(57)【要約】【課題】移植用の細胞に直接触れることなく、その細胞の増殖状態を正確に判定する。【解決手段】複数の試料をそれぞれ個別に収容できる培養容器１００に、移植用試料２００と検査用試料３００とをそれぞれ個別に収容し、移植用試料２００と検査用試料３００とを同一条件下で培養し、検査用試料３００の増殖状態によって移植用試料２００の増殖状態を判定する。【選択図】　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植用細胞と同一条件化で検査用細胞を培養し、該検査用細胞を使用して、該移植用細胞の増殖状態を判定する細胞培養方法。
【請求項２】
複数の試料をそれぞれ個別に収容できる培養容器に、前記移植用細胞と前記検査用細胞とを収容し、培養する請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
前記移植用細胞と、前記検査用細胞とにおいて、培養開始時において、互いに単位体積当たりの細胞数のオーダーを等しくする請求項１又は請求項２に記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、骨腫瘍摘出や外傷等によって生じる骨の欠損部に、骨補填材を補填して骨を修復させることが行われている。しかしながら、骨粗鬆症のように、骨が次第にもろくなっていく場合や、欠損部が非常に広域である場合等には、上記方法では問題を解決することが難しい。
そこで、近年、患者から骨髄を採取し、この採取した骨髄に含まれる間葉系幹細胞から人為的に骨芽細胞を十分に増殖させた後に、再び患者の体内に戻すという新たな試みが要請されている。この場合、患者自身から採取した骨髄から骨芽細胞を増殖させ、該患者の体内に戻すため、免疫反応を生じることなく骨の形成を活性化させることができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、上述したように人為的に骨芽細胞を増殖させる場合、骨芽細胞が十分に増殖されたか否かを正確に判断する必要がある。
骨芽細胞は、患者の体内に戻すものであるので、できるだけ細胞への接触を控えることが望ましいが、一般的に、骨芽細胞の増殖状態は、目視では判断できないため、何らかの処置を試料に施して、増殖状態を判断しなければならなかった。
【０００４】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、移植用の細胞に直接触れることなく、その細胞の増殖状態を正確に判定することができる細胞培養方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、移植用細胞と同一条件化で検査用細胞を培養し、該検査用細胞を使用して、該移植用細胞の増殖状態を判定する細胞培養方法を提供する。
【０００６】
また、上記記載の細胞培養方法において、複数の試料をそれぞれ個別に収容できる培養容器に、前記移植用細胞と前記検査用細胞とを収容し、培養することを特徴とする。
【０００７】
また、上記記載の細胞培養方法において、前記移植用の培養骨と、前記検査用の培養骨とにおいて、互いに単位体積当たりの細胞数のオーダーを等しくすることを特徴とする。
【０００８】
本発明によれば、移植用細胞と検査用細胞とをそれぞれ個別に培養するので、検査用細胞を容器から取り出す際にも、移植用細胞に接触することなく簡単に取り出すことが可能となる。更に、上記培養容器に移植用細胞と検査用細胞とを収容することにより、前記培養容器を移動させることにより、双方を常に同一条件下に置くことが可能となる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照し、本発明の一実施形態について説明する。
始めに、本実施形態に係る細胞培養方法が適用される細胞培養システムの概要について図１を参照して簡単に説明する。
【００１０】
図１において、病院１で患者から採取された骨髄は、所定の搬入容器に収容され、培養骨を形成する培養センタ２へ搬入される。なお、搬入容器は、約３７℃に保たれていても良く、また、４℃或いは冷凍されていても良い。
培養センタ２では、搬入された骨髄に含まれている間葉系幹細胞を培養する一次培養、培養された間葉系幹細胞をスキャホールドと呼ばれる足場材に加え培養骨を形成する二次培養、細菌や真菌が骨髄や培養液等に含まれていないかを調べる検査等が行われ、最終的に形成された培養骨が所定の搬出容器に収容されて、病院１へ搬出される。なお、搬入容器は、約３７℃に保たれていても良く、また、４℃或いは冷凍されていても良い。
なお、二次培養において使用されるスキャホールドは、スキャホールド供給センタ３から供給される。
【００１１】
次に、培養センタ２において行われる培養工程について図２を参照して簡単に説明する。
まず、病院１で患者から採取された骨髄は、所定の搬入容器に収容されて培養センタ２に搬入される。
培養センタ２では、搬入容器に収容されている骨髄細胞の一部を取り出し、採取された骨髄に細菌や真菌等が含まれていないかを検査する（ステップＳＰ１）。
【００１２】
そして、検査結果に異常が無ければ、骨髄液中に含まれている間葉系幹細胞の増殖工程へ移行する（ステップＳＰ２）。なお、この間葉系幹細胞の増殖工程を一次培養と称する。この一次培養では、真菌、細菌エンドトキシン等が含まれていないことが確認された検査済みの血清を含む培地（この培地は人或いは牛の血清が使用される）に、同じくステップＳＰ１において検査済みである骨髄を浸透させることにより、間葉系幹細胞を増殖させる。
