(57)【要約】【課題】　本発明は、がん、特に、子宮頸がんの免疫療法用の核酸ワクチンの提供。【解決手段】　子宮頸がんに対するＤＮＡ免疫用のベクターは、ＨＰＶ−１６などの子宮頸がんに関連するヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ）株のＥ６および／またはＥ７抗原の少なくとも１つの非毒性Ｔ細胞エピトープをコードする核酸分子と、このベクターが投与される宿主における、その核酸分子の発現のため、前記核酸と作動的に結合されているプロモーターとを含む。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　子宮頸がんに関連するヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ）株のＥ６および／またはＥ７抗原の少なくとも１つの非毒性Ｔ細胞エピトープをコードする核酸分子と、かかるベクターが投与された宿主中でその核酸分子の発現をさせるため、前記核酸分子に対して作動的に結合されているプロモーターとを含んでなるベクター。
【請求項２】
　前記プロモーターは、サイトメガロウィルス・プロモーターである請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
　前記核酸分子は、プラスミドＣＭＶ−３中に入れられている請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
　前記核酸分子は、宿主中でのがん遺伝子の複製を防ぐことを目的とし、無毒化がなされたＥ７抗原のコード配列である請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
　ＨＰＶ−１６のアミノ酸２１から２６をコードする核酸を、その本来の配列から除去することにより、前記無毒化が施されている請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
　前記ベクターは、ｐＣＭＶ−ｄＥ７と同一の特徴を有する請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
　前記核酸分子は、ＨＰＶ−１６のアミノ酸１１から２０、４９から５７、８２から９０、ならびに８６から９３を含んでなるＥ７抗原エピトープと、アミノ酸２９から３８を含むＥ６抗原エピトープとコードしている請求項１に記載のベクター。
【請求項８】
　前記核酸分子は、配列番号４または５の配列を有する請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
　前記核酸分子は、配列番号６の配列を有するアミノ酸配列をコードしている請求項７に記載のベクター。
【請求項１０】
　前記ベクターは、ｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１と同一の特徴を有する請求項７に記載のベクター。
【請求項１１】
　請求項１に記載のベクターを含んでなる、宿主に対してｉｎ　ｖｉｖｏ投与用の免疫原性組成物。
【請求項１２】
　ヒト・ピペローマウィルスにより引き起こされる子宮頸がんに対して、宿主を免疫する方法であって、宿主に対する、有効量の請求項１１に記載の免疫原性組成物の投与を含んでなる方法。
【請求項１３】
　ヒト・ピペローマウィルスにより引き起こされる子宮頸がんを患う宿主の治療方法であって、宿主に対する、有効量の請求項１１に記載の免疫原性組成物の投与を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　　（発明の分野）
　本発明は、がん、特に、子宮頸がんの免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　　（発明の背景）
　子宮頸がんは、世界中の女性において、２番目に多いがん関連死の原因である。子宮頸がんの病因を、１６型および１８型ヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ）感染と関連付ける、疫学的、ならびに実験的なデータがともにある。ＨＰＶウィルスは、若い女性の３５から４０％に広まっている。初期段階の疾患の治療は、比較的に成功をおさめているものの、患者の１５％では、再発が認められている。疾患の再発患者での成果は比較的によくない。したがって、新規な治療法に対する要望がある（参考文献１、２、３；−本発明の属する技術分野の水準をより十分に記述するため、様々な参考文献を括弧内に示す。各引用文献の完全な書誌事項は、明細書の最後、請求の範囲の直前に示してある。これらの参考文献の開示は、以後参照することによって、本発明の開示中に組み入れられる）。
【０００３】
　ＨＰＶ感染と子宮頸がんの強い関連性は、ウィルス抗原に特異的な免疫療法的アプローチが子宮頸がん治療の実施可能な戦略となりうることを示唆している。特異的免疫療法の目標は、腫瘍の病巣を攻撃し、根絶させるため、腫瘍を有する患者の免疫応答を刺激することにある。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が同定されたことにより、この戦略が実施できるようになった。ＨＰＶ−１６感染と子宮頸がんとの強い関連性は、この疾患を免疫療法的な治療のよい候補としている（参考文献４）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
　ＨＰＶ　ＤＮＡ陽性の子宮頸がんでは、Ｅ６およびＥ７がんタンパク質が発現される。実験的証拠は、これらの２つのタンパク質は、その発現はヒト上皮細胞培養物において、形質転換ならびに、不死化された状態に導き、子宮頸がんの発がんの進行の要因であることを示唆されている（参考文献５）。したがって、これらの２つのタンパク質は、ＨＰＶで誘発された子宮頸がんにおける、抗原特異的免疫療法の有力な候補物質であり、以下に検証する。
