(57)【要約】【目的】アミノ酸配列分析において用いられる支持試薬ヘキサジメトリン塩の精製法を提供する。【解決手段】粗ヘキサジメトリン塩を水に溶解し、これに水溶性の有機溶媒を添加してヘキサジメトリン塩を析出させることにより、必要時に、簡便かつ高度にヘキサジメトリン塩を精製する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粗ヘキサジメトリン塩を水に溶解し、これに水溶性の有機溶媒を添加し、ヘキサジメトリン塩を析出させることを特徴とするヘキサジメトリン塩の精製方法。
【請求項２】
析出したヘキサジメトリン塩を沈降により分離する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
有機溶媒が、エタノール、ｉｓｏ−プロパノール、アセトン、およびｎ−プロパノールからなる群から選ばれるものである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（１）ヘキサジメトリン塩の水溶液にエタノールを添加し、（２）析出したヘキサジメトリン塩を沈殿させ、（３）生成した沈殿を分離することを特徴とするヘキサジメトリン塩の精製方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法により精製されたヘキサジメトリン塩。
【請求項６】
アミノ酸配列分析装置に用いるヘキサジメトリン塩であって、これをアミノ酸配列分析の支持試薬として用いたときに、該塩に含有される不純物由来のピーク値が１ｐｍｏｌ以下であることを特徴とするヘキサジメトリン塩。
【請求項７】
請求項１〜４の何れかに記載の方法によりヘキサジメトリン塩を精製し、これをアミノ酸配列分析におけるペプチドまたはタンパク質の支持試薬として用いることを特徴とするアミノ酸配列分析方法。
【請求項８】
請求項１〜４の何れかに記載の方法により精製されたヘキサジメトリン塩が固定化されたアミノ酸配列分析に用いるためのペプチドまたはタンパク質の支持体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ酸配列分析に用いられる支持試薬ヘキサジメトリン塩の精製方法、該方法により得られるヘキサジメトリン塩、該ヘキサジメトリン塩を用いるアミノ酸配列の分析方法、および、該ヘキサジメトリン塩が固定化された支持体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリアミン系化合物であるヘキサジメトリン塩（Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎ　ｓａｌｔ）は、自動化されたアミノ酸配列分析装置を用いる分析において最も一般的に使われているタンパク質またはペプチドの支持試薬であり、中でも臭化ヘキサジメトリン（化学名：１，３−Ｄｉｂｒｏｍｏｐｒｏｐａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ　ｐｏｌｙｍｅｒ、慣用名：ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ））が広く用いられている。
【０００３】
エドマン法（Ｅｄｍａｎ，　Ｐ．，　Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２２，　４７５−４７６　（１９４９））を応用した自動アミノ酸配列分析装置は、ペプチドやタンパク質をガラスフィルター等に吸着させて、そのＮ末端のアミノ酸のアミノ基とフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）とを反応させ（カップリング反応）、それをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で切断してＮ末端のアミノ酸をＡＴＺアミノ酸（２−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体）として遊離させて（切断反応）、これにＴＦＡを作用させてＰＴＨアミノ酸（３−フェニル−２−チオヒダントン誘導体）へ転換させ（転換反応）、このＰＴＨアミノ酸をＨＰＬＣカラムで分離・溶出して検出するという各工程を自動化したものである。このうちカップリング反応および切断反応はガラスフィルター上で行われるが、この時に多くの化学試薬や溶媒がこのガラスフィルター上を通過する。従って、ペプチドまたはタンパク質が完全に吸着されていないと、それらの化学試薬や溶媒で洗い流されて収率が低下してしまう。そこで、ガラスフィルターにペプチドまたはタンパク質を確実に吸着させるために支持試薬として繁用されているのが、ヘキサジメトリン塩である。
