(57)【要約】      （修正有）【課題】代謝物質輸送の異常により生ずる疾患等の診断に役立つヒト又はラットＡＢＣＡ２遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドがコードするＡＢＣＡ２タンパク質、並びにかかる疾患の診断方法の提供。【解決手段】ヒト若しくはラット由来の特定のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はその１若しくは複数の塩基の置換、付加若しくは欠失により異なる塩基配列を有するポリヌクレオチド、及びＡＢＣＡ２遺伝子が関与する疾患を診断するための方法であって、前記ポリヌクレオチドの塩基配列と、被験体から得た生物サンプル中のＡＢＣＡ２遺伝子の塩基配列と、を比較することを含む方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの１若しくは複数の塩基の置換、付加若しくは欠失により該ポリヌクレオチドと異なる塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号：１に記載の塩基配列の塩基番号２５０〜７５５７からなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの１若しくは複数の塩基の置換、付加若しくは欠失により該ポリヌクレオチドと異なる塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター。
【請求項４】
請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチド又は請求項３に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項５】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列内の１若しくは複数のアミノ酸の置換、付加若しくは欠失により配列番号：２に記載のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するヒトＡＢＣＡ２タンパク質又はその誘導体。
【請求項６】
配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの１若しくは複数の塩基の置換、付加若しくは欠失により該ポリヌクレオチドと異なる塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号：４に記載の塩基配列の塩基番号６８〜７３６９からなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの１若しくは複数の塩基の置換、付加若しくは欠失により該ポリヌクレオチドと異なる塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター。
【請求項９】
請求項６もしくは７に記載のポリヌクレオチド又は請求項８に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項１０】
配列番号：５に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列内の１若しくは複数のアミノ酸の置換、付加若しくは欠失により配列番号：５に記載のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するラットＡＢＣＡ２タンパク質又はその誘導体。
【請求項１１】
ＡＢＣＡ２遺伝子が関与する疾患を診断するための方法であって、請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチドの塩基配列若しくは請求項５に記載のヒトＡＢＣＡ２タンパク質のアミノ酸配列、又は請求項６若しくは７に記載のポリヌクレオチドの塩基配列若しくは請求項１０に記載のラットＡＢＣＡ２タンパク質のアミノ酸配列と被験体から得たサンプル中のＡＢＣＡ２遺伝子の塩基配列又はＡＢＣＡ２タンパク質のアミノ酸配列とを比較するステップと、該塩基配列又はアミノ酸配列間で異なる塩基又はアミノ酸を同定することによりＡＢＣＡ２遺伝子が関与する疾患を診断するステップと、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、代謝物質輸送の異常により生ずる疾患等の診断に役立つヒト又はラットＡＢＣＡ２遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドがコードするＡＢＣＡ２タンパク質、並びにかかる疾患を診断するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内外の物質輸送に関与する遺伝子として、イオン、糖、アミノ酸、ポリペプチド等の輸送体であるＡＢＣトランスポータースーパーファミリー（ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリー）がある（Ｈｉｇｇｉｎ，  Ｃ．Ｆ．  （１９９２）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８．，  ６７−１１３  ）。このＡＢＣトランスポータースーパーファミリーは、２つの膜貫通ドメイン（ＭＳＤ）と２つの細胞質ヌクレオチド結合ドメインとからなる一群のタンパク質であり、細胞質内に存在する高度に保存されたＡＴＰ結合カセットを特徴とする（Ｄｅａｎ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，  Ｒ．  （１９９５）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  ５，  ７７９−７８５）。また、このファミリーに属するタンパク質は、原核生物及び真核生物を含む極めて広範囲の生物において、５００を超えるメンバーが同定されており、ヒトにおいては、ＭＤＲ１、ＭＲＰ、ｃＭＯＡＴ、ＣＦＴＲ、ＳＵＲ、及びＡＢＣＡＲなどが知られている（Ｈｉｇｇｉｎ，  Ｃ．Ｆ．，前掲；Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，Ｒ．，  Ｇｅｒｒａｒｄ，  Ｂ．，  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｄｅａｎ，  Ｍ．  （１９９６）  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ５，  １６４９−１６５５  ）。
【０００３】
