(57)【要約】　　　（修正有）【課題】植物が外界から硝酸イオンを吸収する過程、更に吸収した硝酸イオンの植物内での細胞間輸送に関与しているニコチアナ属由来の硝酸輸送タンパク質と、それをコードする遺伝子を提供すること。【解決手段】ニコチアナ　タバカムの各器官（例えば、葉肉、中骨、茎、根など）の総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によりクローニングされた４個の特定の塩基配列及び該配列によりコードされる４個のアミノ酸配列により示されるポリペプチド。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列により示されるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、並びにその相補的配列からなる群より選択される塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７に記載の塩基配列、並びにその相補的配列からなる群より選択される塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４に記載の塩基配列、並びにその相補的配列からなる群より選択される塩基配列により示されるオリゴヌクレオチドを含むプライマー。
【請求項５】
配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７に記載の塩基配列、並びにその相補的配列からなる群より選択される塩基配列により示されるオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は植物が外界から硝酸イオンを吸収する過程、更に吸収した硝酸イオンの植物内での細胞間輸送に関与している硝酸輸送タンパク質と、それをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
硝酸輸送遺伝子には、硝酸イオン濃度が高い（即ち、０．５ｍＭ以上）ときに働く低親和性硝酸輸送輸送遺伝子と、低い（即ち、０．５ｍＭ以下）のときに働く高親和性硝酸輸送遺伝子が存在する（化学と生物，　Ｖｏｌ．３８，　ｐ１９６−２０３，　２０００）。これまでに遺伝子レベルでの研究が進み、植物由来の低親和性硝酸輸送遺伝子としてシロイヌナズナ由来のＣＨＬ１（ＡｔＮＲＴ１）（Ｃｅｌｌ，　ｖｏｌ．７２，　ｐ７０５−７１３，　１９９３，Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　ｖｏｌ．８，　ｐ２１８３−２１９１，　１９９６）、ＮＴＬ１（ＡｔＮＲＴ１：２）（Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　ｖｏｌ．１１，　ｐ１３８１−１３９２，　１９９９）、イネ由来のＯｓＮＲＴ１（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｖｏｌ．１２２，　ｐ３７９−３８８，　２０００）、アブラナ由来のＢｎＮＲＴ１：２（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　Ｖｏｌ．２７３，　ｐ１２０１７，　１９９８）、トマト由来のＬｅＮＲＴ１（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　ＶＯｌ．９３，　ｐ８１３９−８１４４，　１９９６）などの報告がある。なお、ＣＨＬ１については低親和性、高親和性両方の機能を併せ持っているとの報告もある（Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　ｖｏｌ．１１，　ｐ８６５−８７４，　１９９９）。これらの遺伝子のうち、硝酸イオン輸送活性が実験的に確認されているものは、ＣＨＬ１、ＮＴＬ１およびＯｓＮＲＴ１である。この他にも遺伝子レベルで相同性のある遺伝子が多数単離されているが、それらの硝酸イオン輸送活性は測定されておらず、硝酸輸送遺伝子であるという明確な確認はなされていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ニコチアナ属由来の硝酸輸送遺伝子を提供することにある。
【０００４】
それにより、ニコチアナ属の硝酸輸送遺伝子が単離され、その機能や発現様式が解明されれば、その遺伝子を操作し、硝酸イオン吸収能を増大、或いは削減した植物を育種することが可能になる。更に、低栄養な土壌でも生育可能な植物の育種、或いは、植物中の硝酸含量を削減して品質の向上した植物の育種が期待される。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意検討の結果、ニコチアナ　タバカム　ｃｖ．　バーレー２１の根、またはニコチアナ　タバカム　ｃｖ．　ブライトイエロー４号の葉の総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法で低親和性硝酸輸送遺伝子をクローニングし、その塩基配列を決定し、その知見に基づいて本発明に至った。