【０００５】
　天然のＨＰＶ感染、また、代わりに、子宮頸がんに対する免疫性の性質に関しては多くの疑問が残っているものの、免疫抑制された個体は子宮頸部悪性疾患発症のリスクがより高くなっていることから、免疫成分が存在することは明らかである（参考文献６）。さらに、この免疫性は、免疫応答の細胞性攻撃が介在している可能性が極めて高い。子宮頸部腫瘍の自然退縮部の観察において、広範な細胞浸潤が認められる（参考文献７）。したがって、抗原特異的な細胞応答は、子宮頸がん患者を治療する上で、必要と思われる。
【０００６】
　免疫療法的戦略の結果の性質は確認されているが、従来のワクチン技術を使用して、この種の応答を誘導する能力は限られている。ＨＰＶに対する予防用ワクチンの開発は、Ｌ１およびＬ２ビリオンの構造タンパク質からなる組換えサブユニット製剤に焦点を当てていた。真核細胞では、Ｌ１（主要キャプシドタンパク質）は、それ自体を、パピローマウィルス様粒子（ＶＬＰ）に構成する（参考文献１７）。ＶＬＰのアセンブリにはＬ１のみで十分であるものの、Ｌ２（副キャプシドタンパク質）の同時発現により、より大きなキャプシド産生が提供される（参考文献１８）。対照的に、治療用ワクチンの開発は、一般に、野生型Ｅ６および／またはＥ７タンパク質の発現を対象としてきている。使用する発現ベクターには、ワクシニアウィルス（例えば、米国特許第５７４４１３３号、（参考文献１９、２０）に記載されたもの）、アルファウィルス（例えば、米国特許第５８４３７２３号）、その他のポックスウィルス（例えば、米国特許第５６７６９５０号）が含まれる。したがって、疾患の発がんの進行に関わる、ＨＰＶ抗原をコードするＤＮＡベクターは、免疫療法的戦略の成功を達成させることのできる最適な方法であると、判断された。
【０００７】
　しかし、上記のように、Ｅ６およびＥ７ＨＰＶ抗原は、発がん性であると推測され、したがって、これらのタンパク質の一方または両方をコードするＤＮＡ構築物による免疫は、別の悪性疾患の誘発を引き起こす可能性がある（参考文献５、１０、１１）。したがって、毒性リスクを最小限に留めるために、ここでは、遺伝子工学的に無毒化したＥ７分子をＤＮＡ構築物にコードした。この無毒化した分子は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）結合領域を欠失させることにより、改変される（参考文献８、９）。がん原性の形質転換のリスクを伴うことなく、抗原特異的な免疫性を達成する別の方法は、特異的免疫応答を誘導するため、分子の重要な部分のみを投与するという、エピトープ戦略の利用である（参考文献１２〜１６）。ここでは、Ｅ６およびＥ７の両者に由来するいくつかのＴ細胞エピトープが互いに連結されている、ＤＮＡ−ポリエピトープ構築物の設計にこのアプローチを使用した。ここでは、ＨＰＶ関連子宮がんの齧歯類モデルで、これら２つのアプローチの比較を行った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
　　（発明の概要）
　本発明によれば、宿主において免疫応答を提供するための、宿主に対するＨＰＶ抗原の投与用の、新規なＤＮＡ構築物が提供される。本発明は、ＨＰＶにより生じる腫瘍、特には子宮頸がんの免疫療法の方法まで及ぶ。
【０００９】
　ＨＰＶ　ＤＮＡ陽性子宮頸がんの免疫療法のために選択される抗原は、かかるがんにより発現されるものとすることができる。このようなＨＰＶ抗原の１つは、Ｅ７抗原であり、これはワクシニアベクター系において、防御能を有することが既に示されている。
【００１０】
　Ｒｂタンパク質に結合し、そして、発がん性の状態を促進するその能力から、ワクチンに天然型のＥ７の使用には、潜在的な毒性の懸念が存在する。ここでは、 Ｅ７の新規な無毒化型を、Ｒｂ結合部位を欠失させることにより構築し、ｐＣＭＶ３（図２）に導入することにより、免疫用のベクターｐＣＭＶ−ｄＥ７（図１）を提供した。
【００１１】
　この無毒化したＥ７をコードする配列は、アニールしたオリゴから形成されたＤＮＡで約２１０ｂｐを置き換えることにより、未修飾のコード配列から調製した。置換配列は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）ファミリーの細胞性タンパク質との複合体形成に関与するＥ７の領域、すなわち、アミノ酸２１から２６をコードする１８ヌクレオチドを、天然のＥ７タンパク質から欠いている。
【００１２】
　ｐＣＭＶ−ｄＥ７構築物による免疫は、野生型Ｅ７分子を発現する、生きているＣ３腫瘍細胞の接種に引き続く、腫瘍増殖からの顕著な防御をもたらし、このＥ７ＤＮＡ構築物は、付随する毒性リスクなしに、防御免疫性の刺激に有効に利用できることを示している。
【００１３】
　もう１つのこのようなＨＰＶ抗原は、Ｅ６抗原である。これらの抗原は、ＤＮＡ構築物中において、全長タンパク質として、または特異的Ｔ細胞エピトープの形で提供することができる。
【００１４】
　Ｔ細胞によるアプローチを評価するために、ＨＰＶ−１６のＥ６およびＥ７タンパク質の両者由来の、Ｔ細胞エピトープをコードする核酸配列を含む、合成ミニ遺伝子を調製した（図５Ａ）。このミニ遺伝子を含むＤＮＡ構築物（ｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１）（図６）は、マウスの免疫に使用した。図６のＤＮＡ構築物で免疫されたマウスは、腫瘍増殖から１００％防御された。
【００１５】
　これら研究の結果は、ＤＮＡ免疫は、生きているＣ３腫瘍による誘発に対する防御に、有効に利用でき、したがって、子宮頸がんの臨床的治療においても、効果があるであろうことを示している。
【００１６】
　したがって、本発明の１つの形態では、ＨＰＶ−１６などの子宮頸がんに関連するヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ）株のＥ６および／またはＥ７抗原の少なくとも１つの非毒性Ｔ細胞エピトープをコードする核酸分子と、ベクターを投与する宿主における、その核酸分子の発現のため、前記核酸と作動的に結合されているプロモーターとを含むベクターが提供される。
