(57)【要約】【課題】腸管出血性大腸菌によって産生されるｖｅｒｏ毒の毒性を消去又は軽減する作用を有し、しかも人体に対して有害な副作用を生じさせない安全、かつ安定なｖｅｒｏ毒作用減弱活性を有する物質を天然物から探索すると共に、当該物質を添加してｖｅｒｏ毒減弱作用を付与した機能性食品を提供すること。【解決手段】乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリスの培養物から酢酸エチル又はブタノールで抽出することにより得られ、弱塩基性又は強塩基性陰イオン交換樹脂に吸着する性質があり、ｖｅｒｏ細胞に対する細胞毒性を減弱する作用を有することを特徴とするｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物並びに当該組成物を食品に添加してｖｅｒｏ毒減弱作用を付与したことを特徴とする機能性食品。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリスの培養物から酢酸エチル又はブタノールで抽出することにより得られ、弱塩基性又は強塩基性陰イオン交換樹脂に吸着する性質があり、ｖｅｒｏ細胞に対する細胞毒性を減弱する作用を有することを特徴とするｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物。
【請求項２】
ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物が、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリスの培養物からの酢酸エチル又はブタノールによる抽出液から当該酢酸エチル又はブタノールを除去した後、水を加えて得た水溶液を合成吸着樹脂又は活性炭のカラムに通液したとき吸着され、有機溶媒水溶液で溶出される物質並びに乳酸を含むものである請求項１記載のｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物。
【請求項３】
乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリスが、乳酸菌ラクトトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリス　ＳＷＴ３０５２株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８６３５）である請求項１記載のｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物。
【請求項４】
請求項１記載のｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を食品に添加してｖｅｒｏ毒減弱作用を付与したことを特徴とする機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物及び当該組成物を配合した機能性食品に関し、詳しくは乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリスの培養物から得られるｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物及び当該組成物を配合した機能性食品に関する。
本発明のｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物は、病原性大腸菌による食中毒を治療、軽減もしくは予防することができ、さらには該大腸菌の産生するｖｅｒｏ毒素に起因する疾病の治療、軽減又は予防に有用である。そのため、当該組成物は医薬品や機能性食品に応用することができるものである。
【０００２】
【従来の技術】
病原性大腸菌は、ヒトの腸管内に常在する一般の大腸菌とは生化学的な性質では区別できず、抗原的に区別されている。
病原性大腸菌は５種に分類されており、このうち腸管出血性大腸菌（ｖｅｒｏ毒素産生性大腸菌）には、血清型分類でＯ−１５７：Ｈ７（以下、Ｏ−１５７菌と略記することがある。）と言われる重要な食中毒菌が含まれている。
【０００３】
Ｏ−１５７菌の産生する毒素は、アフリカミドリザルの腎臓由来細胞であるｖｅｒｏ細胞に対して約１０９　分の１ｇという極微量で致命的な障害を与えることから、ｖｅｒｏ毒素（Ｓｈｉｇａ　ｔｏｘｉｎ　、Ｓｔｘ、ＶＴ）とも呼ばれている。
このｖｅｒｏ毒素は、ヒトに対して出血性の大腸炎を起こし、腎臓その他に致死性の障害を与える他、ときには給食等を介して集団食中毒を起こす。
【０００４】
ｖｅｒｏ毒素は、現在までに、生物細胞中の蛋白合成の場である２８ＳリボソームＲＮＡの特定部位（塩基配列で４３２４番目のアデニン）のＮ−グルコシド結合を加水分解し、１分子のアデニンを遊離させ、リボソームを不活性化することにより蛋白質合成を阻害する作用を有するグルコシダーゼであることが判明している。
しかし、ｖｅｒｏ毒素を産生する腸管出血性大腸菌に起因する食中毒の予防や治療法は確立されておらず、これらの早急な確立が待望されているのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
また、ｖｅｒｏ毒作用を消去する、例えば毒素の中和、分解、包接、修飾失活、細胞への取りこみを不能にする等によってｖｅｒｏ毒素を無毒化する物質を開発し、当該物質を食品に付加又は富化することにより、ｖｅｒｏ毒消去機能を有する食品の開発が待たれている。
【０００６】
本発明の目的は、腸管出血性大腸菌によって産生されるｖｅｒｏ毒素の毒性を消去又は軽減する作用を有し、しかも人体に対して有害な副作用を生じさせない安全、かつ安定なｖｅｒｏ毒作用減弱作用を有する天然組成物を探索すること、並びに当該組成物を配合することによりｖｅｒｏ毒作用減弱作用を付加した機能性食品を提供することである。
