(57)【要約】試料中の各リポ蛋白中のコレステロールを分画操作することなく、簡便に直接定量測定する系である。【課題】従来の技術よりも、原法である超遠心法と相関性に優れ、添加剤等の配合の系が簡単であり、信頼性に優れた測定値を得られるコレステロールの測定方法を提供することにある。【解決の手段】カイロミクロン、高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白のいずれか１種以上を含む試料中のコレステロール量を直接、選択的に測定する方法において、燐脂質及び、又は燐脂質類似基含有化合物と糖化合物を用いることを特徴とするコレステロールの定量方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カイロミクロン、高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白のいずれか１種以上を含む試料中のコレステロール量を直接、選択的に測定方法において、燐脂質又は燐脂質類似化合物及び糖硫酸化合物又は糖燐酸化合物を用いることを特徴とするコレステロールの定量方法
【請求項２】
燐脂質又は燐脂質類似基含有化合物が、少なくとも１種以上のホスホリルコリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルセリン基のいずれか１種または２種以上の基を有する化合物である請求項１記載のコレステロールの定量方法。
【請求項３】
燐脂質類似基含有化合物が、式（１）で示されるホスホリルコリン類似基を含有する化合である請求項１〜２記載のコレステロールの定量方法。
【化１】
2004121185.tif 000007
（式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は同一又は異なる基で、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を示しｎは１〜４の整数を示す。）
【請求項４】
燐脂質類似基含有化合物が、式（２）で示される単量体を構成成分とする重合体である請求項１〜３記載のコレステロールの定量方法。
【化２】
2004121185.tif 000008
（式中、Ｘは２価の有機残基、Ｙは炭素数１〜６のアルキレンオキシド基、Ｚは水素原子、アルキルカルボニル基、炭素数１〜１０のヒドロキシアルキル基、又は炭素数１〜１０のアルキル基を示す。Ｒ４は水素原子もしくはメチル基を示す。Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は同一又は異なる基で、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示し、ｍは０又は１、ｎは１〜４の整数を示す。）
【請求項５】
糖硫酸化合物が，ポリヘキソースの硫酸化合物、ポリペントースの硫酸化合物、及び、又ポリオールの硫酸化合物である請求項１〜４記載のコレステロールの定量方法。
【請求項６】
糖燐酸化合物が、ポリヘキソースの燐酸化合物、ポリペントースの燐酸化合物、及び、又はポリオールの燐酸化合物えある請求項１〜５記載のコレステロールの定量方法。
【請求項７】
試料にコレステロール加水分解酵素とコレステロール酸化酵素又はコレステロール脱水素酵素を作用させ、生成する過酸化又は還元型補酵素を定量する事から成るコレステロール量を測定する方法において、１〜３価の金属塩を共存させる事を特徴とする請求項１〜６記載のコレステロールの定量方法。
【請求項８】
試料にコレステロール加水分解酵素とコレステロール酸化酵素又はコレステロール脱水素酵素を作用させ、生成する過酸化水素又は還元型補酵素を定量することからなるコレステロール量を測定する方法において、使用する各々の酵素が化学修飾されている事を特徴とする請求項一〜７記載のコレステロールの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床診断の分野において脂質代謝の面で重要なリポ蛋白中のコレステロールの定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）は抗動脈硬化作用を持つリポ蛋白として注目されるようになり、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）は末梢細胞にコレステロールを供給する役割を有するとされ、動脈硬化症を初めとする各種動脈硬化症の直接的因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の指標となることが知られている。又、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）も動脈硬化が注目されている。
