(57)【要約】【課題】コストパフォーマンスに優れ、かつあらゆる機能性分子を超高速に導入することができる、機能性ＰＮＡの新規合成方法およびそれに用いる化合物、ならびに新規機能性ＰＮＡの提供。【解決手段】機能性ＰＮＡオリゴマーを製造するための方法であって、チミンまたは保護基によって保護されたアデニン、グアニンもしくはシトシン、Ｃｂｚ基を有するＰＮＡオリゴマーの前記Ｃｂｚ基を、ＰＮＡオリゴマーを担体レジンから切り出した後に機能性分子によって置換し、前記保護基の脱保護を行う工程を含む、前記方法および該方法によって機能性ＰＮＡオリゴマー。【選択図】  図２
2004196662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性ＰＮＡオリゴマーを製造するための方法であって、チミンまたは保護基によって保護されたアデニン、グアニンもしくはシトシン、Ｃｂｚ基を有するＰＮＡオリゴマーの前記Ｃｂｚ基を、ＰＮＡオリゴマーを担体レジンから切り出した後に機能性分子によって置換し、前記保護基の脱保護を行う工程を含む、前記方法。
【請求項２】
ＰＮＡオリゴマーが、さらなる機能性分子を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨとＣｂｚ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨとを反応させた後に、Ｆｍｏｃ基を機能性分子によって置換して、さらなる機能性分子を有するＰＮＡオリゴマーを得る工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｑ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（Ｑは機能性分子を表す）をＰＮＡオリゴマーに導入することによって、さらなる機能性分子を有するＰＮＡオリゴマーを得る工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ｃｂｚ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨが、Ｃｂｚ−ω−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルとＢｏｃＰＮＡ−ＯＨとの反応によって製造されたものである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
Ｃｂｚ−ω−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルが、Ｃｂｚ−ω−アミノ酸とペンタフルオロフェノールとの反応によって製造されたものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
機能性分子が、光放出性分子、光消失性分子、膜透過性機能性分子、臓器選択性機能性分子、殺菌性機能性分子、分子認識性機能性分子、光架橋機能性分子、光増感機能性分子、ＤＮＡ結合性分子およびＤＮＡ切断機能性分子から選択された１種または２種以上である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
機能性分子が、光放出性分子および光消失性分子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
光放出性分子が、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅであり、光消失性分子がＤａｂｃｙｌ、ＨＡＢＡ、ＮＤＩまたはＡｚｏである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
機能性分子が、光放出性分子および膜透過性機能性分子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
光放出性分子が、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅであり、膜透過性機能性分子が水溶性アミノ酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アデニン、グアニンまたはシトシンを保護する保護基が、Ｃｂｚ基である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＰＮＡオリゴマーの合成が、ｔＢｏｃ法用固相担体を用いたＰＮＡ鎖における縮合・伸長を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ｔＢｏｃ法用固相担体がＭＢＨＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｃｂｚ基の機能性分子による置換が、縮合剤ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＤＣＣまたは機能性分子のペンタフルオロフェニルエステル誘導体やＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体との縮合によって行われる、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
Ｆｍｏｃ基の機能性分子による置換が、Ｆｍｏｃ基をピペリジン処理によって選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われる、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨが、下記一般式（Ｉ）
【化１】
2004196662.tif 000036
（式中、ｎは１〜１５までの整数を表す）で表される化合物である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
Ｃｂｚ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨが、下記一般式（Ｉ’）
【化２】
2004196662.tif 000037
（式中、ｎは１〜１５までの整数を表す）で表される化合物である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
Ｑ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨが、下記一般式（Ｉ’’）
【化３】
2004196662.tif 000038
（式中、Ｑは機能性分子を表し、ｎは１〜１５までの整数を表す）で表される化合物である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
下記一般式（ＩＩ）
【化４】
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（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基、機能性カルボン酸誘導体または水素原子であり、Ｒ１は、水素原子、水酸基または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｋは０〜１０の整数であり、Ｘ１〜Ｘ７、Ｙ１〜Ｙ４およびＺ１〜Ｚ３はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＋Ｘ４＋Ｘ５＋Ｘ６＋Ｘ７＞０であり、Ｙ１＋Ｙ２＋Ｙ３＋Ｙ４＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＞０である。ただし、Ｘ６＋Ｚ３＋Ｘ７＋Ｙ４≠０であり、Ｒ１が水酸基の場合、Ｒ１に結合している−ＮＨ−は−ＣＯ−である。）
で表される化合物。
【請求項２１】
ａが０〜３の整数であり、ｂが０〜５の整数であり、ｈ、ｌおよびｋの少なくとも１つが４である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｘ１＝１であり、Ｘ２＝０または１であり、Ｘ３＝Ｘ４＝０である、請求項２０または２１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｙ１、Ｙ２およびＹ４が０または１であり、Ｙ３＝０である、請求項２０〜２２のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４】
機能性分子が、光放出性分子、光消失性分子、膜透過性機能性分子、臓器選択性機能性分子、殺菌性機能性分子、分子認識性機能性分子、光架橋機能性分子、光増感機能性分子、ＤＮＡ結合性分子およびＤＮＡ切断機能性分子から選択された１種または２種以上である、請求項２０〜２３のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５】
機能性分子が、光放出性分子および光消失性分子を含む、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