そこで、本発明者らはｖｅｒｏ毒素がｖｅｒｏ細胞の増殖を抑制するという系を用いて鋭意研究を重ねた結果、チーズ等の伝統的な発酵食品の製造に広く利用されている乳酸菌等の食品微生物の中に、本発明の目的とするｖｅｒｏ毒作用減弱作用を有する組成物を産生する微生物が存在することを初めて見出し、かかる知見に基づいて本発明を完成した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載の本発明は、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリスの培養物から酢酸エチル又はブタノールで抽出することにより得られ、弱塩基性または強塩基性陰イオン交換樹脂に吸着する性質があり、ｖｅｒｏ細胞に対する細胞毒性を減弱する作用を有することを特徴とするｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物である。
請求項２に記載の本発明は、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物が、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリスの培養物からの酢酸エチル又はブタノールによる抽出液から当該酢酸エチル又はブタノールを除去した後、水を加えて得た水溶液を合成吸着樹脂又は活性炭のカラムに通液したとき吸着され、有機溶媒水溶液で溶出される物質並びに乳酸を含むものである請求項１記載のｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物である。
請求項３に記載の本発明は、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリスが、乳酸菌ラクトトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリス菌　ＳＷＴ３０５２株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８６３５）である請求項１記載のｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物である。
請求項４に記載の本発明は、請求項１記載のｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を食品に添加してｖｅｒｏ毒減弱作用を付与したことを特徴とする機能性食品である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物は、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリスの培養物から酢酸エチル又はブタノールで抽出することにより得られ、弱塩基性または強塩基性陰イオン交換樹脂、例えばアンバーライト（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ）　ＩＲＡ３５、アンバーライトＩＲＡ４００、アンバーライト　ＩＲＡ４１０　、ＤＥＡＥ−　セファデックス（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　などに吸着するという性質があり、ｖｅｒｏ細胞に対する細胞毒性を減弱する作用を有するものである。本発明者らの知見によると、当該組成物には、有効成分として乳酸及び乳酸とは異なる未知の物質が含まれている。
【０００９】
ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を産生する微生物として、チーズ、ヨーグルトなどの伝統食品の製造に使用されている安全な乳酸菌であるラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ）属やラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　）属等の細菌を選定し、これら乳酸菌の中から目的とするｖｅｒｏ毒作用を減弱し得る物質の産生能を有する菌株の検索を行った。
その結果、ラクトコッカス属に属するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ）　が有用であることを見出した。中でも、チーズから分離したラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリス　ＳＷＴ３０５２株は目的とする物質の産生能が高い。
当該菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所　特許微生物センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ　Ｐ−１８６３５である。
【００１０】
次に、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリス　ＳＷＴ３０５２株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８６３５）の培養物からｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を取得する方法について説明する。
まず、当該菌株を種培養用培地、例えば下記組成のＭＲＳ液体培地もしくはｇｌｕｃｏｓｅ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ　（Ｄｉｆｃｏ　社製）　に接種し、２２〜３０℃、好ましくは２５℃で２〜４日間、好ましくは２日間の種培養を行う。
【００１１】
ＭＲＳ液体培地組成（最終ｐＨ６．５）：
Ｂａｃｔｏ　ｐｒｏｔｅｏｓｅ　ｐｅｐｔｏｎ　（ＢＢＬ社製）　　　　　　　　　　１０．０ｇ
Ｂａｃｔｏ　ｍｅａｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　（Ｄｉｆｃｏ　社製）　　　　　　　　　　　１０．０ｇ
Ｂａｃｔｏ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　　　　　　　　　　　　　５．０ｇ
