(57)【要約】【課題】ＤＡＮマイクロアレイに代表されるプローブ担体により検体中の変異やプローブとのミスマッチを検出する際に、変異やミスマッチ部位の数が少ない場合でもこれを検出できる方法を提供すること。【解決手段】プローブＤＮＡと検体ＤＮＡとの間にある変異などに由来するミスマッチ部分の修飾に標識を有するヌクレオチドを使用して、ミスマッチ部分を検出可能とする。【選択図】　　図５
2004016131.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照ＤＮＡ配列に対する検体ＤＮＡ配列における変化を検出するための方法であって、
前記対照ＤＮＡ配列から選択した配列に相補的な配列をプローブ配列とし、該プローブ配列を担体上の固定化領域に配置したプローブ担体を用意する工程と、
前記検体ＤＮＡ配列を前記プローブ担体と反応させて前記プローブと該検体ＤＮＡ配列とをハイブリダイズさせてこれらの配列から二本鎖体を得る工程と、
前記二本鎖体中に二本鎖を形成していない塩基がある場合に、該塩基の二本鎖体の一方の鎖にある側のヌクレオチドを該二本鎖体から除去して、鎖の切断部位を形成する工程と、
前記鎖の切断部位を検出可能な標識を有するヌクレオチドで修復する工程と、
前記修復された部位に挿入された標識を検出することで、前記検体ＤＮＡ配列中における変化を検出する工程と
を有することを特徴とする対照ＤＮＡ配列に対する検体ＤＮＡ配列における変化を検出するための方法。
【請求項２】
前記プローブ配列が、制限酵素の認識配列を介して前記担体に結合しており、前記検体ＤＮＡ配列が、該プローブ配列の有する認識配列に対応する制限酵素によって処理された断片として前記プローブ担体との反応に供給される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
担体上にＤＮＡの固定化領域の複数を配置したＤＮＡ担体において、
互いに異なる第１〜第ｎの制限酵素（ｎ≧２）により形成される突出末端の配列と相補的な第１〜第ｎのプローブ結合用配列の各々を前記固定化領域ごとに配置したことを特徴とするプローブ結合用ＤＮＡ担体。
【請求項４】
担体上にＤＮＡの固定化領域の複数を配置したＤＮＡ担体において、
任意の制限酵素により提供される突出末端の塩基数の範囲内でランダムに塩基を組み合わせた多数の塩基配列の各々を前記固定化領域ごとに配置したことを特徴とするプローブ結合用ＤＮＡ担体。
【請求項５】
対照ＤＮＡ配列に対する検体ＤＮＡ配列における変化を検出するために用いるプローブ担体であって、
前記対照ＤＮＡ配列に相補的配列を第１〜第ｎの制限酵素（ｎ≧２）のそれぞれで処理して得られた第１〜第ｎのＤＮＡ断片の各々を対応する制限酵素の認識配列を介して担体に固定して各ＤＮＡ断片ごとに固定化領域を形成したことを特徴とするプローブ担体。
【請求項６】
請求項５に記載のプローブ担体の製造方法であって、
請求項２に記載されるプローブ結合用ＤＮＡ担体の有するプローブ結合用配列に対応する第１〜第ｎの制限酵素のそれぞれを用いて前記対照ＤＮＡ配列を有する二本鎖ＤＮＡを処理して得られるＤＮＡ断片をプローブとして用意する工程と、
これらのＤＮＡ断片を請求項２に記載されるプローブ結合用ＤＮＡ担体と反応させ、各ＤＮＡ断片の有する突出末端を、該プローブ結合用ＤＮＡ担体上の対応するプローブ結合用配列とハイブリダイズさせて、該ＤＮＡ断片を該担体上に固定する工程と、
該担体上に固定されたＤＮＡ断片を一本鎖化して、前記プローブ結合用配列を介して該担体に前記対照ＤＮＡ配列由来の断片がプローブとして結合した構造を得る工程と
を有することを特徴とするプローブ担体の製造方法。
【請求項７】
請求項５に記載のプローブ担体の製造方法であって、
請求項３に記載されるプローブ結合用ＤＮＡ担体の有するプローブ結合用配列の塩基数に相当する突出末端を生じさせる制限酵素を用いて前記対照ＤＮＡ配列を有する二本鎖ＤＮＡを処理して得られるＤＮＡ断片をプローブとして用意する工程と、
これらのＤＮＡ断片を請求項２に記載されるプローブ結合用ＤＮＡ担体と反応させ、各ＤＮＡ断片の有する突出末端を、該プローブ結合用ＤＮＡ担体上の対応するプローブ結合用配列とハイブリダイズさせて、該ＤＮＡ断片を該担体上に固定する工程と、
該担体上に固定されたＤＮＡ断片を一本鎖化して、前記プローブ結合用配列を介して該担体に前記対照ＤＮＡ配列由来の断片がプローブとして結合した構造を得る工程と
