(57)【要約】　　　（修正有）【課題】天然においては、細胞形質膜表面に局在化されないようなポリペプチドを細胞形質膜表面に局在化させうる技術を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列又はそのバリアントからなる群より選ばれたアミノ酸配列からなり、かつ異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチド；該ポリペプチドをコードする核酸；異種ポリペプチドを細胞表面に局在化させるための細胞導入用構築物：該構築物を保持した形質転換細胞：それらを用いる細胞形質膜表面へのポリペプチドの局在化方法；該ポリペプチドと異種ポリペプチドとの融合タンパク質；該構築物を含有した、細胞形質膜上への異種ポリペプチドの発現用キット；該核酸に特異的なプローブ及びプライマー対；該核酸又は該ポリペプチド検出方法；それに用いるキット；リガンド又はレセプターの検出用キット；並びに標的部位への細胞の送達方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
（ｃ）配列番号：２において、下記（１）〜（３５）：
（１）第１位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（２）　第２位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（３）　第３位のアミノ酸残基の、Ｐ又はＴへの置換
（４）　第４位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（５）　第５位のアミノ酸残基の、Ｑへの置換
（６）第６位のアミノ酸残基の、Ａへの置換
（７）　第７位のアミノ酸残基の、Ｆ又はＰへの置換
（８）　第８位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（９）　第９位のアミノ酸残基の、Ｐへの置換
（１０）第１１位のアミノ酸残基の、Ｌ、Ｓ又はＰへの置換
（１１）第１２位のアミノ酸残基の、Ｎ、Ｓ又はＡへの置換
（１２）第１３位のアミノ酸残基の、Ｓへの置換
（１３）第１５位のアミノ酸残基の、Ｐへの置換
（１４）第１７位のアミノ酸残基の、Ｓ又はＰへの置換
（１５）第１８位のアミノ酸残基の、Ｐ、Ｔ又はＡへの置換
（１６）第１９位のアミノ酸残基の、Ｐへの置換
（１７）第２０位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（１８）第２１位のアミノ酸残基の、Ｓ又はＩへの置換
（１９）第２３位のアミノ酸残基の、Ｓ又はＴへの置換
（２０）第２４位のアミノ酸残基の、Ｐ又はＡへの置換
（２１）第２５位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（２２）第２６位のアミノ酸残基の、Ｉへの置換
（２３）第２７位のアミノ酸残基の、Ｓへの置換
（２４）第２８位のアミノ酸残基の、Ｓへの置換
（２５）第２９位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（２６）第３０位のアミノ酸残基の、Ｔ又はＱへの置換
（２７）第３１位のアミノ酸残基の、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＡへの置換
（２８）第３２位のアミノ酸残基の、Ｆ又はＣへの置換
（２９）第３３位のアミノ酸残基の、Ｒへの置換
（３０）第３４位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（３１）第３５位のアミノ酸残基の、Ｅ又はＴへの置換
（３２）第３６位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（３３）第１位から第８位のアミノ酸からなる配列の欠失、
（３４）第１位から第７位のアミノ酸からなる配列の欠失、及び
（３５）第３２位から第３６位のアミノ酸からなる配列の欠失、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなり、かつ異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
（Ａ）請求項１記載の（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列と少なくとも２７％の配列同一性を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドである塩基配列、及び
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドである塩基配列
からなる群より選ばれた１種の塩基配列を有する、請求項１記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
（Ａ）請求項１記載の（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列と少なくとも２７％の配列同一性を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドである塩基配列、及び
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドである塩基配列
からなる群より選ばれた１種の塩基配列を含有してなる、異種ポリペプチドを細胞表面に局在化させるための細胞導入用構築物。
【請求項４】
請求項３の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列の下流に、異種ポリペプチドをコードする核酸を作動可能に連結するための塩基配列を介して、発現対象の異種ポリペプチドをコードする核酸が作動可能に連結されてなる、請求項３記載の細胞導入用構築物。
【請求項５】
該異種ポリペプチドが、酵素、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体分子、補体分子、血清タンパク質、細胞接着因子、核酸結合タンパク質、神経栄養因子、レセプター及びリガンドからなる群より選ばれた１種である、請求項４記載の細胞導入用構築物。
【請求項６】
請求項４又は５記載の細胞導入用構築物を保持してなる形質転換細胞。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換細胞を培養し、それにより、得られた培養細胞の形質膜上に、発現対象の異種ポリペプチドを局在化させることを特徴とする、細胞形質膜表面へのポリペプチドの局在化方法。
【請求項８】
（Ｉ）請求項３記載の細胞導入用構築物中の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列の下流に、発現対象の異種ポリペプチドをコードする核酸を作動可能に連結する工程、及び
（ＩＩ）前記工程（Ｉ）で得られた産物を、翻訳後修飾としてＯ−結合型糖鎖の付加を行ないうる宿主に導入し、請求項６記載の形質転換細胞を得る工程、
を含む、請求項７記載の細胞形質膜表面へのポリペプチドの局在化方法。
【請求項９】
請求項７又は８記載の局在化方法を行なうことにより得られる、請求項１記載のポリペプチドと異種ポリペプチドとからなる融合タンパク質。
【請求項１０】
該異種ポリペプチドが、酵素、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体分子、補体分子、血清タンパク質、細胞接着因子、核酸結合タンパク質、神経栄養因子、レセプター及びリガンドからなる群より選ばれた１種である、請求項９記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項３記載の細胞導入用構築物を含有してなる、発現対象の異種ポリペプチドを細胞形質膜上に発現させるためのキット。
【請求項１２】
翻訳後修飾としてＯ−結合型糖鎖の付加を行ないうる宿主をさらに含有してなる、請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸又はそのアンチセンス核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ１５〜１５０塩基長からなるオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１４】
配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ８〜５０塩基長からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号：１に示される塩基配列からなるアンチセンス核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ８〜５０塩基長からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対。
【請求項１５】
請求項１３記載のオリゴヌクレオチドプローブ及び／又は請求項１４記載のプライマー対を含有してなる、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出に用いるためのキット。
【請求項１６】
請求項１３記載のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、該オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッドを検出するステップ、及び／又は、
請求項１４記載のプライマー対と、検出対象の核酸とを用いた核酸増幅法により、増幅産物を検出するステップ、
を行なうことを特徴とする、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出方法。
【請求項１７】
請求項１記載のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物に特異的に結合する抗体又はその断片。
【請求項１８】
請求項１記載のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物に特異的に結合しうる物質を用いて、被験試料から、該物質に結合するポリペプチドを検出することを特徴とする、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドの検出方法。
【請求項１９】
請求項１記載のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物に特異的に結合しうる物質が、請求項１７記載の抗体又はその断片、ムチン型糖鎖に特異的なレクチン、Ｔｎ抗原に対する抗体又はその断片、及びＴ抗原に対する抗体又はその断片からなる群より選ばれたものである、請求項１８記載の検出方法。
【請求項２０】
請求項１７記載の抗体又はその断片、ムチン型糖鎖に特異的なレクチン、Ｔｎ抗原に対する抗体又はその断片、及びＴ抗原に対する抗体又はその断片からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有してなる、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドの検出に用いるためのキット。
【請求項２１】
請求項７又は８記載の局在化方法を行なった後、
（ＩＩＩ）　得られた培養細胞と、被験試料とを接触させるステップ、及び
（ＩＶ）該培養細胞の細胞形質膜表面上の異種ポリペプチドに結合した物質を検出するステップ、
を行なうことを特徴とする、ポリペプチドに対するリガンド又はレセプターの検出方法。
【請求項２２】
請求項６記載の形質転換細胞を含有してなる、請求項２１記載の検出方法によりポリペプチドに対するリガンド又はレセプターを検出するためのキット。
【請求項２３】
請求項６記載の形質転換細胞を個体に導入することを特徴とする、標的部位への細胞の送達方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、ポリペプチドの細胞表面局在化方法、該ポリペプチド又は核酸の検出方法に関する。さらに詳しくは、タンパク質の機能を解析する上で有用なタンパク質発現システムを構築するのに有用な、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする核酸；酵素、ペプチドホルモン、各種成長因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体分子、補体分子、血清タンパク質、細胞接着因子、核酸結合タンパク質、神経栄養因子、レセプター又はリガンドの検出に有用な、ポリペプチドを細胞形質膜表面に局在化させる方法；ポリペプチドの機能解析、生体内での該ポリペプチド発現細胞の標的部位へのデリバリー、該ポリペプチドに対する抗体の作製、該ポリペプチドを抗原とするワクチンの作製、該ポリペプチドを標的とするガンの遺伝子治療等に有用な、該ポリペプチド若しくはポリペプチド糖鎖修飾物又は核酸の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の糖鎖生物学の進展により、糖タンパク質の糖鎖の構造と機能に関する知見が集積されつつある。しかしながら、Ｏ−結合型糖鎖、いわゆる、ムチン型糖鎖の構造及び機能に関しては、簡便な糖鎖構造解析法が確立されていないため、解析が遅れているのが現状である。
【０００３】
とりわけ、分泌タンパク質のＯ−結合型糖鎖修飾の生物学的意義に関する報告は、数少なく、例えば、ラット膵臓胆汁塩依存性リパーゼ（Ｒａｔ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｂｉｌｅｓａｌｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｌｉｐａｓｅ）　のＣ−末端タンデムリピート配列中のＯ−結合糖鎖修飾は、該リパーゼの分泌を制御していることが報告されている。また、前記ラット膵臓胆汁塩依存性リパーゼにおいても、Ｏ−結合糖鎖修飾によって、プロリンとＧｌｕ　とセリンとスレオニンとに富んだ領域　［ＰＥＳＴ領域という、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、第２３４　巻、第　３６４−３６８頁　（１９８６）］が隠され、結果として、該リパーゼが、分解系でなく分泌系の経路にデリバリーされることが報告されている　［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第　２７２巻、第　２７３５３−２７３６１　（１９９７）］。
【０００４】
さらに、ムチン様配列もしくはムチンボックスへの変異導入又は代謝阻害剤等によってＯ−結合型糖鎖修飾を阻害することにより、極性細胞のアピカル面へのタンパク質のターゲッティングが起こらなくなることが報告されている　［例えば、スクラーゼイソマルターゼ（ｓｕｃｒａｓｅ　ｉｓｏｍａｌｔａｓｅ）に関して、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第　２７５巻、第　６５６６−６５７２頁　（２０００）　；ジペプチヂルペプチダーゼＩＶ（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ　ｐｅｐｔｉｄａｓｅ　ＩＶ）　に関して、エクスペリメンタル・セル・リサーチ　（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）　第　２５８巻、第　１８４−１９４頁（２０００）　；ニューロトロフィンレセプター（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）　に関して、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、第　１３９巻、第　９２９−９４０頁　（１９９７）　及びジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第　２７３巻、第　３０２６３−３０２７０　（１９９８）　等の文献を参照のこと］　。しかしながら、前記文献においては、細胞膜表面へのターゲッティングに必要な配列又はシグナルそのものを特定するに至っていないのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、天然においては、細胞形質膜表面に局在化されないようなポリペプチドを細胞形質膜表面に局在化させうる、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドを提供することを目的とする。また、本発明の目的は、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングするための構築物の作製、前記のポリペプチドの糖鎖の付加パターンや物理化学的性質を改変すること、遺伝子工学的に、本発明のポリペプチドを容易に得ること等を可能にしうる核酸を提供することを目的とする。さらに、本発明の目的は、細胞形質膜表面に局在化されないようなポリペプチドを細胞形質膜表面に局在化させること、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドを得ること、被験対象のポリペプチドに対するレセプター又はリガンドのスクリーニング、標的部位への細胞の送達等の少なくともいずれかを達成しうる、細胞導入用構築物又は形質転換細胞を提供することを目的とする。また、本発明は、細胞形質膜表面に局在化されないようなポリペプチドを細胞形質膜表面に局在化させることができる、細胞形質膜表面へのポリペプチドの局在化方法及びそのキットを提供することを目的とする。さらに、本発明は、本発明のポリペプチド又は核酸を容易に検出することができ、細胞形質膜局在タンパク質の検索又は塩基配列からの予測、さらには細胞形質膜局在化シグナルの検索、該シグナルをコードする遺伝子を含むタンパク質発現用ベクターの構築等に用いられうる、オリゴヌクレオチドプローブ、プライマー対、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出に用いるためのキット、該核酸の検出方法、該ポリペプチド若しくはポリペプチド糖鎖修飾物に特異的に結合する抗体若しくはその断片、該ポリペプチド若しくはポリペプチド糖鎖修飾物の検出方法又はそのキットを提供することを目的とする。また、本発明は、新たなリガンド、レセプターのスクリーニングに利用することができる、ポリペプチドに対するリガンド又はレセプターの検出方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕　下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
