(57)【要約】      （修正有）【課題】発明者らが既に見出していた転写リプレッサーとして機能するＺＨＸ１の生物学的役割を決定するために、酵母２−ハイブリッドシステムを用いて、ＺＨＸ１と相互作用するタンパク質の探索を行った。【解決手段】その結果、新規なタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡの分子クローニング及びヌクレオチド配列を決定したところ、特定の配列から成る新規なタンパク質が見出された。このタンパク質（ＺＨＸ３）は、ＺＨＸ１と同様に、２つのジンクフィンガー（Ｚｎｆ）モチーフ及び５つのホメオドメイン（ＨＤｓ）を含み、転写抑制活性を有することが明らかになった。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列の機能部分若しくは該機能部分において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から成り、転写抑制活性を有するタンパク質又はペプチド。
【請求項２】
前記機能部分が、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３０３〜５０２番目のアミノ酸配列である請求項１に記載のタンパク質又はペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質又はペプチドを有効成分とする、転写抑制を目的とする薬剤。
【請求項４】
肝癌細胞でのみ発現する遺伝子の転写を抑制する請求項１又は２に記載のタンパク質又はペプチド。
【請求項５】
前記遺伝子がＩＩ型ヘキソース又はピルビン酸キナーゼＭである請求項４に記載のタンパク質又はペプチド。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のタンパク質又はペプチドを有効成分とする肝癌の治療薬。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のペプチド又はタンパク質を特異的に認識することができる抗体。
【請求項８】
請求項７に記載の抗体を有効成分とする、転写抑制活性を有する薬剤のスクリーニング剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、転写抑制活性を有するタンパク質に関し、より詳細には、肝癌に特異的な遺伝子の転写制御因子ＺＨＸ３に関する。
【０００２】
【従来の技術】
解糖系酵素遺伝子であるピルピン酸キナーゼ（ＰＫ）Ｍ遺伝子やＩＩ型ヘキソキナーゼ（ＨＫ ＩＩ）遺伝子は、正常肝では発現が抑制されているが、肝発癌により誘導される。両者に共通の転写因子は、Nuclear Factor-Y（ＮＦ−Ｙ）であるが、正常肝細胞と肝癌細胞におけるＮＦ−Ｙの発現には差異が認められない。従って、ＮＦ−Ｙと相互作用する因子が肝癌に特異的な遺伝子発現に関与していると考えられる。
そこで、ＮＦ−Ｙで特に重要であるＡサブユニット（ＮＦ−ＹＡ）と相互作用する蛋白質の検索を行ったところ、８７３個のアミノ酸から成り、２つのジンクフィンガー（Ｚｎｆ）モチーフと５つのホメオドメイン（ＨＤ）を有するＺＨＸ１をクローニングしてきた（非特許文献１）。ＺＨＸ１は、ホメオボックスタンパク質スーパーファミリーのＺｎｆクラスに属し、ヒトＺＨＸ１のＨＤ１からＨＤ２領域を含む２７２〜５６４のアミノ酸配列は、ＮＦ−ＹＡのＮ末端グルタミン−リッチＡＤとの相互作用に必要である（非特許文献１）。このノザンブロット分析を行った結果、ＺＨＸ１転写産物が普遍的に発現していることがわかった（非特許文献２，３）。このヒトＺＨＸ１遺伝子は染色体８ｑ上、マーカーＣＨＬＣ．ＧＡＴＡ５０Ｂ０６及びＣＨＬＣ．ＧＡＴＡ７Ｇ０７の間に局在する（非特許文献２）。発明者らは、このＺＨＸ１が転写リプレッサーとして機能し、そして核内に局在することを報告した（非特許文献４）。
【０００３】
なお、後述する本発明者らが発見した新規な転写制御因子（ＺＨＸ３）をコードすると思われる塩基配列を含む配列（GenBank/XM 029734）及びその一部（DDBJ/ AB007855）は既にデータベースに登録されているが、前者はデータベース上で散在していた部分配列をつなげて、推定上の蛋白質として報告されたものであり、蛋白質をコードしている可能性を示唆したに過ぎない。また後者は部分的にクローニングされていた配列であるが、機能解析は行われていなかった。即ち、これら公開された塩基配列のコードするタンパク質が転写抑制活性を有することは全く知られておらず、またこれらの開示情報から推測することも不可能であった。
【０００４】
【非特許文献１】
Yamada, K., Osawa, H., and Granner, D. K. (1999) FEBS Lett. 460, 41-45
【非特許文献２】
Yamada, K., Printz, R. L., Osawa, H., and Granner, D. K. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 261, 614-62l
【非特許文献３】
Hirano, S., Yamada, K., Kawata, H., Shou, Z., Mizutani, T., Yazawa, T., Kajitani, T., Sekiguchi, T., Yoshino, M., Shigematsu, Y., Mayumi, M., and Miyamoto, K. (2002) Gene 290, 107-114
【非特許文献４】
Yamada, K., Kawata, H., Matsuura, K., Shou, Z., Hirano, S., Mizutani, T., Yazawa, T., Yoshino, M., Sekiguchi, T., Kajitani, T., and Miyamoto. K. (2002) Biochem. Biophys. Res. Comm. 279, 368-374
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
発明者らは、ＺＨＸ１の生物学的役割を決定することを目的として、ＺＨＸ１がＮＦ−ＹＡ以外のタンパク質と相互作用し、そして遺伝子転写を制御するかどうかを調べた。そのため、発明者らは、酵母２−ハイブリッドシステムを用いて、ラット肝臓及び卵巣顆粒膜細胞のｃＤＮＡライブラリーにおいてＺＨＸ１と相互作用するタンパク質の探索を行った。
【０００６】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
その結果、ＺＨＸ１、転写共因子、ＤＮＡ結合タンパク質、Ｚｙｘｉｎ、アンドロゲン誘発性アルドース還元酵素のような核タンパク質、１１−１９リジン−リッチ白血病遺伝子、及びその他の未知のタンパク質がクローニングされ、新規なタンパク質が見出された。この新規タンパク質をコードする全長ｃＤＮＡの分子クローニング及びヌクレオチド配列を決定したところ、その新規なタンパク質は９５６アミノ酸残基（配列番号１）から成り、ＺＨＸ１と同様に、２つのジンクフィンガー（Ｚｎｆ）モチーフ及び５つのホメオドメイン（ＨＤｓ）を含むことが明らかになった。
発明者らはこの新規なタンパク質がＺＨＸ１と共にＺＨＸファミリーを形成することと結論し、そしてそれをＺＨＸ３と名付けた。ＺＨＸファミリーは、互いにホモダイマーやヘテロダイマーを形成することにより、遺伝子発現の調節に関与していると推察される。
ＺＨＸ３は、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３の両方と二量体を形成するのみでなく、上記ＮＦ−ＹＡのＡＤとも相互作用する。さらに分析したところ、このＺＨＸ３は核内に局在する普遍的な転写リプレッサーであり、そして二量体として機能することが明らかになった。
【０００７】
即ち、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列の機能部分若しくは該機能部分において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から成り、転写抑制活性を有するタンパク質又はペプチドである。
ヒトとマウスのＺＨＸ３のアミノ酸配列を比べると、その相同性は８５．３％であり、ヒトとラット型ＺＨＸ３のアミノ酸配列の相同性は８７．３％であった。ラット型ＺＨＸ３のアミノ酸配列を配列番号２に示す。このアミノ酸配列はヒトＺＨＸ３でいうところのアミノ酸配列１１４番から６４２番目までに相当する領域と考えられる。従って、ＺＨＸ３のアミノ酸配列（配列番号１）と８５％以上相同のアミノ酸配列を有するタンパク質はヒトのＺＨＸ３と同一の転写抑制機能を有するタンパク質であると考えられる。
従って、本発明はまた、配列番号１で表されるアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に少なくとも８５％相同のアミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列の機能部分若しくは該機能部分に少なくとも８５％相同のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から成り、転写抑制活性を有するタンパク質又はペプチドと表すことができる。
後述の実施例でも明らかにされるが、配列番号１のアミノ酸配列の３０３〜５０２番目のアミノ酸配列はその転写抑制機能を担う部分であるといえる。従って、上記配列番号１で表されるアミノ酸配列の機能部分は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３０３〜５０２番目のアミノ酸配列であることが好ましい。
【０００８】
肝癌細胞では専ら亢進した解糖系に依存してエネルギー代謝を行っていることから、ＺＨＸ３が正常肝では肝癌特異的アイソザム遺伝子群の発現を抑制しており、癌化に伴いＺＨＸ３の発現が低下するか、又は、ＺＨＸ３蛋白質が修飾されて活性を失うものと考えられる。従って、ＺＨＸ３の存在を検出する物質や機能を調節する薬剤を開発することにより、肝癌の診断と治療へ応用することができる。
即ち、本発明は、また、上記のタンパク質又はペプチドを有効成分とする、転写抑制を目的とする薬剤である。更に、本発明は、肝癌細胞でのみ発現する遺伝子の転写を抑制する上記いずれかのタンパク質又はペプチドである。この遺伝子はＩＩ型ヘキソース又はピルビン酸キナーゼＭであってもよい。また、本発明は、このタンパク質又はペプチドを有効成分とする肝癌の治療薬である。更に、本発明は、このタンパク質又はペプチドを用いて転写抑制因子の欠如に起因する疾患、特に肝癌を治療する方法である。
また、本発明は、上記いずれかのペプチド又はタンパク質を特異的に認識することができる抗体である。更に、本発明は、この抗体を有効成分とする、転写抑制活性を有する薬剤のスクリーニング剤である。
【０００９】
【実施例】
