(57)【要約】【課題】輝度の強弱に拘わり無く実際の輝度に応じた広い範囲の光量情報を得ることができる光走査型顕微鏡及びその測光装置を提供する。【解決手段】走査型レーザ顕微鏡装置のシステムコントローラ８はＡ／Ｄ変換クロックａを測光装置７のＡ／Ｄ変換器１２に出力し、画素クロックｐを同じく測光装置７の演算装置１３に出力する。光検出器１１はダイクロイックミラー６を介して入力される標本５より発せられた光をアナログ電気信号に変換する。Ａ／Ｄ変換器１２はＡ／Ｄ変換クロックａに同期してアナログ電気信号をからデジタルデータに変換する。演算装置１３は画素クロックｐに同期してデジタルデータを演算し１画素毎の輝度データを出力する。記憶装置１４は１画素毎の輝度データを記憶する。【選択図】　図２
2004144734.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学顕微鏡用測光装置において、
光源からの照明光を観察試料に照射して得られる光の光量をクロック毎に検出して光量情報を得る光検出器と、
該光検出器からのアナログ検出信号をデジタルデータにＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換手段と、
該Ａ／Ｄ変換手段によりＡ／Ｄ変換されたデジタルデータに対し所定の演算を行う演算手段と、
を備えたことを特徴とする顕微鏡用測光装置。
【請求項２】
上記演算手段は、上記デジタルデータが所定の閾値以上であるかの比較演算を行うことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡用測光装置。
【請求項３】
上記演算手段は、上記デジタルデータを全て加算することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡用測光装置
【請求項４】
光源からの照明光を観察試料に対し走査照射して得られる光を、対物レンズを含む光学系を介して結像し、その結像の光量により上記観察試料の光量情報を得る光走査型顕微鏡において、
上記結像の光量をクロック毎に検出する光検出器と、
該光検出器からのアナログ検出信号をデジタルデータにＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換手段と、
該Ａ／Ｄ変換手段によりＡ／Ｄ変換されたデジタルデータに対し所定の演算を行う演算手段と、
を備え、
上記演算手段は、１画素分の光量検出期間の間に入力された上記デジタルデータを演算してその演算結果を上記１画素分の輝度値とすることを特徴とする光走査型顕微鏡。
【請求項５】
上記演算手段は、上記デジタルデータが所定の閾値以上であるかの比較演算を行うことを特徴とする請求項４記載の光走査型顕微鏡。
【請求項６】
上記演算手段は、上記デジタルデータを全て加算することを特徴とする請求項４記載の光走査型顕微鏡。
【請求項７】
光源からの照明光を観察試料に照射して観察試料から得られる光量を検出して光量情報を得る光学顕微鏡用測光装置において、
上記光量を検出する光検出器と、
該光検出器により検出された光量を示すアナログ電圧信号の帯域を可変する可変帯域手段と、
該可変帯域手段により可変された帯域に基づいて上記光検出器により検出された光量を示すアナログ電気信号をデジタル値に変換するアナログ／デジタル変換手段と、
閾値設定手段とカウンタとを内蔵する制御部と、
を備え、
上記制御部は、一方では上記観察試料から得られる光量が弱いとき上記可変帯域手段の帯域を広くすることにより上記光量の検出をフォトカウント法に切り替えて光量情報を取得し、他方では上記観察試料から得られる光量が強いとき上記可変帯域手段の帯域を狭くすることにより上記光量の検出をアナログ積算法に切り替えて光量情報を取得し、これら取得した光量情報をデジタルデータに変換して出力することを特徴とする顕微鏡用測光装置。
【請求項８】
上記制御部は、
上記光量の検出をフォトカウント法に切り替えて光量情報を取得するときは、上記閾値設定手段により設定された閾値と、アナログ／デジタル変換手段による出力との比較演算を行い、この比較演算の結果を上記カウンタによりカウントして光子数を取得し、この取得した光子数を光量情報とすることを特徴とする請求項７記載の顕微鏡用測光装置。
【請求項９】
記憶手段を更に有し、上記制御部は、
上記アナログ積算器により単一光子入射時毎のアナログ出力を上記Ａ／Ｄ変換手段によりデジタルデータに変換し、該デジタルデータに基づき上記輝度値演算手段により演算して単一光子入射時のＡ／Ｄ変換値の平均値を求め、該平均値を上記記憶手段により予め記憶し、
上記光量の検出をアナログ積算法に切り替えて光量情報を取得するときは、上記アナログ積算法により出力される電圧値を上記記憶手段に記憶された上記平均値により除算することにより上記アナログ積算器から出力される電圧値の単位を光子数に変換して、この変換された光子数を光量情報とすることを特徴とする請求項７記載の顕微鏡用測光装置。
【請求項１０】
上記記憶手段は、上記平均値と上記光検出器の感度との相関を予め記憶し、
上記制御部は、上記記憶手段に記憶されている上記平均値と上記光検出器の感度との相関に基づいて、上記光量情報を上記光検出器の基準感度における光量情報に変換する、
ことを特徴とする請求項９記載の顕微鏡用測光装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光走査型顕微鏡及びその測光装置に関わり、更に詳しくは蛍光色素や蛍光タンパクで標識された試料を励起光を用いて励起して、試料から発せられる微弱な蛍光を検出する光走査型顕微鏡及び顕微鏡用測光装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、微弱光の検出方法として、フォトンカウントによるものと、アナログ積算によるものがある。
フォトンカウントによる微弱光の検出方法（フォトンカウント法）は、光検出器からの検出信号をアナログ信号のまま比較器を通して加算して、その加算値を輝度値としている。（例えば、特許文献１参照。）
また、アナログ積算による微弱光の検出方法（アナログ積算法）は、光検出器からの検出信号をコンデンサに蓄えて、コンデンサの電圧をＡＤ変換して、そのＡＤ変換した値を輝度値とする。（例えば、特許文献２参照。）
ところで、従来は、例えばレーザ顕微鏡等の測定分野において、測定作業としては、明るい部分のみを測定するだけで足りていたが、近年では、より暗い部分も見えるようにしたいという要望が強まってきた。
【０００３】
一般に、共焦点走査型レーザ顕微鏡では、レーザを標本に照射して、標本から発せられる蛍光を測光して画像とするが、ある一点にレーザが照射される時間は短く、従って、そこから発せられる蛍光光量も少ない。従って、蛍光光量が少ない状況では上記のフォトンカウントが良いとされる。
【０００４】
しかし、フォトンカウントは本来は天体観測などの暗い宇宙から飛び込んでくる光子を捉えて宇宙の輝度を観測するのに適した測光方法であるため、これをレーザ顕微鏡の測光に用いると、レーザ顕微鏡の測光対象物である標本の中には強い蛍光を発するものもあり、このような標本の場合、フォトンカウントでは蛍光光量が多いと光検出器の出力パルスの重複のため、このように明るい部分の輝度を正確に測定できないという問題が発生する。
【０００５】
図１７（ａ），（ｂ）　は、上述した従来のフォトンカウント測光方法をレーザ顕微鏡の測光に用いた場合の不具合を説明する図である。図１７（ａ），（ｂ）　は、横軸に時間を示し、縦軸に光検出信号を示している。図１７（ａ）　の場合は、横軸の時間の流れに沿って光検出信号が単発のパルスで現れており、検出された輝度が低いことを表している。この光検出信号を比較値である閾値ｄを用いてカウンタで計数すると「５」という積算輝度値が得られる。
【０００６】
他方、図１７（ｂ）　の場合は、横軸の時間の流れに沿って、光検出信号は、最初にシングルフォトイベントと称される単発のパルスが２回出現し、次にマルチフォトンイベントと称される複数（図１７（ｂ）　の例では５個）のパルスが連続して重畳した幅広（この場合の幅は振幅の意味ではなく零クロスから零クロスまでの時間方向の幅の意味、以下「時間幅」ということにする）のパルスが出現している。これは、最初の測光部分では輝度が弱く、続く測光部分では強い輝度の部分が比較的広い範囲で現れていることになる。ところが、これらの光検出信号を同じく閾値ｄを用いてカウンタで計数すると「３」という積算輝度値しか得られない。
【０００７】
すなわち、従来のフォトンカウントは、光検出器からの光検出信号をアナログの比較器で比較するため、入射光量が多い場合に問題が生じる。つまり図１７（ｂ）　のように、入射光量が多い場合は、光検出器の出力パルスは連なって重畳し、大きな一つのパルスとなる。アナログの比較器ではパルスの時間幅は無視され、閾値ｄを越える光検出信号の立ち上がりで「１」と計数するから、本来の輝度値は過小評価されるという問題が起こる。
