(57)【要約】【課題】ＤＮＡを伸長し配列して基板上に固定し、一端より順次断片に切断して回収し、各々の断片を解析した後、解析結果をつなぎ合わせて、元のＤＮＡの全塩基配列を決定する方法が提案されているが、これを適用するためには、元の塩基配列を損なうことなく効率良くＤＮＡ断片を回収する手法が必要になる。【解決手段】そこで本発明では、第１の基板１の表面に塩基配列解析試料固定用の薄膜３を形成して、この薄膜上に塩基配列解析試料４を伸長して固定し、この状態で塩基配列解析試料を酵素により切断して断片化した後、所望の部位の薄膜を加熱手段により加熱して気化させることにより、所望の部位の断片７を第１の基板表面から飛ばして、この第１の基板の表面側に対向して配置した第２の基板８表面に捕捉し、この状態で塩基配列を解析する塩基配列解析方法を提案している。【選択図】      図４
2004147528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の基板の表面に塩基配列解析試料固定用の薄膜を形成して、この薄膜上に塩基配列解析試料を伸長して固定し、この状態で塩基配列解析試料を酵素により切断して断片化した後、所望の部位の薄膜を加熱手段により加熱して気化させることにより、所望の部位の塩基配列解析試料の断片を第１の基板表面から飛ばして、この第１の基板の表面側に対向して配置した第２の基板表面に捕捉し、この状態で塩基配列を解析することを特徴とする塩基配列解析方法
【請求項２】
第１の基板の表面に、加熱により気化する材料を含むアブレーション層を介して塩基配列解析試料固定用の薄膜を形成して、この薄膜上に塩基配列解析試料を伸長して固定し、この状態で塩基配列解析試料を酵素により切断して断片化した後、所望の部位のアブレーション層を加熱手段により加熱して気化させることにより、所望の部位の塩基配列解析試料の断片を第１の基板表面から飛ばして、この第１の基板の表面側に対向して配置した第２の基板表面に捕捉し、この状態で塩基配列を解析することを特徴とする塩基配列解析方法
【請求項３】
請求項１又は請求項２の塩基配列解析を、伸長して固定した塩基配列解析試料の一端側から他端側に対応して順次行って塩基配列解析試料の全塩基配列を解析することを特徴とする塩基配列解析方法
【請求項４】
塩基配列解析試料固定用の薄膜は高分子ゲルとすることを特徴とする請求項１又は２に記載の塩基配列解析方法
【請求項５】
塩基配列解析試料固定用の薄膜は微細ピッチの凹凸を形成した薄膜とすることを特徴とする請求項１又は２に記載の塩基配列解析方法
【請求項６】
薄膜の材料はポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）であることを特徴とする請求項５に記載の塩基配列解析方法
【請求項７】
ピッチは０．１μｍ〜１０μｍの範囲とすることを特徴とする請求項５に記載の塩基配列解析方法
【請求項８】
加熱手段は、第１の基板の裏面からのレーザ光照射であることを特徴とする請求項１又は２に記載の塩基配列解析方法
【請求項９】
加熱手段は、第１の基板に予め形成した通電加熱体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の塩基配列解析方法
【請求項１０】
アブレーション層の、加熱により気化する材料はプラスチックとしたことを特徴とする請求項２に記載の塩基配列解析方法
【請求項１１】
第１の基板の裏面からのレーザ光照射を加熱手段とする場合において、アブレーション層には、加熱により気化する材料に加えて、ビーム吸収性の材料を含ませることを特徴とする請求項２に記載の塩基配列解析方法
【請求項１２】
ビーム吸収性の材料はカーボンとしたことを特徴とする請求項１１に記載の塩基配列解析方法
【請求項１３】
ビーム吸収性の材料は、加熱により気化する材料と第１の基板の間に蒸着することを特徴とする請求項１１又は１２に記載の塩基配列解析方法
【請求項１４】
塩基配列解析試料を伸長して固定する塩基配列解析試料固定用の薄膜を表面に形成した第１の基板と、上記薄膜の所望部位を加熱して気化させる加熱手段と、第１の基板の表面側に対向させて配置する第２の基板とから構成した塩基配列解析装置
【請求項１５】
塩基配列解析試料を伸長して固定する塩基配列解析試料固定用の薄膜を、加熱により気化する材料を含むアブレーション層を介して表面に形成した第１の基板と、上記アブレーション層の所望部位を加熱して気化させる加熱手段と、第１の基板の表面側に対向させて配置する第２の基板とから構成した塩基配列解析装置
【請求項１６】
塩基配列解析試料固定用の薄膜は高分子ゲルとすることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の塩基配列解析装置
【請求項１７】
