(57)【要約】【課題】ヒトＴＧＦ−βの作用により惹起される種々の臓器での組織線維症、組織線維症を伴う疾患（腎硬化症、肺線維症、肝硬変など）、関節リウマチ、血管再狭窄、及び／または皮膚のケロイドなどの種々の疾患の効率的な治療に有用な高親和性抗ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体モノクローナル抗体を提供する。【解決手段】組織繊維症などの種々疾患の治療に有用なヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対するモノクローナル抗体の作製について鋭意検討し、ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対して極めて高い結合親和性及び中和活性を有するモノクローナル抗体を得ることに成功した。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その重鎖の可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡがヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメント３−２３に由来することを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項２】
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その軽鎖の可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡがヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントＡ３０に由来することを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項３】
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その重鎖の可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡがヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメント３−２３に由来し、且つその軽鎖の可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡがヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントＡ３０に由来することを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項４】
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その重鎖の可変領域が下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至１１５番目のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至１１５番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項５】
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その軽鎖の可変領域が下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部：
（ｃ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至１１７番目のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至１１７番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項６】
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その重鎖の可変領域が下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を含み、且つその軽鎖の可変領域が下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至１１５番目のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至１１５番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至１１７番目のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至１１７番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項７】
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その重鎖の可変領域が下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有することを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至４５８番目のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至４５８番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項８】
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その軽鎖の可変領域が下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有することを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部：
（ｃ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至２３６番目のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至２３６番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項９】
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その重鎖の可変領域が下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、且つその軽鎖の可変領域が下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有することを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至４５８番目のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至４５８番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至２３６番目のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至２３６番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項１０】
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体との解離定数（Ｋｄ）が、１０×１０−１０（Ｍ）より小さい数値であることを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項１１】
該モノクローナル抗体が、ヒトモノクローナル抗体である請求項１乃至請求項１０のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項１２】
請求項１乃至請求項１１のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生する細胞。
【請求項１３】
該細胞が、該ヒトモノクローナル抗体を産生する能力を哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動物由来のミエローマ細胞とを融合して得られる融合細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
該細胞が、該モノクローナル抗体の重鎖をコードするＤＮＡ若しくはその軽鎖をコードするＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ、または両方のＤＮＡが細胞内に導入されることにより形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１乃至請求項１１のいずれかに記載のモノクローナル抗体若しくはその一部、及び薬学的に許容されうる担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１６】
該医薬組成物が、ヒトＴＧＦ−βがヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合することにより生ずるシグナルの細胞内への伝達を阻害するために用いられることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
該医薬組成物が、組織の線維化を抑制するために用いられることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
該組織の線維化が、肺、肝臓、腎臓または皮膚における線維化であることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
該組織の線維化が、腎臓における線維化であることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
該医薬組成物が、腎臓疾患の治療または予防に用いられることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
該医薬組成物が、腎硬化症、肺線維症、肝硬変、血管再狭窄、動脈硬化症、乾癬、強皮症、アトピー、ケロイドまたは関節炎を抑制または治療するために用いられることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
配列番号６のアミノ酸番号２乃至１１５番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号６のアミノ酸番号２乃至４５８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号６のアミノ酸番号２乃至４５８番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖ポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号８のアミノ酸番号２乃至１１７番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号８のアミノ酸番号２乃至２３６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号８のアミノ酸番号２乃至２３６番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２１乃至請求項２６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２９】
配列番号７の塩基番号９６乃至４４０番目の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項３０】
配列番号７の塩基番号９６乃至１４７２番目の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項３１】
配列番号９の塩基番号３９乃至３８９番目の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項３２】
配列番号９の塩基番号３９乃至７４９番目の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項３３】
請求項２９乃至請求項３２のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項３４】
請求項２９乃至請求項３２のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクターで形質転換された細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトトランスフォーミング成長因子−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）のＩＩ型受容体（以下「ＴＧＦ−βＩＩ型受容体」または「ＴβＲＩＩ」と呼ぶこともある。）に結合するモノクローナル抗体（特には、ヒトモノクローナル抗体）若しくはその一部、該モノクローナル抗体を産生する細胞、該モノクローナル抗体を含んでなる医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
正常ラットの線維芽細胞の増殖因子に探索において、正常細胞の形質転換を促進する分子として見出された２つの増殖因子は、トランスフォーミング成長因子−α（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ−α；ＴＧＦ−α）とトランスフォーミング成長因子−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ−β；ＴＧＦ−β）と命名された。その後の研究により、ＴＧＦ−αは上皮増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ；　ＥＧＦ）ファミリーに属する分子であり、一方、ＴＧＦ−βは、ほとんどの種類の細胞で産生され、その受容体も各臓器及び細胞で広く発現されている（Ｂｉｏｌ．　Ｓｉｇｎａｌｓ．，　Ｖｏｌ．５，　ｐ，２３２，　１９９６及びＰｕｌｍｏｎａｒｙ　Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，　Ｖｏｌ．８０　ｏｆ　Ｌｕｎｇ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　ＤｉｓｅａｓｅＳｅｒｉｅｓ，　ｅｄ．　ｂｙ　Ｐｈａｎ　ｅｔ　ａｌ，　ｐ．６２７，　Ｄｅｋｋｅｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９９５）。ＴＧＦ−βは細胞の分化及び増殖を制御する活性を有する。ＴＧＦ−βの細胞増殖活性は、細胞の種類によって大きく異なる（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ，　Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−βｓ，　Ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，　Ｐａｒｔ　Ｉ，　ｅｄ．　ｂｙ　Ｓｐｏｒｎ，　Ｍ．Ｂ．　＆　Ｒｏｂｅｒｔｓ，　Ａ．Ｂ．，　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，　Ｂｅｒｌｉｎ，　１９９０，　ｐ．４１９−４７２）。例えば、線維芽細胞や血管平滑筋細胞などの間葉系の細胞に対しては細胞増殖を促進する活性を有する一方で、上皮細胞、血管内皮細胞及び血球系細胞などの多種の細胞に対しては増殖促進よりもむしろ増殖の抑制をする因子として働くことが明らかにされた。さらに、ＴＧＦ−βは細胞増殖の制御だけでなく、免疫系の制御やコラーゲン、ファイブロネクチン及びテニシンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ；Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ）の蓄積促進などの多彩な機能を有することが明らかにされた（Ａｄｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　Ｖｏｌ．５５，　ｐ．１８１，　１９９４及びＳｅｍｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．５，　ｐ．３８９，　１９９４）。
【０００３】
最近になって、ＴＧＦ−βのこの多彩な機能のメカニズムが、ＴＧＦ−β受容体の構造とシグナル伝達の特有性に由来することが明らかにされつつある。
ＴＧＦ−βは、分子量約２５ｋＤの蛋白質で、２本のペプチドでダイマーを構成する。ＴＧＦ−βには５つのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）が存在し、哺乳動物ではＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３があり、ニワトリではＴＧＦ−β４が、またカエルではＴＧＦ−β５が存在する。これらのアイソフォームは互いに約７０％の相同性を有する。
【０００４】
ＴＧＦ−βのうちＴＧＦ−β１については、特にその機能が解析されている。ＴＧＦ−β１は、生体組織における創傷の治癒過程において極めて重要な役割をする（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．，　Ｖｏｌ．３３１，　ｐ．１２８６，　１９９４及びＪ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．１１９，　ｐ．１０１７，　１９９２）。組織の創傷部位では、炎症細胞や線維芽細胞の浸潤、ＥＣＭの増生と血管新生、及び組織再生のための細胞増殖などの迅速かつダイナミックな生体反応が起こり傷が修復される。
【０００５】
創傷時にはまず出血が起こり、次いで血小板からＴＧＦ−βやＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）が産生されるとともに、創傷部位のＥＣＭに結合している不活性型ＴＧＦ−βを活性化される。遊走してきた細胞や創傷部位の細胞は、そのように産生された高濃度のＴＧＦ−βに曝させることにより、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ）及びＩＬ−１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）などの増殖因子やサイトカインを分泌し、また線維芽細胞ではＥＣＭの合成及び分泌が起こる。
さらに、例えば、線維芽細胞や間葉細胞では、血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　（ＰＤＧＦ））や結合組織成長因子（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　（ＣＴＧＦ）；Ｈｃｓ２４とも呼ぶ。Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．１１４，　Ｎｏ．６，　ｐ．１２８５−１２９４，　１９９１；Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２９，　Ｎｏ．１，　ｐ．１５３−１６１，　１９９７；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，　Ｖｏｌ．９５，　Ｎｏ．４，　ｐ．８３１−８３９，　１９９７；Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．，　Ｖｏｌ．７，　Ｎｏ．４，　ｐ．４６９−４８０，　１９９６；Ｊ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，　Ｖｏｌ．１０６，　Ｎｏ．４，　ｐ．７２９−７３３，１９９６；Ｊ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，　Ｖｏｌ．１０５，　Ｎｏ．２，　ｐ．２８０−２８４，　１９９５；Ｊ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，　Ｖｏｌ．１０５，　Ｎｏ．１，　ｐ．１２８−１３２，　１９９５；及び国際特許出願公開ＷＯ９６／３８１７２号公報）やファイブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）の産生の増加が観察される。
ＴＧＦ−β１はさらに蛋白質分解酵素の産生を抑える一方で、その酵素阻害剤を増加させるとともに、ＥＣＭの細胞への接着に関与するインテグリンの合成を促しＥＣＭの増生と沈着を助長し、創傷の修復を行うと考えられている。この他に、ＴＧＦ−βは、Ｔリンパ球及びＢリンパ球の機能を抑制し、ＴＮＦやＩＬ−１の合成を阻害することによる免疫抑制作用も有する。
