＤカード・パスワード・鍵・身分証明書等のように忘れたり紛失したり、他人に偽造・変造・コピーされてしまうということはないという特長がある。バイオメトリクスは人それぞれに固有な生体情報を用いた本人認証法で、利用されるのは生体情報なので、上記の他人による偽造・変造・コピー等は非常に困難で、また、個人保有のものなので忘れたり紛失したりすることはない。バイオメトリクス認証は「身体的特徴もしくは行動様式で人を自動的に認識する」方法で、主に、指紋、掌形、顔、網膜、眼球の虹彩（アイリス）、声、サイン（筆跡）等が用いられている。その他の方法としては、耳形状、キーストローク、手の甲の血管パターン、におい、ＤＮＡがある。
【０００６】
ＤＮＡ認証法は、本人認証及び物品認証に用いることができる。たとえば、真偽を立証したい物品の標識（特許文献１を参照）がある。この他にも関連するものとして、公開鍵暗号方法及びその装置（特許文献２を参照）、遺伝子情報のセキュリティ管理方法及びそのシステムとプログラム（特許文献３を参照）、遺伝子情報利用システム、及びＩＤカード等（特許文献４を参照）がある。このほかに、特許文献５、特許文献６、特許文献７等がある。
【０００７】
具体的には、株式会社アイ・ディ・テクニカは、ＤＮＡの混入したインキ（ＤＮＡインキ）を直径１／８インチの円形の目に見えないマークとして印刷し、発光性化学物質のスペクトラムの特性を読めるマイクロプロセッサーが制御するスキャナー、デコーダーによって認識するシステムを開発している。更に、同社は消費者がインターネット上で物品認証局に真偽鑑定データを問い合わせることにより、消費者が購入する商品の真偽鑑定を行うシステムの構築に関する物品のＤＮＡデータを利用したビジネスモデル特許を出願している（特許文献８を参照）。
【０００８】
ドイツのノーベンバーＡＧ社も、ＤＮＡを用いた真贋判定技術を開発している。これはある配列を持った合成ＤＮＡを、商品に貼付する純正品証書にあらかじめ入れておき、それに対する相補的な配列のプローブＤＮＡを用いて瞬時に鑑別する技術である（特許文献９を参照）。
【０００９】
【特許文献１】特許番号第２７２６８７７号
【００１０】
【特許文献２】特開２００１−２１１１７２
【００１１】
【特許文献３】特開２００２−２１５０２８
【００１２】
【特許文献４】特開２００２−１７５２８０
【００１３】
【特許文献５】ＵＳ５３６０６２８
【００１４】
【特許文献６】ＵＳ５５９９５７８
【００１５】
【特許文献７】ＵＳ５６４３７２８
【００１６】
【特許文献８】特開２００２−１４０４４９
【００１７】
【特許文献９】特表２００２−５０６６５４
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
従来のＤＮＡ認証法では、用いるＤＮＡは、各個人のＤＮＡそのものか、もしくは、そこから認証用途に用いやすいように必要な部分を選別して合成する等して作製したＤＮＡである。しかし、認証用途にＤＮＡを使用するには通常のＤＮＡではその安定性（熱、光、ｐＨ等）の点で不充分で実際に使用するには困難である。本発明では、物品認証及び本人認証において重要な、認証用途に適した安定な核酸、特に認証用途に適した安定なＤＮＡを提供するものである。これまで多くのＤＮＡ認証技術が開発されてきたが、この点に着目した技術は皆無である。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
ＤＮＡ認証技術の用途としては、クレジットカードや紙幣をはじめとする有価証券、パスポート等政府発行証明書類、ブランド製品やグッズ、飼料等の食品、工業用・科学用・農業用の化学品、医療用機械器具及び医療用品、貴金属製品、玩具・遊戯用具・運動用具、自動車等の乗り物その他移動用の装置及びその部品芸術作品等幅広い分野の物品や本人認証に活用できる。本発明者らは、このような数多くの用途に使用するために必要な、ＤＮＡの安定化技術の構築を目指し、鋭意検討を重ねた結果、アプタマー構造をとった核酸、チミンダイマーを生成しない配列である核酸、ペプチド核酸及びＺ型ＤＮＡが、上記目的を満たし得るものであることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
すなわち、本発明は安定な構造を有する認証用途に用いられる核酸に関する。好ましい態様は、前記核酸がアプタマー、特にＤＮＡアプタマーである。別の好ましい態様は、チミンダイマーを生成しない配列のＤＮＡである。また、別の好ましい態様は、ペプチド核酸である。さらに別の好ましい態様は、Ｚ型ＤＮＡである。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳述する。まず、本発明を説明する上で用いられる用語を説明する。
【００２２】