このファミリーに属するタンパク質は、化学療法剤の輸送体としての多剤耐性タンパク質ＭＤＲ１活性を有するものやフリッパーゼとしてのＭＤＲ２活性を有するものがあり、生物において重要な機能を担っている（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，  Ｉ．  （１９９３）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６２，  ３８５−４２７；  Ｓｍｉｔ，  Ｊ．Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５，  ４５１−４６２  ）。特に、哺乳動物におけるＡＢＣトランスポータースーパーファミリーのタンパク質は、嚢胞性繊維症（Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ｄ．  Ｎ．  ａｎｄ  Ｗｅｌｓｈ，  Ｍ．  Ｊ．  （１９９９）  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ７９，  ２３−４５  ）、副腎脳白質ジストロフィー（Ｍｏｓｓｅｒ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６１，  ７２６−７３０）、新生児期の持続性高インスリン血症性低血糖症（Ｔｈｏｍａｓ，  Ｐ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８，  ４２６−４２９）、先天性黄疸（Ｐａｕｌｕｓｍａ，  Ｃ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１，  １１２６−１１２８）、及び肝臓内胆汁うっ滞（Ｓｔｒａｕｔｎｉｅｋｓ，  Ｓ．  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０，  ２３３−２３８  ）のような重大な疾患に関連しているので、臨床的に極めて重要なタンパク質群である。
【０００４】
このＡＢＣトランスポータースーパーファミリーにはいくつかのサブファミリーがあることが知られており、特に他のサブファミリーと異なる構造的特徴を有するものとしてＡＢＣＡ１サブファミリーがある（Ｌｕｃｉａｎｉ，  Ｍ．  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２１，  １５０−１５９）。このサブファミリーに属するメンバーとして、現在、４種のタンパク質：ＡＢＣＡ１（又はＡＢＣ１）（Ｌｕｃｉａｎｉ，  Ｍ．  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  前掲）、ＡＢＣＡ２（又はＡＢＣ２）（Ｌｕｃｉａｎｉ，  Ｍ．  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  前掲）、ＡＢＣＡ３（ＡＢＣ−Ｃ）（又はＡＢＣ３）（Ｋｌｕｇｂａｕｅｒ，  Ｎ．  ａｎｄ  Ｈｏｆｍａｎｎ，  Ｆ．  （１９９６）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３９１，  ６１−６５）及びＡＢＣＡＲ（又はＡＢＣＲ）（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  １５，  ２３６−２４６；  Ｉｌｌｉｎｇ，  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  １０３０３−１０３１０；  Ａｚａｒｉａｎ，  Ｓ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｔｒａｖｉｓ，  Ｇ．  Ｈ．  （１９９７）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４０９，  ２４７−２５２）が知られている。この中で、ＡＢＣＡ１及びＡＢＣＡＲはタンジール病（Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２２，  ３３６−３４５；  Ｂｏｄｚｉｏｃｈ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２２，  ３４７−３５１；  Ｒｕｓｔ，  Ｓ．，  ｅｔａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２２，  ３５２−３５５  ）及びシュタガルト黄斑部ジストロフィー（Ｋｌｕｇｂａｕｅｒ，  Ｎ．  ａｎｄ  Ｈｏｆｍａｎｎ，  Ｆ．  （１９９６），  前掲）の原因遺伝子であることが判明しており、各々細胞内コレステロール及びプロトン化Ｎ−レチニリデン−ホスファチジルエタノールアミンのためのフリッパーゼであると考えられている（Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｃ．Ｆ．  （１９９４）  Ｃｅｌｌ  ７９，  ３９３−３９５；  Ｗｅｎｇ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｃｅｌｌ  ９８，１３−２３）。このことから、ＡＢＣＡ１サブファミリーに属するタンパク質はフリッパーゼとして機能すると考えられている。
【０００５】
一方で、プログラム化された細胞死において、その死んだ細胞の取り込みに関連している線虫Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の遺伝子ｃｅｄ−７はＡＢＣＡ１サブファミリーのタンパク質と類似したタンパク質をコードしており、このＡＢＣＡ１サブファミリーのタンパク質も哺乳動物のアポトーシス細胞の取り込みに関連していることが示唆されている（Ｗｕ，  Ｙ．  Ｃ．  ａｎｄ  Ｈｏｒｖｉｔｚ，  Ｈ．  Ｒ．  （１９９８）  Ｃｅｌｌ  ９３，  ９５１−９６０）。
【０００６】
以上の通り、ＡＢＣトランスポータースーパーファミリー、特にＡＢＣＡ１サブファミリーに属するタンパク質は、生物にとって極めて重要な物質群であり、その遺伝子の異常は代謝物質の輸送等に異常をきたし、重大な疾患を引き起こす。この中で、ＡＢＣＡ２の異常は、例えば脂質輸送障害などの重大な疾患に結びつくと考えられている。
【０００７】
しかしながら、ＡＢＣＡ２は上述のように重大な疾患に関連し、これらの診断、治療等を行う上で極めて重要な物質であるにかかわらず、それが脳内に豊富に存在することが知られている（Ｌｕｃｉａｎｉ，  Ｍ．  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  前掲）だけであり、未だその塩基配列さえ決定されておらず、その遺伝子産物の完全な構造や機能については解明されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、ＡＢＣＡ２遺伝子の異常により生ずる疾患の診断又は治療に役立つ方法等を開発し、これを提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、このような問題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、ヒトＡＢＣＡ２遺伝子及びラットＡＢＣＡ２遺伝子の配列決定に成功し、これに基づいてかかる遺伝子の異常に関連する疾患の診断等に役立つ方法等を見いだし、本発明を完成させた。
【００１０】
したがって、本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの１若しくは複数の塩基の置換、付加若しくは欠失により該ポリヌクレオチドと異なる塩基配列からなるポリヌクレオチド、並びに配列番号：１に記載の塩基番号２５０〜７５５７の塩基配列からなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの１若しくは複数の塩基の置換、付加若しくは欠失により該ポリヌクレオチドと異なる塩基配列からなるポリヌクレオチドに関する。
【００１１】
