(57)【要約】【課題】  安定化剤として実質的にタンパク質を含有しない、凍結乾燥製剤に代わるＥＰＯの製剤を提供する。【解決手段】    尿素を含まず、安定化剤として、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸及びアルギニンならびにその塩から選択される１または２以上のアミノ酸を含む、エリスロポエチン溶液製剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿素を含まず、安定化剤として、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸及びアルギニンならびにその塩から選択される１または２以上のアミノ酸を含む、エリスロポエチン溶液製剤。
【請求項２】
安定化剤が、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−アルギニンならびにその塩から選択される１または２以上のアミノ酸である、請求項１に記載の溶液製剤。
【請求項３】
安定化剤が、トリプトファン及び／又はその塩である、請求項１に記載の溶液製剤。
【請求項４】
安定化剤が、アルギニン及び／又はその塩である請求項１に記載の溶液製剤。
【請求項５】
安定化剤として、さらにヒスチジンを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の溶液製剤。
【請求項６】
安定化剤として、さらにＬ−ヒスチジンを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の溶液製剤。
【請求項７】
アミノ酸の濃度が０．１〜４０ｍｇ／ｍｌである請求項１〜６のいずれかに記載の溶液製剤。
【請求項８】
アルギニンの濃度が１〜５ｍｇ／ｍｌである、請求項１、２及び４〜７のいずれかに記載の溶液製剤。
【請求項９】
安定化剤として、実質的にタンパク質を含まない、請求項１〜８のいずれかに記載の溶液製剤。
【請求項１０】
界面活性剤をさらに含む請求項１〜９のいずれかに記載の溶液製剤。
【請求項１１】
界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである、請求項１０に記載の溶液製剤。
【請求項１２】
界面活性剤がポリソルベート２０及び／又は８０である、請求項１１に記載の溶液製剤。
【請求項１３】
塩をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の溶液製剤。
【請求項１４】
塩が塩化ナトリウムである、請求項１３に記載の溶液製剤。
【請求項１５】
緩衝液に溶解されている、請求項１〜１４のいずれかに記載の溶液製剤。
【請求項１６】
緩衝液がリン酸及び／又はクエン酸である、請求項１５に記載の溶液製剤。
【請求項１７】
尿素を含まず、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸及びアルギニンならびにその塩から選択される１または２以上のアミノ酸を含む、安定化剤をエリスロポエチン溶液製剤に添加することを含む、エリスロポエチン溶液製剤の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
【０００２】
本発明はエリスロポエチンの溶液製剤に関する。
【従来の技術】
【０００３】
エリスロポエチン（以下においてＥＰＯと記載することもある）は、赤血球系前駆細胞の分化、増殖を促進する酸性糖タンパク質ホルモンであり、主として腎臓から産生される。血液中に最も豊富に存在する赤血球は、一定期間機能した後に脾臓などで破壊される（ヒトでは平均寿命が約１２０日）が、骨髄から絶えず供給されることによって、正常な状態では末梢の全赤血球数は常に一定に保たれている。ＥＰＯはこのような生体の赤血球の恒常性維持において中心的な役割を担っている。
【０００４】
大量の再生不良性貧血患者の尿から高純度のヒト尿由来ＥＰＯが精製されて以来、これを契機に、ヒトＥＰＯ遺伝子のクローニングに成功し、現在では遺伝子工学的方法によって動物細胞で組換えヒトＥＰＯを大量に生産することが可能になった。また、本願出願人はこの精製したＥＰＯの製剤化（凍結乾燥製剤）に成功し、腎性貧血改善剤などとして市場に製品を供給している。
【０００５】
安定なＥＰＯ製剤を市場に供給するための処方設計では、ＥＰＯに見られる化学的変化（加水分解、ジスルフィド交換反応など）あるいは物理的変化（変性、凝集、吸着など）を抑制する必要がある。現在市場に供給されている製品には、これら化学的、物理的変化を抑制するために、安定化剤として一般的に使用されているヒト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンが添加されている。このうち、ヒト血清アルブミンは輸血に依存する血液製剤であり、医薬品適正使用の面からその添加の可否が問われている。また、前述のアルブミンやゼラチン以外のタンパク質を安定化剤として添加することに関しても、ウィルスのコンタミなどの危険性を完全に回避することは困難である。
【０００６】