【０００８】
したがって、そのようなフォトンカウントでは正確に計測できない比較的発光輝度の強い標本を測光する場合には、光検出器の出力パルスを所定の時間全て蓄積して、その電荷量を輝度値とするアナログ積算の方が正確な測光ができる。
このように、従来のフォトンカウント法による測光をレーザ顕微鏡の測光に応用しても、強弱に大きな差のある輝度分布の広い範囲にわたって最適な測光が出来ないという問題があって使用範囲が限られる。
【０００９】
他方、アナログ積算法による測光は、特には図示しないが、光検出器からの信号をすべてコンデンサに蓄え、その電圧をＡＤ変換する。そのため、信号とは関係のない電気ノイズも積算する傾向があり、輝度の比較的強い標本の測光には適するが、輝度の弱い標本の測光にはＳ／Ｎ比（信号／雑音比）が悪くて信頼性が低く、これも同様に強弱に大きな差のある輝度分布の広い範囲にわたって最適な測光が出来ないという問題があって使用範囲が限られた。
【００１０】
このように、従来、微弱光の輝度の弱いものと強いものの両方を一つの検出方法で検出することが出来なかったため、一つの装置内に相互に独立したフォトカウント回路とアナログ積算回路を併設し、標本の輝度に応じてスイッチで回路を切り替えて検出方法を変更するようにし、一つの装置で微弱光の輝度の弱いものと強いものの両方を検出できるようにした技術も提案されている。（例えば、特許文献３、４参照。）
しかしながら、上記の特許文献３又は４のように、並列に設けられたフォトカウント回路とアナログ積算回路の２つの測光処理回路を切り替えて使う方式は、入射光量の測定実効領域を広くすることはできるが、フォトンカウントの場合は測定単位が光子数であり、アナログ積算の場合は測定単位が電圧値であって測光単位が双方で異なるため、上記のように測光処理回路を切り替えた時点での輝度値を連続的に取り扱うことが出来ないという問題を有している。
【００１１】
この測光処理回路の切り替え時点における輝度測定値の不連続性の問題を多少なりとも改善するために、アナログ積算値を出力するＡ／Ｄ変換部とアナログパルスをデジタル変化して出力するパルス計数部の２つの出力回路を並列に実装し、いずれの出力であるかをユーザに報知して、測光方式切り替え時点での測光値の相関性をユーザの判断に委ねる技術も提案されている。（例えば、特許文献５参照。）
【００１２】
【特許文献１】
特開平１０−２２７６９５号公報（要約、段落［００２６］〜［００２８］。図３）
【特許文献２】
特開平０９−１９６７５２号公報（要約、段落［００２２］。図１）
【特許文献３】
特開平０３−１８１８２５号公報（第３頁左欄第２７行目〜同右欄第５０行目。第１図）
【特許文献４】
特開２００２−５５０５０号公報（要約。段落［００４５］。図１）
【特許文献５】
特開平０９−０７２７８４号公報（要約。図２）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、通常、レーザ顕微鏡では蛍光の波長帯域に応じた複数の光検出器を備え、それぞれについて測光回路を持たなければならないから、波長帯域ごとの測光装置の規模を最小限に抑える必要がある。ところが上記の特許文献３又は４のように測光装置としてフォトンカウント回路とアナログ積算器の２つの受光処理機構を並列に実装しなければならないのでは、装置が大型化してしまうという新たな問題が発生する。
【００１４】
また、特許文献５のように、Ａ／Ｄ変換部とパルス計数部の２つの出力回路を並列に実装していずれの出力かを報知してユーザに相関性を判断させるのは、切り替えた時点での輝度値をそのまま連続的に取り扱うことが出来るということとは程遠く、問題の根本的な解決にはならないという不満が残るものであった。
【００１５】
本発明の課題は、上記従来の実情に鑑み、アナログパルス／デジタル変換機能とアナログ積分機能を単一の構成として備え、２つの機能を切り替えても測光結果を同一の測光単位で出力でき、輝度の強弱に拘わり無く実際の輝度に応じた信頼性の高い且つ広い範囲の光量情報を得ることができる光走査型顕微鏡及びその測光装置を提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
以下に、本発明に係わる光走査型顕微鏡及び顕微鏡用測光装置の構成を述べる。
先ず、請求項１記載の発明の光学顕微鏡用測光装置は、光源からの照明光を観察試料に照射して得られる光の光量をクロック毎に検出して光量情報を得る光検出器と、該光検出器からのアナログ検出信号をデジタルデータにＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換手段と、該Ａ／Ｄ変換手段によりＡ／Ｄ変換されたデジタルデータに対し所定の演算を行う演算手段と、を備えて構成される。
【００１７】
上記演算手段は、例えば請求項２記載のように、上記デジタルデータが所定の閾値以上であるかの比較演算を行うように構成され、また、例えば請求項３記載のように、上記デジタルデータを全て加算するように構成される。
次に、請求項４記載の発明の光走査型顕微鏡は、光源からの照明光を観察試料に対し走査照射して得られる光を、対物レンズを含む光学系を介して結像し、その結像の光量により上記観察試料の光量情報を得る光走査型顕微鏡であって、上記結像の光量をクロック毎に検出する光検出器と、該光検出器からのアナログ検出信号をデジタルデータにＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換手段と、該Ａ／Ｄ変換手段によりＡ／Ｄ変換されたデジタルデータに対し所定の演算を行う演算手段と、を備え、上記演算手段は、１画素分の光量検出期間の間に入力された上記デジタルデータを演算してその演算結果を上記１画素分の輝度値とするように構成される。
【００１８】
上記演算手段は、例えば請求項５記載のように、上記デジタルデータが所定の閾値以上であるかの比較演算を行うように構成され、また、例えば請求項６記載のように、上記デジタルデータを全て加算するように構成される。
更に、請求項７記載の発明の光学顕微鏡用測光装置は、光源からの照明光を観察試料に照射して観察試料から得られる光量を検出して光量情報を得る光学顕微鏡用測光装置において、上記光量を検出する光検出器と、該光検出器により検出された光量を示すアナログ電気信号の帯域を可変する可変帯域手段と、該可変帯域手段により可変された帯域に基づいて上記光検出器により検出された光量を示すアナログ電気信号をデジタル値に変換するアナログ／デジタル変換手段と、閾値設定手段とカウンタとを内蔵する制御部と、を備え、上記制御部は、一方では上記観察試料から得られる光量が弱いとき上記可変帯域手段の帯域を広くすることにより上記光量の検出をフォトカウント法に切り替えて光量情報を取得し、他方では上記観察試料から得られる光量が強いとき上記可変帯域手段の帯域を狭くすることにより上記光量の検出をアナログ積算法に切り替えて光量情報を取得し、これら取得した光量情報をデジタルデータに変換して出力するように構成される。
【００１９】
上記制御部は、例えば請求項８記載のように、上記光量の検出をフォトカウント法に切り替えて光量情報を取得するときは、上記閾値設定手段により設定された閾値と、アナログ／デジタル変換手段による出力との比較演算を行い、この比較演算の結果を上記カウンタによりカウントして光子数を取得し、この取得した光子数を光量情報とするように構成される。
【００２０】
また、この顕微鏡用測光装置は、例えば請求項９記載のように、記憶手段を更に有し、上記制御部は、上記アナログ積算器によるり単一光子入射時毎のアナログ出力を上記Ａ／Ｄ変換手段によりデジタルデータに変換し、該デジタルデータに基づき上記輝度値演算手段により演算して単一光子入射時のＡ／Ｄ変換値の平均値を求め、該平均値を上記記憶手段により予め記憶し、上記光量の検出をアナログ積算法に切り替えて光量情報を取得するときは、上記アナログ積算法により出力される電圧値を上記記憶手段に記憶された上記平均値により除算することにより上記アナログ積算器から出力される電圧値の単位を光子数に変換して、この変換された光子数を光量情報とするように構成される。
【００２１】
この場合、上記記憶手段は、例えば請求項１０記載のように、上記平均値と上記光検出器の感度との相関を予め記憶し、上記制御部は、上記記憶手段に記憶されている上記平均値と上記光検出器の感度との相関に基づいて、上記光量情報を上記光検出器の基準感度における光量情報に変換するように構成するのが好ましい。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
＜第１の実施形態＞
図１は、第１の実施の形態における走査型レーザ顕微鏡装置の構成を模式的に示す図である。尚、同図には光学系の光路を破線で示し、制御系の信号経路を実線矢印で示している。
