(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト細胞を感染させうる新規なウイルスベクターの構築。【解決手段】ＧａＬＶ成分を包含する複製欠陥ハイブリッドレトロウイルスベクター及びこのようなベクターの製造方法及び使用を提供する。ベクターはエンベロープ成分、コア成分及び欠陥ゲノムを包含し、そのうちの少なくとも１つはＧａＬＶに由来する。ベクターは、ハイブリッドビリオン中に欠陥ゲノムのパッケージングを指示するＧａＬＶからの最小ｃｉｓ作用配列を包含し得る。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
着目のポリヌクレオチド配列を含む欠陥ウイルスゲノム及びテナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）成分を包含する組換え体ＤＮＡ構築物。
【請求項２】
ＧａＬＶ成分がＧａＬＶパッケージング部位を含む請求項１記載の構築物。
【請求項３】
パッケージング部位が約150 塩基対と約1500塩基対との間から成る請求項２記載の構築物。
【請求項４】
パッケージング部位が本質的には図１に示される配列のおよそ位置200 からおよそ位置910 まで延びる配列で構成される請求項２記載の構築物。
【請求項５】
ＧａＬＶ成分が着目のポリヌクレオチドの発現を指示する調節配列を含む請求項１記載の構築物。
【請求項６】
調節配列がＧａＬＶ３’ＬＴＲからである請求項５記載の構築物。
【請求項７】
プロモーターがＧａＬＶ  ＳＦからのものである請求項６記載の構築物。
【請求項８】
請求項１記載の欠陥ウイルスゲノムを包含する哺乳類細胞。
【請求項９】
さらにレトロウイルスｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を包含する請求項８記載の細胞。
【請求項１０】
ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子がＧａＬＶ  ＳＦ又はＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯからのものである請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子がＭｏＭＬＶからのものである請求項９記載の細胞。
【請求項１２】
さらにレトロウイルスｅｎｖ遺伝子を包含する請求項８記載の細胞。
【請求項１３】
ｅｎｖ遺伝子がＧａＬＶ  ＳＦ又はＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯからのものである請求項１２記載の細胞。
【請求項１４】
ＰＧ１３又はＰＡ３１７である請求項８記載の細胞。
【請求項１５】
ＧａＬＶエンベロープタンパク質並びに着目のポリヌクレオチド配列及びＧａＬＶ成分を含むＲＮＡゲノムを包含する単離ハイブリッドビリオン。
【請求項１６】
さらにＧａＬＶコアタンパク質を包含する請求項１５記載のビリオン。
【請求項１７】
さらにＭｏＭＬＶコアタンパク質を包含する請求項１５記載のビリオン。
【請求項１８】
エンベロープタンパク質がＧａＬＶ  ＳＦタンパク質である請求項１５記載のビリオン。
【請求項１９】
ＧａＬＶ配列がパッケージング部位を含む請求項１５記載のビリオン。
【請求項２０】
パッケージング部位が約150 塩基対と約1500塩基対との間から成る配列から転写される請求項１９記載のビリオン。
【請求項２１】
パッケージング部位が図１に示される配列のおよそ位置200 からおよそ位置910 まで延びるポリヌクレオチド配列から転写される請求項１９記載のビリオン。
【請求項２２】
哺乳類細胞を感染させ、感染性ウイルス子孫を産生し得る感染性ＧａＬＶビリオンをコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離組換え体ＤＮＡ構築物。
【請求項２３】
ＤＮＡ構築物がＧａＬＶ  ＳＦ配列及びＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ配列を包含する請求項２２記載の構築物。
【請求項２４】
ＤＮＡ構築物がＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ配列  97 %及びＧａＬＶ  ＳＦ配列  ３% で構成される請求項２３記載の構築物。
【請求項２５】
ＧａＬＶ受容体を有するヒト細胞に着目のポリヌクレオチドを導入する方法であって、
細胞をＧａＬＶエンベロープタンパク質並びに当該のポリヌクレオチド配列及びＧａＬＶ成分を含むＲＮＡゲノムを包含するハイブリッドビリオンと接触させ；そして
当該ポリヌクレオチドを有する細胞を選択する
ことを包含する方法。
【請求項２６】
さらに細胞をヒト患者に移植することを包含する請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ヒト細胞が骨髄細胞及び腫瘍浸潤細胞から選択される請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は概してレトロウイルスベクターに関する。特に本発明はテナガザル白血病ウイルスからの核酸配列を包含するレトロウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子療法及びトランスジェニック動物の産生を含めた種々の適用のために哺乳類細胞に遺伝子工学的処理遺伝子を導入することに目下かなりの努力が払われている。このような戦法は、適切な標的細胞及び組織への遺伝子の安全供給のための有効な手段の開発に依っている。
【０００３】
レトロウイルスベクターは、適切な細胞へ所望のポリヌクレオチドを向かわせ、そして宿主細胞ゲノムにポリヌクレオチドを組み込むのに特に有用である。例えば米国における承認済遺伝子伝達試験は、レトロウイルスゲノムの一部として治療用ポリヌクレオチド配列を保有する複製欠陥レトロウイルスベクターに依っている（Miller et al., Mol. Cell. Biol. 10:4239 (1990); Kolberg R J.NIH Res. 4:43 (1992); Cornetta et al., Hum. Gene Ther.  2: 215 (1991) ）。当業界で公知のように、遺伝子療法に関するレトロウイルスベクターの大きな利点は、ある種の複製中の細胞への遺伝子伝達の効率が高いこと、細胞ＤＮＡ中への伝達遺伝子の正確な組込み、及び遺伝子伝達後の配列がさらに広がらないことである。
【０００４】
残念ながら、多数のヒト細胞は従来の技術のレトロウイルスベクターによっては有効に感染されない。レトロウイルス感染に対する感受性の低減は、ウイルス複製の３段階：即ち１）細胞表面上のレトロウイルス受容体との結合及び初期ウイルス侵入；２）ウイルスゲノムの細胞核への後期侵入及び伝達、並びにウイルスゲノムの標的細胞ＤＮＡ中への組込み；及び３）ウイルスゲノムの発現；のうちの１つが無効力であるためであるというのが最も考えられることである。これら３つの段階は、それぞれウイルスエンベロープタンパク質、ウイルスコアタンパク質及びウイルスゲノムにより支配される。これら３つの要素はすべて、標的細胞中で有効に機能して最適治療遺伝子供給を達成しなければならない。
【０００５】
テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）は、利用可能なレトロウイルスベクターの者とは異なる細胞表面インターナリゼーション受容体を用い、したがって普通ではレトロウイルス感染に耐性の細胞及び組織を感染させる。ＧａＬＶに対するヒト受容体が近年クローニングされており、広範な細胞型及び種分布を示す（Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992)）。実際、ＧａＬＶは、多数の哺乳類種を感染させ得るが、マウス細胞が例外であることは注目に値する。同受容体は、ＧａＬＶの一株であるサル肉腫関連ウイルス（ＳＳＡＶ）により用いられる（Sommerfelt et al., Virol. 176;58-59(1990) ）。
【０００６】
