(57)【要約】【課題】造血幹細胞または前駆細胞を胎盤または臍帯から取得されるストローマ細胞を用いて、インビトロ培養で、簡便かつ安全に大量に増幅する方法を提供する。【解決手段】ヒト造血幹細胞または前駆細胞を、ヒト胎盤組織または臍帯組織由来のストローマ細胞の共存下で培養してヒト造血幹細胞または前駆細胞を増幅する方法。この培養は、Ｆｌｔ‐３リガンド、ＴＰＯ及びＳＣＦ等のサイトカインの存在下で行うことが望ましい。造血幹細胞を約１０日間共培養することにより、ソースとして用いた造血幹細胞と同一の特性を有する多分化能を有する造血幹細胞を大量に得ることができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト造血幹及び／または前駆細胞を、ヒト胎盤組織または臍帯組織由来のストローマ細胞の共存下で培養することを特徴とする、ヒト造血幹及び／または前駆細胞の増幅方法。
【請求項２】
ヒト造血幹及び／または前駆細胞が、ヒト臍帯血、骨髄、肝臓、脾臓又は末梢血に由来する造血幹及び／または前駆細胞である請求項１に記載の増幅方法。
【請求項３】
ヒト造血幹及び／または前駆細胞が、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹及び／または前駆細胞である請求項１または２に記載の増幅方法。
【請求項４】
ヒト造血幹及び／または前駆細胞と、ヒト胎盤組織または臍帯組織のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項５】
ヒト造血幹及び／または前駆細胞の培養を、サイトカインの存在下で行うことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項６】
サイトカインが、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、可溶性インターロイキン‐６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）、インターロイキン‐６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）からなる群から選ばれる１種または２種以上のサイトカインであることを特徴とする請求項５に記載の増幅方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載の増幅方法により増幅されたヒト造血幹及び／または前駆細胞。
【請求項８】
請求項７に記載のヒト造血幹及び／または前駆細胞をヒトに移植する細胞治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの胎盤組織および臍帯組織由来の造血支持能を有する細胞を用いることを特徴とする、ＣＤ３４陽性細胞を含むヒト造血幹および前駆細胞を増幅する方法に関する。さらに詳しくは、ヒト胎盤および臍帯組織由来の造血支持細胞と、該ヒト造血幹及び／または前駆細胞との共存下、各種サイトカイン含有若しくは非含有栄養培地中で、該造血幹及び／または前駆細胞を増殖させる方法、該増幅方法によって得られたヒト造血幹及び／または前駆細胞、及び該造血幹及び／または前駆細胞を用いた細胞治療法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中には、生体機能を司る血球細胞として酸素運搬に関わる赤血球系、血小板を産生する巨核球系、感染防御に関わる顆粒球、単球及び／またはマクロファージなどの骨髄球系、免疫を担当するＴ細胞・Ｂ細胞などのリンパ球系の各細胞系列がある。血球細胞のいずれの細胞も、共通の起源である造血幹細胞より分化・成熟することにより、一生を通じて維持、産生されている。造血幹細胞は、リンパ球、赤血球、血小板等の機能細胞に分化し得る多能性と、そのような多能性を維持したまま自己増殖する能力（自己複製能）を兼ね備えており、造血制御機構によって造血幹細胞が枯渇しないように自己複製を行うと共に、各種血球細胞に分化・成熟していく。これまでの多くの研究から、造血幹細胞が各種血球細胞へ分化する過程は多段階の分化決定によって各血球系列への分化が方向づけられている。
【０００３】
造血幹細胞は、まず骨髄球系及びリンパ球系の２系列へ方向づけられ、それぞれ骨髄系幹細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）及びリンパ球系幹細胞へ分化し、さらに骨髄系幹細胞は赤血球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、ＣＦＵ−Ｅを経て赤血球に、巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＣ−ＭＥＧ）を経て好中球に、好酸球コロニー形成細胞（ＥＯ−ＣＦＣ）を経て好酸球に、顆粒球・マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）を経て単球・好中球・好塩基球になり、またリンパ球系幹細胞はＴ前駆細胞を経てＴ細胞に、Ｂ前駆細胞を経てＢ細胞になる。骨髄系幹細胞及びこれから派生する各種前駆細胞の特定方法については、各種サイトカインの存在下における半固形培地中でできるコロニーの性状によってこれらの細胞を特定するいわゆるコロニー形成法が知られている。この方法によって、骨髄系幹細胞である顆粒球・赤血球系・単球系・巨核球系コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）及び前駆細胞である顆粒球・マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤血球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＭＥＧ）、好酸球コロニー形成細胞（ＥＯ−ＣＦＣ）等の骨髄系の前駆細胞を特定することが可能である（非特許文献１）。