【０００６】
ＴＧＦ−βの発現の制御のメカニズムは未だ未解明な部分もあるが、ＴＧＦ−βがＥＣＭであるプロテオグリカンに結合することによりその発現が制御されるものと考えられている（Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３４６，　ｐ．２８１，　１９９０及びＮａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３６０，　ｐ．３６１，　１９９２）。即ち、ＴＧＦ−βが、ＴＧＦ−β自身が産生促進したＥＣＭにより負の制御を受け、創傷の治癒とともにＴＧＦ−βの過剰な発現が抑制されると考えられている。従って、この負の制御に異常が起こるとＴＧＦ−βの過剰な発現が起こり組織の線維化（線維症）などの病的状態が起こるものと考えられている。
【０００７】
一方、肺線維症や腎硬化症においては、ＥＣＭの沈着が十分に起こっているにもかかわらず、ＴＧＦ−βは高濃度に保たれており、そのうような線維症等の病的状態がさらに進行する（Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．，　Ｖｏｌ．４５，　ｐ．９１６，　１９９４及びＪ．Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　Ｖｏｌ．９２，　ｐ．６３２，　１９９３）。肺線維症や腎硬化症では、組織の傷害が絶えず起こることによりＴＧＦ−βの発現のシグナルが常にオンの状態であるか、上述のようなＴＧＦ−β発現の負の制御シグナルが入らないか、あるいはその両者が相乗的に働くものと推察されている。
【０００８】
腎硬化症は、慢性糸球体腎炎や糖尿病性腎症などの多くの腎疾患の最終像であり、メサンギウム細胞の増殖とＥＣＭの増生により特徴付けられる。腎硬化症の腎臓においては、ＴＧＦ−βの異常発現が認められてきた（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　Ｖｏｌ．９０，　ｐ．１，　１９９２及びＰｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．８６，　ｐ．１０５６，　１９８９）。また抗Ｔｈｙ−１抗体により誘発される実験的腎炎モデルにおいては、抗ＴＧＦ−β抗体の投与により腎炎の進行が抑制されることが示されＴＧＦ−βが腎硬化症の病態形成に関与することが示唆されてきている（Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３４６，　ｐ．３７１，　１９９０）。
【０００９】
一方、肺については、ブレオマイシン投与により誘導される肺線維症や突発性はい線維症では、ＴＧＦ−βが高濃度に発現しており、ＴＧＦ−βの肺線維症の形成に関与することが示唆されてきている。
また、慢性肝炎や肝硬変の患者の生検組織においては、コラーゲンの沈着部位にＴＧＦ−βの発現が認められている。このほか、血管再狭窄、関節リウマチ等の関節炎及び皮膚のケロイドなどにおいてもＥＣＭの沈着とＴＧＦ−βの発現が報告されてきている。
【００１０】
このような事実から、ＴＧＦ−βが種々の組織の線維化（線維症）の病態形成に関与する可能性が示唆されてきており、アンチセンス医薬や遺伝子治療などによりＴＧＦ−βの機能の抑制することにより組織線維症の治療の試みが実験的になされつつある（Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．，　Ｖｏｌ．５０，　ｐ．１４８，　１９９６）。
上述したＴＧＦ−βの種々の機能発現、及びＴＧＦ−βによる組織線維症等の種々の病態の形成は、ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β受容体に結合することにより細胞内にシグナルが伝達することにより開始される。
【００１１】
ヒト及びラット等の哺乳動物におけるＴＧＦ−βの受容体としては、これまでにＩ型受容体（分子量約５３ｋＤ；ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：Ｌ１１６９５；Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．７５，　Ｎｏ．４，ｐ．６８１，　１９９３；以下「ＴＧＦ−βＩ型受容体」（ＴＧＦ−βＴｙｐｅＩ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）または「ＴβＲＩ」と呼ぶこともある。）、ＩＩ型受容体（分子量約７０ｋＤ；ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：Ｍ８５０７９；Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．６８，　Ｎｏ．４，　ｐ．７７５，　１９９２；以下「ＴＧＦ−βＩＩ型受容体」（ＴＧＦ−βＴｙｐｅＩＩ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）または「ＴβＲＩＩ」と呼ぶこともある。）及びＩＩＩ型受容体（分子量約２００−３００ｋＤ；ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：Ｌ０７５９４；Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．６７，　Ｎｏ．４，　ｐ．７８５，　１９９１；Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．６７，　Ｎｏ．４，　ｐ．７９７，　１９９１；及びＢｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　Ｖｏｌ．１８９，　Ｎｏ．１，　ｐ．３５６，　１９９２；以下「ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体」（ＴＧＦ−βＴｙｐｅＩＩＩ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）または「ＴβＲＩＩＩ」と呼ぶこともある。）の３つの受容体が同定され構造が明らかにされている（Ａｄｖ．　Ｉｍｍ．，　Ｖｏｌ．５５，　ｐ．１８１，　１９９４）。
【００１２】
それらの受容体の役割については、人為的に樹立されたＴＧＦ−βに抵抗性のミンク肺上皮細胞株Ｍｖ１Ｌｕの変異株を用いてそれらの受容体の機能解析により、それら３つの受容体のうちＴＧＦ−βＩ型受容体とＴＧＦ−βＩＩ型受容体がＴＧＦ−βのシグナル伝達に重要かつ必須であることが明らかにされている（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．２６５，　ｐ．１８５１８，　１９９０及びＪ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．２６６，　ｐ．９１０８，　１９９１）。一方、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体は、ＴＧＦ−βのシグナル伝達には必須ではなく、間接的な役割を演じていると考えられている。
【００１３】
ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体は、８４９個のアミノ酸からなる細胞膜貫通蛋白質であり、細胞外領域（７６１個のアミノ酸）、細胞膜貫通領域（２４個のアミノ酸）及び細胞内領域（４３個のアミノ酸）から構成される。ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体の細胞内領域は、セリン（Ｓｅｒ）／スレオニン（Ｔｈｒ）残基に富み、４０％以上を占める。
ＴＧＦ−βＩ型受容体は、５０３個のアミノ酸からなる細胞膜貫通蛋白質であり、細胞外領域（１０１個のアミノ酸）、細胞膜貫通領域（２２個のアミノ酸）及び細胞内領域（３５６個のアミノ酸）から構成される。
【００１４】
ＴＧＦ−βＩＩ型受容体は、同様に５６７個のアミノ酸からなる細胞膜貫通蛋白質であり、シグナル配列（２３個のアミノ酸）、細胞外領域（１３６個のアミノ酸）、細胞膜貫通領域（３０個のアミノ酸）及び細胞内領域（３７８個のアミノ酸）から構成される。
ＴＧＦ−βＩ型受容体及びＴＧＦ−βＩＩ型受容体は、細胞外領域が比較的短く、２箇所のキナーゼ挿入部位を有するセリン／スレオニンキナーゼ構造を有する１回膜貫通型蛋白質である。また、細胞内領域にはアスパラギン酸（Ａｓｐ）結合型糖鎖が結合し、システイン（Ｃｙｓ）残基がＴＧＦ−βＩ型受容体には１０個及びＴＧＦ−βＩＩ型受容体には１２個見られ、特徴的な蛋白三次構造をとっている。
【００１５】
ＴＧＦ−βＩ型受容体の細胞内領域には、キナーゼ領域に隣接してＧＳ領域を呼ばれるグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）及びスレオニン（Ｔｈｒ）に富む領域が見られる。ＴＧＦ−βＩＩ型受容体もＴＧＦ−βＩ型受容体と似た構造ではあるが、ＧＳ領域は有しない。
ＴＧＦ−βＩ型受容体及びＴＧＦ−βＩＩ型受容体のキナーゼ領域は、約４３％の相同性を有し、ともにセリン／スレオニンに特異的なプロテインキナーゼであることが示されているが、ＴＧＦ−βのシグナルが細胞内に伝達されるためには、両者のセリン／スレオニンキナーゼ領域が作用することが必要であることが明らかとされている（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．２６９，　ｐ．３０７５３，　１９９４）。
【００１６】
ＴＧＦ−βのシグナルの細胞内への伝達には、ＴＧＦ−βＩ型受容体とＴＧＦ−βＩＩ型受容体の必須である。ＴＧＦ−βＩＩ型受容体は単独でＴＧＦ−βと結合するが、ＴＧＦ−βＩ型受容体単独ではＴＧＦ−βに結合しない。ＴＧＦ−βのシグナルの細胞内への伝達には、ＴＧＦ−βＩ型受容体及びＴＧＦ−βＩＩ型受容体の両者が細胞表面で複合体を形成することが重要である。
【００１７】
ＴＧＦ−βがＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合すると、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体はＴＧＦ−βＩ型受容体と細胞表面でヘテロ４量体の複合体を形成することが示されている（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．２６９，　ｐ．２０１７２，　１９９４）。即ち、ＴＧＦ−βＩ型受容体は、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体の基質として働き、ＴＧＦ−βの存在下に両者が複合体を形成すると、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体がＴＧＦ−βＩ型受容体のＧＳ領域をリン酸化することによってＴＧＦ−βＩ型受容体が活性化され、その結果細胞内の他の基質をリン酸化することによりＴＧＦ−βのシグナルがさらに下流へと伝達されると考えられている（Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３７０，　ｐ．３４１，　１９９４）。
【００１８】
ＴＧＦ−βのシグナルのＴＧＦ−βＩ型受容体より下流への伝達の経路の詳細については未だ不明の点も残っているが、最近になってＴＧＦ−βＩ型受容体より下流に位置しＴＧＦ−βのシグナル伝達を媒介する８つのアイソフォームからなりＳｍａｄ（Ｓ　Ｍｏｔｈｅｒｓ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｄｐｐ）と総称されるシグナル伝達分子（Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３８１，　ｐ．６２０，　１９９６；　Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．８６，　ｐ．５４３，　ｐ．１９９６；　Ｎａｔｕｒｅ，　３８３，　ｐ．１６８，　１９９６；及びＮａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３８３，　ｐ．８３２，　１９９６）、及びＴＡＫ１（ＴＧＦ−β　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｋｉｎａｓｅ−１）と呼ばれるシグナル伝達分子（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．２７０，　ｐ．２００８，　１９９５）が同定されている。Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３は、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体と複合体を形成することにより活性化されたＴＧＦ−βＩ型受容体に結合し、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体のキナーゼでリン酸化された後、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体から離れ、Ｓｍａｄ４（ＤＰＣ４）と複合体を形成した後核内に移行することが明らかにされている（Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．８７，　ｐ．１２１５，　１９９６及びＥＭＢＯ　Ｊ．，　Ｖｏｌ．１６，　Ｎｏ．１７，　１９９７）。核内に移行したＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ４またはＳｍａｄ３／Ｓｍａｄ４複合体は、ＤＮＡ結合蛋白質（転写因子）と結合し転写活性因子として働き遺伝子の発現を制御すると考えられている（Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３８３，　ｐ．８３２，　１９９６及びＮａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３９０，　ｐ．４６５，　１９９７）。
ＴＡＫ１は、ＭＡＰキナーゼカスケード上でＭＡＰＫＫＫとして働くことによりＴＧＦ−βのシグナル伝達に関与することが示されている。
【００１９】
上述したように、ＴＧＦ−βは、腎硬化症、肺線維症や肝硬変等の種々の組織線維症、さらに慢性肝炎、関節リウマチ、血管再狭窄及び皮膚のケロイド等の種々病態の形成に深く関与しており、これらの病態の形成は、ＴＧＦ−βのシグナルがＴＧＦ−β受容体を介して細胞内に伝達されることにより起こるものと考えられる。
従って、ＴＧＦ−βのシグナルの細胞内への伝達を制御、とりわけ抑制することにより、それらの病態を治療または予防できる可能性が示唆される。
ＴＧＦ−βのシグナル伝達の抑制によるそれらの病態の治療の試みについては、ＴＧＦ−βをターゲットとし、ＴＧＦ−βに対する抗体あるいはＴＧＦ−β遺伝子に対するアンチセンスを用いてＴＧＦ−βの機能を抑制することにより腎炎等の病態を抑制しようとする試みがなされている。
【００２０】
しかしながら、ＴＧＦ−βの結合の相手方であるＴＧＦ−β受容体、とりわけＴＧＦ−βＩＩ型受容体の機能の抑制、換言すればＴＧＦ−βＩＩ型受容体をターゲットとし、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を介したＴＧＦ−βの細胞内へのシグナル伝達を阻害することによる疾患の治療についてはほとんど報告されていない。
【００２１】
このような中、本発明者らはヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対するヒトモノクローナル抗体に関して鋭意研究し、ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合する種々のヒトモノクローナル抗体の作製に成功するともに、種々ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏ試験により該ヒトモノクローナル抗体がＴＧＦ−βＩＩ型受容体を介するＴＧＦ−βの細胞内へのシグナル伝達を阻害し、腎炎等の腎疾患の治療に有用であることを世界に先駆けて初めて報告した（Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．，　Ｖｏｌ．６０，　Ｎｏ．５，　ｐ．１７４５−５５，　２００１；及び国際出願公開ＷＯ０１−３６６４２号公報）。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】
モノクローナル抗体を用いた疾患治療においては、該モノクローナル抗体の標的抗原への結合親和性の高さ及び該標的抗原の活性の中和活性の強さが重要な因子の一つとなる。
従って、本発明者らが目指すヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対するモノクローナル抗体（特にはヒトモノクローナル抗体）を用いた種々疾患（例えば、腎硬化症、肺線維症や肝硬変等の種々の組織線維症、さらに慢性肝炎、関節リウマチ、血管再狭窄及び皮膚のケロイド等）の治療または予防を効率的（種々側面における効率性：医学的側面、薬学的側面、製造技術的側面、経済的側面、社会的側面など）に達成するためには、できる限り高い抗原親和性と抗原中和活性を有する抗ＴＧＦ−βＩＩ型受容体モノクローナル抗体を作製するのが好ましい。
【００２３】
即ち、本発明は、そのような種々疾患の効率的な治療及び予防を可能たらしむる高親和性／高中和活性を有する抗ＴＧＦ−βＩＩ型受容体モノクローナル抗体（特にはヒトモノクローナル抗体）、該モノクローナル抗体からなる医薬組成物並びにそれらを用いる該疾患の療方法を提供することを目的とする。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の目的を達成するために、ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対するヒトモノクローナル抗体に関して鋭意研究した結果、ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対する極めて高い結合親和性と該受容体の活性の高い中和活性を有するモノクローナル抗体を作製することに世界に先駆けて初めて成功した。
【００２５】
さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を介するＴＧＦ−βの細胞内へのシグナル伝達を有意に阻害するのみならず、種々疾患（例えば、腎疾患（例えば、腎炎、腎線維症、腎硬化症など）、腎線維症及び肺線維症等の種々の組織線維症、肝硬変、関節リウマチ、皮膚ケロイドなど）の治療効果を有することを見出し、本発明を完成するに到った。
【００２６】
本発明に含まれるモノクローナル抗体の一態様であるヒトモノクローナル抗体は、ヒトに由来する抗体であることから、マウス由来の抗体等の非ヒト哺乳動物由来の抗体からなる抗体医薬品の治療上の大きな問題点（副作用）であったヒトに対する抗原性、即ちＨＡＭＡ（Ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）に起因する宿主の重篤な免疫拒絶反応を全く惹起しないことから、抗体の医薬品としての価値を劇的に増大させるものである。
【００２７】
本発明のモノクローナル抗体またはその一部を含んでなる医薬組成物は、ＴＧＦ−βの作用に起因する種々の疾患、例えば、腎疾患（腎繊維症、腎炎、腎不全、腎硬硬化症など）、肺疾患（例えば、肺線維症、肺炎など）、肝臓疾患（例えば、肝臓組織繊維症、肝硬変、肝炎など）、皮膚疾患（例えば、創傷、強皮症、、乾癬、ケロイドなど）、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症など）、血管疾患（例えば、血管再狭窄、リウマチ性血管炎など）、種々臓器での組織繊維症（種々の癌で併発する組織線維症を含む）、及び動脈硬化症（併発する組織繊維症を含む）などの発症及び／または進行を抑制、阻止し、該疾患を治療または予防するための医薬品として有用である。
【００２８】
即ち、本発明の下記（１）乃至（３４）に記載されるとおりの発明である。
（１）　ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その重鎖の可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡがヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメント３−２３に由来することを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部。
（２）　ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その軽鎖の可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡがヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントＡ３０に由来することを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部。
