(57)【要約】【課題】曝露された細胞に損傷を与えることなく、顕微鏡での高精度の観察、及び様々な生物学的測定を行うのに十分な量の細胞を効率的かつ容易に回収することができる煙曝露試験用モジュールを提供する。【解決手段】所定量の細胞が付着して形成された細胞付着面（１５）と、この細胞付着面（１５）を中に有するチャンバ（２）と、前記細胞付着面（１５）に曝露されるように、前記チャンバ（２）内に煙を導入する導入部（２２）と、前記煙を前記チャンバから排気する排気部（２３）とを具備する煙曝露試験用モジュールにおいて、顕微鏡で観察するように前記チャンバ（２）内から取り出し可能に支持され、前記細胞付着面（１５）が設けられている少なくとも１つの顕微鏡観察用部材（１４）をさらに具備する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定量の細胞が付着して形成された細胞付着面と、
この細胞付着面を中に有するチャンバと、
前記細胞付着面に曝露されるように、前記チャンバ内に煙を導入する導入部と、
前記煙を前記チャンバから排気する排気部と
を具備する煙曝露試験用モジュールにおいて、
顕微鏡で観察するように前記チャンバ内から取り出し可能に支持され、前記細胞付着面が設けられている少なくとも１つの顕微鏡観察用部材をさらに具備することを特徴とする煙曝露試験用モジュール。
【請求項２】
前記顕微鏡観察用部材は、顕微鏡観察用のスライドガラスであることを特徴とする請求項１に記載の煙曝露試験用モジュール。
【請求項３】
請求項１もしくは２に記載の煙曝露試験用モジュールを用いた煙曝露試験方法であって、
前記細胞付着面が設けられた顕微鏡観察用部材を前記チャンバ内に載置し、
前記細胞付着面へ煙を曝露し、
この曝露の後に、前記細胞付着面を、顕微鏡観察用部材ごと前記チャンバから取り出し、
取り出した前記細胞付着面に、顕微鏡で観察するためのすべての処理を前記顕微鏡観察用部材上において行い、
この処理を行った前記細胞付着面を顕微鏡観察用部材ごと顕微鏡のステージに載置し、そして、
前記細胞付着面を所定の観察法により顕微鏡で観察することを特徴とする煙曝露試験方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞が付着して形成された細胞付着面と、この細胞付着面を中に有するチャンバと、前記細胞付着面に曝露されるように、前記チャンバ内に煙を導入する導入部と、前記煙を前記チャンバから排気する排気部とを具備する煙曝露試験用モジュールに関する。また、この煙曝露試験用モジュールを用いた煙曝露試験方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞への煙曝露を行う煙曝露試験において、中に細胞を収容しているチャンバを有するモジュール内に煙を導入する試験装置が知られている。このような試験装置は、例えば、遺伝毒性試験や細胞毒性試験などの生物学的試験に用いられ、細胞への煙曝露による毒性を生物学的に評価するのに利用することができる。
【０００３】
上記試験装置の一例として、特表２００２−５０８９５４には、細胞を培養可能に付着した培養細胞挿入物（インサート）を支持している培養チャンバを有する試験装置が開示されている。この試験装置は、前記細胞に煙を曝露するように、前記培養チャンバ内に煙を導入する曝露形式であるモジュールを有する。また、このモジュールと同様のモジュールを用い、煙の曝露機構に特徴を有する曝露装置が、本出願人により特願２００１−３０３６６８において提案されている。
【０００４】
これら装置のインサートは、断面Ｕ字状のほぼ円筒部材であり、このインサートの底面に、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）などの材料からなる膜が形成されている。曝露される細胞は、このインサートの膜に付着しており、前記チャンバの中で煙が曝露されるようになっている。煙が曝露された後の細胞の様子を顕微鏡で観察する場合には、前記膜に付着している細胞は、前記インサートの繰り返しの遠心操作によってかき集められて、顕微鏡観察用部材に移されるという処理が行われている。
【０００５】
【特許文献１】
特願２００１−３０３６６８
【特許文献２】
特表２００２−５０８９５４。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
一般に、煙が曝露された細胞の様子を精度良く観察するためには、十分な量の細胞を回収する必要がある。上記のような試験装置ではインサートの底面積が比較的小さいので、１回の曝露試験で回収される細胞の量は、顕微鏡での高精度の観察や生物学的測定を行うのに必ずしも十分な量ではない。そこで、回収される細胞の量を増加させるために、インサートの底面積を大きくすることが考えられるが、煙の均一性や培地効率などの点から、インサートを大きくするには限界がある。
