(57)【要約】【課題】ブタについてＲＮＡウイルス由来の疾病に対する遺伝的抵抗性を知る方法を提供することを課題とする。【解決手段】ブタＭｘ１遺伝子において、ミクソウイルスの１種であるインフルエンザウイルスの増殖抑制能が１１塩基の欠損にどのように影響されるかについて研究を行い、１１塩基欠損型はウイルス増殖抑制能を全く失っていることを明らかにした。ブタについて該１１塩基の欠損を検出することにより、インフルエンザウイルス抵抗性の判定を行うことができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルス抵抗性のブタを判定する方法であって、ブタＭｘ１遺伝子のエキソン上の配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の１１ｂｐの欠損を検出することを含む方法。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検ブタからＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検ブタからＤＮＡを調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する工程
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検ブタからＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する工程
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検ブタからＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検ブタからＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを質量分析器にかけ、分子量を測定する工程
（ｄ）工程（ｃ）で測定した分子量を対照と比較する工程
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検ブタからＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する工程
（ｄ）工程（ｂ）のＤＮＡと工程（ｃ）の基板を接触させる工程
（ｅ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程
（ｆ）工程（ｅ）で検出された強度を対照と比較する工程
【請求項８】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、請求項１に記載の判定方法。
（ａ）被検ブタからタンパク質試料を調製する工程
（ｂ）該タンパク質試料に含まれる、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の１１ｂｐが欠損した塩基配列によってコードされるブタＭｘ１変異タンパク質の量を測定する工程
【請求項９】
請求項１に記載の判定方法のためのＰＣＲプライマーであって、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡ領域を増幅するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡ領域、または１９６４位〜１９７４位が欠損した塩基配列を含むＤＮＡ領域とハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の１１ｂｐが欠損した塩基配列によってコードされるブタＭｘ１変異タンパク質を認識する抗体。
【請求項１２】
請求項９もしくは１０に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項１１に記載の抗体を含む、インフルエンザウイルス抵抗性ブタの判定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ブタについてＲＮＡウイルス由来の疾病に対する遺伝的抵抗性を知る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マウスからの知見で、Ｍｘ遺伝子は、オルソミクソウイルスに属する（直鎖状１本鎖ＲＮＡウイルス）インフルエンザウイルス等のＲＮＡウイルスの増殖を抑制する（ＲＮＡ合成を阻害する）タンパク質を生産することが知られている。
【０００３】
豚には２つのＭｘ遺伝子がありその一つがＭｘ１遺伝子である。Ｍｘ１遺伝子は１４のエキソンから構成されている。梅山豚（メイシャントン；Ｍｅｉｓｈａｎ）の一部の個体はエキソン（ｅｘｏｎ）１３に３ｂｐ  （Ｓｅｒ）  の欠損を持つ。また、ランドレース（Ｌａｎｄｒａｃｅ）、デュロック（Ｄｕｒｏｃ）等の西洋で家畜化され、世界に広く用いられているブタ品種の一部の個体は、最終エキソンに１１塩基の欠損を持つ（非特許文献１参照）。
【０００４】
これまでにＳＴＡＦＦ研究所と本発明者のグループは協同で欠損型の存在とその存在割合を報告（非特許文献１参照）しているが、その中で、世界で最も広く用いられているランドレース種にウイルス抑制能を持たない１１塩基欠損型が高い頻度で認められた。ランドレース種は肥育生産用の３元交雑ブタ（図１写真）を作るのに広く用いられている。
【０００５】
一方、ニホンイノシシ、梅山豚など野生又は半野生の品種には１１塩基欠損型はこれまで見出されていない。
【０００６】
ランドレース種内でヘテロの存在割合に対してＣホモ型が少ないこと、他の品種ではヘテロはいてもホモ型がいないことから、Ｃのホモ型は生存に不利である、と推察される。なお、旧畜産試験場で２０００年にランドレースを含む白色西洋品種約４０頭を調査したときにはＣ／Ｃは１頭も存在していなかった。
【０００７】
また、１９１７年〜１９１８年、スペイン風邪と呼ばれている、歴史に残る最大のインフルエンザが全世界で流行した。全世界では２千万人から４千万人が死亡した。我が国でも３０万人以上が死亡した。米国北西部から始まったスペイン風邪により、米国内でも約６０万人が死亡した。そのとき、ブタの集団にも風邪が流行していた、との報告がある。また、当時死亡した兵士の肺組織ホルマリン漬け・パラフィン包埋試料から取り出したＲＮＡウイルスの系統解析では、このインフルエンザウイルスはブタのものに非常に近い、と報告されている。
【０００８】
