(57)【要約】      （修正有）【課題】凍結保存および融解処理された受精能の低下した精子に対しても体外受精率の高い哺乳動物、特に遺伝子改変マウスの透明帯穿孔未受精凍結卵の提供。【解決手段】哺乳動物から採取された未受精卵の周囲を覆う透明帯に、該透明帯を貫通するほぼ円形状の穿孔であって、直径または短軸の長さが１０μｍ〜４０μｍの穿孔を形成させてなることを特徴とする哺乳動物の透明帯穿孔卵および哺乳動物から採取された未受精卵の周囲を覆う透明帯に、レーザー光線を穿孔条件下において照射し、該透明帯を貫通する穿孔を形成させることを特徴とする哺乳動物の透明帯穿孔卵の作製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物から採取された未受精卵の周囲を覆う透明帯に、該透明帯を貫通するほぼ円形状の穿孔であって、直径または短軸の長さが１０μｍ〜４０μｍの穿孔を形成させてなることを特徴とする哺乳動物の透明帯穿孔卵。
【請求項２】
前記哺乳動物が、マウスである請求項１に記載の哺乳動物の透明帯穿孔卵。
【請求項３】
前記透明帯穿孔卵が、凍結保存および融解処理に供された精子に対しても体外受精が可能な未受精卵である請求項１または２に記載の哺乳動物の透明帯穿孔卵。
【請求項４】
哺乳動物から採取された未受精卵の周囲を覆う透明帯に、レーザー光線を穿孔条件下において照射し、該透明帯を貫通する穿孔を形成させることを特徴とする哺乳動物の透明帯穿孔卵の作製方法。
【請求項５】
前記レーザー光線の照射による穿孔位置が、前記未受精卵を細胞収縮処理に供し、該細胞質と透明帯との間の囲卵腔の容積が最大となる透明帯部位である請求項４に記載の透明帯穿孔卵の作製方法。
【請求項６】
前記哺乳動物が、マウスである請求項４または５に記載の透明帯穿孔卵の作製方法。
【請求項７】
前記レーザー光線の穿孔条件が、波長；５００ｎｍ〜２０００ｎｍにおいて、出力；２０ｍＷ〜２００ｍＷである請求項４ないし６のいずれかの１項に記載の透明帯穿孔卵の作製方法。
【請求項８】
前記レーザー光線の穿孔条件が、パルス巾０．１ｍｓ〜１２５ｍｓである請求項４ないし７のいずれかの１項に記載の透明帯穿孔卵の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物の卵透明帯に穿孔した卵子（本明細書において、「透明帯穿孔卵」という。）および透明帯穿孔卵の作製方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、凍結融解後の運動性の悪い精子に対しても、良好な体外受精を可能とする透明帯穿孔未受精卵および該透明帯穿孔未受精卵をレーザー光線を用いて作製する方法に関するものである。
【０００２】
また、本発明は、透明帯穿孔卵の作製のためのレーザー穿孔装置を用いる穿孔システムを提供するものである。
【０００３】
【従来の技術】
現在、ゲノム解析の進渉に伴ない、遺伝子の機能を解析・研究する必要性が強くなり、その目的のために、クローン化されたＤＮＡのマウス生殖系列への導入などにより、膨大な数量および種類の遺伝子導入マウスまたは遺伝子破壊マウス等の遺伝子改変マウスが作製されている。
そこで、膨大に開発される遺伝子改変マウスの保存が極めて重要な課題となっている。
【０００４】
しかしながら、何万種類もの極めて多種類の遺伝子改変マウスをすべて生体で維持することは不可能であり、受精卵および精子等の生殖細胞の凍結保存が経済的にもまた技術的にも有利なことからこれらの開発が急速に進められている。特に、受精卵に比較して精子が数の面でも多量に保存可能なため、マウス精子の凍結保存が注目されており、将来は精子の凍結保存が主流になるものと予測されている。
【０００５】
ところが、遺伝子改変マウスのバックグラウンドに約７０％以上も多用されているＣ５７ＢＬ／６系統マウスの精子は、凍結後、融解すると、その運動性は比較的良好であるものの、受精能が極端に低下し、通常の体外受精が、見込めないという状況にある。その原因は、本発明者らの検討によれば、精子の頭部の膜が、凍結処理および融解処理により破壊され、卵透明帯を自力で通過できなくなる点にあることが把握された。すなわち、図３の電子顕微鏡写真で示す新鮮な精子に対し、図４に示すように凍結融解精子は、頭部の膜が破壊されていることが観察できる。
【０００６】
