(57)【要約】      （修正有）【課題】  特定のヒトサイクリンＥ  ｃＤＮＡ配列の１位から１１８５位の間に存在するヌクレオチド配列と緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下でハイブリッド形成できる核酸分子を単離すること。【解決手段】  以下の配列の1位から1185位の配列またはその相補鎖の、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、サイクリンＥ遺伝子の発現を阻害し得る、アンチセンス核酸分子。アンチセンス核酸分子を用いて細胞をトランスフェクションするかまたは形質導入する工程を含む、哺乳動物細胞の細胞周期を長くする方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列の１位から１１８５位の配列またはその相補鎖の、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、アンチセンス核酸分子であって、該アンチセンス核酸分子はサイクリンＥ遺伝子の発現を阻害し得る：
【化１】
2004222728.tif 000027
。
【請求項２】
請求項１に記載のアンチセンス核酸分子を用いて細胞をトランスフェクションするかまたは形質導入する工程を含む、哺乳動物細胞の細胞周期を長くする方法。
【請求項３】
以下の配列のヒトサイクリンＥ  ｃＤＮＡの１位から１１８５位のヌクレオチド配列またはその相補鎖に緊縮条件下でハイブリッド形成し得るポリヌクレオチドの、ヒトサイクリンＥの発現を阻害するためのアンチセンスポリヌクレオチドとしての、インビトロ使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は１９９１年９月２０日に出願された出願番号第０７／７６４，３０９号の一部継続出願である。
【０００２】
本発明は米国立保健研究所によって認められた援助金ＣＡ４７８１８による政府の支援でなされた。政府は本発明に一定の権利を有している。
【０００３】
本発明は組換え体ＤＮＡ技術に係わる遺伝子工学、そして特に細胞周期のＧ１期での進行およびＳ期への進入を制御することによって細胞の増殖速度を制御するヒトサイクリンＥをコードするヌクレオチド配列の同定に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
高等真核細胞の増殖および分化を研究する主要な目標は細胞周期、特にＧ１期からＳ期およびＧ２期からＭ期への移行による進行を調節する経路、酵素および補因子を生化学用語で記載することである。現在サイクリンとして知られているタンパク質は、受精したウニおよび二枚貝の卵中で、受精後に合成が非常に刺激され（添付の引用文献：Ｅｖａｎｓ等、１983年）そして各有糸分裂時に値が減少する少数のタンパク質のメンバーとして記載された。サイクリンＡ（Ｓｗｅｎｓｏｎ等、１９８６年）およびＢ（ＰｉｎｅｓおよびＨｕｎｔ、１９８７年）は有糸分裂細胞中に周期的に蓄積することが発見されたので、生化学的根拠は不明であったけれども、有糸分裂過程での役割があり得ると考えられた（Ｅｖａｎｓ等、１９８３年）。遺伝子および生化学分析の結果は現在減数分裂および有糸分裂での或る種のサイクリンの役割を支持している。減数分裂１およびＩＩから細胞を誘導させるためには二枚貝またはウニのサイクリンＢ１  ｍＲＮＡをツメガエルの卵母細胞に注入することで十分であると報告されており（ＰｉｎｅｓおよびＨｕｎｔ、１９８７年；Ｗｅｓｔｏｎｄｏｒｆ等、１９８９年〕、そしてサイクリンＢはツメガエルの初期胚での各有糸分裂周期で合成されなければならない唯一のタンパク質であると思われる（ＭｕｒｒａｙおよびＫｉｒｓｃｈｎｅｒ、１９８９年）。逆に、サイクリンＢ１およびＢ２ｍＲＮＡを破壊すると、ツメガエルの受精卵をＤＮＡ複製後ではあるが有糸分裂の前に停止させることができる（Ｍｉｓｈｕｌｌ等、１９８９年）。ツメガエルの他に、酵母の中でＳ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）およびＳ．セレビシエ（ｃｏｒｅｖｉｓａｅ）がサイクリンＢがｐ３４ＣＤＣ２タンパク質キナーゼ（Ｎｕｒｓｅ、１９９０年；Ｃｒｏｓｓ、１９８９年、で総説された）の活性化に対して有糸分裂制御を発揮することによって有糸分裂の移行の調節で役割を果たしていると報告されている（Ｈｕｇａｎ等、１９８８年；Ｇｈｉａｒａ等、１９９１年；Ｓｕｒａｎａ等、１９９１年；ＢｏｏｈｅｒおよびＢｅａｃｈ、１９８７年；Ｂｏｏｈｅｒ等、１９８９年；Ｈｕｓａｎ等、１８８年；Ｇｈｉａｒａ等、１９９１年；Ｓｕｒａｎａ等、１９９１年）。後者の場合には、ＣＤＣ２キナーゼはモノマーとしては触媒的に活性でないが、サイクリンＢとの結合および一連のリン酸化および脱リン酸化段階の後にキナーゼ活性が生じる（ＳｉｍａｎｉｓおよびＮｕｒｓｅ、１９８６年；ＤｒａｅｔｔａおよびＢｅａｃｈ、１９８８年；Ｐｏｎｄａｖｅｎ等、１９９０；Ｓｏｌｏｍｏｎ等、１９９０年；ＧｏｕｌｄおよびＮｕｒｓｅ、１９８９年；ＥｎｏｃｈおよびＮｕｒｓｅ、１９９０年；Ｓｏｌｍｏｎ等、１９９２年）。
【０００５】
サイクリンＢ依存性のｐ３４ＣＤＣ２キナーゼの活性化は或る種の体細胞で有糸分裂を開始させるためにも必要である（Ｎｕｒｓｅ、１９９０年；Ｃｒｏｓｓ、１９８９年；Ｍａｌ１ｅｒ等、１９９１年）が、活性化だけが唯一の必要なことではないと思われる（Ｌａｍｂ等、１９９０年；Ｏｓｍａｎｉ等、１９９１年；Ａｍｏｎ等、１９９２年；Ｓｏｒｇｅｒ等、１９９２年）。Ｓ．セレビシエは明らかにＣＤＣ２８と称されるＣＤＣ２相同体を有している。ＣＤＣ２とＣＤＣ２８遺伝子生成物は構造的に類似しており（ＬｏｕｉｎｃｚおよびＲｅｅｄ、１９８４年；ＨｉｎｄｌｅｙおよびＰｈｅａｒ、１９８４年）そして機能的に相同性であると思われる（Ｂｅａｃｈ等、１９８２年；ＢｏｏｈｅｒおよびＢｅａｃｈ、１９８７年）。これらは、脊椎動物および無脊椎動物の有糸分裂促進因子中の３４ｋＤａのタンパク質キナーゼの相同体であるセリン／スレオニンタンパク質キナーゼをコードする（ＭＰＦ；ＬｅｅおよびＮｕｒｓｅ、１９８７年；Ａｒｉｏｎ等、１９８８年；Ｄｕｎｐｈｙ等、１９８８年；Ｇａｕｔｉｅｒ等、１９８８年；Ｌａｂｂｅ等、１９８８年）。Ｇ２／Ｍ期およびＧ１／Ｓ期での細胞周期移行でＣＤＣ２８は種々のサイクリンを必要とする；即ち、報告によれば、Ｇ２／ＭＣＤＣ２８ではＢタイプのサイクリンと結合してこれにより活性化され（Ｇｈｉａｒａ等、１９９１年；Ｓｕｒａｎａ等、１９９１年）、一方報告によればＧ１／ＳＣＤＣ２８ではＣＬＮ−タイプのサイクリン（即ち、ＣＬＮ１、ＣＬＮ２およびＣＬＮ３；Ｓｕｄｂｅｒｙ等、１９８０年；Ｎａｓｈ等、１９８８年；Ｃｒｏｓｓ、１９８８、１９９０年；Ｈａｄｗｉｇｅｒ等、１９８９年；Ｒｉｃｈａｆｄｓｏｎ等、１９８９年；Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇ等、１９９０年）によって活性化される。
【０００６】
ＣＬＮ１およびＣＬＮ２サイクリンは細胞周期中に周期的に現れ、Ｇ１／Ｓ移行点で発生量のピークに達し（Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇ等、１９９０年；ＣｒｏｓｓおよびＴｉｎｋｅｌｅｎｂｅｒｇ、１９９１年）そして酵母細胞でのＣＬＮタンパク質の蓄積は細胞周期のＧ１からＳ期への移行速度を限定するものと思われる。
【０００７】
本開示の目的では、用語「ＣＤＣタンパク質キナーゼ」は最近採用された「細胞分裂キナーゼ（ＣＤＫ）」の命名と同義語として使用する。
【０００８】
ｐ３４  ＣＤＣ２キナーゼ活性は細胞周期中で明らかに変動し（Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ等、１９８７年；ＤｒａｅｔｔａおよびＢｅａｃｈ；１９８８年；Ｌａｂｂｅ等、１９８９年ｂ；Ｍｏｒｅｎｏ等、１９８９年；ＰｉｎｅｓおよびＨｕｎｔｅｒ、１９９０年）、そしてこの活性の変動は細胞中に存在するＣＤＣ２遺伝子産生物の量の変動に起因するものではない（Ｄｕｒｋａｃｚ等、１９８６年；ＳｉｍａｎｉｓおよびＮｕｒｓｅ、１９８６年；ＤｒｅａｔｔｅおよびＢｅａｃｈ、１９８８年〕。むしろ、ＣＤＣ２キナーゼ活性はキナーゼと（上記した）サイクリンを含む他のタンパク質との相互作用によって影響を受けると思われる（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ等、１９８０年；Ｅｖａｎｓ等、１９８３年；Ｓｗｅｎｓｏｎ等、１９８６年；Ｄｒｅｔｔｅ等、１９８９年；Ｍｅｉｊｏｒ等、１９８９年；Ｍｉｎｓｈｕｌｌ等、１９８９年；ＭｕｒｒａｙおよびＫｉｒｓｃｈｎｅｒ、１９８９年；Ｌａｂｂｅ等、１９８９年ａ；Ｓｏｌｏｍａｎ等、１９９０年；Ｇａｕｔｉｅｒ等、１９９０年；ＭｕｒｒａｙおよびＫｉｕｓｃｈｎｅｒで総説された、１９８９年；Ｈｕｎｔ、１９８９年〕。明らかに、酵母を含む広範囲の生物（ＢｏｏｈｅｒおよびＢｅａｃｈ、１９８９年；Ｈａｇａｎ等、１９８９年；Ｍｏｒｅｎｏ等、１９８９年；Ｓｏｌｏｍａｎ等、１９８８年；Ｂｏｈｅｒ等、１９８９年；Ｓｕｒａｎａ等、１９９１年；Ｇｈｉａｒａ等、１９９１年）およびヒト（ＤｒａｅｔｔａおよびＢｅａｃｈ、１９８８年；ＰｉｎｅｓおよびＨｕｎｔｅｒ、１９８９年；Ｒｉａｂｏｗｏｌ等、１９８９年）での有糸分裂の開始時にｐ３４キナーゼを活性化するためにはｐ３４  ＣＤＣ２タンパク質とＢタイプサイクリン間の会合が必要である。
【０００９】
発芽酵母においては、細胞増殖の主要な制御決定点は報告によればＧ１期中、即ちスタート（ＳＴＡＲＴ）と称される点で生起し、ここで細胞は、或る条件が充足されるまでＳ期に入ることが制限される（Ｈａｒｔｗｅｌｌ、１９７４年）。このスタート移行にはＣＤＣ２８またはｃｄｃ２遺伝子産生物が必要であるように思われる（Ｈａｒｔｗｅｌｌ等、１９７３、１９７４年；ＮｕｒｓｅおよびＢｉｓｅｒ、１９８１年）が、スタートでＣＤＣ２８を活性化する生化学的経路は完全には理解されていない。ＣＬＮ１、ＣＬＮ２およびＣＬＮ３サイクリンの全てを欠いている細胞はスタートで停止し；そして細胞は増殖し続けるが、Ｓ期に入ることはできないので、後者の生化学的経路は、上記の３つのＣＬＮタンパク質と、ＣＤｑ２８の活性化に係わっているものと思われる（Ｓｕｄｂｅｒｒｙ等、１９８０年；Ｎａｓｈ等、１９８８年；Ｃｒｏｓ、１９８８、１９９０年；Ｈａｄｗｉｇｅｒ等、１９８９年；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等、１９８９年；Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇ等、１９９０年）。ＣＬＮ２、そして多分ＣＬＮ１およびＣＬＮ３はスタート前またはスタート時にＣＤＣ２８キナーゼとのコンプレックスを形成すると思われる（Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇ等、１９９０年〕。ＣＬＮ１およびＣＬＮ２は細胞周期中に変動するが、最大値は報告によればＧ１後期（即ちＧ２後期ではなくて；Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇ等、１９９０年）に観察される。
【００１０】
高等真核細胞においてＤＮＡ合成の開始を制御する生化学的経路、またはこれらの経路が酵母での経路と類似する程度については現在殆ど知られていない。しかし乍ら、ヒト細胞では（発芽酵母と同様に）細胞増殖を制御する優先的な態様は細胞周期のＧ１期中に生起するように思われる（ＺｅｔｔｅｒｂｅｒｇおよびＬａｒｓｏｎ、１９８５年；Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ、１９９０年）。哺乳動物細胞におけるＧ１からの移動の動力学は、ＤＮＡ合成を開始させるために細胞の拘束を制御する「制限点」と称される単一の決定点を示唆している（Ｐａｒｄｅｅ、１９７４年）。制限点より前ではＧ１の進行は細胞の増殖状態に対し敏感である（例えば、タンパク質合成の速度を低下させるかまたは成長因子を除去すると明らかにＳ期への移行が遅延しそして細胞周期を停止させることさえできる）が、制限点より後では細胞周期は実質的にこれらのシグナルに対する応答が小さくなる（Ｐａｒｄｅｅ、１９８９年、で総説された）。酵母とは異なって、ＣＤＣ２サイクリンは哺乳動物細胞では小さいタンパク質群に多様化させられるように思われ（Ｐａｒｉｓ等、１９９１年；ＥｌｌｅｄｇｅおよびＳｐｏｔｓｗｏｏｄ、１９９１年；Ｔｓａｉ等、１９９１年；Ｋｏｆｆ等、１９９１年）そしてＣＤＣ２／２８活性も幾つかの異なるキナーゼ群のメンバーに分けられよう（ＦａｎｇおよびＮｅｗｐｏｒｔ、１９９１年）。或る種のサイクリンは高等真核生物でのＧ１規制において酵母で報告された役割と同様な役割を有すると思われる。例えば、サイクリンＡ合成は報告によればＧ１後期に始まり、そしてこれはｐ３４ＣＤＣ２と或る種の関連ｐ３３  ＣＤＫ２キナーゼの両方を活性化することができる（Ｇｉｏｒｄａｎｏ等、１９８９年；ＰｉｎｅｇおよびＨｕｎｔｅｒ、１９９０年；Ｍａｒｎａｃｃｉｎｏ等、１９９２年；Ｔｓａｉ等、１９９１年）。報告によれば、サイクリンＡ機能の阻害は或る種の細胞ではＳ期のスタート様機能も阻止することがあり（Ｇｉｒａｒｄ等、１９９１年）、そして報告によれば、サイクリンＡは或る種の形質転換および増殖抑制因子と会合することができる（ＨｕｎｔｅｒおよびＰｉｎｅｅ、１９９１年）。しかしながら、高等真核生物でのスタート様機能の制御におけるサイクリンＡの役割を支持するこれらの明らかな結果にも拘わらず、サイクリンＡが発芽酵母ＣＬＮタンパク質と機能的に相同性であることを疑う幾つかの理由もある。幾つかの研究室が、酵母には存在しない哺乳動物中の２つの新規なサイクリン、即ちサイクリンＣおよびサイクリンＤを最近同定している。サイクリンＤ遺伝子は、Ｇ１後期にネズミマクロファージでＣＳＦ−１によって誘導された遺伝子として報告され（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ等、１９９１年）そしてこの遺伝子は、ヒト傍甲状腺腫瘍で起こり得る転位による破壊点に染色体位置を有していると思われる（Ｍｏｔｏｋｕｒａ等、１９９１年）。報告によれば、サイクリンＤ
のみならずサイクリンＣもＳ，セレビシエＣＬＮ遺伝子の突然変異を相補うことができる遺伝子をスクリーニングすることによってヒトおよびショウジョウバエ属ｃＤＮＡライブラリーで同定されている（Ｌａｈｅｕ等、１９９１年；Ｌｅｗ等、１９９１年；ＬｅｏｐｏｌｄおよびＯＦａｒｒｅｌｌ、１９９１年；Ｘｉｏｎｇ等、１９９１年）。これらの結果はサイクリンＣおよびサイクリンＤのＧ１機能と一致しているが、サイクリンＢ（有糸分裂サイクリン）は後者のＳ，セレビシエＣＬＮ変異体も保護できることが見い出され、酵母の相補性アッセイが高等真核細胞で類似する機能を果たすサイクリンを必ずしも同定するとは限らないことを示している。
【００１１】
哺乳動物細胞の制限点と酵母のスタートとの間の類似性はｐ３４ＣＤＣ２キナーゼの考えられる役割を示唆していた。この仮説を支持して、ヒトＣＤＣ２遺伝子は、Ｇ１／ＳおよびＧ２／Ｍの両方の役割でＳ，ポンベｃｄｃ２遺伝子の活性を代替できることが見い出された（ＬｅｅおよびＮｕｒｓｅ、１９８７年）。更に、Ｓ期の細胞がＧ１細胞に融合されたとき、拡散性のトランス作用因子はＤＮＡ合成の活性化に係わっていると報告されているので、細胞融合実験によって、上記仮説を支持する環境的証拠が提供される（ＲａｏおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８７年）。しかし乍ら、Ｓ後期アクチベーターとｐ３４  ＣＤＣ２キナーゼ間の関係は依然として不明のままである。報告によれば、最近、サイクリン−ＣＤＣ２コンプレックスをヒトＳ期細胞から単離しそしてＧ１細胞の抽出物に添加したときＳＶ４０−ＤＮＡ複製の誘導に活性であることが示された（Ｄ’Ｕｒｓｏ等、１９９０年〕。ヒトＣＤＣ２ｍＲＮＡに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドはＳ期への移行時にヒトＰＨＡ−活性化Ｔ細胞を阻止すると報告されている（Ｆｕｒａｋａｗａ等、１９９０年）。他の高等真核細胞では、ツメガエル抽出物からＣＤＣ２タンパク質を枯渇させるとＤＮＡ複製を阻害できることが報告されている（ＢｌｏｗおよびＮｕｒｓｅ、１９９０年）。最近の示唆的な報告にも拘わらず、ヒトの細胞周期のＧ１期にｐ３４キナーゼを活性化させる経路は現在わかっていない。
【００１２】
酵母のスタート時でのＣＤＣ２８のＣＬＮ依存性活性化と同様にして、特定のＧ１サイクリンはＧ１からＳ期への移行中にヒトｐ３４キナーゼの制御で役割を果たすことができる。この考えを試験するために、本明細書で実験を行ってヒト細胞が酵母Ｓ．セレビシエＣＬＮタンパク質を代替できる特定のサイクリンを含有しているかどうかを測定した。このアッセイによって新しいヒトサイクリン、サイクリンＥが同定された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要約）
本発明は、図２に示されるヒトサイクリンＥ  ｃＤＮＡ配列の１位から１１８５位の間に存在するヌクレオチド配列と緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下でハイブリッド形成できる核酸分子を単離して提供する。このような核酸分子は好ましくは、細胞分裂キナーゼ（例えば、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２８、ＣＤＫ２−ＸＬ、ＣＤＣ２−ＨＳおよびＣＤＫ２−ＨＳ）と結合しそしてこれを活性化させ得るサイクリンＥポリペプチドをコードする。サイクリンＥポリペプチドは典型的には細胞周期のＧ１期を短縮することもできる。本発明はまた、上記の核酸分子でコードされたポリペプチドおよび該ポリペプチドと特異的に結合できる免疫学的に結合するパートナーも提供する。
【００１４】
サイクリンＥは、ＣＤＣ２に関連したタンパク質キナーゼ、ＣＤＫ２と結合しそしてこれを活性化することによって細胞周期のＧ１後期およびＳ前期に特異的に機能する。サイクリンＥ／ＣＤＫ２ポリペプチドコンプレックスの値によって細胞周期が制御され、そして細胞周期のＧ１後期に発生量のピークに達する。細胞中のサイクリンＥの構造発現だけで細胞周期のＧ１期を短縮させそして細胞の増殖を促進するのに十分である。細胞中のサイクリンＥ値の増加または減少はそれぞれ細胞増殖を増加させまたは減少させる。腫瘍細胞のような細胞中のサイクリンＥ値を検出することによって増殖速度に関する情報を提供することができる。染色体の破壊点でのサイクリンＥの位置の再配置は細胞増殖の速度を変えることができる。
【００１５】
従って、本発明は、以下を提供する：
（１）図２に示されるヒトサイクリンＥ  ｃＤＮＡ配列の1位から1185位の間に存在するヌクレオチド配列またはその相補的ストランドと緊縮条件下でハイブリッド形成できる単離された核酸分子。
（２）サイクリンＥポリペプチドをコードする、項目１に記載の単離された核酸分子。
（３）サイクリンＥポリペプチドが細胞分裂キナーゼと結合し、それを活性化することができる、項目２に記載の単離された核酸分子。
（４）細胞分裂キナーゼが、CDC2、CDC28、CDK2-XL、CDC2-HSおよびCDK2-HSからなる群から選択される項目３に記載の単離された核酸分子。
（５）サイクリンＥポリペプチドが真核生物細胞周期のＧ１期を短縮化することができる、項目２に記載の単離された核酸分子。
（６）図２に示されるサイクリンＥポリペプチドと結合する抗体に結合し得るポリペプチドをコードする項目１に記載の単離された核酸分子。
（７）適当な制御配列に作動可能に結合された項目１に記載の単離された核酸分子を含む組換え発現ベクター。
（８）項目７に記載の組換え発現ベクターでトランスフェクションするか形質導入した細胞。
（９）項目８に記載の細胞を培養して上記の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチドを産生させる工程を含む、細胞周期のＧ１期を短縮する細胞分裂キナーゼを活性化し得るポリペプチドを産生させる方法。
（１０）項目７に記載の組換え発現ベクターで細胞をトランスフェクションするかまたは形質導入する工程を含む、哺乳動物細胞の細胞周期を短縮させる方法。
（１１）項目１に記載の、単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
（１２）項目１１に記載のポリペプチドと特異的に結合し得る免疫学的結合パートナー。
（１３）項目１２に記載の免疫学的結合パートナーとサイクリンＥとの間で複合体を形成させるのに適当な条件下で免疫学的結合パートナーを生物学的液体とともにインキュベートし、遊離の結合パートナーまたは液体から複合体を分離し、そして分離した複合体中でサイクリンＥまたは結合パートナーを検出することを含む生物学的液体中でサイクリンＥの値を検出するためのアッセイ。
（１４）生物学的液体から複合体を分離しそして分離した複合体をアッセイしてサイクリンＥまたは細胞分裂キナーゼの量を測定することを含む生物学的液体中のサイクリンＥ：細胞分裂キナーゼ複合体の発生量を測定するためのアッセイ。
（１５）図２に示されるヒトサイクリンＥアミノ酸配列と結合し得る抗体によって認識されるポリペプチド。
（１６）項目１に記載のｃＤＮＡまたは項目１に記載の単離された核酸分子から転写されたｍＲＮＡと結合しそして上記ｃＤＮＡの転写または上記ｍＲＮＡの翻訳を阻止し得るアンチセンスヌクレオチド配列。
（１７）項目１６に記載のアンチセンスヌクレオチド配列で細胞をトランスフェクションするかまたは形質導入することを含む、哺乳動物細胞の細胞周期を長くする方法。
（１８）図２に示されるサイクリンＥ  ｃＤＮＡ疎水性αヘリックス配列の631位から936位の配列に存在するヌクレオチド配列と緊縮条件下でハイブリッド形成し得る核酸分子によってコードされたポリペプチド。
（１９）図２に示されるサイクリンＥ  ｃＤＮＡ保存ＭＲＡＩＬ配列の385位から645位の間に存在するヌクレオチド配列と緊縮条件下でハイブリッド形成し得る核酸分子によってコードされたポリペプチド。
（２０）CDCタンパク質キナーゼと結合し得る項目１９に記載のポリペプチド。
（２１）図２に示されるサイクリンＥ  ｃＤＮＡ  Ｃ末端配列の640位から1185位の間に存在するヌクレオチド配列と緊縮条件下でハイブリッド形成し得る核酸分子によってコードされたポリペプチド。
（２２）図２に示されるサイクリンＥ  ｃＤＮＡ  Ｃ末端保存配列の1048位から1080位の間に存在するヌクレオチド配列と緊縮条件下でハイブリッド形成し得る核酸分子によってコードされたポリペプチド。
（２３）clnl、cln2およびcln3を欠くゲノムを有し、かつ選択可能なマーカーおよび制御要素に作動可能に連結されたエピソームCLN3コード化ヌクレオチド配列を有し、細胞が哺乳動物サイクリン核酸で形質転換されるとき細胞周期のＧ１期の短縮化を示す、遺伝子変換酵母細胞。
（２４）項目２３に記載の酵母株５８９−５（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７４０９８）の細胞。
（２５）候補核酸分子を項目２３に記載の遺伝子変換酵母細胞中に導入し、そして細胞周期のＧ１期が少なくとも１時間短縮されているかどうかをスクリーニングすることからなる哺乳動物サイクリン核酸分子のクローニング法。
（２６）ｃｄｃ２８−１３遺伝子、Ｇ１  ｃｌｎ遺伝子、有糸分裂ｃｌｂサイクリン遺伝子およびサイクリンＥ遺伝子を含むゲノムを有し、細胞が哺乳動物細胞分裂キナーゼコード化核酸で形質転換されるとき細胞周期のＧ１期の短縮化を示す遺伝子変換酵母細胞。
（２７）候補核酸を項目２６に記載の遺伝子変換酵母細胞に導入しそして細胞周期のＧ１期が少なくとも１時間短縮されているかどうかをスクリーニングすることからなる、サイクリンＥタンパク質と結合しそしてそれによって活性化され得るＣＤＣタンパク質をコードする哺乳動物ｃｄｃ遺伝子のクローニング法。
（２８）項目２６に記載の１２３８−１４  Ｃ−ｃｙｃＥ株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７４０９９）の細胞。
（２９）clnl、cln2およびcln3を欠くゲノムを有し、エピソームCLN3コード化ヌクレオチド配列、ならびに選択可能なマーカーおよび制御要素に作動可能に連結された哺乳動物サイクリン核酸配列を有し、その際上記哺乳動物サイクリン核酸は、図２に示されるサイクリンＥ  ｃＤＮＡ配列の１位から１１８５位の間に存在するヌクレオチド配列と緊縮条件下でハイブリッド形成することができ、かつ細胞周期のＧ１期を短縮することができる遺伝子変換酵母細胞。
（３０）候補核酸分子を項目２９に記載の遺伝ｓに変換酵母細胞中に導入し、そして細胞周期のＧ１期の持続の復活についてスクリーニングすることを含む哺乳動物サイクリン核酸分子のインヒビターをクローニングする方法。
