(57)【要約】【課題】細胞の培養に使用された使用済み培地を検査することにより、細胞の培養状態を確認する。【解決手段】細胞の培養に使用される培地を検査することにより培養状態を検査する細胞培養状態検査方法であって、使用されていた培地の成分を分析し、その分析結果に基づいて、細胞の培養状態を判断する。【選択図】　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の培養に使用される培地を検査することにより培養状態を検査する細胞培養状態検査方法であって、
使用されていた培地の成分を分析する第１の過程と、
分析結果に基づいて、細胞の培養状態を判断する第２の過程と
を具備する細胞培養状態検査方法。
【請求項２】
前記第１の過程において、前記細胞から産生される所定の成分を分析する請求項１に記載の細胞培養状態検査方法。
【請求項３】
前記第１の過程において、前記培地に所定の刺激を与えた後に、前記培地の成分を分析する請求項１又は請求項２に記載の細胞培養状態検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養状態検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、骨腫瘍摘出や外傷等によって生じる骨の欠損部に、骨補填材を補填して骨を修復させることが行われている。しかしながら、骨粗鬆症のように、骨が次第にもろくなっていく場合や、欠損部が非常に広域である場合等には、上記方法では問題を解決することが難しい。
そこで、近年、患者から骨髄を採取し、この採取した骨髄に含まれる間葉系幹細胞から人為的に骨芽細胞を十分に増殖させた後に、再び患者の体内に戻すという新たな試みが要請されている。この場合、患者自身から採取した骨髄から骨芽細胞を増殖させ、該患者の体内に戻すため、免疫反応を生じることなく骨の形成を活性化させることができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
一般的に、骨芽細胞の培養は、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）、血清、抗生剤などが混合された培地に、骨髄液を浸すことにより行われる。そして、この培地は、骨髄液から骨芽細胞を培養する過程において、数回取り替えが行われる。或いは、培地が循環されることで新しい培地が供給される。従来、培地交換において、使用済みとなった培地は廃棄されていたが、今後、この使用済みの培地を有効に利用することが求められている。
【０００４】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、細胞の培養に使用された使用済み培地を検査することにより、細胞の培養状態を確認することにより、細胞の培養に使用された培地を有効利用する細胞培養検査方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、細胞の培養に使用される培地を検査することにより培養状態を検査する細胞培養状態検査方法であって、使用されていた培地の成分を分析する第１の過程と、分析結果に基づいて、細胞の培養状態を判断する第２の過程とを具備する細胞培養状態検査方法を提供する。
【０００６】
また、上記細胞培養状態検査方法は、前記第１の過程において、前記細胞から産生される所定の成分を分析することを特徴とする。
【０００７】
また、上記細胞培養状態検査方法は、前記第１の過程において、前記培地に所定の刺激を与えた後に、前記培地の成分を分析することを特徴とする。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照し、本発明の一実施形態について説明する。
始めに、本実施形態に係る細胞培養状態検査方法が適用される細胞培養システムの概要について図１を参照して簡単に説明する。
【０００９】
まず、骨を培養するシステムについて、図１を参照して簡単に説明する。
図１において、病院１で患者から採取された骨髄は、所定の搬入容器に収容され、培養骨を形成する培養センタ２へ搬入される。なお、搬入容器は、約３７℃に保たれていても良く、また、４℃或いは冷凍されていても良い。
【００１０】
培養センタ２では、搬入された骨髄に含まれている間葉系幹細胞を培養する一次培養、培養された間葉系幹細胞をスキャホールドと呼ばれる足場材に加え培養骨を形成する二次培養、細菌や真菌が骨髄や培養液等に含まれていないかを調べる検査等が行われ、最終的に形成された培養骨が所定の搬出容器に収容されて、病院１へ搬出される。なお、搬入容器は、約３７℃に保たれていても良く、また、４℃或いは冷凍されていても良い。
