(57)【要約】【課題】ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子（ＨＭＯＸ−１遺伝子）のプロモーター領域における変異と女性における本態性高血圧症との関連を明らかにし、得られた知見に基づいて、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための方法を提供することを課題とする。また、該検査のための試薬を提供することを課題とする。【解決手段】ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域における多型部位における変異と女性における本態性高血圧症との関連を検討した。その結果、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位における遺伝子型を解析することで、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査ができることが明らかとなった。さらに、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位に変異が生じている場合、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター活性が、変異が生じていない場合と比較して有意に高いことが明らかとなった。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域における変異を検出する工程を含む、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための方法。
【請求項２】
変異が、ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター活性の上昇を導く変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
変異が、多型部位における変異である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
多型部位における変異が、ＴからＡへの置換変異である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
多型部位が、配列番号：１に記載の塩基配列の９６８番目に相当する部位である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
（ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）（ｉ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡ、および
（ｉｉ）該ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程、
（ｄ）検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する工程
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを調製する工程
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｂ）で調製したプライマーを用いて、プライマー伸長反応を行う工程
（ｄ）工程（ｃ）で得られたプライマー伸長反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う工程
（ｅ）質量測定の結果から遺伝子型を決定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で決定した遺伝子型を対照と比較する工程
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズする、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）で調製したヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
（ｄ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｅ）レポーター蛍光の発光を検出する工程
（ｆ）工程（ｅ）で検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する工程
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｈ）の工程を含む、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基から５’側の塩基配列と相補的な配列および該塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列とハイブリダイズしない配列（フラップ）を有するヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｃ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基に対応する塩基（任意の塩基）が３’末端であり、該多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列と相補的な配列を有するヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｄ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）および工程（ｃ）で調製したヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
（ｅ）工程（ｄ）でハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、フラップを遊離させる工程
（ｆ）フラップと相補的な配列を有するヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる工程
（ｇ）工程（ｆ）により発生する蛍光の強度を測定する工程
（ｈ）工程（ｇ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する工程
（ｅ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
【請求項１６】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを調製する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）蛍光の偏光度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを調製する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で調製したプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）工程（ｄ）で反応に使われた塩基種を判定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で判定された塩基種を対照と比較する工程
【請求項１８】
ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子の発現量を測定する工程を含む、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための方法。
【請求項１９】
ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための試薬。
【請求項２０】
ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための試薬。
【請求項２１】
プロモーター領域を含むＤＮＡが、プロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡである、請求項１９または２０に記載の試薬。
【請求項２２】
ヘム・オキシゲナーゼ１に結合する抗体を含む、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９６８年にヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）酵素が生化学的に単離されて以来、ＨＯに関する研究は、ヘム代謝にＨＯが果たす役割に焦点があてられてきた。しかし最近では、さまざまな生物学的過程にＨＯが果たす役割が明らかになってきたことで、ＨＯが細胞のホメオスタシスの維持に果たす役割に関心が多く寄せられている。
【０００３】
ヘムの分解に不可欠なＨＯは、胆汁色素、フェリチン、一酸化炭素（ＣＯ）を産生する（非特許文献１）。ＨＯおよびＣＯは、血圧の調節を含む心血管機能のホメオスタシス調節に関与する（非特許文献２）。
【０００４】