【０００６】
即ち、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７に記載の塩基配列、並びにその相補鎖からなる群より選択される塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
１．低親和性硝酸輸送遺伝子
上述の通り、本発明者らは、ニコチアナ　タバカム　ｃｖ．　バーレー２１、またはニコチアナ　タバカム　ｃｖ．　ブライトイエロー４号の各器官（例えば、葉肉、中骨、茎、根など）の総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により、低親和性硝酸輸送遺伝子をクローニングし、単離し、その塩基配列を決定した。
【０００８】
本発明に従う低親和性硝酸輸送タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７で示される塩基配列並びにその相補鎖からなる群より選択される塩基配列により示されるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に記載のアミノ酸をコードする塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
【０００９】
更に本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７で示される塩基配列並びにその相補鎖からなる群より選択される塩基配列により示されるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】
また、本発明に従う低親和性硝酸輸送タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドは、その塩基配列の幾つかの塩基が置換または欠失していてもよく、また、幾つかの塩基が更に付加していてもよく、また化学的な修飾がなされていてもよい。そのようなオリゴヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。
【００１１】
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」の語は、合成若しくは天然、またはＤＮＡ若しくはＲＮＡの何れかに関わらず、複数のヌクレオチドを含み、且つ特定の塩基配列により表されるものを示す。
【００１２】
本発明に従うオリゴヌクレオチドは、それ自体で遺伝子として使用されてもよく、または所望のプロモーター、エンハンサーサイレンサーおよびアテニュエーターなどの発現調節遺伝子、並びに薬物耐性因子、緑色蛍光タンパク質、フィコシアニンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼなどのマーカー遺伝子を付加した形態のオリゴヌクレオチドを遺伝子として使用されてもよい。そのようなオリゴヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。また、そのような遺伝子を導入するための対象は、ファージおよびプラスミドなどのベクター、ウイルス、細胞、組織、植物および動物などであればよく、そのような遺伝子を導入された対象も本発明として提供される。また、そのような遺伝子の導入はそれ自身公知の手段により行うことが可能である。
【００１３】
例えば、本発明に従う遺伝子は、所望の対象に導入され、低親和性硝酸輸送遺伝子を発現または発現促進してもよく、または、低親和性硝酸輸送タンパク質を産生させてもよく、低親和性硝酸輸送タンパク質の産生量を増加するために使用してもよい。
【００１４】
或いは、例えば、本発明に従うオリゴヌクレオチドを遺伝子として植物に導入することにより硝酸イオンの吸収能や他細胞への輸送をコントロールできる植物を育種することができる。例えば、低栄養な土壌でも、生育可能な植物の育種、或いは植物中の硝酸含量を削減して品質の向上した植物の育種に使用することが可能である。
【００１５】
また、本発明に従うと、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７並びにその相補鎖からなる群より選択された塩基配列の所望の一部分を含むオリゴヌクレオチド断片も提供される。そのようなオリゴヌクレオチド断片は、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドを検出するためのプローブ、本発明のオリゴヌクレオチドを増幅するためのプライマーなどとして使用することも可能である。
【００１６】
例えば、そのようなオリゴヌクレオチド断片をプローブとして使用する場合には、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７並びにその相補鎖からなる群より選択された塩基配列の連続する約２００塩基から約１０００塩基、好ましくは約５００塩基から約８００塩基であればよい。
【００１７】
