(57)【要約】【課題】　検体の検査において、特に手作業で行われることが多い検体採取、検体処理、測定（反応）系へ検体導入および検体の希釈などの前処理工程全般を簡素化し、大型自動化装置およびＰＯＣＴ対応装置を用いた検査の操作性を向上し得る技術を提供する。【解決手段】　検体を定量的に採取して一時的に保持し得る第１の領域、および前記第１の領域を運動させるために外部から力学的作用を受ける第２の領域を有することを特徴とする検体用サンプリング素子。【選択図】図１
2004144739.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　検体を定量的に採取して一時的に保持し得る第１の領域、および前記第１の領域を運動させるために外部から力学的作用を受ける第２の領域を有することを特徴とする検体用サンプリング素子。
【請求項２】
　前記第１の領域が毛細管現象により前記検体を保持することを特徴とする請求項１記載の検体用サンプリング素子。
【請求項３】
　前記力学的作用が磁場の変化によるものであることを特徴とする請求項１記載の検体用サンプリング素子。
【請求項４】
　前記第２の領域の運動により前記第１の領域が前記検体を放出することを特徴とする請求項１記載の検体用サンプリング素子。
【請求項５】
　前記検体に含まれる物質と反応する試薬ａ1および／または前記検体に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ1を保持していることを特徴とする請求項１記載の検体用サンプリング素子。
【請求項６】
　前記試薬ａ1が、酵素、抗原、抗体、レセプターまたは核酸であることを特徴とする請求項５記載の検体用サンプリング素子。
【請求項７】
　前記物質が、蛋白質、ホルモン、抗体、酵素、抗原または核酸であることを特徴とする請求項５記載の検体用サンプリング素子。
【請求項８】
　前記試薬ｂ1が、無機塩または界面活性剤であることを特徴とする請求項５記載の検体用サンプリング素子。
【請求項９】
　前記細胞が、赤血球、白血球または血小板であることを特徴とする請求項５記載の検体用サンプリング素子。
【請求項１０】
　前記試薬ｂ1により破壊された前記細胞から放出される成分が、蛋白質、糖化蛋白質、リン酸化蛋白質、ホルモン、脂質、抗体、酵素、抗原、レセプター、インヒビター、ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項５記載の検体用サンプリング素子。
【請求項１１】
　検体を定量的に採取して一時的に保持し得る第１の領域、および前記第１の領域を運動させるために外部から力学的作用を受ける第２の領域を有する検体用サンプリング素子と、
　前記サンプリング素子が導入される反応セルと、
　前記反応セル内において前記サンプリング素子に力学的作用を与える手段と、
　前記反応セル内の反応を測定するための光学測定系とを具備することを特徴とする検体処理装置。
【請求項１２】
　前記力学的作用を与える手段が、前記サンプリング素子に磁力により力学的作用を与える磁場変化装置であることを特徴とする請求項１１記載の検体処理装置。
【請求項１３】
　前記光学測定系が、光散乱分光光度計、蛍光分光光度計、吸光分光光度計または発光分光光度計であることを特徴とする請求項１１記載の検体処理装置。
【請求項１４】
（ａ）検体を定量的に採取して一時的に保持し得る第１の領域、および前記第１の領域を運動させるために外部から力学的作用を受ける第２の領域を有する検体用サンプリング素子に、検体を定量的に採取して保持させる工程と、
（ｂ）前記検体を保持した前記サンプリング素子を反応系に導入する工程と、
（ｃ）前記反応系外からの力学的作用により、前記サンプリング素子を運動させ、前記サンプリング素子から前記検体を放出させるとともに、攪拌しながら前記検体を前記反応系に混合する工程とを含むことを特徴とする検体処理方法。
【請求項１５】
前記工程（ａ）の前に、前記サンプリング素子に前記検体に含まれる物質と反応する試薬ａ1および／または前記検体に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ1を担持させることを特徴とする請求項１４記載の検体処理方法。
【請求項１６】
　前記試薬ａ1が、酵素、抗原、抗体、レセプターまたは核酸であることを特徴とする請求項１５記載の検体処理方法。
【請求項１７】
　前記物質が、蛋白質、ホルモン、抗体、酵素、抗原または核酸であることを特徴とする請求項１５記載の検体処理方法。
【請求項１８】
　前記試薬ｂ1が、無機塩または界面活性剤であることを特徴とする請求項１５記載の検体処理方法。
【請求項１９】
　前記細胞が、赤血球、白血球または血小板であることを特徴とする請求項１５記載の検体処理方法。
【請求項２０】
　前記試薬ｂ1により破壊された前記細胞から放出される成分が、蛋白質、糖化蛋白質、リン酸化蛋白質、ホルモン、脂質、抗体、酵素、抗原、レセプター、インヒビター、ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１５記載の検体処理方法。
【請求項２１】
　前記反応系が、緩衝液、前記検体に含まれる物質と反応する試薬ａ2を含む溶液、または前記検体に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ2を含む溶液であることを特徴とする請求項１４記載の検体処理方法。
【請求項２２】
　前記工程（ｃ）において、攪拌しながら前記検体を前記反応系に混合すると同時に、前記試薬ａ2が前記検体に含まれる物質と反応すること、および／または前記試薬ｂ2が前記検体に含まれる細胞を破壊することを特徴とする請求項１４記載の検体処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、検体に含まれる物質を分析するにあたって前記検体を簡易に処理するための素子、および前記素子を用いた検体処理方法に関する。したがって、本発明は主として臨床検査分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
　近年、分析技術、解析技術および検査技術の進歩により、様々な物質を測定することが可能となってきている。特に臨床検査分野においては、生化学反応、酵素反応または免疫反応などの特異反応に基づく測定原理の開発により、病態に反映する体液中の物質を測定できるようになった。これに追随し、より多くの検体についてより多くの項目を測定し得ること（多検体多項目測定）を目的として、様々な大型自動化装置も開発されてきた。かかる自動化装置によれば、装置を構成する部品の性能の向上に加え、その装置において用いられる反応試薬の性能の向上により、高感度で高精度の測定が可能である。
