(57)【要約】      （修正有）【課題】  ＣＤ４＋Ｔ細胞に粘膜侵入性タンパク質抗原を抗原提示することができる抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体および多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体、該多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を含み粘膜侵入性タンパク質抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出でき、粘膜系におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原特異的活性化の解析等に有効に利用可能な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出体等を提供する。【解決手段】  粘膜侵入性タンパク質のＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基を含む抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の少なくとも一部とを含んでなり、該抗原ペプチドを抗原提示することを特徴とする抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体、および、該抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体をモノマー単位として含む多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘膜侵入性タンパク質のＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基を含む抗原ペプチドと、ＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外領域の少なくとも一部または該ＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外領域の少なくとも一部に対し１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものとを含んでなり、該抗原ペプチドを抗原提示することを特徴とする抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項２】
生理的条件下で可溶性である請求項１に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項３】
粘膜侵入性タンパク質が、微生物由来粘膜侵入性タンパク質である請求項１および２のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項４】
微生物由来粘膜侵入性タンパク質がＡＢサブユニット型毒素である請求項３に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項５】
ＡＢサブユニット型毒素が、コレラ毒素および病原性大腸菌由来毒素のいずれかである請求項４に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項６】
Ｔ細胞抗原受容体認識抗原決定基が、ａ）からｅ）のいずれかである請求項５に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
ａ）コレラ毒素Ｂサブユニットの８６番目から１０３番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＢ８６−１０３）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部
ｂ）コレラ毒素Ｂサブユニットの３１番目から５０番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＢ３１−５０）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部
ｃ）コレラ毒素Ａサブユニットの２１番目から３９番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＡ２１−３９）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部
ｄ）コレラ毒素Ａサブユニットの１８０番目から１９４番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＡ１８０−１９４）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部
ｅ）病原性大腸菌由来毒素Ｂサブユニットの２６から４５番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＬＴＢ２６−４５）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部
【請求項７】
ＭＨＣクラスＩＩ分子が哺乳類由来である請求項１から６のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項８】
ＭＨＣクラスＩＩ分子がマウスＭＨＣクラスＩＩ分子である請求項７に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項９】
ＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外領域の一部がＭＨＣクラスＩＩ分子のα１ドメインおよびα２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分と、β１ドメインおよびβ２ドメインとを少なくとも含む細胞外領域部分とであり、
該α１ドメインおよびα２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分を含むα鎖と、
該β１ドメインおよびβ２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分を含むβ鎖とが共有結合および非共有結合の少なくともいずれかにより結合されており、該β鎖に前記抗原ペプチドが融合されている請求項１から８のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項１０】
β１ドメインのＮ末端、１番目と２番目のアミノ酸残基の間、２番目と３番目のアミノ酸残基の間、および、３番目と４番目のアミノ酸残基の間のいずれかに、抗原ペプチドが直接又は間接的に挟まれて融合されている請求項９に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項１１】
抗原ペプチドの融合部が、β１ドメインの３番目と４番目のアミノ酸残基の間である請求項１０に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項１２】
抗原ペプチドのＣ末端が、可動リンカーを挟んで間接的にβ１ドメインの１番目から４番目のいずれかのアミノ酸残基に融合されている、請求項１０および１１のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項１３】
α鎖が前記α１およびα２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分のＣ末端に一のロイシンジッパーのＮ末端が直接または間接に連結されてなり、β鎖が前記β１およびβ２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分のＣ末端に他のロイシンジッパーのＮ末端が直接または間接に連結されてなり、該２つのロイシンジッパーのうち、一方が酸性ロイシンジッパーであり、他方が塩基性ロイシンジッパーであり、前記α鎖とβ鎖との結合が該ロイシンジッパーによりなされる請求項９から１２のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項１４】
α鎖およびβ鎖の少なくともいずれかが、Ｃ末端に多量体化のためのタグ配列を含んでいる請求項９から１３のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項１５】
検出用マーカーを含む請求項１から１４のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項１６】
少なくとも２つの請求項１から１５のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を単量体ユニットとして含むことを特徴とする多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項１７】
ビオチン化された４つの抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体がストレプトアビジンに結合する４量体である請求項１６に記載の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項１８】