Ｂａｃｔｏ　ｄｅｘｔｒｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　２０．０ｇ
Ｔｗｅｅｎ　８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０ｇ
クエン酸アンモニウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０ｇ
酢酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　５．０ｇ
硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
硫酸マンガン　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５ｇ
リン酸カリウム　　　　　　　　　　　　　　　２．０ｇ
蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１Ｌ
【００１２】
Ｇｌｕｃｏｓｅ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ　（Ｄｉｆｃｏ　社製）　組成（最終ｐＨ６．８）：
Ｍｅａｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　（Ｄｉｆｃｏ　社製）　　　　　　　　　　３．０ｇ
Ｐｅｐｔｏｎ　（ＢＢＬ　社製）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０ｇ
Ｇｌｕｃｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０ｇ
蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１Ｌ
【００１３】
種培養終了後、当該菌株にｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を生産させるため、上記のＧｌｕｃｏｓｅ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈを基本とするｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物生産用液体培地に、種培養液を０．５〜２％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．５〜１．５％（ｖ／ｖ）となるように接種し、温度２２〜３０℃、好ましくは２５℃で３〜１４日間、好ましくは５〜１０日間静置培養する。
【００１４】
本発明者らの知見によると、培養開始から６〜８日目に、培養液中のｖｅｒｏ毒作用減弱活性が最高になる。このため、この期間を含むように培養期間を設定することによって、効率良くｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を得ることができる。また、培養期間を上限よりも長くした場合、培養液中のｖｅｒｏ毒作用減弱活性がある一定以上には高くならないため、培養を続ける意味がない。一方、培養期間が下限よりも短い場合、培養液中のｖｅｒｏ毒作用減弱活性が十分に高くなく、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物が十分に生産されないため好ましくない。
【００１５】
培養物からのｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を取得するには、培養物を遠心分離などの固−液分離操作して得た培養液から酢酸エチルやブタノール等の水不混和性溶剤を用いて抽出する方法を行うことが好ましい。
溶剤を用いる抽出方法の１例としては、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を含む培養液に、上記溶剤を培養液に対して１０〜１００％、好ましくは５０〜１００％となるように加え、これをよく攪拌混合した後、水層と溶剤層を分離し、溶剤層を分取する。
抽出する際のｐＨについては２〜８で可能であるが、ｐＨ２付近で行うと抽出効率が高く、好ましい。培養液のｐＨを調整する場合は常法で行えばよく、例えばＨＣｌ等を用いて行うことができる。また、ｐＨ７付近の蒸留水を用いて抽出することもできる。抽出後、蒸留等の常法に従って、溶剤を除去することが好ましい。
【００１６】
上記の抽出方法により、本発明のｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を含む抽出物が得られるが、必要により、当該抽出物をさらに分画・精製することもでき、これにより当該組成物中の有効成分を得ることができる。
分画・精製方法としては、イオン交換樹脂や吸着クロマト用樹脂による吸着、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記することがある。）、ゲル濾過等の通常用いられる操作を、単独あるいは適宜組み合わせて行うことができる。なお、ＨＰＬＣ等によって分画・精製する場合、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を含む培養液又はその濾液を直接適用することはできないため、上記の如く、本操作に適用可能な程度に抽出・精製したものを使用すべきである。
【００１７】
以下に、有効成分の１つである乳酸の分画・精製方法の１例を示す。まず、上記した方法により得たｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を含有する抽出物を少量のメタノール等のアルコールに溶解させ、これをＨＰＬＣにより精製する。
ＨＰＬＣに用いるカラムとしては逆相シリカゲルを用いることができ、具体的には　Ｃａｐｃｅｌｌ　Ｐａｃｋ　Ｃ１８　ＵＧ１２０　（資生堂社製）等が挙げられる。
【００１８】