ＧａＬＶエンベロープタンパク質を有するハイブリッドビリオンの構築が立証された。例えば、Wilson等(J. Virol. 63:2374-2378 (1989)) は、ＧａＬＶ及びヒトＴ細胞白血病ウイルスレトロウイルスｅｎｖ糖タンパク質並びにMoloney ネズミ白血病ウイルス( ＭｏＭＬＶ) のｇａｇ及びｐｏｌタンパク質を有する感染性ハイブリッドビリオンの調製を記載する。さらに、Miller等 ( J. Virol. 65:2220-2224 (1991)) は、ＧａＬＶエンベロープ及びＭｏＭＬＶｇａｇ−ｐｏｌタンパク質を発現するハイブリッドパッケージング細胞株の構築を記載する。
【０００７】
ヒト細胞を感染させ得る現下のレトロウイルスベクターはすべて、ＭｏＭＬＶ由来のコア及びゲノム成分を含有する。上記の３つの任意の段階でのこのようなベクターによる有効な感染に耐性であるヒト細胞に関しては、改良エンベロープ、コア又は調節配列を包含する新規のベクターが意図されねばならない。したがって一般に用いられているレトロウイルスベクターにより有効に感染されないヒト細胞中に遺伝子を導入ために用い得るレトロウイルスベクター成分を企画する必要がある。本発明は、これらの及び他の必要なものを扱う。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の要約
本発明は当該のポリヌクレオチド配列を有する欠陥ウイルスゲノム及びＧａＬＶ成分を包含する組換え体ＤＮＡ構築物を提供する。例えばＧａＬＶ成分は、感染生複製欠陥ビリオン中での欠陥ウイルスゲノムのパッケージングを指示するＧａＬＶパッケージング部位である。パッケージング部位は一般的には、約150 塩基対と約1500塩基対との間から成り、図１に示される配列のおよそ位置200 からおよそ位置1290まで延びる配列を含む。
【０００９】
構築物はさらに当該ポリヌクレオチドの発現を指示するＧａＬＶ調節配列を包含する。一般的には、調節配列はＧａＬＶ（例えばＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ又はＧａＬＶ  ＳＦ）５’又は３’ＬＴＲプロモーターを包含する。
【００１０】
本発明はさらに、上記の欠陥ルスゲノムを包含する哺乳類細胞に関する。哺乳類細胞はパッケージング細胞であり、この場合細胞はさらにレトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を包含する。これらの遺伝子は、ＭｏＭＬＶ、ＧａＬＶ  ＳＦ又はＧａＬＶ
ＳＥＡＴＯに由来する。本発明に用いられるパッケージング細胞は、ＰＧ１３及びＰＡ３１７を含むと便利である。
【００１１】
本発明はさらに、ＧａＬＶ（例えばＳＦ又はＳＥＡＴＯ）エンベロープタンパク質並びに当該のポリヌクレオチド配列及びＧａＬＶ成分を含むＲＮＡゲノムを包含する単離ハイブリッドビリオンを提供する。ビリオンは一般的にはＧａＬＶコアタンパク質を含有する。ＭｏＭＬＶコアタンパク質も用い得る。
【００１２】
本発明はさらに、哺乳類細胞を感染させ、機能性ウイルス子孫を産生し得る感染性ＧａＬＶビリオンをコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離組換え体ＤＮＡ構築物を提供する。感染性クローンは一般的にＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ配列  97 %及びＧａＬＶ  ＳＦ配列  ３% で構成される。
【００１３】
上記のハイブリッドビリオンを用いてヒト細胞に当該ポリヌクレオチドを導入する方法も開示する。本方法は、好ましくはヒト患者を治療するための遺伝子療法プロトコールの一部として用いられる。
【００１４】
定義
”ハイブリッドビリオン”とは、１つ以上のウイルス由来のゲノム、コア及びエンベロープ成分を包含スルビリオンである。この用語は特に、あるウイルスからのゲノムと別のものからの構造タンパク質を含有すると歴史的に定義されている”プソイドビリオン”を含む。
【００１５】
”パッケージング細胞”とは、パッケージングに必要とされるウイルス構造タンパク質を産生する遺伝子処理して構築した哺乳類組織培養細胞である。本細胞は、欠陥ゲノムが細胞に導入されるまで感染ビリオンを産生できない。ウイルス構造タンパク質のための遺伝子物質は細胞により産生されるビリオンとともに伝達されず、したがってウイルスは複製できない。
【００１６】
”複製−欠陥”ビリオン又はレトロウイルスベクターは、上記のようなパッケージング細胞により産生されるものである。このようなビリオンは標的細胞を感染させるが、しかし他の細胞を感染させ得る子孫ビリオンを産生することができない。
【００１７】
２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドは、最大限対応するように並べた場合に、２つの配列中のヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列が同一であるならば、”同一である”といわれる。比較のための配列の最適整列は、Smith とWaterman(Adv. Appl. Math. 2:
482(1981))の局所相同算法により、Needleman とWunsch (J. Mol. Biol. 48:443(1970)) の相同整列算法により、Pearson とLipman (Proc. Natl.Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988))の類似法に関する検査により、これらの算法のコンピューター処理実行により、又は点検によって実施し得る。これらの参考文献は、参照により本明細書中に含めるものとする。
【００１８】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、少なくとも20の位置の比較のウインドウを通じて２つの最適整列配列を比較することにより確定される。パーセンテージは、同一核酸塩基又はアミノ酸残基が両配列に生じる位置の数を確定して、適合位置の数を得て、比較のウインドウにおける位置の総数（即ちウインドウのサイズ）により適合位置の数を探査し、そして結果に100 を掛けて配列同一性のパーセンテージを得る。
【００１９】
例えば配列を比較するための好ましい方法は、Needleman 等（上記）の算法を基礎にしたＧＡＰプログラムを用いる。一般的には、全パラメーターに関するデフォルト値を選択する。これらはｇａｐ重量： 5.0、長さ重量： 0.30 、平均適合： 1.0  及び平均不適合：0.0 である。
【００２０】
”実質的同一性”とは、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、約20 bp 〜約2000 bp 、典型的には約50〜1500  bp、通常約350 bp〜約1200  bpの比較ウインドウ中の参照配列と比較して、少なくとも80% の同一性、好ましくは90% 、さらに好ましくは95% 又はそれ以上の同一性を有する配列を包含することを意味する。パーセント同一性の値は、上記のＧＡＰプログラムを用いて確定する。
ヌクレオチド配列が実質的に同一であるというもう一つの表示は、２つの分子が緊縮状態下で互いにハイブリダイズするか否かである。緊縮状態は配列依存性であって、異なる環境では異なる。一般に緊縮状態は、限定イオン強度及びpH  での特異的配列に関する熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いよう選択される。Ｔｍは、標的配列の50% が好ましく適合したプローブとハイブリダイズする温度（限定イオン強度及びpH下）である。一般的には緊縮状態は、塩濃度がpH７で約 0.2モル、温度が少なくとも約 60 ℃である状態である。
【００２１】
好ましい態様の説明
ＧａＬＶ成分を含む新規のハイブリッドレトロウイルスベクターが本発明によりを提供される。本ベクターの組織特異性は、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルスコアタンパク質及びウイルスゲノムにより調べるが、このうち少なくとも１つはＧａＬＶ由来である。ベクターは複製欠陥ハイブリッドビリオン中で欠陥ゲノムをパッケージングさせるＧａＬＶからの最小ｃｉｓ配列（パッケージングシグナル）を包含し得る。さらに、欠陥ゲノムのＬＴＲは、ＧａＬＶから得られる。例えばハイブリッドレトロウイルスベクターの３’ＬＴＲ領域は、種々のＧａＬＶ配列から選択されて、ゲノム中の構造遺伝子の所望の組織特異的発現を提供する。
【００２２】
