(57)【要約】【課題】蛋白質あるいはペプチドのアミノ酸配列解析を行うためにはアミノ酸を１つずつ切断しなければならないが、物理的な手法では結合がランダムに切断されるため解析が極めて難しく、また化学的な方法ではアミノ酸１つの解析に３０分以上かかる。本発明は、アミノ酸配列解析を迅速にかつ簡便に行えるプロテオームカラムの提供を行う。【解決手段】ペプチド結合を加水分解する酵素を担体あるいは樹脂に固定化した後、その担体に別の酵素を固定化した担体あるいは樹脂もしくは酵素が固定化されていない担体あるいは樹脂を添加することで、第一の酵素がカラム内で不均一になるようにしたカラムを作成した。このカラムに試料の蛋白質あるいはペプチドを通すことにより、末端から１つずつアミノ酸が切断されるので、物理的、化学的方法と比べ解析が簡単かつ迅速である。また酵素を固定化した担体単独のものに比べ長いアミノ酸配列を解析する事が可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質あるいはペプチドのペプチド結合を加水分解する固定化酵素と、固定化酵素を保持するための担体あるいは樹脂に、酵素が固定化されていない担体あるいは樹脂を添加し充填したカラム
【請求項２】
請求項１記載の酵素を含む２種類以上の固定化酵素と、それぞれの固定化酵素を保持するための１種類以上の担体あるいは樹脂からなるカラム
【請求項３】
請求項１記載の酵素を含む２種類以上の固定化酵素と、それぞれの固定化酵素を保持するための１種類以上の担体あるいは樹脂に、酵素が固定化されていない担体もしくは樹脂を添加し充填したカラム
【請求項４】
請求項１記載の酵素を含む２種類以上の固定化酵素が、同一の担体あるいは樹脂に固定化されているカラム
【請求項５】
請求項４記載の担体あるいは樹脂に、酵素が固定化されていない担体もしくは樹脂を添加し充填したカラム
【請求項６】
充填する担体あるいは樹脂が、酵素反応によって得られた物質の分離手段となることを特長とする請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４又は請求項５記載のカラム
【請求項７】
充填する担体あるいは樹脂としてイオン交換樹脂、逆相および順相クロマトグラフィー用充填剤、サイズ排除クロマトグラフィー用充填剤、疎水クロマトグラフィー用充填剤、吸着クロマトグラフィー用充填剤を単独もしくは２種類以上の混合物として用いることを特長とする請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４又は請求項５記載のカラム
【請求項８】
蛋白質あるいはペプチド試料を請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４又は請求項５又は請求項６又は請求項７記載のカラムに通し、質量分析装置に導入することにより、それぞれの断片の質量からアミノ酸の配列を求める分析法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は蛋白質やペプチドの末端から切断していくことで蛋白質やペプチドの断片を得る為のカラム及びそのカラムを用いた分析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ペプチドや蛋白質のアミノ酸残基配列を決定することは生命体の主要成分である蛋白質の多彩な機能の解明をするためにも重要なことである。アミノ酸の配列を解析するためにはペプチドや蛋白質からアミノ酸を切り出して解析する必要がある。アミノ酸の間のペプチド結合を切断する方法として、物理的に切断する方法（例えば特許文献１及び２参照。）や化学反応を用い切断していく方法（例えば特許文献３参照。）がある。
【０００３】
生物的な方法としては、蛋白質あるいはペプチドをアミノペプチダーゼやカルボキシペプチダーゼといった酵素で分解し、経時的に一部ずつ採取し、その反応液をアミノ酸分析装置で分析して、遊離されたアミノ酸を定量する方法が用いられてきた（例えば非特許文献１参照。）。またその反応液を質量分析装置にかけて、蛋白質あるいはペプチドの断片の分子量を測定し、もとの蛋白質あるいはペプチドの分子量からの差からアミノ酸の種類を求めていく方法も報告されている（例えば非特許文献２参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００１−２３５４７７
