(57)【要約】      （修正有）【課題】従来知られている選択的ＤＮＡメチルトランスフェレースを用いた場合、不活化が完全に行いうるか否かは明確ではなかったため、選択的ＤＮＡメチルトランスフェレースのみでは、十分な遺伝子発現制御は行い得なかった。そこで、想定される遺伝子ユニットの不活化を完全に行いうる新規ＤＮＡメチルトランスフェレースを提供する。【解決手段】上記課題を解決するため、新規ＤＮＡメチルトランスフェレース、すなわちＮｔＤＲＭ１と称するＤＮＡメチルトランスフェレースを提供する。また、ＮｔＤＲＭ１をコードする全塩基配列および当該ＮｔＤＲＭ１のアミノ酸配列を図７に示す。【選択図】  図７
2004222581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ鎖中のシトシンを、当該シトシンに隣接する塩基の種類の如何にかかわらず、メチル化する能力を有するＤＮＡメチルトランスフェレース。
【請求項２】
基質としてのＤＮＡに対するＤＮＡメチルトランスフェレースのモル比に依存して、メチル化の効率が変化する、請求項１記載のＤＮＡメチルトランスフェレース。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する、請求項１または２記載のＤＮＡメチルトランスフェレース：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；
2004222581.tif 000013
2004222581.tif 000014
（ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１または２記載のＤＮＡメチルトランスフェレース：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
2004222581.tif 000015
2004222581.tif 000016
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡメチルトランスフェレースをコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡメチルトランスフェレースおよびこれをコードするＤＮＡ、特に基質ＤＮＡ中のシトシンをメチル化する新規ＤＮＡメチルトランスフェレース（ＮｔＤＲＭ１：  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１）およびこれをコードするＤＮＡに関する。当該酵素は、遺伝子の機能解析や、遺伝子の異常発現、発現制御異常による病変の制御などを可能にするものである。
【従来の技術】
【０００２】
ＤＮＡのメチル化は、ＤＮＡの主な修飾であり、広く生物界で見られる。近年、遺伝子の発現制御機構の解明が進み、ＤＮＡの塩基がメチル化されることにより、原核生物においては自己ゲノムの認識と保護に機能し、真核生物では自己ゲノムの発現調節、外来ＤＮＡの不活性化などに関与しているものと考えられている。多様な生物において、ゲノムに関して重要な修飾反応を担うＤＮＡメチルトランスフェレースが見出され、その作用の解明が行われている。
【０００３】
本明細書における「メチル化」とは、ＤＮＡの構成塩基、特にシトシンにメチル基を導入する反応を意味する。ＤＮＡメチル化は複製後反応であり、ＤＮＡメチルトランスフェレースは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）をメチル基供与体として、ＤＮＡへメチル基を転移させる触媒である。
【０００４】
メチル化により、原核生物ではアデニンの６位の窒素に、真核生物では特定のＣＧ（Ｃ：シトシン、Ｇ：グアニン）配列のシトシンの５位の炭素に、メチル基が導入される。高等生物のＤＮＡは、アデニン、チミン、シトシン、グアニンの４塩基から構成され、微量塩基として５−メチルシトシンを含んでいる。５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）は、動物および植物にわたる真核生物のＤＮＡ中に共通して存在する修飾塩基である。その含有率は、種によって異なり、例えば哺乳類では全塩基の１％、植物では７％にも及ぶ。このＤＮＡのシトシンのメチル化は、ＤＮＡの複製後、メチル基がシトシンに転移することによって生じるが、その転移反応を触媒するのがＤＮＡメチルトランスフェレースである。
【０００５】
この酵素の作用として、これまでに（１）遺伝子発現の調節（Ｆｉｎｎｅｇａｎ，  Ｅ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｋ．Ａ．  Ｋｏｖａｃ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４３，  １８９−２０１）、（２）自己ＤＮＡの保護、（３）修復（エピジェネティクス）の標識（Ｔｏｍｐａ，  Ｒ．，  ＭａＣａｌｌｕｍ，  Ｃ．Ｍ．，  Ｄｅｌｒｏｗ，  Ｊ．，  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｊ．Ｇ．，  ｖａｎ  Ｓｔｅｅｎｓｅｌ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｓ．  （２００２）  Ｃｕｒ．  Ｂｉｏｌ．  １２，  ６５−６８）、（４）遺伝的刷り込み（ゲノミックインプリンティング）、（５）変異のスポットなどが考えられてきた。当該酵素の触媒ドメインはＣ末端領域に存在し、生物種を超えて高度に保存されている。一方、Ｎ末端側の領域は、ファミリー間での保存度が低く、各酵素の特異的な機能に関わる調節領域と考えられている。
【０００６】
ＤＮＡメチルトランスフェレースの活性には２種類あり、メチル化されていないＤＮＡを新たにメチル化する活性をデ・ノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）型（両鎖がメチル化される）、片鎖のみメチル化（ヘミメチル化）されたＤＮＡに対する活性をメインテナンス（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）型と呼ぶ。
【０００７】
動物には、異なる活性を持つメインテナンス型とデ・ノボ型の２種類のＤＮＡメチルトランスフェレース、例えばＤｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ａおよび３ｂなどがある。Ｄｎｍｔ１は最初に単離されたＤＮＡメチルトランスフェレースで（Ｂｅｓｔｏｒ，  Ｔ．，  Ｌａｕｄａｎｏ，  Ａ．，  Ｍａｔｔａｌｉａｎｏ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｖ．  Ｉｎｇｒａｍ．  （１９８８）Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０３：  ９７１−９８３）、ＣｐＧ配列のメインテナンス型活性を持つ（Ｙｏｄｅｒ，  Ｊ．Ａ．，  Ｗａｌｓｈ，  Ｃ．Ｐ．，  ａｎｄ  Ｂｅｓｔｏｒ，  Ｔ．Ｈ．（１９９７）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １３，  ３３５−３４０）。細胞内で細胞周期のＳ期にＤＮＡ複製複合体に結合し、ＤＮＡ複製後に新生鎖のＣｐＧ配列をメチル化し、メチル化パターンを維持するとされる（Ｃｈｕａｎｇ，  Ｌ．Ｓ．−Ｈ．，  Ｉａｎ，  Ｈ−Ｌ，  Ｋｏｈ，  Ｔ−Ｗ．，  Ｎｇ，  Ｈ−Ｈ．，  Ｘｕ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｂ．Ｆ．Ｌ．  Ｌｉ．  （１９９７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２７７：  １９９６−２０００）。Ｄｎｍｔ３ａ、３ｂはメチル化されていないＤＮＡに対する活性を示すデ・ノボ型酵素であり（Ｏｋａｎｏ，  Ｍ．，  Ｘｉｅ，  ＳＰ．，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｌｉ．  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  １９，  ２１９−２２０）、胚発生過程でメチル化パターンの創成を行うとされる（Ｏｋａｎｏ，  Ｍ．，  Ｂｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．，  Ｈａｂｅｒ，  Ｄ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｌｉ．  （１９９９）  Ｃｅｌｌ．  ９９（３）：  ２４７−５７）。