（３１）図２に示されるｃＤＮＡ配列によってコードされるサイクリンＥの活性より大きいかまたは小さい活性を有するポリペプチドをコードし、その際該活性はＣＤＫ２キナーゼポリペプチドに対するポリペプチドまたはサイクリンＥの結合親和性、ポリペプチドまたはサイクリンＥおよびＣＤＫ２が一緒にポリペプチドまたはサイクリンＥ：ＣＤＫ２複合体中に存在するときのＣＤＫ２キナーゼの酵素活性、およびサイクリンＥ：ＣＤＫ２複合体と比較したときのポリペプチド：ＣＤＫ２複合体の変化した安定性の中から選択される項目１に記載の単離された核酸分子。
【００１６】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
サイクリンＥと命名された新規なヒトサイクリンは、Ｓ．セレビシエにおけるトリプルｃｌｎ欠失を相補うことによって単離した。サイクリンＥはＣＤＣ２８遺伝子との相互作用を示し、サイクリンＥがＣＤＣ２８タンパク質との相互作用によってスタート時に機能を果たしたことを示唆していた。サイクリンＥと相互作用してｃｄｃ２８突然変異を有する酵母でスタートを行い得る２つのヒト遺伝子を同定した。１つはｃｄｃ２−ＨＳでありそして２番目はツメガエルＣＤＫ２のヒト相同体であった。サイクリンＥは大腸菌で産生され、ヒトＧ１細胞から得られた抽出物中のＣＤＣ２タンパク質と結合しそしてこれを活性化させ、そしてサイクリンＥに対する抗体はＨｅＬａ細胞から得られるヒストンＨ１キナーゼを免疫沈降させた。サイクリンＥとＣＤＣ２またはＣＤＫ２との間の相互作用はヒト細胞におけるＧ１期からＳ期への移行で重要であると思われる。
【００１７】
本発明は、図２の１位から１１８５位までで示されるヒトサイクリンＥ  ｃＤＮＡと緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下でハイブリッド形成し得る核酸分子を提供する。図２ではｃＤＮＡの一本（＋）ストランドだけしか示されていないが、当該技術分野の熟練者はこれによってその相補的（−）ストランドも同様に開示されていると認識するであろう。核酸分子によって、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／または合成ヌクレオチド配列、例えば、示されたサイクリンＥヌクレオチド配列の少なくとも１つの螺旋ターン（約１０から１５個のヌクレオチド）と同一、相同または相補的であるオリゴヌクレオチドが意味される。本発明は、サイクリンＥ  ｍＲＮＡｓの代替的スプライシング、遺伝的多型性および腫瘍原の転位から生じる３つ以上のサイクリンＥ  ｃＤＮＡｓを提供する。当該技術分野の熟練者は、サイクリンＥ核酸の密接に関連する群のメンバーが、図２のヌクレオチド配列またはその相補的（−）ストランドの全部または部分と緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下でハイブリッド形成し得ることによって容易に同定されると認識するであろう。緊縮条件下でのハイブリッド形成可能性によって、標準的な条件下、例えば相補的ヌクレオチド配列のハイブリッド形成に不利益である高温および／または低塩含量下で、開示されたサイクリンＥ核酸配列（ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかとして）の少なくとも１領域またはその相補的ストランドに対する核酸分子のアニーリングが意味される。適当なプロトコール（０．１×ＳＳＣを含有する、６８℃で２時間）はマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．等の分子クローニング：実験室マニュアル、コールドスプリングスハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８２年、３８７〜３８９頁に記載されている。このようなハイブリッド形成核酸分子は欠失、点変異、塩基置換、フレームシフト、代替的ＯＲＦｓ、ｍＲＮＡスプライシングおよびプロセッシング、または転写後修正（例えば、メチル化等）によって開示された配列に関連することができる。例えば、アンチセンス核酸が提供され、これはサイクリンＥ配列と相補的なヌクレオチド配列を有しておりそして例えば、サイクリンＥ  ｍＲＮＡと結合しそしてその転写を阻止することによってサイクリンＥ遺伝子の発現を阻害できることを特徴としている。アンチセンス核酸は、例えば、アンチセンス核酸をコードするベクターＤＮＡまたはＲＮＡ配列を用いて細胞を形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）させるかまたはトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後に宿主細胞内でコードさせるか、或いはアンチセンス核酸は合成オリゴヌクレオチドであることができる。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは多様な手段によって、例えばアンチセンスｍＲＮＡを細胞内にコードするレトロウイルスベクターを用いて、または細胞とアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するリボソームを融合させること等によって細胞中に導入される。主題のアンチセンス核酸分子は緊縮条件下で示されたサイクリンＥ核酸、その相補的ストランド、サイクリンＥ遺伝子の５’転写制御領域またはサイクリンＥ  ｍＲＮＡの転写制御領域とハイブリッド形成できることを特徴としている。
【００１８】
本発明の単離された核酸は好ましくはサイクリンＥポリペプチドをコードする。当該技術分野の熟練者は開示されたサイクリンＥヌクレオチド配列によって種々の合成ポリペプチドの構築が可能になることを知っているので、上記の単離された核酸分子は必ずしも上記ポリペプチドをコードしなくても良い。このような合成ポリペプチドは長さが変動し（例えば約５個のアミノ酸から数百個のアミノ酸まで）、そしてコードされたサイクリンＥポリペプチドの選択された領域に対応して構築される。かくして、主題のサイクリンＥポリペプチドは単離されたサイクリンＥポリペプチド（即ち、正常な細胞中に見られる）、突然変異ポリペ，プチド（例えば、変異原から生じるかまたは腫瘍細胞中に見られる）および化学的に修飾されたポリペプチド（例えば、１つまたはそれ以上の化学的に改変されたアミノ酸、その際指示されたアミノ酸を別のアミノ酸に変更することができる、または化学的に置換されたか若しくは誘導された等）を包含する。サイクリンＥポリペプチドの機能部位は、例えばサイクリンＥ核酸の変異体を構築し、そしてＣＤＣタンパク質キナーゼと結合しないか若しくはこれを活性化しないかまたは細胞周期を進行させないような機能特性の変化を有している発現産生物の構成を試験して同定される。このような変異体を構築するのに特に有用なものは、例えば、サイクリンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ間で保存されるかまたはサイクリンＥ属のメンバーの間で保存されている保存ヌクレオチドまたはアミノ酸配列領域である。サイクリンＥの保存領域は機能的でありそしてポリペプチドのタンパク質の構造領域である。
【００１９】
実例的な好ましい特徴において、細胞内でサイクリンＥポリペプチドが発現するとサイクリンＥがＣＤＣタンパク質キナーゼと結合してこれを活性化させ、そして細胞周期のＧ１期から細胞を進行させる或る種の成長因子および血清要件を消失させる点まで、細胞内のサイクリンＥ値を上昇させることができる。その結果として、細胞周期のＧ１期が短縮される。Ｇ１期は一般的に約８から約１２時間継続し、そして細胞内でサイクリンＥポリペプチドが発現すると（または細胞をサイクリンＥポリペプチドに暴露すると）Ｇ１期を約１時間から数時間短縮させることができる。本発明のサイクリンが細胞周期のＧ１期を短縮させることは、以下の実施例で提供されるようなモデル試験系を使用して、例えば酵母の「５９８−５」または「１２３８−１４Ｃ」株によって当該技術分野の熟練者は容易に測定することができる。或いは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のような哺乳動物細胞は、サイクリンＥハイブリッド形成核酸を含有する発現ベクターでトランスフェクションするかまたは形質導入することができ、そしてその後３Ｔ３の細胞周期のＧ１期の長さは、以下に提供する説明的な実施例のような動力学的細胞周期アッセイで測定することができる。例えば、当該技術分野の熟練者は、Ｍ期からＳ期への細胞の進行が三重水素化チミジンまたはブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の導入を測定する（時間および分で）ことによって測定できることを知っているであろう。サイクリンＥ核酸は、試験細胞中にトランスフェクションされるかまたは形質導入されたとき、Ｍ期からＳ期への細胞のより早い進行を誘導し；または外因性刺激物、即ち血清または成長因子等を必要としないでＭ期からＳ期への細胞の進行を誘導する。どちらの場合にも、主題のサイクリンを試験細胞中に導入するとＧ１期の短縮およびＭ期からＳ期へのより急速な進行をもたらす。
【００２０】
サイクリンＥが結合するＣＤＣタンパク質キナーゼの代表的な例にはＣＤＣ２、ＣＤＣ２８、ＣＤＣＫ２−ＸＬ、ＣＤＣ２−ＨＳおよびＣＤＫ２−ＨＳが含まれる。（この専門用語「ＨＳ」はホモサピエンスを示しそして「ＸＬ」はアフリカツメガエルを示すことに注意されたい。）本発明はまた、サイクリンＥと結合しそしてそれによって活性化される他のＣＤＣキナーゼの同定法およびクローニング法も提供する（以下の実施例１０参照）。当該技術分野の熟練者は、開示されたアミノ酸配列を修正し、そして変化した機能特性、即ち変化したＣＤＣタンパク質キナーゼとの結合、その活性化および／または細胞周期のＧ１期の変化した短縮化能力を試験することによって合成サイクリンＥポリペプチドが容易に構築されることを理解するであろう。このような合成サイクリンＥポリペプチドは、正常若しくは変異サイクリンＥ（即ち、正常若しくは変異細胞に由来する）またはそのＣＤＣタンパク質キナーゼ結合パートナーの有用な競合的および非競合的インヒビターである。このような合成ポリペプチドには、例えば、ａ）ＣＤＣタンパク質キナーゼによって活性化されるホスホリラーゼ活性；ｂ）例えば、ＣＤＣタンパク質キナーゼを活性化させるサイクリンＥの活性；ｃ）サイクリンＥ：細胞分裂キナーゼコンプレックスの細胞周期促進活性；および／またはｄ）サイクリンＥ遺伝子の５’領域と結合する転写制御因子を増加させ、減少させまたはそうでない場合修正し若しくは調節することによって、サイクリンＥ：ＣＤＣタンパク質キナーゼコンプレックスの機能特性を変化させるのに有用なポリペプチドアンタゴニストまたはアゴニストも含まれる。
【００２１】
熟練技術者は更に、組換え体サイクリンＥ核酸、細胞およびインビトロアッセイに関する本明細書の開示は細胞中のサイクリンＥタンパク質またはサイクリンＥ核酸の機能的活性を調節するかまたは完全に変化させる化合物をスクリーニングする機会を提供すると理解するであろう。この文脈で、「調節する」とは、主題化合物が１つまたはそれ以上のサイクリンＥタンパク質または核酸の機能的活性を増加させるかまたは減少させることを意味するように意図するものであり、一方「変化させる」とは、主題化合物がサイクリンＥタンパク質または核酸の機能的活性を別の機能的活性に完全に変化させることを意味するように意図する。この文脈で、サイクリンＥタンパク質の活性を「調節する」化合物の例は、サイクリンＥをＣＤＣキナーゼに結合させた後にＣＤＣキナーゼ活性値を減少させ得るインヒビターであり；そしてサイクリンＥタンパク質の活性を「変化させる」化合物の例はＣＤＫ２の代わりにＣＤＣ２と結合するようにサイクリンＥを誘導する化合物である。
【００２２】
実施例（以下）で説明するスクリーニングアッセイには、生化学的アッセイ（例えば、ＣＤＣ２およびＣＤＫ２ホスホリラーゼ活性に与えるサイクリンＥタンパク質の影響の測定）、および細胞のインビトロアッセイ（例えば、細胞増殖に与えるサイクリンＥ発現の影響の測定）が含まれる。実例的な生化学的アッセイはサイクリンＥ分子活性を調節する化合物をスクリーニングする際に特に有用であると思われ、一方細胞アッセイは細胞内のサイクリンＥ活性を変化させる化合物をスクリーニングする際に特に有用であるとおもわれる。例えば、増殖中の細胞では、サイクリンＥは、環境に対する細胞の増殖応答を制御する際に他のサイクリン、ＣＤＣキナーゼ、成長因子第２メッセンジャー、転写制御因子等と一緒に関与する。当該技術分野の熟練者は、分子結合部位でのリガンドの結合が、間接的な態様で変化する（例えば、遠位の別の（異なる）リガンドと結合した後に誘導される高次構造の変化によって）だけでなく直接的な態様で調節され得る（例えば、部位をブロックすることによって）と理解するであろう。この点に関しては、特定のＣＤＣキナーゼ（または、以下で検討する幾つかの他の細胞制御因子）に対するサイクリンＥの結合部位特異性はサイクリンＥポリペプチドの遠位で結合する物質によって完全に変化させる（例えば、異なるリガンドと結合するように）ことができる。後者の幾つかのアッセイでスクリーニングできる化合物の例には少なくとも１つの核酸（例えば、タンパク質と結合してそれらの機能を変化させるＤＮＡオリゴヌクレオチドアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、タンパク質、炭水化物、レクチン、有機化学品等が含まれる。このようなスクリーニングアッセイは動物およびヒトで有用な医薬品を提供する候補となる治療剤を確認するために有用であると思われる。
【００２３】
更になお、細胞周期でサイクリンＥおよびサイクリンＥ：ＣＤＣタンパク質キナーゼが重要であるため、サイクリンＥまたはサイクリンＥ含有コンプレックスと結合することによってこれらの活性を制御する固有の制御メカニズムが細胞内に存在していると理解されている。このような制御因子には、少なくとも：ａ）コンプレックスと結合しそしてコンプレックスを脱安定化させるかまたは安定化させることによって制御作用を発揮する補因子；ｂ）コンプレックス中で一緒に結合されているようなＣＤＣタンパク質キナーゼおよび／またはサイクリンＥポリペプチドにおいて高次構造の変化を誘導してコンプレックスの活性を調節するかまたは変化させる物質；ｃ）コンプレックスのメンバーの１つまたは両者を不活性化させる酵素；および、ｄ）サイクリンＥまたはサイクリンＥコンプレックスと結合して機能活性を調節するかまたは変化させる細胞制御因子（例えば、シグナル形質導入セカンドメッセンジャー、転写制御因子等）を含めることができる。かくして、このような制御因子の活性を抑制するかまたは促進することによって細胞内のサイクリンＥ：ＣＤＣタンパク質キナーゼコンプレックスの活性を制御するポリペプチドを構築することができる。当該技術分野の熟練者は、サイクリンＥの機能領域が三次元分子モデルおよび模倣化合物、例えば、サイクリンＥとそのＣＤＣタンパク質キナーゼ結合パートナーとの間の三次元的相互作用を模倣するように構築された有機化学品の構成に対して特に魅力ある標的を表わしていると認識するであろう。特に好ましい実施態様では、本発明は、ＣＤＣタンパク質キナーゼと結合するがこれを活性化させない人工的なサイクリンＥポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００２４】
本発明の他の好ましい実施態様では、サイクリンＥヌクレオチド配列の次の領域（即ち、サイクリンＡ、ＢおよびＥの間で保存されている領域）に対応する核酸によってコードされるポリペプチドが提供される：即ち、ａ）カルボキシ末端ロイシン繰り返し配列（即ち、図２に示されるサイクリンＥ  ｃＤＮＡの６４０位から１１８５位の間、そして更に詳細には６３１位から９３６位の間に存在する）；ｂ）ＭＲＡＩＬ配列（即ち、図２に示されるサイクリンＥ  ｃＤＮＡの３８５位から６４５位の間に存在する）；およびｃ）Ｃ末端配列領域（即ち、図２に示されるサイクリンＥ  ｃＤＮＡの１０４８位から１０８０位の間に存在する）。ＭＲＡＩＬ配列は必要であるが、細胞分裂キナーゼと結合するには十分ではない。
【００２５】
更に、突然変異サイクリンＥヌクレオチド配列は図２に示された配列から構築させることができると理解される。主題の突然変異サイクリンＥヌクレオチド配列は、サイクリンＥポリペプチドが非形質転換哺乳動物細胞中のＣＤＣキナーゼに対して示すより高いかまたは低い結合親和性をＣＤＣキナーゼ（例えば、ＣＤＫ２）ポリペプチドに対して有していることができる突然変異サイクリンＥポリペプチドをコードする能力によって認識される。主題の突然変異ポリペプチドはまた、主題の突然変異サイクリンＥポリペプチドとＣＤＫ２がコンプレックス中に一緒に存在しているとき、ＣＤＫ２キナーゼの酵素活性を変化させる（即ち、増加させるかまたは減少させる）こともできる。酵素活性の変化の実例には：ａ）酵素活性（例えば、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、ｋｃａｔ等）の増加または減少；ｂ）コンプレックス中のキナーゼの安定性の変化（例えば、コンプレックスまたは酵素活性の時間依存性の低下）；ｃ）キナーゼのタンパク質分解不活性化を受ける影響の変化；ｄ）サイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスと制御因子（上記した）の結合に応答して該コンプレックスからＣＤＫ２の解離を受ける影響の変化；またはｅ）競合的または非競合的インヒビターに対するコンプレックス中のキナーゼの感受性の変化。熟練した技術者は、図２の配列を変異させ（例えば、化学物質または照射を用いて）、そして変異させたサイクリンＥヌクレオチド配列を含有する細胞のクローンを同定しおよび／または選択する種々の方法を知っているであろう。主題の変異サイクリンＥヌクレオチド配列は細胞内のサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの活性を調節するかまたは変化させるのに有用である。例えば、腫瘍細胞内でＣＤＫ２キナーゼ活性を低下させそして細胞増殖を緩慢化させるかまたは最終的に分化した細胞でＣＤＫ２キナーゼを増加させそして増殖を刺激する。主題の変異サイクリンＥヌクレオチド配列は、実施例９の実例的なレトロウイスルベクターのようなベクターを使用して導入することができる。
【００２６】
人工のサイクリンＥポリペプチド、有機模倣化学品、アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド等は、組織内の継続中の回復有糸分裂活性を抑制しないで、成長因子、マイトジェン、サイトカイン等で誘発される細胞増殖の選択的インヒビターとして広範な有用性が見い出されている。かくして、本発明の合成ペプチド、模倣物およびアンチセンス実施態様は種々の抑制活性を望ましくは示すと考えられよう；例えば、主題インヒビターを２つの細胞（１つはサイトカインで誘発されて増殖し、そして第２のものは有糸分裂している）に導入するとき、最初の細胞は抑制されるが２番目の細胞は抑制されない。本発明の主題の合成サイクリンＥポリペプチドは、Ｇ１期からＳ期に移行している細胞を抑制するだけで、既に有効に有糸分裂しているような細胞は抑制しない。かくして、当該技術分野の熟練者は、有用性の代表的な例には免疫応答の誘導の抑制；継続中の免疫応答のクローン増大（即ち、ＴかまたはＢリンパ球のどちらか）の中断；Ｇ１期からＳ期に移行しつつある腫瘍細胞または転移細胞の成長因子で誘導される増殖の抑制；そして成長因子で誘導される組織肥大（例えば、アテローム性動脈硬化症プラークにおけるような血管平滑筋細胞の増殖、リウマチ性関節におけるような線維芽細胞や結合組織細胞の間葉肥大等の抑制）が含まれることを知っているであろう。主題の選択的インヒビターは、例えば、ａ）インビトロの試験細胞中のサイクリンＥポリペプチドまたはｍＲＮＡの値を減少させる（または増加させる）（即ち、向じタイプの対照細胞と比べて）；ｂ）ＣＤＫ２とコンプレ
ックスを形成することができるサイクリンＥの値を減少させる（または増加させる）；またはｃ）哺乳動物細胞中の細胞周期依存性キナーゼのＣＤＫ２属のメンバーに対するサイクリンＥポリペプチドの結合親和性を減少させる（または増加させる）能力によって都合良く認識される。熟練した技術者は、主題の選択的インヒビターの活性の低下（または上昇）の測定は非同調または同調細胞培養物を使用して達成することができる；例えば、細胞の同調培養物では、サイクリンＥ値および活性は細胞周期のＧ１期中に試験される。
【００２７】
本発明の特徴には、哺乳動物細胞用のウイルスベクター（例えば、実施例９に示したものと類似するレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ＣＭＶ等）のような組換え体発現ベクター、並びに核酸を原核細胞および真核細胞にトランスフェクションしそして形質導入するのに有用なプラスミドまたはコスミドベクターが含まれる。本発明の組換え体発現ベクターは例えばサイクリンＥ核酸を適当な対照配列に操作して結合させることによって構築させる。操作的に結合するとは本明細書では、好ましくは、発現ベクター内の対照配列（即ち、サイクリンＥ遺伝子の発現、過剰発現および構成発現を行い得る制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、オペレーター配列等を有している）が現す予め定められた陽性（または陰性）の制御対照下でサイクリンＥの転写および翻訳に適する方法でサイクリンＥ核酸を発現ベクター核酸に結合させることを意味するように使用される。選択可能なマーカーは一般的には発現ベクターに含まれている。このような選択可能なマーカーの代表的な例には酵素、抗原、医薬品耐性マーカーまたは細胞の増殖要件を充足させるマーカーが含まれる。或る種の細胞では、サイクリンＥ核酸によるトランスフェクションまたは形質導入が選択可能なマーカーの１つのタイプとして働く選択的増殖／成長の利益を提供する（例えば、以下の実施例に記載した代表的な酵母株「５９８−５」または「１２３８−１４Ｃ」のような、細胞周期の進行を停止された変異株において）ことも評価されよう。主題の発現ベクターはサイクリンＥポリペプチド、突然変異サイクリンＥポリペプチド、およびアンチセンス核酸を生じさせるために細胞をトランスフェクションしそして形質転換するのに有用である。例えば、本発明の特徴には、ＣＤＣタンパク質キナーゼを活性化しそしてＧ１期からＳ期までの制限点の細胞周期を進行させ得るポリペプチドを生じさせるために、トランスフェクションされそして形質導入された細胞を使用する方法が含まれる。サイクリンＥ核酸によってコードされたポリペプチドが細胞周期を進行させ得ることを測定するために幾つかの方法が利用可能である。酵母細胞および哺乳動物細胞に係わる代表的な例は以下の実施例に記載する。
【００２８】
本発明はまた、サイクリン（例えば、サイクリンＥ）発現ベクターを用いて形質導入するかまたはトランスフェクションされている細胞タイプも提供する。１つの好ましい実施態様では、サイクリンＥを構成的に過剰発現する細胞はその親細胞より速い速度で増殖する。下記実施例１４で説明した、サイクリンＥを形質導入したヒト二倍体線維芽細胞は対照の形質導入細胞または正常細胞より長さおよび幅が２０〜５０％小さかった。熟練した技術者は小さい急速に増殖している細胞、例えば、費用効率的な態様で増殖させることができそしてプログラムされた老化現象をそれらの正常な対応物より速く受けると思われる細胞の遺伝子治療での利点を理解するであろう。遺伝子変換動物（例えば、実験動物および家畜動物）はこのような小さい急速に増殖する細胞から構築させることができるということも理解されよう。熟練した技術者は、主題細胞によって提供される利点には、ａ）通常は培養することが困難であるかまたは不可能である最終的に分化された細胞タイプ（例えば、幹細胞）の組織培養物の増殖の改善；およびｂ）細胞増殖用（例えば、筋肉または神経細胞のようなインビトロでは増殖することが困難である細胞用）の成長因子に対する依存性の低下（または非依存性）が含まれ、低血清（または血清不含）培地中で哺乳動物細胞の培養物（例えば、生物療法剤を製造する細胞の産生培養物）をより急速に増殖させることができることも理解するであろう。本明細書での開示は、幾つかの決定点の各々で細胞周期の進行を測定する際にサイクリンの並々ならぬ重要性を確認する。用語「決定点」とは、細胞周期を進行させるために適当なシグナルを受け取るときまで細胞がその増殖を停止すると思われる細胞周期中の点を意味すると当該技術分野では良く理解されている。下記実施例１４に表わした結果は、細胞周期のＧ１期内の決定点で潜在的なＣＤＫ２キナーゼ活性を活性化させる際のサイクリンＥの重要性を示すものである。幾つかの決定点が細胞周期の種々の期に存在する。本明細書の開示は、少数のサイクリン、即ち１つのサイクリンを細胞周期で操作して各決定点で細胞周期を進行させることができる。かくして、細胞内で比較的少数のサイクリンを過剰発現させると、細胞を外来性成長因子にほぼ完全に非依存性とするのに十分であると思われる。
【００２９】