ＨＰＬＣを行うにあたり、まず水をカラムに満たして平衡化（２分間）しておく。カラムを平衡化した後、溶媒としてメタノール／水（濃度勾配０／１００〜５０／５０）、流速１．０ｍＬ／分の条件で１時間程度通液し、紫外部波長（波長２２５ｎｍ）の吸収を検出することにより、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を含む画分がピークとして得られる。
ＨＰＬＣにより分取したピーク画分を常法により乾固させた物質に、ｖｅｒｏ毒作用減弱活性が認められる。この乾固物質を乳酸検出定量キット等により分析したところ、乳酸と特定された。乳酸のｖｅｒｏ毒作用減弱活性を調べたところ、０．２５〜１．０ｍｇ／ｍＬで５０％毒減弱活性度を示した。
【００１９】
次に、乳酸とは異なる未知の物質の分画・精製方法の１例を示す。まず、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリス　ＳＷＴ３０５２株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８６３５）の培養物から、酢酸エチルなどの溶剤を用いて抽出することにより抽出物を得た後、蒸留器等により溶剤を除去した後、水を加えて水溶液とする。
当該水溶液について合成吸着樹脂、例えばダイヤイオン（ＤＩＡＩＯＮ）ＨＰ−２０　（三菱化成社製）、セパビーズ（ＳＥＰＡＢＥＡＳ）　ＳＰ２０７　（三菱化成社製）や活性炭等のカラムを用いてカラム下流法を行うと、カラムを通過した通過液中に乳酸が検出される。
一方、カラム内に吸着した物質を、水と混和する有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、プロパノール、アセトン等）と水との混液、例えば５０％アセトン水で溶出させた溶出液を蒸発濃縮して濃縮物質を得る。この物質について、ブタノール／酢酸／水（４／２／１）の展開溶媒を用いてシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略記することがある。）を行うと、燐モリブテンで呈色する乳酸とは異なるスポットを与える。このようにして得た乳酸とは異なる未知の物質を、ＰＢＳ（−），リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）を用いて濃度１．０ｍｇ／ｍＬとした希釈液は、１５％毒減弱活性度を示し、ｖｅｒｏ毒作用減弱活性を有していることが確認された。
【００２０】
ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物の有するｖｅｒｏ毒減弱作用の測定法について説明する。本発明におけるｖｅｒｏ毒減弱作用とは、ｖｅｒｏ毒に感受性の高いｖｅｒｏ細胞にＯ−１５７菌体又は抽出精製されたｖｅｒｏ毒素を投与して得られる細胞毒性を消去又は減弱する作用を意味し、その度合を活性として測定するものである。
まず、測定に必要なｖｅｒｏ細胞懸濁液を調製する。Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地に濾過滅菌したＬ−グルタミン酸（最終濃度０．０９２ｇ／Ｌ）及び補体を非動化した牛胎仔血清（以下、ＦＣＳと略記することがある。）１０％を添加し、これを表面積が７５ｃｍ２　程度の組織培養用フラスコに約１０ｍＬ入れる。
【００２１】
これに、ｖｅｒｏ細胞（国立感染症研究所より供与）の懸濁液を、５〜２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１０％（ｖ／ｖ）となるように接種し、５％炭酸ガス培養装置内で３２〜４０℃、好ましくは３７℃で、１〜５日間、好ましくは３日間培養する。
培養終了後、常法によりトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．５％トリプシン、５．３ｍＭ　ＥＤＴＡ）１０倍希釈液等を用いてトリプシン処理し、フラスコ壁から細胞を剥離し、均一なｖｅｒｏ細胞懸濁液とする。
【００２２】
このｖｅｒｏ細胞懸濁液をＰＢＳ（−）溶液１０ｍＬで洗浄した後、ｖｅｒｏ毒素を切断する作用を有するトリプシンを除去するため、当該細胞懸濁液を１０％ＦＣＳを添加したＥａｇｌｅ　ＭＥＭ培地約５ｍＬに懸濁し、１０００〜３０００ｒｐｍ、好ましくは１５００ｒｐｍで１〜５分間、好ましくは１分間の遠心分離処理を２回程度行い、沈殿したｖｅｒｏ細胞を回収する。
さらに、回収したｖｅｒｏ細胞からＦＣＳを除去するため、ＰＢＳ（−）溶液５ｍＬに懸濁した後、１０００〜３０００ｒｐｍ、好ましくは１５００ｒｐｍで１〜５分間、好ましくは１分間の遠心分離を行い、沈殿したｖｅｒｏ細胞を６％ＦＣＳを添加した２倍濃度のＥａｇｌｅ　ＭＥＭ培地１〜５ｍＬ、好ましくは１ｍＬに懸濁する。
このｖｅｒｏ細胞懸濁液１０μＬと０．２％トリパンブルー／５倍濃度生理食塩水１０μＬを混合し、血球測定盤を用いて細胞数を計測する。これを基にして細胞数が１×１０５　細胞／ｍＬとなるように、６％ＦＣＳを添加した２倍濃度のＥａｇｌｅ　ＭＥＭ培地を用いて調整し、これをｖｅｒｏ細胞液とする。
【００２３】
一方、ｖｅｒｏ毒素（デンカ生研株式会社より供与）は、あらかじめ蛋白質分析試薬であるＢＣＡ（Ｒｉｅｒｃｅ社製）を用いて、蛋白質濃度を測定しておく。測定に際して用いる検量線は、牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記することがある。）を標準蛋白質として用い、吸光度５７０ｎｍにおける測定値をプロットしたものを用いる。
ｖｅｒｏ毒減弱作用の測定のための反応液の組成は、ｖｅｒｏ細胞液５０μＬ（５×１０４　ｖｅｒｏ細胞／ｍＬ）にｖｅｒｏ毒素５μＬ（２×１０−１０　ｇ／ｍＬ）を加えたものとし、これにｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物、例えばラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリス　ＳＷＴ３０５２株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８６３５）の培養物を遠心分離して得られる培養液上清あるいは培養物からの抽出物を加えて、３７℃で５％ＣＯ２　環境下の培養器中で４８時間培養する。なお、ｖｅｒｏ毒素の反応液中の最終濃度は、１×１０−１１　ｇ／ｍＬである。
