(57)【要約】【課題】Ｓ１００ＣがＤＮＡ合成を抑制する仕組みを詳細に解析し、医学上および産業上有用な方法・物質を提供すること。【解決手段】本発明は、Ｓ１００Ｃの機能解析の結果得られた知見に基づきなされたものであり、Ｓｐ１分子をヌクレオリン分子から解離させる物質のスクリーニグ方法、Ｓｐ１分子活性化方法、Ｓｐ１分子活性化剤、細胞増殖を制御する物質のスクリーニグ方法、細胞増殖促進剤、細胞増殖抑制剤、細胞増殖性疾病の治療方法およびその治療薬を含むものである。本発明のスクリーニグ方法などは、薬剤開発などに利用でき、医学上および産業上有用なものである。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｐ１分子をヌクレオリン分子から解離させる物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質を用いることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
▲１▼　ヌクレオリン分子
▲２▼　ヌクレオリン分子の改変体
▲３▼　ヌクレオリンの部分タンパク質であって、ヌクレオリンのアミノ酸配列中、少なくとも２７１〜６４３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体
【請求項３】
下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質と、下記▲５▼〜▲８▼の何れかの物質とを用いることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
▲１▼　ヌクレオリン分子
▲２▼　ヌクレオリン分子の改変体
▲３▼　ヌクレオリンの部分タンパク質であって、ヌクレオリンのアミノ酸配列中、少なくとも２７１〜７０７番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体
▲５▼　Ｓｐ１分子
▲６▼　Ｓｐ１分子の改変体
▲７▼　Ｓｐ１の部分タンパク質であって、Ｓｐ１のアミノ酸配列中、少なくとも５４１〜７８５番目の領域を含む部分タンパク質
▲８▼　上記▲７▼の部分タンパク質の改変体
【請求項４】
Ｓｐ３分子をヌクレオリン分子から解離させる物質のスクリーニング方法であって、（ｉ）　Ｓｐ３分子、当該Ｓｐ３の部分タンパク質、または、当該Ｓｐ３もしくはその部分タンパク質の改変体と、（ｉｉ）　ヌクレオリン分子、当該ヌクレオリンの部分タンパク質、または、当該ヌクレオリンもしくはその部分タンパク質の改変体とを用いるスクリーニング方法。
【請求項５】
細胞内でヌクレオリン分子と結合し不活化されたＳｐ１分子またはＳｐ３分子の活性化方法であって、ヌクレオリン分子と結合することでＳｐ１分子またはＳｐ３分子を当該ヌクレオリン分子から解離させる物質を細胞内に導入することにより、Ｓｐ１分子またはＳｐ３分子を活性化させる方法。
【請求項６】
Ｓｐ１分子またはＳｐ３分子をヌクレオリン分子から解離させる物質として、下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質を細胞内に導入することを特徴とする請求項５記載のＳｐ１分子またはＳｐ３分子の活性化方法。
▲１▼　Ｓ１００Ｃタンパク質
▲２▼　Ｓ１００Ｃタンパク質の改変体
▲３▼　Ｓ１００Ｃの部分タンパク質であって、Ｓ１００Ｃのアミノ酸配列中、少なくとも１〜２３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体
【請求項７】
請求項６記載の▲１▼〜▲４▼の何れかの物質を含んでなるＳｐ１分子（またはＳｐ３分子）活性化剤。
【請求項８】
細胞増殖を制御する物質のスクリーニング方法であって、ヌクレオリン分子とＳ１００Ｃ分子との結合を阻害する物質、または、Ｓｐ１分子をヌクレオリン分子から解離させる物質をスクリーニングする方法。
【請求項９】
ヌクレオリン分子とＳ１００Ｃ分子との結合を阻害する物質のスクリーニング方法であって、下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質と、下記▲５▼〜▲８▼の何れかの物質とを用いることを特徴とする請求項８記載のスクリーニング方法。
▲１▼　ヌクレオリン分子
▲２▼　ヌクレオリン分子の改変体
▲３▼　ヌクレオリンの部分タンパク質であって、ヌクレオリンのアミノ酸配列中、少なくとも２７１〜６４３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体
▲５▼　Ｓ１００Ｃタンパク質
▲６▼　Ｓ１００Ｃタンパク質の改変体
▲７▼　Ｓ１００Ｃの部分タンパク質であって、Ｓ１００Ｃのアミノ酸配列中、少なくとも１〜２３番目の領域を含む部分タンパク質
▲８▼　上記▲７▼の部分タンパク質の改変体
【請求項１０】
Ｓｐ１分子をヌクレオリン分子から解離させる物質のスクリーニング方法であって、下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質と、下記▲５▼〜▲８▼の何れかの物質とを用いることを特徴とする請求項８記載のスクリーニング方法。
▲１▼　ヌクレオリン分子
▲２▼　ヌクレオリン分子の改変体
▲３▼　ヌクレオリンの部分タンパク質であって、ヌクレオリンのアミノ酸配列中、少なくとも２７１〜７０７番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体
▲５▼　Ｓｐ１分子
▲６▼　Ｓｐ１分子の改変体
▲７▼　Ｓｐ１の部分タンパク質であって、Ｓｐ１のアミノ酸配列中、少なくとも５４１〜７８５番目の領域を含む部分タンパク質
▲８▼　上記▲７▼の部分タンパク質の改変体
【請求項１１】
請求項８〜１０の何れか１項に記載のスクリーニング方法を用いて得られた細胞増殖促進剤。
【請求項１２】
下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質を含んでなる請求項１１記載の細胞増殖促進剤。
▲１▼　ヌクレオリン分子
▲２▼　ヌクレオリン分子の改変体
▲３▼　ヌクレオリンの部分タンパク質であって、ヌクレオリンのアミノ酸配列中、少なくとも２７１〜６４３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体
【請求項１３】
請求項４、８〜１０の何れか１項に記載のスクリーニング方法を用いて得られた細胞増殖抑制剤。
【請求項１４】
下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質を含んでなる請求項１３記載の細胞増殖抑制剤。
▲１▼　Ｓ１００Ｃタンパク質
▲２▼　Ｓ１００Ｃタンパク質の改変体
▲３▼　Ｓ１００Ｃの部分タンパク質であって、Ｓ１００Ｃのアミノ酸配列中、少なくとも１〜２３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体
【請求項１５】
請求項１３または１４記載の細胞増殖抑制剤を細胞内に導入することによる細胞増殖性疾病の治療方法。
【請求項１６】
請求項１３または１４記載の細胞増殖抑制剤を含んでなる細胞増殖性疾病の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞増殖を制御する物質のスクリーニング方法、及びＳｐ１分子等をヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）分子から解離させる物質のスクリーニング方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らは、以前、正常ヒト線維芽細胞とその不死化株の発現タンパク質を二次元電気泳動で比較し、発現量に差があるタンパク質の１つとしてＳ１００Ｃを同定した。Ｓ１００Ｃは、Ｃａ結合性を有するＳ１００タンパク質ファミリーのメンバーでその詳細な機能は不明であった。そこで、ヒト線維芽細胞を用いてＳ１００Ｃの機能を検討し、以下の１）〜３）の知見を得て下記の非特許文献１に発表した。
