(57)【要約】【課題】環状ＤＮＡを伸長し、固体基板上に固定化する方法の提供。【解決手段】カチオン性両親媒性物質と環状ＤＮＡとからなる複合単分子膜を気水界面に作製し、該複合単分子膜を固体基板上への移し取り、それにより固体基板上へ環状ＤＮＡを伸長固定化する方法を提供する。【効果】本発明の方法を用いると、再現的に、効率よく、環状ＤＮＡを伸長した状態で固体基板上へ固定化することが可能となる。また、固定化されたＤＮＡ試料は、塩基配列解析のための試料として、あるいはこのＤＮＡに特異的に結合するタンパク質の結合配列の特性解析に用いることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状ＤＮＡを含有してなるＤＮＡ水溶液上に、カチオン性両親媒性物質を展開し、前記カチオン性両親媒性物質と前記環状ＤＮＡとからなる複合単分子膜を形成することを含む環状ＤＮＡの伸長固定化方法。
【請求項２】
前記複合単分子膜を、前記ＤＮＡ水溶液に予め沈めておいた固体基板を垂直に引き上げることによって、その固体基板上に移し取ることを含む前記請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記固体基板がガラス基板である前記請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記カチオン性両親媒性物質がジドデシルアンモニウム塩、ジテトラデシルアンモニウム塩、ジヘキサデシルアンモニウム塩、ジオクタデシルアンモニウム塩からなる群から選ばれる前記請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
前記カチオン性両親媒性物質がジオクタデシルアンモニウム塩である前記請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡ水溶液を調製する水として、比抵抗値１８．３  Ωｃｍ以上に精製された超純水を用いる前記請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
前記カチオン性両親媒性物質を展開するための展開液として、ベンゼン、エタノール、スペクトロゾールクロロホルムからなる群から選ばれる前記請求項１または２記載の方法。
【請求項８】
前記展開液が、スペクトロゾールクロロホルムである前記請求項７記載の方法。
【請求項９】
環状ＤＮＡを含有してなるＤＮＡ水溶液上に、カチオン性両親媒性物質を展開し、前記カチオン性両親媒性物質と前記環状ＤＮＡとからなる複合単分子膜を形成することを含む環状ＤＮＡの伸長固定化法によって固定された環状ＤＮＡを、走査型近接場光学顕微鏡によって解析することを含む環状ＤＮＡの解析方法。
【請求項１０】
前記複合単分子膜を、前記ＤＮＡ水溶液に予め沈めておいた固体基板を垂直に引き上げることによって、その固体基板上に移し取ることを含む前記請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記固体基板がガラス基板である前記請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
前記カチオン性両親媒性物質がジドデシルアンモニウム塩、ジテトラデシルアンモニウム塩、ジヘキサデシルアンモニウム塩、ジオクタデシルアンモニウム塩からなる群から選ばれる前記請求項９または１０記載の方法。
【請求項１３】
前記カチオン性両親媒性物質がジオクタデシルアンモニウム塩である前記請求項９または１０記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ水溶液を調製する水として、比抵抗値１８．３  Ωｃｍ以上に精製された超純水を用いる前記請求項９または１０記載の方法。
【請求項１５】
前記カチオン性両親媒性物質を展開するための展開液として、ベンゼン、エタノール、スペクトロゾールクロロホルムからなる群から選ばれる前記請求項９または１０記載の方法。
【請求項１６】
前記展開液が、スペクトロゾールクロロホルムである前記請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環状ＤＮＡを固体基板上へ伸長、固定化する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
染色体ＤＮＡがもつ塩基配列情報を解読することにより、染色体上に存在する遺伝子が特定できる。しかし、遺伝子の染色体上での位置、遺伝子の並び方、遺伝子間の距離などの情報を知るだけでも、遺伝子解析にとって重要である。