検出用マーカーを含む請求項１６および１７のいずれかに記載の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項１９】
検出用マーカーがストレプトアビジンに標識されている請求項１８に記載の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項２０】
検出用マーカーが蛍光色素である請求項１８および１９のいずれかに記載の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体。
【請求項２１】
請求項１６から２０のいずれかに記載の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を含むことを特徴とする抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出体。
【請求項２２】
請求項１６から２０のいずれかに記載の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を用いて、抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を抗原ペプチド特異的に認識するＴ細胞抗原受容体を持つＣＤ４＋Ｔ細胞を検出することを特徴とする抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出方法。
【請求項２３】
細胞試料と蛍光標識された多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体とを接触させる工程と、
細胞試料と蛍光標識されたＣＤ４抗体とを接触させる工程と、
前記二つの工程後に細胞試料を、レーザー光を用いて蛍光測定する工程と、
該測定データをコンピューターにより統計処理する工程とを含み、
ＣＤ４＋Ｔ細胞数中の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体＋Ｔ細胞数のパーセンテージを測定するフローサイトメトリー法による請求項２２に記載の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘膜免疫システムのメカニズム解析ツール等として有効に利用できる抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体および多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体、該多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を含む抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出体、該抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出体を用いた抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
外来抗原に対する免疫応答は、免疫関連組織内でＣＤ４陽性Ｔ細胞がマクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞上の抗原ペプチド／ＭＨＣクラスII複合体を認識することから始まる（図１）。粘膜免疫システムにおいては、循環帰巣経路に関するＩｇＡ誘導組織として良く知られているパイエル板が、抗原認識における代表的な場である。パイエル板では、抗原認識により活性化したＴｈ細胞が様々なサイトカインを産生し、Ｂ細胞の抗体産生前駆細胞への分化を誘導している。また、この活性化Ｔｈ細胞は抗体産生前駆Ｂ細胞とともに、一方では、循環帰巣経路を介して粘膜固有層に代表されるＩｇＡ実行組織へ移住し、抗原特異的分泌型ＩｇＡ応答を誘導する。また、他方では、脾臓に代表される全身系免疫担当組織へ移住し、抗原特異的ＩｇＧ応答を誘導すると言われている。このように、粘膜免疫システムは粘膜面および全身系の両免疫応答を誘導できるというユニーク且つ優れた特性を保持している。
したがって、このような粘膜免疫システム、特に消化器系の粘膜免疫システムにおけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の動態をモニターすることは、経口ワクチン等の粘膜免疫を賦活化する方法の開発に必須である。
【０００３】
しかし、無毒タンパク抗原の経粘膜単独投与では粘膜免疫応答を誘導することができず、逆に、免疫学的寛容と呼ばれる抗原特異的不応答状態に陥ることが知られている。
【０００４】
一方、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に抗原提示し、これを活性化または検出できるものとして、Ｔ細胞抗原受容体認識抗原決定基を含むＭＨＣクラスＩＩテトラマーが数例知られている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、前記免疫学的寛容により、一般的なＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基に反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞は粘膜系においては誘導されず、既存のＭＨＣクラスＩＩテトラマーは、粘膜免疫系の解析には利用できない。また、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と異なり、α鎖とβ鎖という２つの同等の大きさのタンパク質コンポネントが複雑に相互作用しあってフォールドするため、可溶性で有効に抗原提示できるＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基を含むＭＨＣクラスＩＩテトラマーを構築することは一般に難しい。これらのことから、粘膜侵入性抗原のＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基を含む可溶性ＭＨＣクラスIIテトラマーは未だ存在しない。
また、抗原ペプチド／ＭＨＣクラスII複合体の構造解析に関する研究から、抗原ペプチドにはコアとなる９つのペプチドアミノ酸モチーフがあり、そのうちの数個のアミノ酸がＭＨＣクラスIIのペプチド結合溝にはまることによって複合体を形成していることが分っている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
また、現在のところ、経粘膜投与抗原に対する特異的なＴｈ細胞がどの程度の頻度でどの組織に存在するのかを直接的に証明している報告は無い。例えば、消化管粘膜固有層には多数のＣＤ４陽性細胞が存在し、そのほとんどがある程度の活性化状態にあり、ある特定の抗原に対する特異性を持ったＣＤ４陽性Ｔ細胞のみを識別することは困難である。
【０００６】
一方、コレラ毒素（ＣＴ：accesion No. X00171）や病原性大腸菌由来の毒素（ＬＴ）等のＡＢ型毒素は、リンパ球や抗原提示細胞などの免疫担当細胞に作用することにより、免疫原性および免疫増強活性を発揮し、粘膜および全身系の両免疫応答を誘導することが知られている（例えば、非特許文献３参照）。ＣＴおよびＬＴは、それぞれコレラ菌および病原性大腸菌が産生する８５−ｋＤａのタンパクであり、１つのＡサブユニットと５量体のＢサブユニットで構成されている(図２)。Ａサブユニットは酵素（ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ）活性を有し、Ｂサブユニットは細胞表面上の主たるレセプターであるのＧＭ１ガングリオシドへ結合することによりＣＴおよびＬＴの細胞内への取り込みを媒介する。ＣＴおよびＬＴは腸管上皮細胞に作用し、重度の下痢を引き起こす。
【０００７】
また、ＣＴは（１）Ｂサブユニット中に強い免疫原性を持つＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基（８９−１００）および弱いＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基（３１−５０）を持ち、（２）Ａサブユニット中に中度の免疫原性を持つＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基（２１−３９および１８０−１９４）を持つこと、（３）これらのＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基の免疫原性はＨ−２ｂのハプロタイプを有するマウスにおいて顕著であることが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。
病原性大腸菌由来易熱性毒素（ＬＴ）は（１）Ｂサブユニット(ＬＴＢ：acesion No. J01646）中に強い免疫原性をもつＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基（２６−４５）を持ち、（２）このＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基はＨ−２ｂ、Ｈ−２ｄ、Ｈ−２ｋのハプロタイプを有するマウスにおいて有効であること、また、（３）このＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基の中でも３４から４２番目のアミノ酸残基が主要な役割を果たしていることが知られている（例えば、非特許文献５）。
