(57)【要約】【課題】取扱いが容易であり安定して入手可能な培養細胞を用いて、被検物質の感作性をより簡便に且つ精度良く評価できる方法を提供する。【解決手段】ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれる抗原提示細胞を被検物質と共にインキュベートし、当該細胞内に発現されたＣＤ８６又はＣＤ５４をコードする遺伝子を検出することを特徴とする被検物質の感作性の評価方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれる抗原提示細胞を被検物質と共にインキュベートし、当該細胞内に発現されたＣＤ８６又はＣＤ５４をコードする遺伝子を検出することを特徴とする被検物質の感作性の評価方法。
【請求項２】
抗原提示細胞が株化された培養細胞である請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
抗原提示細胞がＴＨＰ−１細胞である請求項１又は２記載の評価方法。
【請求項４】
ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれる抗原提示細胞を、感作性物質及び被検物質と共にインキュベートし、当該細胞内に発現されたＣＤ８６又はＣＤ５４をコードする遺伝子を検出することを特徴とする該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インビトロでの被検物質の感作性を評価する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
従来、生体においてアレルギー等を誘発する物質（感作性物質）を評価する方法としては、例えば、Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ  ＢとＫｌｉｇｍａｎ    ＡＭが報告したモルモットＭａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎテスト（非特許文献１参照）のように、実験動物に被検物質を適用し（感作処理し）、後日当該被検物質を当該実験動物の皮膚等に、感作処理を行っていない動物には炎症反応が生じない濃度で適用したときに生ずる炎症反応を視察する方法が行われていた。しかしながら、実験動物を用いた方法は、評価時間やコストがかかるものであり、また動物の愛護等の見地からも望ましくない。従って、実験動物を用いないインビトロ評価方法の開発が求められていた。
【０００３】
一般に、感作とは、生体にある処置を行い何らかの反応性が増大すること（岩波書店刊、岩波生物学辞典  第２版、２１７頁）、具体的には過去において被曝した化学物質に対して、被曝していないヒト又は動物では炎症反応が生じない濃度で、当該化学物質に接触した場合に炎症反応が生じる現象をいう。そして、化学物質による個体の感作は、感作物質が抗原提示細胞を刺激して成熟させ、当該細胞表面に、プロセシングされた抗原を担持したＭＨＣクラスＩＩ蛋白質を発現させ、次いで当該細胞がＴ細胞に接触して抗原特異的なＴ細胞の増殖を促すことにより起こると考えられている。
【０００４】
化学物質の感作性の評価に際して重要な段階は、生体にとっての外来物質としての化学物質が生体内で感作の方向へ進むよう方向づけられる最初の段階であり、斯かる段階において役割を果たすのが皮膚ランゲルハンス細胞、単核球由来の樹状細胞、脾臓由来の樹状細胞等の抗原提示細胞である。しかしながら、これらの細胞を感作性試験に用いることは、抗原提示能という側面では優れているものの個体差や操作の煩雑さ等の問題がある。
【０００５】
一方、これらの抗原提示細胞から誘導された株化細胞は、安定的に用いることができるが、このような細胞株が上記抗原提示細胞と同様に感作性物質により刺激されて成熟し、感作物質の性質を反映して抗原提示を行うか否か明らかでない。
【０００６】
斯かる状況の下、感作性物質を作用させたときに単核球細胞表面に存在するＣＤ８６分子の増加量をフローサイトメトリーを用いて検出し、感作性を評価する技術が報告されている（特許文献１参照）。しかしながら、この方法では、細胞を被検物質に接触させ培養する時間が２４〜４８時間と長時間を必要とし、また細胞表面にはすでにＣＤ８６分子が存在しており、刺激後そのレベルが増加する程度を観察する当該方法では、Ｓ／Ｎ比が悪く精度が十分ではない。
【０００７】
本発明は、化学物質の感作性をより簡便に且つ精度良く評価できる方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００１−２２１７９６号公報
【非特許文献１】
Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，５２（３），２６８，１９６９
