(57)【要約】　　　（修正有）【課題】マツタケ菌株と松の無菌発芽苗の共培養によるマツタケ菌感染苗の形成方法。【解決手段】PDB培地で液体培養したマツタケ菌の子実体を粉砕して得た菌糸体粉砕物を、滅菌水１mLあたり乾燥重量0.01〜0.02mgの量で滅菌した培養容器の底に接種する段階；パーライトとミズゴケピートモスを80：1〜2の割合で混合し、得られた混合床土を前記接種した菌糸体粉砕物の上に配置する段階；K-液体培地を処方してpH5.5〜5.6に調整し、該K-液体培地を前記混合床土の上に分注する段階；松の種子を無菌発芽させて得た長さ３cm以下の無菌発芽苗を、前記混合床土とK-液体培地を含む感染培地上に置床して、該培養容器に蓋をかぶせる段階；および、前記段階から得た松の幼苗とマツタケ菌培養体を15〜25℃で24時間、10〜40,000ルクスの光条件下で共培養する段階；を含むマツタケ菌と無菌発芽松苗の共培養によるマツタケ菌感染松苗の形成方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　PDB培地で液体培養したマツタケ菌の子実体を粉砕して得た菌糸体粉砕物を、滅菌水１mLあたり乾燥重量0.01〜0.02mgの量で滅菌した培養容器の底に接種する段階；
　パーライトとミズゴケピートモスを80：1〜2の割合で混合し、得られた混合床土を前記接種した菌糸体粉砕物の上に配置する段階；
　精製水１LあたりNH4NO3　1.65g、KNO3　0.2g、CaCl2・2H2O　0.002g、KCl　0.02g、KH2PO4　0.2g、MgSO4・7H2O　0.9g、(NH4)２HPO4　0.2g、NH4-Tar　0.5g、Fe-Cit　0.5ml、H3BO3　0.031g、MnSO3・4H2O　0.01516g、ZnSO4・7H2O　0.0086g、KI　0.00083g、Na2MoO4・2H2O　0.00025g、塩酸チアミン100μg、麦芽エキス1.0g、酵母エキス0.5g、カゼイン0.3gおよびブドウ糖3.0gを含むK-液体培地を処方してpH5.5〜5.6になるように調整し、該K-液体培地を前記混合床土の上に分注する段階；
　松の種子を無菌発芽させて得た長さ３cm以下の無菌発芽苗を、前記混合床土とK-液体培地を含む感染培地上に置床して、該培養容器に蓋をかぶせる段階；および
　前記段階から得た松の幼苗とマツタケ菌培養物を15〜25℃で24時間、10〜40,000ルクスの光条件下で共培養する段階；
を含むことを特徴とする、マツタケ菌と無菌発芽松苗の共培養によるマツタケ菌感染松苗の形成方法。
【請求項２】
　前記PDB培地で液体培養したマツタケ菌の子実体を粉砕して得た菌糸体粉砕物を滅菌培養容器の底に接種する段階に先立って、精製水１LあたりNH4NO3　1.65g、KNO3　0.2g、CaCl２・2H2O　0.002g、KCl　0.02g、KH2PO4　0.2g、MgSO4・7H2O　0.9g、(NH4)２HPO4　0.2g、NH4-Tar　0.5g、Fe-Cit　0.5ml、H3BO3　0.031g、MnSO3・4H2O　0.01516g、ZnSO4・7H2O　0.0086g、KI　0.00083g、Na2MoO4・2H2O　0.00025g、塩酸チアミン100μg、麦芽エキス1.0g、酵母エキス0.5g、カゼイン0.3g、ブドウ糖10.0gおよびフィタゲル2.0gを含むK-固体培地を処方してpH5.5〜5.6になるよう調整し、該K-固体培地を先ず前記培養容器に分注する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
　前記培養容器はその下端に紙コップを密着して嵌め入れた形に製作されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
　前記K-固体培地を前記培養容器の底に0.5〜20mmの厚さで分注することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
　PDB培地で液体培養したマツタケ菌の子実体を粉砕して得た菌糸体粉砕物を、滅菌水１mLあたり乾燥重量0.01〜0.02mgの量で滅菌した培養容器の底に接種する段階；
　パーライトとミズゴケピートモスを80：1〜2の割合で混合し、得られた混合床土を前記接種した菌糸体粉砕物の上に配置する段階；