また、ペプチド医薬品製剤の安定化を図るために、凍結乾燥を施している場合が多いが、凍結乾燥は、工業的には生産コストの増大を招き、さらに機械トラブルによる危険性の増大を伴うことになる。
【発明が解決すべき課題】
【０００７】
以上の理由から、安定化剤としてタンパク質を含有せず、しかも長期の保存にも安定な凍結乾燥製剤に代わるＥＰＯの製剤が求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは安定化剤にある種のアミノ酸を添加することにより、ヒト血清アルブミンや精製ゼラチンを含まない安定なＥＰＯ溶液製剤となしうることを見いだし本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、安定化剤としてアミノ酸を含むエリスロポエチン溶液製剤を提供する。さらに詳しくは、本発明は以下のものを提供する。
（１）尿素を含まず、安定化剤として、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸及びアルギニンならびにその塩から選択される１または２以上のアミノ酸を含む、エリスロポエチン溶液製剤。
（２）安定化剤が、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−アルギニンならびにその塩から選択される１または２以上のアミノ酸である、前記（１）に記載の溶液製剤。
（３）安定化剤が、トリプトファン及び／又はその塩である、前記（１）に記載の溶液製剤。
（４）安定化剤が、アルギニン及び／又はその塩である、前記（１）に記載の溶液製剤。
（５）安定化剤として、さらにヒスチジンを含む、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の溶液製剤。
（６）安定化剤として、さらにＬ−ヒスチジンを含む、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の溶液製剤。
（７）アミノ酸の濃度が０．１〜４０ｍｇ／ｍｌである、前記（１）〜（６）のいずれかに記載の溶液製剤。
（８）アルギニンの濃度が１〜５ｍｇ／ｍｌである、前記（１）、（２）及び（４）〜（７）のいずれかに記載の溶液製剤。
（９）安定化剤として、実質的にタンパク質を含まない、前記（１）〜（８）のいずれかに記載の溶液製剤。
（１０）界面活性剤をさらに含む、前記（１）〜（９）のいずれかに記載の溶液製剤。
（１１）界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである、前記（１０）に記載の溶液製剤。
（１２）界面活性剤がポリソルベート２０及び／又は８０である、前記（１１）に記載の溶液製剤。
（１３）塩をさらに含む、前記（１）〜（１２）のいずれかに記載の溶液製剤。
（１４）塩が塩化ナトリウムである、前記（１３）に記載の溶液製剤。
（１５）緩衝液に溶解されている、前記（１）〜（１４）のいずれかに記載の溶液製剤。
（１６）緩衝液がリン酸及び／又はクエン酸である、前記（１５）に記載の溶液製剤。
（１７）尿素を含まず、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸及びアルギニンならびにその塩から選択される１または２以上のアミノ酸を含む、安定化剤をエリスロポエチン溶液製剤に添加することを含む、エリスロポエチン溶液製剤の安定化方法。
【００１０】
本明細書中で安定化とは、エリスロポエチン溶液製剤を例えば１０℃で２年間以上、又は２５℃で６ヶ月以上、あるいは４０℃で２週間以上保存し、その際にエリスロポエチンの残存率を９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上に保つことを意味する。
【００１１】
本発明の溶液製剤に使用するＥＰＯは、哺乳動物、特にヒトのＥＰＯと実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法によって得られたものを含む。遺伝子組換え法によって得られるＥＰＯには天然のＥＰＯとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１または複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。本発明におけるＥＰＯは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト尿より種々の方法で抽出し分離精製したもの、遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。
【００１２】
本発明で安定化剤として添加するアミノ酸には、遊離のアミノ酸ならびにそのナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの塩を含む。本発明の溶液製剤には、これらのアミノ酸の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。好ましいアミノ酸は、Ｄ−、Ｌ−およびＤＬ−体のロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンならびにその塩であり、より好ましいのはＬ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−リジンならびにその塩である。特に好ましいのは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−リジンならびにその塩である。最も好ましいのはＬ−ヒスチジンならびにその塩である。