【００１７】
　プロモーターは、好ましくはサイトメガロウィルス・プロモーターである。核酸分子は、エンハンサ配列およびイントロン配列を含む、非常に初期のサイトメガロウィルス・プロモーターを、ウシ・成長ホルモンのポリＡテールおよびカナマイシン耐性遺伝子と共に含んでいるプラスミドＣＭＶ−３中に含まれていることができる。ｐＣＭＶ−３の要素は、図２に示す。
【００１８】
　１つの実施態様では、核酸分子は、宿主でのがん遺伝子の複製を防止するために無毒化したＥ７抗原のコード配列である。この無毒化は、ＨＰＶ−１６のアミノ酸２１から２６をコードするものを含んでいる、Ｒｂ結合部位をコードする核酸を、天然の配列から除去することを含む、任意の好都合な方法で実施することができる。このような核酸分子を含むベクターは、図１に示す制限酵素マップおよび構築要素を含んでいる、ｐＣＭＶ３−ｄＥ７と同一な特性を有することができる。
【００１９】
　別の実施態様では、核酸分子は、ＨＰＶ−１６の、アミノ酸１１から２０、４９から５７、８２から９０および８６から９３を含むＥ７抗原エピトープ、ならびにアミノ酸２９から３８を含むＥ６抗原エピトープをコードする。この実施態様では、特には、核酸分子は、配列番号：４または５を有するものであってよく、あるいは、配列番号：６を有するアミノ酸配列をコードするものであってよい。このような核酸分子を含むベクターは、図６に示すような制限酵素マップおよび構築要素を含み、ｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１と同一な特性を有することができる。
【００２０】
　本発明は、別の形態では、ここで提供されるベクターを含む、宿主にｉｎ　ｖｉｖｏで投与するための免疫原性組成物を提供し、それ用の薬学的に許容される担体を含むことができる。本発明は、別の形態では、ヒト・ピペローマウィルス（ＨＰＶ）により生じる子宮頸がんに対して、宿主を免疫する方法を提供し、それは、有効量の本発明の免疫原性組成物の宿主への投与を含む。付加的な形態では、本発明は、子宮頸がんの宿主の治療方法を提供し、それは、有効量の本発明の免疫原性組成物の宿主に対する投与を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
　　（発明の一般的な説明）
　本発明は、ＤＮＡ免疫に基づく、ヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ）により生じた子宮頸がんに対する免疫治療アプローチを提供する。
【００２２】
　Ｃ３子宮頸がんモデル系において、一連の実験を実施した。ＤＮＡ送達プラットフォームを使用して、いくつかのＥ７抗原をベースとするワクチンを、生きている腫瘍細胞の感作に伴う、腫瘍増殖ふの防止能について評価した。Ｅ７抗原はワクシニアワクチン系において、いくらかの防御能を有することが示されているものの、上記のように、Ｒｂタンパク質に結合し、そして、発がん性の状態を促進する能力から、ワクチンにおける天然型のＥ７の使用することについては、潜在的な毒性の懸念が存在する。したがって、ＨＰＶ−１６のＥ７の「無毒化」型（ｄＥ７）をコードするＤＮＡ構築物を構築した。ｄＥ７　ＤＮＡ構築物（ｐＣＭＶ−ｄＥ７、図１）による免疫は、野生型Ｅ７分子を発現する、生きているＣ３腫瘍細胞の接種に続く、腫瘍増殖からの顕著な防御をもたらした。この知見は、毒性リスクを伴うことなく、防御免疫を刺激するために、ｄＥ７ＤＮＡ構築物は、有効に使用できることを示している。
【００２３】
　エピトープ特異的なアプローチも評価した。ＨＰＶ−１６のＥ６タンパク質およびＥ７タンパク質の両者に由来するＴ細胞エピトープからなるＤＮＡ構築物は、マウスの免疫に使用した（ｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１、図６）。このポリ・エピトープ構築物で免疫したマウスの群において、著しい結果が認められ、そこでは、腫瘍増殖からの１００％の防御が観察された。
【００２４】
　本発明の様々な実施態様は、ＨＰＶ感染のワクチン接種、診断および治療の分野で多くの用途を有することは、当業者には明らかである。このような用途の特に非限定的な説明を以下に示す。
【００２５】
　ワクチンの調製および使用
　ワクチンとして使用するのに適する免疫原性組成物は、ここに開示するように、ＨＰＶ遺伝子、エピトープおよびベクターから調製することができる。ワクチンは、対象において、防御的または治療的な抗腫瘍応答を誘発するための、免疫応答を引き起こす。核酸を含有する、ワクチンを含めた免疫原性組成物は、ポリヌクレオチドを投与するための生理学的に許容される液体の溶液またはエマルジョンの形で注射可能医薬品として調製することができる。許容できる液体中に溶かした核酸を直接免疫剤として使用することができる（例えば、米国特許第５５８９４６６号に一般的に記載されている。あるいは、核酸を、レシチンリポソームおよび当技術分野で核酸リポソームとして知られている他のリポソーム（例えば、ＷＯ９３／２４６４０、参考文献２１に記載されている）などのリポソームと合わせることができ、または核酸をより詳細に以下に記述するアジュバントと合わせることができる。カチオン性脂質を含むリポソームは自発的に、迅速に、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのポリアニアオンと相互作用して、ポリヌクレオチドを１００％まで捕獲するリポソーム／核酸複合体となる。さらに、ポリカチオン性複合体は細胞膜と融合して、リソソームコンパートメントの消化酵素をバイパスするポリヌクレオチドの細胞内送達を生じる。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／２７４３５はカチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含む遺伝的免疫用組成物を記載している。カルシウムイオン、ウィルスタンパク質および他のトランスフェクション促進物質などの核酸の細胞取り込みを助ける物質を有利に使用することができる。