【０００３】
　現在では、例えば総合病院などの大きな病院の中央臨床検査センターが大型自動化装置を所有しており、ここで、日々送られてくる多種多様な検体が検査されている。一般的に、自動化装置で測定される検体は前処理を施され、さらに必要ならば希釈操作などを行われ、その後に測定が開始される。例えば、血液の場合であれば、血球と血漿とを分離する前処理が行われる。したがって、中央臨床検査センターの検査装置使用者には必要最低限の専門性が要求される。
【０００４】
　一方、昨今においては、ポイント・オブ・ケア・テスティング（ＰＯＣＴ）と呼ばれる臨床検査分野が注目されている。ＰＯＣＴは、上述した中央臨床検査センターで行われる検査に相反する考え方に基づき、検体を採取してから検査結果が出るまでの時間を短縮させ、簡易で迅速な測定を第１の目的としている。したがって、ＰＯＣＴには、簡易な測定原理、ならびに小型で携帯性および操作性に優れた測定装置が要求される。近年の技術開発の進歩により、例えば血糖センサに代表されるように、簡単に測定できる小型の測定機器が開発されている。
【０００５】
　また、ＰＯＣＴの効果としては、迅速な測定結果の取得による迅速で正確な診断を可能とすることに加え、検査にかかるコストの低減、血液などの検体の少量化に伴う被検者の負担の軽減、および感染性廃棄物の少量化などが考えられる。現在、臨床検査はＰＯＣＴへの移行が急速に起こっており、そのニーズに応える形で、ＰＯＣＴに対応する測定機器の開発が行なわれている。
【０００６】
　ＰＯＣＴに対応する測定機器としては、上述した血糖センサに代表される酵素電極反応を利用した酵素センサの他に、妊娠診断薬に代表される免疫抗原抗体反応を利用した定性免疫センサなどがある。最近では定量免疫センサも開発されて商品化されつつある。いずれも、簡易測定原理の構築と、それに伴う生体成分の固相化技術、センサデバイス化技術およびセンサシステム化技術の進歩とによるものである。さらには、上述した中央臨床検査センターが所有する大型自動化装置の小型化技術の開発も行なわれつつある。
【０００７】
　ところで検体の検査は、一般的に、（１）検体採取、（２）検体処理、（３）測定（反応）系へ検体導入、（４）検体の希釈、（５）試薬導入、（６）反応、（７）未反応物除去、（８）検出、および（９）検体中の物質の測定の９つの工程によってなされる。また、大型自動化装置においては、主として（３）〜（９）の工程が自動化されており、多検体多項目測定が可能である。
【０００８】
　しかし、（１）および（２）の工程、例えば、血液からの血球分離操作、夾雑物除去などの工程は自動化されていない。したがって、これらの工程が検査時間の大部分を占め、迅速な結果を得るのに障害となっていた。さらに、検体処理に関する専門性を必要とし、誰もが行える操作ではなかった。また、高濃度蛋白質が含まれる検体において必要となる希釈操作については、一部で自動化されている機器があるものの、一方で装置の構成も複雑になり、ＰＯＣＴで使用されるにはコストが高い。さらに、今後、臨床検査の重要な位置付けとなるＰＯＣＴを意識して、μ−ＴＡＳ等の技術により大型自動化装置が小型化されたとしても、検体前処理工程で問題が生じることが予想される。
【０００９】
　一方、例えば血糖センサなどのＰＯＣＴ対応装置は、（２）の工程を必要とせず、（１）の工程の後に検体がセンサデバイスに流れ込む過程において、（３）〜（８）の工程が短時間で行われる。妊娠診断薬の場合も同様である。しかし、ＰＯＣＴ対応装置のすべてがこのようなセンサシステムを取り得るとは限らず、やはり、（１）および（２）、時には（３）および（４）の工程において、手動による操作が要求されるものが多く問題であった。すなわち、現状のＰＯＣＴ対応装置のほとんどは、（４）〜（９）の工程のみを簡易化して実施するにすぎない（例えば特許文献１）。
【特許文献１】特開平６−１６０３８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
　以上の従来技術に鑑み、本発明は、あらゆる自動化小型装置またはＰＯＣＴ対応装置に適用できるもので、（１）〜（３）、（４）または（５）の工程を簡易に操作性良く行うことのできる検体用サンプリング素子、ならびにこれを使用した検体処理装置および検体処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
　本発明は、上記の目的を実現するために、検体を定量的に採取して一時的に保持し得る第１の領域、および前記第１の領域を運動させるために外部から力学的作用を受ける第２の領域を有することを特徴とする検体用サンプリング素子を提供する。
【００１２】
　前記第１の領域が毛細管現象により前記検体を保持することが有効である。
　また、前記力学的作用が磁場の変化によるものであることが有効である。
　また、前記第２の領域の運動により前記第１の領域が前記検体を放出することが有効である。
【００１３】
　前記検体用サンプリング素子は、前記検体に含まれる物質と反応する試薬ａ1および／または前記検体に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ1を保持していることが有効である。
　前記試薬ａ1は、酵素、抗原、抗体、レセプターまたは核酸であることが有効である。
【００１４】
　また、前記物質は、蛋白質、ホルモン、抗体、酵素、抗原または核酸であることが有効である。
　前記試薬ｂ1は、無機塩または界面活性剤であることが有効である。
【００１５】
　また、前記細胞は、赤血球、白血球または血小板であることが有効である。
　前記試薬ｂ1により破壊された前記細胞から放出される成分が、蛋白質、糖化蛋白質、リン酸化蛋白質、ホルモン、脂質、抗体、酵素、抗原、レセプター、インヒビター、ＤＮＡまたはＲＮＡであることが有効である。
【００１６】
　また、本発明は、検体を定量的に採取して一時的に保持し得る第１の領域、および前記第１の領域を運動させるために外部から力学的作用を受ける第２の領域を有する検体用サンプリング素子と、前記サンプリング素子が導入される反応セルと、前記反応セル内において前記サンプリング素子に力学的作用を与える手段と、前記反応セル内の反応を測定するための光学測定系とを具備することを特徴とする検体処理装置を提供する。
