(57)【要約】【課題】本発明は、ＩＰ３の検出および定量に有効な指示薬となる新規ＩＰ３受容体結合タンパク質を提供し、ならびにそれを用いたＩＰ３の検出および／または定量方法を提供する。【解決手段】ＩＰ３受容体結合タンパク質、特にＩＰ３受容体と相互作用し、かつ該相互作用がＩＰ３により制御される、新規ＩＰ３受容体結合タンパク質ＩＲＢＩＴを同定した。ＩＲＢＩＴは生理的濃度のＩＰ３によりＩＰ３受容体から解離可能であるという特性を有する。該特性により、ＩＲＢＩＴはＦＲＥＴ法等によりＩＰ３を検出するために指示薬として有用である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質。
（ａ）　　配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質（ＩＲＢＩＴ）
（ｂ）　　配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｃ）　　配列番号１に示すアミノ酸配列またはその１〜１０４番目までのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＩＰ３受容体に結合するタンパク質
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）　　配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）　　配列番号２に示す塩基配列の１〜３１２番目までの塩基配列を含むＤＮＡ
（ｃ）　（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰ３受容体に結合するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２または３記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項５】
請求項２または３記載の遺伝子に、プロモーターが機能し得る形で連結されている、請求項４記載のベクター。
【請求項６】
請求項２または３記載の遺伝子を、蛍光または発光タンパク質をコードする遺伝子とインフレームで連結された形で含む、請求項５記載のベクター。
【請求項７】
蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＶｅｎｕｓおよびＦｌＡｓＨならびにこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項６記載のベクター。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項９】
哺乳動物細胞である、請求項８記載の宿主細胞。
【請求項１０】
サンプル中のＩＰ３を検出するための、請求項１記載のタンパク質を含むＩＰ３指示薬。
【請求項１１】
上記タンパク質が蛍光または発光タンパク質と融合されている、請求項１０記載のＩＰ３指示薬。
【請求項１２】
上記タンパク質がＦＲＥＴ法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせのうちのいずれか一方の蛍光分子で標識されており、上記組合せのうちの他方の蛍光分子で標識されたＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質と組合わせてＦＲＥＴ法によりＩＰ３を検出するための、請求項１１記載のＩＰ３指示薬。
【請求項１３】
２つの蛍光分子からなる組合わせが、ＶｅｎｕｓとＣＦＰとの組合せ、ＹＦＰとＣＦＰとの組合せ、またはＦｌＡｓＨとＣＦＰとの組合せである、請求項１２記載のＩＰ３指示薬。
【請求項１４】
請求項１記載のタンパク質を特異的に認識する抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項１５】
ウサギポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１４記載の抗体およびその機能的フラグメント。
【請求項１６】
サンプル中のＩＰ３濃度を測定するための方法であって、
（ｉ）　　ＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質とＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質からなるタンパク質複合体を調製し；
（ｉｉ）　上記タンパク質複合体とサンプルを接触させ；
（ｉｉｉ）　　遊離ＩＲＢＩＴもしくはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質および／または上記複合体を定量すること；
を含む、上記方法。
【請求項１７】
上記（ｉｉｉ）における定量が、抗ＩＲＢＩＴ抗体および／または抗ＩＰ３受容体抗体を用いた免疫化学的反応系を利用して実施されることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
上記（ｉｉｉ）における定量が、ＩＲＢＩＴもしくはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質またはＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質を予め標識しておいて、該標識物に由来するシグナルを測定することにより実施されることを特徴とする、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
標識が蛍光標識である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
上記（ｉｉｉ）における定量が、ＦＲＥＴ法により実施されることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
ＹＦＰもしくはＶｅｎｕｓで標識したＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質と、ＣＦＰで標識したＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質とを用いることを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＣＦＰで標識したＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質と、ＶｅｎｕｓまたはＹＦＰで標識したＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質とを用いることを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
生細胞の細胞内のＩＰ３濃度を定量する方法であって、
（ｉ）　　細胞に、ＦＲＥＴ法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせのうちの一方で標識されたＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子、および上記組合せのうちの他方で標識されたＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能な形で導入して発現させ；
（ｉｉ）　該細胞を蛍光顕微鏡下で、上記の２つの蛍光分子のうち低波長側の蛍光分子の励起波長を照射して、該分子の蛍光波長と、他方の長波長側の蛍光分子の蛍光波長とを測定すること；
を含む上記方法。
【請求項２４】
ＦＲＥＴ法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせが、ＶｅｎｕｓとＣＦＰとの組合せ、ＹＦＰとＣＦＰとの組合せ、またはＦｌＡｓＨとＣＦＰとの組合せである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質とＩＰ３受容体またはその少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質からなる、ＩＰ３濃度を定量するためのタンパク質複合体。
【請求項２６】
ＦＲＥＴ法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせのうちの一方で標識されたＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子、および上記組合せのうちの他方で標識されたＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能な形で含み、生細胞内のＩＰ３濃度を定量するためのベクター。
【請求項２７】
２つの蛍光分子からなる組合わせが、ＶｅｎｕｓとＣＦＰとの組合せ、ＹＦＰとＣＦＰとの組合せ、またはＦｌＡｓＨとＣＦＰとの組合せである、請求項２６記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＩＰ３受容体に結合する新規タンパク質に関する。該タンパク質は、細胞内およびセルフリー（ｃｅｌｌ　ｆｒｅｅ）の系においてＩＰ３指示薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
細胞膜上のレセプターの活性化に伴いホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ　４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が加水分解されると、細胞内セカンドメッセンジャーであるイノシトール１，４，５−三リン酸（ｉｎｏｓｉｔｏｌ　１，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　（ＩＰ３））が生成する。ＩＰ３はＩＰ３受容体（ＩＰ３Ｒ）に結合することにより、細胞内カルシウム貯蔵オルガネラ（主に小胞体）からのＣａ２＋放出を誘導する。このＩＰ３／Ｃａ２＋シグナル経路において、ＩＰ３受容体は、ＩＰ３のシグナルをＣａ２＋のシグナルへ変換する役割を担っている（１−３）。
【０００３】
ＩＰ３受容体は、４量体の細胞内ＩＰ３−誘導性Ｃａ２＋　放出チャネル（ＩＰ３−ｇａｔｅｄ　Ｃａ２＋　ｒｅｌｅａｓｅ　ｃｈａｎｎｅｌ）である（３，　４）。哺乳動物では、３種の異なるＩＰ３受容体が存在する（５−７）。ＩＰ３受容体タイプＩ（ＩＰ３Ｒ１）は、中枢神経系、特に小脳において高発現している（８，　９）。マウスＩＰ３Ｒ１は、２７４９アミノ酸からなり（５）、　３つの機能的に異なる領域に分かれている。すなわち、Ｎ末端近傍にＩＰ３結合ドメイン、Ｃ末端近傍に６回膜貫通領域を有するチャネル形成ドメイン、およびこれら２つの領域のあいだに制御領域が存在する（１０，　１１）。ＩＰ３結合ドメインの欠失突然変異体解析より、ＩＰ３受容体のアミノ酸２２６〜５７８残基が特異的かつ高親和性のリガンド結合に必要な最小領域であることが示され、ＩＰ３結合コアと呼ばれている（１２）。ＩＰ３により誘発されるＩＰ３受容体チャネル開口の詳細な機序は未だ不明であるが、ＩＰ３結合がＩＰ３受容体の何らかの立体構造変化を誘導することによって、チャネルの開口が起こると考えられる（１０）。チャネルの開口以外にも、ＩＰ３−誘導性の立体構造変化は、ＩＰ３受容体の分解にも関与していると考えられる　（１３，　１４）。
【０００４】
ＩＰ３受容体の活性化による細胞質Ｃａ２＋濃度の増加によって、多種多様な下流標的分子の活性が制御される。これら下流標的分子は、受精、発生、増殖、分泌、シナプス可塑性など多岐に渡る細胞応答において重要な役割を担っている　（１−２，１５）。このような多岐に渡る細胞機能を制御するために、Ｃａ２＋シグナルは、空間、時間、および濃度の点で厳密に制御される必要がある（２，　１５）。このようなＣａ２＋シグナルの複雑な制御は、ＩＰ３受容体アイソフォームの発現の多様性、ＩＰ３受容体アイソフォームのヘテロ４量体の形成、ＩＰ３受容体の細胞内分布、ならびにＣａ２＋自体、ＡＴＰおよびリン酸化によるＩＰ３受容体の制御によって部分的にになわれている　（３−４，　１６）。ＩＰ３受容体チャネルはまた、カルモジュリン（１８，　１９）、ＦＫＢＰ１２　（２０−２２、２３−２４）、カルシニューリン（２１、２５、２３−２４）、アンキリン　（２６−２８）、σ−１　受容体（２８）、クロモグラニンＡおよびＢ　（２９−３１）、ＩＲＡＧ　（３２）、　Ｆｙｎ　（３３）ならびにＢＡＮＫ　（３４）などの該チャネルと相互作用するタンパク質によっても制御される（４，１７）。さらに、ＣａＢＰと呼ばれるファミリーが、Ｃａ２＋依存的にＩＰ３受容体と結合し、ＩＰ３非存在下でＩＰ３受容体を直接活性化することが示された（３５）。ＩＰ３受容体はまた、タンパク質−タンパク質間相互作用によってその上流または下流のシグナル分子に物理的に会合していることが示されている。例えば、ＩＰ３受容体は、Ｈｏｍｅｒファミリータンパク質を介して代謝型グルタミン酸受容体グループ１（ｍＧｌｕＲｓ）と結合し（３６）、また、未知の機序によってＢ２ブラジキニン受容体　（Ｂ２Ｒｓ）と結合している（３７）。ｍＧｌｕＲｓやＢ２Ｒｓの活性化によって、ＩＰ３受容体に近接した位置でＩＰ３が産生され、効率的かつ特異的にシグナルが伝播される。
【０００５】
このように、ＩＰ３分子は、様々な細胞機能を制御する重要なセカンドメッセンジャーであり、その細胞内の濃度は時間空間的に制御された形で変化していると考えられる。しかし、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＩＰ３の定量に有効な指示薬として［３Ｈ］ＩＰ３を用いた方法が開発されているものの、放射性同位元素を使用するなどの点で簡便ではない。さらに、Ｃａ２＋やｃＡＭＰといった他のセカンドメッセンジャーとは異なり、生細胞内のＩＰ３濃度変化の経時的な検出法は、ＧＦＰ−プレクストリン相同性ドメイン（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｄｏｍａｉｎ）の細胞膜から細胞質への移行をモニターすることにより検出する方法があるのみで、該方法も間接的、かつ定量性及び空間解像度の等の点で問題があるなど、必ずしも有効な方法ではない。このことが、細胞内ＩＰ３動態解析の障害となっている。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，　Ｍ．　Ｊ．　（１９９３）　Ｎａｔｕｒｅ　３６１，　３１５−３２５
【非特許文献２】
Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，　Ｍ．　Ｊ．，　Ｌｉｐｐ，　Ｐ．，　ａｎｄ　Ｂｏｏｔｍａｎ，　Ｍ．　Ｄ．　（２０００）　Ｎａｔ．　Ｒｅｖ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．　１，　１１−２１
【非特許文献３】
Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９９５）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　６４，　９５３−９６０
【非特許文献４】
Ｐａｔｅｌ，　Ｓ．，　Ｊｏｓｅｐｈ，　Ｓ．　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｔｈｏｍａｓ，　Ａ．　Ｐ．　（１９９９）　Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ　２５，　２４７−２６４
【非特許文献５】
Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，　Ｓ．，　Ｍｉｙａｗａｋｉ，　Ａ．，　Ｗａｄａ，　Ｋ．，　Ｍａｅｄａ，　Ｎ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　３４２，　３２−３８
【非特許文献６】
Ｓｕｄｈｏｆ，　Ｔ．　Ｃ．，　Ｎｅｗｔｏｎ，　Ｃ．　Ｌ．，　Ａｒｃｈｅｒ，　Ｂ．　Ｔ．，　ＩＩＩ，　Ｕｓｈｋａｒｙｏｖ，　Ｕ．　Ａ．，　ａｎｄ　Ｍｉｇｎｅｒｙ，　Ｇ．　Ａ．　（１９９１）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１０，　３１９９−３２０６
【非特許文献７】
Ｂｌｏｎｄｅｌ，　Ｏ．，　Ｔａｋｅｄａ，　Ｊ．，　Ｊａｎｓｓｅｎ，　Ｈ．，　Ｓｅｉｎｏ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｂｅｌｌ，　Ｇ．　Ｉ．　（１９９３）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６８，　１１３５６−１１３６３
【非特許文献８】
Ｗｏｒｌｅｙ，　Ｐ．　Ｆ．，　Ｂａｒａｂａｎ，　Ｊ．　Ｍ．，　Ｃｏｌｖｉｎ，　Ｊ．　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｓｎｙｄｅｒ，　Ｓ．　Ｈ．　（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２５，　１５９−１６１
