(57)【要約】　　　（修正有）【課題】永年性植物において花芽形成抑制に関与しているＴＥＲＭＩＮＡＬ　ＦＬＯＷＥＲ　１様遺伝子を単離し、さらに、該遺伝子のアンチセンスＤＮＡで植物を形質転換して、早期開花性を有する植物を提供する。【解決手段】リンゴから新規なＴＥＲＭＩＮＡＬ ＦＬＯＷＥＲ １様遺伝子をクローニングした。該遺伝子の塩基配列及び該塩基配列の全部若しくは一部に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ花芽形成抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつ花芽形成抑制活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列の全部若しくは一部に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ花芽形成抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
請求項２記載の遺伝子の塩基配列に対し相補的な配列からなるアンチセンスＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２記載の遺伝子の全部又は一部を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項３記載のアンチセンスＤＮＡの全部又は一部を含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項４又は５記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
植物である請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
植物が永年性植物である請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
永年性植物が永年性果樹植物である請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
早期開花性を有することを特徴とする請求項７〜９のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の形質転換体から得られる種子。
【請求項１２】
請求項２記載の遺伝子又は請求項３記載のアンチセンスＤＮＡを植物に導入することを特徴とする、植物に早期開花性を付与する方法。
【請求項１３】
請求項２記載の遺伝子又は請求項３記載のアンチセンスＤＮＡを含む組換えベクターを構築する工程、該組換えベクターを用いて植物宿主を形質転換する工程、及び得られる形質転換体から植物体を再生する工程を含むことを特徴とする早期開花性植物の作出方法。
【請求項１４】
植物が永年性植物である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
永年性植物が永年性果樹植物である請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、永年性植物に早期開花性を付与するために有用で新規な花芽形成抑制遺伝子に関する。また本発明は、上記遺伝子をコードするＤＮＡ又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、並びに該形質転換体から得られる種子に関する。さらに本発明は、植物に早期開花性を付与する方法、及び早期開花性植物の作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
木本植物は、草本植物と異なり、開花・結実までの期間、すなわち幼若期間が長い。従って、バラ科に属するリンゴ等の永年性果樹作物育種においては、品種改良に長期間を要する。例えば播種から初結実までに、リンゴでは７〜８年の期間が必要である。果樹育種では、野生品種が有する耐病性遺伝子等の農業上有用な遺伝子を栽培品種に導入する場合、１０回近く交配を行われなければ確率的に良い品質を備えた系統が得られず、木本植物特有の幼若性は、交雑育種の効率を妨げる大きな要因である。
【０００３】
早期開花・結実により果樹の育種年限を短縮する手段として、従来からわい性台木の利用、結果母枝の誘因等が試みられているが、いずれの方法も画期的な効果を発揮しうるものとはいえない。
【０００４】
一方、近年、双子葉植物のモデル植物であるシロイヌナズナにおいて、花芽形成を制御する遺伝子が複数単離され、花芽形成の分子メカニズムが明らかにされつつある。例えば、花芽形成を抑制する機能を有する遺伝子（ｌａｔｅ−ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ　ｇｅｎｅｓ）としてＴＥＲＭＩＮＡＬ　ＦＬＯＷＥＲ　１遺伝子（ＴＦＬ１）が知られている。シロイヌナズナにおいて、該遺伝子を強制発現させると開花が遅れ、発現を抑制すると開花が早まることが実験的に示されている。しかしながらリンゴ属を含むバラ科植物では、現在までこのような花芽形成に関わる遺伝子やタンパク質の本体は明らかにされていない。
また、農業分野において、花芽形成を抑制する遺伝子を制御して、永年性作物に早期開花性を付与するなどの試みは報告されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、永年性植物において花芽形成抑制に関与しているＴＥＲＭＩＮＡＬＦＬＯＷＥＲ　１（ＴＦＬ１）様遺伝子を単離し、さらに、該遺伝子のアンチセンスＤＮＡで植物を形質転換し、早期開花性を有する植物を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を達成するため鋭意検討した結果、リンゴから新規なＴＥＲＭＩＮＡＬ　ＦＬＯＷＥＲ　１様遺伝子をクローニングすることに成功した。そこで本発明者は、該遺伝子のアンチセンスＤＮＡを組み込んだベクターＤＮＡを用いて植物の細胞を形質転換し、該細胞をカルス形成させた。続いて、カルス増殖の後、植物体を再分化し、台木に接ぎ木すると、早期開花性が付与された再生植物が作出されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつ花芽形成抑制活性を有するタンパク質
【０００８】
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子である。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列の全部若しくは一部に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ花芽形成抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【０００９】
本発明はまた、上記遺伝子の全部又は一部を含む組換えベクターである。
さらに本発明は、上記遺伝子の塩基配列に対し相補的な配列からなるアンチセンスＤＮＡである。
本発明はまた、上記アンチセンスＤＮＡの全部又は一部を含む組換えベクターである。
【００１０】
さらにまた本発明は、上記組換えベクターを含む形質転換体である。ここで該形質転換体としては、例えば植物が挙げられる。該植物は、永年性植物、特に永年性果樹植物であることが好ましい。上記形質転換体は、早期開花性を有するものである。
【００１１】
また本発明は、上記形質転換体から得られる種子である。
本発明は、上記遺伝子又は上記アンチセンスＤＮＡを植物に導入することを特徴とする、植物に早期開花性を付与する方法である。
【００１２】
また本発明は、上記遺伝子又は上記アンチセンスＤＮＡを含む組換えベクターを構築する工程、該組換えベクターを用いて植物宿主を形質転換する工程、及び得られる形質転換体から植物体を再生する工程を含むことを特徴とする早期開花性植物の作出方法である。ここで植物は、永年性植物、特に永年性果樹植物であることが好ましい。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
本発明者らは、バラ科に属する植物、特にリンゴ（Ｍａｌｕｓ）属に属する植物に由来するＴＦＬ１様タンパク質をコードする遺伝子を単離するために、他の植物由来のＴＦＬ１様タンパク質間でよく保存されているアミノ酸配列に基づいて設計した縮重プライマーを用いて、リンゴ茎頂由来ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行って遺伝子断片を取得し、さらにＲＡＣＥ−ＰＣＲにより全長ｃＤＮＡを増幅することによって新規なＴＦＬ１様遺伝子を見出した。なお、この遺伝子は、シロイヌナズナのＴＥＲＭＩＮＡＬ　ＦＬＯＷＥＲ　１（ＴＦＬ１）遺伝子と相同性が高く（約７５％）、バラ科植物においては最初にリンゴ（Ｍａｌｕｓ×ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）から単離されたため、ＭｄＴＦＬ（Ｍａｌｕｓ×ｄｏｍｅｓｔｉｃａ　ＴＦＬ１）という。本発明は、ＭｄＴＦＬ遺伝子の発現を促進又は抑制することによってＭｄＴＦＬ遺伝子が導入された植物の開花時期を調節しようとするものである。
【００１５】
ＭｄＴＦＬ遺伝子は、バラ科植物の花芽形成の抑制に関与している。従って、内在性ＭｄＴＦＬ遺伝子の発現が抑制されるよう形質転換された植物は、花芽形成抑制活性が阻害される結果として早期開花性を示すことになる。
【００１６】
遺伝子の発現を抑制する手法としては、遺伝子のアンチセンスＤＮＡを導入する手法（アンチセンス法）が知られている。アンチセンス法は、目的遺伝子の配列にアンチセンス配列を特異的に結合させて、目的遺伝子の発現を抑えるというものである。このアンチセンス配列は、細胞ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに結合して翻訳又は転写をブロックすることにより、目的遺伝子の発現を阻害する。また別の手法としては、コサプレッションを利用する手法がある。コサプレッションとは、植物において、例えば恒常的かつ強力な発現を引き起こすプロモーターの下流に遺伝子をセンス方向で連結して植物に導入した場合に、導入された遺伝子と内在性遺伝子との双方の発現が抑制される現象である（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，　ＭＫ　ａｎｄ　Ｆｉｒｅ，　Ａ　（１９９８），　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．，　１４，　２５５−８）。