また、本発明は、配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの１若しくは複数の塩基の置換、付加若しくは欠失により該ポリヌクレオチドと異なる塩基配列からなるポリヌクレオチド、並びに配列番号：４に記載の塩基番号６８〜７３６９の塩基配列からなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの１若しくは複数の塩基の置換、付加若しくは欠失により該ポリヌクレオチドと異なる塩基配列からなるポリヌクレオチドにも関する。
【００１２】
さらに、本発明は、これらのポリヌクレオチドを含有するベクター、これらのポリヌクレオチド又はベクターを保持する形質転換体、及びこれらポリヌクレオチドがコードするヒトもしくはラットＡＢＣＡ２タンパク質又はこれらの誘導体にも関する。
また、本発明は、ＡＢＣＡ２遺伝子が関与する疾患を診断するための方法であって、上述のポリヌクレオチドの塩基配列若しくは上述のヒトもしくはラットＡＢＣＡ２タンパク質のアミノ酸配列と被験体から得たサンプル中のＡＢＣＡ２遺伝子の塩基配列又はＡＢＣＡ２タンパク質のアミノ酸配列とを比較し、そしてこれらの塩基配列又はアミノ酸配列間で異なる塩基又はアミノ酸を同定することによりＡＢＣＡ２遺伝子が関与する疾患を診断することを含む方法にも関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
一態様において、本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：１の塩基番号２５０〜７５５７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＡＢＣＡ２タンパク質に関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：４の塩基番号６８〜７３６９の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるラットＡＢＣＡ２タンパク質に関する。
これら本発明によるポリヌクレオチド又はＡＢＣＡ２タンパク質は、被検体から得られたサンプル中の対応するポリヌクレオチド又はタンパク質と比較してＡＢＣＡ２が関与する疾患、例えば脂質代謝疾患を診断したり、かかる病気の治療法又は治療剤を開発したりするために用いることができる。
【００１５】
本発明おいて、ポリヌクレオチドとは、ヌクレオチドが鎖状に重合したもの、特にリボ核酸（ＲＮＡ  ）とデオキシリボ核酸（ＤＮＡ  ）とがある。ポリヌクレオチドは、当業者において慣用的に用いられている方法により、ヒトのサンプル等、自然界に存在するものから単離しても、化学的又は生物学的に合成してもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、適切な保護基やリン酸活性化試薬等を用いて、ジエステル法、リン酸トリエステル法、亜リン酸法又は固相法などにより合成することができる。特に、ＤＮＡ自動合成装置を用いて簡単に合成することができる。さらに、本発明によるポリヌクレオチドは、慣用的な方法、例えばＰＣＲ等により簡単に増幅することができる。
【００１６】
また、本発明によるタンパク質も、当業者において慣用的に用いられている方法により、自然界に存在するものから単離しても、化学的又は生物学的に合成してもよい。例えば、本発明によるヒト又はラットＡＢＣＡ２タンパク質は、後述するような組換えＤＮＡ技術等を用いることにより、本発明によるポリヌクレオチドを適切なプロモーター等と共に発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを大腸菌等の宿主にトランスフェクトし、その宿主を培養等した後に発現させることにより生産することができる。
【００１７】
これらのポリヌクレオチド又はタンパク質は、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、種々のクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー若しくはゲル濾過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動法等を用いて慣用の方法により生産することができる。
【００１８】
本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号：２又は配列番号：５に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列、特に配列番号：１又は配列番号：４の各々塩基番号２５０〜７５５７又は６８〜７３６９の塩基配列を有する。これらの塩基配列は、病気の診断及びその産物の機能の観点から、１若しくは複数の塩基の置換、付加若しくは欠失を行ったものであってもよい。例えば、配列番号：２又は５に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全長の塩基配列に対して、５％以下、好ましくは３％以下、更に好ましくは２％以下、最も好ましくは１％以下の塩基が置換、付加又は欠失されてもよい。例えば、１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、更に好ましくは３０塩基以下、最も好ましくは１０塩基以下の塩基が置換、付加又は欠失されてもよい。また、本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号：２又は配列番号：５に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列、特に配列番号：１又は配列番号：４の各々塩基番号２５０〜７５５７又は６８〜７３６９の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであってもよい。ハイブリダイズさせる条件は、低ストリンジェント条件、中ストリンジェント条件、又は高ストリンジェント条件のいずれかから選択することができる。
【００１９】
本発明によるタンパク質は、配列番号：２又は配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する。これらのアミノ酸配列は、その本質的機能を保持していれば、１若しくは複数のアミノ酸の置換、付加若しくは欠失を行った誘導体であってもよい。例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対して、５％以下、好ましくは３％以下、更に好ましくは２％以下、最も好ましくは１％以下のアミノ酸が置換、付加又は欠失されてもよい。具体的には、５０アミノ酸以下、好ましくは３０アミノ酸以下、更に好ましくは２０アミノ酸以下、最も好ましくは１０アミノ酸以下が置換、付加又は欠失されてもよい。
【００２０】
また、本発明は、上述のポリヌクレオチドを含有するベクターまたは上述のポリヌクレオチドもしくは前記ベクターを保持する形質転換体にも関する。これらは、本発明によるＡＢＣＡ２タンパク質を組換え生産するのに有用である。
すなわち、本発明によるＡＢＣＡ２タンパク質をコードするＤＮＡ、例えば配列番号：１又は４に記載のＤＮＡを適切なベクターに挿入し、該ベクターを適切な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、それから発現させた本発明によるタンパク質を単離・精製することにより本発明によるＡＢＣＡ２タンパク質を容易かつ大量に生産することができる。
【００２１】