　精製水１LあたりNH4NO3　1.65g、KNO3　0.2g、CaCl2・2H2O　0.002g、KCl　0.02g、KH2PO4　0.2g、MgSO4・7H2O　0.9g、(NH4)２HPO4　0.2g、NH4-Tar　0.5g、Fe-Cit　0.5ml、H3BO3　0.031g、MnSO3・4H2O　0.01516g、ZnSO4・7H2O　0.0086g、KI　0.00083g、Na2MoO4・2H2O　0.00025g、塩酸チアミン100μg、麦芽エキス1.0g、酵母エキス0.5g、カゼイン0.3gおよびブドウ糖3.0gを含むK-液体培地を処方してpH5.5〜5.6になるように調整し、該K-液体培地を前記混合床土の上に分注する段階；
　松の種子を無菌発芽させて得た長さ３cm以下の無菌発芽苗を、前記混合床土とK-液体培地を含む感染培地上に置床して、該培養容器に蓋をかぶせる段階；および
　前記段階から得た松の幼苗とマツタケ菌培養物を15〜25℃で24時間、10〜40,000ルクスの光条件下で共培養する段階；
を含む方法により形成された、松の幼苗の根にマツタケ菌を感染させたことを特徴とするマツタケ菌感染松苗。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、マツタケ菌と松の無菌発芽苗の共培養によるマツタケ菌感染松苗の形成方法に関する。より詳細には、本発明は無菌発芽松苗とマツタケ菌糸体を共培養して、松の苗木の根にマツタケ菌だけを選択的に感染させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　マツタケ(Tricholoma matsutake)は担子菌亜門(Basidioｍycotina)ハラタケ目(Agaricales)マツタケ科(Tricholomatsutaceae)に属する菌類であって、松、朝鮮松、栂、蝦夷松などの針葉樹群落周辺で採集され、韓国では松の群落でのみ発生することが知られている。マツタケは日本と韓国の人達が好んで食するキノコであって、特に韓国の東海岸地域の重要な農家所得源である。マツタケは固有の独特な香りを有し、そのような香りの原因物質には１-オクテン-３-オール、２-オクタノール、１-オクテンおよび４-メチルシンナメートなどがある。マツタケは主に松(例えば、赤松)の細い根に共生する寄生菌であって、外菌根を形成しながら共生するキノコとして知られているが、いまだ人工的な子実体形成についての報告はない。産地の菌環周囲の土壌に松の苗木を移植する従来の方法によりマツタケ菌感染苗を生産しようとしたが、成功率は高くなかった(TS Kim, GH Ga, H Park, YC Park, GH YoonおよびGY Lee, 1999, In vitro cultivation of T. matsutake and increase of its production yield(マツタケの人工栽培およびその生産量の増加)、韓国林業研究院研究資料第153号、pp13〜16)。また、茨城県林業技術センターは、赤松の苗木でのマツタケ菌の外菌根形成に成功したと報じている(Akiyoshi Yamada、Ken MaedaおよびMasatake Ohmasa, 1999, Ectomycorrhiza formation of Tricholoma matsutake isolates on seedlings of pinus densiflora in vitro, Mycoscience 40：pp455〜463)。
【０００３】
　すなわち、マツタケは生きている木の根に寄生する菌であるため、人為的に子実体(キノコ)を形成させることが難しく、人工栽培を行った事例がなかった。このような理由で、従来のマツタケ栽培技術は、単にマツタケが発生する産地でマツタケ発生に影響を及ぼす環境因子(湿度、林内比陰度、温度など)を充足させるために、潅水、低温トンネル設置、落葉掻き、コップ被せなどの人為的な方法によりマツタケの生産量を増大させるなどの一連の野外作業によりなされてきた。このような方法によりある程度マツタケを増収することができたが、マツタケが生産される産地のみに限られていた。従って、マツタケの増収のため、間接的な方法ではなく、具体的な方法、例えば、マツタケの菌糸体を培養した後にその菌糸体をマツタケ発生産地に散布して菌糸体の塊を土壌に入れる方法、またはマツタケの子実体から胞子を回収して産地に散布する方法、あるいは菌糸体が生きている状態の土壌をマツタケが発生しない山地に移植する方法が用いられたが、菌糸の生長速度が細菌や他の真菌より遅いマツタケ菌の特性のため群生するには至らず、降雨と土壌状態などによって松の根に感染することなく流失されることにより、マツタケ増収のための実質的な効果は見られなかった。
【０００４】
　また、マツタケが発生する松の周囲に形成されたマツタケ菌環のまわりの土壌に松の苗木を植えて数年間苗木を成長させ、その苗木をさらにマツタケ非発生山地に移植する方法があるが、その方法もまた、マツタケ菌糸が松の根に感染する前に、松の苗木に、野外に発生する数多くの他の似通った菌類が感染して定着してしまい、苗木に定着した真菌がマツタケ菌であるか否かを確認する方法がなく、また、多数の苗木を生産し得ないという難点があった。