【００１７】
従って、本発明においては、強力なプロモーターにより制御されるＭｄＴＦＬ遺伝子、又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡのいずれかを植物に導入することにより、内在性ＭｄＴＦＬ遺伝子の発現を抑制し、花芽形成抑制活性を阻害して、早期開花性を示す植物を作出する。
【００１８】
一方、通常は、ＭｄＴＦＬ遺伝子をセンス方向で植物に導入した場合には、該ＭｄＴＦＬ遺伝子の発現は増強される。このような場合には、該植物は、花芽形成抑制活性が高まるため、遅延開花性を示す。遅延開花性を有する植物は、花芽形成を抑制する機構の研究に有用である。
【００１９】
以下に、ＭｄＴＦＬ遺伝子の単離、ＭｄＴＦＬタンパク質の製造、組換えベクターの作製、及び形質転換体の作出について説明する。
【００２０】
１．ＭｄＴＦＬ遺伝子の単離・同定
（１）ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーの調製
ＭｄＴＦＬ遺伝子は、バラ科植物の組織から抽出したＲＮＡから精製したｍＲＮＡを用いて、公知の方法、例えばＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ）−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニングなどにより得ることができる。ＭｄＴＦＬ遺伝子は、主に植物の葉、茎頂、がく等に発現していることから、ｍＲＮＡの供給源としては、バラ科植物の葉、茎頂など植物体の一部が挙げられる。また、ＭＳ培地などで無菌的に培養したバラ科植物の組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は組織培養細胞（例えばカルス）も用いることができる。本発明において遺伝子単離のための供給源となる植物としては、バラ科に属する植物であれば特に限定されるものではなく、例えば以下に示すものが挙げられる。
リンゴ（Ｍａｌｕｓ）属：リンゴ（Ｍａｌｕｓ×ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ヒメリンゴ（Ｍａｌｕｓ　ｂａｃｃａｔａ　ｖａｒ．ｍａｎｄｓｃｈｕｒｉｃａ）、ミツバカイドウ（Ｍａｌｕｓ　ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、マルバカイドウ（Ｍａｌｕｓ　ｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ　ｖａｒ．ｒｉｎｇｏ　ＡＳＡＭＩ）
バラ（Ｒｏｓａ）属：バラ（Ｒｏｓｅ　ｈｙｂｒｉｄａ）
サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ）属：モモ（Ｐｒｕｎｕｓ　ｐｅｒｓｉｃａ）、オウトウ（Ｐｒｕｎｕｓ　ａｖｉｕｍ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ　ａｍｙｇｄａｌｕｓ）
ナシ（Ｐｙｒｕｓ）属：ナシ（Ｐｙｒｕｓ　ｐｙｒｉｆｏｌｉａ）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）
イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）属：イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ×ａｎａｎａｓｓａ）
マルメロ（Ｃｙｄｏｎｉａ）属：マルメロ（Ｃｙｄｏｎｉａ　ｏｂｌｏｎｇａ）
キイチゴ（Ｒｕｂｕｓ）属：キイチゴ（Ｒｕｂｕｓ　ｐａｌｍａｔｕｓ）
【００２１】
ｍＲＮＡの調製は、例えば、バラ科植物の茎頂部分を液体窒素で凍結した後で、通常行われる手法により行うことができる。例えば、凍結した植物体を乳鉢などで摩砕後、得られた摩砕物から、塩化セシウム法、セチルトリメチルアセチルブロマイド（ＣＴＡＢ）法などにより粗ＲＮＡ画分を抽出調製する。次いで、この粗ＲＮＡ分画から、オリゴｄＴ−セルロースを担体とするアフィニティーカラム法、又はオリゴｄＴ固定化ラテックス粒子を用いた方法などにより、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得ることができる。
【００２２】
このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、市販のキット（例えば、ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製））を用い、オリゴｄＴ２０及び逆転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで得られた二本鎖ｃＤＮＡに適切なアダプター又はカセット（例えば、ＥｃｏＲＩカセット（ＴＡＫＡＲＡ社製））を付加することにより、例えばＲＡＣＥ−ＰＣＲの鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。ＲＡＣＥ−ＰＣＲ法を行うためのキットとしては、例えば３’−Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ社製）、５’−Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ社製）などを用いることができる。
【００２３】
（２）ＭｄＴＦＬ遺伝子断片の取得
ＭｄＴＦＬ遺伝子をクローニングする方法としては、該遺伝子の断片を用いて、ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより未知のＤＮＡ領域を明らかにし、最終的に全長ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅して、該遺伝子を含む増幅産物を適切なベクターにクローニングする方法が挙げられる。
【００２４】
ＭｄＴＦＬの断片は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）のＴＦＬ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ７７６７４）及びキンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ　ｍａｊａｓ）のＣＥＮＴＲＯＲＡＤＩＡＬＩＳ（ＣＥＮ遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ８１１９３）のコンセンサス配列から設計した縮重プライマーを使用して、ＰＣＲを行うことによって得ることができる。ここでＰＣＲで用いることのできる鋳型ＤＮＡとしては、バラ科植物のゲノムＤＮＡ又は上記（１）で得られたｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。また縮重プライマーの例として、センスプライマーとしては５’−ＡＡＴ／ＣＧＧＩＣＡＴ／ＣＧＡＡ／ＧＴ／ＣＴＩＴＴＴ／ＣＣＣ−３’（配列番号３）、アンチセンスプライマーとしては５’−ＣＧ／ＴＴ／ＣＴＧＩＧＣＡ／ＧＴＴＡ／ＧＡＡＡ／ＧＡＡＩＡＣ−３’（配列番号４）が挙げられる。ただし、本発明においてはこれらのプライマーに限定されるものではなく、当業者であれば上記コンセンサス配列に基づいて適当なプライマーを設計することができる。
【００２５】
（３）ＭｄＴＦＬ遺伝子の取得
上記（２）で得られたＭｄＴＦＬ遺伝子の断片内に、遺伝子特異的なセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを適切な領域にそれぞれ２つ設計し、該遺伝子の５’側の未知配列の解明には２つのアンチセンスプライマーと２つのカセットプライマー、該遺伝子の３’側の未知配列の解明には２つのセンスプライマーと２つのカセットプライマーを用いてＲＡＣＥ−ＰＣＲを行い、ＭｄＴＦＬ遺伝子の５’上流又は３’下流を含むＤＮＡ断片を得る。このプライマーは、５’−ＲＡＣＥに対しては、上記（２）で得られた遺伝子断片の３’側に２０ｂｐ程度の特異的配列、また３’−ＲＡＣＥに対しては、上記（２）で得られた遺伝子断片の５’側に２０ｂｐ程度の特異的配列として設計する。
【００２６】
次いで、５’上流及び３’下流の特異的配列をもつプライマーを作製し、ＰＣＲを行うことによりＭｄＴＦＬｃＤＮＡを増幅することができる。このプライマーは、５’−ＲＡＣＥで得られた５’上流の２０ｂｐ程度の特異的配列及び３’−ＲＡＣＥで得られた３’下流領域（ポリＡ領域を除く）の特異的配列として設計する。ＰＣＲの鋳型としては、上記（１）で得られたｃＤＮＡライブラリーを用いることができる。
【００２７】
上記（３）で得られたＭｄＴＦＬ遺伝子を、例えばプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶ部位にＴ末端を付加したプラスミドベクターに連結した後、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等を形質転換することにより、この遺伝子をクローニングすることができる。
【００２８】
具体的には、使用し得るベクターとしては、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ以外に、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２等が挙げられる。ＰＣＲ産物は、通常は末端にアデニン（Ａ）が付加する傾向があり、ベクターは、例えばＥｃｏＲＶ等の平滑末端を生じる制限酵素で切断し、チミン（Ｔ）末端を付加することにより容易にクローニングできる（ＴＡクローニング法）。該遺伝子のＰＣＲ産物と、Ｔ末端処理したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔとの結合は、例えばＴＡＫＡＲＡ社製のＬｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて、通常１６℃で約１時間処理することにより行えばよい。