他の実施態様では、本発明は、サイクリンＥポリペプチドと特異的に結合できるポリクローナルおよびモノクローナル抗体分子のようなサイクリンＥポリペプチドの免疫学的結合パートナー並びにそれらの種々の抗原結合フラグメントを提供する。このような免疫学的結合パートナーはハイブリドーマまたはｒＤＮＡ発現技術によって生成させることができそして治療、精製および診断適用での有用性が見い出されている。治療適用には、サイクリンＥとそのＣＤＣタンパク質キナーゼの結合を抑制する結合パートナー；ＣＤＣタンパク質キナーゼを調節する結合パートナー；および細胞内でサイクリンＥの制御調節を変化させる結合パートナーが含まれる。精製適用の代表的な例には免疫化学法および免疫アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。診断適用の代表的な例には酵素結合および放射性同位元素イムノアッセイ、免疫蛍光法、蛍光イムノアッセイ、時間解析蛍光イムノアッセイ等が含まれる。これらのアッセイに使用された特異的な結合パートナーは遊離サイクリンＥポリペプチドと、ＣＤＣタンパク質キナーゼとのコンプレックスで結合したサイクリンＥとを区別することができると思われる。当該技術分野の熟練者は、高次構造が変化したポリペプチドによって「ネオ」（新規）抗原が獲得されることを知っており、そして更にはサイクリンＥとＣＤＣタンパク質キナーゼとの間の結合が両ポリペプチドでのこのような高次構造の変化を誘導することも認識しているであろう。サイクリンＥに特異的な結合パートナーは、腫瘍細胞のような細胞で遊離サイクリンＥ（またはコンプレックス会合サイクリンＥ）の値（例えば、タンパク質または抗原）および機能活性（例えば、ホスホリラーゼキナーゼ活性化）を検出しそして定量する診断アッセイで一般的に有用であることが見い出されている。主題の診断アッセイには、ａ）非同調細胞集団（例えば、腫瘍剖検標本）でのサイクリンＥの絶対的な値および活性を検出し；ｂ）同調細胞集団（例えば、チミジン停止によって同調された細胞集団）の細胞周期の種々の期のサイクリンＥの値および活性を比較し；そしてｃ）生物学的液体（即ち、血液、血清、血漿、粘液分泌物、ＣＮＳ液体、細胞抽出物等）中のサイクリンＥの値および活性を測定するためのアッセイが含まれる。悪性の生物学的液体（例えば、腫瘍細胞抽出物、癌患者の血清等）に発現されるサイクリンＥの絶対的な値および活性並びに細胞周期の種々の期で調製された細胞抽出物に発現される値および活性は、細胞増殖速度に関する情報を提供することができる。この点に関して、アッセイされたサイクリンＥの値および活性は、
ａ）分化した細胞は形質転換した細胞より緩慢に増殖し；形質転換した細胞より低いサイクリンＥタンパク質値および活性値を示し；そして（形質転換した細胞とは対照的に）分化した細胞は細胞周期のＧ１期にだけサイクリンＥを発現するので、腫瘍を段階化させ；
ｂ）転移可能な急速に増殖している悪性細胞は一般的に分化した細胞より速く増殖し；指数的に増殖する細胞はより高い絶対的な値（または活性）のサイクリンＥを発現するか、或いはより高い値（活性）のサイクリンＥが細胞周期の特定の期、例えばＳ、Ｇ１またはＧ２期に存在することができるので、予後を決定し、即ち、患者の生存性および腫瘍の再発時間を予測し；そして／または
ｃ）より緩慢に増殖している細胞はより低い値（または活性）のサイクリンＥを発現することができ（即ち、急速に増殖している転移細胞より）そして更にはそれほど徹底的でなく且つより長期間の治療規制に対して一層応答性でもあるので、療法、即ち特定の治療規制の成功を予測する、
ための診断マーカーとして役立てることができる。
【００３０】
細胞中のサイクリンＥの値（または活性）を測定する主題アッセイは、細胞周期のＧ１期の細胞に影響を与える特定の治療用薬剤に対する患者の腫瘍の応答性も示唆することができる。当該技術分野の熟練者は、主題の診断アッセイが、腫瘍を段階化させる方法、適当な治療規制を選択する方法、療法の成功を評価する方法および患者の危険性または生存性を評価する方法を決定する際に開業医に有用である可能性がある。
【００３１】
他の実施態様では、本発明は非同調細胞でのサイクリンＥ：ＣＤＫ２ポリペプチドコンプレックスの絶対的な値（または機能活性）および細胞周期の種々の段階でのサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの値（または活性）を測定する診断アッセイを提供する。非形質転換細胞では、サイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスのピーク量は細胞周期のＧ１後期に生じ、例えば細胞周期の他の期より４倍から６倍高い値である。形質転換細胞では、サイクリンＥおよび／またはＣＤＫ２の構成の過剰発現によって、細胞周期のＧ１、Ｇ２、ＭおよびＳ期で種々に検出され得るサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの値と相違するようになる。細胞中のサイクリンＥ／ＣＤＫ２コンプレックスの値を測定する主題のアッセイは患者の悪性細胞を、例えば上記したようにして、評価するのに有用であると思われる。
【００３２】
他の実施態様では、本発明は細胞内のサイクリンＥおよびＣＤＫ２の染色体転移を測定する診断アッセイを提供する。サイクリンＥおよびＣＤＫ２遺伝子の染色体位置はオリゴヌクレオチドプローブまたはｃＤＮＡ等とのその場でのハイブリッド形成により染色体塗抹標本で都合良く測定される。サイクリンＥ遺伝子またはＣＤＫ２の転移、即ち正常細胞で見られる染色体位置から形質転換細胞で見られる位置への転移は、サイクリン、例えばサイクリンＥかまたはＣＤＣキナーゼ、例えばＣＤＫ２かのどちらかの遺伝子発現の正常な転写調節制御を除くことによって、制御されていない細胞増殖の表現型に寄与することができる。本明細書で開示された所見は、多数の成長因子に由来する第２のメッセンジャーシグナルが少数の異なるサイクリン：ＣＤＣキナーゼコンプレックスに集中する、これまでに認識されていない共通の結合点を示唆している。第２のメッセンジャーとサイクリン：ＣＤＣキナーゼコンプレックスの分子相互作用の結果は、細胞が細胞周期を進行させるかどうかを決定する。かくして、細胞内でのサイクリン遺伝子の転移は劇的な結末を有する。転移が過剰発現を誘導する場合には、細胞は悪性（即ち、制御されていない）の増殖表現型を獲得することができ、そして転移が過少発現を誘導する場合には、細胞は早期老化を受けると思われる。個人からの細胞試料のサイクリンＥまたはＣＤＫ２染色体転移可能性をスクリーニングすると癌を発生させる可能性の相対的な危険因子を示唆することができる。このような転移が検出された場合には、転移した染色体位置のサイクリン遺伝子（例えば、サイクリンＥ）またはＣＤＣキナーゼ遺伝子（例えば、ＣＤＫ２）の正常な制御を回復させると、形質転換細胞の悪性表現型を逆転させることができる。例えば、サイクリンＥ遺伝子（ＣＤＫ２遺伝子の）およびその制御因子は、転移遺伝子を、例えばその場に向けられた組み換え／突然変異または標的化した統合を使用して転移遺伝子を中断させて、不活性化させるように設計した遺伝子療法ベクターの標的として役立てることができる。
【００３３】
本発明はまた、細胞周期の進行に必要なｃｌｎ１、ｃｌｎ２およびｃｌｎ３遺伝子を欠いているがＣＬＮ３をコードし得るエピソーム核酸を有しているゲノムを含有するように操作される酵母細胞の突然変異株も提供する。代表的な実施態様は酵母株「５８９−５」であり、これは哺乳動物サイクリン遺伝子を確認するために有用である。株「５８９−５」は、受理番号７４０９８でメリーランド州ロックビルの米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）に寄託されている。サイクリンＥ核酸をこの株の突然変異酵母細胞に導入するとき、細胞はスタートから細胞周期を経由してＳ期に進行する。他のものは以前に、酵母ｃｄｃ遺伝子を同定しそしてクローン化するには幾分類似する突然変異酵母の構成が有用であることを示しているが、哺乳動物のサイクリンＥ  ｃＤＮＡを同定しそしてクローン化するためには、そしてまた哺乳動物のｃｄｃタンパク質キナーゼｃＤＮＡｓを同定しそしてクローン化するためにも主題の株が有用である。
【００３４】
本発明は、ｃｄｃ２８−１３遺伝子、調節プロモーター（例えばＧＡＬ）の制御下の内在性Ｇ１  ＣＬＮ（例えばＣＬＮ３）、有糸分裂ＣＬＢサイクリン（例えばＣＢＣ）およびサイクリンＥ遺伝子を有する酵母細胞の他の突然変異株、例えば代表的な酵母株「１２３８−１４  Ｃ−サイクリンＥ」も提供する。この場合に、調節プロモーターは、代謝または増殖に必要な因子（「調節」）の存在下でＧ１サイクリンを発現させる。次に、Ｇ１サイクリンはｃｄｃ２８−１３遺伝子によってコードされる細胞分裂キナーゼと結合してそれを活性化させ、そしてＣＤＫの活性化は細胞が増殖しそして継代することを可能にする。株「１２３８−１４  Ｃ−サイクリンＥ」は、受理番号７４０９９でメリーランド州ロックビルの米国菌培養物収集所（Ａｍｅｆｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）に寄託されている。細胞周期は、ｃｄｃタンパク質キナーゼ核酸が導入されるまで停止される。かくして、突然変異細胞のこの株は、真核宿主細胞中でサイクリンＥと会合しそして細胞周期をＧ１期からＳ期に進行させるｃｄｃタンパク質キナーゼを同定しそしてクローニングするのに有用である。
【００３５】
本発明はまた、サイクリンＥ：ＣＤＣタンパク質キナーゼコンプレックスと結合しそして該コンプレックスの活性を抑制するか若しくは促進するかまたは該コンプレックスの半減期を変える等を行うポリペプチドのような制御剤をクローニングする方法も提供する。このような制御剤をコードする核酸は候補核酸分子を酵母細胞、または哺乳動物細胞の突然変異株に導入することによって同定され、その際細胞のＧ１からＳ期への進行は、サイクリンＥ：ＣＤＣタンパク質キナーゼの活性に依存する。この態様で有用な突然変異酵母株の代表的な例は、下記実施例で更に詳細に記載されている株ＨＵ４のような、サイクリンＥ遺伝子でトランスフェクションされるか形質導入された株５９８−５によって提供される。制御剤をコードする核酸は、Ｇ１からＳ期の細胞の進行を阻止する能力が知られている。かくして、記載した突然変異酵母株の場合には、任意の候補ｃＤＮＡでトランスフェクションまたは形質導入された後に、スタート点で細胞周期を進行し得ない細胞、例えば哺乳動物、昆虫、鳥類、爬虫類、両生類のクローンを同定するために、重複スクリーニング技術を使用することができる。
【実施例】
【００３６】
以下に記載するデータは、サイクリンＥがＳ．セレビシエＣＬＮ遺伝子にとって代わり、そしてＣＤＣ２８と相互作用してスタートを実施することを示している。ヒトＣＤＣ２遺伝子属の少なくとも２つの異なるメンバーがサイクリンＥと相互作用して発芽酵母、ＣＤＣ２−ＨＳおよびＣＤＫ２−ＨＳ内でスタートを制御することができよう。我々は、サイクリンＥタンパク質がヒトリンパ球Ｇ１細胞から得られる抽出物でｐ３４ＣＤＣ２タンパク質と結合してそれを活性化したことおよびサイクリンＥがＨｅＬａ細胞内でＨＩキナーゼ活性と関係していることも示した。他の者はサイクリンＥ  ｍＲＮＡがＨｅＬａの細胞周期のＧ１後期中に特異的に存在していたことを見い出した（Ｌｅｗ等、１９９１年）。これらの結果を合わせると、サイクリンＥがヒトの細胞周期のＧ１期からＳ期への移行でｐ３４  ＣＤＣ２キナーゼの制御因子として機能することができる。
【００３７】
サイクリンＥがトリプルｃｌｎ欠失を救ったとの本発明者の結果に関する解釈は、有糸分裂サイクリンであるヒトサイクリンＢも酵母ＣＬＮ遺伝子を代替するという事実によって複雑になった。サイクリンＢがＣＬＮタンパク質として機能するメカニズムに関係なく、サイクリンＢがこの役割を果たしたという事実によって、我々の相補性アッセイがＣＬＮタイプのサイクリンを特異的に同定したわけではなかったことが暗示された。それ故、サイクリンＥの機能を更に完全に理解するためには、正常なヒト細胞の細胞周期中のサイクリンＥタンパク質の発生量の分析およびＣＤＣ２またはＣＤＣ２関連タンパク質と該タンパク質の会合の分析を待たなければならない。
【００３８】
酵母、そして多分大部分の生物では、ＣＤＣ２タンパク質は細胞周期中少なくとも２回；Ｇ１／Ｓ期、そして更にはＧ２／Ｍ期でも機能する。各時点で、ＣＤＣ２タンパク質は特有のタイプのサイクリン：Ｇ２ＭではＢタイプのサイクリンそしてＧ１／ＳではＣＬＮｓ（少なくとも発芽酵母で）と会合する。それ故、各制御点で集合した特有のサイクリン−ＣＤＣ２コンプレックスはＣＤＣ２キナーゼに必要な特異性を付与してＳ期かまたは有糸分裂を活性化するであろうと期待されていた。例えば、ＣＤＣ２キナーゼの基質特異性または細胞内局在化はその特別のサイクリンパートナーによって決定されよう。ヒトサイクリンＢがＣＬＮタンパク質を代替する能力は、この単純な仮説とは反対に、表面に見られる。或いは、細胞周期の種々の時点でのｐ３４  ＣＤＣ２の作用の特異性は、少なくとも１部、ＣＤＣ２タンパク質それ自体によって測定することができよう。これはＣＤＣ２タンパク質の細胞周期特異性修正による（ＳｉｍａｎｉｓおよびＮｕｒｓｅ、１９８６年；Ｌｅｅ等、１９９８年；ＧｏｕｌｄおよびＮｕｒｓｅ、１９８９年；ＫｒｅｋおよびＮｉｇｇ、１９９１年）かまたは、高等真核細胞では、細胞周期の種々の時点でのＣＤＣ２遺伝子属の種々のメンバーの活性化による（Ｐａｒｉｓ等、１９９１年；ＰｉｎｅｓおよびＨｕｎｔｅｒ、１９９０年）ものであろう。ＣＤＣ２遺伝子属の少なくとも２つの異なるメンバーが酵母内でスタートを実施することができるという本発明者の観察はこの考え方と一致する。このモデルでは、サイクリンタンパク質の周期的な蓄積と破壊によってｐ３４キナーゼ活性化のタイミングは決定されるがその特異性は決定されないであろう。これに類似するモデルは、Ｓ．ポンベでの或る種のｃｄｃ２変異体の表現型に基づいて以前に提案されたことがある（Ｂｆｏｃｋ等、１９８１年）。代替法としては、ＳまたはＭ期を誘導するためにＣＤＣ２またはＣＤＣ２８に必要な特別の基質が細胞周期に依存する態様で利用可能になることである。しかし乍ら、本発明者は、本発明者の実験の設計ではサイクリン特異性に関する全ての正常な対照が観察されるようにはできないことを指摘する。例えば、強力なＡＤＨプロモーターによるヒトサイクリンＢの発現は、通常はサイクリンＢ−ＣＤＣ２８の活性をＧ２／Ｍ移行に限定する或る種の制御過程を圧倒していたと思われる。
【００３９】
ヒトサイクリンＥは発芽酵母ＣＬＮタンパク質よりヒトサイクリンＡおよびＢに密接に関連している。サイクリンのボックス内では、ＣＬＮ１に対する同一性の値は２１％でありＣＬＮ３に対しては１７％である。これはヒトサイクリンＡに対する４９％の同一性およびヒトサイクリンＢに対する４４％に匹敵する。サイクリンのボックス領域外では、サイクリンＥはヒトサイクリンまたは酵母ＣＬＮタンパク質のどちらとも広範な相同性を全く示さない。このことに基づくと、サイクリンＥは酵母ＣＬＮ遺伝子の直接的な相同体であるようには思われない。しかし乍ら、これらの機能的差異を決定する種々のサイクリン内の正確な領域は確認されていないので、上記の比較は注意して行わなければならない。更に、ヒトサイクリン間の類似性は、或る程度まで、ヒトＣＤＣ２タンパク質のような通常の標的との同時進化を反映すると思われる。
【００４０】
サイクリンＥ配列の他の２つの特徴に注目すべきである。本発明者のサイクリンＥのクローンはサイクリンＡとＢの両方で見られるＮ末端配列を欠いており、これは有糸分裂での破壊を仲介するユビキチン化酵素の認識主要素であると考えられる（Ｇｌｏｔｚｅｒ等、１９９１年）。更に、サイクリンＡおよびＢと比較するとき、サイクリンＥはＣ末端伸長を有している。このＣ末端領域は塩基性残基が側面にあり、そしてＰ（Ｐｒｏ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｓ（Ｓｅｒ）およびＴ（Ｔｈｒ）残基に富んでいる。このような「ＰＥＳＴ」領域はタンパク質転換の制御に係わっていた（Ｒｏｇｅｒｓ等、１９８６年〕。実際、酵母ＣＬＮタンパク質の安定性は、Ｐ、Ｅ、Ｓおよび丁残基に富むＣ末端領域によって決定することができる（Ｎａｓｈ等、１９８８年；Ｃｒｏｓｓ、１９９０年；Ｈａｄｗｉｇｅｒ等、１９８９年）。これらの観察は、細胞周期中のサイクリンＥの安定性が有糸分裂サイクリンとは異なって制御され得ることを示唆している。
【００４１】
高等真核生物では、細胞周期のＧ１期進行中のＣＤＣ２タンパク質の役割はあまり良くは理解されていない。多数の独立した観察は、ＣＤＣ２タンパク質が細胞周期の上記部分に必須の機能を有していることを示唆している。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して（Ｆｕｒｕｋａｗａ等、１９９０年）ヒト細胞内のインビボで、または免疫沈降法によって（ＢｌｏｗおよびＮｕｒｓｅ、１９９０年）ツメガエル抽出物内のインビトロでＣＤＣ２タンパク質を枯渇させると、ＤＮＡ合成の開始を阻止することができる。ヒトＳ期細胞から得られるサイクリン−ＣＤＣ２コンプレックスをＧＩ細胞から得られる抽出物に添加するとＤＮＡ合成を活性化することができる（Ｄ’Ｕｒｓｏ等、１９９０年）。しかし乍ら、ネズミＣＤＣ２遺伝子り熱不安定性の突然変異は、非許容温度では有糸分裂への進入は阻止するがＳ期への進入は阻止しない（Ｔｈ’ｎｇ等、１９９０年）。更に、酵
母ＣＤＣ２タンパク質の抗体をヒト細胞へ顕微鏡下注射すると、Ｇ２／Ｍ移行を阻止するが、Ｇ１／Ｓ移行は阻止しない（Ｒｉａｂｏｗｏｌ等、１９８９年）。ＣＤＣ２遺伝子属の少なくとも２つの異なるメンバーがＳ．セレビシエでＧ１／Ｓ移行を制御するという我々の観察はこれらの明らかに矛盾する結果を説明するのに役立つと思われる。これらの１つのヒトＣＤＫ２遺伝子はＧ２／Ｍ期と対照させたときＧ１／Ｓ期で優先的に作用することができよう。それ故、高等真核生物では、酵母での状況とは対照的に、ＣＤＣ２遺伝子属の多数のメンバーがＧ１／Ｓ制御に寄与することができる。或る状況下では、それらの役割は余分のものであり、一方他の状況下ではそれらは全て必須であると思われよう。
【００４２】
Ｇ１からＳの間でのＣＤＣ２キナーゼの活性化はサイクリンとの会合を必要とすると思われる。Ｓ．セレビシエではＣＬＮタイプのサイクリンの蓄積がスタートから移行する速度を限定する段階である（Ｎａｓｈ等、１９８８年；Ｃｒｏｓｓ脇、１９８８年；Ｈａｄｗｉｇｅｒ等、１９８９年）。ヒト細胞では、Ｓ期の開始時のｐ３４キナーゼの活性化は該キナーゼの高分子量コンプレックスヘの集合と関係があり（Ｄ’Ｕｒｓｏ等、１９９０年；Ｍａｒｒａｃｃｉｎｏ等、未発表データ）、ｐ３４とサイクリンタンパク質との会合が細胞周期のこの部分でのｐ３４の活性を制御することを暗示している。本発明者はまた、ＳＶ４０  ＤＮＡ複製を活性化するためには、精製された組換え体二枚貝サイクリンＡをヒトＧ１細胞抽出物に添加することで十分であったことも見い出した。これはサイクリンの蓄積がＳ期の開始時にｐ３４キナーゼの活性化を限定する段階であることを示唆していた。
【００４３】
少なくとも４つの異なるヒトサイクリンは細胞周期のＧ１期またはＳ期で役割を果たすことが示唆されていた。これらにはサイクリンＡ（Ｇｉｏｒｄａｎｏ等、１９８９年；Ｗａｎｇ等、１９９０年）、Ｃ（Ｌｅｗ等、１９９１年〕、Ｄ（またはｐｒａｄｌ；Ｍｏｔｏｋｕｒａ等、１９９１年；Ｘｉｏｎｇ等、１９９１年；Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｉ等、１９９１年）およびＥ（本開示；Ｌｅｗ等、１９９１年）が含まれる。酵母では、ヒトサイクリンＥはＣＤＣ２−ＨＳかまたはＣＤＫ２−ＨＳのどちらかと会合してスタートを行うことができる。インビトロでサイクリンＥはＣＤＣ２−ＨＳと結合してそれを活性化することができるが、Ｇ１細胞のＣＤＫ２を活性化する能力は未だ試験されていない。ヒトサイクリンＡもＣＤＣ２遺伝子属の２つの異なるメンバー、ＣＤＣ２−ＨＳおよびＣＤＫ２であると思われる３３ｋＤａのタンパク質と会合することが見い出されている（Ｇｉｏｒｄａｎｏ等、１９８９年；ＰｉｎｅｓおよびＨｕｎｔｅｒ、１９９０年；Ｒ．ＭａｒｒａｃｃｉｎｏおよびＪ．Ｒ．、未発表所見〕。対照的に有糸分裂サイクリンＢはｐ３４ＣＤＣ２とだけ会合して見い出されている（Ｈｕｎｔ、１９８９年参照）。
【００４４】
Ｇ１制御に寄与する細胞内および細胞外シグナルの多様な配列を伝達するためには多数のサイクリンとＣＤＣ２−様タンパク質が必要であると思われる。ＣＤＣ２タンパク質属の種々のメンバーが特別のサイクリンと優先的に相互作用すると思われる（ＰｉｎｅｓおよびＨｕｎｔｅｆ、１９９０年〕。更に、各サイクリン−ＣＤＣ２コンプレックスはスタートが生起するために必要な部分的な事象しか遂行しない。最後に、タンパク質のＣＤＣ２属がＧ１期の１つ以上の点で機能することが考えられる。酵母でのスタート決定は細胞周期のＧ１期でのＣＤＣ２８の唯一の明確に特定された実行点である。スタートは高等真核生物の細胞周期の制限点と一定の類似性を有しているが、制限点はＳ期が開始する何時間も前に生起することができる。本発明者のインビトロでの複製実験は、ＣＤＣ２キナーゼがＤＮＡ合成を直接活性化できることを示唆している（Ｄ’Ｕｒｓｏ等、１９９０年）。それ故、ＣＤＣ２または関連タンパク質はＧ１期で２回、最初は細胞増殖と同時点でそしてＤＮＡ合成の開始時に再度、機能すると思われる。各制御点ではサイクリンタンパク質の固有の組が必要であると思われる；例えば、ＣＬＮタイプのサイクリンは制限点で機能しそして他のサイクリン、例えばサイクリンＥはＧ１／Ｓ移行で作用することができよう。
【００４５】
（実施例１：ＣＬＮ１、−２および−３を欠く酵母株とヒトｃＤＮＡライブラリーの相補性）
本発明者の最初の目標は、酵母ＣＬＮタンパク質を代替し得るタンパク質をコードするヒトｃＤＮＡを同定することであった。酵母株、５８９−５が構築されたが、その際３つの染色体ＣＬＮ遺伝子は全て欠失されておりそしてエピソームのＧＡＬ１プロモーターの制御下でＣＬＮ３遺伝子を含有していた。ＣＬＮタンパク質はスタートを通過するのに必要であるので，この株はＧＡＬＩプロモーターが誘導されるガラクトースで増殖し；この株をグルコースで増殖させるとき、ＧＡＬ１プロモーターは抑制され、ＣＬＮａタンパク質は製造されず、そして細胞はスタートで抑止する（Ｃｒｏｓｓ、１９９０年）。ｃＤＮＡライブラリー（ＣｏｌｉｃｅｌｌｉおよびＭ．Ｗｉｇｌｅｒの寄贈品）は、ヒト膠芽腫細胞株Ｕ１１８から調製されたｍＲＮＡを使用して、ヒトｃＤＮＡｓの発現用の構成酵母ＡＤＨプロモーターを含有するＳ．セレビシエベクター内で構築させた（Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ等、１９８９年）。このライブラリーを株５８９−５にトランスフェクションさせ、そして１０５個の独立形質転換体は、レプリカ培養によって、それらのグルコースでの増殖可能性についてスクリーニングした。１つの形質転換体、ＨＵ４を単離し、その際ＨＵ４のグルコースでの増殖はヒトｃＤＮＡの発現に依存していた（図１）。更なる実験の詳細については添付した材料および方法の項を参照のこと。
【００４６】
（実施例２：ＨＵ４はサイクリンタンパク質属の新しいメンバーをコードする）
１．７ｋｂのＨＵ４  ｃＤＮＡのＤＮＡ配列は図２に示し、そしてこの配列の、ヒトサイクリンＡおよびＢに対するタンパク質値の相同性は図３に示す。このＤＮＡ配列によって、３９５個のアミノ酸および４５，１２０ダルトンの分子量を有するタンパク質が予測される。ＨＵ４ｃＤＮＡのインビトロ転写／翻訳によって予測された分子量を有するタンパク質が産生される（図８参照）。既知のサイクリンは全て、約８７個のアミノ酸の高度に保存された中心領域を有している。ＨＵ４はこの領域内で、ヒトサイクリンＡに対して４９％の同一性であり、そしてヒトサイクリンＢに対して４４％の同一性である。このことに基づいて、本発明者はＨＵ４タンパク質をサイクリン属の範囲内に入れた。この保存された領域のＮ末端のサイクリンＡとの相同性は５％の同一性になり、そしてサイクリンＢに対しては４％の同一性になる。この領域のＣ末端のサイクリンＡとの同一性は１４％であり、そしてサイクリンＢとの同一性は１０％である。保存された中心領域のＮ末端およびＣ末端の両方での相同性のこの低い値は、ＨＵ４が新しいクラスのサイクリンタンパク質を表わしていることを示唆しており、そして本発明者はこのクラスをサイクリンＥと命名した。本発明者は、オープン読み取り枠が配列決定されたｃＤＮＡの５’末端にまで伸びているので、本発明者のサイクリンＥ  ｃＤＮＡクローンがサイクリンＥタンパク質全体をコードする配列を有していることを確かめることはできない。しかし乍ら、ＭＡＮＣＡ細胞ライブラリーから得られたサイクリンＥ  ｃＤＮＡクローンは本明細書で記載したものと同一の５’末端を示した。
【００４７】
（実施例３：ヒトサイクリンＢはトリプルｃｌｎ欠失を相補う）
本発明者は、ヒトサイクリンＡ、ＢおよびＥ  ｃＤＮＡが株５８９−５内でのトリプルｃｌｎ欠失を相補う能力を比較した。ヒトサイクリンＡ（ＰｉｎｅｓおよびＨｕｎｔｅｒ，１９９０年）およびＢ１（ＰｉｎｅｓおよびＨｕｎｔｅｒ、１９８９年）をコードする完全な長さのｃＤＮＡは、上記したライブラリーの構築に使用されたＡＤＨ発現ベクターにクローン化させた。種々のサイクリンＥ発現プラスミドはロイシン原栄養株性について選択することによって酵母内にトランスフェクションさせた。形質転換体を取り、そしてＣＬＮタンパク質の欠如を相補うヒトサイクリンの能力はグルコースでの増殖によって試験した。サイクリンＡベクターを使用してもロイシン原栄養株は得られず、Ｓ．セレビシエ内での完全な長さのヒトサイクリンＡの発現が致死的であることを示唆している。図４は、サイクリンＢかまたはＥ発現プラスミドのどちらかを含有しているとき、グルコース対ガラクトースでの５８９−５の相対的平板効率を表わす。驚いたことには、有糸分裂サイクリンＢはＣＬＮタンパク質の欠如を相補った。この実験は、ＣＬＮ機能の相補性がＣＬＮタイプのサイクリンに限定されないことを証明した。
【００４８】
（実施例４：サイクリンＥとＣＤＣ２８の間の相互作用）
本発明者は、容認される３０℃の温度で、ＣＤＣ２８かまたはｃｄｃ２Ｈ３対立遺伝子のどちらかを含有する同系遺伝子型株におけるトリプル６ｈ欠失をサイクリンＥが助ける能力を比較した。図４は、サイクリンＥがｃｄｃ２８−１３の背景ではＣＬＮタンパク質を有意には殆ど代替しないことを示している。サイクリンＥとＣＤＣ２８遺伝子との間のこの遺伝的相互作用は、サイクリンＥタンパク質がＣＤＣ２９タンパク質との相互作用によってその機能を果たすことを示唆していた。サイクリンＣはｃｄｃ２８−１３対ＣＤＣ２８株でほぼ同じように有効であり、サイクリンＢがサイクリンＥとは異なってＣＤＣ２８と相互作用するであろうと示唆していた。
【００４９】
（実施例５：ヒトサイクリンＥとヒトＣＤＣ２はＳ．セレビシエでスタートを実施することができる）
ｃｄｃ２８−１３と内在性Ｇ１（ＣＬＮ）を含有する株および有糸分裂（ＣＬＢ）サイクリンは３０℃で生存可能である。それ故、ｃｄｃ２８−１３タンパク質は両タイプのサイクリンと機能的に相互作用できるはずである。上記したように、ＣＬＮ遺伝子の代わりにサイクリンＥを有するｃｄｃ２８−１３株は３０℃では増殖しなかった。本発明者は、多分、ｃｄｃ２８−１３突然変異がサイクリンＥと生産的に相互作用する能力を消失させたので、この株はＣＤＣ２８タンパク質のスタート機能を特異的に欠いており、そしてそのＧ２／Ｍ役割は欠いていないと推測した。サイクリンＥ−ｃｄｃ２８−１３株のこれらの特徴は図５に示す。本発明者はこの株を、サイクリンＥと相互作用してスタートを実施させ得るヒト遺伝子をスクリーニングする宿主として使用した。ヒト遺伝子がＣＤＣ２８を完全に代替することを要求するスクリーニングとは異なって、このスクリーニングはヒト遺伝子がＧ２／Ｍ期で機能することを要求しなくても良い。本発明者はこの株を上記したヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーでトランスフェクションさせ、そして１０５個の独立コロニーをそれらがグルコースで増殖する能力について試験した。本発明者は、両ヒトｃＤＮＡ８（サイクリンＥおよび新しいサイクリン）の発現に依存して増殖する５つの酵母クローンを同定した（図６）。これらの各クローン内のヒトｃＤＮＡを制限マップに作成した（データは示していない）。これらのうち４つ（Ｓ２−６ａ２、Ｓ２−１０３、Ｓ２−１１２、Ｓ２−２２７）はＣＤＣ２−ＨＳ遺伝子を含有していた（ＬｅｅおよびＮｕｒｓｅ、１９８７年）。Ｓ．ポンベｃｄｃ＋遺伝子もこの株でヒトサイクリンＥと一緒にスタートを行った（Ｆ．Ｃ，およびＡ．Ｔｉｎｋｅｌｅｎｂｅｒｇ、未発表の所見）。これらの結果は、サイクリンＥタンパク質がＣＤＣ２またはＣＤＣ２８タンパク質との相互作用によってスタートを制御するという更なる証拠を提供する。Ｓ．セレビシエＣＤＣ２８およびＣＬＮ遺伝子がヒトタンパク質によって同時的に置換され得るという事実も、その程度まで基本的な細胞周期の機構が進化中に保存されたことを強調している。
【００５０】
（実施例６：ヒトサイクリンＥおよびＣＤＣ２遺伝子属のメンバーであるヒトまたはツメガエルＣＤＫ２を含有する酵母でのスタートからの移行）
５番目のクローン、Ｓ２−１２４の制限マップはＣＤ２−ＨＳの制限マップとは適合しなかった。最近、ツメガエルＣＤＫ２遺伝子（正式にはＥｇ−１と称される、Ｐａｒｉｓ等、１９９１年）のヒト相同体をクローン化する（Ｓ．Ｅｌｌｅｄｇｅ、個人的通信）と、Ｓ２−１２４の制限マップはＣＤＫ２’−ＨＳの制限マップと適合した。更に本発明者は、ツメガエルＣＤＫ２遺伝子もＣＤＣ２８の代わりに使用すると、サイクリンＥと結合してスタートを行った。それ故、ヒトおよびツメガエルは、酵母内でＧ１／Ｓ移行を制御することができるＣＤＣ２遺伝子属の少なくとも２つのメンバーを含有する。ヒトＣＤＣ２遺伝子またはＣＤＣ２相同体ＣＤＫ２がｃｄｃ２８−１２を完全に相補したかどうかを試験するために、本発明者はこれら形質転換体を３８℃で増殖させた（図５）。３８℃では、ｃｄｃ２８−１３はＧ１／ＳとＧ２／Ｍの両方の野生型ＣＤＣ肥に比べて不完全である（ＲｅｅｄおよびＷｉｔｔｅｎｂｅｒｇ、１９９０年）。予想された（ＷｉｔｔｅｎｂｅｒｇおよびＲｅｅｄ、１９８９年）ように、ＣＤＣ２−ＨＳ遺伝子を含有する細胞は３０°または３８℃で等しく良好に増殖し、ＣＤＣ２−ＨＳ遺伝子が、ｃｄｃ２８−１３のＧ１／ＳおよびＧ２／Ｍの機能の両方を相補できたことを示していた。興味深いことに、３８℃ではヒトまたはツメガエルＣＤＫ２遺伝子およびヒトサイクリンＥを含有する株は増殖しなかった。それ故、これらの実験条件下で、ヒトまたはッメガエルＣＤＫ２遺伝子だけをＣＤＣ２８の代わりに部分的に使用した。更に、ＧＡＬ−ＣＤＣ２８株をＣＤＫ２−ＨＳで相補する（グルコースで）最初の試みは、ＣＤＣ２−ＨＳによる相補性と比べて相補性が非常に乏しかったことを示した。ＣＤＫ２−ＨＳがｃｄｃ２９一月またはＧＡＬ−ＣＤＣ２８のどちらかを十分に相補できないことは、ツメガエルＣＤＫ２遺伝子がｃｄｃ２８−１３またはｃｄｃ２の温度感受性対立遺伝子のどちらも相補しなかったことを示す以前の報告（Ｐａｒｉｓ等、１９９１年）と一致する。ＣＤＫ２によるｃｄｃ２８−１３の部分的救済に関する説明は明らかでないが、１つの可能性としては、ＣＤＫ２タンパク質がＧ１／Ｓは効果的に相補するがＣＤＣ２８のＧ２／Ｍ機能は相補しないということである。この問題に明確に着手するためには、上記した株の細胞周期抑制点を決定することが必須であろう。このことは、プラスミドの不安定性によって選択的培地であっても３つの全てのプラスミドを含有する少数の細胞が生じた（データは示していない）ので可能ではなかった。
【００５１】
（実施例７：サイクリンＥによるｐ３４  ＣＤＣ２の活性化）
サイクリンＥタンパク質をＧ１細胞抽出物と混合することによって、サイクリンＥがヒトＣＤＣ２タンパク質とインビトロで結合することができそしてこの会合がＣＤＣ２キナーゼの活性化を導くことが直接証明された。本発明者はヒトＧ１細胞が活性のｐ３４  ＣＤＣ２キナーゼを含有していないことを以前に示した；細胞に存在するｐ脳タンパク質は単量体であり、どんなサイクリンとも会合していない（ＤｕｒａｅｔｔａおよびＢｅａｃｈ、１９８８年；Ｄ’Ｕｒｓｏ等、１９９０年）。Ｇ１抽出物はＭＡＮＣＡ細胞、ヒトバーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ球細胞株から調製された。本発明者はこれらのＧ１抽出物が検出可能なＣＤＣ２キナーゼを含有していることを確認した。この抽出物を、ＣＤＣ２タンパク質に関連して大過剰のｐ１３−セファロースと、ＣＤＣ２タンパク質がｐ１３−セファロースに確実に定量的に結合する条件下で混合した。ヒストンＨｌキナーゼ活性がｐ１３−セファロースビーズと特異的に会合していることは検出できなかった（図７Ｂ参照）。更に、これらのＧ１抽出物は、ＣＤＣ２キナーゼの特異的なペプチド基質を使用するキナーゼアッセイでは不活性であった（Ｍａｒｓｈａｋ等、１９９１年）。
【００５２】
サイクリンＥとＣＤＣ２との相互作用を試験するために、サイクリンＥを大腸菌内でグルタチオントランスフェラーゼ融合タンパク質（ＧＴ−サイクリンＥ）として発現させそしてグルタチオン−セファロースによるアフィエティークロマトグラフィーで精製した。本発明者はＧ１細胞抽出物をＧＴ−サイクリンＥ−セファロース、ＧＴ−セファロース、ｐ１３−セファロースおよびブランクセファロースビーズと共にインキュベートした。ＧＴ−サイクリンＥ−セファロースとｐ１３−セファロースは、Ｃ末端特異性のｐ３４  ＣＤＣ２抗血清を使用する免疫ブロット法で検出するとき、等量のｐ３４  ＣＤＣ２タンパク質と結合した（図７Ａ）。本発明者はｐ３４ＣＤＣ２とＧＴ−セファロースまたはブランクセファローズとの結合は検出しなかった。
【００５３】
Ｇ１抽出物中でインキュベーションした後、セファロースビーズはヒストンＨ１キナーゼ活性についてアッセイした。ｐ１３−セファロースとＧＴ−サイクリンＥ−セファロースビーズは等量のｐ３４  ＣＤＣ２タンパク質と結合したけれども、ＧＴ−サイクリンＥ−セファロースビーズしかヒストンＨ１キナーゼ活性を有していなかった（図７Ｂ）。本発明者はまた、サイクリンＥ融合タンパク質が結合キナーゼによってリン酸化された（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）ことも観察した。サイクリンＥ融合タンパク質と正確に一緒に移動するタンパク質はＨ１キナーゼ反応の間にリン酸化され、そしてこのリンタンパク質はサイクリンＥ抗血清によって免疫沈降された（図７Ｂ）。リン酸化ＧＴ−サイクリンＥとトロンビンとの融合タンパク質の開裂は、融合タンパク質のサイクリンＥ部分がリン酸化されたことを示した（データは示していない）。サイクリンサブユニットの自動リン酸化がサイクリン−ＣＤＣ２コンプレックスの特徴である（ＤｒａｅｔｔａおよびＢｅａｃｈ、１９８８年；ＰｉｎｅｓおよびＨｕｎｔｅｒ、１９８９年）ので、ＧＴ−サイクリンＥ融合タンパク質のリン酸化は多分結合ＣＤＣ２キナーゼによるものであった（下記参照）。
【００５４】
上記の実験はＧＴ−サイクリンＥ−会合キナーゼがｐ３４ＣＤＣ２キナーゼであることは直接証明しなかった。このことを試験するために、本発明者は、遊離のグルタチオンと共にインキュベーションすることによってＧＴ−サイクリンＥ−会合タンパク質をセファロースビーズから放出させた。放出したｐ３４  ＣＤＣ２タンパク質はＣ末端特異性ｐ３４  ＣＤＣ２抗血清により免疫沈降され、そしてヒストンＨ１キナーゼ活性を有することが示された（図７Ｃ）。対照として、本発明者はＧＴ−セファロースビーズから放出されたタンパク質からキナーゼは全く免疫沈降されなかったことを示した（図７Ｃ）。本発明者はＧＴ−サイクリンＥ−結合キナーゼのどのフラクションがｐ３４  ＣＤＣ２抗血清で免疫沈降され得るのかを知っていないので、他のキナーゼ（ＣＤＫ２のような）がＧＴ−サイクリンＥ−結合キナーゼ活性に寄与するということを排除することはできない。
【００５５】
本発明者の結果はサイクリンＥがｐ脳ＣＤＣ２キナーゼと結合したことを示し、そして該キナーゼがサイクリンＥによって活性化されたことを支持している。最初のＧ１抽出物中でＣＤＣ２キナーゼが全く検出されなかったという事実はＣＤＣ２タンパク質とＧＴ−サイクリンＥ−セファロースとの会合がそれまでは不活性だったタンパク質を活性化に導いたことを示唆している。これらの実験は粗製の細胞抽出物中で行ったので、サイクリンＥとＣＤＣ２タンパク質との会合がＣＤＣ２キナーゼを活性化するのに十分であったかどうか言及することはできなかった。ＣＤＣ２かまたはサイクリンタンパク質のどちらかを更に修正することが活性化経路で必要な工程であることがある。
【００５６】
ＧＴ−サイクリンＥ融合タンパク質に対して抗体をウサギで生じさせた。これらの抗体は、インビトロで翻訳されたサイクリンＥを免疫沈降させたがヒトサイクリンＡまたはＢは沈降させなかったので、サイクリンＥを特異的に認識した（図８Ａ）。この抗血清はＨｅＬｓ細胞からＨ１キナーゼ活性を免疫沈降させた（図８Ｂ）。これはインビボでサイクリンＥがキナーゼと会合したことを示したが、もっとも本発明者はどのＣＤＣ２属のメンバーがこれらのコンプレックス中に存在したかは知らない。
【００５７】
（実施例８：サイクリンＥおよびサイクリンＡと会合したタンパク質キナーゼの細胞周期依存性の活性化）
前記の実施例は指数的に増殖するＭＡＮＣＡ細胞（ヒトＢ細胞系）から得られるサイクリンＥの免疫沈降物が細胞分裂キナーゼを含有していることを示している。細胞周期中のサイクリンＥ会合キナーゼの活性は、遠心水力分級を使用して指数的に増殖するＭＡＮＣＡ細胞を８つのフラクションに分離して調べた。遠心水力分級は細胞を種々の細胞周期フラクションに物理的に分離し、それによって、誘導された同調法と関係があることが知られている潜在的な人工物を回避する。本発明者はプロピジウムヨージッドで染色した核の流動細胞計測法分析によって核ＤＮＡ含量を測定することによって、水力分級フラクションの位置を決定した（図９Ａ）。８つの異なる細胞周期フラクションの各々から得られた細胞抽出物は）抗サイクリンＥポリクローナル抗血清を使用して免疫沈降させた。同じ動物から得られる前免疫血清（αＰＩ）を陰性対照として使用した。各フラクションで、対照の免疫沈降物中のキナーゼ活性を特異的な抗サイクリンＥ免疫沈降物中で観察された活性から差し引いた。図９Ｂに示されたデータは、サイクリンＥと会合したＨ１キナーゼの活性によって触媒されたヒストンＨ１リン酸化の値を測定することによって決定される、細胞の水力分級フラクション中のサイクリンＥ−キナーゼコンプレックス発現値を示している（図９Ａ）。各フラクションから同じ数の細胞を溶解させ、そして溶解物中のサイクリンＥをアフィニティー精製抗サイクリンＥ抗体（αｃｙｃ  Ｅ）で免疫沈降させた。リンイメージングによって定量した結果は、サイクリンＥ会合キナーゼの活性が細胞周期依存性であり、そして３つの実験では、細胞周期中に４倍から８倍の間で変動したことを示唆している。サイクリンＥ会合キナーゼの活性ピークは、Ｇ１後期およびＳ前期の最大数の細胞を有する細胞の水力分級フラクションに対応していた。或る実験では、本発明者はまた、水力分級細胞のＧ２／Ｍフラクション中のサイクリンＥと会合した活性のより小さい第２のピークも観察した（データは示していない）。
【００５８】
細胞周期中のサイクリンＥ会合キナーゼの活性はサイクリンＡ会合キナーゼとは顕著に異なっている。Ｃ１６０抗サイクリンＡモノクローナル抗体を使用して、サイクリンＥ会合キナーゼ活性を測定するために使用されたのと同じ細胞抽出物からサイクリンＡおよびその会合タンパク質を免疫沈降させた（図９Ｃ）。上記したように、サイクリンＡ会合キナーゼの活性はＳ期の開始時に先ず検出される（ＰｉｎｅｓおよびＨｕｎｔｅｒ、１９９０年；Ｍａｒｒａｃｃｉｎｏ等、１９９２年）。サイクリンＥ会合キナーゼの活性とは対照的に、サイクリンＡ会合キナーゼの活性はＳ期中に上昇し続け、そしてＧ２期でピークに達する。これらの結果も、サイクリンＡ会合キナーゼのピーク値がサイクリンＥ会合キナーゼのピーク活性値より約５倍から１０倍大きいことを示唆している（データは示していない〕。しかし乍ら、絶対値は、本明細書で示された値が僅かに異なる会合定数（Ｋａ）を有することができる２つの抗体に依存しているので、変動させることができる。これらの結果は、明確なサイクリン依存性キナーゼ活性が連続してが細胞周期中に活性化される；サイクリンＥのキナーゼ活性は上昇し、続いてサイクリンＡ会合キナーゼ活性、次にサイクリンＢ会合キナーゼ活性が増加することを示唆している。
【００５９】
サイクリンＥ会合キナーゼ活性が細胞周期のＧ１期に蓄積する動力学は、酵素的に活性のサイクリンＥ：キナーゼコンプレックスの発生量の相対的測定として研究した。ＭＡＮＣＡ細胞はノコダゾールにより細胞周期の中期段階で３時間抑止され、そしてこの時点で細胞の７５％が細胞質分裂を完了していた。次に、残存する有糸分裂細胞から水力分級で分離された細胞を３、４、５、６または７時間細胞周期のＧＩ期に解放させた。これら細胞は、核ＤＮＡ含量の流動細胞計測法測定（９Ｄ）および染色体ＤＮＡへの三重水素化チミジン導入の両方で測定するとき、約６または７時間後に同調してＳ期に進行した（データは示していない）。次に、細胞を遠心水力分級によって細胞周期の種々の期のサブ集団に分画した。サイクリンＥ会合キナーゼ活性はＧ１期中に上昇することが見られ、細胞が丁度Ｓ期に入ったときにピーク活性に達した（図９Ｄ）。対照的に、本発明者はサイクリンＡ会合キナーゼがＧ１期には存在せず、そして細胞がＳ期に入ったとき最初に検出されたことを見い出した（図９Ｅ）。この実験では、サイクリンＡ会合Ｈ１キナーゼ活性は、サイクリンＡ会合キナーゼ活性を免疫沈降させるためにＣ１６０抗サイクリンＡモノクローナル抗体を使用して測定した。細胞の水力分級Ｇ１フラクション（フラクション２）は３２．５℃で培養して細胞周期のＧ１期を拡張させた。細胞分別物は、細胞がＳ期に近づきそしてＳ期に入る点まで、核ＤＮＡ含量並びにサイクリンＡ−およびサイクリンＥ会合キナーゼ活性を測定するために１時間毎に採取した。
【００６０】
サイクリンＥ会合キナーゼは増殖中のラット２０８  Ｆ細胞では容易に検出可能であるが、血清除去後の静止期に入ったときに消失する（図１０Ａ）。同様に、ＮＧＦに暴露してラットＰＣ１２細胞をニューロンに分化するように誘導したとき、サイクリンＥ会合キナーゼは低い値になった（図１０Ｂ）。これらの実験では、本発明者は増殖中および静止中のラット２０８Ｆ細胞並びに増殖中のＰＣ−１２細胞から得られた溶解物中のＨ１キナーゼ活性をアッセイした。免疫沈降物はサイクリンＥ（αＥ）、ヒトｐ３４  ＣＤＣ２（αｐ３４）のＣ末端または対照として前免疫抗サイクリンＥ抗血清（αＰＩ）に対するアフィニティー精製抗体を使用して調製した。細胞は１０％の仔ウシ血清（１０％ＣＳ、図１０Ａ）を使用して増殖させそしてＮＧＦ（＋ＮＧＦ、図１０Ｂ）を使用して分化させるように誘導した。静止対照は０．１％の仔ウシ血清（０．１％ＣＳ、図１０Ａ）中で増殖させた。非分化対照はＮＧＦの不存在下（−ＮＧＦ、図１０Ｂ）で増殖させた。これらの結果は、サイクリンＥ会合キナーゼ活性がサイクリンＥの発現値と同様に増殖を制御していることを証明している。
【００６１】
（実施例９：サイクリンＥの構成発現はＧ１を短縮する）
細胞周期中のサイクリンＥ会合キナーゼ活性のパターンは、サイクリンＥによって介在された生理学的機能が細胞周期のＧ１期に生起することを示唆している。この可能性を試験するために、レトロウイルスＬＴＲプロモーターからヒトサイクリンＥを構成的に発現させた安定な細胞株を構築させた。細胞および細胞周期動力学に与える構成サイクリンＥ発現の影響を試験した。
【００６２】
ヒトサイクリンＥ  ｃＤＮＡをレトロウイルス発現ベクター、ＬＸＳＮ（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、１９８９年）中にクローン化した。これは５’ＬＴＲ由来の挿入ｃＤＮＡを発現しそして選択可能なマーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有している。この構成体によって、アンホトロピック（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）またはエコトロピック（ｅｃｏｔｒｏｇｉｃ）宿主範囲特異性を有するレトロウイルスベクター粒子を産生することができる。本発明者はベクター粒子のエコトロピックストックを使用してＲａｔ−１線維芽細胞株を感染させ、そして選択培地を含有するＧ−４１８中で２週間増殖させて１万個以上の独立して感染させられた細胞のプールを選択した。同時に、ＬＸＳＮ対照ベクターで感染させた細胞のプールを生じさせた。個々の選択した細胞クローンではなくて感染細胞のプールを試験して、Ｒａｔ−１細胞株内部に存在すると思われるクローン変動の可能性を最小にした。図１１Ａ（ａ）で示された結果はＬＸＳＮ−サイクリンＥ感染細胞が、対照のＬＸＳＮウイルスベクターで感染した細胞で検出されるものより約５から１０倍多いサイクリンＥタンパク質を含有していたことを示している。４５ｋＤａ（完全な長さのサイクリンＥの大きさ）および４０ｋＤ２の２つのサイクリンＥバンドがサイクリンＥを形質導入した細胞で特異的に現れた。サイクリンＥ：キナーゼ活性の増加はＬＸＳＮ−サイクリンＥを形質導入した細胞でも見い出された。図１１Ａ（ｂ）の結果は指数的に増殖するＲａｔ−１細胞の培養物中でサイクリンＥ会合ヒストンＨ１キナーゼ活性の値の３乃至５倍の増加を示している。対照細胞で検出されたサイクリンＥおよびサイクリンＥ会合キナーゼのより低い値は多分、内在性ラットサイクリンＥによるものであった。細胞周期に与えるサイクリンＥの影響を評価するために、指数的に増殖するＬＸＳＮ−サイクリンＥを形質導入した細胞を遠心水力分級で集めた。形質導入した細胞の細胞周期での分布はプロピジウムヨウジッドでＤＮＡ染色した後に流動細胞計測法で測定した（図１１Ｂ）。ＬＸＳＮ−サイクリンＥにより形質導入された細胞は、対照ベクター、ＬＸＳＮで形質導入された対照細胞と比較して細胞周期のＧ１期の細胞フラクション中で減少したことを示していた。サイクリンＥ形質導入細胞はまた細胞周期のＳ期の細胞のフラクションにおける増加も示した。細胞周期の種々の期でのサイクリンＥ形質導入細胞のフラクションにおけるこれらの観察された変化は細胞周期のＧ１期からの細胞の移行の加速と一致する。このことは、サイクリンＥ感染細胞でＧ１期の長さを直接測定することによって確認された。サイクリンＥ感染細胞はノコダゾールに暴露して擬似中期に同調させ、そして有糸分裂細胞を採集した。有糸分裂細胞を培養に戻し、そしてＳ期への進入はＢｒｄＵ（５−ブロモデオキシウリジン）でパルス標識することによって監視した。ＢｒｄＵは免疫化学法を使用して検出した。図１１Ｃで示された結果は、ＬＸＳＮ−サイクリンＥ感染細胞のＧ１期の長さ（即ち、有糸分裂の終結からＳ期でのＤＮＡ合成が再開されるまで）はＬＸＳＮで形質導入された細胞より実質的に短かった。
【００６３】
独立した２対のトランスフェクションした細胞集団を使用した５つの別々の実験で、Ｇ１の期間はＬＸＳＮ−サイクリンＥレトロウイルスベクターで感染させた細胞ではＬＸＳＮ対照ベクターで感染させた細胞より平均して３３％短かった。同様に、核ＤＮＡに導入されたＢＵＤＲの免疫化学検出を使用してサイクリンＥ−形質導入細胞のＳ期への進入速度を測定するために試験を行い、ＬＸＳＮ−サイクリンＥ形質導入細胞ではＳ期の短縮化が確認された（データは示していない）。有糸分裂追放法によって得ることができる細胞数が限られているため、感染したＲａｔ−１細胞集団の有糸分裂からＳ期への進行中の各時点でサイクリンＥ会合キナーゼ活性の値を測定することはできなかった。
【００６４】
（実施例１０：サイクリンＥ会合タンパク質）
前記実施例は、タンパク質を発芽酵母と一緒に発現させるとき、サイクリンＥがヒトｐ３４ＣＤＣ２およびヒトまたはツメガエルｐ３３  ＣＤＫ２を活性化できることを示している。更に、これらの結果は、サイクリンＥがインビトロで（即ち、細胞不含系で）ヒトＣＤＣ２およびヒトＣＤＫ２の両者と結合してこれらを活性化できることを示している。キナーゼとサイクリンＥの会合はインビボ研究で（即ち、細胞内で）試験し、その際細胞抽出物は、［３５Ｓ］−メチオニンを用いて生合成で３時間放射標識させた指数的に増殖するＭＡＮＣＡ細胞の水力分級した細胞周期フラクションから調製した。抽出物はＳＤＳ−ＲＩＰＡ緩衝液中で調製しそして特定のタンパク質はアフィニティー精製した抗サイクリンＥ抗体（ＧＳＴ−サイクリンＥ融合タンパク質に対して調製した）およびヒトＣＤＣ２（ｐ３４）のＣ末端に対する抗血清を使用して免疫沈降させた。免疫沈降物を集め、洗浄し、そして１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離する前にＳＤＳ緩衝液中で沸騰させた。ゲル内の放射標識したポリペプチドの検出はサリチル酸ナトリウムを使用して促進し、そしてその後ゲルをオートラジオグラフィー用に乾燥させた。図１２はｐ３４会合タンパク質（レーン１）並びに指数的に増殖する細胞中（レーン２）、Ｇ１期中（レーン３）、Ｇ１／Ｓ（レーン４）、Ｓ（レーン４５〜８）、Ｓ／Ｇ２（レーン９〜１０）およびＭ期（レーン１１）のサイクリンＥ会合タンパク質（レーン２〜１１）を示す。図１２のアッセイでのサイクリンＥ：ＣＤＣキナーゼコンプレックスと会合しているタンパク質の分子量は下記の表１に要約する。ｌ３ＫｄのポリペプチドはＳ期の中期でコンプレックスと会合し；１７Ｋｄのポリペプチドは全細胞周期で会合し；３２Ｋｄのダブレットは大部分Ｇ１後期およびＳ期で会合し；２６ＫｄのポリペプチドはＧ１およびＧ２／Ｍ期でだけ会合し；７０Ｋｄのポリペプチドは主としてＳ期で会合し；８５Ｋｄのポリペプチド（即ち、トリプレット中の最も低いバンド）は全細胞周期で会合し；そして１０７ＫｄのポリペプチドはＳ期およびＳ期の丁度前後に会合する。３２Ｋｄのダブルの発現パターンの差異はこれがＣＤＫ２またはＣＤＣ２ではないことを示唆しており、そしてこれは免疫沈降コンプレックスと会合したバンド「ｘ」と称されるＣＤＫ２、ＣＤＣ２および３２ｋＤのバンドのトリプシン消化フラグメントをマップ化することによって確認された。
【００６５】
【表１】
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一連の対照の免疫沈降反応は抗ＣＤＣ２および抗ＣＤＫ２抗体の特異性を特徴化するために実施した。指数的に増殖するＭＡＮＣＡ細胞から得られた溶解物は、ヒトｐ３４ＣＤ
