(57)【要約】【課題】本発明は、口腔という限られた空間内で組織再生のための空間を所定期間保持し得、組織再生後には生体内で分解され、そして必要な増殖因子や成長分化因子等を適度なタイミングで創面に供給し得る又は所要細胞の成長に資する適当な支持体を提供する。【解決手段】本発明は、歯科用材料であって、その中に自己組織再生支援物質を少なくとも１種含有してなる層を有する再生アテロコラーゲンからなることを特徴とする。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
その中に自己組織再生支援物質を少なくとも１種含有してなる層を有する再生アテロコラーゲンからなる歯科用材料。
【請求項２】
前記の自己組織再生支援物質が栄養物質、増殖刺激因子、分化誘導因子、抗生物質、抗真菌剤である請求項１に記載の歯科用材料。
【請求項３】
前記の自己組織再生支援物質を含有してなる層がゼラチンからなる層であり、該層の上下両面に再生アテロコラーゲンからなるスポンジ層を有する請求項２に記載の歯科用材料。
【請求項４】
前記の自己組織再生支援物質を含有してなる層が再生アテロコラーゲンからなるゲル層であり、該ゲル層の上下いずれか一方の面に再生アテロコラーゲンからなるスポンジ層を有する請求項２に記載の歯科用材料。
【請求項５】
前記の再生アテロコラーゲンからなるゲル層が、８０％以上のビーズ残存率（２４時間経過時点）を有するものである請求項４に記載の歯科用材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、歯周病治療用の材料に関し、特に歯周組織の再生を促す材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
歯周病は口腔内の雑菌が歯周部に繁殖し、それらが分泌する酵素や炎症物質の作用にヒト自体の炎症性サイトカインの働きが加わり歯周組織が損傷する病気である。現在の一般的な歯周病の治療は、感染物質や壊死した歯周組織を機械的に除去、洗浄し、局所抗生物質を投与して、急性炎症の消失した後に口腔衛生指導を行い、経過観察によって歯周病の進行を防ぐのみであり、処置を受けた患者には義歯の利用しか残された道がなかった。
【０００３】
このような状況下、義歯の利用に抵抗を示す患者の要求が高まり、歯周組織の再生現象を利用した医療が行われるようになってきた。
【０００４】
その中で臨床的に行われている方法としては、ＧＴＲ（Ｇｕｉｄｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）法とエムドゲイン（登録商標）法が挙げられる（例えば、非特許文献１参照）。前者は、生体の自己再生能力を利用する方法であって、歯槽骨、セメント質、歯根膜に比し、創面被覆スピードが格段に早い上皮と歯肉結合組織の創面への侵入を膜（吸収性と非吸収性のものが開発されている）で遮断し、歯根膜や歯槽骨が再生するための欠損空隙を確保する方法であるが、適応症例が限られ、手技が煩雑であり、膜の露出に伴い感染が起こりやすいため予後の不確実性がある。また、非吸収性膜の場合、膜を除去するための二次手術を要し、患者の負担は大きい。後者は、ブタの歯胚から精製したエナメル基質由来タンパクを創面に適用して歯の発生過程に似た環境を再現することで歯周組織の再生を促す方法とされている。しかし、その精製過程などは企業秘密のため再生効果の作用機序は不明であり、さらに原料に由来する未知のウイルス・病原体の混入可能性を払拭し得ているとはいい難い状況にある。このように、従来の歯周組織再生法は、有効性や安全性が低く、術者の熟練に頼るところが大きい。
【０００５】
