(57)【要約】【課題】側鎖にマレイミド基を有する高分子化合物を用いて酵素などの生体由来分子を炭素などの基材に固定したバイオセンサを提供する。【解決手段】表面に多数の反応性残基を有する炭素電極の表面をＡＰＴＥＳを用いてアミノ基で修飾し、このアミノ基にポリマレイミドスチレン（ＰＭＳ）の側鎖のマレイミド基の一部と反応させて炭素電極表面をＰＭＳで修飾し、さらに、ＰＭＳの側鎖のマレイミド基の残りを使って酵素を固定化する。【選択図】      図３
2004300328.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表わされる繰り返し単位の少なくとも一部に１級アミノ基、２級アミノ基またはチオール基を有する生体由来分子が付加され、該生体由来分子が付加された繰り返し単位は下記一般式（２）で表わされる機能性高分子化合物。
【化１】
2004300328.tif 000009
【請求項２】
前記生体由来分子は、酵素及び／又は該酵素の電極反応を促進する電子移動メディエータである請求項１記載の機能性高分子化合物。
【請求項３】
基材と、
該基材に物理的または化学的に固定され、側鎖にマレイミド基を有する高分子化合物と、
該高分子化合物の側鎖のマレイミド基の少なくとも一部に化学的に結合された１級アミノ基、２級アミノ基またはチオール基を有する生体由来分子とを具備するバイオセンサ。
【請求項４】
前記生体由来分子は、酵素及び／又は該酵素の電極反応を促進する電子移動メディエータである請求項３記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記基材は、端面に反応性残基を実質的に有する炭素電極である請求項３または４記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記基材は、炭素多孔体である請求項３または４記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、側鎖に酵素、電子移動メディエータなどの生体由来分子を化学的に結合させた機能性高分子、および、それを基材や炭素電極に固定したバイオセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでタンパク表面に存在するリジン残基やカルボキシル基などの官能基の反応性を利用してタンパクを化学結合により固定化する技術が多数開発されてきた。しかし、これまではこれらの官能基と反応する官能基をあらかじめ固定化担体に修飾しなくてはならず、例えばガラスビーズ表面へのアミノアリル基の導入とそのジアゾ化やグルタルアルデヒド修飾などが良く知られているが、いずれもかなりの煩雑さが伴っている。
【０００３】
マレイミドはチオール基と極めて迅速に化学結合することが知られており、従来より、チオール基を酵素や抗体などのタンパクに導入してマレイミドに結合させることが行われている。しかし、これまでタンパク固定に用いられるマレイミドはモノマーや低分子化合物に限られており、マレイミド基を表面に密に有するポリマーを用いたタンパク固定については全く報告がない。
【０００４】
本願の発明者の一人である萩原は１９９１年にＮ−（４−ビニルフェニル）マレイミドモノマーのスチレン基をカチオン重合により重合させて化学反応活性のあるマレイミド基を密にペンダントさせた水に不溶なポリスチレン（ポリマレイミドスチレン：ＰＭＳ）を合成し、その物性について報告した（非特許文献１）。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｔ．  Ｈａｇｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−（４−Ｖｉｎｙ          ｌｐｈｅｎｙｌ）  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ”，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２４  （１９９１），  ｐ６８５６−６８５８
