(57)【要約】      （修正有）【課題】ペチュニア属植物の花持ち性を調節するための方法及び手段、並びにエチレン受容体遺伝子様核酸又はそのアンチセンスＤＮＡが導入された形質転換植物の検出方法を提供する。【解決手段】ペチュニア由来の特定の塩基配列からなるＤＮＡを含む核酸、並びに、ペチュニア属に属する植物由来のエチレン受容体遺伝子様核酸配列をコードするｃＤＮＡを構成するエキソン１とエキソン２との境界領域１、エキソン２とエキソン３との境界領域２、エキソン３とエキソン４との境界領域３及びエキソン４とエキソン５との境界領域４からなる群から選択される一の境界領域を形成する塩基又はその相補配列を含むプライマー１と、他の境界領域を形成する塩基又はその相補配列を含むプライマー２との組合せからなるプライマーセットであって、プライマー１及び２のうち一方をフォワードプライマーとして、他方をリバースプライマーとしてそれぞれ作製されるプライマーセット。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部を含む核酸
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相同性が９６％以上の塩基配列からなり、かつエチレン感受性に関与する機能を有する核酸
【請求項４】
配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部を含む核酸。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の核酸の全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるアンチセンス核酸。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の核酸の全部又は一部を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項５記載のアンチセンス核酸の全部又は一部を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の核酸又は請求項５記載のアンチセンス核酸を含む形質転換体。
【請求項９】
植物である請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
花卉植物である請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
花卉植物がペチュニア属に属するものである請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
野生型植物と比較して花持ち性が高められていることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の形質転換体から得られる種子。
【請求項１４】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の核酸又は請求項５記載のアンチセンス核酸を植物に導入することを特徴とする、植物の花持ち性を調節する方法。
【請求項１５】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の形質転換体又は請求項１３記載の種子を培養又は栽培し、植物体を再生することを特徴とする、形質転換植物の作出方法。
【請求項１６】
植物が花卉植物である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
植物がペチュニア属に属するものである請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項８記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からエチレン受容体を採取することを特徴とする、エチレン受容体の製造方法。
【請求項１９】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項５記載のアンチセンス核酸の一部の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
ペチュニア属に属する植物由来のエチレン受容体遺伝子様核酸配列をコードするｃＤＮＡを構成するエキソン１とエキソン２との境界領域１、エキソン２とエキソン３との境界領域２、エキソン３とエキソン４との境界領域３及びエキソン４とエキソン５との境界領域４からなる群から選択される境界領域を形成する塩基配列又はその相補配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
境界領域１を形成する塩基が配列番号１に示す塩基配列の９０８番のチミンと９０９番のチミンであり、境界領域２を形成する塩基が１２７３番のグアニンと１２７４番のアデニンであり、境界領域３を形成する塩基が１５４５番のチミンと１５４６番のアデニンであり、境界領域４を形成する塩基が１６６９番のシトシンと１６７０番のグアニンである、請求項２０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも９０８〜９０９番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも１２７３〜１２７４番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも１５４５〜１５４６番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも１６６９〜１６７０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項２３】
以下の（ａ）〜（ｇ）からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド。
（ａ）配列番号４に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列のうち少なくとも１６〜１７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号６に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列のうち少なくとも１４〜１５番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号８に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号９に示す塩基配列のうち少なくとも１６〜１７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｇ）配列番号１０に示す塩基配列のうち少なくとも１８〜１９番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項２４】
請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、請求項２若しくは３記載の核酸又は請求項５記載のアンチセンス核酸が導入された植物の検出用プローブ。
【請求項２５】
請求項２４記載のプローブと被検植物のＤＮＡとを反応させ、その反応産物を検出することを特徴とする、請求項２若しくは３記載の核酸又は請求項５記載のアンチセンス核酸が導入された植物の検出方法。
【請求項２６】
ペチュニア属に属する植物由来のエチレン受容体遺伝子様核酸配列をコードするｃＤＮＡを構成するエキソン１とエキソン２との境界領域１、エキソン２とエキソン３との境界領域２、エキソン３とエキソン４との境界領域３及びエキソン４とエキソン５との境界領域４からなる群から選択される一の境界領域を形成する塩基又はその相補配列を含むプライマー１と、他の境界領域を形成する塩基又はその相補配列を含むプライマー２との組合せからなるプライマーセットであって、プライマー１及び２のうち一方をフォワードプライマーとして、他方をリバースプライマーとしてそれぞれ作製されるプライマーセット。
【請求項２７】
境界領域１を形成する塩基が配列番号１に示す塩基配列の９０８番のチミンと９０９番のチミンであり、境界領域２を形成する塩基が１２７３番のグアニンと１２７４番のアデニンであり、境界領域３を形成する塩基が１５４５番のチミンと１５４６番のアデニンであり、境界領域４を形成する塩基が１６６９番のシトシンと１６７０番のグアニンである、請求項２６記載のプライマーセット。
【請求項２８】
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーと、以下の（ｅ）〜（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーとを含むプライマーセット。
（ａ）配列番号４に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるフォワードプライマー
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列のうち少なくとも１６〜１７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるフォワードプライマー
（ｃ）配列番号６に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるフォワードプライマー
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列のうち少なくとも１４〜１５番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるフォワードプライマー
（ｅ）配列番号８に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるリバースプライマー
（ｆ）配列番号９に示す塩基配列のうち少なくとも１６〜１７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるリバースプライマー
（ｇ）配列番号１０に示す塩基配列のうち少なくとも１８〜１９番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるリバースプライマー
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて被検植物のＤＮＡを増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、請求項２若しくは３記載の核酸又は請求項５記載のアンチセンス核酸が導入された植物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペチュニア属植物の花持ち性を改善するために有用で新規なエチレン受容体遺伝子様核酸に関する。また本発明は、上記核酸をコードするＤＮＡ又は該核酸のアンチセンス核酸を含む発現ベクター、上記核酸又はアンチセンス核酸を含む形質転換体、並びに該形質転換体から得られる種子に関する。さらに本発明は、植物の花持ち性を調節する方法、及び花持ち性が高められた植物の作出方法に関する。
【０００２】
また本発明は、エチレン受容体遺伝子様核酸又はそのアンチセンス核酸が導入された形質転換植物の検出方法、並びに検出用プローブ及びプライマーセットに関する。
【０００３】
【従来の技術】
これまでの研究において、いくつかのエチレン受容体遺伝子及びシグナル伝達系の下流遺伝子が同定されている。最も詳細に研究されているシロイヌナズナにおいては、５種類のエチレン受容体遺伝子ＥＴＲ１、ＥＲＳ１、ＥＴＲ２、ＥＲＳ２及びＥＩＮ４が単離され、その遺伝子から予想されるタンパク質の一次構造の特徴と塩基配列の相同性から２つのサブファミリーに分類されている。ＥＴＲ１とＥＲＳ１はＥＴＲ１サブファミリーに分類され、タンパク質のＮ末端に３つの疎水性ドメインを持つことを特徴とする。一方、ＥＴＲ２、ＥＲＳ２及びＥＩＮ４はＥＴＲ２サブファミリーに分類され、これらのタンパク質のＮ末端側には４つの疎水性ドメインがある。またサブファミリー内の塩基配列の相同性は高く、サブファミリー間の塩基配列の相同性は低い。
【０００４】
このエチレン受容体遺伝子の研究では、例えば、シロイヌナズナやトマトにエチレン受容体遺伝子のアンチセンスＤＮＡ又は変異エチレン受容体遺伝子を導入した形質転換体を作製し、その転換体のエチレン感受性が低下したことが報告されている（報告１という）。
【０００５】
一方、シロイヌナズナにおいてエチレンのシグナル伝達系のモデルが提唱されている。エチレンに応答する植物のエチレン受容体は、基本的にはシロイヌナズナと共通の機能を有すると考えられる。このモデルによれば、エチレンが結合する前の状態では、下流のエチレン応答性の遺伝子の発現が起こらず、追熟が進行しない。しかし、エチレンが受容体に結合すると、下流の遺伝子が活性化されてエチレンが結合することによる様々な反応が起こる。このモデルに従って、エチレン感受性を低下させる方法には、遺伝子導入により植物においてエチレン結合能を欠失した受容体を発現させる手法、及び植物において正常な受容体を過剰に発現させる手法が考えられる（江面浩，生物工学，第７８巻第８号，３１７〜３２１頁）。
【０００６】
上記報告１で用いられたアンチセンス法（又はコサプレッション法）について、上記シロイヌナズナのモデルに上記エチレン感受性を低下させる方法を当てはめて検討した場合には、エチレン感受性が高められるという結果になることが予想される。そのため、報告１による結果は、エチレンのシグナル伝達系のモデルとは異なる機構が働いていると考えられる。このように、現在までに単離されている複数のエチレン受容体遺伝子については、各々がコードするタンパク質の相互作用、存在様式、発現制御機構など、未だに不明な点が多い。
【０００７】
さらに、タバコ、トマト、ジャガイモなどが属するナス科植物においては、果実の登熟を遅らせるために、エチレン及びエチレン受容体が研究され、上記植物のエチレン受容体遺伝子が単離されている。しかしながら、ナス科植物においてエチレン受容体遺伝子と花の老化に関する研究はなされているものの（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，  Ｊ．Ｑ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．１５，  ４４４−４４７，  １９９７）、花持ち性の改善を目的としたエチレン受容体遺伝子はナス科植物からは単離されていない。
【０００８】
一方、外来遺伝子を導入した遺伝子組換え植物を実用化して市場に流通させる際には、厚生労働省による「食品衛生法」、及び農林水産省による「改正ＪＡＳ法」に従って、安全性確認はもちろん遺伝子組換え体であることを明示する必要性がある。現在（２００１年末）のところ、この法律は食品となるものについてのみ適用されているので、花卉品種であるペチュニアの遺伝子組換えを行った場合には適用されないと考えられる。しかしながらペチュニアは、ナス、ジャガイモ、トウガラシ、ピーマン、トマト等の主要野菜が含まれるナス科植物に属するため、遺伝子組換えペチュニアからの導入遺伝子が野菜類に伝達する可能性も否定できない。従って、遺伝子組換えペチュニアの実用化における安全性確保のためのツールとして、遺伝子組換え体及び組換えられた遺伝子を検出する技術を確立しておくことが望ましい。厚生労働省の「組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法」（平成１４年４月、９月に一部改訂）及び農林水産消費技術センター作成のＪＡＳ分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル」（平成１４年４月）によると、遺伝子の検出は「ＰＣＲ法による定性分析による」とされている。「組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法」を例に取ると、ＰＣＲ反応のブランク反応液として、プライマーを加えないもの並びにＤＮＡ試料液を加えないものについても、必ず同時に調製する必要がある。また、試料からＤＮＡが抽出されていることの確認として、各ＤＮＡ試料液ごとに、組換え遺伝子検出用プライマーの代わりに陽性対照用プライマー対を用い、同様にＰＣＲ増幅を行う必要もある。さらに、陽性対照用プライマー対、標的組換え遺伝子検出用プライマー対によりＰＣＲ増幅バンドが検出された場合、新たに同一のＤＮＡ試料液を用いてＰＣＲ反応液を調製し、確認用プライマー対（組換え遺伝子検出用とは別のプライマー対）を用いてＰＣＲ増幅を行わなければならない。この様な試験を行う場合、ＰＣＲ増幅断片の有無を明確に判定できることが必須である。また、組換え遺伝子の有無を検査する必要が生じた場合には、大量の試料を迅速かつ確実に判別することが要求される。
【０００９】
しかしながらエチレン受容体遺伝子は、天然の植物中にも存在するため、遺伝子を外部から再導入した組換え植物の場合には、一般的に遺伝子を増幅するように設計したＰＣＲプライマーでは天然の非組換え植物においても内在遺伝子由来の増幅産物が検出されてしまう。この問題は、外部から導入した遺伝子は通常ｃＤＮＡの形で導入されることから、外来遺伝子（ｃＤＮＡ）と内在遺伝子（ゲノムＤＮＡ）の増幅産物の長さの違いによって両者を区別することにより回避できると考えられる。しかし、この場合には増幅断片の長さを電気泳動等で比較し判定する操作が必須であるため、「増幅産物の有無」を判定する操作のみで簡便かつ客観的に判別することは難しい。これは同時に大量自動解析が困難であることを意味する。従って、内在遺伝子が存在する遺伝子を導入した形質転換体を簡便かつ明確に判定する方法が望まれている。
【００１０】
【特許文献１】特許第３１８３４０７号明細書
【特許文献２】特許第３０３００１５号明細書
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ペチュニア属植物の花持ち性を調節するための方法及び手段、並びにエチレン受容体遺伝子様核酸若しくはそのアンチセンス核酸、又はそれらの部分配列が導入された形質転換植物の検出方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を達成するため鋭意検討した結果、花持ち性に関与するエチレン受容体遺伝子様核酸をペチュニアから単離することに成功し、該核酸又はそのアンチセンス核酸を含むベクターを用いて植物を形質転換することにより、花持ち性が調節された形質転換植物を得ることが可能であることを見出した。また本発明者は、上記遺伝子のエキソン−エキソン境界領域を明らかにし、この領域の塩基配列を含むプライマー及びプローブを設計し、そのプライマー又はプローブを用いることによって、上記核酸又はそのアンチセンス核酸が導入された形質転換植物を簡便かつ明確に検出可能であることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつエチレンとの結合能を有するタンパク質
【００１４】
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする核酸である。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつエチレンとの結合能を有するタンパク質
