(57)【要約】【課題】キャベツＤＮＡを特異的に検出可能なオリゴヌクレオチド、および当該オリゴヌクレオチドをＰＣＲにおいてプライマーとして用いることにより、原料ケールまたはケール食品中に混入するキャベツの有無を判定する方法を提供する。【解決手段】キャベツＤＮＡを特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドをキャベツＤＮＡ検出用プライマーとして用いて、原料ケールまたはケール加工食品から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、電気泳動でケールＤＮＡとキャベツＤＮＡの電気泳動パターンを比較することにより原料ケールまたはケール加工食品に混入したキャベツを識別する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるＤＮＡ配列からなるキャベツＤＮＡ検出用プライマー。
【請求項２】
配列番号２で表されるＤＮＡ配列からなるキャベツＤＮＡ検出用プライマー。
【請求項３】
配列番号３で表されるＤＮＡ配列からなるキャベツＤＮＡ検出用プライマー。
【請求項４】
配列番号４で表されるＤＮＡ配列からなるキャベツＤＮＡ検出用プライマー。
【請求項５】
配列番号５で表されるＤＮＡ配列からなるキャベツＤＮＡ検出用プライマー。
【請求項６】
配列番号６で表されるＤＮＡ配列からなるキャベツＤＮＡ検出用プライマー。
【請求項７】
請求項１乃至６に記載のキャベツＤＮＡ検出用プライマーのうち２種以上を使用して、原料ケールまたはケール加工食品から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、電気泳動によりケールＤＮＡとキャベツＤＮＡの電気泳動パターンを比較することにより原料ケールまたはケール加工食品に混入したキャベツを識別することを特徴とするキャベツ混入判定方法。
【請求項８】
配列番号１０〜１２で表されるＤＮＡ配列をプライマーとして用い、原料ケールから抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、電気泳動によりケールＤＮＡとキャベツＤＮＡの電気泳動パターンを比較することにより原料ケールに混入したキャベツを識別することを特徴とするキャベツ混入判定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キャベツＤＮＡ検出用プライマー及び当該プライマーを用いて簡易且つ良好な精度で原料ケールまたはケール加工食品中に含まれるキャベツ混入の有無を判定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、種々の健康食品が上市されているが、その中に、ケール（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　ｖａｒ．　ａｃｅｐｈａｌａ）を原料にした健康食品がある。ケールはキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ　ｖａｒ．　ｃａｐｉｔａｔａ）の原種であるが、その栄養価の高さから葉を搾って飲料としたり粉末にしたものを水に溶かして飲用している。しかしながら、原料の状態でのケールとキャベツは、葉（特に外葉・幼葉）の形状が外観上酷似している。従って、原料ケールとして入荷した場合であっても、その中にキャベツの外葉や幼葉が混入している場合に、ケールとキャベツを肉眼で識別することは困難である。ましてや、原料を搾汁した後は、両者の判別は更に困難となる。
【０００３】
一方、ケールなど植物原料を加工した食品（青汁等）における原料の純度およびキャベツなどの他原料の混入を判定する方法はこれまで効果的な手段がなく、製造直前の原料目視検査や製品の出荷前での官能検査等に頼らざるを得なかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記の問題を解決するためになされたものであり、キャベツ品種のＤＮＡに結合可能なオリゴヌクレオチドを見出し、当該オリゴヌクレオチドをＰＣＲにおけるプライマーとして用いることにより、原料ケールまたはケール加工食品中に混入したキャベツを識別することを目的とする。
【０００５】
