(57)【要約】【課題】ミトコンドリア遺伝子の変異抑制剤あるいは変異軽減剤の提供。【解決手段】インターフェロンを有効成分とする、ミトコンドリア遺伝子の変異抑制剤あるいは変異軽減剤。さらには、これら変異抑制剤あるいは変異軽減剤を用いることにより、発ガンあるいはガン再発の抑制剤または予防剤を提供できる。【選択図】　　　なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアＤＮＡの変異を評価することによる発癌リスクの高い患者の評価選別及び診断方法。
【請求項２】
ミトコンドリアＤＮＡの変異が、ウイルス性慢性炎症患者のミトコンドリアＤＮＡの変異である、請求項１記載の患者の評価選別及び診断方法。
【請求項３】
ウイルス性慢性肝炎がＣ型あるいはＢ型慢性肝炎である、請求項１又は２記載の患者の評価選別及び診断方法。
【請求項４】
ミトコンドリアＤＮＡの変異箇所がＤ−ｌｏｏｐ領域である、請求項１、２又は３記載の患者の評価選別及び診断方法。
【請求項５】
ウイルス性慢性炎症患者のミトコンドリアＤＮＡの変異を評価することにより、インターフェロン（ＩＦＮ）治療の終了時期の決定方法。
【請求項６】
ウイルス性慢性炎症が、Ｃ型あるいはＢ型慢性肝炎である、請求項５記載の決定方法。
【請求項７】
インターフェロンがインターフェロン−αあるいはβである、請求項５又は６記載の決定方法。
【請求項８】
ミトコンドリアＤＮＡの変異箇所がＤ−ｌｏｏｐ領域である、請求項５、６又は７記載の決定方法。
【請求項９】
ミトコンドリアＤＮＡの変異を指標とするインターフェロン治療の終点マーカー
【請求項１０】
インターフェロンがインターフェロン−αあるいはβである、請求項９記載の終点マーカー。
【請求項１１】
ミトコンドリアＤＮＡの変異が正常細胞と比較して少なくとも１３個以下である、請求項９又は１０記載の終点マーカー。
【請求項１２】
ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の変異が正常細胞と比較して少なくとも３個以下である、請求項９、１０又は１１記載の終点マーカー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発癌リスクの評価方法に関するものである。より詳しくは、肝炎ウイルスの感染に起因し、慢性肝炎または肝硬変を発症した患者に対し、インターフェロン（ＩＦＮ）治療をいつまで継続すればよいかの評価・診断方法に関するものである。具体的には、肝炎ウイルスに感染した患者のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列を評価し、インターフェロンαまたはインターフェロンβ投与の治療期間を評価・診断する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
肝ガンの９０％以上が肝炎ウイルス感染者からの発病であることから、発癌に肝炎ウイルスそのものが重要な役割を担っていると考えられている。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）では、染色体にＨＢＶ遺伝子が組み込まれており、ＨＢｘ遺伝子は癌化に関連すると報告されている。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）においても、コア蛋白が癌抑制遺伝子を転写レベルで抑制するという報告や、コア蛋白のトランスジェニックマウスに発癌が見られたと言う報告がある（Ｒａｙ　ＲＢ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，２７２，１０９８３（１９９７），　Ｒａｙ　ＲＢ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，３０６０（１９９８），　Ｍｏｒｉｔａ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ，　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．，４，１０６５（１９９８））。しかし、臨床的には長年の肝傷害の末に多くは肝硬変に至って発癌することから、ウイルスの直接的な発癌能のみでは肝癌発症には至らないと考えられている。その証拠として、Ｃ型慢性肝炎に対するＩＦＮの発癌抑制効果は、ＨＣＶが消失しない場合でも肝機能が安定化すればＨＣＶ消失例とほぼ同等であることがあげられる（Ｙｏｓｈｉｄｏ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ，　Ａｎｎ．　Ｉｎｔｅｒｎ．　Ｍｅｄ．，１３１，１７４（１９９９））。少なくともＣ型慢性肝炎・肝硬変からの発癌は、ＨＣＶによって生じる持続炎症が主因である。このように、肝発癌において肝炎ウイルスと慢性炎症による遺伝子への傷害や発現調節が相乗的に作用すると考えられるが、その協調作用の詳細については充分解明されていない。
