(57)【要約】【課題】酵母類により汚染されたはっ酵乳製品を試料として、その汚染酵母類のＡＴＰを測定する方法において、ＡＴＰ消去剤によって処理できない、乳酸菌由来のＡＴＰを、試料中に効率よく遊離せしめ、除くための処理剤、及びその方法、更に同処理剤を用いる酵母類ＡＴＰの高感度検出法を提供する。【解決手段】酵母類を含有するはっ酵乳試料にＡＴＰ消去剤を添加作用せしめて該試料中の遊離ＡＴＰを消去する第一工程、これにＡＴＰ抽出剤を添加作用せしめて酵母類由来のＡＴＰを試料中に遊離せしめる第二工程、ここで遊離したＡＴＰを測定する第三工程をこの順序で行う酵母類由来ＡＴＰの測定法において、第一工程と同時または同工程に先立ち、グラム陽性菌にのみ働く界面活性剤を含有するＡＴＰ消去前処理剤、或いは更に金属キレート剤を含有するＡＴＰ消去前処理剤を添加作用せしめ、酵母類由来ＡＴＰを高感度で測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性菌のみに働く界面活性剤を有効成分として含有する、酵母類由来ＡＴＰの検出法において添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤。
【請求項２】
グラム陽性菌のみに働く界面活性剤と金属キレート剤とをそれぞれ有効成分として含有する、酵母類由来ＡＴＰの検出法において添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤。
【請求項３】
グラム陽性菌及び酵母を含有する試料にＡＴＰ消去剤を添加作用せしめて該試料中の遊離ＡＴＰを消去する第一工程、これにＡＴＰ抽出剤を添加作用せしめて酵母類に由来するＡＴＰを試料中に遊離せしめる第二工程、ここで遊離したＡＴＰを測定する第三工程をこの順序で行う酵母類由来ＡＴＰの検出法において、第一工程と同時または同工程に先立ち、請求項１または請求項２のいずれかに記載されたＡＴＰ消去前処理剤を該試料に添加作用せしめることを特徴とする酵母類由来ＡＴＰの高感度検出法。
【請求項４】
遊離したＡＴＰを測定する手段として、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を使用することを特徴とする請求項３に記載された酵母類由来ＡＴＰの高感度検出法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明はグラム陽性菌含有物の酵母類由来ＡＴＰの測定法において添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤およびその処理剤を用いる酵母類由来ＡＴＰの高感度検出法に関する。特に、グラム陽性菌及び酵母類を含有する試料、例えば酵母に汚染されたはっ酵乳製品を試料として用いる酵母類由来ＡＴＰの検出法において、ＡＴＰ消去剤によって処理できない、乳酸菌由来のＡＴＰを、試料中に効率よく遊離せしめるための処理剤、（以下、「ＡＴＰ消去前処理剤」という）およびその処理剤を用いる酵母類由来ＡＴＰの高感度検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
飲食品を問わず様々な分野で行われている微生物検査法のひとつに、バイオルミネッセンス法がある。この方法は、ルシフェリンの酸化発光量とＡＴＰ（アデノシン三リン酸）量が比例することから微生物のＡＴＰ量を指標として菌数を測定する方法である。しかし、様々な食品には、微生物以外の体細胞や、遊離ＡＴＰが含まれており、試料中の生菌数を通常のバイオルミネッセンス法で測定しようとしても、体細胞由来のＡＴＰ、遊離ＡＴＰ、微生物由来のＡＴＰの合計のＡＴＰ量を測定することとなり、微生物由来のＡＴＰ量のみを測定して生菌数を求めることができない問題を有していた。そこで、これら微生物以外の成分を低減する以下のような前処理技術を組込んだ方法が提案された。即ち、試料に、微生物以外の細胞に含まれているＡＴＰを選択的に抽出する体細胞ＡＴＰ抽出試薬を添加し、体細胞由来のＡＴＰを抽出し、フリー（遊離）ＡＴＰと共にＡＴＰ分解試薬で分解後、これに微生物ＡＴＰ抽出試薬を加え微生物由来のＡＴＰを抽出し、これにルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を加えて生じた発光をルミノメーターで測定することにより、前記微生物ＡＴＰ量を求める方法（例えば、非特許文献１、特許文献１〜３参照。）。
【０００３】