（ｃ）配列番号：２において、下記（１）〜（３５）：
（１）第１位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（２）　第２位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（３）　第３位のアミノ酸残基の、Ｐ又はＴへの置換
（４）　第４位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（５）　第５位のアミノ酸残基の、Ｑへの置換
（６）第６位のアミノ酸残基の、Ａへの置換
（７）　第７位のアミノ酸残基の、Ｆ又はＰへの置換
（８）　第８位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（９）　第９位のアミノ酸残基の、Ｐへの置換
（１０）第１１位のアミノ酸残基の、Ｌ、Ｓ又はＰへの置換
（１１）第１２位のアミノ酸残基の、Ｎ、Ｓ又はＡへの置換
（１２）第１３位のアミノ酸残基の、Ｓへの置換
（１３）第１５位のアミノ酸残基の、Ｐへの置換
（１４）第１７位のアミノ酸残基の、Ｓ又はＰへの置換
（１５）第１８位のアミノ酸残基の、Ｐ、Ｔ又はＡへの置換
（１６）第１９位のアミノ酸残基の、Ｐへの置換
（１７）第２０位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（１８）第２１位のアミノ酸残基の、Ｓ又はＩへの置換
（１９）第２３位のアミノ酸残基の、Ｓ又はＴへの置換
（２０）第２４位のアミノ酸残基の、Ｐ又はＡへの置換
（２１）第２５位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（２２）第２６位のアミノ酸残基の、Ｉへの置換
（２３）第２７位のアミノ酸残基の、Ｓへの置換
（２４）第２８位のアミノ酸残基の、Ｓへの置換
（２５）第２９位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（２６）第３０位のアミノ酸残基の、Ｔ又はＱへの置換
（２７）第３１位のアミノ酸残基の、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＡへの置換
（２８）第３２位のアミノ酸残基の、Ｆ又はＣへの置換
（２９）第３３位のアミノ酸残基の、Ｒへの置換
（３０）第３４位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（３１）第３５位のアミノ酸残基の、Ｅ又はＴへの置換
（３２）第３６位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（３３）第１位から第８位のアミノ酸からなる配列の欠失、
（３４）第１位から第７位のアミノ酸からなる配列の欠失、及び
（３５）第３２位から第３６位のアミノ酸からなる配列の欠失、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなり、かつ異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチド、
〔２〕　（Ａ）前記〔１〕記載の（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列と少なくとも２７％の配列同一性を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドである塩基配列、及び
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドである塩基配列
からなる群より選ばれた１種の塩基配列を有する、前記〔１〕記載のポリペプチドをコードする核酸、
〔３〕　（Ａ）前記〔１〕記載の（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列と少なくとも２７％の配列同一性を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドである塩基配列、及び
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドである塩基配列
からなる群より選ばれた１種の塩基配列を含有してなる、異種ポリペプチドを細胞表面に局在化させるための細胞導入用構築物、
〔４〕　前記〔３〕の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列の下流に、異種ポリペプチドをコードする核酸を作動可能に連結するための塩基配列を介して、発現対象の異種ポリペプチドをコードする核酸が作動可能に連結されてなる、前記〔３〕記載の細胞導入用構築物、
〔５〕　該異種ポリペプチドが、酵素、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体分子、補体分子、血清タンパク質、細胞接着因子、核酸結合タンパク質、神経栄養因子、レセプター及びリガンドからなる群より選ばれた１種である、前記〔４〕記載の細胞導入用構築物、
〔６〕　前記〔４〕又は〔５〕記載の細胞導入用構築物を保持してなる形質転換細胞、
〔７〕　前記〔６〕記載の形質転換細胞を培養し、それにより、得られた培養細胞の形質膜上に、発現対象の異種ポリペプチドを局在化させることを特徴とする、細胞形質膜表面へのポリペプチドの局在化方法、
〔８〕　（Ｉ）前記〔３〕記載の細胞導入用構築物中の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列の下流に、発現対象の異種ポリペプチドをコードする核酸を作動可能に連結する工程、及び
（ＩＩ）前記工程（Ｉ）で得られた産物を、翻訳後修飾としてＯ−結合型糖鎖の付加を行ないうる宿主に導入し、前記〔６〕記載の形質転換細胞を得る工程、
を含む、前記〔７〕記載の細胞形質膜表面へのポリペプチドの局在化方法、
〔９〕　前記〔７〕又は〔８〕記載の局在化方法を行なうことにより得られる、前記〔１〕記載のポリペプチドと異種ポリペプチドとからなる融合タンパク質、〔１０〕　該異種ポリペプチドが、酵素、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体分子、補体分子、血清タンパク質、細胞接着因子、核酸結合タンパク質、神経栄養因子、レセプター及びリガンドからなる群より選ばれた１種である、前記〔９〕記載の融合タンパク質、
〔１１〕　前記〔３〕記載の細胞導入用構築物を含有してなる、発現対象の異種ポリペプチドを細胞形質膜上に発現させるためのキット、
〔１２〕　翻訳後修飾としてＯ−結合型糖鎖の付加を行ないうる宿主をさらに含有してなる、前記〔１１〕記載のキット、
〔１３〕　配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸又はそのアンチセンス核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ１５〜１５０塩基長からなるオリゴヌクレオチドプローブ、
〔１４〕　配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ８〜５０塩基長からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号：１に示される塩基配列からなるアンチセンス核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ８〜５０塩基長からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
〔１５〕　前記〔１３〕記載のオリゴヌクレオチドプローブ及び／又は前記〔１４〕記載のプライマー対を含有してなる、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出に用いるためのキット、
〔１６〕　前記〔１３〕記載のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、該オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッドを検出するステップ、及び／又は、
前記〔１４〕記載のプライマー対と、検出対象の核酸とを用いた核酸増幅法により、増幅産物を検出するステップ、
を行なうことを特徴とする、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出方法、
〔１７〕　前記〔１〕記載のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物に特異的に結合する抗体又はその断片、
〔１８〕　前記〔１〕記載のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物に特異的に結合しうる物質を用いて、被験試料から、該物質に結合するポリペプチドを検出することを特徴とする、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドの検出方法、
〔１９〕　前記〔１〕記載のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物に特異的に結合しうる物質が、前記〔１７〕記載の抗体又はその断片、ムチン型糖鎖に特異的なレクチン、Ｔｎ抗原に対する抗体又はその断片、及びＴ抗原に対する抗体又はその断片からなる群より選ばれたものである、前記〔１８〕記載の検出方法、
〔２０〕　前記〔１７〕記載の抗体又はその断片、ムチン型糖鎖に特異的なレクチン、Ｔｎ抗原に対する抗体又はその断片、及びＴ抗原に対する抗体又はその断片からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有してなる、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドの検出に用いるためのキット、
〔２１〕　前記〔７〕又は〔８〕記載の局在化方法を行なった後、
（ＩＩＩ）　得られた培養細胞と、被験試料とを接触させるステップ、及び
（ＩＶ）該培養細胞の細胞形質膜表面上の異種ポリペプチドに結合した物質を検出するステップ、
を行なうことを特徴とする、ポリペプチドに対するリガンド又はレセプターの検出方法、
〔２２〕　前記〔６〕記載の形質転換細胞を含有してなる、前記〔２１〕記載の検出方法によりポリペプチドに対するリガンド又はレセプターを検出するためのキット、並びに
〔２３〕　前記〔６〕記載の形質転換細胞を個体に導入することを特徴とする、標的部位への細胞の送達方法、
に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、スフィンゴ脂質代謝のキーエンザイムであるセラミダーゼのうち、中性セラミダーゼは、ラット肝実質細胞においては、エンドソーム様オルガネラに分布するが、腎臓においては、近位／遠位尿細管、集合管の形質膜アピカル面のラフト上に発現しているという本発明者らの知見に基づく。すなわち、本発明は、前記セラミダーゼの細胞内局在化において、セラミダーゼを細胞形質膜表面にターゲッティングする活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列があるという本発明者らの知見に基づくものであり、かかるポリペプチドにより、目的タンパク質を動物細胞で発現させる際に形質膜上に局在化させることができるという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
【０００８】
なお、本明細書において、アミノ酸残基は、慣用の生化学命名法に準拠したアミノ酸の一文字表記により表記する場合もある。
【０００９】
本発明によれば、下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
（ｃ）配列番号：２において、下記（１）〜（３５）：
（１）第１位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（２）　第２位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（３）　第３位のアミノ酸残基の、Ｐ又はＴへの置換
（４）　第４位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（５）　第５位のアミノ酸残基の、Ｑへの置換
（６）第６位のアミノ酸残基の、Ａへの置換
（７）　第７位のアミノ酸残基の、Ｆ又はＰへの置換
（８）　第８位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（９）　第９位のアミノ酸残基の、Ｐへの置換
（１０）第１１位のアミノ酸残基の、Ｌ、Ｓ又はＰへの置換
（１１）第１２位のアミノ酸残基の、Ｎ、Ｓ又はＡへの置換
（１２）第１３位のアミノ酸残基の、Ｓへの置換
（１３）第１５位のアミノ酸残基の、Ｐへの置換
（１４）第１７位のアミノ酸残基の、Ｓ又はＰへの置換
（１５）第１８位のアミノ酸残基の、Ｐ、Ｔ又はＡへの置換
（１６）第１９位のアミノ酸残基の、Ｐへの置換
（１７）第２０位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（１８）第２１位のアミノ酸残基の、Ｓ又はＩへの置換
（１９）第２３位のアミノ酸残基の、Ｓ又はＴへの置換
（２０）第２４位のアミノ酸残基の、Ｐ又はＡへの置換
（２１）第２５位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（２２）第２６位のアミノ酸残基の、Ｉへの置換
（２３）第２７位のアミノ酸残基の、Ｓへの置換
（２４）第２８位のアミノ酸残基の、Ｓへの置換
（２５）第２９位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（２６）第３０位のアミノ酸残基の、Ｔ又はＱへの置換
（２７）第３１位のアミノ酸残基の、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＡへの置換
（２８）第３２位のアミノ酸残基の、Ｆ又はＣへの置換
（２９）第３３位のアミノ酸残基の、Ｒへの置換
（３０）第３４位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（３１）第３５位のアミノ酸残基の、Ｅ又はＴへの置換
（３２）第３６位のアミノ酸残基の、Ｔへの置換
（３３）第１位から第８位のアミノ酸からなる配列の欠失、
（３４）第１位から第７位のアミノ酸からなる配列の欠失、及び
（３５）第３２位から第３６位のアミノ酸からなる配列の欠失、
からなる群より選ばれた少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなり、かつ異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドが提供される。
【００１０】
本発明のポリペプチドは、前記アミノ酸配列からなるものであるため、かかるポリペプチドと、その下流に、異種ポリペプチドとを連結させた場合、該異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングするという優れた効果を発揮する。
【００１１】
本明細書において、「異種ポリペプチド」とは、前記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列をその一部に含有しない発現対象のポリペプチドを意味し、例えば、ラット腎臓由来セラミダーゼ以外のポリペプチドを意味する。具体的には、酵素、ペプチドホルモン、各種成長因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体分子、補体分子、血清タンパク質、細胞接着因子、核酸結合タンパク質、神経栄養因子、レセプター、リガンド等が挙げられる。
【００１２】
また、本明細書において、「（異種ポリペプチドを）細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチド」とは、前記のように、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面に局在させるのに必要かつ十分な能力を有するポリペプチドをいう。
【００１３】
前記配列番号：２に記載のアミノ酸配列は、ラット腎臓由来セラミダーゼ　［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第　２７６巻、第　２６２４９−２６２５９頁（２００１）］のＮ末端部分より見出されたムチンボックスであり、エンテロペプチダーゼ　（Ｅｎｔｅｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）において見出されたムチン様ドメイン　［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第　２７７巻、第　６８５８−６８６３　（２００２）］とは、ほとんど配列の相同性がない配列である。なお、前記エンテロペプチダーゼのムチン様ドメインは、イヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞におけるアピカル面へのソーティングを指示するシグナルであることが示唆されているものの、Ｏ−結合型糖鎖による修飾はターゲッティングにはあまり必要ないと考えられている。
【００１４】