【０００８】
【非特許文献１】Novak EJ, Liu AW, Nepom GT, Kwok WW., JClin Invest 1999 Dec;104(12):R63-7
【非特許文献２】Rammensee HG, Friede T,Stevanoviic S., Immunogenetics 1995;41(4):178-228
【非特許文献３】Spangler BD., Microbiol Rev 1992Dec;56(4):622-7
【非特許文献４】Cong Y, Bowdon HR, Elson CO., Eur JImmunol 1996 Nov;26(11):2587-94
【非特許文献５】Takahashi I, Kiyono H, Jackson RJ,Fujihashi K, Staats HF, Hamada S, Clements JD, Bost KL, and McGhee JR., InfectImmun 1996 Apr; 64(4):1290-8
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に粘膜侵入性、好ましくは微生物由来粘膜侵入性タンパク質抗原を抗原提示することができる抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体および多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体、該多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を含み粘膜侵入性、好ましくは微生物由来粘膜侵入性タンパク質抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出でき、粘膜系および全身系免疫システムにおける抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の動態解明等に有効に利用可能な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出体、該抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出体を用いた抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、前記ＣＴの免疫学的特性から、ＣＴや病原性大腸菌由来毒素等のＡＢサブユニット型毒素がモデル粘膜抗原として有用であるとの知見に基づき、粘膜侵入性タンパク質のＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基を含む可溶性ＭＨＣクラスIIテトラマーの開発を行った。
【００１１】
すなわち、本発明の前記課題を解決するための手段は以下の通りである。
＜１＞  粘膜侵入性タンパク質のＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基を含む抗原ペプチドと、ＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外領域の少なくとも一部または該ＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外領域の少なくとも一部に対し１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものとを含んでなり、該抗原ペプチドを抗原提示することを特徴とする抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜２＞  生理的条件下で可溶性である前記＜１＞に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜３＞  粘膜侵入性タンパク質が、微生物由来の粘膜侵入性タンパク質である前記＜１＞および＜２＞のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜４＞  微生物由来粘膜進入タンパク質が、ＡＢサブユニット型毒素である前記＜３＞に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜５＞  ＡＢサブユニット型毒素が、コレラ毒素および病原性大腸菌由来毒素のいずれかである前記＜４＞に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜６＞  Ｔ細胞抗原受容体認識抗原決定基が、ａ）からｅ）のいずれかである前記＜５＞に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
ａ）コレラ毒素Ｂサブユニットの８６番目から１０３番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＢ８６−１０３）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部
ｂ）コレラ毒素Ｂサブユニットの３１番目から５０番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＢ３１−５０）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部
ｃ）コレラ毒素Ａサブユニットの２１番目から３９番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＡ２１−３９）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部
ｄ）コレラ毒素Ａサブユニットの１８０番目から１９４番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＡ１８０−１９４）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部
ｅ）病原性大腸菌由来毒素Ｂサブユニットの２６から４５番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＬＴＢ２６−４５）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部
＜７＞  ＭＨＣクラスＩＩ分子が哺乳類由来である前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜８＞  ＭＨＣクラスＩＩ分子がマウスＭＨＣクラスＩＩ分子である前記＜７＞に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜９＞  ＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外領域の一部がＭＨＣクラスＩＩ分子のα１ドメインおよびα２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分と、β１ドメインおよびβ２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分とであり、
該α１ドメインおよびα２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分を含むα鎖と、該β１ドメインおよびβ２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分を含むβ鎖とが共有結合および非共有結合の少なくともいずれかにより結合されており、該β鎖に前記抗原ペプチドが融合されている前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜１０＞  β１ドメインのＮ末端、１番目と２番目のアミノ酸残基の間、２番目と３番目のアミノ酸残基の間、および、３番目と４番目のアミノ酸残基の間のいずれかに、前記抗原ペプチドが直接又は間接的に挟まれて融合されている前記＜９＞に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜１１＞  抗原ペプチドの融合部がβ１ドメインの３番目と４番目のアミノ酸残基の間である前記＜１０＞に記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜１２＞  抗原ペプチドのＣ末端が可動リンカーを挟んで間接的に前記β１ドメインの１番目から４番目のいずれかのアミノ酸残基に融合されている、前記＜１０＞および＜１１＞のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜１３＞  α鎖が前記α１およびα２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分のＣ末端に一のロイシンジッパーのＮ末端が直接または間接に連結されてなり、β鎖が前記β１およびβ２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分のＣ末端に他のロイシンジッパーのＮ末端が直接または間接に連結されてなり、該２つのロイシンジッパーのうち、一方が酸性ロイシンジッパーであり、他方が塩基性ロイシンジッパーであり、前記α鎖とβ鎖との結合が該ロイシンジッパーによりなされる前記＜９＞から＜１２＞のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜１４＞  