【００１５】
本発明はまた、以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸である。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相同性が９６％以上の塩基配列からなり、かつエチレン感受性に関与する機能を有する核酸
【００１６】
また本発明は、配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部を含む核酸である。
さらに本発明は、上記核酸の全部又は一部を含む発現ベクターである。
【００１７】
本発明はまた、上記核酸の全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるアンチセンス核酸である。また本発明は、該アンチセンス核酸の全部又は一部を含む発現ベクターである。
【００１８】
さらに本発明は、上記核酸又は上記アンチセンス核酸を含む形質転換体である。ここで該形質転換体としては、特に限定するものではないが、植物、好ましくは花卉植物、特に好ましくはペチュニア属に属する植物が挙げられる。また該形質転換体は、野生型と比較して花持ち性が高められているものである。
本発明はまた、上記形質転換体から得られる種子である。
【００１９】
さらに本発明は、上記核酸又は上記アンチセンス核酸を植物に導入することを特徴とする、植物の花持ち性を調節する方法である。
【００２０】
またさらに本発明は、上記形質転換体又は上記種子を培養又は栽培し、植物体を再生することを特徴とする、形質転換植物の作出方法である。ここで該植物としては、花卉植物、好ましくはペチュニア属に属する植物が挙げられる。
【００２１】
本発明はまた、上記核酸又はアンチセンス核酸の一部の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
また本発明は、ペチュニア属に属する植物由来のエチレン受容体遺伝子様核酸配列をコードするｃＤＮＡを構成するエキソン１とエキソン２との境界領域１、エキソン２とエキソン３との境界領域２、エキソン３とエキソン４との境界領域３及びエキソン４とエキソン５との境界領域４からなる群から選択される境界領域を形成する塩基配列又はその相補配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【００２３】
上記オリゴヌクレオチドにおいて、例えば、境界領域１を形成する塩基は配列番号１に示す塩基配列の９０８番のチミンと９０９番のチミンであり、境界領域２を形成する塩基は１２７３番のグアニンと１２７４番のアデニンであり、境界領域３を形成する塩基は１５４５番のチミンと１５４６番のアデニンであり、境界領域４を形成する塩基は１６６９番のシトシンと１６７０番のグアニンである。
【００２４】
また上記オリゴヌクレオチドとしては、例えば以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるものが挙げられる。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも９０８〜９０９番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも１２７３〜１２７４番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも１５４５〜１５４６番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも１６６９〜１６７０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド
【００２５】
また上記オリゴヌクレオチドとしては、以下の（ａ）〜（ｇ）からなる群より選択されるものが挙げられる。
（ａ）配列番号４に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列のうち少なくとも１６〜１７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号６に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列のうち少なくとも１４〜１５番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号８に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号９に示す塩基配列のうち少なくとも１６〜１７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｇ）配列番号１０に示す塩基配列のうち少なくとも１８〜１９番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００２６】
さらに本発明は、上記オリゴヌクレオチドを含む、上記核酸又は上記アンチセンス核酸が導入された植物の検出用プローブである。
【００２７】
本発明はさらに、上記オリゴヌクレオチドプローブと被検植物のＤＮＡとを反応させ、その反応産物を検出することを特徴とする、上記核酸又はそのアンチセンス核酸が導入された植物の検出方法である。
【００２８】
さらに本発明は、ペチュニア属に属する植物由来のエチレン受容体遺伝子様核酸配列をコードするｃＤＮＡを構成するエキソン１とエキソン２との境界領域１、エキソン２とエキソン３との境界領域２、エキソン３とエキソン４との境界領域３及びエキソン４とエキソン５との境界領域４からなる群から選択される一の境界領域を形成する塩基又はその相補配列を含むプライマー１と、他の境界領域を形成する塩基又はその相補配列を含むプライマー２との組合せからなるプライマーセットであって、プライマー１及び２のうち一方をフォワードプライマーとして、他方をリバースプライマーとしてそれぞれ作製されるプライマーセットである。
【００２９】
上記プライマーセットにおいて、例えば、境界領域１を形成する塩基は配列番号１に示す塩基配列の９０８番のチミンと９０９番のチミンであり、境界領域２を形成する塩基は１２７３番のグアニンと１２７４番のアデニンであり、境界領域３を形成する塩基は１５４５番のチミンと１５４６番のアデニンであり、境界領域４を形成する塩基は１６６９番のシトシンと１６７０番のグアニンである。
【００３０】
また上記プライマーとしては、例えば以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーと、以下の（ｅ）〜（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーとを含むものが挙げられる。
（ａ）配列番号４に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるフォワードプライマー
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列のうち少なくとも１６〜１７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるフォワードプライマー
（ｃ）配列番号６に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるフォワードプライマー
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列のうち少なくとも１４〜１５番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるフォワードプライマー
（ｅ）配列番号８に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるリバースプライマー
（ｆ）配列番号９に示す塩基配列のうち少なくとも１６〜１７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるリバースプライマー
（ｇ）配列番号１０に示す塩基配列のうち少なくとも１８〜１９番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるリバースプライマー
【００３１】
さらに本発明は、プライマーセットを用いて被検植物のＤＮＡを増幅し、得られる増幅産物を検出することを特徴とする、上記核酸又はそのアンチセンス核酸が導入された植物の検出方法である。
【００３２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３３】
本発明者は、植物（例えばペチュニア属に属する植物）の花持ち性を調節するため、花持ちに関与する因子の１種であるエチレンに着目した。エチレンは、植物ホルモンとして、花の老化や果実の成熟促進に関与している。そのため、植物体内でエチレンの働きが高まると花の老化が進む。
【００３４】
本発明は、ペチュニア属に属する植物において、該植物のエチレン受容体遺伝子様核酸（Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１という）の発現を促進又は抑制することによって該植物体内におけるエチレンの働きを促進又は阻害し、植物の花持ち性を調節しようとするものである。
【００３５】
Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１は、上述したように、エチレン感受性に関与する機能を有し、ペチュニア属植物の花の老化に関与している。従って、内在性Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現が抑制されるよう形質転換された植物は、エチレンの働きが阻害される結果として花持ち性が高められることになる。
【００３６】
遺伝子の発現を抑制する手法としては、遺伝子のアンチセンス核酸を導入する手法（アンチセンス法）、ＲＮＡ干渉を利用する手法（ＲＮＡｉ）などが知られている。アンチセンス法は、目的遺伝子の配列にそのアンチセンス配列を特異的に結合させて、目的遺伝子の発現を抑えるというものである。このアンチセンス配列は、細胞ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに結合して翻訳又は転写をブロックすることにより、目的遺伝子の発現を阻害する。また別の手法としては、コサプレッションを利用する手法がある。コサプレッションとは、植物において、例えば恒常的かつ強力な発現を引き起こすプロモーターの下流に遺伝子をセンス方向で連結して植物に導入した場合に、導入された遺伝子と内在性遺伝子との双方の発現が抑制される現象である（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，  ＭＫ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅ，  Ａ  （１９９８），  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，  １４，  ２５５−８）。従って、本発明においては、強力なプロモーターにより制御されるＰｈｖｃ−ｅｒｓ１のセンスＤＮＡ、若しくはその核酸配列のアンチセンスＤＮＡ、又はそれらの部分配列のいずれかを植物に導入することにより、内在性Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現を抑制し、エチレンの働きを阻害して、花持ち性が高められた植物を作出する。これらのアンチセンス法及びコサプレッション法は、用いるＤＮＡ又はアンチセンスＤＮＡの塩基配列が、内在的に存在するエチレン受容体遺伝子の塩基配列と相同性が高いほど、その遺伝子の発現が抑制される確率は高くなる。従って、効率的に植物の花持ち性を高めるためには、使用するＤＮＡ又はアンチセンスＤＮＡを、内在性エチレン受容体遺伝子の塩基配列に基づいて作製することが望ましい。
【００３７】
またＲＮＡ干渉とは、二本鎖を形成しているＲＮＡ（以下、二本鎖ＲＮＡともいう）が細胞内に存在する場合に、そのＲＮＡの塩基配列に相同的な内在性のｍＲＮＡが分解されて、結果としてその細胞での遺伝子発現が特異的に抑制される現象であり、ＲＮＡインターフェアランス、ＲＮＡｉとも称される。このＲＮＡ干渉は、最初に線虫で報告され、その後ショウジョウバエ、植物、哺乳動物細胞などにおいても確認されている（例えば、Ｈａｎｎｏｎ，  ＧＪ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２年，第４１８巻，ｐ．２４４−２５１（ｒｅｖｉｅｗ）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  ＳＭ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１年，第４１１巻，ｐ．４９４−４９８；及びＭｃＣａｆｆｒｅｙ，  ＡＰ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２年，第４１８巻，ｐ．３８−３９参照）。例えばショウジョウバエにおいては、ヘアピン型の二本鎖ＲＮＡを作製し、これが細胞内で二本鎖ＲＮＡとして認識されて、内在性のｍＲＮＡが分解・破壊されるという手法が知られている。従って、本発明においては、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１に対して相同的な二本鎖ＲＮＡ（アンチセンス核酸）を植物に導入することにより、ＲＮＡ干渉を利用して内在性Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現を特異的に抑制することもできる。
【００３８】
一方、通常は、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１をセンス方向で植物に導入した場合には、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現は増強されることが予測される。このような場合には、花の老化が促進されて花持ち性が低下する。花持ち性が低下した植物は、種子を早く入手したい場合や植物のライフサイクルを早めることが望まれる場合などに有用である。
【００３９】
以下に、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の単離、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質の製造、発現ベクターの作製、及び形質転換体の作出について説明する。
【００４０】
１．Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の単離・同定
（１）ＲＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーの調製
Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１は、植物の組織から抽出した総ＲＮＡ又は精製したｍＲＮＡを用いて、公知の方法、例えばＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニングなどにより得ることができる。Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１は、主に植物の葉、蕾、花等に発現していることから、ＲＮＡの供給源としては、そのような組織を利用することができる。なお、発現量は低いが、これ以外の組織を用いることもできる。例えば、ＭＳ培地などで無菌的に培養した植物の組織又は組織培養細胞を用いることができる。本発明の主な目的は、花卉植物であるペチュニア属植物の花持ち性の調節であるため、核酸を単離するための供給源となる植物としては、ペチュニアに近縁な植物であれば特に限定するものではないが、好ましくは、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）に属する植物である。
【００４１】
ペチュニア属に属する植物としては、公知のものとして、例えばＰ．ｈｙｂｒｉｄａ種、Ｐ．ａｘｉｌｌａｒｉｓ種、Ｐ．ｉｎｆｌａｔａ種、Ｐ．ｖｉｏｌａｃｅａ種、及びＰ．ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａが挙げられる。
【００４２】
また本発明において「花卉植物」とは、観賞用に栽培する切花、切葉若しくは切枝類、鉢物類、花壇用苗物類、球根類、花木類、芝類などを指す。
【００４３】
ＲＮＡの調製は、例えば、上記植物の組織を材料として、通常行われる手法により行うことができる。例えば、液体窒素凍結した植物組織を乳鉢などで粉砕後、得られた粉砕物から、グアニジンチオシアン酸法、塩化セシウム法、セチルトリメチルアセチルブロマイド（ＣＴＡＢ）法などにより粗ＲＮＡ画分を抽出調製する。次いで、必要に応じてこの粗ＲＮＡ分画から、オリゴｄＴ−セルロースを担体とするアフィニティーカラム法、又はオリゴｄＴ固定化ラテックス粒子を用いた方法などにより、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得ることができる。植物組織から総ＲＮＡを調製するための市販のキットとしては、例えば  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）が挙げられる。
【００４４】
このようにして得られた総ＲＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー又はクローニング用に設計したプライマー、及び逆転写酵素を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次に、得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで発現ベクターを作製する。そしてこの発現ベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーを得ることができる。なお、ベクターとしてプラスミドを用いる場合は、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有することが必要である。また、プラスミド以外のクローニングベクター、例えばλファージ（λｇｔ１１等）を用いることもできる。
【００４５】
あるいは、上記のように調製したｍＲＮＡを鋳型として、市販のキット（例えば、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）を用いて、オリゴｄＴ２０及び逆転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで得られた二本鎖ｃＤＮＡに適切なアダプター又はカセット（例えば、ＥｃｏＲＩカセット（ＴＡＫＡＲＡ社製））を付加することにより、例えばＲＡＣＥ−ＰＣＲの鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。ＲＡＣＥ−ＰＣＲ法を行うためのキットとしては、例えば、５´／３´  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティック製）、３´−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ社製）、５´−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ社製）などを用いることができる。