本実施例において、酵母２−ハイブリッドシステム、pDsRed1-C1、X-α-gal、ヒト精巣マラソン−レディｃＤＮＡ、Advantage2PCRキット、ヒトMultiple Tissue Northern Blot及びBlot II、ExpressHybハイブリダイゼーション溶液、及びpEGFP-C1はClontech(Palo Alto、CA)から購入した。pGEX-4T-2、pGEX-5X-1、α-32PdCTP(111TBq/mmol)、グルタチオン−セファロース４Ｂ、及び３５Ｓ−メチオニン(37TBq/mmol)はAmersham Pharmacia Biotech(Cleveland、OH)から購入した。HEK293細胞、ヒト胎児腎細胞系はAmerican Type Culture Collection(Manassas、VA)から購入した。TRIOZOL試薬、SuperscriptII、pcDNA3.1His-Cプラスミド、及びLIPOFECTAMINE PLUSはInvitrogen(Groningen、Netherlands)から購入した。ExTaqDNAポリメラーゼ、pT7Blue-T2ベクター、及びBcaBestDNAラベリングキットはTaKaRa BIOMEDICALSから入手した。pGEM-T Easyベクター、T7 TNT Quick-結合転写／翻訳系、pGL3-Control、pRL-CMV、及び二重ルシフェラーゼ分析系はPromega(Madison、WI)から購入した。Big Dye terminator FS cycleシークエンシングキットはApplied Biosystems Japan(Tokyo、Japan)から購入した。TOPP3細胞はStragene(La Jolla、CA)から入手した。QIAGENプラスミドキットはQIAGEN(Hilden、Germany)から購入した。
【００１０】
本実施例において行った試験の手順を以下に示す。
試験例１  プラスミドの構築
ｐＡＣＴ２Ｂ１プラスミドを既報に従って作製した（非特許文献１）。
クローン化されたＧ２３プラスミド、ｐＡＤ−Ｇ２３をＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ又はＳｆｉＩ／ＢｇｌIIで消化し、それぞれの断片をｐＧＥＸ−４Ｔ−２ベクターのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイト又はｐＧＢＫＴ７ベクターのＳｆｉＩ／ＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、それぞれｐＧＳＴ−Ｇ２３及びｐＤＢＤ−Ｇ２３を得た。
ｐＡＤ−Ｇ２３の２５０ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII断片をｐＤｓＲｅｄ１−Ｃ１のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIサイト中へサブクローニングし、ｐＤｓＲｅｄ−逆向きＧ２３（ＨＤ１）を作製した。上記Ｓ−ＤｓＲｅｄ１Ｃ１−ＨｉｎｄIII（配列番号３）及び上記Ａｓ−ＤｓＲｅｄ１Ｃ１−ＳａｌＩオリゴヌクレオチド（配列番号４）をその後、アニーリングし、リン酸化し、そしてｐＤｓＲｅｄ１−Ｃ１のＨｉｎｄIII／ＳａｌＩサイト中へ挿入し、ｐＤｓＲｅｄ１−Ｃ１Ｅ１を得た。ｐＤｓＲｅｄ−逆向きＧ２３（ＨＤ１）のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌII断片をｐＤｓＲｅｄ１−Ｃ１Ｅ１のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ中へサブクローニングし、ｐＤｓＲｅｄ−ｒＺＨＸ３（ＨＤ１）を作製した。生ずるプラスミドのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片をｐＡＣＴ２のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイト中へサブクローニングし、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（２４２−４８８）を得た。
ｐＢＳII−ＫＩＡＡ０３９５はDr.Takahiro Nagase(KAZUSA DNA RESEARCH INSTITUTE、Japan)から賦与された。上記プラスミドの１．２ｋｂのＳａｌＩ／ＡｐａＩ断片をｐＤｓＲｅｄ１−Ｃ１Ｅ１のＳａｌＩ／ＡｐａＩサイト中へサブクローニングし、ｐＤｓＲｅｄ−ＺＨＸ３（ＨＤ２−５）を作製した。生ずるもののＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片をｐＡＣＴ２Ｂ１のＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（４９８−９０３）を得た。
【００１１】
ｐＡＤ−ＺＨＸ１（１４２−８７３）、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（２７２−８７３）、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（５６５−８７３）、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（２７２−５６４）、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（４３０−５６４）、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（３４５−４６３）、ｐＤＢＤ、ｐＹＡ１−２６９、ｐＹＡ１−１４０、ｐＹＡ１−１１２、ｐＹＡ１４１−２６９、ｐＹＡ１７２−２６９、及びｐＹＡ２０５−２６９を既報に従って作製した（非特許文献１、２）
ＨＥＫ２９３細胞からのトータルＲＮＡを製造業者のプロトコルに従ってＴＲＩＺＯＬ試薬を用いて調製した。逆転写−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲｓ）を若干の改変を伴って以前に示したように行った（非特許文献２）。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）条件はＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼの使用を除いては、以前に示した（非特許文献２）。Ｓ−ｈＺＨＸ３−ＡｐａＩ２（配列番号５）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−ＳＴＯＰ４（配列番号６）、Ｓ−ｈＺＨＸ３−ＮｃｏＩ（配列番号７）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−ＢｓｍＢＩ２（配列番号８）、Ｓ−ｈＺＨＸ３−Ｍｅｔ（配列番号９）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−ＮｃｏＩ（配列番号１０）、Ｓ−ｈＺＨＸ３−ＨＤ１（配列番号１１）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−ＨＤ２（配列番号１２）、Ｓ−ｈＺＨＸ３−ＨＤ１（配列番号１１）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−１５０６（配列番号１３）、Ｓ−ｈＺＨＸ３−１０９０（配列番号１４）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−ＨＤ２（配列番号１２）、Ｓ−ｈＺＨＸ３−ＨＤ２（配列番号１５）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−ＨＤ２（配列番号１２）、Ｓ−ｈＺＨＸ３−ＨＤ１（配列番号１１）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−ＨＤ１（配列番号１６）、及びＳ−ｈＺＨＸ３Ｎ（配列番号１７）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３Ｎ（配列番号１８）の組み合わせをプライマーとして用いた。
【００１２】
これらの生成物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター中へサブクローニングし、それぞれ、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＡｐａＩ／ＳＴＯＰ）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＮｃｏＩ／ＢｓｍＢＩ）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（Ｍｅｔ／ＮｃｏＩ）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＨＤ１−２）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＨＤ１−１５０６）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（１０９０−ＨＤ２）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＨＤ２）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＨＤ１）、及びｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３Ｎを得た。
ＧＢＫＴ７ＭＣＳ１（配列番号１９）及びＧＢＫＴ７ＭＣＳ２オリゴヌクレオチド（配列番号２０）をアニーリングし、リン酸化し、そしてｐＧＢＫＴ７のＥｃｏＲ１／ＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、ｐＧＢＫＴ７Ｂ１を得た。上記ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＡｐａＩ／ＳＴＯＰ）のＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＤｓＲｅｄ−ＺＨＸ３（ＨＤ２−５）のＡｐａＩ／ＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、ｐＤｓＲｅｄ−ＺＨＸ３（ＨＤ２−ＳＴＯＰ）を得た。ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＮｃｏＩ／ＢｓｍＢＩ）のＥｃｏＲＩ／ＢｓｍＢＩ断片をｐＤｓＲｅｄ−ＺＨＸ３（ＨＤ２−ＳＴＯＰ）のＥｃｏＲ１／ＢｓｍＢＩサイト中へサブクローニングし、ｐＤｓＲｅｄ−ＺＨＸ３（ＮｃｏＩ−ＳＴＯＰ）を得た。
【００１３】
