(57)【要約】【課題】高脂血症の予防・治療、特に消化管内の胆汁酸を強力に除去し、かつ飲食品および薬剤等に汎用可能な調製物を提供する。【解決手段】新規なキトサン・オロチン酸塩を製造した。その低コレステロール作用はキトサンに倍する効力を有し、胆汁酸吸着能は１次、２次胆汁酸或いは抱合体種にかかわらず、遍く胆汁酸を吸着し、特に２次胆汁酸に対する吸着能が高い。またキトサン・オロチン酸塩はゲルビーズばかりでなく、粉末として調製することができ、直接的に、或いは各種経口用に製剤化して、飲食品及び薬剤に汎用することが出来る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キトサン・オロチン酸塩を有効成分とすることを特徴とする胆汁酸吸着剤。
【請求項２】
前記の剤型が粉末又はゲルビーズである請求項１記載の胆汁酸吸着剤。
【請求項３】
請求項２記載の粉末又はゲルビーズを含有する飲食品、医薬品または医薬部外品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なキトサン・オロチン酸塩を有効成分とする胆汁酸吸着剤。高脂血症、動脈硬化症、肥満などの予防・改善効果を期待できる飲食品、医薬品または医薬部外品に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年の動脈硬化性疾患の増加は、食習慣の変化に伴う高脂血症の増加と大きく関連しており、我が国の食生活の変化から考えても、これらの疾患に対して、欧米諸国なみの認識が必要であると考えられる。高脂血症の治療や予防に関しては、食品は非常に重要な因子であり、特に、高脂血症患者においては、その疾患の進行を予防するためにも、コレステロール摂取量を制限した日常的な食習慣が大切であるとされている。
【０００３】体内のコレステロールの殆どは肝臓で胆汁酸に異化される。そしてコレステロールから生合成された胆汁酸は、胆管を通じて腸管内に分泌されて、小腸内の脂肪の消化吸収を助けている。分泌された胆汁酸は、その９５％以上が腸管から再吸収されて腸肝循環を行い、糞便として体外に排斥されるのは５％以下である（牧野勲他、「代謝」２４（８）ｐ．６８５，１９８７年）。
【０００４】従って、血液中のコレステロール値を低下させるための一つの手段として、腸管内の胆汁酸を吸着除去することにより、胆汁酸の腸肝循環を抑制させ、コレステロールから胆汁酸への異化作用を促進する方法が試みられてきている。この作用機序に基づく薬剤として上市されているものに、陰イオン交換樹脂であるコレスチラミンがあり、長期使用に於ける有効性と安全性が確認されて、広く臨床応用されている。しかし、コレスチラミンは、１日の投与量が８〜１２ｇと非常に多く、しかも水やジュースに懸濁して服用しなければならないことから、副作用として腹部膨満感や便秘などの胃腸症状が多く発生する。このため、胆汁酸吸着能力が優れ、副作用のない代替薬剤が望まれている。
【０００５】キトサンは、蟹や海老の甲殻や昆虫の外皮、イカ・貝等の軟体動物の器官、きのこ等菌類の細胞壁など、地球上に広く分布している生体高分子（多糖類）のキチン質を脱アセチル化して製造され、β−１．４−ポリ−Ｄ−グルコサミンの化学構造を有する塩基性多糖類である。キトサンに高脂血症を改善する薬効があることが報告されている。特公平６−９２３０８号、特許第２８８５８６８号、特許第３１０８６７５号、特開平９−８７３０２号、特表２００１−５１２４３２号、特開２０００−１５７２１０号、特開２００１−１６９７５３号、特開２００１−３０２５１９号、特開２００２−４５１４６号などがあるが、此等の内容はキトサンオリゴマー、キトサンの粒度、結晶等に関するもの、或いはキトサンと食物繊維、糖、蛋白質水解物などとの配合に関するものである。
【０００６】オロチン酸は、哺乳動物のミルク中から検出され、各種器官の構成・機能に必須のピリミジン体前駆物質として哺乳動物生体に存在している。その化学構造はウラシル−６−カルボン酸で、発酵法または化学合成で製造され市販されている。胆汁酸吸着作用に関する報告はない。