【００２９】
大腸菌の形質転換は周知の方法を用いて行うことができる。ベクターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いた場合は、得られる形質転換体がアンピシリン耐性になり、同時に、βガラクトシダーゼをコードしている領域に外来遺伝子が挿入されることにより、βガラクトシダーゼ活性が欠失する。そのため、アンピシリン耐性で、かつＸ−ＧＡＬを分解できない、白色のコロニーを形質転換体として選択できる（ブルー・ホワイトセレクション）。このようにして、ベクタープラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＭｄＴＦＬ遺伝子が組み込まれたプラスミドｐＢＭＤＴＦＬ１２を有する形質転換体を得ることができる。例えば、大腸菌ＪＭ１０９に導入して、形質転換体である大腸菌ＪＭ１０９（ｐＢＭＤＴＦＬ１２）を得ることができる。
【００３０】
また、形質転換された微生物、例えば上記のプラスミドｐＢＭＤＴＦＬ１２を有する大腸菌を培養し、例えばアルカリ−ＳＤＳ法等の周知の手段を用いることにより、ＭｄＴＦＬ遺伝子が組み込まれたプラスミドｐＢＭＤＴＦＬ１２を大量に得ることが可能である。
【００３１】
（４）遺伝子の解析
上記（３）で得られたプラスミドベクターｐＢＭＤＴＦＬ１２を用いて、ＭｄＴＦＬの全塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定は、マクサム−ギルバートの化学修飾法、又はジデオキシヌクレオチド鎖終結法などの周知の手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えば日立製作所製ＳＱ−５５００　ＤＮＡシーケンサーなど）を用いて配列決定を行う。
【００３２】
配列番号１に、本発明のＭｄＴＦＬ遺伝子の塩基配列を、配列番号２に、該ＭｄＴＦＬ遺伝子をコードするタンパク質（以下、「ＭｄＴＦＬタンパク質」という）のアミノ酸配列を例示する。ただし、植物間でも品種等によって多少のアミノ酸配列の相違はあり得る。また、同一植物品種であっても突然変異等によってアミノ酸が変化する場合がある。よって、本発明では、配列番号２に示すアミノ酸配列のうち複数個（１若しくは数個、例えば１〜１０個）のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ花芽形成抑制活性を有するタンパク質も本発明に含まれる。
【００３３】
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のＭｄＴＦＬタンパク質に含まれる。
【００３４】
本発明において「花芽形成抑制活性」とは、花芽形成を抑制し、開花の遅延を引き起こす性質を指す。この活性は、モデル植物であるシロイヌナズナやタバコに、該活性を有すると考えられる遺伝子を導入し、それらの開花時期を調べることによって確認することができる。
【００３５】
さらに、上記ＭｄＴＦＬ遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、花芽形成抑制活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明のＭｄＴＦＬ遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が７６％以上、好ましくは８０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が３００〜２０００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が４０〜７５℃、好ましくは６５℃での条件をいう。例えば、ハイブリダイゼーション条件が、ナトリウム濃度が５００ｍＭ、温度が６５℃の場合に、慣例的な手法、例えばサザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーションなどによってハイブリダイズすることが確認された場合には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするといえる。
【００３６】
ここで、「一部の配列」とは、上記ＭｄＴＦＬ遺伝子の塩基配列の一部分を含むＤＮＡの塩基配列であって、該ＤＮＡが花芽形成抑制活性を有するタンパク質をコードするものを指す。
【００３７】
一旦本発明のＭｄＴＦＬ遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は該遺伝子のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明のＭｄＴＦＬ遺伝子を得ることができる。
本発明のＭｄＴＦＬ遺伝子の塩基配列及びＭｄＴＦＬのアミノ酸配列は、ＤＤＢＪにアクセッション番号ＡＢ０５２９９４として登録されている。
【００３８】
（５）ＭｄＴＦＬ遺伝子のコピー数、及び植物組織における発現部位の分析
ＭｄＴＦＬ遺伝子のバラ科植物におけるコピー数の確認は、バラ科植物の細胞及び組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、サザン分析を用いて行うことができる。このようにしてＭｄＴＦＬ遺伝子のコピー数及び発現部位を分析することによって、ジーンファミリーを形成する傾向があるＴＦＬ１様遺伝子の特徴を調べることができる。
【００３９】
また、ＭｄＴＦＬ遺伝子の植物組織における発現は、バラ科植物の各組織におけるｍＲＮＡの発現又はタンパク質の発現を解析することにより確認することができる。具体的には、本発明のＭｄＴＦＬ遺伝子の発現を確認する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザン分析等が挙げられ、ＭｄＴＦＬタンパク質の発現の確認方法としては、ＭｄＴＦＬタンパク質に対する抗体を用いたウェスタン分析等が挙げられる。ＭｄＴＦＬ遺伝子の発現様式を特定することによって、ＭｄＴＦＬ遺伝子の特徴を明らかにすることができるため、機能の解明に役立つ。
【００４０】
２．ＭｄＴＦＬタンパク質の製造
本発明のＭｄＴＦＬタンパク質は、前述したバラ科植物の細胞又は組織から当技術分野で公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。また、当技術分野で公知の化学的ペプチド合成方法、例えば固相合成法などによって製造することもできる。また、ＭｄＴＦＬタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養し、得られる培養物から該タンパク質を回収することによっても製造することができる。このような遺伝子工学的手法を利用したタンパク質の生産方法は当技術分野で周知であり、以下に具体的に説明する。
【００４１】
（１）ベクターの作製
形質転換用の組換えベクターは、ＭｄＴＦＬ遺伝子を適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、この組換えベクターを、ＭｄＴＦＬ遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００４２】
ベクターには、宿主において自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００４３】
ベクターにＭｄＴＦＬ遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００４４】
ＭｄＴＦＬ遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、組換えベクターには、プロモーター、ＭｄＴＦＬ遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。さらに、大腸菌及び酵母などの２種以上の宿主微生物で自律的増殖が可能なベクターのほか、各種のシャトルベクターを使用することもできる。このようなベクターについても、前記制限酵素で切断し、その断片を得ることができる。
【００４５】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、組換えベクターを作製する。
【００４６】
（２）形質転換
形質転換に使用する宿主としては、ＭｄＴＦＬ遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、植物細胞、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００４７】
細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、ＭｄＴＦＬ遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５αなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４８】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等を用いることができる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００４９】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００５０】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００５１】
（３）ＭｄＴＦＬタンパク質の生産