【００１３】
そして、間葉系幹細胞が培養骨を形成するために必要とされる十分な量まで増殖すると、続いて、この間葉系幹細胞に真菌や細菌等が含まれていないかを検査し（ステップＳＰ３）、この結果、問題がなければ、培養骨を形成する二次培養へ移行する（ステップＳＰ４）。
二次培養では、一次培養によって増殖させた間葉系幹細胞をスキャホールドと呼ばれる足場材に附着させる。
このスキャホールドは、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材である。このスキャホールドに間葉系幹細胞を附着させることにより、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化が促進し、骨組織が形成される。なお、このとき骨芽細胞への分化を更に促進させるために、成長因子等を添加してもよい。なお、上記β−ＴＣＰに代わって、ハイドロキシアパタイト多孔体等のスキャホールドを用いても良い。
【００１４】
そして、このようにして形成された培養骨は、搬出前の検査、例えば、ウイルスやマイコプラズマ培養液、真菌、細菌が含まれていないかを検査する工程へ進み（ステップＳＰ５）、異常がなければ、所定の搬送用容器へ移し替えられ、病院１へ搬出される。
そして、培養骨を受け取った病院側では、設定されている手術日において、該培養骨を患者に移植する移植手術が行われる。
【００１５】
次に、上述した二次培養について詳細に述べる。
まず、二次培養において、一次培養によって増殖された間葉系幹細胞を複数のスキャホールドに附着させる。このとき、作業員は、移植用のスキャホールド（以下、移植用試料と称する）と、検査用のスキャホールド（以下、検査用試料と称する）とを作成する。
このとき、作業員は、移植用試料２００と同じロット番号の培地、同じロット番号であり、大きさ、形状が同一のスキャホールドを使用して検査用試料３００を作成する。更に、作業員は、移植用試料２００と単位面積当たりの細胞数のオーダーが同じになるように、検査用試料３００を作成する。
そして、作業員は、作成したこれらの移植用試料２００と検査用試料３００とを図３に示すような培養容器１００に収容する。
【００１６】
培養容器１００は、図３に示すように、複数の試料をそれぞれ個別に収容できるような構成となっている。具体的には、試料を収容する孔（くぼみ）１０１が複数設けられており、これらの孔１０１に移植用試料２００及び検査用試料３００を個々に収容する。
【００１７】
そして、移植用試料２００及び検査用試料３００が収容された培養容器１００を二次培養を行う雰囲気中、即ち、二次培養を行うのに適した条件下に設置する。例えば、温度が３７±０．５℃、二酸化炭素濃度が５％に保持された雰囲気中に設置する。これにより、スキャホールドに附着された間葉系幹細胞がβ−ＴＣＰを貪食し、骨芽細胞の分化が促進し、二次培養開始から約１０日〜２週間程度で骨組織が形成されていく。
【００１８】
そして、作業員は、二次培養を開始してから１０日経過したときに、培養容器１００の検査用試料３００を取り出し、この検査用試料３００の骨形成状態を確認することにより、移植用試料２００の培養の進行状況を確認する。
【００１９】
例えば、上記二次培養の増殖状態を判定する手法としては、以下に示すような判定手法が挙げられる。
（１）アルカリフォスファターゼの活性度に基づいて判定する手法。
検査用試料３００を粉砕し、粉砕した検査用試料３００のアルカリフォスファターゼを測定する。このアルカリフォスファターゼは、骨芽細胞の活性度を示す成分であり、この骨芽細胞の活性度を測定することにより、二次培養の増殖状態を把握する。
【００２０】
（２）顕微鏡を使用して判定する手法。
（ａ）スキャホールド１００の表面をコンフォーカル顕微鏡１０２により画像として取り込み、画像処理によって細胞を抽出し、抽出された細胞の数が所定数以上であるか否かを判定することにより、二次培養の状態を判定する。
（ｂ）また、円筒状の孔を中心に有するスキャホールドの場合には、スキャホールドの円筒状の孔にボールペン型のコンフォーカル顕微鏡を挿入し、内部まで骨細胞に分化できているか否かを調べることにより、二次培養の状態を判定することも可能である。
（ｃ）粉砕した検査用試料３００に蛍光染色を施し、蛍光染色された検査用試料３００の蛍光測定を行い、測定結果、即ち蛍光染色された程度に応じて二次培養の増殖状態を把握する手法がある。これは、蛍光染色し、染色された骨芽細胞を顕微鏡などで数えることにより、二次培養の増殖状態を判定する。例えば、骨芽細胞が確認できれば、骨形成が十分進んでいると判断して、二次培養を終了する。
【００２１】
作業員は、上述したような手法により、検査用試料３００の二次培養の増殖状態を確認した結果、細胞の分化が十分進み、骨が形成されていると判断した場合には、培養容器１００から移植用試料２００を取り出し、この移植用試料２００を図２に示した次の工程である検査工程へ進める。
【００２２】
一方、検査用試料３００の増殖状態が不十分であった場合には、作業員は、今回、二次培養の状態判定に使用した検査用試料３００が収容されていた培養容器１００に残っている移植用試料２００及び検査用試料３００の培養を引き続き行う。そして、数日間経過後に、再度、培養容器１００から検査用試料３００を１つ取り出し、取り出した検査用試料３００の増殖状態を判定する。