【０００７】キトサンとニコチン酸を配合した低コレステロール剤として、特表２０００−５０４７２４号があり、ニコチン酸に対するキトサン配合の重量比を０．６７〜３６０に限定し、また胆汁酸吸着に関する記載はない。特開平９−２４１１６９号は本発明者等の出願特許で、キトサンと有機酸との塩を製造し、ゲル状組成物に製剤化した胆汁酸吸着剤の最初の発明であり、有機酸としては乳酸、リンゴ酸、クエン酸、グルタミン酸及びアスパラギン酸を具体的に例示している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、本発明者らの前記発明（特開平９−２４１１６９号）がキトサンと有機酸との塩をゲルマトリックス中に包含するゲル状組成物製剤に関し、その使用・応用が限られるため、汎用性の高い粉末化が可能で、更に強力に胆汁酸を吸着するキトサン・有機酸塩を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らはキトサンと、経口摂取が可能な各種有機酸との塩を製造し、粉末化及び胆汁酸吸着能の実験を重ね、新規なキトサン・オロチン酸塩が粉末化が可能で、かつ強力な胆汁酸吸着能を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】本発明のキトサン・オロチン酸塩は前記発明（特開平９−２４１１６９号）の製剤と同様にアルギン酸ゲル等のゲルマトリックス中に包含させたゲルビーズとして、また粉末として、または腸溶性コーテイングした粉末として直接的に、或いはシロップ剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口用製剤化して、飲食品、医薬品または医薬部外品に使用することが出来る。
【００１１】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１２】
【実施例１】キトサン・オロチン酸塩粉末の製法
０．５ｇキトサンを０．０７２％オロチン酸水溶液５００ｍｌに加え、攪拌する。肉眼的には、キトサン粉末が浮遊（或いは沈澱）した状態にある。一日後、グラスフィルターにて濾取し、水洗する（乾燥を早めるためにエタノールでリンスしてもよい）。乾燥させデシケーター中で保管する。
また１２ｇのキトサンを用いて、同様の方法でスケールアップを試みたが、全く同様にキトサン・オロチン酸塩の粉末を調製できた。
【００１３】キトサン・オロチン酸塩粉末中のオロチン酸含有量
キトサン・オロチン酸塩２０ｍｇを秤量し、希塩酸溶液（或いは蒸留水）に加えて一日放置し、解離したオロチン酸量を高速液体クロマトグラフィで測定した　［測定条件：カラムＣ１８（１５０ｘ４．６ｍｍ）、溶出液５ｍＭリン酸（ｐＨ約２．９）、流速０．８ｍｌ／分、注入量１０μｌ、検出２８０ｎｍ］。測定結果は２．７ｍＭオロチン酸／キトサン・オロチン酸塩１ｇであった。
【００１４】
【実施例２】インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）における胆汁酸取り込み試験
供試したサンプルは実施例１のキトサン・オロチン酸塩粉末、実施例１と同様の製法で調製したキトサン・リンゴ酸塩、キトサン・ニコチン酸塩、キトサン・クエン酸塩の４サンプルである。胆汁酸としては１次胆汁酸であるタウロコール酸ナトリウムとグリココール酸ナトリウム、２次胆汁酸としてタウロデオキシコール酸ナトリウムとグリコケノデオキシコール酸ナトリウムを用いた。
【００１５】２ｍＭ胆汁酸水溶液１５ｍｌの入ったＬ字管を予め３７°Ｃに加温し、各サンプル１０ｍｇ、或いは５０ｍｇを入れ、振とうする（６７回／分）。経時的にＬ字管から水溶液試料を採取して、系中の胆汁酸量を高速液体クロマトグラフィにより測定した。測定条件は、カラムＣ１８（１５０ｘ４．６ｍｍ）、溶出液はメタノール：３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．４）：アセトニトリル＝６：３：１、流速０．８ｍｌ／分、注入量２０μｌ、検出は２３０ｎｍの吸光度で行った。
