(57)【要約】【課題】硬い肉を容易にかつ効果的に軟らかくする方法の開発を課題とする。【解決手段】エビ、特にホッコクアカエビの頭胸部中のタンパク質分解酵素を用いることによって解決できる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エビの頭胸部から抽出したタンパク質分解酵素を含有することを特徴とする肉軟化剤。
【請求項２】
エビがホッコクアカエビであることを特徴とする請求項１記載の肉軟化剤。
【請求項３】
ホッコクアカエビの頭胸部から抽出したタンパク質分解酵素を含有する肉軟化剤で食肉を処理することを特徴とする食肉の軟化方法。
【請求項４】
真空タンブリングで処理することを特徴とする請求項３記載の食肉の軟化方法。
【請求項５】
コラーゲン又はエラスチンを分解する酵素を含有し、食肉の処理温度が０℃〜５０℃で処理することを特徴とする請求項３記載の食肉の軟化方法。
【請求項６】
食肉の処理温度が４℃〜３５℃で処理することを特徴とする請求項５記載の食肉の軟化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エビ、特にホッコクアカエビの頭胸部中のタンパク質分解酵素を用いて、結合組織を多く含む硬い食肉を軟化する食肉軟化剤及び食肉の処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食肉は、種や部位によって硬さが異なっており、軟らかい肉ほど消費者に好まれる傾向にある。
食肉の硬さの要因には、▲１▼筋原繊維タンパク質と▲２▼筋周膜や筋上膜といった膜構造をとっている結合組織との２種類がある。
【０００３】
筋原繊維タンパク質が要因となる硬さは、熟成によって軟化することが知られているが、結合組織は熟成によってはほとんど軟化しない。
また、パパインやブロメラインを用いる方法は、古くから知られているが、これは食肉本来の食感が失われたり、植物性の異味を残す等の欠点があった。
【０００４】
一方、結合組織を特異的に分解する方法として、貝類の中腸腺より抽出した粗酵素を利用する方法がある（特開平１０−３２７８１０号公報）。しかし、この方法も食肉を粗酵素溶液に３７℃で２昼夜漬け込む処理方法で行っているため、実用的な方法とはいえない。
【０００５】
更に、テンダーライザー等の機械的手法による方法もあるが、十分な効果を期待できず、他の方法との併用にならざるを得ない。
従って、硬い肉を容易にかつ効果的に軟らかくする方法の開発が求められているのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
硬い肉を容易にかつ効果的に軟らかくする方法の開発を課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意努力した結果、エビ、特にホッコクアカエビの頭胸部中のタンパク質分解酵素を用いることによって解決できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）エビの頭胸部から抽出したタンパク質分解酵素を含有することを特徴とする肉軟化剤、
（２）エビがホッコクアカエビであることを特徴とする（１）記載の肉軟化剤、
（３）ホッコクアカエビの頭胸部から抽出したタンパク質分解酵素を含有する肉軟化剤で食肉を処理することを特徴とする食肉の軟化方法、
（４）真空タンブリングで処理することを特徴とする（３）記載の食肉の軟化方法、
（５）コラーゲン又はエラスチンを分解する酵素を含有し、食肉の処理温度が０℃〜５０℃で処理することを特徴とする（３）記載の食肉の軟化方法、
（６）食肉の処理温度が４℃〜３５℃で処理することを特徴とする（５）記載の食肉の軟化方法
に関する。
【０００９】
本発明においては、エビ、例えばサクラエビ、クルマエビ、イセエビ等いずれのものも有効であるが、特に効果的なエビは、ホッコクアカエビ、俗称アマエビである。ホッコクアカエビは、北太平洋、北大西洋に分布し、通常−１．６〜５℃の低温環境下に生息する低温適応種である。
【００１０】
本発明は、従来例のような３７℃で処理するのではなく、比較的低温の２５℃前後で処理することができるため、経費や装置の面から実用的である。
このことが、低温で生息しているホッコクアカエビが最も本発明に適している理由でもある。
【００１１】
食肉軟化剤で食肉を処理する方法としては、軟化剤を食肉に塗布する方法、水溶液にして浸漬する方法なども採用できるが、真空タンブラーを用いる方法が最も均一性に優れている。
以下、ホッコクアカエビを用いた実施例で本発明を具体的に説明するが、これに限定されるものでないことは言うまでもない。
【００１２】
【発明の実施の形態】
１．食肉軟化剤の調製
冷凍された市販のホッコクアカエビ（ニチレイ）から頭胸部を得て、この頭胸部に２倍量のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を加え、ホモジナイズした。次に、１０倍量のアセトン（−２０℃）を攪拌しながらゆっくりと加えた。−２０℃で３０分間放置した後、遠心分離（１９，０００ｇ、２０分間、４℃）して沈殿を回収し、３倍量のｎ−ブタノールに懸濁した。遠心分離（１９，０００ｇ、２０分間、４℃）後沈殿を回収し、真空デシケーター内で乾燥した。これをアセトンパウダーとした。
【００１３】