光放出性分子が、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅであり、光消失性分子がＤａｂｃｙｌ、ＨＡＢＡ、ＮＤＩまたはＡｚｏである、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
機能性分子が、光放出性分子および膜透過性機能性分子を含む、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ１が水酸基である、請求項２０〜２７のいずれかに記載の化合物。
【請求項２９】
ＲおよびＲ１の少なくとも１個が機能性カルボン酸誘導体である、請求項２０〜２８のいずれかに記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、機能性ペプチド核酸モノマーの新規な製造方法、該製造方法によって製造された機能性ペプチド核酸オリゴマーおよびその中間体に関する。より詳細には、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡオリゴマーに導入した後に１種または２種以上の機能性分子をポスト合成的に導入した後および／または機能性分子を導入した前駆体的ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡオリゴマーに導入した後に、さらに１種または２種以上の機能性分子をポスト合成的に導入することを特徴とする、前記製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
核酸は生物の遺伝情報を司るＤＮＡおよびＲＮＡである。これに対して、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とは、核酸の糖リン酸骨格をＮ−（２−アミノエチル）グリシン骨格に変換した修飾核酸である（図１）。ＤＮＡ／ＲＮＡの糖リン酸骨格は中性条件で負電荷を帯びていて相補鎖間の静電的な反発があるが、ＰＮＡの背骨構造はもともと電荷を持たないので静電的な反発がない。そのためＰＮＡは従来の核酸と比較して、高い二重鎖形成能をもち、高い塩基配列認識能を持つ。さらにＰＮＡは生体内ヌクレアーゼ・プロテアーゼに対し非常に安定で分解されないので、アンチセンス分子として遺伝子治療に応用することが検討されている。
【０００３】
従来のＤＮＡを媒体にしていた技術をＰＮＡ化することにより、これまで克服できなかったＤＮＡの欠点を補うことが可能となった。例えば、遺伝情報の体系的な解析を高速に且つ大量に行うための「ＤＮＡマイクロアレイ技術」および塩基配列を特異的に認識したことを蛍光発光により検出できるプローブとして最近開発された「モレキュラービーコン」に応用することが可能である。これらはいずれも酵素耐性に乏しいＤＮＡを媒体とするため、これらの技術を用いるに際しては厳密なサンプリングが要求される。この要求を満たすことが、前記の技術を高度化する上での鍵となっている。
【０００４】
一方ＰＮＡは酵素に対し完全な耐性を持つので、ＤＮＡマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコンにおいてＰＮＡをＤＮＡに代用することによって、前記技術の欠点が克服され、さらに長所が引き出されるものと期待されている。
ＤＮＡマイクロアレイ技術およびモレキュラービーコン以外にもＰＮＡ化することにより発展が期待される分野は数多いが、それらにおいてはＰＮＡの効率的な機能化、すなわちＰＮＡモノマーへの機能性分子の効率的な導入による新規なＰＮＡモノマーの設計が必要である。
【０００５】
ＰＮＡオリゴマーの合成方法には通常の固相ペプチド合成法を用いるので、ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡの背骨構造によって分類すると、Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットとｔＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットの２種類が含まれる（図２）。
Ｆｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニットの合成方法は既に確立されており、しかもそのオリゴマーの合成は一般的なＤＮＡ自動合成機によって可能であるため、下記のルート
【化５】
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によって、少量スケールでの合成が可能となっている。
【０００６】
当初ＰＮＡには下記のようなｔＢｏｃ型ＰＮＡモノマーユニット
【化６】
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が採用され、その後より効率のよい合成方法
【化７】
2004196662.tif 000005
が確立された。しかし、前述したように取り扱いが容易なＦｍｏｃ型が開発されたため、ｔＢｏｃ型の使用頻度は減少している。
しかし、グアニン・チミン・シトシン・アデニン４種類の核酸塩基以外の機能性分子を導入する際、例えば光放出性分子を導入する際には、導入する機能性分子がアルカリ条件に不安定な場合が多いので、アルカリ条件を使用しないｔＢｏｃ型ＰＮＡ背骨構造の有用性は高い。「ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミンおよびアミノ酸誘導体の製造方法」に関しては、本発明者らが特願２０００−２６８６３８として既に特許出願中である。
【０００７】
これ以外にも、光放出性オリゴＰＮＡのモノマーユニットの合成例は過去に５例が知られている。これら全てが上記ルートを用いているが、その収率については記載がないか、または極めて低いものでしかない（例えば特許文献１〜２および非特許文献１〜３参照）。また、用いられる化合物の構造がアルカリ性条件に比較的安定であることが特徴的であるため、アルカリ性条件に不安定な発色団が付くと、前記従来法と類似の方法、すなわち下記ルートＡ
【化８】
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【化９】
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では効率良く合成できないと予想された。
【０００８】
したがって、一般に光放出性分子等の機能性分子は高価な場合が多いため、より合理的な機能性ＰＮＡの合成方法、すなわち、▲１▼機能性ＰＮＡモノマーユニットの設計における、機能性分子のＰＮＡ背骨構造への効率的な導入、▲２▼コストパフォーマンスを考えた合成ルート、および▲３▼遺伝子診断薬としての応用へ適応させるための、これらの機能性分子を超高速に導入する方法が探求された。
【０００９】
上記課題に鑑み、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーの新規製造方法として、下記ルートＢ
【化１０】
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に示すように、ＰＮＡ背骨構造にｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体６を用いて１のペンタフルオロフェニル基を含む活性エステル体５と縮合してほぼ定量的に機能性ＰＮＡモノマー４を合成する方法を見出した。
【００１０】
また、本発明者らは、機能性ＰＮＡモノマーを合成する別法として、ＰＮＡ背骨構造に上記ｔ−ブトキシカルボニルアミノエチルアミン誘導体６の代わりにベンジルオキシカルボニル−ω−アミノ酸誘導体を用いる方法（ルートＣ）を見出した。これらの方法については、既に特許出願がなされている。
【００１１】
したがって、最終的に機能性ＰＮＡを合成するための方法として、上記ルートＢおよびルートＣのいずれかを用いる方法によって機能性ＰＮＡモノマーを合成した後に、それらを重合する方法が工業的にも確立されつつある。すなわち、現在までの機能性ＰＮＡの合成法によってＰＮＡプローブとして用いられる機能性ＰＮＡを工業的に大量合成することは可能になりつつある。
【００１２】
一方、コストパフォーマンスの向上および機能性分子を超高速に導入することを目的とした、機能性ＰＮＡを合成方法の改良もなされている。例えば、前記機能性ＰＮＡモノマーユニットを用いる方法とは異なるアプローチとして、下記の前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを利用することによって、ポスト合成的に機能性分子をＰＮＡオリゴマーに導入する方法が報告されている（非特許文献４参照．）。
【化１１】
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【００１３】
当該方法は、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットをＰＮＡオリゴマーに導入した後、さらに機能性分子を導入することによって機能性ＰＮＡを合成するものである。
しかし、当該方法においては、導入できる機能性分子の種類が限定される等の欠点がある。