【００２３】
同図に示すように、走査型レーザ顕微鏡装置１は、光学系においては、レーザ光を発振するレーザ光発信部２と、このレーザ光発信部２から射出されるレーザ光を走査させるためのガルバノミラー３と、このガルバノミラー３によって走査されるレーザ光を収束させるための対物レンズ４と、この対物レンズ４によって収束されたレーザ光を受けて光を発する標本５と、この標本５が発した光を測光の経路に送るためのダイクロイツクミラー６と、このダイクロイツクミラー６から送られてくる光の強度を検出する測光装置７とから構成される。
【００２４】
そして、これらの光学系から画像を得るための制御系においては、先ず、システムコントローラ８は、ガルバノミラー３にレーザ光の標本５上での位置情報を与えて、ガルバノミラー３による走査のための振り動作を制御している。
更に、システムコントローラ８は、Ａ／Ｄ変換クロックと画素クロックを測光装置７に送っており、測光装置７は、そのＡ／Ｄ変換クロックと画素クロックとに同期して、１画素クロック毎に、その１画素クロック期間中の輝度データをシステムコントローラ８に送っている。
【００２５】
システムコントローラ８は、ガルバノミラー３の位置情報と、その位置での輝度情報を得ることとにより、３次元画像を作成して、その生成した３次元画像をディスプレイ９に表示させることができる。
図２は、上記測光装置７の構成を示すブロック図である。測光装置７は、図１のダイクロイックミラー６を介して反射して入力されてくる標本５より発せられた光をアナログ電気信号に変換する例えばフォトマルからなる光検出器１１と、この光検出器１１により変換されたアナログ電気信号をシステムコントローラ８から入力されるＡ／Ｄ変換クロックａに同期してデジタルデータに変換するＡ／Ｄ変換器１２と、このＡ／Ｄ変換器１２により変換されたデジタルデータをシステムコントローラ８から入力される画素クロックｐに同期して演算して１画素毎の輝度データを出力する演算装置１３と、この演算装置１３から出力される輝度データを記憶する記憶装置１４とから構成される。
【００２６】
図３は、測光装置７による処理の流れを示すフローチャートである。同図に示す処理は、測光装置７の演算装置１３の制御の下に、各部により演算装置１３を中心として行われる処理である。
図４は、上記の処理で行われる信号の処理を分かりやすく図解して示す図である。同図（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）　は、いずれも横軸に時間を示している。
【００２７】
図４（ａ）　に示すＡ／Ｄ変換クロックａは、例えば周期が１０ｎｓｅｃのパルスであり、パルスの立ち上がりと立ち下りのエッジが共に検出信号をＡ／Ｄ変換するタイミング示している。また、画素クロックｐは、例えば周期が１μｓｅｃのパルスであり、１画素の測光期間を指定するものであるが、この場合もこの画素クロックｐのパルス１周期で１画素の測光期間を指定するのではなく、パルスの立ち上がりのエッジから立ち下りのエッジまで、及びその立ち下りのエッジから次の立ち上がりのエッジまでが、共に隣接の１画素の測光期間の区切りを示している。つまりパルスの１周期で２画素分の測光期間を指定している。
【００２８】
また、図４（ｂ）　は、縦軸に光検出器１１から出力される検出信号（アナログ電気信号）の大きさを示しており、同図（ｂ）　に時間軸に沿って示される３つのアナログパルス１５（１５−１、１５−２、１５−３、ただし３番目のパルス１５−３は複数の検出信号が重畳して連続する１つの変形パルスになっている）は、検出信号の一例を示している。
【００２９】
これらの図３及び図４を用いて、測光装置７による処理を説明する。尚、この処理では、特には図示しないが、演算装置１３に内蔵される輝度値レジスタ及び閾値レジスタが使用される。閾値レジスタには予め所定の閾値が設定されている。図３において、先ず、輝度値レジスタの内容がゼロクリアされて、輝度値レジスタが初期設定される（ＳＴ１）。
【００３０】
次に、Ａ／Ｄ変換クロックａがＡ／Ｄ変換器１２に入力しているか否かが判別される（ＳＴ２）。そして、Ａ／Ｄ変換クロックａが入力していなければ入力されるまで待機する（ＳＴ２がＮＯ）。
そして、Ａ／Ｄ変換クロックａがＡ／Ｄ変換器１２に入力すると（ＳＴ２がＹＥＳ）、Ａ／Ｄ変換器１２は、Ａ／Ｄ変換クロックａのエッジに同期して、検出信号をＡ／Ｄ変換する（ＳＴ３）。
【００３１】
この処理では、図４（ａ）　に示すＡ／Ｄ変換クロックａのパルスの立ち上がり及び立ち下りに同期して、例えば、図４（ｃ）　に示すように、検出信号のパルス１５−１がデジタルデータ１６−１に変換され、検出信号のパルス１５−２がデジタルデータ１６−２に変換され、そして、検出信号のパルス１５−３が５個のデジタルデータ１６−３〜１６−７に変換される。この変換されたデジタルデータ１６−１〜１６−７は演算装置１３に入力する。
【００３２】
ここでＡＤ変換クロックａのエッジからエッジまでの時間間隔は検出信号の単一パルスの時間幅よりも小さく、つまり少なくとも単一パルスを検出できる程度の間隔以下であることが望ましい。本例ではＡ／Ｄ変換クロックａのパルス周期を、前述したように例えば１０ｎｓｅｃとしている。
【００３３】
続いて、図３において、演算装置１３は、上記入力される各デジタルデータ１６（１６−１〜１６−７）が、それぞれ所定の閾値よりも大きいか否かを判別する（ＳＴ４）。
この処理では、図４（ｄ）　に示すように、演算装置１３には所定の閾値ｈが予め設定されている。また、この閾値ｈは、通常想定されるノイズレベルよりも大きな値を設定されている。この閾値ｈと上記入力されてくる各デジタルデータ１６（１６−１〜１６−７）とが順次比較される。
【００３４】
そして、デジタルデータ１６のほうが閾値ｈよりも大きい場合は、輝度値レジスタに「１」が加算される（ＳＴ５）。図４（ｄ）　の例では最初のデジタルデータ１６−１は閾値ｈよりも大きいので、輝度値レジスタに「１」が加算される。
続いて、演算装置１３は、次の画素クロックの期間に変化したか否かを判別する（ＳＴ６）。この判別処理では、図４（ａ）　に示す画素クロックｐのパルスが立ち下がっている（“Ｌ”）のであれば、立ち上がり（“Ｈ”）に変化したかを判別し、又は画素クロックｐのパルスが立ち上がっている（“Ｈ”）のであれば、立ち下がり（“Ｌ”）に変化したかを判別する。
【００３５】
そして、画素クロックｐのパルスに変化がなければ（ＳＴ６がＮＯ）、処理ＳＴ２の処理に戻って、処理ＳＴ２〜ＳＴ６を繰り返す。これにより、上記のデジタルデータ１６−１に続いて図４（ｄ）　に示すデジタルデータ１６−２から１６−４までの各値が、順次閾値ｈと比較され、いずれも値が閾値ｈよりも大きいことにより輝度値レジスタに「１」が加算されていく。
【００３６】
そして、上記ＳＴ６の判別処理で、画素クロックｐのパルスが変化して（図４（ａ）　の例では“Ｌ”から“Ｈ”に変化して）、次の画素クロックになったとき、すなわち図４（ｄ）　に示すそれまでの画素測光期間ｐ１から次の画素の測光期間ｐ２になったときは（ＳＴ６がＹＥＳ）、輝度値レジスタに加算されていた値を記憶装置１４の所定の記憶領域に出力して（ＳＴ７）、ＳＴ１の処理に戻る。
【００３７】
これにより、１画素ごとに、Ａ／Ｄ変換クロックａに同期して閾値ｈと比較演算された検出信号のデジタルデータが加算されて、その加算された輝度値レジスタ内の演算結果が、１画素ごとに、記憶装置１４の所定の記憶領域に記憶されていく。
【００３８】
次の画素の測光では、図４（ｄ）　に示すように、デジタルデータ１６−５及び１６−６の値は閾値ｈよりも大きいので、輝度値レジスタに加算されるが、次のデジタルデータ１６−７の値は閾値ｈ以下であるので無視されて（図３のＳＴ４がＮＯ）、輝度値レジスタには加算されない。
＜第１の実施形態の作用・効果＞
このように、本例では、単一パルスを検出できる程度の時間間隔以下のＡ／Ｄ変換クロックａを発生させ、このＡ／Ｄ変換クロックａで指定されるタイミングで、検出信号をデジタルデータ化しているので、例えばフォトンカウンタと同様にフォトマル光検出器を用いた場合でも、図１７（ａ），（ｂ）　に示した従来の検出方法では、同図（ｂ）　に示したパルスが重畳してパルス時間幅が広く強い輝度を示す検出信号に対しても、１個のデジタルデータとしてしか検出できなかったものが、本例の検出方法では、図４（ｄ）　に示すように４個のデジタルデータ１６−３〜１６−６として検出することができる。
【００３９】
すなわち、測定した標本の輝度が強く、そのアナログ検出信号の単一パルスが重畳して１パルスの時間幅が広がった場合でも、そのパルスの時間幅に応じた数のデジタル輝度データが得られる。つまり標本に対するより忠実度の高い輝度データを得ることができる。
【００４０】
また、光検出器から出力された直後に、つまりアナログ信号にノイズが入りにくい段階で、そのアナログ信号をＡ／Ｄ変換するので、ノイズを拾う虞がなく、この点でも標本に対するより忠実度の高い輝度データを得ることができる。