塩基配列解析試料固定用の薄膜は微細ピッチの凹凸を形成した薄膜とすることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の塩基配列解析装置
【請求項１８】
薄膜の材料はポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）であることを特徴とする請求項１７に記載の塩基配列解析装置
【請求項１９】
ピッチは０．１μｍ〜１０μｍの範囲とすることを特徴とする請求項１７に記載の塩基配列解析装置
【請求項２０】
加熱手段は、第１の基板の裏面からのレーザ光照射であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の塩基配列解析装置
【請求項２１】
加熱手段は、第１の基板に予め形成した通電加熱体であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の塩基配列解析装置
【請求項２２】
アブレーション層の、加熱により気化する材料はプラスチックとしたことを特徴とする請求項１５に記載の塩基配列解析装置
【請求項２３】
アブレーション層には、加熱により気化する材料に加えて、ビーム吸収性の材料を含ませることを特徴とする請求項１５に記載の塩基配列解析装置
【請求項２４】
ビーム吸収性の材料はカーボンとしたことを特徴とする請求項２３に記載の塩基配列解析装置
【請求項２５】
ビーム吸収性の材料は、加熱により気化する材料と第１の基板の間に蒸着することを特徴とする請求項２３又は２４に記載の塩基配列解析装置
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列解析方法及び装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、ＤＮＡ等の塩基配列解析試料の塩基配列を解析する従来の塩基配列解析装置では、一時に解析可能な塩基対の数は数百〜千である。従って、一般にこのような塩基対よりも遥かに長い塩基配列解析試料を解析する場合には、塩基配列解析試料を、まず水溶液中で制限酵素により切断して断片化し、その後に上記塩基配列解析装置を用いて解析することになる。
【０００３】
このようにＤＮＡ等の塩基配列解析試料を水溶液中で制限酵素により断片化する方法では、解析した塩基配列解析試料断片が、元の塩基配列解析試料のどの位置にあったものであるかが分からなくなってしまうという欠点がある。
【０００４】
このため従来は、何種類もの制限酵素を使用して形成した各断片を解析して、得られた解析結果をつなぎ合わせて全体の塩基配列を推定しているが、このような方法では、何種類もの制限酵素を用いて行う解析自体が多大な労力とコストを必要とすることに加えて、解析結果をつなぎ合わせて全体の配列を推定することにも多大な労力が必要であるという欠点がある。この欠点は、解析対象のＤＮＡ等の塩基配列解析試料が長くなるほど顕著になる。
【０００５】
この欠点を解決するために、例えば特許第３２８２６７９号の発明では、ＤＮＡを伸長し配列して基板上に固定し、一端より数百〜千の塩基対毎に順次断片に切断して回収し、各々の断片を解析した後、解析結果をつなぎ合わせることにより、元のＤＮＡの全塩基配列を決定する方法が提案されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような方法を適用するためには、塩基配列を損なうことなく効率良くＤＮＡ等の塩基配列解析試料を切断して断片を回収する手法が必要になる。
そこで本発明では、ＤＮＡ等の塩基配列解析試料の切断回収を効率的に行うことができる方法と装置を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上述した課題を解決するために、まず請求項１の発明では、第１の基板の表面に塩基配列解析試料固定用の薄膜を形成して、この薄膜上に塩基配列解析試料を伸長して固定し、この状態で塩基配列解析試料を酵素により切断して断片化した後、所望の部位の薄膜を加熱手段により加熱して気化させることにより、所望の部位の塩基配列解析試料の断片を第１の基板表面から飛ばして、この第１の基板の表面側に対向して配置した第２の基板表面に捕捉し、この状態で塩基配列を解析する塩基配列解析方法を提案する。
【０００８】
次に請求項２の発明では、第１の基板の表面に、加熱により気化する材料を含むアブレーション層を介して塩基配列解析試料固定用の薄膜を形成して、この薄膜上に塩基配列解析試料を伸長して固定し、この状態で塩基配列解析試料を酵素により切断して断片化した後、所望の部位のアブレーション層を加熱手段により加熱して気化させることにより、所望の部位の塩基配列解析試料の断片を第１の基板表面から飛ばして、この第１の基板の表面側に対向して配置した第２の基板表面に捕捉し、この状態で塩基配列を解析する塩基配列解析方法を提案する。
