(57)【要約】【課題】実験動物の遺伝子発現分布データをヒトに外挿する方法を提供する。また進化の度合いが異なる生物種同士のデータ比較を行うことで、進化の過程に対応する遺伝子機能の変化を研究するための方法を提供する。【解決手段】塩基配列の異なる複数のオリゴヌクレオチドを支持体上の異なる位置に固定化したアレイであって、生物種Ａと生物種Ｂのオーソログ遺伝子の部分配列をプローブとし、かつクロスハイブリダイゼーションを実質上無視できる程度に低減させたオリゴヌクレオチドアレイ。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる生物種のオーソログ遺伝子由来の複数のオリゴヌクレオチドを支持体上に固定化してなるオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項２】
上記異なる生物種が２種であり、片方がヒトである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項３】
塩基配列の異なる複数のオリゴヌクレオチドを支持体上の異なる位置に固定化したアレイであって、前記オリゴヌクレオチドの各々が生物種Ａ及び生物種Ｂのオーソログ遺伝子のいずれかの部分配列であり、
（１）生物種Ａの該オーソログ遺伝子以外の遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列マッチ度が７０％未満、
（２）生物種Ｂの該オーソログ遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列マッチ度が７０％未満、かつ
（３）生物種Ａ及び生物種Ｂのオーソログ遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列マッチ度がいずれも７０％以上、
であることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項４】
塩基配列の異なる複数のオリゴヌクレオチドを支持体上の異なる位置に固定化したアレイであって、前記オリゴヌクレオチドの各々が生物種Ａ及び生物種Ｂのオーソログ遺伝子のいずれかの部分配列であり、
（１）生物種Ａの該オーソログ遺伝子以外の遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列相同性がＢＬＡＳＴ等のホモロジーサーチアルゴリズムを用いて計算される統計的有意水準値で０．１以上、
（２）生物種Ｂの該オーソログ遺伝子以外の遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列相同性がＢＬＡＳＴ等のホモロジーサーチアルゴリズムを用いて計算される統計的有意水準値で０．１以上、かつ
（３）生物種Ａ及び生物種Ｂのオーソログ遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列相同性がＢＬＡＳＴ等のホモロジーサーチアルゴリズムを用いて計算される統計的有意水準値でいずれも０．１未満、
であることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項５】
塩基配列の異なる複数のオリゴヌクレオチドを支持体上の既知の異なる位置に固定化したアレイであって、前記オリゴヌクレオチドの各々が生物種Ａ及び生物種Ｂのオーソログ遺伝子のいずれかの部分配列であり、
（１）生物種Ａの該オーソログ遺伝子以外の遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの融解温度差異の実測値もしくは計算値が２０℃以上、
（２）生物種Ｂの該オーソログ遺伝子以外の遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの融解温度差異の実測値もしくは計算値が２０℃以上、かつ、
（３）生物種Ａ及び生物種Ｂのオーソログ遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの融解温度差異の実測値もしくは計算値がいずれも２０℃未満、
であることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアレイであって、２種以上の生物種の遺伝子発現分布測定を同時に行うことができることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアレイを用いた、異なる生物種におけるオーソログ遺伝子の発現分布測定方法。
【請求項８】
薬剤投与に対するオーソログ遺伝子の発現変化を比較するための、請求項７に記載のオーソログ遺伝子の発現分布測定方法。
【請求項９】