前記ムチンボックスには、配列番号：２に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸番号：１０、１４、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２６、２７、２９に示される「Ｏ−結合型糖鎖が付加されうる部位」が存在し、かかる「Ｏ−結合型糖鎖が付加されうる部位」は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％、好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは、少なくとも６０％、さらに好ましくは、少なくとも７０％の配列同一性を有するものが挙げられる。また、上記部位のアミノ酸残基は、Ｏ−結合型糖鎖が付加できるものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、スレオニン（Ｔ）又はセリンが好適である。
【００１５】
前記「異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性」（以下、「ターゲッティング活性」という）は、評価対象のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチド）を、例えば、オワンクラゲ　（Ａｅｑｕｏｒｉａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）　のような蛍光タンパク質、ヒスチジン　（Ｈｉｓ）タグ、又は特定のエピトープでタグを付けたベクターを用いて発現させ、蛍光タンパク質、Ｈｉｓ　タグ、エピトープ等をレポーターとして発現量及び局在を測定する活性測定方法により評価されうる。かかる評価方法に用いられるベクターとしては、例えば、Ｎ末端融合タンパク質発現ベクターとして、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１、ｐＥＣＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３、ｐＥＹＦＰ−Ｎ１ベクター　（クローンテック社製）　等；Ｈｉｓ　タグ又は　ｍｙｃタグの付いた　ｐｃＤＮＡベクターとして、例えば、　ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−ｈｉｓ（＋）（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
【００１６】
また、本発明においては、天然型のアミノ酸配列（前記配列番号：２）からなるムチンボックスポリペプチドの他に、前記活性測定方法で測定することによって、同様のターゲッティング活性が認められるものであれば、天然由来のアミノ酸配列である配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。本発明においては、前記配列同一性は、少なくとも４０％であり、好ましくは、５０％以上、より好ましくは、６０％以上、さらに好ましくは、６５％以上、よりさらに好ましくは、７０％以上であることが望ましい。
【００１７】
なお、本明細書において、「配列同一性」とは、２つの分子間、具体的には、２つのポリペプチド間又は２つの核酸間の残基の配列類似性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定されうる。ここで、比較対象のポリペプチド又は核酸は、２つの配列の最適なアラインメントのための参考配列（例えば、コンセンサス配列等）と比べて、付加又は欠失（例えば、ギャップ等）を有していてもよい。配列同一性の数値（パーセンテージ）は、両方の配列に存在する同一の残基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の残基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００をかけることにより、算出されうる。
【００１８】
最適なアラインメント及びホモロジーを得るためのアルゴリズムとしては、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）　らの局所ホモロジーアルゴリズム［Ａｄｄ．　ＡＰＬ．　Ｍａｔｈ．，　２，　４８２　（１９８１）］、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）　らのホモロジーアラインメントアルゴリズム［Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　４８，　４４３（１９７０）］、パールソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）　らの相同性検索法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８５，　２４４４　（１９８８）］　が挙げられ、より具体的には、ダイナミックプログラミング法、ギャップペナルテイ法、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｇｏｏｄ−Ｋａｎｅｈｉｓａ　アルゴリズム、ＢＬＡＳＴ　アルゴリズム、ＦＡＳＴＡ　アルゴリズム等が挙げられる。
【００１９】
配列同一性は、例えば、配列解析ソフト、具体的には、ポリペプチドについて、ＢＬＡＳＴＰ等、核酸について、ＢＬＡＳＴＮ等を用いて測定される。前記ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮは、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ　において、一般に利用可能である。
【００２０】
さらに、本発明においては、天然型のアミノ酸配列（前記配列番号：２）からなるムチンボックスポリペプチドの他に、前記活性測定方法で測定することによって、同様のターゲッティング活性が認められるものであれば、天然由来のアミノ酸配列である配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、前記（１）〜（３５）からなる群より選ばれた少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをも包含する。また、本発明においては、得られたポリペプチドがターゲッティング活性を有するような変異であれば、前記（１）〜（３５）からなる群より選ばれた２種以上の変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。ここで、前記「変異を有するアミノ酸配列」とは、天然由来のバリアント及び人為的な変異を導入されたアミノ酸配列のいずれをも含む。ポリペプチドへの変異の導入は、後述の本発明の核酸を用い、慣用の変異導入方法により行なわれうる。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、慣用の化学合成法により、ペプチド合成機等を用いて合成すること又は慣用の遺伝子工学的手法により、後述の本発明の核酸を発現させることにより得ることもできる。
【００２２】
前記化学合成法としては、例えば、ペプタイド・シンセシス　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　（１９６６）、ペプチド合成，丸善（株），　（１９７５）；ペプチド合成の基礎と実験，　丸善（株）等に記載の方法等が挙げられ、遺伝子工学的手法としては、例えば、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　３ｒｄ　Ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（２００１）］等に記載の方法等が挙げられる。
【００２３】
本発明により、さらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸が提供される。本発明の核酸は、前記細胞形質膜表面へのターゲッティングシグナル活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であり、すなわちムチンボックスのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸をいう。具体的には、本発明の核酸としては、下記（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）前記（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列と少なくとも２７％の配列同一性を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドである塩基配列、及び
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドである塩基配列
からなる群より選ばれた１種の塩基配列を有する核酸が挙げられる。
【００２４】
本発明の核酸によれば、本発明の核酸の下流に発現対象の異種ポリペプチドをコードする核酸を配置又は任意に、分泌シグナルをコードする核酸と本発明の核酸の下流に発現対象の異種ポリペプチドをコードする核酸とを配置し、発現させることにより、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングさせることができるという優れた効果を発揮する。さらには、本発明の核酸によれば、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングするための構築物、例えば、発現ベクター等を作製することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードするものであるため、本発明のポリペプチドに関して、細胞形質膜表面へのターゲッティングシグナルを有するが、糖鎖の付加パターンや物理化学的性質を改変することもできるという優れた効果を発揮する。また、本発明の核酸によれば、遺伝子工学的に、本発明のポリペプチドを得ることもできるという優れた効果を発揮する。
【００２５】
前記（Ａ）の塩基配列において、前記（ａ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした核酸としては、具体的には、配列番号：１に示される塩基配列及び該配列番号：１と縮重を介して異なる塩基配列が挙げられる。前記（ａ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした核酸は、例えば、以下のように、得られうる。すなわち、ラット腎臓由来セラミダーゼをコードするＤＮＡを得、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲティングする活性を有するポリペプチドに対応するＤＮＡを得ればよい。ここで、ラット腎臓由来セラミダーゼのアミノ酸配列は、マウス肝臓由来セラミダーゼ（配列番号：３）と非常に相同性が高いので、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第　２７６巻、第　２６２４９−２６２５９　（２００１）　記載の方法に従って、マウス肝臓由来セラミダーゼの塩基配列情報　［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第　２７５巻、第　１１２２９−１１２３４　（２０００）］を基にデザインしたプライマー対及びプローブを用いて、市販のラット腎臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲ及びコロニーハイブリダイゼーションを行なうことによって、マウス腎臓由来セラミダーゼ遺伝子を取得することができる。このようにして得られる、ラット腎臓由来セラミダーゼをコードするＤＮＡの全塩基配列を配列番号：４に示す。また、前記配列番号：４に示される塩基配列より推定されるセラミダーゼのアミノ酸配列を配列番号：５に示す。なお、前記配列番号：５に示されるアミノ酸配列と、配列番号：３に示されたマウス肝臓由来セラミダーゼのＮ末端アミノ酸配列と、配列番号：６、７、８、９及び１０のそれぞれに示された粘菌、緑膿菌、結核菌、ショウジョウバエ及びシロイヌナズナのそれぞれの中性セラミダーゼのＮ末端アミノ酸配列とを比較することにより、他の細菌や無脊椎動物のセラミダーゼには存在しないセリン、スレオニン、プロリンに富んだ繰り返し配列、すなわち、ムチンボックスがラット及びマウスの中性セラミダーゼのＮ末端シグナル配列のすぐ下流に存在することがわかる。図１に各種中性セラミダーゼの推定Ｎ末端構造を示す。得られたＤＮＡより、慣用の手法により、前記（ａ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした核酸を得ることができる。
【００２６】
前記（Ａ）の塩基配列において、前記（ｂ）及び（ｃ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした核酸は、前記（ａ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした核酸に対して、慣用の変異導入方法により、所望の変異を導入することにより得られうる。
【００２７】
変異導入方法としては、ランダムな変異を導入する方法として、例えば、亜硫酸水素ナトリウムを用いた化学的な処理によりシトシン塩基をウラシル塩基に置換するトランジション変異を起こさせる方法　［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、第７９巻、第１４０８〜１４１２頁　（１９８２）］、マンガンを含む反応液中でＰＣＲを行ない、ＤＮＡ合成時のヌクレオチドの取り込みの正確さを低くする方法　［アナリティカル・バイオケミストリー　（Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．）　、第２２４　巻、第３４７　〜３５３　頁　（１９９５）］等が挙げられ、部位特異的変異を導入する方法として、例えば、アンバー変異を利用する方法　［ギャップド・デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ）　法、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻、第９４４１〜９４５６頁　（１９８４）］、ｄｕｔ（ｄＵＴＰａｓｅ）　とｕｎｇ（ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ）遺伝子を欠損した宿主を利用する方法　［クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、第８２巻、第４８８　〜４９２　頁（１９８５）］　、アンバー変異を利用したＰＣＲによる方法（国際公開９８／０２５３５号パンフレット）等が挙げられる。これらの方法で目的の遺伝子に部位特異的な変異を導入するための各種のキットが市販されており、該キットを利用することにより、所望のアミノ酸の変異に対応する変異を導入された遺伝子を得、所望の変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを得ることができる。得られた核酸について、コードされるポリペプチドを、慣用の遺伝子工学的手法により発現させ、該ポリペプチドについて、前記活性測定方法で測定することによって、ターゲティング活性が認められることを指標として、本発明の核酸を得ることができる。
【００２８】
本発明においては、コードされるポリペプチドが、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドであれば、前記（Ｂ）の塩基配列、すなわち、配列番号に示される塩基配列と少なくとも２７％、好ましくは、５０％以上、より好ましくは、７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有する核酸であってもよい。
【００２９】
また、本発明においては、コードされるポリペプチドが、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドであれば、前記（Ｃ）の塩基配列、すなわち、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列を有する核酸であってもよい。
【００３０】
ここで、ハイブリダイゼーションは、例えば、前記モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第３版に記載の方法により実施することができる。また、ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％　ＳＤＳと５×デンハルトと１００ｍｇ／ｍｌ　ニシン精子ＤＮＡとを含む溶液中、プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件があげられる。
【００３１】
また、かかるストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにおいて、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、５×ＳＳＣ、３×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の２５℃下、好ましくは、２２℃下、より好ましくは、２０℃下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、６５℃以上、好ましくは、６７℃以上、より好ましくは７０℃以上等の条件下でのハイブリダイゼーション；より厳しい洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例えば、２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ等を使用し、より高い温度、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃下、より好ましくは、３０℃下、さらに好ましくは、２５℃下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、３０℃以上、３７℃以上、４２℃以上、４５℃以上等の条件下での洗浄等を行なうことにより、例えば、配列番号：１に示される塩基配列と少なくとも約２７％、好ましくは、５０％以上、より好ましくは、７０％以上の配列同一性を有する核酸を得ることが可能になる。なお、Ｔｍは、例えば、下記式：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋　］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