【０００４】
ヒトにおいて、生体外でコロニーを形成する前駆細胞が、細胞表面抗原であるＣＤ３４分子を発現している細胞集団に濃縮されることから（非特許文献２）、Ｂｅｒｅｎｓｏｎらは血球細胞死滅処理したがん患者へＣＤ３４陽性細胞の移植を試みたところ造血系の再構築が認められ、造血能を有する造血幹細胞はＣＤ３４陽性細胞の集団に含まれることが臨床的にも認められるようになった（非特許文献３）。一方、造血幹細胞は、主として骨髄、臍帯血などに存在し、さらに末梢血中にも存在することが明らかにされている（非特許文献４）。多くの研究者が造血幹細胞の実体を明らかにするために均一の細胞として生体から分離する試みが行われているものの、現在もなお成功していない。造血幹細胞には、放射線照射によって造血幹細胞を含む血球細胞を完全に死滅させた個体に移植したときに、その個体で産生されるべきすべての血球細胞系列を再び構築できる“造血再構築能”をもつことが必須の条件であるといわれている。
【０００５】
造血再構築能を有する造血幹細胞は、骨髄移植治療をおこなうことによって、一生涯にわたり各種血球細胞を産生する造血幹細胞を提供者（ドナー）から受容者（レシピエント）の骨髄に定着させ、血液に関連する各種疾患を根治できるのではないかと考えられた。初期には実験的治療法であったものの、現在では確立された治療法となった。現在では、急性白血病をはじめとする腫瘍性血液疾患や、重症免疫不全、アデノシンデアミナーゼ欠損症、再生不良性貧血等の疾患に対し、骨髄移植治療が施されている。さらに、これら造血幹細胞が少量ながら末梢血にも存在することが明らかになるにつれ、顆粒球―コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）製剤を投与して造血幹細胞を含む末梢血を用いた移植も普及しつつある（非特許文献５，６）。この方法は、骨髄移植が大量の骨髄細胞を必要とするためドナーの心身への負担が大きいのに対して、ドナーに対して心身への負担が軽減され、また白血球や血小板の回復が早いという利点がある。
【０００６】
また最近になって、臍帯血が骨髄と同程度の造血幹細胞を含むことが明らかにされ、移植治療に有用であることが明らかにされた（非特許文献７）。臍帯血は、骨髄や末梢血と比べて重症の急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生率が低く、その有用性が期待されている。しかしながら臍帯血の場合、採取量の少なさが問題とされ、１個体に由来する臍帯血では体重４０ｋｇ程度までのレシピエントにのみ移植可能であると考えられている（非特許文献４）。骨髄移植においては、ドナー由来のＴ細胞の混入によるＧＶＨＤの発症や、自己移植の際のがん細胞の混入による再発が問題となっている（非特許文献８）。
【０００７】
一方、造血幹細胞は、上述したようにＣＤ３４陽性の細胞集団として濃縮することができるため、不要な細胞を除去できる可能性があることから、今日ではＣＤ３４陽性幹細胞移植が行われるようになっている（非特許文献３，９）。このような進歩にともなって、移植治療の確実性を高め、より効率的な実施を行うべく、数多くのドナーに由来する造血幹細胞バンクの整備が急務となりつつある（非特許文献１０）。同時に、このような造血幹細胞を効率的に増幅する試みも行われている（非特許文献４）。また、幼弱な造血幹細胞を多く含む臍帯血についても同様に移植応用への期待が高まっているものの、前述のとおり採取量が少ないことから、造血幹細胞を増幅するシステムが期待されている（非特許文献４）。
このように造血幹細胞を安定かつ確実に入手できるシステムの構築は、移植以外に治療法のない前記難治性血液疾患の患者にとっては生命に関わる問題であり、社会的にも重要な果たすべき課題であるといえる。
【０００８】
造血幹細胞およびこれら造血幹細胞から派生する各種前駆細胞は、ＣＤ３４陽性細胞集団に含まれていることが明らかにされているため、分離、濃縮するのに好適であり、増幅のための出発材料として利用されている（非特許文献４）。これらＣＤ３４陽性細胞は、骨髄や臍帯血の血液細胞中に１〜２％存在している。ＣＤ３４陽性細胞の分離は、細胞表面のＣＤ３４分子を認識する抗体と反応性を有する陽性細胞を回収することが基本原理である。ＣＤ３４抗体をビオチンや磁気ビーズで標識し、分離したい細胞群と反応させ、その後それぞれアビジンビーズや磁石でＣＤ３４陽性細胞を回収する方法や、ＣＤ３４抗体をコートした培養器具に細胞を入れ、ＣＤ３４抗体と反応しない細胞を除去した後、ＣＤ３４陽性細胞を回収する方法がよく使用されており、いずれの方法であっても質的には差のないＣＤ３４陽性細胞が回収できる（非特許文献１１，１２）。臨床では、磁気標識したＣＤ３４抗体と磁石を利用した機器が開発され、日本でも医薬審議会において希少疾患治療器具として認定されている。
【０００９】
ＣＤ３４陽性細胞の増幅は、一般に液体培養にて行われるが、個々の造血幹細胞や前駆細胞に対する特異的増殖因子が明らかになっていないために、それぞれの血球細胞に作用する各種サイトカインの組み合わせが用いられており、これまでに多くの報告がなされている（非特許文献１３）。サイトカインの組み合わせによるＣＤ３４陽性細胞の増幅では、培養後の全血球細胞数は増加するものの、培養中に分化誘導が促進され、結果的に最終分化した血球細胞が増加する一方、増幅の源となったＣＤ３４陽性細胞自体はほとんど枯渇されてしまう傾向があることが知られている（非特許文献４）。これまでに報告されたＣＤ３４陽性細胞の増幅においては、前駆細胞であるＣＦＵ−ＧＭの増幅が指標にされていることが多い。
【００１０】