【００１７】
　この検体処理装置においては、前記力学的作用を与える手段が、前記サンプリング素子に磁力により力学的作用を与える磁場変化装置であることが有効である。
　また、前記光学測定系が、光散乱分光光度計、蛍光分光光度計、吸光分光光度計または発光分光光度計であることが有効である。
【００１８】
　さらに、本発明は、（ａ）検体を定量的に採取して一時的に保持し得る第１の領域、および前記第１の領域を運動させるために外部から力学的作用を受ける第２の領域を有する検体用サンプリング素子に、検体を定量的に採取して保持させる工程と、（ｂ）前記検体を保持した前記サンプリング素子を反応系に導入する工程と、（ｃ）前記反応系外からの力学的作用により、前記サンプリング素子を運動させ、前記サンプリング素子から前記検体を放出させるとともに、攪拌しながら前記検体を前記反応系に均一に混合する工程とを含むことを特徴とする検体処理方法をも提供する。
【００１９】
　前記工程（ａ）の前に、前記サンプリング素子に前記検体に含まれる物質と反応する試薬ａ1および／または前記検体に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ1を担持させることが有効である。
　また、本検体処理方法においても、前記試薬ａ1が、酵素、抗原、抗体、レセプターまたは核酸であることが有効である。
【００２０】
　また、前記物質は、蛋白質、ホルモン、抗体、酵素、抗原または核酸であることが有効である。
　前記試薬ｂ1は、無機塩または界面活性剤であることが有効である。
　前記細胞は、赤血球、白血球または血小板であることが有効である。
　前記試薬ｂ1により破壊された前記細胞から放出される成分は、蛋白質、糖化蛋白質、リン酸化蛋白質、ホルモン、脂質、抗体、酵素、抗原、レセプター、インヒビター、ＤＮＡまたはＲＮＡであることが有効である。
【００２１】
　さらに、前記反応系が、緩衝液、前記検体に含まれる物質と反応する試薬ａ2を含む溶液、または前記検体に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ2を含む溶液を具備することが有効である。
　前記工程（ｃ）において、前記検体と前記反応系とを攪拌しながら均一に混合すると同時に、前記試薬ａ2が前記検体に含まれる物質と反応すること、および／または前記試薬ｂ2が前記検体に含まれる細胞を破壊することが有効である。
【発明の効果】
【００２２】
　本発明に係るサンプリング素子、ならびにこれを用いる検体処理装置および検体処理方法によれば、分析、解析および検査における検体のサンプリングとその前処理を簡易に行うことができ、さらに簡易で迅速な測定を行うＰＯＣＴ対応装置の開発に貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
　本発明に係る検体用サンプリング素子は、検体を定量的に採取して一時的に保持し得る第１の領域、および前記第１の領域を運動させるために外部から力学的作用を受ける第２の領域を有することを特徴とする。そして、前記第１の領域は毛細管現象により前記検体を保持することができ、前記力学的作用は磁場の変化によるものであることが有効である。
【００２４】
　したがって、本発明に係る検体用サンプリング素子の具体的な態様としては、例えば、検体を定量的に採取して保持し得る毛細管、および前記毛細管に接して設けられた第１の磁性体を具備する。すなわち、この場合、前記第１の領域が毛細管に相当するとともに、前記第２の領域が第１の磁性体に相当し、本発明に係る検体用サンプリング素子は、毛細管および磁性体（材料）で構成される点に特徴を有する。
【００２５】
　この検体用サンプリング素子を用いれば、後述するが、例えば外部から磁場を利用した力学的作用により第２の磁性体を運動させることによって、前記第１の磁性体とともに前記毛細管を運動させ、遠心力等によって前記検体を前記毛細管から放出し、攪拌しながら前記検体を前記毛細管の外部の液系に混合することができる。
【００２６】
　ここで、毛細管とは、毛管またはキャピラリーともいい、毛細管現象が現れる程度の太さを有する細い管、または、２枚以上の平板などを毛細管現象が現れる程度の隙間をもつように積層させて得られる複合体などのことをいう。例えば、細い繊維を撚り合わして得られた糸を縦糸および横糸として用い、これらを織り上げて得られる布なども、毛細管現象が現れる程度に繊維同士または糸同士の間に隙間をもたせれば、毛細管として用いることができる。いずれにおいても、毛細管現象がみられるものを総称して毛細管という。
【００２７】
　つぎに、毛細管現象とは、固体と液体とが界面において平衡状態に達した後、これらがある形またはある面積をもつ現象のことをいい、液体の表面張力、液体に対する固体の濡れやすさ、および毛細管の直径の３つの要因が関係している。これら３つの要因と毛細管現象との関係を、水がガラス管内を上昇する現象を例にして簡単に説明する。水分子間には分子間力（凝集力）が働いているが、水面の水分子は空気に接しているため、水の中へ向かう方向にだけ引っ張られている。この水面に働いている力を表面張力といい、一般に水の表面が丸くなっているのはこのためである。
【００２８】
　このような状態の水に細いガラス管などの毛細管を垂直にしてつけると、水分子に働く分子間力（凝集力）よりもガラス管と水分子との間に働く力（付着力および濡れ易さ）の方が大きいため、水はガラス管の壁に引き寄せられてせり上がり、前記付着力と上昇した水の重さとがつり合う位置まで水は上へ移動する。その際、ガラス管が細いほど上昇すべき水の重さが軽いため、付着力とつり合うように水はより高い位置まで移動する。したがって、毛細管を構成する材料としては、親水性を有するものであればよい。
【００２９】
　濡れやすさの尺度は、例えば、毛細管を構成する材料と同じ材料からなる平板などに水を垂らし、その広がりの程度を調べることにより簡易に知ることができる。すなわち、広がりが大きいほどその材料は濡れ易いといえる。具体的には、ガラス、石英または鉄などが挙げられ、いずれも毛細管を構成し得る。本発明における毛細管に要求される機能は、検体を毛細管内に定量的に採取して導入し、かつ保持することにある。すなわち、検体の多種多様な分析を行うまでの一連の操作において、サンプリングすることである。
【００３０】