【０００９】
次に請求項３の発明では、上記請求項１又は請求項２の塩基配列解析を、伸長して固定した塩基配列解析試料の一端側から他端側に対応して順次行って塩基配列解析試料の全塩基配列を解析する塩基配列解析方法を提案する。
【００１０】
次に請求項４の発明では、請求項１又は２の方法において、塩基配列解析試料固定用の薄膜は高分子ゲルとすることを提案する。
【００１１】
次に請求項５の発明では、請求項１又は２の方法において、塩基配列解析試料固定用の薄膜は微細ピッチの凹凸を形成した薄膜とすることを提案する。
【００１２】
次に請求項６の発明では、請求項５の方法において、薄膜の材料はポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）ですることを提案する。
【００１３】
次に請求項７の発明では、請求項５の方法において、ピッチは０．１μｍ〜１０μｍの範囲とすることを提案する。
【００１４】
次に請求項８の発明では、請求項１又は２の発明において、加熱手段は、第１の基板の裏面からのレーザ光照射とすることを提案する。
【００１５】
次に請求項９の発明では、請求項１又は２の発明において、加熱手段は、第１の基板に予め形成した通電加熱体ですることを提案する。
【００１６】
次に請求項１０の発明では、請求項２の発明において、アブレーション層の、加熱により気化する材料はプラスチックとすることを提案する。
【００１７】
次に請求項１１の発明では、請求項２の方法において、第１の基板の裏面からのレーザ光照射を加熱手段とする場合、アブレーション層には、加熱により気化する材料に加えて、ビーム吸収性の材料を含ませることを提案する。
【００１８】
次に請求項１２の発明では、請求項１１の方法において、ビーム吸収性の材料はカーボンとすることを提案するものである。
【００１９】
次に請求項１３の発明では、請求項１１又は１２の方法において、ビーム吸収性の材料は、加熱により気化する材料と第１の基板の間に蒸着することを提案する。
【００２０】
次に請求項１４の発明では、塩基配列解析試料を伸長して固定する塩基配列解析試料固定用の薄膜を表面に形成した第１の基板と、上記薄膜の所望部位を加熱して気化させる加熱手段と、第１の基板の表面側に対向させて配置する第２の基板とから構成した塩基配列解析装置を提案する。
【００２１】
次に請求項１５の発明では、塩基配列解析試料を伸長して固定する塩基配列解析試料固定用の薄膜を、加熱により気化する材料を含むアブレーション層を介して表面に形成した第１の基板と、上記アブレーション層の所望部位を加熱して気化させる加熱手段と、第１の基板の表面側に対向させて配置する第２の基板とから構成した塩基配列解析装置を提案する。
【００２２】
次に請求項１６の発明では、請求項１４又は１５の装置において、塩基配列解析試料固定用の薄膜は高分子ゲルとすることを提案する。
【００２３】
次に請求項１７の発明では、請求項１４又は１５の装置において、塩基配列解析試料固定用の薄膜は微細ピッチの凹凸を形成した薄膜とすることを提案する。
【００２４】
次に請求項１８の発明では、請求項１７の装置において、薄膜の材料はポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）とすることを提案する。
【００２５】
次に請求項１９の発明では、請求項１８の装置において、ピッチは０．１μｍ〜１０μｍの範囲とすることを提案する。
【００２６】
次に請求項２０の発明では、請求項１４又は１５の装置において、加熱手段は、第１の基板の裏面からのレーザ光照射とすることを提案する。
【００２７】
次に請求項２１の発明では、請求項１４又は１５の装置において、加熱手段は、第１の基板に予め形成した通電加熱体とすることを提案する。
【００２８】
次に請求項２２の発明では、請求項１５の装置において、アブレーション層の、加熱により気化する材料はプラスチックとすることを提案する。
【００２９】
次に請求項２３の発明では、請求項１５の装置において、アブレーション層には、加熱により気化する材料に加えて、ビーム吸収性の材料を含ませることを提案する。
【００３０】
次に請求項２４の発明では、請求項２３の装置において、ビーム吸収性の材料はカーボンとすることを提案する。
【００３１】
次に請求項２５の発明では、請求項２３又は２４の装置において、ビーム吸収性の材料は、加熱により気化する材料と第１の基板の間に蒸着することを提案する。
【００３２】
本発明によれば、第１の基板の表面に形成した塩基配列解析試料固定用の薄膜上にＤＮＡ等の塩基配列解析試料を伸長して固定し、この状態で酵素により塩基配列解析試料を切断するため、切断後の塩基配列解析試料の断片は薄膜上に固定状態であり、元の塩基配列解析試料上での並びが保存される。また切断は制限酵素により行うため、分子構造が明確な切断を行うことができる。