また、本発明は、より簡易な方法で、原料ケール中に混入したキャベツを識別することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、配列番号１乃至６に記載のキャベツＤＮＡ検出用プライマーを提供するものである。
【０００７】
これらはケールとキャベツの識別が可能であり、ケール加工食品の原料として入荷した中に混入したキャベツの有無や、青汁等のケール利用食品に混入したキャベツの有無を判定することを目的としたキャベツＤＮＡ検出用のプライマーとして用いることができる。
【０００８】
また、本発明は、配列番号１乃至６に記載のキャベツＤＮＡ検出用プライマーのうち２種以上を使用して、原料ケールまたはケール加工食品から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を行い、電気泳動によりケールＤＮＡとキャベツＤＮＡの電気泳動パターンを比較することにより、原料ケールまたはケール加工食品に混入したキャベツを識別することができる。
【０００９】
特に、前記プライマーを用いる際、フォワード側プライマーとリバース側プライマーとの組み合わせとして、配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６をセットで用いる。このフォワード側プライマーとリバース側プライマーのセットを１セットとして用いることができる。但し、より確実に結果を導くためには、少なくとも２セット用いることが必要であり、３セットのプライマーを用いてＰＣＲを行うことがより好ましい。
【００１０】
また、本発明は、配列番号１０〜１２で表されるＤＮＡ配列をプライマーとして用い、原料ケールから抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、電気泳動によりケールＤＮＡとキャベツＤＮＡの電気泳動パターンを比較することにより原料ケールに混入したキャベツを識別することにより、原料ケールに含まれるキャベツをケールと識別することもできる。
【００１１】
即ち、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ）法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１８，　６５３１−６５３５（１９９０）など）によっても、原料ケールに混入したキャベツを識別することができる。
【００１２】
これにより、市販のプライマーを用いて、後述するＳＴＳ化をすることなく、青汁等の原料ケールに混入したキャベツの有無を判定することができる。市販のプライマーとしては、例えば、Ｕｐｓｔｒｅａｍ　ｐｒｉｍｅｒ（ＴａＫａＲａ社製、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｋｉｔ）、１０−ｍｅｒ　ｋｉｔ　Ａ（オペロン社製）等が好適に用いられる。特に、配列番号１０〜１２で表されるＤＮＡ配列をプライマーとして用いることが好ましい。
【００１３】
【実施例等】
以下、実施例等により本発明をさらに詳細に説明する。
（実施例１）植物体からの全ＤＮＡの抽出およびＲＡＰＤマーカーの検索
キャベツ−ケール間で多型の得られるプライマーを、ＲＡＰＤ法により検索した。まず１系統のケール（キューサイ社の契約生産者より入手）およびキャベツ（市販品を購入）それぞれの成葉からＣＴＡＢ法により全ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを鋳型とし、４４種類の１０ヌクレオチド（ＴａＫａＲａ社製Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｋｉｔに梱包のＵｐｓｔｒｅａｍ　ｐｒｉｍｅｒ　２４種［ＤＤ　０ｌ〜ＤＤ２４］（以下、「ＤＤプライマー」と称することがある）及びオペロン社製１０−ｍｅｒｋｉｔ　Ａ　２０種［ＯＰＡ０１〜２０］）　（以下、「ＯＰＡプライマー」と称することがある）を１種または２種組み合わせて（うち８５通りを解析）プライマーとし、ＰＣＲ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製ＧｅｎｅＡｍｐ（商標）ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００）を用いて抽出したＤＮＡを増幅した。
【００１４】