これまでに、ＤＮＡをスライドガラス上で伸長し、蛍光色素により遺伝子を光らせ、その位置を直接的に光学顕微鏡で測定する方法が知られていた（Ｘ．  Ｍｉｃｈａｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７７，  １５１８−１５２３  （１９９７））。しかし、光学顕微鏡の解像度では一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡを区別したり、遺伝子の位置を正確に検出することは困難であった。
ＤＮＡの分子構造やＤＮＡとタンパク質の間の特異的結合を、より詳細に、例えば１分子のレベルで蛍光像の画像解析などにより調べるためには、固体基板上へＤＮＡを固定化することが必要不可欠である。すなわち、水溶液中では凝集状態にあるＤＮＡ分子を伸長して固体基板に固定化する方法が開発されている（非特許文献１：Ａｌｌｅｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ７３，  ２０６４−２０７０  （１９９７））。Ａｌｌｅｍａｎｄらの方法は、特定のｐＨ条件でポリスチレン等にＤＮＡが特異的に結合することを利用し、ポリスチレン等で表面をコートした固体基板にＤＮＡを選択的に結合する方法である。
【非特許文献１】Ａｌｌｅｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ７３，  ２０６４−２０７０  （１９９７）
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
前述のＡｌｌｅｍａｎｄらの方法では、ＤＮＡを固体基板上に選択的に結合させるために、ＤＮＡ分子に末端を必要とした。そのため、末端のない環状ＤＮＡに該方法を適用することは困難であった。また、環状ＤＮＡを固定化する技術についての開示あるいは示唆をする文献等は見当たらない。本発明は、環状ＤＮＡを伸長し、固体基板上に固定化する方法を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、再現的に、効率よく、環状ＤＮＡを伸長した状態で、固体基板上へ固定化することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明は、環状ＤＮＡを含有してなるＤＮＡ水溶液上に、カチオン性両親媒性物質を展開し、前記カチオン性両親媒性物質と前記環状ＤＮＡとからなる複合単分子膜を形成することを含む環状ＤＮＡの伸長固定化方法を提供する。本発明の方法においては、通常、複合単分子膜は、ＤＮＡ水溶液に予め沈めておいた固体基板を垂直に引き上げることによって、その固体基板上に移し取ることができる。ここで用いられる固体基板は、好ましくはガラス基板である。
また、カチオン性両親媒性物質は、例えば、ジドデシルアンモニウム塩、ジテトラデシルアンモニウム塩、ジヘキサデシルアンモニウム塩、ジオクタデシルアンモニウム塩からなる群から選ばれる。本発明の方法においては、カチオン性両親媒性物質としては、ジオクタデシルアンモニウム塩が好ましい。ＤＮＡ水溶液を調製する水として、好ましくは、比抵抗値１８．３  Ωｃｍ以上に精製された超純水を用いる。カチオン性両親媒性物質を展開するための展開液としては、ベンゼン、エタノール、スペクトロゾールクロロホルム等が用いられる。
また、本発明は、上記のようにして固定された環状ＤＮＡを、走査型近接場光学顕微鏡等の光学的解析および形状解析の手段によって解析することを含む環状ＤＮＡの解析方法も提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、伸長した状態にある環状ＤＮＡを固体基板上へ固定化する方法に関する。具体的には、カチオン性両親媒性物質と環状ＤＮＡとからなる複合単分子膜を気水界面に作製し、該複合単分子膜を固体基板上へ移し取り、それにより固体基板上へ環状ＤＮＡを伸長固定化する方法に関するものである。ここで、「伸長」とは、例えばランダムなコイル状態にある部分を線状に引き伸ばすことをいう。固体基板上への環状ＤＮＡの固定化は、蛍光色素を結合させたＤＮＡを試料として用いることにより、近接場光学顕微鏡等でその蛍光像および形状像を観察することにより確認できる。また、種々の結合特性を示す蛍光色素をＤＮＡ試料に結合させることによって、そのＤＮＡ試料の解析に役立てることができる。
【０００７】
