(57)【要約】【課題】クモ膜下出血が、遺伝子発現プロフィールに与える変化を解明し、この血管障害後の血管攣縮を抑制する薬剤を見出す方法、及びその方法によって得られた血管攣縮抑制剤を提供すること。【解決手段】クモ膜下出血後の遺伝子発現プロフィールの変化から解析したところ、ヒートショックプロテインの発現誘導を行う物質をスクリーニングすることにより、クモ膜下出血後の血管攣縮を抑制できる物質を見出すことができる。また、このスクリーニングによって見出されたＧＧＡ（下記、一般式（１））【化１】2004224744.tif 000011を投与することにより、脳底動脈にヒートショックプロテインを誘導し、クモ膜下出血後の脳血管攣縮を抑制することができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
出血あるいは虚血などの障害部位にヒートショックプロテインの発現を誘導することにより、血管障害に関する病態を改善する血管障害病態改善剤。
【請求項２】
前記ヒートショックプロテインがＨＳＰ７２であり、かつ前記血管障害が血管攣縮であることを特徴とする請求項１に記載に血管障害病態改善剤。
【請求項３】
一般式（１）
【化１】
2004224744.tif 000010
で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ノナデカテトラエン−２−オン、またはその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の血管障害病態改善剤。
【請求項４】
ヒートショックプロテインの発現誘導を指標として請求項１〜請求項３のいずれかに記載の血管障害病態改善剤をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血管障害病態改善剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血管障害は、虚血性心疾患、脳血管障害、末梢血管障害などの基本的病態であり、臨床医学上極めて重要である。脳血管障害の一つである脳血管攣縮とは、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ；以下には、「ＳＡＨ」と称することがある）後に起こる大脳動脈の攣縮のことを言う。この脳血管攣縮には、早発性のものと遅発性のものとがある。このうち、遅発性脳血管攣縮は、クモ膜下出血の発症から３日後〜９日後に発症する。クモ膜下出血患者の２７％〜３８％において、遅発性神経虚血性障害（脳血管攣縮）が起こると言われている。また、頭蓋内動脈瘤の外科的処置や術後の処置が成功した場合であっても、そのような患者のうちの２６％〜３８％は後遺症に苦しむようになり、血管攣縮による死亡例も見られる。
従来から、遅発性脳血管攣縮に内在するメカニズムの調査が広く行われてきており、多くの先端治療が施されているが（非特許文献１参照）、未だに成功したとの報告例は見出されない。
【０００３】
一方、近年には、バイオテクノロジーの驚異的な発展により、多くの遺伝子が同定されるに至っている。しかしながら、これらの遺伝子については、一次構造は知られているものの、機能が判明しているとは言い難いものの多い。また、ＤＮＡマイクロアレイによれば、多くの遺伝子の発現プロフィールを見ることができることから、種々のショック（例えば、熱ショック、薬剤投与など）が遺伝子発現に与える影響を確認する研究が進行している。
【０００４】
ところで、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）は、細胞や個体が平常温度よりも５℃〜１０℃程度高い温度変化を急激に受けたとき（熱ショック）に、合成が誘導されるタンパク質群の総称である。ＨＳＰの合成は、熱ショックの他に、様々な化学物質（例えば、電子伝達系の阻害剤、遷移金属、ＳＨ試薬、エタノールなど）によっても誘導される。このためＨＳＰは、ストレスタンパク質とも呼ばれている。真核生物では、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ユビキチン、及びＨＳＰ２６などの低分子量ＨＳＰ群が代表的ＨＳＰであり、それぞれのアミノ酸配列は進化の過程で良く保存されている。このうち、ヒトＨＳＰ７０には、少なくとも約１０種類のＨＳＰ７０遺伝子が存在する。
【０００５】
ＨＳＰの機能は多岐に渡っている。例えば、ＨＳＰ７０には、変性タンパク質に結合し、その会合沈殿を防ぐ機能・ＡＴＰ依存的に結合タンパク質を遊離する機能が知られている。また、ＨＳＰ６０には、フォールディング中間体モルテングロビュール構造を認識し結合する機能がある。
【０００６】
一方、一般式（１）
【化２】
