(57)【要約】【課題】伸長状態の検出用ヌクレオチド鎖を反応領域全体に固定させるように工夫することによって、ハイブリダイゼーション効率の向上を図る。【解決手段】検出用ヌクレオチド鎖Ｘと該検出用ヌクレオチド鎖と相補性のある塩基配列を有する標的ヌクレオチド鎖との間のハイブリダイゼーションの場となる反応領域Ｒと、前記反応領域Ｒに配設された対向電極Ａ，Ｂと、前記対向電極Ａ−Ｂ間に点在するように配置された浮遊電極Ｃと、を備えるハイブリダイゼーション検出部１ａ及び該検出部１ａが形成されたセンサーチップ並びに該検出部１ａで行うハイブリダイゼーション方法を提供する。【選択図】　図１
2004132720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出用ヌクレオチド鎖と該検出用ヌクレオチド鎖と相補性のある塩基配列を有する標的ヌクレオチド鎖との間のハイブリダイゼーションの場となる反応領域と、
前記反応領域に配置された対向電極と、
前記対向電極間に点在するように配設された浮遊電極と、を備えるハイブリダイゼーション検出部。
【請求項２】
前記浮遊電極は、不均一電界を形成できる形状を備えることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項３】
前記浮遊電極の電極表面は、前記対向電極の電極表面よりも狭小に形成されていることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項４】
前記浮遊電極の表面が、前記検出用ヌクレオチド鎖を固定できる表面処理が施されていることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項５】
前記対向電極が、平行に配置されていることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項６】
請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部を少なくとも備えることを特徴とするセンサーチップ。
【請求項７】
前記対向電極によって形成される電界が、交流であることを特徴とする請求項６記載のセンサーチップ。
【請求項８】
検出用ヌクレオチド鎖と該検出用ヌクレオチド鎖と相補性のある塩基配列を備える標的ヌクレオチド鎖との間のハイブリダイゼーションの場となる反応領域と、前記反応領域に配置された対向電極と、前記対向電極間に配設された複数の浮遊電極と、を備えた検出部を用いて、
前記対向電極に電圧を印加することにより前記反応領域に存在する前記検出用ヌクレオチド鎖を伸長状態とし、この伸長状態の検出用ヌクレオチド鎖を前記対向電極及び前記浮遊電極の局所的な表面部位に生じる不均一電界で誘電泳動して、前記浮遊電極の前記表面部位に固定させる手順と、
前記対向電極に電圧を印加することにより前記反応領域に存在する前記標的ヌクレオチド鎖を伸長状態にして、前記浮遊電極の前記表面部位に固定された伸長状態の前記検出用ヌクレオチド鎖とハイブリダイゼーションさせる手順と、
を備えるハイブリダイゼーション方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡチップ等のセンサーチップに好適に利用できるハイブリダイゼーション検出部に係わる技術に関する。より詳細には、ハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域において、伸長状態の検出用ヌクレオチド鎖を走査電極間に整列固定させることによって、ハイブリダイゼーション効率の向上を図る技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
まず、本発明の一般的な従来技術を以下説明する。現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００３】
このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００４】
ＤＮＡチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、ガラス基板やシリコン基板上に固相化されたＤＮＡプローブに対して、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡを逆転写ＰＣＲ反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅し、前記基板上においてハイブリダイゼーションを行い、所定の検出器で蛍光測定を行うという手法である。
