(57)【要約】【課題】ＬＬＰＬ遺伝子およびその遺伝子産物の新規用途の提供。【効果】本発明のＬＬＰＬを用いるスクリーニング方法によれば、ＬＬＰＬ欠損に起因する各種疾病の予防および／または治療剤を効率良くスクリーニングすることができる。また、本発明のＬＬＰＬ発現不全非ヒト動物は、ＬＬＰＬにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、ＬＬＰＬ欠損に起因する疾病のモデルとなり得る。したがって、このモデルによれば、ＬＬＰＬ欠損に起因する各種症状、例えばアポトーシスに起因する疾病の予防および／または治療剤のスクリーニングや、ＬＬＰＬ関連疾患の原因究明および治療法の検討に有用である。さらに、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物は、アポトーシスに起因する疾病の予防および／または治療剤として有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする、当該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様リゾホスホリパーゼ（ＬＬＰＬ）活性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を用いる、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＬＬＰＬ活性を変化させる化合物またはその塩がアポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩である請求項１または請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有することを特徴とする、当該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様リゾホスホリパーゼ（ＬＬＰＬ）活性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項５】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を含有してなる、請求項４記載のスクリーニング用キット。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法または請求項４もしくは５記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のＬＬＰＬ活性を変化させる化合物またはその塩。
【請求項７】
請求項６記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項８】
アポトーシス誘導調節剤である請求項７記載の医薬。
【請求項９】
抗癌剤である請求項７記載の医薬。
【請求項１０】
神経変性疾患予防・治療剤である請求項７記載の医薬。
【請求項１１】
配列番号：２で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１２】
配列番号：２で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたはその一部を含有することを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１３】
請求項１１記載のスクリーニング方法または請求項１２記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の発現量を変化させる化合物またはその塩。
【請求項１４】
請求項１３記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１５】
アポトーシス誘導調節剤である請求項１４記載の医薬。
【請求項１６】
抗癌剤である請求項１４記載の医薬。
【請求項１７】
神経変性疾患予防・治療剤である請求項１４記載の医薬。
【請求項１８】
哺乳動物に対して、請求項６または請求項１３記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とするアポトーシス誘導調節方法。
【請求項１９】
哺乳動物に対して、請求項６または請求項１３記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の予防および／または治療方法。
【請求項２０】
アポトーシス誘導調節剤を製造するための請求項６または請求項１３記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項２１】
抗癌剤を製造するための請求項６または請求項１３記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項２２】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする、当該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様リゾホスホリパーゼ（ＬＬＰＬ）活性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２３】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を用いる、請求項２２記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
ＬＬＰＬ活性を変化させる化合物またはその塩がアポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩である請求項２２または請求項２３記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有することを特徴とする、当該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様リゾホスホリパーゼ（ＬＬＰＬ）活性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項２６】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を含有してなる、請求項２５記載のスクリーニング用キット。
【請求項２７】
請求項２２〜２４のいずれかに記載のスクリーニング方法または請求項２５もしくは２６記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のＬＬＰＬ活性を変化させる化合物またはその塩。
【請求項２８】
請求項２７記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項２９】
アポトーシス誘導調節剤である請求項２８記載の医薬。
【請求項３０】
抗癌剤である請求項２８記載の医薬。
【請求項３１】
神経変性疾患予防・治療剤である請求項２８記載の医薬。
【請求項３２】
配列番号：９で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴とする、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項３３】
配列番号：９で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたはその一部を含有することを特徴とする、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項３４】
請求項３２記載のスクリーニング方法または請求項３３記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の発現量を変化させる化合物またはその塩。
【請求項３５】
請求項３４記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項３６】
アポトーシス誘導調節剤である請求項３５記載の医薬。
【請求項３７】
抗癌剤である請求項３５記載の医薬。
【請求項３８】
神経変性疾患予防・治療剤である請求項３５記載の医薬。
【請求項３９】
哺乳動物に対して、請求項２７または請求項３４記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とするアポトーシス誘導調節方法。
【請求項４０】
哺乳動物に対して、請求項２７または請求項３４記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の予防および／または治療方法。
【請求項４１】
アポトーシス誘導調節剤を製造するための請求項２７または請求項３４記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項４２】
抗癌剤を製造するための請求項２７または請求項３４記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項４３】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞を用いることを特徴とする、アポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項４４】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与することを特徴とする、請求項４３記載のスクリーニング方法。
【請求項４５】
請求項４３記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、アポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩。
【請求項４６】
請求項４３記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、アポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項４７】
アポトーシス誘導調節剤である請求項４６記載の医薬。
【請求項４８】
抗癌剤である請求項４６記載の医薬。
【請求項４９】
神経変性疾患予防・治療剤である請求項４６記載の医薬。
【請求項５０】
哺乳動物に対して、請求項４５記載のアポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とするアポトーシス誘導調節方法。
【請求項５１】
哺乳動物に対して、請求項４５記載のアポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の予防および／または治療方法。
【請求項５２】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなるアポトーシス誘導阻害剤。
【請求項５３】
哺乳動物に対して、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の有効量を投与することを特徴とするアポトーシス誘導阻害方法。
【請求項５４】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有してなるアポトーシス誘導阻害剤。
【請求項５５】
哺乳動物に対して、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの有効量を投与することを特徴とするアポトーシス誘導阻害方法。
【請求項５６】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなるアポトーシス誘導促進剤。
【請求項５７】
抗癌剤である請求項５６記載の剤。
【請求項５８】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる癌の診断剤。
【請求項５９】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする癌の診断方法。
【請求項６０】
配列番号：９で表されるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス・ポリヌクレオチドを含有してなるアポトーシス誘導促進剤。
【請求項６１】
抗癌剤である請求項６０記載の剤。
【請求項６２】
配列番号：９で表されるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス・ポリヌクレオチドを含有してなる癌の診断剤。
【請求項６３】
配列番号：９で表されるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス・ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする癌の診断方法。
【請求項６４】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡを含有してなるアポトーシス誘導促進剤。
【請求項６５】
抗癌剤である請求項６４記載の剤。
【請求項６６】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡを含有してなる癌の診断剤。
【請求項６７】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡを用いることを特徴とする癌の診断方法。
【請求項６８】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなる酸性ホスホリパーゼＡ２（ａＰＬＡ２）増強剤。
【請求項６９】
哺乳動物に対して、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の有効量を投与することを特徴とする酸性ホスホリパーゼＡ２（ａＰＬＡ２）増強方法。
【請求項７０】
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のＬＬＰＬ活性または発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス誘導調節剤。
【請求項７１】
哺乳動物に対して、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のＬＬＰＬ活性または発現量を変化させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とするアポトーシス誘導調節方法。
【請求項７２】
アポトーシス誘導調節剤製造のための配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のＬＬＰＬ活性または発現量を変化させる化合物またはその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様リゾホスホリパーゼ（ＬＣＡＴ−ｌｉｋｅ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ、以下「ＬＬＰＬ」と略すことがある）の活性を変化させる化合物のスクリーニング方法、そのスクリーニング方法によって得られうる化合物またはその塩、その化合物または塩を含有する医薬、ＬＬＰＬ遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物を用いるアポトーシス誘導調節薬のスクリーニング方法などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
リポタンパク代謝にはアポタンパク［Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  Ｒ．  ＆  Ａ．，  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  Ｎ．  （２０００）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２０９，  １３１−１４４］、酵素、レセプター［Ｈｉｌｔｕｎｅｎ，  Ｔ．，  Ｐ．  ＆  Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ，  Ｓ．  （１９９８）  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  １３７，  Ｓ８１−８８］、脂質転送タンパク質［Ｙａｍａｓｈｉｔａ，  Ｓ．  ら，  （２０００）  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  １５２，  ２７１−２８５、  Ｏｒａｍ，  Ｊ．，  Ｆ．  ＆  Ｖａｕｇｈａｎ，  Ａ．，  Ｍ．  （２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｌｉｐｉｄｏｌ．，  １１，  ２５３−２６０］など多くの分子が関係しているが、これらのタンパク質の遺伝子型の違いや食事の違いがもたらす個人差が動脈硬化症と密接に関連している。その中の１つである高比重リポタンパク（ＨＤＬ）コレステロールは、冠動脈疾患の独立した負の危険因子として多くの疫学的研究により認められている［Ｂａｒｔｅｒ，  Ｐ．，  Ｊ．  ＆  Ｒｙｅ，  Ｋ．，  Ａ．  （１９９６）  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ，  １２１，  １−１２］。ＨＤＬは末梢組織の過剰なコレステロールを引き抜いて肝臓へ転送する、いわゆるコレステロール逆転送系において主要な役割を果たしている［Ｔａｌｌ，  Ａ．ら、  （２０００）  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ２０，  １１８５−１１８８、Ｓａｎｔａｍａｒｉｎａ−Ｆｏｊｏ，  Ｓ．ら、（２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｌｉｐｉｄｏｌ．，  １１，  ２６７−７５］。このコレステロール逆転送系の律速酵素であるレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）は、主として肝臓で産生され［Ｗａｒｄｅｎ，  Ｃ．ら、（１９８９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６４，  ２１５７３−２１５８１］、血液中のＨＤＬ粒子中に存在している［Ｋｕｉｖｅｎｈｏｖｅｎ，  Ｊ．ら、（１９９７）  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，  ３８，  １９１−２０５］。ＰｒｅβＨＤＬによって引き抜かれた末梢細胞の遊離コレステロールは、ＬＣＡＴによってエステル化されて、細胞へのコレステロール流入が抑制されるために、結果的にコレステロール引き抜き促進作用を示し、抗動脈硬化的に働いていると考えられている［Ｃｚａｒｎｅｃｋａ，  Ｈ．  ＆  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｓ．  （１９９５）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３４，  ４３８５−９２］。このヒトＬＣＡＴに対してアミノ酸レベルで４７％の相同性を有する酵素ＬＬＰＬが、ヒトマクロファージ様細胞のｃＤＮＡライブラリーを用いたサブトラクションＰＣＲ法で発見され、その全アミノ酸配列もｃＤＮＡの解析から明らかにされている［Ｔａｎｉｙａｍａら；  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，２５７：５０−５６（１９９９）（非特許文献１）］。
