(57)【要約】【課題】３次元的に再構築された細胞を、その機能を維持しつつ簡便に培養できる細胞培養方法及びその方法により得られる細胞培養物を提供する。【解決手段】１種または複数種の細胞からなる細胞群が密着した透過性膜の、細胞群が密着していない面を培養容器内の培養液に接触させた状態で、この培養容器を連続的又は間欠的に動かしながら細胞を培養する細胞の培養方法。特に、透過性膜からなる中空糸内に細胞の凝集体を形成し、この中空糸を容器内に入れ、容器を例えば汎用の震盪培養器上に載せ震盪させつつ培養することが好ましい。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または複数種の細胞からなる細胞群が密着した透過性膜の、細胞群が密着していない面を容器内の培養液に接触させた状態で、該容器を連続的又は間欠的に動かしながら細胞を培養する細胞の培養方法。
【請求項２】
透過性膜が中空糸の形態を採っている請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
細胞群が凝集体を形成している請求項１または２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
凝集体が、細胞に遠心力または圧力をかけることにより形成されたものである請求項３に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
細胞群がゲル内に含まれている請求項１から４のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項６】
細胞が肝臓由来の細胞である請求項１から５のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項７】
容器を水平方向に回転又は往復動させる請求項１から６のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の細胞培養方法により得られる細胞培養物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養、組織培養等の分野において利用される細胞の培養方法及びこの方法により得られた細胞培養物に関する。特に、細胞の機能を維持しつつ細胞を培養できる細胞の培養方法及びこの方法により得られた細胞培養物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、接着性の動物細胞を培養する場合は、細胞が培養容器の底面に自発的に接着し、細胞質を偏平に延ばして増殖または接着する、いわゆる単層培養の形態をとるのが一般的である。
【０００３】
しかし、生体から取り出し培養し始めてすぐのいわゆる初代培養の細胞は、その由来する組織の特性を保持している場合が多いが、ほとんどの場合その機能は数日・数週の単位で消失することが知られている。
【０００４】
初代培養細胞の中でも高度に分化した初代肝細胞では、単層培養期間内にその機能が特に失われ易い。例えば、ラット初代培養肝細胞は、フラスコ内で単層培養を行っても、例えば肝細胞の重要な機能のひとつであるアンモニア代謝能が、通常、培養開始から２週間程度で失われてしまう。
【０００５】
このような機能の消失を回避するために、細胞をコラーゲンゲル内に包埋したり、細胞を中空糸モジュール内に充填したりすることにより細胞を３次元的に再構築した状態で培養する方法が種々研究されている（例えば特許文献１）。
【０００６】
細胞を３次元的に再構築した場合は、一般に細胞の代謝活性は上昇し、また培養時の細胞密度も単層培養に比べ著しく高くなるため、培養に際して多量の栄養分の供給及び効率良いガス交換が必須である。このため、従来の単層培養と同様の静置培養では、細胞に充分な栄養分及び酸素がゆきわたらず、細胞は死に至り易く、その結果細胞の充分な機能を発揮することはできない。
【０００７】
