(57)【要約】【課題】サツマイモ帯状粗皮病に防除効果を有する弱毒ウイルスとこれを利用した防除技術を提供する。【解決手段】カンショ塊根に対するウイルス症状が極めて軽微であり、ウイルスフリー苗に予防接種しておくことによりサツマイモ帯状粗皮病の発生を防ぐことができる弱毒ウイルスを自然界より選抜・単離し、これを利用した本病の防除技術を開発した。【選択図】  図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンショに帯状粗皮病を発症せず、サツマイモ帯状粗皮病の病原ウイルスであるサツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統に干渉効果を有し、図３〜８に記載した塩基配列を含むことを特徴としたサツマイモ斑紋モザイクウイルスに属する弱毒ウイルス（１０−Ｏ）
【請求項２】
請求項１記載のサツマイモ斑紋モザイクウイルスに属する弱毒ウイルス（１０−Ｏ）を、カンショに接種することを特徴とするサツマイモ帯状粗皮病の防除法
【請求項３】
請求項１記載のサツマイモ斑紋モザイクウイルスに属する弱毒ウイルスを接種して得られるサツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統抵抗性カンショ
【請求項４】
請求項３記載のサツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統抵抗性カンショの一部を栄養繁殖して得られるサツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統抵抗性カンショ
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サツマイモ斑紋モザイクウイルスの弱毒ウイルス（１０−Ｏ）、該弱毒ウイルス（１０−Ｏ）を用いるサツマイモ帯状粗皮病の防除方法及びサツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統抵抗性カンショに関する。
【０００２】
【従来の技術】
カンショ栽培の阻害要因として、サツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統の感染による帯状粗皮病の発生があり、これによる品質の低下や販売単価の下落が生産者に深刻な打撃を与えている。
【０００３】
サツマイモ帯状粗皮病の防除対策は長い間困難を極めてきたが、その理由として、ＳＰＦＭＶ−Ｓの塊根伝染性がある。これにより、病原ウイルスが感染したカンショを種イモとすると、それから得られた苗がほとんど全てウイルスに感染し、生産したいもの大部分が発病してしまう。
【０００４】
サツマイモ帯状粗皮病に効果の高い農薬はなく、対策法として、ウイルスフリー化したカンショ苗（以下ウイルスフリー苗）の栽培により被害軽減を図っている。しかし、ウイルスフリー苗は、ウイルス抵抗性を持たないため、アブラムシの媒介により病原ウイルスに容易に再感染してしまう。そのため、苗の有効期間も１〜２作と短期間で利用不能となり、定期的な苗の更新が必要となることから、生産者は、少なくとも隔年で苗を更新（購入）しなくてはならず、負担が大きい。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ウイルスフリー苗に予防接種してサツマイモ帯状粗皮病に対する抵抗力を付け発病を抑える弱毒ウイルス（１０−Ｏ）、該弱毒ウイルスを用いて長期的な防除効果を可能とするサツマイモ帯状粗皮病の防除法及びサツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統抵抗性カンショを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため、自然界より得たウイルス症状の軽微なカンショ塊根の中から、サツマイモ斑紋モザイクウイルスの弱毒ウイルスの選抜を重ねた結果、カンショ塊根に対するウイルス症状が極めて軽微であり、ウイルスフリー苗に予防接種しておくことによりサツマイモ帯状粗皮病の発生を防ぐことができる弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の単離に成功し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、請求項１記載の発明は、カンショに帯状粗皮病を発症せず、サツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統に干渉効果を有することを特徴とするサツマイモ斑紋モザイクウイルスに属する弱毒ウイルス（１０−Ｏ）であり、請求項２記載の発明は、上記の弱毒ウイルス（１０−Ｏ）を、カンショに接種することを特徴とするサツマイモ帯状粗皮病の防除法であり、また、請求項３記載の発明は、上記の弱毒ウイルス（１０−Ｏ）を接種して得られるサツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統抵抗性カンショであり、請求項４記載の発明は、上記の弱毒ウイルス（１０−Ｏ）を接種して得られるサツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統抵抗性カンショの一部を栄養繁殖して得られるサツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統抵抗性カンショである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