【０００８】
メチル化パターンは、組織、細胞によって異なる。また発生過程、疾病により大きく変化する（Ｂｅｓｔｏｒ，  Ｔ．  （２０００）  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０３：  ９７１−９８３）。動物では、メチル化パターンは、一世代ごとに消去された後、新たに作られる（Ｊａｅｎｉｓｈ  （１９９７）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １３（８）：  ３２３−３２９）。その機構は、受精卵においてＤｎｍｔ１活性が抑制されるため（Ｃａｒｄｏｓｏ，  Ｍ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｌｅｐｎｈａｒｄｔ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４７：  ２５−３２）、細胞分裂時にメチル化維持が行われず、卵及び精子由来のゲノムのメチル化は胚盤胞期までに失われる（Ｊａｅｎｉｓｈ  （１９９７）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １３（８）：３２３−３２９）。このようにして一旦メチル化パターンが消去され、着床後は、細胞の分化とともにメチル化レベルが上昇し、形態形成の完了までにメチル化パターンが再形成される。
【０００９】
一方、植物においてもいくつかのＤＮＡメチルトランスフェレースの存在が知られ、その作用の解明が進められているが、すべて隣接する塩基を選択してメチル化を行う選択的ＤＮＡメチルトランスフェレースである。
【００１０】
植物ＤＮＡのメチル化は、対称ＣｐＧおよびＣｐＮｐＧ、また非対称ＣｐＮｐＮ配列に位置するシトシン残基で起きる（Ｆｉｎｎｅｇａｎ，  Ｅ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｋ．Ａ．  Ｋｏｖａｃ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４３：  １８９−２０１）。標的配列に関するそのような様々なメチル化の生物学的意義は、明らかでなかったが、細胞特異的メチル化パターンを確立するためには、非対称シトシンの選択的メチル化が、特に重要であることは指摘されていた。
【００１１】
半保存的ＤＮＡ複製後、ＣｐＧおよびＣｐＮｐＧでのメチル化は、通常、メインテナンス型ＤＮＡメチルトランスフェレースによって維持される。主に、親のＤＮＡと同じメチル化パターンを与える。対照的に、ＣｐＮｐＮでのメチル化は一過性であり、デ・ノボ型メチルトランスフェレースが存在していない場合、ＤＮＡ複製後喪失する。これは、環境状況に応じた自身のメチル化パターンを確立するための個々の細胞への好機となる。即ち、細胞が持つメチル化パターンを維持するためにはメインテナンス型のメチル化活性が必要であるが、環境適応、細胞分化や癌細胞の増殖などによる細胞特異的メチル化パターンを変化させるためにはデ・ノボ型活性が重要な意義を持つ。
【００１２】
植物のＤＮＡメチルトランスフェレースには３種類ある。全ゲノム配列が決定されたアラピドプシスのＤＮＡメチルトランスフェレース遺伝子は、アミノ酸の一次配列から３種類（ＭＥＴ１、ＣＭＴ、ＤＲＭ）に分類され（Ｆｉｎｎｅｇａｎ，  Ｅ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｋ．Ａ．  Ｋｏｖａｃ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４３：  １８９−２０１）、それぞれＤＮＡ中の異なったシトシンを標的にする。第一には、動物のメインテナンス型メチルトランスフェレースＤｎｍｔ１と高い相同性を示すＭＥＴ１ファミリーである（Ｆｉｎｎｅｇａｎ，  Ｅ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｅ．Ｓ．  Ｄｅｎｎｉｓ．  （１９９３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１（１０）：  ２３８３−２３８８）。ＭＥＴ１は、ＤＮＡが複製される時に、新しくコピーされた娘鎖を親鎖と同じようにメチル化するメインテナンス型と考えられている（Ｆｉｎｎｅｇａｎ，  Ｅ．Ｊ．，  Ｐｅａｃｏｃｋ，  Ｗ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｄｅｎｎｉｓ，  Ｅ．  Ｓ．  （１９９６）  Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３，  ８４４９−８４５４；Ｒｏｎｅｍｕｓ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｇａｌｂｉａｔｉ，  Ｍ．，  Ｔｉｃｋｎｏｒ，  Ｃ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ，  Ｓ．Ｌ．  （１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３，  ６５４−６５７；Ｎａｋａｎｏ，  Ｙ．，  Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｎ．，  Ｋｕｓａｎｏ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｓａｎｏ，  Ｈ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４１，  ４４８−４５７）。第二には、植物に特有とされるクロモメチラーゼ（ｃｈｒｏｍｏｍｅｔｈｙｌａｓｅ：ＣＭＴ）類で、ヘテロクロマチン結合モチーフとされるクロモドメインを有する。ＣＭＴは、ＣｐＮｐＧ配列のシトシンのメチル化に関与すると報告されている（Ｌｉｎｄｒｏｔｈ，  Ａ．Ｍ．，  Ｃａｏ，  Ｘ．，  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｚｉｌｂｅｒｍａｎ．  Ｄ．，  ＭｃＣａｌｌｕｍ，  Ｃ．Ｍ．，  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓｅｎ，  Ｓ．Ｅ．  （２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２，  ２０７７−２０８０）。第三は、ドメイン・リアレンジ・メチルトランスフェレース  （ＤＲＭ）とよばれるグループで、植物でのみ報告されている。