を有することを特徴とするプローブ担体の製造方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載の製造方法により得られたことを特徴とするプローブ担体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はゲノムの多様性、遺伝子多型、ＳＮＰｓ等、変異またはミスマッチ塩基の検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ゲノムの多様性を解析する方法の一つに、ＲＦＬＰｓ法が上げられる。ＲＦＬＰｓ法は、制限酵素で切断したＤＮＡ断片が、電気泳動で移動度の差として十分識別できるときは、複数のゲノム間または遺伝的背景を調べる上で、有効な方法であった。しかしながら、この方法では、例えば一塩基のミスマッチ等、移動度にまったく差が出ない場合などに十分な解析ができないことが多く、近年ではＳＮＰｓ解析の重要性が広く認識されるなかで、その重要性は低いものとなっている。
【０００３】
こうした中で、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐなど、ＤＮＡマイクロアレイによる方法が近年注目されている。しかしながら、この方法は一つの変異塩基を検出するのに２０個のマトリックスを使用してしまうため、その分のロスがある。また、ユーザ側にとっては、基板上のターゲットＤＮＡが予め決められてしまうという制約もある。その他の方法としては、Ｎａｎｏｇｅｎ社の印可電圧式ハイブリダイゼーション法や質量分析による方法もあるが、ＤＮＡマイクロアレイほど大規模な一括処理をすることができていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＤＡＮマイクロアレイに代表されるプローブ担体により検体中の変異やプローブとのミスマッチを検出する際に、変異やミスマッチ部位の数が少ない場合でもこれを検出できる方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明にかかる対照ＤＮＡ配列に対する検体ＤＮＡ配列における変化を検出するための方法は、
前記対照ＤＮＡ配列から選択した配列に相補的な配列をプローブ配列とし、該プローブ配列を担体上の固定化領域に配置したプローブ担体を用意する工程と、
前記検体ＤＮＡ配列を前記プローブ担体と反応させて前記プローブと該検体ＤＮＡ配列とをハイブリダイズさせてこれらの配列から二本鎖体を得る工程と、
前記二本鎖体中に二本鎖を形成していない塩基がある場合に、該塩基の二本鎖体の一方の鎖にある側のヌクレオチドを該二本鎖体から除去して、鎖の切断部位を形成する工程と、
前記鎖の切断部位を検出可能な標識を有するヌクレオチドで修復する工程と、
前記修復された部位に挿入された標識を検出することで、前記検体ＤＮＡ配列中における変化を検出する工程と
を有することを特徴とするものである。
【０００６】
上記のプローブ配列としては、制限酵素の認識配列を介して担体に結合しているものが好適に利用でき、検体ＤＮＡ配列が、プローブ配列の有する認識配列に対応する制限酵素によって処理された断片としてプローブ担体との反応に供給される方法を用いることができる。
【０００７】
本発明にかかるプローブ結合用ＤＮＡ担体の第１の態様は、担体上にＤＮＡの固定化領域の複数を配置したＤＮＡ担体において、互いに異なる第１〜第ｎの制限酵素（ｎ≧２）により形成される突出末端の配列と相補的な第１〜第ｎのプローブ結合用配列の各々を前記固定化領域ごとに配置したことを特徴とするプローブ結合用ＤＮＡ担体である。
【０００８】
本発明にかかるプローブ結合用ＤＮＡ担体の第２の態様は、担体上にＤＮＡの固定化領域の複数を配置したＤＮＡ担体において、任意の制限酵素により提供される突出末端の塩基数の範囲内でランダムに塩基を組み合わせた多数の塩基配列の各々を前記固定化領域ごとに配置したことを特徴とするプローブ結合用ＤＮＡ担体である。
【０００９】
また、本発明にかかる対照ＤＮＡ配列に対する検体ＤＮＡ配列における変化を検出するために用いるプローブ担体は、前記対照ＤＮＡ配列に相補的配列を第１〜第ｎの制限酵素（ｎ≧２）のそれぞれで処理して得られた第１〜第ｎのＤＮＡ断片の各々を対応する制限酵素の認識配列を介して担体に固定して各ＤＮＡ断片ごとに固定化領域を形成したことを特徴とするプローブ担体である。
【００１０】