【０００５】
ここで、ＤＮＡチップは二つのタイプに分類できる。第１のタイプは、半導体露光技術を応用したフォトリソグラフィーの技術を用いて、所定の基板上に直接オリゴヌクレオチドを合成していくものであり、アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）によるものが代表的である（例えば、特許文献１参照。）。この種のチップは、集積度は高いが、基板上でのＤＮＡ合成には限界があって、数十塩基程度の長さである。
【０００６】
第２のタイプは、「スタンフォード方式」とも称されるもので、先割れピンを用いて、予め用意されたＤＮＡを基板上に分注・固相化していくことによって作製されるものである（例えば、特許文献２参照。）。この種のチップは、集積度は前者に比べて低いが、１ｋｂ程度のＤＮＡ断片を固相化できるという利点がある。
【０００７】
続いて、非特許文献１には、対向電極間に配列された浮遊電極（ｆｌｏａｔｉｎｇ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）に形成される電界の作用によって、ＤＮＡを電極表面に固定する技術（ＤＮＡ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ）が開示されている。
【０００８】
【特許文献１】
特表平４−５０５７６３号公報
【特許文献２】
特表平１０−５０３８４１号公報
【非特許文献１】
ＩＥＥＥ　ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＯＮＳ　ＯＮ　ＩＮＤＵＳＴＲＹ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＶＯＬ．３１，Ｎｏ．３　ＭＡＹ／ＪＵＮＥ　１９９５、Ｐ４５１
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
まず、上記した従来の一般的なＤＮＡチップ技術では、検出表面部位（スポット部位）に固定化されたＤＮＡプローブ等の検出用ヌクレオチド鎖は、ブラウン運動の作用でランダムコイル状に絡まったり、丸まったり等しており、また、検出表面においてその集積密度に偏りがあった。このため、標的ヌクレオチド鎖とのハイブリダイゼーションの際には立体障害が発生するので、ハイブリダイゼーションの効率が悪く、反応にも長時間を要し、更には、擬陽性又は偽陰性を示してしまう可能性もあるという基本的な技術的課題があった。
【００１０】
このため、ハイブリダイゼーションの効率を向上させるために、既存のＤＮＡチップの検出表面領域（スポット領域）に対して、ＤＮＡを、立体障害が起き難いと予測される直鎖状構造で固定することを実現するべく、前記非特許文献１に開示されたＤＮＡ固定技術を応用し、ＤＮＡチップの検出表面領域に、対向電極と該対向電極間に浮遊電極を配列しておき、試料溶液に電界をかけて浮遊電極表面にＤＮＡを固定することが考えられる。しかし、前記ＤＮＡ固定技術では、対向電極の間に該対向電極と同長の浮遊電極を単に配置した構成であるので、浮遊電極表面に形成される不均一電界の量や密度が低く、固定されるＤＮＡの量が充分でないため、ハイブリダイゼーション効率の向上が充分に図れないことが予測された。
【００１１】
そこで、本発明は、ハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域に、伸長状態の検出用ヌクレオチド鎖を均密に固定できるように工夫することによって、検出用ヌクレオチド鎖と標的ヌクレオチド鎖との間のハイブリダイゼーション効率の向上を図ることを主な目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記技術的課題を解決するために、まず、本願においては、検出用ヌクレオチド鎖と該検出用ヌクレオチド鎖と相補性のある塩基配列を有する標的ヌクレオチド鎖との間のハイブリダイゼーションの場となる反応領域と、前記反応領域に配置された対向電極と、前記対向電極間に点在するように配設された複数の浮遊電極と、を備えるハイブリダイゼーション検出部を提供する。
【００１３】
前記対向電極の配置構成は特に限定しないが、反応領域に平行に配置された構成を採用することによって、対向電極に挟まれた反応領域全体に、電界を均一かつ高密度に形成することができ、これにより反応領域に存在する各ヌクレオチド鎖を電気力線に沿って平行に伸長させることができる。
【００１４】