異なる生物種におけるオーソログ遺伝子の機能の変化を比較するための、請求項７に記載のオーソログ遺伝子の発現分布測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、従来複数の異なるアレイを用いて測定する必要があった複数生物種の遺伝子発現分布測定を１枚のアレイで評価するためのオリゴヌクレオチドアレイ、及び該オリゴヌクレオチドアレイを用いたオーソログ遺伝子発現分布測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
創薬の過程において、毒性及び薬理作用の実験に用いられるラットやマウスなどの生物と、実際に医薬を服用するヒトとの生物種差をどのように克服するかが問題となっている。すなわち、ラットやマウスから得られた薬効や毒性データをヒトへ外挿する方法論がいまだに確立されていない。このためラットやマウスに対しては毒性がないのに、ヒトに対しては副作用が認められた結果、発売開始後の薬剤が販売停止になった例も数多い。
【０００３】
一方、近年、ＤＮＡマイクロアレイを用いた発現分布測定により毒性、副作用予測を行うことが提案されている。Ｇｅｒｈｏｌｄ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｄｒｕｇ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ｕｓｉｎｇ　ＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　ｖｏｌ．５，　ｐｐ．１６１−１７０　（２００１）、Ｔｈｏｍａｓ　Ｒ．Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｅ　ｇｅｎｅ　ｓｅｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｃＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，　ｖｏｌ．６０，　ｐｐ．１１８９−１１９４　（２００１）を参照。ＤＮＡマイクロアレイを用いることで、例えば実験動物として代表的なラットにおける毒性や薬効予測の精度は大幅に向上できる可能性が高い。しかし、たとえラットに対する毒性や薬効予測が高精度で得られたとしても、その結果を生物種の異なるヒトに外挿する方法は依然確立されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
毒性や薬効予測に優れた性能を有するＤＮＡチップを用いて、実験動物（例えばラットやマウス）における毒性・薬効予測のデータをヒトに外挿することを可能とするオリゴヌクレオチドアレイ及びこれを用いた方法を提供する。またラット・マウスとヒトの組み合わせ以外でも、例えば、大腸菌、線虫、分裂酵母、出芽酵母、ショウジョウバエ、ラット、マウス、メダカ、ゼブラフィッシュ、ゴリラ、チンパンジー、ヒト、シロイヌナズナなどの異なる生物種のうちいずれか２種のＤＮＡチップデータ比較を行うことで、進化の過程に対応する遺伝子機能の変化を研究するためのオリゴヌクレオチドアレイ及びこれを用いた方法を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
生物種Ａ（例えばラット）と生物種Ｂ（例えばヒト）由来のＲＮＡサンプルを異なる蛍光試薬を用いて標識した後、同一のＤＮＡチップとハイブリダイズさせて、生物種Ａと生物種Ｂの発現分布を直接比較することで上記課題を解決する。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の１）〜９）を提供する。
１）　異なる生物種のオーソログ遺伝子由来の複数のオリゴヌクレオチドを支持体上に固定化してなるオリゴヌクレオチドアレイ。
２）　上記異なる生物種が２種であり、片方がヒトである、上記１）に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【０００７】
３）　塩基配列の異なる複数のオリゴヌクレオチドを支持体上の異なる位置に固定化したアレイであって、前記オリゴヌクレオチドの各々が生物種Ａ及び生物種Ｂのオーソログ遺伝子のいずれかの部分配列であり、
（１）生物種Ａの該オーソログ遺伝子以外の遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列マッチ度が７０％未満、
（２）生物種Ｂの該オーソログ遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列マッチ度が７０％未満、かつ
（３）生物種Ａ及び生物種Ｂのオーソログ遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列マッチ度がいずれも７０％以上、
であることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【０００８】
４）　塩基配列の異なる複数のオリゴヌクレオチドを支持体上の異なる位置に固定化したアレイであって、前記オリゴヌクレオチドの各々が生物種Ａ及び生物種Ｂのオーソログ遺伝子のいずれかの部分配列であり、
