(57)【要約】【課題】消泡剤を用いなくとも泡の発生が少なく、その結果、培養液が培養容器からこぼれて生産物や微生物が失われることによる生産性の低下がない微生物の培養方法を提供する。【解決手段】微生物を含有する培養液中に酸素透過性のチューブを配置し、このチューブ内に酸素を含む気体を通過させながら微生物を培養することを特徴とする微生物の培養方法。【効果】培養液が培養容器からこぼれて生産物や微生物が失われることによる生産性の低下がなくなる。また、消泡剤を用いる必要もないので生産物が汚染されることもなくなる。【選択図】　図１
2004121110.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を含有する培養液中に酸素透過性のチューブを配置し、このチューブ内に酸素を含む気体を通過させながら微生物を培養することを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物の培養装置において、前記酸素透過性のチューブがシリコーンチューブであることを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の微生物の培養装置において、前記培養液を撹拌しながら微生物を培養することを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の微生物の培養方法において、少なくとも培養初期には前記チューブ内に二酸化炭素と酸素とを含む気体を通過させながら微生物を培養することを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項５】
請求項４に記載の微生物の培養方法において、前記チューブ内に二酸化炭素と酸素とを含む気体を通過させながら微生物を培養した後、前記二酸化炭素と酸素とを含む気体よりも酸素濃度の高い気体を通過させながら微生物を培養することを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の微生物の培養方法において、前記微生物が好気性の微生物であることを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の微生物の培養方法において、前記微生物が粘性の高い産生物を産生する微生物であることを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の微生物の培養方法において、前記微生物がリポマイセス属に属し多糖類を産生する酵母であることを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項９】
請求項８に記載の微生物の培養方法において、前記酵母が、リポマイセス　スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｔａｒｋｅｙｉ）、リポマイセス　リポフェラス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、リポマイセス　コノネンコアーエ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｋｏｎｏｎｅｎｋｏａｅ）、リポマイセス　テトラスポルス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｔｒａｓｐｏｒｕｓ）からなる群より選択される一又は二以上の酵母であることを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項１０】
培養容器と、少なくとも本体部が前記培養容器中に配置され気体導入口と気体排出口を有する酸素透過性のチューブと、を備えたことを特徴とする微生物の培養装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の微生物の培養装置において、前記酸素透過性のチューブがシリコーンチューブであることを特徴とする微生物の培養装置。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の微生物の培養装置において、前記培養容器中で培養液を撹拌可能な撹拌装置をさらに備えたことを特徴とする微生物の培養装置。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の微生物の培養装置において、前記酸素透過性のチューブに供給する気体の種類、気体の圧力又は気体の流量を制御するためのコントローラをさらに備えたことを特徴とする微生物の培養装置。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれかに記載の微生物の培養装置において、前記培養容器中の溶存酸素濃度を測定する溶存酸素電極をさらに備えたことを特徴とする微生物の培養装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、微生物の培養方法及び培養装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
