(57)【要約】      （修正有）【課題】  頭頚部癌などの癌におけるＳＥＲＥＸ法を用いた抗原特異性免疫療法に必要な抗原、抗体、細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。【解決手段】  下記（Ａ）又は（Ｂ）の何れかの蛋白質とこれらをエピトープとする抗体、キラーＴ細胞、癌ワクチン、ガン診断用プローブ、ガン診断薬、および癌の予防治療薬。（Ａ）特定のアミノ酸配列を有する蛋白質。（Ｂ）特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、免疫誘導活性を有する蛋白質。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）の何れかの蛋白質。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、免疫誘導活性を有する蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質の一部からなり、かつ免疫誘導活性を有するペプチド。
【請求項３】
癌抗原蛋白質を認識する細胞障害性Ｔ細胞を活性化しうる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
下記式（１）〜（８）の何れかに記載のアミノ酸配列を有する、請求項２又は３に記載のペプチド。
Val-Phe-Gly-Thr-Arg-Ile-Glu-Lys-Asp-Leu（１）
Lys-Phe-Glu-Asn-Ser-Ile-Ser-Arg-Leu    （２）
Glu-Tyr-Leu-Ser-Leu-Ser-Asp-Lys-Ile    （３）
Tyr-Phe-Lys-Val-Lys-Asp-Arg-Thr-Leu    （４）
Asn-Tyr-Asn-Asn-Phe-Tyr-Arg-Phe-Leu    （５）
Ile-Tyr-Lys-Asn-Ser-Leu-Ser-Glu-Ile    （６）
Thr-Tyr-Ile-Ser-Arg-Arg-Glu-Lys-Phe    （７）
Glu-Tyr-Ser-Lys-Glu-Cys-Leu-Lys-Glu-Phe（８）
【請求項５】
請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、免疫誘導活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡの部分配列を有し、かつ、免疫誘導活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項1記載の蛋白質又は請求項２から４の何れかに記載のペプチドに対する抗体。
【請求項８】
請求項1記載の蛋白質又は請求項２から４の何れかに記載のペプチドを用いてインビトロ刺激により誘導された細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項９】
請求項1記載の蛋白質又は請求項２から４の何れかに記載のペプチドを含む癌ワクチン。
【請求項１０】
アジュバンドをさらに含む請求項９に記載の癌ワクチン。
【請求項１１】
請求項５又は６に記載のＤＮＡ、又は該ＤＮＡを含む組換えウイルス若しくは組換え細菌を含む、癌ワクチン。
【請求項１２】
アジュバンドをさらに含む請求項１１に記載の癌ワクチン。
【請求項１３】
請求項５又は６に記載のＤＮＡ又は請求項１に記載の蛋白質又はその部分ペプチドを含む、癌診断用プローブ。
【請求項１４】
請求項１３に記載の癌診断用プローブ、及び／又は請求項７に記載の抗体、及び／又は請求項１に記載の蛋白質又はその部分ペプチドを含む、癌診断薬。
【請求項１５】
請求項1に記載の蛋白質、請求項２から４の何れかに記載のペプチド、請求項７に記載の抗体、及び／又は請求項８に記載の細胞傷害性Ｔ細胞を含む、癌の予防・治療薬。
【請求項１６】
癌マーカーとして請求項１に記載の蛋白質又はその部分ペプチドを使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト癌に特異的な蛋白質、その部分ペプチド、それらをコードするＤＮＡ、上記蛋白質をエピトープとする抗体、キラーＴ細胞、癌ワクチン、癌診断用プローブ、癌診断薬および癌の予防・治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト頭頚部癌は全癌患者の１割弱を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にもかかわらす、ヒト頭頚部癌は５年生存率が３０年前からほとんど変わっていない現在まであまり治療成績の向上が見られない悪性腫瘍の一つとして知られている。
【０００３】
近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応するキラーT細胞により認識される癌抗原や抗原となりうる蛋白をコードする遺伝子が数多く同定されていて、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている。免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチドまたは蛋白は、正常細胞には存在せず、癌細胞のみに特異的に存在していることが必要とされる。
【０００４】