ヒトとマウスにおいては、（１）ヒトではマクロファージ様細胞で、マウスでは腹腔マクロファージでＬＬＰＬが分泌されること、（２）アミノ酸配列で８８％の相同性があること、（３）リパーゼモチーフは同じＡＨＳＭＧ配列であること（特開平１１−２６９１９９号（特許文献１））、（４）個体全体におけるＬＬＰＬ遺伝子の発現特異性が末梢組織にあることなど類似する点が多い。さらに、ＡｐｏＥ欠損マウスの動脈硬化病変部でのＬＬＰＬ遺伝子の発現が確認されているので、動脈硬化病変や血漿脂質プロファイルに対する作用が考えられた。そこで、ＬＬＰＬの生体内における本来の機能および作用機序について解明する目的で、ＬＬＰＬを全く産生しないようなＬＬＰＬ遺伝子発現不全動物のモデルを作製し、野生型と比較することでその解析を行った。その結果、ＬＬＰＬ／ＡｐｏＥ二重欠損マウスでは、ＡｐｏＥ欠損マウスと比べて動脈硬化病変部の進展が見られたことから、ＬＬＰＬに動脈硬化抑制作用があることが分かった。しかしながら、血中のコレステロールやトリグリセライドなどの脂質組成には大きな変化は見られず、このＬＬＰＬの動脈硬化抑制活性はこれらの脂質代謝に対する作用以外の作用で主に発現していると考えられる。
近年、酸化ＬＤＬの特異的抗体を用いた血中酸化ＬＤＬの定量系の開発が行われ、心疾患のリスクが高い患者群での血中濃度が上昇し、さらに病変部位での酸化ＬＤＬ陽性マクロファージ細胞数が増加しており（Ｅｈａｒａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０３，  ｐｐ１９５５−１９６０，  ２００１（非特許文献２））、酸化ＬＤＬによるマクロファージの泡沫化を機序とした粥状動脈硬化病変形成が生体レベルで起きていることが強く示唆されてきた。酸化ＬＤＬはマクロファージ細胞を泡沫化させるだけではなく、血管内皮細胞、平滑筋細胞、マクロファージ細胞に対して、動脈硬化惹起性の作用を示すが、その１つとしてアポトーシスの誘導が考えられる。
最近では、動脈硬化とアポトーシスとの関連を述べた論文が多く見られる［Ｍａｒｔｉｎｅｔ，  Ｗ．  ＆  Ｋｏｃｋｘ，  Ｍ．  Ｍ．，（２００１）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｌｉｐｉｄｏｌ．，  １２，  ５３５−５４１（非特許文献３）、Ｃｏｌｌｅｓ，  Ｓ．  Ｍ．ら、（２００１）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ，  １１，  １３１−１３８（非特許文献４）、岡崎俊朗、（１９９９）  タンパク質  核酸  酵素、４４，  １０５２−１０５８（非特許文献５）］。例えば、アポトーシス誘導分子であるｐ５３の欠損マウスでは、ＡｐｏＥとの二重欠損マウスの結果として、細胞増殖による病巣の進展加速が報告されている［Ｇｕｅｖａｒａら、（１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，  ５，  ３３５−３３９（非特許文献６）］。また、病巣内のアポトーシスの分布を調べると、浸潤したマクロファージが多い領域でアポトーシスが比較的良く見られることから、プラーク内のアポトーシスは浸潤マクロファージと強く関連していることが示唆されている。この様に、酸化ＬＤＬや炎症性細胞がアポトーシスに関与し動脈硬化の進展を促進している可能性が考えられている。
【特許文献１】
特開平１１−２６９１９９号
【非特許文献１】
Ｔａｎｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．），２５７：５０−５６（１９９９）
【非特許文献２】
Ｅｈａｒａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０３，  ｐｐ１９５５−１９６０，  ２００１
【非特許文献３】
Ｍａｒｔｉｎｅｔ，  Ｗ．  ＆  Ｋｏｃｋｘ，  Ｍ．  Ｍ．，（２００１）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｌｉｐｉｄｏｌ．，  １２，  ５３５−５４１
【非特許文献４】
Ｃｏｌｌｅｓ，  Ｓ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ，  １１，  １３１−１３８
【非特許文献５】
岡崎俊朗、（１９９９）  タンパク質  核酸  酵素、４４，  １０５２−１０５８
【非特許文献６】
Ｇｕｅｖａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，  ５，  ３３５−３３９
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＬＬＰＬ−ノックアウトマウスは高脂血症を起こす遺伝子改変マウス、例えばアポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）−ノックアウトマウスとのダブルノックアウトマウスにおいて動脈硬化病変形成が進行することから、動脈硬化形成に対して防御的に働くことを見出している（特願２００１−１５２５２０号、特願２００１−３１１９７１号、特願２００２−１４５８７６号およびＰＣＴ／ＪＰ０２／０４８７６＝ＷＯ０２／１０２９９８）。このＬＬＰＬの抗動脈硬化作用をさらに深く調べることで、新たなＬＬＰＬの生理活性を発見することができる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意努力した結果、ＬＬＰＬに抗アポトーシス活性があることを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいて、ＬＬＰＬをターゲットとしたアポトーシス誘導調節作用を持つ薬剤は、動脈硬化予防および／または治療薬となる可能性に加えて、さらに、細胞保護作用やガン治療剤として有効であると考え、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明は、
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする、当該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様リゾホスホリパーゼ（ＬＬＰＬ）活性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２）配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を用いる、上記（１）記載のスクリーニング方法、
（３）ＬＬＰＬ活性を変化させる化合物またはその塩がアポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩である上記（１）または（２）記載のスクリーニング方法、
（４）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有することを特徴とする、当該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様リゾホスホリパーゼ（ＬＬＰＬ）活性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（５）配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を含有してなる、上記（４）記載のスクリーニング用キット、
（６）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法または上記（４）もしくは（５）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のＬＬＰＬ活性を変化させる化合物またはその塩、
（７）上記（６）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（８）アポトーシス誘導調節剤である上記（７）記載の医薬、
（９）抗癌剤である上記（７）記載の医薬、
（１０）神経変性疾患予防・治療剤である上記（７）記載の医薬、
（１１）配列番号：２で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１２）配列番号：２で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたはその一部を含有することを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１３）上記（１１）記載のスクリーニング方法または上記（１２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の発現量を変化させる化合物またはその塩、
（１４）上記（１３）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１５）アポトーシス誘導調節剤である上記（１４）記載の医薬、
（１６）抗癌剤である上記（１４）記載の医薬、
（１７）神経変性疾患予防・治療剤である上記（１４）記載の医薬、
（１８）哺乳動物に対して、上記（６）または（１３）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とするアポトーシス誘導調節方法、
（１９）哺乳動物に対して、上記（６）または（１３）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の予防および／または治療方法、
（２０）アポトーシス誘導調節剤を製造するための上記（６）または（１３）記載の化合物またはその塩の使用、
（２１）抗癌剤を製造するための上記（６）または（１３）記載の化合物またはその塩の使用、
（２２）配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする、当該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様リゾホスホリパーゼ（ＬＬＰＬ）活性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２３）配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を用いる、上記（２２）記載のスクリーニング方法、
（２４）ＬＬＰＬ活性を変化させる化合物またはその塩がアポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩である上記（２２）または（２３）記載のスクリーニング方法、
（２５）配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有することを特徴とする、当該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ様リゾホスホリパーゼ（ＬＬＰＬ）活性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２６）配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を含有してなる、上記（２５）記載のスクリーニング用キット、
（２７）上記（２２）〜（２４）のいずれかに記載のスクリーニング方法または上記（２５）もしくは（２６）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のＬＬＰＬ活性を変化させる化合物またはその塩、
（２８）上記（２７）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２９）アポトーシス誘導調節剤である上記（２８）記載の医薬、
（３０）抗癌剤である上記（２８）記載の医薬、
（３１）神経変性疾患予防・治療剤である上記（２８）記載の医薬、
（３２）配列番号：９で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴とする、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３３）配列番号：９で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたはその一部を含有することを特徴とする、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（３４）上記（３２）記載のスクリーニング方法または上記（３３）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の発現量を変化させる化合物またはその塩、
（３５）上記（３４）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（３６）アポトーシス誘導調節剤である上記（３５）記載の医薬、
（３７）抗癌剤である上記（３５）記載の医薬、
（３８）神経変性疾患予防・治療剤である上記（３５）記載の医薬、
（３９）哺乳動物に対して、上記（２７）または（３４）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とするアポトーシス誘導調節方法、
（４０）哺乳動物に対して、上記（２７）または（３４）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の予防および／または治療方法、
（４１）アポトーシス誘導調節剤を製造するための上記（２７）または（３４）記載の化合物またはその塩の使用、
（４２）抗癌剤を製造するための上記（２７）または（３４）記載の化合物またはその塩の使用、
（４３）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞を用いることを特徴とする、アポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（４４）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与することを特徴とする、上記（４３）記載のスクリーニング方法、
（４５）上記（４３）記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、アポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩、
（４６）上記（４３）記載のスクリーニング方法を用いて得られうる、アポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（４７）アポトーシス誘導調節剤である上記（４６）記載の医薬、
（４８）抗癌剤である上記（４６）記載の医薬、
（４９）神経変性疾患予防・治療剤である上記（４６）記載の医薬、
（５０）哺乳動物に対して、上記（４５）記載のアポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とするアポトーシス誘導調節方法、
（５１）哺乳動物に対して、上記（４５）記載のアポトーシス誘導調節作用を有する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の予防および／または治療方法、
（５２）配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなるアポトーシス誘導阻害剤、
（５３）哺乳動物に対して、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の有効量を投与することを特徴とするアポトーシス誘導阻害方法、
（５４）配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ含有してなるアポトーシス誘導阻害剤、
（５５）哺乳動物に対して、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの有効量を投与することを特徴とするアポトーシス誘導阻害方法、
（５６）配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなるアポトーシス誘導促進剤、
（５７）抗癌剤である上記（５６）記載の剤、
（５８）配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる癌の診断剤、
（５９）配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする癌の診断方法、
（６０）配列番号：９で表されるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス・ポリヌクレオチドを含有してなるアポトーシス誘導促進剤、
（６１）抗癌剤である上記（６０）記載の剤、
（６２）配列番号：９で表されるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス・ポリヌクレオチドを含有してなる癌の診断剤、
（６３）配列番号：９で表されるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス・ポリヌクレオチドを用いることを特徴とする癌の診断方法、
（６４）配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡを含有してなるアポトーシス誘導促進剤、
（６５）抗癌剤である上記（６４）記載の剤、
（６６）配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡを含有してなる癌の診断剤、
（６７）配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡを用いることを特徴とする癌の診断方法、
（６８）配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなる酸性ホスホリパーゼＡ２（ａＰＬＡ２）増強剤〔ａＰＬＡ２活性増強剤〕、
（６９）哺乳動物に対して、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩の有効量を投与することを特徴とする酸性ホスホリパーゼＡ２（ａＰＬＡ２）増強方法、