【０００４】
極微量の試料を用いるアミノ酸配列分析では、わずかなバックグラウンドの上昇や不純物の混入でも検出したいアミノ酸のピークが隠れてしまい、検出感度を大きく低下させてしまう。検出感度を上昇させ、繰り返し収率（ｎサイクル目と（ｎ＋１）サイクル目のＰＴＨアミノ酸の収量の比率であって、何サイクル目のアミノ酸残基まで分析が可能であるかを示す指標）を向上させるためには、バックグラウンドを低く維持することは非常に重要である。
【０００５】
アミノ酸配列分析においてバックグラウンドに影響する要因の一つとして、支持試薬として用いられるヘキサジメトリン塩の純度が挙げられるが、市販のヘキサジメトリン塩に混入するアミノ酸や製造過程において生じる分解物等の不純物の存在量は、ｐｍｏｌもしくはｆｍｏｌレベルと推測されている。近年、アミノ酸配列分析に求められる感度はｐｍｏｌレベル、ｆｍｏｌレベルへと高まってきており、１ｐｍｏｌのレベルで分析が可能な装置が開発されている。このような装置を用いた分析では、前記したようなｐｍｏｌもしくはｆｍｏｌレベルの不純物であっても問題となるが、このような極微量の不純物を取り除いてより高度に精製する方法は知られていない。
【０００６】
例えば、”Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（ｅｄ，ｂｙ　Ｔ，−Ｙ．Ｌｉｕ，　Ａ，Ｎ．Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，　Ｒ，Ｌ．Ｈｅｉｎｒｉｋｓｏｎ，　Ｐ．Ｇ．Ｃｏｎｄｌｉｆｆｅ，　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，　Ｏｘｆｏｒｄ，　ｐ．７５−１１０）では、臭化ヘキサジメトリンをイオン交換樹脂カラムおよび酸化アルミナカラムにより精製する方法を開示しているが、この方法では、不純物のピークが消失するように精製を行うと、測定対象であるＰＴＨアミノ酸のピークの一部までもが相対的に低下する現象が起こってしまうと報告されている。また、操作は非常に煩雑で、労力を要する手法であった。一方、より簡便な手法として、Ｌ．Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　２５９，　８２９３−８３０３　（１９８４））は、アミノ酸配列分析装置のガラスフィルター上にヘキサジメトリン塩を固定化した後に、ペプチドまたはタンパク質を吸着させる前に数サイクル空運転を行い、ヘキサジメトリン塩に含まれる不純物を洗い流す方法を報告している。この方法は現在も多用されているが、長時間を要し試薬等の消費を伴う上に、ｐｍｏｌもしくはｆｍｏｌレベルの不純物を取り除くことはできなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アミノ酸配列分析において用いられる支持試薬ヘキサジメトリン塩の精製法を提供するためになされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、支持試薬としてヘキサジメトリン塩を用いるアミノ酸配列分析において、バックグラウンドが上昇して高感度での分析が妨害される等の問題点があり、分析結果にばらつきを生じることに着目して、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた。その結果、粗ヘキサジメトリン塩を水に溶解し、これに水溶性の有機溶媒を添加してヘキサジメトリン塩を析出させれば、必要時に、簡便かつ高度にヘキサジメトリン塩を精製できることを見出した。また、この方法により精製されたヘキサジメトリン塩を支持試薬として用いれば、高感度でアミノ酸配列分析が行えることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００９】
すなわち本発明によれば、
（１）粗ヘキサジメトリン塩を水に溶解し、これに水溶性の有機溶媒を添加し、ヘキサジメトリン塩を析出させることを特徴とするヘキサジメトリン塩の精製方法、
（２）析出したヘキサジメトリン塩を沈降により分離する工程をさらに含む上記（１）に記載の方法、
（３）有機溶媒が、エタノール、ｉｓｏ−プロパノール、アセトン、およびｎ−プロパノールからなる群から選ばれるものである上記（１）または（２）に記載の方法、
