(57)【要約】【課題】細胞内に蛋白質を導入することができる複合体、及び、該複合体を用いて、時間的・量的に制御でき、なおかつ効率的に蛋白質を細胞内へ導入する方法を提供する。【解決手段】蛋白質又はペプチド（ａ）と２を超えて３万以下のカチオン価を有する重合体（ｂ）とが結合した複合体（Ａ）を蛋白質又はペプチド（ｃ）のキャリアーとして用いて、該蛋白質又はペプチド（ｃ）を細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質又はペプチド（ａ）と２を超えて３万以下のカチオン価を有する重合体（ｂ）とが結合した複合体（Ａ）を蛋白質又はペプチド（ｃ）のキャリアーとして用いて、該蛋白質又はペプチド（ｃ）を細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法。
【請求項２】
前記蛋白質又はペプチド（ａ）が抗体である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記蛋白質又はペプチド（ａ）がプロテインＡ又はプロテインＧである請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記蛋白質又はペプチド（ａ）がアビジン類である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な蛋白質複合体、及び該複合体を用いて蛋白質を細胞内に効率的に導入する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内で任意の蛋白質を機能させる技術は、現在のところ遺伝子導入法がほぼ唯一の手法となっている。恒常的に細胞内で任意の蛋白質を機能させたい場合は遺伝子導入法が有利な手法ではあるが、任意の蛋白質を一過的に細胞内で機能させたい場合は蛋白質そのものを細胞内に導入することが好ましい。
【０００３】
従来、蛋白質そのものを細胞内へ導入する方法としては、細胞膜を透過させる必要があることから、マイクロインジェクション等の特殊な手法や、リポソーム等のカプセル状のものに蛋白質を封入し、それを細胞膜に融合させることにより内容物（蛋白質等）を細胞内に導入する手法が用いられている。また、細胞の種類は限定されるものの、細胞表面に発現する各種のレセプターを標的とし、そのリガンドをキャリアーとしたレセプター依存経路による細胞内導入法も実用化されている。
【０００４】
我々は最近、これらの経路以外にカチオン性の高い蛋白質や化学修飾によりカチオン化された蛋白質が、負に帯電している細胞表面に静電的に吸着し、高効率に細胞内に取り込まれることを確認した（例えば、非特許文献１参照）。同じく最近、ＨＩＶ由来の塩基性に富むＴＡＴペプチド（例えば、非特許文献２参照）やＰｏｌｙ−Ａｒｇ等のカチオン性ペプチド（例えば、非特許文献３参照）を付加した蛋白質が細胞膜を効率的に透過することが報告された。何れも詳細なメカニズムは不明ではあるが、カチオン性蛋白質と細胞表面との静電相互作用に起因する経路による細胞膜透過経路が考えられる。
【０００５】
しかしながら、従来の蛋白質のカチオン化による手法では、蛋白質分子内の多部位のアミノ酸側鎖の修飾が必要であったため、機能低下の問題があった。
【０００６】
カチオン性ポリマーを蛋白質に１〜数個以内の少数の側鎖の修飾で、蛋白質をカチオン化することにより、機能低下が軽微に抑制されることを見いだしているが（特願２００２−１５６１９７）、蛋白質機能への影響や細胞内局在への影響が問題であった。
【０００７】
【非特許文献１】
二見等、「バイオケミストリー」（Ｆｕｔａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），４０，　ｐ．７５１８−７５２４，　２００１
【非特許文献２】
シュワルツ等、「サイエンス」（Ｓｃｈｗａｒｚｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ），　２８５，ｐ．１５６９−１５７２，　１９９９
【非特許文献３】
二木等、「ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー」（Ｆｕｔａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．），　２７６，　ｐ．５８３６−５８４０，　２００１