（１）生物種Ａの該オーソログ遺伝子以外の遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列相同性がＢＬＡＳＴ等のホモロジーサーチアルゴリズムを用いて計算される統計的有意水準値で０．１以上、
（２）生物種Ｂの該オーソログ遺伝子以外の遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列相同性がＢＬＡＳＴ等のホモロジーサーチアルゴリズムを用いて計算される統計的有意水準値で０．１以上、かつ
（３）生物種Ａ及び生物種Ｂのオーソログ遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列相同性がＢＬＡＳＴ等のホモロジーサーチアルゴリズムを用いて計算される統計的有意水準値でいずれも０．１未満
であることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【０００９】
５）　塩基配列の異なる複数のオリゴヌクレオチドを支持体上の既知の異なる位置に固定化したアレイであって、前記オリゴヌクレオチドの各々が生物種Ａ及び生物種Ｂのオーソログ遺伝子のいずれかの部分配列であり、
（１）生物種Ａの該オーソログ遺伝子以外の遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの融解温度差異の実測値もしくは計算値が２０℃以上、
（２）生物種Ｂの該オーソログ遺伝子以外の遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの融解温度差異の実測値もしくは計算値が２０℃以上、かつ、
（３）生物種Ａ及び生物種Ｂのオーソログ遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの融解温度差異の実測値もしくは計算値がいずれも２０℃未満
であることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【００１０】
６）　上記１）〜５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアレイであって、２種以上の生物種の遺伝子発現分布測定を同時に行うことができることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
７）　上記１）〜５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアレイを用いた、異なる生物種におけるオーソログ遺伝子の発現分布測定方法。
８）　薬剤投与に対するオーソログ遺伝子の発現変化を比較するための、上記７）に記載のオーソログ遺伝子の発現分布測定方法。
９）　　異なる生物種におけるオーソログ遺伝子の機能の変化を比較するための、上記７）に記載のオーソログ遺伝子の発現分布測定方法。
以下、本発明について具体的に説明する。
【００１１】
本明細書において、共通の祖先の遺伝子から種分化によって進化した異なる種の遺伝子を「オーソログ遺伝子」という。オーソログ遺伝子は進化の過程で同じ機能を保持することが多いことが知られており、お互いに類似した遺伝子機能を有すると考えられる。本発明者等は、一般的にオーソログ遺伝子同士が、コードしている蛋白質配列、塩基配列同士の類似性が高いことから、類似配列部分をプローブ配列として用いて本発明を完成させることができることに着目し、生物種Ａと生物種Ｂとで類似した機能を有すると考えられるオーソログ遺伝子と相補結合を形成するプローブを固定化したチップを作製した。以後、本明細書において、本発明で用いるチップを「オーソログチップ」と呼ぶ。尚、本明細書において、「オリゴヌクレオチドアレイ」、「チップ」または「ＤＮＡチップ」は、支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するものと、増幅した遺伝子断片（オリゴヌクレオチド）を支持体上にスポットして得られるもののいずれをも含み、名称によって製法が特定されることを意図するものではない。
【００１２】
まず、薬物投与によるオーソログ発現分布測定を例として、異なる生物種ＡとＢのＤＮＡチップによる測定について、従来のＤＮＡチップを用いて行う場合と本発明により行う場合の相違を図１に示す。従来のＤＮＡチップでは、図１（Ａ）に示すように生物種Ａの薬物投与サンプル（ＡＳ：Ａ　ｓａｍｐｌｅ）と、生物種Ａの薬物非投与サンプル（ＡＣ：Ａ　ｃｏｎｔｒｏｌ）を生物種Ａチップとハイブリダイズ（相補結合形成）させる。生物種Ｂについても同様である。仮に生物種ＡのサンプルＡＳやＡＣを生物種Ｂにおける検出のみを目的として作製されたチップとハイブリダイズさせても蛍光信号を得ることができるが、その蛍光信号の意味を解釈することは困難である。何故なら生物種Ｂに対して設計されたプローブに対して生物種Ａのサンプルがハイブリダイズしたとしても、それがオーソログの関係にある遺伝子の発現解析にとって十分ではないからである。