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このＰＭＳをはじめとする、側鎖にマレイミド基を有する高分子化合物に着目し、これを用いた機能性高分子、および、この機能性高分子を利用した酵素センサや機能性電極などのバイオセンサを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の機能性高分子化合物は、下記一般式（１）で表わされる繰り返し単位の少なくとも一部に１級アミノ基、２級アミノ基またはチオール基を有する生体由来分子が付加され、該生体由来分子が付加された繰り返し単位は下記一般式（２）で表わされることを特徴とするものである。
【０００８】
【化２】
2004300328.tif 000003
【０００９】
本発明のバイオセンサは、基材と、該基材に物理的または化学的に固定され、側鎖にマレイミド基を有する高分子化合物と、該高分子化合物の側鎖のマレイミド基の少なくとも一部に化学的に結合された１級アミノ基、２級アミノ基またはチオール基を有する生体由来分子とを具備することを特徴とするものである。
【００１０】
前記生体由来分子は例えば酵素及び／又は該酵素の電極反応を促進する電子移動メディエータである。
【００１１】
前記基材は、例えば端面に反応性残基を実質的に有する炭素電極である。
【００１２】
前記基材は、また例えば炭素多孔体である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、例えばポリマレイミドスチレン（ＰＭＳ）のマレイミド基がチオール基だけでなくリジンとも速やかに結合することができることを実証し、ＰＭＳが酵素の簡便迅速な固定化材料として極めて有用であることを見いだしたことに基づいている。酵素のチオール基およびリジン残基のアミンとポリマーの結合反応式を図１に示す。なお、図には１級アミンとの結合が示されているが、ＰＭＳは２級アミンとも結合する。
【００１４】
本発明によれば、ＰＭＳを被覆したカーボン電極やガス透過性膜を有するセンサを酵素溶液に浸すだけで極めて簡便迅速に酵素センサを作製することができる。さらにＰＭＳとカーボンなどの電極表面への被覆状態の安定性の向上を図るため、図２のようにカーボン電極表面にアミノ基を修飾してＰＭＳと結合させれば長期間ポリマーが脱離することなく使用できる。
【００１５】
この場合に、電極材料として、高分子樹脂に黒鉛を混合し、黒鉛の結晶を一方向に配向させつつ成形した後、焼成して得られるＰＦＣ（Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｆｏｒｍｅｄ  Ｃａｒｂｏｎ）は、端面に多数の反応性残基が存在するので、アミノ基による修飾に適する。図３にＰＦＣ電極表面をＡＰＴＥＳ（γ−アミノプロピルトリエトキシシラン）を用いてアミノ基で修飾し、次いでＰＭＳで修飾し、さらに酵素で修飾する過程を示す。
【００１６】
ＰＭＳはクロロホルムなどの極性のある有機溶媒に溶けて均一溶液となる。そこでＰＭＳの均一溶液を用いてＰＭＳを被覆させた多孔性膜を作製すればこの膜をタンパク溶液に浸すだけで酵素や抗体が固定でき、各種電極やセンサデバイスに装着することによって酵素反応や抗原抗体反応に関与する反応物や生成物を検出する方式のセンサが作製できる。
【００１７】
【実施例】
１．前駆体ポリマーの合成
（実施例１）
前述の非特許文献１の記載に従い、Ｎ−（ｐ−ビニルフェニル）マレイミド（ＶＰＭＩ）＝２．５×１０−２  ｍｏｌ／Ｌ、ＢＦ３  ・Ｏ（Ｃ２Ｈ５）２  ＝１．０×１０−２  ｍｏｌ／Ｌの濃度で窒素下、フラスコにてジクロロメタン中、０℃で１２時間重合を行った。