ＤＮＡメチル化触媒ドメインの構造に特徴が見られ、既知の酵素はＮ末端側からＩ−Ｘの順にモチーフが見られ、ＤＲＭ型は、Ｉ−ＩＶとＶ−Ｘの間の触媒モチーフが転位したドメイン構造をとる。これらのモチーフにおけるアミノ酸配列は、Ｄｎｍｔ３などのデ・ノボ型酵素と非常に類似している（Ｃａｏ，  Ｘ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｎ．Ｍ．，  Ｍｕｓｚｙｎｓｋｉ，  Ｍ．Ｇ．，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｋａｅｐｐｌｅｒ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓｅｎ，  Ｓ．Ｅ．  （２０００）  Ｐｒｏ．  Ｎａｄ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，  ４９７９−４９８４）。配列中のＣｐＮｐＧおよび非対称配列のシトシンのメチル化に関与することが示唆されたシロイヌナズナからのＤＲＭ類（ＤＲＭ１、ＤＲＭ２）（Ｃａｏ，  Ｘ．，  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓｅｎ，  Ｓ．  （２００２）  Ｃｕｒ．  Ｂｉｏｌ．  １２，  １１３８−１１４４）、トウモロコシからのＺｍｅｔ３などの酵素が見いだされ、ｃＤ��Ａ配列が決定されているが、これらの酵素の機能や活性は全く分かっていなかった（Ｃａｏ，  Ｘ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｎ．Ｍ．，  Ｍｕｓｚｙｎｓｋｉ，  Ｍ．Ｇ．，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｋａｅｐｐｌｅｒ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｓ．Ｅ．  Ｊａｃｏｂｓｅｎ．  （２０００）  Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，  ４９７９−４９８４）。
【００１３】
【非特許文献１】
Ｆｉｎｎｅｇａｎ，  Ｅ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｋｏｖａｃ，  Ｋ．Ａ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４３，  １８９−２０１
【非特許文献２】
Ｃａｏ，  Ｘ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｎ．Ｍ．，  Ｍｕｓｚｙｎｓｋｉ，  Ｍ．Ｇ．，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｋａｅｐｐｌｅｒ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓｅｎ，  Ｓ．Ｅ．  （２０００）  Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，  ４９７９−４９８４
【非特許文献３】
Ｃａｏ，  Ｘ．，  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓｅｎ，  Ｓ．  （２００２）  Ｃｕｒ．  Ｂｉｏｌ．  １２，  １１３８−１１４４
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝子の作用解明は、通常、想定される遺伝子ユニットを不活化し、それによって生ずる現象の変化を観察することによって行なわれる。しかしながら、従来知られている選択的ＤＮＡメチルトランスフェレースを用いた場合、不活化が完全に行いうるか否か明確ではなかったため、十分な遺伝子発現制御を行うことができなかった。
【００１５】
本発明は、想定される遺伝子ユニットの不活化を完全に行いうるＤＮＡメチルトランスフェレースを提供し、それによって、遺伝子の作用解明を確実かつ効率的に行なう道を開こうとするものである。
【００１６】
【発明が解決しようとする手段】
本発明により提供されるＤＮＡメチルトランスフェレース酵素ＮｔＤＲＭ１は、隣接する塩基の如何にかかわらず、ＤＮＡ中のシトシンをメチル化することができる酵素であって、上記した課題を解決するものである。当該酵素ＮｔＤＲＭ１をコードする全塩基配列（配列番号１）および当該酵素ＮｔＤＲＭ１のアミノ酸配列（配列番号２）は、それぞれ下記の配列表に示すとおりである。
【００１７】
上記酵素ＮｔＤＲＭ１は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  ｃｖ．  Ｘａｎｔｈｉ  ｎｃ）由来のものであって、本発明者らの研究により、当該酵素のアミノ酸配列およびこれをコードする塩基配列ならびに当該酵素の機能が初めて解明されたものである。当該酵素は、基質としてのＤＮＡ配列中のシトシンを、それに隣接する塩基の種類の如何を問わずメチル化することが可能なものであり、特に基質（Ｓ）／酵素（Ｅ）の相対モル比が５よりも低い反応条件下において、ＤＮＡ配列中に含まれるすべてのシトシン塩基を完全にメチル化することができる。
以下、本発明にかかる酵素ＮｔＤＲＭ１の調製方法および性状、機能を詳細に説明する。
【００１８】
（図面の詳細な説明）
図１は植物ＤＮＡメチルトランスフェレースの比較を示す。ＤＮＡメチルトランスフェレースの構造略図。各タンパク質のサイズをアミノ酸の数で示し、触媒領域における保存モチーフは、ローマ数字のついた枠で示される。調節領域における特定領域は、適切な名のついた影のかかったボックスによって示される。Ｂは、ＤＮＡメチルトランスフェレース間の系統発生論的関係である。配列のデータは、データベースから得られる；アクセッション番号は、ＡＦ２４２３２０（Ｚｍｅｔ３）、ＡＦ２４０６９５（ＤＲＭ２）、ＡＦ０６８６２５（Ｄｎｍｔ３ａ）、ＡＦ０６８６２８（Ｄｎｍｔ３ｂ）、Ｐ１３８６４（Ｄｎｍｔ１）、Ｐ３４８８１（ＭＥＴ１）、ＡＦ０３９３７２（ＣＭＴ１）およびＡＬ０２１７１１（ＣＭＴ３）。
【００１９】
図２はＢＹ２細胞におけるＮｔＤＲＭ１−ＧＦＰの核局在性を示す。タバコＢＹ２培養細胞を、ｐＮｔＤＲＭ１−ＧＦＰにより形質転換し、安定な形質転換体をＤＡＰＩ（Ａ）による染色、もしくはエピ蛍光（Ｂ）によって観察した。
【００２０】
図３はＮｔＤＲＭ１の産生および特性を示す。Ａはイン・ビトロのＮｔＤＲＭ１タンパク質の発現である。ＮｔＤＲＭ１を、バキュロベクター、ｐＤＥＳＴ２０に融合し、ｓｆ９細胞に形質転換し、増殖させ、そして抽出した粗試料（レーン１）またはＧＳＴ−カラム（レーン２）からの精製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、コマジー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）で染色した。タンパク質を、膜上にブロットし、抗ＧＳＴ抗体を用いて免疫染色を行った（レーン３）。タンパク質のサイズは、左端にｋＤａとして示す。Ｂはメチル化活性に対するｐＨの影響である。２μＭ［３Ｈ］ＡｄｏＭｅｔ、２μｇのｐｏｌｙｄＩ／ｄＣおよび１．３ｎｇのタンパク質調製物を含有する反応混合物を、ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５〜７．５）およびＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５〜９．０）によって表示のｐＨに調整し、１．５時間インキュベートし、ＤＥＡＥフィルターペーパー上にスポットし、洗浄し、放射活性を測定した。Ｃはメチル化産物のＨＰＬＣ分析である。標準試料は、オーセンティックなシトシンとｍ５Ｃ（ａ）であった。形質転換していない野生型ｓｆ９細胞のＤＮＡをモノヌクレオチドに直接消化するか（ｂ）、もしくは、モノヌクレオチド消化前にＮｔＤＲＭ１によりメチル化に処した（ｃ）。ＮｔＤＲＭ１形質転換ｓｆ９細胞のＤＮＡ（ｄ）を、モノヌクレオチドに消化した。ｍ５Ｃの位置は、アスタリスクによって示した。
