(57)【要約】【課題】化粧用または皮膚薬用組成物およびこれらの使用を提供する。【解決手段】水系媒質に不溶性の酵素を少なくとも一種の化粧的または皮膚薬的に許容し得る賦形剤と混合して含む化粧用または皮膚薬用組成物、特に抗しわ化粧用または皮膚薬用組成物である。この組成物は、主に、局所使用の際に刺激および／またはアレルギーの反応を制限するのに使用される。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水系媒質に不溶性であり、少なくとも一種の酵素を、少なくとも一種の化粧的または皮膚薬的に許容し得る賦形剤と混合して含むことを特徴とする化粧用または皮膚薬用組成物。
【請求項２】
前記酵素は、リパーゼ、酸化還元酵素、カルボヒドラーゼ、およびプロテアーゼからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記酵素は、サブチリシン、トリプシン、キモトリプシンまたはサーモリシンのようなプロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、α−アミラーゼもしくはβ−アミラーゼまたはグルコアミラーゼのようなアミラーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、セレブロシダーゼ、スーパーオキサイド・ジスムターゼ、ペルオキシダーゼおよびリポキシゲナーゼからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
前記酵素は、結晶化され、かつ架橋された酵素、または不溶性ポリマー上に接合された酵素、または粒子、好ましくはマイクロメーターもしくはナノメーター級の粒子であって、好ましくは球、カプセルまたはスポンジである粒子上に接合された酵素であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記不溶性ポリマーまたは粒子は、それらの表面上に前記酵素と共有結合を形成するのに使用できる少なくとも一種の修飾可能な化学官能基を有し、例えば前記粒子は一種のセルロース、一種のポリスチレン、一種のアルキルシアノアクリレート、一種のシリカ、一種のナイロン、一種のポリアミド（合成、または天然ポリアミド由来）、一種のポリエステル（合成、または天然ポリエステル由来）、またはそれらの混合物の一種を少なくとも含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記結晶化され、かつ架橋された酵素が０．２〜５０μｍ、好ましくは１〜５μｍの大きさを持つ結晶を形成することを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項７】
前記賦形剤は、ブチレングリコール、水、ステアレス−２、ステアレス−２１、グリコール−１５・ステアリル・エーテル、セテアリルアルコール、フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ブチレングリコール、天然トコフェロール、グリセロール、ジヒドロキシセチルナトリウム、イソプロピル・ヒドロキシセチル・エーテル、グリコール・ステアレート、トリイソノナオイン、オクチル・ココエート、ポリアクリルアミド、イソパラフィン、ラウレス−７、カルボマー、プロピレングリコール、グリセロール、ビスアボロール、ジメチコン、水酸化ナトリウム、香料、ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアレート、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、セテアリル・オクタノエート、ジブチル・アジペート、ブドウ種子油、ホホバ油、硫酸マグネシウム、ＥＤＴＡ、シクロメチコン、キサンタンガム、クエン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、ミネラルワックスおよび鉱油、イソステアリル・イソステアレート、プロピレングリコール・ジペラルゴネート、プロピレングリコール・イソステアレート、ＰＥＧ８−ミツロウ、水素化ヤシ心材油グリセリド、水素化ヤシ油グリセリド、ラノリン油、ゴマ油、セチル・ラクテート、ラノリンアルコール、ヒマシ油、二酸化チタン、着色剤、および顔料からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、水系または油系である溶液、水系クリームもしくはゲルまたは油系ゲル、特にポットまたはチューブ入りのもの、特にシャワージェル、シャンプー；乳液；エマルジョン、マイクロエマルジョンもしくはナノエマルジョン、特に水中油型もしくは油中水型もしくは複合もしくはシリコーン含有マイクロエマルジョンまたはナノエマルジョン；ローション、特にガラス瓶、プラスチック瓶もしくは計量瓶入りのもの、またはエーロゾルのもの；アンプル；液状石鹸；皮膚科用棒石鹸（dermatological bar）；軟膏；フォーム；無水製品、好ましくは液状、ペースト状もしくは固形無水製品、例えばスティックの形態、特にリップスティックの形態のものからなる群から選ばれる形態に配合されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記酵素は、水相に不溶性の粒子またはポリマー上に共有結合により接合されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記酵素は、カルボジイミドのような二官能性剤で活性化することにより接合すべき酵素と反応するように調製されている球上に接合されていることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記結晶化され、かつ架橋された酵素は、グルタルアルデヒドで架橋されていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、少なくとも一種の有効成分（不溶性の形態の酵素以外）をさらに含み、前記酵素の存在により少なくとも前記有効成分の経皮浸透が促進されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