【０００３】
【特許文献１】
西川　学　等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，１８４３−１８４５，２００１
【非特許文献１】
Ｓ．Ｎｏｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ，　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８，４８１−４８７，２００２
【非特許文献２】
Ｓ．Ｋｕｂｏ　ｅｔ　ａｌ，　Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１３４，９６３−９６７，２００１
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ミトコンドリアＤＮＡの変異頻度、特にＤ−ｌｏｏｐ領域に着目したミトコンドリアＤＮＡの変異頻度を用いて、発癌のリスク評価方法を提供することにある。更には、本発明の第２の目的は、ミトコンドリアＤＮＡの塩基配列の決定による発癌リスクの高い患者の選別及び診断方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
従来の癌の遺伝子異常の研究では、特に癌組織の探索に重点がおかれて来た。例えば、肝癌の発癌過程の解明を目指すには、前癌病変における検討が必要であるが、遺伝子の修復機構が働くために、肝硬変組織では核の遺伝子異常はほとんど見出せない。肝癌の長い発癌過程を把握するためには、持続炎症に密接に関連する事象が糸口になると考えられる。
そこで、本発明者らは、炎症によって傷害を受けやすく、傷害ＤＮＡの修復機構が不十分なミトコンドリア遺伝子に着目し、慢性肝炎・肝硬変・肝癌のそれぞれの肝組織について検討した。その結果、本発明者らは、ミトコンドリア遺伝子異常の集積と肝発癌との関連性について新たな知見を得て、本発明を完成した。
【０００６】
本発明の要旨は、
（１）ミトコンドリアＤＮＡの変異を評価することによる発癌リスクの高い患者の評価選別及び診断方法、
（２）ミトコンドリアＤＮＡの変異が、ウイルス性慢性炎症患者のミトコンドリアＤＮＡの変異である、上記（１）記載の患者の評価選別及び診断方法、
（３）ウイルス性慢性炎症患者がＣ型あるいはＢ型慢性肝炎ウイルスに感染した患者である、上記（１）又は（２）記載の患者の評価選別及び診断方法、
（４）ミトコンドリアＤＮＡの変異箇所がＤ−ｌｏｏｐ領域である、上記（１）、（２）又は（３）記載の患者の評価選別及び診断方法、
（５）ウイルス性慢性炎症患者のミトコンドリアＤＮＡの変異を評価することにより、インターフェロン（ＩＦＮ）治療の終了時期の決定方法、
（６）ウイルス性慢性炎症が、Ｃ型あるいはＢ型慢性肝炎である、上記（５）記載の決定方法、
（７）インターフェロンがインターフェロン−αあるいはβである、上記（５）又は（６）記載の決定方法、
（８）ミトコンドリアＤＮＡの変異箇所がＤ−ｌｏｏｐ領域である、上記（５）、（６）又は（７）記載の決定方法、
（９）ミトコンドリアＤＮＡの変異を指標とするインターフェロン治療の終点マーカー、
（１０）インターフェロンがインターフェロン−αあるいはβである、上記（９）記載の終点マーカー、
（１１）ミトコンドリアＤＮＡの変異が正常細胞と比較して少なくとも１３個以下である、上記（９）又は（１０）記載の終点マーカー、
（１２）ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の変異が正常細胞と比較して少なくとも３個以下である、上記（９）、（１０）又は（１１）記載の終点マーカー、に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の第一の態様は、ミトコンドリアＤＮＡの変異を評価することによる発癌リスクの高い患者の評価選別及び診断方法に関するものである。
【０００８】
