(57)【要約】【課題】昆虫の形質を改変することにより、産業上より有用な昆虫を作出し、且つ改変された昆虫が遺伝的汚染を引き起こす危険性のない技術の提供。また、迅速に実施可能で、且つ特定の昆虫の種類に適用が限定されない昆虫を改変する技術の提供。【解決手段】昆虫の脳において所定の機能を司る標的領域にエレクトロポレーション法で１以上の物質を導入して、前記標的領域における実質的に全ての細胞を形質転換する工程を具備した昆虫の形質を改変する方法を提供する。また、形質転換が昆虫の生殖細胞を介して後代にまで承継されない昆虫の形質を改変する方法を提供する。また、昆虫の集団において特定の役割を持った昆虫にて前記方法を適用することにより、前記昆虫の集団の形質を改変する方法を提供する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫の形質を改変する方法であって、昆虫の脳において所定の機能を司る標的領域にエレクトロポレーション法で１以上の物質を導入して、前記標的領域における実質的に全ての細胞を形質転換する工程を具備した方法。
【請求項２】
前記形質転換は、前記昆虫の生殖細胞を介して後代にまで承継されない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記昆虫が膜翅目昆虫である、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項４】
前記昆虫がセイヨウミツバチ、ハリナシバチ、またはマルハナバチである、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記標的領域がキノコ体または神経分泌細胞である、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記物質が遺伝子関連物質である、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子関連物質がＣａＭＫＩＩ遺伝子、ＩＰ３受容体遺伝子、Ｍｂｌｋ―１遺伝子、ＱＭ１遺伝子、Ａｇｇ―１遺伝子もしくはＡｇｇ―２遺伝子、またはそれらの断片をコードする遺伝子である、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記昆虫の集団において特定の役割を持った昆虫に請求項１〜７に記載の方法を適用することにより、前記昆虫の集団の形質を改変する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は脳機能を操作する技術を用いた、昆虫の形質の改変技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
昆虫の形質を改変する場合、旧来の交雑による品種改良方法に加えて、遺伝子組換え技術を利用した方法などが適用可能である。
旧来の品種改良は、長い年月をかけて何世代もの交雑を繰り返すことにより、有用形質を具備する遺伝的に均質な品種として固定化していく方法である。この旧来の方法に比べて、遺伝子組換え技術を利用したトランスジェニック生物を作出する方法は、目的とする有用形質を比較的早期に固定化できる方法であることは周知の事実である。しかしながら、生物種を超えて全く異なる生物由来の外来遺伝子を導入したトランスジェニック生物の作出は、該生物が野生生物と交雑することにより自然環境に対して遺伝子汚染を起こし、これまで予想しなかった害をもたらす危険性が懸念されている。遺伝子汚染とは、改変した生物が人的制御から逸脱して自然生態に離散し、野生生物との交配などを介して、改変された形質を自然生態にばら撒いてしまうことであり、最近は遺伝子組換え作物などで話題となっている環境問題である。交雑による品種改良の技術においても、野生生物の遺伝子を汚染することにかわりなく、野生生物種の保護的な側面からも好ましくない。
【０００３】
