(57)【要約】    【課題】  本発明は、腫瘍血管新生を阻害する効果を有する組成物を開発・提供し、併せてこの組成物を含む腫瘍の治療用医薬組成物または食品組成物を提供することを課題とする。    【解決手段】  本発明は、血管新生阻害活性を有するシイタケ菌糸体抽出物、および血管新生を阻害すべき疾患を治療するためのシイタケ菌糸体抽出物を含む医薬組成物、もしくは血管新生を阻害するためのシイタケ菌糸体抽出物を含む食品組成物を提供することにより、上記課題を解決できることを示した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シイタケ菌糸体抽出物を含む、血管新生阻害物質。
【請求項２】
腫瘍もしくは癌、慢性炎症または網膜症における血管新生を阻害する、請求項1に記載の血管新生阻害物質。
【請求項３】
血管新生を阻害すべき疾患を治療または予防するための、シイタケ菌糸体抽出物を含む医薬組成物。
【請求項４】
血管新生を阻害すべき疾患が腫瘍もしくは癌、慢性炎症または網膜症である、請求項3に記載の医薬組成物。
【請求項５】
血管新生を阻害するための、シイタケ菌糸体抽出物を含む食品組成物。
【請求項６】
腫瘍もしくは癌、慢性炎症または網膜症からなる血管新生を阻害すべき状態における血管新生を阻害するための、請求項5に記載の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な血管新生阻害物質を提供することに関する。本発明はまた、このような血管新生阻害物質を含む医薬組成物を提供することにも関する。本発明はさらに、このような血管新生阻害物質を含む食品組成物を提供することにも関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内における、腫瘍または癌の増殖・転移、リウマチ様関節炎や乾癬などの慢性炎症、糖尿病性網膜症などの網膜症、などの病態の進展過程において、腫瘍または癌の増殖や組織の肥大化の際にその組織に栄養を供給するため、新たな血管が形成される。これを血管新生という。このような新生血管の形成は、腫瘍もしくは癌の増殖、組織の肥大化に不可欠であり、このような新生血管の形成を抑制することができれば、腫瘍もしくは癌の増殖・転移、慢性炎症、網膜症などの病態を抑制することができると考えられている。
【０００３】
腫瘍細胞もしくは癌細胞は、1〜2 mm3程度の大きさになると、血管新生促進性の物質を産生し、腫瘍細胞もしくは癌細胞自体が増殖するために必要とする栄養および酸素を供給し、そしてこれらの細胞からの代謝老廃物を排出するための血管を新生する。このような新生血管が形成されることにより、これらの細胞の初期増殖が促進される。
【０００４】
また、網膜静脈閉塞症や増殖糖尿病網膜症などの網膜症を発生し、網膜毛細血管に閉塞領域が形成されると、低酸素状態に陥った網膜組織から血管形成因子が放出され、網膜に新生血管が形成される。このような新生血管は、硝子体組織の癒着などを引き起こし、場合により重篤な緑内障を発症することがある。その一方で、網膜色素上皮からは血管形成抑制因子を産生していることが知られており、通常の網膜組織はこのような血管形成抑制因子の存在により、病態の発症を予防していると考えられる。
【０００５】
このような血管新生の促進に際しては、生体内において、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子（aFGFおよびbFGF）、インターロイキン-8（IL-8）、などの血管形成誘導因子、マトリクスメタロプロテアーゼ（MMP）、そしてTNF-α、IL-1などの炎症性サイトカインが、病態とは関係なく共通して働いていることが知られている。正常な生体内組織においても、血管新生は行われているものの、過度な血管新生は生じない。これは、血管新生促進性因子の働きを、血管新生抑制性因子の働きによりコントロールしているためである。そして、血管新生抑制性因子の働きを血管新生促進性因子の働きが上回る時に、過剰な血管新生が生じ、上述した様々な病態を発生することとなる。
【０００６】