この結果、骨形成が十分であれば、移植用試料２００を次の工程へ、また、骨形成が不十分であれば、二次培養を継続して行う。
【００２３】
以上説明したように、本実施形態に係る培養方法によれば、移植用試料２００と検査用試料３００とを同一条件下で培養することにより、検査用試料３００の細胞増殖状態は、移植用試料２００の細胞増殖状態とほぼ等しいと見なすことができる。これにより、検査用試料３００の細胞増殖状態を確認することにより、移植用試料２００に直接接触することなく、移植用試料２００の細胞増殖状態を把握することができる。
【００２４】
また、複数の試料をそれぞれ個別に収容できる培養容器１００に、移植用試料２００と検査用試料３００とをそれぞれ個別に収容し、培養するので、各試料が接触することを防ぐことができる。これにより、検査用試料３００を培養容器１００から取り出す際にも、移植用試料２００に接触することなく、簡単に取り出すことができる。これにより、移植用試料２００が細菌や真菌に感染する虞を回避することができる。また、二次培養を開始する際には、移植用資料２００と検査用試料３００とをともに収容した培養容器１００を二次培養に適した雰囲気中に設置することにより、簡単に、移植用試料２００と検査用試料３００とを同一条件化で培養させることができる。
【００２５】
なお、上述した実施形態では、骨髄液から間葉系幹細胞を一次培養する場合について述べたが、骨髄液の代わりに臍帯血や末梢血などを採取してこれを元に培養を行っても良い。
また、培養する細胞は、間葉系幹細胞の他、体性幹細胞、ＥＳ細胞、骨関連細胞、軟骨細胞などでも良い。更に、自家細胞でも他家細胞でも良い。
また、培養する際に適切な成長因子、例えば、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦなどを添加しても良い。
また、二次培養時には、β−ＴＣＰの代わりに以下のようにしても良い。
即ち、生体組織に親和性のある材料であれば何でも良く、生体吸収性の材料であればなお良い。また、多孔体でも良い。
多孔体とは、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、又は多孔体のメタルなどであり、多数の気孔を有するものであれば、これらに限定されない。
また、多孔体として、一般的にアパタイトやβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）などのリン酸カルシウム系セラミックス、コラーゲン、ポリ乳酸などを使用することができる。
【００２６】
また、リン酸カルシウム系セラミックスとコラーゲンを組み合わせたり、リン酸カルシウム系セラミックスとポリ乳酸を組み合わせたりしても良い。β−リン酸三カルシウム、コラーゲン、ポリ乳酸は、生分解性で生体に吸収される特徴を有し、アパタイトはその強度が高いという特徴を有する。
なお、当業者であれば、移植する部位などに応じて、適切な種類の多孔体を適宜選択して使用することができるのは言うまでもない。
【００２７】
以上、この発明の実施形態を図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【００２８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の細胞培養方法によれば、移植用細胞と検査用細胞とを同一条件下で培養し、検査用細胞の増殖状態によって移植用細胞の増殖状態を判定するので、移植用細胞に一切触れることなく、移植用細胞の正確な増殖状態を確認することができる。これにより、増殖状態を判定する際に、移植用細胞が真菌や細菌などに感染することを回避することができる。
【００２９】
また、本発明の細胞培養方法によれば、複数の試料をそれぞれ個別に収容できる培養容器に、移植用細胞と検査用細胞とを収容し、それぞれ個別に培養するので、各細胞が接触することを防ぐことができ、検査用細胞を取り出す際にも、簡単に取り出すことができる。
更に、同一の培養容器に移植用細胞と検査用細胞とを収容することにより、二次培養を開始する際には、培養容器を二次培養に適した雰囲気中に設置することにより、簡単に、移植用細胞と検査用細胞とを同一条件化で培養させることができる。これにより、二次培養に係る作業員の労力を極めて軽減させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞培養システムの概要を簡単に説明するための図である。
【図２】培養センタ２において行われる培養工程について説明するための図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る培養容器を示す図である。
【符号の説明】
１　病院
２　培養センタ
１００　培養容器
１０１　孔
２００　移植用試料（移植用細胞）
３００　検査用試料（検査用細胞）
【図１】
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【図２】
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【図３】
2004016107.tif 000005