土壌粒子の団粒形成は、植物の生育にとって重要な因子であり、土壌の団粒化を促進するために土壌改良剤が使用されている。このような土壌改良剤として、堆肥や厩肥が古くから用いられており、近年ではポリアクリル酸塩、ポリアクリルニトリル、ポリアクリルアミド及びポリビニルアルコール等の合成高分子化合物や、アルギン酸、酸化デンプン、キトサン等の天然物由来の多糖類、さらにはこれらの誘導体が用いられるようになっている。
【０００３】
しかし、堆肥や厩肥は単位面積当たりの使用量が多く、必要量を確保することが困難であり、また、上記のような合成高分子化合物は、微生物によって分解されにくいために土壌中に長時間残留し、安全性の面から問題が残る。さらに、天然物由来の多糖類は、これらのものに比べて団粒形成作用が弱く、原料となる天然物の入手が天候などによって左右されるという問題があった。
【０００４】
これに対し、本発明者らは、子嚢菌に属する土壌酵母の一種であるリポマイセス　スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｔａｒｋｅｙｉ）の生産する菌体外多糖が、土壌の団粒形成に著効を示し、しかも土壌中に長期間残留したりするなど安全性の問題もなく、有効な土壌改良剤として使用できることを見出している（例えば、特許文献１及び２参照。）
【０００５】
一方、これらの酵母その他の微生物等を培地中で大量に培養して多糖類等の有用な生産物を効率よく産出させるためには十分な酸素の供給が必要であることから、図６のような培養装置を好適に用いることができる（例えば、特許文献３及び４参照。）。図６は、特許文献３に記載された培養装置を示す図である。この培養装置は、ヘッドプレート１２が取り付けられた培養容器１０内で、モーター１４がかい心棒９１６を動かし、培養液９２２内に配置されるかい９１８及び９２０を回転させる構造を有している。培養に必要な酸素及び二酸化炭素含有ガスは、無菌フィルター９２４、空気管２６及び吹き込みヘッド９２８を通して培養液中に吹き込まれる。吹き込みヘッド９２８は２．５ミクロンの微小多孔性の磁器性のフィルターからなっている。
【０００６】
しかしながら、図６のような従来の培養装置を用いて、リポマイセス　スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｔａｒｋｅｙｉ）を培養すると、泡が大量に発生して培養液が培養容器からこぼれてしまい、せっかく生産された多糖類や微生物が大量に失われてしまい、多糖類の生産性を大幅に低下させてしまうという問題点があった。一方、泡の発生を防ぐために消泡剤を入れる方法もあるが、それほど大きな効果は得られず逆に生産物を汚染してしまうという問題点があった。
【０００７】
【特許文献１】
特開平５−３１１１６９号公報（０００１〜００１７段落）
【特許文献２】
特開平７−２９８８７３号公報（０００１〜０００４段落）
【特許文献３】
特開昭６０−１９９３８０号公報（図２）
【特許文献４】
特開平１−１６８２７２号公報（図１）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、上記の問題を解決し、消泡剤を用いなくとも泡の発生が少なく、このため、培養液が培養容器からこぼれて生産物や微生物が失われることによる生産性の低下がない微生物の培養方法及び培養装置を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
（１）本発明の微生物の培養方法は、微生物を含有する培養液中に酸素透過性のチューブを配置し、このチューブ内に酸素を含む気体を通過させながら（供給しながら）微生物を培養することを特徴とする。
【００１０】
このため、分子状の酸素がこの酸素透過性のチューブを透過して十分な量の酸素を培養液中に供給することができる。その結果、従来のように吹き込みヘッドから空気や酸素をバブリングする必要がなくなるので、泡の発生がほとんどなくなる。このため、培養液が培養容器からこぼれて生産物や微生物が失われることによる生産性の低下がなくなる。また、消泡剤を用いる必要もないので生産物が汚染されることもなくなる。
【００１１】
酸素を含む気体としては、「空気」、「酸素を濃縮した空気（例えば９０ｖｏｌ％酸素濃縮空気）」又は「純酸素」を好ましく用いることができる。
【００１２】
（２）上記（１）に記載の微生物の培養装置においては、前記酸素透過性のチューブがシリコーンチューブであることが好ましい。シリコーンチューブは極めて酸素透過性が高いため、また表面積を極めて大きくできるため、このシリコーンチューブを透過して十分な量の酸素を培養液中に供給することができるからである。
【００１３】
（３）上記（１）又は（２）に記載の微生物の培養装置においては、前記培養液を撹拌しながら微生物を培養することが好ましい。培養液を撹拌することによって、チューブを通過してきた酸素を効率よく培養液中に供給できるようになるからである。
【００１４】
（４）上記（１）〜（３）に記載の微生物の培養方法において、少なくとも培養初期には前記チューブ内に二酸化炭素と酸素とを含む気体を通過させながら微生物を培養することが好ましい。微生物の培養には二酸化炭素が必要な場合が多いからである。この場合、二酸化炭素と酸素とを含む気体としては、「空気」や「酸素を濃縮した空気（例えば９０ｖｏｌ％酸素濃縮空気）に二酸化炭素を例えば０．２ｖｏｌ％を含有させた気体」を好ましく用いることができる。