これらの新生血管の形成により特徴づけられる種々の症状は、組織への血管新生を抑制することにより治療・予防することができると考えられており、これまでにも腫瘍または癌の増殖に対する血管新生阻害物質の効果に関して、研究が行われてきた。これまでの研究においては、アンギオスタチン（O'Reilly, M.S., et al., Nature Med., 2:689-692, 1996；Kim, B., et al., Cancer Res., 57:1329-1334, 1997；漆崎一朗、癌治療と宿主、Vol.9, 381-392, 1997）、エンドスタチン（O'Reilly, M.S., et al., Cell, 88:277-285, 1997）、Aspergillus fumigatusに由来するフマギリン（fumagillin）およびその合成誘導体であるTNP-470（Ingber, D., et al., Nature, 348:555-557, 1990）、サイトジェニン（Oikawa, et al., Anticancer Res., 17:1881-1886, 1997）血小板因子-4（Gupta, S.K. and Singh, J.P., J. Cell. Biol., 127:1121-1127, 1994）、インターフェロンα（Sidky, Y.A. and Borden E.C., Cancer Res., 47:5155-5161, 1987）、IL-12（Majewski, S., et al., J. Invest. Dermatol., 106:1114-1117, 1996）、メタロプロテアーゼ阻害薬であるバチマスタット（BB-94）およびマリマスタット（BB-2516）（Taroboletti, G., et al., JNCI, 87:293-298, 1995）、などの合成化学物質の他、血管新生因子（von Willebrand因子、TGF、VEGFなど）に対する抗体（掛地吉弘、上原記念生命科学財団研究報告集、9:400-401, 1995）が、血管新生阻害物質として知られている。しかしながら、これらの物質は、副作用などを考慮しなければならないため、容易には使用できないという欠点が存在した。
【非特許文献１】O'Reilly, M.S., et al., Nature Med., 2:689-692, 1996
【非特許文献２】Kim, B., et al., Cancer Res., 57:1329-1334, 1997
【非特許文献３】漆崎一朗、癌治療と宿主、Vol.9, 381-392, 1997
【非特許文献４】O'Reilly, M.S., et al., Cell, 88:277-285, 1997
【非特許文献５】Ingber, D., et al., Nature, 348:555-557, 1990
【非特許文献６】Oikawa, et al., Anticancer Res., 17:1881-1886, 1997
【非特許文献７】Gupta, S.K. and Singh, J.P., J. Cell. Biol., 127:1121-1127, 1994
【非特許文献８】Sidky, Y.A. and Borden E.C., Cancer Res., 47:5155-5161, 1987
【非特許文献９】Majewski, S., et al., J. Invest. Dermatol., 106:1114-1117, 1996
【非特許文献１０】Taroboletti, G., et al., JNCI, 87:293-298, 1995
【非特許文献１１】掛地吉弘、上原記念生命科学財団研究報告集、9:400-401, 1995  このほかに、副作用がほとんど存在しないという特徴のため、食品由来の物質から血管新生阻害作用を有する物質を探す試みが行われてきた。例えば、サメ軟骨（八木田旭邦、Biotherapy, 14:973-982, 2000）、緑茶成分であるエピガロカテキン（EGC）やエピガロカテキン-3-没食子酸エステル（EGCG）（Cao, Y. and Cao, R., Nature, 398:381, 1999）、大豆のイソフラボン（Fotsis, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2690-2694, 1993）やゲニステイン（三浦ら、New Food Industry, 43:17-22, 2001）などに、血管新生阻害作用が存在することが報告された。
【非特許文献１２】八木田旭邦、Biotherapy, 14:973-982, 2000
【非特許文献１３】Cao, Y. and Cao, R., Nature, 398:381, 1999
【非特許文献１４】Fotsis, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2690-2694, 1993
