(57)【要約】【課題】糖鎖固相合成において簡便、迅速、高感度かつ選択的に反応の進行状況をリアルタイムにてモニターすることができる手法を提供すること。【解決手段】固相に固定されている、水酸基又はＺ−ＣＨ２−ＣＯ−基（式中、Ｚはハロゲン又は−Ｏ−ＳＯ２−Ｒを示し、ここでＲは脂肪族又は芳香族炭化水素基を示す）で保護された水酸基を有する糖類と、式Ｘ−Ｙ（式中、Ｘはアゾ色素化合物の残基を示し、Ｙは糖の水酸基と反応しうる基を示す）の化合物とを反応させる工程、及び／又は、上記糖類と（ｐ−ニトロベンジル）ピリジンとを反応させる工程を含む、糖類中における水酸基が保護されているか否かを検出する方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相に固定されている水酸基を有する糖類と、式Ｘ−Ｙ（式中、Ｘはアゾ色素化合物の残基を示し、Ｙは糖の水酸基と反応しうる基を示す）の化合物とを反応させることを含む、糖類中における水酸基の存在を検出する方法。
【請求項２】
固相に固定されているＺ−ＣＨ２−ＣＯ−基（式中、Ｚはハロゲン又は−Ｏ−ＳＯ２−Ｒを示し、ここでＲは脂肪族又は芳香族炭化水素基を示す）で保護された水酸基を有する糖類と、（ｐ−ニトロベンジル）ピリジンとを塩基性条件下で反応させることを含む、糖類中における保護された水酸基の存在を検出する方法。
【請求項３】
固相に固定されている、水酸基又はＺ−ＣＨ２−ＣＯ−基（式中、Ｚはハロゲン又は−Ｏ−ＳＯ２−Ｒを示し、ここでＲは脂肪族又は芳香族炭化水素基を示す）で保護された水酸基を有する糖類と、式Ｘ−Ｙ（式中、Ｘはアゾ色素化合物の残基を示し、Ｙは糖の水酸基と反応しうる基を示す）の化合物とを反応させる工程、及び／又は、上記糖類と（ｐ−ニトロベンジル）ピリジンとを塩基性条件下で反応させる工程を含む、糖類中における水酸基が保護されているか否かを検出する方法。
【請求項４】
式Ｘ−Ｙの化合物が、Ｎ−［２−［（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）オキシ］エチル］−Ｎ−エチル−４−［（４−ニトロフェニル）アゾ］−ベンゼンアミドである、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項５】
Ｚ−ＣＨ２−ＣＯ−基がクロロアセチル基である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
固相に固定されている水酸基を有する第一の糖類と、該水酸基と反応する反応性基と保護された水酸基とを有する第二の糖類とを反応させて糖鎖を合成する方法において、水酸基の保護基がＺ−ＣＨ２−ＣＯ−基（式中、Ｚはハロゲン又は−Ｏ−ＳＯ２−Ｒを示し、ここでＲは脂肪族又は芳香族炭化水素基を示す）であり、固相に固定されている糖類中の水酸基または保護された水酸基の存在を、式Ｘ−Ｙ（式中、Ｘはアゾ色素化合物の残基を示し、Ｙは糖の水酸基と反応しうる基を示す）の化合物または（ｐ−ニトロベンジル）ピリジンとの反応によって検出する、糖鎖の合成反応の進行をモニターする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖鎖固相合成法における呈色反応による反応モニタリング法に関する。より詳細には、本発明は、水酸基、並びに水酸基の保護基であるクロロアセチル基の存在を呈色反応により検出することを特徴とする、糖鎖固相合成法における反応モニタリング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、糖鎖固相反応において反応の進行状況を確認するためには固相から反応産物を切り出すか、またはＭａｇｉｃ　ａｎｇｌｅ　ｓｐｉｎｎｉｎｇ　ＮＭＲなどの装置を必要としていた　（Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ，　Ｐ．　Ｈ．他、Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．，　１９９７，　３６，　４９１−４９３）。その他の手法としては、ＮＭＲにより測定可能な炭素同位体１３Ｃやフッ素原子を保護基に組み込んで測定する手法も知られていた（Ｋａｎｅｍｉｔｓｕ，　Ｔ．他、Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．，　１９９８，　３７，　３４１５−３４１８；　Ｍｏｇｅｍａｒｋ，　Ｍ．他、Ｏｒｇ．　Ｌｅｔｔ．，　２００１，　３，　１４６３−１４６６）。しかしながら、これらの方法は時間と労力を要するか、あるいは特殊な装置を必要とし、反応を逐一停止しないと測定できないという欠点があった。
