(57)【要約】【課題】チューブリン重合阻害作用機序の解明のための化合物及びＮＭＲデータの提供。【解決手段】特定の三次元立体構造を有するソブリドチン及びそのＮＭＲデータを、ソブリドチンとチューブリンとの相互作用機序の解明に使用する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１乃至表８に記載のＮＭＲデータによって同定される三次元立体構造を有する式（Ｉ）
【化１】
2004262799.tif 000014
の化合物。
【請求項２】
表９又は表１０の三次元座標によって特定される三次元立体構造を有する式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物のチューブリンに対する重合阻害作用の機序の解明に使用するための、表１乃至表８に記載のＮＭＲデータによって同定される三次元立体構造。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物のチューブリンに対する重合阻害作用の機序の解明に使用するための、表１乃至表８に記載のＮＭＲデータ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ソブリドチンのＮＭＲデータによって同定される三次元立体構造を有する化合物に関する。また、本発明は、ソブリドチンの生体内及び生体外における作用機序の解明、特に、ソブリドチンのチューブリンに対する重合阻害作用の機序の解明に有用なＮＭＲデータに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ソブリドチン（Ｓｏｂｌｉｄｏｔｉｎ、化学名：Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｖａｌ  ｙｌ）−Ｎ１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｏｘｏ−３−［（２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ］−１−［（１Ｓ）−１−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ］−４−ｏｘｏｂｕｔｙｌ］−Ｎ１−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｖａｌｉｎａｍｉｄｅはＤｏｌａｂｅｌｌａ  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ（タツナミガイ）から単離されたＤｏｌａｓｔａｔｉｎ  １０の誘導体であり、式（Ｉ）の化学構造を有する新規な抗悪性腫瘍剤である（非特許文献１及び２参照）。ソブリドチンは細胞の分裂期（Ｇ２／Ｍ期）においてチューブリンに作用し、その重合を阻害してＤＮＡの断片化や核の断片化を伴うアポトーシスを誘導することにより抗悪性腫瘍活性を示す。
【０００３】
ソブリドチンの他に、チューブリンに作用してアポトーシスを誘導する抗悪性腫瘍剤としては、チューブリン重合阻害剤として、酒石酸ビノレルビン（本邦では「ナベルビン」で協和醗酵工業株式会社により販売）、硫酸ビンクリスチン（本邦では「オンコビン」で塩野義製薬株式会社により販売）、硫酸ビンデシン（本邦では「フィルデシン」で塩野義製薬株式会社により販売）及び硫酸ビンブラスチン（本邦では「エクザール」で塩野義製薬株式会社により販売）などのビンカアルカロイド系抗悪性腫瘍剤が、また、チューブリン重合促進剤として、ドセタキセル水和物（本邦では「タキソテール」でアベンティス  ファーマ株式会社により販売）及びパクリタキセル（本邦では「タキソール」でブリストル製薬株式会社により販売）などのタキソイド系抗悪性腫瘍剤が知られている。
【０００４】
Ｄｏｌａｎｔａｔｉｎ  １０を含む、これらチューブリン作用化合物のチューブリンに対する作用機序の解明については、Ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ  １０の立体構造（非特許文献３及び４参照）及びタキソールを結合させた状態で単離したチューブリンの結晶（非特許文献５参照）が報告されている。しかしながら、ソブリドチンについては、そのチューブリンに対する作用機序の分子的解明は殆んどなされていない。
【０００５】
一方、薬物と受容体等の薬物作用対象物質との相互作用機序の解明には、薬物自身の三次元立体構造も大きな意味をもつが、これについても、Ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ  １０に結合した状態のタキソールの三次元立体構造が示されている（非特許文献３及び４参照）のみで、チューブリン重合阻害作用を有するその他のドラスタチン誘導体についての三次元立体構造は、これまで全く示されていない。
【０００６】