好ましくは請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化粧用または皮膚薬用組成物を形成するように化粧的または皮膚薬的に許容し得る賦形剤と混合した水系媒質に不溶性である酵素の、化粧的または皮膚薬的ケアを行うための使用。
【請求項１４】
前記酵素の局所使用の際の刺激および／またはアレルギー反応を制限するための請求項１２に記載の水系媒質に不溶性である酵素の使用。
【請求項１５】
特に皮膚および／または毛髪のケラチンのケラチン合成細胞の増殖作用を強化して、特に明色化（lightening）効果を得るための使用であって、好ましくは前記酵素は、プロテアーゼである請求項１２または１３に記載の水系媒質に不溶性である酵素の使用。
【請求項１６】
抗しわ効果を奏するための請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の水系媒質に不溶性である酵素の使用。
【請求項１７】
皮膚バリアーの再構築を促進して、バリアー効果を得るための請求項１２または１３のいずれか一項に記載の水系媒質に不溶性である酵素の使用であって、好ましくは前記酵素は、リパーゼまたはアミラーゼである使用。
【請求項１８】
油性肌に局所適用することにより過剰な皮脂を除去し、皮膚が光る効果を消失させるための請求項１２または１３のいずれか一項に記載の水系媒質に不溶性である酵素の使用であって、好ましくは前記酵素は、リパーゼである使用。
【請求項１９】
乾燥肌の治療を促進するための請求項１２または１３のいずれか一項に記載の水系媒質に不溶性である酵素の使用であって、好ましくは前記酵素は、プロテアーゼまたはアミラーゼである使用。
【請求項２０】
酵素を含み、少なくとも一種の有効成分(不溶性形態の前記酵素以外)を含む化粧用もしくは皮膚薬用組成物であって、前記組成物中に含まれる少なくとも前記有効成分の経皮浸透を増加させるための、請求項１２または１３のいずれか一項に記載の酵素を含む化粧用または皮膚薬用組成物の使用。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化粧用組成物を局所適用することを含むことを特徴とする化粧的ケア方法。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の皮膚薬用組成物を局所適用することを含むことを特徴とする皮膚薬的ケア方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は水系媒質に不溶性の酵素を、少なくとも一種の化粧的または皮膚薬的に許容し得る賦形剤と混合して含む化粧用または皮膚薬用組成物およびそれらの使用に関する。
【０００２】
本発明は、主に上述のような組成物の局所使用中の刺激および／またはアレルギー反応を制限するための使用に関する。
【０００３】
【従来の技術】
過去何年もの間、α−ヒドロキシ酸類（ＡＨＡ）は、化粧品業界では主に「抗しわ」剤として用いられている。数多くの研究により、ＡＨＡはそれらの水和力により表皮の上層が水を摂取することができるようにし、それにより角質細胞間の凝集力の低下がもたらされることが示された（ファン・スコット他(Van Scottet al.)，「ジャーナル・オブ・アメリカン・アカデミー・オブ・ダーマトロジー(Journal of American Academy of Dermatology)」，米国，１９８４年，第１１巻，ｐ．８６７−８７９（非特許文献１）；ズー・ドレロス(Zoe Draelos)，「コスメティック・ダーマトロジー(Cosmetic Dermatology)」，米国，２０００年，第１０巻，ｐ．５１−５７（非特許文献２）参照）。
【０００４】
有効性が非常に高いにもかかわらず、ＡＨＡは強い角質溶解活性を有する他の製品（サリチル酸、果物酸）と全く同様に、激しい刺激反応を誘発することがあり、これらの刺激反応は時には角質溶解効果を得るのに必要な用量よりも少ない用量で現れ得る（スラビン(Slavin)，「クリニカル・プラスチック・サージャリー(Clinical Plastic Surgery)」，米国，１９９８年，第２５巻，ｐ．４５−５２（非特許文献３）参照）。
【０００５】
角質溶解活性物を開発する他のアプローチ・ルートは、プロテアーゼまたはリパーゼのような酵素を使用することである。実際、正常なヒトの皮膚にはタンパク質分解活性を有する二種の酵素が皮膚剥離の過程に関与しており、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）および角質層トリプシン酵素（ＳＣＴＥ）とがある（ルントシュトレーム(Lundstroem)他，「アクタ・デルマトロギア・ベネレオロギカ(Acta Dermato-Venereologica)」，ノルウェー国，１９９１年，第４１巻，ｐ．４７１−４７４（非特許文献４）；エクホルム(Ekholm)他，「ザ・ジャーナル・オブ・インベスチゲイティブ・ダーマトロジー(The Journal of Investigative Dermatology)」，米国，２０００年，第１１４巻，ｐ．５６−６３（非特許文献５）参照）。従って、皮膚剥離現象を促進するのにプロテアーゼのような酵素を使用することは、これらの酵素が皮膚表面に生理学的に存在するので当然である、またはリパーゼまたはグリコシダーゼのような酵素を使用して脂質または糖類の有機的構造を破壊して皮膚剥離の効果を増大し、最終的にケラチン合成細胞の増殖作用の強化を誘発し、抗しわ効果を誘発するのは当然であるように見える。
【０００６】