例えばＨａｙｌｏｃｋらは、末梢血ＣＤ３４陽性細胞をインターロイキン１β（ＩＬ−１β）、およびＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦの存在下で１４日培養して、ＣＦＵ−ＧＭを２０−６０倍に増幅したと報告している（非特許文献１４）。またＣＤ３４陽性細胞をＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で７日間培養してＣＦＵ−ＧＭを５７倍増幅したとの報告もある（非特許文献１５）。また骨髄系幹細胞であるＣＦＵ−ＧＥＭＭの増幅の報告もされており、Ｂｒａｇｇｅｒらは末梢血ＣＤ３４陽性細胞をＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、ＥＰＯで１２日間培養し、ＣＦＵ−ＧＥＭＭを２５０倍に増幅した（非特許文献１６）。またＳＣＦおよびＩＬ−６、ｓＩＬ−６Ｒでの培養によってもＣＦＵ−ＧＥＭＭの増幅は可能との報告もある（特許文献１）。
【００１１】
以上の報告では、特定の細胞系列への方向づけが既に決定された前駆細胞であるＣＦＵ−ＧＭや、造血幹細胞ではあるものの既に分化がおきた骨髄系幹細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）を対象としているため、造血再構築能を有する造血幹細胞の増幅とは言い難いものであった。そのため、ＣＦＵ−ＧＥＭＭよりも造血幹細胞により近い細胞の同定法として、長期培養を可能にさせる細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）を検出する評価法を用いた解析が試みられたが、ごくわずか増幅するか維持されるだけで、ＣＦＵ−ＧＭのように著しい増幅は認められなかった（非特許文献１６，１７）。
【００１２】
一方、ＣＤ３４陽性細胞の増幅方法として、ヒト骨髄由来のストローマ細胞を株化し、この細胞を支持体として造血幹細胞・前駆細胞の維持・増殖させる方法が試みられている（非特許文献１８）。また、ストローマ細胞を異種動物由来たとえばマウス由来の細胞ＨＥＳＳ−５を用いた方法も試みられている  （非特許文献１９，特許文献２）。ストローマ細胞は、造血幹細胞の維持に重要な役割を果たすと考えられているが、実際の造血幹細胞との相互作用はよく理解されていない。杉浦らは、ストローマ細胞と造血幹細胞との相互作用に着目して研究した結果、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）、すなわちヒトでいうＨＬＡの一致が重要であり、不一致な場合よりも良いことを明らかにしている（非特許文献２０）。
【００１３】
また、ストローマ細胞に異種動物由来細胞を用いる場合には、増殖後にレシピエントの生体内で免疫反応が起こる危険性があるため、ストローマ細胞とＣＤ３４陽性細胞を完全に分離して、ＣＤ３４陽性細胞のみを移植しなければならない。さらには異種動物由来の未知の病原体があった場合、その存在を確認することはできないという問題点がある。この点に関連して厚生労働省は、異種移植に伴う感染症問題に関する指針を、２００２年７月９日、各都道府県に通知している。同指針は、異種移植のリスクとして、ブタ内在性のレトロウイルスがヒトに感染するなど、異種移植により未知の感染症が誘発される危険性が指摘されたことを受け作成している。異種動物由来のストローマを用いた造血細胞の増幅方法においても、従来ヒトに感染しなかったウイルスなどの病原体が培養することによって、あるいは直接ヒトに移植されることにより、感染性を獲得する器具も指摘されており、臨床応用にあたっては慎重な検討が必要である（非特許文献２１）。
【００１４】
特許文献３には、ある種のストローマ細胞と白血病阻害因子（ＬＩＦ）を必須のサイトカインとして用い、その他の数種のサイトカインとの共存下でのＣＤ３４陽性細胞の増殖が認められる旨の記載がある。しかしながら、培養期間が数週間と長期であり、臨床で使用して行くには困難であると考えられている。
【００１５】
近年、ヒト造血幹細胞の骨髄再構築能を実験的に検証する手段として、糖尿病マウスと免疫不全マウスを掛け合わせて作られたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにヒトの造血幹細胞が定着して、長期にわたってヒト細胞が産生されることが明らかとなり、この手法により骨髄再構築能を有する造血幹細胞の存在を調べる方法が見出されようになった（非特許文献２２）。この方法により測定される細胞は、ＳＣＩＤ−ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  （ＳＲＣ）と呼ばれ、現時点で測定可能なヒト造血幹細胞に、最も近い細胞と考えられており、ＳＲＣをいかに増幅できるかが、最近の造血幹細胞の増幅研究の焦点となっている。
【００１６】
造血幹細胞の増幅システムの構築は、前述のように多数の課題がある。また、移植以外に治療法のない前記難治性血液疾患の患者にとっては生命に関わる問題であり、社会的にも重要な果たすべき課題であるといえる。また、簡便に安定してさらに効率良く増幅可能な方法が望まれており、このようなシステムが移植等の臨床上での使用に有用であろうと考えられる。
【００１７】
【特許文献１】
国際公開第９６／１５２３０号パンフレット
【特許文献２】
特開平１０−２９５３６９号公報
【特許文献３】
特開平７−５０４３３１７号公報
【００１８】
【非特許文献１】
Ｌｕ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．，  １１，  ７２１−９，  １９８３
【非特許文献２】
Ｅｍａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｂｌｏｏｄ，  ７５，  １９４１−６，  １９９０