一方、癌患者が自己の癌に反応して産生する抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する方法、SEREX(serological identification of antigens by recombinant expression cloning)が1995年にPfreundschuhらにより、確立された。SEREX法は、腫瘍抗原の同定を加速的に進展させており、すでにSEREX法により同定された約1700もの腫瘍抗原の候補がデータベース化されている。さらにその一部をターゲットにして抗腫瘍免疫療法の臨床試験も開始されている。本発明者らもこのＳＥＲＥＸ法を用いて、いくつかの癌に特異的な抗原、およびそれをコードする遺伝子を同定している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記研究を更に進めた結果到達したものであり、頭頚部癌などの癌におけるＳＥＲＥＸ法を用いた抗原特異性免疫療法に必要な抗原、抗体、細胞傷害性Ｔ細胞を提供することを目的としている。より具体的には、本発明は、正常細胞になく癌細胞に特異的に存在し、かつ細胞傷害性Ｔ細胞が抗原として認識しうる蛋白、またはペプチド、これらを抗原として認識する抗体、及び細胞傷害性Ｔ細胞を提供することを目的としている。本発明はまた、上記抗原または細胞傷害性Ｔ細胞を用いた有効な抗原特異性免疫療法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
即ち、本発明によれば、下記（Ａ）又は（Ｂ）の何れかの蛋白質が提供される。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、免疫誘導活性を有する蛋白質。
【０００７】
本発明の別の側面によれば、上記の本発明の蛋白質の一部からなり、かつ免疫誘導活性を有するペプチドが提供される。
本発明のペプチドは、好ましくは、癌抗原蛋白質を認識する細胞障害性Ｔ細胞を活性化しうるペプチドである。
【０００８】
本発明の別の側面によれば、下記式（１）〜（８）の何れかに記載のアミノ酸配列を有するペプチドが提供される。
Val-Phe-Gly-Thr-Arg-Ile-Glu-Lys-Asp-Leu（１）
Lys-Phe-Glu-Asn-Ser-Ile-Ser-Arg-Leu    （２）
Glu-Tyr-Leu-Ser-Leu-Ser-Asp-Lys-Ile    （３）
Tyr-Phe-Lys-Val-Lys-Asp-Arg-Thr-Leu    （４）
Asn-Tyr-Asn-Asn-Phe-Tyr-Arg-Phe-Leu    （５）
Ile-Tyr-Lys-Asn-Ser-Leu-Ser-Glu-Ile    （６）
Thr-Tyr-Ile-Ser-Arg-Arg-Glu-Lys-Phe    （７）
Glu-Tyr-Ser-Lys-Glu-Cys-Leu-Lys-Glu-Phe（８）
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
【０００９】
本発明のさらに別の側面によれば、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、免疫誘導活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡの部分配列を有し、かつ、免疫誘導活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質又はペプチドに対する抗体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質又はペプチドを用いてインビトロ刺激により誘導された細胞傷害性Ｔ細胞が提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質又はペプチドを含む癌ワクチンが提供される。本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡ、又は該ＤＮＡを含む組換えウイルス若しくは組換え細菌を含む、癌ワクチンが提供される。本発明の癌ワクチンは、好ましくはアジュバンドをさらに含む。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡ又は本発明の蛋白質又はその部分ペプチドを含む、癌診断用プローブが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の癌診断用プローブ、及び／又は本発明の抗体、及び／又は本発明の蛋白質又はその部分ペプチドを含む、癌診断薬が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質、ペプチド、抗体、及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞を含む、癌の予防・治療薬が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、癌マーカーとして本発明の蛋白質又はその部分ペプチドを使用する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の抗原は癌細胞と精巣細胞にのみ特異的に現れる。従って，本発明の抗原ペプチド、あるいは本発明の蛋白またはペプチドをコードするDNAは自己傷害性等の副作用が少なく優れた抗癌ワクチンとして使用することが出来る。また本発明の抗原により刺激、活性化されたキラーT細胞は抗癌剤として使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳しく説明する。
（１）本発明の蛋白質及びペプチド