しかし、今回測定しようとしているはっ酵乳製品中の酵母類は、はっ酵乳製品中に乳酸菌が１０７ＣＦＵ／ｍｌ以上存在しているために、従来のＡＴＰ分解試薬だけでは、乳酸菌のＡＴＰが分解されず、試料に残り、微生物ＡＴＰ抽出試薬による処理により遊離ＡＴＰとして試料中に抽出されることが判明した。
【０００４】
従って、微生物以外の成分の影響を低減する上記前処理技術を用いて、ＡＴＰ消去剤で処理しても、乳酸菌由来のＡＴＰを、試料中に効率よく遊離せしめることができず、最後に乳酸菌由来のＡＴＰと酵母類由来のＡＴＰの合計のＡＴＰ量を測定することとなり、酵母類由来のＡＴＰ量のみを測定して生菌数を求めることができないという問題を有していた。
【０００５】
【非特許文献１】
倉田浩、「ＡＴＰバイオルミネッセンス法の微生物汚染対策への有効性」、月刊フードケミカル、１９９５年、５号、ｐ．５５−６３
【特許文献１】
特開平４−２２８０９７号公報
【特許文献２】
特表平６−５００４６２号公報
【特許文献３】
特開平９−７５０９８号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記のような問題点を解決するため、汚染されたはっ酵乳製品を試料として用い、その汚染酵母類由来ＡＴＰを測定する方法において、ＡＴＰ消去剤によって処理できない、乳酸菌由来のＡＴＰを、試料中に効率よく遊離せしめ、除くための処理剤及びその方法を提供する。また、同処理剤を用いる酵母類由来ＡＴＰの高感度検出法を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、汚染されたはっ酵乳を試料として用い、これにグラム陽性菌特異的な界面活性剤を添加作用せしめるときは、ＡＴＰ消去剤によって処理できない、試料由来の、グラム陽性菌の一つである乳酸菌由来の該ＡＴＰを、試料中に効率よく遊離できることを知った。また、グラム陽性菌特異的な界面活性剤と共に金属キレート剤（例えば、ＥＧＴＡ）を添加作用せしめるときは、乳酸菌由来の該ＡＴＰを、さらに効率よく試料から遊離できることを知った。
【０００８】
本発明は、これらの知見に基づいて完成したものであって、すなわち（１）本発明はグラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤を有効成分として含有する、酵母類由来ＡＴＰの測定法において添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤である。また（２）本発明はグラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤と金属キレート剤とをそれぞれ有効成分として含有する、酵母類由来ＡＴＰの測定法において添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤である。（３）本発明は酵母を含有する試料にＡＴＰ消去剤を添加作用せしめて該試料中の遊離ＡＴＰを消去する第一工程、これにＡＴＰ抽出剤を添加作用せしめて酵母類由来のＡＴＰを試料中に遊離せしめる第二工程、ここで遊離したＡＴＰを測定する第三工程をこの順序で行う酵母類由来ＡＴＰの測定法において、第一工程と同時または同工程に先立ち、前記に記載されたＡＴＰ消去前処理剤を該試料に添加作用せしめることを特徴とする酵母類由来ＡＴＰの高感度測定法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明で用いる試料としては、グラム陽性菌と酵母類を含むと思われるものであれば特に限定されないが、例えば飲食品、医薬品、化粧品等の各工業製品、その半製品、その原料、海水、河川水、工業用水、下水、土壌、尿、糞便、血液、喀痰、膿汁、細胞の培養液等が挙げられる。また、細菌汚染検査、清浄度検査、拭き取り検査等の各種検査における検体も、本発明の試料として挙げることができる。しかし、本発明の効果が顕著に現れるはっ酵乳を含有する試料が好ましい。
【００１０】
本発明を実施するには、前記したグラム陽性菌及び酵母類を含有する試料にＡＴＰ消去剤を添加作用せしめて該試料中の遊離ＡＴＰを消去する第一工程、これにＡＴＰ抽出剤を添加作用せしめて酵母類由来のＡＴＰを試料中に遊離せしめる第二工程、ここで遊離したＡＴＰを測定する第三工程を従来公知の酵母類由来ＡＴＰの測定法（従来法）に行う。しかし、第一工程と同時または同工程に先立ち、（１）グラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤を有効成分として含有するＡＴＰ消去前処理剤、または（２）グラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤と金属キレート剤とをそれぞれ有効成分として含有するＡＴＰ消去前処理剤、を添加作用せしめる点が従来法と異なる。