Ｃ２（αＣＤＣ２）の７個のＣ末端アミノ酸に向けられたアフィニティー精製抗体またはヒトｐ３３ＣＤＫ２（αＣＤＫ２）の１５個のＣ末端アミノ酸に向けられた抗血清を使用して免疫ブロット法を行った。図１３では、レーン１および２は全細胞抽出物の免疫ブロットであり；レーン３および４では、全細胞抽出物は最初にアフィニティー精製抗ｐ３４ＣＤＣ２抗体で免疫沈降させ、次に指示された抗体でブロットとし；レーン５および６では、全細胞抽出物をｐ３３ＣＤＫ２のＣ末端に対する抗血清を用いて先ず免疫沈降させ、次に指示された抗体でブロットとした。５０から８０ｋＤａの間の免疫沈降抗体から誘導された非特異的シグナルの存在に注目されたい。アフィジコリンを用いてＧ１／Ｓ境界で抑止されたＭＡＮＣＡ細胞から得た抽出物はヒトサイクリンＥに対するアフィニティー精製抗体を使用して免疫沈降させそしてその後同一の抗体を使用してプロットとした。４５ｋＤａのシグナルタンパク質バンドが検出された。それ故、サイクリンＥ免疫沈降物中の会合タンパク質はサイクリンＥと結合している可能性が最も多いように思われ、そしてこの抗体との非特異的交差反応性のために検出されなかった。
【００６６】
これらの結果を確認するために、免疫プロット法を使用してサイクリンＥと、指数的に増殖するかまたはアフィジコリンでＧ１／Ｓ境界に抑止されたＭＡＮＣＡ細胞から調製した抽出物中のｐ３３ＣＤＫ２およびｐ３４ＣＤＣ２の両者との間の会合を試験した。サイクリンＥ会合キナーゼの活性はＧ１からＳ期への移行で最大であるので、アフィジコリンで阻止した細胞を選択した。細胞抽出物は、アフィニティー精製抗サイクリンＥ抗体を使用して免疫沈降させ、そして免疫沈降物はＣＤＣ２およびＣＤＫ２特異的抗血清の両方を使用してウエスターンブロット法を実施した。全ての免疫沈降物について、抗体はセファロースに交差結合していた。免疫沈降法は前免疫血清（「αＰＩ」）、ブランクセファロースビーズ（「ＳＥＰＨ」）、アフィニティー精製抗ｐ３４ＣＤＣ２Ｃ末端（「αｐ３４」）およびアフィニティー精製抗サイクリンＥ（「αＥ」）を用いて実施した（図１４Ａ）。「−−」で標識したレーンの組は細胞抽出物を含有していなかった。両抗血清はそれぞれのタンパク質のＣ末端に対応するペプチドに対して生じさせた。ＣＤＣ２に関連したタンパク質のＣ末端は高度には保存されていない。これらの結果は、抗Ｃ末端ＣＤＣ２抗血清はＣＤＣ２を認識してＣＤＫ２を認識せず、そして逆に抗Ｃ末端ＣＤＫ２抗血清はＣＤＫ２を認識してＣＤＣ２を認識しなかったことを示している（図１３）。
【００６７】
全細胞抽出物の免疫プロット法は２つの形態のＣＤＫ２を示している（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ等、１９９２年；図１４Ａも参照のこと）。両アフィジコリン抑止細胞（図１４Ａ）および指数的増殖細胞（示していない；図１５参照）において、サイクリンＥはより急速に移動している形態のＣＤＫ２と優先的に会合した。サイクリンＥ免疫沈降物中でのＣＤＫ２の同定は、ヒトＣＤＫ２のＣ末端に対して独立して生じさせた３つの異なる抗血清を使用して確認された。３つの抗血清は全てＣＤＫ２を認識してＣＤＣ２を認識しない（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ等、１９９２年；Ｅｌｌｅｄｇｅ等、１９９２年；図１３）。更に急速に移動している形態のＣＤＫ２は一層高度にリン酸化されると現在考えられている（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ等、１９９２年）。これは、［３５Ｓ］−メチオニンで標識した細胞抽出物中で検出されたＣＤＫ２のサイクリンＥと会合したアイソフォームが全て［３２Ｐ］−オルソフオスフエトで標識した細胞抽出物由来の抗サイクリンＥ免疫沈降物中でも検出されたとの本発明者の観察と一致する。
【００６８】
これらの結果は、ｐ３４ＣＤＣ２の量はＣＤＫ２の量より実質的に少なかったけれども、ｐ３４ＣＤＣ２はサイクリンＥ免疫沈降物中でも検出されたことを示している。指数的に増殖する細胞では、主としてハイポリン酸化された形態のｐ３４ＣＤＣ２が検出され、一方アフィジコリンで抑止した細胞では、サイクリンＥと会合し一層高度にリン酸化された形態のｐ３４ＣＤＣ２も存在した（図１４Ｂ）。両事例で、サイクリンＥと会合した非常に少量のｐ２４ＣＤＣ２を検出することができた。
【００６９】
（実施例１１：サイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの細胞周期依存性の形成）
サイクリンＥとＣＤＫ２が酵素的に活性のコンプレックスを形成する細胞周期の期を調べた。指数的に増殖するＭＡＮＣＡ細胞は遠心水力分級によって８つの細胞周期フラクションに分離しそして細胞抽出物を調製した。各フラクションの細胞の細胞周期の位置は核ＤＮＡ含量の流動細胞計測法測定によって決定した（図１５Ａ）。サイクリンＥとその会合タンパク質はアフィニティー精製抗サイクリンＥ抗体を使用して免疫沈降させた。本発明者はＣＤＫ２のＣ末端に特異的な抗血清を使用してウエスターンブロット法によってＣＤＫ２の存在を視覚化した（図１５Ｂ１〜Ｂ４）。ごれらの結果は、酵素的に活性のサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの値がＧ１後期およびＳ前期中にピークに達し、そして細胞が細胞周期の残りの期を進行するにつれて発生量が低下したことを示している。サイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの発生量はサイクリンＥ会合キナーゼの細胞周期の周期性に密接に対応していた（上記の実施例に記載したように）。更に、現在の結果は指数的増殖細胞ではサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスがＧ１後期で活性化されるまで不活性形態で蓄積しなかったことを示唆している。外観および活性化のパターンはサイクリンＡ会合キナーゼ活性、即ち、報告によればサイクリンＡの量と正比例して増加した活性に関して報告されたパターンと類似していることが観察された（ＰｉｎｅｓおよびＨｕｎｔｅｒ、１９９０年；Ｍａｒｒａｃｉｎｏ等、１９９２年）。しかし乍ら、現在の結果はサイクリンＢ：Ｐ３４ＣＤＣ２コンプレックスで得られた結果とは、報告されているように、サイクリンＢＣＤＣ２コンプレックスがＳおよびＧ２で蓄積し、それらが有糸分裂の開始時に活性化されるまでは不活性で高度にリン酸化されている（ＧｏｕｌｄおよびＮｕｒｓｅ、１９８９年；Ｐｏｎｄａｖｅｎ等、１９９０年；Ｓｏｌｏｍｏｎ等、１９９０年）点で異なっている。
【００７０】
（実施例１２：サイクリンＥの発生量が細胞周期を調節する）
サイクリンＥタンパク質の発生量は細胞周期の種々の期で測定した。ＭＡＮＣＡ細胞は遠心水力分級によって細胞周期の各期を代表するフラクションに分離した。本発明者は、免疫沈降物中でサイクリンＥの発生量を測定するためにも使用したアフィニティー精製抗サイクリンＥ抗体を使用して免疫沈降法によって各フラクションから得られた細胞溶解物を分析した。これらの結果は、サイクリンＥ値がＧ１後期で最大でありそしてＳ、Ｇ２およびＭで低下したことを示している（図１５Ｂ１〜Ｂ４）。検出されたサイクリンＥタンパク質の量が免疫沈降法で使用された細胞抽出物の量に直線的に依存していたので、イムノアッセイ法は各細胞周期フラクションにおけるサイクリンＥの相対的な値を正確に反映すると思われた（図１５Ｃ）。要するに、これらの結果はサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの発生量、そしてそれ故サイクリンＥ会合キナーゼ活性の周期性はサイクリンＥの値によって直接制御されると思われる。
【００７１】
（実施例１３：インビトロでのサイクリンＥ：ＣＤＣ２およびサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの集合物）
示されたように、ヒトの細胞中でサイクリンＥはｐ３４  ＣＤＣ２よりむしろｐ３３  ＣＤＫ２と優先的に会合する。これに対する１つの考えられる説明は、サイクリンＥの親和性がＣＤＫ２に対してとＣＤＣ２に対してとでは異なっているということである。これの可能性はＣＤＣ２およびＣＤＫ２キナーゼを含有する組換え体サイクリンＥの細胞不含系と細胞抽出物中で評価した。サイクリンＥはバクロウイルスベクターを使用してＳｆ９昆虫細胞内で発現させた。サイクリンＥタンパク質を形質導入昆虫細胞内で過剰発現させ、細胞内濃度は４８時間後に約５〜１０μＭであり（Ｄｅｓａｉ等、１９９２年）、そしてこれらの細胞を採取してタンパク質を分析するために抽出した。サイクリンＥ、ＣＤＣ２およびＣＤＫ２間の結合は、サイクリンＥの供給源として希釈昆虫細胞抽出物を、そしてＣＤＣ２およびＣＤＫ２の供給源としてＧ１細胞の抽出物を使用して評価した。ＣＤＣ２およびＣＤＫ２キナーゼに与えるサイクリンＥの影響における細胞周期依存性の差異を測定するために、細胞抽出物は、２ｍＭのヒドロキシウレア（Ｓ期の細胞は停止させそして他の細胞は全てＳ期の次に集積させる）を含有する培地中で増殖を１２時間抑止させ（即ち、Ｓ期より前に）、次に３．５時間増殖を解除して細胞を全てＳ期に入らせた細胞（「ＨＵ」、図１６Ａ〜１６Ｂ）；並びに、ノコダゾールで停止させ、３時間解除してＧ１に入らせ、そしてその後遠心水力分級で更に選択した細胞（「Ｇ１」、図１６Ａおよび１６Ｂ）から調製した。細胞抽出物は全て低張緩衝液中で調製した。インキュベーション混合物は３種のタンパク質濃度を約０．２μＭの通常の生理的値に近づけるように設計した。指示されたサイクリンＥ、ＣＤＣ２およびＣＤＫ２を含有する希釈溶解物は単独でまたは組み合わせて、プラスミドを含有するＳＶ４０のインビトロ複製に適する条件下で３７℃で３０分間インキュベートした（Ｄ’Ｕｒｓｏ、１９９０年）。インキュベーション混合物中のサイクリンＥ：ＣＤＣ２およびサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの形成は、ＣＤＣ２に対する（抗−ＣＤＣ２）、ＣＤＫ２のＣ末端に対する（抗−ＣＤＫ２）またはサイクリンＥに対する（抗−サイクリンＥ）抗血清のいずれかによる免疫沈降法、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを使用して測定した（図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ）。種々の各免疫沈降物と会合したキナーゼの活性はＨ１キナーゼアッセイ（上記実施例に記載したような）で測定した。
【００７２】
免疫沈降物は、免疫沈降物をヒストンＨ１およびγ−３２Ｐオルトホスフェートと混合することによってヒストンＨ１のリン酸化を介在する能力（即ち、Ｈ１キナーゼ活性）について試験した。３２Ｐ−放射標識ヒストンＨ１はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびリンイメージングによって検出した（図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ）。（図１６Ａ〜１６Ｃのリンイメージングを定量し、そして結果は図１７に図示する。）ＣＤＣ２キナーゼ活性は、ＨＵ抑止細胞（図１６Ｃ“ＨＵ”）から調製した免疫沈降物で低い値であるのは明らかであるが、Ｇ１期（図１６Ｃ、Ｇ１抽出物、「０」）には殆ど検出できない値にまで低下しそしてキナーゼ活性の値は細胞抽出物に種々の量のサイクリンＥを添加しても変わらなかった（即ち、図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ；「５、１、０．２」）。対照的に、ＨＵ抑止細胞抽出物（図１６Ａ、「ＨＵ」）で低い値で存在するＣＤＫ２キナーゼ活性はＧ１（図１６Ａ、Ｇ１抽出物、「０」）では検出できない値に低下したが、サイクリンＥをＧ１細胞抽出物（図１６Ａ、「５、１、０．２」）に添加したときＣＤＫ２キナーゼ活性は回復した。これらの結果は、サイクリンＥを添加した後のＧ１期の細胞抽出物で潜在的なＣＤＫ２キナーゼ活性が活性化することを示しており、そしてキナーゼ活性がサイクリンＥの発生量によって制御されることを示唆している。これらの研究の量的な特徴は図１７に示し、その際ＣＤＫ２キナーゼ活性のサイクリンＥ介在活性化の値はＧ１期の細胞抽出物に添加したサイクリンＥの量（「ＨＵ抽出物中のサイクリンＥの値の倍数」、図１７）の関数として測定された（即ち、上記の図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃで示されたＳＤＳ−ＰＡＧＥのリンイメージングを使用して）。（図１７のサイクリンＥを含有するＳｆ９溶解物の種々の量は図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃの「５、１および０．２」の量に相当する。）ＣＤＣ２、ＣＤＫ２およびサイクリンＥ免疫沈降物の各々のキナーゼ活性に関するリンイメージングデ一夕はＨＵで抑止した対照細胞の細胞溶解物中に見られる活性（即ち、「ヒドロキシウレアＨ１キナーゼの活性％」を１００％とする；図１７）のパーセントとして活性を計算することによって一般化した。図１７に示した結果は、ＣＤＫ２キナーゼ活性値がＧ１抽出物に添加されたサイクリンＥの量に依存しており、そしてＨＵ抑止細胞抽出物に見られた値より２２倍以上大きいＣＤＫ２キナーゼ活性値が達成されたことを示している（即ち、５倍のサイクリンＥでのサイクリンＥ免疫沈降物；図１７）。更に、これらの結果は、サイクリンＥ免疫沈降物と会合したキナーゼ活性がＣＤＣ２免疫沈降物と会合した活性より一定して大きかったことを示している。これらの結果はまた、ＣＤＣ２活性に関しては低い値しかＧ１期の細胞抽出物に存在せずそしてこれらの抽出物に存在すると思われる潜在的ＣＤＣ２がサイクリンＥの添加によってそれほど活性化しないというこれまでの調査結果（上記）も確認している。
【００７３】
これらの結果を総合すると、サイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの形成から生じるサイクリンＥによるキナーゼ活性の活性化を示唆している。他の研究（示していない）では、サイクリンＥとＣＤＣ２またはＣＤＫ２との会合はセファロース１２によるモレキュラーシーブゲルクロマトグラフィーを使用して証明された。ｐ３４ＣＤＣ２およびｐ３３ＣＤＫ２モノマーは３０〜４０ｋＤａで溶出しそしてヒストンＨ１キナーゼ活性は無視できるほどであった。組換え体サイクリンＥを含有する昆虫細胞抽出物をＣＤＫ２含有溶解物と混合したとき、大部分のＣＤＫ２タンパク質は約１６０ｋＤａの分子サイズで溶出し、サイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの形成を示唆していた。対照的に、同様な量のＣＤＣ２を含有する抽出物をサイクリンＥ溶解物と混合したとき、小フラクションのＣＤＣ２タンパク質しかサイクリンＥと安定な形態では会合しなかった。モレキュラーシーブカラムから溶出されたサイクリンＥ：ＣＤＣ２およびサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスはキナーゼ活性を示した。
【００７４】
（実施例８〜１３に関する考察：サイクリンＥはＧ１サイクリンである。）
真核細胞の増殖は主として細胞周期のＧ１期に生じる１回の決定によって制御される−−細胞周期に入りそして分裂するかまたは細胞周期から引き上げそして静止状態に入る（Ｂａｓｅｒｇａ、１９９５年；Ｐａｒｄｅｅ、１９８９年）。酵母では、この細胞決定の基礎にある生化学的過程はＣＤＣ８タンパク質キナーゼとＣＬＮタイプのサイクリンとの間のコンプレックスの集合物および活性化である（Ｎｕｒｓｅ、１９９０年；Ｈａｒｔｗｅ１１、１９９２年で検討された）。種々のモデル系での最近の実験は、ＣＤＣ２関連キナーゼの役割が進化論的に保存されているという考え方を支持している（Ｄ’Ｕｒｓｏ等、１９９０年；ＢｌｏｗおよびＮｕｒｓｅ、１９９０年；Ｆｕｒａｋａｗａ等、１９９０年；ＦａｎｇおよびＮｏｗｐｏｒｔ、１９９１年）。本明細書に示された観察は、ヒトサイクリンＥが細胞周期のＧ１後期にＣＤＣ２関連キナーゼを特異的に活性化しそしてサイクリンＥの蓄積がＧ１移行の速度を限定するということを証明している。それ故、本発明者は全ての真核生物で細胞増殖を制御する生化学的経路での臨界的段階がサイクリンＥ／ＣＤＫコンプレックス（用語ＣＤＫはＣＤＣ２タンパク質属におけるサイクリン依存性キナーゼを呼称するために使用される）の集合物であることを提案する。
【００７５】
サイクリンＥがヒト細胞周期のＧ１期に機能するという証拠は次のように要約することができる：サイクリンＥは酵母ＣＬＮ遺伝子において突然変異を相補うことができるので、酵母ＣＬＮタンパク質のスタート機能を実施することができる（Ｋｏｆｆ等、１９９１年；Ｌｅｗ等、１９９１年）。更に、本発明者はヒトＣＤＣ２かまたはヒトＣＤＫ２のどちらかと組み合わせたサイクリンＥがＣＬＮおよびＣＤＣ２Ｂ両機能用に二重に突然変異させた酵母株を救済できるであろうということを示した（Ｋｏｆｆ等、１９９１年）。しかし乍ら、有糸分裂中には明らかに機能するがＧ１中には機能しないヒトサイクリンＢもＣＬＮ突然変異を救済できるであろうから、このアッセイの特異性は疑わしかった（Ｋｏｆｆ等、１９９１年；Ｌｅｗ等、１９９１年；Ｘｉｏｎｇ等、１９９１年）。本明細書で報告したように、サイクリンＥはヒト細胞ではタンパク質キナーゼと会合しそしてこのキナーゼは細胞周期を制御する。サイクリンＥの発生量のみならずサイクリンＥ会合タンパク質キナーゼの活性もＧ１後期およびＳ初期にピークに達し、そしてその後細胞がＳ期、Ｇ２期および有糸分裂を進行するにつれて下降する。このキナーゼは細胞周期に入りそして分化するかまたは静止している細胞には存在しないので、このキナーゼも成長を制御する。サイクリンＥおよびサイクリンＡ活性の相対的なタイミングは重要である。サイクリンＡタンパク質およびサイクリンＡと会合したキナーゼの活性はＳ期が開始するとすぐに検出可能であり（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｏ等、１９９２年）、そしてＳ期であるためにはサイクリンＡ機能が必要である（Ｇｉｒａｒｄ等、１９９１年）。本発明者は、サイクリンＥがサイクリンＡの前に蓄積しそしてサイクリンＥ会合キナーゼがサイクリンＡ会合キナーゼより早く細胞周期に現れることも示した。Ｇ１期のサイクリンＥのこの生化学的機能は、サイクリンＥの生理学的機能がサイクリンＡのＳ期での役割に先行するであろうことを示唆していた。このことは、ラット線維芽細胞株、Ｒａｔ−１内でヒトサイクリンＥを構成的に発現させることによって直接示された。本発明者は、サイクリンＥの５乃至１０倍の過剰発現がサイクリンＥ会合キナーゼの活性値を３乃至５倍上昇させたことを見い出した。サイクリンＥのこの過剰発現の値は細胞周期のＧ１期の長さを３０〜３５％減少させた。
【００７６】
サイクリンＥタンパク質の発生量は通常は細胞周期を制御する−−これはＧ１後期で鋭いピークを示す。これは、サイクリンＥ  ｍＲＮＡ値が細胞周期中にサイクリンＥタンパク質の値と平行して影響を与えるので、多分サイクリンＥ  ｍＲＮＡの値の制御（Ｌｅｗ等、１９９１年）によるものであろう。サイクリンＥ、ＡおよびＢをコードするｍＲＮＡは細胞周期を制御しそしてそれぞれのサイクリンタンパク質の蓄積パターンを予測する（ＰｉｎｅｓおよびＨｕｎｔｅｒ、１９８９年、１９９０年）。発芽酵母では、ＣＬＮ  ｍＲＮＡの蓄積はプラスのフィードバック制御によるものであり、そしてスタートでのＣＬＮ  ｍＲＮＡおよびタンパク質値が急速に増加する（ＣｒｏｓｓおよびＴｉｎｋｅｌｅｎｂｅｒｇ、１９９１年；ＤｉｒｉｃｋおよびＮａｓｍｙｔｈ、１９９１年）。哺乳動物細胞内でのサイクリンタンパク質と転写因子の会合は、細胞周期中のサイクリン遺伝子発現のタイミングを制御する同様な機構の１部であると思われる（Ｂａｎｄａｒａ、１９９１年；Ｍｕｄｒｙｊ等、１９９１年；ＤｅＶｏｔｏ等、１９９２年；Ｓｈｉｒｏｄｋａｒ等、１９９２年）。サイクリンの蓄積はそれぞれのｍＲＮＡの値によって１部決定されるが、サイクリンの発生量はタンパク質転換によって制御することもできる（ＭｕｒｒａｙおよびＫｉｒｓｃｈｎｅｒ、１９９９年；Ｇｌｏｔｚｅｒ等、１９９１年）。サイクリンＥタンパク質の安定性が細胞周期中に制御されるかどうかは知られていないが、このタンパク質はサイクリンＡおよびＢの有糸分裂転換を介在する遍在性酵素によって認識されるコンセンサス配列を欠いている（Ｇｌｏｔｚｅｒ等、１９９１年）。
【００７７】
（サイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックス）
データは、主要なサイクリンＥ−会合タンパク質キナーゼがＣＤＫ２であることを示唆している。３２Ｐまたは３５Ｓ−メチオニン標識タンパク質の二次元ゲル分析は、ヒトの細胞の中でサイクリンＥと会合した主要なＣＤＣ２に関連するタンパク質がＣＤＫ２であることを示している。サイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスがインビボで活性のキナーゼであるという直接的な証拠はないが、これが最もあり得そうな結論である。サイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの発生量は細胞周期を制御しそしてサイクリンＥ会合キナーゼの値と良く適合する。更に、サイクリンＥと結合したＣＤＫ２タンパク質は主として、一次元ＰＡＧＥによって検出可能な２つの形態が一層急速に移行しているものである。この下方への移動性のシフトはＣＤＫ２とサイクリンの結合およびＣＤＫ２キナーゼの活性化の両方に関係があることが知られている（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ等、１９９２年）。これはスレオニン１６０のリン酸化を示すものぞあると考えられ、ＣＤＫ２キナーゼ活性化の必要条件である（Ｙ．ＧｕおよびＤ．Ｍ．、未発表の所見）。Ｓ．セレビシエではサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスをＣＬＮ／ＣＤＣ２８コンプレックスの代わりに使用することができ（Ｋｏｆｆ、１９９１年）、そしてサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスがインビトロで活性のキナーゼであることも示されている。
【００７８】
細胞内でのサイクリンＥタンパク質の周期的な蓄積はサイクリンＥ：ＣＤＫ２の蓄積と適合し、一方ＣＤＫ２タンパク質は細胞周期中一定の値で存在している（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ等、１９９２年）。それ故、サイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの発生量は主としてサイクリンＥタンパク質の値で制御される。しかし乍ら、サイクリンＥのリン酸化状態もコンプレックスの集合を制御できるであろう。
【００７９】
ＣＤＫ２の少なくとも６つのリン酸化されたアイソフォームがサイクリンＥと会合している。この複雑さは、これらのアイソフォームの２つしかサイクリンＡと結合して検出されていないので、驚くべきことであった。予備的な証拠は、ＣＤＫ２が、ＣＤＣ２のリン酸化と同様に３残基−−Ｔ１４、Ｙ１５およびＴ１６０でリン酸化される。（Ｙ．ＧｕおよびＤ．Ｍ．、未発表の観察）ことを示している。これら部位の組合せリン酸化が６つのＣＤＫ２アイソフォームと考えることができよう。しかし乍ら、抗ＣＤＫ２抗体との免疫沈降物がＣＤＫ２の２つの追加的リン酸化アイソフォームを有しており、検出される総数は８つになる（図１１Ｄ）ので、他のリン酸化部位も存在していることが一層ありそうに思われる。１つの解釈は、サイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスが、例えばシグナル形質導入に係わる別のメッセンジャーを結合することによって、細胞増殖を制御する多数のシグナルによって提供される情報を統合するということである。ＣＤＫ２の複数的にリン
酸化された形態はサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの活性化に与える種々の有糸分裂シグナルの影響を反映すると思われる。複数のＣＤＫ２ホスフェートがＣＤＫ２の活性に対してプラスとマイナスの影響の両方を有することができ、そして特定のリン酸化状態には特定の機能が必要であると思われる。細胞周期への付託がなされた後に生起するサイクリンＡ：ＣＤＫ２コンプレックスの下流の活性化ははるかに少数のファクターにしか応答し得ず、そしてそれ故生化学的には殆ど説明できない。
【００８０】
ＣＤＫ２が細胞周期のＧ１からＳ期の間に役割を果たすという他の証拠が提案される。細胞周期進行中の細胞では、ＣＤＫ２キナーゼ活性がＣＤＣ２キナーゼ活性に先行する（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ等、１９９２年）。Ｓ．セレビシエでの１つの実験は、或る種の遺伝子背景で、ＣＤＫ２がＣＤＣ２８のＧ１／Ｓ機能を相補いそしてＧ２／Ｍ機能を相補わないことを示していた（Ｋｏｆｆ等、１９９１年）。更に、活性化したツメガエルの卵の抽出物からＣＤＫ２を枯渇させるとＤＮＡ複製の開始を妨げる（ＦａｎｇおよびＮｅｗｐｏｒｔ、１９９１年）。これらの結果は全て、細胞を細胞周期に付託する際のＣＤＫ２の役割と一致する。
