(57)【要約】【課題】プローブ固定基材が既に標的物質の検出処理に供されたか否かを、観察工程に先立ち、簡便に判別する方法、ならびに、かかる判別に利用される判別素子を具えているプローブ固定基材の提供。【解決手段】プローブ固定基材が標的物質の検出処理操作の実施に供されたか否かを判別する手段として、温度変化により色変化を起こす物質あるいは水等に濡れることにより色変化や形状変化を起こす物質を利用した判別素子をプローブ固定基材に装備させ、検出処理操作中の加熱、検体試料液との接触に伴い、判別素子の表出する可視的な変化を指標として、既に標的物質の検出処理に供されたか否かを判定する。【選択図】　　図３
2004020433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質の検出処理に使用されるプローブ固定基材であって、
前記プローブは、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブ分子であり、該基材の表面上の特定部位に固定化されており、
該プローブ固定基材に対して、標的物質の検出処理実施の有無を判別する素子として、
該プローブ固定基材上に、前記標的物質の検出処理を施すことに伴い、可視的な変化を表する素子を具えることを特徴するプローブ固定基材。
【請求項２】
標的物質の検出処理に使用されるプローブ固定基材に関して、該プローブ固定基材が標的物質の検出処理操作の実施に供されたか否かを判別する方法であって、
該プローブ固定基材は、
前記プローブは、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブ分子であり、該基材の表面上の特定部位に固定化されており、
該プローブ固定基材上に、標的物質の検出処理を施すことで可視的な変化を表する素子を、標的物質の検出処理実施の有無を判別する素子として具えており、前記プローブ固定基材が標的物質の検出処理操作の実施に供されたか否かの判別は、前記判別素子の表出する可視的な変化の有無の識別により行うことを特徴とする、プローブ固定基材における標的物質の検出処理実施の有無を判別する方法。
【請求項３】
前記標的物質の検出処理は、
該プローブの固定化される基材の表面に対して、検体試料を接触させ、前記特異的な結合形成を達成させる工程として、
水溶液又は液相の形態をとる検体試料を接触させ、その接触状態において、加熱処理を施す操作を有し、
前記判別素子は、前記水溶液又は液相の形態をとる検体試料との接触、または、その接触状態における加熱処理によって、可視的な変化を表する素子であることを特徴とする請求項１に記載のプローブ固定基材。
【請求項４】
前記標的物質の検出処理は、
該プローブの固定化される基材の表面に対して、検体試料を接触させ、前記特異的な結合形成を達成させる工程として、
水溶液又は液相の形態をとる検体試料を接触させ、その接触状態において、加熱処理を施す操作を有し、
前記判別素子は、前記水溶液又は液相の形態をとる検体試料との接触、または、その接触状態における加熱処理によって、可視的な変化を表する素子であり、前記プローブ固定基材が標的物質の検出処理操作の実施に供されたか否かを判別は、前記判別素子の表出する可視的な変化の有無の識別により行うことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記可視的な変化を表する素子は、
色彩の変化または形状の変化を伴うものであることを特徴とする請求項１に記載のプローブ固定基材。
【請求項６】
前記判別素子は、
温度変化により色変化を起こす物質を利用するものであることを特徴とする請求項１に記載のプローブ固定基材。
【請求項７】
前記判別素子は、
水溶液又は液相の形態をとる検体試料中に含有される溶媒との接触により、色変化または形状変化を起こす物質を利用するものであることを特徴とする請求項１に記載のプローブ固定基材。
【請求項８】
前記可視的な変化は、非可逆的な変化であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記判別素子は、
前記水溶液又は液相の形態をとる検体試料との接触、または、その接触状態における加熱処理に際し、
検体試料との接触、あるいは、加熱処理に伴う温度変化が可能な基材上の表面部位に設けられていることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記判別素子において、
可視的な変化を呈する領域サイズは、目視にて識別可能なサイズに選択されていることを特徴とする請求項１に記載のプローブ固定基材。
【請求項１１】
前記可視的な変化は、
