(57)【要約】【課題】新規で、且つ、従来の側脳室周囲から分離される細胞群を分離培養する方法等と比べて遙かに分化誘導率の高い神経幹細胞、神経系前駆細胞等の分離若しくは作製方法と、この方法により得られる神経幹細胞、神経系前駆細胞等の提供。【解決手段】ミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞由来の、神経系前駆細胞、神経細胞前駆細胞、神経細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト又は神経幹細胞、及び、当該細胞若しくは当該細胞と担体を含有してなる細胞治療用組成物又は再生移植治療用組成物、並びに、ミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞をアルブミン、α−フェトプロテイン又は血清の存在下、培地中で培養することを特徴とする、当該細胞の分離若しくは作製方法。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞由来の、神経系前駆細胞、神経細胞前駆細胞、神経細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト又は神経幹細胞。
【請求項２】
ミクログリア前駆細胞がミクログリオブラストである請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ミクログリア様細胞がマクロファージ細胞系譜に属する未分化細胞群の何れかである請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
マクロファージ細胞系譜に属する未分化細胞が、マクロファージ、モノサイト、クッパー細胞、樹状細胞、ＣＤ１１ｂ又はＣＤ６８陽性のミクログリア、顆粒球／モノサイト／マクロファージ系の造血系前駆細胞又は造血幹細胞である請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の神経系前駆細胞、神経細胞前駆細胞、神経細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト又は神経幹細胞、若しくは当該細胞と担体を含有してなる細胞治療用組成物又は再生移植治療用組成物。
【請求項６】
ミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞をアルブミン、α−フェトプロテイン又は血清の存在下、培地中で培養することを特徴とする、神経系前駆細胞、神経細胞前駆細胞、神経細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト又は神経幹細胞の分離若しくは作製方法。
【請求項７】
アルブミン、α−フェトプロテイン又は血清が生体内又は生体外に存在するものである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
血清が牛胎仔血清である請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
ミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞がラット由来のミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞である請求項６〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
培地がＤＭＥＭ　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）又はＭＥＭ　（ｍｉｎｉｍｕｍ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）である請求項６〜９の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、細胞治療用や再生移植治療用に使用し得る、神経系前駆細胞、神経細胞前駆細胞、神経細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト、神経幹細胞等の新規な分離若しくは作製方法と、該方法により得られた神経系前駆細胞、神経細胞前駆細胞、神経細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト又は神経幹細胞、並びにこれらの細胞の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経幹細胞に関する研究が近年急速に発展し、脳再生の可能性が唱えられるようになった。アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患、脳卒中など脳血管障害、脳腫瘍、神経外傷等様々な脳神経疾患は、消失した神経組織の再生源として神経幹細胞を用いることによって根本的に治療できるのではないかという期待が持たれている。脳再生治療の大きな期待を担う神経幹細胞は、中枢神経系全般に存在していると推測されているが、実際には主に側脳室周囲から分離される細胞群を分離培養することにより、ニューロスフェアーという未分化細胞の凝集塊を作り、ここから神経細胞及び／又はグリア細胞を誘導する技術が広く用いられている。しかしながらこの方法は、極めて分化誘導率が不良である。神経幹細胞研究の中心的人物の一人であるＧａｇｅらの報告によれば（非特許文献１参照）、人工的添加物であるレチノイン酸なしでは、神経細胞に分化する神経幹細胞はわずか２％にも満たない。分化率は、レチノイン酸を添加した場合でも５％程度に過ぎない。即ち、神経幹細胞に関する報告は全て、混雑物程度の神経細胞分化率しか示さないのである。このことから本発明者らは、神経系前駆細胞又は神経細胞前駆細胞が脳において別に存在すると考えた。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｓｏｎｇ　Ｈ，　Ｓｔｅｖｅｎｓ，　ＣＦ　ａｎｄ　Ｇａｇｅ　ＦＨ；　Ｎａｔｕｒｅ　４１７；　３９−４４，　２００２
【非特許文献２】
Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｌｉａ，　２４，　１９８−２１５，　１９９８