【００１４】
例えば、下図に示すように、市販されている光放出性分子のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅエステルを導入することはできず、導入するためにはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ等のリンカーをまず導入する必要があるが、結果として上記化合物は使用しにくいものになっている。
【化１２】
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【００１５】
また、細胞中に導入するためのに蛍光プローブとして、これまでＤＮＡオリゴマー・ＲＮＡオリゴマー・ＰＮＡオリゴマーが利用されているが、これらを細胞中に導入するためには、当然ながら細胞膜を通過させなければならない。しかし、細胞膜は膜表面が負電荷を帯びているため、元々負に帯電しているＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマーを導入するのは非常に困難である。
【００１６】
一方ＰＮＡオリゴマーは電気的に中性であるが、膜透過しにくいという結果が得られている。したがって、ＰＮＡオリゴマーを細胞内に導入するに際しては、膜表面を前処理してその導入をしやすくしたり、あるいはトランスフェクション試薬を用いて導入せざるを得ないのが現状である。
【００１７】
しかし、そのような処理を施してＰＮＡオリゴマーを導入した場合においてプローブの機能が発揮されたとしても、本来生体が示す挙動を正確に表現していることは必ずしも保証されない。しかも、これは細胞１個の場合であり、多細胞（個体）での利用に至っては到底不可能である。
このような現状および観点から、膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブの開発が有用であると考えられている。
【００１８】
なお、膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブは既に存在する。例えば、▲１▼膜透過性機能を有するオリゴペプチドをＰＮＡに結合させたもの、▲２▼膜透過性機能を有するリン脂質をＰＮＡに結合させたものが挙げられる。しかしながら、これらは膜透過した後細胞内においてプロテアーゼ等の酵素によりＰＮＡ以外の部分が分解され、細胞内に滞留してしまうことが予想される。このことは、ターゲットを捕捉出来なかった過剰なＰＮＡプローブが膜透過性機能を失い、その後の洗浄過程で細胞外に出にくくなることにつながるため、本来細胞が持っている遺伝子発現系を正確に表現できないことを意味する。
【００１９】
上記背景の下、１個または２個以上の機能性分子を超高速に導入することができる、機能性ＰＮＡオリゴマーの合成方法およびそれに用いる化合物に関して、既に特許出願がなされている（特願２００２−１２１６６７）。
この機能性ＰＮＡオリゴマーを製造する方法は、チミンまたは保護基によって保護されたアデニン、グアニンもしくはシトシンを有するＰＮＡモノマーユニットを、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを合成した後、該ＰＮＡオリゴマーに遊離カルボン酸を有する機能性分子をポスト合成的に導入し、さらに前記保護基の脱保護を行うことによって目的物を得ることを特徴とする。
【００２０】
しかしながら、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを用いる上記公知の製造方法においては、機能性分子のＰＮＡオリゴマーへの結合が弱い場合には、保護基の脱保護の際に機能性分子も脱離してしまうため、十分な収率が得られない。
したがって、特に、ＰＮＡオリゴマーへの結合が弱い機能性分子をより効率的に導入する方法に対する要求は依然として大きいものである。
【００２１】
【特許文献１】
ピーター・イー・ニールセンら（Ｐｅｔｅｒ  Ｅ．  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）  国際公開第９８／５２９５  Ａ１  号パンフレット。
【特許文献２】
ハンス−ゲオルゲ・バッツら（Ｈａｎｓ−ｇｅｏｒｇ  Ｂａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．）  国際公開第９８／３７２３２  Ａ２号公報。
【非特許文献１】
ティー・エイ・トランら（Ｔ．  Ａ．  Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．）「ペプチド研究ジャーナル」（”Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｒｅｓ．”）、１９９９年、第５３巻、ｐ．１３４−１４５。
【非特許文献２】
ジェスパー・ローゼら（Ｊｅｓｐｅｒ  Ｌｏｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ．）「バイオコンジュゲート化学」（”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．”）、１９９７年、第８巻、ｐ．５０３−５０９。
【非特許文献３】
ブルース・アルミタージら（Ｂｒｕｃｅ  Ａｒｍｉｔａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）  「核酸研究」（”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．”）、１９９８年、第２６巻、ｐ．７１５−７２０。
【非特許文献４】
オリバー・ザイツ（Ｏｌｉｖｅｒ  Ｓｅｉｔｚ）「テトラヘドロン・レターズ」（”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ”）  １９９９年  第４０巻、ｐ．４１６１−４１６４。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、コストパフォーマンスに優れ、かつあらゆる機能性分子を超高速に導入することができる、機能性ＰＮＡの新規合成方法およびそれに用いる化合物、ならびに新規機能性ＰＮＡを提供することを目的とする。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑み研究を重ねた結果、本発明者らは、新たな前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを用いることによって、驚くべきことに、従来法における前記課題が克服され、かつより広範にわたる機能性ＰＮＡを合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２４】
すなわち、本発明は、機能性ＰＮＡオリゴマーを製造するための方法であって、チミンまたは保護基によって保護されたアデニン、グアニンもしくはシトシン、Ｃｂｚ基を有するＰＮＡオリゴマーの前記Ｃｂｚ基を、ＰＮＡオリゴマーを担体レジンから切り出した後に機能性分子によって置換し、前記保護基の脱保護を行う工程を含む、前記方法に関する。
また、本発明は、ＰＮＡオリゴマーが、さらなる機能性分子を有する、前記方法に関する。
【００２５】
さらに、本発明は、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨとＣｂｚ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨとを反応させた後に、Ｆｍｏｃ基を機能性分子によって置換して、さらなる機能性分子を有するＰＮＡオリゴマーを得る工程を含む、前記方法に関する。
また、本発明は、Ｑ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（Ｑは機能性分子を表す）をＰＮＡオリゴマーに導入することによって、さらなる機能性分子を有するＰＮＡオリゴマーを得る工程を含む、前記方法に関する。
【００２６】
さらに、本発明は、Ｃｂｚ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨが、Ｃｂｚ−ω−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルとＢｏｃＰＮＡ−ＯＨとの反応によって製造されたものである、前記方法に関する。
また、本発明は、Ｃｂｚ−ω−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルが、Ｃｂｚ−ω−アミノ酸とペンタフルオロフェノールとの反応によって製造されたものである、前記方法に関する。
【００２７】
さらにまた、本発明は、機能性分子が、光放出性分子、光消失性分子、膜透過性機能性分子、臓器選択性機能性分子、殺菌性機能性分子、分子認識性機能性分子、光架橋機能性分子、光増感機能性分子、ＤＮＡ結合性分子およびＤＮＡ切断機能性分子から選択された１種または２種以上である、前記方法に関する。
またさらに、本発明は、機能性分子が、光放出性分子および光消失性分子を含む、前記方法に関する
