(57)【要約】【課題】より簡便且つ安価にセロビオースを製造する。【解決手段】α−グルカンに、リン酸および／またはα−グルコ−ス−１−リン酸の存在下にて、α−グルカンホスホリラ−ゼ、グルコアミラ−ゼおよびセロビオ−スホスホリラ−ゼを作用させることを特徴とするセロビオースの製造法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−グルカンに、リン酸および／またはα−グルコ−ス−１−リン酸の存在下にて、α−グルカンホスホリラ−ゼ、グルコアミラ−ゼおよびセロビオ−スホスホリラ−ゼを同一反応系にて、もしくは順次作用させることを特徴とするセロビオ−スの製造方法。
【請求項２】
α−グルカンおよび／またはグルコ−スおよび／またはα−グルコ−ス−１−リン酸が、反応系に連続的にまたは断続的に追加される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
α−グルカンがデンプン、デキストリン、マルトオリゴ糖、短鎖アミロ−スの中から単独もしくは組み合わせて選ばれたものである請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
セロビオ−スホスホリラ−ゼの起源がセルビブリオ・ギルバス（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）  、クロストリディウム・サ−モセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリディウム・ステロコラリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）  、サ−モトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、サ−モトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、ルミノコッカス・フラボファシエンス  （Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、フォメス・アノス（Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）  属の微生物の中から選ばれたものである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項４に記載の方法にて製造された、セロビオ−スを含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はセロビオ−スの製造法に関し、詳しくは原料であるα−グルカンにα−グルカンホスホリラ−ゼ（［ＥＣ  ２．４．１．１］）、グルコアミラ−ゼおよびセロビオ−スホスホリラ−ゼを同一反応系にて、もしくは順次作用させることを特徴とするセロビオ−スの製造方法に関する。
また、本発明は前記方法にて製造された、セロビオースを含有する組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セロビオ−スは二分子のグルコ−スがβ−１，４結合したホモ二糖類である。市場において、低粘度・低甘味・低カロリ−の物性を有する素材が嘱望されてきた。セロビオ−スはこれに合致する糖質であり、組み合わせる素材の質感を損なうことなく添加使用することが可能な点において、バルク剤など食品工業分野を中心に利用が期待される。
【０００３】
α−グルカンホスホリラ−ゼは、α−グルカン分子中のα−１，４−グルコシド結合の加リン酸分解を触媒する酵素であり、生成物として分子量が低下したα−グルカンおよびα−グルコ−ス−１−リン酸を生成する。グルコアミラ−ゼは、デンプン分子中の非還元性末端側α−１，４−グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素であり、生成物として分子量が低下したα−グルカンおよびβ−グルコ−スを生成する。セロビオ−スホスホリラ−ゼは、セロビオ−ス分子中のβ−１，４−グルコシド結合の加リン酸分解を触媒する酵素であり、生成物としてグルコ−スおよびα−グルコ−ス−１−リン酸を生成する。このセロビオ−スホスホリラ−ゼが触媒する反応は可逆的であり、グルコシル基受容体の基質特異性の低さを利用し、α−グルコ−ス−１−リン酸と種々の単糖類から、多様なヘテロオリゴ糖が合成されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
セロビオ−スの製造法は、化学的方法と酵素学的方法に大別できる。化学的方法として、セルロ−スの加酢分解によって得られるオクタアセチルセロビオ−スを脱アセチルしてセロビオ−スを得る方法やケ−ニッヒ・クノ−ル反応を利用した合成法が知られている。
【０００５】