次に研究・前臨床レベルにあるものとして、歯槽骨を積極的に再生させる物質、例えば骨形成タンパク（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）や塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ｂＦＧＦ）等の成長分化因子を創面に適用する方法と患者から採取した組織を体外で培養した後に患者に戻す方法がある（例えば、非特許文献１参照）が、前者の中でＢＭＰの適用に関しては、その実効性を疑問視する意見があると共に用量設定の難しさ（歯槽骨成長速度と歯根膜成長速度とのアンバランスの解消又は調整）も指摘され、骨性癒着（アンキローシス）の副作用の報告もあり、未だ基本的な検討課題を残すものである。またｂＦＧＦの適用に関しては、組織幹細胞の分化の一連の流れにおいてｂＦＧＦがＢＭＰより上流に作用するため歯槽骨・歯根膜・セメント質の３者の再生が誘導される成長分化因子になる可能性を有しているとされる。しかし、いかにこれらの成長分化因子を所用期間患部にとどめておくかという点、そして適度な所要量を創面に供給するかという点、さらに局所に大量の成長分化因子を投与することによる副作用においても課題を残すものである（この課題についてはＢＭＰを含めすべての成長分化因子も同様）。
【０００６】
一方、後者には患者の口腔内から採取した歯根膜を細胞シート工学を利用して培養しシート化した細胞を創面に貼り付ける方法（歯根膜シート）と患者の骨髄から採取した間葉系幹細胞を培養し骨芽細胞の直前まで分化させ注射可能な形態にした後、歯槽骨組織に注入する方法（注射培養骨）とが挙げられるが、歯根膜シートに関しては再生期間をどの程度まで短縮し得るのかという点、多様な細胞を含む歯根膜細胞からいかに効率よく歯槽骨・歯根膜・セメント質を分化誘導するのかという課題を有する。また注射培養骨に関しては一般歯科診療で骨髄を採取しなければならないという点において歯根膜シート以上に自家細胞の供給源問題が課題であり、また骨髄細胞によって歯周組織の再生に欠かせないセメント質及び歯根膜の再生が有効になされるかという点について確認を要する。尚、歯根膜シートにもまたＢＭＰやｂＦＧＦと同様、口腔という限られた空間内で組織再生のための空間を所定期間保持し得、組織再生後には生体内で分解され、そして必要な増殖因子を適度なタイミングで創面に供給し得る又は所要細胞の成長に資する適当な支持体の開発が望まれている。
【０００７】
【非特許文献１】
「開幕！再生歯科レース  逃げる増殖因子、猛追する細胞・組織」、日経ＢＰ社、日経バイオビジネス２００２年７月号、ｐ．７３−８０
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況を改善すべくなされたものであって、口腔という限られた空間内で組織再生のための空間を所定期間保持し得、組織再生後には生体内で分解され、そして必要な増殖因子や成長分化因子等を適度なタイミングで創面に供給し得る又は所要細胞の成長に資する適当な支持体を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、歯科用材料であって、その中に自己組織再生支援物質を少なくとも１種含有してなる層を有する再生アテロコラーゲンからなることを特徴とする。
【００１０】
ここで、「アテロコラーゲン」とは、各種動物、例えばウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、カンガルー、鳥等の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器を原料とし、酸、アルカリ、酵素等を用いて可溶化されたＩ型コラーゲン、又はＩ型とＩＩＩ  型の混合コラーゲンをいい、アテロコラーゲンは、優れた生体親和性及び組織適合性を有し組織の再生を促進する、というコラーゲン本来の性質を保持しており、しかも可溶化操作にて抗原性基であるテロペプタイドが除去されているので、本発明の目的には好適な材料である。