しかしながら、化粧品では酵素類の使用はほとんど不可能である。なんとなれば、酵素類はすべて水系媒質中では一般に使用されているエージング試験の温度（４５℃）で不安定である、かつ酵素類はすべて一般にヒトの皮膚がよく耐えられないからである（刺激やアレルギーはこの非耐性の明白な臨床的徴候である）。このように、例えば、プロテアーゼは水系媒質中では特に不安定であるが、その理由は、それらのタンパク質の構造により水の存在下で自己溶解する（それ自体加水分解する）からである。ある著者は指向性突然変異誘発により自己溶解されたペプチド部位を修飾すること（バラリエイ(Varallyay)，「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochemical and Biophysical Research Communications)」，米国，１９９８年，第４巻，第２４３号，ｐ．５６−６０（非特許文献６）；ファン・デン・ブルク(Van den Burg)，「バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー(Boptechnology and Applied Biochemistry)」，１９９８年，第２７巻，ｐ．１２５−１３２（非特許文献７）参照）、酵素を溶解性ポリマーと共有結合させることにより該酵素を固定化すること（リー(Lee)他，「バイオテクノロジー・プログレス(Biotechnology Progress)」，米国，１９９８年，第１４巻，第3号，ｐ．５０８−５１６（非特許文献８）参照）、または酵素を疎水性相中に懸濁して水相をエマルジョンから分離すること（米国特許第５，８１１，８１２号明細書（米国特許出願１９９７年第８６６９１６号））（特許文献１）さえも提案している。
【０００７】
第二の問題は酵素、特にプロテアーゼを皮膚の表面に適用することにより惹起される非常に高いアレルゲン性である（ペプシ(Pepsy)他，「クリニカル・アラジー(Clinical Allergy)」，英国，１９８５年，第１５巻，ｐ．１０１−１１５（非特許文献９）；ソト−メラ(Soto-Mera)他，「アラジー(Allergy)」，デンマーク国，２０００年，第５５巻，ｐ．９８３−９８４（非特許文献１０）参照）。観察された不耐性の現象は、それらの現象が酵素類の精製が不完全であることに起因していようと、またはそれらの現象が使用した酵素類の加水分解または自己溶解により生成されたフラグメントに起因していようと、使用した酵素溶液中に存在する溶解性ペプチド類の浸透が顕著であることと多分関連しており、その場合には、該ペプチド類は強い免疫源性を有していることになる。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許第５，８１１，８１２号明細書（米国特許出願１９９７年第８６６９１６号）
【非特許文献１】
ファン・スコット他(Van Scott et al.)，「ジャーナル・オブ・アメリカン・アカデミー・オブ・ダーマトロジー(Journal of American Academy of Dermatology)」，米国，１９８４年，第１１巻，ｐ．８６７−８７９
【非特許文献２】
ズー・ドレロス(Zoe Draelos)，「コスメティック・ダーマトロジー(Cosmetic Dermatology)」，米国，２０００年，第１０巻，ｐ．５１−５７
【非特許文献３】
スラビン(Slavin)，「クリニカル・プラスチック・サージャリー(Clinical Plastic Surgery)」，米国，１９９８年，第２５巻，ｐ．４５−５２
【非特許文献４】
ルントシュトレーム(Lundstr・m)他，「アクタ・デルマトロギア・ベネレオロギカ(Acta Dermato-Venereologica)」，ノルウェー国，１９９１年，第４１巻，ｐ．４７１−４７４
【非特許文献５】
エクホルム(Ekholm)他，「ザ・ジャーナル・オブ・インベスチゲイティブ・ダーマトロジー(The Journal of Investigative Dermatology)」，米国，２０００年，第１１４巻，ｐ．５６−６３
【非特許文献６】
バラリエイ(Varallyay)，「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochemical and Biophysical Research Communications)」，米国，１９９８年，第４巻，第２４３号，ｐ．５６−６０
【非特許文献７】
ファン・デン・ブルク(Van den Burg)，「バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー(Boptechnology and Applied Biochemistry)」，１９９８年，第２７巻，ｐ．１２５−１３２
【非特許文献８】
リー(Lee)他，「バイオテクノロジー・プログレス(Biotechnology Progress)」，米国，１９９８年，第１４巻，第3号，ｐ．５０８−５１６
【非特許文献９】
ペプシ(Pepsy)他，「クリニカル・アラジー(Clinical Allergy)」，英国，１９８５年，第１５巻，ｐ．１０１−１１５
【非特許文献１０】
ソト−メラ(Soto-Mera)他，「アラジー(Allergy)」，デンマーク国，２０００年，第５５巻，ｐ．９８３−９８４
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は酵素を含むときにいささかの刺激またはアレルギーの問題もなく使用することが可能である化粧用または皮膚薬用組成物を提供することからなる新規な技術的問題を解決することである。
【００１０】
本発明の他の目的は酵素を含む抗しわ効果を有する化粧用または皮膚薬用組成物を提供することからなる新規な技術的課題を解決することである。
【００１１】
本発明の他の目的はケラチン合成細胞の増殖作用の強化および皮膚の明色化(lightening)を促進する化粧用または皮膚薬用組成物を提供することからなる新規な技術的課題を解決することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、皮膚バリアーの再構築を促進する、酵素を含む化粧用または皮膚薬用組成物を提供することからなる新規な技術的課題を解決することである。
【００１３】