また、たとえ、アナログ信号にノイズが入るようなことがあったとしても、アナログ信号からＡ／Ｄ変換したデジタルデータを、通常想定されるノイズレベルよりも大きな閾値ｈを設けて取捨選択しているので、この点でもノイズを拾うことがなく、標本に対するより忠実度の高い輝度データを得ことができる。
＜第２の実施形態＞
図５は、第２の実施の形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置の構成を示すブロック図である。尚、本例の走査型レーザ顕微鏡装置は、測光装置の構成が異なるだけで全体としての構成は図１の場合と同様である。また、図５に示す測光装置７′には、図２に示した測光装置７と同一の構成部分には図２と同一の番号を付与して示している。
【００４１】
図５に示すように、例の測光装置７′は、図２に示した測光装置７と同様の構成に更にＡ／Ｄ変換クロック計数器１７が追加されている。このＡ／Ｄ変換クロック計数器１７には、図１に示したシステムコントローラ８からＡ／Ｄ変換クロックａと画素クロックｐを入力される。この画素クロックｐは演算装置１３にも入力される。
【００４２】
上記のＡ／Ｄ変換クロック計数器１７は、上記入力された画素クロックｐの１画素期間内のＡ／Ｄ変換クロックａの数を計数して、その計数結果を演算装置１３に出力する。
また、特には図示しないが、本例では図１と同様の構成でガルバノミラー３からシステムコントローラ８に対しガルバノミラ−３の位置情報信号が送信される。システムコントローラ８は、そのガルバノミラ−３の位置情報信号に基づいて上記の画素クロックｐ（後述する画素クロックｐ′（ｐｅ　、ｐｃ　））を生成して、その生成した画素クロックｐを演算装置１３及びＡ／Ｄ変換クロック計数器１７に対して出力する。
【００４３】
ここで、図１に示したガルバノミラー３の動作特性について説明する。ガルバノミラー３は、レーザ光発信部２からのレーザ光を標本５上に走査させるために、一種の首振り運動を行っている。走査の動作が遅いときは大きな影響は現れないが、レーザ走査型顕微鏡では、レーザ光を高速に標本上に走査させるためにガルバノミラー３を高速で振らなければならない。
【００４４】
走査の動作を速くさせると、首振り運動の両終端部では、方向転換に伴う反動によって動作がやや遅くなり、その遅くなった反動で今度は首振り運動の中央部では、動作がやや速くなる。このように、最も高速に振るとき、ガルバノミラー３の角速度は一定ではなくなる。したがって、各画素の測光時間が変化し、測光時間が長いところは明るく、短いところでは暗くなって、測光された輝度と標本の実際の輝度とにずれが生じてくる。
【００４５】
図６（ａ），（ｂ）　は、そのように走査の動作を速くした場合に生じる輝度のずれを説明する図であり、同図（ｃ）　は、その輝度のずれを解消するために、第２の実施の形態においてシステムコントローラ８で生成される画素クロックｐ′を示す図である。
【００４６】
同図（ａ）　は、測光装置７′に入力される標本５に対応する検出信号の輝度を示しており、主走査方向（図の左右方向）の両端は、ガルバノミラー３の首振り運動の両終端部に対応しており、走査の動作がやや遅い分、測光時間が長くなり、本来の標本５の輝度よりも明るくなっている。そして、主走査方向の中央部では、走査の動作がやや速い分、測光時間が短くなり、本来の標本５の輝度よりも暗くなっている。
【００４７】
ただし、実際には、同図（ａ）　に示すように明暗がはっきり分かれているわけではなく、同図（ｂ）　示すように輝度のずれは、ほぼ連続的に変化する。同図（ｂ）　は横軸に時間、縦軸に輝度を示している。
このような輝度の実際とのずれを補正するために、本例では、ガルバノミラー３の位置信号に基づいてシステムコントローラ８で生成された不等時間間隔の後述する画素クロックｐ′（ｐｅ　、ｐｃ　）で測光する。すなわち、同図（ｃ）　に示すように、ガルバノミラー３の首振り運動の、両端部と中央部の動作の遅速に合わせて、１画素当りの画素クロックｐ′を生成する。すなわち、主走査の両端部になるほど画素クロックｐｅ　のように徐々に周期が長くなり、主走査の中央部になるほど画素クロックｐｃ　のように徐々に周期が短くなる。
【００４８】
これに対して、検出信号の検出周期を示すＡ／Ｄ変換クロックａは一定であるので、画素クロックｐ′（ｐｅ　、ｐｃ　）で示される１画素当たりの期間（以下、画素期間という）内のＡ／Ｄ変換クロックａを計数すれば、周期が変化している画素クロックｐ′で示される個々の１画素ごとの画素期間内の時間が正確にわかる。この計数された１画素ごとの画素期間内のＡ／Ｄ変換クロック計数値で、その画素期間内に検出されて加算されている輝度値を除算すれば、ガルバノミラー３の首振り運動の遅速に関係なく、各画素ごとに同一時間内の計測輝度が得られる。
【００４９】
ただし、１０μｓｅｃ前後の画素クロックｐ´の周期に対してＡ／Ｄ変換クロックａの周期は１０ｎｓｅｃであるので、そのまま上記の除算を行ったのでは求まる値が小さくなりすぎるから、適宜の係数を除算前の輝度値に掛けるようにする。この係数は、例えば一番周期の短い画素クロックｐｃ　の画素期間内のＡ／Ｄ変換クロック計数値とすれば、もっとも簡明である。
【００５０】
図７は、測光装置７′による処理の流れを示すフローチャートである。同図に示す処理も、測光装置７′の演算装置１３の制御の下に、各部により演算装置１３を中心として行われる処理である。
図８（ａ）　〜（ｄ）　は、上記の処理で行われる信号の処理を分かりやすく図解して示す図である。図８（ａ）　は、図４（ａ）　の場合と同様に、横軸に時間を示しておりＡ／Ｄ変換クロックａは、例えば周期が１０ｎｓｅｃのパルスであり、画素クロックｐは、例えば周期が１μｓｅｃのパルスである。そして、いずれも、パルスの立ち上がりと立ち下りのエッジで、Ａ／Ｄ変換クロックａの場合は検出信号をＡ／Ｄ変換するタイミングを示し、画素クロックｐの場合は１画素の測光期間の区切りを示している。
【００５１】
また、図８（ｂ），（ｃ）　は、図４（ｂ），（ｃ）　と同一の例を示している。そして、図８（ｄ）　も、図（ｄ）　の場合と同様に、アナログパルスから変換されたデジタルデータ１６（１６−１〜１６−７）を示しているが、本例で場合は、設定されてる閾値が図４のように閾値ｈの１つでなく、図８（ｄ）　に示すように閾値ｈ１、ｈ２、及びｈ３の３つの閾値が設定されている。
【００５２】
そして、本例では、デジタルデータ１６が閾値ｈ１よりも大きく閾値ｈ２以下であるときは輝度値「１」と判定する。また、デジタルデータ１６が閾値ｈ２よりも大きく閾値ｈ３以下であるときは輝度値「２」と判定する。そして、デジタルデータ１６が閾値ｈ３よりも大きいときは（同図（ｄ）　の例では示されていない）輝度値「３」と判定する。このようにすれば、単に重畳するパルスの時間幅に対応する輝度値（パルスの数に対応した輝度値）だけでなく重畳しているパルスの振幅にも対応した輝度値（各パルスの強さに対応した輝度値）が得られる。
【００５３】
これらの図６、図７、及び図８を用いて、測光装置７′による処理を説明する。尚、この処理においては、特には図示しないが、演算装置１３に内蔵される輝度値レジスタ及びが３個の閾値レジスタが使用される。３個の閾値レジスタには予め、図８（ｄ）　に示す３種類の閾値ｈ１、ｈ２及びｈ３がそれぞれ設定されている。
【００５４】
図７において、先ず、Ａ／Ｄ変換クロック計数器１７のＡ／Ｄ変換クロック計数値がゼロクリアされて、Ａ／Ｄ変換クロック計数器１７が初期化され（ＳＴ１０１）、次に、輝度値レジスタの内容がゼロクリアされて、輝度値レジスタが初期設定される（ＳＴ１０２）。
【００５５】
続いて、Ａ／Ｄ変換クロックａが測光装置７′に（つまりＡ／Ｄ変換器１２及びＡ／Ｄ変換クロック計数器１７に）入力しているか否かが判別される（ＳＴ１０３）。そして、Ａ／Ｄ変換クロックａが入力していなければ入力されるまで待機する（ＳＴ１０３がＮＯ）。
【００５６】
そして、Ａ／Ｄ変換クロックａが入力すると（ＳＴ１０３がＹＥＳ）、Ａ／Ｄ変換クロックａのエッジに同期して、一方では、Ａ／Ｄ変換クロック計数器１７の値に「１」が加算され（ＳＴ１０４）、他方では、Ａ／Ｄ変換器１２が検出信号をＡ／Ｄ変換する（ＳＴ１０５）。
【００５７】
これにより、例えば、図８（ｂ）　に示す波形のアナログ検出信号が、図４（ｄ）　の場合と同様に、図８（ｃ）　に示すように、デジタルデータ１６−１〜１６−７に変換される。この変換されたデジタルデータ１６−１〜１６−７は演算装置１３に入力する。
【００５８】
続いて、図７において、演算装置１３は、上記入力される各デジタルデータ１６（１６−１〜１６−７）が、それぞれ所定のｎ個の閾値（本例では３個の閾値ｈ１、ｈ２、ｈ３）よりも大きいか否かを判別する（ＳＴ１０６）。