複製欠陥レトロウイルスベクターは、欠陥ＤＮＡウイルスゲノムがパッケージング細胞株中に導入されると産生される。欠陥ゲノムは、感染性ビリオン中へのゲノムのパッケージングのために、標的細胞ゲノム中への組み込みに必要な配列を、並びに治療遺伝子の発現に必要なウイルス配列又は欠陥ウイルスゲノム内に含有される他のポリヌクレオチド含有する。パッケージング細胞は、ウイルスコア及びエンベロープ成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を包含する。これらのコア及びエンベロープタンパク質は欠陥ゲノム周囲に集合して、レトロウイルスベクターを産生する。
【００２３】
多数の標準技法がレトロウイルスベクターの安全性を保証するために用いられる。例えばコア及びエンベロープ成分をコードする遺伝子から別々に細胞中に欠陥ゲノムが導入される。この方法では、完全ウイルスゲノムのパッケージングに至ゲノム及びコア及びエンベロープ遺伝子間の組換えは、到底ありそうにない。その結果生じるビリオンはしたがってｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含有せず、したがって複製欠陥性である。しかしながら挿入体間の相同組換えは、感染性ビリオンの産生を生じ得る。一般的にはパッケージング細胞は、少なくとも２つの別々のプラスミド上のｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を導入することにより産生される。この概要は、発生している多数の別々の相同組換え事象の確率が非常に低いために、感染性ウイルスの再構築を引き起こす相同組換えを有効に防止する。
【００２４】
レトロウイルスベクターはさらに、組込み欠陥ゲノムによるウイルスタンパク質の合成を防止するよう意図される。例えばｇａｇ遺伝子の一部分がパッケージング効率を増大するために含まれる場合には、停止コードを遺伝子に導入してｇａｇタンパク質の合成を防止し得る（Miller et al., BioTechniques 7:982-988 (1989) ）（この記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする）。
【００２５】
さらにパッケージング細胞を作成するために用いられる細胞は、ＧａＬＶに対する細胞受容体を所有せず、したがってＧａＬＶに感染性でない。したがってＧａＬＶエンベロープを有するレトロウイルスベクタービリオンはパッケージング細胞を再感染せず、パッケージング細胞中に広がるベクターは大いに低減される。適切なパッケージング細胞はさらに、限定された内生的ウイルス配列を有するか又は全く有さない。このための細胞株は、Mus dunni （ハツカネズミ類）尾繊維芽細胞株を含む。この戦法は、親ベクターより高効率でしばしば伝達される組換え体ベクターの生成の可能性を低減する。
【００２６】
最後に、ＧａＬＶが進化的にマウスのアジア株の異向性ウイルス由来であり、ヒト病原性ウイルスと密接に関連するとは思えないため、発明の複製欠陥ベクターは特に安全である。したがって含入の点では、ＧａＬＶベースの複製欠陥ハイブリッドビリオンは従来技術のネズミレトロウイルスベクターと同じくらい安全で、ヒト遺伝子治療に関する遺伝子の供給のための安全なビヒクルを提供する。
本発明のパッケージング細胞を用いて、ヒト、ハムスター、ウシ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、マカック属サル、霊長類、及び細胞がＧａＬＶエンベロープタンパク質に対する宿主細胞受容体を有する他の種における遺伝子伝達に用いるための感染性複製欠陥ハイブリッドビリオンを提供し得る。
【００２７】
一般に、以後用いる名称及び細胞培養における実験室手順、下記の分子遺伝学及び核酸化学は十分公知のものであり、当業界で普通に用いられる。組換え体核酸法、ポリヌクレオチド合成及び細胞培養に関しては、標準技法が用いられる。一般に、酵素反応、オリゴヌクレオチド合成、オリゴヌクレオチド修飾及び精製工程は、メーカーの仕様書に従って実施する。技法及び手順は一般に当業界での慣用的方法及び本文書を通じて提供される種々の一般参考文献に従って実施する。本発明の仕様の一般方法を開示する基本的原文は、Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual,Cold Spring Habor Publish., Cold Spring Habor, NY 2nd ed. (1989)（この記載内容は、参照により本明細書中に含めるものとする）である。
【００２８】
本発明のレトロウイルスベクターの合成の第一段階は、感染性ＧａＬＶ  ＤＮＡクローンの生成である。少なくとも３つのＧａＬＶ株（ＧａＬＶ  ＳＦ、ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ及びＳＳＡＶ）からのプロウイルスＤＮＡがクローニングされている。ゲノムの両端及びエンベロープ遺伝子を含むがしかしコアタンパク質をコードするゲノムの無傷領域を含まないＧａＬＶ  ＳＦクローンが、Scott 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4213-4217(1981)) により報告されている。エンベロープ及びゲノムの一部を含有するがしかしＳＳＡＶのコアタンパク質をコードする領域を含まない部分クローンは、Gelman  等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3373-3377(1981)) に記載されている。最後に、Gelman  等(J. Virol. 44:269-275 ( 1982))は、ＧａＬＶのコア領域の350 塩基以外の全てを含有する第三のＧａＬＶ株  ＳＥＡＴＯの部分クローンを開示する。このクローンはDelassus等()によりその存在物中にシーケンシングされている( 図１参照）。欠失350 塩基も、ＧａＬＶ  ＳＦ感染細胞株で発現されたウイルスＲＮＡから生成したＰＣＲ断片以外から、シーケンシングされた。組込み形態のＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯゲノムの配列は、配列番号１で示される。上記の参考文献はすべて、参照により本明細書中に含めるものとする。
【００２９】
実施例１は、ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ及びＧａＬＶ  ＳＦからの配列を包含する感染性ＧａＬＶクローンの構築を記載する。以下に詳述するように、この構築を用いて多数のレトロウイルスベクターを調製し得る。
【００３０】
パッケージング細胞
本発明に用いるためのパッケージング細胞は、あらゆる動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ミンク肺細胞、Ｄ１７イヌ細胞及びＭＤＢＫ細胞から作成し得る。コア及びエンベロープ成分の一方又は両方は、ＧａＬＶ遺伝子でコードされる。しかしながらコア及びエンベロープ成分は、同一ＧａＬＶ株由来である必要はない。実際、いくつかの態様において、コア成分は異なる種（例えばＭｏＭＬＶ）から得られる。例えばＰＧ１３ネズミパッケージング細胞株は、ＭｏＭＬＶコア及びＧａＬＶエンベロープ粒子を有するビリオン粒子を産生する（Miller et al. (1991) J.Virol. 65: 2220-2224 参照）。
【００３１】
パッケージング細胞株を調製するために、パッケージング部位（ψ）が欠失されていた所望のレトロウイルス（例えばＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ）を構築する。この構築物を包含する細胞は、全ＧａＬＶ構造タンパク質を発現するが、しかし導入ＤＮＡはパッケージングされ得ない。あるいはパッケージング細胞株は、適切なコア及びエンベロープタンパク質をコードする１つ又はそれ以上の発現プラスミドで細胞株を形質転換することにより産生し得る。これらの細胞において、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子は同一の又は異なるレトロウイルスから得られる。
【００３２】
ある種の細胞はレトロウイルスベクターに対する受容体を発現するが、しかし受容体とエンベロープタンパク質との間の最適適合の損失のために、細胞は有効に感染されない。例えばグリコシル化様式の変化がレトロウイルス感染を阻害し得る（Wilson et al., J.