米国北西部、アイオワ州などは現在でも養豚が盛んな地域である。当時の養豚がどのような状況であったのか不明であるが、既にランドレース種やこれを交配した交雑種が集約的に飼われていたとしたら、インフルエンザウイルス感受性を大きい割合で保持するブタ集団こそが、新たなウイルス発生の温床となり世界的疫病（Ｐａｎｄｅｍｉｃ）を流行させたと推察される。
【０００９】
家畜は定められた場所の限られた面積の中で高密度に飼養されている。高密度の飼養は、伝染性の疾病が一度発生すれば容易にその群内に広がり生産面で大きなダメージを与えることを意味する。また、高密度な家畜の飼養群はブタからヒトへのインフルエンザ伝搬の例が示すように、時には種を越えた新たな群へ疾病を伝搬する温床ともなる。このような危険を避けるために、現在では、疾病予防のワクチン接種が行われ、健全状態においてさえも抗生物質を混入した飼料が与えられている。このような予防措置をとっても、１９９８から２０００年に米国で見られたような新型Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス発生による豚生産の大きな損失等が起こりうる。また抗生物質の定常的な投与は、食肉中への抗生物質の残存の点から消費者にとっての「食の安全」に不安を与えるものである。しかし、これらの予防措置は、疾病による家畜の損失率を抑えるのに必要であるから行われているのである。現在の家畜の疾病抑制率を維持しつつあるいは向上させながら食の安全を守るには、家畜が潜在的にもつ疾病抵抗性を支配する遺伝情報の発見が必要であったが、そのような情報は発見されていなかった。
【００１０】
また、これまでのところ、ブタについてＲＮＡウイルス由来の疾病に対する遺伝的抵抗性を知ることが可能な有効な方法は知られていなかった。
【００１１】
【非特許文献１】
Ｍｏｒｏｚｕｍｉ  Ｔ．ら著、「Ｔｈｒｅｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｅｘｏｎ  １４  ｉｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｍｘ１  ｇｅｎｅ．」、Ｂｉｏｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．、２００１年、Ｖｏｌ．３９、ｐ．２５１−２６０
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ブタについてＲＮＡウイルス由来の疾病に対する遺伝的抵抗性を知る方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
家畜の特定の系統あるいは個体は「生産性は低いが特定の病気には強い」という抗病性形質を遺伝的に保有している場合がある。このような抗病性形質を生産性の高い系統へと引き継がせることができれば「生産性も高く病気にも強い」系統の作出が可能になり、必要とされた投薬量も減少する。遺伝する形質の分子レベルでの本体の究明はこれまで困難であったが、分子遺伝学の発展により、ヒトやマウスにおける多くの遺伝的形質について本体の究明が急速に進んでいる。家畜においてもこのような遺伝分子情報の中で、特定の疾病に対する抵抗性との関係が明らかにされるなら、当該遺伝情報を用いて抵抗性の家畜を選抜・育種をすることができる。
【００１４】
発明者はかつての研究の中で、家畜化されたブタの中には、ミクソウイルスの増殖を抑えるＭｘ１タンパクをコードする遺伝子に１１塩基の欠損を持つ個体が存在することを明らかにしていた（論文として公表済み）。その後、欠損型をヘテロで持つ個体の割合に比べ欠損型をホモで持つ個体の割合が低いことに思い当たった。また、養豚の現場から、ブタが呼吸器系の疾病に弱いこと、そのことが子豚の生産に大きく影響していることを知っていた。そこで、Ｍｘ１遺伝子において、ミクソウイルスの１種であるインフルエンザウイルスの増殖抑制能が１１塩基の欠損にどのように影響されるかについて研究を行い、１１塩基欠損型はウイルス増殖抑制能を全く失っていることを明らかにし、本発明に至った。
【００１５】
より詳細には、最終エキソン  に１１ｂｐ  の欠損を持つＭｘ１遺伝子では、１１ｂｐの欠損によって３塩基が１単位となるコドンがずれ、終止コドンが大きく後方へシフトし、下流でアミノ酸配列が大きく異なるため、Ｍｘ１タンパク質は正常型（野生型）のそれと分子量も構造も大きく異なる。従って、ウイルス抑制能を失っている可能性が考えられた。
【００１６】
そこで、本発明者は、Ｍｘ１遺伝子正常型（野生型）、エキソン１３の３塩基（３ｂｐ）欠損型、最終エキソンの１１塩基（１１ｂｐ）欠損型、ベクターのみを、マウス３Ｔ３細胞（Ｍｘ１活性をもたない）に導入し、インフルエンザウイルスＡ型の感染試験を行った。
【００１７】
その結果、１１ｂｐ欠損型はウイルス増殖抑制能を全く失い（図２の最も左の矢印）、ベクターのみ導入と同じようにウイルスが、野生型に比べ１０から１００倍の増殖を示した。さらに、３ｂｐ欠損型では野生型と同じようなウイルス増殖カーブを示し、ウイルス抑制能に影響がなく、ウイルス抑制能を保持していた（図２の最も右の矢印）。なお、ウイルス感染濃度はもう１段階低いレベル（ＭＯＩ１）でも行い、同様の結果を得た。
【００１８】
特に世界中で広く用いられている家畜豚の中には、ウイルス抑制能を持たないＭｘ１遺伝子を保有している個体があり、本発明における実験結果から、ＲＮＡウイルスの侵害に対する初期防衛能に大きな問題があることが予想される。
【００１９】
すなわち、ブタＭｘ１の当該部分の遺伝子配列型を知ることにより、ブタについてＲＮＡウイルス由来の疾病に対する遺伝的抵抗性を知ることができる。さらに、Ｍｘ１の１１塩基欠損型の除去は、家畜の健康のみでなく人類に対する新たなインフルエンザウイルス発生の脅威を除くためにも重要であると考えられる。
【００２０】
即ち本発明は、ブタについてＲＮＡウイルス由来の疾病に対する遺伝的抵抗性を知る方法に関し、より詳しくは、
〔１〕  インフルエンザウイルス抵抗性のブタを判定する方法であって、ブタＭｘ１遺伝子のエキソン上の配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の１１ｂｐの欠損を検出することを含む方法、
〔２〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検ブタからＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