本発明にかかるプローブ担体の製造方法の第１の態様は、上記のプローブ担体の製造方法であって、上記第１の態様にかかるプローブ結合用ＤＮＡ担体の有するプローブ結合用配列に対応する第１〜第ｎの制限酵素のそれぞれを用いて前記対照ＤＮＡ配列を有する二本鎖ＤＮＡを処理して得られるＤＮＡ断片をプローブとして用意する工程と、
これらのＤＮＡ断片を上記第１の態様にかかるプローブ結合用ＤＮＡ担体と反応させ、各ＤＮＡ断片の有する突出末端を、該プローブ結合用ＤＮＡ担体上の対応するプローブ結合用配列とハイブリダイズさせて、該ＤＮＡ断片を該担体上に固定する工程と、
該担体上に固定されたＤＮＡ断片を一本鎖化して、前記プローブ結合用配列を介して該担体に前記対照ＤＮＡ配列由来の断片がプローブとして結合した構造を得る工程と
を有することを特徴とするプローブ担体の製造方法である。
【００１１】
本発明にかかるプローブ担体の製造方法の第２の態様は、
上記第２の態様にかかるプローブ結合用ＤＮＡ担体の有するプローブ結合用配列の塩基数に相当する突出末端を生じさせる制限酵素を用いて前記対照ＤＮＡ配列を有する二本鎖ＤＮＡを処理して得られるＤＮＡ断片をプローブとして用意する工程と、
これらの上記第２の態様にかかるプローブ結合用ＤＮＡ担体と反応させ、各ＤＮＡ断片の有する突出末端を、該プローブ結合用ＤＮＡ担体上の対応するプローブ結合用配列とハイブリダイズさせて、該ＤＮＡ断片を該担体上に固定する工程と、
該担体上に固定されたＤＮＡ断片を一本鎖化して、前記プローブ結合用配列を介して該担体に前記対照ＤＮＡ配列由来の断片がプローブとして結合した構造を得る工程と
を有することを特徴とするプローブ担体の製造方法である。
【００１２】
本発明では、プローブ担体をＤＮＡマイクロアレイとした場合の大規模一括処理という特長を活かすことができ、任意の制限酵素の認識切断部位と相補的な配列をターゲットＤＮＡに用意し、ライゲーション反応によって、ある基準としたいＤＮＡ断片の鎖を継ぎ足すという工夫と、継ぎ足された新規のオリゴヌクレオチドと検体とのハイブリダイゼーション、および遺伝子の修復機構とを組み合わせ、応用することによって、たった１個のマトリックスで、変異またはミスマッチ塩基を検出することを可能とした。
【００１３】
また従来のＤＮＡマイクロアレイは大規模一括処理という特長はあっても、実際アレイを構成するターゲットＤＮＡ群をどのように選定するかについては、依然として難しい問題である。本発明による方法では、ランダムニックによる制限酵素を想定した場合、例えば突出末端部分を６塩基とすると、すべての場合の数を想定しても４６＝４０９６スポットにしかならず、現行の一般的なマイクロアレイサイズと比べても十分余裕で、尚且つその上にライゲーションによって実在する配列をすべて継ぎ足すことができるため、解析上、優位なマイクロアレイを提供することができる。
【００１４】
なお、本発明においては、検体側のＤＮＡをターゲット、マイクロアレイに固定化するＤＮＡをプローブと表現した。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明にかかるプローブ担体は、検体に対する標準の配列を規定する対照ＤＮＡ配列から選択された少なくとも１種（対照ＤＮＡ配列全体あるいはこれから選択された部分配列）をプローブとして担体上に固定したもので、複数種のプローブをそれぞれ独立した領域、例えばドット状スポットとして担体表面に固定化したものである。このようなプローブの固定化領域が所定の間隔で配列されたものをプローブ・アレイという。このプローブ担体には、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、プローブ・アレイと一般的に呼ばれている検査用等のプレートやチップが含まれる。
【００１６】
一方、プローブは担体表面に結合可能な構造を有しており、担体上へのプローブの固定は固定用の官能基を用いて行われる好ましい。その際、プローブが有する担体表面に結合可能な構造は、アミノ基、スルフィドリル基、カルボキシル基、水酸基、酸ハライド化物（ハロホルミル基；−ＣＯＸ）、ハライド化物（−Ｘ）、アジリジン、マレイミド基、スクシイミド基、イソチオシアネート基、スルフォニルクロリド基（−ＳＯ２Ｃｌ）、アルデヒド基（ホルミル基；−ＣＨＯ）、ヒドラジン、ヨウ化アセトアミド、チオール基などの有機官能基の少なくとも１種を導入する処理により形成されたものであることが好ましい。また、プローブ側の担体への結合に必要な構造に応じて、担体の表面に必要とされる処理を施してもよい。例えば、後述する実施例におけるような、基板側にマレイミド基を導入し、プローブ側にチオール基を導入してプローブの固定化を行う方法を好ましい方法として挙げることができる。