また、本発明は、光放出性分子が、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅであり、光消失性分子がＤａｂｃｙｌ、ＨＡＢＡ、ＮＤＩまたはＡｚｏである、前記方法に関する。
【００２８】
そして、本発明は、機能性分子が、光放出性分子および膜透過性機能性分子を含む、前記方法に関する
そしてまた、本発明は、光放出性分子が、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅであり、膜透過性機能性分子が水溶性アミノ酸である、前記方法に関する。
そしてさらに、本発明は、アデニン、グアニンまたはシトシンを保護する保護基が、Ｃｂｚ基である、前記方法に関する。
また、本発明は、ＰＮＡオリゴマーの合成が、ｔＢｏｃ法用固相担体を用いたＰＮＡ鎖における縮合・伸長を含む、前記方法に関する。
さらに、本発明は、ｔＢｏｃ法用固相担体がＭＢＨＡである、前記方法に関する。
【００２９】
また、本発明は、Ｃｂｚ基の機能性分子による置換が、縮合剤ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＤＣＣまたは機能性分子のペンタフルオロフェニルエステル誘導体やＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体との縮合によって行われる、前記方法に関する。
さらに、本発明は、Ｆｍｏｃ基の機能性分子による置換が、Ｆｍｏｃ基をピペリジン処理によって選択的に脱保護して得られた１級アミノ基との脱水縮合によって行われる、前記方法に関する。
【００３０】
またさらに、本発明は、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨが、下記一般式（Ｉ）
【化１３】
2004196662.tif 000011
（式中、ｎは１〜１５までの整数を表す）で表される化合物である、前記方法に関する。
【００３１】
さらにまた、本発明は、Ｃｂｚ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨが、下記一般式（Ｉ’）
【化１４】
2004196662.tif 000012
（式中、ｎは１〜１５までの整数を表す）で表される化合物である、前記方法に関する。
【００３２】
そして、本発明は、Ｑ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨが、下記一般式（Ｉ’’）
【化１５】
2004196662.tif 000013
（式中、Ｑは機能性分子を表し、ｎは１〜１５までの整数を表す）で表される化合物である、前記方法に関する。
【００３３】
また、本発明は、下記一般式（ＩＩ）
【化１６】
2004196662.tif 000014
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基、機能性カルボン酸誘導体または水素原子であり、Ｒ１は、水素原子、水酸基または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｋは０〜１０の整数であり、Ｘ１〜Ｘ７、Ｙ１〜Ｙ４およびＺ１〜Ｚ３はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＋Ｘ４＋Ｘ５＋Ｘ６＋Ｘ７＞０であり、Ｙ１＋Ｙ２＋Ｙ３＋Ｙ４＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＞０である。ただし、Ｘ６＋Ｚ３＋Ｘ７＋Ｙ４≠０であり、Ｒ１が水酸基の場合、Ｒ１に結合している−ＮＨ−は−ＣＯ−である。）
で表される化合物に関する。
【００３４】
また、本発明は、ａが０〜３の整数であり、ｂが０〜５の整数であり、ｈ、ｌおよびｋの少なくとも１つが４である、前記化合物に関する。
さらに、本発明は、Ｘ１＝１であり、Ｘ２＝０または１であり、Ｘ３＝Ｘ４＝０である、前記化合物に関する。
また、本発明は、Ｙ１、Ｙ２およびＹ４が０または１であり、Ｙ３＝０である、前記化合物に関する。
【００３５】
さらに、本発明は、機能性分子が、光放出性分子、光消失性分子、膜透過性機能性分子、臓器選択性機能性分子、殺菌性機能性分子、分子認識性機能性分子、光架橋機能性分子、光増感機能性分子、ＤＮＡ結合性分子およびＤＮＡ切断機能性分子から選択された１種または２種以上である、前記化合物に関する。
また、本発明は、機能性分子が、光放出性分子および光消失性分子を含む、前記化合物に関する。
また、本発明は、光放出性分子が、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅであり、光消失性分子がＤａｂｃｙｌ、ＨＡＢＡ、ＮＤＩまたはＡｚｏである、前記化合物に関する。
さらに、本発明は、機能性分子が、光放出性分子および膜透過性機能性分子を含む、前記化合物に関する。
またさらに、本発明は、Ｒ１が水酸基である、前記化合物に関する。
そして、本発明は、Ｒ１が機能性カルボン酸誘導体である、前記化合物に関する
【００３６】
本発明は、ＰＮＡ背骨構造にＣｂｚ−ω−アミノ酸を導入した前駆体的ＰＮＡモノマーユニット、すなわちＣｂｚ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨをＰＮＡオリゴマーに導入した後、機能性分子をポスト合成的に導入することにより、ほぼ定量的に機能性分子を有する機能性ＰＮＡオリゴマーを合成することに成功したものである。
本発明の製造方法においては、少なくとも１個の機能性分子は、ＰＮＡオリゴマー上のＣｂｚ基（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル基）を該機能性分子で置換することによって、ＰＮＡオリゴマーのレジンからの切り出しの後に導入される。また、さらなる機能性分子を、ＰＮＡ背骨構造に導入した、他の前駆体的ＰＮＡモノマーユニット由来のＦｍｏｃ基を他の機能性分子によって置換する工程またはＰＮＡ背骨構造の一部を、機能性分子を有するＰＮＡモノマーによって構築し、プレ合成的に導入する工程によって導入することができる。
【００３７】
上記特徴により、本発明の製造方法においては、導入する機能性分子として市販のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅエステル等を使用でき、カルボン酸を有する化合物であれば問題なく利用でき且つ定量的に導入できる。しかも、機能性分子を導入したＣｂｚ基を有するＰＮＡオリゴマーを担体レジンから切り出した後に、Ｃｂｚ基の置換によって機能性分子を導入することができるため、本発明の製造方法においては、前記切り出しの条件に耐性を有しない機能性分子を導入することができる。したがって、本発明による製造方法においては、１個または２個以上の機能性分子を有するあらゆる機能性ＰＮＡオリゴマーを高収率で得ることができるため、コストパフォーマンスに極めて優れている。
【００３８】
また、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを機能性ＰＮＡオリゴマーに導入した後にレジンを分割することにより、それぞれのレジンに異なった機能性分子を導入することもできる。したがって、本発明による製造方法によれば、極めて高速な機能性ＰＮＡオリゴマーの合成手法を開発することが可能となる。
【００３９】
本発明の方法によって効率的な合成が可能になる機能性ＰＮＡオリゴマーの例として、下記一般式（ＩＩ）
【化１７】
2004196662.tif 000015
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基、機能性カルボン酸誘導体または水素原子であり、Ｒ１は、水素原子、水酸基または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｋは０〜１０の整数であり、Ｘ１〜Ｘ７、Ｙ１〜Ｙ４およびＺ１〜Ｚ３はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＋Ｘ４＋Ｘ５＋Ｘ６＋Ｘ７＞０であり、Ｙ１＋Ｙ２＋Ｙ３＋Ｙ４＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＞０である。ただし、Ｘ６＋Ｚ３＋Ｘ７＋Ｙ４≠０であり、Ｒ１が水酸基の場合、Ｒ１に結合している−ＮＨ−は−ＣＯ−である。）
で表される化合物において、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＋Ｘ４＋Ｘ５＋Ｘ６＋Ｘ７＝０であり、Ｒ１が水素原子である化合物を挙げることができる。
一般式（ＩＩ）で表される化合物において、少なくとも１つのＲがＦｍｏｃ基である化合物は、その前記Ｆｍｏｃ基を機能性分子によって置換することによって、少なくとも１つの機能性分子が導入された機能性ＰＮＡオリゴマーになる。したがって、前記少なくとも１つのＲがＦｍｏｃ基である化合物は、機能性ＰＮＡオリゴマーの前駆体的な化合物である。
【００４０】