α鎖およびβ鎖の少なくともいずれかが、Ｃ末端に多量体化のためのタグ配列を含んでいる前記＜９＞から＜１３＞のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜１５＞  検出用マーカーを含む前記＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜１６＞  少なくとも２つの前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を単量体ユニットとして含むことを特徴とする多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜１７＞  ビオチン化された４つの抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体がストレプトアビジンに結合する４量体である前記＜１６＞に記載の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜１８＞  検出用マーカーを含む前記＜１６＞および＜１７＞のいずれかに記載の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜１９＞  検出用マーカーがストレプトアビジンに標識されている前記＜１８＞に記載の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜２０＞  検出用マーカーが蛍光色素である前記＜１８＞および＜１９＞のいずれかに記載の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体である。
＜２１＞  前記＜１６＞から＜２０＞のいずれかに記載の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を含むことを特徴とする抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出体である。
＜２２＞  前記＜１６＞から＜２０＞のいずれかに記載の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を用いて、抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を特異的に認識するＴ細胞抗原受容体を持つＣＤ４＋Ｔ細胞を検出することを特徴とする抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出方法である。
＜２３＞  細胞試料と蛍光標識された多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体とを接触させる工程と、
細胞試料と蛍光標識されたＣＤ４抗体とを接触させる工程と、
前記二つの工程後に細胞試料を、レーザー光を用いて蛍光測定する工程と、
該測定データをコンピューターにより統計処理する工程とを含み、
ＣＤ４＋Ｔ細胞数中の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体＋Ｔ細胞数のパーセンテージを測定するフローサイトメトリー法による前記＜２２＞に記載の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、ＣＤ４＋Ｔ細胞に粘膜侵入性、好ましくは微生物由来粘膜侵入性タンパク質抗原を抗原提示することができる抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体および多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体、該多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を含み粘膜侵入性、好ましくは微生物由来粘膜侵入性タンパク質抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出でき、粘膜系および全身系免疫システムにおける抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の動態解明等に有効に利用可能な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出体、該抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出体を用いた抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、粘膜侵入性タンパク質のＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基を含む抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の少なくとも一部とを含んでなり、該抗原ペプチドを抗原提示することを特徴とする。
【００１４】
このような抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、粘膜免疫並びに全身系免疫システム、特に消化器系や呼吸器系の粘膜免疫システムにおけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の賦活化や検出に利用することができ、該賦活化や検出を利用して粘膜免疫システムにおけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の動態をモニターすることは、経口・経鼻・経皮ワクチン等が粘膜免疫を介して粘膜系と全身系の両免疫システムを賦活化する方法の開発に極めて有効である。
ここで、抗原ペプチドを抗原提示するとは、抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体が抗原ペプチド特異的にＴ細胞抗原受容体に認識されることを意味する。
前記抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、生理的条件下で可溶性であることが好ましい。
【００１５】
前記粘膜侵入性タンパク質とは、消化器や呼吸器等の粘膜に覆われた器官の上皮細胞を介して進入するもしくは取り込まれるという性質を有するタンパク質をいい、なかでも免疫原性、安定性、免疫調節効果の観点から微生物由来の粘膜侵入性タンパク質が好ましく、ＡＢサブユニット型毒素であることが更に好ましく、このなかでもコレラ毒素、大腸菌毒素、志賀毒素、大腸菌Ｏ１５７志賀毒素様毒素、百日咳毒素、ジフテリア毒素ボツリヌス毒素が強い免疫原性を持ち得ることから特に好ましい。なお、ＡＢサブユニット型毒素は、ＡサブユニットとＢサブユニットとを含み、Ａサブユニットに酵素活性を有し、Ｂサブユニットに細胞への結合活性を有するタイプの毒素である。
前記、Ｔ細胞抗原受容体認識抗原決定基とは、Ｔ細胞抗原受容体によって認識される部位（エピトープ）をいい、Ｔ細胞抗原受容体によって認識される限り、より広いＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基の一部であるものも含まれる。前記粘膜侵入性タンパク質のＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基としては、例えば、コレラ毒素Ｂサブユニットの８６番目から１０３番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＢ８６−１０３）、３１番目から５０番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＢ３１−５０）、コレラ毒素Ａサブユニットの２１番目から３９番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＡ２１−３９）、１８０番目から１９４番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＡ１８０−１９４）、病原性大腸菌由来毒素（ＬＴ）Ｂサブユニットの２６番目から４５番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＬＴＢ２６−４５）、又はこれらの一部であるペプチド等が挙げられる。
【００１６】