【非特許文献１】TS Kim, GH Ga, H Park, YC Park, GH YoonおよびGY Lee, 1999, In vitro cultivation of T. matsutake and increase of its production yield、韓国林業研究院研究資料第153号、pp13〜16
【非特許文献２】Akiyoshi Yamada、Ken MaedaおよびMasatake Ohmasa, 1999, Ectomycorrhiza formation of Tricholoma matsutake isolates on seedlings of pinus densiflora in vitro, Mycoscience 40：pp455〜463
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　従って、本発明の課題は、マツタケ菌糸体が松の根内に侵入して共寄生することに基づいて、in vitroで松の無菌発芽苗とマツタケ菌糸体を共培養することにより松の苗木の根にマツタケ菌だけを選択的に感染させて、マツタケ菌感染松苗を大量生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
　本発明の前記課題は、滅菌した培養容器内にPDB(Potato Dextrose Broth、Difco社製)培地で液体培養した天然産マツタケの子実体から分離されたマツタケ菌KBFERI 20T05株を接種し、その上にパーライトとミズゴケ(sphagnum)ピートモスの混合床土とK-液体培地を加え、松の種子を無菌発芽させて得た無菌発芽苗を前記混合床土に移植し、その後前記マツタケ菌株と共培養して松の幼苗の細根にマツタケ菌根を形成させることにより解決された。
【発明の効果】
【０００７】
　本発明は、in vitroで松の無菌発芽苗とマツタケ菌糸体を共培養して、松の苗木の根にマツタケ菌だけを選択的に感染させる方法を提供するという格別の効果を有する。また、本発明は、rDNA(ITS領域、5.8S全領域、18S部分領域)部分において従来のマツタケ菌との相同性を有するマツタケ菌株を用いることにより、感染源（接種物）の実体の客観性を維持することができる効果がある。さらに、本発明は、移植時に紙コップを分離して移植するという作業利便性およびマツタケ菌の活着に比較的有利な効果があり、in vitro培養法により年間を通してのマツタケ菌感染苗木の大量生産が可能であるため、産業上非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
　本発明は、松の幼苗とマツタケ菌の子実体を共培養することによりマツタケ菌のみに感染した松苗を形成させる方法に関するもので、この方法は、感染培地を入れるための培養容器を製作する段階、マツタケ菌KBFERI 20T05株の子実体を感染培地に接種する段階、松の発芽苗を生長させるための混合床土とK-液体培地を処方する段階、松の発芽苗を前記感染培地に置床する段階により構成される。
【０００９】
　詳細には、本発明は、マツタケ菌と松の無菌発芽苗の共培養によりマツタケ菌感染松苗を形成させる方法に関するもので、PDB培地で液体培養したマツタケ菌の子実体を粉砕して得た菌糸体粉砕物を、滅菌水１mLあたり乾燥重量0.01〜0.02mgの量で滅菌した培養容器の底に接種する段階；パーライトとミズゴケピートモスを80：1〜2の割合で混合し、得られた混合床土を前記接種した菌糸体粉砕物の上に配置する段階；精製水１LあたりNH4NO3　1.65g、KNO3　0.2g、CaCl2・2H2O　0.002g、KCl　0.02g、KH2PO4　0.2g、MgSO4・7H2O　0.9g、(NH4)２HPO4　0.2g、NH4-Tar　0.5g、Fe-Cit　0.5ml、H3BO3　0.031g、MnSO3・4H2O　0.01516g、ZnSO4・7H2O　0.0086g、KI　0.00083g、Na2MoO4・2H2O　0.00025g、塩酸チアミン100μg、麦芽エキス1.0g、酵母エキス0.5g、カゼイン0.3gおよびブドウ糖3.0gを含むK-液体培地を処方してpH5.5〜5.6になるように調整し、該K-液体培地を前記混合床土の上に分注する段階；松の種子を無菌発芽させて得た長さ３cm以下の無菌発芽苗を、前記混合床土とK-液体培地を含む感染培地上に置床して、該培養容器に蓋をかぶせる段階；および前記段階から得た松の幼苗とマツタケ菌培養物を15〜25℃で24時間、10〜40,000ルクスの光条件下で共培養する段階；を含むことを特徴とする。