上記のような遺伝子汚染を引き起こす危険性を回避するためには、物理的に外界と遮断された特別な隔離施設を設けるなどの対策が必要とされ、一般的にその維持管理には資金面および労力面において莫大な負担を強いられる。
特に、哺乳類などの人的管理が比較的容易な生物に比べて、多くの種が飛翔能力を有し、体躯が小さい昆虫を物理的に完全に隔離することは格段に難しい課題である。
【０００４】
加えて、現状においては、交配および遺伝子組換えを利用した形質改変技術が開発されている昆虫は少なく、昆虫全般にわたって一般的にこの方法が適用されているわけではない。即ち、遺伝子導入による生物個体の改変も適用できる生物種が限られており、昆虫においては、ショウジョウバエ等においてのみ実施されているのが現状である。また、一般的に昆虫への遺伝子導入の様式は初期胚等に目的遺伝子を含むベクターを導入し、その後に目的遺伝子が導入された個体を、目的遺伝子の発現等を指標にして効率的なスクリーニング方法により選択することが必要である。更に、遺伝的に均質な系統として固定するためには、導入遺伝子がホモ接合した個体を交配後に選択する必要がある。このような技術上の制約から、通常は遺伝的に安定な系統は実際に遺伝子導入を行った個体から何世代か後の子孫において確立されることになる。このため、実際に導入した有用形質を具備した昆虫を利用するためには、改変操作の開始後かなりの時間を要することとなる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は昆虫の形質を改変することにより、産業上より有用な昆虫を作出し、且つ改変された昆虫が遺伝的汚染を引き起こす危険性のない技術を提供することを課題とする。
また、迅速に実施可能で、且つその適用が特定の昆虫の種類に限定されないような、昆虫の個体および集団の形質を改変する技術を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下に示す手段によって本発明の課題を解決するものである。
すなわち、本発明は昆虫の脳において所定の機能を司る標的領域にエレクトロポレーション法で１以上の物質を導入して、前記標的領域における実質的に全ての細胞を形質転換する工程を具備した、昆虫の形質を改変する方法を提供する。また、本発明は前記形質転換が昆虫の生殖細胞を介して後代にまで承継されない昆虫の形質を改変する方法を提供する。
【０００７】
前記方法において、前記昆虫は昆虫全般であり、好ましくは膜翅目昆虫であり、より好ましくは、セイヨウミツバチ、ハリナシバチ、またはマルハナバチである。
前記方法において、前記標的領域はキノコ体または神経分泌細胞である。
前記方法において、前記物質は遺伝子関連物質であり、好ましくはＣａＭＫＩＩ遺伝子、ＩＰ３受容体遺伝子、Ｍｂｌｋ―１遺伝子、ＱＭ１遺伝子、Ａｇｇ―１遺伝子もしくはＡｇｇ―２遺伝子、またはそれらの断片をコードする遺伝子である。
また、本発明は昆虫の集団において特定の役割を持った昆虫にて前記方法を適用することにより、前記昆虫の集団の形質を改変する方法を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は特定の機能を司る脳の機能領域を操作して昆虫の行動、生殖などの形質を改変することにより上記課題を克服するものである。
【０００９】
脳は各部位が異なる機能を分担しており、特に哺乳類などにおいては詳しい機能領域のマッピングがなされている。これは各機能領域を手術などで切除もしくは破壊することにより、当該機能を失った個体を作成し得ることからも確認される。しかし、前記領域の少数の細胞のみを欠失しても当該機能の損失が生じないことが容易に予想され、その理由の１つは当該機能を担当する他の細胞による補償作用である。
【００１０】
従って、脳を操作して個体の行動等を改変するためには、機能が解明された機能領域を広範囲にわたり改変する操作が必要であることが当然のごとく予想される。しかしながら、その実施は困難であり脳研究の進んだ哺乳類などにおいてもいまだ達成されていない。その理由としては脳の機能領域において、個体の行動等に影響し得る程度の全範囲にわたり、該領域を改変する具体的な技術が確立されていなかったことが挙げられる。実際、哺乳類で脳の一部の領野にエレクトロポレーション法で外来遺伝子を導入する技術が最近報告された。しかしながら、この方法は脳の局部の機能解析の目的においてのみ実施でき得るものであり、個体の行動の改変を可能とするものではない。
