(57)【要約】【課題】気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法、および気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法、並びに気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療のための薬剤の提供を課題とする。【解決手段】ＩＬ−１３によって杯細胞への分化を誘導した気道上皮細胞と無刺激の気道上皮細胞の間で発現レベルに差が見られる遺伝子を見出した。気道上皮細胞は、Ａｉｒ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ法にしたがって培養した。そしてこれらの遺伝子が、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査や治療薬のスクリーニングにおいて指標として有用であることを明らかにした。すなわち本発明は、こうして見出された指標遺伝子の発現レベルの比較に基づく、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法、および該疾患の治療のための化合物のスクリーニング方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程（１）〜（３）を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法であって、指標遺伝子が次のａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である方法。
（１）被検者から採取された生体試料における指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
（２）工程（１）で測定された発現レベルを、健常者から採取された生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程、および
（３）工程（２）の比較の結果、指標遺伝子がａ）に記載された遺伝子の場合には対照と比較して発現レベルが高い場合に、また指標遺伝子がｂ）に記載された遺伝子の場合には対照と比較して発現レベルが低い場合に、前記被検者は気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患を有すると判定する工程
ａ）　配列番号：２５〜配列番号：３１０のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子、またはいずれかに記載の塩基配列を含む遺伝子からなる、気道上皮細胞をインターロイキン１３によって刺激したときに発現レベルが高まる遺伝子群
ｂ）　配列番号：３１１〜配列番号：５４７のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子、またはいずれかに記載の塩基配列を含む遺伝子からなる、気道上皮細胞をインターロイキン１３によって刺激したときに発現レベルが低下する遺伝子群
【請求項２】
生体試料が気道上皮細胞である、請求項１記載の検査方法。
【請求項３】
遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する請求項１に記載の検査方法。
【請求項４】
遺伝子の発現レベルを、指標遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する請求項１に記載の検査方法。
【請求項５】
指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患検査用試薬であって、指標遺伝子が請求項１におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患検査用試薬。
【請求項６】
指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患検査用試薬であって、指標遺伝子が請求項１におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患検査用試薬。
【請求項７】
次の工程を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が請求項１におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程、
（２）前記遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
【請求項８】
細胞が気道上皮細胞または杯細胞である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
気道上皮細胞の粘膜側の培養液を除去し、漿膜側から培養液を供給する条件下で培養する工程を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が請求項１におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるキット。
【請求項１１】
指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が請求項１におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるキット。
【請求項１２】
更に、漿膜側から培養液を供給する条件下で気道上皮細胞を培養するための細胞支持媒体を含む、請求項１０または請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
更に、気道上皮細胞を含む請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の気道組織における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなる気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患モデル動物であって、指標遺伝子が請求項１におけるａ）、並びに以下のＡ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるモデル動物。
Ａ）配列番号：９５４〜配列番号：１１７４のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子、またはいずれかに記載の塩基配列を含む遺伝子からなる、卵白アルブミン抗原暴露気道過敏性モデルマウス肺において発現レベルが高まる遺伝子群
【請求項１５】
非ヒト脊椎動物がマウスである請求項１４に記載のモデル動物。
【請求項１６】
指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の気道組織における発現強度を低下させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなる気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患モデル動物であって、指標遺伝子が請求項１におけるｂ）、並びに以下のＢ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるモデル動物。
Ｂ）配列番号：１３７６〜配列番号：１５１５のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子、またはいずれかに記載の塩基配列を含む遺伝子からなる、卵白アルブミン抗原暴露気道過敏性モデルマウス肺において発現レベルが低下する遺伝子群
【請求項１７】
非ヒト脊椎動物がマウスである請求項１６に記載のモデル動物。
【請求項１８】
次のｉ）−ｉｖ）のいずれかに記載の成分をマウスに投与する工程を含む、気管支喘息モデル動物の製造方法。
ｉ）請求項１４におけるＡ）に記載の遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子を構成する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
ｉｉ）請求項１４におけるＡ）に記載の遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子を構成する塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質
ｉｉｉ）請求項１６におけるＢ）に記載の遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子を構成する塩基配列を含むポリヌクレオチドのアンチセンス核酸、リボザイム、またはＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド、および
ｉｖ）請求項１６におけるＢ）に記載の遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子を構成する塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質に結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片
【請求項１９】
請求項１８におけるｉ）−ｉｖ）のいずれかに記載の成分を有効成分として含む、マウスに気管支喘息を誘導するための誘導剤。
【請求項２０】
次の工程を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が請求項１におけるａ）、ｂ）、並びに請求項１４におけるＡ）、および請求項１６におけるＢ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）前記被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群またはＡ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群またはＢ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
【請求項２１】
次の工程を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が請求項１におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程、
【請求項２２】
次の工程を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が請求項１におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群の指標遺伝子については前記活性を低下させる化合物を、またｂ）群の指標遺伝子については前記活性を上昇させる化合物を選択する工程
【請求項２３】
請求項７、請求項２０、請求項２１、および請求項２２のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬。
【請求項２４】
指標遺伝子、またはその一部のアンチセンス核酸、リボザイム、またはＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを有効成分として含む気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬であって、指標遺伝子が請求項１におけるａ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である治療薬。
【請求項２５】
指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を有効成分として含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬であって、指標遺伝子が請求項１におけるａ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である治療薬。
【請求項２６】
指標遺伝子、または指標遺伝子によってコードされる蛋白質を有効成分として含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬であって、指標遺伝子が請求項１におけるｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である治療薬。
【請求項２７】
指標遺伝子を測定するためのプローブを固定した気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の診断用ＤＮＡチップであって、指標遺伝子が請求項１に記載されたａ）群およびｂ）群から選択された少なくとも１種類の遺伝子であるＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ　ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＤＰＤ）の検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、喘息患者数は世界で一億人以上にものぼり、日本においても気管支喘息患者の急増が社会問題化してきている。先進国では１０年間に２０〜５０％も患者数が増加しており、２１世紀において大きな問題になる疾患の一つが喘息であると言われている。
【０００３】
現在、使用されている喘息治療薬または喘息治療の候補薬としては、吸入及び経口ステロイド；メディエーター遊離抑制剤、ヒスタミンＨ１拮抗薬等の抗アレルギー薬；気管支拡張剤として働くβ２刺激薬；免疫抑制剤等を挙げることができる。ニュージーランドにおける症例では、吸入ステロイド、β２刺激薬の普及により、患者致死率が１０年前と比べると３０％減少したことが知られている。ただし、吸入ステロイド及びβ２刺激薬は副作用があることも知られている。吸入ステロイドの副作用としては、例えば、口腔内及び食道カンジダ症、嗅覚異常、副腎抑制、骨粗鬆症、白内障、緑内障、皮膚の被薄化、小児における成長障害等を挙げることができる。また、β２刺激薬の副作用としては、虚血性疾患、甲状腺機能亢進症、糖尿病等が例示され、さらに常用により有用性が乏しくなることも知れられている。
【０００４】
気管支喘息は気道の炎症と種々の程度の気道狭窄による気流制限により特徴付けられ、発作性の咳、呼吸困難等の症状を示すことが知られている。気管支喘息における気流制限の程度は、比較的軽度のものから致死的な高度のものまで様々である。そして、気管支喘息の病態形成には、気道粘膜や気管支平滑筋におけるアレルギー反応の密接な関与が指摘されている。
すなわち、気管支喘息の患者の多くに、ＩｇＥ抗体の産生亢進を伴うアトピー素因が見られる。多様な原因により気管支喘息の発症に到ると考えられているが、アトピー素因が多くの患者における過敏症の原因となっていることは疑いを入れない。喘息発作の気道閉塞の機序には、気管支平滑筋の収縮、あるいは気道粘膜の浮腫や気道内分泌亢進が関与していることが予測されている。このような気道の変化には、病因アレルゲンへの曝露による気道でのＩ型アレルギー反応が重要な役割を果たしている。
【０００５】
気管支喘息の患者ではＴｈ２型ヘルパーＴ細胞の機能が亢進しており、また、Ｔｈ２型のサイトカインであるインターロイキン３（以下ＩＬ−３と記載する、同様に以下インターロイキンをＩＬと記載する）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ；ＧＭ−ＣＳＦ）等、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ等のケモカインの産生が増加している。ＩＬ−４及びＩＬ−１３はＩｇＥ産生誘導作用を示し、ＩＬ−３及びＩＬ−４は肥満細胞増殖誘導作用を有する。また、ＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦにより分化増殖された好酸球は、エオタキシン及びＲＡＮＴＥＳの作用により気道へと浸潤する（文献１／Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｓｔｈｍａ．　Ｐｒｏｃ．　２０：　１４１
（１９９９））。
【０００６】
気道へと浸潤した好酸球は、細胞内顆粒蛋白質である活性化された主要塩基性蛋白質（ＭＢＰ）、好酸球陽イオン蛋白質（ＥＣＰ）等を脱顆粒により放出する（文献２／Ｃｏｍｐｒ．　Ｔｈｅｒ．　２０：　６５１　（１９９４））。これらの顆粒蛋白質は細胞障害作用を示し、上皮細胞を剥離、損傷する。上皮細胞の剥離により知覚神経末端が露出され、上皮の透過性が亢進され、さらに、上皮由来平滑筋弛緩因子の喪失が起こる。また、好酸球は、気管支平滑筋の緊張を亢進する作用を有するロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）、及び血小板活性化因子（ＰＡＦ）を分泌することが知られている。これらの反応が生体内において繰り返され、慢性化することにより気管支壁が肥厚し、気道過敏症を起こすと考えられている。
【０００７】
特に、ＩＬ−４及びＩＬ−１３がアレルギー反応に深く関与していることが、幾つかの報告により示唆されている。例えば、ＩＬ−４をノックアウトしたマウスでは気道過敏性が消失することが知られている（文献３／Ｙｓｓｅｌ　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｇｒｏｕｘ　Ｈ．，　Ｉｎｔ．　Ａｒｃｈ．　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１２１：　１０−８　（２０００））。モデルマウスにおいては、ＩＬ−１３がＩｇＥ産生やＴｈ２型に関係なく喘息様病態の形成に関与していることが示されている（文献４／Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２２：　２２５８−６１　（１９９８）；　文献５／Ｇｒｕｎｉｇ　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：　２２６１−３　（１９９８）；　文献６／Ｚｈｕ　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　１０３：　７７９−８８　（１９９９））。また、ヒト気道上皮細胞、気管支平滑筋でＩＬ−４受容体及びＩＬ−１３受容体が高発現している　（文献７／Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　９：　５４９−５９　（２０００））ことから、これらの組織はＩＬ−４及びＩＬ−１３の標的細胞であると考えられる。一方、ＩＬ−４受容体α及びＩＬ−１３に存在するＳＮＰが、アレルギー疾患の遺伝的要因の一つであることが示されている（文献８／ＭｉｔｓｕｙａｓｕＨ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　１９：　１１９−２０　（１９９８）；　文献９／Ｍｉｔｓｕｙａｓｕ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１６２：　１２２７−３１　（１９９９）；　文献１０／Ｋｒｕｓｅ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　９６：３６５−７１　（１９９９）；　文献１１／Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　９：　５４９−５９　（２０００））。
【０００８】
さらに、気管上皮細胞においてＩＬ−４およびＩＬ−１３は、アミロイド感受性ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）のβ及びγサブユニットの発現を抑制し、嚢胞性線維症トランスメンブレン伝達調節因子（ｃｙｓｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ；　ＣＦＴＲ）の発現を上昇させると報告されている。その結果、Ｎａ＋の流出が抑制され、Ｃｌ−分泌が上昇し、最終的に気管支腔内の水分分泌物が増加するとされている（文献１２／Ｇａｌｉｅｔｔａ　Ｌ．Ｊ．Ｖ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１６８：　８３９−４５　（２００２））。ＩＬ−４やＩＬ−１３のシグナル伝達分子をターゲットとした治療薬では、ＩＬ−４アゴニスト、可溶性ＩＬ−４受容体α（文献１３／Ｂｏｒｉｓｈ　Ｌ．　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍ．　Ｊ．　Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．　Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ．　１６０：　９１２−２２　（１９９９））、可溶性ＩＬ−１３受容体α２、抗ＩＬ−１３抗体、抗ＩＬ−４抗体等、既に臨床応用が試みられているものもあり、気管支喘息の効果的な治療薬として期待されている。
【０００９】
気道における炎症に伴って、サイトカインや接着分子の発現が上昇することは知られている。これらのサイトカインや接着分子をコードする遺伝子は、気管支喘息等のアレルギー疾患の発症に関与する創薬ターゲットとなる可能性がある。すなわち、これらの遺伝子の発現の変動を検出することにより患者における病態発症、重症度、治療への反応性等を診断したり、遺伝子の発現を調節または蛋白質活性を調節する物質を治療に用いることが考えられる。
喘息の際の窒息死の原因となる喀痰を取り除く去痰剤は、既に複数種販売されているが、最近までは、活性ＳＨ基を含んだものや、粘液を溶解あるいは潤滑しやすくするもののみであった。しかし、昨年１２月になって初めて発売されたエスエス製薬および三菱ウェルファーマにより共同開発された「フドステイン」（低分子経口剤）は、杯細胞の過形成抑制作用を示す医薬品である。
また、（株）武田薬品から報告されているＧｏｂ−５のヒトカウンターパートｈＣＬＣＡ１遺伝子（文献１４／Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９８：　５１７５−８０　（２００１））は、米国Ｇｅｎａｅｒａ社が喘息患者の粘膜上皮におけるＩＬ−９産生と粘液産生に深く関与していると報告（文献１５／Ｊ．　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１０９：　２４６−５０　（２００２））した。そしてこの遺伝子の機能を阻害する低分子経口剤「ＬＯＭＵＣＩＮ」は、既に臨床試験が開始されている。
【００１０】
ところで、喘息患者の気管支においては、病態悪化に伴い気道上皮細胞の杯細胞（ｇｏｂｌｅｔ　ｃｅｌｌ）への分化・増殖が起こる。杯細胞はムチンという巨大糖蛋白質を産生し、それが喀痰となり呼吸困難を招くため、慢性気管支喘息の代表的な死因の一つとなっている。分泌細胞である杯細胞の増加は、気道内分泌物の増加をきたし、気道の閉塞を促進し、喘息の重症化に大きく関与している。しかし、気道上皮の杯細胞分化機構については明らかになっていない。
【００１１】
一方慢性閉塞性肺疾患は、肺気しゅ、慢性気管支炎のことを指し、肺気しゅは息切れ、慢性気管支炎は咳と痰で、高齢者の呼吸器疾患の自覚症状で最も多いものである。また、加齢以外に慢性閉塞性肺疾患の発症にはタバコの喫煙が深く関わっている。肺気しゅは、細気管支の先の肺胞の隔壁が壊れ、大きく膨らみ弾力性や収縮性が低下し、呼気時に肺が縮まりにくくなり、息切れをおこしやすくなる。さらに、気管支障害によって粘膜の腫れや痰などによる気管支の閉塞が起こる。慢性気管支炎は、気管支の慢性の炎症や浮腫が生じ、気管支上皮細胞が杯細胞に分化することにより、分泌物が過剰となり、痰を伴った咳が出る。慢性閉塞性肺疾患で細くなった気管支やダメージを受けた肺は元に戻らない。また、日本での患者は約２２万人で、アメリカでは約１４００万人で、両国ともに死亡原因が第４位となっており非常に深刻な疾患である。
慢性閉塞性肺疾患とＩＬ−１３との関連で、ＩＬ−１３をマウス気道上皮細胞に発現させたトランスジェニックマウスでは、肺気しゅ、炎症、杯細胞の過形成が生じたという報告がある（文献１６／Ｚｈｅｎｇ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｊ　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．；　１０６，　１０８１−１０９３，　２０００）。
【００１２】
【文献１】Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｓｔｈｍａ．　Ｐｒｏｃ．　２０：　１４１　（１９９９）
【文献２】Ｃｏｍｐｒ．　Ｔｈｅｒ．　２０：　６５１　（１９９４）
【文献３】Ｙｓｓｅｌ　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｇｒｏｕｘ　Ｈ．，　Ｉｎｔ．　Ａｒｃｈ．　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１２１：　１０−８　（２０００）
【文献４】Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２２：　２２５８−６１　（１９９８）
【文献５】Ｇｒｕｎｉｇ　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：　２２６１−３　（１９９８）
【文献６】Ｚｈｕ　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　１０３：　７７９−８８　（１９９９）
【文献７】Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　９：　５４９−５９　（２０００）
【文献８】Ｍｉｔｓｕｙａｓｕ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　１９：　１１９−２０　（１９９８）
【文献９】Ｍｉｔｓｕｙａｓｕ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１６２：　１２２７−３１　（１９９９）
【文献１０】Ｋｒｕｓｅ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　９６：　３６５−７１　（１９９９）
【文献１１】Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　９：　５４９−５９　（２０００）
【文献１２】Ｇａｌｉｅｔｔａ　Ｌ．Ｊ．Ｖ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１６８：　８３９−４５　（２００２）
【文献１３】Ｂｏｒｉｓｈ　Ｌ．　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍ．　Ｊ．　Ｒｅｓｐｉｒ．　Ｃｒｉｔ．　Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ．　１６０：　９１２−２２　（１９９９）
【文献１４】Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９８：　５１７５−８０　（２００１）
【文献１５】Ｊ．　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１０９：　２４６−５０　（２００２）
【文献１６】Ｚｈｅｎｇ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｊ　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．；　１０６，　１０８１−１０９３，　２０００
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患における気道上皮細胞の変化は、病態を構成する重要な要素である。気道上皮細胞の病的な変化の一つが杯細胞への分化である。本発明は、杯細胞への分化に関連する遺伝子の特定を課題としている。また本発明は、気管支喘息の診断指標や、治療のための創薬ターゲットの提供を課題とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
気道上皮組織における杯細胞への分化を抑制する薬剤の開発は近年になり漸く進められてきたものであり、創薬開発においては新しい切り口である。杯細胞への分化メカニズムの解明により、気管支喘息の根本的な治療を実現できる可能性がある。さらに、杯細胞の分化過程に作用する薬剤は、喘息以外にも、粘液の過剰産生と炎症が係わっている慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、慢性副鼻腔炎、気管支拡張症、び慢性汎細気管支炎等の治療においても有用と予測される。
【００１５】
ヒト気道上皮細胞にＩＬ−１３を作用させることにより杯細胞に分化する培養方法（ａｉｒ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（ＡＩ）法）が本発明の共同研究者である東北大・医・老年呼吸器科により確立された気道上皮細胞の培養方法である。本発明では該方法を利用して、ＩＬ−１３刺激により気道上皮細胞において発現レベルが変化する遺伝子を明らかにすることにより、杯細胞への分化に関連する遺伝子を見出すことができると考えた。
【００１６】
気管上皮細胞は動物およびヒトにおいて水や電解質輸送の研究や、特にヒトでは嚢胞性繊維症の気道感染の病態解明や治療法の究明に重要な役割を担っていた。プロテアーゼ処理によって、ここ２０年の間に培養液の改善や成長支持物質の導入、および粘膜側の培養液を取り除いて、漿膜側から水分や栄養を供給する方法として線毛や分泌顆粒が発現するａｉｒ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ法が確立された（Ｖａｎ　Ｓｃｏｔｔ　ＭＲ．，　Ｅｘｐ　Ｌｕｎｇ　Ｒｅｓ，　１１：　７５−９４，　１９８６，　Ｗｉｄｄｉｃｏｍｂｅ　ＪＨ．，　Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　２５８：Ｌ１３−Ｌ１８，　１９９０，　Ｋｉｍ　ＫＣ，　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，　２６０：　４０２１−４０２７，　１９８５，　Ａｄｌｅｒ　ＫＢ，　Ａｍ　Ｊ　Ｒｅｓｐｉｒ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　２：１４５−１５４，　１９９０）。
【００１７】
ヒト気管支上皮細胞を用いて、ヒトＩＬ−１３存在下でａｉｒ−ｌｉｑｕｉｄ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ法にて培養すると、ＴＧＦ−αが誘導されることが報告された（Ｂｏｏｔｈ　ＢＷ，　Ａｄｌｅｒ　ＫＢ，　Ｂｏｎｎｅｒ　ＪＣ，　Ｔｏｕｒｎｉｅｒ　Ｆ，　Ｍａｒｔｉｎ　ＬＤ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ａｉｒｗａｙ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉａ　ａ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ．　Ａｍ　Ｊ　Ｒｅｓｐｉｒ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．　２００１　Ｄｅｃ；２５（６）：７３９−７４３．）。さらに、ヒト気管支上皮細胞をａｉｒ−ｌｉｑｕｉｄ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ法で培養し、そこにＩＬ−１３を添加することによって、細胞におけるイオン輸送能を検討した論文も報告されている（Ｄａｎａｈａｙ　Ｈ，　Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｌｕｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　２８２：Ｌ２２６−Ｌ２３６，　２００２）。しかしこれら報告では、杯細胞分化には触れておらず、網羅的な遺伝子解析を行ったものではない。
【００１８】
またモルモットの気管支上皮細胞を用いて、ヒトＩＬ−１３存在下で１４日間　ａｉｒ−ｌｉｑｕｉｄ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ法にて培養したところ、杯細胞に分化することが報告された（Ｋｏｎｄｏ，　Ｍ．，　Ｔａｍａｏｋｉ，　Ｊ．，　Ｔａｋｅｙａｍａ，　Ｋ．，　Ｎａｋａｔａ，　Ｊ．　ａｎｄ　Ｎａｇａｉ，　Ａ．　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｇｏｂｌｅｔ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｒｏｍ　Ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ｔｒａｃｈｅａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．　Ａｍ　Ｊ　Ｒｅｓｐｉｒ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２７，５３６−５４１，　２００２）。しかし、ヒトの気管支上皮細胞を同方法で培養し、網羅的な遺伝子発現解析を行った例はない。
【００１９】
一方本出願人は、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３によってヒト気道上皮細胞を刺激し，複数ロットの細胞において発現が大きく低下する８種の遺伝子をアレルギー関連遺伝子として取得した（特開２００２−１９１３９８）。更に同様の条件で、複数ロットの細胞において発現が大きく上昇する６種の遺伝子をアレルギー関連遺伝子として取得した（ＷＯ　０２／０５２００６　Ａ１）。これらの遺伝子発現解析では、杯細胞への分化が起こらない培養法が利用された。
【００２０】
本発明者らは、ＩＬ−１３で杯細胞への分化を誘導した気道上皮細胞で発現している遺伝子について、ジーンチップを用いて発現プロファイルを比較した。分化にともなって２倍以上または１／２以下の発現変動のあった遺伝子を選別し、遺伝子の発現レベルを測定した。そして、以下のａ）またはｂ）に記載の群から選択された指標遺伝子の発現が変動していることを確認した。
【００２１】
更にこうして選択されたヒト遺伝子に対するマウスホモログについて、気道過敏性モデルマウスにおける発現レベルの変動を確認した。その結果、マウスホモログの発現レベルの変動パターンが、ヒト遺伝子の変動パターンと良く一致することを明らかにした。
【００２２】
ａ）またはｂ）に記載した各指標遺伝子の塩基配列は既知である。各指標遺伝子によってコードされる蛋白質の機能は、後に記載する表３−表１９（上昇分）、および表２０−表３６（低下分）のＲｅｆｅｒｅｎｃｅの項に示した論文に記載されている。更に本発明における指標遺伝子のマウスホモログの塩基配列も公知である。各指標遺伝子のマウスホモログによってコードされる蛋白質の機能は、後に記載する表４０−表６２（上昇分）、および表６３−表８３（低下分）のＲｅｆｅｒｅｎｃｅの項に示した論文に記載されている。
【００２３】
これらの遺伝子群の中には気管支喘息との直接的な関連性について報告されている遺伝子もあるが、多くの遺伝子についてはアレルギー性疾患との関連を示す報告はない。また、気管支喘息との関連性が報告されている遺伝子についても、同じタイミングで共発現変動する他の遺伝子との組み合わせという観点では報告はない。
【００２４】
気道上皮細胞の杯細胞への分化の過程において、指標遺伝子の発現レベルに変動が観察されたという事実は、本発明の指標遺伝子と気管支喘息症状との深い結びつきを表している。また本発明の指標遺伝子の、気道上皮のアレルギー性の応答との関連性は、気道過敏性モデルマウスにおけるマウスホモログの発現レベルの変動パターンがヒトと一致することによっても裏付けられた。以上の知見に基づいて、本発明者らは、各指標遺伝子の発現レベル、あるいは各指標遺伝子によってコードされる蛋白質の活性を指標とすることにより、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の診断、およびこれらの疾患のための治療薬をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
【００２５】
すなわち本発明は、以下の気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法、並びに気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。
〔１〕次の工程（１）〜（３）を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法であって、指標遺伝子が次のａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である方法。
（１）被検者から採取された生体試料における指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
（２）工程（１）で測定された発現レベルを、健常者から採取された生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程、および
（３）工程（２）の比較の結果、指標遺伝子がａ）に記載された遺伝子の場合には対照と比較して発現レベルが高い場合に、また指標遺伝子がｂ）に記載された遺伝子の場合には対照と比較して発現レベルが低い場合に、前記被検者は気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患を有すると判定する工程
ａ）　配列番号：２５〜配列番号：３１０のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子、またはいずれかに記載の塩基配列を含む遺伝子からなる、気道上皮細胞をインターロイキン１３によって刺激したときに発現レベルが高まる遺伝子群
ｂ）　配列番号：３１１〜配列番号：５４７のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子、またはいずれかに記載の塩基配列を含む遺伝子からなる、気道上皮細胞をインターロイキン１３によって刺激したときに発現レベルが低下する遺伝子群
〔２〕生体試料が気道上皮細胞である、〔１〕記載の検査方法。
〔３〕遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔４〕遺伝子の発現レベルを、指標遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔５〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患検査用試薬であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患検査用試薬。
〔６〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患検査用試薬であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患検査用試薬。
〔７〕次の工程を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程、
（２）前記遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
〔８〕細胞が気道上皮細胞または杯細胞である〔７〕に記載の方法。
〔９〕気道上皮細胞の粘膜側の培養液を除去し、漿膜側から培養液を供給する条件下で培養する工程を含む〔８〕に記載の方法。
〔１０〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるキット。
〔１１〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるキット。
〔１２〕更に、漿膜側から培養液を供給する条件下で気道上皮細胞を培養するための細胞支持媒体を含む、〔１０〕または〔１１〕に記載のキット。
〔１３〕更に、気道上皮細胞を含む〔１２〕に記載のキット。
〔１４〕指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の気道組織における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなる気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患モデル動物であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）、並びに以下のＡ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるモデル動物。Ａ）配列番号：９５４〜配列番号：１１７４のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子、またはいずれかに記載の塩基配列を含む遺伝子からなる、卵白アルブミン抗原暴露気道過敏性モデルマウス肺において発現レベルが高まる遺伝子群
〔１５〕非ヒト脊椎動物がマウスである〔１４〕に記載のモデル動物。
〔１６〕指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の気道組織における発現強度を低下させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなる気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患モデル動物であって、指標遺伝子が〔１〕におけるｂ）、並びに以下のＢ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子であるモデル動物。Ｂ）配列番号：１３７６〜配列番号：１５１５のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子、またはいずれかに記載の塩基配列を含む遺伝子からなる、卵白アルブミン抗原暴露気道過敏性モデルマウス肺において発現レベルが低下する遺伝子群
〔１７〕非ヒト脊椎動物がマウスである〔１６〕に記載のモデル動物。
〔１８〕次のｉ）−ｉｖ）のいずれかに記載の成分をマウスに投与する工程を含む、気管支喘息モデル動物の製造方法。
ｉ）〔１４〕におけるＡ）に記載の遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子を構成する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
ｉｉ）〔１４〕におけるＡ）に記載の遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子を構成する塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質
ｉｉｉ）〔１６〕におけるＢ）に記載の遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子を構成する塩基配列を含むポリヌクレオチドのアンチセンス核酸、リボザイム、またはＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド、および
ｉｖ）〔１６〕におけるＢ）に記載の遺伝子群から選択されたいずれかの遺伝子を構成する塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質に結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片
〔１９〕〔１８〕におけるｉ）−ｉｖ）のいずれかに記載の成分を有効成分として含む、マウスに気管支喘息を誘導するための誘導剤。
〔２０〕次の工程を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）、ｂ）、並びに〔１４〕におけるＡ）、および〔１６〕におけるＢ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）前記被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群またはＡ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群またはＢ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
〔２１〕次の工程を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程、
〔２２〕次の工程を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群の指標遺伝子については前記活性を低下させる化合物を、またｂ）群の指標遺伝子については前記活性を上昇させる化合物を選択する工程