１）　正常ヒト線維芽細胞がコンフルエントになって増殖が止まる際に、Ｓ１００Ｃはリン酸化され核に移行する。この増殖の接触阻止が起こりにくい不死化細胞株では、Ｓ１００Ｃのリン酸化・核移行は見られなかった。
２）　接触阻止状態にある細胞の核に抗Ｓ１００Ｃ抗体を注入すると、ＤＮＡ合成が誘導された。
３）　Ｓ１００Ｃを核内に導入するとＤＮＡ合成が抑制され、それはｐ２１、ｐ１６を介すると推定された。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｍ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌｕｍｅ　１４９，Ｎｕｍｂｅｒ　６，　Ｊｕｎｅ　１２，　２０００　１１９３−１２０６。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の研究に基づき、Ｓ１００ＣがＤＮＡ合成を抑制する仕組みをさらに詳細に解析し、医学上および産業上有用な方法・物質を提供することをその課題とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＫ）とその自然形質転換株（ＨａＣａＴ）とを用いて詳細なＳ１００Ｃの機能解析を行った。そして、その結果得られた知見から、医学上または産業上有用な方法・物質として、下記Ａ）〜Ｐ）の発明を完成するに至った。
【０００６】
Ａ）　Ｓｐ１分子をヌクレオリン分子から解離させる物質のスクリーニング方法。
【０００７】
Ｂ）　上記Ａ）のスクリーニング方法において、下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質を用いることを特徴とする方法。
▲１▼　ヌクレオリン分子
▲２▼　ヌクレオリン分子の改変体
▲３▼　ヌクレオリンの部分タンパク質であって、ヌクレオリンのアミノ酸配列中、少なくとも２７１〜６４３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体。
【０００８】
Ｃ）　上記Ａ）のスクリーニング方法において、下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質と、下記▲５▼〜▲８▼の何れかの物質とを用いることを特徴とする方法。
▲１▼　ヌクレオリン分子
▲２▼　ヌクレオリン分子の改変体
▲３▼　ヌクレオリンの部分タンパク質であって、ヌクレオリンのアミノ酸配列中、少なくとも２７１〜７０７番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体
▲５▼　Ｓｐ１分子
▲６▼　Ｓｐ１分子の改変体
▲７▼　Ｓｐ１の部分タンパク質であって、Ｓｐ１のアミノ酸配列中、少なくとも５４１〜７８５番目の領域を含む部分タンパク質
▲８▼　上記▲７▼の部分タンパク質の改変体。
【０００９】
Ｄ）　Ｓｐ３分子をヌクレオリン分子から解離させる物質のスクリーニング方法であって、（ｉ）　Ｓｐ３分子、当該Ｓｐ３の部分タンパク質、または、当該Ｓｐ３もしくはその部分タンパク質の改変体と、（ｉｉ）　ヌクレオリン分子、当該ヌクレオリンの部分タンパク質、または、当該ヌクレオリンもしくはその部分タンパク質の改変体とを用いるスクリーニング方法。
【００１０】
Ｅ）　細胞内でヌクレオリン分子と結合し不活化されたＳｐ１分子またはＳｐ３分子の活性化方法であって、ヌクレオリン分子と結合することでＳｐ１分子またはＳｐ３分子を当該ヌクレオリン分子から解離させる物質を細胞内に導入することにより、Ｓｐ１分子またはＳｐ３分子を活性化させる方法。
【００１１】
Ｆ）　上記Ｅ）のＳｐ１分子またはＳｐ３分子の活性化方法において、Ｓｐ１分子またはＳｐ３分子をヌクレオリン分子から解離させる物質として、下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質を細胞内に導入することを特徴とする方法。
▲１▼　Ｓ１００Ｃタンパク質
▲２▼　Ｓ１００Ｃタンパク質の改変体
▲３▼　Ｓ１００Ｃの部分タンパク質であって、Ｓ１００Ｃのアミノ酸配列中、少なくとも１〜２３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体。
【００１２】
Ｇ）　上記Ｆ）に記載の▲１▼〜▲４▼の何れかの物質を含んでなるＳｐ１分子（またはＳｐ３分子）活性化剤。
【００１３】
Ｈ）　細胞増殖を制御する物質のスクリーニング方法であって、ヌクレオリン分子とＳ１００Ｃ分子との結合を阻害する物質、または、Ｓｐ１分子をヌクレオリン分子から解離させる物質をスクリーニングする方法。
【００１４】
Ｉ）　上記Ｈ）の方法における、ヌクレオリン分子とＳ１００Ｃ分子との結合を阻害する物質のスクリーニング方法であって、下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質と、下記▲５▼〜▲８▼の何れかの物質とを用いることを特徴とする方法。
▲１▼　ヌクレオリン分子
▲２▼　ヌクレオリン分子の改変体
▲３▼　ヌクレオリンの部分タンパク質であって、ヌクレオリンのアミノ酸配列中、少なくとも２７１〜６４３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体
▲５▼　Ｓ１００Ｃタンパク質
▲６▼　Ｓ１００Ｃタンパク質の改変体
▲７▼　Ｓ１００Ｃの部分タンパク質であって、Ｓ１００Ｃのアミノ酸配列中、少なくとも１〜２３番目の領域を含む部分タンパク質
▲８▼　上記▲７▼の部分タンパク質の改変体。
【００１５】
Ｊ）　上記Ｈ）の方法における、Ｓｐ１分子をヌクレオリン分子から解離させる物質のスクリーニング方法であって、下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質と、下記▲５▼〜▲８▼の何れかの物質とを用いることを特徴とする方法。
▲１▼　ヌクレオリン分子
▲２▼　ヌクレオリン分子の改変体
▲３▼　ヌクレオリンの部分タンパク質であって、ヌクレオリンのアミノ酸配列中、少なくとも２７１〜７０７番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体
▲５▼　Ｓｐ１分子
▲６▼　Ｓｐ１分子の改変体
▲７▼　Ｓｐ１の部分タンパク質であって、Ｓｐ１のアミノ酸配列中、少なくとも５４１〜７８５番目の領域を含む部分タンパク質
▲８▼　上記▲７▼の部分タンパク質の改変体。
【００１６】
Ｋ）　上記Ｈ）〜Ｊ）の何れかに記載のスクリーニング方法を用いて得られた細胞増殖促進剤。
【００１７】
Ｌ）　下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質を含有する上記Ｋ）記載の細胞増殖促進剤。▲１▼　ヌクレオリン分子
▲２▼　ヌクレオリン分子の改変体
▲３▼　ヌクレオリンの部分タンパク質であって、ヌクレオリンのアミノ酸配列中、少なくとも２７１〜６４３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体。
【００１８】
Ｍ）　上記Ｄ）、Ｈ）〜Ｊ）の何れかに記載のスクリーニング方法を用いて得られた細胞増殖抑制剤。