【００２１】
図４は、基質特異性についてのＮｔＤＲＭ１タンパク質の酵素アッセイを示す。Ａはこのアッセイに用いたオリゴヌクレオチドの配列である。ＣｐＧ：５’−ＡＣＧＡＴＣＧＴ（ｘ３）−３’、ＣｐＮｐＧ：５’−ＡＣＴＧＣＡＧＴ（ｘ３）−３’、ＣｐＮｐＮ：５’−ＡＧＣＡＴＧＣＴ（ｘ３）−３’。Ｂはメチル化のタイムコースである。１．３ｎｇのタンパク質、［３Ｈ］ＡｄｏＭｅｔおよびＡに示した１．８μＭ合成オリゴヌクレオチドを含有する反応混合物を、表示の時間インキュベートした（ｈ）。Ｃは基質濃度の影響である。１．３ｎｇのタンパク質、［３Ｈ］ＡｄｏＭｅｔおよび表示の合成オリゴヌクレオチドを含有する反応混合物を、１．５時間インキュベートした。値は３回の実験を平均した値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【００２２】
図５は、ＮｔｄＲＭ１によるメチル化ＤＮＡの制限分析を示す。Ａは、メチル化感受性および非感受性制限酵素に対する制限部位の概略図である。ｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクターの位置４５２１〜５１３の間の９６２ｂｐＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅し、このアッセイにおける基質として使用した（数字１〜４は、図５Ｂのレーン数にそれぞれ対応している）。認識に影響を及ぼすｍ５Ｃを、アスタリスクで示した。Ｂは、制限消化に対するタンパク質濃度の影響を示す。ＤＮＡを、ＤＮＡ（モノヌクレオチド塩基）と酵素のモル比を変化させるように与えるために、基質ＤＮＡ（２５μｇ）の固定量とＮｔＤＲＭ１（０〜０．５ｍｇ）の変化量を含有する反応混合物（２ｍｌ）中、３７℃、１６時間でメチル化した。基質と酵素の比は、各々２５、１２．５、６．３または３．２に調整した。メチル化されていないＤＮＡをコントロールとして示す。基質９６２ｂｐＤＮＡフラグメントのアリコート（５００ｎｇ）を、表示のようにＨａｐＩＩ、ＰｖｕＩＩ、Ｂｓｐ１２８６ＩまたはＴａｑＩで消化する。得られる試料を２％のアガロースゲルで分画し、エチジウムブロマイド染色で可視化した。未消化９６２ｂｐＤＮＡを、コントロールとして左に示す（Ｃ）。Ｃは、Ｂで示されたデータを基にしたメチル化頻度の濃度定量である。縦軸は、制限消化後の未消化ＤＮＡの頻度を（％）で示し、横軸は精製ＧＳＴ−ＮｔＤＲＭ１タンパク質濃度を示す。
【００２３】
図６は、ＮｔＤＲＭ１ゲノムの器官および組織特異的発現を示す。Ａはサザンハイブリダイゼーションの分析を示す。全ＤＮＡ（１０μｇ）のアリコートを、表示の制限酵素で消化し、ＮｔＤＲＭ１プローブとＤＮＡハイブリダイゼーションに供した。Ｂは組織および器官特異的転写物蓄積である。全ＲＮＡを表示の組織または花から抽出し、アリコート（１０μｇ）をアガロース電気泳動で分画し、ナイロン膜に移し、ＮｔＤＲＭ１プローブとハイブリダイゼーションに供した。花では、胚（Ｏｖ）、萼（がく）片（Ｓｅ）、めしべ（Ｐｉ）、おしべ（Ｓｔ）、若い花弁（Ｐｅ１）および古い花弁（Ｐｅ２）であった。内部標準はリボゾームタンパク質ｃＤＮＡ（ｒｒｍ１８）を用いて下欄に示した。Ｃは、同調培養タバコＢＹ２細胞中のＮｔＤＲＭ１およびＮｔＭＥＴ１の細胞周期依存的発現である。レーンあたり全ＲＮＡ（１５μｇ）を持つ膜を、ＮｔＤＲＭ１およびＮｔＭＥＴ１特異的プローブを用いて探索した。内部標準はエチジウムブロミドで染色したｒＲＮＡを下欄に示した。表示された細胞周期の期を、アフィジコリン放出後の有糸分裂指標変化によって評価した。
【００２４】
図７は、ＮｔＤＲＭ１の完全長ｃＤＮＡと、アミノ酸配列を示す。
【００２５】
【発明の実施の形態】
ＮｔＤＲＭ１をコードするＤＮＡフラグメントを、傷つけたタバコ葉から誘導されるｃＤＮＡ群のディファレンシャルディスプレイにより得た。全長２．４ｋｂのＮｔＤＲＭ１のｃＤＮＡを、タバコライブラリィーｃＤＮＡのコロニーハイブリダイゼーションにより単離した。
【００２６】
ＮｔＤＲＭ１遺伝子を、実施例に記載のようにプライマーを用いてＰＣＲを行い、ベクターにクローニングし、昆虫細胞の大量発現系で発現させた。その大量発現後、得られた粗抽出液を精製することにより当該酵素を得た。
【００２７】
ＮｔＤＲＭ１タンパク質は、ＤＮＡ配列分析により、Ｃ末端にＶＩ−ＶＩＩＩ−ＩＸ−Ｘ−Ｉ−ＩＶの順に並ぶ触媒モチーフ（配列番号２において、ＶＩ：アミノ酸位置２８７−３００、ＶＩＩＩ：アミノ酸位置３２１−３４０、ＩＸ：アミノ酸位置４３１−４４４、Ｘ：アミノ酸位置４５５−４６４、Ｉ：アミノ酸位置４８５−５０３、ＩＶ：アミノ酸位置５６３−５７４）を持ち、Ｎ末端に２つのＵＢＡドメイン（アミノ酸位置６１−９７および１６６−２０４である）と核局在性シグナル（ＮＬＳ）（アミノ酸位置２３４−２３７である）が存在することがわかった（図１Ａ）。
【００２８】
既知の保存触媒モチーフＩからＩＶにより作成した系統樹を示す（図１Ｂ）。ホモロジー探索から、シロイヌナズナ（ＤＲＭ１、ＤＲＭ２）およびトウモロコシ（Ｚｍｅｔ３）（Ｃａｏ，  Ｘ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｎ．Ｍ．，  Ｍｕｓｚｙｎｓｋｉ，  Ｍ．Ｇ．，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｋａｅｐｐｌｅｒ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｓ．Ｅ．  Ｊａｃｏｂｓｅｎ．  （２０００）  ＰＮＡＳ．  ９７（９）：  ４９７９−４９８４）由来のドメインと相同性が高いことを示した（図１Ｂ）。そこで、我々は、この単離した遺伝子は、ＤＲＭをコードしていると結論付け、ＮｔＤＲＭ１（Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１）と名付けた。
【００２９】
当該酵素を用い、実施例に記載のようなＤＮＡメチルトランスフェレースアッセイにより当該酵素触媒特性を評価した。
【００３０】
実施例に記載のようなＮｔＤＲＭ１の酵素分析により、当該酵素のＤＮＡメチル化には濃度依存性選択性があるという特徴を当該酵素が有することがわかった。すなわち、本発明の酵素ＮｔＤＲＭ１のメチル化の程度は、基質ＤＮＡに対する酵素濃度の相対濃度に依存して、メチル化が頻発する。従来のＤＮＡメチルトランスフェレースの場合、特定のＤＮＡ配列を持たないとシトシンをメチル化することはできない。従来のＤＮＡメチルトランスフェレース酵素は、例えば、ＣｐＧ、ＣｐＮｐＧ、ＣｐＮｐＮなどの各々のメチルトランスフェレースに対する特異的な配列を有していなければメチル化されないという基質ＤＮＡに対して配列特異性を示すものばかりであった。しかし、本発明の酵素は、
▲１▼基質ＤＮＡに対してＮｔＤＲＭ１の濃度が低いと（Ｓ／Ｅのモル比＞１０）、非対称ＣｐＮｐＮのシトシンを優先的にメチル化し、
▲２▼基質ＤＮＡに対してＮｔＤＲＭ１の濃度を上げると（Ｓ／Ｅのモル比＜５）、非対称ＣｐＮｐＮのシトシンのみならず、対称ＣｐＧ、ＣｐＮｐＧのシトシンも完全にメチル化でき、非特異的にＤＮＡのシトシンをメチル化する。この濃度依存性選択性、即ち、ＣｐＮｐＮに対する選択的酵素として（▲２▼の場合）機能するかどうかは、酵素および基質に関する相対モル濃度の比に依存することがわかった。かかる特徴は、従来のメチルトランスフェレースにはみられず、本発明のＮｔＤＲＭ１は今までにない新規なメチルトランスフェレース酵素であるといえる。