【非特許文献１５】三浦ら、New Food Industry, 43:17-22, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、腫瘍血管新生を阻害する作用を有する物質を開発・提供し、併せてこの物質を含む腫瘍の治療用医薬組成物または食品組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の発明者らは、シイタケの生活環において、食用形態である子実体の前の形態である菌糸体から得られた抽出物（本明細書の以下において、「シイタケ菌糸体抽出物」という）が、血管新生抑制活性を有していることを新たに見出し、これに基づいて本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、シイタケ菌糸体抽出物を含む血管新生阻害物質、および血管新生を阻害すべき疾患を治療するためのシイタケ菌糸体抽出物を含む医薬組成物、もしくは血管新生を阻害するためのシイタケ菌糸体抽出物を含む食品組成物を提供することにより、上記課題を解決できることを示した。
【００１０】
本発明において、「血管新生を阻害する」という場合、VEGF、aFGF、bFGFなどの血管新生促進性因子の働きによる新たな血管新生を、完全にまたは部分的に抑制することができることをいう。このような活性により、血管新生が病態の発生に関与している疾患の発症および／または進行を、完全に阻害するかまたはその速度を遅くすることができる。
【００１１】
本発明において、上述したシイタケ菌糸体抽出物が有する血管新生阻害活性を利用して、血管新生を阻害すべき疾患を治療することができる。具体的には、上述したシイタケ菌糸体抽出物および場合により医薬的に許容可能な担体を組み合わせて投与することにより、血管新生を阻害すべき疾患を治療するための医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、経口投与用、注射用、経粘膜投与用、経消化管投与用、または経皮投与用などの投与経路のいずれであってもよい。そしてまた、本発明においては、上述したシイタケ菌糸体抽出物を含む食品組成物を提供する。この食品組成物は、食品形態、飲料形態または飼料形態のいずれの形態であってもよい。
【００１２】
ここで、「血管新生を阻害すべき疾患」とは、血管新生が病態の発生に重要な働きをしている疾患であれば、どのようなものでもよい。具体的には、血管新生を阻害すべき疾患は例えば、種々の組織に発生する固型腫瘍、骨髄腫、血管腫などの腫瘍もしくは癌；慢性関節性リウマチ、乾癬、変形性関節症などの慢性炎症；または加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、新生血管緑内障などの網膜症；などの疾患をあげることができるが、これらのものには限定されない。本発明においては、血管新生を阻害すべき疾患として、種々の腫瘍または癌を標的とすることが好ましい。
【００１３】
本発明において、「シイタケ菌糸体抽出物」という場合、シイタケを固体培地上で培養して得られる、菌糸体を含む固体培地を、水および酵素の存在下において粉砕、分解して得られる抽出物のことをいう。
【００１４】
シイタケ菌糸体抽出物は以下の方法により得られたものを使用することができる。すなわち、バガス（サトウキビのしぼりかす）と脱脂米糠を基材とする固体培地上にシイタケ菌を接種し、次いで菌糸体を増殖して得られる菌糸体を含む固体培地を12メッシュ通過分が30重量％以下となるよう解束する。この解束された固体培地に水およびセルラーゼ、プロテアーゼまたはグルコシターゼから選ばれる酵素の1種またはそれ以上を、前記固体培地を30〜55℃の温度に保ちながら添加するとともに、前記固体培地を前記酵素の存在下に粉砕し、すりつぶしてバガス繊維の少なくとも70重量％以上が12メッシュ通過分であるようにする。次いで95℃までの温度に加熱することにより酵素を失活させるとともに滅菌し、得られた懸濁状液を濾過することによってシイタケ菌糸体抽出物を得る。シイタケ菌糸体抽出物は、そのまま用いてもよいが、これを濃縮、凍結乾燥して粉末として保存し、使用時に種々の形態で使用するのが便宜的である。凍結乾燥して得られる粉末は褐色粉末で、吸湿性があり、特異な味と臭いをもつ。
【００１５】
この様に得られたシイタケ菌糸体抽出物は、血管新生を阻害する効果を有することが見出された。このような効果を試験する方法は、in vivoおよびin vitroについて、当該技術分野において確立されている。
【００１６】