【００１９】
Ｎ）　下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質を含有する上記Ｍ）記載の細胞増殖抑制剤。▲１▼　Ｓ１００Ｃタンパク質
▲２▼　Ｓ１００Ｃタンパク質の改変体
▲３▼　Ｓ１００Ｃの部分タンパク質であって、Ｓ１００Ｃのアミノ酸配列中、少なくとも１〜２３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体。
【００２０】
Ｏ）　上記Ｍ）またはＮ）に記載の細胞増殖抑制剤を細胞内に導入することによる細胞増殖性疾病の治療方法。
【００２１】
Ｐ）　上記Ｍ）またはＮ）に記載の細胞増殖抑制剤を含んでなる細胞増殖性疾病の治療薬。
【００２２】
上記Ａ）〜Ｐ）の各発明は、後述の実施例に示される詳細な機能解析の結果から得られた知見、とりわけ、（ａ）　Ｓ１００Ｃが核移行するためにはヌクレオリン分子と結合することが必要である点、（ｂ）　Ｓｐ１分子は、核内でヌクレオリン分子と結合して不活化されているが、Ｓ１００Ｃが当該ヌクレオリン分子と結合することによってヌクレオリン分子から解離し活性化される点、（ｃ）　Ｓｐ１分子の活性化によって少なくともｐ２１の発現レベルが上がり、細胞増殖が抑制される点、および、（ｄ）　Ｓｐ３分子もヌクレオリン分子と結合し、その結合がＳｐ１分子と同様にＳ１００Ｃによって阻害される点、などの知見に基づいてなされたものである。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的態様について説明する。
【００２４】
（１）Ｓｐ１分子をヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）分子から解離させる物質のスクリーニング方法
ここで、「Ｓｐ１」および「ヌクレオリン」とは、主としてヒト由来のタンパク質を意味する。それぞれの模式的構造が図１１（ｅ）に示される。Ｓｐ１は７８５個のアミノ酸からなり、例えば下記文献１・２に記載されるものである。ヌクレオリンは７０７個のアミノ酸配列からなり、例えば下記文献３・４に記載されるものである。
文献１：Ｂｌａｃｋ，　Ａ．Ｒ．，　Ｂｌａｃｋ，　Ｊ．Ｄ．，　Ａｚｉｚｋｈａｎ−Ｃｌｉｆｆｏｒｄ，　Ｊ．　（２００１）．　Ｓｐ１　ａｎｄ　ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ．　Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１８８，　１４３−１６０．
文献２：Ｓｕｓｋｅ　Ｇ．　（１９９９）．　Ｔｈｅ　Ｓｐ−ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ．　Ｇｅｎｅ　２３８，　２９１−３００．
文献３：Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｐｏｌｌａｒｄ，　Ｈ．Ｂ．　（１９９９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ’ｓ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ：　ｎｅｗ　ｉｎｓｉｇｈｔｓ．　ＦＡＳＥＢＪ．　１３，　１９１１−１９２２．
文献４：Ｇｉｎｉｓｔｙ，　Ｈ．，　Ｓｉｃａｒｄ，　Ｈ．，　Ｒｏｇｅｒ，　Ｂ．，　ａｎｄ　Ｂｏｕｖｅｔ，　Ｐ．　（１９９９）．　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ．　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．　１１２，　７６１−７７２。
【００２５】
後述の実施例に示すように、Ｓｐ１分子は、核内でヌクレオリン分子と結合しているが、Ｓ１００Ｃが当該ヌクレオリン分子と結合することによってヌクレオリン分子から解離する。また、Ｓｐ１とヌクレオリンとは、Ｓｐ１のセグメント３（Ｓｅｇ−３）領域とヌクレオリンのセグメント４（Ｓｅｇ−４）領域との間で結合し、Ｓ１００Ｃとヌクレオリンとは、Ｓ１００ＣのＮ末側（ｐｅｐＡ）領域とヌクレオリンのセグメント３（Ｓｅｇ−３）領域との間で結合することも明らかにした（各領域の詳細は、後述する）。
【００２６】
転写因子であるＳｐ１は、ヌクレオリンから解離（リリース）され自由になると活性化され、ｐ２１やその他の遺伝子の発現を誘導し、ひいては種々の生物活性（生物作用）を誘導する。したがって、Ｓｐ１をヌクレオリンから解離させる物質は、薬剤の候補分子（創薬ターゲット）となり、医学上および産業上有用である。本発明は、このような物質のスクリーニグ方法を提供するものである。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではないが、以下では、その一例について図１〜図３に基づき説明することとする。このスクリーニング方法は、Ｓ１００Ｃ様の作用を示す物質のスクリーニング方法である。上記のように、Ｓ１００Ｃは、ヌクレオリンと結合することで、Ｓｐ１をヌクレオリンから解離させる作用を有している。以下のスクリーニング方法は、このＳ１００Ｃと同様に、ヌクレオリンと結合することでＳｐ１をヌクレオリンから解離させる作用を示す物質を２段階のスクリーニングによって選抜する方法である。
【００２８】
〔第１段階のスクリーニング〕
図１は、第１段階のスクリーニング方法を概略的に示す説明図である。この第１段階のスクリーニングでは、試験管内反応系（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　ｓｙｓｔｅｍ）にて、Ｓ１００Ｃとヌクレオリンとの結合を阻害する物質をスクリーニングする。上述のように、Ｓ１００Ｃとヌクレオリンとは、Ｓ１００ＣのｐｅｐＡ領域とヌクレオリンのＳｅｇ−３領域との間で結合することが分かっているので、スクリーニングには、Ｓ１００Ｃの部分タンパク質であるｐｅｐＡと、ヌクレオリンの部分タンパク質であるＳｅｇ−３（図中、Ｎｕｃｌ−３）とを使用できる。ｐｅｐＡは、適当なタグ（図中、丸印）でエピトープ標識しておくとよい。
【００２９】
大腸菌などで発現させたヌクレオリンのＳｅｇ−３（Ｎｕｃｌ−３）をウェル底面に固着し、タグをつけたｐｅｐＡと被検物質（図中、星印）とを混ぜてウェルに入れる。もし被検物質がＳ１００ＣのｐｅｐＡもしくはヌクレオリンのＮｕｃｌ−３と相互作用し、ｐｅｐＡとヌクレオリン（Ｎｕｃｌ−３）との結合を阻害するものであれば（つまり、図１の１ａの場合であれば）、洗浄後、抗タグ抗体ではｐｅｐＡは検出されない。一方、もし被検物質がＳ１００ＣのｐｅｐＡとヌクレオリン（Ｎｕｃｌ−３）との結合に関与しないものであれば（つまり、図１の１ｂの場合であれば）、洗浄後、抗タグ抗体によりｐｅｐＡが検出される。このように、ｐｅｐＡの検出の有無により、Ｓ１００Ｃとヌクレオリンとの結合を阻害する物質を検索することができる。
【００３０】
〔第２段階のスクリーニング〕
第２段階では、第１段階で陽性であった物質（即ち、結合を阻害した物質）について、Ｓ１００Ｃに代わってヌクレオリンと結合しＳｐ１を遊離させる物質かどうかを検索する。図２は、この第２段階のスクリーニング方法を概略的に示す説明図である。Ｓｐ１とヌクレオリンとは、Ｓｐ１のＳｅｇ−３領域とヌクレオリンのＳｅｇ−４領域との間で結合することが分かっているので、今回のスクリーニングには、▲１▼ヌクレオリンのＳｅｇ−３（図中、Ｎｕｃｌ−３）とＳｅｇ−４（図中、Ｎｕｃｌ−４）とからなるタンパク質、▲２▼Ｓｐ１のＳｅｇ−３領域からなるタンパク質（図中、Ｓｐ１−３）、および▲３▼Ｓ１００ＣのｐｅｐＡにタグをつけたタンパク質、を使用する。