さらに、本発明の他の目的は、乾燥肌または油性肌の治療を可能にする、酵素を含む化粧用または皮膚薬用組成物を提供することからなる新規な技術的課題を解決することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
これらの技術的課題のすべてが本発明によりはじめて同時に解決される。
【００１５】
このように、本発明の文脈において、特に意外な態様で、水系媒質に不溶性の酵素類が化粧用または皮膚薬用組成物に特に刺激やアレルギーの問題なしに使用できることが発見された。
【００１６】
従って、第一の態様において、本発明は水系媒質に不溶性である少なくとも一種の酵素を、少なくとも一種の化粧的または皮膚薬的に許容し得る賦形剤と混合して含む化粧用または皮膚薬用組成物に関する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
「賦形剤」とは、本発明者によれば、不溶性の形態の酵素である有効成分以外の成分のすべてを意味する。
【００１８】
この酵素は、リパーゼ、酸化還元酵素、カルボヒドラーゼ、およびプロテアーゼからなる群から選ばれるのが好適である。
【００１９】
この酵素はサブチリシン、トリプシン、キモトリプシンまたはサーモリシンのようなプロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、α−アミラーゼもしくはβ−アミラーゼまたはグルコアミラーゼのようなアミラーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、セレブロシダーゼ、スーパーオキサイド・ジスムターゼ、ペルオキシダーゼおよびリポキシゲナーゼからなる群から選ばれるのが好適である。
【００２０】
本発明が網羅する実施形態のすべてのうちから、本発明者は以下の本発明の３つの特定の実施形態を推奨する：
−第１の好適な実施形態は、酵素を結晶化して不溶性タンパク質結晶を形成し、ついでこれらの結晶を例えばグルタルアルデヒドにより化学的に架橋してこれらの粒子を不溶化し、かつそれらを水系媒質に不溶性にすることからなる。
−第２の好適な実施形態は、酵素を水系媒質に不溶性であるように選ばれたポリマー上に接合することからなる。
−第３の好適な実施形態は、酵素を粒子、好ましくはマイクロメーターまたはナノメーター級の粒子であって、好ましくは球、カプセルまたはスポンジであり、すべて水系媒質に不溶性である粒子上に接合することからなる。
【００２１】
これらのポリマーまたはこれらの粒子は、水系媒質に不溶性であり、それらの表面上に少なくとも一種の修飾可能な化学官能基を有し、この官能基が酵素と共有結合を形成するのに使用できるのが好適である。例えば、これらのポリマーまたはこれらの粒子は下記のものの少なくとも一種：すなわち、一種のセルロース、一種のポリスチレン、一種のアルキルシアノアクリレート、一種のシリカ、一種のナイロン、一種のポリアミド（合成、または天然ポリアミド由来）、一種のポリエステル（合成、または天然ポリエステル由来）、またはそれらの混合物の一種を含む。
【００２２】
本発明の文脈において、球は、米国特許第５，３９５，６２０号明細書、フランス国特許第２，６８３，１５９号（米国特許第６，３０３，１５０号）明細書、国際公開第９４／０４２６１号（米国特許第号５，６９１，０６０号）明細書、米国特許第５，９１２，０１６号明細書、フランス国特許第２，７８０，９０１号（米国特許第６，１９７，７５７号）明細書、フランス国特許第２，７０３，９２７号（米国特許第５，６３５，６０９号）明細書に記載されているような球であり得る。
【００２３】
上記第１の実施形態について、結晶化され、かつ架橋された酵素は結晶の形態である。これらの結晶は０．２〜５０μｍ、好ましくは１〜５μｍの大きさを持つ。これらの結晶は特に針状または卵形の形態を有し、上記の大きさはそれらの最大の大きさに相当する。
【００２４】
これらの結晶は、特に架橋による酵素の結晶の不溶化技術により、他の点に関しては文献に記載されているように形成される（「架橋酵素結晶」、「トレンズ・イン・バイオテクノロジー（ＴＩＢＴＥＣＨ）」，１９９６年，第１４巻，第７（１５０）号，ｐ．２１９−２５９）。
【００２５】
これらの結晶はゲル、特に皮膚および／または頭皮、および／または毛髪に対して許容し得るゲル中に希釈して化粧用または皮膚薬用組成物を調製するのが好ましい。
【００２６】
好適には、賦形剤は、ブチレングリコール、水、ステアレス−２、ステアレス−２１、グリコール−１５・ステアリル・エーテル、セテアリルアルコール、フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ブチレングリコール、天然トコフェロール、グリセロール、ジヒドロキシセチルナトリウム、イソプロピル・ヒドロキシセチル・エーテル、グリコール・ステアレート、トリイソノナオイン、オクチル・ココエート、ポリアクリルアミド、イソパラフィン、ラウレス−７、カルボマー、プロピレングリコール、グリセロール・ビスアボロール、ジメチコン、水酸化ナトリウム、香料、ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアレート、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、セテアリル・オクタノエート、ジブチル・アジペート、ブドウ種子油、ホホバ油、硫酸マグネシウム、ＥＤＴＡ、シクロメチコン、キサンタンガム、クエン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、ミネラルワックスおよび鉱油、イソステアリル・イソステアレート、プロピレングリコール・ジペラルゴネート、プロピレングリコール・イソステアレート、ＰＥＧ８−ミツロウ、水素化ヤシ心材油グリセリド、水素化ヤシ油グリセリド、ラノリン油、ゴマ油、セチル・ラクテート、ラノリンアルコール、ヒマシ油、二酸化チタン、着色剤、および顔料からなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む。