により求められる。
【００３２】
得られた核酸について、コードされるポリペプチドを、慣用の遺伝子工学的手法により発現させ、該ポリペプチドについて、前記活性測定方法で測定することによって、ターゲティング活性が認められることを指標として、本発明の核酸を得ることができる。
【００３３】
本発明の核酸は、公知のベクター等に連結し、様々な宿主において発現させることができる。なお、本発明の核酸を導入する宿主により、コドン使用頻度が異なり、発現が抑制される場合があるが、この場合、本発明の核酸に使用されるコドンを、それぞれの宿主に合わせたコドンにかえて用いてもよい。
【００３４】
本発明の核酸により、さらに、異種ポリペプチドを細胞表面に局在させるための細胞導入用構築物も提供される。本発明の細胞導入用構築物は、具体的には、前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列を含有することに１つの大きな特徴がある。
【００３５】
したがって、本発明の細胞導入用構築物によれば、該細胞導入用構築物中の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列の下流又は任意に、分泌シグナルをコードする核酸と（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列の下流に、作動可能に、発現対象の異種ポリペプチドをコードする核酸を配置（連結）することにより、細胞形質膜表面へターゲッティングする対象となる異種ポリペプチドと本発明のポリペプチドとの融合タンパク質をコードする核酸を容易に得ることができ、かつ得られた細胞導入用構築物によれば、該融合タンパク質をコードする核酸を容易に宿主となる細胞に導入することができるという優れた効果を発揮する。さらには、本発明の細胞導入用構築物によれば、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングさせることができるという優れた効果を発揮する。
【００３６】
ここで、「作動可能（な連結）」とは、宿主細胞内で、発現対象の異種ポリペプチド及びその生理活性を発現することができ、かつ該異種ポリペプチドが、本発明のポリペプチドとの融合タンパク質として発現されるように連結されることを意味する。
【００３７】
本発明の細胞導入用構築物は、前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列の下流に、異種ポリペプチドをコードする核酸を作動可能に連結するための塩基配列をさらに含有していてもよい。
【００３８】
また、本発明の細胞導入用構築物には、前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列の下流又は、任意に、分泌シグナルをコードする核酸と前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列の下流に、発現対象の異種ポリペプチドをコードする核酸が作動可能に連結された細胞導入用構築物；前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列の下流又は任意に、分泌シグナルをコードする核酸と前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列の下流に、異種ポリペプチドをコードする核酸を作動可能に連結するための塩基配列を介して、発現対象の異種ポリペプチドをコードする核酸が作動可能に連結された細胞導入用構築物〔すなわち、前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列の下流に、異種ポリペプチドをコードする核酸を作動可能に連結するための塩基配列をさらに含有し、かつ該異種遺伝子を作動可能に連結するための塩基配列に、発現対象の異種ポリペプチドをコードする核酸が作動可能に連結された細胞導入用構築物〕も包含される。
【００３９】
前記「細胞導入用構築物」の形態としては、前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列と、該塩基配列の下流に、異種遺伝子を作動可能に連結するための塩基配列とからなるｎａｋｅｄ−ＤＮＡ；前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列と、該塩基配列の下流に、異種遺伝子を作動可能に連結するための塩基配列とを含有した発現ベクター；該ｎａｋｅｄ−ＤＮＡをリポソーム、金粒子等の担体に保持させた構築物等が挙げられる。ここで、前記発現ベクターは、プラスミド由来のベクターのみに限定されるものではなく、本発明の目的を妨げないものであれば、ファージ、コスミド等由来のベクターであってもよい。また、前記発現ベクターとしては、本発明のポリペプチドを容易にかつ大量に製造する観点から、外来遺伝子を誘導発現させることが可能なベクター、レポーター遺伝子産物との融合タンパク質として発現させることが可能なベクター等が望ましい。
【００４０】
本発明の細胞導入用構築物によれば、翻訳後修飾としてＯ−結合型糖鎖の付加を行ないうる宿主に導入することにより、発現対象の異種ポリペプチドを細胞形質膜表面にターゲッティングすることができるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明の細胞導入用構築物は、例えば、細胞形質膜表面への発現対象のポリペプチドの局在化、被験対象のポリペプチドに対するレセプター又はリガンドのスクリーニング、標的部位への細胞の送達、該ポリペプチドに対する抗体の作製、該ポリペプチドを抗原とするワクチンの作製、該ポリペプチドを標的とするガンの遺伝子治療等に用いられうる。
【００４１】
本発明により、発現対象の異種ポリペプチドを細胞形質膜表面にターゲッティングするために、細胞形質膜表面へのターゲッティングシグナルを有するムチンボックス、すなわち、本発明のポリペプチドを、発現対象の異種ポリペプチドのＮ末端側に連結して融合タンパク質として、細胞に発現させればよい。
【００４２】
本発明においては、本発明のポリペプチドを単独で、発現対象の異種ポリペプチドのＮ末端側に連結することができ、好ましくは、分泌シグナル配列と、本発明のポリペプチドとを、発現対象の異種ポリペプチドのＮ末端に付加することが望ましい。
【００４３】
前記分泌シグナル配列として、発現対象の異種ポリペプチドが分泌タンパク質の場合は、該異種ポリペプチドの分泌シグナル配列を用いることができるが、一般的には、例えば、ラット腎臓由来セラミダーゼの分泌シグナル配列、マウス肝臓由来セラミダーゼ等の分泌シグナル配列を用いることができる。また、発現対象の異種ポリペプチドが膜結合型タンパク質の場合は、膜貫通領域を除いた上で、そのＮ末端に分泌シグナル配列とムチンボックスを付加することができる。かかる分泌シグナル配列の具体例としては、特に限定されないが、例えば、配列番号：１１のアミノ酸番号：１〜３６、配列番号３のアミノ酸番号：１〜３６等が挙げられる。
【００４４】
以下、発現対象の異種ポリペプチドをグリーン・フルオレッセント・プロテイン　（ＧＦＰ）にした場合の、プラスミドベクター型の細胞導入用構築物の構築法に関して説明する。本発明のポリペプチドと分泌シグナル配列とを付加したＧＦＰ　（Ｓ−Ｍ−ＧＦＰ）　は、ラット中性セラミダーゼのＮ末端の２つのフラグメント、すなわち、配列番号：１７のアミノ酸番号：１〜７８（第１位のメチオニン〜第７８位のグルタミン）と配列番号：１１のアミノ酸番号：１〜４２（第１位のメチオニン〜第４２位のリジン）とを用いてデザインする。これらのフラグメントをコードする遺伝子断片を、それぞれ　ＫｐｎＩ　認識部位を有する５’側プライマー５（配列番号：１８、５’−ＡＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＣＧＡＡＣＣＴＴＣＴＣＣ−３’）　とＢａｍＨＩ　認識部位を有する３’側プライマー６（配列番号：１９、５’−ＣＣＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧ−３’）　とからなるプライマー対、５’側プライマー５（前記配列番号：１８）　とＢａｍＨＩ　認識部位を有する３’側プライマー７（配列番号：２０、５’−ＴＴＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＣＣＣ−３’）　とからなるプライマー対のそれぞれを用いて、ＰＣＲにより増幅する。得られた増幅産物を、　ｐＥＧＦＰ−Ｎ２　にサブクローニングする。得られた全ての構築物について、その塩基配列をＤＮＡシーケンサー（アプライド　バイオシステムズ社製、モデル３７７）を用いて確認し、目的の塩基配列を有するものを本発明の細胞導入用構築物（プラスミドベクター）として得ることができる。前記プラスミドベクターの模式図を図２に示す。
【００４５】
さらに、本発明の細胞導入用構築物を、宿主に導入（形質転換、トランスフェクション）することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。本発明の形質転換細胞は、本発明の細胞導入用構築物、具体的には、発現対象の異種ポリペプチドをコードする核酸を含有した細胞導入用構築物を保持することに１つの特徴がある。本発明の形質転換細胞によれば、発現対象の異種ポリペプチドが細胞形質膜表面にターゲッティングされるという優れた性質を発現する。したがって、本発明の形質転換細胞は、例えば、例えば、細胞形質膜表面への発現対象のポリペプチドの局在化、被験対象のポリペプチドに対するレセプター又はリガンドのスクリーニング、該ポリペプチドに対する抗体の作製、該ポリペプチドを抗原とするワクチンの作製、該ポリペプチドを標的とするガンの遺伝子治療等に用いられうる。
【００４６】
宿主としては、動物細胞、植物細胞等が挙げられる。また、発現対象の異種ポリペプチドを細胞形質膜表面に発現させるために、本発明のポリペプチドの部分が、Ｏ−結合型糖鎖による修飾を受ける必要がある。したがって、前記宿主として、一般的にＯ−結合型糖鎖修飾に必要な糖転移酵素群を発現しており、ムチン型糖鎖を有する糖タンパク質を発現している細胞を用いればよい。前記Ｏ−結合型糖鎖修飾系の糖転移酵素としては、例えば、ポリペプチド　Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ［ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　（ＥＣ　２．４．１．４１）］　、グリコプロテイン−Ｎ−アセチルガラクトサミン　３−β−ガラクトシルトランスフェラーゼ［Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ　３−ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　（ＥＣ　２．４．１．１２２）］、Ｎ−アセチルラクトサミニド　β−１，３−Ｎアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ［Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ　ｂｅｔａ−１，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　（ＥＣ　２．４．１．１４９）］　、α−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−β−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニド　α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ［（ａｌｐｈａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｎｅｕｒａｍｉｎｙｌ−２，３−ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ−１，３）−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ　ａｌｐｈａ−２，６−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　（ＥＣ　２．４．９９．７）］　、β−ガラクトサミド　α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ［ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｄｅ　ａｌｐｈａ−２，６−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　（ＥＣ　２．４．９９．１）］、β−ガラクトシド　α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ［ｂ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ　ａｌｐｈａ−２，３−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　（ＥＣ　２．４．９９．４）］　、Ｎ−アセチルラクトサミン　シンターゼ［Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　（ＥＣ　２．４．１．９０）］、Ｎ−アセチルラクトサミニド　β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ［Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ　ｂｅｔａ−１，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　（ＥＣ　２．４．１．１４９）］　、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ［ｂえた−１，３−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ］　等が挙げられる。本発明に用いられる宿主は、これらの酵素群が適切に細胞内に発現しており、小胞体及びゴルジ装置内で糖タンパク質が正しくプロセッシングされて、Ｏ−結合型糖鎖を有する糖タンパク質が発現している細胞であればよい。前記宿主のより具体的な例示としては、特に限定されるものではないが、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯＰ細胞、イヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞等が挙げられる。
【００４７】
すなわち、本発明の形質転換細胞は、
（Ｉ）請求項３記載の細胞導入用構築物中の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれた１種の塩基配列の下流に、発現対象の異種ポリペプチドをコードする核酸を作動可能に連結する工程、及び
（ＩＩ）前記工程（Ｉ）で得られた産物を、翻訳後修飾としてＯ−結合型糖鎖の付加を行ないうる宿主に導入し、本発明の細胞導入用構築物、具体的には、発現対象の異種ポリペプチドをコードする核酸を含有した細胞導入用構築物を保持した形質転換細胞を得る工程
を行なうことにより得られうる。
【００４８】
本発明の形質転換細胞によれば、形質転換細胞を個体に導入することを特徴とする、標的部位への細胞の送達方法も提供される。
【００４９】
本発明によれば、細胞形質膜表面へのポリペプチドの局在化方法が提供される。本発明の局在化方法は、本発明の形質転換細胞を培養し、それにより、得られた培養細胞の形質膜上に、発現対象の異種ポリペプチドを局在化させることを１つの大きな特徴とする。したがって、本発明の局在化方法によれば、天然の状態では、細胞形質膜表面へ局在化されることがないポリペプチドを、細胞形質膜表面へ局在化させることができるという驚くべき優れた効果を発揮する。
【００５０】
本発明の局在化方法においては、本発明の形質転換細胞を、宿主及び発現対象の異種ポリペプチドに適した条件下で培養することにより、細胞形質膜表面へのターゲッティングシグナルを有する、本発明のポリペプチドと発現対象の異種ポリペプチドとの融合タンパク質として、発現対象の異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へ局在化させることができる。形質転換細胞が、培養細胞である場合には、培地組成、培地のｐＨ、培養温度、培養時間の他、インデューサーの使用量、使用時間等について、それぞれの発現対象の異種ポリペプチドの細胞形質膜表面での発現に最適な条件を決定することによって、効率よく、発現対象の異種ポリペプチドを発現させることができる。
【００５１】