〔２３〕〔７〕、〔２０〕、〔２１〕、および〔２２〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬。
〔２４〕指標遺伝子、またはその一部のアンチセンス核酸、リボザイム、またはＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを有効成分として含む気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である治療薬。
〔２５〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を有効成分として含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬であって、指標遺伝子が〔１〕におけるａ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である治療薬。
〔２６〕指標遺伝子、または指標遺伝子によってコードされる蛋白質を有効成分として含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬であって、指標遺伝子が〔１〕におけるｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子である治療薬。
〔２７〕指標遺伝子を測定するためのプローブを固定した気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の診断用ＤＮＡチップであって、指標遺伝子が〔１〕に記載されたａ）群およびｂ）群から選択された少なくとも１種類の遺伝子であるＤＮＡチップ。
【００２６】
あるいは本発明は、〔７〕、〔２０〕、〔２１〕および〔２２〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を投与する工程を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療方法に関する。また本発明は、〔７〕、〔２０〕、〔２１〕および〔２２〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物の、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。
【００２７】
加えて本発明は、次の成分（ｉ）または（ｉｉ）を投与する工程を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療方法に関する。あるいは本発明は、次の成分（ｉ）または（ｉｉ）の、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。
（ｉ）上記ａ）に記載の遺伝子、またはその一部のアンチセンス核酸、リボザイム、またはＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド、
（ｉｉ）上記ａ）に記載の遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体
【００２８】
更に本発明は、次の成分（ｉｉｉ）または（ｉｖ）を投与する工程を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療方法に関する。あるいは本発明は、次の成分（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。
（ｉｉｉ）上記ｂ）に記載の遺伝子、
（ｉｖ）上記ｂ）に記載の遺伝子によってコードされる蛋白質
【００２９】
【発明の実施の形態】
本発明において、アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅ）とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
【００３０】
代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘息、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｄｉａｔｈｅｓｉｓ）とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。
気管支喘息は、気道の炎症と種々の程度の気流制限により特徴付けられ、発作性の咳、喘鳴、および呼吸困難を示す。気流制限は軽度のものから致死的な高度のものまで存在し、自然に、または治療により少なくとも部分的には可逆的である。気道炎症には好酸球、Ｔ細胞（Ｔｈ２）、マスト細胞など多くの浸潤細胞が関与し、気道粘膜上皮の損傷がみられる。長期罹患成人患者では気流制限の可逆性の低下がみられる傾向があり、しばしば気道上皮下基底膜肥厚などのリモデリングを示す。反応性のある患者では気道のリモデリングは気道過敏性を伴う。
【００３１】
本発明において、気管支喘息の指標とすることができる遺伝子を、指標遺伝子という。また指標遺伝子がコードするアミノ酸配列からなる蛋白質を指標蛋白質という。指標遺伝子は特に断らない限り、ａ）またはｂ）に記載された遺伝子から選択されたいずれか１つまたは複数の任意の遺伝子を示す用語として用いられる。本発明における指標遺伝子の塩基配列、またはその一部は公知である。本発明における指標遺伝子の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が明らかにされているものもある。指標遺伝子の部分塩基配列データを得るためのＧｅｎＢａｎｋ登録番号を、指標遺伝子の名前とともに後にまとめた。また指標蛋白質のアミノ酸配列は、表８４−表１１３の配列番号に示した。
【００３２】
指標遺伝子の一部の塩基配列が明らかであれば、当業者はこれらの部分塩基配列情報に基づいて、指標遺伝子の全長塩基配列を明らかにすることができる。全長塩基配列は、たとえばｉｎ　ｓｉｌｉｃｏクローニングによって取得することができる。すなわち、公共データベースに集積されている膨大なＥＳＴ情報を対象として、指標遺伝子の一部を構成するＥＳＴの塩基配列（クエリー配列）を照合する。照合の結果に基づいて、クエリー配列と一定の長さに渡って塩基配列が一致する他のＥＳＴ情報を取得する。得られたほかのＥＳＴ情報を新たなクエリー配列として、更に他のＥＳＴ情報の取得を繰り返す。この操作の繰り返しによって、部分的な塩基配列を共有する複数のＥＳＴのセットを得ることができる。ＥＳＴのセットはクラスターと呼ばれる。クラスターを構成するＥＳＴの塩基配列を重ね合わせて一つの塩基配列に統合することにより、目的とする遺伝子の塩基配列を明らかにすることができる。
【００３３】
更に当業者は、ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏクローニングによって決定された塩基配列に基づいて、ＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを使ったＲＴ−ＰＣＲによって、設計どおりの長さを有する遺伝子断片が増幅されることを確認すれば、決定された塩基配列からなる遺伝子が実際に存在することを裏付けることができる。
【００３４】
あるいは、ノーザンブロッティングによって、ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏクローニングの結果を評価することもできる。決定された塩基配列情報に基づいてデザインされたプローブを使ってノーザンブロッティングを行う。その結果、上記塩基配列情報と一致するバンドが検出できれば、決定された塩基配列を有する遺伝子の存在を確認することができる。
【００３５】
ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏクローニングの他、実験的に目的とする遺伝子を単離することもできる。まず、ＥＳＴとして登録されている塩基配列情報を与えたｃＤＮＡクローンを入手し、そのクローンが有するｃＤＮＡの塩基配列の全てを決定する。その結果、ｃＤＮＡの全長配列を明らかにできる可能性がある。少なくとも、より長い塩基配列を明らかにすることができる。当該クローンが有するｃＤＮＡの長さは、ベクターの構造が明らかであれば予め実験的に確認することもできる。
【００３６】
またＥＳＴの塩基配列情報を与えたクローンが手元に無くとも、部分塩基配列に基づいて、当該遺伝子の塩基配列が未知の部分を取得する方法は公知である。たとえば、ＥＳＴをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、より長い塩基配列を明らかにできる場合がある。ｃＤＮＡライブラリーとして、全長ｃＤＮＡを多く含むライブラリーを用いれば、容易に全長ｃＤＮＡクローンを単離することができる。たとえば、オリゴキャップ法の原理に基づいて合成されたｃＤＮＡライブラリーは、全長ｃＤＮＡを多く含むとされている。
【００３７】
更に、部分的な塩基配列情報に基づいて、遺伝子の塩基配列が未知の領域を合成するための手法が公知である。たとえばＲＡＣＥ法は、未知塩基配列を含む遺伝子の単離のための代表的な手法である。ＲＡＣＥ法においては、ｃＤＮＡの末端に人為的にオリゴヌクレオチドリンカーが連結される。このオリゴヌクレオチドリンカーの塩基配列は予めわかっている。したがって、ＥＳＴとして既に塩基配列が明らかな領域と、オリゴヌクレオチドリンカーの塩基配列情報に基づいて、ＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。こうしてデザインされたプライマーを使ったＰＣＲによって、塩基配列が未知の領域が特異的に合成される。
【００３８】
本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、被検者の生体試料における各指標遺伝子の発現レベルを測定し、対照となる生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程を含む。指標遺伝子が上記ａ）に記載された遺伝子であれば、対照と比較して発現レベルが高い場合に被検者が気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患と判定される。また指標遺伝子が上記ｂ）に記載された遺伝子であれば、対照と比較して発現レベルが低い場合に被検者が気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患と判定される。本発明においては、ＩＬ−１３の刺激を与えていない気道上皮細胞を対照とすることができる。対照とする気道上皮細胞は、ＡＩ法によって培養されたものであることが望ましい。
【００３９】
対照との発現レベルの比較のために、予め対照における指標遺伝子の発現レベルを測定して、対照における標準値を決定することができる。通常、たとえば対照における前記指標遺伝子の発現レベルに基づいて、標準値が設定される。この標準値をもとに、たとえば±２Ｓ．Ｄ．の範囲が許容範囲とされる。指標遺伝子の測定値に基づいて、標準値や許容範囲を設定する手法は公知である。標準値を設定した後には、被検者から採取された生体試料の発現レベルのみを測定し、予め決定された対照の標準値との比較に基づいて、本発明の検査方法を実施することもできる。
【００４０】
指標遺伝子が上記ａ）に記載された遺伝子である場合には、対照と比較して被検者の発現レベルが許容範囲よりも高ければ、被検者は気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患であると判定される。同様に、指標遺伝子が上記ｂ）に記載された遺伝子である場合には、対照と比較して被検者の発現レベルが許容範囲よりも低ければ、被検者は気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患であると判定される。指標遺伝子の発現レベルが許容範囲内であれば、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患である可能性は低いと予想される。
【００４１】
本発明において、指標遺伝子の発現レベルとは、該指標遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。従って本発明による気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法は、指標遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現強度、あるいは該指標遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
【００４２】
本発明における気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査における指標遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝子解析方法にしたがって実施することができる。具体的には、例えばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発明の指標遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
【００４３】
本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマーは、指標遺伝子の塩基配列に基づいてデザインすることができる。指標遺伝子の塩基配列、および該指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の一部は公知である。本発明の各指標遺伝子の公知の塩基配列のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号は、下記の表３−表１９（上昇分）、および表２０−表３６（低下分）に記載したとおりである。表中、ＲｅｆＳｅｑの欄にＮＭで始まる番号を有する遺伝子は、その全長塩基配列が公知である。ＲｅｆＳｅｑの欄にＮＭで始まる番号を持たないものは、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．に基づいてその断片塩基配列を得ることができる。既知の部分塩基配列情報に基づいて、遺伝子の全長塩基配列を取得することが可能であることは既に述べた。また本発明の指標遺伝子の一部については、その塩基配列と塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を表中の配列番号に示した。
【００４４】
なお一般に高等動物の遺伝子は、高い頻度で多型を伴う。また、スプライシングの過程で相互に異なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子も多く存在する。多型やアイソフォームによって塩基配列が異なる遺伝子であっても、指標遺伝子と同様の活性を持ち、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患に関与する遺伝子は、いずれも本発明の指標遺伝子に含まれる。
【００４５】
また、本発明において、指標遺伝子は、ヒトのみならず、他種におけるホモログも含む。従って、ヒト以外の種における指標遺伝子とは、特に断らないときには、その種に固有の指標遺伝子のホモログ、あるいはその個体に導入されている外来性の指標遺伝子を言う。
【００４６】
本発明においてヒト指標遺伝子のホモログとは、ヒト指標遺伝子をプローブとしてストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、ヒト以外の種に由来する遺伝子を言う。ストリンジェントな条件とは、一般的には以下のような条件を示すことができる。すなわち、４×ＳＳＣ、６５℃でハイブリダイゼーションさせ、０．１×ＳＳＣを用いて６５℃で１時間洗浄する。ストリンジェンシーを大きく左右するハイブリダイゼーションや洗浄の温度条件は、融解温度（Ｔｍ）に応じて調整することができる。Ｔｍはハイブリダイズする塩基対に占める構成塩基の割合、ハイブリダイゼーション溶液組成（塩濃度、ホルムアミドやドデシル硫酸ナトリウム濃度）によって変動する。従って、当業者であればこれらの条件を考慮して同等のストリンジェンシーを与える条件を実験または経験的に設定することができる。
【００４７】
本発明の指標遺伝子の他種におけるホモログとして、マウスホモログを示すことができる。本発明者らは、Ａ）あるいはＢ）に記載したマウス遺伝子が、気道過敏性モデルマウスにおいてヒト指標遺伝子と同様の変動パターンを示すことを確認した。このことは、本発明において同定されたヒト指標遺伝子と、気道組織のアレルギー性の応答との密接な関連性を裏付けている。またこの結果は、本発明の指標遺伝子として、多種におけるホモログを用いうることの裏付けでもある。
【００４８】
プライマーあるいはプローブには、指標遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
【００４９】
このようなポリヌクレオチドは、指標遺伝子を検出するためのプローブとして、また指標遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することができる。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、指標遺伝子（またはその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
【００５０】
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Ｂｅｒｇｅｒ　ＳＬ，　Ｋｉｍｍｅｌ　ＡＲ．　（１９８７）　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｈａｍｅｓ　ＢＤ，　Ｈｉｇｇｉｎｓ　ＳＪ　（１９８５）　Ｇｅｎｅｓ　Ｐｒｏｂｅｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ．　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ，　Ｆｒｉｔｓｃｈ　ＥＦ，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．　（１９８９）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　Ｅｄｎ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）・ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（Ｍｅｌｔｏｎ　ＤＡ，　Ｋｒｉｅｇ，ＰＡ，　ＲｅｂａｇｋｉａｔｉＭＲ，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ，　Ｚｉｎｎ　Ｋ，　Ｇｒｅｅｎ　ＭＲ．　（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，　１２，７０３５−７０５６）
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Ｋｒｉｃｋａ　ＬＪ．　（１９９２）　Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）
【００５１】
ハイブリダイゼーション技術を利用した気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の指標遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
【００５２】
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、蛍光色素とその蛍光を吸収するクエンチャーで標識したプローブを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応が進んでＴａｑポリメラーゼの　５’−３’エキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性により同プローブが分解されると蛍光色素とクエンチャーが離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Ｈｏｌｌａｎｄ，　Ｐ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　１９９１，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８８：７２７６−７２８０；　Ｌｉｖａｋ，　Ｋ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５，　ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　４（６）：３５７−３６２；　Ｈｅｉｄ，　Ｃ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：９８６−９９４；　Ｇｉｂｓｏｎ，　Ｅ．　Ｍ．　Ｕ．ｅｔ　ａｌ．，　１９９６，　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：９９５−１００１）。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いることができる。
【００５３】
また本発明の気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法は、指標遺伝子によりコードされる蛋白質を検出することにより行うこともできる。このような検査方法としては、例えば、各指標蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。
【００５４】
この検出に用いる指標蛋白質に結合する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ，　ｅｔ　ａｌ．，１９８３，　Ｎａｔｕｒｅ　３０５（５９３４）：　５３７−４０）であることができる。例えば、指標蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
【００５５】
指標蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
【００５６】
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えば指標遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
【００５７】
更に本発明においては、指標遺伝子の発現レベルのみならず、生体試料における指標蛋白質の活性を指標として、アレルギー性疾患の検査を行うこともできる。指標蛋白質の活性とは、該蛋白質が備える生物学的な活性を言う。以下に各蛋白質の有する活性を測定するための一般的な方法を記載する。
【００５８】
［プロテアーゼ］
プロテアーゼサンプルをゼラチンなどの基質を共重合させたＳＤＳポリアクリルアミドゲルで非還元条件下に電気泳動を行い、泳動後に至適緩衝液中で３７℃、１６時間静置する。１６時間後にクマシーブリリアントブルーＲ２５０でゲルを染色し、プロテアーゼの泳動位置が染色されないこと、すなわちゼラチンが分解されていることでプロテアーゼ活性を評価できる。
Ｃｈｅｎ，　Ｊ．　Ｍ．ら　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６６，　５１１３−５１２１（１９９１）
【００５９】
［プロテアーゼインヒビター］
プロテアーゼインヒビターをゼラチンなどのプロテアーゼ基質を共重合させたＳＤＳポリアクリルアミドゲルで非還元条件下に電気泳動を行い、泳動後にプロテアーゼを添加した至適緩衝液中で３７℃、１６時間静置する。１６時間後にクマシーブリリアントブルーＲ２５０でゲルを染色し、プロテアーゼインヒビターの泳動位置が染色されていること、すなわちゼラチンが分解されていないことでプロテアーゼインヒビター活性を評価できる。
Ｇｒｅｅｎｅ　Ｊら　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７１，　３０３７５−３０３８０（１９９６）
【００６０】
［転写因子］
転写因子を３２Ｐなどで標識した転写因子の標的配列を含む２本鎖オリゴＤＮＡと共に室温でインキュベートして結合させる。インキュベート後のサンプルはＳＤＳを含まない未変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、標識したオリゴＤＮＡの移動度を３２Ｐの放射活性などを指標にして評価する。転写因子にオリゴＤＮＡに対する結合活性があれば、標識したオリゴＤＮＡの移動度が遅くなり、高分子量側にシフトする。標的配列に対する結合特異性は、過剰量の標識をしていない２本鎖オリゴＤＮＡにより転写因子と標識オリゴＤＮＡの結合が阻害されることにより確認できる。
また、転写因子による転写活性化能は、その標的配列の下流にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーター遺伝子を連結した発現ベクターと転写因子遺伝子をヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の応答遺伝子プロモーターなどの下流に連結した発現ベクターをＨｅｌａやＨＥＫ２９３などの細胞株に共遺伝子導入し、４８時間後に細胞破砕液を調製してＣＡＴの発現量を調べることにより評価できる。
Ｚｈａｏ　Ｆら　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６，　４０７５５−４０７６０　（２００１）
【００６１】
［キナーゼ］
キナーゼをｍｙｅｌｉｎ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎを基質として含む緩衝液（２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　ｐＨ７．５，　１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　２　ｍＭ　ＭｎＣｌ２，　２　ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，　ａｎｄ　２５　μＭ　ＡＴＰ）に添加し、更に［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを添加して３７℃で１０分保温する。１０分後にＬａｅｍｍｌｉ緩衝液で反応を止め、反応液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、泳動後にゲルを乾燥させてリン酸化されたｍｙｅｌｉｎ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎの放射活性をＸ線フィルムにて検出する。
Ｐａｒｋ　ＳＹら　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５，　１９７６８−１９７７７　（２０００）
【００６２】
［フォスファターゼ］
フォスファターゼをｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　（ｐＮＰＰ）を基質として含む緩衝液（２５　ｍＭ　ＭＥＳ，　ｐＨ　５．５，　１．６　ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，　１０　ｍＭ　ｐＮＰＰ）に添加し、３７℃で３０分間保温する。３０分後に１Ｎ　ＮａＯＨを添加して反応を停止し、ｐＮＰＰの加水分解の結果生じた４０５ｎｍの吸光度を測定する。
Ａｏｙａｍａ　Ｋら　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６，　２７５７５−２７５８３　（２００１）
【００６３】
［ケモカイン、ケモカインレセプター］
ケモカインレセプターを強制発現させた細胞を、カルシウム感受性蛍光色素ｆｕｒａ−２を含むＨａｎｋ’ｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎに懸濁し、ケモカインにより刺激を加える。ケモカイン刺激により引き起こされる細胞内カルシウム濃度の上昇をＬＳ５０Ｂ　（　ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）　などの蛍光検出器で測定する。
Ｚｈｏｕ　Ｎら　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６，　４２８２６−４２８３３　（２００１）
【００６４】
［サイトカイン、サイトカインレセプター］
サイトカインでサイトカインレセプターを発現する細胞を刺激し、これにより引き起こされる細胞増殖をチミジンの取り込みで評価する。
または、サイトカイン刺激によるサイトカインレセプター下流に位置する転写因子の活性化をルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子の発現により評価することもできる。
Ｐｉｅｋ　Ｅら　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６，　１９９４５−１９９５３　（２００１）
【００６５】
［イオンチャンネル］
先端の開口径が数μｍ２のガラスピペットの先端にイオンチャンネルを含む形質膜を貼り付け、ピペット内外に電位差を与えてその時にチャンネルを通る電流を測定するパッチクランプ法により評価できる。
Ｈａｍｉｌｌ，　Ｏ．　Ｐ．ら　Ｐｆｌｕｅｇｅｒｓ　Ａｒｃｈ．　３９１，　８５−１００　（１９８１）
【００６６】
［細胞接着因子］
細胞表面に接着分子を発現させた細胞をそのリガンドをコートしたプレート上でインキュベートし、接着した細胞数を評価する。
Ｆｕｊｉｗａｒａ　Ｈら　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６，　１７５５０−１７５５８　（２００１）
【００６７】
［細胞外マトリックス蛋白質］
細胞外マトリックス蛋白質をコートしたプレートにインテグリンなどの細胞外マトリックス蛋白質に対する受容体を持つ細胞の懸濁液を加え、３７℃で１時間培養する。培養後に細胞を固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２などのＤＮＡ結合性蛍光色素を加えて反応させる。反応後にフルオロメーターを使用して蛍光強度を測定し、蛍光強度として定量化された接着細胞数を細胞外マトリックス蛋白質の活性として評価する。
Ｍｉｙａｚａｋｉ　Ｋら　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　９０，　１１７６７　（１９９３）
【００６８】
本発明の検査方法においては、通常、被検者から採取された生体試料を試料とする。生体試料としては、血液試料が望ましい。血液試料とは、全血、あるいは全血から得られた血漿や血清を用いることができる。また本発明における生体試料としては、血液のほか、喀痰、鼻粘膜分泌物、気管支肺胞洗浄液、肺擦か細胞などを用いることもできる。これらの生体試料の採取方法は公知である。
【００６９】
生体試料が気道上皮細胞等の細胞である場合には、ライセートを調製すれば、前記蛋白質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。あるいはこのライセートからｍＲＮＡを抽出すれば、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡの測定のための試料とすることができる。生体試料のライセートやｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。あるいは、血液、鼻粘膜分泌物、並びに気管支肺胞洗浄液のような液状の生体試料においては、必要に応じて緩衝液等で希釈して蛋白質や遺伝子の測定のための試料とすることができる。
【００７０】
上記の生体試料からライセートを調製すれば、指標蛋白質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。あるいはこのライセートからｍＲＮＡを抽出すれば、指標遺伝子に対応するｍＲＮＡの測定のための試料とすることができる。生体試料のライセートまたはｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。また指標蛋白質が血中に分泌されていれば、被検者の血液や血清などの体液試料に含まれる目的とする蛋白質の量を測定することによって、それをコードする遺伝子の発現レベルの比較が可能である。上記試料は、必要に応じて緩衝液等で希釈して本発明の方法に使用することができる。
【００７１】
ｍＲＮＡを測定する場合には、本発明における指標遺伝子の発現レベルの測定値は、公知の方法によって補正することができる。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を比較することができる。測定値の補正は、上記生体試料における各細胞において、発現レベルが大きく変動しない遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明において指標遺伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行われる。発現レベルが大きく変動しない遺伝子の例としては、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ等を挙げることができる。
【００７２】
更に本発明は、本発明の検査方法のための試薬を提供する。すなわち本発明は、指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査用試薬に関する。あるいは本発明は、指標蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査用試薬に関する。
【００７３】
本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な標識を結合することができる。あるいは本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な支持体に固定化しておくこともできる。また本発明の試薬は、前記オリゴヌクレオチドまたは前記抗体の他に、検査や保存に必要な付加的な要素と組み合せて検査用キットとすることもできる。キットを構成することができる付加的な要素を、以下に示す。これらの要素は、必要に応じて予め混合しておくこともできる。また、必要に応じて、保存剤や防腐剤を各要素に加えることができる。
試薬や生体試料を希釈するための緩衝液
陽性対照
陰性対照
標識を測定するための基質
反応容器
アッセイプロトコルを記載した指示書
【００７４】
本発明における指標遺伝子は、ＩＬ−１３で刺激した気道上皮細胞において、無刺激の気道上皮細胞と比較して、発現量の変動が確認された。従って、指標遺伝子の発現レベルを指標として、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査を行うことができる。
【００７５】
本発明における気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査とは、たとえば以下のような検査が含まれる。気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患が疑われる症状を示しながら、一般的な検査では気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患と判定できない患者であっても、本発明に基づく検査を行えば気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の患者であるか否かを容易に判定することができる。より具体的には、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患が疑われる症状を示す患者において、指標遺伝子がａ）に記載された遺伝子である場合、指標遺伝子の発現の上昇は、その症状の原因が気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患である可能性が高いことを示している。また、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患が疑われる症状を示す患者において、指標遺伝子がｂ）に記載された遺伝子である場合、指標遺伝子の発現の低下は、その症状の原因が同じく気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患である可能性が高いことを示している。
【００７６】
あるいは、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査が可能となる。つまり、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患に対する治療効果の判定に有用である。また、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患と診断された患者において、指標遺伝子がａ）に記載された遺伝子である場合、指標遺伝子の発現の上昇は、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患がさらに進行している可能性が高いことを示している。また、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患と診断された患者において、指標遺伝子がｂ）に記載された遺伝子である場合、指標遺伝子の発現の低下は、同じく気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患がさらに進行している可能性が高いことを示している。
【００７７】
更に、発現レベルの違いに基づいて気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の重症度を判定することもできる。すなわち、指標遺伝子がａ）に記載された遺伝子である場合、指標遺伝子の発現の上昇の程度は、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の重症度に相関する。あるいは指標遺伝子がｂ）に記載された遺伝子である場合、指標遺伝子の発現の低下の程度が、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の重症度に相関する。
【００７８】
また本発明は、ａ）に記載の指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の、気道上皮における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト動物からなる気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患モデル動物に関する。
本発明によって、ａ）に記載の指標遺伝子の発現強度が、ＩＬ−１３の刺激によって気道上皮細胞において上昇することが明らかとなった。したがって、気道上皮細胞において、ａ）に記載の指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患のモデル動物として利用することができる。
【００７９】
また本発明は、ｂ）に記載の指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の、気道上皮細胞における発現強度を低下させたトランスジェニック非ヒト動物からなる気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患モデル動物に関する。
本発明によって、ｂ）に記載の指標遺伝子の発現強度が、ＩＬ−１３の刺激によって気道上皮細胞において低下することが明らかとなった。したがって、気道上皮細胞において、ｂ）に記載の指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に低下させた動物は、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患のモデル動物として利用することができる。
【００８０】
本発明において機能的に同等な遺伝子とは、指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、被験動物が本来備えている、その動物種における指標遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。
【００８１】
たとえば前記Ａ）群およびＢ）群に記載の遺伝子は、マウスにおける機能的に同等な遺伝子である。Ａ）群またはＢ）群に記載された遺伝子は、本発明に基づくスクリーニングをマウスを用いて実施するときに望ましい指標遺伝子である。
【００８２】
更に本発明は、ａ）またはｂ）に記載の指標遺伝子のマウスにおけるカウンターパートを明らかにした。ａ）またはｂ）に記載の指標遺伝子に対するマウスカウンターパートは、それぞれＡ）−Ｂ）として記載した。これらのカウンターパートは、気管支喘息モデルマウスと正常マウスの気道上皮細胞における遺伝子の発現レベルを比較したときに、２倍以上の差が見られた遺伝子である。したがって、これらのカウンターパートの発現レベルの調節や、投与によって、気管支喘息モデル動物を作り出すことができる。すなわち本発明は、Ａ）−Ｂ）に記載の遺伝子群の発現レベルの調節による、気管支喘息モデル動物の製造方法に関する。あるいは本発明は、Ａ）−Ｂ）に記載の遺伝子群によってコードされるタンパク質そのもの、または該タンパク質の抗体の投与による、気管支喘息モデル動物の製造方法に関する。
【００８３】
まず、Ａ）に記載された遺伝子群は、ａ）に記載の遺伝子群と同様に、発現レベルの上昇によって気管支喘息を誘導することができる。あるいはこれらの遺伝子群から選択された遺伝子や、その遺伝子がコードするタンパク質の投与によって、気管支喘息モデル動物を作り出すことができる。これらのカウンターパートはいずれもマウスの遺伝子であることから、遺伝子やタンパク質を投与する場合には、マウスに投与するのが望ましい。
【００８４】
また、Ｂ）に記載された遺伝子群は、ｂ）に記載の遺伝子群と同様に、発現レベルの抑制によって、気管支喘息を誘導することができる。あるいはこれらの遺伝子群から選択された遺伝子の発現や、その遺伝子がコードするタンパク質の活性を抑制することによって、気管支喘息を作り出すことができる。発現の抑制には、アンチセンス核酸、リボザイム、あるいはＲＮＡｉを利用することができる。タンパク質の活性の調節には、抗体などの活性阻害物質の投与が有効である。すなわち、Ｂ）に記載の遺伝子群を先天的に有する動物、すなわちマウスに、これらの成分を投与することによって気管支喘息が誘導される。
【００８５】
該気管支喘息モデル動物または慢性閉塞性肺疾患モデル動物は、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患における生体内の変化を明らかにするために有用である。更に、気管支喘息モデル動物または慢性閉塞性肺疾患モデル動物を使用することにより、指標遺伝子のさらなる機能を解明すること、および該遺伝子を標的とする薬剤を評価することには大きな意義がある。
【００８６】
また本発明による気管支喘息モデル動物または慢性閉塞性肺疾患モデル動物は、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験に有用である。たとえば本発明による気管支喘息モデル動物や慢性閉塞性肺疾患モデル動物が喘息症状や慢性閉塞性肺疾患症状を示したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。
【００８７】
本発明において、発現レベルの上昇とは、指標遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、あるいは被験動物が本来備えている指標遺伝子の転写と蛋白質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。
【００８８】
本発明において、発現レベルの低下とは、被験動物が備える指標遺伝子の転写と蛋白質への翻訳が阻害されている状態、あるいは翻訳産物である蛋白質の分解が促進された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベルは、たとえば実施例に示すようなＤＮＡチップにおけるシグナル強度の差により確認することができる。また翻訳産物である蛋白質の活性は、正常な状態と比較することにより確認することができる。
【００８９】
代表的なトランスジェニック動物は、指標遺伝子を導入し強制発現させた動物、または指標遺伝子をノックアウトした動物、他の遺伝子と置換（ノックイン）した動物等を示すことができる。また、指標遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイムやＲＮＡｉ効果をもたらすポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ、あるいはデコイ核酸として機能するＤＮＡ等を導入したトランスジェニック動物も、本発明におけるトランスジェニック動物として用いることができる。その他、たとえば指標遺伝子のコード領域に変異を導入し、その活性を増強あるいは抑制したり、あるいは分解されにくいあるいは分解されやすいアミノ酸配列に改変した動物などを示すことができる。アミノ酸配列の変異として、置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、本発明の指標遺伝子の発現そのものを調節することもできる。