〔３〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検ブタからＤＮＡを調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する工程
〔４〕  以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検ブタからＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する工程
〔５〕  以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検ブタからＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔６〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検ブタからＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）工程（ｂ）で増幅したＤＮＡを質量分析器にかけ、分子量を測定する工程
（ｄ）工程（ｃ）で測定した分子量を対照と比較する工程
〔７〕  以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検ブタからＤＮＡを調製する工程
（ｂ）ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅する工程
（ｃ）ヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する工程
（ｄ）工程（ｂ）のＤＮＡと工程（ｃ）の基板を接触させる工程
（ｅ）該ＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程
（ｆ）工程（ｅ）で検出された強度を対照と比較する工程
〔８〕  以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、〔１〕に記載の判定方法、
（ａ）被検ブタからタンパク質試料を調製する工程
（ｂ）該タンパク質試料に含まれる、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の１１ｂｐが欠損した塩基配列によってコードされるブタＭｘ１変異タンパク質の量を測定する工程
〔９〕  〔１〕に記載の判定方法のためのＰＣＲプライマーであって、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡ領域を増幅するためのオリゴヌクレオチド、
〔１０〕  ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡ領域、または１９６４位〜１９７４位が欠損した塩基配列を含むＤＮＡ領域とハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド、
〔１１〕  ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の１１ｂｐが欠損した塩基配列によってコードされるブタＭｘ１変異タンパク質を認識する抗体、
〔１２〕  〔９〕もしくは〔１０〕に記載のオリゴヌクレオチド、または〔１１〕に記載の抗体を含む、インフルエンザウイルス抵抗性ブタの判定用試薬、を提供するものである。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明は、インフルエンザウイルス抵抗性のブタを判定する方法であって、ブタＭｘ１遺伝子のエキソン上の配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の１１ｂｐの欠損を検出することを含む方法を提供する。
【００２２】
上記Ｍｘ１遺伝子の最終エキソンの塩基配列を配列番号：１に、該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。当該配列は、当業者においては、ＰｕｂＭｅｄアクセッション番号Ｍ６５０８７によって容易に取得することが可能である。
【００２３】
本発明において「欠損」している１１ｂｐは、Ｍｘ１遺伝子の最終エキソン上の配列５’−ｇｇ  ｃｇｃ  ｃｇｇ  ｃｔｃ−３’であり、配列番号：１においては、２０６４〜２０７４位の塩基領域に相当する。
【００２４】
本発明においては、被検ブタについてＭｘ１遺伝子の最終エキソンにおいて上記の「１１ｂｐの欠損」がヘテロ型として検出された場合に、被検ブタはインフルエンザ抑制能を持たないＭｘ１タンパク質を持っていると判断される。また上記の「１１ｂｐの欠損が」ホモ型として検出された場合、被検ブタの細胞はインフルエンザ抑制能を持たないＭｘ１タンパク質しか持たないと判断され、このことから、当該被検ブタはインフルエンザウイルスに高い感受性を示すと判断される。前記「１１ｂｐの欠損」が検出されない場合に、被検ブタはインフルエンザウイルスに抵抗性であるものと判断される。
【００２５】
本発明の判定方法において、ブタＭｘ１遺伝子の最終エキソンの上記「１１ｂｐの欠損」を検出する方法（手段）は、上記「欠損」を検出可能な方法（手段）であれば特に制限されるものではないが、例えば、被検ブタのＭｘ１遺伝子の上記欠損部位を含む最終エキソンの塩基配列を直接決定することにより行うことができる。
【００２６】
この方法においてはまず、被検ブタからＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、例えば被検ブタの臓器、または組織、あるいは細胞や血液、口腔粘膜、皮膚、毛等から抽出した染色体ＤＮＡを基に、あるいはイントロンを含まないｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡを基に調製することができる。
【００２７】
本方法においては、次いで、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡの単離は、ブタＭｘ１遺伝子の最終エキソンにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことも可能である。本方法においては、次いで、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
【００２８】