【００４６】
（２）Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のクローニング
Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１をクローニングする方法としては、該核酸の断片を用いて、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲなどにより未知のＤＮＡ領域を明らかにし、最終的に全長ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅して、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１を含む増幅産物を適切なベクターにクローニングする方法が挙げられる。
【００４７】
Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の断片は、他のナス科植物のエチレン受容体遺伝子の塩基配列から設計したプライマー（例えば縮重プライマー）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲを行うことによって得ることができる。ナス科植物のエチレン受容体遺伝子としては、例えばタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ；アクセッションＮｏ．ＡＦ０３９９２１）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ；アクセッションＮｏ．Ｚ５４０９９）、ジャガイモ（Ｓｏｌｏｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ；アクセッションＮｏ．Ｕ３８６６６）などが知られている。ここでＲＴ−ＰＣＲ又はＲＡＣＥ−ＰＣＲで用いることのできる鋳型ＲＮＡとしては、上記（１）で調製した植物由来総ＲＮＡ又はｍＲＮＡが挙げられる。またＰＣＲで用いることのできる鋳型ＤＮＡとしては、上記（１）で調製したｃＤＮＡライブラリー、及びゲノムＤＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ製ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔなどを用いて調製可能）が挙げられる。
【００４８】
またプライマーの例として、ＲＴ−ＰＣＲを行うためのセンスプライマーとしては、ａｔｇｇａａｔｃｃｔｇｔｇａｔｔｇｃａｔｔｇａｇ（配列番号１１）、リバースプライマーとしてはｔｔａｃａｒａｃｔｙｃｔｔｔｇａｔａｇｃｇｔｔｇａ（配列番号１２）が挙げられる。上記プライマーはミックスプライマーであり、ｒはＡ又はＧ、ｙはＣ又はＴを表す。ただし、本発明においてはこれらのプライマーに限定されるものではなく、当業者であれば上記ナス科植物のエチレン受容体遺伝子の塩基配列に基づいて適当なプライマーを設計することができる。
【００４９】
上述のようにして得られたＰｈｖｃ−ｅｒｓ１の増幅断片を、例えばプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどのプラスミドベクターに連結した後、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などを形質転換することにより、この核酸をクローニングすることができる。
【００５０】
具体的には、使用し得るベクターとしては、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２等が挙げられる。増幅断片は、通常は末端にアデニン（Ａ）が付加する傾向があるため、ベクターは、例えばＥｃｏＲＶ等の平滑末端を生じる制限酵素で切断し、チミン（Ｔ）末端を付加することにより容易にクローニングできる（ＴＡクローニング法）。あるいは、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の増幅断片を、適当な制限酵素部位が導入されるように再度増幅し、その後、その制限酵素部位を利用してベクターに該増幅断片を挿入し、クローニングしてもよい。
【００５１】
大腸菌の形質転換は周知の方法を用いて行うことができる。ベクターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いた場合は、得られる形質転換体がアンピシリン耐性になり、同時に、βガラクトシダーゼをコードしている領域に外来遺伝子が挿入されることにより、βガラクトシダーゼ活性が欠失する。そのため、アンピシリン耐性で、かつＸ−ｇａｌを分解できない、白色のコロニーを形質転換体として選択できる（ブルー・ホワイトセレクション）。このようにして、ベクタープラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＰｈｖｃ−ｅｒｓ１が組み込まれたプラスミドを有する形質転換体を得ることができる。
【００５２】
また、形質転換体を培養し、例えばアルカリ−ＳＤＳ法等の周知の手段を用いることにより、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１が組み込まれたプラスミドを大量に調製することが可能である。
【００５３】
（３）Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の解析
上記（２）で得られたプラスミドベクターを用いて、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定は、ダイ・ターミネーター法などの周知の手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばＡＢＩ製  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒなど）を用いて配列決定を行う。塩基配列決定反応を行うためのキットとしては、例えば  ＢｉｇＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）などが市販されている。
【００５４】
配列番号１に、本発明のＰｈｖｃ−ｅｒｓ１の塩基配列を、配列番号２に、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１をコードするタンパク質（以下、「Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質」という）のアミノ酸配列を例示する。ただし、植物間でも品種等によって多少のアミノ酸配列の相違はあり得る。また、同一植物品種であっても突然変異等によってアミノ酸が変化する場合がある。よって、本発明では、配列番号２に示すアミノ酸配列のうち複数個（１〜数十個、例えば１〜３０個）のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつエチレンとの結合能を有するタンパク質も本発明に含まれる。
【００５５】
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のＰｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質に含まれる。
【００５６】
本発明において「エチレンとの結合能」とは、エチレン受容体タンパク質とエチレンとの結合能を指す。この機能は、エチレン受容体遺伝子を宿主細胞で発現させ、１４Ｃ−エチレンとの結合を測定することによって確認することができる。
【００５７】
さらに、上記Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか又は該ＤＮＡと相同性が９６％以上の塩基配列からなり、かつ、エチレン感受性に関与する機能を有する核酸配列も本発明のＰｈｖｃ−ｅｒｓ１に含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。本発明においてＰｈｖｃ−ｅｒｓ１に関するストリンジェントな条件とは、高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡのみが強くハイブリダイズする条件をいう。また本発明において「相同性」とは、当技術分野で公知の配列比較用プログラムを利用して計算される相同性を表す。例えばそのような配列比較用プログラムとしては、ジェネティックス・コンピュータ・グループ（ＧＣＧ）の配列解析パッケージに含まれるプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ＿ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ＿ｐａｃｋａｇｅ／）などが挙げられる。また「エチレン感受性に関与する機能」とは、本発明においては、内在性のエチレン受容体遺伝子の核酸（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）と核酸間相互作用することを指す。従って、本発明の核酸は、上記アンチセンス法、コサプレッション法、ＲＮＡ干渉法などにより、目的とする内在性エチレン受容体遺伝子の核酸と核酸間相互作用を起こし、その結果、その遺伝子産物の機能（すなわちエチレン結合能）に影響を与えうる。具体的に説明すると、本発明の核酸として、例えば、アンチセンスＤＮＡの導入を行った場合に、内在性エチレン受容体遺伝子から転写されるｍＲＮＡと特異的に結合可能なアンチセンスＲＮＡを作製することができる核酸配列が包含される。
【００５８】
また、「一部の配列」とは、上記Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の塩基配列の一部分を含むＤＮＡの塩基配列であって、該ＤＮＡがエチレンとの結合能を有するタンパク質をコードする又はエチレン感受性に関与する機能を有するものを指す。
【００５９】
また、本発明のＰｈｖｃ−ｅｒｓ１は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつエチレンとの結合能を有するタンパク質をコードする核酸である。
【００６０】
一旦本発明のＰｈｖｃ−ｅｒｓ１の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はＰｈｖｃ−ｅｒｓ１のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明のＰｈｖｃ−ｅｒｓ１を得ることができる。
【００６１】
このように単離されたＰｈｖｃ−ｅｒｓ１は、ペチュニア属植物におけるエチレン受容体遺伝子をコードするものである。従って、上述したようなアンチセンス法又はコサプレッション法を用いて植物の花持ち性を高めようとする場合に、導入するＤＮＡ又はアンチセンスＤＮＡをＰｈｖｃ−ｅｒｓ１の塩基配列に基づいて作製することによって、導入ＤＮＡ又はアンチセンスＤＮＡと内在的に存在するエチレン受容体遺伝子との配列相同性が高くなるため、他の遺伝子情報を利用する場合と比較して、より効率的かつ確実に花持ち性を高めることができる。
【００６２】
２．ベクターの構築、形質転換、及びＰｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質の製造
本発明のＰｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質は、前述した植物（例えばペチュニア属植物）の細胞又は組織から当技術分野で公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。また、当技術分野で公知の化学的ペプチド合成方法、例えば固相合成法などによって製造することもできる。また、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養し、得られる培養物から該タンパク質を採取することによって製造することもできる。このような遺伝子工学的手法を利用したタンパク質の生産方法は当技術分野で周知であり、以下に具体的に説明する。
【００６３】
（１）ベクターの作製
形質転換用の発現ベクターは、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はその一部を適当なベクターに連結することにより得ることができる。またこの発現ベクターを、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１が発現し得るように宿主中に導入することにより、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質を産生する形質転換体を得ることができる。「一部」とは、宿主中に導入されてＰｈｖｃ−ｅｒｓ１を発現することができるＰｈｖｃ−ｅｒｓ１の一部分を指す。
【００６４】
ベクターには、宿主において自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００６５】
ベクターにＰｈｖｃ−ｅｒｓ１を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００６６】
Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１は、その核酸配列の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、発現ベクターには、プロモーター、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。さらに、大腸菌及び酵母などの２種以上の宿主微生物で自律的増殖が可能なベクターのほか、各種のシャトルベクターを使用することもできる。このようなベクターについても、前記制限酵素で切断し、その断片を得ることができる。
【００６７】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後に連結させ、発現ベクターを作製する。
【００６８】
（２）形質転換
形質転換に使用する宿主としては、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、植物細胞、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００６９】
細菌を宿主とする場合は、発現ベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５αなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。細菌への発現ベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００７０】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されない。酵母への発現ベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００７１】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への発現ベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００７２】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への発現ベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００７３】
植物細胞を宿主とする場合に関しては、以下の「３．形質転換植物の作出、及び花持ち性の調節」の節において説明する。
【００７４】
（３）Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質の生産
本発明において、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質は、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１を保有する前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００７５】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００７６】
炭素源としては、炭水化物、有機酸、アルコール類が用いられる。窒素源としては、無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、又はその他の含窒素化合物が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００７７】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜５０時間行う。培養期間中、ｐＨは５〜７付近に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７８】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００７９】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８０】
培養後、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からＰｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質を単離精製することができる。
Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
【００８１】
３．形質転換植物の作出、及び花持ち性の調節