シイタケ菌糸体抽出物が有する血管新生阻害活性をin vitroにおいて調べるためには、培養条件下で血管内皮細胞と線維芽細胞とを、必要に応じて血管新生誘導性因子であるVEGFの存在下にて、共培養させることにより管腔形成初期段階の増殖状態が作り出された培養中に、シイタケ菌糸体抽出物を添加して、血管新生の抑制が生じるかどうかを確認することができる。血管新生の抑制は、例えば管腔を染色して管腔形成が抑制されているかどうかを調べることにより行うことができる。このようなin vitroにおける血管新生の阻害効果を調べるためのキットとしては、血管新生キット（KURABO, Osaka, Japan）を、管腔を染色するためには抗CD31抗体や抗フォン-ウィルブランド因子抗体などの抗体を使用する管腔染色キット（KURABO, Osaka, Japan）を、それぞれ使用することができる。
【００１７】
シイタケ菌糸体抽出物が有する血管新生阻害活性をin vivoにおいて調べるためには、受精鶏卵の漿尿膜を用いたCAM法（Gitterman, C.O. and Luell, S., Proc. Amer. Ass. Cancer Res., 10:29 (1969)）、ハムスターの頬袋を使用するチークポーチ法（Greenblatt, M. and Shubik, P., J. Natl. Cancer Inst., 41:111-124 (1968)）、ウサギなどの角膜を用いたコルネア法（Gimbrone, M.A., et al., J. Natl. Cancer Inst., 52:413-427 (1974)）、そしてマウスあるいはラットを用いた背部皮下法（Folkman, J., et al., J. Exp. Med., 133:275-288 (1971)）などを使用することができる。例えば、背部皮下法は、腫瘍細胞を封入したミリポアチャンバー（ミリポアリング（ミリポア社）の両面にフィルター（ミリポア社）を接着させた、内部に空洞を有するチャンバー）を、マウスまたはラットの側背部皮下にあらかじめ作製したポーチ中に移植し、そのチャンバーに血管が分布する程度を測定することにより、血管新生を調べることができる。
【００１８】
このようなシイタケ菌糸体抽出物が有する血管新生を阻害する作用を利用することにより、シイタケ菌糸体抽出物および場合により医薬的に許容可能な担体を含む、血管新生を阻害すべき疾患を治療または予防するための、ヒト用もしくは獣医用医薬組成物を提供することができる。この医薬組成物は、治療を目的としたものであっても予防を目的としたものであってもよいが、両方を目的としてもよい。本発明の医薬組成物は、シイタケ菌糸体抽出物そのものであってもよく、あるいは、シイタケ菌糸体抽出物および薬学上許容可能な担体を含有するものであってもよい。さらに、シイタケ菌糸体抽出物と他の有効成分とを組み合わせたものであってもよい。
【００１９】
治療用および／または予防用組成物としての投与経路は、経口投与が最も好ましいが、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、経皮投与などであってもよい。経口投与に適した製剤には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、シロップ剤などが含まれるが、これに限定されない。経鼻投与または経皮投与に適した製剤には、パップ剤、貼布剤などが含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
薬剤的に許容できる担体には、当該技術分野で公知の適当な賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香料、着色剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などを含むが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明のシイタケ菌糸体抽出物の投与量は、被検体の年齢、体重、症状、投与経路などを考慮して医師もしくは獣医師により決定される。本発明の医薬組成物に含まれるシイタケ菌糸体抽出物は元来食品として使用されてきたものであり、極めて安全であるところから、投与量を厳しく限定する必要はないが、通常シイタケ菌糸体抽出物を、好ましくは1日1〜数回（1〜3回程度）、1回100 mg〜10000 mg、より好ましくは、1回あたり300 mg〜3000 mg、さらに好ましくは、1回あたり500 mg〜1000 mgである。これは、総投与量としてみた場合、好ましくは1日あたり100 mg〜30000 mg、より好ましくは1日あたり300 mg〜9000 mg、さらに好ましくは1日あたり500 mg〜3000 mgさらに、他の抗腫瘍剤と併用して投与してもよい。