【００１３】
実際に生物種Ａをヒト、生物種Ｂをマウスとした図１Ａの実験を行った。ヒトとマウスのオーソログに関する情報は、米国ＮＣＢＩのＭＧＤ　ｍａｐｓやＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅを検索すれば、得ることができる。しかし、このオーソログ同士の遺伝子発現を比較したところ、ヒトとマウスとで驚くほど低い相関（３０％程度）しか得られなかった。この低い相関しか得られない原因の一つは、実験で用いたヒトチップとマウスチップとが配列や基板が全く異なるチップであるためである。この問題を解決するには、図１Ｂのように、生物種ＡとＢに対して使用可能に設計されたオーソログチップに、生物種Ａ薬物投与サンプル（ＡＳ）と生物種Ｂ薬物投与サンプル（ＢＳ）をそれぞれ異なる蛍光試薬で標識した後、同時にハイブリダイズさせることで、チップ間差をキャンセルすることが有効である。
【００１４】
図２に、従来のチップとオーソログチップの測定誤差の比較式を示す。図２（Ａ）は従来のチップの測定誤差（σ）を、図２（Ｂ）は本発明のオーソログチップの測定誤差（σ）を示す。生物種Ａと生物種Ｂの違いを両者の比として得る場合、測定誤差はσＡＳ／ＢＳとなる。図２（Ａ）と（Ｂ）を比較すると、（Ｂ）は同一チップを用いるため測定誤差が原理的に小さいことがわかる。尚、図２に示された測定誤差の比較は、予想される測定誤差の最小値であって、実際には、プローブ配列が全く異なるなどの理由から、より測定誤差は大きくなる。
【００１５】
つまり、生物種ＡとＢに対する薬物投与による遺伝子発現変化を測定するために２枚のオーソログチップを用いた図３の場合でも、図３（Ａ）では生物種Ａチップと生物種Ｂチップとで、全く異なるプローブ配列であるのに対し、図３（Ｂ）では同一のプローブ配列であるので、測定誤差をより小さくすることができる。
【００１６】
図４と図５にオーソログチップ用プローブ設計方法を示す。オーソログチップ用プローブ配列を設計するには、まずＧＥＮＢＡＮＫなどの塩基配列データベース、ないしはＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ）配列データベース等の公共もしくは商用データベースから、生物種Ａと生物種ＢのゲノムＤＮＡ或いはメッセンジャーＲＮＡ配列を取得する。プローブはＤＮＡで構成することが多いので、メッセンジャーＲＮＡ配列の代わりに、メッセンジャーＲＮＡ配列と相補的な配列であるｃＤＮＡ配列を取得してもよい。これら取得したゲノムもしくはｃＤＮＡ配列を、図４，５に示すようにプローブ設計における出発点とする。このゲノム・ｃＤＮＡ配列上の部分配列が求めたいプローブ配列４７に相当する。図４に示したプローブ設計工程では、まず、生物種Ａと生物種Ｂのオーソログ上において類似した配列を検索する、類似配列検索工程４３をおこなう。続いてプローブ候補を列挙するプローブ候補リスト作成工程（リストアップ工程）４４により作成したプローブ候補リスト４５から、プローブに適さない不適合候補を除外する工程（フィルタリング工程）４６を経るという、２つの工程を経ている。フィルタリング工程４６に合格したものが、ＤＮＡアレイに使用可能なプローブ配列４７である。
【００１７】
フィルタリング工程４６は、例えば（１）プローブの融解温度（Ｔｍ）がある一定の範囲内であること、（２）１本鎖ＤＮＡであるプローブが安定な二次構造を持たないこと、（３）非特異的配列を生じやすい反復配列を持たないこと、（４）他遺伝子と相同性の高い類似配列をもたないこと、（５）他遺伝子とクロスハイブリダイゼーションを生じないこと等をチェックする複数の工程からなる。クロスハイブリダイゼーションのチェックでは、配列同士の一致度（配列マッチ度（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）：何％の塩基が一致するか）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム等のホモロジーサーチアルゴリズムで算出した統計的有意水準値（ｐ値）を用いる。ＢＬＡＳＴにおいてはＥ値がこの統計的有意水準値に相当する。ｐ値は確率論的な指標であり、大抵は、例えばあるプローブ候補と他遺伝子配列に対し、ブラストアルゴリズムで計算したｐ値が０．１以下の場合、比較された二者のＤＮＡ配列のホモロジーは十分に高い（危険率１０％以下）として、そのプローブ候補を棄却することができる。こうしてクロスハイブリダイゼーションを十分に低減させることができる。
【００１８】