具体的には、目的とする形質転換体の宿主が大腸菌である場合、ベクターとして、例えばｐＥＴ−３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ａ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ５６，  １２５−３５（１９８７））、ｐＧＥＸ−１（Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｋ．Ｓ．，  Ｇｅｎｅ  ６７．  ３１−４１（１９８８）  ）などのプラスミドベクターを用いることができる。大腸菌の形質転換は、慣用的な方法、例えばＨａｎａｈａｎ法（Ｈａｎａｈａｎ，  Ｄ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  １６６  ，  ５５７−５８０（１９８３）  ）や電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒ，  Ｗ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６，  ６１２７−６１４５（１９８８）  ）などを用いて行うことができる。精製を容易にするために、本発明による組換えタンパク質にタグのような標識を結合させることができ、例えばタンパク質のＮ末端にヒスチジン残基のタグやグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を結合させることができる。次にこれらは、融合タンパク質として合成して金属キレート樹脂やＧＳＴ親和性レジンに結合させることにより精製することができる（Ｓｍｉｔｈ，  Ｍ．Ｃ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，  ２６３  ，  ７２１１−７２１５（１９８８）  ）。これら融合タンパク質は、適切な酵素等、例えばトロンビンや血液凝固因子Ｘａなどで切断して目的のタンパク質を得ることができる。
【００２２】
宿主が分裂酵母シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ）である場合には、プラスミドベクターとしてｐＥＳＰ−１（Ｌｕ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ２００  ，  １３５−１４４（１９９７）  ）等を用いることができ、スフェロプラスト法（Ｂｅａｃｈ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，  Ｐ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９０  ，  １４０  （１９８１））や酢酸リチウム法（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，  ６４８５−６４８９  ）などで形質転換を行うことができる。ｐＥＳＰ−１を用いる場合、グルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合タンパク質として合成されるため、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることにより組換えタンパク質を精製することができる。これらの切断は、トロンビンや血液凝固因子Ｘａ等で行うことができる。
【００２３】
宿主が哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣由来細胞ＣＨＯやヒトＨｅＬａ細胞である場合、ｐＭＳＧ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などのベクターを用いて、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ，  Ｆ．Ｌ．  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒＥｂ，  Ａ．Ｊ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７  （１９７３））、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｕｓｓｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，  Ｇ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．４  ，  １６４１−１６４３  （１９８４））、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ，  Ｐ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４，  ７４１３−７４１７  （１９８７））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，１  ，  ８４１−８４５  （１９８２））等で組換えＤＮＡを導入することができる。
【００２４】
宿主が昆虫細胞である場合には、便利には、バキュウロウイルスベクターｐＢａｃＰＡＫ８／９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、例えばＢｉｏ／Ｔｅｃｈｂｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８０）記載の方法を用いて形質転換を行うことができる。
また、本発明によるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えばｃＤＮＡは、さらに、当該遺伝子又はポリヌクレオチドのクローニング又はＰＣＲによる増幅に利用することができる。さらに、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）や１本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）などの方法により、当該遺伝子又はｃＤＮＡの異常の検出に利用できる。
【００２５】
さらに、本発明によるポリヌクレオチド又はＡＢＣＡ２タンパク質は、以下に本発明の一態様として記載するように、その変異に起因する疾患を診断するために用いることができ、また遺伝子治療に用いることもできる。これは、レトロウイルスベクター（Ｄａｎｏｓ，  Ｏ．  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｒ．Ｃ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８５，  ６４６０−６４６４  （１９８８）；  Ｄｒａｎｏｆｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０，  ３５３９−３５４３  （１９９３））やアデノウイルスベクター（Ｗｉｃｋｈａｍ，  Ｔ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ７３，３０９−３１９  （１９９３））などのベクターを用いて、骨髄移植、皮下注射、静脈注射等で患者に投与することにより遺伝子治療を行うことができる（Ａｓａｎｏ，  Ｓ．，蛋白質核酸酵素，  ４０，  ２４９１−２４９５  （１９９５））。また、本発明によるポリヌクレオチド又はＡＢＣＡ２タンパク質は、ＡＢＣＡ２タンパク質が関与する疾患の新規治療法又は治療剤を開発するために用いることができる。