【００２４】
培養終了後、反応液中に還元性色素であるアラマーブルー（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ）を指示薬として加え、さらに３時間培養した後の反応液の発色を、５７０ｎｍでの吸光度を５９５ｎｍを参照波長として測定し、下記の式により毒減弱活性度を算出する。
【００２５】
【数１】
2004051581.tif 000002
【００２６】
上記式中、Ａはｖｅｒｏ細胞、ｖｅｒｏ毒素及びｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を含む系の吸光度、Ｂはｖｅｒｏ細胞及びｖｅｒｏ毒素を含む系の吸光度、Ｃはｖｅｒｏ細胞のみを含む系の吸光度をそれぞれ表す。
アラマーブルーは、生存しているｖｅｒｏ細胞が産生するデヒドロゲナーゼによって還元され、ブルー色からピンク色に変化する。このため、反応液のピンク色が濃く吸光度が高い場合、反応液中のｖｅｒｏ毒素が不活性化（減毒）されるか、又はｖｅｒｏ毒素によるｖｅｒｏ細胞の活性阻害作用が抑えられていることを示している。
【００２７】
本発明に係るｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物は、ｖｅｒｏ細胞がｖｅｒｏ毒素によって受ける細胞毒性を減弱する作用を有するものである。当該組成物に含まれる有効成分としては、前記したように、乳酸と未知の物質が挙げられる。これら２物質はそれぞれ単独でもｖｅｒｏ毒を減弱する作用を有しているが、後述の実施例に示すとおり、両者を併用した場合には相乗的な効果が得られる。なお、ｖｅｒｏ毒減弱の態様としては、毒素の中和、分解、包接、修飾失活、細胞への取込み不能などによる無毒化等が考えられ、本発明に係るｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物は、これらの単独作用もしくは複数の作用によりｖｅｒｏ毒作用を減弱するものと解される。
【００２８】
また、このｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物は、ｐＨ２．０〜９．０という幅広い範囲において、６０℃、３０分間程度の加熱に耐えて失活せず、特にｐＨ７．０付近では１００℃、３０分間の加熱に対しても耐熱性を有しており、優れた安定性を示す。
さらに、本発明に係るｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物は、古くから食されているチーズやヨーグルト等の製造に使用されている乳酸菌から分離されたものであるから、人体に対する有害な副作用はなく、安全性にも優れている。
【００２９】
上記のような特色を有するｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物は、医薬品として食中毒や毒素による疾病の治療、軽減もしくは予防に資することができる。その他、食品に添加してｖｅｒｏ毒を減弱する作用を付加又は富化し、この食品を摂取することにより、大腸菌Ｏ−１５７菌の産生するｖｅｒｏ毒素の作用を減弱することができる。
本発明に係るｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物は、単独で用いる他、補助的成分、例えば賦形剤、膨張剤、増粘剤、保存料、ｐＨ調節剤、殺菌剤、甘味料、香料、色素等の製薬や食品製造上許容されるものを適宜配合して用いることもできる。医薬品としては、主に経口的に投与され、その形態は通常の製剤化方法によるカプセル剤、顆粒剤、錠剤、粉末などが考えられる。
また、食品に添加する添加する場合は、その使用目的などを考慮して適宜添加量を決めればよいが、目安としては食品１ｋｇあたり０．１〜１０ｇ、好ましくは２〜４ｇ程度が適当である。
【００３０】
【実施例】
以下に、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１
（１）乳酸菌の培養
チーズやヨーグルトから分離した２種類の乳酸菌ラクトコッカス　ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリス　ＳＷＴ３０５２株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８６３５）及び同　３０８０株を、ＭＲＳ液体培地（組成は前記）に渦巻き白金耳を用いて接種し、２５℃で２日間の一次種培養を行った。
【００３１】
一次種培養終了後、Ｇｌｕｃｏｓｅ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ（組成は前記）を基本とするｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物生産用液体培地１０ｍＬに、一次種培養液１００μＬを接種して温度２５℃で２〜７日間静置培養し、二次種培養液を得た。
本培養は、５００ｍＬ容三角フラスコにＧｌｕｃｏｓｅ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈを５００ｍＬ入れ、滅菌、冷却後、二次種培養液５００μＬを接種して温度２５℃で５〜１０日間静置培養した。
なお、すべての培地は０．１Ｎ塩酸及び炭酸ナトリウムで最終的にｐＨ６．８±０．２に調整した後、１２１℃で１５分間滅菌し、室温で冷却した。
培養終了後、培養液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、培養液上清を得た。この培養液上清について、ｖｅｒｏ毒作用減弱活性の測定と耐熱性試験を行った。
【００３２】
（２）ｖｅｒｏ毒作用減弱活性の測定