【００３１】
上記▲１▼のヌクレオリンの部分タンパク質（Ｓｅｇ−３とＳｅｇ−４とからなるタンパク質）を底面に固着し、これに上記▲２▼のＳｐ１のＳｅｇ−３領域からなるタンパク質を予め結合しておく。そこに被検物質とｐｅｐＡとの混合物を作用させ、洗浄後に、Ｓｐ１（Ｓｐ１−３）のヌクレオリン（Ｎｕｃｌ−３＋Ｎｕｃｌ−４）への結合の有無を抗Ｓｐ１−３抗体によって検出する。被検物質は、第１段階で陽性であった物質であり、Ｓ１００ＣのｐｅｐＡもしくはヌクレオリンのＮｕｃｌ−３と相互作用すると考えられるが、相互作用しても、Ｓｐ１を遊離させる作用を持たないものであれば（つまり、図２の２ａの場合であれば）、洗浄後、抗Ｓｐ１−３抗体によりＳｐ１−３が検出される。一方、相互作用の結果、Ｓｐ１を遊離させるものであれば（つまり、図２の２ｂの場合であれば）、洗浄後、抗Ｓｐ１−３抗体ではＳｐ１−３が検出されない。このようにして被検物質がＳｐ１を遊離させる物質かどうかを検索する。
【００３２】
加えるｐｅｐＡの濃度を様々に変えて上記の実験を行い、各濃度において得られたＳｐ１の結合度をプロットすると、被検物質が２ａの場合であるか、２ｂの場合であるかに応じて、その軌跡が図３のグラフに示すように異なると考えられる。２ａの場合は、被検物質はｐｅｐＡが存在してもＳｐ１を遊離させない、つまり、ｐｅｐＡの作用を抑制し、Ｓ１００Ｃの機能をブロックする訳であるから、同グラフの２ａに示す軌跡（カーブ）になる。一方、２ｂの場合は、ヌクレオリンと結合してＳｐ１を遊離させる、つまりＳ１００Ｃ様の作用を示す物質であるから、同グラフの２ｂに示す軌跡（カーブ）になる。
【００３３】
このように、上記スクリーニング方法では、ｐｅｐＡの濃度０と適当な値（点線で示す）とでＳｐ１の結合度を調べれば、Ｓ１００Ｃ様の作用を示す物質と、Ｓ１００Ｃの機能をブロックする物質との両方を同じ系でスクリーニングできることになる。また、第１段階で誤って陽性と判定された物質は、第２段階でコントロールと同じカーブ（図３参照）になるのでチェック可能である。
【００３４】
ところで、上記スクリーニング方法は、２段階のスクリーニングによってＳ１００Ｃ様の作用を示す物質（および、Ｓ１００Ｃの機能をブロックする物質）を検索するものであるが、第２段階だけのスクリーニングとすることも可能である。上記のように２段階のスクリーニングとすると、多数の検体を絞り込んでいく能率はよくなる。一方、第２段階だけのスクリーニングとすると、ヌクレオリンのＳｅｇ−３領域以外の部位に結合して結果的にＳ１００Ｃとヌクレオリンとの結合に影響を及ぼすような物質やＳｐ１に直接働いて機能する物質など、創薬ターゲットとなり得る医学上および産業上有用な種々の物質が広く得られる可能性がある。
【００３５】
上記スクリーニング方法では、ヌクレオリン、Ｓｐ１、Ｓ１００Ｃの部分（断片）タンパク質を使用した。本発明のスクリーニング方法は、このように部分（断片）タンパク質を使用してもよいし、全長タンパク質を使用してもよい。具体的には、第１段階のスクリーニグでは、下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質と、下記▲５▼〜▲８▼の何れかの物質とを用いることができる。
▲１▼　ヌクレオリン分子
▲２▼　ヌクレオリン分子の改変体
▲３▼　ヌクレオリンの部分タンパク質であって、ヌクレオリンのアミノ酸配列中、少なくとも２７１〜６４３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体
▲５▼　Ｓ１００Ｃタンパク質
▲６▼　Ｓ１００Ｃタンパク質の改変体
▲７▼　Ｓ１００Ｃの部分タンパク質であって、Ｓ１００Ｃのアミノ酸配列中、少なくとも１〜２３番目の領域を含む部分タンパク質
▲８▼　上記▲７▼の部分タンパク質の改変体。
【００３６】
上記▲３▼の「２７１〜６４３番目の領域」とは、ヌクレオリンのＳｅｇ−３領域に相当し、上記▲７▼の「１〜２３番目の領域」とは、Ｓ１００ＣのｐｅｐＡの領域に相当する。
【００３７】
本明細書において、「（タンパク質の）改変体」とは、当該タンパク質の１個または数個（好ましくは７個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された改変体をいい、後述のリン酸化相当体などを含む意味である。アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により人為的に行うことができる。また、「（タンパク質の）改変体」は、当該タンパク質がＨｉｓ　やＭｙｃ　等のタグによって標識される場合や、当該タンパク質を蛍光タンパク質（ＧＦＰ・ルシフェラーゼ等）または他のタンパク質と融合させる場合、当該タンパク質にリン酸化や糖鎖結合等により修飾を施す場合などをも含む意味で用いている。
【００３８】
第２段階のスクリーニグでは、下記▲１▼〜▲４▼の何れかの物質と、下記▲５▼〜▲８▼の何れかの物質とを用いることができる。
▲１▼　ヌクレオリン分子
▲２▼　ヌクレオリン分子の改変体
▲３▼　ヌクレオリンの部分タンパク質であって、ヌクレオリンのアミノ酸配列中、少なくとも２７１〜７０７番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体
▲５▼　Ｓｐ１分子
▲６▼　Ｓｐ１分子の改変体
▲７▼　Ｓｐ１の部分タンパク質であって、Ｓｐ１のアミノ酸配列中、少なくとも５４１〜７８５番目の領域を含む部分タンパク質
▲８▼　上記▲７▼の部分タンパク質の改変体。
【００３９】
上記▲３▼の「２７１〜７０７番目の領域」とは、ヌクレオリンのＳｅｇ−３領域とＳｅｇ−４領域とを合わせた領域に相当し、上記▲７▼の「５４１〜７８５番目の領域」とは、Ｓｐ１のＳｅｇ−３領域に相当する。
【００４０】
勿論、本発明のスクリーニング方法は、上記の方法に限定されるものではなく、これとは異なる種々の方法が適用可能である。例えば、上記の方法は、試験管内反応系（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　ｓｙｓｔｅｍ）でのスクリーニング方法であったが、培養細胞等を用いて細胞内でスクリーニングを行ってもよい。一例として、Ｓｐ１が結合すると活性化するプロモーターに（ルシフェラーゼ遺伝子など）発現を容易に確認できる遺伝子をつないだものを細胞に導入し、その細胞に例えばＳ１００Ｃ（またはｐｅｐＡ）をかけるとルシフェラーゼが発現して光るというアッセイ系を挙げることができる。具体的には、２４ウエルのプレートに細胞をまいておいて、ルシフェラーゼ・プラスミドを導入し、２４時間後にｐｅｐＡまたは被検物質をかけて６時間後に細胞を溶かしてアッセイする。もし被検物質がＳ１００Ｃ様の作用を示すものであれば、同様にルシフェラーゼの発現レベルが上がるので、容易に確認できる。この方法では、９６ウエルプレートとロボット分注機を使えばかなりのハイスループット化も期待できる。
【００４１】
そのほか、▲１▼ヌクレオリンのＳｅｇ−３領域をカラムに固定してこれと結合する物質を検索する方法や、▲２▼免疫沈降―免疫ブロット法を用いてヌクレオリンとＳ１００Ｃとの結合を阻害する物質を検索する方法など、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を本発明のスクリーニング方法に適用可能である。
【００４２】