かかる状況下において、従来、受精相手の未受精卵の透明帯の一部について研究者自ずからの手作業によるスリット状切開が実施されてきた（透明帯部分切開法（Ｐａｒｔｉａｌ  Ｚｏｎａ  Ｐｅｌｌｕｃｉｄａ  Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）  以下、「ＰＺＤ」と称する。）（例えば、非特許文献１参照。）。かかる操作で透明帯の一部を切開することにより、運動性の悪い精子でも卵細胞質へ侵入させ、受精率を向上させることが試みられてきた。
【０００７】
また、非特許文献２には、圧電マイクロマニピュレーターを用いて透明帯の一部を切開する方法（Ｚｏｎａ  Ｐｅｌｌｕｃｉｄａ  Ｉｎｃｉｓｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｉｅｚｏ−ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ）（以下、「ＺＩＰ」と称する。）が開示され、長さが約２６μｍの切開の事例が記載されている。
【０００８】
しかしながら、かかるＰＺＤおよびＺＩＰの方法は、いずれも透明帯の一部をスリット状に切開するものであり、手作業によるものであるから切開にはかなりの熟練と労力を要するものであり、処理量には限度があった。また、切開寸法の大きさにバラツキが生じ、均一の寸法のものが連続的に得られないなど、作製効率が低く、その結果、体外受精率も低いものであった。
【０００９】
【非特許文献１】
「ＢＩＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＲＥＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ」（米国）５７，  １０５０−１０５５（１９９７）
【非特許文献２】
「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ（  Ｏｖａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」（日本）１９，  ２６−３１（２００２）
【非特許文献３】
「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＲＥＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ａｎｄ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ」（米国）８７，  ４７９−４８３（１９８９）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の第一の課題は、前記の如き、斯界における開発状況に鑑み、凍結保存および融解処理後の運動性の低下した精子に対してもさらに体外受精率の高い未受精卵を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の第二の課題は、従来のＰＺＤおよびＺＩＰの手作業による卵透明帯の一部切開方法の難点を克服し、最も良好な穿孔サイズを均一に施した透明帯穿孔卵の効率的な作製方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を重ねたところ、卵子を覆っている透明帯にレーザー光線を用いて穿孔を形成させる方法を採用することにより、ほぼ円形状で均一の大きさの穿孔を有し、体外受精率が９０％にも達する良好な透明帯穿孔卵を実現できることができ、また、透明帯穿孔卵の作製方法として、例えば、一人一日当たり１０００個以上もの高効率で処理することができ、しかも穿孔後の生存卵の割合が１００％を達成できることに着目し、かかる知見に基づいて本発明の完成に至った。
【００１３】
かくして、本発明によれば、
哺乳動物から採取された未受精卵の周囲を覆う透明帯に、該透明帯を貫通するほぼ円形状の穿孔であって、直径または短軸の長さが、１０μｍ〜４０μｍの穿孔を形成させてなることを特徴とする哺乳動物の透明帯穿孔卵
が提供される。
【００１４】
また、本発明によれば、
哺乳動物から採取した未受精卵の周囲を覆う透明帯に、レーザー光線を穿孔条件下において照射し、該透明帯を貫通する穿孔を形成させることを特徴とする哺乳動物の透明帯穿孔卵の作製方法