【０００３】
ペプチド固相合成においてはアミノ基とニンヒドリンによるアミノ基の発色であるニンヒドリン反応により反応進行を呈色追跡確認する技術が確立され、自動合成機にも応用されている（Ｋａｉｓｅｒ，　Ｅ．他、Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９７０，　３４，　５９５−５９８）。
【０００４】
しかしながら、糖鎖固相合成に関しては主要な官能基に対する水酸基に対してペプチド合成におけるアミノ基と同様な発色法が開発されていなかったために簡便な呈色反応による反応モニタリングは開発されていなかった。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ，　Ｐ．　Ｈ．他、Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．，　１９９７，　３６，　４９１−４９３
【非特許文献２】
Ｋａｎｅｍｉｔｓｕ，　Ｔ．他、Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．，　１９９８，　３７，　３４１５−３４１８
【非特許文献３】
Ｍｏｇｅｍａｒｋ，　Ｍ．他、Ｏｒｇ．　Ｌｅｔｔ．，　２００１，　３，　１４６３−１４６６
【非特許文献４】
Ｋａｉｓｅｒ，　Ｅ．他、Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９７０，　３４，　５９５−５９８
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
固相合成法は自動合成の鍵技術であり、またコンビナトリアル・ケミストリーの基盤技術でもある。上記した通り、固相反応は過剰の試薬や基質を洗い流せることができる長所がある一方、反応の追跡が非常に難しいという欠点があった。本発明の目的は、糖鎖固相合成において簡便、迅速、高感度かつ選択的に反応の進行状況をリアルタイムにてモニターすることができる手法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、糖鎖固相合成における反応進行状況をリアルタイムで追跡する技術を開発することに成功した。即ち、グリコシル化反応、並びに一時的保護基の脱保護反応の２つの反応の繰り返しからなる糖鎖固相合成においては、水酸基のみならず、一時的な保護基の呈色反応も必要となる。そこで本発明者らは、一時的な保護基として糖鎖合成において汎用されているクロロアセチル基を（ｐ−ニトロベンジル）ピリジン（ＰＮＢＰ）　（下記反応式中の化合物１）と反応させて塩基性下において赤色を発色させることにより検出し、一方、水酸基はＤｉｅｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄ　（赤色色素）とｃｙａｎｕｒｉｃ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ複合体（下記反応式中の化合物２）　により検出することにより、糖鎖固相合成における反応進行状況をリアルタイムで追跡することに成功した。
【０００８】
【化１】
2004144689.tif 000002
【０００９】
クロロアセチル基などの水酸基の保護基を有する糖供与体を用いてグリコシル化反応を行うとグリコシル化反応の進行状況は水酸基の消失、すなわちＤｉｓｐｅｒｓｅＲｅｄの呈色反応の消失とＰＮＢＰの呈色反応の増大、クロロアセチル基などの水酸基の保護基の脱保護反応はＰＮＢＰの呈色反応の消失とＤｉｓｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄの呈色反応の増大により、簡便に追跡することができる。すなわち、本発明の方法によれば、固相から基質を切り出すことなくまた特殊な装置を必要とせずに、迅速にリアルタイムで固相反応を追跡することができる。また、必要とする固相樹脂の量は極少量である。