Ｓ−ＧＢＫＴ７−ＮｄｅＩ（配列番号２１）及びＡｓ−ＧＢＫＴ７−ＮｃｏＩオリゴヌクレオチド（配列番号２２）をアニーリングし、リン酸化し、そしてｐＧＢＫＴ７Ｂ１のＮｄｅＩ／ＮｃｏＩサイト中へ挿入し、ｐＧＢＫＴ７ＮＥＮを得た。ｐＤｓＲｅｄ−ＺＨＸ３（ＮｃｏＩ−ＳＴＯＰ）の２ｋｂのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＧＢＫＴ７ＮＥＮのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、ｐＧＢＫＴ７−ＺＨＸ３（ＮｃｏＩ−ＳＴＯＰ）を得た。上記ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（Ｍｅｔ／ＮｃｏＩ）をＮｃｏＩで消化し、９６０ｂｐの断片をｐＧＢＫＴ７−ＺＨＸ３（ＮｃｏＩ−ＳＴＯＰ）のＮｃｏＩサイト中へサブクローニングし、ｐＤＢＤ−ＺＨＸ３（１−９５６）を得た。生ずるプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ反応により平滑末端処理し、そしてその後ＥｃｏＲＩで消化した。上記２．９ｋｂの断片をｐＧＥＸ−５Ｘ−１ベクターのＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩサイト中へサブクローニングし、ｐＧＳＴ−ＺＨＸ３（１−９５６）を得た。ｐＧＳＴ−ＺＨＸ３（１−９５６）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片をｐＡＣＴ２Ｂ１のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイト中へサブクローニングし、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（１−９５６）を得た。ＰＣＲはＳ−ｈＺＨＸ３ＨＤ１（配列番号１１）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−ＨＤ１−Ｅｃｏ（配列番号２３）の組み合わせをプライマーとして、ｐＤＢＤ−ＺＨＸ３（１−９５６）を鋳型として用いて行われた。ＥｃｏＲＩでの消化後、上記断片をｐＡＣＴ２Ｂ１のＥｃｏＲＩサイト中へサブクローニングし、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（３０３−３６４）を得た。
【００１４】
ｐＳＧ４２４、ｐＳＧ４２４Ｂ１、５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３  Ｃｏｎｔｒｏｌ、及びｐＥＧＦＰ−Ｃ１Ｅ１プラスミドは以前に示された（６、１３〜１５）。ｐＤＢＤ−ＺＨＸ３（１−９５６）の２．９ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＧ４２４Ｂ１又はｐＥＧＦＰ−Ｃ１Ｅ１ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、それぞれ、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１−９５６）及びｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（１−９５６）を得た。ｐＤｓＲｅｄ−ＺＨＸ３（ＨＤ２−５）のＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＧ４２４Ｂ１のＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（４９８−９０３）を得た。ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＨＤ１−２）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＨＤ１−１５０６）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（１０９０−ＨＤ２）、及びｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＨＤ２）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＧ４２４Ｂ１又はｐＥＧＦＰ−Ｃ１Ｅ１ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、それぞれ、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（３０３−５５５）、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（３０３−５０２）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（３０３−５５５）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（３０３−５０２）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（３６４−５５５）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（４９７−５５５）を得た。ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＨＤ１）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＧ４２４Ｂ１ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（３０３−３６４）を得た。
【００１５】
ＰＣＲはＳ−ｈＺＨＸ３−Ｍｅｔ３（配列番号２４）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−９０９（配列番号２５）、Ｓ−ｈＺＨＸ３−Ｍｅｔ３（配列番号２４）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−４３５（配列番号２６）、Ｓ−ｈＺＨＸ３−４３６（配列番号２７）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−９０９（配列番号２５）、Ｓ−ｈＺＨＸ３−Ｍｅｔ３（配列番号２４）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−３２１（配列番号２８）、Ｓ−ｈＺＨＸ３−３２２（配列番号２９）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−４３５（配列番号２６）、及びＳ−ｈＺＨＸ３−１６６３（配列番号３０）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−ＢｓｍＢＩ−２（配列番号３１）の組み合わせをプライマーとして、ｐＤＢＤ−ＺＨＸ３（１−９５６）を鋳型として用いて、そしてＳ−ｈＺＨＸ３−１０９０（配列番号１４）及びＡｓ−ｈＺＨＸ３−１５０６（配列番号１３）の組み合わせをプライマーとして、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（３０３−５５５）を鋳型として用いて行われた。増幅されたＤＮＡもｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ又はｐＴ７Ｂｌｕｅ−２  Ｔ−ベクター中へサブクローニングし、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（Ｍｅｔ／９０９）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（Ｍｅｔ／４３５）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（４３６／９０９）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２  Ｔ  ＺＨＸ３（Ｍｅｔ／３２１）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２  Ｔ  ＺＨＸ３（３２２／４３５）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（１６６３／２０２２）、及びｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（１０９０／１５０６）をそれぞれ得た。これらのプラスミドのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＧ４２４Ｂ１又はｐＥＧＦＰ−Ｃ１Ｅ１ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１−１４５）、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１４６−３０３）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（１−３０３）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（１−１０７）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（１０８−１４５）、及びｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（１４６−３０３）をそれぞれ得た。ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（１０９０／１５０６）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＧ４２４Ｂ１のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（３６４−５０２）を得た。ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（１６６３／２０２２）のＥｃｏＲＩ／ＢｓｍＢＩ断片をｐＤｓＲｅｄ−ＺＨＸ３（ＨＤ２−ＳＴＯＰ）のＥｃｏＲＩ／ＢｓｍＢＩサイト中へサブクローニングし、ｐＤｓＲｅｄ−ＺＨＸ３（１６６３−ＳＴＯＰ）を得た。生ずるプラスミドのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＥＧＦＰ−Ｃ１Ｅ１のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（５５５−９５６）を得た。
【００１６】