【００１５】
（５）上記（４）に記載の微生物の培養方法においては、培養初期に前記チューブ内に二酸化炭素と酸素とを含む気体を通過させながら微生物を培養した後、前記二酸化炭素と酸素とを含む気体よりも酸素濃度の高い気体を通過させながら微生物を培養することが好ましい。培養初期の後、前記二酸化炭素と酸素とを含む気体よりも酸素濃度の高い気体を通過させるのは、この時期になると、微生物の増殖が活発になり、微生物の代謝により十分に二酸化炭素の供給が行われるようになるからである。
【００１６】
ここで、「二酸化炭素と酸素とを含む気体よりも酸素濃度の高い気体」には、二酸化炭素を含む場合と含まない場合の両方が含まれる。また、「二酸化炭素と酸素とを含む気体よりも酸素濃度の高い気体」としては、「濃縮酸素空気（例えば９０ｖｏｌ％）」や「純酸素」を好ましく用いることができる。
【００１７】
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の微生物の培養方法においては、前記微生物が好気性の微生物である場合に特に効果が大きい。これは、微生物が好気性微生物の場合には酸素が必要であるからである。
【００１８】
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の微生物の培養方法においては、前記微生物が粘性の高い産生物を産生する微生物である場合に特に効果が大きい。これは、粘性の高い産生物を産生する微生物を培養すると、培養液の粘性が高くなり泡が発生し易くなるので、従来の微生物の培養方法では泡の発生による弊害が顕著になるためである。
【００１９】
（８）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の微生物の培養方法においては、前記微生物がリポマイセス属に属し多糖類を産生する酵母である場合に特に効果が大きい。リポマイセス属に属し多糖類を産生する酵母を培養すると、産生する多糖類のために粘性が高くなり泡が発生し易くなるので、従来の微生物の培養方法では泡の発生による弊害が顕著になるためである。
【００２０】
（９）上記（８）に記載の微生物の培養方法においては、前記酵母が、リポマイセス　スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｔａｒｋｅｙｉ）、リポマイセス　リポフェラス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、リポマイセス　コノネンコアーエ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｋｏｎｏｎｅｎｋｏａｅ）、リポマイセス　テトラスポルス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｔｒａｓｐｏｒｕｓ）からなる群より選択される一又は二以上の酵母である場合に特に効果が大きい。これらの酵母を培養すると、産生する多糖類のために粘性が高くなり泡が発生し易くなるので、従来の微生物の培養方法では泡の発生による弊害が顕著になるためである。
【００２１】
（１０）本発明の微生物の培養装置は、培養容器と、少なくとも本体部が前記培養容器中に配置され気体導入口と気体排出口を有する酸素透過性のチューブとを備えたことを特徴とする。
【００２２】
このため、分子状の酸素がこの酸素透過性のチューブを透過して十分な量の酸素を培養液中に供給することができる。その結果、従来のように吹き込みヘッドから空気や酸素をバブリングする必要がなくなるので、泡の発生がほとんどなくなる。このため、培養液が培養容器からこぼれて生産物や微生物が失われることによる生産性の低下がなくなる。また、消泡剤を用いる必要もないので生産物が汚染されることもなくなる。
【００２３】
（１１）上記（１０）に記載の微生物の培養装置においては、前記酸素透過性のチューブがシリコーンチューブであることが好ましい。シリコーンチューブは極めて酸素透過性が高いため、また表面積を極めて大きくできるため、このシリコーンチューブを透過して十分な量の酸素を培養液中に供給することができるからである。
【００２４】
シリコーンチューブの外径、内径、肉厚、長さなどは、微生物の培養に必要な酸素量と、シリコーンチューブから供給される酸素量とを比較して適宜決定すればよいが、例えば、微生物としてリポマイセス　スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｔａｒｋｅｙｉ）を５リットルの培養容器中で２５℃で培養する場合には、それぞれ、３ｍｍ，２ｍｍ，０．５ｍｍ，５０ｍ程度にするのが好ましい。
【００２５】
上記（１０）に記載の微生物の培養装置においては、前記チューブは培養容器の外周部に巻回して配置されてなることが好ましい。上述したようにチューブの長さが数十ｍにもなるため培養容器の外周部に巻回して配置するのが好適である。
【００２６】