ヘム・オキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）をメタロポルフィリンで阻害すると、バルーン傷害後に血圧が上昇し、動脈の新内膜の形成が増加することが知られている（非特許文献３、４）。ＨＯ−１系をＨＯ誘導物質で増強すると血圧が低下し、新内膜の形成が抑制される（非特許文献３、５）。一方、長期にわたってＨＯ−１を、血管平滑筋細胞で部位特異的に過剰発現するトランスジェニックマウス系列では、動脈圧の有意な上昇と血管拡張反応の低下が認められている（非特許文献６）。したがって、ＨＯ−１の長期および全身性の活性化が、血管緊張および血圧に影響を及ぼしうるか否かは未だ不明である。
【０００５】
ＨＯの産物の一つであるＣＯは、生理学的に重要な血管作動性物質と考えられている。過去に行われたｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では、一酸化窒素（ＮＯ）とＣＯが、可溶性グアニル酸シクラーゼを異なる機構で活性化すること、また、その強度はＣＯの方がＮＯよりはるかに小さいことが明らかにされている（非特許文献７）。したがってＣＯは、ＮＯと競合することによってＮＯに対する血管拡張反応を抑え、そのため、ＣＯ濃度が過剰でない場合は動脈圧の上昇を招く可能性がある。
【０００６】
ＣＯは、血圧の調節を含む心血管機能の調節に関与する。ＣＯは、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）を活性化することで血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の弛緩を誘導することが報告されている（非特許文献８）。ｓＧＣが活性化されるとＧＴＰがｃＧＭＰに変換され、細胞内のｃＧＭＰが、ｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼを活性化することで生物学的機能を調節する（非特許文献９）。したがって、ＨＯ−ＣＯ−ｓＧＣ−ｃＧＭＰ系の活性の同期は、血圧の調節における重要な代謝経路を構成している可能性がある。
【０００７】
過去に行われたｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける実験では、ＮＯおよびＣＯが、別の機構によって同シクラーゼを活性化することと、ＣＯの作用がＮＯよりはるかに弱いことが報告されている（非特許文献７）。２種の気体にはシクラーゼを活性化する特性に差があるため、ＶＳＭＣから内因的に生じるＣＯが、内皮細胞から放出されるＮＯと競合することでシクラーゼ活性を調節している可能性がある（非特許文献６）。
【０００８】
血圧は女性より男性の方が高いので、女性における高血圧症の発症予防に女性ホルモンが重要な役割を果たしている可能性がある。エストロゲンはＮＯ産生を促進することが報告されている（非特許文献１０、１１）。エストロゲンによって促進されたＮＯ産生は、血圧調節に大きく影響する。なぜなら、エストロゲンβ受容体をもたないマウスでは、ＮＯの減少に起因すると思われる高血圧症が認められるからである（非特許文献１２）。エストロゲンは、エストロゲンβ受容体を介して誘導型ＮＯ合成酵素の発現を上昇させることで血管収縮を弱めるので、ＨＯ／ＣＯ系が血圧値に及ぼす作用は、男女の被検者間で異なる可能性がある（非特許文献１２）。
【０００９】
一方、ＨＭＯＸ−１遺伝子（別名ＨＯ−１遺伝子）の欠損症例の報告は一例のみあり（ｅｘｏｎ  ２の完全欠失、ｅｘｏｎ３の欠失）、発育遅滞、溶血性貧血、内皮細胞障害を特徴とする（非特許文献１３）。（ＧＴ）ｎ反復配列の多型部位における遺伝子型と肺気腫の関連（非特許文献１４）、（ＧＴ）ｎ反復配列の多型部位における遺伝子型と血管形成術後の再狭窄の頻度の関連（非特許文献１５）などの報告があるが、ＨＭＯＸ−１遺伝子の変異と血圧レベルとの関連を示す報告例は皆無である。
【００１０】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ  Ｂ，  Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ  ＪＭ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ  ａｎｄ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９９０；１８６：１−８５．
【非特許文献２】Ｃｈｒｉｓｔｏｖａ  Ｔ，  Ｄｉａｎｋｏｖａ  Ｚ，  Ｓｅｔｃｈｅｎｓｋａ  Ｍ．  Ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−−ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｓ  ａ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｕｌｇ．  ２０００；２５：９−１７．
【非特許文献３】Ｔｏｇａｎｅ  Ｙ，  Ｍｏｒｉｔａ  Ｔ，  Ｓｕｅｍａｔｓｕ  Ｍ，  Ｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｙ，  Ｙａｍａｚａｋｉ  ＪＩ，Ｋａｔａｙａｍａ  Ｓ．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ  ｉｎ  ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２０００；２７８：Ｈ６２３−３２．
【非特許文献４】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＲＡ，  Ｌａｖｅｓａ  Ｍ，  Ａｓｋａｒｉ  Ｂ，  Ａｂｒａｈａｍ  ＮＧ，  Ｎａｓｊｌｅｔｔｉ  Ａ．Ａ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ，  ｐｒｅｓｕｍａｂｌｙ  ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ，  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａ  ｖａｓｏｄｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．  １９９５；２５：１６６−９．
【非特許文献５】Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  Ｈ，  Ｍｏｒｉｔａ  Ｔ，  Ｈｓｉｅｈ  ＣＭ，  Ｋｏｉｋｅ  Ｈ，  Ａｒｋｏｎａｃ  Ｂ，  Ｐｅｒｒｅｌｌａ  ＭＡ，  Ｋｏｕｒｅｍｂａｎａｓ  Ｓ．  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．
２０００；８６：１２２４−９．
【非特許文献６】Ｉｍａｉ  Ｔ，  Ｍｏｒｉｔａ  Ｔ，  Ｓｈｉｎｄｏ  Ｔ，  Ｎａｇａｉ  Ｒ，  Ｙａｚａｋｉ  Ｙ，  Ｋｕｒｉｈａｒａ  Ｈ，  Ｓｕｅｍａｔｓｕ  Ｍ，  Ｋａｔａｙａｍａ  Ｓ．  Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  ｅｌｅｖａｔｅｓ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  ２００１；８９：５５−６２．
【非特許文献７】Ｋｈａｒｉｔｏｎｏｖ  ＶＧ，  Ｓｈａｒｍａ  ＶＳ，  Ｐｉｌｚ  ＲＢ，  Ｍａｇｄｅ  Ｄ，  Ｋｏｅｓｌｉｎｇ  Ｄ．  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ
Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９５；９２：２５６８−７１．
【非特許文献８】Ｗａｎｇ  Ｒ，  Ｗａｎｇ  Ｚ，  Ｗｕ  Ｌ．  Ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｖａｓｏｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １９９７；１２１：９２７−３４．
【非特許文献９】Ｆｕｋａｏ  Ｍ，  Ｍａｓｏｎ  ＨＳ，  Ｂｒｉｔｔｏｎ  ＦＣ，  Ｋｅｎｙｏｎ  ＪＬ，  Ｈｏｒｏｗｉｔｚ  Ｂ，  Ｋｅｅｆ  ＫＤ．  Ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ＢＫＣａ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｔ  ｓｅｒｉｎｅ  １０７２．
Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９９；２７４：１０９２７−３５．
【非特許文献１０】Ｗｅｉｎｅｒ  ＣＰ，  Ｌｉｚａｓｏａｉｎ  Ｉ，  Ｂａｙｌｉｓ  ＳＡ，  Ｋｎｏｗｌｅｓ  ＲＧ，  ＣｈａｒｌｅｓＩＧ，  Ｍｏｎｃａｄａ  Ｓ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ｂｙｓｅｘ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９４；９１：５２１２−６．
【非特許文献１１】Ｇｏｅｔｚ  ＲＭ，  Ｍｏｒａｎｏ  Ｉ，  Ｃａｌｏｖｉｎｉ  Ｔ，  Ｓｔｕｄｅｒ  Ｒ，  Ｈｏｌｔｚ  Ｊ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ａｏｒｔａ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９９４；２０５：９０５−１０．