化合物の三次元立体構造を決定する方法の中で最も頻繁に用いられる方法の一つにＸ線結晶構造解析がある。しかしながら、この方法は、化合物を結晶として取り出す必要があるため、結晶化しない化合物の三次元立体構造の決定には使用することができない。また、その結晶が、たとえ化合物とその作用対象物質との結合物であったとしても、その結晶状態が実際の薬物作用の状況  を表す状態であるとは限らないため、その結晶状態をもって、分子間相互作用のような、いわば分子の動的な状態を解析することには適していない。
【０００７】
ＮＭＲも、化合物の三次元立体構造を決定するために用いられる方法の一つとして挙げることができる。ＮＭＲは、主として、溶液や生体中における分子の化学構造を決定するものであるが、分子内原子間の相互作用の状況をも観察することで、分子の三次元立体構造に関する情報を得ることができる。しかしながら、分子によっては、分子を構成する各原子の帰属ができなかったり、分子内原子間相互作用が観察されないこともある。そのような場合は、ＮＭＲから分子の三次元立体構造を決定することは非常に困難となる。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ８８，  ３１６−３２７（１９９７）
【０００９】
【非特許文献２】
Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ９１，  ７３７−７４７（２０００）
【００１０】
【非特許文献３】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  Ｖｏｌ．  ５１，  Ｎｏ．  ９，  ｐｐ．  ２５９３−２６０４，  １９９５
【００１１】
【非特許文献４】
Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  Ｖｏｌ．  ３６，  ５２５−５３８（１９９５）
【００１２】
【非特許文献５】
Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１，  １９９−２０３（１９９８）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、特定の三次元立体構造を有するソブリドチンを提供することである。また、本発明の別の目的は、ソブリドチンの作用機序、特に、ソブリドチンとチューブリンとの相互作用機序の解明に有用となるソブリドチンのＮＭＲデータを提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ソブリドチンのＮＭＲを従来より行われていた測定方法にて測定していたところ、ソブリドチンが特定の三次元立体構造を有することを示唆する知見を得た。そこで、ＮＭＲ測定条件をさらに鋭意検討して精密に測定したところ、ソブリドチンが特定の三次元立体構造を有することを示す詳細なＮＭＲデータを得ることができた。さらに、この詳細なＮＭＲデータを基にしてソブリドチンを三次元立体構造化し、本発明を完成させた。
【００１５】
しかして、本発明によれば、表１乃至表８に記載のＮＭＲデータによって同定される三次元立体構造を有する式（Ｉ）
【００１６】
【化２】
2004262799.tif 000002
【００１７】
の化合物が提供される。
【００１８】
また、本発明によれば、表９又は表１０の三次元座標によって特定される三次元立体構造を有する式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００１９】
さらに、本発明によれば、式（Ｉ）の化合物の作用機序、特に、式（Ｉ）の化合物のチューブリンに対する重合阻害作用の機序の解明に使用するための、表１乃至表８に記載のＮＭＲデータが提供される。
【００２０】
本発明の三次元立体構造を有する化合物には、表１乃至表８のＮＭＲデータによって同定される三次元立体構造を有する全ての化合物が包含され、典型的には、表９又は表１０の三次元座標によって特定される三次元立体構造を有する化合物が挙げられる。
【００２１】
また、本明細書において、ｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩ及びｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩＩはそれぞれ表９及び表１０の三次元座標によって特定される三次元立体構造を意味し、それぞれをコンピューターディスプレイ上に示したものが図１及び図２である。ｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩ及びｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩＩは、下記の化学構造式において番号１１で示される窒素原子と番号１２で示される炭素原子とのアミド結合がトランソイドか若しくはシソイドかによって大まかに区別される回転異性体であると見ることもできる。
【００２２】