所定の温度以上に、一定の時間以上曝される処理により色変化を起こす物質を利用するものであることを特徴とする請求項１に記載のプローブ固定基材。
【請求項１２】
前記可視的な変化は、
水溶液又は液相の形態をとる検体試料中に含有される溶媒との一定の時間以上の接触により、色変化または形状変化を起こす物質を利用するものであることを特徴とする請求項１に記載のプローブ固定基材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的物質の検出処理に利用される、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを表面に固定しているプローブ固定基材に関して、該プローブ固定基材が既に標的物質の検出処理に供されたか否かを判別する方法、ならびに、かかる判別に利用される判別素子を具えているプローブ固定基材に関する。より具体的には、プローブ固定基材に対して、既に標的物質の検出処理が実施されたか否かの判別を、その場で容易に判定することができる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸の塩基配列の決定やサンプル中の標的核酸の検出、各種細菌の同定を迅速、正確に行える技術の一つとして、例えば、特定の塩基配列を有する標的核酸と特異的に結合する物質、いわゆるプローブを利用し、固相上に、複数種のプローブをアレイ状に配置したプローブ・アレイ基板とした上で、同時に複数種のプローブに対する特異的な結合能を評価する方法が提案されている。
【０００３】
近年、このような固相プローブ・アレイを利用する標的物質の検出や定量に関する研究開発は精力的に行われてきている。例えば、米国特許公報５，６８８，６４２には、フォト・リソグラフィーを用いて作製された固相オリゴヌクレオチド・アレイが示され、ＰＣＴ公開公報Ｗ０　９５／２５１１６、米国特許公報５，６８８，６４２には、インクジェット法を用いた固相ＤＮＡプローブ・アレイの作製方法が示されている。これら種々の方法で作製される固相プローブ・アレイを利用して、標的物質を検出する検出方法は、▲１▼固相プローブ・アレイの作製工程、▲２▼固相プローブ・アレイのプローブと標的物質の検出処理工程、▲３▼検出処理工程後の観察工程、の３つに大別される。以下、ＤＮＡプローブ・アレイを例にとり、一般的な検出方法を述べる。
【０００４】
（１）固相プローブ・アレイの作製工程
固相プローブ・アレイの作製工程では、調べたい標的物質に対して特異的に結合可能であるＤＮＡプローブを用意し、該ＤＮＡプローブを、予め前処理などを施した、固相（基板など）表面上に、アレイ状のスポットの形態で付着させる工程である。図１に、この工程で作製される固相プローブ・アレイにおける、各スポットに固定されるＤＮＡプローブの状態を模式的に示す。
【０００５】
図１は、固相プローブ・アレイ上に配置される、ＤＮＡプローブの固定がなされるスポットのアレイ状の配列を模式的に示す。ガラスやプラスチック等の基板上に、ＤＮＡプローブを含むＤＮＡスポットが、等間隔に配列され、マトリックス様とされている例を示す。図２は、図１に示すアレイ中の、１つのＤＮＡスポットを拡大して示す模式図である。各ＤＮＡスポットの中における、基板上に固定されたＤＮＡプローブの様子を模式的に示してある。
【０００６】
（２）固相プローブ・アレイのプローブと標的物質の検出処理工程
固相プローブ・アレイのプローブと標的物質の検出処理工程は、調べたい標的物質を固相プローブ・アレイのプローブに接触させ、特異的な結合を行わせる工程、いわゆるハイブリダイゼーションの工程である。ハイブリダイゼーション反応は、通常、プローブを標的物質の含まれた溶液に接触または浸漬させ、加熱し、所定の温度に維持する状況下で行われる。この温度は、プローブと標的物質の組み合わせにより決定されるものである。
【０００７】
（３）検出処理工程後の観察工程
検出処理工程後の観察工程は、標的物質がプローブと反応し、特異的な結合を形成しているか否かを、例えば、蛍光標識を利用する蛍光検出など、既知の方法を用いて検出する工程である。すなわち、（２）のプローブと標的物質とハイブリダイゼーションの工程において、標的物質に予め蛍光分子など、標識を施しておけば、固相プローブ上に結合した標的物質だけが蛍光などを発することになる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、固相プローブ上に結合した標的物質が存在する際には、その蛍光が観測され、検出処理工程がなされていることは確認される。しかし、この観察工程に先立ち、（２）のプローブと標的物質との検出処理工程が実施されているか否かを、容易に判断できる方法はなかった。
【０００９】