本発明において、ＭｄＴＦＬタンパク質は、ＭｄＴＦＬ遺伝子を保有する前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００５２】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００５３】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、又はその他の含窒素化合物が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００５４】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約３７℃で約５〜３０日間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５５】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００５６】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で約１〜３０日間行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５７】
培養後、ＭｄＴＦＬタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、ＭｄＴＦＬタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からＭｄＴＦＬタンパク質を単離精製することができる。
ＭｄＴＦＬタンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
【００５８】
３．組換えベクターの作製及び形質転換植物の作出
上記「１．ＭｄＴＦＬ遺伝子の単離・同定」の節に記載のようにして得られたＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡを植物宿主に導入し、該ＭｄＴＦＬ遺伝子の発現を増強又は抑制することにより、花芽形成時期を制御することができる。例えば、植物宿主のＭｄＴＦＬ遺伝子の発現を抑制することによって、早期開花性を有する形質転換植物を作出することができる。一方、ＭｄＴＦＬ遺伝子の発現を増強することによって、遅延開花性を有する形質転換植物を作出することができる。このようにＭｄＴＦＬ遺伝子の発現が制御された形質転換植物は、植物の花芽形成及び開花を研究するために利用することができる。
【００５９】
本発明において「早期開花性」とは、植物体が発生してから初めて開花するまでの期間が対照植物（非形質転換体）より短いことを意味する。また「遅延開花性」とは、植物体が発生してから初めて開花するまでの期間が対照植物より遅いことを意味する。
【００６０】
（１）形質転換のための植物宿主
本発明において植物宿主とは、植物培養細胞、栽培植物の植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）、又は植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）のいずれをも意味するものである。植物宿主として用いることのできる植物としては、特に限定されるものではないが、幼若期間が長い植物種に早期開花性を付与するという本発明の目的を考慮した場合、モデル植物であるシロイヌナズナの他に、特に永年性植物や樹木が望ましい。「永年性」とは、イネやムギなどのように１年で一生を終えるのではなく、数年間（５〜１０年以上）生育できること（多年生）を指す。永年性植物としては、例えば果実を有する植物（果樹植物）が挙げられる。永年性果樹植物としては、バラ科植物（リンゴ、ナシ、モモ、オウトウ等）、カキノキ科植物（カキ等）、ブドウ科植物（ブドウ等）、ミカン科植物（カラタチ属、キンカン属、カンキツ属等に属する植物）、ツツジ科（ブルーベリー、クランベリー等）、クルミ科（クルミ等）、ブナ科（クリ等）などが挙げられる。樹木としては、スギ科（スギ等）、マツ科（アカマツ、クロマツ等）、ヒノキ科（ヒノキ等）などが挙げられる。
【００６１】
（２）組換えベクター
ＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡを含む組換えベクターは、適当なベクターに、該遺伝子又は該アンチセンスＤＮＡを連結（挿入）することにより得ることができる。ＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡを挿入するためのベクターは、植物宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、バイナリーベクター系などが挙げられる。
【００６２】
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＢＵ１１０、ｐＴＰ５等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。また、アグロバクテリウム法（後述参照）を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター系（ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＳＭＡＫ２５１等）を使用することができる。
【００６３】
ＭｄＴＦＬ遺伝子は、上記「１．ＭｄＴＦＬ遺伝子の単離・同定」の節に記載のようにして得ることができる。またＭｄＴＦＬ遺伝子のアンチセンスＤＮＡとしては、配列番号１に示す塩基配列に対し相補的な配列からなるＤＮＡを例示することができる。ただし、本発明において用いるアンチセンスＤＮＡは、植物宿主に導入されて、内在性ＭｄＴＦＬ遺伝子の発現を抑制しうる限り、配列番号１に示す塩基配列に対して完全に相補的な配列である必要はない。従って、配列番号１に示す塩基配列の全部若しくは一部に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ花芽形成抑制活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに対し相補的な配列からなるＤＮＡもまた本発明においてアンチセンスＤＮＡとして利用可能である。さらに、アンチセンスＤＮＡは、植物宿主に導入されて、内在性ＭｄＴＦＬ遺伝子の発現（翻訳又は転写）を抑制又は阻害しうる限り、配列番号１に示す塩基配列に対し相補的な配列の一部分であってもよい。
ストリンジェントな条件及びＤＮＡの合成方法は、「１．ＭｄＴＦＬ遺伝子の単離・同定」の節に記載の通りである。
【００６４】
組換えベクターに、ＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断した後、必要に応じて適切なリンカーを連結し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００６５】
ＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡは、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこでベクターには、発現カセットとして、（ｉ）植物細胞内で転写可能なプロモーター配列、（ｉｉ）プロモーター配列の下流にＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡと、（ｉｉｉ）該遺伝子又は該アンチセンスＤＮＡの下流に結合された、転写の終結及びポリアデニル化に必要な配列を含むターミネーター配列を連結する。発現カセットには、プロモーター以外にも転写をさらに促進するためのＤＮＡ配列、例えばエンハンサー配列などのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。
【００６６】
用いられるプロモーターとしては、植物内で機能するものであれば特に制限されない。例えば、３５Ｓプロモーターなどの恒常的な発現のためのプロモーターや誘導可能なプロモーターを用いることも可能である。
【００６７】
また、必要に応じて転写終結を指令するターミネーターをＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡの下流に連結することもできる。ターミネーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス由来ターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターなどが挙げられる。ただし、植物内で機能することが知られているターミネーターであればこれに限定されるものではない。
【００６８】
さらに、効率的に目的とする形質転換植物を選択するために、有効な選択マーカー遺伝子を組換えベクターに連結することが望ましい。その際に使用する選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＴＰＩＩ）、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子などが挙げられる。
【００６９】
（３）形質転換体の作出
本発明の形質転換植物は、上記（２）に記載の組換えベクターを、該ベクターに連結したＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡが機能し得るように植物宿主中に導入することにより得ることができる。
【００７０】
上記組換えベクターは、公知の種々の方法を用いて植物宿主に導入することができる。例えば、アグロバクテリウムを利用した間接導入法や、エレクトロポレーション法、ポリエチエレングリコール法、パーティクルガン法等に代表される直接導入法を用いることができる。これらのうち、バラ科をはじめとする双子葉植物に対しては、アグロバクテリウムを用いる方法が安定な形質転換を確実に行える点から極めて有効である。
【００７１】
例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した組換えベクターを、適当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ、ＥＨＡ１０５等、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＬＢＡ９４０２等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法などを利用して導入する。続いてこの株をフローラルディップ法、リーフディスク法などに従って無菌培養葉片に感染させて、形質転換植物を得ることができる。また、アグロバクテリウム感染法には、中間ベクター法、バイナリーベクター法などがあり、本発明においてはいずれの感染法を利用しても遺伝子導入が可能である。