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、抗原提示細胞に感作性物質又は非感作性物質を作用させたときに生じる現象を詳細に検討したところ、特定の抗原提示細胞に感作性物質を作用させた場合に、当該細胞の内部に感作性物質の量や特性を反映してＣＤ８６分子又はＣＤ５４分子をコードしたｍＲＮＡが新たに発現され、斯かる遺伝子を検出することにより当該物質の感作性を簡易に且つ精度良く評価できることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれる抗原提示細胞を被検物質と共にインキュベートし、当該細胞内に発現されたＣＤ８６又はＣＤ５４をコードする遺伝子を検出することを特徴とする被検物質の感作性の評価方法を提供するものである。
【００１１】
また本発明は、ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれる抗原提示細胞を、感作性物質及び被検物質と共にインキュベートし、当該細胞内に発現されたＣＤ８６又はＣＤ５４をコードする遺伝子を検出することを特徴とする該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において用いる抗原提示細胞は、ヒト又は哺乳類動物の皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞から選ばれるものである。斯かる細胞は、感作性物質の特性を反映してその内部にＣＤ８６分子又はＣＤ５４分子をコードするｍＲＮＡを新たに発現する。
【００１３】
本発明において、皮膚ランゲルハンス細胞、単核球細胞及び樹状細胞は、いずれもヒト又は哺乳動物由来のものが用いられるが、特にヒト又はマウス由来のものを用いるのが好ましい。中でもヒト又はマウスの骨髄細胞や末梢血単球を、サイトカイン類を用いて樹状細胞に誘導して用いるのが好ましく、樹立された培養細胞を用いることが更に好ましい。樹立された培養細胞としては、ヒト末梢血由来ＨＬ−６０細胞、ヒト組織球由来Ｕ９３７細胞、ヒト骨髄由来ＫＧ−１細胞、ヒト末梢血単球由来ＴＨＰ−１細胞等が挙げられ、更にマウス表皮由来ＸＳ−５２細胞を挙げることができる。特に、樹立されたヒト培養細胞であって、公的な細胞バンク又は民間企業より容易に入手することができるＴＨＰ−１細胞は好適である。
【００１４】
斯かる抗原提示細胞を培養するための培地としては、これらの細胞を培養できる常用の任意の培地を使用することができるが、例えばＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地等が挙げられる。これらの培地にはおよそ１０％程度のウシ胎児血清を添加することができるが、適宜適当な増殖因子等のホルモン類を含有させて培養することができる。
尚、抗原提示細胞の初期濃度は、例えば１×１０２〜１×１０８細胞／ｍＬとするのが好ましく、特に１×１０５〜５×１０６細胞／ｍＬとするのが好ましい。
【００１５】
インキュベーションは、培地中の上記細胞に被検物質を加えて、例えばＣＯ２インキュベーター中で、約３７℃にて少なくとも３０秒間〜２４時間、好ましくは約３７℃にて３０分間〜１０時間、更に好ましくは約３７℃にて１時間〜４時間行えば良く、特開２００１−２２１７９６号公報に記載のように、必ずしも２４から４８時間の培養は必要としない。例えば、被検物質を加えて４時間インキュベーションした後、被検物質を含まない培地で更に６時間培養する方法で好適に実施することができ、これによれば、被検物質との接触は４時間であり、トータルの培養時間は１０時間である。被検物質との接触時間を短くできることにより、被検物質の細胞に対する毒性からの影響を最小限に抑えることができ、またトータルの培養時間を短縮できることからその利点は大きい。
【００１６】
本発明の評価方法は、抗原提示細胞内に発現されたＣＤ８６又はＣＤ５４をコードする遺伝子を検出し、その発現量を測定するものである。
ＣＤ８６分子又はＣＤ５４分子は、細胞表面に常時表現されているため、フローサイトメトリー等で表面抗原として検出する場合、ベースが高くなり、被検物質による増加分に対するＳ／Ｎ比が悪くなり検出精度に問題が残るが、ＣＤ８６分子又はＣＤ５４分子のｍＲＮＡレベルは低く、刺激を受けてはじめていずれの分子もｍＲＮＡの合成が亢進するので、被検物質による増加分はベースに比べ著しく高いシグナルとして検出でき、良好なＳ／Ｎ比を得ることができる。
【００１７】
ｍＲＮＡの検出は、通常遺伝子操作で用いられる方法のいずれの方法も用いることができる。すなわち、抽出した全ＲＮＡ又はオリゴｄＴカラム等を用いてｍＲＮＡにまで精製したＲＮＡのノーザンブロット、逆転写反応（ＲＴ）を実施した後に得られたｃＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ法で得られた産物の電気泳動、又は定量的ＰＣＲ法等を用いることができるが、このうち定量的ＰＣＲ法が好ましい。
