(57)【要約】【課題】全体に培養細胞を良好に浸透させることができる生体組織補填体、生体組織補填体の製造方法および手術方法の提供。【解決手段】多孔質の生体組織補填材１２に培養細胞１５を付与することにより生体組織欠損部に補填される生体組織補填体１１を製造する製造方法であって、培養細胞１５をゲル状生体吸収材料１７で包埋しゲル状体１９として生体組織補填材１２の内部空間１３に入れることで、浸透性を増大させる。【選択図】　　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞及び又は成長因子をゲル状生体吸収材料で包埋して生体組織補填材の内部空間に入れてなることを特徴とする生体組織補填体。
【請求項２】
培養細胞及び又は成長因子をゲル状生体吸収材料で包埋して、培養細胞及び又は成長因子付きの生体組織補填材の内部空間に入れてなることを特徴とする生体組織補填体。
【請求項３】
多孔質の生体組織補填材に培養細胞を付与することにより生体組織欠損部に補填される生体組織補填体を製造する製造方法であって、
前記培養細胞をゲル状生体吸収材料で包埋して前記生体組織補填材の内部空間に入れることを特徴とする生体組織補填体の製造方法。
【請求項４】
前記培養細胞を前記ゲル状生体吸収材料で包埋し前記生体組織補填材の内部空間に入れた状態で二次培養することを特徴とする請求項３記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項５】
前記培養細胞を前記ゲル状生体吸収材料で包埋し二次培養した後に前記生体組織補填材の内部空間に入れることを特徴とする請求項３記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項６】
前記生体組織補填材として細胞濃縮液を浸透させてなるものを用いることを特徴とする請求項３乃至５のいずれか一項記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項７】
前記生体組織補填材に浸透させた状態の細胞濃縮液の細胞を培養することを特徴とする請求項６記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項８】
培養細胞及び又は成長因子をゲル状生体吸収材料で包埋したものと、培養細胞及び又は成長因子付きの生体組織補填体とを混合して、生体組織欠損部へ補填することを特徴とする手術方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体組織欠損部を再生する際に使用される生体組織補填体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨欠損部等の生体組織欠損部に骨補填材等の生体組織補填材を補填することにより、骨等の生体組織を再生させて骨欠損部等の生体組織欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨組織に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄液に含まれる間葉系幹細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される骨補填体を使用することが提案されている。培養されることにより骨補填材を足場にして増殖した多くの間葉系幹細胞を含む骨補填体を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる。このような骨補填体は、骨髄液を所定の培養条件で一次培養して細胞数を増やし、この培養細胞を多孔質ブロック状の骨補填材に播種して二次培養を行うことで製造されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記従来の方法では、多孔質の骨補填材の気孔性状をかなり良好なものとしても、骨補填材の全体に培養細胞を十分に浸透させることができないという問題があった。
【０００５】
したがって、本発明は、全体に培養細胞を良好に浸透させることができる生体組織補填体、生体組織補填体の製造方法および手術方法の提供を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、請求項１に係る発明は、培養細胞及び又は成長因子をゲル状生体吸収材料で包埋して生体組織補填材の内部空間に入れてなることを特徴としている。
【０００７】