【００２６】
　ポリヌクレオチドの免疫原性製剤は、生分解可能な徐放粒子を含むマイクロカプセルとして処方することもできる。すなわち、米国特許第５１５１２６４号は、Ｂｉｏ　Ｖｅｃｔｅｕｒｓ　Ｓｕｐｒａ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅｓ（ＢＶＳＭ）と命名されているリン脂質／糖脂質／多糖の性質を有する粒状担体を記載している。この粒状担体は、その層の１つの生物活性を有する多様な分子を輸送することを意図している。
【００２７】
　米国特許第５０７５１０９号は、５０：５０のポリ（ＤＬ−ラクチドコ−グリコライド）中に抗原、トリニトロフェニル化キーホールリンペットヘモシアニンおよびブドウ球菌エンテロトキシンＢをカプセル封入することを記載している。ポリ（グリコライド）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコライド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポリオルトエステルおよびポリ８−ヒドロキシ酪酸）ならびにポリ無水物などのカプセル封入用の他のポリマーが示唆されている。
【００２８】
　公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９１／０６２８２は、複数の生体接着性ミクロスフェアおよび抗原を含む送達用ベヒクルを記載している。マクロスフェアは、デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミン製である。この送達用ベヒクルは、ワクチンを鼻粘膜を通る取込みを特に意図している。送達用ベヒクルは、さらに吸収促進剤を含むことができる。
【００２９】
　ベクターを相容性のある薬学的に許容される賦形剤と混合することができる。このような賦形剤は、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せを含むことができる。免疫原性組成物およびワクチンはさらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ調整剤、有効性を高めるアジュバントなどの佐剤物質をさらに含むことができる。
【００３０】
　本発明で提供される免疫原性組成物およびワクチンは、おそらく注射部位を局所麻酔剤で前処理した後に、皮下、静脈内、皮内または筋肉内注射により非経口的に投与することができる。あるいは、本発明に従って処方した免疫原性組成物は、粘膜表面で免疫応答を引き起こすように処方し、送達することができる。したがって、免疫原性組成物は、例えば、経鼻または経口（胃内）経路で粘膜表面に投与することができる。あるいは、座薬および経口用処方を含む他の投与様式も望ましいことがある。座薬用には、結合剤および担体は、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドを含むことができる。経口用処方は、例えば、医薬用グレードのサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの、通常使用するインシピエントを含むことができる。
【００３１】
　免疫原性製剤およびワクチンは、剤形に適した方法で、治療上有効で、防御的で、免疫原性となる量で投与する。投与すべき量は、例えば、各自の免疫系が腫瘍関連抗原およびそれに対する抗体を合成し、必要に応じ、細胞性免疫応答を生じる能力を含め、治療する対象に依存する。投与すべき活性成分の正確な量は医師の判断に依存する。しかし、適した用量の範囲は当業者には容易に決定でき、ベクター約１μｇから約１ｍｇの程度とすることができる。初回投与および追加投与に適した投与計画も様々でありうるが、初回投与後に複数回投与することができる。用量も投与経路に依存する可能性があり、宿主のサイズにより変化する。
【００３２】
　一般にリン酸緩衝食塩水の０．０５から０．１パーセント溶液として使用するアジュバントと共にベクターを同時投与すると、免疫原性を顕著に改善することができる。アジュバントは、抗原の免疫原性を高めるが、それ自体免疫原性である必要はない。アジュバントは、抗原を投与部位の近くでの局在を維持することによって作用し、抗原の免疫系細胞への徐放を促進するデポ作用を生じることができる。アジュバントは免疫系の細胞を抗原デポに引きつけ、このような細胞を刺激して、免疫応答を誘導することもできる。
【００３３】
　免疫刺激剤またはアジュバントは長年にわたり、例えばワクチンに対する宿主の免疫応答を改良するために使用されてきた。したがって、抗原に対する免疫応答を増強するアジュバントが同定されている。しかし、これらのアジュバントの一部は毒性であり、望ましくない副作用を引き起こす可能性があるため、ヒトおよび多くの動物への使用に適さない。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（集合的に一般的にアラムと呼ばれている）のみが、ヒトおよび動物用ワクチンのアジュバントとして日常的に使用されている。
【００３４】
　広範な外因性アジュバントおよび他の免疫調整物質が抗原に対する強力な免疫応答を誘起することができる。これらには、膜タンパク質抗原と複合体を形成して免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）を生成するサポニン、鉱物油と共に使用するプルロニックポリマー、鉱物油中の死滅マイコバクテリア、フロインド完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）などの細菌生成物、ならびにモノホリル脂質Ａ、ＱＳ２１およびポリホスファゼンが含まれる。