ミトコンドリアは１細胞当たり１０００個前後存在し、さらにミトコンドリア内には数個の遺伝子が存在する。通常は健常者の個体内のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は単一の配列を有しているが、病的な状態では変異型と正常型のｍｔＤＮＡが混在する。
【０００９】
ｍｔＤＮＡは環状で１６．５キロ塩基（ｋｂ）しかなく、核の染色体ＤＮＡが約３０奥塩基対（ｂｐ）であることを思えば、全配列の解析も容易である。ｍｔＤＮＡは染色体ＤＮＡとは異なり、ヒストンなどのＤＮＡを防御する核タンパク質が存在せず、また傷害部位の修復酵素も不十分である。従って、核のＤＮＡに比べてｍｔＤＮＡは傷害されやすく、かつ傷害が修復されずに蓄積しやすい。このため、ｍｔＤＮＡの塩基配列置換速度は核ＤＮＡに比べて１０倍以上速い。
【００１０】
ミトコンドリアのタンパク質は細胞のエネルギー産生を担っていることから、ミトコンドリアＤＮＡの変異に基づく、ミトコンドリアの機能障害は細胞の全ての活性を低下させ、アポトーシスにつながる。特に、ミトコンドリアのタンパク質であるシトクロムＣはアポトーシスの機構に重要な役割を担っている。
【００１１】
一方、このミトコンドリアＤＮＡに変異をもたらすものは、炎症局所で発生する活性酸素であることが示唆されており、例えば、慢性肝障害の肝組織では、肝炎ウイルス自体の発癌作用だけでなく、持続炎症が重要な役割を演じると考えられる。即ち、炎症によって発生した活性酸素は直接遺伝子を傷害し、炎症がもたらした肝細胞壊死は細胞周期をはやめることになる。このように、炎症によって肝細胞の遺伝子異常が蓄積してくると考えられている。この様子を模式図的に表わせば、図５のようになる。これは肝炎ウイルス自体の発癌能と炎症（肝炎）による発癌促進が相乗的に働き、癌化の過程が進行する。この過程において、慢性炎症による多数の遺伝子異常の集積が遺伝子の不安定性をもたらしている。
【００１２】
このような遺伝子の不安定な状態が、最終的には肝癌の発症につながると考えられている（Ａｏｋｉ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，９３，７３００（１９９６））。
【００１３】
炎症局所では、一酸化窒素（ＮＯ）をはじめとする大量の活性酸素種が産生されている。その内の１〜５％が活性酸素に変換されると推測されており、ミトコンドリアは細胞内最大の活性酸素発生源である。そこで、本発明者らは、活性酸素種によるｍｔＤＮＡの変化を解析するため、参考例１に示す基礎実験を行い、ＮＯ供与体であるＮＯＣ１８の添加前後で、ミトコンドリア遺伝子のＤループ部分の変異が、当初４箇所であったものが新たに４箇所加わり、計８個所になった。変異が新たに生じた場所は全てＣであり、Ｃ→ＴあるいはＣ→Ｇの変異であった。
【００１４】
ＮＯは、ミトコンドリアの電子伝達系において終末のシトクロームＣオキシダーゼを可逆的に阻害することにより電子伝達系を阻害し、その結果ミトコンドリアから電子が漏出しやすくなる（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　１９９６；　５６：　４５３５−４５４０）。漏出した電子は酸素と結合してスーパーオキシドラジカルに変化し、スーパーオキシドディスムターゼの存在のもと、また、不均化反応により過酸化水素にとなる。過酸化水素は、鉄などの遷移金属の存在下にヒドロキシラジカルとなる。
ヒドロキシラジカルは、またＮＯラジカルとスーパーオキシドラジカルが直接反応しても産生される。ヒドロキシラジカルは遺伝子変異を引き起こす強いＤＮＡ傷害分子である。
【００１５】
また、臨床的にもＣ型慢性肝炎に対する除鉄療法はアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値を低下させることが知られており、これらラジカルが肝障害と関係することが示唆されている。種々の癌組織においても、ミトコンドリアの高変異が認められる報告があるが、その変異の原因が上記のようにヒドロキシラジカルが多量に発生していることであると明確に言えるものではないが、慢性肝炎の場合には癌が発生した局所ではヒドロキシラジカルが多量に発生していることが示されている（Ｐｏｌｙａｋ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．　１９９８；　２０：　２９１−２９３、　Ｂｕｒｇａｒｔ　ＬＪ．　ｅｔ　ａｌ．　