【００２２】
本発明においてはまた、シイタケ菌糸体抽出物および場合により食品中に添加可能な担体を含む、血管新生を阻害するための、ヒト用もしくは獣医用食品組成物を提供することができる。この食品組成物は、血管新生を阻害すべき疾患の症状の改善を目的としたものであってもその予防を目的としたものであってもよいが、両方を目的としてもよい。本発明の食品組成物は、シイタケ菌糸体抽出物そのものであってもよく、あるいは、シイタケ菌糸体抽出物および食品中に添加可能な担体を含有するものであってもよい。さらに、シイタケ菌糸体抽出物と他の有効成分とを組み合わせたものであってもよい。
【００２３】
本発明のシイタケ菌糸体抽出物を含む食品組成物は、食品の形態で提供することもできる。好ましい食品の形態としては粉末、顆粒、ペースト状、ゼリー状などが挙げられる。さらに顆粒等にする場合は、甘味を加えるため、乳糖などの糖類を加えてもよい。また、本発明のシイタケ菌糸体抽出物を含む食品組成物は、飲料の形態で提供することもできる。このような食品または飲料には、シイタケ菌糸体抽出物の他に、ビタミン剤、カルシウムなどの無機成分、アルコール類、ポリフェノールなどの消臭成分などを追加してもよい。この食品または飲料には、特定保健用食品、病者用食品等の範疇にあるものも含まれる。
【００２４】
本発明のシイタケ菌糸体抽出物を含む食品組成物は、飼料としてまたは飼料への添加剤の形態で提供することもできる。家畜の飼料としてまたは飼料への添加剤として本発明の血管新生阻害活性を有するシイタケ菌糸体抽出物を使用することにより、家畜に発生する血管新生を阻害すべき疾患を治療および／または予防することができる。その結果、家畜について現在使用されている治療薬、たとえば抗生物質などの使用量を減少することができ、それに伴って飼育コストを低下することができる。
【００２５】
本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、これにより本発明の範囲を限定するものではない。本発明の方法を種々変更、修飾して使用することが当業者には可能であり、これらも本発明の範囲に含まれる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明において、シイタケ菌糸体抽出物が、有意な血管新生の阻害効果を有することを見出した。これにより、副作用が少ない、血管新生阻害活性を有する組成物を新たに提供することができる。
【００２７】
また、シイタケ菌糸体抽出物が免疫活性増強作用を有することは以前から知られている。したがって、本発明のシイタケ菌糸体抽出物を、癌または腫瘍の治療に使用すれば、免疫活性増強作用に加えて血管新生の阻害作用を同時に発揮することができ、他の血管新生阻害活性を有する食品（例えばサメの軟骨）と比べても、より効率的に癌または腫瘍の治療を行うことができる。
【実施例】
【００２８】
実施例1：シイタケ菌糸体抽出物の調製
バガス90重量部、米糠10重量部からなる固体培地に純水を適度に含ませた後に、シイタケ種菌を接種し、温度および湿度を調節した培養室内に放置し、菌糸体を増殖させた。菌糸体が固体培地に蔓延した後、バガス基材の繊維素を解束し、12メッシュ通過分が24重量％以下となるようにした。この解束された培地1.0kgに、純水3.5 Lおよび精製セルラーゼ2.0 gを固体培地を40℃に保ちながら加えて培地含有混合物とした。
【００２９】
次いで培地含有混合物を変速付ギヤーポンプにより循環させながら、固体培地にギヤー部分において粉砕およびすりつぶし作用を200分間程度加え、バガス繊維の約80重量％が12メッシュ通過分となるようにした。培地含有混合物の粉砕およびすりつぶしは、該混合物の温度を徐々に上昇させながら行った。その後培地含有混合物をさらに加熱して、90℃として30分間放置した。90℃への加熱により、酵素を失活せしめ、かつ殺菌を施した。得られた培地含有混合液を60メッシュ濾布を用いて濾過してシイタケ菌糸体抽出液を得た。これを濃縮した後、凍結乾燥し、シイタケ菌糸体抽出物原末を得た。
【００３０】
このようにして得られるシイタケ菌糸体抽出物はフェノール硫酸法による糖質分析により糖質を25.3％（w/w）、Lowry法によるタンパク質分析によりタンパク質を19.7％（w/w）、没食子酸を標準とするFolon-Denis法によりポリフェノールを2.6％（w/w）含んでいた。シイタケ菌糸体抽出物にはそのほかに粗脂肪8％、粗灰分22％、糖質以外の可溶性無窒素物を約20％含む。