【００９０】
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｍ．　Ｌａｖｉｔｒａｎｏｅｔ　らＣｅｌｌ，　５７，　７１７，　１９８９）。
【００９１】
発現ベクターに使用するプロモーターとして、適当な薬剤等の物質により転写が調節されるプロモーターを用いれば、該物質の投与によってトランスジェニック動物における外来性の指標遺伝子の発現レベルを調整することができる。
【００９２】
本発明の気管支喘息のモデル動物または慢性閉塞性肺疾患モデル動物として用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作成することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
【００９３】
さらに本発明は、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明において、指標遺伝子はａ）またはｂ）に記載の群から選択された遺伝子である。ａ）に記載の群から選択された遺伝子は、ＩＬ−１３によって刺激した気道上皮細胞において無刺激の気道上皮細胞と比較して有意に発現レベルが上昇している。ｂ）に記載の群から選択された遺伝子は、ＩＬ−１３によって刺激した気道上皮細胞において無刺激の気道上皮細胞と比較して有意に発現レベルが低下している。
したがって、ａ）群の指標遺伝子については、前記指標遺伝子の発現レベルを低下させることができる化合物を選択することによって、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬を得ることができる。一方ｂ）群の指標遺伝子については、前記指標遺伝子の発現レベルを上昇させることができる化合物を選択することによって、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬を得ることができる。
【００９４】
本発明において遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、およおび蛋白質の活性発現のいずれかのステップに対して促進的に作用する作用を持つ化合物である。また本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、これらのステップのいずれかに対して阻害的な作用を持つ化合物である。
【００９５】
本発明のアレルギー性疾患治療候補化合物のスクリーニング方法は、ｉｎ　ｖｉｖｏで行うこともｉｎ　ｖｉｔｒｏで行うこともできる。このスクリーニングは、例えば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）被験動物に、候補化合物を投与する工程、
（２）前記被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
【００９６】
本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子としては、上記ａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子と機能的に同等な遺伝子を利用することができる。本発明において機能的に同等な遺伝子とは、指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、被験動物が本来備えている、その動物種における指標遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。
【００９７】
本発明のスクリーニング方法における被験動物としては、例えば気管支喘息モデル動物を利用することができる。気管支喘息モデル動物は公知である。たとえば気管支喘息モデルとして、卵白アルブミン（以下ＯＶＡと記載する）抗原曝露気道過敏性モデルが報告されている。Ｂａｌｂ／ｃ　マウス（雄性、７週齢）に５０　μｇのＯＶＡとアジュバントである水酸化アルミニウム１　ｍｇを腹腔内に注射し、その１０日後同様な条件でＯＶＡを感作した。さらにその１０日後から４日ごとに３回１％ＯＶＡをウルトラネブライザー　ｍｏｄｅｌ　ＵＮ７０１（アズウェル（株））で３０分吸入させた。気道過敏性の亢進は、最終抗原吸入の２４時間後にアセチルコリン（６．２５−２０００　ｍｇ／ｋｇ）による気道狭窄反応を人工呼吸器（ｍｏｄｅｌ　１３１，　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ．）にて測定した（Ｎａｇａｉ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｉｎｔ　Ａｒｃｈ　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　；１０８：　１８９−１９５，　１９９５）。このような処理によって気道過敏性を誘発することができる。
【００９８】
また慢性閉塞性肺疾患モデル動物も公知である。慢性閉塞性肺疾患モデル動物は、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、イヌ、ウマ等を用いて作成することができる。例えば、ニュージーランドホワイトラビットにエラスターゼを３回吸入させることにより、肺気しゅなどを引き起こす慢性閉塞性肺疾患モデルを誘発することができる（Ｂｒｅｎｎｅｒ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｃｈｅｓｔ，　１２１，　２０１−２０９，　２００２）。これらのモデル動物に候補化合物を投与し、本発明の指標遺伝子の発現レベルの変化を追跡することによって本発明によるスクリーニングを実施することができる。
【００９９】
モデル動物を利用したスクリーニング方法においては、一般に当該モデル動物が生来的に有している指標遺伝子の発現レベルが測定される。したがって、たとえばモデルマウスを用いたスクリーニング方法では、指標遺伝子のマウスホモログが測定される。Ａ）に示したマウス遺伝子は、ＯＶＡ抗原曝露気道過敏性モデルマウスの気道組織において発現が上昇した遺伝子である。一方、Ｂ）に記載されたマウス遺伝子は、このモデルマウスの気道組織で発現が低下した遺伝子である。これらのマウスホモログ遺伝子を、本発明のスクリーニング法方法における指標遺伝子として利用することができる。
【０１００】
当業者は、本発明の開示に基づいて、マウス以外の種におけるホモログを特定することができる。たとえばホモロジーサーチによって、ヒト指標遺伝子やマウスホモログの塩基配列、あるいはアミノ酸配列と相同性の高い多種の遺伝子（あるいは蛋白質）を見出すことができる。あるいは、指標遺伝子とのハイブリダイゼーションによって、他種におけるホモログを単離することもできる。
なお、ヒト遺伝子を導入されたモデル動物を用いるスクリーニング方法では、当該動物のホモログのみならず、ヒト遺伝子が指標遺伝子として測定される場合もある。
【０１０１】
このようにして被験動物に薬剤候補化合物を接触させ、被験動物由来の生体試料における指標遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、指標遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を評価することができる。被験動物の由来の生体試料における指標遺伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の検査方法と同様の手法によってモニターすることができる。更にこの評価の結果に基づいて、指標遺伝子がａ）群に記載の遺伝子である場合には発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を、指標遺伝子がｂ）群に記載の遺伝子である場合には発現レベルを上昇させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。
【０１０２】
より具体的には、被験動物から、気道上皮細胞試料を採取し、指標遺伝子の発現レベルを候補化合物を接触させない対照と比較することにより、本発明によるスクリーニングを実施することができる。気道上皮細胞の採取方法、および調製方法は公知である。
【０１０３】
被験動物を用いた本発明のスクリーニング方法において、被験動物はアレルゲンやＩＬ−１３による刺激を与えることができる。刺激の前、後、あるいは刺激と同時に候補化合物を投与し、指標遺伝子の発現レベルを対照と比較することにより、スクリーニングが実施される。その結果、これらの刺激に応答する指標遺伝子に与える候補化合物の影響を知ることができる。スクリーニングの結果、アレルゲンやＩＬ−１３の刺激に対する指標遺伝子の応答を調節する作用を有する化合物を得ることができる。
【０１０４】
このようなスクリーニングにより、指標遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
指標遺伝子がａ）群に記載の遺伝子である場合：
・指標遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の抑制
・指標遺伝子の転写活性の抑制
・指標遺伝子の転写産物の安定化阻害もしくは分解の促進等
指標遺伝子がｂ）群に記載の遺伝子である場合：
・指標遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の活性化、
・指標遺伝子の転写活性の促進、
・指標遺伝子の転写産物の安定化や分解の阻害等
【０１０５】
また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのスクリーニングにおいては、例えば、指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、指標遺伝子がａ）群に記載の遺伝子である場合には発現レベルを低下させる化合物を、指標遺伝子がｂ）群に記載の遺伝子である場合には発現レベルを上昇させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、例えば以下のような工程に従って実施することができる。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）前記指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群に記載の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群に記載の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
【０１０６】
本発明において、指標遺伝子を発現する細胞は、指標遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。利用できるベクター、および宿主細胞は、本発明の指標遺伝子を発現し得るものであればよい。宿主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用できるベクターを適宜選択することができる。
【０１０７】
ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅ　ｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
【０１０８】
本発明のスクリーニング方法においては、指標遺伝子を発現する細胞として、気道上皮細胞や杯細胞等の気道組織に見出される細胞を用いることができる。より具体的には、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、あるいは粘膜細胞などをスクリーニングに用いることができる。
【０１０９】
気道組織に見出される細胞として、株化した気道上皮細胞を利用することもできる。株化気道上皮細胞は、均質な細胞を大量に入手できること、培養が容易なことなどの点で、本発明のスクリーニング方法に好適である。気道上皮細胞株は、たとえば次のようにして樹立することができる。すなわち、肺、あるいは気管、粘膜よりプロテアーゼ処理等によって細胞を回収する。回収した細胞にＨｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　（ＨＢＶ）　等のウイルスを感染させ、不死化させることによって、株化できる細胞もある。また既に樹立された細胞株を本発明のスクリーニングに用いることもできる。以下に本発明に利用できる気道上皮細胞株の例を示す。（）にセルバンクＡＴＣＣのアクセション番号を示した。
2004121218.tif 000002
【０１１０】
本発明のスクリーニング方法は、前記株化気道上皮細胞に候補化合物を接触させた後、該株化気道上皮細胞における指標遺伝子の発現レベルを測定することにによって実施することができる。測定の結果、候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群に記載の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群に記載の指標遺伝子については前記遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物が選択される。
【０１１１】
本発明のスクリーニング方法において、気道上皮細胞は、公知の方法により培養することができる。好ましい気道上皮細胞の培養法として、前述のａｉｒ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（ＡＩ）法を利用することができる。本発明においてＡＩ法とは、気道上皮細胞の粘膜側が空気に接し、漿膜側に培養成分を供給する培養方法を言う。ＡＩ法における空気とは、通常の哺乳動物細胞の培養に用いられる５％　ＣＯ２を含む空気を言う。空気は、無菌ろ過の後、ＡＩ法に用いられる。
一般に、動物細胞が培養液中で一定のＣＯ２濃度条件下で培養されるのに対して、ＡＩ法では空気との接触を維持した状態で気道上皮細胞を培養する。気道上皮細胞一般的な培養方法であるｉｍｍｅｒｓｅｄ　ｆｅｅｄｉｎｇ（ＩＭＭ）法とＡＩ法の違いを図２に模式的に示した。
【０１１２】
ＡＩ法で気道上皮細胞を培養することによって、気道上皮細胞はＩＬ−１３の刺激で杯細胞へと分化する。したがって、ＡＩ法で培養した気道上皮細胞を用いることによって、杯細胞への分化の過程に作用する化合物を選択できる可能性が高まる。本発明のスクリーニング方法において、気道上皮細胞はＩＬ−１３によって処理することができる。具体的には、候補化合物を気道上皮細胞に接触させる前、または後、若しくは候補化合物と同時に気道上皮細胞をＩＬ−１３で処理することができる。
ＡＩ法で培養された気道上皮細胞はＩＬ−１３の刺激によって杯細胞に分化する。したがって、ＩＬ−１３の刺激を与えた気道上皮細胞に対する候補化合物の作用を指標とすることにより、候補化合物が、杯細胞への分化過程における指標遺伝子の発現レベルに与える影響を検出することができる。
【０１１３】
ＡＩ法に基づく気道上皮細胞の培養方法は公知である。たとえば次に示す論文の開示に基づいて、気道上皮細胞をＡＩ法に基づいて培養することができる。
山谷　陸雄；呼吸　１２巻，１０号，１２３８−１２４３，１９９３年、
Ｙａｍａｙａ　ａｔ　ａｌ，　Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２６２　（Ｌｕｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　６）：Ｌ７１３−Ｌ７２４，１９９２
【０１１４】
より具体的には、まず生体から気道上皮組織を採取し、プロテアーゼ処理によって気道上皮細胞の細胞浮遊液を得る。また気道上皮細胞株を利用することもできる。ヒトを含むあらゆる哺乳動物由来の気道上皮細胞を、本発明のスクリーニング方法に利用することができる。得られた気道上皮細胞は、支持体上で培養される。支持体上の気道上皮細胞の密度は、１０４個／ｃｍ２〜１０８個／ｃｍ２、好ましくは１０６個／ｃｍ２程度が好ましい。支持体上に保持できなかった余剰の細胞を除去して、培養を継続する。
【０１１５】
支持体には、気道上皮細胞を支持するとともに、細胞層の裏側から培養液成分を細胞に供給できる素材が用いられる。たとえば、細胞が透過できない程度のポアサイズを有するフィルターは、ＡＩ法における細胞の支持体として好ましい。支持体とするフィルターは、細胞との親和性を有する素材でコートしておくことができる。このような素材としては、例えばコラーゲンゲルを用いることができる。実施例では、市販のフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＨＡ）をビトローゲンゲル（ＣＥＬＴＲＩＸ社、ビトローゲンをゲル化して使用）でコートしてＡＩ法に用いた。フィルターは適当なセルの底に固定されており、このセルに気道上皮細胞の浮遊液を加えれば、細胞の層がフィルター上に形成される。その後、コラーゲンゲルをコートしたセルを培地を満たしたウエルに浮かべることによってＡＩ法に基づく培養が可能となる。
【０１１６】
気道上皮細胞のための培地は、気道上皮細胞の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。具体的には、ダルベッコＭＥＭとハムＦ１２を１：１に混ぜたものに、２％　ウルトロセルＧ、抗生物質としてペニシリン・ストレプトマイシン・ゲンタマイシン・アンホテリシンＢを混合した培地を示すことができる。
【０１１７】
上記フィルター上に細胞を付着させ、フィルター側を培地に接触させ、細胞側を空気に接触させた状態で培養を継続することによって、ＡＩ法に基づく培養が可能となる。気道上皮細胞に作用させる被験化合物やＩＬ−１３は、培地に添加することによって細胞に接触させることができる。ＡＩ法においてＩＬ−１３で気道上皮細胞を刺激するためには、培地中に通常５−１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０−８０ｎｇ／ｍＬ、たとえば５０　ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１３が添加される。ＩＬ−１３は、気道上皮細胞と同じ種に由来するのが望ましい。
【０１１８】
なお本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子の発現レベルは、該遺伝子がコードする蛋白質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルを比較するためには、蛋白質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡや蛋白質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
【０１１９】
さらに本発明の開示に基づいて本発明の指標遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
【０１２０】
すなわち本発明は、次の工程を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、ａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群に記載の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群に記載の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
【０１２１】
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。
【０１２２】
またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ　ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。
【０１２３】
あるいは本発明における各指標遺伝子の転写調節領域を、次のようにして取得することもできる。すなわち、まず本発明で開示したｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＢＡＣライブラリー、ＹＡＣライブラリー等のヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該ｃＤＮＡの配列を含むゲノムＤＮＡクローンを得る。得られたゲノムＤＮＡの配列を基に、本発明で開示したｃＤＮＡの転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群に記載の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、またｂ）群に記載の指標遺伝子については前記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択することにより本発明のスクリーニングを行うことができる。
【０１２４】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がａ）またはｂ）に記載の群から選択されたいずれかの遺伝子、または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、ａ）群に記載の指標遺伝子については前記活性を低下させる化合物を、またｂ）群に記載の指標遺伝子については前記活性を上昇させる化合物を選択する工程
【０１２５】
本発明における指標蛋白質が有する活性を指標として、ａ）群に記載の指標遺伝子については、その活性を阻害する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、ａ）群に記載の各指標遺伝子の働きを抑制する。その結果、気道上皮細胞において発現が誘導された指標蛋白質の阻害を通じて、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患を制御することができる。
【０１２６】
またｂ）群に記載の指標遺伝子については、その活性を促進する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、ｂ）群に記載の指標遺伝子の働きを促進する。その結果、気道上皮細胞において発現が阻害された指標蛋白質の促進を通じて、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患を制御することができる。
【０１２７】
これらスクリーニングに用いる被験候補物質としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
【０１２８】
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。たとえば、ＡＩ法に基づく気道上皮細胞の培養のためのフィルター、またはフィルター付きのセル、更にこのセルを装着して実際に培養を維持するためのウエル、および培地等を組み合せることができる。
【０１２９】
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬として有用である。あるいは、ａ）に記載のいずれかの指標遺伝子の発現を抑制することができるアンチセンス核酸、リボザイム、またはＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドも、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬として有用である。
【０１３０】
さらに、ａ）に記載されたいずれかの指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体も、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬として有用である。ａ）に記載された指標遺伝子は、ＩＬ−１３で刺激された気道上皮細胞において発現が上昇する遺伝子である。したがってこれらの遺伝子の発現、あるいはこれら遺伝子によってコードされる蛋白質の機能を抑制することによって、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療効果を期待することができる。
加えてｂ）に記載されたいずれかの指標遺伝子、並びに該遺伝子によってコードされる蛋白質そのものも、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療薬として有用である。
【０１３１】
本発明のアレルギー性疾患の治療薬は、スクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明のアレルギー性疾患の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経口、あるいは非経口的に投与することができる。
【０１３２】
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
【０１３３】
また、投与すべき化合物がタンパク質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。
【０１３４】
あるいはアンチセンス核酸、リボザイム、またはＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドは、適当なプロモーター配列の下流に組み込み、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、あるいはＲＮＡｉ効果をもたらすＲＮＡの発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターをアレルギー疾患患者の単核球細胞へ導入すれば、これらの遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、またはＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によってアレルギーの治療効果を達成することができる。単核球細胞への発現ベクターの導入としては、ｉｎ　ｖｉｖｏ、あるいはｅｘ　ｖｉｖｏで行う方法が公知である。
【０１３５】
アンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉについて一般的な説明を追加アンチセンスＲＮＡとは、遺伝子のセンス配列に相補的な塩基配列を有するＲＮＡである。アンチセンスＲＮＡによって遺伝子発現を抑制するには、通常１５塩基以上、たとえば２０塩基以上、あるいは３０塩基以上の連続した塩基配列を有するＲＮＡが用いられる。たとえば開始コドンを含む領域にハイブリダイズするかことができるアンチセンス核酸は、当該遺伝子の発現抑制効果が大きいとされている。
【０１３６】
リボザイムは、塩基配列特異的にＲＮＡを切断する触媒作用を備えたＲＮＡである。ハンマーヘッド型やヘアピン型のリボザイムが知られている。いずれのリボザイムも、切断すべき領域に相補的な塩基配列部分と、触媒活性の発現に必要な構造を保持するための塩基配列部分とで構成されている。切断すべき領域に相補的な塩基配列は任意とすることができる。したがって、この領域の塩基配列を標的遺伝子に相補的な塩基配列とすることによって、指標遺伝子の発現を制御するためのリボザイムをデザインすることができる。
【０１３７】
次にＲＮＡｉ（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）効果は、ｍＲＮＡと同じ塩基配列を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を協力に抑制する現象を言う。したがって、指標遺伝子のｍＲＮＡと同一の塩基配列を有する２本鎖構造を含むＲＮＡは、指標遺伝子の発現抑制に利用することができる。ＲＮＡｉ効果を得るには、少なくとも２０以上の連続する塩基配列を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが望ましい。２本鎖構造は、異なるストランドで構成されていても良いし、１つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖であってもよい。
【０１３８】
アンチセンス核酸、リボザイム、並びにＲＮＡｉ効果を得るためのポリヌクレオチドにおいて、相補的、あるいは同一の塩基配列とは、完全に相補的、あるいは同一の塩基配列に限定されない。これらのＲＮＡの発現抑制作用は、高度な相補性あるいは同一性を維持して入りれば、維持される。ある塩基配列またはある塩基配列と相補的な塩基配列に対して、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、たとえば９８％以上の同一性を有する場合、高度な同一性あるいは相補性を有すると言うことができる。
【０１３９】
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき０．１　ｍｇから５００　ｍｇの範囲で、好ましくは０．５　ｍｇから２０　ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
【０１４０】
また本発明は、ａ）群またはｂ）群から選択された少なくとも１種類の遺伝子であり、指標遺伝子を測定するためのプローブを固定した気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の診断用ＤＮＡチップを提供する。測定すべき指標遺伝子の種類は任意である。指標遺伝子の数が多いほど、多くの指標に基づく判断が可能となる。一般に、より多くの指標を測定する方が、診断の確度は高まる。また、複数の指標遺伝子を測定する場合には、性質の異なった遺伝子を選択するのが有利である。発現レベルの変動のメカニズム、あるいは遺伝子によってコードされる蛋白質の機能などが異なると考えられる遺伝子は、相互に性質の異なる遺伝子と言うことができる。
【０１４１】
指標遺伝子の組み合せの例として、次のような例を示すことができる。次に示すような指標遺伝子の組み合せは、アレルギーの検査の精度の向上に貢献する。［プロテアーゼとプロテアーゼインヒビターで構成される群に含まれる指標遺伝子から選択された２以上の遺伝子］
プロテアーゼとプロテアーゼインヒビターとは、組織の崩壊と構築のバランスの指標となる。すなわち、本発明における指標遺伝子のうち、プロテアーゼ群に含まれる遺伝子と、プロテアーゼインヒビターに含まれる遺伝子から選択された遺伝子について、その遺伝子検出用のプローブを集積して、アレルギー性の気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患検査用チップとすることができる。各群に含まれる指標遺伝子は、明細書の最後に示した指標遺伝子のリストから見出すことができる。
【０１４２】
［サイトカイン、サイトカインレセプター、ケモカイン、ケモカインレセプター、ＣＤ抗原、抗体、および抗体レセプターで構成される群に含まれる指標遺伝子から選択された２以上の遺伝子］
これらの組み合せは、いずれも相互にリガンドとレセプターの関係にある物質の組み合せである。免疫応答は、これらの物質間の相互作用の結果と見ることもできる。したがって、これらの指標遺伝子を組み合せることによって、気道上皮組織が免疫学的にどのような状態にあるかを判断できる可能性がある。指標遺伝子としては、リガンドとレセプターの関係にある分子の両方を選択しても良いし、本発明における指標遺伝子としていずれか一方しか示されていない場合には、いずれか一方のみを指標遺伝子として選択することもできる。
【０１４３】
［サイトカイン、細胞外マトリックス蛋白質、細胞骨格系の蛋白、細胞間接着分子、および転写因子で構成される群に含まれる指標遺伝子から選択された２以上の遺伝子］
細胞外マトリックス蛋白質としてはコラーゲンなどを示すことができる。細胞骨格系の蛋白は、ケラチン、ｓｍａｌｌ　ｐｒｏｌｉｎ　ｒｉｃｈ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎなどを含む。また、細胞間接着分子には、カドヘリン、デスモコリンなどが含まれる。そして、転写因子としては、ｊｕｎ、ｆｏｓ、あるいはｍｙｃを示すことができる。これらの指標遺伝子の発現レベルを観察することによって、気道上皮組織の分化、炎症部位の再構築（修復）の度合を評価できる可能性がある。
【０１４４】
［酵素に含まれる指標遺伝子から選択された２以上の遺伝子］
酵素に含まれる指標遺伝子を選択することによって、気道上皮細胞でどのような代謝が行われているかを知ることができる。例えば、脂質メディエーターやバリア機能を支える脂質分子の代謝については脂質代謝酵素の発現レベルから判断することができる。脂質代謝酵素には、たとえばｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ａ２、ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２、ｐｒｏｓｔａｇｒａｎｄｉｎ　Ｄ２　ｓｙｎｔｈａｓｅ、あるいはＦａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ　１，　２などが含まれる。
【０１４５】
あるいは、より精度の高い検査を実現するために、ａ）群およびｂ）群を構成する遺伝子から選択された任意の複数の遺伝子の組み合せについて、選択された遺伝子を検出することができるプローブを集積した気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患検査用チップは有効である。具体的には、ａ）群から通常１０以上、たとえば３０以上、好ましくは５０以上、より好ましくは６０以上、更に好ましくは８０以上、あるいは１００以上の遺伝子を選択することができる。一方ｂ）群からも同様に、通常１０以上、たとえば３０以上、好ましくは５０以上、より好ましくは６０以上、更に好ましくは８０以上、あるいは１００以上の遺伝子を選択することができる。更に多くの遺伝子、たとえばａ）群およびｂ）群からそれぞれ、１５０以上、好ましくは１８０以上、より好ましくは２００以上の遺伝子を選択しても良い。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。
【０１４６】
【実施例】
〔実施例１〕ａｉｒ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（ＡＩ）法とｉｍｍｅｒｓｅｄ　ｆｅｅｄｉｎｇ（ＩＭＭ）法
１．Ａｉｒ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ法；東北大医学部の倫理委員会で承認された解剖検体の気管を平皿の上に伸展して上皮を剥離し、プロテアーゼ（０．０５％）を溶かしたリン酸緩衝液に入れて４℃で一晩静置した。翌日牛胎児血清培養液を加えて酵素活性を中和し、振盪して気道上皮細胞を単離した。
細胞数を数え、１０６個／ｃｍ２　密度で０．４５μｍの穴の空いたフィルター膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＨＡ）に播いた。その際にフィルター膜の上に成長支持物質としてビトローゲンゲル（ＣＥＬＴＲＩＸ社、ビトローゲンをゲル化して使用）を用いて、その上に上皮細胞をのせた。そのフィルター膜をダルベッコＭＥＭとハムＦ１２を１：１に混ぜたものに，２％　ウルトロセルＧ、抗生物質としてペニシリン・ストレプトマイシン・ゲンタマイシン・アンホテリシンＢを混合した培地が添加された２４穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社）上にのせ一晩培養した。その後、コラーゲンゲルに接着しなかった細胞を取り除き、細胞側が空気と接するような状態（ａｉｒ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）で約２週間培養した（図１参照）。ＡＩ法による気道上皮細胞の基本的な培養操作は、次の論文にしたがった。
山谷　陸雄；呼吸　１２巻，１０号，１２３８−１２４３，１９９３年、
Ｙａｍａｙａ　ａｔ　ａｌ，　Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２６２　（Ｌｕｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　６）：Ｌ７１３−Ｌ７２４，１９９２
【０１４７】
２．Ｉｍｍｅｒｓｅｄ　ｆｅｅｄｉｎｇ法（ＩＭＭ法）；基本的にＡＩ法と同様にフィルター膜の上にビトローゲンゲルを用いて、その上に上皮細胞をのせた。ＩＭＭ法においては上皮細胞の上に培地が添加される点が、ＩＭＭ法とＡＩ法の相違点である。さらに、そのフィルター膜をＡＩ法で用いた培地が添加された２４穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社）上にのせ約２週間培養した（図２参照）。ＩＭＭ法による気道上皮細胞の基本的な培養操作は、次の論文にしたがった。
山谷　陸雄；呼吸，１２巻，１０号，１２３８−１２４３，１９９３年、
Ｙａｍａｙａ　ａｔ　ａｌ，　Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２６２　（Ｌｕｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　６）：Ｌ７１３−Ｌ７２４，１９９２
【０１４８】
〔実施例２〕気管支上皮細胞のＩＬ−１３刺激
実施例１のＡＩ法では、培地に５０　ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を７日間毎日培地交換する際に添加し、７日目以降は、１日おきに培地交換する際に添加した。１４日間培養したのちに酸性糖鎖を染色するＰＡＳ染色と塩基性糖鎖を染色するアルシアンブルー染色をしたところ、巨大な糖タンパクであるムチンを含む杯細胞に分化した。
ＩＭＭ法も同様にヒトＩＬ−１３を添加したが、杯細胞への分化は認められなかった。本研究では、気道上皮細胞のＡＩ法でのＩＬ−１３刺激による杯細胞分化に関連する遺伝子の探索を目的としたため、杯細胞分化が完全に起こってしまう１４日目の細胞ではなく、分化している過程の３日目、７日目の細胞を回収した。さらに、本培養は２つの異なるロットの細胞を用いて行った。培養条件は、以下に示した。
【０１４９】
【表１】
2004121218.tif 000003
【０１５０】
〔実施例３〕　ＧｅｎｅＣｈｉｐ用ＲＮＡの調製
上記のように処理した気道上皮細胞を　Ｉｓｏｇｅｎ（日本ジーン；和光純薬）に溶解し、この溶液から、Ｉｓｏｇｅｎに添付されているプロトコルに従ってＲＮＡを分離した。クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿の全ＲＮＡを回収した。Ｎｏ．１−１２までのサンプルから約５−１５μｇの全ＲＮＡを回収した。これら全ＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＨＧ−Ｕ９５Ａ−Ｅ　を用いて発現解析を行った。Ａチップは約１２０００の全長ｃＤＮＡの塩基配列情報に基づくプローブが、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの各チップは約５００００のＥＳＴの塩基配列情報に基づくプローブが集積されたジーンチップである。
【０１５１】
〔実施例４〕　ＧｅｎｅＣｈｉｐ用のｃＲＮＡ合成
全ＲＮＡ　５μｇから、Ｔ７−（ｄＴ）２４　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）をプライマーとして、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌの方法に従いＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて逆転写し１本鎖　ｃＤＮＡを作製した。Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマーは、以下のようにＴ７プロモーターの塩基配列にｄ（Ｔ）２４を付加した塩基配列からなる。
Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマー（配列番号：１）
５’−ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧ−（ｄＴ）２４−３’
【０１５２】
次に、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌに従い、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ，　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＩおよびＲＮａｓｅ　Ｈを加え、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出後、Ｐｈａｓｅ　Ｌｏｃｋ　Ｇｅｌｓに通し、エタノール沈澱し精製した。
さらに、ＢｉｏＡｒｒａｙ　Ｈｉｇｈ　Ｙｉｅｌｄ　ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔを用い、ビオチンラベルしたｃＲＮＡを合成した。Ｎｏ．１−１２までのサンプルから約２０−５０μｇのビオチン化ｃＲＮＡを合成した。ＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ　（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｃＲＮＡを精製し、熱処理により断片化した。
そのうち１５μｇのｃＲＮＡをＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌに従いＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｃｏｃｋｔａｉｌに加えた。これをアレイに入れ、４５℃　１６時間ハイブリダイゼーションした。
アレイを洗浄した後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを加え染色した。洗浄後、ｎｏｒｍａｌ　ヤギＩｇＧとビオチン化ヤギＩｇＧの抗体混合液をアレイに加えた。さらに、蛍光強度を増強する目的で、再度Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを加え染色した。洗浄後、スキャナーにセットし、ＧｅｎｅＣｈｉｐ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｓｕｉｔｅ　４．０にて解析した。
【０１５３】
〔実施例５〕　ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析
ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析ソフトであるＳｕｉｔｅ　４．０を用いてデータを解析した。Ａｂｓｏｌｕｔｅ　ａｎａｌｙｓｉｓで、Ａｖｅｒａｇｅ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　（１）とＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ　Ａｖｅｒａｇｅ　（２）を調べ、（１）から（２）を引いた、ＡＩ法・無刺激、ＡＩ法・ＩＬ−１３刺激、ＩＭＭ法・無刺激、ＩＭＭ法・ＩＬ−１３刺激の４つの平均を補正値（Ｓｃａｌｅ　Ｆａｃｔｏｒ）としてＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓを行った。
まず、Ａｂｓｏｌｕｔｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓを行い１個のチップデータの解析をした。プローブセットのパーフェクトマッチとミスマッチの蛍光強度を比較して、ｐｏｓｉｔｉｖｅとｎｅｇａｔｉｖｅを決定した。Ｐｏｓ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ，　Ｌｏｇ　Ａｖｇ，　Ｐｏｓ／Ｎｅｇの値から判定されるＡｂｓｏｌｕｔｅ　ＣａｌｌであるＰ（ｐｒｅｓｅｎｔ）、Ａ　（ａｂｓｅｎｔ）、およびＭ　（ｍａｒｇｉｎａｌ）の３区分の判定をした。
Ｐｏｓ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ；　Ｐｏｓｉｔｉｖｅなペアの割合。
Ｌｏｇ　Ａｖｇ；　パーフェクトマッチとミスマッチのプローブセル蛍光強度比の対数の平均
Ｐｏｓ／Ｎｅｇ；　Ｐｏｓｉｔｉｖｅペア数とＮｅｇａｔｉｖｅペア数の比
また、それぞれの遺伝子において、パーフェクトマッチとミスマッチプローブセルの蛍光強度の差の平均値であるＡｖｅｒａｇｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　（Ａｖｇ　Ｄｉｆｆ）　も計算した。
【０１５４】
次に２つのデータを比較解析（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）した。例として、Ｄａｙ３のＡＩ法・無刺激とＤａｙ３のＡＩ法・ＩＬ−１３刺激で比較し、発現レベルの差を以下のようにランキングした。