2004224744.tif 000002
で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ノナデカテトラエン−２−オンは、種々の消化性潰瘍や胃炎の治療予防に有効であることが知られている（特許文献１，特許文献２参照）。しかしながらこれまでの知見において、かかる化合物と遅発性脳血管攣縮との関係については全く知られていない。
【０００７】
【特許文献１】特開昭５３−１４５９２２号公報
【特許文献２】特開昭６２−１００１３号公報
【非特許文献１】Ｍａｙｂｅｒｇ  Ｍ．Ｒ．，”Ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｖａｓｏｓｐａｓｍ”．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，  アメリカ合衆国，１９９８年，第９巻，ｐ．６１５−６２７
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、血管障害（特に、血管攣縮）が、遺伝子発現プロフィールに与える変化を解明し、この血管攣縮を抑制する薬剤を見出す方法、及びその方法によって得られた血管攣縮抑制剤を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、出血（特に、クモ膜下出血）後の遺伝子発現プロフィールの変化を確認した結果、血管攣縮を抑えられる物質としてヒートショックプロテインを見出した。
更に、一般式（１）
【化３】
2004224744.tif 000003
で表される化合物が、出血を起こした障害部位において、ヒートショックプロテインの発現を誘導することにより、血管攣縮に対して効果のあることを見出すことにより、基本的には本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、第１の発明は、出血を起こした障害部位にヒートショックプロテインの発現を誘導することにより、血管障害に関する病態を改善する血管障害病態改善剤である。
【００１１】
この発明において、「出血を起こした障害部位」は、例えば脳である（この場合に、出血は、例えばクモ膜下出血である）。また、本明細書中において、「ヒートショックプロテイン」とは、熱、活性酸素、放射線などのストレス（ショック）により発現するタンパク質を意味しており、ＨＳＰ６０ファミリー、ＨＳＰ７０ファミリー、ＨＳＰ９０ファミリーなどのファミリーを含む。特に、これらのファミリーのうち、ＨＳＰ７０ファミリー（ＨＳＰ７０，ＨＳＰ７２，ＨＳＰ７３等）であることが好ましく、このうちＨＳＰ７２であることが更に好ましい。
【００１２】
「血管障害に関する病態」とは、例えば、出血後に起こる早発性または遅発性の血管攣縮がある。なお、この場合に、「血管障害病態改善剤」は、血管攣縮抑制剤となる。
【００１３】
また、第１の発明において、血管障害病態改善剤、又は血管攣縮抑制剤は、一般式（１）
【化４】
2004224744.tif 000004
で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ノナデカテトラエン−２−オン（別名：ゲラニルゲラニルアセトン、一般名：テプレノン、以下、「ＧＧＡ」と称する。）を有効成分とすることが好ましい。ＧＧＡは、プレニルケトン系化合物であり、その構造から見て、種々の異性体が考えられる。本発明は、それら各種の異性体を含むものであり、例えば５，９，１３位がそれぞれＥ体、Ｚ体のいずれでもよく、１種類のみの異性体からなる単独物、または２種類以上の異性体の混合物でもよい。但し、好ましくは、（５Ｅ，９Ｅ，１３Ｅ）体単独、（５Ｚ，９Ｅ，１３Ｅ）体単独、またはこれら二種類の異性体の任意の混合比による混合物であり、更に好ましくは、（５Ｅ，９Ｅ，１３Ｅ）体と（５Ｚ，９Ｅ，１３Ｅ）体との質量比が３：２の混合物である。ＧＧＡは、例えば特開昭５３−１４５９２２号公報に記載されている製造方法に準じて製造することができる。
【００１４】
上記化合物は、ヒートショックプロテインの発現を誘導することにより、血管攣縮の予防剤及び／または治療剤として用いられ、好ましくは脳血管攣縮の予防剤及び／または治療剤として、更に好ましくはクモ膜下出血後に発症する遅発性脳血管攣縮の予防剤及び／または治療剤として用いることができる。本発明に係る化合物の投与形態は特に制限されず、例えば経口的・非経口的に投与することができる。経口投与のための剤型は、固体又は液体の剤型、具体的には錠剤、被羅錠剤、丸剤、細粒剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤等が好ましい。非経口投与のための剤型は、注射用製剤、点滴剤、外用剤、坐剤等が好ましい。