ヌクレオチド鎖の伸長は、１ＭＶ／ｍ程度の高周波電界を印加すると、ヌクレオチド鎖（リン酸イオン等を備えるヌクレオチド鎖の陰電荷とイオン化した水素原子の陽電荷で構成される多数の分極ベクトルからなるヌクレオチド鎖）に誘電分極が生じ、その結果、ヌクレオチド分子が電界と平行に直線状に引き伸ばされるという原理に基づいている。
【００１５】
伸長されたヌクレオチド鎖は、塩基同士が重層することが無くなる結果、反応時の立体障害がなくなって、相補性のある塩基配列同士の会合（水素結合）の確率をより高めることができ、近在するヌクレオチド鎖とのハイブリダイゼーション反応が円滑に行われるようになる。
【００１６】
本発明において、上記浮遊電極は、電気力線が一部に集中する箇所を反応領域内に多数形成する役割を果たし、当該箇所に検出用ヌクレチド鎖（の末端）を固定する役割を果たす。この浮遊電極を前記対向電極間の反応領域に点在するように配設する構成を採用することによって、電気力線が集中する箇所を、前記反応領域内に均一かつ高密度で設けることができる。また、浮遊電極を反応領域に点在させる構成によって、反応領域中のヌクレオチド鎖が自由に移動できるという利点がある。
【００１７】
浮遊電極の形態は特に限定しないが、電界（電気力線）が集中し易く、かつヌクレオチド鎖が固定し易い形態であるという観点から、円弧状又は多角形状の表面形状を備える浮遊電極、即ち不均一電界を形成できる形状を備える浮遊電極を採用することができる。また、浮遊電極の電極表面は、前記対向電極の電極表面よりも狭小に形成することによって、浮遊電極の電極表面に電界が集中し易くなり、不均一電界が形成されやすくなるので好適である。更には、浮遊電極の表面を、前記検出用ヌクレオチド鎖を固定できる表面処理を施こしておくことによって、前記検出用ヌクレオチド鎖の固定作業を、確実に行うことができる。
【００１８】
次に、本願では、上記ハイブリダイゼーション検出部を少なくとも備えるセンサーチップを提供する。より具体的には、検出用ヌクレオチド鎖と該検出用ヌクレオチド鎖と相補性のある塩基配列を備える標的ヌクレオチド鎖との間のハイブリダイゼーションの場となる反応領域と、前記反応領域に配設された対向電極と、前記対向電極間に配置された複数の浮遊電極と、を備え、前記対向電極に電圧を印加することにより前記反応領域に存在する前記検出用ヌクレオチド鎖を伸長状態にし、この伸長状態の検出用ヌクレオチド鎖を前記対向電極及び前記浮遊電極の局所的な表面部位に生じる不均一電界で誘電泳動させて、前記対向電極及び前記浮遊電極の前記表面部位に固定させることが可能なセンサーチップを提供する。
【００１９】
このセンサーチップによれば、反応領域に滴下されて分散し、ブラウン運動によってランダムコイル状に絡み合った形態となっている（ハイブリダイゼーションには適さない形態の）検出用ヌクレオチド鎖を、伸長させてハイブリダイゼーションし易い直鎖状の形態に調整し、更に、この検出用ヌクレオチド鎖を、伸長状態のままで浮遊電極の表面部位に固定させていくことが可能となる。
【００２０】
そして、更に前記対向電極に電圧を印加することによって、前記反応領域に存在する前記標的ヌクレオチド鎖を伸長状態にして、前記対向電極及び前記浮遊電極の前記表面部位に固定させた前記検出用ヌクレオチド鎖とハイブリダイゼーションさせることが可能となる。なお、本発明に係るセンサーチップにおける前記対向電極によって形成される電界は、特に交流を採用することができる。
【００２１】
更に、本願では、以下のハイブリダイゼーション方法を提供する。本方法は、検出用ヌクレオチド鎖と該検出用ヌクレオチド鎖と相補性のある塩基配列を備える標的ヌクレオチド鎖との間のハイブリダイゼーションの場となる反応領域と、前記反応領域に配置された対向電極と、前記対向電極間に配設された複数の浮遊電極と、を備えた検出表面を用いる方法である。
【００２２】
そして、前記対向電極に電圧を印加することにより前記反応領域に存在する前記検出用ヌクレオチド鎖を伸長状態とし、この伸長状態の検出用ヌクレオチド鎖を前記対向電極及び前記浮遊電極の局所的な表面部位に生じる不均一電界で誘電泳動して、前記浮遊電極の前記表面部位に固定させる手順（第１手順）と、前記対向電極に電圧を印加することにより前記反応領域に存在する前記標的ヌクレオチド鎖を伸長状態にして、前記浮遊電極の前記表面部位に固定された伸長状態の前記検出用ヌクレオチド鎖とハイブリダイゼーションさせる手順（第２手順）と、を備える。
【００２３】
この方法では、対向電極に電圧を印加することによって反応領域中に電界を形成することによって、該反応領域中に配設された浮遊電極の表面部位及び対向電極の表面部位に不均一電界を形成し、この不均一電界による誘電泳動の作用に基づいて、最初に、前記電極の表面部位に検出用ヌクレオチド鎖を伸長させながら固定する。