（７０）配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のＬＬＰＬ活性または発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなるアポトーシス誘導調節剤、
（７１）哺乳動物に対して、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のＬＬＰＬ活性または発現量を変化させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とするアポトーシス誘導調節方法、
（７２）アポトーシス誘導調節剤製造のための配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有してなるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩のＬＬＰＬ活性または発現量を変化させる化合物またはその塩の使用などを提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
（本発明で用いられるタンパク質）
本発明で用いられるタンパク質は、配列番号：１または配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、ＬＬＰＬと略記する）もしくはその部分ペプチドまたはその塩である。ヒトＬＬＰＬのアミノ酸配列は公知であり、例えば、特開平１１−２６９１９９号の配列番号：１で表されるアミノ酸配列などが挙げられる。また、マウスＬＬＰＬのアミノ酸配列は公知であり、例えば、特開平１１−２６９１９９号の配列番号：８で表されるアミノ酸配列などが挙げられ、ＧｅｎＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＢ０１７４９４として登録されている（文献：Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２５７  （１），  ５０−５６  （１９９９））。今回、初めてＬＬＰＬがアポトーシスに関与していることが解明された。
本明細書における「ＬＬＰＬ活性」とは、（ｉ）リゾホスフォリパーゼ活性、（ｉｉ）ＰＬＡ２活性、（ｉｉｉ）アシル転移活性、およびこれらに基づくアポトーシス抑制活性や細胞の保護作用の活性をいう。また、本明細書における「アポトーシス誘導調節」とは、アポトーシスの直接的な調節（促進または阻害）あるいはアポトーシスの間接的な調節（促進または阻害）の何れであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞〔例えば、網膜細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、白血球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞（例、乳癌細胞株（ＧＩ−１０１）、結腸癌細胞株（ＣＸ−１、ＧＩ−１１２）、肺癌細胞株（ＬＸ−１、ＧＩ−１１７）、卵巣癌細胞株（ＧＩ−１０２）、前立腺癌細胞株など）など〕、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
【０００７】
本明細書において、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、比較するアミノ酸配列に対して、例えば、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。具体的には、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質として、例えば、特開平１１−２６９１９９号のマウス由来のタンパク質などが挙げられ、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列があげられる。
また、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。具体的には、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質として、例えば、特開平１１−２６９１９９号のマウス由来のタンパク質などが挙げられ、配列番号：１０、１２から１５で表されるアミノ酸配列があげられる。
実質的に同質の活性としては、例えば、リゾホスホリパーゼ活性、アポトーシス阻害活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リゾホスホリパーゼ活性、アポトーシス阻害活性などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リゾホスホリパーゼ活性、アポトーシス阻害活性などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
【０００８】
また、本発明で用いられるタンパク質としては、（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（４）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。
【０００９】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有する本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質があげられる。
【００１０】
（部分ペプチド）
本発明で用いられる部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）としては、上記した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、上記タンパク質と実質的に同質の活性を有するものが好ましい。
部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
【００１１】
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、上記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１２】
（タンパク質またはその塩の製造法）
本発明で用いられるタンパク質またはその塩は、上記したヒトやその他の哺乳動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載する本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１３】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられるタンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。
なお、公知の合成方法、縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（１）〜（７）に記載された方法が挙げられる。
（１）ＷＯ  ００／１４２２７号公報（国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ９９／０４７６６）（特に、その明細書第１３頁第２７行〜第１７頁第１７行参照）
（２）ＥＰ１１１１０４７Ａ２号公報（特に、段落［００３９］〜［００５３］参照）
（３）Ｍ．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  および  Ｍ．Ａ．  Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド  シンセシス  （Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（４）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ  ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（５）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（６）矢島治明  および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５（１９７７年）
（７）矢島治明監修、続医薬品の開発  第１４巻  ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００１４】
（ポリヌクレオチド）
本発明で用いられるポリヌクレオチドとしては、上記したタンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７記載の公知の方法またはそれに準じた方法により、本発明で用いられるタンパク質のｍＲＮＡを定量することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞または組織より全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２または配列番号：９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：１または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性（例、アポトーシス阻害活性など）を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００１５】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
「ハイストリンジェントな条件」とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００１６】
本発明で用いられる「タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチド」とは、下記の本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、タンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、アミノ酸配列が決定されたタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいはクローン化されたＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計、合成することができる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、本発明で用いられるタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明で用いられるタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明で用いられるタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明で用いられるタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明で用いられるタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、本発明で用いられるタンパク質遺伝子の生体内および生体外での発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。本発明で用いられるタンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、本発明で用いられるタンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００１７】
（アンチセンス・ポリヌクレオチド）
目的核酸と対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質、核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００１８】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は、（１）細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、（２）アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、（３）目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、（４）もし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにするなどの方針で好ましく設計されうる。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば  Ｊ．  Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，  Ｖｏｌ．  ８，  ｐｐ．２４７，  １９９２；  Ｖｏｌ．  ８，  ｐｐ．３９５，  １９９２；  Ｓ．  Ｔ．  Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３  などに開示がある。
【００１９】
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療に適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００２０】
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明で用いられるタンパク質の生体内や生体外の遺伝子発現系あるいは翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、生体内におけるＬＬＰＬ又はＬＬＰＬ遺伝子の機能を抑制することができるので、例えば、ＬＬＰＬの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。さらに、本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、組織や細胞におけるＬＬＰＬをコードするＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできるので、ＬＬＰＬの機能不全に関連する疾患の診断に用いることができる。
【００２１】
（部分ペプチドをコードするＤＮＡ）
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞または組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
（１）配列番号：２または配列番号：９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、
（２）配列番号：２または配列番号：９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：１または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質ペプチドと実質的に同質の活性（例、アポトーシス阻害活性など）を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２または配列番号：９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：９で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２２】
（ＤＮＡのクローニング）
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチド（以下、本発明で用いられるタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングのための選別手段としては、（１）本発明で用いられるペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅、（２）本発明で用いられるタンパク質の一部あるいは全領域をコードする、放射性物質または酵素等で標識したＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡと適当なベクターに組み込んだ本発明で用いられるペプチドをコードするＤＮＡとのハイブリダイゼーションが挙げられる。ハイブリダイゼーションの方法は、前記と同様の方法に従って行なうことができる。
【００２３】
ＤＮＡの塩基配列の置換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２４】
（発現ベクター）
本発明で用いられるタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２５】
発現ベクターには、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明で用いられるタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
【００２６】
（形質転換体）
このようにして構築された本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕，ＤＨ５α〔Ｉｎｏｕｅ，  Ｈ．，  Ｎｏｊｉｍａ，Ｈ．ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，  Ｇｅｎｅ，  ９６，  ２３−２８（１９９０）〕，ＤＨ１０Ｂ〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），８７巻，４６４５−４６４９（１９９０）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。
【００２７】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ  細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，  Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ），１３，  ２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００２８】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，  ４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
各種宿主について適当な培地、培養条件などについては公知である（特に、ＷＯ  ００／１４２２７号公報第２４頁第２４行〜第２６頁第８行、ＥＰ１１１１０４７Ａ２号公報段落［００９０］〜［００９６］参照）