【００１６】図１に、胆汁酸としてタウロコール酸ナトリウムを用いた場合の実験結果を示す。サンプル量は各１０ｍｇで、供試した４サンプルの中、キトサン・オロチン酸塩の胆汁酸吸着が最速で、１５分後には系中に溶解している胆汁酸の約４７％を吸着し、その量は１．４２±０．０８ｍＭタウロコール酸／サンプル１ｇ（ｎ＝５）で最大であった。一方、キトサン・ニコチン酸塩及びキトサン・クエン酸塩の胆汁酸吸着は悪く、１５分後ではキトサン・オロチン酸塩の半分以下であり、１時間経過しても殆どその胆汁酸吸着量の増大はなかった。
【００１７】また、キトサン・オロチン酸塩を５０ｍｇ使用した時には系中の９０％以上の胆汁酸吸着が認められた。
【００１８】図２に、キトサン・オロチン酸塩（サンプル量１０ｍｇ）のキトサン脱アセチル化度の相違による胆汁酸（タウロコール酸）吸着への影響についての実験結果を示す。結果はキトサン脱アセチル化度の増加と共に、タウロコール酸吸着量の増加がみられた。一方、図３に示される様に含有されるオロチン酸量はキトサン脱アセチル化度の相違に関連性がなかった。１００％アセチル化しているキチンでは殆どオロチン酸の吸着がないことから、脱アセチル化度の大きいキトサンほど効率よくイオン交換が起こっていると考えられる。
【００１９】図４に、キトサン・オロチン酸塩粉末（サンプル量１０ｍｇ）の粒子径による胆汁酸（タウロコール酸）吸着量への影響についての実験結果を示す。キトサン・オロチン酸塩を篩にかけて以下の３つのサイズに分け、各粒子径による胆汁酸吸着量を測定した。
Ａ：４８〜８０メッシュ（３００〜１８０μｍ）
Ｂ：８０〜２００メッシュ（１８０〜７５μｍ）
Ｃ：２００メッシュ＞（７５μｍ＞）
結果はいずれの粒子径に於いても、ほぼ同程度のタウロコール酸吸着が認められた。この事は胆汁酸のキトサン・オロチン酸塩粉末への吸着が粉体表面のみで起きているのでないことを証明した。むしろ２００メッシュ以上の微粉末では吸着量が若干減少しており、これは微粉末化による「固体表面のぬれ」の変化に起因すると考えられる。
【００２０】図５及び図６に、キトサン・オロチン酸塩（サンプル量１０ｍｇ）中のオロチン酸濃度による胆汁酸（タウロコール酸）吸着量への影響についての実験結果を示す。結果はキトサンに対して、塩としてオロチン酸が０．０３６％以上の濃度で存在すれば十分な胆汁酸吸着が起こることを証明した。
【００２１】図７に、キトサン・オロチン酸塩（サンプル量１０ｍｇ）の胆汁酸選択性についての実験結果を示す。結果はキトサン・オロチン酸塩が１次、２次胆汁酸或いは抱合体種にかかわらず、各胆汁酸を吸着することを証明した。とりわけ２次胆汁酸の吸着量が大きかったことは特質すべき新知見である。
【００２２】
【実施例３】キトサン・オロチン酸塩固定化アルギン酸ゲルビーズの調製
０．５ｇキトサンを１（Ｗ／Ｗ）％アルギン酸ナトリウム溶液９．５ｇに加え、攪拌分散させる。この溶液約２ｇ（１サンプル分）を０．０５Ｍ塩化カルシウム溶液１０ｍｌに滴下すると、瞬時にキトサン固定化アルギン酸ハイドロゲルビーズが形成され、これを室温にて３０分間ほど放置後、メッシュフィルターにて取り出し、０．０７２％オロチン酸溶液１００ｍｌに移し替え、一日室温にて放置する。ハイドロゲルビーズを篩で取り出し、蒸留水１０ｍｌ程度で洗浄した後、乾燥させる。
【００２３】キトサン・オロチン酸塩固定化乾燥アルギン酸ゲルビーズ中から放出されるオロチン酸の測定
乾燥ゲルビーズ０．１３ｇ（１サンプル分）を１００ｍｌのメスフラスコに入れ、蒸留水を加えてメスアップして室温放置、６時間後及び２４時間後に放出されたオロチン酸量を高速液体クロマトグラフィにて測定した［測定条件：カラムＣ１８（１５０ｘ４．６ｍｍ）、溶出液５ｍＭリン酸（ｐＨ約２．９）、流速０．８ｍｌ／分、注入量１０μｌ、検出２８０ｎｍ］。測定結果は６時間後及び２４時間後共に同量の２６．１±０．２μＭのオロチン酸が放出された（ｎ＝３）。
【００２４】
【実施例４】キトサン・オロチン酸塩固定化アルギン酸ゲルビーズのインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）における胆汁酸取り込み試験