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞内に蛋白質をその機能・構造を損なうことなく導入することができる複合体、及び、該複合体を用いて、時間的・量的に制御でき、なおかつ効率的に蛋白質を細胞内へ導入する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するべく検討を重ねた結果、カチオン性ポリマーと蛋白質又はペプチド（ａ）の複合体をキャリアーとして用い、導入目的物である蛋白質又はペプチド（ｃ）を、複合体（Ａ）と可逆的な非共有結合等で結合させ、これを細胞と接触させることにより細胞内に蛋白質（ｃ）を効率的に、且つ蛋白質（ｃ）の構造及び機能を維持したまま導入できることを見いだし本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）蛋白質又はペプチド（ａ）と２を超えて３万以下のカチオン価を有する重合体（ｂ）とが結合した複合体（Ａ）を蛋白質又はペプチド（ｃ）のキャリアーとして用いて、該蛋白質又はペプチド（ｃ）を細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法。
（２）前記蛋白質又はペプチド（ａ）が抗体である前記（１）記載の方法。
（３）前記蛋白質又はペプチド（ａ）がプロテインＡ又はプロテインＧである前記（１）記載の方法。
（４）前記蛋白質又はペプチド（ａ）がアビジン類である前記（１）記載の方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本明細書でいう「蛋白質又はペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合して生じる化合物を意味する。本発明で用いることのできる蛋白質又はペプチドとしては特に限定されず、ペプチド、酵素、その他機能性（生理活性）を有する蛋白質等の任意の蛋白質又はペプチドを用いることができ、その分子量としては１００〜１００万が好ましい。なお、本明細書でいう「蛋白質」とは、その蛋白質に、糖鎖、脂質、及び／又はリン酸基が結合した複合蛋白質をも含む意味である。また、その蛋白質の構造は天然状態であっても変性状態であってもよい。
【００１２】
本発明で用いられる、蛋白質又はペプチド（ａ）（以下、蛋白質（ａ）という）と重合体（ｂ）との複合体（Ａ）としては、細胞内に導入しようとする蛋白質又はペプチド（ｃ）（以下、蛋白質（ｃ）という）と可逆的に結合又は会合できるものが好ましい。そのような蛋白質（ａ）としては、抗体結合能を有する蛋白質又はペプチド、例えば各種の抗体のサブクラス：ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合することが知られているプロテインＡ及びプロテインＧ等が挙げられる。また、蛋白質（ａ）として、卵白由来のアビジン、菌体由来のストレプトアビジン等のアビジン類等も挙げられる。
【００１３】
さらに、本発明では、複合体（Ａ）と直接蛋白質（ｃ）とが可逆的に結合又は会合しなくても、例えば、複合体（Ａ）と蛋白質（ｃ）とが可逆的に結合又は会合できるようなスペーサーを介して複合体（Ａ）と蛋白質（ｃ）とが可逆的に結合又は会合する形態も好ましい。このような例としては、蛋白質又はペプチド（ａ）（以下、蛋白質（ａ）という）としてはアビジン等が挙げられ、そして、スペーサーとしてはビオチンを用いることが挙げられる。ビオチンをスペーサーとして用いる場合には、例えば、細胞内に導入しようとする蛋白質（ｃ）を市販のビオチン化試薬等を用いて公知の方法により処理することにより蛋白質（ｃ）にビオチン基を導入することができる。
【００１４】
また、本発明で用いられる蛋白質（ａ）、重合体（ｂ）又は蛋白質（ｃ）を、必要に応じて標識することが好ましい。標識方法としては、一般的な公知の方法であれば特に限定されないが、蛍光標識、オートラジオグラフィ、高電子密度物質、色素不溶化酵素であることが好ましい。特に好ましい形態は、蛍光標識を共有結合により複合体（Ａ）、蛋白質（ｃ）を標識することである。
【００１５】
蛍光標識に用いる蛍光物質としては、特に限定されないが、例えばピレン、アントラニロイル基、ダンシル基、フルオレセイン、ローダミン、ニトロベンゾキサジアゾール基等の蛍光団を有する化合物が挙げられる。上記の蛍光団を有する化合物は公知であり（例えば、平塚寿章、「蛋白質　核酸　酵素」、Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．７（１９９７）等参照）、常法により蛋白質分子又はペプチド等に導入することができる。
【００１６】