この処理では、図８（ｄ）　に示すように、演算装置１３の３個の閾値レジスタに設定されている３個の閾値ｈ１、ｈ２、及びｈ３と上記入力されてくる各デジタルデータ１６（１６−１〜１６−７）とが、それぞれ順次比較される。
【００５９】
そして、デジタルデータ１６が閾値ｈ１よりも大きく閾値ｈ２以下であるときは輝度値として「１」、閾値ｈ２よりも大きく閾値ｈ３以下であるときは輝度値として「２」、そして、閾値ｈ３よりも大きいときは輝度値として「３」が、輝度値レジスタに加算される。つまりｎ個の閾値に対応する輝度値がそれぞれ加算される（ＳＴ１０７）。
【００６０】
続いて、演算装置１３は、画素クロックの期間が次の画素クロックの期間に変化したか否かを判別する（ＳＴ１０８）。この判別処理では、前述したように、画素クロックｐのパルスに、立ち下がり又は立ち上がりのエッジが発生したかが判別される。
【００６１】
そして、未だ次の画素クロックｐの期間に変っていなければ（ＳＴ１０８がＮＯ）、処理ＳＴ１０３の処理に戻って、処理ＳＴ１０３〜ＳＴ１０８を繰り返えす。
これにより、上述した処理ＳＴ１０７の加算処理では、図８（ｄ）　の例では、最初のＡ／Ｄ変換の処理周期でデジタルデータ１６−１は閾値ｈ１よりも大きく閾値ｈ２以下であるので、輝度値レジスタには「１」が加算される。次のＡ／Ｄ変換の処理周期では変換値が「０」であるので、輝度値レジスタには「０」が加算される。次のＡ／Ｄ変換の処理周期でも同様に変換値が「０」であるので、輝度値レジスタには「０」が加算される。そして、次のＡ／Ｄ変換の処理周期では変換値のデジタルデータ１６−２があり、この値は閾値ｈ１よりも大きく閾値ｈ２以下であるので、輝度値レジスタには「１」が加算される。
【００６２】
同様に、次のＡ／Ｄ変換の処理周期では変換値が「０」で輝度値レジスタには「０」が加算され、次も同様であるので輝度値レジスタに「０」が加算され、そして、次のＡ／Ｄ変換の処理周期では変換値のデジタルデータ１６−３があり、この値は閾値ｈ２よりも大きく閾値ｈ３以下であるので、輝度値レジスタには「２」が加算される。更に、次のＡ／Ｄ変換の処理周期では変換値のデジタルデータ１６−４があり、この値は閾値ｈ２よりも大きく閾値ｈ３以下であるので、輝度値レジスタには「２」が加算される。
【００６３】
続いて、図７において、上記ＳＴ１０８の判別処理で画素クロックｐのエッジが検出され、図８（ｄ）　に示す画素の測光期間ｐ１から測光期間ｐ２になったときは（ＳＴ１０８がＹＥＳ）、上記のように輝度値レジスタに加算されていた値をＡ／Ｄ変換クロック計数器１７で計数していたＡ／Ｄ変換クロック計数値で除算して、この除算結果の値を輝度値レジスタの値とし（ＳＴ１０９）、この輝度値レジスタの値が記憶装置１４の所定の記憶領域に格納される（ＳＴ１１０）。
【００６４】
上記の図８（ｄ）　に示す例であれば、画素クロックｐのエッジが切り替わるまでの間の画素期間ｐ１で得られる１、０、０、１、０、０、２、２の値を加算した６の値に、所定の係数αを掛けて、この画素期間ｐ１中に計数されたＡ／Ｄ変換クロック数で割った値が記憶装置１４に格納される。
＜第２の実施形態の作用・効果＞
このように、本例では複数の閾値を設定することにより、第１の実施の形態における輝度の強さに応じて広がったパルス時間幅に対してもそのパルス時間幅に応じた輝度データを得ることができる効果に加えて、本例によれば、標本の輝度の強さに応じて大きくなったアナログ検出信号のパルス振幅に対してもその振幅の大きさに応じた輝度データを得ることができる。更にガルバノミラーの不等速度の振り運動に対しても、各画素ごとに一定時間当りの輝度値を得るようにしている。これにより、より一層標本に対する忠実度の高い輝度データを得ることができると共に高速な走査による測光時間の短縮を実現することができる。
【００６５】
上述した第１及び第２の実施の形態においては、いずれもＡ／Ｄ変換されたデジタル輝度データに対して閾値を設けているが、これに限ることなく、閾値を設けずに単純に１画素期間内のデジタル輝度データを加算して、これを１画素の輝度データとしてもよい。これを第３の実施の形態として以下に説明する。
＜第３の実施形態＞
図９は、第３の実施の形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置による処理の流れを示すフローチャートである。尚、本例における走査型レーザ顕微鏡装置及びその測光装置の構成は、図１及び図２の構成と同一であり、ただし、本例では、測光装置７の演算装置１７には、閾値レジスタは内蔵されておらず、演算装置１７の処理方法は加算のみとなる。また、第２の実施形態の測光装置７′のようにＡ／Ｄ変換クロック計数器１７などの構成も無いので、全体としての構成は簡単であり、したがって廉価な装置として提供することができる。
【００６６】
図９において、処理ＳＴ２０１〜ＳＴ２０３の処理は、図３に示した処理ＳＴ１〜ＳＴ３の処理と同一である。図９において、上記の処理ＳＴ２０３に続いて演算装置１７は、上記Ａ／Ｄ変換されたデジタルデータを、輝度値レジスタに加算して（ＳＴ２０４）、次の画素クロックになったか否かを判別し（ＳＴ２０５）、まだ、次の画素クロックになっていなければ（ＳＴ２０５がＮＯ）、処理ＳＴ２０２に戻って、処理ＳＴ２０２〜ＳＴ２０５を繰り返す。これにより、１画素クロックの期間の間において検出され、Ａ／Ｄ変換されたデジたるデータが全て輝度値レジスタに加算される。
【００６７】
そして、次の画素クロックになったときは（ＳＴ２０５がＹＥＳ）、輝度値レジスタに加算されている輝度値を記憶装置１４に出力して記憶させ（ＳＴ２０６）、処理ＳＴ２０１に戻る。
＜第３の実施形態の作用・効果＞
本例のようにしても、標本の輝度の強さに応じたアナログ検出信号パルスの時間幅や振幅の大きさに応じたデジタル輝度データが得られるので、閾値が設定されていないために輝度データにノイズが含まれる不具合を考慮してもなお利点の方が大きい。
【００６８】
なお、上述した、第１〜第３の実施の形態においては、１画素当りの測光時間がアナログ積算方式の場合の放電時間に近づいても、いずれも電荷蓄積時間を必要とする構成ではないので、その面での測光時間に制約を受けることがなく高速化が実現できる。
【００６９】
とこで、上記第１〜第３の実施形態では、フォトンカウント方式とは異なる方式で、アナログデータをすべてデジタルデータに変換して扱うようにし、アナログ検出信号パルスから信頼性の高いデジタル輝度データの測光値を得るようにしている。
【００７０】
ところが、上記のように単にアナログ／デジタル変換によるアナログサンプリングだけでなく、上記のアナログサンプリングのほかに、デジタル変換前のアナログ測定にフォトンカウント方式やこのフォトンカウント方式よりも大きな輝度値の検出が可能なアナログ積算方式を併用し、しかも、これらフォトンカウント方式によるアナログパルス／デジタル変換機能と、アナログ積算機能とを、単一の構成として備え、２つの機能を切り替えてもそれらの測光結果をデジタル化して同一の測光単位で出力して、同じデータとして統一して見れるように構成することもできる。
【００７１】
これにより、輝度の強弱に拘わり無く実際の輝度に応じた信頼性の高い且つ広い範囲の光量情報を得ることができるようになる。以下、これを第４〜第６の実施の形態として説明する。
＜第４の実施形態＞
図１０は、第４の実施形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置の構成を示すブロック図である。尚、本例の走査型レーザ顕微鏡装置は、測光装置の構成が異なるだけで全体としての構成は図１の場合と同様である。
【００７２】
図１０において、測光装置７ａは、標本より発せられた光を受光してその光量をアナログ電気信号ｑに変換する光電子増倍管（ＰＭＴ）２０と、上記アナログ電気信号ｑの帯域を変化させる帯域可変部２１と、この帯域可変部２１のコンデンサ２２を放電させるための放電スイッチ２３と、上記アナログ電気信号ｑを増幅するための増幅器２４と、Ａ／Ｄ変換クロックに同期して上記増幅されたアナログ電気信号ｑｘをデジタルデータｑｄに変換するＡ／Ｄ変換器２５と、そのデジタルデータｑｄを演算して、所望のデータ（輝度値ｑｂ）に加工したり、Ａ／Ｄ変換クロックの生成や上記帯域可変部２１の帯域の制御や放電スイッチ２３の制御を行う制御・演算部２６により構成される。
【００７３】
尚、帯域可変部２１は、上記のコンデンサ２２の他に、上記アナログ電気信号ｑの出力線２６と接地回路間に上記のコンデンサ２２と並列に接続された可変抵抗２７を備えている。また、放電スイッチ２３は、常時開スイッチで構成されている。
【００７４】
この測光装置７ａは、フォトンカウント機能、アナログ積算機能、及びアナログサンプリング機能の３つの測光機能を備えており、制御・演算部２６による制御により、上記３つの測光機能を任意に使い分けることができる。