上記（１０）のいずれかに記載の微生物の培養装置においては、前記培養容器中に配置された円筒状の網体をさらに備え、前記チューブをこの網体の網目に編み込むなどの手法によって前記チューブの表面を互いに離隔するように配置することが好ましい。円筒状の網体を備えるようにするのは長いチューブをうまく巻回するためであり、チューブをこの網体の網目に編み込むなどの手法によってチューブの表面を互いに離隔するように配置することとするのは、チューブ同士がくっつかないようにしてチューブと培養液との接触面積を大きくして培養液への酸素供給量を大きくするためである。
【００２７】
（１２）上記（１０）又は（１１）に記載の微生物の培養装置においては、前記培養容器中で培養液を撹拌可能な撹拌装置をさらに備えたものであることが好ましい。撹拌装置が培養液を撹拌することによって、チューブを通過してきた酸素を効率よく培養液中に供給できるようになるからである。
【００２８】
（１３）上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の微生物の培養装置においては、酸素透過性のチューブに供給する気体の種類、気体の圧力又は気体の流量を制御するためのコントローラをさらに備えたものであることが好ましい。微生物の培養中に気体の種類、気体の圧力又は気体の流量を適宜変化させることによって、微生物の培養効率ひいては微生物の産生する産生物の収量を大幅に向上することができるからである。例えば、培養初期には前記チューブ内に「空気」や「酸素を濃縮した空気（例えば９０ｖｏｌ％酸素濃縮空気）に二酸化炭素を例えば０．２ｖｏｌ％を含有させた気体」を通過させながら微生物を培養し、その後、「濃縮酸素空気（例えば９０ｖｏｌ％）」や「純酸素」を通過させながら微生物を培養するようにすれば、、微生物の培養効率ひいては微生物の産生する産生物の収量を大幅に向上することができる。
【００２９】
（１４）上記（１０）〜（１３）のいずれかに記載の微生物の培養装置においては、前記培養容器中の溶存酸素濃度を測定する溶存酸素電極をさらに備えたものであることが好ましい。これによって、微生物の培養中に培養液中の溶存酸素濃度をモニターすることができ、この溶存酸素濃度に基づいて、チューブに供給する気体の種類、気体の圧力、気体の流量等を制御することができるからである。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、図面を用いて、本発明の実施の形態を詳しく説明する。
【００３１】
図１は、本発明の実施の形態に係る微生物の培養装置の説明図である。この微生物の培養装置１０は、気体導入口２０と気体排出口（図示せず。）とを有するガラス製の培養容器１２，１４と、この培養容器１２，１４中に配置され気体導入口１２と気体排出口に接続された酸素透過性のチューブ３０とを備えている。
【００３２】
このため、この微生物の培養装置１０によれば、分子状の酸素がこの酸素透過性のチューブ３０を透過して十分な量の酸素を培養液中に供給することができる。その結果、従来のように吹き込みヘッドから空気や酸素をバブリングする必要がなくなるので、泡の発生がほとんどなくなる。このため、培養液が培養容器からこぼれて生産物や微生物が失われることによる生産性の低下がなくなる。また、消泡剤を用いる必要もないので生産物が汚染されることもなくなる。
【００３３】
酸素透過性のチューブ３０としては酸素透過性が極めて高いシリコーンチューブを用いている。このため、このシリコーンチューブを透過して十分な量の酸素を培養液中に供給することができる。
【００３４】
シリコーンチューブ３０の外径、内径、肉厚、長さなどは、微生物の培養に必要な酸素量と、シリコーンチューブから供給される酸素量とを比較して適宜決定すればよいが、例えば、微生物としてリポマイセス　スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｔａｒｋｅｙｉ）を５リットルの培養容器中で２５℃で培養する場合には、それぞれ、３ｍｍ，２ｍｍ，０．５ｍｍ，５０ｍ程度にする。
【００３５】
微生物の培養装置１０は、図２を参照して、培養容器１２，１４中に配置された円筒状の網体２６，２７，２８をさらに備え、シリコーンチューブ３０をこの網体２７の網目に編み込むなどの手法によってシリコーンチューブの表面を互いに離隔するように配置している。このため、シリコーンチューブ同士がくっつかないようになりシリコーンチューブと培養液との接触面積が大きくなり、培養液への酸素供給量を大きくすることができる。
【００３６】
培養容器１２，１４中へのシリコーンチューブ３０の収納の仕方を説明する。図２を参照して、まずステンレスの網で円筒状の網体２６，２７，２８を作成する（図２（ａ））。次に、この網体２６，２７，２８を結合する（図２（ｂ））。次に、この中央の網体２７の周囲にシリコーンチューブ３０を巻いてシリコーンチューブ部を作成する（図２（ｃ））。次にこれと蓋部３２とを組み合わせ（図２（ｄ））、これを培養容器１２，１４中に入れる（図１）。
【００３７】
微生物の培養装置１０は、培養容器１２中で培養液を撹拌可能な撹拌装置（図示せず）をさらに備えている。このため、撹拌装置が培養液を撹拌することによって、シリコーンチューブ３０を通過してきた酸素を効率よく培養液中に供給できるようになる。また、図３を参照して、シリコーンチューブ３０表面に発生する気泡を分散して培養液中への酸素の供給量を大きくすることができる。
【００３８】