なお、二次培養において使用されるスキャホールドは、スキャホールド供給センタ３から供給される。
【００１１】
次に、培養センタ２において行われる培養工程について図２を参照して簡単に説明する。
まず、病院１で患者から採取された骨髄は、所定の搬入容器に収容されて培養センタ２に搬入される。
培養センタ２では、搬入容器に収容されている骨髄細胞の一部を取り出し、採取された骨髄に細菌や真菌等が含まれていないかを検査する（ステップＳＰ１）。
【００１２】
そして、検査結果に異常が無ければ、骨髄液中に含まれている間葉系幹細胞の増殖工程へ移行する（ステップＳＰ２）。なお、この間葉系幹細胞の増殖工程を一次培養と称する。この一次培養では、真菌、細菌エンドトキシン等が含まれていないことが確認された検査済みの血清を含む培地（この培地は人或いは牛の血清が使用される）に、同じくステップＳＰ１において検査済みである骨髄を浸透させることにより、間葉系幹細胞を増殖させる。
【００１３】
そして、間葉系幹細胞が培養骨を形成するために必要とされる十分な量まで増殖すると、続いて、この間葉系幹細胞に真菌や細菌等が含まれていないかを検査し（ステップＳＰ３）、この結果、問題がなければ、培養骨を形成する二次培養へ移行する（ステップＳＰ４）。
二次培養では、一次培養によって増殖させた間葉系幹細胞をスキャホールドと呼ばれる足場材に附着させる。
このスキャホールドは、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材である。このスキャホールドに間葉系幹細胞を附着させることにより、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化が促進し、骨組織が形成される。なお、このとき骨芽細胞の分化を更に促進させるために、成長因子等を添加してもよい。なお、上記β−ＴＣＰに代わって、ハイドロキシアパタイト多孔体等のスキャホールドを用いても良い。
【００１４】
そして、このようにして形成された培養骨は、搬出前の検査、例えば、ウイルスやマイコプラズマ培養液、真菌、細菌が含まれていないかを検査する工程へ進み（ステップＳＰ５）、異常がなければ、所定の搬送用容器へ移し替えられ、病院１へ搬出される。
そして、培養骨を受け取った病院側では、該培養骨を患者に移植する移植手術が行われる。
【００１５】
次に、上述した図２のステップＳＰ２で行われる一次培養について図３を参照して説明する。
一次培養では、図３に示すように、培地１２に骨髄液を浸透させ、骨髄液中の間葉系幹細胞１１を培養骨を形成するために必要とされる十分な量まで増殖させる。上記培地１２は、１週間に１回〜３回の割合で交換される。これは、使用している培地１２を培養皿１０から取り出し、新しい培地１２Ａを培養皿１０に注ぐことにより行われる。
【００１６】
なお、新しい培地１２Ａは、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）、抗生剤、成長因子などの各種要素を混合したものである。
抗生剤は、例えば、ペニシリン系抗生物質などであり、成長因子は、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦや、これらを複合させたものなどの細胞の成長に寄与する物質である。また、細胞の増殖を更に活性化させるために、エストロゲンなどのホルモン剤や、ビタミンなどの栄養剤を混合するようにしても良い。
【００１７】
一方、培養皿１０から取り出された使用済み培地１２Ｂについては、その成分分析を行い、その分析結果に基づき細胞の培養状態を判断する。
上記分析においては、例えば、培地中のアルカリフォスファターゼ、酸素、二酸化炭素などの含有率や、酸性度などを分析する。このアルカリフォスファターゼは、細胞の活性度を示す成分であるため、この成分が多く含まれていれば、培養中の細胞の増殖が進んでいると判断することができる。
また、細胞から産成されるタンパク質などの成分を調べることにより、上記細胞の増殖状態を判断することも可能である。
なお、このとき使用済み培地に所定の刺激を与え、その後、培地中の成分を分析するようにしても良い。
【００１８】
また、上記成分分析の他、使用済み培地１２Ｂに真菌や細菌、エドトキシンなどが含まれているか否かを検査することにより、培養中の細胞がこれらの菌に感染しているか否かを判断することができる。
【００１９】
次に、上述した図２のステップＳＰ４において行われる二次培養について図４を参照して詳しく述べる。