【００１７】
本発明においては、固定化するプローブとしてのオリゴヌクレオチド（一本鎖）が、現在機能の知られている、入手可能な制限酵素の認識配列を介してプローブが担体に固定される。
【００１８】
このプローブを担体に固定するためのプローブ結合用ＤＮＡ担体は、多くの異なる制限酵素の認識配列、具体的には第１〜第ｎの制限酵素（ｎ≧２）のそれぞれが生じる突出末端に相補的なプローブ結合用配列の複数を、好ましくはアレイ状に並べた構成とすることができる。そして、このプローブ結合用ＤＮＡ担体に上記第１〜第ｎの制限酵素（ｎ≧２）のそれぞれで対照ＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡを処理して得られた二本鎖ＤＮＡ断片を反応させて、対応する第１〜第ｎの制限酵素（ｎ≧２）のそれぞれが生じる突出末端に相補的なプローブ結合用配列とそれぞれ二本鎖を形成させ、必要に応じてリガーゼによる修復を行う。そして、この二本鎖を加熱および洗浄することによって一本鎖化することで、担体には制限酵素の認識配列を介して対照ＤＮＡ配列に由来するプローブとしての配列が結合したプローブ担体を得ることができる。
【００１９】
このプローブ担体を新しいＤＮＡマイクロアレイ等として、これと比較したい検体を同様に制限酵素で処理したあと、これとハイブリダイゼーションを行う。もしもここで、２つの検体間にミスマッチがあった場合の検出方法は、以下のプロセスで構成される。
【００２０】
ハイブリダイズ後、ＤＮＡグシコシラーゼを作用させてミスマッチ塩基を取り除く。次にＡＰエンドヌクレアーゼを作用させて鎖を切断する。予め蛍光標識されたｄＮＴＰｓを混入させておき、ＤＮＡポリメラーゼβを作用させて、ミスマッチがあった所の塩基を蛍光標識された塩基に置き換えて修復することによって、蛍光検出できるようにした。
【００２１】
以下に、図を用いて本発明における各操作について具体的に説明する。図１〜５は本発明の実施形態を表したものである。まず、図１に示すとおり、オリゴヌクレオチド断片をいくつもスポット状に配置するための基板１（これはガラスや樹脂などが用いられ各スポットの形状はウェル状でも板状でもかまわない。例えばマイクロプレートや顕微鏡スライドガラス、シリコンウエハなどに相当する）の上に、あらかじめ用意された複数種のオリゴヌクレオチド断片を固相化する。オリゴヌクレオチド断片２とオリゴヌクレオチド断片３は、それぞれ異なるスポットを形成している。ここで各スポットのオリゴヌクレオチド断片は、図２（１）に図示のように、例えば、ある６カッターの制限酵素に相当する断片４−１、とある４カッターの制限酵素に相当する断片４−２・・・というように、現在機能の知られている制限酵素の認識部位に相補的なオリゴヌクレオチド断片で、複数のスポットが構成されることを特徴としたＤＮＡアレイもしくはＤＮＡマイクロアレイである。
【００２２】
プローブ担体としてのアレイの構成にかかわる実施形態は、この他、ＤＮａｓｅ　Ｉによるランダムニックに対応するように、まったく任意の配列、予め個々に決められた長さのオリゴヌクレオチド断片を複数のスポットに固相化したＤＮＡアレイもしくはＤＮＡマイクロアレイ（プローブ結合用担体の第１及び第２の実施態様を用いて形成されたもの）と、何の制約もない市販のＤＮＡアレイもしくはＤＮＡマイクロアレイと、アレイの構成に関して３つの実施形態が可能である。
【００２３】
このようなＤＮＡアレイに対して、ｍＲＮＡを出発点としてｄｓ−ｃＤＮＡを取得し、これを幾つかの制限酵素で切断し、これを該ＤＮＡアレイと図２の（１）に示されるような通常のライゲーション反応をＴ４　ＤＮＡ　リガーゼによって行う。もしもプロモーター領域や転写制御領域の解析が対象であるなら、プライマー伸長反応を併用することによってさらに上流のシークエンスを取得しても良いし、ゲノムを直接制限酵素で処理し、図２（１）のライゲーションに供給してもかまわない。ただしこのとき供給されるゲノムにはメチル化や変異によるウラシル化が予め刷り込まれている可能性があるので、解析が複雑である。図２（２）は、ライゲーション反応が終了した段階を示している。