また、微生物の培養装置１０は、酸素透過性のチューブに供給する気体の種類、気体の圧力又は気体の流量を制御するためのコントローラ（図示せず。）をさらに備えている。このため、微生物の培養中に気体の種類、気体の圧力又は気体の流量を適宜変化させることによって、微生物の培養効率ひいては微生物の産生する産生物の収量を大幅に向上することができる。例えば、培養初期には前記チューブ内に「空気」や「酸素を濃縮した空気（例えば９０ｖｏｌ％酸素濃縮空気）に二酸化炭素を例えば０．２ｖｏｌ％を含有させた気体」を通過させながら微生物を培養し、その後、「濃縮酸素空気（例えば９０ｖｏｌ％）」や「純酸素」を通過させながら微生物を培養するようにすると、微生物の培養効率ひいては微生物の産生する産生物の収量を大幅に向上することができる。
【００３９】
また、微生物の培養装置１０は、培養容器１２，１４中の溶存酸素濃度を測定する溶存酸素電極１８をさらに備えている。このため、微生物の培養中に培養液中の溶存酸素濃度をモニターすることができ、この溶存酸素濃度に基づいて、シリコーンチューブ３４に供給する気体の種類、気体の圧力、気体の流量等を制御することができる。
【００４０】
本発明の実施の形態に係る微生物の培養方法は、微生物を含有する培養液中に酸素透過性のチューブを配置し、このチューブ内に酸素を含む気体を通過させながら微生物を培養する。
【００４１】
このため、本発明の実施の形態に係る微生物の培養方法によれば、分子状の酸素がこの酸素透過性のチューブを透過して十分な量の酸素を培養液中に供給することができる。その結果、従来のように吹き込みヘッドから空気や酸素をバブリングする必要がなくなるので、泡の発生がほとんどなくなる。このため、培養液が培養容器からこぼれて生産物や微生物が失われることによる生産性の低下がなくなる。また、消泡剤を用いる必要もないので生産物が汚染されることもなくなる。
【００４２】
酸素を含む気体としては、「空気」、「酸素を濃縮した空気（例えば９０ｖｏｌ％酸素濃縮空気）」又は「純酸素」を好ましく用いることができる。
【００４３】
本発明の実施の形態に係る微生物の培養方法においては、酸素透過性のチューブとしてシリコーンチューブ３０を用いた。シリコーンチューブ３０は極めて酸素透過性が高いため、また表面積を極めて大きくできるため、このシリコーンチューブ３０を透過して十分な量の酸素を培養液中に供給することができる。
【００４４】
本発明の実施の形態に係る微生物の培養方法においては、培養液を撹拌しながら微生物を培養している。このため、培養液を撹拌することによって、チューブを通過してきた酸素を効率よく培養液中に供給できるようになる。
【００４５】
本発明の実施の形態に係る微生物の培養方法においては、少なくとも培養初期にはシリコーンチューブ３０内に二酸化炭素と酸素とを含む気体を通過させながら微生物を培養することが好ましい。微生物の培養には二酸化炭素が必要な場合が多いからである。この場合、二酸化炭素と酸素とを含む気体としては、「空気」や「酸素を濃縮した空気（例えば９０ｖｏｌ％酸素濃縮空気）に二酸化炭素を例えば０．２ｖｏｌ％を含有させた気体」を好ましく用いることができる。
【００４６】
本発明の実施の形態に係る微生物の培養方法においては、培養初期にシリコーンチューブ３０内に二酸化炭素と酸素とを含む気体を通過させながら微生物を培養した後、二酸化炭素と酸素とを含む気体よりも酸素濃度の高い気体を通過させながら微生物を培養することが好ましい。培養初期の後、二酸化炭素と酸素とを含む気体よりも酸素濃度の高い気体を通過させるのは、この時期になると、微生物の増殖が活発になり、微生物の代謝により十分に二酸化炭素の供給が行われるようになるからである。
【００４７】
ここで、「二酸化炭素と酸素とを含む気体よりも酸素濃度の高い気体」には、二酸化炭素を含む場合と含まない場合の両方が含まれる。また、「二酸化炭素と酸素とを含む気体よりも酸素濃度の高い気体」としては、「濃縮酸素空気（例えば９０ｖｏｌ％）」や「純酸素」を好ましく用いることができる
【００４８】
本発明の実施の形態に係る微生物の培養方法においては、微生物が好気性の微生物である場合に特に効果が大きい。これは、微生物が好気性微生物の場合には酸素が必要であるからである。
【００４９】
本発明の実施の形態に係る微生物の培養方法においては、微生物が粘性の高い産生物を産生する微生物である場合に効果が大きい。これは、微生物が粘性の高い産生物を産生する微生物を培養すると、培養液の粘性が高くなり泡が発生し易くなるので、従来の微生物の培養方法では泡の発生による弊害が顕著になるためである。
【００５０】
本発明の実施の形態に係る微生物の培養方法においては、微生物がリポマイセス属に属し多糖類を産生する酵母である場合に特に効果が大きい。リポマイセス属に属し多糖類を産生する酵母を培養すると、産生する多糖類のために粘性が高くなり泡が発生し易くなるので、従来の微生物の培養方法では泡の発生による弊害が顕著になるためである。
【００５１】