一方、酵素学的方法として、セルロ−スにトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属起源、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属起源等の市販セルラ−ゼ製剤を作用させ、セロビオ−スを得る方法が広く知られている。また、セルラ−ゼ以外の酵素を利用する方法として、ショ糖にスクロ−スホスホリラ−ゼ、キシロ−スイソメラ−ゼおよびセロビオ−スホスホリラ−ゼの３酵素を同時に作用させ、一段階反応でセロビオ−スを得る方法（例えば、非特許文献１参照。）やα−グルカンホスホリラ−ゼ・セロビオ−スホスホリラ−ゼ・セロデキストリンホスホリラ−ゼを可溶性デンプンに作用させ、セロオリゴ糖を得る方法（例えば、特許文献２参照。）が知られている。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００１−２０４４８９号公報
【特許文献２】
特開２００１−１１２４９６号公報
【非特許文献１】
北岡本光、外２名、「シュクロースホスホリラーゼ、キシロースイソメラーゼおよびセロビオースホスホリラーゼを用いたシュークロースのセロビオースへの変換」、澱粉科学会誌、１９９２年、３９巻、ｐ．２８１−２８３
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前記化学的方法においては、煩雑な作業工程において大量の有機溶媒を取り扱うとともに、廃液処理が与える環境への負荷が大きく、かつ、セロビオ−スの収率も低いため、安全面・コスト面などにおいて産業的な要望を満たすものではない。前記酵素学的方法のうち、セルラ−ゼ系を利用したセロビオ−ス製造法は、酵素反応の効率化のため、予め基質セルロ−スに物理的・化学的前処理を施さねばならないが、現在のところ、産業的な前処理法は開発されていない。可溶性デンプンからセロデキストリンを得る方法は、反応時に等モルのリン酸を副生するため、反応終了後に除去する必要を生じる。また、この反応中では、α−グルコ−ス−１−リン酸やリン酸のイオン価数の変化（α−グルコ−ス−１−リン酸＝２、リン酸＝３）に起因するｐＨの大幅な低下が見られるため、アルカリなどの添加あるいは高濃度の緩衝液を使用することにより反応液のｐＨを維持する操作等が必要であり、さらには、反応系へグルコ−スおよびα−グルコ−ス−１−リン酸を別途添加する必要があるため、簡便な製造方法とは言い難いものであった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、上記の課題を解決し、より簡便かつ低コストでセロビオ−スを製造する方法を提供することである。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、原料として工業的に有利なα−グルカンを用いることで、原料コストの問題を解決すると同時に、ｐＨを維持する操作等が不要で、かつ、α−グルカンにα−グルカンホスホリラ−ゼ、グルコアミラ−ゼおよびセロビオ−スホスホリラ−ゼを同一反応系にて作用させ、一段階反応でセロビオ−スを製造する方法を開発した。
【０００９】
【発明の実施の形態】
即ち本発明は、α−グルカンに、リン酸および／またはグルコ−ス−１−リン酸の存在下にて、α−グルカンホスホリラ−ゼ、グルコアミラ−ゼおよびセロビオ−スホスホリラ−ゼを同一反応系にて作用させることを特徴とするセロビオ−スの製造方法、好ましくは、α−グルカンがデンプン、デキストリン、マルトオリゴ糖、短鎖アミロ−スの中から単独もしくは組み合わせて選ばれたものである前記方法、最も好ましくは、セロビオ−スホスホリラ−ゼの起源がセルビブリオ・ギルバス（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）  、クロストリディウム・サ−モセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリディウム・ステロコラリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）  、サ−モトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、サ−モトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、ルミノコッカス・フラボファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、フォメス・アノス（Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）  属の微生物の中から選ばれたものである前記方法に関する。
また、本発明は前記方法にて製造された、セロビオ−スを含有する組成物に関する。
【００１０】