まず、測定に必要なｖｅｒｏ細胞懸濁液を調製した。すなわち、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地（Ｄｉｆｃｏ　社製）に濾過滅菌したＬ−グルタミン酸を最終濃度が０．０９２ｇ／Ｌとなるように加え、さらに補体を非動化したＦＣＳを１０％添加した。この培地を、表面積が７５ｃｍ２　の組織培養用フラスコに１０ｍＬ入れた。
一方、ｖｅｒｏ細胞（国立感染症研究所より供与）を上記の組織培養用フラスコに入れた培地に１０％（ｖ／ｖ）となるように接種し、５％炭酸ガス培養装置内で３７℃で３日間培養した。
培養終了後、ＰＢＳ（−）溶液１０ｍＬで洗浄した後、常法によりトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．５％トリプシン、５．３ｍＭ　ＥＤＴＡ）１０倍希釈液を用いてトリプシン処理し、フラスコ壁から細胞を剥離し、均一なｖｅｒｏ細胞懸濁液とした。
【００３３】
ｖｅｒｏ毒素を失活する作用を有するトリプシンを除去するため、当該細胞懸濁液を１０％ＦＣＳを添加したＥａｇｌｅ　ＭＥＭ培地約５ｍＬに懸濁し、１５００ｒｐｍで１分間の遠心分離処理を２回行い、沈殿したｖｅｒｏ細胞を回収した。
さらに、回収したｖｅｒｏ細胞からＦＣＳを除去するため、ＰＢＳ（−）溶液５ｍＬに懸濁した後、１５００ｒｐｍで１分間の遠心分離を行い、沈殿したｖｅｒｏ細胞を６％ＦＣＳを添加した２倍濃度のＥａｇｌｅ　ＭＥＭ培地１ｍＬに懸濁した。
このｖｅｒｏ細胞の懸濁液１０μＬと０．２％トリパンブルー／５倍濃度生理食塩水１０μＬを混合し、血球測定盤を用いて細胞数を計測した。これを基にして細胞数が１×１０５　細胞／ｍＬとなるように、６％ＦＣＳを添加した２倍濃度のＥａｇｌｅ　ＭＥＭ培地を用いて調整し、これをｖｅｒｏ細胞液として以下のｖｅｒｏ毒作用減弱活性測定に用いた。
【００３４】
一方、ｖｅｒｏ毒素（デンカ生研株式会社より供与）は、あらかじめ蛋白質分析試薬ＢＣＡ（Ｒｉｅｒｃｅ社製）を用いて蛋白質濃度を測定した。測定に用いる検量線は、ＢＳＡを標準蛋白質として用い、吸光度５７０ｎｍにおける測定値をプロットしたものを用いた。
ｖｅｒｏ毒減弱作用の測定のための反応液の組成は、ｖｅｒｏ細胞液５０μＬ（５×１０４　ｖｅｒｏ細胞／ｍＬ）にｖｅｒｏ毒素５μＬ（２×１０−１０　ｇ／ｍＬ）を加えたものとし、これに上記（１）で得たラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリスの各培養液上清を４５μＬ加えて、３７℃で５％ＣＯ２　環境下の培養器中で４８時間培養した。さらに、上記培養上清の代わりに、１００℃で３０分間加熱処理した各培養液上清を加えたものについても同様に実験を行った。なお、ｖｅｒｏ毒素の反応液中の最終濃度は、１×１０−１１　ｇ／ｍＬである。
【００３５】
４８時間培養した後、培養液中に還元性色素アラマーブルー（米国　トレク
デイアグノステック　システム社製）を指示薬として加え、さらに３時間培養した後の反応液の発色を吸光度（Ｏ．Ｄ．）５７０ｎｍにおける吸光度を５９５ｎｍを参照波長として測定し、毒減弱活性度を算出した。
なお、乳酸菌を接種していない培地についても同様に実験を行い、これをコントロールとした。
また、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物生産用液体培地での３〜１０日間の培養期間中、培養液を毎日サンプリングした培養液についても同様の測定を行い、毒減弱活性度を算出した。図１は、２株のラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリスについて、ｖｅｒｏ毒作用減弱活性の測定結果（培養開始から８日目）を示した図である。図中、左側はコントロール（培地のみ）、中央はＳＷＴ３０５２株、右側は３０８０株の結果を示す。図２は、培養期間におけるｖｅｒｏ毒作用減弱活性の経時的な変化を示した図である。図中、●はＳＷＴ３０５２株、□は３０８０株、▲はコントロール（ｖｅｒｏ毒素なし）、△はコントロール（ｖｅｒｏ毒素あり）の結果を示す。
【００３６】
図１に示すように、ｖｅｒｏ細胞にｖｅｒｏ毒素を加えず、乳酸菌の培養液上清又はコントロールは、いずれの場合も、吸光度は０．１５以上の値を示しており、ｖｅｒｏ細胞の増殖が十分に保持されていることが明らかとなった。これに対して、各培養液上清とｖｅｒｏ細胞を含む系にｖｅｒｏ毒素を加えた試験区については、吸光度の低下がコントロールに比べ抑えられ、ｖｅｒｏ毒素によるｖｅｒｏ細胞の増殖の阻害が抑えられていることが明らかとなった。特に、乳酸菌３０８０株の培養液上清を用いた試験区は、ｖｅｒｏ細胞の増殖がかなり保持されていた。
【００３７】
さらに、図２に示した通り、乳酸菌ＳＷＴ３０５２株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８６３５）の培養液上清は、３〜１０日間の培養期間中、他の菌株の培養液上清よりも高い吸光度を示し、ｖｅｒｏ毒作用を低減する物質を効率良く生産していることが明らかとなった。
また、乳酸菌ＳＷＴ３０５２株は、培養開始後３日目から急激にｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物の生成量が増加し、６日目に最高値を示し、１０日目まで同程度の水準を維持していた。このことから、乳酸菌ＳＷＴ３０５２株は活発にｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を生産していることが明らかとなった。よって、乳酸菌ＳＷＴ３０５２株を用いる場合は、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を効率良く生産するためには、培養期間を６〜１０日間とすることが好ましい。
【００３８】
実施例２