本発明の実施の形態に係る微生物の培養方法において、酵母が、リポマイセススタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｔａｒｋｅｙｉ）、リポマイセス　リポフェラス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、リポマイセス　コノネンコアーエ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｋｏｎｏｎｅｎｋｏａｅ）、リポマイセス　テトラスポルス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｔｒａｓｐｏｒｕｓ）からなる群より選択される一又は二以上の酵母である場合に特に効果が大きい。これらの酵母を培養すると、産生する多糖類のために粘性が高くなり泡が発生し易くなるので、従来の微生物の培養方法では泡の発生による弊害が顕著になるためである。
【００５２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。なお、本実施例で使用した培地の組成を以下の表１に示す。
【表１】
2004121110.tif 000003
【００５３】
（実施例）シリコーンチューブによる通気
本実施例では、微生物として、リポマイセス　スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｔａｒｋｅｙｉ）ＩＡＭ　ＦＲ株（リポマイセス　スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｔａｒｋｅｙｉ）ＩＡＭ　４７５３株から粘性多糖類を多量に産生する変異株として分離された酵母）を用いた。ＹＭ寒天培地に保存用として接種されていた酵母をＳ培地に接種して前々培養を行い、さらにＷ培地に接種して前培養を行い、さらにＣＧ−Ｔ培地に接種して本培養を行った。
【００５４】
Ｓ培地とＷ培地は調整後に１００ｍｌずつ５００ｍｌ容振盪フラスコへ分注し、綿栓した後、１２１℃で１５分間オートクレープ殺菌を行った。
本培養には、図１に示した微生物の培養装置を用いた。培養槽は培地を入れる前に、水をシリコーンチューブ３０が浸るまで入れて、通気口、トラップに綿栓をした後、１２１℃で３０分間オートクレープ殺菌を行った。その後に水を捨て培養槽を乾燥させてからＣＧ−Ｔ培地を入れ、上記と同様の手順で、１２１℃で３０分間のオートクレープ殺菌を行った。
【００５５】
本培養の条件を以下の表２に示す。表２中、無発泡型培養槽とあるのは図１に示した実施例に係る微生物の培養装置であり、従来型培養槽とあるのは後述する図４に示した比較例に係る微生物の培養装置である。
【表２】
2004121110.tif 000004
【００５６】
本実施例においては、図１に示した無発泡型培養槽を用いて本培養を行った。表２に示されるように培養開始時には酸素濃縮空気ではなく空気をシリコーンチューブ内に通気する。これは、培養開始時から酸素濃縮空気を通気すると、菌体の増殖に必要な二酸化炭素が不足してしまい、正常な生育が起こらないためである。その後、菌体が成育し空気通気では酸素供給が追いつかなくな段階で、酸素濃縮空気（帝人製Ｔ０−９０−３Ｌを用いて濃縮された９０ｖｏｌ％酸素濃縮空気）の通気へと切り換えた。本実施例においては、培養６０時間目に空気通気から酸素濃縮空気による通気へと切り換えた。
【００５７】
生育の測定は、分光光度計（日立製作所製：ＭＯＤＥＬ１０１）を用いた。全菌数の測定は、トーマ血球計算盤を用いて３回測定を行い、その平均値を全菌数とした。生菌率の測定は、０．０７５％エリトロシンＢ溶液を用いた。多糖類の測定は、Ｆ−キット　乳糖／ガラクトース（ＢＩＥＨＲＩＮＧＥＲ　ＭＡＮＮＨＥＩ社製）を用いた。
【００５８】
図５にＯＤ６６０で測定した生育のグラフを示し、図６に全菌数のグラフを示した。図７に、生菌率のグラフを示した。図８に多糖生産量のグラフを示した。
【００５９】
（比較例）バブリングによる通気
比較例における本培養の条件を表２に示す。表２中、従来型培養槽とあるのが本比較例に係る微生物の培養装置である。
【００６０】
本比較例においては、図４に示した無発泡型培養槽を用いて本培養を行った。表２に示されるように、実施例とは異なり培養中を通じてバブリングにより空気を通気した。
【００６１】
生育の測定は、分光光度計（日立製作所製：ＭＯＤＥＬ１０１）を用いた。全菌数の測定は、トーマ血球計算盤を用いて３回測定を行い、その平均値を全菌数とした。生菌率の測定は、０．０７５％エリトロシンＢ溶液を用いた。多糖類の測定は、Ｆ−キット　乳糖／ガラクトース（ＢＩＥＨＲＩＮＧＥＲ　ＭＡＮＮＨＥＩ社製）を用いた。
【００６２】
図５にＯＤ６６０で測定した生育のグラフを示し、図６に全菌数のグラフを示した。図７に、生菌率のグラフを示した。図８に多糖生産量のグラフを示した。
【００６３】
（実施例と比較例との比較）
１．生育
図５及び図６に示されるように、培養終了時におけるＯＤ６６０値及び全菌数のいずれも比較例が実施例より高い値を示したが、その差はわずかであった。このことから、シリコーンチューブによる通気の条件を最適化することによって、シリコーンチューブによる通気の場合にはバブリングによる通気の場合よりも効率よく生育させることが可能であると思われる。
【００６４】
２．生菌率
図７に示されるように、培養２４時間目以降、実施例の方が比較例よりも常に高い値を示し、実施例の場合の方が菌体にストレスをかけていないことが示唆された。