本発明で用いることのできるカチオン性の基を有する重合体（ｂ）としては、例えば、２を超えて３万以下のカチオン価を有する重合体が挙げられる。本明細書でいう「カチオン価」とは、前記重合体のアミン価（ｍｍｏｌ／ｇ）と前記重合体の数平均分子量との積を１０００で割った値のことである。本発明で用いられる前記重合体のカチオン価は一般に２を超えて３万以下であるが、２を超えて２万以下が好ましく、２を超えて２５００以下がより好ましく、２を超えて２５０以下が特に好ましく、４以上７０以下が最も好ましい。なお、「アミン価（ｍｍｏｌ／ｇ）」とは試料化合物中に含まれるアミンの総量の指標であり、試料化合物１ｇに含まれるアミンのｍｍｏｌ数で表される。試料化合物のアミン価は一般的なアミノ基の定量方法に従って測定できる。一般的なアミノ基の定量方法としては、「新実験化学講座　第１３巻　有機化学構造Ｉ」（丸善株式会社発行、日本化学会編、昭和５３年１１月２０日発行）の第８８頁〜第９９頁に記載の方法やコロイド滴定法を挙げることができる。コロイド滴定法は、「コロイド滴定法」（株式会社南江堂発行、千手諒一著、第１版１９６９年１１月２０日発行）に記載されている。アミン価の分析は試料化合物の形態、溶解性、含有不純物等を考慮して、精度よく分析できる方法を適宜選択する必要がある。本発明で用いられる重合体のアミン価は特に限定されるものではないが、１〜３０が好ましく、５〜２５がさらに好ましい。
【００１７】
また、本発明で用いられる重合体（ｂ）の数平均分子量としては、一般に１００〜１００万であるが、１００〜１０万が好ましく、１００〜１万が更に好ましく、２００〜３０００が特に好ましい。なお、重合体の数平均分子量の測定にあたっては、重合体の数平均分子量が１万以下の場合は沸点上昇法により測定し、１万を超える場合はＧＰＣにより測定すると分子量を精度よく測定できる。
【００１８】
本発明で用いることのできる重合体（ｂ）としては、例えば、ポリアルキレンポリアミン骨格、ポリアリルアミン骨格、ポリビニルアミン骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルアミド骨格、ポリアミジン骨格、ポリビニルピリジン骨格、若しくはポリビニルイミダゾール骨格を有する重合体、又はこれらの共重合体を挙げることができる。また、それらの重合体の塩、例えば、第一級、第二級、第三級、及び第四級アンモニウム塩等も同様に用いることができる。更にこれらの重合体を化学的に修飾、変成した重合体も同様に用いることができる。
【００１９】
そのような重合体（ｂ）の具体例としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン等のポリアルキレンイミン等のポリアルキレンポリアミン、ポリアリルアミン、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド等のポリアリルアミン、ポリアクリルアミドのホフマン分解物、ポリビニルアセトアミド加水分解物、ポリビニルフタルイミドの加水分解物、Ｎ−ビニルホルムアミドポリマーの加水分解物等のポリビニルアミン、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド（共）重合体等のジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド（共）重合体、ポリメタアクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド等のジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレート（共）重合体、ポリアミジン、ポリビニルピリジン、ポリビニルイミダゾール、ジシアンジアミド系縮合物、エピクロロヒドリン・ジメチルアミン縮合物等のエピクロロヒドリン・ジアルキルアミン縮合物、ジメチルアミン・エチレンジクロライド縮合物等のジアルキルアミン・アルキルジハライド縮合物、ポリビニルイミダゾリン、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド、カルボキシメチルセルロース第四級アンモニウム（第四級アンモニウムＣＭＣ）、グリコールキトサン、カチオン化デンプン等が挙げられる。
【００２０】
上記重合体のうち代表的な化合物のアミン価の理論値は以下の表のとおりである。本表に記載のアミン価の理論値とは、重合体を形成する単量体の分子量の逆数に１０００をかけた値である。一般的に、上記の方法により測定されるアミン価の実測値はその理論値と測定誤差の範囲内でほぼ一致する。上述の方法により測定されるアミン価に基づいて重合体のカチオン価を算出することができる。アミン価は重合体の合成方法を変更したり、他成分との共重合、重合体の化学的修飾により任意に変化させることが可能である。
【００２１】
【表１】
2004121041.tif 000002
【００２２】
以下に、本発明で用いられる複合体（Ａ）の製造方法について述べる。重合体（ｂ）として、例えばポリアルキレンイミンを用いる場合、以下のようにして複合体（Ａ）を製造することができる。
