(57)【要約】【課題】多くの結晶試料に対するＸ線回折測定を迅速に処理できるようにするとともに、高い信頼性をもった結晶構造の解析・評価を実現する。【解決手段】結晶試料が収容されたＸ線透過性を有する試料ホルダ４０をほぼ水平配置可能な試料ステージ１０と、この試料ステージ１０上に配置された試料ホルダ４０内の結晶試料に対し、上方又は下方からＸ線を照射するＸ線照射ユニット２０と、結晶試料からの回折Ｘ線を検出するＸ線検出器３０とを備える。Ｘ線照射ユニット２０及びＸ線検出器３０は、ともに回転アーム５０に固定する。そして、回転アーム５０を回転駆動機構５１によりほぼ水平な軸中心に任意の角度回転可能とする。【選択図】　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶試料が収容されたＸ線透過性を有する試料ホルダをほぼ水平配置可能であってかつＸ線が透過する試料配置部を形成する試料ステージと、
この試料配置部に配置された試料ホルダ内の結晶試料に対し、上方又は下方からＸ線を照射するＸ線照射手段と、
前記試料ホルダを介して前記Ｘ線照射手段と対向配置され、前記試料ホルダを透過してきた前記結晶試料からの回折Ｘ線を検出するＸ線検出手段と、を含み、
さらに、前記Ｘ線照射手段及びＸ線検出手段がともに回転アームに固定され、かつ回転アームをほぼ水平な軸中心に任意の角度回転させる回転駆動機構を備えたことを特徴とする結晶評価装置。
【請求項２】
前記試料ホルダは、タンパク質結晶を生成するための複数の凹部が形成された結晶化プレートであることを特徴とする請求項１に記載の結晶評価装置。
【請求項３】
前記試料ステージは、前記試料ホルダを水平面上の直角２方向に移動調整可能なＸ−Ｙテーブルで構成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の結晶評価装置。
【請求項４】
前記試料ステージは、さらに前記試料ホルダを上下方向に移動調整可能であることを特徴とする請求項３に記載の結晶評価装置。
【請求項５】
前記Ｘ線検出手段は、前記結晶試料からの回折Ｘ線を平面上で検出する二次元Ｘ線検出器であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の結晶評価装置。
【請求項６】
前記試料配置部に配置された試料ホルダに対し前記Ｘ線検出手段を接近又は離間させる検出位置調整機構を備えたことを特徴とする請求項５に記載の結晶評価装置。
【請求項７】
前記検出位置調整機構は、さらに前記試料配置部に配置された試料ホルダと平行に前記Ｘ線検出手段を移動調整可能であることを特徴とする請求項６に記載の結晶評価装置。
【請求項８】
前記Ｘ線照射手段は、Ｘ線を発生させるＸ線源と、このＸ線源から取り出されたＸ線を単色化して前記試料配置部内の結晶試料に導くＸ線光学系を含むことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の結晶評価装置。
【請求項９】
前記試料ホルダ内における結晶試料の位置を検出するとともに該結晶試料を撮像する画像形成手段を備えたことを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の結晶評価装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、結晶試料をＸ線の回折現象を利用して測定・評価するための結晶評価装置に関し、特にタンパク質の結晶評価に好適な結晶評価装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡの二重らせん構造が発見されて以来、ゲノム計画の展開と相まって、タンパク質の構造解析が世界的に注目を集めている。タンパク質の構造解析には、ＮＭＲ（核磁気共鳴装置）を用いた手法、電子顕微鏡を用いた手法、Ｘ線の回折現象を利用した手法等が開発されており、特に、Ｘ線の回折現象を利用したＸ線結晶構造解析は、イメージングプレート等の二次元Ｘ線検出器や二次元データからの解析ソフトウエア等の開発に伴い飛躍的な進展をみせている。