【００１８】
重合はメタノールを加えて停止し、その後大量のメタノール中に投入して、沈澱したポリマーを回収した。その後ジクロロメタンに再度溶解、メタノールに再沈澱することによりポリマーを精製し、ろ過後減圧乾燥にてポリマーを単離した。
【００１９】
収率：５６％、
数平均分子量＝１．０×１０５
数平均分子量はＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィ）にて単分散ポリスチレンを用いた検量線により測定した。
【００２０】
ＮＭＲにて構造を解析した。  １Ｈ  ＮＭＲ：ＶＰＭＩに観測された、６．８ｐｐｍ  のビニレン基の吸収（２Ｈ）は線幅が広がるものの化学シフトおよび吸収強度に変化なく、５．３，５．８、および６．７ｐｐｍ  のビニル基の吸収は消失、新たに１．４−２．５ｐｐｍ  にポリマー主鎖のメチン、メチレンの吸収（３Ｈ）が観測された。
【００２１】
以上からポリマレイミドスチレン（ＰＭＳ）が合成されたと確認した。
（実施例２）
下式（３）の構造を有するｐ−マレイミドスチレンオキシド（ＭＩＳＯ）を次のようにして合成した。
【００２２】
還流冷却器を付けた２００ｍｌ二口フラスコにクロロホルム２０ｍｌに溶解させた５．５ｍｍｏｌ（１．０２ｇ）のｐ−マレイミドスチレンを入れ、そこへクロロホルム３０ｍｌに溶解させた８．８ｍｍｏｌ（１．５１ｇ）のｍ−クロロ安息香酸を室温で２．５時間かけて滴下した。滴下終了後、加熱しクロロホルム還流下反応させた。反応はガスクロマトグラフィーで追跡し、原料のｐ−マレイミドスチレンが完全に反応しガスクロマトグラフィー上ピークが観測されなくなるまで反応を行った。その後２０％亜硫酸ナトリウム水溶液、１０％炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて後処理し、溶媒のクロロホルムを除去することにより、淡黄色の固体として生成物であるｐ−マレイミドスチレンオキシドを得た。収量２９６ｍｇ、収率２４．９％。
【００２３】
１Ｈ  ＮＭＲ：２．７，３．０ｐｐｍ  （ｄ，１Ｈ，ｄ，１Ｈ、エポキシ環内のメチレン水素）、３．８ｐｐｍ  （ｄ−ｄ，１Ｈ  エポキシ環内のメチレン水素）、６．８ｐｐｍ  （ｓ，２Ｈ  イミド環内のビニレン水素）、７．２５〜７．３４ｐｐｍ  （ｍ，４Ｈ，ｐ−ジ置換フェニル）。
【００２４】
【化３】
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【００２５】
１０ｍｌのジクロロメタンにＭＩＳＯ  ２１５ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、ＢＦ３  ・Ｏ（Ｃ２  Ｈ５  ）２  ５．６８ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）を入れ、−１０℃で２４時間反応させた。反応はメタノールにて停止し、大量のメタノール中に投入してポリマーを沈澱させ単離した。得られたポリマーは下図のような構造のｐｏｌｙ（ＭＩＳＯ）であった。
【００２６】
【化４】
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【００２７】
収量１５０ｍｇ、収率６９．８％。
【００２８】
１Ｈ  ＮＭＲ：２．７，３．０ｐｐｍ  （ｄ，１Ｈ，ｄ，１Ｈ、エポキシ環内のメチレン水素）及び、３．８ｐｐｍ  （ｄ−ｄ，１Ｈ  エポキシ環内のメチン水素）が消失。かわって、３．７〜４．２ｐｐｍ  にポリマー主鎖のオキシエチレン（３Ｈ）に由来するピークを観察した。６．８ｐｐｍ  （ｓ，２Ｈ  イミド環内のビニレン水素）、７．２〜７．４ｐｐｍ  （ｍ，４Ｈ，ｐ−ジ置換フェニル）の吸収は変化なく観測された。
２．機能性高分子合成とキャラクタリゼーション
（実施例３）