従来の各リポ蛋白中のコレステロールの定量方法としては、超遠心法、電気泳動法、換算法、分画沈殿法などがあるが、これらの定量法は、迅速な自動分析装置には不向きである。最近、リポ蛋白中のコレステロールを直接側定する方法として、ポリカチオンや２価のカチオン等の凝集剤を用いる方法（特開平６−２４２１１０号公報、特開平８−１３１１９７号公報）、界面活性剤を用いる方法（特開昭６２−６９９９号公報、特開昭５８−１６５８００号公報）、蛋白質可溶化剤と硫酸化多糖類を組み合わせる方法（国際公報Ｗ０９６／２９５９９号、特開平７−３０１６３６号公報）等が開示されている。前記何れの方法も、リポ蛋白中の特定のリポ蛋白、実質的には主としてＨＤＬ以外のリポ蛋白のみを反応系より除き、ＨＤＬ中のコレステロールを選択的に定量ための方法が考案されている。しかし、前記のいずれの系もトリグリセライド（ＴＧ）、Ｍ蛋白の高い試料中のリポ蛋白中のコレステロール量測定を正確に行なうことは出来ない等の問題があった。そこで有機及び無機の燐酸化合物を用いる方法（特開２０００−１１６４００号公報）により、ＣＤＣ法等との相関性の改善が図られているが相関性は０．９８以下であり必ずしも十分ではない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は，試料中の各リポ蛋白中のコレステロールを分画操作することなく、上記従来の技術よりも、簡便に、正確に直接定量測定する方法において、相関性に優れ、添加剤の配合系が簡単であるコレステロールの測定方法を提供する事にある。特に基準であるＣＤＣ法と相関性に優れ、信頼性に優れた測定値を得られるコレステロールの測定方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記の問題点に鑑み、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及びカイロミクロン（ＣＭ）等を含有する試料中の各コレステロールの測定において特定の燐脂質もしくは燐脂質類似基を有する化合物及び糖燐酸化合物及び、又糖硫酸化合物を測定試薬と共存させて、超遠心分画したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及びＣＭである各リポ蛋白を用いて測定したところ、前記の化合物の種類と濃度の組み合わせによい各リポ蛋白の反応性が異なりその結果ＨＤＬ，ＬＤＬ，ＶＬＤＬ及びＣＭ中に含まれる各コレステロールの反応性が異なる事を見出し、本発明を完成した。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明は、カイロミクロン、高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白のいずれか１種以上を含む試料中のコレステロール量を直接、選択的に測定する方法において、燐脂質及び、又は燐脂質類似基含有化合物及び、又は糖燐酸化合物及び、又は糖硫酸化合物を用いることを特徴とする各コレステロールの定量方法である。本発明で用いるＣＭ，ＨＤＬ，ＬＤＬ、ＶＬＤＬ，及びレムナントリポ蛋白の少なくとも１種又は２種以上を含むコレステロールを含有する試料としては、例えば、血清、尿糖が挙げられる。
【０００６】本発明に用いる燐脂質としては、例えば具体的にはホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン等が挙げられる。又、本発明に用いる燐脂質類似基含有化合物としては、前記の燐脂質の極性基を有する化合物が上げられ、特にホスホリルコリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルセリン基等を有する化合物が挙げられる。本発明で用いる燐脂質類似基を含有する化合物としては式
【化１】で示される化合物が好ましく挙げられる。又、更に燐脂質類似基化合物は式
【化２】で示される単量体（以下ＰＣ単量体とする。）を構成成分とする重合体がより好ましく挙げられる。
【０００７】糖硫酸化合物としては、ポリヘキソース硫酸塩、ポリペントース硫酸塩、ポリオール硫酸塩等を用いる事ができる。
【０００８】糖燐酸化合物としては、ポリヘキソース燐酸塩、ポリペントース燐酸塩、ポリオール燐酸塩、ビタミンＥ燐酸塩を好ましく用いることができる。