すなわち、固相プローブ・アレイ自体、検出処理工程を実施する前後では、一見したところ、外見上の相違はなく、観察工程に先立ち、検出処理工程が行われたか否かを判断する絶対的な指標はないのが現状であった。仮に、検体試料中に、検出すべき標的物質が存在していない場合には、観察工程でも、蛍光が観測されず、実際に検出処理工程が行われたか否かの判断を行うことができなくなる。
【００１０】
また、検出処理工程を実施する前後では、一見したところ、外見上の相違がないため、既に検出処理工程を実施した固相プローブ・アレイに、誤って、再度検出処理工程を施してしまう危険性もあった。
【００１１】
仮に、再度検出処理工程を施すと、固相プローブと特異的に結合する標的物質量は増し、結果として、検体試料中に含有される標的物質濃度の評価が正当に行われない事態を引き起こす。
【００１２】
本発明は前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、該プローブ固定基材が既に標的物質の検出処理に供されたか否かを、観察工程に先立ち、簡便に判別する方法、ならびに、かかる判別に利用される判別素子を具えているプローブ固定基材を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記の課題を解決すべく、鋭意検討を行ったところ、プローブ固定基材を利用する、標的物質の検出処理工程では、そのハイブリダイゼーション反応は、通常、プローブを標的物質の含まれた溶液に接触または浸漬させ、加熱し、所定の温度に維持する状況下で行われるため、例えば、この工程に付随する、温度変化、あるいは、標的物質の含まれた溶液に接触または浸漬に伴い、色変化や形状変化を生ずる判別素子をプローブ固定基材に装備させると、前記検出処理工程が実施された際、判別素子に可視的な変化が引き起こされることに想到した。本発明者は、かかる着想に基づき、判別素子を作製して、実際に判別が可能であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明にかかるプローブ固定基材は、
標的物質の検出処理に使用されるプローブ固定基材であって、
前記プローブは、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブ分子であり、該基材の表面上の特定部位に固定化されており、
標的物質の検出処理を実施する際、該プローブの固定化される基材の表面に対して、検体試料を接触させる形態で使用され、かつ、前記特異的な結合形成を達成させる所定の処理操作を施す使用形態を採り、
該プローブ固定基材上に、前記所定の処理操作を施すことで、可視的な変化を表する素子を、標的物質の検出処理実施の有無を判別する素子として具えることを特徴するプローブ固定基材である。
【００１５】
その際、標的物質の検出処理を実施する際の所定の処理操作は、
該プローブの固定化される基材の表面に対して、検体試料を接触させ、前記特異的な結合形成を達成させる工程として、
水溶液又は液相の形態をとる検体試料を接触させ、その接触状態において、加熱処理を施す操作を有し、
前記判別素子は、前記水溶液又は液相の形態をとる検体試料との接触、または、その接触状態における加熱処理によって、可視的な変化を表する素子であることを特徴とするプローブ固定基材とすることができる。例えば、判別素子として該プローブ固定基材上に具える、前記所定の処理操作を施すことで、可視的な変化を表する素子は、
前記可視的な変化は、色彩の変化または形状の変化を伴うものであることを特徴とするプローブ固定基材とすることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、上記のプローブ固定基材を利用することで、プローブ固定基材における標的物質の検出処理実施の有無を容易に判別する方法の発明をも提供し、すなわち、本発明にかかるプローブ固定基材における標的物質の検出処理実施の有無を判別する方法は、
標的物質の検出処理に使用されるプローブ固定基材に関して、該プローブ固定基材が標的物質の検出処理操作の実施に供されたか否かを判別する方法であって、
該プローブ固定基材は、
前記プローブは、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブ分子であり、該基材の表面上の特定部位に固定化されており、
標的物質の検出処理を実施する際、該プローブの固定化される基材の表面に対して、検体試料を接触させる形態で使用され、かつ、前記特異的な結合形成を達成させる所定の処理操作を施す使用形態を採り、