【非特許文献９】
Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　Ｓｉｍｏｎ−Ｃｈａｚｏｔｔｅｓ，　Ｄ．，　Ｆｕｊｉｎｏ，　Ｉ．，　Ｙａｍａｄａ，　Ｎ．，　Ｈａｓｅｇａｗａ，　Ｍ．，Ｍｉｙａｗａｋｉ，　Ａ．，　Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，　Ｓ．，　Ｇｕｅｎｅｔ，　Ｊ．−Ｌ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９９３）　Ｒｅｃｅｐｔ．　Ｃｈａｎｎｅｌｓ　１，　１１−２４
【非特許文献１０】
Ｍｉｇｎｅｒｙ，　Ｇ．　Ａ．，　ａｎｄ　Ｓｕｄｈｏｆ，　Ｔ．　Ｃ．　（１９９０）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　９，　３８９３−３８９８
【非特許文献１１】
Ｍｉｙａｗａｋｉ，　Ａ．，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　Ｒｙｏｕ，　Ｙ．，　Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，　Ｓ．，　Ｎａｋａｇａｗａ，　Ｔ．，　Ｓａｉｔｏｈ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９９１）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８８，　４９１１−４９１５
【非特許文献１２】
Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，　Ｆ．，　Ｍｏｒｉｔａ，　Ｍ．，　Ｍｏｎｋａｗａ，　Ｔ．，　Ｍｉｃｈｉｋａｗａ，　Ｔ．，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　ａｎｄＭｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９９６）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７１，　１８２７７−１８２８４
【非特許文献１３】
Ｚｈｕ，　Ｃ．−Ｃ．，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｗｏｊｃｉｋｉｅｗｉｃｚ，　Ｒ．　Ｊ．　Ｈ．　（１９９９）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７４，　３４７６−３４８４
【非特許文献１４】
Ｚｈｕ，　Ｃ．−Ｃ．，　ａｎｄ　Ｗｏｊｃｉｋｉｅｗｉｃｚ，　Ｒ．　Ｊ．　Ｈ．　（２０００）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　３４８，　５５１−５５６
【非特許文献１５】
Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，　Ｍ．　Ｊ．，　Ｂｏｏｔｍａｎ，　Ｍ．　Ｄ．，　ａｎｄ　Ｌｉｐｐ，　Ｐ．　（１９９８）　Ｎａｔｕｒｅ　３９５，　６４５−６４８
【非特許文献１６】
Ｔｈｒｏｗｅｒ，　Ｅ．　Ｃ．，　Ｈａｇａｒ，　Ｒ．　Ｅ．，　ａｎｄ　Ｅｈｒｌｉｃｈ，　Ｂ．　Ｅ．　（２００１）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｓｃｉ．　２２，　５８０−５８６
【非特許文献１７】
Ｍａｃｋｒｉｌｌ，　Ｊ．　Ｊ．　（１９９９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　３３７，　３４５−３６１
【非特許文献１８】
Ｐａｔｅｌ，　Ｓ．，　Ｍｏｒｒｉｓ，　Ｓ．　Ａ．，　Ａｄｋｉｎｓ，　Ｃ．　Ｅ．，　Ｏ’ｂｅｉｒｎｅ，　Ｇ．，　ａｎｄ　Ｔａｙｌｏｒ，　Ｃ．　Ｗ．（１９９７）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９４，　１１６２７−１１６３２
【非特許文献１９】
Ｍｉｃｈｉｋａｗａ，　Ｔ．，　Ｈｉｒｏｔａ，　Ｊ．，　Ｋａｗａｎｏ，　Ｓ．，　Ｈｉｒａｏｋａ，　Ｍ．，　Ｙａｍａｄａ，　Ｍ．，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９９９）　Ｎｅｕｒｏｎ　２３，　７９９−８０８
【非特許文献２０】
Ｃａｍｅｒｏｎ，　Ａ．　Ｍ．，　Ｓｔｅｉｎｅｒ，　Ｊ．　Ｐ．，　Ｓａｂａｔｉｎｉ，　Ｄ．　Ｍ．，　Ｋａｐｌｉｎ，　Ａ．　Ｉ．，　Ｗａｌｅｎｓｋｙ，　Ｌ．　Ｄ．，　ａｎｄ　Ｓｎｙｄｅｒ，　Ｓ．　Ｈ．　（１９９５）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９２，　１７８４−１７８８
【非特許文献２１】
Ｃａｍｅｒｏｎ，　Ａ．　Ｍ．，　Ｎｕｃｉｆｏｒａ，　Ｆ．　Ｃ．，　Ｊｒ，　Ｆｕｎｇ，　Ｅ．　Ｔ．，　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，　Ｄ．　Ｊ．，　Ａｌｄａｐｅ，　Ｒ．　Ａ．，　Ｒｏｓｓ，　Ｃ．　Ａ．，　ａｎｄ　Ｓｎｙｄｅｒ，　Ｓ．　Ｈ．　（１９９７）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７２，　２７５８２−２７５８８
【非特許文献２２】
Ｄａｒｇａｎ，　Ｓ．　Ｌ．，　Ｌｅａ，　Ｅ．　Ｊ．　Ａ．，　ａｎｄ　Ｄａｗｓｏｎ，　Ａ．　Ｐ．　（２００２）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　３６１，　４０１−４０７
【非特許文献２３】
Ｂｕｌｔｙｎｃｋ，　Ｇ．，　Ｄｅ　Ｓｍｅｔ，　Ｐ．，　Ｗｅｉｄｅｍａ，　Ａ．　Ｆ．，　Ｖｅｒ　Ｈｅｙｅｎ，　Ｍ．，　Ｍａｅｓ，　Ｋ．，　Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，　Ｇ．，　Ｍｉｓｓｉａｅｎ，　Ｌ．，　Ｐａｒｙｓ，　Ｊ．　Ｂ．，　ａｎｄ　Ｄｅ　Ｓｍｅｄｔ，　Ｈ．　（２０００）　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　５２５，　６８１−６９３
【非特許文献２４】
Ｂｕｌｔｙｎｃｋ，　Ｇ．，　Ｄｅ　Ｓｍｅｔ，　Ｐ．，　Ｒｏｓｓｉ，　Ｄ．，　Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，　Ｇ．，　Ｍｉｓｓｉａｅｎ，　Ｌ．，　Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ，　Ｖ．，　Ｄｅ　Ｓｍｅｄｔ，　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｐａｒｙｓ，　Ｊ．　Ｂ．　（２００１）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　３５４，　４１３−４２２
【非特許文献２５】
Ｃａｍｅｒｏｎ，　Ａ．　Ｍ．，　Ｓｔｅｉｎｅｒ，　Ｊ．　Ｐ．，　Ｒｏｓｋａｍｓ，　Ａ．　Ｊ．，　Ａｌｉ，　Ｓ．　Ｍ．，　Ｒｏｎｎｅｔｔ，　Ｇ．　Ｖ．，　ａｎｄ　Ｓｎｙｄｅｒ，　Ｓ．　Ｈ．　（１９９５）　Ｃｅｌｌ　８３，　４６３−４７２
【非特許文献２６】
Ｊｏｓｅｐｈ，　Ｓ．　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｓａｍａｎｔａ，　Ｓ．　（１９９３）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６８，　６４７７−６４８６
【非特許文献２７】
Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎ，　Ｌ．　Ｙ．　Ｗ．，　Ｊｉｎ，　Ｈ．，　Ｉｉｄａ，　Ｎ．，　Ｂｒａｎｄｔ，　Ｎ．　Ｒ．，　ａｎｄ　Ｚｈａｎｇ，　Ｓ．　Ｈ．　（１９９３）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６８，　７２９０−７２９７
【非特許文献２８】
Ｈａｙａｓｈｉ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｓｕ，　Ｔ．−Ｐ．　（２００１）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９８，　４９１−４９６
【非特許文献２９】
Ｙｏｏ，　Ｓ．　Ｈ．，　Ｓｏ，　Ｓ．　Ｈ．，　Ｋｗｅｏｎ，　Ｈ．　Ｓ．，　Ｌｅｅ，　Ｊ．　Ｓ．，　Ｋａｎｇ，　Ｍ．　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｊｅｏｎ，　Ｃ．　Ｊ．　（２０００）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　１２５５３−１２５５９
【非特許文献３０】
Ｙｏｏ，　Ｓ．　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｊｅｏｎ，　Ｃ．　Ｊ．　（２０００）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　１５０６７−１５０７３
【非特許文献３１】
Ｔｈｒｏｗｅｒ，　Ｅ．　Ｃ．，　Ｐａｒｋ，　Ｈ．　Ｙ．，　Ｓｏ，　Ｓ．　Ｈ．，　Ｙｏｏ，　Ｓ．　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｅｈｒｌｉｃｈ，　Ｂ．　Ｅ．　（２００２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７７，　１５８０１−１５８０６
【非特許文献３２】
Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎｎ，　Ｊ．，　Ａｍｍｅｎｄｏｌａ，　Ａ．，　Ａｓｈｍａｎ，　Ｋ．，　Ｚｏｎｇ，　Ｘ．，　Ｈｕｂｅｒ，　Ａ．，　Ｎｅｕｂａｕｅｒ，　Ｇ．，　Ｗａｎｇ，　Ｇ．−Ｘ．，　Ａｌｌｅｓｃｈｅｒ，　Ｈ．−Ｄ．，　Ｋｏｒｔｈ，　Ｍ．，　Ｗｉｌｍ，　Ｍ．，　Ｈｏｆｍａｎｎ，　Ｆ．，　ａｎｄ　Ｒｕｔｈ，　Ｐ．　（２０００）　Ｎａｔｕｒｅ　４０４，　１９７−２０１
【非特許文献３３】
Ｊａｙａｒａｍａｎ，　Ｔ．，　Ｏｎｄｒｉａｓ，　Ｋ．，　Ｏｎｄｉａｓｏｖａ，　Ｅ．，　ａｎｄ　Ｍａｒｋｓ，　Ａ．　Ｒ．　（１９９６）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２，　１４９２−１４９４
【非特許文献３４】
Ｙｏｋｏｙａｍａ，　Ｋ．，　Ｓｕ，　Ｉ．，　Ｔｅｚｕｋａ，　Ｔ．，　Ｙａｓｕｄａ，　Ｔ．，　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．，　Ｔａｒａｋｈｏｖｓｋｙ，　Ａ．，　ａｎｄ　Ｙａｍａｍｏｔｏ，　Ｔ．　（２００２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　２１，　８３−９２
【非特許文献３５】
Ｙａｎｇ，　Ｊ．，　ＭｃＢｒｉｄｅ，　Ｓ．，　Ｍａｋ，　Ｄ．−Ｏ．　Ｄ．，　Ｖａｒｄｉ，　Ｎ．，　Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ，　Ｋ．，　Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ，　Ｆ．，　ａｎｄ　Ｆｏｓｋｅｔｔ，　Ｊ．　Ｋ．　（２００２）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９９，　７７１１−７７１６
【非特許文献３６】
Ｔｕ，　Ｊ．　Ｃ．，　Ｘｉａｏ，　Ｂ．，　Ｙｕａｎ，　Ｊ．　Ｐ．，　Ｌａｎａｈａｎ，　Ａ．　Ａ．，　Ｌｅｏｆｆｅｒｔ，　Ｋ．，　Ｌｉ，　Ｍ．，　Ｌｉｎｄｅｎ，　Ｄ．　Ｊ．，　ａｎｄ　Ｗｏｒｌｅｙ，　Ｐ．　Ｆ．　（１９９８）　Ｎｅｕｒｏｎ　２１，　７１７−７２６
【非特許文献３７】
Ｄｅｌｍａｓ，　Ｐ．，　Ｗａｎａｖｅｒｂｅｃｑ，　Ｎ．，　Ａｂｏｇａｄｉｅ，　Ｆ．　Ｃ．，　Ｍｉｓｔｒｙ，　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｂｒｏｗｎ，　Ｄ．　Ａ．　（２００２）　Ｎｅｕｒｏｎ　１４，　２０９−２２０
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＩＰ３の検出および定量に有効な指示薬となる新規ＩＰ３受容体結合タンパク質を提供し、ならびにそれを用いたＩＰ３の検出および／または定量方法を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、ＩＰ３受容体結合タンパク質、特に、ＩＰ３受容体と相互作用し、かつ該相互作用がＩＰ３により制御されている分子に注目し、鋭意検討を行った。ＩＰ３Ｒ１（アミノ酸配列を配列番号７に示している）の細胞質領域の大部分に当たるＮ末端２２１７アミノ酸残基を結合させたアフィニティカラムを用いて、ＩＰ３で該カラムに結合したタンパク質を溶出することにより、新規ＩＰ３受容体結合タンパク質を同定し、ＩＲＢＩＴ（ＩＰ３Ｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｌｅａｓｅｄｗｉｔｈ　ｉｎｏｓｉｔｏｌ　１，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐａｔｅ）と命名した。ＩＲＢＩＴは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏでＩＰ３Ｒ１に結合し、その細胞内局在はＩＰ３Ｒ１とよく一致した。さらに、ＩＲＢＩＴは生理的濃度のＩＰ３によりＩＰ３Ｒ１から解離することも判った。これらの結果から、ＩＲＢＩＴはＩＰ３の指示薬として有用であると考え、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
したがって、本発明は、以下の態様：
１．　以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質、
（ａ）　　配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）　　配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜１０４番目までのアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｃ）　　配列番号１に示すアミノ酸配列またはその１〜１０４番目までのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＩＰ３受容体に結合するタンパク質
２．　上記１記載のタンパク質をコードする遺伝子、
３．　以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子、
（ａ）　　配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）　　配列番号２に示す塩基配列の１〜３１２番目までの塩基配列を含むＤＮＡ
（ｃ）　（ａ）または（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰ３受容体に結合するタンパク質をコードするＤＮＡ
４．　上記２または３記載の遺伝子を含むベクター、
５．　上記２または３記載の遺伝子に、プロモーターが機能し得る形で連結されている、上記４記載のベクター、
６．　上記２または３記載の遺伝子を、蛍光または発光タンパク質をコードする遺伝子とインフレームで連結された形で含む、上記５記載のベクター、
７．　蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＶｅｎｕｓおよびＦｌＡｓＨならびにこれらの誘導体からなる群から選択される、上記６記載のベクター、
８．　上記４〜７のいずれか１つ記載のベクターを含有する宿主細胞、
９．　哺乳動物細胞である、上記８記載の宿主細胞、
１０．　サンプル中のＩＰ３を検出するための、上記１記載のタンパク質を含むＩＰ３指示薬、
１１．　上記タンパク質が蛍光または発光タンパク質と融合されている、上記１０記載のＩＰ３指示薬、
１２．　上記タンパク質がＦＲＥＴ法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせのうちのいずれか一方の蛍光分子で標識されており、上記組合せのうちの他方の蛍光分子で標識されたＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質と組合わせてＦＲＥＴ法によりＩＰ３を検出するための、上記１１記載のＩＰ３指示薬、１３．　２つの蛍光分子からなる組合わせが、ＶｅｎｕｓとＣＦＰとの組合せ、ＹＦＰとＣＦＰとの組合せ、またはＦｌＡｓＨとＣＦＰとの組合せである、上記１２記載のＩＰ３指示薬、