【００２４】
続いて、前記同様の誘電泳動の作用に基づいて、前記反応領域に後添加されてきた標的ヌクレオチド鎖を伸長させながら、前記表面部位に固定されている伸長状態の検出用ヌクレオチド鎖に接近させ、直鎖状同士のヌクレオチド鎖同士で、より効率の良いハイブリダイゼーションを進行させることができる。
【００２５】
以上の本発明は、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等において必須となるハイブリダイゼーションの検出を、効率良く実施できるハイブリダイゼーション検出部及び該検出部を備えるＤＮＡチップ等のセンサーチップを、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の関連産業界に提供するという技術的意義を有している。
【００２６】
ここで、本願における主な技術用語の定義付けを行う。本願において「ヌクレオチド鎖」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体を意味し、ＤＮＡプローブを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃＤＮＡプローブ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２７】
「検出用ヌクレオチド鎖」は、前記対向電極や前記浮遊電極の直接的に又は間接的に固定化されるヌクレオチド鎖であり、「標的ヌクレオチド鎖」は、前記検出用ヌクレオチド鎖と相補的な塩基配列を備えるヌクレオチド鎖であって、場合によっては、蛍光物質等により標識されるものである。
【００２８】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備えるヌクレオチド鎖間の相補鎖（二重鎖）形成反応を意味する。
【００２９】
「反応領域」は、液相中でのハイブリダイゼーション反応の場を提供できる領域である。この反応領域では、一本鎖ヌクレオチド間の相互反応、即ちハイブリダイゼーションに加え、検出用ヌクレオチド鎖から所望の二本鎖ヌクレオチドを形成し、該二本鎖ヌクレオチドとペプチド（又はタンパク質）の相互反応、酵素応答反応その他の分子間相互反応も行わせることができる。例えば、前記二本鎖ヌクレオチドを用いる場合は、転写因子であるホルモンレセプター等のレセプター分子と応答配列ＤＮＡ部分の結合等を分析することができる。
【００３０】
「対向電極」は、反応領域内に少なくとも一対の相対向する電極であって、電圧が印加されたときに、反応領域に電界を形成する役割を発揮するものである。
【００３１】
「浮遊電極」は、導電性を備え、外部電源に接続されていない孤立した電極を意味する。
【００３２】
「立体障害（ｓｔｅｒｉｃ　ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）」は、分子内の反応中心等の近傍に嵩高い置換基の存在や反応分子の姿勢や立体構造（高次構造）によって、反応相手の分子の接近が困難になることによって、所望の反応（本願では、ハイブリダイゼーション）が起こりにくくなる現象を意味する。
【００３３】
「誘電泳動」は、電界が一様でない場において、分子が電界の強い方へ駆動する現象であり、交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる（監修・林　輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、Ｐ３７〜Ｐ４６・第５章・細胞およびＤＮＡのマニピュレーション参照）。
【００３４】
「センサーチップ」は、石英ガラスや合成樹脂等で形成された基板に物質間の相互反応作用を検出できる反応領域と該反応領域に設けられる対向電極に対する電圧印加手段を少なくとも備えるものを意味し、代表例としてＤＮＡチップを挙げることができる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面に基づいて、本発明の好適な実施形態について説明する。まず、図１は、本発明に係るハイブリダイゼーション検出部（以下、「検出部」と略称する。）及びセンサーチップの第１実施形態（符号１ａ）の要部構成を表す図である。
【００３６】
検出部１ａには、まず、反応領域Ｒが設けられている。この反応領域Ｒは、図１中において符号Ｘで示された検出用ヌクレオチド鎖と図示しない標的ヌクレオチド鎖を含む試料溶液が添加される貯留領域であって、ハイブリダイゼーションの反応の場を提供する領域又は空間である。