また、「再生アテロコラーゲン」とは、可溶化コラーゲンの塩酸水溶液から線維化させたものをいう。これらコラーゲンの由来は特に限定されず、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、カンガルー、鳥、魚などの動物の皮、骨、軟骨、腱、臓器などから抽出・精製して得られるＩ型コラーゲン、又はＩ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンの混合物を用いることができる。場合によっては、ヒト遺伝子組換えコラーゲンを用いてもよい。
【００１１】
また、自己組織再生支援物質としては、栄養物質、例えばアミノ酸、ビタミン、グルコース、電解質等；増殖刺激因子や分化誘導因子、例えば塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ステロイド、レチノイン酸等；感染予防薬、例えば抗生物質、抗真菌剤等が挙げられる。これらの自己組織再生支援物質は、所望により２種以上用いてもよい。場合によっては更に、自家組織から採取した歯根膜由来細胞等を加えてもよい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の一実施例に基き本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の歯科用材料において、その中に栄養物質、増殖刺激因子、分化誘導因子、抗生物質、抗真菌剤の少なくとも１種を含有してなる層には、次の二つの形態がある。一つは、ゼラチンからなる層（以下、ゼラチン層という。尚、その形態は、小球、シート状、ブロック状等種々の形態を採り得る）であり、もう一つは再生アテロコラーゲンからなるゲル層（以下、コラーゲンゲル層という）である。ここで、該層の上下両面又は上下いずれか一方の面には再生アテロコラーゲンからなるスポンジ層（以下、コラーゲンシートという）を有するものを基本とする。尚、自己組織再生支援物質として別途培養した歯根膜細胞等を含有せしめる場合には、それを含有させる媒体として基本通りゼラチンからなる層又はコラーゲンゲル層をあててもよいが、該歯科用材料をコラーゲンシートのみからなるものとし、該コラーゲンシート中に培養した歯根膜細胞等を直接含浸せしめてもよい。
【００１４】
ここで、「ゼラチンからなる層」とは、小球の形態をとるものにて説明すると、酸性ゼラチンのＷ／Ｏエマルションをアセトンにて処理して得られるゼラチンの小球をグルタールアルデヒドにて化学架橋したものの集合体を意味する。このゼラチンの小球中に自己組織再生支援物質を導入すると、負に帯電したゼラチンと正に帯電した自己組織再生支援物質とが静電的に結合しているので、生体内でゼラチンが分解されるにつれその中に導入された自己組織再生支援物質が放出され、該自己組織再生支援物質の放出はゼラチンがなくなるまで続くことになる。換言すれば、ゼラチンは自己組織再生を直接的及び／又は間接的に支援する物質を局所に所望の期間保持し、放出し得る機能材（徐放材）として働くものである（保持・放出の機序はその他の形態においても同様である）。ここで、自己組織再生支援物質は、複数種のそれらを一緒に該小球中に含有せしめてもいいし、また該小球からなる群毎に異なる種類のものを含有せしめてもよい。
【００１５】