まず、フォトンカウントとしての機能について述べる。この測光装置７ａをフォトンカウントとして使用するには、帯域可変部２１の帯域をできる限り広くする。図１０に示す例では、帯域可変部２１はコンデンサ２２と可変抵抗２７で構成されているが、ここで、コンデンサ２２の蓄電容量をＣ、可変抵抗２７の抵抗値をＲとすると、帯域可変部２１の帯域は１／（２πＣＲ）と表されるので、帯域を広くするには可変抵抗２７の抵抗値Ｒを小さくする。
【００７５】
ただし、抵抗値Ｒを０としてしまってはＰＭＴ２０の出力電流が電圧に変換されないので、ＰＭＴ２０の出力が持つ帯域以下の帯域とすることが望ましい。
図１１は、フォトンカウントの動作概念を模式的に説明する図である。上記のように制御・演算部２６により帯域可変部２１の帯域を広くなるように制御をすることによって、ＰＭＴ２０から出力される図１０に示した電流（電気信号ｑ）は、パルス状の電圧となって増幅器２４に入力する。
【００７６】
増幅器２４では。図１１に示すように、パルスの大きさを増幅して、増幅パルスｑｘとし、この増幅パルスｑｘをＡ／Ｄ変換器２５に入力する。このときＡ／Ｄ変換器２５のＡ／Ｄ変換クロックの間隔は、上記ＰＭＴ２０から出力され増幅器２４で増幅されたパルス電圧（増幅パルスｑｘ）のパルス幅ｗ１、ｗ２、・・・に比べて十分小さな時間となるように予め設定し、このＡ／Ｄ変換クロックに同期して、常に増幅パルスｑｘをＡ／Ｄ変換するようにする。
【００７７】
このＡ／Ｄ変換された増幅パルスｑｘのデジタルデータｑｄ（図１０も参照）は、制御・演算部２６に入力する。制御・演算部２６は、入力されたデジタルデータｑｄを、所定の閾値ｋと比較演算する。入力されたデジタルデータｑｄが閾値ｋよりも大きいデータの場合には「１」をカウントする。
【００７８】
但し、Ａ／Ｄ変換クロックの時間的な間隔は、上述したようにＰＭＴ２０が出力する電流パルスのパルス幅よりも狭いので、一つの出力電流パルスｑｘ（図１１参照）を複数回計数してしまう虞がある。そこで、「１」をカウントしたあとは、次に閾値ｋよりも大きいデータがあっても計数しないようにする。
【００７９】
図１１の例では、カウント値「１」は最初の「１」み計数され、次に破線丸印ｅで囲まれた２個のカウント値「１」は計数されない。カウント値が「２」となる２番目の出力電流パルスｑｘについても同様である。こうすることにより、一つの出力電流パルスを数回カウントしてしまうことを避けることができ、単一光子ごとの計数を確実に行うことができる。
【００８０】
このような比較演算により、図１のシステムコントローラ８から送られてくるサンプリングクロックの１クロックの間のカウント数を輝度値とすることで、フォトンカウントによる輝度値計測を実現することができる。
次に、図１０の測光装置７ａのアナログ積算器としての機能について説明する。この測光装置７ａをアナログ積算器として使用するには、帯域可変部２１の帯域を最小にする。すなわち、図１０の可変抵抗２７の抵抗値Ｒを最大にして、可変抵抗２７に電流が流れないようにする。
【００８１】
これにより、ＰＭＴ２０から出力される電流パルスの電荷はコンデンサ２２にのみ流れ込んでコンデンサ２２に蓄えられる。この電荷の充放電は放電スイッチ２３で行う。放電スイッチ２３は、Ａ／Ｄ変換クロックと同期しており、Ａ／Ｄ変換器２５にクロックが入り、Ａ／Ｄ変換された直後に、可能な限り短時間の間隔で放電スイッチ２３をＯＮにして放電をする。これによってアナログ積算器が構成される。
【００８２】
尚、本例では、放電スイッチ２３で充放電をしているが、放電スイッチ２３を除去して、帯域可変部２１の可変抵抗１７の抵抗値Ｒを切り替えることによっても充放電をすることができる。すなわち、充電時には抵抗値Ｒを大きくし、放電時には抵抗値Ｒを最小にすることによって、アナログ積算器を構成するようにしてもよい。
【００８３】
続いて、更に、図１０の測光装置７ａのアナログサンプリング回路としての機能について説明する。この測光装置７ａをアナログサンプリング回路として使用するには、ＰＭＴ２０の出力信号の帯域が広いので、アナログサンプリングをするには帯域を落とす必要がある。帯域の制限は図１０の可変帯域部２１で行うことができ、これにより可変帯域部２１をローパスフイルタとして用いることでアナログサンプリングが可能となる。尚、サンプリングの方法、つまりサンプリング周期の設定は、測光装置の使用目的に応じて適宜に設定してよい。
【００８４】
尚、図１０において、光検出器としてＰＭＴ２０を用いているが、これに限ることなく、電流出力型の光検出器、フォトダイオード、アバランシュ・フォトダイオードなどを使用するようにしてもよい。
また、図１０において、帯域可変部２１の可変部分は、可変抵抗２７となっているが、これに限ることなく、抵抗を固定抵抗とし、コンデンサ２２を可変コンデンサとして構成してもよい。また、帯域可変部２１を帯域可変フイルタ、又は可変ゲインアンプなどで構成するようにしてもよい。
【００８５】
また、Ａ／Ｄ変換器の変換クロック（図１１のカウント間隔）は、Ａ／Ｄ変換器の性能が許す範囲で可能な限り高速なものを使用するのが好ましい。また、閾値は、一つと限ることなく、例えばパルスが重なってしまった場合にも対応できるように、複数のレベルの閾値をもち、それぞれについて、閾値の重み付けをして輝度値の演算をするようにしてもよい。
【００８６】
その場合は、例えば、第１〜３までの閾値を持ち、第１閾値＜第２閾値＜第３閾値と設定し、これらと比較されるＡ／Ｄ変換値が第１閾値以上、第２閾値末満の場合はカウント値に＋１をする。第２閾値以上、第３閾値末満の場合はカウント値に＋２をするなどとすればよい。
＜第４の実施形態の作用・効果＞
いずれにしても、本例の測光装置７ａによれば、フォトンカウントとアナログ積算器とアナログサンプリングの３つの受光方式を、並列の構成部分がない小型な回路構成の中で実現できるので、光走査型顕微鏡において広い範囲の輝度条件の中での測光装置として好適に使用することができる。
【００８７】
そして、Ａ／Ｄ変換クロックの間隔をＰＭＴから出力される電流パルスのパルス幅に比べて十分小さな時間となるように設定するので、フォトンカウントとして用いる場合は、閾値以上の電流パルス信号を検出し損じることなく確実に検出することができる。
＜第５の実施形態＞
図１２は、第５の実施形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置の構成を示すブロック図である。尚、本例の走査型レーザ顕微鏡装置も、測光装置の構成が異なるだけで全体としての構成は図１の場合と同様である。また、図１２には、図１０の構成と同一構成部分には図１０と同一の番号を付与してい示している。
【００８８】
図１２に示すように、本例の測光装置７ｂは、図１０の測光装置７ａの制御・演算部２６に、記憶装置２８が接続されて構成される。この記憶装置２８には後述するアナログ積算の平均値が記憶される。また、本例の測光装置７ｂにおけるアナログ積算機能への切り替えは、極めて微弱な光しか発しないような標本を測光する場合に有効である。以下、これについて説明する。
【００８９】
図１３は、アナログ積算において光子数が極めて少ない時におけるＡ／Ｄ変換器２５の入力部分の電圧波形を示す図ある。この電圧波形ｑΣは、光子がＰＭＴ２０に入射したときはＰＭＴ２０から出力電流が流れて、コンデンサ２２に充電され、次にＰＭＴ２０からの出力電流がくるまでは、充電も放電もせずにそのままの電圧を保つため、図１３に示すような段階形の波形となる。
【００９０】
尚、ＰＭＴ２０の出力電流ｑ（ｑ１、ｑ２、ｑ３、・・・）の大きさは、確率によって支配されているため、同じように光子１つがＰＭＴ２０に入射した場合でも出力電流ｑの大きさは異なる。しかし、不図示の電源からＰＭＴ２０に印加する電圧が一定のもとでは、ＰＭＴ２０の出力電流ｑの大きさは平均的な値を持つことができる。
【００９１】
このことに着目して、本例では、図１３の段階の高さｑ（ＰＭＴ２０の出力電流ｑ）を複数測定することによって、光子１つがＰＭＴ２０に入射したときの図１３の段階の高さｑ（ｑ１、ｑ２、ｑ３、・・・）の平均値を求め、この平均値を記憶装置２８に記憶して、この記憶した平均値に基づいて、以後測定するアナログ積算値ｑΣを、光子数をあらわすデジタルデータｑｄに変換する。
【００９２】
先ず、標本から入射する光量が微弱な状態で、図１１に示したフォトンカウントを実行する。このフォトンカウントの実行により、ＰＭＴ２０に入射している光量が微弱であることを確認する。尚、１秒間にカウントする光子の数が１００万個程度ならば微弱と考えて良い。
【００９３】
また、ＰＭＴ２０に入射している光量が大きすぎたり、小さすぎる場合は、図１のレーザ光発信部２のレーザの光量を変化させて、上記の程度の光量がＰＭＴ２０に入射するように調整する。
次に測光装置７ｂを、アナログ積算器として動作させる。このとき帯域可変部２１および放電スイッチ２３の動作とそのタイミングについては、第１の実施例におけるフォトンカウントの場合のＡ／Ｄ変換クロックと同様に、高速な周波数で動作させる。