また、Ｓｐ１をヌクレオリンから解離させる物質としては、（ａ）　ヌクレオリンと結合することでＳｐ１を当該ヌクレオリンから解離させる物質のほかに、（ｂ）　ヌクレオリンと結合することなくＳｐ１をヌクレオリンから解離させる物質、も存在する可能性がある。本発明のスクリーニング方法は、何れの物質をスクリーニングする方法であってもよい。
【００４３】
さらに、ヌクレオリン、Ｓｐ１、Ｓ１００Ｃの各タンパク質について、ヒト以外のもの、例えば、マウスホモログやラットホモログ、その他の生物の各ホモログを用いてスクリーニングを行ってもよい。
【００４４】
（２）Ｓｐ１分子活性化方法およびＳｐ１分子活性化剤
上記（１）のスクリーニング方法によって得られた物質は、Ｓｐ１をヌクレオリンから解離させる作用を持つ訳であるから、Ｓｐ１分子活性化方法およびＳｐ１分子活性化剤として利用することができる。物質の細胞への導入方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。
【００４５】
また、後述の実施例に示すように、Ｓ１００Ｃ（およびｐｅｐＡ）は、Ｓｐ１をヌクレオリンから解離させ、活性化させる作用を有することから、下記▲１▼〜▲４▼の物質はＳｐ１分子活性化方法およびＳｐ１分子活性化剤として利用可能である。
▲１▼　Ｓ１００Ｃタンパク質
▲２▼　Ｓ１００Ｃタンパク質の改変体
▲３▼　Ｓ１００Ｃの部分タンパク質であって、Ｓ１００Ｃのアミノ酸配列中、少なくとも１〜２３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体。
【００４６】
上記▲１▼〜▲４▼の物質を細胞内に導入する方法としては、従来公知の遺伝子導入方法（エレクトロポレーション法・リポフェクション法など）やタンパク質（ペプチド）導入方法を適用することができ、特に限定されるものではない。
【００４７】
（３）細胞増殖を制御する物質のスクリーニング方法
Ｓｐ１がヌクレオリンから遊離し活性化されると、ｐ２１の発現レベルが上がり、その結果、細胞増殖が抑制され、あるいは細胞死が誘導される。したがって、Ｓ１００Ｃ様の作用を示し、Ｓｐ１をヌクレオリンから遊離させる物質は、細胞増殖抑制作用を有しており、一方、Ｓ１００Ｃとヌクレオリンとの結合を阻害し、Ｓ１００Ｃの機能をブロックする物質（換言すれば、Ｓ１００Ｃの機能をブロックし、Ｓｐ１のヌクレオリンからの遊離を阻害する物質）は、細胞増殖促進作用を有しており、いずれも細胞増殖を制御する物質ということができる。
【００４８】
このような細胞増殖を制御する物質のスクリーニング方法は、▲１▼Ｓｐ１をヌクレオリンから解離させる物質をスクリーニングする方法、または、▲２▼ヌクレオリン分子とＳ１００Ｃ分子との結合を阻害する物質をスクリーニングする方法であるから、上記（１）で説明した方法と同様の方法を挙げることができる。例えば、上記（１）で説明した２段階スクリーニング方法により「２ａ」と判定されれば、その被検物質はＳ１００Ｃの機能をブロックし、細胞増殖促進作用を有するものである。一方、「２ｂ」と判定されれば、その被検物質はＳｐ１をヌクレオリンから遊離させ、細胞増殖抑制作用を有するものである。
【００４９】
（４）細胞増殖促進剤および細胞増殖抑制剤
上記（３）のスクリーニング方法によって得られた物質は、細胞増殖促進作用または細胞増殖抑制作用を持つ訳であるから、細胞増殖促進剤または細胞増殖抑制剤として利用することができる。物質の細胞への導入方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。
【００５０】
また、後述の実施例に示すように、Ｓ１００Ｃはリン酸化されると、ヌクレオリンのＳｅｇ−３領域に結合する。したがって、Ｓ１００Ｃのリン酸化酵素の基質となり得る物質は、Ｓ１００Ｃのリン酸化を阻害し、細胞増殖促進剤として利用できる可能性がある。また、下記▲１▼〜▲４▼の物質は、細胞内に導入することによって内在性のヌクレオリンとＳ１００Ｃとの結合を阻害し、細胞増殖促進剤として利用できる可能性がある。
▲１▼　ヌクレオリン分子
▲２▼　ヌクレオリン分子の改変体
▲３▼　ヌクレオリンの部分タンパク質であって、ヌクレオリンのアミノ酸配列中、少なくとも２７１〜６４３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体。
【００５１】
特に、ヌクレオリンの核移行シグナルを改変した改変体は、Ｓ１００Ｃの核移行を阻害し、細胞増殖促進剤として利用できる可能性がある。
【００５２】
また、下記▲１▼〜▲４▼の物質は、細胞内に導入することによってＳｐ１をヌクレオリンから遊離させる作用を有することから、細胞増殖抑制剤として利用可能である。
▲１▼　Ｓ１００Ｃタンパク質
▲２▼　Ｓ１００Ｃタンパク質の改変体
▲３▼　Ｓ１００Ｃの部分タンパク質であって、Ｓ１００Ｃのアミノ酸配列中、少なくとも１〜２３番目の領域を含む部分タンパク質
▲４▼　上記▲３▼の部分タンパク質の改変体。
【００５３】
（５）細胞増殖性疾病の治療方法およびその治療薬
上記（４）の細胞増殖抑制剤は、細胞増殖性疾病の治療方法およびその治療薬に利用可能である。実際、後述の実施例に示すように、ｐｅｐＡを様々ながん細胞株に導入したところ、大部分の細胞株で細胞死を誘導した。したがって、ｐｅｐＡ等の細胞増殖抑制剤をドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）等により、体内のがん細胞に効率よく導入することによって、治療効果が期待できる。
【００５４】
（６）Ｓｐ３分子をヌクレオリン分子から解離させる物質のスクリーニング方法等
上記Ｓｐ１分子の構造によく似た仲間としてＳｐ３分子が知られている（前記文献２参照）。このＳｐ３は、ｐ２１のプロモーター領域に結合することを含め、Ｓｐ１と非常に近い機能を示すが、異なる働きも報告されている。
【００５５】
本発明者らは、このＳｐ３について解析したところ、下記１）〜３）の実験結果を得た。
１）　Ｓｐ３もヌクレオリンと結合する。
２）　Ｓｐ３とヌクレオリンとの結合は、Ｓｐ１の場合と同様、Ｓ１００Ｃによって阻害される。
３）　ゲルシフトアッセイで、高Ｃａで培養したＨａＣａＴ細胞抽出液中のＳｐ３はＳｐ１と同様、ｐ２１のプロモーター領域に結合する（また、Ｓｐ３がｐ２１の転写を活性化することは既に報告がある）。
【００５６】
以上の結果から、Ｓｐ３は、Ｓｐ１と同様の機構で作用し、ヌクレオリンから遊離し自由になると活性化され、ｐ２１やその他の遺伝子の発現を誘導し、ひいては種々の生物作用を誘導すると考えられる。したがって、Ｓｐ３をヌクレオリンから解離させる物質は、薬剤の候補分子となり、その物質のスクリーニング方法は上記（１）のスクリーニング方法と同様に、医学上および産業上有用である。また、そのスクリーニング方法によって得られた物質は、Ｓｐ３分子活性化方法およびＳｐ３分子活性化剤として、細胞増殖抑制剤として、さらに、細胞増殖性疾病の治療方法およびその治療薬として利用可能である。尚、このようなＳｐ３をヌクレオリンから解離させる物質のスクリーニング方法、Ｓｐ３分子活性化方法およびＳｐ３分子活性化剤、細胞増殖抑制剤、細胞増殖性疾病の治療方法およびその治療薬、の各具体的態様については、上記（１）〜（５）の説明と同様であり、ここではその説明を省略する。
【００５７】
【実施例】
以下、本発明の基礎をなす、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＫ）とその自然形質転換株（ＨａＣａＴ）とを用いたＳ１００Ｃの機能解析の結果について、図面を参照しながら説明する。
【００５８】
〔実施例１：ＮＨＫ細胞およびＨａＣａＴ細胞の高Ｃａに対する反応〕