ここで、本発明のポリペプチドと発現対象の異種ポリペプチドとの融合タンパク質の確認は、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて発現を測定することができる。また、細胞形質膜表面における発現対象の異種ポリペプチドの発現を測定することにより行なうことができる。活性測定は、発現対象の異種ポリペプチドに特異的に結合するタンパク質、抗体等を用いることによって行なわれうる。例えば、用いられた細胞導入用構築物がタグ配列を含む場合は、そのタグ配列に対する抗体を用いること、該タグ配列がヒスチジンタグである場合は、キレーティング樹脂等を用いること等により、細胞表面での発現を測定することができる。また、ＧＦＰ　のようにそれ自身が蛍光を発するようなタグの場合は直接蛍光シグナルを測定することによって、細胞表面での発現を確認することができる。測定方法としては、発現対象の異種ポリペプチド、タグ配列等に特異的な１次抗体と蛍光標識された２次抗体を用いて発現細胞を免疫染色し、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて細胞表面の蛍光シグナルを観測する方法や、染色した細胞をフローサイトメトリーで測定する方法等が挙げられる。また、細胞形質膜画分を調製し、発現対象の異種ポリペプチドに対する抗体やタグに対する特異抗体と標識　２次抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なう方法等が挙げられる。
【００５２】
さらに、本発明には、前記局在化方法を行なうことにより得られる、本発明のポリペプチドと異種ポリペプチドとからなる融合タンパク質も含まれる。
【００５３】
なお、本発明によれば、本発明の局在化方法を行なうに有用なキット、すなわち、本発明の細胞導入用構築物を含有した、発現対象の異種ポリペプチドを細胞形質膜上に発現させるためのキット（局在化方法用キットという）が提供される。また、前記局在化方法用キットは、翻訳後修飾としてＯ−結合型糖鎖の付加を行ないうる宿主をさらに含有したキットであってもよい。かかる局在化方法用キットには、本発明の細胞導入用構築物、翻訳後修飾としてＯ−結合型糖鎖の付加を行ないうる宿主等を用いて、本発明の局在化方法を行なうための試薬、例えば、細胞への核酸導入用試薬、リガーゼ及びその緩衝液、細胞形質膜表面における発現対象の異種ポリペプチドの検出用試薬（活性測定に用いられる試薬）、宿主を培養するための培地等をさらに含有していてもよい。また、本発明の局在化方法用キットには、本発明の局在化方法用キットを用いて本発明の局在化方法を行なうための手順が記載された説明書、該手順の情報を提供するための手段等も含まれる。
【００５４】
本発明の核酸により、該核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー対が提供される。かかるオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー対としては、１）配列番号：１に示される核酸若しくはその断片、２）該核酸若しくはその断片に相補的な塩基配列を有する核酸、又は３）該核酸若しくはその断片に相補的な塩基配列を有する核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸が挙げられる。ここで、相補的な塩基配列を有する核酸とは、いわゆる、アンチセンス核酸、アンチセンス鎖等と同意義であると解される。
【００５５】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、具体的には、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸又はそのアンチセンス核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ１５〜１５０塩基長からなるオリゴヌクレオチドプローブである。また、本発明のプライマー対は、具体的には、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ８〜５０塩基長からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号：１に示される塩基配列からなるアンチセンス核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ８〜５０塩基長からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対である。
【００５６】
本明細書において、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー対に関して用いられる「ストリンジェントな条件」の語は、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中、〔オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーのＴｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等を意味する。
【００５７】
前記温度の条件は、例えば、Ｔｍ値により近づけること（例えば、Ｔｍ−２４℃、Ｔｍ−２２℃、Ｔｍ−２０℃等）により、ストリンジェンシーを高めることができる。また、より高イオン強度、例えば、５×ＳＳＣ、４×ＳＳＣ等の条件におけるハイブリダイゼーションにより、ストリンジェンシーを高めることもできる。
【００５８】
さらには、より厳しい洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例えば、２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ等を使用し、より高い温度、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃下、より好ましくは、３０℃下、さらに好ましくは、２５℃下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、３７℃以上、４２℃以上、４５℃以上等の条件下での洗浄により、プライマー及び／又はプローブとして、配列番号：１のアンチセンス核酸と少なくとも約８０％、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上の配列同一性を有する核酸を得ることが可能になる。
【００５９】
オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーのＴｍは、例えば、下記の式により求められる。
Ｔｍ＝８１．５−１６．６　（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋　］）＋０．４１　（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である。）
【００６０】
また、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの鎖長が１８塩基より短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）　×２＋（Ｇ＋Ｃ）　×４　〕により推定することができる。
【００６１】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、本発明の核酸の塩基配列をもとに設計し、例えば、常法により化学的に合成し作製することができる。前記オリゴヌクレオチドプローブの鎖長としては、特に限定はないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点から、１５塩基以上であることが好ましく、１８塩基以上であることがさらに好ましい。かかる鎖長を有するオリゴヌクレオチドプローブの一例としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列中若しくは該塩基配列に相補的な配列中の連続した１５塩基長以上の塩基配列を有するプローブ等が挙げられる。
【００６２】
また、本発明のプライマー対についても、前記オリゴヌクレオチドプローブと同様の塩基配列を有する核酸が挙げられる。例えば、本発明の遺伝子の塩基配列をもとに設計し、化学的に合成すること等により作製することができる。プライマーの鎖長には、特に限定はないが、例えば、１５〜４０塩基の鎖長のものを使用することができ、特に１７〜３０塩基の鎖長のものを好適に使用することができる。前記プライマーはポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法をはじめとする種々の遺伝子増幅法に使用することが可能であり、これによって本発明のムチンボックス遺伝子の検出を行なうことができる。かかる鎖長を有するプライマー対の一例としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列中若しくは該塩基配列に相補的な配列中の連続した１５〜４０塩基の塩基配列を有するプライマーからなるプライマー対が挙げられる。
【００６３】
前記オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーに適した配列は、例えば、前記Ｔｍ値、鎖長等を基礎とし、核酸の二次構造の形成等を予測しうる市販のソフトウェア等により得られうる。かかるソフトウェアとしては、ＯＬＩＧＯプライマー・アナリシス・ソフトウェア（宝酒造社製）〕等が挙げられる。当業者であれば、前記ソフトウェアを用い、例えば、公知の遺伝子と全体にわたって、３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは、１０％以下、さらに好ましくは５％以下、特に好ましくは０％の配列同一性である配列を選択することにより、公知の遺伝子と相同性の低い部分又は配列番号：１に特徴的な部分から、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーに適した配列を選択できる。
【００６４】
また、前記オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー対として、天然由来のムチンボックスをコードする核酸を、制限酵素処理、エキソ型ヌクレアーゼ処理等の酵素的処理、超音波等の物理的処理等により断片化し、得られた断片を、アガロースゲル等に代表される各種核酸分離法により分離精製することにより得られた核酸を用いてもよい。前記のようにして得られた核酸は、本発明の核酸に特徴的な配列を有する領域由来であることが望ましい。
【００６５】
また、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー対は、該プローブ又はプライマー対の検出に適した各種標識、例えば、蛍光標識、放射活性標識、ビオチンやジゴキシゲニン等のリガンド等を有していてもよい。かかる標識を有したオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー対は、本発明の核酸の検出に使用されうる。したがって、本発明により、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出に用いるためのキット（核酸検出用キットという）が提供される。
【００６６】
本発明の核酸検出用キットは、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ及び／又は本発明のプライマー対を含有することに１つの大きな特徴がある。
【００６７】
したがって、本発明の核酸検出用キットは、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸を検出するのに用いられ得、それにより、簡便に検出することが可能になる。
【００６８】
本発明の核酸検出用キットには、さらに、核酸を固定するための膜やハイブリダイゼーション緩衝液等に代表されるハイブリダイゼーション用の各種試薬、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合液、ＰＣＲ用緩衝液等に代表されるＰＣＲ用試薬、プローブや増幅されたＤＮＡを検出するための試薬や細胞増殖用の培地、試料より核酸を抽出するための試薬等を含有してもよい。
【００６９】
また、本発明により、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出方法が提供される。
【００７０】
本発明の核酸の検出方法は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、該オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッドを検出するステップ、及び／又は、
本発明のプライマー対と、検出対象の核酸とを用いた核酸増幅法により、増幅産物を検出するステップ、
を行なうことを１つの大きな特徴とする。
【００７１】
したがって、本発明の核酸の検出方法によれば、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸を検出することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の核酸の検出方法は、細胞形質膜局在化タンパク質をコードする核酸の検索、塩基配列からのタンパク質細胞形質膜局在化の予測、局在化シグナルの検索等に有用である。
【００７２】
本発明の検出方法においては、前記オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーション法等により遺伝子の検出を行なってもよく、また、前記プライマーを用いて、ＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅方法により遺伝子の検出を行なってもよい。
【００７３】
オリゴヌクレオチドプローブを用いる場合、検出用試料としては、例えば、組織切片や培養細胞のような試料、これらの試料中のＤＮＡやＲＮＡを膜上に固定したもの、これらの試料から抽出されたＤＮＡやＲＮＡ等が挙げられる。なかでも試料の安定性の観点から、膜上に固定されたＤＮＡあるいは抽出されたＤＮＡが好ましい。オリゴヌクレオチドプローブを用いる場合、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第３版等に記載の公知のハイブリダイゼーション法等により遺伝子の検出を行なうことができる。
【００７４】
前記ハイブリダイゼーションの条件は、用いるプローブのＴｍ値、標的ＤＮＡのＧＣ含量等により適宜決定することができる。例えば、前記モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第３版に記載の条件等を適用できる。
【００７５】
プライマー対を用いる場合、検出用試料としては、例えば、皮膚、組織、組織切片のような生体由来試料や組織培養の試料等が挙げられる。
【００７６】
前記プライマー対を用いる場合の検出用試料は、例えば、組織のような固体試料は浸出液や懸濁液を調製して使用することができる。また、これらの試料の上清又はこれらの試料について界面活性剤処理のような細胞溶解処理が施された試料やその上清も使用することができる。さらに、検出対象である核酸を損なわない範囲で試料中の他の成分を除去する操作が施されていてもよい。
【００７７】
前記プライマー対を用いてＰＣＲ法により検出を行なう場合、ＰＣＲ条件は、用いるプライマー対の各プライマーのＴｍ値、増幅し検出する対象の領域の長さ等により、適宜選択することができる。
【００７８】
前記プライマー対を用いる場合、ＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅方法により増幅し、ＰＣＲ増幅産物の有無を確認することにより検出することができる。増幅の有無の確認法には特に限定はないが、例えば、核酸増幅反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルを適当な核酸染色試薬、例えばエチジウムブロマイド、ＳＹＢＥＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　等で染色し、紫外線を照射して生じるバンドの有無を検出することにより確認できる。バンドの検出は肉眼で観察してもよいが、例えば蛍光イメージアナライザー等を用いて検出することもできる。
【００７９】
本発明の核酸の検出方法においては、検出感度を上昇させるために、前記プローブを用いた検出及びプライマー対を用いた検出を併用してもよい。例えば、前記プライマー対を用いて、ＰＣＲ法により、試料中に微量に存在する「異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸」を増幅し、ついで、プローブを用いて該核酸とハイブリダイズさせることによって、高感度かつ正確に検出することができる。
【００８０】
本発明の核酸の検出方法により「異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸」の検出を行ない、さらに該核酸の発現量を決定する場合には、ハイブリダイズしたプローブに由来するシグナルの強度、プライマーを用いて増幅された産物に由来するバンドの蛍光強度等を定量することにより行なうことができる。
【００８１】
さらに、本発明のポリペプチドにより、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片が提供される。
【００８２】
本発明の抗体又はその断片は、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物、すなわち、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドに特異的に結合する能力を有するものであれば、特に限定はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらでもよい。さらに、公知技術により修飾された抗体や抗体の誘導体、例えばヒト化抗体、Ｆａｂ　フラグメント、単鎖抗体等を使用することもできる。本発明の抗体は、例えば、１９９２年、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ　Ｗｅｉｌｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ）発行、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ　Ｅ．　Ｃｏｌｉｇａｎ　）編集、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　）に記載の方法により、本発明のポリペプチドの全部又は一部を用いてウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。また、遺伝子工学的に抗体を作製することもできる。また、ポリペプチドのある部分断片に特異的に結合しうる抗体又はその断片も含まれる。