Ａｍ．　Ｊ．　Ｐａｔｈｏｌ．　１９９５；　１４７：　１１０５−１１１１、Ｊｅｒｏｎｉｍｏ　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．２００１；　２０：　５１９５−５１９８、Ｙｅｈ　ＪＪ．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　２０００；　１９：　２０６０−２０６６）。さらに、慢性肝炎に由来する肝細胞癌でもミトコンドリアＤＮＡの変異頻度が高く、非癌部でも既に多数の変異が蓄積していることが報告されている（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２００１；　６１　：１８４３−１８４５）。
【００１６】
参考例１の結果、ＮＯラジカルがミトコンドリア遺伝子変異を引き起こすことが判明した。炎症局所では、炎症性細胞により大量のＮＯラジカルが産生されているため、慢性肝炎では肝組織で同様の反応が起こっていると考えられる。傷害されたミトコンドリアＤＮＡから合成される電子伝達系タンパク質は、その機能が不完全であるため、さらに電子を漏出しやすくなり、前述のような反応を経てより強くＤＮＡを傷つけることになる。以上のように、ミトコンドリア遺伝子が傷害されると、そのミトコンドリア自身が活性酸素種の発生源となってしまうため、細胞内の酸化ストレスが増強して核ＤＮＡをも傷害してしまうものと考えられる。炎症によるミトコンドリアＤＮＡ変異が発癌に直接関与するかどうかは現段階では不明であるが、細胞内酸化ストレスを増強してＤＮＡ傷害を増悪することは事実であることが判明した。
そこで、肝癌とミトコンドリアＤＮＡ変異、発癌リスクとの関係を検討した。
【００１７】
本発明者らは、健常者７名の肝組織のミトコンドリアＤＮＡの配列を解析し、プロトタイプの塩基配列に比べ３塩基の共通した変異を認めた。そこで、この塩基配列を日本人における共通の配列と考えた。次に、肝癌切除例において、癌部と非癌部をのそれぞれについてｍｔＤＮＡの全領域の塩基配列を同定した。癌部のみならず非癌部にも多数のｍｔＤＮＡ塩基変異が存在した（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２００１；　６１　：１８４３−１８４５）。これらの変異はＤループ領域に集中していたため、以降の解析はこの領域に限定して行った。
【００１８】
非癌部の塩基変異数は癌部の変異数と相関するが、図６に示されるように、一部に非癌部でも変異数の少ない症例が見られた。この変異数の少ない症例は、全て過去にＩＦＮの投与歴があり、ＨＣＶが消失しているか、残存していてもＡＬＴ値が正常化している症例であった（図７を参照）。
【００１９】
そこで本発明では、ＩＦＮ投与が肝臓ミトコンドリアのｍｔＤＮＡ塩基変異に対してどのように作用するかを解析した。実施例１に示すように、ＩＦＮ−βの投与前と投与直後に経皮的肝生検を実施したＣ型慢性肝炎２６例を対象とし、肝組織のｍｔＤＮＡの塩基配列を決定した。著効（ＣＲ）の１症例において、実施例１に示すようにｍｔＤＮＡの塩基配列を決定したところ、ｍｔＤＮＡの１６５９６塩基中、ＩＦＮ投与前の肝組織では２６箇所に変異が存在した。ＩＦＮ投与後は１４箇所に減少した。なお、本症例は、ＨＣＶが消失した著効例であるが、ＩＦＮ投与終了後もＡＬＴ異常が継続しており、飲酒継続の影響が考えられている。
【００２０】
ミトコンドリアＤＮＡ全塩基配列を検討した症例では、ＩＦＮ投与直後では、変異の数が約半数に減少していた。このことは、ＩＦＮ投与期間中に変異数の多い肝細胞が排除されたことを示している。恐らく、変異の多いミトコンドリアを持つ細胞は、ＩＦＮによるミトコンドリア遺伝子の転写抑制の圧力・負荷に耐え切れずアポトーシスを起こしたものと考えられる。
【００２１】
ＩＦＮによって肝発癌が抑制されることは周知の事実であり（Ｙｏｓｉｄａ　Ｈ．，　Ａｎｎ．　Ｉｎｔｅｒｎ．　Ｍｅｄ．　１３１，１７４（１９９９）、Ｎｉｓｈｉｇｕｔｉ　Ｓ．，　Ｌａｎｃｅｔ，３４６，１０５１（１９９５））、実施例１で示される組織学的な炎症の活動度の低下は、その後の肝癌の発症抑制に寄与していると考えられる。
【００２２】
以上の結果より、ミトコンドリアＤＮＡの変異は肝組織の炎症所見とも関連し、発癌過程にも関連していることから、発癌リスクのより定量的な評価方法になることが明らかとなった。
【００２３】