実施例１にて合成したポリマレイミドスチレン０．２ｇ（マレイミドユニット１．０×１０−３ｍｏｌ  ）を５０ｍｌのクロロホルムに溶解させたポリマー溶液と、Ｌ−システイン１．２ｇ（１．０×１０−２ｍｏｌ  ）を純水１００ｍｌに溶解させた溶液を分液ロートにて１０分間振盪した。水層と有機層の境界面に白色のレイヤーが出現し、それを回収、純水およびクロロホルムにて３回洗浄後乾燥し、目的物を単離した。
（実施例４）
実施例１にて合成したポリマレイミドスチレン０．２ｇ（マレイミドユニット１．０×１０−３ｍｏｌ  ）を５０ｍｌのクロロホルムに溶解させたポリマー溶液と、Ｌ−リジン１．５ｇ（１．０×１０−２ｍｏｌ  ）を純水１００ｍｌに溶解させた溶液を分液ロートにて１０分間振盪した。水層と有機層の境界面に白色のレイヤーが出現し、それを回収、純水およびクロロホルムにて３回洗浄後乾燥し、目的物を単離した。
（実施例５）
実施例１にて合成したポリマレイミドスチレン０．２ｇ（マレイミドユニット１．０×１０−３ｍｏｌ  ）を５０ｍｌのクロロホルムに溶解させたポリマー溶液にカーボンフェルトに浸し引き上げ乾燥させた。そのポリマー被覆カーボンフェルトを１ｇ／Ｌのウレアーゼ水溶液に１０分間浸漬後引き上げ、十分に純水にて洗浄した後、さらに純水中で超音波を照射、洗浄することにより物理的な吸着物を全て洗い流すことによりカーボンフェルト上に目的物を生成させた。
（実施例６）
実施例３にて合成した目的物をＮＭＲとＩＲにてキャラクタリゼーションした。
【００２９】
１Ｈ  ＮＭＲ：６．８ｐｐｍ  に観測されたビニレン基の吸収は消失し、３．５−４．５ｐｐｍ  に新たにスクシンイミド環内のメチレンおよび硫黄原子に隣接したメチン水素が観測され、システイン由来の吸収もそれぞれ観測された。また主鎖のメチン、メチレンの吸収もそれぞれ観測された。
【００３０】
ＩＲ：２７００〜３５００ｃｍ−１および３４００ｃｍ−１付近にそれぞれアミノ酸のカルボキシル基とアミノ基の吸収が観測された。前駆体ポリマーであるポリマレイミドスチレンに存在した１６７８ｃｍ−１のビニレン基の二重結合由来の吸収はシステインのメルカプト基が二重結合に反応し、共有結合にて付加するため観測されなかった。
【００３１】
また、ニンヒドリン反応に対しても陽性であった。
【００３２】
従って、得られた物質は下式（５）の構造を有すると結論できる。
【００３３】
【化５】
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【００３４】
（実施例７）
実施例４にて得られた高分子化合物も実施例３と同様な解析により、スクシンイミド環にリジンのアミノ基が付加共有結合を形成した下式（６）の構造を有する化合物であることが明かとなった。
【００３５】
【化６】
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【００３６】
（実施例８）
実施例５にて得られた高分子化合物については、物理的吸着を排除した後の生成物がニンヒドリン反応に対して明白な陽性を示すことに加え、実施例６および実施例７でアミノ酸のメルカプト基またはアミノ基が前駆体ポリマー（ポリマレイミドスチレン）のマレイミド基の二重結合に付加しスクシンイミド環に共有結合することが明らかになっていることおよびウレアーゼはタンパク質すなわちポリアミノ酸であることを考慮すると、ウレアーゼの有するメルカプト基および／またはアミノ基がマレイミドの二重結合と反応し、スクシンイミド環にウレアーゼが共有結合して、下式（７）の構造をした高分子化合物が生成したことは明白である。
【００３７】
【化７】
2004300328.tif 000008
【００３８】
（実施例９）
同様な方法にて、実施例２で合成したｐｏｌｙ（ＭＩＳＯ）のクロロホルム溶液とＬ−システインの水溶液または、ウレアーゼ水溶液を分液ロート中で振盪することにより機能性高分子化合物を合成した。生体由来分子がマレイミド環のビニレン基に付加反応し、スクシンイミド環の構造を有するポリマーが生成したことは、実施例６，７と同様な方法にて確かめた。
