(57)【要約】【課題】交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法を提供することを課題とする。また、該検査のための試薬を提供することを課題とする。【解決手段】ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモーター領域において新たに見出した多型と交感神経系の活性化に伴う疾患である高血圧疾患との関連を検討した。その結果、ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモーター領域における多型が高血圧の素因であるとの結論を得た。このことから、ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域における多型を解析することで、高血圧疾患などの交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査することが可能となった。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法であって、ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型を検出する工程を含み、多型が検出される場合に該疾患に発症しやすい遺伝性素因を有すると判定され、多型が検出されない場合に該疾患に発症しにくい遺伝性素因を有すると判定される方法。
【請求項２】
多型が一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多型が、ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子の−３５８番目の多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子の−３５８番目の多型が、アデニンからグアニンへの変異である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
疾患が、高血圧疾患またはｏｒｔｈｏｓｔａｔｉｃ　ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
（ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）（ｉ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡ、および
（ｉｉ）該ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程
（ｄ）検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する工程
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する工程
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｂ）で調製したプライマーを用いて、プライマ―伸長反応を行う工程
（ｄ）工程（ｃ）で得られたプライマ―伸長反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う工程
（ｅ）質量測定の結果から遺伝子型を決定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で決定した遺伝子型を対照と比較する工程
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズする、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）で調製したヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
（ｄ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｅ）レポーター蛍光の発光を検出する工程
（ｆ）工程（ｅ）で検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する工程
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｈ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基から５’側の塩基配列と相補的な配列および該塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列とハイブリダイズしない配列（フラップ）を有するヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｃ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基に対応する塩基（任意の塩基）が３’末端であり、該多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列と相補的な配列を有するヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｄ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）および工程（ｃ）で調製したヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
（ｅ）工程（ｄ）でハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、フラップを遊離させる工程
（ｆ）フラップと相補的な配列を有するヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる工程
（ｇ）工程（ｆ）により発生する蛍光の強度を測定する工程
（ｈ）工程（ｇ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する工程
（ｅ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
【請求項１６】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）蛍光の偏光度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で調製したプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）工程（ｄ）で反応に使われた塩基種を判定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で判定された塩基種を対照と比較する工程
【請求項１８】
ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子の−３５８番目の塩基（グアニン）を含む、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための試薬。
【請求項２０】
ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための試薬。
【請求項２１】