本発明の頭頚部癌に関連する蛋白質は、下記（Ａ）又は（Ｂ）の何れかの蛋白質である。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質（以下「ＫＭ−ＨＮ−１」とも言う）。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、免疫誘導活性を有する蛋白質。
【００１５】
本明細書で言う免疫誘導活性を有する蛋白質とは、抗体産生、細胞性免疫等の免疫反応を誘導する活性を有する蛋白質を言うが、なかでも、細胞傷害性Ｔ細胞（キラーＴ細胞／ＣＴＬ）を刺激するＴ細胞誘導活性を有する蛋白質が特に好ましい。
【００１６】
上記した「配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列」における「１若しくは数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００１７】
本発明の蛋白質の入手・製造方法は特に限定されず、天然由来の蛋白質でも、化学合成した蛋白質でも、遺伝子組み換え技術により作製した組み換え蛋白質の何れでもよい。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、組み換え蛋白質が好ましい。
【００１８】
天然由来の蛋白質を入手する場合には、該蛋白質を発現している細胞又は組織から蛋白質の単離・精製方法を適宜組み合わせて単離することができる。化学合成蛋白質を入手する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明の蛋白質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明の蛋白質を合成することもできる。
【００１９】
本発明の蛋白質を組み換え蛋白質として産生するには、該蛋白質をコードする塩基配列（例えば、配列番号２に記載の塩基配列）を有するＤＮＡ又はその変異体又は相同体を入手し、これを好適な発現系に導入することにより本発明の蛋白質を製造することができる。
【００２０】
発現ベクターとしては、好ましくは宿主細胞において自立複製可能であるか、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものであればよく、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーターを含有しているものが使用される。また、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を有する形質転換体は、上記の発現ベクターを宿主に導入することにより作製することができる。宿主は、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞のいずれでもよく、また宿主への発現ベクターの導入は、各宿主に応じた公知の手法により行えばよい。
【００２１】
本発明においては、上記のようにして作製した本発明の遺伝子を有する形質転換体を培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より本発明の蛋白質を採取することにより組み換え蛋白質を単離することができる。
【００２２】
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。また培養条件も該微生物を培養するのに通常用いられる条件にて行えばよい。培養後、形質転換体の培養物から本発明の蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
【００２３】
なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有する蛋白質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の一例示す配列番号２に記載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造又は入手することができる。
【００２４】
即ち、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする塩基配列を有する遺伝子（変異遺伝子）は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。具体的には、配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。
【００２５】
例えば、配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２６】
本発明はさらに、上記した本発明の蛋白質の一部からなり、かつ免疫誘導活性を有するペプチドにも関する。本発明のペプチドは、癌抗原蛋白質を認識する細胞障害性Ｔ細胞を活性化しうるものが好ましい。このようなペプチドの具体例としては、下記の何れかのアミノ酸配列を有するものが挙げられ、この８種のペプチドにおいてＨＬＡ−Ａ２４拘束性の癌細胞傷害活性が認められた。
Val-Phe-Gly-Thr-Arg-Ile-Glu-Lys-Asp-Leu（１）
Lys-Phe-Glu-Asn-Ser-Ile-Ser-Arg-Leu    （２）
Glu-Tyr-Leu-Ser-Leu-Ser-Asp-Lys-Ile    （３）
Tyr-Phe-Lys-Val-Lys-Asp-Arg-Thr-Leu    （４）
Asn-Tyr-Asn-Asn-Phe-Tyr-Arg-Phe-Leu    （５）
Ile-Tyr-Lys-Asn-Ser-Leu-Ser-Glu-Ile    （６）
