(57)【要約】【課題】動物の分化細胞を大量かつ簡便に作製する手法、及び細胞の分化を調節する手法の提供。【解決手段】分化細胞の作製方法であって、以下の工程：（ａ）血管内皮由来細胞を増殖因子を含む培地中で培養する工程、及び（ｂ）培養した細胞の培地から増殖因子を除き、又は上記の増殖因子活性を阻害した状態で、さらに細胞を培養する工程、を含み、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び／又は他の種の細胞に分化した細胞を得ることを特徴とする、上記作製方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化細胞の作製方法であって、以下の工程：
（ａ）血管内皮由来細胞を増殖因子を含む培地中で培養する工程、及び
（ｂ）培養した細胞の培地から増殖因子を除き、又は上記の増殖因子活性を阻害した状態で、さらに細胞を培養する工程、を含み、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び／又は他の種の細胞に分化した細胞を得ることを特徴とする、上記作製方法。
【請求項２】
血管内皮由来細胞が臍帯静脈血管内皮由来細胞である、請求項１記載の作製方法。
【請求項３】
血管内皮由来細胞が哺乳動物から採取されたものである、請求項１又は２記載の作製方法。
【請求項４】
哺乳動物がヒトである、請求項３記載の作製方法。
【請求項５】
増殖因子が繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーに属する因子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項６】
繊維芽細胞増殖因子が酸性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）である、請求項５記載の作製方法。
【請求項７】
他の種の細胞が、平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞からなる群より選択されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の作製方法により得られる分化細胞。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の作製方法に従って培養した細胞を、さらに増殖因子添加培地中で培養し、血管内皮細胞に再分化させることを特徴とする、血管内皮細胞の作製方法。
【請求項１０】
血管内皮由来細胞を分化させる方法であって、以下の工程：
（ａ）血管内皮由来細胞を増殖因子を含む培地中で培養する工程、及び
（ｂ）培養した細胞の培地から増殖因子を除き、又は上記の増殖因子活性を阻害した状態で、さらに細胞を培養する工程、を含み、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び／又は他の種の細胞に分化した細胞を得ることを特徴とする、上記分化方法。
【請求項１１】
増殖因子が繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーに属する因子である、請求項１０記載の分化方法。
【請求項１２】
繊維芽細胞増殖因子が酸性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）である、請求項１１記載の分化方法。
【請求項１３】
他の種の細胞が、平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞からなる群より選択されるものである、請求項１０記載の分化方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）において、増殖因子不含培地に別の因子を添加することにより、細胞の分化を増強又は抑制するものである、請求項１０記載の分化方法。
【請求項１５】
別の因子がトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリーに属する因子及びＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害物質からなる群より選択される少なくとも１種であり、細胞の分化を増強するものである、請求項１４記載の分化方法。
【請求項１６】
トランスフォーミング増殖因子βがアクチビンＡである、請求項１５記載の分化方法。
【請求項１７】
ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害物質がＰＤ９８０５９である、請求項１５記載の分化方法。
【請求項１８】
別の因子がトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）阻害物質であり、細胞の分化を抑制するものである、請求項１４記載の分化方法。
【請求項１９】
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）阻害物質がアクチビン結合タンパク質又はｓｍａｄ７タンパク質である、請求項１８記載の分化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血管内皮由来細胞から各種細胞への分化能力を有する細胞又は各種細胞に分化した細胞を作製する方法、及び該方法により作製された分化細胞に関する。また本発明は、血管内皮由来細胞を各種細胞への分化能力を有する細胞又は各種細胞に分化した細胞に分化させる方法、及びその分化を調節する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
組織補填等の再生医療や遺伝子治療など、先端的医療におけるヒト分化細胞の必要性は極めて高い。また、ヒトの生体分子生産に用いうる分化細胞の必要性も高い。しかし、このような必要性を満たす細胞を供給するには、原理的及び現実的な困難性がある。すなわち、必要とされる細胞が生存中の他人又は死亡直後の他人から供与される場合、あるいは、必要とされる細胞として他人の細胞から作出された胎生幹細胞を用いる場合には、倫理的な問題、細胞の数が不足する問題、免疫的に拒絶される問題などの複数の困難性が存在する。そのため、上述したような問題を解決し、必要なヒト分化細胞を作製する方法を開発することが、当技術分野において大きな課題となっている。
【０００３】
上述したような分化細胞を得る方法に関して、現在までにいくつかの報告がある。例えば、ウシ生体由来の血管内皮細胞が平滑筋細胞に分化することが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、この系においてはごく少量（約０．０１〜０．０３％）しか分化細胞を得ることはできず、実際的な使用には不十分である。