【００１３】
本発明の溶液製剤には好ましくは安定化剤として、実質的にタンパク質を含まない。
本発明の溶液製剤に添加するアミノ酸の添加量は使用するアミノ酸の種類により、後述する試験方法を用いて好ましい範囲を定めることができる。一般には０．００１〜５０ｍｇ／ｍｌ、アルギニンでは好ましくは０．１〜４０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌであり、リジンでは好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌであり、ヒスチジンでは好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１．０〜４．０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１．０〜２．０ｍｇ／ｍｌである。後述するように、Ｌ−アルギニン塩酸塩の場合ならびにＬ−リジン塩酸塩の場合には、遊離のアミノ酸に換算して約１〜５ｍｇ／ｍｌ、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩の場合には、４０℃−２週間加速試験では遊離のアミノ酸に換算して１〜１０ｍｇ／ｍｌで、また２５℃−６ヶ月加速試験では０．５〜５ｍｇ／ｍｌの範囲で最も高いＥＰＯ残存率を示した。
【００１４】
本発明の溶液製剤中に含まれるＥＰＯの量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般には１００〜５０００００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは２００〜１０００００ＩＵ／ｍｌ、さらに好ましくは７５０〜７２０００ＩＵ／ｍｌである。本発明の溶液製剤は、通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下又は静注）、経皮、経粘膜、経鼻などで投与されるが、経口投与も可能である。
【００１５】
本発明の溶液製剤には、ＥＰＯ、アミノ酸の他に、ポリエチレングリコール；デキストラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、シュークロース、ラフィノースなどの糖類；塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩；及び場合によってはグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、チオ−硫酸ナトリウムなどの含硫還元剤、などの溶液製剤に通常添加される成分を含んでいてよい。好ましい塩は塩化ナトリウムである。さらに、本発明の溶液製剤にはポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルなどの吸着防止剤を添加することが好ましい。特に好ましいポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルは、ポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１、８５であり、最も好ましいのはポリソルベート２０及び／又は８０である。ポリソルベート２０及び／又は８０の好ましい添加量は０．０１〜１ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．０５〜０．１ｍｇ／ｍｌである。
【００１６】
本発明の溶液製剤はこれらの成分をリン酸及び／又はクエン酸緩衝液などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって調製できる。リン酸緩衝液は、リン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム系が好ましく、クエン酸緩衝液としてはクエン酸ナトリウムの緩衝液が好ましい。本発明の溶液製剤のｐＨは５．０〜８．０、好ましくは６．０〜７．０とすることが好ましい。
【００１７】
特開昭６４−７１８１８号は、尿素、アミノ酸、非イオン性湿潤剤を含有することを特徴とするヒト蛋白質製剤を開示する。しかし、本発明の溶液製剤は好ましくは尿素を含まない。尿素は例えばエリスロポエチンのような糖鎖タンパク質の長期安定化への寄与が明確でなく、また尿素の分解による生成物とタンパク質との反応が知られており（タンパク質化学３、共立出版、第１２章）、このため製剤に悪影響を及ぼすことがあるからである。さらに、一般的には製剤中の添加成分は少ない方がよいと考えられる。
【００１８】
本発明の溶液製剤は、通常密封、滅菌されたプラスチックまたはガラス容器中に収納されている。容器はアンプル、バイアルまたはディスポーザブル注射器のような規定用量の形状で供給することができ、あるいは注射用バックまたは瓶のような大用量の形状で供給することもできる。