【００８３】
さらに、得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。得られた抗体又はその断片の用途としては、ムチンボックスの検出、ムチンボックス付加タンパク質の検出、アフィニティークロマトグラフィー、各種ライブラリー（ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）のスクリーニング、医薬、診断薬、研究用試薬等への応用が考えられる。
【００８４】
さらに、本発明の抗体又はその断片は、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法等による検出を容易にするために、各種修飾をしてもよい。
【００８５】
なお、本発明の抗体又はその断片は、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物に対するアビディティーが、非常に高いものが望ましい。
【００８６】
本発明のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物は、前記抗体又はその断片等の本発明のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物に特異的に結合しうる物質を用いることにより検出されうる。本発明には、かかる本発明のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物、すなわち、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドの検出方法も含まれる。
【００８７】
本発明のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物の検出方法は、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物に特異的に結合しうる物質を用いて、被験試料から、該物質に結合するポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物を検出することを１つの大きな特徴とする。
【００８８】
したがって、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物の検出方法によれば、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドを検出することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物の検出方法は、細胞形質膜局在化タンパク質の検索、タンパク質細胞形質膜局在化の予測、局在化シグナルの検索等に有用である。
【００８９】
本発明においては、被験試料として、例えば、培養細胞、組織、該培養細胞の膜画分、該組織の膜画分、該培養細胞由来のタンパク質若しくは該組織由来のタンパク質が固定された膜等のタンパク質試料を用いることができる。
【００９０】
本発明のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物に特異的に結合しうる物質としては、本発明の抗体又はその断片、ムチン型糖鎖に特異的なレクチン、Ｔｎ抗原に対する抗体、該Ｔｎ抗原に対する抗体断片、Ｔ抗原に対する抗体、該Ｔ抗原に対する抗体断片等が挙げられる。
【００９１】
本発明の抗体又はその断片と本発明のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物との特異的な結合の検出は、公知の方法が利用でき、例えば、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法等により行なわれうる。
【００９２】
また、培養細胞や組織をそのまま用いる場合、免疫染色法と顕微鏡やフローサイトメトリーを用いて、前記結合を測定することが出来る。さらに、被験タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供し、ついで、本発明の抗体又はその断片を用いたウエスタンブロッティングによって、前記結合を検出することもできる。
【００９３】
また、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物の検出方法によれば、本発明の局在化方法により局在化された融合タンパク質の検出も行なうことができ、例えば、検出検出の特異性及び感度を上げるために、あらかじめ、目的のタンパク質や本発明のポリペプチド又はタグ配列に対する特異的抗体を用いて、試料からムチンボックス付加タンパク質を免疫沈降し、検出することもできる。
【００９４】
また、前記ムチン型糖鎖に特異的なレクチンは、ムチンボックスに結合しているＯ−結合型糖鎖を特異的に認識するタンパク質の１つである。具体的には、Ｏ−結合型糖鎖構造の１型コア構造である　Ｇａｌｂ１，３ＧａｌＮＡｃを特異的に認識するピーナッツレクチン　（ＰＮＡ）、ジャッカリンレクチン等が挙げられる。また、前記Ｔｎ抗原　（ＮｅｕＡｃａ２，３Ｇａｌｂ１，３ＧａｌＮＡｃａ１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）　に対する抗体又はその断片、Ｔ抗原（Ｇａｌｂ１，３ＧａｌＮＡｃａ１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）に対する抗体又はその断片は、Ｏ−結合型糖鎖のコア構造に対する抗体であり市販の抗体を用いることもできる。
【００９５】
本発明により、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチド糖鎖修飾物の検出方法に用いるためのキット、すなわち、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドの検出に用いるためのキット（ポリペプチド検出用キットという）も提供される。本発明のポリペプチド検出用キットは、本発明の抗体又はその断片、前記ムチン型糖鎖に特異的なレクチン、前記Ｔｎ抗原に対する抗体、前記Ｔｎ抗原に対する抗体断片、前記Ｔ抗原に対する抗体及び前記Ｔ抗原に対する抗体断片からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有することに１つの特徴がある。
【００９６】
したがって、本発明のポリペプチド検出用キットにより、簡便に、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドを検出することができるという優れた効果を発揮する。さらに、本発明のポリペプチド検出用キットによれば、本発明のポリペプチドと結合した形態で発現された異種ポリペプチドの細胞形質膜表面での検出にも用いることができる。
【００９７】
本発明のポリペプチド検出用キットには、さらに、反応用緩衝液、標識二次抗体、発色試薬等を含有してもよい。
【００９８】
本発明の局在化方法により、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面に局在化させた形質転換細胞において、該異種ポリペプチドが、レセプター又はリガンドである場合、かかる形質転換細胞を用いることにより、被検試料中に含まれる前記レセプターに対するリガンド又は前記リガンドに対するレセプターを検出することもできる。かかるポリペプチドに対するリガンド又はレセプターの検出方法も本発明に含まれる。
【００９９】
本発明のリガンド又はレセプターの検出方法は、本発明の局在化方法を行なった後、
（ＩＩＩ）　得られた培養細胞と、被験試料とを接触させるステップ、及び
（ＩＶ）該培養細胞の細胞形質膜表面上の異種ポリペプチドに結合した物質を検出するステップ、
を行なうことを１つの特徴とする。また、前記ステップ（ＩＩＩ）　においては、予め調製された形質転換細胞を用いてもよい。
【０１００】
前記ステップ（ＩＩＩ）　における被験試料としては、被験試料として、例えば、細胞、組織、該細胞の膜画分、該組織の膜画分、該細胞由来のタンパク質、該組織由来のタンパク質等が挙げられる。
【０１０１】
前記ステップ（ＩＶ）において、培養細胞の細胞形質膜表面上の異種ポリペプチドに結合した物質、すなわち、リガンド又はレセプターの検出は、例えば、リガンド、レセプター等に特異的な蛍光標識された抗体を用いて発現細胞を免疫染色し、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて細胞表面の蛍光シグナルを検出する方法や染色した細胞をフローサイトメトリーで測定する方法が挙げられる。また、培養細胞の細胞形質膜表面上の異種ポリペプチドに結合した物質、すなわち、リガンド又はレセプターの検出は、細胞形質膜画分を調製し、特異的な抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なう方法、直接、リガンド又はレセプターの活性を測定する方法により行なうこともできる。
【０１０２】
なお、本発明のリガンド又はレセプターの検出方法は、本発明の形質転換細胞を含有した、ポリペプチドに対するリガンド又はレセプターを検出するためのキットにより、より簡便に実施されうる。かかるキットも本発明に含まれる。
【０１０３】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を具体的に示すが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
【０１０４】
実施例１　ヒト由来中性セラミダーゼ、ムチンボックス欠失変異体及びムチンボックス含有構築物のそれぞれを発現するためのプラスミドの構築
ｐｃＤＮＡｋＣＤ中に含まれるラット由来中性セラミダーゼ（以下、ＣＤａｓｅ　と表記する）遺伝子の全長を含んだベクター　ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−ｈｉｓ（＋）を、光武らの方法　［ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー、第２７６　巻、第２６２４９　〜２６２５９　頁（２００１）］　によって調製した。具体的には、プラスミドｐｃＤＮＡｋＣＤを制限酵素　ＫｐｎＩ　と　ＸｈｏＩ　とで処理し、ついで、得られた断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＳＫ　（ストラタジーン社製）　にサブクローニングした。その後、中性　ＣＤａｓｅ遺伝子全長を、ＫｐｎＩとＳｍａＩとで消化し、ついで、得られた産物を　ｐＥＧＦＰ−Ｎ２　（クローンテック社製）にクローニングした。これにより、　ＧＦＰのタグを有するラット由来中性ＣＤａｓｅ　を発現させるためのプラスミド（「野生型ＣＤａｓｅ　発現用プラスミド」という）を得た。
【０１０５】
一方、ムチンボックス欠失変異体　（Δｍｕｃｉｎ）について、Ｎ末端断片（Ｍｅｔ１−Ｌｙｓ４２）（配列番号：１１）とＣ末端側断片　（Ａｓｎ７９−Ｔｈｒ７６１）　　（配列番号：１２）　とを連結して構築した。まず、　ＫｐｎＩ　認識部位を有する５’側プライマー１（配列番号：１３、５’−ＡＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＣＧＡＡＣＣＴＴＣＴＣＣ−３’）と３’側プライマー２（配列番号：１４、５’−ＡＣＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＴＡＧＣＣＡＣＴＧＡＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＣＣＣ−３’　）を用いたＰＣＲ　を行ない、前記Ｎ末端断片部分をコードする核酸を得た。また、５’側プライマー３（配列番号：１５、　５’−ＧＧＧＡＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＡＡＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＴＧＧＴＧＴ−３’）と　ＸｈｏＩ　認識部位を有する３’側プライマー４（配列番号：１６、５’−ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＧＴＡＧＴＧＡＣＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡ−３’）とを用いたＰＣＲ　を行ない、前記Ｃ末端側断片をコードする核酸を得た。得られた各産物について、パイロベスト　ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させ、ベクター　ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−ｈｉｓ（＋）　（インビトロジェン社製）　にサブクローニングして、Δｍｕｃｉｎ　発現用プラスミドを得た。
【０１０６】
また、以下のように、ムチンボックスと分泌シグナル配列とを付加したＧＦＰ　（Ｓ−Ｍ−ＧＦＰ）　及び分泌シグナルのみを付加した　ＧＦＰ　（Ｓ−ＧＦＰ）を、ラット中性　ＣＤａｓｅのＮ末端の２つの断片、すなわち、Ｍｅｔ１−Ｇｌｎ７８（配列番号：１７）とＭｅｔ１−Ｌｙｓ４２（配列番号：１１）とを用いて設計した。
【０１０７】
ＫｐｎＩ認識部位を有する５’側プライマー５（配列番号：１８、５’−ＡＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＣＧＡＡＣＣＴＴＣＴＣＣ−３’）とＢａｍＨＩ　認識部位を有する３’側プライマー６（配列番号：１９、５’−ＣＣＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧ−３’）とからなるプライマー対及び５’側プライマー５（配列番号：１８）　とＢａｍＨＩ　認識部位を有する３’側プライマー７（配列番号：２０、５’−ＴＴＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＣＣＣ−３’）を用いたＰＣＲ　を行ない、それぞれ、前記Ｍｅｔ１−Ｇｌｎ７８（配列番号：１７）をコードする断片及びＭｅｔ１−Ｌｙｓ４２（配列番号：１１）をコードする断片を得た。
【０１０８】
得られた各断片を、それぞれ、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２にサブクローニングし、Ｓ−Ｍ−ＧＦＰ　発現用プラスミド及びＳ−ＧＦＰ　発現用プラスミドを得た。
【０１０９】
得られた各プラスミドについて、その塩基配列を、ＤＮＡ　シーケンサー（アプライド　バイオシステムズ社製、モデル３７７）を用いて確認した。プラスミドの模式図を図２に示す。ＣＤａｓｅ　活性の測定に関して、　Ｃ１２−ＮＢＤ−Ｃｅｒを基質として、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー、第２７５　巻、第３４６２〜３４６８頁（２０００）記載の方法に従って行なった。
【０１１０】
実施例２　ムチンボックス欠失変異体　（Δｍｕｃｉｎ）の発現解析
実施例１で得られたΔｍｕｃｉｎ　発現用プラスミド及び野生型ＣＤａｓｅ　発現用プラスミドを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ　Ｐｌｕｓ（インビトロジェン社製）　を用い、ヒト胚腎由来ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ヒト胚腎由来ＨＥＫ２９３細胞は、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー、第２７６　巻、第２６２４９　〜２６２５９　頁（２００１）に記載の方法で培養した。具体的には、１０％ウシ胎仔血清、６０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地中、５％ＣＯ２　濃度のインキュベータで培養した。
【０１１１】
トランスフェクションから１８時間後、細胞を回収し、培地を血清フリーのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロジェン社）　に交換し、ついで、２４ウェルプレートに１ウェルあたり、０．５　ｍｌの培地を添加し、さらに２４時間培養を続けた。その後、培養上清を回収し、１５０００　回転、　５分間遠心分離した。
【０１１２】
遠心分離により得られた上清に、１／１０　（ｖ／ｖ）量の　１％　　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００　と　３．３　　μｇ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル　（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，　ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）とを含む　２００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ　７．５を添加した。得られた溶液を、培養上清として用いた。培養プレートに接着した細胞を、ＰＢＳ　で洗浄し、その後、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００　と３．３　μｇ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル　（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，　ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）とを含む　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ　７．５）を添加して溶解した。得られた細胞溶解液は、ピペットで回収し、以下の実験に用いた。