ＨｉｓＣＭＣＳ１（配列番号３２）及びＨｉｓＣＭＣＳ２オリゴヌクレオチド（配列番号３３）をアニーリングし、リン酸化し、そしてｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ−ＣのＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩサイト中へサブクローニングし、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ−Ｃ２を得た。上記ｐＧＳＴ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）は以前に示された（１２）。ｐＧＳＴ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）の４８０ｂｐのＢａｍＨＩ断片をｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ−Ｃ２のＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、ｐＣＭＶ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）を得た。
以上全てのプラスミドのヌクレオチド配列をＤＮＡシークエンサー３１００(Applied Biosystems)を用いて確認した。
【００１７】
試験例２  ライブラリースクリーニング
酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合した、ヒトＺＨＸ１の全コード配列を発現する、ｐＤＢＤ−ＺＨＸ１（１−８７３）（ｐＧＢＫＴ７−ＺＨＸ１（１−８７３））、及びラット顆粒膜細胞及び肝ｃＤＮＡライブラリーの構築は既報に従って行った（非特許文献３等）。ＡＨ１０９酵母細胞を上記ｐＤＢＤ−ＺＨＸ１（１−８７３）プラスミドで形質転換した。上記株はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのおとりとして使用された。ＴＥ／ＬｉＡｃ−に基づいた高効率形質転換法がライブラリースクリーニングに使用された（Yamada, K., Wang, J.-C., Osawa, H., Scott, D. K., and Granner, D. K. (1998) BioTechniques 24, 596-600）。肝及び顆粒膜細胞ｃＤＮＡライブラリーの１５００万及び１１００万の独立のクローンがそれぞれ、４ｍＭ  ３−アミノトリアゾール及びＸ−α−ｇａｌで補充された、ヒスチジン−、トリプトファン−、ロイシン−、及びアデニン−なしの合成デキストロースプレート上にプレートされた。３３及び１０９の陽性クローンがそれぞれ第一形質転換体から得られた。量化可能なｌａｃＺレポーターを含む、上記酵母株ＳＦＹ５２６、及びｐＧＢＫＴ７又はｐＤＢＤ−ＺＨＸ１（１−８７３）プラスミドのいずれかを、第一スクリーニング又は親ベクター、ｐＡＣＴ２における陽性クローンから単離されたプラスミドで形質転換した。第二スクリーニングでは、肝及び顆粒膜細胞ｃＤＮＡライブラリーの、それぞれ、１６及び２５のクローンが再現可能な高β−ガラクトシダーゼ活性を特に示した。ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクドシドを用いる、計量可能なβ−ガラクトシダーゼ分析を、既報に示されたように
（非特許文献１、２等）、浸透された細胞について行った。それぞれの陽性クローンからのヌクレオチド配列をＢＬＡＳＴ配列探索及び比較プログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋデータベース内に入っているものと比較した。
【００１８】
試験例３  ｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）
ヒトＺＨＸ３ｃＤＮＡの５’末端を得るために、ヒト精巣マラソン−レディｃＤＮＡ及びＡｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲキットを用いて５’−ＲＡＣＥ法を使用した。２つの遺伝子特異的プライマー、ｈＺＨＸ３−５ＲＡＣＥ−Ａｓ１（配列番号３４）、及びｈＺＨＸ３−５ＲＡＣＥ−Ａｓ２（配列番号３５）を使用した。上記５’−ＲＡＣＥ手順は製造業者が推奨するプロトコルに従って行われた。増幅されたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター中にサブクローングし、そしてそれらのヌクレオチド配列を決定した。
【００１９】
試験例４  Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡブロット分析
ヒトＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ及びＢｌｏｔIIを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｈＺＨＸ３Ｎ  プラスミドから単離された、ヒトＺＨＸ３  ｃＤＮＡの０．６ｋｂのα−３２Ｐ  ｄＣＴＰ−標識ＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイゼーションし、そしてＢｃａＢｅｓｔ  ＤＮＡ標識キットで標識した。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液を前ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションに使用した。前ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄の手順は供給者により提供されるプロトコルに従って行われた。
【００２０】
試験例５  酵母２−ハイブリッドシステム及び液体β−ガラクトシダーゼ分析
ＺＨＸ３とのＺＨＸ１のヘテロ二量体化ドメインを分析するために、ｐＤＢＤ又はｐＤＢＤ−Ｇ２３を含むＳＦＹ５２６酵母株を、ＧＡＬ４  ＡＤを融合したＺＨＸ１のさまざまな切り取られた形態、又はｐＡＣＴ２で形質転換した。ＺＨＸ１とのＺＨＸ３のヘテロ二量体化ドメイン又はＺＨＸのホモ二量体化ドメインをマッピングするために、ｐＤＢＤ、ｐＤＢＤ−ＺＨＸ１（１−８７３）又はｐＤＢＤ−Ｇ２３を含むＳＦＹ５２６酵母株を、ＧＡＬ４  ＡＤを融合したＺＨＸ３のさまざまな切り取られた形態、又はｐＡＣＴ２で形質転換した。ＺＨＸ３のＮＦ−ＹＡとの相互作用ドメインを調べるために、ｐＤＢＤ又はｐＹＡ１−２６９を含むＳＦＹ５２６酵母株を、ＧＡＬ４  ＡＤに融合されたＺＨＸ３のさまざまな切り取られた形態で形質転換した。ＮＦ−ＹＡのＺＨＸ３との相互作用ドメインをマッピングするために、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（２４２−４８８）を含むＳＦＹ５２６酵母株を、ＧＡＬ４  ＤＢＤに融合されたＮＦ−ＹＡのさまざまな切り取られた形態で形質転換した。
これらのβ−ガラクトシダーゼ活性は既報（非特許文献１、２、３）に示されたように、決定された。
【００２１】
試験例６  グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウン分析
ｐＧＳＴ−ＺＨＸ１（１−８７３）プラスミドを既報に従って作製した（非特許文献３）。ＴＯＰＰ３細胞をｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＳＴ−ＺＨＸ１（１−８７３）、ｐＧＳＴ−Ｇ２３又はｐＧＳＴ−ＺＨＸ３（１−９５６）融合タンパク質発現プラスミドで形質転換した。上記ＧＳＴ融合タンパク質の調製、in vitroで翻訳されたＺＨＸ１の３５Ｓ−標識及びプルダウン分析は以前に示された（非特許文献２、３）。上記ｐＤＢＤ−ＺＨＸ３（１−９５６）プラスミドをin vitroで翻訳された、３５Ｓ−標識された、ＺＨＸ３の調製のために使用した。最後に、ビーズを等体積の２×ＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁し、そしてそれぞれの上清を前染色分子量マーカーと共に、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにのせた。上記ゲルを乾燥させ、そしてＦＵＪＩＸ画像化プレート(Kanagawa、Japan)に露出した。相互作用シグナルをＦＵＪＩＸ  ＢＡＳ−２０００画像分析システムを用いて検出した。それぞれの融合タンパク質の比較の純度及び量はクマシーブリリアントブルーＲ−２５０でのゲル染色により決定された。
【００２２】
試験例７  細胞培養及びＤＮＡトランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞を１０％ウシ胎児血清で補充したDulbecco’s modified Eagles medium中で３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。ＤＮＡトランスフェクションはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ試薬を用いて行われた。トランスフェクションに使用された全てのプラスミドはＱＩＡＧＥＮプラスミドキットを用いて調製され、続いてＣｓＣｌ勾配超遠心分離を行った。細胞（ウェル当たり５×１０４）をトランスフェクションの前日に２４ウェルプレート中で接種した。上記５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３  Ｃｏｎｔｒｏｌは既報に従って作製した（Tanaka, T., Inazu. T., Yamada, K., Myint, Z., Keng, V. W., Inoue, Y., Taniguchi, N., and Noguchi, T. (1999) Biochem. J. 339,111-117 ）。５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３Ｃｏｎｔｒｏｌ又はｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌはレポータープラスミドとして使用された。ＺＨＸ３の転写活性の決定のために、１００ｎｇのレポータープラスミド、２ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＷ、及び示された量のＧＡＬ４  ＤＢＤ−ＺＨＸ３融合タンパク質発現プラスミドをトランスフェクトした。プラスミドの総量（１５２ｎｇ）を、必要であれば、ｐＳＧ４２４の添加により調節した。ＺＨＸ３のＺＨＸ１とのヘテロ二量体化の、ＺＨＸ３の転写活性への効果の分析のために、１００ｎｇのレポータープラスミド、２ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＷ、５０ｎｇのＧＡＬ４  ＤＢＤ融合タンパク質発現プラスミド、及び示された量のヒトＺＨＸ１のニ量体化ドメインの発現プラスミド、ｐＣＭＶ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）をトランスフェクトした。プラスミドの総量（２０２ｎｇ）を、必要であれば、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ−Ｃ２の添加により調節した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−融合タンパク質の観察のために、３００ｎｇの示されたＧＦＰプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション３時間後、培地を変えた。４８時間後、上記細胞をルシフェラーゼ分析にかけ又はLaser microscope(Olympus)で観察した（１５）。ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ分析を製造業者の推奨するプロトコル(Promega)に従って行った。ルシフェラーゼ活性をBerthold Lumat model LB 9501(Wildbad、Germany)により決定した。ホタルルシフェラーゼ活性（比較光単位）をウミシイタケルシフェラーゼ活性により正規化した。