１４．　上記１記載のタンパク質を特異的に認識する抗体またはその機能的フラグメント、
１５．　ウサギポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、上記１４記載の抗体およびその機能的フラグメント、
１６．　サンプル中のＩＰ３濃度を測定するための方法であって、
（ｉ）　　ＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質とＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質からなるタンパク質複合体を調製し；
（ｉｉ）　上記タンパク質複合体とサンプルを接触させ；
（ｉｉｉ）　　遊離ＩＲＢＩＴもしくはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質および／または上記複合体を定量すること；
を含む、上記方法、
１７．　上記（ｉｉｉ）における定量が、抗ＩＲＢＩＴ抗体および／または抗ＩＰ３受容体抗体を用いた免疫化学的反応系を利用して実施されることを特徴とする、上記１６記載の方法、
１８．　上記（ｉｉｉ）における定量が、ＩＲＢＩＴもしくはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質またはＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質を予め標識しておいて、該標識物に由来するシグナルを測定することにより実施されることを特徴とする、上記１６または１７記載の方法、
１９．　標識が蛍光標識である、上記１８記載の方法、
２０．　上記（ｉｉｉ）における定量が、ＦＲＥＴ法により実施されることを特徴とする、上記１６記載の方法、
２１．　ＹＦＰもしくはＶｅｎｕｓで標識したＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質と、ＣＦＰで標識したＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質とを用いることを特徴とする、上記２０記載の方法、
２２．　ＣＦＰで標識したＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質と、ＶｅｎｕｓまたはＹＦＰで標識したＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質とを用いることを特徴とする、上記２０記載の方法、
２３．　生細胞の細胞内のＩＰ３濃度を定量する方法であって、
（ｉ）　　細胞に、ＦＲＥＴ法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせのうちの一方で標識されたＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子、および上記組合せのうちの他方で標識されたＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能な形で導入して発現させ；
（ｉｉ）　該細胞を蛍光顕微鏡下で、上記の２つの蛍光分子のうち低波長側の蛍光分子の励起波長を照射して、該分子の蛍光波長と、他方の長波長側の蛍光分子の蛍光波長とを測定すること；
を含む上記方法、
２４．　ＦＲＥＴ法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせが、ＶｅｎｕｓとＣＦＰとの組合せ、ＹＦＰとＣＦＰとの組合せ、またはＦｌＡｓＨとＣＦＰとの組合せである、上記２３記載の方法、
２５．　ＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質とＩＰ３受容体またはその少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質からなる、ＩＰ３濃度を定量するためのタンパク質複合体、
２６．　ＦＲＥＴ法が可能な２つの蛍光分子からなる組合わせのうちの一方で標識されたＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子、および上記組合せのうちの他方で標識されたＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合ドメインを含有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能な形で含み、生細胞内のＩＰ３濃度を定量するためのベクター、ならびに
２７．　２つの蛍光分子からなる組合わせが、ＶｅｎｕｓとＣＦＰとの組合せ、ＹＦＰとＣＦＰとの組合せ、またはＦｌＡｓＨとＣＦＰとの組合せである、上記２６記載のベクター、に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１１】
本発明者らが新たにクローニングした新規ＩＰ３受容体タンパク質であるＩＲＢＩＴは、配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、これはＮ末端領域（アミノ酸１〜１０４）とＣ末端領域（アミノ酸１０５〜５３０）とに分けられ、Ｃ末端領域はＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼに相同性を有しているものの該酵素活性は示さず、Ｎ末端領域はＩＰ３受容体（本明細書中、ＩＰ３受容体とはＩＰ３Ｒ１およびＩＰ３受容体タイプＩＩ（ＩＰ３Ｒ２）を含むＩＰ３受容体の任意のサブタイプを指す）との結合に必須な領域である。該タンパク質の特徴としては、以下の：（１）中性タンパク質である（推定ｐＩ値：６．４８）が、Ｎ末端領域は比較的酸性である（推定ｐＩ値：４．９８）こと、（２）Ｎ末端領域に７つのリン酸化部位が集中的に局在しており、リン酸化がＩＰ３Ｒ１との相互作用に必要であると推測されること、（３）　ＩＰ３Ｒ１のＩＰ３との結合に必須である５０８番目のリジン残基がＩＲＢＩＴとの相互作用においても必須であること、（４）　ＩＰ３によりＩＰ３Ｒ１との相互作用が解離すること、および（５）高塩濃度により、ＩＰ３Ｒ１との相互作用が解離し、かつ粗ミクロソーム画分から抽出されることから、ＩＰ３Ｒ１との相互作用は静電気的結合によると推測されること：が挙げられる。
【００１２】
したがって、本発明は、ＩＲＢＩＴタンパク質、ＩＲＢＩＴのＩＰ３受容体への結合に必須な領域であるＮ末端領域（１〜１０４番目のアミノ酸）、およびこれらのアミノ酸配列を含むタンパク質を包含する。場合によっては、ＩＲＢＩＴの１〜２７７番目のアミノ酸を含むタンパク質が好ましい。さらに、これらのタンパク質の変異体であって、ＩＰ３受容体結合活性を保持したまま、１もしくは複数個のアミノ酸、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ配列を含むタンパク質もまた、本発明に包含される。
【００１３】
さらに、これらのタンパク質をコードする遺伝子も本発明に包含される。該遺伝子は、例えばＩＲＢＩＴタンパク質をコードする配列番号２に示す塩基配列、またはＩＲＢＩＴのＩＰ３受容体結合ドメインであるＮ末端領域（１〜１０４番目のアミノ酸）をコードする配列番号２に示す塩基配列の１〜３１２番目までの塩基配列を含むＤＮＡである。また、これらのＤＮＡまたはその相補鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをも含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１０ｍＭ〜３００ｍＭであり、好ましくは３７〜６５℃、より好ましくは４２℃である条件をいう。あるいは、このような条件は、ＥＣＬＴＭ　ｄｉｒｅｃｔ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いて、添付されている説明書の記載に従うことにより達成することができる。さらに、配列番号２の塩基配列またはその１〜３１２番目までの塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつＩＰ３受容体結合活性を有するタンパク質をコードするものも含む。ここで、欠失、置換または付加を受ける塩基の数は特に制限されないが、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個である。このような核酸の塩基配列としては、配列番号１に表される塩基配列との相同性が、ＢＬＡＳＴ等を用いて計算したときに（例えば、ＢＬＡＳＴのデフォルトすなわち初期条件のパラメーターを用いた場合）、７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上である。さらに、これらのＤＮＡに対応するＲＮＡ、これらのＤＮＡを含むベクター、上記ＤＮＡが発現可能なように該ＤＮＡにプロモーターが機能し得る形で連結されているベクター、および上記ＤＮＡの発現産物（ＩＲＢＩＴ分子等）を標識化するための何らかの標識物をコードするＤＮＡと上記ＤＮＡがインフレームで連結されているベクター、さらにはこれらのベクターを含有する宿主細胞（昆虫細胞、大腸菌および哺乳動物細胞が好ましいが、これらに限定はされない）も、本発明に包含される。上記標識物は、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびビオチン等の免疫学的反応またはタンパク質間結合を利用するための標識でもよく、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ＣＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＦｌＡｓＨおよびＲｅＡｓＨならびにこれらの誘導体などの蛍光または発光タンパク質であってもよいが、これらに限定されることはなく、公知のあらゆる標識物のうちの任意のものであってよい。
【００１４】
さらに、ＩＲＢＩＴはＩＰ３により選択的かつ濃度依存的に、ＩＰ３受容体から解離し得るタンパク質である。例えば、ＩＰ３受容体をＩＰ３受容体タイプＩとした場合、その上記解離に対するＥＣ５０値は約０．５μＭである。この値は従来法によるＩＰ３結合アッセイにより測定されたＩＰ３Ｒ１のＩＰ３への結合におけるＫｄ値（Ｋｄ＝８３〜１００　ｎＭ：６０，　６１）より高いが、この差は、ＩＰ３のＩＰ３受容体への結合親和性はｐＨおよびイオン強度に大きく依存していることから（６２−６４）、おそらくバッファー条件が異なる（該アッセイでは、ｐＨ８．０〜８．３、低イオン強度の条件で測定している）ことに起因するのではないかと考えられる。従来法とは異なる表面プラズモンレゾナンスバイオセンサーによる研究では、ＩＰ３Ｒ１のＮ末端領域（アミノ酸１〜６０４）について生理的条件下（ｐＨ７．４、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ）で測定するとＫｄ値は３３６　ｎＭであり（６４）、これは従来法によるＫｄ値と比較して親和性が約７．５倍低いことを示す。この値は、ＩＲＢＩＴのＩＰ３Ｒ１（本発明においては、実験の利便性のためにＧＳＴ融合タンパク質を用いており、これをＧＳＴ−ＥＬと本明細書中では呼ぶ）との相互作用の解離におけるＥＣ５０値（約０．５　μＭ：ｐＨ７．４、１００　ｍＭ　ＮａＣｌ下で測定）に近い。以上のことから、ＩＲＢＩＴはＩＰ３受容体にＩＰ３が結合することによりＩＰ３受容体と解離すると考えられる。これを支持するデータとして、Ｌｕｚｚｉらが検出細胞／キャピラリー電気泳動システムを用いて測定した結果によると、ＩＰ３の細胞内濃度は、刺激前は数十ｎＭであり刺激後は数μＭに上昇するとされている（５０）。上述のとおりＩＰ３Ｒ１からのＩＲＢＩＴの解離に対するＩＰ３のＥＣ５０値が約０．５μＭであり、この値は、刺激前と刺激後の細胞内ＩＰ３濃度の変化範囲に含まれており、ＩＲＢＩＴは細胞外刺激により誘導されるＩＰ３産生後にＩＰ３受容体から解離することが強く示唆される。
【００１５】
ＩＰ３により濃度依存的にＩＰ３受容体から解離するというＩＲＢＩＴの特性によって、ＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを少なくとも含有するタンパク質を新規ＩＰ３指示薬として利用できる。すなわち、例えばＩＲＢＩＴを用いる場合、対象とするサンプルを、ＩＲＢＩＴ−ＩＰ３受容体複合体（この際のＩＰ３受容体は完全な分子である必要はなく、ＩＰ３とＩＲＢＩＴの両方が結合できる領域を少なくとも含むフラグメント（以下、ＩＰ３ＢＤと称する）でよい）と接触させて、ＩＰ３受容体から解離したＩＲＢＩＴの量を定量するか、逆にＩＰ３との接触後に残存するＩＲＢＩＴ−ＩＰ３受容体／ＩＰ３ＢＤ複合体を定量することにより、ＩＰ３の定量的検出が可能となる。ＩＲＢＩＴのＩＰ３受容体結合ドメインを少なくとも含有するタンパク質を用いた場合も同様である。
【００１６】
遊離ＩＲＢＩＴまたはＩＲＢＩＴ−ＩＰ３受容体複合体の定量的検出は、免疫学的手法によっても可能である。
【００１７】
本明細書において「抗体」という用語は、完全な抗体分子およびその完全な抗体に由来する抗原結合能を保持しているフラグメント、およびこれらの誘導体を含む。ＩＲＢＩＴに対する抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体であってよく、いずれの場合も、ＩＲＢＩＴ分子またはその一部のペプチドを動物に免疫することによる一般的な方法で取得できる。これらの抗体分子を精製する方法、およびＩＲＢＩＴに対する結合性を有する抗体の断片に切断してこれを精製する方法もまた当業者には公知であり、所望により適切な方法を選択することができる。これらの抗体分子を用いて、遊離ＩＲＢＩＴを検出することは、当業者であれば容易に達成し得る。また、該抗体分子を用いてＩＲＢＩＴ−ＩＰ３受容体／ＩＰ３ＢＤ複合体を検出する方法も、当業者であれば容易に達成し得る。例えば、ＩＰ３Ｒ１を予め固相支持体（ビーズ、またはアッセイプレート表面等）に結合させておき、ＩＰ３Ｒ１を介して固相に結合しているＩＲＢＩＴを検出するとよい。
【００１８】
さらに、ＩＲＢＩＴを適切な分子で標識化し、該標識を検出することにより遊離ＩＲＢＩＴまたはＩＲＢＩＴ−ＩＰ３受容体／ＩＰ３ＢＤの定量的検出が可能である。標識は、放射性標識、免疫標識、色素標識、蛍光標識または発光標識等、タンパク質の標識物として公知である標識分子のうち任意のものを該標識分子に応じた公知の方法でＩＲＢＩＴ分子に結合させることにより達成できる。また、使用する標識によって、その標識に由来するシグナルを検出することは、当業者であれば公知技術に基づいて容易に達成できる。
【００１９】
まず、ＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを少なくとも含むタンパク質とＩＰ３受容体またはＩＰ３ＢＤからなる複合体（ＩＲＢＩＴ−ＩＰ３受容体／ＩＰ３ＢＤ複合体と称する）を調製する。ＩＲＢＩＴは細胞内でＩＰ３受容体と複合体を形成するため、ＩＰ３受容体を発現する天然の細胞（小脳神経細胞等）から精製することもできるが、ＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合ドメインを少なくとも含むタンパク質とＩＰ３受容体分子またはＩＰ３ＢＤを含むタンパク質を強制発現させた細胞（大腸菌またはＳｆ９細胞等）から、生化学的分画法によりミクロソーム画分を分画してもよい。あるいは、分子標識物（ヒスチジンタグ等）が付いた形で上記タンパク質を強制発現させて、細胞溶解液から標識物を利用して抽出することもできる。場合によっては、その他公知の精製法（カラムクロマトグラフィーなど）を用いてもよい。
【００２０】
さらに、ＩＲＢＩＴとＩＰ３ＢＤを別々にそれぞれ調製し、複合体を形成させることも可能である。すなわち、例えば、ＧＳＴ−ＩＰ３ＢＤを大腸菌で発現させてグルタチオン−セファロースで精製し、ＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合領域を含むタンパク質を大腸菌またはＳｆ９細胞で発現させる。該ＩＲＢＩＴまたはそのＩＰ３受容体結合領域を含むタンパク質をＧＳＴ−ＩＰ３ＢＤと接触させることにより複合体を形成させ、グルタチオン−セファロースでプルダウンすることにより該複合体を精製できる。あるいはまた、小脳高塩抽出画分などより、組織中のＩＲＢＩＴをＧＳＴ−ＩＰ３ＢＤとグルタチオン−セファロースでプルダウンすることにより上記複合体を調製してもよい。
【００２１】
