(57)【要約】【課題】  副作用なく活性の高いシナプス後膜−結合レセプター数又は機能における欠乏によって特徴付けられる状態の治療のための医薬の製造。【解決手段】  本発明は、認識機能不全及び類似の状態の治療において、多くのサポニンとサポゲニン、特にステロイド構造のそれらの使用を開示する。治療の方法、及び薬学組成物もまた開示する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルササポゲニンを有効成分として含むパーキンソン病の治療剤。
【請求項２】
サルササポゲニン及びスミラゲニンの一つ以上を有効成分として含む、レウィ体痴呆、体位性低血圧症、自閉症、慢性疲労症候群、重症筋無力症、ランバート‐イートン症候群、湾岸戦争症候群、及び有機燐化合物への職業上の曝露から選択される疾患の治療剤。
【請求項３】
スミラゲニン、アンズロゲニンＤ、及びアストラガロシドから選択される少なくとも一つの更なる有効成分を含む請求項２に記載の治療剤。
【請求項４】
アンズロゲニンＤ及びアストラガロシドから選択される少なくとも一つの更なる有効成分を含む請求項３に記載の治療剤。
【請求項５】
前記有効成分が、サルトリイバラ（Smilax)、アスパラガス(Asparagus)、アネマルヘナ(Anemarrhena)、イトラン(Yucca)、又はリュウゼツラン(Agave)属の植物の抽出物である請求項１から４のいずれか一項に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜結合レセプターとその機能；認識機能不全と同様の状態；その治療；及びそのような治療において使用するための組成物に関する。特に、排他的でなく、本発明は、膜結合レセプターの数又は機能の欠乏により特徴付けられるその状態の治療に関する。以下において、本発明は、レセプター型の数の欠乏が示されている、アルツハイマー病（ＡＤ）及びアルツハイマー型の老年痴呆（ＳＤＡＴ）の治療に関連して原理的に記載されるだろう。しかしながら、本発明は、膜結合レセプターの数又は機能の欠乏又はニューロン又はニューロンの結合点とエフェクター細胞との間の結合における伝達の欠乏によって特徴付けられる環境状態に逆行する固有の病的状態及び／又は提示に起因すると考えられる状態を治療することに全体的に関すると解されるべきである。
【背景技術】
【０００２】
上述したタイプの状態は、パーキンソン病、レウィ体痴呆(Lewi body dementia)、体位性低血圧症、自閉症、慢性疲労症候群、重症筋無力症、ランバート‐イートン症候群、湾岸戦争症候群に関連した病気と問題、有機燐化合物への職業上の曝露及び老化に関連した問題を含む。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）及びアルツハイマー型の老年痴呆（ＳＤＡＴ）は、平均余命の増加と外因性疾患の制御のために、人工統計学的なプロフィールがより老化した集団に向かって漸増的に進展している場合に全ての社会において重大かつ増大する問題である。治療することができ、又は管理の助けとなる薬剤を，ＡＤ／ＳＤＡＴは、緊急に必要としている。
【０００４】
年齢性記憶障害（ＡＡＭＩ）は、心理学的及び物理学的に正常であると同時に、記憶欠落の病訴のある老齢の患者の特徴である。それは、不完全に表された症候群であるが、しかしＡＤ／ＳＤＡＴの治療において有効とされる薬剤が、これらの患者においてもまた、価値があるであろう。
ＡＤ／ＳＤＡＴの中のリサーチは、伝統的でかつ通常の医薬リサーチ法と規律によって実施されている。通常の医薬において、ＡＤ／ＳＤＡＴの治療のための幾つかのアプローチがある。大脳皮質において記憶を促進する生化学プロセスは（少なくとも部分的に）、コリン作用的に−仲介されることが知られる。当業者であれば、「コリン作用的に仲介された」メカニズムが、レセプター上で作用するアセチルコリンに直接起因し得ること、及び直接影響を及ぼすことを知るであろう。その他、臨床的に有用な作用は、シナプス前部の神経末端からのアセチルコリンの放出の変調又はアセチルコリンを破壊する酵素の阻害によってもまた、生じるであろう。これらの変調作用因子は、メディエイタが非-コリン作用性である場合に、ニューロンを通して効力を発揮し得る；これらは間接的な作用として関与する。治療における幾つかの試みが、中脳核のような脳の他のエリアにおけるメディエイタである、５−ヒドロキシトリプタミンのような他のメディエイタの役割に集中している。しかしながら、最初の伝達物質がアセチルコリンである場合、これらのエリアからの繊維が大脳皮質の内部に向かって出されることから、試みは、適当な治療薬のサーチにおけるこのメディエイタの管理に集中している。
【０００５】
ＡＤ／ＳＤＡＴの治療のためのコリン作用の戦略は、幾つかのポイントで形成の経路に沿って、シナプスの放出及び放出されたアセチルコリンの除去に向けられている。
【０００６】
一つのアプローチは、レシチン及び他のアセチルコリンの前駆体の高い用量による治療を含む。これは、認識の実行における維持された改善をもたらすことにおける制限された使用である。
【０００７】
別のアプローチは、コリン−アセチルコリントランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性及び脳における神経成長因子（ＮＧＦ）分泌を増すことが示されている、ヒメハギ根抽出物(Polygalae root extract)のような植物性薬剤の使用を含む。ＮＧＦの経口投与は、それが血液脳関門を通過することができないような高分子量のタンパク質であることから、中枢神経系ニューロンに関しては効果を有していない。しかしながら、血液脳関門を通過することができ、中枢神経系におけるＮＧＦ合成での刺激効果を有する薬剤が、記憶関連挙動の改善のために提案されている。
【０００８】