【００３７】
この反応領域Ｒには、対向電極Ａ、Ｂがその端面が平行になるよう配置されており、図示された電源Ｖに、スイッチＳを介して接続可能な状態に構成されている。また、対向電極Ａ、Ｂ間には、複数の浮遊電極Ｃが電源Ｖには接続されない状態で、縦横方向に整列されて点在するように配設されている（図１参照）。なお、ここでは、各浮遊電極Ｃを円形状としたが、この形状に特に限定ものではなく、多角形、楕円等、不均一電界を形成させる任意の形状とすることができる。
【００３８】
また、各浮遊電極Ｃの電極表面を、前記対向電極Ａ，Ｂの電極表面よりも狭小に形成することによって、浮遊電極Ｃの電極表面に電界が集中し易くなり、不均一電界が形成され易くなるので好適である。
【００３９】
なお、図１は、スイッチＳがオンされ、対向電極Ａ−Ｂ間に電圧が印加されている状態を示しており、また、反応領域Ｒ中に示された符号Ｘは未だランダムコイル状に丸まっている状態の検出用ヌクレオチド鎖を表し、符号Ｘ’は、直鎖状に伸長されで、電極表面に固定された検出用ヌクレオチド鎖を表している。
【００４０】
なお、検出部１ａは、特に図示しないが、石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の合成樹脂で形成された基板の間の狭小な間隙に設けられている。検出部１ａでは、対向電極Ａ、Ｂ等の厚みと反応領域Ｒの深さ（又は幅）が一致し、場合によっては、誘電体によって各電極Ａ、Ｂ等を挟持させた構成を採用し、これにより基板の間隔を広げ、反応領域Ｒの容量を増やすようにしてもよい（後述する第２実施形態でも同様）。
【００４１】
ここで、図２は、前記検出部１ａにおいて、図示されたスイッチＳをオンにし、電源Ｖによって対向電極Ａ−Ｂ間に高周波電圧を印加することによって、反応領域Ｒに電界Ｌが形成された状態を、電気力線を示すことで表している。電極Ａ−Ｂ間に高周波電圧が印加されると前記反応領域Ｒには、符号Ｌで示された不均一電界が形成される。
【００４２】
即ち、対向電極Ａ、Ｂの電圧を印加すると、電極Ａ，Ｂ及び各浮遊電極Ｃの表面部位に電界が局所的に集中する不均一電界Ｌが形成されることになる（図２参照）。この不均一電界Ｌの作用によって、前記反応領域Ｒ中にランダムに分散して存在している検出用ヌクレオチド鎖Ｘを、前記不均一電界Ｌに沿った方向に伸長させながら駆動させることができる。
【００４３】
更に、前記検出用ヌクレオチド鎖Ｘは、誘電泳動の作用によって駆動されて、電界強度の強い電極Ａ、Ｂ、Ｃの各表面部位に対して、伸長した状態でその一端が固定される。図１，図２は、各電極Ａ、Ｂ、Ｃの表面部位に伸長状態の検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’が固定されている状態を示されている。
【００４４】
なお、対向電極Ａ、Ｂ間に印加される電界の条件は、約１×１０６ｖ／ｍ、約１ＭＨｚが好適である（Ｍａｓａｏ　Ｗａｓｈｉｚｕ　ａｎｄ　Ｏｓａｍｕ　Ｋｕｒｏｓａｗａ：”Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”，ＩＥＥＥ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．２６，ｐ．１１６５−１１７２（１９９０）参照）。
【００４５】
続いて、反応領域Ｒに後添加されてきた標的ヌクレオチド鎖は、対向電極Ａ、Ｂにより形成された不均一電界Ｌの作用を受けて、上記検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’と同様に伸長され、電界強度の強い電極Ａ、Ｂ、Ｃの各表面部位に対して誘電泳動により引き寄せられる。
【００４６】
前記各表面部位に引き寄せられた標的ヌクレオチド鎖は、同表面部位に既に固定された伸長状態の検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’との間で、立体障害の影響を受けずに、効率の良いハイブリダイゼーションが進行する。
【００４７】
なお、対向電極Ａ，Ｂ並びに各浮遊電極Ｃの表面あるいは端部を、検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’の末端部位がカップリング反応等の反応によって固定されるように表面処理しても良い。一例を挙げれば、ストレプトアビジンによって表面処理された電極表面の場合には、ビオチン化されたヌクレオチド鎖末端の固定に適している。
【００４８】