（３）　ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その重鎖の可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡがヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメント３−２３に由来し、且つその軽鎖の可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡがヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントＡ３０に由来することを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部。
（４）　ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その重鎖の可変領域が下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至１１５番目のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至１１５番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
（５）　ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その軽鎖の可変領域が下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部：
（ｃ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至１１７番目のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至１１７番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
（６）　ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その重鎖の可変領域が下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を含み、且つその軽鎖の可変領域が下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至１１５番目のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至１１５番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至１１７番目のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至１１７番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
（７）　ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その重鎖の可変領域が下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有することを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至４５８番目のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至４５８番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
（８）　ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その軽鎖の可変領域が下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有することを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部：
（ｃ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至２３６番目のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至２３６番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
（９）　ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、その重鎖の可変領域が下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、且つその軽鎖の可変領域が下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有することを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至４５８番目のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号２乃至４５８番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至２３６番目のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号２乃至２３６番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列。
（１０）　ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体であって、ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体との解離定数（Ｋｄ）が、１０×１０−１０（Ｍ）より小さい数値であることを特徴とするモノクローナル抗体またはその一部。
（１１）　該モノクローナル抗体が、ヒトモノクローナル抗体である前記（１）乃至（１０）のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその一部。
（１２）　前記（１）乃至（１１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生する細胞。
（１３）　該細胞が、該ヒトモノクローナル抗体を産生する能力を哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動物由来のミエローマ細胞とを融合して得られる融合細胞であることを特徴とする前記（１２）に記載の細胞。
（１４）　該細胞が、該モノクローナル抗体の重鎖をコードするＤＮＡ若しくはその軽鎖をコードするＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ、または両方のＤＮＡが細胞内に導入されることにより形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする前記（１２）に記載の細胞。
（１５）　前記（１）乃至（１１）のいずれかに記載のモノクローナル抗体若しくはその一部、及び薬学的に許容されうる担体とを含んでなる医薬組成物。
（１６）　該医薬組成物が、ヒトＴＧＦ−βがヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合することにより生ずるシグナルの細胞内への伝達を阻害するために用いられることを特徴とする前記（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）　該医薬組成物が、組織の線維化を抑制するために用いられることを特徴とする前記（１５）に記載の医薬組成物。
（１８）　該組織の線維化が、肺、肝臓、腎臓または皮膚における線維化であることを特徴とする前記（１７）に記載の医薬組成物。
（１９）　該組織の線維化が、腎臓における線維化であることを特徴とする前記（１７）に記載の医薬組成物。
（２０）　該医薬組成物が、腎臓疾患の治療または予防に用いられることを特徴とする前記（１５）に記載の医薬組成物。
（２１）　該医薬組成物が、腎硬化症、肺線維症、肝硬変、血管再狭窄、動脈硬化症、乾癬、強皮症、アトピー、ケロイドまたは関節炎を抑制または治療するために用いられることを特徴とする前記（１５）に記載の医薬組成物。
（２２）　配列番号６のアミノ酸番号２乃至１１５番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（２３）　配列番号６のアミノ酸番号２乃至４５８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（２４）　配列番号６のアミノ酸番号２乃至４５８番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖ポリペプチド。
（２５）　配列番号８のアミノ酸番号２乃至１１７番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（２６）　配列番号８のアミノ酸番号２乃至２３６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（２７）　配列番号８のアミノ酸番号２乃至２３６番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド。
（２８）　前記（２２）乃至（２７）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（２９）　配列番号７の塩基番号９６乃至４４０番目の塩基配列を含むＤＮＡ。
（３０）　配列番号７の塩基番号９６乃至１４７２番目の塩基配列を含むＤＮＡ。
（３１）　配列番号９の塩基番号３９乃至３８９番目の塩基配列を含むＤＮＡ。
（３２）　配列番号９の塩基番号３９乃至７４９番目の塩基配列を含むＤＮＡ。
（３３）　前記（２９）乃至前記（３２）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
（３４）　前記（２９）乃至前記（３２）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクターで形質転換された細胞。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明で用いる語句の意味を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
本発明における「哺乳動物」とは、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット等を意味し、好ましくは、ヒト、ウサギ、ラット、ハムスターまたはマウスであり、特に好ましくは、ヒト、ラット、ハムスターまたはマウスである。
本発明で用いられる「ヒト以外の哺乳動物」及び「非ヒト哺乳動物」なる用語は各々同義であり、前述に定義した哺乳動物におけるヒト以外のあらゆる哺乳動物を意味する。
【００３０】
本発明において用いられる「アミノ酸」とは、自然界に存在するあらゆるアミノ酸を意味し、好ましくは、アミノ酸を表記するために用いられるアルファベットの三文字表記法または一文字表記法に従って各々下記のように表されるアミノ酸を意味する。
グリシン（Ｇｌｙ／Ｇ）、アラニン（Ａｌａ／Ａ）、バリン（Ｖａｌ／Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ／Ｉ）、セリン（Ｓｅｒ／Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ／Ｔ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）、アスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｕ／Ｑ）、リジン（Ｌｙｓ／Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ／Ｃ）、メチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ／Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ／Ｙ）、トリプトファン（Ｔｒｐ／Ｗ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）、プロリン（Ｐｒｏ／Ｐ）。
【００３１】
本発明でいう「ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体」（「ＴβＲＩＩ」と称する場合もある。）とは、前述に記載したとおりの既報に報告される構造及び機能を有するヒトのＴＧＦ−βＩＩ型受容体（ｈｕｍａｎ　ＴＧＦ−βｔｙｐｅＩＩ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を意味する（例えば、Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．６８，　Ｎｏ．４，　ｐ．７７５−７８５，　１９９２；　Ａｄｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　Ｖｏｌ．５５，　ｐ．１８１−２２０，　１９９４；　ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．：Ｍ８５０７９）。
該天然型ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体は、下記のような構造的特徴及び性質を有する。
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体は、５６７個のアミノ酸からなる細胞膜貫通蛋白質であり、細胞外領域（１３６個のアミノ酸）、細胞膜貫通領域（３０個のアミノ酸）及び細胞内領域（３７８個のアミノ酸）から構成される。また、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体は、細胞外領域が比較的短く、２箇所のキナーゼ挿入部位を有するセリン／スレオニンキナーゼ構造を有する１回膜貫通型蛋白質である。また、細胞内領域にはアスパラギン酸（Ａｓｐ）結合型糖鎖が結合するとともに、システイン（Ｃｙｓ）残基が１２個見られ、特徴的な蛋白三次構造をとっている。
【００３２】
ＴＧＦ−βＩＩ型受容体のキナーゼ領域は、セリン／スレオニンに特異的なプロテインキナーゼであり、ＴＧＦ−βＩ型受容体のキナーゼ領域と約４３％の相同性を有する。このキナーゼ領域は、ＴＧＦ−βのシグナルが細胞内に伝達されるために必須である（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．２６９，　ｐ．３０７５３，　１９９４）。
【００３３】
ＴＧＦ−βＩＩ型受容体は、ＴＧＦ−βＩ型受容体と共同してＴＧＦ−βのシグナルの細胞内への伝達する極めて重要な分子である。ＴＧＦ−βＩＩ型受容体は単独でＴＧＦ−βと結合する。ＴＧＦ−βがＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合すると、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体はＴＧＦ−βＩ型受容体と細胞表面でヘテロ４量体の複合体を形成することが示されている（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．２６９，　ｐ．２０１７２，　１９９４）。ＴＧＦ−βの存在下に両者が該複合体が形成されると、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体は、ＴＧＦ−βＩ型受容体のＧＳ領域（前述）をリン酸化しＴＧＦ−βＩ型受容体が活性化する。その結果細胞内の他の基質をリン酸化することによりＴＧＦ−βのシグナルがさらに下流へと伝達されると考えられている（Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３７０，　ｐ．３４１，　１９９４）。
【００３４】
また、本発明で言う「ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体」（「ＴβＲＩＩ」とも呼ぶ。）には、上述の既報に記載される天然型のタンパク一次構造（アミノ酸配列）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する天然型ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体の変異体も包含する。
【００３５】
ここで「実質的に同一のアミノ酸配列を有する天然型ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体の変異体」とは下記変異蛋白を意味する。
即ち、天然型のヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体と実質的に同等の生物学的性質を有する限り、該アミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が置換、欠失及び／または修飾されているアミノ酸配列を有する変異蛋白、並びに該天然のヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体のアミノ酸配列中にに、複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する変異蛋白。
さらに、そのような置換、欠失、修飾及び付加の複数を有する変異体であってもよい。
本発明におけるヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体は、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。
【００３６】
また、本発明における「ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体」（「ＴβＲＩＩ」とも呼ぶ。）には、該ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体の「一部」も包含される。ここで「一部」とは、前記に定義したヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体のアミノ酸配列中の任意の部分配列を含むポリペプチドを意味する。
好ましくは、前記に定義したヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体の細胞外領域若しくはその任意の一部を意味する。
【００３７】
ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体の「一部」（好ましくはヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体の細胞外領域若しくはその任意の一部）は、後述する当該技術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法に従って、遺伝子組換え技術または化学的合成法により製造することもできるし、また細胞培養方法により単離したヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体をタンパク分解酵素等を用いて適切に切断することにより製造することができる。
【００３８】
本発明の「ヒトモノクローナル抗体」とは、前記に定義したヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するヒトモノクローナル抗体である。
さらに詳細には、イムノグロブリンを構成する重鎖（Ｈ鎖）の可変領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ）及びＨ鎖の定常領域（Ｃｏｎｓｔａｎｔ　Ｒｅｇｉｏｎ）並びに軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するヒトイムノグロブリンである。Ｌ鎖としては、ヒトκ鎖またはヒトλ鎖が挙げられる。
【００３９】
本発明の「ヒトモノクローナル抗体」は、下記のいずれかの免疫原（抗原）を以下に述べるヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫することにより作製することができる。
（イ）　前記に定義したヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体を細胞表面に発現する天然の細胞または人工的に樹立した細胞株。