（４）（ｉ）ヘキサジメトリン塩の水溶液にエタノールを添加し、（ｉｉ）析出したヘキサジメトリン塩を沈殿させ、（ｉｉｉ）生成した沈殿を分離することを特徴とするヘキサジメトリン塩の精製方法、
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法により精製されたヘキサジメトリン塩、
（６）アミノ酸配列分析装置に用いるヘキサジメトリン塩であって、これをアミノ酸配列分析の支持試薬として用いたときに、該塩に含有される不純物由来のピーク値が１ｐｍｏｌ以下であることを特徴とするヘキサジメトリン塩、
（７）上記（１）〜（４）の何れかに記載の方法によりヘキサジメトリン塩を精製し、これをアミノ酸配列分析におけるペプチドまたはタンパク質の支持試薬として用いることを特徴とするアミノ酸配列分析方法、
（８）上記（１）〜（４）の何れかに記載の方法により精製されたヘキサジメトリン塩が固定化されたアミノ酸配列分析に用いるためのペプチドまたはタンパク質の支持体
が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
１．ヘキサジメトリン塩の精製方法
本発明のヘキサジメトリン塩の精製方法は、粗ヘキサジメトリン塩を水に溶解し、これに水溶性の有機溶媒を添加し、ヘキサジメトリン塩を析出させることを特徴としている。
【００１１】
ヘキサジメトリン塩としては、ポリアミン化合物ヘキサジメトリンの塩であって、水に溶解し得るものであればいかなるものでも用いることができるが、具体的には、例えば、臭化ヘキサジメトリン（化学名：１，３−Ｄｉｂｒｏｍｏｐｒｏｐａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ　ｐｏｌｙｍｅｒ、一般名：ポリブレン、（Ｃ１３Ｈ３０Ｂｒ２Ｎ２）ｘ）等が挙げられる。臭化ヘキサジメトリンは、アミノ酸配列分析の支持試薬等として広く用いられ、市販されている。
【００１２】
ヘキサジメトリン塩は、タンパク質、ペプチド、またはアミノ酸等を高度に吸着する性質を有するために、種々の操作過程において混入する極微量のアミノ酸をも吸着して汚染されてしまう。また、ヘキサジメトリン塩は化学合成により調製されることから、市販の試薬グレードのものでも製造過程において生じる分解物等が残存し、純度にばらつきが見られることがある。アミノ酸配列分析の支持試薬として用いられる場合には、このような極微量の不純物の混入であってもピークを生じてしまい、試料由来の検出すべきピークを隠したり、それとの区別が不可能であったりして、高感度かつ高精度の分析を妨害する。特に、各アミノ酸と同じ保持時間のピークを示す不純物の混入は非常に問題となる。
【００１３】
要求されるヘキサジメトリン塩の純度は、用いる分析装置の検出感度、ガラスフィルター等に固定化されて分析に用いられるヘキサジメトリン塩の量（以下、これを「支持試薬量」と称することがある）等によっても異なることから、これらを鑑みて目的の分析に十分な純度が達成されていればよい。例えば、アプライドバイオシステム社製タンパク質シーケンサー４９２ｃＬＣ等の１ｐｍｏｌレベルでアミノ酸の分析・検出が可能な装置を用いて、該装置において推奨される支持試薬量で分析を行う場合には、該支持試薬量中に含まれる不純物由来のピーク値が１ｐｍｏｌ以下、好ましくは５００ｆｍｏｌ以下、より好ましくは３００ｆｍｏｌ以下、さらに好ましくは１００ｆｍｏｌ以下、特に好ましくは５０ｆｍｏｌ以下のヘキサジメトリン塩が好ましく用いられる。ヘキサジメトリン塩に含まれる全ての不純物が完全に除去されていなくてもよいが、各アミノ酸と同じ保持時間のピークを有する不純物由来のピーク値が前記濃度以下であることが好ましい。
【００１４】
アミノ酸配列分析装置においては、通常、ＰＴＨアミノ酸が装置内に組み込まれているＨＰＬＣカラムを通ることにより分離され、続いて検出装置において検出されてグラフとしてデータを得ることができる。従って、上記したようなヘキサジメトリン塩に含まれる不純物の濃度とは得られたグラフ上のピーク値であり、すなわち、ＰＴＨアミノ酸の測定値に換算された値として得られるものである。このようなヘキサジメトリン塩に含まれる不純物の濃度は、例えば、精製していないヘキサジメトリン塩を用いたアミノ酸配列分析と、濃度既知の内標準物質等を用いた分析とを行い、得られた各グラフを比較することにより換算して求めることができる。内標準物質としては、例えば、ＰＴＨアミノ酸等が好ましく用いられ、市販の内標準物質溶液等を用いればさらに簡便に行うことができる。ここで、ＰＴＨアミノ酸２０種が混合された溶液を用いた場合には、濃度だけでなく各アミノ酸のピーク位置も決定することができ、ヘキサジメトリン塩由来の不純物が示すピークが、どのような濃度で、どのアミノ酸の検出を妨害するかを決定することができる。