【００１１】
グラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤は、具体的にはデオキシコール酸ナトリウムが好ましい。またその他、グラム陽性菌のみに働く同物質の異なる金属塩や誘導物質を用いてもよい。
【００１２】
本発明においてグラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤を用いると、「はっ酵乳を試料とした場合、乳酸菌のＡＴＰを除き、酵母類由来のみのＡＴＰの測定」を期待することが可能となる。
【００１３】
なお、グラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤と金属キレート剤を併用すると、はっ酵乳中の乳酸菌の分散によく作用し、乳酸菌のＡＴＰが除き易くなるので好ましい。
【００１４】
グラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤を添加作用せしめるときの条件は、試料の種類、性状等に応じて適宜設定することが好ましく、通常は以下の要領で行うことが好ましい。
（１）デオキシコール酸ナトリウムの終濃度：０．２重量％〜２．０重量％
（特に０．５重量％〜１．０重量％が好ましい）
（２）ｐＨ条件：弱酸性〜弱アルカリ性
（特にｐＨ６．０〜７．５が好ましい）
（３）反応温度：２０〜５０℃
（特に２３〜２７℃が好ましい）
（４）反応時間：１０秒〜１時間
（特に３〜１０分が好ましい）
【００１５】
また、本発明のＡＴＰ消去前処理剤として用いられる金属キレート剤としては、乳成分のカゼインミセルに働くキレート剤であれば使用できるが、特にカルシウムに働くキレート剤（例えば、ＥＧＴＡ）が好ましい。
【００１６】
金属キレート剤の終濃度は、界面活性剤や試料の種類などによっても異なるが、例えばＥＧＴＡを用い、ヨーグルトを試料とした場合、濃度は、０．０１Ｍ〜０．１Ｍが好ましく、特に０．０３Ｍ〜０．０６Ｍが好ましい。ｐＨ条件、反応温度、反応時間は、それぞれグラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤を添加作用せしめるときの条件と同一とすることが好ましい。
【００１７】
本発明のＡＴＰ消去前処理剤は、固体状（例えば、顆粒状、粉末状、錠剤状等）であっても、液体状であってもよいが、操作の簡便性からすると、液体状であることが好ましい。その場合、有効成分であるグラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤を、滅菌処理した水や適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、メス（ＭＥＳ）緩衝液）に溶解すればよい。そして、上記の成分以外に、他の成分、たとえば賦形剤、分散剤、乳化剤、保存剤、防腐剤、ｐＨ緩衝剤、吸湿剤等が使用可能である。これらの成分の種類や、添加量は特に限定されず、試料の用途、操作性、測定系の種類、試料の形態等に応じて適宜設定すれば良い。
【００１８】
以下に、本発明の酵母ＡＴＰの測定法の一具体例を以下に示す。
第一工程：細胞を含む試料に、本発明のグラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤を有効成分として含有するＡＴＰ消去前処理剤を添加し、試料中に含まれる乳酸菌に付着あるいは内蔵されるＡＴＰを溶液中に遊離させ、遊離させたＡＴＰおよび元来から存在する遊離ＡＴＰを測定系に影響がないように処理する。すなわち、フィルターを用いる方法や遠心分離による方法、さらには、溶液中にＡＴＰ分解活性を有する酵素（以下「ＡＴＰ分解酵素」ということがある）を添加作用せしめＡＴＰを分解する方法など任意の方法により、遊離ＡＴＰの影響を取り除く。このうち、簡便性や迅速性を考えた場合、ＡＴＰ分解酵素を用いる方法がより好ましい。