塩酸タクリンのようなコリンエステラーゼ阻害剤を用いる第３の臨床アプローチの結果は、前記のものよりもより限界的に陽性となっている。漢方及び西洋医薬で用いられる植物から得られた物質、例えば、フペルジン(huperzine)，ガランタミン(galantamine)，及びフィゾスチグミン(physostigmine)は、臨床試験において及び実験モデルにおいても、ＡＤ／ＳＤＡＴの治療において−制限されるとしても−何らかの有効性があることを全てが示している。これらの物質の全ては、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の阻害剤である。ＡＤ／ＳＤＡＴに罹った患者においては、アセチルコリン（ＡＣｈ）の合成が減じられ、シナプス前部貯蔵部(presynaptic stores)からのＡＣｈの放出の効率が減じられ、さらにシナプス後部（Ｍ１）レセプターの数又は機能を減じるであろう。シナプス前部Ｍ２レセプターの減少もまた、示されている。ＡＣｈＥ阻害剤の有益な効果は、放出された伝達物質の分解を遅延することによって、脳中シナプスにおけるアセチルコリンの増大に起因する。
【０００９】
コリン作用の機能を変調する組成物は、記憶及び想起に作用することが知られる。ニコチンは、ニコチン性レセプターを刺激し、また喫煙の短命な記憶増強効果は、ニコチンの効果のためであると思われる。スコポラミン、アセチルコリンのアンタゴニストは、健忘症を生じるであろうし、また、減じられた注意力の結果として起こり得る、単純反応時間の延長化のような精神運動試験において明らかとなる認識機能を減じ、さらに付加の鎮痛治療のようなこの目的のために用いられる。スコポラミンの健忘作用は、ニコチンによって拮抗させることができる。
【００１０】
ニコチンレセプターサブタイプ（αとβ）の２つのファミリーがあり、それぞれは、リガンド特異性の異なる４つのサブグループを含む。ＣＮＳにおけるニコチン性レセプターの役割は、分子レベルでは十分に理解されていない。ニコチン性レセプターに結合する薬剤が、脳中のムスカリン性レセプター部位でのターンオーバーの速度を修正し得る可能性がある。ニコチン性レセプターは、リガンド-ゲート化イオンチャンネルであり、またその活性は、Ｎａ＋とＣａ＋＋に対する細胞の透過性、脱分極及び興奮の迅速な（ミリ秒）増加に起因する。
【００１１】
コリン作用性レセプターの別なクラスは、ムスカリンによって刺激することができる。そのようなムスカリン性（Ｍ）レセプターは、Ｇタンパク質-結合レセプターである。ムスカリン性レセプターの応答は、より遅い；それらは興奮性又は抑制性となり得る。それらは、イオン透過性の変化に必然的に結合されない。ムスカリン性レセプターの５つのタイプは、コリン作用性レセプタークローニングによって検出されており、ｍ１−ｍ５と称される。薬学的効果は、クローンしたレセプターの４つと関連し、それらは薬学的特異性に基づきＭ１−Ｍ４と称される。
【００１２】
特異的レセプタータンパク質とモノクローナル抗体を用いて、ｍ１（シナプス後部）及びｍ２（シナプス前部）として脳の中のムスカリン性レセプターをさらに局在化することが可能である。心臓において、Ｍ２レセプターは、シナプス後部性である。シナプス前ムスカリン性レセプターは、Ａｃｈ放出のためのネガティブなフィードバックメカニズムを提供するために更なるＡＣｈの放出を減じるこれらのレセプターへのＡＣｈの結合を抑制するものと思われる。脳に優先的に分布した選択Ｍ２レセプターアンタゴニストは、それ故にアルツハイマー病の治療において有用となり得る。
【００１３】
ＡＤ／ＳＤＡＴのような疾患状態において、全般的なニューロンの損失と、コリン作用性神経機能の不足があることが知られる。コリン作用性ニューロンにおける高親和性ニコチン結合部位が、そのような疾患の治療において、低い親和性結合部位に変換でき、それによって伝達物質放出を維持する。ニコチン結合部位親和性を低下することによって、迅速な除感作プロセスが回避される。
【００１４】
脳におけるニコチン性レセプターのアゴニスト活性化は、迅速に始まり且つ停止する。ニコチン性レセプターの減じられた親和性は、除感作プロセスを減じるであろう。Schwarz R.D.ら（J. Neuro Chem 42,(1984), 1495-8）は、ニコチン結合部位が、コリン作用性（及び５−ヒドロキシトリプタミン性及びカテコールアミン性）軸索末端上にシナプス前部的に配置されることを示している。ＡＤ／ＳＤＡＴ上の高い親和性結合部位への変化は、他の伝達物質系について有し得るニコチン結合部位の変調効果における変化もまた誘導し得る。
【００１５】
シナプス前部のコリン作用性メカニズムはまた、ＧＡＢＡエルジック(GABAergic)ニューロンによって抑制的制御下にあり、この抑制は、ＡＤ／ＳＤＡＴにおいて増加されると思われる。この抑制の除去又は削減は、シナプス前皮質のコリン作用性活性を増強し且つ認識処理を増大する。
【００１６】
ニコチン（結合親和性を減じる）、及びＧＡＢＡエルジック繊維の脱抑制によって刺激されたニューロン内繊維の相互作用は、シナプス前部位置を有する。
【００１７】
これは、中枢伝達の単純なモデルであるが、しかし中枢シナプスにおけるアセチルコリンの有効な濃度を増加するために行われている試みを理解するための枠組みを提供する。これはさらに、直接及び間接的な作用の概念を示す。上述したＡＤ／ＳＤＡＴ治療への３つの通常の治療的アプローチに起因する不都合がある：ＡＣｈ前駆体補充物、アゴニスト代替物及びアセチルコリンエステラーゼ抑制。これらの治療は、シナプス後部レセプターの除感作をもたらすフィードバックメカニズムを活性化し得るＡＣｈの利用能における短期間の増加を生じ得る。理論的見地から、長期間の有効性は予想されないであろうし、治療が中断された場合、ＡＤ／ＳＤＡＴ及びＡＡＭＩの管理におけるいずれの有効性も見えなくなり、且つその状態は一様に悪化するであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
Ｍ１アゴニストとＭ２／Ｍ３アンタゴニスト活性を持った化合物は、ＳＤＡＴ患者における認識動作を改善したことは示されている(Sramakら, Life Sciences vol.2, No.3, 195-202, 1997）。しかしながら、この化合物は、疲労、下痢及び悪心のような許容できないコリン作用性の副作用を生じる。