次に、図３に基づいて、本発明に係る検出部及びセンサーチップの第２実施形態（符号１ｂ）の構成を説明する。
【００４９】
まず、検出部１ｂには、上記した検出部１ａ同様に、反応領域Ｒと、該反応領域Ｒに対向電極Ａ、Ｂが平行に配置され、電源Ｖにより接続可能な状態となっている。そして、対向電極Ａ−Ｂ間には、電源Ｖには接続されていない複数の浮遊電極Ｄ群が配置されている。
【００５０】
この第２実施形態の浮遊電極Ｄ群と上記第１実施形態の浮遊電極Ｃ群は、反応領域Ｒに点在するように配置されている点で共通しているが、検出部１ａにおいては浮遊電極Ｃが縦横方向ともに整列されて配置されているのに対して（図１、図２参照）、検出部１ｂの浮遊電極Ｄは、互い違いに配置されている点で異なる（図３参照）。なお、図３においては、各浮遊電極Ｄを円形状としたが、この形状に特に限定ものではなく、多角形、楕円等、不均一電界を形成させる任意の形状とすることができる。
【００５１】
以上説明した第１，第２実施形態では、浮遊電極Ｃ群又はＤ群を反応領域Ｒ内に間隔を置いて、いわばマトリックス状に点在させた結果、反応領域Ｒ内に電気力線が集中する箇所を多数形成することができ、反応領域Ｒ内に形成される電界の不均一性を強めることができるという利点がある。
【００５２】
更に、浮遊電極Ｃが反応領域Ｒに点在するように配設されたことで、ヌクレチド鎖の自由な移動を確保しながら、反応領域Ｒ全域にわたってハイブリダイゼーションを進行させることができる。この結果、ハイブリダイゼーションを検出できる範囲が反応領域Ｒ全体に広がるので、検出感度が向上する。
【００５３】
各浮遊電極Ｃ群又はＤ群の各電極の配置間隔は、特に限定するものではないが、伸長状態である検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’の分子長の２倍以上とすることによって、隣接する電極Ｃ−Ｃ間あるいはＤ−Ｄ間において、検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’の自由な移動を確保し、固定された検出用ヌクレオチドＸ’同士の干渉や立体障害を防ぐことができる。
【００５４】
一方、各浮遊電極Ｃの配置間隔を伸長状態の検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’よりも短い間隔とすることによって、前記検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’を浮遊電極Ｃ−Ｃ間に架橋するように固定することが可能となる。
【００５５】
以下、添付した図４に基づいて本発明に係る「ハイブリダイゼーション方法」の実施例について説明する。図４は、同方法の手順を簡潔に示すフロー図である。
【００５６】
まず、図４（Ａ）は、反応領域Ｒに滴下された直後において、検出用ヌクレオチド鎖Ｘが丸まった状態で存在している段階を示している。この段階では、浮遊電極Ｃ（Ｄ）には、まだ検出用ヌクレオチド鎖は固定されていない。
【００５７】
図４（Ｂ）、（Ｃ）は、本発明に係るハイブリダイゼーション方法の第１手順Ｐ１を示している。まず、図４（Ｂ）は、図１〜図３に図示された対向電極Ａ−Ｂ間に電圧を印加し、浮遊電極Ｃ（Ｄ）の表面部位に電気力線が集中する不均一電界Ｌを形成し、検出用ヌクレオチド鎖Ｘを電気力線に沿って伸長させ、浮遊電極Ｃ（Ｄ）に引き寄せている段階を示している。図４（Ｃ）は、この段階を経て、浮遊電極Ｃ（Ｄ）に対して、伸長された状態の検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’の一端が固定された段階を示している。
【００５８】
続いて、図４（Ｄ）は、反応領域Ｒに標的ヌクレオチド鎖Ｙが添加されてきた段階を示している。この段階では、対向電極Ａ−Ｂに対する電圧印加は停止され、標的ヌクレオチド鎖Ｙは丸まった状態にある。なお、反応領域Ｒに標的ヌクレオチド鎖Ｙを添加する段階においても、対向電極Ａ−Ｂに対する電圧印加を継続させておいてもよい。
【００５９】
次に、図４（Ｅ）、（Ｆ）は、本発明に係るハイブリダイゼーション方法の第２手順Ｐ２を示している。まず、図４（Ｅ）は、再び対向電極Ａ−Ｂ間に電圧を印加して、浮遊電極Ｃ（Ｄ）の表面部位に電気力線が集中する不均一電界Ｌを形成することにより、前記標的ヌクレオチド鎖Ｙを電気力線に沿って伸長させ、検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’に引き寄せている段階である。
【００６０】