【非特許文献３】
Ｔｏｋｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　Ｒｅｓ．，　５３，　４１５−４２５　１９９８
【非特許文献４】
Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　Ｒｅｓ．，　３４，　２０７−２１５，　１９９９
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き現状に鑑みなされたもので、新規で、且つ、従来の側脳室周囲から分離される細胞群を分離培養する方法等と比べて遙かに分化誘導率の高い神経幹細胞、神経系前駆細胞等の分離若しくは作製方法と、この方法により得られる神経幹細胞、神経系前駆細胞等を提供することを目的とする。
なお、本発明においては、ネスチン陽性で、且つＰＫＨ２６という赤色蛍光色素の貪食作用を有するミクログリア由来の神経幹細胞と、ミクログリア由来の多分化能を有する神経系前駆細胞とを区別することとする。本発明の神経幹細胞は、従来の報告の如く大半がアストロサイトに分化し、ごく一部が神経細胞に分化する。一方、本発明の神経系前駆細胞は高頻度で神経細胞前駆細胞（ニューロブラスト）を経て神経細胞に分化する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞由来の、神経系前駆細胞、神経細胞前駆細胞、神経細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト又は神経幹細胞に関する。
【０００６】
また、本発明は、上記神経系前駆細胞、神経細胞前駆細胞、神経細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト又は神経幹細胞、若しくは当該細胞と担体を含有してなる細胞治療用組成物又は再生移植治療用組成物に関する。
【０００７】
更に、本発明は、ミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞をアルブミン、α−フェトプロテイン又は血清の存在下、培地中で培養することを特徴とする、神経系前駆細胞、神経細胞前駆細胞、神経細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト又は神経幹細胞の分離若しくは作製方法に関する。
【０００８】
中枢神経系には、神経外胚葉由来とされてきた、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトの他に、一般的には中胚葉由来のマクロファージ様細胞とされてきたミクログリアがある。しかし、機能的形態的特徴から、ミクログリアは終末分化細胞とされる末梢のマクロファージとは異なり、やや未分化な細胞であると考えられる。本発明者らはこの点に着目し、ミクログリアの未分化性を応用し、ミクログリアから神経系前駆細胞又は神経細胞前駆細胞を作製するための可能性について鋭意研究を重ねてきた。その結果、思いもかけずミクログリアから神経細胞前駆細胞のみならず神経系未分化前駆細胞を容易に且つ効率的に作り出す方法を確立し、ミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞から神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、神経幹細胞等を誘導できることを見出し本発明を完成するに到った。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明に係るミクログリア前駆細胞としては、例えば、先に本発明者らが、世界に先駆けてその培養に成功したミクログリオブラスト等が挙げられる。
また、本発明のミクログリア様細胞の例としては、例えば、ヒトやラットなどの哺乳動物のマクロファージ細胞系譜に属する未分化細胞群が挙げられる。
こらら未分化細胞群の具体例としては、例えば、マクロファージ、モノサイト、クッパー細胞、樹状細胞、ＣＤ１１ｂ又はＣＤ６８陽性のミクログリア、顆粒球／モノサイト／マクロファージ系の造血系前駆細胞、造血幹細胞等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。なお、造血幹細胞よりミクログリアが分化することは公知である。
【００１０】
本発明の細胞治療用組成物又は再生移植治療用組成物において用いられる担体としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液、ブドウ糖液等の公知の溶媒、リポフェクタミン及び／又はウイルスベクターを含有してなる遺伝子導入用試薬、コラーゲン、アガロース、高分子化合物のミクロ粒子、マイクロカプセル、ポリエルリジン等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。また、これらの担体は１種類のみ用いてもよいし、複数組み合わせ用いてもよい。
【００１１】
本発明の分離若しくは作製方法で用いられる血清としては、例えば、牛胎仔血清（ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ，　ＦＣＳ）等が好ましいものとして挙げられるが、これに限定されるものではなく、ウマ、ブタ、ヒト等の哺乳動物の血清又は胎児血清であればその何れを用いてもよい。
本発明において用いられる血清は、患者由来の自家血清又は成人の血清でもよく、胎児由来の血清でもよい。また、胎児由来の血清、患者由来の自家血清、成人の血清、又はＦＣＳの中に、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ，　ＣＥＡ）等の胎児血清特異的蛋白群を含んでいてもよい。
本発明の方法において用いられる血清の濃度は、１０容量％〜１００容量％、好ましくは２０容量％〜９０容量％、より好ましくは３０容量％〜８０容量％、更に好ましくは６５容量％〜７５容量％である。
本発明の方法において、血清を用いる代りに、血清を含む血液又は血漿を用いてもよい。
【００１２】