『弱毒ウイルスの作出方法（弱毒株の探索）』
弱毒ウイルスは自然界からの選択分離により作出した。また、分離源（弱毒株）は次のように得た。平成７〜１１年度に大分県大野郡４町２村の現地カンショ畑において、カンショ約５万株について病徴調査を実施し、塊根の症状の軽微なカンショ２４９株を採集した。これらの株についてサツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統及び普通系統の外被蛋白質領域及び３’末端側非翻訳領域の共通配列を元にしたプライマーによるＲＴ−ＰＣＲに供試した。その結果、全ての株でサツマイモ斑紋モザイクウイルスの感染が確認された。そこで、これらにサツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統を接木接種によりチャレンジ接種し、６代にわたり病徴調査を実施したところ、なお発病しない干渉効果を有している株を得たため、これを弱毒株として弱毒ウイルスの分離源とした。
【０００９】
『弱毒ウイルスの作出方法（弱毒ウイルスの選択分離）』
弱毒株は、それ自身干渉効果を有しているものの、複数のサツマイモ斑紋モザイクウイルスの系統に重複感染していたため、干渉効果を有する弱毒ウイルスを特定するために、これらの系統を全身感染宿主であるアサガオを用いた希釈分離法により分離した。すなわち、弱毒株にアサガオを接木し、分離した各ウイルスは、分離確認のため、サツマイモ斑紋モザイクウイルス各系統及びサツマイモウイルスＧのＮＩｂ蛋白質領域及び外被蛋白質領域の共通配列を元にしたプライマーと２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ）を用いたＲＦＬＰ−ＲＴ−ＰＣＲによる系統識別法に供試した。その結果、弱毒株からは、普通系統、ＪＣ系統と同様のバンドパターンを示す２系統が分離された。これらをカンショウイルスフリー株に接種して症状を検討すると共に、接種株に強毒系統をチャレンジ接種して干渉効果の有無を確認したところ、普通系統と同様のバンドパターンを示した１系統のみが干渉効果を有しており、実用的な弱毒ウイルス（１０−Ｏ）として選抜した（図１、９）。
【００１０】
『弱毒ウイルスの特性』
弱毒ウイルス（１０−Ｏ）はひも状を呈する植物ウイルスであり、サツマイモ斑紋モザイクウイルスに属する。また、全塩基配列を解読したところ、塩基からなり、５’側１．２Ｋｂｐが強毒系統と、３’側９．２Ｋｂｐが普通系統と相同性が高く、これまで報告のあるサツマイモ斑紋モザイクウイルスの各系統とは異なる系統であった（図２〜８）。カンショ及びアサガオで全身感染する。アサガオでは、容易に汁液接種で増殖できるが、カンショでは汁液接種で感染しないため、カンショウイルスフリー株に感染させる場合は、アサガオもしくは、カンショ弱毒ウイルス感染株（弱毒株）からの接木接種により感染させる必要がある。一方で、このウイルスはカンショで塊根伝染性が認められるため、一度感染させると蔓や塊根を媒介として次代以降もカンショ体内に維持される。
病原ウイルスであるサツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統との識別は、段落番号０００９に示したＲＦＬＰ−ＲＴ−ＰＣＲによる系統識別法により容易に区別できる（図１）。６代にわたる病徴調査や系統識別法による検討等の結果、弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の病原力は安定して弱く、変異しにくい弱毒ウイルスであることが確認された。
【００１１】
『弱毒ウイルスのクローニングとシーケンス』
弱毒ウイルス（１０−Ｏ）に感染したサツマイモ葉から全ＲＮＡを抽出した。この弱毒ウイルスは、段落番号０００９に示したＲＦＬＰ−ＲＴ−ＰＣＲによる系統識別法によりサツマイモ斑紋モザイクウイルス普通系統と極めてよく似た性質を持つことが明らかとなっていたため（図１）、普通系統の塩基配列を参考にして合成したＤＮＡプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、弱毒ウイルス（１０−Ｏ）のゲノムの全長をカバーするｃＤＮＡ断片を複数得た。これらをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のＥｃｏＲＶ部位に導入し、クローニングした。得られたクローンを普通系統の塩基配列を参考にして合成したＤＮＡプライマーを用いてＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７３Ａ）で塩基配列を決定した（図３〜８）。
【００１２】
『弱毒ウイルスの接種方法と感染苗の利用方法』
カンショへの弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の接種方法は、弱毒ウイルス（１０−Ｏ）に感染したアサガオを穂木とする接木接種を用いておこなう。また、穂木用のアサガオは、弱毒ウイルスに感染したアサガオ葉０．１ｇに緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を１０ｍｌ加え作出した磨砕液を葉１枚あたり１００μｌずつカーボランダム法により汁液接種し、２１℃、１６時間日長下で１４日間育苗したものを用いた。一方、接木は、腹接ぎにより行い、２１℃、１６時間日長下で１４日間の育苗すると、弱毒ウイルス（１０−Ｏ）はカンショに全身感染する。