【００３５】
　本発明の特定の実施形態では、ベクターは、標的化分子と共に送達して、免疫系の細胞を含む選択した細胞にベクターを向けることができる。
【００３６】
　ポリヌクレオチドは様々な手順で宿主に送達することができ、例えば、Ｔａｎｇ他（参考文献２２）は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡでコーティングした金のマイクロプロジェクチルをマウスの皮膚の導入して、マウスで抗ＢＧＨ抗体を産生することを開示しており、一方、Ｆｕｒｔｈ他（参考文献２３）はジェット・インジェクタを使用して、生きている動物の皮膚、筋肉、脂肪組織および乳腺組織をトランスフェクトすることができることを示している。
【実施例】
【００３７】
　実施例
　上記の開示は、本発明を一般的に述べているものである。以下の特定の実施例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は例示のために述べるものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。状況により示唆されるか、または適切なものとなる可能性のあるとき、形態の変更および等価物による代替が企図される。本明細書で特定の用語が用いられるが、そのような用語は説明的な意味で用いられるものであって、限定するものではない。
【００３８】
　本開示およびこれらの実施例で用いられているが、明確に記述されていない分子遺伝学、タンパク質生化学、および免疫学の方法は、科学文献に詳細に報告されており、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００３９】
　実施例１
　本実施例は、本明細書で用いられる免疫化プロトコルを説明する。
【００４０】
　体重１８グラムから２０グラムの雌のＣ５７Ｂ１／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ（Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）から得た。Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｃｏｕｎｃｉｌ　ｏｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）によって立案されたガイドラインに従って、このマウスをマイクロアイソレータに収容した。各処置群には１０匹の動物が含まれた。０日目に、前頸骨筋の筋内経路（ｉ．ｍ．）または皮内経路（ｉ．ｄ．）のいずれかを経て、それぞれのＤＮＡ構築物１００μｇで免疫化した。試験の２１日、および４２日目に、各構築物の等量を投与し、この免疫化を繰り返した。２０日、４０日、および５６日目に、マウスから血清試料を採取した。
【００４１】
　実施例２
　本実施例は、腫瘍細胞チャレンジのプロトコルを説明する。
【００４２】
　実施例１の手順によるＤＮＡ構築物での最後のブースタ投与２週間後、各マウスに生Ｃ３腫瘍細胞を５×１０5の用量で、頚部の項に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。このＣ３腫瘍細胞ラインは、Ｒ．ＯｆｆｒｉｎｇａおよびＣ．Ｍｅｌｉｅｆから親切に提供された。このＣ３細胞ラインは、ｒａｓ癌遺伝子で形質転換したＨＰＶ−１６の完全ゲノムでＢ６マウス胚細胞をトランスフェクトすることによって作られた。ＨＰＶ１６腫瘍形成タンパク質Ｅ６およびＥ７の発現は、形質転換状態を維持するために必要とされる。
【００４３】
　注射を施した後、研究の継続期間、１週間につき３回マウスを検査した。腫瘍測定は、バーニアカリパスを用いて行なった。腫瘍塊の体積は以下の式を用いて算出した。体積＝ａｂ2／２で、式中ａ＝２つのうち長い径、ｂ＝小さい測定値。初回の生腫瘍細胞のチャレンジから約３ヵ月の間、無腫瘍のままであったマウスは、その後、研究の１４１日目に、上述した５７日目の初回のチャレンジと同じ投与量および同じ経路で再チャレンジを行なった。再チャレンジ後、前述のとおり、腫瘍増殖の出現に関してモニターした。
【００４４】
　実施例３
　本実施例は、Ｅ７およびｄＥ７特異的ＩｇＧイムノアッセイ（ＥＩＡ）を説明する。
【００４５】
　Ｎｕｎｃ　Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノアッセイプレートを、５０ｍＭの炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６に希釈した濃度１０μｇ/ｍｌの組換えＥ７または組換えｄＥ７抗原のいずれかで、１晩被覆した。翌日、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中で洗浄し、次に室温で１時間、１％の乳溶液でブロックした。ブロック工程の後、プレートをＰＢＳ−Ｔ中で洗浄し、プレートに多様な希釈度で血清試料を添加した。この試料を、４℃で１晩、プレート上でインキュベートした。翌日、ＰＢＳ−Ｔを用いて試料をプレートから洗い落とし、ペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧコンジュゲートを１／２５０００の希釈度で各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ−Ｔ中で洗浄し、ＴＭＢ基質（ＡＤＩ）を用いて比色反応を発現させた。この反応を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＭＲ５０００、９６ウェルのプレートリーダにより、４５０ｎｍで読み取った。
【００４６】
　実施例４
　本実施例は、ｐＣＭＶ−ｄＥ７の構築を説明する。
【００４７】