【００６５】
３．多糖生産量
図８に示されるように、多糖生産量は全菌数の増加が止まる培養１０６時間目過ぎから急激に増大している。これは、この時点で菌体増殖代謝から多糖生産代謝への切り換えが起こったと考えられる。
培養１５４時間目から１９０時間目の培養液あたりの多糖生産量は、実施例が１１．４１ｇ／リットル、比較例が１４．７５ｇ／リットルであり、比較例の方が高かった。一方、菌体あたりの多糖生産量は、実施例が２．４８ｇ／１０１１ｃｅｌｌｓ、比較例が１．６１ｇ／１０１１ｃｅｌｌｓであり、実施例の方が高かった。この結果は、菌体あたりの多糖生産量は実施例の場合の方が高いのであるが、菌体数が低いため、培養液あたりの多糖生産量が低くなったことを示している。このことは、シリコーンチューブによる通気の条件を最適化するなどによって、バブリングによる通気の場合よりも効率よく菌を生育させることが可能になれば、多糖生産量の生産生を大幅に向上させることができることを示唆している。
【００６６】
４．泡
培養終了後に培養装置に残存していた培養液量は、実施例が１．８５リットルであり、比較例が１．５４リットルであった。比較例では泡による培養液の流出が０．３リットルもある一方、実施例では泡による培養液の流失はなかったのである。このことから、実施例では、培養液が培養容器からこぼれて生産物や微生物が失われることによる生産性の低下がなくなることが明らかになったた。また、このため、消泡剤を用いる必要がないことも明らかになった。
【００６７】
以上、本発明の微生物の培養方法及び培養装置を実施の形態に基づいて説明したが、本発明はこれに限られず、種々の微生物の培養方法及び培養装置にも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る微生物の培養装置を説明するための図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る微生物の培養装置の組み立て方法を説明するための図である。
【図３】シリコーンチューブの表面状態を説明するための図である。
【図４】比較例に係る微生物の培養装置を説明するための図である。
【図５】ＯＤ６６０で測定した生育のグラフである。
【図６】全菌数のグラフである。
【図７】生菌率のグラフである。
【図８】多糖生産量のグラフである。
【図９】従来の微生物の培養装置を説明するための図である。
【符号の説明】
１０　　微生物の培養装置
１２，１４　　培養容器
１６　　固定治具
１８　　溶存酸素電極
２０　　気体導入部
２２　　サンプリングポート
２４　　トラップ
２６，２７，２８　　ステンレス網
３０　　シリコンチューブ
３２　　蓋部
４０　　撹拌装置
１２０　　気体導入部
１３０　　気体導入ヘッド
１４４　　邪魔板
９１０　　培養容器
９１２　　ヘッドプレート
９１４　　モーター
９１６　　かい心棒
９１８，９２０　　かい
９２２　　培養液
９２４　　無菌フィルター
９２６　　空気管
９２８　　吹き込みヘッド
９３０　　培養容器の上部空間
９３２　　排気口
９３４，９３６、９４０　　フィルター
９３８　　入口
９４２　　バルブ
９４４　　側管
Ｂ　　気泡
【図１】
2004121110.tif 000005
【図２】
2004121110.tif 000006
【図３】
2004121110.tif 000007
【図４】
2004121110.tif 000008
【図５】
2004121110.tif 000009
【図６】
2004121110.tif 000010
【図７】
2004121110.tif 000011
【図８】
2004121110.tif 000012
【図９】
2004121110.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成14年11月6日(2002.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
一方、これらの酵母その他の微生物等を培地中で大量に培養して多糖類等の有用な生産物を効率よく産出させるためには十分な酸素の供給が必要であることから、図９のような培養装置を好適に用いることができる（例えば、特許文献３及び４参照。）。図９は、特許文献３に記載された培養装置を示す図である。この培養装置は、ヘッドプレート９１２が取り付けられた培養容器９１０内で、モーター９１４がかい心棒９１６を動かし、培養液９２２内に配置されるかい９１８及び９２０を回転させる構造を有している。培養に必要な酸素及び二酸化炭素含有ガスは、無菌フィルター９２４、空気管９２６及び吹き込みヘッド９２８を通して培養液中に吹き込まれる。吹き込みヘッド９２８は２．５ミクロンの微小多孔性の磁器性のフィルターからなっている。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
しかしながら、図９のような従来の培養装置を用いて、リポマイセス　スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｔａｒｋｅｙｉ）を培養すると、泡が大量に発生して培養液が培養容器からこぼれてしまい、せっかく生産された多糖類や微生物が大量に失われてしまい、多糖類の生産性を大幅に低下させてしまうという問題点があった。一方、泡の発生を防ぐために消泡剤を入れる方法もあるが、それほど大きな効果は得られず逆に生産物を汚染してしまうという問題点があった。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