【非特許文献３】
Ｂｅｒｅｎｓｏｎ，  Ｒ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｂｌｏｏｄ，  ７７，  １７１７−２２，  １９９１
【非特許文献４】
Ｅｍｅｒｓｏｎ，  Ｓ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｂｌｏｏｄ，  ８７，  ３０８２−８，  １９９６
【非特許文献５】
Ｔａｋａｕｅ，  Ｙ．；  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．，  ２，  ５１３−８，  １９９３
【非特許文献６】
Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｎ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｌａｎｃｅｔ，  ３４１，  １４８２，  １９９３
【非特許文献７】
Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．．Ｍｅｄ．，  ３３５，  １５７−６６，  １９９６
【非特許文献８】
Ｂｒｅｎｎｅｒ，  Ｍ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｌａｎｃｅｔ，  ３４１，  ８５−６，  １９９３
【非特許文献９】
Ｓｈｐａｌｌ，  Ｅ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １２，  ２８−３６，  １９９４
【非特許文献１０】
Ｂｅｒｅｎｓｏｎ，  Ｒ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  Ｐｒｏｃ．，  ２４，  ３０３２−４，  １９９２
【非特許文献１１】
Ｉｓｈｉｚａｗａ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．，  ２，  ３３３−８，  １９９３
【００１９】
【非特許文献１２】
Ｃａｓｓｅｌ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，  ２１，  ５８５−９１，  １９９３
【非特許文献１３】
Ｅｍｅｒｓｏｎ，  Ｓ．Ｇ．  ；  Ｂｌｏｏｄ，  ８７，  ３０８２−８，  １９９６
【非特許文献１４】
Ｈａｙｌｏｃｋ，  Ｄ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｂｌｏｏｄ，  ８０，  １４０５−１２，  １９９２
【非特許文献１５】
Ｓａｔｏ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｂｌｏｏｄ，  ８２，  ３６００−９，  １９９３
【非特許文献１６】
Ｂｒａｇｇｅｒ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｂｌｏｏｄ，  ８１，  ２５７９−８４，  １９９３
【非特許文献１７】
Ｈｅｎｓｃｈｌｅｒ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｂｌｏｏｄ，  ８４，  ２８９８−９０３，  １９９４
【非特許文献１８】
Ａｉｚａｗａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，  ２２，  ４８２−７，  １９９４
【非特許文献１９】
Ｋａｗａｄａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．，  ５，  ９０４−１５，  １９９９
【非特許文献２０】
Ｓｕｇｉｕｒａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  ；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  １５，  ４６１−８，  １９９７
【非特許文献２１】
中畑龍俊；臨床病理レビュー，  １２２，  １０２−９，  ２００２
【非特許文献２２】
Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ２，  １３２９−３７，  １９９６
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べてきたように、造血再構築能を有する造血幹細胞をはじめとするＣＤ３４陽性細胞の増幅は、増幅を行う過程でおこる分化をいかに抑制してＣＤ３４陽性細胞自体の増殖をいかに可能にするかが大きな課題となっている。また生体外で簡便に、かつできる限り短い培養期間で、安定して増幅できる培養法の開発が待たれていた。本発明は、胎盤組織および臍帯組織由来のストローマ細胞を、ヒトＣＤ３４陽性細胞の増幅に応用したものである。胎盤または臍帯由来のストローマ細胞がＣＤ３４陽性細胞を含めたヒトの造血幹細胞にいかなる作用を及ぼすのかという効果に関しては、これまでに知見がなく、本発明において初めて明らかになった。
すなわち、本発明は、ヒト造血幹及び／または前駆細胞の分化を抑制して短時間に安定して増幅する方法を提供しようとするものである。さらに、本発明は、このような増幅方法によって増幅されたヒト造血幹及び／または前駆細胞、及びこの細胞を用いる細胞治療方法を提供しようとするものである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞を、ヒト胎盤組織または臍帯組織由来のストローマ様細胞との共存下において顕著に増殖させることができ、必要に応じて栄養培地中にサイトカインを混合させることで、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞及びＳＲＣを増殖させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２２】