３．ＰＦＣ電極の作製
（実施例１０）
塩素化塩化ビニル樹脂（日本カーバイド社製Ｔ−７４１）３０部、フラン樹脂（日立化成社製ヒタフランＶＦ−３０２）４５部、の混合樹脂系を用い、これに黒鉛微粉末（日本黒鉛社製ＳＰ−３００Ｓ平均粒度２μｍ）２５部を複合した組成物１００部に対し、可塑剤としてジアリルフタレートモノマー２０部を添加して、ヘンシェル・ミキサーを用いて分散した後、表面温度を１２０℃に保ったミキシング用二本ロールを用いて十分に混練を繰り返してシート状組成物を得、ペレタイザーによってペレット化し成形用組成物を得た。このペレットをスクリュー型押出機で直径３．６ｍｍのダイスを用い脱気を行いつつ１３０℃で３ｍ／秒の速度で押し出し、これを枠に固定して、１８０℃に加熱されたエアー・オーブン中で１０時間処理してプリ・カーサー（炭素前駆体）線材とした。次に、これを窒素ガス中で５００℃までを１０℃／ｈ、５００℃から１０００℃迄を５０℃／ｈの昇温速度で昇温し、その後１５００℃迄を１００℃／時で昇温し、１５００℃で３時間保持した後自然冷却することで断面部直径３ｍｍの円柱状カーボン電極を得た。
【００３９】
得られたカーボン電極の細孔直径を、湯浅アイオニクス社製ポロシメーター（オートスキャン−６０）を用いて水銀圧入法により測定した結果、最大細孔直径は１２０オングストロームであった。電極特性としては、柳本製ポーラログラフィクアナライザー（ＹＡＮＡＣＯ  Ｐ−１１００）を使用し、電極反応活性の目安として５×１０−３Ｍ  Ｆｅ（ＣＮ）６４−  と１Ｍ  ＫＣｌ系中でのフェロ／フェリシアンイオンのレドックス反応性を観察した結果、特別な前処理を施さなくてもブランク電流は小さく、シャープな酸化波、還元波のピークが得られ、ピーク電位の差ΔＥｐは理論値に近似した。又、電解液の侵入に伴なう電流値の増加は見られず、実質的にガラス状炭素並の電解液不浸透性を示した。
４．炭素多孔体の作製
（実施例１１）
フラン樹脂初期縮合物（日立化成社製  ヒタフランＶＦ−３０２）７５部に、乾留ピッチ（呉羽化学工業社製  ＫＨ−１Ｐ）５部、平均粒径１μｍの天然鱗状黒鉛微粉末（日本黒鉛社製  ＣＳＳＰ−Ｂ）２０部を加え、ミキサーで混合して液状組成物を調製した。次いで、三次元網目構造を有し気孔率６０％のポリウレタンフォームに上記液状組成物を含浸させた。余剰の液状組成物を取り除いた後１００℃乾燥機中で３時間かけ硬化反応させた。次に、１８０℃乾燥機中で１０時間かけ炭素前駆体化処理を行なった。この前駆体処理物を、窒素ガス中で５００℃迄を２０℃／ｈの昇温速度で昇温し、その後１０００℃迄を１００℃／ｈで昇温し、１０００℃で３時間保持した後自然冷却して炭素多孔体を得た。
５．ポリマレイミドスチレンを酵素固定化担体とするポテンショメトリックバイオセンサ
（実施例１２）
アンモニア検出型ウレアーゼ固定化尿素センサ
クロロホルムに溶解したポリマレイミドポリスチレン（ＰＭＳ）溶液をアンモニア電極のアンモニアガス透過性膜上に浸して乾燥させた後、ウレアーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ  ｆｒｏｍ  Ｊａｃｋｂｅａｎ）に３０分浸漬し、ウレアーゼを結合させた。そして０．０１Ｍジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）溶液に３０分浸して酵素を活性化させた。ウレアーゼは酵素活性の発現にＳＨ基が不可欠なＳＨ酵素として良く知られており、固定化段階で一部ＳＨ基が酸化されてジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成して失活している酵素分子があり、Ｓ−Ｓ結合切断試薬であるジチオスレイトールを加えて酵素活性を再生させた。この酵素修飾アンモニアガス透過性膜を装着したアンモニア電極の構造を図４に示す。このセンサをｐＨ８の０．１Ｍリン酸緩衝液に入れてバックグランド電位が安定した後尿素を加えたところ、尿素濃度に応じた電位変化が生じた。尿素が加水分解されてアンモニアと炭酸ガスを生じる反応は（８）式に示す通りである。