本発明によれば、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物において同一または異なるあらゆる機能性分子を、任意の複数の位置に導入することも可能となる。すなわち、前記前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを用いてＰＮＡオリゴマーを導入した後、ピペリジン処理と機能性分子のポスト合成的導入を一括して行うことによるものである。これはＰＮＡオリゴマーの細胞膜透過性機能を向上させるアンテナペディアを高速に設計する上で欠かせないものである。また、本発明の製造方法によれば、光放出性分子と光消失性分子とを有するＰＮＡオリゴマーであるモレキュラービーコンの合成も容易に行うことができる。この点においても、本発明による方法は極めて優れたものである。
【００４１】
このように製造される化合物の例として、前記一般式（ＩＩ）において、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＋Ｘ４＋Ｘ５＋Ｘ６＋Ｘ７＞０であり、Ｒが細胞膜透過性分子誘導体であり、Ｒ１が機能性カルボン酸誘導体であるものが挙げられる。
【００４２】
このプローブは大きく蛍光標識領域・細胞膜透過性機能領域・分子認識領域の３つに分けることができ、それぞれをリンカー部位（Ｘ１〜Ｘ７の添字付きで表される部分）を介して結合させた形をしている。
蛍光標識化合物は市販のものも、既に本発明者らがＰＣＴ出願を行った新規蛍光標識化ＰＮＡモノマーユニットも用いることができる。
【００４３】
分子認識部位は市販のＰＮＡユニットを用いて合成する。この化合物の特徴は、既に国内特許出願を行っている一般式（Ｉ）で表される新規ＰＮＡユニットおよび／または一般式（Ｉ’’）で表される新規ＰＮＡユニットを膜透過性機能領域部に用いていることである。該一般式（Ｉ）で表される新規ＰＮＡユニットは機能性分子をポスト合成的に導入するために開発された前駆体ユニットであり、これを複数個並べて導入した後、前記したように同一機能性分子を一括導入できることを特徴としている。
【００４４】
したがって、本発明によれば、光機能性分子に限定されることない、多種多様な機能性分子を、ＰＮＡ中に容易かつ極めて効率的に導入することができるようになる。
このような機能性分子として、ＦＩＴＣ型、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ型、Ｆｌａｖｉｎ型、ＦＡＭ型、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ型、ＴＡＭＲＡ型、ＲＯＸ型、Ｐｙｒｅｎｅ型およびＣｏｕｍａｒｉｎｅ型等の光放出性分子、Ｄａｂｃｙｌ型、ＨＡＢＡ型、ＤＮＩ型およびＡｚｏ型等の光消失性分子、水溶性アミノ酸等の膜透過機能性分子、ラクトースやトリスエックス等の臓器選択機能性分子、タナチンやセクロピン等の殺菌機能性分子、Ｂｉｏｔｉｎ型およびビオローゲン等の分子認識機能性分子、ソラレン等の光架橋機能性分子、ルシフェリン等の光増感機能性分子、ディスタマイシン、ヘキスト３３２５８およびエチジウムブロミド等のＤＮＡ結合性分子、ならびにブレオマイシン等のＤＮＡ切断機能性分子の各モノマーユニットが挙げられる。
【００４５】
すなわち、本発明における「機能性」の語は、光放出性、光消失性、膜透過機能性、臓器選択性機能性、殺菌性機能性、分子認識性機能性、光架橋機能性、光増感機能性、ＤＮＡ結合性、およびＤＮＡ切断機能性から選択された１種または２種以上である等を含む、ある特定の修飾を行うことによって化合物に新たに付与される種々の機能の全てを意味するものである。
そして、本発明の化合物は、特に、式（ＩＩ）において、
ａ）ａが０〜３の整数であり、ｂが０〜５の整数であり、ｈ、ｌおよびｋの少なくとも１つが４である化合物、
ｂ）Ｘ１＝１であり、Ｘ２＝０または１であり、Ｘ３＝Ｘ４＝０である化合物、ｃ）Ｙ１、Ｙ２およびＹ４が０または１であり、Ｙ３＝０である化合物、
である、合成が比較的容易であり、かつ有用性が高いものである。
式（ＩＩ）の化合物の、遺伝子診断薬およびアンチセンス分子等の機能性素材としての使用は有用である。また、ＰＮＡは前記の通り酵素耐性が高いため、アンチセンスの１種であるＲＮＡインターフェレンス（ＲＮＡｉ）の代替物としての使用（ＰＮＡｉ）も有用である。特に、ＲおよびＲ１の少なくとも１個が機能性カルボン酸誘導体である化合物の使用は有用である。また、ＲおよびＲ１の少なくとも１個が、光放出性分子であり、ＲおよびＲ１の少なくとも１個が、光消失性分子である化合物はモレキュラービーコンとして有用である。
さらに、式（ＩＩ）において、Ｒ１が水酸基である化合物は、チップ化が容易に行えるため有用である。
【００４６】
【発明の実施の形態】
ここで、本発明による方法の特徴を更に詳細に説明する。
【００４７】
本発明による方法は、典型的には下図
【化１８】
2004196662.tif 000016
に示すとおりである（第ＩＩ法）。
【００４８】
必要に応じて、Ｃｂｚ−ω−アミノ酸とペンタフルオロフェノール（ＰｆｐＯＨ）とを反応させて得られるＣｂｚ−ω−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステル（Ｃｂｚ−ω−アミノ酸−ＯＰｆｐ）とＢｏｃＰＮＡ−ＯＨとから、Ｃｂｚ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを予め合成する。
以後の工程において用いる該Ｃｂｚ−ω−アミノ酸−ＯＰｆｐの溶液を得るには、ＤＭＦなどの有機溶媒、またはアセトン等と水とを含む水溶性溶媒したものいずれも好適に用いることができる。前記水溶性溶媒を用いた場合には、精製等の後処理の面におけるメリットを有するものである。
【００４９】
Ｃｂｚ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨの例としては、下記一般式（Ｉ’）
【化１９】
2004196662.tif 000017
で表される化合物が挙げられる。
【００５０】
Ｃｂｚ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨおよび後述するＦｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡは、ＰＮＡモノマーユニットの前駆体として機能するため、いずれも前駆体的ＰＮＡモノマーユニットと呼ぶことができる。
式（Ｉ’）において、ｎとしては１〜１５までの整数を適宜選択できるが、ｎの値が大きい方が、ハイブリッド形成時の立体的反発（あるいは障害）を軽減する点において好ましい。
次に、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットである前記Ｃｂｚ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを用いて、オリゴマーＩＩａを合成する。具体的には、チミンまたはＣｂｚ基（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル基）等で保護されたアデニン、グアニンもしくはシトシンを有するＰＮＡモノマーユニットを、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットであるＣｂｚ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨと反応させ、ｔＢｏｃ法用固相担体を用いてＰＮＡ鎖を逐次縮合・伸長せしめる。
【００５１】
ＰＮＡ鎖の縮合においては、予めｔＢｏｃ基を脱離しておく必要があるが、その方法に制限はなく、一般的な方法が用いられる。それに続く縮合には、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
また、固相担体に関しては、ｔＢｏｃ法用のものであれば特に制限はないが、特にＭＢＨＡが好適に用いられる。
【００５２】
次に、化合物ＩＩａを担体レジンから切り出し、Ｃｂｚ基を脱保護してアミノ基とし、化合物ＩＩｂを得る。
切り出しおよび脱保護は同時に行ってもよい。この場合、切り出しおよび脱保護の条件に特に制限はない。例えば、ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｐ−ｃｒｅｓｏｌ／Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ＝６０／２５／１０／１０のような一般的な条件において好適に行われる。
【００５３】
続いて、前記ＩＩｂの前記アミノ基に、カルボン酸基を有する機能性分子の活性エステルを脱水縮合してＩＩｃを得る。活性エステルとしては、市販のｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅエステルまたはペンタフルオロフェニルエステルを用いることができる。
前記カルボン酸として特に制限はないが、反応性の点においては脂肪族カルボン酸が芳香族カルボン酸を上回るため、脂肪族カルボン酸を用いると製造の効率が高く好ましい。
【００５４】