【００１９】
ＡＤ／ＳＤＡＴ及びＡＡＭＩへのよりラジカルなアプローチは、脳において、シナプス後部（Ｍ１）レセプターの数を増加することをねらう。サルササポゲニン（ＳａＧ）がＭ１コリン作用性レセプターをアップレギュレーションすることができ、更にβ−アドレナリン性レセプター、そのＡＤ／ＳＤＡＴにおいて病理学的に増加するであろう数をダウンレギュレーションすることもできる（即ち、正常なレベルに向かう移動）ことが、中国特許第ＣＮ１０９６０３１Ａから知られている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、レセプターを調整する能力を示す多くのサポニンとサポゲニンを見出している。かくして、本発明の一態様に従い、シナプス後膜−結合レセプター数又は機能における欠乏によって特徴付けられる状態の治療のための医薬の製造における、スミラゲニン(smilagenin)，アンズロゲニンＤ(anzurogenin D)，又はアストラガロシド(astragarosido)の１つ以上の使用が提供されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
当業者であれば、サポニンとそのサポゲニンとの間の相関関係、及びサポゲニンの望ましい効果が相当するサポニン、又はその混合物の投与によって患者において示すことができることを承知しているであろう。サポニンの少なくとも一部の加水分解が、消化管の中で起こる。当業者であれば、酸性加水分解の条件下で一定のサポゲニンのエピマー化もまた、承知しているであろう。
【００２２】
全てではないがサポニン及び／又はそのアグリコンがＡＤ／ＳＤＡＴの治療に有用であり、ジキタリスからのサポニン及びサポゲニンのような幾つかは、心筋層の強力な強心作用を有する。サポニンのこのグループは、ＡＤ／ＳＤＡＴにおける治療的使用を断定するであろう中枢神経系（ＣＮＳ）における効果を有するとは思われない；その高い用量での効力と毒性もまた、これを除外する。
【００２３】
基本的なサポゲニンの幾つかは、以下の一般式のものである：
【化１】
2004224797.tif 000002
【００２４】
この一般式に関して、例示のサポゲニンの構造は、以下の表に示した通りである：
【表１】
2004224797.tif 000003
【００２５】
各種のタイプのサポゲニンの薬理学的な特性及び薬力学的作用における変化は、ＡＤ／ＳＤＡＴの治療のために最も有用であるそれらの薬剤の選択の必要性を強調する。ＳａＧの作用についての新規の事実の発見は、ＡＤ／ＳＤＡＴなどの治療のために最も有用である物質を決定することを可能にしている。
【００２６】
本発明のある態様において主な重要なサポニン及びサポゲニンは、サルトリイバラ（Smilax)，アスパラガス(Asparagus)，アネマルヘナ(Anemarrhena)，イトラン(Yucca)又はリュウゼツラン(Agave)属の植物種の範囲内で天然に産生する。目下、最も重要な種は、スミラックス・レジェリー(Smilax regelii) Kilip & Morton−ホンジュラスサルサ(Honduran sarsaparilla)として一般に知られる；スミラックス・アリストロチアエフォリア(Smilax aristolochiaefolia) Miller−メキシコサルサ(Mexican sarsaparilla)として一般に知られる；スミラックス・オルナタ(Smilax ornata) Hooker−ジャマイカサルサ(Jamaican sarsaparilla)として一般に知られる；スミラックス・アスペラ(Smilax aspera)−スペインサルサ(Spanish sarsaparilla)として一般に知られる；スミラックス・グラブラ(Smilax glabra) Roxburgh；スミラックス・フェブリフューガ(Smilax febrifuga)-Kunth−エクアドル又はペルーサルサとして一般に知られる；アネマルヘナ・アスフォデロイデス(Anemarrhena asphodeloides) Bunge；ユッカ・スキジゲラ(Yucca schidigera) Roezl ex Ortgies；及びユッカ・ブレビフォリア(Yucca Brevifolia) Engelmを含む。重要となり得るサポニンとサポゲニンはまた、他の属、例えば、ヤマノイモ(Dioscorea)，エンレイソウ(Trillium)，ナス／ジャガイモ(Solanum)，ストロファンタス(Strophanthus)，ジキタリス(Digitalis)及びトリゴネラ(Trigonella)において天然に産生する。前述した通り、これらの供給源からの幾つかのサポニンとサポゲニンは、望ましくない特性を所有し、かくしてまた本発明において使用するために推奨できない。
【００２７】
本発明の更なる態様に従い、薬学的有効量のサポニン又はサポゲニンを含む、認識機能増強特性を有している薬学組成物が提供される。サポニン又はサポゲニンは、ステロイドサポニン又はサポゲニンが好適である。そのような組成物は、好ましくは薬学的有効量の非エストロゲン様のサポニン又はサポゲニンを含む。
【００２８】
別な態様において、本発明は、サルトリイバラ（Smilax)，アスパラガス(Asparagus)，アネマルヘナ(Anemarrhena)，イトラン(Yucca)又はリュウゼツラン(Agave)属の植物から得られた薬学的有効量のサポニン又はサポゲニン（好ましくは非エストロゲン様のサポニン又はサポゲニン）を含む、認識機能増強特性を有している薬学組成物を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、認識機能増強特性を有する医薬の製造における、サルトリイバラ（Smilax)，アスパラガス(Asparagus)，アネマルヘナ(Anemarrhena)，イトラン(Yucca)又はリュウゼツラン(Agave)属の植物の抽出物の使用を提供する。
【００３０】
本発明は、前記組成物の使用の範囲内に及ぶことが理解されるであろう。かくして、本発明の第５の態様に従い、本発明は、本発明の組成物の有効用量をヒト又は動物に投与することを含む認識機能の増強方法を提供する。