【００７２】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エレクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。
【００７３】
組換え効率及び取り扱いの容易性の観点から、本発明の好ましい例として、以下にバイナリーベクター系を用いたアグロバクテリウム感染法による形質転換植物の作出を具体的に説明する。
【００７４】
アグロバクテリウム感染法により遺伝子を導入する場合、目的の遺伝子を含むプラスミドを保有するアグロバクテリウムを植物宿主に感染させる工程が必要である。この工程をフローラルディップ法により行う場合には、形質転換対象の植物宿主を生育させ、ＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡを有するプラスミドを含むアグロバクテリウム懸濁溶液に直接該植物宿主の花芽を浸漬し、鉢をトレーに移し、覆いをして一晩湿度を保つ。翌日覆いを取り、植物をそのまま生育させて種子を収穫する。次いで、導入遺伝子保有個体を選択するために、様々な株由来の種子を適切な抗生物質を加えたＭＳ寒天培地に播種する。この培地で生育した植物を鉢に移植し、生育させることにより、本発明のＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡが導入された形質転換植物の種子を得ることができる。
【００７５】
一方、永年性植物を宿主とした場合のアグロバクテリウムの感染は、直接かつ多数の形質転換体を作成し得るという観点から、リーフディスク法を採用することが望ましい。すなわち、無菌培養したリンゴ属植物の無菌葉から採取したリーフディスクを、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１（ｐＳＭＤＴＦＬ）の培養液に浸漬した後に、茎葉分化培地にて培養してカルスを形成させ、増殖させればよい。茎葉分化培地としては、例えばＭＳ培地等の公知の培地に植物ホルモンを添加したものを使用することができる。その後に選択用の茎葉分化培地を用いてカルスの選択を行う。選択用の培地としては、上記の茎葉分化培地にさらに、形質転換体の選抜のために例えばカナマイシンを２５〜１００μｇ／ｍＬ、またアグロバクテリウムの殺菌のためにセフォタキシム等の殺菌剤を２００〜５００μｇ／ｍＬ加えたものを使用すればよい。
【００７６】
形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン等）の投与などにより植物体に再生させることができる。また形質転換植物の鉢上げは、形質転換した植物体を発根培地に移植して自根を形成させ、次いでポット土に移植する。あるいは、適当な台木に接ぎ木することにより鉢上げを行う。これにより培養室レベルから温室レベルの栽培に移行することが可能となる。
【００７７】
ＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００７８】
（４）形質転換植物におけるＭｄＴＦＬ遺伝子の発現解析
ＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡを導入した形質転換植物におけるＭｄＴＦＬ遺伝子の発現レベル及び発現部位の分析は、これらの細胞及び組織から当技術分野で公知の方法に従ってｍＲＮＡを抽出し、公知のＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザン分析を用いてＭｄＴＦＬ遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより行うことができる。
【００７９】
ＭｄＴＦＬ遺伝子の発現が増強された形質転換植物は、植物の花芽形成及び開花を研究するために利用することができる。またＭｄＴＦＬ遺伝子の発現が抑制された形質転換植物は、早期開花性を示すため、農業的に価値が高いものである。
【００８０】
４．早期開花性植物
上記「２．組換えベクターの作製及び形質転換植物の作出」の節に従って作出された、ＭｄＴＦＬ遺伝子の発現が抑制された形質転換植物は早期開花性を示し、該遺伝子の発現が増強された形質転換植物は遅延開花性を示す。
【００８１】
この形質転換植物の開花時期に関する評価（例えば早期開花性又は遅延開花性）は、ＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡを導入した形質転換植物と非形質転換植物を同様の条件で栽培し、それぞれの開花時期を比較することにより行うことができる。例えば、モデル植物であるシロイヌナズナでは、バーミキュライト及びパーライトを含む土を入れた植木鉢に形質転換植物を植え、２０〜２５℃で生育させ、開花時期を調べればよい。また永年性植物では、上記無菌培養系で形質転換されたシュートを接ぎ木するなどして鉢上げし、温室に移した後、開花時期を調べればよい。
【００８２】
さらに、上記の感染細胞からの植物体の分化／誘導の手順を用いて、形質転換された植物体の組織（例えば、根、茎、葉）又は器官（例えば、生長点、花粉）の組織培養によって、生殖過程（種子）を介することなく、さらなる形質転換植物を得ることができる。このような技術及び手順は当業者には公知であり、組織培養の一般的な方法は、種々の実験マニュアルに記載されている。
【００８３】
このようにして作出した本発明の形質転換植物から得られる種子もまた正常に発芽及び成長し、そして早期開花性を示す。これは導入されたＭｄＴＦＬ遺伝子又は該遺伝子のアンチセンスＤＮＡが次世代においても保存されることを示し、それゆえ上記早期開花性が安定して後代に受け継がれることを示す。従って、本発明により、早期開花性を示す実用的で有用な植物が得られる。
【００８４】
【実施例】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８５】
〔実施例１〕ＭｄＴＦＬ遺伝子の単離
（１）実験に使用したリンゴ植物体
マルバ台に接ぎ木した１５〜１６年生の紅玉（Ｍａｌｕｓ×ｄｏｍｅｓｔｉｃａ　　ｖａｒ．　Ｊｏｎａｔｈａｎ）を使用した。
【００８６】
（２）ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの調製
花芽分化前後の７月〜９月に、上記（１）の植物体より茎頂部分を採取し、ＣＴＡＢ法により全ＲＮＡを調製した。すなわち、凍結したリンゴ茎頂３ｇを粉末状に磨砕後、３ｍＬの２×ＣＴＡＢ溶液（２％ＣＴＡＢ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ９．５、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．４Ｍ　ＮａＣｌ、１％　２−プロパノール）に懸濁し、６５℃で１０分間インキューべートした。溶液をクロロホルム・イソアミルで２回抽出後、１／４倍量の１０Ｍ塩化リチウムを加え、−２０℃にて２時間放置し、ＲＮＡを析出させた。その後、４℃、１２，０００×ｇで１０分間遠心し、ＲＮＡを沈殿させた。
【００８７】
得られた全ＲＮＡをＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解し、ＴＥ飽和フェノール、フェノール／クロロフォルム処理、及びエタノール沈殿を行うことにより全ＲＮＡを得た。得られた全ＲＮＡを滅菌水に溶解し、吸光度測定法及びホルムアルデヒド変性アガロースゲル電気泳動法により、良質の全ＲＮＡが調製されたことを確認した。
【００８８】
上記全ＲＮＡ　１４０μｇを、２３５μｌの滅菌水に溶解し、３５μｌのｏｌｉｇｏｔｅｘ（ｄＴ）３０（ＴＯＹＯＢＯ社製）を加え、７０℃で１０分間加熱後、氷中で急冷した。これに１７．５μｌの５Ｍ　ＮａＣｌを加え、攪拌した後、３７℃で１０分間加熱した。次いで、２５℃、１２，０００×ｇで５分間遠心し、上清を捨て、５００μｌの洗浄バッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ）を加えて再度２５℃、１２，０００×ｇで５分間遠心した。沈殿に１００μｌの蒸留水を加え、６５℃で５分間加熱した後、２５℃、１２，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を保存し、沈殿に再度１００μｌの蒸留水を加え、６５℃で５分間加熱した後、２５℃、１２，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を回収し、１回目の上清と合わせた。次いで、エタノール沈殿を行って、３．０μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを得た。
【００８９】
（３）ｃＤＮＡライブラリーの合成
上記（２）によって得られたポリ（Ａ）＋ＲＮＡ　３．０μｇを使って、ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）により１本鎖ｃＤＮＡを合成した。この反応には、プライマーとして、オリゴ（ｄＴ）２５を用いた。ＲＮＡ／プライマー混合液は以下の組成で調製した。
2004016201.tif 000002
【００９０】
上記混合物を、７０℃で５分間加熱した。氷上に１分間置き、以下の試薬を加えた。
2004016201.tif 000003
【００９１】
上記溶液に、逆転写酵素３μｌ（２０単位／μｌ）を添加して、４２℃で２時間インキュベートすることにより一本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、得られた一本鎖ｃＤＮＡの反応液に、以下の試薬を加えた。
2004016201.tif 000004
【００９２】