培地中のカルシウム（Ｃａ）濃度を高めることは角化細胞の増殖を抑制し分化を誘導する方法としてよく知られている。これはまた生体内で起こる現象に非常に近いとも考えられている。しかし、その機構はよく分かっていなかった。そこでまず、ＮＨＫ細胞およびＨａＣａＴ細胞の高Ｃａに対する反応を確認した。その結果をまとめて図４に示す。
【００５９】
図４の（ａ）は、培地中のＣａイオンの濃度に応じて、細胞増殖がどのように変化するかを調べた結果を示すグラフである。同図（ｂ）は、Ｃａ濃度を上げた後、時間経過に従って細胞増殖がどのように変化するかを調べた結果を示すグラフであり、図中、○はＮＨＫ細胞、□はＨａＣａＴ細胞の結果を示す。細胞増殖の変化は、３Ｈ−ＴｄＲの取り込みを指標に判断した。これらのグラフに示すように、ＮＨＫ細胞およびＨａＣａＴ細胞いずれも、Ｃａ濃度の上昇につれて３Ｈ−ＴｄＲの取り込みが減少しており、Ｃａ濃度を上げると細胞の増殖は抑制された。
【００６０】
同図（ｃ）は、培地中のＣａ濃度を上げた後、細胞内Ｃａ濃度がどのように変化するかを調べた結果を示すグラフ、並びに、各Ｃａ濃度における培地中のＣａイオンの濃度分布を示す画像である。グラフ中、○はＮＨＫ細胞、□はＨａＣａＴ細胞の結果を示し、グラフ縦軸は、Ｃａ濃度を上げた時点（０分）での細胞内Ｃａ濃度を「１．０」とし、その相対値を示すものである。これらの結果に示すように、Ｃａ濃度を上げると、両細胞共に細胞内Ｃａ濃度が上昇した。
【００６１】
〔実施例２：Ｓ１００Ｃの細胞増殖抑制能とその機能に必要な領域の同定〕
次に、ＨａＣａＴ細胞を用いて、Ｓ１００Ｃの細胞増殖抑制能と、その機能に必要な領域について調べた。その結果をまとめて図５に示す。
【００６２】
図５の（ａ）は、ＴＡＴ−Ｓ１００Ｃを培地に加えた後、同タンパク質の細胞内局在をウエスタンブロット法により調べた結果、並びに、培地中のＴＡＴ−Ｓ１００Ｃの濃度に応じて、細胞増殖がどのように変化するかを調べた結果を示すグラフである。図中、「Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｆｒ．」は細胞質の画分を、「Ｎｕｃｌｅａｒ　ｆｒ．」は核内タンパク質の画分を、「ｅｎｄ．Ｓ１００Ｃ」は、内在性のＳ１００Ｃをそれぞれ示す。「ＴＡＴ−ＧＳＴ」は対照用である。また、ＴＡＴは、タンパク質の細胞内導入を助けるペプチドである。
【００６３】
上記実験の結果、図に示されるように、ＴＡＴ−Ｓ１００Ｃを培地に加えると、核内にも移行し、その結果ＤＮＡ合成が抑制（即ち、細胞増殖が抑制）された。
【００６４】
図５の（ｂ）は、Ｓ１００Ｃを二次構造に配慮しつつ６つの部分ペプチド（ペプチドＡ〜Ｆ）に分割し、何れの部分が増殖抑制作用に必要か調べた結果を示すグラフである。上記ペプチドＡ〜Ｆ（以下、ｐｅｐＡ〜ｐｅｐＦという）の各アミノ酸配列についても合わせて同図に示される。図中、アミノ酸配列の右側の数字は、Ｓ１００Ｃにおけるアミノ酸残基の位置（Ｎ末から数えて何番目から何番目に位置するか）を示す。＊印は、後述するように、リン酸化部位と同定されたアミノ酸残基を示す。グラフに示されるように、６つのペプチドｐｅｐＡ〜ｐｅｐＦのうち、Ｎ末部分のｐｅｐＡだけが増殖抑制作用を示した。
【００６５】
以上のように、Ｓ１００Ｃを導入するとＨａＣａＴ細胞の増殖は抑制され、その抑制機能はＳ１００Ｃを６つの部分に分割するとＮ末部分のｐｅｐＡに担われていた。
【００６６】
〔実施例３：Ｓ１００ＣとＣａによる増殖抑制との関連性、及びＳ１００Ｃのリン酸化部位の同定〕
Ｓ１００ＣがＣａによる増殖抑制と何らかの関連性があるかどうかを検討した。あわせて、Ｓ１００Ｃのリン酸化部位を同定した。その結果を図６および図７に示す。
【００６７】
図６の（ａ）は、ＮＨＫ細胞およびＨａＣａＴ細胞において、Ｃａ濃度に応じてＳ１００Ｃのリン酸化がどのように変化するかを免疫沈降―免疫ブロット法により調べた実験結果であり、図中、矢印はリン酸化されたＳ１００Ｃを示す。また、「３２Ｐ−Ｓ１００Ｃ」は、３２Ｐにより標識されリン酸化されたＳ１００Ｃを示し、「β−Ａｃｔｉｎ」は、対照用で各レーンのタンパク質がほぼ同量であることを示し、「Ｌｏｗ」「Ｈｉｇｈ」は、細胞密度を示す。同図に示すように、高Ｃａで培養すると両細胞においてＳ１００Ｃのリン酸化が亢進した。
【００６８】
同図（ｂ）は、上記各ペプチドｐｅｐＡ〜ｐｅｐＦを細胞抽出液と混合してリン酸化を調べた結果を示すグラフである。３２Ｐにより標識された値を指標にリン酸化の有無を判断した。グラフに示すように、高Ｃａで培養したときのみ、ｐｅｐＡとｐｅｐＦとがリン酸化された。また、同図（ｃ）は、ｐｅｐＡおよびｐｅｐＦの何れのアミノ酸残基がリン酸化されるかを調べた結果であり、同図に示すように、リン酸化アミノ酸残基は、ｐｅｐＡではスレオニン（Ｔｈｒ）、ｐｅｐＦではセリン（Ｓｅｒ）であった。
【００６９】
ｐｅｐＡには２つのスレオニン（Ｔ）が存在し、ｐｅｐＦにも２つのセリン（Ｓ）が存在する（図２（ｂ）参照）。そこで、各アミノ酸をアスパラギン酸（Ｄ）に置換したペプチドを合成して何れのアミノ酸がリン酸化されるかを調べた。その結果を図７の（ａ）に示す。図中、上段はＮＨＫ細胞の結果を、下段はＨａＣａＴ細胞の結果を示す。左側のグラフは、ｐｅｐＡの８番目および１０番目のスレオニン（Ｔ）について、両方ともスレオニンのままのもの（ＴＴ）、両方ともアスパラギン酸に置換したもの（ＤＤ）、一方をアスパラギン酸に置換したもの（ＤＴ，ＴＤ）、の結果であり、右側のグラフは、ｐｅｐＦにおける（Ｓ１００ＣのＮ末から数えて）９４番目および１０１番目のセリン（Ｓ）について、両方ともセリンのままのもの（ＳＳ）、両方ともアスパラギン酸に置換したもの（ＤＤ）、一方をアスパラギン酸に置換したもの（ＤＳ，ＳＤ）、の結果である。同図に示すように、ｐｅｐＡでは１０番目のスレオニンが、ｐｅｐＦでは９４番目のセリンがそれぞれリン酸化されることが分かった。
【００７０】
図７の（ｂ）（ｃ）は、Ｃａ濃度に応じてＳ１００Ｃの核移行がどのように変化するかを調べた結果を示すものであり、同図に示すように、ＮＨＫ細胞、ＨａＣａＴ細胞いずれの場合も、細胞を高Ｃａに曝すとＳ１００Ｃは核に移行した。尚、図中、「Ｓｏｌ」「Ｉｎｓｏｌ」「Ｎｕｃ」は、それぞれ、可溶性画分、不溶性画分、核内タンパク質画分を示し、「Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１」「β−Ａｃｔｉｎ」は、対照用である。
【００７１】
以上のように、高Ｃａ条件下ではＳ１００Ｃがリン酸化され、かつ核に移行することが分かった。
【００７２】
〔実施例４：Ｓ１００Ｃが核移行する機構の検討〕
次に、Ｓ１００Ｃが核移行する機構を検討した。Ｓ１００Ｃは核移行シグナルを持たないので、何らかのタンパク質と結合して移行するものと考え、結合タンパク質を探索した。その結果をまとめて図８に示す。
【００７３】
図８の（ａ）は、Ｓ１００ＣのｐｅｐＡ（但し、１０番目のスレオニン（Ｔ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換したリン酸化相当体（ＴＤ））を固定したカラムにＨａＣａＴ細胞抽出液をアプライし、同ｐｅｐＡに結合するタンパク質を調べた結果であり、矢印で示すように、同ｐｅｐＡに結合したものに〜１００ｋＤａのタンパク質があった。そのバンドを切り出して部分的にアミノ酸配列を決定したところ、ヌクレオリンと一致した。逆に、ヌクレオリンタンパク質（Ｎｕｃｌ−ＧＳＴ）を膜上に固定し細胞抽出液をアプライしたところ、Ｓ１００Ｃが結合した（同図右）。
【００７４】