【００１５】
上記のような濃度以上の不純物を含むヘキサジメトリン塩は、これを自動アミノ酸配列分析装置のペプチドまたはタンパク質の支持試薬として用いた場合に該不純物由来のピークを有し、これが分析を妨害する要因となり得ることから、本発明の精製方法を用いて精製してから用いることが好ましい。本明細書においては、上記したような濃度以上の不純物を含むヘキサジメトリン塩を「粗ヘキサジメトリン塩」と称することがある。すなわち、「粗ヘキサジメトリン塩」とは、自動アミノ酸配列分析装置による分析に通常の支持試薬量で用いられた場合に、アミノ酸由来のピークと同じ位置に前記した濃度以上のピーク値を示す不純物を含有するヘキサジメトリン塩である。
【００１６】
粗ヘキサジメトリン塩を溶解する水としては、それ自体が前記したような不純物を含まない水であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、蒸留水、高速液体クロマトグラフィー用蒸留水、市販の純水製造装置（例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製等）により精製された水等が好ましく用いられる。これらの適当量を、粗ヘキサジメトリン塩に加え、必要に応じて攪拌等の操作を行い完全に溶解することが好ましい。このとき、ヘキサジメトリン塩の濃度としては、ヘキサジメトリン塩の溶解度を基準にして適当な範囲を設定すればよいが、濃度が低すぎると析出したヘキサジメトリン塩を回収する際に全量の回収が困難になることから、飽和して析出しない程度に高い濃度で溶解するのがよい。例えば、臭化ヘキサジメトリンの場合には、水への溶解度が０．１ｇ／ｍｌであることから、０．０１〜０．１ｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５〜０．１ｇ／ｍｌの濃度で溶解することが好ましい。
【００１７】
次いで、粗ヘキサジメトリン塩を溶解した水に水溶性の有機溶媒を添加して、ヘキサジメトリン塩を析出させる。用いる有機溶媒としては、水溶性であって、粗ヘキサジメトリン塩を溶解した水に対して適当な比率で添加した場合にヘキサジメトリン塩を析出させる性質を有するものであればいかなるものでも用い得る。ここで、添加量が多すぎると、析出したヘキサジメトリン塩の回収率が低下するだけでなく、溶媒を多量に消費するためにコストがかかったり、廃液処理上の問題等を生じることがある。従って、少ない添加量で効率的にヘキサジメトリン塩を析出させることのできる有機溶媒を選択して用いることが好ましい。具体的には、例えば、上記したような濃度で粗ヘキサジメトリン塩を溶解した水に対して、１倍量〜１９倍量、好ましくは１倍量〜９倍量を加えたときに、効率的にヘキサジメトリン塩を析出させることのできる有機溶媒を選択して用いる。具体的には、例えば、エタノール、ｉｓｏ−プロパノール、アセトン、ｎ−プロパノール等の一般的な有機溶媒が用いられるが、中でも特に少ない添加量でヘキサジメトリン塩を析出させることができ、廃液処理上の問題等の少ないエタノールが好ましく用いられる。これらの有機溶媒は、それ自体が前記したような濃度以上の不純物を含まないものを用いることが好ましい。各有機溶媒の添加量は、粗ヘキサジメトリン塩を溶解した一定量の水に何通りかの量で有機溶媒を添加し、最も効率的にヘキサジメトリン塩を析出させることのできる添加量を実験的に求め、決定すればよい。
【００１８】
かくして析出させたヘキサジメトリン塩を分離し、高度に精製された本発明のヘキサジメトリン塩を得ることができる。分離する方法としては、沈降による方法、カラムによる方法等が挙げられるが、沈降による方法が好ましく用いられ、中でも遠心分離法が特に好ましく用いられる。具体的には、例えば、適当なチューブ等の中で粗ヘキサジメトリン塩を溶解した水に有機溶媒を添加し、ヘキサジメトリン塩を析出させて、これを遠心分離機に供して遠心分離する。分離後、上清を除去すれば、沈殿として精製されたヘキサジメトリン塩を得ることができる。得られたヘキサジメトリン塩の沈殿は、例えば、デシケーター等の中で乾燥させた後、４℃以下で保存することができる。また、不純物を含まない水等に再度溶解し分注して、４℃以下、好ましくは−２０℃以下で保存することができる。