上記「１．Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の単離・同定」の節に記載のようにして得られたＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸の全部又は一部を植物宿主に導入し、形質転換植物を得る。本発明において、「Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンスが導入された植物又は形質転換体」とは、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１若しくはそのアンチセンス核酸、又はそれらの部分配列が導入されたものを包含する。部分配列とは、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸の一部の配列であって、植物に導入されて、内在性Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現を増強又は抑制することが可能な配列を指す。内在性Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現を増強又は抑制することにより、花持ち性を調節することができる。ここで「調節」とは、花持ち性を高める又は低下させることを指す。例えば、植物宿主のＰｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現を抑制することによって、花持ち性が高められた形質転換植物を作出することができる。一方、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現を増強することによって、花持ち性が低下した形質転換植物を作出することができる。
【００８２】
本発明において「花持ち性」とは、開花期間、すなわち花の寿命を意味する。また花持ち性が「高められた」又は「低下した」とは、天然（野性型）植物の花持ち性と比較して、それぞれ開花期間が「延長」又は「短縮」したことを意味する。
【００８３】
（１）形質転換のための植物宿主
本発明において植物宿主とは、植物培養細胞、栽培植物の植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）、又は植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）のいずれをも意味するものである。植物宿主として用いることのできる植物としては、特に限定されるものではないが、ペチュニア属植物由来のエチレン受容体遺伝子様核酸又はそのアンチセンス核酸を利用して花持ち性を調節するという本発明の目的を考慮した場合、ペチュニア属に属する植物が好ましい。ペチュニア属植物としては、上記「Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の単離・同定」の節に記載のものが挙げられる。
【００８４】
（２）発現ベクター
Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸の全部又は一部を含む発現ベクターは、適当なベクターに、この核酸又はそのアンチセンス核酸の全部又は一部を連結（挿入）することにより得ることができる。Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸を挿入するためのベクターは、植物宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡウイルス、バイナリーベクター系などが挙げられる。
【００８５】
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＢＵ１１０、ｐＴＰ５等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。また、アグロバクテリウム法（後述参照）を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター系（ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＳＭＡＫ２５１等）を使用することができる。
Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１は、上記「１．Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の単離・同定」の節に記載のようにして得ることができる。
【００８６】
またＰｈｖｃ−ｅｒｓ１のアンチセンス核酸としては、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなる核酸を例示することができる。ただし、本発明において用いるアンチセンス核酸は、植物宿主に導入されて、内在性Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現を抑制しうる限り、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して完全に相補的な配列である必要はない。従って、配列番号１に示す塩基配列の全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなる核酸とハイブリダイズし、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現を抑制する核酸を本発明においてアンチセンス核酸として利用可能である。さらに、アンチセンス核酸は、植物宿主に導入されて、内在性Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現（翻訳又は転写）を抑制又は阻害しうる限り、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列の一部分（部分配列）であってもよい。本発明においてアンチセンス核酸に関して、生体内でｍＲＮＡと二本鎖を形成させ、塩基配列特異的に発現を抑制させようとする場合、ハイブリダイゼーション条件は、センス配列と高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件であることが好ましい。また本発明においてアンチセンス核酸としては、ＲＮＡ干渉を引き起こす二本鎖ＲＮＡを用いてもよい。そのような二本鎖ＲＮＡの作製方法は、ＲＮＡ干渉と共に当技術分野で公知である。
また、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成方法は、「１．Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の単離・同定」の節に記載の通りである。
【００８７】
発現ベクターに、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸（全部又は一部）を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断した後、必要に応じて適切なリンカーを連結し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００８８】
Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこでベクターには、発現カセットとして、（ｉ）植物細胞内で転写可能なプロモーター配列、（ｉｉ）プロモーター配列の下流にＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸、並びに（ｉｉｉ）Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸の下流に結合された、転写の終結及びポリアデニル化に必要な配列を含むターミネーター配列を連結する。発現カセットには、プロモーター以外にも転写をさらに促進するためのＤＮＡ配列、例えばエンハンサー配列などのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。
【００８９】
用いられるプロモーターとしては、植物内で機能するものであれば特に制限されない。例えば、３５Ｓプロモーターなどの恒常的な発現のためのプロモーターや誘導可能なプロモーターを用いることも可能である。
【００９０】
また、必要に応じて転写終結を指令するターミネーターをＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸の下流に連結することもできる。ターミネーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス由来ターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターなどが挙げられる。ただし、植物内で機能することが知られているターミネーターであればこれに限定されるものではない。
【００９１】
さらに、効率的に目的とする形質転換植物を選択するために、有効な選択マーカー遺伝子を発現ベクターに連結することが望ましい。その際に使用する選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＴＰＩＩ）、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子などが挙げられる。
【００９２】
（３）形質転換植物の作出
本発明の形質転換植物は、上記（２）に記載の発現ベクターを、該ベクターに連結したＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸が機能し得るように植物宿主中に導入することにより得ることができる。
【００９３】
上記発現ベクターは、公知の種々の方法を用いて植物宿主に導入することができる。例えば、アグロバクテリウムを利用した間接導入法や、エレクトロポレーション法、ポリエチエレングリコール法、パーティクルガン法等の直接導入法を用いることができる。これらのうち、ペチュニア属に属する双子葉植物に対しては、アグロバクテリウムを用いる方法が安定な形質転換を確実に行える点から極めて有効である。この方法では、アグロバクテリウムが保持しているＴｉプラスミドの一部分であるＴ−ＤＮＡ領域が転移して植物のゲノムに組み込まれる。Ｔ−ＤＮＡの転移及び組み込みには、Ｔ−ＤＮＡの両端にある２５塩基対の不完全な繰り返し配列が必須である。従って、この境界配列の間に外来ＤＮＡを挿入することによって、植物ゲノムへ目的とするＤＮＡを取り込むことができる。また、Ｔ−ＤＮＡ領域の転移には、Ｔｉプラスミド上のＶｉｒ領域の遺伝子産物が必要である（植物遺伝子操作マニュアル，内宮博文ら編，講談社サイエンティフィク，１９８４）。
【００９４】
例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した発現ベクター（例えば、Ｔ−ＤＮＡ領域を有するｐＢＩ１２１などのバイナリーベクター）を、適当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）  Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ、ＥＨＡ１０５等、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＬＢＡ９４０２等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法などを利用して導入する。続いてこのアグロバクテリウム株を、フローラルディップ法、リーフディスク法などに従って植物宿主の無菌培養物に感染させて、形質転換植物を得ることができる。また、アグロバクテリウム感染法には、中間ベクター法、バイナリーベクター法などがあり、本発明においてはいずれの感染法を利用しても遺伝子導入を行うことができる。
【００９５】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官若しくは植物組織、又はそれらの切片、あるいはカルスやプロトプラストなどの種々の試料を使用することができる。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）等）を用いて処理することによって、植物宿主にＤＮＡを導入する。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
【００９６】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、発現ベクターをパーティクルガン法、エレクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。
【００９７】
組換え効率及び取り扱いの容易性の観点から、本発明の好ましい例として、以下にバイナリーベクター系を用いたアグロバクテリウム感染法による形質転換植物の作出を具体的に説明する。
【００９８】
アグロバクテリウム感染法によりＤＮＡを導入する場合、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１を含むプラスミドを保有するアグロバクテリウムを植物宿主に感染させる工程が必要である。
【００９９】
この工程をフローラルディップ法などのｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ法により行う場合には、形質転換対象の植物宿主を生育させ、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸を有するプラスミドを含むアグロバクテリウムを懸濁した溶液に植物宿主の花芽を直接浸漬し、その後植物を生育させて種子を収穫する。次いで、導入ＤＮＡ保有個体を選択するために、得られた種子を適切な抗生物質を加えたＭＳ寒天培地に播種する。この培地で生育した植物を鉢に移植し、生育させることにより、本発明のＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸が導入された形質転換植物を得ることができる（植物のゲノム研究プロトコール，佐々木卓治ら監修，秀潤社，２００１）。
【０１００】
一方、アグロバクテリウムを植物宿主に感染させる工程をリーフディスク法により行う場合には、無菌培養した植物宿主の無菌葉から採取したリーフディスクを、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸を含むプラスミドを保有するアグロバクテリウムの培養液に浸漬した後に、茎葉分化培地にて培養してカルスを形成させ、増殖させる。茎葉分化培地としては、例えばＭＳ培地等の公知の培地に植物ホルモンを添加したものを使用することができる。その後に選択用の茎葉分化培地を用いてカルスの選択を行う。選択用の培地としては、上記の茎葉分化培地にさらに、形質転換体の選抜のために例えばカナマイシンを、またアグロバクテリウムの殺菌のためにセフォタキシム等の殺菌剤を加えたものを使用すればよい。
【０１０１】
形質転換の結果得られるカルス、シュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能である。また従来知られている植物組織培養法を用いて、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）投与などにより植物体に再生させることができる。
【０１０２】
Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【０１０３】
Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現が増強された形質転換植物は、種子を早く入手したい場合や植物のライフサイクルを早めるために利用することができる。またＰｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現が抑制された形質転換植物は、花持ち性が高められているため、観賞用花卉植物として商業的に価値が高いものである。また本発明の形質転換植物に導入されるＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸は、ペチュニア属植物に内在的に存在するエチレン受容体遺伝子様核酸の情報から作製しており、そのため宿主としてペチュニア属植物を用いる場合には、このＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸を利用することによって、従来のエチレン受容体遺伝子情報を利用した場合よりも、効率的かつ確実に花持ち性を高めることが可能である。
【０１０４】
４．花持ち性が調節された植物
上記「３．形質転換植物の作出、及び花持ち性の調節」の節に従って作出された、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の発現が抑制された形質転換植物は花持ち性が高められており、該核酸の発現が増強された形質転換植物は花持ち性が低下する。
【０１０５】
この形質転換植物の花持ち性に関する評価は、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸を導入した形質転換植物と非形質転換植物（野生型植物）を同様の条件で栽培し、それぞれの開花から花枯れまでの期間を比較することにより行うことができる。例えば、ペチュニアの花持ち試験は、以下の方法により行うことができる。すなわち、開花後２日後までの花を試験に使用して、その花の花首から下約３ｃｍのところで茎を切り取り、花の部分を水の入ったフラスコ（例えば１００ｍｌ三角フラスコ）に入れ、これを２５℃の人工気室（１６時間明期、８時間暗期）内に置き、その後の花弁の変化を観察する。その他、花持ち性を評価する方法についての詳細な説明は、例えば、切り花の鮮度保持マニュアル（（財）日本花普及センター監修，（株）流通システム研究センター，１９９７）、切り花の鮮度保持（市村一雄著，筑波書房，２０００）などを参照されたい。
【０１０６】
さらに、上記のアグロバクテリウム感染細胞からの植物体の分化／誘導の手順を用いて、形質転換された植物体の組織（例えば、根、茎、葉）又は器官（例えば、生長点、花粉）を組織培養することによって、生殖過程（種子）を介することなく、さらなる形質転換植物を得ることができる。このような技術及び手順は当業者には公知であり、組織培養の一般的な方法は、種々の実験マニュアルに記載されている。
【０１０７】
このようにして作出した本発明の形質転換植物から得られる種子もまた正常に発芽及び成長し、そして花持ち性が調節されているものである。これは導入されたＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸が次世代においても保存されることを示し、それゆえこの調節された花持ち性が安定して後代に受け継がれることを示す。従って、本発明により、花持ち性が高められた（又は低下した）実用的で有用な植物が得られる。
【０１０８】
５．オリゴヌクレオチド
（１）概要
エチレン受容体遺伝子様核酸（Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１）は、非形質転換体（野生型植物）においても内在的に存在する核酸である。本発明者は、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸が導入された形質転換植物を検出するために、配列番号１において以下の境界領域に対応する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを設計し、これをプライマー又はプローブとして用いることとした。
【０１０９】
【化１】
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本発明において「境界領域」（境界部位ともいう）とは、ゲノム上で２つのエキソンがイントロンを挟んで離れて存在している場合、イントロンがスプライシングされた後に、２つのエキソンが結合したときの結合点（境界点）、すなわちスプライス部位を指す（図２）。