【０００４】
また、マウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から、血管内皮細胞と平滑筋細胞に分化する能力を有する幹細胞が分離されている（非特許文献２）が、ＥＳ細胞をヒトの医療に応用するには制約が多く、現時点で現実的ではない。
【０００５】
さらに、ウシ大動脈由来血管内皮細胞が、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリー、特にＴＧＦ−β１の刺激によって平滑筋類似の細胞に分化したことが報告されている（非特許文献３）。しかし、この系においては平滑筋細胞のごく初期の分化段階の細胞のみが得られているにすぎない。従って、完全に分化した平滑筋細胞を得るには、まだ不十分なものであり、ヒトの再生医療には利用できないと考えられる。
従って、動物、特にヒトの分化細胞を、大量かつ簡便に作製する手法が望まれていた。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｆｒｉｄ，　Ｍ．Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＵＳＡ），２００２年，第９０巻，ｐ．１１８９−１１９６
【非特許文献２】
Ｙａｍａｓｈｉｔａ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（ＵＫ），２０００年，第４０８巻，ｐ．９２−９６
【非特許文献３】
Ａｒｃｉｎｉｅｇａｓ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＫ），１９９２年，第１０３巻，ｐ．５２１−５２９
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、動物の分化細胞を大量かつ簡便に作製する手法、及び細胞の分化を調節する手法に関する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、初代ヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞をあらかじめ増殖因子の１種であるＦＧＦとウシ胎児血清で刺激した状態で単層培養して増殖させ、次いでＦＧＦを除きウシ胎児血清のみで刺激した状態で培養を続けた結果、細胞の形態が著しく変化することに着目し、この細胞の形態変化と細胞分化との関連性について明らかにするため、各種細胞分化マーカーの発現を解析したところ、平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞に特異的に認められる遺伝子発現が上昇することを見出した。従って本発明者は、血管内皮由来細胞を増殖因子添加培地中で培養した後に、増殖因子不含培地中で培養することにより、各種細胞に分化可能な細胞を作製することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、分化細胞の作製方法であって、以下の工程：
（ａ）血管内皮由来細胞を増殖因子を含む培地中で培養する工程、及び
（ｂ）培養した細胞の培地から増殖因子を除き、又は上記の増殖因子活性を阻害した状態で、さらに細胞を培養する工程、を含み、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び／又は他の種の細胞に分化した細胞を得ることを特徴とする、上記作製方法である。
【００１０】
上記作製方法において、血管内皮由来細胞としては、臍帯静脈血管内皮由来細胞を用いることが好ましい。また血管内皮由来細胞は、哺乳動物、特にヒトから採取されたものであることが好ましい。
【００１１】
また上記作製方法において、増殖因子は繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーに属する因子とすることができる。この繊維芽細胞増殖因子としては、酸性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）が挙げられるが、それに限定されるものではない。
さらに上記作製方法において、他の種の細胞としては、平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞が挙げられる。
【００１２】
また本発明は、上記作製方法により得られる分化細胞である。
本発明はまた、上記作製方法に従って培養した細胞を、さらに増殖因子添加培地中で培養し、血管内皮細胞に再分化させることを特徴とする、血管内皮細胞の作製方法である。
【００１３】
さらに本発明は、血管内皮由来細胞を分化させる方法であって、以下の工程：（ａ）血管内皮由来細胞を増殖因子を含む培地中で培養する工程、及び
（ｂ）培養した細胞の培地から増殖因子を除き、または上記の増殖因子活性を阻害した状態で、さらに細胞を培養する工程、を含み、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び／又は他の種の細胞に分化した細胞を得ることを特徴とする、上記分化方法である。
【００１４】
上記分化方法において、増殖因子が繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーに属する因子とすることができる。この繊維芽細胞増殖因子としては酸性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）が挙げられる。
上記分化方法において、他の種の細胞としては、平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００１５】