【００１９】
上記した本発明のヘキサジメトリン塩の精製法において、最も好ましい態様として、粗ヘキサジメトリン塩を水に溶解し、この水溶液にエタノールを添加し、析出したヘキサジメトリン塩を沈殿させ、生成した沈殿を分離することを特徴とする方法が用いられる。さらには、飽和しない程度に高い濃度で溶解したヘキサジメトリン塩の水溶液に対して、４倍量〜９倍量のエタノールを添加することが好ましい。また、生成した沈殿の分離は遠心分離により行われることが好ましい。
【００２０】
かくして精製されたヘキサジメトリン塩は、それ自体公知の通常用いられる方法に従って、自動アミノ酸配列分析装置に適当な支持試薬量で用いられた場合に、ヘキサジメトリン塩に含まれる不純物由来のピーク値が上記したような濃度以下であることを確認すればよい。アミノ酸配列分析の結果、ヘキサジメトリン塩に含まれる不純物由来のピーク値が前記濃度以上であった場合には、繰り返し同じ方法を用いて精製してから用いることが好ましい。
【００２１】
２．精製されたヘキサジメトリン塩
上記１．において詳述した方法により精製されたヘキサジメトリン塩は、これをアミノ酸配列分析の支持試薬として用いたときに、該塩由来の不純物のピーク値が１ｐｍｏｌ以下、好ましくは５００ｆｍｏｌ以下、より好ましくは３００ｆｍｏｌ以下、さらに好ましくは１００ｆｍｏｌ以下、特に好ましくは５０ｆｍｏｌ以下であるという特徴を有する。特に、各アミノ酸と同じ保持時間を有する不純物由来のピークがこのような濃度以下である。本発明のヘキサジメトリン塩を支持試薬として用いれば、高感度かつ高精度でアミノ酸配列分析を行うことができる。
【００２２】
例えば、二次元電気泳動法やＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を行ったゲル中のスポットやバンドを酵素消化して得られる微量のペプチドをそのままアミノ酸配列分析に供する場合には、５ｐｍｏｌ、試料によっては５０ｆｍｏｌのペプチドまたはタンパク質の分析・検出が必要である。例えば、５０ｆｍｏｌとは、通常のタンパク質（分子量約１万〜１０万）では５〜５０ｎｇに相当する微量なものであり、これは通常電気泳動後のゲルの染色試薬として繁用されるクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）でも検出困難な量である。また、ペプチドにおいてもキャピラリーカラム（内径１ｍｍ以下のカラム）の検出限界に近い量である。このような微量のペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列分析を行う場合に、本発明の方法により精製されたヘキサジメトリン塩を用いれば、不純物由来のピーク値が上記したような濃度以下であることから、試料由来のピークが隠されたり区別できなくなったりすることなく、極微量の分析を高精度で行うことができる。
【００２３】
３．アミノ酸配列分析方法
本発明のアミノ酸配列分析方法は、上記１．において詳述した方法によりヘキサジメトリン塩を精製し、これを自動アミノ酸配列分析装置のペプチドまたはタンパク質の支持試薬として用いることを特徴とする方法である。
【００２４】
粗ヘキサジメトリン塩は、上記したような本発明の精製方法により精製した後にアミノ酸配列分析に用いる。ヘキサジメトリン塩は、あらかじめ精製してから不純物が混入しないような状態で保存しておいたものを用いてもよいし、用時精製して用いてもよいが、用時精製を行うことにより、確実に、高度に精製されたヘキサジメトリン塩を用いたアミノ酸配列分析を行うことができる。自動アミノ酸配列分析装置としては、例えば、エドマン法を応用した自動アミノ酸配列分析装置等が挙げられ、例えば、アプライドバイオシステム社製タンパク質シーケンサー４９２ｃＬＣ等の市販の分析装置を用いて、その説明書に記載の方法に従って分析を行うことができる。このような分析装置においては、アミノ酸配列を分析したい試料溶液をガラスフィルター等の支持体に供して装置にセットするが、このとき、あらかじめガラスフィルター等の支持体に本発明の方法により精製されたヘキサジメトリン塩を固定化しておき、そこへペプチドまたはタンパク質を含む試料溶液を滴下して吸着させる方法が好ましく用いられる。ここで試料溶液を十分にヘキサジメトリン塩に吸着させることにより、以後の分析においてペプチドまたはタンパク質の損失を防ぐことができる。