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明の本発明で用いられるタンパク質を生成せしめることができる。
【００２９】
（形質転換体からのタンパク質の分離精製など）
上記培養物から本発明で用いるタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明で用いるタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁する。超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明で用いられるタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に本発明で用いられるタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明で用いられるタンパク質の精製は、公知の分離精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３０】
このようにして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
このようにして生成する本発明で用いられるタンパク質またはその塩の活性は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００３１】
（抗体）
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明で用いられるタンパク質等と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質等を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００３２】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明で用いられるタンパク質等は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された哺乳動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化した本発明で用いられるタンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００３３】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、本発明で用いられるタンパク質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した本発明で用いられるタンパク質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３４】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００３５】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（本発明で用いられるタンパク質等の抗原）とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明で用いられるタンパク質等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、哺乳動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００３６】
以下、（１）ＬＬＰＬまたはその部分ペプチド（その塩も含まれる）のＬＬＰＬ活性を変化させる化合物のスクリーニング方法、（２）ＬＬＰＬの機能不全または発現過多に関連する疾患の予防および／または治療剤、（３）ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはそれに対するアンチセンスＤＮＡを用いるｍＲＮＡの定量方法、診断剤および診断方法、（４）ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法、（５）ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤、（６）ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドに対する抗体を用いるタンパク質などの定量、該抗体を含有する診断薬および診断方法、（７）ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドに対する抗体を含有する医薬、（８）トランスジェニック動物、（９）ノックアウト動物などについて具体的に説明する。
【００３７】
（１）ＬＬＰＬ活性を変化させる化合物のスクリーニング方法
ヒトＬＬＰＬは遊離コレステロールをエステル化するＬＣＡＴ活性を持たないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでリゾホスファチジルコリンを基質として、遊離脂肪酸とグリセロホスフォリルコリンに分解するリゾホスホリパーゼ活性を示す〔Ｔａｎｉｙａｍａら；バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．），２５７：５０−５６（１９９９）〕。
炎症性サイトカインの過剰生産はまた、標的細胞上のサイトカイン特異的なレセプターに結合することによりアポトーシスを誘導する。このアポトーシスが原因となって自己免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患等の各種疾患が発症する。ＬＬＰＬ遺伝子産物は、このようなアポトーシス誘導を含むアポトーシス誘導やアポトーシスの阻害（抑制）活性を有する。
したがってＬＬＰＬは、ＬＬＰＬ活性（例えば、アポトーシス阻害活性）を変化（例えば、促進または阻害）させる化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用であり、そのような化合物は、例えばアポトーシス誘導調節剤（アポトーシス誘導促進剤またはアポトーシス誘導阻害剤）として有用であると考えられる。
本明細書における「アポトーシス誘導調節」とは、アポトーシスの直接的な調節（促進または阻害）あるいはアポトーシスの間接的な調節（促進または阻害）の何れであってもよい。
以下、本発明のスクリーニング方法について説明する。
【００３８】
本発明は、ＬＬＰＬ活性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、本発明は、
（ｉ）本発明で用いられるタンパク質を産生する能力を有する細胞のＬＬＰＬ活性と（ｉｉ）本発明で用いられるタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物のＬＬＰＬ活性の比較を行なうことを特徴とするＬＬＰＬ活性促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
【００３９】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明で用いるタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、ＬＬＰＬ活性を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明で用いるタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明で用いられるタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
【００４０】
例えば、上記（ｉｉ）の場合におけるＬＬＰＬ活性（例、リゾホスホリパーゼ活性、アポトーシス阻害活性など）を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明で用いられるタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
また、例えば、上記（ｉｉ）の場合におけるＬＬＰＬ活性を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害（または抑制）する試験化合物を本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
また、ＬＬＰＬ遺伝子のプロモーター下流に分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの遺伝子を挿入し、上記の各種細胞に発現させ、該細胞に上記試験化合物を接触させた場合におけるＬＬＰＬ活性を賦活化または阻害する化合物またはその塩を探索することによってＬＬＰＬの発現を促進または抑制（すなわち、本発明で用いられるタンパク質の活性を促進または阻害）する化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。
【００４１】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、ＬＬＰＬ活性（例、リゾホスホリパーゼ活性、アポトーシス阻害活性など）を促進または阻害する化合物またはその塩である。
具体的には、ＬＬＰＬの活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、アポトーシス誘導調節剤（特に、アポトーシス誘導阻害剤）、アポトーシスに起因する疾病（例、アルツハイマー病などの神経変性疾患、動脈硬化症、高脂血症など）に対する予防および／または治療剤などの医薬として有用である。
ＬＬＰＬの活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、アポトーシス誘導調節剤（特に、アポトーシス誘導促進剤）やアポトーシスに起因する疾病（例、癌など）に対する予防および／または治療剤などの医薬、抗がん剤、なかでも、薬剤感受性増強剤として有用である。
【００４３】
（２）ＬＬＰＬの機能不全または発現過多に関連する疾患の予防および／または治療剤
（１）ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドまたは（２）ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを、ＬＬＰＬの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、生体内においてＬＬＰＬが減少しているために生理作用が期待できない（ＬＬＰＬの欠乏症）患者がいる場合に、（１）ＬＬＰＬを該患者に投与し該タンパク質の量を補充したり、（２ａ）ＬＬＰＬをコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（２ｂ）対象となる細胞にＬＬＰＬをコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるＬＬＰＬの量を増加させ、生理作用を充分に発揮させることができる。すなわち、ＬＬＰＬをコードするＤＮＡは、ＬＬＰＬの機能不全に関連する疾患（例、アルツハイマー病などの神経変性疾患、動脈硬化症、高脂血症など）の予防および／または治療剤として有用である。
ＬＬＰＬまたはＬＬＰＬをコードするＤＮＡは、例えば、アポトーシスに起因する疾病（例、癌）などの予防および／または治療に有用である。
一方、ＬＬＰＬ  アンチセンスＤＮＡは、例えば、アポトーシスに起因する疾病（例、癌）などの予防および／または治療に有用である。
【００４４】
（３）ＬＬＰＬをコードするＤＮＡまたはそれに対するアンチセンスＤＮＡを用いるｍＲＮＡの定量方法、診断剤および診断方法
ＬＬＰＬもしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＬＬＰＬ・ＤＮＡともいう）またはそれに対するポリヌクレオチド（ＬＬＰＬ・アンチセンスＤＮＡともいう）は、プローブとして使用することにより、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）における本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの定量あるいは異常（遺伝子異常）の検出をすることができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤、あるいは関連遺伝子が関与する疾患（例えば、癌など）の診断剤として有用である。
ＬＬＰＬ・ＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりＬＬＰＬの発現低下が検出された場合は、例えば、ＬＬＰＬの機能不全に関連する疾患（例、アルツハイマー病などの神経変性疾患、動脈硬化症、高脂血症など）である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションによりＬＬＰＬの発現過多が検出された場合は、例えば、ＬＬＰＬの過剰発現に起因する疾患（例えば、癌など）である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００４５】
（４）ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法
ＬＬＰＬ・ＤＮＡは、プローブとして用いることにより、ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物の（１）血液、（２）特定の臓器、（３）臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ｉｉ）形質転換体等に含まれるＬＬＰＬまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量を測定することによる、ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４６】
ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肺、大腸など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれるＬＬＰＬまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、公知の手段によりノザンブロットを行うことにより解析することもできる。
（ｉｉ）ＬＬＰＬもしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれるＬＬＰＬまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
【００４７】
ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞に含まれるＬＬＰＬまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができ、
（ｉｉ）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれるＬＬＰＬまたはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができる。
【００４８】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドの発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドの発現量を増加させることにより、本発明で用いられるタンパク質を介する細胞刺激活性（例えば、アポトーシス阻害活性など）を増強させる化合物、（ロ）ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドの発現量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、ＬＬＰＬ等の生理活性を増強するための医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、ＬＬＰＬ等の生理活性を減少させるための医薬として有用である。
【００４９】
（５）ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤
ＬＬＰＬは上記のとおり、例えば、中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物は、ＬＬＰＬの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。
より具体的には、ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドの発現量を減少する化合物は、例えば癌などの予防および／または治療剤として有用である。
該化合物をＬＬＰＬの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
【００５０】
（６）本発明の抗体を用いるタンパク質などの定量、本発明の抗体を含有する診断薬およびそれを用いる診断方法
本発明の抗体は、ＬＬＰＬ等を特異的に認識することができるので、被検液中のＬＬＰＬ等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどによる定量などに使用することができる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要としない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＬＬＰＬまたはその塩の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エンジモノジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）Ｖｏｌ．  ７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、  同書  Ｖｏｌ．  ７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、  同書  Ｖｏｌ．  ７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、  同書  Ｖｏｌ．  ８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、  同書  Ｖｏｌ．  ９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、  同書  Ｖｏｌ．  １２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）、ＷＯ  ００／１４２２７号公報第３９頁第２５行〜第４２頁第８行、ＥＰ１１１１０４７Ａ２号公報段落［０１１５］第１９頁第３５行〜第２０頁第４７行など参照」。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、ＬＬＰＬまたはその塩を感度良く定量することができる。さらに、本発明の抗体を用いる、生体内でのＬＬＰＬまたその塩の定量法を利用することにより、ＬＬＰＬの機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。