即ち、本発明によればヒト造血幹細胞は、従来ストローマ細胞として用いてきたマウス由来細胞やヒト骨髄由来のストローマ細胞よりも、胎盤組織または臍帯組織由来のストローマ細胞の共存下においてより顕著に増幅することができる。また、必要に応じて１種または２種以上のサイトカインを栄養培地中に混合させることにより、造血幹細胞はさらに自己複製させることができる。
また、造血幹細胞より若干分化段階の進んだ造血前駆細胞群についても同様に増殖を誘導する。
【００２３】
さらに本発明によれば、臍帯血由来の造血幹細胞を増幅する際に、同一の胎盤から単離したヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ，  ＨＬＡ）が適合したストローマ細胞を用いれば、増幅後もストローマ細胞を分離する必要がなく、極めて容易に増殖した細胞を採取することができ、直接増殖させた細胞を輸注することができるという利点がある。なお、ＣＤ３４陽性細胞としてはこれらの細胞に特に限定される訳ではなく、ＣＤ３４陽性率が弱いものから強い細胞が広範囲で含まれていることが好ましい。また、場合によってはＣＤ３４陽性ではない細胞群であっても、造血幹細胞としての性質、すなわち従来の技術の項で説明したような分化能と自己複製能を兼ね備えた細胞であれば、本発明による造血幹細胞の範疇に入るものと見なすことができる。また純粋な血液細胞のみならずこのような細胞を含む組織であってもよい。
【００２４】
すなわち、本発明は以下の内容から構成される。
（１）    ヒト造血幹及び／または前駆細胞を、ヒト胎盤組織または臍帯組織由来のストローマ細胞の共存下で培養することを特徴とする、ヒト造血幹及び／または前駆細胞の増幅方法。
（２）    ヒト造血幹及び／または前駆細胞が、ヒト臍帯血、骨髄、肝臓、脾臓又は末梢血に由来する造血幹及び／または前駆細胞である前記（１）に記載の増幅方法。
（３）    ヒト造血幹及び／または前駆細胞が、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹及び／または前駆細胞である前記（１）または（２）に記載の増幅方法。
（４）    ヒト造血幹及び／または前駆細胞と、ヒト胎盤組織または臍帯組織のＨＬＡが適合することを特徴とする前記（１）乃至（３）のいずれかに記載の増幅方法。
【００２５】
（５）    ヒト造血幹及び／または前駆細胞の培養を、サイトカインの存在下で行うことを特徴とする前記（１）乃至（４）のいずれかに記載の増幅方法。
（６）    サイトカインが、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、可溶性インターロイキン―６受容体  （ｓＩＬ−６Ｒ）、インターロイキン―６  （ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）からなる群から選ばれる１種または２種以上のサイトカインであることを特徴とする前記（５）に記載の増幅方法。
【００２６】
（７）    前記（１）乃至（６）のいずれかに記載の増幅方法により増幅されたヒト造血幹及び／または前駆細胞。
（８）    前記（７）に記載のヒト造血幹及び／または前駆細胞をヒトに移植する細胞治療方法。
【００２７】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明に用いられる造血幹細胞とは、あらゆる種類の血球に分化する能力を有するとともに造血再構築能を有する細胞であり、主に骨髄、臍帯血、脾臓あるいは肝臓中に存在し、微量ながら末梢血にも存在する。幹細胞とは、造血幹細胞及びこれから分化したリンパ球系幹細胞、骨髄系幹細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）を意味する。これらの細胞はＣＤ３４陽性細胞である。
【００２８】
前駆細胞とは、造血幹細胞から各系統の血液細胞が分化形態学的には同定できないがすでに赤血球系など一方向の血液細胞にしか分化し得ない細胞を意味する。具体的には血小板コロニー形成細胞（ＣＦＣ−ＭＥＧ）、好酸球コロニー形成細胞（ＥＯ−ＣＦＣ）、顆粒球単球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤血球形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ）、Ｔ前駆細胞、Ｂ前駆細胞などである。これらはいずれもＣＤ３４陽性細胞である。組織とは、特定方向に分化し、同一の機能、形態をもつ細胞集団をいう。
【００２９】
ＣＤ３４陽性細胞とは、抗原表現型の一つであるＣＤ３４を発現している細胞を意味し、具体的には造血幹細胞、ＨＰＰ−ＣＦＣ等の造血幹細胞、リンパ球系幹細胞、骨髄系幹細胞等の幹細胞、Ｔ前駆細胞、Ｂ前駆細胞、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＭＥＧ、ＥＯ−ＣＦＣ、ＣＦＵ−ＧＭ等の前駆細胞がこれに該当する。
【００３０】
ストローマ細胞とは、従来、骨髄、脾臓などに由来する基質細胞または間質細胞を指してきたが、本発明においては、ヒトのＣＤ３４陽性細胞を増殖する能力を有するストローマ細胞として胎盤または臍帯組織由来の細胞を用いることができる。
【００３１】