弱毒ウイルス（１０−Ｏ）に感染したカンショ苗（弱毒ウイルス感染苗）を実際に利用する場合は、最初に接木接種すれば、ウイルスの塊根伝染性により接種株からの採苗により感染苗を得ることができる。特に次年度以降は、苗を保存するか、収穫した塊根を貯蔵し、それから採苗することにより、接種をすることなく容易に感染苗を得ることができる。
【００１３】
【実施例１】
弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の防除効果試験について説明する。
段落番号００１２に従い弱毒ウイルス（１０−Ｏ）を接種したカンショに、接種１４日後にサツマイモ斑紋モザイクウイルス強毒系統をチャレンジ接種し、さらに２１℃、１６時間日長下で１４日間育苗したポット苗から採苗し、表の耕種概要により農業技術センター畑地利用部圃場（大分県三重町）に挿苗し、塊根を収穫して病徴調査を行ったところ、弱毒ウイルス（１０−Ｏ）をあらかじめ接種しておいたカンショは発病せず、塊根の品質低下も認められなかった。しかし、弱毒ウイルス（１０−Ｏ）をあらかじめ接種していなかったカンショでは、発病して塊根表皮に帯状の細かなひび割れが生じるほか、退色、くびれ等が生じ、外観を損ない、著しく品質がが低下した。
【００１４】
また、弱毒ウイルス（１０−Ｏ）をあらかじめ接種しておいたカンショは、次代（図９）、三代においても発病せず、塊根の品質低下も認められなかった。
さらに、このカンショは、ウイルスフリー苗と同程度の収量が得られた。
【００１５】
【実施例２】
弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の現地実証試験について説明する。
段落番号００１２の苗を大分県内の農家（三重町１件、大野町２件）のカンショ圃場に挿苗したところ、いずれの場合も弱毒ウイルス（１０−Ｏ）をあらかじめ接種しておいたカンショは発病せず、塊根の品質低下も認められなかった（図１０）。
また、収量についてもウイルスフリー苗と同程度の量が得られた。
【００１６】
【本発明の効果】
本発明の弱毒ウイルス（１０−Ｏ）は、自然界に揉まれて存在したサツマイモ斑紋モザイクウイルスの系統から選抜しているので変異しにくく安全な弱毒ウイルスである。また、弱毒ウイルス（１０−Ｏ）をカンショに接種し、一般栽培圃場において栽培した場合、防除効果を有し、直ちに実用化できる弱毒ウイルスである。その効果は、当代だけでなく生産された塊根を母本として利用することにより次代以降も継続されるため、苗の更新期間が延長され、苗代にかかる生産者の負担を軽減させることができる。さらに、ウイルスを媒介するアブラムシ防除の農薬や、アブラムシ忌避資材なども要しないことから、環境汚染の問題がなく、栽培経費の大幅な削減効果が期待できるものである（図１１）。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＦＬＰ−ＲＴ−ＰＣＲによる弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の解析
【図２】弱毒ウイルス（１０−Ｏ）とサツマイモ斑紋モザイクウイルス２系統との塩基配列の相同性の比較
【図３】弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の塩基配列（１〜１９８０）
【図４】弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の塩基配列（１９８１〜３９６０）
【図５】弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の塩基配列（３９６１〜５９４０）
【図６】弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の塩基配列（５９４１〜７９８０）
【図７】弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の塩基配列（７９８１〜９９６０）
【図８】弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の塩基配列（９９６１〜１０８２０）
【図９】弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の干渉効果
【図１０】弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の現地実証試験
【図１１】弱毒ウイルス（１０−Ｏ）の防除効果写真
【符号の説明】
使用した制限酵素
１〜４：ＢａｍＨＩ  ５〜８：ＥｃｏＲＩ
解析したウイルス
４，８：１０−Ｏ  １，５：ＳＰＦＭＶ−Ｓ  ２，６：ＳＰＦＭＶ−Ｏ  ３，７：ＳＰＦＭＶ−ＪＣ
サイズマーカー
Ｍ：λ／ＨｉｎｄＩＩＩ・ＨｉｎｃＩＩ
発病度＝｛Σ（発病指数※×同株数）／（３×全株数）｝×１００
※発病指数：０：無症，１：わずかな退色，２：退色、わずかな粗皮症状
３：激しい粗皮症状や退色、くびれ
Ａ  ウイルスフリー株
Ｂ  １０−Ｏ感染株にＳＰＦＭＶ−Ｓを接種
Ｃ  ウイルスフリー株にＳＰＦＭＶ−Ｓを接種
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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