また、「コラーゲンゲル層（アテロコラーゲンからなるゲル層）」とは、冷コラーゲン塩酸水溶液に塩基性バッファーを加えて、該冷コラーゲン塩酸溶液を中性化し、３７℃に加温することによりゲル化したコラーゲン溶液からなる層を意味する。要するに、コラーゲン溶液が流動性を失って固化した状態、具体的には、寒天状に、一定の堅さと形をもった弾性のある一様なハイドロゲルであって、コラーゲン分子が互いにつながりあって立体網目構造をとり、その空間を水などの液体が満たしている状態にあるものである。このゲル層もまた生体内で徐々に分解されるので、その中に導入された自己組織再生支援物質の徐放材として機能するものである。尚この層は、自己組織再生のための足場ともなるものである。ここで、自己組織再生支援物質は、複数種のそれらを単一のゲル層に含有せしめてもいいし、また複数の層からなるゲル層の各層にそれぞれ別個のものを含有せしめてもよい。更に、含有せしめる形態としては、該ゲル層中にすべて含有せしめてもよいし、また一部をその中に、そして一部をその表面に含有せしめてもよい。
【００１６】
該コラーゲンゲル層は、標識物質、例えば蛍光マーカービーズ（ベクソン・ディッキンソン社製キャリブライトビーズ−商品名−が例示される。尚、該ビーズは６μｍの直径を有するポリメチルメタクリレートからなるビーズである）をその中に含む（１０，０００個／ｍｌ−ゲル層）該コラーゲンゲル層をＰＢＳ中に緩やかな撹拌下に留置し、所定の経過時間毎に該ビーズの残存率を調べる方法において、２４時間経過後においても所定レベルの残存率を示すものが好ましい。もし、所定の経過時間後においても該ビーズの残存率が所定のレベルを維持しているならば、該コラーゲンゲル層は所望の自己組織再生支援物質保持機能を有している、と判定される。因みに所定のレベルとは８０％である。該コラーゲンゲル層が自己組織再生支援物質保持機能を有しているならば、該コラーゲンゲル層構成材料としてのゲル化コラーゲンが水可溶性とならない  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  条件においては、ＰＢＳとの接触初期に該コラーゲンゲル層中に形成されるであろう物理的な水路を介した該ビーズの放出以外起らないからである。
【００１７】
更に、「再生アテロコラーゲンからなるスポンジ層」とは、ホモジナイズした可溶化コラーゲンの塩酸水溶液（コラーゲン濃度：好ましくは約０．５〜３重量％、特に好ましくは約０．５〜１重量％）を、適当な鋳型に入れ、凍結乾燥した後、真空下で熱脱水架橋（好ましくは１１０〜１４０℃×１２〜４８ｈｒ、特に好ましくは１２０〜１４０℃×１２〜２４ｈｒ）して得られる多孔質・シート状のコラーゲン体を意味する。この層は、前記のゲル層以上に生体内での分解耐性を有するので、主にセメント質、歯根膜及び歯槽骨の再生過程における上皮の創面への侵入を防ぐバリヤーとして機能するが、前記のゲル層と同様、自己組織再生のための足場ともなるものである。
【００１８】
以下に、本発明の歯科用材料の一般的な作り方を示す。
【００１９】
Ａ．コラーゲンシートの作製
豚皮を酵素可溶化したコラーゲン（日本ハム社製）の約１Ｎ塩酸水溶液（ｐＨ＝約３、コラーゲン濃度：１重量％）を氷冷下ホモジナイズ（８，０００回転×１５ｍｉｎ）し、ガラス製の鋳型（例えば、１５８ｍｍＷ×２３ｍｍＬ×２ｍｍＤ）に入れ、凍結乾燥する（４８ｈｒ）。その後、真空下、熱脱水架橋（１２０℃×２４ｈｒ又は１４０℃×１２ｈｒ）を施すと、多孔質状のコラーゲンシートが得られる。尚、コラーゲンシートの厚さは、熱脱水架橋の後で鋳型へのコラーゲン塩酸水溶液の注型以降の操作を繰り返すことで所望のものにすることができる。
【００２０】
Ｂ．コラーゲンゲル層の作製
前記の冷コラーゲンの約１Ｎ塩酸水溶液に塩基性バッファー（炭酸水素ナトリウム及びＨＥＰＥＳを水酸化ナトリウムに溶解せしめたもの）を加えて、該コラーゲン塩酸水溶液を中性化した後、約３７℃に加温（１０分程度）し、該コラーゲン中性溶液をゲル化させる。尚、この層の場合、自己組織再生支援物質（場合によっては、前記の自己細胞及び／又はそれらの幹細胞を更に含む）は、加温に先立ち中性化したコラーゲン水溶液中に所定量、撹拌下に投入すればよい。更に、操作Ａにて作製したコラーゲンシートを水平に収容し得るバットの底面に、該コラーゲンシートを敷き、該バットへ自己組織再生支援物質をその中に含む中性化したコラーゲン水溶液を所定量注ぎ込んだ後で加温操作を行って該中性化したコラーゲン水溶液をゲル化させることによって、その上下いずれか一方の面にコラーゲンシートを有し、その中に自己組織再生支援物質を含有するコラーゲンゲル層が一体的に形成されるので好都合である。尚、この層の厚みは、中性化したコラーゲン水溶液のゲル化を繰り返すことで所望のものにすることができる。