疾患が、高血圧疾患またはｏｒｔｈｏｓｔａｔｉｃ　ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅである、請求項１９または２０に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ノルエピネフリン・トランスポーター　（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ＮＥＴ）　は、プレシナプスに存在し、放出されたノルエピネフリンの再吸収を通して、ノルエピネフリンの作用を終了させる役割をもつ分子である。すでに、この遺伝子の変異により、交感神経系の活性化が生じ、ｏｒｔｈｏｓｔａｔｉｃ　ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ　と呼ばれる重症の起立性頻拍症（低血圧症または起立性低血圧症と表現されることもある）を発症することが示されている（Ｓｈａｎｎｏｎ　ＪＲ，　ｅｔ　ａｌ．，　ＮＥＪＭ　２０００；３４２：５４１−５４９．）。また、ＮＥＴの特異的阻害薬ｒｅｂｏｘｅｔｉｎｅ　は、ヒトにおいて軽い昇圧作用があることが判明している（Ｓｃｒｏｅｄｅｒ　Ｃ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　２００２；１０５：３４７−３５３）。しかしながら、これまでにＮＥＴ遺伝子のプロモーター領域の多型についての報告例、ならびに、ＮＥＴ遺伝子のプロモーター領域の多型と交感神経系の活性化に伴う疾患との関係についての報告例はなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＮＥＴ遺伝子のプロモーター領域の多型と交感神経系の活性化に伴う疾患との関連を明らかにし、得られた知見に基づいて、交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法を提供することである。また、該検査のための試薬を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。２４人の被検者を対象にＮＥＴ遺伝子のプロモーター領域のシークエンスを行い、３種類の遺伝的変異を見いだした。さらに、本発明者らは、一般人口を代表するように抽出された疫学調査、吹田スタデーを用いて、これら３種類の変異と血圧レベルの相関を調べた。その結果、３種類のうち、１つの変異（ＮＥＴ４変異）と血圧レベルに弱い相関が認められた。また、血圧レベルに大きな影響を与える年齢と体容積指数による補正を行うと、ＮＥＴ４遺伝型が血圧レベルに影響を与えることが判明し、ＮＥＴ４遺伝的多型のＧアレルが、高血圧の素因であるとの結論を得た。このことから、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域における多型を解析することで、高血圧疾患などの交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査することが可能となった。
【０００５】
即ち、本発明は、
〔１〕交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法であって、ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型を検出する工程を含み、多型が検出される場合に該疾患に発症しやすい遺伝性素因を有すると判定され、多型が検出されない場合に該疾患に発症しにくい遺伝性素因を有すると判定される方法、
〔２〕多型が一塩基多型である、〔１〕に記載の方法、
〔３〕多型が、ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子の−３５８番目の多型である、〔１〕に記載の方法、
〔４〕ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子の−３５８番目の多型が、アデニンからグアニンへの変異である、〔３〕に記載の方法、
〔５〕疾患が、高血圧疾患またはｏｒｔｈｏｓｔａｔｉｃ　ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅである、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔６〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
（ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
〔７〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔８〕以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔９〕以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔１０〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔１１〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）（ｉ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡ、および
（ｉｉ）該ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のＤＮＡと工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程
（ｄ）検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する工程
〔１２〕以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する工程
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｂ）で調製したプライマーを用いて、プライマ―伸長反応を行う工程
（ｄ）工程（ｃ）で得られたプライマ―伸長反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う工程
（ｅ）質量測定の結果から遺伝子型を決定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で決定した遺伝子型を対照と比較する工程
〔１３〕以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズする、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｃ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）で調製したヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
（ｄ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｅ）レポーター蛍光の発光を検出する工程
（ｆ）工程（ｅ）で検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する工程
〔１４〕以下の（ａ）〜（ｈ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基から５’側の塩基配列と相補的な配列および該塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列とハイブリダイズしない配列（フラップ）を有するヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｃ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基に対応する塩基（任意の塩基）が３’末端であり、該多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列と相補的な配列を有するヌクレオチドプローブを調製する工程
（ｄ）工程（ａ）で調製したＤＮＡに、工程（ｂ）および工程（ｃ）で調製したヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程
（ｅ）工程（ｄ）でハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、フラップを遊離させる工程
（ｆ）フラップと相補的な配列を有するヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる工程
（ｇ）工程（ｆ）により発生する蛍光の強度を測定する工程
（ｈ）工程（ｇ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
〔１５〕以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する工程
（ｅ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の強度を対照と比較する工程
〔１６〕以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）蛍光の偏光度を測定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で測定した蛍光の偏光度を対照と比較する工程