さらに、ミトコンドリア遺伝子の変異解析により、ＩＦＮや他の薬剤の発癌抑制効果を把握する指標となると共に、これら薬剤の投薬の終了時期を定める指標にもなることが示された。
【００２４】
本発明の「ミトコンドリアＤＮＡの変異」とは、慢性炎症部分、ウイルス傷害性ガン化細胞、白血病細胞あるいは悪性リンパ腫におけるミトコンドリアＤＮＡと正常組織細胞のミトコンドリアＤＮＡを比較して、遺伝子に生じている変異のことである。比較するミトコンドリアＤＮＡとしては、ＤＮＡ全体でもよくその一部でも良い。例えば、細胞からＤＮＡを抽出し、ミトコンドリアＤＮＡに対して特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲにて増幅し、ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法にてＰＣＲ産物の塩基配列を決定する。それぞれガン細胞と正常細胞の塩基配列の決定結果を比較し、遺伝子の変異の数を計算する。ミトコンドリアＤＮＡの一部の塩基配列としては、Ｄ−ｌｏｏｐ領域が好適なものとして挙げられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００２５】
例えば、Ｃ型慢性肝炎患者の場合、肝組織からＤＮＡを抽出し、ミトコンドリアＤＮＡの全配列を解析したところ、炎症部分の前癌状態の細胞と正常細胞の塩基配列の対比により、２３個の変異が確認された。インターフェロン投与直後には、塩基配列の変異は１０個に低下したことが認められた。ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列の変異は４個であり、インターフェロン投与直後には、塩基配列の変異は２個に低下した。いずれも、インターフェロン投与前後を比較すると、塩基変異の箇所は共通しており、新たな変異蓄積は認められなかった。
【００２６】
本発明の「ウイルス性慢性炎症」とは、例えばＣ型あるいはＢ型のウイルス性慢性肝炎が挙げられ、さらには肝硬変に進行したものも含むものである。また、それ以外にも、各種のウイルス性感染症に起因するような慢性炎症を挙げることができる。
【００２７】
本発明の「評価選別及び診断方法」とは、バイオプシー等の生検手段により慢性炎症組織の細胞を得て、その細胞のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列を決定し、正常細胞のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列と対比し、遺伝子の変異が高頻度で生じているミトコンドリアＤＮＡを持つ慢性炎症組織の細胞を評価・選別することである。このような慢性炎症組織を持つ患者が発癌リスクの高い患者であると診断される。
図２に記載のＣ型ウイルス肝炎患者の例から示されるように、ミトコンドリアＤＮＡの変異は、正常細胞と対比して２１個の変異が生じていた。また、ＩＦＮの投与により、Ｃ型肝炎ウイルスが消失し１０個の変異に減少した。また、３年後には、１３個の変異となっていたが、発癌等の様子は見られていない。このことから正常細胞と比較し、多くとも１３個の変異が生じているだけであれば、発癌の可能性は少ないと判断される。従って、正常細胞と比較して１４個以上の変異を持つミトコンドリアＤＮＡを有する慢性炎症患者の人は、発癌リスクがあると判断される。
【００２８】
ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列の変異を見ると、正常細胞と対比して、４個の変異が認められるが、ＩＦＮ投与後には２個の変異となり、３年後には３個の変異となっていた。このことから、ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列の変異が多くとも３個以下であれば、発癌の可能性が少ないと判断される。従って、正常細胞と比較して、少なくとも４個以上の変異を持つミトコンドリアＤＮＡＤ−ｌｏｏｐ領域を有する慢性炎症患者の人は、発癌リスクがあると判断される。
【００２９】
本発明の第二の態様としては、インターフェロン治療の終了時期を決定する方法に関するものである。
【００３０】