【００２１】
Ｃ．ゼラチンからなる層（代表例として小球状の形態のものにて示す）の作製
牛骨等から抽出したコラーゲンをアルカリ処理して得られる酸性ゼラチン（新田ゼラチン社製）溶液（濃度：１０重量％）０．２ｍｌを約３７℃のオリーブ油５ｍｌに加えて撹拌（約１ｍｉｎ）し、Ｗ／Ｏエマルションを作製する。該エマルションを氷冷固化した後、アセトン１．５ｍｌを加え撹拌（１ｈｒ）し、生成したゼラチン微粒子を遠心分離（回転数：５０００ｒｐｍ、５分、４℃）にて回収した後、グルタルアルデヒド溶液（濃度：０．２５重量％）１２０ｍｌ中に分散させ、化学架橋（４℃×２４ｈｒ）する。次いで、該ゼラチン微粒子をグリシン（濃度：１００ｍＭ）で処理して架橋反応を停止させ、グルタルアルデヒドを除去する。該架橋ゼラチン微粒子を蒸留水で洗浄し液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥（７２ｈｒ）を行うと、ゼラチン小球（含水率：９１．４％、平均粒子径：１５．１μｍ）が得られる。
【００２２】
Ｄ．ゼラチンへの自己組織再生支援物質の導入
２ｍｇのゼラチン小球に、１０μｌのｂＦＧＦ（１００μｇ含有）水溶液を含浸させ、室温にて３０分静置した。
【００２３】
Ｅ．コラーゲンシートへの自己組織再生支援物質の導入
自家歯根膜由来細胞を懸濁させた１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）無添加Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）１０μｌをコラーゲンシート上に滴下し、培養液を含浸させた。
【００２４】
以下に、本発明の歯科用材料の代表的な数例を示す。
【００２５】
試験例１（ｂＦＧＦ含有歯科用材料）
歯科用材料の準備
前記の操作Ａに従って作製した（但し、熱脱水架橋は１４０℃×１２ｈｒの条件にて行った）コラーゲンシート（１５ｍｍＷ×１０ｍｍＬの大きさにトリミングした）の中央部に、操作Ｃ及び操作Ｄに従って作製した（但し、ゼラチンはコラーゲンのアルカリ処理にて得た）自己組織再生支援物質含有ゼラチン微粒子２ｍｇ（ｂＦＧＦを１００μｇ含有）を置き、次いで該コラーゲンシートをその中心線にて二つに折り、更に二つ折りされた該コラーゲンシートの長辺の中心線にて二つに折り、折り畳まれた該コラーゲンシート間に該ｂＦＧＦ含有ゼラチン微粒子の集合体を含む歯科用材料（試験群用材料）を得た。尚、対照群用としてｂＦＧＦを含まないゼラチン微粒子を同量含有する歯科用材料を準備した。
【００２６】
動物実験
ビーグル成犬（体重：８〜１２ｋｇ×９頭）の上下顎左右側切歯を抜歯し、創傷が治癒した後、全身麻酔と局所麻酔の併用下に、上下顎の犬歯近心部に人工的に３壁性歯槽骨欠損（３ｍｍＷ×４ｍｍＬ×４ｍｍＤ）を作製し、そこに試験群用材料と対照群用材料をそれぞれ左右側に埋入した。術後１、２、４週目に再生組織の組織学的観察と組織計測評価（ｎ＝６／群／週）を行った。
【００２７】
試験結果