【００１１】
本発明の発明者等は、哺乳類等の高等な脳の高次機能を有する生物に比べて、特定の機能を司る脳の領域が昆虫においては比較的小さな領域に限局されている点に注目した。例えば、ヒトの大脳皮質の神経細胞は約１４０億個であるのに対して、ミツバチの脳の神経細胞数は約１００万個と桁違いに少ない（Ｍｏｂｂｓ、　１９８２）。ミツバチの脳で感覚統合や、記憶・学習の中枢となる部位はキノコ体と呼ばれる、約３４万個の神経細胞からなる部分であると考えられている。実際、このキノコ体を冷却金属針で活動抑制すると、匂いと砂糖水とを連合する条件反射が成立しなくなることがわかっている（Ｅｂｅｒ等、　１９８０）。また、キノコ体は他の昆虫においても同様の機能を担っていることが報告されている。例えば、キノコ体を欠損したショウジョウバエの変異体（ｍｕｓｈｒｏｏｍ　ｂｏｄｉｅｓ　ｄｅｒａｇｅｄ，　ｍｕｓｈｒｏｏｍ　ｂｏｄｉｅｓ　ｍｉｎｉａｔｕｒｅ）では、匂いと電気ショックを連合させる回避学習が成立しなくなることが知られている（Ｈｅｉｓｅｎｂｅｒｇ等、　１９８５）。
【００１２】
本発明の発明者等は、比較的少数の細胞から構成される機能領域においては、その細胞の多くに遺伝子導入などで変更を加えることにより、当該機能領域の機能を改変することが可能ではないかと考えた。
本発明の発明者等は、昆虫学の多岐にわたる学問領域においての長年の見識から上記着想を想到するに至り鋭意研究を行った結果、本発明の完成に至ったものである。
【００１３】
本発明において「改変」という用語は、昆虫の形質を個体および集団において一代限り変更するが、生殖系列の細胞を介して、遺伝的に後代にまで変更された形質が伝播しない変更を広く意味している。本発明において「改変」は以下に示す複数の改変段階を介して、目的とする効果が奏される改変段階で達成される。すなわち、
第一改変段階として、本法を用いて各種の「物質」を脳などの改変する所定の機能を司る標的領域に導入して前記標的領域における実質的に全ての細胞を形質転換させることにより、更に該部位の担う高次機能に影響を与えて、個体における行動、生殖などの高次機能を変更することによって達成される。
第二改変段階として、前記第一改変段階で達成された変更を具備する個体の行動、生殖などの高次機能の変更により、他の個体の行動、個体数などに影響を与え、結果として集団の形質を変更することにより達成される。
上記の第一改変段階では細胞レベル、組織レベル、個体レベル、第二改変段階では集団レベルでの改変が達成される。
【００１４】
当然のことながら、目的とする改変は対象とする昆虫および期待される効果などによって異なる。従って、適宜実施者の目的に応じて、対象とする昆虫の種および発生段階、導入する前記物質、前記標的領域などが選択されるが、例えば以下に示す例が挙げられる。
本発明において、対象とする昆虫種は特に限定されないが、好ましくは蜂類または蟻類等の膜翅目昆虫である。
本発明の方法は、卵、幼虫、および成虫などのいずれの発生段階にある昆虫に対しても適用できる。即ち、結果として、目的とする改変を達成すべき発生段階の昆虫において、前記標的領域の実質的に全ての細胞に前記物質が導入されるのであれば、前記物質を導入する昆虫の発生段階は特に限定されない。しかし、社会性昆虫に適用し、集団の形質を改変する場合は、女王（女王蜂、女王蟻など）、労働者（働き蜂、働き蟻など）の成虫などのように、社会的分業を達成した後の成虫に適用するのが好ましい。