Ｔ細胞抗原受容体認識抗原決定基は、以下の（ａ）から（ｅ）のいずれかであることが好ましい（ａ）コレラ毒素Ｂサブユニットの８６番目から１０３番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＢ８６−１０３）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部（ｂ）コレラ毒素Ｂサブユニットの３１番目から５０番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＢ３１−５０）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部（ｃ）コレラ毒素Ａサブユニットの２１番目から３９番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＡ２１−３９）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部（ｄ）コレラ毒素Ａサブユニットの１８０番目から１９４番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＴＡ１８０−１９４）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部。ｅ）病原性大腸菌由来毒素Ｂサブユニットの２６から４５番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＬＴＢ２６−４５）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部。これらの中でも特に、ＣＴＢ８６−１０３を含むペプチドが、強い免疫原性をもつことから好ましい。また、前記ｅ）においては、Ｂサブユニットの３３番目から４３番目までのアミノ酸残基からなるペプチド（ＬＴＢ３３−４３）の全部または少なくとも連続して９個のアミノ酸残基からなる一部が好ましい。また、前記Ｔ細胞抗原受容体認識抗原決定基を含むペプチドには、例えば、前記（ａ）から（ｅ）のいずれかのＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基からなるペプチドの他、該抗原決定基のＮ末端側および／またはＣ末端側のより長い配列を含んでいる場合も含まれる。
【００１７】
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子は、哺乳類由来であることが、ヒトにおける粘膜免疫システムのモデルになることから好ましい。ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子としては、ＨＬＡ−ＤＲやＨＬＡ−ＤＱ等が挙げられ、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子としては、Ｉ−ＡやＩ−Ｅが挙げられる。特に、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子は、マウスを実験動物とした実験系に用いることができる点で好ましい。
【００１８】
前記抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外領域の少なくとも一部を含んでいればよいが、該一部とは、ＭＨＣクラスＩＩ分子のα１ドメインおよびα２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分と、β１ドメインおよびβ２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分である。細胞外領域であって、α１ドメインおよびα２ドメイン以外の部分（例えばα２ドメインの下流の配列）を欠いているものも、本明細書でいうα１ドメインおよびα２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分に含まれる。β１ドメインおよびβ２ドメインを少なくとも含む細胞外領域部分についても同様である。本明細書において、ＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外領域の少なくとも一部を含んでいるとは、前記細胞外領域中に抗原ペプチドやリンカーが挿入されていて、不連続に含んでいることも含む意味である。
【００１９】
なお、ＭＨＣクラスＩＩ分子において、細胞外領域部分とは、その膜貫通領域と細胞質内領域以外の部分をいう。
【００２０】
また、該ＭＨＣクラスＩＩ分子の一部において、１若しくは数十個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものであっても、結合する抗原ペプチドをＴ細胞抗原受容体に抗原提示できるものであるかぎり本発明に含まれる。
【００２１】
α鎖とβ鎖とは、共有結合および非共有結合の少なくともいずれかにより結合されてなる。結合方法は、Ｔ細胞抗原受容体による認識を損なうものでない限り、どのようなものでもよいが、製造過程におけるα鎖とβ鎖の会合を促進および安定させるという観点から、ロイシンジッパー配列を付加することが好ましい。具体的には、α鎖の細胞外領域部分のＣ末端に一のロイシンジッパーのＮ末端が直接または間接に連結されてなり、β鎖の細胞外領域部分のＣ末端に他のロイシンジッパーのＮ末端が直接または間接に連結されてなり、該２つのロイシンジッパーのうち、一方が酸性ロイシンジッパーであり、他方が塩基性ロイシンジッパーであり、α鎖とβ鎖とが該ロイシンジッパーにより結合されている構造が好ましく、α鎖に酸性ロイシンジッパー、β鎖に塩基性ロイシンジッパーが結合されていることが特に好ましい。
【００２２】
抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子のα鎖またはβ鎖に融合または付加されていることが好ましい。天然のＭＨＣクラスＩＩ分子では、α１ドメインとβ１ドメインが分子の細胞外部分の先端に溝状の構造を形成し、抗原ペプチドは、該ＭＨＣクラスＩＩ分子の溝に位置するアミノ酸残基との水素結合および該溝に存在するポケット構造に抗原ペプチドのアミノ酸側鎖がはまり込むことによりＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する。しかし、このような非共有結合による結合においては、ペプチドの交換が起こる可能性があり、すべてのＭＨＣクラスＩＩ分子が同一の抗原ペプチドをもつようにＭＨＣクラスＩＩ分子を安定に調製できる観点から、抗原ペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子のα鎖またはβ鎖に融合または付加されていることが好ましい。
【００２３】
抗原ペプチドは、β鎖に融合または付加されていることが、ＭＨＣクラスＩＩ分子のフォールディングしやすさや、Ｔ細胞抗原受容体によく認識される観点から好ましく、β鎖のＮ末端もしくは１番目から４番目のアミノ酸残基の間に、前記抗原ペプチドが直接又は間接的にはさまれて融合または付加されていることが更に好ましく、β鎖のβ１ドメインの３番目と４番目のアミノ酸残基の間に融合されていることが特に好ましい。
前記抗原ペプチドのＣ末端とβ１ドメインの４番目のアミノ酸の間には、可動性リンカーを挿入することが、ＭＨＣクラスＩＩ分子の立体構造に影響を与えないことから好ましい。
【００２４】
また、本発明の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、α鎖およびβ鎖の少なくともいずれかが、Ｃ末端に多量体を形成するために用いられるタグ配列を含んでいることが、多量体製造のための原料ユニットとして利用される場合に、多量体化が容易である観点から好ましい。
また、本発明の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出に利用される場合には、検出用マーカーを含んでいることが好ましい。
【００２５】
本発明の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、少なくとも２つの前記本発明の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を単量体ユニットとして含むこと以外は特に制限はなく、単量体ユニットの数や、単量体ユニット同士の結合方法は、目的に応じて適宜選択できる。多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、単量体と比較して、複数のエピトープをもつことにより、多価の効果でＴ細胞抗原受容体との結合のアフィニティーが高く、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出に用いる場合には検出感度を高くすることができ、特に有効である。一般に、多価の効果は単量体ユニットの数が多いほど高くなるが、立体障害や、分子の持つ自由度が制限される観点から、結合方法に合わせて適宜選択でき、２〜１０が好ましい。
【００２６】
なかでも、ビオチン化された抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体とストレプトアビジンとの結合を利用して形成した４量体が、製造が容易であり、フローサイトメトリーにより検出できる程度の高いアフィニティーを有することから特に好ましい。ビオチン化のためには、多量体を形成するために用いられるタグ配列として、ＢｉｒＡ認識配列を付加することが好ましく、該ＢｉｒＡ認識配列においてビオチン化された抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体がストレプトアビジンに結合して４量体を形成することができる。
【００２７】
また、本発明の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出に利用できる観点から、検出用マーカーを含むことが好ましい。検出マーカーとしては、特に制限はないが、蛍光色素標識、酵素標識、放射性同位元素による標識などが挙げられ、蛍光色素標識がフローサイトメトリーで解析可能な観点から好ましい。蛍光色素標識としては、例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）、ＡＰＣ、ＦＩＴＣなどが挙げられる。検出マーカーはどこに標識されていてもよいが、例えば、多量体形成にストレプトアビジンを用いる態様においては、ストレプトアビジンに標識することができる。