Ｉｎｃ／Ｄｅｃ，　Ｉｎｃ　Ｒａｔｉｏ，　Ｄｐｏｓ−Ｄｎｅｇ　Ｒａｔｉｏ，　Ｌｏｇ　Ａｖｇ　Ｒａｔｉｏ　Ｃｈａｎｇｅの値から判定されるＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ＣａｌｌであるＩ，　Ｄ，　ＭＩ，　ＭＤ，　ＮＣの５区分の判定をした。
Ｉｎｃ：　ＩＬ−１３刺激と無刺激の対応するプローブペアについてＩＬ−１３刺激の方が増加していると判定されたペア数。
Ｄｅｃ：　ＩＬ−１３刺激の方が減少していると判定されたペア数。
Ｉｎｃ／Ｄｅｃ：　Ｉｎｃと判定されたペア数とＤｅｃと判定されたペア数の比。
Ｉｎｃ　Ｒａｔｉｏ：　Ｉｎｃと判定されたペア数／実際に使用されたペア数。
Ｄｐｏｓ／Ｄｎｅｇ　Ｒａｔｉｏ：　Ｐｏｓ　ＣｈａｎｇｅからＮｅｇ　Ｃｈａｎｇｅを引いた数と実際に使用されたペア数の比
Ｐｏｓ　Ｃｈａｎｇｅ：　ＩＬ−１３刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅ　ＡｎａｌｙｓｉｓでＰｏｓｉｔｉｖｅなペア数と無刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅ　ＡｎａｌｙｓｉｓでＰｏｓｉｔｉｖｅなペア数の差。
Ｎｅｇ　Ｃｈａｎｇｅ：　ＩＬ−１３刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅ　ＡｎａｌｙｓｉｓでＮｅｇａｔｉｖｅなペア数と無刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅ　ＡｎａｌｙｓｉｓでＮｅｇａｔｉｖｅなペア数の差
Ｌｏｇ　Ａｖｇ　Ｒａｔｉｏ　Ｃｈａｎｇｅ：　ＩＬ−１３刺激と無刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅ　ＡｎａｌｙｓｉｓでのＬｏｇ　Ａｖｇ　の差。
増加：Ｉ　（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）、
減少：Ｄ　（Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）、
わずかに増加：ＭＩ　（Ｍａｒｇｉｎａｌｌｙ　Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）、
わずかに減少：ＭＤ　（Ｍａｒｇｉｎａｌｌｙ　Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）、および
変化無し：ＮＣ　（ｎｏ　ｃｈａｎｇｅ）
【０１５５】
６．ＨＧ−Ｕ９５ＡチップからＥチップより絞り込まれた杯細胞分化に関与する遺伝子群（ａ）群／発現が上昇した遺伝子群、およびｂ）群／発現が低下した遺伝子群）
表２にＡチップからＥチップにおいて、ＡＩ法による培養条件下、ＩＬ−１３刺激によってＬｏｔ１，２の両方に共通して２倍以上または１／２以下の変動が見られた配列および遺伝子の数をカテゴリー別に示した。ｉｎｃｒｅａｓｅｄは、ＩＬ−１３刺激によって発現レベルに増加が見られた配列および遺伝子の数を示した。ｄｅｃｒｅａｓｅとは、ＩＬ−１３刺激によって発現レベルに減少が見られた配列および遺伝子の数を示した。ＢからＥまでのＥＳＴチップによって選択された遺伝子には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＮｅｔＡｆｆｙｘというデータベースの２００２年６月のバージョンをもとにアノテーションを記載した。
【０１５６】
【表２】
2004121218.tif 000004
【０１５７】
表３−表１９（ＩＬ−１３刺激による発現上昇群）および表２０−表３６（ＩＬ−１３刺激による発現低下群）にＨＧ−Ｕ９５ＡからＥまでのチップの遺伝子リストをカテゴリー別に示した。表中には、ｌｏｔ１あるいは２におけるＡＩ法あるいはＩＭＭ法におけるＩＬ−１３刺激によるＦｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅも示した。
【０１５８】
【表３】
2004121218.tif 000005
【０１５９】
【表４】
2004121218.tif 000006
【０１６０】
【表５】
2004121218.tif 000007
【０１６１】
【表６】
2004121218.tif 000008
【０１６２】
【表７】
2004121218.tif 000009
【０１６３】
【表８】
2004121218.tif 000010
【０１６４】
【表９】
2004121218.tif 000011
【０１６５】
【表１０】
2004121218.tif 000012
【０１６６】
【表１１】
2004121218.tif 000013
【０１６７】
【表１２】
2004121218.tif 000014
【０１６８】
【表１３】
2004121218.tif 000015
【０１６９】
【表１４】
2004121218.tif 000016
【０１７０】
【表１５】
2004121218.tif 000017
【０１７１】
【表１６】
2004121218.tif 000018
【０１７２】
【表１７】
2004121218.tif 000019
【０１７３】
【表１８】
2004121218.tif 000020
【０１７４】
【表１９】
2004121218.tif 000021
【０１７５】
【表２０】
2004121218.tif 000022
【０１７６】
【表２１】
2004121218.tif 000023
【０１７７】
【表２２】
2004121218.tif 000024
【０１７８】
【表２３】
2004121218.tif 000025
【０１７９】
【表２４】
2004121218.tif 000026
【０１８０】
【表２５】
2004121218.tif 000027
【０１８１】
【表２６】
2004121218.tif 000028
【０１８２】
【表２７】
2004121218.tif 000029
【０１８３】
【表２８】
2004121218.tif 000030
【０１８４】
【表２９】
2004121218.tif 000031
【０１８５】
【表３０】
2004121218.tif 000032
【０１８６】
【表３１】
2004121218.tif 000033
【０１８７】
【表３２】
2004121218.tif 000034
【０１８８】
【表３３】
2004121218.tif 000035
【０１８９】
【表３４】
2004121218.tif 000036
【０１９０】
【表３５】
2004121218.tif 000037
【０１９１】
【表３６】
2004121218.tif 000038
【０１９２】
配列表にＨＧ−Ｕ９５ＡからＥまでのチップのＲｅｆＳｅｑ遺伝子配列とアミノ酸配列、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子のないものは、ＥＳＴ配列を示した。
【０１９３】
７．ペンドリン遺伝子
上記解析の結果、気道上皮細胞のＡＩ法でＩＬ−１３刺激によって、Ｌｏｔ１，　２に共通で発現変動が認められた配列のうち、Ｄａｙ　３，　７で、１０倍以上の発現レベルの増大が見られた遺伝子として、トランスポーター（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）に分類されたペンドリン遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ；ＮＭ＿０００４４１，　ＮＭ＿０００４３２　配列番号２，　３）　が選抜された。ペンドリン遺伝子は、気道上皮細胞のＩＭＭ法でもＩＬ−１３刺激によって、Ｌｏｔ１，　２に共通で、Ｄａｙ　３，　７両時期において２０倍以上の発現増強が認められた。
この遺伝子は、ＩＬ−１３刺激によって誘導されたアレルギーに密接に関連した遺伝子である。ＨＧ−Ｕ９５Ａチップでのペンドリン遺伝子の解析結果を表３７に示した。
【０１９４】
【表３７】
2004121218.tif 000039
【０１９５】
ＰＤＳ遺伝子は、ペンドレッド症候群という先天性難聴と甲状腺腫の表現型を示す遺伝性疾患の原因遺伝子である（Ｅｖｅｒｅｔｔ　Ｌ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　１７：　４１１−２２　（１９９７））。硫酸トランスポータードメインを持っていることから、硫酸トランスポーターとして報告されていたが、その後、Ｃｌ−やＩ−等の他の陰イオンを輸送する蛋白質として研究されている（Ｓｃｏｔｔ　Ｄ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．　２１（４）：　４４０−３　（１９９９）；　Ｓｃｏｔｔ　Ｄ．Ａ．　ａｎｄ　Ｋａｒｎｉｓｋｉ　Ｌ．Ｐ．，　Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２７８：　Ｃ２０７−１１　（２０００））。ペンドリンは、７８０残基のアミノ酸からなる分子量８６ｋＤの１２回膜貫通領域を含む膜蛋白質である。ヒトでは、内耳、甲状腺において高い発現が認められ、より低レベルでの発現ではあるが腎臓、子宮内膜、胎盤における発現が認められる（Ｒａｙａｕｘ　Ｉ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１４１：　８３９−４５　（２０００）；　Ｂｉｄａｒｔ　Ｊ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｃｌｉｎ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　Ｍｅｔａｂ．　８５：　２０２８−３３　（２０００））。一方、マウス及びラットでは、腎臓に高い発現が認められ、その他、子宮内膜及び胎盤においても発現が認められる。ペンドリンをコードするＰＤＳ遺伝子は、染色体７ｑ３１のＤＦＮＢ４位にマップされている。ＰＤＳ遺伝子のすぐ下流に先天性結腸異常原因遺伝子であるＤＲＡ（ＳＬＣ２６Ａ３；　ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｉｎ　ｃｏｌｏｎｉｃ　ａｄｅｎｏｍａ）が逆向きにマップされている。
【０１９６】
該ＤＲＡ遺伝子は、結腸や粘膜で高発現が観察される硫黄のトランスポーターであり、ペンドリンと極めて高い構造類似性を有する。その他、ＰＤＳ遺伝子と高い類似性を示す遺伝子として、染色体５ｑ３２−ｑ３３．１にマップされている捻曲性骨胃形成症原因遺伝子であるＤＴＤＳＴ（ＳＬＣ２６Ａ２；　ｄｉａｓｔｏｒｏｐｈｉｃ　ｄｙｓｐｌａｓｉａ）を挙げることができる。ＤＴＤＳＴもまた、硫黄のトランスポーターとして機能する蛋白質をコードしていることが知られている。ＰＤＳ遺伝子をノックアウトしたマウスは、聾唖になり、前庭の機能障害が認められる。１５日目までの胎児では内耳は正常であるが、それ以降は拡張が認められ、感覚細胞の変形や、耳頭蓋の奇形も認められる（Ｅｖｅｒｅｔｔ　Ｌ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　１０（２）：　１５３−６１　（２００１））。
【０１９７】
〔実施例６〕候補遺伝子のＡＩ法あるいはＩＭＭ法で培養した気管支上皮細胞を用いた発現レベルの確認
実施例５で選択されたペンドリン遺伝子の発現量を定量的に確認するために、実施例１で示したＡＩ法あるいはＩＭＭ法で培養した２つの上皮細胞を用いて更にＡＢＩ７７００による定量的ＰＣＲを行った。ＡＢＩ　７７００による測定に用いたプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、ペンドリン遺伝子の配列情報に基づいてＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＰＥバイオシステムズ）により設計した。ＴａｑＭａｎプローブの５’末端はＦＡＭ　（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、また３’末端はＴＡＭＲＡ　（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）　で標識されている。ペンドリン遺伝子のフォワードプライマー（Ｆ）、リバースプライマー（Ｒ）、およびＴａｑＭａｎプローブ（ＴＰ）に用いたオリゴヌクレオチドの塩基配列は、以下に示すとおりである。各指標遺伝子の塩基配列に対応するＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号を、名称に続けて（）内に示した。
ペンドリン（ＡＦ０３０８８０）
Ｆ：ＴＴＴＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＣＣ（配列番号：４）
Ｒ：ＣＣＴＡＣＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＡＡＧＣ（配列番号：５）
ＴＰ：ｃｔｔｇｔｔｃｔｃｇｇａｇａｔｇｃｔｇｇｃｔｇｃａｔ（配列番号：６）
【０１９８】
前述の方法で抽出した全ＲＮＡをＤＮａｓｅ（ニッポンジーン）処理した。その後、ｒａｎｄａｍ　ｈｅｘａｍｅｒ　（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）をプライマーとして逆転写したｃＤＮＡを鋳型とした。コピー数を算出する標準曲線のために両プライマーで増幅される塩基配列領域を含むプラスミドクローンを各々の遺伝子について準備し、その段階希釈を鋳型として反応を行った。ＰＣＲ増幅のモニタリングのための反応液の組成は表３８に示した。
【０１９９】
【表３８】
2004121218.tif 000040
【０２００】
また、試料中のｃＤＮＡ濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子、およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子のコピー数を算出した。
βアクチン、あるいはＧＡＰＤＨ測定用のプライマーとプローブは、各遺伝子の配列情報に基づいてＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ）により設計した。塩基配列は以下の通りである。βアクチンにより補正した指標遺伝子の発現量（ｃｏｐｙ／ｎｇ　ＲＮＡ）を図３に示す。
βアクチンフォーワードプライマー（配列番号：７）
ＴＣＡ　ＣＣＣ　ＡＣＡ　ＣＴＧ　ＴＧＣ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＡＣＧ　Ａ
βアクチンリバースプライマー（配列番号：８）
ＣＡＧ　ＣＧＧ　ＡＡＣ　ＣＧＣ　ＴＣＡ　ＴＴＧ　ＣＣＡ　ＡＴＧ　Ｇ
βアクチンＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：９）
（ＦＡＭ）　ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴ　（ＴＡＭＲＡ）　−３’
ＧＡＰＤＨフォーワードプライマー（配列番号：１０）
ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴ
ＧＡＰＤＨリバースプライマー（配列番号：１１）
ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ
ＧＡＰＤＨ　ＴａｑＭａｎ　プローブ（配列番号：１２）
（ＦＡＭ）ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’
ＦＡＭ：６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
ＴＡＭＲＡ：６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ
【０２０１】
定量的ＰＣＲの結果、実施例５で選択したペンドリン遺伝子の気道上皮細胞における発現レベルは、ＡＩ法あるいは、ＩＭＭ法のＩＬ−１３刺激によって、２つの異なる気道上皮細胞において１００倍以上に上昇した。これらの結果に基づいて、気道上皮細胞では、ＩＬ−１３に応答して、この指標遺伝子の発現レベルが上昇することが予測された。
アレルギー反応との密接な関連が知られているＩＬ−１３の刺激によって、本発明の指標遺伝子は、異なるロットの気管支上皮細胞で共通の挙動を示す。したがって、本発明の指標遺伝子は、アレルギー反応の進行を制御する重要な遺伝子であると考えられる。
【０２０２】
〔実施例７〕　ＯＶＡ抗原暴露気道過敏性マウスモデル肺のＲＮＡ回収
気管支喘息モデルとして、ＯＶＡ抗原曝露気道過敏性モデルが報告されている。Ｂａｌｂ／ｃ　マウス（雄性、７週齢）に５０　μｇのＯＶＡとアジュバントである水酸化アルミニウム１　ｍｇを腹腔内に注射し、その１０日後同様な条件でＯＶＡを感作した。さらにその１０日後から４日ごとに３回１％ＯＶＡをウルトラネブライザー　ｍｏｄｅｌ　ＵＮ７０１（アズウェル（株））で３０分吸入させた。気道過敏性の亢進は、最終抗原吸入の２４時間後にアセチルコリン（６．２５−２０００　μｇ／ｋｇ）による気道狭窄反応を人工呼吸器（ｍｏｄｅｌ　１３１，　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ．）にて測定した（Ｎａｇａｉ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｉｎｔ　Ａｒｃｈ　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　；１０８：　１８９−１９５，　１９９５）。このような処理によって気道過敏性を誘発することができる。
本モデルの肺ＲＮＡを用いて、マウスペンドリン遺伝子の発現変動を検討した。
【０２０３】
ＯＶＡ抗原暴露気道過敏性群（Ｎ＝７）の対照群として、無処理群（Ｎ＝６）、２回ＯＶＡ抗原免疫し、生理食塩水を吸入させた生理食塩水吸入群（Ｎ＝６）、抗原を吸入する前日より最終抗原吸入まで計１０回プレドニゾロンを５　ｍｇ／ｋｇで経口投与させ、気道過敏性を抑制したプレドニゾロン投与群（Ｎ＝７）の４群を実施した。
気道過敏性の症状が認められる３回抗原吸入２４時間後のマウスの左肺を採取し、２　ｍｌのＩｓｏｇｅｎ（日本ジーン；和光純薬）に溶解し、直ちにホモジナイザーＤＩＡＸ１００（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ社）で破砕した。この溶液１　ｍｌから、Ｉｓｏｇｅｎに添付されているプロトコールに従ってＲＮＡを分離した。クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿の全ＲＮＡを回収した。上記４群（Ｎ＝２６）のサンプルから約２０−６０μｇの全ＲＮＡを回収した。
【０２０４】
〔実施例８〕ＯＶＡ抗原暴露気道過敏性モデル肺でのペンドリン遺伝子の発現レベルの確認
実施例８の肺ＲＮＡを用いマウスペンドリン遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ：　ＮＭ＿０１１８６７、ＮＭ＿０３５９９７、配列番号：１３／ＤＮＡ、および配列番号：１４／アミノ酸配列）　の発現量を定量的に確認するために、ＡＢＩ　７７００による定量的ＰＣＲを行った。ＡＢＩ　７７００による測定に用いたプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、ペンドリン遺伝子の配列情報に基づいてＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ）により設計した。ＴａｑＭａｎプローブの５’末端はＦＡＭ　（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、また３’末端はＴＡＭＲＡ　（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）　で標識されている。ペンドリン遺伝子のフォワードプライマー（Ｆ）、リバースプライマー（Ｒ）、およびＴａｑＭａｎプローブ（ＴＰ）に用いたオリゴヌクレオチドの塩基配列は、以下に示すとおりである。マウスペンドリン遺伝子の塩基配列に対応するＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号を、名称に続けて（）内に示した。
【０２０５】
マウスペンドリン（ＡＦ１６７４１１）
Ｆ：ＧＧＴＴＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＧ（配列番号：１５）
Ｒ：ＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＴＧＣＡＧＣＣＡ（配列番号：１６）
ＴＰ：ｃａｔｃｔｇｔｇｇｇｃｃｔｇｔｔｔｔｃｇｇａｃａｔｇ（配列番号：１７）
【０２０６】
前述の方法で抽出した全ＲＮＡをＤＮａｓｅ（ニッポンジーン）処理した。その後、ｒａｎｄａｍ　ｈｅｘａｍｅｒ　（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）をプライマーとして逆転写したｃＤＮＡを鋳型とした。コピー数を算出する標準曲線のために両プライマーで増幅される塩基配列領域を含むプラスミドクローンを各々の遺伝子について準備し、その段階希釈を鋳型として反応を行った。ＰＣＲ増幅のモニタリングのための反応液の組成は表３９に示した。
【０２０７】
【表３９】
2004121218.tif 000041
【０２０８】
また、試料中のｃＤＮＡ濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてマウスβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子、およびマウスグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子のコピー数を算出した。
マウスβアクチン、あるいはマウスＧＡＰＤＨ測定用のプライマーとプローブは、各遺伝子の配列情報に基づいてＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ）により設計した。塩基配列は以下の通りである。マウスβアクチンにより補正した各遺伝子の発現量（ｃｏｐｙ／ｎｇ　ＲＮＡ）を図４に示す。
【０２０９】
マウスβアクチンフォーワードプライマー（配列番号：１８）
ＡＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＣ
マウスβアクチンリバースプライマー（配列番号：１９）
ＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＧＡＴＴＣＣＡＴＡＣＣ
マウスβアクチンＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：２０）
（ＦＡＭ）　ＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴ　（ＴＡＭＲＡ）　−３’
マウスＧＡＰＤＨフォワードプライマー（配列番号：２１）
ＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣＣ
マウスＧＡＰＤＨリバースプライマー（配列番号：２２）
ＣＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＧＣＴＣＡＴＧ
マウスＧＡＰＤＨ　ＴａｑＭａｎ　プローブ（配列番号：２３）
（ＦＡＭ）　ＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧ　（ＴＡＭＲＡ）−３’
ＦＡＭ：６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
ＴＡＭＲＡ：６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ
【０２１０】
定量的ＰＣＲの結果、ＯＶＡ抗原曝露気道過敏性マウス肺で、生理食塩水吸入マウス肺に比べ、約５０倍発現が高値であった。以上のことから、ヒトの喘息に近いＯＶＡ抗原曝露気道過敏性モデルマウスの肺にペンドリン遺伝子が高発現することから、アレルギー反応特に喘息の進行を制御する重要な遺伝子であると考えられる。
【０２１１】
〔実施例９〕　ＯＶＡ抗原曝露気道過敏性モデル肺でのｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｙｚａｔｉｏｎ　（以下ＩＳＨと示す）におけるペンドリン遺伝子の局在確認
実施例９で使用したＯＶＡ抗原曝露気道過敏性モデルマウス４群（無処理群、生理食塩水吸入群、プレドニゾロン投与群あるいはＯＶＡ抗原吸入群）各３匹について、１０％中性緩衝ホルマリンを用い潅流固定後に肺組織を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンによる固定後パラフィン包埋して、ブロックを作製した。
すべてのサンプルのマウス肺パラフィンブロックを７μｍの厚さに薄切し、ヘマトキシリンにて核染色した。その切片の中で、組織の状態が良かった生理食塩水吸入群とＯＶＡ抗原吸入群の１例づつを用いてＩＳＨを実施した。ＩＳＨ用のプローブの塩基配列は、配列番号：２４に示した。
【０２１２】
上記プローブを用いて、生理食塩水吸入群とＯＶＡ抗原吸入群のマウス肺のパラフィン切片を用いて、脱パラフィンによる親水化（キシレン、１００，９０，８０，７０％アルコールで処理した後水洗い）をした後、ペンドリン遺伝子のＩＳＨ染色を実施した。染色後は、ケルネトールにより核染色を行った。ＩＳＨの条件は以下のとおりである。ＩＳＨの結果を図５に示した。
プローブ濃度；２５０　ｎｇ／ｍｌ
ハイブリダイゼーション温度；６０℃
ハイブリダイゼーション時間；６時間
ハイブリダイゼーション後の洗浄；０．１ｘＳＳＣ／７０℃／６分／３回
発色基質；ＮＢＴ／ＢＣＩＰ
発色時間；７時間
ＩＳＨの結果から、ＯＶＡ抗原吸入群のマウス肺の切片は、アンチセンスプローブにおいて、特異的な発色が認められた。発色は、気管支、細気管及び肺胞の大食細胞に認められた。また、気管支の粘膜上皮細胞においても同等な強さの発色が認められた。センスプローブでは発色は認められなかった。
【０２１３】
〔実施例１０〕　ＯＶＡ抗原曝露気道過敏性モデル肺組織のＰＡＳ染色、およびアルシアンブルー染色
ＯＶＡ抗原曝露気道過敏性モデル肺組織のどの部分に巨大糖タンパクであるムチンが存在していることを確かめるために、酸性糖鎖を染めるＰＡＳ染色及び塩基性糖鎖を染めるアルシアンブルー染色を行った。実施例１０で使用した生理食塩水吸入群あるいはＯＶＡ抗原吸入群のマウス肺パラフィンブロックを３μｍの厚さに薄切し、脱パラフィンによる親水化（キシレン、１００，９０，８０，７０％アルコールで処理した後水洗い）をした後、ＰＡＳ染色及びアルシアンブルー染色した。染色結果を図６に示した。反応条件は以下のとおりである。
【０２１４】
ＰＡＳ染色；
１％過ヨウ素酸液　１０分
水洗　５分
コールド・シッフ試薬　１５分
亜硫酸水　２分ｘ３回
水洗
Ａｌｃｉａｎ　Ｂｌｕｅ染色；
３％　酢酸　１分
アルシアンブルー染色液（ｐＨ２．５）　３０分
３％　酢酸　５回洗浄
水洗
脱水・透徹・封入
７０％　アルコール　５分
８０％　アルコール　５分
９０％　アルコール　５分
１００％　アルコール　５分ｘ２回
キシレン　５分ｘ２回
キシレン系封入剤、カバーグラスで封入
ＰＡＳ、アルシアンブルー染色の結果、両染色とも気管支粘膜の上皮細胞及び杯細胞の細胞質顆粒において陽性反応が認められた。よって、気管支粘膜上皮細胞及び杯細胞内にムチンを含んでいることが示された。実施例１２、および実施例１３の結果により、気管支粘膜上皮細胞及び杯細胞にペンドリン遺伝子が局在していることが示された。
【０２１５】
〔実施例１１〕気道過敏性モデルマウスにおける指標遺伝子の発現レベルの変化１．ＯＶＡ抗原暴露気道過敏性モデルマウス肺のＲＮＡ回収
ヒトの喘息に近いモデルとして、７週齢の雄性のＢａｌｂ／ｃマウスを用いたＯＶＡ抗原暴露気道過敏性モデルが報告されている。このマウスに５０　μｇのＯＶＡとアジュバントである水酸化アルミニウム　１　ｍｇをＤａｙ０と１０に２回腹腔内に免疫し、その１０日後から４日ごとに３回１　％　ＯＶＡをウルトラネブライザーにて３０分マウスに吸入させた。最終抗原吸入後のマウスの気道過敏性が上昇することから喘息と酷似した症状を誘発することができる。
本実施例では、ＯＶＡ抗原暴露１、２、３回目の２４時間後の肺と気管のＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡ，　ｃＲＮＡを合成し、それぞれをマウスＧｅｎｅＣｈｉｐ　（ＭＧ−Ｕ７４Ａ−Ｃ）、にて解析し、さらにその結果をヒト杯細胞分化モデルと比較した。
【０２１６】
ＯＶＡ抗原暴露１、２、３回目のそれぞれ２４時間後の肺と気管のＲＮＡを回収した。また、ＯＶＡ抗原暴露気道過敏性群（Ｓ−ＯＶＡ群）の対照群として、無処理群（ｎａｉｖｅ群）、２回ＯＶＡ抗原免疫し、生理食塩水を吸入させた生理食塩水吸入群　（Ｓ−Ｓａｌ群）、抗原を吸入する前日より最終抗原吸入まで計１０回プレドニゾロン（Ｐｒｅｄ群）を５　ｍｇ／ｋｇで経口投与させ、気道過敏性を抑制したプレドニゾロン投与群の４群を実施した。
【０２１７】
ＯＶＡ抗原暴露１、２、３回目のそれぞれ２４時間後の肺と気管を採取し、４　ｍｌのＩｓｏｇｅｎ（日本ジーン；和光純薬）に溶解し、直ちにポリトロンと呼ばれるホモジナイザーで破砕した。この溶液１　ｍｌから、Ｉｓｏｇｅｎに添付されているプロトコールに従ってＲＮＡを分離した。クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿の全ＲＮＡを回収した。上記１２群のサンプルから約２０−６０　μｇの全ＲＮＡを回収した。
【０２１８】
２．ＧｅｎｅＣｈｉｐ用のｃＲＮＡ合成
実施例４と同様の方法により、ビオチンラベルしたｃＲＮＡを合成した。上記１２群のサンプルから合成されたｃＤＮＡから約２０−５０　μｇのビオチン化ｃＲＮＡを合成した。ＲＮｅａｓｙ　Ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ　（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｃＲＮＡを精製し、熱処理により断片化した。そのうち１５　μｇのｃＲＮＡをＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌに従いＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｃｏｃｋｔａｉｌに加えた。これをアレイに入れ、４５℃で１６時間ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションの後、実施例４と同様の操作により、染色と解析を行った。
【０２１９】
３．　ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析
ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析ソフトであるＳｕｉｔｅ　４．０を用いてデータ解析を行った。Ａｂｓｏｌｕｔｅ　ａｎａｌｙｓｉｓで、Ａｖｅｒａｇｅ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　（１）とＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ　Ａｖｅｒａｇｅ　（２）を調べ、（１）から（２）を引いた、ｎａｉｖｅ群，　Ｓ−ｓａｌ群，　Ｓ−ＯＶＡ群，　Ｐｒｅｄ群の４つの平均を補正値（ＳｃａｌｅＦａｃｔｏｒ）としてＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓを行った。
まず、Ａｂｓｏｌｕｔｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓを行い１個のチップデータの解析をした。プローブセットのパーフェクトマッチとミスマッチの蛍光強度を比較して、ｐｏｓｉｔｉｖｅとｎｅｇａｔｉｖｅを決定した。Ｐｏｓ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ，　Ｌｏｇ　Ａｖｇ，　Ｐｏｓ／Ｎｅｇの値から判定されるＡｂｓｏｌｕｔｅ　ＣａｌｌであるＰ（ｐｒｅｓｅｎｔ）、Ａ　（ａｂｓｅｎｔ）、およびＭ　（ｍａｒｇｉｎａｌ）の３区分の判定をした。
Ｐｏｓ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ；　Ｐｏｓｉｔｉｖｅなペアの割合。
Ｌｏｇ　Ａｖｇ；　パーフェクトマッチとミスマッチのプローブセル蛍光強度比の対数の平均
Ｐｏｓ／Ｎｅｇ；　Ｐｏｓｉｔｉｖｅペア数とＮｅｇａｔｉｖｅペア数の比
また、それぞれの遺伝子において、パーフェクトマッチとミスマッチプローブセルの蛍光強度の差の平均値であるＡｖｅｒａｇｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　（Ａｖｇ　Ｄｉｆｆ）　も計算した。
【０２２０】
次に２つのデータを比較解析（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）した。例として、Ｓ−Ｓａｌ群とＳ−ＯＶＡ群を比較し、発現レベルの差を以下のようにランキングした。
Ｉｎｃ／Ｄｅｃ，　Ｉｎｃ　Ｒａｔｉｏ，　Ｄｐｏｓ−Ｄｎｅｇ　Ｒａｔｉｏ，　Ｌｏｇ　Ａｖｇ　Ｒａｔｉｏ　Ｃｈａｎｇｅの値から判定されるＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ＣａｌｌであるＩ，　Ｄ，　ＭＩ，　ＭＤ，　ＮＣの５区分の判定をした。
Ｉｎｃ：　Ｓ−Ｓａｌ群とＳ−ＯＶＡ群の対応するプローブペアについてＳ−ＯＶＡ群の方が増加していると判定されたペア数。
Ｄｅｃ：　Ｓ−ＯＶＡ群の方が減少していると判定されたペア数。
Ｉｎｃ／Ｄｅｃ：　Ｉｎｃと判定されたペア数とＤｅｃと判定されたペア数の比。
Ｉｎｃ　Ｒａｔｉｏ：　Ｉｎｃと判定されたペア数／実際に使用されたペア数。
Ｄｐｏｓ／Ｄｎｅｇ　Ｒａｔｉｏ：　Ｐｏｓ　ＣｈａｎｇｅからＮｅｇ　Ｃｈａｎｇｅを引いた数と実際に使用されたペア数の比
Ｐｏｓ　Ｃｈａｎｇｅ：　Ｓ−Ｓａｌ群のＡｂｓｏｌｕｔｅ　ＡｎａｌｙｓｉｓでＰｏｓｉｔｉｖｅなペア数とＳ−ＯＶＡ群のＡｂｓｏｌｕｔｅ　ＡｎａｌｙｓｉｓでＰｏｓｉｔｉｖｅなペア数の差。
Ｎｅｇ　Ｃｈａｎｇｅ：　Ｓ−Ｓａｌ群のＡｂｓｏｌｕｔｅ　ＡｎａｌｙｓｉｓでＮｅｇａｔｉｖｅなペア数とＳ−ＯＶＡ群のＡｂｓｏｌｕｔｅ　ＡｎａｌｙｓｉｓでＮｅｇａｔｉｖｅなペア数の差
Ｌｏｇ　Ａｖｇ　Ｒａｔｉｏ　Ｃｈａｎｇｅ：　Ｓ−Ｓａｌ群とＳ−ＯＶＡ群のＡｂｓｏｌｕｔｅ　ＡｎａｌｙｓｉｓでのＬｏｇ　Ａｖｇ　の差。
増加：Ｉ　（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）、
減少：Ｄ　（Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）、
わずかに増加：ＭＩ　（Ｍａｒｇｉｎａｌｌｙ　Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）、
わずかに減少：ＭＤ　（Ｍａｒｇｉｎａｌｌｙ　Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）、および
変化無し：ＮＣ　（ｎｏ　ｃｈａｎｇｅ）
【０２２１】
４．ＨＧ−Ｕ９５Ａ〜Ｅチップより絞り込まれた杯細胞分化に関与する遺伝子群とＭＧ−Ｕ７４Ａ，Ｂ，Ｃチップより絞り込まれたＯＶＡ抗原暴露気道過敏性モデルでの遺伝子群の比較
上記のＨＧ−Ｕ９５Ａ−Ｅチップにおいて絞り込まれた遺伝子をもとに、ＮｅｔＡｆｆｙｘデータベース（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）より、マウスのカウンターパートを検索した。さらに、カウンターパートがあったものに対して、マウスＧｅｎｅＣｈｉｐ　ＭＧ−Ｕ７４ＡからＣチップにおいて、Ｓ−Ｓａｌ群とＳ−ＯＶＡ群をＳｕｉｔｅ４．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）で比較して解析した際のＦｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅを表４０−表８３に示した。
表４０−表６２（ＡＩ法による培養条件下、ＩＬ−１３により発現上昇が見られたヒト遺伝子のマウスカウンターパート）および表６３−表８３（ＡＩ法による培養条件下、ＩＬ−１３により発現低下が見られたヒト遺伝子のマウスカウンターパート）に、マウス喘息モデルにおける発現を遺伝子カテゴリー別に示した。
【０２２２】
【表４０】
2004121218.tif 000042
【０２２３】
【表４１】
2004121218.tif 000043
【０２２４】
【表４２】
2004121218.tif 000044
【０２２５】
【表４３】
2004121218.tif 000045
【０２２６】
【表４４】
2004121218.tif 000046
【０２２７】
【表４５】
2004121218.tif 000047
【０２２８】
【表４６】
2004121218.tif 000048
【０２２９】
【表４７】
2004121218.tif 000049
【０２３０】
【表４８】
2004121218.tif 000050
【０２３１】
【表４９】
2004121218.tif 000051
【０２３２】
【表５０】
2004121218.tif 000052
【０２３３】
【表５１】
2004121218.tif 000053
【０２３４】
【表５２】
2004121218.tif 000054
【０２３５】
【表５３】
2004121218.tif 000055
【０２３６】
【表５４】
2004121218.tif 000056
【０２３７】
【表５５】
2004121218.tif 000057
【０２３８】
【表５６】
2004121218.tif 000058
【０２３９】
【表５７】
2004121218.tif 000059
【０２４０】
【表５８】
2004121218.tif 000060
【０２４１】
【表５９】
2004121218.tif 000061
【０２４２】
【表６０】
2004121218.tif 000062
【０２４３】
【表６１】
2004121218.tif 000063
【０２４４】
【表６２】
2004121218.tif 000064
【０２４５】
【表６３】
2004121218.tif 000065
【０２４６】
【表６４】
2004121218.tif 000066
【０２４７】
【表６５】
2004121218.tif 000067
【０２４８】
【表６６】
2004121218.tif 000068
【０２４９】
【表６７】
2004121218.tif 000069
【０２５０】
【表６８】
2004121218.tif 000070
【０２５１】
【表６９】
2004121218.tif 000071
【０２５２】
【表７０】
2004121218.tif 000072
【０２５３】
【表７１】
2004121218.tif 000073
【０２５４】
【表７２】
2004121218.tif 000074
【０２５５】
【表７３】
2004121218.tif 000075
【０２５６】
【表７４】
2004121218.tif 000076
【０２５７】
【表７５】
2004121218.tif 000077
【０２５８】
【表７６】
2004121218.tif 000078
【０２５９】
【表７７】
2004121218.tif 000079
【０２６０】
【表７８】
2004121218.tif 000080
【０２６１】
【表７９】
2004121218.tif 000081
【０２６２】
【表８０】
2004121218.tif 000082
【０２６３】
【表８１】
2004121218.tif 000083
【０２６４】
【表８２】
2004121218.tif 000084
【０２６５】
【表８３】
2004121218.tif 000085
また、マウスカウンターパートの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号：９５４〜配列番号：１６３５に示した。内訳は次のとおりである。
ＡＩ法でＩＬ−１３により発現上昇するヒト遺伝子のマウスカウンターパート：
９５４−１１７４（塩基配列）　１１７５−１３７５（アミノ酸配列）
ＡＩ法でＩＬ−１３により発現減少するヒト遺伝子のマウスカウンターパート：
１３７６−１５０５（塩基配列）　１５０６−１６３５（アミノ酸配列）
マウスカウンターパートのＰｒｏｂｅ　ＩＤ、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．、およびＲｅｆ　ＳＥＱＮｏ．と配列表における配列番号の対応を表８４〜表１１３に示した。
【０２６６】
【表８４】
2004121218.tif 000086
【０２６７】
【表８５】
2004121218.tif 000087
【０２６８】
【表８６】
2004121218.tif 000088
【０２６９】
【表８７】
2004121218.tif 000089
【０２７０】
【表８８】
2004121218.tif 000090
【０２７１】
【表８９】
2004121218.tif 000091
【０２７２】
【表９０】
2004121218.tif 000092
【０２７３】
【表９１】
2004121218.tif 000093
【０２７４】
【表９２】
2004121218.tif 000094
【０２７５】
【表９３】
2004121218.tif 000095
【０２７６】
【表９４】
2004121218.tif 000096
【０２７７】
【表９５】
2004121218.tif 000097
【０２７８】
【表９６】
2004121218.tif 000098
【０２７９】
【表９７】
2004121218.tif 000099
【０２８０】
【表９８】
2004121218.tif 000100
【０２８１】
【表９９】
2004121218.tif 000101
【０２８２】
【表１００】
2004121218.tif 000102
【０２８３】
【表１０１】
2004121218.tif 000103
【０２８４】
【表１０２】
2004121218.tif 000104
【０２８５】
【表１０３】
2004121218.tif 000105
【０２８６】
【表１０４】
2004121218.tif 000106
【０２８７】
【表１０５】
2004121218.tif 000107
【０２８８】
【表１０６】
2004121218.tif 000108
【０２８９】
【表１０７】
2004121218.tif 000109
【０２９０】
【表１０８】
2004121218.tif 000110
【０２９１】
【表１０９】
2004121218.tif 000111
【０２９２】
【表１１０】
2004121218.tif 000112
【０２９３】
【表１１１】
2004121218.tif 000113
【０２９４】
【表１１２】
2004121218.tif 000114
【０２９５】
【表１１３】
2004121218.tif 000115
【０２９６】
５．４で絞り込まれた遺伝子のヒト杯細胞分化モデル及びマウスＯＶＡ抗原暴露気道過敏性モデルでの発現レベルの確認
４で絞り込まれた遺伝子の中から、ヒトとマウスで変動が認められたものを中心に８８遺伝子について、ヒトでは杯細胞分化モデルｃＤＮＡを用いて、マウスではＯＶＡ抗原暴露気道過敏性モデルｃＤＮＡを用いてＡＢＩ　７７００による定量的ＰＣＲを行った。
【０２９７】
ＡＢＩ　７７００による測定に用いたプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、各遺伝子の配列情報に基づいてＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＰＥバイオシステムズ）により設計した。ＴａｑＭａｎプローブの５’末端はＦＡＭ　（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、また３’末端はＴＡＭＲＡ　（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）　で標識されている。各遺伝子のフォワードプライマー（Ｆ）、リバースプライマー（Ｒ）、およびＴａｑＭａｎプローブ（ＴＰ）に用いたオリゴヌクレオチドの塩基配列は、以下に示すとおりである。プローブＩＤ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．、遺伝子のシンボル、および遺伝子名を／／で区切って記載した後に、各遺伝子の検出のために用いたフォワードプライマー、ＴａｑＭａｎプローブ、そしてリバースプライマーの塩基配列を記載した。各塩基配列の後に記載した（）内の数字は、配列番号を示している。なおＴａｑＭａｎプローブの５’末端はＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、また３’末端はＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で標識されている。
【０２９８】
2004121218.tif 000116
2004121218.tif 000117
【０２９９】
2004121218.tif 000118
【０３００】
2004121218.tif 000119
【０３０１】
2004121218.tif 000120
【０３０２】
2004121218.tif 000121