【００２６】
他の態様において、本発明は、ＡＢＣＡ２遺伝子が関与する疾患を診断するための方法であって、上述のポリヌクレオチドの塩基配列又はヒト若しくはラットＡＢＣＡ２タンパク質のアミノ酸配列と被験体から得た生物サンプル中のＡＢＣＡ２遺伝子の塩基配列又はタンパク質のアミノ酸配列とを比較し、これらの間で相違する塩基又はアミノ酸を同定することによりＡＢＣＡ２遺伝子が関与する疾患を診断することを含む方法に関する。
【００２７】
ここで、被検体とは、かかる疾患の診断が必要とされる対象をいい、特にヒト又はラットである。また、サンプルは、血液、尿、唾液等被検体からＡＢＣＡ２遺伝子又はその産物を採取できるものであれば特に限定されない。ＡＢＣＡ２遺伝子が関与する疾患とは、ＡＢＣＡ２遺伝子の異常、例えば、１又は複数の塩基欠失、付加又は置換により生ずる疾患をいう。
【００２８】
比較する方法は、両者の塩基配列又はアミノ酸配列の差を検出できる方法であれば、いずれの方法も用いることができ、当業者により慣用の方法で行うことができる。例えば、被験体から得た生物サンプルからＡＢＣＡ２遺伝子を単離し、ＰＣＲ等により増幅して、その塩基配列をシーケンサー等を用いて直接決定し、それを本発明によるポリヌクレオチドの塩基配列と比較してもよいし、その増幅したＡＢＣＡ２遺伝子のＤＮＡ／ＲＮＡと本発明によるポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせることにより行ってもよい。
【００２９】
【実施例】
＜実施例１＞  ラットＡＢＣＡ２の配列決定
（１）実験手順
１．ＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡのクローニング
（ラットＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡの翻訳開始部位と予想される位置に対してヌクレオチド＋２９５７〜＋５２１９に対応する）マウスＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡのフラグメント（Ｃｈｉｍｉｎｉ，Ｇ．ら（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２１，１５０−１５９）を、先に報告（Ｓｅｉｎｏ，Ｓら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，２６７９−２６８３）されているようにマウスの脳から抽出した全ＲＮＡを用いて、逆転写酵素によるポリメラーゼ鎖反応により増幅した。ラットｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の７．２×１０５  のプラークを、標準的ハイブリダイゼーション条件下でプローブとして３２Ｐ−ニックトランスレーションした部分的マウスｃＤＮＡフラグメントを用いてスクリーニングした。ここで、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬの音波処理し変性させたサケ精巣ＤＮＡ、１０％硫酸デキストラン、及び１×１０６  ｃｐｍ／ｍＬの３２Ｐ−標識化プローブ中で、４２℃で１６時間、行った（Ｓｅｉｎｏ，Ｓら，前掲）。そのナイロン膜を０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで、５０℃で１時間、洗浄し、その後オートラジオグラフィーを行った。ラットＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡの上流部分を得るために、プローブとして単離したラットＡＢＣＡ２クローンのＤＮＡフラグメントを用いて、先と同じライブラリーを再びスクリーニングした。ＤＮＡシークエンスは、適切なＤＮＡフラグメントをｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした後、Ｂｉｇｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることによりＡＢＩ３７７自動化ＤＮＡシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。両方の鎖を配列決定した。ラットＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡの５’末端を得るために、製造元の説明に従って５’ＲＡＣＥシステム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いることにより、ｃＤＮＡ端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）を行った。簡単に説明すると、第１鎖ＤＮＡは、アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＣＡＧＡＣＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＧＣ−３’（ラットＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡの翻訳開始部位と予想される部位に対してヌクレオチド３８３〜３６４）を用いてラット脳の全ＲＮＡから合成し、ＲＮａｓｅＨでの処理によりもとになったｍＲＮＡテンプレートを除去し、そして末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ及びデオキシＣＴＰを用いてそのｃＤＮＡの３’末端にホモポリマー尾部を加えた。その尾部ｃＤＮＡ末端を、第２のアンチセンスプライマー：５’−ＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＣ−３’（ラットＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡの翻訳開始部位と予想される部位に対してヌクレオチド２５５〜２３６）を用いてＰＣＲにより増幅し、その増幅したＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化し、次に配列決定した。ヒトＡＢＣＡ１    ｃＤＮＡの５’末端を得るために、製造元の説明書に従ってＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを用いてネスティドＰＣＲを行った。そのネスティドＰＣＲにおいて、アンチセンスプライマー：５’−ＧＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣ−３’（登録されたヒトＡＢＣＡ１    ｃＤＮＡのヌクレオチド１５１〜１３０）及びアンチセンスプライマー：５’−ＧＴＡＧＣＴＣＡＧＣＣＧＡＡＣＡＧＡＧＡＴＣ−３’（登録されたヒトＡＢＣＡ１    ｃＤＮＡの７８〜５７）を、各々第１及び第２のＰＣＲに用いた。その約４００ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、その配列を決定した。この配列決定した塩基配列を配列番号：４に、それから予想されるアミノ酸配列を配列番号：５に、そしてこれらの塩基配列とアミノ酸配列との対応関係を配列番号：６に示す。
【００３０】
２．ＲＮＡブロット分析