該プローブ固定基材上に、前記所定の処理操作を施すことで可視的な変化を表する素子を、標的物質の検出処理実施の有無を判別する素子として具えており、前記プローブ固定基材が標的物質の検出処理操作の実施に供されたか否かを判別は、前記判別素子の表出する可視的な変化の有無の識別により行うことを特徴とする、プローブ固定基材における標的物質の検出処理実施の有無を判別する方法である。その際、標的物質の検出処理を実施する際の所定の処理操作は、
該プローブの固定化される基材の表面に対して、検体試料を接触させ、前記特異的な結合形成を達成させる工程として、
水溶液又は液相の形態をとる検体試料を接触させ、その接触状態において、加熱処理を施す操作を有し、
前記判別素子は、前記水溶液又は液相の形態をとる検体試料との接触、または、その接触状態における加熱処理によって、可視的な変化を表する素子であり、前記プローブ固定基材が標的物質の検出処理操作の実施に供されたか否かを判別は、前記判別素子の表出する可視的な変化の有無の識別により行うことを特徴とする方法とすることが好ましい。
【００１７】
加えて、前記判別素子の表出する可視的な変化は、
温度変化により色変化を起こす物質を利用する色彩の変化を伴うものであることが好ましい。あるいは、前記判別素子の表出する可視的な変化は、
水溶液又は液相の形態をとる検体試料中に含有される溶媒との接触により、色変化または形状変化を起こす物質を利用する、色彩の変化または外形変化を伴うものであることが好ましい。さらには、前記判別素子の表出する可視的な変化は、非可逆的な変化であることがより好ましい。
【００１８】
例えば、該プローブ固定基材上に具える判別素子は、
前記水溶液又は液相の形態をとる検体試料との接触、または、その接触状態における加熱処理に際し、
検体試料との接触、あるいは、加熱処理に伴う温度変化が可能な基材上の表面部位に設けられていることが望ましい。また、該プローブ固定基材上に具える判別素子は、
可視的な変化を呈する領域サイズは、目視にて識別可能なサイズに選択されていることが望ましい。
【００１９】
さらには、該プローブ固定基材上に具える判別素子の表出する可視的な変化は、
所定の温度以上に、一定の時間以上曝される処理により色変化を起こす物質を利用する色彩の変化を伴うものであることを特徴とする方法とすることもできる。あるいは、該プローブ固定基材上に具える判別素子の表出する可視的な変化は、水溶液又は液相の形態をとる検体試料中に含有される溶媒との一定の時間以上の接触により、色変化または形状変化を起こす物質を利用する、色彩の変化または外形変化を伴うものであることを特徴とする方法とすることもできる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
【００２１】
本発明では、プローブ固定基材が標的物質の検出処理操作の実施に供されたか否かを判別する手段として、プローブ固定基材に具える判別素子の表出する可視的な変化を指標として利用する。この可視的な変化は、検出処理操作の前後において、判別素子において、例えば、色彩の変化、あるいは形状の変化を通して、視覚的に認識可能な変化を示すことを指す。この判別素子を配置する位置は、予め定められており、その部分のみに注目して、所定に可視的な変化が生じているか否かを、確認することで、容易に判別が可能となる。
【００２２】
本発明において、この検出処理実施の有無を判別する素子として、利用可能な素子の一例を以下に示す。しかし、可視的な変化を生じ、利用可能な素子は、ここに例示するものに限られるものではない。
【００２３】
（Ａ）本発明で判別素子に利用される、温度変化により色変化を起こす物質は、少なくとも、検出処理操作における加熱、冷却などに伴う、温度変化によって色彩の変化を伴うものが利用できる。より具体的には、温度変化により色変化を起こす物質は、検出処理工程の反応温度に応じて、かかる温度に達した際に、確実に色変化を起こすものを、適宜選択して利用することが好ましい。あるいは、かかる検出処理工程の反応温度を経た後、冷却される結果、色変化を起こす物質も、好適に利用できる。この温度変化により色変化を起こす物質を利用する判別素子は、プローブ固定基材のプローブ固定面に配置することもできるが、プローブ固定面ではないものの、検出処理工程中、所定の温度変化に曝される部位に配置することもできる。
【００２４】
（Ｂ）温度変化により色変化を起こす物質を利用する判別素子の形態は、シール状のものでも良いし、インク状のものやシート状のものを用いても良い。また、平面的な形状、配置位置は、例えば、図３に例示するように、プローブ固定基材のプローブ固定領域と分離された端部、隅部とすることが好ましいが、検出処理工程において、不具合が無い限り、固相プローブ・アレイと近接する領域とすることもできる。また、全体的な形状等も、特に視覚的な識別が可能であれば、種々に選択することができる。なお、固相プローブ・アレイ中のＤＮＡプローブの存在する領域と、判別素子の配置位置とを、明確に区分することがより好ましい。