【００３３】
そして、塩基配列解析試料固定用の薄膜又は薄膜と第１の基板との間に介在させたアブレーション層の所望部位を、レーザ照射や通電加熱体等の加熱手段により加熱して気化させることにより、その部位に対応する塩基配列解析試料の断片を飛ばして第２の基板表面に捕捉するので、所望の部位の塩基配列解析試料の断片を確実に回収して塩基配列の解析に供することができる。
【００３４】
そして、このような解析を、伸長して固定用の薄膜に固定した塩基配列解析試料の一端側から他端側に対応して順次行うことにより、ＤＮＡ等の塩基配列解析試料の全塩基配列を解析することができる。
【００３５】
塩基配列解析試料を固定用の薄膜は、高分子ゲルとしたり、例えば０．１〜１０μｍ以下という微細ピッチの凹凸を形成したＰＭＭＡ等の材料の薄膜とすることにより、制限酵素による切断を阻害せず、そして切断後にも固定状態を維持することができる。
【００３６】
【発明の実施の形態】
次に本発明の実施の形態を図１〜図４を参照して説明する。
図１は第１の基板の表面にＤＮＡ等の塩基配列解析試料固定用の薄膜を形成して、この薄膜上に塩基配列解析試料を伸長して固定した状態を示す平面図、図２は図１の一部拡大Ａ−Ａ断面図である。また、図３、図４は動作の進行した状態を示す図１のＡ−Ａ断面図である。
即ち、図において符号１は第１の基板であり、この第１の基板１は後述するようにレーザ光が透過する透光性の材質により構成している。この第１の基板１の表面にはアブレーション層２を介して塩基配列解析試料固定用の薄膜３を形成している。アブレーション層２は、例えばポリエチレン、ポリメタクリル酸メチル又はポリカーボネート等の、加熱により気化するプラスチックにより構成している。また薄膜３は、ポリメタクリル酸メチル等の材料をフォトリソグラフィーやマイクロモールディング等の手段により加工して例えば０．１〜１０μｍの範囲の適宜の微細ピッチの凹凸を形成した薄膜として構成している。
【００３７】
以上の構成において、図１、図２に示すように、薄膜３上に塩基配列解析試料の例としてのＤＮＡ４を伸長して固定する。ＤＮＡ４を伸長して薄膜３に固定する手法は、例えば特許第３０６４００１号公報に記載されているように、溶液中のＤＮＡを静電的に配向・伸長させ、溶液の流れにより付着させて固定する手法を適用する他、適宜の伸長・固定手法を適用することができる。
【００３８】
このように薄膜３の微細ピッチの凹凸の凸部５に吸着されて固定されているＤＮＡ４に、ＤＮＡ切断酵素を作用させると、凸部５に吸着されている部位には酵素が作用しないため切断が生じないのに対して、凹部６に対応するＤＮＡの部位には酵素が作用できるためＤＮＡの切断が生じる。従って図３に示すように、薄膜３の微細ピッチの凹凸の凸部５で支持された多数のＤＮＡ断片７が得られる。これらの多数のＤＮＡ断片７は薄膜３の凸部に支持されているため、元のＤＮＡでの並びが保持されている。
【００３９】
次いで図４に示すように、第１の基板１の表面側に第２の基板８を対向させた後、アブレーション層２の所望部位に第１の基板１の裏面側からレーザ光９を照射すると、アブレーション層２の対応部位１０が加熱されて気化し、その膨張による力により薄膜３をＤＮＡ断片７と共に飛ばして第２の基板８の表面に付着させる。
【００４０】
本発明では、このようにして、元のＤＮＡ４の、所望の部位のＤＮＡ断片７を第１の基板１の表面から第２の基板８の表面に捕捉することができ、こうして元のＤＮＡ４における位置が分かる所望の部位のＤＮＡ断片７を確実に回収して塩基配列の解析に供することができる。
【００４１】
以上のような解析を、伸長して薄膜３に固定したＤＮＡ４の一端側から他端側に対応して順次行うことにより、ＤＮＡ４の全塩基配列を解析することができる。
【００４２】
本発明においては、ＤＮＡ４等の切断に酵素を用いているため、ＤＮＡ断片７の両端の分子構造は明確に定義されており、従って、その両端に既知配列のＤＮＡをライゲーションさせて、既知配列に対するプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅したり、あるいはＤＮＡ断片７を自己環状化させてローリングサークル法により増幅したりすることを容易に行うことができる。
【００４３】
尚、第２の基板８は、第１の基板１と同様に板状の構成とする他、フィルム状の構成とすることもできる。また上記のＤＮＡ断片７の捕捉動作を第２の基板８又は第１の基板１を移動させながら行うことにより、元のＤＮＡの全塩基配列を順次解析することも可能である。
【００４４】