【００２７】
好適には、上記の組成物は、水系または油系である溶液、水系クリームもしくはゲルまたは油系ゲル、特にポットまたはチューブ入りのもの、特にシャワージェル、シャンプー；乳液；エマルジョン、マイクロエマルジョンもしくはナノエマルジョン、特に水中油型もしくは油中水型もしくは複合もしくはシリコーン含有マイクロエマルジョンまたはナノエマルジョン；ローション、特にガラス瓶、プラスチック瓶もしくは計量瓶入りのもの、またはエーロゾルのもの；アンプル；液状石鹸；皮膚科用棒石鹸（dermatological bar）；軟膏；フォーム；無水製品、好ましくは液状、ペースト状もしくは固形無水製品、例えばスティックの形態、特にリップスティックの形態のものからなる群から選ばれる形態に配合される。
【００２８】
好適には、酵素は水相に不溶性の粒子またはポリマー上に共有結合により接合される。
【００２９】
好適には、酵素は、カルボジイミドのような二官能性剤で活性化することにより接合すべき酵素と反応するように調製されている球上に接合される。
【００３０】
一般に、これらの粒子上に酵素を接合する際に用いられるポリマーまたは粒子は、活性化剤により活性化することができる。この活性化は主にポリマーまたは粒子の外表面上に存在する化学的機能を活性化することからなる。
【００３１】
好適には、結晶化され、架橋された酵素はグルタルアルデヒドで架橋されている。
【００３２】
一般に、かつ意外にも、本発明者は本発明を実現する際に、酵素の不溶化時に精製工程が得られること、および可溶性の形態で使用されるアレルゲン性酵素がひとたび不溶性の形態で使用されると全く低アレルゲン性になることをも示した。
【００３３】
さらに、酵素を不溶性の形態で使用するとこのように修飾された酵素の酵素活性を安定化することが可能となり、かつこれによりそれらの化粧用途および皮膚薬用途における使用を予想することができる。
【００３４】
水系媒質に不溶性にした酵素は、皮膚の耐性の系統的な改善を可能にするとともに、これらの酵素を化粧用または皮膚薬用配合剤、特に通常はそれらが用いられない低アレルゲン性の化粧用または皮膚薬用配合剤において使用する可能性を与える。
【００３５】
意外にも、上述の化粧用または皮膚薬用組成物が少なくとも一種の有効成分（不溶性の形態の酵素以外）を含むときは、この酵素は少なくともこの有効成分の経皮浸透を改善することを可能とする。
【００３６】
従って、本発明は、第二の態様として、好ましくは上述のような化粧用または皮膚薬用組成物を形成するように化粧的または皮膚薬的に許容し得る賦形剤と混合した、水系媒質に不溶性である酵素の、化粧的または皮膚薬的ケアを行うための使用に関する。
【００３７】
有利なことに、この酵素は、化粧用または皮膚薬用組成物を形成するために混合したものであるのが好ましく、局所使用の際の刺激および／またはアレルギー反応を制限するのに使用できる。
【００３８】
有利なことに、この酵素またはそれを含む化粧用もしくは皮膚薬用組成物の使用は、特に皮膚および／または毛髪のケラチンのケラチン合成細胞の増殖作用の強化を行うことを可能とし、特に皮膚を明色化することができ、この酵素はプロテアーゼであるのが好ましい。
【００３９】
有利なことに、この酵素またはそれを含む化粧用もしくは皮膚薬用組成物は、抗しわ効果を奏するために使用することができる。
【００４０】
有利なことに、この酵素またはそれを含む化粧用もしくは皮膚薬用組成物は、皮膚バリアーを再構築してバリアー効果を得るのに用いることができ、この酵素はリパーゼまたはアミラーゼであるのが好ましい。
【００４１】
有利なことに、この酵素またはそれを含む化粧用もしくは皮膚薬用組成物は、油性肌に局所適用することにより過剰な皮脂を除去し、皮膚が光る効果を消失させることができ、この酵素はリパーゼであるのが好ましい。
【００４２】
有利なことに、この酵素またはそれを含む化粧用もしくは皮膚薬用組成物は、鱗屑の消失を可能とし、乾燥肌に局所適用することにより正常な状態への復帰を可能とし、この酵素はプロテアーゼまたはアミラーゼであるのが好ましい。
【００４３】
有利なことに、この酵素および少なくとも一種の有効成分(不溶性形態のこの酵素以外)を含む化粧用もしくは皮膚薬用組成物は、この組成物中に含まれる少なくともこの有効成分の経皮浸透を増加させることができる。
【００４４】
第３の態様として、本発明は上記のような酵素または化粧用組成物を局所適用することを含む化粧的ケア方法に関する。
【００４５】
第４の態様として、本発明は上記のような酵素または皮膚薬用組成物を局所適用することを含む皮膚薬的ケア方法に関する。
【００４６】
特に、本発明のすべての態様について、この局所適用は特に皮膚および／または頭皮、および／または毛髪への外部適用に関する。
【００４７】
本発明の他の目的、特徴および利点は、単に説明のために示され本発明の範囲を何ら限定しない実施例を参照して詳細な説明を読む際に当業者には明白であろう。
【００４８】
実施例は本発明の一部分を成し、実施例を含む説明全体から従来の技術水準に対して新規であると思われるいかなる特徴も、その機能および一般性において本発明の一部分を成す。
【００４９】
従って、すべての実施例は包括的な範囲を有する。
【００５０】
さらに、実施例において、特に指示しない限り％はすべて重量により、周囲温度は特に指示しない限り℃であり、圧力は特に指示しない限り気圧である。
【００５１】
【実施例】
実施例1: 不溶性結晶化形態のプロテアーゼ
まず、サブチリシンを結晶化すると、不純物を除去することができ、ついでこの結晶形態をグルタルアルデヒドによりタンパク質を架橋することにより安定化する。使用した技法は「トレンズ・イン・バイオテクノロジー（ＴＩＢＴＥＣＨ）」，１９９６年，第１４巻，第７（１５０）号，ｐ．２１９−２５９のような種々の刊行物に記載されているものである。
【００５２】
このようにして得られたタンパク質の結晶は水系媒質に完全に不溶性である。この方法により、酵素分子それ自体の間の相互作用が低減され、酵素の活性部位により認識される開裂部位の数が減少する。このようにしてプロテアーゼの自己溶解は低減され、従ってそれにより水系媒質中で非常に良好な酵素安定性を得ることができる。