ＲＡＰＤ法によるＤＮＡの増幅は以下の条件で行った。即ち、前記鋳型ＤＮＡ（１５０ｎｇ）、２μＭ　ＤＤプライマー（２．５μｌ）あるいは２０ｎｇ／μｌ　ＯＰＡプライマー（１．５μｌ）（それぞれ２種のプライマーを混合する場合は、半量ずつ）、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰｍｉｘ（２μｌ、ＴａＫａＲａ社製）、１０×ＰＣＲ　緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ　ＫＣｌ）２．５μｌ、２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２（１．５μｌ）、５Ｕ／μｌ　耐熱性ポリメラーゼＴａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（０．２５μｌ、ＴａＫａＲａ社製）を混合し、滅菌水を加えて全量２５μｌの反応液を調製した。
【００１５】
ＰＣＲ反応は、予備変性９４℃／１分に続き、変性９４℃／１分、アニーリング３５℃／１分、伸長反応７２℃／２分を４５サイクル行い、７２℃／３分の伸長反応で終了した。得られた増幅断片について、１．５％アガロースゲル電気泳動を行った。この結果、１１通りのプライマーの組み合わせで、１３のキャベツ特異的多型断片が得られた。これらのうち、明瞭なバンドとして観察された、塩基長▲１▼約１．４ｋｂ、▲２▼約０．５ｋｂ、▲３▼約１．５ｋｂの多型断片３種を以降の解析に用いた。それらの電気泳動像（１．５％アガロースゲル）を図１に示す。なお、上記多型断片は、それぞれ▲１▼ＤＤ０４（ＴａＫａＲａ社製Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｋｉｔに梱包のＵｐｓｔｒｅａｍ　ｐｒｉｍｅｒ：配列番号１０）、▲２▼ＤＤ１９（ＴａＫａＲａ社製Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｋｉｔに梱包のＵｐｓｔｒｅａｍ　ｐｒｉｍｅｒ：配列番号１１）、▲３▼ＯＰＡ０６（オペロン社製１０−ｍｅｒｋｉｔ　Ａ：配列番号１２）の増幅産物である。
【００１６】
図に示すように、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＲＡＰＤ法を行うことにより、キャベツ（Ｃ）とケール（Ｋ）との間で多型が得られた。以上の結果から、上記３種のプライマーを用いたＲＡＰＤ法によりキャベツとケールを識別できる可能性が示唆された。
【００１７】
一方、その他のプライマー、例えば、図１中のＯＰＡ０３（５’→３’）ＡＧＴＣＡＧＣＣＡＣおよびＯＰＡ１１（５’→３’）ＣＡＡＴＣＧＣＣＧＴではキャベツ（Ｃ）とケール（Ｋ）との間で多型は得られず、両者を識別することはできなかった。
【００１８】
（実施例２）ＲＡＰＤ法によるケール−キャベツの識別
実施例１で得られた３種の多型断片を、それぞれ▲１▼ＤＤ０４０４−１４００、▲２▼ＤＤ１９１９−５００、▲３▼ＯＰＡ０６０６−１５００と命名し、これらをＲＡＰＤマーカーとしてケールとキャベツの識別を試みた。即ち、実施例１に記載の方法（ＣＴＡＢ法）により複数系統のケール及びキャベツから全ＤＮＡを抽出し、前記プライマー（▲１▼ＤＤ０４、▲２▼ＤＤ１９、▲３▼ＯＰＡ０６）を用いてＰＣＲを行い、前記３種のＲＡＰＤマーカー（▲１▼ＤＤ０４０４−１４００、▲２▼ＤＤ１９１９−５００、▲３▼ＯＰＡ０６０６−１５００）が検出されるか否かを観察した。なお、ＰＣＲ条件は実施例１と同様とした。
【００１９】
得られた増副産物の電気泳動像（１．５％アガロースゲル）を図２に示す。図から明らかなように、プライマーＤＤ０４を用いた場合、キャベツは１４００ｂｐ付近で増幅バンド（ＤＤ０４０４−１４００）が検出されたが、ケール＃１、＃３〜５では検出されなかった。また、プライマーＤＤ１９を用いた場合、キャベツは５００ｂｐ付近で増幅バンド（ＤＤ１９１９−５００）が検出されたが、ケール＃１、２および＃６、７には検出されなかった。更に、プライマーＯＰＡ０６を用いた場合、キャベツは１５００ｂｐ付近で増幅バンド（ＯＰＡ０６０６−１５００）が検出されたが、ケール＃１および＃５には検出されなかった。
【００２０】
一方、３種のＲＡＰＤマーカーの有無を一覧表としたＤＮＡタイピングを下記表に示す。
【００２１】
【表１】