【００２３】
ポリアルキレンイミン（重合体（ｂ））としては、例えば下記一般式（Ｉ）：
【化１】
2004121041.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はアルキレン基を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ０以上の整数であり、ＸとＹの和は１以上である。）
で表され、直鎖状のもの、又は、枝分かれ状のものどちらであってもよい。
【００２４】
前記ポリアルキレンイミンは、式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、及びＲ３が互いに同一でも異なっていてもよい炭素原子数２〜４のアルキレン基であるポリアルキレンイミンが好ましく、さらには式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、及びＲ３が炭素原子数２のエチレン基であるポリエチレンイミンがより好ましい。
【００２５】
以下に、ポリエチレンイミンを用いる場合についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、これ以外のその他のポリアルキレンイミン等の重合体（ｂ）についても以下と同様にして実施することができる。
【００２６】
本発明で好ましく用いられるポリエチレンイミン（以下、「ＰＥＩ」という）は下記式で表される。
【化２】
2004121041.tif 000004
（式中、Ｘ及びＹはそれぞれ１以上の整数である。）
【００２７】
ＰＥＩは、大きな正の電荷密度を有する水溶性ポリマーである。なお、ＰＥＩはかまぼこの沈殿剤等の食品添加物としても利用されており、生体に対する安全性が確認されている。
【００２８】
本発明では、直鎖状のＰＥＩでも分岐鎖を多数有する枝分かれ構造のＰＥＩでも用いることができるが、下記式：
【化３】
2004121041.tif 000005
で例示されるような枝分かれ構造を有するＰＥＩが、より正電荷密度が高いことから好ましい。また、分子量は細胞導入効率、取扱い性等を考慮すると、数平均分子量が１００〜１００，０００の範囲のＰＥＩが好ましく、１００〜１０，０００のＰＥＩがより好ましく、２００〜３，０００の低分子量のＰＥＩが特に好ましい。
【００２９】
本発明で用いられる複合体（Ａ）は、前記蛋白質（ａ）と前記ＰＥＩ等の重合体（ｂ）とが結合したものである。蛋白質（ａ）と重合体（ｂ）とはそれらの間に何も介さずに直接的に結合していてもよいし、又は、公知の２価性架橋試薬等を用いて、間にスペーサー等を介して結合していてもよい。一分子の蛋白質（ａ）に対して結合する重合体（ｂ）の分子数は特に限定されないが、１〜１０個が好ましく、１〜３個が特に好ましい。また、個々の重合体（ｂ）における蛋白質（ａ）との結合部位数は１点であることが好ましい。本発明では、１個の蛋白質（ａ）に対して１個の重合体（ｂ）が１点だけで結合した複合体（Ａ）が特に好ましい。
【００３０】
重合体（ｂ）がＰＥＩである場合、蛋白質（ａ）とＰＥＩとの間の結合は、蛋白質（ａ）とＰＥＩとを結合させることができるものであれば特に限定されるものではなく、化学分野で公知の合成手法を利用することにより様々な結合方法で結合させることができる。以下に、蛋白質（ａ）とＰＥＩとの結合方法について例示するが、本発明で用いられる結合方法はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
蛋白質（ａ）とＰＥＩとをアミド結合を介して結合する場合には、例えば、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド）等の活性化剤を用いて、蛋白質分子中のアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、又は炭素末端のカルボキシル基とＰＥＩのアミノ基との間にアミド結合を形成させることができる。ＥＤＣを用いた場合の例を下記に模式的に示す。
【００３２】
【化４】
2004121041.tif 000006
【００３３】
蛋白質（ａ）とＰＥＩとをジスルフィド結合を介して結合する場合には、例えば、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）等の試薬を用いて、蛋白質分子中のシステイン残基のチオール基とＰＥＩのアミノ基との間にジスルフィド結合を含む共有結合を形成させることができる。ＳＰＤＰを用いた場合の例を下記に模式的に示す。
【００３４】
【化５】