図８の（ｂ）には、ｐｅｐＡの何ら置換を施していないもの（ｗｔ）、１０番目のスレオニン（Ｔ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換したリン酸化相当体（ＴＤ）、同スレオニン（Ｔ）をアラニン（Ａ）に置換した非リン酸化体（ＴＡ）等のアミノ酸配列が示される。これらのペプチド及び同様の置換を施したＳ１００Ｃとヌクレオリンとの結合を調べたところ、リン酸化相当体（ＴＤ）がヌクレオリンとの高い親和性を示した。
【００７５】
図８の（ｃ）に示すように、細胞を高Ｃａに曝露し、細胞質（Ｃ）と核（Ｎ）の抽出物を用いて解析したところ、時間経過につれてＳ１００Ｃがリン酸化し、ヌクレオリン（Ｎｕｃｌ）と結合して核に移行することが明らかになった。また、同じ実験で、予めフォスファターゼにより脱リン酸化させておくと、Ｓ１００Ｃとヌクレオリンとの結合が低下した（図８（ｄ）の「＋」レーン参照）。
【００７６】
さらに、膜透過性を亢進させた細胞を用いた核移行アッセイ系において、加える細胞質からヌクレオリンを抗体（ａｎｔｉ−Ｎｕｃｌ）によって予め取り除いておくと、蛍光ラベルしたＳ１００Ｃの核移行が妨げられた（図８（ｅ）参照）。
【００７７】
以上のように、Ｓ１００Ｃの結合タンパク質としてヌクレオリンが同定された。ヌクレオリンの非存在下ではＳ１００Ｃは核に移行できなかった。
【００７８】
〔実施例５：核移行したＳ１００Ｃによる増殖抑制メカニズムの検討〕
次に、核に移行したＳ１００Ｃがどのようにして増殖を抑制するのかを検討した。具体的には、既に増殖に抑制的に働くことが知られているＣｄｋインヒビターをスクリーニングしたところ、ｐ２１とｐ１６が誘導され、そのうちｐ２１が主要な役割を果たすことが明らかになった。結果を図９および図１０に示す。
【００７９】
図９の（ａ）（ｂ）に示すように、ＮＨＫ細胞、ＨａＣａＴ細胞共に、高Ｃａ処理、Ｓ１００Ｃの導入によって、ｐ２１とｐ１６が誘導された。
【００８０】
図９の（ｃ）に示すように、ＴＡＴ−Ｓ１００Ｃを細胞内に導入してｐ２１が誘導された状態にした後、抗Ｓ１００Ｃ抗体（Ａｎｔｉ−Ｓ１００Ｃ）を導入するとｐ２１タンパク質が減少し、それに伴ってＣｄｋ２活性が回復した。この結果は、ｐ２１の誘導が確かにＳ１００Ｃによるものであることを示すものである。尚、Ｃｄｋ２活性の回復は、試験管内でのヒストンＨ１のリン酸化を指標に判断した。
【００８１】
図９の（ｄ）に示すように、Ｓ１００Ｃのｐ２１誘導作用は、ｐｅｐＡによって担われていることが明らかになった。これに対して、ｐｅｐＥにはｐ２１の誘導能が認められなかった。
【００８２】
図１０の（ａ）に示すように、ｐ２１の誘導作用はｐｅｐＡのリン酸化相当体（ＴＤ）で強く、非リン酸化体（ＴＡ）ではその作用はなかった。この結果は、ヌクレオリンとの親和性の結果（図８（ｂ）参照）とよく符合するものである。
【００８３】
図１０の（ｂ）に示すように、ＴＡＴ−Ｓ１００Ｃを細胞内に導入するとＤＮＡ合成が抑制される。それは抗Ｓ１００Ｃ抗体を一緒に入れることによって回復する。さらに、抗ｐ２１抗体ではＤＮＡ合成は回復するが、抗ｐ１６抗体では回復しなかった。この結果は、Ｓ１００ＣのＤＮＡ合成抑制作用にはｐ２１が主要な役割を果たしていることを示すものである。Ｃｄｋ２活性を調べても、この結論と一致する結果が得られた（図１０（ｃ）参照）。
【００８４】
〔実施例６：Ｓ１００Ｃによるｐ２１誘導メカニズムの検討〕
次に、Ｓ１００Ｃがどのような機構でｐ２１を誘導するのかを検討した。抗体メンブレンを用いてスクリーニングしたところ、ヌクレオリンと結合し、その結合がＳ１００Ｃによって抑制されるタンパク質としてＳｐ１が同定された。Ｓｐ１はｐ２１の発現を誘導する転写因子であることが分かっている。それぞれの部分タンパク質を用いて、結合領域を決定した。結局、低ＣａではＳｐ１はヌクレオリンと結合して不活化状態にあり、高ＣａでＳ１００Ｃがヌクレオリンと結合すると、Ｓｐ１がヌクレオリンから離れ、自由になったＳｐ１がｐ２１のプロモーターに働いてｐ２１レベルを上げることが分かった。結果をまとめて図１１に示す。
【００８５】
図１１の（ａ）は、抗体メンブレンの結果である。矢印がヌクレオリンと結合し、その結合がＳ１００Ｃの同時添加によって抑制されるスポットを示す。それはＳｐ１であった。ＧＳＴ−Ｓ１００Ｃ、ＧＳＴはバックグラウンドのコントロールである。
【００８６】
図１１の（ｂ）に示すように、メンブレン上にＳ１００Ｃ（ＧＳＴ−Ｓ１００Ｃ）とヌクレオリン（ＧＳＴ−Ｎｕｃｌ）とを固定して細胞抽出液をかけたところ、Ｓｐ１はヌクレオリンには結合したが、Ｓ１００Ｃには結合しなかった。
【００８７】
図１１の（ｃ）に示すように、細胞抽出液を免疫沈降し、それをウエスタン法で解析したところ、抗ヌクレオリン抗体（Ａｎｔｉ−Ｎｕｃｌ）で免疫沈降すると低ＣａではＳｐ１が検出できたが、高Ｃａではリン酸化されたＳ１００Ｃが結合していた。予め脱リン酸化しておくと、Ｓ１００Ｃの結合能力はなくなり、再びＳｐ１が結合した（Ａｌ−Ｐ「＋」のレーン参照）。抗Ｓｐ１抗体（Ａｎｔｉ−Ｓｐ１）で免疫沈降した場合も、このような結合の変動を支持する結果を得た。
【００８８】
Ｓｐ１及びヌクレオリンの各部分タンパク質とＳ１００Ｃとを用いて、各タンパク質間の結合部位を確定した。その結果を図１１の（ｄ）に示す。図中、Ｓｐ１のＳｅｇ−１、Ｓｅｇ−２、Ｓｅｇ−３の各セグメントは、同図（ｅ）のＳｐ１の模式的構造中の下線１，２，３に対応する。同様に、ヌクレオリンのＳｅｇ−１、Ｓｅｇ−２、Ｓｅｇ−３、Ｓｅｇ−４の各セグメントは、同図（ｅ）のヌクレオリンの模式的構造中の下線１，２，３，４に対応する。Ｓ１００ＣのｐｅｐＡ〜ｐｅｐＦの各領域も合わせて同図に示される。
【００８９】
上記実験の結果、図１１の（ｄ）に示すように、Ｓｐ１のＳｅｇ−３がヌクレオリンのＳｅｇ−４に、Ｓ１００ＣのｐｅｐＡがヌクレオリンのＳｅｇ−３に結合することが分かった。
【００９０】
〔実施例７：経路のまとめと生体内でのＳ１００Ｃ作用の考察〕
図１２の（ａ）には、これまでの実験結果から明らかにされた高Ｃａによるヒト表皮角化細胞の増殖抑制経路の模式図を示す。
【００９１】
ヒト表皮角化細胞の増殖抑制機構は他にもいろいろな経路が提唱されている。Ｓ１００Ｃ経路の相対的意義を検討するため、抗Ｓ１００Ｃ抗体（Ｓ１００Ｃ　Ａｂ）を用いて増殖がどの程度回復するかを調べたところ、〜７０％の回復が見られた（図１２（ｂ）参照）。尚、細胞増殖は、チミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）の取り込みを指標に判断した。この結果は、Ｓ１００Ｃが唯一ではないにせよ、主要な増殖抑制メディエイターであることを示すものである。
【００９２】
図１２の（ｃ）は、ノーザンブロット解析によりＳ１００Ｃがヒトの何れの組織・器官で発現しているかを調べた結果であり、同図に示すように、Ｓ１００Ｃは心臓、脾臓、腎臓、肝臓などヒトの様々な組織で発現していた。
【００９３】
また、生体内表皮組織におけるＳ１００Ｃの役割を検討した。その結果を図１３に示す。Ｓ１００Ｃは基底層のみで核に存在せず、その上層からは核にも検出された（同図左）。この結果は、表皮では増殖細胞は基底層のみに存在することとよく符合する。ｐ２１の染色では、Ｓ１００Ｃが核に検出される細胞においてｐ２１が検出された（同図右）。以上の結果は、上記模式図に示す経路が生体内で働くことを支持するものである。
【００９４】
〔実施例８：細胞増殖性疾病に対するｐｅｐＡの治療効果の検討〕
以上の結果から、Ｓ１００Ｃ、特にｐｅｐＡがｐ２１を誘導し、細胞の増殖抑制を起こすことが分かった。ｐ２１は可逆的な増殖抑制のほかに、状況によっては細胞死（アポトーシス）を起こすことが知られている。そこで、ｐｅｐＡをがんを含む細胞増殖性疾病の治療に応用する可能性を探るため、培養がん細胞株に対する効果を調べた。その結果を図１４に示す。