二次培養では、一次培養によって増殖させた間葉系幹細胞１１をスキャホールドに附着させ、この細胞付きスキャホールド２１を図４に示すような培地２２に浸す。これにより、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化が促進し、骨組織が形成される。
【００２０】
この二次培養においては、培地２２は、１週間に１回〜３回の割合で交換される。これは、使用している培地２２を培養容器２０から取り出し、新しい培地２２Ａを培養容器２０に注ぐことにより行われる。なお、二次培養における新しい培地２２Ａは、上述した一次培養における新しい培地１２Ａとほぼその構成を同じくする。なお、抗生剤や、成長因子、ビタミン剤、ホルモン剤などの付加的な構成要素については、そのときの細胞の状態などに応じて適宜調整するようにしてもよい。
【００２１】
一方、培養容器２０から取り出された使用済み培地２２Ｂについては、その成分分析を行い、その分析結果に基づき骨芽細胞の分化状態を判断する。
上記分析においては、例えば、培地中のアルカリフォスファターゼ、酸素、二酸化炭素などの含有率や、酸性度などを分析する。このアルカリフォスファターゼは、細胞の活性度を示す成分であるため、この成分が多く含まれていれば、骨芽細胞の分化が進み、骨組織の形成が進んでいると判断することができる。
なお、このとき使用済み培地に所定の刺激を与え、その後、培地中の成分を分析するようにしても良い。
【００２２】
また、上述した実施形態においては、骨髄液を培養する場合について説明したが、これに代えて、末梢血や臍帯血などを用いても良い。
また、培地を環流させて細胞の培養を行う環流培養の場合には、使用済みの培地を一定期間毎に採取してそれを検査しても良い。
【００２３】
以上、この発明の実施形態を図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【００２４】
例えば、培養する細胞は、間葉系幹細胞の他、体性幹細胞、ＥＳ細胞、骨関連細胞、軟骨細胞などでも良い。更に、自家細胞でも他家細胞でも良い。
また、二次培養時には、β−ＴＣＰの代わりに以下のようにしても良い。
即ち、生体組織に親和性のある材料であれば何でも良く、生体吸収性の材料であればなお良い。また、多孔体でも良い。
多孔体とは、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、又は多孔体のメタルなどであり、多数の気孔を有するものであれば、これらに限定されない。
また、多孔体として、一般的にアパタイトやβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）などのリン酸カルシウム系セラミックス、コラーゲン、ポリ乳酸などを使用することができる。
【００２５】
また、リン酸カルシウム系セラミックスとコラーゲンを組み合わせたり、リン酸カルシウム系セラミックスとポリ乳酸を組み合わせたりしても良い。β−リン酸三カルシウム、コラーゲン、ポリ乳酸は、生分解性で生体に吸収される特徴を有し、アパタイトはその強度が高いという特徴を有する。
なお、当業者であれば、移植する部位などに応じて、適切な種類の多孔体を適宜選択して使用することができるのは言うまでもない。
【００２６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係る細胞培養状態検査方法によれば、使用されていた培地の成分を分析し、その分析結果に基づいて細胞の培養状態を判断するので、細胞に直接触れることなく、その増殖状態などを把握することができる。これにより、細胞が細菌などに感染することを防ぐことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞培養システムの概要を簡単に説明するための図である。
【図２】培養センタ２において行われる培養工程について説明するための図である。
【図３】一次培養で行われる培地交換について示した図である。
【図４】二次培養で行われる培地交換について示した図である。
【符号の説明】
１　病院
２　培養センタ
３　スキャホールド供給センタ
１０　培養皿
１１　間葉系幹細胞
１２　培地
１２Ａ　新しい培地
１２Ｂ　使用済み培地
２０　培養容器
２１　細胞付きスキャホールド
２２　培地
２２Ａ　新しい培地
２２Ｂ　使用済み培地
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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