また、本発明の方法において血清の代わりにアルブミン又は前記した胎児血清特異的蛋白群のうち１つ又は２つ以上を、１００ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは１００μｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で用いてもよい。なお、本発明者らは３０ｍｇ／ｍｌの濃度のアルブミンが本発明の血清と同様の作用を有することを見出しているので、当然のことながらアルブミンと類似したアミノ酸配列及び／又は機能を有するα−フェトプロテインも胎生期の生理的血中濃度で本発明の血清と同様の作用を示すと考えられる。
【００１３】
本発明の方法で用いられるミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞としては、例えば、ラット由来のものが好ましいものとして挙げられるが、これに限定されるものではなく、ヒト由来のミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞でも、その他の哺乳動物由来のミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞でも何れも使用可能である。
【００１４】
本発明の分離若しくは作製方法で用いられる培地としては、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）やＭＥＭ　（ｍｉｎｉｍｕｍ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）等の培地が好ましいものとして挙げられるが、これ以外の、例えば、ＭＣＤＢ１５３及びその改変培地、ＣＭＦ、セルバンカー等の培地も同様に使用可能である。
なお、これらの培地類は、本発明の細胞治療用組成物又は再生移植治療用組成物における担体としても使用得る。
【００１５】
本発明者らは、ラット脳から公知の方法により分離したミクログリアを１０容量％ＦＣＳを含んでなるＤＭＥＭ中で３日間培養することにより、ミクログリア前駆細胞の１つであるミクログリオブラストを作製し、更に同ミクログリオブラストを２０容量％〜１００容量％のＦＣＳ、好ましくは３０容量％〜９０容量％のＦＣＳ、より好ましくは４０容量％〜８０容量％のＦＣＳ、更に好ましくは７０容量％のＦＣＳを含有してなるＤＭＥＭ中で２日間培養することにより、神経系前駆細胞又は神経細胞前駆細胞を作製することに成功し本発明を完成した。なお、前記した方法で得られた神経系前駆細胞をスクレーパーを用いて回収し、浮遊培養用ポリスチレンディッシュにまき、炭酸ガスインキュベーター中で３０分間インキュベートすると、少量残存しているミクログリアはディッシュに接着した。一方、神経系前駆細胞（即ち未分化細胞群）は培養液に浮遊しているので、これらを遠心にて集め、高濃度グルコース（４．５ｇ／Ｌ）を含んでなる無血清のＤＭＥＭ培地に懸濁し、ポリエルリジンコートした基質上にまくと、未分化細胞群は速やかに接着し、特定の細胞（即ち、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト又は神経幹細胞）に分化することも見出された。
【００１６】
また、前記したミクログリオブラストを７０容量％ＦＣＳを含んでなるＤＭＥＭ中で２日間培養後、同培養用ディッシュを振とう機で１０−３０分間程度好ましくは２０分間程度振とうすると、神経系前駆細胞（即ち未分化細胞群）の中でも、集団発生し、且つ最も基質接着力が弱い神経細胞前駆細胞（ニューロブラスト）が選択的に浮遊してくることも見出された。この神経細胞前駆細胞を遠心により集め、ポリエルリジンコートした基質上にまき無血清培地中で培養すれば、神経細胞様の突起を伸展し２４時間以内に自動的に神経細胞特異蛋白質［ニューロフィラメント、ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２（ＭＡＰ２）、シナプシンＩ等］の発現が見出された。即ち前記した方法によりミクログリオブラストから神経細胞への分化が効率よく誘導された。
【００１７】
一方、本発明では、ミクログリアを１０容量％ＦＣＳを含んでなるＤＭＥＭ中で培養して得られたミクログリオブラストの中にも、オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーであるＯ４陽性の細胞が存在することも見出された。このＯ４を蛍光標識した細胞群をセルソーターにより分離し、ポリエルリジンをコートした基質上にまき無血清培地中で培養すれば、同細胞は複雑な突起を伸展し７２時間以内に自動的にオリゴデンドロサイト特異マーカー（ＣＮＰａｓｅ、ガラクトセレブドシド等）を発現することも判明した。
【００１８】
以上の如く、本発明は複雑な操作により非効率的に神経幹細胞を分離する従来の技術と比較して、より簡便に且つ確実に多くの神経系前駆細胞、特には神経細胞前駆細胞をミクログリア様細胞から作製又は分離する技術を提供するものである。なお、本発明の方法によりミクログリオブラストから、アストロサイトへの分化能力が高い従来の神経幹細胞も作製可能であるが、本発明の方法により得られた神経幹細胞も、以前の報告通り神経細胞に分化する確率は極めて低いことが判明した。
【００１９】
従って本発明は、次のような観点から神経科学研究史上画期的なものであり、再生医学の新しい展開を約束するものである。
（１）ミクログリアは中胚葉系の細胞であり、外胚葉から発生するその他の細胞とは性質、細胞系譜が全く異なるものとされてきたが、本発明はそれを覆すものであり、ミクログリアを脳・神経再生医療のツールとして利用することを可能ならしむる。
（２）ミクログリアは灰白質、白質を問わず脳・脊髄の全域にまんべんなく存在する。また、ミクログリアは極めて遊走能の高い細胞であり、病変部位へ速やかに移動することが出来る。従って、脳・脊髄は全域で完全に再生する可能性を有することが判明した。現実には脳が再生困難であるのは、ミクログリアが、通常の脳内環境では神経細胞前駆細胞（ニューロブラスト）に分化することが出来ず、不適切な割合でアストロサイトやオリゴデンドロサイトに分化するためであると考えられる。適切に脳内微小環境を整えることにより、例えば脳・神経病変部の微小環境において血清濃度を１０容量％〜１００容量％、好ましくは２０容量％〜９０容量％、より好ましくは３０容量％〜８０容量％、更に好ましくは７０容量％程度に上げることにより生体内又は生体外で、完全な神経細胞再生・新生若しくは脳再生が期待できる。