Virol. 65:5975-5982 (1991)）（この記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする）。さらに、標的細胞受容体の１個のアミノ酸の差のために、同一受容体クラスにおいてレトロウイルスは異なる宿主範囲を示し得る。
【００３３】
これらの考察にかんがみて、宿主範囲を調整するためにハイブリッドビリオンのエンベロープタンパク質を修飾する必要がある。従来感染に耐性であった細胞の感染を可能にするか又は非標的細胞の感染を防止するようタンパク質を修飾する。
【００３４】
エンベロープタンパク質を修飾するための一戦法は、in vitro選択案の使用である。このアプローチでは、選択性マーカー遺伝子を伴うレトロウイルスの感染性クローンを感染に耐性である標的細胞中に導入する。細胞の感染を可能にする突然変異を包含するレトロウイルスにより感染させた細胞を次に、培養上清の標準逆転写酵素検定により同定する。適応レトロウイルスのｅｎｖ遺伝子をクローニングし、シーケンシングして、標的細胞を有効に感染し得る新規のレトロウイルスベクターを構築するために用いる。この戦法は、腫瘍浸潤リンパ球、骨髄細胞、幹細胞及び肝細胞のようなＧａＬＶ感染に対して一般に耐性である多数のヒト細胞を感染させ得る変異体を単離するのに有用である。
【００３５】
あるいは細胞受容体をコードする遺伝子がクローニング去れている場合には、普通は受容体を産生しない細胞株中に遺伝子を挿入できる。次に上記と同様の方法で、受容体と結合し得る変異体レトロウイルスを同定し得る。例えばヒトＧａＬＶ細胞表面受容体がクローニングされ、シーケンシングされている（米国特許第5,151,361号、及びJohann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992)）（これらの記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする）。したがってこの遺伝子を用いて、修飾エンベロープタンパク質を発現する新規のレトロウイルスベクターを同定し得る。
【００３６】
レトロウイルスベクターの宿主範囲を修飾する第三の方法は、エンベロープタンパク質を直接修飾することによるものである。ポリペプチドをコードする配列の修飾は、種々の十分公知の技法、例えば特定部位の突然変異誘発によって容易に達成し得る（例えば、Gillman and Smith, Gene 8:81-97 (1979)及びRoberts,S. et al., Nature 328:731-734 (1987)）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含めるものとする）。修飾の効果は、遺伝子工学的処理を施したビリオンの標的細胞を感染させる能力に関してスクリーニングすることにより評価される。
【００３７】
さらに当業者に公知の方法を用いて、所望のポリペプチドをコードする特異的ポリヌクレオチド配列をｅｎｖ遺伝子と融合させることができる。抗体、ＳＣＦ、ＩＬ−６ソマトスタチン等をコードする配列を包含する遺伝子融合はしたがって標的化手段として用い得る。パッケージング細胞中での形質転換のために、融合遺伝子を適切なプラスミド中に挿入し得る。
【００３８】
さらにエンベロープタンパク質は、例えばタンパク質における点突然変異を導入することにより修飾して、有機化学手段（例えばスルフヒドリル基を生じるためのシステイン残基の挿入）によるカップリングのための部分を生じ得る。当業者に公知の他の手段により、細胞特異性標的化部分をグルタールアルデヒド、ペリオデート又はマレイミド化合物と結合させることができる。このような結合は野性型又は未修飾エンベロープタンパク質と直接なされるが、この場合、結合は炭化水素部分、スルフヒドリル基、アミノ基又は結合に利用できる他の基に対して可能である。
【００３９】
本発明に適した多数のパッケージング細胞株は、従来の技術にも利用できる。これらの株としては、Ｃｒｉｐ  及びＧＰＥ−Ａｍが挙げられる。好ましい既存細胞株としては、ＭｏＭＬＶコア及びエンベロープタンパク質を発現するＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ
９０７８）、並びにＭｏＭＬＶコア及びＧａＬＶエンベロープ成分を有するビリオンを産生するＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０，６８３）が挙げられる（Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224(1991) 参照）（この記載内容は、参照により本明細書中にふくめるものとする）。ＰＧ１３パッケージング細胞株は、５２１プラスミド及び５３７プラスミドとともに用い得るが、これらはいずれも５’ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲ及びパッケージングシグナル配列を含有する（本明細書の実施例３参照）。
【００４０】
欠陥ゲノム
レトロウイルスベクターの他の成分は、当該のポリヌクレオチド配列、典型的には構造遺伝子を包含するパッケージング可能な欠陥遺伝子である。本発明の欠陥遺伝子は、標的細胞ゲノムに組み込むためのゲノムに対して欠陥ゲノムそれ自体の中に存在しなければならないそして感染ビリオン中にパッケージングされねばならない（即ち配列はｃｉｓで必要とされる）最小ＧａＬＶヌクレオチド配列を含むＧａＬＶ成分を含有する。したがって本発明の欠陥ゲノムのＧａＬＶ成分は、パッケージング部位ψ、及び／又は長末端反復配列（ＬＴＲ）を含有する。ＬＴＲはプロウイルスＤＮＡのどちらかの端に位置し、プロウイルスＤＮＡ内の遺伝子の発現を指示スル調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー及びポリアデニール化配列）を含有する。ＧａＬＶ成分のポリヌクレオチド配列は、例えば配列番号１に示されるような配列と同一であるか、又は上記の配列と実質的に同一である。
【００４１】
典型的には、プロウイルス調節配列は挿入遺伝子の発現を駆動する。２つの挿入遺伝子が含まれる（例えばマーカー遺伝子と当該遺伝子）態様では、発現の効率を増大するためにウイルス内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含むことがしばしば望ましい（Ghattas et al., Mol. Cell. Biol. 11:5848-5859(1991) ）（この記載内容は、参照により本明細書中に含めるものとする）。
【００４２】
当該遺伝子と操作可能的に結合するプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的及び／又は調節可能的（例えばグルココルチコイドのようなホルモンにより）である。本発明に適したプロモーターとしては、初期ＳＶ４０、ＣＭＶ極後期、アデノウイルス直後初期、ヒストンＨ４、βアクチン、ＭＭＴＶ及びＨＳＶ−ＴＩＣのような遺伝子に由来するものが挙げられる。
【００４３】
エンハンサーはプロモーターからの転写速度を増大し、大距離でｃｉｓ結合プロモーターに作用し、配向依存性で、転写単位から上流（５’）及び下流（３’）の両方に位置し得る。ホルモン及び金属イオンにより誘導可能で、特異的組織にのみ見出されるエンハンサーが記載されている。ある組織型でのみ合成されるタンパク質、例えば筋肉中のアクチン及びミオシンは、しばしば組織特異的エンハンサーにより調節される。本発明のレトロウイルスベクターに用いられる当該の誘導遺伝子の組織特異的発現のためには、組織特異的エンハンサーは当該の特定のものである。
【００４４】
ＧａＬＶ  ＬＴＲのＵ３領域の反復性45塩基対エンハンサー要素は、導入遺伝子の組織特異的発現にとって重要である。このエンハンサー領域はＧａＬＶ  ＳＦの３’ＬＴＲに１回だけ存在するが、しかしＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯの３’ＬＴＲには３回存在する（Quinn et al., Mol. Cell. Biol. 7:2735-2744  参照）（この記載内容は、参照により本明細書中に含めるものとする）。45bpエンハンサー領域の３反復体を有するＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯの３’ＬＴＲの配列を配列番号２に示す。したがってレトロウイルスベクターにおける（ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ又はＧａＬＶ  ＳＦからの）３’ＧａＬＶ  ＬＴＲ領域の起源は、異なる組織における導入遺伝子の発現に影響を及ぼす（本明細書の実施例４参照）。
【００４５】
有効な発現を保証するために、３’ポリアデニール化領域が存在してｍＲＮＡ転写体の適切な成熟を提供しなければならない。当該遺伝子のネイティブ３’未翻訳領域が好ましくは用いられるが、しかしより有効な発現を提供する特にスプライス部位を含む例えばＳＶ４０からのポリアデニール化シグナルを用いてもよい。あるいは特定細胞型で高度に発現される遺伝子由来の３’未翻訳領域を当該遺伝子と融合する。