【非特許文献１２】Ｚｈｕ  Ｙ，  Ｂｉａｎ  Ｚ，  Ｌｕ  Ｐ，  Ｋａｒａｓ  ＲＨ，  Ｂａｏ  Ｌ，  Ｃｏｘ  Ｄ，  Ｈｏｄｇｉｎ  Ｊ，Ｓｈａｕｌ  ＰＷ，  Ｔｈｏｒｅｎ  Ｐ，  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ  Ｏ，  Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ＪＡ，  Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ＭＥ．  Ａｂｎｏｒｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００２；２９５：５０５−８．
【非特許文献１３】Ｙａｃｈｉｅ  Ａ，  Ｎｉｉｄａ  Ｙ，  Ｗａｄａ  Ｔ，  Ｉｇａｒａｓｈｉ  Ｎ，  Ｋａｎｅｄａ  Ｈ，  Ｔｏｍａ  Ｔ，  Ｏｈｔａ  Ｋ，  Ｋａｓａｈａｒａ  Ｙ，  Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｓ．  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｃａｕｓｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９９；  １０３：  １２９−１３５．
【非特許文献１４】Ｙａｍａｄａ  Ｎ，  Ｙａｍａｙａ  Ｍ，  Ｏｋｉｎａｇａ  Ｓ，  Ｎａｋａｙａｍａ  Ｋ，  Ｓｅｋｉｚａｗａ  Ｋ，Ｓｈｉｂａｈａｒａ  Ｓ，  Ｓａｓａｋｉ  Ｈ．  Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｅｍｐｈｙｓｅｍａ．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００；  ６６：  １８７−１９５．
【非特許文献１５】Ｅｘｎｅｒ  Ｍ，  Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ  Ｍ，  Ｍｉｎａｒ  Ｅ，  Ｍｌｅｋｕｓｃｈ  Ｗ，  Ｓｃｈｌｅｒｋａ  Ｇ，  Ｈａｕｍｅｒ  Ｍ，  Ｍａｎｎｈａｌｔｅｒ  Ｃ，  Ｗａｇｎｅｒ  Ｏ．  Ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ．Ｊ  Ｅｎｄｏｖａｓｃ  Ｔｈｅｒ  ２００１；  ８：  ４３３−４４０．
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の変異と女性における本態性高血圧症との関連を明らかにし、得られた知見に基づいて、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための方法を提供することである。また、該検査のための試薬を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明では、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域における変異のスクリーニングを行い、高血圧症における多型の有意性の評価を行った。まず、本発明者らは、ＨＭＯＸ−１のプロモーター領域における多型の同定を試みた。その結果、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域には、Ｇ（−１１３５）Ａ多型およびＴ（−４１３）Ａ多型が認められ、（ＧＴ）ｎ反復配列の多型の存在が確認された。次いで、これら３種類の多型部位における遺伝子型と本態性高血圧症の関連を検討した。心血管系合併症の既往のない１９９８人の被検者を吹田試験から選択した。被検者は、収縮期血圧が１４０  ｍｍＨｇを上回る場合、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上の場合に高血圧群に分類した。降圧薬を使用していた被検者も高血圧群に分類した。
【００１３】
検討の結果、女性において、Ｔ（−４１３）Ａ多型部位における遺伝子型がＡＡ型であるときに、高血圧被検者の頻度、および降圧薬の使用率が有意に高かった（ＡＡ／ＡＴ／ＴＴ；４５．５／３４．２／３５．０％、ｐ＝０．００９９、および２３．４／１７．５／１５．０％、ｐ＝０．０３８３）。さらに、年齢と体容積指数（Ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘ；ＢＭＩ）を考慮した多重ロジスティック回帰の結果、ＡＡ型の方が他の遺伝子型（ＡＴ＋ＴＴ型）に比して、オッズ比１．５９（ｐ＝０．００５８、９５％信頼区間：１．１４〜２．２０）で高血圧を持つと結論された。
【００１４】
さらに、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域のＴ（−４１３）Ａ多型部位に変異が生じている場合、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター活性が、変異が生じていない場合と比較して有意に高いことが明らかとなった。
【００１５】
即ち、本発明は、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための方法に関し、以下の〔１〕〜〔２２〕を提供するものである。
〔１〕  ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域における変異を検出する工程を含む、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための方法。
〔２〕  変異が、ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター活性の上昇を導く変異である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕  変異が、多型部位における変異である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕  多型部位における変異が、ＴからＡへの置換変異である、〔３〕に記載の方法。
〔５〕  多型部位が、配列番号：１に記載の塩基配列の９６８番目に相当する部位である、〔３〕または〔４〕に記載の方法。
〔６〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
（ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
〔７〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔８〕  以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔９〕  以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔１０〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔１１〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）（ｉ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡ、および
（ｉｉ）該ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程、
（ｄ）検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する工程
〔１２〕  以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを調製する工程
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｂ）で調製したプライマーを用いて、プライマー伸長反応を行う工程
（ｄ）工程（ｃ）で得られたプライマー伸長反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う工程
（ｅ）質量測定の結果から遺伝子型を決定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で決定した遺伝子型を対照と比較する工程
〔１３〕  以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズする、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）で調製したヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
（ｄ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｅ）レポーター蛍光の発光を検出する工程
（ｆ）工程（ｅ）で検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する工程