【００３１】
本発明はまた、サポニン又はサポゲニン、好ましくは非エストロゲン様のサポニン又はサポゲニンの有効用量を投与することを含む、ヒト又は非ヒト動物における認識機能の増強方法をも提供する。
【００３２】
ここで用いたような用語「認識機能(cognitive function)」は、思考、推論、記憶、イメージング及び学習のような機能に関する。
【００３３】
かくして、本発明の第７の態様に従い、シナプス後部膜結合レセプター数又は機能の欠乏によって特徴付けられる状態の治療のための医薬の製造における、スミラゲニン(smilagenin)，プラゼリゲニン(prazerigenin)，アストラガロシド(astragaloside)，チゴゲニン(tigogenin)，ルスコゲニン(ruscogenin)，ヘコゲニン(hecogenin)及びジオスゲニン(diosgenin)の１つ以上の使用を提供する。
【００３４】
本発明はまた、サルササポゲニン(sarsasapogenin)と、ある種の他のサポゲニンとを組み合わせた場合に、予期し得なかった相乗効果が得られることをも見出している。
【００３５】
かくして、本発明の第８の態様に従い、サルササポゲニン，スミラゲニン，プラゼリゲニン，アストラガロシド，チゴゲニン，ルスコゲニン，ヘコゲニン及びジオスゲニンの少なくとも２つを含む、シナプス後膜−結合レセプター数又は機能における欠乏によって特徴付けられる状態の治療用組成物を提供する。
【００３６】
本発明の第７及び第８の態様において使用される物質は、患者における高い明白なエストロゲン性及び／又はアンドロゲン性及び／又は同化作用活性を有していない。それにもかかわらず、幾つかの実施態様において、低いレベルのエストロゲン性及び／又はアンドロゲン性の補足的効果がある。
【００３７】
本発明の第９の態様に従い、アゴニストの結合によってそれが活性化される際に、又はアンタゴニストの不活性化によってその活性が促進される際に、組織、器官、細胞型又は小器官において膜結合レセプターの数及び／又はターンオーバーをアップレギュレーションする及び／又は正常化する、サイトゾルの、核の又は膜結合タンパク質の作用を直接或いは間接的に変調することを含む、組織、器官、細胞型又は小器官において膜結合レセプター数又は機能における結合によって特徴付けられる状態の治療方法が提供される。
【００３８】
驚くべきことに、本発明者らは、放射性標識したＳａｇが、ラットから単離した脳細胞の核で濃縮されること、及びＭレセプターｍＲＮＡのレベルがＳａＧで処理したラットにおいて上昇することを見出している。本発明者らはいずれの理論に結び付けることを望まない一方で、Ｓａｇは、ＤＮＡ発現を変調することによって中国特許第ＣＮ１０９６０３１Ａ中に記載された効果を発揮すると確信される。
【００３９】
本発明に従う一つの可能性のある説明は、Ｓａｇがステロイドレセプターの細胞内アゴニストであり、エストロゲン性レセプター、又は転写因子又はプロモーターと思われる。ステロイドとＳａＧの構造において化学的類似性があり、それ故に、細胞質から核までのＳａＧの輸送メカニズムは、そのステロイドと同じである。その細胞膜を通しての拡散の後、ＳａＧは、細胞質中に存在するステロイドレセプターに結合し、高-親和性核複合体が核ＤＮＡタンパク質複合体上の応答部位に運ばれるように、該レセプターのコンホーメーション形質転換を促進する。ムスカリン性レセプターの増加した生産をもたらすため、それは核からリボソームまで移動するｍＲＮＡの転写を増大する。
【００４０】
第２の可能性は、ＳａＧが、核の中のＤＮＡタンパク質複合体に結合すること及びプロモーターとして作用することによって、ｍＲＮＡ発現の増加をもたらすように作用する、未知のレセプターのアゴニストである、ということである。
【００４１】
何れかのケースにおいて、ＤＮＡへのＳａＧ−レセプター複合体の結合は、コリン作用性レセプター、ドーパミン性レセプター、又はアドレナリン性レセプター又は他の膜結合レセプターをコードするｍＲＮＡの発現の増加を生じ得る。
【００４２】
或いは、ＤＮＡへのＳａＧレセプター複合体の結合は、Ｇタンパク質のような結合タンパク質の生産における増加；又はその分解の妨害；又はそのようなタンパク質と、関連するレセプターとの間の結合の遅延、それによってレセプター数の二次的な変化の発生を生じ得る。
【００４３】
ＳａＧの効果は、１つ以上の神経栄養因子、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）のレベルの増加を通して介在し得る。
【００４４】
ニューロン及びコリン作用的に介在されるシナプスのメカニズムに加えて、一酸化窒素（ＮＯ）及び非コリン作用性アゴニストのような物質がコリン作用性伝達についての変調作用を有することができることが可能であることもまた、認識される。
【００４５】
ＳａＧがその効果を発揮するために結合する細胞成分の正確な本質がどうであれ、これは標的にすることができるＡＤ／ＳＤＡＴ，ＡＡＭＩなどの潜在的な治療についての新規の通路を提供する。
【００４６】
ＳａＧが膜結合レセプターｍＲＮＡ、特にｍ１レセプターｍＲＮＡのレベルを増加することが示されている。それ故に、サイトゾル又は核レセプター又はプロモーターは、活性化した際に、膜結合レセプターをコードする組織、器官、細胞型又は小器官中のｍＲＮＡ分子の生産を増加する、又は膜結合レセプターをコードする組織、器官、細胞型又は小器官中のｍＲＮＡ分子の分解を減じることが可能である。
【００４７】
該サイトゾル又は核レセプターはまた、活性化した際に、膜結合レセプターをコードする組織、器官、細胞型又は小器官中のｍＲＮＡ分子の転写をも増加し得る。
【００４８】
上述した通り、ニコチン性レセプターは、膜結合レセプターの数及び／又はターンオーバーを変調し得る。従って、一実施態様において、サイトゾルの又は核レセプターの作用は、ニコチン性レセプターの少なくとも部分的なアゴニストである物質を投与することによって変調される。
【００４９】