本発明の「決定方法」とは、バイオプシー等の手段により対象患部の細胞と患部以外の正常細胞を入手し、ミトコンドリアＤＮＡに対して特異的なプライマーを用いてＰＣＲを使用して増殖し、ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ法にてＰＣＲ産物の塩基配列を決定する。そして、両者の塩基配列を比較し、変異数の多い患者を選択する方法である。また、場合によっては、正常細胞のバイオプシーを行うことなく、一般的な標準のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列と対比することができる。
【００３１】
変異数の多い患者としては、ミトコンドリアＤＮＡの変異が正常細胞と比較して少なくとも１２個以上の変異を有するものが発癌リスクの高い細胞であると考えられる。また、ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の変異においては正常細胞と比較して少なくとも３個以上であるものが、発癌リスクの高い細胞であると考えられる。
【００３２】
本発明の「インターフェロン」とは、インターフェロン−αあるいはβのことであり、インターフェロン−αとして、例えばスミフェロンのような天然型インターフェロンα、例えばロフェロン、キャンフェロンあるいはコンセンサスインターフェロンを含む組換え型インターフェロンαを挙げることができる。インターフェロン−βとして、天然型インターフェロンβ、組換え型インターフェロンβを挙げることができる。好ましいものとしてはインターフェロン−αを挙げることができる。
【００３３】
さらに本発明のインターフェロンにはインターフェロン−αあるいはβに関する各種のインターフェロン製剤が含まれ、例えば、ペグ化インターフェロン製剤やミニペレットあるいはナノスフェアー等による持続性あるいは徐放性インターフェロン製剤や埋め込み型のインプラント製剤、経口製剤経肺製剤も含まれる。
【００３４】
本発明のインターフェロンの投与方法は、皮下注、筋注、静脈注、局部注、経口投与、経肺投与等の何れでも良く、各インターフェロン製剤の特性と疾患あるいは患者の状況に応じて使い分けることができる。
【００３５】
本発明のインターフェロンの投与量は、一般のインターフェロンα製剤やインターフェロンβ製剤のごとく、１〜９ＭＵの投与で良いが、副作用及びミトコンドリアＤＮＡの変異率に応じて、適宜増減することができる。
【００３６】
本発明の第三の態様としては、インターフェロン治療の終了時期を決定する終点マーカーに関するものである。
本発明の「終点マーカー」とは、ミトコンドリアＤＮＡの全配列においては、非癌部分の正常細胞と対比して、塩基配列の変異数が、多くとも１３個の変異以下になる場合に終点とすることを言う。また、ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列の変異数が、インターフェロン投与直後に多くとも３個以下の変異を持つものになる場合を終点とする。そのようなマーカーになるミトコンドリアＤＮＡ、さらにはＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列を言うものである。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００３８】
実施例１
インターフェロン‐β投与前後におけるミトコンドリアＤＮＡ変異の変化
Ｃ型慢性肝炎患者２６例に対してインターフェロン治療を行うと共に、投与前後に経皮的肝生検を実施した。常法に従い、肝組織よりＤＮＡを抽出し、ミトコンドリアＤＮＡに対する特異的なプライマー（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，１８４３−１８４５，２００１）を用いてＰＣＲにて増幅し、ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ法にてＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。
【００３９】
インターフェロン治療で著効を示した１症例に関して、投与前と治療直後、３年後におけるミトコンドリアＤＮＡの全配列を決定した。その他の２５症例については投与前と治療直後でのミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列を解析した。
【００４０】
インターフェロンの治療結果とミトコンドリアＤＮＡの変異数の変化は図１に示される。即ち、インターフェロンの投与により、肝組織における炎症の活動度（ＨＡＩ　ｓｃｏｒｅのｇｒａｄｉｎｇ）が低下する（図１の縦軸参照）と共に、ミトコンドリアの変異数が減少していた（図１の横軸参照）。このようにインターフェロン投与により、ミトコンドリアの塩基変異数が減少することが見出された。また、それと共にこの変異数の減少が肝組織の炎症の活動度の低下と相関することが示された。