Thr-Tyr-Ile-Ser-Arg-Arg-Glu-Lys-Phe    （７）
Glu-Tyr-Ser-Lys-Glu-Cys-Leu-Lys-Glu-Phe（８）
【００２７】
本発明のペプチドは、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のペプチドを合成することもできる。
【００２８】
（２）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記（１）に記載した本発明の蛋白質をコードするＤＮＡであり、好ましくは、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかのＤＮＡである。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、免疫誘導活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡの部分配列を有し、かつ、免疫誘導活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００２９】
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３０】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００３１】
本発明のＤＮＡの取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１および配列番号２に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてヒトなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。
【００３２】
ＰＣＲ法により配列番号２に記載した塩基配列を有するＤＮＡを取得することもできる。ヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号２に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたDNA断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００３３】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。
【００３４】
(３)本発明の抗体及び細胞障害性細胞
本発明は、上記した本発明の蛋白質またはペプチドの一部もしくは全部をエピトープ（抗原）として認識する抗体、並びに該蛋白質又はペプチドを用いてインビトロ刺激により誘導された細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞（ＣＴＬ）にも関する。一般的には、ＣＴＬのほうが抗体よりも強い抗腫瘍活性を示す。
【００３５】
本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、その作製は定法により行なうことができる。
【００３６】
例えば、ポリクローナル抗体は、本発明の蛋白質を抗原として哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物を免疫することができる。免疫感作の方法は当業者に公知であり、例えば抗原を、例えば７〜３０日間隔で２〜３回投与すればよい。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５〜２ｍｇ程度とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができる。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント又は水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができる。
【００３７】
免疫感作した哺乳動物を一定期間飼育した後、抗体価が上昇してきたら、例えば１００μｇ〜１０００μｇの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物から血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム又はポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の常法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、本発明の蛋白質を認識するポリクローナル抗体を得ることができる。
【００３８】
一方、モノクローナル抗体はハイブリドーマを調製して得ることができる。例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマを得ることができる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。
【００３９】
抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用する。抗原としては、本発明の蛋白質又はその部分ペプチドを使用する。免疫動物としてはマウス、ラット等を使用でき、これらの動物への抗原の投与は常法により行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原である本発明の蛋白質との懸濁液もしくは乳化液を動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とを公知の方法（G.Kohler et al .,Nature,256 495(1975)）により融合してハイブリドーマを作製することができる。