本発明の方法によって固定化される「環状ＤＮＡ」は、例えばｐＢＲ３２２  ＤＮＡ、Ｍ１３ｍｐ８  ＲＦＩ  ＤＮＡなどの配列既知のＤＮＡ、および配列が未決定の環状ＤＮＡを含む。本発明によって固定化されるＤＮＡのサイズ（塩基対）は特に限定されないが、例えば、１ｋ〜１Ｍｂｐ、より好ましくは２ｋ〜１００ｋｂｐである。配列既知のＤＮＡの場合、そのＤＮＡに特異的に結合するタンパク質の結合配列の特性解析等に、配列未決定のＤＮＡの場合、その塩基配列、塩基数等の解析に用いることができる。ＤＮＡ試料を、水に溶解しＤＮＡ水溶液を調製する。ここで用いられる水としては、固定化されたＤＮＡの解析の妨げとならないように、不純物の混入量ができるだけ少ない純水が好ましい。ここで用いられる純水としては、好ましくは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ＳＰシステム（日本ミリポア社製）等により比抵抗値１８．３  Ωｃｍ以上に精製された超純水が用いられる。なお、ＤＮＡ水溶液は、例えば、１×１０−６〜３０×１０−６  ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５×１０−６〜２０×１０−６  ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは６×１０−６〜１０×１０−６  ｍｇ／ｍｌの濃度で調製される。
【０００８】
本明細書中、「カチオン性両親媒性物質」とは、分子内に親水基と疎水基を有する物質を指し、例えば、細胞膜の構成物であるリン脂質、糖脂質などがあげられる。本発明では、カチオン性のものであればいずれでも構わないが、ジドデシルアンモニウム塩、ジテトラデシルアンモニウム塩、ジヘキサデシルアンモニウム塩、ジオクタデシルアンモニウム塩などが好ましく用いられる。なかでも、水に溶けにくく、安定な単分子膜を形成するという理由から、ジオクタデシルアンモニウム塩がより好ましい。前記カチオン性両親媒性物質は例えば、ベンゼン、エタノール、スペクトロゾールクロロホルム、好ましくはスペクトロゾールクロロホルムのような溶媒に溶解し、展開溶液とする。この展開溶液は、例えば、０．１〜１  ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で調製される。
【０００９】
本発明の方法において、基板上への固定化を確認するために、蛍光物質をＤＮＡ水溶液に添加し、ＤＮＡに結合させることが好ましい。好ましく用いられる蛍光物質としては、例えば、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｉｌｉｎｄｏｌｅ  （ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ））、ＹＯＹＯ（登録商標）−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ：  Ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ，  １，１’−［１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｙｌｂｉｓ［（ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）−３，１−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｙｌ］］ｂｉｓ［４−［（３−ｍｅｔｈｙｌ−２（３Ｈ）−ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］］−，  ｔｅｔｒａｉｏｄｉｄｅ）などがあげられるが、本発明では特に、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合性を示すＤＡＰＩ、ＹＯＹＯ（登録商標）−１などが好ましく、より強い蛍光を発することからＹＯＹＯ（登録商標）−１が最適である。ＹＯＹＯ（登録商標）−１は、ＤＮＡの塩基対に対してのモル比で１：８以下のときビスインターカレーターとして作用すると考えられている。本発明では、好ましくは１：８以下の比率、具体的には例えば、１：８〜１：１０の比率で使用される。
【００１０】