これにより、培養細胞及び又は成長因子がゲル状生体吸収材料に包埋されることで、浸透性が増大し、その結果、培養細胞が良好に浸透させられることになる。
【０００８】
請求項２に係る発明は、培養細胞及び又は成長因子をゲル状生体吸収材料で包埋して、培養細胞及び又は成長因子付きの生体組織補填材の内部空間に入れてなることを特徴としている。
【０００９】
これにより、培養細胞及び又は成長因子がゲル状生体吸収材料に包埋されることで、浸透性が増大し、その結果、培養細胞が良好に浸透させられることになる。
【００１０】
請求項３に係る発明は、多孔質の生体組織補填材に培養細胞を付与することにより生体組織欠損部に補填される生体組織補填体を製造する製造方法であって、前記培養細胞をゲル状生体吸収材料で包埋して前記生体組織補填材の内部空間に入れることを特徴としている。
【００１１】
これにより、培養細胞がゲル状生体吸収材料に包埋されることで、浸透性が増大し、その結果、培養細胞が多孔質の生体組織補填材に良好に浸透させられることになる。
【００１２】
請求項４に係る発明は、請求項３に係る発明に関して、前記培養細胞を前記ゲル状生体吸収材料で包埋し前記生体組織補填材の内部空間に入れた状態で二次培養することを特徴としている。
【００１３】
これにより、培養細胞が多孔質の生体組織補填材に良好に浸透させられながら二次培養されることになる。
【００１４】
請求項５に係る発明は、請求項３に係る発明に関して、前記培養細胞を前記ゲル状生体吸収材料で包埋し二次培養した後に前記生体組織補填材の内部空間に入れることを特徴としている。
【００１５】
これにより、二次培養された培養細胞が多孔質の生体組織補填材に良好に浸透させられることになる。
【００１６】
請求項６に係る発明は、請求項３乃至５のいずれか一項に係る発明に関して、前記生体組織補填材として細胞濃縮液を浸透させてなるものを用いることを特徴としている。
【００１７】
このように、生体組織補填材として細胞濃縮液を浸透させてなるものを用いるため、培養細胞が浸透しきれない部分が生体組織補填材に仮にあったとしても、この部分にも細胞を存在させることができる。
【００１８】
請求項７に係る発明は、請求項６に係る発明に関して、前記生体組織補填材に浸透させた状態の細胞濃縮液の細胞を培養することを特徴としている。
【００１９】
このように、生体組織補填材に浸透させた状態の細胞濃縮液の細胞を培養することで培養細胞にできるため、ゲル状生体吸収材料に包埋された培養細胞が浸透しきれない部分が生体組織補填材に仮にあったとしても、この部分にも培養細胞を存在させることができる。
【００２０】
請求項８に係る発明は、培養細胞及び又は成長因子をゲル状生体吸収材料で包埋したものと、培養細胞及び又は成長因子付きの生体組織補填体とを混合して、生体組織欠損部へ補填することを特徴としている。
【００２１】
これにより、培養細胞及び又は成長因子がゲル状生体吸収材料に包埋されることで、浸透性が増大し、その結果、培養細胞が良好に浸透させられることになる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明の第１実施形態を図１を参照して以下に説明する。
【００２３】
第１実施形態において、生体組織補填体は、骨欠損部に補填される骨補填体１１であって、多孔質の骨補填材（生体組織補填材）１２を有している（図１（Ａ）参照）。この骨補填材１２は、例えば、特開平５−２３７１７８号公報に開示されている方法により製造されたβ−ＴＣＰからなるもので、中央に内部空間１３が形成された有底円筒状に形成されている。
【００２４】
患者の腸骨から骨髄液を抽出し、この骨髄液を遠心分離等の適宜の濃縮処理あるいは一次培養を行うことによって所望の不要成分を除去した間葉系幹細胞を含む細胞濃縮液１６を作成する（図１（Ａ）参照）。
【００２５】
そして、この細胞濃縮液１６を多孔質の骨補填材１２の全体に浸透させる（図１（Ｂ）参照）。このとき、細胞濃縮液１６に成長因子を付加しても良く、細胞濃縮液に換えて成長因子のみとしても良い。成長因子としては、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ等を採用できる。
【００２６】
一方、同じ患者の骨髄液を所定の一次培養条件で培養することによって間葉系幹細胞を含む培養細胞１５を得る（図１（Ｃ）参照）。
【００２７】
生体吸収材料であるコラーゲンゲル（ゲル状生体吸収材料）１７を準備する（図１（Ｃ）参照）。
【００２８】