2004121041.tif 000007
【００３５】
この他に、蛋白質（ａ）とＰＥＩとを結合させる例としては、２−イミノチオラン等を用いて、蛋白質分子中のリジン残基又はＮ末端のアミノ基とＰＥＩのアミノ基とを結合させる方法や、ＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド　）等を用いて、蛋白質分子中のシステイン残基のチオール基とＰＥＩのアミノ基との間にチオエーテル結合を含む共有結合を形成させる方法等が挙げられる。
【００３６】
ここで挙げた結合方法以外にも、エーテル結合、エステル結合、イミド結合、炭素−炭素結合、アミジン結合等が挙げられ、文献（例えば、株式会社　東京化学同人「蛋白質ＩＶ　構造機能相関」社団法人　日本生化学会　編、第１版１９９１年３月２０日　発行）等を参照することにより、様々な結合方法を採用して複合体（Ａ）を製造することができる。
【００３７】
上述の製造方法及び当技術分野で公知の合成手段を参照することにより、ポリアルキレンイミン以外の重合体を用いた場合についても同様に複合体（Ａ）を製造することができる。
【００３８】
上述の複合体（Ａ）を用いて蛋白質（ｃ）を細胞内に導入する方法は以下のようにして行われる。
【００３９】
まず、本発明で用いられる複合体（Ａ）を細胞内に導入しようとする蛋白質（ｃ）と結合又は会合させる。
【００４０】
蛋白質（ｃ）は、複合体（Ａ）中の蛋白質（ａ）部分と結合又は会合させることが好ましい。さらに、この結合又は会合は可逆的な非共有結合であることが好ましい。このような結合又は会合としては、蛋白質とその蛋白質に対するリガンドとの関係を挙げることができる蛋白質のリガンドとは、例えば酵素とそれに対する基質又は補酵素、抗体に対する抗原、或いはアビジンやストレプトアビジンに対するビオチンのように特定の蛋白質に親和性を有し、その蛋白質に非共有結合的に結合又は会合する化合物である。このような結合又は会合としては、例えば、ブドウ球菌由来プロテインＧ又はプロテインＡと各種哺乳類等の抗体のサブクラス：ＩｇＧのＦｃフラグメントとの結合や、アビジンとビオチンとの結合、抗体のＦｃ部位を認識する２次抗体と１次抗体との結合などが挙げられ、これらの結合を利用して細胞内に導入しようとする蛋白質（ｃ）を複合体（Ａ）の蛋白質（ａ）に結合させる。即ち、例えば、細胞内に導入しようとする蛋白質（ｃ）が抗体である場合には、蛋白質（ａ）として抗体結合性の蛋白質を採用し、または蛋白質（ｃ）に対して１次抗体と２次抗体との関係にあるような蛋白質を蛋白質（ａ）として採用する。あるいは、蛋白質（ｃ）としてビオチン化蛋白質を用いる場合には、蛋白質（ａ）としてアビジンを採用すればよい（例えば、図１参照）。このように蛋白質（ｃ）に対して親和性を有する蛋白質又はペプチドを蛋白質（ａ）として採用することにより、蛋白質（ａ）が結合した複合体（Ａ）と蛋白質（ｃ）とを混合するだけで蛋白質（ｃ）は複合体（Ａ）中の蛋白質（ａ）に結合又は会合する。
【００４１】
さらに、複合体（Ａ）と蛋白質（ｃ）との結合又は会合は、細胞内で開裂する結合又は会合を選択することも本発明の好ましい形態である。細胞内で開裂する結合又は会合には、例えば、複合体（Ａ）と蛋白質（ｃ）との間に導入したスペーサー部位で開裂する形態も含まれる。
【００４２】
次に、蛋白質（ｃ）が結合した複合体（Ａ）をキャリアーとして用いて細胞内に蛋白質（ｃ）を導入する方法について説明するが、本発明の方法はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
蛋白質（ｃ）を導入しようとする細胞を含む培地中に、蛋白質（ｃ）が結合した複合体（Ａ）又はそれを含む溶液を添加する。その後、細胞を適切な培養温度、培養時間等の培養条件で培養することにより、蛋白質（ｃ）が結合した複合体（Ａ）は細胞内に取り込まれ、時間の経過とともに該複合体（Ａ）の細胞への取り込み量は増加する。本発明の方法では、蛋白質（ｃ）が結合した複合体（Ａ）の添加量、添加濃度、添加時間等を変化させることにより蛋白質（ｃ）の細胞内への導入量を容易に制御できる。なお、本発明の複合体は、該複合体が有する正電荷と細胞表面の負電荷との静電相互作用に起因する機構により細胞内へ取り込まれるものと推測され、このため、培地中で細胞に複合体を取り込ませる場合には、ヘパリン、核酸等のアニオン性ポリマーが共存しない条件下で行うことが好ましい。また、本発明の複合体を含む溶液を、例えば経口投与、静脈内投与、患部への注射、皮膚への塗布等の方法により直接生体に接種して、生体内の細胞に複合体を取り込ませることもできる。
【００４４】
【実施例】