また上記分化方法の工程（ｂ）において、増殖因子不含培地に別の因子を添加することにより、細胞の分化を増強させる又は抑制することができる。ここで例えば別の因子としてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリーに属する因子又はＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害物質を用いた場合には、細胞の分化が増強される。トランスフォーミング増殖因子βとしてはアクチビンＡが挙げられる。またＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害物質としてはＰＤ９８０５９が挙げられる。さらに例えば別の因子としてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）阻害物質を用いた場合には、細胞の分化が抑制される。トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）阻害物質としてはアクチビン結合タンパク質及びｓｍａｄ７タンパク質が挙げられる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、分化細胞の作製方法及び血管内皮由来細胞を分化させる方法に係るものであり、血管内皮由来細胞を増殖因子を含む培地中で培養し、その後、培養した細胞を増殖因子を含まない培地中で培養することにより、又は増殖因子活性を阻害した状態でさらに培養することにより、分化細胞（すなわち、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び／又は他の種の細胞に分化した細胞）を得ることを特徴とするものである。
【００１７】
１．血管内皮由来細胞の調製
本発明においては血管内皮由来細胞を培養し、分化細胞を得る。本発明において「血管内皮由来細胞」とは、血管の内壁を酵素処理又は物理的処理することにより剥離する細胞を指し、例えば、静脈内皮由来細胞（臍帯静脈内皮由来細胞等）などが挙げられる。
【００１８】
上述した細胞の供与源は、動物であれば特に限定されるものではなく、例えば哺乳動物、特にヒトが好ましい。上述した細胞の調製方法は、当技術分野で周知の細胞単離法に従えばよく、特に限定されるものではない。
【００１９】
例えば臍帯静脈内皮由来細胞は、出生時に入手可能となる臍帯の静脈内皮をトリプシン液処理することにより、液内に剥がれ落ちる細胞の集団中に含まれるものとして採取することができる。
【００２０】
２．細胞培養
上記「１．血管内皮由来細胞の調製」に記載のように得られた細胞は、最初に増殖因子存在下にて培養する。ここで増殖因子存在下とは、物質的に解明された増殖因子を培養液に添加すること、及び増殖因子活性を有する血清などを添加することを指す。本発明において「増殖因子」とは、細胞・組織・臓器・個体などの数・重量・体積などを増加させる作用を有するタンパク質を指し、限定するものではないが、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）（例えばＴＧＦ−β等）などが挙げられる。本発明においては、増殖因子としてＦＧＦを用いることが好ましく、このＦＧＦとしては、例えば酸性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１又はａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２又はｂＦＧＦ）、角質細胞増殖因子（ＦＧＦ−７又はＫＧＦ）などが知られている。特にＦＧＦ−１又はＦＧＦ−２を用いることが好ましい。
【００２１】
細胞培養に使用する培地としては、血管内皮由来細胞を培養するために一般的に使用されている培地であれば特に限定されるものではなく、例えば、Ｍ１９９培地（Ｓｉｇｍａ製）、ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ製）、ＭＣＤＢ培地（Ｓｉｇｍａ製）、ＭＣＤＢ１５１培地（Ｓｉｇｍａ製）などが挙げられる。
【００２２】
培地に添加する増殖因子濃度は、使用する増殖因子により異なり、当業者であれば適宜設定することが可能である。例えばＦＧＦを用いる場合には、ＦＧＦ濃度は、約１０〜３ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌとする。
【００２３】
培地には、血管内皮由来細胞を培養するために適切なその他の成分を添加してもよい。例えば、ウシ胎児血清、ヘパリン、カナマイシン（抗生物質）などを添加することが当技術分野で公知である。
【００２４】
培養条件は、血管内皮由来細胞を培養するための当業者に公知の条件を採用することができ、例えば、約３７℃にて、約１０〜４０日間、好ましくは１４〜３５日間にわたり細胞を培養する。
【００２５】
好ましい実施形態においては、血管内皮由来細胞を、ＦＧＦ−１（５ｎｇ／ｍｌ）及びヘパリン（１０μｇ／ｍｌ）又はＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）を含むウシ胎児血清（１５％）添加Ｍ１９９培地で、３７℃にて細胞密度がｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔの状態になるまで単層培養する。増殖因子存在下にて、血管内皮由来細胞は血管内皮細胞の性質を有したまま増殖をくり返す。
【００２６】
続いて、上述のように増殖因子含有培地中で培養した細胞を、増殖因子を除去した培地中又は増殖因子活性を阻害した状態で培養する。増殖因子活性の阻害は、増殖因子とその受容体との結合阻害剤、増殖因子又はその受容体に結合する中和抗体、増殖因子の特異的吸収剤、増殖因子の細胞内シグナル伝達の阻害剤などを用いて行うことができるが、これ以外の方法によってもよい。このような増殖因子活性の阻害は当業者に周知であり、上述した結合阻害剤、中和抗体、特異的吸収剤及び細胞内シグナル伝達阻害剤なども当業者であれば適宜選択することができる。培養期間は、約４日〜３週間、好ましくは２〜３週間である。またその他の培養条件は、上記培養条件と同様である。
【００２７】
本発明者は、上述したように培養した血管内皮由来細胞は、増殖因子を除去した培地中又は増殖因子活性を阻害した状態で長期間培養した後、平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞に特異的なマーカー遺伝子を発現する細胞に変化することを確認した（実施例２〜４、８及び９参照）。従って本発明により、血管内皮由来細胞を分化させて、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び／又は他の種の細胞に分化した細胞を得ることができる。
【００２８】
３．分化細胞
以上のように、本発明の培養技術により、血管内皮由来細胞を分化させて分化細胞を作製することができる。本発明において「分化細胞」とは、他の種の細胞への分化能力を有する細胞、及び他の種の細胞に分化した細胞を指す。ここで「他の種の細胞」とは、血管内皮細胞以外の細胞を指し、限定するものではないが、平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞などが挙げられる。また「他の種の細胞への分化能力を有する細胞」とは、作製した細胞が、他の種の細胞としての性質・機能を有しているが、なおも分化前の血管内皮由来細胞の性質・機能を有しているものを指す。一方「他の種の細胞に分化した細胞」とは、作製した細胞が、他の種の細胞としての性質・機能のみを有し、分化前の血管内皮由来細胞の性質・機能は保持していないものを指す。