【０００７】
また、上記のような試験装置では、インサートの繰り返しの遠心操作によって細胞をかき集めるので、この操作により細胞に損傷を与えることがある。細胞の損傷がひどい場合には、顕微鏡観察や生物学的測定に用いる細胞数の減少をもたらすだけでなく、これら観察や測定を行うまでに時間や手間がかかるという問題がある。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、細胞への煙曝露試験において、曝露された細胞に損傷を与えることなく、顕微鏡での高精度の観察、及び様々な生物学的測定を行うのに十分な量の細胞を効率的かつ容易に回収することができる煙曝露試験用モジュールを提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明の煙曝露試験用モジュールは、所定量の細胞が付着して形成された細胞付着面と、この細胞付着面を中に有するチャンバと、前記細胞付着面に曝露されるように、前記チャンバ内に煙を導入する導入部と、前記煙を前記チャンバから排気する排気部とを具備する煙曝露試験用モジュールにおいて、顕微鏡で観察するように前記チャンバ内から取り出し可能に支持され、前記細胞付着面が設けられている少なくとも１つの顕微鏡観察用部材をさらに具備することを特徴とする。
【００１０】
また、このような構成を有する煙曝露試験用装置を用いて煙曝露試験を行う方法は、前記細胞付着面が設けられた顕微鏡観察用部材を前記チャンバ内に載置し、前記細胞付着面へ煙を曝露し、この曝露の後に、前記細胞付着面を、顕微鏡観察用部材ごと前記チャンバから取り出し、取り出した前記細胞付着面に、顕微鏡で観察するためのすべての処理を前記顕微鏡観察用部材上において行い、この処理を行った前記細胞付着面を顕微鏡観察用部材ごと顕微鏡のステージに載置し、そして、前記細胞付着面を所定の観察法により顕微鏡で観察することを特徴とする。
【００１１】
上記構成によれば、細胞への煙の曝露から、曝露された細胞の顕微鏡観察までを同一部材上で行うことができるので、従来のようなインサートの繰り返しの遠心操作によって細胞をかき集める処理が不要であり、回収工程において細胞に損傷を与えることが無い。したがって、必要とされる量の細胞を曝露時から直接顕微鏡観察用部材に付着させることにより、１度の曝露試験を行うだけで、顕微鏡での高精度の観察、及び様々な生物学的測定を行うのに十分な量の細胞を効率的かつ容易に回収することができる。また、十分な量の細胞を確保できるので、顕微鏡観察用部材から細胞を直接抽出もしくは回収することにより、これら細胞を顕微鏡観察のみならず様々な生物学的測定に用いることも可能である。
【００１２】
前記顕微鏡観察用部材は、ガラスからなる顕微鏡用のスライドガラスであるが、使用する顕微鏡の特性に応じて、プラスチックなどの他の材料であってもよい。また、あらゆる種類の顕微鏡観察法に応じて、シャーレなどの他の器具が用いられてもよい。
【００１３】
このように、ガラスからなるスライドガラスに細胞が付着されていると、培養細胞の観察に一般的に用いられている位相差顕微鏡による観察に限らず、微分干渉顕微鏡などの他の観察法で観察することもできる。また、スライドガラスに細胞が接着されているので、シャーレ内で培養されている細胞の観察に一般的に用いられる倒立顕微鏡に限らず、正立型顕微鏡で観察することもできる。
【００１４】
さらに、本発明の煙曝露試験用モジュールは、複数のチャンバを有し、複数の顕微鏡観察用部材が、前記各チャンバ内に設けられていてもよい。このような構成によれば、細胞をそれぞれのチャンバ内の顕微鏡観察用部材に付着させ同時に曝露を行うことによって、検体の測定数が確保でき、より正確な測定及び統計学的処理を行うことができる。
【００１５】
尚、本発明の煙曝露試験用モジュール、及びこのモジュールを用いた煙曝露試験方法は、例えば、以下のように遺伝毒性試験、細胞毒性試験、並びにその他の試験に分類される各試験に適用することができる。
【００１６】
遺伝毒性試験に分類される適用可能な試験は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）小核試験、染色体異常試験、姉妹染色分体交換試験（ＳＣＥ）、ＦＩＳＨ、クロモゾームペインティング試験、細胞形質転換試験（セルトランスフォーメーション試験）、コメットアッセイ（ＳＣＧＥ）、ＤＮＡアダクト試験、トランスジェニックを用いた遺伝毒性試験、不定期ＤＮＡ合成試験（ＵＤＳ）、Ｈ（Ｇ）ＰＲＴ試験、代謝共同阻害試験、並びに、抗変異原検出試験である。
【００１７】
細胞毒性試験に分類される適用可能な試験は、細胞数測定試験、ニュートラルレッド取り込み試験、クリスタルバイオレット染色試験、ギムザ染色試験、ＭＴＴ試験、ＷＳＴ−１試験、ＡＴＰ測定、ＢｒｄＵ試験、ＤＮＡ量の測定、並びに、タンパク質量の測定である。
【００１８】