上記反応液を、１２℃で１時間、２２℃で１時間、さらに７０℃で１０分間インキュベートすることにより、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成した二本鎖ｃＤＮＡを、Ｔ４ポリメラーゼ６単位を用いて３７℃で１０分間インキュベートすることにより末端を平滑にした。次いで、フェノール／クロロフォルム抽出及びエタノール沈殿を行った後、得られたペレットを２０μｌのＴＥバッファーに溶解した。３μｌのｃＤＮＡ溶液（１．０ｇ）に、３μｌのＥｃｏＲＩアダプター、３μｌのライゲーションキット溶液Ｉ及び６μｌのライゲーションキット溶液ＩＩ（Ｔａｋａｒａ社製）を混合し、４℃で１２時間インキュベートすることによりｃＤＮＡにＥｃｏＲＩ末端を付加した。次いで４．５μｌ（５００μｇ）のＥｃｏＲＩ末端化ｃＤＮＡ溶液、１．０μｌのＥｃｏＲＩカセット（Ｔａｋａｒａ社製）、５μｌのライゲーションキット溶液Ｉ及び１０μｌのライゲーションキット溶液ＩＩ（Ｔａｋａｒａ社製）を混合し、４℃で１２時間インキュベートすることにより二本鎖ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩカセットを付加し、ＲＡＣＥ−ＰＣＲクローニング用のｃＤＮＡライブラリーを調製した。
【００９３】
（４）プライマーの作製
シロイヌナズナのＴＦＬ１及びキンギョソウのＣＥＮＴＲＯＲＡＤＩＡＬＩＳ（ＣＥＮ）のタンパク質間でよく保存されているアミノ酸配列をもとに、プライマーを合成した。すなわち、５’センスプライマーとして、両植物のＴＦＬ様タンパク質に共通するＮ末端側のＩＶＴＤＩＰＧ（配列番号５）に基づいて、プライマー５’−ＡＴＴＧＴＧＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号６）を合成した。一方、３’アンチセンスプライマーとして、Ｃ末端側のＶＹＦＮＡＱＲＥ（配列番号７）に基づいて、縮重プライマー５’−ＣＧ／ＴＴ／ＣＴＧＩＧＣＡ／ＧＴＴＡ／ＧＡＡＡ／ＧＡＡＩＡＣ−３’（配列番号４）を合成した。
【００９４】
（５）ＲＴ−ＰＣＲによるリンゴＭｄＴＦＬ遺伝子断片の増幅
上記（２）で合成した二本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、プライマーとしては上記（３）で作製したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液の組成は以下の通りである。
2004016201.tif 000005
上記反応液をよく混合し、９５℃で１０分間加熱した。ＰＣＲは、９４℃で１分間の熱変性、５０℃で１分間のアニーリング及び７２℃で２分間の伸長反応の条件を１サイクルとして４０サイクル行った。
【００９５】
得られたＰＣＲ産物を１．５％アガロールゲル電気泳動に供試し、２３５ｂｐの単一バンドを確認した。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで切断しかつチミン（Ｔ）末端を付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫＩＩ（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に連結し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを大腸菌（ＤＨ５α株）に形質転換した。単一コロニーをＬＢ培地中で培養し、プラスミドを精製し、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ｐｒｅｍｉｘｅｄ　ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｅｎｃｅ　ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて、蛍光自動ＤＮＡシーケンサー（日立製作所製、ＳＱ５５００）により解析した。複数のＰＣＲ産物の塩基配列を決定した結果、いずれも同配列であり、シロイヌナズナＴＦＬ１と高い相同性（約７５％）を示した。従って、この遺伝子断片はリンゴのＴＦＬ相同遺伝子の一部分と考えられた。
【００９６】
（６）リンゴＭｄＴＦＬ遺伝子の単離
上記（３）において調製したｃＤＮＡライブラリー及び上記（５）において調製した遺伝子断片を用いてＲＡＣＥ−ＰＣＲを行い、ＭｄＴＦＬ遺伝子の全長の単離を行った。すなわち、上記（５）において得られた遺伝子断片内に、特異的なＤＮＡ配列を有する２つのセンスプライマー（Ｒ１Ｓ、Ｒ２Ｓ）（それぞれ配列番号８及び９）並びに特異的なＤＮＡ配列を有する２つのアンチセンスプライマー（Ｒ１Ａ、Ｒ２Ａ）（それぞれ配列番号１０及び１１）を設定し、これら４つのプライマーとカセットプライマー（Ｃ１、Ｃ２）（それぞれ配列番号１２及び１３）（ＴＡＫＡＲＡ社製）との間で５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲを行った。５’ＲＡＣＥでは、１回目のＰＣＲはｃＤＮＡライブラリーを鋳型にＣ１及びＲ２Ａプライマーを用いて行い、２回目のＰＣＲは１回目のＰＣＲ産物を鋳型にＣ２及びＲ２Ａプライマーを用いて行った。一方、３’ＲＡＣＥでは、１回目のＰＣＲはｃＤＮＡライブラリーを鋳型にＣ１及びＲ１Ｓプライマーを用いて行い、２回目のＰＣＲは１回目のＰＣＲ産物を鋳型にＣ２及びＲ２Ｓプライマーを用いて行った。ＰＣＲの反応組成は以下の通りである。
2004016201.tif 000006
【００９７】
上記反応液をよく混合し、１回目及び２回目のいずれのＰＣＲ反応も、９４℃で３０秒間の熱変性、６２℃で４分間のアニーリング及び伸長反応の条件を１サイクルとして３０サイクル行った。５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物として５５０ｂｐ、３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物として４５０ｂｐの増幅産物が得られ、上記（５）に記載の方法で、それぞれの遺伝子断片を複数クローニングし、塩基配列を決定した。５’上流の５５０ｂｐ断片には翻訳開始点のＡＴＧ、３’下流の４５０ｂｐ断片にはポリＡ配列の存在が判明したため、それぞれの遺伝子断片内に特異的プライマー（２Ｓ、２Ａ）（それぞれ配列番号１４及び１５）を設定し、ＬＡ−ＰＣＲによりＭｄＴＦＬ遺伝子の全長を増幅した。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃で１分間熱変性、５０℃で１分間アニーリング及び７２℃で２分間の伸長反応を１サイクルとし、２５サイクル行った。以上の操作により、６５０ｂｐの遺伝子増幅断片を得た。次いで、上記（５）に記載の方法で、遺伝子断片を複数クローニングし、４つの組換えプラスミドｐＢＭＤＴＦＬ１，ｐＢＭＤＴＦＬ２，ｐＢＭＤＴＦＬ５，及びｐＢＭＤＴＦＬ１２をそれぞれ得た。ＰＣＲの反応組成は以下の通りである。
2004016201.tif 000007
【００９８】
（７）塩基配列の決定
これらのプラスミドｐＢＭＤＴＦＬ１，ｐＢＭＤＴＦＬ２，ｐＢＭＤＴＦＬ５，及びｐＢＭＤＴＦＬ１２を用いて、得られたｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。プラスミドは、培養した大腸菌細胞からアルカリ−ＳＤＳ法によって調製した。塩基配列決定は、上記（５）と同様の方法で行った。その結果、プラスミドｐＢＭＤＴＦＬ１，ｐＢＭＤＴＦＬ２，ｐＢＭＤＴＦＬ５，及びｐＢＭＤＴＦＬ１２中のｃＤＮＡは、いずれも６５６ｂｐの塩基から構成されており（配列番号１）、該塩基中には１７２アミノ酸残基からなると推定されるタンパク質をコードする唯一のオープンリーディングフレームの存在が明らかとなった。
【００９９】
〔実施例２〕ＭｄＴＦＬ遺伝子のサザンブロット解析
（１）ゲノムＤＮＡの調製
リンゴ「紅玉」の葉から、ＣＴＡＢ法によって、ゲノムＤＮＡを調製した。すなわち、リンゴ葉３ｇを液体窒素で凍結し、乳鉢で迅速に砕いて粉末化した。糖類を除去するため、抽出緩衝液（１０％ポリエチレングリコール６０００、０．３５Ｍソルビトール、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１％　２−メルカプトエタノール）を加えて５０ｍＬチューブ内でよく混合した後、室温で１，２０００×ｇで５分間遠心した。上清を捨て、ペレットに９ｍＬの分解緩衝液（０．３５Ｍソルビトール、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１％　２−メルカプトエタノール）と１ｍＬの１０％サルコシンを加え、室温で１０分間穏やかに攪拌した後、１０ｍＬの２×ＣＴＡＢ（２％ＣＴＡＢ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ９．５、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．４Ｍ　ＮａＣｌ、１％　２−メルカプトエタノール）を加え、５６℃で２０分間穏やかに振とうした。
【０１００】
上記ＣＴＡＢ溶液をクロロフォルム／イソアミルで２回処理した後、等量の２−プロパノールを加え、白い沈殿を得た。このＤＮＡ繊維をガラス棒に巻き付けることにより回収し、５ｍＬの１Ｍ　ＮａＣｌ溶液に溶解して、５６℃で２〜３時間のＲＮａｓｅ処理（１０ｍｇ・ｍＬ−１）を行った。次いで、得られた消化溶液をエタノール沈殿処理し、１ｍＬのＴＥに溶解してゲノムＤＮＡを得た。
【０１０１】
（２）ハイブリダイゼーション
上記（１）で得られたゲノムＤＮＡ　１０μｇをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩで消化し、その分解物を０．８％アガロース電気泳動に供試した。泳動後、ＤＮＡ断片をナイロンメンブレンにトランスファーし、そのメンブレンをプレハイブリダイゼーション溶液（０．５Ｍ　リン酸水素２ナトリウムｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に６５℃で３０分浸漬することにより、プレハイブリダイゼーションを行った。
【０１０２】