　一方、磁性体とは、磁場において磁化する性質（磁性）を有する物質であって、物質そのものが有する磁場と相互作用する物質をいう。すべての物質は、磁場に対してなんらかの反応を示し、磁場方向に強くひきつけられる強磁性体、弱くひきつけられる常磁性体、弱い反発を示す反磁性体などに区別される。本発明でいう磁性体とは、特に、強磁性体、または常磁性体をいい、例えば、磁石にひきつけられる鉄などの金属材料を示す。ここで、本発明における第１の磁性体と第２の磁性体とは、相互にひきつけ合う性質を有する。
【００３１】
　特に、第１の磁性体に必要な機能は、磁石などの第２の磁性体にひきつけられることに加えて、第２の磁性体の動きに応じてなんらかの運動をすることである。例えば、両者は、第２の磁性体が回転運動をすれば第１の磁性体も回転運動をし、第２の磁性体が振幅運動をすれば第１の磁性体も振幅運動し、または、第２の磁性体が回転運動をすれば第１の磁性体も単振動をすることができる関係にあることが必要である。したがって、第１の磁性体は第２の磁性体によって運動させられる程度の重量および寸法などを有する必要がある。
【００３２】
　本発明に係るサンプリング素子は、毛細管と第１の磁性体とが一体化して形成されている。したがって、第１の磁性体の運動によって毛細管そのものも運動することになる。両者を一体化させる方法としては、例えば、毛細管と第１の磁性体とをテープなどの粘着性材料で巻き付ける方法、毛細管と第１の磁性体とを例えばテフロンなどのフッ素樹脂製のフィルムなどの材料で包み込む方法、毛細管そのものを磁性を有する材料で形成する方法などが挙げられる。いずれにしても、第１の磁性体の運動により第１の磁性体から毛細管がはずれずに共に運動し得るように一体化されていることが重要であり、一体化の形態にはこれらに限定されるものではない。
【００３３】
　ここで、図１は、本発明に係るサンプリング素子の概略斜視図である。図１に示すように、本発明に係るサンプリング素子１は、毛細管１１と第１の磁性体１２とが、例えば粘着性テープ１３により一体化されて構成されている。なお、参考のために、図２に、図１の矢印Ｘの方向から見たサンプリング素子を示し、図３に、図１の矢印Ｙの方向から見たサンプリング素子を示した。
【００３４】
　さらに、このように構成された本発明に係るサンプリング素子には、第１の試薬が担持されていてもよい。担持の形態としては、例えば、第１の磁性体にさらに第２の毛細管を一体化させ、この第２の毛細管に溶液状態または乾燥状態の第１の試薬を担持させておく方法、サンプリング素子に器状部分を形成し、当該部分の中に第１の試薬を乾燥状態で担持させておく方法、または、第１の試薬を含浸・担持させたガラス繊維濾紙もしくはセルロース性濾紙などのキャリアをサンプリング素子に一体化させておく方法などが挙げられる。いずれにしても、第１の試薬が零れ落ちないように担持されており、第１の試薬の担持されている領域が密封状態になく、外部に曝露されていることが必要である。
【００３５】
　ここで、図４は、本発明に係る別のサンプリング素子の概略斜視図である。図４に示すように、本発明に係るサンプリング素子１は、毛細管２１と第１の磁性体２２とが、例えば粘着性テープ２４により一体化されて構成されている。さらに、毛細管２１と第１の磁性体２２と間には、第１の試薬を含浸・担持したガラス繊維濾紙２３が一体的に保持されている。なお、参考のために、図５に、図４の矢印Ｘの方向から見たサンプリング素子を示し、図６に、図４の矢印Ｙの方向から見たサンプリング素子を示した。
【００３６】
　担持させる第１の試薬としては、検体に含まれる物質と反応する試薬ａ1が挙げられ、例えば、酵素、抗原、抗体、レセプターまたは核酸などがある。
　酵素としては、例えばグルコースオキシダーゼなどが挙げられ、これは検体中のグルコースと特異的に反応する。
　抗原としては、主として検体中に存在する抗体と特異的に反応する蛋白質などが挙げられる。なお、検体中に存在する抗体とは、例えばＨＣＶ抗体、またはＨＩＶ抗体などがある。
【００３７】
　抗体としては、例えば、ポリクロナール抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ）２抗体、またはＦｖ抗体などが挙げられ、前記検体中に存在する抗原から作製することができる。なお、検体中に存在する抗原とは、蛋白質、糖化蛋白質、リン酸化蛋白質またはハプテンなどである。
　レセプターとしては、例えば検体中に含まれるステロイド、甲状腺ホルモン、ビタミン、ペプチドホルモン、増殖因子、サイトカインまたはカテコールアミンなどの生理活性物質と特異的に反応するものが挙げられる。
　また、核酸としては、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの遺伝子となり得るものが挙げられる。
【００３８】
　したがって、前記検体に含まれる物質とは、蛋白質、ホルモン、抗体、酵素、抗原または核酸などである。
　蛋白質としては、アルブミン、グロブリン、ミオグロビン、プロラミン、グルテリン、ヒストンおよびプロタミンなどの２０種類のアミノ酸の少なくとも１種のみで構成される蛋白質、感染症マーカーのＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、腫瘍マーカーの癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、グリコアルブミンなどの糖と蛋白質との複合体であるすべての糖化蛋白質、蛋白質のセリン、トレオニン、チロシン残基のヒドロキシル基にリン酸がエステル結合して得られるすべてのリン酸化蛋白質、ならびに高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）および低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）などの脂質と蛋白質の複合体であるすべてのリポ蛋白質などが挙げられる。
【００３９】
　ホルモンとしては、ヒト絨毛性ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、サイロキシン（Ｔ４）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、およびインスリンなどが挙げられる。