が提供される。
【００１５】
特に、前記レーザー光線の照射による穿孔位置が、前記未受精卵を細胞収縮処理に供し、該細胞質と透明帯との間の囲卵腔の容積が最大となる透明帯部位にある前記哺乳動物の透明帯穿孔卵の作製方法
が提供される。
【００１６】
本発明は、前記の如く哺乳動物の透明帯穿孔卵および該透明帯穿孔卵の作製方法を提供するものであるが、さらに、次に示す如き１）〜５）の好ましい実施の態様を包含する。
【００１７】
１）前記哺乳動物が遺伝子改変マウスである前記哺乳動物の透明帯穿孔卵。
２）前記透明帯穿孔卵が、凍結保存された未受精凍結卵である前記哺乳動物の透明帯穿孔卵。
３）雌マウスから採取された未受精卵を細胞収縮処理に供し、該細胞質と透明帯との間の囲卵腔の容積が最大となる透明帯部位にレーザー光線を穿孔条件下において照射し、前記透明帯を貫通する直径または短軸の長さが１０μｍ〜４０μｍの穿孔を形成させる前記透明帯穿孔卵の作製方法。
４）前記レーザー光線の穿孔条件が、波長：５００ｎｍ〜２，０００ｎｍ、出力：２０ｍＷ〜２００ｍＷ、パルス巾：０．１ｍｓ〜１２５ｍｓである前記透明帯穿孔卵の作製方法。
５）雌マウスから採取された未受精卵の周囲を覆う透明帯に、レーザー光線を波長：１，０００ｎｍ〜１，８００ｎｍ、出力：１００ｍＷ〜２００ｍＷ、パルス巾：３ｍｓ〜１００ｍｓで照射し、該透明帯を貫通するほぼ円形状の穿孔であって、直径または短軸の長さが１０μｍ〜２０μｍの穿孔を形成させた透明帯採光卵の作製方法。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、哺乳動物の卵透明帯に特定のほぼ円形状の穿孔をレーザー光線により形成させた透明帯穿孔卵および該透明帯穿孔卵の作製方法を提供するものである。
【００１９】
本発明に係る透明帯穿孔卵の作製方法に用いられる未受精卵を提供する哺乳動物は、特に限定されるものではなく、牛、馬、ヤギ、ヒツジ、豚、ウサギ等の家畜およびマウス、ラット、モルモット、その他の実験動物等のあらゆる哺乳動物を対象とすることができるが、本発明によれば、マウス、ラット、特に遺伝子改変マウスに有用である。
【００２０】
哺乳動物の卵透明帯は、卵細胞質の周囲を覆う透明な卵膜であり、糖タンパク質から成り、精子受容体活性および先体反応誘起活性を有することが知られている。その直近の外側は、濾泡細胞からなる放射冠があり、その外側は濾泡細胞からなる卵丘で囲まれている。通常、精子はアクロシン等により透明帯を溶かし囲卵腔に侵入するものと理解されている。
【００２１】
受精に際しては、近傍に到来した精子は、透明帯に接触すると先体反応が生じ、頭部の先端にある先体が変化してヒアルロニダーゼ、アクロシン等の溶解素が放出され、これらの働きにより精子は透明帯を通過し、内部に存在する卵細胞に到達し、受精に到るが、前記した如く、凍結保存されたマウス、特にＣ５７ＢＬ／６系統雄マウスの精子は、凍結処理および融解処理により損傷をうけ活力を低下し、透明帯を通過する力を欠いているものが多く、受精率が低いことに鑑み、精子が透明帯を通過できるように特定の大きさで、かつ最適な形状の穿孔を透明帯に形成させたものである。
【００２２】
かかる透明帯に形成させた穿孔の形状は、図１の本発明に係る透明帯穿孔卵の電子顕微鏡写真で示すように、穿孔部分がほぼ円形状のものであり、透明帯を貫通したものである。かかる穿孔形状を有する透明帯穿孔卵は、体外受精率の向上に寄与する点が大きく、これは、円形状の穿孔構造が精子の通過を容易にしているものと推定されるのであり、スリット状の切開方法による場合と比較して穿孔した後の生存卵の割合（生存率）、体外受精率等の点において著しく顕著な効果を奏するものである。
【００２３】
また、透明帯の穿孔の寸法は、その直径または楕円形の場合の短軸の長さが１０μｍ〜４０μｍ、好ましくは１０μｍ〜２０μｍであり、かかる直径等の範囲において体外受精率を著しく向上させることができる。
【００２４】
以下、本発明に係る哺乳動物の透明帯穿孔卵の作製方法についてマウスを例に説明する。
すなわち、該透明帯穿孔卵の作製方法は、少なくとも次の工程を含む。
【００２５】
１）未受精卵の採取