【００１０】
　以下、本発明の具体的な方法を段階別に説明する。
【００１１】
第１段階：感染培地を入れるための培養容器の製作および滅菌
　松の幼苗とマツタケ菌を共培養するための感染培地を含む培養容器を製作し、121℃、20分間、1.2気圧下でオートクレーブ滅菌する。前記培養容器は滅菌過程で変形や溶融しない材質で製作しなければならず、また、培養過程での他の微生物による感染から安全でなければならない。
【００１２】
　一方、生分解性の材料で作られた培養容器を用いることは望ましいが、産地に感染松苗を移植する場合、培養容器のまま移植すると培養容器は生分解に長い時間がかかるので、できる限り培養と移植の両方を考慮したうえで培養容器を製作することが好ましい。この点を考慮して、本発明では培養容器に紙コップを嵌め入れたままで培養し、移植時に紙コップを分離して廃棄し、感染した松苗だけを野外に移植する方法を選択した。従って、望ましくは、前記培養容器の下端に市販の紙コップを培養容器に密着して嵌め入れ、上端には紙コップが接触しないようにし、透明な空蓋でおおって、図３に示した形状に培養容器を製作してオートクレーブ滅菌する。前記紙コップは、培養物の生長にほとんど影響を与えずに、滅菌および培養過程で多少の外形の変化はあるものの、培養の全期間中そして移植時までその感染苗の内容物をそのまま維持するので、非常に有用である。培養容器は滅菌後すぐにクリーンベンチに移して紫外線消毒を施すことが好ましい。
【００１３】
第２段階：液体培養したマツタケ菌KBFERI 20T05株の感染培地への接種
　前記段階で製作および滅菌した培養容器内の下端に天然産マツタケ由来のマツタケ菌KBFERI 20T05株を均一に接種する。
【００１４】
　接種物としては、これまでに知られたまたは外観もしくは官能試験により判定されたマツタケ菌を用いるのではなく、既知のマツタケ菌とのDNA配列相同性をもつことが確認されたマツタケの子実体からの分離株を用いることが好ましい。従って、本発明は、既知のマツタケ菌のITS領域、5.8S全領域および18Sの部分領域のGeneBankに登録されたDNA配列に対して99％を上回る相同性を有するマツタケ菌KBFERI 20T05株を用いる。マツタケ菌KBFERI 20T05株のDNA配列はGeneBankに登録された。前記マツタケ菌を培養するにはPDB培地(Difco社製)を使用する。液体培養したマツタケ菌KBFERI 20T05株の菌糸体の塊を、下記表１に示した成分表に従って処方したpH5.6のK-液体培地で洗浄し、滅菌したメッシュで濾過した後、Waring社製の滅菌可能な粉砕機31L91を用いてK-液体培地中で微細に粉砕し、クリーンベンチに移し、10mLの滅菌ガラスピペットを使って、前記の滅菌培養容器の蓋をあけて底部分に前記微細なマツタケ菌糸体を均一に接種する。前記接種された菌糸体は多層の菌叢を形成しながら均一に生長し、このタイプの生長パターンは松の細根とマツタケ菌との接触を増加させる。その際、菌糸体の塊を粉砕機で極めて微細に粉砕することが好ましい。また、粉砕機から発生する熱はマツタケ菌の生長にマイナスの影響を及ぼすため、これを相殺する意味で、例えば冷蔵庫に保管して、5℃以下の温度に予め冷却したK-液体培地を用いて粉砕を行うことが有利である。接種量はK-液体培地５mlあたり乾燥重量0.05〜0.10mg程度とする。接種物の乾燥重量は、５mlの接種物を濾紙で濾過して24時間乾燥させた後、初めの濾紙の重量を引き、上記手順を20回繰り返して平均をとることにより算出される。接種量はマツタケ菌と松の細根の接触に最も大きな影響を及ぼす。接種量が多いほど松の細根との接触も増加するが、より高濃度で接種したときのマツタケ菌の生長速度が速くないことを考慮すると、前記の接種量が妥当であると判断される。
【００１５】
　一方、マツタケ菌のバイオマスを高め、かつ松の細根との接触を高めるために、前記培養容器内の底面にpH5.5〜5.6のK-固体培地を添加することができる。
【００１６】
　K-固体培地の成分表は表１に記載されており、pHは5.5〜5.6に固定するが、一般的に植物のin vitro培養時の最適pHは約5.7〜5.8であり、マツタケ菌の最適培養pHは約5.4であるため、二つの生物の共培養に適合するようK-固体培地のpHを5.5〜5.6とする。また、一般的にマツタケ菌を液体培養する場合は生産量が低いため、マツタケ菌の生長速度を高めるために培養容器内の底に配置したK-固体培地の炭素源の含量を高める。さらに、短時間でマツタケ菌のバイオマスを高めて、固体培地内の炭素源を完全に消費させるため、培養容器の底面へのK-固体培地の分注量は最小にし、好ましくは２cm以下の厚さにし、より好ましくは0.5mmにする。その際、あまり多量のK-固体培地を分注すると、マツタケ菌が高い濃度で存在する炭素源のみを利用するようになって、松の細根内に侵入しなくなり、結果的に外菌根を形成しない。