〔１４〕  以下の（ａ）〜（ｈ）の工程を含む、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基から５’側の塩基配列と相補的な配列および該塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列とハイブリダイズしない配列（フラップ）を有するヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｃ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基に対応する塩基（任意の塩基）が３’末端であり、該多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列と相補的な配列を有するヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｄ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）および工程（ｃ）で調製したヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
（ｅ）工程（ｄ）でハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、フラップを遊離させる工程
（ｆ）フラップと相補的な配列を有するヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる工程
（ｇ）工程（ｆ）により発生する蛍光の強度を測定する工程
（ｈ）工程（ｇ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
〔１５〕  以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する工程
（ｅ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
〔１６〕  以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを調製する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）蛍光の偏光度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程
〔１７〕  以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検女性からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを調製する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で調製したプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）工程（ｄ）で反応に使われた塩基種を判定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で判定された塩基種を対照と比較する工程
〔１８〕  ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子の発現量を測定する工程を含む、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための方法。
〔１９〕  ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための試薬。
〔２０〕  ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための試薬。
〔２１〕  プロモーター領域を含むＤＮＡが、プロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡである、〔１９〕または〔２０〕に記載の試薬。
〔２２〕  ヘム・オキシゲナーゼ１に結合する抗体を含む、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための試薬。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、ヘム・オキシゲナーゼ１遺伝子（ＨＭＯＸ−１遺伝子）のプロモーター領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ８２２４４）の変異と女性における本態性高血圧症の発症しやすさが関連することを見出した。具体的には、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位（配列番号：１に記載の塩基配列において９６８番目の部位、または、図１に記載の塩基配列において−４１３番目の部位に相当）における遺伝子型がＡＡ型の場合に該疾患に発症しやすいと判定でき、ＡＴ型またはＴＴ型の場合に該疾患に発症しにくいと判定できることがわかった。さらに、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位に変異が生じている場合、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター活性が、変異が生じていない場合と比較して有意に高いことが明らかとなった。本発明は、この知見に基づくものである。なお、正常な（より高頻度な、または、野生型の）ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を配列番号：１、および、配列番号：１に記載の塩基配列の９６８番目の塩基ＴがＡに置換された変異体の塩基配列を配列番号：２に例示する。
【００１７】
本発明は、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域における変異を検出する工程を含む、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための方法を提供する。
【００１８】
本発明における本態性高血圧症は、収縮期血圧１４０ｍｍＨｇ以上又は拡張期血圧９０ｍｍＨｇ以上の症状を意味する。
【００１９】
本発明において、ヘム・オキシゲナーゼ１タンパク質（ＨＯ−１）とは、ヘムを一酸化炭素とビリベルジンに分解する律速酵素のうち１型を意味する。１型は２型と異なり種々の刺激で誘導される性質を持つ。ＨＯ−１の活性としてはヘムの分解活性が挙げられる。該活性は以下の方法で評価することができる。ＮＡＤＰＨ（０．８ｍＭ）、グルコース６リン酸  （２ｍＭ）、  グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（０．２ｕｎｉｔｓ）、ビリベルジンレダクターゼ源としての１０５，０００×ｇで得られる上清フラクションから調整したラット肝臓サイトゾル（３ｍｇ）、リン酸カリウム緩衝液（ＰＢＳ，  １００ｍＭ，  ｐＨ７．４）、ＭｇＣｌ２  （０．２ｍＭ）、および、ヘミン（２０μＭ）を含む反応液に、細胞由来のミクロソームを添加する。反応は、１時間暗条件において３７℃で行ない、１ｍｌ  のクロロホルムを添加することで停止させる。抽出したビリルビンを吸光度４６４と５３０ｎｍ（ε＝４０ｍＭ−１ｃｍ−１）の違いによって測定する。ＨＯ−１活性は、ビリルビン／細胞内タンパク質ｍｇ／時間のピコモル数として示される。よって、本発明における「ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域」とは、上記ＨＯ−１の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域を意味する。
【００２０】
本発明における変異は、女性特異的な本態性高血圧症のマーカーとなる変異（多型部位における変異を含む）であれば特に制限はないが、好ましくは女性特異的に高血圧発症素因となる変異である。
【００２１】
また、本発明における変異としては、好ましくはＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター活性の上昇を導く変異、より好ましくは多型部位における変異であってＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター活性の上昇を導く変異が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、該多型部位における変異としては、例えば、ＴからＡへの置換変異が挙げられる。また、該多型部位としては、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列の９６８番目に相当する部位が挙げられる。
【００２２】
本発明において、「配列番号：１に記載の塩基配列の９６８番目に相当する部位」とは、配列番号：１に記載の塩基配列の９６８番目の塩基部位だけではなく、配列番号：１に記載の塩基配列において１もしくは複数の塩基が変異した（置換、欠失、付加、および／または挿入された）塩基配列における塩基部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列の９６８番目に相当する部位をも含む概念である。このような１もしくは複数の塩基が変異した塩基配列としては、例えば、実施例に記載のＧ（−１１３５）Ａ多型部位および（ＧＴ）ｎ反復配列の多型部位における塩基が変異した塩基配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