【００２９】
本発明に従ってＦＧＦ不含培地において３週間培養した細胞は、エンドセリン−１（ＥＴ−１）の刺激により収縮することから、平滑筋細胞としての機能を有していると考えられた（実施例６参照）。またこの細胞は、平滑筋細胞マーカー及び血管内皮細胞マーカーの両者を示すことから（実施例２及び３参照）、これらの細胞は、平滑筋細胞への分化能力を有する細胞といえる。
【００３０】
血管内皮由来細胞（例えばヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞）を、増殖因子（好ましくはＦＧＦ）添加培地中で培養した場合、その増殖能が非常に高いことから、本発明に従って、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び他の種の細胞に分化した細胞を簡便かつ大量に作製することが可能となる。従って、その分化細胞を用いることにより、再生医療などにおいて有用な細胞を大量に得ることができる。また本発明において最も好ましい血管内皮由来細胞である臍帯静脈血管内皮由来細胞は、液体窒素中に長期保存可能であることから、出生時に臍帯静脈血管内皮由来細胞を採取しておけば、将来的に何らかの病的原因により各種細胞（例えば平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞）の再生が必要になった際に保存細胞を取り出して、増殖及び分化させて使用することができる。その結果、自己から取り出した細胞を分化させた後に体内に戻すことができるため、免疫学的な問題が少ないことが期待される。
【００３１】
４．分化の調節
（１）血管内皮細胞への再分化
本発明により分化した細胞を、再度増殖因子添加培地中で培養することにより、血管内皮細胞に再分化させることができる。この際、用いる増殖因子は、ＦＧＦ−１又はＦＧＦ−２を用いることができるが、それ以外の増殖因子であっても、血管内皮細胞への再分化を誘導可能な活性を有するものであれば用いることができる。
【００３２】
このように一度他の種の細胞に分化した細胞を血管内皮細胞に再分化させることにより達成される効果・利点としては以下のものがある：
・再生医療などの目的のために最初に十分な量として準備した分化細胞よりも実際には多くの分化細胞が必要であると判断された場合には、分化細胞を上記再分化操作により血管内皮細胞に戻してから必要な量が得られるまで培養・増殖させ、その後、再度分化細胞に誘導して用いることが可能である。この場合、分化細胞を増殖させるよりも、血管内皮細胞を増殖させたほうが増殖率がよく、また培養も簡便である。
・動脈硬化などの生体の疾病として、血管内皮細胞が平滑筋細胞などの他の種の細胞に分化して不利益な性質を有することになる可能性が考えられるが、本発明に従って他の種の細胞の性質を有する細胞を血管内皮細胞に再分化させることができれば、疾病の治療（改善）に役立つものと期待される。
【００３３】
（２）分化の増強及び抑制
本発明に従って増殖因子不含培地中で培養する工程において、他の種々の因子を添加することにより、細胞の分化を増強又は抑制することが可能である。
【００３４】
例えば、他の因子としてトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）に属する因子又はＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害物質を使用した場合には、血管内皮由来細胞から他の種の細胞を誘導可能な細胞への分化を増強することができる。ＴＧＦ−βファミリーに属する因子としては、限定するものではないが、アクチビン、骨形成因子（ＢＭＰ）などが挙げられる。本発明においては、アクチビン、特にアクチビンＡを用いることが好ましい。
ＭＥＫ阻害物質としては、限定するものではないが、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６などが挙げられる。
【００３５】
また例えば、他の因子としてＴＧＦ−β阻害物質を使用した場合には、分化を抑制することができる。ＴＧＦ−β阻害物質としては、その阻害作用機構に限定されることはなく、例えばアクチビン結合タンパク質、Ｓｍａｄ７タンパク質、アクチビン中和抗体などが挙げられる。本発明においては、アクチビン結合タンパク質として特にフォリスタチン、及びＳｍａｄ７タンパク質を用いることが好ましい。
【００３６】
上述したように、他の種の細胞への分化を調節することにより達成される効果・利点としては以下のものがある：
・再生医療などの目的で、分化した細胞の性質と分化前の細胞の性質の両者を有するような中等度の分化細胞が必要であると判断されるような場合には、本発明に従って分化を調節する技術が有効であると考えられる。
・動脈硬化などの生体の疾病として、血管内皮細胞が平滑筋細胞などの他の種の細胞に分化して不利益な性質を有することになる可能性が考えられるが、本発明に従って他の種の細胞への分化を調節することができれば、疾病の予防・治療（改善）に役立つものと期待される。
【００３７】
【実施例】
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００３８】
〔実施例１〕ヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の培養
ヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞（ＨＵＶＥ−ＤＣ）は、既に報告されているＨＵＶＥＣ単離手法により単離した（Ｉｍａｍｕｒａ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｍｉｔｓｕｉ，　Ｙ．　（１９８７）　Ｅｘｐ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．　１７２，　９２−１００）。すなわち、ヒト臍帯静脈血管内壁を洗浄後、０．２５％トリプシン含有リン酸緩衝溶液を注入し、室温にて１５分静置することにより内皮細胞を細胞壁より剥離させ回収した。
【００３９】
上記の通り単離した細胞をＩ型コラーゲンで被覆したプラスチック製培養ディッシュ中に接種し、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｆｉｌｔｒｏｎ）を添加し、５ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ−１及び１０μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ）を添加した又は添加しないＭ１９９培地（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。