しかし、遺伝子のほぼ全領域にわたって、塩基配列が類似している場合、例えば同一のスーパーファミリーに属しているような、シトクロムＰ４５０のＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９などの遺伝子では、確率論的指標だけではプローブとして用いることができるのか否かの明確な判定が難しいプローブ候補が多数存在する。なぜなら相同性検索において用いられるＥ値やｐ値は、配列マッチ度が同一でも、配列の長さにより異なる値を示すことがあるためである。例えばブラストアルゴリズムにより算出されるｐ値で１．０、すなわち比較対象の二者の相同性が確率的にはほぼゼロの場合でも、配列マッチ度で約４０％〜約７５％までの値を示すことがある。相同性検索の目的は、あるＤＮＡ配列がデータベース中に格納されている遺伝子配列と一致しないとした場合（帰無仮説）、その仮説が正しい確率を示す。配列マッチ度が７５％とは、２５％の配列が異なるということである。配列長さにもよるが、２５％も配列が異なれば、比較している２配列は異なる遺伝子である確率が高い。そのためｐ値がほぼ１．０となり相同性はゼロと判定される。しかし実際には、配列マッチ度が７５％の配列同士は、ハイブリダイゼーションを行う温度が約３０℃のＴｍより低ければハイブリダイゼーションしてしまう。このようにハイブリダイゼーションが生じるか否かについてホモロジーサーチのアルゴリズムは直接的な解答を与えない。そのためプローブとターゲットの間のハイブリダイゼーションという物理化学的反応をより直接的に表す、熱力学的指標、例えば融解温度や自由エネルギーといった指標をホモロジーサーチから得られるＥ値やｐ値に加えて用いるのが望ましい。そこで、フィルタリング工程４６では融解温度の差、自由エネルギーの差といった、熱力学的指標に基づいて、プローブ候補を棄却するフィルターを設けても良い。
【００１９】
図５と図４の相違は、図４では生物種Ａと生物種Ｂの類似配列を検索したのちにリストアップ工程とフィルタリング工程を行うのに対し、図５では片方の生物種（例えば生物種Ａ）のみに対しリストアップ工程とフィルタリング工程を行った後に、生物種Ｂと類似した配列のみを検索してプローブ配列４７とする点である。図４と図５のどちらのアルゴリズムを用いてもオーソログチップ用プローブを設計することができる。従って、オーソログチップの作製のために設計するオリゴヌクレオチドは、生物種Ａ及び生物種Ｂのオーソログ遺伝子のうち、いずれかまたは双方の部分配列となり得るが、双方の部分配列と完全に一致しないが下記（１）〜（３）、（１’）〜（３’）、または（１”）〜（３”）の条件を満たすものであれば良い。
【００２０】
なおリストアップ工程４４とフィルタリング工程４６とを同一工程にした場合、ゲノム、ｃＤＮＡ配列４１，４２の全ての部分配列に対し、融解温度、二次構造、クロスハイブリダイゼーションの可能性をチェックしなくてはならない。リストアップ工程４４によりプローブ候補リスト４５を作成すれば、融解温度、二次構造、クロスハイブリダイゼーションの可能性のチェックを、リスト４５に対してのみ行えばよいので、計算時間の短縮が行える。
【００２１】
配列マッチ度とクロスハイブリダイゼーションの関係を調べるために実験を行った。実験のため塩基長が８０ｂｐ、配列が異なる合成ＤＮＡ（オリゴヌクレオチドＤＮＡ，もしくはオリゴＤＮＡ）を５本用意した。これら５種類のオリゴＤＮＡをプローブとして用いる。５本のＤＮＡは組み合わせを変えることで互いの配列マッチ度が異なるようになっている。実験では、１２時間、６２℃でハイブリダイゼーションさせ、蛍光標識由来の蛍光信号強度は蛍光スキャナーにより数値化した。５種類のターゲットＤＮＡのそれぞれに対し３回ずつ実験を行った結果を整理し、図６に示した。図６の横軸は配列マッチ度を、縦軸は標的由来信号を未標的由来信号で割った商を示す。エラーバーは標準偏差を示す。標的由来信号とは配列マッチ度が１００％のターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡ間のハイブリダイゼーションによる信号強度を示す。そして未標的由来信号とは、標的由来信号を除く、配列マッチ度が９０、８０，７０，６０，５０％のターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡ間のハイブリダイゼーションによる信号強度である。本明細書において、「配列マッチ度」とは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較した際の配列が一致する度合いのことをいう。具体的には、配列を構成する全塩基数（またはアミノ酸数）を１００としたときに配列が一致する塩基数（またはアミノ酸数）に相当する。図６において、配列マッチ度が１００％の場合、縦軸（標的由来信号／未標的由来信号）が１．０であり、標的由来信号と未標的由来信号の強度が等しいことを示す。このとき、クロスハイブリダイゼーション（本来ハイブリダイズすべきでないハイブリダイゼーション）が本来のターゲット−プローブ間ハイブリダイゼーションと同程度に生じていることになり、そのプローブは遺伝子ごとの発現を分離して測定していないので、ＤＮＡチップのプロ−ブとして用いることができない。