【００２３】
実施例１
本実施例では、ＺＨＸ１による転写抑制の分子メカニズムを分析し、ヒトＺＨＸ１が既知の又は新規の転写因子と相互作用するかという問題を調べるために、ＺＨＸ１相互作用タンパク質のスクリーニングを行った。ヒトＺＨＸ１の全コード配列をＧＡＬ４  ＤＢＤに融合し、そしてこのキメラタンパク質を酵母２−ハイブリッドシステム（試験例５）を用いてラット肝及び顆粒膜細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのおとりとして使用した（試験例２）。それぞれのライブラリーの約１．５×１０７及び１．１×１０７の独立のクローンをスクリーニングし、そして１６及び２５クローンが再現可能なＨｉｓ＋、Ａｄｅ＋、及びα−ｇａｌ陽性特性をそれぞれ示した。これらのクローンからＧＡＬ４ＡＤ融合タンパク質をコードするプラスミドを単離した。それらのヌクレオチド配列の決定後、それらをＢＬＡＳＴ探索プログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋデータベースと比較した。その結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
2004196700.tif 000002
【００２５】
表１に示すように、ＢＳ６９共リプレッサー、核タンパク質、毛細血管拡張性運動失調様タンパク質、アンドロゲンで誘発されるアルドース還元酵素、活性化転写因子（ＡＴＦ）相互作用タンパク質（ＡＴＦ−ＩＰ）、脊髄小脳性運動失調Ｉ型、ジキシン、Ｅｌｆ−１、１１−１９リジン−リッチ白血病遺伝子、及びＺＨＸ１が既知のタンパク質としてクローニングされた（非特許文献３等）。８クローンは未知のタンパク質をコードした。興味深いことに、３クローン、Ｇ２３、Ｇ５８、及びＬ２６はＺｎｆ及びＨＤモチーフの両方をコードした。詳細なヌクレオチド配列分析は、Ｇ２３のヌクレオチド配列がＧ５８のそれに含まれており、そして上記ヌクレオチド配列ははじめにクローニングされたヒトＫＩＡＡ０３９５  ｃＤＮＡのそれと相似性を示したことを示した。発明者らはこの研究においてこれらのクローンの分析に焦点をおいた。ＫＩＡＡ０３９５とは異なる上記Ｌ２６クローンはＺＨＸ２として他の報告において現れるであろう。
次に、ヒトＫＩＡＡ０３９５ｃＤＮＡの５’−非コード配列及び残りのコード領域を単離するために、５’−ＲＡＣＥ法（試験例３）を用いた。遺伝子特異的プライマー及びアダプタープライマーの組み合わせを用いて、ｃＤＮＡ断片をヒト精巣マラソンｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより得た。最後に、全長ｃＤＮＡの大きさが９，３０２ｂｐであることが決定された。
【００２６】
非常に興味深いことに、全長ｃＤＮＡは９６５アミノ酸残基のオープンリーディングフレームを有し、そしてそのタンパク質の推定されたアミノ酸配列はＺＨＸ１に加えて２つのＣｙｓ２−Ｈｉｓ２−型Ｚｎｆモチーフ及び５つのＨＤを含む。このアミノ酸配列を配列番号１に示す。発明者らはこのタンパク質をＺＨＸ３と呼ぶ。記号ＺＨＸ３は、ジンクフィンガー及びホメオボックス３の名前から、HUGO Nomenclature Committeeに提示された。図１にこのヒトＺＨＸ３の推測されるアミノ酸配列のヒトＺＨＸ１との比較を示す。
このヒトＺＨＸ３タンパク質は予測された分子量１０４．７キロダルトン及び等電点５．６８を有する。上記ｐＡＤ−Ｇ５８及びｐＡＤ−Ｇ２３がそれぞれＺＨＸ３の１１４〜６４２の及び２４２〜６１５のアミノ酸配列をコードする一方で、上記ＫＩＡＡ０３９５はヒトＺＨＸ３の４９８〜９５６のアミノ酸配列をコードする。転写制御ドメインとして働きうるグルタミン酸−リッチ領域は６７０〜７１０のアミノ酸配列中に存在し、そして推定される核移行シグナルは存在しない。ＺＨＸ３及びＺＨＸ１の間のコード領域におけるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列における相同性は、それぞれ４６．９％及び３４．４％であった。
【００２７】
次に、ヒトＺＨＸ３  ｍＲＮＡの組織分布をノザンブロット分析（試験例４）により決定した。図２に示すように、ヒトＺＨＸ３  ｍＲＮＡは複数のバンド、長さ９．４、７．３、５．０、及び４．６ｋｂとして検出された。発明者らのクローニングされた挿入物の大きさは９，３０２ｂｐであったので、それは最長の転写物とほぼ同じである。強さは組織間でさまざまであったが、これらの転写物は調べた全ての組織において観察された。このことはヒトＺＨＸ３  ｍＲＮＡは普遍的に発現されることを示している。
【００２８】
実施例２
本実施例では、ＺＨＸ１のどのドメインがＺＨＸ３との相互作用に必要とされるかという問題を調べるために、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３の間の最小ヘテロ二量体化ドメインのマッピングを行った。酵母株ＳＦＹ５２６を、ＧＡＬ４  ＤＢＤのみを発現するｐＤＢＤ又はＧＡＬ４  ＤＢＤに融合されたＺＨＸ３のアミノ酸残基２４２〜６１５をコードするｐＤＢＤ−Ｇ２３で形質転換した。上記２つの酵母株はレポーター酵母として使用された。ＧＡＬ４  ＡＤのみを発現するｐＡＣＴ２又はＧＡＬ４  ＡＤに融合されたＺＨＸ１のさまざまな切断された形態をコードするいくつかのプラスミドは獲物プラスミドとして使用された。ｐＤＢＤを含むレポーター酵母をこれらの獲物プラスミドで形質転換したとき、それらは低β−ガラクトシダーゼ活性を示した（データは示していない）。さらに、ｐＤＢＤ−Ｇ２３を含むレポーター酵母をｐＡＣＴ２、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（５６５−８７３）、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（４３０−５６４）又はｐＡＤ−ＺＨＸ１（３４５−４６３）で形質転換したとき、これらの酵母も低β−ガラクトシダーゼ活性を示した（図３）。対照的に、上記酵母をｐＡＤ−ＺＨＸ１（１４２−８７３）、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（２７２−８７３）、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（２７２−５６４）又はｐＡＤ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）で形質転換したとき、高β−ガラクトシダーゼ活性が観察された。上記ｐＡＤ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）はＺＨＸ１の２４２〜４３２のアミノ酸残基をコードする。
【００２９】
次に、ＺＨＸ３のどのドメインがＺＨＸ１との相互作用に必要とされるかの問題を決定した。酵母株ＳＦＹ５２６を、ＧＡＬ４  ＤＢＤに融合されたＺＨＸ１の全コード配列をコードするｐＤＢＤ−ＺＨＸ１（１−８７３）又はｐＤＢＤで形質転換した。上記２つの酵母株はレポーター酵母として使用された。上記ｐＡＣＴ２又はＧＡＬ４  ＡＤに融合されたＺＨＸ３のさまざまな切断された形態をコードするいくつかのプラスミドは獲物プラスミドとして使用された（図４）。ｐＤＢＤを含むレポーター酵母をこれらの獲物プラスミドで形質転換したとき、それらは低β−ガラクトシダーゼ活性を示した（データは示していない）。これらの酵母はｐＤＢＤ−ＺＨＸ１（１−８７３）を含むレポーター酵母をｐＡＤ−Ｇ２３又はｐＡＤ−ＺＨＸ３（２４２−４８８）で形質転換したときのみ、高β−ガラクトシダーゼ活性を示した。上記ｐＡＤ−ＺＨＸ３（２４２−４８８）はＺＨＸ３の２４２〜４８８のアミノ酸残基をコードする。
これらの結果はＺＨＸ１及びＺＨＸ３はＨＤ１を含むそれぞれの領域を通してヘテロ二量体化することを示す。
【００３０】
次に、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３の間の特異的相互作用を実証するためにin vitroＧＳＴプルダウン分析（試験例６）を行った。発明者らは４つのプラスミド、ＧＳＴのみを発現するｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ＧＳＴに融合されたヒトＺＨＸ３の２４２〜６１５のアミノ酸配列をコードするｐＧＳＴ−Ｇ２３、ＧＳＴに融合されたヒトＺＨＸ３タンパク質の全コード領域を発現するｐＧＳＴ−ＺＨＸ３（１−９５６）、及びＧＳＴに融合されたヒトＺＨＸ１タンパク質の全コード領域を発現するｐＧＳＴ−ＺＨＸ１（１−８７３）をそれぞれ使用した。これらのタンパク質を大腸菌で発現させ、そしてグルタチオン−セファロースビーズに固定した。上記in vitroで翻訳した、３５Ｓ−標識した、全長ヒトＺＨＸ１は、ＧＳＴ−Ｇ２３及びＧＳＴ−ＺＨＸ３（１−９５６）に結合するが、ＧＳＴのみには結合しないことがわかった（図５、レーン３及び６）。さらに、上記in vitroで翻訳した、３５Ｓ−標識した、全長ヒトＺＨＸ３はＧＳＴ−ＺＨＸ１（１−８７３）に結合するが、ＧＳＴのみには結合しないことがわかった（図５、レーン９）。対照的に、プログラム化されていない網状赤血球溶解物は上記タンパク質のいずれにも結合しなかった（データは示していない）。
これらの結果は、ＺＨＸ１はin vivo及びin vitroの両方で、ＺＨＸ３とヘテロ二量体を形成することができることを示す。
【００３１】
実施例３