（３）ミクログリアは中枢神経系のあらゆる部位に存在するため、手術時等に附随して得られる少量の脳組織からミクログリアを分離し、同ミクログリアから本発明に基づく方法を利用して大量の神経系前駆細胞（即ち、神経細胞前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞等）を作製しうる。また造血幹細胞又は胚性幹細胞からミクログリアを作製してもよい。
【００２０】
なお、後述する実施例では、ラット由来のミクログリア又はミクログリオブラストに高濃度のＦＣＳを投与することにより、神経系前駆細胞を作製したが、当然のことながら、ヒト由来のミクログリア又はミクログリオブラストも同様の方法により分離作製したのちに高濃度（１０〜１００容量％、好ましくは２０〜９０容量％、より好ましくは３０〜８０容量％、更に好ましくは７０容量％）のヒト血清（胎児血清を含む）又はＦＣＳに暴露すれば、ヒトの神経系前駆細胞が効率よく安定的に作製できる。即ち、血清を用いることからなる、ミクログリア又はミクログリオブラストより神経系前駆細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、神経細胞前駆細胞、神経細胞、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞又は神経幹細胞を作製するための本発明の方法は、生体内、生体外及び動物種を問わず、普遍的に利用できると言える。更に、ミクログリア様細胞として、マクロファージ細胞系譜に属する未分化細胞群（例えば、マクロファージ、モノサイト、クッパー細胞、樹状細胞、ＣＤ１１ｂ又はＣＤ６８陽性のミクログリア、顆粒球／モノサイト／マクロファージ系の造血系前駆細胞、造血幹細胞等）を用いてもよい。また、実施例ではミクログリア、ミクログリオブラスト又は神経系前駆細胞培養用の培地としてＤＭＥＭを用いているが、ＤＭＥＭに代わるその他の培地としてＭＣＤＢ１５３およびその改変培地、ＣＭＦ、セルバンカー、ＭＥＭ等自体公知の培地を用いてもよい。更に、本発明の方法において用いられる血清もＦＣＳに限定する必要はなく、ウマ、ブタ、ヒト等の哺乳動物の血清又は胎児血清であればその何れを利用してもよいこと、また、本発明において用いられる血清は、患者由来の自家血清でも、成人の血清でも、胎児由来の血清でもよいこと、更には、胎児由来の血清、患者由来の自家血清、成人の血清、又はＦＣＳの中に、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ，　ＣＥＡ）等の胎児血清特異的蛋白群を含んでいてもよいこと、血清の代わりにアルブミン又は前記した胎児血清特異的蛋白群のうち１つ又は２つ以上を用いても良いこと、アルブミンと類似したアミノ酸配列及び／又は機能を有するα−フェトプロテインも胎生期の生理的血中濃度で用い得ること等は既に述べた通りである。
【００２１】
アルブミン、α−フェトプロテイン又は血清の存在下に、培地中で培養することからなる、ミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞より神経系前駆細胞、神経細胞前駆細胞、神経細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、又は神経幹細胞を作製若しくは分離するための本発明の方法は、生体外における基礎研究用の細胞を供給するために利用することもできるが、生体内における細胞治療、再生移植治療にも応用することができる。
より具体的には、縫合糸の素材として用いられるポリグリコール酸などの生分解性材料からカプセル若しくはマイクロカプセルを作製し、同カプセルの中に高濃度（３０容量％以上）の血清と１万個〜１０００万個／ｍｌ程度のミクログリオブラストを含んでなる培養液（例えばＤＭＥＭ）を封入したのちに、同カプセルを脳神経組織の病変部若しくは欠損部に１回あたり０．１ｍｌ〜１０ｍｌ程度病状が改善するまでくり返し（最大１０００回まで）、移植又は注入してもよい。
なお、前記した脳神経組織の病変部若しくは欠損部の例としては、パーキンソン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患、脳卒中、脳梗塞などの脳血管障害、頭部外傷や脊髄損傷などの神経外傷、多発性硬化症などの脱髄疾患、中枢神経の発生異常・代謝異常などにより生じたものがあげられる。
また、あらかじめミクログリオブラストの中に含まれるＯ４陽性のオリゴデンドロサイト前駆細胞をセルソーターにより分離し、オリゴデンドロサイト前駆細胞及び／又はポリエルリジンコートした基質を含んでなる無血清培地を前記のカプセル若しくはマイクロカプセルに封入したのちに、脳神経組織の病変部若しくは欠損部にミクログリオブラストの場合と同様の細胞数を移植又は注入することもできる。
【００２２】
このように、本発明は好ましくは患者自身の脳組織から採取したミクログリア若しくは造血幹細胞由来のミクログリアからミクログリオブラストを作製し、それをその他の種類の脳細胞（神経系前駆細胞、ニューロブラスト、神経細胞、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、神経幹細胞）に変化せしめたのちに、脳・神経疾患を有する当該患者の予防、処置又は治療に応用するための技術を提供するものである。
もちろん、本発明の方法において、ミクログリオブラストから作製された前記の細胞（例えば、神経系前駆細胞、神経細胞前駆細胞、神経幹細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、神経細胞、アストロサイト、アストロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト）及び／又はミクログリオブラストを含有してなる培養液（ＤＭＥＭ、ＭＥＭ等）を１回あたり細胞数として１千個〜１億個程度直接脳神経組織の病変部若しくは欠損部に移植又は注入してもよい。また、これらを血管内好ましくは内頚動脈系又は椎骨動脈系細動脈内に注入してもよいし、その他皮下注射等の公知の投与法、投与経路を選択してもよい。
即ち、本発明の方法によりミクログリアより作製された神経系前駆細胞などの細胞及びその担体は、細胞治療用組成物又は再生移植治療用組成物として利用できると言える。
【００２３】