【００１５】
また、上記化合物は、慣用される方法により製剤化することが可能であり、通常用いられる賦形剤（例えば、乳糖、白糖、でんぷん、マンニトール等）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク等）、着色剤、矯味矯臭剤等、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤等を使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して定法により製剤化される。上記化合物の投与量は、症状、年齢、体重などの条件により適宜定められるが、成人一日当たり２０ｍｇ〜２０００ｍｇ、好ましくは５０ｍｇ〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは１００ｍｇ〜５００ｍｇである。
【００１６】
また、第２の発明は、第１の発明に係る剤をスクリーニングするための方法であって、ヒートショックプロテイン（特に、ＨＳＰ７２）の発現誘導を指標とすることを特徴とする。
本発明において、「発現誘導」とは、▲１▼ヒートショックプロテインが実質的に全く発現されていない状態から、ヒートショックプロテインの発現を誘導すること、及び、▲２▼既に発現されているヒートショックプロテインの量を増加させることの両者を含む。「剤」とは、比較的低分子量の化合物、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）、タンパク質等を含む。
【００１７】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の一実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１８】
＜実験例１＞  蛍光ディファレンシャルディスプレイ法（ＦＤＤ法）による発現プロフィールの変化
クモ膜下出血後に遺伝子発現プロフィールがどのような変化を起こしているかをＦＤＤ法により確認した。ＦＤＤ（蛍光ディファレンシャル・ディスプレイ）法は、多数のサンプルを同時に発現比較する遺伝子発現解析法原理としては、全ＲＮＡから蛍光アンカープライマーで第一鎖ＤＮＡを合成し、任意プライマーと蛍光アンカープライマーを用いたＰＣＲを行い、複数のｃＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲ産物を変性ポリアクリルアミドゲルで分離後、蛍光イメージを取得し、バンド強度（発現量）が異なるＤＮＡバントを切り出し、再増幅、クローニング、塩基配列を決定するものである。このＦＤＤ法の結果、クモ膜下出血から血管攣縮に伴って、ＨＰＳ７２の発現が高度に増加していることを確認した。
＜実験例２＞  実験動物、及び脳血管攣縮モデル
なお、以下の実験例においては、実験動物の取扱に関する実験手順は、三重大学医学部の動物実験のガイドラインに従った。スプレーグ−ドーリーラット（ＳＤラット；１１〜１２週齢、３４０〜３８０ｇ；ＪＡＰＡＮ  ＳＬＣ社）に抱水クローラル（４００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射にて投与して麻酔をかけた。なお、ラットは自発呼吸できるようにしておいた。２４ゲージカテーテルを右橈骨動脈に配置し、自家動脈血を取りだした。動物は、頭を３０度曲げた状態でヘッドホルダーに配置した。外科顕微鏡による後頭の正中切開にて、前環椎後頭膜を露出させ、２７ゲージの針を小脳延髄槽に穿刺した。０．１ｍｌの髄液を上記針にて取り出し、その後０．３ｍｌの自家血液または生理食塩水を５分間かけてゆっくりと注入した。ラットは、頭を下にして１０分間放置した後、覚醒させた。
ラット脳血管攣縮モデルは、文献記載の方法に準じて行った（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１９９９，Ｊｕｌ，１０４（１），５９−６６）。即ち、ＳＤラット大槽内に自家動脈血を１回注入した脳血管攣縮モデル（１回出血モデル）を用いた。１回出血モデルにおいて、自家動脈血の大槽内への注入量は、０．４ｍｌとした。また、対照として、上記自家動脈血に代えて、生理食塩水、またはビヒクルを用いて同様に操作した。
【００１９】
＜実験例３＞  血管造影法
血管造影法（椎骨動脈造影）は、造影剤１ｍｌ（ＩＯＭＥＲＯＮ４００；エーザイ株式会社製）を右橈骨動脈へ注射していった。被爆データは、５０ｍＡＳ、１５０ｋＶ、０．５秒であった。また、焦点−対物間距離を５０ｃｍ、焦点−フィルム間距離を１００ｃｍとして測定した。
【００２０】
＜実験例４＞  動脈径の測定