本発明において導入する前記物質としては、遺伝子関連物質を発現するベクター、前記遺伝子関連物質の配列情報をもとにして転写されたｍＲＮＡもしくはそのアンチセンス、および／または該ｍＲＮＡから翻訳された蛋白質、或いは蛋白質関連物質、合成核酸、薬学的組成物などを、単独もしくは組み合わせて使用することができる。前記物質は、昆虫の形質を一代限りで変更し、目的とする改変が達成し得るものであれば、それが由来する生物種などは特に限定されない。
【００１５】
本発明で使用される前記ベクターは、それが標的領域の細胞内で一定期間保持され、発現を意図する転写単位が転写および／または翻訳されるものであれば特に限定されない。一般的に、前記ベクターがプラスミッドベクターである場合に具備すべき因子は、プラスミッドを得る目的で使用される大腸菌等の宿主生物内での複製に必要な複製起点配列、並びに標的領域の細胞内および／またはベクターを複製する宿主生物内において、１以上の転写単位を発現誘導するためのプロモーターおよび／またはエンハンサー配列などである。前記転写単位は、標的領域での発現を意図する遺伝子関連物質、および選択のための薬剤耐性遺伝子などをコードするものである。
【００１６】
前記プロモーターおよび／またはエンハンサー配列は、ベクター中の発現を意図する転写単位を、その発現を意図する場所において発現するものであれば特に限定されない。特に、改変すべき標的領域で前記遺伝子関連物質を発現させる場合は、発現を意図する部位で特異的な発現をもたらす標的領域特異的なプロモーターおよび／またはエンハンサー配列が使用され、好ましくはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、カイコのアクチンプロモーターＡ３が使用される。
【００１７】
本発明において「遺伝子関連物質」の用語は、１以上の遺伝子もしくはその断片またはそのアンチセンスまたはそのインバーテッドリピート構築物（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ　Ｒｅｐｅａｔ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）などを意味する。また、「遺伝子関連物質」という用語は、１以上の遺伝子もしくはその断片の翻訳産物に反応する抗体もしくはその断片をコードする遺伝子をも意味する。
インバーテッドリピート構築物はＲＮＡｉ（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）による遺伝子の機能発現抑制を期待するもので、分子内相互作用により相補的な２重鎖ｍＲＮＡを形成し得る配列のｍＲＮＡを発現するベクターの構築物を意味する。前記ｍＲＮＡは、転写後にヘアピン構造の２重鎖ｍＲＮＡを形成し、これが触媒として、前記ｍＲＮＡをコードするゲノム上の遺伝子から転写されたｍＲＮＡを分解する。結果として、前記遺伝子の機能発現を抑制することになる。
【００１８】
本発明において「蛋白質関連物質」という用語は、蛋白質もしくはその断片、または、それに結合する抗体もしくはその断片などを広く意味する。また、組織などから抽出した粗精製物、または各種精製法により精製した精製物、微生物等で生産した組換え型などを用いることができ、その純度および由来などに限定されない。
前記遺伝子としては、例えばＣａＭＫ　ＩＩ遺伝子、ＩＰ３受容体遺伝子、Ｍｂｌｋ―１遺伝子、ＱＭ１遺伝子、攻撃蜂の脳に選択的に発現する遺伝子（Ａｇｇ―１、　Ａｇｇ―２）などが挙げられる。
前記蛋白質としては、例えば前記遺伝子の翻訳産物などが挙げられる。
【００１９】
本発明は、例えば前記物質を脳の特定の領域に導入し、前記物質に起因する生体内での特有の活性を利用して、前記第一段階における改変を達成する。
例えば、前記物質が前記標的領域において存在し、および特定の機能を有している場合においては、次の作用機序が考えられる。つまり、前記標的領域において、前記物質を導入して該領域の前記物質の存在量を増加させることによって、前記物質の特異的な活性の促進的な効果を生じて、該領域の機能を亢進して形質を変化させることになる。