試験群では、術後１週において、未分化細胞の増殖とコラーゲンシート内への細胞浸潤が見られ、術後２週には著しい毛細血管の増殖（２６．８±５．６／ｍｍ２、Ｐ＜０．０１）と新生骨の形成（３７．９±９．２％、Ｐ＜０．０１）が見られた。術後４週では毛細血管の増殖が高いレベルで維持され（２６．０±５．６／ｍｍ２、Ｐ＜０．０１）、新生骨形成も更に進行していた（７０．８±５．８％、Ｐ＜０．０１）。また歯根表面には新生セメント質が形成され（２．４±０．９ｍｍ）、その中に包埋されたセメント細胞や新生セメント質表面に配列したセメント芽細胞の層が観察された。更に新生歯根膜コラーゲン線維の機能的な走行も回復していた。残存したゼラチン微粒子の周囲に多数の毛細血管が観察され、ｂＦＧＦの効果が持続していることが確認された。
一方、対照群では、術後１週において欠損内は赤血球に満たされ、細胞の集積や増殖は見られなかった。術後４週を通して著しい毛細血管の増殖は見られず（２週：１１．１±４．３ｍｍ２、４週：９．７±３．６ｍｍ２）、新生骨の形成は骨欠損部周辺に限局し（２週：２３．１±７．２％、４週：３３．４±６．６％）、骨欠損内は線維性組織に満たされていた。また、術後４週において、明らかな新生セメント質の形成が見られず、対照群にのみ骨欠損内への上皮組織の進入と結合組織による歯根吸収が認められた。
【００２８】
試験例２（細胞含有歯科用材料）
歯科用材料の準備
前記の操作Ａに従って作製した（但し、熱脱水架橋は１２０℃×２４ｈｒの条件にて行った）コラーゲンシート（６ｍｍＷ×４ｍｍＬの大きさにトリミングした）に、自家歯根膜由来細胞（凍結保存したものを解凍して使用）を１０％ＦＢＳ無添加ＤＭＥＭに懸濁し、前記の操作Ｅに従って含浸させ、その中に自家歯根膜由来細胞を３×１０５個含む歯科用材料（試験群用材料）を得た。尚、自家歯根膜由来細胞の懸濁液は下記の操作にて作製した。
【００２９】
自家歯根膜由来細胞の培養
全身麻酔と局所麻酔との併用下、ビーグル成犬（体重：１０〜１２ｋｇ×６頭）の上下顎左右側切歯を抜歯し、それらの歯根表面に残存した歯根膜組織をメスにて採取した。採取組織片を１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを入れた６０ｍｍ培養シャーレ上で培養した（炭酸ガス培養器内）。培養液は２〜３日おきに交換した。培養開始数日後、シャーレ底面に線維芽細胞様の細胞が組織片より遊走し増殖しているのが観察された。培養２〜３週間で６０ｍｍシャーレのほぼ一面に細胞が増殖したところでトリプシン−ＥＤＴＡにて細胞を剥がし、２個の８０ｃｍ２培養フラスコに継代した。これをさらに培養し、８０％コンフルエントになったところで再びトリプシン−ＥＤＴＡで細胞を剥がし、１０％ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）含有ＤＭＥＭに懸濁し、４本のクライオチューブに凍結保存した（２×１０６〜３×１０６個／ｍｌ）。４本中各１本を下記のアルカリフォスファターゼ活性測定と動物実験に供した。
【００３０】
アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰａｓｅ）活性測定
前記の操作で凍結保存した細胞を解凍後、２個の８０ｃｍ２培養フラスコにて培養し、数日後６ウェルプレートに細胞を播種した（１０×１０４個／ウェル）。２日後、アスコルビン酸２リン酸（５０μｇ／ｍｌ）とβ−グリセロフォスフェート（１０ｍＭ）添加したＤＭＥＭと無添加ＤＭＥＭに培養液を交換し、以後９日目までに１日おきに培養細胞のＡＬＰａｓｅ活性を測定した。無添加ＤＭＥＭで培養した細胞に比し、添加ＤＭＥＭで培養した細胞は、培養５日目から有意にＡＬＰａｓｅ活性が上昇したことが確認された。現在まで歯根膜細胞の特異的なマーカーとなるものが見つかっていないが、歯根膜細胞が骨芽細胞の性質を持つことが知られている。したがって、培養細胞のＡＬＰａｓｅ活性を確認したことにより、同細胞が歯根膜由来の細胞であることが証明された。
【００３１】
動物実験