本方法においては、次いで、決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する。本方法における対照とは、正常な（野生型）ブタＭｘ１遺伝子の配列（例えば、配列番号：１）を言う。
【００２９】
本発明の判定方法は、上記の如く直接被検ブタ由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に、上記「欠損」の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
【００３０】
例えば、本発明における上記「欠損」の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。
【００３１】
まず、被検ブタからＤＮＡ試料を調製する。次いで、調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検ブタからＤＮＡ試料を調製する。次いで、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。
【００３２】
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異（欠損）が存在する場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブＤＮＡを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも被検ブタから調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
【００３３】
さらに別の方法においては、まず、被検ブタからＤＮＡ試料を調製する。次いで、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００３４】
該方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ａｌｕ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９２  Ｊａｎ  １；  １２（１）：  １３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １９９１  Ａｕｇ  １；  ６（８）：  １３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ＰＣＲ−ＳＳＣＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．  、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．  １９９５  Ａｐｒ  １；  ４（５）：  ２７５−２８２．）が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に欠損等による変異が存在することを検出することができる。
【００３５】
具体的には、まず、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。ＰＣＲの際に、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。あるいはＰＣＲ反応液に３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。さらに、ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識ＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０から２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４から３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
【００３６】
さらに別の方法は、まず、被検ブタから調製したブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡ、および該ＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する。次いで、該ＤＮＡと該基板を接触させる。さらに、基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたＤＮＡを検出することにより、上記「欠損」を検出する。
【００３７】
このような方法としては、ＤＮＡアレイ法が例示できる。被検ブタからのブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡ試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。該ＤＮＡ試料の調製の好ましい態様においては、例えば被検ブタの血液、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡを基に調製することができる。染色体ＤＮＡから本方法のＤＮＡ試料を調製するには、例えばブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によってブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを調製することも可能である。調製したＤＮＡ試料には、必要に応じて、当業者に周知の方法によって検出のための標識を施すことができる。
【００３８】
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。
【００３９】
一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−  ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
【００４０】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