例えば、ＬＬＰＬの濃度低下が検出された場合は、例えば、ＬＬＰＬの機能不全に関連する疾患（例、アルツハイマー病などの神経変性疾患、動脈硬化症、高脂血症など）である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ＬＬＰＬの濃度増加が検出された場合は、例えば、ＬＬＰＬの過剰発現に起因する疾患（例えば、癌など）である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するＬＬＰＬ等を特異的に検出するために使用することができる。また、ＬＬＰＬ等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のＬＬＰＬ等の検出、被検細胞内におけるＬＬＰＬの挙動の分析などのために使用することができる。
【００５１】
（７）ＬＬＰＬ、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体を含有する医薬
ＬＬＰＬもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の、本発明で用いられるタンパク質などに対する中和活性とは、該タンパク質の関与する生理活性を不活性化する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、該タンパク質の関与する、例えば該タンパク質を介する細胞刺激活性（例えば、アポトーシス阻害活性など）を不活性化することができる。したがって、このような抗体は、該タンパク質の過剰発現などに起因する疾患、例えばアポトーシスに起因する疾患（例、癌）の予防および／または治療に用いることができる。
【００５２】
（８）トランスジェニック動物
ＬＬＰＬ・ＤＮＡを用いて、ＬＬＰＬ等を発現するトランスジェニック動物を作出することができる。動物としては、非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）など（以下、動物と略記する場合がある）が挙げられるが、特にマウス、ウサギなどが好適である。
ＬＬＰＬ・ＤＮＡを対象動物に導入するにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、ウサギ由来のＬＬＰＬ・ＤＮＡを導入する場合、これと相同性が高い動物由来のＬＬＰＬ・ＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、例えば、ウサギ受精卵へマイクロインジェクションすることによってＬＬＰＬ等を高産生するＤＮＡ導入動物を作出できる。このプロモーターとしては、例えば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネイン等のユビキアスな発現プロモーターも使用しうるが、好ましくは脳で特異的に発現するＮＧＦ遺伝子プロモーターやエノラーゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。
受精卵細胞段階におけるＬＬＰＬ・ＤＮＡの導入は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てにＬＬＰＬ・ＤＮＡが存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞においてＬＬＰＬ等が存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てにＬＬＰＬ等を有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てにＬＬＰＬ等を有する。
ＬＬＰＬ・ＤＮＡ導入動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保有する雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
ＬＬＰＬ・ＤＮＡが導入された動物は、ＬＬＰＬ等が高発現させられているので、ＬＬＰＬ等に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用の動物などとして有用である。
ＬＬＰＬ・ＤＮＡ導入動物を、組織培養のための細胞源として使用することもできる。例えば、ＬＬＰＬ・ＤＮＡ導入マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、あるいは遺伝子により発現されたＬＬＰＬが存在する組織を分析することにより、ＬＬＰＬ等について分析することができる。ＬＬＰＬ等を有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、例えば、脳や末梢組織由来のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。また、その細胞を用いることにより、例えば、各種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能である。また、高発現細胞株があれば、そこから、ＬＬＰＬ等を単離精製することも可能である。
【００５３】
（９）ノックアウト動物
本発明は、ＬＬＰＬ・ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞およびＬＬＰＬ・ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）ＬＬＰＬ・ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された上記（１）記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である上記（１）記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである上記（４）記載の胚幹細胞、
（６）ＬＬＰＬ・ＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子がＬＬＰＬ・ＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである上記（８）記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）上記（７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とするＬＬＰＬ・ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００５４】
（ＬＬＰＬ遺伝子発現不活性哺乳動物ＥＳ細胞）
ＬＬＰＬ遺伝子が不活性化された哺乳動物ＥＳ細胞とは、哺乳動物ＥＳ細胞が有するＬＬＰＬ遺伝子に人為的に変異を加えることにより、遺伝子の発現能を抑制するか、もしくは該遺伝子がコードしているＬＬＰＬの活性を実質的に喪失させることにより、遺伝子が実質的にＬＬＰＬの発現能を有さない不活性化された（以下、本発明のノックアウト遺伝子と称することがある）哺乳動物のＥＳ細胞をいう。
本明細書中、ＥＳ細胞の材料とする哺乳動物としては、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。
また、本明細書中、非ヒト動物としては、ＬＬＰＬ遺伝子を有するヒト以外の動物ならば、いかなる動物でもよいが、非ヒト哺乳動物が好ましい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。非ヒト哺乳動物のなかでも、病態動物モデル系の作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など（なかでも好ましくは、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統など、交雑系として、ＢＤＦ１系統またはＩＣＲ系統など））またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが特に好ましい。
【００５５】
ＬＬＰＬ遺伝子に人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該遺伝子配列の一部又は全部の削除、もしくは他遺伝子の挿入または置換があげられる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらすか、プロモーターあるいはエクソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウト遺伝子を作製することができる。
ＬＬＰＬ遺伝子が不活性化された哺乳動物（好ましくは、非ヒト哺乳動物）ＥＳ細胞（以下、ＬＬＰＬ遺伝子不活性化ＥＳ細胞またはノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子またはゼオシン耐性遺伝子など、好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝子など）、あるいはレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ（大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、タウマリン遺伝子、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子など、好ましくは、ｌａｃＺなど）等を挿入することによりＬＬＰＬ遺伝子のエクソンの機能を破壊するか、あるいはエクソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡベクター（以下、ターゲティングベクターと略記する）を作製する。レポーター遺伝子を挿入してエクソンの機能を破壊する場合、該レポーター遺伝子は、ＬＬＰＬプロモーターの制御下で発現するように挿入することが好ましい。
上記「薬剤耐性遺伝子」とは、抗生物質などの薬剤耐性に関与する遺伝子を示し、導入される遺伝子が細胞において発現したか否かを選抜するマーカーとして利用される。
また、上記「レポーター遺伝子」とは、遺伝子発現の指標になる遺伝子群のことを示し、通常、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が利用されることが多く、▲１▼遺伝的背景がないもの、▲２▼遺伝子発現を定量的に行える高感度の方法があるもの、▲３▼形質転換細胞への影響が少ないもの、▲４▼発現部位の局在性が示されるものなどが好ましく用いられる（植物細胞工学、第２巻、第７２１頁、１９９０）。また、上記の「薬剤耐性遺伝子」なども同じ目的で使用されるが、「レポーター遺伝子」は、単に導入される遺伝子が細胞において発現したかどうかだけではなく、どの組織でいつ発現したかを調べることができ、しかも定量的に発現量を正確に調べることができるものである。
【００５６】
さらに、ターゲティングベクターを、例えば、相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞についてＬＬＰＬ遺伝子上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲティングベクター作製に使用したＬＬＰＬ遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
上記のターゲティングベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３など）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＢ５，ｐＣ１９４など）、酵母由来のプラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５など）、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスベクター、バキュロウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス群からのウイルス、またはエプスタイン・バー・ウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。
【００５７】
また、相同組換え法等によりＬＬＰＬ遺伝子を不活性化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを遺伝的背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚（受精後２．５日目頃の８細胞期胚が好ましい）を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
【００５８】
また第二次セレクションは、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えばマウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られたＥＳ細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１−０．５％トリプシン／０．１−５ｍＭ  ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合は、その培養細胞は放棄することが望まれる。
【００５９】
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．  Ｊ．  ＥｖａｎｓおよびＭ．  Ｈ．  Ｋａｕｆｍａｎ，  ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．  Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎ  プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．  Ｃ．  Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られるＬＬＰＬ遺伝子発現不全細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＬＬＰＬの細胞生物学的検討において有用である。
また、ＥＳ細胞を保存する場合には、適当な凍結用培地（例えば、１０％ＤＭＳＯ、１０％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）などを用いて、約−８０℃以下で凍結保存する。
【００６０】
（ＬＬＰＬ遺伝子発現不全動物）
本発明のＬＬＰＬ遺伝子発現不全非ヒト動物（以下、遺伝子発現不全非ヒト動物と称す場合がある）とは、例えば、前記のＬＬＰＬ遺伝子が不活性化された哺乳動物ＥＳ細胞由来の細胞を用いて遺伝子工学的に作出されたものであり、例えば、生殖細胞および体細胞に胚形成初期に不活性化ＬＬＰＬ遺伝子配列を導入された非ヒト動物である。
該非ヒト動物としては、前記と同様のものが用いられる。
ＬＬＰＬ遺伝子をノックアウトさせるには、前記のターゲティングベクターを非ヒト動物ＥＳ細胞または非ヒト動物卵細胞に公知の方法（例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、凝集法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法など）によって導入し（好ましい導入法としては、ＥＳ細胞に導入する場合にはエレクトロポレーション法、卵細胞に導入する場合にはマイクロインジェクション法などがあげられる）、ターゲティングベクターの不活性化されたＬＬＰＬ遺伝子配列を相同組換えにより、非ヒト動物ＥＳ細胞または非ヒト動物卵細胞の染色体上のＬＬＰＬ遺伝子と入れ換えることにより行うことができる。
ＬＬＰＬ遺伝子がノックアウトされた細胞は、ＬＬＰＬ遺伝子上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲティングベクターに使用したマウス由来のＬＬＰＬ遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。
【００６１】
非ヒト動物ＥＳ細胞を用いた場合は、相同組換えにより、ＬＬＰＬ遺伝子が不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を胚形成の初期の適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト動物胚または胚盤胞に注入し（注入法）、またはＬＬＰＬ遺伝子が不活性化されたＥＳ細胞塊を２個の８細胞期胚ではさみ込む（集合キメラ法）ことにより作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト動物の子宮に移植する。
作出された動物は正常なＬＬＰＬ遺伝子座をもつ細胞と人為的に変異したＬＬＰＬ遺伝子座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異したＬＬＰＬ遺伝子座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えたＬＬＰＬ遺伝子座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、ＬＬＰＬヘテロ発現不全個体であり、ＬＬＰＬヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔からＬＬＰＬホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法で遺伝子溶液を注入することによりターゲティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト動物を比較することにより、相同組換えによりＬＬＰＬ遺伝子座に変異のあるものを選択することにより得られる。
ＬＬＰＬ遺伝子発現不全非ヒト動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知の方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
【００６２】