【００２８】
本発明の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体および多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体の製造方法には特に制限はないが、例えば次のような方法により製造することができる。ここでは、一例として、ＣＴの強い免疫原性を持つＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基（ＣＴＢ８６−１０３）を含む抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体について説明する。
ＭＨＣα鎖とＭＨＣβ鎖の細胞外領域のＣ末端にそれぞれ酸性型および塩基性型ロイシンジッパーの遺伝子配列、β鎖においてはさらにＣ末端にビオチン化酵素であるＢｉｒＡの認識分位、および、Ｎ末端から３番目と４番目のアミノ酸残基配列の間にＣＴのＴ細胞抗原受容体認識抗原決定基（ＣＴＢ８６−１０３）の配列を含むようにｃＤＮＡを構築する（図３）。
【００２９】
このｃＤＮＡをバキュロウイルストランスファーベクターにクローニングし、バキュロウィルス−昆虫細胞によるタンパク質発現系にて発現させる（図４、５および６）。バキュロウィルス−昆虫細胞によるタンパク質発現系は、糖鎖も合成できるため、哺乳類のタンパク質を比較的忠実に発現させることができ、フォールディングの特定も優れている。産生物をアフィニティーおよびゲルろ過により精製し、抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体が得られる。この抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は酵素によるビオチン化し、ＰＥ-標識ストレプトアビジンとの混合により四量体化される（図７）。
【００３０】
本発明の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体または多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体が、抗原ペプチド特異的にＴ細胞抗原受容体に認識されるかどうかを調べるためには、該抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞株を作成し、該Ｔ細胞に（多量体化）抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を添加して、該（多量体化）抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体＋Ｔ細胞が検出できるかどうかにより調べることができる。該検出は、フローサイトメトリーや、組織切片を用いた免疫組織化学的手法および表面プラズモン共鳴分析を利用したＢＩＡｃｏｒｅなどにより行うことができる。特に、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞数中の該（多量体化）抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体＋Ｔ細胞数のパーセンテージを測定し、コントロールのＭＨＣクラスＩＩ分子複合体の場合と比較することにより、簡便に調べることができる。
該抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞株は、微生物系粘膜侵入性抗原を経口投与したマウスの免疫関連組織から調整した細胞を用いて樹立することができる。
【００３１】
本発明の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出体は、前記本発明の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を含むものであれば特に制限はないが、検出マーカーを含むものであることが、検出が容易である観点から特に好ましい。
【００３２】
本発明の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出方法は、本発明の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を用いて、抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を抗原ペプチド特異的に認識するＴ細胞を検出すること以外は特に制限はなく、フローサイトメトリーや、組織切片を用いた免疫組織化学的手法および表面プラズモン分析等を用いた方法が挙げられるが、フローサイトメトリーによる解析が操作的に簡易であることから特に好ましい。抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を抗原ペプチド特異的に認識するＴ細胞の、フローサイトメトリーによる検出は、例えば、次のように行うことができる。検査したい細胞試料に本発明の蛍光標識された多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を最終濃度で好ましくは１〜３０μｇ／ｍｌの範囲内で添加して、３７℃にて１〜３時間保温し、反応させる。洗浄後、該細胞試料をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５, ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）等の蛍光標識されたＣＤ４抗体と反応させ、再び洗浄する。得られた細胞試料を、レーザー光を用いて蛍光測定を行い、そのデータをコンピューターにより統計的に処理するフローサイトメトリー法により、例えばＦＡＣＳｃａｎ(ＢＤ社）と同社のＣＥＬＬ−Ｑｕｅｓｔソフトウェアーを用いて解析を行う。ＣＤ４＋Ｔ細胞数中の多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体＋Ｔ細胞数のパーセンテージを測定することにより全ＣＤ４＋Ｔ細胞中、どれくらいの細胞が該抗原ペプチド特異的に認識するＴ細胞であるかを定量的に検出することができる。試料は、例えば、免疫関連組織、血液等から採取して、使用することができる。
【実施例】
【００３３】
以下に本発明の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体、多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出体、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出方法について、実施例により更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
（実施例１）
（ＣＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子産生用ｃＤＮＡコンストラクトの作製）
本発明の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体の一例としてＣＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子を作製するためのｃＤＮＡコントラクトを作製した。
Ｉ−Ａｂα鎖の一部と酸性ロイシンジッパーの融合タンパク質（Ｉ−Ａｂα−ＬＺ）（図３および図８）のｃＤＮＡの作製は、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ−ＳＫ ｐｌａｓｍｉｄ (pBSSK, STRATAGENE社)にクローン化したＩ−Ａｂα鎖ｃＤＮＡを鋳型として、Ｉ−Ａｂα鎖の成熟タンパク１９１位以降のアミノ酸配列をＳＳＡＤＬＶＰＲＧＳＴＴＡＰＳＡＱＬＥＫＥＬＱＡＬＱＫＥＮＡＱＬＥＷＥＬＱＡＬＥＫＥＬＡＱ（配列番号１）の配列にＰＣＲにて置換した(ｐＢＳＳＫ−Ｉ−Ａｂα−ＬＺ)。なお、図８中の、Ｉ−Ａｂα−ＬＺタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号８とする。リーダー配列はイタリックで表し、Ｉ−Ａｂαに由来する配列には下線を付して表した。リーダー配列は、分泌シグナルを与える配列であり、細胞外への分泌に伴いこの部分は切り取られ、成熟タンパクとなる。
【００３５】
Ｉ−Ａｂβ鎖の一部、Ｅαペプチド配列、塩基性ロイシンジッパーおよびＢｉｒＡの融合タンパク質（Ｉ−Ａｂβ−Ｅα−ＬＺ−ＢｉｒＡ）（図３）のｃＤＮＡの作製は、ｐＤＲ５１(ＨＬＡ−ＤＲｂ鎖のリーダー配列を含む)にクローン化したＥαペプチド配列およびリンカー含有Ｉ−Ａｂβ鎖ｃＤＮＡ (Immunity, 6:401-410, 1997)を鋳型として、成熟タンパク１９３位以降のアミノ酸配列をＳＳＡＤＬＶＰＲＧＳＴＴＡＰＳＡＱＬＫＫＫＬＱＡＬＫＫＫＮＡＱＬＫＷＫＬＱＡＬＫＫＫＬＡＱＬＨＨＩＬＤＡＱＫＭＥＷＮＨＲ（配列番号２）の配列にＰＣＲにて置換し（Ｉ−Ａｂβ−Ｅα−ＬＺ−ＢｉｒＡ）、ｐＢＳＳＫにクローン化した(ｐＢＳＳＫ−Ｉ−Ａｂβ−Ｅα−ＬＺ−ＢｉｒＡ)。
【００３６】