以下の参考例１〜３及び実施例１のようにして、蛋白質（ａ）としてビオチン及び／又はアビジンを、その蛋白質（ａ）をカチオン化するための重合体（ｂ）としてＰＥＩを、そして細胞内に導入する蛋白質（ｃ）としてｅＧＦＰを用いて実験を行った。
【００４５】
（参考例１）ビオチン化ｅＧＦＰの調製
蛋白質として、細胞内への取り込みが蛍光により容易に確認できるＥｎｈａｎｃｅｄ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　（ｅＧＦＰ：ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた。ｅＧＦＰはアミノ末端にＨｉｓタグを含み、大腸菌リコンビナント蛋白質として発現・精製したものである。ＰＢＳに２．５ｍｇ／ｍｌの濃度でｅＧＦＰを溶解した。ＤＭＦに２ｍｇ／ｍｌ濃度になるよう溶かしたビオチン−ＡＣ５−ＯＳｕ（同仁化学社製）３７．９μｌをｅＧＦＰ溶液に添加してボルテックスミキサーで３０秒間攪拌後、室温で３時間インキュベートした。反応溶液をゲルろ過クロマトグラフィー（ＰＤ１０）で精製して、ビオチン化ｅＧＦＰを得た。
【００４６】
（参考例２）ビオチン−ＰＥＩ複合体の調製
ビオチン化ＰＥＩは次の手順で調製した。３０ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ（分子量６００：カチオン価　１２）水溶液４１８μｌ（塩酸でｐＨ８に調製）に１ｍｇ／ｍｌ濃度のビオチン−ＡＣ５−ＯＳｕ（ＤＭＦに溶解）を７６μｌ添加した。反応は室温で７時間インキュベートした後、反応終了後、使用するまで４℃で保存した。なお、ビオチン化ＰＥＩの濃度はビオチンの最終濃度である３３．８ｍＭとした。
【００４７】
（参考例３）アビジン−ＰＥＩ複合体の調製
６０ｍｇ／ｍｌ濃度のＰＥＩ（分子量６００：カチオン価　１２）の水溶液　１ｍｌ（塩酸でｐＨ５に調整）にアビジン　１ｍｇを溶解した。ＥＤＣ　３０ｍｇを添加してボルテックスミキサーで３０秒間攪拌後、室温で１６時間インキュベートした。反応溶液を水に対して透析し、凍結乾燥した後、０．５Ｍのヒドロキシルアミン溶液　１ｍｌに溶かし、室温で５時間インキュベートした。反応終了後、反応溶液を水に対して透析し、アビジン−ＰＥＩを得た。
【００４８】
（実施例１）ビオチン化ｅＧＦＰ複合体の細胞内への導入
３Ｔ３−ＳＶ−４０細胞株をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養し、その培養上清に、
（ｉ）　　ビオチン−ｅＧＦＰ　２００ｎＭ（６μｇ／ｍｌ）
（ｉｉ）　ビオチン−ｅＧＦＰ　２００ｎＭ＋アビジン　１００ｎＭ＋ビオチン−ＰＥＩ　２００ｎＭの複合体
（ｉｉｉ）ビオチン−ｅＧＦＰ　２００ｎＭ＋アビジン−ＰＥＩ　５０ｎＭの複合体
の３つのサンプルを添加・混合し、２４時間後のｅＧＦＰの取り込みを蛍光により観察した。その観察結果を図２に示す。図２の観察結果からわかるとおり、（ｉ）ビオチン−ｅＧＦＰ単独ではほとんど細胞内に取り込まれないのに対して、（ｉｉ）ビオチン−ｅＧＦＰ　２００ｎＭ＋アビジン　１００ｎＭ＋ビオチン−ＰＥＩ　２００ｎＭの複合体、及び（ｉｉｉ）ビオチン−ｅＧＦＰ　２００ｎＭ＋アビジン−ＰＥＩ　５０ｎＭの複合体ではどちらも効率的に細胞内に取り込まれていることが分かる。これは、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）では図１に示すようなカチオン化アビジン（複合体（Ａ））が形成され、これがビオチン化ｅＧＦＰ（蛋白質（ｃ））のキャリアーとして働いて、ビオチン化ｅＧＦＰが効率的に細胞内に導入されるためであると考えられる。なお、蛍光観察は生細胞のままで、固定等は行なっていない。
【００４９】
次に、以下の参考例４及び実施例２のようにして、蛋白質（ａ）としてプロテインＧを、その蛋白質（ａ）をカチオン化するための重合体（ｂ）としてＰＥＩ（分子量６００：カチオン価　１２）を、そして細胞内に導入する蛋白質（ｃ）としてローダミン標識したマウスＩｇＧに対するウサギＩｇＧ抗体（以下、ローダミン−ｒＩｇＧという）を用いて実験を行った。
【００５０】
（参考例４）プロテインＧ−ＰＥＩ複合体の調製
リコンビナントプロテインＧ（シグマ社製、カタログ番号Ｐ５１７０）に平均分子量６００、カチオン価　１２のＰＥＩ（ＷＡＫＯ社製、カタログ番号１６１−１７８３１）を以下のようにしてアミド結合により結合させ複合体（Ａ）を調製した。
【００５１】
リコンビナントプロテインＧ　５ｍｇを終濃度０．５ｍｇ／ｍｌになるように６０ｍｇ／ｍｌ　ＰＥＩ溶液（ｐＨ　０．５）に溶解した。１０ｍｇのＥＤＣ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を前記プロテインＧ溶液に添加し、３０秒間ボルテックスで撹拌した後に４℃で一晩放置した。ＲＯ水（逆浸透膜透過水）に対して透析を行うことにより未反応のＰＥＩを除き、標記のプロテインＧ−ＰＥＩを得た。