そのようなオリゴヌクレオチド断片を増幅反応におけるプライマーとして使用する場合には、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７並びにその相補鎖からなる群より選択された塩基配列から設計すればよい。例えば、２０ｍｅｒ前後、好ましくは２２から２５ｍｅｒ、ＧＣ含量が４０から６０％、Ｔｍ値を６０℃以上として設計することができる。
【００１８】
これに限定するものではないが、好ましいプライマーは、例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４並びにその相補鎖により示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。以下、夫々の配列について説明する。
【００１９】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２は、配列番号１の塩基配列の一部である。
【００２０】
配列番号９は、配列番号１の塩基の第１位から第２４位までの塩基からなる配列であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと記す）におけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号１０は、配列番号１の塩基の第１７７３位から第１７５０位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号９と共に使用され得る。
【００２１】
配列番号１１は、配列番号１の塩基の第１６５３位から第１６７５位までの塩基からなる配列であり、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＲＴ−ＰＣＲと記す）におけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号１２は、配列番号１の塩基の第１７６２位から第１７４１位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号９と共に使用され得る。
【００２２】
配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６は、配列番号３の塩基配列の一部である。
【００２３】
配列番号１３は、配列番号３の塩基の第１位から第２４位までの塩基からなる配列であり、例えば、ＰＣＲにおけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号１４は、配列番号３の塩基の第１７７３位から第１７５０位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号１３と共に使用され得る。
【００２４】
配列番号１５は、配列番号３の塩基の第１６５３位から第１６７５位までの塩基からなる配列であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲにおけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号１６は、配列番号１の塩基の第１７６２位から第１７４１位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号１５と共に使用され得る。
【００２５】
配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０は、配列番号５の塩基配列の一部である。
【００２６】
配列番号１７は、配列番号５の塩基の第１位から第２２位までの塩基からなる配列であり、例えば、ＰＣＲにおけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号１８は、配列番号５の塩基の第１７８５位から第１７６３位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号１７と共に使用され得る。
【００２７】
配列番号１９は、配列番号５の塩基の第３９４位から第４１６位までの塩基からなる配列であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲにおけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号２０は、配列番号５の塩基の第５４４位から第５２３位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号１９と共に使用され得る。
【００２８】
配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４は、配列番号７の塩基配列の一部である。
【００２９】
配列番号２１は、配列番号７の塩基の第１位から第２２位までの塩基からなる配列であり、例えば、ＰＣＲにおけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号２２は、配列番号７の塩基の第１７８５位から第１７６３位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号２１と共に使用され得る。