　酵素としては、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、アルカリフォスフォターゼ（ＡＬＰ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、γ−グルタミールトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、酸性フォスフォターゼ（ＡＣＰ）、および前立腺酸性フォスフォターゼ（ＰＡＰ）などが挙げられる。
　抗体としては、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ抗体および免疫グロブリン（ＩｇＥ）などが挙げられ、抗原としては、ウィルスおよび細菌などが挙げられる。
　また、核酸としては、ＳＮＰＳ、ＤＮＡおよびＲＮＡなどが挙げられる。
【００４０】
　また、担持される第１の試薬は、検体に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ1でもよい。かかる試薬ｂ1としては、例えば無機塩または界面活性剤などが挙げられる。無機塩は、細胞内外の浸透圧を変化させ、細胞を収縮または膨張させることで細胞破壊を促す。一方、界面活性剤は、細胞成分である蛋白質の親水性と疎水性のバランスを崩すことにより細胞破壊を促す。
　かかる無機塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、フッ化ナトリウム、チオシアン化ナトリウム、およびチオシアン化カリウムなどが挙げられ、界面活性剤としては、例えば、スクロースモノラウレート、オレイン酸ナトリウム、およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などが挙げられる。
【００４１】
　また、試薬ｂ1によって破壊される細胞としては、例えば、血液中の赤血球、白血球、および血小板などが挙げられる。この場合、赤血球、白血球または血小板内部の物質を細胞外の液系に混合または溶解させることを目的とする。
　破壊された細胞から放出される成分としては、例えば、蛋白質、糖化蛋白質、リン酸化蛋白質、ホルモン、脂質、抗体、酵素、抗原、レセプター、インヒビター、ＤＮＡ、およびＲＮＡなどが挙げられる。
【００４２】
　さらに、本発明に係るサンプリング素子には、検体に含まれる物質と反応する試薬ａ1と検体に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ1が同時に担持されていてもよい。この際、前記検体に含まれる物質と反応する試薬ａ1と検体に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ1とが互いに影響を及ぼさないものでなければならないが、これらの組合せは、本発明の効果を損なわない範囲で当業者であれば適宜選択することができる。
【００４３】
　ここで、本発明に係るサンプリング素子の使用目的は、簡易かつ迅速に検体をサンプリングし、簡易かつ迅速に検体を反応系（液系）中などに放出させることにある。したがって、本発明は、前記サンプリング素子を用いた検体処理装置および検体処理方法にも関する。ここでいう検体処理方法とは、検体を所定の液系に混合したり、溶解したり、希釈したりすることも含まれる。
【００４４】
　本発明に係る検体処理装置は、前記検体用サンプリング素子と、前記サンプリング素子が導入される反応セルと、前記反応セル内において前記サンプリング素子に力学的作用を与える手段と、前記反応セル内の反応を測定するための光学測定系とを具備することを特徴とする。
【００４５】
　前記力学的作用を与える手段は、前記サンプリング素子に磁力により力学的作用を与える磁場変化装置であればよく、例えば後述するマグネティック・スターラーを用いることができる。
　また、前記光学測定系には、光散乱分光光度計、蛍光分光光度計、吸光分光光度計または発光分光光度計を用いればよい。
【００４６】
　また、本発明に係る検体用サンプリング素子を用いた検体処理方法は、上記検体処理装置によって実施することができ、具体的には、（ａ）検体を定量的に採取して一時的に保持し得る第１の領域、および前記第１の領域を運動させるために外部から力学的作用を受ける第２の領域を有する検体用サンプリング素子に、検体を定量的に採取して保持させる工程と、（ｂ）前記検体を保持した前記サンプリング素子を反応系に導入する工程と、（ｃ）前記反応系外からの力学的作用により、前記サンプリング素子を運動させ、前記サンプリング素子から前記検体を放出させるとともに、前記検体と前記反応系とを攪拌しながら均一に混合する工程とを含む。
【００４７】
　前記工程（ａ）の前に、前記サンプリング素子に前記検体に含まれる物質と反応する試薬ａ1および／または前記検体に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ1を担持させることが好ましい。
　また、前記工程（ｃ）においては、前記検体と前記反応系とを攪拌しながら均一に混合すると同時に、前記試薬ａ2を前記検体に含まれる物質と反応させ、および／または前記試薬ｂ2によって前記検体に含まれる細胞を破壊することができる。
【００４８】
　ここで、有機合成反応および固体の溶解の際に用いる攪拌バー（スターラー・バー）にガラス製毛細管（ガラス管）を一体化してなるサンプリング素子を用いた場合に代表させて、本発明に係る検体処理方法を説明する。
　まず、ガラス管内に検体を定量的に上昇および保持（サンプリング）させて、サンプリング素子を対象となる液系（反応系）に接触させる（好ましくは浸す）。
【００４９】
　つぎに、例えばマグネティック・スターラーという装置を用いて、液系外から液系内の攪拌バー（第１の磁性体）を回転運動させる。この回転運動によりガラス管内に保持された検体を液系内に放出させ、さらに前記検体と液とを均一に混合または溶解させるのである。なお、スターラーには第２の磁性体が含まれている。
　ガラス管と攪拌バーとは一体となっているため、攪拌バーが回転運動をすることによりガラス管も一体となって回転運動する。そのため、ガラス管に保持された検体は、遠心力により液中に放出され、さらに、攪拌により均一に混合されるのである。
【００５０】
　なお、サンプリング素子の形状は棒状に限らず、液内で液外の第２の磁性体（例えば磁石）の運動に伴って運動でき、検体が放出されて液全体と均一に混合、攪拌される程度の重量および寸法を有すればよい。また、液系外からの第２の磁性体の運動は、上述のようなスターラーの回転運動に限らず、例えば、振幅運動または単振動であってもよい。重要なのは液に効率よくサンプリング素子に保持された検体を放出させ、さらに液と均一に混合させる運動を行わせる点にある。