サイトゾルの又は核レセプターの作用が、それの少なくとも部分的なアゴニストである物質を投与することによって変調されることが、目下好適である。
【００５０】
そのアゴニストは、サポニン又はサポゲニンとして良く、好ましくは、サルササポゲニン，スミラゲニン，プラゼリゲニン，アストラガロシド，チゴゲニン，ルスコゲニン，ヘコゲニン及びジオスゲニンの１つ以上である。これらの化合物は、患者における高い明白なエストロゲン様の及び／又はアンドロゲン性及び／又は同化作用活性を有していない。低レベルのエストロゲン様の及び／又はアンドロゲン補足的効果は、本発明の第９の態様の方法において有益となり得る。
【００５１】
レセプターは、組織、器官、細胞型又は小器官の細胞のサイトゾルに配して良く、且つアゴニストを結合することによって活性化した際に、細胞の核に移動する。レセプターを組織、器官、細胞型又は小器官の細胞の核に配し、アゴニストを核の中に拡散させること、又は別なメカニズムにより輸送することもまた可能である。
【００５２】
本発明の第１の態様に従う方法において、サイトゾル又は核レセプター自身の上で直接作用する物質を投与することは必須ではない。代わりに、作用は、サイトゾル又は核レセプターの又はプロモーターの経路中の関与の上流又は下流のいずれかで実行することができる。かくして、サイトゾル又は核レセプターの作用は、膜結合レセプターをコードする組織、器官、細胞型又は小器官中のｍＲＮＡ分子の発現を増加する物質を投与することによって変調し得る。
【００５３】
ＳＤＡＴの可能性のある治療としてのエストロゲン及び他の関連化合物の役割は、相当な重要性を与えられている。ＳＤＡＴに罹った患者における認識機能についてのコリンエステラーゼ阻害剤、タクリンの有効性を見るために実施した研究において、二次分析は、全ての改善が、ホルモン（エストロゲン）補充療法（ＥＲＴ）をも受けている女性患者において見られたことを示唆した。疫学的データもまた、ＥＲＴがＳＤＡＴの進行に対して保護し得ることを示唆する。卵巣摘出が減じられた認識機能をもたらし、この作用がエストロゲンの投与によって少なくとも部分的に逆行することができることを示唆するラットにおける詳細な研究がある。このモデルにおけるエストロゲンの作用は、脳における一定のエリア、特に海馬における高い親和性コリン取込みを増加でき、それによってコリン作用性伝達を改善する。同じモデルにおいて、エストロゲンの投与は、適当なin situハイブリダイゼーション技術(Singh 1995)を用いて脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のｍＲＮＡのレベルを増加することを示している。
【００５４】
エストロゲンの作用の背後に隠された可能性のあるメカニズムは、インビトロでの実験において研究されている。これらの研究は、神経芽細胞を用いて、血清剥奪に対する該細胞の応答又はベータアミロイド（ＢＡ）画分の作用を用いて実行されている。この後者の刺激剤は、ＳＤＡＴの後期段階におけるアミロイドプラークの隆起のため、特別の関連性があると思われる。血清剥奪とＢＡの両者は、細胞死を誘導する。１７−βエストラジオールは、血清剥奪とＢＡによって誘導した細胞死に対し保護することが示されている。その保護作用は、１７−βエストラジオールが、エストロゲンアンタゴニスト、タモキシフェンの存在中で試験した際に根絶されない。非-エストロゲン性エナンチオマー、１７α−エストラジオールは、細胞死を抑制することにおいて有効である。次の研究は、これらの化合物の保護効果が、完全な脱飽和フェノールのＡ環と３つの位置での保護していない水酸基の存在に基づくことを示唆している（Simpkins 1997; Green 1997）。神経芽細胞培養において、エストロゲン化合物は、神経成長因子の放出を増加することを示した。ＳＤＡＴにおけるエストラゲンの効果のこれら知見の関連性は不明確なままである。
【００５５】
特許出願は、ＳＤＡＴを含む疾患の治療において、スピロスタン、スピロソラン又はソラニジン構造を有する多数のステロイドサポゲニンの有用性を請求して公表されている。２つの特許公報が特にここに関係する：中国特許公開第ＣＮ１０９６０３１Ａ号は、ＳＤＡＴの治療において、スピロスタンサポゲニン、サルササポゲニンの使用をクレームする。この文献における開示は、しかしながら、簡略である。関連の他の文献は、発明者がウイルス起源と考察した疾患の全体の範囲の治療においてサポニン及びサポゲニンの非常に広い範囲の使用をクレームする特許公開ＤＥ４３０３２１４Ａ１である。この開示は、しかしながら、欠陥のあるシナプスの伝達によって特徴付けられる非常に多くの状態に対しては不適切な要素のない、かくして主張した発明の基本的な根拠に欠点があることを十分認識されることにおいて疑わしい点がある。加えて、それらは、大量のクレームされた好適な化合物から選択できることが当業者に可能であることの何れの種類のデータをも提供していない。
【００５６】
レセプター数又はシナプス伝達の減少によって特徴付けられるＳＤＡＴと他の疾患における使用を有するであろうと同定された化合物において、本発明者らは、望まれる効果を有するであろうが、しかしこれらが、特に男性患者において許容できないであろう、いずれかのエストロゲンの効果を欠いているであろう化合物を同定する必要性の考慮を与えている。特許出願ＤＥ４３０３２１４Ａ１において活性を有するために請求された多くの化合物は、顕著なエストロゲン活性を有しており、従って許容できない。このデータは、下記の表２中に要約される。
【００５７】
【表２】
2004224797.tif 000004
【００５８】
加えて、これらの化合物は、他のステロイドレセプターで効果を有さないべきである臨床上の病訴のあるであろうその化合物を、考慮される他のステロイドレセプターで試験した。以下のレセプターの何れかで、何ら活性を有することが見出された化合物は無い：
プロゲステロン
グルココルチコイド
テストステロン
【００５９】
かくして、エストロゲンレセプターで活性を有さないことを示した化合物は、他の重要なステロイドレセプターでも不活性であった。
【００６０】