脳底動脈の直径は、３箇所（椎骨動脈の節点の０．５ｍｍ上方、中間点、後脳大動脈の分岐点のすぐ下）で測定した。３人の熟練した技術者が、治療群に関する情報を知らされない状態で、コンピュータモニターにて脳底動脈の直径を３回測定した。ＮＩＨ（米国国立医療研究所）の画像解析ソフト、高解像度スキャナー、マッキントッシュ社製コンピュータを用いて平均値を決定した。
【００２１】
＜実験例５＞  ＲＴ−ＰＣＲ分析
全ＲＮＡは、ＩＳＯＧＥＮ試薬（ニッポンジーン社製）を用いて、脳底動脈から単離した。このＲＮＡ（０．５μｇ）をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて提供業者のプロトコルに従って、逆転写した。結果物のｃＤＮＡは、ＰＣＲ増幅用のテンプレートとして使用した。
ラットＨＳＰ７２ｍＲＮＡ（Ｌ１６７６４）の増幅用プライマーとして、フォワードプライマーには、５’−ＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＴＧＡＡＧ−３’（配列番号１）を、リバースプライマーには、５’−ＡＧＡＧＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号２）を用いた。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して検出した。
【００２２】
＜実験例６＞  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、供給業者のプロトコルに従って実施した。
ラットＨＳＰ７２ｍＲＮＡの増幅用プライマーとして、フォワードプライマーには、５’−ＣＣＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴＡＡＣＴＴＧＡＴＡＡＧ−３’（配列番号３）を、リバースプライマーには、５’−ＴＧＧＡＴＴＡＧＡＧＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＣ−３’（配列番号４）を用いた。また、ラットＨＳＰ７２ｍＲＮＡの検出用プローブとして、５’（ＦＡＭ）−ＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＴＣＴＧＴ−（ＴＡＭＲＡ）ｐ３’（配列番号５）を用いた。
【００２３】
ラットβ−アクチンの増幅用プライマーとして、フォワードプライマーには、５’−ＴＧＡＡＣＡＣＧＧＣＡＴＴＧＴＡＡＣＣＡＡＣ−３’（配列番号６）を、リバースプライマーには、５’−ＣＡＧＴＧＧＴＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡ−３’（配列番号７）を用いた。また、ラットβ−アクチンｍＲＮＡの検出用プローブとして、５’（ＦＡＭ）−ＴＧＴＡＣＧＴＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＴＣＴＣＴＴＧ−（ＴＡＭＲＡ）ｐ３’（配列番号８）を用いた。
【００２４】
なお、ＰＣＲ反応と、その結果起きる蛍光染色発光は、７７００−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、リアルタイムにモニターした。シグナルは、ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｖ１．６．３  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して分析した。
【００２５】
＜実験例７＞  ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドの大槽への注射
アンチセンスＨＳＰ７２オリゴヌクレオチド（以下、「ＯＤＮ」という）シークエンスとして、５’−ＴＧＴＴＴＴＣＴＴＧＧＣＣＡＴ−３’（配列番号９）を用いた。センスＨＳＰ７２ＯＤＮシークエンスとして、５’−ＡＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡ−３’（配列番号１０）を用いた。アンチセンスＨＳＰ７２ＯＤＮ及びセンスＨＳＰ７２ＯＤＮは、それぞれ生理食塩水で希釈して、２００μＭの濃度とした。
ＯＤＮ溶液は、２回に渡って大槽に注射した。最初の注射（０．５ｍｌ）は、クモ膜下出血を起こす４８時間前に投与した。次の注射（０．５ｍｌ）は、クモ膜下出血を起こす２４時間前に投与した。なお、各ＯＤＮ溶液については、細胞毒性は観察されなかった。シークエンスの類似性は、ジーンバンクに存在する報告済みのＤＮＡシークエンスと比べてチェックした。
【００２６】
＜実験例８＞  ウエスタンブロット分析