また、中空糸モジュールを用いて細胞を培養する場合には、中空糸内に培養液を灌流させることにより、中空糸の外側に充填された細胞に栄養分及び酸素を効率良く運搬することができる。しかし、灌流を行なうには、中空糸をハウジング内に収容する必要があり、更にポンプを始めとする多くの器材が必要であり、培養操作も煩雑なものになる。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００１−１２８６６０（第３欄第４９行〜第４欄第３行）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、３次元的に再構築された細胞を、その機能を維持しつつ簡便に培養できる細胞培養方法及びその方法により得られる細胞培養物を提供することを主目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。すなわち、細胞群を透過性膜に密着させ、該透過性膜の細胞群が密着していない面を容器内の培養液に接触させた状態で、連続的又は間欠的に該容器を動かしながら細胞群を培養する場合には、簡単に容器内の培養液を流動させることができ、その結果、簡単に細胞群の全体に栄養分を供給できるとともに、ガス交換を行うことができる。これにより、長期間にわたり細胞の機能を維持しつつ、簡単に、細胞を培養できる。特に、透過性膜上に細胞の凝集体を形成したり、コラーゲンゲル中に細胞群を形成する場合には、細胞機能が一層効率よく維持される。
【００１１】
本発明は前記知見に基づき完成されたものであり、以下の細胞培養方法等を提供する。
【００１２】
項１．  １種または複数種の細胞からなる細胞群が密着した透過性膜の細胞群が密着していない面を容器内の培養液に接触させた状態で、該容器を連続的又は間欠的に動かしながら細胞を培養する細胞の培養方法。
【００１３】
項２．  透過性膜が中空糸の形態を採っている項１に記載の細胞培養方法。
【００１４】
項３．    細胞群が凝集体を形成している項１または２に記載の細胞培養方法。
【００１５】
項４．  凝集体が、細胞に遠心力または圧力をかけることにより形成されたものである項３に記載の細胞培養方法。
【００１６】
項５．  細胞群がゲル内に含まれている項１から４のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００１７】
項６．  細胞が肝臓由来の細胞である項１から５のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００１８】
項７．    容器を水平方向に回転又は往復動させる項１から６のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００１９】
項８．  項１から７のいずれかに記載の細胞培養方法により得られる細胞培養物。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）細胞培養方法
基本的構成
本発明の細胞の培養方法は、１種または複数種の細胞からなる細胞群が密着した透過性膜の、細胞群が密着していない面を容器内の培養液に接触させた状態で、該容器を連続的又は間欠的に動かしながら細胞を培養する方法である。
【００２１】
本発明方法においては、細胞を３次元的に再構築した細胞群の状態で培養するため、長期にわたり細胞機能を維持しつつ細胞を培養できる。また、細胞群の内部の細胞にまで効率よく確実に栄養分や酸素を供給したり、内部の細胞から老廃物を廃棄するためには、透過性膜を介して細胞群に接触する培養液を流動させることが効果的であるが、本発明方法においては、容器を動かすことにより、簡便に培養液を流動させることができる。
透過性膜
透過性膜は、細胞は通過させないが水、塩類、蛋白質などの培養液成分は通過させる通孔を多数有する膜であり、通常０．１〜５μｍ程度、特に０．２〜３μｍ程度の通孔を有するものであることが好ましい。透過性膜の厚さは、膜の適度の強度及び良好な物質透過性が保たれる範囲であればよく、特に限定されないが、通常１０〜２００μｍ程度、特に２０〜１００μｍ程度のものが好適である。
【００２２】
透過性膜の材料は、細胞毒性を有さず、滅菌、洗浄、培養液との接触などにより変質、分解しない材料であればよく、特に限定されない。例えばセルロース系樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレンのようなポリオレフィン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、フッ素樹脂、ポリカーボネート、アクリル樹脂等からなる透過性膜を利用できる。
【００２３】