【００５３】
このようにして得られた結晶は、０．２〜５０μｍの大きさを持ち、そのため皮膚組織の深い層に浸透することができず、それにより従来、遊離酵素を使用したときに観察される不耐性の反応が制限または除去される。
【００５４】
ゲルは、上記結晶をｐＨ＝５．８に予備緩衝（１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ＣａＣｌ2  ２０ｍＭ）した０．５％キサンタンゲル中で１０％の濃度になるように希釈することにより形成する。全体を１０分間機械撹拌し、次いで２％の防腐剤を添加して生成物を細菌学的に安定化する。
【００５５】
本発明の有効性をまず第一にＤＨＡを用いた試験により評価し、一般に用いられているα−ヒドロキシ酸、グリコール酸と比較した。手短にいうと、この試験の原理は次の通りである。２０人のボランティアの前腕の４つの領域をＤＨＡ５％を含む化粧品を用いて１日２回３日間処置した。ＤＨＡと皮膚のタンパク質との反応の結果強い着色が誘発される。種々の角質溶解配合剤を毎日適用の下、消失するこの着色を彩度測定法（chromametric method）（ミノルタ・クロマメーター（Minolta Chromameter）)を用いて追跡し、比較することができる。
【００５６】
上記ゲル２％を含む配合剤を使用すると、対照領域に対してメラニン指数を１６％低下させることができる。この低下はプラセボ・クリームで処置した後に観察されたものよりも１８３％大きく、グリコール酸３％を含むクリームで処置した後に観察されたものよりも１２８％大きい。本発明のゲルを含む配合剤は、従って、落屑性を有することで周知である角質溶解活性物であるグリコール酸３％を含む配合に対して２倍有効である。
【００５７】
このように上述の角質溶解効果から必然的に生じる抗しわ効果を、第２のシリーズの実験において評価した。実施例１で調製したゲル２％を含む配合剤を２８日間２０人のボランティアに適用した後、外観としわの発展を「ケノポジウム」油中のシリコーン型により検討したところ、プラセボ配合剤を施した対照領域に比べて大きく低下した（１５日間処置後  −３０％）。
【００５８】
モルモットにおける皮膚感作能力の評価
上述のゲルを、ＯＥＣＤの第４０６号指令に従ったプロトコルであるマグヌッソン(Magnusson)およびクリーグマン(Kligmann)により記載された最大化試験にかけた。
【００５９】
そのまま（１００％）使用した場合、ゲルを皮膚との接触により非感作性である（低アレルゲン性、クラスＩ）と分類し、この試験の同じ酵素をそのままの形態（すなわち、非−不溶化形態）で使用した場合、「非常に感作性」であると分類する。
【００６０】
実施例２：化粧用ゲルに導入後の不溶性結晶のプロテアーゼ活性の測定
２．１  ｉｎ  ｖｉｖｏで遭遇する状況をなるべく正確に再現するように、本発明者は高分子量の基質：カゼインを使用するプロテアーゼ活性測定法を用いる。
【００６１】
実際には、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．５に希釈した濃度０．６６％（ｗ／ｖ）のカゼイン溶液を、本発明の実施例１の不溶性架橋結晶の存在下、または市販のプロテアーゼの存在下に置き、これらを（実施例１に記載したような）ゲルに懸濁する（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液／５ｍＭ酢酸カルシウムに希釈、ｐＨ＝７．５）。
【００６２】
３７℃で１０分間インキュベートした後、酵素反応の際の反応媒質中の遊離アミノ酸を濾過により回収し、次いでフォリン試薬により測定する。この試薬はとりわけチロシン、トリプトファン、システインおよびヒスチジンが減少すると６６０ｎｍにおいて吸収する。その場合、酵素活性は反応媒質の６６０ｎｍにおける吸収に直接比例する（フォリン(Folin)他，「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(The Journal of Biological Chemistry)」，米国，１９２９年，第７３巻，ｐ．６２７；アンソン(Anson)他，「ザ・ジャーナル・オブ・ジェネラル・フィジオロジー(The Journal of General Physiology)」，米国，１９３８年，第２２巻，ｐ．７９−８９）。結果を表１に示す。
【００６３】
【表１】
2004196763.tif 000002
【００６４】
２．２  不溶性架橋結晶化サブチリシン（以下、「サブチリシン結晶」と呼ぶ）を含む実施例１のゲルと、市販のサブチリシン（バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)から抽出）を含むゲルを４℃、２０℃、および４５℃に置く。プロテアーゼ活性の測定は上述の技法により行う。
【００６５】
得られた結果は、測定活性値対Ｔ＝０における当初活性値の％で与えられるが、それらは以下の各表に示す通りである。
【００６６】
【表２】
2004196763.tif 000003
【００６７】
従って、本発明は貯蔵温度にかかわらず、非常に高い酵素安定性を有する。
【００６８】
実施例３：その他の架橋結晶化酵素
リパーゼとグルコシダーゼも精製し、次いで結晶化し、さらに化学的に架橋することができ、それにより不溶性粒子を得る。
【００６９】
このように、発酵により調製したリパーゼまたはアミラーゼを結晶として不溶化し、次いで化粧用途に使用することが可能であった。
【００７０】
得られた化粧効果を１５人の一連のボランティアについて評価した。皮膚科医の作成した等級は、抗しわ結果、油性肌、および１０％ラウリル硫酸ナトリウムで攻撃した後正常化された皮膚の格付けであった。格付けは下記の通りである。効果なし（−）〜非常に有効（＋＋＋）；ｎｕｈ：アレルギーの問題のためにヒトには使用不可。
【００７１】
【表３】