【００４０】
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選択にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用する。細胞融合により得られるハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングする。さらに必要に応じて、本発明の蛋白質を用いた酵素免疫測定法によりスクリーニングを行うことにより、本発明の蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。
【００４１】
このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。
【００４２】
また、上記した抗体の断片も本発明の範囲内である。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。
【００４３】
さらに、上記した抗体の標識抗体も本発明の範囲内である。即ち、上記のようにして作製した本発明の抗体は標識して使用することができる。抗体の標識の種類及び標識方法は当業者に公知である。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどの酵素標識、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）又はＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート）等の蛍光標識、コロイド金属および着色ラテックスなどの呈色物質による標識、ビオチンなどのアフィニティー標識、あるいは125Ｉなどの同位体標識などを挙げることができる。本発明の標識抗体を用いた本発明の蛋白質（即ち、癌抗原）の分析又は測定は、酵素抗体法、免疫組織染色法、免疫ブロット法、直接蛍光抗体法又は間接蛍光抗体法等の当業者に周知の方法に従って行うことができる。
【００４４】
本発明はまた、本発明の蛋白質又はペプチドを用いたインビトロ刺激により誘導された活性化Ｔ細胞に関する。例えば、末梢血リンパ球や腫瘍浸潤リンパ球を本発明の蛋白質又はペプチドでインビトロ刺激すると腫瘍反応性活性化Ｔ細胞が誘導され、この活性化されたＴ細胞は養子免疫療法に有効に用いることができる。また本発明の蛋白質又はペプチドを強力な抗原提示細胞である樹状細胞にインビボあるいはインビトロで発現させて、その抗原発現樹状細胞投与により免疫誘導を行うことができる。
【００４５】
（４）本発明の癌ワクチン
本発明のＤＮＡ、蛋白質及びペプチドは、癌細胞特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができるので、癌の治療、予防剤として期待できる。例えば、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、この組換えＤＮＡで形質転換されたBCG菌の細菌、または本発明のＤＮＡをゲノムに組み込まれたワクシニアウイルス等のウイルスは、ヒト癌の治療・予防用生ワクチンとして有効に利用できる。なお、癌ワクチンの投与量及び投与法は通常の種痘やＢＣＧワクチンと同様である。
【００４６】
即ち、本発明のＤＮＡ（そのまま、あるいは発現ベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡの形）、該ＤＮＡを含む組換えウイルス若しくは組換え細菌はそのままあるいはアジュバントに分散した状態で癌ワクチンとしてヒトを含む哺乳動物に投与することができる。本発明のペプチドも同様にアジュバンドと分散した状態で癌ワクチンとして投与することができる。
【００４７】
本発明で用いることができるアジュバントとしては、フロイントの不完全アジュバント、ＢＣＧ、トレハロースダイマイコレート（ＴＤＭ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ミョウバンアジュバント、シリカアジュバント等が挙げられるが、抗体の誘導能等の関係から、フロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）を使用することが好ましい。
【００４８】
（５）本発明の癌診断用プローブ、癌診断薬、癌の予防・治療薬
本発明のＤＮＡは各種ヒト癌のＤＮＡを取り出してその相同性を調べることで診断用プローブとして使用することができる。また、このプローブや前記抗体を使用して癌診断薬として使用することができる。また、本発明の蛋白質又はその部分ペプチドは、それを用いて癌患者血清中の抗体価を調べることにより癌診断薬として使用することができる。本発明の蛋白質の部分ペプチドとしては、本発明の蛋白質であるＫＭ−ＨＮ−１に特異的なＩｇＧ抗体を検出できるペプチドであれば任意のペプチドを使用することができ、例えば、  配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列（ＫＭ−ＨＮ−１）の３７−５２４のアミノ酸配列を有するペプチドなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４９】