【００３１】
また、保存触媒モチーフにより作成した系統樹から、他の植物ＤＮＡよりも、哺乳類由来のデ・ノボ型メチルトランスフェレース（Ｄｎｍｔ３ａ，  Ｄｎｍｔ３ｂ）と密接に関連することが示され、また、ＮｔＤＲＭ１を発現するＳｆ９細胞ではｍ５Ｃが検出され、形質転換されていない細胞では全くｍ５Ｃが検出されなかったため、ＮｔＤＲＭ１は、イン・ビボにおいてデ・ノボ型メチルトランスフェレースとして機能することが明らかになった。
【００３２】
したがって、本発明の上記特徴を利用すれば、当該ＤＮＡユニットの機能解明において当該ＤＮＡユニットをほぼ完全に不活化することが可能となり、本発明のＮｔＤＲＭ１および当該酵素をコードする塩基配列および相補的配列を利用して、遺伝子の機能解析及び遺伝子の異常発現、発現制御異常などを探索するための実験用キット、および生化学およびバイオテクノロジーなどの分野における研究試薬としても使用することも可能である。
【００３３】
また、当該遺伝子を導入した細胞を病変部に局在させることや、当該酵素の局部導入により、遺伝子発現の暴走による病変を制御および治療できる可能性を示唆するものである。
【００３４】
さらに、本発明は、ＮｔＤＲＭ１をコードする配列番号２記載のポリペプチドにおいて１または数個のアミノ酸が欠失、置換（例えば、保存的置換）および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも含む。配列番号２記載の情報に従って改変ポリペプチドを作成する手法、即ち、ポリペプチドを構成する１または数個のアミノ酸を欠失、置換および／または付加する手法は、当業者には周知（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）である。
【００３５】
また、本発明は、配列番号１記載のＤＮＡ、および該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも含む。「ストリンジェント」とは、低塩濃度、高温度条件を指し、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｅｔ  ａｌ  に記載の条件などを用いてもよいが、具体的には、０．１×ＳＳＣ、６５℃である。
【００３６】
（定義）
本明細書において、酵素の「高濃度下」とは、基質と酵素（Ｓ／Ｅ）の相対モル比が、５よりも低い場合の相対濃度である。
【００３７】
本明細書において、「濃度依存選択性」とは、基質ＤＮＡに対する当該ＤＮＡメチルトランスフェレースの相対モル比に依存して変化するメチル化選択性である。
【００３８】
本明細書において、「対称」とは、ＮｔＤＲＭ１の基質ＤＮＡ配列が、パリンドロームと呼ばれる配列逆方向に繰返した塩基配列となっている状態である。例えば、ＣｐＧ、ＣｐＮｐＧの場合をいう。
【００３９】
本明細書において、「非対称」とは、塩基配列が「対称」である状態以外の状態をいう。例えば、ＣｐＮｐＮの場合をいう。
【００４０】
以下本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記実施例に限定されるものではない。
【００４１】
【実施例】
植物種
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ，  ｃｖ  Ｘａｎｔｈｉ）を天然の日長状態で、温室で栽培した。Ｔｏｂａｃｃｏ  ＢＹ２細胞（Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ，  ｃｖ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  ２）を、修飾Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ培地（ＬＳ培地）（Ｎａｇａｔａ，  Ｔ．，  Ｔａｋａｂｅ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｍａｔｓｕｉ．Ｃ．  （１９８１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８４：  １６１−１６５）を用いる懸濁倍溶液中、連続的な暗所下、増殖させた。ＢＹ２細胞の同調は、修飾を加えた従来の手法（Ｎａｋａｎｏ，  Ｙ．，  Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｎ．，  Ｋｕｓａｎｏ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｓａｎｏ，  Ｈ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ４１：  ４４８−４５７）のように行った。５μｇｍｌ−１アフィジコリンを含む修飾ＬＳ培地中で２４時間培養した後、細胞を回収し、３％シュクロース溶液で洗浄し、新しい培地へ移し、更に培養した。遠心分離により細胞を回収し、１％オルセインで染色し、分裂の指標とした。
【００４２】
ＮｔＤＲＭ１  ｃＤＮＡの単離
最初に、ＮｔＤＲＭ１をコードするＤＮＡフラグメントを、傷をつけたタバコの葉から誘導されるｃＤＮＡ群のディファレンシャルディスプレイにより得た（Ｈａｒａ，  Ｋ．，  Ｙａｇｉ，  Ｍ．，  Ｋｏｉｚｕｍｉ，  Ｎ．，  Ｋｕｓａｎｏ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｓａｎｏ，  Ｈ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．  ４１，  ６８４−６９１）。全長２．４ｋｂのＮｔＤＲＭ１のｃＤＮＡを、プローブとしてＮｔＤＲＭ１フラグメントを用い、タバコ（Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ）ライブラリーｃＤＮＡのコロニーハイブリダイゼーションにより単離した。当該ｃＤＮＡクローンについて、Ｂｉｇｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、両鎖の配列決定を行った。モチーフ予測は、オンラインデータベース；ＰＲＯＳＩＴＥ（ｈｔｔｐ：／／ｔｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ／）およびＩＳＲＥＣモチーフスキャン（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｔｓ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＰＦＳＣＡＮ）で行った。系統学的分析は、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）で行った。
【００４３】
ＢＹ２細胞の形質転換および組織化学的分析