【０１１０】
図２に示すＰｈｖｃ−ｅｒｓ１のｃＤＮＡにおいて、エキソン１とエキソン２との境界を境界領域１、エキソン２とエキソン３との境界を境界領域２、エキソン３とエキソン４との境界を境界領域３、エキソン４とエキソン５との境界を境界領域４という。従って、境界領域１は、エキソン１の最も３´側の塩基とエキソン２の最も５´側の塩基により形成される。具体的には、エキソン１の最も３´側の塩基は、配列番号１に示す塩基配列の第９０８番目のチミンであり、エキソン２の最も５´側の塩基は、配列番号１に示す塩基配列の第９０９番目のチミンである。また、境界領域２は、エキソン２の最も３´側の塩基とエキソン３の最も５´側の塩基により形成され、具体的には、エキソン２の最も３´側の塩基は、配列番号１に示す塩基配列の第１２７３番目のグアニンであり、エキソン３の最も５´側の塩基は、配列番号１に示す塩基配列の第１２７４番目のアデニンである。また境界領域３は、エキソン３の最も３´側の塩基とエキソン４の最も５´側の塩基により形成され、具体的には、エキソン３の最も３´側の塩基は、配列番号１に示す塩基配列の第１５４５番目のチミンであり、エキソン４の最も５´側の塩基は、配列番号１に示す塩基配列の第１５４６番目のアデニンである。さらに境界領域４は、エキソン４の最も３´側の塩基とエキソン５の最も５´側の塩基により形成され、具体的には、エキソン４の最も３´側の塩基は、配列番号１に示す塩基配列の第１６６９番目のシトシンであり、エキソン５の最も５´側の塩基は、配列番号１に示す塩基配列の第１６７０番目のグアニンである。
【０１１１】
（２）オリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、上記のような１つの境界領域を挟む両側の領域（例えばエキソン１とエキソン２）の配列又はその相補配列を含むものである。従って、図２に示すように、オリゴヌクレオチドＤ〜Ｇ及びＨ〜Ｋは、それらの相補性に基づいて、境界領域に対しハイブリダイズするものである。本発明において、オリゴヌクレオチドに関して用いる「ハイブリダイズ」又は「ハイブリダイゼーション」とは、検出対象のＰｈｖｃ−ｅｒｓ１のｃＤＮＡに対し、その相補性に基づいて特異的に結合することを指す。オリゴヌクレオチドＤ〜Ｇは、検出対象のＰｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡに対し相補的な配列を有するものであり、導入されたＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はその部分配列とハイブリダイズするものである。一方、オリゴヌクレオチドＨ〜Ｋは、検出対象のＰｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡに対し相同的な配列を有するものであり、導入されたＰｈｖｃ−ｅｒｓ１のアンチセンス核酸又はその部分配列とハイブリダイズするものである。
【０１１２】
境界領域（境界部位）を挟む両側の配列、すなわち、境界領域を形成する配列（特に境界部の両隣りの配列）又はその相補配列を、以下「境界領域の塩基配列」という。
【０１１３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、上記のような境界領域の塩基配列を含むものであり、外来的に導入されたＰｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡ又はそのアンチセンス核酸（ｃＤＮＡ）のみとハイブリダイズすることができる。
【０１１４】
従って、このような境界領域の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った場合には、野生型植物（非形質転換体）のゲノムＤＮＡ由来の内在遺伝子のハイブリダイゼーションは起こらず、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡ又はそのアンチセンス核酸が導入された形質転換植物の場合にのみハイブリダイゼーションが起こり、それが検出される。従って、本発明のオリゴヌクレオチドを用いてＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸が導入された形質転換植物を検出する場合には、ハイブリダイゼーションが起こるかどうかの検出操作のみを行えばよい。そのため本発明のオリゴヌクレオチドを用いることにより、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸が導入された形質転換植物の検出を簡便かつ明確に行うことができる。
【０１１５】
（３）プライマーセット
また、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する場合、本発明のプライマーセットは、上記「（１）概要」の項に記載の１つの境界領域を挟む両側の領域（例えばエキソン１とエキソン２）の塩基配列を含むプライマーと他の境界領域を挟む両側の領域（例えばエキソン３とエキソン４）の塩基配列を含むプライマーとからなる。従って、図３に示すように、フォーワードプライマーＬ、Ｍ又はＮのいずれかと、リバースプライマーＯ、Ｐ又はＱのいずれかとが組み合わされたものが１つのプライマーセットとなる。フォーワードプライマーＬとリバースプライマーＯとを組み合わせた場合には増幅産物Ｌ−Ｏが得られ、フォーワードプライマーＬとリバースプライマーＰとを組み合わせた場合には増幅産物Ｌ−Ｐが得られ、フォーワードプライマーＭとリバースプライマーＰとを組み合わせた場合には増幅産物Ｍ−Ｐが得られ、フォーワードプライマーＭとリバースプライマーＱとを組み合わせた場合には増幅産物Ｍ−Ｑが得られ、フォーワードプライマーＮとリバースプライマーＱとを組み合わせた場合には増幅産物Ｎ−Ｑが得られ、そしてフォーワードプライマーＬとリバースプライマーＱとを組み合わせた場合には増幅産物Ｌ−Ｑが得られる（図３）。
【０１１６】
本発明の境界領域の塩基配列を含むプライマーは、図４Ａに示すように、３´から５´方向のＤＮＡを鋳型としてプライマーを作製する場合には、このプライマー配列がスプライス部位から５´側の部分（以下、５´側配列という）と３´側の部分（以下、３´側配列という）とからなるものである。プライマーの設計は、最初に３´側配列を決定する。３´側配列は、増幅対象であるＰｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡの境界領域から約２〜８塩基の配列からなるように設計する。プライマーは、鋳型ＤＮＡに対し相同的な場合と相補的な場合があり、一般にフォワードプライマーの場合は鋳型ＤＮＡに対し相同配列となり、リバースプライマーの場合は鋳型ＤＮＡに対し相補配列となる。一方、５´側配列は、オリゴヌクレオチドのＴｍからプライマーの長さを調整することを優先して、５´側配列の長さを決めてから設計する。従って、５´側配列は、増幅対象であるＰｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡの境界領域と対応する約１０〜４０塩基の配列からなるように設計する。このように設計した、境界領域の塩基配列を含むプライマーは、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡにアニーリングして、それを増幅することができる（図４Ａ）。
【０１１７】
続いて、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１ゲノムＤＮＡを鋳型とした場合について説明する（図４Ｂ）。ゲノムＤＮＡは、エキソンとイントロンを含むため、境界領域はイントロンによって分断されている。従って、本発明のプライマーの５´側配列は、ゲノムＤＮＡの分断された境界領域の一部とアニーリングすることができる。しかし３´側配列は、イントロン配列に対応する配列を含まないため、ゲノムＤＮＡのイントロンにアニーリングすることができない（図４Ｂ▲１▼）。ＤＮＡポリメラーゼによる増幅には、３´側配列のアニーリングが重要であるため、３´側配列がアニーリングできない場合には、ゲノムＤＮＡが増幅されることはない。また、本発明のプライマーの３´側配列は、約２〜８塩基と非常に短い配列であるため、３´側配列のみではゲノムＤＮＡにアニーリングすることはできない（図４Ｂ▲２▼）。従って、本発明の境界領域の塩基配列を含むプライマーは、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１ゲノムＤＮＡを増幅することができない。
【０１１８】
以上より、本発明の境界領域の塩基配列を含むプライマーは、外来的に導入されたＰｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡ又はそのアンチセンス核酸（ｃＤＮＡ）のみを特異的に増幅することができる。
【０１１９】
従って、このような境界領域の塩基配列を含むプライマーセットを用いて増幅反応を行った場合には、野生型植物（非形質転換体）のゲノムＤＮＡ由来の内在遺伝子の増幅は起こらず、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡ又はそのアンチセンス核酸が導入された形質転換植物の場合にのみ増幅が起こり、増幅産物が検出される。従って、本発明のプライマーセットを用いてＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸が導入された形質転換植物を検出する場合には、増幅産物が生成されるかどうかの検出操作のみを行えばよく、従来のように電気泳動によるゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの増幅断片の長さの違いを判別する操作は不要となる。そのため本発明のプライマーセットを用いることにより、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸が導入された形質転換植物の検出を簡便かつ明確に行うことができる。
【０１２０】
（４）ゲノムＤＮＡ及びスプライス部位の決定
境界領域の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（プライマー又はプローブ）を設計するため、まず、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のゲノムＤＮＡ配列及びスプライス部位（イントロン／エキソン境界領域）を決定する。
【０１２１】
Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のゲノムＤＮＡは、ペチュニア由来の全ゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて増幅することにより調製することができる。続いて、このように増幅したＰｈｖｃ−ｅｒｓ１ゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。このゲノムＤＮＡの塩基配列と、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のｃＤＮＡ配列（例えば配列番号１）とを比較することによって、イントロン配列及びスプライス部位（イントロン／エキソン境界領域）を特定することができる。上記塩基配列の比較は、当技術分野で公知の配列比較プログラムなどを用いて行うことができ、そのようなプログラムとしては、例えばＧＥＮＥＴＩＸ−ＭＡＣ１０．１（ソフトウエア開発株式会社）などが挙げられる。
【０１２２】
イントロン配列は、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の配列を解読して決定することが好ましい。ゲノムＤＮＡが長すぎるためにイントロン配列の全長を決定することができない場合には、プライマーウォーキング法を利用して全長配列を決定してもよい。プライマーウォーキング法は、当技術分野で公知の塩基配列決定法であり、決定しようとする全塩基配列の端から１回目の配列決定を行って約５００〜６５０ｂｐの領域（ただし、使用する塩基配列決定用の試薬、機器などの能力に応じて変化する）を解析し、続いて１回目の解析情報を利用してプライマーを設計し、そのプライマーを用いて２回目の配列決定を同様に行うというものである。この部分的な配列決定操作を繰り返すことによって全長の配列を決定することができる。
【０１２３】
上述した方法に従って決定したＰｈｖｃ−ｅｒｓ１のゲノムＤＮＡを配列番号３に示す。ＯＲＦ領域は３７８２塩基であり、そのうちｃＤＮＡ配列は１９１１塩基である（配列番号１）。また、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１（図１Ａ）と、公開されている２１８５塩基のシロイヌナズナＥＲＳ１遺伝子（図１Ｂ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション・ナンバーＵ２１９５２）とのスプライス部位の比較を図１に示す。図１に示すように、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のスプライス部位（境界領域）は、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のｃＤＮＡ配列（配列番号１）の９０８番（チミン）と９０９番（チミン）の間、１２７３番（グアニン）と１２７４番（アデニン）との間、１５４５番（チミン）と１５４６番（アデニン）との間、及び１６６９番（シトシン）と１６７０番（グアニン）との間の４箇所である。これら境界領域は、それぞれ図２及び３に示す境界領域１、境界領域２、境界領域３及び境界領域４に対応している。
【０１２４】
（５）オリゴヌクレオチドの設計
上記（４）に従って決定された境界領域（境界領域１〜４）の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを設計する。設計するオリゴヌクレオチドとしては、図２に示すように、８種類のオリゴヌクレオチド、すなわち境界領域１（Ｄ及びＨ）、境界領域２（Ｅ及びＩ）、境界領域３（Ｆ及びＪ）、並びに境界領域４（Ｇ及びＫ）の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１２５】
オリゴヌクレオチドを設計する際の条件は、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、プローブを設計する場合には、これに限定するものではないが、ロシュ・ダイアグノスティックス製のＤＩＧ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ３´Ｅｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔのようなキットに添付の説明書に従ってプローブとして使用可能なオリゴヌクレオチドを設計することができる。なお、プライマーとして使用可能なオリゴヌクレオチドの設計手法に関しては、以下（７）において詳細に説明する。
【０１２６】
プローブとして設計するオリゴヌクレオチドの長さは、合計約１２〜４０塩基であり、好ましくは１５〜３０塩基である。プローブとして用いるオリゴヌクレオチドは、相補性に基づいてＰｈｖｃ−ｅｒｓ１のｃＤＮＡとハイブリダイズ可能であれば、ＤＮＡプローブであってもＲＮＡプローブであってもよい。
【０１２７】
またオリゴヌクレオチドの合成法は当技術分野で周知である。例えば、ホスホロアミダイト法などの一般的なオリゴヌクレオチド合成法を用いることができる。
【０１２８】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、例えば以下のものが挙げられる：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも９０８〜９０９番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド（境界領域１に対応する）
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも１２７３〜１２７４番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド（境界領域２に対応する）
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも１５４５〜１５４６番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド（境界領域３に対応する）
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも１６６９〜１６７０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド（境界領域４に対応する）
【０１２９】
さらに具体的には、例えば以下の（ａ）〜（ｇ）のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
（ａ）配列番号４に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（境界領域１に対応する）
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列のうち少なくとも１６〜１７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（境界領域２に対応する）
（ｃ）配列番号６に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（境界領域２に対応する）
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列のうち少なくとも１４〜１５番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（境界領域３に対応する）
（ｅ）配列番号８に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（境界領域１に対応する）
（ｆ）配列番号９に示す塩基配列のうち少なくとも１６〜１７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（境界領域２に対応する）
（ｇ）配列番号１０に示す塩基配列のうち少なくとも１８〜１９番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（境界領域３に対応する）
【０１３０】
続いて、上述のようにして設計したオリゴヌクレオチドが、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることなく、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズ可能であるかどうかを試験する。本発明においては、上記設計したオリゴヌクレオチドが、（Ａ）ｃＤＮＡとハイブリダイズすること、及び（Ｂ）ゲノムＤＮＡとハイブリダイズしないこと、の２つを確認する。このような試験は、当技術分野で周知であり、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＴａｑＭａｎ（Ｒ）プローブのようなキットを利用することにより簡便に行い、オリゴヌクレオチドの機能を確認することができる。