乳酸菌ＳＷＴ３０５２株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８６３５）を用いて、実施例１に記載した方法と同様に培養してｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を含む培養液を得た後、塩酸でｐＨ２．０又は８．０に調整した当該培養液２００ｍＬから、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物の抽出を行った。
抽出の際には、水不混和性溶剤として酢酸エチルを等量（２００ｍＬ）用いて攪拌混合した後、分液した水層と溶剤層を得た。この水層と溶剤層について、ｖｅｒｏ毒作用減弱活性を実施例１と同様に測定し、有効活性の転溶可能性について試験した。なお、対照として、培養液のみについても同様に試験した。
【００３９】
その結果、図３に示したように、酢酸エチル層に培養液中のｖｅｒｏ毒減弱活性が転溶したことが認められ、この溶剤によってｖｅｒｏ毒減弱用組成物を抽出できることが分った。なお、抽出時のｐＨについては、ｐＨ２．０及びｐＨ８．０のいずれにおいても抽出可能なことが見出され、幅広いｐＨ条件において抽出可能であるけれども、ｐＨ２．０の方が好ましいことが判明した。
一方、酢酸エチルの代わりにブタノールで抽出した場合についても、上記と同様にしてｖｅｒｏ毒作用減弱活性を測定した。結果を図４に示す。図から明らかなように、ブタノール層にｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物が転溶したことが認められた。なお、抽出時のｐＨは２．０の方が好ましいことが判明した。
【００４０】
実施例３
乳酸菌ＳＷＴ３０５２株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８６３５）を用いて、実施例１に記載した方法と同様に培養してｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を含む培養液を得た後、塩酸を用いてｐＨを２．０に調整した。当該培養液から溶剤として酢酸エチルを用いて、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物の抽出を行い、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物の抽出物を得た。
該抽出物を常法に従って低温減圧濃縮して得られた濃縮物について、弱塩基性陰イオン交換樹脂であるＡＭＢＥＲＬＩＴＥ　ＩＲＡ３５　（ローム・アンド・ハース社製）を用いて、分画・精製を行った。
【００４１】
ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ　ＩＲＡ３５　樹脂５ｃｃをカラム（１．５×１０ｃｍ）に充填した後、０．２Ｍ　ＨＣｌ（５０ｍＬ）により平衡化しておいた。
ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を含む濃縮物を少量のメタノールに溶解し、上記のＡＭＢＥＲＬＩＴＥ　ＩＲＡ３５　の充填されたカラムに４０ｍＬづつ通液し、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を樹脂に吸着させた。
【００４２】
次に、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物の吸着したカラムを蒸留水を用いて水洗した後、０．４〜１．０Ｍ　酢酸ナトリウムを０．２Ｍ毎に各４０ｍＬづつ通液し、溶出液を１５ｍＬ毎に分取した。こうして得た溶出液について、実施例１と同様にｖｅｒｏ毒作用減弱活性を測定した。
その結果、ｖｅｒｏ毒作用減弱活性は濃度０．４〜１．０Ｍの範囲にわたって広く分布して溶出されたことから、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物はＡＭＢＥＲＬＩＴＥ　ＩＲＡ３５　に吸着する性質を有することが明らかとなった。
【００４３】
実施例４
実施例２においてｐＨ２で抽出して得たｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を含む酢酸エチル層を、常法に従って低温減圧濃縮し、濃縮物を得た。該濃縮物について、さらにＨＰＬＣによる精製を行った。
すなわち、分離用カラムとしてＣａｐｃｅｌｌ　Ｐａｋ　Ｃ１８　ＵＧ１２０　、２０　ｘ　２５０ｍｍ（資生堂）を用い、まずトリフルオロ酢酸０．１％を含む５％メタノール水で平衡化した後、同溶媒で２０分間溶出、分画（１５ｍＬ）し、その後９０％メタノール水で溶出、分画（１５ｍＬ）した。溶出液の吸光度を２２０ｎｍで測定した。なお、ＨＰＬＣは下記の条件で行った。
カラム：Ｃａｐｃｅｌｌ　Ｐａｋ　Ｃ１８　ＵＧ１２０　、２０　ｘ　２５０ｍｍ（資生堂）
溶媒：トリフルオロ酢酸０．１％を含む５％メタノール水及び９０％メタノール水
流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２２０ｎｍ
【００４４】
これらの分画について、実施例１と同様に、ｖｅｒｏ毒減弱作用を測定した。その結果、最初に検出された吸収帯中（Ａ）及び９０％メタノール水で溶出した際の、最初に検出された吸収帯（Ｂ）中にｖｅｒｏ毒減弱作用が認められた。
当該Ａ物質は純度の高い物質であると考えられたので、その物理化学的性質を調べた。
図５に示した１Ｈ　ＮＭＲ（４００Ｍｚ　、重アセトニトリル中）、図６に示した１３Ｃ　ＮＭＲ　（１００Ｍｚ、重アセトニトリル中）及び図７に示したマススペクトル（ｍ／ｚ　８９、（Ｍ−１）−　）　はＡが乳酸であることを証明している。また、ＡをシリカゲルＴＬＣ（展開溶媒：ブタノール／メタノール／水＝４／２／１）に付し、リンモリブデン酸で検出した結果、Ａは標品乳酸と同じ位置に発色スポットを与えた。
【００４５】
さらに、乳酸検出キット（ＪＫインターナショナル）で解析した結果、定量的　に乳酸が検出され、生物学的にもＡが乳酸であることが証明された。
Ａのｖｅｒｏ毒作用減弱活性について調べた結果、１ｍｇ／ｍＬで５０％減弱した（ｖｅｒｏ毒素濃度：１０−１１　ｇ／Ｌ）。
【００４６】