これを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．２）に懸濁し、４℃で２時間攪拌後、遠心分離（１９，０００ｇ、２０分間、４℃）して、得られた上清を硫安分画に供した。３０〜７０％飽和硫安画分を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液　（ｐＨ６．８）に懸濁後、同緩衝液に対して透析した溶液を粗抽出液とした。この粗抽出液はコラーゲンを２５℃で比較的短時間で分解した（図１）。しかし、粗抽出液を食肉に作用させると、好ましくない肉の過剰な分解が認められた。
【００１４】
そこで、粗抽出液をハイドロキシアパタイト（バイオラッド）のカラムに添加し、上記の１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で溶出し、分画した。後述の方法でタンパク質分解活性を測定し、活性のある画分を回収して通過画分とした（図３のフラクション４〜８）。
【００１５】
次に、カラムに吸着した画分は４００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出し、分画して、同様にタンパク質分解活性のある画分を吸着画分とした（図３のフラクション２６〜２９）。通過画分はさらにＭｏｎｏＱ（アマシャムファルマシア）イオン交換カラムに添加し、活性画分を回収した。この画分を蒸留水に対して透析後、凍結乾燥して食肉軟化剤Ａとした（図４の２１フラクション）。
【００１６】
吸着画分は、濃縮して１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に透析後、同緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（アマシャムファルマシア）ゲルろ過カラムに供した。３つの活性ピークが得られ、それぞれを回収した。これらの画分を蒸留水に対して透析後、凍結乾燥して、それぞれ食肉軟化剤Ｂ、Ｃ、Ｄとした。食肉軟化剤Ｂ、Ｃ、Ｄはそれぞれ図５の１１，１３，１７のフラクションである。
【００１７】
２．酵素活性測定
各画分のコラーゲン分解活性は、酸可溶性Ｉ型コラーゲン（和光純薬）を基質として各食肉軟化剤を加え、２５℃で１時間反応後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により定性的に確認した（図７）。
【００１８】
市販の牛肉を購入し、０．２５Ｍ　ｓｕｃｒｏｓｅ、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）を１０倍量加えて、ホモジナイズ後遠心分離（１，０００ｇ、１０分間）した。沈殿を５倍量の同緩衝液に懸濁して遠心分離（１，０００ｇ、１０分間）した。沈殿を１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に再懸濁した後、篩を通過させて結合組織を除去した。篩を通過させた懸濁液を遠心分離（１，０００ｇ、１０分間）して沈殿を回収した。沈殿を０．１５Ｍ　ＫＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、遠心分離（１，０００ｇ、１０分間）して沈殿を回収した。これを筋原繊維タンパク質とした。
【００１９】
各画分の筋原繊維タンパク質の分解活性は、上記筋原繊維タンパク質を基質として各食肉軟化剤を加え、２５℃で１時間反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定性的に確認した（図６）。
エラスチン分解活性は、コンゴ−レッド−エラスチン（シグマ）を基質として反応後、遠心分離して上精の４９５ｎｍの吸光度から活性を測定した。
【００２０】
さらに、精製過程の酵素活性をゼラチンザイモグラフィーで視覚的にモニタリングした（図４（Ｂ）及び図５（Ｂ））。０．１％ゼラチンを含む１５％ポリアクリルアミドゲルを用いて４℃で電気泳動後、２．５％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３０分間の洗浄を２回繰り返し、ゲルからＳＤＳを除去した。次に、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で、２５℃、１時間インキュベーションした。
【００２１】
また、以下に示す合成基質を用いた方法で精製過程の酵素活性を定量的にモニタリングした。トリプシン様酵素、キモトリプシン様酵素、エラスターゼ様酵素及びコラゲナーゼ様酵素の活性を測定する基質として、それぞれ、Ｂｚ−ＤＬ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ＢＡＰＡ）、Ｂｚ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ、Ｓｕｃ−（Ａｌａ）３−ｐＮＡ（ＳＴＡＮＡ）及びＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇ（ＤＮＰ−ペプチド）（以上すべて、ペプチド研究所）（なお、ＢｚはＢｅｎｚｏｉｌを、ｐＮＡはｐ−Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅを、ＳｕｃはＳｕｃｃｉｎｙｌをそれぞれ表す。）を用いた。
【００２２】
ｐ−ニトロアニリド（−ｐＮＡ）を含む基質はすべて、ジメチルスルホキシドを用いて５０ｍＭの濃度で基質溶液を調製した。各画分の酵素溶液を１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に加えてプレインキュベート後、基質溶液を終濃度０．５ｍＭになるように添加して２５℃で、５分間反応させ、遊離したｐ−ニトロアニリンを４０５ｎｍで比色定量した。Ｂｚ−Ｔｙｒ−ｐＮＡは難溶性であるため、終濃度２０％でメタノールを添加した。１分間に１μｍｏｌの基質を加水分解するときの酵素量を１ｕｎｉｔとした。