全身麻酔と局所麻酔の併用下、自家歯根膜由来細胞の採取源としたビーグル犬の上顎犬歯部歯槽骨に開窓状欠損（６ｍｍＷ×４ｍｍＬ）を作製した（露出した歯根表面の歯根膜とセメント質を象牙質が露出するまで機械的に除去）。次いで先に準備した細胞含有歯科用材料（試験群用）を細胞播種面を歯根膜表面に向けて該欠損に埋入した。ここで、該歯科用材料の反細胞播種面側は、試験の確実性を保証するため該欠損を覆うようにテフロン（登録商標。ｅｘｐａｎｄｅｄ−ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ；  ｅ−ＰＴＦＥ）膜にて被覆し、更に骨ピンで固定した。対照群用の歯科用材料はｅ−ＰＴＦＥ膜のみとした（該欠損内は空所のままである）。
【００３２】
試験結果
両群とも術後４週目で、組織学的観察と組織計測評価を行った。対照群では骨欠損の中央部に孤立性に形成されるセメント質がほとんど見られなかったのに対し、試験群でははるかに多くの孤立性セメント質の形成（Ｐ＜０．０００１）が観察された。また、すべての症例でコラーゲンシートは分解され再生組織に置換されていた。これらの所見は、播種細胞がコラーゲンシートを足場として歯根表面上でセメント芽細胞に分化し、新生セメント質を形成したことを示している。
【００３３】
試験例３（コラーゲンゲル層の徐放効果）
前記の操作Ｂに従って作製したコラーゲンゲル層（その中にベクソン・ディッキンソン社製キャリブライトビーズ（商品名）を該コラーゲンゲル層１ｍｌ当り１０，０００個含有）をＰＢＳ中に緩やかな撹拌下に留置し、所定の経過時間毎に該基層中ビーズの残存率を調べた。本発明の歯科用材料の該ゲル層は、２４時間経過後においても８０％以上の残存率を示したのに対し、対照（前記のコラーゲンシートを使用）は５時間経過時点ですでに８０％以下の残存率であった。
試験１の結果と本試験の結果より、コラーゲンゲル層は少なくともコラーゲンシートと同等以上の徐放効果を持っていることがわかった。
【００３４】
本発明の歯科用材料として動物実験に供されたものは、ゼラチン小球（その中にｂＦＧＦを含有）の集合体をコラーゲンシートにて挟み込んだ態様のもの及びコラーゲンシート中に自家歯根膜由来細胞を含有せしめた態様のものだけであるが、試験３の結果より徐放担体としてのコラーゲンゲル層を組み込んだ態様（外側：コラーゲンシート、創面側：コラーゲンゲル層）のものもまた同様に採用可能であることが示唆される。また、試験１及び試験２の結果より、自己組織再生支援物質としてｂＦＧＦと自家歯根膜由来細胞を併用することの可能性も示唆される。この併用は、歯周病の処置の結果として露出した歯根部に歯根膜線維の受け手となる新生セメント質を誘導（歯槽骨の再建ができたとしても歯根膜とセメント質が再生しない限り歯の機能再建が完了しないのでその意義は大きい）することができ、更に徐々に放出されるｂＦＧＦの持続的な作用により播種細胞（歯周組織幹細胞も含むと考えられる）の増殖活性が増強されるし、同時に生体内の歯周組織幹細胞も活性化され支持体としてのコラーゲンシート内に遊走してくるとともに、血管も誘導されるので組織再生に動員された細胞群へ常時豊富な血液供給がなされるのでその効用はきわめて大きい。
【００３５】
【発明の効果】
上記の通り、本発明の歯科用材料によれば、口腔という限られた空間内で組織再生のための空間を所定期間保持し得、組織再生後には生体内で分解され、そして必要な増殖因子や成長分化因子等を適度なタイミングで創面に供給し得る又は所要細胞の成長に資する適当な支持体を提供することができる。
また、本発明の歯科用材料は、簡単な操作にて作製可能であり、また自己組織再生支援物質の媒体中への導入操作以降には高温雰囲気での操作が含まれていないので、該媒体中に含有せしめられる自己組織再生支援物質として熱や化学物質に弱いものでもその活性や生存率を低下させることなく使用することができる。更に、本発明の歯科用材料自身（コラーゲン、ゼラチン）、長い臨床実績のある生体材料として認知されており、安全性も高い。