実施例５
実施例４に示したように、当該培養液中には乳酸以外にもｖｅｒｏ毒減弱作用を有するＢ物質のような成分の存在が明らかとなった。そこで、さらに該成分の存在を明らかにすると共に、精製を行った。すなわち、実施例１において得られた培養液中の乳酸以外のｖｅｒｏ毒作用減弱成分の有無を探索するため、吸着クロマト用樹脂であるＤＩＡＩＯＮ　ＨＰ−２０（三菱化成社製）を用いて、該成分の分離・精製を行った。
まず、２１０ｃｃのＤＩＡＩＯＮ　ＨＰ−２０をカラム（５×５０ｃｍ）に充填し、実施例１と同様に培養して得た乳酸菌ＳＷＴ３０５２株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８６３５）の培養液を毎分１０ｍＬの速度で通過させた。カラムの通過液について、乳酸検出定量キット（ＪＫインターナショナル社製）を用いて解析し、乳酸が含まれていることを確認した。
次に、カラムを水洗した後、５０％アセトン水で溶出し、実施例１と同様にｖｅｒｏ毒作用減弱活性を測定した。
【００４７】
その結果、カラム溶出液には、乳酸が含まれていないのにもかかわらず、ｖｅｒｏ毒減弱活性が認められた。そこで、この溶出液を常法によって蒸発濃縮して得た物質（Ｂ）について、同様にｖｅｒｏ毒作用減弱活性を測定したところ、濃度１ｍｇ／ｍＬで１５％毒減弱活性度を有していることが分かった。
ＴＬＣによって、この物質（Ｂ）は乳酸とは異なるスポットを与えるｖｅｒｏ毒減弱作用を有する物質を含有していることが明らかとなった。
【００４８】
実施例６
実施例４で得られた物質（Ａ）、すなわち乳酸、実施例５で得られた乳酸を含まない物質（Ｂ）及び標品乳酸について、ｖｅｒｏ毒作用減弱活性を実施例１と同様に測定した。
その結果、標品乳酸は、濃度１０ｍＭ（０．９ｍｇ／ｍＬ）ではｖｅｒｏ細胞にはほとんど阻害を与えず、１５％毒減弱活性度を示した。また、乳酸を含む乾固物質（Ａ）は、濃度１ｍｇ／ｍＬで５０％毒減弱活性度を示した。
【００４９】
一方、乳酸を含まず、乳酸とは異なる物質（Ｂ）は、１．０ｍｇ／ｍＬで標品乳酸と同等の１５％毒減弱活性度を示した。また、物質（Ｂ）のｖｅｒｏ細胞に対する細胞毒性を５０％致死量（ＬＤ５０）として推定すると８ｍｇ／ｍＬ以上と推定される。これを、上記の物質（Ｂ）の１５％毒減弱活性度を示した１．０ｍｇ／ｍＬと比較すると、８倍以上の差があり、ｖｅｒｏ細胞には毒性を示さない物質（Ｂ）の濃度でｖｅｒｏ毒素の作用を減弱できると考えられる。
以上のことから、物質（Ａ）及び物質（Ｂ）は、いずれもｖｅｒｏ細胞に対する毒性は低く、これら物質を含有するｖｅｒｏ毒減弱用組成物を動物あるいは人に投与することにより、ｖｅｒｏ毒の減弱作用が期待できることが示唆される。
【００５０】
また、濃度１ｍｇ／ｍＬの物質（Ａ）と濃度１０ｍｇ／ｍＬの物質（Ｂ）を混合し、ｖｅｒｏ毒作用減弱活性を測定したところ、標品乳酸１０ｍＭのみのｖｅｒｏ毒作用減弱活性の５倍の強度を示した。このことから、これらの物質を組み合わせて使用することによって、それぞれ単独では得られない相乗的な効果が得られることが明らかとなった。
【００５１】
実施例７
実施例２において得たｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物を含む培養液について、各種ｐＨにおける熱安定性試験を行った。すなわち、所定のｐＨに調整した培養液を温浴槽中で６０℃で３０分間加熱処理して熱安定性を調べた。
結果を図８に示す。図から明らかなように、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物はｐＨ２．０〜９．０という幅広いｐＨ範囲において、６０℃で３０分間の加熱処理に対して安定性を有していることが明らかとなった。したがって、この組成物は、製造工程に加熱工程を含む食品の製造過程において添加することができる。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により、ｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物並びに当該組成物を食品に添加してｖｅｒｏ毒減弱作用を付与した機能性食品が提供される。
本発明に係るｖｅｒｏ毒作用減弱用組成物は、大腸菌Ｏ−１５７菌等の腸管出血性大腸菌により産生される毒素に起因する疾病の治療や軽減に有効である。
また、当該組成物は、チーズ、ヨーグルト等の伝統食品の製造に使用されている乳酸菌によって生産される物質であるため、安全性の面で心配がない上に、性質の安定した製品を安価に、かつ多量に生産することができる。
さらに、ｖｅｒｏ毒減弱作用を付与した機能性食品を日常的に摂取することによって、食中毒やＯ−１５７毒素に起因する疾病を予防することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】２株のラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ　クレモリスについて、ｖｅｒｏ毒作用減弱活性の測定結果を示した図である。
【図２】培養期間におけるｖｅｒｏ毒作用減弱活性の経時的な変化を示した図である。
【図３】抽出溶剤として酢酸エチルを用いて得た抽出物についてのｖｅｒｏ毒作用減弱活性の測定結果を示す図である。
【図４】抽出溶剤としてブタノールを用いて得た抽出物についてのｖｅｒｏ毒作用減弱活性の測定結果を示した図である。
【図５】実施例４における１Ｈ　ＮＭＲ　（４００Ｍｚ，重アセトニトリル中）　の結果を示した図である。
【図６】実施例４における１３Ｃ　ＮＭＲ　（１００Ｍｚ，　重アセトニトリル中）　の結果を示した図である。
【図７】実施例４におけるマススペクトル（ｍ／ｚ　８９　、（Ｍ−１）　−　）　結果を示した図である。
【図８】実施例７における熱安定性試験の結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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