【００４６】
本発明のレトロウイルスベクターはさらに、組織／細胞特異的様式でゲノム内に含有される遺伝子の発現を指示し得るＧａＬＶベースの調節要素を含有する。概して、ＧａＬＶ調節要素は、ヒト細胞において遺伝子を発現する場合のＭｏＭＬＶ要素より有効である。さらに異なるＧａＬＶ株からの調節配列は、異なる細胞及び組織特異性を有する。例えばＧａＬＶ  ＳＦ調節遺伝子は霊長類リンパ球で機能し（例えばＵＣＤ  １４４）、ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ調節遺伝子はヒト骨髄細胞で有効に機能する（例えばＨＬ６０細胞）が、一方ＭｏＭＬＶ調節遺伝子は有効には機能しない。したがって本発明のベクターの組織特異性は、適切なＧａＬＶ株を選択することにより修飾し得る。種々のＧａＬＶ株からの調節遺伝子の組織特異性は、当業者に十分公知のルーチンのスクリーニング技術を用いて確定される。
【００４７】
別のものに由来する欠陥遺伝子に、あるレトロウイルス又はＧａＬＶ株の５’及び３’ＬＴＲを用いてもよい。例えばＳＳＡＶからの３’ＬＴＲを別のＧａＬＶ株の感染性クローンの３’ＬＴＲに置換し得る。３’ＬＴＲのＵ３領域は子孫ウイルスの５’及び３’ＬＴＲの両方のＵ３領域の合成の鋳型であるため、３’ＬＴＲを重複させ、宿主細胞の５’ＬＴＲに伝達する。この方法で、標的細胞中の当該遺伝子の最適発現が達成される。
【００４８】
さらに、パッケージングの効率を増大するために、或るウイルス（例えばＭｏＭＬＶ）からの５’ＬＴＲを第二のウイルス（例えばＧａＬＶ）の３’ＬＴＲと組み合わせて用い得る。構築物がＭｏＭＬＶ  ５’ＬＴＲ及びＧａＬＶ  ３’ＬＴＲを含有する場合、それらはネズミパッケージング細胞（例えばＰＧ１３）で有効に発現されるが、しかしヒト細胞でより有効に機能するＧａＬＶからのプロモーター配列を包含するプロウイルスＤＮＡを生じる。これらの構築物は、５’ＬＴＲ我パッケージング細胞中の遺伝子転写を駆動するため、ＰＧ１３のようなパッケージング細胞中に有効にパッケージングされる。しかしながらパッケージング化レトロウイルスベクターが適切な標的細胞に感染された場合は、３’ＧａＬＶ  プロモーターが遺伝子転写を駆動する（本明細書の実施例３参照）。ＭｏＭＬＶ  ５’ＬＴＲ及びパッケージングシグナル、及び３’ＧａＬＶ  ＬＴＲを有するレトロウイルスベクターの例としては、本明細書の実施例３に記載のプラスミド５２１及び５３７が挙げられる。この種のレトロウイルスベクターは、ＰＧ１３のような細胞株中での有効なパッケージング及び種々の標的細胞中でのより高度のはげという利点を有する（本明細書の実施例４参照）。
【００４９】
欠陥ウイルスゲノムに用いられるｃｉｓ作用パッケージング配列は、ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯに由来する。ＧａＬＶベースの欠陥ゲノムの有効なパッケージングに要する最小配列をここに記載する。特に以下に詳述するように、ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯゲノムの5'末端からの最初の910 〜1290ヌクレオチドは、ＰＧ13及びＰＡ317 細胞による欠陥ゲノムのパッケージングを指示し得る。この結果は、ＧａＬＶからの有効なパッケージングに必要な配列がＭｏＭＬＶコアタンパク質により認識されることを示す。したがってＧａＬＶ及びＭｏＭＬＶ成分の両方を含有するハイブリッドレトロウイルスベクターが便利に構築される。
【００５０】
欠陥ゲノムのパッケージングに必要なＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ配列は、後ＬＴＲを含み、図１に示したＧａＬＶ  ゲノムのおよそ位置１２９０に延びる。パッケージングに必要な配列はさらに、ウイルスゲノムから欠失された場合にゲノムの有効なパッケージングを妨げる配列として一般的に負の定義がなされるパッケージング部位ψを含む。ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯゲノムで、ψはおよそ位置200 で開始する５’ＬＴＲの下流に位置する。本部位は通常、少なくとも約350 bp、好ましくは約500 bp〜約1500bp、さらに好ましくは約700
〜約1200bpを包含する。当業者は、図１に示したパッケージング配列に対する最小修飾がパッケージングを指示する配列の能力に実質的に影響を及ぼすことはないと認識する。したがって”ＧａＬＶパッケージング部位”という用語は、本明細書中で用いる場合は、ＧａＬＶゲノム又は欠陥ゲノム中にｃｉｓで存在する場合にパッケージングを指示し得るＧａＬＶ  ＤＮＡ配列、又はそれらから転写されるＲＮＡ配列を表す。”ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯパッケージング部位”は、開示した配列と実質的に同一である（上記で確認）ＤＮＡ又はＲＮＡ配列で、本発明の欠陥ゲノム中で機能的であるものを表す。
【００５１】
本発明のレトロウイルスベクターは、遺伝子治療における内生的遺伝子を増大又は置換するための又はトランスジェニック動物を産生するためのトランスジーンを含めて、細胞への種々のポリヌクレオチドの供給に適している。アンチセンスポリヌクレオチドを用いて腫瘍遺伝子のような標的内生的遺伝子の発現を制御し得る。さらに毒素をコードする遺伝子を、癌細胞に供給するために標的化する。他の適切な配列としては、癌または感染に対する免疫反応を促すための成長物質、受容体活性を調節するための可溶性因子等をコードするものが挙げられる。当該挿入ポリヌクレオチドは、約10kb未満、好ましくは約７〜８kbである必要がある。
【００５２】
ある態様においては、相同標的構築物を用いて内生的標的遺伝子を置換する。このような構築物を調製するための方法及び材料は当業者には公知であって、種々の参考文献に記載されている（例えばThomas et al., Cell 51:503(1987)  及びCapecchi, Science 244:1288(1989)  参照）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含めるものとする）。
【００５３】
相同標的構築物は、予定内生的標的遺伝子配列（例えば、標的遺伝子のエキソン配列、エンハンサー、プロモーター、イントロン配列又はフランキング配列）と実質的に対応するか又は実質的に相補的である配列を有する少なくとも１つの領域を有する。このような相同領域は、相同対合及び実質的に同一の内生的遺伝子配列との組換えのための鋳型として役立つ。トランスジーンの標的化においては、このような相同領域は一般的には標的化内生的遺伝子配列との組換えを施される標的トランスジーンの領域である組換え領域と側面を接する。したがって相同領域と側面を接する標的トランスジーンのセグメントは、二重交差相同組換えにより内生的遺伝子配列のセグメントを置換し得る。
【００５４】
さらに相同標的化及び無作為組み込みに関する構築物は、細胞の選択を可能にする選択性マーカー遺伝子を包含する。しばしば、例えば相同遺伝子標的化のための正負選択構築物で、多数の選択性マーカー遺伝子が組み込まれる。
【００５５】
選択性マーカー遺伝子発現カセットは一般的に、標的化宿主細胞に選択性表現型を付与するタンパク質をコードする構造配列と結合する標的化宿主細胞中で操作性であるプロモーター、及びポリアデニール化シグナルを包含する。発現カセット中に含有されるプロモーターは、構成性、細胞型特異性、段階特異性及び／又は調節可能性（例えばグルココルチコイドのようなホルモンにより；ＭＭＴＶ  プロモーター）であるが、しかし選択前及び／又は選択中に発現される。
【００５６】
選択性マーカーが相同標的構築物中に含まれると、標的化内生的部位での相同性組換えが選択されて、機能性内生的プロモーターの下流に選択性マーカー構造配列を置き、そして標的構築物置換領域が選択性マーカーをコードする構造配列のみを包含し、内生的プロモーターに依って転写を駆動する。同様に、標的化内生部位近くに位置する内生的エンハンサーが力になってエンハンサーを含有しない構築物中の選択性マーカー遺伝子配列の転写を増強する。
【００５７】
適切な選択性マーカー遺伝子としては、例えば以下のものが挙げられる：ｇｐｔ（キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする）。これはミコフェノール酸を用いて選択し得る；ｎｅｏ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする）。これはＧ４１８を用いて選択し得る。及びＤＦＨＲ（ジヒドロフォレートレダクターゼをコードする）。これはメトトレキセートを用いて選択し得る。他の適切な選択性マーカーは、当業界者には明らかである。
【００５８】
正確に標的化された組換え体細胞の選択は、一般に少なくとも正の選択を用いるが、この場合、選択性マーカー遺伝子発現カセットは、選択因子（例えばＧ４１８、プロマイシン又はミコフェノール酸）の付加により、このような標的化細胞が組み込み発現カセットを有していない細胞に及ぶ成長又は生存面での利点を有するように、内生的的に組み込まれた発現カセットを保有する標的化細胞に選択性表現型を付与する機能性タンパク質（例えばｎｅｏ又はｇｐｔ）をコードし、発現する。