【００４１】
ＣＲの１例について、ミトコンドリアＤＮＡの全配列を解析したところ、図２に示されるようにインターフェロン投与の前では、ミトコンドリアに２６箇所存在した変異がインターフェロン治療後には１４箇所に減少した。
【００４２】
３年後に解析したところ、変異数が若干増加していた。本症例においてはＨＣＶが消失した著効例であるが、インターフェロン治療終了後も、３合以上の飲酒の継続による、ＡＴＬ異常が継続している症例であるためと考えられる。
【００４３】
慢性肝炎等のように、炎症の継続によりミトコンドリアＤＮＡに塩基変異が蓄積すると推測されている。本実施例の知見により、インターフェロンの投与により塩基変異数が減少すると共に組織学的な炎症の活動度の低下と相関することが判明した。そして、インターフェロンの投与により比較的短期間に変化することが明らかとなった。
【００４４】
参考例１
ＮＯによるミトコンドリアＤＮＡ変異の蓄積
発癌過程とミトコンドリアＤＮＡの変異の関与は非常に興味深く、炎症局所ではＮＯラジカルをはじめとする大量の活性酸素種が産生されている。ミトコンドリアＤＮＡは、核ＤＮＡと異なりヒストンをもたず修復機構も不完全であるため、この様な場では傷害を受けやすいと考えられる。そこで、活性酸素種によるミトコンドリアＤＮＡの変化を解析するため、培養細胞にＮＯラジカルを作用させて培養細胞のミトコンドリアＤＮＡに塩基配列が生じるかを検討した。
【００４５】
ＤＭＥＭにて肝癌細胞ＨｅｐＧ２を培養し、ＮＯラジカル供与体であるＮＯＣ１８を１ｍＭを添加し、７２時間培養を行い、培養後細胞を回収した。ＮＯラジカル供与体前後での細胞からＤＮＡを抽出し、実施例１と同様にして、ミトコンドリアのＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列を決定した。
【００４６】
その結果、図３に示されるように、ＮＯ１８の投与前には４箇所であったミトコンドリアＤＮＡの変異に対して、新たな変異が４箇所加わり、計８箇所の変異となった。また、図４で示されるように、変異個所は全てシトシン（Ｃ）であり、Ｃ→ＴあるいはＣ→Ｇの変異であった。
【００４７】
本参考例に示されるように、ＮＯラジカルがミトコンドリア遺伝子変異を引き起こすことが判明した。炎症局所では、炎症性細胞により大量のＮＯラジカルが産生されているため、慢性肝炎では肝組織で同様の反応が起こっていると考えられる。傷害されたミトコンドリアＤＮＡから合成される電子伝達系タンパク質は、その機能が不完全であるため、さらに電子を漏出しやすくなり、前述のような反応を経てより強くＤＮＡを傷つけることになる。以上のように、ミトコンドリア遺伝子が傷害されると、そのミトコンドリア自身が活性酸素種の発生源となってしまうため、細胞内の酸化ストレスが増強して核ＤＮＡをも傷害してしまうものと考えられる。炎症によるミトコンドリアＤＮＡの変異により、細胞内酸化ストレスを増強してＤＮＡ傷害をさらに増悪することが判明した。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、ミトコンドリアＤＮＡの変異を評価することにより発癌リスクをより定量的に評価できる方法が提供される。
さらに、本発明のミトコンドリア遺伝子の変異解析により、ＩＦＮや他の薬剤の発癌抑制効果を把握する指標と共に、これら薬剤の投薬の終了時期を定める指標も提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】インターフェロン投与前後の組織学的活動性の変化とミトコンドリアＤＮＡの変異数（Ｄ−ｌｏｏｐ領域）の変化の関係。
【図２】インターフェロン投与によるミトコンドリアＤＮＡ変異の変化。
【図３】ＮＯＣ１８添加培養によるＨｅｐＧ２のミトコンドリアＤＮＡの変異の蓄積。
【図４】一酸化窒素によるミトコンドリアＤＮＡ塩基の変化。
【図５】肝細胞癌における発癌機序。
【図６】癌部と非癌部のｍｔＤＮＡ（Ｄループ領域）の塩基変異数。
【図７】ＩＦＮの投与既往歴と非癌部のｍｔＤＮＡ塩基変異数。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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