（ロ）　前記に定義したヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体を細胞表面に発現するように遺伝子組換え技術を用いて作製された遺伝子組換え細胞。
（ハ）　前記（イ）または（ロ）の細胞を可溶化して得た細胞可溶化物（ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅ）、または該ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅから精製したヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体のポリペプチド断片。
【００４０】
（ニ）　前記に定義したヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体の一部（特に好ましくは、その細胞外領域若しくはその任意のペプチド）を可溶性ポリペプチドとして発現するように遺伝子組換え技術を用いて作製された遺伝子組換え細胞。
（ホ）　前記（ニ）の遺伝子組換え細胞を培養して得た培養上清若しくは該培養上清から精製されたヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体の細胞外領域ポリペプチド（可溶性ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体）。
（ヘ）　化学的に合成されたヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体の一部（（特に好ましくは、その細胞外領域若しくはその任意のペプチド）。
【００４１】
さらには、本発明のモノクローナル抗体は、遺伝子組換え技術を用いて、そのような本発明モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡにより宿主細胞を形質転換して得られる遺伝子組換え細胞であって、遺伝子組換えモノクローナル抗体を産生する本発明の「遺伝子組換え細胞」を培養することにより培養上清中から得ることもできる。
また、本発明モノクローナル抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤまたはＩｇＥのいずれのアイソタイプを有するヒトモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）であり、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、特に好ましくはＩｇＧ４である。
【００４２】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、後述するヒト抗体産生トランスジェニックマウスのようなヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に前述の（イ）乃至（ヘ）のいずれかの免疫原（抗原）を免疫し、モノクローナル抗体の既存の一般的な製造方法に従って製造することができる。
即ち、例えば、該抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）とともに、該ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫する。ポリクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。またモノクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）から融合細胞（ハイブリドーマ）を調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
【００４３】
さらに具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、前述の（イ）乃至（ハ）のいずれかの免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）とともに、該ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物（特に好ましくは後述の「ヒト抗体産生トランスジェニックマウス」）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃至５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。免疫を施す回数及び時間的インターバルは、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更することができる。
【００４４】
モノクローナル抗体を分泌する融合細胞（ハイブリドーマ）の調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．２５６，　ｐ．４９５−４９７，　１９７５）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作されたヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合させることにより調製される。
【００４５】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．　ＣＲＬ−１５８０）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ，Ｓｐ２）、ＰＡＩ、Ｆ０あるいはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ．２．３．、ヒト由来ミエローマＵ−２６６ＡＲ１、ＧＭ１５００−６ＴＧ−Ａ１−２、ＵＣ７２９−６、ＣＥＭ−ＡＧＲ、Ｄ１Ｒ１１あるいはＣＥＭ−Ｔ１５を使用することができる。
モノクローナル抗体を産生する細胞（例えば、ハイブリドーマ）のスクリーニングは、該細胞を、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡ（ｒａｄｉｏ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）やＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ　ａｓｓａｙ）等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
【００４６】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
【００４７】
また、該ハイブリドーマあるいは後述する遺伝子組換えモノクローナル抗体を産生する本発明の「遺伝子組換え細胞」からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、トランスジェニック動物作製技術を用いて当該遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタを作製し、当該トランスジェニック動物のミルク中から当該モノクローナル抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である（日系サイエンス、１９９７年４月号、第７８頁乃至８４頁）。
該モノクローナル抗体産生細胞をインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
【００４８】
基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
【００４９】
本発明のモノクローナル抗体には、該抗体を構成する重鎖及び／または軽鎖の各々のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／または軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体も包含される。
【００５０】
ここで、「数個のアミノ酸」とは、複数個のアミノ酸を意味し、具体的には１乃至１０個のアミノ酸であり、好ましくは１乃至５個のアミノ酸である。
本発明のヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列中に、前記のようなアミノ酸の部分的改変（欠失、置換、挿入、付加）は、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより導入することができる。この塩基配列の部分的改変は、既知の部位特異的変異導入法（Ｓｉｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　）を用いて常法により導入することができる（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｓｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．８１，　ｐ．５６６２−５６６６，　１９８４）。
本発明における「ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントに由来する」とは、係るモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖の可変領域をコードするＶ領域のＤＮＡが、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（Ｉｇ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　ｇｅｎｅ　ｌｏｃｕｓ）または軽鎖遺伝子座（Ｉｇ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　ｇｅｎｅ　ｌｏｃｕｓ）に存在する多数のＶ遺伝子セグメントのいずれか１つのＶ遺伝子の核酸配列の転写によるものであり、該Ｖ遺伝子の核酸配列と完全に一致する核酸配列を有すること、あるいは該Ｖ遺伝子の核酸配列と１または数個（具体的には１乃至１０個）の塩基が異なる（ここでは欠失、置換及び／または挿入を意味する。）ことを意味する。
【００５１】
本発明における「ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物」、特に好ましい態様であるヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、既報に従って作製することができる（Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｖｏｌ．７，　ｐ．１３−２１，　１９９４；Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｖｏｌ．１５，　ｐ．１４６−１５６，　１９９７；特表平４−５０４３６５号公報；特表平７−５０９１３７号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３６８，　ｐ．８５６−８５９，　１９９４；及び特表平６−５００２３３号公報など）。
該ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、具体的には、例えば下記の工程からなる手法を用いることにより作製できる。他のヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物も同様にして製造することができる。
【００５２】
（１）マウス内在性イムノグロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で置換することにより該マウス内在性イムノグロブリン重鎖遺伝子が機能的に不活性化されたノックアウトマウスを作製する工程。
（２）マウス内在性イムノグロブリン軽鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で置換することにより該マウス内在性イムノグロブリン軽鎖遺伝子（特にκ鎖遺伝子）が機能的に不活性化されたノックアウトマウスを作製する工程。
（３）酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，　ＹＡＣ）ベクター等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組み込まれたトランスジェニックマウスを作製する工程。
（４）ＹＡＣ等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン軽鎖（特にκ鎖）遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組み込まれたトランスジェニックマウスを作製する工程。
（５）前記（１）乃至（４）のノックアウトマウス及びトランスジェニックマウスを任意の順序で交配することにより、マウス内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座及びマウス内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座がともに機能的に不活性化され、且つヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の所望の領域及ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の所望の領域がともにマウス染色体上に組み込まれたトランスジェニックマウスを作製する工程。
【００５３】
前記ノックアウトマウスは、マウス内在性イムノグロブリン遺伝子座の適当な領域を外来性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で相同組換えにより置換することにより該遺伝子座が再構成（リアレンジメント）できないように不活性化することにより作製できる。該相同組換えを用いた不活性化には、例えば、ポジティブ・ネガティブ・セレクション（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ；　ＰＮＳ）と呼称される方法を用いることができる（日経サイエンス，　５月号，　ｐ．５２−６２，　１９９４）。
イムノグロブリン重鎖遺伝子座の機能的不活性化には、例えば、Ｊ領域またはＣ領域（例えばＣμ領域）の一部に障害を導入することにより達成できる。またイムノグロブリン軽鎖（例えばκ鎖）に機能的不活性化は、例えば、Ｊ領域若しくはＣ領域の一部、またはＪ領域及びＣ領域にまたがる領域を含む領域に障害を導入することにより達成可能である。
【００５４】
トランスジェニックマウスは、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような常法（例えば、最新動物細胞実験マニュアル、エル・アイ・シー発行、第７章、第３６１〜第４０８頁、１９９０年を参照）に従って作製することが可能である。具体的には、例えば、正常マウス胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）に由来するＨＰＲＴ陰性（ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている）ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）を、該ヒトイムノグロブリン重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座をコードする遺伝子またはその一部並びにＨＰＲＴ遺伝子が挿入されたＹＡＣベクターを含む酵母とスフェロプラスト融合法により融合する。該外来性遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグレートされたＥＳ細胞をＨＡＴセレクション法により選別する。次いで、選別したＥＳ細胞を、別の正常マウスから取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．７７，　Ｎｏ．１２，　ｐｐ．７３８０−７３８４，　１９８０；米国特許第４，８７３，１９１号公報）。該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。そうして該仮親マウスから、キメラトランスジェニックマウスが生まれる。該キメラトランスジェニックマウスを正常マウスと交配させることによりヘテロトランスジェニックマウスを得る。該ヘテロ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｃ）トランスジェニックマウス同士を交配することにより、メンデルの法則に従って、ホモ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｃ）トランスジェニックマウスが得られる。
【００５５】
本発明における「モノクローナル抗体の一部」とは、前述の本発明のヒトモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ　ｓｔａｂｉｌｉｓｅｄ　Ｆｖ）あるいはｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）等が挙げられる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ（Ｅｘｐ．　Ｏｐｉｎ．　Ｔｈｅｒ．　Ｐａｔｅｎｔｓ），第６巻，第５号，第４４１〜４５６頁，１９９６年）。
【００５６】
ここで、「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ’」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）を、蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてＶＬ（Ｌ鎖可変領域）とＣＬ（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶＨ（Ｈ鎖可変領域）とＣＨγ１（Ｈ鎖定常領域中のγ１領域）とからなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Ｆａｂ’という。またＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのＦａｂ’がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをＦ（ａｂ’）２という。
【００５７】
本発明の「モノクローナル抗体を産生する細胞」あるいは遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する本発明の「遺伝子組換え細胞」とは、前述した本発明のモノクローナル抗体を産生する任意の細胞を意味する。
具体的には、例えば、下記（１）乃至（３）のいずれかに記載される細胞を挙げることができるがこの限りではない。
（１）前記で定義した免疫原（抗原）を前述の非ヒト哺乳動物（ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む）に免疫することにより得られ、該被免疫動物から採取され得るモノクローナル抗体産生Ｂ細胞。
（２）そのようにして得られたモノクローナル抗体産生Ｂ細胞を哺乳動物由来のミエローマ細胞と細胞融合して得られる前述の融合細胞（ハイブリドーマ）。（３）該モノクローナル抗体産生Ｂ細胞またはモノクローナル抗体産生融合細胞（ハイブリドーマ）から単離される該モノクローナル抗体をコードする遺伝子（重鎖をコードする遺伝子若しくは軽鎖をコードする遺伝子のいずれか一方、または両方の遺伝子）で、該Ｂ細胞及びハイブリドーマ以外の細胞（例えば、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｒｉａｎ）細胞）、ＢＨＫ（Ｂａｂｙ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｋｙｄｎｅｙ）細胞など）を形質転換して得られる遺伝子組換えモノクローナル抗体を産生する遺伝子組換え細胞。
ここで、前記（３）に記載の遺伝子組換えモノクローナル抗体を産生する遺伝子組換え細胞は、即ち、前記（１）のＢ細胞または（２）のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の遺伝子組換え体を産生する遺伝子組換え細胞を意味する。
【００５８】
本発明における「結合速度定数（ｋａ）」とは、抗原抗体反応速度論に基づき算出される該モノクローナル抗体の標的抗原への結合の強さ（程度）を示す値を意味する。「解離速度定数（ｋｄ）」とは、抗原抗体反応速度論に基づき算出される該モノクローナル抗体の標的抗原からの解離の強さ（程度）を示す値を意味する。「解離定数（Ｋｄ）」とは、該「解離速度定数（ｋｄ）」値を該「結合速度定数（ｋａ）」値で除して求められる値である。これらの定数は、該モノクローナル抗体の抗原に対する親和性及び抗原の中和活性を表す指標として用いられる。
【００５９】