【００４１】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、上記「欠損」を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、野生型のブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡ、あるいはブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列が欠損したＤＮＡと特異的にハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、検出するブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡ、またはブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列が欠損したＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
【００４２】
本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ベースであり、好ましくは１０〜５０ベースであり、さらに好ましくは１５〜２５ベースである。
【００４３】
本発明においては、次いで、該ｃＤＮＡ試料と該基板を接触させる。本工程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、ＤＮＡ試料をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
【００４４】
本発明においては、次いで、該ＤＮＡ試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの有無または強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、ＤＮＡアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したＤＮＡをプローブといい、一方溶液中のラベルしたＤＮＡをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。
【００４５】
上記の方法以外にも、特定位置の欠損のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異（欠損）が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料ＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法、等により検出することができる。また、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだＭｘ１遺伝子最終エキソンｃＤＮＡ等から調製した標識ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行う。変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼＡによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
【００４６】
さらに別の方法においては、まず、被検ブタからＤＮＡを調製し、次いで、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡを増幅する。次いで、増幅したＤＮＡを質量分析器にかけ、分子量を測定する。次いで、測定した分子量を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２０００）：１８：７７−８４）等が挙げられる。
【００４７】
本発明の上記検査方法の別つの態様は、ブタＭｘ１遺伝子の最終エキソンの発現産物を指標とすることによって検査を行う方法である。ここで「発現」とは、転写および翻訳が含まれる。従って、「発現産物」には、ｍＲＮＡおよびタンパク質が含まれる。
【００４８】
本発明は、ブタＭｘ１遺伝子の最終エキソンの発現産物を検出することを特徴とする、インフルエンザウイルス抵抗性のブタを判定する方法を提供する。該方法の好ましい態様においては、まず、被検ブタからタンパク質試料を調製し、該タンパク質試料に含まれる、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の１１ｂｐが欠損した塩基配列によってコードされるブタＭｘ１変異タンパク質の量を測定する。
【００４９】
このような方法としては、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、並びにブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の１１ｂｐが欠損した塩基配列によってコードされるブタＭｘ１変異タンパク質を認識する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法を例示することができる。
【００５０】
上記の方法によって、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の１１ｂｐが欠損した塩基配列によってコードされるブタＭｘ１変異タンパク質が検出された場合に、被検ブタはインフルエンザウイルス非抵抗性であるものと判定される。一方、上記変異タンパク質が検出されない場合に、被検ブタはインフルエンザウイルス抵抗性であるものと判定される。
【００５１】
以上、種々の検出方法を例示したが、これらに特に限定されるものではない。
【００５２】
本発明はまた、本発明のインフルエンザウイルス抵抗性のブタを判定する方法に用いるための判定用試薬を提供する。
【００５３】
その一つの態様は、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡ領域、または１９６４位〜１９７４位が欠損した塩基配列を含むＤＮＡ領域とハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、判定試薬である。
【００５４】
該オリゴヌクレオチドは、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡ領域、または１９６４位〜１９７４位が欠損した塩基配列を含むＤＮＡ領域に特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、検出する上記塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【００５５】