図６によると、配列マッチ度が５０、６０、７０％では、標準偏差を考慮するとクロスハイブリダイゼーションは有意でないが、配列マッチ度が７０％で平均約１割、配列マッチ度が８０％で平均約２割のクロスハイブリダイゼーションが見られた。図６の結果は、プローブの長さや、ハイブリダイゼーション温度や、洗浄の仕方によっても大きく変わるので、全てのチップに対してあてはまるわけではない。しかしクロスハイブリダイゼーションを防ぐための設計指針を与えてくれる。つまり図６の結果は、全てのＤＮＡチップにはそのままあてはまる保証はないものの、大雑把に言って、配列マッチ度が７０％を超えた場合にクロスハイブリダイゼーションが生じる危険性が高いと言える。予備検討の結果、この配列マッチ度が７０％という値は、統計的有意水準値（ｐ値）で約０．１、融解温度差で約２０℃に相当する。そこで、オーソログチップとして、各プローブのオリゴヌクレオチドが、
（１）生物種Ａの他遺伝子（目的のオーソログ遺伝子以外の遺伝子）と前記オリゴヌクレオチドとの配列一致度（配列マッチ度）が７０％未満、
（２）生物種Ｂの他遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列マッチ度が７０％未満、かつ
（３）生物種Ａと生物種Ｂの目的のオーソログ遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列マッチ度がそれぞれ７０％以上
の３条件を満たせば、クロスハイブリダイゼーションを実質上無視することができる。更に、目的のオーソログ遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列マッチ度が９０％以上のものを選択すれば、良好な測定結果を得る上で更に好ましい。
【００２２】
同様に、各プローブのオリゴヌクレオチドが、
（１’）生物種Ａの他遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列相同性がＢＬＡＳＴ等のホモロジーサーチアルゴリズムを用いて計算される統計的有意水準値（ｐ値、もしくはＢＬＡＳＴで出力されるＥ値）が０．１以上、
（２’）生物種Ｂの他遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列相同性がＢＬＡＳＴ等のホモロジーサーチアルゴリズムを用いて計算される統計的有意水準値（ｐ値、もしくはＢＬＡＳＴで出力されるＥ値）が０．１以上、かつ
（３’）生物種Ａと生物種Ｂの目的のオーソログ遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列相同性がＢＬＡＳＴ等のホモロジーサーチアルゴリズムを用いて計算される統計的有意水準値（ｐ値、もしくはＢＬＡＳＴで出力されるＥ値）がそれぞれ０．１未満、
という条件を満たす場合であってもよい。
【００２３】
また、各プローブのオリゴヌクレオチドが、
（１”）生物種Ａの他遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの融解温度差異の実測値もしくは計算値が２０℃以上、
（２”）生物種Ｂの他遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの融解温度差異の実測値もしくは計算値が２０℃以上、かつ
（３”）生物種Ａと生物種Ｂの目的のオーソログ遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの融解温度差異の実測値もしくは計算値がそれぞれ２０℃未満、
の３条件を満たす場合であってもよい。
【００２４】
更に、上記（１）〜（３）、（１’）〜（３’）、または（１”）〜（３”）と同様の条件を満たす限りにおいて、３種以上の生物種由来のオーソログ遺伝子の発現を検出することも可能である。例えば、生物種Ａ、Ｂ、及びＣ由来のオーソログ遺伝子の発現を同時に検出しようとする場合、各プローブのオリゴヌクレオチドが、
（１）生物種Ａの他遺伝子（目的のオーソログ遺伝子以外の遺伝子）と前記オリゴヌクレオチドとの配列一致度（配列マッチ度）が７０％未満、
（２）生物種Ｂの他遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列マッチ度が７０％未満、
（３）生物種Ｃの他遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列マッチ度が７０％未満、かつ
（４）生物種Ａ、生物種Ｂ及び生物種Ｃの目的のオーソログ遺伝子と前記オリゴヌクレオチドとの配列マッチ度がいずれも７０％以上
の４条件を満たせば、クロスハイブリダイゼーションを実質上無視することができるオーソログチップが作製できる。
【００２５】