2004016024.tif 000002
これら３種のＲＡＰＤマーカーは、キャベツＤＮＡを鋳型とした場合にはすべての検体で検出された。一方、ケールＤＮＡを鋳型とした場合には系統によって増幅バンドが検出される場合と検出されない場合とがあったが、少なくとも２種のプライマー（ＤＤ０４、ＤＤ１９）の検出結果を比較・検討することにより、複数系統のケールとキャベツを識別することが可能であることが判明した。
【００２２】
即ち、表１におけるケール＃１はいずれのＲＡＰＤマーカーが検出されなかったためキャベツと異なることは明らかであるが、ケール＃２はプライマーＤＤ０４を用いた場合にはＲＡＰＤマーカーＤＤ０４０４−１４００が検出されてしまう（キャベツと識別できない）。ところが、プライマーＤＤ１９を用いた場合、ＲＡＰＤマーカーＤＤ１９１９−５００は検出されないため、このケール＃２はキャベツとバンドパターンが異なることにより、キャベツと識別することができることになる。
【００２３】
（実施例３）キャベツ識別用ＲＡＰＤマーカーの塩基配列の決定
実施例２に記載のＲＡＰＤマーカーを、後述する実施例４でＳＴＳ（ＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇｇｅｄ　Ｓｉｔｅ）化するために、それらの塩基配列を以下の要領で決定した。キャベツＤＮＡを鋳型とした際に増幅された３種のＲＡＰＤマーカー（▲１▼ＤＤ０４０４−１４００、▲２▼ＤＤ１９１９−５００、▲３▼ＯＰＡ０６０６−１５００）をそれぞれ電気泳動ゲルから切り出した。次いで、ＴａＫａＲａ社製ＳＵＰＲＥＣ（商標）−０１（ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ　０．２２μｍ）を用いてゲル中のＤＮＡを抽出し、ＴＡクローニングによって、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでプラスミドベクター　（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｐＧＥＭ（商標）−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ）に挿入した後、大腸菌（ＴａＫａＲａ社製Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９コンピテントセル）を形質転換した。
【００２４】
塩基配列の決定は、前記大腸菌を集菌し、アルカリ−ＳＤＳ法（アルカリミニプレップ）およびポリエチレングリコール沈殿（ＰＥＧ沈殿）によりプラスミドを回収し、回収したプラスミドを鋳型にＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を用いたサイクルシークエンス（Ｃｙｃｌｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）反応を行った後、シークエンサー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（商標）Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）により両端から塩基配列を決定した。
【００２５】
これらの操作の結果、キャベツ識別用ＲＡＰＤマーカーの塩基数は、▲１▼ＤＤ０４０４−１４００…１４３７ｂｐ（配列番号７）、▲２▼ＤＤ１９１９−５００…５３５ｂｐ（配列番号８）、▲３▼ＯＰＡ０６０６−１５００…１５４２ｂｐ（配列番号９）であることが判明した。その塩基配列を図３〜５に示す。
（実施例４）キャベツ識別用ＲＡＰＤマーカーのＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇｇｅｄ　Ｓｉｔｅ）化
原料ケールあるいはケール食品中に含まれるキャベツを再現性よく、更に特異的に検出するため、実施例２で得られたキャベツ識別用ＲＡＰＤマーカーのＳＴＳ化（ＤＮＡ　ｒｅｓ．１，１３９−１４８（１９９４））を行った。
【００２６】
実施例３で得られたそれぞれの塩基配列をもとに、ＧＣ含量、Ｔｍ値、二次構造などを考慮し、ＰＣＲプライマーの塩基配列を以下のように決定した（図３〜５下線部参照）。
【００２７】
【表２】
2004016024.tif 000003