【００５１】
　したがって、本発明に係るサンプリング素子は、「検体サンプリング機能」、「検体を液中に放出する放出機能」および「検体を液と均一に混合させる均一化機能」という３つの重要な機能を有する。サンプリングとは、毛細管現象を利用して毛細管内へ検体を定量的に採取、保持させることをいい、放出とは、毛細管内に保持された検体を液中に放出させることをいう。また、均一化とは、検体と液が均一に混合され、検体に含まれる物質が、得られる混合物中のあらゆる部分で一定の濃度で存在することをいう。
【００５２】
　また、本発明に係る検体処理方法は、サンプリング素子の毛細管に検体が毛細管現象により定量的に注入される工程、液中において検体が注入された前記サンプリング素子を液系外から磁力により運動させる工程、前記運動中において前記毛細管内の検体が液中に均一に混合される工程を含むことを特徴とする検体均一混合方法であるとも言える。
　本発明の検体処理方法を用いることで、検体中に含まれる物質を簡易に希釈することができる。例えば、血液中の赤血球内に高濃度に存在するヘモグロビンを前記方法により簡易に希釈することができる。さらに、液中に検体中の物質と反応する試薬が含まれていれば、検体均一溶解の後、直ちに検体中の物質を分析するための反応を行うことができる。
【００５３】
　ここで、本発明に係る検体処理方法において用いる液とは、緩衝液、検体中に含まれる物質と反応する試薬ａ2を含む溶液、または、検体中に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ2を含む溶液を含み得る。
　緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、または炭酸緩衝液などが挙げられる。
　また、検体中に含まれる物質と反応する試薬ａ2としては、上述した検体中に含まれる物質と反応する試薬ａ1として列挙したものを用いることができ、検体中に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ2としては、上述した検体中に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ1として列挙したものを用いることができる。
【００５４】
　本発明に係るサンプリング素子にさらに第１の試薬が担持されている場合、第１の試薬がサンプリング素子の運動中に液中に放出されてもよい。この際、放出された第１の試薬は、前記検体中の物質と反応する試薬ａ1であり、前記検体中の物質と前記試薬ａ1とが均一混合過程において同時に反応する場合もある。
　また、本発明の検体均一混合方法に適用される検体としては、例えば体液が挙げられ、さらに具体的には、例えば血液、尿、唾液、涙および汗などが挙げられる。
　本発明に係る検体均一混合過程において起こりうる反応は、例えば、酵素反応、免疫反応、ハイブリダイゼーション、溶血反応、または溶菌反応などである。
【００５５】
　ここで、図面を参照しながら、本発明に係る検体用サンプリング素子およびスターラーを用いた均一混合方法について説明する。
　図７は、本発明に係るサンプリング素子を用いた検体処理方法の工程図である。なお、ここでは、図１に示すサンプリング素子１を用いた場合を説明するが、粘着性テープ１３は省略した。まず、図７の（ａ）に示すように、検体３０にサンプリング素子１を接触させ、毛細管現象によって毛細管１１に検体３０を導入する。これにより、図７の（ｂ）に示すように、サンプリング素子１の毛細管１１に検体３０が保持される。
【００５６】
　ついで、このサンプリング素子１を、液３３を含む反応セル３１（反応系）内に導入し、反応セル３１の底面の外側には、例えばスターラーを構成する第２の磁性体であるマグネット３２が位置する。第２の磁性体３２が回転することによって、サンプリング素子１は液中で回転運動をし、毛細管１１に保持された検体が遠心力によって液３３中に放出される（図７の（ｃ））。そして、サンプリング素子１の回転運動による攪拌によって、両者は均一に混合されるのである。サンプリング素子１の毛細管１１に含まれていた検体３０は、液３３と混合され、このとき、反応セル３１中には混合液（または溶解液）３４が存在することになる（図７の（ｄ））。
【００５７】
　つぎに、上記サンプリング素子を用いた検体処理方法を実施するために、本発明は、前記検体用サンプリング素子のためのハンドリング装置も提供する。このハンドリング装置は、検体を定量的に採取して一時的に保持し得る第１の領域、および前記第１の領域を運動させるために外部から力学的作用を受ける第２の領域を有する検体用サンプリング素子を着脱可能に含み、前記検体を保持した前記サンプリング素子を反応系に導入し得ることを特徴とする。
【００５８】
　さらに、前記ハンドリング装置は、前記反応系を構成する液系を保持し、前記液系を前記サンプリング素子とともに前記反応系に導入し得る機構を有するのが有効である。
　前記液系は、緩衝液、前記検体に含まれる物質と反応する試薬ａ2を含む溶液、または前記検体に含まれる細胞を破壊する試薬ｂ2を含む溶液であればよい。
【００５９】
　ここで、図８に、本発明に係るサンプリング素子およびハンドリング装置を用いた検体処理方法の工程図を示す。図８の（ａ）に示すように、本発明に係るハンドリング装置４０は、ピストン４３ａを具備するとともに液４３ｂを保持するシリンジ４３、および液４３ｂをシリンジ４３の内部に保持するためにシリンジ４３の底に設けられたアルミシール４４を含む。また、シリンジ４３の先端部分には、本発明に係るサンプリング素子１が取り付けられている。
【００６０】
　このハンドリング装置４０を使用する場合、図８の（ａ）に示すように、あらかじめサンプリング素子１の毛細管１１に検体３０を保持させておき、その後、図８の（ｂ）に示すように、シリンジ４３のピストン４３ａを押すことにより、反応セル４６内に、サンプリング素子１とともに液４３ｂを導入する。その後、図８の（ｃ）に示すように検体３０を保持するサンプリング素子１および液４３ｂを含む反応セル４６を、例えばスターラー上に設置し、サンプリング素子１を回転させて、検体３０を放出させて攪拌しながら液４３ｂと均一に混合させる。
【００６１】