2004121218.tif 000122
【０３０３】
2004121218.tif 000123
【０３０４】
2004121218.tif 000124
2004121218.tif 000125
【０３０５】
2004121218.tif 000126
【０３０６】
2004121218.tif 000127
2004121218.tif 000128
【０３０７】
2004121218.tif 000129
2004121218.tif 000130
【０３０８】
2004121218.tif 000131
【０３０９】
2004121218.tif 000132
2004121218.tif 000133
【０３１０】
2004121218.tif 000134
2004121218.tif 000135
【０３１１】
2004121218.tif 000136
2004121218.tif 000137
【０３１２】
2004121218.tif 000138
【０３１３】
2004121218.tif 000139
2004121218.tif 000140
【０３１４】
2004121218.tif 000141
【０３１５】
2004121218.tif 000142
【０３１６】
2004121218.tif 000143
2004121218.tif 000144
2004121218.tif 000145
【０３１７】
2004121218.tif 000146
【０３１８】
2004121218.tif 000147
【０３１９】
2004121218.tif 000148
【０３２０】
2004121218.tif 000149
【０３２１】
前述の方法で抽出した全ＲＮＡをＤＮａｓｅ（ニッポンジーン）処理した。その後、ｒａｎｄａｍ　ｈｅｘａｍｅｒ　（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）をプライマーとして逆転写したｃＤＮＡを鋳型とした。コピー数を算出する標準曲線のために両プライマーで増幅される塩基配列領域を含むプラスミドクローンを各々の遺伝子について準備し、その段階希釈を鋳型として反応を行った。ＰＣＲ増幅のモニタリングのための反応液の組成は表３９に示した組成と同一である。
【０３２２】
また、試料中のｃＤＮＡ濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子、およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子のコピー数を算出した。
ヒト、マウスβアクチン及びヒト、マウスＧＡＰＤＨ測定用のプライマーとプローブの塩基配列は、実施例６（ヒト、配列番号：７−配列番号：１２）および実施例９（マウス、配列番号：１８−配列番号：２３）に示したとおりである。βアクチンにより補正した各遺伝子の発現量（ｃｏｐｙ／ｎｇ　ＲＮＡ）を図７−図３１（ヒトとマウスの両者で変動したもの）、および図３２−図６９（ヒトで変動したもの）に示す。いずれの遺伝子についても、ＯＶＡ投与群において有意な発現レベルの変化が見られた。具体的には、Ａ）群の遺伝子の発現レベルの上昇、そしてＢ）群の遺伝子の発現レベルの低下が確認された。
【０３２３】
６．ＯＶＡ抗原暴露気道過敏性モデル肺でのｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｙｚａｔｉｏｎ　（以下ＩＳＨと示す）における各遺伝子の局在確認
Ａ３２／ＩＬ−１Ｒ−１、Ａ３６／ＡＤＡＭ　８、Ａ３７／ｄｉｕｂｉｑｕｔｉｎ、Ａ４２／ＳＤＣ１、Ａ５０／ＩＧＦＢＰ３、およびＡ１２９／ＣＴＳＣについて、その局在パターンを解析した。ＯＶＡ抗原暴露気道過敏性モデルマウス最終抗原暴露２４時間後のｎａｉｖｅ群、Ｓ−Ｓａｌ群、Ｐｒｅｄ群あるいはＳ−ＯＶＡ４群の各３匹について、１０％中性緩衝ホルマリンを用い潅流固定後に肺組織を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンによる固定後パラフィン包埋して、ブロックを作製した。
【０３２４】
すべてのサンプルのマウス肺パラフィンブロックを３　μｍの厚さに薄切し、ヘマトキシリンにて核染色した。その切片の中で、組織の状態が良かったＳ−Ｓａｌ群とＳ−ＯＶＡ群の１例づつを用いてＩＳＨを実施した。ＩＳＨ用のプローブは、以下の配列番号に示した
ＣＴＳＣ（配列番号：２０８０、２０８１）
ＩＬ−１受容体１（配列番号：２０８２）
ＡＤＡＭ８（配列番号：２０８３）
ｄｉｕｂｉｑｕｔｉｎ（配列番号：２０８４）
ＳＤＣ１（配列番号：２０８５）
ＩＧＦＢＰ３（配列番号：２０８６）
【０３２５】
上記プローブを用いて、Ｓ−Ｓａｌ群とＳ−ＯＶＡのマウス肺のパラフィン切片を用いて、脱パラフィンによる親水化（キシレン、１００，９０，８０，７０％アルコールで処理した後水洗い）をした後、各遺伝子のＩＳＨ染色を実施した。染色後は、ケルネトールにより核染色を行った。ＩＳＨの条件は以下のとおりである。各遺伝子の局在の結果を表１５８に示した。
プローブ濃度；２５０　ｎｇ／ｍｌ
ハイブリダイゼーション温度；６０℃
ハイブリダイゼーション時間；６時間
ハイブリダイゼーション後の洗浄；０．１ｘＳＳＣ／７０℃／６分／３回
発色基質；ＮＢＴ／ＢＣＩＰ
発色時間；７時間
【０３２６】
【表１１４】
2004121218.tif 000150
【０３２７】
【発明の効果】
本発明は、以下のａ）およびｂ）の各群に示す気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の指標遺伝子を提供する。
ａ）　気道上皮細胞をＩＬ−１３によって刺激したときに発現レベルが高まる遺伝子群：
ｂ）　気道上皮細胞をＩＬ−１３によって刺激したときに発現レベルが低下する遺伝子群：
各遺伝子の発現レベルを指標とすることにより、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患モデル動物の作成、および該疾患の治療のための化合物をスクリーニングすることが可能となった。本発明の指標遺伝子はいずれもＡＩ法によって培養された気道上皮細胞において、ＩＬ−１３の刺激によって発現レベルの変動が観察された。ＡＩ法は、気道上皮細胞を局所に近い状態で培養することができる培養方法である。したがって、本発明において見出された指標遺伝子は、実際に気道組織においてもＩＬ−１３の刺激によって発現が変動している可能性が高い。本発明の指標遺伝子がマウス喘息モデルにおいて実際に上昇していることは実施例においても確認されているとおりである。したがって、本発明の指標遺伝子は、いずれも気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の指標、あるいは気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療の標的としての有用性を有する。
【０３２８】
本発明の各指標遺伝子は、その発現の変化が病態と結びついている。したがって指標遺伝子の発現や、指標遺伝子によってコードされる蛋白質の活性を調節することによって気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療が可能となる。例えば気道上皮細胞の杯細胞への分化にともなって気道上皮細胞において発現が上昇する遺伝子の場合には、発現やその活性を阻害することが、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療戦略のターゲットとなる。逆に発現が低下する遺伝子の場合には、発現や活性を促進することが、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療戦略のターゲットとなる。また、これらの指標遺伝子は、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療におけるモニタリングのための新しい臨床診断指標としての有用性が期待できる。
【０３２９】
本発明によって提供された各指標遺伝子は、アレルゲンの種類に関わらず、簡便にその発現レベルを知ることができる。従って、アレルギー反応の病態を総合的に把握することができる。
また本発明による気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法は、生体試料を試料としてその発現レベルを解析することができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺伝子発現解析に関しては、微量サンプルによる高感度な測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスループット化、低価格化が進行している。従って本発明による気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法は、近い将来、ベッドサイドにおける重要な診断方法となることが期待される。この意味で本発明の指標遺伝子の診断的価値は高い。
【０３３０】
更に、本発明により、気道上皮細胞におけるペンドリンの発現がＩＬ−１３刺激により増加することが明らかにされ、ペンドリンをコードするＰＤＳ遺伝子が気道上皮の杯細胞への分化に関与する遺伝子であることが示された。ペンドリンの発現はまた、喘息モデルマウスの肺でも上昇しており、本発明により、ペンドリンをコードするＰＤＳ遺伝子が気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患と密接な関連を有する遺伝子であることが明らかにされた。杯細胞への分化を抑制する薬剤の開発は近年になり漸く進められてきたものであり、創薬開発においては新しい切り口となる。また、本発明により杯細胞の分化に関与する遺伝子が解明されたことから、より根本的な治療を行うことが可能となると考えられる。さらに、杯細胞の分化に関与する遺伝子の発現、または杯細胞の分化に関与する蛋白質の活性を調節する薬剤は、喘息以外にも、粘液の過剰産生と炎症が係わっている慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、慢性副鼻腔炎、気管支拡張症、び慢性汎細気管支炎等の治療においても有用である。
【０３３１】
【配列表】
2004121218.tif 000151
2004121218.tif 000152
2004121218.tif 000153
2004121218.tif 000154
2004121218.tif 000155
2004121218.tif 000156
2004121218.tif 000157
2004121218.tif 000158
2004121218.tif 000159
2004121218.tif 000160
2004121218.tif 000161
2004121218.tif 000162
2004121218.tif 000163
2004121218.tif 000164
2004121218.tif 000165
2004121218.tif 000166
2004121218.tif 000167
2004121218.tif 000168
2004121218.tif 000169
2004121218.tif 000170
2004121218.tif 000171
2004121218.tif 000172
2004121218.tif 000173
2004121218.tif 000174
2004121218.tif 000175
2004121218.tif 000176
2004121218.tif 000177
2004121218.tif 000178
2004121218.tif 000179
2004121218.tif 000180
2004121218.tif 000181
2004121218.tif 000182
2004121218.tif 000183
2004121218.tif 000184
2004121218.tif 000185
2004121218.tif 000186
2004121218.tif 000187
2004121218.tif 000188
2004121218.tif 000189
2004121218.tif 000190
2004121218.tif 000191
2004121218.tif 000192
2004121218.tif 000193
2004121218.tif 000194
2004121218.tif 000195
2004121218.tif 000196
2004121218.tif 000197
2004121218.tif 000198
2004121218.tif 000199
2004121218.tif 000200
2004121218.tif 000201
2004121218.tif 000202
2004121218.tif 000203
2004121218.tif 000204
2004121218.tif 000205
2004121218.tif 000206
2004121218.tif 000207
2004121218.tif 000208
2004121218.tif 000209
2004121218.tif 000210
2004121218.tif 000211
2004121218.tif 000212
2004121218.tif 000213
2004121218.tif 000214
2004121218.tif 000215
2004121218.tif 000216
2004121218.tif 000217
2004121218.tif 000218
2004121218.tif 000219
2004121218.tif 000220
2004121218.tif 000221
2004121218.tif 000222
2004121218.tif 000223
2004121218.tif 000224
2004121218.tif 000225
2004121218.tif 000226
2004121218.tif 000227
2004121218.tif 000228
2004121218.tif 000229
2004121218.tif 000230
2004121218.tif 000231
2004121218.tif 000232
2004121218.tif 000233
2004121218.tif 000234
2004121218.tif 000235
2004121218.tif 000236
2004121218.tif 000237
2004121218.tif 000238
2004121218.tif 000239
2004121218.tif 000240
2004121218.tif 000241
2004121218.tif 000242
2004121218.tif 000243
2004121218.tif 000244
2004121218.tif 000245
2004121218.tif 000246
2004121218.tif 000247
2004121218.tif 000248
2004121218.tif 000249
2004121218.tif 000250
2004121218.tif 000251
2004121218.tif 000252
2004121218.tif 000253
2004121218.tif 000254
2004121218.tif 000255
2004121218.tif 000256
2004121218.tif 000257
2004121218.tif 000258
2004121218.tif 000259
2004121218.tif 000260
2004121218.tif 000261
2004121218.tif 000262
2004121218.tif 000263
2004121218.tif 000264
2004121218.tif 000265
2004121218.tif 000266
2004121218.tif 000267
2004121218.tif 000268
2004121218.tif 000269
2004121218.tif 000270
2004121218.tif 000271
2004121218.tif 000272
2004121218.tif 000273
2004121218.tif 000274
2004121218.tif 000275
2004121218.tif 000276
2004121218.tif 000277
2004121218.tif 000278
2004121218.tif 000279
2004121218.tif 000280
2004121218.tif 000281
2004121218.tif 000282
2004121218.tif 000283
2004121218.tif 000284
2004121218.tif 000285
2004121218.tif 000286
2004121218.tif 000287
2004121218.tif 000288
2004121218.tif 000289
2004121218.tif 000290
2004121218.tif 000291
2004121218.tif 000292
2004121218.tif 000293
2004121218.tif 000294
2004121218.tif 000295
2004121218.tif 000296
2004121218.tif 000297
2004121218.tif 000298
2004121218.tif 000299
2004121218.tif 000300
2004121218.tif 000301
2004121218.tif 000302
2004121218.tif 000303
2004121218.tif 000304
2004121218.tif 000305
2004121218.tif 000306
2004121218.tif 000307
2004121218.tif 000308
2004121218.tif 000309
2004121218.tif 000310
2004121218.tif 000311
2004121218.tif 000312
2004121218.tif 000313
2004121218.tif 000314
2004121218.tif 000315
2004121218.tif 000316
2004121218.tif 000317
2004121218.tif 000318
2004121218.tif 000319
2004121218.tif 000320
2004121218.tif 000321
2004121218.tif 000322
2004121218.tif 000323
2004121218.tif 000324
2004121218.tif 000325
2004121218.tif 000326
2004121218.tif 000327
2004121218.tif 000328
2004121218.tif 000329
2004121218.tif 000330
2004121218.tif 000331
2004121218.tif 000332
2004121218.tif 000333
2004121218.tif 000334
2004121218.tif 000335
2004121218.tif 000336
2004121218.tif 000337
2004121218.tif 000338
2004121218.tif 000339
2004121218.tif 000340
2004121218.tif 000341
2004121218.tif 000342
2004121218.tif 000343
2004121218.tif 000344
2004121218.tif 000345
2004121218.tif 000346
2004121218.tif 000347
2004121218.tif 000348
2004121218.tif 000349
2004121218.tif 000350
2004121218.tif 000351
2004121218.tif 000352
2004121218.tif 000353
2004121218.tif 000354
2004121218.tif 000355
2004121218.tif 000356
2004121218.tif 000357
2004121218.tif 000358
2004121218.tif 000359
2004121218.tif 000360
2004121218.tif 000361
2004121218.tif 000362
2004121218.tif 000363
2004121218.tif 000364
2004121218.tif 000365
2004121218.tif 000366
2004121218.tif 000367
2004121218.tif 000368
2004121218.tif 000369
2004121218.tif 000370
2004121218.tif 000371
2004121218.tif 000372
2004121218.tif 000373
2004121218.tif 000374
2004121218.tif 000375
2004121218.tif 000376
2004121218.tif 000377
2004121218.tif 000378
2004121218.tif 000379
2004121218.tif 000380
2004121218.tif 000381
2004121218.tif 000382
2004121218.tif 000383
2004121218.tif 000384
2004121218.tif 000385
2004121218.tif 000386
2004121218.tif 000387
2004121218.tif 000388
2004121218.tif 000389
2004121218.tif 000390
2004121218.tif 000391
2004121218.tif 000392
2004121218.tif 000393
2004121218.tif 000394
2004121218.tif 000395
2004121218.tif 000396
2004121218.tif 000397
2004121218.tif 000398
2004121218.tif 000399
2004121218.tif 000400
2004121218.tif 000401
2004121218.tif 000402
2004121218.tif 000403
2004121218.tif 000404
2004121218.tif 000405
2004121218.tif 000406
2004121218.tif 000407
2004121218.tif 000408
2004121218.tif 000409
2004121218.tif 000410
2004121218.tif 000411
2004121218.tif 000412
2004121218.tif 000413
2004121218.tif 000414
2004121218.tif 000415
2004121218.tif 000416
2004121218.tif 000417
2004121218.tif 000418
2004121218.tif 000419
2004121218.tif 000420
2004121218.tif 000421
2004121218.tif 000422
2004121218.tif 000423
2004121218.tif 000424
2004121218.tif 000425
2004121218.tif 000426
2004121218.tif 000427
2004121218.tif 000428
2004121218.tif 000429
2004121218.tif 000430
2004121218.tif 000431
2004121218.tif 000432
2004121218.tif 000433
2004121218.tif 000434
2004121218.tif 000435
2004121218.tif 000436
2004121218.tif 000437
2004121218.tif 000438
2004121218.tif 000439
2004121218.tif 000440
2004121218.tif 000441
2004121218.tif 000442
2004121218.tif 000443
2004121218.tif 000444
2004121218.tif 000445
2004121218.tif 000446
2004121218.tif 000447
2004121218.tif 000448
2004121218.tif 000449
2004121218.tif 000450
2004121218.tif 000451
2004121218.tif 000452
2004121218.tif 000453
2004121218.tif 000454
2004121218.tif 000455
2004121218.tif 000456
2004121218.tif 000457
2004121218.tif 000458
2004121218.tif 000459
2004121218.tif 000460
2004121218.tif 000461
2004121218.tif 000462
2004121218.tif 000463
2004121218.tif 000464
2004121218.tif 000465
2004121218.tif 000466
2004121218.tif 000467
2004121218.tif 000468
2004121218.tif 000469
2004121218.tif 000470
2004121218.tif 000471
2004121218.tif 000472
2004121218.tif 000473
2004121218.tif 000474
2004121218.tif 000475
2004121218.tif 000476
2004121218.tif 000477
2004121218.tif 000478
2004121218.tif 000479
2004121218.tif 000480
2004121218.tif 000481
2004121218.tif 000482
2004121218.tif 000483
2004121218.tif 000484
2004121218.tif 000485
2004121218.tif 000486
2004121218.tif 000487
2004121218.tif 000488
2004121218.tif 000489
2004121218.tif 000490
2004121218.tif 000491
2004121218.tif 000492
2004121218.tif 000493
2004121218.tif 000494
2004121218.tif 000495
2004121218.tif 000496
2004121218.tif 000497
2004121218.tif 000498
2004121218.tif 000499
2004121218.tif 000500
2004121218.tif 000501
2004121218.tif 000502
2004121218.tif 000503
2004121218.tif 000504
2004121218.tif 000505
2004121218.tif 000506
2004121218.tif 000507
2004121218.tif 000508
2004121218.tif 000509
2004121218.tif 000510
2004121218.tif 000511
2004121218.tif 000512
2004121218.tif 000513
2004121218.tif 000514
2004121218.tif 000515
2004121218.tif 000516
2004121218.tif 000517
2004121218.tif 000518
2004121218.tif 000519
2004121218.tif 000520
2004121218.tif 000521
2004121218.tif 000522
2004121218.tif 000523
2004121218.tif 000524
2004121218.tif 000525
2004121218.tif 000526
2004121218.tif 000527
2004121218.tif 000528
2004121218.tif 000529
2004121218.tif 000530
2004121218.tif 000531
2004121218.tif 000532
2004121218.tif 000533
2004121218.tif 000534
2004121218.tif 000535
2004121218.tif 000536
2004121218.tif 000537
2004121218.tif 000538
2004121218.tif 000539
2004121218.tif 000540
2004121218.tif 000541
2004121218.tif 000542
2004121218.tif 000543
2004121218.tif 000544
2004121218.tif 000545
2004121218.tif 000546
2004121218.tif 000547
2004121218.tif 000548
2004121218.tif 000549
2004121218.tif 000550
2004121218.tif 000551
2004121218.tif 000552
2004121218.tif 000553
2004121218.tif 000554
2004121218.tif 000555
2004121218.tif 000556
2004121218.tif 000557
2004121218.tif 000558
2004121218.tif 000559
2004121218.tif 000560
2004121218.tif 000561
2004121218.tif 000562
2004121218.tif 000563
2004121218.tif 000564
2004121218.tif 000565
2004121218.tif 000566
2004121218.tif 000567
2004121218.tif 000568
2004121218.tif 000569
2004121218.tif 000570
2004121218.tif 000571
2004121218.tif 000572
2004121218.tif 000573
2004121218.tif 000574
2004121218.tif 000575
2004121218.tif 000576
2004121218.tif 000577
2004121218.tif 000578
2004121218.tif 000579
2004121218.tif 000580
2004121218.tif 000581
2004121218.tif 000582
2004121218.tif 000583
2004121218.tif 000584
2004121218.tif 000585
2004121218.tif 000586
2004121218.tif 000587
2004121218.tif 000588
2004121218.tif 000589
2004121218.tif 000590
2004121218.tif 000591
2004121218.tif 000592
2004121218.tif 000593
2004121218.tif 000594
2004121218.tif 000595
2004121218.tif 000596
2004121218.tif 000597
2004121218.tif 000598
2004121218.tif 000599
2004121218.tif 000600
2004121218.tif 000601
2004121218.tif 000602
2004121218.tif 000603
2004121218.tif 000604
2004121218.tif 000605
2004121218.tif 000606
2004121218.tif 000607
2004121218.tif 000608
2004121218.tif 000609
2004121218.tif 000610
2004121218.tif 000611
2004121218.tif 000612
2004121218.tif 000613
2004121218.tif 000614
2004121218.tif 000615
2004121218.tif 000616
2004121218.tif 000617
2004121218.tif 000618
2004121218.tif 000619
2004121218.tif 000620
2004121218.tif 000621
2004121218.tif 000622
2004121218.tif 000623
2004121218.tif 000624
2004121218.tif 000625
2004121218.tif 000626
2004121218.tif 000627
2004121218.tif 000628
2004121218.tif 000629
2004121218.tif 000630
2004121218.tif 000631
2004121218.tif 000632
2004121218.tif 000633
2004121218.tif 000634
2004121218.tif 000635
2004121218.tif 000636
2004121218.tif 000637
2004121218.tif 000638
2004121218.tif 000639
2004121218.tif 000640
2004121218.tif 000641
2004121218.tif 000642
2004121218.tif 000643
2004121218.tif 000644
2004121218.tif 000645
2004121218.tif 000646
2004121218.tif 000647
2004121218.tif 000648
2004121218.tif 000649
2004121218.tif 000650
2004121218.tif 000651
2004121218.tif 000652
2004121218.tif 000653
2004121218.tif 000654
2004121218.tif 000655
2004121218.tif 000656
2004121218.tif 000657
2004121218.tif 000658
2004121218.tif 000659
2004121218.tif 000660
2004121218.tif 000661
2004121218.tif 000662
2004121218.tif 000663
2004121218.tif 000664
2004121218.tif 000665
2004121218.tif 000666
2004121218.tif 000667
2004121218.tif 000668
2004121218.tif 000669
2004121218.tif 000670
2004121218.tif 000671
2004121218.tif 000672
2004121218.tif 000673
2004121218.tif 000674
2004121218.tif 000675
2004121218.tif 000676
2004121218.tif 000677
2004121218.tif 000678
2004121218.tif 000679
2004121218.tif 000680
2004121218.tif 000681
2004121218.tif 000682
2004121218.tif 000683
2004121218.tif 000684
2004121218.tif 000685
2004121218.tif 000686
2004121218.tif 000687
2004121218.tif 000688
2004121218.tif 000689
2004121218.tif 000690
2004121218.tif 000691
2004121218.tif 000692
2004121218.tif 000693
2004121218.tif 000694
2004121218.tif 000695
2004121218.tif 000696
2004121218.tif 000697
2004121218.tif 000698
2004121218.tif 000699
2004121218.tif 000700
2004121218.tif 000701
2004121218.tif 000702
2004121218.tif 000703
2004121218.tif 000704
2004121218.tif 000705
2004121218.tif 000706
2004121218.tif 000707
2004121218.tif 000708
2004121218.tif 000709
2004121218.tif 000710
2004121218.tif 000711
2004121218.tif 000712
2004121218.tif 000713
2004121218.tif 000714
2004121218.tif 000715
2004121218.tif 000716
2004121218.tif 000717
2004121218.tif 000718
2004121218.tif 000719
2004121218.tif 000720
2004121218.tif 000721
2004121218.tif 000722
2004121218.tif 000723
2004121218.tif 000724
2004121218.tif 000725
2004121218.tif 000726
2004121218.tif 000727
2004121218.tif 000728
2004121218.tif 000729
2004121218.tif 000730
2004121218.tif 000731
2004121218.tif 000732
2004121218.tif 000733
2004121218.tif 000734
2004121218.tif 000735
2004121218.tif 000736
2004121218.tif 000737
2004121218.tif 000738
2004121218.tif 000739
2004121218.tif 000740
2004121218.tif 000741
2004121218.tif 000742
2004121218.tif 000743
2004121218.tif 000744
2004121218.tif 000745
2004121218.tif 000746
2004121218.tif 000747
2004121218.tif 000748
2004121218.tif 000749
2004121218.tif 000750
2004121218.tif 000751
2004121218.tif 000752
2004121218.tif 000753
2004121218.tif 000754
2004121218.tif 000755
2004121218.tif 000756
2004121218.tif 000757
2004121218.tif 000758
2004121218.tif 000759
2004121218.tif 000760
2004121218.tif 000761
2004121218.tif 000762
2004121218.tif 000763
2004121218.tif 000764
2004121218.tif 000765
2004121218.tif 000766
2004121218.tif 000767
2004121218.tif 000768
2004121218.tif 000769
2004121218.tif 000770
2004121218.tif 000771
2004121218.tif 000772
2004121218.tif 000773
2004121218.tif 000774
2004121218.tif 000775
2004121218.tif 000776
2004121218.tif 000777
2004121218.tif 000778
2004121218.tif 000779
2004121218.tif 000780
2004121218.tif 000781
2004121218.tif 000782
2004121218.tif 000783
2004121218.tif 000784
2004121218.tif 000785
2004121218.tif 000786
2004121218.tif 000787
2004121218.tif 000788
2004121218.tif 000789
2004121218.tif 000790
2004121218.tif 000791
2004121218.tif 000792
2004121218.tif 000793
2004121218.tif 000794
2004121218.tif 000795
2004121218.tif 000796
2004121218.tif 000797
2004121218.tif 000798
2004121218.tif 000799
2004121218.tif 000800
2004121218.tif 000801
2004121218.tif 000802
2004121218.tif 000803
2004121218.tif 000804
2004121218.tif 000805
2004121218.tif 000806
2004121218.tif 000807
2004121218.tif 000808
2004121218.tif 000809
2004121218.tif 000810
2004121218.tif 000811
2004121218.tif 000812
2004121218.tif 000813
2004121218.tif 000814
2004121218.tif 000815
2004121218.tif 000816
2004121218.tif 000817
2004121218.tif 000818
2004121218.tif 000819
2004121218.tif 000820
2004121218.tif 000821
2004121218.tif 000822
2004121218.tif 000823
2004121218.tif 000824
2004121218.tif 000825
2004121218.tif 000826
2004121218.tif 000827
2004121218.tif 000828
2004121218.tif 000829
2004121218.tif 000830
2004121218.tif 000831
2004121218.tif 000832
2004121218.tif 000833
2004121218.tif 000834
2004121218.tif 000835
2004121218.tif 000836
2004121218.tif 000837
2004121218.tif 000838
2004121218.tif 000839
2004121218.tif 000840
2004121218.tif 000841
2004121218.tif 000842
2004121218.tif 000843
2004121218.tif 000844
2004121218.tif 000845
2004121218.tif 000846
2004121218.tif 000847
2004121218.tif 000848
2004121218.tif 000849
2004121218.tif 000850
2004121218.tif 000851
2004121218.tif 000852
2004121218.tif 000853
2004121218.tif 000854
2004121218.tif 000855
2004121218.tif 000856
2004121218.tif 000857
2004121218.tif 000858
2004121218.tif 000859
2004121218.tif 000860
2004121218.tif 000861
2004121218.tif 000862
2004121218.tif 000863
2004121218.tif 000864
2004121218.tif 000865
2004121218.tif 000866
2004121218.tif 000867
2004121218.tif 000868