【０００９】本発明に用いる金属塩としては、例えば、マグネシュウム塩、カルシュウム塩、マンガン塩、コバルト塩等が挙げられる。それらの塩の使用量としては、例えば、０．００００１〜７０ミリモルが挙げられる。
【００１０】本発明のコレステロールの定量方法は、燐脂質及び、又は燐脂質極性基或いは燐脂質極性類似基を有する化号物、すなわち特にホスホリルコリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルセリン基或いは各々の類似基を１種以上勇する１種以上のカ合物、及び、糖燐酸化合物及び、又は糖燐酸化合物をリポ蛋白中のコレステロールを測定する試薬中に共存させて、直接リポ蛋白中のコレステロールを分別定量する方法であり、コレステロール測定系は、酵素的測定系であればいずれの方法でも可能である。本発明において、コレステロールの測定系自体は既に知られている下記式（３）の反応原理に基ずく一般法に従うものである。
【００１１】
【化３】
2004121185.tif 000002
【００１２】
【実施例】以下、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
（糖燐酸塩の製造例）塩化亜鉛処理により活性化したβ−グルカンに尿素と燐酸を加え摂氏１３０度で加熱処理後、ＭｅＯＨ処理、アセトン処理によりβ−グルカン燐酸塩を得た。。
【００１３】
【実施例１】本発明のＰＣ重合体とデキストラン硫酸塩を用いるＨＤＬコレステロールを直接定量する方法について、標準法として超遠心法、従来法として分画法（リンタングステン酸法）と比較して測定した結果を示す。
（試薬組成）
第１試薬
燐酸二ナトリュウム　　　　　　　　　　　　　　　３５ｍＭ
参考例１で製造したＰＣ重合体　　　　　　　　　　　２．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリュウム　　　　　　　　　７００　　ｇ／Ｌ
ＴＯＯＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．３ｇ／Ｌ
トリス緩衝液（ＰＨ６．９）　　　　　　　　　　　２５　　ｍＭ
第２試薬
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　１．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　７．０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　２．３ｍＭ
パーオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　２３　　Ｕ／ｍＬ
燐酸二ナトリュウム　　　　　　　　　　　　　　　２５ｍＭ
グッド緩衝液（ＰＨ６．９）　　　　　　　　　　　２５ｍＭ
【００１４】本法出は、血清試料６μｌを、予め摂氏３７度で加温した第１試薬３００μｌに加え摂氏３７度で５分巻加温し、得られた溶液の５８５ｎｍにおける吸光度を測定した（Ｅ−；濃度補正後の値）。次いで、予め摂氏３７度に加温した第２試薬１００μｌを添加攪拌し、５分後に同波長における吸光度を測定した（Ｅ２）。ＨＤＬコレスチロールの量は、ＨＤＬコレステロール５０ｍｇ／ｄｌの標準液を用いて同様の操作を行ない（Ｅ２−Ｅ１）の値を比較する事により算出した。測定操作は血清試料１０検体につき行ない、得られたコレステロール値について、本発明の方法と超遠心法の値と、従来の分画法との値の比較を行なった。結果を表一に示す。
2004121185.tif 000003
【００１５】表１に示したヨように、本発明の測定結果は、原法である超遠心法に、分画法よりよく相関した。
【００１６】
【実施例２】
前記実施例１の第１試薬で使用するデキストラン硫酸の代わりにイノシトール燐酸を用いる他は、及び第２試薬で使用する酵素を修飾酵素に変更し、更にβ−グルカン硫酸塩ヲ加えた下記の第１試薬及び第２試薬を用いた以外は実施例１と同様にしてＨＤＬコレステロールの定量測定を行なった。
【００１７】（試薬組成）
第１試薬
燐酸二ナトリュウム　　　　　　　　　　　　　　　３５　ｍＭ
イノシトール燐酸ナトリュウム　　　　　　　　　　　８ｇ／Ｌ
ＴＯＯＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．３ｍＭ
アスコルビンオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　１　　μ／Ｌ
グッド緩衝液（ＰＨ６．９）　　　　　　　　　　　２５　　ｍＭ
第２試薬