複合単分子膜の作製するには、まず、ＤＮＡ水溶液をガラスセル、ラングミュアトラフ等の容器に入れる。ここでは、特にポリフッ化エチレン（テフロン（登録商標））コーティングしたラングミュアトラフが好ましく用いられる。水溶液量は、後述の固体基板が完全に沈む量であれば、いかなる量であっても構わない。ＤＮＡ水溶液は、例えば、１０℃から３０℃、好ましくは１８℃から２２℃に保持する。次に、マイクロシリンジ等を用いて、１０〜２５  ｍｌ、好ましくは１５〜２０  ｍｌの展開溶液をＤＮＡ溶液表面に展開し、展開溶媒が蒸発するまで一定時間、例えば２から１５分、好ましくは３から１０分、より好ましくは４から６分間静置する。静置後、フィルムバランスＦＳＤ−３００を用いてバリアーによる圧縮を、例えば、０．０５〜０．２  ｍｍ／ｓｅｃ、好ましくは０．１〜０．１２５  ｍｍ／ｓｅｃの速度で行う。この結果、カチオン性両親媒性物質によって形成される単分子膜は正電荷を有するので、負電荷を有しているＤＮＡはその単分子膜に引き寄せられ、気水界面にＤＮＡ−カチオン性両親媒性物質の複合単分子膜が形成される。
【００１１】
次に、上記のようにして形成されたＤＮＡ−カチオン性両親媒性物質の複合単分子膜を基板に移し取る操作を行なう。例えば、複合単分子膜を、ＤＮＡ水溶液に予め沈めておいた固体基板を垂直に引き上げることによって、その固体基板上に移し取る。ここで、垂直とは、ほぼ垂直を意味し、複合単分子膜にしわがよることなく引き上げることができる限り多少傾斜していてもかまわない。複合膜を移し取るための基板としては、平坦であれば何れの基材を用いたものでもよい。例えば、固定化後に蛍光を観察する場合は、基板自身の蛍光を少なくするために、カバーガラスを用いることが好ましい。ガラス基板は、通常、界面活性剤、例えばデコン９０（Ｄｅｃｏｎ  ９０、ＡＲ  ＢＲＯＷＮ社製）溶液、続いて超純水を用いて超音波にて洗浄する。上記（１）において作製した複合単分子膜を、予めＤＮＡ溶液中に沈めておいた洗浄済みのガラス基板を一定速度、例えば０．５〜５  ｍｍ／ｓｅｃ、好ましくは１〜２  ｍｍ／ｓｅｃで引き上げることにより、基板上へ移し取る。
ここで、複合単分子膜の形成及びその引き上げ操作について、図１を参照して説明する。図１（ａ）は、単分子複合膜を形成する器具の概要を示す図、図１（ｂ）は、ラングミュアトラフ中で単分子膜が形成される状況を示す図、そして図１（ｃ）は、複合単分子膜を引き上げる操作を示す図である。
図１（ａ）中、ポリフッ化エチレン（テフロン（登録商標））コーティングしたラングミュアトラフ１中にＤＮＡ水溶液２が入れられている。ＤＮＡ水溶液２には、引き上げ用の取っ手を有する固体基板３が浸漬される。カチオン性両親媒性物質を含む展開液（不図示）は、マイクロシリンジ４からＤＮＡ水溶液２上に展開される。なお、５は温度センサー、６は、カチオン性両親媒性物質の展開液に圧力を与えるバリアー、７は表面圧を測定するためのウィルヘルミー・プレートである。図１（ｂ）に示すように、
ＤＮＡ試料２ａを含有するＤＮＡ水溶液２の表面に、カチオン性両親媒性物質８ａの単分子膜８が形成されている。このカチオン性両親媒性物質８ａにＤＮＡ試料２ａが静電吸着し、複合単分子膜を形成する。固体基板３はＤＮＡ水溶液２中に予め浸漬されている。形成された複合単分子膜を引き上げる際は、図１（ｃ）に示すように、バリアー６を移動し、カチオン性両親媒性物質８ａに圧力をかけてカチオン性両親媒性物質８ａからなる単分子膜８の密度を高くする。そして、固体基板３をゆっくりと垂直に引き上げることによって、ＤＮＡ試料２ａを伸長させながら固体基板３に移し取る。
【００１２】
上記のように固定化されたＤＮＡ試料は、塩基配列解析のための試料として有効に用いられる。また、固定化されたＤＮＡ試料は、このＤＮＡに特異的に結合するタンパク質の結合配列の特性解析に用いることができる。
【００１３】
【実施例】
以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００１４】
実施例１
（１）試薬
気液界面に展開するカチオン性脂質として、ジオクタデシルアンモニウム塩（相互薬工）を使用した。これをスペクトロゾールクロロホルム（和光純薬）を溶媒として、濃度約０．５  ｍｇ／ｍｌの展開溶液を調製した。
環状ＤＮＡとして、Ｍ１３ｍｐ８  ＲＦＩ  ＤＮＡ（日本ジーン）およびｐＢＲ３２２  ＤＮＡ（日本ジーン）を使用した。
ＤＮＡが固定化されたことを確認するために、ＤＮＡに特異的に結合し、蛍光を発する分子として、ＹＯＹＯ（登録商標）−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を使用した。
【００１５】
（２）ＤＮＡ水溶液の調製
Ｍ１３ｍｐ８  ＲＦＩ  ＤＮＡ（７２２９  ｂｐ）およびｐＢＲ３２２  ＤＮＡ（４３６３  ｂｐ）を一晩室温で放置することにより超純水に完全に溶解し、濃度が約０．３  μｇ／μｌとなるように超純水を加えた。これを母液として、終濃度が１．０×１０−８  ｉｎ  ｂｐとなるように調製した。固定化を確認するために、ＹＯＹＯ（登録商標）−１を、ＤＮＡ塩基対に対して、モル比が１：１０となるようにＤＮＡ水溶液に添加した。ＹＯＹＯ（登録商標）−１をＤＮＡ分子に結合させるために、溶液調製後２時間以上静置した。