また、その他の試験として、酸化ストレス測定試験、活性酵素産出測定試験、脂質過酸化測定、タンパク障害測定、ニトロチロシン測定試験、ＲＮＡ量測定、遺伝子発現解析、定量ＰＣＲ試験、ＰＣＲ試験、ノーザンブロッティング、サザンハイブリダイゼーション、イムノサイトケミストリー試験、フローサイトメトリーなどによる細胞周期の測定試験、ＤＮＡ鎖切断試験、Ｔｕｎｎｅｌ法、マウススポット試験、アポトーシス検出試験、光毒性試験、グルタチオンの測定試験、８ＯＨｄＧの測定試験、ＤＮＡメチル化の測定、ＥＬＩＳＡ、ガン遺伝子の測定、ガン抑制遺伝子の測定、並びに、レポータ遺伝子の測定に適用可能である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下に、図面を参照して、本発明の一実施の形態を説明する。図１に、煙曝露装置（図示せず）に装着されている煙曝露試験用モジュール（本実施の形態においては、煙曝露モジュール）１の一実施の形態を示す。この煙曝露モジュール１は、従来の煙曝露モジュールを改良したものであり、本実施の形態における煙の曝露方法については、図４に概略的に示しているように、従来の煙曝露装置と同様の原理・機構が用いられている。したがって、以下の記載では、主に本発明の特徴部分を説明する。
【００２０】
本発明の一実施の形態に係る煙曝露モジュール１は、第１のモジュール部１０と第２のモジュール部２０とから構成されている。第１のモジュール部１０の上部には、平らな底面を有し、断面Ｕ字状のチャンバ２が形成されている。このチャンバ２には、培地供給管１１と培地排出管１２とが、それぞれこのチャンバ２と連通して接続されている。培地供給管１１は、チャンバ２から第１のモジュール部１０の内部を通って外部まで延出し、ポンプを介して培地供給源に接続されている（図示せず）。同様に、培地排出管１２は、チャンバ２から第１のモジュール部１０の内部を通って外部まで延出し、ポンプを介して培地排出槽に接続されている（図示せず）。
【００２１】
前記培地供給管１１は、図２の（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、第１のモジュール部１０内で、中心線１００に関して対称に２つに分離し、前記チャンバ２の底面のほぼ中央に開口している。また、前記培地排出管１２は、図２の（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、第１のモジュール部１０内で、中心線１００に関して対称に４つに分離し、それぞれ前記チャンバ２の底面の隅部に開口している。
【００２２】
さらに、前記チャンバ２の底面には、厚みを有する板状の２つの支持部材１３が設けられている。これら支持部材１３は、前記開口部分を塞がないように、互いに中心線１００方向に離間して、前記チャンバ２の底面の両側に位置されている。
【００２３】
前記支持部材１３上には、顕微鏡観察用部材であるスライドガラス１４が載置されている。このスライドガラス１４は、顕微鏡で観察されるようにガラスから製造されており、所定の厚みを有する板状部材である。このスライドガラス１４は、支持部材１３の厚みの分だけ前記チャンバ２の底面から離間しており、前記開口部分を塞がないように位置されている。また、スライドガラス１４上には、細胞自体の特性により、もしくは接着剤とともにあらかじめ細胞を付着させた細胞付着面１５が形成されている。
【００２４】
再度、図１を参照すると、第２のモジュール部２０には、前記チャンバ２を閉鎖する天井面２１が形成されている。この天井面２１には、導入管２２と排気管２３とが、それぞれ前記チャンバ２と連通するように接続されている。導入管２２は、チャンバ２から第２のモジュール部２０の内部で２方に分岐して外部まで延出しており、一方が発煙源及び清浄空気供給源に、他方が煙濃度測定器にそれぞれ接続されている（共に図示せず）。同様に、排気管２３は、第２のモジュール部２０の内部を通って外部まで延出し、ポンプを介して排気槽に接続されている（図示せず）。
【００２５】
前記導入管２２は、図３の（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、前記細胞付着面１５に対向して前記天井面２１の中心に開口している。また、前記排気管２３は、図３の（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、第２のモジュール部２０内で、中心線１００に関して対称に４つに分離し、それぞれ前記天井面２１の隅部に開口している。このように排気管２３を配置して排気を行うことにより、煙の均一性が確保できるようになっている。
【００２６】
また、前記第１及び第２のモジュール部１０，２０の内部には、温水などの恒温媒体を循環させるための保温管２４が、前記チャンバ２の近傍を取り巻くように配管されている。この保温管２４は、恒温媒体の循環回路を形成しており、煙曝露モジュール１の外部で恒温槽に接続されている（図示せず）。