上記条件を満たすように選択された各プローブを、公知の方法に従って支持体上に固定する。具体的には、選択されたプローブのヌクレオチド配列に基づいて支持体上で合成することができる。あるいは、予め調製された各プローブを支持体上の異なる位置にスポットすることによって固定化することができる。プローブの長さは、２０〜１００塩基、好ましくは６０〜８０塩基である。
【００２６】
選択されたプローブは、一枚の支持体上に２０個以上、好ましくは５０個以上、更に好ましくは１００個以上固定する。ヒトにおいて機能する蛋白質の種類は約１０万とも言われており、これらをコードする遺伝子の発現を網羅的に検出するために、一枚の支持体上に数百〜数千個のオーソログ遺伝子を固定しても良く、その数はオーソログ遺伝子由来のオリゴヌクレオチドを固定した本発明のオリゴヌクレオチドアレイの用途に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
本発明のオーソログチップを用いた遺伝子発現の測定は、設計されたオーソログチップの由来となる２種以上の生物種由来のサンプルからＲＮＡを抽出し、ＰＣＲで増幅する際にそれぞれ標識を行う。標識は、蛍光色素やローダミン等の当分野で使用されるものであればいずれでも良く、特に限定するものではないが、検出の簡便さ等からＣｙ３、Ｃｙ５等の蛍光色素を用いることが特に好ましい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社（米国）等から種々の蛍光色素が市販されており、目的に応じて適宜選択することができ、例えば互いに識別可能な３種または４種の色素を用い、３種または４種のサンプル由来のＲＮＡを同時に測定することも可能である。
【００２８】
標識されたサンプルを、次いでオーソログチップとストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる。この場合、サンプルを別々のチップとハイブリダイズさせても良いが、測定誤差を最小にするため等の理由から、異なるサンプル由来の標的配列を同じチップに同時にかけることが好ましい。一枚のチップに２種のサンプルをかける場合には、ＲＮＡ重量を揃えておくことが好ましい。
【００２９】
上記のように、本発明のオリゴヌクレオチドアレイを用い、異なる生物種におけるオーソログ遺伝子の発現分布測定が可能である。本方法は、例えば薬剤投与に対するオーソログ遺伝子の発現変化を比較するために行うことができる。この場合、実験動物において得られたデータをヒトに外挿するためには、異なる生物種を２種とし、一方がヒトとすることができる。また、異なる生物種におけるオーソログ遺伝子の機能の変化を比較するために行うこともできる。
【００３０】
【発明の実施の形態】
Ｕｎｉｇｅｎｅに登録されている４２７４個のラット既知遺伝子、１２８１０個のヒト既知遺伝子に対し１１０個のオーソログを選択し、８０塩基長のオリゴヌクレオチドプローブを設計した（配列番号１〜１１０）。選択した１１０個のオーソログのＵｎｉｇｅｎｅ番号とＳｙｍｂｏｌ名のリストを表１から４に示した。またそれぞれのオーソログに対するプローブ配列を表５から８に示した。
【００３１】
【表１】
2004016070.tif 000003
【００３２】
【表２】
2004016070.tif 000004
【００３３】
【表３】
2004016070.tif 000005
【００３４】
【表４】
2004016070.tif 000006
【００３５】
【表５】
2004016070.tif 000007
【００３６】
【表６】
2004016070.tif 000008
【００３７】
【表７】
2004016070.tif 000009
【００３８】
【表８】
2004016070.tif 000010
【００３９】
図７は選択した１１０個のプローブの融解温度を示した図である。図７の横軸はプローブ番号を、図７の縦軸はプローブの融解温度（℃）を示す。設計時のプローブ融解温度の目標値は７５℃とした。フィルタリング工程の全条件を満たした上で、最も目標値に近い融解温度を持つ配列がプローブとして選択されている。１１０個のプローブ融解温度の平均値とその標準偏差は７５．１±０．９℃であった。
【００４０】
図８は１１０個のプローブのクロスハイブリダイゼーションの可能性について、最類似遺伝子断片との一致度（％）を示した図である。プローブ配列は、そのプローブと本来ハイブリダイズする遺伝子と１００％一致する配列を有する。その一方、Ｕｎｉｇｅｎｅに登録されている４２７４個のラット既知遺伝子、１２８１０個のヒト既知遺伝子のなかで、プローブが本来ハイブリダイズする遺伝子を除いて、最も類似した８０塩基の部分配列を有する遺伝子配列との一致度を図８は示している。図８によると最も類似した遺伝子配列との一致度（最類似遺伝子断片一致度）は、ヒトでもラットでも７０％未満である。最類似遺伝子断片一致度（％）の平均値とその標準偏差は、ラット遺伝子間で５６．０±５．０％、ヒト遺伝子間で５７．８±６．７％であった。