全実施例における細胞分化実験では、いずれも一度ＦＧＦ添加培地で細胞を培養し、ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔの状態まで増殖させた後にＦＧＦ無添加培地にて培養した。
【００４０】
ここで使用したＦＧＦ−１は遺伝子組換え手法により作製したものであり、この組換えＦＧＦ−１は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞においてｐＥＴ−３ｃ系（Ｉｍａｍｕｒａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９０）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，　１５６７−１５７０）を利用して発現させた。また得られたＦＧＦ−１は、ヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーにより均質に精製することにより調製した（Ｉｍａｍｕｒａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，　１５６７−１５７０）。ヘパリン（Ｓｉｇｍａ製）の添加は、ＦＧＦ−１活性の最適化のために行い、細胞の分化に影響はなかった。得られた細胞を以下の試験において使用した。
【００４１】
〔実施例２〕免疫細胞化学試験
本実施例においては、実施例１において培養した細胞を用いて免疫細胞化学試験を行った。
実施例１において培養した細胞を、血管内皮細胞マーカーであるフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に対するポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ製）、及び平滑筋細胞マーカーであるカルポニンに対するモノクローナル抗体（クローンｈＣＰ）（Ｓｉｇｍａ製）を一次抗体として用いて二重標識し、その後、それぞれテキサスレッドコンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）及びＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）を用いて二次標識した。続いて、共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ，　Ｊｅｎａ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてシグナルを検出した。
【００４２】
結果を図１ａ及びｂに示す。図１ａは、ＦＧＦ添加（＋）およびＦＧＦ除去後３週目（−）のヒト臍帯静脈内皮由来細胞の顕微鏡像を示す。ＦＧＦ除去後３週目には平らで大きな細胞が出現していることがわかる。また図１ｂは、ＦＧＦ添加（＋）およびＦＧＦ除去後３週目（−）のヒト臍帯静脈内皮由来細胞を、それぞれ血管内皮細胞マーカーである抗ｖＷＦ抗体（赤）、及び平滑筋細胞マーカーである抗塩基性カルポニン抗体（緑）で同時染色した像を示す。ＦＧＦ除去後３週目において、両者の平滑筋細胞マーカーを発現している細胞が確認できた。
【００４３】
〔実施例３〕平滑筋細胞マーカー及び血管内皮細胞マーカーの発現確認（ＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット分析）
本実施例においては、実施例１において培養した細胞を用いて、平滑筋細胞マーカーの発現を、ＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット法を利用して調べた。
【００４４】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット分析を、既に記載されている通りに行った（Ｏｚａｗａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ　１，　２１１−２１６）。簡単に説明すると、細胞からＩｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ）を用いて総ＲＮＡを単離した後、１μｇのサンプルを、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を製造業者の説明書に従って用いて逆転写した。４％の逆転写混合物を用いて、試験遺伝子のｃＤＮＡ断片を、その直線状部分をＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を用いてＰＣＲにより増幅した。使用した平滑筋細胞マーカー及び血管内皮細胞マーカーに特異的なプライマーを表１に示す。表中、血管内皮細胞マーカーである「ｖＷＦ」はフォンウィルブランド因子、「ＰＥＣＡＭ−１」は血小板／血管内皮細胞固着分子を表し、平滑筋細胞マーカーである「ＳＭ２２α」はアクチン結合タンパク質、「ＰＧＥＳ」はプロスタグランジンＥ合成酵素、「カルポニン」はアクチン結合タンパク質を表す。「ＧＡＰＤＨ」は、内部標準として用いた。また、プライマー配列の項目の「Ｆ」及び「Ｒ」はそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーを表す。サイクルの項目に記載の数値は、当該プライマーセットを用いて行うＰＣＲサイクル数を表し、また断片の項目に記載の数値は、ＰＣＲにより得られる断片長を表す。
【００４５】
【表１】
2004121159.tif 000002
【００４６】
続いて、ＰＣＲ産物のアリコートを１．０％アガロースゲル上で分離させ、それをＨｙｂｏｎｄ　Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にトランスファーした。続いてこの膜を、ジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰ（ＤＩＧ−Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ，　Ｒｏｃｈｅ）により標識した対応するｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＮＩＨ　Ｉｍａｇｅソフトウエア（ｖｅｒｓｉｏｎ　１．６２）を用いてシグナルを可視化、統合、及び定量した。
【００４７】