【０１３１】
（６）ハイブリダイゼーション
本発明のハイブリダイゼーション方法は、エチレン受容体遺伝子様核酸配列（Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１）若しくはそのアンチセンス核酸、又はその部分配列が導入された形質転換体を検出するため、被検植物のＤＮＡを鋳型として、上記（５）で設計したオリゴヌクレオチドを用いてハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーションが検出された場合に、被検植物がＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸が導入された形質転換植物であると判定するものである。
【０１３２】
本方法においては、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸（ｃＤＮＡ）が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こる。従って、本方法により形質転換植物を検出しようとする場合には、ハイブリダイゼーションの有無を検出すればよい。本方法で用いられる被検植物としては、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸が導入されているか否かを検出しようとする植物であればいずれのものでもよく、特にペチュニア属植物が好ましい。上記被検植物から、当技術分野で周知の方法を使用してＤＮＡを抽出することができる。
【０１３３】
本発明において利用可能なハイブリダイゼーション反応の手法としては、上述したように、オリゴヌクレオチドプローブが検出対象のＤＮＡのみとハイブリダイズして、検出可能であればどのような手法でもよい。例えば、タックマン法は、ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ）の５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を利用するものであり、５´レポーター色素（例えば蛍光色素）と３´クエンチャー色素を有するオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応に導入し、そのＰＣＲ過程において、プローブが標的配列とハイブリダイズした場合には、ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼの５´−３´ポリヌクレオチド分解活性によって、プローブがレポーター色素とクエンチャー色素との間で切断され、その結果、レポーター色素がクエンチャー色素と分離することによって蛍光が増大するため、そのシグナルを蛍光検出器を用いて検出するものである。
【０１３４】
例えば、上記ハイブリダイゼーション反応は、市販のキットを用いて簡便に行うことができる。そのようなキットとしては、Ｔａｑ  Ｍａｎ（Ｒ）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などが挙げられる。
【０１３５】
上記ハイブリダイゼーションの検出には、ハイブリダイゼーションを特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、オリゴヌクレオチドプローブを標識して用いることにより、ハイブリダイゼーションを検出することができる。
【０１３６】
以上のようにしてハイブリダイゼーションが検出された場合には、被検植物が、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１遺伝子若しくはそのアンチセンス核酸、又はその部分配列が導入された形質転換植物であると判定する。
【０１３７】
（７）プライマーの設計
上記（４）に従って決定された境界領域（境界領域１〜４）の塩基配列を含むプライマーを設計する。設計するプライマーとしては、図３に示すように、３種類のフォーワードプライマー、すなわち境界領域１（Ｌ）、境界領域２（Ｍ）及び境界領域３（Ｎ）の塩基配列を含むプライマーと、３種類のリバースプライマー、すなわち境界領域２（Ｏ）、境界領域３（Ｐ）及び境界領域４（Ｑ）の塩基配列を含むプライマーが挙げられる。
【０１３８】
プライマーを設計する際の条件は、（Ａ）スプライス部位から３´末端までの鎖長（３´側配列の長さ）、及び（Ｂ）プライマーの融解温度（Ｔｍ）である。
【０１３９】
（Ａ）スプライス部位から３´末端までの鎖長
プライマーの配列が、スプライス部位から３´末端までの鎖長が長い場合には、ゲノムＤＮＡに対してもプライマーの３´側配列がアニーリングする可能性が高まると考えられる。そのためスプライス部位から３´末端までの鎖長が２〜８塩基となるように設計することが好ましい。
【０１４０】
（Ｂ）Ｔｍ（融解温度）
また設計の際には、プライマーのＴｍを確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意のオリゴヌクレオチドの５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型ＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してプライミング反応を効果的に起こすためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、アニーリング温度を下げすぎると非特異的増幅が起こるため、アニーリング温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、プライマーのＴｍは、増幅反応を行う上で重要な因子である。Ｔｍは、例えば以下に示す式に従って求めることができる：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６×ｌｏｇ１０［Ｓ］  ＋  ０．４１×（％ＧＣ）−（５００／ｎ）
〔式中、［Ｓ］は塩のモル濃度（Ｍ）を表し、（％ＧＣ）はプライマー配列中のＧＣ含量（％）を表し、ｎはプライマーの長さ（ｂｐ）を表す。〕
また本発明においては、プライマー配列中のＧとＣの総数に４を掛け、ＡとＴの総数に２を掛けて、その和の値をＴｍとする簡便法も利用可能である。
【０１４１】
Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができ、本発明で利用可能なプライマー設計用ソフトウエアとしては、例えばＯｌｉｇｏ  ５．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ４（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）などが挙げられる。本発明では、平均Ｔｍが約５０〜６０℃であることが好ましい。
【０１４２】
設計するプライマーの長さは、５´側配列と３´側配列とを合わせて合計約１２〜４０塩基であり、好ましくは１５〜３０塩基である。またプライマーの合成法は当技術分野で周知である。例えば、ホスホロアミダイト法などの一般的なオリゴヌクレオチド合成法を用いることができる。
【０１４３】
本発明のプライマーとしては、例えば以下のものが挙げられる：
（ａ）配列番号４に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるフォワードプライマー（境界領域１に対応する）
（ｂ）配列番号５に示す塩基配列のうち少なくとも１６〜１７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるフォワードプライマー（境界領域２に対応する）
（ｃ）配列番号６に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるフォワードプライマー（境界領域２に対応する）
（ｄ）配列番号７に示す塩基配列のうち少なくとも１４〜１５番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるフォワードプライマー（境界領域３に対応する）
（ｅ）配列番号８に示す塩基配列のうち少なくとも１９〜２０番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるリバースプライマー（境界領域１に対応する）
（ｆ）配列番号９に示す塩基配列のうち少なくとも１６〜１７番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるリバースプライマー（境界領域２に対応する）
（ｇ）配列番号１０に示す塩基配列のうち少なくとも１８〜１９番の塩基を含み、かつ連続した１５塩基以上の塩基配列からなるリバースプライマー（境界領域３に対応する）。
【０１４４】
上記プライマーのうち、本発明において特に好ましい組み合わせのプライマーセットは以下の通りである：
・プライマー（ａ）とプライマー（ｅ）    境界領域１〜２間が増幅される
・プライマー（ａ）とプライマー（ｆ）    境界領域１〜３間が増幅される
・プライマー（ｂ）とプライマー（ｆ）    境界領域２〜３間が増幅される
・プライマー（ｃ）とプライマー（ｇ）    境界領域２〜４間が増幅される
・プライマー（ｄ）とプライマー（ｇ）    境界領域３〜４間が増幅される
【０１４５】
（８）設計したプライマーの確認
続いて、上記（７）で設計したプライマーの確認試験を行う。本発明のプライマーは、形質転換体に導入されたＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸（すなわちｃＤＮＡ）のみを特異的に増幅するものでなければならない。従って、上記（７）で設計したプライマーを用いて、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のゲノムＤＮＡを増幅することなく、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のｃＤＮＡを特異的に増幅可能であるかどうかを試験する。
【０１４６】
本発明においては、上記設計したプライマーが、（Ａ）ｃＤＮＡを鋳型として増幅すること、及び（Ｂ）ゲノムＤＮＡを鋳型として増幅しないこと、の２つを確認する。
【０１４７】
（Ａ）ｃＤＮＡを鋳型とした増幅試験
本発明者は、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ増幅反応を行って特異的な増幅産物が得られる場合には、該プライマーがＰｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡを特異的に増幅できると判断した。
【０１４８】
従って、確認試験（Ａ）においては、ペチュニア属植物由来のｍＲＮＡを鋳型として上記（７）で設計したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行う。ｍＲＮＡの調製方法は、上記「１．Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１の単離・同定」の項に記載の通りである。ＲＴ−ＰＣＲは、市販のキットを用いて簡便に行うことができる。そのようなキットとしては、ＱＩＡＧＥＮ製  Ｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ、ＳＩＧＭＡ製  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｖｉａｎ  ＨＳ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔなどが挙げられる。
【０１４９】
またＲＴ−ＰＣＲの条件は、５０℃で３０分、９４℃で１５分の後、９４℃で１分、５０．０〜７０．５℃で１分及び７２℃で１分３０秒の増幅工程を３５サイクル行い、７２℃で１５分の伸長工程後、４℃ホールドである。ここで、５０．０℃〜７０．５℃として示す温度は、例えば５℃毎に数段階に設定し、反応の最適条件を検討することにより、最適温度を決定することができる。
ＲＴ−ＰＣＲ反応の結果、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のｃＤＮＡのサイズのバンドが１本だけ検出された場合に、特異的増幅反応が起こったと判定する。
【０１５０】
（Ｂ）ゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅試験
上記（７）で設計したプライマーを用いて、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅反応を行った場合に増幅産物が検出されないことを確認する。
【０１５１】
従って、確認試験（Ｂ）においては、ペチュニア属植物由来のゲノムＤＮＡを鋳型として上記（７）で設計したプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＤＮＡの調製方法は、当技術分野で公知であり、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法などが挙げられる。ＰＣＲは、市販のキットを用いて簡便に行うことができる。そのようなキットとしては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、サワディーテクノロジー製  Ｌｅｔ’ｓ  Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｋｉｔなどが挙げられる。
【０１５２】
またＰＣＲの条件は、９４℃で１５分の後、９４℃で１分、５０．０〜７０．５℃で１分及び７２℃で１分３０秒の増幅工程を３０サイクル行い、７２℃で１５分の伸長工程後、４℃ホールドである。ここで、５０．０℃〜７０．５℃として示す温度は、例えば５℃毎に数段階に設定し、反応の最適条件を検討することにより、最適温度を決定することができる。
【０１５３】
ＰＣＲ反応の結果、増幅産物が検出されなかった場合に、ゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応は行われなかったと判定する。
以上の確認試験（Ａ）及び（Ｂ）の両者を満たしたプライマーセットを本発明のプライマーセットとして用いることができる。
また本発明のプライマーセットは、ポリメラーゼ、緩衝液などと共にキットとしても使用可能である。
【０１５４】
（９）増幅反応
本発明の検出方法は、エチレン受容体遺伝子様核酸配列（Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１）若しくはそのアンチセンス核酸、又はその部分配列が導入された形質転換体を検出するため、被検植物のＤＮＡを鋳型として、上記（７）で設計したプライマーセットを用いて増幅反応を行い、増幅産物が検出された場合に、被検植物がＰｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸が導入された形質転換植物であると判定するものである。
【０１５５】
本方法においては、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸（ｃＤＮＡ）に特異的な断片のみを増幅する。従って、本方法により形質転換植物を検出しようとする場合には、増幅産物の有無のみを検出すればよい。プライマーとしては、上記（７）及び（８）で設計し、その機能を確認したプライマーセットを用いる。
【０１５６】
本方法で用いられる被検植物としては、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１又はそのアンチセンス核酸が導入されているか否かを検出しようとする植物であればいずれのものでもよく、特にペチュニア属植物が好ましい。上記被検植物から、当技術分野で周知の方法を使用してＤＮＡを抽出することができる。
【０１５７】
増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄＣｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等を挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。
【０１５８】
ＰＣＲ法は、被検植物に含まれるＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより、プライマーセットに含まれる一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。ＰＣＲ法によれば、変性、アニーリング及び合成からなるサイクルを繰り返すことによって、増幅断片を指数関数的に増幅させることができる。ＰＣＲの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、上記（７）において設計したプライマー（ａ）〜（ｇ）を用いてＰＣＲを行う場合には以下の通りである。
９０〜９７℃、好ましくは９３〜９５℃の変性工程を３０秒〜３分、好ましくは３０秒〜１分；３７〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃のアニーリング工程を２０秒〜１分、好ましくは３０秒〜１分；及び５０〜８０℃、好ましくは７０〜７５℃の伸長工程を１〜５分、好ましくは１〜２分、からなるサイクルを４〜４０サイクル。
【０１５９】
但し、鋳型ＤＮＡ及びプライマーを十分変性させるために、上記増幅サイクルの前に９４℃で１〜３分の変性工程を加えてもよく、また、増幅されたＤＮＡを完全に伸長するために、増幅サイクルの後に７２℃で２〜２０分の伸長工程を加えてもよい。さらに、増幅産物の検出を直ちに行わない場合は、非特異的な増幅が起こらないようにするために、増幅産物を４℃で保存する工程を加えることが好ましい。
【０１６０】
（１０）増幅産物の検出
上記増幅反応後の増幅産物の検出には、このような産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、増幅反応の過程で取り込まれるｄＮＴＰに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＴＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。
【０１６１】
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。
【０１６２】
本発明において、標識したｄＮＴＰを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。
【０１６３】
以上のようにして増幅産物が検出された場合には、被検植物が、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１若しくはそのアンチセンス核酸、又はその部分配列が導入された形質転換植物であると判定する。