2004121218.tif 000869
2004121218.tif 000870
2004121218.tif 000871
2004121218.tif 000872
2004121218.tif 000873
2004121218.tif 000874
2004121218.tif 000875
2004121218.tif 000876
2004121218.tif 000877
2004121218.tif 000878
2004121218.tif 000879
2004121218.tif 000880
2004121218.tif 000881
2004121218.tif 000882
2004121218.tif 000883
2004121218.tif 000884
2004121218.tif 000885
2004121218.tif 000886
2004121218.tif 000887
2004121218.tif 000888
2004121218.tif 000889
2004121218.tif 000890
2004121218.tif 000891
2004121218.tif 000892
2004121218.tif 000893
2004121218.tif 000894
2004121218.tif 000895
2004121218.tif 000896
2004121218.tif 000897
2004121218.tif 000898
2004121218.tif 000899
2004121218.tif 000900
2004121218.tif 000901
2004121218.tif 000902
2004121218.tif 000903
2004121218.tif 000904
2004121218.tif 000905
2004121218.tif 000906
2004121218.tif 000907
2004121218.tif 000908
2004121218.tif 000909
2004121218.tif 000910
2004121218.tif 000911
2004121218.tif 000912
2004121218.tif 000913
2004121218.tif 000914
2004121218.tif 000915
2004121218.tif 000916
2004121218.tif 000917
2004121218.tif 000918
2004121218.tif 000919
2004121218.tif 000920
2004121218.tif 000921
2004121218.tif 000922
2004121218.tif 000923
2004121218.tif 000924
2004121218.tif 000925
2004121218.tif 000926
2004121218.tif 000927
2004121218.tif 000928
2004121218.tif 000929
2004121218.tif 000930
2004121218.tif 000931
2004121218.tif 000932
2004121218.tif 000933
2004121218.tif 000934
2004121218.tif 000935
2004121218.tif 000936
2004121218.tif 000937
2004121218.tif 000938
2004121218.tif 000939
2004121218.tif 000940
2004121218.tif 000941
2004121218.tif 000942
2004121218.tif 000943
2004121218.tif 000944
2004121218.tif 000945
2004121218.tif 000946
2004121218.tif 000947
2004121218.tif 000948
2004121218.tif 000949
2004121218.tif 000950
2004121218.tif 000951
2004121218.tif 000952
2004121218.tif 000953
2004121218.tif 000954
2004121218.tif 000955
2004121218.tif 000956
2004121218.tif 000957
2004121218.tif 000958
2004121218.tif 000959
2004121218.tif 000960
2004121218.tif 000961
2004121218.tif 000962
2004121218.tif 000963
2004121218.tif 000964
2004121218.tif 000965
2004121218.tif 000966
2004121218.tif 000967
2004121218.tif 000968
2004121218.tif 000969
2004121218.tif 000970
2004121218.tif 000971
2004121218.tif 000972
2004121218.tif 000973
2004121218.tif 000974
2004121218.tif 000975
2004121218.tif 000976
2004121218.tif 000977
2004121218.tif 000978
2004121218.tif 000979
2004121218.tif 000980
2004121218.tif 000981
2004121218.tif 000982
2004121218.tif 000983
2004121218.tif 000984
2004121218.tif 000985
2004121218.tif 000986
2004121218.tif 000987
2004121218.tif 000988
2004121218.tif 000989
2004121218.tif 000990
2004121218.tif 000991
2004121218.tif 000992
2004121218.tif 000993
2004121218.tif 000994
2004121218.tif 000995
2004121218.tif 000996
2004121218.tif 000997
2004121218.tif 000998
2004121218.tif 000999
2004121218.tif 001000
2004121218.tif 001001
2004121218.tif 001002
2004121218.tif 001003
2004121218.tif 001004
2004121218.tif 001005
2004121218.tif 001006
2004121218.tif 001007
2004121218.tif 001008
2004121218.tif 001009
2004121218.tif 001010
2004121218.tif 001011
2004121218.tif 001012
2004121218.tif 001013
2004121218.tif 001014
2004121218.tif 001015
2004121218.tif 001016
2004121218.tif 001017
2004121218.tif 001018
2004121218.tif 001019
2004121218.tif 001020
2004121218.tif 001021
2004121218.tif 001022
2004121218.tif 001023
2004121218.tif 001024
2004121218.tif 001025
2004121218.tif 001026
2004121218.tif 001027
2004121218.tif 001028
2004121218.tif 001029
2004121218.tif 001030
2004121218.tif 001031
2004121218.tif 001032
2004121218.tif 001033
2004121218.tif 001034
2004121218.tif 001035
2004121218.tif 001036
2004121218.tif 001037
2004121218.tif 001038
2004121218.tif 001039
2004121218.tif 001040
2004121218.tif 001041
2004121218.tif 001042
2004121218.tif 001043
2004121218.tif 001044
2004121218.tif 001045
2004121218.tif 001046
2004121218.tif 001047
2004121218.tif 001048
2004121218.tif 001049
2004121218.tif 001050
2004121218.tif 001051
2004121218.tif 001052
2004121218.tif 001053
2004121218.tif 001054
2004121218.tif 001055
2004121218.tif 001056
2004121218.tif 001057
2004121218.tif 001058
2004121218.tif 001059
2004121218.tif 001060
2004121218.tif 001061
2004121218.tif 001062
2004121218.tif 001063
2004121218.tif 001064
2004121218.tif 001065
2004121218.tif 001066
2004121218.tif 001067
2004121218.tif 001068
2004121218.tif 001069
2004121218.tif 001070
2004121218.tif 001071
2004121218.tif 001072
2004121218.tif 001073
2004121218.tif 001074
2004121218.tif 001075
2004121218.tif 001076
2004121218.tif 001077
2004121218.tif 001078
2004121218.tif 001079
2004121218.tif 001080
2004121218.tif 001081
2004121218.tif 001082
2004121218.tif 001083
2004121218.tif 001084
2004121218.tif 001085
2004121218.tif 001086
2004121218.tif 001087
2004121218.tif 001088
2004121218.tif 001089
2004121218.tif 001090
2004121218.tif 001091
2004121218.tif 001092
2004121218.tif 001093
2004121218.tif 001094
2004121218.tif 001095
2004121218.tif 001096
2004121218.tif 001097
2004121218.tif 001098
2004121218.tif 001099
2004121218.tif 001100
2004121218.tif 001101
2004121218.tif 001102
2004121218.tif 001103
2004121218.tif 001104
2004121218.tif 001105
2004121218.tif 001106
2004121218.tif 001107
2004121218.tif 001108
2004121218.tif 001109
2004121218.tif 001110
2004121218.tif 001111
2004121218.tif 001112
2004121218.tif 001113
2004121218.tif 001114
2004121218.tif 001115
2004121218.tif 001116
2004121218.tif 001117
2004121218.tif 001118
2004121218.tif 001119
2004121218.tif 001120
2004121218.tif 001121
2004121218.tif 001122
2004121218.tif 001123
2004121218.tif 001124
2004121218.tif 001125
2004121218.tif 001126
2004121218.tif 001127
2004121218.tif 001128
2004121218.tif 001129
2004121218.tif 001130
2004121218.tif 001131
2004121218.tif 001132
2004121218.tif 001133
2004121218.tif 001134
2004121218.tif 001135
2004121218.tif 001136
2004121218.tif 001137
2004121218.tif 001138
2004121218.tif 001139
2004121218.tif 001140
2004121218.tif 001141
2004121218.tif 001142
2004121218.tif 001143
2004121218.tif 001144
2004121218.tif 001145
2004121218.tif 001146
2004121218.tif 001147
2004121218.tif 001148
2004121218.tif 001149
2004121218.tif 001150
2004121218.tif 001151
2004121218.tif 001152
2004121218.tif 001153
2004121218.tif 001154
2004121218.tif 001155
2004121218.tif 001156
2004121218.tif 001157
2004121218.tif 001158
2004121218.tif 001159
2004121218.tif 001160
2004121218.tif 001161
2004121218.tif 001162
2004121218.tif 001163
2004121218.tif 001164
2004121218.tif 001165
2004121218.tif 001166
2004121218.tif 001167
2004121218.tif 001168
2004121218.tif 001169
2004121218.tif 001170
2004121218.tif 001171
2004121218.tif 001172
2004121218.tif 001173
2004121218.tif 001174
2004121218.tif 001175
2004121218.tif 001176
2004121218.tif 001177
2004121218.tif 001178
2004121218.tif 001179
2004121218.tif 001180
2004121218.tif 001181
2004121218.tif 001182
2004121218.tif 001183
2004121218.tif 001184
2004121218.tif 001185
2004121218.tif 001186
2004121218.tif 001187
2004121218.tif 001188
2004121218.tif 001189
2004121218.tif 001190
2004121218.tif 001191
2004121218.tif 001192
2004121218.tif 001193
2004121218.tif 001194
2004121218.tif 001195
2004121218.tif 001196
2004121218.tif 001197
2004121218.tif 001198
2004121218.tif 001199
2004121218.tif 001200
2004121218.tif 001201
2004121218.tif 001202
2004121218.tif 001203
2004121218.tif 001204
2004121218.tif 001205
2004121218.tif 001206
2004121218.tif 001207
2004121218.tif 001208
2004121218.tif 001209
2004121218.tif 001210
2004121218.tif 001211
2004121218.tif 001212
2004121218.tif 001213
2004121218.tif 001214
2004121218.tif 001215
2004121218.tif 001216
2004121218.tif 001217
2004121218.tif 001218
2004121218.tif 001219
2004121218.tif 001220
2004121218.tif 001221
2004121218.tif 001222
2004121218.tif 001223
2004121218.tif 001224
2004121218.tif 001225
2004121218.tif 001226
2004121218.tif 001227
2004121218.tif 001228
2004121218.tif 001229
2004121218.tif 001230
2004121218.tif 001231
2004121218.tif 001232
2004121218.tif 001233
2004121218.tif 001234
2004121218.tif 001235
2004121218.tif 001236
2004121218.tif 001237
2004121218.tif 001238
2004121218.tif 001239
2004121218.tif 001240
2004121218.tif 001241
2004121218.tif 001242
2004121218.tif 001243
2004121218.tif 001244
2004121218.tif 001245
2004121218.tif 001246
2004121218.tif 001247
2004121218.tif 001248
2004121218.tif 001249
2004121218.tif 001250
2004121218.tif 001251
2004121218.tif 001252
2004121218.tif 001253
2004121218.tif 001254
2004121218.tif 001255
2004121218.tif 001256
2004121218.tif 001257
2004121218.tif 001258
2004121218.tif 001259
2004121218.tif 001260
2004121218.tif 001261
2004121218.tif 001262
2004121218.tif 001263
2004121218.tif 001264
2004121218.tif 001265
2004121218.tif 001266
2004121218.tif 001267
2004121218.tif 001268
2004121218.tif 001269
2004121218.tif 001270
2004121218.tif 001271
2004121218.tif 001272
2004121218.tif 001273
2004121218.tif 001274
2004121218.tif 001275
2004121218.tif 001276
2004121218.tif 001277
2004121218.tif 001278
2004121218.tif 001279
2004121218.tif 001280
2004121218.tif 001281
2004121218.tif 001282
2004121218.tif 001283
2004121218.tif 001284
2004121218.tif 001285
2004121218.tif 001286
2004121218.tif 001287
2004121218.tif 001288
2004121218.tif 001289
2004121218.tif 001290
2004121218.tif 001291
2004121218.tif 001292
2004121218.tif 001293
2004121218.tif 001294
2004121218.tif 001295
2004121218.tif 001296
2004121218.tif 001297
2004121218.tif 001298
2004121218.tif 001299
2004121218.tif 001300
2004121218.tif 001301
2004121218.tif 001302
2004121218.tif 001303
2004121218.tif 001304
2004121218.tif 001305
2004121218.tif 001306
2004121218.tif 001307
2004121218.tif 001308
2004121218.tif 001309
2004121218.tif 001310
2004121218.tif 001311
2004121218.tif 001312
2004121218.tif 001313
2004121218.tif 001314
2004121218.tif 001315
2004121218.tif 001316
2004121218.tif 001317
2004121218.tif 001318
2004121218.tif 001319
2004121218.tif 001320
2004121218.tif 001321
2004121218.tif 001322
2004121218.tif 001323
2004121218.tif 001324
2004121218.tif 001325
2004121218.tif 001326
2004121218.tif 001327
2004121218.tif 001328
2004121218.tif 001329
2004121218.tif 001330
2004121218.tif 001331
2004121218.tif 001332
2004121218.tif 001333
2004121218.tif 001334
2004121218.tif 001335
2004121218.tif 001336
2004121218.tif 001337
2004121218.tif 001338
2004121218.tif 001339
2004121218.tif 001340
2004121218.tif 001341
2004121218.tif 001342
2004121218.tif 001343
2004121218.tif 001344
2004121218.tif 001345
2004121218.tif 001346
2004121218.tif 001347
2004121218.tif 001348
2004121218.tif 001349
2004121218.tif 001350
2004121218.tif 001351
2004121218.tif 001352
2004121218.tif 001353
2004121218.tif 001354
2004121218.tif 001355
2004121218.tif 001356
2004121218.tif 001357
2004121218.tif 001358
2004121218.tif 001359
2004121218.tif 001360
2004121218.tif 001361
2004121218.tif 001362
2004121218.tif 001363
2004121218.tif 001364
2004121218.tif 001365
2004121218.tif 001366
2004121218.tif 001367
2004121218.tif 001368
2004121218.tif 001369
2004121218.tif 001370
2004121218.tif 001371
2004121218.tif 001372
2004121218.tif 001373
2004121218.tif 001374
2004121218.tif 001375
2004121218.tif 001376
2004121218.tif 001377
2004121218.tif 001378
2004121218.tif 001379
2004121218.tif 001380
2004121218.tif 001381
2004121218.tif 001382
2004121218.tif 001383
2004121218.tif 001384
2004121218.tif 001385
2004121218.tif 001386
2004121218.tif 001387
2004121218.tif 001388
2004121218.tif 001389
2004121218.tif 001390
2004121218.tif 001391
2004121218.tif 001392
2004121218.tif 001393
2004121218.tif 001394
2004121218.tif 001395
2004121218.tif 001396
2004121218.tif 001397
2004121218.tif 001398
2004121218.tif 001399
2004121218.tif 001400
2004121218.tif 001401
2004121218.tif 001402
2004121218.tif 001403
2004121218.tif 001404
2004121218.tif 001405
2004121218.tif 001406
2004121218.tif 001407
2004121218.tif 001408
2004121218.tif 001409
2004121218.tif 001410
2004121218.tif 001411
2004121218.tif 001412
2004121218.tif 001413
2004121218.tif 001414
2004121218.tif 001415
2004121218.tif 001416
2004121218.tif 001417
2004121218.tif 001418
2004121218.tif 001419
2004121218.tif 001420
2004121218.tif 001421
2004121218.tif 001422
2004121218.tif 001423
2004121218.tif 001424
2004121218.tif 001425
2004121218.tif 001426
2004121218.tif 001427
2004121218.tif 001428
2004121218.tif 001429
2004121218.tif 001430
2004121218.tif 001431
2004121218.tif 001432
2004121218.tif 001433
2004121218.tif 001434
2004121218.tif 001435
2004121218.tif 001436
2004121218.tif 001437
2004121218.tif 001438
2004121218.tif 001439
2004121218.tif 001440
2004121218.tif 001441
2004121218.tif 001442
2004121218.tif 001443
2004121218.tif 001444
2004121218.tif 001445
2004121218.tif 001446
2004121218.tif 001447
2004121218.tif 001448
2004121218.tif 001449
2004121218.tif 001450
2004121218.tif 001451
2004121218.tif 001452
2004121218.tif 001453
2004121218.tif 001454
2004121218.tif 001455
2004121218.tif 001456
2004121218.tif 001457
2004121218.tif 001458
2004121218.tif 001459
2004121218.tif 001460
2004121218.tif 001461
2004121218.tif 001462
2004121218.tif 001463
2004121218.tif 001464
2004121218.tif 001465
2004121218.tif 001466
2004121218.tif 001467
2004121218.tif 001468
2004121218.tif 001469
2004121218.tif 001470
2004121218.tif 001471
2004121218.tif 001472
2004121218.tif 001473
2004121218.tif 001474
2004121218.tif 001475
2004121218.tif 001476
2004121218.tif 001477
2004121218.tif 001478
2004121218.tif 001479
2004121218.tif 001480
2004121218.tif 001481
2004121218.tif 001482
2004121218.tif 001483
2004121218.tif 001484
2004121218.tif 001485
2004121218.tif 001486
2004121218.tif 001487
2004121218.tif 001488
2004121218.tif 001489
2004121218.tif 001490
2004121218.tif 001491
2004121218.tif 001492
2004121218.tif 001493
2004121218.tif 001494
2004121218.tif 001495
2004121218.tif 001496
2004121218.tif 001497
2004121218.tif 001498
2004121218.tif 001499
2004121218.tif 001500
2004121218.tif 001501
2004121218.tif 001502
2004121218.tif 001503
2004121218.tif 001504
2004121218.tif 001505
2004121218.tif 001506
2004121218.tif 001507
2004121218.tif 001508
2004121218.tif 001509
2004121218.tif 001510
2004121218.tif 001511
2004121218.tif 001512
2004121218.tif 001513
2004121218.tif 001514
2004121218.tif 001515
2004121218.tif 001516
2004121218.tif 001517
2004121218.tif 001518
2004121218.tif 001519
2004121218.tif 001520
2004121218.tif 001521
2004121218.tif 001522
2004121218.tif 001523
2004121218.tif 001524
2004121218.tif 001525
2004121218.tif 001526
2004121218.tif 001527
2004121218.tif 001528
2004121218.tif 001529
2004121218.tif 001530
2004121218.tif 001531
2004121218.tif 001532
2004121218.tif 001533
2004121218.tif 001534
2004121218.tif 001535
2004121218.tif 001536
2004121218.tif 001537
2004121218.tif 001538
2004121218.tif 001539
2004121218.tif 001540
2004121218.tif 001541
2004121218.tif 001542
2004121218.tif 001543
2004121218.tif 001544
2004121218.tif 001545
2004121218.tif 001546
2004121218.tif 001547
2004121218.tif 001548
2004121218.tif 001549
2004121218.tif 001550
2004121218.tif 001551
2004121218.tif 001552
2004121218.tif 001553
2004121218.tif 001554
2004121218.tif 001555
2004121218.tif 001556
2004121218.tif 001557
2004121218.tif 001558
2004121218.tif 001559
2004121218.tif 001560
2004121218.tif 001561
2004121218.tif 001562
2004121218.tif 001563
2004121218.tif 001564
2004121218.tif 001565
2004121218.tif 001566
2004121218.tif 001567
2004121218.tif 001568
2004121218.tif 001569
2004121218.tif 001570
2004121218.tif 001571
2004121218.tif 001572
2004121218.tif 001573
2004121218.tif 001574
2004121218.tif 001575
2004121218.tif 001576
2004121218.tif 001577
2004121218.tif 001578
2004121218.tif 001579
2004121218.tif 001580
2004121218.tif 001581
2004121218.tif 001582
2004121218.tif 001583
2004121218.tif 001584
2004121218.tif 001585
2004121218.tif 001586
2004121218.tif 001587
2004121218.tif 001588
2004121218.tif 001589
2004121218.tif 001590
2004121218.tif 001591
2004121218.tif 001592
2004121218.tif 001593
2004121218.tif 001594
2004121218.tif 001595
2004121218.tif 001596
2004121218.tif 001597
2004121218.tif 001598
2004121218.tif 001599
2004121218.tif 001600
2004121218.tif 001601
2004121218.tif 001602
2004121218.tif 001603
2004121218.tif 001604
2004121218.tif 001605
2004121218.tif 001606
2004121218.tif 001607
2004121218.tif 001608
2004121218.tif 001609
2004121218.tif 001610
2004121218.tif 001611
2004121218.tif 001612
2004121218.tif 001613
2004121218.tif 001614
2004121218.tif 001615
2004121218.tif 001616
2004121218.tif 001617
2004121218.tif 001618
2004121218.tif 001619
2004121218.tif 001620
2004121218.tif 001621
2004121218.tif 001622
2004121218.tif 001623
2004121218.tif 001624
2004121218.tif 001625
2004121218.tif 001626
2004121218.tif 001627
2004121218.tif 001628
2004121218.tif 001629
2004121218.tif 001630
2004121218.tif 001631
2004121218.tif 001632
2004121218.tif 001633
2004121218.tif 001634
2004121218.tif 001635
2004121218.tif 001636
2004121218.tif 001637
2004121218.tif 001638
2004121218.tif 001639
2004121218.tif 001640
2004121218.tif 001641
2004121218.tif 001642
2004121218.tif 001643
2004121218.tif 001644
2004121218.tif 001645
2004121218.tif 001646
2004121218.tif 001647
2004121218.tif 001648
2004121218.tif 001649
2004121218.tif 001650
2004121218.tif 001651
2004121218.tif 001652
2004121218.tif 001653
2004121218.tif 001654
2004121218.tif 001655
2004121218.tif 001656
2004121218.tif 001657
2004121218.tif 001658
2004121218.tif 001659
2004121218.tif 001660
2004121218.tif 001661
2004121218.tif 001662
2004121218.tif 001663
2004121218.tif 001664
2004121218.tif 001665
2004121218.tif 001666
2004121218.tif 001667
2004121218.tif 001668
2004121218.tif 001669
2004121218.tif 001670
2004121218.tif 001671
2004121218.tif 001672
2004121218.tif 001673
2004121218.tif 001674
2004121218.tif 001675
2004121218.tif 001676
2004121218.tif 001677
2004121218.tif 001678
2004121218.tif 001679
2004121218.tif 001680
2004121218.tif 001681
2004121218.tif 001682
2004121218.tif 001683
2004121218.tif 001684
2004121218.tif 001685
2004121218.tif 001686
2004121218.tif 001687
2004121218.tif 001688
2004121218.tif 001689
2004121218.tif 001690
2004121218.tif 001691
2004121218.tif 001692
2004121218.tif 001693
2004121218.tif 001694
2004121218.tif 001695
2004121218.tif 001696
2004121218.tif 001697
2004121218.tif 001698
2004121218.tif 001699
2004121218.tif 001700
2004121218.tif 001701
2004121218.tif 001702
2004121218.tif 001703
2004121218.tif 001704
2004121218.tif 001705
2004121218.tif 001706
2004121218.tif 001707
2004121218.tif 001708
2004121218.tif 001709
2004121218.tif 001710
2004121218.tif 001711
2004121218.tif 001712
2004121218.tif 001713
2004121218.tif 001714
2004121218.tif 001715
2004121218.tif 001716
2004121218.tif 001717
2004121218.tif 001718
2004121218.tif 001719
2004121218.tif 001720
2004121218.tif 001721
2004121218.tif 001722
2004121218.tif 001723
2004121218.tif 001724
2004121218.tif 001725
2004121218.tif 001726
2004121218.tif 001727
2004121218.tif 001728
2004121218.tif 001729
2004121218.tif 001730
2004121218.tif 001731
2004121218.tif 001732
2004121218.tif 001733
2004121218.tif 001734
2004121218.tif 001735
2004121218.tif 001736
2004121218.tif 001737
2004121218.tif 001738
2004121218.tif 001739
2004121218.tif 001740
2004121218.tif 001741
2004121218.tif 001742
2004121218.tif 001743
2004121218.tif 001744
2004121218.tif 001745
2004121218.tif 001746
2004121218.tif 001747
2004121218.tif 001748
2004121218.tif 001749
2004121218.tif 001750
2004121218.tif 001751
2004121218.tif 001752
2004121218.tif 001753
2004121218.tif 001754
2004121218.tif 001755
2004121218.tif 001756
2004121218.tif 001757
2004121218.tif 001758
2004121218.tif 001759
2004121218.tif 001760
2004121218.tif 001761
2004121218.tif 001762
2004121218.tif 001763
2004121218.tif 001764
2004121218.tif 001765
2004121218.tif 001766
2004121218.tif 001767
2004121218.tif 001768
2004121218.tif 001769
2004121218.tif 001770
2004121218.tif 001771
2004121218.tif 001772
2004121218.tif 001773
2004121218.tif 001774
2004121218.tif 001775
2004121218.tif 001776
2004121218.tif 001777
2004121218.tif 001778
2004121218.tif 001779
2004121218.tif 001780
2004121218.tif 001781
2004121218.tif 001782
2004121218.tif 001783
2004121218.tif 001784
2004121218.tif 001785
2004121218.tif 001786
2004121218.tif 001787
2004121218.tif 001788
2004121218.tif 001789
2004121218.tif 001790
2004121218.tif 001791
2004121218.tif 001792