【００３０】
配列番号２３は、配列番号７の塩基の第３９４位から第４１７位までの塩基からなる配列であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲにおけるセンスプライマーとして使用され得る。配列番号２４は、配列番号７の塩基の第３９４位から第４１７位までの塩基からなる配列の相補鎖であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのアンチセンスプライマーとして、例えば、配列番号２３と共に使用され得る。
【００３１】
また、上述のようなオリゴヌクレオチド断片は所望により、更に任意の配列を具備してもよく、また、任意の標識物質などを具備してもよく、その一部に化学的修飾がなされてもよい。
【００３２】
本発明に従い提供される配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７で示される塩基配列並びにその相補鎖からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド断片は、ニコチアナ属の植物、好ましくは、ニコチアナ　タバカム　ｃｖ．　バーレー２１、またはニコチアナ　タバカム　ｃｖ．　ブライトイエロー４号から、それ自身公知の手段により単離され、精製されればよく、所望に応じて増幅されてもよい。或いは、それ自身公知の核酸合成手段により、人工的に合成されてもよい。
【００３３】
本発明に従い提供される配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７で示される塩基配列並びにその相補鎖からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド、およびそれらの一部分であるオリゴヌクレオチド断片は、対象における低親和性硝酸輸送遺伝子の発現を阻害するためのアンチセンスとして使用されてもよい。そのようなアンチセンスも本発明の範囲に含まれる。
【００３４】
本発明に従うアンチセンスの例は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７に示す塩基配列の全長のアンチセンスであってもよいが、夫々の配列の連続した約２５％以上の断片のアンチセンスであれば効果は得られる。
【００３５】
本発明に従うアンチセンスの使用方法は、それ自身公知の何れの手段を利用すればよい。
【００３６】
また、そのようなアンチセンスで処理された細胞、組織および植物などの対象も本発明の範囲に含まれる。また、本発明に従うアンチセンスを使用した低親和性硝酸輸送遺伝子の阻害方法も本発明の範囲内である。
【００３７】
２．低親和性硝酸輸送タンパク質
本発明に従うと、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に記載のアミノ酸配列により示されるタンパク質およびポリペプチドが提供される。これらの配列は、実質的に低親和性硝酸輸送タンパク質を示すアミノ酸配列である。
【００３８】
また、本発明に従うと、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に記載されるアミノ酸配列により示されるタンパク質は、その幾つかのアミノ酸が置換または欠失していてもよく、また、幾つかのアミノ酸が更に付加していてもよく、また化学的な修飾がなされていてもよい。そのような修飾タンパク質および修飾ポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。
【００３９】
また、本発明に従って提供されるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に記載されるアミノ酸配列により示されるポリペプチドに約６０％以上で相同的なアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。
【００４０】
本発明に従う低親和性硝酸輸送タンパク質は、任意の大腸菌や細胞などを利用するそれ自身公知のタンパク質生産方法を利用すればよい。
【００４１】
本発明の遺伝子はまた、定法に従って常用のプラスミドベクターに挿入した後、宿主細胞、例えば、大腸菌などの細胞を含めての原核性細胞、酵母などの単細胞性宿主を含めての下等真核性細胞、カイコなどの高等真核細胞を形質転換して増幅することが可能である。そのことを、その具体的な一例は、上述の実施例５に示す通り、本発明の遺伝子の硝酸イオン輸送活性をカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターに連結したプラスミドを培養細胞ＢＹ２に導入することにより確認することができた。また、アフリカツメガエルの卵母細胞に合成した本発明の遺伝子のｍＲＮＡを直接導入し、硝酸イオン溶液中で電気生理学的に輸送能を測定することも可能である。更に、硝酸輸送能が欠失した酵母などに本発明の遺伝子を導入して、硝酸輸送能が相補されることにより、本発明の遺伝子の活性を確認することも可能である。