【００２５】
（Ｃ）温度変化により色変化を起こす物質を利用する判別素子の搭載は、一般に、固相プローブ・アレイの基板部表面に直接搭載する形態とされる。なお、プローブ固定基材は、取り扱いを容易にするため、固相プローブ・アレイの基板部と一体化される外周部（パッケージ部分）を設ける形態とされる場合がある。その際、検出処理工程の際の加温時に、かかる外周部（パッケージ部分）も同等の温度変化を受ける場合、図４に一例を示すように、この外周部（パッケージ部分）上、所望の温度変化に曝される部分に搭載位置を選択することもできる。
【００２６】
（Ｄ）判別素子を固相プローブ・アレイ等に直接搭載する場合には、検出処理工程時に、固相プローブ・アレイを検体試料液と接触させる際、判別素子も検体試料液で濡れる場合がある。その状態でも、温度変化による色変化に影響の無い、耐水性、耐溶媒性を有する物質を利用する、あるいは、固相プローブ・アレイ等に搭載した後、耐水性、耐溶媒性の被覆を施し、影響を排除する形態とすることが望ましい。固相プローブ・アレイ等の外部に搭載する際には、判別素子は検体試料液で濡れない配置とでき、必ずしも、耐水性、耐溶媒性を有する物質を利用しなくともよいが、固相プローブ・アレイ等の取り扱いの際に、水や溶媒により濡れてしまう場合も少なからず想定される。従って、一般的に、耐水性、耐溶媒性を付与した形態の判別素子とすることが好ましい。
【００２７】
（Ｅ）色彩の変化を利用する判別素子では、例えば、図５に例示するように、検出処理工程の加熱温度が７０℃に選択される場合、７０℃に達する際、色変化を起こす物質を利用する判別素子を固相プローブ・アレイ等に搭載しておく。この所望の温度で検出処理工程を実施されたプローブ固定基材では、検出処理前と検出処理後とで、温度変化により色変化を起こす物質の色が、例えば、無色から黒色へ変化する。この判別素子における色彩変化を目視、確認することで、プローブ固定基材について、検出処理工程が実施済みであることが容易に判別できる。
【００２８】
（Ｆ）温度変化により色変化を起こす物質を利用する場合、個々の検出処理工程の温度条件毎に、その温度条件に応じて、最適な温度特性を有する物質を選択することが適当である。なお、温度条件に依らず、検出処理工程に伴う加温を受けたか否かを判断するだけならば、ある一定の温度以上で色変化を起こす物質を用いても良い。
【００２９】
（Ｇ）また、ある一定の温度以上で、一定の時間以上に曝された際、色変化を起こす物質を用いれば、検出処理時間の時間管理も同時に行うことができる。
【００３０】
図６に模式的に示すように、検出処理の所定の条件が、加熱温度が７０℃で、処理時間が２時間の場合、所定の条件で検出処理が行われると、色変化を起こす物質は色変化を起こす（図６の（１））が、前記の条件を満たしていない場合（例えば、処理時間が２時間よりも短かった場合）色変化をおこす物質は色変化を起こさず（図６の（２））、この相違に基づき、検出処理で所定の条件を満たしていたか否かも容易に確認できる。
【００３１】
（Ｈ）この可視的な変化は、非可逆的な変化であることが望ましい。例えば、一般に、温度変化により、非可逆性の色変化を起こす物質としては、非結晶−結晶または相分離−非相分離によるリタイラブル系の下記のような材料を利用することで、調製することができる。
【００３２】
（イ）電子供与性呈色性化合物
ロイコオーラミン類、ジアリールフタリド類ポリアリールカルビノール類、アシルオーラミン類、ローダミンＢラクタム類、インドリン類、スピロピラン類、フルオラン類、シアニン色素類、クリスタルバイオレット等、の電子供与性有機物等。
【００３３】
（ロ）電子受容性化合物
フェノール類、フェノール金属塩類、カルボン酸金属塩類、スルホン酸、スルホン酸塩、リン酸塩、リン酸金属塩類、酸性リン酸エステル、酸性リン酸エステル金属塩類、亜リン酸塩、亜リン酸類、亜リン酸金属塩類等の酸化物等
（ハ）可逆剤
ステロイド系等
この系は、サーマルヘッドにより融点以上に加熱され、急冷されたときに無色に固定され、一方、そのインク系のガラス転移点以上で加熱すると、徐々に発色する。その温度と発色に要する時間は、付加する可逆剤等の濃度により、コントロールすることができる。
【００３４】
（Ｉ）判別素子には、水溶液又は液相の形態をとる検体試料中に含有される溶媒との接触により、色変化または形状変化を起こす物質を利用することもできる。この水等に濡れる際、色変化や形状変化を起こす物質を利用する際、水等に浸漬又は接触させると、色が消えるマーカー等で、固相プローブ・アレイ等に印をつけ、判別素子に利用することもできる。検出処理後、検体試料中に含有される溶媒等に触れ、その印が消えていることが確認できれば、十分に目的が達成できるため、そのような簡便な手法を採用することもできる。