調製したＩＲＢＩＴ−ＩＰ３受容体／ＩＰ３ＢＤ複合体（１〜１００μＭ程度に１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、１００　ｍＭ　ＮａＣｌ、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　２−ＭＥ、ｐＨ７．４中にて調製する）にＩＰ３を含むサンプルを接触させて、５〜３０分程度氷上でインキュベートした後、該溶液中に存在する遊離ＩＲＢＩＴまたは残存するＩＲＢＩＴ−ＩＰ３受容体／ＩＰ３ＢＤ複合体を検出する。反応に用いるＩＲＢＩＴ−ＩＰ３受容体／ＩＰ３ＢＤ複合体を予め固相担体に結合させておき、反応後固相担体を液相から分離して液相中の遊離ＩＲＢＩＴを検出するか、または固相担体に結合しているＩＲＢＩＴ−ＩＰ３受容体／ＩＰ３ＢＤ複合体中のＩＲＢＩＴを検出することもできる。ＩＲＢＩＴの検出は、ＩＲＢＩＴを認識する抗体を用いて免疫学的反応系により行ってもよく、また標識化ＩＲＢＩＴを用いた場合には該標識を検出することで行ってもよい。
【００２２】
さらに、本発明の１実施形態では、蛍光のエネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ，　ＦＲＥＴ）を利用した方法により、ＩＰ３を定量することも可能である。
【００２３】
蛍光のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）とは、２つの蛍光団が互いに近距離で適切な位置関係にある時に、一方の蛍光団（エネルギー供与体（ｄｏｎｏｒ））から、もう一つのより長波長側の蛍光団（エネルギー受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ））へ励起エネルギーが移動する現象である。２つの分子を特定の２種の蛍光分子で標識することにより、その２つの分子間の相互作用の変化をＦＲＥＴ効率の変化として測定することができる。また、分子間の相互作用を制御する別の分子の濃度変化を測定することも可能となる。
【００２４】
ＦＲＥＴ法により、細胞内Ｃａ２＋濃度変化の検出法（７２）またはｃＡＭＰ濃度変化の検出法（７１）等が開発されている。
【００２５】
ＩＲＢＩＴはＩＰ３受容体のＩＰ３ＢＤに結合しており、ＩＰ３によりＩＰ３受容体から解離する。この性質を利用し、ＩＲＢＩＴとＩＰ３ＢＤを各々ＦＲＥＴが可能な２種の蛍光標識からなる組合わせのそれぞれで標識することにより、ｉｎ　ｖｉｔｒｏあるいは細胞内でのＩＰ３濃度変化を検出することができる。すなわち、例えば、ＩＲＢＩＴを例えば黄色蛍光タンパク質　（ＹＦＰ）またはその改良体であるＶｅｎｕｓで標識し、ＩＰ３ＢＤをシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）で標識する。ＩＰ３非存在下ではＩＲＢＩＴはＩＰ３ＢＤに結合しておりＣＦＰからＶｅｎｕｓにＦＲＥＴが起こるが、ＩＰ３存在下では両者は解離し、ＦＲＥＴが起こらなくなる。さらにＶｅｎｕｓ−ＩＲＢＩＴとＣＦＰ−ＩＰ３ＢＤをリンカー配列を介して結合させる（Ｖｅｎｕｓ−ＩＲＢＩＴ−ＩＰ３ＢＤ−ＣＦＰ）と両者のモル比が等しくなり、効率的である。ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＩＰ３濃度を測定する場合は、細胞の抽出液などにＶｅｎｕｓ−ＩＲＢＩＴ−ＩＰ３ＢＤ−ＣＦＰタンパク質を加え、ＦＲＥＴを測定する。また、Ｖｅｎｕｓ−ＩＲＢＩＴ−ＩＰ３ＢＤ−ＣＦＰの遺伝子を細胞内に導入させれば、生きた細胞内のＩＰ３濃度変化を時間空間的に解析することができる。ＦＲＥＴ法の測定は、蛍光顕微鏡または蛍光計等で測定することができる。
【００２６】
ＦＲＥＴ法によるＩＰ３検出法の例をさらに詳細に以下に記載する。
まず、Ｖｅｎｕｓ−ＩＲＢＩＴ−ＩＰ３ＢＤ−ＣＦＰ発現ベクターを作成する。ＩＲＢＩＴ全長またはＩＰ３ＢＤとの結合に必要十分な領域を含むその欠失変異体（例えば、アミノ酸１〜１０４またはアミノ酸１〜２７７からなる変異体）、マウスＩＰ３受容体タイプＩのＩＰ３結合領域（配列番号７のアミノ酸２２４〜６０４からなる領域）を含むタンパク質、ＶｅｎｕｓおよびＣＦＰの４つのｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、フレームが合うように哺乳動物細胞発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３など）に挿入する。順番は、例えばＶｅｎｕｓ−ＩＲＢＩＴ−ＩＰ３ＢＤ−ＣＦＰのように内側２つにＩＲＢＩＴとＩＰ３ＢＤ、外側２つにＶｅｎｕｓとＣＦＰというようにすれば、特に制約はない。リコンビナントタンパク質調製用には、大腸菌発現用ベクター（ｐＥＴなど）あるいはＳｆ９発現用ベクター（ｐＦａｓｔＢａｃなど）に挿入する。この場合は精製用にタグ（Ｈｉｓタグなど）をＮ末端あるいはＣ末端に付加する。
【００２７】
Ｖｅｎｕｓ−ＩＲＢＩＴ−ＩＰ３ＢＤ−ＣＦＰを大腸菌あるいはＳｆ９細胞で発現させ、Ｈｉｓタグを付けた場合はＰｒｏＢｏｎｄ　ｒｅｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）などで精製する。場合によってはイオン交換カラム、ゲルろ過カラムで精製してもよい。
【００２８】
精製したＶｅｎｕｓ−ＩＲＢＩＴ−ＩＰ３ＢＤ−ＣＦＰタンパク質に、濃度の分かっているＩＰ３溶液を添加し、ＣＦＰの励起波長（４４０　ｎｍ付近）をあて、ＣＦＰの蛍光波長（４８０　ｎｍ付近、ＣＦＰ蛍光）と、Ｖｅｎｕｓの蛍光波長（５３５　ｎｍ付近、ＦＲＥＴ蛍光）を測定する。ＩＰ３濃度とＦＲＥＴ蛍光／ＣＦＰ蛍光比をプロットすることにより、検量線を決定する。ＩＰ３濃度が未知のサンプル（細胞抽出液など）にＶｅｎｕｓ−ＩＲＢＩＴ−ＩＰ３ＢＤ−ＣＦＰタンパク質を添加し、ＦＲＥＴ蛍光／ＣＦＰ蛍光比を求め、検量線と比較することにより、ＩＰ３濃度を定量する。
【００２９】
生細胞中のＩＰ３濃度もまた、ＦＲＥＴ法により測定できる。まず、ｐｃＤＮＡ−Ｖｅｎｕｓ−ＩＲＢＩＴ−ＩＰ３ＢＤ−ＣＦＰを培養細胞（Ｃｏｓ−７、ＨｅＬａなど）に遺伝子導入試薬（Ｔｒａｎｓ　ＩＴ　（Ｍｉｒｕｓ）など）で遺伝子導入する。遺伝子導入してから１〜３日後のグラスボトムディッシュ上の細胞を冷却ＣＣＤカメラ付き倒立型蛍光顕微鏡（ＩＸ７１　（Ｏｌｙｍｐｕｓ）など）で観察する。ＣＦＰの励起波長（４４０　ｎｍ付近）をあて、ＣＦＰの蛍光波長（４８０　ｎｍ付近、ＣＦＰ蛍光）と、Ｖｅｎｕｓの蛍光波長（５３５　ｎｍ付近、ＦＲＥＴ蛍光）を測定する。両者の蛍光強度の比をとることによりＦＲＥＴ効率を定量する。ＩＰ３を産生するアゴニスト（Ｃｏｓ−７の場合はＡＴＰ、ＨｅＬａの場合はヒスタミンなど）をグラスボトムディッシュに添加し、ＦＲＥＴ効率を経時的に測定する。アゴニストによりＩＰ３が産生されれば、ＦＲＥＴ／ＣＦＰの比が低下することが期待される。
【００３０】
上記にＶｅｎｕｓとＣＦＰの組合せの蛍光標識を用いた場合について例示的に述べたが、この組み合わせは、ＹＦＰとＣＦＰまたはＦｌＡｓＨとＣＦＰでも可能であり、またこれらに限定されない。さらに、ＦＲＥＴ法に用いるための蛍光分子は今後種々のものが開発されるであろうと予測されるが、それらもまた本発明の実施に使用可能であろう。
【００３１】
また、本発明のＩＰ３検出方法に使用するための本発明のＩＰ３指示薬またはＩＰ３検出用キットもまた、本発明に包含される。該指示薬またはキットには、ＩＲＢＩＴの少なくともＩＰ３受容体結合領域を含むタンパク質またはこれをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡが含まれている。場合によっては、ＩＰ３受容体の少なくともＩＰ３結合領域を含むタンパク質またはコードするＤＮＡもしくはＲＮＡを含む。さらに、標識試薬（蛍光標識化合物等）および／または上記タンパク質を認識する抗体を含んでいてもよい。
【００３２】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【００３３】
方法
ＩＰ３Ｒ１アフィニティカラムの作製
マウスＩＰ３Ｒ１のＮ末端領域（アミノ酸１〜２２５）をコードするｃＤＮＡをグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ベクターｐＧＥＸ−ＫＧに挿入した（４０）。該ＧＳＴ−ＩＲ３Ｒ１（１−２２５）断片をバキュロウイルストランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。該ＧＳＴ−ＩＲ３Ｒ１（１−２２５）のＳｍａＩ部位より下流の領域を、マウスＩＰ３Ｒ１（アミノ酸７９〜２２１７に相当）のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片で置き換え、ＧＳＴ−ＩＰ３Ｒ１（１−２２１７）ベクター（ＧＳＴ−ＥＬと命名した）を構築した。コントロールとしてＧＳＴのみをコードする断片をｐＢｌｕｅＢａｃ４．５にサブクローニングした。Ｓｆ９細胞は２７℃で１０％ウシ胎仔血清を添加したＴＮＭ−ＦＨ培地で培養した。ＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴ遺伝子を持つ組換えバキュロウイルスをＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（商標）トランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付の説明書にしたがって作製した。感染多重度５で組換えバキュロウイルスを感染させて４８時間インキュベートすることにより、ＧＳＴ−ＥＬおよびＧＳＴを２×１０８個のＳｆ９細胞で発現させた。細胞を回収後−８０℃で保存した。凍結保存しておいた細胞を１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ　７．４）、１００　ｍＭ　ＮａＣｌ、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、およびプロテアーゼインヒビター（１　ｍＭ　フェニルメチルスフホニルフロライド（ＰＭＳＦ）、１０　μＭ　ロイペプチン、２　μＭ　ペプスタチンＡ　および１０　μＭ　Ｅ−６４）に懸濁し、ガラステフロンホモジナイザーでホモジナイズした（１０００　ｒｐｍ、１０ストローク）。ホモジネートを２０，０００ｘ　ｇで　３０分遠心し、上清を　３　ｍｌのグルタチオン−セファロース　４Ｂ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に３時間　４℃でインキュベートした。４０　ｍｌの１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ　７．４）、２５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　２−ＭＥおよび０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で８回洗浄後、グルタチオン−セファロースに結合した　ＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴをカラムに充填して１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ　７．４）、１００　ｍＭ　ＮａＣｌ、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　２−ＭＥおよび０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で平衡化した。約５ｍｇのＧＳＴ−ＥＬを固定化した。
【００３４】
ＩＲＢＩＴの精製および部分アミノ酸配列決定
成熟ラット小脳（約５ｇ）をホモジナイズバッファー（１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ　７．４）、２０　ｍＭ　ショ糖、　２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　２−ＭＥ、およびプロテアーゼインヒビター）４５ｍｌ中でガラステフロンホモジナイザーでホモジナイズした（９５０　ｒｐｍ、１０　ストローク）。ホモジネートを１，０００　ｘ　ｇで１０分間遠心し、上清（Ｓ１画分）をさらに１００，０００　ｘ　ｇで６０分間遠心して、細胞質画分（上清）と粗ミクロソーム画分（ペレット）とを得た。粗ミクロソーム画分を、５００　ｍＭ　ＮａＣｌを含むホモジナイズバッファー２５ｍｌ中でガラステフロンホモジナイザーでホモジナイズし（１，２００　ｒｐｍ、１０　ストローク）、１５分氷上でインキュベート後、１００，０００　ｘ　ｇで６０分間遠心して高塩抽出画分（上清）と高塩抽出後粗ミクロソーム画分（ペレット）とを得た。高塩抽出画分を希釈バッファー（１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ　７．４）、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　２−ＭＥ、　０．０１％　Ｂｒｉｊ　３５、およびプロテアーゼインヒビター）で５倍希釈し、希釈した高塩抽出画分をグルタチオン−セファロースで前処理した後、結合バッファー　（１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ　７．４）、１００　ｍＭ　ＮａＣｌ、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、および１　ｍＭ　２−ＭＥ）で平衡化しておいたＧＳＴ−ＥＬ　アフィニティカラムに添加した。コントロールとしてＧＳＴカラムを用いた。カラム容量の２０倍の結合バッファーにてカラムを洗浄した後、５０　μＭ　ＩＰ３　（Ｄｏｊｉｎｄｏ）と０．０５％　Ｂｒｉｊ　３５とを含む結合バッファーでカラムに結合しているタンパク質を溶出させた。溶出液を濃縮して、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離してクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した。約６０ｋＤａの位置にあるタンパク質のバンドをゲルから切り出し、公知の方法（４１）に従いリジルエンドペプチドチダーゼ（Ｗａｋｏ）で切断した。切断したペプチドをＳＭＡＲＴシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）につないだＣ−１８　逆相カラム（μＲＰＣ　Ｃ２／Ｃ１８　ＳＣ　２．１／１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で分離した。各ペプチドのアミノ酸配列を４９４　ｐｒｏｃｉｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で配列決定したところ、２つのペプチド配列、Ｎ−ＹＳＦＭＡＴＶＴＫ−Ｃ（配列番号３）およびＮ−ＱＩＱＦＡＤＤＭＱＥＦＴＫ−Ｃ（配列番号４）が得られた。
【００３５】
ＩＲＢＩＴのｃＤＮＡクローニング
上記６０ｋＤａのタンパク質から得られた上記２つのペプチド配列を非重複データベース（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ　ｄａｔａｂａｓｅ）についてＢＬＡＳＴ検索したところ、これらの配列は、データベース中の１つの配列（登録番号　ＣＡＣ０９２８５）にマッチした。マウス発現配列タグのデータベース（登録番号ＡＷ２２９８７０およびＢＥ２８２１７０）に基づいて、該ｃＤＮＡに相同的なプライマー（５’−ＡＴＧＴＣＧＡＴＧＣＣＴＧＡＣＧＣＧＡＴＧＣ−３’（配列番号５）および５’−ＧＣＧＴＧＧＴＴＣＡＴＧＴＧＧＡＣＴＧＧＴＣ−３’（配列番号６））を合成した。ＩＲＢＩＴのｃＤＮＡを、ｏｌｉｇｏｄＴ−プライマーを用いて合成したマウス小脳第１鎖ｃＤＮＡをテンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にて増幅させた。ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（＋）　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングして配列決定した。３つの独立クローンの配列を確認した。
【００３６】
組換えタンパク質の調製