【００４０】
尿素  ＋  Ｈ２  Ｏ  →  ２ＮＨ３    ＋  ＣＯ２        （８）
試料添加から２０分程度で電位応答が定常値となったが、この応答速度はＰＭＳの膜圧によって大きく変化する。センサ作製してから３日後に得られた検量線を図５に示す。検量線の傾きは５５ｍＶ／ｄｅｃａｄｅとほぼネルンスト応答を示した。また毎日検量線の作成実験を行ったところ１週間後に３０％の応答減少が生じた。これは主としてポリマーの隔膜からの離脱が関係しているものと考えられるので担体表面へのアミンの導入などを行ってポリマーの強固な担体への固定を行う必要がある。
【００４１】
またウレアーゼは表面にＳＨ基を有することが知られており、ウレアーゼのチオール基の炭素電極における酸化で活性が失われることを本願発明者の内山らは見いだしている（Ｓ．  Ｕｃｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｕｒｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｆｅｌｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ”，  Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ  ２００２，  １４  ｐｐ．１６４４−１６４７）。さらにウレアーゼを金網に吸着固定させたところ、活性を保持した状態で金に結合することがわかり、またシステインとほぼ同じ電極酸化波を有することから、ウレアーゼ自身のＳＨ基がマレイミドと反応して固定化されたものと考えられる。なぜならＳＨ基とマレイミドの反応速度の方がリジン残基とマレイミドのそれより極めて大きいことが知られているからである。さらに水晶振動子センサを用いて金表面にウレアーゼが直接結合あるいは強い吸着をすることを確認している。従って、ウレアーゼのように酵素表面にチオール基を有するタンパクは自身のチオール基で結合させることができるが、これまで天然のタンパク分子の表面のチオール基を用いて固定化したとの報告は見受けられない。
（実施例１３）
二酸化炭素検出型ウレアーゼ固定化尿素センサ
クロロホルムに溶解したポリマレイミドスチレン（ＰＭＳ）溶液にカーボンフェルトを浸して乾燥された後ウレアーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に３０分浸漬し、ウレアーゼを結合させた。そして炭酸ガス電極のガス透過性膜上に装着し、二酸化炭素検出型尿素センサを作製した。このセンサも上述のアンモニア電極を検出電極とするセンサと同様に電位応答が得られた。検量線の傾きが４０ｍＶ／ｄｅｃａｄｅと小さかったが、応答時間が５〜１０分程度と迅速であった。なお、このセンサの応答は作成してから３０日後に約５０％の減少が見られたもののアンモニアガスの隔膜上に被覆させた時よりもより安定であった。これはポリマー鎖とカーボンフェルト表面の親和力の方がポリマー鎖とガス透過性膜のそれより強いことに起因していると考えられる。
（実施例１４）
アデノシンデイミナーゼ固定アデノシンセンサ
カーボンペーパーを１ｍｇ／ｍｌのポリマーのクロロホルム溶液１ｍｌに浸し、乾燥させ、ポリマー被覆カーボンペーパーを作製した。次にアデノシンデイミナーゼ溶液（ｐＨ７のリン酸緩衝液）に３０分浸けた後水洗し、アンモニアガス透過性膜上に装着した。この電極を緩衝液中に入れ、電位が安定した後、アデノシン溶液を段階的に加えて電位応答を記録した。検量線の傾きは約４０ｍＶ／ｄｅｃａｄｅ応答時間は２０分程度であった（図６）。アデノシンデイミナーゼも迅速にＰＭＳと結合するので表面に存在するＳＨ基とポリマーが結合したものと考えられる。アデノシンの酵素による加水分解反応は（９）式の通りである。なおセンサ応答は３週間ほとんど低下しなかった。