（９）上記（８）に記載の微生物の培養方法においては、前記酵母が、リポマイセス　スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｓｔａｒｋｅｙｉ）、リポマイセス　リポフェラス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、リポマイセス　コノネンコアーエ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｋｏｎｏｎｅｎｋｏａｅ）、リポマイセス　テトラスポルス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｔｒａｓｐｏｒｕｓ）からなる群より選択される一又は二以上の酵母である場合に特に効果が大きい。これらの酵母を培養すると、産生する多糖類のために粘性が高くなり泡が発生し易くなるので、従来の微生物の培養方法では泡の発生による弊害が顕著になるためである。なお、リポマイセス　リポフェラス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）は、リポマイセス　リポフェル（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｐｏｆｅｒ）ということもある。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
図１は、本発明の実施の形態に係る微生物の培養装置の説明図である。この微生物の培養装置１０は、気体導入口２０と気体排出口（図示せず。）とを有するガラス製の培養容器１２，１４と、この培養容器１２，１４中に配置され気体導入口２０と気体排出口に接続された酸素透過性のチューブ３０とを備えている。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
Ｓ培地とＷ培地は調製後に１００ｍｌずつ５００ｍｌ容振盪フラスコへ分注し、綿栓した後、１２１℃で１５分間オートクレープ殺菌を行った。
本培養には、図１に示した微生物の培養装置を用いた。培養槽は培地を入れる前に、水をシリコーンチューブ３０が浸るまで入れて、通気口、トラップに綿栓をした後、１２１℃で３０分間オートクレープ殺菌を行った。その後に水を捨て培養槽を乾燥させてからＣＧ−Ｔ培地を入れ、上記と同様の手順で、１２１℃で３０分間のオートクレープ殺菌を行った。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
本実施例においては、図１に示した無発泡型培養槽を用いて本培養を行った。表２に示されるように培養開始時には酸素濃縮空気ではなく空気をシリコーンチューブ内に通気する。これは、培養開始時から酸素濃縮空気を通気すると、菌体の増殖に必要な二酸化炭素が不足してしまい、正常な生育が起こらないためである。その後、菌体が成育し空気通気では酸素供給が追いつかなくなる段階で、酸素濃縮空気（帝人製Ｔ０−９０−３Ｌを用いて濃縮された９０ｖｏｌ％酸素濃縮空気）の通気へと切り換えた。本実施例においては、培養６０時間目に空気通気から酸素濃縮空気による通気へと切り換えた。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
生育の測定は、分光光度計（日立製作所製：ＭＯＤＥＬ１０１）を用いた。全菌数の測定は、トーマ血球計算盤を用いて３回測定を行い、その平均値を全菌数とした。生菌率の測定は、０．０７５％エリトロシンＢ溶液を用いた。多糖類の測定は、Ｆ−キット　乳糖／ガラクトース（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ　ＭＡＮＮＨＥＩＭ社製）を用いた。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
生育の測定は、分光光度計（日立製作所製：ＭＯＤＥＬ１０１）を用いた。全菌数の測定は、トーマ血球計算盤を用いて３回測定を行い、その平均値を全菌数とした。生菌率の測定は、０．０７５％エリトロシンＢ溶液を用いた。多糖類の測定は、Ｆ−キット　乳糖／ガラクトース（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ　ＭＡＮＮＨＥＩＭ社製）を用いた。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
４．泡
培養終了後に培養装置に残存していた培養液量は、実施例が１．８５リットルであり、比較例が１．５４リットルであった。比較例では泡による培養液の流出が０．３リットルもある一方、実施例では泡による培養液の流失はなかったのである。このことから、実施例では、培養液が培養容器からこぼれて生産物や微生物が失われることによる生産性の低下がなくなることが明らかになった。また、このため、消泡剤を用いる必要がないことも明らかになった。