ＩＲＢＩＴの全長およびＮ末端（アミノ酸１〜１０４）をコードするｃＤＮＡを、大腸菌ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）　融合ベクターｐＥＴ−２３ａ（＋）　（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングして、各々ＩＲＢＩＴ−ＨｉｓおよびＩＲＢＩＴ（１−１０４）−Ｈｉｓ　発現ベクターを作製した。同じｃＤＮＡをＧＳＴ融合ベクター　ｐＧＥＸ−４Ｔ−１　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）　にサブクローニングし、各々ＧＳＴ−ＩＲＢＩＴおよびＧＳＴ−ＩＲＢＩＴ（１−１０４）　発現ベクターを作製した。マウスＩＰ３Ｒ１のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸１〜２２５、１〜３４３、３４１〜９２３、６００〜１２４８、９１６〜１５８１および１５５３〜１９４３をコードするｃＤＮＡ断片を　ｐＧＥＸ−ＫＧに挿入して、各々ＧＳＴ−Ｉａ、ＧＳＴ−Ｉａｂ、ＧＳＴ−ＩＩａｂ、　ＧＳＴ−ＩＩｂＩＩＩａ、ＧＳＴ−ＩＩＩａｂおよびＧＳＴ−ＩＶ発現ベクターとした。マウスＩＰ３Ｒ１のアミノ酸１５９３〜２２１７をｐＧＥＸ−４Ｔ−１に挿入してＧＳＴ−ＩＶ−Ｖａ発現ベクターを得た。これらの融合タンパク質を大腸菌で発現させた。ＧＳＴ−ＥＬは、上記のようにしてＳｆ９　細胞で発現させた。発現されたＨｉｓ−タグ融合タンパク質はＰｒｏＢｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製し、ＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオン−セファロースで精製した。ＧＳＴ−ＩｂＩＩａ（マウスＩＰ３Ｒ１のアミノ酸２２４〜６０４）とその部位特異的突然変異Ｋ５０８ＡおよびＲ４４１Ｑは既に公知であるものを用いた（引用文献４２参照のこと、ＧＳＴ−ＩｂＩＩａは該文献中Ｇ２２４と称されている）。
【００３７】
酵素活性測定
Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼの加水分解方向への活性を測定するために、公知の方法に（４３）したがって、精製したＩＲＢＩＴ−Ｈｉｓ（３．０　μｇ）、ＧＳＴ−ＩＲＢＩＴ（４．３　μｇ）、ＧＳＴ（１．３　μｇ）およウサギＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（Ｓｉｇｍａ）　（２．４　μｇ）を用いて、生成産物（ホモシステイン）と５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（Ｓｉｇｍａ）との反応による発色を光学的に測定した。　４１２　ｎｍでの吸光度を、ＤＵ　６４０分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ）にて０、５、２０および６０分後に測定した。３回の独立した実験結果を平均　±　標準偏差で示した（図２）。
【００３８】
アフィニティ精製用抗ＩＲＢＩＴ抗体の作製
ニホンシロウサギに、精製ＩＲＢＩＴ（１−１０４）−Ｈｉｓを、完全フロイントアジュバントと共に１４日間隔で皮下注射して免疫した。抗ＩＲＢＩＴ抗血清を、シアノジェンブロマイド−活性化セファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に共有結合させたＧＳＴ−ＩＲＢＩＴ（１−１０４）に通し、該カラムに特異的に結合した抗体を１００　ｍＭ　グリシン−ＨＣｌ　（ｐＨ　２．５）で溶出した。
【００３９】
細胞画分の調製およびイムノブロッティング
大脳、小脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、胸腺、脾臓、精巣および卵巣を、成熟マウスより摘出してＳ１画分を上記方法により得た。マウス小脳の細胞質画分、粗ミクロソーム画分、高塩抽出画分、および高塩抽出後粗ミクロソーム画分を、上記と同様の方法により得た。図に示す量のタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写した。ブロッキングした後に、該膜を抗ＩＲＢＩＴ抗体（１　μｇ／ｍｌ）で室温にて１時間インキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）でブロットした。免疫反応したバンドを、増幅化学発光検出システム（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で検出した。
【００４０】
ほ乳細胞発現ベクターの作製とトランスフェクション
全長ＩＲＢＩＴをコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。全長ＩＲＢＩＴまたはその欠失変異体（アミノ酸１〜２７７、１〜１０４、および１０５〜５３０）をコードするｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｃ１　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングして、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質発現ベクターを作製した。マウスＩＰ３Ｒ１発現ベクターｐＢａｃｔ−ＳＴｎｅｏＢ−Ｃ１は既に公開されているものを用いた（４４）。Ｃｏｓ−７細胞を１０％ウシ胎仔血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で３７℃にて培養した。ＴｒａｎｓＩＴ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔｓ　（Ｍｉｒｕｓ）を用いて、添付の説明書にしたがって、一過性遺伝子導入を行った。遺伝子導入してから２日後の細胞をイムノブロッティング、プルダウン実験、または免疫染色に用いた。
【００４１】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ結合実験
マウス小脳細胞質画分を１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ　７．４）、　２００　ｍＭ　ＮａＣｌ、　２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　２−ＭＥ　および０．０２％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で２倍希釈した。高塩抽出画分は、１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ　７．４）、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　２−ＭＥおよび０．０１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で５倍希釈した。希釈した画分を（両画分ともＮａＣｌ最終濃度は１００　ｍＭ）を２０　μｇのＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴと４℃にて２時間インキュベートした。１０　μｌのグルタチオン−セファロースを添加してさらに２時間インキュベートし、該樹脂を洗浄バッファー（１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ　７．４）、１００　ｍＭ　ＮａＣｌ、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　２−ＭＥ、ａｎｄ　０．０１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）で５回洗浄した後、結合したタンパク質を２０ｍＭのグルタチオンで溶出させた。溶出したタンパク質は抗ＩＲＢＩＴ抗体によるウェスタンブロットにより解析した。
【００４２】
脱リン酸化のためには、希釈した高塩抽出画分を大腸菌アルカリホスファターゼ（Ｔｏｙｏｂｏ）の存在下または非存在下のいずれかで２　ｍＭ　ＭｇＣｌ２と共に３７℃にて３０分インキュベート後、５　ｍＭのＥＤＴＡを添加して、上述のとおりプルダウンアッセイに供した。
【００４３】
解離実験には、希釈した高塩抽出画分中のＩＲＢＩＴをＧＳＴ−ＥＬを用いて、上述のとおりプルダウンにより沈降させて洗浄の後、ＩＰ３、イノシトール４，５−二リン酸（ＩＰ２）　（Ｄｏｊｉｎｄｏ）、イノシトール１，３，４，５−四リン酸（ＩＰ４）　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、イノシトール１，２，３，４，５，６−六リン酸（ＩＰ６）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）またはＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）　（各０．１、０．３、１、３または１０　μＭ）を含む洗浄バッファー１００μｌを、樹脂に添加した。氷上で１０分間インキュベートした後、サンプルを１０，０００　ｒｐｍで１分間遠心し、その上清を抗ＩＲＢＩＴ抗体またはヤギ抗ＧＳＴ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）によるイムノブロットに供した。定量化のために、Ａｌｅｘａ　６８０−結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を二次抗体として用いた。ＩＲＢＩＴの免疫反応性のバンドの蛍光強度は、Ｏｄｙｓｓｅｙ　ｉｎｆｒａｒｅｄ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｌｏｋａ）で測定した。定量データ（少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤ）は、１０μＭの　ＩＰ３溶出物中のＩＲＢＩＴの量に対する比率で示した。
【００４４】
ＩＰ３Ｒ１のＩＲＢＩＴ結合領域およびＩＲＢＩＴ結合に必要なアミノ酸残基を特定するために、希釈した高塩抽出画分を１００　ｐｍｏｌ　のＧＳＴ、ＧＳＴ−ＥＬ、ＧＳＴ−Ｉａ、ＧＳＴ−Ｉａｂ、　ＧＳＴ−ＩｂＩＩａ、　ＧＳＴ−ＩＩａｂ、ＧＳＴ−ＩＩｂＩＩＩａ、ＧＳＴ−ＩＩＩａｂ、ＧＳＴ−ＩＶ、ＧＳＴ−ＩＶ−Ｖａ、Ｋ５０８ＡまたはＲ４４１Ｑを用いて上述のとおりプルダウンアッセイに供し、抗ＩＲＢＩＴ抗体にてウェスタンブロッティングにより解析した。
【００４５】
ＩＲＢＩＴのＩＰ３Ｒ１−結合領域の同定は、ＧＦＰ−タグ付き全長ＩＲＢＩＴまたはこれの末端欠失型変異体を発現するＣｏｓ−７細胞を溶解バッファー（１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ７．４）、１００　ｍＭ　ＮａＣｌ、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　２−ＭＥ、０．５％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０、およびプロテアーゼインヒビター）で４℃にて３０分間溶解させて遠心した（１００，０００　ｘ　ｇ、　３０分）。上清を、ＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴで上述のとおりプルダウンアッセイに供し、結合したタンパク質を抗ＧＦＰ抗体（Ｍｅｄｉｃａｌ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でイムノブロット解析に供した。
【００４６】
間接的免疫蛍光法および共焦点顕微鏡法
遺伝子導入したＣｏｓ−７細胞をガラスカバースリップ上で培養して、生理的リン酸バッファー（ＰＢＳ）で１度洗浄して４％　ホルムアルデヒド含有　ＰＢＳで１５分間固定化し、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００含有ＰＢＳで５分間、膜透過処理した後、２％のヤギ血清を含むＰＢＳで室温にて６０分間ブロッキングした。細胞質中のタンパク質を洗い流すために、遺伝子導入した細胞を氷冷した０．１％サポニン含有細胞膜透過化バッファー（８０　ｍＭ　ＰＩＰＥＳ　（ｐＨ　７．２）、１　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１　ｍＭ　ＥＧＴＡおよび４％　ポリエチレングリコール）中で細胞膜に穴をあけ、氷冷細胞膜透過化バッファーで２回洗浄した後、固定化した。その後細胞に、ウサギ抗ＩＲＢＩＴ抗体（１μｇ／ｍｌ、室温、６０分）およびラット抗ＩＰ３Ｒ１抗体１８Ａ１０（４５）（４℃にて一晩）を反応させた。ＰＢＳで５分間洗浄した後、Ａｌｅｘａ　４８８−結合ヤギ抗ウサギＩｇＧおよびＡｌｅｘａ　５９４−結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を３７℃で４５分間反応させた。ＰＢＳにて５分間ずつ４回洗浄した後、カバースリップをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ　（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でマウントしてＩＸ−７０共焦点蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて６０倍の対物レンズで観察した。
【００４７】
免疫沈降
１％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０を含む５０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ７．４）、１　ｍＭ　ＭｇＣｌ２およびプロテアーゼインヒビターで４℃にて３０分間処理することにより、粗ミクロソームから界面活性剤可溶化抽出物を得、２０，０００　ｘ　ｇで３０分間遠心した。上清を免疫沈降バッファー（１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ７．４）、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、１　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、および１％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０）にて１０倍に希釈し、ウサギ抗ＩＲＢＩＴ抗体（３μｇ）あるいはコントロールウサギＩｇＧ（３μｇ）と共に４℃にて２時間インキュベートした。免疫複合体を、プロテインＧ　セファロース４ファストフロー（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加して４℃にて２時間反応させた。樹脂を免疫沈降バッファーで３回洗浄して抗ＩＲＢＩＴ抗体またはマウス抗ＩＰ３Ｒ１抗体　ＫＭ１１１２（４７）によるウエスタンブロットに供した。
【００４８】
結果
新規ＩＰ３Ｒ結合タンパク質の精製およびｃＤＮＡクローニング
ＩＰ３受容体と相互作用する分子を同定するために、マウスＩＰ３Ｒ１のＩＰ３結合ドメインおよび制御ドメインを含む細胞質領域（１０，　１１）の大部分をコードするＮ末端２２１７アミノ酸領域を、ＧＳＴとの融合タンパク質（ＧＳＴ−ＥＬ）として用いた。ＧＳＴ−ＥＬおよびＧＳＴをバキュロウイルス／Ｓｆ９細胞系により発現させて、グルタチオン−セファロースに結合させた。小脳の粗ミクロソーム画分から高塩濃度バッファー（５００ｍＭのＮａＣｌを含む）で抽出される画分は、膜結合タンパク質に富んだ画分であると考えられ、これをＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴを固定化したグルタチオン−セファロースアフィニティカラムに添加した。ＩＰ３が存在するとＩＰ３受容体から解離するタンパク質を検出すべく、５０μＭのＩＰ３を用いてアフィニティカラムに結合したタンパク質の溶出を行ったところ、ＧＳＴ−ＥＬカラムから分子量約６０ｋＤａのタンパク質が溶出されたが（図１Ａ）、ＧＳＴカラムからはこのようなタンパク質は溶出されず（データは示していない）、かかるタンパク質がＩＰ３Ｒ１に特異的に結合するタンパク質であることが示唆された。かかる６０ｋＤａのタンパク質に由来する２つのペプチドの配列を決定し、非重複データベースのＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、これらの２つの配列はデータベース中のあるヒト由来ｃＤＮＡの配列とマッチした。このｃＤＮＡに相同性のあるマウス発現配列タグの配列情報に基づいて、マウス小脳から逆転写ＰＣＲにより、上記６０ｋＤａタンパク質のｃＤＮＡを得た。クローニングされたｃＤＮＡの推定アミノ酸配列から５３０アミノ酸残基からなるタンパク質であることが示された（図１Ｂ）。計算上の分子量は５８．９ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって推定された分子量とほぼ一致していた。この６０ｋＤａの分子をＩＲＢＩＴと名付けた。
【００４９】
ＩＲＢＩＴのＣ末端領域（アミノ酸１０５〜５３０）はメチル化経路の酵素Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＥＣ　３．３．１．１．）（４８）に対して相同性（同一性５１％、類似性７４％）を有していることが明らかとなった（Ｆｉｇ．　１，　ＣおよびＤ）。ＩＲＢＩＴのＮ末端側の領域（アミノ酸１〜１０４）は、既知のタンパク質との相同性はなく、セリンに富んだ領域（アミノ酸６２〜１０３）を含んでいた（Ｆｉｇ．　１，　ＢおよびＤ）。ＩＲＢＩＴの配列のモチーフ検索によって、推定コイルドコイルモチーフ（アミノ酸１１１〜１３８）および推定ＮＡＤ＋結合領域（アミノ酸３１４〜３４４）が存在することが明らかとなった（図１ＢおよびＤ）。カゼインキナーゼＩＩ、ＰＫＣ、ＰＫＡ／ＰＫＧおよびチロシンキナーゼなどのプロテインキナーゼによる推定リン酸化部位を１７箇所含んでいた。そのうちの７箇所は、Ｎ末端側に集中していた（図１Ｂ）。推定膜貫通領域およびシグナル配列は見出されなかった。