　プラスミドｐＣＭＶ３は、種々の源からのセグメントを含んでおり、構築のエレメントを図２に示す。簡潔には、原核生物ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、ｐＣＭＶ３のバックボーンであり、ＫａｎR遺伝子でのＡｍｐR遺伝子の置換、ならびにｆ１およびＬａｃＺ領域の欠失によって改変された。この改変は、ＡｍｐR、ｆ１起点、およびＬａｃＺ配列を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫの制限部位ＡｈｄＩ（ヌクレオチド２０４１）とＳａｃＩ（ヌクレオチド７５９）の間の配列を欠失することによって達成された。ＫａｎR遺伝子を含有するプラスミドｐＵＣ−４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からの１．２ｋｂＰｓｔＩフラグメントは、転写に関する反時計回り配向において、改変ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫプラスミドのＡｈｄＩ部位にライゲートした平滑末端であった。最初期のヒト・サイトメガロウィルス遺伝子プロモーター、エンハンサ、およびイントロンＡ配列（図２のＣＭＶに示す）を含む１．６ｋｂＳｓｐＩ／ＰｓｔＩフラグメントは、時計回り配向でＣＭＶプロモーターからの転写が進むように、ＫａｎR遺伝子の他端にライゲートした。この手順で、図３に示したプラスミドｐＣＭＶ２Ｋが生成された。
【００４８】
　ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリアデニル化シグナル配列を含む０．２ｋｂフラグメントを、ＸｂａＩ消化、それに続く平滑末端を生成するためのクレノウ処理、およびＢａｍＨＩ消化によって、プラスミドｐＥＮ−３から除去した。ＢＧＨｐＡフラグメントを含む１９２ｂｐフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって分離した。プラスミドｐＥＮ−３は、ｂＧＨｐＡのｐＥＮ−１へのクローニングによって調製した（図４）。
【００４９】
　次にプラスミドｐＣＭＶ２Ｋに、ＢｇｌＩＩ消化、クレノウ処理、およびＢａｍＨＩ消化を行なった。この４．２ｋｂフラグメント（図３参照）を次に分離し、前に分離した１９２ｂｐＢＧＨｐＡフラグメントにライゲートし、プラスミドｐＣＭＶ３を生成した。
【００５０】
　このｄＥ７遺伝子を次に、５’末にＰｓｔＩ部位（配列番号２−ＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴ）、３’末にＳａｌＩ部位（配列番号１２−ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＣＡＣＡ）を導入したプライマーを用いてプラスミドｐＳＥ８５９．２からＰＣＲ増幅した。増幅した配列を図１Ｂに示すが、これはＨＰＶ−１６の無毒化Ｅ７タンパク質を含む。このＰＣＲフラグメントをＰｓｔＩおよびＳａｌＩで消化したｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、この挿入物を配列した（図１Ｂ）。ＰｓｔＩからＳａｌＩまでのフラグメントを次に、ＰｓｔＩからＳａｌＩまでのｐＣＭＶ３にサブクローンし、図１Ａに示したプラスミドｐＣＭＶ−ｄＥ７を生成した。
【００５１】
　実施例５
　本実施例は、野生型ＨＰＶ−１６Ｅ７を発現する腫瘍細胞ラインの移植後の腫瘍増殖から動物を守るためのｐＣＭＶ−ｄＥ７の使用を例示する。
【００５２】
　実施例１のプロトコルに従って、筋内経路で、無毒化Ｅ７タンパク質をコードするＤＮＡ構築物（ｐＣＭＶ−ｄＥ７、実施例４に記載のとおり調製、図１）、ＤＮＡコントロール（ｐＣＭＶ−３、図２）、またはＰＢＳのいずれかを用いてマウスを免疫化した。３回の連続免疫化の後、野生型Ｅ７タンパク質を発現する生Ｃ３腫瘍細胞を、実施例２のプロトコルに従って、５×１０5細胞の用量で移植した。生細胞のチャレンジ後、無腫瘍のマウスの数を下の表１に示す。
【００５３】
　チャレンジの約１ヵ月後（３０日目）、コントロール群（ｐＣＭＶ−３コントロールおよびＰＢＳ群）のすべてのマウスは、触知可能な腫瘍を有した。しかしながら、対照的に、ｐＣＭＶ−ｄＥ７免疫化群のマウスはいずれも触知可能な腫瘍を示さなかった。６０日目までに、前に腫瘍陰性であったｐＣＭＶ−ｄＥ７免疫化群のマウス１匹が、触知可能な腫瘍の初期徴候を示した。９０日目までに、このマウスは大きな腫瘍のため安楽死させた。しかしながら、ｐＣＭＶ−ｄＥ７免疫化群の残りのマウスは、無腫瘍のままであった。このように、ｄＥ７免疫化群とコントロール群の間の、無腫瘍の状況には著しい相違が観察された。この結果はしたがって、遺伝子的に無毒化されたＥ７分子（ｄＥ７）をコードするＤＮＡ構築物を用いた免疫化が、生腫瘍細胞の移植後から動物を守ることのできる免疫応答を誘発したことを示している。
【００５４】
【表１】
2004121263.tif 000002
　実施例６
　本実施例は、ｐＣＭＶ−ｄＥ７構築物で免疫化したマウスから得られた血清が無毒化Ｅ７および野生型Ｅ７組換えタンパク質の両方に反応性であることを例示する。
【００５５】
　実施例５によって、遺伝子的無毒化Ｅ７タンパク質で免疫化されたマウスが野生型Ｅ７タンパク質と交差反応性の免疫性を生じることができたという血清学的な証拠を提供するために、免疫化マウスの血清を実施例３の手順に従ってＥＩＡによって分析した。アッセイした血清試料は、生腫瘍細胞チャレンジの１日前、最後の追加免疫の２週間後である５６日目に採取した血液試料から得た。
【００５６】
　血清の反応性抗体滴定量は、下の表２に見られるように、ｄＥ７特異的ＥＩＡまたはＥ７特異的ＥＩＡのアッセイのいずれも等量であった。このように、抗体レベルにおいて、ｄＥ７での免疫化によって生じた抗体はＥ７タンパク質に交差反応性であった。
【００５７】
【表２】
2004121263.tif 000003
　実施例７