【表１】
2004129653.tif 000002
【００１７】
第３段階：感染培地の混合床土の構成およびK-液体培地の添加
　松の幼苗を培養するために、前記段階でマツタケ菌株が接種されている濾紙上にパーライトとミズゴケピートモスの混合床土を添加し、松の幼苗の乾燥を防止するためにK-液体培地を注ぐ。
【００１８】
　感染培地に用いられる床土としてパーライト、ミズゴケピートモスを80：1〜2の割合で混合するが、パーライトは一般的に床土用として多用され、他の有機物や無機物がほとんど存在しないため、培養時にK-固体培地やK-液体培地の添加に適している。ミズゴケピートモスは保湿のために用いる。特にミズゴケピートモスを微量で混合するが、これはミズゴケピートモスが強い酸性を示すからである。培養容器内に紙コップが密着された培養容器の場合、前記混合床土を他の容器で滅菌した後、前記段階でマツタケ菌株が接種された培養容器に紙コップと同じ高さまで混合床土を添加し、K-液体培地を添加しても紙コップと培養容器の間にK-液体培地が入り込まないようにする。前記混合床土の添加はクリーンベンチで行う。
【００１９】
　一方、表１の培地成分表に従って処方したK-液体培地を121℃、20分間、1.2気圧下で滅菌し、冷した後、クリーンベンチ内で各容器あたりK-液体培地を100mLずつ混合床土添加培地に注ぐ。液体培地をやや多く添加することにより培養全期間中の乾燥を防止することができ、それゆえに松の幼苗生長時の乾燥を防ぐことができる。
【００２０】
第４段階：無菌の発芽松苗の誘導および感染培地への置床
　種子から無菌発芽した松苗を、根部分は下方へ子葉部分は上方へ向くうようにして、前記第３段階で配合した混合床土とK-液体培地を含む感染培地に置床し、前記培養容器の蓋を閉じる。
【００２１】
　一方、松の発芽苗を得るために、松の種子を70％エタノール中に10〜60秒間浸漬した後、0.5〜3％次亜塩素酸ナトリウム(最適２％)で１〜7分間処理し、滅菌水で３〜４回水洗することにより滅菌する。その際、次亜塩素酸ナトリウムによる処理時間が長いと発芽率が下がり、適正な次亜塩素酸ナトリウムによる処理時間は5分程度である。滅菌種子を無菌状態で維持したまま種皮を剥がし、栄養ブロス(Nutrient Broth、Scharlau社製)に寒天８g/Lを添加してから滅菌使い捨てペトリ皿に分注して固めた発芽培地に置床して15〜28℃(最適温度：23〜26℃、一般的な種子発芽温度は24℃)で発芽させた。発芽した種子は、他の微生物に汚染されておらず、しかも幼苗の長さが３cm以下のものを選択する。３cm以上の発芽苗は培養時に倒れたり乾燥したりする現象が認められた。前記幼苗を第４段階で得られたマツタケ菌が接種された感染培地含有培養容器内に置床するが、置床時には根部分を下方へ子葉部分を上方へ向くように混合床土に２cm程の深さで植えて、子葉部分の地面露出を１cm以下にする。
【００２２】
第５段階：マツタケ菌感染松苗を形成するための培養
　松苗の細根にマツタケ菌糸が感染した感染苗を形成するために、前記段階で得られた松苗培養物を15〜25℃、24時間、10〜40,000ルクスの光条件下で培養する。
【００２３】
　一般的な感染培養温度は15〜25℃であり、本発明は適正温度として20℃を用いたが、これは植物体への遺伝子導入時にベクターとして作用するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの感染時の最適温度とされた20℃を適用したものである。最も重要な光条件は10〜40,000ルクスであって、野外での自然光は20,000ルクス程度であるが、人為的に20,000ルクスを維持することは培養容器の透過性阻害、照明装置の過熱の問題などで現実的に不可能であるため、本発明では自然光と最も近似する３波長蛍光燈を用いる。この蛍光燈を四つ以上取り付けた培養器内で感染過程を実施するが、その間培養容器内の照度を8,000ルクス以上に維持し、植物生長に不可欠な炭素源の供給を継続的に維持するようにした。これらの培養条件により、炭素源不足のマツタケ菌が炭素源を得ようとして感染メカニズムを自発的に誘導するようにしたのである。
【００２４】
第６段階：マツタケ菌感染松苗形成の確認
　前記松の幼苗とマツタケ菌株を共培養した後、感染苗の細根に形成された菌根の香りを調査し、立体顕微鏡、光学・蛍光顕微鏡および電子顕微鏡下で松の幼苗細根の組織内に侵入した菌糸の状態を検鏡する。