【００３１】
また、シイタケ菌糸体抽出物の構成糖組成（％）は以下の通りであった：Xyl：15.2；Ara：8.2；Man：8.4；Gul：39.4；Gal：5.4；GlcN：12.0；GLuUA：11.3。
実施例2：シイタケ菌糸体抽出物のin vitroでの血管新生阻害効果
本実施例においては、シイタケ菌糸体抽出物がin vitroにおいて血管新生阻害活性を発揮することができることを、血管新生キット（KURABO, Osaka, Japan）を使用して確認した。
【００３２】
実施例1で調製したシイタケ菌糸体抽出物を、最終濃度として200μg/ml（L.E.M.200群）、最終濃度として100μg/ml（L.E.M.100群）、最終濃度として50μg/ml（L.E.M.50群）、最終濃度として10μg/ml（L.E.M.10群）となるように、キットに付属する血管新生専用培地-2に溶解させることにより、それぞれの被験培地を用意する。また、対照群として何も添加しない血管新生専用培地-2を被験培地として用意する。
【００３３】
血管新生キットは、培養条件下で、ヒト臍帯静脈由来の初代血管内皮細胞とヒト成人皮膚由来の初代線維芽細胞とを、血管新生キットに付属する血管新生専用培地-2を用いて、共培養させて管腔形成初期段階の増殖状態が作り出された培養物をウェル中に含む。このような状態の上述の血管新生キット中の24ウェルプレートを37℃に移し、3時間インキュベートする。3時間のインキュベート後、各ウェルから培地を除去し、その後ウェル中に上述のように調製した各種被検培地を2〜3 ml添加する。このような処理を行った24-ウェルプレートを、37℃、5％CO2、湿潤条件のインキュベーター中にて培養する。
【００３４】
培養開始後4日、7日および9日の時点で、それぞれの培地を新鮮なそれぞれの被検培地により交換し、さらに培養を継続する。培養開始後11日目に、24ウェルプレート中で培養した血管新生の抑制が生じるかどうかを確認する。
【００３５】
培養開始後11日目に、各ウェルの培地を吸引除去した後、ウェルを1 mlの洗浄緩衝液（ダルベッコのPBS（-）；0.2 g/L KCl、0.2 g/L KH2PO4、8 g/L NaCl、1.15 g/L Na2HPO4）を用いて洗浄する。この洗浄緩衝液を吸引除去した後、氷冷した固定液（70％エタノール）を各ウェルに1 mlずつ添加し、室温にて30分間静置した。30分後に各ウェルの固定液を吸引除去し、各ウェルを1 mlのブロッキング剤（1％BSAを含有する上記洗浄緩衝液）で洗浄する。
【００３６】
血管新生の抑制は、管腔染色キット（KURABO, Osaka, Japan）を使用して、管腔をマウス抗ヒトCD31抗体を使用して染色して管腔形成が抑制されているかどうかを調べることにより測定した。具体的には、キットに含まれるマウス抗ヒトCD31抗体をブロッキング剤にて4000倍希釈した一次抗体を、各ウェルに対して0.5 mlずつ添加し、37℃にて60分間インキュベートする。一次抗体による60分間のインキュベーション期間経過後、各ウェルをブロッキング剤にて洗浄し（1 ml×3回）、その後キットに含まれるヤギ抗マウスIgG抗体-アルカリホスファターゼ複合体をブロッキング剤にて500倍希釈した二次抗体を各ウェルに0.5 mlずつ添加し、さらに37℃にて60分間インキュベートする。
【００３７】
二次抗体によるインキュベーション期間中に、キットに付属のBCIP/NBT錠剤2錠を、20 mlの蒸留水中に溶解し、ポアサイズ0.2μmのフィルターにて濾過滅菌し、基質溶液を別途調製する。そして二次抗体による60分間のインキュベーション期間経過後、二次抗体を注意深く吸引除去し、各ウェルを蒸留水で洗浄する（1 ml×3回）。洗浄後の各ウェルに、上述した基質溶液を0.5 mlずつ分注し、管腔が深紫色に染色されるまで、37℃にて5〜10分間インキュベートして染色する。染色後、各ウェルを蒸留水にて洗浄し（1 ml×3回）、この洗浄用蒸留水を除去した後、自然乾燥させる。
【００３８】
このように染色された管腔を、血管新生定量ソフトウェア（KURABO, Osaka, Japan）により測定した。新生血管の長さ総和に関する結果を図1に、そして新生血管の面積総和に関する結果を図2に、それぞれ示す。
【００３９】