【００１８】
斯くして検出されたＣＤ８６分子又はＣＤ５４分子をコードするｍＲＮＡの発現量は、後述実施例２に示すように強感作性物質２，４−ジニトロクロルベンゼン（ＤＮＣＢ）との４時間培養によって相対発現量として、ＣＤ８６で約３０倍、ＣＤ５４で約１５倍と、高いシグナルとして示されるが、非感作性物質ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の場合、実施例３に示すように、ＤＭＳＯ  １ｍｇ／ｍＬ存在下で培養した場合、ＣＤ８６が１．８３倍、ＣＤ５４が１．２１倍といずれも２倍弱でありほとんど変化しない。更に、水に溶けにくい物質、例えば実施例４に記載の如く中程度の感作性を有するヘキシルシンナムアルデヒド（ＨＣＡ）でも相対発現量５．１３と十分なシグナルとして観察できる。このようにＣＤ８６分子又はＣＤ５４分子をコードするｍＲＮＡの発現量は、感作性物質の量や特性を忠実に反映している。従って、本発明の方法によれば、ＤＮＣＢ、ＤＭＳＯ、ＨＣＡ等の化学物質や、感作性を調べることが必要な化粧品原料、香粧品原料、医薬品原料（化学物質、動植物エキス等）等、様々な被検物質の感作性を精度よく評価することができる。
【００１９】
また、上記評価方法において、抗原提示細胞を、既知の感作性物質及び被検物質と共にインキュベートして、当該細胞内に発現されたＣＤ８６又はＣＤ５４をコードする遺伝子を検出することにより、該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤をスクリーニングすることができる。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例１
ＴＨＰ−１細胞（大塚製薬株式会社より購入）を細胞培養液としてＲＰＭＩ１６４０（含１０％  ＦＢＳ）培地を用いて終濃度２×１０６細胞／ｍＬに調製した。更にＤＮＣＢを終濃度が６μｇ／ｍＬとなるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とＤＮＣＢ溶液を１：１に混合し、２４穴プレートに１ｍＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。ＤＮＣＢを培地に加えた細胞は、ＣＯ２インキュベーター中で培養し、２４時間まで適宜回収した。
培養後の細胞から、ＲＮＡ抽出試薬（ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン（株）社製））を添付のプロトコールに従って全ＲＮＡを取得した。すなわち、クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿の全ＲＮＡを回収した。このように調製した全ＲＮＡを用いて、ＣＤ５４及びＣＤ８６遺伝子の発現量をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００による定量的ＰＣＲにより解析した。尚、プライマーはＡＢＩ社が提供する専用プライマーを用いた。鋳型には、全ＲＮＡよりオリゴｄＴ（１２〜１８ｍｅｒ）をプライマーとして４２℃で５０分間逆転写反応を行って合成したｃＤＮＡを用いた。また、試料中のｃＤＮＡ濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子について同様の定量解析を行った。
【００２１】
結果を図１及び図２に示す。両図からわかるように２４時間の培養で、相対発現量がＣＤ８６で約２５倍、ＣＤ５４で約１４倍と、高いシグナルが得られた。更に１０時間の培養でシグナルの増加を観察できる。また、図１及び図２は同一の実験を、時期を別にして実施した結果であるが、良好な再現性が存在する。
【００２２】
実施例２
実施例１で示した方法によりＴＨＰ−１細胞培養液（終濃度：２×１０６細胞／ｍＬ）を調製し、更にＤＮＣＢを終濃度が６μｇ／ｍＬとなるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とＤＮＣＢ溶液を１：１に混合し、２４穴プレートに１ｍＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。
ＤＮＣＢを培地に加えた細胞は、ＣＯ２インキュベーター中で４時間培養し、その後被検物質を含有しない培地に交換し更に培養を続け、適宜細胞を回収した。
【００２３】
結果を図３に示す。図からわかるようにＤＮＣＢと４時間の培養であっても図１及び図２と同等の結果が得られ、被検物質との培養時間を短くすることが可能である。
【００２４】
実施例３