【０１６４】
【実施例】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１６５】
〔実施例１〕ペチュニアのエチレン受容体遺伝子様核酸（Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１）のクローニング
ペチュニアのエチレン受容体遺伝子様核酸をクローニングするため、以下の実験を行った。
【０１６６】
（１）植物試料
市販のペチュニア種子（ｃｖ．  ｖｅｌｖｅｔ  ｃａｒｐｅｔ、福花園種苗）を人工気象器（コイトトロン；小糸製作所）中で２５℃、日照１６時間、湿度５０％で栽培した植物体を試料とした。
【０１６７】
（２）ペチュニアＲＮＡの調製
ペチュニア植物体（葉、蕾、花など）を１００ｍｇ程度採取し、液体窒素凍結下で粉砕した。ＱＩＡＧＥＮ製ＲＮＡ調製キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）を用いてキット添付の標準プロトコールに従ってＲＮＡを調製した。
【０１６８】
（３）クローニング用ＰＣＲプライマー
ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ＧｅｎＢａｎｋホームページ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＧｅｎＢａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に登録されている既知のＥＲＳ１遺伝子について、遺伝子解析ソフトのＧｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ１０．１（ソフトウエア開発株式会社）を使用して分子系統解析を行った。作成した分子系統樹のナス科クラスターより分類学的近縁と判断されるタバコ、トマト及びジャガイモの同遺伝子の配列を参考にしてＯＲＦの両末端部分の配列を持つ下記のプライマーを設計し合成した。
フォーワードプライマー
ＥＲＳ−Ｆ：ａｔｇｇａａｔｃｃｔｇｔｇａｔｔｇｃａｔｔｇａｇ  （配列番号１１）
リバースプライマー
ＥＲＳ−Ｒ：ｔｔａｃａｒａｃｔｙｃｔｔｔｇａｔａｇｃｇｔｔｇａ  （配列番号１２）
上記プライマーは、ミックスプライマーとして作成され、ｒはＡ又はＧ、ｙはＣ又はＴを表す。
【０１６９】
（４）ＲＴ−ＰＣＲ増幅
上記プライマーを用いてＱＩＡＧＥＮ製  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを使用してＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。反応液組成はキット添付の標準プロトコールに従い、Ｔａｋａｒａ製サーマルサイクラー（ＭＰ）を用いて実施した。ＰＣＲ条件は以下のとおりである。
５０℃  ３０分
９４℃  １５分
（９４℃      １分／５５℃      １分／７２℃  １分３０秒）×４０サイクル
７２℃  １５分
４℃
【０１７０】
（５）再ＰＣＲ増幅による制限酵素サイトの導入
クローニング用ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（ＴＯＹＯＢＯ）及び植物用バイナリーベクターであるｐＢＩ１２１へのクローニングを目的として、ＲＴ−ＰＣＲ増幅断片に制限酵素サイト配列を導入するため、制限酵素サイト配列（ＸｂａＩ、ＳａｃＩ、ＳｍａＩ）を付加した以下のプライマーを合成した。
フォーワードプライマー
Ｘｂａ−ＥＲＳ−Ｆ：ｇｃｔｃｔａｇａａｔｇｇａａｔｃｃｔｇｔｇａｔｔｇｃａｔｔｇａｇ（配列番号１３）
Ｓａｃ−ＥＲＳ−Ｆ：ｃｇａｇｃｔｃａｔｇｇａａｔｃｃｔｇｔｇａｔｔｇｃａｔｔｇａｇ（配列番号１４）
リバースプライマー
Ｓａｃ−ＥＲＳ−Ｒ：ｃｇａｇｃｔｃｔｔａｃａｒａｃｔｙｃｔｔｔｇａｔａｇｃｇｔｔｇａ（配列番号１５）
Ｓｍａ−ＥＲＳ−Ｒ：ｔｃｃｃｃｃｇｇｇｔｔａｃａｒａｃｔｙｃｔｔｔｇａｔａｇｃｇｔｔｇａ（配列番号１６）
Ｘｂａ−ＥＲＳ−Ｒ：ｇｃｔｃｔａｇａｔｔａｃａｒａｃｔｙｃｔｔｔｇａｔａｇｃｇｔｔｇａ（配列番号１７）
上記プライマーは、ミックスプライマーとして作成され、ｒはＡ又はＧ、ｙはＣ又はＴを表す。
【０１７１】
これらを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ増幅断片の再ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅時の増幅エラー（間違った塩基が取り込まれて増幅される）を防止するため、３´→５´エキソヌクレアーゼ活性を有する  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ、ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。反応液組成はキット添付の標準プロトコールに従い、Ｔａｋａｒａ製サーマルサイクラー（ＭＰ）を用いて実施した。ＰＣＲ条件は以下のとおりである。
９４℃      ２分
（９４℃      １分／５５℃      １分／７２℃  １分３０秒）×３０サイクル
７２℃  １５分
４℃
【０１７２】
（６）増幅断片の精製と制限酵素処理
得られたＰＣＲ増幅産物断片について、対応する制限酵素の組み合わせ（ＸｂａＩ−ＳａｃＩ、ＸｂａＩ−ＳｍａＩ）を用いて、ＰＲＯＭＥＧＡ製ＭＵＬＴＩＣＯＲＥバッファー中で３７℃で同時制限酵素消化を行った。また、クローニング・ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（ＴＯＹＯＢＯ）についても同様の処理を行った。０．８％アガロース・ゲルを用いてＴＡＥバッファーで電気泳動後、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色を行い、目的断片を確認した。目的断片部分をゲルごとメスで切出し、ＱＩＡＧＥＮ製  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲルより溶出・精製した。
【０１７３】
（７）クローニングベクターへの増幅断片の導入と増幅
Ｔａｋａｒａ製  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて、上記のＰＣＲ増幅断片と制限酵素消化したベクターのライゲーションを行った。ＴＯＹＯＢＯ製コンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）を付属プロトコールに従って上記ＤＮＡを用いて形質転換し、ＩＰＴＧ、Ｘ−ｇａｌ、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）添加したＬＢ培地で培養し、形質転換体を選抜した。出現したコロニーを釣菌してアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）添加したＬＢ培地で液体培養した。得られた菌体からＱＩＡＧＥＮ製  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを調製した。制限酵素処理後の断片の長さ比較及びＰＣＲ増幅により、インサートの確認を行い、目的断片がサブクローニングされたプラスミドを得た。
【０１７４】
（８）ＤＮＡシークエンサーによる塩基配列の確認
選られたプラスミドについてＡＢＩ製  ＤＮＡシークエンサー（３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）による塩基配列の確認を行った。シークエンス反応には  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＦＳキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。詳細な実験手順はＡＢＩ製のマニュアル（操作ガイド、２０００年８月版Ｒｅｖ．４．０）にしたがって実施した。
【０１７５】
（９）塩基配列の解析
得られた塩基配列は、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ／  ＡＴＳＱ  ３．０（ソフトウエア開発株式会社）を用いて解析・編集した。クローニングした全長配列を決定後、インターネット上のデータベースに照会し（ＧｅｎＢａｎｋ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＧｅｎＢａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、類似度の高い登録配列を探索した。これら（既知のＥＲＳ１遺伝子）の配列を用いて分子系統解析（遺伝子解析ソフト；Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ１０．１を使用）を行った。
【０１７６】
（１０）ペチュニアの各組識におけるＰｈｖｃ−ｅｒｓ１の配列の確認
４つの組織（葉・未熟な蕾・成熟した蕾・開花した花）より上記の方法でＲＮＡを抽出した。このＲＮＡより同様にＲＴ−ＰＣＲ増幅した断片を電気泳動後にゲルより切出し精製した。この断片をテンプレートとしてシークエンス反応を行い、ダイレクト・シークエンシングを行った。この方法で各組識由来のｃＤＮＡの全長配列をそれぞれ決定した（ただし「未熟な蕾」のみ部分配列を確認）。
【０１７７】
４つの組織（葉・未熟な蕾・成熟した蕾・開花した花）よりＲＮＡを抽出・精製し、ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって得た断片のｃＤＮＡの全長配列をそれぞれ決定した（ただし「未熟な蕾」のみ部分配列を確認）。
【０１７８】
実験データの解析の結果、この核酸配列は１９１１塩基対（６３７アミノ酸をコードする）のＯＲＦを有すると推定された。得られた配列をデーターベースに照会した結果、エチレン受容体ＥＲＳ１様遺伝子と相同性が高い遺伝子断片であることが判明した。特に、系統分類学的に近縁なタバコ及びトマトの同遺伝子と相同性が高いという結果が得られた。データーベース上で相同性がみられた植物由来の同遺伝子配列についてＮＪ法（近隣結合法）で分子系統樹を作成した。その結果、本実施例で得たエチレン受容体ＥＲＳ１様遺伝子の核酸配列（Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１）は、双子葉植物・ナス科植物クラスターに属し、分類学的位置関係とも一致した。このクラスターに属する植物種の遺伝子とのホモロジー（配列相同性）は、核酸レベルでタバコ、トマト及びジャガイモに対して、それぞれ９３．６％、９１．２％及び９１．１％であった。またアミノ酸レベル（核酸配列からの推定アミノ酸配列）で比較した場合にはそれぞれ９５．３％、９２．６％及び９２．１％であった。一方、メロン果実の日持ち性改良を目指した遺伝子導入に一般的に使用されたメロンＥＲＳ１に対しては、核酸レベルで７０．７％、アミノ酸レベルで７１．０％であることが判明した。この結果から、植物体に導入したときの効果において、ペチュニア由来とその他の植物由来とで差が生じる可能性がある（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  （１９９９）  ｖｏｌ．１１９，  ３２１−３２９）。
【０１７９】
（１１）Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のクローニング
上記（１０）に記載の方法で得た核酸断片をクローニングベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋））にクローニングし、ＤＮＡシークエンサーにより挿入位置及び挿入断片の核酸配列を確認した。この結果、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）中のＳｍａＩ−ＸｂａＩ間に３´→５´方向に挿入されたクローン（ｐＰｈｖｃ−ｅｒｓ１）を得た。この時点で、得られたペチュニアＥＲＳ１様核酸配列をＰｈｖｃ−ｅｒｓ１と命名した。
【０１８０】
〔実施例２〕Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のＯＲＦ両末端領域の決定
（１）植物試料及びペチュニアＲＮＡの調製
植物試料及びペチュニアＲＮＡの調製（葉組織由来）は、実施例１の（１）及び（２）に記載のように行った。
【０１８１】
（２）ＲＡＣＥ法
ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）は、市販のキット（ロシュ・ダイアグノスティク製５´／３´  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ）を用いて行い、目的の断片を得た。
【０１８２】
（３）ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ条件は、後述するように複数のアニーリング条件で同時検討し、良好な増幅産物が得られたものについて次の段階に使用した。３´ＲＡＣＥでは、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを実施した。
【０１８３】
最初に、実施例１で得られたＰｈｖｃ−ｅｒｓ１の推定配列に基づいて、そのＯＲＦ部分の両末端領域近傍を標的としたＰＣＲプライマーを設計した。ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲのために両末端用にそれぞれ複数個のプライマーを作製したが、目的領域の増幅に成功した際に使用したもののみを下記表１に記載した。
【０１８４】
【表１】
2004147511.tif 000003
【０１８５】
表１に示すプライマーを用いて、上記（１）で調製したペチュニア葉由来ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを鋳型として、Ｔａｋａｒａ製  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用してＰＣＲ増幅を行った。反応液組成はキット添付の標準プロトコールに従い、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製サーマルサイクラー（マスターサイクラーグラディエント）を用いて実施した。この装置はヒートブロック上に任意の（最大１２段階の）温度勾配を設定して反応を行う事ができるので、増幅効率と特異性に重要なアニーリング温度を５０．０℃から７０．５℃（約５℃毎に５段階；すなわち、５０．０℃、５５．５℃、６０．８℃、６６．０℃、及び７０．５℃）に設定し、その最適条件を検討した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
９４℃  １５分
（９４℃      １分／５０．０〜７０．５℃      １分／７２℃  １分３０秒）×３０サイクル
７２℃  １５分
４℃
【０１８６】
（４）増幅断片の精製
得られたＰＣＲ増幅産物断片について、２％アガロース・ゲル（０．８％は不適切）を用いてＴＡＥバッファーで電気泳動後、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色を行い、目的断片を確認した。目的断片部分をゲルごとメスで切出し、ＱＩＡＧＥＮ製ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてゲルより溶出・精製した。
【０１８７】
（５）クローニングベクターへの増幅断片の導入と増幅
Ｔａｋａｒａ製  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて、上記（４）で精製したＰＣＲ増幅断片とＴＡクローニング用（ＰＣＲ産物のクローニング用）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ製  ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２）のライゲーション（１６℃、一晩反応）を行った。ＴＯＹＯＢＯ製コンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）を付属プロトコールに従って形質転換し、ＩＰＴＧ、Ｘ−Ｇａｌ及びアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）添加したＬＢ培地で培養し、形質転換体を選抜した。出現したコロニーを釣菌してアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）添加したＬＢ培地で液体培養して得た菌体から、ＱＩＡＧＥＮ製  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを調製した。ゲル電気泳動によるインサートの確認を行い、目的断片がサブクローニングされたと予想されるプラスミドを得た。
【０１８８】
（６）ＤＮＡシークエンサーによる塩基配列の確認
使用したシークエンサー及び実験手順は実施例１の（８）に記載と同様にした。またシークエンシング用プライマーは、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ベクターのクローニングサイトの両端に存在するＴ７配列及びＭ１３配列を標的としたプライマー（Ｔａｋａｒａ製  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｔ７；ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号２３）及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４；ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ（配列番号２４））を使用した。
【０１８９】
（７）塩基配列の解析
得られた塩基配列は、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ／  ＡＴＳＱ  ３．０を用いて解析・編集した。実施例１においてクローニングしたｃＤＮＡ配列（１９１１塩基対）と比較してＯＲＦの両末端領域配列を再決定した。
【０１９０】
配列解析の結果得られたペチュニア由来Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１のｃＤＮＡ（ＯＲＦ領域）の塩基配列を配列番号１に、Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０１９１】
〔実施例３〕スプライス部位及びイントロン配列の決定
（１）植物試料及びペチュニアＤＮＡの調製
植物試料は、実施例１の（１）に記載のように行った。
またペチュニアＤＮＡ（葉組織由来）は、ペチュニア植物体（葉）を１００ｍｇ程度採取し、液体窒素凍結下で粉砕した後、ＱＩＡＧＥＮ製ＤＮＡ調製キット（ＤＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ）を用いてキット添付の標準プロトコールに従って調製した。