【００１６】
（３）単分子膜の作製
表面圧−分子占有面積（π−Ａ）等温線の測定には、マイクロプロセッサー制御のフィルムバランスＦＳＤ−３００（ＵＳＩシステム）を用いた。ポリフッ化エチレン（テフロン（登録商標））コーティングされたラングミュアトラフにＤＮＡ水溶液を満たし、２０℃に保持した。その後、マイクロシリンジにて１５  ｍｌの展開溶液をＤＮＡ水溶液の表面に展開し、展開溶媒が蒸発するまで５分間静置した。静置後、ＦＳＤ−３００を用いてバリアーによる圧縮を０．１  ｍｍ／ｓｅｃの速度で行った。表面圧は１  ｃｍ四方の濾紙片を用いたウィルヘルミー法により測定した。
【００１７】
（４）複合膜の移し取り
複合膜を移し取るための基板としてカバーガラスを用いた。ガラス基板を界面活性剤であるｄｃｎ９０溶液（３０  ｍｌ／Ｌ  ｉｎ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  水）に浸漬し、約１５分間超音波洗浄した後、さらに超純水中で１５分間の超音波洗浄を３回繰り返した。種々の条件下で作製した複合膜を、予めＤＮＡ水溶液に沈めておいたガラス基板を２  ｍｍ／ｍｉｎの速度で引き上げることにより、基板上へ移し取った。
【００１８】
（５）蛍光イメージの観察
前記（４）にて得られた複合膜を移し取った基板を十分乾燥させた後、走査型近接場光学顕微鏡ＳＰＡ３００／ＳＮＯＡＭ（ＳＥＩＫＯインストルメンツ）を用いて、基板上のＤＮＡ分子の形状を観察した。波長４８８  ｎｍの励起光のアルゴンイオンレーザーＳｔａｂｉｌｉｔｅ２０１７（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）を用いて、近接場光学顕微鏡のファイバープローブ先端において、約３００  μＷの出力となるように調整した。ＹＯＹＯ（登録商標）−１からの蛍光を対物レンズで集光し、シングルフォトンカウンティングモジュールＳＰＣＭ−ＡＱＲ−１４（ＥＧ＆Ｇ）にて検出した。得られた検出フォトン数をＳＰＩ３８００Ｎ（ＳＥＩＫＯインストルメンツ）を用いて画像化し、蛍光像を構成した。
【００１９】
（６）蛍光像とヒストグラム
Ｍ１３ｍｐ８  ＲＦＩ  ＤＮＡを環状ＤＮＡとして用いて得られた蛍光像（ａ）および蛍光像から得られる直剪の長さに関するヒストグラム（ｂ）を図１に示す。また、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡから得られた蛍光像およびヒストグラムを図２（蛍光像（ａ）、ヒストグラム（ｂ））に示す。
Ｍ１３ｍｐ８  ＲＦＩ  ＤＮＡは７２２９  ｂｐであり、一塩基対あたりの長さを０．３４  ｎｍとすると、全長２４５８  ｎｍと見積もることができる。ヒストグラムから得られる蛍光像の最長は約１３００  ｎｍであることから、Ｍ１３ｍｐ８  ＲＦＩ  ＤＮＡは環状のまま伸長され、固定化されていることが明らかとなった。
同様に、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡは４３６３  ｂｐであり、全長を１４７７  ｎｍと見積もることができる。ヒストグラムによると、８００  ｎｍ付近が最長であるので、この場合もｐＢＲ３２２  ＤＮＡは環状のまま伸長され、固定化されていると考えられる。
【００２０】
【発明の効果】
本発明の方法を用いると、再現的に、効率よく、環状ＤＮＡを伸長した状態で固体基板上へ固定化することが可能となる。また、固定化されたＤＮＡ試料は、塩基配列解析のための試料として、あるいはこのＤＮＡに特異的に結合するタンパク質の結合配列の特性解析に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（ａ）は、単分子複合膜を形成する器具の概要を示す図、図１（ｂ）は、ラングミュアトラフ中で単分子膜が形成される状況を示す図、そして図１（ｃ）は、複合単分子膜を引き上げる操作を示す図である。
【図２】Ｍ１３ｍｐ８  ＲＦＩ  ＤＮＡを環状ＤＮＡとして用いて得られた蛍光像（ａ）および蛍光像から得られる直線の長さに関するヒストグラム（ｂ）を示す。
【図３】ｐＢＲ３２２  ＤＮＡを環状ＤＮＡとして用いて得られた蛍光像（ａ）および蛍光像から得られる直線の長さに関するヒストグラム（ｂ）を示す。
【図１】
2004147537.tif 000002
【図２】
2004147537.tif 000003
【図３】
2004147537.tif 000004