透過性膜の形態は特に限定されず、例えば膜状、中空糸状、又は、開口部を１以上有する袋状等の形態が挙げられる。特に中空糸を好適に使用できる。中空糸の大きさは、特に限定されないが、内部の細胞に効率よく栄養分を供給するためには、内径が通常２０〜１０００μｍ程度、特に５０〜５００μｍ程度、さらに特に１００〜３００μｍ程度であることが好ましい。前記範囲であれば、中空糸中心部の細胞の物質交換を十分に行えるとともに、実用上十分な数の細胞を入れることができる。中空糸の長さは、特に限定されないが、例えば０．５〜２０ｃｍ程度、特に１〜１０ｃｍ程度とすることができる。
【００２４】
また、透過性膜は膜状のままで使用することもできる。例えば、容器底面の全部又は一部が透過性膜で構成された容器、容器の底面の他に側面の全部又は一部も透過性膜で構成された容器、複数ウェルを有し各ウェルの底面の全部又は一部が透過性膜で構成された容器、複数ウェルを有し各ウェルの底面の他に側面の全部又は一部も透過性膜で構成された容器等を採用し、該容器の透過性膜上に細胞群を形成することができる。
【００２５】
細胞
本発明において細胞群とは、細胞の種類や大きさにより異なるが、概ね１０５個／ｍｌ以上の密度で集合した細胞の集まりをいう。細胞群における細胞密度の上限は特に限定されないが、通常は１０１０個／ｍｌ程度までである。細胞群は１種類の細胞からなるものであってもよく、又は、複数種類の細胞からなるものであってもよい。
【００２６】
細胞群は、特に、細胞の凝集体であることが好ましい。細胞の凝集体とは、分散された細胞による自発的な凝集ではなし得ない程度に、細胞同士が高度に接着した状態又は高頻度に接着した状態の細胞群をいう。また、細胞はコラーゲン又はアガロースなどのゲル内に含まれた状態で高密度を保っていてもよい。さらに、細胞凝集体がコラーゲン又はアガロースなどのゲル内に含まれていてもよい。
ゲルを用いる場合は、細胞はゲル内に包埋されていてもよく、一部がゲルから露出していてもよい。細胞凝集体又はゲル内に含まれた状態の細胞群を培養することにより、一層長期にわたり、細胞の一層高い機能を発現、維持させた状態で培養できる。
＜細胞凝集体＞
例えば、中空糸内にこのような細胞の凝集体を形成させる場合は、細胞を適当な液体培地又はバッファーに懸濁した懸濁液を中空糸内に注入し、例えば注射器などを用いて、細胞の種類に応じて細胞に障害を与えない範囲の圧力をかけることにより形成できる。圧力は、細胞の種類によって異なるが、概ね５〜５０ｋｇ重／ｃｍ２程度、特に５〜３５ｋｇ重／ｃｍ２程度、さらに特に１０〜２０ｋｇ重／ｃｍ２程度が好ましい。本発明において、圧力をかけることには、注射器、アスピレーター（水流ポンプ）、電動ポンプなどを用いて細胞に陽圧又は陰圧の圧力をかけることが含まれる。
【００２７】
また、細胞懸濁液を中空糸内に注入後、汎用の遠心機を用いて、細胞の種類に応じて細胞に傷害を与えない範囲の遠心力をかけることによっても形成することができる。遠心力は、細胞の種類によっても異なるが、概ね２〜２０００×Ｇ程度、特に４〜５００×Ｇ程度とすることが好ましい。例えば初代ラット肝細胞の場合には、通常１５００×Ｇ以下、特に４００×Ｇ以下の遠心力をかけることが好ましい。また、初代ラット肝細胞の場合には、遠心力の下限値は細胞の凝集体が形成されるのであればよく、特に限定されないが、通常５×Ｇ程度である。遠心時間は、細胞凝集体を形成できる範囲で適宜設定すればよい。
【００２８】
また、例えば透過性膜を備えた容器の透過性膜上に細胞凝集体を形成する場合は、透過性膜上に細胞懸濁液を載せた状態で遠心力をかけることにより細胞凝集体を形成できる。遠心力の大きさ及び遠心時間は前述したとおりである。
＜ゲル内に細胞群を形成する方法＞
細胞群をコラーゲンゲル等のゲル内に含ませる方法は、すでに公知であり、例えば「組織培養の技術」（日本組織培養学会、第３版第２刷、第２７１〜２７３頁）に記載されている。
＜細胞群のその他の形成方法＞
その他、例えば１０７〜１０９個／ｍｌ程度の高密度で細胞を分散させた細胞分散液を透過性膜からなる袋状のいれもの（例えば中空糸）内に注入することによって袋内に細胞群を形成することもできる。
【００２９】
本発明方法の対象となる細胞としては、接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、接着性の動物細胞は、初代培養細胞及び株化細胞の双方を対象とすることができる。本発明方法は、特に、細胞の機能維持が困難な初代培養細胞の培養に適する。初代培養細胞は、肝臓、腎臓、神経、肺等のいずれの組織由来のものであってもよいが、特に、単層培養により急激に分化機能を失うヒト肝細胞が本発明方法の対象細胞として好適である。
【００３０】
培養