このようにしてＬＬＰＬ遺伝子がノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該遺伝子がノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従って行うことができる。即ち、該不活化遺伝子配列の保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化遺伝子配列を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得することができる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化遺伝子配列を有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代することができる。このようにして得られた該不活化遺伝子配列を有する動物の子孫も本発明のＬＬＰＬ遺伝子発現不全非ヒト動物に含まれる。
このようにＬＬＰＬ遺伝子が不活性化された哺乳動物ＥＳ細胞は、ＬＬＰＬ遺伝子発現不全非ヒト動物を作出する上で、非常に有用である。また、ＬＬＰＬ遺伝子発現不全非ヒト動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞は、ＬＬＰＬの欠損に起因する疾病、例えば、ＬＬＰＬにより誘導され得る種々の生物活性の欠失に基づく、ＬＬＰＬの生物活性の不活性化に起因する疾病（例えば、セプティックショック、アポトーシスに起因する疾病など）のより良いモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明および治療法の検討に有用である。
このように、本発明のＬＬＰＬ遺伝子発現不全非ヒト動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞を、該疾病の予防および／または治療薬のスクリーニングに用いることができる。ここで、上記組織やそれに由来する細胞の例としては、肝臓や腎臓などのホモジネートを用いて特定の活性を測定する、あるいは、腹腔マクロファージを用いて特定産物の活性や産生量を測定することでスクリーニングに用いることができる。
【００６３】
（１０）ＬＬＰＬ・ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療および／または予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
ＬＬＰＬ・ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ＬＬＰＬ・ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して予防および／または治療効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、ＬＬＰＬ・ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、ＬＬＰＬ・ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して予防および／または治療効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられるＬＬＰＬ・ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、ＬＬＰＬ・ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の予防および／または治療効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００６４】
例えば、アポトーシスに起因する疾患に対して予防および／または治療効果を有する化合物をスクリーングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物由来初代培養細胞に試験化合物を接触させ、アポトーシス惹起性の刺激（細胞内カルシウムイオン増加誘導剤、ＴＮＦ−αあるいはＦａｓリガンド、放射線、紫外線、熱、過酸化水素などのストレス、ＬＰＳ、セラミドなど）を加え、アポトーシスの細胞生物学的あるいは生化学的マーカ（カスパーゼ活性、クロマチン凝集、染色体の断片化など）を経時的に計測する。
【００６５】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の生存率が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上向上した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して予防および／または治療効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して予防および／または治療効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００６６】
（１１）ＬＬＰＬ・ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、ＬＬＰＬ・ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とするＬＬＰＬ・ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、ＬＬＰＬ・ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記したＬＬＰＬ・ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、ＬＬＰＬ・ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子がＬＬＰＬ・ＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
【００６７】
ＬＬＰＬ・ＤＮＡをレポーター遺伝子で置換されたＬＬＰＬ・ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子がＬＬＰＬ・ＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のポリペプチドの発現する組織で、本発明のポリペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のポリペプチドの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のポリペプチド欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
【００６８】
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、ＬＬＰＬ・ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
ＬＬＰＬ・ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を促進し、該ポリペプチドの機能を促進することができるので、例えば、アポトーシスに起因する疾病（例、アルツハイマー病などの神経変性疾患、動脈硬化症、高脂血症など）などの医薬として有用である。
また、ＬＬＰＬ・ＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を阻害し、該ポリペプチドの機能を阻害することができるので、例えばアポトーシスに起因する疾病（例、癌）などの予防および／または治療剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
【００６９】
このように、ＬＬＰＬ・ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ＬＬＰＬ・ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、ＬＬＰＬ・ＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防および／または治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のポリペプチドのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子導入動物）を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポータ遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のポリペプチドそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【００７０】
（１２）本発明で用いられるタンパク質などの活性成分の製剤化、投与方法、投与量など
ＬＬＰＬまたはその部分ペプチド、ＬＬＰＬ活性を変化させる化合物、ＬＬＰＬタンパク質をコードするポリヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、ＬＬＰＬまたはその部分ペプチドに対する抗体、上記のいずれかのスクリーニング方法によって得られる化合物（以下、活性成分と略記する場合がある）などを、上記予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
ＬＬＰＬをコードするポリヌクレオチド又はアンチセンス・ポリヌクレオチド（以下、ＬＬＰＬ・ＤＮＡと略記する場合がある）を上記予防および／または治療剤として使用する場合は、ＬＬＰＬ・ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。ＬＬＰＬ・ＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００７１】
本発明は、さらに
▲１▼本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ、
▲２▼前記二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬、
▲３▼本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、
▲４▼前記リボザイムを含有してなる医薬を提供する。
二重鎖ＲＮＡが特異的に遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）という現象が知られており、哺乳動物細胞においてこの現象を誘導するために用いられるＲＮＡをｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉ  ＲＮＡと略記する）という。
また、自己切断反応をおこなうＲＮＡ分子であるリボザイム（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）も遺伝子発現の抑制に関連していることが知られている。
上記の二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなどは、アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の発現を抑制することができ、生体内における本発明のタンパク質または本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の活性を阻害することができるので、各種癌などの予防・治療剤として使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１巻，  ４９４頁，  ２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ７巻，  ２２１頁，  ２００１年）に準じて、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
【００７２】
上記活性成分（または化合物）が、製薬学的に許容できる塩を形成できるときは、そのような塩を形成していてもよい。そのような塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
上記活性成分（その塩も含む）は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、上記活性化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００７３】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００７４】
また、上記予防および／または治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。さらに、上記予防および／または治療剤は適当な薬剤と組み合わせて例えばＬＬＰＬが高発現している臓器や組織を特異的なターゲットとしたＤＤＳ製剤として使用することもできる。
本発明の活性成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このようにして得られる製剤は、例えばヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【００７５】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
Ｇｌｙ  ：グリシン
Ａｌａ      ：アラニン
Ｖａｌ        ：バリン
Ｌｅｕ      ：ロイシン
Ｉｌｅ  ：イソロイシン
Ｓｅｒ  ：セリン
Ｔｈｒ    ：スレオニン
Ｃｙｓ  ：システイン
Ｍｅｔ  ：メチオニン
Ｇｌｕ  ：グルタミン酸
Ａｓｐ  ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ  ：リジン
Ａｒｇ  ：アルギニン
Ｈｉｓ  ：ヒスチジン
Ｐｈｅ  ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ  ：チロシン
Ｔｒｐ  ：トリプトファン
Ｐｒｏ  ：プロリン
Ａｓｎ  ：アスパラギン
Ｇｌｎ  ：グルタミン
【００７６】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
マウス由来ＬＬＰＬのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
マウス由来ＬＬＰＬをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
プライマーＰ９４−１の塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
プライマーＰ１０１−４の塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
プライマーＳＩ−７５の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
プライマーＰ３−ｔの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
プライマーＰ４−ｓの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
ヒト由来ＬＬＰＬのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
ヒト由来ＬＬＰＬをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ヒト腎臓由来ＬＬＰＬ（成熟体）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
マウス腎臓由来ＬＬＰＬ（成熟体）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ヒト心臓由来ＬＬＰＬ（成熟体）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ヒト腎臓由来ＬＬＰＬ（成熟体）のアミノ酸配列を示す。配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列の第６６番目（Ｌｅｕ）と第６７番目（Ｖａｌ）の間に、配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列の第６７番目（Ｇｌｕ）〜第９８番目（Ｌｅｕ）の３２アミノ酸残基が挿入されたものである。
〔配列番号：１４〕
ヒト心臓由来ＬＬＰＬ（前駆体）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ヒト腎臓由来ＬＬＰＬ（前駆体）のアミノ酸配列を示す。
【００７７】
【実施例】
以下に、本発明を参考例および実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００７８】
参考例１  ＥＳ細胞の培養
ＥＳ細胞として１２９／ＳｖＥｖ由来のＡＢ２．２−Ｐｒｉｍｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌｓ（ＬＥＸＩＣＯＮ）を用い、Ｊｏｙｎｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  １９９３，  ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓあるいは、その翻訳本、ジーンターゲティング、野田哲生監修、（株）メディカル・サイエンス・インターナショナル）に準拠して培養を行った。ＥＳ細胞およびフィーダー細胞は推奨されている１５％  ＦＢＳ，２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１０−４Ｍ  β−メルカプトエタノール，５０Ｕ／ｍｌ  ペニシリン，５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含むＥＳＱ  ＤＭＥＭ培地（ＥＳ細胞用培地）を用い、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で培養した。ＥＳ細胞は、１０μｇ／ｍｌ  マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）を添加した培地で３時間培養することによりアレストしたフィーダー細胞層上で培養した。ＥＳ細胞の分化をできるだけ抑えるため培地交換は半量交換を基本とし、２〜３日毎に継代を行った。
【００７９】