本発明に係る透明帯穿孔卵の作製方法において、哺乳動物、特にマウスからの未受精卵の採取に際しては、当該技術分野で実施されている前処理を採用することができる。すなわち、排卵誘発剤の投与により過排卵処理を行なった雌マウスを安楽死させ腹部を切開する。子宮、卵管、卵巣を体外に取り出した後、卵管のみを採取し、卵管膨大部より卵丘細胞に包まれた未受精卵を取り出す。具体的には、過排卵処理は、排卵誘発剤、例えば、卵胞刺激ホルモン性の性腺刺激ホルモンの卵胞成熟効果と、黄体形成ホルモン性の性腺刺激ホルモンの排卵効果とを組合せたものであり、具体的には、成熟雌マウスに所定濃度の妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳ）とヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を、例えば４８時間間隔で腹腔内に投与（２．５〜７．５単位／匹）することにより過排卵処理を施すことができる。過排卵処理を施した雌マウスの卵管膨大部より未受精卵塊を採取する。
【００２６】
２）卵丘細胞の除去
前記工程にて得られた未受精卵をヒアルロニダーゼ処理に供し、卵丘細胞を除去する。具体的には、未受精卵をヒアルロニダーゼを添加した体外受精用培地（ＨＴＦ培地）に導入し、ヒアルロニダーゼで処理し、洗浄後、卵丘細胞が除去された未受精卵を得る。
【００２７】
３）細胞質収縮処理
卵細胞収縮処理は、前記の如くして得られた未受精卵をレーザー光線による穿孔に供する前に、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）溶液に導入するものである。すなわち、前記工程にて得られた未受精卵をスクロース溶液に導入することにより、細胞質を収縮させ、細胞質と透明帯の間の囲卵腔を拡大させる。スクロースの濃度としては、０．１Ｍ〜１Ｍのものが好ましい。スクロース処理により図２に示すように卵細胞質が収縮し、囲卵腔が拡大されるので、同図に示すようにレーザー光線の照射位置を最適化することができ、これにより、レーザーによる卵細胞質へのダメージを回避することができる。
【００２８】
４）レーザー光線による穿孔
前記工程にて得られた未受精卵の囲卵腔の最大スペースの透明帯部位（図２参照。）に透明帯穿孔卵作製用レーザー穿孔装置（図５）を用いてモニター画面を見ながらボタン操作とピント調整によりレーザー光線を穿孔条件下において照射する。レーザー光線の照射による透明帯穿孔卵の作製方法について図５を参照して具体的に説明する。レーザー光線により得られた透明帯穿孔卵の電子顕微鏡写真を図１に示す。
【００２９】
透明帯穿孔卵の作製に用いられるレーザー穿孔装置を図５に示す。該穿孔装置は、透明帯に照射するレーザー光線を発生させるレーザー装置１、レーザー装置１から出力されたレーザー光線（ビーム）ａａを照射する未受精卵を保有するシャーレ６を具備する倒立顕微鏡２、モニター３およびリモコン４から構成されたものである。倒立顕微鏡２は、ケーブルａおよびｂによりレーザー装置１およびモニター３に接続され、倒立顕微鏡２の映像は、ケーブルｂを経てモニター３に映し出される。レーザー装置１の設定およびレーザー照射は、すべてリモコン４により操作される。リモコン４からの信号によりレーザー装置１から出力されたレーザー光線ａａは線ａを経て倒立顕微鏡２に入り、ステージ５上に置かれたシャーレ６内の未受精卵に下から照射され、透明帯の所定部位が穿孔される。
【００３０】
次に、穿孔の操作について説明する。
本発明に係る透明帯穿孔卵は、前記レーザー穿孔装置を用いることにより効率よく作製することができ、透明帯卵作製方法によれば、次の操作手順を採用することができる。
【００３１】
倒立顕微鏡２のステージ５に卵丘細胞を除去した所定数量の未受精卵を装入したシャーレ４を載置する。倒立顕微鏡２を覗いて視野の中央に未受精卵を移動させる。モニター３の画面にも所定操作により顕微鏡と同じ画像が映し出されるように制御する。レーザー装置１とケーブルＣにより接続しているリモコン４で穿孔の大きさを設定する。ついで、ステージ５を移動させて、モニター３画面上の照射ポイントに未受精卵の穿孔部位とピントを合わせた後、リモコン４のスイッチ４を押し、レーザー光線をケーブルａを経て倒立顕微鏡２のステージ５上のシャーレ６内の未受精卵に照射し穿孔する。
【００３２】
穿孔を確認後、ステージ５を移動させ、次に未受精卵を前記と同様にモニター３画面上の照射ポイントに合わせ、リモコン４を操作してレーザー装置１からレーザー光線をシャーレ６内の未受精卵に照射し穿孔する。