2004121218.tif 001793
2004121218.tif 001794
2004121218.tif 001795
2004121218.tif 001796
2004121218.tif 001797
2004121218.tif 001798
2004121218.tif 001799
2004121218.tif 001800
2004121218.tif 001801
2004121218.tif 001802
2004121218.tif 001803
2004121218.tif 001804
2004121218.tif 001805
2004121218.tif 001806
2004121218.tif 001807
2004121218.tif 001808
2004121218.tif 001809
2004121218.tif 001810
2004121218.tif 001811
2004121218.tif 001812
2004121218.tif 001813
2004121218.tif 001814
2004121218.tif 001815
2004121218.tif 001816
2004121218.tif 001817
2004121218.tif 001818
2004121218.tif 001819
2004121218.tif 001820
2004121218.tif 001821
2004121218.tif 001822
2004121218.tif 001823
2004121218.tif 001824
2004121218.tif 001825
2004121218.tif 001826
2004121218.tif 001827
2004121218.tif 001828
2004121218.tif 001829
2004121218.tif 001830
2004121218.tif 001831
2004121218.tif 001832
2004121218.tif 001833
2004121218.tif 001834
2004121218.tif 001835
2004121218.tif 001836
2004121218.tif 001837
2004121218.tif 001838
2004121218.tif 001839
2004121218.tif 001840
2004121218.tif 001841
2004121218.tif 001842
2004121218.tif 001843
2004121218.tif 001844
2004121218.tif 001845
2004121218.tif 001846
2004121218.tif 001847
2004121218.tif 001848
2004121218.tif 001849
2004121218.tif 001850
2004121218.tif 001851
2004121218.tif 001852
2004121218.tif 001853
2004121218.tif 001854
2004121218.tif 001855
2004121218.tif 001856
2004121218.tif 001857
2004121218.tif 001858
2004121218.tif 001859
2004121218.tif 001860
2004121218.tif 001861
2004121218.tif 001862
2004121218.tif 001863
2004121218.tif 001864
2004121218.tif 001865
2004121218.tif 001866
2004121218.tif 001867
2004121218.tif 001868
2004121218.tif 001869
2004121218.tif 001870
2004121218.tif 001871
2004121218.tif 001872
2004121218.tif 001873
2004121218.tif 001874
2004121218.tif 001875
2004121218.tif 001876
2004121218.tif 001877
2004121218.tif 001878
2004121218.tif 001879
2004121218.tif 001880
2004121218.tif 001881
2004121218.tif 001882
2004121218.tif 001883
2004121218.tif 001884
2004121218.tif 001885
2004121218.tif 001886
2004121218.tif 001887
2004121218.tif 001888
2004121218.tif 001889
2004121218.tif 001890
2004121218.tif 001891
2004121218.tif 001892
2004121218.tif 001893
2004121218.tif 001894
2004121218.tif 001895
2004121218.tif 001896
2004121218.tif 001897
2004121218.tif 001898
2004121218.tif 001899
2004121218.tif 001900
2004121218.tif 001901
2004121218.tif 001902
2004121218.tif 001903
2004121218.tif 001904
2004121218.tif 001905
2004121218.tif 001906
2004121218.tif 001907
2004121218.tif 001908
2004121218.tif 001909
2004121218.tif 001910
2004121218.tif 001911
2004121218.tif 001912
2004121218.tif 001913
2004121218.tif 001914
2004121218.tif 001915
2004121218.tif 001916
2004121218.tif 001917
2004121218.tif 001918
2004121218.tif 001919
2004121218.tif 001920
2004121218.tif 001921
2004121218.tif 001922
2004121218.tif 001923
2004121218.tif 001924
2004121218.tif 001925
2004121218.tif 001926
2004121218.tif 001927
2004121218.tif 001928
2004121218.tif 001929
2004121218.tif 001930
2004121218.tif 001931
2004121218.tif 001932
2004121218.tif 001933
2004121218.tif 001934
2004121218.tif 001935
2004121218.tif 001936
2004121218.tif 001937
2004121218.tif 001938
2004121218.tif 001939
2004121218.tif 001940
2004121218.tif 001941
2004121218.tif 001942
2004121218.tif 001943
2004121218.tif 001944
2004121218.tif 001945
2004121218.tif 001946
2004121218.tif 001947
2004121218.tif 001948
2004121218.tif 001949
2004121218.tif 001950
2004121218.tif 001951
2004121218.tif 001952
2004121218.tif 001953
2004121218.tif 001954
2004121218.tif 001955
2004121218.tif 001956
2004121218.tif 001957
2004121218.tif 001958
2004121218.tif 001959
2004121218.tif 001960
2004121218.tif 001961
2004121218.tif 001962
2004121218.tif 001963
2004121218.tif 001964
2004121218.tif 001965
2004121218.tif 001966
2004121218.tif 001967
2004121218.tif 001968
2004121218.tif 001969
2004121218.tif 001970
2004121218.tif 001971
2004121218.tif 001972
2004121218.tif 001973
2004121218.tif 001974
2004121218.tif 001975
2004121218.tif 001976
2004121218.tif 001977
2004121218.tif 001978
2004121218.tif 001979
2004121218.tif 001980
2004121218.tif 001981
2004121218.tif 001982
2004121218.tif 001983
2004121218.tif 001984
2004121218.tif 001985
2004121218.tif 001986
2004121218.tif 001987
2004121218.tif 001988
2004121218.tif 001989
2004121218.tif 001990
2004121218.tif 001991
2004121218.tif 001992
2004121218.tif 001993
2004121218.tif 001994
2004121218.tif 001995
2004121218.tif 001996
2004121218.tif 001997
2004121218.tif 001998
2004121218.tif 001999
2004121218.tif 002000
2004121218.tif 002001
2004121218.tif 002002
2004121218.tif 002003
2004121218.tif 002004
2004121218.tif 002005
2004121218.tif 002006
2004121218.tif 002007
2004121218.tif 002008
2004121218.tif 002009
2004121218.tif 002010
2004121218.tif 002011
2004121218.tif 002012
2004121218.tif 002013
2004121218.tif 002014
2004121218.tif 002015
2004121218.tif 002016
2004121218.tif 002017
2004121218.tif 002018
2004121218.tif 002019
2004121218.tif 002020
2004121218.tif 002021
2004121218.tif 002022
2004121218.tif 002023
2004121218.tif 002024
2004121218.tif 002025
2004121218.tif 002026
2004121218.tif 002027
2004121218.tif 002028
2004121218.tif 002029
2004121218.tif 002030
2004121218.tif 002031
2004121218.tif 002032
2004121218.tif 002033
2004121218.tif 002034
2004121218.tif 002035
2004121218.tif 002036
2004121218.tif 002037
2004121218.tif 002038
2004121218.tif 002039
2004121218.tif 002040
2004121218.tif 002041
2004121218.tif 002042
2004121218.tif 002043
2004121218.tif 002044
2004121218.tif 002045
2004121218.tif 002046
2004121218.tif 002047
2004121218.tif 002048
2004121218.tif 002049
2004121218.tif 002050
2004121218.tif 002051
2004121218.tif 002052
2004121218.tif 002053
2004121218.tif 002054
2004121218.tif 002055
2004121218.tif 002056
2004121218.tif 002057
2004121218.tif 002058
2004121218.tif 002059
2004121218.tif 002060
2004121218.tif 002061
2004121218.tif 002062
2004121218.tif 002063
2004121218.tif 002064
2004121218.tif 002065
2004121218.tif 002066
2004121218.tif 002067
2004121218.tif 002068
2004121218.tif 002069
2004121218.tif 002070
2004121218.tif 002071
2004121218.tif 002072
2004121218.tif 002073
2004121218.tif 002074
2004121218.tif 002075
2004121218.tif 002076
2004121218.tif 002077
2004121218.tif 002078
2004121218.tif 002079
2004121218.tif 002080
2004121218.tif 002081
2004121218.tif 002082
2004121218.tif 002083
2004121218.tif 002084
2004121218.tif 002085
2004121218.tif 002086
2004121218.tif 002087
2004121218.tif 002088
2004121218.tif 002089
2004121218.tif 002090
2004121218.tif 002091
2004121218.tif 002092
2004121218.tif 002093
2004121218.tif 002094
2004121218.tif 002095
2004121218.tif 002096
2004121218.tif 002097
2004121218.tif 002098
2004121218.tif 002099
2004121218.tif 002100
2004121218.tif 002101
2004121218.tif 002102
2004121218.tif 002103
2004121218.tif 002104
2004121218.tif 002105
2004121218.tif 002106
2004121218.tif 002107
2004121218.tif 002108
2004121218.tif 002109
2004121218.tif 002110
2004121218.tif 002111
2004121218.tif 002112
2004121218.tif 002113
2004121218.tif 002114
2004121218.tif 002115
2004121218.tif 002116
2004121218.tif 002117
2004121218.tif 002118
2004121218.tif 002119
2004121218.tif 002120
2004121218.tif 002121
2004121218.tif 002122
2004121218.tif 002123
2004121218.tif 002124
2004121218.tif 002125
2004121218.tif 002126
2004121218.tif 002127
2004121218.tif 002128
2004121218.tif 002129
2004121218.tif 002130
2004121218.tif 002131
2004121218.tif 002132
2004121218.tif 002133
2004121218.tif 002134
2004121218.tif 002135
2004121218.tif 002136
2004121218.tif 002137
2004121218.tif 002138
2004121218.tif 002139
2004121218.tif 002140
2004121218.tif 002141
2004121218.tif 002142
2004121218.tif 002143
2004121218.tif 002144
2004121218.tif 002145
2004121218.tif 002146
2004121218.tif 002147
2004121218.tif 002148
2004121218.tif 002149
2004121218.tif 002150
2004121218.tif 002151
2004121218.tif 002152
2004121218.tif 002153
2004121218.tif 002154
2004121218.tif 002155
2004121218.tif 002156
2004121218.tif 002157
2004121218.tif 002158
2004121218.tif 002159
2004121218.tif 002160
2004121218.tif 002161
2004121218.tif 002162
2004121218.tif 002163
2004121218.tif 002164
2004121218.tif 002165
2004121218.tif 002166
2004121218.tif 002167
2004121218.tif 002168
2004121218.tif 002169
2004121218.tif 002170
2004121218.tif 002171
2004121218.tif 002172
2004121218.tif 002173
2004121218.tif 002174
2004121218.tif 002175
2004121218.tif 002176
2004121218.tif 002177
2004121218.tif 002178
2004121218.tif 002179
2004121218.tif 002180
2004121218.tif 002181
2004121218.tif 002182
2004121218.tif 002183
2004121218.tif 002184
2004121218.tif 002185
2004121218.tif 002186
2004121218.tif 002187
2004121218.tif 002188
2004121218.tif 002189
2004121218.tif 002190
2004121218.tif 002191
2004121218.tif 002192
2004121218.tif 002193
2004121218.tif 002194
2004121218.tif 002195
2004121218.tif 002196
2004121218.tif 002197
2004121218.tif 002198
2004121218.tif 002199
2004121218.tif 002200
2004121218.tif 002201
2004121218.tif 002202
2004121218.tif 002203
2004121218.tif 002204
2004121218.tif 002205
2004121218.tif 002206
2004121218.tif 002207
2004121218.tif 002208
2004121218.tif 002209
2004121218.tif 002210
2004121218.tif 002211
2004121218.tif 002212
2004121218.tif 002213
2004121218.tif 002214
2004121218.tif 002215
2004121218.tif 002216
2004121218.tif 002217
2004121218.tif 002218
2004121218.tif 002219
2004121218.tif 002220
2004121218.tif 002221
2004121218.tif 002222
2004121218.tif 002223
2004121218.tif 002224
2004121218.tif 002225
2004121218.tif 002226
2004121218.tif 002227
2004121218.tif 002228
2004121218.tif 002229
2004121218.tif 002230
2004121218.tif 002231
2004121218.tif 002232
2004121218.tif 002233
2004121218.tif 002234
2004121218.tif 002235
2004121218.tif 002236
2004121218.tif 002237
2004121218.tif 002238
2004121218.tif 002239
2004121218.tif 002240
2004121218.tif 002241
2004121218.tif 002242
2004121218.tif 002243
2004121218.tif 002244
2004121218.tif 002245
2004121218.tif 002246
2004121218.tif 002247
2004121218.tif 002248
2004121218.tif 002249
2004121218.tif 002250
2004121218.tif 002251
2004121218.tif 002252
2004121218.tif 002253
2004121218.tif 002254
2004121218.tif 002255
2004121218.tif 002256
2004121218.tif 002257
2004121218.tif 002258
2004121218.tif 002259
2004121218.tif 002260
2004121218.tif 002261
2004121218.tif 002262
2004121218.tif 002263
2004121218.tif 002264
2004121218.tif 002265
2004121218.tif 002266
2004121218.tif 002267
2004121218.tif 002268
2004121218.tif 002269
2004121218.tif 002270
2004121218.tif 002271
2004121218.tif 002272
2004121218.tif 002273
2004121218.tif 002274
2004121218.tif 002275
2004121218.tif 002276
2004121218.tif 002277
2004121218.tif 002278
2004121218.tif 002279
2004121218.tif 002280
2004121218.tif 002281
2004121218.tif 002282
2004121218.tif 002283
2004121218.tif 002284
2004121218.tif 002285
2004121218.tif 002286
2004121218.tif 002287
2004121218.tif 002288
2004121218.tif 002289
2004121218.tif 002290
2004121218.tif 002291
2004121218.tif 002292
2004121218.tif 002293
2004121218.tif 002294
2004121218.tif 002295
2004121218.tif 002296
2004121218.tif 002297
2004121218.tif 002298
2004121218.tif 002299
2004121218.tif 002300
2004121218.tif 002301
2004121218.tif 002302
2004121218.tif 002303
2004121218.tif 002304
2004121218.tif 002305
2004121218.tif 002306
2004121218.tif 002307
2004121218.tif 002308
2004121218.tif 002309
2004121218.tif 002310
2004121218.tif 002311
2004121218.tif 002312
2004121218.tif 002313
2004121218.tif 002314
2004121218.tif 002315
2004121218.tif 002316
2004121218.tif 002317
2004121218.tif 002318
2004121218.tif 002319
2004121218.tif 002320
2004121218.tif 002321
2004121218.tif 002322
2004121218.tif 002323
2004121218.tif 002324
2004121218.tif 002325
2004121218.tif 002326
2004121218.tif 002327
2004121218.tif 002328
2004121218.tif 002329
2004121218.tif 002330
2004121218.tif 002331
2004121218.tif 002332
2004121218.tif 002333
2004121218.tif 002334
2004121218.tif 002335
2004121218.tif 002336
2004121218.tif 002337
2004121218.tif 002338
2004121218.tif 002339
2004121218.tif 002340
2004121218.tif 002341
2004121218.tif 002342
2004121218.tif 002343
2004121218.tif 002344
2004121218.tif 002345
2004121218.tif 002346
2004121218.tif 002347
2004121218.tif 002348
2004121218.tif 002349
2004121218.tif 002350
2004121218.tif 002351
2004121218.tif 002352
2004121218.tif 002353
2004121218.tif 002354
2004121218.tif 002355
2004121218.tif 002356
2004121218.tif 002357
2004121218.tif 002358
2004121218.tif 002359
2004121218.tif 002360
2004121218.tif 002361
2004121218.tif 002362
2004121218.tif 002363
2004121218.tif 002364
2004121218.tif 002365
2004121218.tif 002366
2004121218.tif 002367
2004121218.tif 002368
2004121218.tif 002369
2004121218.tif 002370
2004121218.tif 002371
2004121218.tif 002372
2004121218.tif 002373
2004121218.tif 002374
2004121218.tif 002375
2004121218.tif 002376
2004121218.tif 002377
2004121218.tif 002378
2004121218.tif 002379
2004121218.tif 002380
2004121218.tif 002381
2004121218.tif 002382
2004121218.tif 002383
2004121218.tif 002384
2004121218.tif 002385
2004121218.tif 002386
2004121218.tif 002387
2004121218.tif 002388
2004121218.tif 002389
2004121218.tif 002390
2004121218.tif 002391
2004121218.tif 002392
2004121218.tif 002393
2004121218.tif 002394
2004121218.tif 002395
2004121218.tif 002396
2004121218.tif 002397
2004121218.tif 002398
2004121218.tif 002399
2004121218.tif 002400
2004121218.tif 002401
2004121218.tif 002402
2004121218.tif 002403
2004121218.tif 002404
2004121218.tif 002405
2004121218.tif 002406
2004121218.tif 002407
2004121218.tif 002408
2004121218.tif 002409
2004121218.tif 002410
2004121218.tif 002411
2004121218.tif 002412
2004121218.tif 002413
2004121218.tif 002414
2004121218.tif 002415
2004121218.tif 002416
2004121218.tif 002417
2004121218.tif 002418
2004121218.tif 002419
2004121218.tif 002420
2004121218.tif 002421
2004121218.tif 002422
2004121218.tif 002423
2004121218.tif 002424
2004121218.tif 002425
2004121218.tif 002426
2004121218.tif 002427
2004121218.tif 002428
2004121218.tif 002429
2004121218.tif 002430
2004121218.tif 002431
2004121218.tif 002432
2004121218.tif 002433
2004121218.tif 002434
2004121218.tif 002435
2004121218.tif 002436
2004121218.tif 002437
2004121218.tif 002438
2004121218.tif 002439
2004121218.tif 002440
2004121218.tif 002441
2004121218.tif 002442
2004121218.tif 002443
2004121218.tif 002444
2004121218.tif 002445
2004121218.tif 002446
2004121218.tif 002447
2004121218.tif 002448
2004121218.tif 002449
2004121218.tif 002450
2004121218.tif 002451
2004121218.tif 002452
2004121218.tif 002453
2004121218.tif 002454
2004121218.tif 002455
2004121218.tif 002456
2004121218.tif 002457
2004121218.tif 002458
2004121218.tif 002459
2004121218.tif 002460
2004121218.tif 002461
2004121218.tif 002462
2004121218.tif 002463
2004121218.tif 002464
2004121218.tif 002465
2004121218.tif 002466
2004121218.tif 002467
2004121218.tif 002468
2004121218.tif 002469
2004121218.tif 002470
2004121218.tif 002471
2004121218.tif 002472
2004121218.tif 002473
2004121218.tif 002474
2004121218.tif 002475
2004121218.tif 002476
2004121218.tif 002477
2004121218.tif 002478
2004121218.tif 002479
2004121218.tif 002480
2004121218.tif 002481
2004121218.tif 002482
2004121218.tif 002483
2004121218.tif 002484
2004121218.tif 002485
2004121218.tif 002486
2004121218.tif 002487
2004121218.tif 002488
2004121218.tif 002489
2004121218.tif 002490
2004121218.tif 002491
2004121218.tif 002492
2004121218.tif 002493
2004121218.tif 002494
2004121218.tif 002495
2004121218.tif 002496
2004121218.tif 002497
2004121218.tif 002498
2004121218.tif 002499
2004121218.tif 002500
2004121218.tif 002501
2004121218.tif 002502
2004121218.tif 002503
2004121218.tif 002504
2004121218.tif 002505
2004121218.tif 002506
2004121218.tif 002507
2004121218.tif 002508
2004121218.tif 002509
2004121218.tif 002510
2004121218.tif 002511
2004121218.tif 002512
2004121218.tif 002513
2004121218.tif 002514
2004121218.tif 002515
2004121218.tif 002516
2004121218.tif 002517
2004121218.tif 002518
2004121218.tif 002519
2004121218.tif 002520
2004121218.tif 002521
2004121218.tif 002522
2004121218.tif 002523
2004121218.tif 002524
2004121218.tif 002525
2004121218.tif 002526
2004121218.tif 002527
2004121218.tif 002528
2004121218.tif 002529
2004121218.tif 002530
2004121218.tif 002531
2004121218.tif 002532
2004121218.tif 002533
2004121218.tif 002534
2004121218.tif 002535
2004121218.tif 002536
2004121218.tif 002537
2004121218.tif 002538
2004121218.tif 002539
2004121218.tif 002540
2004121218.tif 002541
2004121218.tif 002542
2004121218.tif 002543
2004121218.tif 002544
2004121218.tif 002545
2004121218.tif 002546
2004121218.tif 002547
2004121218.tif 002548
2004121218.tif 002549
2004121218.tif 002550
2004121218.tif 002551
2004121218.tif 002552
2004121218.tif 002553
2004121218.tif 002554
2004121218.tif 002555
2004121218.tif 002556
2004121218.tif 002557
2004121218.tif 002558
2004121218.tif 002559
2004121218.tif 002560
2004121218.tif 002561
2004121218.tif 002562
2004121218.tif 002563
2004121218.tif 002564
2004121218.tif 002565
2004121218.tif 002566
2004121218.tif 002567
2004121218.tif 002568
2004121218.tif 002569
2004121218.tif 002570
2004121218.tif 002571
2004121218.tif 002572
2004121218.tif 002573
2004121218.tif 002574
2004121218.tif 002575
2004121218.tif 002576
2004121218.tif 002577
2004121218.tif 002578
2004121218.tif 002579
2004121218.tif 002580
2004121218.tif 002581
2004121218.tif 002582
2004121218.tif 002583
2004121218.tif 002584
2004121218.tif 002585
2004121218.tif 002586
2004121218.tif 002587
2004121218.tif 002588
2004121218.tif 002589
2004121218.tif 002590
2004121218.tif 002591
2004121218.tif 002592
2004121218.tif 002593
2004121218.tif 002594
2004121218.tif 002595
2004121218.tif 002596
2004121218.tif 002597
2004121218.tif 002598
2004121218.tif 002599
2004121218.tif 002600
2004121218.tif 002601
2004121218.tif 002602
2004121218.tif 002603
2004121218.tif 002604
2004121218.tif 002605
2004121218.tif 002606
2004121218.tif 002607
2004121218.tif 002608
2004121218.tif 002609
2004121218.tif 002610
2004121218.tif 002611
2004121218.tif 002612
2004121218.tif 002613
2004121218.tif 002614
2004121218.tif 002615
2004121218.tif 002616
2004121218.tif 002617
2004121218.tif 002618
2004121218.tif 002619
2004121218.tif 002620
2004121218.tif 002621
2004121218.tif 002622
2004121218.tif 002623
2004121218.tif 002624
2004121218.tif 002625
2004121218.tif 002626
2004121218.tif 002627
2004121218.tif 002628
2004121218.tif 002629
2004121218.tif 002630
2004121218.tif 002631
2004121218.tif 002632
2004121218.tif 002633
2004121218.tif 002634
2004121218.tif 002635
2004121218.tif 002636
2004121218.tif 002637
2004121218.tif 002638
2004121218.tif 002639
2004121218.tif 002640
2004121218.tif 002641
2004121218.tif 002642
2004121218.tif 002643
2004121218.tif 002644
2004121218.tif 002645
2004121218.tif 002646
2004121218.tif 002647
2004121218.tif 002648
2004121218.tif 002649
2004121218.tif 002650
2004121218.tif 002651
2004121218.tif 002652
2004121218.tif 002653
2004121218.tif 002654
2004121218.tif 002655
2004121218.tif 002656
2004121218.tif 002657
2004121218.tif 002658
2004121218.tif 002659
2004121218.tif 002660
2004121218.tif 002661
2004121218.tif 002662
2004121218.tif 002663
2004121218.tif 002664
2004121218.tif 002665
2004121218.tif 002666
2004121218.tif 002667
2004121218.tif 002668
2004121218.tif 002669
2004121218.tif 002670
2004121218.tif 002671
2004121218.tif 002672
2004121218.tif 002673
2004121218.tif 002674
2004121218.tif 002675
2004121218.tif 002676
2004121218.tif 002677
2004121218.tif 002678
2004121218.tif 002679
2004121218.tif 002680
2004121218.tif 002681
2004121218.tif 002682
2004121218.tif 002683
2004121218.tif 002684
2004121218.tif 002685
2004121218.tif 002686
2004121218.tif 002687
2004121218.tif 002688
2004121218.tif 002689
2004121218.tif 002690
2004121218.tif 002691
2004121218.tif 002692
2004121218.tif 002693
2004121218.tif 002694
2004121218.tif 002695
2004121218.tif 002696
2004121218.tif 002697
2004121218.tif 002698
2004121218.tif 002699
2004121218.tif 002700
2004121218.tif 002701
2004121218.tif 002702
2004121218.tif 002703
2004121218.tif 002704
2004121218.tif 002705
2004121218.tif 002706
2004121218.tif 002707
2004121218.tif 002708
2004121218.tif 002709
2004121218.tif 002710
2004121218.tif 002711
2004121218.tif 002712
2004121218.tif 002713
2004121218.tif 002714
2004121218.tif 002715
2004121218.tif 002716
2004121218.tif 002717
