(57)【要約】【課題】プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡがどの程度ハイブリダイズしたか、定量的な測定を可能とする。【解決手段】プローブ１ａ，１ｂ，１ｃを標識した蛍光物質２を発光させてガラスプレート４のスポット３ａ，３ｂ，３ｃに固定化されたプローブの量を求め、更にサンプル５ａ，５ｂを標識した蛍光物質６を発光させてプローブにハイブリダイズしたサンプルの量を求める。そして、その差分を前記プローブの量で規格化した値で基板上にスポットされたプローブ量に対して、サンプルがどれくらいハイブリダイズしたかを測定する。【選択図】　図３
2004029009.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、前記基板上の異なる位置にそれぞれ固定化された複数種類のプローブとを含むバイオチップにおいて、
前記複数種類のプローブはそれぞれ同一の蛍光物質で標識されていることを特徴とするバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サンプル生体高分子とプローブ生体高分子とのハイブリダイゼーションを利用してサンプル生体高分子に目的とする配列が存在するか否かを分析するハイブリダイゼーション検出法、及びそれに用いられるバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、生体内の分子を同定・分画するために、特に目的ＤＮＡの検出、あるいは遺伝子ＤＮＡの有無検出などのために、既知の配列をもつ核酸や蛋白質をプローブとしてハイブリダイズする方法が多く用いられてきた。ハイブリダイゼーション検出の方法は、固定したプローブＤＮＡに蛍光物質を標識したサンプルＤＮＡを入れてハイブリダイズさせる。サンプルＤＮＡがプローブＤＮＡに結合すると、プローブＤＮＡと一緒に固定され、光源からの励起光で蛍光物質を励起し、発光する蛍光を検出することでハイブリダイゼーションを検出していた。
【０００３】
図７、図８、図９は、この従来のハイブリダイゼーション検出方法の原理を説明する図である。図７に示すように、一定量のプローブＤＮＡ１ａをガラスプレート４にスポット３ａとして固定化する。別種のプローブＤＮＡ１ｂ、プローブＤＮＡ１ｃも同様に、スポット３ｂ、スポット３ｃとして固定化する。このとき、各スポット１ａ，１ｂ，１ｃのプローブＤＮＡを全て同量にして固定化することはできない。
【０００４】
図８（ａ）に示すように、全てのサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…を蛍光物質６で標識する。図８（ｂ）に示すように、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡをハイブリダイズさせるために、スポットされたガラスプレート４と蛍光標識したサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…をハイブリダイゼーション溶液７に入れ、ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液７は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（ＮａＣｌ，ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）、ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｄｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【０００５】
このとき図８（ｃ）に示すように、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡが相補鎖であればプローブＤＮＡ１ａ，１ｂとサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂのようにハイブリダイゼーションして二重らせん構造で結合する。一方、両者が相補鎖ＤＮＡでなければ、プローブＤＮＡ１ｃのようにサンプルＤＮＡが結合しないでそのままである。ハイブリダイゼーションの検出は、図９に示すように、励起光源としてのランプ９からの励起光でガラスプレート４を照射して蛍光物質６を励起し、発光波長域以外の光を光学フィルター１０でカットして、各スポットからの発光をＣＣＤカメラなどの二次元光センサー８で検出する。
【０００６】
この時、ハイブリダイゼーションが生じたスポット３ａ，３ｂには蛍光物質６が存在するため、ランプ９からの励起光によって蛍光物質６が励起され、発光が検出される。一方、ハイブリダイゼーションが生じていないスポット３ｃには蛍光物質が存在しないため、ランプ９からの励起光照射によっても発光は生じない。このようにして、ハイブリダイゼーションが生じたか否かによってスポット毎に明暗が観察される。二次元光センサー８からの画像データは、コントローラ１２によってコンピュータ１３に転送され、ディスプレイに画像表示される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
プローブＤＮＡをガラスプレートに固定化するとき、全てのプローブを同じ量ずつ均等にスポットすることはできないため、プローブが多量に固定化されたスポットと少量に固定化されたスポットとではプローブＤＮＡの量が異なる。このため、ハイブリダイゼーションの検出ではサンプルＤＮＡがハイブリダイズしたか否かは判断できるが、どの位のプローブＤＮＡにどの程度のサンプルＤＮＡがハイブリダイスしたか定量的な測定を行うことはできなかった。