【００３３】
かかる操作により、すべての未受精卵の穿孔が終了した後、倒立顕微鏡ステージ５からシャーレ６を脱着し、新たなシャーレを設置する。この操作を繰り返すことにより、穿孔作業を連続的に行なうことができる。
【００３４】
前記レーザー装置は、誘導放出を利用した光の増巾器または発振器であるが、レーザー媒質の種類により、気体レーザー、固体レーザー、半導体レーザー等各種の型が開発されている。気体レーザーとしては、ＨｅとＮｅとの混合ガスを用いたＨｅ−Ｎｅレーザー、アルゴンイオンの励起準位を利用したアルゴンレーザー、炭酸ガスを用いる炭酸ガスレーザーのほか、銅蒸気レーザー等を、また固体レーザーとしては、ネオジウムイオン（Ｎｄ３＋）をドープしたＹＡＧ（イットリウム・アルミニウム・ガーネット結晶）を用いるＮｄ：ＹＡＧレーザー、ガラスにネオジウムイオンをドープしたガラスレーザー、ルピーにクロムイオンをドープしたルピーレーザー等を挙げることができる。本発明の透明帯穿孔卵の作製には、レーザー光線の波長、出力およびパルス巾等の穿孔条件を設定・制御できるものであれば、特に限定するものではなく、市販品を使用することができる。
【００３５】
本発明に係る透明帯穿孔卵の作製方法において、用いられるレーザー光線は、波長（λ）として５００ｎｍ〜２０００ｎｍの範囲のものを選択することができるが、特に、１０００ｎｍ〜１８００ｎｍの範囲のものが好ましい。出力としては、２０ｍＷ〜２００ｍＷ、好ましくは１００ｍＷ〜２００ｍＷの範囲のものを採用することができる。また、パルス巾としては０．１ｍｓ〜１２５ｍｓ、好ましくは、３ｍｓ〜１００ｍｓの範囲のものを選択して採用することができる。
【００３６】
レーザー光線による穿孔条件は、前記の各条件を適宜選択して組合せることができるが、波長が５００ｎｍに達しないと穿孔が十分形成できず、一方、２０００ｎｍを超えると細胞破壊の弊害が生ずる。また、出力が２０ｍＷに達しないと、穿孔が不十分であり容易に貫通孔が得られない。一方、２００ｍＷを超えると細胞破壊のおそれが生じ、効率よく穿孔処理ができないという難点がある。また、パルス巾についても０．１ｍｓに満たないと穿孔不十分のおそれがあり、一方、１２５ｍｓを超えると細胞破壊が生ずるという難点を包蔵する。
【００３７】
５）穿孔卵の凍結保存
前記工程にて得られた透明帯穿孔卵は、通常、凍結保存に供される。
凍結方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、中尾・中潟式簡易ガラス化法、緩慢法、二段階法等をはじめ各種方法を任意に選択して用いることができる。中尾・中潟式簡易ガラス化方法によれば、非特許文献３に示すように、透明帯穿孔未受精卵を５μｌの１Ｍジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と共にクライオチューブ内に移し、５分間静置する。次に簡易ガラス化保存用液（ＤＡＰ２１３；２Ｍジメチルスルホキシド、１Ｍアセトアミドおよび３Ｍプロピレングリコールを含むリン酸緩衝液）を４５μｌ添加し、５分後液体窒素中に浸漬し、未受精卵を凍結保存する方法が採用されている。
【００３８】
なお、本発明に係る透明帯穿孔卵の作製方法に供される未受精卵は、当然のことながら凍結保存後、融解処理したものも用いることができる。前記方法による凍結保存は、透明帯穿孔卵のほか、未穿孔卵、穿孔受精卵についても同様に適用することができる。
【００３９】
ここでマウスについて、本発明に係るレーザー光線を用いる透明帯穿孔卵の作製方法と従来から実施されているＰＺＤ法との各評価項目に対する評価結果をまとめると表１に示す通りである。
【００４０】
【表１】
2004147604.tif 000002
【００４１】
表中、作業性を示す「作業時間」は、穿孔または切開から洗浄までの時間であり、レーザーおよびＰＺＤにはあまり相違がないが、「労力」、「熟練度」については本発明に係るレーザーによれば、ヒトへの負担は小さいため軽く、また、レーザー装置は操作が容易なため熟練度は不必要である。
【００４２】
また、「作業量」については、本発明の方法では一人一日当たり１０００個以上の穿孔卵の作製が可能であるが、ＰＺＤでは手作業のため約３００個が限界とされる。また、穿孔卵の品質・性能については、穿孔卵の生存率がＰＺＤでは手作業による操作ミスのため９０％にとどまるのに対し、本発明では１００％の結果であり、全量安全に確保することができる。