【００４２】
アデノシン  ＋  Ｈ２  Ｏ  →  イノシン  ＋  ＮＨ３      （９）
６．ポリマレイミドスチレンに電子移動メディエータを固定した機能性電極
（実施例１５）
ドーパミン結合ＰＭＳ修飾ＰＦＣ（Ｐｌａｓｔｉｃ  ｆｏｒｍｅｄ  ｃａｒｂｏｎ）電極によるアスコルビン酸の電極酸化触媒波の測定
１ｍｇ／ｍｌのＰＭＳクロロホルム溶液中にＰＦＣ電極を浸して乾燥させ、ＰＭＳを被覆した後、０．０１Ｍドーパミン溶液（ｐＨ９．０リン酸緩衝液）に３０分浸してドーパミンの側鎖のアミノ基をマレイミドに固定化させた。このドーパミン固定化電極を用いて０．１ｍＭアスコルビン酸溶液（ｐＨ７．０）のサイクリックボルタンメトリーを行ったところ、アスコルビン酸の電極酸化メディエータ電流が観察された。全くＰＭＳ処理をしていないＰＦＣ電極では溶液に浸されている電極面積が大きいので大きな容量性電流があらわれているのに対し、ＰＭＳ被覆電極では小さな容量性電流となった。しかし、アスコルビン酸の電解酸化電流が前置波として現れた。この前置波は固定化されたドーパミンが電解酸化されて生成するドーパミンキノンがアスコルビン酸に還元再生されることにより発生したものである。固定化反応を図７に示す。
７．ＰＦＣ電極に被覆したＰＭＳを酵素固定層とするアンペロメトリック酵素センサ
（実施例１６）
ＰＦＣ電極を研磨しエッジ面をろ出させた後、ＰＭＳ塩化メチレン溶液をディップコーティングした。その後チロシナーゼ（ポリフェノールオキシダーゼ）（０．２５ｍｇ／ｍｌ）溶液（ｐＨ６．５リン酸緩衝液）と反応させ、チロシナーゼを固定化した。これを作用極として銀塩化銀電極を参照極、白金線を対極として−０．０５Ｖで定電位アンペロメトリーを行った。電解液には０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．５  １０ｍｌを用い、撹拌子により溶液を一定測度で撹拌しながら、測定対象となるチロシナーゼ基質の標準液を所定量添加した。本センサではチロシナーゼ触媒反応によりカテコール化合物またはフェノール化合物から生じたｏ−キノン化合物をＰＦＣ電極で電解還元再生することにより図８に示すような循環反応が生じ、カテコールまたはフェノール化合物などのチロシナーゼ基質を高感度に測定することができる。この応答は迅速であり、５〜１０秒程度で定常値に達した。また図３を参照して説明したように、あらかじめＡＰＴＥＳ処理によりＰＦＣ電極にアミノ基を導入後ＭＰＳを被覆すると、測定感度が増大するとともに、連続測定に対する安定性が向上した。図９にＡＰＴＥＳ処理をしない場合とした場合のカテコールの検量線を示す。
【００４３】
測定可能なフェノール化合物の例としては、フェノール、クロロフェノール、アミノフェノール、クレゾールなどが挙げられ、測定可能なカテコール化合物の例としては、カテコール、ドーパミン、Ｌ−ドーパ、アドレナリン、カフェイン酸などが挙げられる。
【００４４】
また、上記チロシナーゼ基質を一定量添加し定常電流値が得られたところでＣＮ−  ，Ｎ３−  ，ＳＣＮ−  、安息香酸、コウジ酸、アトラジンなどの酵素阻害剤を加えることで、その阻害電流から各種阻害剤の測定も可能であった。
【００４５】
ＰＦＣに酵素のチロシナーゼと同様にチオニンなどのチオール基、１級アミノ基、２級アミノ基を有する電子移動メディエータを同時に固定化することも可能であり、これにより、感度の向上を達成することができた。
（実施例１７）