選択した化合物はまた、多くのインビトロでのアッセイにおいてその活性を試験している。膜結合レセプター数の上昇における可能性のある活性の測定において鍵となる重要性を検討したアッセイ／実験は、以下の通りであった；
１．チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をムスカリン性レセプターをコードしているＤＮＡフラグメントとトランスフェクションした。大部分の実験に使用した細胞系は、ｍ２レセプターを発現している細胞系とした。
２．神経由来の培養した細胞系におけるムスカリン性レセプター発現の効果を調査した。
３．培養心筋細胞は、Sprague Dawleyラットから得た。該心筋細胞は、ムスカリンレセプター、典型的にｍ２を発現する。これらのレセプターのレベルが延長された培養で低下し、予防における重要な化合物の効果がレセプター数において低下することを調査した。
これらの実験の方法と結果を順次ここに記載する。
【００６１】
１  ＣＨＯ細胞系実験
ｍ２レセプターをＤＮＡにトランスフェクションしたＣＨＯ細胞上のｍ２レセプターの発現における各種化合物の効果を調べた。レセプター数は、滴定したＱＮＢ結合を用い、且つ非特異的結合を差し引きすることでアッセイした。化合物は、ＤＭＳＯに溶かし、またＤＭＳＯをコントロールとして用いた。化合物は、最終濃度の範囲で試験した。化合物はまた、エストロゲン性レセプター介在メカニズムを識別する試みのためにタモキシフェンの存在と不在においてもまた試験した。その結果を以下の表３中に要約した。
【表３】
2004224797.tif 000005
【００６２】
このように実験は、幾つかの化合物が、インビトロで培養したＣＨＯ細胞の表面上で発現したムスカリン性レセプターの数を増加できたことを示した。その効果は、タモキシフェンによって拮抗されず、関係したメカニズムがエストロゲン性レセプターを包含していないことを示す。Simpkinらによって公表された研究と異なり、完全なフェノールＡ-環が必要でないことが見出された。同様に、ステロイドサポゲニンである多くの化合物が活性を欠いていた。さらに、補足の実験では、β−エストラジオールが、１０−５Ｍで投与した際にレセプター発現を増加する類似の効果を有したことを示した。
【００６３】
２  細胞生存についての化合物の効果
他のインビトロでのアッセイが、活性及び不活性化合物との間を識別するために用いられる。特に、ＳＫＮ−ＳＮ及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、同じくファエクロモアシトーマ(phaechromoacytoma)細胞系を含む各種の神経芽細胞系を、β−アミロイドフラグメント又は血清剥離の存在中、インビトロで培養している。培養細胞の保護における化合物の有効性を実証するための多くの技術を調査した。これらの技術は、トリバンブルー排除、化学ルミネッセンス及び乳酸脱水素酵素の放出を含む。最も興味あることが、放射性標識リガンド結合技術を用いて測定した、細胞、特にＰＣ１２細胞と、β−アミロイドとの、ムスカリン性レセプターの数を減じたインキュベーションで観測された。レセプター数におけるこの減少は、活性化合物によって改善されることが見出された。
【００６４】
３  培養した心筋細胞についての化合物の効果
心筋細胞は、標準技術を用いて新生児Sprague Dawleyラットの心室筋肉から単離した。細胞はインビトロで培養し、各種時間点で採取した細胞の均質化後の細胞表面膜フラグメントを発現したムスカリン性レセプターの数は、滴定したＱＮＢの特異的結合を用いて評価した。最初の実験は、発現したレセプターの数が培養の１０日後に低下する傾向であったことを示した。その実験は、従って、レセプター数におけるこの減少を抑制することにおいての各種化合物の効果を調べるために表した。
【００６５】
これらの実験の結果を表４に要約した。
【表４】
2004224797.tif 000006
【００６６】
驚くべきことに、本発明者らは、サポゲニンがインビトロで培養した細胞の核の中に優先的に濃縮されることを見出している。これは、前述した通り、ムスカリン性レセプターの数を増加することが示されているサルササポゲニン（ＳａＧ）及び他の化合物が、周知のステロイドレセプターに結合しないために、予期し得ないことである。加えて、これらの化合物の効果は、ムスカリン性レセプターを発現するが、しかし該レセプター用のＤＮＡが細胞質の中にトランスフェクションされている、従って正常な制御メカニズムのもとではない場合であるインビトロでのアッセイ系において見ることができるために、ＳａＧが核の中に優先的に取り込まれることは予期し得なかった。
【００６７】
試験を行って、レセプターのレベルをアップレギュレーションすることが示されたＳａＧ及び他の化合物は、膜結合レセプターの主要な周知のクラスのいずれにも直接結合しないことを全てが示している。かくして、観測された効果は、例えばニコチン性レセプターでの効果、及びムスカリン性レセプターの数において重要な増加のためではないと思われる。この説明は、一定の化合物が末梢血液リンパ球上で発現したベータアドレナリン作用性レセプターの数が増加することが本発明によって示されていると見なされるなら、一様により劣った弁解（たとえそれが除外することができたとしても）であると思われる。かくして、そのメカニズムは、膜結合レセプターの調節についてのより全般的な効果を有する一つとして見なされるであろう。
【００６８】
本発明において請求した活性化合物の効果が、Ｇタンパク質の効果を通して作動し得ること、及びレセプター数についての効果がＧ−タンパク質についての効果に対して二次的であることが、ここで推測される。レセプターに結合した膜結合Ｇ-タンパク質が刺激された際に、２つの一連の基本的な事象が開始される：エフェクター応答；及びレセプターの内在化。それが細胞表面上に、又はそれが別なレセプターリガンドと相互作用できる場合に他の膜表面上で再び形成される状態への、該レセプターの続行する処理は、多くの作用因子に従属していると思われる。多くのこれらの作用因子又はメカニズムは、Ｇ-タンパク質に結合すると思われる。ｍ３レセプターの活性化が、Ｇ-タンパク質発現又はレベルについての効果を有し得ることの証拠がある。この特許において記載した化合物の作用が、レセプター再生、Ｇ-タンパク質結合又はＧ-タンパク質ホメオスタシスのプロセスにおける相互作用に依存し得ることが推測される。