【０００３】
従来、Ｘ線の回折現象を利用したタンパク質の結晶構造解析は、まず溶液中でタンパク質を結晶化させて得られたタンパク質の結晶粒をキャピラリーと称するガラス製の細管に注入し、この状態でＸ線回折装置に装填して行われていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、タンパク質の結晶粒のキャピラリーへの封入は、パスツールピペット等を用いて手作業で行われるため煩雑で時間がかかる。しかも、従来は一回の測定が終了する都度、Ｘ線回折装置へキャピラリーの装填作業を行う必要があったので、多くの試料を迅速に測定・評価するには適さなかった。
例えば、人体を構成するタンパク質は５万〜１０万種類にも及ぶとされており、それら多くのタンパク質の構造を短期間で解明することが、近年の構造生物学における緊急の課題となっている。
【０００５】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、多くの結晶試料に対するＸ線回折測定を迅速に処理できるようにするとともに、高い信頼性をもった結晶構造の解析・評価を実現することのできる結晶評価装置の提供を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明の結晶評価装置は、結晶試料が収容されたＸ線透過性を有する試料ホルダをほぼ水平配置可能であってかつＸ線が透過する試料配置部を形成する試料ステージと、
この試料配置部に配置された試料ホルダ内の結晶試料に対し、上方又は下方からＸ線を照射するＸ線照射手段と、
試料ホルダを介してＸ線照射手段と対向配置され、試料ホルダを透過してきた結晶試料からの回折Ｘ線を検出するＸ線検出手段と、を含み、
さらに、Ｘ線照射手段及びＸ線検出手段がともに回転アームに固定され、かつ回転アームをほぼ水平な軸中心に任意の角度回転させる回転駆動機構を備えたことを特徴とする（請求項１）。
【０００７】
上記構成の本発明装置によれば、例えば、タンパク質結晶を生成するための複数の凹部が形成された結晶化プレートを試料ホルダとして利用し（請求項２）、そのまま試料ステージへ配置してＸ線回折測定を実行することが可能となる。結晶化プレートは、本来、タンパク質を結晶化させるために用いられる器具であるが、これをそのまま試料ホルダとして利用することで、生成された結晶粒をいちいちキャピラリーへ移し替える手間を省き、測定作業の迅速化を図ることができる。
【０００８】
また、本発明装置は、Ｘ線照射手段及びＸ線検出手段を回転アームに固定して回転駆動機構により任意の角度回転させる機能を有するので、試料ホルダを回転させることなく、結晶試料に対する回折Ｘ線の積分強度を求めることができる。回折Ｘ線の積分強度は、測定対象となる結晶を回転させ、結晶に対して様々な角度からＸ線を照射して回折Ｘ線の強度を検出し、それらの強度データを積分して求められる。従来は、結晶試料を封入したキャピラリーを回転させることで、回折Ｘ線の積分強度が求められていた。
【０００９】
タンパク質の構造を解析するには、結晶で回折してきたＸ線の積分強度を求める必要がある。すなわち、回折を生じる可能性のある結晶からの反射Ｘ線は、逆格子空間（回折空間）において球状に分布している。したがって、結晶に対し固定された位置で検出される回折Ｘ線のピーク強度（回折斑点）は、この球状に分布する反射Ｘ線の一断面のみを観察して得られたものであり、結晶の構造解析（すなわち、分子構造の決定）に必要なピーク強度のわずか数百分の一乃至数千分の一に過ぎない。
【００１０】