また、脳神経組織の病変部若しくは欠損部において、例えば血清徐放カプセル若しくは血清徐放ミニポンプなどを用いて高血清濃度を示す微小環境を形成し、当該脳神経組織における内因性ミクログリアのミクログリオブラストへの脱分化、更にはミクログリオブラストから神経系前駆細胞への脱分化を誘導してもよい。もちろん前記した内因性ミクログリアの脱分化誘導に加えて、本発明の方法により生体外で得られたミクログリオブラストを、真皮コラーゲン蛋白、低濃度（０．０５〜０．５重量％）アガロース、血清等と混合したのちに前記の如く脳神経組織の病変部若しくは欠損部に直接注入・移植してもよいし、血管内に注入してもよい。更に、α−フェトプロテイン又はアルブミンの遺伝子を一過性に発現する公知のウイルスベクターを微小な注射針を用いて、脳神経組織の病変部位に注入することにより、α−フェトタンパク質又はアルブミンを強制発現させ、これにより、内因性ミクログリアを神経系前駆細胞へと脱分化せしめることもできる。その後、ウイルスベクターによるα−フェトプロテイン又はアルブミンの強制発現効果が消失すると、神経系前駆細胞は神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化する。これによって、脳神経組織の欠損部若しくは病変部の傷害を回復せしめることができる。
【００２４】
アルツハイマー病患者においては、大脳皮質の神経細胞が細胞死に陥り、その結果著しい脳萎縮がみられる。そこで本発明により作製された、ミクログリオブラスト（０．１万個〜１０００万個／ｍｌ程度）、高濃度の血清（３０容量％以上）及び／又はＤＭＥＭなどの培養液若しくは担体を含有してなる細胞治療用組成物又は再生・移植治療用組成物を脳神経組織の病変部若しくは欠損部に１回あたり０．１ｍｌ〜１０ｍｌ程度症状が改善するまでくり返し（最大１０００回まで）直接移植するか注入することにより、アルツハイマー病を治療することができる。その際に、前記の組成物の中に、高分子化合物のミクロ粒子にポリエリリジンや真皮コラーゲン蛋白などをコーティングした基質を添加しておいてもよい。また、ミクログリオブラスト及び高濃度の血清の代わりに、本発明の方法により分離・作製された神経系前駆細胞、神経細胞前駆細胞、神経幹細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト前駆細胞、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトのうち１つ又は２つ以上をミクログリオブラストと同様の数量で使用してもよい。これらの移植する細胞種として、アルツハイマー病の場合は神経細胞前駆細胞又は神経細胞が選ばれることが多いが、その他の疾患例えば多発性硬化症などの脱髄疾患では、オリゴデンドロサイト前駆細胞及び／又はオリゴデンドロサイトが選択される。また、これらの細胞治療用組成物又は再生・移植治療用組成物は、生分解性のマイクロカプセル又はカプセルなどに封入された形であってもよいし、アガロースやゲルなどの公知の基剤に添加したような剤形であってもよい。また、前記した細胞治療用の細胞又は再生移植治療用細胞に、アルブミン、α−フェトプロテイン、酵素、成長因子、サイトカイン等有用と考えられる任意の遺伝子の発現ベクターを組み込んでおいてもよい。そうすることにより、ガングリオシドーシスのような酵素欠損を有する中枢神経疾患の予防、処置、治療も可能となる。
【００２５】
更に、アルツハイマー病等の脳神経疾患患者に対して、脳神経組織の病変部又は欠損部の血清濃度を血清徐放剤又は浸透圧ミニポンプ等を用いてあらかじめ上げておき、ミクログリオブラスト又はミクログリア（０．１万個〜１０００万個／ｍｌ）及び薬学上許容される担体を含有してなる細胞治療用組成物又は再生移植治療用組成物を１回あたり０．１ｍｌ〜１０ｍｌ程度くり返し（最大１０００回まで）、血管内好ましくは内頸動脈又は椎骨動脈内へ神経症状が改善するまで投与してもよい。その場合、ミクログリオブラスト又はミクログリアに有用な遺伝子の発現ベクターを前記の如く組み込んでおいてもよい。なお、本発明の細胞治療用組成物又は再生移植治療用組成物の原材料としてのミクログリア様細胞は、患者自身の健常な脳組織から採取・分離してもよいし、組織適合性を有する胚性幹細胞や造血幹細胞などから作製してもよい。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２７】
実施例１（ミクログリアの分離）
ラット新生仔前脳の髄膜を除去し、前脳よりナイロンメッシュを利用して細胞懸濁液を作製した。この懸濁液をポリエルリジンをコートした細胞培養フラスコに入れ、１０容量％牛胎仔血清（ＦＣＳ）を含んでなるＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　（ＤＭＥＭ）中で１３日間培養を行った。培養液は２日に１回交換した。培養終了後同フラスコを振とう機を用いて、１時間振とうし、培養液中に浮遊してきた細胞を集め、浮遊培養用のポリスチレンディッシュにまいた。このディッシュに接着する細胞は殆どがミクログリアである（純度９９％以上）。この方法は、ミクログリアを分離する方法として、広く用いられる周知の方法である（例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照。）。
成熟ラット脳よりミクログリアを分離する場合は、髄膜を除去後、トリプシンＥＤＴＡによって細胞を分散し、その後同様に浮遊培養用のポリスチレンディッシュにまく。この手技のみで純度の高いミクログリアが得られる。ヒト脳からも同様の方法によりミクログリアを分離できると考えられる。
結果を図１Ａに示す。図１Ａは図面に代わる写真である。図１Ａは分離されたミクログリアを、ミクログリア特異抗原（ＣＤ６８）に対する抗体（ＥＤ１）とオリゴデンドロサイト特異抗原（Ｏ４）に対する抗体とで二重免疫染色したものである。ＥＤ１抗体による反応を緑色の蛍光色素で、Ｏ４抗原を赤色の蛍光色素で標識しており、両者が重なった場合、矢尻で示す如く黄色を呈する。なお、細胞全体は骨格タンパクとしてのアクチンを青色に染色することにより描出している。
【００２８】