参考例２  マウスゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ｍＬＬＰＬ  ｃＤＮＡを含むｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴプラスミド（ｐＴＢ２０１０）をＳｍａＩ制限酵素処理によりＮ末端に位置するベクターのＭＣＳからｍＬＬＰＬのＳｍａＩサイトまでの約１ｋｂｐを単離した。これをプローブＡとして１２９／ＳｖｊマウスゲノムライブラリーからＢＡＣ  ＥＳ  Ｍｏｕｓｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＧＥＮＯＭＥ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を利用して、ｍＬＬＰＬの全ゲノム配列を含むプラスミドｍＬＬＰＬ／ｐＢｅｌｏＢａｃ１１を３クローン取得した。この３クローンについて、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ制限酵素処理によって断片化させたＤＮＡ断片を、ｍＬＬＰＬ  ＯＲＦのほぼ全域を含むＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリダイゼーション法により解析を行った。ＤＮＡプローブはｐＴＢ２０１０をテンプレートとしてセンス鎖プライマーＰ９４−１（配列番号：３）およびアンチセンス鎖プライマーＰ１０１−４（配列番号：４）を用いてＰＣＲ法により作製した。ＥｃｏＲＩ処理産物からは約１１ｋｂｐ、約７．５ｋｂｐの２つのＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ処理産物からは約６．５ｋｂｐ、約１．５ｋｂｐおよび約０．６ｋｂｐの３つのＤＮＡ断片がポジティブバンドとして得られ、合計５種類のｍＬＬＰＬのポジティブバンドを検出できた。これらをそれぞれｐＵＣ１１８ベクターにサブクローニングを行い、プラスミドＥｃｏＲＩ（１１ｋｂｐ）／ｐＵＣ１１８、ＥｃｏＲＩ（７．５ｋｂｐ）／ｐＵＣ１１８、ＰｓｔＩ（６．５ｋｂｐ）／ｐＵＣ１１８、ＰｓｔＩ（１．５ｋｂｐ）／ｐＵＣ１１８、ＰｓｔＩ（０．６ｋｂｐ）／ｐＵＣ１１８を取得して、制限酵素マッピングおよび塩基配列を解析した。取得したクローンはｍＬＬＰＬのゲノムの全領域約１３ｋｂｐをカバーするものであることが明らかになり、１３ｋｂｐ  ｍＬＬＰＬゲノム上のエクソンイントロン構造を決定した（図１）。マウスＬＬＰＬのＯＲＦは計６個のエクソンから構成されており、その活性部位と予想されているリパーゼモチーフは第５エクソン上に存在することが明らかになった。
【００８０】
参考例３  ターゲティングベクターｐＴＢ２２２４の構築
ｍＬＬＰＬ／ｐＢｅｌｏＢａｃ１１を制限酵素処理により断片化してｐＵＣ１１８ベクターにサブクローニングしたプラスミドを用いて、ｓｈｏｒｔ  ａｒｍおよびｌｏｎｇ  ａｒｍとなるＤＮＡ断片を作製した。第６エクソンを含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ断片（１．１ｋｂｐ）の両端にＳａｌＩ部位を付加したものをｓｈｏｒｔ  ａｒｍとして、第一および第二エクソンを含むＥｃｏＲＩ断片（１１ｋｂｐ）の両端にＮｏｔＩ部位を付加したものをｌｏｎｇ  ａｒｍとして用いるために、以下の操作を行った。ＥｃｏＲＩ（７．５ｋｂｐ）／ｐＵＣ１１８プラスミドからＨｉｎｄＩＩＩ断片（１．３ｋｂｐ）を単離してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ＭＣＳのインサートの５’末端がＳａｌＩ部位近傍にあるクローンを選択した。このプラスミドをＢａｍＨＩで切断後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端平滑化を行いＳａｌＩリンカーを挿入したプラスミドを取得した。これをＰｓｔＩで切断後、自己環化させることによりインサートの３’端のＰｓｔＩ断片（０．２ｋｂｐ）を除いた。これをＳａｌＩで切断することにより両端にＳａｌＩ部位の付加したｓｈｏｒｔ  ａｒｍとなるＤＮＡ断片を取得した。一方、ＥｃｏＲＩ（１１ｋｂｐ）断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングしたものを、ＮｏｔＩで切断することにより両端にＮｏｔＩ部位の付加したｌｏｎｇ  ａｒｍとなるＤＮＡ断片を取得した。調製したｓｈｏｒｔ  ａｒｍおよびｌｏｎｇ  ａｒｍをそれぞれｐＰｏｌＩＩｓｈｏｒｔ−ｎｅｏｂＰＡ−ＨＳＶＴＫベクター（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  Ｓ．ら、  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９４  Ｍａｙ；９３（５）：１８８５−９３）のＸｈｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位に連結することにより、目的とするターゲティングベクターｐＴＢ２２２４を構築した（図２）。
【００８１】
参考例４  ＬＬＰＬ遺伝子欠損ＥＳ細胞の選別
ほぼコンフルエントまで増殖した［参考例１］で得られたＥＳ細胞について培地交換から３時間後に以下の方法でトリプシン処理を行い、ＥＳ細胞懸濁液を調製した。ＥＳ細胞（Ｔ−７５）をＰＢＳ／ＥＤＴＡ  １０ｍｌで３回洗浄し、０．２５％  トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）３ｍｌに懸濁させた後に、さらにＤ−ＰＢＳ（−）７ｍｌを添加して懸濁させてから、遠沈して細胞を回収した。回収した細胞をＤ−ＰＢＳ（−）１０ｍｌで３回洗浄した後に、Ｄ−ＰＢＳ（−）１ｍｌに再懸濁してＥＳ細胞懸濁液を調製した。〔参考例３〕で得られたターゲティングベクターＤＮＡ（約１２０μｇ）ｐＴＢ２２２４をＳａｌＩ制限酵素処理により直線化した後に、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行って精製後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水１００μｌに溶かした。このＤＮＡ溶液にＤ−ＰＢＳ（−）０．９ｍｌを加えて１ｍｌとし、先に調製したＥＳ細胞懸濁液に添加して３分間放置した。エレクトロポレーション用キュベットに１ｍｌずつ分注し、Ｃｅｌｌ  Ｐｏｒａｔｏｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いてＥＳ細胞へのエレクトロポレーションを行った（Ｃｈａｒｇｅに設定し３３０μＦ，Ｌｏｗ  Ωを確認後、Ｆａｓｔ−ＵＰでモニター値を３００程度まで上げる。次に、Ａｒｍに設定しＭｅｄ−Ｄｏｗｎでモニター値２７５になったところで、素早くＴｒｉｇｇｅｒを押す）。エレクトロポレーション後の細胞をＥＳ細胞用培地４０ｍｌに移して穏やかに撹拌後、１０ｃｍディッシュ４枚にアレストしたフィーダー細胞上に播種した。播種してから２４時間後に培地にＧ４１８（最終濃度１９０μｂ／ｍｌ：Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加し、エレクトロポレーション後４日目に１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ；最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）を添加してＬＬＰＬ遺伝子欠損ＥＳ細胞の選択培養を行った。毎日培地を交換し９日から１１日目に増殖したコロニーを採取して、ＰＣＲ産物のサザン解析による一次スクリーニングとゲノミックサザン解析による二次スクリーニングにより、目的クローンの選択を行った。得られたＧ４１８耐性株のＬＬＰＬ遺伝子欠損の判定は、採取した各コロニーの一部より調製したセルライセートをテンプレートとして、ネオマイシン耐性遺伝子上のセンス鎖プライマーＳＩ−７５（配列番号：５）とｓｈｏｒｔ  ａｒｍ上に位置するアンチセンス鎖プライマーＰ３−ｔ（配列番号：６）を用いたＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をアガロースゲル上で電気泳動した後にＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にアルカリトランスファーした。作製したサザンブロットについてｓｈｏｒｔ  ａｒｍ領域中の０．４ｋｂｐのＰｖｕＩＩ断片をプローブＢとして用いたサザンハイブリダイゼーション法により解析を行った。１．２ｋｂｐにバンドが検出されたクローンについては、引き続きスケールアップして培養した細胞からそのゲノムＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩ制限酵素処理を行ったものを用いて、ＬＬＰＬ  ｃＤＮＡ  ３’−非翻訳領域に存在するｓｈｏｒｔ  ａｒｍの外側領域の０．５ｋｂｐのＨｉ���ｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ断片をプローブＣとして使用しゲノミックサザン解析を行った。ＬＬＰＬ遺伝子のノックアウト細胞株では６．８ｋｂｐ（Ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ａｌｌｅｌｅ）および７．５ｋｂｐ（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ａｌｌｅｌｅ）の位置にバンドが検出できた。これに対して対照である野生株では７．５ｋｂｐ（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ａｌｌｅｌｅ）のバンドのみが検出できた。Ｗｉｌｄ  ａｌｌｅｌｅ由来の７．５ｋｂｐとＤｉｓｒｕｐｔｅｄ  ａｌｌｅｌｅ由来の６．８ｋｂｐの２本のバンドが検出できたものを最終的に目的とする相同組換え体として選択した。２回の相同組換え体取得の実験を行ったところ、Ｇ４１８とＦＩＡＵ両方に耐性を示した計４３０クローンのうち５クローンが変異の導入されている相同組換え体であることを確認した（図３）。
【００８２】
参考例５  相同組換え体ＥＳ細胞ＬＸ−２−１６３株を用いたキメラマウスの作出
１．胚盤胞の取得
胚盤胞採取用動物は下記のように作出した。まず、８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＣｒＪ）雌マウスを購入し、室温２５±１℃、湿度５０±１０％および７〜１９時の１２時間日照条件に制御されたＳＰＦ動物飼育施設にて１週間馴化させた。実験初日に１０週齢以上の同系統雄マウスと同居させ、自然交配を行った。翌日、同居させた雌マウスの膣栓確認を行い、膣栓確認された雌マウスはマイクロインジェクション実験まで３日間飼育を行った。
マイクロインジェクション実験当日、マウスを頸椎脱臼により屠殺後、腹部を開腹し卵巣、卵管、子宮を取り出した。子宮角より上部を取り除き、子宮部を左右切り分けた。さらに子宮角側および膣側からそれぞれ２５Ｇ注射針を差し込み、採卵用培地（１０％  ＦＣＳ，１００Ｕ  ペニシリンおよび１００Ｕ  ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）を用いて灌流し、１匹分づつの灌流液を３．５ｃｍシャーレに回収し、３７℃、７％  ＣＯ２条件下のインキュベーターに３０分以上静置した後、胚盤胞のみを回収した。
２．相同組換え体ＥＳ細胞の調製
５×１０５あるいは１×１０６の細胞密度で凍結保存されていた相同組換え体ＥＳ細胞は実験２日目に解凍後、直ちにＳＴＯ細胞をＦｅｅｄｅｒ培地（１０％  ＦＣＳ，２００ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１０ｍＭ  ＮＥＡＡ，１００Ｕ  ペニシリンおよび１００Ｕ  ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）にて培養しておいた６ｃｍ径フィーダーディッシュ上に播種した。３７℃、７％  ＣＯ２条件に制御されたインキュベーター中において  マイクロインジェクション実験当日までＥＳ培地（１６％  ＦＣＳ，２００ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１０ｍＭ  ＮＥＡＡ，１００Ｕ  ペニシリン，１００Ｕ  ストレプトマイシン，１Ｍ  ＨＥＰＥＳ，１０００Ｕ  ＥＳＧＲＯおよび０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭ）中で３日培養を行った。
増殖した相同組換え体ＥＳ細胞は培地を除いたあとＰＢＳ溶液を用いて２回洗浄した。洗浄した細胞は０．０２５％  トリプシン溶液による５分間処理を行い、上記ＥＳ培地を添加後、１２００ｒｐｍ、２分、４℃条件で遠心した。次に上清を除き、ＥＳ培地を２〜３ｍｌ添加し、よく細胞をほぐしてからさらに同培地を添加し、１０ｍｌに容量調整を行った。以上の細胞懸濁液を１０ｃｍ径カルチャーディッシュに播いた後、３７℃、７％  ＣＯ２条件に制御されたインキュベーター内で３０分間培養し、フィーダー細胞をカルチャーディッシュに接着させた。さらに上清中含まれたＥＳ細胞のみを６ｃｍ径ペトリディッシュに回収し、マイクロインジェクション実験を開始するまで４℃条件下に保存した。
３．相同組換え体ＥＳ細胞のマイクロインジェクション実験
インジェクションチャンバーとして６ｃｍ径ペトリディッシュのふたの中央にマイクロインジェクション用培地（１６％  ＦＣＳ，２００ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１０ｍＭ  ＮＥＡＡ，１００Ｕ  ペニシリン，１００Ｕ  ストレプトマイシン，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭ）の１ドロップを滴下し、ドロップ内中央に胚盤胞を５〜１０個、ドロップ内周辺部に上記の相同組換え体ＥＳ細胞を移した。ドロップが乾燥しないよう流動パラフィンを添加し、４℃で２０〜３０分冷蔵した。マイクロインジェクション実験はＨｏｇａｎらの方法（Ｈｏｇａｎ，  Ｂ．，  Ｃｏｓｔａｎｉｔｉｎｉ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｌａｃｙ，  Ｅ．  （Ｅｄｓ）．  １９８６．  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ；  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．）に準拠して行った。相同組換え体ＥＳ細胞の胚盤胞へのマイクロインジェクションは、ドロップ中の１０〜１５個のＥＳ細胞をマイクロインジェクションピペットで採取した後、胚盤胞の内部細胞塊と反対側の位置から上記マイクロインジェクションピペットを胞胚腔に差し込み、注入する方法で行った。マイクロインジェクションを終了した胚盤胞は１０％  ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地に移し、３７℃、７％  ＣＯ２条件に制御されたインキュベーターにおいて胚盤胞が元の形に戻るまで培養した。正常な胚盤胞は下記の方法により作製したＩＣＲ（ＪｃＬ）系統偽妊娠雌マウスの左右子宮角に各８〜１０個移植し、室温２５±１℃、湿度５０±１０％および７〜１９時の１２時間日照条件に制御された飼育室にて移植マウスの飼育を行った。
偽妊娠雌マウス作出は次のように行った。８週齢ＩＣＲ（ＪｃＬ）系統雌を購入し、室温２５±１℃、湿度５０±１０％および７〜１９時の１２時間日照条件に制御されたＳＰＦ動物飼育施設にて１週間馴化させた。実験２日目、あらかじめ用意された１０週齢以上のＩＣＲ（ＪｃＬ）系統精管結紮雄マウスと同居させ、自然交配を行った。翌日、同居させた雌マウスの膣栓確認を行い、マイクロインジェクション実験当日まで２日間飼育を行い、実験に供した。
以上の結果、ＬＸ−２−１６３株のマイクロインジェクション実験では仔マウスを４９個体得た。そのうち２７個体はアグーチ色の体毛を有するキメラマウスであった。キメラマウスの体毛色に対するＥＳ細胞の寄与率（キメラ率）には個体間変異がみられた。同実験においては７５％以上の高キメラ率を有する雄キメラマウス１０個体が得られた。
【００８３】
参考例６  ＬＬＰＬ欠損マウスの作出
高キメラ率を示した雄キメラマウスのみを１０週齢以上のＣ５７ＢＬ／系統（ＣｒＪ）雌との交配を行った。最初、ＥＳ細胞の生殖系列への移行の判定は、産仔体毛色を確認する方法によって行った。ＬＸ−２−１６３株細胞の寄与率がほぼ１００％のキメラマウスとの交配から得られた７５匹の仔マウスはすべてアグーチ色を示し、産仔は全てＥＳ細胞由来と考えられた。７５％以上の高キメラ率を有する雄キメラマウスとの交配から得られた１２０匹の仔マウスでは、そのうち８０匹がＥＳ細胞に由来するアグーチ色を示した。次にアグーチ色の体毛色を呈するマウスについて下記のＰＣＲ法およびサザン解析によって遺伝子欠損を判定した。
ＥＳ細胞由来の子マウスの尾から定法に従ってＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型としてネオマイシン耐性遺伝子上のセンス鎖プライマーＳＩ−７５（配列番号：５）とＬＬＰＬ遺伝子上のセンス鎖プライマーＰ４−ｓ（配列番号：７）および、ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ上に位置するアンチセンス鎖プライマーＰ３−ｔ（配列番号：６）の３種類のプライマーを用いたＰＣＲを行い、アガロースゲルにて解析した。このプライマーを用いると、変異の導入されていないＷｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ａｌｌｅｌｅからは０．４  ｋｂｐのバンドの増幅が見られ、ＬＬＰＬ遺伝子に変異が導入されたＤｉｓｒｕｐｔｅｄ  ａｌｌｅｌｅからは０．３ｋｂｐのバンドの増幅が見られる。キメラマウス（Ｆ０）とＣ５７ＢＬ／６Ｊから得られた産仔２８例（雄１２，雌１６）のうち、１６例（雄６，雌１０）において０．３ｋｂｐと０．４ｋｂｐの２本のバンドの増幅が認められ、ＬＬＰＬ遺伝子に変異（欠損）が導入されたヘテロ接合体マウスであると考えられた。これらのマウスＤＮＡについてＥｃｏＲＩ処理した後に、実施例１と同様にプローブＣを用いてゲノミックサザンハイブリダイゼーションにて解析した。参考例４で得られたＬＬＰＬ遺伝子欠損ＥＳ細胞株ＬＸ−２−１６３と同様に７．５ｋｂｐおよび６．８ｋｂｐの位置にバンドが検出され、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１）であることが確認された。
【００８４】
実施例１  ＬＬＰＬのアポトーシス発現への関与
ＬＬＰＬ欠損マウスおよびその野生型マウスに由来する初代培養細胞を用い、ＴＮＦ−α、紫外線、過酸化水素などのストレス、ＬＰＳ、セラミド等のアポトーシス惹起性刺激を細胞に加え、アポトーシスに特異的な細胞生物学的あるいは生化学的マーカー（例えば、カスパーゼ活性、クロマチン凝集、染色体の断片化等）の検出を行う。野生型マウスに比べＬＬＰＬ欠損マウスでは、低刺激でこれらの現象が観察される。すなわち、アポトーシスの発現へのＬＬＰＬ遺伝子（または遺伝子産物）の関与が示唆される。ＬＬＰＬ欠損マウスはアポトーシス誘導を補償する薬剤のスクリーニングに使用することができる。
【００８５】
実施例２  酸化ＬＤＬ及びＤＬ−ＰＰＭＰによるアポトーシス誘導感受性