【０１９２】
（２）ＰＣＲ増幅
実施例１の（３）で設計したプライマーを用いて、上記（１）で調製したペチュニア葉由来ＤＮＡを鋳型として、Ｔａｋａｒａ製  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用してＰＣＲ増幅を行った。反応液組成はキット添付の標準プロトコールに従い、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製サーマルサイクラー（マスターサイクラーグラディエント）を用いて実施した。アニーリング温度及びＰＣＲ条件は実施例２の（３）と同様にした。
【０１９３】
（３）増幅断片の精製
ＰＣＲ増幅産物断片の精製は、０．８％アガロース・ゲルを用いた以外は実施例２の（４）と同様に行った。
【０１９４】
（４）ＤＮＡシークエンサーによる塩基配列の確認と解析
得られたＰＣＲ増幅産物断片について、実施例１の（８）と同様に塩基配列を確認した。
得られた塩基配列は、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ／  ＡＴＳＱ  ３．０を用いて解析・編集した。これまでにクローニングしたｃＤＮＡ配列（１９１１塩基対）と比較してイントロン配列及びスプライス部位を特定した。
【０１９５】
（５）プライマーウォーキングによる未知配列の解析
イントロン部分の配列は、隣接するエキソン領域に設計したプライマーによって両方の鎖（センス鎖／アンチセンス鎖）の配列を解読する事により決定した。イントロン部分の全域の解読ができない場合は、解析結果に基づきスプライシング領域近傍に新たにシークエンシング用プライマーを設計して解読を進めるプライマーウォーキング法により全長配列の決定を行った。この実験に使用したシークエンシング用プライマーを表２にまとめた。
【０１９６】
【表２】
2004147511.tif 000004
【０１９７】
配列解析の結果得られた塩基配列の情報に基づいて作成したＰｈｖｃ−ｅｒｓ１遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示した。染色体上にコードされる該遺伝子のＯＲＦ領域の長さは３７８２塩基（ｃＤＮＡ配列は１９１１塩基）と判明した。これはシロイヌナズナＥＲＳ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション・ナンバーＵ２１９５２）の２１８５塩基（ｃＤＮＡ配列は１８４２塩基）と比較すると著しく長い。また、ＥＲＳ１タイプの遺伝子の中で唯一イントロン配列の情報がデータベース上に公開されているシロイヌナズナＥＲＳ１とのイントロン領域の比較を図１に示す。
【０１９８】
〔実施例４〕内在／外来Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１を識別して検出可能なＰＣＲプライマーの設計
（１）植物試料及びペチュニアＲＮＡの調製
植物試料及びペチュニアＲＮＡの調製（葉組織由来）は、実施例１の（１）及び（２）に記載のように行った。
【０１９９】
（２）プライマーの設計
実施例３から、ペチュニアのゲノムＤＮＡにコードされるＰｈｖｃ−ｅｒｓ１の配列を決定しており、該遺伝子には４箇所のイントロンが存在することが明らかになった（図１）。
【０２００】
また、ゲノムＤＮＡから転写後にスプライシングを受けたｍＲＮＡには、切り出されたイントロンを挟んだ２つのエキソン間の境界領域（スプライス部位）が４箇所存在する（以下、それぞれ境界領域１、境界領域２、境界領域３、及び境界領域４と呼ぶ）。この４箇所の境界領域を標的としてプライマーを設計した。プライマーは、境界領域１においては、フォーワードプライマーのみ、境界領域２及び境界領域３においては、フォーワードプライマーとリバースプライマーの両方、境界領域４においては、リバースプライマーのみを設計した（図３）。また、プライマーの設計時には、スプライス部位から３´末端までの鎖長（３´側配列の長さ）と、プライマーのＴｍについて考慮し、合計３１種類のプライマーを設計及び合成し、そのうち表３に示す１１種類のプライマーを選択した。表３中、方向の欄に示す「Ｆ」はフォーワードプライマーを表し、「Ｒ」はリバースプライマーを表す。また、標的部位の欄に示す数字は、配列番号１に示すＰｈｖｃ−ｅｒｓ１遺伝子の塩基配列の番号を表し、鎖長の欄に示す数字は、スプライス部位からプライマーの３´末端まで（３´側配列）の鎖長を表す。
【０２０１】
【表３】
2004147511.tif 000005
【０２０２】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ増幅
上記（２）で設計したプライマーを用いて、上記（１）で調製したペチュニア葉由来ＲＮＡを鋳型として、ＱＩＡＧＥＮ製  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを使用してＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。反応液組成はキット添付の標準プロトコールに従い調製した。
2004147511.tif 000006
【０２０３】
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製  マスターサイクラー・グラディエントを用いて、５０．０℃〜７０．５℃の範囲で約５℃毎に５段階のアニーリング温度を設定し、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅条件を以下に示す。
▲１▼５０℃  ３０分
▲２▼９４℃  １５分
▲３▼（９４℃  １分／５０．０〜７０．５℃  １分／７２℃  １分３０秒）×３５サイクル
▲４▼７２℃  １５分
▲５▼４℃
【０２０４】
抽出したペチュニアのＲＮＡを鋳型にして、表３に示すプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。４箇所の境界領域を標的として設計したプライマーを用いて増幅されるＰｈｖｃ−ｅｒｓ１遺伝子のｃＤＮＡ断片は、境界領域１〜２間、境界領域１〜３間、境界領域１〜４間、境界領域２〜３間、境界領域２〜４間、及び境界領域３〜４間の６種類である（図３）。
【０２０５】
それぞれの境界領域間のＲＴ−ＰＣＲ増幅後のゲル電気泳動の結果、目的のサイズのバンドを１本のみ検出可能であったプライマーの組み合わせを表４に示す。表４中、Ｆの欄に示すアルファベットはフォーワードプライマーの名称を表し、Ｒの欄に示すアルファベットはリバースプライマーの名称を表す。また鎖長の欄に示す数字は、スプライス部位から３´末端まで（３´側配列）の鎖長を表す。
【０２０６】
【表４】
2004147511.tif 000007
【０２０７】
Ｔｍが６０℃程度となるように設計したプライマー（表３及び４参照）を用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った結果、境界領域１〜３間（図５Ａ）、境界領域２〜４間（図５Ｂ）、及び境界領域３〜４間（図５Ｃ）において目的のサイズの増幅産物のみが増幅され、特異的検出が可能となった。図５Ａ〜Ｃにおいて、各レーンは、レーン１：アニーリング温度５０．０℃、レーン２：アニーリング温度５５．５℃、レーン３：アニーリング温度６０．８℃、、レーン４：アニーリング温度６６．０℃、及びレーン５：アニーリング温度７０．５℃で得られた結果を示す。
【０２０８】
さらにＴｍを６０℃として設計したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った場合には、アニーリング温度５０．０〜７０．５℃の全範囲において非特異的な増副産物が見られる傾向にあった。そこで、プライマーのアニーリングが低い温度で起こるようにするため、Ｔｍの設定温度を６０℃以下に設定する方法を考察した。境界領域１〜２間、境界領域２〜３間において、Ｔｍの設定温度が６０℃以下になるように設計したプライマー（表３及び４参照）を用いて、上述したのと同様にＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。その結果、アニーリング温度７０．５℃では非特異的な増副産物が見られなくなり、境界領域１〜２間（図６Ａ）、及び境界領域２〜３間（図６Ｂ）においても、目的のサイズの増幅産物のみが検出され、特異的検出が可能となった。図６Ａ及びＢにおいて、各レーンは、レーン１：アニーリング温度５０．０℃、レーン２：アニーリング温度５５．５℃、レーン３：アニーリング温度６０．８℃、、レーン４：アニーリング温度６６．０℃、及びレーン５：アニーリング温度７０．５℃で得られた結果を示す。
【０２０９】
これらのことから、４箇所のそれぞれの境界領域を標的として設計したプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅により、外来遺伝子に相当するＰｈｖｃ−ｅｒｓ１遺伝子ｃＤＮＡの特異的検出が可能になった。
【０２１０】
〔実施例５〕ゲノムＤＮＡの存在下におけるＰＣＲ増幅条件の検討
ペチュニア葉由来のＤＮＡは、実施例３（１）に記載と同様にして調製した。
（１）ＰＣＲ条件の検討
Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅による特異的検出が可能となった至適アニーリング温度において（表３及び４参照）、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅を行う場合に、増幅産物が得られるか否かを検討した。そのために、実施例４で行ったＲＴ−ＰＣＲ増幅反応と反応溶液組成及びＰＣＲ反応条件などを同一条件にした比較実験を実施した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅で用いた酵素溶液（ＱＩＡＧＥＮ製）の中には、２種類の逆転写酵素  （Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）と  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  が含まれている。そこで、ＰＣＲ増幅にはｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ増幅で用いられている酵素（ＱＩＡＧＥＮ製  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を同じ濃度で用いた。
【０２１１】
条件の検討には、実施例１の（３）で設計したプライマーを用いた。
フォーワードプライマー
ＥＲＳ−Ｆ：ａｔｇｇａａｔｃｃｔｇｔｇａｔｔｇｃａｔｔｇａｇ（配列番号１１）
リバースプライマー
ＥＲＳ−Ｒ：ｔｔａｃａｒａｃｔｙｃｔｔｔｇａｔａｇｃｇｔｔｇａ（配列番号１２）
プライマーの添加量は、上記実施例４のＲＴ−ＰＣＲ反応液と同じ２．０μＭと、ＱＩＡＧＥＮ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒ  Ｔａｑ  ＰＣＲで推奨している量０．５μＭの２つの条件で比較した。
ＰＣＲ反応液中のマグネシウム濃度については、実施例４のＲＴ−ＰＣＲ反応液と同じ２．５ｍＭ（添加量１．０μｌ）と１．５ｍＭ（添加量０μｌ）の２つの条件で比較した。
以上をふまえ、以下の表５に示す４条件でＰＣＲ増幅を行った。
【０２１２】
【表５】
2004147511.tif 000008
【０２１３】
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製マスターサイクラー・グラディエントを用いて、５０．０℃〜７０．５℃の範囲で約５℃毎に５段階のアニーリング温度を設定し、増幅反応を実施した。ＰＣＲ条件を以下に記載する。
▲１▼９４℃  １５分
▲２▼（９４℃  １分／５０．０〜７０．５℃  １分／７２℃  １分３０秒）×３０サイクル
▲３▼７２℃  １５分
▲４▼  ４℃
【０２１４】
実施例４においてプライマーＥＲＳ−Ｆ及びＥＲＳ−Ｒ（それぞれ配列番号１１及び１２）を用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅の至適アニーリング温度は約５５〜６０℃であった。表５に示す４条件のＰＣＲ反応液を用いてアニーリング温度５５．５℃及び６０．８℃でＰＣＲ増幅行った結果、どの条件でもアニーリング温度６０．８℃での特異的検出が可能であった。これにより、今回設定したプライマーの添加量及びマグネシウム濃度では、特異的増幅に影響はないことが判明し、ＲＴ−ＰＣＲ増幅時とほぼ同じ条件を設定できたと考えられる。以上の結果に基づき、ＰＣＲ増幅の反応液組成については、実施例４のＲＴ−ＰＣＲ増幅と同じ、条件３を採用した。
【０２１５】
（２）Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１  ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅試験
ゲノムＤＮＡの存在下で、選択した７組のプライマーセット（表４参照）を用いて、それぞれの至適アニーリング温度（表４参照）で条件３を用いてＰＣＲ増幅を行った結果、増副産物は検出されなかった（図７参照）。このことから、これらのプライマーでは内在遺伝子は増幅されないことが確認できた。
【０２１６】
各レーンは、以下を表す：
レーン１：分子量マーカー（１ｋｂｐ）
レーン２：分子量マーカー（１００ｂｐ）
レーン３：プライマー１Ｆ−Ｓ１及び２Ｒ−Ｓ４を用いて境界領域１〜２間のｃＤＮＡを増幅した
レーン４：プライマー１Ｆ−Ｓ１及び２Ｒ−Ｓ４を用いて境界領域１〜２間のゲノムＤＮＡを増幅した
レーン５：プライマー１Ｆ−Ｓ１及び２Ｒ−Ｓ５を用いて境界領域１〜２間のｃＤＮＡを増幅した
レーン６：プライマー１Ｆ−Ｓ１及び２Ｒ−Ｓ５を用いて境界領域１〜２間のゲノムＤＮＡを増幅した
レーン７：プライマー１Ｆ−Ｓ１及び２Ｒ−Ｓ６を用いて境界領域１〜２間のｃＤＮＡを増幅した
レーン８：プライマー１Ｆ−Ｓ１及び２Ｒ−Ｓ６を用いて境界領域１〜２間のゲノムＤＮＡを増幅した
レーン９：分子量マーカー（１ｋｂｐ）
レーン１０：分子量マーカー（１００ｂｐ）
レーン１１：プライマー１Ｆ０及び３Ｒ０を用いて境界領域１〜３間のｃＤＮＡを増幅した
レーン１２：プライマー１Ｆ０及び３Ｒ０を用いて境界領域１〜３間のゲノムＤＮＡを増幅した
レーン１３：分子量マーカー（１ｋｂｐ）
レーン１４：分子量マーカー（１００ｂｐ）
レーン１５：プライマー２Ｆ−Ｓ１及び３Ｒ−Ｓ１を用いて境界領域２〜３間のｃＤＮＡを増幅した
レーン１６：プライマー２Ｆ−Ｓ１及び３Ｒ−Ｓ１を用いて境界領域２〜３間のゲノムＤＮＡを増幅した
レーン１７：分子量マーカー（１ｋｂｐ）
レーン１８：分子量マーカー（１００ｂｐ）
レーン１９：プライマー２Ｆ２及び４Ｒ０を用いて境界領域２〜４間のｃＤＮＡを増幅した
レーン２０：プライマー２Ｆ２及び４Ｒ０を用いて境界領域２〜４間のゲノムＤＮＡを増幅した
レーン２１：分子量マーカー（１ｋｂｐ）
レーン２２：分子量マーカー（１００ｂｐ）
レーン２３：プライマー３Ｆ０及び４Ｒ０を用いて境界領域３〜４間のｃＤＮＡを増幅した
レーン２４：プライマー３Ｆ０及び４Ｒ０を用いて境界領域３〜４間のゲノムＤＮＡを増幅した
【０２１７】
以上より、ペチュニアのＰｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡの境界領域の塩基配列を含むプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅により、外来遺伝子に相当するＰｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡの特異的検出が可能になった。また、このプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った場合、内在遺伝子として染色体にコードされるＰｈｖｃ−ｅｒｓ１（ゲノムＤＮＡ）の特異的検出はされないという結果となった。これらのことから、ペチュニアの内在／外来Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１を識別して特異的に検出可能なＰＣＲプライマーを設計することができた。
【０２１８】
【発明の効果】
本発明により、ペチュニア属に属する植物の花持ち性を調節することが可能となり、商業的に有用な植物が得られる。また本発明により、そのような形質転換植物を迅速かつ簡便に検出することが可能となる。
【０２１９】
【配列表】
2004147511.tif 000009
2004147511.tif 000010
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【０２２０】
【配列表フリーテキスト】
配列番号４〜６３：合成オリゴヌクレオチド
【図面の簡単な説明】
【図１】ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ×ｈｙｂｒｉｄａ）Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１（Ａ）とシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＥＲＳ１（Ｂ）のゲノムＤＮＡの構造を表す図である。
【図２】ペチュニアのエチレン受容体遺伝子様核酸（Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１）のｃＤＮＡにおける境界領域と、それに対応する本発明のオリゴヌクレオチドプローブの設計を示す図である。
【図３】ペチュニアのエチレン受容体遺伝子様核酸（Ｐｈｖｃ−ｅｒｓ１）のｃＤＮＡにおける境界領域と、それに対応する本発明のプライマーの設計を示す図である。
【図４】本発明のプライマーセットを用いたＰｈｖｃ−ｅｒｓ１のｃＤＮＡ（Ａ）及びＰｈｖｃ−ｅｒｓ１ゲノムＤＮＡの増幅を示す図である。
【図５】ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応によるＰｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡの特異的検出を示す電気泳動写真を示す。プライマーは、Ｔｍを６０℃に設定したものを使用した。
【図６】ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応によるＰｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡの特異的検出を示す電気泳動写真を示す。プライマーは、Ｔｍを５０〜５６℃に設定したものを使用した。
【図７】境界領域の塩基配列を含むプライマーを用いたＰｈｖｃ−ｅｒｓ１  ｃＤＮＡ及びＰｈｖｃ−ｅｒｓ１ゲノムＤＮＡの検出結果を示す電気泳動写真である。写真は、ｃＤＮＡが特異的に検出され、ゲノムＤＮＡが検出されないことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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