2004196763.tif 000004
【００７２】
実施例４：水相に不溶性の粒子上への酵素のグラフティング
セレブロシダーゼを次のようにして粒子に接合することができる。すなわち、コレティカ(COLETICA)社の米国特許第５，３９５，６２０号明細書、フランス国特許第２，６８３，１５９号（米国特許第６，３０３，１５０号）明細書、国際公開第ＷＯ９４／０４２６１号（米国特許第号５，６９１，０６０号）明細書、米国特許第５，９１２，０１６号明細書、フランス国特許第２，７８０，９０１号（米国特許第６，１９７，７５７号）明細書、フランス国特許第２，７０３，９２７号（米国特許第５，６３５，６０９号）明細書に記載されているような球をｐＨ４〜８に保った水溶液中でカルボキシジイミド（球１０ｇに対して１〜３０ｇ）と反応させて「反応性」カルボキシル基の形成を活性化した。次いで接合しようとする酵素をこの反応生成物と接触させ、１〜２４時間、４〜６０℃の温度でグラフティングを行った後、反応生成物を単なる濾過またはデカンテーションにより洗浄し、次いでその反応媒質から分離してから、マーケティングを容易にするためにゲルに懸濁した。
【００７３】
同様に、発酵により調製したリパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼを不溶性粒子の形態に不溶化し、次いで化粧用途に使用することができた。
【００７４】
得られた化粧効果を１５人の一連のボランティアについて評価した。皮膚科医の作成した等級は、抗しわ結果、油性肌、および１０％ラウリル硫酸ナトリウムで攻撃した後、正常化された皮膚の格付けであった。格付けは下記の通りである。
効果なし（−）〜非常に有効（＋＋＋）；ｎｕｈ：アレルギーの問題のためにヒトには使用不可。
【００７５】
【表４】
2004196763.tif 000005
【００７６】
実施例５：水相に不溶性の粒子上へのβ−Ｄ−グルコシダーゼの接合
実施例５ａ：  スイートアーモンドから抽出したβ−Ｄ−グルコシダーゼ（Sigma）を下記の３段階を含むプロトコルにより不溶性粒子に接合した。
−コレティカ社の米国特許第５，３９５，６２０号明細書の記載に従って調製される不溶性粒子の調製のために使用するタンパク質のカルボキシル官能基を活性化する段階。この工程は、１０ｍＭヘペス(hepes)緩衝液、ｐＨ７．５に溶解した１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Sigma）０．４ｇを栓子(plug)としてのマイクロスフェアー１００ｇに添加することにより行った。この溶液を周囲温度で１時間撹拌し、次いで球を２，３００ｒｐｍで３分間遠心して回収した。この栓子を１０ｍＭヘペス緩衝液、ｐＨ７．５で３回洗浄した。
−酵素と結合する段階、ここではβ−Ｄ−グルコシダーゼを０．１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ８．５に０．０４％の含有量で添加溶解する。
−この溶液を周囲温度で１時間撹拌する。
−洗浄段階、遊離酵素を除去する目的：溶液を２，３００ｒｐｍで３分間遠心し、次いで上清を除去する。酵素を接合した球を０．１Ｍ酢酸塩緩衝液、ｐＨ６．２で３回洗浄する。
この洗浄した接合された球を０．１Ｍ酢酸塩緩衝媒質、ｐＨ６．２に含有量が２０％となるように溶解した。
【００７７】
接合による酵素の安定化の証明
実施例５ａから得た生成物をβ−Ｄ−グルコシダーゼ活性について測定し、次いで２０℃および４５℃にして、これら２種類の温度において酵素活性の経時安定性を検討した。遊離酵素、すなわちスイートアーモンド由来のβ−Ｄ−グルコシダーゼを０．１Ｍ酢酸塩緩衝液、ｐＨ６．２に同じ濃度で溶解することにより構成されるサンプルを調製し、２０℃および４５℃で安定性を試験した。
【００７８】
測定原理：
β−Ｄ−グルコシダーゼ活性の測定は、プローブである４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコピラノシド（Molecular Probes）を用いた蛍光測定技法により行った。これは、酵素により加水分解されると、オリゴ糖と、励起および発光波長がそれぞれ３６０／４６０ｎｍの蛍光性を有する化合物である４−メチルウンベリフェロンとを放出することを可能にする。
【００７９】
得られた結果はｔ＝０において測定した活性に対する活性（％）で表されている。
【００８０】
【表５】
2004196763.tif 000006
【００８１】
球への酵素の接合により、１００％活性が２０℃で１か月経過後に得られたので２０℃における酵素活性の安定化が可能となり、また遊離酵素に対して観察されたものに対して４５℃における活性損失の低速化が可能となった。
【００８２】
配合剤中に導入後のサンプルの安定性：
使用したクリームの構成は次の通りである：
2004196763.tif 000007
【００８３】
クリーム中に導入されたサンプルのβ−Ｄ−グルコシダーゼ活性の測定を、下記のプロトコルにより水相および油相を分離した後に得られた水相で直接行った。すなわち、クリームを０．１Ｍクエン酸緩衝液／０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム、ｐＨ５に５倍希釈し、次いで１０％ＮａＣｌを添加し、混合物を５分間非常に強く撹拌し、次いで５，０００ｒｐｍで２５分間遠心分離した。活性の測定を得られた水相で直接行った。
【００８４】
【表６】
2004196763.tif 000008
【００８５】
２０℃において測定したこれらの配合剤の酵素活性は安定していたが、これは球に接合された酵素について２０℃で１か月経過後に約９０％の活性が保存されていたからである。
【００８６】
実施例５ｂ：
β−Ｄ−グルコシダーゼまたは任意の他の市販酵素を上述の実施例５ａのプロトコルの不溶性粒子上に接合した。ただし、不溶性粒子としては下記のタイプのもの：すなわち、表面に酵素の化学官能基と共有結合を形成するのに使用可能な修飾可能な化学官能基をする、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、アルキルシアノアクリレートビーズ、ナイロンビーズ、シリカビーズ、ポリアミドビーズ、ポリエステルビーズまたは任意のビーズを使用し、好ましくはこれらの化学官能基または上記化学官能基間の反応を可能にする二官能性剤を使用した。