多型とは、遺伝学的には、母集団中１％以上の頻度で存在している塩基変化と一般的に定義される。しかしながら、本発明における「多型」は、この定義に制限されず、１％未満の塩基の変化も「多型」に含む。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型、一から数十塩基（時には数千塩基）が欠失、置換あるいは挿入している多型等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明における「多型部位」とは、このような多型が存在する部位を意味する。本発明における多型部位の数としては、特に制限はなく、１個以上の多型部位を有していてもよい。また、後述の「多型部位を含むＤＮＡ」には、多型部位において変異を有するＤＮＡだけでなく、多型部位において変異を有しないＤＮＡも含まれる。
【００２４】
本発明の好ましい態様としては、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域において、両方のアレル共に上記本発明における変異が検出される場合に本態性高血圧症に発症しやすいと判定され、片方のアレルのみに該変異が検出される場合または両方のアレル共に該変異が検出されない場合に該疾患に発症しにくいと判定される。
【００２５】
以下、本発明の検査方法の好ましい態様を記載するが、本発明の方法はそれらの方法に限定されるものではない。
【００２６】
本発明の検査方法の好ましい態様においては、まず、被検女性からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、例えば被検女性の血液、皮膚、口腔粘膜、毛髪、手術により採取あるいは切除した組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを基に調製することができる。
【００２７】
本方法においては、次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡの単離は、例えば、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。
【００２８】
本発明において、「ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ」としては、好ましくはＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡであり、より好ましくは配列番号：１に記載の塩基配列の９６８番目に相当する部位を含むＤＮＡが挙げられる。
【００２９】
本方法においては、次いで、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
【００３０】
本方法においては、次いで、決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する。本方法における対照とは、正常なＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡの配列を言う。一般に健常人のＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡの配列は正常であるものと考えられることから、上記「対照と比較する」とは、通常、健常人のＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡの配列と比較することを意味するが、ＧｅｎＢａｎｋ等の各種遺伝子データベースまたは文献等に野生型として記載されているＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡの配列と比較してもよい。
【００３１】
本発明の検査方法は、上記の如く被検女性由来のＤＮＡの塩基配列を直接決定する方法以外に、変異の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
【００３２】
例えば、本発明における変異の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、被検女性からＤＮＡ試料を調製する。次いで、調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検女性からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。
【００３３】
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブＤＮＡを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも被検女性から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
【００３４】
さらに別の方法においては、まず、被検女性からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００３５】
該方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ａｌｕ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９２  Ｊａｎ  １；  １２（１）：  １３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １９９１  Ａｕｇ  １；  ６（８）：  １３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ＰＣＲ−ＳＳＣＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．  、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．  １９９５  Ａｐｒ  １；  ４（５）：  ２７５−２８２．）が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異の存在を検出することができる。
【００３６】
具体的には、まず、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。ＰＣＲの際に、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。あるいはＰＣＲ反応液に３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。さらに、ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識ＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０から２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４から３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
【００３７】
さらに別の方法においては、まず、被検女性からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００３８】
このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：  ＤＧＧＥ法）等を例示することができる。ＤＧＧＥ法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、ＤＮＡ断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってＤＮＡ断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なＤＮＡ断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のＤＮＡ配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。この部分的に解離したＤＮＡ断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖ＤＮＡの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを本発明のプライマー等を用いたＰＣＲ法等によって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在するＤＮＡ断片の場合、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
【００３９】
さらに別の方法においては、まず、被検女性から調製したＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡ、および該ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する。
【００４０】
本発明において、「ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡ」としては、好ましくは配列番号：１に記載の塩基配列の９６８番目に相当する部位を含むＤＮＡが挙げられる。
【００４１】