ＮｔＤＲＭ１コード領域（１８２４ｂｐ）を、ＮｃｏＩ部位を介し、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）オープンリーディングフレームに、フレームを合わせて融合した。そして、当該コンストラクトをｐＢＩ１２１（Ｂｅｖａｎ，  Ｍ．  （１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２，  ８７１１−８７２１）のＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ヒートショック法によりＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  株  ＥＨＡ１０５（Ｈｏｏｄ，  Ｅ．Ｅ．，  Ｇｅｌｖｉｎ，  Ｓ．Ｂ．，  Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，  Ｌ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ａ．  Ｈｏｅｋｅｍａ．  （１９９３）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  ２：２０８−２１８）に形質転換した。暗所で４日間培養したタバコＢＹ−２細胞５ｍｌと各形質転換Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとを２日間共培養した後、１００μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５０μｇ／ｍｌを用いカルスを４週間かけて選択した（Ａｎ，  Ｇ．  （１９８５）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ７９：  ５６８−５７０）。ＤＮＡ染色は、１ｍｇ／ｍｌ  ４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含むＭＳ培地の培地のアリコートで行った。ＧＦＰ蛍光は、標準の蛍光イソチオシアネートフィルター（オリンパス光学）を用いるＵＶ−およびＢ−励起フィルター（ＡＸ７０，  Ｏｌｙｍｐｕｓ，  Ｔｏｋｙｏ）を装備した蛍光顕微鏡を用いて観察した。デジタルイメージは、冷却型電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰ−ＨＱ，  Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ）を使用した。
【００４４】
ＧＳＴ：  ＮｔＤＲＭ１融合タンパク質の発現および精製
ＮｔＤＲＭ１を、ＧＡＴＥＷＡＹｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）を用い、製造者使用説明書に基づき、昆虫細胞発現のためのＧＳＴベクターへ融合した。ＮｔＤＲＭ１は、一組のプライマー（フォワード：５’−ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＴＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＡＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣ−３’；リバース：５’−ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＣＴＡＡＴＧＴＴＴＡＴＧＴＣＴＧＧＡＣＡＴＴＡＴＧＧＡＣＴＴ−３’）を用いて増幅し、得られたフラグメントに他の一組のプライマー（フォワード：５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧ−ＴＡＣＡＡＡＡＡＡ−ＧＣＡＧＧＣ−３’；リバース：５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴ−３’）を用い２回目のＰＣＲを行った。最終フラグメントをｐＤＥＳＴ２０ベクターにクローニングした。ｐＤＥＳＴ２０ベクタープラスミドを、バキュミド（バキュロウイルス（Ｓｆ９株，  ＧＩＢＣＯ）のゲノム）と共にＥ．  ｃｏｌｉ中へ形質転換し、イン・ビボ組換えをなし、得られる単一のプラークをピックアップし、更に増殖させた。１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および５００μｇ／ｍｌゲンタマイシンを加えたＧｒａｃｅ昆虫培地で保持したＳｆ９細胞（６×１０９）を、組換えバキュロウイルスに感染させ、２７℃で４日間インキュベートした。１ディッシュからの細胞を、リシス緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），  ５ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０および２５％（ｖ／ｖ）グリセロール，  １ｍＭ  ＤＴＴ，  １ｍＭ  フェニルメチルスルホニルおよび１００μｇ／ｍｌ  アプロチニン）１ｍｌに懸濁し、２回、１０秒間超音波処理した。７７ｋＤａのＧＳＴ融合ＮｔＤＲＭ１を、グルタチオン−セファロースカラムを用い、製造者使用説明書に基づき精製した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により算出した。イムノブロット分析は、従来技術（Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｎ．，  Ｋｕｓａｎｏ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｓａｎｏ，  Ｈ．  （２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８，  ３２５０−３２５９）に従い行った。
【００４５】
ＤＮＡメチルトランスフェレースアッセイ
ＤＮＡメチルトランスフェレース活性は、レシピエントＤＮＡ基質中へのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの３Ｈ−標識メチル基の取込みにより、モニターする。２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ、２μＭ  Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（メチル−３Ｈ）（ＮＥＮ）、および適当量の基質ＤＮＡを含む反応混合物１００μｌを、所定の時間、３７℃でインキュベーションした。最初のアッセイの場合、ポリ（ｄＩ−ｄＣ）／ポリ（ｄＩ−ｄＣ）（Ｓｉｇｍａ）２μｇを基質として使用した。当該反応混合物を、１％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．５  ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプロテイナーゼＫ−ＳＤＳＫ−ＳＤＳ緩衝液中で１ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と混合し、更に５０℃で１時間インキュベーションした。そして、基質ＤＮＡをフェノール／クロロホルム処理により抽出し、エタノールで沈殿させ、ＤＥＡＥ−ペーパー上にスポットし、０．５Ｍ  リン酸ナトリウムで洗浄し、乾燥させ、そして放射活性をカウントした。
【００４６】
ｍ５Ｃの定量分析