【００４２】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例にのみに限定されるものではない。
【００４３】
実施例１．低親和性硝酸輸送遺伝子の単離
（１）ニコチアナ　タバカム　ｃｖ．　バーレー２１の総ＲＮＡの抽出
標準的な水耕液（５ｍＭのＫＮＯ３、２．５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＣａ（ＮＯ３）、０．０５ｍＭのＦｅ−ＥＤＴＡ、７０μＭのＨ３ＢＯ３、１４μＭのＭｎＣｌ２、０．５μＭのＣｕＳＯ４、１μＭのＺｎＳＯ４、０．２μＭのＮａＭｏＯ４、１０μＭのＮａＣｌ、０．０１μＭのＣｏＣｌ２）で２〜３週間栽培したニコチアナ　タバカム　ｃｖ．　バーレー２１（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ．　Ｂｕｒｌｅｙ　２１）の根を総ＲＮＡの調製に供した。０．５ｇの根をＦａｓｔ　ＲＮＡ−Ｇｒｅｅｎ　Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）のチューブに入れ、これをＦａｓｔＰｒｅｐ　ＦＰ１２０装置にセットして磨砕した。更に、添付されたプロトコールに従い総ＲＮＡを得た。
【００４４】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ法による低親和性硝酸輸送遺伝子の単離
上記（１）で得られた総ＲＮＡを鋳型として使用し、逆転写反応を行った。即ち、総ＲＮＡ１〜２μｇ、１０×ＲＴ緩衝液、終濃度０．５ｍＭのｄＮＴＰｓ、ｏｌｉｇｏ　ｄＴ（１５）プライマー１０ｐｍｏｌｅｓ、ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　１０ユニット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　１ユニット（Ｑｉａｇｅｎ）、合計１０μＬにＲＮａｓｅ−フリー　ウォーター（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ）で調製後、３７℃で６０分間逆転写反応を行い、９３℃で５分間処理して酵素を失活した。次に、反応溶液の一部を鋳型にしてＰＣＲを行った。即ち、反応液５μＬ、１０×緩衝液１０μＬ、終濃度０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーセット、５ユニットのＥｘ−Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）、合計５０μＬに調整後、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００）を用いて９４℃で２分を１サイクル、９４℃で３０秒→５５℃で３０秒→７２℃で１．５分を３０サイクル、７２℃で７分を１サイクルとして反応を行った。プライマーセットの配列は、配列番号１、配列番号２に示したＮ−１（５’−ＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣ　ＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡ　ＡＣＡＡ−３’）とＮ−２（５’−ＴＴＡＧＴＧＧＣＡＡ　ＧＣＴＧＧＴＴＣＴＧ　ＡＡＴＣ−３’），及び配列番号３および配列番号４に示したＮ−３（５’−ＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣ　ＣＴＧＡＧＡＣＡＣＡ　ＧＣ−３’）とＮ−４（５’−ＴＣＡＡＴＧＡＣＡ　ＡＡＣＣＧＧＴＣＣＡ　ＴＣＡＴ−３’）の２組を用いた。
【００４５】
Ｎ−１とＮ−２、Ｎ−３とＮ−４の２組のプライマーセットを用いて、それぞれ約１．８ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。それぞれの増幅産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、ｐＵＣ１９（ＴａＫａＲａ）にクローニングした。大腸菌数十コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し，ＢｉｇＤｙｅ　ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識後、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７００に供して塩基配列を解析した。その結果、各プライマーセットで２分子種ずつが増幅されることが判明した。その塩基配列を配列番号１、３、５、及び７に示す。なお、それぞれの配列の名称をｎｒｔ１．１Ａ、ｎｒｔ１．１Ｂ、ｎｒｔ１．２Ａ、及びｎｒｔ１．２Ｂとした。
【００４６】