【００２３】
ＤＮＰ−ペプチドは１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に１ｍＭの濃度で溶解して基質溶液とした。この基質溶液１００μｌに各画分の酵素溶液を等量加え、２５℃で、１０分間反応させた。１Ｎ　ＨＣｌを０．５ｍｌ加えて反応を停止させ、酢酸エチルとｎ−ブタノールの混液（１：０．１５）を加えた後、激しく振盪した。次いで、遠心分離後、上清の吸光度を３６５ｎｍで測定した。１分間に１ｎｍｏｌの基質を加水分解するときの酵素量を１ｕｎｉｔとした。各画分のタンパク質量はＢｒａｄｆｏｒｄ法で定量した。
【００２４】
３．食肉軟化剤のタンパク質分解活性
○コラーゲンの分解活性
図７から明らかなように、食肉軟化剤Ａ及びＤはコラーゲンをよく分解した。食肉軟化剤Ｂは若干、分解した。食肉軟化剤Ｃはコラーゲンを分解しなかった。
また、合成基質を用いた方法では、食肉軟化剤Ａ及びＤのコラゲナーゼ様酵素活性が高かった（表１）。
【００２５】
○筋原繊維タンパク質の分解活性
図６から分るように、食肉軟化剤Ｄは筋原繊維タンパク質をよく分解した。食肉軟化剤ＡおよびＢは若干、分解したが、食肉軟化剤Ｃは分解しなかった。
【００２６】
○エラスチンの分解活性
食肉軟化剤Ｃは、コンゴ−レッド−エラスチンをよく分解した（５５Ｕ／ｍｇ）。食肉軟化剤Ａ、Ｂ及びＤはほとんど作用しなかった。また、合成基質を用いた方法では、食肉軟化剤Ｃのエラスターゼ様酵素活性が高かった（表１）。
【００２７】
○合成基質に対する活性を表１に示す。
【表１】
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【００２８】
４．食肉の処理方法
１５ｘ１５ｘ３０ｍｍの大きさに筋繊維の方向が同一になるようにカットした市販のアメリカ産牛肉外ももに、上述の製法で得た食肉軟化剤Ａ〜Ｄを牛肉と等量の１ｘＰＢＳに溶解して添加し、４℃で、２時間、真空タンブリング処理を施した。１０℃で１時間放置して反応させた後、９０℃、１０分間加熱処理した。この加熱で食肉軟化剤の酵素活性は完全に失活した。コントロールとして、食肉軟化剤を含まない１ｘＰＢＳを食肉に添加して、同様の処理を施した。
【００２９】
５．食肉の硬さの測定
上記の処理を施した牛肉を各試験区１０サンプルずつ、さらに１０ｘ１０ｘ２０ｍｍにカットした後、ＩＮＳＴＲＯＮ　　５５６４のＶ字型治具を用いたワーナー・ブラッツラー法により最大圧縮荷重を測定した。その測定結果を図２に示す。
【００３０】
上記の食肉軟化剤Ａ，Ｃ，Ｄで処理した牛肉は、コントロールと比べ、有意に最大圧縮荷重が小さくなった（ｐ＜０．０１）。食肉軟化剤Ａ及びＣでは官能検査においても食肉本来の食感を保持しつつ、軟化が認められた。しかし、筋原繊維タンパク質もよく分解する食肉軟化剤Ｄでは、肉の過剰な分解が認められ、食肉本来の食感の点でやや劣った。
【００３１】
以上の試験結果から、食肉軟化剤Ｂは軟化効果が弱く、食肉軟化剤Ｄは食肉軟化剤Ａ，Ｂ，Ｃに比べて問題はあるものの、ホッコクアカエビの頭胸部から抽出したタンパク質分解酵素よりなる食肉軟化剤は、食肉を低温領域で軟化する作用があることが判明した。
【００３２】
【発明の効果】
エビ、特にホッコクアカエビの頭胸部より抽出した食肉軟化剤を用いることにより、結合組織を多く含む硬い食肉を低温領域でかつ短時間の処理で、食肉本来の食感が失われることなく効果的に軟化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】粗抽出液によるコラーゲン分解パターンを示した図。
【図２】ワーナー・ブラッツラー法による最大圧縮荷重の測定結果を示した図。＊コントロールと比較して、ｐ＜０．０１。
【図３】ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの溶出パターンと各フラクションの酵素活性を示した図。挿入図はピークに対応するフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示した図。
【図４】（Ａ）ＭｏｎｏＱイオン交換カラムクロマトグラフィーの溶出パターンと各フラクションの酵素活性を示した図。挿入図はピークに対応するフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示した図。
（Ｂ）ピークに対応するフラクションのゼラチンザイモグラフィーを示す図。
【図５】（Ａ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの溶出パターンと各フラクションの酵素活性を示した図。挿入図はピークに対応するフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示した図。
（Ｂ）　ピークに対応するフラクションのゼラチンザイモグラフィーを示す図。
【図６】食肉軟化剤Ａ〜Ｄによる筋原繊維タンパク質の分解パターンを示す図。
【図７】食肉軟化剤Ａ〜Ｄによるコラーゲンの分解パターンを示す図。
【符号の説明】
ＬａｎｅＭ；分子量マーカー
ＬａｎｅＣ；コラーゲン
ＬａｎｅＥ；各食肉軟化剤
ＬａｎｅＭｆ；筋原繊維タンパク質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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