各スポットには、同じ切断部位認識配列をもつ、異なる長さのＤＮＡ断片が結合される。この場合の用途はスクリーニング的用途である。その他の実施形態としては、制限酵素で切断したＤＮＡを電気泳動やＨＰＬＣにて分画したものを各スポットに反応させれば、同じ長さのＤＮＡ断片が結合される。図３の（１）は、十分なディネーチャーと洗浄操作により、一本鎖化したところを表した。この操作は、次の図３（２）（比較したいサンプルＤＮＡの断片とのハイブリダイゼーション）と併せて行ってプロセスを短縮できるが、もともとのＤＮＡ断片と競合し、反応の確率が１／２になるので感度の点では不利である。サンプルＤＮＡの断片は、組織、血液、培養細胞、菌体などから抽出し、さきほどのｄｓ−ｃＤＮＡと同じ制限酵素処理によって得られたサンプルである。制限酵素の処理形態には、二つの実施形態がある。第一は、サンプルを予め小分けし、各制限酵素切断、完全に失活させたあと、もとの一つの容器に混合する方法で、この場合ＤＮＡ断片の両側は同じ切断構造となるので、解析には有利な情報となる。第二は、幾つかの制限酵素はバッファーを共有できるため、一つの容器内で複数タイプの切断が可能である。さて、図３（２）では塩基配列のミスマッチや変異６を伴ったＤＮＡ断片がハイブリダイゼーションされたことを表している。未反応物を除去した後、グリコシラーゼ活性のある物質を使って、変異塩基、ミスマッチ塩基を除去する。ウラシル化による変異塩基では図４（１）に示されるようなａｂａｓｉｃな状態、ＡＰ部位７を作るのにＵｒａｃｉｌ−Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅが第一候補に上げられる。ミスマッチ塩基の場合には、第一候補としてＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩのグリコシラーゼ活性を利用できるが、その他にもＡＡＧ／ＭＰＧ（ａｌｋｉｌ−ａｄｅｎｉｎｅ　ＤＮＡ　ｇｌ
ｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、ＴＤＧ（Ｔｈｙｍｉｎｅ（Ｔ：Ｇ）−ｍｉｓｓｍａｔｃｈ　ＤＮＡ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、ｈＭＹＨ（Ａｄｅｎｉｎ　ＤＮＡ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）　、ｈＯＧＧ１（８−ｏｘｏ−ｇｕａｎｉｎｅ　ＤＮＡ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、ｈＮＴＨ１（Ｔｈｙｍｉｎｅｇｌｙｃｏｌ　ＤＮＡ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）が利用できる。
【００２４】
このようにしてできたＡＰ部位に、ＡＰエンドヌクレアーゼ活性をもつＨｕｍａｎ　ＡＰ　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＡＰＥ）、もしくはＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩのＡＰエンドヌクレアーゼ活性を利用して、図４（２）に示されるような一塩基ギャップ８を作る。外れたフリーの塩基を分離後、次にＨｕｍａｎ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　βと、蛍光標識されたｄＮＴＰｓ８を加えて、ギャップを埋めることによって、図５に示されるように、変異もしくはミスマッチを検出できるアッセイ系を構築することができる。蛍光標識されたｄＮＴＰｓの蛍光色素は、たとえばＣｙ　Ｄｙｅシリーズ、ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッドを使うことができる。また、ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　β以外に、フリーの塩基を分離後、リガーゼを用いてリン酸ジエステル結合の鎖を修復することも可能である。この場合ペア塩基が何であれ、アミノアリルｄＵＴＰを使えば、上記の蛍光色素のほかにＡｌｅｘａシリーズの蛍光色素も使える。ビオチン―アビジン結合を介したこれら蛍光標識物も同様に使用できる。またこれらの標識された塩基が蛍光色素ではなく、ＲＩ標識されたｄＮＴＰｓであっても良い。