タンパク質の５０μｇ当量を１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、ニトロセルロース膜へ転写した。この膜をラットＨＳＰ７２に対するウサギポリクローナル抗体、ＳＰＡ−７６０（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の１：２００００の希釈溶液を使用してインキューベートした。シグナル増幅は、高度化学発光（ＥＣＬ）検出キットを用いて行った。
【００２７】
＜実験例９＞  ＧＧＡの経口投与
ＧＧＡは、ＧＧＡ１００質量％に対してアラビアゴム５質量％及びトコフェロール０．００８質量％を加えて、エマルジョン化して経口投与した。
脳内あるいは脳底動脈内におけるＨＳＰ７２の発現の時間依存性を調査するため、ＧＧＡを単一の投与量（４００ｍｇ／ｋｇ）で投与してから０時間、４時間、１２時間、２４時間、４８時間後にラットを死亡させた。
【００２８】
また、ＨＳＰ７２発現の投与量依存性を調べるため、ラットはＧＧＡを各種の投与量（０，４００，６００，８００ｍｇ／ｋｇ）で投与してから２４時間後に死亡させた。
ＧＧＡやビヒクルの投与による処置を伴うクモ膜下出血後、脳底動脈内のＨＳＰ７２誘導はＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット法や血管造影にて評価した。ＧＧＡ投与群ラットは、１２時間毎にＧＧＡ（４００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。クモ膜下出血群のラットは、自家血０．４ｍｌを注射し、同量（４００ｍｇ／ｋｇ）のビヒクルを１２時間毎に経口投与した。クモ膜下出血とＧＧＡ群のラットは、自家血０．４ｍｌを注射し、１２時間毎にＧＧＡ（４００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。
【００２９】
＜実験結果＞
ＲＴ−ＰＣＲ法によると、クモ膜下出血後第１日目及び第２日目のＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現は、クモ膜下出血を起こさない場合に比べて、３倍以上に増加した。また、生理食塩水を投与した場合に比べると、クモ膜下出血後第２日目のＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現は、３倍以上に増加した（図１）。クモ膜下出血後の脳底動脈における構成的ＨＳＰ７３ｍＲＮＡは、生理食塩水の投与によっては変わらなかった（図１）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法の結果からも、クモ膜下出血後第２日目のＨＳＰ７２ｍＲＮＡは、有意に（１．８倍程度）誘導されていることが判明した（図２）。しかしながら、生理食塩水投与後またはクモ膜下出血後において、第１日目のＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現量には、違いが見られなかった。ＨＳＰ７２タンパク質の発現は、誘導的ＨＳＰ７２に対して特異的に反応する抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した。その結果、第２日目には、ＨＳＰ７２タンパク質が有意に誘導されている（２．３倍）ことが分かった（図３）。
【００３０】
脳底動脈におけるクモ膜下出血後の血管攣縮試験は、血管造影法によって実施された（図７）。クモ膜下出血を起こしたラットにおいては、血管攣縮は第１日目から観察され、第２日目において最高値となり、動脈径はベースライン（開始前の径）に比べて８６％に減少した。その後、血管攣縮は徐々に解消し、第７日目にはベースラインに戻った。
【００３１】
脳底動脈におけるＨＳＰ７２の発現の重要性を確認するために、ＨＳＰ７２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）を用いて、ＨＳＰ７２タンパク質の発現を抑制した。ＲＴ−ＰＣＲ法の結果によれば、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮを投与した場合には、第２日目におけるＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現増加は抑制されていることが分かった（図４）。デンシトメータを用いた解析によれば、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮを投与した場合には、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮを投与した場合に比べると、ＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現量は、６３％に減少していた。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法の結果からも、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮを投与した場合には、第２日目のＨＳＰ７２ｍＲＮＡ発現量は有意に抑制されている（０．７４倍）ことが判明した（図５）。