本発明は、このような従来技術の問題点に鑑みなされたもので、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡがどの程度ハイブリダイズしたか、定量的な測定が可能な検出方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、本発明では、プローブ生体高分子とサンプル生体高分子に各々異なる蛍光物質を標識し、蛍光物質の発光波長が異なることを利用して各スポット毎に、そのスポットに存在しているプローブ生体高分子とサンプル生体高分子を別々に検出できるようにする。また、ハイブリダイゼーションの検出で、プローブ生体高分子を標識している蛍光物質の発光波長とサンプル生体高分子を標識している蛍光物質の発光波長を分離検出することにより、各スポット毎にプローブ生体高分子の量及びそのプローブ生体高分子にハイブリダイズしたサンプル生体高分子の量を個別に検出して定量測定することを可能とする。
【０００９】
すなわち、プローブ生体高分子を標識した蛍光物質を発光させてガラスプレートのスポットに固定化されたプローブ生体高分子の量を求め、更にサンプル生体高分子を標識した蛍光物質を発光させてプローブ生体高分子にハイブリダイズしたサンプル生体高分子の量を求める。そして、その差分を前記プローブの量で規格化した値で、基板上にスポットされたプローブ量に対して、サンプルがどれくらいハイブリダイズしたかを測定する。ここで生体高分子とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質など、生体を構成する高分子をいう。
【００１０】
以上をまとめると、本発明によるハイブリダイゼーション検出方法は、プローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出するハイブリダイゼーション検出方法において、プローブの量と前記プローブに結合したサンプルの量とを検出することを特徴とする。ここでいうプローブとは、基板に固定する生体高分子（例えばＤＮＡ）を示し、サンプルとはハイブリダイズに用いる生体高分子（例えばＤＮＡ）を示す。
本発明によるハイブリダイゼーション検出方法は、また、プローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出するハイブリダイゼーション検出方法において、プローブの量と前記プローブに結合したサンプルの量との差分を前記プローブの量で規格化した値を検出することを特徴とする。
【００１１】
プローブの量とプローブに結合したサンプルの量の検出は、ハイブリダイゼーションを行う前にプローブの量を検出し、ハイブリダイゼーション終了後にプローブに結合したサンプルの量を検出するようにしてもよいし、ハイブリダイゼーション終了後にプローブの量とプローブに結合したサンプルの量を共に検出するようにしてもよい。
【００１２】
プローブの量とプローブに結合したサンプルの量の検出は、プローブとサンプルに各々異なる検出用の標識を付けておき、その標識を検出することで行うことができる。
検出されたプローブの量とプローブに結合したサンプルの量との差分を前記プローブの量で規格化した値はディスプレイに表示することができる。
本発明によるバイオチップは、蛍光物質で標識したプローブをスポットしたことを特徴とする。
【００１３】
基板に固定されるプローブ量は、各プローブごと、各基板ごとに異なる。同じプローブが固定されている２個のバイオチップ１，２を用いて、異なるサンプルＡ、Ｂについて実験を行ったときを例に挙げて説明する。用いたサンプル及びプローブはＤＮＡであるとする。バイオチップ上のあるプローブが、バイオチップ１には１０ｎｇ固定され、バイオチップ２には８ｎｇ固定されていて、ハイブリダイズ前の蛍光強度が例えば２５６階調の１００と８０あったとする。サンプルＡ、Ｂをそれぞれこのバイオチップ１，２上のプローブとハイブリダイズしたとき、ハイブリダイズ後の蛍光強度がサンプルＡは７０、サンプルＢは６０となったとすると、このままではサンプルＡの方がサンプルＢよりもそのＤＮＡ量が多いと判断される。しかし、バイオチップにもともと固定されていたプローブの量とそのプローブに結合したサンプルの量との差分をプローブの量で規格化した値を計算して、どのくらいの割合でハイブリダイズしているのかを考えると、
サンプルＡ：（１００−７０）÷１００＝０．３
サンプルＢ：（８０−６０）÷８０＝０．２５
となり、プローブとハイブリダイズしたＤＮＡの割合は実際にはサンプルＡの方がサンプルＢより少ないといえる。このようにハイブリダイズ後の蛍光強度だけでサンプルのＤＮＡ量を考えるより、より精密な解析ができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。ここでは、本発明の一例として、プローブ生体高分子及びサンプル生体高分子が共にＤＮＡである場合について説明するが、ＤＮＡ以外のＲＮＡや蛋白質に対しても本発明が同様に適用可能であるのは勿論である。
【００１５】
図１〜図３は、本発明によるハイブリダイゼーション検出方法の一例の原理を説明する図である。図１に示すように、全てのプローブＤＮＡ１ａ，１ｂ，１ｃ，…に同一の蛍光物質２を標識する。蛍光物質２としては、例えばイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を使用する。プローブＤＮＡ１ａをガラスプレート４にスポット３ａとして固定化し、別種のプローブＤＮＡ１ｂ、プローブＤＮＡ１ｃ、…も同様に、スポット３ｂ、スポット３ｃ、…としてガラスプレート４に固定化する。