ところが、結晶化プレートを試料ホルダとして利用した場合、結晶化プレートの溝には溶液が充填されており、結晶はこの溶液中に浮遊した状態で存在する。したがって、結晶化プレートを回転させると溶液が零れ出たり、溶液中の結晶が移動したりするため、これを回転させることはできない。
本発明装置によれば、試料ホルダに対しＸ線照射手段及びＸ線検出手段を回転させる構成としたので、球状に分布する結晶からの反射Ｘ線に対して複数の断面からピーク強度（回折斑点）を検出して、その積分強度を求めることができる。その結果、検出された回折Ｘ線の積分強度に基づいて、高い信頼性をもった結晶構造の解析・評価を実現することができる。
【００１１】
また、試料ステージは、試料ホルダを水平面上の直角２方向に移動調整可能なＸ−Ｙテーブルで構成することができる（請求項３）。このように構成すれば、試料ホルダに収容された複数の結晶試料を、Ｘ−Ｙテーブルによる移動をもって自動的にＸ線の測定ライン上に順次位置決めすることができ、いっそう作業性が向上する。
【００１２】
試料ステージは、さらに試料ホルダを上下方向に移動調整可能な構成とすることもできる（請求項４）。試料ホルダに収容された結晶試料は、Ｘ線照射手段及びＸ線検出手段の回転軸上に位置決めすることが好ましい。上記構成とすれば、このような回転軸に対する結晶試料の位置決めを、上記水平面上の直角２方向と上下方向の移動調整をもって実現することが可能となる。
【００１３】
また、Ｘ線検出手段は、結晶試料からの回折Ｘ線を平面上で検出する二次元Ｘ線検出器で構成することが好ましい（請求項５）。二次元Ｘ線検出器は、結晶試料から放射状に反射してくる回折Ｘ線をまとめて検出することができるので、測定時間を飛躍的に短縮することができる。二次元Ｘ線検出器によれば、結晶試料から放射状に反射してくる回折Ｘ線のピーク強度が回折斑点として検出される。なお、二次元Ｘ線検出器としては、イメージングプレートやＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｄｅｖｉｃｅ）が広く知られているが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
また、本発明装置は、試料配置部に配置された試料ホルダに対しＸ線検出手段を接近又は離間させる検出位置調整機構を備えた構成としてもよい（請求項６）。この検出位置調整機構は、特に、二次元Ｘ線検出器を用いた場合に有効である。一般に、結晶試料に二次元Ｘ線検出器を近づけるほど、結晶試料から放射状に反射してくるＸ線の回折斑点を広い角度範囲で検出することができる。しかし、結晶試料の格子密度が高い場合、結晶試料に二次元Ｘ線検出器を近づけると、結晶試料から放射状に反射してくるＸ線の回折斑点が重なり合って検出されてしまうおそれがある。そこで、検出位置調整機構をもって結晶試料とＸ線検出手段との間の距離を適宜調整することで、好適な検出データを得ることが可能となる。
【００１５】
検出位置調整機構は、さらに試料配置部に配置された試料ホルダと平行にＸ線検出手段を移動調整可能な構成とすることもできる（請求項７）。これにより、結晶試料から放射状に反射してくる回折Ｘ線の検出範囲を任意に変更することが可能となる。
【００１６】
なお、Ｘ線照射手段は、Ｘ線を発生させるＸ線源と、このＸ線源から取り出されたＸ線を単色化して試料配置部内の結晶試料に導くＸ線光学系を含む構成とすることができ（請求項８）、さらに、試料ホルダ内における結晶試料の位置を検出するとともに該結晶試料を撮像する画像形成手段を備えた構成とすることもできる（請求項９）。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。
図１は本実施形態に係る結晶評価装置の構成図、図２は試料ホルダの一例を示す図、図３は本実施形態に係る結晶評価装置による測定原理を模式的に示す図である。