このように、本発明に従う遺伝子が、ニコチアナ　タバカム　ｃｖ．　バーレー２１の各器官（例えば葉肉、中骨、茎および根など）の総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により単離することができた。
【００４７】
実施例２．低親和性硝酸輸送遺伝子の発現解析１
（１）バーレー２１の水耕栽培
播種後１ヶ月の幼苗を２５℃の温室内において、標準水耕液（硝酸イオン濃度９ｍＭ）で２週間栽培した。なお、標準水耕液の組成は実施例１と同様であり、一週間ごとに水耕液は新たなものと取替えた。さらに、エアーポンプで水耕液内に空気を供給した。
【００４８】
（２）総ＲＮＡの抽出
水耕栽培したタバコから葉、中骨（主脈）、茎、根を０．２〜０．３ｇずつサンプリングし、実施例１（１）と同様に、ＦａｓｔＲＮＡ−Ｇｒｅｅｎ　Ｋｉｔ（ＢＩＯ　１０１）を用いて総ＲＮＡを抽出した。その結果、２５〜１６５μｇの総ＲＮＡが得られ、そのうち１μｇをＲＴ−ＰＣＲの鋳型として使用した。
【００４９】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ法による低親和性硝酸輸送遺伝子の定量的発現解析
（２）で得られた総ＲＮＡ（１μｇ）を用いて、逆転写酵素反応を行った。方法は実施例１（２）と同様である。この反応液を滅菌水で５倍に希釈し、そのうち５μＬを鋳型としてＡＢＩＰＲＩＳＭ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応にはＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｃｏｒｅ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、方法は添付のプロトコールに従った。定量する遺伝子のプライマーセットとして、ｎｒｔ１．１およびｎｒｔ１．２を増幅するためのプライマーセット、即ち、配列番号９と配列番号１０、配列番号１３と配列番号１４、配列番号１７と配列番号１８、および配列番号２１と配列番号２２を使用した。また、内部標準としてアクチン遺伝子を増幅する合成プライマーを用いた。
【００５０】
その結果を図１に示した。図１中、Ｌ１は上位葉ラミナ、Ｌ２は下位葉ラミナ、Ｍ１は上位葉中骨、Ｍ２は下位葉中骨、Ｓは茎、Ｒは根を示す。ｎｒｔ１．１は根での発現が特に高かったが、葉、中骨、茎といった他の器官でも一様に発現していた。ｎｒｔ１．２は根、茎で高く、葉や中骨ではほとんど発現していなかった。
【００５１】
（４）ＲＴ−ＰＣＲ法による低親和性硝酸輸送遺伝子の定性的発現解析
各器官におけるｎｒｔ１．１Ａおよびｎｒｔ１．１Ｂ、並びにｎｒｔ１．２Ａおよびｎｒｔ１．２Ｂの発現様式を検討した。上記（３）の逆転写産物を鋳型に実施例１（２）と同様な方法でＰＣＲを行った。プライマーセットはｎｒｔ１．１Ａとｎｒｔ１．１Ｂ、及びｎｒｔ１．２Ａとｎｒｔ１．２Ｂに共通の配列部分を用いた。ｎｒｔ１．１のＰＣＲ産物はＳａｌＩで、ｎｒｔ１．２のＰＣＲ産物はＳｓｐＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行ってそれぞれＡ、Ｂを区別した。すなわち、ｎｒｔ１．１ＡのＰＣＲ産物はＳａｌＩで消化されるのに対し、ｎｒｔ１．２Ｂは消化されず、同様にｎｒｔ１．２ＢはＳｓｐＩで消化されるのに対し、ｎｒｔ１．２Ａは消化されないことから、アガロースゲル電気泳動により両者を区別した。結果を図２に示した。図２中、Ｌ１は上位葉ラミナ、Ｌ２は下位葉ラミナ、Ｍ１は上位葉中骨、Ｍ２は下位葉中骨、Ｓは茎、Ｒは根を示す。根、茎および中骨ではｎｒｔ１．１Ｂの発現が顕著に高く、ラミナではｎｒｔ１．１Ｂよりもｎｒｔ１．１Ａの発現の方が高い傾向であった。一方、ｎｒｔ１．２Ａは根、茎、中骨で高く、上位葉ラミナではｎｒｔ１．２Ｂの方が高かった。以上の結果から、ｎｒｔ１．１およびｎｒｔ１．２は器官によりそれぞれ異なった分子種の遺伝子が優先的に発現していることが明らかとなった。
【００５２】
このような実施例により、即ち、ニコチアナ　タバカム　ｃｖ．バーレー２１について、水耕液で栽培した後、各器官から継時的に総ＲＮＡを抽出し、本発明の遺伝子特異的配列をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ｍＲＮＡの発現量を定量的に調べることで本発明の遺伝子の発現様式を確認できた。
【００５３】
実施例３．低親和性硝酸輸送遺伝子の発現解析２
（１）バーレー２１の水耕栽培
播種後１ヶ月の幼苗を２５℃の温室内において、硝酸イオン濃度の異なる水耕液（０．１、１，５および１０ｍＭ）で２週間栽培した後、実施例２（２）と同様の方法で葉（上位葉、中位葉および下位葉）、茎、根から総ＲＮＡを抽出した。水耕液の硝酸カリウム以外の組成は実施例１（１）と同様である。
【００５４】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ法による低親和性硝酸輸送遺伝子の定量的発現解析