本明細書において、ソブリドチンは化学名：Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｖａｌｙｌ）−Ｎ１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｏｘｏ−３−［（２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ］−１−［（１Ｓ）−１−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ］−４−ｏｘｏｂｕｔｙｌ］−Ｎ１−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｖａｌｉｎａｍｉｄｅで表される式（Ｉ）の化合物を表す。ソブリドチンは生体内及び生体外において種々の作用を奏する化合物であって、ソブリドチンの好ましい作用としては、抗悪性腫瘍作用を挙げることができる。また、ソブリドチンの特に好ましい作用は、チューブリン重合阻害作用である。
【００２３】
しかして、本明細書において、「式（Ｉ）の化合物のチューブリンに対する重合阻害作用」とは、細胞の分裂期（Ｇ２／Ｍ期）におけるチューブリンの重合を阻害する作用を表し、「式（Ｉ）の化合物のチューブリンに対する重合阻害作用の機序の解明」とは、ソブリドチンが細胞の分裂期（Ｇ２／Ｍ期）においてチューブリンに作用する様子を観察し、その作用機序を解明すること  を表す。
以下の表１乃至表８に本発明のＮＭＲデータを記載し、表９及び表１０に本発明の典型的な三次元立体構造を有する化合物の三次元座標を記載する。なお、表１乃至表１０において、Ａｔｏｍｓの欄の番号は下記構造上の原子に付した番号を表す。
【００２４】
【化３】
2004262799.tif 000003
【００２５】
【表１】
2004262799.tif 000004
【００２６】
【表２】
2004262799.tif 000005
【００２７】
【表３】
2004262799.tif 000006
【００２８】
【表４】
2004262799.tif 000007
【００２９】
【表５】
2004262799.tif 000008
【００３０】
【表６】
2004262799.tif 000009
【００３１】
【表７】
2004262799.tif 000010
【００３２】
【表８】
2004262799.tif 000011
【００３３】
【表９】
2004262799.tif 000012
【００３４】
【表１０】
2004262799.tif 000013
【００３５】
本発明の三次元立体構造を有する化合物の三次元立体構造は、本発明のＮＭＲデータによって同定することができる。また、本発明の三次元立体構造は、ＳＹＢＹＬ（登録商標）等の分子設計支援ソフト等を用いてコンピューターディスプレイ上に可視化することができる。
【００３６】
さらに、本発明のＮＭＲデータ及び三次元立体構造は、ソブリドチンの作用機序、特にソブリド  チンとチューブリンとの相互作用の機序の解明に用いることができる。
【００３７】
さらに加えて、本発明のＮＭＲデータ及び三次元立体構造は、チューブリンに作用する新規活性化合物の創製に有益なファーマコフォアの知見を得るために用いることができる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明により、本発明の三次元立体構造を有する化合物、特にｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩ及びｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩＩの三次元立体構造を有する化合物を得ることができる。これらの化合物から得られる情報により、ソブリドチンの作用機序、特にソブリドチンとチューブリンとの相互作用の機序の解明について更なる研究、例えば、チューブリンに作用する新規活性化合物の創製に有益なファーマコフォアに関する研究を行うことが可能となる。
【００３９】
以下、測定例及び実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００４０】
【測定例】
測定例−１：ＤＭＳＯ溶液中でのソブリドチンの１Ｈに関するＮＭＲ測定
測定例−１−１：ＮＭＲ測定試料の調製
ＮＭＲ用試料管並びにパスツールピペットは、使用前に予め乾熱乾燥を行った。
ソブリドチン２０ｍｇをＤＭＳＯ−ｄ６  ０．７５ｍＬに溶解し、これに内部標準物質として１０％  ＴＭＳ／ＣＣｌ４を一滴加えて試料用液とし、試料溶液をＮＭＲ試料管に移した。ＮＭＲ試料管を、真空下、液体窒素による凍結及びアセトンによる溶解を５回繰り返して脱気した後、先端をガスバーナーにより溶封した。
測定例−１−２：１Ｈ一次元測定
ＮＭＲ測定機器は、日本電子製４００ＭＨｚ  ＦＴ−ＮＭＲ；ＪＮＭ−ＥＣＰ４００を用いた。また、データ処理は、ＪＮＭ−ＥＣＰ  ４００にインストールされている処理ソフトＤｅｌｔａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｒ．３．１．２により行った。また、以下の測定例においても、同じ測定機器及び処理ソフトを用いた。