【００２５】
【実施例】
これより実施例により本発明をより具体的に説明するが、ＤＮＡマイクロアレイにかかわる、ｃＤＮＡの調製、ＰＣＲ増幅、蛍光ラべリング、ハイブリダイゼーションといった基本的実験操作は、当業者によく知られた参考書、ＷＥＢサイト等に詳しく記載されている（参考：ＤＮＡマイクロアレイ実践マニュアル（羊土社、監修　林崎良英、編集　岡崎康司）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｗｆｓｃ．ｎｏａａ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｈｔｌｍ）など）ものであって、以下の説明により本発明は何等限定されるものではない。
【００２６】
（Ａ）切断部位認識配列の相補的な断片をもつＤＮＡマイクロアレイの作成
表１に選択した制限酵素群に対応するアレイの構成を示した。５番から６８番については、ＤＮａｓｅＩを用い、塩基配列はＡＡＡＡから順番にすべての組み合わせに対応させた。表１の塩基配列をもつプローブＤＮＡは、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成し、５’末端にはＴｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて−ＳＨ基を導入した。一方基板となるガラス板上には、シランカップリング剤とＮ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミドによってマレイミド基を導入し、先ほどのプローブＤＮＡを所定の濃度、Ｂｕｆｆｅｒに調製した後、インクジェットプリンタ（キャノン社）で基板上に打ち、化学的に結合、ブロッキング処理を行った。以上の工程の詳細は、特開平１１−１８７９００号公報の実施例を採用したものである。
【００２７】
【表１】
2004016131.tif 000003
【００２８】
（Ｂ）制限酵素処理断片を継ぎ足したＤＮＡマイクロアレイの作成
ＮＨＢＥ−Ｃｅｌｌ（気管支／気管上皮細胞、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）からＣｅｌｌ−ｔｏ−ＤＮＡキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を使ってＤＮＡを抽出し、表１の５種類の制限酵素で処理できるよう小分けした。各試験管は、制限酵素に添付のＢｕｆｆｅｒで溶解、切断した後、ＥＤＴＡ０．１ｍＭを１滴滴下し、Ｍｇイオンをマスキング、失活処理を７０℃、３０分行った。各制限酵素の処理時間および濃度は、カタログデータ完全分解に要する時間を参考にした。次にＭｉｃｒｏＳｐｉｎ　Ｓ−２００　ＨＲ　Ｃｏｌｕｍｎｓを用いて各溶液を脱塩、混合したあと、ライゲーション反応バッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、４ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｕＭ　ＮＡＤ、０．００５％ＢＳＡ）の組成となるよう、２０×濃縮バッファーを添加、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅを１Ｕになるように添加し、速やかに（Ａ）のスライドグラス上で室温、４５分間ライゲーションを行った。
【００２９】
（Ｃ）制限酵素処理断片を継ぎ足した一本鎖ＤＮＡマイクロアレイの作成
ライゲーション終了後、スライドグラスを９５℃の同バッファーに浸し、３〜４回液を交換しながらよく洗浄して一本鎖化したのち、４℃で保存した。
【００３０】
（Ｄ）検体側の調整
Ｈｅｐ２−Ｃｅｌｌ（ヒト咽頭癌由来）からＣｅｌｌ−ｔｏ−ＤＮＡキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を使ってＤＮＡを抽出し、表１の５種類の制限酵素で処理できるよう小分けした。各試験管は、制限酵素に添付のＢｕｆｆｅｒで溶解、切断した後、ＥＤＴＡ０．１ｍＭを１滴滴下し、Ｍｇイオンをマスキング、失活処理を７０℃、３０分行った。各制限酵素の処理時間および濃度は、カタログデータ完全分解に要する時間を参考にした。以上は（Ａ）と同様に行った。
【００３１】
（Ｅ）ハイブリダイゼーション