【００２７】
次に、図１及び４を参照して、上記構成による動作について説明する。図１に示されているように、前記細胞付着面が形成されたスライドガラス１４は、前記チャンバ２内の支持部材１３に載置され、培地Ａが前記培地供給管１１を介してチャンバ２内に供給される。続いて、図４に示されているように、細胞が培地Ａに浸された状態で、所定量の煙Ｂが導入管２２を介して導入され、チャンバ２が完全に密閉される。そして、細胞付着面１５を露出するように、培地Ａが培地排出管１２を介して排出され、チャンバ２内に導入された煙Ｂが前記細胞付着面１５に曝露される。細胞付着面１５に煙Ｂを所定の時間曝露させた後、再び新鮮な培地Ａ’が培地供給管１１を介してチャンバ２内に供給される。最後に、チャンバ２の排気管２３から煙Ｂが排気されるとともに、清浄空気Ｃが煙Ｂと同様に導入管２２を介してチャンバ２内に導入され、チャンバ２内をクリーニングする。培地Ａ，Ａ’の供給及び排出、並びに、煙Ｂ及び清浄空気Ｃの導入及び排気は、ポンプなどの手段を用いて行われる。
【００２８】
曝露試験の間、前記保温管２４内に温水Ｄを循環させることによって、チャンバ２内の温度は一定に保たれている。したがって、培地及び細胞は、温度による悪影響を受けない。
【００２９】
図１には、曝露モジュール１内に単一のチャンバ２が形成されているが、複数のチャンバを有していてもよい。このような構成にすると、細胞をそれぞれのチャンバ内の顕微鏡観察用部材に付着させ同時に曝露を行うことによって、検体の測定数が確保でき、より正確な測定及び統計的処理を行うことができる。
【００３０】
曝露された細胞は、スライドガラス１４ごとチャンバ２から取り出され、このスライドガラス１４上で顕微鏡観察を行うための処理が行われる。この処理は、例えば、細胞への染色やカバーガラスによる被覆、並びにステージへの設置などである。また、生物学的試験を行うために、スライドガラス１４から細胞を直接抽出もしくは回収して各生物学的試験に対応した処理が行われる。
【００３１】
このように、本実施の形態に係る煙曝露モジュールは、顕微鏡観察用部材上で直接煙曝露が行われるように構成されているので、曝露後に、細胞をかき集めて顕微鏡観察用部材へ移すという処理を行う必要はない。したがって、回収工程において細胞に損傷が与えられない。また、細胞への煙の曝露から、曝露された細胞の観察や測定までに、時間や手間を著しく省くことができる。
【００３２】
曝露された細胞の観察に関しては、従来の顕微鏡観察法で行われる。用いられる顕微鏡は、培養細胞の観察に一般的に用いられている位相差顕微鏡をはじめ、微分干渉顕微鏡などである。前記顕微鏡観察用部材は、スライドガラス１４だけではなく、顕微鏡に対応して適切な部材が用いられ得る。本実施の形態のように、スライドガラス１４を使用した場合、シャーレ内で培養されている細胞の観察に一般的に用いられる倒立顕微鏡に限らず、正立型顕微鏡で観察することもできる。
【００３３】
【発明の効果】
以上のように、本発明の煙曝露試験用モジュールによれば、細胞付着面が直接顕微鏡観察用部材に付着されているので、回収工程において細胞に損傷を与えることが無い。したがって、必要とされる量の細胞を曝露時から直接顕微鏡観察用部材に付着させることにより、１度の曝露試験を行うだけで、顕微鏡での高精度の観察、及び様々な生物学的測定を行うのに十分な量の細胞を効率的かつ容易に回収することができる。また、十分な量の細胞を確保できるので、顕微鏡観察用部材から細胞を直接抽出もしくは回収などを行うことにより、これら細胞を顕微鏡観察のみならず様々な生物学的測定に用いることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、顕微鏡観察用部材が載置されている本発明の煙曝露モジュールを正面から見た部分断面図である。
【図２】図２（Ａ）は、煙曝露試験用モジュールの下部を上面から見た部分断面図であり、図２（Ｂ）は、煙曝露モジュールの下部を側面から見た部分断面図である。
【図３】図３（Ａ）は、煙曝露試験用モジュールの上部を上面から見た部分断面図であり、図３（Ｂ）は、煙曝露モジュールの上部を側面から見た部分断面図である。
【図４】図４は、本発明に係る煙曝露のスケジュールを示す図である。
【符号の説明】
１  煙曝露モジュール
２  チャンバ
１４  顕微鏡観察用部材
１５  細胞付着面
【図１】
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【図２】
2004222533.tif 000004
【図３】
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【図４】
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