即ち、本発明は、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部を含む癌診断用プローブに関する。さらに本発明は、上記の癌診断用プローブ又は本発明の蛋白質に対する抗体を含む、癌診断薬に関する。本発明の癌診断用プローブとしては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃＲＮＡ）のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものが好ましい。例えば、上記アンチセンス鎖を用いて検体から得られた本発明の蛋白質（癌抗原）のｍＲＮＡを検出することにより、癌の診断が可能となる。検出に用いられる検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるゲノムＤＮＡや、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。かかる検体を使用する場合、ＰＣＲ等により増幅したものを用いてもよい。あるいは、本発明の蛋白質又はその部分ペプチドを合成し、それを用いてELISA法などにより癌患者血清中の抗体価を調べることにより癌の診断を行うことも可能である。
【００５０】
現在まで多数の腫瘍関連抗原が同定されており、それらはいくつかに分類されている。その１つにcancer/testis抗原として分類されている抗原がある。この抗原は正常細胞では精巣でのみ発現する。本発明の抗原はcancer/testis抗原の１つである。
【００５１】
本明細書で言う癌の種類は特に限定されず、具体例としては、頭頚部癌、脳腫瘍、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、腎臓癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、精巣癌、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。対象となる癌の特に好ましい例は、頭頚部癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、胆管癌、乳癌、舌癌、甲状腺癌、胃癌、肺癌、および膵臓癌である。
【００５２】
本発明の蛋白質又はペプチドは、Ｔ細胞エピトープとして癌細胞特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができるので、ヒト癌の予防・治療剤として有用である。また、本発明の抗体も、癌抗原である本発明の蛋白質の活性を阻害することができるものであれば、ヒト癌の予防・治療剤として有用である。実際の使用法としては、本発明の蛋白質、ペプチド又は抗体をそのまま、又は医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤ととともに、必要に応じて下記の補助剤も加えて、注射剤として投与することもできるし、噴霧などの方法で粘膜からの経皮吸収などで投与してもよい。尚、ここで言う担体とは例えば、ヒト血清アルブミンであり、また希釈剤としては、例えばＰＢＳ、蒸留水等を挙げることができる。
【００５３】
投与量は成人１人当たり、本発明の蛋白質、ペプチド又は抗体を例えば、１回当たり0.01mg〜100mgの範囲になるように投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。製剤の形態も特に限定されず、凍結乾燥したものや、糖などの賦形剤を加えて顆粒にしたものでもよい。
【００５４】
本発明の薬剤に添加することができる細胞障害性Ｔ細胞誘導活性を高めるための補助剤としては、ＢＣＧ菌などの菌体成分、Nature, vol. 344, p873 (1990)に記載されるISCOM、J.Immunol. vol. 148, p1438(1992)に記載されるサポニン系のQS-21、リポソーム、水酸化アルミニウムなどが挙げられる。また、レンチナン、シゾフィラン、ピシバーニールなどの免疫賦活剤を補助剤として用いることもできる。また、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦなどのＴ細胞の増殖、分化を増強するサイトカイン等も補助剤として用いることができる。
【００５５】
また、患者から採取した細胞または、同一のHLAパプロタイプを持つ細胞に試験管内で当該抗原ペプチドを加え、抗原提示させた後、患者血管内に投与し、患者体内で効果的に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することもできる。また、患者末梢血リンパ球に当該ペプチドを加えて試験管内で培養することにより試験管内で細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した後に患者血管内に戻すこともできる。このような細胞移入による治療は既に癌治療法として実施されており、当業者間ではよく知られた方法である。
【００５６】
特異的抗腫瘍免疫療法の標的抗原となるものは、その抗原が細胞傷害性Ｔ細胞（キラーＴ細胞／ＣＴＬ）の認識抗原であることが必要である。本発明の抗原は日本人に多いＨＬＡ−Ａ２４において、インビトロにおけるキラーＴ細胞誘導活性を増大させた。このことから本発明の抗原を体内に注入することにより、ＣＴＬを誘導活性化し、その結果、抗腫瘍効果が期待できる。また、本発明の抗原で刺激すると腫瘍部において活性化Ｔ細胞が誘導され、この活性化されたＴ細胞を患部に注入することによる養子免疫療法に有効に用いることができる。
以下、本発明の抗原、その製造方法、効果について実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制約されるのもではない。本発明の頭頚部癌抗原であるＫＭ−ＨＮ−１は例えば、下記実施例のようなＳＥＲＥＸ法で検出することができる。