【００５９】
当該の無作為に組み込まれた又は相同組み換えにより組み込まれたトランスジーンを保有する細胞をさらに、当業界で十分公知の技術を用いて同定し得る。例えばサザンブロット又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて細胞をスクリーニングし得る。標的化組込みをスクリーニングする場合、オリゴヌクレオチドプローブ又はＰＣＲプライマーは、所望の相同部位でのトランスジーン組込み時に形成される組換え接合点を一括する必要がある。
【００６０】
遺伝子治療
本発明のレトロウイルスベクターは、多数の疾患の遺伝子治療のために細胞にポリヌクレオチドを供給するのに特に適している。遺伝子治療に関する最新戦法は、Friedmann, Science 244:1275(1989) （この記載内容は、参照により本明細書中に含めるものとする）で検討されている。
【００６１】
当該ポリヌクレオチドの供給は、個々の患者へのベクターの投与により、典型的には全身投与（例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は頭蓋内注入）により、in vivo で達成される。あるいは、ベクターを用いてポリヌクレオチドをex vivo に細胞、例えば個々の患者から外植された細胞( 例えば腫瘍浸潤リンパ球、骨髄吸引物、組織生検) 、あるいは普遍的ドナー造血幹細胞に供給し、その後、通常はポリヌクレオチドを組込んだ細胞の選択後に、細胞を患者に再移植し得る。
【００６２】
ベクターを遺伝子治療に用いて、先天性遺伝病、後天性遺伝病（例えば癌）、ウイルス性疾患（例えばＡＩＤＳ、単核細胞症、ヘルペスウイルス感染、サイトメガロウイルス感染、乳頭腫ウイルス感染）を治療し、あるいはあらゆる治療利益のために患者の細胞の選択型のゲノムを修飾し得る。治療可能疾患としては、血友病、地中海貧血、ＡＤＡ欠乏症、家族性高コレステロール血症、遺伝性気腫、嚢胞性繊維症、デュシェーヌ筋ジストロフィー、リソソーム貯蔵疾患、ゴシェ病及び慢性肉芽腫症が挙げられる。
【００６３】
本発明のベクターを用いて、ポリヌクレオチドを骨髄球細胞、骨髄細胞、リンパ球、肝細胞、繊維芽球、肺細胞及び筋肉細胞を含めた種々の細胞及び組織中に導入し得る。例えば化学治療薬に対する耐性を付与するポリヌクレオチドを非腫瘍性細胞、特に造血細胞に伝達し得る。あるいは毒素遺伝子（例えばリシン又はジフテリアトキシン）発現カセット又は負の選択性マーカー遺伝子発現カセットを包含するポリヌクレオチドを選択的に腫瘍細胞に挿入する。毒素遺伝子又は負の選択遺伝子の発現（その後の負の選択）は、標的細胞を選択的に殺す。細胞毒性ではないがしかし腫瘍表現型を逆転するか又は抑制する（例えば腫瘍遺伝子発現のアンチセンス阻害）ポリヌクレオチドを用いて同様に癌を治療し得る。他の用途としては、癌を治療するための骨髄細胞中への免疫修飾剤の導入が挙げられる。
【００６４】
トランスジェニック動物
上記のように、本発明のベクターは、標的ポリヌクレオチド構築物と相同染色体配列との間の相同組換えにより媒介される遺伝子標的化に特に有用である。遺伝子治療のほかに、このような戦法はトランスジェニック動物の産生に有用である。
【００６５】
新規の遺伝子を動物の胚芽株に導入する能力は、遺伝子発現の基本的理解に非常に有益である。農業用又は家畜化動物における所望の特性の改良は、これらの技術を用いて成しうる。例えば導入し得る有望な新規の特性としては、畜牛の食肉産生系統における滅菌性、又は乳牛の繁殖力及び乳産生が挙げられる。他の商業的に望ましい特性としては、家畜類における耐久力及び急速な体重増量、あるいはイヌやネコのような飼育動物の”外見的特質”が挙げられる。家畜類の遺伝子工学的処理の再検討に関しては、Pursel et al.,Science 244:1281(1989)（この記載内容は、参照により本明細書中に含めるものとする）を参照して頂きたい。
【００６６】
一般的には、胚幹（ＥＳ）細胞はトランスジーン受容体として用いられる。新規遺伝子工学的処理遺伝子を含有する細胞を宿主胚盤胞に注入し、これを雌受容体に再移植する。これらの胚のいくつかは、突然変異体細胞株に一部由来する生殖細胞を有するキメラ動物に発生する。キメラ動物を繁殖させることにより、導入遺伝子を含有する新規の株が得られる。
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００６７】
実施例１
ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ及びＧａＬＶ  ＳＦ配列を包含するＧａＬＶ感染性クローンの構築
ＧａＬＶ感染性クローンを調製するために、ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯクローンのｐｏｌ遺伝子からの約250 kbの欠損断片をＧａＬＶ  ＳＦからの対応する配列と置換した。以下の工程は、図２Ａ〜２Ｆに示した工程の番号に対応している。
【００６８】
図２Ａに示した工程は、ＧａＬＶ−ＳＥＡＴＯのｐｏｌ遺伝子の修復を示す。
１．ｐＧＡＳ−２（Gelman et al., 1982,  上記）からの約8.5kb置換ＧａＬＶ−ＳＥＡＴＯプロウイルス（ｐＧＡＳ−２  Ｈｄ１）をＨｉｎｄＩＩＩ消化及びアガロースゲル中でのＤＥＡＥ−セルロース膜遮断により単離した。ｐＧＡＳ−２の欠損ｐｏｌ断片に対応するｐＧＶ−３の約250 bpのＧａＬＶ−ＳＦｐｏｌ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩ消化及びアガロースゲル中でのＤＥＡＥ−セルロース膜遮断により単離した。
【００６９】
２．２つのＤＮＡ種を低濃度で結紮して、多量体形成中は好ましい環状化にした。
３．結紮物質を沈殿させた後、ＳａｌＩ制限を用いて構築物を線状化した。
４．構築物をＳａｌＩ制限及びホスファターゼ処理ｐＶＺ−１ベクターに結紮した。
５．ＤＨ５αＦ’細胞を形質転換した。
【００７０】
６．形質転換体をアルカリ性溶菌によりスクリーニングし、プラスミドミニｐｒｅｐｓし、及び”ＧＶＧＡＳ  10”プライマーでシーケンシングしてＧａＬＶ−ＳＥＡＴＯ配列内のＧａＬＶ−ＳＦ  ｐｏｌ断片挿入物の数及び配向を点検した。正しい構築によるクローンを中間クローン６６と名付けた。
【００７１】
図２Ｂは、ＧａＬＶ−ＳＥＡＴＯ挿入物配向の変化を示す。
【００７２】
７．置換プロウイルスクローン６６挿入物をＳａｌＩ消化及びアガロースゲルでのＤＥＡＥ−セルロース膜遮断により単離した。
８．挿入物をｐＶＺ−１  ＳａｌＩ切断及びホスファターゼ処理ベクターに再結紮し戻して、反対配向を得た。反対配向クローンを中間クローン１２０と名付けた。
図２Ｃ及び２Ｄは、中間クローン６６及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ及びＶＩＩを用いた挿入物長の一方向性減少を示す。
【００７３】
９．挿入物内距離を公知の配列及び正確な制限マッピングにより概算した。目標は、8.5 kb挿入物を5.4 kbまで低減し、ＬＴＲ−ＬＴＲ接合部のちょうど３’の点で停止させ、一方のＬＴＲは無傷のままにしておくことであった。その結果生じたクローン（ベクター＋挿入物）のサイズは〜６kbであった。
１０．クローン６６及びクローン１２０のＮｏｔＩ制限を用いて挿入物内部位の非存在を調べた。それらは存在しないことが認められた。クローン６６を多数クローニング部位でＮｏｔＩを用いて線状化した。
【００７４】
１１．ＮｏｔＩ末端を冷ｄＣＴＰ〔αＳ〕及びｄＧＴＰ〔αＳ〕及びＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）で充填した。α−チオデオッキシリボヌクレオチドを用いてこれらの末端をエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化から遮断した。
【００７５】
１２．クローン６６及びクローン１２０をＸｂａＩで制限して挿入物内部位の非存在に関して調べた。クローン６６を多クローニング部位でＸｂａＩで制限して、５’張出付着末端を生じた。
１３．正確に時間を計ったエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化はＸｂａＩ部位を破壊したがしかし５’挿入物末端のＳａｌＩ部位は無傷のままで、不完全ＮｏｔＩ部位はエキソヌクレアーゼＩＩＩの襲撃を耐容した。
【００７６】
１４．エキソヌクレアーゼＩＩＩによる消化を用いて残りの一本鎖を除去した。
１５．”ギザギザ端”をＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ）及び冷デオキシヌクレオチドトリホスフェートで充填した。
１６．盲端化不完全ＮｏｔＩ部位を挿入配列とけっさつした。
１７．ＤＨ５αＦ’細胞を形質転換した。
【００７７】
１８．形質転換体をアルカリ性溶菌によりスクリーニングし、プラスミドミニｐｒｅｐｓ処理し、ＳａｌＩ線状化し、シーケンシングして、（ａ）挿入物欠失の程度、並びに（ｂ）不完全ＮｏｔＩ部位の性質及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ又はＶＩＩによるベクターへの消化からα−チオデオキシリボヌクレオチドにより示される保護の真の程度を調べた。