【００９４】
図１４は、上記のアナログ積算器としての動作においてアナログ積算値を順次測定するときの測定波形を模式的に示す図であり、増幅器２４から入力されたアナログ積算値をＡ／Ｄ変換機２４によりデジタルデータに変換した波形と、記憶装置２８に予め記憶されている閾値ｋとの関係を示している。
【００９５】
図１５は、上記のアナログ積算値を順次測定する動作のフローチャートである。上記の図１３〜図１５を用いて、アナログ積算値のデジタルデータ化後の平均値を求める処理動作を説明する。尚、この処理は、図１に示すシステムコントローラ８による制御に基づいて、図１２に示す測光装置７ｂの制御・演算部２６により行われる処理である。
【００９６】
図１５において、先ず、制御・演算部２６は電圧値と閾値とを比較する（Ｓ１）。この処理は、図１２に示す増幅器２４からＡ／Ｄ変換機２４に入力されるアナログ積算値ｑΣの最初のサンプリング値である電圧をＡ／Ｄ変換機２４によりＡ／Ｄ変換されてデジタルデータ化した図１４の電圧波形のデジタル値ｑｄ１と、図１２の記憶装置２８に予め記憶されている図１４に示す閾値ｋとを比較する処理である。
【００９７】
尚、記憶装置２８に予め設定する閾値の大きさは、雑音を拾わない範囲で最も低い大きさに設定することが望ましい。
そして、上記の比較判別で、制御・演算部２６は、Ａ／Ｄ変換機２４からＡ／Ｄ変換されて入力した電圧波形のデジタル値が閾値ｋ以下であるときは（Ｓ１がＮ）、上記入力した電圧波形は雑音であると判別して次の電圧の入力を待機する、ということを繰り返す。
【００９８】
そして、上記Ａ／Ｄ変換機２４から入力した電圧波形のデジタル値が閾値ｋよりも大きいときは（Ｓ１がＹ）、制御・演算部２６は、その電圧値を記憶装置２８の所定の記憶領域に格納して記憶する（Ｓ２）。
この処理では、上記最初のサンプリング値である電圧波形のデジタル値は、図１４に示す電圧波形のデジタル値ｑｄ１であり、これは例えば図１３のアナログ積算値ｑΣの最初の段階の電圧値ｑ１に相当している。
【００９９】
続いて、制御・演算部２６は、放電スイッチをＯＮにする（Ｓ３）。この処理では、図１３に示す放電スイッチ２３が閉じられて、コンデンサ２２に蓄電されていた上記の電圧値ｑ１の電荷が可及的速やかに接地回路に放電され、コンデンサ２２の蓄電量が０に設定される。
【０１００】
更に続いて、制御・演算部２６は、放電スイッチをＯＦＦにして（Ｓ４）、最初のＳ１の処理に戻り、上述したＳ１〜Ｓ４の処理を繰り返す。
このように、上述したＳ１〜Ｓ４の処理が繰り返されることにより、図１４に示すＡ／Ｄ変換された電圧波形のデジタル値ｑｄ２、ｑｄ３、・・・が記憶装置２８の所定の記憶領域に順次記憶されていく。
【０１０１】
そして、制御・演算部２６は、上記測定したＡ／Ｄ変換後の電圧波形のデジタル値ｑｄ１、ｑｄ２、ｑｄ３、・・・が、その平均値をとるのに十分なだけ記憶装置２８に記憶されたと判断したときは、図１５に示す処理を終わって、記憶装置２８に記憶されたデジタル値ｑｄ１、ｑｄ２、ｑｄ３、・・・の平均値を求め、この平均値を、光子１個がＰＭＴ２０に入射したときの図１３に示す段階の高さの平均値として記憶装置２８の所定の記憶領域に記憶する。また、そのときの電源からＰＭＴ２０への印加電圧も上記の平均値に関連付けて記憶する。
【０１０２】
その後、図１に示す標本５を、通常の生物標本など観察したい標本に切り替えて観察を行う。この観察の中で、アナログ積算をする場合は、その輝度値として通常にアナログ積算を行ってＡ／Ｄ変換された電圧値を、上記の平均値で割り算して輝度値とする。これにより、アナログ積算で得られた輝度値の単位を光子数で表すことができる。
＜第５の実施形態の作用・効果＞
このように、本例によれば、フォトンカウントでは勿論のこと、アナログ積算においても輝度値の単位を光子数で表すことが可能となる。したがって、標本の光量が非常に微弱な場合にはフォトンカウントを用い、通常の光量においてはアナログ積算に切り換えて測光して、それぞれ得られる輝度値を共通の単位で表すことができ、これにより、入射光量の強弱に拘わりなく広い範囲にわたって光子数を計数することができる測定実効領域の広い測光装置を提供することが可能となる。
＜第６の実施形態＞
ところで、上述までの実施の形態では、標本の光量が非常に微弱な場合と、標本の光量が通常の光量である場合の測光について説明したが、標本の輝度が非常に高く、光量が多い場合は、たとえアナログ積算を用いたとしても通常の用い方ではＰＭＴ２０からの出力電圧は増幅器２４及びＡ／Ｄ変換器２５の入力許容範囲を越えるようになる。したがって、そのような場合は、ＰＭＴ２０への印加電圧を下げなければならない。
【０１０３】
上述した第５の実施の形態では、アナログ積算によって光子数を計測したが、この測光方法はＰＭＴ２０のゲインが一定の時に限るものであり、ＰＭＴ２０のゲインを変化させると、図１３に示した電圧値の段階の高さの平均値も変化してくる。
【０１０４】
上記の段階の高さの平均値は、ＰＭＴ２０のゲインの関数であるが、ＰＭＴ２０のゲインはその印加電圧の関数である。従って、段階の高さの平均値は、ＰＭＴ２０への印加電圧から推定することができる。この場合、ＰＭＴ２０への印加電圧が基準印加電圧であるときの段階の高さの平均値を予め求めておくようにする。
【０１０５】
これによって、標本の輝度が非常に高く光量が多い場合でも、アナログ積算を用いて、光子数を単位とする適正な測光を行うことができる。以下、これについて第６の実施形態として説明する。
図１６は、第６の実施形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置の構成を示すブロック図である。尚、本例の走査型レーザ顕微鏡装置も、測光装置の構成が異なるだけで全体としての構成は図１の場合と同様である。また、図１６には、図１２の構成と同一構成部分には図１２と同一の番号を付与してい示している。
【０１０６】
図１６に示すように、本例の測光装置７ｃでは、ＰＭＴ２０に接続する図１０及び図１２では図示を省略していたＰＭＴ電源２９を示している。そして、このＰＭＴ電源２９には印加電圧・ゲイン相関部３１が接続されている。印加電圧・ゲイン相関部３１には、予め測光により又は後述する式（１）によって得られる印加電圧・ゲイン相関テーブルが格納されている。
【０１０７】
上記の構成において、制御・演算部２６は、ＰＭＴ電源２９のＰＭＴ印加電圧Ｂを、標本の光量に応じて変化させたとき、そのＰＭＴ電源２９の印加電圧Ｂと、段階の高さの平均値を取得したときの基準となる印加電圧Ａが異なる場合は、印加電圧Ａと印加電圧Ｂのゲインの比を、印加電圧・ゲイン相関部３１に設定されている印加電圧・ゲイン相関テーブルによって求める。
【０１０８】
この求められたゲインの比から、ＰＭＴ電源２９の印加電圧Ｂでの段階の高さの平均値を計算する。このようにして得られた現行の印加電圧Ｂでの段階の高さの平均値で、Ａ／Ｄ変換器２５からの出力データを除算し、その商を輝度値とする。上記のようにして得られた輝度値は、その単位は光子数である。
【０１０９】
一般に、上記の印加電圧・ゲインの相関は、印加電圧をＶ、ゲインをμとすると、
μ＝Ｋ・Ｖ＾αｎ（Ｋ、αは定数）　・・・・・（１）
で表わされる。ここでｎはＰＭＴ２０のダイノード段数なので既知であり、２つの印加電圧値についてゲインを求めることにより、Ｋ及びαを求めることができる。
【０１１０】
尚、本例における測光装置７ｃを用いて、第４又は第５の実施形態で説明した微弱光の標本に対するフォトンカウントによる測光、通常光量の標本に対するアナログ積算による測光ができることは勿論である。
＜第６の実施形態の作用・効果＞
このように、本例によれば、標本５の輝度が高く、したがってＰＭＴ印加電圧を小さくし、ゲインを低く設定しなければならない状況においても、実際の輝度値を光子数として表すことができる。
【０１１１】
つまり、通常の光量よりも強い光量の標本に対しても、アナログ積算方式を用い、ＰＭＴのゲインを低く設定して測光して、光子数の計数を推定することができる。
これにより、微弱光、通常光量、強い輝度の光量のいずれに対しても、その測光値を光子数で表すことができ、したがって、入射光量の強弱に拘わりなく広い範囲にわたって光子数を計数することができる測定実効領域の広い測光装置を提供することが可能となる。
（付記１）光学顕微鏡用測光装置であって、
光源からの照明光を観察試料に照射して得られる光の光量をクロック毎に検出して光量情報を得る光検出器と、
該光検出器からのアナログ検出信号をデジタルデータにＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換手段と、
該Ａ／Ｄ変換手段によりＡ／Ｄ変換されたデジタルデータに対し所定の閾値以上であるかの比較演算を行う演算手段と、