【００１０】
即ち、本発明によれば、固相に固定されている水酸基を有する糖類と、式Ｘ−Ｙ（式中、Ｘはアゾ色素化合物の残基を示し、Ｙは糖の水酸基と反応しうる基を示す）の化合物とを反応させることを含む、糖類中における水酸基の存在を検出する方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、固相に固定されているＺ−ＣＨ２−ＣＯ−基（式中、Ｚはハロゲン又は−Ｏ−ＳＯ２−Ｒを示し、ここでＲは脂肪族又は芳香族炭化水素基を示す）で保護された水酸基を有する糖類と、（ｐ−ニトロベンジル）ピリジンとを塩基性条件下で反応させることを含む、糖類中における保護された水酸基の存在を検出する方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、固相に固定されている、水酸基又はＺ−ＣＨ２−ＣＯ−基（式中、Ｚはハロゲン又は−Ｏ−ＳＯ２−Ｒを示し、ここでＲは脂肪族又は芳香族炭化水素基を示す）で保護された水酸基を有する糖類と、式Ｘ−Ｙ（式中、Ｘはアゾ色素化合物の残基を示し、Ｙは糖の水酸基と反応しうる基を示す）の化合物とを反応させる工程、及び／又は、上記糖類と（ｐ−ニトロベンジル）ピリジンとを塩基性条件下で反応させる工程を含む、糖類中における水酸基が保護されているか否かを検出する方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、式Ｘ−Ｙの化合物は、Ｎ−［２−［（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）オキシ］エチル］−Ｎ−エチル−４−［（４−ニトロフェニル）アゾ］−ベンゼンアミドである。
好ましくは、Ｚ−ＣＨ２−ＣＯ−基はクロロアセチル基である。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、固相に固定されている水酸基を有する第一の糖類と、該水酸基と反応する反応性基と保護された水酸基とを有する第二の糖類とを反応させて糖鎖を合成する方法において、水酸基の保護基がＺ−ＣＨ２−ＣＯ−基（式中、Ｚはハロゲン又は−Ｏ−ＳＯ２−Ｒを示し、ここでＲは脂肪族又は芳香族炭化水素基を示す）であり、固相に固定されている糖類中の水酸基または保護された水酸基の存在を、式Ｘ−Ｙ（式中、Ｘはアゾ色素化合物の残基を示し、Ｙは糖の水酸基と反応しうる基を示す）の化合物または（ｐ−ニトロベンジル）ピリジンとの反応によって検出する、糖鎖の合成反応の進行をモニターする方法が提供される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、固相に固定されている糖類の水酸基又は保護された水酸基の存在を検出する方法に関するものである。
糖類の水酸基は、糖類と式Ｘ−Ｙ（式中、Ｘはアゾ色素化合物の残基を示し、Ｙは糖の水酸基と反応しうる基を示す）の化合物とを反応させることにより検出することができる。
【００１６】
水酸基を検出するために使用する式Ｘ−Ｙ（式中、Ｘはアゾ色素化合物の残基を示し、Ｙは糖の水酸基と反応しうる基を示す）の化合物について説明する。
式Ｘ−Ｙの化合物は、Ｘで示されるアゾ色素成分を含有するため着色しており、またＹで示される基により糖の水酸基と結合することができる化合物である。固相に固定された水酸基を有する糖と式Ｘ−Ｙの化合物とを反応させることにより固相に式Ｘ−Ｙの化合物が固定され、固相の着色の有無を判別することにより、糖中における水酸基の有無を検出することができる。
【００１７】
Ｘで示されるアゾ色素成分の具体例としては、
Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄ　（一般名）：２−［エチル［４−［（４−ニトロフェニル）アゾ］フェニル］アミノ］−エタノール；
【化２】
2004144689.tif 000003