【００７８】
１９．形質転換体をさらにＮｏｔＩ消化によりスクリーニングし、完全ＮｏｔＩ部位に関して調べた。
２０．ＮｏｔＩにより線状化するクローンを線状化して完全ＮｏｔＩ部位の存在を確証し、挿入物欠失の程度を正確に調べた。ＬＴＲ−ＬＴＲ接合部の丁度３’の点に所望の消化を有し、完全ＮｏｔＩ部位を有するあるクローンを中間６６Ｅｘｏ５２と名付けた。
図２Ｅは中間クローン１２０を示す：エキソヌクレアーゼＩＩＩ及びＶＩＩを用いた挿入物長の一方向性低減。
【００７９】
２１．挿入物内距離を公知の配列及び正確な制限マッピングにより概算した。目標は、8.5 kb挿入物を2.6 kbまで低減し、ＬＴＲ−ＬＴＲ接合部のちょうど３’の点で停止させ、一方のＬＴＲは無傷のままにしておくことであった。その結果生じたクローン（ベクター＋挿入物）のサイズは〜９kbであった。
【００８０】
２２〜３２．工程１０〜２０に関して記載したように本工程を実行した。ＬＴＲ−ＬＴＲ接合部の丁度３’の点に所望の消化を有し、完全ＮｏｔＩ部位を有するあるクローンを中間１２０Ｅｘｏ５５と名付けた。
図２Ｆはクローン６６Ｅｘｏ５２挿入物とクローン１２０Ｅｘｏ５５挿入物の結合を示す：ＬＴＲｓの分離及び感染性クローンの生成。
【００８１】
３３．ＳａｌＩ及びＮｏｔＩによるクローン６６Ｅｘｏ５２とクローン１２０Ｅｘｏ５５との二重消化を用いて、挿入物を放出した。
３４．挿入物をアガロースゲル中でのＤＥＡＥセルロース膜遮断により単離した。
【００８２】
３５．クローン６６Ｅｘｏ５２挿入物とクローン１２０Ｅｘｏ５５挿入物及びＮｏｔＩ制限化ｐＶＺ−ベクターとの結紮。
３６．ＤＨ５αＦ’細胞を形質転換した。
３７．コロニーの32Ｐ標識化プロービングにより形質転換体をスクリーニングし、アルカリ性溶菌プラスミドミニｐｒｅｐｓ処理して、制限分析し、シーケンシングして正しい配向を有する有望な感染性クローンを探した。
【００８３】
３８．ＧａＬＶ−ＳＥＡＴＯ感染性クローンの大規模プラスミド調製及び制限マッピング。
その結果生じたクローン化ＧａＬＶゲノムはその後感染性ＧａＬＶビリオンをコードすることが示された。
【００８４】
実施例２
ＧａＬＶ  ＳＦ及びＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯパッケージング部位を包含する欠陥ゲノムの構築
実施例１の感染性クローンからのＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ配列を包含する欠陥ゲノムを調製するために用いた工程を以下に示す。
１．ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯの感染性クローンの５’末端からの１６６７bp  ＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片を単離した。
２．Ｌａｃ  Ｚ遺伝子に対応する３１１６bpのＢａｍＨＩ−  ＸｂａＩ断片をｐ１２０３  Ｌａｃ  Ｚプラスミド（Ghattas et al., 上記）から単離した。
３．ＥＣＭＶ  ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ内部リボソーム侵入部位）に対応する５９６  bpのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＬＺＩＣ２（Ghattas et al., 上記）から単離した。
【００８５】
４．Ｇ４１８耐性遺伝子に対応する８９０bp  ＳｔｕＩ−ＳｆｕＩ断片をｐＲｃＣＭＶプラスミド（Invitrogen）から単離した。
５．ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ感染性クローンの３’末端に対応する９９５bp  ＳｔｕＩ−ＮｏｔＩ断片を単離した。
６．線状化ＮｏｔＩ  ｐＧｅｍ１３プラスミド（Promega, 318 bp ）を単離した。
【００８６】
７．これらの断片を一緒に結紮してｐＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ  ３９５プラスミドを組み立てた。
図３（上）はその結果生じた欠陥ゲノムを示す。図３（中）は、同一方法で構築されたがしかしＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯゲノムの５’末端からのＮｏｔＩ−ＮｃｏＩ断片を用いた欠陥ゲノムを示す。図３（下）は、ＧａＬＶ  ＳＦ配列から調製された構築物を示す。
ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ  ５５８構築物を作る際に３２８bpまで５’推定パッケージング領域の長さを増大して、ｐＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ３９５プラスミドをさらに修飾した。プラスミド  ５５８は、ＧａＬＶゲノムの位置１２９０でＢｇｌＩＩ部位に延びた５’ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ配列の付加的３２８ヌクレオチドを含有する修飾３９５プラスミドを示す（プラスミド３９５は、ＧａＬＶゲノムの位置９１０でＮｃｏＩ部位にのみ延びる）。５５８プラスミド構築は、１９４ＧａＬＶ  ＳＦプラスミドを用いて行った。ＧａＬＶ  ＳＦ１９４プラスミドは、ＥｃｏＲＩ部位でPromega ｐＳＰ７２ゲノム中にクローン化された平頭化ＧａＬＶＳＦゲノムを含有する。
５５８プラスミドの構築における工程を以下に示す。
【００８７】
１．５’ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ  ＬＴＲ及びＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ  パッケージング部位を含有するＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯのＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片を用いて、ＧａＬＶ  ＳＦ１９４プラスミド部分ゲノムの対応する領域を置換した。
【００８８】
２．細菌ＬａｃＺ遺伝子を含有するがしかし開始コドンを欠くBarn  ＨＩ−ＸｂａＩ断片を読み取り枠内で、ＬａｃＺ遺伝子がＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ  ｇａｇタンパク質翻訳開始コドンから始まるように、ＢｇｌＩＩ部位と結紮した。したがってβガラクトシダーゼタンパク質はＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ  ｇａｇ−ＬａｃＺ融合タンパク質である。
【００８９】
３．ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ及びＧ４１８遺伝子を含有するＸｂａＩ−ＮｓｉＩ断片を、ＬａｃＺ遺伝子の下流のＸｂａＩ部位及びＧａＬＶ  ＳＦ１９４ゲノムの３’領域のＮｓｉＩに結紮した。
４．１９４ＧａＬＶ  ＳＦゲノムの３’末端のＮｓｉＩ−ＳｍａＩ領域をＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯの対応する領域と置換して、ＬＴＲの３’Ｕ３がＧａＬＶ  ＳＦ１９４配列の代わりにＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ由来配列を含有するようにした。
プラスミド３９５及び５５８の略図を図４で比較し、プラスミド５５８のヌクレオチド配列を配列番号３に示した。
【００９０】
実施例３
ＭｏＭＬＶ構造タンパク質を発現するネズミパッケージング細胞中でのパッケージング効率の改良を伴うＧａＬＶ欠陥ゲノムの構築
ＰＧ１３及びＰＡ３１７のようなＭｏＭＬＶ構造タンパク質を発現するネズミパッケージング細胞株におけるパッケージングの効率を改良するために、５’末端にＭｏＭＬＶプローブを、３’末端にＧａＬＶプロモーターを有するＧａＬＶゲノムを構築した。
【００９１】
プラスミド５２１及びプラスミド５３７と呼ばれる、欠陥５’末端にＭｏＭＬＶプローブを、３’末端にＧａＬＶプロモーターを有する２つの欠陥ゲノムを構築した。プラスミド５２１を構築するために、３９５プラスミド（SfiI/ ClaIに充填）を同様のＭｏＭＬＶベースのＬａｃＺゲノム（Sst II/ ClaIに充填）の対応する断片と置換した。プラスミド５３７を構築するために、５２１の３’ＮｓｉＩ−ＮｏｔＩ（充填）断片をＧａＬＶ  ＳＦ１９４のＮｓｉＩ−ＢｇｌＩＩ（充填）断片で置換した。
【００９２】