ここで、上記表におけるＦｏｒｗａｒｄ−１及びＲｅｖｅｒｓｅ−１はＤＤ０４０−１４００に特異的なプライマーであり、図３の矢印で示したように、Ｆｏｒｗａｒｄ−１はＤＤ０４０４−１４００における３−２７番目のヌクレオチドに対応し、Ｒｅｖｅｒｓｅ−１はＤＤ０４０４−１４００における１３７０−１３９３番目のヌクレオチドに対応する。
【００２８】
また、上記表におけるＦｏｒｗａｒｄ−２及び　Ｒｅｖｅｒｓｅ−２はＤＤ１９１９−５００に特異的なプライマーであり、図４の矢印で示したように、Ｆｏｒｗａｒｄ−２はＤＤ１９１９−５００における１９−４３番目のヌクレオチドに対応し、Ｒｅｖｅｒｓｅ−２はＤＤ１９１９−５００における４６６−４９０番目のヌクレオチドに対応する。
【００２９】
更に、上記表におけるＦｏｒｗａｒｄ−３及び　Ｒｅｖｅｒｓｅ−３はＯＰＡ０６０６−１５００に特異的なプライマーであり、図５の矢印で示したように、Ｆｏｒｗａｒｄ−３はＯＰＡ０６０６−１５００における２３−４６番目のヌクレオチドに対応し、Ｒｅｖｅｒｓｅ−３はＯＰＡ０６０６−１５００における１４９２−１５１５番目のヌクレオチドに対応する。
【００３０】
（実施例５）ＳＴＳ化プライマーを用いたケールとキャベツの識別
実施例４に記載のＳＴＳ化プライマーをＦｏｒｗａｒｄ−１とＲｅｖｅｒｓｅ−１（以下、両者をまとめて「ｓｅｔ１」と称する）、Ｆｏｒｗａｒｄ−２とＲｅｖｅｒｓｅ−２（以下、両者をまとめて「ｓｅｔ２」と称する）、Ｆｏｒｗａｒｄ−３とＲｅｖｅｒｓｅ−３（以下、両者をまとめて「ｓｅｔ３」と称する）で組み合わせ、これらをキャベツＤＮＡ検出用プライマーとして、ケールとキャベツの識別を行った。
【００３１】
まず、複数系統のケール（キューサイ社の契約生産者より入手）およびキャベツ（市販品を購入）の成葉からＣＴＡＢ法により全ＤＮＡを抽出し、抽出した全ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製ＧｅｎｅＡｍｐ（商標）ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ９７００）を行った。
【００３２】
ＳＴＳ化プライマーを用いたＤＮＡの増幅は以下の条件で行った。即ち、前記鋳型ＤＮＡ（１５０ｎｇ）、２０μＭ　ＳＴＳ化プライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅ　それぞれ０．５μｌ）、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘ（４μｌ、ＴａＫａＲａ社製）、１０×ＰＣＲ　緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ　ＫＣｌ）５μｌ、２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２（３μｌ）、５Ｕ／μｌ　耐熱性ポリメラーゼＴａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（０．２５μｌ、ＴａＫａＲａ社製）を混合し、滅菌水（３５．２５μｌ）を加えて全量５０μｌの反応液を調製した。
【００３３】
ＰＣＲ反応は、予備変性（９４℃／２分）に続き、変性（９４℃／４５秒）、アニーリング（６６℃／１分）、伸長反応（７２℃／１分）を３０サイクル行った。
【００３４】
前記の各プライマーによる増幅産物の電気泳動像（１．５％アガロースゲル）を図６に示す。また、同様の条件で他の検体についても行った結果を下記表に示す。
【００３５】
【表３】
2004016024.tif 000004
これら３種のＳＴＳ化プライマーを用いることで、キャベツＤＮＡを鋳型とした場合にはすべての目的サイズのバンドが検出された。
【００３６】
一方、ケールＤＮＡは系統によって増幅バンドが検出される場合と検出されない場合とがあったが、ケール＃３および＃５は、ＲＡＰＤ法においてはＲＡＰＤマーカーが増幅されていたが（表１）、ＳＴＳ化プライマーを用いた場合にはＤＮＡが増幅されず、ＳＴＳ化によりプライマーのキャベツＤＮＡに対する特異性が向上したことがわかる。
【００３７】