ＨＰＬＣによるｍ５Ｃの同定は、従来技術（Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｎ．，  Ｋｕｓａｎｏ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｓａｎｏ，  Ｈ．  （２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８，  ３２５０−３２５９）を多少修飾してＳｆ９細胞から単離した基質ＤＮＡを用いて行った。当該基質ＤＮＡは、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１の９６２フラグメント（位置４５２１−５１３）をＰＣＲ増幅することにより調製した。上記のようなメチル化緩衝液中、ＤＮＡ１００μｇ、２ｍＭ  Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（Ｓｉｇｍａ）および適当な量のＮｔＤＲＭ１を含む反応混合物２００μＬを３７℃で１６時間インキュベーションした。当該反応混合物をＲＮａｓｅＡ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）１１０ｎｇと共に３７℃で２時間インキュベーションした。ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、３ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）および０．５ｍＭ  ＺｎＳＯ４を含む緩衝液１００μｌにおいて、３７℃、２０時間、２ユニットのヌクレアーゼＰ１（Ｓｉｇｍａ）で消化した。得られたヌクレオチドを、２０ユニットの仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（Ｔａｋａｒａ）で、３７℃、２時間、脱リン酸化した。当該サンプルを限外濾過（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ  ＰＬ−１０  ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｔｕｂｅｓ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により分画し、透過物をＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−１８Ｓカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）に注入した。分離は、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．３）の存在下、２．５〜２０％のメタノール勾配で行った。
【００４７】
メチル化感受性制限酵素アッセイ
９６２ｂｐ基質ＤＮＡを調製し、上記の通りメチル化した。アリコート（２５μｇ）を、制限酵素ＨａｐＩＩ、ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｂｓｐ１２８６１（メチル化感受性）またはＳｓｐＩおよびＴａｑＩ（メチル化非感受性）のうち１つで消化し、アガロース電気泳動分析を行った。非メチル化ＤＮＡフラグメントもまたコントロールと同じ条件下で処理した。
【００４８】
ＤＮＡおよびＲＮＡ単離およびゲルブロットハイブリダイゼーション
ゲノムＤＮＡはＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ，  Ｍ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｗ．Ｆ．  （１９８０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ８，  ４３２１−４３２５）により抽出した。トータルＲＮＡを、所定の組織またはＢＹ２細胞から、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，  Ｎ．  （１９８７）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６２，  １５６−１５９）により単離した。ハイブリダイゼーション分析は、各遺伝子に特異的な一対のプライマーから作成したプローブを用いて、従来技術（Ｙｏｄａ，  Ｈ．，  Ｏｇａｗａ，  Ｍ．，  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｙ．，  Ｋｏｉｚｕｍｉ，  Ｎ．  ａｎｄ  Ｓａｎｏ，  Ｈ．  （２００２）Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｇｅｎｏｍ．  ２６７，  １５４−１６１）の通り行った。
【００４９】
ＮｔＤＲＭ１の同定
タバコの葉が損傷した後の初期段階で転写物が蓄積する遺伝子の、修飾ディファレンシャルディスプレイによるスクリーニングにおいて、〜１ｋｂの特定のフラグメントを同定した。ホモロジー探索により、ＤＮＡメチルトランスフェレースに似た遺伝子が示唆されたため、さらに特性分析を行った。その後のタバコｃＤＮＡライブラリィーのスクリーニングにより、６０８個のアミノ酸（配列番号２）のタンパク質をコードする完全長の２５４０ｂｐ（配列番号３）のｃＤＮＡを得た。配列分析により、ＤＮＡメチルトランスフェレースで見出される少なくとも６つの保存性の高いモチーフを含有することがわかった。しかし、このモチーフの順序は、主要な真核生物ＤＮＡメチルトランスフェレースで保存されているＩ−ＩＶ−ＶＩＩＩ−Ｘとは異なり、ＶＩ−ＶＩＩＩ−ＩＸ−Ｘ−Ｉ−ＩＶ（図１Ａ）というモチーフを持つ。このｃＤＮＡは、ＤＮＡメチルトランスフェレースで見出される保存モチーフに関するホモロジー探索から、シロイヌナズナ（ＤＲＭ１、ＤＲＭ２）およびトウモロコシ（Ｚｍｅｔ３）由来のドメイン・リアレンジ・メチルトランスフェレース（ＤＲＭ）（Ｃａｏ，  Ｘ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｎ．Ｍ．，  Ｍｕｓｚｙｎｓｋｉ，  Ｍ．Ｇ．，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｋａｅｐｐｌｅｒ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓｅｎ，  Ｓ．Ｅ．  （２０００）  Ｐｒｏ．  Ｎａｄ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，  ４９７９−４９８４）と高いホモロジーを示した。即ち、この単離した遺伝子はＤＲＭをコードすると結論づけ、この遺伝子をＮｔＤＲＭ１（Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１）と名づけた。保存触媒モチーフにより作成した系統樹から、このＮｔＤＲＭは、他の植物ＤＮＡよりも、哺乳類由来のデ・ノボ型メチルトランスフェレース（Ｄｎｍｔ３ａ，  Ｄｎｍｔ３ｂ）と密接に関連することが示された。
【００５０】
植物におけるＮｔＤＲＭ１の細胞内局在性を決定するために、ＮｔＤＲＭ１−ＧＦＰ融合タンパク質をコードする発現コンストラクトを含むプラスミドでタバコＢＹ−２細胞を安定に形質転換した。この細胞をＤＡＰＩで染色すると、核は、明らかな蛍光を示す（図２Ａ）。エピ蛍光観察により、ＧＦＰ蛍光がＤＡＰＩシグナルと同じ位置にあることから、ＮｔＤＲＭ１は核に独占的に局在することがわかった。
【００５１】