【００１８】
図１に示すように、本実施形態の結晶評価装置は、試料ステージ１０と、Ｘ線照射ユニット２０（Ｘ線照射手段）と、Ｘ線検出器３０（Ｘ線検出手段）とを備えている。
試料ステージ１０は、装置本体１に設置されている。この試料ステージ１０は、水平面上の直角２方向（図示Ｘ，Ｙ方向）と、垂直方向（図示Ｚ方向）に移動可能なＸ−Ｙ−Ｚテーブルで構成してあり、その上面には試料ホルダ４０を水平配置するための試料配置部１１が形成されている。試料配置部１１の床面には、図示しないが、後述するように下方から照射されるＸ線を透過するための開口が形成されている。さらに、試料ステージ１０には、試料配置部１１に試料ホルダ４０を固定するためのホルダ固定機構１２が設置されている。ホルダ固定機構１２は、例えば、アクチュエータの駆動によって出没する固定ピンにより、試料ホルダ４０を押圧固定する構成となっている。
【００１９】
試料ホルダ４０には、公知の結晶化プレートを利用することができる。結晶化プレートは、ポリイミド等のＸ線透過性を有する材料で形成されている。結晶化プレートを利用した試料ホルダ４０には、図２（ａ）に示すように、多数の凹部４１が形成されており、この凹部４１内でタンパク質の結晶を生成することができる。結晶化プレートを用いたタンパク質の結晶生成方法は、蒸気拡散法をはじめとして種々の方法が知れている。図２（ｂ）は、蒸気拡散法によりタンパク質の結晶粒（結晶試料Ｓ）が生成された状態を模式的に示す図であり、カバープレート４２の下面においた溶液Ｌの滴中にタンパク質の結晶粒（結晶試料Ｓ）が生成されている。
試料ホルダ４０に形成された多数の凹部４１には、それぞれ生成条件を違えたり、異なる種類のタンパク質の結晶を別個に生成することができる。
【００２０】
本実施形態の結晶評価装置では、結晶化プレートで構成された試料ホルダ４０をそのまま試料ステージ１０に配置することで、試料ホルダ４０の各凹部４１に生成された複数の結晶試料Ｓを、連続的に測定・評価することが可能となる。勿論、結晶試料Ｓをキャピラリーへ移し替える作業も必要なく、作業性が格段に向上する。
【００２１】
Ｘ線照射ユニット２０は、Ｘ線源２１とＸ線光学系２２を含んでいる。Ｘ線源２１には、電子銃とターゲットを内蔵したラボ用のＸ線発生器が用いられる。この種のＸ線発生器は、放射光を発生させる大規模Ｘ線発生設備と異なり、寸法および重量が格段に小さい。そのため、後述するように回転アームに搭載して回転駆動することが可能である。
【００２２】
Ｘ線光学系２２は、Ｘ線源２１から取り出されたＸ線のうち、特定波長のＸ線のみを選別したり（単色化）、試料ステージ１０上の試料配置部１１へＸ線を収束する等の機能を有し、コンフォーカルミラーやコリメータ等の光学機器の組合せをもって構成されている。
【００２３】
Ｘ線検出器３０には、二次元Ｘ線検出器が用いられる。特に、本実施形態では、Ｘ線検出器３０としてＣＣＤを用いており、平面上に検出される回折Ｘ線の強度を電気信号に変換して、図示しないデータ処理用コンピュータへ出力するように構成されている。
【００２４】
上述したＸ線照射ユニット２０及びＸ線検出器３０は、回転アーム５０にそれぞれ搭載されている。なお、回転アーム５０の形状は任意であり、例えば、板状であっても棒状であってもよい。この回転アーム５０の一端部にＸ線照射ユニット２０が搭載され、他端部にＸ線検出器３０が対向するように搭載されている。
【００２５】
回転アーム５０の中心部は、回転駆動機構５１の回転軸５１ａに装着されており、回転駆動機構５１により回転軸中心に任意の角度回転可能となっている。回転駆動機構５１の回転軸５１ａの中心線Ｏは、ほぼ水平に配置してあり、Ｘ線照射ユニット２０から放射されるＸ線の光軸は、この回転軸５１ａの中心線Ｏと交わるように調整されている。この回転駆動機構５１は、例えば、ステッピングモータ等の高精度に回転角度を制御可能な駆動モータとその回転を回転軸に伝達する歯車機構で構成されており、駆動モータは、図示しない制御コンピュータによって、回転角度が制御されている。回転角度は、正逆両方向へ４５°程度の範囲で任意に制御できるようにすることが好ましい。