該オリゴヌクレオチドは、本発明の判定方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡ領域を増幅しうるものであれば、特に制限されない。該プライマーとしては、例えば、後述の実施例に記載された配列番号：９または１０で示される配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられるが、このオリゴヌクレオチドに特に限定されるものではない。
【００５６】
また、本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の塩基配列を含むＤＮＡ領域、または１９６４位〜１９７４位が欠損した塩基配列を含むＤＮＡ領域の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【００５７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得されるの二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００５９】
本発明の検査薬の他の一つの態様は、ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の１１ｂｐが欠損した塩基配列によってコードされるブタＭｘ１変異タンパク質を認識する抗体を含む、判定試薬である。該抗体は、本発明の方法に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が挙げられる。抗体は必要に応じて標識される。
【００６０】
ブタＭｘ１遺伝子のエキソンであって配列番号：１に記載の塩基配列における２０６４位〜２０７４位の１１ｂｐが欠損した塩基配列によってコードされるブタＭｘ１変異タンパク質を認識する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。ブタＭｘ１変異タンパク質、あるいはＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントブタＭｘ１変異タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ブタＭｘ１変異タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、ブタＭｘ１変異タンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどの試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、ブタＭｘ１変異タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ブタＭｘ１変異タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
【００６１】
上記の判定試薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００６２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００６３】
ブタ品種ＭｅｉｓｈａｎとＬａｎｄｒａｃｅで判明したＭｘ１遺伝子における変異は、その発現タンパク質の機能に影響があるのか否かを検討した。
【００６４】
具体的には、正常及び変異のあるＭｘ１遺伝子を強制発現させた細胞を用い、インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）による感染実験を行い、Ｍｘ１遺伝子の変異が感染防御機能に影響を及ぼすか否かを検証した。
【００６５】
〔実施例１〕  ＭｅｉｓｈａｎとＬａｎｄｒａｃｅの正常型と変異型のＭｘ１遺伝子のｃＤＮＡクローニング
Ｍｅｉｓｈａｎ  ３９頭、Ｌａｎｄｒａｃｅ  ３６頭よりＥＤＴＡ血５ｍｌを採取し、ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）培地で２倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）  に重層後、４００  ｘ  ｇで４０分間遠心を行い、リンパ球層を分離・採取し、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で３回洗浄し、リンパ球を調製した。これらのリンパ球のＤＮＡＺｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （ＧＩＢＣＯ）  処理によりＤＮＡを精製した。これらのＤＮＡを鋳型に、Ｍｅｉｓｈａｎはエキソン１３をプライマー対（５’−ＣＴＧＡＡＡＧＡＴＣＴＣＧＧＣＴＡＴＧＧＡＧＧ−３’／配列番号：３、５’−ＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡＴＣＣＧＧＣＴ−３’／配列番号：４）で、Ｌａｎｄｒａｃｅは最終エキソンをプライマー対（５’−ＡＡＧＣＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣ−３’／配列番号：５、５’−ＡＡＧＡＣＡＴＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＡＧＧ−３’／配列番号：６）で、それぞれＰＣＲ（９４℃５分間、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を４０サイクル、７２℃５分）により増幅した。エキソン１３はダイレクトシークエンスにより変異の有無を判定した。最終エキソンはＮａｌ  Ｉ  の３７℃２時間処理によるＲＦＬＰで変異の検出を行った。
【００６６】