【００８１】
（サイクリンＥ：ＣＤＣ２コンプレックス）
サイクリンＥは、タンパク質を酵母内で一緒に発現させるとき、ヒトＣＤＫ２およびヒトＣＤＣ２の両者と相互作用することができ、そしてサイクリンＥはＣＤＫ２およびＣＤＣ２キナーゼの両者をインビトロで活性化することができる（上記の実施例）。本発明者は、ヒト細胞ではサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの方がより多量であるが、サイクリンＥ：ＣＤＣ２コンプレックスも存在することを示した。更に、サイクリンＥを潜在的に調節するかまたは変化させることができる他のタンパク質とサイクリンＥとのコンプレックスが観察された（図１２；表１）。細胞周期中のサイクリンＥ会合キナーゼ活性のパターンはサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの発生量との相異を幾らか示した。これらの違いはサイクリンＥ：ＣＤＣ２または他のサイクリンＥコンプレックスに起因すると思われる。
【００８２】
インビボでのサイクリンＥ：ＣＤＣ２コンプレックスの低い値はＣＤＣ２に対するサイクリンＥの比較的低い親和性の結果であるように思われる。本明細書に提示した再構築実験は、サイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスが、非常に少しのサイクリンＥしかＣＤＣ２に結合していない条件下で容易に形成されることを示している。しかし乍ら、本発明者はサイクリンＥがインビボで多数のリン酸化状態で存在していることを見い出した。それ故、もう１つの可能性はサイクリンＥの或る比較的まれなアイソフォームがＣＤＣ２に結合し得るということである。
【００８３】
本発明者は、酵母ＣＤＣ２８遺伝子における突然変異がサイクリンＥの能力は非常に削減するがサイクリンＢの能力は削減しないでＣＬＮ機能を救済することをこれまでに観察し、そしてその結果、本発明者はサイクリンＥがサイクリンＢとは異なってＣＤＣ２８と相互作用するであろうと提案した（Ｋｏｆｆ等、１９９１年）。インビトロでの再構築実験は、サイクリンＢはＣＤＣ２と効果的に結合した（Ｄｅｓａｉ等、１９９２年）が、少量のサイクリンＥ：ＣＤＣ２コンプレックスしか検出できなかったということを示すことによってこの考え方を支持している。
【００８４】
（他のサイクリンＥ：ＣＤＣ２コンプレックス）
上記の図１２および表１に示した結果は、サイクリンＥと会合しているこれまでには認識されなかった他の細胞分裂キナーゼの存在の可能性を示していると解釈することもできる。３２Ｋｄのバンド「ｘ」タンパク質（表１、図１２）は、既知のＣＤＣ２およびＣＤＣ２キナーゼとの大きさの類似性並びにサイクリンＥとの明白な会合の両者に基づいて、確かにこのような新規なキナーゼタンパク質の候補である。
【００８５】
（哺乳動物細胞におけるＧ１制御）
１９７４年にパルディ（Ｐａｒｄｅｅ）は哺乳動物細胞の増殖が、制限点と呼ばれる細胞周期のＧ１期の或る点で細胞外の分裂誘発因子シグナルによって制御されることを提案した（Ｐａｒｄｅｅ、１９７４年）。これらのシグナルが存在しなかった場合、または細胞がこれらシグナルに適切に応答できなかった場合（例えば、タンパク質合成が阻止されている場合）には、細胞は制限点を越えずそしてＧ０と呼ばれる静止状態に入るであろう（Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ、１９９０年、で総説された）。細胞は細胞外分裂誘発シグナルの広い列に応答することはできるが、これらのシグナルによって誘発される細胞内結果には多様性が殆どないという印象を受ける（Ｃａｎｔｌｅｙ、１９９１年；Ｃｈａｏ、１９９２年参照）。実際、多様な分裂誘発因子経路が通過しなければならない最終的な共通点がありそしてこれが制限点であると期待することは不合理ではない（Ｐａｒｄｅｅ、１９７４年）。
【００８６】
制限点制御に関する分子の詳細は殆どない。正常な細胞では、制限点からの進行はタンパク質合成速度に非常に感受性である（Ｒｏｓｓｏｗ等、１９７９年、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｍａｎ等、１９７１年；Ｂｒｏｏｋｓ、１９７７年）。制限点より前における（しかし後ではない）タンパク質合成の少しで且つ一時的な減少はＧ１の長さを実質的により長く増加させる（ＺｅｔｔｅｒｂｅｒｇおよびＬａｒｓｏｎ、１９８５年）。細胞外分裂誘発因子刺激を除去しそして細胞タンパク質合成を阻止すると、事実上、同一の細胞周期の生起を妨げると考えられる（Ｐａｒｄｅｅ等、１９８１年）。タンパク質合成速度の比較的小さい変化によるＧ１の長さに与える不釣り合いな大きい影響を考慮して、細胞が制限点を越えるためには、不安定なタンパク質がＧ１中に蓄積しなければならないと提案された（Ｐａｒｄｅｅ、１９８９年、によって総説された）。
【００８７】
サイクリンが制限点のこの不安定な調節因子でありそしてサイクリン／ＣＤＫコンプレックスの形成および／または活性化がＧ１進行においても速度を限定するものであると推測することは興味がある。細胞周期中にサイクリンＥが周期的に蓄積することは、サイクリンＥが比較的短い生存タンパク質であることを示唆しており、そしてその発生量のＧ１ピークは制限点での役割と一致していると思われる。更に、構成サイクリンＥ発現によるＧ１の長さの減少は、Ｓ期への進入がサイクリンＥの発生量によって制限されることを示唆している。しかし乍ら、構成サイクリンＥ発現によってＧ１が全て消失されるわけではないことを覚えておくことが重要である。Ｇ１の継続がサイクリンＥの発生量によって影響を受けない必須のＧ１期が幾らか存在すると最も考えられる。この例には、染色体の脱縮合や核膜集合が含まれると思われる。更に、或る状況下ではＧ１制限点はＳ期の開始前１時間未満で生起する（Ｗｙｎｆｏｒｄ−Ｔｈｏｍａｓ等、１９８５年）が、他の場合には制限点はＧ１よりかなり早い時期に生起する（Ｐａｒｄｅｅ、１９７４年）ことが報告されている。本発明者の測定は、最大のサイクリンＥ会合キナーゼ値がＧ１の比較的遅い時期に到達することを示唆している。このことは、Ｇ１の殆どがサイクリンＥ−会合キナーゼが検出されるより前に完結する血清刺激細胞で特に明白である（Ａ．Ｋ．およびＪ．Ｒ．、未発表の所見）。サイクリンＤおよびサイクリンＣのような他のサイクリンはＧ１中に発現することもでき（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ等、１９９１年；Ｍｏｔｏｋｕｒａ等、１９９１年；Ｌｅｗ等、１９９１年）、そして多数のサイクリン：ＣＤＫコンプレックスの連続的形成が細胞がＧ１を越えるために必要であることも考えられる。その場合には、構成サイクリンＥ発現はＧ１後期しか短縮しないであろう。
【００８８】
Ｓ．セレビシエでは、スタートの通過を制御する因子はＣＬＮ機能に、明らかに多数の値で、影響を与えることができる（ＣｈａｎｇｅおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９９０年；ＣｒｏｓｓおよびＴｉｎｋｅｌｅｎｂｅｒｇ、１９９１年）。類推によって、本発明者は哺乳動物細胞におけるＧ１サイクリン機能が細胞増殖を調節するタンパク質によって制御されると予想することができよう。例えば、サイクリンＥとＲｂタンパク質属のメンバーとの間の直接的相互作用を観察することは驚くべきことではなかったろう（Ｂａｎｄａｒａ等、１９９１年；Ｍｕｄｒｙｊ等、１９９１年；Ｓｈｉｒｏｄｋａｒ等、１９９２年；ＤｅＶｏｔｏ等、１９９２年）。更に、サイクリンＥ遺伝子の発現は１つまたはそれ以上の腫瘍原性転写因子によって制御されよう。
【００８９】
（実施例１４：構成的にサイクリンＥを発現する細胞の成長因子依存性）
全ての正常な高等真核生物細胞の細胞分裂周期は、細胞分裂に必要な特異的な細胞外成長因子によって制御される。既知の成長因子の属はさまざまであり、そしてインスリン、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ、エリスロポエチンおよび他の幹細胞因子のようなタンパク質が含まれる。種々の細胞タイプは、それらの細胞表面に発現された成長因子レセプターによってそしてそれらの分化の状態によって部分的に決定される特別の成長因子要件を示す。典型的には、細胞培養物中の細胞は増殖するためには動物血清（即ち、ウシ胎児血清）中に外来性の成長因子を要求する；または化学的に特定された血清不含培地中に特定の成長因子を添加しなければならない。必要な成長因子の不存在下では、細胞は分裂を停止しそしてＧ１で抑止される。上記実施例で示された結果は、サイクリンＥの値および／またはサイクリンＥ：細胞分裂キナーゼコンプレックスの活性がＧ１から細胞を移行させるのに速度限定である可能性を示した。それ故、細胞増殖がサイクリンの活性化（例えば、サイクリン遺伝子の転写または翻訳の増加；またはサイクリン：キナーゼコンプレックス活性の増加）を必要とする段階によって制御されそして成長因子がサイクリンを活性化させることによって細胞に作用するのであろうと理由づけられた。増殖にはサイクリンの活性化が必要であると仮定して、２つの仮説が考えられた：分化の特別の段階の細胞が１つの成長因子によって誘発させることができる１つのサイクリンを有しているという単一仮説；および１つの成長因子が多数のサイクリンを活性化しそして細胞の増殖を誘発するためには細胞内の全てのサイクリンの作用を組み合わせることが必要であるという多様仮説。単一仮説の単純な原因と結果の論理が真実であると思われる場合には、細胞内のサイクリンＥ値を修正すると細胞がインビトロで増殖する成長因子要件を変えるであろう；一方多様仮説が真実であると思われる場合には、１つのサイクリンの何らかの変更は細胞内の他の全てのサイクリンの作用によって隠蔽されるであろうと理由づけられた。これらの２つの仮説を試験するために、細胞はＬＸＳＮ−サイクリンＥベクター配列を用いて形質導入した。
【００９０】
ヒト線維芽細胞およびラットＲａｔ−１細胞の初代培養物はＬＸＳＮ一サイクリンＥベクター粒子で感染させるか、または対象としてＬＸＳＮで感染させた（実施例９に記載したようにして）。形質導入した細胞はサイクリンＥの発現について試験し（上記したようにして）、そしてＬＸＳＮ−サイクリンＥ−形質導入したＲａｔ−１およびヒト線維芽細胞はそれらが由来する細胞より３乃至５倍多い（そして対照のＬＸＳＮ−形質導入細胞より３乃至５倍多い）値のサイクリンＥタンパク質を発現することが見い出された。ＬＸＳＮ−サイクリンＥ−形質導入したヒト細胞の成長因子依存性は血清不含培地（Ｄ−ＭＥＭ）または１０％、１％、０．１％または０．０１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（表２）を補充した培地中で三重水素化チミジンのＤＮＡへの導入を測定することによって決定しそしてＲａｔ−１細胞の成長因子依存性は１０％、１．０％または０．１％血清中でＢｒｄＵの導入を測定して決定した（図１８Ａ〜１８Ｂ）。ＢｒｄＵアッセイでは、ＤＮＡを合成している細胞（即ち、Ｓ期の細胞）だけがＢｒｄＵをＤＮＡに導入しそしてアッセイで陽性と記録される。それ故、ＢｒｄＵ陽性細胞の蓄積速度は、１つの有糸分裂の終結からＧ１期を経由しそして次の回のＤＮＡ合成（即ち、Ｓ期）に移行する速度の相対的な尺度と考えることができる。図１８Ａおよび１８Ｂに示した結果は、ＬＸＳＮ−形質導入した対照Ｒａｔ−１細胞（「ＲＡＴ１／ＬＸ」、白丸）およびＬＸＳＮ−サイクリンＥ−形質導入した細胞（「ＲＡＴ１／サイクリンＥ」、黒丸）の培養物中でＢｒｄＵで標識した総細胞核のパーセントをノコダゾール処理によって誘導された有糸分裂抑止を解除した後の時間の関数として示す。細胞の成長因子依存性は１０％のウシ胎児血清中（図１８Ａ）または１％若しくは０．１％血清中（図１８Ｂ）で細胞を培養することによって評価した。図１８Ａおよび１８Ｂの結果は、ａ）培養培地中の血清のパーセントに関係なく、ＬＸＳＮ−サイクリンＥ−形質導入細胞は対照細胞より急速にＤＮＡ合成を開始し；そしてｂ）ＬＸＳＮ−サイクリンＥ−形質導入細胞は低い血清（即ち、０．１％）に対する耐性の増加を示しそしてＤＮＡ合成を対照細胞より約１０〜１２時間早く開始したことを示している（図１８Ｂ）。
【００９１】
同様な方法で、表２に示した結果はＬＸＳＮ−サイクリンＥ−形質導入ヒト線維芽細胞およびＲａｔ−１細胞が増殖の成長因子要件の減少を表わしていることを示している。対照細胞（即ち、ＬＸＳＮ−形質導入細胞）では、血清を１０％から０．１％に低下させたとき、速度は低下したが、細胞は増殖しそしてＤＮＡにチミジンを導入し続け、最適の成長因子値（即ち、１０％血清）の存在下では１１％の値が観察された。対照的に、ＬＸＳＮ−サイクリンＥ−形質導入細胞の増殖は最大値の１９％に減少した（１０％血清で見られた）がこの値は対照のＬＸＳＮ−血清導入細胞で見られた値より２倍以上高かった。更に、０．１％血清中で増殖しているサイクリンＥ−形質導入細胞にＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したとき、増殖値は１０％血清の存在下で生起する最大値の５０％であった（表２）。対照的に、０．１％血清中で増殖している対照のヒト線維芽細胞にＰＤＧＦを添加したとき、チミジン導入の刺激は観察されなかった。
【００９２】
【表２】
2004222728.tif 000003
ａ）＋＝培養培地に添加されたＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）；
０＝ＰＤＧＦなし；
ｂ）３Ｈ−ＴｄＲ、培養培地に１〜２μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−ＴｄＲを添加して３６時間後に測定した三重水素化したチミジンの導入；
ｃ）最大ＣＰＭパーセント、３Ｈ−ＴｄＲ  ＣＰＭの最大パーセント＝（０．１％でのＣＰＭ）／（１０％血清でのＣＰＭ）
（流動細胞計測法分析によって、０．１％血清の存在下ＬＸＳＮ−サイクリンＥ形質導入Ｒａｔ−１およびヒト線維芽細胞中で細胞周期進行中の細胞の継続的な存在が確認された。）
これらの結果を組み合わせると、ＬＸＳＮ−サイクリンＥ−形質導入Ｒａｔ−１細胞は細胞周期のＧ１期移行に関して成長因子依存性が減少している。
【００９３】
これらの組み合わせた結果は１つのサイクリン、即ちサイクリンＥが３〜５倍過剰に発現すると成長因子の不存在下で細胞が増殖する能力を部分的に（しかし完全にではない）回復することができ、そして１つの成長因子、ＰＤＧＦの存在下では増殖を完全に回復するという仮説を支持している。かくして、これらの結果は１つのサイクリンと１つの成長因子が特別の分化段階で細胞の増殖を制御するという単一仮説を支持することとなる；しかし乍ら、この解釈はデータの量的な特徴では支持されない。即ち、過剰発現は細胞を完全には成長因子非依存性としなかった。それ故、ＰＤＧＦの存在下ではサイクリンＥ以外のサイクリンが細胞増殖の刺激に関与している可能性も存在する。（かくして、これらの結果は幾つかのサイクリンと成長因子の活性を組み合わせて細胞増殖を促進するという細胞増殖の多様モデルに対する支持を提供していると解釈することができよう。）
要約すると、これらの結果は細胞増殖に関する単一モデルかまたは多様モデルのどちらかに対する支持を提供すると解釈することができる。解釈は別として、これらの結果は、インビトロで細胞を増殖させるのに必要な条件を劇的に変更するには、細胞内での１つのサイクリンの遺伝子操作および１つの成長因子による処理で十分であることを証明するのに重要である。これらの結果から、特定の細胞内でＧ１サイクリン発現を適当に組み合わせると、ａ）増殖が外来性成長因子の不存在下で非常に抑制される細胞株を製造することができ、そしてｂ）増殖が１つまたはそれ以上の選択された成長因子に依存性である細胞株を製造することができるように思われる。現在の調査結果に関する潜在的な長期間の重要性を考慮すると、サムハンクス（Ｓａｍ  Ｈａｎｋｓ）はハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を開発する研究にほぼ１０年かかり；イーグルがイーグル最少必須培地（ＭＥＭ）を開発するのに更に約３〜５年かかり；そしてレーンダルベッコ（Ｒｅｎｅ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）がＤ−ＭＥＭ処方を達成するのに更に長期間かかったことを思い出す価値があると思われる。（ＲＰＭＩ１６４０およびＭ１９９のような培地もやはりそれらの開発にどの位多くの処方が先行したかを意味する数を有している。）それ故、本明細書に記載した調査結果は、血清成長因子のほぼ完全な不存在下のインビトロで細胞の増殖を促進するためには細胞内で１つのタンパク質を簡単に操作することで十分であることを示しているので、非常に重要である。
【００９４】
（材料および方法）
プラスミドおよびライブラリー：ヒトｃＤＮＡライブラリーはＪ．コリセリ（Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ）およびＭ．ビグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）からの贈与品であった。これはベクターｐＡＤＮＳ内でヒト膠芽腫細胞様Ｕ１１８から調製した（Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ等、１９８８年）。これらの実験で使用したライブラリーの部分は＞２ｋｂであるように選択されたｃＤＮＡ挿入物を含有していた。ヒトＣＤＣ２相同体の単離に係わる実験では、サイクリンＥ  ｃＤＮＡをベクターｐＭＡＣに移植させた。この２μ系ベクターはＡＤＨプロモーターを使用してヒトｃＤＮＡの発現を行わせ、そしてＴＲＰ１選択マーカーを含有している。大腸菌でサイクリンＥを発現させるためには、全サイクリンＥコード化領域を含有するＳｍａＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントをベクターｐＧＥＸ−３Ｔ（Ａｍｇｅｎ）内の非反復Ｓｍａ１部位にクローン化させた。インビトロ転写／翻訳反応では、サイクリンＥのＳｍａＩ−ＮｏｔＩフラグメントをベクターｐＣＩＴＥ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）内のＭｓｃＩ部位にクローン化させた。ヒトサイクリンＡおよびＢのインビトロ翻訳では、開始メチオニンで遺伝子操作されたＮｃｏＩ部位を有するｃＤＮＡはジョナサンパインズ（Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｐｉｎｅｓ）およびトニーハンター（Ｔｏｎｙ  Ｈｕｎｔｅｒ）によって豊富に提供された。ＰＣＩＴＥベクターをＳａＩＩで開裂し、クレノウ酵素でブラント末端とし、そしてその後非反復ＮｃｏＩ部位で開裂させた。サイクリンｃＤＮＡはＥｃｏＲＩ（サイクリンＡに対して）またはＢａｍＨＩ（サイクリンＢに対して）で開裂して単離し、クレノウでブラント末端とし、そしてその後非反復ＮｃｏＩ部位で開裂させた。ツメガエルＣＤＫ２クローン、ｐＥＭＢＬＹ８３０／２は以前に記載されている（Ｐａｒｉｓ等、１９９１年）。酵母での幾つかのアッセイでは、サイクリンＡ、ＢおよびＥ  ｃＤＮＡｓは、ＡＤＨタンパク質の最初の１０個のアミノ酸を融合させて発現タンパク質にすることを除いてｐＡＤＮＳと同一であるベクターｐＡＤＮＳ中にクローン化させた。
【００９５】
（抗体：）  ヒトＣＤＣ２のＣ末端に対応するペプチドＹＬＤＮＱＩＫＫＭ（配列ＩＤ．Ｎｏ．３）を化学的に合成し、ウサギヘの注射用にチロシン残基を介してＢＳＡに共有結合させた。アフィニティー精製用に、ウサギ血清を５０％硫酸アンモニウムで沈降させ、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）に再懸濁させ、そして１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）で徹底的に透析した。アフィニティーカラムはファルマシアが推奨する条件を使用してペプチドをＣＮＢｒ活性化セファロースにカップリングさせて調製した。透析物はＰＢＳ中で平衡化したアフィニティーカラムに適用した。続いてこの実施を２回実施した。カラムをカラム容量の１０倍のＰＢＳ＋２Ｍ  ＫＣｌで洗浄し、そして続けてカラム容量の１０倍の５Ｍ  ＮａＩ＋１ｍＭチオ硫酸ナトリウム（使用前に新たに作成した）で溶出した。免疫グロブリンを含有するフラクションは２９０での吸光度で決定し、集め、そしてＰＢＳに対して徹底的に透析した。ＣＤＣ２遺伝子属の保存「ＰＳＴＡＩＲＥ」領域に対応するペプチドＣＥＧＶＰＳＴＡＩＲＥＩＳＬＬＫＥ（配列ＩＤ．Ｎｏ．４）を化学的に合成しそしてシステイン残基を介してアオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）にカップリングさせ、そしてウサギで抗体を作らせて上記したようにしてアフィニティー精製した。ヒトサイクリンＡの残基１０４〜１２３に対応するペプチドＹＤＥＡＥＫＥＡＱＫＫＰＡＥＳＱＫＩＥＲＥ（配列ＩＤ．Ｎｏ．５）を化学的に合成し、そしてＢＳＡにカップリングさせ、そしてウサギで抗体を作らせて上記したようにしてアフィニティー精製した。
【００９６】
ＣＤＫ２に向けた抗体はアオガイヘモシアニンにカップリングさせたヒトＣＤＫ２の１５Ｃ末端アミノ酸に対応するペプチドに対して生じさせた。ヒトＣＤＫ２の９Ｃ末端アミノ酸に対する他の２つの抗血清もこれらの実験の途中で使用した（Ｅｌｌｅｄｇｅ等、１９９２年；Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ等、１９９２年）。ポリクローナル抗サイクリンＥ抗血清は記載されている（Ｋｏｆｆ等、１９９１年）。
【００９７】
サイクリンＥ抗体の調製には、ＧＥＸ−ｃｙｃＥを含有する大腸菌（以下参照）をＯＤ６００が０．４〜０．６になるまで増殖させ、そして融合タンパク質発現は１０ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。３０℃で更に３時間増殖させた後、大腸菌をペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄し、そしてＧＥＸ緩衝液Ａ（６０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５％スクロース、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で再度洗浄し、そして−７５℃で貯蔵した。細胞は、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１００μｇ／ｍｌの大豆トリプシンインヒビター（ＳＢＴ１）および１０μｇ／ｍｌのＮ−トシル−Ｌ−フェニルアラニン  クロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）を含有するＧＥＸ緩衝液Ａ中で元の培養物容量の１／３０で再懸濁した。プロテアーゼインヒビターを以後の全ての段階で使用した。ＳＤＳを０．０３％となるように添加し、そして音波処理して細胞を溶解させた。溶解物は１３，０００Ｘｇで遠心して清明とし、そして０．０３％ＳＤＳを有するＧＥＸ緩衝液Ｃ（０．０２Ｍ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％グリセリンおよびｌｍＭ  ＤＴＴ）中でセファロースＣＬ４Ｂと１：１になるように添加し、４℃で１時間インキュベートし、そして低速遠心によってセファロースを除去した。清明溶解物はグルタチオン−アガロースビーズ（ＳＩＧＭＡ＃Ｇ４５１０）（グルタチオン−アガロースビーズ１ｍｌ当たり約３６０μｇのＧＥＸ−サイクリンＥ）と共に４℃で１時間インキュベートした。アガロースビーズをペレット化し、そして０．０３％のＳＤＳを有する１０倍容量のＧＥＸ緩衝液Ｃで５回洗浄し、そして０．０３％のＳＤＳと５ｍＭのグルタチオンを有する緩衝液ＣでサイクリンＥ融合タンパク質（ＧＥＸ−Ｅ）を溶出した。ＧＥＸ−Ｅを含有するフラクションはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびクーマシーブルー染色で確認した。フロイントの完全アジュバント中４００μｇの総ＧＥＸ−Ｅタンパク質をウサギに注射した：３２０μｇを皮下注射しそして８０μｇを筋肉内注射した。ウサギは、フロイントの不完全アジュバントを使用した以外同じレジメンを使用して３週間毎に追加抗原刺激した。注射後７日間瀉血して血液を得、そしてそれらがウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で産生されたサイクリンＥを免疫沈降させる能力によって分析した。
【００９８】