　ここで、図８に示すハンドリング装置４０の特徴は、シリンジ形状を有すること、検体に混合される液４３ｂが封入されること、脱着可能なサンプリング素子１が先端に設けられること、ピストン４３ａを押すとサンプリング素子１が外れるとともにアルミシール４４が破れ、液４３ｂが流れ出ることを満たす点にある。シリンジ形状の部分は、例えばプラスチックで構成し、使い捨て可能であるのが好ましい。
　また、アルミシール４４は、液４３ｂを漏れない状態で保持し、かつ外力で簡単に破れる機能を有する。したがって、アルミシール４４の代わりに、かかる機能を有する、破れ得る材料を用いても構わない。
【００６２】
　つぎに、図９に、図８に示すハンドリング装置４０の先端部分から、サンプリング素子１が着脱される様子を示す。図９は、ハンドリング装置４０の先端部分の拡大図である。
　図９に示すように、部材５３は、芯５３ｂおよびこの芯５３ｂのまわりを上下に移動し得る筒５３ａで構成される。この場合のサンプリング素子５０における第１の磁性体５１は筒状であり、芯５３ｂに突き刺された状態で保持されている。筒５３ａを下に移動させると、保持されていたサンプリング素子５０が、筒５３ａに押されて芯５３ｂから外れる。
【００６３】
　図８および９により、ハンドリング装置４０の機能をまとめると、サンプリング素子１が付されたハンドリング装置４０を用い、まず、図８に示すようにサンプリング素子１の毛細管１１に検体３０を導入する。つぎに、反応セル４６内にめがけてシリンジ４３のピストン４３ａを押すことにより、図９に示すような着脱機能により、サンプリング素子１を反応セル４６に導入するとともに、ピストン４３ａの先端でアルミシール４４を破って液４３ｂも反応セル４６内に導入する。その後は、図７の（ｃ）および（ｄ）に示すような操作を行う。
【００６４】
　また、本発明に係る別のハンドリング装置を用いた検体処理方法を説明する。図１０の（ａ）に示すように、このハンドリング装置６０は、液６３ｂを保持する反応セル６３ａが、サンプリング素子１で密封されて構成されている。サンプリング素子１の毛細管１１には検体が保持されている（図示せず。）。
　また、ハンドリング装置６０は、図１０の（ｂ）に示すようにサンプリング素子１を反応セル６３ａ内に矢印Ｚの方向に落とすことのできる機構を有する蓋６２を具備する。蓋６２を垂直方向下向きに押すことによりサンプリング素子１を反応セル６３ａ内に導入する。なお、図８および１０のいずれの場合、簡易にサンプリング、液導入および均一混合を実施することができる。
【００６５】
　つぎに、図１１および１２を用いて、上記検体用サンプリング素子を用いた本発明に係る検体処理装置の一実施の形態を説明する。図１１は、本発明に係る検体処理装置の一部を断面にした構成を示す図である。この検体処理装置は、前記サンプリング素子が導入される反応セル７０と、反応セル７０内において前記サンプリング素子に力学的作用を与える手段（例えばマグネティックスターラー）７１と、反応セル７０内の反応を測定するための光学測定系とを具備する。そして、光学測定系は、光源７２と光光度計（検出器）７３とを具備し、反応セル７０内には図示していないが本発明に係るサンプリング素子が導入される。
【００６６】
　反応セル７０は例えば透明の石英で構成されており、光源７２から出射された略平行光（またはレーザー）７４が反応セル７０内の液系に照射される。例えば、まず反応セル７０内に所定の試薬（液系）を入れておき、ついで、毛細管（第１の領域）および磁性体（第２の領域）を具備し、毛細管に検体を保持するサンプリング素子を、反応セル７０内に導入する。その後、力学的作用を与える手段７１からの力学的作用を受けたサンプリング素子が回転し、毛細管（第１の領域）から検体が反応セル７０内に放出される。
【００６７】
　検体と試薬との反応により、例えば反応セル７０内の液系が白濁し、この液系の反応前後の散乱光７６の強度などを光光度計７３で測定すれば、検体と試薬との反応の完了、または検体の定量もしくは定性を行うことができ、好適に検体を処理することができる。なお、この検体処理装置は、制御装置７５によって制御すればよい。
　以下に、本発明に係るサンプリング素子を用いた検体処理方法について、実施例を参照しながら詳細に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【実施例】
【００６８】
《実施例１》
　本実施例においては、まず図１に示す本発明に係るサンプリング素子を作製した。毛細管１１としてガラス管（アズワン株式会社製のＥＭマイスターミニキャップス）を使用し、第１の磁性体１２としてスターラー・バー（アズワン株式会社製のラボラン回転子）を使用した。ガラス管とスターラー・バーとを粘着性テープ１３で巻きつけて一体化することにより、図１に示す構造を有する本発明に係るサンプリング素子を作製した。なお、ガラス管の容量は５ｕｌとし、スターラー・バーの寸法は、２５ｍｍ×φ８ｍｍとした。
【００６９】
《実施例２〜６および比較例１》
　本実施例においては、実施例１で作製したサンプリング素子を用いて、図７に示す手順にしたがって本発明に係る検体処理方法を実施し、検体の希釈の効果を調べた。
　まず、実施例１と同様にして本発明に係るサンプリング素子を作製した。検体が液に混合、溶解する様子を吸収スペクトルによって観測するために、蒸留水１ｍｌに色素（和光純薬（株）製のBRILLIANT GREEN）２０ｍｇを溶解して、２０ｍｇ／ｍｌの濃度の検体（ＢＧ溶液）を得た。
【００７０】
　当該検体をサンプリング素子の５ｕｌガラス管に注入した後、当該サンプリング素子を５ｍｌの蒸留水を含むビーカー内に入れ、直ちにスターラー（KOIKE PRECISION INSTRUMENT社製のMIGHTY MAGNETIC STIRRER MODEL-16）により攪拌を行った。攪拌を１分間行った後、ビーカー内の液体を１ｍｌ採取し、その吸収スペクトルを測定した。その結果を図１３のａで示した（実施例２）。
　一方、従来どおり、ピペットマン（ギルソン社製）で実施例２と同じ検体５ｕｌを採取し、ビーカー内においてスターラーにより攪拌中の５ｍｌの水溶液中に入れ、攪拌を１分間行った。その後、ビーカー内の液体を１ｍｌ採取し、その吸収スペクトルを測定した。結果を図１３のｂで示した（比較例１）。
　図１３より、本発明に係るサンプリング素子による検体処理方法を用いることによっても、従来どおりに検体の均一な混合を実施することができ、さらに、簡易な検体処理方法を提供できることがわかった。
【００７１】