結果を図２ａ〜ｄに示す。図２ａ及びｂは、各平滑筋細胞マーカー（ａ）及び各血管内皮細胞マーカー（ｂ）の発現を示す。またこの結果をグラフ化したものがそれぞれ図２ｃ及びｄである。図２ａ及びｃより、ＦＧＦ除去後１〜２週経過後の細胞においては、平滑筋細胞マーカーの発現が経時的に上昇していることがわかる。
【００４８】
〔実施例４〕ヒト臍帯静脈内皮由来細胞の細胞クローンを用いた試験
本実施例においては、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞の細胞クローンを培養し、平滑筋細胞に分化する能力について試験した。
【００４９】
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞の細胞クローンＣＬ１及びＣＬ１４は、実施例１と同様にＦＧＦ添加培地で培養した後、ＦＧＦ無添加培地で２週間培養した。その後、実施例２と同様に血管内皮細胞マーカーに対する抗体と平滑筋細胞マーカーに対する抗体とを用いて同時染色した。また、実施例３と同様に平滑筋細胞マーカーであるカルポニン遺伝子の発現を調べた。
【００５０】
その結果を図３ａ〜ｃに示す。図３ａは、血管内皮細胞マーカーに対する抗体と平滑筋細胞マーカーに対する抗体とを用いた染色結果であり、この写真から、ＣＬ１４細胞においては平滑筋細胞マーカーのみが確認された。また図３ｂ及びｃは、カルポニン遺伝子の発現を経時的に調べた結果を示し、ＣＬ１細胞及びＣＬ１４細胞の両者においてカルポニンの有意な発現増大が確認されたが、細胞クローンごとに、平滑筋細胞分化能力に差があることが判明した。
【００５１】
〔実施例５〕内皮細胞への再分化
本実施例においては、実施例２及び３において確認した、分化した平滑筋細胞から再度内皮細胞を分化させることを確認した。
【００５２】
実施例１と同様の条件下にて、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞をＦＧＦ無添加培地で４日間培養した後、さらにＦＧＦ添加培地又はＦＧＦ無添加培地において４日間培養した。その後、実施例３と同様の手法にて細胞からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット法で平滑筋細胞特異的マーカー遺伝子（カルポニン及びＳＭ２２α）の発現を調べた。
【００５３】
結果を図４に示す。図４において、各平滑筋細胞のマーカーの発現は、ＦＧＦ除去後（−）に経時的（４日、８日）に増加したが、ＦＧＦ除去後４日目にＦＧＦを再度添加しさらに４日間培養したもの（＋）については、各マーカー遺伝子の発現はＦＧＦ除去前のレベル近くにまで減少していた。すなわち、ＦＧＦ除去により平滑筋細胞に分化した細胞が、再度ＦＧＦを添加することによって、再び内皮細胞に分化したことがわかった。
【００５４】
〔実施例６〕平滑筋細胞の収縮
本実施例においては、ＦＧＦ除去培養したヒト臍帯静脈内皮由来細胞の収縮能を試験した。
【００５５】
最初に、ＦＧＦ−１＋ヘパリンの存在下又は不在下にて、Ｉ型コラーゲンで被覆したプラスチック製培養ディッシュ上でヒト臍帯静脈内皮由来細胞を３週間培養した後、その細胞を１０ｍＭ　８−ブロモ−ｃＧＭＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製）と共に３７℃にて２０分間インキュベートして弛緩させ、２４ウエルプレート上でコラーゲンゲル中に包理した。この際、ゲル中の８−ブロモ−ｃＧＭＰの最終濃度は１ｍＭであった（０．７５ｍｌゲル／ウエル中、２．４×１０５細胞）。
【００５６】
コラーゲンゲルは、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ　ｔｙｐｅ　Ｉ−Ｐ（０．３％ブタＩ型コラーゲン；Ｎｉｔｔａ−ｇｅｌａｔｉｎ　Ｃｏｒｐ．，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を製造業者の指示に従って用いて調製した。簡単に説明すると、１０×Ｍ１９９培地、１×Ｍ１９９培地中の細胞懸濁液、重炭酸バッファー、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及びＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ　ｔｙｐｅ　Ｉ−Ｐ溶液を、１：１：１：１．５：５．５の比率で混合し、ウエルに注入して、重合させた。得られるＳＭＣ封入ゲルを、０．５ｍｌの１５％　ＦＢＳ含有Ｍ１９９で被覆した。ゲルがウエルの底から分離する１７時間の時点までゲルをインキュベートした後、エンドセリン（ＥＴ−１；ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製）（２５０ｎＭ）を３０分毎に培養物に添加した。定量に関しては、各ゲル片を５００μｌの培養液を含む１．５ｍｌマイクロチューブに移し、遠心し、その体積を測定した。
【００５７】
その計測結果を図５に示す。図５は、ＦＧＦ添加（Ｆ）又は無添加（Ｄ）で培養した細胞のＥＴ−１刺激による収縮率をグラフとして示している。ＦＧＦ除去後３週目のヒト臍帯静脈内皮由来細胞は、ＥＴ−１刺激により、約２０％のゲル収縮を引き起こしている。図中、星印はスチューデントのＴ試験にてｐ値＜０．０５で有意差があることを示す。この結果から、ＦＧＦ除去後３週目のヒト臍帯静脈内皮由来細胞の中には、平滑筋細胞の特徴を有する細胞が含まれていることがわかる。
【００５８】
〔実施例７〕分化の調節
本実施例においては、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞の平滑筋細胞への分化の調節について試験した。
【００５９】
（１）ＴＧＦ−βファミリーによる分化増強
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞を実施例１と同様にＦＧＦ添加又は無添加で７日間培養した。またこれらの細胞に対し、ＴＧＦ−βファミリーに属する増殖因子の１種であるアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製）１００μｇ／ｍｌを投与し、その作用を調べた。実施例３と同様に、平滑筋細胞マーカー遺伝子（カルポニン、ＳＭ２２α）及び血管内皮細胞マーカー遺伝子（ｖＷＦ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット法により調べた。また実施例２と同様に、ＦＧＦ除去後のヒト臍帯静脈内皮由来細胞を抗ｖＷＦ抗体及び抗カルポニン抗体で同時染色した。
【００６０】