【００３５】
なお、検出処理工程中に、検体試料中に含有される溶媒等に触れる限り、この種の溶媒との接触により、色変化または形状変化を起こす物質を利用する判別素子は、図３に一例を示すように、固相プローブ・アレイ等の上であれば、その位置、形状等は問わない。但し、プローブと共に水等に接触したり、浸漬したりする処理が、確実に行なわれる必要があるので、固相プローブ・アレイに付属されるパッケージ部ではなく、固相プローブ・アレイの基板部に直接搭載することが好ましい。
【００３６】
（Ｊ）この水等に濡れる際、色変化や形状変化を起こす物質を利用する判別素子を用いると、例えば、図７に例示するように、検出処理前、まだ、水等に濡れていない時点では黒色を示すが、検出処理工程で、検体試料液と触れ、水等に濡れる結果、白色に変化する。検出処理後、判別素子部における、この色変化を目視、確認することにより、検出処理工程が施されているか否か、容易に判別が可能となる。
【００３７】
（Ｋ）また、ある一定時間、水等と接触または浸漬する際に、色変化や形状変化を起こす物質を用いれば、検出処理時間の時間管理も同時に行うことができる。
【００３８】
図８に模式的に示すように、検出処理の所定の条件が、加熱温度が７０℃で、処理時間が２時間の場合、所定の条件で検出処理が行われると、一定時間水と接した際、色変化を起こす物質は、２時間を経過した時点で色変化を起こす（図８の（１））が、前記の条件を満たしていない場合（例えば、処理時間が２時間よりも短かった場合）色変化をおこす物質は、まだ色変化を起こさず（図８の（２））、この相違に基づき、検出処理で所定の条件を満たしていたか否かも容易に確認できる。
【００３９】
（Ｌ）これら水等に濡れることにより、色変化や形状変化を起こす物質を利用する判別素子は、例えば、基材シート上に、染料や顔料による着色剤を水溶性樹脂中に混入、溶解または分散した水溶性着色樹脂を直接塗布して水溶性の着色層を設けたラベルの形態で作製することができる。このラベルを粘着剤などで、プローブ・アレイ基板に貼り付け、そのラベルが、検体試料液中に浸漬等することで、色変化を起こしたり、色が滲んだりすることにより判別を可能とするものとできる。あるいは、少なくとも１つの電子受容性顕色化合物及び電子供与性呈色化合物を含んでなり、水と接触することにより消色する発色剤組成物を用いて、ラベルに存在する該発色剤組成物の消色により、水等との接触の有無を検知する形態とすることもできる。
【００４０】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。かかる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら実施例の形態に限定はされない。
【００４１】
（実施例１）
温度変化により色変化を起こす物質を利用する判別素子を用いた固相プローブ・アレイと、かかるプローブ・アレイ基板を利用した標的物質の検出処理工程の実施
（１）ＤＮＡプローブ・アレイの作製
特開平１１−１８７９００号公報に記載される工程に従って、ＤＮＡプローブ・アレイを作製する。
【００４２】
先ず、超音波洗浄及びアルカリ洗浄を施したガラス基板に、アミノ基を結合したシラン化合物を含むシランカップリング剤による表面処理、さらに、そのアミノ基に対して、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（ＥＭＣＳ）で表面処理を施す。シランカップリング剤由来のアミノ基と、スクシイミド基とが反応し、基板表面に該ＥＭＣＳに由来するマレイミド基が導入される。
【００４３】
一方、１本鎖ＤＮＡプローブとして、５’末端にスルファニル基による修飾を施した、５’ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ３’の塩基配列を有するＤＮＡオリゴマーを合成し、この１本鎖ＤＮＡプローブを含む液体を、インクジェット法を用いて前記処理済のガラス基板にスポッティングする。その結果、マレイミド基と５’末端のスルファニル基との反応によって固定化がなされ、ＤＮＡプローブ・アレイが作製される。
【００４４】
（２）シール状の判別素子を利用する実施有無の判別
作製したＤＮＡプローブ・アレイを、２％牛血清アルブミン水溶液中に浸して２時間放置し、基板表面のブロッキング反応を行った。一方、ＤＮＡプローブ・アレイ基板の裏側には、４５℃で色変化を起こす、温度変化により色変化を起こす物質を利用するシール状の判別素子を装着する。
【００４５】