最後に各塩基の保護基であるＣｂｚ基の脱保護を行うことによって、機能性分子基としてＲを有する、目的物である機能性ＰＮＡオリゴマーＩＩｄを得る。
【００５５】
上記のように、本発明による方法においては、従来の機能性モノマー合成に用いる活性エステル化の合成を要する方法とは異なり、機能性分子をそのまま利用できる。また一旦ＩＩａを合成した後に、固相からの切り出しに耐性を有しないものを含む種々の機能性分子が導入可能であるため、従来導入が困難であった機能性分子も、効率的にＰＮＡプローブに導入することが可能である。
さらに、以下のさらなる前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを用いた本発明の方法によって、従来困難であった高速かつ多様な並列ＰＮＡプローブ合成も併せて可能になる。
【００５６】
また、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを用いる場合の本発明によるオリゴＰＮＡを合成するルートは、典型的には、下図
【化２０】
2004196662.tif 000018
に示すとおりである（第ＩＩＩ法）。
【００５７】
まず、必要に応じて、下図
【化２１】
2004196662.tif 000019
に示すように、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸とペンタフルオロフェノール（ＰｆｐＯＨ）とを反応させて得られるＦｍｏｃ−ω−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステル（Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＯＰｆｐ）とＢｏｃＰＮＡ−ＯＨとから、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを合成する。
以後の工程において用いる該Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＯＰｆｐの溶液を得るには、ＤＭＦなどの有機溶媒、またはアセトン等と水とを含む水溶性溶媒したものいずれも好適に用いることができる。前記水溶性溶媒を用いた場合には、精製等の後処理の面におけるメリットを有するものである。
【００５８】
前記Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＯＰｆｐは、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸とＰｆｐＯＨをＤＭＦ溶液中にてＤＣＣを加えて反応させることによって、例えば下記式
【化２２】
2004196662.tif 000020
（式中、ｎは１〜１５の整数を表す）
で表されるものが得られる。
【００５９】
次いで、これにＢｏｃＰＮＡ−ＯＨのＤＭＦ溶液にジイソプロピルエチルアミンとともに添加し、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを得る。
【００６０】
Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨは、ＰＮＡモノマーユニットの前駆体として機能するため、Ｃｂｚ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨと同様に前駆体的ＰＮＡモノマーユニットと呼ぶことができる。
式（Ｉ）において、ｎとしては１〜１５までの整数を適宜選択できるが、ｎの値が大きい方が、ハイブリッド形成時の立体的反発（あるいは障害）を軽減する点において好ましい。
次に、下図
【化２３】
2004196662.tif 000021
に示すように、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットを用いて、オリゴマーＩＩＩａを合成する。具体的には、チミンまたはＣｂｚ基（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル基）等で保護されたアデニン、グアニンもしくはシトシンを有するＰＮＡモノマーユニットを、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットと反応させ、ｔＢｏｃ法用固相担体を用いてＰＮＡ鎖を逐次縮合・伸長せしめる。なお、前駆体的ＰＮＡモノマーユニットの導入の順番に制限はない。
【００６１】
ＰＮＡ鎖の縮合においては、予めｔＢｏｃ基を脱離しておく必要があるが、その方法に制限はなく、一般的な方法が用いられる。それに続く縮合には、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
また、固相担体に関しては、ｔＢｏｃ法用のものであれば特に制限はないが、特にＭＢＨＡが好適に用いられる。
【００６２】
次に、下図
【化２４】
2004196662.tif 000022
に示すように、ピペリジン処理によってＦｍｏｃ基を選択的に脱保護してアミノ基とし、ＩＩＩｂを得て、さらに、下図
【化２５】
2004196662.tif 000023
に示すように、該ＩＩＩｂの前記アミノ基にカルボン酸基を有する機能性分子の活性エステルを脱水縮合してＩＩＩｃを得る。
前記カルボン酸として特に制限はないが、反応性の点においては脂肪族カルボン酸が芳香族カルボン酸を上回るため、脂肪族カルボン酸を用いると製造の効率が高く好ましい。
【００６３】
また、ピペリジン処理によるＦｍｏｃ基の脱保護は、ある程度の時間をかけることによって好適に行われる。特に、２０〜４０分が好適であり、最も好適には３０分であった。
縮合剤の種類に特に制限はなく、前記ＰＮＡ鎖の縮合と同様に、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰ等の一般的な縮合剤が用いられる。
【００６４】
なお、機能性分子の導入は、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを縮合した後、直ちに行ってもよく（第１法）、あるいは、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを含む全てのＰＮＡモノマーユニットを逐次縮合した後に行ってもよい（第２法）。
【００６５】
次に、下図
【化２６】
2004196662.tif 000024
に示すように、担体レジンからの切り出しとＣｂｚ基の脱保護を行うことによって、機能性分子基としてＲおよびＲ’を有する、機能性分子を有する化合物ＩＩＩｄを経て目的物であるＩＩＩｅを得る。
切り出しおよび脱保護は同時に行ってもよい。この場合、Ｆｍｏｃ基の脱保護の後に行われる限りにおいてはその条件に特に制限はない。例えば、ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｐ−ｃｒｅｓｏｌ／Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ＝６０／２５／１０／１０のような一般的な条件において好適に行われる。
【００６６】
次に、本発明の製造方法においては、上記のＦｍｏｃ基を機能性分子による置換することによって機能性分子の導入を行う以外に、ＰＮＡ背骨構造の一部を、機能性分子を有するＰＮＡモノマー、すなわちさらなる別異の前駆体的ＰＮＡモノマーユニットによって構築し、プレ合成的に機能性分子を導入することもできる（第Ｖ法）。
この場合の典型的な合成経路は以下に示すとおりである：
【化２７】
2004196662.tif 000025
【００６７】
すなわち、前記Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを用いる方法と比べると、ＩＩＩａおよびＩＩＩｂに相当する化合物を経ずに、機能性ＰＮＡオリゴマーを製造することができる。なお、各ＰＮＡモノマーユニットを導入する順番に制限はない。
機能性分子を有するＰＮＡモノマーは、例えば（液相法）によって製造することができる。該ＰＮＡモノマーとして、式（Ｉ’’）：
【化２８】
2004196662.tif 000026
（式中、Ｑは機能性分子を表し、ｎは１〜１５までの整数を表す）
の化合物が例として挙げられる。
また、式Ｖａの化合物を得るためには、従来の固相法を用いる。その後の工程は、前記Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨを用いる場合と同様に行うことによって、目的物Ｖｃを得ることができる。
【００６８】
さらに下図に示すように、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ’）の化合物および式（Ｉ”）の化合物を用いて、機能性ＰＮＡオリゴマーを合成することができる（第ＶＩ法）。
【化２９】
2004196662.tif 000027
この場合も各ＰＮＡモノマーユニットを導入する順番に制限はない。