本発明の酵素反応で使用する原料α−グルカンとしては、α−１，４−グルコシド結合を主鎖に持つものであれば、遺伝子組み換え生物を含め、その起源に制限はない。本酵素反応に使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、デンプン分子中の分枝部分において加リン酸分解が停止するため、当該反応基質として、直鎖のα−１，４−グルカンであることが望ましいが、同時に使用されるグルコアミラーゼは直鎖部に加え、この分枝部分をも加水分解できるため、基質が直鎖のα−１，４−グルカンである必然性は無い。従って、α−グルカンにα−グルカンホスホリラーゼを作用させるための前処理が不必要となり、簡便性の向上が図られる。具体的には、本反応系における基質には、入手が容易な可溶性デンプンや、デンプンの部分加水分解物など、α−グルカンの１種または２種以上を用いる。デンプン部分加水分解物は主としてマルトデキストリンであり、デンプンを常法により、酸または酵素により加水分解し、必要に応じて分離精製することで得られる。また、イソアミラ−ゼやプルラナ−ゼなどの脱分枝酵素で  α−１，６結合を加水分解した短鎖アミロ−スを例示することもできる。脱分枝酵素の起源にも制限はない。さらに、デンプン部分加水分解物の一部であるマルトオリゴ糖等をα−グルカンの代わりに用いることもできる。マルトオリゴ糖としては、例えば、マルトトリオ−ス、マルトテトラオ−ス、マルトペンタオ−ス、マルトヘキサオ−ス、マルトヘプタオ−スなどを例示することができる。マルトオリゴ糖は高純度の試薬レベルのものであっても、マルトオリゴ糖シラップのように純度の低いものであってもよい。反応液中のデンプン部分加水分解物濃度は、特に制限はない。
【００１１】
本発明の反応系に存在させるリン酸とα−グルコ−ス−１−リン酸は、いずれか一方を用いてもよく、両者を併用してもよいが、好ましくはリン酸を単独で使用する。リン酸としては、任意のものが使用でき、例えばオルトリン酸やリン酸二ナトリウムなどのリン酸塩を単独で、もしくは２種類以上を組み合わせて用いることができる。反応液中のリン酸やグルコ−ス−１−リン酸の濃度は特に限定されるものではないが、通常は０．００１ｍＭ以上１Ｍ以下、好ましくは０．０１ｍＭ以上５００ｍＭ以下、より好ましくは０．１ｍＭ以上２００ｍＭ以下である。
【００１２】
次に、本発明の方法に用いる酵素であるα−グルカンホスホリラ−ゼとしては、いかなる起源のものでも用いることができる。例えば、ウサギ筋肉、ジャガイモ、トウモロコシ、大腸菌をはじめとした微生物などのα−グルカンホスホリラ−ゼが好適である。α−グルカンホスホリラ−ゼの形態は特に限定されるものではなく、精製酵素の他に、粗酵素、酵素含有菌体、固定化酵素、遺伝子組み換え酵素などいかなる形態のものでも用いることができる。α−グルカンホスホリラ−ゼの使用量は特に限定されるものではないが、好ましくは反応液１ｍＬあたり０．０００１単位以上１０００単位以下であり、より好ましくは反応液１ｍＬあたり０．００１単位以上１００単位以下である。なお、α−グルカンホスホリラ−ゼ１単位とは、３０℃、ｐＨ６．８においてグリコ−ゲン、オルトリン酸塩から毎分１μｍｏｌのα−グルコ−ス−１−リン酸を生成する酵素量と定義する。
【００１３】
また、グルコアミラ−ゼについても、いかなる起源のものでも用いることができる。例えば、リゾプス・ニベアス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、リゾプス・ディレマ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などの微生物起源の酵素が好適である。グルコアミラ−ゼの形態は特に限定されるものではなく、精製酵素の他にも、粗酵素、酵素含有菌体、固定化酵素、遺伝子組み換え酵素などいかなる形態のものでも用いることができる。グルコアミラ−ゼの使用量は特に限定されるものではないが、好ましくは反応液１ｍＬあたり０．０００１単位以上１０００単位以下であり、より好ましくは反応液１ｍＬあたり０．００１単位以上１００単位以下である。なお、グルコアミラ−ゼ１単位とは、３０℃、ｐＨ７．０において可溶性デンプンから毎分１μｍｏｌのグルコ−スを生成する酵素量と定義する。
【００１４】
さらに、セロビオ−スホスホリラ−ゼについても、いかなる起源のものでも用いることができる。例えば、セルビブリオ・ギルバス（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ）  、クロストリディウム・サ−モセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリディウム・ステロコラリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ）  、サ−モトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、サ−モトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、ルミノコッカス・フラボファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ）、フォメス・アノス（Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）  属等の微生物起源の酵素が好適であり、特にセルビブリオ・ギルバス、サ−モトガ・マリティマ、クロストリディウム・サ−モセラム起源の当該酵素に関する情報量は豊富であり、また、取り扱いが容易であるため好ましい。セロビオ−スホスホリラ−ゼの形態は特に限定されるものではなく、精製酵素の他に、粗酵素、酵素含有菌体、固定化酵素、遺伝子組み換え酵素などいかなる形態のものでも用いることができる。セロビオ−スホスホリラ−ゼの使用量は特に限定されるものではないが、好ましくは反応液１ｍＬあたり０．０００１単位以上１０００単位以下であり、より好ましくは反応液１ｍＬあたり０．００１単位以上１００単位以下である。なお、セロビオ−スホスホリラ−ゼ１単位とは、３０℃、ｐＨ７．０においてセロビオ−ス、オルトリン酸塩から毎分１μｍｏｌのα−グルコ−ス−１−リン酸を生成する酵素量と定義する。