　本実施例は、免疫化の特定の経路が保護免疫性の誘発に著しい影響を及ぼすことを例示する。
【００５８】
　ＤＮＡ免疫化の皮内（ｉ．ｄ．）経路に対する筋内（ｉ．ｍ．）経路の、抗腫瘍免疫性誘発に及ぼす影響を調査した。簡潔には、実施例１で上述した用量および頻度で、両群のマウスを同じ構築物（ｐＣＭＶ−ｄＥ７、実施例４に記載のとおり調製、図１）を用いて免疫化した。しかしながら、１群はｉ．ｍ．経路で免疫化し、もう一方の群はｉ．ｄ．経路で免疫化した。実施例２の手順に従った生Ｃ３腫瘍細胞チャレンジ後、無腫瘍のままであったｉ．ｍ．経路で免疫化した群とはまったく対照的に、ｉ．ｄ．群によって免疫化した群は腫瘍増殖を示した。このように、免疫化がｉ．ｍ．経路で行われたときにだけ、ｄＥ７ＤＮＡ構築物によるＤＮＡワクチン接種が腫瘍細胞チャレンジに対する保護免疫性を引き出したことが確かめられた。結果を以下の表３に示す。
【００５９】
【表３】
2004121263.tif 000004
　実施例８
　本実施例は、プラスミドｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１の調製を説明する。
【００６０】
　５つのＴ細胞エピトープ型ＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７タンパク質をコードする合成ミニ遺伝子（図５Ａ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３ＡＢ　ＤＮＡシンセサイザを用いて、オリゴヌクレオチド合成によって構築した。５つの合成オリゴヌクレオチド（ＩからＶ、図５Ｂ）を用いて集成された合成ミニ遺伝子は、５’端にＳａｌＩ制限部位、３’端にＥｃｏＲＩ部位を含有した。この集成遺伝子（図５）を、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ制限プラスミドｐＣＭＶ３にクローンし、図６に示したプラスミドｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１を生成した。ｐＣＭＶ３の構築は実施例３に記載し、エレメントは図２に示す。
【００６１】
　実施例９
　本実施例は、保護抗腫瘍免疫性を誘発するためのｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１の使用を例示する。
【００６２】
　Ｃ５７Ｂ１／６マウスを、ＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７タンパク質の多数のエピトープをコードするＤＮＡ構築物（ｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１、実施例８に記載のとおりに調製、図６）またはコントロール（ｐＣＭＶ−３ベクター単独、図２、またはＰＢＳ）のいずれかで、実施例１のプロトコルに従って免疫化した。実施例２のプロトコルに従ったＤＮＡポリエピトープ構築物での予防的免疫化は、チャレンジしたマウスの１００％で保護抗腫瘍免疫性を誘発した。対照的に、コントロール群では無腫瘍のマウスはいなかった。結果を以下の表４に示す。
【００６３】
【表４】
2004121263.tif 000005
　実施例１０
　本実施例は、初回の生腫瘍細胞のチャレンジ後、３ヵ月無腫瘍であったマウスにおける、生Ｃ３腫瘍細胞による２回目の再チャレンジの影響を例示する。
【００６４】
　実施例７に見られる、実施例４に記載のとおり調製されたｐＣＭＶ−ｄＥ７構築物（図１）、または実施例９に見られる、実施例８に記載のとおり調製されたｐＣＭＶ−ポリエピトープ構築物（図６）のいずれかによって誘発された保護抗腫瘍免疫性が持続性であるかどうかを判定するために、初回の腫瘍細胞のチャレンジで生存し、３ヵ月の間無腫瘍のままであったマウスに、生Ｃ３腫瘍細胞を再移植した。次にこのマウスを、腫瘍の発生に関してモニターした。
【００６５】
　下の表５に示したように、２回目のチャレンジ投与の後、ｐＣＭＶ−ｄＥ７群の動物１匹が腫瘍を生じた。しかしながら、ＤＮＡ−ポリエピトープ免疫化群のマウスはいずれも無腫瘍のままであった。このように、腫瘍細胞チャレンジからの保護は、ポリエピトープ免疫化群において最大レベルであるように見えた。
【００６６】
【表５】
2004121263.tif 000006
　参考文献
【００６７】
【表６】
2004121263.tif 000007
【００６８】
【表７】
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【００６９】
【表８】
2004121263.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００７０】
　　（開示の概要）
　本開示を要約すると、本発明は、子宮頚癌に関わるＨＰＶ株のＥ６および／またはＥ７抗原の、少なくとも１つのＴ細胞エピトープをコードする核酸を含有するある種の新規のベクター、ならびに、かかるベクターを用いる免疫化法を提供する。本発明の技術的範囲内において、変更を施すこもの可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１Ａ】図１Ａは、ＨＰＶ−１６由来の無毒化したＥ７の挿入されたプラスミドｐＣＭＶ−３からなるプラスミドｐＣＭＶ−ｄＥ７のマップである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＨＰＶ−１６（ｐＳＥ８５９．２）由来のＰＣＲ増幅されたｄＥ７のヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。５’ＰＣＲプライマーおよび３’ＰＣＲプライマー（配列番号：２、３）は、この図中にボックスにて示す。
【図２】エンハンサ配列およびイントロン配列を含む、非常に初期のサイトメガロウィルスのプロモーター、ウシ・成長ホルモンポリＡ（ＢＧＨ　ＰＡ）ならびにカナマイシン耐性遺伝子（ＫＮ（Ｒ））を含むプラスミドベクターｐＣＭＶ３のマップである。