また、前記Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨのみを用いる方法（第Ｉ法）および前記Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨと前記Ｑ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨとを用いる方法（第ＩＶ法）については、既に特許出願済みである（特願２００２−１２１６６７）。
【００６９】
本発明による方法によれば、下記一般式（ＩＩ）
【化３０】
2004196662.tif 000028
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一または異なって、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、Ｒは、互いに独立し、同一または異なって、Ｆｍｏｃ基、機能性カルボン酸誘導体または水素原子であり、Ｒ１は、水素原子、水酸基または機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｋは０〜１０の整数であり、Ｘ１〜Ｘ７、Ｙ１〜Ｙ４およびＺ１〜Ｚ３はいずれも０以上の整数であり、Ｘ１＋Ｘ２＋Ｘ３＋Ｘ４＋Ｘ５＋Ｘ６＋Ｘ７＞０であり、Ｙ１＋Ｙ２＋Ｙ３＋Ｙ４＞０であり、Ｚ１＋Ｚ２＋Ｚ３＞０である。ただし、Ｘ６＋Ｚ３＋Ｘ７＋Ｙ４≠０であり、Ｒ１が水酸基の場合、Ｒ１に結合している−ＮＨ−は−ＣＯ−である。）
で表される化合物等が好適に合成される。
【００７０】
本発明の方法によって、式（ＩＩ）で表される化合物として、例えば、ＲおよびＲ１の少なくとも１個が、光機能性分子であり、ＲおよびＲ１の少なくとも１個が、光消失性分子である化合物、Ｒ１が水酸基である化合物またはＲ１が機能性カルボン酸誘導体、特にＲ１が光機能性カルボン酸誘導体である化合物等が好適に合成される。
また、Ｒ１がａが０〜３の整数であり、ｂが０〜５の整数であり、ｈ、ｌおよびｋの少なくとも１つが４である化合物、Ｘ１＝１であり、Ｘ２＝０または１であり、Ｘ３＝Ｘ４＝０である化合物、Ｙ１、Ｙ２およびＹ４が０または１であり、Ｙ３＝０である、化合物等も好適に合成される。
なお、一般式（ＩＩ）で表される化合物において、少なくとも１つのＲがＦｍｏｃ基である化合物も、上記製造方法によって合成される、機能性ＰＮＡオリゴマーの前駆体的な化合物である。
【００７１】
また、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物において、複数の機能性分子が導入されたものとして、例えば、ＲまたはＲ１が細胞膜透過性機能性分子誘導体であるものが好適に合成される。このような化合物は、典型的には、Ｒが細胞膜透過性機能性分子誘導体等であり、Ｒ１が光機能性分子等の機能性カルボン酸誘導体等であるもの、すなわち、末端部を含む複数部位に機能性分子が導入され、それらによって複数の機能が付与された化合物である。このような化合物は、例えば下記のように模式化することができる。
【化３１】
2004196662.tif 000029
【００７２】
このような化合物は、例えば前記一般式（ＩＩ）において、Ｘ１＝Ｘ２＝Ｙ１＝１であり、かつＺ１≧２である化合物である。このような化合物は合成のしやすさおよび合成コストの面等において好適である。
【００７３】
リンカー部位を導入することによって、個々の機能性部位および塩基配列認識領域の干渉を防ぎ、分子の機能をより確実なものにすることができる。本明細書におけるＰＮＡ、ＰＮＡモノマーおよびＰＮＡオリゴマーの語には、リンカー部位をその末端および／または内部に含むものも包含される。
これらの部位または領域間の相互干渉を防ぐための部位としては、前記リンカー部位のみならず、一般式（ＩＩ）におけるｆ〜ｈを、所望に応じて選択することによっても可能である。
リンカー部位を構成する基としては、直鎖状または分枝状の炭化水素およびそれらのエーテル体等が挙げられるが、直鎖状炭化水素基は導入の容易さおよびコストなどの面から好適であり、特に炭素数１〜６の直鎖状炭化水素基が好適である。また、エーテル体は、その汎用性において好適である。
【００７４】
前記複数の機能性分子が導入された化合物は、例えばＫｏｃｈ，  Ｔ．；  Ｈａｎｓｅｎ，  Ｈ．Ｆ．；  Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｐ．；  Ｌａｒｓｅｎ，  Ｔ．；  Ｂａｔｚ，  Ｈ．Ｇ．；  Ｏｔｔｅｓｏｎ，  Ｋ．；  Ｏｒｕｍ，  Ｈ．  Ｊ．  ＰｅｐｔｉｄｅＲｅｓ．  １９９７，  ４９，  ８０−８８．を利用して好適に合成される。
塩基配列認識部位は、市販の各種ＰＮＡモノマーを用いて固相合成によりオリゴマー化することができる。リンカー部位には、市販のＢｏｃ−７−アミノヘプタン酸、Ｂｏｃ−６−アミノカプロン酸等を用いることができる。
【００７５】
１の機能性分子として光機能性分子を導入すれば、蛍光標識することが可能であり、かつ他の機能も有する化合物を合成することができる。このような蛍光標識部位として、市販のＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡまたはＰｙｒｅｎｅ等の市販の活性エステル型蛍光標識化合物を用いて、多様な蛍光発光波長を選択することが可能であるが、導入される蛍光標識化合物はこれらに限定されるものではない。
【００７６】
本発明の化合物に導入し得る他の機能性の例としては、膜透過性機能が挙げられる。このような膜透過性機能部位は、前記一般式（Ｉ）で表される化合物を用いることにより、同様に導入することができる。膜透過性を向上させることができる機能性分子としてアルギニンが挙げられるが、リシンおよびセリン等の他の水溶性アミノ酸も好適に用いることができる。
【００７７】
また、Ｃｂｚアミノ酸ユニットとＦｍｏｃアミノ酸ユニットおよび／または機能性分子を有するアミノ酸ユニットを用いることによって、複数個のアミノ酸を導入することも可能である。しかしながら、上記２化合物は本発明による膜透過性機能を有する蛍光ＰＮＡプローブのモデル化合物であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７８】
これらのプローブの特徴は、「全てＰＮＡ型になっているので、完全な酵素耐性を有すること」である。すなわち、これまでの膜透過性機能を有するプローブは、ＰＮＡと膜透過性機能を有するペプチド鎖あるいはリン脂質を共有結合させたものが主流であったが、これらの既知のプローブは優れた膜透過性機能を有するものの、一旦細胞内に入ると酵素群によりペプチド鎖あるいはリン脂質が分解されることが予想される。したがって、これらは、ターゲットを認識していない分解を受けたプローブを洗浄過程で完全に取り除くことができないという欠点を有する。
【００７９】
これに対して、今回設計したプローブは、細胞内においても酵素分解を受けないため、ターゲットを認識していないプローブは洗浄過程で完全に取り除かれるため、正確な遺伝子発現量の定量を可能とするものである。
なお、これらの機能性を有する化合物以外にも、ラクトースやトリスエックス等の臓器選択性機能性分子、タナチンやセクロピン等の殺菌性機能性分子およびビオローゲン等の分子認識性機能性分子等も、本発明によれば制限なく導入することが可能であり、そのような化合物を、大量に低コストで実用に供することが可能になる。
【００８０】
さらに、本発明によるプローブには、光放出性分子および光消失性分子とを併せて有するモレキュラービーコンも包含される。モレキュラービーコンとは塩基配列を特異的に認識したことを蛍光発光により検出するプローブであって、遺伝子工学において重要な化合物である。
従来のモレキュラービーコンは、ＤＮＡを用いていたため、酵素耐性が低く保存に適さなかったが、本発明によるプローブはＰＮＡバックボーンを用いているため、より安定性が高いものである。
前記光放出性分子としては、ＦＩＴＣ、Ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ、Ｆｌａｖｉｎ、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＰｙｒｅｎｅおよびＣｏｕｍａｒｉｎｅ等を挙げることができ、光消失性分子としてＤａｂｃｙｌ、ＨＡＢＡ、ＮＤＩおよびＡｚｏ等を挙げることができる。
【００８１】
【実施例】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限られるものではない。
（実施例１）第ＩＩＩ法に関する例（１）
【化３２】
2004196662.tif 000030
【００８２】
（１）前駆体的ＰＮＡモノマーユニットの固相担体への導入
まず、固相担体ＭＢＨＡ（５０  ｍｇ）にＣｂｚ−Ｃ４−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（９．０  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０  ｍＬ、２０  ｍｍｏｌ）を用いて伸長反応を行った。縮合反応が定量的にいっているか否かを調べるために、ニンヒドリン反応を利用した。
（２）ＰＮＡオリゴマーの伸長反応