【００１６】
また、図２（ａ）に示すように、サンプルＤＮＡは全てのサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…を蛍光物質６で標識する。蛍光物質６としては、例えばＣｙ５を使用する。ハイブリダイゼーションに当たっては、図２（ｂ）に示すように、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡをハイブリダイズさせるために、プローブＤＮＡ１ａ，１ｂ，１ｃ，…がスポットされたガラスプレート４（図１参照）と蛍光標識したサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…とをハイブリダイゼーション溶液７に入れ、ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液７は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（ＮａＣｌ，ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）、ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｄｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【００１７】
このとき、サンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…とプローブＤＮＡが相補鎖であれば、図２（ｃ）に示すスポット３ａのプローブＤＮＡ１ａやスポット３ｂのプローブＤＮＡ１ｂのように、サンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…とハイブリダイゼーションして二重らせん構造で結合する。一方、両者が相補鎖ＤＮＡでなければ、図２（ｃ）に示すスポット３ｃのプローブＤＮＡ１ｃのように、サンプルＤＮＡが結合しないでそのままである。つまり、ハイブリダイゼーションが生じたスポット３ａや３ｂには、プローブＤＮＡ１ａ，１ｂを標識している蛍光物質２と、プローブＤＮＡ１ａ，１ｂに結合したサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂを標識している蛍光物質６が存在する。一方、ハイブリダイゼーションが生じていないスポット３ｃには、プローブＤＮＡ１ｃを標識している蛍光物質２のみが存在する。
【００１８】
ハイブリダイゼーションの検出は、図３に示すように、励起光源としてのランプ９からの励起光でサンプルを標識する蛍光物質６とプローブＤＮＡを蛍光物質２を励起して発光させる。励起光源のランプとしては例えば、発光波長域が約３００−約７００ｎｍであるキセノンランプを使用する。これは、ＦＩＴＣが励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍであり、Ｃｙ５が励起波長６５０ｎｍ、発光波長６６７ｎｍであるため、両方の蛍光物質を同時に発光させることができるからである。発光の検出にあたっては、ＦＩＴＣの発光を読み取るときは透過波長５２０ｎｍの光学フィルター１０を、Ｃｙ５の発光を読み取るときは透過波長６６７ｎｍの光学フィルター１１を用いて二次元光センサー８で読み取る。二次元光センサー８からのデータは、コントローラー１２によってコンピュータ１３へ転送される。二次元光センサー８としては例えばＣＣＤカメラを使用し、２枚の光学フィルター１０，１１はステージ１４の駆動によって矢印の方向に移動され、交換される。
【００１９】
コンピュータ１３では、ＦＩＴＣの発光を読み取ったデータ値から各スポットにおけるプローブＤＮＡの量を求め、Ｃｙ５の発光を読み取ったデータ値から各スポットにおいてプローブＤＮＡとハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの量を求める。ＦＩＴＣの発光量ＡｉからＣｙ５の発光量Ｂｉを引いて得られた差分をＦＩＴＣの発光量で割った評価値Ｃｉ〔Ｃｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／Ａｉ〕を計算すれば、プローブＤＮＡ量からの相対値でハイブリダイズしたサンプルＤＮＡ量を求めることができ、高精度な定量測定ができる。
【００２０】
上記評価値Ｃｉを計算することにより、評価値Ｃｉ〔Ｃｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／Ａｉ〕が大きいほどプローブＤＮＡにハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの量が少ないことを意味し、反対に評価値Ｃｉが小さいほどプローブＤＮＡにハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの量が多い、即ちプローブＤＮＡと相補性があると判断できる。ここで、評価値としてＣｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／Ａｉを採用したのは、プローブＤＮＡ量からハイブリダイズしたサンプルＤＮＡ量を引いた方が比較を簡単に行えるからである。つまり、どんな状態でも、基板上に固定されたプローブＤＮＡの方が、そのＤＮＡにハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの量より少ないということはないからである。