栄養培地とは、天然培地、半合成培地、合成培地、固形培地、半固形培地、液体培地などが挙げられるが、前述に定義されるＣＤ３４陽性細胞を、自己を含めた増殖、分化、成熟または保存させるために用いられるものであり、通常、細胞培養に用いられるようなものであれば如何なる培地であってもよい。例を挙げると、α−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ基本培地、または無血清培養用の培地で既に臨床試験にも用いられているＸ−ＶＩＶＯ１０やＸ−ＶＩＶＯ１５  （Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社）などを用いることができる。
基本成分としてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有することもできる。
【００３２】
サイトカインとは、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子で、免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖・分化の調節作用などを示す物質であって、具体的にはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７，  ＩＬ−１８インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＦＬ（ＦＩＴ‐３リガンド）、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、ＴＰＯ（トロンボポエチン）などが挙げられ、好ましくはＦＬ、ＳＣＦ、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯまたはＴＰＯなどが挙げられる。
【００３３】
コロニーとは、固型培地で１個の細胞から出発してできた可視的な集塊をいう。
【００３４】
分化とは、ここではＣＤによって表される表面抗原分子が変化して、次の段階の細胞になることをいう。具体的には幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）からリンパ系幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）または骨髄系幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ３３＋）のように分化抗原の表原型が変化することをいい、リンパ系幹細胞からＴ前駆細胞またはＢ前駆細胞、骨髄系幹細胞からＢＦＵ−Ｃ、ＣＦＣ−ＭＥＧ、ＥＯ−ＣＦＣまたはＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−ＥからＣＦＵ−Ｅ、Ｔ前駆細胞からＴ細胞、Ｂ前駆細胞からＢ細胞、ＣＦＵ−Ｅから赤血球、ＣＦＣ−ＭＥＧから血小板、ＥＯ−ＣＦＣから好酸化球、ＣＦＵ−ＧＭから単球や好中球または好塩基球になることをいう。
【００３５】
本発明における細胞培養とは、常法に従って、例えば下記のように実施することができる。すなわち培養容器中で、必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有したα−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＭＥＭ基本培地などの栄養培地中あるいはＸ−ＶＩＶＯ１０やＸ−ＶＩＶＯ１５などの培地中に、ストローマ細胞の存在下、必要に応じて５ｎｇ／ｍｌ乃至２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ乃至１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７，  ＩＬ−１８，  ＩＦＮ−α，  ＩＦＮ−β，  ＩＦＮ−γ，  Ｇ−ＣＳＦ，  ＧＭ−ＣＳＦ，  ＳＣＦ，  ＦＬ，  ＥＰＯ，  ＴＰＯなどのサイトカイン  の存在下、ＣＤ３４陽性細胞を播種し、３０℃乃至４０℃、好ましくは３７℃で培養できる。培養期間は、数時間レベルの短期間のものから、おおよそ１年間にわたって行うような長期間のものまでを挙げることができる。長期間の場合は、定期的な培地交換を行い、温度、湿度、二酸化炭素濃度等をモニタリングして培養維持することにより、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞を増殖させることが可能である。
【００３６】
本発明による細胞培養に用いる培養容器には、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる素材・形状のものを用いてもよい。例えば、支持台の素材としては具体的にはガラス、合成樹脂、天然樹脂または金属などが挙げられる。培養容器はまた、ストローマ細胞が維持・生存でき、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる素材、形状のものを用いてもよい。具体的には培養容器の素材としてはガラス、不織布を含む合成樹脂や天然樹脂、または金属などが挙げられ、形状としては具体的には三角柱、立方体、直方体などの多角柱、三角錐、四角錐などの多角錘、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円形、楕円形、半円形などが挙げられる。培養は開放条件下であってもよいし、閉鎖（密閉）条件下であってもよい。
【００３７】
培養液（培地）については、ストローマ細胞が維持・生存でき、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる培養液（培地）を用いることができる。培養するにあたり、温度、浸透圧、光などの物理的環境条件、酸素、炭酸ガス、ｐＨ、酸化還元電位などの化学的環境条件としてはストローマ細胞が維持・生存でき、ＣＤ３４陽性細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる環境条件であってもよい。温度については具体的には、３０℃乃至４０℃であり、好ましくは３７℃である。