供試したサンプルは、実施例３で調製したビーズと、実施例３に於いてキトサン固定化アルギン酸ハイドロゲルビーズを０．０７２％オロチン酸溶液１００ｍｌに移し替える際の該溶液量を１００ｍｌの替わりに２０ｍｌ、５０ｍｌ及び１５０ｍｌとして調製した３種のキトサン・オロチン酸塩固定化アルギン酸ゲルビーズを加えた計４サンプルである。胆汁酸にはタウロコール酸ナトリウムを使用した。
【００２５】２ｍＭタウロコール酸ナトリウム水溶液１５ｍｌの入ったＬ字管を予め３７°Ｃに加温し、各サンプル０．１３ｇを入れ、振とうする（６７回／分）。経時的にＬ字管から試料を採取して、系中の胆汁酸量を高速液体クロマトグラフィにより測定した。測定条件は、カラムＣ１８（１５０ｘ４．６ｍｍ）、溶出液はメタノール：３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．４）：アセトニトリル＝６：３：１、流速０．８ｍｌ／分、注入量２０μｌ、検出は２３０ｎｍの吸光度で行った。
【００２６】図８は、キトサン・オロチン酸塩固定化アルギン酸ゲルビーズの調製時にオロチン酸溶液量を変化させたときの胆汁酸（タウロコール酸）吸着量への影響を示した実験結果である。結果は０．０７２％オロチン酸５０〜１５０ｍｌで調製したビーズに於いてはほぼ同様のタウロコール酸取り込み挙動を示し、１〜１．５時間で取り込みは終了した。また、その取り込み量は系中に存在する胆汁酸の約９０％であった。
【００２７】図９は、キトサン・オロチン酸塩固定化アルギン酸ゲルマトリックスの乾燥時と水を含んだ状態での胆汁酸（タウロコール酸）取り込みへの影響を示す実験結果である。結果は乾燥ゲルビーズもハイドロゲルビーズも、全く同様の胆汁酸取り込み挙動を示した。これはゲルが消化管内で水分を含むか否かに拘わらず、同様の胆汁酸吸着が起ることを証明した。
【００２８】
【実施例５】キトサン・オロチン酸塩経口摂取による血中コレステロール低下作用実験
実験動物はウイスター（ｗｈｉｓｔｅｒ）系ラット５週令を使用した。ステンレス製ケージ１室に１匹を飼育し、自由摂餌及び自由摂水とした。ラットを４群（１群３〜５匹）に分け、各群には、第１表に示す組成の標準飼料ＣＲＦ−１（チャールズリバー配合）粉末飼料（標準飼料群）を、第２表に示す組成を有する高脂高コレステロール飼料（高コレステロール群）を、キトサンを５％含有する高脂高コレステロール飼料（キトサン投与群）を、及びキトサン・オロチン酸塩を５％含有する高脂高コレステロール飼料（キトサン・オロチン酸塩投与群）を投与した。採血は１週間目、実験開始後２週間目に尾静脈より血液を採取し、採血後約１時間放置し、完全に凝血したのち３０００ｒｐｍにて遠心し上清を血清とし、血清中の総コレステロール量を測定した。測定はコレステロールＥ・テストワコー（ＤＡＯＳ法）、或いはコレステロールＣ・テストワコー法により行った。
【００２９】
【第１表】標準飼料組成
ＣＲＦ−１（チャールズリバー配合）粉末飼料（１００ｇ中）
水分　　　　　　　　　　８．１ｇ
粗タンパク質　　　　　２２．６ｇ
粗脂肪　　　　　　　　　５．６ｇ
粗灰分　　　　　　　　　６．６ｇ
粗繊維　　　　　　　　　３．３ｇ
可溶性無窒素物　　　　５３．８ｇ
カロリー　　　　　　３５６　ｋｃａｌ
【００３０】
【第２表】高脂高コレステロール飼料組成
コレステロール　　　　　１．０％
オリーブ油　　　　　　　２．０％
コール酸ナトリウム　　　０．２％
ＣＲＦ−１　　　　　　９６．８％
以上の各成分を乳鉢にて十分混和後、７１０μｍの篩にかけ飼料とした。
【００３１】図１０に上記４種の異なる飼料で飼育した場合のラット飼料摂取量の１週間及び２週間後の変化の結果を示す。結果は標準飼料群および高コレステロール群の飼料摂取量に差は認められなかった。また同様にキトサン投与群及びキトサン・オロチン酸塩投与群とも飼料摂取量に差は認められなかった。