結果を図６ａ及びｂに示す。図６ａは、ＦＧＦ添加（＋）又はＦＧＦ無添加（−）、及びアクチビンＡ添加（＋）又は無添加（−）で７日間培養した後の各マーカー遺伝子の発現を示している。図６ｂは、抗ｖＷＦ抗体及び抗カルポニン抗体で同時染色した細胞の写真を示す。これらの結果から、アクチビンＡが、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞のＦＧＦ除去後の平滑筋細胞への分化を増強することがわかる。
【００６１】
（２）アクチビン結合タンパク質による分化抑制
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞を実施例１と同様にＦＧＦ添加又は無添加で５日間培養した。またこれらの細胞に対し、アクチビンＡの阻害剤であるアクチビン結合タンパク質の１種であるフォリスタチン（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製）１μｇ／ｍｌを投与し、その作用を調べた。実施例３と同様に、平滑筋細胞マーカー遺伝子（カルポニン、ＳＭ２２α）、血管内皮細胞マーカー遺伝子（ｖＷＦ）、及び内部標準（ＧＡＰＤＨ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット法により調べた。
【００６２】
結果を図７に示す。図７は、ＦＧＦ添加（＋）又はＦＧＦ無添加（−）、及びフォリスタチン添加（＋）又は無添加（−）で５日間培養した後の各マーカー遺伝子の発現を示している。これらの結果から、フォリスタチンが、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞のＦＧＦ除去後の平滑筋細胞への分化を抑制することがわかる。
【００６３】
（３）ＴＧＦ−βファミリー阻害物質による分化抑制
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞に、アデノウイルスベクターを用いて、ＴＧＦ−βファミリーの細胞内情報伝達経路の阻害物質であるｓｍａｄ７を強制発現させた。具体的に説明すると、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にてＦＬＡＧ−エピトープ（Ｎａｋａｏ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｎａｔｕｒｅ　３８９，　６３１−６３５）とライゲートしたマウスＳｍａｄ７　ｃＤＮＡを有する組換えＥ１欠失アデノウイルスベクター（ＡｄＣＭＶ−Ｓｍａｄ７）を作製し、既に記載されている手法（Ｆｕｊｉｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｅｌｌ　１０，　３８０１−３８１３；Ｎａｋａｏ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　１０４，　５−１１．）に従って精製した。すなわち、２９３細胞に上記ベクターを導入後、その培養上清中に発現される組換えＳｍａｄ７タンパク質を精製し利用した。
【００６４】
上述のように作製したＳｍａｄ７発現細胞及び非発現細胞を、実施例１と同様にＦＧＦ除去培地中で７日間培養した後、実施例２と同様に血管内皮細胞マーカー（ｖＷＦ）及び平滑筋細胞マーカー（カルポニン）で同時染色した。
【００６５】
結果を図８に示す。図８は、Ｓｍａｄ７発現細胞（１及び３）と、Ｓｍａｄ７非発現細胞（２及び４）の写真を示す。これらの結果から、Ｓｍａｄ７が、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞のＦＧＦ除去後の平滑筋細胞への分化を抑制することがわかる。
【００６６】
（４）ＭＥＫ依存的分化及び分化抑制の解除
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞をＦＧＦ無添加培地中で４日間培養した後、さらにＦＧＦ添加又は無添加で４日間培養した。またこれらの細胞に対し、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤の１種であるＰＤ９８０５９（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）５０μｇ／ｍｌを投与し、その作用を調べた。実施例３と同様に、平滑筋細胞マーカー遺伝子（カルポニン、ＳＭ２２α）及び内部標準（ＧＡＰＤＨ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット法により調べた。
【００６７】
結果を図９に示す。図９は、ＦＧＦ無添加で４日間培養（４）したもの、及びＦＧＦ添加（８＋）又はＦＧＦ無添加（８−）でさらに４日間培養したもの、並びにＰＤ９８０５９添加で培養した後（右端のレーン）の各マーカー遺伝子の発現を示している。各平滑筋細胞マーカーの発現は、ＦＧＦ除去後に経時的（４日、８日）に増加したが、ＦＧＦ除去後４日目にＦＧＦを再度添加し、さらに４日間培養したもの（８（＋））については、各平滑筋細胞マーカーの発現はＦＧＦ除去前のレベル近くまで減少していた。このＦＧＦ再添加による各平滑筋細胞マーカーの発現減少は、ＰＤ９８０５９の投与によって阻害された（右端のレーン）。これらの結果から、ＦＧＦによる平滑筋細胞への分化抑制作用は、ＭＥＫ依存的に起こることがわかり、ＭＥＫ阻害剤の投与によって、平滑筋細胞への分化抑制が解除され、分化が増強されることがわかる。
【００６８】
〔実施例８〕骨芽細胞への分化
本実施例においては、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞から骨芽細胞への分化を確認した。
【００６９】
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞は、実施例１と同様にＦＧＦ添加培地で培養した後、ＦＧＦ無添加培地で３週間培養した。その後、血管内皮細胞マーカーであるウサギポリクローナル抗ｖＷＦ抗体（Ｄａｋｏ製）、及び骨芽細胞マーカーであるヤギポリクローナル抗アルカリホスファターゼ抗体（Ｃｏｒｔｅｘ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．）を一次抗体として用いて二重標識し、その後、それぞれテキサスレッドコンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びＦＩＴＣコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて二次標識した。続いて、共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ，　Ｊｅｎａ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてシグナルを検出した。