実施例２（３）と同様の方法で定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーセットは本発明のｎｒｔ１．１、ｎｒｔ１．２、及び高親和性硝酸輸送遺伝子（Ｎｒｔ２：１）、さらに内部標準としてアクチン遺伝子に特異的な配列を用いた。Ｎｒｔ２：１は、ニコチアナ　プランパギニフォリアの高親和性硝酸輸送遺伝子（Ｎｒｔ２：１Ｎｐ，　Ｐｌａｎｔ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏ．　Ｖｏｌ．　３４，　２６５−２７４，　１９９７，　ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｙ０８２１０）をもとに、定法によりニコチアナ　タバカム　ｃｖ　バーレー２１から単離した。その結果を表１に示す。ｎｒｔ１．１は硝酸イオン濃度の違いに伴い若干発現量に変動が見られるものの、各器官で一様に発現していた。葉でのｎｒｔ１．２発現量は非常に低いレベルであり、さらに硝酸イオン濃度により大きな変化はなかった。茎、根では０．５ｍＭで発現量は低かったのに対し、１ｍＭ以上の硝酸イオン濃度では顕著に発現が高かった。一方、高親和性硝酸輸送遺伝子（Ｎｒｔ２：１）は根でのみ発現が認められ、さらに０．５ｍＭでの発現量が高く、１０ｍＭでは約１／１４しか発現していなかった。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
このような実施例により、即ち、ニコチアナ　タバカム　ｃｖ．バーレー２１を硝酸イオン濃度の異なる水耕液で栽培した後、各器官から継時的に総ＲＮＡを抽出し、本発明の遺伝子特異的配列をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ｍＲＮＡの発現量を定量的に調べることにより、本発明の遺伝子の発現様式を確認できた。
【００５７】
実施例４．低親和性硝酸輸送遺伝子の発現解析３
（１）バーレー２１の水耕栽培
播種後１ヶ月の幼苗を２５℃の温室内において、実施例１（１）に示した水耕液で１０日間栽培した後、硝酸イオン濃度の異なる水耕液（０ｍＭおよび５ｍＭ）で１週間栽培し、さらに５ｍＭ、０ｍＭおよび０．２ｍＭの硝酸イオンを含む水耕液に移して経時的に根を採取してそれぞれから総ＲＮＡを抽出した。
【００５８】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ法による低親和性硝酸輸送遺伝子の定量的発現解析
実施例２（３）と同様の方法で本発明のｎｒｔ１．１とｎｒｔ１．２について定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。内部標準としてはＡＴＰシンターゼ遺伝子を用いた。
【００５９】
その結果を図３に示す。図３中、黒丸は５ｍＭ硝酸濃度で継続して栽培した場合、白丸は５ｍＭ硝酸濃度から無窒素状態に移した場合、白三角は無窒素状態から０．２ｍＭ硝酸濃度に移した場合、黒三角は無窒素状態から５ｍＭ硝酸濃度に移した場合を示した。図の横軸はタバコを新たな水耕液に移した時からの経過時間を表している。ｎｒｔ１．１は０時間目では発現量に明確な差はなかったが、硝酸イオン濃度を０ｍＭから５ｍＭに替えると１時間で顕著に発現が高まり、その後減少して一定のレベルを維持した。０ｍＭから０．２ｍＭに替えた時は若干発現量が高まるものの、５ｍＭに替えた時と比べて劇的な変化はなかった。５ｍＭで栽培を継続したとき、あるいは５ｍＭから無窒素状態にしたときは発現量に大きな変化はなかった。一方、ｎｒｔ１．２は０時間では無窒素状態で発現量が顕著に低く、硝酸イオンを投与した場合、１〜２時間で発現が誘導されたが、０．２ｍＭと５ｍＭとの間での差異は認められなかった。また、５ｍＭから無窒素状態に替えた場合、１時間で発現量は顕著に減少し、その後低いレベルで推移した。
【００６０】
以上のことから、ｎｒｔ１．１は硝酸イオンの有無に関わらず発現していることから構成的発現をしており、また、高濃度の硝酸イオンで特に発現が誘導されることから低親和性の機能を有するものと考えられた。ｎｒｔ１．２は無窒素状態ではほとんど発現しておらず、硝酸イオンの投与により増大することから硝酸イオン誘導性であることが示唆された。
【００６１】
このような実施例により、即ち、ニコチアナ　タバカム　ｃｖ．バーレー２１を様々な条件で栽培した後、各器官から継時的に総ＲＮＡを抽出し、本発明の遺伝子特異的配列をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ｍＲＮＡの発現量を定量的に調べることにより、本発明の遺伝子の発現様式を確認できた。
【００６２】
実施例５．低親和性硝酸輸送遺伝子の発現量と硝酸イオン含量との関係
（１）形質転換培養細胞の作出