透過性膜が中空糸などの袋状（１又は複数の開口部を有する）の形態を採る場合は、この袋を培養液中に浸漬した状態で培養を行う。細胞を培養する容器は特に限定されるものではないが、例えばシャーレやマルチウェルプレートなどが好適に利用できる。
【００３１】
また、細胞群を形成する透過性膜を備えた容器（第１の容器）を使用する場合は、例えばこの第１容器を内側に嵌めることができる第２容器内に第１容器を装着した状態で、この第２容器に培養液を入れ、第１容器の透過性膜を介して細胞群を培養液と接触させつつ培養することができる。具体的には、複数ウェルを有しウェル底面が透過性膜で構成されたいわゆるカルチャーインサートの透過性膜上に細胞群を形成し、適合するマルチウェルプレートにカルチャーインサートをウェルどうしがかみあうように装着し、マルチウェルプレートの各ウェル内に培養に適した量の培養液を入れた後、そのまま細胞群を培養することができる。
【００３２】
細胞の培養は容器を連続的又は間欠的に動かすことにより培養容器内で培養液を流動させながら行う。培養容器は、円形または多角形状に回転ないしは旋回させるようにして水平方向に動かしたり、又は水平方向に往復動させることができる。回転には一方向に回転させる場合の他、交互に逆方向に回転させる場合等が含まれる。往復には、一方向に往復させる場合の他、角度をつけて往復させること等が含まれる。また往復には、完全に元の位置に戻すようにして往復させる場合の他、不完全に往復させる場合が含まれる。
【００３３】
培養中は、細胞群が密着した透過性膜の全体が培養液に接触又は浸漬していてもよく、又は透過性膜の一部が培養液から露出していてもよい。
【００３４】
培養容器を動かす機器は特に限定されないが、市販の振盪器を好適に利用できる。シャーレやマルチウェルプレートなどのように培養液を入れる部分が円形又は楕円形である培養容器を用いる場合は、旋回運動を行なう振盪器が望ましい。
【００３５】
培養容器を動かす速度は、旋回運動の場合は、通常１〜２００ｒｐｍ程度、特に１０〜１００ｒｐｍ程度とすることが好ましい。前記範囲であれば、細胞に効率よく栄養分を供給できるとともに細胞に傷害を与えることがない。また、培養容器を往復動させる場合は、その振れ幅、培養容器の用量や形状、容器内の培養液量などによって異なるが、通常１〜２００回／分程度、特に１０〜１００回／分程度とすることが好ましい。また、容器の振れ幅は、振り速度、培養容器の用量や形状、容器内の培養液量などによって異なるが、例えば、直径が３ｃｍ〜１０ｃｍ程度のシャーレであれば、毎分１０〜５０回程度の速度で、振幅は１〜３ｃｍ程度が適当である。
【００３６】
培養液は、特に限定されず、例えばダルベッコの改変イーグル培地、ウィリアムズＥ培地、ＨａｍのＦ−１０培地、Ｆ−１２培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ１５３培地、１９９培地などの従来公知の細胞培養用基礎培地に、必要に応じて各細胞の培養に適合した従来公知の成長因子や抗生物質などを加えたものを使用することができる。
【００３７】
培養時の温度は、細胞の種類によって異なるが、概ね３６〜３７℃程度とすればよい。培養時間は、得られる細胞培養物の用途によっても異なるが、１２時間程度以上、特に２４〜９６時間程度とすることができる。
【００３８】
細胞培養物
この程度の培養により、細胞が生体内で保持していた機能を良好に発現している細胞培養物が得られる。得られた細胞培養物は、例えば細胞の機能試験、代謝能力試験、細胞による物質の生産試験、これらを利用した薬物のスクリーニング試験などに用いることができる。また、透過性膜からなる袋に含ませた状態で人工臓器として利用することもできる。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例及び試験例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
先端部をシリコンボンドにより封止し、束ねられたセルローストリアセテート製の血漿分離用中空糸（東洋紡績製ＡＰ２５０Ｎ１５タイプ；内径２８５μｍ，外径３８７μｍ）６本の内腔にコラゲナーゼ消化法により調製した初代ラット肝細胞５×１０５個を６０×Ｇで、９０秒間の遠心によって充填した。肝細胞を充填後、先端から３ｃｍの部分を圧着し、この部分を切断して、内部に肝細胞が封入された長さ３ｃｍの中空糸束を得た。
【００４１】