図１Ａに示す如く、フラスコより分離した直後のミクログリアは、培養ラットミクログリアの一般的なマーカーであるＥＤ１反応抗原（ＣＤ６８）を強く発現しており、いわゆるアメーバ型の形態をとっている。しかし、これらの典型的マクロファージ様形態をとるミクログリアの一部には未分化オリゴデンドロサイトのマーカーであるＯ４陽性の細胞が存在しており、これらがオリゴデンドロサイト前駆細胞（オリゴデンドログリオブラスト）である。オリゴデンドログリオブラストはＯ４抗体とセルソーターを用いて分離精製することが出来る。
【００２９】
実施例２（ミクログリオブラストの分離・作製）
次に本発明者らは、ミクログリオブラストを作製した。
上記の方法で分離したミクログリアは、増殖能は低いが、一酸化窒素や炎症性サイトカインの産生などマクロファージ様の機能を強く有する。上記のポリスチレンディッシュ上にて１０容量％ＦＣＳを含んでなる培地中でミクログリアを３日間培養することにより、同ミクログリアはマクロファージ様機能を喪失し、著しい増殖能を有するミクログリオブラストに変化する。ミクログリオブラストは、世界に先駆けて本発明者らが最近培養することに成功した細胞である。
結果を図１Ｂに示す。図１Ｂは図面に代わる写真である。図１Ｂはミクログリオブラストを、ミクログリア特異抗原（ＣＤ６８）に対する抗体（ＥＤ１）とオリゴデンドロサイト特異抗原（Ｏ４）に対する抗体とで二重染色したものである。ＥＤ１抗体による反応を緑色の蛍光色素で、Ｏ４抗原を赤色の蛍光色素で標識しており、両者が重なった場合、左下の矢尻で示す如く黄色を呈する。なお、細胞全体は、骨格タンパクとしてのアクチンを青色に染色することにより描出している。
【００３０】
図１Ｂに示す如く、ＥＤ１陽性ミクログリアは１０％ＦＣＳを含んでなるＤＭＥＭ中で３日間培養することにより細胞体は拡大し、増殖能を著しく高めてくる。Ｏ４陽性ミクログリアは依然存在している（矢尻、下）。一部のミクログリアはＣＤ６８の発現（即ちＥＤ１反応性）を著しく低下させると同時に、Ｏ４の発現を増強させ、オリゴデンドロサイトへの分化傾向を強めてくる（矢尻、上）。
【００３１】
実施例３（神経系前駆細胞の作製）
次に、本発明者らは培養液中のＦＣＳの濃度を上げることにより神経系前駆細胞（即ち神経細胞前駆細胞、アストロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、神経幹細胞の前駆細胞等）を作製した。このため、ミクログリオブラストの培養液を１０％ＦＣＳを含んでなるＤＭＥＭから７０容量％ＦＣＳを含んでなるＤＭＥＭに変更した。このＦＣＳの濃度は２０容量％以上、好ましくは３０容量％以上、より好ましくは５０容量％以上、更に好ましくは７０容量％以上であればよい。しかし、前駆細胞への脱分化は、高濃度ＦＣＳの方が効率良く進行した。７０％ＦＣＳを含んでなるＤＭＥＭ中でミクログリオブラストを２日間培養した後の細胞（即ち神経系前駆細胞）を図１Ｃに示す。図１Ｃは図面に代わる写真である。
【００３２】
さて、ミクログリオブラストが神経系前駆細胞に脱分化する過程で、ミクログリア特異抗原の発現が減少してくるので、本発明者らは神経系前駆細胞がミクログリア由来であることを確認するため２つのマーカーを選択した。即ち、本発明者らは、ミクログリアがマクロファージと同様の機能を持つことに着目し、生きたミクログリアを特異的に染色する２種類の蛍光物質を用い、ミクログリア由来であることを証明した。一つは、ＰＫＨ２６　（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ，　ＵＳＡ）と呼ばれる貪食能依存性に細胞内に取り込まれる赤色蛍光色素である。末梢組織では単球やマクロファージなどが、中枢神経系ではミクログリアがこの色素を特異的に取り込むことが示されてきた。もう一つは、末梢マクロファージ同様、ミクログリアには変性低比重リポ蛋白質　（ＬＤＬ）受容体が発現しておりアセチル化ＬＤＬ　（ＡｃＬＤＬ）がこの受容体を経由して細胞内特には細胞質又はリソゾームに取り込まれることを利用したもので、本発明では緑色蛍光を発するＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識ＡｃＬＤＬ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，　ＯＲ，　ＵＳＡ）を用いた。前記のミクログリア脱分化処理によってＣＤ６８等のミクログリアマーカーの発現レベルは低下していくが、ＰＫＨ２６による赤色蛍光あるいはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８−ＡｃＬＤＬによる緑色蛍光は、ミクログリアが脱分化した後にもある期間のみ残存するため、これらの蛍光の有無により起源がミクログリアであるかどうかを判定することができた。
【００３３】
そこで、図１Ｃには、緑色蛍光を発するＡｃＬＤＬを核周部に取り込んだミクログリア由来の神経系前駆細胞とオリゴデンドロサイトのマーカーであるＯ４を同時に発現するミクログリア由来の神経系前駆細胞が赤色で標識されている。
図１Ｃに示す如く、７０％ＦＣＳ存在下での培養が終了する時点では、オリゴデンドロサイト様の突起を伸展するものもみられた。少なくとも一部のＯ４強陽性細胞はＡｃＬＤＬ陽性であり、起源がミクログリアである（図１Ｃ、矢尻）。一方、殆どのＯ４弱陽性ミクログリアは見られなくなった。これは、脱分化が一層進行した結果であると考えられる。
【００３４】
実施例４（神経系前駆細胞より神経細胞前駆細胞、神経細胞、神経幹細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトの分化）
次に本発明者らは、ミクログリオブラストを７０容量％ＦＣＳ存在下で２日間培養することにより得られる上記の細胞が、神経系前駆細胞であることを証明するために、同細胞から神経細胞前駆細胞（ニューロブラスト）、神経細胞、神経幹細胞、アストロサイト及び／又はオリゴデンドロサイトが分化誘導されることを示した。すなわち、神経細胞前駆細胞、神経細胞、アストロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、神経幹細胞の分化を誘導するために、ミクログリオブラストを２日間７０％ＦＣＳを含んでなるＤＭＥＭ中で培養した後、得られた細胞をスクレーパーを用いて回収し、浮遊培養用ポリスチレンディッシュにまき炭酸ガスインキュベーター中で３０分間インキュベートした。ごく少量残存しているミクログリア又はミクログリオブラストはこの間にディッシュに接着した。一方、未分化細胞群すなわち神経系前駆細胞は培養液中に浮遊しているので、これらの細胞を遠心にて集め、高濃度グルコース（４．５ｇ／Ｌ）を含んでなる無血清のＤＭＥＭ培地に懸濁し、ポリエルリジンコートした基質上にまいた。