尚、図８において、７０％のライン上にあるポイントは、数値データでは全て７０％未満のものである。
【００４１】
図９は１１０個のプローブがヒトとラットのオーソログとハイブリダイズするかを示した図である。ヒトとラットのオーソログに対し、プローブ配列との一致度は全て９５％以上であり、その平均値と標準偏差は９６．７±１．７％であった。図６の結果から、選択した１１０個のプローブを用い、異なる生物種であるラットとヒトのオーソログに十分にハイブリダイズし、かつ、クロスハイブリダイゼーションは実質上無視できるオーソログチップが作製できることがわかる。
【００４２】
上記のようにして得られたオーソログチップを用いた異なる生物種におけるオーソログ遺伝子発現分布測定方法は、特に限定するものではないが、具体的には例えば以下のようにして行うことができる。
【００４３】
サンプルは異なる生物種それぞれの組織または細胞から通常用いられる方法に従ってｍＲＮＡを抽出し、ポリｄＴを鋳型としたＰＣＲによって増幅すると同時に、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の当分野において通常用いられる蛍光色素によって標的ＲＮＡを標識する。この場合、生物種によって標識を変えておくことによって、混合したサンプル由来のオーソログ遺伝子の発現を同時に検出することが可能である。２つのサンプル間での発現量の量比は、２種の蛍光色素由来の蛍光強度の比率から推定できる。図１（Ｂ）に示す例においては、同一の薬物を投与した生物種Ａ（ＡＳ）及び生物種Ｂ（ＢＳ）におけるオーソログ遺伝子の発現を蛍光強度の測定によって同時に検出することができ、同じ薬物の投与によるオーソログ遺伝子発現を異なる生物種で直接比較することができる。
【００４４】
別の態様として、図３（Ｂ）に示す例のように、同一の構成を有する２枚のオーソログチップを用い、一方では生物種Ａの薬物未投与サンプル（ＡＣ）及び薬物投与サンプル（ＡＳ）におけるオーソログ遺伝子の発現を同時に検出し、他方では生物種Ｂの薬物未投与サンプル（ＢＣ）及び薬物投与サンプル（ＢＳ）におけるオーソログ遺伝子の発現を同時に検出することによって、生物種Ａ及びＢにおける薬物投与によるオーソログ遺伝子の発現の変化及び種間比較を容易に行うことができる。
【００４５】
あるいはまた、互いに識別可能な４種の標識、例えば蛍光色素を用いて、生物種Ａの薬物未投与サンプル（ＡＣ）及び薬物投与サンプル（ＡＳ）、並びに生物種Ｂの薬物未投与サンプル（ＢＣ）及び薬物投与サンプル（ＢＳ）をそれぞれ標識し、これらのサンプルにおけるオーソログ遺伝子の発現を一枚のオーソログチップ上で同時に検出し、それぞれの種における薬物投与の効果（ＡＳ／ＡＣとＢＳ／ＢＣ）を直接比較することも可能である。それによって、チップの配列が同一であり、チップ自体も同一であり、更に実験操作によるバイアスもかからないため、測定誤差を最小限にすることができる。
【００４６】
【発明の効果】
２種以上の異なる生物種の遺伝子発現分布を同一のＤＮＡチップで測定することで、チップ間差をキャンセルし、測定の信頼性を向上させることができる。そのため実験動物のデータをヒトに外挿する有効な方法を提供できる。また進化の度合いが異なる生物種同士のデータ比較を行うことで、進化の過程に対応する遺伝子機能の変化を研究するための方法を提供できる。
【００４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】従来のチップ（Ａ）と本発明のチップ（オーソログチップ）（Ｂ）を用いた測定の比較を示す。
【図２】従来のチップ（Ａ）とオーソログチップ（Ｂ）の測定誤差を算出する式を示す。
【図３】従来のチップ（Ａ）と本発明のチップ（オーソログチップ）（Ｂ）を用いた測定の比較を示す。
【図４】オーソログチップ用プローブ配列決定アルゴリズムの一例を示す。
【図５】オーソログチップ用プローブ配列決定アルゴリズムの一例を示す。
【図６】配列マッチ度とクロスハイブリダイゼーションの関係の一例を示す。
【図７】本プローブ配列決定アルゴリズムで設計したプローブの融解温度を示す。
【図８】同一種内におけるプローブ配列相同性を示す。（Ａ）ラット遺伝子、（Ｂ）ヒト遺伝子
【図９】オーソログ間におけるプローブ配列相同性を示す。
【符号の説明】
４１．生物種Ａのゲノム、ｃＤＮＡ配列、もしくはＥＳＴ配列、４２．生物種Ｂのゲノム、ｃＤＮＡ配列、もしくはＥＳＴ配列、４３．類似配列検索工程、４４．リストアップ工程、４５．プローブ候補リスト、４６．フィルタリング工程、４７．プローブ配列、５１．プローブ候補１次リスト、５２．プローブ候補２次リスト
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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