〔１７〕以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する工程
（ｄ）蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを鋳型とし、工程（ｃ）で調製したプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行う工程
（ｅ）工程（ｄ）で反応に使われた塩基種を判定する工程
（ｆ）工程（ｅ）で判定された塩基種を対照と比較する工程
〔１８〕ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子の−３５８番目の塩基（グアニン）を含む、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド、〔１９〕ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための試薬、
〔２０〕ノルエピネフリン・トランスポーター遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための試薬、
〔２１〕疾患が、高血圧疾患またはｏｒｔｈｏｓｔａｔｉｃ　ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅである、〔１９〕または〔２０〕に記載の試薬、
を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、ノルエピネフリン・トランスポーター（ＮＥＴ）遺伝子のプロモータ―領域の多型を明らかにした。具体的には、配列番号：１に記載の塩基配列の１５８９番目の塩基ＴがＣに変異している多型、該塩基配列の２３７９番目の塩基ＣがＧに変異している多型、および、該塩基配列の２８３７番目の塩基ＡがＧに変異している多型を新たに見出した。さらに、該塩基配列の２８３７番目の塩基ＡがＧに変異している多型を検出することにより、交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査できることを明らかにした。
【０００７】
本発明においては、正常な（より高頻度な、あるいは、野生型の）ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の塩基配列を配列番号：１、および、配列番号：１に記載の塩基配列の２８３７番目の塩基ＡがＧに置換された変異体の塩基配列を配列番号：２に記載する。
【０００８】
本発明は、交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法であって、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型を検出する工程を含み、多型が検出される場合に該疾患に発症しやすい遺伝性素因を有すると判定され、多型が検出されない場合に該疾患に発症しにくい遺伝性素因を有すると判定される方法を提供する。
【０００９】
本発明において、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域とは、プレシナプスに存在し、ノルエピネフリンの吸収活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のプロモータ―領域を意味する。このようなプロモーター領域としては、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列の１番目から３１９４番目までの配列、配列番号：１に記載の塩基配列の１番目から３１９４番目までの配列であって、１５８９番目および／または２３７９番目に変異を有する配列、または、それらの部分配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
多型とは、遺伝学的には、母集団中１％以上の頻度で存在している塩基変化と一般的に定義される。しかしながら、本発明における「多型」は、この定義に制限されず、１％未満の塩基の変化も「多型」に含む。本発明において、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型としては、例えば、ＮＥＴ遺伝子のエクソン１のはじめの塩基の１塩基５’側の塩基を−１番目としたときに、−３５８番目（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列における２８３７番目の部位）のＡがＧに置換した多型が挙げられるが、交感神経系の活性化に伴う疾患の発症頻度を上昇させる多型であれば、その部位、その種類、その数などに制限はない。上記多型の種類としては、例えば、一塩基多型、一から数十塩基（時には数千塩基）が欠失、置換あるいは挿入している多型等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
本発明において、交感神経系の活性化に伴う「疾患」としては、特に制限はなく、高血圧疾患またはｏｒｔｈｏｓｔａｔｉｃ　ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅが例示できる。
【００１２】
本発明においては、多型が検出される場合に、交感神経系の活性化に伴う疾患に発症しやすい遺伝性素因を有すると判定され、多型が検出されない場合に該疾患に発症しにくい遺伝性素因を有すると判定される。さらに、交感神経系の活性化に伴う疾患に罹患している被検者は、その原因が、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型にあると判定される。
【００１３】
以下、本発明の検査方法の好ましい態様を記載するが、本発明の方法はそれらの方法に限定されるものではない。
【００１４】
本発明の検査方法の好ましい態様においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜、毛髪、手術により採取あるいは切除した組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを基に調製することができる。
【００１５】
本方法においては、次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡの単離は、例えば、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。本発明において、「多型部位」とは、多型が存在しうる部位を意味する。具体的には、多型を有する被検者では多型が存在する部位であり、多型を有しない被検者では多型が存在する部位に対応する部位である。よって、本発明において、「多型部位を含むＤＮＡ」には、変異型の多型部位を含むＤＮＡだけでなく、正常型の多型部位を含むＤＮＡも含まれる。
【００１６】
本方法においては、次いで、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
【００１７】
本方法においては、次いで、決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する。本発明において、対照とは、正常なＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域を含むＤＮＡを言う。一般に健常人のＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域を含むＤＮＡの配列は正常であるものと考えられることから、上記「対照と比較する」とは、通常、健常人のＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域を含むＤＮＡの配列と比較することを意味するが、ＧｅｎＢａｎｋ等の各種遺伝子データベースもしくは文献等に野生型として記載されているＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域を含むＤＮＡの配列または配列番号：１に記載の塩基配列と比較してもよい。
【００１８】
本発明の検査方法は、上記の如く被検者由来のＤＮＡの塩基配列を直接決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
【００１９】