【特許文献２】
特開２００２−１３１２８４
【特許文献３】
特開平１０−２９３１３０
【非特許文献１】
日本生化学会編、生化学実験講座第１巻、タンパク質の化学ＩＩ、ｐ２０３−２１１、１９７６年発行
【非特許文献２】
Ａ．  Ｔｓｕｇｉｔａ，  Ｒ．  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｋ，  Ｍ．  Ｐｙｚｙｂｙｌｓｋｉ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １３７，  １９（１９８２）（Ａ．ツギタ、Ｒ．ファン  デン  ブルック、Ｍ．  ピジビルスキー，フェブス  レター  １３７巻１９頁（１９８２年））
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし物理的な方法ではランダムに切断されるため、配列を決定するための解析が困難であり、化学的な方法は１つのアミノ酸を解析するのに３０分以上と時間が膨大にかかる。
【０００６】
また、先に述べた生化学的な手法は操作が煩雑であること、酵素が再利用できず、毎回新しい酵素を必要とすること、酵素が自己消化性を持つことや酵素の精製が不十分であることによるアミノ酸もしくはペプチドの混入が生じること等の問題点を有している。さらに、解析のため質量分析装置に導入する場合、イオン化法としてエレクトロスプレーイオン化法（以下ＥＳＩ法と略す）が簡便で有用な方法であるが、この方法の欠点として、多価イオンが生じやすく、正確な分子量を見積もるのが困難になるといった問題点がある。
【０００７】
酵素の再利用及び酵素の自己消化性の問題を解決するために用いられる方法の一つとして、酵素の固定化がある。固定化酵素とは、ある一定の空間内に閉じこめられた状態にある酵素のことであり、連続的に酵素反応を行うことが出来、反応後酵素を回収し、再利用できる状態にある酵素のことである。酵素の移動が制限されるため、酵素同士の反応の結果生じる酵素の自己消化もまた起きにくくなる。また使用前によく洗浄することで不純物のアミノ酸もしくはペプチドが除去できる。
【０００８】
この固定化酵素をカラムの中に充填することにより、サンプルをカラムの中に通すだけで、蛋白質あるいはペプチドから末端のアミノ酸を失った断片を得ることが出来る。
【０００９】
この方法は酵素の再利用が可能であるものの、固定化酵素がカラム内に一様に充填されているため、カラムを通すだけでは、ほぼ決まった回数の酵素反応が起こるだけであり、限られた範囲の長さの断片しか得ることができず、得られた断片からアミノ酸配列を求めることは困難であった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】前記問題点を解決するために鋭意検討を行った結果、以下のカラムの発明に至った。
【００１１】
（１）蛋白質あるいはペプチドのペプチド結合を加水分解する固定化酵素と、固定化酵素を保持するための担体あるいは樹脂に、酵素が固定化されていない担体もしくは樹脂を添加し充填したカラム、（２）第１の発明記載の酵素を含む２種類以上の固定化酵素と、それぞれの固定化酵素を保持するための１種類以上の担体あるいは樹脂からなるカラム、（３）第１の発明記載の酵素を含む２種類以上の固定化酵素と、それぞれの固定化酵素を保持するための１種類以上の担体あるいは樹脂に、酵素が固定化されていない担体もしくは樹脂を添加し充填したカラム、（４）第１の発明記載の酵素を含む２種類以上の固定化酵素が、同一の担体あるいは樹脂に固定化されているカラム、（５）第４の発明記載の担体あるいは樹脂に、酵素が固定化されていない担体もしくは樹脂を添加し充填したカラム、（６）充填する担体あるいは樹脂が、酵素反応によって得られた物質の分離手段となることを特長とする第１の発明又は第２の発明又は第３の発明又は第４の発明又は第５の発明記載のカラム、（７）充填する担体あるいは樹脂としてイオン交換樹脂、逆相および順相クロマトグラフィー用充填剤、サイズ排除クロマトグラフィー用充填剤、疎水クロマトグラフィー用充填剤、吸着クロマトグラフィー用充填剤を単独もしくは２種類以上の混合物として用いることを特長とする第１の発明又は第２の発明又は第３の発明又は第４の発明又は第５の発明記載のカラム、（８）蛋白質あるいはペプチド試料を第１の発明又は第２の発明又は第３の発明又は第４の発明又は第５の発明又は第６の発明又は第７の発明記載のカラムに通し、質量分析装置に導入することにより、それぞれの断片の質量からアミノ酸の配列を求める分析法
【００１２】
第１から第７の発明に記載されたカラムをプロテオームカラムと呼称する。
【００１３】
蛋白質あるいはペプチド試料をプロテオームカラムに通し、質量分析装置に導入することにより、それぞれの断片の質量の差からアミノ酸の配列を求めることができ、従来法より反応、解析時間が短く、再利用が可能な経済的に優れたカラムとなった。
【００１４】
【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。また以下に記されているペプチド及び蛋白質のアミノ酸表記は全て一文字表記にて表示する。
【００１５】
実施例１  第１工程、ブロモシアン活性化セファロース４Ｂ（アムシャムファルマシア社）５２８ｍｇを１ｍｍｏｌ／ｌ塩酸溶液に室温で３０分浸し、樹脂の活性化を行った後、溶液をｐＨ８．０の１００ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液に置換し、これに１０μｇ／μｌのカルボキシペプチダーゼＹ（以下ＣＰ−Ｙと略す）溶液を５０μｌ加え、３０℃で４時間振とうした。振とう終了後、リン酸ナトリウム緩衝液を除き、樹脂を洗浄した後、１０ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン溶液を２ｍｌ加え、３０℃で４時間振とうし、残った活性基を牛血清アルブミンにてブロックした。その後、樹脂をリン酸緩衝液にて洗浄することで、酵素が樹脂に固定化された樹脂を得た。
【００１６】
第２工程、第１工程で得られた樹脂を、陰イオン交換樹脂であるトヨパールＳＰ−６５０Ｍと体積比１：３でよく混合し、内径２ｍｍ、長さ１００ｍｍのステンレス製のカラムに充填した。またこれとは別に、第１工程で得られた樹脂を陽イオン交換樹脂であるトヨパールＤＥＡＥ−６５０Ｍと体積比１：３でよく混合し、内径２ｍｍ、長さ１００ｍｍのステンレス製のカラムに充填した。
【００１７】
第３工程、第２工程で得られたプロテオームカラムを液体クロマトグラフィー質量分析計に組み込み、ブラジキニン溶液のアミノ酸配列の解析を質量分析にて行った。液体クロマトグラフィーの装置として、デガッサーＤＧＶ−１２ＡＭ（島津社製）及びポンプＬＣ１０ーＡＤＶＰ（島津社製）を用い、質量分析計としてＬＣＭＳ−２０１０α（島津社製）を用いた。実験条件として移動相に１００ｍｍｏｌ／ｌ酢酸アンモニウム緩衝液を流速０．２ｍｌ／分で流し、イオン化法としてＥＳＩ法を用いた。また対照実験として、イオン交換樹脂が添加されていないカラムを作成し、実験に用いた。
【００１８】
質量分析の結果を図１、２、３に示す。陰イオン交換樹脂を添加したプロテオームカラムではブラジキニン（アミノ酸配列ＲＰＰＧＦＳＰＦＲ）のカルボキシ末端（以下Ｃ末端と略す）側から切断された断片として分子量９０４．２５、７５７．３５、６６０．３０、５７３．２５、４２６．１０のところにピークが得られた。これらの差をとり、その値を解析することにより、Ｃ末端側にＦＳＰＦのアミノ酸配列が存在していることが明らかになった（図１）。
【００１９】
次に陽イオン交換樹脂を添加したプロテオームカラムでは、分子量９０４．２５、７５７．３５、６６０．２５、５７３．２０、４２６．１０のところにピークが得られ、同様に解析することでＣ末端側にＦＳＰＦのアミノ酸配列が存在していることが解析できた（図２）。
【００２０】
一方、従来法による対照実験では、図３より分子量７５７．３５、５７３．２５、４２６．１０のピークしか得られなかったことから、ピークの差をとり、その値を解析してもＣ末端側のＦとＳＰの部分の配列しか求められなかった。