【００１９】
種々のアミノ酸を含むＥＰＯ溶液製剤を調製し、４０℃−２週間の加速試験を実施し、試験後の製剤中のＥＰＯ含量をＲＰ−ＨＰＬＣ法（逆相高性能液体クロマトグラフィー）によってその添加効果を測定した。その結果、アミノ酸を添加しない溶液製剤に比べて、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩およびＬ−リジン塩酸塩を添加した溶液製剤におけるＥＰＯ残存率の高いことが判明した。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果から、Ｌ−アルギニン塩酸塩およびＬ−ヒスチジン塩酸塩については、加速試験後の製剤中に認められるＥＰＯ分解物の生成を抑制する効果があることも確認された。
【００２０】
さらに、添加効果が認められたアミノ酸のうちで、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−リジン塩酸塩及びヒスチジン塩酸塩について、製剤の安定化に及ぼす添加濃度の影響について検討した。Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−リジン塩酸塩又はヒスチジンを種々の濃度で添加した製剤を調製し、４０℃−２週間の加速試験を行った後の製剤中のＥＰＯ残存率は、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−リジン塩酸塩のいずれの場合においても濃度が約１〜５ｍｇ／ｍｌの間で極大になる傾向が認められ、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩では１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲で最高のＥＰＯ残存率を示した。また、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩を種々の濃度で添加した製剤を調製し、２５℃−６ヶ月の加速試験を行った後のＥＰＯ残存率は０．５〜５ｍｇ／ｍｌの範囲で極大を示した。このことから、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−リジン塩酸塩及びＬ−ヒスチジン塩酸塩には至適添加濃度が存在することが明らかとなった。
【００２１】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。
【実施例】
【００２２】
試験方法
調剤溶液１ｍｌ中に以下の成分：
ＥＰＯ                                        １５００国際単位
非イオン性界面活性剤                          ０．０５ｍｇ
（ポリソルベート８０：日光ケミカル社製）
塩化ナトリウム                                ８．５ｍｇ
アミノ酸（Ｓｉｇｍａ社製）                  ０〜４０ｍｇ
を含み、１０ｍＭリン酸緩衝溶液（和光純薬社製）にてｐＨ６．０に調整した溶液を、５ｍｌのガラスバイアルに１ｍｌ充填し、打栓、密封し、溶液製剤に供した。加速試験は同製剤を４０℃の恒温槽内に２週間放置した。製剤の評価は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析法（ＷＡＴＥＲＳ社製）およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析法により行った。
実施例１：各種アミノ酸添加のＥＰＯ残存率に及ぼす効果
以下に記載の各種アミノ酸を添加した溶液製剤を上述の試験方法により調製し、４０℃−２週間加速試験を行った後のＥＰＯ残存率をＲＰ−ＨＰＬＣ法により算出した。得られた結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
2004196824.tif 000002
【００２４】
Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩およびＬ−リジン塩酸塩が特に顕著なＥＰＯ残存率を示した。
実施例２：アミノ酸添加濃度のＥＰＯ残存率に及ぼす効果
以下に示す各種濃度でＬ−アルギニン塩酸塩を添加した溶液製剤を上述の試験方法により調製し、４０℃−２週間加速試験を行った後のＥＰＯ残存率をＲＰ−ＨＰＬＣ法により算出した。得られた結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
2004196824.tif 000003
【００２６】
また、この結果を図１にグラフとして示す。
この結果から、Ｌ−アルギニン塩酸塩は約１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲で、極大のＥＰＯ残存率を示した。
【００２７】
次いでＬ−リジン塩酸塩を用いて同様の試験を行ったときの、Ｌ−リジン塩酸塩添加量と加速試験後のＥＰＯ残存率を表３に示す。
【００２８】
【表３】
2004196824.tif 000004