【００３２】図１１に上記４種の異なる飼料で飼育した場合のラット体重の１週間、２週間及び３週間後の変化の結果を示す。結果は高コレステロール群、キトサン投与群及びキトサン・オロチン酸塩投与群とも、ラット体重は１．２及び３週間後いずれも順調に増加し、標準飼料群とに差は全く観察されなかった。
【００３３】図１２に上記４種の異なる飼料で飼育した場合のラット血清中総コレステロール量変動の１週間及び２週間後の実験結果を示す。最初の１週間は高コレステロール群、キトサン投与群及びキトサン・オロチン酸塩投与群いずれも高い血清コレステロール値を示し、標準飼料群に比し二倍近い値を示した。２週間後、高コレステロール群では依然として高い血清コレステロール値を維持しているが、キトサン投与群では標準飼料群とほぼ同程度まで低下し、キトサン・オロチン酸塩投与群に於いては標準飼料群の血清コレステロール値の半分近くにまで低下した。
【００３４】
【発明の効果】本発明の新規なキトサン・オロチン酸塩は低コレステロール作用剤として知られるキトサンよりも、それに倍するコレステロール低下作用を有し、キトサン・オロチン酸塩の胆汁酸吸着能は１次、２次胆汁酸或いは抱合体種にかかわらず、遍く胆汁酸を吸着し、特に２次胆汁酸に対する吸着能が高いのは特質である。またキトサン・オロチン酸塩はゲルビーズばかりでなく、粉末として調製することができ、直接的に、或いはシロップ剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の各種経口用製剤化して、飲食品、医薬品または医薬部外品等に広く使用することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】キトサンと各種有機酸塩の胆汁酸吸着量を比較した図である。各サンプル量は１０ｍｇで、縦軸の胆汁酸にはタウロコール酸ナトリウムを使用した。
【図２】キトサン脱アセチル化度の相違によるキトサン・オロチン酸塩１０ｍｇの胆汁酸吸着量を示す図である。縦軸の胆汁酸にはタウロコール酸ナトリウムを使用した。
【図３】キトサン脱アセチル化度の相違によるキトサン・オロチン酸塩１０ｍｇ中のオロチン酸量を示す図である。
【図４】キトサン・オロチン酸塩（１０ｍｇ）粉末の粒子径の相違による胆汁酸吸着量を示す図である。縦軸の胆汁酸にはタウロコール酸ナトリウムを使用した。
【図５】キトサン・オロチン酸塩１０ｍｇ中のオロチン酸濃度の相違による胆汁酸吸着量を示す図である。縦軸の胆汁酸にはタウロコール酸ナトリウムを使用した。
【図６】キトサン・オロチン酸塩１０ｍｇ中のオロチン酸濃度の百分率と塩形成しているオロチン酸量との関係を示す図である。
【図７】キトサン・オロチン酸塩１０ｍｇを使用したときの胆汁酸選択性を示す図である。
【図８】キトサン・オロチン酸塩固定化アルギン酸ゲルビーズ中のオロチン酸濃度の相違による胆汁酸吸着量を示す図である。縦軸の胆汁酸にはタウロコール酸ナトリウムを使用した。
【図９】キトサン・オロチン酸塩固定化アルギン酸ゲルビーズの乾燥ゲルビーズとハイドロゲルビーズの胆汁酸吸着量を示す図である。縦軸の胆汁酸にはタウロコール酸ナトリウムを使用した。
【図１０】４種の異なる飼料で飼育した場合の１週間及び２週間後のラット飼料摂取量を示す図である。
【図１１】４種の異なる飼料で飼育した場合の１週間、２週間及び３週間後のラット体重を示す図である。
【図１２】４種の異なる飼料で飼育した場合の１週間及び２週間後のラット血清中総コレステロール量を示す図である。
【図１】
2004051615.tif 000002
【図２】
2004051615.tif 000003
【図３】
2004051615.tif 000004
【図４】
2004051615.tif 000005
【図５】
2004051615.tif 000006
【図６】
2004051615.tif 000007
【図７】
2004051615.tif 000008
【図８】
2004051615.tif 000009
【図９】
2004051615.tif 000010
【図１０】
2004051615.tif 000011
【図１１】
2004051615.tif 000012
【図１２】
2004051615.tif 000013