次いで、プローブとして、ＭｄＴＦＬ遺伝子を鋳型とし、ＤＩＧ発光検出キットを用いてＰＣＲによりＤＩＧ（ジゴキシゲニン）標識したものを用い、ハイブリダイゼーションを行った。すなわち、ハイブリダイゼーションは、標識ＰＣＲプローブを含むハイブリダイゼーション用緩衝溶液（０．５Ｍ　リン酸水素２ナトリウムｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中、６５℃で１６時間メンブレンを浸漬することにより行った。次いで、メンブレンをリン酸緩衝液（４０ｍＭ　リン酸水素二ナトリウムｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中、６５℃で２０分間３回洗浄し、抗体反応を行った。反応後、オートラジオグラムをとってプローブとハイブリダイズしたバンドを調べた。その結果を図１に示す。
【０１０３】
ＤＮＡの消化に用いた制限酵素のうち、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩは、いずれもその切断部位がプローブ内に存在しないものであり、メジャーなバンド以外にマイナーなバンドが認められることから、目的のＭｄＴＦＬ遺伝子と相同性が比較的高い別の遺伝子も存在すると考えられた。
【０１０４】
〔実施例３〕ＭｄＴＦＬ遺伝子のノーザンブロット解析
（１）ＲＮＡの調製
リンゴの各器官、すなわち萼、花弁、雄蕊、雌蕊、茎頂、葉、子葉、茎及び根より、上記実施例１の（２）に記載の方法により全ＲＮＡを調製した。また、リンゴの茎頂及び花芽部分を、６月から翌年の４月まで一定期間をおいて採取し、それぞれの時期における花芽茎頂の全ＲＮＡを調製した。
【０１０５】
（２）ハイブリダイゼーション
上記（１）で得られた全ＲＮＡ　１０μｇをホルムアルデヒド変性１．２％アガロースゲル電気泳動に供試し、ナイロンメンブレンに転写した。そのメンブレンをプレハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、１０×デンハルト溶液、１０ｍＭ　Ｎａ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）、０．５％ＳＤＳ、５０％フォルムアミド、１０ｍｇ／ｍＬ　サケ精子ＤＮＡ）中に６５℃で１時間浸漬することにより、プレハイブリダイゼーションを行った。次いで、プローブとして、ＭｄＴＦＬ遺伝子（配列番号１）を鋳型とし、ＤＩＧ−ＲＮＡラベリングキットを用いて試験管内逆転写反応によりＤＩＧ（ジゴキシゲニン）標識したＲＮＡプローブを使用してハイブリダイゼーションを行った。すなわち、ハイブリダイゼーションは、ＤＩＧラベルＲＮＡプローブを含むハイブリダイゼーション用緩衝溶液中、６５℃で１６時間浸漬することにより行った。次いで、メンブレンを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中に室温で１５分間の洗浄を２回行い、さらに０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中に６５℃で１５分間の洗浄を２回行った。次いで抗体反応を行った後、オートラジオグラムをとってプローブとハイブリダイズしたバンドを調べた。その結果を図２及び図３に示す。
【０１０６】
ＭｄＴＦＬ遺伝子はリンゴの器官中では、がく、葉及び茎頂部分に発現が認められた（図２）。またリンゴの花芽茎頂部分における時期別の発現パターンは、花芽分化期直前の６月の後半に強い発現が見られ、その後次第に発現レベルが減少する傾向が認められた（図３）。
【０１０７】
〔実施例４〕植物への遺伝子導入（形質転換）
（１）植物プラスミドの構築
上記実施例１で得られた、ＭｄＴＦＬ遺伝子がセンス方向に導入されたｐＢＭＤＴＦＬ１２（１μｇ）を、Ｌバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ジチオトレイトール）中３７℃でＫｐｎＩ（３ユニット）を用いて、次いでＫバッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ジチオトレイトール、１００ｍＭ　ＮａＣｌ）中３０℃でＢａｍＨＩ（３ユニット）を用いてそれぞれ２時間かけて切断し、ＭｄＴＦＬ遺伝子を含む約６５０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドベクターｐＵＣ１１９を同様の制限酵素で切断し、ライゲーションキットを用いて該遺伝子をｐＵＣ１１９ベクターに連結してｐＵＭＤＴＦＬ１２．１＋を作製し、これを大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。
【０１０８】
得られた形質転換体を培養後、該培養物からｐＵＭＤＴＦＬ１２を精製した。次いで、ｐＵＭＤＴＦＬ１２．１＋（１０μｇ）を、Ｍバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ジチオトレイトール、５０ｍＭ　ＮａＣｌ）中、ＸｂａＩ（３０ユニット）とＳａｃＩ（３０ユニット）を用いて３７℃で１２時間切断し、ＭｄＴＦＬ遺伝子を含む約６５０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターＤＮＡを持つバイナリーベクターｐＳＭＡＫ２５１（１０μｇ）を、ＸｂａＩ（３０ユニット）とＳａｃＩ（３０ユニット）を用いて上記と同様に処理し、ＧＵＳ領域を除去した。ＭｄＴＦＬを含む約６５０ｂｐの前記ＤＮＡ断片とｐＳＭＡＫ２５１とを、ライゲーションキット（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて、４℃で１６時間反応させることにより連結し、得られた連結物を上記と同様に大腸菌に形質転換した。得られた形質転換体を培養し、該培養物からｐＳＭＤＴＦＬ１２．１．２＋を精製した。ｐＳＭＤＴＦＬ１２．１．２＋は、ＳａｃＩで切断することにより、センス方向に結合したものであることを確認した（図４Ａ）。
【０１０９】
次いで、ＭｄＴＦＬ遺伝子をアンチセンス方向に結合したバイナリーベクターを作製するため、ＭｄＴＦＬ遺伝子がアンチセンス方向に導入されたプラスミドｐＢＭＤＴＦＬ５を用いて、上記と同様の方法で操作を行い、ｐＳＭＤＴＦＬ５．１−を得た。ｐＳＭＤＴＦＬ５．１−は、ＳａｃＩで切断することにより、アンチセンス方向に結合したものであることを確認した（図４Ｂ）。
【０１１０】
（２）植物プラスミドｐＳＭＤＴＦＬ１２．１．２＋及びｐＳＭＤＴＦＬ５．１−を含むアグロバクテリウムの調製
上記（１）において得られた植物プラスミドｐＳＭＤＴＦＬ１２．１．２＋及びｐＳＭＤＴＦＬ５．１−を凍結融解法によりアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＥＨＡ１０１株（Ｅ．Ｅ．　Ｈｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｅ　ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ａ２８１　ｉｓ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｉｎ　ａ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ＴｉＢｏ５４２　ｏｕｔｓｉｄｅ　ｏｆ　Ｔ−ＤＮＡ，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１６８（１９８６）　１２９１−１３０１）に導入した。すなわち、アグロバクテリウム菌を５００ｍＬのψＢ培地（２％バクトトリプトン、０．５％バクト酵母抽出物、１．０％　ＭｇＳＯ４、ｐＨ７．２）にて２８℃で１晩培養し、Ｏ．Ｄ．６５０が１．０になったときに細胞を回収し、６０００×ｇで５分遠心した。ペレットを１００ｍＬのＬＢ培地で洗浄して上記と同様に遠心し、ペレットを２５ｍＬのＬＢ培地に再懸濁した。１．５ｍＬチューブに２００μｌずつ分注した後、−８０℃に保存し、コンピテント細胞を得た。
【０１１１】
２００μｌのコンピテント細胞とｐＳＭＤＴＦＬ１２．１．２＋又はｐＳＭＤＴＦＬ５．１−の精製プラスミド（５μｇ）と１００μｌのＬＢ培地を混合し、この混合液を液体窒素に５分間静置した。次に３７℃で２５分間インキュベートした後、１５ｍＬのＬＢ培地を加えた。このようにして得た形質転換アグロバクテリウム懸濁液を２８℃で一晩インキュベーターに静置した。
【０１１２】
上記懸濁液を６０００×ｇで５分間遠心して細胞を回収した。ペレットを３００μｌのＬＢ培地に懸濁し、抗生物質（１００μｇ／ｍＬ　スペクチノマイシン（トロビシン）、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン）を含むＬＢ寒天プレートに前記アグロバクテリウム菌懸濁液を１００μｌ塗りつけた。２８℃で２日間培養し、ｐＳＭＤＴＦＬ１２．１＋及びｐＳＭＤＴＦＬ５．１−が導入されたアグロバクテリウムをそれぞれ得た。
【０１１３】
（３）シロイヌナズナへのアグロバクテリウムの感染
シロイヌナズナへのアグロバクテリウムの感染は、フローラル・ディップ法で行った。すなわち、上記（２）において得られた形質転換アグロバクテリウムの接合体を、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍＬを含むψＢ培地（１０ｍＬ）中２８℃でＯ．Ｄ．６００ｎｍが０．８になるまで培養した。この培養液を遠心して培地を除き、５％ショ糖溶液をＯ．Ｄ．６００ｎｍが０．８になるように添加し、懸濁した。次にＳｉｌｗｅｔ７７（日本ユニカー社製）を最終濃度０．０２〜０．０５％（ｖ／ｖ）になるように加え、処理液とした。
【０１１４】
一方、バーミキュライトとパーライトを等量ずつ合わせた土を入れた７センチの植木鉢で２０本ほどのシロイヌナズナ（コロンビア）を３週間育てた。プラスミドｐＳＭＤＴＦＬ１２．１．２＋又はｐＳＭＤＴＦＬ５．１−を含む上記のアグロバクテリウム処理液に、抽台したシロイヌナズナの蕾を３秒間浸透しアグロバクテリウムを感染させた。鉢をトレーに移し、一日コップで覆い湿度を保った。植物をそのまま成育させて種子を得た。種子は０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２．５％次亜塩素酸ナトリウム水溶液にて滅菌後、選択用の１／２ＭＳ培地にカナマイシン２５ｍｇ／ｍＬを加えた寒天培地に播種した。この選択培地で生育したシロイヌナズナを鉢に移し、形質転換体シロイヌナズナを得た。この種子を選択培地に同様に播種し、さらに後代を獲得した。