例えば、本発明における多型の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。
【００２０】
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブＤＮＡを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも被検者から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
【００２１】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００２２】
該方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎｏｎｙｍｏｕｓ　Ａｌｕ　ｒｅｐｅａｔｓ　ｏｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１１．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．　１９９２　Ｊａｎ　１；　１２（１）：　１３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒｓ　ｂｙ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．　１９９１　Ａｕｇ　１；　６（８）：　１３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ　ＰＣＲ−ＳＳＣＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．　、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌ．　１９９５　Ａｐｒ　１；　４（５）：　２７５−２８２．）が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異の存在を検出することができる。
【００２３】
具体的には、まず、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。ＰＣＲの際に、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。あるいはＰＣＲ反応液に３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。さらに、ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識ＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０から２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４から３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
【００２４】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００２５】
このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：　ＤＧＧＥ法）等を例示することができる。ＤＧＧＥ法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、ＤＮＡ断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってＤＮＡ断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なＤＮＡ断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のＤＮＡ配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。この部分的に解離したＤＮＡ断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖ＤＮＡの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを本発明のプライマー等を用いたＰＣＲ法等によって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在するＤＮＡ断片の場合、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
【００２６】
さらに別の方法においては、まず、被検者から調製したＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡ、および、該ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する。
【００２７】
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドプローブを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドプローブを固定することができれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−　ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
【００２８】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ　ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
【００２９】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ベースであり、好ましくは１０〜５０ベースであり、さらに好ましくは１５〜２５ベースである。
【００３０】
本方法においては、次いで、該ＤＮＡと該基板を接触させる。この過程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、ＤＮＡをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
【００３１】
本方法においては、次いで、該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、ＤＮＡアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したＤＮＡをプローブといい、一方溶液中のラベルしたＤＮＡをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。本方法においては、さらに、検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する。
【００３２】
このような方法としては、例えば、ＤＮＡアレイ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）２２：１６４−１６７）等が挙げられる。
【００３３】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。また、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する。次いで、該ＤＮＡを鋳型とし、該プライマーを用いて、プライマ―伸長反応を行う。次いで、プライマ―伸長反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う。次いで、質量測定の結果から遺伝子型を決定する。次いで、決定した遺伝子型を対照と比較する。
【００３４】