【００２５】
　前記培養後70日以内にマツタケ菌感染を確認することができる。すなわち、培養中の感染苗細根の菌根はマツタケの香りと一致する香りを放っており、立体顕微鏡で菌膜形成が確認され、また、光学・蛍光顕微鏡および電子顕微鏡上で細根の組織内に侵入した菌糸の状態を検鏡することができる。前記菌根の一部を無菌的に切り出し、MMN(Modified Melin-Norkron's)培地に置床して培養した結果、培養培地内の菌糸生長の形態的な様子がマツタケ菌と同一であり、その香りもマツタケの香りと一致した。
【００２６】
　以下、本発明の具体的な方法について実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明の権利範囲はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
実施例１：エノキタケ(Flammulina velutipes)培養容器を利用したマツタケ菌感染苗の培養
　本発明のマツタケ菌感染苗を得るために、図４に示された通り、エノキタケの培養に一般的に用いられる滅菌した培養容器内に滅菌K-固体培地を注いで固めた後、K-固体培地を濾紙で覆い、液体培養したマツタケ菌KBFERI 20T05株の子実体を滅菌水５mlあたり乾燥重量0.075mg程の量で前記濾紙上に接種し、その上にパーライトとミズゴケピートモスを80：1.5の割合で混ぜた混合床土を添加して、pH5.6のK-液体培地を分注して感染培地を製造した。その後、松の種子を無菌発芽させて得た発芽苗を前記混合床土とK-液体培地を含む感染培地に置床して蓋を閉じ、前記松の幼苗とマツタケ菌株を20℃、24時間、25,000ルクスの光条件下で共培養した。前記培養物を共培養した後、感染苗細根の菌根の香りを調べ、立体顕微鏡、光学・蛍光顕微鏡および電子顕微鏡下で松の幼苗細根の組織内に侵入した菌糸の状態を検鏡した。
【００２８】
　その際、K-固体培地の厚さは5.0mm以下にし、濾紙はADVANTEC社のNO５Bを使用し、混合床土の厚さは５cm以下にした。
【００２９】
　また、感染培地を含む培養容器の外部を感染培地の高さまでアルミニウムホイルで覆い、光が入るのを遮断してマツタケ菌および松の細根の生長を保護した。
【００３０】
　松の幼苗とマツタケ菌株をエノキタケ培養容器内で共培養した結果、培養中の感染苗細根の菌根は香りがマツタケの香りと一致しており、立体顕微鏡下で菌膜の形成が確認され、光学・蛍光および電子顕微鏡上で細根の組織内に侵入した菌糸の状態を検鏡することができたことから、最初の培養から70日以内に感染を確認することができた。菌根の一部を無菌的に切り出し、MMN培地に置床して培養した結果、培養培地内の菌糸生長の形態的な様子がマツタケ菌と同一であり、その香りもマツタケの香りと一致していた(図示されていない)。
【００３１】
　製造例１：感染培地に接種するための液体培養したマツタケ菌株の製造
　本発明に用いられたマツタケ菌株は天然産マツタケから分離した菌株であり、慶州市南山洞所在の道有林10haから採取した傘が広がる直前のマツタケを用いた。前記マツタケを採取した後8時間以内に、傘部分と皺部分との連結部の組織を0.5mm３程の大きさの切片に切り取り、表２に示した成分表に従って処方したpH5.5のMMN培地に置床し、分離された菌糸体をPDA培地にてマツタケ菌分離の最適温度である23±0.5℃で60日間継続培養した。培養後、約98％のマツタケ菌株分離率を示した。本発明者は、前記のマツタケ菌分離株がGeneBankに登録された既知のマツタケ菌のITS配列および5.8S rRNA全体と18Sの一部のDNA配列に対して99％以上相同であることを確認し、同定されたrDNA配列をGeneBankに2001年4月3日付で登録して、登録番号AF367417を受け取った。本発明者は前記マツタケ菌株を任意に「KBFERI 20T05株」と命名した。天然産マツタケから分離されるマツタケ菌株のうち、既知のITS配列および5.8S全体と18Sの一部のDNA配列に対して99％以上の相同性を示す如何なるマツタケ菌株でも本発明のマツタケ菌感染苗形成のために使用可能であることが、当業者には理解されよう。
【００３２】
　本発明のマツタケ菌感染苗を得るための接種物としてマツタケ菌糸体の塊を得るために、前記で得た天然産マツタケの子実体から分離されたマツタケ菌KBFERI 20T05株をPDB培地(PDA培地から寒天を除く)で液体培養した。得られた菌糸体の塊を無菌的にpH5.0の滅菌水で水洗した後、Waring社製の滅菌可能な粉砕機31L91を用いて、滅菌水中で微細に粉砕した。微細なマツタケ菌糸体をK-固体培地上に置いた濾紙上に10ml-ガラスピペットで均一に接種して接種菌が菌叢を形成するようにした。マツタケ菌の接種量は滅菌水５mLあたり乾燥重量0.075mg程の量とした。