上記培養細胞１５をコラーゲンゲル１７で包埋してゲル状体１９とする（図１（Ｄ）参照）。このとき、培養細胞に成長因子を付加しコラーゲンゲル１７で包埋してゲル状体１９としても良い。成長因子としては、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ等を採用できる。
【００２９】
ゲル状体１９を、細胞濃縮液１６を浸透させた骨補填材１２の中央の内部空間１３に入れる（図１（Ｅ）参照）。
【００３０】
次に、上記骨補填材１２を例えば骨芽細胞への分化誘導因子であるデキサメタゾン等を含む骨形成培地１８に入れてゲル状体１９に含まれる培養細胞１５を二次培養する（図１（Ｆ）参照）。このとき、ゲル状体１９に含まれる培養細胞１５が骨補填材１２を足場にして増殖し、骨補填材１２の内部に浸透して、骨補填材１２とともに骨補填体１１となる。
【００３１】
このようにして得られた骨補填体１１が手術によって患者の骨欠損部に補填されることになる。なお、ゲル状体１９を、細胞濃縮液１６を浸透させた骨補填材１２の中央の内部空間１３に入れた状態（図１（Ｅ）参照）のものを骨欠損部に補填しても良い。
【００３２】
以上に述べたように、第１実施形態によれば、培養細胞１５がコラーゲンゲル１７に包埋されることで、浸透性が増大し、その結果、培養細胞１５が多孔質の骨補填材１２に良好に浸透させられることになる。しかも培養細胞１５が骨補填材１２に良好に浸透させられながら二次培養されることになる。したがって、骨補填材１２の全体に培養細胞１５を良好に浸透させてなる骨補填体１１を得ることができる。
【００３３】
加えて、骨補填材１２として細胞濃縮液１６を浸透させてなるものを用いるため、培養細胞１５が浸透しきれない部分が骨補填材１２に仮にあったとしても、この部分にも細胞を存在させることができる。
【００３４】
本発明の第２実施形態を図２を参照して第１実施形態との相違部分を中心に以下に説明する。なお、第１実施形態と同様の部分には同一の符号を付しその説明は略す。
【００３５】
第１実施形態と同様、患者の腸骨から骨髄液を抽出し、この骨髄液を遠心分離等の適宜の濃縮処理あるいは一次培養を行うことによって所望の不要成分を除去した間葉系幹細胞を含む細胞濃縮液１６を作成する（図２（Ａ）参照）。
【００３６】
そして、この細胞濃縮液１６を多孔質の骨補填材１２の全体に浸透させる（図２（Ｂ）参照）。このとき、細胞濃縮液１６に成長因子を付加しても良い。成長因子としては、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ等を採用できる。
【００３７】
骨補填材１２に浸透させられた状態の細胞濃縮液１６の細胞について、例えば骨芽細胞への分化誘導因子であるデキサメタゾン等を含む骨形成培地１８にて培養する（図２の（Ｃ）参照）。
【００３８】
一方、同じ患者の骨髄液を所定の一次培養条件で培養することによって間葉系幹細胞を含む培養細胞１５を得る（図２（Ｄ）参照）。
【００３９】
生体吸収材料であるコラーゲンゲル（ゲル状生体吸収材料）１７を準備する（図２（Ｄ）参照）。
【００４０】
上記培養細胞１５をコラーゲンゲル１７で包埋してゲル状体１９とする（図２（Ｅ）参照）。このとき、培養細胞に成長因子を付加しコラーゲンゲル１７で包埋してゲル状体１９としても良い。成長因子としては、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ等を採用できる。
【００４１】
そして、ゲル状体１９に含まれる培養細胞１５を例えば骨芽細胞への分化誘導因子であるデキサメタゾン等を含む骨形成培地１８に入れて二次培養する（図２（Ｆ）参照）。
【００４２】
以上のようにして、二次培養された培養細胞１５を含むゲル状体１９を、必要により適宜の大きさにして、細胞が培養された骨補填材１２の中央の内部空間１３に入れることで骨補填体１１とする（図２（Ｇ）参照）。
【００４３】
このようにして得られた骨補填体１１が手術により患者の骨欠損部に補填されることになる。
【００４４】
以上に述べたように、第２実施形態によれば、培養細胞１５がコラーゲンゲル１７に包埋されることで、浸透性が増大し、その結果、培養細胞１５が多孔質の骨補填材１２に良好に浸透させられることになる。
【００４５】
しかも、骨補填材１２に浸透させた状態の細胞濃縮液１６の細胞を培養することで培養細胞にできるため、コラーゲンゲル１７に包埋された培養細胞１５が浸透しきれない部分が骨補填材１２に仮にあったとしても、この部分にも培養細胞を存在させることができる。
【００４６】