【００４１】
測定条件については、測定温度を３０℃、測定範囲は６，０００Ｈｚ、データポイントは１６Ｋ、積算回数は８回、データ取り込み時間（ｘ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ＋  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｄｅｌａｙ  ｔｉｍｅ）は７．２秒、９０度パルス幅は１０．２μｓとした。
【００４２】
上記の測定条件にて、測定例−１−１で調製したソブリドチンのＮＭＲ測定試料を測定し、表１の左側の欄に記載の１Ｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔｓ値の帰属をするための１Ｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔｓのＮＭＲデータを得た。
測定例−１−３：１Ｈ同種核ＤＱＦ−ＣＯＳＹ測定
測定条件については、測定温度を３０℃、測定範囲はＦ１及びＦ２とも３，４００Ｈｚ、データポイントはＦ１を０．２５Ｋ、Ｆ２を０．５Ｋとし、積算回数は６４回、データ取り込み時間は１．７秒、９０度パルス幅は１０．２μｓとした。
【００４３】
上記の測定条件にて、測定例−１−１で調製したソブリドチンのＮＭＲ測定試料を測定し、表１の左側の欄に記載の１Ｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔｓ値の帰属をするための１Ｈ同種核二次元相関のＮＭＲデータを得た。
測定例−１−４：  位相検出型１Ｈ同種核Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ＣＯＳＹ測定
測定条件については、測定温度を３０℃、測定範囲はＦ１及びＦ２とも２，０００Ｈｚ、データポイントはＦ１を１Ｋ、Ｆ２を２Ｋとし、積算回数は４８回、データ取り込み時間は２．２秒、９０度パルス幅は１０．２μｓとした。
【００４４】
上記の測定条件にて、測定例−１−１で調製したソブリドチンのＮＭＲ測定試料を測定し、表３に記載の３ＪＨＨ値のＮＭＲデータを得た。
測定例−１−５：位相検出型１Ｈ同種核ＲＯＥＳＹ測定
測定条件については、測定温度を３０℃、測定範囲はＦ１及びＦ２とも３，４００Ｈｚ、データポイントはＦ１を０．２５Ｋ  Ｆ２を４Ｋとし、積算回数は４０回、データ取り込み時間は１．６５秒、スピンロッキング時間は０．５秒、９０度パルス幅は１０．２μｓとした。
【００４５】
上記の測定条件にて、測定例−１−１で調製したソブリドチンのＮＭＲ測定試料を測定し、表７に記載の１Ｈ同種核二次元ＮＯＥ相関のＮＭＲデータを得た。
測定例−２：ＤＭＳＯ溶液中でのソブリドチンの１３Ｃに関するＮＭＲ測定
測定例−２−１：１３Ｃ一次元測定
測定条件については、測定温度を３０℃、測定範囲は２２，０００Ｈｚ、データポイントは３２Ｋ、積算回数は４，０９６回、データ取り込み時間は１１．３秒、９０度パルス幅は９．８μｓとした。
【００４６】
上記の測定条件にて、測定例−１−１で調製したソブリドチンのＮＭＲ測定試料を測定し、表１の右側の欄に記載の１３Ｃ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔｓ値の帰属をするための１３Ｃ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔｓのＮＭＲデータを得た。
測定例−２−２：ＤＥＰＴ測定
測定条件については、測定温度を３０℃、測定範囲は１５，０００Ｈｚ、データポイントは３２Ｋ、積算回数は２，０４８回、データ取り込み時間は３．３秒、９０度パルス幅は９．８μｓとした。
【００４７】
上記の測定条件にて、測定例−１−１で調製したソブリドチンのＮＭＲ測定試料を測定し、表１の右側の欄に記載の１３Ｃ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔｓ値の帰属をするための１３Ｃ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔｓのＮＭＲデータを得た。
測定例−２−３：位相検出型１３Ｃ−１Ｈ  ＣＯＳＹ測定
測定条件については、測定温度を３０℃、測定範囲はＦ１を３，４００Ｈｚ、Ｆ２を１５，０００Ｈｚとし、データポイントはＦ１を０．２Ｋ、Ｆ２を２Ｋとした。積算回数は２５６回、データ取り込み時間は１．７秒、ｘ  ｄｏｍａｉｎの９０度パルス幅は９．８μｓとし、ｙ  ｄｏｍａｉｎの９０度パルス幅は１０．２μｓとした。
【００４８】
上記の測定条件にて、測定例−１−１で調製したソブリドチンのＮＭＲ測定試料を測定し、表１に記載の  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔｓ値の帰属をするための位相検出型１３Ｃ−１Ｈ異種核二次元相関のＮＭＲデータを得た。