以上に説明した実施の形態では、ＤＮＡ固定用の薄膜３は、微細ピッチの凹凸を形成した薄膜として構成しているが、他の実施の形態として、この薄膜３としては、高分子ゲルにより形成した薄膜を適用することができる。
即ち、高分子ゲルは、多量の水を包含する網目状の構造を持つので、その網目構造によりＤＮＡ分子を固定しても、ＤＮＡの大部分は水中に存在するため、酵素が作用する際の障害とならない。
【００４５】
但し、高分子ゲルの薄膜上にＤＮＡを伸長して固定した場合には、微細ピッチの凹凸を有する薄膜のように、凹凸のピッチに対応した切断は行えない。しかしながら、この場合には、ＤＮＡの切断に制限酵素を用いれば良い。
【００４６】
例えば、４塩基の並びを認識して切断を行う４ベースカッターと称される制限酵素を用いれば、４種類の塩基（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）に対応して、平均して４４＝２５６塩基毎に１個所、従って塩基間の間隔は０．３４ｎｍであることから、０．３４×２５６＝８７ｎｍ毎に切断がされることになる。また６塩基の並びを認識して切断を行う６ベースカッターを用いれば、０．３４×４６＝１．４μｍ毎に切断がされることになる。こうして、微細ピッチの凹凸を有する薄膜によりＤＮＡを所望の長さの断片に切断したのと同等の切断を行うことができる。
【００４７】
次に上記の実施の形態では、第１の基板１と塩基配列解析試料固定用の薄膜３との間にアブレーション層２を介在させ、このアブレーション層２を加熱して気化させることにより、その部位に対応するＤＮＡ断片７を薄膜３と共に第１の基板１から飛ばして第２の基板８表面に捕捉するようにしているが、他の実施の形態として、アブレーション層２を省略し、薄膜３自体を加熱により気化させることによりＤＮＡ断片７を飛ばすようにすることもできる。
【００４８】
またアブレーション層２には、加熱により気化する材料に加えて、ビーム吸収性の材料を含ませることができる。ビーム吸収性の材料としては、例えばレーザ加工におけるビーム吸収剤として使用されるカーボンを用い、これを加熱により気化する材料と第１の基板１の間に蒸着してコーティングすれば、レーザ光のビームを効率的に吸収して、プラスチック等の加熱により気化する材料を効率的に加熱して気化させることができる。
【００４９】
しかしながら加熱手段としてレーザ光照射を適用する場合においても、加熱により気化させる材料と、レーザ光の波長を適宜に選択すれば、ビーム吸収性の材料を用いずに、効率的に加熱して気化させることもできる。
【００５０】
また、上記の実施の形態では、アブレーション層２を加熱する手段をレーザ照射としているが、この他の実施の形態として、予め第１の基板１に通電加熱体を配置しておき、この通電加熱体に通電することによりアブレーション層２の所望部位、又は薄膜３自体を加熱するようにすることができる。
【００５１】
【発明の効果】
本発明は以上のとおりであるので、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列解析において、次のような効果がある。
ａ．塩基配列を損なうことなく効率良くＤＮＡ等の塩基配列解析試料を切断し、所望の位置の断片を確実に回収して塩基解析に供することができる。
ｂ．塩基配列解析試料の断片の回収を、元の塩基配列解析試料の一端側から他端側に順次行うことにより、ＤＮＡ等の塩基配列解析試料の全塩基配列の解析を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１の基板の表面にＤＮＡ等の塩基配列解析試料固定用の薄膜を形成して、この薄膜上にＤＮＡを伸長して固定した状態を示す平面図である。
【図２】図１の一部拡大Ａ−Ａ断面図である。
【図３】動作の進行した、ある局面の状態を示す図１のＡ−Ａ断面図である。
【図４】動作の進行した、他のある局面の状態を示す図１のＡ−Ａ断面図である。
【符号の説明】
１                      第１の基板
２                      アブレーション層
３                      ＤＮＡ等の塩基配列解析試料固定用の薄膜
４                      ＤＮＡ
５                      凸部
６                      凹部
７                      ＤＮＡ断片
８                      第２の基板
９                      レーザ光
１０                    対応部位
【図１】
2004147528.tif 000003
【図２】
2004147528.tif 000004
【図３】
2004147528.tif 000005
【図４】
2004147528.tif 000006