【００３２】
アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮによる転写段階での抑制が、タンパク質レベルでの発現を抑制しているかどうかを確認するために、ウエスタンブロット解析を行った。その結果、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮは、ＨＳＰ７２タンパク質の発現を抑制していることが分かった（図６）。デンシトメータを用いた解析によれば、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮは、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮに比べると、ＨＳＰ７２タンパク質を約７５％に抑えていた。
【００３３】
血管造影法によれば、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮ、又はセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮを大槽に投与した場合には、クモ膜下出血後第２日目と第３日目の動脈径には、有意な差異が認められた（図７）。すなわち、アンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮを大槽内に投与した場合には、血管攣縮は有意に増悪した。これに対して、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮを投与した場合には、クモ膜下出血後の血管攣縮には、影響を与えなかった。いずれの群においても、血管攣縮は、クモ膜下出血後第７日目には回復した。
【００３４】
脳または脳底動脈におけるＨＳＰ７２の発現に対するＧＧＡの用量依存的な影響を確認するために、経口投与後２４時間目の評価を行った（図８）。脳及び脳底動脈のいずれにおいても、ＨＳＰ７２の発現は、４００ｍｇ／ｋｇの投与量で認められ、用量に依存して６００ｍｇ／ｋｇの投与量でピークに至った。
【００３５】
また、脳または脳底動脈におけるＨＳＰ７２の発現に対するＧＧＡの時間依存的な影響を確認するために、単一の用量（４００ｍｇ／ｋｇ）を投与した後の経時的な評価を行った（図９）。脳におけるＨＳＰ７２の発現は、ＧＧＡ投与後４時間でピークに達し、その後徐々に減少して４８時間目には見られなくなった。一方、脳底動脈におけるＨＳＰ７２の発現は、ＧＧＡ投与後４時間目から認められ、１２時間目でピークに達した後、徐々に減少して４８時間目には見られなくなった。
【００３６】
脳底動脈において、ＧＧＡ投与によるＨＳＰ７２の発現変化を、ＲＴ−ＰＣＲ法及びウエスタンブロット法を用いて検討した（図１０及び図１１）。生食大槽内投与後、４回ＧＧＡを経口投与した２日目では、２回ＧＧＡを投与した１日目に比べ、脳底動脈のＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現レベル有意に上昇は、投与量依存性であった。これは、くも膜下出血後も同様に、投与量依存性に上昇していた。さらに、２日目の各群を比較すると、生食大槽内投与に比べ、ＳＡＨでは、ＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現レベルが有意に上昇していた。ＧＧＡ経口投与、ヴィークル経口投与ともに、くも膜下出血後２日目、３日目で、ＨＳＰ蛋白質の顕著な誘導がみられた。
ＧＧＡ投与後、２日目では、生食大槽内投与とくも膜下出血ではＨＳＰ７２蛋白質の発現レベルは同程度であったが、３日目ではくも膜下出血でＨＳＰ７２蛋白質の発現が有意に上昇していた。
【００３７】
血管造影法によれば、ＧＧＡまたはビィークルを投与した後にクモ膜下出血を起こすと、第１日目〜第３日目において、動脈径に有意な変化が認められた（図１２）。図から明らかなように、ＧＧＡを経口投与すると、血管攣縮は改善された。
【００３８】
【発明の効果】
クモ膜下出血後の遺伝子発現プロフィールの変化から解析したところ、ヒートショックプロテインの発現誘導を行う物質をスクリーニングすることにより、クモ膜下出血後の血管攣縮を抑制できる物質を見出すことに成功した。