【００３８】
浸透圧については、具体的には生理条件における浸透圧であり、好ましくは生理食塩水と等しい浸透圧である。光としては暗室ほどの暗い条件であってもよいし、晴天時の外の明るさほどに明るくてもよい。酸素濃度としては具体的には培養系が気相中の酸素濃度が１０％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度乃至気相中の酸素濃度が３０％の気相と接触している状態での酸素濃度であってもよく、好ましくは気相中の酸素濃度が２０％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度の気相と接触している状態での酸素濃度である。培養系において一般的にｐＨをコントロールするためのｐＨとして具体的にはｐＨ６．０乃至ｐＨ８．０であり、好ましくは生理条件と同等のｐＨである。ｐＨをコントロールする為には二酸化炭素を用いてもよいし、他のいかなる緩衝液を用いてもよい。炭酸ガスの濃度としては具体的には培養系が５％の気相と接触している状態での溶存炭酸ガス濃度である。
【００３９】
さらに、培養容器中の培地（培養液）には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素などの無機物、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、サイトカイン、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有することもできる。ストローマ細胞、哺乳動物から採取したＣＤ３４陽性細胞（好ましくはヒト由来のＣＤ３４陽性細胞）または培養し増殖したＣＤ３４陽性細胞を保存（長期間も含む）する場合、通常の方法を用いることができる。保存の方法としては例えば凍結保存法が挙げられ、この場合必要に応じてグリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、蔗糖、グルコース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの凍結防御剤を加え、プログラムフリーザーなどを用い緩速凍結を行い、その後液体窒素などの中に保存すればよい。
【００４０】
これまでＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞を移植するにあたっては、増殖に用いた第２の細胞、具体的にはストローマ細胞が、従来の異種動物由来である場合あるいは同種の動物の場合であっても別の個体や株化した細胞を用いる場合には増殖後のレシピエントの生体内で免疫反応が起こる可能性があるため、ストローマ細胞とＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞を分離し、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞のみを移植に用いることが必要とされてきた。しかしながら、本発明による培養による増幅法を用いれば、ストローマ細胞とＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞が両者ともヒト由来であり、互いの細胞の分離・精製に必要がなくなり、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞の移植が素早くしかも安全に行うことができる。さらに同一の組織すなわち胎盤組織から採取したストローマ細胞と臍帯血を用いた培養を行う場合は、ＨＬＡが一致した条件となるため、より効率よく造血幹細胞および前駆細胞を増幅することができる。
また、本発明による胎盤および臍帯組織由来の造血ストローマ細胞を用いれば、造血幹細胞だけではなく、肝臓、すい臓、および腎臓を構成しうる幹細胞も増殖することができることを発見した。
【００４１】
【発明の実施の形態】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を具体的に説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【００４２】
【実施例１】
ヒト胎盤からの造血ストローマ細胞の分離回収
東京臍帯血バンクにおいて、臍帯血採取後の胎盤を、インフォームドコンセントを得た後入手した。全て３８週から４０週までの正期産で、重量は４２０から６３０ｇ（中央値５５２ｇ）であった。搬送は氷冷にて行い、４８時間以内に細胞採取を開始した。採取は胎盤切片からのｏｕｔｇｒｏｗｔｈを利用したエクスプラント法を用いて行った。すなわち、胎盤から臍帯と羊膜を除去した後、母体側からハサミで組織を採取した。
さらにメスで１ｍｍ角に細切した後、カルシウムおよびマグネシウム不含リン酸緩衝液［ＰＢＳ（−）］で血液を可及的に除いた。このようにして１個の胎盤より２００から３００ｇの胎盤切片が採取できた。これら組織切片を培養皿に張り付け、クリーンベンチ内で１５−３０分間放置した後、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＤＭＥＭ，  ｌｏｗ  ｇｌｕｃｏｓｅ，  Ｓｉｇｍａ）＋１０％ＦＢＳを加え１０日から１４日培養した後回収した。
【００４３】
【実施例２】
ヒト臍帯血からのＣＤ３４陽性細胞の採取及び調製