このような方法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１０６−１１７、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　（２０００）：１８：７７−８４）等が挙げられる。具体的には、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。この際、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡをＰＣＲなどを使用して増幅することで調製することが好ましい。次いで、ＰＣＲ産物を鋳型として、ジェノタイピングプライマ―（ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―）のｄｄＮＴＰプライマ―伸長反応を行う。この反応に用いるＰＣＲ産物は、ＰＣＲプライマ―を除去するための精製が行われていることが好ましい。ジェノタイピングプライマ―は、通常、１５ｂｐ以上の長さを有する。プライマ―伸長反応においては、通常、ＰＣＲ産物に対して１０倍以上の過剰のジェノタイピングプライマ―を加えるが、これに制限されるものではない。サーマルサイクルの条件は適宜選択しうるが、ジェノタイピングプライマ―のうち３０〜６０％程度が伸長する条件が好ましい。例えば、９４℃と３７℃の２温度間で２５回程度行うことで適当な伸長効率を得ることができる。次いで、プライマ―伸長反応産物のＭＡＬＤＩプレートへのスポットを行い、次いで、質量測定を行う（マススペクトログラムを作成する）。次いで、マススペクトログラム解析から遺伝子型を決定し、対照と比較する。
【００３５】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズする、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブを調製する。次いで、該ＤＮＡに、該ヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる。次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、レポーター蛍光の発光を検出する。次いで、検出したレポーター蛍光の発光を対照と比較する。
【００３６】
上記方法としては、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ９４−１０５、Ｇｅｎｅｔ　Ａｎａｌ．　（１９９９）１４：１４３−１４９）等を挙げることができる。具体的には、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブの５’末端にレポーター蛍光を標識する。本発明において、レポーター蛍光としては、ＦＡＭやＶＩＣなどが例示できるが、これらに限定されない。さらに、上記プローブの３’末端にクエンチャー蛍光を標識する。本発明において、クエンチャー蛍光としては、レポーター蛍光を消光できる物質であれば特に制限されない。次いで、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブを、被検者から調製したＤＮＡにハイブリダイズさせる。次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅する。その結果、レポーター蛍光とクエンチャー蛍光を標識したヌクレオチドプローブのレポーター蛍光標識部分が切断され、レポーター蛍光が遊離する。本発明において、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、好適にはＴａｑＤＮＡポリメラーゼが例示できるが、これに限定されるものではない。本方法においては、次いで、遊離したレポーター蛍光を検出し、さらに、該レポーター蛍光の発光を対照と比較する。なお、本方法においては、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基が正常型である場合と変異型である場合で異なるレポーター蛍光を標識した２種類のヌクレオチドプローブを用いることで、１回の反応でタイピングすることが可能である。
【００３７】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基から５’側の塩基配列と相補的な配列および該塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列とハイブリダイズしない配列（フラップ）を有するヌクレオチドプローブを調製する。また、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基に対応する塩基（任意の塩基）が３’末端であり、該多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列と相補的な配列を有するヌクレオチドプローブを調製する。次いで、調製したＤＮＡに、上記２種類のヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、フラップを遊離させる。本発明において、一本鎖ＤＮＡ切断酵素としては、特に制限はなく、例えば下記のｃｌｅａｖａｓｅが例示できる。本方法においては、次いで、フラップと相補的な配列を有するヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる。次いで、発生する蛍光の強度を測定する。次いで、測定した蛍光の強度を対照と比較する。
【００３８】
上記方法としては、例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ９４−１０５、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（２０００）１０：３３０−３４３）等が挙げられる。具体的には、まず、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基から５’側の塩基配列と相補的な配列および該塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列とハイブリダイズしない配列（フラップ）を有するヌクレオチドプローブ（プローブＡ）を合成する。また、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基に対応する塩基（任意の塩基）が３’末端であり、該多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列と相補的な配列を有するヌクレオチドプローブ（プローブＢ）を合成する。次いで、これらプローブを調製した鋳型ＤＮＡにハイブリダイズさせる。この際、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基に対応するプローブＢの塩基（任意の塩基）が鋳型ＤＮＡとプローブＡとの間に侵入する。この侵入部位を認識して、該部位に対応するプローブＡの塩基と該塩基の１塩基３’側の塩基の間を切断するエンドヌクレアーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）を用いてハイブリダイズしたＤＮＡを切断する。これにより、フラップ部分が遊離する。次いで、遊離したフラップ部分と、フラップと相補的な配列を有するヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたヌクレオチドプローブ（検出用プローブ）をハイブリダイズさせる。該検出用プローブは、一般的にｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）プローブとよばれる。該プローブにおいて、５’側は自身で相補的に結合できる。また、３’側はフラップと相補的な配列を有している。また、自身で相補的に結合できる５’側において、５’末端にはレポーター蛍光が標識され、該５’末端の３’側にはクエンチャー蛍光が標識されている。遊離したフラップの３’末端の塩基が、ＦＲＥＴプローブにハイブリダイズする結果、該プローブのレポーター蛍光が標識された相補結合部位に侵入することで、ｃｌｅａｖａｓｅが認識する構造が生成される。本方法においては、ｃｌｅａｖａｓｅによるレポーター蛍光標識部分の切断によって遊離したレポーター蛍光を検出し、さらに、測定した蛍光の強度を対照と比較する。
【００３９】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する。次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する。次いで、測定した蛍光の強度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　（２０００）１０：１０３−１１０）等が挙げられる。