【００５２】
（実施例２）プロテインＧ−ＰＥＩ複合体を用いる抗体の細胞内への導入
参考例４で調製したプロテインＧ−ＰＥＩ（複合体（Ａ））と抗体（蛋白質（ｃ））との混合液を動物細胞の培養上清に添加して、プロテインＧ−ＰＥＩをキャリアーとする抗体の細胞内への導入を検討した。導入する抗体としてはローダミン標識したマウスＩｇＧに対するウサギＩｇＧ抗体（以下、ローダミン−ｒＩｇＧという）を用いた。抗体の細胞内への導入を細胞内のローダミンによる蛍光を観察することにより評価した。
【００５３】
プロテインＧ−ＰＥＩ及びローダミン−ｒＩｇＧの濃度がそれぞれ１６０ｎＭ及び５８７ｎＭとなるように、プロテインＧ−ＰＥＩ溶液、ローダミン−ｒＩｇＧ溶液及び無血清ＤＭＥＭ培地とを混合して全量を５０μｌの混合溶液とし、４℃で一晩放置した。一方、ゼラチンコートしたガラスを２４ウェル細胞培養用プレートの底に敷き、その上にＢａｌｂ／ｃ　３Ｔ３（ｃｌｏｎｅ：Ａ３１−１−１）細胞を１ウェルにつき約２００００個ずつ播種して一晩放置した。次いで、プロテインＧ−ＰＥＩ及びローダミン−ｒＩｇＧを含有する前記混合溶液５０μｌを１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで８倍希釈し、これを細胞培養液として用いて前記Ｂａｌｂ／ｃ　３Ｔ３を４時間培養した。その蛍光観察図を図３に示す。また、４時間培養後に、培地を完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）に交換してさらに２４時間培養した。その蛍光観察図を図４に示す。
【００５４】
次に、以下の参考例５及び実施例３のようにして、蛋白質（ａ）としてフナコシ社製のＡｎｔｉ−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ　ｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｙ（以下、Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈ＋Ｌ）という）及びＡｎｔｉ−ＩｇＧ（Ｆｃ），Ｒａｂｂｉｔ，Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ　ｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｙ（以下、Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆｃ）という）を、その蛋白質（ａ）をカチオン化するための重合体（ｂ）としてＰＥＩ（分子量６００：カチオン価　１２）を、そして細胞内に導入する蛋白質（ｃ）としてフナコシ社製ＦＩＴＣ−Ａｎｔｉ−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｔ，Ｒａｂｂｉｔ−Ｐｏｌｙ　ｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｂｓｏｒｂｅｄ）（以下、ＦＩＴＣ−ＩｇＧという）を用いて実験を行った。
【００５５】
（参考例６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥＩ複合体及びＡｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆｃ）−ＰＥＩの調製
２．０ｍｇ／ｍｌ濃度のＡｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈ＋Ｌ）５００μｌに１２０ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ溶液（塩酸でｐＨ５．０に調整）を５００μｌ加え、３ｍｇのＥＤＣを添加して４℃で１６時間反応させた。反応終了後、４℃の水に対して十分に透析した後、０．５Ｍヒドロキシルアミン溶液（ｐＨ７．０）に対して４℃で半日間インキュベートした。さらに水に対して十分な透析を行った後、ＰＢＳに対して１日透析してＡｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥＩ複合体を得た。
また、Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆｃ）についても同様にして操作を行い、Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆｃ）−ＰＥＩ複合体を得た。