また例えば、前記物質が結果として特定蛋白質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡのアンチセンス、または、インバーテッドリピート構築物などを導入部位に生じる場合には、前記特定蛋白質の生成を阻害することによって、前記特定蛋白質の機能発現を抑制して形質を変化させることになる。
また、前記物質が例えば、ジフテリアトキシン、コレラトキシンなどのトキシン蛋白質の機能ドメインを結果として前記標的領域に生じる場合には、前記標的領域の細胞を殺傷することにより形質を変化させることになる。
以上のような様式で前記第一改変段階の改変を達成して、引き続く以後の各改変段階における改変を達成する。
本発明で使用される前記物質は何れも分子生物学、生化学、薬学等の当業者に周知の方法を用いて作成、および／または、様々な会社および寄託機関などから入手することができる。
【００２０】
本発明において、前記物質の導入部位は脳の各領域であり、好ましくはキノコ体もしくは神経分泌細胞であり、より好ましくはキノコ体の大型ケニヨン細胞もしくは小型ケニヨン細胞である。
【００２１】
本発明において、前記物質の導入方法は、例えばエレクトロポレーション法などを利用することができるが、特定の対象とする標的領域に前記物質を導入可能であり、目的とする前記第一改変段階を達成できる方法であれば特に限定されない。
【００２２】
例えば、前記物質の導入は以下のようにして実施することができる。すなわち、最初に導入対象部位の周囲を囲むように陽極および陰極の電極を挿入して、両電極の間に前記物質を注入するためのシリンジを挿入する。次に、シリンジから前記物質の適切量を注入して、適切な矩形パルス電圧を適切な回数印加することにより実施することができる。
【００２３】
エレクトロポレーション法による場合は、電圧の上昇にしたがって遺伝子導入率が上昇する一方、個体の生存率は逆に低下する（図４を参照）。従って、電圧の条件は、目的とする改変段階に応じ、対象の生存率を考慮して決定されなければならない。例えば、個体の生存が必要ない目的においては、比較的高い電圧で操作して細胞のみを高率に改変し、該細胞を摘出して使用するような適用も考えられる。一方、個体の高い生存率が必要な目的においては、比較的低い電圧で操作して個体の生存率を高率にし、当該個体をそのまま利用することになる。この場合は、一般に電圧の条件は５０Ｖ〜６０Ｖ程度で行うことが好ましい。
【００２４】
エレクトロポレーション法による場合は、前記電極の陽極側近傍の細胞のみに前記物質を導入できる（図２および５）。このため、陽極側の電極を適宜移動することによって導入部位を任意に設定することができる。エレクトロポレーション法は通常の矩形波を発生できる市販の装置を利用して実施できるが、例えばＮＥＰＡ　ＧＥＮＥ社のＣＵＹ２１ＥＤＩＴを用いて実施することができる。
【００２５】
電極には間隔可変の平行ニードル電極（例えば、ＣＵＹ５６７；　ＮＥＰＡ　ＧＥＮＥなど）を使用でき、適宜対象とする標的領域の大きさなどに応じて、電極の間隔を調整して使用する。例えば、蜂類のキノコ体の場合には電極間隔１ｍｍ程度、視葉の場合には同２ｍｍ程度が好ましい。
【００２６】
現在のところ、エレクトロポレーション法により昆虫の脳で外来遺伝子を発現させた例はなく、本発明において初めてその実施可能性が開示されるものである。
【００２７】
本発明で作成した改変昆虫は当業者に周知の方法で維持管理することができる。また、本発明で作成した改変昆虫は、上記のとおり遺伝子汚染を生じないので特別な隔離する施設等を必要としないため、当業者において通常使用される管理用の飼育箱などを使用できる。
【００２８】
＜蜂類に対する適用＞
以下に本発明の好適な態様として、本発明を蜂類に適用する場合について更に具体的に説明するが、本発明はこれらの態様にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００２９】
昆虫のなかでも特に植物の花粉を媒介するポリネーター（花粉媒介）、およびハチミツ生産などに利用できる蜂類は産業上有用な昆虫である。このような産業利用上の背景から特にミツバチやマルハナバチなどの生産は企業レベルで行われており、品種改良などによる昆虫を改変する技術の必要性は高い。