測定例−２−４：ＨＭＢＣ測定
測定条件については、測定温度を３０℃、測定範囲はＦ１を２２，０００Ｈｚ、Ｆ２を３，４００Ｈｚとし、データポイントはＦ１を０．５Ｋ、Ｆ２を１Ｋとした。積算回数は２５６回、データ取り込み時間は３．３秒、ｘ  ｄｏｍａｉｎの９０度パルス幅は１０．２μｓとし、ｙ  ｄｏｍａｉｎの９０度パルス幅は９．８μｓとした。
【００４９】
上記の測定条件にて、測定例−１−１で調製したソブリドチンのＮＭＲ測定試料を測定し、表１に記載の  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔｓ値の帰属をするための１Ｈ−１３Ｃ異種核ロングレンジ二次元相関のＮＭＲデータを得た。
測定例−２−５：Ｊ−ＨＭＢＣ  ２Ｄ測定
測定条件については、測定温度を３０℃、測定範囲はＦ１を２２，０００Ｈｚ、Ｆ２を３，４００Ｈｚとし、データポイントはＦ１を１Ｋ、Ｆ２を４Ｋとした。積算回数は５０回、データ取り込み時間は３．３秒、Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｔｉｍｅは０．２秒、ｖａｒｉａｂｌｅ  ｔｉｍｅは３０，５０，７０，９０，１１０，１２０，１５０及び１７０秒とした。ｘ  ｄｏｍａｉｎの９０度パルス幅は１０．２μｓとし、ｙ  ｄｏｍａｉｎの９０度パルス幅は９．８μｓとした。
【００５０】
上記の測定条件にて、測定例−１−１で調製したソブリドチンのＮＭＲ測定試料を測定し、表５に記載の３ＪＣＨ値のＮＭＲデータを得た。
測定例−３：ピリジン溶液中でのソブリドチンの１Ｈ及び１３Ｃに関するＮＭＲ測定
測定例−１と同様にして、ソブリドチンのピリジン−ｄ６試料用液についてＮＭＲ測定を行い、表２に記載のｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔｓ値の帰属をするためのデータ並びに表４、表６及び表８に記載のデータを得た。
【００５１】
【実施例】
実施例−１：ＮＭＲデータから導かれる三次元立体構造の構築
表１乃至表８のＮＭＲデータより、そのスピン結合定数に対応する４原子のなす二面角に基づき、分子設計支援ソフトプログラム：ＳＹＢＹＬを用いて、三次元立体構造を構築した。
【００５２】
また、本実施例において構築した立体構造は、本願発明のＮＯＥデータによって示される空間的配置と矛盾しないことを確認した。すなわち、例えば、表７におけるＡｔｏｍ１３とＡｔｏｍ１０の間に観測されたＮＯＥはＴＺＴ−１０２７がｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩの立体構造であることを支持しており、Ａｔｏｍ１３とＡｔｏｍ６及び７の間に観測されたＮＯＥはＴＺＴ−１０２７がｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩＩの立体構造であることを支持している。
実施例−２：三次元座標によって定義される立体構造の構築
表９の三次元座標に基づき、分子設計支援ソフトプログラム：ＳＹＢＹＬを用いて、三次元立体構造を構築した。この立体構造をコンピューターディスプレイ上で可視化し、図１にｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩとして示した。
【００５３】
また、同様にして、表１０の三次元座標に基づき三次元立体構造を構築し、図２にｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩＩとして示した。
実施例−３：重合阻害作用機序の解明
チューブリンの立体構造を、非特許文献５の記載等を参考にして、分子設計支援ソフトプログラム：ＳＹＢＹＬを用いてコンピューターディスプレイ上に可視化した。そして、同じ画面上にｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩの立体構造も可視化した。コンピューター上において、２つの化合物の相互作用状況を種々検討し、ソブリドチンのチューブリンに対する重合阻害作用に関するいくつかの知見を得た。また、ｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩＩについても同様に検討して知見を得た。
【００５４】
これらの知見をもとに、ソブリドチンの作用機序に関する更なる研究を行っている。
【図面の簡単な説明】
【図１】表９の三次元座標によって特定される三次元立体構造を有する化合物の三次元立体構造をｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩとしてコンピューターディスプレイ上に可視化させた図。
【図２】表１０の三次元座標によって特定される三次元立体構造を有する化合物の三次元立体構造をｃｏｎｆｏｒｍｅｒＩＩとしてコンピューターディスプレイ上に可視化させた図。
【図１】
2004262799.tif 000015
【図２】
2004262799.tif 000016