Ｂａｓｉｃ　Ｂｌｕｅ　４１（一般名）：　２−［４−［エチル（２−ヒドロキシエチル）アミノ］フェニル］アゾ］−６−メトキシ−３−メチル−ベンゾチアゾリウムメチル硫酸塩；
【化３】
2004144689.tif 000004
Ｃｏｎｇｏ　Ｒｅｄ（一般名）：１−［［３−メチル−４−［（３−メチルフェニル）アゾ］フェニル］アゾ−ナフタノール　；
【化４】
2004144689.tif 000005
Ｓｕｄａｎ　Ｒｅｄ　７Ｂ　（一般名）：Ｎ−エチル１−［［４−（フェニルアゾ）−フェニルアゾ］−２−ナフタレンアミン；
【化５】
2004144689.tif 000006
Ｃｏｎｇｏ　Ｒｅｄ　（一般名）：３，３’−［［１，１’−ビフェニル−］　−４，４’−ジイルビス（アゾ）−］ビス［４−アミノ］−１−ナフタレンスルホン酸ジナトリウム塩；及び、
【化６】
2004144689.tif 000007
５−アミノ−３−［（１Ｅ）−フェニルアゾ］−４−ヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン酸ジナトリウム塩；
【化７】
2004144689.tif 000008
などが挙げられる。
【００１８】
Ｙで示される糖の水酸基と反応しうる基の具体例としては、ハロゲン、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ（Ｒは脂肪族又は芳香族炭化水素基を示す）、イソチオシアネート、クロロトリアジン誘導体などが挙げられる。
【００１９】
式Ｘ−Ｙの化合物の好ましい具体例としては、
Ｎ−［２−［（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）オキシ］エチル］−Ｎ−エチル−４−［（４−ニトロフェニル）アゾ］−ベンゼンアミド、
Ｐｒｏｃｉｏｎ　Ｒｅｄ　ＭＸ−５Ｂ（一般名）；５−［（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ］−４−ヒドロキシ−３−フェニルアゾ２，７−ナフタレンジスルホン酸ジナトリウム塩、
【化８】
2004144689.tif 000009
Ｃｉｂａｃｒｏｎ　Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｒｅｄ　ＭＸ−５Ｂ（一般名）、５−（ベンゾイルアミノ）−３−［［５−［［４−クロロ−６−［（４−スルホフェニル）アミノ］−１，３，５−トリアジン−２−イル］アミノ］−２−スルホフェニル］アゾ］−４−ヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン酸塩ジナトリウム塩、
【化９】
2004144689.tif 000010
などが挙げられる。
【００２０】
また、糖類中のＺ−ＣＨ２−ＣＯ−基で保護された水酸基は、糖類と（ｐ−ニトロベンジル）ピリジンとを塩基性条件下で反応させることによって検出することができる。
【００２１】
上記式中、Ｚはハロゲン又は−Ｏ−ＳＯ２−Ｒを示し、ここでＲは脂肪族又は芳香族炭化水素基を示す。ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素が挙げられるが、好ましくは塩素である。また、Ｒが示す脂肪族又は芳香族炭化水素基としては、メチル、エチル、プロピル又はブチルなどの低級（例えば、炭素数１〜６程度の）アルキル基又はフェニル又はナフチルなどの炭素数６〜１２のアリール基などが挙げられ、これらが組み合わせて成るアルキル基でもよい。Ｚ−ＣＨ２−ＣＯ−基の特に好ましい例は、クロロアセチル基である。
【００２２】
固相に固定されているＺ−ＣＨ２−ＣＯ−基（式中、Ｚはハロゲン又は−Ｏ−ＳＯ２−Ｒを示し、ここでＲは脂肪族又は芳香族炭化水素基を示す）で保護された水酸基を有する糖類と、（ｐ−ニトロベンジル）ピリジンとを塩基性条件下で反応させることにより、呈色反応が生じる。ここで言う塩基性条件下とは、好ましくはピリジン、アミン類（例えば、Ｎ，　Ｎ’−ジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルフォリンなど）、アニリン類（例えば、アニリン、Ｎ−メチルアニリン、ｐ−トルイジンなど）などの弱塩基の存在下で反応を行うことを言う。この呈色の有無を判別することにより、Ｚ−ＣＨ２−ＣＯ−基で保護された水酸基の存在を検出することができる。