【００６９】
代替の仮説は、その化合物が、脳由来成長因子及び／又は神経成長因子のような神経栄養因子の合成又は放出を増加し又は分解の速度を減じることである。成長因子についてのこれらの効果は、サイトゾル又は核レセプターについての該化合物の効果、或いは該成長因子用のｍＲＮＡの生産の速度についての直接的な効果を持ったプロモーター領域に対する化合物の結合、或いはレセプター又はＧ-タンパク質プロセッションについての効果に対して二次的となり得る効果のためとし得る。
【００７０】
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の増加した発現及び／又は異常な後修飾は、アルツハイマー病の主要な形態学的証拠であるアミロイドプラーク及び脳血管性アミロイド堆積の形成と関連する。特に興味あることは、アミロイド原性及び非アミロイド原性フラグメントへのＡＰＰの蛋白分解的な切断を調節するプロセスである。該タンパク質のβ−アミロイド配列の中の酵素α−セクレターゼによるＡＰＰの切断は、非アミロイド原性Ｃ末端フラグメント、及び可溶性ＡＰＰｓαフラグメントの形成をもたらす；この後者のフラグメントは、脳血管内（ＩＣＶ）に注入した際にマウスにおいて、神経栄養性の及び神経保護的活性を有すること、同じく記憶を増強することを示している。反対に、γ−セクレターゼによるＡＰＰの後修飾は、可変Ｃ末端でのγ−セクレターゼ切断により放出されるβ−アミロイドのＮ末端を曝露する。３９−４３アミノ酸を含む、得られたβ−アミロイドペプチドは、神経毒性であること、及びニューロン間接続に干渉するプラーク中に蓄積することが示されている。
【００７１】
多くの研究は、タンパク質−キナーゼ（ＰＫＣ）結合ムスカリン性Ｍ１及びＭ３レセプターの刺激が、α−セクレターゼ活性の増加をもたらす。その結果、その神経保護的な効果によるＡＰＰのＡＰＰｓαへの後修飾が増加される。それと並行して、β−及びγ−セクレターゼによるＡＰＰの後処理は減じられ、β−アミロイドの重大な減少がある。神経成長因子（ＮＧＦ）及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）同じくブラジキニン及びバソプレシンのような他の伝達物質は、ＡＰＰｓαに後修飾されたＡＰＰの比率を増加する類似の効果を有し得る。チロシンキナーゼレセプター（ＴｒｋＡ）への該因子の結合及び続くリン酸化反応によりホスホリパーゼＣγの刺激及びタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化及びα−セクレターゼの相対活性の増加を含み得るＮＧＦの効果に含まれた多くの作用因子があり得る。
【００７２】
脳におけるタンパク質キナーゼＣ選択性の活性を増加する何れかの処理は、従ってアルツハイマー病の管理における使用を予期し得る。最近までＭ１レセプターでのアゴニスト選択は、利用可能ではなかった。非選択アゴニストは、ネガティブなフィードバックを生じ、それ故にムスカリン性伝達がさらに弱められるであろうシナプス前部Ｍ２レセプターを刺激することが予期されるであろう。Ｍ１レセプターでの選択アゴニストは、現に利用可能になっており（タルサクリジン(talsaclidine)）、そのような薬剤はＡＤの治療の調査を受けている。しかしながら、何れかのレセプターアゴニストの臨床投与に伴う相当な危険があり、知見した臨床的有益性は、レセプター数を減じること又は選択性を減じることによって有効性の程度に関して、及びレセプター特異性の欠如のための副作用に関して厳しく制限されるであろう。かくして、ムスカリン性Ｍ１レセプター数を選択的に増加し、脳におけるムスカリン性Ｍ２レセプター数について僅かな効果を持つか又は効果の無い、本発明中に記載した化合物は、ムスカリン性アゴニストで見られる欠点を欠いていること、及びそれ故に特有な利用性を有することが予期されるであろう。実際の有益性は以下の３つのパートに見ることができる。
【００７３】
１．増大したシナプスの伝達に至るＭ１レセプター数の選択的増加。選択アゴニストの臨床投与は、最良では、伝達についての逆効果を有さないであろう；
２．二次的に増加したレセプター数、α−セクレターゼ活性の重大な増加に伴うＰＫＣの刺激の増加は以下のことに帰結する：
２．１  β−アミロイドの減じられた生産及び結果として起こるプラーク形成とニューロン損失の減少；
２．２  ＡＰＰｓαの増加及び結果として起こる短期及び長期記憶の改善によって証明されるような大脳機能の改善。
【００７４】
伝達を変調することにおけるＧＡＢＡ系の最終的な効果は、先に論じられている。ベンゾジアゼピン、塩化物及びＧＡＢＡ結合部位とは別個のＧＡＢＡレセプター上にステロイド結合部位があることが周知である。多くの治療用化合物は、この部位に結合することが知られ、自覚のレベルを増大する又は減じるために用いられている。この部位での部分アゴニストの臨床投与が伝達の増加に至り得ることが予測される。
【００７５】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載されるであろう。
【実施例】
【００７６】
実施例−in situハイブリダイゼーションを用いたｍＲＮＡレベルの調査
２０月齢の純系オスＳＤラットを、２つの群に無作為に分割した。一方の群には、ラット当たり１日当たり平均３ｍｇのサルササポゲニンを毎日餌と混合して与えた。コントロール群は、正常な餌と水を与えた。４ヶ月後、それらの脳をハイブリダイゼーション技術実験で使用するとともに、４乃至６月齢のラットを若年コントロール群として用いた。それぞれの群の他の給餌列は、完全に同一であった。
【００７７】