【００３０】
以上のような産業利用上の背景から本発明において好適に使用される対象はセイヨウミツバチ、ハリナシバチ、マルハナバチなどの蜂類である。これらの昆虫の何種かは、個体間分業および個体間コミュニケーションを成立させた社会性昆虫である。
【００３１】
個体間分業とは、主に生殖に従事する女王蜂、雄蜂、およびその他のコロニーを維持するための労働に従事する働き蜂など、個体毎に担当する仕事を分業するシステムである。また、働き蜂の中ではさらに加齢分業が成立しており、羽化したばかりの若い蜂は、巣の中で幼虫や女王蜂の世話をする育児蜂として働くが、数週間すると巣の外に出て花の蜜や花粉を集める採餌蜂として働くようになる。
【００３２】
個体間コミュニケーションの例としては、例えば花の蜜を見つけて巣に戻った働き蜂が記憶した花の位置を、ダンス言語を用いて仲間に伝えることなどがある。このような象徴的言語をもちいて個体間コミュニケーションを行う動物は、高等霊長類および鯨類の他はほとんど知られていない。
【００３３】
上記のような生物学的な背景から、これら社会性の蜂は本発明における前記第二改変段階において達成される集団レベルでの形質を改変する場合の好適な対象となる。
【００３４】
この前記第二改変段階の改変を目的とする場合は、女王蜂、働き蜂の育児蜂、働き蜂の採餌蜂、および雄蜂の成虫などのように、社会的分業を達成した後の成虫に適用するのが好ましい。
【００３５】
例えば、女王蜂は１コロニー内に１匹のみ存在し、上記のとおりひたすら卵を生みコロニーの個体数を増加する役割を担う。従って、女王蜂の脳に本発明の方法で産卵を促す操作を施せば、コロニーの個体数を増加することができる。結果として、コロニーを集団レベルで群勢のよいコロニーに改変することができ、ハチミツの増産等の効果を得ることができる。
【００３６】
また、花の位置情報などを仲間に伝達する行為は、コロニー中でも限られた数の採餌蜂が担っている。前記採餌蜂の採集はダンスを踊っている蜂のみを捕獲すればよく、採集後に本発明の方法で脳の機能を改変することができる。例えば、採餌蜂の記憶能力等が向上する改変を行うことにより、他の個体へ伝達される情報の量および精度が向上し、集団内で共有される花の位置情報等の量および質が増大することになる。結果として、集団レベルでハチミツ採取能力およびポリネーター（花粉媒介）能力が向上する。
【００３７】
以上のような様式で前記第二改変段階である集団レベルの形質の改変が達成される。
【００３８】
これら蜂類における代表的な実施態様を以下に例示する。
本発明の第一の態様において、以下の構成により昆虫を改変でき、下記の理由などから下記改変効果を提供することができる。
導入遺伝子．．．．．．ＣａＭＫ　ＩＩ遺伝子、ＩＰ３受容体遺伝子、Ｍｂｌｋ―１遺伝子
標的領域　．．．．．．キノコ体（ケニヨン細胞）
導入対象　．．．．．．働き蜂（採餌蜂）
改変効果　．．．．．．ハチミツ採取能力の向上、ポリネーター（花粉媒介）能力の向上
理　　由　．．．．．．いずれのタンパク質も記憶・学習に関与することが知られている（ＣａＭＫＩＩ，　ＩＰ３受容体）もしくは推測されている（Ｍｂｌｋ―１）ことから、遺伝子導入法を用いて発現量を増加させることにより、一般的に蜂類において花の場所等の記憶能力の向上、ひいては、ハチミツ採取能力およびポリネーター（花粉媒介）能力が向上する。
【００３９】
本発明の第二の態様において、以下の構成により昆虫を改変でき、下記の理由などから下記改変効果を提供することができる。
導入遺伝子．．．．．．ＱＭ１遺伝子
標的領域　．．．．．．神経分泌細胞
導入対象　．．．．．．女王蜂、働き蜂
改変効果　．．．．．．産卵能力の向上、獲得
理　　由　．．．．．．ＱＭ１は卵巣を発達させる活性を持つと推測されることから、一般的に蜂類において、女王蜂に導入した場合には産卵能力のさらなる向上を、働き蜂の場合にはその能力を獲得する。
【００４０】