【００２５】
４．精製されたヘキサジメトリン塩が固定化された支持体
また、本発明の方法により精製されたヘキサジメトリン塩は、あらかじめ支持体に固定化しておくこともできる。支持体としては、ガラスフィルター、ポリビニリデンジフルオライド膜（ＰＶＤＦ膜）、シリコナイズドグラスファイバー膜（ＳＧＦ膜）等が挙げられるが、ガラスフィルターが特に好ましく用いられる。いずれも、用いる自動アミノ酸配列分析装置に適したものを選択すればよい。このような支持体に精製されたヘキサジメトリン塩を固定化させる方法としては、例えば、本発明の方法により精製されたヘキサジメトリン塩を適当な溶媒に溶解し、これを支持体表面に滴下して乾固する方法等が挙げられる。溶媒としては、それ自体が不純物を含まないものであって、アミノ酸配列分析の各工程で行われる化学反応を妨げないようなものであればよいが、例えば、水、緩衝液、塩溶液等が挙げられ、中でも、蒸留水や、純水製造装置で精製された水等が好ましく用いられる。
【００２６】
具体的には、例えば、本発明の方法によりヘキサジメトリン塩を精製した後、適当な濃度で水に再度溶解し、この水溶液を適量分取してガラスフィルター上に滴下する。水溶液の量、すなわち、支持体に固定化するヘキサジメトリン塩の量としては、用いる自動アミノ酸配列分析装置において推奨される支持試薬量を参考にして適宜決定すればよいが、例えば、アプライドバイオシステム社製タンパク質シーケンサー４９２ｃＬＣ等の場合には、０．０５〜１ｍｇ、好ましくは０．１〜０．３ｍｇを用いればよい。溶液を滴下し、乾燥した後、この支持体を適当な条件下で保存しておくこともできる。かくして調製されるあらかじめ精製されたヘキサジメトリン塩が固定化された支持体は、必要時に簡便にアミノ酸配列分析に用いることができる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
１．試薬等の準備
（１）ヘキサジメトリン塩としては、臭化ヘキサジメトリン、すなわちポリブレン（化学名：１，３−Ｄｉｂｒｏｍｏｐｒｏｐａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｐｏｌｙｍｅｒ、商品名：バイオブレンプラス、分子量：１５８５．７３、Ｃａｔ．Ｎｏ．４００３８５、Ｌｏｔ．０００６００９、アプライドバイオシステム社製（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ，　ＵＳＡ））を用いた。
（２）有機溶媒
メタノール、ｎ−プロパノール、ｉｓｏ−プロパノール、１−ブタノール、アセトン、および、エタノール（すべて特級グレード試薬）を用いて比較することにした。
（３）ｓｔａｎｄａｒｄ溶液
ｓｔａｎｄａｒｄ溶液としては、アプライドバイオシステム社製の市販キットを用いた（Ｃａｔ．Ｎｏ．４００８７９）。該キットに含まれるＰＴＨアミノ酸の標品から、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、およびピリジルエチルシステイン（ＰＥ−Ｃ）の計２０種類のＰＴＨアミノ酸を混合して、各ＰＴＨアミノ酸を０．０２５ｐｍｏｌ／μｌで含む溶液として用いた。
【００２８】
２．各有機溶媒を用いたポリブレンの精製
（１）有機溶媒の比較
ポリブレン７５ｍｇ（５ｍｇ　ＮａＣｌを含む）を１．５ｍｌ容量のエッペンチューブ（エッペンドルフ社製）に入れ、これに７５０μｌの蒸留水を加えて溶解した。その２５μｌを別のエッペンチューブに分取し、それぞれ４倍量（１００μｌ）ないし９倍量（２２５μｌ）の各有機溶媒を添加して攪拌し、５倍希釈、１０倍希釈を行った。
【００２９】
有機溶媒の添加によってポリブレンが析出する様子を目視により確認したところ、エタノールを用いた場合に最も多くのポリブレンが析出していた。ｉｓｏ−プロパノール、アセトン、およびｎ−プロパノールでも析出が見られた。一方、メタノールおよび１−ブタノールではほとんど析出が見られなかった。各有機溶媒において、加えた有機溶媒の量による差はなかった。
【００３０】
（２）エタノールを用いたポリブレンの精製
上記（１）においては、各有機溶媒において加えた有機溶媒の量による差はなかったが、最も多くの沈殿が析出したエタノールの添加量についてさらに検討した。すなわち、蒸留水に溶解したポリブレンを４本のエッペンチューブに分取し、これに対して１倍量、４倍量、９倍量、および１９倍量のエタノールを添加して、ポリブレンの析出の度合いを目視により確認した。蒸留水に溶解したポリブレンは上記（１）と同様に２５μｌを分取して用いたが、１倍量のエタノールを添加するチューブのみ５０μｌ用いた。