β−グルカン燐酸二ナトリュウム　　　　　　　　　　２．２ｍＭ
燐酸二ナトリュウム　　　　　　　　　　　　　　　２５　　ｍＭ
パーオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　２０　　Ｕ／ｍＬ
修飾コレステロールエステラー　　　　　　　　　　　１　　Ｕ／ｍＬ
修飾コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　５．５Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　２．３ｍＭ
ビタミンＥ燐酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１μＭ
グッド緩衝液（Ｐ６．９）　　　　　　　　　　　　２０ｍＭ
【００１８】自動分析計で得られた結果を表２に示す。
2004121185.tif 000004
【００１９】表２に示したように、本発明の方法である実施例２の測定結果は、凝集剤による直接法の測定結果より、原法である超遠心法の測定結果とより良い相関であった。
【００２０】実施例３
固相にメンブランフィルター（ミリポアフィルター）を用い，被検体をあらかじめ第一抗体と処理後，濾過し，標識第三抗体を用いないでパーオキシダーゼ標識第二抗体を用いる他は実施例二と同様に行なった結果を図４に示した。
【００２１】実施例４
被検液がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　０−１５７の浮遊液であり，第一抗体が抗Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　０−１５７マウスモノクロナール抗体であり，第二抗体が抗Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　０−１５７ウサギポリクロナール抗体であり、被検体をあらかじめ第二抗体と処理後，濾過した他は，実施例１と同様に行なった結果を図４に示した。
【００２２】
【実施例３】
燐脂質としてホスファチジルセリンを、糖化合物としてβ−グルカン燐酸二ナトリュウムを用いて、直接ＬＤＬコレステロールを定量する方法とＣＤＣ法とを比較した。
（試薬組成）
第１試薬
燐酸二ナトリュウム　　　　　　　　　　　　　　２７　　ｍＭ
β−グルカン燐酸二カリウム　　　　　　　　　　　５　　ｍＭ
ポリオキシエチレンモノラウレート　　　　　　　　５ｇ／Ｌ
ポリオキシエチレンステアリルアミン　　　　　　　３ｇ／ｌ
ＴＯＯＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．１ｍＭ
硫酸マグネシュウム　　　　　　　　　　　　　　　８ｇ／Ｌ
トリス緩衝液（ＰＨ７．０）　　　　　　　　　　２７　　ｍＭ
第２試薬
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　１．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　５．０Ｕ／ｍＬ
パーオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　２５．０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　２．３　ｍＭ
リン酸二ナトリュウム　　　　　　　　　　　　　２２．１　ｍＭ
ホスファチジルセリン　　　　　　　　　　　　　　３　　ｇ／Ｌ
β−グルカン燐酸ナトリュウム　　　　　　　　　　７．０　ｍＭ
グッド緩衝液（ＰＨ７．０）　　　　　　　　　　５０　　　ｍＭ
【００２３】実施例３では、血清試料６μｌを、予め摂氏３７度で加温した第１試薬３００μｌに加え、摂氏３７度で５分間か恩師、得られた溶液の５８５ｎｍにおける吸光度を測定した（Ｅ１）。次いで、予め摂氏３７度に加温した第２試薬１００μｌを添加攪拌し、５分後に同波長における吸光度ｗ０測定した８Ｅ２；濃度補正後の値）。ＬＤＬコレステロールの量はＬＤＬコレステロール２００ｍｇ？ｄｌの標準液を用いて同樺の操作を行ない、（Ｅ２−Ｅ１）ｎｏ値を比較する事により算出した。その結果を表３に示した。
2004121185.tif 000005
【００２４】表３に示したように、本発明の方法である実施例３の測定結果は、従来の特許に記載の方法である凝集剤による直接法より、ＣＤＣ法とよく相関した。
【００２５】
【実施例４】
実施例１の第１試薬で用いた参考例１のポリマーの代わりに後期参考例３の重合体を用いて、血清試料を測定した。結果を表四位示した。