（Ｄ）の検体に、ホルムアミドが３０％となるように添加し、９５℃１０分間一本鎖化を行った後、予め４℃に冷やしたスライドグラスの上に約数十〜数百ｕｌ滴下し、保湿反応チャンバー内で６５℃２時間反応させた。反応終了後５×ＳＳＣバッファー（０．２％ＳＤＳ）で洗浄し、そのあと１×ＳＳＣで３回洗浄した。
【００３２】
（Ｆ）ミスマッチ塩基の除去
（Ｅ）のハイブリダイゼーション終了後のスライドグラスを予め１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　の溶液に浸しておき、そこに１ＵｎｉｔとなるようにＥ．ｃｏｌｉ　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＩＩＩ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ　Ｉｎｃ．）を加え、３７℃１時間処理した。
【００３３】
（Ｇ）１塩基ギャップ処理
（Ｆ）のミスマッチ塩基除去終了後のスライドグラスを予め５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１ｕｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸの溶液に浸しておき、そこに１ＵｎｉｔとなるようにＨｕｍａｎ　　ＡＰ　　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ　Ｉｎｃ．）を加え、３７℃１時間処理した。
【００３４】
（Ｈ）蛍光標識修復
（Ｇ）の１塩基ギャップ処理終了後のスライドグラスを予め５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ　ＫＣｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　　ＤＴＴの溶液に浸しておき、そこに１ＵｎｉｔとなるようにＨｕｍａｎ　　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒｒａｓｅ　　β（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ　Ｉｎｃ．）と、各５０ｕＭとなるようにＣｙ５−ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを加え、３７℃１時間処理した。
【００３５】
（Ｉ）洗浄および観察
（Ｈ）の蛍光標識修復終了後のスライドグラスを１×ＳＳＣで３回洗浄し、最後水に置換し、風乾したものを、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂで測定した。
【００３６】
【発明の効果】
本発明のプローブ固定用の担体は、固定するプローブの種類の選択幅が広くユニバーサルなＤＮＡチップを提供することを可能としている。すなわち、わざわざ専用のＤＮＡチップを直接作るのではなく、もともとのわずかな配列にリガーゼで必要な配列を追加することで、任意のチップを作ることが出来る。また従来フルマッチと１塩基ミスマッチのハイブリダイゼーションは、殆ど差がなくその識別は大変困難なものであったが、ＤＮＡの修復機構を応用することによって、その識別を蛍光標識によって直接行うことが出来る。さらに応用として、ある塩基についてはＤＮＡメチル化の修復が同じ方法で行われているので、適当な酵素を選択することによって、メチル化の有無、程度を知ることも本法で可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】プローブ担体調製用の基板の構成を示す図である。
【図２】（１）及び（２）は検体ＤＮＡの検出方法における各反応工程を示す図である。
【図３】（１）及び（２）は検体ＤＮＡの検出方法における各反応工程を示す図である。
【図４】（１）及び（２）は検体ＤＮＡの検出方法における各反応工程を示す図である。
【図５】検体ＤＮＡの検出方法における各反応工程を示す図である。
【符号の説明】
１　　基板
２　　スポット
３　　スポット
４−１、４−２　　制限酵素認識配列
５　　対照ＤＮＡ由来の制限酵素断片
６　　ミスマッチ（変異）
７　　ＡＰ部位
８　　一塩基ギャップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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