次いで、グアニンＰＮＡモノマーユニット（１０．８  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０  ｍＬ、２０  ｍｍｏｌ）を用いて逐次伸長反応を行った。他のＰＮＡモノマーユニットも同様にして縮合し、伸長反応を行った。
（３）前駆体的ＰＮＡモノマーユニットの導入）
さらに、Ｆｍｏｃ−Ｃ５−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（２２．２  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）を、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０  ｍＬ、２０  ｍｍｏｌ）を用いて縮合させた。
（機能性分子の固相合成時ポスト合成的導入）全てのユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（２０％  ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ＤＭＦ、室温３分）してＦｍｏｃ基を脱保護した。次いで、機能性カルボン酸誘導体としてＦＩＴＣ（１５．６  ｍｇ、４０  ｍｍｏｌ）をＴＥＡ（５．６  ｍＬ、４０  ｍｍｏｌ）を用いて縮合し、ポスト合成的に機能性分子を導入した。
（４）固相担体からの切り出し
切り出し試薬（ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｐ−ｃｒｅｓｏｌ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌ＝６０／２５／１０／１０）により固相担体からの切り出しとＣｂｚ基の脱保護を同時に行い、後処理して下記化合物を得た。
【化３３】
2004196662.tif 000031
【００８３】
（５）固相担体から切り出した後の機能性分子のポスト合成的導入
精製した上記化合物に、機能性カルボン酸誘導体としてＤａｂｃｙｌ−ＯＳｕ（１４．６  ｍｇ、４０  ｍｍｏｌ）をＴＥＡ（１３．９  ｍＬ、４０  ｍｍｏｌ）を用いて縮合し、ポスト合成的に機能性分子を導入した。反応後、ＨＰＬＣによる精製を行い、目的とする下記化合物を得た。
【化３４】
2004196662.tif 000032
【００８４】
（実施例２）  第ＩＩＩ法に関する例（２）
（１）前駆体的ＰＮＡモノマーユニットの固相担体への導入
まず、固相担体ＭＢＨＡ（５０  ｍｇ）にＦｍｏｃ−Ｃ５−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（２２．２  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）を、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０  ｍＬ、２０  ｍｍｏｌ）を用いて縮合させた。縮合反応が定量的にいっているか否かを調べるために、ニンヒドリン反応を利用した。
（２）ＰＮＡオリゴマーの伸長反応）
次いで、グアニンＰＮＡモノマーユニット（１０．８  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０  ｍＬ、２０  ｍｍｏｌ）を用いて逐次伸長反応を行った。他のＰＮＡモノマーユニットも同様にして縮合し、伸長反応を行った。
（３）前駆体的ＰＮＡモノマーユニットの導入）さらに、Ｃｂｚ−Ｃ５−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（９．０ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０  ｍＬ、２０  ｍｍｏｌ）を用いて伸長反応を行った。この過程を２回繰り返した。
（４）機能性分子の固相合成時ポスト合成的導入
全てのユニットを逐次縮合した後、ピペリジン処理（２０％  ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ＤＭＦ、室温３分）してＦｍｏｃ基を脱保護した。次いで、機能性カルボン酸誘導体としてＦＡＭ−ＯＳｕ（１５．６  ｍｇ、４０  ｍｍｏｌ）をＴＥＡ（５．６  ｍＬ、４０  ｍｍｏｌ）を用いて縮合し、ポスト合成的に機能性分子を導入した。
（５）固相担体からの切り出し
切り出し試薬（ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｐ−ｃｒｅｓｏｌ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌ＝６０／２５／１０／１０）により固相担体からの切り出しとＣｂｚ基の脱保護を同時に行い、後処理して機能性分子を導入する前の化合物を得た。
（６）固相担体から切り出した後の機能性分子のポスト合成的導入
機能性カルボン酸誘導体としてＤａｂｃｙｌ−ＯＳｕ（１４．６  ｍｇ、４０  ｍｍｏｌ）をＴＥＡ（１３．９  ｍＬ、４０  ｍｍｏｌ）を用いて縮合し、ポスト合成的に機能性分子を導入した。反応後、ＨＰＬＣによる精製を行い、目的とする下記化合物を得た。
【００８５】
【化３５】
2004196662.tif 000033
【００８６】
（実施例３）  第ＶＩ法に関する例
【化３６】
2004196662.tif 000034
【００８７】
（１）前駆体的ＰＮＡモノマーユニットの固相担体への導入
まず、固相担体ＭＢＨＡ（５０  ｍｇ）にＦｍｏｃ−Ｃ５−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（２２．２  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０  ｍＬ、２０  ｍｍｏｌ）を用いて伸長反応を行った。縮合反応が定量的にいっているか否かを調べるために、ニンヒドリン反応を利用した。
（２）ＰＮＡオリゴマーの伸長反応
次いで、チミンＰＮＡモノマーユニット（７．７  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）、Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（８．２  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）、あるいはシトシンＰＮＡモノマーユニット（１０．１  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）を、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０  ｍＬ、２０  ｍｍｏｌ）を用いて逐次縮合し、ＰＮＡオリゴマーの伸長反応を行った。
（３）機能性分子の固相合成時ポスト合成的導入
ピペリジン処理（２０％  ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ＤＭＦ、室温３分）してＦｍｏｃ基を脱保護した。次いで、機能性カルボン酸誘導体としてＡｚｏ−ＯＳｕ（１３．８  ｍｇ、４０  ｍｍｏｌ）をＴＥＡ（１３．９  ｍＬ、４０  ｍｍｏｌ）を用いて縮合し、ポスト合成的に機能性分子を導入した。（ＰＮＡオリゴマーの伸長反応）さらに、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（１３．９  ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）を、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６  ｍｇ、２０  ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０  ｍＬ、２０  ｍｍｏｌ）を用いて再度縮合し、ＰＮＡオリゴマーの伸長反応を行った。
（固相担体からの切り出し）切り出し試薬（ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｐ−ｃｒｅｓｏｌ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌ＝６０／２５／１０／１０）により固相担体からの切り出しとＣｂｚ基の脱保護を同時に行い、後処理して下記化合物を得た。
【００８８】
【化３７】
2004196662.tif 000035
【００８９】
【発明の効果】
本発明によれば、光機能性分子に限定されることない多種多様な機能性分子を、ＰＮＡ中に容易に導入することができ、多種多様な機能性分子をＰＮＡ中に容易かつ効率的に導入することができ、遺伝子治療などに用いられる種々のＰＮＡの構築が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡとＰＮＡの構造および荷電の状況の違いを表す図である。
【図２】２種類のＰＮＡモノマーユニットの構造を表す図である。
【図１】
2004196662.tif 000040
【図２】
2004196662.tif 000041