本発明の第三の態様において、以下の構成により昆虫を改変でき、下記の理由などから下記改変効果を提供することができる。
導入遺伝子．．．．．．攻撃蜂の脳に選択的に発現する遺伝子（Ａｇｇ―１，　Ａｇｇ―２）のインバーテッドリピート構築物
標的領域　．．．．．．キノコ体をはじめとする脳内各領野
導入対象　．．．．．．働き蜂
改変効果　．．．．．．攻撃性の低下
予想理由　．．．．．．Ａｇｇ―１，　Ａｇｇ―２　ともに攻撃性の高い個体で強く発現することから、一般的に蜂類において両遺伝子の発現量を抑えるインバーテッドリピート構築物を導入することで、働き蜂の攻撃性を低下させ、刺害の発生を抑える。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００４２】
＜対象昆虫＞
対象として社会性昆虫であるセイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ　ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）を使用する。
＜材料および方法＞
［ミツバチの保定］
ふたを切除した５００μｌチュウブの口の部分に糊を塗布した後、ミツバチ成虫を頭が外に出るようにチュウブ内に入れる。次にミツバチの頚部をはさむように、凹型（１３ｍｍ　ｘ　１３ｍｍ；中央部の切り込みは幅１〜２ｍｍ長さ約１０ｍｍ）のプラスチック板を差し込み、あらかじめチュウブの口に塗布しておいた糊を利用して板とチュウブを固定する。同様の板をもう１枚、先の板と９０度になるように差し込み、２枚の板をクリップではさみ固定する。これにより、ミツバチ頚部は１〜２ｍｍ四方の長方形内に固定され、頭部外殻をメスを用いて切り取ることが可能になる。
【００４３】
［電気穿孔法］
ＮＥＰＡ　ＧＥＮＥ社のＣＵＹ２１ＥＤＩＴを用いて、５０ｍｓｅｃオン、９５０ｍｓｅｃオフの矩形パルスを電圧５０Ｖで５回適用した。電極には間隔可変の平行ニードル電極（ＣＵＹ５６７；　ＮＥＰＡ　ＧＥＮＥ）をキノコ体の場合には電極間隔１ｍｍ、視葉の場合には同２ｍｍで使用した。
［ＤＮＡ溶液］
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ；　Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーターの下流にＧＦＰ−Ｓ６５Ｔが接続されたプラスミッド（ｐｈＧＦＰ−Ｓ６５Ｔ、　クロンテック）を用いた。終濃度０．５μｇ／μｌ　ＤＮＡ、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ファーストグリーン（和光純薬）の水溶液を個体あたり１μｌ注入した。
【００４４】
［遺伝子導入操作］
上記の方法によりミツバチの頭部を固定し、クチクラの一部を剥がし、電極（図面で手前に伸びる２本のシリンジ）とＤＮＡ溶液を注入するシリンジ（図面で上方に伸びる細いシリンジ）を脳に挿入した（図１）。
【００４５】
＜結果および考察＞
視葉へのＧＦＰ遺伝子導入（図２）
上記の方法でＧＦＰ遺伝子を対象の視葉（図３）に導入したところ、未処理個体ではＧＦＰの蛍光は観察されなかったが、遺伝子導入個体では観察された。
図２に個体から脳を摘出してＧＦＰ遺伝子の発現をＧＦＰの緑色蛍光で観察した結果を示している、上段が未処理個体、下段がＧＦＰ遺伝子導入個体である。上段では、羽根を広げた蝙蝠のような暗緑色（図では淡黒色；自家蛍光による）の脳が見える、下段では矢印で示す電極を刺した部分（左側の視葉；視覚中枢）でＧＦＰ遺伝子が発現していることが観察された（図２；図では発現部位が黒色で示される）。
【００４６】
キノコ体へのＧＦＰ遺伝子導入（図５）
コントロール処理個体では暗緑色（図では淡黒色；自家蛍光による）で脳の輪郭が観察される（上段左）。
ＧＦＰ遺伝子導入個体＃１において、左右一対のキノコ体（図３）の内、右側のキノコ体の部分に電極を刺し、遺伝子導入操作後に脳を摘出してＧＦＰ遺伝子の発現を蛍光で観察した（上段右）。矢印で示すように、キノコ体のかなりの部分で蛍光が観察され（図では発現部位が黒色で示される）、一部のキノコ体からの神経投射が蛍光で可視化されて見える。