本実施例では、ＺＨＸ１はホモ二量体を形成するので、酵母２−ハイブリッドシステム（試験例５）を用いてＺＨＸ３のホモ二量体の形成を調べるために、ＺＨＸ３の最小ホモ二量体化ドメインのマッピングを行った。ｐＤＢＤ又はｐＤＢＤ−Ｇ２３を含む２つのＳＦＹ５２６酵母株をレポーター酵母として使用した。発明者らはさまざまな獲物プラスミド、ｐＡＣＴ２、ｐＡＤ−Ｇ２３、及びｐＡＤ−ＺＨＸ３（２４２−４８８）、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（３０３−３６４）、及びｐＡＤ−ＺＨＸ３（４９８−９０３）をそれぞれ調製した。これらのプラスミドをレポーター酵母に形質転換し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性をそれぞれの場合において決定した（図６）。ｐＤＢＤを含むレポーター酵母を上記プラスミドで形質転換したとき、それらは低β−ガラクトシダーゼ活性を示した（データは示していない）。さらに、ｐＤＢＤ−Ｇ２３を含むレポーター酵母をｐＡＣＴ２、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（３０３−３６４）、及びｐＡＤ−ＺＨＸ３（４９８−９０３）で形質転換したときも、非常に低いβ−ガラクトシダーゼ活性が検出された。対照的に、ｐＡＤ−Ｇ２３又はｐＡＤ−ＺＨＸ３（２４２−４８８）で形質転換した酵母は高β−ガラクトシダーゼ活性を示した。これらの結果は、ＺＨＸ３は２４２〜４８８の領域を介してホモ二量体を形成することができることを示す。
次に、ＺＨＸ３のホモ二量体化を実証するためにin vitro ＧＳＴプルダウン分析を行った。発明者らは２つのプラスミド、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１及びｐＧＳＴ−ＺＨＸ３（１−９５６）をそれぞれ使用した。これらのタンパク質を大腸菌で発現させ、そしてグルタチオン−セファロースビーズに固定した。上記in vitroで翻訳された、３５Ｓ−標識された、全長ヒトＺＨＸ３はＧＳＴ−ＺＨＸ３（１−９５６）に結合するがＧＳＴのみには結合しないことがわかった（図７）。対照的に、プログラム化されていない網状赤血球溶解物は上記タンパク質のいずれにも結合しなかった（データは示していない）。これらの結果は、ＺＨＸ３はin
vivo及びiv vitroでホモ二量体を形成することができることを示す。
【００３２】
実施例４
本実施例では、ＺＨＸ３がＮＦ−ＹＡのＡＤとも相互作用することを調べた。ヒトＺＨＸ１ははじめにＮＦ−ＹＡと相互作用するタンパク質としてクローニングされた（非特許文献２）。本実施例では、ＺＨＸ３のＮＦ−ＹＡとの相互作用を酵母２−ハイブリッドシステム（試験例５）を用いて調べた。発明者らはそれぞれｐＤＢＤ又はｐＹＡ１−２６９で形質転換した２つのレポーター酵母株を使用した。上記ｐＹＡ１−２６９はＧＡＬ４  ＤＢＤと融合したＮＦ−ＹＡのＡＤを発現する。上記ｐＡＣＴ２、ｐＡＤ−Ｇ２３、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（４９８−９０３）、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（２４２−４８８）、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（３０３−３６４）、及びｐＡＤ−ＺＨＸ３（１−９５６）をレポーター酵母株に形質転換し、そしてそれらのβ−ガラクトシダーゼ活性を決定した。ｐＤＢＤを含むレポーター酵母をこれらのプラスミドで形質転換したとき、それらのβ−ガラクトシダーゼ活性はかなり低いことがわかった（データは示していない）。図８中に示すように、ｐＹＡ１−２６９を含むレポーター酵母をｐＡＣＴ２、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（４９８−９０３）又はｐＡＤ−ＺＨＸ３（３０３−３６４）で形質転換したときも、それらのβ−ガラクトシダーゼ活性低かった。しかしながら、上記酵母をｐＡＤ−Ｇ２３、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（１−９５６）又はｐＡＤ−ＺＨＸ３（２４２−４８８）で形質転換したとき、高い値のβ−ガラクトシダーゼ活性が検出された。これらの結果は、ＺＨＸ３はＮＦ−ＹＡのＡＤと相互作用し、そして残基２４２〜４８８のアミノ酸配列がこの相互作用に重要であることを示す。
次に、酵母２−ハイブリッドシステム（試験例５）を用いてＮＦ−ＹＡのＺＨＸ３との最小相互作用ドメインを同定した。図９に示すように、ＮＦ−ＹＡのＡＤはそれぞれグルタミン−リッチ及びセリン／スレオニン−リッチドメインから成る。ｐＡＤ−ＺＨＸ３（２４２−４８８）を含むＳＦＹ５２６酵母株がレポーター酵母として使用された。ＧＡＬ４  ＤＢＤに融合されたＮＦ−ＹＡの切断された形態を発現する、さまざまなプラスミドを上記酵母に形質転換し、そしてそれらのβ−ガラクトシダーゼ活性を決定した。その結果、どちらもＮＦ−ＹＡの１４１〜２６９のアミノ酸配列を含む、ｐＹＡ１−２６９又はｐＹＡ１４１−２６９を含む酵母のみが高い値のβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。これらの結果は、ＮＦ−ＹＡのセリン／スレオニン−リッチＡＤはＺＨＸ３との最小相互作用ドメインを表すことを示す。
【００３３】
実施例５
本実施例では、ＺＨＸ３が転写リプレッサーであることを確認するために、哺乳類のワンハイブリッドシステム（試験例７）を用いてＺＨＸ３の転写の役割を決定した。ＧＡＬ４−結合部位の５つのコピーがｐＧＬ３−ＣｏｎｔｒｏｌのＳＶ４０プロモーターの上流に挿入された、上記５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドを、レポータープラスミドとして使用された（１４）。２つのエフェクタープラスミド、ＧＡＬ４  ＤＢＤのみを発現するｐＳＧ４２４、及びＧＡＬ４  ＤＢＤのＣ末端に融合されたヒトＺＨＸ３の全コード領域を発現するｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１−９５６）を調製した。図１０及び図１１に示すように、５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３Ｃｏｎｔｒｏｌ及びさまざまな量のｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１−９５６）をＨＥＫ２９３細胞中に共トラスフェクトしたとき、上記ルシフェラーゼ活性は用量依存的な様式で減少された。上記最高阻害は５０ｎｇのｐＧＡＬ４−ＺＨＸ１（１−９５６）で得られた。対照的に、ＧＡＬ４−結合部位の５つのコピーを欠く上記ｐＧＬ３−ＣｏｎｔｒｏｌをｐＳＧ４２４又はｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１−９５６）でトラスフェクトしたとき、上記ルシフェラーゼ活性は変化しなかった（図１０）。これらの結果は、上記ＧＡＬ４−ＺＨＸ３融合タンパク質はＧＡＬ４結合部位依存的な様式でルシフェラーゼ活性を減少させることを示し、ＺＨＸ３は転写リプレッサーとしてはたらくことを示す。
発明者らはその後ＺＨＸ３のＺＨＸ１とのヘテロ二量体化はその転写リプレッサー活性に必要であるかどうかの問題を調べた。発明者らは、ＺＨＸ１の２７２〜４２３のアミノ酸配列が発現される、ｐＣＭＶ−ＺＨＸ３（２７２−４３２）を調製した。この領域はＺＨＸ１のＺＨＸ３との二量体化ドメインと一致するが、ＺＨＸ１のリプレッサードメインは含まない（Yamada, K., Kawata, H., Matsuura, K., Shou, Z., Hirano, S., Mizutani, T., Yazawa, T., Yoshino, M., Sekiguchi, T., Kajitani, T., and Miyamoto. K. (2002) Biochem. Biophys. Res. Comm. 279, 368-374 ）。従って、このタンパク質の過剰発現はＺＨＸ１のドミナントネガティブ形として機能する。上記プラスミドを上記分析システムにおいて共トラスフェクトしたとき、上記ルシフェラーゼ活性は用量依存的な様式で増加された（図１１）。対照的に、ｐｃＤＮＡ３．１ＨｉｓＣ−２の共トランスフェクトはルシフェラーゼ活性に全く影響しなかった。これらの結果は、ＺＨＸ３のＺＨＸ１とのヘテロ二量体化はリプレッサー活性の必要条件であることを示す。
【００３４】
最後に、ＺＨＸ３の最小リプレッサードメインを決定するために、上記５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３Ｃｏｎｔｒｏｌをさまざまなプラスミド、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１−１４５）、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１４６−３０３）、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（３０３−５５５）又はｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（４９８−９０３）でトランスフェクトした（図１２）。残基３０３〜５５５のアミノ酸配列を発現するｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（３０３−５５５）のみが、ルシフェラーゼ活性における減少を引き起こした。
より詳細な分析のために、発明者らはエフェクタープラスミド、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（３０３−５０２）、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（３０３−３６４）又はｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（３６４−５０２）を調製した。ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（３０３−５０２）を上記レポータープラスミドでトランスフェクトしたときのみ、上記ルシフェラーゼ活性は減少された（図１２）。これらの結果は、ＺＨＸ３の残基３０３〜５０２のアミノ酸配列はリプレッサー活性に重要であることを示す。
【００３５】
実施例６