正常型と変異型を同定した個体より、２０ｍｌ  のＥＤＴＡ血を採取し、リンパ球を調製、１０％子牛血清（ＦＢＳ）加  ＲＰＭＩ  １６４０培地に浮遊させ、一晩３７℃、炭酸ガス培養器で培養した後、ヒトＩＦＮα  （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ）  ５００Ｕで３時間処理し、処理リンパ球よりＲＮＡを精製した。このＲＮＡを鋳型にし、プライマー対ＡｔｔＢ１ｍｘＦ  （５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＣＧＴＣＡ  ＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧ−３’／配列番号：７）、ａｔｔＢ２ｍｘＲ（５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＴＡＴＧＣＧＧ−３’／配列番号：８）を用い、ＲＴ−ＰＣＲでＭｘ１遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＧＩＢＣＯ）  のベクターｐＤＯＮＲ２０１と混合後、ＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ  （ＧＩＢＣＯ）処理を２５℃で１時間行った。このＢＰ反応液をコンピテントセルＤＨ５αに型どおりトランスフォームし、選択はカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を５０μｇ／ｍｌ含有のＬＢ培地（ｐｌａｔｅｓ）で行った。各クローンのインサートの確認は、ａｔｔＢ１ｍｘ−Ｆ及びａｔｔＢ２ｍｘ−Ｒを用い、コロニーＰＣＲ（９４℃２分間、９４℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル、７２℃５分）を行い、このＰＣＲ産物のダイレクトシークエンスにより行った。正常Ｍｘ１遺伝子のｃＤＮＡクローンをｐＥｎｔｍｘ１、Ｍｅｉｓｈａｎ型をｐＥｎｔｍｘ１−３、Ｌａｎｄｒａｃｅ型をｐＥｎｔｍｘ１−１１とした。
【００６７】
〔実施例２〕各Ｍｘ１遺伝子の発現ベクターの構築
ｐＥｎｔｍｘ１、ｐＥｎｔｍｘ１−３、ｐＥｎｔｍｘ１−１１の組み換え体クローンを、それぞれ１５ｍｌのＬＢ培地に移植し、３７℃、一晩振とう培養後、アルカリ法によりプラスミドＤＮＡを精製した。これらプラスミドＤＮＡとｐＤＥＳＴ１２．２  （ＧＩＢＣＯ）  を混合し、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  （ＧＩＢＣＯ）  で２５℃、６０分処理を行った後、ＤＨ５αコンピテントセルにトランスフォームし、１００μｇ／ｍ  のアンピシリン含有のＬＢ  培地で選択を行った。各組み換え体クローンよりプラスミドＤＮＡを精製し、ｐＥｘｍｘ１、ｐＥｘｍｘ１−３、ｐＥｘｍｘ１−１１とした。インサートの確認は、ａｔｔＢ１ｍｘ−Ｆ及びａｔｔＢｍｘ−Ｒを用いたコロニーＰＣＲ産物のダイレクトシークエンスにより行った。
【００６８】
〔実施例３〕各Ｍｘ１遺伝子による形質転換体の構築
ＮＩＨ３Ｔ３細胞の継代維持は、７％  ＦＢＳ  加Ｄｕｌｂｅｋｏ’ｓ  ｍｏｄｅｆｉｅｄ  ＭＥＭ  （ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ）で行った。ｐＥｘｍｘ１、ｐＥｘｍｘ１−３、ｐＥｘｍｘ１−１１を５μｇ  づつ、および４  ｘ  １０６／０．４ｍｌ  の３Ｔ３細胞と混合し、２ｍｍ  幅のキュベットに入れ、１００μＦ、１３  ｏｈｍ、２００ｖ、１ｋｖ／ｃｍでエレクトロポレーションを行った。各細胞は４日間培養後、Ｇ４１８  （Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，ＧＩＢＣＯ）  を５００μｇ／ｍｌ  の濃度で加えたＤＭＥＭで培養し、形質転換体の選択を行った。ｐＥｘｍｘ１による形質転換体を３Ｔ３−０、ｐＥｘｍｘ１−３  による形質転換体を３Ｔ３−３、ｐＥｘｍｘ１−１１による形質転換体を３Ｔ３−１１とした。
【００６９】
〔実施例４〕インフルエンザウイルスの調製
インフルエンザウイルス（Ａｉｃｈｉ，  Ｈ２Ｎ２）は卵令１１日のＳＰＦ卵の尿液腔内に接種し、３７℃で２日間培養した後、一晩４℃に静置してから尿液を採取した。尿液を、３５００  ｒｐｍで２０分間遠心し、その上清を種ウイルス液とし分注後、−８０℃で保存した。種ウイルスの力価は、１０  ７．５  ＥＩＤ５０  （５０％  Ｅｇｇ−Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  Ｄｏｓｅ  ）／０．２ｍｌであった。
【００７０】
〔実施例５〕インフルエンザウイルスの感染実験
各Ｍｘ１遺伝子の強制発現によりウイルスの増殖に影響があるのか否かの検討を、感染させるウイルス量を変えて行った。
【００７１】
３Ｔ３、３Ｔ３−０、３Ｔ３−３、３Ｔ３−１１をそれぞれ細胞濃度  ５  ｘ  １０  ４／ｍｌ  に調製し、２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  に  １ｍｌ／ｗｅｌｌで植え込み、３７℃の炭酸ガスふらん器で２日間培養した。各細胞をＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎ  （ＰＢＳ  ）  で１回洗浄後、ＰＢＳで種ウイルスを１０倍希釈（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  １０に相当）及び１００倍希釈  （ＭＯＩ  １に相当）したウイルス液を接種し、３７℃で１時間吸着を行った。未吸着ウイルスはＰＢＳで２回細胞面を洗浄し除去した後、ＤＭＥＭを２ｍｌ  加え培養した。採材は、０、６、１２、１８、２４、３０、３６、４８、５４時間後に行い、採取した培養上清を２５００  ｒｐｍで５分間遠心し、その上清を力価測定まで  −８０℃に保存した。
【００７２】
経時的に採取した上清中のウイルスの力価測定は、ＰＢＳでそれぞれ１０倍段階希釈したウイルス液を各希釈について２個の１１日卵に、０．２ｍｌずつ尿液腔内接種をし、２日間培養後、一晩４℃に静置し、その尿液のニワトリ赤血球凝集能の有無により判定した。
【００７３】
その結果、ＭＯＩ  １の場合、３Ｔ３、３Ｔ３−１１においては、ウイルス感染後１８時間より培養上静中に増殖ウイルスの放出が認められ、ピークは３６時間後で２．８−３．０  ＥＩＤ５０／０．２ｍｌ  のウイルス増殖が認められた。一方、３Ｔ３−０及び３Ｔ３−３では、３６〜４８時間後に１．０  ＥＩＤ５０／０．２ｍｌ  のウイルス増殖が認められたが、それ以上の増殖は認められず、３Ｔ３、３Ｔ３−１１におけるウイルス増殖と明らかな差が観察された（図２）。
【００７４】