【００８７】
実施例６：水中油型エマルジョンの化粧用または皮膚薬用配合剤における本発明の製品の使用
【００８８】
【表７】
2004196763.tif 000009
【００８９】
【表８】
2004196763.tif 000010
【００９０】
【表９】
2004196763.tif 000011
【００９１】
本発明の実施例７：油中水型配合剤における本発明の製品の使用
【００９２】
【表１０】
2004196763.tif 000012
【００９３】
本発明の実施例８：シャンプーまたはシャワージェル型の配合剤における本発明の製品の使用
【００９４】
【表１１】
2004196763.tif 000013
【００９５】
本発明の実施例９：リップスティック型その他の無水製品の配合剤における本発明の製品の使用
【００９６】
【表１２】
2004196763.tif 000014
【００９７】
本発明の実施例１０：水性ジェルの配合剤における本発明の製品の使用（眼の周囲、減量者等）
【００９８】
【表１３】
2004196763.tif 000015
【００９９】
実施例１１：本発明の不溶性酵素を含む標品の化粧的許容性の評価
実施例１により得られた化合物についてウサギにおける眼球評価、ラットにおける単独経口投与による異常な毒性の不在の検討、およびモルモットにおける感作能力の検討により毒性試験を行った。次いで、ヒトのボランティアに対する低アレルゲン性の検討を、実施例１に記載の化合物を０．４５％カルボポールゲル、ｐＨ５．８に１０％に希釈した標品を用いて行った。
【０１００】
ウサギの皮膚における一次刺激の評価
「皮膚に対する急性刺激／腐食作用」の検討に関するＯＥＣＤ推奨の方法により、上記の標品を希釈せずに３匹のウサギの皮膚に０．５ｍｌの用量で適用した。
【０１０１】
基本指令６７／５４８／ＥＥＣおよび後続の修正を適用してなされた２０／０４／９９決定に定義されている基準により製品を分類した。
【０１０２】
このようにして試験した標品は、皮膚に対する刺激剤である製品には分類されなかった。
【０１０３】
ウサギにおける眼球刺激の評価
上記の標品を基本指令６７／５４８／ＥＥＣおよび後続の修正に推奨されている方法により３匹のウサギの眼に単独で０．１ｍｌの量を１回点滴した。
【０１０４】
この試験の結果から、上記標品は、眼に対する刺激剤である製品には分類されないという結論を得ることができた。
【０１０５】
ラットにおける単独経口投与による異常毒性の不在試験
１９８７年２月２４日付けＯＥＣＤ第４０１号指令により啓発され化粧品に適合された方法により、上記の標品を雄ラット５匹と雌ラット５匹とに５ｇ／体重Ｋｇの薬用量で１回経口投与した。
【０１０６】
ＬＤ0およびＬＤ50は５，０００ｍｇ／Ｋｇよりも大きいことが見出された。試験した標品は従って摂取すると危険である標品には分類されなかった。
【０１０７】
モルモットにおける皮膚感作能力の評価
上記の標品をＯＥＣＤ第４０６号指令に一致するプロトコルであるマグヌッソン(Magnusson)およびクリーグマン(Kligmann)により記載された最大化試験にかけた。
【０１０８】
この標品は皮膚と接触すると非感作性であると分類された。
【０１０９】
ヒトのボランティアにおける低アレルゲン性試験
製品の低アレルゲン性を、実施例１に記載の製品をゲルに１０％に希釈したものについて試験した。この試験は健常ボランティア１００人のパネルに対して行った。
【０１１０】
製品を閉塞性パッチ下で２４時間適用し、次いでパッチ下で２日間、全部で９回再適用した（誘導期）。２週間の期間経過後、製品を含む他のパッチをボランティアの皮膚に適用し、２４時間接触したままにした。パッチを除去してから２４、４８および７２時間後に刺激と皮膚感作の臨床的徴候を評価した（攻撃期）。
【０１１１】
これらの実験条件下で、この製品はアレルゲン性能力を欠いていることが示された。
【０１１２】
実施例１２：本発明の製品の存在下での化粧用配合剤に含まれるアスコルビン酸の浸透の増加
この試験は配合剤６ａにおいて本発明の製品（Ｄ）を
・配合Ａ：実施例１に記載の本発明の製品２％およびアスコルビン酸２％
・配合Ｂ：アスコルビン酸２％単独
により置き換えたものについて行った。
【０１１３】
これら２種類の配合剤を拡散セルに載置したヒト生検材料上に置いた（５０μｇ／ｃｍ2）。生検材料を横断することができるアスコルビン酸の量を拡散セルのレシービング・コンパートメント内で定量し、かつＨＰＬＣにより定量した。２４時間拡散した後、レシービング・コンパートメント内で見出すことができるアスコルビン酸の量は配合剤Ａでは配合剤Ｂの４倍であった。したがって、本発明の製品は配合中に存在するアスコルビン酸の浸透を改善することができ、それ故、有効成分の浸透の促進剤である。
【０１１４】
実施例１３：本発明の製品の存在下での化粧用配合剤に含まれるカフェインの浸透の増加
これらの試験は配合剤６ａにおいて本発明の製品（Ｄ）を
・配合Ａ：実施例１に記載の本発明の製品２％およびカフェイン３％
・配合Ｂ：カフェイン３％単独
により置き換えたものについて行った。
【０１１５】
これら２種類の配合剤を拡散セルに載置したヒト生検材料上に置いた（５０μｇ／ｃｍ2）。生検材料を横断することができるカフェインの量を拡散セルのレシービング・コンパートメント内で定量し、かつＨＰＬＣにより定量した。
【０１１６】
２４時間拡散した後、レシービング・コンパートメント内で見出すことができるカフェインの量は配合剤Ａでは配合Ｂよりも４７％多かった。したがって、本発明の製品は配合中に存在するカフェインの浸透を改善することができ、それ故、有効成分の浸透の促進剤である。
【外国語明細書】
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