　さらに、実施例１と同様にしてサンプリング素子を作製し、検体の希釈効果を分析した。容量１μｌ、３μｌ、５μｌまたは１０ｕｌのガラス管（アズワン（株）製のＥＭマイスターミニキャップス）およびスターラー・バー（２５ｍｍ×φ８ｍｍ）を用い、容量が１μｌ、３μｌ、５μｌまたは１０ｕｌのサンプリング素子４種を作製した。実施例２と同じ検体を４種類のサンプリング素子に注入し、それぞれビーカーに含まれる５ｍｌの水溶液中に導入し、スターラーにより攪拌して希釈を行った。その後、ビーカー内の液体を１ｍｌ採取し、その吸収スペクトルを測定した。結果を図１４に示した（実施例３〜６）。図１４より、本発明に係るサンプリング素子による検体処理方法を用いることにより、検体の希釈系列を作製することができた。
【００７２】
《実施例７〜１１》
　本実施例においては、図４に示す構造を有し、塩化カリウムが担持されたサンプリング素子を作製し、血液の溶血を行った。
　０．１％、０．５％、１％、５％または１０％の塩化カリウム溶液を含浸させ、凍結乾燥させたガラス繊維濾紙２３（ワットマン社製のＦ０７５−１４、１０ｍｍ×３０ｍｍ）を用意し、毛細管２１である容量３ｕｌのガラス管と、第１の磁性体２２であるスターラー・バーとの間に配置し、粘着性テープ２４で巻きつけて、塩化カリウムが担持されたサンプリング素子５種類を作製した。
　これらを１ｍｌの全血中に入れ、３分間攪拌を行った後に、遠心分離により血球分離を行った。こうして得られた血漿中のへのグロビン濃度をＳＬＳ−Ｈｂ測定キット（和光純薬（株）製）を用いて測定した。結果を図１５に示した。図１５から、塩化カリウムが担持されたサンプリング素子を用いることにより血液の溶血を制御する可能性が示されたことがわかる。
【００７３】
《実施例１２》
　本実施例においては、図１に示す構造を有する本発明に係るサンプリング素子を用いてヒト血清アルブミン測定を行った。
　毛細管として容量３ｕｌのガラス管を含むサンプリング素子を、実施例１と同様にして作製した。また、検体として、濃度が０ｇ／ｌ、０．００５ｇ／ｌ、０．０１５ｇ／ｌ、０．０４６ｇ／ｌ、０．２３ｇ／ｌ、０．４６ｇ／ｌ、１．５ｇ／ｌまたは４．６ｇ／ｌのヒト血清アルブミンを用いた。
　測定は、前記サンプリング素子にヒト血清アルブミン３ｕｌを注入した後に、当該サンプリング素子をウサギ由来抗ヒトアルブミン抗体とマウス由来抗ヒトアルブミン抗体を含む１ｍｌ緩衝液（５０ｍＭＭＯＰＳ、４％ＰＥＧ、ｐＨ７．４）の中にいれ、３分間攪拌を行った後、散乱強度（測定波長６７０ｎｍ）を測定した。結果を図１６に示した。図１６に示すように、本発明に係るサンプリング素子を用いてヒト血清アルブミンを測定できることが確認された。これは、ヒト血清アルブミン以外の測定項目についても適用できる可能性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
　本発明に係る検体用サンプリング素子、検体処理装置および検体処理方法は、例えば尿検査、妊娠検査、血液検査、免疫血清検査、内分泌機能検査、ウイルス検査、細菌検査などに好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明に係るサンプリング素子の概略斜視図である。
【図２】図１の矢印Ｘの方向から見たサンプリング素子を示す図である。
【図３】図１の矢印Ｙの方向から見たサンプリング素子を示す図である。
【図４】本発明に係る別のサンプリング素子の概略斜視図である。
【図５】図４の矢印Ｘの方向から見たサンプリング素子を示す図である。
【図６】図４の矢印Ｙの方向から見たサンプリング素子を示す図である。
【図７】本発明に係るサンプリング素子を用いた検体処理方法の工程を示す図である。
【図８】本発明に係る検体処理装置を用いた検体処理方法の工程を示す図である。
【図９】図８に示すハンドリング装置４０の先端部分から、サンプリング素子５０が着脱される様子を示す図である。
【図１０】本発明に係る別のハンドリング装置を用いた検体処理方法の工程を示す図である。
【図１１】本発明に係る検体処理装置の構成を示す概略側面図である。
【図１２】図１１に示す検体処理装置の概略上面図である。
【図１３】本発明の実施例における吸収スペクトルと比較例における吸収スペクトルを示すグラフである。
【図１４】本発明の実施例における希釈系列を示すグラフである。
【図１５】本発明の実施例における溶血反応の測定結果を示すグラフである。
【図１６】本発明の実施例におけるヒト血清アルブミンの測定結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００７６】
　　　１　　　　　　サンプリング素子
　　　１１、２１　　毛細管
　　　１２、２２　　第１の磁性体
　　　１３、２４　　粘着性テープ
　　　２３　　　　　ガラス繊維濾紙
　　　３０　　　　　検体
　　　３１、６３ａ　反応セル
　　　３２　　　　　第２の磁性体
　　　３３、６３ｂ　液
　　　３４　　　　　混合液
　　　４０、６０　　ハンドリング装置
　　　４３　　　　　シリンジ
　　　４３ａ　　　　ピストン
　　　４３ｂ　　　　液
　　　４４　　　　　アルミシール
　　　４６　　　　　反応セル
　　　５０　　　　　サンプリング素子
　　　５１　　　　　第１の磁性体
　　　５２　　　　　毛細管
　　　５３　　　　　部材
　　　６２　　　　　蓋
　　　７０　　　　　反応セル
　　　７１　　　　　力学的作用を与える手段
　　　７２　　　　　光源
　　　７３　　　　　光光度計
　　　７４　　　　　略平行光
　　　７５　　　　　制御装置
【図１】
2004144739.tif 000003
【図２】
2004144739.tif 000004
【図３】
2004144739.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004144739.tif 000009
【図８】
2004144739.tif 000010
【図９】
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【図１０】
2004144739.tif 000012
【図１１】
2004144739.tif 000013
【図１２】
2004144739.tif 000014
【図１３】
2004144739.tif 000015
【図１４】
2004144739.tif 000016
【図１５】
2004144739.tif 000017
【図１６】
2004144739.tif 000018