【００２３】
上記した本発明の方法を利用して糖鎖の合成反応の進行をモニターすることができる。糖鎖の合成は、固相に固定されている第一の糖類に第二の糖類を反応させて行う。糖鎖の合成反応は、当業者に公知の常法により行うことができる。
【００２４】
固相に固定されている第一の糖類は、必要に応じて保護基を有している水酸基を有している。この水酸基の保護基は、次に行われる第二の糖類との反応の際に適宜、脱保護する必要がある。本発明では、水酸基の保護基としてＺ−ＣＨ２−ＣＯ−基（式中、Ｚはハロゲン又は−Ｏ−ＳＯ２−Ｒを示し、ここでＲは脂肪族又は芳香族炭化水素基を示す）を使用する。この保護基の存在は、上記した通り（ｐ−ニトロベンジル）ピリジンと塩基性条件下で呈色反応を行うことにより検出することができる。また、保護基が脱保護された水酸基は、式Ｘ−Ｙ（式中、Ｘはアゾ色素化合物の残基を示し、Ｙは糖の水酸基と反応しうる基を示す）の化合物との反応により検出することができる。本発明においては、この２種類の反応により水酸基の保護及び脱保護の状態をモニターすることにより、糖鎖の合成反応の進行をモニターすることができる。
【００２５】
本発明で用いる固相は糖を固定化でき、洗浄・分離などの操作を行うことができるものであれば特に限定されず、通常の糖鎖の固相合成方法で使用するものを使用することができる。本発明で用いることができる固相担体の具体例としては、マイクロプレート、ビーズ、チューブ、メンブレン、ゲル、微粒子状固相担体〔例えばアガロース粒子、ゼラチン粒子、カオリン粒子、合成ポリマー粒子（ラテックス粒子等）〕等が挙げられ、これらの中でも微粒子状固相担体を用いることが好ましい。
【００２６】
本発明で用いることができる糖類の種類は特に限定されず、単糖、二糖、又は三糖以上の多糖の何れでもよい。より具体的には、エリスロース、スレオース等のテトラオース、リボース、アラビノース、キシロース等のペントース、グルコース、マンノース、ガラクトース、アロース、タロース等のヘキソース、または２−デオキシグルコース、２−デオキシリボース等これらの糖の一部がデオキシ化された糖あるいは２−アセトアミド−２−デオキシグルコース等のアミノ糖、さらには、ラクトース、キトビオース等のようにこれらの糖が相互にエーテル結合したオリゴ糖や、シアル酸、グルクロン酸などを挙げることができる。また、これらの糖にはＤ体、Ｌ体が存在するが、そのいずれでも、また、混合物でも使用できる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００２７】
【実施例】
（１）Ｎ−［２−［（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）オキシ］エチル］−Ｎ−エチル−４−［（４−ニトロフェニル）アゾ］−ベンゼンアミドの合成；
【００２８】
【化１０】
2004144689.tif 000011
【００２９】
Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄ　Ｉ　（２．００ｇ，　６．３６　ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍＬ，　６．３６　ｍｍｏｌ）　をＣＨ２Ｃｌ２　（５０　ｍＬ）に溶解し、ｃｙａｎｕｒｉｃ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　（１．１７　ｇ，　６．３６　ｍｍｏｌ，　ｌａｃｈｒｙｍａｔｏｒ）　を０°Ｃで加えた。反応液を室温にて終夜撹拌し、酢酸エチル（１００　ｍＬ）　で薄めた後、冷飽和食塩水（３０　ｍＬ）で有機層を洗浄した。水層を酢酸エチル（３０　ｍＬ）　で抽出し、あわせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、溶媒を減圧濃縮し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ　９：１　−　１：１）で精製し、目的物（２．０５　ｇ　７０％）を得た。