結果を図２、図３に示す。図２、図３は図面に代わる写真である。
【００３５】
図２Ａは神経細胞へ分化する直前の神経細胞前駆細胞（ニューロブラスト）を、神経細胞特異抗原であるニューロフィラメントに対する抗体を用いて緑色に免疫染色し、且つミクログリアのマーカーである赤色蛍光色素ＰＫＨ２６で赤色に標識したものである。免疫染色とＰＫＨ２６標識の重なりにより黄色の反応がみられる（矢尻）。図２Ｂは、ミクログリオブラスト由来の神経細胞を、神経細胞特異抗原であるニューロフィラメントに対する抗体を用いて赤色に免疫染色したものである（矢尻）。図２Ｃは、ミクログリオブラスト由来のニューロブラストから分化した神経細胞を、神経細胞特異抗原であるニューロフィラメントに対する抗体により緑色に免疫染色し、且つミクログリアのマーカーであるＰＫＨ２６で赤色に標識したものである。免疫染色とＰＫＨ２６標識の重なりが黄緑色を呈している（矢尻）。図２Ｃには、ＰＫＨにのみ標識された細胞もみられる。図２Ｄは、ミクログリオブラスト由来のニューロブラストから分化した神経細胞を、ミクログリアのマーカーであるＡｃＬＤＬにより緑色に標識し、且つ神経細胞特異抗原であるシナプシンＩに対する抗体を用いて赤色に免疫染色したものである。ＡｃＬＤＬ標識と免疫染色の重なりが黄色を呈している（矢尻、中央）。なお、その他の細胞はアクチン染色により細胞全体が青色に描出され、核周部はＡｃＬＤＬで標識されている。図２Ｅはミクログリオブラスト由来のニューロブラストから分化した神経細胞を、ミクログリアのマーカーであるＡｃＬＤＬにより緑色に核周部標識し、且つ神経細胞特異抗原であるニューロフィラメントの抗体を用いて赤色に免疫染色したものである。両者の重なりを矢尻で示す。なお、細胞全体は骨格タンパクとしてのアクチンを青色で染色することにより描出している。
【００３６】
図２Ａに示す如く、ミクログリオブラストを７０％ＦＣＳ存在下で２日間培養した後に得られた未分化細胞群即ち神経系前駆細胞を無血清培養液中に移すと、丸く特徴のない細胞がしばしば多数観察された。これらの細胞は、ミクログリアから由来していることを示すＰＫＨ２６赤色蛍光と発現し始めたニューロフィラメント２００ｋＤａタンパク質の緑色蛍光が重なって黄色を呈していた（矢尻）。これらは神経細胞に分化する直前の神経細胞前駆細胞（ニューロブラスト）と考えられた。更に一部のニューロブラストは既に短い突起を伸展し始めていた。図２Ｂに示すように、このようなニューロブラストの集まりは、まもなく突起を大きく伸展し分化した神経細胞（ニューロン）の集団として観察されるようになった（矢尻）。個々の神経細胞の拡大像を図２Ｃに示す。図２Ｃに示す如く（矢尻）、ニューロフィラメントタンパク質の存在を示す緑色蛍光はＰＫＨ２６の赤色蛍光と混じり、黄緑色として観察された。また、図２Ｃには、ミクログリア様の形態を持つ未分化細胞も同時に示されているが、こちらはニューロフィラメントタンパク質を発現していないが、起源がミクログリアであったことを示すＰＫＨ２６の赤色蛍光を保持していた。図２Ｄでは、ミクログリア起源を示すＡｃＬＤＬの緑色蛍光とともに、シナプス小胞に付随するタンパク質シナプシンＩ即ち神経細胞特異抗原の発現を赤色蛍光で示している（矢尻、中央）。中央の神経細胞はゴルジ体に豊富に存在するシナプシンＩの赤色蛍光と、ＡｃＬＤＬの緑色蛍光が混じり合い、細胞体が黄色を呈していた（矢尻、中央）。突起先端部にはシナプシンＩの顆粒状の強い集積があり、この部がシナプスとなる成長円錐部分であることを示している（矢尻、下）。図２Ｅでは、ニューロフィラメントタンパク質を発現する長大な突起を持つ神経細胞群が、細胞体内又は核周部にＡｃＬＤＬの蛍光を保持していた（矢尻）。従って、これらの細胞がミクログリア起源の神経細胞であることが判明した。
以上のことより、ミクログリオブラストを７０容量％のＦＣＳを含有してなる培養液（例えばＤＭＥＭ）中で２日間培養することにより得られる細胞群は、神経細胞前駆細胞（ニューロブラスト）を含んでなるものであり、当該神経細胞前駆細胞（ニューロブラスト）は更に神経細胞へと分化することが見出されたことになる。
【００３７】
図３Ａは、ミクログリオブラストを７０容量％ＦＣＳ存在下で２日間培養することにより得られる細胞群から分化した神経幹細胞を示しており、当該神経幹細胞を神経幹細胞のマーカーであるネスチンに対する抗体を用いて緑色に免疫染色し、且つミクログリアのマーカーであるＰＫＨ２６で赤色に標識している。免疫染色とＰＫＨ２６標識の重なりが黄色を呈している。図３Ｂは、ミクログリオブラストを７０容量％ＦＣＳ存在下で２日間培養することにより得られる細胞群から分化したアストロサイトを示しており、当該アストロサイトをアストロサイト特異抗原であるＧＦＡＰ　（ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｉｌｌａｒ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）に対する抗体を用いて緑色に免疫染色し、且つミクログリアのマーカーであるＰＫＨ２６で赤色に標識している。免疫染色とＰＫＨ２６標識の重なりが黄色を呈している。図３Ｃは、ミクログリオブラストを７０容量％ＦＣＳ存在下で２日間培養することにより得られる細胞群から分化したオリゴデンドロサイトを示しており、当該オリゴデンドロサイトをミクログリアのマーカーであるＡｃＬＤＬで緑色に標識し、且つオリゴデンドロサイトのマーカーであるガラクトセレブドシドに対する抗体を用いて赤色に免疫染色している。ＡｃＬＤＬ標識と免疫染色の重なりが黄色を呈している（矢尻）。なお、その他の細胞はアクチン染色により青色を呈している。図３Ｄは、ミクログリオブラストを７０容量％ＦＣＳ存在下で２日間培養することにより得られる細胞群から分化したオリゴデンドロサイトを示しており、当該オリゴデンドロサイトをオリゴデンドロサイト特異抗原（Ｏ４）に対する抗体を用いて緑色に免疫染色し、且つミクログリアのマーカーであるＰＫＨ２６で赤色に標識している。免疫染色とＰＫＨ標識の重なりが黄緑色を呈している（矢尻）。