袴田らの方法（実験医学別冊  ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．  １２、循環研究プロトコール、ｐｐ．４９−５２  （１９９６））に従い、チオグリコレート刺激後のＬＬＰＬ／ＡｐｏＥダブルノックアウトマウスおよびＡｐｏＥノックアウトマウスより腹腔マクロファージを調製した。ＬＤＬは山村らの方法（新生化学実験講座４、ｐｐ．１８７−２０６（１９９３））に従い、ウサギ血清より調製後、袴田らの方法（細胞工学別冊  医学実験マニュアルシリーズ  ２、動脈硬化＋高脂血症研究ストラテジー、ｐｐ．３６−４１（１９９６））に従い酸化ＬＤＬを調製した。腹腔マクロファージ細胞は所定濃度のグルコシルセラミド合成酵素阻害剤であるＤＬ−ｔｈｒｅｏ−１−Ｐｈｅｎｙｌ−２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｍｉｎｏ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ・ＨＣｌ（ＤＬ−ＰＰＭＰ）を含む酸化ＬＤＬ含有ＤＭＥＭ−２５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）培地を用いて２４時間培養した。ＰＢＳで２回洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＬＵＯＳ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてアポトーシス細胞を染色した。ＤＡＰＩ含有ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ＶＥＣＴＯＲ社）でマウントし、蛍光顕微鏡下でアポトーシス細胞を検出した。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｖｅｒ．４．５（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社）による画像処理により、ＤＡＰＩ陽性面積に対するＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ陽性面積比を求めた。ＡｐｏＥノックアウトマウス由来の腹腔マクロファージ細胞におけるコントロール処理条件の値を１として各条件での相対比を求めた。結果を表１に示す。
【表１】
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表１が示すように、ＬＬＰＬ欠損マクロファージ細胞はＬＬＰＬ野生型マクロファージ細胞に比較し、酸化ＬＤＬ及びＤＬ−ＰＰＭＰ誘発アポトーシスの感受性が高いことが示された。
ＬＬＰＬ欠損に起因する、アポトーシス感受性の上昇を確認した。
【００８６】
実施例３  組換えヒトＬＬＰＬタンパクのヒト大動脈内皮細胞における抗アポトーシス作用
正常ヒト大動脈内皮細胞（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社）をヒト内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ、ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社）で懸濁後、６ウェルプレートに１０５細胞／ウェルとなるように塗抹した。一晩、３７℃、５％  ＣＯ２下で培養後、１０μｇ／ｍｌの組換えヒトＬＬＰＬタンパクを含有するヒト内皮細胞用培地に交換後、さらに２日間培養した。ＰＢＳで２回洗浄後、５μＭのＤＬ−ｔｈｒｅｏ−１−Ｐｈｅｎｙｌ−２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｍｉｎｏ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ・ＨＣｌ（ＤＬ−ＰＰＭＰ）を含むヒト内皮細胞用培地に交換し、４８時間培養した。サブカルチャー用試薬（ＲｅａｇｅｎｔＰａｃｋ、ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社）を用いて細胞を回収し、Ｃａｓｐａｓｅ−３  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ社）を用いてＣａｓｐａｓｅ−３の活性化をＦＡＣＳ（ＢＤ社）にて解析した。データ解析はＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（ＢＤ社）を用いて、全細胞数に対するＣａｓｐａｓｅ−３活性化細胞数の比を求めＣａｓｐａｓｅ−３活性化細胞率とした。統計解析はＤｕｎｎｅｔ検定を用いた。結果を表２に示す。
【表２】
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表２に示すように、組換えヒトＬＬＰＬタンパク前処置群においてＤＬ−ＰＰＭＰによるＣａｓｐａｓｅ−３活性化細胞率が有意に低下した。このことから、内皮細胞において組換えヒトＬＬＰＬタンパクは抗アポトーシス作用を示すことが明らかとなった。
【００８７】
実施例４  ＬＬＰＬサンドイッチＥＬＩＳＡ法
ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫペプチド）融合ヒトＬＬＰＬタンパクを谷山らの報告［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ）、第２５７巻、５０−５６頁（１９９９）］に従い作製した。
得られたＦＬＡＧ融合ヒトＬＬＰＬタンパクとフロインドの完全アジュバンド（ＦＣＡ）を混合し、均一なエマルジョンにした後、常法［アンチボディーズ・ア・ラボラトリー・マニュアル（１９８８）］に従いモノクローナル抗体を作製した。
次に、上記で得られた８種類のモノクローナル抗体について、Ｌ．Ｃ．Ｇｒｕｅｎらの報告［ジャーナル・イムノロジカル・メソッド（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第１６８巻、９１−１００頁（１９９４）］を参考にして、表面プラズモン共鳴解析装置（ビアコア社）を用いてモノクローナル抗体の評価を行なった。
その結果、ＦＬＡＧ融合ヒトＬＬＰＬタンパクと強い親和性が認められた３つの抗体（ｍ２３Ｆ，  ｍ４−１Ｈおよびｍ７−１Ｃ）を選択することに成功した。
精製したモノクローナル抗体ｍ７−１Ｃを２．５μｇ／ｍｌ含むＣｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１  Ｍ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，  ｐＨ９．６）を９６ウェルマイクロプレートに２００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。次に、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（ＰＢＳ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で６回洗浄した後に、ウェルの余剰の結合部位をＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０，  １％  ＢＳＡ）を加え不活化した。上記調製済みプレートに、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（１０  ｍＭ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ｐＨ  ７．４，  １％  ＢＳＡ，  １  Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０，  １  ｍＭ  ＳＤＳ，  １％  Ｍｏｕｓｅ  ｓｅｒｕｍ）で希釈したＦＬＡＧ融合ヒトＬＬＰＬタンパク標準液を２００μｌ加え、４℃で２４時間反応させた。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａで６回洗浄したのち、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（ＰＢＳ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０，  １％  ＢＳＡ，  １％  Ｍｏｕｓｅ  ｓｅｒｕｍ）で３０００倍希釈した２００μｌのＨＲＰ標識したモノクローナル抗体ｍ４−１Ｈ−ＨＲＰを加え、４℃で２４時間反応させた。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａで６回洗浄、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（１０  ｍＭ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  （ｐＨ  ７．４），  ０．７５  Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で６回洗浄したのち、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｌｕ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて固相上のＨＲＰ活性を測定した（酵素反応は、室温で６０分）。結果を図４に示す。
これより、固相抗体として７−１Ｃを用い、標識体として４−１Ｈ−ＨＲＰを用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法は、ヒトＬＬＰＬを０．５ｎｇ／ｍｌまで検出することが可能であり、極めて高感度に検出することが可能であることがわかった。
つぎに、構築したＥＬＩＳＡ系を用いて、ヒト血清中のＬＬＰＬ濃度を測定した。結果を図５に示す。
ヒトＬＬＰＬの血中濃度は、８．４±８．０ｎｇ／ｍｌと予想された。また、ＴＨＰ−１細胞をフォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、１００ｎＭで３日間処理し、マクロファージ様にした後、１％ＦＢＳおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に置き換え、１から３日間培養した培養上清について、ＬＬＰＬ産生量を測定した。結果を図６に示す。
マクロファージ様ＴＨＰ−１細胞３日間のＬＬＰＬ分泌産生量は、２．３±１．２ｎｇ／ｍｌと予想された。
【００８８】
実施例５  ＬＬＰＬ／ＡｐｏＥダブル欠損マウスにおける酸性ホスホリパーゼＡ２（ａＰＬＡ２）活性の測定
ＬＬＰＬ／ＡｐｏＥダブル欠損マウスから調製した肝臓、腎臓および脳組織におけるａＰＬＡ２活性を測定した。反応バッファー（５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ４．５）にリポソーム（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（７０  ｍｏｌ％），  １−ａｃｙｌ−２−［１−Ｃ１４］ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（２  ｍｏｌ％），  ｄｉｃｅｔｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（３０  ｍｏｌ％））を最終濃度が１２８μＭになるように基質として加え、つぎに各組織ライセートタンパク質（最終濃度：１００μｇ／ｍｌ）を加え全量を５００μｌとした。３７℃で１時間インキュベートし、クロロホルム／メタノール（２／１）を加えて反応を終了させた。激しく攪拌した後に、０．９％塩化ナトリウム溶液３００μｌを加え、さらに激しく攪拌、遠心後、クロロホルム層を回収した。得られたクロロホルム層を乾固させた後に、５０μｌのクロロホルム／メタノール（９５／５）で再溶解し、２０μｌをＨＰＴＬＣ（メルク社）にスポットした。クロロホルム／酢酸（９／１）で展開後、ＢＡＳイメージングアナライザー（富士フィルム社）を用いて遊離脂肪酸を検出した。対照として、ＡｐｏＥ欠損型でＬＬＰＬ野生型およびヘテロ接合型マウスの組織を用いた。その結果を図７に示す。
ＬＬＰＬ欠損マウスでは、調べた組織いずれにおいてもａＰＬＡ２活性がほぼ完全に消失していることを確認した。
【００８９】
実施例６  蛍光基質を用いた酸性ホスホリパーゼＡ２活性の測定
実施例５で使用したＬＬＰＬ／ＡｐｏＥダブル欠損マウスの肝臓組織ライセートタンパク質について、蛍光リン脂質である１，２−ｂｉｓ−（１−ｐｙｒｅｎｅｂｕｔａｎｏｙｌ）−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（Ｂ−３７８１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて酸性ホスホリパーゼＡ２活性を測定した。すなわち反応バッファー（５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ４．５）に蛍光リン脂質のメタノール溶液（最終濃度：０．９μＭ）を基質として加え、組織ライセートタンパク質（最終濃度：１０μｇ／ｍｌ）を加え全量を２００μｌとした。３７℃でインキュベートし、１時間後に蛍光強度（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：３２０ｎｍ，  ｅｍｉｓｓｉｏｎ：４０５ｎｍ）を測定した。対照として、ＡｐｏＥ欠損型でＬＬＰＬ野生型およびヘテロ接合型マウスの組織を用いた。その結果を図８に示す。
また、腹腔マクロファージから調製したライセートタンパク質（最終濃度：１０μｇ／ｍｌ）についても同様に測定を行なった。結果を図９に示す。
ＬＬＰＬ欠損マウスでは、調べた組織いずれにおいても、酸性ホスホリパーゼＡ２活性がほぼ完全に消失していることを確認した。
【００９０】
実施例７  ＬＬＰＬ／ＡｐｏＥダブル欠損マウスにおける１−Ｏ−アシルセラミドシンターゼ活性の測定
ＬＬＰＬ／ＡｐｏＥダブル欠損マウスから調製した肝臓、腎臓および脳組織における１−Ｏ−アシルセラミドシンターゼ活性を測定した。
１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む反応バッファー（５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ４．５）にリポソーム（最終濃度：１２８μＭ，  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（７０  ｍｏｌ％），  １−ａｃｙｌ−２−［１−Ｃ１４］ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（２  ｍｏｌ％），ｄｉｃｅｔｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（３０  ｍｏｌ％）），  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ（最終濃度：２０μＭ）を基質として加え、つぎに各組織ライセートタンパク（最終濃度：１００μｇ／ｍｌ）を加え全量を５００μｌとした。３７℃で３０分間インキュベートし、クロロホルム／メタノール（２／１）を加えて反応を終了させた。激しく攪拌した後に、０．９％塩化ナトリウム溶液３００μｌを加え、さらに激しく攪拌、遠心後、クロロホルム層を回収した。得られたクロロホルム層を乾固させた後に、５０μｌのクロロホルム／メタノール（９５／５）で再溶解し、２０μｌをＨＰＴＬＣ（メルク社）にスポットした。クロロホルム／酢酸（９／１）で展開後、ＢＡＳイメージングアナライザー（富士フィルム社）を用いて反応生成物である１−Ｏ−ａｃｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅを検出し、対応する画分をＴＬＣプレートから切り出した後に、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。対照として、ＡｐｏＥ欠損型でＬＬＰＬ野生型およびヘテロ接合型マウスの組織を用いた。その結果を図１０に示す。ＬＬＰＬ欠損マウスでは、調べた組織いずれにおいても１−Ｏ−アシルセラミドシンターゼ活性がほぼ完全に消失していることを確認した。
【００９１】
【発明の効果】
本発明のＬＬＰＬを用いるスクリーニング方法によれば、ＬＬＰＬ欠損に起因する各種疾病の予防および／または治療剤を効率良くスクリーニングすることができる。
また、本発明のＬＬＰＬ発現不全非ヒト動物は、ＬＬＰＬにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、ＬＬＰＬ欠損に起因する疾病のモデルとなり得る。したがって、このモデルによれば、ＬＬＰＬ欠損に起因する各種症状、例えばアポトーシスに起因する疾病の予防および／または治療剤のスクリーニングや、ＬＬＰＬ関連疾患の原因究明および治療法の検討に有用である。
さらに、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物は、アポトーシスに起因する疾病の予防および／または治療剤として有用である。
【００９２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】マウスゲノム上のＬＬＰＬ遺伝子のエクソン・イントロン構造を示す。図中、エクソン部分は箱で、イントロン部分は実線で示した。また、制限酵素処理により取得しサブクローニングを行った５つのＤＮＡ断片を太実線で示した。
【図２】参考例３で得られたターゲティングベクターの構築図を示す。図中、Ｎｅｏｒはネオマイシン耐性遺伝子を、ＨＳＶ−ＴＫは単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ遺伝子を示す。
【図３】参考例４で得られたＬＬＰＬノックアウトＥＳ細胞株のサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図４】サンドイッチＥＬＩＳＡ法による組換えヒトＬＬＰＬ測定の標準曲線を示す。
【図５】正常ヒト血清中のＬＬＰＬ濃度の測定結果を示す。
【図６】マクロファージ様ＴＨＰ−１細胞培養上清中のヒトＬＬＰＬ量の測定結果を示す。
【図７】ＡｐｏＥ欠損の背景でＬＬＰＬのホモ、ヘテロ、野生型のそれぞれのマウスの肝臓、腎臓、脳の組織における酸性ホスホリパーゼＡ２（ａＰＬＡ２）活性の測定結果を示す。
【図８】ＡｐｏＥ欠損の背景でＬＬＰＬのホモ、ヘテロ、野生型のそれぞれのマウスの肝臓組織ライセートタンパク質についての、蛍光基質を用いた酸性ホスホリパーゼＡ２活性の測定結果を示す。
【図９】ＡｐｏＥ欠損の背景でＬＬＰＬのホモ、ヘテロ、野生型のそれぞれのマウス由来の腹腔マクロファージのライセートタンパク質についての、蛍光基質を用いた酸性ホスホリパーゼＡ２活性の測定結果を示す。
【図１０】ＬＬＰＬ／ＡｐｏＥダブル欠損マウスから調製した肝臓、腎臓および脳組織における１−Ｏ−アシルセラミドシンターゼ活性の測定結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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