ＡＢＣＡ２  ｍＲＮＡの組織分布を決定するために、グアニジニウムイソチオシアネート／ＣｓＣｌ法（Ｓｅｉｎｏ，Ｓら，前掲）により種々のラット組織から全細胞ＲＮＡを調製した。ＲＮＡ転移ブロットのために、その種々のラット組織からの２０μｇの全ＲＮＡをホルムアルデヒドで変性し、１％アガロースゲルでの電気泳動にかけ、そしてナイロン膜に移した（Ｓｅｉｎｏ，Ｓら，前掲）。３２Ｐ標識化ＤＮＡフラグメント（ラットＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡの翻訳開始部位と予想される部位に対してヌクレオチド１３６９〜１８８８）とのハイブリダイゼーションを上述の通り行った。その膜を上述の通り洗浄し、増感紙と共に、−８０℃で４日間、Ｘ線フィルムに露出した。
【００３１】
３．細胞培養及びトランスフェクション
ＣＯＳ−１又はＣＯＳ−７細胞の培養及びトランスフェクションを、先に開示されるように行った（Ｂｒｙａｎ，Ｊ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，１１６６−１１７０；Ｓｅｉｎｏ，Ｓら（１９９６）Ｎｅｕｒｏｎ  １６，１０１１−１０１７）。簡単に説明すると、トランスフェクション前に、細胞を皿当たり２×１０５  細胞の密度で３５ｍｍ培養皿に２４時間、培養し、次に１０％ウシ胎児血清を補給したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改良Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（４５０ｍｇ／ｄＬ  グルコース）内で培養した。２μｇのラットＡＢＣＡ２発現ベクター（ｐＣＭＶｒＡＢＣＡ２）を、製造元の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）で細胞にトランスフェクトした。イムノブロット及びＡＴＰ結合分析のために、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）をコードするＤＮＡがｐＣＭＶｒＡＢＣＡ２内のＡＢＣＡ２のコーディング領域の３’末端に導入されているｐＣＭＶｒＡＢＣＡ２−ＨＡをＰＣＲを用いて構築した。
【００３２】
４．粗膜調製
粗膜を以前（Ｔａｋａｔａ，Ｋら（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６，１４４０−１４４４）に開示されるように調製した。簡単に説明すると、イムノブロット分析のために、ｐＣＭＶｒＡＢＣＡ２−ＨＡ又はｐＣＭＶベクターのみでのトランスフェクションの後３日目に、ＣＯＳ−１細胞をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で３回、洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル（１０ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液Ａに懸濁し、ホモジェナイズし、そして次に４℃で１時間、１０，０００×ｇで遠心した。そのペレットを５００μＬの緩衝液Ａに再度懸濁し、イムノブロット分析まで−８０℃で保存した。ＡＴＰ結合分析のために、以前に開示（Ｓｅｉｎｏ，Ｓ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２２９８３−２２９８６）されるように窒素キャビテーションを用いた他は同じ条件下でＣＯＳ−７細胞から粗膜を調製した。
５．イムノブロット分析
上述の通り、ｐＣＭＶｒＡＢＣＡ２−ＨＡ又はｐＣＭＶ単独をトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞から粗膜を調製した。その粗膜タンパク質（２０μｇ）をＳＤＳ還元サンプル緩衝液中で煮沸し、７％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、そして２００ｍＡで４℃で一晩、エレクトロブロッティングすることによりニトロセルロース膜（ＨｙｂｏｎｄＴＭＥＣＬＴＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した（Ｔａｋａｔａ，Ｋら（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６，１４４０−１４４４）。Ｎ−グリコシダーゼＦ処理のために、２０μｇの粗膜タンパク質を４ｕｎｉｔのＮ−グリコシダーゼＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）と共に３時間３７℃でインキュベートし、次に上述の通りＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びエレクトロブロッティングにかけた。その膜を室温で１時間、１×ＰＢＳ（１３６．９ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，１０．１ｍＭ  Ｎａ２  ＨＰＯ４  及び１．８ｍＭ  ＫＨ２  ＰＯ４  ）及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０からなる１×ＰＢＳ−Ｔ（ｐＨ７．４）中５％脱脂乳においてブロックした。１×ＰＢＳ−Ｔで洗った後、その膜を１：１０００に希釈した抗ＨＡ高アフィニティーラット抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）と共に、２時間、室温でインキュベートした。１×ＰＢＳ−Ｔで洗った後、その膜を１：８００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼが結合した抗ラットＩｇＧ（Ｂｉｏｓｙｓ）と共に、１時間、インキュベートした。０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳ、そして次に１×ＰＢＳ−Ｔで洗った後、製造元の説明書に従って、増強ケミルミネセンスシステム（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてタンパク質を検出した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。
【００３３】
６．８−アジド［  α−３２Ｐ］  ＡＴＰとのＡＢＣＡ２の相互作用
ＡＢＣＡ２−ＨＡ融合タンパク質を一時的に発現するＣＯＳ−７細胞からの膜タンパク質（５０μｇ）を、３ｍＭ  ＭｇＳＯ４  （又は１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）又は２ｍＭ  ＡＴＰの存在又は欠如下で０℃で１０分間、全量６μＬの、５０μＭ  ８−アジド−［  α−３２Ｐ］  ＡＴＰ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、２ｍＭ  ウアバイン、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、及び４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）とインキュベートした。タンパク質を氷上で（２５４ｎｍ、５．５ｍＷ／ｃｍ２  で）５分間、ＵＶ照射した。ＡＢＣＡ２−ＨＡ融合タンパク質を抗ＨＡ抗体で免疫沈降させた。サンプルを７％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグラフを撮った。