【０１１３】
培養上清と細胞溶解液とはレームリの方法　（Ｎａｔｕｒｅ　２２７，　６８０−６８５）に従って、７．５％　ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後、ウエスタンブロッティングを行なった。ＰＶＤＦ膜上へのトランスファーは、ＴｒａｎｓＢｌｏｔ　ＳＤ（バイオラッド社製）を用いて行なった。トランスファー後の　ＰＶＤＦ　膜を、　３％　スキムミルクを含む　Ｔ−ＴＢＳ〔０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０　を含む　Ｔｒｉｓ−緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）　〕で１時間ブロッキングし、１次抗体である抗　Ｍｙｃ抗体（インビトロジェン社製）と４℃で１日インキュベートした。その後、膜を、前記　Ｔ−ＴＢＳで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）　標識２次抗体（抗マウス　ＩｇＧ抗体、ナカライテスク社製）と２時間インキュベートした。膜を、　Ｔ−ＴＢＳで洗浄した後、　ＥＣＬ−ｐｌｕｓ　（アマシャムファルマシア社製）　を用いて化学発光させた。発光シグナルについて、　ＳＴＯＲＭ（アマシャムファルマシア社製）　を用いて解析した。結果を図３に示す。なお、図中、　Ｃは、細胞溶解液、　Ｍは、培養上清を示す。
【０１１４】
図３に示すように、野生型ＣＤａｓｅ　の場合、ウエスタンブロッティングの結果、細胞溶解液では、　１３３−ｋＤａのバンドと　１１３−ｋＤａのバンドとが検出され、培養上清では、　１３３−ｋＤａのバンドが検出された。これらの分子種は、それぞれゴルジ装置と小胞体とででグリコシレーションの修飾を受けたものと考えられる。
【０１１５】
一方、Δｍｕｃｉｎ　の場合、細胞溶解液及び培養上清の両方で約　１０５−ｋＤａのバンドが検出された。
【０１１６】
実施例３　Δｍｕｃｉｎ　のＯ−結合糖鎖修飾の解析
抗　ＣＤａｓｅ抗体を用いて、実施例２で調製したΔｍｕｃｉｎ　又は野生型ＣＤａｓｅ　を発現させた　ＨＥＫ２９３　細胞の細胞溶解液から、ＣＤａｓｅ　を免疫沈降した。抗　ＣＤａｓｅを　１００倍希釈したものを、１０μｌ　の　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−ａｇａｒｏｓｅ（サンタ　クルズ社製）と　１００μｌ　の反応バッファー（１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ　と１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００　と　０．１％　ＢＳＡ　とを含む１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ　７．５）中４℃で　２時間カップリングした。得られた産物を、前記反応バッファーで５回洗った。その後、あらかじめ　ＳＤＳサンプルバッファー（１％　ＳＤＳと１％　２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌとを含む　２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ　７．５）中で　１００℃５分間加熱して得られた　ＣＤａｓｅ試料と混合してゆるやかに攪拌しながら４℃で１８時間インキュベートした。その後、免疫沈降物を、遠心分離で沈殿させ、前記反応バッファーで　５回洗浄し、２０μｌ　の　ＳＤＳサンプルバッファーに懸濁し、１００　℃５分間加熱した。得られた産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、実施例２記載の方法でウエスタンブロッティングを行なった。ＰＶＤＦ膜は、抗　Ｍｙｃ抗体又は　ＨＲＰ標識　ＰＮＡレクチンで染色した。結果を図４に示す。なお、ＰＮＡ　（ピーナッツ　アグルチニン）レクチンは、Ｏ−グリカンの　Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ　配列を特異的に認識して結合するレクチンである。
【０１１７】
図４に示すように、野生型ＣＤａｓｅ　の場合、　１１３−ｋＤａのバンドではなく、１３０−ｋＤａ　のバンドが　ＰＮＡレクチンで染色された。一方、Δｍｕｃｉｎ　の場合、レクチンで染色されるバンドは検出されなかった。従って、ムチンボックス部分は、細胞のゴルジ装置内でＯ−グリカンによる修飾を受けており、Δｍｕｃｉｎ　は、確かにＯ−グリコシル化部位を欠損していることがわかった。
【０１１８】
実施例４　Δｍｕｃｉｎ　と野生型ＣＤａｓｅ　の細胞外分泌量の比較
培養上清中の　ＣＤａｓｅ活性を経時的に比較した。その結果を図５に示す。同時に上清中の　ＣＤａｓｅのウエスタンブロッティング分析も行なった。その結果、１３０−ｋＤａ　の成熟型野生型ＣＤａｓｅ　及び１０５−ｋＤａ　のΔｍｕｃｉｎ　の両方が、細胞外に分泌されていた。
【０１１９】
発現プラスミド導入１８時間後、細胞を、阻害剤である１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ又は　５μＭ　サイトカラシンＤを含む　１０％ウシ胎仔血清含有　ＤＭＥＭ　培地に移し、３７℃で　１時間培養した。その後、細胞を、同じ阻害剤を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に移し、さらに　３時間培養した。なお、培養温度の影響を調べるために、トランスフェクト後の細胞を、阻害剤フリーのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中、５　℃で　３時間培養した。これらの培養上清の　ＣＤａｓｅ活性を測定した結果を図６に示す。成熟型野生型　ＣＤａｓｅ及び１０５−ｋＤａ　のΔｍｕｃｉｎ　の両方の細胞外への分泌が、ブレフェルジンＡ及び低温培養で阻害されたが、サイトカラシンＤでは阻害されなかった。従って、ＣＤａｓｅ　は、ムチンボックスの有無にかかわらず、小胞体／ゴルジ装置を通る古典的なルートにのってプロセスされ、分泌されることが分かった。
【０１２０】
実施例５　ムチンボックスによる中性　ＣＤａｓｅの細胞表面へのターゲッティング
実施例１で得られた　ＧＦＰ標識中性　ＣＤａｓｅ発現用プラスミドを、ヒト胚腎由来　ＨＥＫ２９３　細胞に導入して　ＧＦＰ標識中性　ＣＤａｓｅを発現させた。ついで、細胞を固定化後、共焦点レーザー蛍光顕微鏡で　ＧＦＰの蛍光シグナルを観察した。すなわち、プラスミドを導入した細胞をカバーグラス上で培養し、その後、該細胞を、３％グルタルアルデヒドを含む　ＰＢＳで　１５　分間固定した。
【０１２１】
前記細胞について、共焦点レーザー蛍光顕微鏡　（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｅｃｌｉｐｓｅ　Ｃ１、ニコン社製）で観察した。結果を図７のパネルＡに示す。図中、矢印は、細胞形質膜での　ＣＤａｓｅ発現を、矢印頭部は、小胞体／ゴルジ装置内での発現を示す。
【０１２２】
図７のパネルＡに示すように、Ｃ末端を　ＧＦＰで標識した　ＣＤａｓｅ（ＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ　ＣＤａｓｅ）　は、小胞体／ゴルジ装置内のみならず、形質膜にも発現していた。
【０１２３】
次に、実施例１で得られたＣ末端を　ｍｙｃで標識した野生型ＣＤａｓｅ　を発現している細胞とΔｍｕｃｉｎ　を発現している細胞とを　ＰＢＳと５０　ｍＭ　塩化アンモニウムとを含む　ＰＢＳで洗浄した。また、必要に応じて　０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む　ＰＢＳで細胞を透過性にする処理を行なった。５％スキンミルクを含む　ＰＢＳ　（ブロッキング液）　で１５　分間ブロッキングした。その後、スライドグラス上の細胞を、ブロッキング液で　１０００　倍に希釈した１次抗体と４℃で１日インキュベートし、その後、Ｃｙ３　標識した２次抗体と室温で　２時間インキュベートし、抗　ｍｙｃ抗体を用いた免疫染色で観察した。結果を図７のパネルＢに示す。なお、図中、ａ及びｂは、野生型ＣＤａｓｅ　を発現しているＨＥＫ２９３細胞、Ｃ及びｄは、Δｍｕｃｉｎ　を発現しているＨＥＫ２９３細胞を示す。また、ｂ及びｄについては、　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００　による透過性処理を行ない、ａ及びｃについては、前記処理を行なわなかった。
【０１２４】
その結果、図７のパネルＢに示すように、透過性処理を行なわない場合　（ａ及びｃ）、細胞表面における　ＣＤａｓｅの蛍光シグナルは、野生型ＣＤａｓｅ　の方が　　Δｍｕｃｉｎ　に比べてはるかに強かったが、透過性処理を行なった場合　（ｂ及びｄ）、両者のシグナルにほとんど差はなかった。
【０１２５】
実施例６　ムチンボックスによる中性　ＣＤａｓｅの細胞表面へのターゲッティング
Ｃ末端を　ｍｙｃで標識した野生型ＣＤａｓｅ　及びΔｍｕｃｉｎ　をヒト胚腎由来　ＨＥＫ２９３　細胞並びに　ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｐｏｌｙｏｍａ　ＬＴ　ａｎｔｉｇｅｎ　（ＣＨＯＰ）　細胞に発現させて、フローサイトメトリーを用いて解析した。
【０１２６】
なお、　ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｐｏｌｙｏｍａ　ＬＴ　ａｎｔｉｇｅｎ　（ＣＨＯＰ）　は、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー、第２７６　巻、第２６２４９　〜２６２５９　頁（２００１）に記載の方法で培養した。
【０１２７】
すなわち、３ｘ１０５　個の細胞に、野生型ＣＤａｓｅ　発現用プラスミド、Δｍｕｃｉｎ　発現用プラスミド、又は空のベクター　（ｍｏｃｋ）　を導入し、３７℃で２４時間培養した。細胞を回収した後、該細胞を、５０％　ＦＢＳ　を含む　ＰＢＳで１０００倍に希釈した抗　ｍｙｃ抗体１００μｌと氷上で　１．５時間インキュベートした。得られた産物を、ＰＢＳ　で　２回洗浄した後、５０％　ＦＢＳ　を含む　ＰＢＳで希釈した　Ｃｙ３標識２次抗体（Ｃｙ３−抗マウス　ＩｇＧ抗体）１００　μｌ　と氷上で　１時間インキュベートした。その後、フローサイトメトリー　（ＥＰＩＣＳ　ＸＬ　Ｓｙｓｔｅｍ−ＩＣ，　Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｌｌｔｅｒ　社製）　を用いて、得られた産物解析した。結果を図８のパネルＡ及びパネルＢに示す。パネルＡは、ＨＥＫ　２９３　細胞、パネルＢは、ＣＨＯＰ細胞の結果である。
【０１２８】
図８のパネルＡ及びパネルＢに示すように、ＨＥＫ　２９３　細胞及びＣＨＯＰ細胞の両方で、野生型ＣＤａｓｅ　は形質膜表面に発現しているが、Δｍｕｃｉｎ　は発現していなかった。
【０１２９】
実施例７　ＣＤａｓｅ　の細胞形質膜表面における発現に対するムチンの阻害効果
実施例１で得られた　ＧＦＰ標識中性　ＣＤａｓｅ発現用プラスミドを、３ｘ１０５　のヒト胚腎由来ＨＥＫ２９３細胞に導入し、４　時間後に細胞を０．９　ｍｇ／ｍｌ　のブタ胃ムチン　（Ｓｉｇｍａ　社）　を含む　１０％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地に移し、３７℃で１８時間培養した。コントロールとして、ブタ胃ムチンを含まない培地で培養したものも用意した。培養後、細胞を回収し、実施例６と同様に、抗　ＧＦＰ抗体とインキュベートした。ついで、得られた産物を、Ｃｙ３　標識した　２次抗体（Ｃｙ３−抗ウサギ　ＩｇＧ抗体）と４℃でインキュベートした。その後、フローサイトメトリー　（ＥＰＩＣＳ　ＸＬ　Ｓｙｓｔｅｍ−ＩＣ，　Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｌｌｔｅｒ　社）　を用いて解析した。結果を図９に示す。
【０１３０】
図９に示すように、ブタ胃ムチンを添加した場合、細胞形質膜表面での　ＧＦＰ標識中性　ＣＤａｓｅの発現が顕著に抑制された。すなわち、ＣＤａｓｅ　のＨＥＫ　２９３　細胞の形質膜表層への分布は、ムチンによって阻害されることが示された。
【０１３１】
実施例８　ムチンボックス付加　ＧＦＰの細胞内局在
実施例１で作製したムチンボックス付加　ＧＦＰ発現用プラスミドを、ヒト胚腎由来ＨＥＫ２９３細胞に導入し、発現部位を解析した。実施例２と同様の方法でＨＥＫ　２９３　細胞に　ＧＦＰをコードする配列を含むプラスミド　（ｐＥＧＦＰ−Ｎ２）　、Ｓ−ＧＦＰ　発現用プラスミド又は　Ｓ−Ｍ−ＧＦＰ発現用プラスミドを導入し、細胞を培養した。その後、細胞を回収し、抗　ＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロッティングを行なった。結果を図１０のパネルＡに示す。図中、レーン１は、　ＧＦＰ、レーン２は、　Ｓ−ＧＦＰ、レーン３は、　Ｓ−Ｍ−ＧＦＰを示す。
【０１３２】
図１０のパネルＡに示すように、Ｓ−Ｍ−ＧＦＰ　を発現させた　ＨＥＫ　２９３細胞溶解液では主に、３７　ｋＤａのバンドと５５　ｋＤａのバンドとが観察された。また、前記５５　ｋＤａのバンドは、培地へのベンジル−ＧａｌＮＡｃ　の添加によって、低分子化して細胞外に分泌されたが、３７　ｋＤａのバンドには変化がなかった。
【０１３３】
次に、ムチンボックス付加　ＧＦＰ発現細胞を、抗　ＧＦＰ抗体で染色後、共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した。結果を図１０のパネルＢに示す。パネルＢのパネルａ及びｃは、　ＧＦＰの蛍光による観察結果（図中、「ＧＦＰ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」と表記）　、パネルｂ及びｄｈａ、抗　ＧＦＰ抗体による染色結果（図中、「Ａｎｔｉ−ＧＦＰ」と表記）　を示す。また、パネルＢのパネルａ及びｂは、　Ｓ−Ｍ−ＧＦＰ、パネルｃ及びｄは、Ｓ−ＧＦＰの発現を示す。
【０１３４】
図１０のパネルＢのパネルｂに示すように、抗　ＧＦＰ抗体を用いた染色結果から、ムチンボックス及び分泌シグナルの両方を付加した　Ｓ−Ｍ−ＧＦＰは、　ＨＥＫ　２９３細胞の表面に分布していた。一方、図１０のパネルＢのパネルｄに示すように、分泌シグナルのみを付加した　Ｓ−ＧＦＰは、細胞表面には発現していなかった。また、図１０のパネルＢのパネルａ及びパネルｃに示すように、ＧＦＰ　の蛍光シグナルの観察結果から、細胞内での　Ｓ−ＧＦＰの発現及び　Ｓ−Ｍ−ＧＦＰの発現は、同程度であった。
【０１３５】
ついで、前記と同様に、ムチンボックス付加　ＧＦＰの発現をフローサイトメトリーを用いて解析した。すなわち、３　ｘ　１０５　細胞の　ＨＥＫ　２９３細胞に　ＧＦＰ、Ｓ−ＧＦＰ　、及びＳ−Ｍ−ＧＦＰ　のそれぞれを発現するプラスミドを導入し、２４時間培養した。その後、細胞を回収し、抗　ＧＦＰ抗体と　Ｃｙ３標識抗ウサギ　ＩｇＧ抗体とを用いて染色し、フローサイトメトリーで分析した。結果を図１０のパネルＣに示す。
【０１３６】
図１０のパネルＣに示すように、ＨＥＫ　２９３　細胞表面でのＳ−Ｍ−ＧＦＰ　のシグナルは、　Ｓ−ＧＦＰのものよりも遙かに強かった。
【０１３７】
また、実施例７と同様の方法により、ブタ胃ムチンの存在下におけるＳ−Ｍ−ＧＦＰ　の発現を調べた。その結果を図１０のパネルＤに示す。
【０１３８】
図１０のパネルＤに示すように、細胞表面でのＳ−Ｍ−ＧＦＰ　の発現は、顕著に抑制された。
【０１３９】
これらの結果から、Ｏ−結合糖鎖による修飾を受けたムチンボックスそれ自体がタンパク質を細胞形質膜表面に局在化させるシグナルとしての活性を有することがわかった。
【０１４０】
実施例９　マウス臓器及び血清由来中性　ＣＤａｓｅのムチンボックス
ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー、第２７５　巻、第３４６２〜３４６８頁（２０００）記載の方法に従って、マウスの肝臓及び腎臓のそれぞれより膜画分を調製し、凍結融解により中性　ＣＤａｓｅを可溶化した。それぞれの臓器について可溶化画分と不溶性画分について、　ＣＤａｓｅの活性を測定した。その結果を図１１のパネルＡに示す。
【０１４１】
図１１のパネルＡに示すように、凍結融解により、マウス肝臓では、全中性　ＣＤａｓｅ活性のうち　７２％が可溶性画分に見出されたが、マウス腎臓では、　９０％以上が不溶性画分に見出された。
【０１４２】
実施例３記載の方法と同様に、それぞれの画分から中性　ＣＤａｓｅを免疫沈降し、ついで、抗中性　ＣＤａｓｅ抗体を用いたウエスタンブロッティング又は　ＨＲＰ標識　ＰＮＡレクチンを用いたレクチンブロッティングによって分析した。また、各サンプルについて、　５　ｍＭ　ＣａＣｌ２　と　０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００とを含む　５００　ｍＭ　酢酸バッファー（ｐＨ　５．０）中、５　ｍＵのビブリオ　コレラ由来シアリダーゼを用いて、３７℃、１８時間消化した。その結果を図１１のパネルＢに示す。
【０１４３】
図１１のパネルＢに示すように、抗中性　ＣＤａｓｅ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果から、腎臓の不溶性画分の中性　ＣＤａｓｅは、　１１２−ｋＤａのタンパク質分子であり、肝臓の可溶性画分の酵素は、　９４−ｋＤａ　の分子であることが明らかとなった。また、肝臓の不溶性画分にも　１１２−ｋＤａの　ＣＤａｓｅが検出された。これら腎臓及び肝臓それぞれの　１１２−ｋＤａの　ＣＤａｓｅは、　ＰＮＡレクチンによって染色されたが、９４−ｋＤａの　ＣＤａｓｅは染色されなかった。すなわち、不溶性画分に回収された　ＣＤａｓｅだけがＯ−結合糖鎖による修飾を受けていることが分かった。