【実施例】
【００５７】
実施例１
《癌細胞の採取》
まず５種類の頭頚部扁平上皮癌細胞株と、ＲＰＭ１１６４０（１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む）で３７℃、５％のＣＯ2、湿度１００％の条件下で１ｘ１０7となるまで培養した。
【００５８】
《血清の採取》
６人の頭頚部扁平上皮癌患者から血清を採取した。採血後の血清は−８０℃で保存した。この血清サンプルから、大腸菌とファージの溶解物とセファロース4Bが充填されたカラムを用いて大腸菌とλファージに対する抗体を除去した後、１００〜８００倍に希釈し、使用した。
【００５９】
《ＲＮＡ／ｃＤＮＡの作製》
頭頚部扁平上皮癌細胞株から酸−グアニジウム−フェノール−クロロホルム変法により全ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡをoligo(dT) Oligotex-dT30 super mＲＮＡPurification Kit（Takara Shuzou、Kyoto、Japan）を用いたポリ(Ａ)選択法により精製した。精製したポリ(Ａ)ＲＮＡ５μｇから、逆転写酵素を用いて公知の方法によりｃＤＮＡを合成した。
【００６０】
《ｃＤＮＡライブラリー／蛋白の作製》
ＺＡＰ-cＤＮＡ Synthesis Kit（Stratagene、La Jolla、CA）によりλＺＡＰエクスプレスベクターに挿入し、ファージｃＤＮＡライブラリーを作製した。上記方法で作製したλファージｃＤＮＡライブラリーを大腸菌に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で４２℃、４時間培養し溶菌斑（プラーク）を作らせた。isopropyl β-D-thiogalactoside（IPTG）を浸透させたニトロセルロースメンブレンでプレートを３７℃で３時間覆うことにより、プラーク中でλファージに組み込んだcＤＮＡがコードする蛋白を作らせた。
【００６１】
《イムノスクリーニング》
上記方法で産生した蛋白をニトロセルロースメンブレンに転写した。ブロッキング後のニトロセルロースを洗浄し、前記１００〜８００倍に希釈した血清と室温で２時間反応させた。洗浄後２次抗体としてHorseradish Oeroxidase(HRP)標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体をメンブレンと反応させた。洗浄した後に、化学発光をＸ線フイルム上で検出し、写真のプレートと照らし合わせ、陽性プラークを周囲の陰性プラークとともにピックアップした。発色反応陽性部位に一致するプラークを１５ｃｍＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％のゼラチン；ｐＨ７．５）に溶解させた。発色反応陽性プラークが単一化するまで上記と同様の方法で２次、３次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧ抗体が反応する単一のファージクローンを得た。以上の方法により頭頚部扁平上皮癌細胞株由来のｃＤＮＡから１２個、正常精巣由来ｃＤＮＡから１６個、計２８個の陽性クローンを単離した。
【００６２】
《単離抗原遺伝子の相同性検索》
ＰＣＲ法によりインサートＤＮＡを増幅し、以後の解析に用いた。得られたＰＣＲ産物をBig Dye DNA シーケンシングキット（PE Biosystems, CA）Ａシーケンシングを行い、塩基配列を決定した。上記決定された２８種類の遺伝子の塩基配列を、それぞれ相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）を用いて、ＮＣＢＩデータバンクに登録されている遺伝子情報と比較した。
【００６３】
《ＫＭ−ＨＮ−１》
その結果、２８個の陽性クローンは１９種類の遺伝子であることを確認した。これらの遺伝子のうち１個が新規なＤＮＡであった。その１個をＫＭ−ＨＮ−１と名づけた。この遺伝子は第４染色体上に位置し、８３３個のアミノ酸からなる蛋白であり、コイルドコイルドメインとロイシンジッパーモチーフを含んでいた（図１）。ＫＭ−ＨＮ−１のアミノ酸配列を配列番号１に記載し、塩基配列を配列番号２に記載する。
【００６４】
《ＲＴ−ＰＣＲ》
上記方法で得られた陽性クローンのｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増殖させた。ＲＴ−ＰＣＲ反応は一本化処理を９４℃−５分間で、アニール温度を５８℃で、３０サイクル繰り返した。コントロールとしてβ-アクチンｍＲＮＡで標準化した。
【００６５】
《ＫＭ−ＨＮ−１発現の確認》
各種癌組織および正常組織における、ＫＭ−ＨＮ−１の存在の有無を肺癌、舌癌、膵臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、胃癌、喉頭癌、および顎下腺癌についてＲＴ−ＰＣＲ法を用いて検討した。その結果、図２に示したようにＫＭ−ＨＮ−１は舌癌、甲状腺癌、胃癌、肺癌、および膵臓癌組織に現れ、正常な組織では精巣にのみ発現することがわかった。
【００６６】
実施例２
《ＫＭ−ＨＮ−１を構成するペプチド》
ＫＭ−ＨＮ−１で同定されたアミノ酸構造に基づき、９または１０のアミノ酸からなる表１の１３種類のペプチド（配列番号３〜１５）をFmoc/PyBOP法で合成し、以下の試験に用いた。
【００６７】
【表１】
2004147649.tif 000002