【００５０】
ＩＲＢＩＴはＳ−アデノシルホモシステインのアデノシンとホモシステインへの可逆的加水分解を触媒するＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼと相同性を有しているため、まず、大腸菌で発現させた組換えＩＲＢＩＴを用いてこの酵素活性を有しているかどうかについて検討した。Ｃ末端にＨｉｓタグを付したＩＲＢＩＴ（ＩＲＢＩＴ−Ｈｉｓ）およびＮ末端にＧＳＴタグを付したＩＲＢＩＴ（ＧＳＴ−ＩＲＢＩＴ）を精製し、加水分解方向への酵素活性を測定した。図２に示すように、両組換えＩＲＢＩＴは酵素活性を有していなかった。このことから、ＩＲＢＩＴはＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ活性を有していないと結論づけられる。Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼはその結晶解析および部位特異的変異体を用いた研究（４３，　５２−５６）より、基質との結合およびＮＡＤ＋との結合に関与する残基が決定されている。ＩＲＢＩＴがＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ活性を示さないのは、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼの基質結合に重要なアミノ酸、例えば５４番目のリジン、３０２番目のフェニルアラニン、３５３番目のヒスチジンなどが置換されていることによるのではないかと推測される（図１Ｃ）。しかしながら、ＩＲＢＩＴは、基質特異性を異にする酵素活性を有している可能性も否定できない。
【００５１】
ＩＲＢＩＴの組織分布および細胞内局在
ＩＲＢＩＴのＮ末端領域（図１Ｂ、枠内）に対する抗体をアフィニティ精製を経て作製した。該抗体の特異性を調べるために、ＩＲＢＩＴのｃＤＮＡをＣｏｓ−７細胞に遺伝子導入して、その細胞溶解液を抗ＩＲＢＩＴ抗体によるイムノブロットにより解析した。図３Ａに示すように、抗ＩＲＢＩＴ抗体は、約６０ｋＤａの位置にあるタンパク質のみを認識した。外来遺伝子から発現させたＩＲＢＩＴ（図３Ａ、レーン１）の分子量はＣｏｓ−７の内因性タンパク質（図３Ａ、レーン３）と同じであり、上記ｃＤＮＡが全長ＩＲＢＩＴをコードしていることが確認された。抗ＩＲＢＩＴ抗体を用いてイムノブロットによりマウスの組織におけるＩＲＢＩＴの発現を調べた。ＩＲＢＩＴは普遍的に検出されたが、大脳および小脳で最も発現が強かった（図３Ｂ）。
【００５２】
次いで、マウス小脳を分画してＩＲＢＩＴの細胞内局在を調べた。ＩＲＢＩＴは細胞質画分および粗ミクロソーム画分に存在していた（図３Ｃ、レーン２および３）。粗ミクロソーム画分をさらに、膜結合画分（最初にＩＲＢＩＴが単離された画分）、および高塩抽出後粗ミクロソーム画分に分離した。図３Ｃに示すように、粗ミクロソーム画分中のＩＲＢＩＴは高塩濃度バッファーで部分的に抽出された（図３Ｃ、レーン４）。対照的に、小胞体の膜タンパク質であるＩＰ３Ｒ１は、全く抽出されなかった（図３Ｃ、下の図）。これらの結果から、ＩＲＢＩＴは細胞質にも存在し、膜にも結合するタンパク質であることが示された。
【００５３】
高塩抽出画分中のＩＲＢＩＴはＩＰ３Ｒ１と結合し、ＩＲＢＩＴのＮ末端領域は結合に必須であるＩＲＢＩＴはマウス小脳の細胞質画分と膜結合画分との両方に存在していた（図３Ｃ）。そこで、これらの画分中のＩＲＢＩＴがｉｎ　ｖｉｔｒｏでＩＰ３Ｒ１と相互作用するか否かを、ＧＳＴプルダウン法により調べた。マウス小脳の細胞質画分と粗ミクロソーム由来の高塩抽出画分（すなわち膜結合画分）をＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴとインキュベートして、これらの組換えタンパク質とＩＲＢＩＴの結合を抗ＩＲＢＩＴ抗体でイムノブロットにより解析した。図４Ａに示すように、高塩抽出画分中のＩＲＢＩＴはＧＳＴ−ＥＬと結合したが、ＧＳＴとはしなかった。（図４Ａ、レーン６およびレーン５）。一方、細胞質画分のＩＲＢＩＴはＧＳＴ−ＥＬとは結合しなかった（図４Ａ、レーン３）。これらの結果は、バッファーの影響または画分中に含まれる他の低分子物質の影響ではないことを、透析によるバッファー交換後に同様の実験を行うことにより確認した。したがって、ＩＲＢＩＴの翻訳後修飾、例えばリン酸化などにより、ＩＰ３受容体との結合が制御されている可能性が考えられる。
【００５４】
次に、リン酸化の影響を調べるために、高塩抽出画分を非特異的ホスファターゼであるアルカリホスファターゼで処理した後、ＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴと共にインキュベートした。図４Ｂに示すように、高塩抽出画分中のＩＲＢＩＴはホスファターゼ処理後ＧＳＴ−ＥＬとは結合しなかった（図４Ｂ、レーン６）。この結果からＩＲＢＩＴがＩＰ３Ｒ１と結合するには、ＩＲＢＩＴのリン酸化が必要である可能性が示唆された。無論、他のタンパク質がリン酸化されることによりこれらのタンパク質の相互作用が制御されているという可能性も現時点では否定はできないが、ＩＲＢＩＴはアルカリホスファターゼ処理により該相互作用は見られなくなり、リン酸化によっても、ＩＲＢＩＴとＩＰ３受容体との相互作用が制御されていると推測される。次に、ＩＰ３Ｒ１との相互作用に必要なＩＲＢＩＴの領域を特定するために、ＧＦＰのタグを付したＩＲＢＩＴの欠失変異体を用いて、ＧＳＴプルダウン法を行った。図５Ｂに示すように、ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴおよびＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（１−２７７）は両方ともＧＳＴ−ＥＬに効率よく結合した（図５Ｂ、レーン３および６）。ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（１−１０４）はＧＳＴ−ＥＬと結合したが、ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ　およびＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（１−２７７）の該結合より弱かった（図５Ｂ、レーン７と９をレーン１と３およびレーン４と６と比較）。一方、Ｎ末端領域を欠失したＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（１０５−５３０）はＧＳＴ−ＥＬと結合しなかった（図５Ｂ、レーン１２および１５）。これらの結果から、ＩＲＢＩＴのＮ末端領域がＩＰ３Ｒ１との結合には必須であり、コイルドコイル構造を有する約１７０アミノ酸（１０５〜２７７）が該結合の安定化に重要であることが示された。
【００５５】
ＩＲＢＩＴには潜在的リン酸化部位が１７箇所有り、そのうちの７つがＩＰ３受容体との相互作用に必要な上記Ｎ末端領域に局在していることからも、リン酸化がＩＰ３受容体との相互作用に関与している可能性が予想される。これから推測すると、ＩＲＢＩＴは脱リン酸化された状態で細胞質中に遊離しており、リン酸化された状態のものはＩＰ３受容体との相互作用を介して膜に結合しているという仮説が成り立つ。実証するまでには至っていないが、ＩＲＢＩＴとＩＰ３受容体との相互作用がＩＰ３と直接または間接的なリン酸化とにより二元的に制御されているということが考えられる。
【００５６】
Ｃｏｓ−７細胞内ではＩＲＢＩＴはＩＰ３Ｒ１と共に小胞体上に局在している
ＩＲＢＩＴの細胞内局在を調べるために、ＩＲＢＩＴとＩＰ３受容体を過剰発現したＣｏｓ−７細胞で共焦点免疫蛍光顕微鏡分析を行った。ＩＲＢＩＴは細胞質に一様に分布していたが、核内では免疫反応性は示されなかった（図６Ａ）。ＩＲＢＩＴは、生化学的分画法による実験では、細胞質画分および粗ミクロソーム画分の両方に存在していた（図３Ｃ）ので、膜に結合しているＩＲＢＩＴのみを可視化し、観察することとした。そのために、固定化の前にＩＲＢＩＴとＩＰ３受容体を共発現したＣｏｓ−７細胞の細胞膜をサポニンにより透過性にして細胞質に存在するＩＲＢＩＴを洗い出した。そうすると、図６Ｂに示すとおり、ＩＲＢＩＴは網状のパターンで分布しており（図６Ｂ、左図）、このことから膜結合性ＩＲＢＩＴは小胞体上に分布していることが示唆された。ＩＲＢＩＴの免疫反応性は、ＩＰ３Ｒ１と大部分重複した（図６Ｂ、中央の図、および右図）。ＩＰ３Ｒ１の染色パターンは、サポニンで細胞膜透過性にしたことにより変化しなかった（データは示さず）。ＩＰ３Ｒ１とＧＦＰ−ＩＲＢＩＴとを共発現して、ＧＦＰの蛍光を見た場合、同様の結果が観察された（図６ＣおよびＤ）。これらの結果より、過剰発現したＣｏｓ−７においてＩＲＢＩＴは小胞体上のＩＰ３Ｒ１と結合することが示唆された。これらの局在が特異的なものであることを確かめるために、Ｎ末端領域を欠損しているためにＧＳＴ−ＥＬと結合しないＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（１０５−５３０）とＩＰ３Ｒ１をＣｏｓ−７細胞に共発現したところ、ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴとは異なり、ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（１０５−５３０）は細胞質と核に分布していた（図６Ｅ）。ＩＲＢＩＴは核移行シグナルと推定される配列を有していないので、この核への移行の機序については明らかではない。サポニン処理により細胞質に存在するＩＲＢＩＴを洗い出すと、ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（１０５−５３０）は核にのみ存在し、ＩＰ３Ｒ１との共局在は確認されなかった（図６Ｆ）。この結果は、ＩＲＢＩＴのＮ末端領域がＩＰ３Ｒ１への結合に必須であるという生化学的手法による結果（図５Ｂ）と一致する。
【００５７】
ＩＲＢＩＴはｉｎ　ｖｉｖｏでＩＰ３Ｒ１と結合する
組織中でのＩＲＢＩＴとＩＰ３Ｒ１との結合を確認するため、マウス小脳を用いた免疫共沈降を行った。マウス小脳の粗ミクロソーム画分の界面活性剤抽出物を抗ＩＲＢＩＴ抗体で免疫沈降し、沈降物を抗ＩＰ３Ｒ１抗体でイムノブロット解析した。ＩＰ３Ｒ１は抗ＩＲＢＩＴ抗体で共沈澱したが、コントロール抗体ではしなかった（Ｆｉｇ．　７）。この結果は小脳におけるＩＲＢＩＴとＩＰ３Ｒ１とのｉｎ　ｖｉｖｏでの結合を示している。
【００５８】
生理的濃度のＩＰ３により選択的にＩＰ３Ｒ１からＩＲＢＩＴの解離が起こる
ＩＲＢＩＴは最初、５０　μＭのＩＰ３によるＧＳＴ−ＥＬカラムからの溶出液中で同定された（図１Ａ）。このことは、ＩＲＢＩＴとＩＰ３Ｒ１との相互作用をＩＰ３が解離させることを示唆する。しかし、ＩＰ３は刺激により上昇した場合でも数μＭ程度の細胞内濃度であり（５０）、上記溶出に用いた５０　μＭというＩＰ３の濃度は生理的範囲より高い。したがって、生理的濃度のＩＰ３により該タンパク質間相互作用が解離するか否かを検討した。
【００５９】
マウス小脳の粗ミクロソームからの高塩抽出画分中のＩＲＢＩＴをＧＳＴ−ＥＬによりトラップし、これを０．１〜１０　μＭのＩＰ３、および他のイノシトールポリホスフェートとしてＩＰ２、ＩＰ４、ＩＰ６または　ＡＴＰにて溶出を試みた。図８Ａに示すように、ＩＰ３はＧＳＴ−ＥＬからＩＲＢＩＴを濃度依存的に解離させた（図８Ａ　ａ、下図）。このＩＰ３溶出液中のＧＳＴ−ＥＬの存在を確認したが、検出されなかった（図８Ａ　ａ、上図）。長時間露光しても同様であった。ＥＣ５０（ＩＲＢＩＴのＧＳＴ−ＥＬからの解離が最大量の５０％となるＩＰ３濃度）は、約０．５　μＭであった。該濃度はＩＰ３の生理的濃度の範囲内である（５０）　（図８Ｂ）。また、他のイノシトールポリホスフェートでは、解離効率はＩＰ３の５０分の１程度であり、ＡＴＰは１０　μＭの濃度でも解離させなかった。したがって、生理的濃度のＩＰ３により選択的に、ＩＰ３Ｒ１からＩＲＢＩＴが解離することが示された。
【００６０】
ＩＲＢＩＴはＩＰ３Ｒ１のＩＰ３結合領域と結合し、かつＩＰ３Ｒ１のＬｙｓ−５０８はＩＲＢＩＴとＩＰ３の両方の結合にとって必須である
ＩＰ３Ｒ１のＩＰ３結合領域または制御領域のいずれの領域がＩＲＢＩＴとの相互作用に必須であるかを調べるために、ＩＰ３Ｒ１のドメイン構造（５１）に基づいてＧＳＴ融合タンパク質として構築した８種のＩＰ３Ｒ１の欠失変異体を用いた（Ｆｉｇ．　９Ａ）。図９Ｂに示すように、ＩＰ３結合コア領域（アミノ酸２２６〜５７６）（１１）を含有するＧＳＴ−ＩｂＩＩａ（アミノ酸２２６〜６０４）は、ＧＳＴ−ＥＬと同程度にＩＲＢＩＴと結合した。一方、ＧＳＴ−ＩａｂおよびＧＳＴ−ＩＩａｂなどの他のＧＳＴ融合タンパク質は、ＩＲＢＩＴと結合しなかった。次いで、ＩＲＢＩＴとの結合に重要なＩＰ３Ｒ１のアミノ酸残基を特定するために部位特異的突然変異解析を実施した。ＩＰ３Ｒ１の５０８番目のリジン（Ｌｙｓ−５０８）はＩＰ３結合に必須なアミノ酸残基であることが判っており（１２）、該リジン残基をアラニンに置換したＧＳＴ−ＩｂＩＩａ（Ｋ５０８Ａ）では、そのＩＰ３結合親和性が著しく減少することが判っている（４２）。一方、ＧＳＴ−ＩｂＩＩａの４４１番目のアルギニン残基がグルタミンに置換したＲ４４１Ｑは、ＩＰ３に対する結合親和性がＧＳＴ−ＩｂＩＩａより高いことが判っている（４２）。これらの組換えタンパク質を用いてプルダウンアッセイを行ったところ、ＩＲＢＩＴはＧＳＴ−ＩｂＩＩａとＲ４４１Ｑとには同じレベルで結合したが、Ｋ５０８ＡにはＩＲＢＩＴは結合しなかった（図９Ｃ）。ＩＰ３Ｒ１の５０８番目のリジンがＩＰ３とのみならずＩＲＢＩＴとの相互作用にも必要であることを示しており、このことからも、ＩＲＢＩＴとＩＰ３Ｒ１との結合はＩＰ３により解離するという結果が支持される。
【００６１】
【発明の効果】
以上の結果を総合すると、ＩＲＢＩＴは通常ＩＰ３Ｒ１と会合しており、細胞外からの刺激によりＩＰ３の濃度が上昇するとＩＰ３Ｒ１から解離すると考えられる。ＩＲＢＩＴはＩＰ３によりＩＰ３受容体との相互作用が制御され得ることが示された、唯一のＩＰ３受容体結合タンパク質である。
【００６２】
本発明者らが、発見したＩＲＢＩＴタンパク質は、ＩＰ３受容体と結合し、該結合はＩＰ３によって濃度依存的に解離することから、ＩＲＢＩＴは、細胞内およびセルフリーの系のいずれにおいてもＩＰ３の検出および定量のための指示薬として有用なタンパク質分子であることが示された。また、ＩＲＢＩＴのアミノ酸配列の１〜１０４番目までの配列がＩＰ３への結合に必須な領域であることから、このアミノ酸配列を少なくとも含むタンパク質もＩＲＢＩＴと同様、ＩＰ３の指示薬として有用であると考えられる。
【００６３】
参考文献
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１３．　Ｚｈｕ，　Ｃ．−Ｃ．，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｗｏｊｃｉｋｉｅｗｉｃｚ，　Ｒ．　Ｊ．　Ｈ．　（１９９９）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７４，　３４７６−３４８４
１４．　Ｚｈｕ，　Ｃ．−Ｃ．，　ａｎｄ　Ｗｏｊｃｉｋｉｅｗｉｃｚ，　Ｒ．　Ｊ．　Ｈ．　（２０００）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　３４８，　５５１−５５６
１５．　Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，　Ｍ．　Ｊ．，　Ｂｏｏｔｍａｎ，　Ｍ．　Ｄ．，　ａｎｄ　Ｌｉｐｐ，　Ｐ．　（１９９８）　Ｎａｔｕｒｅ　３９５，　６４５−６４８
１６．　Ｔｈｒｏｗｅｒ，　Ｅ．　Ｃ．，　Ｈａｇａｒ，　Ｒ．　Ｅ．，　ａｎｄ　Ｅｈｒｌｉｃｈ，　Ｂ．　Ｅ．　（２００１）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｓｃｉ．　２２，　５８０−５８６
１７．　Ｍａｃｋｒｉｌｌ，　Ｊ．　Ｊ．　（１９９９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　３３７，　３４５−３６１
１８．　Ｐａｔｅｌ，　Ｓ．，　Ｍｏｒｒｉｓ，　Ｓ．　Ａ．，　Ａｄｋｉｎｓ，　Ｃ．　Ｅ．，　Ｏ’ｂｅｉｒｎｅ，　Ｇ．，　ａｎｄ　Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．　Ｗ．　（１９９７）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９４，　１１６２７−１１６３２