【００３８】
図３Ａに示す如く、緑色蛍光を示すネスチン陽性の神経幹細胞は、同時にＰＫＨ２６の赤色蛍光を保持していたので、これらの神経幹細胞が全てミクログリア由来であることが判明した。因みに、これらの神経幹細胞は、殆どアストロサイトに分化した。図３Ｂに示す如く、ＰＫＨ２６の赤色蛍光を保持するミクログリア起源の細胞がアストロサイト特異蛋白であるＧＦＡＰを発現していた。図３Ｃに示す如く、ＡｃＬＤＬによる緑色蛍光を保持するミクログリア起源の細胞が、典型的なオリゴデンドロサイトのマーカーであるガラクトセレブロシド（赤色蛍光）を発現する細胞に変化していた。図３Ｄに示す如く、ミクログリアのマーカーであるＰＫＨ２６の赤色蛍光を保持する細胞が、同じくオリゴデンドロサイトのマーカーであるＯ４陽性であった。
以上のことより、ミクログリオブラストを７０容量％のＦＣＳを含有してなる培養液（例えばＤＭＥＭ）中で２日間培養することにより得られる未分化細胞群は、神経幹細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化することが見出されたことになる。従って、前記した未分化細胞群は、神経細胞前駆細胞（ニューロブラスト）、神経細胞、神経幹細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト又はオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化若しくは変化し得る神経系前駆細胞であることが証明されたことになる。
【００３９】
実施例５（神経系前駆細胞より神経細胞前駆細胞の分離）
本発明者らは、更にミクログリオブラストを２０〜７０容量％のＦＣＳを含有してなる培養液中で２日間培養することにより得られる未分化細胞群即ち神経系前駆細胞群より、神経細胞前駆細胞（ニューロブラスト）を選択的に分離する方法も見出した。神経細胞前駆細胞は、集団で発生し基質接着力が最も弱い。そのため、神経系前駆細胞即ち未分化細胞群を含むディッシュを振とう機で２０分間程度振とうすることにより、神経細胞前駆細胞のみが浮遊してくる。この神経細胞前駆細胞を遠心によって集め、ポリエルリジンをコートした基質上にまき無血清培地中で培養すると、これらの細胞は神経細胞様の突起を伸展し２４時間以内に自動的に神経細胞特異蛋白質（ニューロフィラメント、ＭＡＰ２、シナプシンＩ）を発現した。即ち、神経細胞前駆細胞から神経細胞への分化が確認された。
【００４０】
実施例６（オリゴデンドロサイト前駆細胞及び／又はオリゴデンドロサイトの分離）
前記した如く、ミクログリアを１０％ＦＣＳを含んでなるＤＭＥＭ中で培養して得られたミクログリオブラストの中に、オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーであるＯ４の陽性細胞が存在するので、本発明者らは、オリゴデンドロサイト前駆細胞ならびにオリゴデンドロサイトの分離をも試みた。即ち、Ｏ４抗体を用いて蛍光標識した細胞群をセルソーターにより分離した。この分離した細胞群をポリエルジリンをコートした基質上にまき無血清培地中で培養すると、同細胞は複雑な突起を伸展し７２時間以内に自動的にオリゴデンドロサイト特異マーカー（ＣＮＰａｓｅ、ガラクトセレブロシド）を発現した。従って、本発明は、従来分離同定が困難とされてきたオリゴデンドロサイトも容易に分離することを可能にした。
【００４１】
【発明の効果】
本発明は、生体内若しくは生体外において、ミクログリア、ミクログリア前駆細胞又はミクログリア様細胞をアルブミン、α−フェトプロテイン又は血清の存在下、培地中で培養することにより、神経系前駆細胞、神経細胞前駆細胞、神経細胞、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト又は神経幹細胞を分離若しくは作製する方法を提供するものである。
本発明の方法により得られた前記細胞と担体を含有してなる細胞治療用組成物又は再生移植治療用組成物は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患、多発性硬化症などの脱髄疾患、脳梗塞、脳出血、脳卒中などの脳血管障害、ガングリオシドーシスなどの中枢性代謝異常症、脊髄損傷、頭部外傷などの神経外傷の予防、処置又は治療に有用である。特に本発明は、前記した脳神経疾患を有する患者の脳神経組織のうち健常な部分を利用してミクログリアを分離し、当該ミクログリアを脱分化せしめることによりあらゆる種類の脳細胞に分化可能な神経系前駆細胞を作製する方法をも提供するものであるので、移植医療後の拒絶反応を懸念することも少なくなる。また、本発明の方法により得られた、ミクログリア様細胞由来の上記細胞は、基礎研究用細胞、新薬開発のための薬効評価系としても利用可能であり、脳細胞の可塑性、再生機構、脱分化機構、分化機構を追究する上で必須のツールとなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１のＡは、脳より分離した後のミクログリアを示す、図面に代わる写真である。図１のＢは、１０容量％ＦＣＳ存在下で３日間ミクログリアを培養して得られたミクログリオブラストを示す、図面に代わる写真である。図１のＣは、７０容量％ＦＣＳ存在下で２日間ミクログリオブラストを培養して得られた神経系前駆細胞又は未分化細胞群を示す、図面に代わる写真である。
【図２】図２のＡは、神経細胞に分化する直前のミクログリア由来の神経細胞前駆細胞（ニューロブラスト）を示す、図面に代わる写真である。図２のＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅはそれぞれミクログリア由来の神経細胞を示す、図面に代わる写真である。
【図３】図３のＡは、ミクログリア由来の神経幹細胞を示す、図面に代わる写真である。図３のＢは、ミクログリア由来のアストロサイトを示す、図面に代わる写真である。図３のＣ、Ｄは、それぞれミクログリア由来のオリゴデンドロサイトを示す、図面に代わる写真である。なお、本発明に係る写真はすべて蛍光顕微鏡写真である。
【図１】
2004129561.tif 000002
【図２】
2004129561.tif 000003
【図３】
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