図1および図2から明らかなように、培養液中に添加されたシイタケ菌糸体抽出物の量が増加すると共に、培養中の新生血管の伸長および拡張ともに、濃度依存的に抑制されることが明らかになった。このことから、本発明のシイタケ菌糸体抽出物は、ヒト細胞を用いたin vitroでの実験において、血管新生抑制因子として機能することが明らかになった。
【００４０】
実施例3：シイタケ菌糸体抽出物のin vitroでの血管新生阻害効果
本実施例においては、シイタケ菌糸体抽出物がin vitroにおいて、ヒト腫瘍細胞が誘導する血管新生に対して阻害活性を発揮することができることを、ヒト肺癌細胞A549細胞とヒト臍帯静脈内皮細胞を使用して確認した。
【００４１】
24ウェルプレート用セルカルチャーインサート（0.4μm孔、ベクトンディッキンソン社）のPETメンブレン上部に、細胞外基質としてマトリゲル（5 mg/ml、ベクトンディッキンソン社）の原液を50μL加えて、ゲルが固まるまで37℃で1時間静置する。
【００４２】
ダルベッコの改変イーグル培養液（D-MEM培養液）にFBSを10%(v/v)となるように加えた培養液組成中に、癌細胞としてヒト肺癌細胞であるA549細胞を懸濁した細胞懸濁液（2×105 cells/ml）400μLを、24ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社）に分注し、37℃、5％CO2条件で24時間培養する。24時間後に各ウェルを洗浄緩衝液（ダルベッコのPBS（-）：0.2 g/L KCl、0.2 g/L KH2PO4、8 g/L NaCl、1.15 g/L Na2HPO4）で2回洗浄し、次いで上記記載のD-MEM培養液の新しい培地を800μL加え、37℃、5％CO2条件で4時間培養する。
【００４３】
培養後、マトリゲルをコーティングしたセルカルチャーインサートをA549細胞が培養されている24ウェルプレートの各ウェルに挿入する。このセルカルチャーインサート中に、D-MEM培養液中の血管内皮細胞懸濁液（4×104 cells/mlヒト臍帯静脈内皮細胞、旭テクノグラス社）を200μL加える。24ウェルプレートのウェル内部と、セルインサート内部の両方ともに、実施例1で調製したシイタケ菌糸体抽出物を最終濃度として50μg/ml、200μg/ml、500μg/mlとなるように、D-MEM培養液中に溶解させる。この場合、D-MEM培養液中にそれぞれ5 mg/ml、20 mg/ml、および50 mg/mlのシイタケ菌糸体抽出物を含有する溶液をそれぞれ、24ウェルプレートのウェル内部には8μLずつ、セルインサート内部には2μLずつ、各ウェル、各インサートに添加する。対照としては、培養液中のシイタケ菌糸体抽出物の含有量が0μg/mlとなるよう24ウェルプレートのウェル内部には8μL、セルインサート内部には2μLのD-MEM培養液を添加した。このようにして調製した培養物を37℃、5％CO2の湿潤条件下で培養する。
【００４４】
培養開始24時間後に、セルカルチャーインサート中のマトリゲル内で血管内皮細胞により形成される新生血管が、シイタケ菌糸体抽出物により抑制されるかどうかを確認する。血管新生が抑制されているかどうかは、24時間後に、セルカルチャーインサートのマトリゲル上の血管内皮細胞により形成された管腔を、顕微鏡下で写真撮影（2048×1536ピクセル）し、その伸長した新生血管の長さの総和を画像解析ソフト（Data Picker フリーソフトウェアー）を使用して測定することで行った。
【００４５】
結果を図3に示す。この図において明らかなように、新生血管の長さの総和は、シイタケ菌糸体抽出物の濃度が増加するにつれて、その濃度に依存して短くなる、すなわち血管新生が抑制されることが明らかになった。このことからも、本発明のシイタケ菌糸体抽出物は、ヒト細胞を用いたin vitroでの実験において、血管新生抑制因子として機能することが明らかになった。
【００４６】
実施例4：シイタケ菌糸体抽出物のin vivoでの血管新生阻害効果
本実施例においては、背部皮下法を用いて、シイタケ菌糸体抽出物がin vivoにおいて血管新生阻害活性を発揮することができることを確認した。
【００４７】
ミリポアリング（外径14 mm、内径10 mm、高さ2 mm、容量0.2 ml、ミリポア社）の両面に、MFセメント（ミリポア社）を用いてフィルター（ポアサイズ0.45μm、ミリポア社）を接着させ、内部に空洞を有するチャンバーを作製する。このチャンバーを風乾した後、90℃で24時間以上乾熱滅菌する。このチャンバーに、S-180群としてダルベッコのPBS（-）（0.2 g/L KCl、0.2 g/L KH2PO4、8 g/L NaCl、1.15 g/L Na2HPO4）中で1×107個／mlにしたマウスザルコーマS-180細胞を、対照群としてPBS（-）のみを、それぞれ注射器を用いて200μl注入し（2×106個／チャンバー）、注入口をナイロン棒（ミリポア社）で閉鎖する。細胞注入後のチャンバーは、移植するまで、氷冷PBS（-）中に静置する。