１９．　Ｍｉｃｈｉｋａｗａ，　Ｔ．，　Ｈｉｒｏｔａ，　Ｊ．，　Ｋａｗａｎｏ，　Ｓ．，　Ｈｉｒａｏｋａ，　Ｍ．，　Ｙａｍａｄａ，　Ｍ．，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９９９）　Ｎｅｕｒｏｎ　２３，　７９９−８０８
２０．　Ｃａｍｅｒｏｎ，　Ａ．　Ｍ．，　Ｓｔｅｉｎｅｒ，　Ｊ．　Ｐ．，　Ｓａｂａｔｉｎｉ，　Ｄ．　Ｍ．，　Ｋａｐｌｉｎ，　Ａ．　Ｉ．，　Ｗａｌｅｎｓｋｙ，　Ｌ．　Ｄ．，　ａｎｄ　Ｓｎｙｄｅｒ，　Ｓ．　Ｈ．　（１９９５）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９２，　１７８４−１７８８
２１．　Ｃａｍｅｒｏｎ，　Ａ．　Ｍ．，　Ｎｕｃｉｆｏｒａ，　Ｆ．　Ｃ．，　Ｊｒ，　Ｆｕｎｇ，　Ｅ．　Ｔ．，　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，　Ｄ．　Ｊ．，　Ａｌｄａｐｅ，　Ｒ．　Ａ．，　Ｒｏｓｓ，　Ｃ．　Ａ．，　ａｎｄ　Ｓｎｙｄｅｒ，　Ｓ．　Ｈ．　（１９９７）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７２，　２７５８２−２７５８８
２２．　Ｄａｒｇａｎ，　Ｓ．　Ｌ．，　Ｌｅａ，　Ｅ．　Ｊ．　Ａ．，　ａｎｄ　Ｄａｗｓｏｎ，　Ａ．　Ｐ．　（２００２）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．３６１，　４０１−４０７
２３．　Ｂｕｌｔｙｎｃｋ，　Ｇ．，　Ｄｅ　Ｓｍｅｔ，　Ｐ．，　Ｗｅｉｄｅｍａ，　Ａ．　Ｆ．，　Ｖｅｒ　Ｈｅｙｅｎ，　Ｍ．，　Ｍａｅｓ，　Ｋ．，　Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，　Ｇ．，　Ｍｉｓｓｉａｅｎ，　Ｌ．，　Ｐａｒｙｓ，　Ｊ．　Ｂ．，　ａｎｄ　Ｄｅ　Ｓｍｅｄｔ，　Ｈ．　（２０００）　Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．　５２５，　６８１−６９３
２４．　Ｂｕｌｔｙｎｃｋ，　Ｇ．，　Ｄｅ　Ｓｍｅｔ，　Ｐ．，　Ｒｏｓｓｉ，　Ｄ．，　Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，　Ｇ．，　Ｍｉｓｓｉａｅｎ，　Ｌ．，　Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ，　Ｖ．，　Ｄｅ　Ｓｍｅｄｔ，　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｐａｒｙｓ，　Ｊ．　Ｂ．　（２００１）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　３５４，４１３−４２２
２５．　Ｃａｍｅｒｏｎ，　Ａ．　Ｍ．，　Ｓｔｅｉｎｅｒ，　Ｊ．　Ｐ．，　Ｒｏｓｋａｍｓ，　Ａ．　Ｊ．，　Ａｌｉ，　Ｓ．　Ｍ．，　Ｒｏｎｎｅｔｔ，　Ｇ．　Ｖ．，　ａｎｄ　Ｓｎｙｄｅｒ，　Ｓ．　Ｈ．　（１９９５）　Ｃｅｌｌ　８３，　４６３−４７２
２６．　Ｊｏｓｅｐｈ，　Ｓ．　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｓａｍａｎｔａ，　Ｓ．　（１９９３）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６８，　６４７７−６４８６
２７．　Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎ，　Ｌ．　Ｙ．　Ｗ．，　Ｊｉｎ，　Ｈ．，　Ｉｉｄａ，　Ｎ．，　Ｂｒａｎｄｔ，　Ｎ．　Ｒ．，　ａｎｄ　Ｚｈａｎｇ，　Ｓ．　Ｈ．　（１９９３）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６８，　７２９０−７２９７
２８．　Ｈａｙａｓｈｉ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｓｕ，　Ｔ．−Ｐ．　（２００１）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９８，　４９１−４９６
２９．　Ｙｏｏ，　Ｓ．　Ｈ．，　Ｓｏ，　Ｓ．　Ｈ．，　Ｋｗｅｏｎ，　Ｈ．　Ｓ．，　Ｌｅｅ，　Ｊ．　Ｓ．，　Ｋａｎｇ，　Ｍ．　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｊｅｏｎ，　Ｃ．　Ｊ．　（２０００）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　１２５５３−１２５５９
３０．　Ｙｏｏ，　Ｓ．　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｊｅｏｎ，　Ｃ．　Ｊ．　（２０００）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　１５０６７−１５０７３
３１．　Ｔｈｒｏｗｅｒ，　Ｅ．　Ｃ．，　Ｐａｒｋ，　Ｈ．　Ｙ．，　Ｓｏ，　Ｓ．　Ｈ．，　Ｙｏｏ，　Ｓ．　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｅｈｒｌｉｃｈ，　Ｂ．　Ｅ．　（２００２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７７，　１５８０１−１５８０６
３２．　Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎｎ，　Ｊ．，　Ａｍｍｅｎｄｏｌａ，　Ａ．，　Ａｓｈｍａｎ，　Ｋ．，　Ｚｏｎｇ，　Ｘ．，　Ｈｕｂｅｒ，　Ａ．，　Ｎｅｕｂａｕｅｒ，　Ｇ．，　Ｗａｎｇ，　Ｇ．−Ｘ．，　Ａｌｌｅｓｃｈｅｒ，　Ｈ．−Ｄ．，　Ｋｏｒｔｈ，　Ｍ．，　Ｗｉｌｍ，　Ｍ．，　Ｈｏｆｍａｎｎ，　Ｆ．，　ａｎｄ　Ｒｕｔｈ，　Ｐ．　（２０００）　Ｎａｔｕｒｅ　４０４，　１９７−２０１
３３．　Ｊａｙａｒａｍａｎ，　Ｔ．，　Ｏｎｄｒｉａｓ，　Ｋ．，　Ｏｎｄｉａｓｏｖａ，　Ｅ．，　ａｎｄ　Ｍａｒｋｓ，　Ａ．　Ｒ．　（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２，　１４９２−１４９４
３４．　Ｙｏｋｏｙａｍａ，　Ｋ．，　Ｓｕ，　Ｉ．，　Ｔｅｚｕｋａ，　Ｔ．，　Ｙａｓｕｄａ，　Ｔ．，　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．，　Ｔａｒａｋｈｏｖｓｋｙ，　Ａ．，　ａｎｄ　Ｙａｍａｍｏｔｏ，　Ｔ．　（２００２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　２１，　８３−９２
３５．　Ｙａｎｇ，　Ｊ．，　ＭｃＢｒｉｄｅ，　Ｓ．，　Ｍａｋ，　Ｄ．−Ｏ．　Ｄ．，　Ｖａｒｄｉ，　Ｎ．，　Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ，　Ｋ．，　Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ，　Ｆ．，　ａｎｄ　Ｆｏｓｋｅｔｔ，　Ｊ．　Ｋ．　（２００２）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９９，　７７１１−７７１６
３６．　Ｔｕ，　Ｊ．　Ｃ．，　Ｘｉａｏ，　Ｂ．，　Ｙｕａｎ，　Ｊ．　Ｐ．，　Ｌａｎａｈａｎ，　Ａ．　Ａ．，　Ｌｅｏｆｆｅｒｔ，　Ｋ．，　Ｌｉ，　Ｍ．，　Ｌｉｎｄｅｎ，　Ｄ．　Ｊ．，　ａｎｄ　Ｗｏｒｌｅｙ，　Ｐ．　Ｆ．　（１９９８）　Ｎｅｕｒｏｎ　２１，　７１７−７２６
３７．　Ｄｅｌｍａｓ，　Ｐ．，　Ｗａｎａｖｅｒｂｅｃｑ，　Ｎ．，　Ａｂｏｇａｄｉｅ，　Ｆ．　Ｃ．，　Ｍｉｓｔｒｙ，　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｂｒｏｗｎ，　Ｄ．　Ａ．　（２００２）　Ｎｅｕｒｏｎ　１４，　２０９−２２０
３８．　Ｋｉｓｅｌｙｏｖ，　Ｋ．，　Ｍｉｇｎｅｒｙ，　Ｇ．　Ａ．，　Ｚｈｕ，　Ｍ．　Ｘ．，　ａｎｄ　Ｍｕａｌｌｅｍ，　Ｓ．　（１９９９）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　４，　４２３−４２９
３９．　Ｂｏｕｌａｙ，　Ｇ．，　Ｂｒｏｗｎ，　Ｄ．　Ｍ．，　Ｑｉｎ，　Ｎ．，　Ｊｉａｎｇ，　Ｍ．，　Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，　Ａ．，　Ｚｈｕ，　Ｍ．　Ｘ．，　Ｃｈｅｎ，　Ｚ．，　Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ，　Ｍ．，　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ，　Ｌ．　（１９９９）Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９６，　１４９５５−１４９６０
４０．　Ｇｕａｎ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｄｉｘｏｎ，　Ｊ．　Ｅ．　（１９９１）　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９２，　２６２−２６７
４１．　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，　Ｊ．，　Ｃａｐｄｅｖｉｅｌｌｅ，　Ｊ．，　Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ，　Ｊ．　Ｃ．，　ａｎｄ　Ｆｅｒｒａｒａ，　Ｐ．　（１９９２）　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２０３，　１７３−１７９
４２．　Ｕｃｈｉｙａｍａ，　Ｔ．，　Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，　Ｆ．，　Ｈｉｓｈｉｄａ，　Ａ．，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（２００２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７７，　８１０６−８１１３
４３．　Ｙｕａｎ，　Ｃ．−Ｓ．，　Ａｕｌｔ−Ｒｉｃｈｅ，　Ｄ．　Ｂ．，　ａｎｄ　Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ，　Ｒ．　Ｔ．　（１９９６）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７１，　２８００９−２８０１６
４４．　Ｍｉｙａｗａｋｉ，　Ａ．，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　Ｍａｅｄａ．　Ｎ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９９０）　Ｎｅｕｒｏｎ　５，　１１−１８
４５．　Ｍａｅｄａ，　Ｎ．，　Ｎｉｉｎｏｂｅ，　Ｍ．，　Ｎａｋａｈｉｒａ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９８８）　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　５１，　１７２４−１７３０
４６．　Ｍａｅｄａ，　Ｎ．，　Ｎｉｉｎｏｂｅ，　Ｍ．，　Ｉｎｏｕｅ，　Ｙ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９８９）　Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．　１３３，　６７−７６
４７．　Ｓｕｇｉｙａｍａ，　Ｔ．，　Ｆｕｒｕｙａ，　Ａ．，　Ｍｏｎｋａｗａ，　Ｔ．，　Ｙａｍａｍｏｔｏ−Ｈｉｎｏ，　Ｍ．，　Ｓａｔｏｈ，　Ｓ．，　Ｏｈｍｏｒｉ，　Ｋ．，　Ｍｉｙａｗａｋｉ，　Ａ．，　Ｈａｎａｉ，　Ｎ．，　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｈａｓｅｇａｗａ，　Ｍ．　（１９９４）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　３５４，　１４９−１５４
４８．　Ｏｇａｗａ，　Ｈ．，　Ｇｏｍｉ，　Ｔ．，　Ｍｕｅｃｋｌｅｒ，　Ｍ．　Ｍ．，　Ｆｕｊｉｏｋａ，　Ｍ．，　Ｂａｃｋｌｕｎｄ，　Ｐ．　Ｓ．，　Ｊｒ．，　Ａｋｓａｍｉｔ，　Ｒ．　Ｒ．，　Ｕｎｓｏｎ，　Ｃ．　Ｇ．，　ａｎｄ　Ｃａｎｔｏｎｉ，　Ｇ．　Ｌ．　（１９８７）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８４，　７１９−７２３
４９．　Ｄｅｋｋｅｒ，　Ｊ．　Ｗ．，　Ｂｕｄｈｉａ，　Ｓ．，　Ａｎｇｅｌ，　Ｎ．　Ｚ．，　Ｃｏｏｐｅｒ，　Ｂ．　Ｊ．，　Ｃｌａｒｋ，　Ｇ．　Ｊ．，　Ｈａｒｔ，　Ｄ．　Ｎ．　Ｊ．，　ａｎｄ　Ｋａｔｏ，　Ｍ．　（２００２）　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　５３，　９９３−１００１
５０．　Ｌｕｚｚｉ，　Ｖ．，　Ｓｉｍｓ，　Ｃ．　Ｅ．，　Ｓｏｕｇｈａｙｅｒ，　Ｊ．　Ｓ．，　ａｎｄ　Ａｌｌｂｒｉｔｔｏｎ，　Ｎ．　Ｌ．　（１９９８）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７３，　２８６５７−２８６６２
５１．　Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，　Ｆ．，　Ｉｗａｓａｋｉ，　Ｈ．，　Ｍｉｃｈｉｋａｗａ，　Ｔ．，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９９９）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７４，　３１６−３２７
５２．　Ｔｕｒｎｅｒ，　Ｍ．　Ａ．，　Ｙｕａｎ，　Ｃ．−Ｓ．，　Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ，　Ｒ．　Ｔ．，　Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，　Ｍ．　Ｓ．，　Ｓｍｉｔｈ，　Ｇ．　Ｄ．，　ａｎｄ　Ｈｏｗｅｌｌ，　Ｐ．　Ｌ．　（１９９８）　Ｎａｔ．　ｓｔｒｕｃｔ．　Ｂｉｏｌ．　５，　３６９−３７６
５３．　Ｈｕ，　Ｙ．，　Ｋｏｍｏｔｏ，　Ｊ．，　Ｈｕａｎｇ，　Ｙ．，　Ｇｏｍｉ，　Ｔ．，　Ｏｇａｗａ，　Ｈ．，　Ｔａｋａｔａ，　Ｙ．，　Ｆｕｊｉｏｋａ，　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｔａｋｕｓａｇａｗａ，　Ｆ．　（１９９９）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３８，　８３２３−８３３３
５４．　Ｇｏｍｉ．　Ｔ．，　Ｔａｋａｔａ，　Ｙ．，　Ｄａｔｅ，　Ｔ．，　Ｆｕｊｉｏｋａ，　Ｍ．，　Ａｋｓａｍｉｔ，　Ｒ．　Ｒ．，　Ｂａｃｋｌｕｎｄ，　Ｐ．　Ｓ．，　Ｊｒ．，　ａｎｄ　Ｃａｎｔｏｎｉ，　Ｇ．　Ｌ．　（１９９０）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６５，　１６１０２−１６１０７
５５．　Ａｋｓａｍｉｔ，　Ｒ．　Ｒ．，　Ｂａｃｋｌｕｎｄ，　Ｐ．　Ｓ．，　Ｊｒ．，　Ｍｏｏｓ，　Ｍ．，　Ｊｒ．，　Ｃａｒｙｋ，　Ｔ．，　Ｇｏｍｉ，　Ｔ．，　Ｏｇａｗａ，　Ｈ．，　Ｆｕｊｉｏｋａ，　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｃａｎｔｏｎｉ，　Ｇ．　Ｌ．　（１９９４）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．２６９，　４０８４−４０９１
５６．　Ａｕｌｔ−Ｒｉｃｈｅ，　Ｄ．　Ｂ．，　Ｙｕａｎ，　Ｃ．−Ｓ．，　ａｎｄ　Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ，　Ｒ．　Ｔ．　（１９９４）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６９，　３１４７２−３１４７８
５７．　Ｉｃｈｔｃｈｅｎｋｏ，　Ｋ．，　Ｈａｔａ，　Ｙ．，　Ｎｇｕｙｅｎ，　Ｔ．，　Ｕｌｌｒｉｃｈ，　Ｂ．，　Ｍｉｓｓｌｅｒ，　Ｍ．，　Ｍｏｏｍａｗ，　Ｃ．，　ａｎｄ　Ｓｕｄｈｏｆ，　Ｔ．　Ｃ．　（１９９５）　Ｃｅｌｌ　８１，　４３５−４４３