【０１１５】
（４）リンゴ葉へのアグロバクテリウムの感染
組織培養系のリンゴ（Ｍａｌｕｓ×ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）品種「王林」を、培地１Ｌ当たり１ｍｇ／ｍＬの６−ベンジルアミノプリン、０．１ｍｇ／ｍＬの３−インドール酢酸及びＢ５ビタミンを含むＭＳ培地に継代し、約１ヶ月後に展開した葉を得た。
葉を約５ｍＭ×１０ｍＭの切片にし、２８℃で一晩培養し、ｐＳＭＤＴＦＬ５．１−を保有するアグロバクテリウム菌液を葉片に加え、３０分間感染させた。次いでこの葉片をＭＳ培地上に移し、一週間共存培養した。
【０１１６】
（５）形質転換細胞の選抜及び植物体への再生
共存培養後、葉切片を選択培地（上記ＭＳ培地に３．３８ｍｇ／ｍＬの６−ベンジルアミノプリン、０．９３ｍｇ／ｍＬのα−ナフチル酢酸、５００μｇ／ｍＬのセフォタキシム、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したもの）に移し、２５℃で２週間暗下で培養し、その後、明１６時間及び暗８時間のサイクルで培養した。約１〜２ヶ月後、カルス上に生じたカナマイシン耐性の不定芽を形質転換体として得た。
【０１１７】
得られた不定芽を継代培養し、展開した葉を採取した。これよりＤＮＡを抽出し、導入遺伝子であるＭｄＴＦＬの存在をＰＣＲにより確認した。すなわち、前記ＤＮＡを鋳型として、プライマーとしては上記（６）で作製したセンスプライマー（２Ｓ）及びアンチセンスプライマー（２Ａ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃で１分間熱変性、５０℃で１分間アニーリング及び７２℃で２分間の伸長反応を１サイクルとし、４０サイクル行った。ＰＣＲの反応液の組成は以下の通りである。
2004016201.tif 000008
【０１１８】
（５）形質転換体の鉢上げ
上記（４）でＭｄＴＦＬ遺伝子が導入された個体を、特異的プライマーを用いたＰＣＲにより遺伝子導入を確認した後、培養シュートを台木に接ぎ木することにより、鉢上げを行った。このようにして得られた組換えリンゴを隔離温室に移し、形質評価のため栽培を行った。
【０１１９】
〔実施例５〕形質転換植物の形態学的解析
（１）ＭｄＴＦＬ遺伝子のセンス及びアンチセンスを導入した形質転換シロイヌナズナの形態学的解析
ＭｄＴＦＬ遺伝子のセンスを導入したシロイヌナズナは３１系統、ＭｄＴＦＬ遺伝子のアンチセンスを導入したシロイヌナズナは６系統獲得した（Ｔ１世代）。また、各系統の後代を獲得した（Ｔ２世代）。センス遺伝子であるｐＳＭＤＴＦＬ１２．１．２＋を導入した３１系統の形質転換シロイヌナズナのなかで６系統に開花の遅延が観察された。さらにこれら６系統のＴ２世代を獲得し、長日条件下（１６時間照明・８時間暗下）にて栽培して開花時期を調べた（図５及び表１）。
【０１２０】
【表１】
2004016201.tif 000009
対照である野生型のシロイヌナズナは平均３０日で開花したのに対し、形質転換体は９日から２９日ほどの開花遅延が見られた。
【０１２１】
（２）ＭｄＴＦＬ遺伝子のアンチセンスを導入した形質転換リンゴの形態学的解析
ＭｄＴＦＬ遺伝子のアンチセンスを導入した形質転換リンゴは３系統１０個体（３０３−１、３０３−２、３０３−３、３０３−４、６１４−１、６１４−２、７０５−１、７０５−２、７０５−３及び７０５−４）得た。このうち、３０３−１、３０３−４、７０５−１、７０５−２、７０５−３及び７０５−４については、接ぎ木後８〜１５ヶ月のうちに早期開花が観察された（図６及び表２）。
【０１２２】
【表２】
2004016201.tif 000010
対照として栽培している非形質転換体の王林は６年生であるが、６１ヶ月経過しても未だに開花していない。特に７０５−１は接木後８ヶ月で開花した（図６Ａ）。非形質転換リンゴと比較すると、早期開花系統の花の数は一花叢につき平均１、２花で少ない傾向にあったが、正常な花器官であることが観察された（図７Ｂ及びＣ）。葉の形態は、３０３の系統においてやや鋸歯が多く見られる傾向が認められたが、７０５の系統においては対照の王林と比較して大きな差異はなかった（図６Ｄ）。
【０１２３】
早期開花系統の花粉稔性を、交雑及び寒天培地上での発芽試験により調査した。早期開花系統に和合性品種を交雑させたところ結実した。また、早期開花系統の花粉を一般品種に交雑させたところ結実し、稔性のあることを確認した（図７Ｄ〜Ｆ）。さらに供試したいずれの系統の花粉も発芽能力を有していた（図８）。
【０１２４】
〔実施例６〕リンゴ形質転換体におけるＭｄＴＦＬ遺伝子の発現
ＭｄＴＦＬ遺伝子を導入した形質転換体の葉から全ＲＮＡを抽出し、上記実施例３に従ってノーザンブロット解析を行った。プローブには、ＭｄＴＦＬ遺伝子の全長を鋳型にしたセンスＲＮＡプローブを用いた。バンドの検出は、ＬＡＳ１０００（富士フイルム社製）を用いて行った。
【０１２５】
獲得したリンゴの形質転換系統は、ＭｄＴＦＬ遺伝子を３５Ｓプロモーターの下流にアンチセンス方向に連結したベクターを導入した個体である。ノーザンブロット解析により、供試したいずれの系統においてもアンチセンスｍＲＮＡが過剰発現していることが確認された（図９）。３０３−１、３０３−４及び７０５−１においては、アンチセンスｍＲＮＡの発現が比較的高く、これらの系統は接ぎ木後８〜１１ヶ月という短い期間で早期開花している（表２参照）。
【０１２６】
【発明の効果】
本発明により、花芽形成を抑制する遺伝子及び該遺伝子のアンチセンスＤＮＡを含む形質転換植物が提供される。本発明により得られる形質転換植物は、早期開花性及び早期結実性を有し、かつ形態異常が起こらないため、農業において有用である。
【０１２７】
【配列表】
2004016201.tif 000011
2004016201.tif 000012
2004016201.tif 000013
2004016201.tif 000014
2004016201.tif 000015
2004016201.tif 000016
2004016201.tif 000017
2004016201.tif 000018
2004016201.tif 000019
【０１２８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：合成オリゴヌクレオチド
ｎは、イノシンを表す。（存在位置：６及び１４）
配列番号４：合成オリゴヌクレオチド
ｎは、イノシンを表す。（存在位置：６及び１８）
配列番号５：合成ペプチド
配列番号６：合成オリゴヌクレオチド
配列番号７：合成ペプチド
配列番号８：合成オリゴヌクレオチド
配列番号９：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１０：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１１：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１２：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１３：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１４：合成オリゴヌクレオチド
配列番号１５：合成オリゴヌクレオチド
【図面の簡単な説明】
【図１】非形質転換リンゴにおけるＭｄＴＦＬ遺伝子をサザン・ブロット法により検出した結果を示す写真である。レーン上のアルファベットはそれぞれＢ，　ＢａｍＨＩ；Ｅ，　ＥｃｏＲＩ：Ｈ，　ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｎ，　ＮｃｏＩ；Ｘｂ，　ＸｂａＩ；及びＸｈ，　ＸｈｏＩの各制限酵素を示す。
【図２】非形質転換リンゴの各組織におけるＭｄＴＦＬ遺伝子の発現をノーザン・ブロット法により検出した結果を示す電気泳動像写真である。
【図３】非形質転換リンゴの新梢茎頂におけるＭｄＴＦＬ遺伝子の経時的発現をノーザン・ブロット法により検出した結果を示す電気泳動像写真である。
【図４】本発明においてシロイヌナズナ及びリンゴの形質転換に用いたバイナリーベクター「ｐＳＭＤＴＦＬ１２．１．２＋」（Ａ）及び「ｐＳＭＤＴＦＬ５．１−」（Ｂ）を示す図である。
【図５】ＭｄＴＦＬのセンス遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナの生育を示す写真である。この写真は播種後３５日に撮影した。
【図６】早期開花したリンゴ形質転換体を示す。Ａ及びＢは、接木後８ヶ月及び接木後１２ヶ月の７０５−１系統である。Ｃは、接木後１１ヶ月の７０５−４系統である。Ｄは各系統の葉の形態を比較した写真、Ｅ及びＦは生長段階にあるシュートの先端に形成された花芽を示している。写真Ａ中のｆは花、ｇｔは接ぎ木部位を示す。また写真Ｆは写真Ｅの拡大で、矢印は分化した花芽を示す。
【図７】ＭｄＴＦＬのアンチセンス遺伝子を導入した形質転換リンゴの開花及び結実状況を示す写真である。
【図８】早期開花した形質転換リンゴの花粉発芽能力を示す写真である。
【図９】形質転換体リンゴの葉における導入遺伝子（ＭｄＴＦＬ遺伝子のアンチセンス）の発現をノーザン・ブロット法により検出した結果を示す電気泳動像写真である。
【図１】
2004016201.tif 000020
【図２】
2004016201.tif 000021
【図３】
2004016201.tif 000022
【図４】
2004016201.tif 000023
【図５】
2004016201.tif 000024
【図６】
2004016201.tif 000025
【図７】
2004016201.tif 000026
【図８】
2004016201.tif 000027
【図９】
2004016201.tif 000028