本実施例では、ＺＨＸ３タンパク質の細胞内局在を調べるために、ＧＦＰ−ＺＨＸ３融合タンパク質発現系を使用して、ＺＨＸ３の細胞内局在の決定及び核移行シグナル（ＮＬＳ）のマッピングを行った。このため、ＧＦＰに融合したＺＨＸ３のさまざまな切断された形態を調製した。これらのプラスミドをＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトし、そしてＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を観察した。ＧＦＰタンパク質のみをコードするｐＥＧＦＰ−Ｃ１Ｅ１は細胞全体において観察された（図１３）。対照的に、全長ＺＨＸ３がＧＦＰのＣ末端に融合されたＧＦＰ−ＺＨＸ３（１−９５６）は核内に局在した。ＺＨＸ３のＮＬＳを決定するために、さまざまなプラスミドをトランスフェクトした。ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（１−３０３）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（３０３−５５５）、及びｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（５５５−９５６）をトランスフェクトしたとき、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（１−３０３）及びｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（３０３−５５５）の両方が核内に局在した。対照的に、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（５５５−９５６）をトランスフェクトしたとき、上記タンパク質は核外に局在した。これらの結果は、ＺＨＸ３は２つのＮＬＳ及び核輸出シグナル（ＮＥＳ）を含むことを示す。最小のＮＬＳｓをマッピングするために、さまざまなプラスミドを構築した。３のプラスミド、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（１−１０７）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（３６４−５５５）、及びｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（４９７−５５５）をトランスフェクトしたときのみ、ＺＨＸ３の核局在が観察された。これらの結果は、ＺＨＸ３はＧＦＰ融合タンパク質として核内に局在することができ、そしてＺＨＸ３の２つのＮＬＳはそれぞれ１〜１０７、及び４９７〜５５５のアミノ酸配列に位置することを示す。
【００３６】
まとめ
上記実施例にて、ＺＨＸ−１相互作用タンパク質の探索を行い、主にそれらのうち新規転写リプレッサーＺＨＸ３を分析し、そしてその機能ドメインをマッピングした。ＺＨＸ３の最小機能ドメインは図１４に要約される。ＺＨＸ１はもちろん、ＺＨＸ３は２つのＺｎｆモチーフ及び５つのＨＤを含み、ホモ二量体を形成し、ＮＦ−ＹＡのＡＤと相互作用し、そして核内に局在する。さらに、ＺＨＸ３  ｍＲＮＡは普遍的に発現される。この発見から、発明者らは、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３の両方が同じファミリー、すなわち、ＺＨＸファミリーの構成員であることを結論づけた。ＺＨＸ１及びＺＨＸ３の全アミノ酸配列の相同性は３４．４％であったが、上記２つのＺｎｆモチーフ及び５つのＨＤは高く保存されていた。ＺＨＸ１及びＺＨＸ３の間のＺｎｆ１、Ｚｎｆ２、ＨＤ１、ＨＤ２、ＨＤ３、ＨＤ４、及びＨＤ５のアミノ酸配列における相同性は、それぞれ５０．０、４５．５、６１．７、５０．０、５３．３、４３．３、及び３３．３％であった。上記ＨＤ４は他のドメインよりも非常に低い相同性示した。独特のグルタミン酸−リッチ酸性領域がＺＨＸ３の残基６７０〜７１０のアミノ酸配列中に局在する（図１及び９）。一般的に、上記Ｚｎｆモチーフ、ＨＤ、及び酸性領域は転写因子の機能特性に責任がある。例えば、６０アミノ酸から成る、上記Ｚｎｆモチーフ及びＨＤの両方は同族のＤＮＡ配列に結合するのに必要とされ、上記グルタミン酸−リッチ領域は転写活性に関係し、そして塩基性領域は上記ＤＢＤ又はＮＬＳである（Gehring, W. J., Affolter, M., and Burglin, T. (1994) Annu. Rev. Biochem. 63 , 487-526 等）。
【００３７】
ＺＨＸ３はＺＨＸ１とヘテロ二量体を形成するのみでなく、ホモ二量体をも形成する。ＺＨＸ３の２４２〜４８８のアミノ酸配列はこれらの二量体化に必要及び十分である（図３〜７）。ＺＨＸ１のＺＨＸ３とのホモ及びヘテロ二量体化の最小ドメインはＺＨＸ１の２７２〜４３２のアミノ酸配列にマッピングされた（図３〜５）。これらの領域はＨＤ１を含むが、ＨＤ１のみは二量体化できない（図３〜９）。ＨＤ１を含むより広範な領域が二量体化に必要とされる。さらに、ＺＨＸ３及びＺＨＸ１の両方がＮＦ−ＹＡのＡＤと相互作用する；前者は上記ＮＦ−ＹＡのセリン／スレオニン−リッチＡＤと、そして後者はグルタミン−リッチＡＤとそれぞれ相互作用する（図８，９）。ＺＨＸ３のＮＦ−ＹＡのＡＤとの相互作用ドメインはＺＨＸ３の二量体化ドメインと同じ領域にマッピングされた（図８，９）。対照的に、ヒトＺＨＸ１のＨＤ１〜ＨＤ２領域を含む２７２〜５６４のアミノ酸配列はその相互作用に必要とされる（非特許文献１）。ＺＨＸ１のＺＨＸ３とのヘテロ二量体複合体がＮＦ−ＹＡの異なるＡＤと相互作用するかどうかの問題は決定されないままである。
【００３８】
ＺＨＸ３は転写リプレッサーである（図１０〜１２）。ＺＨＸ３の最小リプレッサードメインは二量体化及び相互作用ドメインの両方と重なる領域にマッピングされる。興味深いことに、ＺＨＸ１のヘテロ二量体化ドメインの過剰発現は、リプレッサー活性には責任はないが、ＺＨＸ３のリプレッサー活性における減少を引き起こした（図１１）。このことは、ＺＨＸ３は本質的にリプレッサー活性をもたず、そして上記観察された活性は二量体化のパートナーである、リプレッサードメインが酸性領域のＣ末端に局在する（Yamada, K., Kawata, H., Matsuura, K., Shou, Z., Hirano, S., Mizutani, T., Yazawa, T., Yoshino, M., Sekiguchi, T., Kajitani, T., and Miyamoto. K. (2002) Biochem. Biophys. Res.Comm. 279, 368-374）ＺＨＸ１のリプレッサー活性に因るものであることを示唆する。しかしながら、ＺＨＸ３の二量体化ドメインは真実にリプレッサー活性を有することを証明することはできない。ＺＨＸ３がＤＮＡ結合タンパク質であるかどうかは明らかでない。その結果として、ＨＤ１領域を含むＺＨＸ３の領域は多面発現性のドメイン；ホモ及びＺＨＸ１とのヘテロ二量体化ドメイン、ＮＦ−ＹＡのＡＤとの相互作用ドメイン、及びリプレッサードメインであるように見える。
【００３９】
転写制御領域は転写リプレッサーとして機能するために共因子と相互作用する（Hu, X., and Lazar, M. A. (2000) Trends Endocrinol. Metab. 11, 6-10 等）。これらの共因子はｍＳｉｎ３Ａ／Ｂ、ヒストンデアセチレース、及び受容体転写の核共リプレッサー（Ｎ−ＣｏＲ）／サイレンシング仲介物質を含む。ＺＨＸ１相互作用タンパク質として、発明者らは２つの共リプレッサー、ＢＳ６９及びＡＴＦ−ＩＰ（表１）をクローニングした（Hateboer, G., Gennissen, A., Ramos, Y. F. M., Kerkhoven, R. M., Sonntag-Buck, V., Stunnenberg, H. G., and Bernards. R. (1995) EMBO J. 14, 3159-3169 等）。ＢＳ６９ははじめに２８９Ｒアデノウイルスタイプ５  Ｅ１Ａタンパク質のＡＤと直接相互作用するタンパク質として同定された。ＢＳ６９は、少なくとも部分的には、ＢＳ６９のＭＹＮＤドメインの共リプレッサーＮ−ＣｏＲとの相互作用を通して、抑制を仲介することも報告されている（Masselink, H., and Bernards, R. (2000) Oncogene 19, 1538-1546）。対照的に、ＡＴＦ−ＩＰは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロエンザイムを含む、基本の転写機構（ＴＦＩＩＥ及びＴＦＩＩＨ）のいくつかの成分と相互作用する（DeGraeve, F., Bahr, A., Chatton, B., and Kedinger, C. (2000) Oncogene 10, 1807-1819）。ＺＨＸ１及びＺＨＸ３が転写リプレッサーとしてはたらくとき、これらの共リプレッサーと相互作用することができ、それゆえ遺伝子転写を抑制する。
【００４０】
さらに、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３の両方はＮＦ−ＹＡ相互作用タンパク質である。ＮＦ−Ｙは共アクチベーター、ｐ３００及びｐ３００／環状ＡＭＰ応答エレメント−結合タンパク質−結合タンパク質−関連因子（Ｐ／ＣＡＦ）と関連することが報告されている（Mantovani, R. (1999) Gene 239, 15-27）。特に、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を伴うＰ／ＣＡＦはＮＦ−ＹＡと相互作用し、転写的に活性なＮＦ−Ｙ複合体を形成する（Mantovani, R. (1999) Gene 239,15-27）。それゆえ、ＺＨＸ１、ＺＨＸ３、及びＮＦ−ＹＡ間の相互作用の組み合わせはＮＦ−Ｙの転写活性に影響するようである。例えば、ＺＨＸ１又はＺＨＸ３のどちらか、又は両方は、Ｐ／ＣＡＦの上記ＮＦ−Ｙとの関連を高め又は妨害することができ、それゆえＮＦ−Ｙ活性を制御する。さらに、共リプレッサーを伴う転写リプレッサー、ＺＨＸファミリーの構成員は、上記ＮＦ−ＹＡと直接関連することができ、それゆえ、ＮＦ−Ｙ活性を阻害する。どちらの場合においても、ＺＨＸタンパク質がいくつかのＮＦ−Ｙ制御可能な遺伝子の制御に参加する可能性がある。
【００４１】
ＺＨＸ３  ｍＲＮＡは普遍的に発現されるが、骨格筋、腎臓、及び精巣においてより高く発現されることがわかった（図２）。ＺＨＸ３  ｍＲＮＡの大きさはノザンブロット分析により決定されるように複数であった。クローニングされた挿入物は９，３０２ｂｐを含み、そして上記大きさはＺＨＸ３の最も大きな転写物と同じである。ヒトＺＨＸ３遺伝子の探索がヒトゲノムプロジェクトにより編集されたデータベースを用いて行われたとき、それは染色体２０ｑに局在することがわかった。このことは、ＺＨＸ３遺伝子はハプロイドヒトゲノム当たり単一のコピーとして存在することを示す。ＺＨＸ３  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、複数のポリアデニル化シグナルが３’−非コード領域内に存在することを明らかにした。それゆえ、より小さな大きさのｍＲＮＡは、他のＺＨＸ３関連のｍＲＮＡの存在よりもむしろ単一の遺伝子からの異なるポリアデニル化シグナルの使用により産生されうるようである。
【００４２】