なお、第１実施形態および第２実施形態で得られた補填体を骨以外の軟骨、皮膚、神経、血管等を含む生体組織の欠損部に補填することも可能である。
【００４７】
生体組織補填材は、生体組織に親和性のある材料ならいずれでも良く、生体吸収性の材料であればさらに良い。生体組織補填材としての多孔体は、生体適合性を有する多孔性のセラミックスやコラーゲン、ポリ乳酸またはメタル等であり、多数の気孔を有するもので有れば、これらに限定されず、種々のものを用いることができる。多孔体として、一般にアパタイトやβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）等のリン酸カルシウム系セラミックス、コラーゲン、ポリ乳酸等を使用することができる。また、リン酸カルシウム系セラミックスとコラーゲンとを組み合わせたり、リン酸カルシウム系セラミックスとポリ乳酸とを組み合わせたりしても良い。β−リン酸三カルシウム、コラーゲン、ポリ乳酸は生分解性で生体に吸収される特徴を有し、アパタイトはその強度が高いという特徴を有する。当業者であれば、移植する部位等に応じて、適切な種類の多孔体を適宜選んで使用することができるのは言うまでもない。
【００４８】
生体組織補填材に付加する細胞は、ＥＳ細胞、体性幹細胞、間葉系幹細胞、骨細胞や軟骨細胞等の体細胞でも良い。自家細胞でも他家細胞でも良い。
【００４９】
さらに、成長因子のみを生体組織補填材に付加しても良い。付加する成長因子としては、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ等を採用できる。
【００５０】
【発明の効果】
以上詳述したように、請求項１に係る発明によれば、培養細胞及び又は成長因子がゲル状生体吸収材料に包埋されることで、浸透性が増大し、その結果、培養細胞が良好に浸透させられることになる。したがって、生体組織補填材の全体に培養細胞及び又は成長因子を良好に浸透させてなる生体組織補填体を得ることができる。
【００５１】
請求項２に係る発明によれば、培養細胞及び又は成長因子がゲル状生体吸収材料に包埋されることで、浸透性が増大し、その結果、培養細胞が良好に浸透させられることになる。したがって、生体組織補填材の全体に培養細胞及び又は成長因子を良好に浸透させてなる生体組織補填体を得ることができる。
【００５２】
請求項３に係る発明によれば、培養細胞がゲル状生体吸収材料に包埋されることで、浸透性が増大し、その結果、培養細胞が多孔質の生体組織補填材に良好に浸透させられることになる。したがって、生体組織補填材の全体に培養細胞を良好に浸透させてなる生体組織補填体を得ることができる。
【００５３】
請求項４に係る発明によれば、培養細胞が多孔質の生体組織補填材に良好に浸透させられながら二次培養されることになる。
【００５４】
請求項５に係る発明によれば、二次培養された培養細胞が多孔質の生体組織補填材に良好に浸透させられることになる。
【００５５】
請求項６に係る発明によれば、生体組織補填材として細胞濃縮液を浸透させてなるものを用いるため、培養細胞が浸透しきれない部分が生体組織補填材に仮にあったとしても、この部分にも細胞を存在させることができる。
【００５６】
請求項７に係る発明によれば、生体組織補填材に浸透させた状態の細胞濃縮液の細胞を培養することで培養細胞にできるため、ゲル状生体吸収材料に包埋された培養細胞が浸透しきれない部分が生体組織補填材に仮にあったとしても、この部分にも培養細胞を存在させることができる。
【００５７】
請求項８に係る発明によれば、培養細胞及び又は成長因子がゲル状生体吸収材料に包埋されることで、浸透性が増大し、その結果、培養細胞が良好に浸透させられることになる。したがって、生体組織補填材の全体に培養細胞及び又は成長因子を良好に浸透させてなる生体組織補填体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施形態である骨補填体の製造工程を概略的に示す図である。
【図２】本発明の第２実施形態である骨補填体の製造工程を概略的に示す図である。
【符号の説明】
１１　骨補填体（生体組織補填体）
１２　骨補填材（生体組織補填材）
１３　空間部
１５　培養細胞
１６　細胞濃縮液
１７　コラーゲンゲル（ゲル状生体吸収材料）
【図１】
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【図２】
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