【００３１】
その結果、最も多くの沈殿を生じたのは９倍量（２２５μｌ）のエタノールを添加したチューブであった。次に多くの沈殿を生じたのは４倍量（１００μｌ）および１９倍量（４７５μｌ）のエタノールを添加したものであり、１倍量（５０μｌのポリブレンに対して５０μｌ）を添加したチューブではポリブレンの析出は見られなかった。これらの結果より、エタノールを用いたポリブレンの精製法では、４〜１９倍量のエタノールを添加すれば効率的にヘキサジメトリン塩を得られることがわかった。多量の有機溶媒を用いるとコストや廃液処理の問題を伴うため、４〜９倍量のエタノールを添加して精製を行うこととした。
【００３２】
ここで、一般に有機化合物を沈殿法により精製する場合、できるだけゆっくりと沈殿を形成させた方が精製効果が高いことが知られていることから、精製度を要求される場合には低い倍率で、回収量を要求される場合には高い倍率で添加する等、適宜調節可能であると考えられた。
【００３３】
３．精製されたポリブレンを用いたアミノ酸配列分析
（１）アミノ酸配列分析
次に、上記２．において、４倍量のエタノールを添加して精製されたポリブレンを支持試薬として用いてアミノ酸配列分析を行い、ポリブレンの純度がバックグラウンドに対して与える影響を検討した。測定にはタンパク質シーケンサー４９２ｃＬＣ（アプライドバイオシステム社製（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ，　ＵＳＡ））を用い、該シーケンサーに付属の説明書に従って通常の操作を行った。アミノ酸配列分析に用いられる各試薬は、ポリブレン以外はすべて同社製のシーケンサー用純正品を使用した。
【００３４】
まず、上記２．においてポリブレンが析出したエッペンチューブをそのまま遠心分離器に供して遠心分離（１６０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）し、上清を取り除いて、精製されたポリブレンを沈殿として回収した。回収した精製ポリブレンを蒸留水に溶解して０．０２ｍｇ／μｌの水溶液とし、このうち７μｌ　（ポリブレン０．１４ｍｇに相当）または３５μｌ（ポリブレン０．７ｍｇに相当）をガラスフィルターに滴下して乾燥させ、アミノ酸配列分析の操作を行った。試料となるタンパク質またはペプチドをアプライしないこと以外は、すべて通常のアミノ酸配列分析における操作と同様にして行った。ここで、ポリブレン０．７ｍｇとは用いたタンパク質シーケンサー４９２ｃＬＣにおいて推奨される支持試薬量であり、０．１４ｍｇとはその１／５量である。
【００３５】
同様にして、精製していないポリブレンをそのまま用いてアミノ酸配列分析の操作を行った。
また、これらとは別に、上記１の（３）に記載のＰＴＨアミノ酸２０種類を含むｓｔａｎｄａｒｄ溶液４０μｌ（各ＰＴＨ−アミノ酸を１ｐｍｏｌずつを含む）を用いて分析を行った。ｓｔａｎｄａｒｄ溶液はＰＴＨアミノ酸を含む溶液であるので、通常分析装置のガラスフィルター上で行われている各種の反応（カップリング反応、切断反応、転換反応）を行う必要がないことから、直接カラムに注入することができる。すなわち、この分析では、すべての試薬がガラスフィルターを経由せずに分析が行われるので、ガラスフィルター由来の汚れを含まない場合としてデータを得ることができる。
【００３６】
（２）結果
上記（１）で行った５通りの測定の結果を図１に示した。これらはいずれも、１サイクル目の測定において得られたグラフである。図１において、「ｐｕｒｉｆｉｅｄ」とは上記２．において精製されたポリブレンを用いた場合、「ｎｏｎ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ」とは精製していないポリブレンをそのまま用いた場合で、それぞれ２通りの支持試薬量で分析を行った結果得られたグラフである。また、「Ｓｔａｎｄａｒｄ　ＲＴＨ−ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ」とは、ｓｔａｎｄａｒｄ溶液を分析に供した結果得られたグラフであり、各ピークがどのＰＴＨアミノ酸に由来するかは既知である（図中、各ピークにアミノ酸の一文字表記で示した）。なお、各グラフにおいて共通に出現する、保持時間が約１０．５分の位置のやや幅広のピークおよび約２１分の位置の大きなピークは、いずれもエドマン分解試薬（ＰＩＴＣ）の反応副産物であることが知られており、支持試薬量や精製の有無にかかわらず、ほぼ同じ大きさのピークを示している。また、ｓｔａｎｄａｒｄ溶液中に含まれるＰＴＨアミノ酸のうち、ＰＴＨピリジルエチル化システイン（ＰＥ−Ｃ）は、通常ＰＴＨプロリン（図中、Ｓｔａｎｄａｒｄ　ＰＴＨ−ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄのグラフに「Ｐ」として示されるピーク）より０．５〜１分程度早く溶離されるが、極めて分解しやすいことが知られておりこのグラフでも明確なピークを形成していない。