図４（Ｆ）は、電圧印加がオフされた状態で、ともに伸長状態にある検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’と標的ヌクレオチド鎖Ｙ’が、ブラウン運動に委ねられてハイブリダイゼーションした段階を示している。
【００６１】
本発明に係るハイブリダイゼーション方法では、対向電極Ａ−Ｂ間に対する電圧印加は、図４（Ｂ）〜（Ｅ）の段階にわたって、スイッチＳをオンし続ける操作例やスイッチＳのオン／オフを断続的に行う操作例のいずれも採用できる。
【００６２】
電圧のオン／オフを所望の回数だけ繰り返し、断続的に電圧を印加することによって、検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’の電極固定のタイミングを調整したり、あるいは既に固定された状態の検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’に対して、反応領域Ｒ中の標的ヌクレオチド鎖を段階的に接近させたり、または標的ヌクレオチド鎖を前後に移動させたり、更には、反応のタイミングを調整したりすることが可能となる。
【００６３】
また、電圧印加の際（特に図４（Ｆ）の段階）に、電圧オフとなる時間を確保することによって、直鎖状とされた標的ヌクレオチド鎖と直鎖状の検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’との間の相補鎖形成反応、即ちハイブリダイゼーションを、専らブラウン運動に委ねて進行させることができる。
【００６４】
以上の方法により、直鎖状に伸長されて電極に固定された状態の検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’と該検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’と同様に直鎖状に伸長された標的ヌクレオチド鎖との相補性のある塩基間の水素結合の形成、即ちハイブリダイゼーションが、立体障害の問題もなく、効率良く進行し、反応時間が短縮されるとともに、擬陽性又は偽陰性を示す確率も減少するという好ましい結果が得られる。
【００６５】
なお、ハイブリダイゼーションの検出は、慣用の方法によって実施でき、例えば、標的ヌクレオチド鎖Ｙに標識された蛍光色素や二重鎖ヌクレオチドの塩基間に特異的に結合するＰＯＰＯ−１やＴＯＴＯ−３等の蛍光インターカレータに励起光を照射し、得られる蛍光を慣用のディテクタを用いて検出できる。
【００６６】
より具体的には、レーザー光（例えば、青色レーザー光）を照射して反応領域Ｒを励起し、蛍光強度の大きさを検出器（図示せず。）によって検出し、検出用ヌクレオチド鎖Ｘ’と標的ヌクレオチド鎖との間のハイブリダイゼーションの状態を判断する。最後に、各反応領域Ｒに対する蛍光強度をＡ／Ｄ変換し、結合反応割合をコンピュータＣの画面に分布表示することによって、視覚化することができる。なお、本発明において、ハイブリダイゼーションの検出方法は、特に限定されることはない。
【００６７】
【発明の効果】
本発明は、ＤＮＡ等のセンサーチップ表面部位においてハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域全体に、伸長状態に調整された検出用ヌクレオチド鎖を固定させることによって、ハイブリダイゼーション効率の向上、反応時間の短縮、検出感度の向上、偽陽性又は偽陰性の発生防止等を確実に達成できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るハイブリダイゼーション検出部及びセンサーチップの第１実施形態（１ａ）の要部構成を表す図
【図２】同検出部に不均一電界（Ｌ）が形成された様子を示す図
【図３】本発明に係るハイブリダイゼーション検出部及びセンサーチップの第２実施形態（１ｂ）の要部構成を表す図
【図４】本発明に係るハイブリダイゼーション方法の実施例手順を簡潔に示すフロー図
【符号の説明】
１ａ，１ｂ　ハイブリダイゼーション検出部
Ａ，Ｂ　対向電極
Ｃ，Ｄ　浮遊電極（群）
Ｒ　反応領域
Ｓ　スイッチ
Ｖ　電源
Ｐ１　第１手順
Ｐ２　第２手順
Ｘ　検出用ヌクレオチド鎖
Ｘ’　伸長状態とされた検出用ヌクレオチド鎖
Ｙ　標的ヌクレオチド鎖
Ｙ’　伸長状態とされた標的ヌクレオチド鎖
【図１】
2004132720.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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