１Ｈ　ＮＭＲ　δ８．３４（ｄｄ，　Ｊ＝９．２Ｈｚ，　２Ｈ），　８．０−７．９（ｍ，　３Ｈ），　６．８７（ｄ，　Ｊ＝９．２Ｈｚ，　２Ｈ），　４．７１（ｔ，　Ｊ＝６．４Ｈｚ，　２Ｈ），　３．８９（ｔ，　Ｊ＝６．０Ｈｚ，　２Ｈ），　３．６２（ｑ，　Ｊ＝７．６Ｈｚ，　２Ｈ），　１．２６（ｔ，　Ｊ＝７．６Ｈｚ，　３Ｈ）．
【００３０】
（２）ＰＮＢＰ　法によるクロロアセチル基発色の典型的実験方法；
反応液中の数粒の樹脂をミクロチューブに移し、（ｐ−ニトロベンジル）ピリジントルエン溶液　（８０　ｍｇ／１０　ｍＬ）を約０．３　ｍＬ　加えた。５分後、固相樹脂をシリカゲル薄層上に溶液ごと広げ、ホットプレート上で１分加熱した。その後、１０％　ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ　トルエン溶液を噴霧し、１０秒ホットプレート上で加熱した。樹脂の色は裸眼で観察、またはＣＣＤ　カメラ付き顕微鏡（２８０ｘ，　ＣＣＤ　Ｍｉｃｒｏ　Ｓｃｏｐｅ　Ｉｎｆ−５５０（Ｍｏｒｉｔｅｘ））によりコンピュータに画像として取り込むことも可能であった。
【００３１】
（３）Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄ−ｃｙａｎｕｒｉｃ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　複合体による水酸基発色法の典型的実験項；
反応液中の数粒の樹脂をミクロチューブに移し、ＴＨＦ　（０．１　ｍＬ）　に膨潤させた。１％ＤｉｓｐｅｒｓｅＲｅｄ　ＴＨＦ　溶液（０．１　ｍＬ），　０．５％　ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ，　ＴＨＦ　溶液を一滴加え、１０分放置した。１０分後、上澄み溶液を捨て、ＴＨＦ，　ＤＭＦ　により固相樹脂を上澄み液が透明になるまで洗浄した。樹脂の色は裸眼で観察、またはＣＣＤ　カメラ付き顕微鏡によりコンピュータに画像として取り込むことも可能であった。
【００３２】
（４）糖鎖合成のモニタリング
【００３３】
【化１１】
2004144689.tif 000012
【００３４】
カルボン酸３　（４１１．０　ｍｇ，　０．５６３　ｍｍｏｌ）　とＴｅｎｔａｇｅｌ　型固相樹脂４　（１．５０　ｇ，　１．３７５　ｍｍｏｌ）の塩化メチレン懸濁液（１０　ｍＬ）　に１，３−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　（８８　μＬ，　０．５６３　ｍｍｏｌ）　を室温にて滴下した。反応液を終夜震盪し、固相樹脂をろ過した。固相樹脂を順次塩化メチレン、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、メタノール、エーテルにより洗浄した。その後、真空乾燥した。ＰＮＢＰ　法、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄ　法により反応が進行していたが、完結していないことが確かめられた（ＰＮＢＰ　法、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄ　法両法ともに呈色反応有り）（図１の一番上の図）。未反応の水酸基を不活性化するためにアセチル化を行った。固相樹脂を塩化メチレン（７　ｍＬ）　に懸濁し、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ　（０．６　ｍＬ）と　Ａｃ２Ｏ　（０．３　ｍＬ）　を滴下した。反応液を２時間震盪させ、固相樹脂をろ過し、順次塩化メチレン、メタノール、塩化メチレン、エーテルにより洗浄した後、真空乾燥した（アセチル化後、ＰＮＢＰ　法で呈色有り、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄ　法で呈色反応なし）。
【００３５】
【化１２】
2004144689.tif 000013
【００３６】