【００２６】
本実施形態では、回転アーム５０に搭載されたＸ線照射ユニット２０を試料ステージ１０の下方に配置するとともに、Ｘ線検出器３０を試料ステージ１０の上方に配置してあり、試料ステージ１０上の試料ホルダ４０に生成された結晶試料Ｓに対して下方からＸ線を照射し、試料結晶試料Ｓで反射してきた回折Ｘ線を、試料ホルダ４０の上方でＸ線検出器３０により検出する構成となっている。なお、Ｘ線照射ユニット２０とＸ線検出器３０の配置を上下逆転して、Ｘ線照射ユニット２０を試料ステージ１０の上方に配置するとともに、Ｘ線検出器３０をその下方に配置することもできる。
【００２７】
ここで、Ｘ線検出器３０には、検出位置調整機構３１が付設されている。Ｘ線検出器３０を回転半径方向（図示ａ方向）に移動させるとともに、試料ステージ１０と平行な一方向（図示ｂ方向）に移動させる機構である。図１に示す構成例では、検出位置調整機構３１を、回転アーム５０に設置された第１の案内レール３２と、この第１の案内レール３２に沿って移動可能な第１の移動台３３と、この移動台３３から図示ｂ方向に延出する第２の案内レール３４と、この第２の案内レール３４に沿って移動可能な第２の移動台（図示せず）と、これら各移動台を駆動する駆動モータ（図示せず）とで構成してあり、第２の移動台にＸ線検出器３０が固定されている。
【００２８】
また、本実施形態の結晶評価装置は、試料ホルダ４０内にある結晶試料Ｓの位置を確認するための撮像カメラ（画像形成手段）を備えている。この撮像カメラは、試料ステージ１０と同じく装置本体１に設置されており、試料ホルダ４０内の結晶試料Ｓを離間した位置から拡大してとらえるための望遠鏡６１と、試料ホルダ４０内の結晶試料Ｓの像を望遠鏡６１へ向けて反射される反射ミラー６２と、望遠鏡６１で拡大された結晶試料Ｓの画像を撮影するＣＣＤ６３とを含んでいる。
これら反射ミラー６２、望遠鏡６１、ＣＣＤ６３を含む構成の撮像カメラは、試料ステージ１０上の試料ホルダ４０に対して接近又は離間できるように装置本体１へ移動可能に設置されており、Ｘ線測定に際しては試料ホルダ４０から離間した位置に退避させておく。
ＣＣＤ６３により撮像した結晶試料Ｓの画像は、図示しない制御コンピュータにより画像処理されて、ディスプレーに表示される。そして、ＣＣＤ６３の撮像位置から制御コンピュータが結晶試料Ｓの位置を認識して、上記検出位置調整機構３１や回転駆動機構５１を制御することが可能となる。
【００２９】
上述した構成の結晶評価装置は、次の動作をもって結晶試料Ｓを測定することができる。まず、試料ステージ１０に試料ホルダ４０を配置する。この配置動作は、搬送ロボットを併設して、自動的に行うことも可能である。次いで、Ｘ線照射ユニット２０から放射されるＸ線の光軸に対し、試料ホルダ４０内に生成されている任意の結晶試料Ｓを位置決めする。この位置決めは、試料ステージ１０をＸ，Ｙ方向に移動調整して行われる。
【００３０】
試料ステージ１０に配置された試料ホルダ４０内における結晶試料Ｓの位置が、前工程であらかじめ検出されていれば、当該検出結果に基づいて制御コンピュータが試料ステージ１０をＸ，Ｙ方向に移動調整して自動的に結晶試料Ｓの位置決めが実行される。一方、結晶試料Ｓの位置があらかじめ検出されていない場合や、搬送中の振動等により試料ホルダ４０内で結晶試料Ｓの位置が移動した場合にあっては、撮像カメラにより結晶試料Ｓの位置を確認して位置決めすることができる。
【００３１】