ＺＨＸ３の全コード領域が上記ＧＦＰのＣ末端に融合されたとき、それは核内に局在した（図１３）。ＺＨＸ３の２つのＮＬＳ、それぞれ１〜１０７、及び４９７〜５５５のアミノ酸配列があった。その一方で、上記ＧＦＰに融合されたＺＨＸ３の４９８〜９５６のアミノ酸配列は細胞全体ではなく、核外に排他的に局在する。ＧＦＰのみ又はＮＬＳを欠くＧＦＰ−ＺＨＸ１融合タンパク質は細胞全体に局在する（図１３）。このことは、ＺＨＸ３の領域はＮＥＳを含むことを示す。それゆえ、ＺＨＸ３は１つの分子内に２つのＮＬＳ及び１つのＮＥＳを含む、より複雑なタンパク質である。ＺＨＸ１を含む多くの他のタンパク質においては、上記ＮＬＳは塩基アミノ酸残基のクラスターにマッピングされたことが報告されている（非特許文献４等）。この領域はインポルチンαの如き、核輸入タンパク質と関連し、そしてそれから細胞質から核へ移行される（Kaffman, A., andO'Shea, E. K. (1999) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 291-339）。しかしながら、ＺＨＸ３の２つのＮＬＳは塩基性領域には局在せず、そして以前に報告されたＮＥＳとは相同性を示さないので、ＺＨＸ３は核へ移行されるための他の分子と関連しうる。
【００４３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＺＨＸ３の推測されるアミノ酸配列のヒトＺＨＸ１との比較を示す図である。ＺＨＸ３及びＺＨＸ１のアミノ酸配列を比較する。２つのＺｎｆモチーフ及び５つのＨＤをそれぞれプラスの印及び下線で示す。アステリスクはアミノ酸同一性を示す。破線はそれぞれのタンパク質に対応するアミノ酸配列が存在しないときのギャップを示す。それぞれ、１１４〜６４２、２４２〜６１５、及び４９５〜９５６のヒトＺＨＸ３のアミノ酸配列に対応する、クローンＧ５８及びＧ２３、並びにＫＩＡＡ０３９５の推測されるアミノ酸配列を示す。
【図２】ヒトＺＨＸ３  ｍＲＮＡの組織分布を示す図である。それぞれのレーンは、示された組織から単離された２μｇのポリＡ＋−ＲＮＡを含む。サイズマーカーはｋｂで左側に示す。レーン１、心臓；レーン２、脳；レーン３、胎盤；レーン４、肺；レーン５、肝臓；レーン６、骨格筋；レーン７、腎臓；レーン８、膵臓；レーン９、脾臓；レーン１０、胸腺；レーン１１、前立腺；レーン１２、精巣；レーン１３、卵巣；レーン１４、小腸；レーン１５、結腸；レーン１６、白血球。
【図３】酵母２−ハイブリッドシステム又はＧＳＴプルダウン分析を用いた、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３間の最小ヘテロ二量体化ドメインの同定を示す図である。ヒトＺＨＸ１及びＧＡＬ４  ＡＤ−ＺＨＸ１融合構築物の図解表示は左側に示す。Ｚｎｆ及びＨＤはそれぞれ、ジンクフィンガーモチーフ及びホメオドメインを示す。＋及び−のシンボルは、ＧＡＬ４  ＤＢＤに融合したヒトＺＨＸ３の２４２〜４８８のアミノ酸配列を発現する、ｐＤＢＤ−Ｇ２３、及びｐＡＣＴ２の組み合わせを含む酵母と比較した、それぞれ、β−ガラクトシダーゼ活性の増加した及び変化のない値を示す。
【図４】酵母２−ハイブリッドシステム又はＧＳＴプルダウン分析を用いた、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３間の最小ヘテロ二量体化ドメインの同定を示す図である。ヒトＺＨＸ３及びＧＡＬ４  ＡＤ−ＺＨＸ３融合構築物の図解表示は左側に示す。Ｚｎｆ、ＨＤ、及びＥは、それぞれ、ジンクフィンガーモチーフ、ホメオドメイン、及びグルタミン酸−リッチ領域を示す。＋及び−のシンボルは、ＧＡＬ４  ＤＢＤに融合したヒトＺＨＸ１の全コード領域を発現する、ｐＤＢＤ−ＺＨＸ１（１−８７３）、及びｐＡＣＴ２の組み合わせを含む酵母と比較した、それぞれ、β−ガラクトシダーゼ活性の増加した及び変化のない値を示す。
【図５】酵母２−ハイブリッドシステム又はＧＳＴプルダウン分析を用いた、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３間の最小ヘテロ二量体化ドメインの同定を示す図である。ＧＳＴプルダウン分析を用いた、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３間のin vitroのヘテロ二量体化。invitroで翻訳された３５Ｓ−標識された、全長ヒトＺＨＸ１又はＺＨＸ３を、結合したＧＳＴのみ（レーン１、５、及び８）及びＧＳＴに融合したＺＨＸ３の２４２〜６１５のアミノ酸配列（レーン３）、ヒトＺＨＸ３（レーン６）又はヒトＺＨＸ１（レーン９）タンパク質の全コード配列を含むセファロースビーズとインキュベートした。上記ビーズを激しく洗浄し、そして結合したタンパク質を溶出し、そして１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。相互作用シグナルはオートラジオグラフィーにより検出された。レーン２、４、及び７、他のレーンで示される上記反応に添加されたタンパク質の１０％がのせられた。
【図６】酵母２−ハイブリッドシステム又はＧＳＴプルダウン分析を用いた、ＺＨＸ３の最小ホモ二量体化ドメインの同定を示す図である。ヒトＺＨＸ３及びＧＡＬ４  ＡＤ−ＺＨＸ３融合構築物の図解表示は左側に示す。Ｚｎｆ、ＨＤ、及びＥは、それぞれ、ジンクフィンガーモチーフ、ホメオドメイン、及びグルタミン酸−リッチ領域を示す。＋及び−のシンボルは図３についての説明において示すものと同じものを示す。
【図７】酵母２−ハイブリッドシステム又はＧＳＴプルダウン分析を用いた、ＺＨＸ３の最小ホモ二量体化ドメインの同定を示す図である。ＧＳＴプルダウン分析を用いた、ＺＨＸ３のin vitroのホモ二量体化。in vitroで翻訳された、３５Ｓ−標識された、全長ヒトＺＨＸ３を、結合したＧＳＴのみ（レーン２）又はＧＳＴに融合したヒトＺＨＸ３タンパク質の全コード配列（レーン３）を含むセファロースビーズとインキュベートした。続く手順は図５についての説明において示されたともの同じである。レーン１、他のレーンで示される上記反応に添加されたタンパク質の１０％がのせられた。
【図８】酵母２−ハイブリッドシステムを用いたＮＦ−ＹＡ及びＺＨＸ３間の相互作用ドメインのマッピングを示す図である。ヒトＺＨＸ３及びＧＡＬ４  ＡＤ−ＺＨＸ３融合構築物の図解表示は左側に示す。Ｚｎｆ、ＨＤ、及びＥは、それぞれ、ジンクフィンガーモチーフ、ホメオドメイン、及びグルタミン酸−リッチ領域を示す。＋及び−のシンボルは、ＧＡＬ４  ＤＢＤに融合したＮＦ−ＹＡの活性化ドメインを発現する、ｐＹＡ１−２６９、及びｐＡＣＴ２の組み合わせを含む酵母と比較した、それぞれ、β−ガラクトシダーゼ活性の増加した及び変化のない値を示す。
【図９】酵母２−ハイブリッドシステムを用いたＮＦ−ＹＡ及びＺＨＸ３間の相互作用ドメインのマッピングを示す図である。ＮＦ−ＹＡ及びＧＡＬ４  ＤＢＤに融合したその欠失変異体の図解表示は左側に示す。Ｑ及びＳ／Ｔは、それぞれ、グルタミン−リッチ及びセリン／スレオニン−リッチ領域を示す。ＳＩＤ及びＤＢＤは、それぞれ、サブユニット相互作用及びＤＮＡ結合ドメインを示す。＋及び−のシンボルは、ｐＤＢＤ及び、ＧＡＬ４  ＡＤに融合したヒトＺＨＸ３の２４２〜４８８のアミノ酸配列を発現する、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（２４２−４８８）の組み合わせを含む酵母と比較した、それぞれ、β−ガラクトシダーゼ活性の増加した及び変化のない値を示す。
【図１０】ＺＨＸ３は転写リプレッサーであることを示す図である。ＨＥＫ２９３細胞を２ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ、５０ｎｇの（カラム上に示す）ＳＶ４０プロモーターダイレクティッド発現ベクター、及び１００ｎｇの５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３  Ｃｏｎｔｒｏｌ又はｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌレポータープラスミドで共トランスフェクトした。ｐＳＧ４２４及びｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１−９５６）は、それぞれ、ＧＡＬ４  ＤＢＤのみ及びＧＡＬ４  ＤＢＤに融合したヒトＺＨＸ３の全コード配列を発現する。１００％の値は、それぞれ、５０ｎｇのｐＳＧ４２４の存在下におけるレポータープラスミドについてのプロモーター活性に示された。
【図１１】ＺＨＸ３は転写リプレッサーであることを示す図である。ＨＥＫ２９３細胞を２ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ、５０ｎｇの（カラム上に示す）ＳＶ４０プロモーターダイレクティッド発現ベクター、１００ｎｇの５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３  Ｃｏｎｔｒｏｌレポータープラスミド、示された量のｐＣＭＶ−ＺＨＸ１（２４２−４３２）発現プラスミドで共トランスフェクトした。プラスミド（２０２ｎｇ）の総量は、必要であれば、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ−Ｃ２の添加により調節された。１００％の値は、５０ｎｇのｐＳＧ４２４及び５０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ−Ｃ２の存在下におけるレポータープラスミドのプロモーター活性に示された。トランスフェクション４８時間後、上記細胞を回収し、そしてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を決定した。ホタルルシフェラーゼ活性は全ての実験においてウミシイタケルシフェラーゼ活性により正規化された。それぞれのカラム及び棒は少なくとも５のトランスフェクション実験の平均及び標準偏差を示す。
【図１２】ＺＨＸ３の最小リプレッサードメインの決定を示す図である。ｐＳＧ４２４及びさまざまなｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３構築物は、それぞれ、ＧＡＬ４  ＤＢＤのみ及びＧＡＬ４  ＤＢＤに融合したヒトＺＨＸ３のさまざまな欠失変異体を発現する。条件は図１０についての説明において示されたものと同じである。それぞれのカラム及び棒は少なくとも５のトランスフェクション実験の平均及び標準偏差を示す。
【図１３】ＨＥＫ２９３細胞におけるＺＨＸ３の細胞内局在及び核移行シグナルの決定を示す図である。ＧＦＰのみ又はＧＦＰのＣ末端に融合されたさまざまな切断されたＺＨＸ３タンパク質をコードする、発現プラスミド（３００ｎｇ）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、ＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を観察した。構築物はそれぞれのパネルの上部に示す。
【図１４】ＺＨＸ３の機能ドメインを示す図である。Ｚｎｆ、ジンクフィンガーモチーフ；ＨＤ、ホメオドメイン；Ｅ、グルタミン酸−リッチ領域；ＤＤ、二量体化ドメイン；ＩＤ、ＮＦ−ＹＡとの相互作用ドメイン；ＲＤ、リプレッサードメイン；ＮＬＳ、核移行シグナル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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