ＣＴエピトープ（ＣＴＢ８６−１０３）配列の挿入は上記のＩ−Ａｂβ−Ｅα−ＬＺ−ＢｉｒＡ ｃＤＮＡのＥαペプチド配列およびリンカー配列がＣＶＷＮＮＫＴＰＨＡＩＡＡＩＳＭＡＮＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）の配列に置き換わるようにＰＣＲにて行った（ｐＢＳＳＫ−Ｉ−Ａｂβ−ＣＴＢ−ＬＺ−ＢｉｒＡ）（図３および図９）。なお、図９中の、Ｉ−Ａｂβ−ＣＴＢ−ＬＺ−ＢｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号９、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１０とする。リーダー配列はイタリックで表し、Ｉ−Ａｂβに由来する配列には下線を付して表した。
【００３７】
これらのｃＤＮＡクローンの塩基配列が正しいことをシークエンシングによって確認した後、ｐＦＡＳＴＢＡＣ ＤＵＡＬ (ＧＩＢＣＯ社)にクローニングした。この際、Ｉ−Ａｂα−ＬＺはＰ１０プロモーターの下流の制限酵素ＸｈｏＩ−Ｎｃｉ部位に、Ｉ−Ａｂβ−ＣＴＢ−ＬＺ−ＢｉｒＡはポリヘドリンプロモーターの下流の制限酵素ＢＳＳＨＩＩ−ＸｂａＩ部位にそれぞれクローニングした。
【００３８】
（実施例２）
（ＣＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子産生用組換え体バキュロウィルスの作成およびタンパクの発現）
組換え体バキュロウィルスの作成およびタンパクの発現にはＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣシステム（ＧＩＢＣＯ社）を用い、同社のプロトコールに従って行った（図４）。同社の昆虫細胞Ｓｆ−９を用い、０．３〜１ＭＯＩの感染率で組換え体バキュロウィルスを感染させ、３日間培養した上精を粗精製組換えタンパクとして用いた。
【００３９】
（ＣＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子の精製）
上記の粗精製組換えタンパクを１）抗Ｉ−Ａ抗体（Ｙ−３Ｐ）固定化セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーおよび２）セファクリルＳ−３００（アマシャムファルマシア社）を用いたゲルろ過によって流速０．７ｍｌ／分にて精製した。溶出液は１フラクション／分ずつ分画し、２８０ｎｍでの吸光度を測定した（図１０）。ピーク画分（Ｐ１−Ｐ３、白抜き丸）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した。Ｐ１画分は吸光度が低かったので、約１０倍に濃縮した。１０μｌずつを還元サンプルバッファー中にて９８℃で３分間熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、クーマシーブルーＲ２５０にて染色した。なお、抗Ｉ−Ａ抗体（Ｙ−３Ｐ）固定化セファロースは、ハイブリドーマＹ−３Ｐ（ＡＴＣＣ）の培養上清から精製したものをＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（アマシャムファルマシア社）と混合することによって作製した。
【００４０】
（実施例３）
（ＬＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子産生用ｃＤＮＡコンストラクトの作製）
本発明の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体の他の一例としてＬＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子を作製するためのｃＤＮＡコントラクトを、前記ＣＴエピトープの替わりにＬＴエピトープ（ＣＴＢ３３−４３）を用いる以外は前記実施例１で記載のＣＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子産生用ｃＤＮＡコンストラクトの作製と同様にして作製した。
すなわち、ＬＴエピトープ（ＣＴＢ３３−４３）配列の挿入は実施例１のＩ−Ａｂβ−Ｅα−ＬＺ−ＢｉｒＡ ｃＤＮＡのＥαペプチド配列およびリンカー配列が、ＧＫＲＥＭＶＩＩＴＦＫＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＧＳ（配列番号１１）の配列に置き換わるようにＰＣＲにて行った（ｐＢＳＳＫ−Ｉ−Ａｂβ−ＬＴＢ−ＬＺ−ＢｉｒＡ）（図３および図１４）。  なお、図１４中のＩ−Ａｂβ−ＬＴＢ−ＬＺ−ＢｉｒＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１３とする。リーダー配列はイタリックで表し、Ｉ−Ａｂβに由来する配列には下線を付して表した。
（ＬＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子産生用組換え体バキュロウィルスの作成およびタンパクの発現およびＬＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子の精製）
ＬＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子産生用組換え体バキュロウィルスの作成およびタンパクの発現およびＬＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子の精製を実施例２と同様に行って、ＬＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子を得た。なお、ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣシステム（ＧＩＢＣＯ社）を用いた、組換え体バキュロウィルスの作成の結果は、大腸菌から精製した組換え体バキュロウイルスについて、１）０．５％アガロースゲルを用いた電気泳動（図６Ａ） および ２）Ｉ−Ａｂ 配列の上流と下流に含まれる配列をプライマー（Ｍ１３プライマー、ＧＩＢＣＯ社）としたＰＣＲ(図６Ｂ)を行うことにより確認した。ＰＣＲは、９４℃、４５秒、５５℃、４５秒、７２℃、５分を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００４１】
（実施例４）
（精製ＣＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子のビオチン化と精製）
精製ＣＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子のビオチン化にはＡＶＩＤＩＴＹ社のプロテインリガーゼ（ＢｉｒＡ）を用い、方法は同社のプロトコールに従った。
ビオチン化タンパクの精製にはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社のキャプトアビジンアガロース（ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ ａｇａｒｏｓｅ）を用い、方法は同社のプロトコールに従った。
【００４２】
（実施例５）
（ＣＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子の四量体化）
ＣＴエピトープ含有可溶性Ｉ−Ａｂ分子の四量体化は、上記のビオチン化タンパクとフィコエリトリン標識ストレプトアビジン（Ｔｅｔｒａｍｅｒ ｇｒａｄｅ, Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）を４：１のモル比でＰＢＳ中において混合し、室温で２時間放置することによって作製した（ＣＴテトラマー）（図７）。
【００４３】
（実施例６）
（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析）
１μｇの精製したＣＴＢまたはＥαのエピトープ含有Ｉ-Ａｂ分子を還元もしくは非還元ＳＤＳサンプルバッファー中で３分間９８℃にて熱処理若しくは無処理した後、４〜２０％濃度勾配のポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品）で、４℃にて１時間泳動した。上記のゲルを０．２５％クマジーブリリアントブルー溶液中、室温で３０分撹拌したのち、脱色した。結果を図１１に表す。図１１の左カラム（ＭＷ）の数値は分子量マーカーの場所を表す。熱処理していないサンプルではα鎖とβ鎖とがＳＤＳによる変性に対して抵抗性のある複合体を形成しているのに対し、熱処理したサンプルでは複合体が解離してα鎖とβ鎖が個々に存在していることがわかる。さらに還元剤存在下においても、前記α鎖とβ鎖との複合体は安定であることからＳ−Ｓ結合によらない結合により結合されていることがわかる。
【００４４】
（実施例７）
（ＣＴＢサブユニット特異的Ｔ細胞株）
前記ＣＴテトラマーが抗原ペプチド特異的にＴ細胞抗原受容体に認識されるかどうか、即ち、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出できるかどうかを調べるために、ＣＴＢサブユニット特異的Ｔ細胞株を作製した。
Ｃ５７/ＢＬ６マウスに５０μｇ／マウスの投与量でＣＴを経口投与し、８〜１０日後にそのパイエル板、腸間膜リンパ節および脾臓から細胞を調製した。
これらの細胞を３μｇ/ｍｌのＣＴＢで３７℃で２時間前処理した脾臓の付着性細胞と３日間ＣＯ２インキュベーター中で共培養し、その後、２〜３日おきに最終濃度５％になるようにコンカナバリンＡ活性化ラット脾臓細胞培養上清を加え、最終的に２週間まで培養した。