【００４０】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う。次いで、蛍光の偏光度を測定する。次いで、測定した蛍光の偏光度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（１９９９）９：４９２−４９８）等が挙げられる。
【００４１】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位の塩基の１塩基３’側の塩基から３’側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマ―を調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行う。次いで、一塩基伸長反応に使われた塩基種を判定する。次いで、判定された塩基種を対照と比較する。このような方法として、例えば、ＳＮｕＰＥ法（Ｒａｐｉｄ　Ｖｏｍｍｕｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．　（２０００）１４：９５０−９５９）等が挙げられる。
【００４２】
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これとＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等により検出することができる。
【００４３】
本発明は、本発明の検査方法などに利用することができる、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域のオリゴヌクレオチドであって、ＮＥＴ遺伝子の−３５８番目の塩基Ｇ（例えば、配列番号：２に記載の塩基配列における２８３７番目の塩基Ｇ）を含む、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを提供する。本発明において、オリゴヌクレオチドには、ポリヌクレオチドが含まれる。
【００４４】
さらに、本発明は、本発明の検査方法に使用するための試薬を提供する。その一つの態様としては、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査試薬が挙げられる。
【００４５】
該オリゴヌクレオチドは、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
【００４６】
ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブ（該プローブが固定された基板を含む）やプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、多型部分を含むＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００４７】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００５０】
また、本発明における検査試薬の別の態様は、ＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の多型部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む検査試薬である。プライマーの長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、多型部分を含むＮＥＴ遺伝子のプロモータ―領域の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００５１】
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００５２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］
本発明者らは、２４人の被検者を対象にＮＥＴ遺伝子のプロモーター領域のシークエンスを行い、ＮＥＴ１、ＮＥＴ２およびＮＥＴ４の３種類の遺伝的変異を見いだした（図１および２）。さらに、本発明者らは、一般人口を代表するように抽出された疫学調査、吹田スタデーを用いて、これら３種類の変異と血圧レベルの相関を調べた。対象は、吹田市一般住民２００７人で調べた（吹田市住民３０万人より、３０歳代男１４４０人、３０歳代女性１４４０人、４０歳代男性１４４０人、４０歳代女性１４４０人、５０歳代男性１４４０人、５０歳代女性１４４０人、６０歳代男性１４４０人、６０歳代女性１４４０人、７０歳代男性１４４０人、７０歳代女性１４４０人、計１４４００人を、無作為に選び出し、手紙を書いて、検診を呼びかけた。一年に２０００から２５００人の受診がある。１９９７年に受診された方で、遺伝子検査に同意された方を対象として調べた）。その結果、３種類のうち、ＮＥＴ４　変異と血圧レベルに弱い相関が認められた（表１、ｐ＝０．０８７）。
【００５３】
【表１】
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高血圧の定義は、収縮期１４０ｍｍＨｇ以上あるいは拡張期９０ｍｍＨｇ以上、あるいは既に降圧剤を服用している場合とした。血圧レベルに大きな影響を与える年齢と体容積指数（ｂｏｄｙ　ｍａｓｓ　ｉｎｄｅｘ）による補正を行うと、ＮＥＴ４遺伝型（ＡＡ型とＡＧ＋ＧＧ型に分ける）が血圧レベルに影響を与えることが認められた（表２、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｌｏｇｉｓｔｉｃ　解析、ｐ＝０．０２１）。以上よりＮＥＴ４遺伝的多型のＧアレルは、高血圧の素因であると結論される。
【００５４】
【表２】
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オッズ比下限およびオッズ比上限は、それぞれ、９５％の信頼区間におけるオッズ比下限およびオッズ比上限を意味する。
【００５５】
ＮＥＴの遺伝的変異により　ｏｒｔｈｏｓｔａｔｉｃ　ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ　と呼ばれる重症の起立性頻拍症を発症することは報告されているが、ＮＥＴ遺伝子の遺伝的多型と一般的な本態性高血圧の関連は報告がない。Ｒｅｂｏｘｅｔｉｎｅ　というＮＥＴの特異的阻害薬に軽い血圧上昇作用のあることより、ＮＥＴの異常が血圧調節の異常を来すことが予想される。一方、本実施例において、ＮＥＴのプロモーター領域の変異が高血圧の遺伝的素因であることを明らかになった。ＮＥＴ４のＧアレルを持つと、プロモーター活性が低下し、トランスポーターの発現量低下、ノルエピネフリンの再吸収低下から血圧が上昇すると想定され、交感神経系の遮断剤がこのＧアレルを有する高血圧患者には有効な治療薬になりうると考えられる。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によって、交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査するための方法および該検査のための試薬が提供された。該検査方法および該検査試薬を使用することで、交感神経系の活性化に伴う疾患の発症しやすさに影響する遺伝性素因を有するか否かを検査できるようになった。また、該検査方法および該検査試薬を使用することで、交感神経系の活性化に伴う疾患に罹患している被検者は、その原因が、交感神経系の活性化に伴う疾患に発症しやすい遺伝性素因にあることを認識することができるようになった。このような検査によって、交感神経系の活性化に伴う疾患の発症予防または適切な治療を、個人個人に適した方法でより効果的に行うことができるものと大いに期待される。具体的には、交感神経系の活性化に伴う疾患に発症しやすい遺伝性素因者に対して、生活習慣の改善勧告を促し、効率的な予防対策ができる。また、該疾患に発症しやすい遺伝性素因者に対して、より効果的な降圧薬（例えば、交感神経系の遮断剤）を選択することができる。
【００５７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＥＴ遺伝子のプロモーター領域の変異を示す図である。
【図２】図１の続きを示す図である。エクソン１領域は灰色の網がけで示している。
【図１】
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【図２】
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