サイクリンＥ抗血清の特異性はインビトロで翻訳されたサイクリンＥ、ＡおよびＢの免疫沈降によって証明された。インビトロで翻訳されたサイクリンは製造者の指示に従って製造した。簡単に言えば、プラスミドをＮｈｅＩ（サイクリンＢ／サイクリンＥ）またはＰｓｔＩ（サイクリンＡ）のいずれかで直線化した。続いてサイクリンＡは、転写反応の前にクレノウ（Ｋｌｏｎｗ）酵素でブラント末端とした。転写はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して実施し、そしてＲＮＡはエタノール沈降で単離した。ウサギ網状赤血球溶解物はＲＮＡでプログラミングし、そして３０℃で２時間インキュベートした。プログラミングした溶解物（５μｌ）は５００μｌの５０ｍＭ  トリス−ＨＣＩ、ｐＨ７．４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％  ＮＰ−４０中１０μｌのサイクリンＥ抗血清と共に４℃で１時間インキュベートした。タンパク質Ａ−セファロースを添加し、そしてインキュベーションを１時間継続した。タンパク質Ａビーズをペレット化し、そして５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡで４回洗浄した。免疫沈降物を試料緩衝液に再懸濁し、そして１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。ゲルを固定しそして１Ｍのサリチル酸ナトリウムで強化した後、乾燥しそしてオートラジオグラフィーにかけた。
【００９９】
サイクリンＥ抗体はＧＳＴ−サイクリンＥ融合タンパク質のカラムでアフィニティー精製した。約１００ｍｌのウサギ血清は５０％の硫酸アンモニウムで沈降させた。この沈降物を８，０００Ｘｇで集めそして１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０に再懸濁し、そしてＰＢＳで透析した。透析物は１０％のグリセリンに調整し、そしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）カラムで予め清明化した。流出フラクションを集め、そしてカラムは０．２Ｍグリセリン、ｐＨ２．２で洗浄して再生させた。カラムはＰＢＳで再度平衡化し、そしてこの方法を３回繰り返した。
【０１００】
続いて清明な血清をＧＳＴ−サイクリンＥカラムに適用した。吸着後、カラムは先ずＰＢＳでそしてその後２Ｍ  ＫＣｌ−ＰＢＳで洗浄し、そして結合抗体は記載されたようにしてＮａＩ−チオ硫酸ナトリウムで溶出した（Ｋｏｆｆ等、１９９１年）。溶出物はカップリング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で透析し、そしてセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）１０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して５〜１０倍に濃縮した。
【０１０１】
（ＤＮＡ配列決定：）  サイクリンＥ  ｃＤＮＡの重なり合った欠失はジデオキシチェーンターミネーター法を使用して両ストランドの配列を決定した。
【０１０２】
（キナーゼアッセイ：）  ＧＥＸ−サイクリンＥ（ＧＥＸ−Ｅ）はグルタチオン−アガロースに結合したＧＥＸ−Ｅの洗浄まで上記したようにして精製した。この実験では、ビーズは０．０３％ＳＤＳを有する５容量のＧＥＸ緩衝液Ｃで３回、０．５％のトリトンＸ−１００を有する１０容量の緩衝液Ｃで５回、１０容量の緩衝液Ｄ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）で５回洗浄した。１００μｌのＧＴ−サイクリンＥ−セファロースビーズ、ｐ１３−セファロース（セファロース１ｍｌ当たり５ｍｇのｐ１３）、ＧＴ−セファロースまたはブランクセファローズは、ＳＶ４０  ＤＮＡのインビトロ複製で使用した条件（緩衝液Ｄに３μｇのクレアチンホスホキナーゼ、４０ｍＭのホスホクレアチン、０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．５ｍＭのＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰ、３ｍＭのＡＴＰを加える）下でヒトＭＡＮＣＡ  Ｇ１細胞（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＤ’Ｕｒｓｏ、１９８８年）から得た１００μｇのＳ−１００抽出物と共にインキュベートした。次に、ビーズをペレット化し、そして０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを加えたキナーゼ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）中で５回洗浄した。キナーゼアッセイでは、ビーズを５０μｌのキナーゼ緩衝液＋３０μＭのＡＴＰ、５μＣｉγ−３２Ｐ−ＡＴＰおよび１μｇのヒストンＨ１中に再懸濁し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。産生物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてオートラジオグラフィーで分析した。
【０１０３】
ＳＤＳ−ＧＴ−サイクリンＥ−セファロースビーズに結合したキナーゼを試験するために、ＧＴ−サイクリンＥビーズおよびＧＴビーズを調製し、そしてＧ１抽出物と共にインキュベートし、そして記載したようにして洗浄した。ＴＮＴ（２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  トゥイーン−２０）および５ｍＭのグルタチオン（還元型）中３７℃で３０分間ビーズをインキュベーションすると、グルタチオンとの相互作用によってビーズに結合したタンパク質を放出させるのに十分であった。上清液を新たな管に移し、そしてｐ３４ｃｄｃ２のＣ末端に向けられアフィニティー精製した抗血清で免疫沈降させた。免疫沈降物（タンパク質Ａ−セファロースを有する）はＴＮＴ中で３回洗浄し、そして記載されたヒストンＨ１キナーゼアッセイで使用した。
【０１０４】
結合ＣＤＣ２キナーゼによるＧＴ−サイクリンＥタンパク質のリン酸化を示すために、ＧＴ−サイクリンＥビーズを調製し、そしてＧ１抽出物と共にインキュベートし、そしてヒストンＨ１に関して上記したキナーゼアッセイで使用した；しかし乍ら、このアッセイにはヒストンＨ１は含めなかった。インキュベーション後に、ペレットはＨ１キナーゼ緩衝液＋０．ｌｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、その後３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．２Ｍ  ＮａＣｌで、そして最後にＴＮＴで洗浄する。次に、ビーズはｌｍｌのＴＮＴおよび５ｍＭグルタチオン（ｐＨ７．５）と共に３７℃で３０分間インキュベートしてＧＴ−サイクリンＥ融合タンパク質を放出させた。次に、上清液を集めそしてサイクリンＥに向けられた抗血清で免疫沈降させた。続いて免疫コンプレックスをタンパク質Ａ−セファロースに付着させて集めた。免疫沈降物はＴＮＴで３回洗浄し、そして生成物は１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、続いてオートラジオグラフィーで分析した。
【０１０５】
ＨｅＬａ細胞抽出物から得られるサイクリンＥを免疫沈降させるために、２×１０６個の細胞は５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５６ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％  ＮＰ−４０に溶解させ、そして１００，０００Ｘｇで３０分間の超遠心によって清明化した。試料は、正常なウサギ血清またはサイクリンＥ融合タンパク質に対して産生させた血清１５μｌを用いてタンパク質Ａ−セファロースを使用して免疫沈降させた。免疫沈降物はキナーゼ緩衝液および０．ｌｍｇ／ｍ１のＢＳＡで洗浄し、そしてキナーゼアッセイは上記したようにして実施した。
【０１０６】
Ｔ−ペプチドキナーゼアッセイは以前に記載されたようにして実施した（Ｄ’Ｕｒｓｏ等、１９９０年）。
【０１０７】
（酵母株：）  使用した酵母株は株ＹＨ１１０と同系であった（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等、１９８９）。ＣＬＮ１、ＣＬＮ２およびＣＬＮ３のマークされていない欠失はこの株のバックグラウンドで構築された。これらの欠失はＣＬＮ１およびＣＬＮ２におけるサイクリン相同性の重要な．部分を除去する（Ｈａｄｗｉｇｅｒ等、１９８９年；ＣｒｏｓｓおよびＴｉｎｋｌｅｎｂｅｒｇ、１９９１年）と、ＣＬＮ３コード化配列は完全に欠失した（Ｃｒｏｓｓ、１９９０年）。欠失対立遺伝子は全て以前に記載されたアッセイによりヌル（ｎｕｌｌ）対立遺伝子であった（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等、１９８９年）。これらの欠失対立遺伝子は最初に記載されたｃｌｎ破壊（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等、１９８９年）とは異なって、マークされておらず、そしてそれ故本明細書で実施したプラスミド形質転換実験と適合した。ｃｌｎ欠失株は以前に記載されたＧＡＬ−ＣＬＮ３プラスミドで生存し続けた（Ｃｒｏｓｓ、１９９０年）。この同系株のバックグラウンドのｃｄｃ２８−１３対立遺伝子はＤ．リュー（Ｌｅｗ）によって提供され、そして対合および四分子分析によって３っのｃｌｎ欠失と組み合わせた。
【０１０８】
（酵母トランスフェクション：）  トランスフェクションはシーストル（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ）およびギーツ（Ｇｉｅｔｚ）（１９８９年）の方法に従って酢酸リチウム法を使用して実施した。ガラクトース中で増殖させた酵母細胞は、２μｇのライブラリーＤＮＡを用いて５０個の別々の各分別物中でトランスフェクションさせた。形質転換体はロイシン原栄養株についてガラクトースで選択しそして典型的にはプレート当たり１０００〜２０００個の数であった。コロニーを２日間増殖させ、そしてその後レプリカをＹＥＰ−グルコースにプレーティングした。グルコースで増殖したコロニーはＦＯＡ培地（Ｂｏｅｋｅ等、１９８４年）にパッチとしてＧＡＬ−ＣＬＮ３プラスミドがなくても増殖できるコロニーを確認した。プラスミドＤＮＡは、このスクリーンで生き残ったコロニーからエレクトロポーレーションによって大腸菌中に取り戻し、そしてミニ調製物を５８９−５株酵母細胞中に再度トランスフェクションさせてトリプルｃｌｎ欠失のプラスミド依存性の相補性を同定した。ヒトＣＤＣ２相同体を同定するスクリーンに対して、グルコースで増殖するコロニーは、グルコース増殖の同時分離およびトランスフェクションさせたプラスミドの保持について試験した。
【０１０９】
（サイクリンＥレトロウイルスベクターの構築）  サイクリンＥレトロウイルスベクター（ＬＸＳＮ−サイクリンＥ）はヒトサイクリンＥ  ｃＤＮＡ  ＨＵ４のブラント末端のＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（Ｋｏｆｆ等、１９９１年）（これは完全なオープン読み取り枠を有している）をＬＸＳＮのＨｐａＩ部位、ネズミレトロウイルスに基づくベクター（ＭｉｌｌおよびＲｏｓｍａｎ、１９８９年）中にセンス方向に挿入して構築させた。
【０１１０】
（細胞）
ＭＡＮＣＡ細胞は、５％のＣＯ２を含有する雰囲気中２〜５×１０５個の細胞／（ＲＰＭＩ＋１０％仔ウシ血清）ｍｌで維持した。指数的増殖集団から遠心水力分級によって細胞を分画した（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｏ等、１９９２年）。Ｇ１／Ｓ境界で同調させるため、約１ｘ１０８個のＧ１細胞を、ＭＡＮＣＡ細胞の指数的増殖集団から水力分級によって集め、そして１０％仔ウシ血清および５μｇ／ｍｌのアフィジコリンを含有するＲＰＭＩ中に接種し、そして８時間増殖させた。細胞ＤＮＡ含量の流動細胞計測法測定を使用して細胞集団の同調を証明した。Ｇ１で同調したＭＡＮＣＡ細胞は、以前に記載されたのと全く同じようにして調製した（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｏ等、１９９２年）。
【０１１１】
Ｒａｔ  ＰＣ−１２細胞は、１０％のＣＯ２を含有する雰囲気中５％のウシ胎児血清および１０％のウマ血清を含有するＤＭＥＭ中で維持した。ニューロン分化を誘導するために、集密細胞を１：２０に分け、そして２日目に培地を血清不含培地に置き換えた。細胞は血清不含培地中で２４時間インキュベートし、そしてその後培地は５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを含有する完全培地に変えた。ＮＧＦは２日毎に加えそして細胞は４〜５日後に採取した。
【０１１２】
Ｒａｔ  ２０８Ｆ細胞は、５％のＣＯ２を含有する雰囲気中１０％仔ウシ血清を加えたＤＭＥＭ中で維持した。静止細胞を産生させるために、細胞はＰＢＳで２回洗浄し、そして続いて０．１％仔ウシ血清を有するＤＭＥＭ中で４８時間増殖させた。
【０１１３】
Ｒａｔ−１細胞でのＧ１の長さを測定するために、細胞は１００ｎｇ／ｍｌのノコダゾールを添加して擬似中期で４時間同調させた。有糸分裂細胞は静かにピペットで取って集めた。次に、細胞はＤＭＥＭで洗浄し、そしてＤＭＥＭ＋１０％仔ウシ血清を用いて２×１０４／３５ｍｍ皿でプレーティングした。細胞は各時点で三重水素化チミジン（８０Ｃｉ／ミリモル；２μＣｉ／ｍｌ）を用いて３０分間パルス標識した。ＤＮＡ中へのチミジンの導入は記載されたようにして測定した（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＤ’Ｕｒｓｏ、１９８８年）。
【０１１４】
サイクリンＥを構造的に発現させたＲａｔ−１細胞は記載されたようにして産生させた（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、１９８９年）。ＰＡ３１７アンホトロピックレトロウイルスパッケージング細胞は１日目に６０ｍｍの皿当たり５×１０５個の細胞でプレーティングした。２日目に、リン酸カルシウム法（Ｏｈｔｓｕｂｏ等、１９９１年）の修正を使用して１μｇのＬＸＳＮ−サイクリンＥまたは対照ＤＮＡ  ＬＸＳＮを細胞内にトランスフェクションさせた。３日目に、培養培地を新鮮な培地に取り替え、そしてＰＥ５０１エコトロピックパッケージング細胞を６０ｍｍの皿当たり１０５個の細胞をプレーティングした。４日目に、ＰＥ５０１細胞に、ポリブレンを含有する新鮮培地４ｍｌを与えた。ＰＡ３１７細胞からウイルスを採取し、そしてこの材料を５μｌから１ｍｌ使用してＰＥ５０１細胞を感染させた。５日目に、ＰＥ５０１細胞をトリプシン処理し、そして０．８ｍｇ／ｍｌのＧ−４１８を含有する培地中で１０ｃｍの皿にプレーティングした。クローニングリングを使用して個々のクローンを単離するために少数のコロニーを有する皿を使用した。次に、これらのクローン株をサザーンブロット分析法で分析し、そしてウイルス産生細胞株として増殖した再転移していないレトロウイルスゲノムを含有するベクターの力価および適当なクローン株についてアッセイした。ＬＸＳＮおよびＬＸＳＮ−サイクリンＥウイルスを使用してＲａｔ−１細胞を感染させ、そして更に研究するためにＧ−４１８耐性細胞集団を使用した。
【０１１５】
（ＧＳＴおよびＧＳＴ−Ｅカラムの調製）
プラスミドｐＧＥＸ−２ＴまたはｐＧＥＸ−２ＴｃｙｃＥ（ＧＥＮ−サイクリンＥ）を含有する大腸菌は、ＯＤ６００＝０．４になるまで増殖させ、そして０．４ｍＭのＩＰＴＧを用いて３０℃で４時間誘導させた。細胞を採取し、そしてＰＢＳ中で１回洗浄し、そして−７０℃で貯蔵した。ｐＧＥＸ−２ＴでコードされるＧＳＴは以前に記載されたようにしで調製した（Ｋｏｆｆ等、１９９１年）。ｐＧＥＸ−２ＴｃｙｃＥでコードされる融合タンパク質ＧＴ−サイクリンＥ（ＧＴ−ｃｙｃＥ）はグロッツァ（Ｇｌｏｔｚｅｒ）等（１９９１年）の方法の修正を使用して調製した。５００ｍｌの培養物から得られた細胞ペレットは、プロテアーゼインヒビターを有する７ｍｌの１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｌｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ中で音波処理した。抽出物は１３，０００Ｘｇで遠心して清明化し、そして上清液は廃棄した。ペレットを７ｍｌのＴＮＤ緩衝液（０．２Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．２、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ）中で再懸濁し、そして再度ペレット化した。上清液を廃棄した後、ペレットは５ｍＭ  ＤＴＴを含有する８Ｍのウレア中に再懸濁し、４℃で４時間静かに混合した。
得られた抽出物は１３，０００Ｘｇで１０分間清明化し、そして上清液はＴＮ緩衝液（即ち、５ｍＭのＤＴＴの変わりに１ｍＭのＤＴＴを含有するＴＮＤ緩衝液）で透析した。
【０１１６】
少なくとも２．５ｍｇのＧＴかまたはＧＴ−ｃｙｃＥのいずれかを１ｍｌのグルタチオンアガロースビーズと共に４℃で２時間インキュベートし、そして続いて１０００Ｘｇで集め、そして１ｍＭのＤＴＴを含有するＴＮ緩衝液で３回洗浄した。ＧＴまたはＧＴ融合タンパク質とグルタチオンアガロース支持体とのカップリングは次のプロトコールを使用して実施した。この支持体をカラムに移し、そして０．１Ｍのホウ酸塩緩衝液、ｐＨ８．０、続いて０．２Ｍのトリエタノールアミン、ｐＨ８．２で洗浄した。ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）交差結合剤（４０ｍＭ  ＤＭＰ、０．２Ｍトリエタノールアミン、ｐＨ８．２）をカラムに入れ，メニスカスだけを残した。室温でカップリングを１時間継続させた。カップリング後に、カラムを４℃とし、そして４０ｍＭのエタノールアミン、ｐＨ８．２、続いて０．ｌＭのホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０で洗浄した。カップリングしていないタンパク質を溶出するために、カラムは２０ｍＭのグルタチオンを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．５で洗浄し、そして続いて０．５％のアジドを含有するＰＢＳ中で貯蔵した。
【０１１７】
（Ｈ１キナーゼアッセイ）
８．３×１０６個の細胞はプロテアーゼインヒビター（１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ、２０μｇ／ｍｌ  ＳＢＴＩ、１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）を含有する１００μｌのＨ１溶解緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ４０）中で音波処理して溶解させた。音波処理した溶解物は１３，０００Ｘｇで１０分間４℃で清明化し、そして上清液を新たな管に移し、そして新鮮なＨ１溶解緩衝液で２倍に希釈した。
【０１１８】
５０μｌの抽出物は、サイクリンＥまたはｐ３４ＣＤＣ２のＣ末端に対するポリクローナル抗血清２μｌで１時間免疫沈降させた。サイクリンＡ免疫沈降では、溶解物は５μｌのＣ１６０モノクローナル抗体と共に３０分間、そして２μｌのウサギ抗マウス抗体を添加した後更に３０分間インキュベートした。免疫コンプレックスはタンパク質Ａセファロースで採集し、溶解緩衝液で２回そしてＨ１キナーゼ緩衝液（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）で４回洗浄した。Ｈ１キナーゼ反応は以前に記載されたようにして実施した（Ｋｏｆｆ等、１９９１年）。
【０１１９】
（免疫沈降−ウエスターンプロット分析法用溶解物の調製）
細胞（８．３×１０６／１００μｌ）は、プロテアーゼインヒビターを含有するＳＤＳ−ＲＩＰＡ（１％  デオキシコレート、１％  トリトンＸ−１００、０．１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  オルトバナデート、５０ｍＭ  ＮａＦ）中で音波処理して溶解させた。これらの実験では、製造者の推奨に従って、約１ｍｇのアフィニティー精製した抗体または１ｍｌのサイクリンＥ前免疫血清を１ｍｌのＣＮＢｒ−活性化セファロースとカップリングさせた。Ｇ１／Ｓ境界で抑止された細胞を使用する実験では、２．５×１０７個の細胞および１００μｌの抗体結合セファロースを使用して、ＣＮＢｒ−活性化セファロースにカップリングしたアフィニティー精製抗体により免疫沈降法を実施した。遠心水力分級によって得られた細胞周期フラクションの試験では、本発明者は３０μｌの抗サイクリンＥセファロースを有する１×１０７個の細胞を使用した。
【０１２０】
免疫コンプレックスは４℃で３時間形成させ、そしてその後５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＳＤＳ−ＲＩＰＡで２回、そしてＳＤＳ−ＲＩＰＡで３回洗浄した。試料はレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試料緩衝液中に懸濁し、そして１２％ＰＡＧＥゲルで分離した。ゲルは、半乾燥エレクトロブロット法でニトロセルロ一スに移し、そして膜は、ＣＤＣ２若しくはＣＤＫ２に対してＴＮＴ（２５ｍＭ  トリス−ＨＣＩｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  トゥイーン−２０）中２％のミルクかまたはサイクリンＥに対してＴＮＴ中１％のゼラチンでブロックした。ブロットはアフィニティー精製した抗ＣＤＣ２の１：３００希釈、または抗ＣＤＫ２血清の１：１０００希釈、またはアフィニティー精製したサイクリンＥ抗体の１：１０００希釈のいずれかを使用して室温で一夜探査した。続いて、１２５Ｉ−タンパク質Ａを用いて結合抗体を検出した。
（引用文献）
【０１２１】
【表３】
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本発明の好ましい実施態様を説明しそして記載したが、本発明の精神および範囲から離れることなくこれら実施態様に種々の変更を行うことができると考えられよう。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
図に示されるヒトサイクリンＥｃＤＮＡ配列の１位から１１８５位の間に存在するヌクレオチド配列と緊縮条件下でハイブリッド形成することができる核酸分子とこのような核酸分子によってコードされたポリペプチドおよびこのようなポリペプチドに向けられた免疫学的結合パートナーに関するものである。本発明の合成サイクリンＥポリペプチドは、Ｇ１期からＳ期に移行している細胞を抑制するだけで、既に有効に有糸分裂しているような細胞は抑制しない。かくして、免疫応答の誘導の抑制；継続中の免疫応答のクローン増大（即ち、ＴかまたはＢリンパ球のどちらか）の中断；Ｇ１期からＳ期に移行しつつある腫瘍細胞または転移細胞の成長因子で誘導される増殖の抑制；そして成長因子で誘導される組織肥大（例えば、アテローム性動脈硬化症プラークにおけるような血管平滑筋細胞の増殖、リウマチ性関節におけるような線維芽細胞や結合組織細胞の間葉肥大等の抑制）において利用可能である。本発明の選択的インヒビターは、例えば、ａ）インビトロの試験細胞中のサイクリンＥポリペプチドまたはｍＲＮＡの値を減少させる（または増加させる）（即ち、向じタイプの対照細胞と比べて）；ｂ）ＣＤＫ２とコンプレックスを形成することができるサイクリンＥの値を減少させる（または増加させる）；またはｃ）哺乳動物細胞中の細胞周期依存性キナーゼのＣＤＫ２属のメンバーに対するサイクリンＥポリペプチドの結合親和性を減少させる（または増加させる）ことにおいて利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１Ａ】図１ＡはヒトサイクリンＥによるトリプルｃｌｕ欠失の相補性を示す：Ｓ．セレビシエ株５８９−５は染色体ＣＬＮ１、−２および−３遺伝子の欠失を有しておりそして多重複製エピソームにＧＡＬ１−ＣＬＮ３遺伝子を有している。この株は、ｐＡＤＮＳ発現ベクターまたはヒトサイクリンＥ  ｃＤＮＡを含有するｐＡＤＮＳベクターで形質転換した。形質転換体、そしてその親株をガラクトースにストリークしそして３０℃で３日間増殖させた。
【図１Ｂ】図１ＢはヒトサイクリンＥによるトリプルｃｌｕ欠失の相補性を示す：Ｓ．セレビシエ株５８９−５は染色体ＣＬＮ１、−２および−３遺伝子の欠失を有しておりそして多重複製エピソームにＧＡＬ１−ＣＬＮ３遺伝子を有している。この株は、ｐＡＤＮＳ発現ベクターまたはヒトサイクリンＥ  ｃＤＮＡを含有するｐＡＤＮＳベクターで形質転換した。形質転換体、そしてその親株をグルコースにストリークしそして３０℃で３日間増殖させた。