【００４８】
7週齢のメスICRマウス（チャールズリバー）の尾根部をあらかじめ剃毛しておき、S-180群に対しては、（A）0.1 ml/10 g体重の蒸留水（n＝6）（S-180-蒸留水群）および（B）実施例1において調製した25 mg/mlのシイタケ菌糸体抽出物を0.1 ml/10 g体重（250 mg/kg体重に相当）（n＝6）（S-180-抽出物群）を、（C）対照群に対しては0.1 ml/10 g体重の蒸留水（n＝6）を、それぞれチャンバーの挿入の1時間前に経口投与する。
【００４９】
このマウスをネンブタールで麻酔して、腹臥位に保定する。尾根部から、26Gの注射針を用いて、10 ml程度の空気を送り込み、皮下にエアポーチを作製する。ついで、尾根部から頭側に約1 cm程度のところの皮膚を、チャンバーが挿入できる程度の長さにわたって、正中と垂直方向に切開し、皮下にチャンバーを挿入する。チャンバーを側腹部まで挿入したら、切開創を消毒し、ミュッヘル針で止める。術後のマウスは、20〜25℃、12時間明条件-12時間暗条件、自由飲水、自由摂食の条件下にて、飼育した。
【００５０】
手術後、（A）群には0.1 ml/10 g体重の蒸留水を、（B）群には実施例1において調製した25 mg/mlのシイタケ菌糸体抽出物を0.1 ml/10 g体重（250μg/kg体重に相当）を、そして（C）群には0.1 ml/10 g体重の蒸留水を、それぞれ毎日1回、経口投与する。チャンバーを移植して7日後に、マウスを再びネンブタールで麻酔し、腹臥位に保定する。背部を広く方形に切開し、チャンバーに分布した血管を損傷しないように慎重に皮膚を剥離する。皮膚側のチャンバー接触部分を写真撮影し、新生血管のうち2 mm以上の血管を1ポイントとしてカウントし、測定した。
【００５１】
結果を、以下の表1および図4に示す。
【００５２】
【表１】
2004196791.tif 000002
【００５３】
この結果から、シイタケ菌糸体抽出物は、S-180細胞の移植により生じる血管新生を、実施例1で調製したシイタケ菌糸体抽出物により有意に阻害することができることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明において、シイタケ菌糸体抽出物が、有意な血管新生の阻害効果を有することを見出した。これにより、副作用が少ない、血管新生阻害活性を有する組成物を新たに提供することができる。
【００５５】
また、シイタケ菌糸体抽出物が免疫活性増強作用を有することは以前から知られている。したがって、本発明のシイタケ菌糸体抽出物を、癌または腫瘍の治療に使用すれば、免疫活性増強作用に加えて血管新生の阻害作用を同時に発揮することができ、他の血管新生阻害活性を有する食品（例えばサメの軟骨）と比べても、より効率的に癌または腫瘍の治療を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図1は、本発明のシイタケ菌糸体抽出物が、ヒト成人皮膚由来の初代線維芽細胞に対して、ヒト臍帯静脈由来の初代血管内皮細胞により形成される新生血管の長さの総和に対して、in vitroで濃度依存的な阻害活性を有することを示すグラフである。
【図２】図2は、本発明のシイタケ菌糸体抽出物が、ヒト成人皮膚由来の初代線維芽細胞に対して、ヒト臍帯静脈由来の初代血管内皮細胞により形成される新生血管の面積総和に対して、in vitroで濃度依存的な阻害活性を有することを示すグラフである。
【図３】図3は、本発明のシイタケ菌糸体抽出物が、ヒト肺癌細胞A549細胞に誘導されて、ヒト臍帯静脈内皮細胞により形成される新生血管の長さの総和に対して、in vitroで濃度依存的な阻害活性を有することを示すグラフである。
【図４】図4は、本発明のシイタケ菌糸体抽出物が、in vivoにおける背部皮下法において、S-180マウスザルコーマ細胞への血管新生を阻害することを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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