また、本発明において「基板」とは、ヌクレオチドプローブを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。
【００４２】
本発明の基板は、ヌクレオチドプローブを固定することができれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−  ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
【００４３】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
【００４４】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位における変異を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ベースであり、好ましくは１０〜５０ベースであり、さらに好ましくは１５〜２５ベースである。
【００４５】
本方法においては、次いで、該ＤＮＡと該基板を接触させる。この過程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、ＤＮＡをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
【００４６】
本方法においては、次いで、該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、ＤＮＡアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したＤＮＡをプローブといい、一方溶液中のラベルしたＤＮＡをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。本方法においては、さらに、検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する。
【００４７】
このような方法としては、例えば、ＤＮＡアレイ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）２２：１６４−１６７）等が挙げられる。
【００４８】
さらに別の方法においては、まず、被検女性からＤＮＡ試料を調製する。また、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを調製する。次いで、該ＤＮＡを鋳型とし、該プライマーを用いて、プライマー伸長反応を行う。次いで、プライマー伸長反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う。次いで、質量測定の結果から遺伝子型を決定する。次いで、決定した遺伝子型を対照と比較する。
【００４９】
このような方法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１０６−１１７、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２０００）：１８：７７−８４）等が挙げられる。具体的には、まず、被検女性からＤＮＡ試料を調製する。この際、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基を含むＤＮＡをＰＣＲなどを使用して増幅することで調製することが好ましい。次いで、ＰＣＲ産物を鋳型として、ジェノタイピングプライマー（ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマー）のｄｄＮＴＰプライマー伸長反応を行う。この反応に用いるＰＣＲ産物は、ＰＣＲプライマーを除去するための精製が行われていることが好ましい。ジェノタイピングプライマーは、通常、１５ｂｐ以上の長さを有する。プライマー伸長反応においては、通常、ＰＣＲ産物に対して１０倍以上の過剰のジェノタイピングプライマーを加えるが、これに制限されるものではない。サーマルサイクルの条件は適宜選択しうるが、ジェノタイピングプライマーのうち３０〜６０％程度が伸長する条件が好ましい。例えば、９４℃と３７℃の２温度間で２５回程度行うことで適当な伸長効率を得ることができる。次いで、プライマー伸長反応産物のＭＡＬＤＩプレートへのスポットを行い、次いで、質量測定を行う（マススペクトログラムを作成する）。次いで、マススペクトログラム解析から遺伝子型を決定し、対照と比較する。
【００５０】
さらに別の方法においては、まず、被検女性からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズする、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブを調製する。次いで、該ＤＮＡに、該ヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、レポーター蛍光の発光を検出する。次いで、検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する。
【００５１】
上記方法としては、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ９４−１０５、Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ．  （１９９９）１４：１４３−１４９）等を挙げることができる。具体的には、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブの５’末端にレポーター蛍光を標識する。本発明において、レポーター蛍光としては、ＦＡＭやＶＩＣなどが例示できるが、これらに限定されない。さらに、上記プローブの３’末端にクエンチャー蛍光を標識する。本発明において、クエンチャー蛍光としては、レポーター蛍光を消光できる物質であれば特に制限されない。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズする、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブを、被検女性から調製したＤＮＡにハイブリダイズさせる。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡを、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅する。その結果、レポーター蛍光とクエンチャー蛍光を標識したヌクレオチドプローブのレポーター蛍光標識部分が切断され、レポーター蛍光が遊離する。本発明において、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、好適にはＴａｑＤＮＡポリメラーゼが例示できるが、これに限定されるものではない。本方法においては、次いで、遊離したレポーター蛍光を検出し、さらに、該レポーター蛍光の発光を対照と比較する。なお、本方法においては、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基が正常型である場合と変異型である場合で異なるレポーター蛍光を標識した２種類のヌクレオチドプローブを用いることで、１回の反応でタイピングすることが可能である。
【００５２】
さらに別の方法においては、まず、被検女性からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基から５’側の塩基配列と相補的な配列および該塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列とハイブリダイズしない配列（フラップ）を有するヌクレオチドプローブを調製する。また、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基に対応する塩基（任意の塩基）が３’末端であり、該多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列と相補的な配列を有するヌクレオチドプローブを調製する。次いで、調製したＤＮＡに、上記２種類のヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、フラップを遊離させる。本発明において、一本鎖ＤＮＡ切断酵素としては、特に制限はなく、例えば下記のｃｌｅａｖａｓｅが例示できる。本方法においては、次いで、フラップと相補的な配列を有するヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる。次いで、発生する蛍光の強度を測定する。次いで、測定した蛍光の強度を対照と比較する。
【００５３】