実施例１６と同様にＰＦＣ電極にＰＭＳをコーティングした後、さらに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１ｍｇ／ｍｌ）とチオニン（０．１ｍＭ）の混合溶液に浸し酵素およびチオニンを固定化した。この応答は、電子メディエーターをＰＭＳに同時に固定することにより著しく向上した。
【００４６】
図１０に示すように、過酸化水素とペルオキシダーゼの反応（１）で生じた２種の酸化型ペルオキシダーゼ中間体は、電子メディエータ（フェノチアジン・フェノオキサジン系電子メディエータ）により順次還元され（２）酵素が再生される。−０．２Ｖ（ｖｓ．Ａｇ．ＡｇＣｌ）で、電子メディエータの還元電流（３）を検出した。
【００４７】
ペルオキシダーゼとチオニンまたはトルイジンブルーを同時にＰＭＳに固定化すると、上記反応スキームにより過酸化水素濃度に依存した定常電流応答を得ることができた。ＰＭＳの膜厚により若干応答速度は異なるが、過酸化水素に対する応答時間は１０秒以内と迅速である。
【００４８】
また、メルドラブルー、メチレンブルーはＰＦＣ電極に強く吸着するため、ＰＦＣにあらかじめこれらを吸着させた後、ＰＭＳを被覆し、ＨＲＰを固定しても同様にセンサを構築できた。電子メディエータを用いず、ＨＲＰのみを固定化しても酸素中間体と電極間の直接電子移動反応に基づく電流応答が得られたが、感度は、メディエーターを同時固定した場合の１／１００程度であった。
８．多孔性カーボン電極に被覆したＰＭＳを酵素固定層とするフロー型バイオセンサ
（実施例１８）
炭素多孔体や多孔性カーボンフェルト（ＣＦ）をフロー型検出器の作用極として用いることで実施例１６〜１７の反応はすべて、図１１に示すようなフロー型バイオセンサに応用可能である。この場合にも炭素多孔体および多孔性ＣＦをＰＭＳで被覆した。さらにチロシナーゼおよびＨＲＰを固定化し、それぞれカテコール（またはフェノール）センサ、過酸化水素センサを構築した。またアミノ基を有するチオニンをＰＭＳに酵素と同時に固定化することで感度の著しい増加が得られた。特にチロシナーゼ・チオニン系ではｐ−クロロフェノールに対して１０ｎＭまで計測可能であった（図１２、図１３）。ＡＰＴＥＳ処理による感度増幅および再現性の向上も認められた（図１４）。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＭＳとチオール基またはアミノ基を有する酵素との結合反応を示す図である。
【図２】炭素電極表面に修飾したアミノ基とＰＭＳとの結合を示す図である。
【図３】ＡＰＴＥＳを用いた炭素表面のアミノ基による修飾、そのＰＭＳによる修飾、さらにＰＭＳ−酵素による修飾の過程を示す図である。
【図４】酵素で修飾されたアンモニアガス透過膜を装着したアンモニア電極を示す図である。
【図５】図４のセンサにおける、透過膜に固定化されたウレアーゼによる尿素の検量線を示すグラフである。
【図６】図４のセンサにおける、透過膜に固定化されたアデノシンデイミナーゼによるアデノシンの検量線を示すグラフである。
【図７】電子移動メディエータとしてのドーパミンのＰＭＳへの固定化反応を示す図である。
【図８】ＰＭＳによりＰＦＣ電極に固定化されたチロシナーゼによる循環反応を示す図である。
【図９】ＰＦＣ電極をアミノ基で修飾した場合と修飾しない場合の測定感度を示すグラフである。
【図１０】ＨＲＰとチオニンの循環反応による過酸化水素の検出の反応を示す図である。
【図１１】フロー型バイオセンサの構成を示す図である。
【図１２】図１１のセンサにおけるｐ−クロロフェノールの測定結果を示すグラフである。
【図１３】図１２の結果に基づくｐ−クロロフェノールの検量線を示すグラフである。
【図１４】ＡＰＴＥＳ処理による感度増幅および再現性の向上を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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