精製および酵素的分析−実施例に従い、ＮｔＤＲＭ１を、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）介在昆虫細胞（Ｓｆ９）発現系を使用して発現させ、感染Ｓｆ９細胞の増殖３サイクル後、タンパク質を回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＧＳＴ融合ＮｔＤＲＭ１タンパク質が、Ｓｆ９細胞中で効率的に産生されていることが明らかとなり、粗抽出液中にも存在することを確認した（図３Ａ）。そして、グルタチオンセファロースカラムによる精製により、ほぼ同じタンパク質を得た（図３Ａ）。これは、抗−ＧＳＴ抗体によるイムノブロット染色によって組換えタンパク質であると確認した（図３Ａ）。これらの結果を基にして、さらに速度論的分析を、精製試料を用いて大部分を実施した。メチル化活性は、合成オリゴヌクレオチド、ポリ（ｄＩ−ｄＣ）／ポリ（ｄＩ−ｄＣ）中のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンから移行した３Ｈ標識メチル基を測定することによって決定した。この反応は、ＧＳＴ−ＮｔＤＲＭ１（１．３ｎｇ）と３．８５μＭ基質ＤＮＡ（モノヌクレオチド塩基）で行った場合、メチル基の取込みは、最初の１．５時間の間に直線的に増加し、６時間後に徐々に安定水準に達した。反応は、３．８５μＭ基質ＤＮＡの存在下、１５μｇまでタンパク質の濃度に比例して増加した。反応に対する至適ｐＨは７．０であった（図３Ｂ）。そのようなメチル基の導入は、発現したＮｔＤＲＭ１によるものであることを対照実験から確認した。この実験で、ＧＳＴ−ＧＵＳを発現する細胞からの粗液および精製タンパク質調製物の両方では、まったく活性を示さなかった（データは示していない）。これらの結果は、発現したＧＳＴ−ＮｔＤＲＭ１が実際にメチルトランスフェレース活性を持つことを示唆するものである。反応生成物の確認のために、定量分析をＨＰＬＣで行った。Ｓｆ９由来の基質ＤＮＡを、イン・ビトロでＮｔＤＲＭ１によってメチル化し、ヌクレアーゼＰ１によって消化し、アルカリホスファターゼによって脱リン酸化した。得られるヌクレオチドのＨＰＬＣ分析により、反応生成物は、ｍ５Ｃ（図３Ｃ）単独であった。ＮｔＤＲＭ１を発現するＳｆ９細胞から単離されたＤＮＡ試料を、ＨＰＬＣと同様にアッセイした場合、ｍ５Ｃを検出した（図３Ｃ）。形質転換されていない細胞は、全くｍ５Ｃを産生しなかったため、ＮｔＤＲＭ１がイン・ビボにおいて、デ・ノボ型メチルトランスフェレースであることが明らかになった。
【００５２】
配列の特異性−ＮｔＤＲＭ１介在メチル化における配列特異性を調べるために、同じ塩基組成であるが異なる配列を持つ合成オリゴヌクレオチドを調製した。即ち、ＣｐＧ、ＣｐＮｐＧまたはＣｐＮｐＮ（ここでＮはグアニン以外の全ての残基である）の６部位を含有するパリンドローム２４量体を調製した。各々３つを、直列に連結して、７２塩基のフラグメントを提供し、メチル化アッセイに供した。最も高いメチル化は、ＣｐＮｐＮ基質で見られ、３Ｈ−取込みは、インキュベーション時間とほぼ直線的に増加することを示した（図４Ｂ）。次いで、酵素活性に対する基質濃度の影響を試験した。酵素濃度固定下（１．３ｎｇ）で、かつＤＮＡ濃度を０〜１．８μＭの範囲に変化させて反応速度を測定した（図４Ｃ）。その結果、最良の基質がＣｐＮｐＮであることを示し、基質依存の双曲線的増加を示した（図４Ｃ）。ＣｐＮｐＧへのメチル基の転位速度は、ＣｐＮｐＮへの転位速度の半分以下であり、ＣｐＧへの取込みはほとんどない（図４Ｃ）。みかけのＫｍ値を、ＣｐＮｐＮとＣｐＮｐＧに対しそれぞれ０．９０μＭおよび０．６２μＭ（モノヌクレオチド塩基）と算出した。これらの酵素実験から、ＮｔＤＲＭ１は、対称配列に位置するシトシンよりも非対称配列に位置するシトシンを優先的にメチル化することが示唆された。
【００５３】
選択的および非選択的メチル化−ＮｔＤＲＭ１によるメチル化部位の特異性を、メチル化感受性制限酵素によるメチル化ＤＮＡの制限パターンで試験した。制限酵素、ＨａｐＩＩ（ＣｐＧについて）、ＰｖｕＩＩ（ＣｐＮｐＧについて）およびＢｓｐ１２８６Ｉ（ＣｐＮｐＮについて）に対して１もしくは最高２つの部位を含有する、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１プラスミド由来の９６２ｂｐフラグメントを、ＰＣＲにより増幅した（図５Ａ）。メチル化を、様々な反応条件下で行った。酵素濃度を変化させ、基質と酵素（Ｓ／Ｅ）間に様々なモル比を与えた。得られる基質の制限分析は、Ｓ／Ｅ比が約１０（ヌクレオチドモノマー塩基）である場合に、メチル化は８０％以上のＣｐＮｐＮで生じるが、ＣｐＮｐＧおよびＣｐＧでは２０％以下であることを示し（図５Ｂ、Ｃ）、Ｓ／Ｅ比が５よりも低い場合では、全てのシトシンは等しくメチル化された（図５Ｂ、Ｃ）。アデニンのメチル化が生じないことは、ｍ６Ａに感受性のあるＴａｑＩを用いる切断で確認した。これらの結果は、基質ＤＮＡに対して低濃度下では、ＮｔＤＲＭ１は選択的にＣｐＮｐＮをメチル化するが、基質ＤＮＡに対して高濃度下ではＣｐＮｐＧおよびＣｐＧに標的を広げるということを示した。
【００５４】
ゲノムの組織および転写物蓄積
タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）のゲノムＤＮＡを、適当な制限酵素で消化し、ＮｔＤＲＭ１の３’ＵＴＲ領域（２０６４−２４９３位置）から調製した特異的なプローブとハイブリダイズさせた。高ストリンジェント条件下で、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの各々で消化した後、プローブは４つの明確なシグナルを示した（図６Ａ）。ＲＮＡハイブリダイゼーション分析は、ＮｔＤＲＭ１転写物が、葉、茎、花および根中のいたるところに蓄積することを示した（図６Ｂ）。また、それらのレベルは、めしべ以外の全ての器官で高かった（図６Ｂ）。同調培養したＢＹ２細胞の細胞周期中、ＮｔＤＲＭ１転写物は全段階を通して蓄積していた（図６Ｃ）。これは、Ｓ期で優先的に発現するメインテナンス型メチルトランスフェレースをコードするＮｔＭＥＴ１の結果と著しく異なっていた（図６Ｃ）。
【００５５】
上記より、ＮｔＤＲＭ１は、非対称ＣｐＮｐＮのシトシンを優先的にメチル化し、次いで基質に対する酵素の相対的な濃度が増加すると、非対称ＣｐＮｐＮ以外の対称ＣｐＮｐＧ、次にＣｐＧのシトシンに対しても相当緩和な基質特異性を有するメチルトランスフェレースであり、このＮｔＤＲＭ１濃度依存の基質特異性によりＤＮＡ中の全てのシトシンを非選択的に完全にメチル化できるデ・ノボ型酵素であることがわかった。
【００５６】
【発明の効果】
遺伝子の作用解明は、想定される遺伝子ユニットを不活化し、それによって生ずる現象の変化を観察することによって、遺伝子ユニットの作用を解明するが、従来知られている選択的ＤＮＡメチルトランスフェレースを用いた場合、不活化が完全に行いうるか否かは明確ではなかった。しかし、本発明のＤＮＡメチルトランスフェレースであるＮｔＤＲＭ１酵素を用いた場合、その目的とするＤＮＡユニットのすべてのシトシンをメチル化できるため、不活化を完全に行うことが可能であり、遺伝子作用解明を確実かつ効率的に行い得る。また、当該遺伝子を導入した細胞を病変部に局在させることや、当該酵素の局部導入により、遺伝子発現の暴走による病変を制御できる可能性を示唆するものである。
【００５７】
また、本発明のＤＮＡメチルトランスフェレースＮｔＤＲＭ１酵素を用い、遺伝子の機能解析及び遺伝子の異常発現、発現制御異常による病変の制御が可能となる。
【００５８】
また、本発明のＮｔＤＲＭ１および当該酵素をコードする塩基配列および相補的配列を、遺伝子の機能解析及び遺伝子の異常発現、発現制御異常などを探索するための実験用キット、および生化学およびバイオテクノロジーなどの分野における研究試薬としても使用することも可能である。
【００５９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、植物ＤＮＡメチルトランスフェレースの比較である。
【図２】図２は、ＢＹ−２細胞におけるＮｔＤＲＭ１−ＧＦＰの核局在性を示す。
【図３】図３は、ＮｔＤＲＭ１の産生および特性を示す。
【図４】図４は基質特異性についてのＮｔＤＲＭ１タンパク質の速度検定。
【図５】図５は、ＮｔＤＲＭ１によるメチル化ＤＮＡの制限分析を示す。
【図６】図６は、ＮｔＤＲＭ１に関するゲノム器官および組織特異的発現を示す。
【図７】図７は、ＮｔＤＲＭ１の完全長ｃＤＮＡおよびＮｔＤＲＭ１のアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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