【表２】
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【００３３】
　製造例２：混合床土およびK-液体培地を用いる感染培地の製造
　本発明の松の幼苗を培養するために用いる床土は、パーライトとミズゴケピートモスを80：1.5の割合で配合したものであり、他の容器で滅菌した後、クリーンベンチ内でマツタケ菌株が接種された培養容器内の紙コップと同じ高さまで混合床土を添加した。
【００３４】
　表１の成分表に従って配合したK-液体培地をオートクレーブ滅菌し、冷した後、K-液体培地をクリーンベンチ内で各容器あたり100mLずつ混合床土に注いだ。
【００３５】
　製造例３：松の種子を無菌発芽させることによる松の幼苗の形成
　松の幼苗は、松の種子を70％エタノールに60秒間浸漬した後、２％次亜塩素酸ナトリウムで４分間処理し、滅菌水で３回水洗した。滅菌した種子は、無菌状態を維持したまま種皮を剥がし、滅菌した栄養ブロス(Nutrient Broth、Scharlau社製)に寒天8g/Lを添加してから滅菌した使い捨てぺトリ皿に分注して固めた発芽培地に置床して、24℃で発芽を誘導した。他の微生物に汚染されておらず、しかも長さが３cm以下の発芽苗だけを選び、マツタケ菌が接種された感染培地の容器内に置床した。
【００３６】
　図２に示した通り、松の幼苗は他の微生物に汚染されていない発芽苗だけを選び、マツタケ菌が接種された感染培地に置床した。
【００３７】
実施例２：紙コップを含む培養容器を利用したマツタケ菌感染苗の形成
　本発明のマツタケ菌感染苗を得るために、下記製造例１により製作した紙コップを含む培養容器において、実施例１の製造例1により製造したマツタケ菌KBFERI 20T05株の菌糸体を滅菌水５mLあたり乾燥重量0.075mg程の量で、滅菌した10mL-ガラスピペットを用いて紙コップの底部分に均一に接種し、その上に前記実施例１の製造例３により製造した混合床土と各容器あたり100mlのK-液体培地を加え、実施例１の製造例２の方法により得た松の無菌発芽苗を置床した。前記培養容器の蓋を閉じ、松の幼苗とマツタケ菌株を20℃で24時間、25,000ルクスの３波長蛍光燈を四つ以上取り付けた培養床で共培養した。前記培養物を共培養した後、感染苗の細根の菌根の香りを調べ、立体顕微鏡、光学・蛍光顕微鏡および電子顕微鏡下で松の幼苗の細根組織内に侵入した菌糸の状態を検鏡した。
【００３８】
　松の幼苗とマツタケ菌株をエノキタケの培養容器内で共培養した結果、培養中の感染苗細根の菌根は香りがマツタケの香りと一致し、立体顕微鏡下で菌膜の形成を確認し、光学・蛍光および電子顕微鏡で細根の組織内に侵入した菌糸の状態を検鏡することができ、最初の培養後70日以内に感染が確認された。前記菌根の一部を無菌的に切り出し、MMN培地に置床して培養した結果、培養培地内の菌糸成長の形態的な様子がマツタケ菌と同様であり、その香りもマツタケの香りと一致した(図示されていない)。
【００３９】
　一方、前記のマツタケ菌糸体を紙コップの底部分に接種すると、菌叢が紙コップの内側底面から層を成しながら均一に成長して、松の細根とマツタケ菌の接触を増大させた。
【００４０】
　製造例１：培養容器の製作および滅菌
　本発明のマツタケ菌感染苗を得るために、松の幼苗とマツタケ菌の共培養のための培養容器を製作するにあたって、培養容器の下端は市販されている焼酎コップ大の紙コップを培養容器に密着して嵌め入れ、上端は紙コップがない透明な空蓋で覆い、図３のような形の培養容器を製作して、121℃で20分間、1.2気圧下で滅菌した。前記培養容器を滅菌した後、クリーンベンチに移して紫外線消毒を施した。
【００４１】
実施例３：K-固体培地を含む培養容器内の床土としてマツタケ生産地土壌を利用したマツタケ菌感染苗の形成
　本発明のマツタケ菌感染苗を得るために、下記製造例１の方法により製造したK-固体培地を含む培養容器内に実施例１の製造例１により製造したマツタケ菌KBFERI 20T05株の菌糸体を滅菌水５mLあたり0.075mg程の量で、滅菌した10ml-ガラスピペットを用いて紙コップの底部分に均一に接種し、その上に下記製造例２の方法により製造したマツタケ生産地の土壌と各容器あたり50mLのK-液体培地を加え、実施例１の製造例２の方法により得た松の無菌発芽苗を置床した。その後、前記培養容器の蓋を閉じ、前記松の幼苗とマツタケ菌株を20℃で24時間、25,000ルクスの３波長蛍光燈を四つ以上取り付けた培養床で共培養した。前記培養物を共培養した後、感染苗細根の菌根の香りを調べ、立体顕微鏡、光学・蛍光顕微鏡および電子顕微鏡下で松の幼苗細根の組織内に侵入した菌糸の状態を検鏡した。