（試薬組成）
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン重合体　　　　５　　ｇ／Ｌ
燐酸二ナトリュウム　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　ｍＭ
参考例３で製造したＰＣ重合体　　　　　　　　　　　　１．４ｇ／Ｌ
β−グルカン燐酸ナトリュウム　　　　　　　　　　　　２　　ｍＭ
シクロデキストリン燐酸カリウム　　　　　　　　　　　１　　ｍＭ
硫酸マグネシュウム　　　　　　　　　　　　　　　　　３　　ｍＭ
ＴＯＯＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．１ｍＭ
トリス緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　ｍＭ
第２試薬
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　　１．１ｇ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　５．１Ｕ／ｍＬ
パーオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　２７　　Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　　２．５ｍＭ
燐酸二ナトリュウム　　　　　　　　　　　　　　　　２８　　ｍＭ
トリス緩衝液（ＰＨ７．０）　　　　　　　　　　　　１５　　ｍＭ
2004121185.tif 000006
【００２６】表４に示したように、本発明である実施例４の測定結果は、凝集剤による従来特許法の測定値より、ＣＤＣ法と良く相関した。
【００２７】なお、前記の用いた試料は次の方法により取得したものである。
【参考例１】実施例１に用いたＰＣ重合体の合成
ＭＰＣ５．４ｇ、メタアクリル酸３．７１ｇ、開始剤であるパーロイル−ＳＡ（日本油脂社製）０．３５１ｇ、重合溶媒として４２．８１８ｇの蒸留水を重合管にとり均一に溶解した。この溶液にアルゴンガスを１０分間吹き込み封管した後摂氏７０度で６時間重合した。反応終了後室温に冷却し重合管を開封し、次いで溶液を透析膜（スペクトラム・メヂカル・インダストリー社製「ｓｐｅｃｔｒｕｍ／ｐｏｒｍｅｍｂｒａｎｅｓ　Ｍｖ　ｃｏ．６０００〜８０００」に挿入し、重合溶液の１０倍量の蒸留水を用いて透析操作を行なった。一回／比の間隔で７日間行ない、未反応モノマー等を除去し精製を行なった。ＧＰＣ測定で得られた共重合体の分子量とＨ−ＮＭＲ測定よりもとめた共重合体組成比の結果を下記した。
ＭＰＣ／メタクリル酸＝３．８／６．１（モル比）
分子量＝　１３３０００
ＭＷ＝　２８６０００
【００２８】
【参考例２】実施例２で用いた修飾酵素の調整
実施例２で用いた修飾酵素は、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの酵素を修飾したものであり、具体的には各々酵素を０．１Ｍ（ＰＨ８．０）ｎｏグッド緩衝液で５０ｇ／Ｌになるように溶解し、ついでサンブライトＶＦＭ４１０１（日本油脂社製）を０．１５ｇ／酵素１ｇになるように添加後摂氏１０〜２０度で１２次間放置し、ポリエチレングリコールで修飾した酵素を調整した。
【００２９】
【参考例３】実施例４で用いたＰＣ重合物の合成
ＭＰＣ３１８．６ｇメタクリル酸ステアリル４１．４ｇ、開始剤であるｔ−ブチルパーオキシネオデカエート７．８１ｇ重合溶媒として１４４０ｇのエタノールを四つ口フラスコにとり均一に溶解した。この溶液に窒素ガスを３０分間吹き込んだ後摂氏５０度で３時間重合し、次いで摂氏６０度に昇温し更に２時間重合した。反応終了後室温に冷却し、得られた重合液を採取してＧＰＣで重合反応率と分子量を測定した。その結果重合反応率は９８．７％、重量平均分子量は１４００００であった。重合液を８Ｌｎｏジエチルエーテル中に攪拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過師、更に４８時間室温で真空乾燥してポリマー粉末を調整した。得られたポリマー粉末を１Ｌｎｏ蒸留水に溶解し、分画分子量３、５００ノ透析膜（スペクトラポア社製）に仕込み、１０Ｌｎｏ蒸留水中に浸漬した。透析液を３回／比の間隔で交換し、計９６時間処理を行ない、未反応モノマー等を除去し精製を行った。Ｈ−ＮＭＲ測定から求めた共重合体組成比の結果を下記した。
ＭＰＣ／メタクリル酸＝９．０／１．０（モル比）