【００３７】
これらのグラフを用いて、特に混入しやすいアミノ酸として知られるグリシンのピーク（図中、Ｓｔａｎｄａｒｄ　ＰＴＨ−ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄのグラフに「Ｇ」として示されるピーク）に着目して比較を行った。まず、ｎｏｎ−Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（０．７ｍｇ）とｎｏｎ−Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（０．１４ｍｇ）のグラフにおいてグリシンのピークを比較したところ、ポリブレンの使用量を減らすことによりグリシンのピークの減少が見られたことから、用いたポリブレンが確かにグリシンもしくはＰＴＨ−グリシンと同じ保持時間を与える未同定の物質を不純物として含んでいることが確認された。
【００３８】
次に、ｎｏｎ−Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（０．７ｍｇ）とＰｕｒｉｆｉｅｄ（０．７ｍｇ）を比較すると、ｎｏｎ−Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（０．７ｍｇ）ではＳｔａｎｄａｒｄ　ＲＴＨ−ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄの約半分、すなわち約５００ｆｍｏｌのグリシンが含まれていたのに対し、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（０．７ｍｇ）ではＳｔａｎｄａｒｄ　ＲＴＨ−ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄの１／４以下に減少していることがわかった。これは、精製されていないポリブレンをそのまま用いる場合には１ｐｍｏｌ程度のアミノ酸の分析を正確に行うことも困難であるが、精製されたポリブレンを用いれば、ｆｍｏｌレベルでより正確な分析が可能になることを示している。
【００３９】
このような微量のアミノ酸やその他の不純物はて極めて除去が困難であることが知られているが、本発明の方法を用いれば簡便にｆｍｏｌレベルまで低下させることが可能であり、本発明の方法によって精製されたポリブレンを用いれば、バックグラウンドを低下させ、高感度でのアミノ酸配列分析が可能になることが示された。
【００４０】
【発明の効果】
本発明の方法を用いれば、極めて微量のアミノ酸や製造過程において生じる分解物等の不純物を取り除いて、高度に精製されたヘキサジメトリン塩を簡便に得ることができる。かくして得られるヘキサジメトリン塩を用いれば、アミノ酸配列分析においてバックグラウンドの上昇を抑制することができ、高感度、高精度で分析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】自動アミノ酸配列分析装置を用いた５通りの分析の結果を示すグラフを並べたものである。グラフの横軸は保持時間（ｍｉｎ）を示す。「ｐｕｒｉｆｉｅｄ」は精製されたポリブレンを用いた場合、「ｎｏｎ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ」は精製していないポリブレンをそのまま用いた場合で、それぞれ０．７ｍｇまたは０．１４ｍｇの２通りの支持試薬量で分析を行った結果を示す。また、「Ｓｔａｎｄａｒｄ　ＲＴＨ−ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ」とは、ｓｔａｎｄａｒｄ溶液を分析に供した結果得られたグラフであり、各ピークがどのＰＴＨアミノ酸に由来するかをアミノ酸の一文字表記で示した。
【図１】
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