【００４２】
　松の幼苗とマツタケ菌株をエノキタケの培養容器内で共培養した結果、培養中の感染苗細根の菌根は香りがマツタケの香りと一致し、立体顕微鏡下で菌膜の形成を確認し、光学・蛍光および電子顕微鏡で細根の組織内に侵入した菌糸の状態を検鏡することができ、最初の培養後70日以内に感染が確認された。前記菌根の一部を無菌的に取りだし、MMN培地に置床して培養した結果、培養培地内の菌糸成長の形態的な様子がマツタケ菌と同様であり、その香りもマツタケの香りと一致した(図示されていない)。
【００４３】
　製造例１：K-固体培地を含む培養容器の製作および滅菌
　本発明の松の幼苗とマツタケ菌の共培養のための培養容器を製作するにあたって、培養容器の下端は市販の紙コップを培養容器に密着して嵌め入れ、上端は紙コップがない透明な空蓋で覆い、図３のような形に培養容器を製作して、121℃で20分間、1.2気圧下で滅菌した。前記培養容器を滅菌した後、クリーンベンチに移して紫外線消毒を施した。前記滅菌培養容器に表１の成分表により配合したpH5.6のK-固体培地をクリーンベンチ内で分注して固めた。分注量は２cm以下にし、0.5mm程度が好ましい。
【００４４】
　製造例２：マツタケ生産地土壌とK-液体培地を用いる感染培地の製造
　本発明の松の幼苗を培養するために用いる床土は、マツタケ生産地の土壌を三つの層(地皮層、細かい磨砂層、粗い磨砂層)に分けて添加したが、この三つの層を野外の土壌構成と同じように底面にはK-固体培地、その上に粗い磨砂層、細かい磨砂層、地皮層の順で添加した。その際、表１の成分表により配合したpH5.6のK-液体培地を121℃で20分間、1.2気圧下で滅菌し、冷した後、クリーンベンチ内でK-液体培地を各容器あたり50mLずつ土壌に添加した。
【００４５】
実施例４：K-固体培地を含む培養容器内の混合床土を利用したマツタケ菌感染苗の形成
　本発明のマツタケ菌感染苗を得るために、実施例３の製造例１の方法により製造したK-固体培地を含む培養容器内に、実施例１の製造例１により製造したマツタケ菌KBFERI 20T05株の菌糸体を滅菌水５mLあたり0.075mg程の量で、滅菌した10ml-ガラスピペットを用いて紙コップの底部分に均一に接種し、その上に実施例１の製造例３の方法により製造した混合床土と各容器あたり100mLのK-液体培地を加え、実施例１の製造例２の方法により得た松の無菌発芽苗を置床した。その後、前記培養容器の蓋を閉じ、前記松の幼苗とマツタケ菌株を20℃で24時間、25,000ルクスの３波長蛍光燈を四つ以上取り付けた培養床で共培養した。前記培養物を共培養した後、感染苗細根の菌根の香りを調べ、立体顕微鏡、光学・蛍光顕微鏡および電子顕微鏡下で松の幼苗細根の組織内に侵入した菌糸の状態を検鏡した。
【００４６】
　前記松の幼苗とマツタケ菌株を共培養した後、感染苗を調査した結果、図５に示すような本発明のマツタケ菌株に感染した松の幼苗が現われ、培養中の感染苗細根の菌根は香りがマツタケの香りと一致し、図６に示した通り、立体顕微鏡下で菌膜の形成を確認し、図７および図８に示した通り、光学および蛍光顕微鏡上で糸のように見える細根の組織内に侵入した菌糸の様子が検鏡され、最初の培養から70日以内に感染が確認された。
【００４７】
　前記菌根の一部を無菌的に取りだし、MMN培地に置床して培養した結果、図９に示した通り、培養培地内の菌糸成長の形態的な様子はマツタケ菌と同様であった。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】天然産マツタケから分離したマツタケ菌KBFERI 20T05株の液体培養の写真図である。
【図２】無菌発芽させた松の幼苗の写真図である。
【図３】紙コップが嵌め込まれた形の培養容器の写真図である。
【図４】マツタケ菌株と松の無菌発芽苗を共培養するための感染培地の構成および写真図である。
【図５】マツタケ菌株の菌糸体を感染させた松の幼苗の写真図である。
【図６】菌根を形成した感染松苗の細根の立体顕微鏡写真図である。
【図７】松の幼苗の細根に侵入した菌糸の光学顕微鏡写真図である。
【図８】松の幼苗の細根に侵入した菌糸の蛍光顕微鏡写真図である。
【図９】感染した松苗の細根を切り取った切片においてPDA固体培地上で生長するマツタケ菌糸体の写真図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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