当該定数は、種々の方法に従って解析することができるが、市販の測定キットであるＢｉａｃｏｒｅＸ（アマシャムファルマシア社製）または類似のキットを用い、　当該キットに添付の取扱い説明書及び実験操作方法に従って容易に解析することができる。当該キットを用いて求められるｋａ値、ｋｄ値及びＫｄ値は各々、１／Ｍ．Ｓｅｃ、１／Ｓｅｃ及びＭ（モル）なる単位を以て表される。試験されたモノクローナル抗体は、ｋａ値が大きいほど強い抗原結合活性を有していることを示し、Ｋｄ値が小さいほど強い中和活性を有していることを示す。
【００６０】
本発明のヒトモノクローナル抗体には、好ましくはヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体との解離定数（Ｋｄ）が、１０×１０−１０（Ｍ）より小さい数値であるモノクローナル抗体（特には、ヒトモノクローナル抗体）が含まれる。
なお、上述のｋａ、ｋｄ及びＫｄの各々の値は、測定時の諸条件に依存して多少の変動は誤差範囲として起こり得ることが予測されるが、指数についてはほとんど変動しないのが一般的である。
【００６１】
本発明における「医薬組成物」は、有効成分としての本発明のヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体若しくはその一部と「薬学的に許容され得る担体」とからなる医薬品として有用な組成物を意味する。
ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。
そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。
これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤およびペッサリーなどが含まれる。
【００６２】
投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分（前記タンパクや抗体など）の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき１０μｇから１０００ｍｇ（あるいは１０μｇから５００ｍｇ）の範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に０．１μｇ抗体／ｍｌ担体〜１０ｍｇ抗体／ｍｌ担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。
【００６３】
このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μｇ〜１００ｍｇの割合で、好ましくは５０μｇ〜５０ｍｇの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。
また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。
そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、種々の病態及び疾患の発症に関与するＴＧＦ−βのシグナルのＴＧＦ−βＩＩ型受容体を介する細胞内への伝達を阻害するために有用である。
さらには、本発明の医薬組成物は、ＴＧＦ−βの作用に起因する種々の疾患、例えば、腎疾患（腎繊維症、腎炎、腎不全、腎硬化症など）、肺疾患（例えば、肺線維症、肺炎など）、肝臓疾患（例えば、肝臓組織繊維症、肝硬変、肝炎など）、皮膚疾患（例えば、創傷、強皮症、、乾癬、ケロイドなど）、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症など）、血管疾患（例えば、血管再狭窄、リウマチ性血管炎など）、種々臓器での組織繊維症（種々の癌で併発する組織線維症を含む）、及び動脈硬化症（併発する組織繊維症を含む）などの発症及び／または進行を抑制、阻止し、該疾患を治療または予防するための医薬品として有用である。
とりわけ、本発明のヒトモノクローナル抗体あるいはその医薬組成物は、ヒト由来のモノクローナル抗体からなることから、ＨＡＭＡ（ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）に起因する宿主の免疫拒絶反応を惹起することなく、抗体医薬品として極めて有用である。
【００６５】
また、本発明の医薬組成物の種々疾患症状の治療効果については、常法に従って、既知の疾患モデル動物に投与することにより試験、検討することができる。
例えば、組織繊維症の一つであり、また腎臓疾患の１つでもある腎繊維症の治療効果の検討の場合には、マウスやサルの一方の尿管を結紮し腎臓の血液等のろ過機能を停止させることにより腎機能不全を惹起させたモデル（ＵＵＯモデル、Ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ　ｕｒｅｔｅｒａｌ　ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）に、本発明の医薬組成物を投与し、該腎機能不全により惹起される腎炎及び腎繊維症の発症の指標であるヒドロキシプロリンの生成の上昇を抑制する程度またはＴｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎのｍＲＮＡの発現の上昇の抑制を測定する方法を用いることができる。
【００６６】
さらに別の方法としては、ラットに細胞表面マーカーであるＴｈｙ−１に対する抗体を投与することにより誘発した腎炎モデルラットに、本発明の医薬組成物を投与し、該腎機能不全により惹起される腎炎及び腎繊維症の発症の指標である尿中に排泄される蛋白量、血清中のクレアチニン量、細胞外マトリックス（フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲンなど）の産生の低減の程度を測定する方法用いることができる（Ｎｅｐｈｒｏｎ，　Ｖｏｌ．７８，　ｐ．４５３−４６３，　１９９８；　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｂｌｏｏｄ　Ｐｒｅｓｓ　Ｒｅｓ．，　Ｖｏｌ．２２，　ｐ．５−１２，　１９９９）。該尿蛋白量、血清クレアチニン量、フィブロネクチンあるいはＩ型コラーゲンの低減は、該医薬組成物が該腎臓疾患の治療に有効であることを示すものである。
【００６７】
腎疾患、例えば、微小糸球体異常（例えば、ネフローゼ型微小変化群（ＭＣＮＳ））、巣状糸球体硬化症（ＦＧＳ）、膜性糸球体腎炎（膜性腎症、ＭＮ）、ＩｇＡ腎症、メサンギウム増殖性腎炎、溶連菌感染後急性糸球体腎炎（ＡＰＳＧＮ）、半月体形成性（管外性）腎炎、間質性腎炎、あるいは急性腎不全などについては、既報に詳述されるモデル動物を用いることができる（「疾患別モデル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法」、ｐ．３４−４６、１９９３、技術情報協会（発行））。
皮膚疾患、例えば、創傷、ケロイド、アトピー、皮膚炎、強皮症あるいは乾癬などについては、既報に詳述されるモデル動物を用いることができる（「疾患別モデル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法」、ｐ．２２９−２３５、１９９３、技術情報協会（発行））。
【００６８】
肝臓疾患、例えば、肝炎（例えば、ウイルス性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型など）など）、肝硬変あるいは薬物肝障害などについては、既報に詳述されるモデル動物を用いることができる（「疾患別モデル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法」、ｐ．１１９−１２９及びｐ．３４９−３５８、１９９３、技術情報協会（発行））。
例えば、動脈硬化症及び血管再狭窄への効果の検討の場合には、ラット大動脈にバルーンカテーテルを挿入しＰＴＣＡを施し疑似的に作成した再狭窄モデルを使用することができる。
【００６９】
本発明において用いられる特定のポリペプチドをコードするＤＮＡは、常法に従って、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法、ゲノムＤＮＡを単離してスプライシング処理する方法、該ｃＤＮＡ配列若しくはｍＲＮＡ配列を鋳型としてＰＣＲにより調製する方法、または化学合成する方法等により取得することができる。
さらに、該ポリペプチドの特定の一部または該一部と他のポリペプチドとの融合ポリペプチド等をコードするＤＮＡは、そのようにして調製したＤＮＡを適切な制限酵素による切断（消化）し、得られたＤＮＡ断片を、必要に応じてリンカーＤＮＡあるいはタグ（Ｔａｇ）と共に、適切なＤＮＡポリメラーゼ等を用いて連結することにより調製することができる。
【００７０】
該目的のポリペプチドをコードするｃＤＮＡをｍＲＮＡからクローン化する方法としては、以下の方法が例示される。
まず、目的ポリペプチドを発現・産生する組織あるいは細胞から目的ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジンチオシアネート法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｖｏｌ．１８，　ｐ．５２９４，　１９７９）、熱フェノール法もしくはＡＧＰＣ法等の公知の方法を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースやポリＵ−セファロース等によるアフィニティクロマトグラフィーにかけることによって行うことができる。
次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法、例えばオカヤマらの方法（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．２，　ｐ．１６１，　１９８２及び同誌　Ｖｏｌ．３，　ｐ．２８０，　１９８３）やホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）らの方法（Ｇｅｎｅ，　Ｖｏｌ．２５，　ｐ．２６３，　１９８３）等によりｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。このｃＤＮＡをプラスミドベクター、ファージベクターまたはコスミドベクターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入（トランスフェクト）することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【００７１】
ここで用いられるプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限されず、また用いられるファージベクターとしても宿主内で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるクローニング用ベクターとしてｐＵＣ１９、λｇｔ１０、λｇｔ１１等が例示される。ただし、後述の免疫学的スクリーニングに供する場合は、宿主内で目的ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させうるプロモーターを有したベクターであることが好ましい。
プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法としては、例えばマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ｐ．１．５３，　１９８９）に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、ヒュン（Ｈｙｕｎｈ）らの方法（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ，　Ｖｏｌ．１，　ｐ．４９，　１９８５）などが挙げられる。簡便には、市販のクローニングキット（例えば、宝酒造社製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えプラスミドやファージベクターは、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＨＢ１０１，　ＤＨ５α，　Ｙ１０９０，　ＤＨ１０ＢまたはＭＣ１０６１／Ｐ３等）等の適当な宿主に導入する。
【００７２】
プラスミドを宿主に導入する方法としては、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ｐ．１．７４，　１９８９）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導入する方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示される。インビトロパッケージングは、市販のインビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン社製、アマシャム社製等）を用いることによって簡便に行うことができる。
上記の方法によって作製されたｃＤＮＡライブラリーから、目的ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング法を組み合わせることによって行うことができる。
【００７３】
例えば、別個に目的ポリペプチドのアミノ酸配列に対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、これを３２Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼーション法（クランシュタイン（Ｃｒｕｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．７２，　ｐ．３９６１，　１９７５）またはプラークハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ　，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐ．２．１０８，　１９８９）により、目的のｃＤＮＡを含有するクローンをスクリーニングする方法、ＰＣＲプライマーを作製し目的ポリペプチドの特定領域をＰＣＲ法により増幅し、該領域をコードするＤＮＡ断片を有するクローンを選択する方法等が挙げられる。
【００７４】
また、ｃＤＮＡを発現しうるベクター（例えば、λｇｔ１１等のファージベクター）を用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを用いる場合には、目的ポリペプチドに反応性を有する抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、目的のクローンを選択することができる。大量にクローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリーニング法を用いることが好ましい。
この様にして得られたＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法（マキサム（Ｍａｘａｍ）ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　Ｖｏｌ７４，　ｐ．５６０，　１９７７）あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　Ｖｏｌ．７４，　ｐ．５４６３−５４６７，　１９７７）によって決定することができる。目的ポリペプチドをコードする遺伝子は、その全部または一部を上記のようにして得られるクローンから制限酵素等により切り出すことにより取得できる。
【００７５】
また、前述のような目的ポリペプチドを発現する細胞に由来するゲノムＤＮＡから目的ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離することによる調製方法としては、例えば以下の方法が例示される。
該細胞を好ましくはＳＤＳまたはプロテナーゼＫ等を用いて溶解し、フェノールによる抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白質を行う。ＲＮＡを好ましくはリボヌクレアーゼにより消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素により部分消化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファージまたはコスミドで増幅しライブラリーを作成する。そして目的の配列を有するクローンを、例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを用いる方法等により検出し、該クローンから目的ポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部を制限酵素等により切り出し取得する。
【００７６】
目的ポリペプチドをコードするＤＮＡのＰＣＲによる調製は、該目的ポリペプチドの既知のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ等を鋳型として常法により調製することができる（「遺伝子増幅ＰＣＲ法・基礎と新しい展開」、共立出版株式会社発行、１９９２年など）。
また、化学的合成による目的ポリペプチドをコードするＤＮＡの製造は、目的ポリペプチドの塩基配列をもとにして、常法に従って行うことができる。
【００７７】
本発明で用いられる該目的ポリペプチドまたはその一部は、上述に例示した方法を用いて調製した該目的ポリペプチドコードするＤＮＡを含むＤＮＡ（ｃＤＮＡあるいはイントロンを含むゲノミックＤＮＡ）を、各々適切な制限酵素で切断することにより、該目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を得、それらの断片を、必要に応じてリンカーＤＮＡあるいはタグ（Ｔａｇ）と共に、適切なＤＮＡポリメラーゼ等を用いて連結させて得たＤＮＡを用いて、慣用される遺伝子組換え技術を用いて、常法により組換え蛋白として調製することができる。
具体的には下記の例示されるとおりである。即ち、上述のようにして調製したＤＮＡを、下記に詳述するようなベクターに挿入して発現ベクターを作成し、該発現ベクターで後述するような宿主細胞を形質転換して形質転換体を得る。該形質転換体を培養することにより、培養上清中に該目的ポリペプチドを産生させる。培養上清中の該目的ポリペプチドは、カラムクロマトグラフィー等を用いて容易に精製することができる。
【００７８】
該目的ポリペプチドを製造するために用いられる発現ベクター、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベクターおよびファージベクターが包含される（Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　エルスビュ−社、ニューヨーク、１９８５年）。
当該発現ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドＤＮＡおよびバクテリアファージＤＮＡ）に目的ポリペプチドをコードするＤＮＡを常法により連結することによって調製することができる。用いられる組換え用ベクターとして具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１９など、酵母由来プラスミドとして例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など、枯草菌由来プラスミドとして例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４などが例示される。また、ファージとしては、λファージなどのバクテリオファージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫のウイルス（ｐＶＬ１３９３、インビトロゲン社製）が例示される。
【００７９】
目的ポリペプチドを生産させる目的においては、プラスミドベクターが有用である。プラスミドベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で該目的ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現し、これらのポリペプチドを生産する機能を有するものであれば特に制限されない。例えば、ｐＭＡＬ　Ｃ２、ｐｃＤＮＡ３．１（−）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｏｌ．１８，　ｐ．５３２２，　１９９０など）あるいはｐＭＥ１８Ｓ（実験医学別冊「遺伝子工学ハンドブック」、１９９２年等）等を挙げることができる。
【００８０】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレーター領域、開始コドン、本発明のタンパクをコードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位から構成される。
宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ、終止コドンを含んでいることが好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、該目的ポリペプチドの５’側および３’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を含んでいてもよい。
【００８１】
細菌中で目的ポリペプチドを発現させるためのプロモーター−オペレータ−領域は、プロモーター、オペレーターおよびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿主がエシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどを含むものが例示される。
酵母中で目的ポリペプチドを発現させるためのプロモーターとしては、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。
また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、例えばＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。しかし、特にこれらに限定されるものではない。また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。
【００８２】
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。
終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ，ＴＡＡ，ＴＧＡ）が例示される。
ターミネーター領域としては、通常用いられる天然または合成のターミネーターを用いることができる。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを言い、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉではプラスミドｐＢＲ３２２、もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドｐＲＳＶｎｅｏ　ＡＴＣＣ　３７１９８、プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ　ＡＴＣＣ　３７１４５、プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　ＡＴＣＣ　３７２２４、プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ　ＡＴＣＣ　３７１４９、プラスミドｐＳＶ２ｂｓｒ等があげられる。
エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接合部位については、例えばそれぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【００８３】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。
遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。
【００８４】
本発明の発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、本発明のタンパクをコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
本発明の形質転換細胞は、上述の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。
【００８５】
本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換え細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞など）が例示される。
好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、具体的には大腸菌（ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、ＴＢ１、ＨＢ１０１、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ等）、マウス由来細胞（ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１またはＮＩＨ３Ｔ３等）、ラット由来細胞、ハムスター由来細胞（ＢＨＫおよびＣＨＯ等）、サル由来細胞（ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１及びＶｅｌｏ等）およびヒト由来細胞（Ｈｅｌａ、２倍体線維芽細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびＮａｍａｌｗａ等）などが例示される。
発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転換（形質移入））は従来公知の方法を用いて行うことができる。
【００８６】
例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　Ｖｏｌ．６９，　ｐ．２１１０，　１９７２）、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　Ｖｏｌ．１６８，　ｐ．１１１，　１９７９）やコンピテント法（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．５６，　ｐ．２０９，　１９７１）によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばハイネン（Ｈｉｎｎｅｎ）らの方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　Ｖｏｌ．７５，　ｐ．１９２７，　１９７８）やリチウム法（Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．１５３，　ｐ．１６３，　１９８３）によって、動物細胞の場合は、例えばグラハム（Ｇｒａｈａｍ）の方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．５２，　ｐ．４５６，　１９７３）、昆虫細胞の場合は、例えばサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）らの方法（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．３，　ｐ．２１５６−２１６５，　１９８３）によってそれぞれ形質転換することができる。
【００８７】
目的ポリペプチドは、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換細胞（以下、形質移入体を包含する意味で使用する。）を栄養培地で培養することによって製造することができる。
栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
培養は当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、本発明のタンパクが大量に生産されるように適宜選択される。
【００８８】
なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれらに限定されるものではない。
宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。
宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、Ｅｘｐ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ｐ．４３１，　１９７２）、ＹＴ培地等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。
【００８９】
宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。
宿主が酵母である場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培（ボスチアン（Ｂｏｓｔｉａｎ）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．７７，　ｐ．４５０５，　１９８０）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．１２２，　ｐ．５０１，　１９５２）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．８，　ｐ．３９６，　１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．　Ａｍ．　Ｍｅｄ．　Ａｓｓｏｃ．，　Ｖｏｌ．１９９，　ｐ．５１９，　１９６７）、１９９培地（Ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｅｘｐ．　Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ．，　Ｖｏｌ．７３，　ｐ．１，　１９５０）、ＨａｍＦ１２培地等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【００９０】
宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．８２，　ｐ．８４０４，　１９８５）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
目的ポリペプチドは、上述のような形質転換細胞（特に動物細胞または大腸菌）を培養することにより、培養上清中に分泌させることにより製造することができる。即ち、得られた培養物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を得、該培養濾液から天然または合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法に従って目的ポリペプチドを精製、単離する。
【００９１】
単離、精製方法としては、例えばアフィニティーカラムクロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００９２】
一方、目的ポリペプチドが培養された形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方法で目的ポリペプチドを含有する膜画分を得る。該膜画分をトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を得る。そして、当該粗溶液を先に例示したような常法を用いることにより、単離、精製することができる。
【００９３】
【実施例】
以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限定されるものではないことは言うまでもない。
なお、以下の実施例においては、「ＴＧＦ−βＩＩ型受容体」を「ＴβＲＩＩ」と称する場合もある。
【００９４】
実施例１　免疫原の調製
ヒトＴβＲＩＩ（配列番号２）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１）をＰＣＲ法を用いて常法により調製した。
具体的には、ヒト腎臓から取得したｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型とし、ヒトＴβＲＩＩのｃＤＮＡ（Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．６８，　ｐ．７７５−７５８，　１９９２；ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．：Ｍ８５０７９）を基に設計したプライマーを用いて常法に従ってＰＣＲにより合成した。
【００９５】
得られた翻訳領域を含むヒトＴβＲＩＩのｃＤＮＡを市販のプラスミドに挿入し発現ベクターを作成した。エレクトロポレ−ションにより、該ベクターでＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬製）を形質転換した。形質転換細胞を、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２栄養培地中で培養し、組換えヒトＴβＲＩＩを発現させた。ヒトＴβＲＩＩの発現は、抗ヒト可溶性ＴβＲＩＩポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ製）を用いたウェスタンブロッティングにより確認した。
該組換え細胞から常法に従って細胞膜画分を調製し、これを免疫原とし用いた。
【００９６】
実施例２　抗ヒトＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製及び選別
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、実験医学（別冊）細胞工学ハンドブック（黒木登志夫ら編集、羊土社発行、第６６〜第７４頁、１９９２年）及び単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行、１９９１年）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。
【００９７】
免疫原（抗原）としてのヒトＴβＲＩＩは、前記で調製した組換えヒトＴβＲＩＩ発現組換え細胞の細胞膜画分を用いた。
被免疫動物としては、前述の方法を用いて製造したヒトＩｇＧ２抗体を産生するトランスジェニックマウスを用いた（Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｖｏｌ．７，　ｐ．１３−２１，　１９９４；Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｖｏｌ．１５，　ｐ．１４６−１５６，　１９９７；特表平４−５０４３６５号公報；特表平７−５０９１３７号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年等）。
細胞培養操作は、マルチウェルマイクロプレートを用いて行った。
【００９８】
前記のヒト抗体産生トランスジェニックマウス（６匹）に、抗原を、完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ、ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製）と共にフッドパッド及び腹腔に注射することにより初回（０日）免疫した。初回免疫から１週間毎に同抗原を、不完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ、ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製）と共にフッドパッド及び腹腔に注射により３回追加免疫し、さらに以下に述べるリンパ節細胞の取得の前々日に同抗原を同様にして最終免疫した。なお、抗原とアジュバントは、約１：１の割合で数分乃至約１時間混和して調製した。
【００９９】
各々の動物から摘出したリンパ節及び脾臓から取得したリンパ球とマウスミエローマ細胞Ｐ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．：　ＣＲＬ−１５８０）とを５：１で混合し、融合剤としてポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ製）を用いて細胞融合させることにより多数のハイブリドーマを作製した。融合細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ含有；ＳＩＧＭＡ製）で２回洗浄し、１０％ＦＢＳとＨＡＴ含有ＡＳＦ１０４培地（コージンバイオ社製）中に懸濁し、９６穴マイクロプレートに播種した。
【０１００】
以下に述べる２種類のＥＬＩＳＡにより、前記で調製したハイブリドーマから抗ヒトＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。
＜１＞　Ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ
細胞融合１週間後に新しい培地に交換し、その３日後以降の培養上清を除去し、Ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡによりハイブリドーマを一次スクリーニングした。
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬製）及び上記で調製ヒトＴβＲＩＩ発現組換えＣＨＯ細胞をＰＢＳで洗浄した後、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）にて処理して各細胞を回収した。細胞を、９６穴マイクロプレートに３乃至２０×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ（１００μｌ／ｗｅｌｌ）で播種しコンフルエントになるまで２日間培養した。
培養後、培養上清を捨て、一次抗体溶液（希釈した精製抗ヒトＴβＲＩＩ抗体または各ハイブリドーマの上清；５０μｌ／ｗｅｌｌ）を加え、室温下で１時間半静置した。プレートを１％胎児牛血清含有ＡＳＦ１０４培地（「洗浄バッファー」；日研生物医学研究所製）で２回洗浄し、１，０００乃至１０，０００倍に希釈した二次抗体であるＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識抗ヒトＩｇＦｃ抗体（５０μｌ／ｗｅｌｌ；Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ製）またはＨＲＰ標識マウスＩｇＦｃ抗体（５０μｌ／ｗｅｌｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ製）を加え、室温に１時間静置した。プレートを洗浄バッファー（２００μｌ／ｗｅｌｌ）で２回洗浄し、基質であるＴＭＢ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００μｌ／ｗｅｌｌ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を加え２０分間発色させた後、０．５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４（５０μｌ／ｗｅｌｌ）を加えて反応を停止させ、波長４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）で測定した。
【０１０１】
コントロールである野生型ＣＨＯ−Ｋ１細を用いたＣｅｌｌ　ＥＬＩＳＡでの値と比較して、陽性ハイブリドーマを選別した。
なお、一次抗体の陰性対照には、前述したヒト抗体産生トランスジェニックマウスに、ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、ピアース（ＰＩＥＲＣＥ）社製）を免疫して調製した抗ＫＬＨヒトモノクローナル抗体（ＪＭａｂ２３）を用いた。
また、このＣｅｌｌ　ＥＬＩＳＡの手法は、マウスＴβＲＩＩ及びラットＴβＲＩＩ各々への交叉反応性の解析並びに本発明のモノクローナル抗体のアイソタイピングにも用いた。
前者のＣｅｌｌ　ＥＬＩＳＡには、上記と同様にして作製したマウスＴβＲＩＩ高発現ＣＨＯ細胞またはラットＴβＲＩＩ高発現ＣＨＯ細胞を用いた。また、後者のＣｅｌｌ　ＥＬＩＳＡには、以下のアイソタイピング用抗体を用いた。
１．ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＦｃ抗体（ＥＹ　Ｌａｂ製）
２．ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＭ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ製）
３．ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇκ抗体（ＴＡＧＯ製）
４．ＨＲＰ標識抗マウスＩｇλ抗体（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ製）
【０１０２】