本発明でいう「安定な構造を有する」とは、３７℃の暗室で３ヶ月放置したときに、９５％以上が分解しないで残っていることをいう。「認証用途に用いられる核酸」とは、認証用途に用いられる物質がＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸ということである。「アプタマー」とは、ある分子に特異的に結合する核酸のことで、ＤＮＡとＲＮＡを区別せず「アプタマー」と呼ぶ（「遺伝子化学」（杉本直己、化学同人））。アプタマーは特定の二次構造をとることが多く、「ヘアピン」、「バルジ」、「シュードノット」、「グアニンカルテット」の構造をとることが知られている。「チミンダイマー」とは、紫外線で形成される、ＤＮＡ中の隣り合った、２個のチミン残基又はシトシン残基であるピリミジン塩基間に共有結合で形成されるダイマー分子のことである（ワトソンら、細胞の分子生物学（第３版）ニュートンプレス）。従って、チミンダイマーを生成しない配列である核酸とは、２個のピリミジン塩基が並んだ配列が存在しない核酸配列ということである。  「ペプチド核酸」とは、ペプチド骨格に核酸塩基をもつ分子で、具体的には２−アミノエチルグリシンを骨格単位とし、これにメチレンカルボニル基を介して核酸塩基を結合させた構造をもった化合物である（図１）。コペンハーゲン大学のニールセンらのグループが１９９１年に報告した（ニールセンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１４９７（１９９１）；特許番号第２７５８９８８号）。一般的に、ペプチド核酸は広い範囲のｐＨ域で安定で、核酸分解酵素やタンパク質分解酵素にも安定である。「Ｚ型ＤＮＡ」とは、左巻き二重らせんとして存在するＤＮＡ構造で、リン酸‐糖骨格が左巻きのジグザグ状になっている。DNA分子は常温で中性の水溶液中では、Ｂ型の二重らせん構造をとる。これは生物の体の中に存在する最も一般的な形である。これに対して、Ｚ型はポリ[d(TG）・d(CA)]等のように、プリン・ピリミジン交互の配列をもったＤＮＡ２本鎖を、高塩濃度水溶液中などの右巻きらせんのねじれをほどいてしまうような環境においた時に形成される左巻きのらせん状構造である。
【００２３】
認証用途にＤＮＡを使用するには、従来認証用途に用いられてきたような通常のＤＮＡでは、その安定性（熱、光、ｐＨ等）の点で不充分で実際に使用するには困難である。認証用途に使用可能な、熱、光、ｐＨ等に対して安定な核酸を探索した結果、驚くべきことに、アプタマー、好ましくは、ＤＮＡアプタマー、チミンダイマーを生成しない配列であるＤＮＡ、ペプチド核酸そしてＺ型ＤＮＡが認証用途に用いられる核酸として望ましいことがわかった。
【００２４】
二本鎖ＤＮＡの熱変性については、ＧＣ含量の高い方が安定であると報告されている（マーマーら、Ｎａｔｕｒｅ、１８３：１４２７（１９５９））ので、認証用途に用いる核酸についても、できる限りＧＣ含量が高いことが望ましいといえる。また、ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡよりも、その相補鎖ＤＮＡと水素結合により結合した二本鎖ＤＮＡの方が種々の安定性が高いことが知られているので、認証用途にＤＮＡを使用するにおいても、二本鎖ＤＮＡで使用することが望ましい。
【００２５】
安定性試験は、熱については、３７℃で数ヶ月間、好ましくは1年間安定であることを指標に実施すればよい。あるいは、７０℃で１０分間、好ましくは９０℃で１０分間安定であることを指標に実施すればよい。光については、太陽光及び紫外線照射実験を行い、それに対する安定性を指標に実施すればよい。ｐＨについては、ＤＮＡが一般にアルカリに対して耐性があり、ＲＮＡの場合は酸耐性であることが知られている。従ってＤＮＡの場合は弱酸存在化での安定性を、ＲＮＡの場合は弱アルカリ存在下での安定性を指標に実施すればよい。核酸分解酵素やタンパク質分解酵素にも安定であることと、熱についての安定性を同時に簡便に評価するには、３７℃で３ヶ月間安定であることを見ればよい。
【００２６】
核酸が安定であることの指標としては、ＤＮＡシークエンサーでＤＮＡの塩基配列を分析し、正常に分析できることと、電気泳動分析し、目的の核酸のバンドが単一であることを指標に行う。ＲＮＡの場合は逆転写酵素でＤＮＡに逆転写してからＤＮＡシークエンサーで同様に塩基配列を分析する。
【００２７】
認証用途に用いられる核酸は、ＤＮＡ合成機で合成するかマニュアルで合成することにより行う方法と、遺伝子工学的手法、すなわち、大腸菌等の微生物にプラスミドを導入して作製する方法とがある。この方法では、目的の認証用途に用いられるＤＮＡを含むプラスミドを作製し、微生物へ導入し、微生物を培養することによって、目的のプラスミドを増幅し、適当な制限酵素等で目的のＤＮＡを切出すことによるものである。目的の核酸がＲＮＡの場合は、まず、上述の通りＤＮＡを作製し、そのＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡに返還することにより得られる。
【００２８】
このように認証用途に用いられる核酸の安定性を評価して、過酷な条件下でも使用可能な安定な認証用核酸を見出すことができる。
【００２９】
このようにして、アプタマー、好ましくは、ＤＮＡアプタマー、チミンダイマーを生成しない配列であるＤＮＡ、ペプチド核酸そしてＺ型ＤＮＡが認証用途に用いられる核酸として望ましい。
【００３０】
なお、これら認証用途に用いられる核酸の配列の長さに関して、ペプチド核酸の場合、ペプチドモノマーを使用して合成できるが、純度、品質、収量の点から、１８mer以下が好ましい。アプタマー、チミンダイマーを生成しない配列であるＤＮＡ、ペプチド核酸そしてＺ型ＤＮＡの場合では、より良い安定性の点から、１５０mer以下が好ましい。
【００３１】
上記の核酸を、クレジットカードや紙幣をはじめとする有価証券、パスポート等政府発行証明書類、ブランド製品やグッズ、飼料等の食品、工業用・科学用・農業用の化学品、医療用機械器具及び医療用品、貴金属製品、玩具・遊戯用具・運動用具、自動車等の乗り物その他移動用の装置及びその部品芸術作品等幅広い分野の物品にシールするかまたは素材に練り込むことにより認証用途に用いることができる。具体的には、上記の核酸そのものを用いた場合には、核酸の配列を同定することにより認証できるし、上記の核酸に蛍光ラベル等の標識をした場合は、その標識を検出することでも認証できる。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明における認証用核酸についてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００３３】
（実施例１）
文献（ウイルソンら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：６０９（１９９８））に従い、色素であるスルフォローダミンＢを認識できるＤＮＡアプタマーである配列１のＤＮＡをＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル３９４）を用いて合成した。配列２のＤＮＡは、配列１のＤＮＡのアデニン、グアニン、シトシン、チミンの塩基をそれぞれの塩基の総数と同じにして全くランダムに配置したものである。配列１及び配列２は、１回のＤＮＡ合成では難しい長鎖のＤＮＡであるので、４本の合成ＤＮＡの酵素的連結によるＤＮＡの合成方法（大塚ら、新生化学実験講座２．核酸III、東京化学同人）を用いて二本鎖ＤＮＡを作製後、一本鎖に分離して作製した。配列１、配列２のＤＮＡを作製後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５)、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸三ナトリウム）に溶解し、３７℃で３ヶ月間処理した群（Ａ群）と２０℃で１０分間処理した対照群（Ｂ群）について、ＤＮＡシークエンサーでＤＮＡの塩基配列の分析と電気泳動分析を行い、核酸分解酵素やタンパク質分解酵素に対する安定性及び熱についての安定性を評価した。結果は、Ｂ群が配列１及び配列２共に、塩基配列分析では正常に分析ができ、正常な塩基配列が得られた。電気泳動分析での判定は、単一のバンドが得られた。一方、Ａ群では、配列１については、Ｂ群と同様の結果が得られたのに対して、配列２では、塩基配列分析では複数の配列が混在しており、しかも目的の配列は収量的にも低下していた。また、電気泳動分析でも、目的のバンドの他に低分子化した複数のバンドが認められた。これらのことより、配列２に対して、配列１は、ＤＮＡだけを分解するデオキシリボヌクレアーゼ、ＲＮＡだけを分解するリボヌクレアーゼ及びＤＮＡ、ＲＮＡ両方を分解するヌクレアーゼからなる核酸分解酵素や、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素であるセリンプロテアーゼ等のタンパク質分解酵素に対する安定性及び熱についての安定性を有しており、認証用途に用いる核酸として望ましいことがわかった。
【００３４】
（実施例２）
文献（ニールセンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１４９７（１９９１）；ニールセンら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１：１９７（１９９３）；チェルニーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１６６７（１９９３））に従い、ペプチド合成機を用い、Ｆｍｏｃ法にて、ペプチド核酸モノマー（ＰＮＡ  Ｆｍｏｃ−Ａ−ＯＨ、ＰＮＡ  Ｆｍｏｃ−Ｃ−ＯＨ、ＰＮＡ  Ｆｍｏｃ−Ｇ−ＯＨ、ＰＮＡ  Ｆｍｏｃ−Ｔ−ＯＨ；アプライドバイオシステムズ社）を用い配列３のペプチド核酸を合成した。配列３のペプチド核酸の対照となるＤＮＡである配列４はＤＮＡ合成機で合成作製した。
【００３５】
配列３、配列４を作製後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸三ナトリウム）に溶解し、３７℃で３ヶ月間処理した群（Ａ群）と２０℃で１０分間処理した対照群（Ｂ群）について、電気泳動分析で判定したところ、Ｂ群については、配列３、配列４共に、単一のバンドが得られた。一方、Ａ群では、配列３については、Ｂ群と同様に単一のバンドが得られたのに対して、配列４では、電気泳動分析で、目的のバンドの他に低分子化した複数のバンドが認められた。これらのことより、配列４に対して、配列３は、核酸分解酵素やタンパク質分解酵素に対する安定性及び熱についての安定性を有しており、認証用途に用いる核酸として望ましいことがわかった。
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、アプタマー構造をとった核酸、チミンダイマーを生成しない配列である核酸、ペプチド核酸及びＺ型ＤＮＡを用いて、物品認証及び本人認証において重要な、認証用途に適した安定な核酸を提供できる。
【００３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ペプチド核酸の構造を示した図である。
【図１】
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