また、このスクリーニングによって見出されたＧＧＡを投与することにより、脳底動脈にヒートショックプロテインを誘導し、クモ膜下出血後の脳血管攣縮を抑制することができた。
【００３９】
【配列表】
2004224744.tif 000005
2004224744.tif 000006
2004224744.tif 000007
2004224744.tif 000008
2004224744.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】大槽内に生理食塩水、または自己動脈血（クモ膜下出血モデル）を注入した後のＨＳＰ７２，ＨＳＰ７３，及びβアクチンの発現量を確認するために、脳底動脈におけるＲＴ−ＰＣＲを行ったサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真図である。
【図２】大槽内に生理食塩水、または自己動脈血（クモ膜下出血モデル）を注入した後に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を行ったときのＨＳＰ７２／βアクチン発現量比を示すグラフ図である。
【図３】大槽内に生理食塩水、または自己動脈血（クモ膜下出血モデル）を注入した後に、ＨＳＰ７２に対するウエスタンブロット法を行ったときの写真図である。
【図４】クモ膜下出血を起こす前にアンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮまたは、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮを大槽内に投与した場合において、クモ膜下出血後のＨＳＰ７２ｍＲＮＡ発現量を確認したＲＴ−ＰＣＲサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真図である。
【図５】クモ膜下出血を起こす前にアンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮまたは、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮを大槽内に投与した場合において、クモ膜下出血後のＨＳＰ７２ｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で確認したときのＨＳＰ７２／βアクチン発現量比を示すグラフ図である。
【図６】クモ膜下出血を起こす前にアンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮまたは、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮを大槽内に投与した場合において、クモ膜下出血後にＨＳＰ７２に対するウエスタンブロット法を行ったときの写真図である。
【図７】クモ膜下出血を起こす前にアンチセンスＨＳＰ７２−ＯＤＮまたは、センスＨＳＰ７２−ＯＤＮを大槽内に投与した場合において、クモ膜下出血を起こした後の血管攣縮を経時的に血管造影法で確認したときの結果を示すグラフである。
【図８】ＧＧＡ（０，４００，６００，８００ｍｇ／ｋｇ）投与後、２４時間目において、脳または脳底動脈でのＨＳＰ７２の発現をＲＴ−ＰＣＲ法で確認したときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真図である。
【図９】ＧＧＡ（４００ｍｇ／ｋｇ）投与後、脳または脳底動脈におけるＨＳＰ７２の経時的な発現をＲＴ−ＰＣＲ法で確認したときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真図である。
【図１０】各処置（クモ膜下出血＋ビヒクル、生理食塩水＋ＧＧＡ、クモ膜下出血＋ＧＧＡ）を行った場合において、ＨＳＰ７２の発現をＲＴ−ＰＣＲ法で確認したときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真図である。
【図１１】各処置（クモ膜下出血＋ビヒクル、生理食塩水＋ＧＧＡ、クモ膜下出血＋ＧＧＡ）を行った場合において、ＨＳＰ７２タンパク質の発現をウエスタンブロット法で確認したときの写真図である。
【図１２】ビィークルまたはＧＧＡを前投与した場合に、クモ膜下出血を起こした後の血管攣縮を経時的に血管造影法で確認したときの結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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