＜２＞　ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Ｎｕｎｃ製）に、ヒトＴβＲＩＩ−Ｆｃキメラ分子（２５ｎｇ／ｗｅｌｌ；　５０μｌ／ｗｅｌｌ；Ｇｅｎｚｙｍｅ製）またはヒトＢ７ｈ−Ｆｃキメラ分子（陰性対照；国際出願公開ＷＯ０１／８７９８１号公報参照）を加え室温下で１時間静置してコートし、Ｂｌｏｃｋ　Ａｃｅ（２００μｌ／ｗｅｌｌ）を加え室温下に２時間以上静置して未反応の部分をブロッキングした。次いで、ＰＢＳ−Ｔ（２００ｍｌ／ｗｅｌｌ）で２回洗浄した後に、一次抗体（希釈した抗ヒトＴβＲＩＩ抗体（陽性対照；クローンＴＲ２Ｂ１９が産生する抗ＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体；国際出願公開ＷＯ０１−３６６４２号公報参照）または各ハイブリドーマの培養上清；５０μｌ／ｗｅｌｌ）を加え、室温下で１．５時間静置した。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔ（２００μｌ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄し、二次抗体であるＨＲＰ標識抗ヒトＩｇκ抗体（２，０００倍希釈を５０μｌ／ｗｅｌｌ；ＴＡＧＯ製）を加え、室温下で１時間静置した。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、基質であるＴＭＢ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００μｌ／ｗｅｌｌ；Ｂｉｏ　Ｒａｄ製）を加え１５分間発色させた後、０．５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４（５０μｌ／ｗｅｌｌ）を加えて反応を停止させ、波長４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）で測定した。
コントロールであるヒトＢ７ｈ−Ｆｃキメラ分子を用いたＥＬＩＳＡでの値と比較して、陽性ハイブリドーマを選別した。
なお、一次抗体の陰性対照には、前述した抗ＫＬＨヒトモノクローナル抗体（ＪＭａｂ２３）を用いた。
【０１０３】
上記Ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡによるスクリーニングでは、４８０クローン中の４８０クローン全てが陽性であった。また、上記ＥＬＩＳＡによるスクリーニングでは、Ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡ陽性４８０クローンの内の２７クローンが陽性であった。また、上述のアイソタイピングＣｅｌｌ　ＥＬＩＳＡでヒトＩｇＧ且つヒトＩｇκであったクローンは、４８０クローン中の７クローンであった。
一連のスクリーニング結果を下に、上記２種類のスクリーニングで陽性であり且つアイソタイプがヒトＩｇＧ２且つヒトＩｇκであるハイブリドーマクローンＪＭａｂ１９５、ＪＭａｂ１９７及びＪＭａｂ１９８を選別した。
選別した各クローンを含むウェルを別に調製したクローニング用培地ＡＳＦ１０４培地（１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ；　１ｘＨＴ；　１０％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ；　１％非必須アミノ酸；　及び１％　Ｔ−ＳＴＩＭ含有）に交換してさらに培養し限界希釈法でクローニングした。
また、前記Ｃｅｌｌ　ＥＬＩＳＡによる交叉反応性試験の結果、該３つのクローンが産生する抗いずれの抗体も、ラット及びマウスＴβＲＩＩのいずれにも交叉反応性を示さなかった。
【０１０４】
実施例３　ＴＧＦβ刺激により誘導される細胞増殖抑制に対する抗ＴＧＦβヒトモノクローナル抗体の阻害活性
前記で選別したハイブリドーマの各々が産生する抗ヒトＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体の生物活性を以下のようにして解析した。
ＴＧＦ−βは、種々組織の線維芽細胞や血管平滑筋細胞などの間葉系の細胞に対する細胞増殖促進活性とは逆に、例えば、上皮細胞、血管内皮細胞及び血球系細胞などの多種の細胞に対しては細胞増殖を抑制する活性を有する。
本試験では、前記で選別した各ハイブリドーマクローンが産生する抗ヒトＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体の、ＴＧＦ−β刺激による上皮系細胞の増殖の抑制に対する阻害効果を下記のようにして解析した。
【０１０５】
９６穴マイクロタイタープレートにヒト由来の上皮細胞系ケラチノサイト（ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）（２００ｃｅｌｌｓ／１００μｌ　０．１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ／ｗｅｌｌ）を播種し、ＣＯ２インキュベーター内で２日間培養した。培地を除去し、各ウェルを同培養液で２回洗浄し、新しい培養液を加えた。次いで、前記で調製したハイブリドーマ（ＪＭａｂ１９５，　ＪＭａｂ１９７及びＪＭａｂ１９８）の培養上清から精製した抗ＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体（０．２３；　０．４７；　０．９３；　１．８８；　３．７５；　７．５；　１５；　３０；　６０μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃でＣＯ２インキュベーター内で３時間培養した。培養後、ヒトＴＧＦβ１（０．３ｎｇ／ｍｌ；　５０μｌ／ｗｅｌｌ；　Ｇｅｎｚｙｍｅ　ＴＥＣＨＮＥ製）を加えＣＯ２インキュベーター内で２日間培養した。
【０１０６】
次いで、各ウェルに、Ｍｅｔｈｙｌ−［３Ｈ］−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（０．５μＣｉ／ｗｅｌｌ；　Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を添加してさらに６時間培養した。細胞をセルハーべスター（ＰＡＣＫＡＲＤ社製）を用いてＧＦ／Ｃフィルター上にトラップした。フィルターを４０℃で２時間以上乾燥させた後、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔｉ　Ｏ（ＰＡＣＫＡＲＤ製）を加え、フィルターにトラップされた３Ｈの放射活性をβカウンター（ＴＯＰ　ＣＯＵＮＴ）を用いて測定し細胞増殖活性の指標とした。
なお、対照試験として、ヒトＴＧＦ−β１を添加せず上記と同様にして試験を行った。また、陰性対照抗体には、前述の抗ＫＬＨヒトモノクローナル抗体（ＪＭａｂ２３）を用いた。
また、試験は、各クローンにつき３回行い、各々のモノクローナル抗体のＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）の平均値は下記のとおりであった。
ＪＭａｂ１９５　：　ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）＝３．０３±０．８６
ＪＭａｂ１９７　：　ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）＝４．６０±０．８９
ＪＭａｂ１９８　：　ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）＝４．１４±０．９３
この結果から、いずれの抗ヒトＴＧＦβヒトモノクローナル抗体も、ＴＧＦβ１刺激により誘導されるヒト由来角化細胞（ケラチノサイト）の増殖の抑制を、有意に抑制することが示された。
【０１０７】
実施例４　ＴＧＦβ刺激により誘導されるメサンギウム細胞からのＰＡＩ−Ｉ分泌亢進に対する抗ヒトＴＧＦβヒトモノクローナル抗体の阻害活性
２２５ｃｍ２フラスコを用いて正常ヒトメサンギウム細胞（ＣＣ−２５５９；Ｓａｎｋｏ　Ｊｕｎｙａｋｕ製）を、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）及び２０％胎児牛血清（ＦＢＳ；ＭＯＲＧＡＴＥ製）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（日研生物医学研究所製）中で３７℃でＣＯ２インキュベーター内で培養した。細胞が９０％コンフルエントに達した時点で以下の試験に用いた。
【０１０８】
２４穴マイクロプレートに細胞（３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、その翌日に培地をＦＢＳを含有しないＰＲＭＩ１６４０培地（１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ含有）（以下ＦＢＳ（−）／ＲＰＭＩ１６４０）に置換して２４時間スタベイション（Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）させた。培地を除去し、各ウェルにＦＢＳ（−）／ＲＰＭＩ１６４０（５００μｌ）及び上記で選別した各ハイブリドーマ（ＪＭａｂ１９５，　ＪＭａｂ１９７及びＪＭａｂ１９８）由来の精製抗ＴＧＦβヒトモノクローナル抗体（２５０μｌ）を添加して１時間インキュベートした後、ヒトＴＧＦβ１（０．４ｎｇ／ｍｌを２５０μｌ；Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を加えて細胞を刺激した。２４時間の培養後、培養上清（２５０μｌ／ｗｅｌｌ）を９６穴マイクロプレートに回収した。残りの培養上清を捨て、細胞に５％ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ製）を含有するＦＢＳ（−）／ＲＰＭＩ１６４０（５００μｌ）を添加して４時間インキュベートした。培養上清（１００μｌ）を９６穴マイクロプレートに回収し、マイクロプレートリーダーで波長４５０乃至６５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０９】
培養上清中に分泌されたＰＡＩ−Ｉ（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の濃度を、市販のＥＬＩＳＡキットであるＴｉｎｔＥｌｉｚｅ　ＰＡＩ−Ｉキット（ＢｉｏｐｏｏｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）を用いて該キットの添付の実験操作マニュアルに従って測定した。ヒトＰＡＩ−Ｉの標準物質として該キットの試薬であるＳｔａｎｄａｒｄ　ＰＡＩ−Ｉ　Ｐｌａｓｍａの各種溶液（４０；　２０；　１０；　５；　２．５；　０　ｎｇ／ｍｌ）を調製した。
該キット中のマイクロプレートにＰＥＴ　Ｂｕｆｆｅｒ（１００μｌ／ｗｅｌｌ）を加え、１分間軽く振盪した。上記で得た各細胞の培養上清（蒸留水で２倍に希釈；２０μｌ）またはＰＡＩ−Ｉの標準物質（２０μｌ）をＮウェル及びＡウェルに添加した。さらに、コンジュゲート（５０μｌ／ｗｅｌｌ）を添加して穏やかに２時間振盪した。次いで、各ウェル中の溶液をデカントで除去し、ＰＥＴ　Ｂｕｆｆｅｒ（２５０μｌ）を加えて洗浄（４回）した。洗浄後、基質（２００μｌ／ｗｅｌｌ）を添加し１５分間穏やかに振盪した。次いで、硫酸（０．５ｍｏｌ／ｌを５０μｌ／ｗｅｌｌ）を加えて、遮光下で１０分間静置した後、マイクロプレートリーダーを用いて波長４９０ｎｍでの吸光度を測定した。求めた吸光度から検量線に従い各細胞培養上清に分泌されたＰＡＩ−Ｉの濃度を求めた。
【０１１０】
なお、陰性対照には、上述した抗ＫＬＨヒトモノクローナル抗体（ＪＭａｂ２３）及び抗ヒトＣＥＴＰモノクローナル抗体（ＪＭａｂ１０９；国際出願公開ＷＯ９６／３４９４８号公報参照。）を用いた。また、比較対照として、別に作製した抗ヒトＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体（クローンＴＲ２Ｂ１９が産生する抗ＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体；国際出願公開ＷＯ０１−３６６４２号公報参照）並びに抗ＴＧＦβ１モノクローナル抗体（ＪＭａｂ８３；ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９８４９のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体１Ｄ１１．１６．８）を用いた。
【０１１１】
結果を図１に示す。
各々の抗ヒトＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体の、ＴＧＦ刺激により誘導されるメサンギウム細胞からのＰＡＩ−Ｉの分泌の阻害活性（ＩＣ５０（μｇ／ｍｌ））は、下記のとおりであった。
ＪＭａｂ１９５　　　　　　　　：　２．２μｇ／ｍｌ
ＪＭａｂ１９７　　　　　　　　：　＞１００μｇ／ｍｌ
ＪＭａｂ１９８　　　　　　　　：　＞１００μｇ／ｍｌ
対照（ＪＭａｂ１４８／　ＴＲ２Ｂ１９）：　２２．３μｇ／ｍｌ
【０１１２】
この結果、ＪＭａｂ１９５のＰＡＩ−Ｉ産生阻害活性は、他の抗ヒトＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体（ＪＭａｂ１９７及びＪＭａｂ１９８）のそれよりも極めて強く、また対照の抗ヒトＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体（ＪＭａｂ１４８／ＴＲ２Ｂ１９）の阻害活性よりも１０倍以上強いことが明らかとなった。
また、サル（カニクイザル；ケアリー製）のメサンギウム細胞を用いて上記と同様にして各々の抗体のＴＧＦβ誘導性ＰＡＩ−Ｉ産生の阻害活性を解析した結果、本発明の抗ＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体ＪＭａｂ１９５は、ＴＧＦβの刺激により誘導されるサルメサンギウム細胞からのＰＡＩ−Ｉの分泌を抗体濃度依存的に有意に阻害した。この結果は、ＪＭａｂ１９５がサルのＴβＲＩＩに反応するだけでなくその中和活性も有することを示していた。
【０１１３】
実施例５　　抗ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体ヒトモノクローナル抗体（ＪＭａｂ１９５及びＪＭａｂ１４８）の抗原（ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体）に対する親和性及び中和活性の測定
前記のＴＧＦβ誘導性メサンギウム細胞ＰＡＩ−Ｉ産生阻害活性試験で最も強い阻害活性を示した抗ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体ヒトモノクローナル抗体ＪＭａｂ１９５並びに陽性対照としての抗ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体ヒトモノクローナル抗体ＪＭａｂ１４８（クローンＴＲ２Ｂ１９が産生する抗ＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体；国際出願公開ＷＯ０１−３６６４２号公報参照）のヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体との結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び解離定数（Ｋｄ）を、市販の測定キットＢｉａｃｏｒｅ　Ｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いて測定した。
下記に述べる抗原（ヒトＴβＲＩＩ−Ｆｃキメラ分子）のセンサーチップへの固定化以外の操作は、市販の測定キットＢｉａｃｏｒｅ　Ｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に添付の取扱い説明書及び実験操作法に従って行った。
【０１１４】
キットにセットされているフローセル１（Ｆｌｏｗ　Ｃｅｌｌ−１）に、ランニング緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ（−）；日研生物医学研究所製）を２０μｌ／ｍｉｎで流し、次いで、１００ｍＭのＮａＯＨ（１０μｌ）及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ製）を加えセルを洗浄した。ランニング緩衝液を１０分間流し、ベースラインが安定したことを確認した後に、ランニング緩衝液の流速を５μｌ／ｍｉｎに調整した。５ｍＭ　ＮＨＳ（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）と２００ｍＭＥＤＣ（Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）とからなる溶液（３５μｌ）を添加し、センサーチップ表面に被覆されているＣＭのカルボキシル基を活性化させた。
次いで、３０μｌのヒトＴβＲＩＩ−Ｆｃキメラ分子（Ｇｅｎｚｙｍｅ製）の溶液（５μｇ／ｍｌ；１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解させた。）を添加し、該ヒトＴβＲＩＩ−Ｆｃをセンサーチップに固定化した。
次いで、未反応の活性化されたカルボキシル基は、３５μｌの１Ｍ　Ｅｔｈａｎｏｌ　ａｍｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを添加することによりブロックした。この抗原固定化操作は、２５℃で行った。また、以下の複数回の試験のために、同一の固定化操作を複数回行った。
当該固定化操作において、固定化された抗原量は、２９２．３乃至５６４．４ＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｕｎｉｔ）であった。なお、ＲＵは、面積当たりの質量を示し、１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ２である。
【０１１５】
リファレンスとしてのフローセル２（Ｆｌｏｗ　Ｃｅｌｌ−２）は、該ヒトＴβＲＩＩ−Ｆｃを加えないで上記と同様にして処理することによりキャッピングした。
フローセル（センサーチップ）に、リン酸緩衝液を２０μｌ／分の流速で流し、前記で調製した精製抗ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体ヒトモノクローナル抗体ＪＭａｂ１９５またはＪＭａｂ１４８（６−１６μｇ／ｍｌ、６０μｌ）を添加した。
測定は、結合相２分間及び解離相２分間を標準条件として行った。抗原に対する抗体の結合量並びに該抗原からの抗体の解離量を経時的に測定しセンサーグラムを得た。
【０１１６】
得られたセンサーグラムのデータに基づき、キットに付随の解析ソフト（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０）を用いて、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び解離定数（Ｋｄ；Ｋｄ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。
本発明の抗ヒトＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体ＪＭａｂ１９５の解離定数（６回の試験の平均値）は８．０６×１０−１０（Ｍ）であり、対照である既知の抗ヒトＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体ＪＭａｂ１４８の解離定数（４回の試験の平均値）１．９１×１０−９（Ｍ）よりも有意に高い抗原親和性及び中和活性を有していた。
驚くべきことに、ＪＭａｂ１９５の解離定数は、モノクローナル抗体の研究開発分野でも極めて稀である１０−１０（Ｍ）以上というオーダーの著しく高い抗原親和性であった。
【０１１７】
実施例６　抗ヒトＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体ＪＭａｂ１９５の遺伝子配列及び
アミノ酸配列の決定及び解析
前記実施例で作製されたヒトＴβＲＩＩに対するヒトモノクローナル抗体ＪＭａｂ１９５を構成する重鎖（Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ）の可変領域をコードするｃＤＮＡ配列、並びに軽鎖（Ｌｉｇｈｔ　Ｃｈａｉｎ）の可変領域及び定常領域をコードするｃＤＮＡ配列を下記のようにして決定するとともに、該遺伝子の構造的特徴を解析した。
前記実施例で作製したＪＭａｂ１９５を産生するハイブリドーマを培養後、遠心分離し、沈殿物を回収し、後述するＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡの抽出時まで−８０℃で保存した。
【０１１８】
＜１＞　ｍＲＮＡの調製
ハイブリドーマからのＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡの抽出、精製は、市販のＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ製）を用いて次のようにしてした。該キットに添付の実験操作説明書に従い、前記凍結ハイブリドーマ細胞からＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡの抽出し、及び２回精製により精製ＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡとして回収した。得られたＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡの濃度を、２６０ｎｍの波長での吸光度を測定することにより決定した。
【０１１９】
＜２＞　ｃＤＮＡの合成
得られたＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡを鋳型とし、市販のｃＤＮＢＡ合成キットＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｃｈｏｉｃｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）及び合成オリゴヌクレオチドＮｏｔＩ−Ｔプライマー（配列番号３）を用いたＲｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ法により二本鎖ｃＤＮＡを合成した。
即ち、前記の精製ＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（約５μｇ）とＮｏｔＩ−Ｔプライマー（４００ｐｍｏｌ）を混和して７０℃で１０分間加熱後、氷冷し、５×１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｂｕｆｆｅｒ（４μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ溶液（１μｌ）及び０．１ＭのＤＴＴ溶液（２μｌ）を加え混和した。３７℃で２分間ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎを行った後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（５μｌ）を加え３７℃で１時間反応を行った。反応後、ＤＥＰＣ処理した水（９３μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ（３μｌ）、５×２ｎｄ　ｓｔｒａｎｄ　ｂｕｆｆｅｒ（３０μｌ）、ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ（４μｌ）、ＲＮａｓｅＨ（１μｌ）及びＥ．Ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ（１μｌ）を加え混和し１６℃で２時間反応させた。反応後Ｔ４ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２μｌ）を加え更に２分間反応した。次いで、フェノール／クロロフォルム（１５０μｌ）を加え、室温下１４，５００ｒｐｍで５分間遠心し水層（１３０μｌ）を回収した。回収した水層に３Ｍ　ＮａＯＡｃ（１３μｌ）及びエタノール（３２５μｌ）を加え混和し−８０℃で冷却し、１４，５００ｒｐｍで１５分間遠心し上清を捨て、ペレットを回収した。ペレットを７０％エタノールで洗浄後、上清を捨て減圧下で乾燥させ、ＴＥ緩衝液に溶解し、ｃＤＮＡ溶液とした。
【０１２０】
＜３＞　ｃＤＮＡアダプターの調製
上記ｃＤＮＡ溶液に２４ａｄｐ（１００ｐｍｏｌ／μｌ；５０μｌ）及び５’末端リン酸化された２０ａｄｐ（１００ｐｍｏｌ／μｌ；５０μｌ）を加え混和し、３Ｍ　ＮａＯＡｃ（１０μｌ）及びエタノール（２５０μｌ）を加え、−８０℃にて終夜冷却した。冷却後、遠心（１４，５００ｒｐｍ；　４℃；１５分間）し上清を捨て、ペレットを回収した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し上清を捨ててペレットを乾燥させた。乾燥したペレットにアニ−リング緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；　ｐＨ８．０；　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ；　５ｍＭ　ＭｇＣｌ２；　２００ｍＭ　ＮａＣｌ）を加えて溶解し、１時間加熱した後室温に戻してｃＤＮＡアダプター溶液を得た。
【０１２１】
＜４＞　ｃＤＮＡライブラリーの作製
前記で得たｃＤＮＡ溶液（４８μｌ）にアダプター溶液（６μｌ）を加え、更にＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（２７μｌ；東洋紡製）を加え混和した。混和後１６℃で約１．５時間反応させた後、７０℃で１０分間加熱し反応を停止させ、直ちに冷却した。氷冷したサンプルにＴＥ緩衝液（１９μｌ）、３Ｍ　ＮａＯＡｃ及びエタノール（２５０μｌ）を加えて混和後−８０℃に冷却した。次いで、遠心（１４，５００ｒｐｍ；１５分；４℃）し、上清を捨て、ペレットを７０％エタノールで洗浄後減圧下で乾燥させた。乾燥後滅菌蒸留水及び１０ＸＨ緩衝液（宝酒造製）を加えペレットを溶解した。次いで、制限酵素ＮｏｔＩ（３μｌ）を加え３７℃で２時間反応させた。次いで反応液に１０ｍＭ　ＡＴＰ（２μｌ）及びＴ４キナーゼ（２μｌ）を加え３７℃で３０分間反応させた。反応後、３Ｍ　ＮａＯＡｃ（１５μｌ）及びエタノール（３７５μｌ）を加え−８０℃に冷却後遠心（１４，５００ｒｐｍ；４℃；１５分）し、上清を捨て７０％エタノールで洗浄した後減圧下で乾燥させＴＥ緩衝液（２０μｌ）に溶解した。これを完全ｃＤＮＡ溶液とした。
【０１２２】
該完全ｃＤＮＡ溶液にローディング緩衝液（４μｌ；宝酒造製）を加えて１／２量をポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品製）にアプライし電気泳動した。ゲルをエチジウムブロマイド溶液に浸漬し核酸を染色（１５分）し紫外線照射して写真撮影した。ゲルから０．５乃至３ｋｂまでの大きさのＤＮＡを回収した。回収した該ＤＮＡ各々と市販のラムダファージベクターλＥＸｃｅｌｌ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ製）を市販のＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて連結させた。次に該ＤＮＡ反応物を市販のラムダファージパッケージングキットＧｉｇａｐａｃｋ　ＩＩＩ　Ｇｏｌｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いてラムダファージとし、ベクターλＥＸｃｅｌｌに添付の大腸菌ＮＭ５２２を宿主としてｃＤＮＡライブラリーとした。
【０１２３】
該ｃＤＮＡライブラリーを合成オリゴＤＮＡをプローブとして用いて常法によりスクリーニングし抗体重鎖及び抗体軽鎖を各々コードするｃＤＮＡを調製した。抗体重鎖に係るプローブには、配列番号４に記載の合成オリゴＤＮＡを用いた。抗体軽鎖に係るプローブには、配列番号５に記載の合成オリゴＤＮＡを用いた。
得られた各々のｃＤＮＡの塩基配列の決定を、市販のＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、ＰＲＩＳＭ３７７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）及び別に合成した各種プライマーＤＮＡを用いて行った。
ハイブリドーマＪＭａｂ１９５が産生するヒトＴβＲＩＩに対するヒトモノクローナル抗体の重鎖の読み取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ；　ＯＲＦ）を含むｃＤＮＡ配列を配列番号６に、また該読み取り枠によりコードされる重鎖の全長（シグナル配列を含む）のアミノ酸配列を配列番号７に、また軽鎖の読み取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ；　ＯＲＦ）を含むｃＤＮＡ配列を配列番号８に、また該読み取り枠によりコードされる重鎖の全長（シグナル配列を含む）のアミノ酸配列を配列番号９に示した。
【０１２４】
決定された各々のＤＮＡ配列を基に、遺伝子配列解析ソフトウェアーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｓｏｆｔｗａｒｅ及びＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎらにより作成されたヒトイムノグロブリンの可変領域遺伝子のライブラリーＶ　ＢＡＳＥ／Ｖ　ＧＯＬＤ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，　Ｉ．　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ；　Ｖ　ＢＡＳＥ：　”Ａ　Ｄａｔａｂａｓｅ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｖａｒｉａｂｌｅ　Ｒｅｇｉｏｎ　Ｇｅｎｅｓ”；　ＭＲＣ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｉｅｅｒｉｎｇ；　Ｈｉｌｌｓ　Ｒｏａｄ，　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　ＣＢ２　２ＱＨ，　ＵＫ）を検索した。
その結果、上記ヒトモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の各々のＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域及びＣ領域の各々の遺伝子は下記のセグメントに最も高い相同性を有することが明らかとなった。
＜重鎖＞
Ｖ領域：３−２３；　Ｄ領域：ＤＮ４；　Ｊ領域：ＪＨ５ｂ；　Ｃ領域：ヒトＧ２
＜軽鎖＞
Ｖ領域：Ａ３０；　Ｊ領域：ＪＫ１；　Ｃ領域：ヒトκ
【０１２５】
さらに解析した結果、ＪＭａｂ１９５の重鎖Ｖ領域ＤＮＡは、ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメント３−２３（配列番号１２；アミノ酸配列は配列番号１３）と比較して、７塩基の欠失と下記の３塩基の変異を有しており、結果として３箇所のアミノ酸変異が起こっていることが明らかとなった。
ＧＴＣ（Ｖａｌ）　　→　　ＡＴＣ（Ｉｌｅ）
ＧＣＴ（Ａｌａ）　　→　　ＧＴＴ（Ｖａｌ）
ＧＧＴ（Ｇｌｙ）　　→　　ＧＴＴ（Ｖａｌ）
【０１２６】
一方、ＪＭａｂ１９５の軽鎖Ｖ領域ＤＮＡは、ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメントＡ３０と比較して、３塩基の欠失と下記の４塩基の変異を有しており、結果として以下の３つのアミノ酸変異が起こっていることが明らかとなった。
ＣＡＡ（Ｇｌｎ）　　→　　ＣＴＡ（Ｌｅｕ）
ＡＧＣ（Ｓｅｒ）　　→　　ＡＡＣ（Ａｓｎ）
ＣＡＧ（Ｇｌｎ）　　→　　ＣＡＡ（Ｇｌｎ）
ＡＧＴ（Ｓｅｒ）　　→　　ＡＣＴ（Ｔｈｒ）
【０１２７】
実施例７　抗ヒトＴβＲＩＩモノクローナル抗体ＪＭａｂ１９５の腎疾患及び組織繊維症の治療効果
本発明の抗ヒトＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体ＪＭａｂ１９５の腎疾患及び組織繊維症の治療効果をカニクイザルの腎臓に人為的に機能不全症及び繊維症を起こさせた疾患モデルを用いて調べた。
当該疾患モデルは、種々の疾患あるいは病的状態、例えば、腎臓疾患（腎不全、腎炎、腎繊維症など）、各種組織繊維症（腎繊維症、肺繊維症、肝臓組織での繊維症、皮膚組織での繊維症など、関節リウマチに伴う滑膜組織での繊維症、各種癌に伴う繊維症）、皮膚疾患（強皮症、乾癬、アトピーなど）、肝臓疾患（肝硬変、肝臓組織での繊維症、肝炎など）、肺疾患（肺繊維症、肺炎など）、関節リウマチ、及び動脈硬化症などのいずれにおいても見られる病理学的特徴の一部または臨床所見の一部を呈する疾患モデルである。従って、本試験で観察される治療効果は、そのような一連の疾患または病的状態の治療効果を代表するものである。
【０１２８】
カニクイザル（雄、３歳、各群３匹、ケアリー製）にケタミン（１ｍｌ／ｂｏｄｙ；　三共製）を筋肉内に、またペントバルビタールナトリウム（５乃至１０ｍｇ／ｋｇ；　大日本製薬製）を静脈内に投与して麻酔した。左脇腹周辺を剃毛し７０％エタノールで消毒後、左腹側を切開し左腎側の尿管を２箇所（腎臓に近い位置及び膀胱に近い位置）で結紮し、その間を手術用鋏で切断した（ＵＵＯ、Ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ　ｕｒｅｔｅｒａｌ　ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）。尿管を切断後直ちに腹壁を縫合し、アンピシリンナトリウム・クロキサシリンナトリウム（０．５ｍｌ／ｂｏｄｙ；明治製菓製）を筋肉内投与した。
縫合後直ちに、下記のいずれかの被験物質または対照物質を静脈内投与した。該物質の溶媒には、ＰＢＳ（−）／０．０１％ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ　８０を用いた。
【０１２９】
１．被験物質
各種濃度の抗ヒトＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体ＪＭａｂ１９５
（１）３０ｍｇ／ｋｇ；　５ｍｇ／ｍｌを６ｍｌ／ｋｇ
（２）１０ｍｇ／ｋｇ；　１．６７ｍｇ／ｍｌを６ｍｌ／ｋｇ
（３）３ｍｇ／ｋｇ；　０．５ｍｇ／ｍｌを６ｍｌ／ｋｇ
２．陽性対照物質
各種濃度の抗ヒトＴＧＦβ１モノクローナル抗体ＪＭａｂ８３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９８４９
のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体１Ｄ１１．１６．８）
（１）３０ｍｇ／ｋｇ；　５ｍｇ／ｍｌを６ｍｌ／ｋｇ
（２）１０ｍｇ／ｋｇ；　１．６７ｍｇ／ｍｌを６ｍｌ／ｋｇ
（３）３ｍｇ／ｋｇ；　０．５ｍｇ／ｍｌを６ｍｌ／ｋｇ
３．陰性対照物質
各種濃度の抗ＫＬＨヒトモノクローナル抗体ＪＭａｂ２３（前述）
（１）３０ｍｇ／ｋｇ；　５ｍｇ／ｍｌを６ｍｌ／ｋｇ
（２）１０ｍｇ／ｋｇ；　１．６７ｍｇ／ｍｌを６ｍｌ／ｋｇ
（３）３ｍｇ／ｋｇ；　０．５ｍｇ／ｍｌを６ｍｌ／ｋｇ
【０１３０】
投与終了後、被験サルを飼育室にて通常の方法で飼育した。
片腎結紮処置から３日目の各被験サルに、ケタミン（１ｍｌ／ｂｏｄｙ；　三共製）を筋肉内に、またペントバルビタールナトリウム（５乃至１０ｍｇ／ｋｇ；　大日本製薬製）を静脈内に投与して麻酔した後、放血致死させた。次いで、正中線に沿って開腹し、ＵＵＯ処置腎として左腎を、また対照である正常腎として右腎を摘出した。各腎の湿重量を測定した後、以下で行うｍＲＮＡ測定用の試料として腎皮質の一部を採取し液体窒素で凍結し−８０℃で保管した。
【０１３１】
常法に従って、各々の腎皮質試料中に発現しているＴｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡを以下のようにして定量した。
市販のＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて該キットに添付の実験操作マニュアルに従って、各腎皮質試料のｔｏｔａｌ　ＲＮＡを取得した。ＲＮＡの定量は、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で行った。
得られたＴｏｔａｌ　ＲＮＡを鋳型としてＭ−ＭＬＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ　Ｓｅｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ製）、５×１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｂｕｆｆｅｒ及び０．１Ｍ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて常法に従ってｃＤＮＡを調製した。
【０１３２】
得られたｃＤＮＡに、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ（ＱＵＩＡＧＥＮ製）、１０×ＴａｑＭａｎ　ｂｕｆｆｅｒ　Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、Ｐｒｉｍｓｅ　ｓｅｎｓｅ、Ｐｒｉｍｅｒ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｂｅ及びＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を加えて反応させ、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、各試料中に発現したＴｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎ及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの量を測定した。
各試料中のＴｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎのｍＲＮＡの発現量は、上記で測定したＴｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎのｍＲＮＡのコピー数をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのコピー数で除して値により解析した。
【０１３３】
結果を、図２に示した。
この結果、本発明の抗ＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体ＪＭａｂ１９５が、陰性対照に比べ、腎臓疾患並びに組織繊維症の代表的なパラメーターであるＴｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎのｍＲＮＡの発現を顕著に抑制した。また、また驚くべきことに、該ＪＭａｂ１９５による当該抑制効果は、ＴβＲＩＩのリガンドであるＴＧＦβ１に対するモノクローナル抗体（陽性対照；１Ｄ１１）のそれよりもさらに高いものであった。
このことから、本発明の抗ＴβＲＩＩヒトモノクローナル抗体ＪＭａｂ１９５が、腎臓疾患並びに組織繊維症に対して有意な抑制及び治療効果を有していることが示された。
【０１３４】
【発明の効果】
本発明のヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するモノクローナル抗体は、ヒトＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対して極めて高い結合親和性及び中和活性を有することから、該モノクローナル抗体またはその一部を含んでなる医薬組成物は、ＴＧＦ−βの作用に起因する種々の疾患、例えば、腎疾患（腎繊維症、腎炎、腎不全、腎硬化症など）、肺疾患（例えば、肺線維症、肺炎など）、肝臓疾患（例えば、肝臓組織繊維症、肝硬変、肝炎など）、皮膚疾患（例えば、創傷、強皮症、、乾癬、ケロイドなど）、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症など）、血管疾患（例えば、血管再狭窄、リウマチ性血管炎など）、種々臓器での組織繊維症（種々の癌で併発する組織線維症を含む）、及び動脈硬化症（併発する組織繊維症を含む）などの発症及び／または進行を抑制、阻止し、該疾患を治療または予防するための医薬品として有用である。
【０１３５】
【配列表】
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【０１３６】
「配列表フリーテキスト」
配列番号：３
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプライマー配列。
配列番号：４
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプローブ配列。
配列番号：５
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプローブ配列。
【０１３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＧＦβ刺激により誘導されるメサンギウム細胞からのＰＡＩ−Ｉ分泌亢進に対する抗ヒトＴＧＦβヒトモノクローナル抗体の阻害活性を示す図。
【図２】ＵＵＯ処置されたサルの腎臓において腎不全症の進行に伴って起こるＴｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎのｍＲＮＡの発現上昇に対する抗ヒトＴＧＦβヒトモノクローナル抗体の阻害活性を示す図。
【図１】
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【図２】
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