【００２１】
図４は、評価値の処理手順を示すフローチャートである。ステップ１１において、評価値を計算するスポットの番号を初期設定する。ステップ１２では、スポットｉのＦＩＴＣの発光量ＡｉとＣｙ５の発光量Ｂｉを求める。ステップ１３では、発光量の差分を発光量Ａｉで割った値Ｃｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／Ａｉを計算する。得られた評価値ＣｉはハイブリダイズしなかったプローブＤＮＡ量に対応し、これからサンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとの相補性の程度を判断することができる。ステップ１４では、求めた相対値Ｃｉをコンピュータ１３の表示部に階調として表示する。このとき、評価値の大きい値は明るく、小さい値は暗く表示する。また、ポジフィルムのようにその反対で表示してもよい。ステップ１５では、全てのスポットを処理したかチェックし、全てのスポットの処理が終了してないときはステップ１６で次のスポットの位置を求め、ステップ１２からの処理を繰り返す。全てのスポットの計算が終了したときは処理を終了する。
【００２２】
図５及び図６は、本発明による検出方法の他の例の原理を説明する図である。この検出方法は、ハイブリダイゼーションする前にプローブＤＮＡの量、すなわちプローブＤＮＡに標識したＦＩＴＣ等の発光量を読み取っておき、ハイブリダイゼーション後、サンプルＤＮＡの量、すなわちサンプルＤＮＡに標識したＣｙ５等の発光量を読み取り、評価値を求める方法である。
【００２３】
図５（ａ）に示すように、例えばＦＩＴＣのような蛍光物質で標識したプローブＤＮＡをスポット３ａ，３ｂ，３ｃ，…としてガラスプレート４に固定化する。これは、先に図１にて説明したのと同様の方法で行う。次に、ハイブリダイゼーション前に各スポット３ａ，３ｂ，３ｃ，…のプローブＤＮＡの量を読み取るため、図５（ｂ）に示すように、ランプ９からの励起光を照射してプローブＤＮＡに標識したＦＩＴＣの発光量を二次元光センサー８で読み取る。このとき、二次元光センサー８の光路中には透過波長５２０ｎｍの光学フィルター１０を配置する。これは、先に図３によって説明したＦＩＴＣの発光量読み取りと同様にして行われる。読み取った各スポットの発光量データＡｉは、フロッピーディスク１４などの記憶媒体に格納しておく。
【００２４】
例えばＣｙ５からなる蛍光物質６で標識したサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…とプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、図６（ａ）に示すように、図２（ｂ）で説明したのと同様にして行われる。ハイブリダイゼーションの検出は、図６（ｂ）に示すように、ランプ９からの励起光でガラスプレート４を照射し、Ｃｙ５からの発光量を二次元光センサー８で読み取ることによって行われる。このとき、二次元光センサー８の光路中には透過波長６６７ｎｍの光学フィルター１１を配置する。これは、図３で説明したＣｙ５の発光読取りと同様である。このあと、フロッピーディスク１４に格納されているＦＩＴＣの発光量データＡｉを読み込み、Ｃｙ５の発光量データＢｉとの差分をとる。各差分はＦＩＴＣの発光量データＡｉで割る。差分の取り方は、図３に示す処理と同様であり、この方法によっても定量測定ができる。
【００２５】
この方法は、基板にどの程度プローブＤＮＡが固定化されたか、ハイブリダイゼーションを行う前に分かるため、サンプルＤＮＡの量をどの程度にしてハイブリダイゼーションすればよいか、また、プローブＤＮＡが固定化できなかった無効なスポットの位置などをハイブリダイゼーション前に知ることができるため、事前の対処ができ、効率の良い実験ができる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によると、スポットされたプローブの量と、プローブにハイブリダイゼーションしたサンプルの量を知ることができ、その差分を前記プローブの量で規格化した値を求めることでより厳密なハイブリダイズ量（相補性の程度）を計算でき、プローブに結合したサンプルの量を高精度に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるハイブリダイゼーション検出方法の一例の原理を説明する図。
【図２】本発明によるハイブリダイゼーション検出方法の一例の原理を説明する図。
【図３】本発明によるハイブリダイゼーション検出方法の一例の原理を説明する図。
【図４】評価値の処理手順を示すフローチャート。
【図５】本発明による検出方法の他の例の原理を説明する図。
【図６】本発明による検出方法の他の例の原理を説明する図。
【図７】従来のハイブリダイゼーション検出方法の原理を説明する図。
【図８】従来のハイブリダイゼーション検出方法の原理を説明する図。
【図９】従来のハイブリダイゼーション検出方法の原理を説明する図。
【符号の説明】
１ａ，１ｂ，１ｃ…プローブＤＮＡ、２…蛍光物質、３ａ，３ｂ，３ｃ…プローブＤＮＡのスポット、４…ガラスプレート、５ａ，５ｂ，５ｃ…サンプルＤＮＡ、６…蛍光物質、７…ハイブリダイゼーション溶液、８…二次元光センサー、９…励起光源、１０，１１…光学フィルター、１２…コンピュータ、１３…コントローラ、１４…フロッピーディスク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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