【００３４】
７．イン・シトゥ・ハイブリダイゼーション
２月齢のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔し（５０ｍｇ／ｋｇ体重、ｉ．ｐ．）、断頭により殺した。その脳を迅速に除去し、液体窒素で凍結して、使用するまで−７０℃で保存した。凍結した７μｍ厚の矢状断をｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ５００）で切断し、３−アミノプロピルトリエトキシシラン−コート化スライド上で解凍してマウントした。３１１ｂｐ  ＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡフラグメント（ラットＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡの翻訳開始部位と予想される部位に対してヌクレオチド４５９３〜４９０３）を含むプラスミドをＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼで転写し、［３５  Ｓ］  ＣＴＰ（１２５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ）で標識してアンチセンスｃＲＮＡプローブを作った。同じプラスミドをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で転写してセンスプローブを作った。そのハイブリダイゼーション組織化学分析を、以前に開示（Ａｒｉｍｕｒａ，Ａ．ら（１９９７）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２８，３４５−３５４）される通り行った。簡単に説明すると、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで３０分、固定した後、その断面をプロテイナーゼＫで処理し（２０μＬ／ｍＬで１０分）、トリエタノールアミン中０．２５％無水酢酸でアセチル化した。５０％ホルムアミド、３００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、０．２５％ＳＤＳ、２００μｇ  大腸菌ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）、及び１×１０５  ｃｐｍ／μＬ  リボプローブを含む溶液中で一晩、５５℃でハイブリダイゼーションを行った。そのハイブリダイズした断面を２０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡで処理し、５５℃で２×ＳＳＣ及び０．２×ＳＳＣで各々４０分、洗浄した。（３００ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む）一連の段階的なエタノール浴を介して脱水し、空気乾燥した後、その断面を室温で１週間、ベータ−マックスハイパーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に露出した。
【００３５】
（２）結果
１．ラットＡＢＣＡ２ｃＤＮＡのクローニング
マウスＡＢＣＡ２ｃＤＮＡの部分的に知られている配列に基づいて、最初のＮＢＤに相当する２２６０ｂｐＤＮＡフラグメントを、マウス脳ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、放射能標識した。その放射能標識したＤＮＡフラグメントをプローブとして用いてラット脳ｃＤＮＡをスクリーニングし、１００を超える陽性のクローンから１４λクローンを単離した。２種類の重複したクローン：λｒＡＢＣＡ２−１−１及びλｒＡＢＣＡ２−１−２３をサブクローン化して配列決定を行った。より上流の配列を得るために、（ラットＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡの翻訳開始部位と予想される部位に基づいてヌクレオチド１３６９−１８８８に相当する）ラットＡＢＣＡ２−１−１の５’端に位置した５２０ｂｐフラグメントを放射能標識し、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーの更なるスクリーニングのためのプローブとして用い、２６λクローンを単離して１つのクローンλｒＡＢＣＡ２−３−１６をサブクローニングして配列決定した。これらの８０４０ｂｐの複合配列は、そのｃＤＮＡ配列内で最初のＡＴＧで始まる一つのオープンリーディングフレームを含み、これは、２，４３４残基のアミノ酸配列のタンパク質（Ｍｒ＝２７０，９１３．５）であると予想された。最初のＡＴＧから４４ｂｐ上流のＤＮＡにおいて、及び５’−ＲＡＣＥによりさらに伸長した付加的な２３ｂｐＤＮＡにおいて終止コドンは見いだされなかった。しかしながら、これらの周囲のヌクレオチド配列はコザックボックス（Ｋｏｚａｋ，  Ｍ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１５，  ８８７−９０３）と一致したので、その最初のＡＴＧが翻訳開始部位であると考えることができる。このＡＢＣＡ２の予想されるアミノ酸配列は、マウスＡＢＣＡ１、ヒトＡＢＣＡ３、及びヒトＡＢＣＡＲと各々４４．５％、４０．０％、及び４０．８％の同一性を示した（図１〜４）。ヒドロパシー分析は、１４の疎水性セグメント、第１のＭＳＤ中に７つ、及び第２のＭＳＤ中に７つがＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ２、ＡＢＣＡ３、及びＡＢＣＡＲ間で保存されていると予測する。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、Ｈ１〜Ｈ２及びＨ８〜Ｈ９を除きＮＢＤだけでなくＭＳＤでも保存されている。更に、これらのタンパク質のＮ末端の約４０アミノ酸配列もよく保存されている。これらのことは、ＡＢＣＡ２の最初のＡＴＧが翻訳開始部位であることを更に示唆する。ＡＢＣＡ２の膜トポロジーはまだ知られていないが、少なくとも細胞質側の２つのＮＢＤにおいて、４つのｃＡＭＰ依存性リン酸化部位（Ｓｅｒ−１１１８，  Ｓｅｒ−１１３２，  Ｓｅｒ−１４５４，  Ｓｅｒ−２１９６）及び７つのプロテインキナーゼＣ依存性リン酸化部位（Ｓｅｒ−１１１５，  Ｓｅｒ−１２４２，  Ｓｅｒ−１３４０，  Ｓｅｒ−１３８２，  Ｓｅｒ−１４２８，  Ｓｅｒ−２０６４，  Ｓｅｒ−２１４６）が存在する可能性がある。最初のＮＢＤにチロシンキナーゼ依存性リン酸化部位（Ｔｙｒ−１３８９）が存在する可能性がある。
【００３６】
２．ＡＢＣＡ２タンパク質のキャラクタリゼーション
ＡＢＣＡ２タンパク質をキャラクタライズするために、ＨＡエピトープ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）をＡＢＣＡ２タンパク質のＣ末端に導入し、抗ＨＡ抗体を用いてイムノブロット分析を行った。ＨＡタグを有するＡＢＣＡ２発現ベクター（ｐｃＭＶｒＡＢＣＡ２−ＨＡ）をトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞の全膜画分は、２６０ｋＤ及び２５０ｋＤの分子量の２つのバンドを示したが（図５、レーン３）、ｐＣＭＶベクターのみをトランスフェクトしたものはバンドを示さなかった（図５、レーン１及び２）。次に、これらのタンパク質がグリコシル化されているか否かを決定するために、その膜タンパク質をＮ−グリコシダーゼＦと共にインキュベートした。Ｎ−グリコシダーゼＦでの３７℃で３時間の処理の後、２つのタンパク質の移動度は増加し、２５０ｋＤより少し小さな分子量の一つのバンドが観察された（図５、レーン４）。このことは、ＡＢＣＡ２が糖タンパク質であることを示す。