比較のために、ｐＬＸＳＮ（ＭｏＭＬＶパッケージング領域の末端、Ｓ部位４０プロモーター及びＧ４１８遺伝子の５’部分を含有する）のＳｐｅＩ−ＳｐｈＩ断片を５２１ゲノムの対応する領域（同じくＳｐｅＩ−ＳｐｈＩ断片）と置換して、５２１プラスミドの構築と同様にＭｏＭＬＶ欠陥ゲノムプラスミドを調製し、それによりＳＶ４０をＩＲＥＳ要素と置換した。この欠陥ゲノムをプラスミド５６０と呼ぶ。プラスミド５２１、５３７及び５６０を図４及び５に図示する。プラスミド５２１のヌクレオチド配列を配列番号４に示し、プラスミド５３７のヌクレオチド配列を配列番号５に示す。
【００９３】
５２１及び５３７プラスミド構築物は、パッケージング細胞における遺伝子発現を最適化し、一方ＧａＬＶプロモーターがＭｏＭＬＶプロモーターより有効に機能する標的細胞におけるＧａＬＶ駆動遺伝子発現はそのままにする手段を提供する。５２１及び５３７構築物は５’末端にＭｏＭＬＶプロモーターを有するため、これらの構築物にトランスフェクトされた細胞（例えばパッケージング細胞ＰＡ３１７及びＰＧ１３）は、ＭｏＭＬＶプロモーター（Ｕ３）駆動遺伝子転写を有する。他方、標的細胞の感染後にゲノムが逆転写去れた場合には、３’ＬＴＲのＧａＬＶ  Ｕ３プロモーターは重複し、５’末端でＭｏＭＬＶプロモーターを置換する。これは、５２１標的細胞からの未組込みベクターＤＮＡの配列分析により立証去れている（データは示していない）。ＰＧ１３又はＰＡ３１７細胞でのパッケージングごんに５２１構築物に感染されたこれらの細胞からのＤＮＡは、５’及び３’ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ  Ｕ３を含有する（データは示していない）。したがって５２１ゲノムの５’末端は感染細胞中でＭｏＭＬＶ  Ｕ３からＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯ  Ｕ３に切り代わり、これが標的細胞におけるＧａＬＶ駆動遺伝子発現を引き起こす。
【００９４】
実施例４
標的細胞における遺伝子発現の効率に及ぼすＧａＬＶ  ＬＴＲのＵ３領域における45 bp エンハンサー要素の数の作用
ＧａＬＶ  ＬＴＲのＵ３領域には種々の数の反復45  bpエンハンサー要素がある。ＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯに由来する５５８プラスミド及び５２１プラスミドＵ３領域は各々、３つの反復45bpエンハンサー要素を含有し、一方ＧａＬＶ  ＳＦ（例えばプラスミド５３７及び５５９）はこれらの要素を１つだけ有する。反復数は、異なる標的細胞における下流遺伝子の発現を支配する際に、限定的なしかし恐らくは有用な役割を演じるものと思われる。下記の実験データは、ＧａＬＶのＬＴＲのＵ３領域の反復45bpエンハンサー要素の数が組織／細胞特異的遺伝子発現の効率に作用し得ることを示唆する。
【００９５】
５２１、５３７又は５６０プラスミドのＰＡ３１７又はＰＧ１３細胞株へのトランスフェクション後に、ＭｏＭＬＶプロモーターを用いてパッケージング可能なゲノムを発現させる。しかしながら５２１及び５３７プラスミドに関しては、ＧａＬＶプロモーターを用いて、パッケージング化欠陥ゲノムで感染させた後に、βガラクトシダーゼ及びＧ４１８耐性を標的細胞中で発現させる。45塩基対エンハンサー領域の３つの反復対ＧａＬＶプロモーターのエンハンサー領域の１つだけのコピーの作用を、下表に示す。Ｇ４１８インジケーター遺伝子の発現は、Ｇ４１８耐性コロニーを滴定して測定する。下表のデータは、異なる細胞型のＧａＬＶ  ＬＴＲにより駆動される遺伝子の発現に及ぼす45bpエンハンサー領域反復の数の変化の作用を立証する（表参照）。
【００９６】
表：  種々の標的細胞におけるレトロウイルスベクターに指示される遺伝子発現の効率
ゲノム                     537         558         560
パッケージング細胞：       PGI3        PGI3        PGI3
使用したプロモーター       GaLV SF     GaLV SEATO  MoMLV
標的細胞：                 2×102      5×104      5.0
ミンク繊維芽球             5×104      5.0         5×104 
ネズミNIH 3T3 細胞          −       0.5×10        −
BHK ハムスター細胞          −       0.5×102       −
HaK ハムスター細胞         5×103      5×104      5×102 
ウシMDBK細胞                −*         −*         −* 
ヒト KB 細胞               5×104      5×102      5×10
ヒトHeLA細胞               5×104      5×102      5×102 
ヒト293 細胞               5×10       5×102      5×104 
5×103*     5×10*      5×103*
【００９７】
#  537、558P又は560 ゲノムを有するレトロウイルスベクターを含有する PG13 又はPA317 上清  1 mlを用いて得られたG418耐性コロニーの数として表した力価。
【００９８】
*  PA317  細胞中にパッケージングされたゲノム。
本発明を明らかにし理解するために図及び実施例により説明してきたが、添付の請求の範囲を逸脱しない限りは、変更及び修正が成されることは明らかである。
【表１】
2004147659.tif 000002
【表２】
2004147659.tif 000003
【表３】
2004147659.tif 000004
【表４】
2004147659.tif 000005
【表５】
2004147659.tif 000006
【表６】
2004147659.tif 000007
【表７】
2004147659.tif 000008
【表８】
2004147659.tif 000009
【表９】
2004147659.tif 000010
【表１０】
2004147659.tif 000011
【表１１】
2004147659.tif 000012
【表１２】
2004147659.tif 000013
【表１３】
2004147659.tif 000014
【表１４】
2004147659.tif 000015
【表１５】
2004147659.tif 000016
【表１６】
2004147659.tif 000017
【表１７】
2004147659.tif 000018
【表１８】
2004147659.tif 000019
【表１９】
2004147659.tif 000020
【表２０】
2004147659.tif 000021
【表２１】
2004147659.tif 000022
【表２２】
2004147659.tif 000023
【表２３】
2004147659.tif 000024
【表２４】
2004147659.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１−１】図１は、Delassus et al., (1989) Virol. 173:205-213  に発表されたようなＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯゲノムの完全配列を示す。
【図１−２】図１は、Delassus et al., (1989) Virol. 173:205-213  に発表されたようなＧａＬＶ  ＳＥＡＴＯゲノムの完全配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｆは、本発明の感染性ＧａＬＶクローンの構築を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｆは、本発明の感染性ＧａＬＶクローンの構築を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｆは、本発明の感染性ＧａＬＶクローンの構築を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ−２Ｆは、本発明の感染性ＧａＬＶクローンの構築を示す。
【図２Ｅ】図２Ａ−２Ｆは、本発明の感染性ＧａＬＶクローンの構築を示す。
【図２Ｆ】図２Ａ−２Ｆは、本発明の感染性ＧａＬＶクローンの構築を示す。
【図３】図３は、本発明のパッケージング欠陥ゲノムを示す。
【図４】図４は、プラスミド３９５、５５８及び５２１の略図を示す。
【図５】図５は、プラスミド３９５、５５９及び５３７の略図を示す。
【図１−１】
2004147659.tif 000026
【図１−２】
2004147659.tif 000027
【図２Ａ】
2004147659.tif 000028
【図２Ｂ】
2004147659.tif 000029
【図２Ｃ】
2004147659.tif 000030
【図２Ｄ】
2004147659.tif 000031
【図２Ｅ】
2004147659.tif 000032
【図２Ｆ】
2004147659.tif 000033
【図３】
2004147659.tif 000034
【図４】
2004147659.tif 000035
【図５】
2004147659.tif 000036