2004121218.tif 002718
2004121218.tif 002719
2004121218.tif 002720
2004121218.tif 002721
2004121218.tif 002722
2004121218.tif 002723
2004121218.tif 002724
2004121218.tif 002725
2004121218.tif 002726
2004121218.tif 002727
2004121218.tif 002728
2004121218.tif 002729
2004121218.tif 002730
2004121218.tif 002731
2004121218.tif 002732
2004121218.tif 002733
2004121218.tif 002734
2004121218.tif 002735
2004121218.tif 002736
2004121218.tif 002737
2004121218.tif 002738
2004121218.tif 002739
2004121218.tif 002740
2004121218.tif 002741
2004121218.tif 002742
2004121218.tif 002743
2004121218.tif 002744
2004121218.tif 002745
2004121218.tif 002746
2004121218.tif 002747
2004121218.tif 002748
2004121218.tif 002749
2004121218.tif 002750
2004121218.tif 002751
2004121218.tif 002752
2004121218.tif 002753
2004121218.tif 002754
2004121218.tif 002755
2004121218.tif 002756
2004121218.tif 002757
2004121218.tif 002758
2004121218.tif 002759
2004121218.tif 002760
2004121218.tif 002761
2004121218.tif 002762
2004121218.tif 002763
2004121218.tif 002764
2004121218.tif 002765
2004121218.tif 002766
2004121218.tif 002767
2004121218.tif 002768
2004121218.tif 002769
2004121218.tif 002770
2004121218.tif 002771
2004121218.tif 002772
2004121218.tif 002773
2004121218.tif 002774
2004121218.tif 002775
2004121218.tif 002776
2004121218.tif 002777
2004121218.tif 002778
2004121218.tif 002779
2004121218.tif 002780
2004121218.tif 002781
2004121218.tif 002782
2004121218.tif 002783
2004121218.tif 002784
2004121218.tif 002785
2004121218.tif 002786
2004121218.tif 002787
2004121218.tif 002788
2004121218.tif 002789
2004121218.tif 002790
2004121218.tif 002791
2004121218.tif 002792
2004121218.tif 002793
2004121218.tif 002794
2004121218.tif 002795
2004121218.tif 002796
2004121218.tif 002797
2004121218.tif 002798
2004121218.tif 002799
2004121218.tif 002800
2004121218.tif 002801
2004121218.tif 002802
2004121218.tif 002803
2004121218.tif 002804
2004121218.tif 002805
2004121218.tif 002806
2004121218.tif 002807
2004121218.tif 002808
2004121218.tif 002809
2004121218.tif 002810
2004121218.tif 002811
2004121218.tif 002812
2004121218.tif 002813
2004121218.tif 002814
2004121218.tif 002815
2004121218.tif 002816
2004121218.tif 002817
2004121218.tif 002818
2004121218.tif 002819
2004121218.tif 002820
2004121218.tif 002821
2004121218.tif 002822
2004121218.tif 002823
2004121218.tif 002824
2004121218.tif 002825
2004121218.tif 002826
2004121218.tif 002827
2004121218.tif 002828
2004121218.tif 002829
2004121218.tif 002830
2004121218.tif 002831
2004121218.tif 002832
2004121218.tif 002833
2004121218.tif 002834
2004121218.tif 002835
2004121218.tif 002836
2004121218.tif 002837
2004121218.tif 002838
2004121218.tif 002839
2004121218.tif 002840
2004121218.tif 002841
2004121218.tif 002842
2004121218.tif 002843
2004121218.tif 002844
2004121218.tif 002845
2004121218.tif 002846
2004121218.tif 002847
2004121218.tif 002848
2004121218.tif 002849
2004121218.tif 002850
2004121218.tif 002851
2004121218.tif 002852
2004121218.tif 002853
2004121218.tif 002854
2004121218.tif 002855
2004121218.tif 002856
2004121218.tif 002857
2004121218.tif 002858
2004121218.tif 002859
2004121218.tif 002860
2004121218.tif 002861
2004121218.tif 002862
2004121218.tif 002863
2004121218.tif 002864
2004121218.tif 002865
2004121218.tif 002866
2004121218.tif 002867
2004121218.tif 002868
2004121218.tif 002869
2004121218.tif 002870
2004121218.tif 002871
2004121218.tif 002872
2004121218.tif 002873
2004121218.tif 002874
2004121218.tif 002875
2004121218.tif 002876
2004121218.tif 002877
2004121218.tif 002878
2004121218.tif 002879
2004121218.tif 002880
2004121218.tif 002881
2004121218.tif 002882
2004121218.tif 002883
2004121218.tif 002884
2004121218.tif 002885
2004121218.tif 002886
2004121218.tif 002887
2004121218.tif 002888
2004121218.tif 002889
2004121218.tif 002890
2004121218.tif 002891
2004121218.tif 002892
2004121218.tif 002893
2004121218.tif 002894
2004121218.tif 002895
2004121218.tif 002896
2004121218.tif 002897
2004121218.tif 002898
2004121218.tif 002899
2004121218.tif 002900
2004121218.tif 002901
2004121218.tif 002902
2004121218.tif 002903
2004121218.tif 002904
2004121218.tif 002905
2004121218.tif 002906
2004121218.tif 002907
2004121218.tif 002908
2004121218.tif 002909
2004121218.tif 002910
2004121218.tif 002911
2004121218.tif 002912
2004121218.tif 002913
2004121218.tif 002914
2004121218.tif 002915
2004121218.tif 002916
2004121218.tif 002917
2004121218.tif 002918
2004121218.tif 002919
2004121218.tif 002920
2004121218.tif 002921
2004121218.tif 002922
2004121218.tif 002923
2004121218.tif 002924
2004121218.tif 002925
2004121218.tif 002926
2004121218.tif 002927
2004121218.tif 002928
2004121218.tif 002929
2004121218.tif 002930
2004121218.tif 002931
2004121218.tif 002932
2004121218.tif 002933
2004121218.tif 002934
2004121218.tif 002935
2004121218.tif 002936
2004121218.tif 002937
2004121218.tif 002938
2004121218.tif 002939
2004121218.tif 002940
2004121218.tif 002941
2004121218.tif 002942
2004121218.tif 002943
2004121218.tif 002944
2004121218.tif 002945
2004121218.tif 002946
2004121218.tif 002947
2004121218.tif 002948
2004121218.tif 002949
2004121218.tif 002950
2004121218.tif 002951
2004121218.tif 002952
2004121218.tif 002953
2004121218.tif 002954
2004121218.tif 002955
2004121218.tif 002956
2004121218.tif 002957
2004121218.tif 002958
2004121218.tif 002959
2004121218.tif 002960
2004121218.tif 002961
2004121218.tif 002962
2004121218.tif 002963
2004121218.tif 002964
2004121218.tif 002965
2004121218.tif 002966
2004121218.tif 002967
2004121218.tif 002968
2004121218.tif 002969
2004121218.tif 002970
2004121218.tif 002971
2004121218.tif 002972
2004121218.tif 002973
2004121218.tif 002974
2004121218.tif 002975
2004121218.tif 002976
2004121218.tif 002977
2004121218.tif 002978
2004121218.tif 002979
2004121218.tif 002980
2004121218.tif 002981
2004121218.tif 002982
2004121218.tif 002983
2004121218.tif 002984
2004121218.tif 002985
2004121218.tif 002986
2004121218.tif 002987
2004121218.tif 002988
2004121218.tif 002989
2004121218.tif 002990
2004121218.tif 002991
2004121218.tif 002992
2004121218.tif 002993
2004121218.tif 002994
2004121218.tif 002995
2004121218.tif 002996
2004121218.tif 002997
2004121218.tif 002998
2004121218.tif 002999
2004121218.tif 003000
2004121218.tif 003001
2004121218.tif 003002
2004121218.tif 003003
2004121218.tif 003004
2004121218.tif 003005
2004121218.tif 003006
2004121218.tif 003007
2004121218.tif 003008
2004121218.tif 003009
2004121218.tif 003010
2004121218.tif 003011
2004121218.tif 003012
2004121218.tif 003013
2004121218.tif 003014
2004121218.tif 003015
2004121218.tif 003016
2004121218.tif 003017
2004121218.tif 003018
2004121218.tif 003019
2004121218.tif 003020
2004121218.tif 003021
2004121218.tif 003022
2004121218.tif 003023
2004121218.tif 003024
2004121218.tif 003025
2004121218.tif 003026
2004121218.tif 003027
2004121218.tif 003028
2004121218.tif 003029
2004121218.tif 003030
2004121218.tif 003031
2004121218.tif 003032
2004121218.tif 003033
2004121218.tif 003034
2004121218.tif 003035
2004121218.tif 003036
2004121218.tif 003037
2004121218.tif 003038
2004121218.tif 003039
2004121218.tif 003040
2004121218.tif 003041
2004121218.tif 003042
2004121218.tif 003043
2004121218.tif 003044
2004121218.tif 003045
2004121218.tif 003046
2004121218.tif 003047
2004121218.tif 003048
2004121218.tif 003049
2004121218.tif 003050
2004121218.tif 003051
2004121218.tif 003052
2004121218.tif 003053
2004121218.tif 003054
2004121218.tif 003055
2004121218.tif 003056
2004121218.tif 003057
2004121218.tif 003058
2004121218.tif 003059
2004121218.tif 003060
2004121218.tif 003061
2004121218.tif 003062
2004121218.tif 003063
2004121218.tif 003064
2004121218.tif 003065
2004121218.tif 003066
2004121218.tif 003067
2004121218.tif 003068
2004121218.tif 003069
2004121218.tif 003070
2004121218.tif 003071
2004121218.tif 003072
2004121218.tif 003073
2004121218.tif 003074
2004121218.tif 003075
2004121218.tif 003076
2004121218.tif 003077
2004121218.tif 003078
2004121218.tif 003079
2004121218.tif 003080
2004121218.tif 003081
2004121218.tif 003082
2004121218.tif 003083
2004121218.tif 003084
2004121218.tif 003085
2004121218.tif 003086
2004121218.tif 003087
2004121218.tif 003088
2004121218.tif 003089
2004121218.tif 003090
2004121218.tif 003091
2004121218.tif 003092
2004121218.tif 003093
2004121218.tif 003094
2004121218.tif 003095
2004121218.tif 003096
2004121218.tif 003097
2004121218.tif 003098
2004121218.tif 003099
2004121218.tif 003100
2004121218.tif 003101
2004121218.tif 003102
2004121218.tif 003103
2004121218.tif 003104
2004121218.tif 003105
2004121218.tif 003106
2004121218.tif 003107
2004121218.tif 003108
2004121218.tif 003109
2004121218.tif 003110
2004121218.tif 003111
2004121218.tif 003112
2004121218.tif 003113
2004121218.tif 003114
2004121218.tif 003115
2004121218.tif 003116
2004121218.tif 003117
2004121218.tif 003118
2004121218.tif 003119
2004121218.tif 003120
2004121218.tif 003121
2004121218.tif 003122
2004121218.tif 003123
2004121218.tif 003124
2004121218.tif 003125
2004121218.tif 003126
2004121218.tif 003127
2004121218.tif 003128
2004121218.tif 003129
2004121218.tif 003130
2004121218.tif 003131
2004121218.tif 003132
2004121218.tif 003133
2004121218.tif 003134
2004121218.tif 003135
2004121218.tif 003136
2004121218.tif 003137
2004121218.tif 003138
2004121218.tif 003139
2004121218.tif 003140
2004121218.tif 003141
2004121218.tif 003142
2004121218.tif 003143
2004121218.tif 003144
2004121218.tif 003145
2004121218.tif 003146
2004121218.tif 003147
2004121218.tif 003148
2004121218.tif 003149
2004121218.tif 003150
2004121218.tif 003151
2004121218.tif 003152
2004121218.tif 003153
2004121218.tif 003154
2004121218.tif 003155
2004121218.tif 003156
2004121218.tif 003157
2004121218.tif 003158
2004121218.tif 003159
2004121218.tif 003160
2004121218.tif 003161
2004121218.tif 003162
2004121218.tif 003163
2004121218.tif 003164
2004121218.tif 003165
2004121218.tif 003166
2004121218.tif 003167
2004121218.tif 003168
2004121218.tif 003169
2004121218.tif 003170
2004121218.tif 003171
2004121218.tif 003172
2004121218.tif 003173
2004121218.tif 003174
2004121218.tif 003175
2004121218.tif 003176
2004121218.tif 003177
2004121218.tif 003178
2004121218.tif 003179
2004121218.tif 003180
2004121218.tif 003181
2004121218.tif 003182
2004121218.tif 003183
2004121218.tif 003184
2004121218.tif 003185
2004121218.tif 003186
2004121218.tif 003187
2004121218.tif 003188
2004121218.tif 003189
2004121218.tif 003190
2004121218.tif 003191
2004121218.tif 003192
2004121218.tif 003193
2004121218.tif 003194
2004121218.tif 003195
2004121218.tif 003196
2004121218.tif 003197
2004121218.tif 003198
2004121218.tif 003199
2004121218.tif 003200
2004121218.tif 003201
2004121218.tif 003202
2004121218.tif 003203
2004121218.tif 003204
2004121218.tif 003205
2004121218.tif 003206
2004121218.tif 003207
2004121218.tif 003208
2004121218.tif 003209
2004121218.tif 003210
2004121218.tif 003211
2004121218.tif 003212
2004121218.tif 003213
2004121218.tif 003214
2004121218.tif 003215
2004121218.tif 003216
2004121218.tif 003217
2004121218.tif 003218
2004121218.tif 003219
2004121218.tif 003220
2004121218.tif 003221
2004121218.tif 003222
2004121218.tif 003223
2004121218.tif 003224
2004121218.tif 003225
2004121218.tif 003226
2004121218.tif 003227
2004121218.tif 003228
2004121218.tif 003229
2004121218.tif 003230
2004121218.tif 003231
2004121218.tif 003232
2004121218.tif 003233
2004121218.tif 003234
2004121218.tif 003235
2004121218.tif 003236
2004121218.tif 003237
2004121218.tif 003238
2004121218.tif 003239
2004121218.tif 003240
2004121218.tif 003241
2004121218.tif 003242
2004121218.tif 003243
2004121218.tif 003244
2004121218.tif 003245
2004121218.tif 003246
2004121218.tif 003247
2004121218.tif 003248
2004121218.tif 003249
2004121218.tif 003250
2004121218.tif 003251
2004121218.tif 003252
2004121218.tif 003253
2004121218.tif 003254
2004121218.tif 003255
2004121218.tif 003256
2004121218.tif 003257
2004121218.tif 003258
2004121218.tif 003259
2004121218.tif 003260
2004121218.tif 003261
2004121218.tif 003262
2004121218.tif 003263
2004121218.tif 003264
2004121218.tif 003265
2004121218.tif 003266
2004121218.tif 003267
2004121218.tif 003268
2004121218.tif 003269
2004121218.tif 003270
2004121218.tif 003271
2004121218.tif 003272
2004121218.tif 003273
2004121218.tif 003274
2004121218.tif 003275
2004121218.tif 003276
2004121218.tif 003277
2004121218.tif 003278
2004121218.tif 003279
2004121218.tif 003280
2004121218.tif 003281
2004121218.tif 003282
2004121218.tif 003283
2004121218.tif 003284
2004121218.tif 003285
2004121218.tif 003286
2004121218.tif 003287
2004121218.tif 003288
2004121218.tif 003289
2004121218.tif 003290
2004121218.tif 003291
2004121218.tif 003292
2004121218.tif 003293
2004121218.tif 003294
2004121218.tif 003295
2004121218.tif 003296
2004121218.tif 003297
2004121218.tif 003298
2004121218.tif 003299
2004121218.tif 003300
2004121218.tif 003301
2004121218.tif 003302
2004121218.tif 003303
2004121218.tif 003304
2004121218.tif 003305
2004121218.tif 003306
2004121218.tif 003307
2004121218.tif 003308
2004121218.tif 003309
2004121218.tif 003310
2004121218.tif 003311
2004121218.tif 003312
2004121218.tif 003313
2004121218.tif 003314
2004121218.tif 003315
2004121218.tif 003316
2004121218.tif 003317
2004121218.tif 003318
2004121218.tif 003319
2004121218.tif 003320
2004121218.tif 003321
2004121218.tif 003322
2004121218.tif 003323
2004121218.tif 003324
2004121218.tif 003325
2004121218.tif 003326
2004121218.tif 003327
2004121218.tif 003328
2004121218.tif 003329
2004121218.tif 003330
2004121218.tif 003331
2004121218.tif 003332
2004121218.tif 003333
2004121218.tif 003334
2004121218.tif 003335
2004121218.tif 003336
2004121218.tif 003337
2004121218.tif 003338
2004121218.tif 003339
2004121218.tif 003340
2004121218.tif 003341
2004121218.tif 003342
2004121218.tif 003343
2004121218.tif 003344
2004121218.tif 003345
2004121218.tif 003346
2004121218.tif 003347
2004121218.tif 003348
2004121218.tif 003349
2004121218.tif 003350
2004121218.tif 003351
2004121218.tif 003352
2004121218.tif 003353
2004121218.tif 003354
2004121218.tif 003355
2004121218.tif 003356
2004121218.tif 003357
2004121218.tif 003358
2004121218.tif 003359
2004121218.tif 003360
2004121218.tif 003361
2004121218.tif 003362
2004121218.tif 003363
2004121218.tif 003364
2004121218.tif 003365
2004121218.tif 003366
2004121218.tif 003367
2004121218.tif 003368
2004121218.tif 003369
2004121218.tif 003370
2004121218.tif 003371
2004121218.tif 003372
2004121218.tif 003373
2004121218.tif 003374
2004121218.tif 003375
2004121218.tif 003376
2004121218.tif 003377
2004121218.tif 003378
2004121218.tif 003379
2004121218.tif 003380
2004121218.tif 003381
2004121218.tif 003382
2004121218.tif 003383
2004121218.tif 003384
2004121218.tif 003385
2004121218.tif 003386
2004121218.tif 003387
2004121218.tif 003388
2004121218.tif 003389
2004121218.tif 003390
2004121218.tif 003391
2004121218.tif 003392
2004121218.tif 003393
2004121218.tif 003394
2004121218.tif 003395
2004121218.tif 003396
2004121218.tif 003397
2004121218.tif 003398
2004121218.tif 003399
2004121218.tif 003400
2004121218.tif 003401
2004121218.tif 003402
2004121218.tif 003403
2004121218.tif 003404
2004121218.tif 003405
2004121218.tif 003406
2004121218.tif 003407
2004121218.tif 003408
2004121218.tif 003409
2004121218.tif 003410
2004121218.tif 003411
2004121218.tif 003412
2004121218.tif 003413
2004121218.tif 003414
2004121218.tif 003415
2004121218.tif 003416
2004121218.tif 003417
2004121218.tif 003418
2004121218.tif 003419
2004121218.tif 003420
2004121218.tif 003421
2004121218.tif 003422
2004121218.tif 003423
2004121218.tif 003424
2004121218.tif 003425
2004121218.tif 003426
2004121218.tif 003427
2004121218.tif 003428
2004121218.tif 003429
2004121218.tif 003430
2004121218.tif 003431
2004121218.tif 003432
2004121218.tif 003433
2004121218.tif 003434
2004121218.tif 003435
2004121218.tif 003436
2004121218.tif 003437
2004121218.tif 003438
2004121218.tif 003439
2004121218.tif 003440
2004121218.tif 003441
2004121218.tif 003442
2004121218.tif 003443
2004121218.tif 003444
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａｉｒ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（ＡＩ）法を模式的に示す図である。
【図２】ＡＩ法とＩＭＭ法の培養操作の違いを模式的に示す図。
【図３】ＡＩ法およびＩＭＭ法による、杯細胞分化におけるペンドリン遺伝子の発現レベルの変化を示すグラフである。発現レベル（ｃｏｐｙ数／ｎｇ　ＲＮＡ）を縦軸に、培養条件と培養日数を横軸に示した。
【図４】ＰＤＳ遺伝子のマウス喘息モデル肺における発現を示すグラフである。発現レベル（ｃｏｐｙ数／ｎｇ　ＲＮＡ）を縦軸に、マウスの処理条件と各処理群における個体の番号を横軸に示した。
ｎａｉｖｅ；無処理、Ｓ−ｓａｌ；　生理食塩水吸入
Ｓ−ＯＡ；ＯＶＡ抗原吸入、Ｐｒｅｄ；　プレドニゾロン処理群
【図５】マウス喘息モデル肺組織におけるＰＤＳ遺伝子の局在をｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより確認した顕微鏡写真（×４００）である。
【図６】マウス喘息モデル肺組織のＨＥ、ＰＡＳ及びアルシアンブルー染色の結果を示す顕微鏡写真（×４００）である。
【図７】図７−図３１は、ヒトとマウスの両者で変動した遺伝子の、ヒトでは杯細胞分化モデルｃＤＮＡを用いて、マウスではＯＶＡ抗原暴露気道過敏性モデルｃＤＮＡを用いてＡＢＩ　７７００による定量的ＰＣＲを行った結果を示す。縦軸はｍＲＮＡのコピー数（ｃｏｐｙ／ｎｇ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ）を示す。左のグラフの横軸は、培養条件（ＡＩ法またはＩＭＭ法）と培養日数を示す。また右のグラフの横軸は、マウスの処理条件と各処理群における個体の番号を示す。
ｎａｉｖｅ；無処理、Ｓ−ｓａｌ；　生理食塩水吸入
Ｓ−ＯＡ；ＯＶＡ抗原吸入、Ｐｒｅｄ；　プレドニゾロン処理群
図７は、遺伝子ＳＣＹＢ１１の測定結果を示す。以下、各遺伝子について同様にして測定された結果を示す図である。各図に示された遺伝子のｓｙｍｂｏｌを以下に記載した。
【図８】ＦＢＰ１
【図９】ＩＬ１ＲＬ１
【図１０】ＡＬＯＸ１５
【図１１】ＡＤＡＭ８
【図１２】ｄｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎ
【図１３】ＥＰＨＸ１
【図１４】ＲＤＣ１
【図１５】ＩＧＦＢＰ３
【図１６】ＩＧＦＢＰ６
【図１７】Ｓ１００Ａ８
【図１８】ＣＮＴＮ１
【図１９】ｃｉｇ５
【図２０】ＳＥＣＴＭ１
【図２１】ＣＰ
【図２２】ＨＥＹ１
【図２３】ＭＧＣ１４５９７
【図２４】ＵＣＰ２
【図２５】ＳＴＥＡＰ
【図２６】ＬＯＣ５１２９７
【図２７】ＳＬＣ３４Ａ２
【図２８】ＡＱＰ５
【図２９】ＳＬＣ２６Ａ４
【図３０】ＳＣＮＮ１Ｂ
【図３１】ＩＬ−１３Ｒａ２
【図３２】図３２−図６９は、ヒトで変動が確認された遺伝子の、ヒトでは杯細胞分化モデルｃＤＮＡを用いて、マウスではＯＶＡ抗原暴露気道過敏性モデルｃＤＮＡを用いてＡＢＩ　７７００による定量的ＰＣＲを行った結果を示す。縦軸はｍＲＮＡのコピー数（ｃｏｐｙ／ｎｇ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ）を示す。左のグラフの横軸は、培養条件（ＡＩ法またはＩＭＭ法）と培養日数を示す。また右のグラフの横軸は、マウスの処理条件と各処理群における個体の番号を示す。
ｎａｉｖｅ；無処理、Ｓ−ｓａｌ；　生理食塩水吸入
Ｓ−ＯＡ；ＯＶＡ抗原吸入、Ｐｒｅｄ；　プレドニゾロン処理群
、および図３２−図６９（ヒトで変動したもの）
図３２は、遺伝子ＮＯＳ２Ａの測定結果を示す。以下、各遺伝子について同様にして測定された結果を示す図である。各図に示された遺伝子のｓｙｍｂｏｌを以下に記載した。
【図３３】ＩＳＧ１５
【図３４】ＣＨ２５Ｈ（ヒト杯細胞分化モデルｃＤＮＡの結果のみ）
【図３５】ＳＥＲＰＩＮＢ４
【図３６】ＳＥＲＰＩＮＢ２
【図３７】ＮＣＦ２
【図３８】ＮＯＴＣＨ３（ヒト杯細胞分化モデルｃＤＮＡの結果のみ）
【図３９】ＭＤＡ５
【図４０】ＧＢＦ５
【図４１】ＰＲＯ１４８９（ヒト杯細胞分化モデルｃＤＮＡの結果のみ）
【図４２】ＭＧＣ１３１０２
【図４３】ＴＧＦＢ２
【図４４】ＤＮＡＪＡ１
【図４５】ＳＩＡＴ１
【図４６】ＣＩＳＨ
【図４７】ＡＧＲ２（ヒト杯細胞分化モデルｃＤＮＡの結果のみ）
【図４８】ＭＳＭＢ（ヒト杯細胞分化モデルｃＤＮＡの結果のみ）
【図４９】ＦＬＪ２３５１６
【図５０】ＫＣＮＭＡ１
【図５１】ＦＬＪ１０２９８
【図５２】ＴＨＢＳ１
【図５３】ＡＢＣＣ５
【図５４】ＳＬＣ２１Ａ１２（ヒト杯細胞分化モデルｃＤＮＡの結果のみ）
【図５５】ＳＬＣ１７Ａ５（ヒト杯細胞分化モデルｃＤＮＡの結果のみ）
【図５６】ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３
【図５７】ＢＳＴ２（ヒト杯細胞分化モデルｃＤＮＡの結果のみ）
【図５８】ＩＦＩ９−２７
【図５９】ＩＣＡＭ１
【図６０】ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ
【図６１】ＣＤＨ−６
【図６２】ＤＤ９６
【図６３】ＣＴＳＣ
【図６４】ＢＥＮＥ（ヒト杯細胞分化モデルｃＤＮＡの結果のみ）
【図６５】ＦＬＪ１０２６１
【図６６】ＯＡＳ２（ヒト杯細胞分化モデルｃＤＮＡの結果のみ）
【図６７】Ｏｄｚ２
【図６８】Ｅ４８
【図６９】ＫＲＴ１６
【図１】
2004121218.tif 003445
【図２】
2004121218.tif 003446
【図３】
2004121218.tif 003447
【図４】
2004121218.tif 003448
【図５】
2004121218.tif 003449
【図６】
2004121218.tif 003450
【図７】
2004121218.tif 003451
【図８】
2004121218.tif 003452
【図９】
2004121218.tif 003453
【図１０】
2004121218.tif 003454
【図１１】
2004121218.tif 003455
【図１２】
2004121218.tif 003456
【図１３】
2004121218.tif 003457
【図１４】
2004121218.tif 003458
【図１５】
2004121218.tif 003459
【図１６】
2004121218.tif 003460
【図１７】
2004121218.tif 003461
【図１８】
2004121218.tif 003462
【図１９】
2004121218.tif 003463
【図２０】
2004121218.tif 003464
【図２１】
2004121218.tif 003465
【図２２】
2004121218.tif 003466
【図２３】
2004121218.tif 003467
【図２４】
2004121218.tif 003468
【図２５】
2004121218.tif 003469
【図２６】
2004121218.tif 003470
【図２７】
2004121218.tif 003471
【図２８】
2004121218.tif 003472
【図２９】
2004121218.tif 003473
【図３０】
2004121218.tif 003474
【図３１】
2004121218.tif 003475
【図３２】
2004121218.tif 003476
【図３３】
2004121218.tif 003477
【図３４】
2004121218.tif 003478
【図３５】
2004121218.tif 003479
【図３６】
2004121218.tif 003480
【図３７】
2004121218.tif 003481
【図３８】
2004121218.tif 003482
【図３９】
2004121218.tif 003483
【図４０】
2004121218.tif 003484
【図４１】
2004121218.tif 003485
【図４２】
2004121218.tif 003486
【図４３】
2004121218.tif 003487
【図４４】
2004121218.tif 003488
【図４５】
2004121218.tif 003489
【図４６】
2004121218.tif 003490
【図４７】
2004121218.tif 003491
【図４８】
2004121218.tif 003492
【図４９】
2004121218.tif 003493
【図５０】
2004121218.tif 003494
【図５１】
2004121218.tif 003495
【図５２】
2004121218.tif 003496
【図５３】
2004121218.tif 003497
【図５４】
2004121218.tif 003498
【図５５】
2004121218.tif 003499
【図５６】
2004121218.tif 003500
【図５７】
2004121218.tif 003501
【図５８】
2004121218.tif 003502
【図５９】
2004121218.tif 003503
【図６０】
2004121218.tif 003504
【図６１】
2004121218.tif 003505
【図６２】
2004121218.tif 003506
【図６３】
2004121218.tif 003507
【図６４】
2004121218.tif 003508
【図６５】
2004121218.tif 003509
【図６６】
2004121218.tif 003510
【図６７】
2004121218.tif 003511
【図６８】
2004121218.tif 003512
【図６９】
2004121218.tif 003513