【００４７】
ＧＦＰ遺伝子導入個体＃２において、左右一対のキノコ体の内、左側のキノコ体の部分に電極を刺し、遺伝子導入操作後に脳を摘出してＧＦＰ遺伝子の発現を蛍光で観察した（下段左）。矢印で示すように、キノコ体の一部分で蛍光が観察される（図では発現部位が黒色で示される）。
下段右の写真はＧＦＰ遺伝子導入個体＃２であり、下段左の写真と同一のサンプルを上部から観察した図である。
【００４８】
リバーストランスクリプション−ポリメラーゼチェインリアクション（Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；　ＲＴ−ＰＣＲ）によるＧＦＰ転写産物の検出（図６）
ＧＦＰ遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた。数字は各個体を示し、各々の個体からＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（ＲＴ）処理したもの（＋）又はしないもの（−）について、ＰＣＲを行い、ＧＦＰ遺伝子由来のｍＲＮＡが検出されるかどうか調べた。図の右に示した矢印の位置のバンドが、ＲＴ（＋）で検出され、ＲＴ（−）で検出されないとき、ＧＦＰ遺伝子が発現していることになる。未処理群では６個体のいずれでもＧＦＰ遺伝子は発現していないが、ＧＦＰ遺伝子導入群では、１２個体中の全ての個体で、導入したＧＦＰ遺伝子が発現していることが分かる（図６、Ｍはマーカーとして使用したＤＮＡ断片）。
【００４９】
以上の結果は、ＧＦＰ蛋白質が遺伝子導入個体のみ、且つ標的領域でのみ観察されたことを示している。ＲＴ−ＰＣＲによっても、遺伝子を導入した個体においてＧＦＰ遺伝子が転写されていることを確認できた。
【００５０】
また、ショウジョウバエのアクチンプロモーターＡｃｔ５Ｃの下流にｌａｃＺを挿入したプラスミッドについても、同条件で行ったが、レポーター遺伝子の活性は検出されなかった。一方、カイコのアクチンプロモーターＡ３の下流にＧＦＰを挿入した場合には、緑色蛍光が観察された。
以上の結果は、上記２種類のプロモーターは双方ともが昆虫由来であり、且つ組織非特異的に発現する蛋白質であるアクチン遺伝子のプロモーター配列であってもプロモーター活性に違いがあることを示している。この事実は使用するプロモーター配列に導入対象の昆虫に単に類縁性の高い生物由来の該配列および／または組織非特異的に発現する遺伝子の該配列を使用することでは本発明の課題は解決できないことを示すものである。
【００５１】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、昆虫の形質を改変することにより、産業上より有用な昆虫を作出し、且つ改変された昆虫が遺伝的汚染を引き起こす危険性のない技術を提供することができる。また、迅速に実施可能で、且つその適用が特定の昆虫の種類に限定されないような、昆虫の個体および集団の形質を改変する技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】セイヨウミツバチの頭部に電極およびシリンジを挿入した際の写真である。
【図２】視葉にＧＦＰ遺伝子を導入した個体および未処理個体の脳の顕微鏡写真である。
【図３】ミツバチの頭部と脳の模式図およびキノコ体（左側）の模式図を表す図である。
【図４】生存率および遺伝子導入率に対する電圧の影響を表したグラフである。
【図５】キノコ体にＧＦＰ遺伝子を導入した個体およびコントロール処理個体の脳の顕微鏡写真である。
【図６】ＲＴ−ＰＣＲによるＧＦＰ転写産物の検出を示す電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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