【００４５】
このＣＴＢでの刺激を１サイクルとし、５サイクル以上経たものをＣＴＢ特異的Ｔ細胞株として用いた。
ＣＴを経口投与されたマウスの腸間膜リンパ節、パイエル板、脾臓より、腸間膜リンパ節（ＣＴＢ−ＭＬＮ）、パイエル板（ＣＴＢ−ＰＰ）、および脾臓（ＣＴＢ−ＳＰ）ＣＴＢサブユニット特異的Ｔ細胞株を作製し、これらの細胞を脾臓由来付着細胞とともに平底９６ウェルプレートに２−５ｘ１０４個／ウェルに播き、３μｇ／ｍｌのＣＴＢペプチド（８９−１００）を４８時間反応させた。これらのＣＴＢ特異的Ｔ細胞株のＭＨＣ拘束性を決定するために、抗Ｉ−Ａ（Ｍ５／１１４）および無関係な特異性を有するコントロールラットＩｇＧ２ｂ（コントロールＩｇ）を３μｇ／ｍｌになるように培地に添加した。細胞回収前７時間に３Ｈ−ＴｄＲを加えることにより増殖反応を測定した。測定結果を図１２に表す。データは３つのウェルの平均±標準偏差で表している。以上の実験より、樹立したＴ細胞株がＣＴＢ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含むことが確認できた。
【００４６】
（実施例８）
（ＣＴテトラマーを用いたフローサイトメトリー解析）
２．５ｘ１０５のＣＴＢサブユニット特異的Ｔ細胞株にＣＴテトラマーを最終濃度１〜３０μｇ/ｍｌの段階的濃度になるようにそれぞれ加え、最終容量５０μｌの培養液（１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）中、３７℃で２時間保温した。
上記の細胞を２％ＦＣＳおよび０．０５％ＮａＮ３含有冷ＰＢＳで２回洗ったのち、１μｇ/ｍｌのＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５, ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）を含む５０μｌのＰＢＳ（２％ＦＣＳおよび０．０５％ＮａＮ３含有）中、４℃で２０分保温した。２％ＦＣＳおよび０．０５％ＮａＮ３含有冷ＰＢＳで２回洗った後、ＦＡＣＳｃａｎ(ＢＤ社）にて取り込みを行い、同社のＣＥＬＬ−Ｑｕｅｓｔソフトウェアーを用いて解析した。死細胞の除去にはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社のＶＩＡ−ＰＲＯＢＥを用いた。
【００４７】
ＣＴテトラマーの各添加濃度について、前記フローサイトメトリー法による解析結果から、ＣＤ４＋Ｔ細胞数中のＣＴテトラマー＋Ｔ細胞数のパーセンテージを図１３（Ａ）に表す。なお、コントロールのテトラマー（Ｅαテトラマー）についても同様に実験を行ったが、ＣＤ４＋Ｔ細胞数中のＥαテトラマー＋Ｔ細胞数のパーセンテージは総て０．１％より小さかった。この実験から、ＣＴ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出に用いるテトラマーの最適濃度は１０μｇ／ｍｌであることが分った。
また、図１３（Ａ）における１０μｇ／ｍｌのテトラマーを添加した場合について、ドットをプロットした（図１３（Ｂ））。ＣＤ４＋Ｔ細胞数中のＣＴテトラマー＋Ｔ細胞数またはＥαテトラマー＋細胞数のパーセンテージをそれぞれのグラフの右上に記載した。この実験から、テトラマー＋細胞はＣＤ４陽性細胞集団にのみ存在することが分った。
【００４８】
（実施例９）
（小腸粘膜固有層細胞におけるＣＴテトラマーを用いたフローサイトメトリー解析）
まず、マウスを免疫し、小腸粘膜固有層細胞を調整した。すなわち、ＣＴは、２５μｇ／マウスの濃度で経口投与した。１週間後、小腸を切り出し、パイエル板を切開により除き、また、上皮間細胞を０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０および１ｍＭのＥＤＴＡ含有ＰＢＳ中３７度で２０分撹拌することにより取り除いた後、０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ処理により分散させて粘膜固有層細胞を得た。
次に、得られた粘膜固有層細胞を直ちに前記本発明のＣＴテトラマーを用いてフローサイトリーで解析した。フローサイトメトリー解析の手法は、実施例８と同様に行った。コントロールとしては、ＣＴの替わりにＰＢＳを経口投与したマウスから得られた粘膜固有層細胞を用いた。測定結果を図１５に表す。
ＣＴテトラマーに特異的に反応する細胞は、ＣＴを経口投与したマウスより得られた粘膜固有層細胞集団にのみ存在し、コントロールには存在しなかった。これにより、本発明のＣＴテトラマーが、ＣＴを投与された動物から得られた細胞をそのまま用いた場合において、ＣＴＢ８６−１０３特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出することができたことが分かる。
【００４９】
これらの結果は、ＣＴテトラマーがＣＤ４＋Ｔ細胞に抗原を提示して、ＣＴ抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を検出、定量することができたことを表している。これにより、ＣＴテトラマーに代表される本発明の多量体化本発明の抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体が、経口・経鼻投与された微生物由来粘膜侵入性タンパク質抗原に対して、粘膜系および全身系免疫システムにおいて活性化された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度やその経時的変化など、粘膜系および全身系免疫システムにおける抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の動態解析に有効に用いることができることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に粘膜侵入性、好ましくは微生物由来粘膜侵入性タンパク質抗原を抗原提示することができる抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体、多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体、および、該多量体化抗原ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を含み粘膜侵入性、好ましくは微生物由来粘膜侵入性タンパク質抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出でき、粘膜系および全身系免疫システムにおける抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の動態解明等に有効に利用可能な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出体の製造や、各種薬剤やワクチン開発のツール等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、経口投与抗原に対するＴｈ細胞ならびにＢ細胞抗原特異的応答の誘導を説明する図である。
【図２】図２は、コレラ毒素および大腸菌由来毒素の生物学的特徴を表す図である。
【図３】図３は、可溶性Ｉ−Ａｂ分子産生に用いたｃＤＮＡを模式的に表す図である。
【図４】図４は、ＣＴテトラマー産生の手順（前半）を表す図である。
【図５】図５は、ＣＴテトラマー産生（後半）および抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞検出方法の手順を表す図である。
【図６】図６は、組換え体バクミドの検出を表す図である。
【図７】図７は、可溶性Ｉ−Ａｂ単量体および４量体を表す図である。
【図８】図８は、Ｉ−Ａｂα−ＬＺ鎖のｃＤＮＡの塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列を表す。
【図９】図９は、Ｉ−Ａｂβ−ＣＴＢ−ＬＺ−ＢｉｒＡ鎖のｃＤＮＡの塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列を表す。
【図１０】図１０は、免疫アフィニティーカラムで精製した可溶性Ｉ−Ａｂ分子のゲル濾過解析を表す図である。
【図１１】図１１は、免疫アフィニティーおよびゲル濾過により精製した可溶性Ｉ−Ａｂ分子のＳＤＳと熱に対する影響を表す図である。
【図１２】図１２は、ＣＴＢ−特異的Ｔ細胞株のＣＴＢペプチドに対する応答性を表す図である。
【図１３】図１３は、ＣＴＢ８６−１０３を有するＩ−Ａｂ４量体を用いたＣＴ特異的ＣＤ４+ Ｔ細胞の検出を表す図である。
【図１４】図１４は、  Ｉ−Ａｂβ−ＬＴＢ−ＬＺ−ＢｉｒＡ鎖のｃＤＮＡの塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配列を表す。
【図１５】図１５は、ＣＴを経口投与されたマウスの小腸粘膜固有層に存在するＣＴＢ８６−１０３特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出を表す図である。
【図３】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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