固相樹脂５　（１．５０　ｇ）　をＤＭＦ　（１０　ｍＬ）　に懸濁し、ｈｙｄｒａｚｉｎｅｄｉｔｈｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ溶液　（０．３７　Ｍ，　２．９　ｍｍｏｌ）を滴下し、室温して１時間震盪した。固相樹脂をろ過し、順次ＤＭＦ，　塩化メチレン、メタノール、エーテルで洗浄した後、真空乾燥した（ＰＮＢＰ　法では呈色反応無し、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄ　法では呈色反応有り）。呈色反応によりクロロアセチル基を脱保護されていることが明らかになった（図１の上から２番目の図）。
【００３７】
【化１３】
2004144689.tif 000014
【００３８】
固相樹脂６　（１．５０　ｇ）　と糖供与体７　を塩化メチレン（１０　ｍＬ）　に懸濁させ、ＢＦ３・ＯＥｔ２　（０．３　ｍＬ）を滴下した。反応液を終夜室温にて震盪した。固相樹脂を順次ＤＭＦ，メタノール、塩化メチレン、エーテルにて洗浄し、真空乾燥した（ＰＮＢＰ　法では呈色反応有り、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄ　法では呈色反応無し）（図１の上から３番目の図）。グリコシル化反応が進行し、水酸基が消失していることが明らかになった。
【００３９】
この固相樹脂のうち、２００　ｍｇをメタノール（３　ｍＬ）　に懸濁し、ＮａＯＭｅ　（０．１５　ｍＬ，２８％メタノール溶液）を室温にて滴下した。終夜撹拌した後、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ　１５Ｅ　にて反応液を中和した。固相樹脂をろ過し、ろ液を減圧濃縮した後、残さをプレパラティブシリカゲル薄層クロマトグラフィーで精製し、化合物８　を得た。切り出された２糖は高純度であった。
１Ｈ　ＮＭＲ　δ７．３−７．２（ｍ，　１０Ｈ），　５．０３（ｄ，　Ｊ＝１１．２Ｈｚ，　１Ｈ），　４．８７（ｄ，　Ｊ＝１１．７Ｈｚ，　１Ｈ），　４．８０（ｄ，　Ｊ＝１１．２Ｈｚ，　１Ｈ），　４．７０（ｄ，　Ｊ＝１２．４Ｈｚ，　１Ｈ），　４．６６（ｄ，　Ｊ＝１２．０Ｈｚ，　１Ｈ），　４．６４（ｄ，　Ｊ＝１２．４Ｈｚ，　１Ｈ），　４．４２（ｄ，　Ｊ＝７．６Ｈｚ，　１Ｈ），　３．８−３．７（ｍ，　２Ｈ），　３．７−３．３（ｍ，　１３Ｈ），　３．２８（ｍ，　１Ｈ），　３．２７（ｍ，　１Ｈ）
【００４０】
【化１４】
2004144689.tif 000015
【００４１】
固相樹脂９　（５００　ｍｇ）　をＤＭＦ　（５　ｍＬ）　に懸濁し、ｈｙｄｒａｚｉｎｅｄｉｔｈｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ溶液（０．３７　Ｍ，　２．９　ｍｍｏｌ）を滴下し、室温して１時間震盪した。固相樹脂をろ過し、順次ＤＭＦ，　塩化メチレン、メタノール、エーテルで洗浄した後、真空乾燥した（ＰＮＢＰ　法では呈色反応無し、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄ　法では呈色反応有り）。クロロアセチル基が脱保護されていることが明らかになった。
【００４２】
【化１５】
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【００４３】
固相樹脂１０　（５００　ｍｇ）　と糖供与体　７　（４６４　ｍｇ）　を塩化メチレン（４ｍＬ）　に懸濁し、ＢＦ３・ＯＥｔ２　（０．１５　ｍＬ）　を加え、室温にて１３時間震盪した。固相樹脂をろ過した後、塩化メチレン、メタノール、ＤＭＦ、塩化メチレンで順次洗浄し、真空乾燥を行った（ＰＮＢＰ　法では呈色反応有り、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄ　法では呈色反応無し）（図１の上から４番目の図）。水酸基が消失し、グリコシル化反応が進行していることが明らかになった。
【００４４】
この固相樹脂のうち、２００　ｍｇをメタノール（３　ｍＬ）　に懸濁し、ＮａＯＭｅ　（０．１５　ｍＬ，２８％メタノール溶液）を室温にて滴下した。終夜撹拌した後、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ　１５Ｅ　にて反応液を中和した。固相樹脂をろ過し、ろ液を減圧濃縮した後、残さをプレパラティブシリカゲル薄層クロマトグラフィーで精製し、化合物１５を得た。切り出された４糖は高純度であった。