この中空糸束を直径３５ｍｍの細胞培養用シャーレ（ファルコン製）に入れ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ    ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；ギブコ製）１３．５ｇ／Ｌに、６０ｍｇ／Ｌ  プロリン、５０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（東洋紡績製）、１０ｍｇ／Ｌ  インシュリン（シグマ製）、７．５ｍｇ／Ｌ  ヒドロコルチゾン（シグマ製）、５０μｇ／Ｌ  リノール酸（シグマ製）、１０万Ｕ／Ｌ  ペニシリンＧカリウム（ナカライテスク製）、１００ｍｇ／Ｌ  ストレプトマイシン硫酸塩（ナカライテスク製）、１．０５ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム（ナカライテスク製）、１．１９ｇ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク製）を添加した無血清培地（ＨＳＦＭ）２ｍｌを添加した。
【００４２】
この培養シャーレを、振盪器（イワキガラス社製）の上に載せ、５％炭酸ガス，９５％大気の雰囲気下、３７℃で振幅２５ｍｍ、回転速度４５回転／分の条件で回転振盪培養を行った。
【００４３】
比較例１
実施例１と同様にして、内部に肝細胞が封入された中空糸束を得た。これを直径３５ｍｍの細胞培養用シャーレに入れ、ＨＳＦＭ２ｍｌを添加し、５％炭酸ガス，９５％大気の雰囲気下、３７℃で静置培養を行った。
【００４４】
比較例２
実施例１と同様にして調製した初代ラット肝細胞の１．０×１０６個を、５％ウシ胎児血清を添加したＨＳＦＭに懸濁し、コラーゲンコート処理した直径３５ｍｍシャーレに播種した。細胞が接着した後、ＨＳＦＭ２ｍｌに培地交換し、５％炭酸ガス、９５％大気の雰囲気下、３７℃で静置培養を行った。
【００４５】
細胞機能評価
肝細胞は、アルブミン等の蛋白質合成能の他に、アンモニアや薬物を代謝する機能を有している。特に、アンモニア代謝能は、通常、培養経過日数とともにすみやかに消失することが知られている。ここでは、アルブミン産生量及びアンモニア代謝量を経時的に測定した。
【００４６】
実施例１、比較例１、比較例２の各培養細胞について、培養開始１日後、３日後、７日後、１４日後、２１日後、２８日後にそれぞれアルブミン産生量、アンモニア代謝量を測定した。
【００４７】
アルブミン産生量は、培地中のアルブミン量を抗ラットアルブミンを用いたＥＩＡ法で測定し、アンモニア代謝量は、培地中に負荷したアンモニア消費量を自動分析機で測定して求めた。
【００４８】
アルブミン産生量の測定結果を図１に示し、アンモニア代謝量の測定結果を図２に示す。図１及び図２から明らかなように、中空糸内腔に遠心力を利用して肝細胞の凝集体を形成した後、振盪培養を行った実施例１の細胞では、高いアルブミン産生能およびアンモニア代謝能を発現し、維持することが示された。
【００４９】
これに対し、静置培養を行った比較例１及び静置による単層培養を行なった比較例２の細胞は、培養初期は実施例１及び２の細胞との差が認められないが、培養日数を経るとその機能は速やかに消失していった。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によると、３次元的に再構築された細胞を、その機能を維持しつつ簡便に培養できる細胞培養方法及びその方法により得られる細胞培養物が提供された。
【００５１】
さらにいえば、細胞を、概ね１０５個／ｍｌ以上の密度で集合した細胞の集まりである細胞群の状態で培養すれば、細胞機能を維持しつつ長期にわたり細胞を培養することができる。しかし、細胞をこのような細胞群の状態とすると内部の細胞にまで栄養分や酸素を確実に供給することが困難になる。本発明方法では、このような細胞群を透過性膜に密着させて形成し、透過性膜を介して細胞群に接触する培養液を、容器を動かすことにより流動させる。これにより、簡便に、効率良く確実に細胞群の全体に栄養分をゆきわたらせることができる。すなわち、本発明方法によれば、このように簡単に、長期間にわたり細胞の機能を維持しつつ細胞を培養できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】単位細胞数あたりのアルブミン産生量を示すグラフである。
【図２】単位細胞数あたりのアンモニア代謝量を示すグラフである。
【図１】
2004147552.tif 000003
【図２】
2004147552.tif 000004