実施例１で示した方法によりＴＨＰ−１細胞培養液（終濃度：２×１０６細胞／ｍＬ）を調製し、更にＤＭＳＯを培養終濃度が２ｍｇ／ｍＬ又は２０ｍｇ／ｍＬとなるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とＤＭＳＯ溶液を１：１に混合し、２４穴プレートに１ｍＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。ＤＭＳＯを培地に加えた細胞は、ＣＯ２インキュベーター中で４時間培養し、その後、ＤＭＳＯを含有しない培地に交換し更に２０時間培養を続け細胞を回収した。培養後の細胞から、実施例１と同様の方法によりＲＮＡの抽出及び定量を行った。
結果は、無処理細胞の発現を１としたときの相対発現量で示すと、ＤＭＳＯ  １ｍｇ／ｍＬ存在下で培養した場合、ＣＤ８６が１．８３で、ＣＤ５４が１．２１であった。またＤＭＳＯ  １０ｍｇ／ｍＬ存在下で培養した場合、ＣＤ８６が１．９５で、ＣＤ５４が０．８６であった。この結果から、非感作性物質であるＤＭＳＯを感作物質ＤＮＣＢより高い濃度で培養してもＣＤ８６及びＣＤ５４分子をコードするｍＲＮＡの新たな発現を観察することはできなかった。
【００２５】
実施例４
実施例１で示した方法によりＴＨＰ−１細胞培養液（終濃度：２×１０６細胞／ｍＬ）を調製し、更にＨＣＡを一旦ＤＭＳＯに溶解させ、終濃度が６０μｇ／ｍＬ（２％ＤＭＳＯ）となるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とＨＣＡ溶液を１：１に混合し、２４穴プレートに１ｍＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。
ＨＣＡを培地に加えた細胞は、ＣＯ２インキュベーター中で４時間培養し、その後被検物質を含有しない培地に交換し更に培養を続け、適宜細胞を回収した。培養後の細胞から、実施例１と同様の方法によりＲＮＡの抽出及び定量を行った。
結果は、無処理細胞の発現を１としたときの相対発現量で示すと、ＣＤ８６が５．１３であり、十分なシグナルとして検出できた。このように水に難溶性の物質であってもＤＭＳＯに溶解させ用いることができる。
【００２６】
比較例
実施例１で示した方法によりＴＨＰ−１細胞培養液（終濃度：２×１０６細胞／ｍＬ）を調製し、更にＤＮＣＢを終濃度が６μｇ／ｍＬとなるように細胞培養液を用いて溶解した。細胞懸濁液とＤＮＣＢ溶液を１：１に混合し、２４穴プレートに１ｍＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。ＤＮＣＢを培地に加えた細胞は、ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養し回収した。
回収した細胞を、ＰＢＳを用いて洗浄し、更にＦＩＴＣで蛍光標識した抗ヒトＣＤ８６抗体又は抗ヒトＣＤ５４抗体を用いて４℃で３０分間染色した。染色した細胞を更にＰＢＳを用いて洗浄し、０．１％牛血清アルブミンと０．０１３％ソジウムアザイドを含むＰＢＳに浮遊させた。その細胞浮遊液を用いて生細胞１×１０４ｃｅｌｌｓの蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定し、溶媒対照と比較した。生細胞の検出はＰＩ染色により行った。
結果を図４に示す。この図から、相対発現量がＣＤ８６で約３倍、ＣＤ５４で約１．７倍に過ぎなかった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明の評価方法を用いれば、インビトロで様々な物質の感作性をより簡便に且つ精度良く評価でき、また既知感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＴＨＰ−１細胞でのＣＤ８６及びＣＤ５４ｍＲＮＡ発現の検出を利用した感作物質の評価の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＴＨＰ−１細胞でのＣＤ８６及びＣＤ５４ｍＲＮＡ発現の検出を利用した感作物質の評価の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、被検物質とＴＨＰ−１細胞を４時間培養し、その後更に被検物質を含まない培地で培養し、被検物質の影響を抑制した状態でＣＤ８６及びＣＤ５４ｍＲＮＡ発現の検出を利用した感作物質の評価の結果を示すグラフである。
【図４】図４はＴＨＰ−１細胞でのＣＤ８６及びＣＤ５４分子の細胞表面発現を、フローサイトメトリーを利用して検出した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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