【００９５】
図１４の（ａ）に示すように、ＴＡＴ−ｐｅｐＡをヒト皮膚由来扁平上皮がん細胞株Ａ−４３１に作用させたところ、時間経過に従って生細胞が減少した。他の部位のペプチドｐｅｐ−Ｃｏではその作用は見られなかった。
【００９６】
図１４の（ｂ）に示すように、様々ながん細胞株に対するＴＡＴ−ｐｅｐＡの作用を調べたところ、ＴＡＴ−ｐｅｐＡは大部分の細胞株で細胞死を誘導することが分かった。図中、「ＢＳＣＣ−９３」「ＨＳＣ−５」「ＤＪＭ−１」はヒト皮膚由来扁平上皮がん細胞株を、「ＭＭＡｃ」はメラノーマ細胞株を、「Ａ−５４９」は肺がん細胞株を、「ＰＫ−８」は膵がん細胞株を、「ＭＣＦ−７」は乳がん細胞株をそれぞれ示す。
【００９７】
【発明の効果】
本発明は、以上のように、Ｓｐ１分子をヌクレオリン分子から解離させる物質のスクリーニング方法などを提供するものであり、薬剤開発などに利用でき、医学上および産業上有用なものである。
【００９８】
例えば、転写因子であるＳｐ１分子は、前述したｐ２１以外にも、▲１▼血小板由来増殖因子ＰＤＧＦ、▲２▼細胞外基質ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、▲３▼基質への結合タンパク質インテグリンα５、および、▲４▼ビタミンＤ受容体が標的分子として知られている（下記文献１〜４参照）。このように、Ｓｐ１分子をヌクレオリン分子から解離させ活性化させることは、各種の遺伝子発現を誘導し、種々の重要な生物作用を誘導すると考えられる。したがって、Ｓｐ１分子をヌクレオリン分子から解離させる物質は、薬剤の候補分子（創薬ターゲット）となり、医学上および産業上有用なものである。
［文献１：血小板由来増殖因子ＰＤＧＦ］
Ｍｏｌａｎｄｅｒ，　Ｃ．，　Ｈａｃｋｚｅｌｌ，　Ａ．，　Ｏｈｔａ，　Ｍ．，　Ｉｚｕｍｉ，　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｆｕｎａ，　Ｋ．　（２００１）．　Ｓｐ１　ｉｓ　ａ　ｋｅｙ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＰＤＧＦ　ｂｅｔａ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．　２８，　２２３−２３３．
［文献２：細胞外基質ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ］
Ｓｕｚｕｋｉ，　Ｍ．，　Ｋｕｒｏｄａ，　Ｃ．，　Ｏｄａ，　Ｅ．，　Ｔｓｕｎｏｄａ，　Ｓ．，　Ｎａｋａｍｕｒａ，　Ｔ．，　Ｎａｋａｊｉｍａ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｏｄａ，　Ｋ．　（１９９５）．　Ｇ１０ＢＰ，　ａｎ　Ｅ１Ａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　Ｓｐ１，ｒｅｐｒｅｓｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　ｇｅｎｅ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１５，５４２３−５４３３．
［文献３：基質への結合タンパク質インテグリンα５］
Ｌａｒｏｕｃｈｅ，　Ｋ．，　Ｌｅｃｌｅｒｃ，　Ｓ．，　Ｓａｌｅｓｓｅ，　Ｃ．，　ａｎｄ　Ｇｕｅｒｉｎ，　Ｓ．Ｌ．　（２０００）．　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｌｐｈａ　５　ｉｎｔｅｇｒｉｎ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｉｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　Ｓｐ１　ｉｎ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　３９１８２−３９１９２．
［文献４：ビタミンＤ受容体］
Ｍｉｙａｍｏｔｏ，　Ｋ．，　Ｋｅｓｔｅｒｓｏｎ，　Ｒ．Ａ．，　Ｙａｍａｍｏｔｏ，　Ｈ．，　Ｔａｋｅｔａｎｉ，　Ｙ．，　Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ，　Ｅ．，　Ｔａｔｓｕｍｉ，　Ｓ．，　Ｉｎｏｕｅ，　Ｙ．，　Ｍｏｒｉｔａ，　Ｋ．，　Ｔａｋｅｄａ，　Ｅ．，　ａｎｄ　Ｐｉｋｅ，　Ｊ．Ｗ．　（１９９７）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ．　Ｍｏｌ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　１１，　１１６５−１１７９。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の一形態に係るスクリーニング方法を説明する図である。
【図２】本発明の実施の一形態に係るスクリーニング方法を説明する図である。
【図３】本発明の実施の一形態に係るスクリーニング方法を説明するグラフである。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、ＮＨＫ細胞およびＨａＣａＴ細胞の高Ｃａに対する反応を調べた結果を示す図である。
【図５】（ａ）・（ｂ）は、ＨａＣａＴ細胞を用いて、Ｓ１００Ｃの細胞増殖抑制能と、その機能に必要な領域について調べた結果を示す図である。
【図６】（ａ）〜（ｃ）は、Ｓ１００ＣとＣａによる増殖抑制との関連性、及びＳ１００Ｃのリン酸化部位について調べた結果を示す図である。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は、Ｓ１００ＣとＣａによる増殖抑制との関連性、及びＳ１００Ｃのリン酸化部位について調べた結果を示す図である。
【図８】（ａ）〜（ｅ）は、Ｓ１００Ｃが他のタンパク質と結合して核移行する機構を検討した結果を示す図である。
【図９】（ａ）〜（ｄ）は、核移行したＳ１００Ｃによる細胞増殖抑制メカニズムの検討結果を示す図である。
【図１０】（ａ）〜（ｃ）は、核移行したＳ１００Ｃによる細胞増殖抑制メカニズムの検討結果を示す図である。
【図１１】（ａ）〜（ｅ）は、Ｓ１００Ｃによるｐ２１誘導メカニズムの検討結果を示す図である。
【図１２】（ａ）〜（ｃ）は、高Ｃａによるヒト表皮角化細胞の増殖抑制経路の模式図、及び、生体内でのＳ１００Ｃの作用とその発現分布について調べた結果を示す図である。
【図１３】生体内表皮組織におけるＳ１００Ｃの役割を検討した結果を示す図である。
【図１４】（ａ）・（ｂ）は、培養がん細胞株に対するｐｅｐＡの効果を調べた結果を示すグラフである。
【図１】
2004144680.tif 000002
【図２】
2004144680.tif 000003
【図３】
2004144680.tif 000004
【図４】
2004144680.tif 000005
【図５】
2004144680.tif 000006
【図６】
2004144680.tif 000007
【図７】
2004144680.tif 000008
【図８】
2004144680.tif 000009
【図９】
2004144680.tif 000010
【図１０】
2004144680.tif 000011
【図１１】
2004144680.tif 000012
【図１２】
2004144680.tif 000013
【図１３】
2004144680.tif 000014
【図１４】
2004144680.tif 000015