【図３Ａ】ｐＣＭＶ２Ｋからの、プラスミドベクターｐＣＭＶ３の組み立てを示す。
【図３Ｂ】ｐＣＭＶ２Ｋからの、プラスミドベクターｐＣＭＶ３の組み立てを示す。
【図４】プラスミドベクターｐＥＮ−１のマップである。
【図５Ａ】図５Ａは、５個のＨＰＶ１６のＴ細胞エピトープ（ＮＨ2からＣＯＯＨ端に向かって）Ｅ７：４９〜５７、１１〜２０、８２〜９０、８６〜９３およびＥ６：２９〜３８からなるタンパク質をコードする合成ＨＰＶミニ遺伝子のヌクレオチド（配列番号：４に全長；配列番号；５にコーディング配列）ならびに由来するアミノ配列（配列番号：６）を示す。スペーサとして、３個のアラニンが各エピトープ間に導入されている。
【図５Ａ−１】図５Ａは、５個のＨＰＶ１６のＴ細胞エピトープ（ＮＨ2からＣＯＯＨ端に向かって）Ｅ７：４９〜５７、１１〜２０、８２〜９０、８６〜９３およびＥ６：２９〜３８からなるタンパク質をコードする合成ＨＰＶミニ遺伝子のヌクレオチド（配列番号：４に全長；配列番号；５にコーディング配列）ならびに由来するアミノ配列（配列番号：６）を示す。スペーサとして、３個のアラニンが各エピトープ間に導入されている。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａのミニ遺伝子を形成するための、Ｅ６およびＥ７由来のＨＰＶ−１６エピトープを含む合成オリゴヌクレオチドのアセンブリを示す。５個の各オリゴヌクレオチドは、ＩからＶ（配列番号：７、８、９、１０、１１）で示す。Ｅ６およびＥ７由来のエピトープは、その特異的な配列の上に表示され、その番号はＨＰＶ−１６の全長Ｅ６およびＥ７タンパク質のアミノ酸配列に対応する。
【図５Ｂ−１】図５Ｂは、図５Ａのミニ遺伝子を形成するための、Ｅ６およびＥ７由来のＨＰＶ−１６エピトープを含む合成オリゴヌクレオチドのアセンブリを示す。５個の各オリゴヌクレオチドは、ＩからＶ（配列番号：７、８、９、１０、１１）で示す。Ｅ６およびＥ７由来のエピトープは、その特異的な配列の上に表示され、その番号はＨＰＶ−１６の全長Ｅ６およびＥ７タンパク質のアミノ酸配列に対応する。
【図６】図３のｐＣＭＶ３ベクターのＳａｌＩとＥｃｏＲＩ部位の間のポリリンカー中に、図５Ａに示す合成ミニ遺伝子を挿入することによるｐＣＭＶ３−ＨＰＶＴ＃１のアセンブリを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
2004121263.tif 000016
【図５Ａ−１】
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【図５Ｂ】
2004121263.tif 000018
【図５Ｂ−１】
2004121263.tif 000019
【図６】
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【配列表】
2004121263000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成15年12月18日(2003.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　子宮頸がんに関連するヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）株のＥ７抗原のＴ細胞エピトープ複数およびＥ６抗原のエピトープ少なくとも一つとをコードするミニ遺伝子を含んでなり、該Ｅ７抗原のエピトープならびにＥ６抗原のエピトープは、前記ＨＰＶ株由来の天然型Ｅ７タンパク質ならびにＥ６タンパク質に由来していることを特徴とするベクター。
【請求項２】
　該ミニ遺伝子は、ＨＰＶ−１６由来Ｅ７タンパク質のアミノ酸１１から２０、４９から５７、８２から９０、ならびに８６から９３、およびＨＰＶ−１６由来Ｅ６タンパク質のアミノ酸２９から３８をコードしていることを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
　該Ｅ７抗原のエピトープおよびＥ６抗原のエピトープをコードしている、ミニ遺伝子のＤＮＡ配列は、図５Ｂ，図５Ｂ’に記載される、配列番号：４の塩基配列であることを特徴とする請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
　該Ｅ７抗原のエピトープおよびＥ６抗原のエピトープをコードしている、ミニ遺伝子のＤＮＡ配列は、図５Ａ，図５Ａ’に記載される、塩基配列であることを特徴とする請求項２に記載のベクター。
【請求項５】
　該ミニ遺伝子は、プロモーターと作動的に結合されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター
【請求項６】
　前記プロモーターは、サイトメガロウィルス・プロモーターであることを特徴とする請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
　請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、宿主に対してｉｎ　ｖｉｖｏ投与用の免疫原性組成物。
【請求項８】
　さらに、アジュバンドを含むことを特徴とする請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
　ヒト・ピペローマウィルスにより引き起こされる子宮頸がんに対する治療用途の医薬の調製に利用可能な組成物であって、
　該組成物は、薬理学上許容される賦形剤中に請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクターを含んでなることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
　さらに、アジュバンドを含むことを特徴とする請求項９に記載の組成物。