５８．　Ｐｅｌｅｓ，　Ｅ．，　Ｎａｔｉｖ，　Ｍ．，　Ｃａｍｐｂｅｌｌ，　Ｐ．　Ｌ．，　Ｓａｋｕｒａｉ，　Ｔ．，　Ｍａｒｔｉｎｅｚ，　Ｒ．，　Ｌｅｖ，　Ｓ．，　Ｃｌａｒｙ，　Ｄ．　Ｏ．，　Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，　Ｊ．，　Ｂａｒｎｅａ，　Ｇ．，　Ｐｌｏｗｍａｎ，　Ｇ．　Ｄ．，　Ｇｒｕｍｅｔ，　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，　Ｊ．　（１９９５）　Ｃｅｌｌ　８２，　２５１−２６０
５９．　Ｐｅｉｆｅｒ，　Ｍ．，　Ｂｅｒｇ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，　Ａ．　Ｂ．　（１９９４）　Ｃｅｌｌ　７６，　７８９−７９１
６０．　Ｓｕｐａｔｔａｐｏｎｅ，　Ｓ．，　Ｗｏｒｌｅｙ，　Ｐ．　Ｆ．，　Ｂａｒａｂａｎ，　Ｊ．　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｓｎｙｄｅｒ，　Ｓ．　Ｈ．　（１９８８）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３，　１５３０−１５３４
６１．　Ｍａｅｄａ，　Ｎ．，　Ｎｉｉｎｏｂｅ，　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９９０）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　９，　６１−６７
６２．　Ｗｏｒｌｅｙ，　Ｐ．　Ｆ．，　Ｂａｒａｂａｎ，　Ｊ．　Ｍ．，　Ｓｕｐａｔｔａｐｏｎｅ，　Ｓ．，　Ｗｉｌｓｏｎ，　Ｖ．　Ｓ．，　ａｎｄＳｎｙｄｅｒ，　Ｓ．　Ｈ．　（１９８７）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６２，　１２１３２−１２１３６
６３．　Ｈａｎｎａｅｒｔ−Ｍｅｒａｈ，　Ｚ．，　Ｃｏｑｕｉｌ，　Ｊ．　Ｆ．，　Ｃｏｍｂｅｔｔｅｓ，　Ｌ．，　Ｃｌａｒｅｔ，　Ｍ．，　Ｍａｕｇｅｒ，　Ｊ．　Ｐ．，　ａｎｄ　Ｃｈａｍｐｅｉｌ，　Ｐ．　（１９９４）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６９，　２９６４２−２９６４９
６４．　Ｎａｔｓｕｍｅ，　Ｔ．，　Ｈｉｒｏｔａ，　Ｊ．，　Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，　Ｆ．，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９９９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍ．　２６０，　５２７−５３３
６５．　Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，　Ｆ．，　Ｕｃｈｉｙａｍａ，　Ｔ．，　Ｉｗａｓａｋｉ，　Ｈ．，　Ｔｏｍｏｍｏｒｉ−Ｓａｔｏｈ，　Ｃ．，　Ｔａｎａｋａ，　Ｔ．，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．　（１９９９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍ．　２５７，　７９２−７９７
６６．　Ｗｏｊｃｉｋｉｅｗｉｃｚ，　Ｒ．　Ｊ．　Ｈ．，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，　Ｔ．，　Ｎａｋａｄｅ，　Ｓ．，　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｎａｈｏｒｓｋｉ，　Ｓ．　Ｒ．　（１９９４）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６９，　７９６３−７９６９
６７．　Ｗｏｊｃｉｋｉｅｗｉｃｚ，　Ｒ．　Ｊ．　Ｈ．　（１９９５）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７０，　１１６７８−１１６８３
６８．　Ｂｏｋｋａｌａ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｊｏｓｅｐｈ，　Ｓ．　Ｋ．　（１９９７）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７２，　１２４５４−１２４６１
６９．　Ｏｂｅｒｄｏｒｆ，　Ｊ．，　Ｗｅｂｓｔｅｒ，　Ｊ．　Ｍ．，　Ｚｈｕ，　Ｃ．　Ｃ．，　Ｌｕｏ，　Ｓ．　Ｇ．，　ａｎｄ　Ｗｏｊｃｉｋｉｅｗｉｃｚ，　Ｒ．　Ｊ．　Ｈ．　（１９９９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　３３９，　４５３−４６１
７０．　Ｐｏｌｌｏｋ，　Ｂ．　Ａ．，　ａｎｄ　Ｈｅｉｍ，　Ｒ．　（１９９９）　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　９，　５７−６０
７１．　Ａｄａｍｓ，　Ｓ．　Ｒ．，　Ｈａｒｏｏｔｕｎｉａｎ，　Ａ．　Ｔ．，　Ｂｕｅｃｈｌｅｒ，　Ｙ．　Ｊ．，　Ｔａｙｌｏｒ，　Ｓ．　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｔｓｉｅｎ，　Ｒ．　Ｙ．　（１９９１）　Ｎａｔｕｒｅ　３４９，　６９４−６９７
７２．　Ｍｉｙａｗａｋｉ，　Ａ．，　Ｌｌｏｐｉｓ，　Ｊ．，　Ｈｅｉｍ，　Ｒ．，　ＭｃＣａｆｆｅｒｙ，　Ｊ．　Ｍ．，　Ａｄａｍｓ，　Ｊ．　Ａ．，　Ｉｋｕｒａ，　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｔｓｉｅｎ，　Ｒ．　Ｙ．　（１９９７）　Ｎａｔｕｒｅ　３８８，　８８２−８８７
７３．　Ｈｉｒｏｓｅ，　Ｋ．，　Ｋａｄｏｗａｋｉ，　Ｓ．，　Ｔａｎａｂｅ，　Ｍ．，　Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｉｉｎｏ，　Ｍ．　（１９９９）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４，　１５２７−１５３０
【００６４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＩＲＢＩＴの精製とそのｃＤＮＡクローニングについて示した図である。
図１Ａは、ラット小脳の粗ミクロソームからの高塩抽出画分よりＧＳＴ−ＥＬカラムを用いて精製したＩＲＢＩＴタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である（矢印はＩＲＢＩＴの位置を示す）。ＩＲＢＩＴは５０μＭのＩＰ３で溶出された。溶出液を濃縮後、１０％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシーブリリアントブルーで染色した。２００　ｋＤａ以上の位置および１００〜２００　ｋＤａの位置に認められるバンドは、複数種の抗ＩＰ３Ｒ１抗体で認識されることから、ＧＳＴ−ＥＬが樹脂からわずかに解離して溶出されたものおよびその分解物であると思われる。図１Ｂは、ＩＲＢＩＴの推定アミノ酸配列を示す。精製したＩＲＢＩＴを消化して得られた２種のペプチド部分には太い下線を、セリンに富んだ領域は破線の下線を、コイルドコイル領域には２重下線を、ＮＡＤ＋結合部位には細い下線を、それぞれ付している。カゼインキナーゼ、プロテインキナーゼＣ、プロテインキナーゼＡ／プロテインキナーゼＧ、およびチロシンキナーゼによる推定リン酸化部位は、それぞれ、黒丸、白丸、黒四角および白四角で配列上部に記している。Ｎ末端領域は、実線で囲んでいる。図１Ｃは、ＩＲＢＩＴのＣ末端領域とＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＡＨＣＹ）（４８）との配列アラインメントを表している。＊印は同一残基、：印は類似残基を示している。Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼの基質結合に関与する残基には黒丸、ＮＡＤ＋結合に関与する残基には白丸をそれぞれ付している。図１Ｄは、ＩＲＢＩＴの構造の模式図である。ＮＴＲはＮ末端領域、ＣＴＲはＣ末端領域、ＳＥＲはセリンに富んだ領域、ＣＣはコイルドコイル領域、およびＮＡＤはＮＡＤ＋結合部位を表す。
【図２】図２は、ＩＲＢＩＴはＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ活性を有していないことを示す。
組換えＩＲＢＩＴ−Ｈｉｓ（白丸）、ＧＳＴ−ＩＲＢＩＴ（三角）、ＧＳＴ（四角）およびＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（黒丸）の加水分解方向へのＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ活性を公知の方法（４３）にしたがって測定した。結果は、３回の独立した実験の結果の平均±標準偏差として示す。
【図３】図３は、ＩＲＢＩＴの組織分布および細胞内局在を示す図である。図３Ａは、外来性発現させたＩＲＢＩＴと内因性ＩＲＢＩＴのウェスタン分析の結果を示す。ＩＲＢＩＴ（レーン１）およびモックコントロール（レーン２および３）を遺伝子導入したＣｏｓ−７細胞の細胞溶解液を抗ＩＲＢＩＴ抗体でウェスタンブロッティング分析した。レーン３はレーン１および２に対して１０倍量の溶解液を添加した。図３Ｂは、マウス組織のＳ１フラクション（２　μｇタンパク質）を抗ＩＲＢＩＴ抗体でウェスタンブロッティング分析することにより、ＩＲＢＩＴの組織分布を調べた結果である。図３Ｃは、マウス小脳の細胞内局在を調べた結果である。マウス組織のＳ１画分を１００，０００　ｘ　ｇで遠心後、その細胞質画分（レーン２）および粗ミクロソーム画分（レーン３）を得た。さらに、粗ミクロソーム画分を５００　ｍＭ　ＮａＣｌを含む高塩濃度バッファーで抽出して、１００，０００　ｘ　ｇで遠心後、膜結合画分（レーン４）と高塩抽出後粗ミクロソーム画分（レーン５）を得た。上図は、各画分（１μｇタンパク質）を抗ＩＲＢＩＴ抗体によるウェスタンブロッティング分析した結果である。下図は、抗ＩＰ３Ｒ１抗体でのウェスタンブロッティング分析の結果である。
【図４】図４は、高塩抽出画分中のＩＲＢＩＴはＩＰ３Ｒ１とｉｎ　ｖｉｔｒｏで相互作用するが、細胞質中のＩＲＢＩＴは相互作用しないことを示す図である。図４Ａは、マウス小脳細胞質画分（レーン１〜３）および粗ミクロソームからの高塩抽出画分（レーン４〜６）を、ＧＳＴ−ＥＬ（レーン３および６）またはＧＳＴ（レーン２および５）と共にインキュベートし、グルタチオン−セファロースにより結合したタンパク質をプルダウンし、グルタチオンで溶出後、抗ＩＲＢＩＴ抗体（上図）でウェスタンブロッティング分析した。グルタチオン−セファロースでプルダウンしたＧＳＴ−ＥＬおよびＧＳＴは、クマシーブリリアントブルーで染色した（下図）。図４Ｂは、マウス小脳から得た粗ミクロソームの高塩抽出画分を、アルカリホスファターゼ処理なし（レーン１〜３）または該処理後（レーン４〜６）にて、ＧＳＴ−ＥＬ（レーン３および６）またはＧＳＴ（レーン２および５）と共にインキュベートし、図４Ａと同様にＩＲＢＩＴの結合を分析した結果を示す。
【図５】図５は、ＩＰ３Ｒ１との相互作用にはＩＲＢＩＴのＮ末端領域が必要であることを示す図である。図５Ａは、ＩＲＢＩＴとＩＲＢＩＴのＧＦＰ融合欠失変異体の構造を模式的に示す。図５Ｂでは、ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ発現Ｃｏｓ−７細胞（レーン１〜３）、ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（１−２７７）発現Ｃｏｓ−７細胞（レーン４〜６）、ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（１−１０４）発現Ｃｏｓ−７細胞（レーン７〜９）、ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（１０５−５３０）発現Ｃｏｓ−７細胞（レーン１０〜１２）およびＧＦＰ発現Ｃｏｓ−７細胞（レーン１３〜１５）の細胞溶解液をＧＳＴプルダウンアッセイに用いた。各ＧＦＰ融合タンパク質を発現しているＣｏｓ−７細胞の溶解液（インプット：Ｉ）をＧＳＴ−ＥＬ（Ｅ）またはＧＳＴ（Ｇ）とインキュベートした。結合したタンパク質をグルタチオン−セファロースでプルダウンし、グルタチオンで溶出後、抗ＧＦＰ抗体でイムノブロット解析した。
【図６】図６は、共発現したＣｏｓ−７細胞では、ＩＲＢＩＴはＩＰ３Ｒ１と共局在することを示す図である。ＩＰ３Ｒ１を、ＩＲＢＩＴ（ＡおよびＢ）、ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（ＣおよびＤ）およびＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（１０５−５３０）（ＥおよびＦ）と共にＣｏｓ−７細胞に一過性に共発現し、それぞれのタンパク質の細胞内局在を間接的免疫蛍光（抗ＩＰ３Ｒ１および抗ＩＲＢＩＴ抗体にて）と蛍光共焦点顕微鏡法（ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴおよびＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（１０５−５３０））により分析した。Ｂ、ＤおよびＦは、細胞を固定化する前に、サポニンで細胞膜透過化して細胞質タンパク質を洗い出した。左列のパネルは、ＩＲＢＩＴ（Ｂ）、ＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（Ｄ）およびＧＦＰ−ＩＲＢＩＴ（１０５−５３０）（Ｆ）を示し、中央のパネルは、ＩＰ３Ｒ１を示す。右列のパネルは、左列および中央のパネルを合わせたものである。Ｂの下列のパネルは、上列のパネルを拡大したものである。スケールは１０　μｍを示す。
【図７】図７は、ｉｎ　ｖｉｖｏでのＩＲＢＩＴのＩＰ３Ｒ１との会合を示す図である。マウス小脳粗ミクロソームの界面活性剤抽出液を抗ＩＲＢＩＴ抗体またはコントロール抗体で免疫沈降した。沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗ＩＰ３Ｒ１（上図）または抗ＩＲＢＩＴ（下図）の各抗体でウェスタンブロットした。
【図８】図８は、生理的濃度のＩＰ３により、選択的にＩＰ３Ｒ１からＩＲＢＩＴが解離する事を示す図である。図８Ａは、マウス小脳から得た粗ミクロソームからの高塩抽出画分をＧＳＴ−ＥＬとインキュベートした。結合したタンパク質をグルタチオン−セファロースでプルダウンし、グルタチオン（Ｇｌｕ）（ａ）または０．１〜１０　μＭ　ＩＰ３（ａ）、ＩＰ２（ｂ）、ＩＰ４（ｃ）、ＩＰ６（ｄ）またはＡＴＰ（ｅ）で溶出した。抽出液中のＩＲＢＩＴを抗ＩＲＢＩＴ抗体とＡｌｅｘａ　６８０コンジュゲート二次抗体で分析した（ａの下のパネル、およびｂ〜ｅ）。グルタチオンおよび０．１〜１０　μＭ　ＩＰ３での溶出液中のＧＳＴ−ＥＬを抗ＧＳＴ抗体で分析した（ａの上のパネル）。図８Ｂは、抗ＩＲＢＩＴ抗体により検出されたＩＲＢＩＴのバンドに由来するシグナル強度を赤外イメージングシステムで定量した結果を示す。相対強度を溶出剤の濃度に対してプロットした。少なくとも３回の独立した実験の平均±標準偏差で示している。
【図９】図９は、ＩＲＢＩＴがＩＰ３Ｒ１のＩＰ３結合領域と相互作用すること、およびこの相互作用にはＩＰ３Ｒ１の５０８番目のＬｙｓが必要であることを示す図である。図９Ａは、用いたマウスＩＰ３Ｒ１と組換えＧＳＴ融合タンパク質の構造を模式的に図示している。ＩＰ３結合コア領域は斜線部、推定膜貫通領域を黒塗りの線で示している。Ｉ〜Ｖのローマ数字は、トリプシン限定分解により決定したＩＰ３Ｒ１のドメイン構造を示している（５１）。各バーの上に付した数字は、アミノ酸残基の番号を示している。図９Ｂは、ＩＰ３Ｒ１のＩＲＢＩＴ結合領域を調べた結果を示す。マウス小脳から得た粗ミクロソームからの高塩抽出画分を（Ａ）に示すＧＳＴ融合タンパク質とインキュベートした。結合したタンパク質をグルタチオン−セファロースでプルダウンした後、グルタチオンで溶出して、抗ＩＲＢＩＴ抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。図９Ｃは、（Ｂ）と同様に、高塩抽出画分をＧＳＴ−ＩｂＩＩａ、Ｒ４４１ＱおよびＫ５０８Ａでプルダウンアッセイした結果である。結合したタンパク質をグルタチオン−セファロースでプルダウンした後、グルタチオンで溶出して、抗ＩＲＢＩＴ抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した（上図）。グルタチオン−セファロースでプルダウンしたＧＳＴ融合タンパク質を、クマシーブリリアントブルーで染色した（下図）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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