この判別素子付きのＤＮＡプローブ・アレイを用いて、（１）のＤＮＡプローブに相補的な塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡ（５’ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’）を標的物質として、標的物質を含む水溶液中、４５℃で２時間検出処理工程を行った。その結果、判別素子に利用した、温度変化により色変化を起こす物質は、検出処理工程前には白色を示していたものが、工程終了後は、黒色に変化した。
【００４６】
この判別素子に表れる色変化により、検出処理工程が行われたということを、容易に確認することができる。
【００４７】
（３）検出処理工程後の観察結果
さらに、検出処理工程後のＤＮＡプローブ・アレイについて、ＤＮＡマイクロアレイ用スキャナー（商品名：ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ；Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．社製）を用いて、蛍光観察を行ったところ、８００８．５の蛍光量を示した。
【００４８】
ＤＮＡプローブ・アレイに直接、温度変化により色変化を起こす物質を利用した判別素子を搭載することで、その後の蛍光観察に支障なく、また、この蛍光観察の工程の前に、検出処理工程が行われたのか否かを、目視によって、容易に判断できる。
【００４９】
（実施例２）
水等に濡れることにより色変化を起こす物質を利用する判別素子を用いた固相プローブ・アレイと、かかるプローブ・アレイ基板を利用した標的物質の検出処理工程の実施
（１）ＤＮＡプローブ・アレイの作製
ＤＮＡプローブ・アレイ自体は、実施例１の（１）に記載した方法と同様な方法で作製した。
【００５０】
（２）マーク状判別素子を利用する実施有無の判別
作製したＤＮＡプローブ・アレイを、２％牛血清アルブミン水溶液中に浸して２時間放置し、基板表面のブロッキング反応を行った。一方、ＤＮＡプローブ・アレイ基板の裏側には、マーク状判別素子として、水に濡れる事で色変化を起こす物質を利用して、文字を書き入れた。
【００５１】
この判別素子付きのＤＮＡプローブ・アレイを用いて、実施例２の（１）のＤＮＡプローブに相補的な塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡ（５’ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’）を標的物質として、標的物質を含む水溶液中、４５℃で２時間検出処理工程を行った。その結果、判別素子に利用した、水に濡れることで色変化を起こす物質は、検出処理工程前には黒色を示していたものが、工程終了後は、無色透明に変化した。
【００５２】
この判別素子に表れる色変化により、検出処理工程が行われたということを、容易に確認することができる。
【００５３】
（３）検出処理工程後の観察結果
さらに、検出処理工程後のＤＮＡプローブ・アレイについて、ＤＮＡマイクロアレイ用スキャナー（商品名：ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ；Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．社製）を用いて、蛍光観察を行ったところ、４７４９．４の蛍光量を示した。
【００５４】
ＤＮＡプローブ・アレイに直接、水に濡れることで色変化を起こす物質を利用した判別素子を搭載することで、その後の蛍光観察に支障なく、また、この蛍光観察の工程の前に、検出処理工程が行われたのか否かを、目視によって、容易に判断できる。
【００５５】
（実施例３）
水等に濡れるにより色変化及び形状変化を起こす物質を利用する判別素子を用いた固相プローブ・アレイと、かかるプローブ・アレイ基板を利用した標的物質の検出処理工程の実施
（１）ＤＮＡプローブ・アレイの作製
ＤＮＡプローブ・アレイ自体は、実施例１の（１）に記載した方法と同様な方法で作製した。
【００５６】
（２）シート状判別素子を利用する実施有無の判別
作製したＤＮＡプローブ・アレイを、２％牛血清アルブミン水溶液中に浸して２時間放置し、基板表面のブロッキング反応を行った。一方、ＤＮＡプローブ・アレイ基板の裏側には、水に濡れる事で色変化および形状変化を起こす物質を利用して、シート状判別素子を設けた。
【００５７】
この判別素子付きのＤＮＡプローブ・アレイを用いて、実施例３の（１）のＤＮＡプローブに相補的な塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡ（５’ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’）を標的物質として、標的物質を含む水溶液中、４５℃で２時間検出処理工程を行った。その結果、判別素子に利用した、水に濡れることで色変化及び形状変化を起こす物質は、検出処理工程前には白色を示していたものが、半透明となり、さらに、基板から剥離し、工程終了時点では、標的物質を含む水溶液中に拡散していた。