【０１４４】
また、各ＣＤａｓｅ　について、Ｎ−末端アミノ酸分析を行なったところ、９４−ｋＤａの　ＣＤａｓｅは、ムチンボックスを失っていることがわかった。しかしながら、腎臓の　ＣＤａｓｅと肝臓の酵素と間においては、Ｏ−結合糖鎖の構造が若干異なっているように＜も割れる。
【０１４５】
肝臓の酵素は、シアリダーゼ消化によって大きく分子量が変化し、ＰＮＡ　レクチンに対する反応性が増大したのに対して、腎臓の　ＣＤａｓｅの場合、シアリダーゼ消化はそれほど大きな影響を与えなかった。さらに、マウスの血清中にも　１１２−ｋＤａの　ＰＮＡレクチンで染色される　ＣＤａｓｅが検出された。この分子は、シアリダーゼに対する挙動が肝臓の不溶性画分の酵素と同じであることから肝臓由来であると考えられる。
【０１４６】
これらの結果は、中性　ＣＤａｓｅのＯ−結合糖鎖による修飾が組織特異的に行なわれており、酵素の形質膜への局在に大きな影響を与えていることを示す。
【０１４７】
実施例１０　ムチンボックス付加による細胞形質膜表面発現用キット
実施例１で構築したムチンボックス付加　ＧＦＰ発現用プラスミドのムチンボックスをコードする配列と　ＧＦＰをコードする配列との間に、目的のタンパク質をコードする遺伝子を挿入することができるように、発現プラスミドを構築した。
【０１４８】
すなわち、分泌シグナルとムチンボックス配列の下流に、目的のタンパク質をコードする配列、さらにその下流に　ＧＦＰをコードする配列を配置した。このようにデザインした発現用プラスミド、並びに抗　ＧＦＰ抗体、動物細胞へのトランスフェクション用試薬、発現用細胞、例えばヒト胚腎由来　ＨＥＫ２９３　細胞、並びに取り扱い説明書を含むタンパク質の細胞形質膜表面発現用キットを構築した。すなわち、ラット中性ＣＤａｓｅ　の分泌シグナルをコードする配列とムチンボックス配列をコードする配列を以下のようにして調製した。
【０１４９】
ＫｐｎＩ認識部位を有する５’側プライマー５（配列番号：１８、５’−ＡＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＣＧＡＡＣＣＴＴＣＴＣＣ−３’）とＢａｍＨＩ　認識部位を有する３’側プライマー６（配列番号：１９、５’−ＣＣＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧ−３’）とからなるプライマー対を用いたＰＣＲ　を行ない、ラット中性ＣＤａｓｅ　の分泌シグナル配列とムチンボックス配列、すなわち、配列番号：１７に示されるアミノ酸配列Ｍｅｔ１−Ｇｌｎ７８をコードする断片を調製した。得られた断片は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２ベクターのマルチクローニングサイトにあるＫｐｎＩ認識部位とＢａｍＨＩ　認識部位との間にサブクローン化した。このようにして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流に分泌シグナルとムチンボックス配列とをコードする塩基配列を有し、かつ該塩基配列の下流にＧＦＰ　をコードする配列を有する発現プラスミドを構築することができる。得られた構築物について、その塩基配列をＤＮＡシークエンサー（アプライド　バイオシステムズ社製、モデル３７７）を用いて確認した。
【０１５０】
得られた発現プラスミドのムチンボックスをコードする配列の下流に、目的のポリペプチドをコードする核酸を作動可能に連結することにより、目的のポリペプチドを細胞形質膜表面に発現させるための発現プラスミドを構築することができる。
【０１５１】
かかる発現プラスミドによれば、抗ＧＦＰ　抗体を用いて、あるいは、直接ＧＦＰ　の蛍光シグナルを利用して、細胞形質膜表面における目的のポリペプチドの発現を観察することができる。
【０１５２】
実施例１１　異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出に用いるためのキットの構築
配列番号：１に示される塩基配列を基にオリゴヌクレオチドプローブを作製し、配列番号１８及び１９のそれぞれに記載のプライマー５及びプライー６を作製し、下記に示す異種ペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出にもちいる為のキットを構築した。
【０１５３】
キットの構成（ＰＣＲ　１００回分）
プライマー５（２０ｐｍｏｌ／μｌ）　　　　　　　　　　　１１０μｌ
プライマー６（２０ｐｍｏｌ／μｌ）　　　　　　　　　　　１１０μｌ
１０×ＰＣＲバッファー　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍｌ
タカラ　タック（５Ｕ／μｌ）　　　　　　　　　　　　　　　５０μｌ
ｄＮＴＰミクスチャー（各２．５ｍＭ）　　　　　　　　　　０．８ｍｌ
ＦＩＴＣ標的プローブ（５ｐｍｏｌ／μｌ）　　　　　　　　１００μｌ
【０１５４】
上記キットを用いて、実施例２で作製した細胞から細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸を検出できた。
【０１５５】
実施例１２　異種ペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドの検出に用いるためのキットの構築
配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドあるいは配列番号：１記載の塩基配列を含む発現ベクターを動物細胞に導入した調製したＯ−結合型糖鎖で修飾された該ポリペプチドを抗原とし、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を免疫することにより、抗ムチンボックス抗体を作製し、下記に示す異種ペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドの検出に用いるためのキットを構築した。
【０１５６】
キットの構成
抗ムチンボックスマウスモノクローナル抗体　　　　　　　　１ｍｌ×１本
ＦＩＴＣ標的ヤギ抗マウス（ＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ　抗体）　　　　　　　１ｍｌ×１本
希釈液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｌ×１本
ブロッキング液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍｌ×１本
【０１５７】
上記キットを用いて、実施例５で同様の実験を行ない、細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドが検出できた。
【０１５８】
本キットを用いることにより、ムチンボックスとの融合タンパク質として発現されている目的タンパク質の細胞形質膜表面での発現を簡単に確認することができる。さらに、本キットを用いることにより、抗　ＧＦＰ抗体の場合と同様に、細胞形質膜表面に発現した目的タンパク質と相互作用するリガンド又はレセプターを簡便にスクリーニングすることが可能である。
【０１５９】
配列表フリーテキスト
配列番号：１３は、プライマーの配列を示す。
【０１６０】
配列番号：１４は、プライマーの配列を示す。
【０１６１】
配列番号：１５は、プライマーの配列を示す。
【０１６２】
配列番号：１６は、プライマーの配列を示す。
【０１６３】
配列番号：１８は、プライマーの配列を示す。
【０１６４】
配列番号：１９は、プライマーの配列を示す。
【０１６５】
配列番号：２０は、プライマーの配列を示す。
【０１６６】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドによれば、天然においては、細胞形質膜表面に局在化されないようなポリペプチドを細胞形質膜表面に局在化させることができるという優れた効果を奏する。また本発明の核酸によれば、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングするための構築物を簡便に作製することができ、前記のポリペプチドの糖鎖の付加パターンや物理化学的性質を改変するために用いることができ、遺伝子工学的に、本発明のポリペプチドを容易に得ることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の細胞導入用構築物及び形質転換細胞によれば、細胞形質膜表面に局在化されないようなポリペプチドを細胞形質膜表面に局在化させることができ、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドを容易に得ることでき、被験対象のポリペプチドに対するレセプター又はリガンドのスクリーニングに用いることができ、標的部位への細胞の送達等の少なくともいずれかを達成しうるという優れた効果を奏する。また、本発明の細胞形質膜表面へのポリペプチドの局在化方法及びそのキットによれば、細胞形質膜表面に局在化されないようなポリペプチドを細胞形質膜表面に局在化させることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ、プライマー対、異種ポリペプチドを細胞形質膜表面へターゲッティングする活性を有するポリペプチドをコードする核酸の検出に用いるためのキット、該核酸の検出方法、ポリペプチド又はポリペプチド糖鎖修飾物に特異的に結合する抗体若しくはその断片、該ポリペプチド若しくはポリペプチド糖鎖修飾物又は該の検出方法又はそのキットによれば、本発明のポリペプチド若しくはポリペプチド糖鎖修飾物又は核酸を容易に検出することができ、細胞形質膜局在化ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードする核酸の検索、細胞形質膜局在化の予測、局在化シグナルの検索等に用いることができるという優れた効果を奏する。また、本発明のリガンド又はレセプターの検出方法によれば、新たなリガンド、レセプターのスクリーニングに利用することができるという優れた効果を奏する。
【０１６７】
【配列表】
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【０１６８】
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【０１６９】
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【０１７０】
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【０１７１】
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【０１７２】
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【０１７３】
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【０１７４】
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【０１７５】
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【０１７６】
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【０１７７】
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【０１７８】
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【０１７９】
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【０１８０】
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【０１８１】
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【０１８２】
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【０１８３】
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【０１８４】
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【０１８５】
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【０１８６】
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【０１８７】
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【０１８８】
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【０１８９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、中性セラミダーゼのアミノ酸配列の比較図である。パネルＡは、ラット（配列番号：５のアミノ酸番号：１〜１１０）及びマウス（配列番号：３のアミノ酸番号：１〜１０５）の中性セラミダーゼと他生物〔粘菌（配列番号：６のアミノ酸番号：１〜６７）、緑膿菌（配列番号：７のアミノ酸番号：１〜５６）、結核菌（配列番号：８のアミノ酸番号：１〜２９）、ショウジョウバエ（配列番号：９のアミノ酸番号：１〜５２）、シロイヌナズナ（配列番号：１０のアミノ酸番号：１〜５６）〕の中性セラミダーゼとについて、塩基配列から推定されたＮ末端アミノ酸配列を比較した図である。パネルＢは、ラット（配列番号：２）及びマウス（配列番号：３のアミノ酸番号：４３〜７３）の中性セラミダーゼのムチンボックスのアミノ酸配列と他のムチン型糖タンパク質のアミノ酸配列〔ラットスクラーゼイソマルターゼ（配列番号：２１）、ヒトＭＵＣ（配列番号：２２）、昆虫腸間ムチン（配列番号：２３）〕との比較を示した図である。
【図２】ラット中性　ＣＤａｓｅのドメイン構造と各種変異体の構造を示した図である。模式図は、野生型中性セラミダーゼ（図中、Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ　ＣＤａｓｅ）、ムチンボックス欠失変異体（図中、Δｍｕｃｉｎ　ＣＤａｓｅ　）、Ｃ末端　ＧＦＰ標識セラミダーゼ（図中、ＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ　ＣＤａｓｅ）　、シグナル配列−ムチンボックス−ＧＦＰ　融合タンパク質　（図中、Ｓ−Ｍ−ＧＦＰ）、シグナル配列付加　ＧＦＰ　（図中、Ｓ−ＧＦＰ）を示す。
【図３】図３は、ＨＥＫ　２９３　細胞で発現させたセラミダーゼのウエスタンブロッティングの結果を示した図である。Ｃ　は、細胞溶解液、　Ｍは、培養上清を示す。
【図４】図４は、野生型セラミダーゼ及びムチンボックス欠失体のＯ−結合型糖鎖修飾をウエスタンブロッティングで分析した結果を示した図である。
【図５】図５は、野生型セラミダーゼ及びムチンボックス欠失体の細胞外への分泌の経時変化を示した図である。
【図６】図６は、セラミダーゼの分泌に対するブレフェルジンＡ　（ＢＦＡ）、サイトカラシンＤ　（ＣｙｔｏＤ）、及び温度の影響を示した図である。
【図７】図７は、野生型セラミダーゼ及びムチンボックス欠失体の発現様式を調べた結果を示す図である。パネルＡは、ＧＦＰ　標識中性セラミダーゼをＨＥＫ２９３細胞で発現させた結果を直接共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した結果を示した図である。パネルＢは、野生型セラミダーゼとムチンボックス欠失体のＨＥＫ２９３細胞内、及び細胞形質膜表面での発現を抗　ｍｙｃ抗体で免疫染色した結果を示した図である。
【図８】図８は、野生型セラミダーゼ及びムチンボックス欠失体のそれぞれを発現する細胞をフローサイトメトリーで解析した結果を示した図である。パネルＡは、ＨＥＫ２９３細胞、パネルＢは、ＣＨＯＰ細胞を用いた結果を示す。
【図９】図９は、ＨＥＫ２９３細胞表面におけるＧＦＰ　標識中性セラミダーゼの発現のムチン添加による阻害効果をフローサイトメトリーで解析した結果を示した図である。
【図１０】図１０は、ＧＦＰ　、Ｓ−ＧＦＰ　及びＳ−Ｍ−ＧＦＰ　について発現様式及びムチンによる影響を調べた結果を示した図である。パネルＡは、ＧＦＰ　、Ｓ−ＧＦＰ　、Ｓ−Ｍ−ＧＦＰ　のＨＥＫ２９３細胞における発現の結果をウェスタンブロティングで解析した結果を示した図である。レーン１は　ＧＦＰ、レーン２は　Ｓ−ＧＦＰ、レーン３は　Ｓ−Ｍ−ＧＦＰを示す。パネルＢは、Ｓ−ＧＦＰ　、Ｓ−Ｍ−ＧＦＰ　の　ＨＥＫ２９３　細胞における発現を免疫染色した後、蛍光顕微鏡で観察した結果を示した図である。パネルＣは、ＧＦＰ　、Ｓ−ＧＦＰ　、Ｓ−Ｍ−ＧＦＰ　のＨＥＫ２９３　細胞表面における発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示した図である。パネルＤは、Ｓ−Ｍ−ＧＦＰ　の　ＨＥＫ２９３　細胞表面における発現に対するムチン添加による阻害効果をフローサイトメトリーで解析した結果を示した図である
。
【図１１】
図１１は、マウス肝臓及び腎臓のそれぞれの膜画分及び可溶性画分における中
性セラミダーゼを調べた結果を示した図である。パネルＡは、マウス肝臓と腎臓
の膜画分と可溶性画分中の中性　ＣＤａｓｅの活性を測定した結果を示した図である。
活性値は　２回測定の平均値である。パネルＢは、マウス肝臓と腎臓の膜画分と可
溶性画分、並びに血清中の中性　ＣＤａｓｅを抗中性　ＣＤａｓｅ抗体と　ＨＲＰ標識　ＰＮＡレクチ
ンを使ってウェスタンブロティングで解析した結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2004016054.tif 000061
【図９】
2004016054.tif 000062
【図１０】
2004016054.tif 000063
【図１１】
2004016054.tif 000064