また、後述するようにＸ線照射ユニット２０を回転させてもそこから放射されるＸ線の光軸上に測定対象となる結晶試料Ｓをおくために、結晶試料Ｓは回転軸５１ａの中心線Ｏ上に位置決めされている必要がある。この位置決めは、試料ステージ１０のＺ方向の移動調整により実行される。
【００３２】
また、必要に応じて結晶試料ＳとＸ線検出器３０との間の距離を調整する。既述したように、結晶試料ＳにＸ線検出器３０を近づけるほど、結晶試料Ｓから放射状に反射してくるＸ線の回折斑点を広い角度範囲で検出することができる。しかし、結晶試料Ｓの逆格子密度が高い場合、結晶試料ＳにＸ線検出器３０を近づけると、結晶試料Ｓから放射状に反射してくるＸ線の回折斑点が重なり合って検出されてしまうおそれがある。そこで、検出位置調整機構３１をもってＸ線検出器３０を図１のａ方向に移動調整することで、結晶試料ＳとＸ線検出器３０との間の距離を適宜調整し好適な検出データを得ることが可能となる。
【００３３】
さらに、検出位置調整機構３１をもってＸ線検出器３０を図１のｂ方向に移動調整することで、結晶試料Ｓから放射状に反射してくる回折Ｘ線の検出範囲を変更することもできる。
【００３４】
結晶試料ＳやＸ線検出器３０を位置決めした後、Ｘ線照射ユニット２０からＸ線を放射してＸ線回折測定を実行する。図３に示すように、Ｘ線照射ユニット２０から放射されたＸ線は、試料ホルダ４０内の結晶試料Ｓに下方から入射する。このとき、試料ステージ１０には開口１０ａが形成されており、さらに試料ホルダ４０はＸ線透過性を有する材料で形成されているので、Ｘ線はこれらを透過して結晶試料Ｓに照射される。そして、結晶試料Ｓからは放射状に回折Ｘ線が反射して、この回折Ｘ線がＸ線検出器３０で検出される。図示しないデータ処理用コンピュータは、検出された回折Ｘ線の強度データに基づき結晶評価や結晶構造解析を実行する。
【００３５】
また、結晶試料Ｓに対して様々な角度からＸ線を照射して回折Ｘ線の強度を検出する場合には、回転駆動機構５１により回転アーム５０を回転駆動して、結晶試料Ｓの格子面に対するＸ線照射ユニット２０及びＸ線検出器３０の角度を調整し、上記Ｘ線回折測定を繰り返す。この操作をもって、試料ホルダ４０を回転させることなく、結晶試料Ｓに対する回折Ｘ線の積分強度を求めることができ、さらに、積分強度に基づき高い信頼性をもった結晶構造解析を実現することができる。
【００３６】
なお、本発明は上述した実施形態に限定されるものではない。例えば、試料ホルダは、Ｘ線透過性を有すれば結晶化プレート以外であってもよい。また、本発明の結晶評価装置は、低分結晶の評価等、タンパク質の結晶評価以外にも適用することができる。
【００３７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の結晶評価装置によれば、多くの結晶試料に対するＸ線回折測定を迅速に処理できるようにするとともに、高い信頼性をもった結晶構造の解析・評価を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態に係る結晶評価装置の構成図である。
【図２】試料ホルダの構成例を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る結晶評価装置による測定原理を模式的に示す図である。
【符号の説明】
１：装置本体
１０：試料ステージ
１１：試料配置部
１２：ホルダ固定機構
２０：Ｘ線照射ユニット
２１：Ｘ線源
２２：Ｘ線光学系
３０：Ｘ線検出器
３１：検出位置調整機構
４０：試料ホルダ
４１：凹部
４２：カバープレート
５０：回転アーム
５１：回転駆動機構
５１ａ：回転軸
６１：望遠鏡
６２：反射ミラー
６３：ＣＣＤ
【図１】
2004020397.tif 000003
【図２】
2004020397.tif 000004
【図３】
2004020397.tif 000005