【００５８】
この判別素子に表れる色変化、特に、形状変化により、検出処理工程が行われたということを、容易に確認することができる。
【００５９】
（３）検出処理工程後の観察結果
さらに、検出処理工程後のＤＮＡプローブ・アレイについて、ＤＮＡマイクロアレイ用スキャナー（商品名：ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ；Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．社製）を用いて、蛍光観察を行ったところ、４７２２の蛍光量を示した。
【００６０】
ＤＮＡプローブ・アレイに直接、水に濡れることで色変化および形状変化を起こす物質を利用した判別素子を搭載することで、その後の蛍光観察に支障なく、また、この蛍光観察の工程の前に、検出処理工程が行われたのか否かを、目視によって、容易に判断できる。
【００６１】
【発明の効果】
本発明においては、プローブ固定基材を利用する、標的物質の検出処理工程では、そのハイブリダイゼーション反応は、通常、プローブを標的物質の含まれた溶液に接触または浸漬させ、加熱し、所定の温度に維持する状況下で行われるため、例えば、この工程に付随する、温度変化、あるいは、標的物質の含まれた溶液に接触または浸漬に伴い、色変化や形状変化を生ずる判別素子をプローブ固定基材に装備させると、前記検出処理工程が実施された際、判別素子に可視的な変化が引き起こされるので、これを指標とすることによって、プローブ固定基材が既に標的物質の検出処理に供されたか否かを容易に判定することが可能となる。その結果、既に標的物質の検出処理に供されたプローブ固定基材を、誤って、再度検出処理工程を行ってしまう危険性もなくなり、間違いなく次の観察工程に移れるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】固相プローブ・アレイ基板上のＤＮＡスポットのアレイ状配置例を模式的に示す図である。
【図２】固相プローブ・アレイ基板上のＤＮＡスポットにおける、ＤＮＡプローブの固定状況を模式的に示す拡大図である。
【図３】本発明にかかる判別素子を具えた固相プローブ・アレイ基板における、判別素子の搭載形状の一例を模式的に示す図である。
【図４】本発明にかかる判別素子を具えた固相プローブ・アレイにおいて、温度変化で色変化を起こす物質を利用する判別素子の搭載形態の一例を模式的に示す図である。
【図５】固相プローブ・アレイに搭載される、温度変化で色変化を起こす物質を利用する判別素子において、加熱工程に伴い、検出処理前と検出処理後に判別素子が表出する色変化の様子を模式的に例示する図である。
【図６】固相プローブ・アレイに搭載される、一定の温度以上、一定の時間以上に曝されることで、色変化を起こす物質を利用する判別素子において、（図６−１）所定の検出処理条件を満足する検出処理前後における色変化の様子、（図６−２）所定の検出処理条件に満たない際、色変化が生じない状態を、それぞれ模式的に示す図である。
【図７】固相プローブ・アレイに搭載される、水等に濡れることで、色変化または形状変化を起こす物質を利用する判別素子において、検体試料液との接触に伴い、検出処理前と検出処理後に判別素子が表出する色変化の様子を模式的に例示する図である。
【図８】固相プローブ・アレイに搭載される、水等に一定の時間以上に接触することで、色変化あるいは形状変化を起こす物質を利用する判別素子において、（図８−１）所定の検出処理条件を満足する検出処理前後における色変化、形状変化の様子、（図８―２）所定の検出処理条件に満たない際、色変化及び形状変化が完了しない状態を、それぞれ模式的に示す図である。
【符号の説明】
ａ：ガラスやプラスチック製の基板
ｂ：ＤＮＡスポット
ｃ：ＤＮＡプローブ
ｄ：温度変化により色変化を起こす物質、あるいは水等に濡れることで色変化または形状変化を起こす物質
ｅ：固相プローブ・アレイの基板部
ｆ：パッケージ部分
ｇ：検出処理前の固相プローブ・アレイ
ｈ：検出処理後の固相プローブ・アレイ
ｉ：検出処理が不十分な固相プローブ・アレイ
ｊ：水等に濡れることにより、色変化及び形状変化を起こす物質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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