【００２１】
この結果より担体を添加したプロテオームカラムは、従来法によるカラムより、より長いアミノ酸配列を解析できることが示された。
【００２２】
実施例２  第１工程、ブロモシアン活性化セファロース４Ｂ（アムシャムファルマシア社）５６４ｍｇを１ｍｍｏｌ／ｌ塩酸溶液に室温で３０分浸し、樹脂の活性化を行った後、溶液をｐＨ８．０の１００ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液に置換し、これに３．４ｍｇ／ｍｌのアミノペプチダーゼＭ（以下ＡＰ−Ｍと略す）溶液を２００μｌ加え、３０℃で４時間振とうした。振とう終了後、リン酸ナトリウム緩衝液を除き、樹脂を洗浄した後、１０ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン溶液を２ｍｌ加え、３０℃で４時間振とうし、残った活性基を牛血清アルブミンにてブロックした。その後、樹脂をリン酸緩衝液にて洗浄することで、酵素が樹脂に固定化された樹脂を得た。
【００２３】
第２工程、第１工程で得られた樹脂を、実施例１と同様にして、陰イオン交換樹脂であるトヨパールＳＰ−６５０Ｍあるいは陽イオン交換樹脂であるトヨパールＤＥＡＥ−６５０Ｍとよく混合し、内径２ｍｍ、長さ１００ｍｍのステンレス製のカラムに充填した。
【００２４】
第３工程、第２工程で得られたカラムを液体クロマトグラフィー質量分析計に組み込み、アンギオテンシンＩＩＩ溶液のアミノ酸配列の解析を質量分析にて行った。実験条件として移動相に１００ｍｍｏｌ／ｌ酢酸アンモニウム緩衝液を流速０．２ｍｌ／分で流し、イオン化法としてＥＳＩ法を用いた。また対照実験として、イオン交換樹脂が添加されていないカラムを作成し、実験に用いた。
【００２５】
質量分析の結果を図４、５、６に示す。陰イオン交換樹脂を添加したプロテオームカラムでは、アンギオテンシンＩＩＩ（アミノ酸配列ＲＶＹＩＨＰＦ）のアミノ末端（以下Ｎ末端と略す）側から切断された断片として、分子量９３１．０５、７７５．２５、６７６．３０、５１３．２５、４００．０５、２６２．８５のところにピークが得られた。これらの差をとり、その値を解析することにより、Ｎ末端側からＲＶＹＩＨの順でアミノ酸が並んでいることが解析できた（図４）。
【００２６】
また、陽イオン交換樹脂を添加したプロテオームカラムでは、分子量７７５．４０、６７６．３５、５１３．０５、４００．１５、２６３．０５のところにピークが得られた。同様に解析したところ、Ｎ末端側にＶＹＩＨのアミノ酸配列が存在していることが明らかになった（図５）
【００２７】
一方、対照実験の方では分子量７７５．４０、６７６．４０、５１３．３０、４００．１５のピークが得られた。同様にして解析した結果、Ｎ末端側のアミノ酸配列ＶＹＩの配列を解析することができた（図６）。
【００２８】
この結果から、従来法によるカラムと比較して、陽イオン交換樹脂を添加したプロテオームカラムで１残基、陰イオン交換樹脂の添加したプロテオームカラムでは２残基分長く、アミノ酸配列を行うことができた。
【００２９】
実施例３  実施例１で得られた陰イオン交換樹脂添加プロテオームカラムを液体クロマトグラフィー質量分析計に組み込み、合成ペプチド（アミノ酸配列ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬＶＩＨ）溶液のアミノ酸配列の解析を質量分析にて行った。実験条件として移動相に１００ｍｍｏｌ／ｌ酢酸アンモニウム緩衝液を流速０．２ｍｌ／分で流し、イオン化法としてＥＳＩ法を用いた。試料の注入後、質量／電荷比５０から２０００までの分子イオンを測定し、時間ごとの各分子イオン量の変化を計測した。全イオンクロマトグラフィーの結果とペプチドのＣ末端のアミノ酸が切断されてできた断片のクロマトグラフィーを図７に示す。
【００３０】
図７より合成ペプチドのＣ末端側から切断されてできた断片由来のピークうち、アミノ酸配列がＤＲＶＤの断片とＲＶＹの断片は、保持時間が０．９分であり、アミノ酸配列がＤＲＶＹＩＨＰの断片及びＤＲＶＹＩＨＰＦの断片は保持時間がそれぞれ２．４分、２．８分とフラグメント長と保持時間の間に相関がみられた。