過剰発現用のコンストラクト（ｐ３５Ｓ−ｎｒｔ１．１Ｂ）は、ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）のＧＵＳ遺伝子を除去した部分に、ＰＣＲ増幅したｎｒｔ１．１Ｂの構造遺伝子の両端をブラント化、リン酸化した後に挿入して構築した。これによりｎｒｔ１．１Ｂはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーターの下流に結合された。ｐ３５Ｓ−ｎｒｔ１．１Ｂはエレクトロポーレーション法によりＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４株に導入し、これをタバコＢＹ２培養細胞に感染させることにより遺伝子を導入した。コントロールとしてベクターｐＢＩ１２１も同様に培養細胞に導入した。カナマイシン２００ｐｐｍを含む培地で形質転換体を選抜し多数の遺伝子導入株を得た。導入した遺伝子が発現している培養細胞系統を選抜するために，得られた全てのカルスから総ＲＮＡを抽出し、実施例２（３）と同様に定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、内在性ｎｒｔ１．１Ｂの発現量に比べ、全ｎｒｔ１．１の発現量が増大した培養細胞系統が得られ（図４）、これらのうち６系統（Ｓ１−５、Ｓ１−８、Ｓ１−１８、Ｓ３−５、Ｓ３−７およびＳ３−１０）を懸濁培養化した。図４中、白丸は野生株（ｗｔ）を、白三角はｐＢＩ１２１で形質転換した培養細胞である。
【００６３】
（２）タバコ培養細胞の維持と細胞内硝酸イオン含量の測定
形質転換タバコＢＹ２培養細胞は懸濁培養化し、５０ｍｌの改変ＭＳ培地（０．２ｇ／ｍｌ　リン酸二水素カリウム，１μｇ／ｍｌ　ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ，０．２μｇ／ｍｌ　２，４−Ｄ，３％　ｓｕｃｒｏｓｅ，５０μｇ／ｍｌ　カナマイシン，ｐＨ５．８）で２５℃、１２０ｒｐｍで回転培養し、７日ごとに１ｍｌの飽和培養細胞液を継代した。硝酸含量測定に用いる培養細胞は、カナマイシンを含まない上記培地に継代培養を２〜３回繰り返したものを新たな液体培地に継代し、５〜７日経過したものを用いた。培養細胞を集め、硝酸イオンを含まない緩衝液（５ｍＭ　ＭＥＳ，３ｍＭ　ＣａＣｌ２，１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４，３％　ｓｕｃｒｏｓｅ，ｐＨ６．０）で３〜４回洗浄し、最後に０．４５μｍの遠心濾過チューブ（ＵＦＣ４０ＨＶ２５，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いてさらに遠心洗浄した。集めた培養細胞から総ＲＮＡを抽出し、さらに１００ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で培養細胞を磨砕して細胞内の硝酸含量測定用試料とした。総ＲＮＡからは定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い遺伝子の発現量を、磨砕抽出液はサリチル酸−硫酸法にて硝酸含量を測定した（図５）。図５中、白丸は野生株（ｗｔ）を、白三角はｐＢＩ１２１で形質転換した培養細胞である。その結果、全ｎｒｔ１．１発現量と細胞内硝酸含量の間には高い正の相関が認められた。また、発現量の高かったＳ１−１８、Ｓ３−１０の２系統について同様の反復実験を行った（図６）。試験は３反復行った。以上の結果から、本発明のｎｒｔ１．１Ｂは硝酸輸送活性を有しているものと判断された。
【００６４】
【発明の効果】
本発明により、その機能や発現様式が明かとなったニコチアナ属由来の硝酸輸送遺伝子が提供された。
【００６５】
本発明を用い、目的とする対象の遺伝子を操作することによって、硝酸イオン吸収能を増大すること、または削減した植物を育種することが可能になる。また、低栄養な土壌でも生育可能な植物の育種を得ることが可能になる。更に、植物中の硝酸含量をコントロールして品質の向上した植物の育種が可能になる。
【００６６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】水耕栽培したニコチアナ　タバカム　ｃｖ．　バーレー２１の各器官でのｎｒｔ１．１，およびｎｒｔ１．２　ｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した結果を示すグラフ。
【図２】水耕栽培したニコチアナ　タバカム　ｃｖ．　バーレー２１の各器官でのｎｒｔ１．１Ａ、ｎｒｔ１．１Ｂ、ｎｒｔ１．２Ａおよびｎｒｔ１．２ＢのｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲで比較した結果を示す電気泳動写真。
【図３】硝酸濃度の異なった栽培条件におけるニコチアナ　タバカム　ｃｖ．　バーレー２１の根でのｎｒｔ１．１，ｎｒｔ１．２　ｍＲＮＡ発現量の変化を示したグラフ。
【図４】ｐ３５Ｓ−ｎｒｔ１．１Ｂを導入したタバコＢＹ２培養細胞の全ｎｒｔ１．１発現量と内在性ｎｒｔ１．１Ｂ発現量の関係を示したグラフ。
【図５】一次選抜した形質転換ＢＹ２培養細胞の全ｎｒｔ１．１発現量と細胞内硝酸含量の関係を示したグラフ。
【図６】外来遺伝子の高発現株Ｓ１−１８，Ｓ３−１０の全ｎｒｔ１．１発現量と細胞内硝酸含量を測定した結果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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