【００４５】
【化１６】
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【００４６】
１Ｈ　ＮＭＲδ（ＣＤ３ＯＤ）７．３−７．２（ｍ，２５Ｈ），　４．９９（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ），　４．９４（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ），４．８４（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），　４．８２（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），　４．６−４．５（ｍ，３Ｈ），　４．４９（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，　１Ｈ），　４．４５（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ），　４．３５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），　４．３１（ｄ，ｄ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），　４．０６（ｍ，１Ｈ），　３．９−３．８（ｍ，２Ｈ），　３．５７（ｍ，１Ｈ），　３．６−３．３（ｍ，１４Ｈ），　３．０４（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），　２．６２（ｍ，１Ｈ）；
１３Ｃ　ＮＭＲδ１３９．９８（Ｃ），１３９．８８（Ｃ），１３９．７０（Ｃ），１３９．４２（Ｃ），１３８．９１（Ｃ），１２９．５６（ＣＨ），　１２９．４１（ＣＨ），１２９．１３（ＣＨ），１２９．０９（ＣＨ），１２９．１３（ＣＨ），１２９．０９（ＣＨ），１２９．０６（ＣＨ），１２９．０３（ＣＨ），１２８．９７（ＣＨ），１２８．８３（ＣＨ），１２８．６７（ＣＨ），１２８．５４（ＣＨ），１２８．４９（ＣＨ），１２８．４５（ＣＨ），　１２８．３４（ＣＨ），１０５．０９（ＣＨ），１０４．５６（ＣＨ），１０４．０９（ＣＨ），１０３．００（ＣＨ），８５．２５（ＣＨ），８３．７０（ＣＨ），７９．０８（ＣＨ），７８．７９（ＣＨ），７８．３９（ＣＨ），７８．２６（ＣＨ），７７．８８（ＣＨ），７７．７８（ＣＨ），７７．４４（ＣＨ），７６．７５（ＣＨ），７６．５７（ＣＨ），７６．４６（ＣＨ），７６．０９（ＣＨ），７６．００（ＣＨ２），７５．９２　（ＣＨ２），　７７．７２（ＣＨ），　７５．６１（ＣＨ２），７５．４７（ＣＨ），７５．０７（ＣＨ２），７１．８２（ＣＨ２），６９．３３（ＣＨ２），６２．４３（ＣＨ２），６２．３６（ＣＨ２），６２．０７（ＣＨ２）．
【００４７】
【化１７】
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【００４８】
固相樹脂６　（２００　ｍｇ）　と糖供与体１２　を塩化メチレン　（２　ｍＬ）　に懸濁し、ＢＦ３・ＯＥｔ２（３０　ｍＬ）　を滴下した。反応液を１２時間震盪させ、固相樹脂をろ過した後、塩化メチレン、メタノール、ＤＭＦ，　塩化メチレンで洗浄した。（ＰＮＢＰ　法では呈色反応有り、Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｒｅｄ　法では呈色反応無し）
【００４９】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、糖鎖固相合成において簡便、迅速、高感度かつ選択的に反応の進行状況をリアルタイムにてモニターすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、水酸基の脱保護を含む糖鎖合成の進行を本発明の方法でモニターした結果を示す。
【図１】
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