また、表３に示すように、これら３種のＳＴＳ化プライマーを用いてＰＣＲを行った場合、キャベツＤＮＡを鋳型とした場合には、すべての検体で３種の目的サイズＤＮＡが増幅された。一方、ケールＤＮＡを鋳型とした場合には系統によって増幅パターンが異なったが、２種のプライマー（ｓｅｔ−１、ｓｅｔ−２）を用いたＰＣＲで同時にＤＮＡが増幅されることはなかった。よって、少なくとも２種のプライマー（ｓｅｔ−１、ｓｅｔ−２）を用いたＰＣＲの結果を比較・検討することにより、複数系統のケールとキャベツを識別することが可能であることが判明した。
【００３８】
以上の結果、これらＳＴＳ化プライマーを用いることで、ＲＡＰＤ法と比較してＰＣＲの再現性と鋳型ＤＮＡへの特異性および操作・判定の簡便性を更に高めたキャベツ識別を行うことができることが判明した。
【００３９】
（実施例６）キャベツ添加ケール利用食品における判定
実際にケール利用食品にキャベツを混入したモデル系を作成し、実施例４で得られたＳＴＳ化プライマー（ｓｅｔ−１、ｓｅｔ−２、ｓｅｔ−３）を用いたキャベツ混入判定を行った。
【００４０】
試料として、前記ＳＴＳ化プライマーではＤＮＡが増幅されないことを確認しているケール（表３の＃１２、キューサイ社の契約農家から入手）及び青汁（キューサイ社製）と、前記ＳＴＳ化プライマーによってＤＮＡが３種共に増幅されることを確認しているキャベツ（表３の＃３、市販品を購入）を用いた。
【００４１】
１．５ｍｌサンプリングチューブに、キャベツ混入量が▲１▼０、▲２▼１．５、▲３▼５、▲４▼１０、▲５▼３０、▲６▼５０、▲７▼７０％（ｗ／ｗ）となるようにキャベツ葉を採取し、ケールまたは青汁を加えて総量を２００ｍｇとした。次いで、これらのサンプルの全ＤＮＡをＣＴＡＢ法により抽出した。抽出したＤＮＡの濃度を２６０ｎｍにおける吸光度から求め、当該ＤＮＡをＰＣＲ反応系に一定量（約１５０ｎｇ／ｔｕｂｅ）ずつ添加した。実施例５と同様の条件でＰＣＲ反応後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅バンドを観察した。その結果を下記表に示す。
【００４２】
【表４】
2004016024.tif 000005
ケールの場合は、ｓｅｔ−２、ｓｅｔ−３のプライマーを用いたとき、当該ケール中にキャベツが５％（ｗ／ｗ）混入している場合であってもキャベツＤＮＡを検出することができ、青汁の場合はｓｅｔ−３のプライマーを用いたとき、１．５％（ｗ／ｗ）のキャベツ混入でもキャベツＤＮＡを検出することができた。
【００４３】
よって、今回の結果から、本発明に係る３種のキャベツＤＮＡ検出用ＳＴＳプライマーを用いて、ケール中へのキャベツ混入を実際に判定することが可能であることが示された。
【００４４】
このモデル系でのキャベツの検出限界（ｓｅｔ−１、ｓｅｔ−２のプライマーで共にバンドが検出され、キャベツの混入を判断可能な点）は、青汁製品を用いた系で５％（ｗ／ｗ）、ケールを用いた系では３０％（ｗ／ｗ）であった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明に係るキャベツＤＮＡ検出用プライマー及び当該プライマーを用いたキャベツ混入判定方法によれば、キャベツなどのケールに近似した野菜との間においてもキャベツＤＮＡを検出することができるため、製造直前の原料目視検査や製品の出荷前での官能検査等では識別が困難な場合であっても、簡易かつ良好な精度でケール食品中のキャベツの混入を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＡＰＤプライマー（ＤＤ０４、ＤＤ１９、ＯＰＡ０６）を用いＲＡＰＤ法により増幅させたキャベツＤＮＡおよびケールＤＮＡの電気泳動パターンを示す図である。
【図２】ＲＡＰＤプライマー（ＤＤ０４、ＤＤ１９、ＯＰＡ０６）を用いＲＡＰＤ法により増幅させたキャベツＤＮＡおよびケールＤＮＡの電気泳動パターンを示す図である。
【図３】ＲＡＰＤマーカー（ＤＤ０４０４−１４００）の塩基配列を示す図である。
【図４】ＲＡＰＤマーカー（ＤＤ１９１９−５００）の塩基配列を示す図である。
【図５】ＲＡＰＤマーカー（ＯＰＡ０６０６−１５００）の塩基配列を示す図である。
【図６】ＳＴＳ化されたキャベツＤＮＡ検出用プライマー（ｓｅｔ１〜ｓｅｔ３）を用いＰＣＲ法により増幅させたキャベツＤＮＡおよびケールＤＮＡの電気泳動パターンを示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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