上記方法としては、例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ９４−１０５、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２０００）１０：３３０−３４３）等が挙げられる。具体的には、まず、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基から５’側の塩基配列と相補的な配列および該塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列とハイブリダイズしない配列（フラップ）を有するヌクレオチドプローブ（プローブＡ）を合成する。また、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基に対応する塩基（任意の塩基）が３’末端であり、該多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列と相補的な配列を有するヌクレオチドプローブ（プローブＢ）を合成する。次いで、これらプローブを調製した鋳型ＤＮＡにハイブリダイズさせる。この際、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基に対応するプローブＢの塩基（任意の塩基）が鋳型ＤＮＡとプローブＡとの間に侵入する。この侵入部位を認識して、該部位に対応するプローブＡの塩基と該塩基の１塩基３’側の塩基の間を切断するエンドヌクレアーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）を用いてハイブリダイズしたＤＮＡを切断する。これにより、フラップ部分が遊離する。次いで、遊離したフラップ部分とフラップと相補的な配列を有するヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブ（検出用プローブ）をハイブリダイズさせる。該検出用プローブは、一般的にｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）プローブとよばれる。該プローブにおいて、５’側は自身で相補的に結合できる。また、３’側はフラップと相補的な配列を有している。また、自身で相補的に結合できる５’側において、５’末端にはレポーター蛍光が標識され、該５’末端の３’側にはクエンチャー蛍光が標識されている。遊離したフラップの３’末端の塩基が、ＦＲＥＴプローブにハイブリダイズする結果、該プローブのレポーター蛍光が標識された相補結合部位に侵入することで、ｃｌｅａｖａｓｅが認識する構造が生成される。本方法においては、ｃｌｅａｖａｓｅによるレポーター蛍光標識部分の切断によって遊離したレポーター蛍光を検出し、さらに、測定した蛍光の強度を対照と比較する。
【００５４】
さらに別の方法においては、まず、被検女性からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する。次いで、測定した蛍光の強度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （２０００）１０：１０３−１１０）等が挙げられる。
【００５５】
さらに別の方法においては、まず、被検女性からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う。次いで、蛍光の偏光度を測定する。次いで、測定した蛍光の偏光度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９９９）９：４９２−４９８）等が挙げられる。
【００５６】
さらに別の方法においては、まず、被検女性からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行う。次いで、一塩基伸長反応に使われた塩基種を判定する。次いで、判定された塩基種を対照と比較する。このような方法として、例えば、ＳＮｕＰＥ法（Ｒａｐｉｄ  Ｖｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  （２０００）１４：９５０−９５９）等が挙げられる。
【００５７】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これとＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等により検出することができる。
【００５８】
また、本発明は、ＨＭＯＸ−１遺伝子の発現量を測定する工程を含む、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査するための方法を提供する。
【００５９】
本発明において、「遺伝子の発現量」は、ｍＲＮＡの発現量だけでなく、タンパク質の発現量（またはタンパク質の活性の上昇）で評価することも可能である。
【００６０】
上記検査方法においては、まず、被検者のＲＮＡ試料を調製する。次いで、該ＲＮＡ試料に含まれるＨＯ−１をコードするＲＮＡの量を測定する。次いで、測定されたＨＯ−１をコードするＲＮＡの量を対照と比較する。このような方法としては、ノーザンブロッティング法、または、ＲＴ−ＰＣＲ法等を例示することができる。また、ＨＭＯＸ−１遺伝子の発現量は、ＤＮＡアレイ法によっても測定することができる。
【００６１】
また、上記検査方法は、ＨＯ−１の発現量を測定することにより、下記の如く実施することができる。まず、被検者からタンパク質試料を調製する。次いで、該タンパク質試料に含まれるＨＯ−１の量を測定する。次いで、測定されたＨＯ−１の量を対照と比較する。このような方法としては、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、並びにＨＯ−１に結合する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法などを例示することができる。
【００６２】
ＨＯ−１の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。該抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。ＨＯ−１、あるいはＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＨＯ−１や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、ＨＯ−１またはその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、ＨＯ−１に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＨＯ−１や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
【００６３】
さらに、本発明は、本発明の検査方法に使用するための試薬を提供する。その一つの態様としては、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査試薬が挙げられる。
【００６４】
該オリゴヌクレオチドは、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
【００６５】
ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブ（該プローブが固定された基板を含む）やプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００６６】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【００６７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００６８】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００６９】
また、本発明における検査試薬の別の態様は、ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む検査試薬である。プライマーの長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、多型部分を含むＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００７０】
本発明の検査薬の別の態様としては、ＨＯ−１に結合する抗体を含む試薬である。上記抗体は、検査に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はない。抗体は必要に応じて標識される。
【００７１】
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００７２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）被検者
心血管系合併症の既往のない１９９８人の被検者を吹田試験から選択した。吹田試験の選択の基準および計画は文献に記載されている（Ｉｗａｉ  Ｎ，  Ｋａｔｓｕｙａ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ２００２；１０５：４１−７．）。また、本発明は、国立循環器病センターの倫理委員会、ならびに循環器病センターの遺伝解析および遺伝子治療に関する委員会の承認を受けた。遺伝解析に関する同意を約３７００人の被検者から得て、被検者１９９８人のＨＭＯＸ−１遺伝子の遺伝子型を決定した。被検者は、収縮期血圧が１４０  ｍｍＨｇを上回る場合、または拡張期血圧が９０  ｍｍＨｇ以上の場合に高血圧群に分類した。降圧薬を使用していた被検者も高血圧群に分類した。
【００７３】
（２）ＤＮＡ試験