ＭＯＩ  １０の場合、３Ｔ３、３Ｔ３−１１においては、ウイルス感染１２時間後より培養上静中に０．３−０．５  ＥＩＤ５０／０．２ｍｌ  の感染性ウイルスが検出され、３６時間後には４．５−４．７  ＥＩＤ５０／０．２ｍｌ  の最大増殖が認められた。３Ｔ３−０及び３Ｔ３−３では、２４時間後に０．５  ＥＩＤ５０／０．２ｍｌ、４８時間後に２．７−２．８  ＥＩＤ５０／０．２ｍｌ  の感染性ウイルスが検出されたが、やはりそれ以上の増殖は認められず、明らかにウイルスの増殖が抑制された（図３）。
【００７５】
インフルエンザウイルスはＲＮＡウイルスであるので、各３Ｔ３  細胞に感染させたことによりマウスＩＦＮαが産生され、ウイルスの増殖に影響を与える可能性がある。そこで、各３Ｔ３  細胞を抗マウスＩＦＮαを加えた培地で１２日間継代維持した後、ＭＯＩ  １０でのウイルス感染実験を行った。採材は３６時間後に行い、培養上清中のウイルス力価測定をした結果、抗マウスＩＦＮαを処理していない細胞群と同様のウイルス増殖結果を得た。このことより、ウイルスの増殖に影響を与えた因子は、導入したブタＭｘ１遺伝子であると考察された。
【００７６】
〔実施例６〕各形質転換細胞におけるＭｘ１の発現量の比較検討
各細胞におけるウイルス増殖の差が、Ｍｘ１の発現を反映したものであるのか否か検討するため、感染に用いた各細胞のＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ  を行った。
【００７７】
３Ｔ３、３Ｔ３−３、３Ｔ３−１１をそれぞれ細胞濃度  ２  ｘ  １０６／ｍｌ  に調製し、ＲＮＡを抽出・精製し、ＲＴ−ＰＣＲによりＭｘ１の発現量を測定した。用いたプライマー対は、ＡｔｔＢ１ｍｘＦ、ＡｔｔＢ２ｍｘＲで、反応条件は５５℃・３０分、９４℃・２分の後、９４℃・１５  秒、５８℃・３０  秒、６８℃・３分を４０  サイクル行った後、７２℃・５分の伸長をした。定量のための外部標準に、マウスＧ３ＨＰＤ（  ＴＯＹＯＢＯ  ）  を増幅し発現量の陽性コントロールとした。陰性コントロールは、鋳型ＤＮＡの代わりに蒸留水を加えたものとした。
【００７８】
その結果、３Ｔ３ではブタＭｘ１  の発現はなく（図４、レーン１）、３Ｔ３−０、３Ｔ３−１１、３Ｔ３−３では、３Ｔ３−１１  においてやや発現量が多い傾向が認められたが、それぞれにおいてブタＭｘ１の発現が認められた（図４、レーン３、４、５）。内部標準のマウスＧ３ＰＤＨの発現量より、各細胞間で採材した細胞数に大きな差はなく、３Ｔ３−０、３Ｔ３−１１、３Ｔ３−３  では、ほぼ等量のそれぞれの  Ｍｘ１  タンパク質が産生されていることが示唆された。
【００７９】
〔実施例７〕  ＰＣＲ増幅によるブタＭｘ１遺伝子最終エキソンおける１１塩基欠損の検出
以下のプライマーセットを用いて、被検ブタについてＰＣＲを行った。増幅部分は、ＰｕｂＭｅｄアクセッション番号Ｍ６５０８７の配列における１９８１位〜２１６０位である（図５）。
・プライマーＦ：  ５’−  ＡＧＴ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＡＧ  −３’（配列番号：９）
・プライマーＲ：  ５’−  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＴＣＡ  −３’（配列番号：１０）
【００８０】
ＰＣＲの条件は、１）９４℃  １０分；  ２）９４℃  ３０秒，  ６０℃  ３０秒，  ７２℃  １分；  ３）７２℃  ５分である。次いで、ＰＣＲ産物２マイクロリットルを６％ＰＡＧＥ、２００Ｖで１時間電気泳動し、銀染色を行った（図６）。ＰＣＲ産物は野生型の場合は、１０５ｂｐであり、１１ｂｐの欠損を含む場合は９４ｂｐである。サイズマーカーは、ｆＸ１７４／ＨａｅＩＩＩを用いた。
【００８１】
図６で示すように、上記のプライマーセットを用いたＰＣＲにより、１１ｂｐの欠損を検出することができた。
【００８２】
【発明の効果】
世界中で広く用いられている家畜豚の中には、ウイルス抑制能を持たない１１塩基欠損型のＭｘ１遺伝子を保有している個体がいる。このような個体はＲＮＡウイルスの侵害に対する初期防衛能に大きな問題があると予想される。
【００８３】
〔遺伝的抗病性能力測定技術の簡易化〕
これらのブタ集団うちからウイルス抑制能を持つ野生型遺伝子を保有する個体を、ブタの血液、肉片、毛根等ＤＮＡを含む組織を少量採取し、そのＤＮＡ抽出物から本発明対象であるＭｘ１遺伝子型を調べることにより、選抜することができる。あるいは、望ましくない遺伝子型を保有する個体を淘汰することができる。
【００８４】
〔ブタの生産性向上〕
本発明により、インフルエンザウイルスを含むＲＮＡウイルス由来の疾病に対しする、遺伝的抗病性の強弱を知ることができる。このことにより生産により望ましい健常な個体が選抜できる。また、子豚の呼吸器病罹患率が低下し、生存率、成長率が上昇する。
【００８５】
〔ヒトに対して〕
インフルエンザ増殖抑制能の弱いブタ個体の群はインフルエンザに感染しやすく、ブタ群が死滅しない場合には、インフルエンザウイルスは遺伝的変異を伴いながら、時には新種のインフルエンザウイルスとなり増殖する。１９１７から１９１８に流行し、世界で４千万人以上、国内だけでも３０万人以上の命を奪ったスペイン風邪のインフルエンザウイルスように、新種のインフルエンザウイルスはヒトへと感染するならば甚大な被害をもたらす。本発明によって、インフルエンザウイルス増殖抑制能の高いブタが選抜されることにより、ブタ群内でのインフルエンザウイルス増殖を抑制され新種インフルエンザウイルス発生の可能性が低下し、人類への脅威の１つを回避する可能性が高くなる。
【００８６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】肥育生産用の３元交雑豚の写真である。
【図２】ＭＯＩ  １における、Ｍｘ１遺伝子型とウイルス抑制能との関係を示すグラフである。
【図３】ＭＯＩ  １０における、Ｍｘ１遺伝子型とウイルス抑制能との関係を示すグラフである。
【図４】３Ｔ３細胞、及び３Ｔ３−０、３Ｔ３−３、３Ｔ３−１１の各形質転換細胞におけるＭｘ１の発現量の比較を、ＲＴ−ＰＣＲによって行った結果を示す写真である。
【図５】ブタＭｘ１遺伝子最終エキソンにおける「１１ｂｐの欠損」領域、および該領域を増幅するためのプライマーセットの塩基配列を示す図である。
【図６】ＰＣＲ増幅によるブタＭｘ１遺伝子の最終エキソンにおける１１塩基欠損の検出を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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