ｍ１とｍ２の両方のｍＲＮＡにそれぞれ相当するｃＤＮＡ鎖を合成した。ｍ１は、レセプタータンパク質の３−１８アミノ酸配列に相当し、即ち、TGG TGC CAA GAC AGT GAT GTT GGG ACT GAC AGC AGG GGG CAC TGA GGTであり、ｍ２は、１−１６アミノ酸配列、即ち、ATG AAT AAC TCA ACA AAC TCC TCG AAC AAT GGC TTG GCT ATT ACC AGTに相当する。そのｃＤＮＡは、標識材料としてａ−３５Ｓ−ｄＡＴＰ（８．９ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）を備えた３’−末端−標識試薬キットを用いて標識した。その反応が終結した後、それをヌクレオチドカラムで精製した。そのバッチの特異的活性を評価した（１６．６７−３３．３４）ｘ１０８ ＭＢｑ／μｇ。ａ−３５Ｓ−ｄＡＴＰ、３’−末端−標識試薬キットとヌクレオチドカラムは、デュポン社,米国から得た。
【００７８】
それぞれの群、それぞれの時間から一匹のラットを使い、並行実験を実行した。そのラットは、断頭し、その脳を完全に取り出した。１５μｍ厚の冠状切片を定常凍結クリオミクロトーム(AS-600 cryo-microtome, Anglia Scientific Co, UK)で調製した。切片は、異なるエリア（それぞれのラットで同一の位置）から採取し、ポリリシンを塗布したスライドガラス上に置き、循環冷気中で乾燥し、ＰＢＳ中で二度の洗浄の前に、５分間、４％パラホルムアルデヒド（１ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ７．０を含む）の溶液中で固定した。それらは、次いで１０分間、０．２５％無水酢酸溶液（０．１Ｍトリエタノールアミン塩酸，ｐＨ８．０と、０．９％塩化ナトリウムとを含む）中に配し、１分間、７０％，８０％，９５％，及び１００％エチルアルコール中で脱水し、５分間、クロロホルム中で変性し、さらに１分間、続けて１００％と９５％エチルアルコール中で最終処理した。
【００７９】
陰性コントロールとして用いた切片は、上述した通りに採取し、エチルアルコール中で脱水などを行うが、しかし前もって３７℃で２時間、１００ｍｇ ｍｌのＲＮアーゼと２ｘＳＳＣ（塩／３００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムと４５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムを含むクエン酸ナトリウム溶液）で処理した。
【００８０】
ハイブリダイゼーションのために、ハイブリダイゼーション用の液体マトリックスを、５０％の脱イオンしたホルムアミド、４ｘＳＳＣ、１０％デキストラン硫酸、２５０μｇ／μｌの酵母ｔＲＮＡ、５ｘデンハード溶液、５００μｇ／ｍｌの変性プロタミンＤＮＡ、１０ｍｍｏｌ／Ｌジチオトレイトールを新たに含めて調製した。３５Ｓで標識したオリゴヌクレオチドプローブ[(１６．６７−３３．３４)ｘ１０ＭＢｑ／５０μｌ]を最後に加え、均等に混合した。５０μｌのマトリックスを、それぞれの切片上に滴下し、ケイ酸塩カバーガラスを起泡を避けつつ軽く配した。その切片は、次いで水分を保持するために底部上の２ｘＳＳＤと共にハイブリダイゼーションボックスに載せ、１８乃至２４時間、３７℃でインキュベーションした。
【００８１】
ハイブリダイゼーション後、その切片を１ｘＳＳＣ溶液に浸漬し、カバーガラスを濯ぐために僅かに揺らした。それらを１ｘＳＳＣ溶液中で簡単に洗浄し、５０％ホルムアミドを含む２ｘＳＳＣ中、３７℃で２０分間、その溶液を４回換えながら、穏やかに揺動し、次いで３０分間実験室温度で１ｘＳＳＣ溶液に移し換えた（２回繰り返した）。最後に、スライドガラスを２回蒸留水で洗浄し、７０％、次いで９５％エチルアルコールで脱水し、そして空気中で乾燥した。
【００８２】
オートラジオグラフは、暗室中で調製し、標本とそのハイパーフィルムベータマックスは、接触法を用いて一緒に押圧し、乾燥剤とともにカセット中に配し、４℃で２乃至３週間曝露させた。それらを現像し（Ｄ１９６）、固定化した（Ｆ５）。最後に、オートラジオグラフをコンピューター化イメージ分析装置（VIDAS imaging analyser, Kontron, ドイツ）を用いて分析した。
【００８３】
ｍ２プローブは、活性の何れかに局在化したエリアを示すことはなかった。ｍ１プローブは、歯状核、大脳皮質及び線条において活性を示した。異なる動物群についてのこれら３つのエリアの化合物は、表５に示した：
【表５】
2004224797.tif 000007
【００８４】
若年コントロールに比べて老年ラットの線条におけるｍ１レセプターのｍＲＮＡ発現において有意の減少があった。ＳａＧの投与は、処理した動物を、老年の、処理していないコントロールと比較した場合、同じ脳のエリアにおけるｍ１レセプターｍＲＮＡの有意な増加を生じた。
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月19日(2004.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルササポゲニンを有効成分として含むパーキンソン病の治療剤。
【請求項２】
サルササポゲニン及びスミラゲニンの一つ以上を有効成分として含む、レウィ体痴呆、体位性低血圧症、自閉症、慢性疲労症候群、重症筋無力症、ランバート‐イートン症候群、湾岸戦争症候群、及び有機燐化合物への職業上の曝露から選択される疾患の治療剤。
【請求項３】
スミラゲニン、アンズロゲニンＤ、及びアストラガロシドから選択される少なくとも一つの更なる有効成分を含む請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
アンズロゲニンＤ及びアストラガロシドから選択される少なくとも一つの更なる有効成分を含む請求項２に記載の治療剤。
【請求項５】
前記有効成分が、サルトリイバラ（Smilax)、アスパラガス(Asparagus)、アネマルヘナ(Anemarrhena)、イトラン(Yucca)、又はリュウゼツラン(Agave)属の植物の抽出物である請求項１から４のいずれか一項に記載の治療剤。