を備え
前記比較演算に用いられる前記所定の閾値は、値の異なる複数の閾値であることを特徴とする顕微鏡用測光装置。
（付記２）前記比較演算に用いられる前記所定の閾値は、任意の値に設定されることを特徴とする付記１記載の顕微鏡用測光装置。
（付記３）前記演算手段は、入力された前記デジタルデータと前記所定の閾値との比較演算の結果を加算することを特徴とする付記１記載の顕微鏡用測光装置。
（付記４）光源からの照明光を観察試料に対し走査照射して得られる光を、対物レンズを含む光学系を介して結像し、その結像の光量により前記観察試料の光量情報を得る光走査型顕微鏡であって、
前記結像の光量をクロック毎に検出する光検出器と、
該光検出器からのアナログ検出信号をデジタルデータにＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換手段と、
該Ａ／Ｄ変換手段によりＡ／Ｄ変換されたデジタルデータに対し所定の閾値以上であるかの比較演算を行う演算手段と、
を備え、
前記演算手段は、１画素分の光量検出期間の間に入力された前記デジタルデータを演算してその演算結果を前記１画素分の輝度値とし、
前記比較演算に用いられる前記所定の閾値は、値の異なる複数の閾値であることを特徴とする光走査型顕微鏡。
（付記５）前記比較演算に用いられる前記所定の閾値は、任意の値に設定されることを特徴とする付記４記載の光走査型顕微鏡。
（付記６）前記演算手段は、入力された前記デジタルデータと前記所定の閾値との比較演算の結果を加算することを特徴とする付記４記載の光走査型顕微鏡。
（付記７）光源からの照明光を観察試料に照射して観察試料から得られる光量を検出して光量情報を得る光学顕微鏡用測光装置において、
上記光量を検出する光検出器と、
該光検出器により検出された光量を示すアナログ電圧の積算量帯域を可変する可変帯域手段と、
該可変帯域手段により可変された積算量帯域に基づいて上記光検出器により検出された光量を示すアナログ電圧をデジタル値に変換するアナログ／デジタル変換手段と、
しきい値設定手段とカウンタとを内蔵する制御部と、
を備え、
上記制御部は、一方では上記観察試料から得られる光量が弱いとき上記可変帯域手段の可変帯域を広くして上記光量の検出をフォトカウント法に切り替えて光量情報を取得し、他方では上記観察試料から得られる光量が強いとき上記可変帯域手段の可変帯域を狭くして上記光量の検出をアナログ積算法に切り替えて光量情報を取得し、これら取得した光量情報をデジタルデータに変換して出力することを特徴とする顕微鏡用測光装置。
（付記８）上記制御部は、
上記光量の検出をフォトカウント法に切り替えて光量情報を取得するときは、上記しきい値設定手段により設定されたしきい値と、アナログ／デジタル変換手段による出力との比較演算を行い、この比較演算の結果を上記カウンタによりカウントして光子数を取得し、この取得した光子数を光量情報とすることを特徴とする付記７記載の顕微鏡用測光装置。
（付記９）記憶手段を更に有し、上記制御部は、
上記アナログ積算器によるり単一光子入射時毎のアナログ出力を上記Ａ／Ｄ変換手段によりデジタルデータに変換し、該デジタルデータに基づき上記輝度値演算手段により演算して単一光子入射時のＡ／Ｄ変換値の平均値を求め、該平均値を上記記憶手段により予め記憶し、
上記光量の検出をアナログ積算法に切り替えて光量情報を取得するときは、上記アナログ積算法により出力される電圧値を上記記憶手段に記憶された上記平均値により除算することにより上記アナログ積算器から出力される電圧値の単位を光子数に変換して、この変換された光子数を光量情報とすることを特徴とする付記７記載の顕微鏡用測光装置。
（付記１０）上記記憶手段は、上記平均値と上記光検出器の感度との相関を予め記憶し、
上記制御部は、上記記憶手段に記憶されている上記平均値と上記光検出器の感度との相関に基づいて、上記光量情報を上記光検出器の基準感度における光量情報に変換する、
ことを特徴とする付記７記載の顕微鏡用測光装置。
【０１１２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、輝度の強弱に拘わり無く実際の輝度に応じた光量情報を得ることができる光走査型顕微鏡及びその測光装置を提供することでが可能となる。
【０１１３】
また、一つの直列回路で構成されたフォトンカウントとアナログ積算器とアナログサンプリングの３つの受光機能を一つの直列回路で構成し、これら３つの受光機能を切り替えて、いずれの最終出力も輝度値の単位を光検出器で検出された光子数として出力するので、受光方式の切り替えによっても測光値に連続性が得られ、これにより輝度の強弱において広い範囲にある標本の測光を連続性のある測光値で実現する光走査型顕微鏡及びその測光装置を提供することでが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１の実施の形態における走査型レーザ顕微鏡装置の構成を模式的に示す図である。
【図２】第１の実施の形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置の構成を示すブロック図である。
【図３】第１の実施の形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置による処理の流れを示すフローチャートである。
【図４】（ａ）　〜（ｄ）　は第１の実施の形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置により行われる信号の処理を分かりやすく図解して示す図である。
【図５】第２の実施の形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置の構成を示すブロック図である。
【図６】（ａ），（ｂ）　はガルバノミラーの動作を速くした場合に生じる不具合を説明する図、（ｃ）　はその不具合を解消するために第２の実施形態のシステムコントローラで生成される画素クロックを示す図である。
【図７】第２の実施の形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置による処理の流れを示すフローチャートである。
【図８】（ａ）　〜（ｄ）　は第２の実施の形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置による行われる信号の処理を分かりやすく図解して示す図である。
【図９】第３の実施の形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置による処理の流れを示すフローチャートである。
【図１０】第４の実施形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置の構成を示すブロック図である。
【図１１】フォトンカウントの動作概念を模式的に説明する図である。
【図１２】第５の実施形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置の構成を示すブロック図である。
【図１３】アナログ積算において光子数が極めて少ない時におけるＡ／Ｄ変換器の入力部分の電圧波形を示す図である。
【図１４】アナログ積算器としての動作においてアナログ積算値を順次測定するときの測定波形を模式的に示す図である。
【図１５】アナログ積算値を順次測定する動作のフローチャートである。
【図１６】第６の実施形態における走査型レーザ顕微鏡装置の測光装置の構成を示すブロック図である。
【図１７】（ａ），（ｂ）　は従来のフォトンカウント測光方法をレーザ顕微鏡の測光に用いた場合の不具合を説明する図である。
【符号の説明】
１　　走査型レーザ顕微鏡装置
２　　レーザ光発信部
３　　ガルバノミラー
４　　対物レンズ
５　　標本
６　　ダイクロイツクミラー
７、７ａ、７ｂ、７ｃ　測光装置
８　　システムコントローラ
９　　ディスプレイ
１１　光検出器
１２　Ａ／Ｄ変換器
１３　演算装置
１４　記憶装置
１５（１５−１、１５−２、１５−３）　アナログパルス
１６（１６−１〜１６−７）　デジタルデータ
１７　Ａ／Ｄ変換クロック計数器
ａ　　Ａ／Ｄ変換クロック
ｄ　　閾値
ｈ、ｈ１、ｈ２、ｈ３　閾値
ｐ、ｐ′、ｐｅ　、ｐｃ　　画素クロック
２０　ＰＭＴ（光電子増倍管）
２１　帯域可変部
２２　コンデンサ
２３　放電スイッチ
２４　増幅器
２５　Ａ／Ｄ変換器
２６　制御・演算部
２７　可変抵抗
ｐ　　アナログ電気信号
ｐｘ　増幅されたアナログ電気信号
ｐｄ　デジタルデータ
ｐｂ　輝度値
２８　記憶装置
２９　ＰＭＴ電源
３１　印加電圧・ゲイン相関部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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