【００３７】
発現されるＡＢＣＡ２が機能的であるか否かを決定するために、そのＡＴＰ結合能を検査した。ＡＢＣＡ２−ＨＡ融合タンパク質を一時的に発現するＣＯＳ−７細胞からの膜タンパク質を５０μＭの８−アジド−［  α−３２Ｐ］  ＡＴＰとともに、０℃で１０分、過剰なＡＴＰ（２ｍＭ）の存在下又は欠如下でインキュベートした。次にそのタンパク質にＵＶ光を照射し、そしてＡＢＣＡ２−ＨＡ融合タンパク質を抗ＨＡ抗体で沈殿させた。図６（レーン３）に見られるように、ＡＢＣＡ２−ＨＡ融合タンパク質は、Ｍｇ２＋の存在下で２６０及び２５０ｋＤタンパク質としてホトアフィニティーラベリングされた。Ｍｇ２＋の欠如下（図６、レーン４）及び過剰なＡＴＰの存在下（図６、レーン５及び６）においてそのホトアフィニティーラベリングは強く阻害された。トランスフェクトしなかったＣＯＳ−７細胞からの膜タンパク質においては、ホトアフィニティーラベリングされたタンパク質は観察されなかった（図６、レーン１及び２）。これらの結果は、８−アジド−［  α−３２Ｐ］  ＡＴＰが、Ｍｇ２＋の存在下において、ＣＯＳ−７膜において発現したＡＢＣＡ２に結合することを示唆する。
【００３８】
３．ＡＢＣＡ２  ｍＲＮＡの組織分布
ＲＮＡブロッティング実験は、脳内で高レベルで、心臓、腎臓及び肺で中程度のレベルで、並びに骨格筋、胃、脾臓、結腸及び膵臓で低レベルで発現されたＡＢＣＡ２の単一の１０．５ｋｂ転写物を示した（図７）。肝臓及び小腸においてはバンドは検出されなかった。これらの結果は、マウスにおいてはＡＢＣＡ２転写物が肝臓で検出されたが脾臓で検出されなかったことを除いてマウスの組織でのＡＢＣＡ２    ｍＲＮＡの分布パターンについて先に報告されているものと一致した。
【００３９】
４．脳でのＡＢＣＡ２    ｍＲＮＡの発現
ＡＢＣＡ２    ｍＲＮＡは脳内で最も豊富であるので、イン・シトゥ・ハイブリダイゼーションによりラットの脳におけるその発現レベルを検査した（図８）。ＡＢＣＡ２    ｍＲＮＡについてのシグナルは、嗅球糸球体層、嗅球内部糸球体層、前交連、脳梁、海馬の歯状回、視神経交叉、視索、内側縦束橋、並びに小脳の顆粒細胞層及び髄質に強く局在化していた。ＡＢＣＡ２    ｍＲＮＡ発現は白質全体で強く見いだされたが、大脳皮質、視床及び脳幹核のような灰白質においては顕著な発現はみられなかった。
＜実施例２＞  ヒトＡＢＣＡ２の配列決定
１．本質的に実施例１記載のラットＡＢＣＡ２の配列決定と同様にしてヒトＡＢＣＡ２の配列を決定した。具体的にはヒトＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡのクローニングは以下の通りである。
【００４０】
（実施例１記載のラットＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡの翻訳開始部位と予想される部位に対して各々ヌクレオチド＋１５９〜＋１８８８及び＋５２２１〜＋７９６０に相当する）実施例１記載のラットＡＢＣＡ２    ｃＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをプローブとして用いた。ヒトｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の７．２×１０５  のプラークを標準ハイブリダイゼーション条件下で３２Ｐ−ニックトランスレーションを行ったプローブを用いてスクリーニングした。そのハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬの音波処理し変性させたサケ精巣ＤＮＡ、１０％硫酸デキストラン、及び１×１０６  ｃｐｍ／ｍＬの３２Ｐ−標識化プローブ中で、４２℃で１６時間、行った（Ｓｅｉｎｏ，Ｓら，前掲）。そのナイロン膜を０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで、５０℃で１時間、洗浄し、その後オートラジオグラフィーを行った。ＤＮＡ配列決定は、適切なＤＮＡフラグメントをｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした後、Ｂｉｇｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることによりＡＢＩ３７７自動化ＤＮＡシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。両方の鎖を配列決定した。この配列決定した塩基配列を配列番号：１に、それから予想されるアミノ酸配列を配列番号：２に、そしてこれらの塩基配列とアミノ酸配列との対応関係を配列番号：３に示す。
【００４１】
なお、全長のヒトＡＢＣＡ２（ｈＡＢＣ２）タンパク質をコードする遺伝子を含む大腸菌を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＭＶ６ｃｈＡＢＣ２として、平成１２年６月２０日に工業技術院生命工学工業技術研究所（ＦＥＲＭ）に寄託し、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９１０を得た。
【００４２】
【発明の効果】
本発明によるポリヌクレオチド、ＡＢＣＡ２タンパク質及び方法等は、ＡＢＣＡ２遺伝子が関与する疾患を診断するために有効である。また、本発明によるポリヌクレオチドは、ヒト又はラットＡＢＣＡ２タンパク質を発現させ、その機能を研究し、更にＡＢＣＡ２遺伝子が関与する疾患を治療するために用いることが期待できる。
【００４３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるラットＡＢＣＡ２、マウスＡＢＣＡ１、ヒトＡＢＣＡ３、及びヒトＡＢＣＡＲのアミノ酸配列の比較を一文字表記で示す図である。
【図２】本発明によるラットＡＢＣＡ２、マウスＡＢＣＡ１、ヒトＡＢＣＡ３、及びヒトＡＢＣＡＲのアミノ酸配列の比較を一文字表記で示す図１の続きの図である。
【図３】本発明によるラットＡＢＣＡ２、マウスＡＢＣＡ１、ヒトＡＢＣＡ３、及びヒトＡＢＣＡＲのアミノ酸配列の比較を一文字表記で示す図２の続きの図である。
【図４】本発明によるラットＡＢＣＡ２、マウスＡＢＣＡ１、ヒトＡＢＣＡ３、及びヒトＡＢＣＡＲのアミノ酸配列の比較を一文字表記で示す図３の続きの図である。
【図５】ＣＯＳ−１細胞で発現されたラットＡＢＣＡ２タンパク質のイムノブロット分析の結果を示すＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の図である。
【図６】８−アジド−［  α−３２Ｐ］  ＡＴＰでのラットＡＢＣＡ２のホトアフィニティーラベリングの結果を示す電気泳動の図である。
【図７】様々のラット組織におけるＡＢＣＡ２  ｍＲＮＡのＲＮＡブロッティング実験の結果を示す電気泳動の図である。
【図８】イン・シトゥ・ハイブリダイゼーションによるラットの脳におけるＡＢＣＡ２ｍＲＮＡの発現レベルの分布を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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