ヒト臍帯血は、東京臍帯血バンクにおいてに充分なインフォームドコンセントを行なった上で、バンク指定病院より採取されたものを入手した。臍帯血液サンプルは、採取後、４℃に保存し、４８時間内にファイコールパックを用いて単核細胞を回収した。次に、臍帯血単核細胞をＣＤ３４  ｓｅｐａｒｅｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、ＡｕｔｏＭＡＣＳ  （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＣＤ３４陽性細胞を分画した。
【００４４】
【実施例３】
臍帯血ＣＤ３４陽性細胞と胎盤由来造血ストローマ細胞との共培養
実施例２で得られた臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞（５ｘ１０３細胞／ｍｌ）を２４ウェ  ル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各々のウェル中に  １％  ＢＳＡを添加したＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を１ｍｌを加え、さらにサイトカイン（ｒｈ−ＩＬ−６及びＳＣＦ）の存在下において、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で実施例１で得られたヒト胎盤由来造血ストローマ細胞と共培養した。培養１０日後、ピペッティングにより細胞を回収し、遠心分離して培養細胞を採取して増殖能の解析を行った。
【００４５】
【実施例４】
臍帯血ＣＤ３４陽性細胞の増幅能の解析
実施例３の培養細胞の増殖能の解析は以下の手法により行った。すなわち、市販の半固形のＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ  Ｈ４４３４Ｖ  （Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．社製、０．９％Ｉｓｃｏｖｅメチルセルロース、３０％ＦＣＳ、１％ＢＳＡ、１０−４Ｍの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのＬ−グルタミン、３Ｕ／ｍｌエリスロポエチン、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＳＣ  Ｆ、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＬ−６を含有している）培地を用いて、培養後の前記臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を、二次培養として、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で１４日および２１日培養して、培地中に形成されたＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭからなる赤血球系コロニー、ＣＦＵ−ＧＭコロニー及び直径  １．０ｍｍ以上の大きさのＨＰＰ−ＣＦＣコロニーの数を測定し、造血幹細胞及び前駆細胞の数を測定した。ＨＰＰ−ＣＦＣコロニーは、さらに直径１．０−２．５ｍｍの小型ＨＰＰ−ＣＦＣ、直径が２．５ｍｍより大きい大型ＨＰＰ−ＣＦＣとして算定した。
【００４６】
増幅率は、培養前の臍帯血ＣＤ３４陽性細胞の半固形培地中でのコロニー形成数に対する培養細胞のコロニー形成数の割合を百分率で示した。対照として、胎盤細胞と共培養しない臍帯血ＣＤ３４陽性細胞を用いた。
小型および大型ＨＰＰ−ＣＦＣコロニー数の増幅率、ＣＦＵ−ＧＭのコロニー数の増幅率、赤血球系コロニーのコロニー数の増幅率を調べた結果、大型および小型ＨＰＰ−ＣＦＣのコロニー数と、赤血球系コロニー、ＣＦＵ−ＧＭコロニーの増幅率においては、何れにおいても、胎盤由来細胞の存在下での培養細胞の方が、非存在下での培養細胞よりも著しい増幅効果がみられた。
【００４７】
【発明の効果】
従来、臍帯血は採取量が限られているため、４０  ｋｇ以下の個体にしか移植が困難であるなど、実際に臍帯血幹細胞移植が骨髄移植に代わりうる様になるためには解決すべき点は多かった。しかしながら、本発明の方法を用いれば、ヒトＣＤ３４陽性幹細胞を簡便にしかも安全に増幅することが可能であることから、任意の成人患者にも移植できる上に、数回にわたる継続投与が可能となる。臍帯血を一度採取しておけば必要なときに必要な量だけ造血幹細胞を供給することができる。
【００４８】
また本発明によれば、骨髄移植においても大量の骨髄細胞を必要とせず、  しかも骨髄の採取に伴うドナーの心身への負担や安全性の問題などを回避することができる。また、造血幹細胞を自己増殖させることにより、急性白血病をはじめとする腫瘍性疾患や重症免疫不全、先天性酵素異常症、再生不良性貧血などの疾患に対し必要最小限の造血幹細胞の採取で治療できると共に、出産に伴って世界中で廃棄されている臍帯血を有効に活用し、幅の広い移植抗原を有する造血幹細胞を保有することによって移植抗原の適合する移植を可能とするため重症の急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを極めて軽減することができる。
【００４９】
臍帯血幹細胞を保存する場合、本発明を用いれば、効率的な保存が可能であると共に、保存量の大幅な減少につながり、また一度採取した血液を登録しておくことでより効率的な造血幹細胞バンクを構築することができる。
さらに、増殖した細胞を凍結保存などの長期保存を行うことにより、必要なときに必要とされる移植抗原を有するＣＤ  ３４陽性細胞を素早く使用することができる。
さらに本発明によれば、臍帯血由来の造血幹細胞を増幅する際に、同一の胎盤から単離したＨＬＡが適合したストローマ細胞を用いれば、増幅後もストローマ細胞を分離する必要がなく、極めて容易に増殖した細胞を採取することができ、直接増殖させた細胞を輸注することができる。