【００２９】
また、この結果を図２にグラフとして示す。
この結果から、Ｌ−リジン塩酸塩の場合も約１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲で、極大のＥＰＯ残存率を示した。
【００３０】
次いでＬ−ヒスチジン塩酸塩を用いて同様の試験を行ったときの、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩添加量と加速試験後のＥＰＯ残存率を表４に示す。
【００３１】
【表４】
2004196824.tif 000005
【００３２】
また、この結果を図３にグラフとして示す。Ｌ−ヒスチジン塩酸塩では１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲で最高のＥＰＯ残存率を示した。
さらに、以下に示す各種濃度でＬ−ヒスチジン塩酸塩を添加した溶液製剤を上述の試験方法により調製し、２５℃−６ヶ月加速試験を行った後のＥＰＯ残存率をＲＰ−ＨＰＬＣ法により算出した。得られた結果を表５に示す。
【００３３】
【表５】
2004196824.tif 000006
【００３４】
この結果から、０．５〜５ｍｇ／ｍｌの範囲で、特に１ｍｇ／ｍｌで極大のＥＰＯ残存率を示した。
実施例３：各種アミノ酸添加のＥＰＯ分解物に及ぼす効果
各種アミノ酸を添加した溶液製剤を上述の試験方法により調製し、４０℃−２週間加速試験を行った後のＥＰＯ分解物の生成をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析法により検討した。
１）試料の調製
ＥＰＯ溶液製剤（実施例１の表１で記載した濃度の各アミノ酸を含む）に上記加速試験後、ＳＤＳ、グリセリンおよびブロムフェノールブルーを含む１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加え、６０℃で１５分加熱し、試料溶液とする。
２）泳動法
試料溶液１０μｌについて以下の操作条件で泳動を行う。
【００３５】
ａ）使用機器：スラブ電気泳動装置（バイオラッド製）
ｂ）泳動ゲル：ＳＤＳ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ８−１６（ポリアクリルアミド濃度８−１６％の濃度勾配ゲル）（テフコ製）
ｃ）泳動温度：２５℃
ｄ）泳動条件：２５ｍＡ定電流（／ゲル）
３）染色法（ウェスタンブロット法）
泳動したゲルをポリビニリデンジフルオリド膜へ転写後、抗ＥＰＯウサギ抗血清、ビオチン標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体およびビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼを用い、３，３’−ジアミノビンジジン−過酸化水素を基質として発色させる。
４）結果
得られた結果を図４に示す。アミノ酸無添加製剤（レーン２）に比べ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム添加製剤（レーン８）、Ｌ−アルギニン塩酸塩添加製剤（レーン９）、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩添加製剤（レーン１０）において、分解物生成抑制の顕著な効果が示された。
［発明の効果］
【００３６】
本発明のＥＰＯ溶液製剤はヒト血清アルブミンや精製ゼラチンなどの異種タンパク質を含有しておらず、またウィルスなどのコンタミの恐れのない安全な製剤である。また、アミノ酸はこれらの従来の安定化剤に比べて安価であり、かつ製造工程にかかるコストも凍結乾燥製剤に比べて安価であり、経済的にも有利な製剤であるといえる。さらに、本発明の溶液製剤は、緩衝液に溶解することなくそのまま使用できるため、凍結乾燥製剤に比較して使用時の手間が省ける。これらの種々の利点から本発明の産業上の利用性は大である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】Ｌ−アルギニン塩酸塩濃度とエリスロポエチン残存率の関係を示すグラフである。
【図２】Ｌ−リジン塩酸塩濃度とエリスロポエチン残存率の関係を示すグラフである。
【図３】Ｌ−ヒスチジン塩酸塩濃度とエリスロポエチン残存率の関係を示すグラフである。
【図４】各種アミノ酸を添加した製剤の分解物抑制効果を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のパターンである（電気泳動の写真）。レーン１：分子量マーカー、レーン２：アミノ酸無添加製剤、レーン３：Ｌ−ロイシン添加製剤、レーン４：Ｌ−フェニルアラニン添加製剤、レーン５：Ｌ−トリプトファン添加製剤、レーン６：Ｌ−セリン添加製剤、レーン７：Ｌ−システイン添加製剤、レーン８：Ｌ−グルタミン酸ナトリウム添加製剤、レーン９：Ｌ−アルギニン塩酸塩添加製剤、レーン１０：Ｌ−ヒスチジン塩酸塩添加製剤。
【図１】
2004196824.tif 000007
【図２】
2004196824.tif 000008
【図３】
2004196824.tif 000009
【図４】
2004196824.tif 000010