【図２Ａ】図２Ａ（配列ＩＤ．Ｎｏ．１〜２）はサイクリンＥの配列：トリプルｃｌｎ欠失を相補ったサイクリンＥ  ｃＤＮＡのＤＮＡと予測されるタンパク質配列を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂ（配列ＩＤ．Ｎｏ．１〜２）はサイクリンＥの配列：トリプルｃｌｎ欠失を相補ったサイクリンＥ  ｃＤＮＡのＤＮＡと予測されるタンパク質配列を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃ（配列ＩＤ．Ｎｏ．１〜２）はサイクリンＥの配列：トリプルｃｌｎ欠失を相補ったサイクリンＥ  ｃＤＮＡのＤＮＡと予測されるタンパク質配列を示す。
【図３Ａ】図３は、ヒトサイクリンＡ、ＢおよびＥのタンパク質配列の整列を示す：サイクリンＡ、ＢおよびＥのタンパク質配列は相同性を最大とするように整列させた。ボックスは同一アミノ酸を示す。３つのサイクリン全てに共有されているアミノ酸は３つの配列の上部にボールド体で示されている。二重のボールド体の線で強調した領域は全ての既知のサイクリン中で特に保護された領域（「サイクリンボックス」）である。一本のボールド体の線で強調された領域はＡ−およびＢ−タイプのサイクリンの全てに共有されている有糸分裂破壊モチーフである。
【図３Ｂ】図３は、ヒトサイクリンＡ、ＢおよびＥのタンパク質配列の整列を示す：サイクリンＡ、ＢおよびＥのタンパク質配列は相同性を最大とするように整列させた。ボックスは同一アミノ酸を示す。３つのサイクリン全てに共有されているアミノ酸は３つの配列の上部にボールド体で示されている。二重のボールド体の線で強調した領域は全ての既知のサイクリン中で特に保護された領域（「サイクリンボックス」）である。一本のボールド体の線で強調された領域はＡ−およびＢ−タイプのサイクリンの全てに共有されている有糸分裂破壊モチーフである。
【図４】図４は、ＣＤＣ２８またはｃｄｃ２８−１２株におけるヒトサイクリンＥおよびＢによるトリプルｃｌｎ欠失の救済の有効性を示す試験した株は全てｃｈｌ−ｃｌｎ２−ｃｌｎ３−（ｐＧＡＬ−ＣＬＮ３）であった：これらの株は指示されたベクタープラスミド、ｐＡＤＮＳ若しくはｐＡＤＡＮＳまたは、ロイシン原栄養株を選択することによってヒトサイクリンＥ若しくはＢのいずれかを含有するベクタープラスミドで形質転換した。ベクターｐＡＤＮＳはｃＤＮＡ発現用の酵母ＡＤＨプロモーターを使用する。ベクターｐＡＤＡＮＳは、発現されたタンパク質がそのアミノ末端でＡＤＨタンパク質の最初の１０アミノ酸と融合していることを除いて、ｐＡＤＮＳと同一であった。プラスミドｐＡＤＮＳ−ＣＹＣ  Ｂでは形質転換体を得ることができず、これが致死的であったことを示唆していた。ガラクトースでの静止相培養の接種物の生存コロニー数は、連続希釈し続いてガラクトース含有培地およびグルコース含有培地の両方で３０℃で４〜５日間増殖させて測定した。平板効率は、ガラクトース生存コロニー数で割ったグルコース生存コロニー数として定義される。細胞を有するプラスミドから生じるコロニーだけを計算に使用する。ＹＣおよびＹＥＰ培地の両方を使用して比較結果を得た。ベクターおよびｐＡＤＮＳ−ＣＹＣＥの値はＣＤＣ＋株とｃｄｃ２８−１３株の２つの異なる対を使用する４つの実験で測定した（１つのＣＤＣ＋株と１つのｃｄｃ２８−１３株を各実験で平行して使用した）。ｐＡＤＡＮＳ−ＣＹＣＥ値は１回の実験から得ている。サイクリンＢ値は、共にＣＤＣ＋株とｃｄｃ２８−１８株の同じ対を使用する２っの実験で測定した。株は全て同系であった。ＣＤＣ＋株での値の範囲：ｐＡＤＮＳ−ＣＹＣ  Ｅで、０．１２〜０．４；ｐＡＤＡＮＳ−ＣＹＣＢで、０．１９〜０．３３；ｃｄｃ２８−１３株では、ｐＡＤＮＳ−ＣＹＣＥで、０．０００６〜０．００８；そしてｐＡＤＡＮＳ−ＣＹＣＢで、０．２〜０．４であった。両サイクリンＥプラスミドでは、グルコース培地でのｃｄｃ２８−１３株のコロニーサイズはＣＤＣ＋株のコロニーサイズよりかなり小さく；サイクリンＢプラスミドでは、コロニーサイズはＣＤＣ＋株とｃｄｃ２８−１３株で類似していた。
【図５】図５は酵母株の構成を示しており、その際ＣＤＣ２９はスタートには不十分であるがＧ２／Ｍには不十分でない：酵母株１２３８−１４  Ｃ−ｃｙｃＥは次の関係遺伝子型を有している：ｃｌｎ１−  ｃｌｎ２−  ｃｌｎ３−  ｃｄｃ２８１３（ｐＡＤＨ−ｃｙｃＥ−ＴＲＰ１、ｐＧＡＬ−ＣＬＮ３−ＵＲＡ３）。この株でのＧ１／ＳおよびＧ２／Ｍ移行を制御する想像上のサイクリンーｃｄｃ２８−１３コンプレックスを示す。ガラクトースかまたはグルコースのいずれかで形成するサイクリン−ｃｄｃ２８−１３コンプレックスおよび３０℃または３８℃でのこれらコンプレックスの機能的活性を示す。ＣＬＢはＢタイプのサイクリンのＳ．セレビシエ相同体を呼称するために使用される命名である。３０℃のグルコースでは、この株はスタートには不十分であるがＧ２／Ｍには不十分でない。
【図６】図６は、ヒトＣＤＣ２またはヒトＣＤＫ２と結合したヒトサイクリンＥによるｃｄｃ２８−１３株でのトリプルｃｌｎ欠失の救済効率を示す：遺伝子型ｃｌｎ１−  ｃｌｎ２−  ｃｌｎ３−  ｃｄｃ２８−１３（ｐＧＡＬ−ＣＬＮ１／ＵＲＡ３）の株はｐＭＡＣ−ＴＲＰ１−ＣＹＣＥとｐＡＤＮＳ−ＬＥＵ２−ＣＤＣ２−ＨＳかまたはｐＭＡＣ−ＴＲＰ１−ＣＹＣＥとｐＡＤＮＳ−ＬＥＵ２−ＣＤＫ２−ＨＳのどちらかで形質転換した。形質転換体はガラクトース上でロイシン、トリプトファンおよびウラシル原栄養株を選択した。２つの独立した形質転換体は非選択的に一夜増殖させ、そしてプラスミド損失はコロニー精製後に同定した。これによって、サイクリンＥとＣＤＣ２−ＨＳ（またはＣＤＫ２−ＨＳ）の両方を含有するかまたは遺伝子単独かの株の同系株の組が生じた。このような２つの組は各同時形質転換で生じた。１２の株は、３０℃および３８℃の両方で平板効率を測定した以外は上記した定量的平板アッセイで試験した（図４の説明参照）。同じプラスミドの組合せを有する株は非常に同じように反応し、そしてそれらのデータは表に集める。図４の実験で使用したサイクリンＥプラスミドとは異なって、これらの実験で使用したｐＭＡＣ−ＴＲＰ１−ＣＹＣＥプラスミドはｃｌｎ１−  ｃｌｎ２−  ｃｌｎ３−  ｃｄｃ２９−１３株の救済は本質的には示さない。
【図７】図７は、サイクリンＥが、ヒトＧ１細胞から得られる抽出物中でｐ３４  ｃｄｃ２キナーゼと結合しそしてこれを活性化し得ることを示す：新生のＭＡＮＣＡヒトＧ１細胞から得られた抽出物をＧＴ−サイクリンＥ−セファロースビーズ、ＧＴ−セファロース、ｐ１３セファロースまたはブランクのセファロースビーズと混合した。パネルＡでは、結合タンパク質は、ピトＣＤＣ２のカルボキシ末端に対する抗ペプチド抗血清を用いて免疫ブロット法を実施した。「＋」と標識したレーンでは、セファロースビーズはヒトＧ１抽出物と共にインキュベートした。「−」と標識したレーンでは、緩衝液による擬似インキュベーションを実施した。矢印はＣ末端抗体と反応するａ４１Ｄａの結合タンパク質を示す。パネルＢでは、ビーズはヒストンＨ１キナーゼ活性についてアッセイした。矢印はヒストンＨ１とＧＴ−サイクリンＥの融合タンパク質マーカーの移動を示す。「ｃｙｃ  Ｅ−ＩＰ」と標識したレーンでは、ＧＴ−サイクリンＥ−セファロースビーズと会合したタンパク質は遊離グルタチオンを用いて放出させそしてサイクリンＥ抗血清で免疫沈降させた。パネルＣでは、遊離グルタチオンによってＧＴ−セファロースかまたはＧＴ−サイクリンＥ−セファロースのどちらかから放出されたタンパク質はアフィニティー精製したＣ末端特異性のｐ３４  ＣＤＣ２抗ペプチド抗血清で免疫沈降させた。免疫沈降物はＨ１キナーゼ活性について試験した。
【図８】図８は、抗サイクリンＥ抗体を使用して、ＨｅＬａ細胞から得られるＨ１キナーゼ活性の免疫沈降を示す。パネルＡでは、インビトロで翻訳されたヒトサイクリンＥ、ＡおよびＢを免疫沈降させるために、ＧＴ−サイクリンＥ融合タンパク質に対してウサギで生じた抗血清を使用した。レーン１〜３：それぞれ、ヒトサイクリンＥ、ＡおよびＢのインビトロ翻訳産生物。レーン４〜６：それぞれ、ヒトサイクリンＥ、ＡおよびＢのサイクリンＥ抗血清を使用した免疫沈降物。パネルＢでは、指数的に増殖させたＨｅＬａ細胞から得られた抽出物は、通常のウサギ血清、抗サイクリンＥ血清および抗サイクリンＡ血清を使用して免疫沈降させた。免疫沈降物はＨ１キナーゼ活性について試験した。サイクリンＥ免疫沈降物内の４５ｋＤａのタンパク質の自動リン酸化に注意のこと。このタンパク質は、サイクリンＥ  ｃＤＮＡのインビトロ転写／翻訳によって産生されたサイクリンＥタンパク質と一緒に移動する。
【図９Ａ】図９は、実施例８に記載したものであり、遠心水力分級によって細胞周期の種々の段階に分画した指数的に増殖するＭＡＮＣＡ細胞の種々のサブ集団中の示差的な値のサイクリンＥ−キナーゼコンプレックスを示す。図９Ａは、種々の水力分級フラクション（横座標）で細胞蛍光定量法で測定した指数的に増殖するＭＡＮＣＡ細胞のＤＮＡ含量（縦座標）を図面で示すものである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａの水力分級フラクションにおけるサイクリンＥ  Ｈ１ヒストンキナーゼ活性の値を図示するものである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、図９Ａの細胞の水力分級フラクションにおけるサイクリンＡ  Ｈ１ヒストンキナーゼ活性の値を図示するものである。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ノコダゾールで誘導された中期の３、４、５、６または７時間後の細胞周期のＧ１期に放出された、種々の水力分級細胞フラクションにおけるＭＡＮＣＡ細胞のＤＮＡ含量（縦座標）を図示するものである。
【図９Ｅ】図９Ｅは、サイクリンＡおよびサイクリンＥと会合したＨ１ヒストンキナーゼの活性値を示す棒グラフを示す。
【図１０】図１０は、実施例８で検討した、静止中、増殖中または分化中のラット２０８ＦおよびＰＣ−１２細胞の免疫沈降物における、Ｈ１キナーゼ活性を測定することによって測定したサイクリンＥの値を示す。図１０Ａは、３２Ｐで標識したＨ１ヒストンのオートラジオグラムを示す。Ｈ１ヒストンのリン酸化は１０％または。０．１％仔ウシ血清中で増殖させた２０８Ｆ細胞の免疫沈降物によって触媒（ｃａｔａｌｙｚｅ）された。サイクリンＥと会合したキナーゼの活性値は、増殖中の細胞（１０％ＣＳ）と比較して静止（０．１％ＣＳ）細胞では顕著に低下した。図１０Ｂは、３２Ｐで標識したＨ１ヒストンのオートラジオグラムを示す。免疫沈降物で触媒されたＨ１ヒストンのリン酸化は神経成長因子の存在下または不存在下で増殖させたＰＣ−１２細胞について測定した。サイクリンＥに会合したキナーゼの活注値は、急速に増殖している細胞（＋ＮＧＦ）と比較して分化した（静止中の）細胞（−ＮＧＦ）で顕著に低下した。
【図１１Ａ】図１１は、実施例９で考察したものであり、サイクリンＥをコードするレトロウイルスベクター（ＬＸＳＮ−サイクリンＥ）かまたは陰性対照としてのＬＸＳＮベクターのどちらかで形質導入したＲａｔ−細胞において構造的に発現されたサイクリンＥ値の上昇を研究するように設計した試験の結果を示す。図１１ＡはＬＸＳＮ−サイクリンＥ（レーン２）かまたは陰性対照としてＬＸＳＮベクター単独（レーン１）のどちらかで形質導入したＲ３ｔ−１細胞溶解物のウエスターン免疫ブロット法のオートラジオグラフを示す。ヒストンＨ１キナーゼ活性で測定したとき、サイクリンＥ値の上昇は対照と比べてＬＸＳＮ−サイクリンＥ形質導入細胞で明白であった。
【図１１Ｂ】図１１ＢはＬＸＳＮ−サイクリンＥで形質導入したＲａｔ−１細胞（レーン２）またはＬＸＳＮ形質導入した対照Ｒａｔ−１細胞（レーン１）の細胞免疫沈降物中のサイクリンＥ会合キナーゼによって触媒された３２Ｐ標識ヒストンＨ１のオートラジオグラムを示す。サイクリンＥ発現の増加はＬＸＳＮ−サイクリンＥ形質導入Ｒａｔ−１の細胞免疫沈降物で明らかであった。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ＬＸＳＮ（Ｒａｔ−１／対照）かまたはＬＸＳＮ−サイクリンＥレトロウイルスベクター（Ｒａｔ−１／サイクリンＥ）のどちらかで形質導入したＲａｔ−１細胞中の核ＤＮＡ含量の流動細胞計測法測定の結果並びに細胞周期のＧ１、ＳまたはＧ２／Ｍ期に存在した各細胞サブ集団中の細胞の算出フラクションを図示するものである。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ＬＸＳＮ（Ｒａｔ−１／対照）かまたはＬＸＳＮ−サイクリンＥレトロウイルスベクター（Ｒａｔ−１／サイクリンＥ）のどちらかで形質導入したＲａｔ−１細胞中の核ＤＮＡ含量の流動細胞計測法測定の結果並びに細胞周期のＧ１、ＳまたはＧ２／Ｍ期に存在した各細胞サブ集団中の細胞の算出フラクションを図示するものである。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、有糸分裂阻止排除後の時間の関数としてＬＸＳＮ−サイクリンＥ（黒いダイヤ）またはＬＸＳＮ（中抜き方形）で形質導入したＲａｔ−１細胞の核ＤＮＡへのＢｒｄＵ（５−ブロモデオキシウリジン）導入に関する免疫化学的検出の結果を図示するものである。ＤＮＡ合成細胞（Ｓ期の細胞）だけがＢｒｄＵを導入して本アッセイで陽性と記録され、そしてそれ故本アッセイは、細胞が１回の有糸分裂の終末から次回の有糸分裂のＤＮＡ合成に移行する速度を測定する。これらの結果は、ＬＸＳＮ−サイクリンＥでの形質導入細胞がＬＸＳＮで形質導入した対照細胞より急速に有糸分裂からＳ期に細胞移行することを示している。
【図１２】図１２は、実施例１０で考察したものであり，指数的に増殖するＭＡＮＣＡの細胞周期の種々の段階でサイクリンＥ会合タンパク質を分析する研究の結果を示すものである。サイクリンＥ会合タンパク質は抗サイクリンＥ抗体とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる免疫沈降法で精製した。
【図１３】図１３は、実施例１０で考察したものであり、抗ＣＤＣ２（「αＣＤＣ２」）、抗ＣＤＫ２（「αＣＤＫ２」）または対照血清（「−−」）で免疫沈降させたＭＡＮＣＡ細胞抽出物から製造された免疫沈降物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって作成したウエスターン免疫ブロット法のオートラジオグラムを示す。これらの結果は上記図９〜１２で使用した抗ＣＤＣ２および抗ＣＤＫ２抗体の特異性を示している。免疫ブロットは、ゲルを抗ＣＤＣ２または抗ＣＤＫ２と、続いて１２５Ｉ−タンパク質Ａと反応させて視覚化した。レーン１および２の免疫沈降物は全細胞抽出物を使用して調製し；レーン３および４の免疫沈降物はＣＤＣ２を予め除去した対照抽出物であり；レーン５および６の免疫沈降物はＣＤＫ２を予め除去したものであり；そしてレーン７はＧ１／Ｓの境界で抑止されたＭＡＮＣＡ細胞の抽出物であらた。タンパク質分子量の標準品の移動位置は示したとおりである。
【図１４】図１４は、実施例１０に記載したものであり、指数的に増殖するＭＡＮＣＡ細胞および実施例１０に記載した方法によってアフィジコリン（ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ）でＧ１／ｓ境界で抑止された細胞中で、サイクリンＥを使用してＣＤＣ２およびＣＤＫ２のコンプレックスを検出するウエスターン免疫ブロット法を示す。図１４Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２つの成分タンパク質に分離されそしてヒトｐ３４ＣＤＣ２のＣ末端に特異的な抗体による免疫ブロット法によって視覚化された精製サイクリンＥ：ＣＤＣ２コンプレックスの免疫ブロットを示す。レーン１および８は、細胞抽出物をαＰＩ+と共にインキュベーションして調製した陰性の対照試料であり；レーン２および７は細胞抽出物とセファロースビーズ（ＳＥＰＨ）とのインキュベーションで得られた陰性対照であり；レーン３および６は抗ｐ３４ＣＤＣ２セファロースでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製したサイクリンＥ：ＣＤＣ２コンプレックスを示し；レーン４および５は抗サイクリンＥ−セファロースでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製したサイクリンＥ：ＣＤＣ２コンプレックスを示し：「−−」と標識したレーン９〜１１は、細胞抽出をしないことを除いて、レーン１〜８と同一の方法で調製した陰性の対照試料である。図１４Ｂは、２つの成分タンパク質に分離した精製サイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの免疫ブロットおよびヒトＣＤＫ２のＣ末端に特異的な抗体を用いた免疫ブロット法で視覚化されたＣＤＫ２の免疫ブロットを示す。使用した略号は図１４Ａに示したとおりである。Ｇ１／Ｓ境界の細胞から得られ、アフィニティー精製しないでＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製した細胞抽出物（「ＥＸ」）中のＣＤＫ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの位置はレーン８に示す。
【図１５Ａ】図１５は、実施例１１〜１２に記載されたものであり、細胞周期の種々の段階でのサイクリンＥの発現値およびサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの発生量を測定するように設計した、試験の結果を示す。図１５Ａは、プロピジュウム沃化物で染色した核を流動細胞計測法で測定した、水力分級したＭＡＮＣＡ細胞の種々のフラクション中のＤＮＡ含量（縦座標）を図示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂ１は、図１５Ｂ２で免疫ブロット化したＣＤＫ２ポリペプチド  バンドで結合し１２５１−タンパク質Ａ  ＣＰＭを図示する。図１５Ｂ２は、抗サイクリンＥ−セファロース、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスを免疫アフィニチィー精製によって測定し、そして抗ＣＤＫ２、１２５Ｉ−タンパク質Ａ、およびオートラジオグラフィーを使用してウエスターン免疫ブロット分析法によってコンプレックス中のタンパク質を視覚化して、細胞中の各水力分級サブ集団（図１５Ａから得られる）中のサイクリンＥの発現値を測定するウエスターン免疫ブロット法を示す。図１５Ｂ３は、図１５Ｂ４で免疫ブロット化したサイクリンＥ（「ｃｙｃＥ」）ポリペプチドバンドで結合した１２５Ｉ−タンパク質Ａ  ＣＰＭを図示する。図１５Ｂ４は、図１５Ｂ２に記載した方法であるが抗サイクリンＥおよび１２５Ｉ−タンパク質Ａを使用して抗ＣＤＫ２の代わりにサイクリンＥ値を視覚化することによって、図１５Ａから得られ声細胞の水力分級サブ集団中のサイクリンＥの発現値を測定するウエスターン免疫ブロット法を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、図１５Ｂ１〜Ｂ４の方法で使用した細胞抽出物（水力分級フラクション３の抽出物）の量の関数として、ウエスターン免疫ブロットの抗サイクリンＥ：サイクリンＥバンドで結合した１２５Ｉ−タンパク質Ａの値を図示する。これらの結果は、サイクリンＥの量が増加するとサイクリンＥの免疫アッセイにおけるシグナル量が増加したことを示す。
【図１６】図１６は、実施例１３に記載されたものであり、サイクリンＥとＣＤＣ２およびＣＤＫ２との分子会合；インビトロでのサイクリンＥ：ＣＤＣ２またはサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックスの集合；およびキナーゼとサイクリンＥの会合後のホスホリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）キナーゼ活性の活性化を研究するために設計された試験の結果を示す。図１６Ａは、ＣＤＫ２に特異的な抗体（抗−ＣＤＫ２）で免疫沈降させたサイクリンＥ：ＣＤＫ２コンプレックス中のホスホリラーゼキナーゼ活性をアッセイした実験の結果を示す。コンプレックスはヒドロキシウレアで抑止した細胞（ＨＵ）の細胞抽出物中および種々の量の組換え体サイクリンＥの不存在下（０）または存在下（５、１、０．２）、でＧ１期細胞の抽出物（Ｇ１抽出物）中で形成させた。免疫沈降物中のキナーゼ活性は基質としてのヒストンＨ１、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルの３２Ｐ−標識ヒストンＨ１バンドのリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）イメージングを使用して測定した。これらの結果は、サイクリンＥをＧ１細胞抽出物に添加すると投与量に依存した態様で抽出物中の潜在的なキナーゼ活性を活性化した、即ち、測定されたキナーゼ活性値は添加したサイクリンＥの量に依存していたことを示している。図１６ＢはサイクリンＥコンプレックス中のホスホリラーゼキナーゼ活性をアッセイした実験の結果を示す。実験は、抗ＣＤＫ２の代わりにサイクリンＥに特異的な抗体（抗サイクリンＥ）を使用した以外、上記図１６Ａに記載したようにして実施した。これらの結果によって、上記図１６Ａに示された結果が確認される：即ち、サイクリンＥは投与量依存性の態様でＧ１細胞の抽出物中の潜在的ＣＤＣキナーゼ活性を活性化する。図１６Ｃは、サイクリンＥ：ＣＤＣ２コンプレックス中のホスホリラーゼキナーゼ活性をアッセイするために設計された実験の結果を示す。実験は、ＣＤＣ２に特異的な抗体（抗ＣＤＣ２）を使用した以外、上記図１６Ａに記載したようにして実施した。これらの結果は、サイクリンＥを添加したときであっても細胞のＧ１抽出物中でＣＤＣ２キナーゼ活性が最小であるかまたは無いことを示している。
【図１７】図１７は上記図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃで得られた結果を図示するものである。それぞれ対応するＧ１細胞抽出物免疫沈降物で得られた結果（ＣＤＣ２、べた刷り／３つの棒の組で一番左の棒；ＣＤＫ２、斜線の棒／各組の真中；またはサイクリンＥ、影付き／３つの各組で一番右の棒）は、ＨＵ細胞抽出物免疫沈降物中のキナーゼ（即ち、ヒドロキシウレアＨ１キナーゼの％を１００％とする）で得られたリンイメージングシグナルのパーセントとして表わす。各棒の頂部の数字はパーセント（％）で記録された最大値である。これらの結果は、サイクリンＥがＧ１細胞抽出物中の潜在的ＣＤＫ２キナーゼ活性を活性化しそしてキナーゼ活性が添加されたサイクリンＥの量（即ち、ＨＵ抽出物に添加されたサイクリンＥの希釈倍数；「ＨＵ抽出物中のサイクリンＥの値の倍数」として表わされる）に依存していたことを示している。これらの結果は、サイクリンＥの利用可能性が細胞周期のＧ１期中のホスホリラーゼキナーゼ活性の制御因子であることを示唆している。
【図１８】図１８は、実施例１４に記載されており、ＬＸＳＮ−サイクリンＥを形質導入したＲａｔ−１細胞，およびＬＸＳＮを形質導入した対照細胞が有糸分裂のノコダゾール抑止後にＤＮＡ合成を開始する速度に与える血清成長因子の影響を図示する。ＢｒｄＵの核ＤＮＡへの導入はＬＸＳＮ−サイクリンＥを形質導入した（ＲＡＴ１／サイクリンＥ）細胞またはＬＸＳＮを形質導入した（ＲＡＴ１／ＬＸ）対照細胞中でノコダゾール有糸分裂停止後の時間の関数として測定した。ＤＮＡを合成する細胞（即ち、Ｓ期細胞）だけがＢｒｄＵをＤＮＡに導入するので、細胞培養物中の核の数（即ち、標識した核のパーセント）の記録を使用してＧ１期からＳ期への細胞の移行速度を評価することができる。図１８Ａは、ＬＸＳＮ−サイクリンＥを形質導入した（ＲＡＴ１／サイクリンＥ）細胞またはＬＸＳＮを形質導入した（ＲＡＴ１／ＬＸ）対照細胞がノコダゾール停止解除後のＤＮＡ合成を開始する速度を評価するために設計した実験の結果を示す。これらの結果は、サイクリンＥで形質導入した細胞が対照の形質導入細胞より２〜３時間以上早くＤＮＡ合成を開始し、そして核標識化（即ち、ＤＮＡ合成の開始）速度もサイクリンＥで形質導入した細胞の方が大きかった（２つの曲線の傾斜の違いによって明らかである）ことを示している。図１８Ｂは、ＬＸＳＮ−サイクリンＥを形質導入した細胞およびＬＸＳＮを形質導入した対照細胞でのＤＮＡ合成の開始について成長因子依存性を評価するために設計した実験の結果を示す。２つのタイプの細胞は、１％又は０．１％の仔ウシの血清を含む媒体中で培養される。これらの結果は、ａ）ＬＸＳＮ−サイクリンＥ形質導入細胞が１％または。０．１％の血清中のどちらでもノコダゾール停止解除後に対照細胞より早くＤＮＡ合成を開始し、そしてｂ）サイクリンＥ形質導入細胞は、低血清中でのより早いＤＮＡ合成開始（即ち、ＬＸＳＮ−サイクリンＥ形質導入細胞は０．１％の血清中でＬＸＳＮ形質導入細胞よむ６〜８時間早くＤＮＡ合成を開始した）によって証明されているように、成長因子に対する依存性がＬＸＳＮ−形質導入対照細胞より少なく、そしてサイクリンＥ形質導入細胞は低血清条件下でも対照より早く増殖した（即ち、０．１％の血清中での２つの形質導入細胞タイプの傾斜を比較して決定された）ことを示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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