【００１５】
酵素反応は任意の形態で行うことができるが、通常は純水あるいは緩衝液、例えばトリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、３−（Ｎ−モノホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液等の水溶液中で実施する。
【００１６】
α−グルカン、リン酸および／またはα−グルコ−ス−１−リン酸および酵素は、いかなる方法で反応液に添加しても差し支えないが、通常は酵素以外のものを溶解した反応液に酵素を加えることにより、反応を開始する。当該反応液を酵素が失活しない程度の温度範囲に維持し、反応を行う。反応温度は、著しく酵素活性が低下しない限り特に限定されないが、通常０℃以上１００℃以下、好ましくは１０℃以上９０℃以下である。また、反応液のｐＨについても酵素が失活しない範囲内であればよく、特に反応中に制御する必要はなく、通常ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ５〜９の範囲で行う。
【００１７】
反応時間についても特に限定されないが、目的とするセロビオ−スの収率等が最大になったところで終了すればよく、通常は１分〜数百時間の範囲でα−グルカンの濃度および酵素濃度を考慮して適宜決定すればよい。反応終了後、セロビオ−スを遠心分離や濾過など既知の方法により物理的に分離することができる。また、必要に応じてセロビオ−スをクロマトグラフィ−など既知の方法により分離することができる。この際、反応液中に残存しているα−グルカンが分離の障害となる場合は、あらかじめ適宜の分解酵素を用いて分解する。例えば反応液にα−アミラ−ゼの他に、イソアミラ−ゼやプルラナ−ゼなどの脱分枝酵素を加えることで、未反応のα−グルカンをグルコ−スにまで分解することができる。この液からグルコ−スをクロマト分離など既知の方法により、またはより簡便にはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属などに属する酵母により消化させることで低グルコ−ス濃度の、あるいはグルコ−スを含まない溶液を得ることができる。得られた溶液は次の酵素反応の酵素溶液として使用可能である。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００１９】
実施例１〜３に共通な反応条件は以下のとおりである。
５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中に、最終濃度が１３．１ｍｇ／ｍＬの原料α−グルカン、４６ｍＭのリン酸二水素カリウム、α−グルカンホスホリラ−ゼ（ウサギ筋肉起源精製酵素；シグマアルドリッチ社製）、グルコアミラ−ゼ（リゾプス属起源；和光純薬工業製）、セロビオ−スホスホリラ−ゼ（セルビブリオ・ギルバス起源精製酵素）および安定化剤として２．０ｍｇ／ｍＬの牛血清アルブミンを添加し、水浴中にて３７℃下、４８時間反応させた。反応終了後、反応液を適宜希釈・脱塩後、高速液体クロマトグラフィ−を用い、そのピ−ク面積からセロビオ−ス濃度を定量した。
【００２０】
（実施例１）
α−グルカンに可溶性デンプン（和光純薬工業（株）製）を用い、０．９４単位／ｍＬのα−グルカンホスホリラ−ゼ、０．４８単位／ｍＬのグルコアミラ−ゼおよび０．１３単位／ｍＬのセロビオ−スホスホリラ−ゼを加えて反応液を調製した。その結果、セロビオ−ス収率は３４．２％であった。
【００２１】
（実施例２）
α−グルカンにデキストリン（松谷化学工業（株）製；パインデックス＃２）を用い、０．９４単位／ｍＬのα−グルカンホスホリラ−ゼ、０．３６単位／ｍＬのグルコアミラ−ゼおよび０．１３単位／ｍＬのセロビオ−スホスホリラ−ゼを加えて反応液を調製した。その結果、セロビオ−ス収率は３５．６％であった。
【００２２】
（実施例３）
α−グルカンにワキシ−コ−ンスタ−チ（和光純薬工業（株）製）を用い、０．７１単位／ｍＬのα−グルカンホスホリラ−ゼ、０．４８単位／ｍＬのグルコアミラ−ゼおよび０．１３単位／ｍＬのセロビオ−スホスホリラ−ゼを加えて反応液を調製した。その結果、セロビオ−ス収率は４０．８％であった。
【００２３】
いずれの反応系においても、反応液のｐＨの著しい低下は起こらず、反応の初発ｐＨを維持することができた。
【００２４】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、工業的に有利な原料であるα−グルカンから、セロビオ−スを一段階で製造することが可能となった。さらに、反応工程中において特別な操作を行わなくても、使用する３種の酵素に至適なｐＨを維持することができるなど簡便性の点でも優れている。