９６人の被検者のゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列分析を行った。プロモーター領域（〜１．４  ｋｂ）の配列を決定した。１ヌクレオチド多型を、ＴａｑＭａｎシステム（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（表１）を用いて決定し、（ＧＴ）ｎ反復配列長の多型を、蛍光標識したセンスプライマー「Ｐ１−Ｓ」（５’−ＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＡ−３’（配列番号：３））およびアンチセンスプライマー「Ｐ１−ＡＳ」（５’−ＡＣＡＡＡＧＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＧＧＡＣ−３’（配列番号：４））を用いたＰＣＲ法による増幅後にＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアを用いてＡＢＩ  ３７００配列決定システムで決定した（図１）。
【００７４】
【表１】
2004222503.tif 000002
【００７５】
（３）発現実験
プロモーター領域におけるＴ（−４１３）Ａ多型の調節作用を調べるために、ＨＭＯＸ−１プロモーター／ルシフェラーゼ融合遺伝子を作製した。−５１７〜＋７６間のプロモーター領域をセンスプライマー「Ｐ２−Ｓ」（５’−ＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＴＣ−３’（配列番号：１３））およびアンチセンスプライマー「Ｐ２−ＡＳ」（５’−ＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＧＴＴＣＧＴＧＣＴＧＧＣＴＣＣ−３’（配列番号：１４））（図１）を用いたＰＣＲ法で増幅し、他のプロモーター配列を含まないｐＧＬ２−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローン化した。トランスフェクションは、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を対象に、内部標準としてＰＲＬ−ＣＭＶベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）およびウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）のルシフェラーゼの活性は、デュアルルシフェラーゼキット（ＰＧ−ＤＵＡＬ−ＳＰ、東洋インキ）で測定した。
【００７６】
（４）統計解析
数値は平均値±平均値の標準誤差（ＳＥ）で表す。すべての統計解析は、ＪＮＰ統計ソフトウェアパッケージ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、米国）を用いて行った。多重ロジスティック回帰を他の共変量について行った。群間の数値データの差は、一元／二元配置ＡＮＯＶＡ、および対応のないｔ検定で解析した。群間の頻度の差、ならびに連鎖不平衡の程度の差は、分割表分析で検定した。
【００７７】
［実施例１］  ＨＭＯＸ−１プロモーターの多型
ヒトＨＭＯＸ−１遺伝子の５’隣接領域および第１エキソンのヌクレオチド配列を図１に示す。ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター領域には、Ｇ（−１１３５）Ａ多型およびＴ（−４１３）Ａ多型が認められ、（ＧＴ）ｎ反復配列の多型の存在が確認された。ＨＭＯＸ−１遺伝子内の（ＧＴ）ｎ反復配列の長さは１５〜４３個であった。また、頻度が１％を上回る（ＧＴ）ｎ反復配列の多型は２２の遺伝子型で認められた（表２）。
【００７８】
【表２】
2004222503.tif 000003
【００７９】
表２から推定されたハプロタイプ頻度を表３に示す。Ａ（−４１３）−（ＧＴ）３０およびＴ（−４１３）−（ＧＴ）２３が２つの主要対立遺伝子であった。
【００８０】
【表３】
2004222503.tif 000004
【００８１】
［実施例２］  関連解析
試験集団の特性を表４、表５に示す。
【００８２】
【表４】
2004222503.tif 000005
【００８３】
【表５】
2004222503.tif 000006
【００８４】
高血圧被検者の頻度、および降圧薬の使用率は、女性ではＡＡ遺伝子型の方が他の遺伝子型より有意に高かった（ＡＡ／ＡＴ／ＴＴ；４５．５／３４．２／３５．０％、ｐ＝０．００９９、および２３．４／１７．５／１５．０％、ｐ＝０．０３８３）。多重ロジスティック回帰の結果、Ｔ（−４１３）Ａ（ＡＡ／ＡＴ＋ＴＴ）多型（ｐ＝０．００５８）、年齢（ｐ＜０．０００１）、およびＢＭＩ（ｐ＜０．０００１）が、女性の高血圧症発生率に影響することがわかった。女性の高血圧症に対するＡＡ対立遺伝子のオッズ比は１．５９であった（ｐ＝０．００５８、９５％信頼区間：１．１４〜２．２０）。女性では３群間に血圧の差は認められなかったが、これは降圧薬の使用によるものと考えられる。以上の関連は男性では認められなかった。Ｇ（−１１３５）Ａ遺伝子型は、正常血圧被検者と高血圧被検者間で、その頻度に有意差は認められなかった。
【００８５】
血圧は女性より男性の方が高いので、女性における高血圧症の発症予防に女性ホルモンが重要な役割を果たしている可能性がある。エストロゲンによって促進されたＮＯ産生は、血圧調節に大きく影響する。女性の血管緊張は、男性の血管緊張と比べてエストロゲンを介したＮＯに大きく依存すると考えられるので、ＨＭＯＸ−１遺伝子に由来するＣＯがＧＣ（グアニレース・サイクレース）に及ぼす阻害作用が女性で顕在化するのかもしれない。
【００８６】
今回、ＨＭＯＸ−１遺伝子型が血圧に及ぼす作用については若齢群と高齢群の間で差は認められなかった（データは提示していない）。しかし、不可逆的な変化が閉経前に生じていた可能性はある。
【００８７】
本実施例では、Ｔ（−４１３）Ａ多型のＡＡ遺伝子型が、おそらくＨＯ−１の高発現により、女性の高血圧症と関連することがわかった。ＨＭＯＸ−１遺伝子のこのような多型は、硝酸薬耐性者を予測する際に有用でもあると考えられる。
【００８８】
［実施例３］  Ｔ（−４１３）Ａ多型の機能上の重要性
次にＢＡＥＣを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴ（−４１３）Ａ多型の機能上の重要性について調べた。図２に示すように、Ａ（−４１３）−（ＧＴ）３０対立遺伝子のプロモーター活性は、Ｔ（−４１３）−（ＧＴ）２３対立遺伝子のプロモーター活性と比べて有意に高かった（ｐ＜０．０１）。このプロモーター領域の基礎活性は低かったので（Ｔｙｒｒｅｌｌ  ＲＭ，  Ａｐｐｌｅｇａｔｅ  ＬＡ，  Ｔｒｏｍｖｏｕｋｉｓ  Ｙ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  １９９３；１４：７６１−５）、ＳＶ４０のエンハンサー配列を含むベクターを用いた。
【００８９】
今回行ったプロモーターアッセイの結果、Ａ（−４１３）−（ＧＴ）３０対立遺伝子のプロモーター活性が、Ｔ（−４１３）−（ＧＴ）２３対立遺伝子のプロモーター活性より有意に高いことが明らかになったので、ＨＭＯＸ−１遺伝子に何らかの機能上の変化があるか否かを見極めるためには、Ｔ（−４１３）Ａ遺伝子型の存在を確認するだけで十分であるといえる。
【００９０】
【発明の効果】
本発明の検査方法および検査試薬を使用することで、被検女性が本態性高血圧症を発症しやすいか否かを検査できるようになった。このような検査によって、女性における本態性高血圧症の効果的な発症予防または適切な治療（例えば、オーダーメード医療）を行うことができるものと大いに期待される。
【００９１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＨＭＯＸ−１遺伝子の５’隣接領域および第１エキソンのヌクレオチド配列（Ｔｙｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３；  ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓ５８２６７）を示す図である。変異型配列（Ｔ（−４１３）Ａ多型部位における塩基がＡである配列）を示している。Ｐ１−ＳとＰ１−ＡＳにはさまれた断片をＰＣＲ法で増幅し、（ＧＴ）ｎ反復配列の長さを決定した。またＰ２−ＳとＰ２−ＡＳを用いて、ＨＭＯＸ−１プロモーター／ルシフェラーゼ遺伝子を作製した。尚、図中のＡ（−４１３）Ｔの部位は、配列番号：１に記載の塩基配列においては、９６８番目の塩基に相当する。
【図２】プロモーター活性の評価を示す図である。ＨＭＯＸ−１プロモーター／ルシフェラーゼ融合遺伝子をＢＡＥＣに一時的に導入した。ＨＭＯＸ−１遺伝子のプロモーター活性の存在を示すホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）ルシフェラーゼ活性値を、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性値で割り、相対ルシフェラーゼ単位で表した。Ａ（−４１３）−（ＧＴ）３０対立遺伝子のプロモーター活性は、Ｔ（−４１３）−（ＧＴ）２３対立遺伝子のプロモーター活性より有意に高かった。各実験の対象数：Ｎ＝４。
【図１】
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【図２】
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