【００５６】
（実施例３）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥＩ複合体又はＡｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆｃ）−ＰＥＩ複合体を用いるＦＩＴＣ−ＩｇＧの細胞内への導入
ＦＩＴＣ−ＩｇＧはウサギ由来の抗体であるので、Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥＩ複合体及びＡｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆｃ）−ＰＥＩ複合体のいずれとも結合すると考えられる。
【００５７】
以下の３つのサンプルを調製した。
（ｉ）　　　　ＦＩＴＣ−ＩｇＧ（１００ｎＭ）
（ｉｉ）　　ＦＩＴＣ−ＩｇＧ（１００ｎＭ）＋Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥＩ複合体（１００ｎＭ）の混合溶液
（ｉｉｉ）　　ＦＩＴＣ−ＩｇＧ（１００ｎＭ）＋Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆｃ）−ＰＥＩ複合体（１００ｎＭ）の混合溶液
上記の３つのサンプルを１時間氷上で放置した。３Ｔ３−ＳＶ−４０細胞株をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養し、その培養上清に上記サンプルを添加して培養４時間後のＦＩＴＣ−ＩｇＧの細胞内への取り込みを蛍光により観察した。その結果を図４に示す。
【００５８】
図４の観察結果からわかるとおり、サンプル（ｉ）　を用いた場合ではキャリアーとなる複合体が存在しないため、ＦＩＴＣ−ＩｇＧは細胞内にほとんど取り込まれていない。これに対して、サンプル（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を用いた場合では、ＦＩＴＣ−ＩｇＧが細胞内に効率的に取り込まれていることが分かる。なお、蛍光観察は生細胞のままで行っており、固定等は行っていない。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、任意の蛋白質を効率的に細胞内に導入することができる。また、本発明の方法では、カチオン性重合体によりカチオン化された蛋白質又はペプチドをキャリアーとして用いており、細胞内に導入しようとする蛋白質は直接カチオン化されないので、そのネイティブの構造と機能を維持したまま目的とする蛋白質を細胞内に導入することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いられる蛋白質（ａ）、重合体（ｂ）及び蛋白質（ｃ）との関係を示す図である。（ｉ）は、蛋白質（ａ）としてプロテインＧ又はＡを、重合体（ｂ）としてＰＥＩを、蛋白質（ｃ）として抗体を用いた例である。（ｉｉ）は、蛋白質（ａ）としてアビジンを、重合体（ｂ）としてＰＥＩを、そして蛋白質（ａ）と蛋白質（ｃ）との間のスペーサーとしてをビオチンを用いた例である。
【図２】実施例１の結果を示す蛍光観察図である。（ｉ）はビオチン−ｅＧＦＰを、（ｉｉ）はビオチン−ｅＧＦＰ＋アビジン＋ビオチン−ＰＥＩを、そして（ｉｉｉ）はビオチン−ｅＧＦＰ＋アビジン−ＰＥＩを用いた場合の結果を示す。
【図３】ローダミン−ｒＩｇＧの細胞内への取り込みを蛍光により観察した図である。（ａ）はプロテインＧ−ＰＥＩ及びローダミン−ｒＩｇＧを含む培地で４時間培養後の観察図であり、（ｂ）はプロテインＧ−ＰＥＩ及びローダミン−ｒＩｇＧを含む培地で４時間培養した後、培地転換してさらに２４時間培養後の観察図である。
【図４】ＦＩＴＣ−ＩｇＧの細胞内への取り込みを蛍光により観察した図である。（ｉ）はＦＩＴＣ−ＩｇＧ（１００ｎＭ）を用いた場合の、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）はそれぞれＦＩＴＣ−ＩｇＧ（１００ｎＭ）＋Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥＩ複合体（１００ｎＭ）の混合溶液、（ｉｉｉ）　　ＦＩＴＣ−ＩｇＧ（１００ｎＭ）＋Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆｃ）−ＰＥＩ複合体（１００ｎＭ）の混合溶液を用いた場合の実験結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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