ＡＴＰ分解酵素としては、例えば、アデノシンリン酸デアミナーゼを単独で使用するか、または、アピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリホスファタ−ゼからなる群の少なくとも１種と、アデノシンリン酸デアミナーゼとを併用する。この工程において、ＡＴＰ分解酵素がプロテアーゼにより分解されにくい性質を有する場合は、プロテアーゼを併用することが好ましい。なお、この第一工程で添加したＡＴＰ分解酵素は、次の工程に入る前に失活させておくことが好ましい。なぜなら、この後に続くＡＴＰ抽出時に、先に添加したＡＴＰ消去剤（ＡＴＰ分解酵素試薬）が、試料（検体）中に残存するため、抽出される酵母類由来のＡＴＰが分解され、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の結果生じる発光量の減少がおこり、酵母類の検出感度が低下するからである。酵素活性を失活させる方法としては、特に限定されないが、例えば、活性阻害剤を添加することにより酵素を失活させる方法が挙げられる。酵素の活性阻害剤としては、後述するＡＴＰ抽出試薬を添加使用することができる。さらには、酸またはアルカリを添加することにより、試料のｐＨを、該酵素が失活する範囲に変化させる方法が使用できる。
【００１９】
第二工程：ＡＴＰ抽出剤を添加作用せしめて酵母類由来のＡＴＰを試料中に抽出する。ＡＴＰを抽出する方法としては、試料にＡＴＰ抽出試薬を添加する方法が好適である。ＡＴＰ抽出試薬としては、例えば、界面活性剤、エタノールとアンモニアの混合液、メタノール、エタノール、トリクロル酢酸、過塩素酸等が使用できるが、このうち界面活性剤はＡＴＰの抽出効率が高いほうが好ましい。界面活性剤としては、アニオン界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイルリン酸ナトリウム、アルキルベンスルホン酸ナトリウム）、カチオン界面活性剤（例えば、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＣ）、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム）、両性（ツイッター）界面活性剤（例えばＴｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ３−０８，  ３−１０，３−１２，  ３−１４，  ３−１６、Ｔｅｇｏ）、非イオン性界面活性剤（例えば、  Ｔｗｅｅｎ  ２０，  ６０，  ８０、Ｓｐａｎ  ６０，  ８０、  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５，  Ｘ−１００，  ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル）が使用できる。
【００２０】
第三工程：抽出されたＡＴＰを測定する。抽出された酵母類由来ＡＴＰの測定法は、従来公知のＡＴＰの測定法により実施することができる。このうち特にルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を用いる方法（生物発光法）が簡便、迅速に測定可能で、かつ測定値の信頼性が高い結果が得られるので好適である。この場合は、抽出されたＡＴＰを含む試料を、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬と接触させ、生成した発光量を測定して酵母類由来ＡＴＰ量を求める。生物発光試薬中のルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである場合、生物発光試薬は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびマグネシウムイオンを含むことが好ましい。生成した発光量は、ルミノメーター、例えばルミテスター  Ｃ−１００、Ｋ−１００、Ｋ−２００、Ｋ−２１０（いずれもキッコーマン社製）、ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１改良型（アロカ社製）、Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０１（ベルトールド社製）により測定することができる。
【００２１】
【実施例】
以下実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
（ＡＴＰ消去前処理剤の調製例）
グラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を終濃度１．０重量％となるように滅菌蒸留水に溶解調製して、酵母ＡＴＰの測定法において添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤を調製した。
【００２３】
実施例２
（ＡＴＰ消去前処理剤の調製例）
グラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬工業社製）および金属キレート剤ＥＧＴＡ（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）を終濃度がそれぞれ１．０重量％、０．１Ｍとなるように滅菌蒸留水に溶解して、酵母類由来のＡＴＰの測定法において添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤を調製した。
【００２４】
実施例３
ブルガリアヨーグルトＬＢ８１（明治乳業社製）に酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｕｒｕｓｅｉ  ＩＦＯ１３９５）を添加培養し、増殖したものをブルガリアヨーグルトＬＢ８１（明治乳業社製）にて１０倍希釈系列を作成し、この希釈系列を試料とし、グラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬工業社製）および金属キレート剤ＥＧＴＡ（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）を有効成分とするＡＴＰ消去前処理剤を用いて、該試料の前処理を行い、次に遊離ＡＴＰを消去し、さらに酵母内ＡＴＰ由来の発光量を測定し、酵母数と発光量の相関性を検討した。
【００２５】
（１）試料の調製：
上記記載の希釈系列よりそれぞれ０．５ｇサンプリングし、試料とした。
【００２６】
第一工程：試料のＡＴＰ消去前処理および試料中の遊離ＡＴＰの消去
試料０．５ｇに、実施例２で得られたＡＴＰ消去前処理剤それぞれを１０ｍｌと５ｍｌさらにｐＨ調整用に０．１Ｍトリシン緩衝液（ｐＨ８．０）を４ｍｌ加え、２５℃で５分間、試料のＡＴＰ消去前処理を行った。次に、反応処理液（試料）を遠心機０５ＰＲ−２２（日立社製）にて２０００回転で１０分間遠心し、上清を除き、沈殿物にルシフェール希釈液（キッコーマン社製）１．０ｍｌを添加し、そこに、ＡＴＰ消去試薬（キッコーマン社製、付属の溶解液で溶解したもの）０．１ｍｌを添加して、攪拌後、室温で３０分間反応することにより遊離ＡＴＰの消去を行った。
【００２７】
第二工程：酵母類由来ＡＴＰの抽出
遊離ＡＴＰを消去した試料を０．１ｍｌ採取し、そこに、ＡＴＰ抽出試薬（キッコーマン社製）０．１ｍｌを添加して、攪拌後、２０秒間放置することにより酵母類由来ＡＴＰの抽出を行った。
【００２８】
第三工程：発光量の測定
ＡＴＰ抽出を行った試料０．２ｍｌに、ルシフェール発光試薬（キッコーマン社製付属の発光試薬溶解液で溶解したもの）０．１ｍｌを添加し、直ちに、キッコーマン社製ルミテスター（Ｌｕｍｉｔｅｓｔｅｒ）Ｃ−１００を用いて、その発光量を測定した。このときの発光量を、消去されてない遊離ＡＴＰと酵母類由来ＡＴＰのトータルの発光量（Ｔ）とした。
【００２９】
試料のかわりに、滅菌ペプトン加生理食塩水を用いて、ＡＴＰ消去の前処理、ＡＴＰの消去、ＡＴＰ抽出剤の添加、発光量の測定を行った。このときの発光量を、消去できなかった遊離ＡＴＰ量（フリー値）Ｆとした。
【００３０】
トータル値Ｔからフリー値Ｆを減することにより、酵母類由来ＡＴＰの正確な発光量を求めることができ、これを補正発光量として求めた。
【００３１】
（寒天培養法により試料の酵母数ＣＦＵ／ｍｌの算出試験）
通常の表面塗沫の寒天培養法を用いて、試料中に含まれる酵母数を求めた。
得られた値を酵母数の実測値とした。
【００３２】
まず、試料と滅菌済みペプトン加生理食塩水で希釈系列を作成し、滅菌シャーレに０．１ｍｌの上記希釈試料を滅菌ピペットで無菌的に採取し、あらかじめ、１２１℃で２０分間滅菌処理を行い、その後、約５０℃に冷却した溶解済みのポテトデキストロース寒天培地（２０％バレイショ浸出液、２．０％ブドウ糖、ｐＨ５．６、１．５％寒天）を滅菌シャーレに加え、平板として固めたものを作製しておき、試料と滅菌済みペプトン加生理食塩水で希釈系列を作成したものを、上記寒天培地に０．１ｍｌ滅菌ピペットで無菌的に加え、コンラージ棒により均一に広げた。次に、その平板を２５℃で４８時間培養し、出現したコロニーの計測を行った。そのコロニー数より酵母数を求め、酵母ＣＦＵとした。