【００３１】
ＥＳＩ法によりイオン化した場合、本条件ではＤＲＶＤ断片とＲＶＹ断片は電荷数が１になるのに対し、ＤＲＶＹＩＨＰ断片及びＤＲＶＹＩＨＰＦ断片は電荷数が２となっているが、図７では電荷数１のＤＲＶＤ断片とＲＶＹ断片は保持時間が１分のところに見られ、電荷数２のＤＲＶＹＩＨＰ断片及びＤＲＶＹＩＨＰＦ断片は保持時間が２分台のところに現れており、電荷数と保持時間の間に相関が見られ、これを利用することにより解析が容易に行えるようになった。
【００３２】
【発明の効果】以上説明したように、第１の発明により、固定化酵素のみを充填した従来法に比べ、より長い範囲のアミノ酸配列の解析が行えるようになると同時に、固定化酵素の使用量を２５％にまで減らすことができるという効果がある。
【００３３】
また第２の発明では添加する担体あるいは樹脂のかわりに、第１の発明記載の酵素と異なる酵素を固定化した担体あるいは樹脂を加えることにより、第１の発明と同様の効果を得られるだけではなく、試料の蛋白質あるいはペプチドに対し、修飾あるいは修飾された部分の脱離を行うことが可能であり、アミノ酸配列をより読みやすくする効果がある。
【００３４】
第３の発明では、第２の発明の効果をより少ない酵素量で実現することが可能となる。
【００３５】
第４の発明では、第２の発明で得られる効果を一つの担体あるいは樹脂によって得ることが可能になり、プロテオームカラムの作製の際、担体あるいは樹脂を混合するという工程を省略することが可能となる。
【００３６】
第５の発明では、第２の発明の効果を持ちつつ、酵素をより局在化させることで、より長い範囲のアミノ酸配列の解析が行えるようになるという効果がある。
【００３７】
第６の発明では、分離能を有する担体あるいは樹脂を添加することで、不純物を分離し、より感度よく測定することが可能となる。また添加する担体あるいは樹脂により、一つのカラムで反応と分離を同時に行えることから、ＥＳＩ法を用いたときに生じる高価イオンの解析を容易に行えるという効果がある。
【００３８】
第７の発明に記載されている担体あるいは樹脂を用いることにより、一つのプロテオームカラムで目的の蛋白質あるいはペプチドに応じた分離を行いつつ、アミノ酸配列解析についての情報を得ることができるという効果がある。
【００３９】
第８の発明では、第１から第７の発明によるプロテオームカラムをアミノ酸配列解析に用いることにより、従来法よりも簡便に且つ迅速に解析が行えるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＰ−Ｙを固定化した樹脂のみを用いたカラムによるブラジキニンの消化断片のマススペクトロメトリー
【図２】ＣＰ−Ｙを固定化した樹脂に陽イオン交換樹脂を添加したカラムによるブラジキニンの消化断片のマススペクトロメトリー
【図３】ＣＰ−Ｙを固定化した樹脂に陰イオン交換樹脂を添加したカラムによるブラジキニンの消化断片のマススペクトロメトリー
【図４】ＡＭ−Ｐを固定化した樹脂のみを用いたカラムによるアンギオテンシンＩＩＩの消化断片のマススペクトロメトリー
【図５】ＡＭ−Ｐを固定化した樹脂に陽イオン交換樹脂を添加したカラムによるアンギオテンシンＩＩＩの消化断片のマススペクトロメトリー
【図６】ＡＭ−Ｐを固定化した樹脂に陰イオン交換樹脂を添加したカラムによるアンギオテンシンＩＩＩの消化断片のマススペクトロメトリー
【図７】ＣＰ−Ｙを固定化した樹脂に陰イオン交換樹脂を添加したカラムによる合成ペプチド（アミノ酸配列ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬＶＩＨ）の全イオンクロマトグラフィー及び、Ｃ末端のアミノ酸が切断された断片（アミノ酸配列：ＤＲＶ、ＤＲＶＹ、ＤＲＶＹＩＨＰ及びＤＲＶＹＩＨＰＦ）のマスクロマトグラフィー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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