【００６８】
《ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフに基づくＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの作製》
ＫＭ−ＨＮ−１のアミノ酸配列からＨＬＡ−ペプチド結合予測を用いＨＬＡ−Ａ２４に結合すると思われる９または１０個のアミノ酸からなる上記表１に記載の１３種類のペプチドをFmoc/PyBOP法で合成し、以下の試験に用いた。
【００６９】
《ＣＴＬ誘導活性能力の測定》
熊本大学附属病院の５人、佐賀医大附属病院の４人の頭頚部癌患者と健常人３人から３０ＣＣの血液を採取した。ＨＬＡ−Ａ２４陽性の８人の頭頚部癌患者と３人の健常人ＰＢＭＣから得たＫＭ−ＨＮ−１由来のペプチド１３種類が癌反応性キラーＴ細胞を誘導する能力を有するかどうかをテストした。４週間培養後ＰＢＭＣ中のキラーＴ細胞活性は51Ｃr release assayで測定することにより調べた。結果を図３に示す。
【００７０】
同様に、ＫＭ−ＨＮ−１のヒトにおけるＨＬＡ−Ａ２４のＣＴＬエピトープペプチドを決定するため、ＨＬＡ−Ａ２４の健常人の末梢血リンパ球を１３種類のペプチドで３回刺激し、51Cr release assayによって、ＫＭ−ＨＮ−１を高発現し、かつＨＬＡ−Ａ２４を発現するヒト食道癌細胞株ＴＥ３、肺癌細胞株ＰＣ−９に対する細胞傷害活性を検討した。結果を以下の表２に示す。
【００７１】
【表２】
2004147649.tif 000003
【００７２】
下記ペプチド（１）〜（８）：
Val-Phe-Gly-Thr-Arg-Ile-Glu-Lys-Asp-Leu（１）
Lys-Phe-Glu-Asn-Ser-Ile-Ser-Arg-Leu    （２）
Glu-Tyr-Leu-Ser-Leu-Ser-Asp-Lys-Ile    （３）
Tyr-Phe-Lys-Val-Lys-Asp-Arg-Thr-Leu    （４）
Asn-Tyr-Asn-Asn-Phe-Tyr-Arg-Phe-Leu    （５）
Ile-Tyr-Lys-Asn-Ser-Leu-Ser-Glu-Ile    （６）
Thr-Tyr-Ile-Ser-Arg-Arg-Glu-Lys-Phe    （７）
Glu-Tyr-Ser-Lys-Glu-Cys-Leu-Lys-Glu-Phe（８）
で誘導したＣＴＬ株はＨＬＡ−Ａ２４でＫＭ−ＨＮ−１を発現してない頭頚部癌細胞株ＨＳＣ−２は傷害しないが、ＨＬＡ−Ａ２４でＫＭ−ＨＮ−１を発現する頭頚部癌細胞株ＨＳＣ−３，食道癌細胞株ＴＥ３，肺癌細胞株ＰＣ−９を特異的に傷害する。
【００７３】
《ペプチドワクチン》
上記結果は、ペプチド（１）〜（８）が抗癌ワクチンとして使用できることの証拠となりうるものである。
【００７４】
《ＣＴＬ癌治療薬》
またこれらのＫＭ−ＨＮ−１および／又はペプチド（１）〜（８）を抗原として認識するキラーＴ細胞は正常細胞を傷付けず、頭頚部癌、食道癌又は肺癌にのみ細胞傷害活性を有するため、副作用の少ない頭頚部癌、食道癌又は肺癌の治療薬として使用することができる。
【００７５】
実施例３
《ＫＭ−ＨＮ−１を構成する蛋白質》
ＫＭ−ＨＮ−１で同定された配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の３７−５２４の部分を大腸菌株ＤＨ５αを用いて合成蛋白質として作製し、以下の試験に用いた。
【００７６】
《癌患者血清中のKM-HN-1特異的IgG抗体の測定》
食道癌、胃癌、肺癌、肝細胞癌、大腸癌、頭頚部癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌と健常人から血液を採取し血清を分離した。ＫＭ−ＨＮ−１蛋白質と血清及び抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法にてＫＭ−ＨＮ−１特異的ＩｇＧ抗体を測定した。具体的には、大腸菌を用いて作製したヒトＫＭ−ＨＮ-1合成蛋白を９６穴プレートに貼り付かせた後、100倍に希釈した各種癌患者血清を入れて反応させた。その後、ＨＲＰ結合マウス抗ヒトＩｇＧ抗体と発色基質であるO-phenylenediamineを加えて吸光度計を用いて吸光度を測定した。結果を図４に示す。
【００７７】
図４の結果から分かるように、健常人の平均値+標準偏差を正常上限と定めると、健常人での抗体陽性率は６．３％と低値であるのに対し、各種癌患者における抗体陽性率は４０〜１００％と高率であった。従って、本発明の蛋白質又はその断片は癌の診断薬として使用できることが実証された。即ち、ＫＭ−ＨＮ−１特異的ＩｇＧ抗体価は、腫瘍マーカーとして有用であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は本発明の抗原を形成する蛋白ＫＭ−ＨＮ−１のアミノ酸配列と塩基配列とを示す。
【図２】図２はＲＴ−ＰＣＲ法を用いて本発明の抗原である蛋白ＫＭ−ＨＮ−１の正常細胞と癌細胞での発現量を比較した図である。なお、各組織のｍＲＮＡ量はβアクチンで標準化している。
【図３】図３は51Ｃr release assayを用いたペプチド特異的キラーＴ細胞の癌傷害活性を示したグラフである。
【図４】図４は、癌患者血清中のKM-HN-1特異的IgG抗体を測定した結果を示す。
【図１】
2004147649.tif 000004
【図２】
2004147649.tif 000005
【図３】
2004147649.tif 000006
【図４】
2004147649.tif 000007
【配列表】
2004147649000001.app