【００３３】
上記により求められた酵母数と補正発光量（ＲＬＵ）との相関関係を、図１（本発明のＡＴＰ消去前処理剤の結果）に示す。
【００３４】
【比較例】
（比較例１）
上記実施例３の「酵母数と発光量の相関性検討試験」において、「ＡＴＰ消去前処理剤の代わりに同量の滅菌水を用いる」以外は全く同様にして、酵母数と発光量の相関性検討試験を行った。その結果を図２に示す。
【００３５】
図１および図２の結果から、先ず図１では、酵母数と補正発光量（ＲＬＵ）との相関関係が高く、傾きが１の直線関係になっているが、本発明のＡＴＰ消去前処理剤を使用していない図２では、酵母数と補正発光量（ＲＬＵ）との相関関係が低く、傾き１の直線性になっていない。このことから、本発明のＡＴＰ消去前処理剤を使用した場合は、発光量より試料中の酵母数を類推することは容易であるが、比較例では、酵母類以外のＡＴＰすなわち標的外ＡＴＰも標的ＡＴＰと共に測定していることから、発光量より試料中の酵母数を類推することが困難になっている。この結果、本発明のＡＴＰ消去前処理剤が、酵母類のＡＴＰの測定法において好適に使用できることが示された。
【００３６】
実施例４
実施例３と同様にして、ブルガリアヨーグルトＬＢ８１（明治乳業社製）に酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｕｒｕｓｅｉ  ＩＦＯ１３９５）を添加培養し、増殖したものをブルガリアヨーグルトＬＢ８１（明治乳業社製）にて１０倍希釈系列を作製し、この希釈系列を試料とした。次いで、実施例３の「酵母数と発光量の相関性検討試験」において、「実施例２のＡＴＰ消去前処理剤（デオキシコール酸ナトリウムとＥＧＴＡの併用）」を用いる代わりに「実施例１のＡＴＰ消去前処理剤（デオキシコール酸ナトリウム単独使用）」とＥＧＴＡの代わりの滅菌水を用いる以外は、全く同様にして酵母数と発光量の相関性検討試験を行った。そして、酵母数と補正発光量（ＲＬＵ）の関係を調べた。結果をまとめて図３に示す。
【００３７】
図１および図３の結果から、先ず図１では、酵母数と補正発光量（ＲＬＵ）との相関関係が高く、傾きが１の直線関係になっているが、本発明のＥＧＴＡを使用していない図３では、酵母数が少ないところでの酵母数と補正発光量（ＲＬＵ）との相関関係が低く、図１と比較して傾き１の直線から離れていることが分かる。このことから、ＡＴＰ消去前処理剤としてグラム陽性菌のみに特異的に働く界面活性剤デオキシコール酸ナトリウム使用することにより、補正発光量と菌数の相関は改善されるが、さらにＡＴＰ消去前処理剤にデオキシコール酸ナトリウムと金属キレート剤を併用することにより、酵母類以外のＡＴＰをより効果的に消去できることが判る。
【００３８】
【発明の効果】
従来の微生物ＡＴＰの測定法においては、酵母類と乳酸菌など複数の微生物種が存在している場合、酵母類のみのＡＴＰを測定しようとしても乳酸菌のＡＴＰが残存してしまうため測定ができず、その結果、試料の酵母類の数のみを正確に測定できないという問題があったが、本発明によれば、上記乳酸菌の該ＡＴＰを、前処理段階において試料中に効率よく遊離せしめるため、除去が容易となり、正確に酵母類のＡＴＰが測定でき、酵母類の数を測定することが可能となる。そして特に、酵母類に汚染されたヨーグルトを試料として用い、汚染酵母類のＡＴＰを測定しようとするとき、従来の微生物ＡＴＰの測定法では、この試料中の乳酸菌のＡＴＰの消去（または低減）が非常に困難であるため、酵母類のＡＴＰの検出限界が低くなり、酵母類の数を測定できないという問題があったが、本発明によれば、試料中の乳酸菌のＡＴＰが遊離され、消去（または低減）が容易となり、高感度に酵母類のＡＴＰを測定でき、これより酵母類の数を測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３における酵母数と補正発光量との相関性を示す図
【図２】比較例１における酵母数と補正発光量との相関性を示す図
【図３】実施例４における酵母数と補正発光量との相関性を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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