【００４３】
さらに、「体外受精率」が、本発明の場合９０％と高水準に達するのに対し、ＰＺＤでは高々６０％程度のものであり、本発明の効果が如実に現われている。
かくして、本発明に係る透明帯穿孔卵の作製方法によれば、前記した如く、従来から実施されているＰＺＤ法に比較して、作業性において効率上極めて優れており、また、得られる透明帯穿孔卵の生存率、体外受精率が著しく高いことから、効率よく高品質の透明帯穿孔卵の作製を実現することができる。
【００４４】
【実施例】
以下、本発明について、実施例および比較例を以ってさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は、実施例等により何ら限定されるものではない。
【００４５】
なお、実施例等において用いた供試動物、透明帯穿孔用レーザー装置および穿孔システムは次の通りである。
（１）供試動物
Ｃ５７ＢＬ／６系統雌マウス（日本クレア社）
（２）使用機器
レーザー装置、倒立顕微鏡、テレビモニターの各市販品
【００４６】
実施例１
成熟した前記Ｃ５７ＢＬ／６系統雌マウス３０匹に妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳ）を腹腔内に投与し、その４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を腹腔内に１匹あたり２．５〜７．５単位を投与し、過排卵処理を行なった。
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の投与１５時間後に過排卵処理した雌マウスを屠殺し、卵管膨大部より未受精卵を取り出し、体外受精用培地（ＨＴＦ）に導入した。未受精卵を導入したＨＴＦ培地に０．１％ヒアルロニダーゼを添加し、３分間インキュベーター内に静置した。その後、３回洗浄を行ない、卵丘細胞を除去した。
卵丘細胞を除去した未受精卵は、クラス３Ｂレーザー装置を用いる透明帯への穿孔に供した。すなわち、該未受精卵をレーザーによる卵細胞質へのダメージを避けるため０．１Ｍ〜１Ｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ溶液に導入し、図２に示すように卵の細胞質を収縮させた。次に、レーザー光線を下記の操作により卵細胞質と透明帯の間、すなわち囲卵腔のスペースが最も広いところ１ケ所に照射し直径１０μｍ〜４０μｍの穿孔を形成させた。
透明帯の穿孔は、図５に示す透明帯穿孔卵作製レーザー穿孔装置を用いて次の操作手順により行なった。
【００４７】
１．先ず、レーザー装置１、倒立顕微鏡２およびモニター３を稼働状態とした後、倒立顕微鏡２のステージ中央にプラスティックシャーレ４を載置した。プラスティックシャーレ４には卵丘細胞を除去した未受精卵を数十個入れておいた。
２．倒立顕微鏡を覗いて、視野の中央に未受精卵を移動させた。
３．モニター画面にも顕微鏡と同一の画像が映し出されることを確認した。
４．レーザー装置本体１からケーブルで結合しているリモコンで穿孔する穴の大きさを設定した。
５．倒立顕微鏡２のステージを移動させモニター画面上の照射ポイントに未受精卵の穿孔部位とピントを合わせた。
６．リモコン４のスイッチを押し、レーザーを照射し穿孔した。
７．穿孔を確認後、ステージを移動させ、次の未受精卵をモニター画面上の照射ポイントに合わせ、レーザー光線ａａを照射した。
８．すべての未受精卵の穿孔の終了後、倒立顕微鏡ステージ５からプラスティックシャーレ６を下ろし、新たなシャーレと交換した。
【００４８】
前記穿孔操作においてレーザー光線による透明帯穿孔の条件は次の通りとした。
波長；１．４８０ｎｍ
出力；１６５〜２００ｍＷ
パルス巾；０．１〜７．０ｍｓ
前記の如くして透明帯への穿孔が終了した透明帯穿孔未受精卵をＨＴＦ培地で３回洗浄し、その後、体外受精に供した。
【００４９】
（精子の融解）
凍結保存していたＣ５７ＢＬ／６系統雄マウスの精子を液体窒素中から取り出し、３７℃の温水中に浸漬した。１５分間放置後融解した精子を１００μｌの体外受精用培地（ＨＴＦ）に懸濁させた。凍結融解後の精子は、図３に示す新鮮精子と比較して図４に示すように頭部に損傷を有するものであった。