【００７０】
その結果を図１０に示す。図１０は、ＦＧＦ添加（＋）及びＦＧＦ除去後３週目（−）のヒト臍帯静脈内皮由来細胞を、抗ｖＷＦ抗体と抗アルカリホスファターゼ抗体とを用いて染色した結果を示す。この写真から、ＦＧＦ除去後３週目に骨芽細胞のマーカーを発現する細胞が確認できた。従って、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞から、骨芽細胞を誘導する分化細胞が得られることがわかった。
【００７１】
〔実施例９〕脂肪細胞への分化
本実施例においては、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞から脂肪細胞への分化を確認した。
【００７２】
ヒト臍帯静脈内皮由来細胞は、実施例１と同様にＦＧＦ添加培地で培養した後、ＦＧＦ無添加培地で０〜３週間培養した。その後、実施例３と同様に、脂肪細胞特異的マーカー遺伝子（リポプロテインリパーゼ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット法により調べた。リポプロテインリパーゼ遺伝子増幅用のプライマーセットを以下に示す：
Ｆ：　ＧＡＧＡＴＴＴＣＴＣＴＧＴＡＴＧＧＣＡＣＣ（配列番号１３）
Ｒ：　ＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣ（配列番号１４）
上記プライマーセットを用いてＰＣＲを３６サイクル行った場合には、得られる断片は２７６ｂｐとなる。その後の操作は、実施例３と同様に行った。
【００７３】
その結果を図１１に示す。図１１は、ＦＧＦ除去後０〜３週目のヒト臍帯静脈内皮由来細胞におけるリポプロテインリパーゼの発現を示す。この結果から、ヒト臍帯静脈内皮由来細胞は、ＦＧＦ除去後に経時的に脂肪細胞を誘導する分化細胞に分化することがわかった。
【００７４】
【発明の効果】
本発明により、他の種の細胞への分化能力を有する細胞及び他の種の細胞に分化した細胞を大量に作製することが可能となる。従って、そのような分化細胞を作製することにより、再生医療などにおいて有用な細胞を大量かつ簡便に得ることができる。また本発明において最も好ましい血管内皮由来細胞である臍帯静脈血管内皮由来細胞は、液体窒素中に長期保存可能であることから、出生時に臍帯静脈血管内皮由来細胞を採取しておけば、将来的に何らかの病的原因により各種細胞（例えば平滑筋細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞）の再生が必要になった際に保存細胞を取り出して、増殖及び分化させて使用することができる。従って、本発明を利用することにより、自己から取り出した細胞を分化させた後に体内に戻すことができるため、再生医療において重要な免疫学的問題が少ないことが期待される。
【００７５】
【配列表】
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【００７６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１〜１４：合成オリゴヌクレオチド
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＦＧＦ除去前と除去後におけるヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の形態を示す。
ａ：ＦＧＦ添加（＋）及びＦＧＦ除去後３週目（−）の細胞の位相差顕微鏡像を示す。
ｂ：ａの細胞を抗ｖＷＦ抗体（赤）及び抗塩基性カルポニン抗体（緑）で同時染色した像を示す。
【図２】図２は、ＦＧＦ除去前と除去後のヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞における平滑筋細胞特異的マーカー（ａ及びｃ）並びに血管内皮細胞マーカー（ｂ及びｄ）の発現を経時的に示す。
【図３】図３は、クローン化されたヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の各集団におけるＦＧＦ除去後２週目における細胞を抗ｖＷＦ抗体（赤）及び抗塩基性カルポニン抗体（緑）で同時染色した像（ａ）、並びに血管内皮細胞マーカー及び平滑筋細胞マーカーの発現（ｂ及びｃ）を経時的に示す。
【図４】図４は、ＦＧＦ除去後の平滑筋細胞特異的マーカーの発現が、ＦＧＦの再投与によって抑制される様子を示す。
【図５】図５は、分化後のヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞がエンドセリン−１の投与により、平滑筋細胞として収縮する様子を示す。
【図６】図６は、ＴＧＦ−βファミリーに属するアクチビンＡが、ヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の平滑筋細胞分化に与える影響を示す。
ａ：ＦＧＦ添加（＋）又は無添加（−）、及びアクチビンＡ添加（＋）又は無添加（−）で培養した細胞における各平滑筋細胞マーカー遺伝子及び各血管内皮細胞マーカー遺伝子の発現を示す。
ｂ：ａの細胞を抗ｖＷＦ抗体及び抗カルポニン抗体で同時染色した像を示す。
【図７】図７は、アクチビンＡの阻害物質であるフォリスタチンがヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の平滑筋細胞分化に与える影響を示す。
【図８】図８は、アクチビンＡの阻害物質であるＳｍａｄ７がヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の平滑筋細胞分化に与える影響を示す。
【図９】図９は、ＭＥＫ阻害物質であるＰＤ９８０５９がヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の平滑筋細胞分化に与える影響を示す。
【図１０】図１０は、ＦＧＦ除去前（＋）と除去後（−）でのヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞を、血管内皮細胞マーカーに対する抗体（抗ｖＷＦ抗体）（赤）及び骨芽細胞特異的マーカーに対する抗体（抗アルカリホスファターゼ抗体）（緑）で同時染色した写真を示す。
【図１１】図１１は、ＦＧＦ除去後０〜３週間におけるヒト臍帯静脈血管内皮由来細胞の脂肪細胞特異的マーカー遺伝子（リポプロテインリパーゼ）の発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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