【００５０】
（体外受精）
前記の受精用培地（ＨＴＦ）に懸濁させた精子の濃度を５００〜７００精子／ｍｌに調整し、その一部を前記透明帯穿孔未受精卵の培地に導入した。３時間後に該透明帯穿孔卵を新鮮な培養液（ＨＴＦ）で洗浄し、２細胞期へ発生した胚および未受精卵を回収し、それらの数を計測し、体外受精率を次の式で求めたところ９０％であった。
体外受精率（％）＝（２細胞期胚の数）／（２細胞期胚の数＋未受精卵の数）×１００
【００５１】
実施例２
実施例１と同一の操作により得られた透明帯穿孔未受精卵を中尾・中潟式簡易ガラス化方法を用いて凍結した。
すなわち、透明帯に穿孔した未受精卵を５μｌの１Ｍ  ＤＭＳＯ  と共にクライオチューブ内に移し、５分間静止した。次に、簡易ガラス化保存用液ＤＡＰ２１３＊を４５μｌ添加し、５分間液体窒素中に浸漬し、凍結保存に供した。
凍結保存後、凍結された透明帯穿孔未受精卵を融解処理に供した後、実施例１に記載の体外受精方法と同一条件・操作の体外受精方法に供したところ、体外受精率７０％であった。
＊２Ｍ  ＤＭＳＯ、１Ｍアセトアミドおよび３Ｍ  プロピレングリコールを含むリン酸緩衝液
【００５２】
実施例３
レーザー光線による透明帯穿孔卵作製において、透明帯に穿孔した穴の数が１個〜５個となるように、レーザー光線の照射条件を制御して穿孔を行なった。それら透明帯穿孔卵は実施例１と同一の操作おび条件による体外受精に供した。その結果、穿孔数による大きな影響は認められず、穿孔後の生存率は９０％〜１００％、体外受精率は７０％〜９０％であった。
【００５３】
比較例１
卵丘細胞を除去した未受精卵のレーザー光線による透明帯の穿孔の代わりにＰＺＤにより透明帯を切開した。
すなわち、過排卵処理した雌マウスから未受精卵を採取し、０．１％ヒアルロニダーゼを添加することにより卵丘細胞の除去を行なった。卵丘細胞を除去した未受精卵は、０．３Ｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ溶液に導入し、卵の細胞質を収縮させ、プラスティックシャーレの底に卵を固定させた。次に顕微鏡下で３０ゲージの注射針を用いて１個１個手作業によって長さ５０〜１００μｍの切り込みを入れ、透明帯に切開を行なった。切開後、透明帯切開卵はＨＴＦ培地で３回洗浄し、その体外受精に供した。なお、透明帯切開以外は、すべて実施例１の操作と同一の操作により体外受精に供した。この方法による生存率は９０％、体外受精率は６０％であった。
【００５４】
【表２】
2004147604.tif 000003
【００５５】
【発明の効果】
レーザー光線を用いる透明帯穿孔卵の作製は、従来のＰＺＤに比較して、連続的な作業が可能であり、熟練を要することがないので、例えば、一人１日当たりＰＺＤでは３００個が限界であるのに対し、本発明では、１０００個以上可能であり、操作ミスが小さいため、穿孔卵の生存率も１００％に達する。
また、レーザー穿孔により体外受精率が９０％にも達するなど高品質の透明帯穿孔卵を提供することができる。
さらに、透明帯穿孔卵作製用レーザー穿孔装置によれば、正確で安定した穿孔が可能であり、高効率の透明帯穿孔卵の作製に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る透明帯穿孔卵の電子顕微鏡写真（倍率；１５００倍である。
【図２】本発明に係る透明帯穿孔卵の穿孔位置を示す断面写真である。
【図３】Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスの新鮮精子の電子顕微鏡写真である。
【図４】Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスの凍結融解精子の電子顕微鏡写真である。
【図５】本発明に係る透明帯穿孔卵の作製に用いるレーザー穿孔装置の構成を示すブロック図である。
【符号の説明】
１    レーザー装置
２    倒立顕微鏡
３    テレビモニター
４    リモートコントローラー
【図１】
2004147604.tif 000004
【図２】
2004147604.tif 000005
【図３】
2004147604.tif 000006
【図４】
2004147604.tif 000007
【図５】
2004147604.tif 000008