(57)【要約】【課題】本発明は、患者の子宮内膜症の検出方法を提供し、侵襲性で高額な外科手順を改良するものである。【解決方法】本方法は、トムゼン−フリーデンライヒ抗原（Ｔｆ）に反応する血清サンプル中の自己抗体を検出する免疫アッセイを使用する。Ｔｆ様抗原に結合する患者由来の血清サンプル中の自己抗体レベルの上昇は、患者の子宮内膜症の指標である。本発明はまた、患者へのＴｆ様抗原またはＴｆ様抗原に特異的に結合する抗体の投与による患者の子宮内膜症の治療方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者にＴｆ様抗原に特異的に結合する抗体を投与する工程を含む、患者の子宮内膜症の治療方法。
【請求項２】
前記Ｔｆ様抗原がＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ二糖類部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体を薬学的に許容可能なキャリアと共に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記キャリアが、油、水、生理食塩水、ゲル、脂質、リポソーム、または多孔質マトリクス材料である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記キャリアが前記抗体を制御放出することができる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体を経口または非経口経路を介して前記患者に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体を、皮下経路を介して前記患者に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者にＴｆ様抗原を投与する工程を含む、患者の子宮内膜症を予防または改善する方法。
【請求項１２】
前記Ｔｆ様抗原が、少なくとも１つのＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ二糖類部分を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｔｆ様抗原が、複数のＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ二糖類部分を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔｆ様抗原を薬学的に許容可能なキャリアと共に投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記キャリアが、油、水、生理食塩水、ゲル、脂質、リポソーム、または多孔質マトリクス材料である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記キャリアが前記抗体を制御放出することができる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体を経口または非経口経路を介して前記患者に投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体を、皮下経路を介して前記患者に投与する、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
子宮内膜症は、子宮外（異所性）部位での子宮内膜細胞の成長によって特徴付けられる一般的な障害である。これは、１０％までの再生産年齢の女性が罹患し得る一般的な疾患である（Ｗｈｅｅｌｅｒ、Ｉｎｆｅｒｔ  Ｒｅｐｒｏｄ．Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．、３、３４５、１９９２）。子宮内膜症の病因は不可解なままであるが、細胞性および体液性免疫機能の変化が確立された疾患の明確な特徴である（Ｂｕｒｎｓら、Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、４２、５８６、１９９９；Ｗｉｔｚ、Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、４２、５６６、１９９９；Ｒｉｅｒら、Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１５、２０９、１９９７）。
【背景技術】
【０００２】
多数の研究で（Ｂｕｒｎｓら、Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、４２、５８６、１９９９）子宮内膜抗原に対する自己抗体および補体成分の沈着が説明されており、多数の血清、腹水、および子宮内膜抗原が説明されている。説明されているおそらく最も特徴的な組織抗原は、これまでのところ、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン受容体（Ｍｏｎｃａｙｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、８４、１８５７、１９８９）ならびに酵素である炭酸脱水素酵素のイソ型ＩおよびＩＩ（Ｂｒｉｎｔｏｎら、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．、２５、４０９、１９９６；Ｄ’Ｃｒｕｚら、Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  ６６、５４７、１９９６；Ｋｉｅｃｈｌｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ、１０１、６１１、１９９４）である。トランスフェリンおよびα２−ヘーレマンスシュミット糖タンパク質（α２−ＨＳＧ）に対する抗体もまた記載されており、診断マーカーとして提案されている（Ｍａｔｈｕｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４０：６９、１９９８；Ｐｉｌｌａｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３５：４８３、１９９６）。子宮内膜症、生殖疾患、および他の自己免疫疾患におけるこれらの抗体の発生率の評価に関する多数の研究が行われており、関連エピトープの性質についてはわずかしか注目されていなかった。同定された抗原は、全ての糖タンパク質である。ただ１つを例外として（Ｍｏｎｃａｙｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、８４：１８５７、１９８９）、これらのタンパク質に対する炭水化物抗原は評価されていない。
【０００３】
本発明によれば、驚いたことに、上記の異なる子宮内膜抗原上に共通の炭水化物部分が存在することが見出された。共通の炭水化物部分は、Ｔｆ抗原またはＴｆ様抗原とも呼ばれるトムゼン−フリーデンライヒ関連抗原（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）である。Ｔｆ抗原は、シアル酸によってマスクされる微小な二糖類構造である。シアル酸部分を、ノイラミニダーゼなどのシアリダーゼによって除去することができる。Ｔｆ抗原はヒト赤血球上に存在し、上皮組織中の腫瘍関連抗原である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、Ｔｆ様抗原との自己抗体反応性に基づく診断方法を提供する。診断方法は、患者の子宮内膜症の存在の同定に有益であり、現在の侵襲性診断方法よりも改良されている。本発明はまた、被験体へのＴｆ様抗原またはＴｆ様抗原に特異的に結合する抗体の投与による被験体の子宮内膜症の治療または予防方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、患者の子宮内膜症の診断方法を提供する。本発明の１つの実施形態では、患者の子宮内膜症の診断方法は、
（ａ）患者から血清サンプルを得る工程と、
（ｂ）トムゼン−フリーデンライヒ（Ｔｆ）様抗原を前記血清サンプルとインキュベートする工程と、
（ｃ）前記サンプル中の前記Ｔｆ様抗原との自己抗体反応性を検出する工程と、
（ｄ）前記サンプル中の前記Ｔｆ様抗原との自己抗体反応性レベルの増加を前記患者の子宮内膜症の診断と相関させる工程とを含む。
【０００６】
抗体反応性を、免疫測定アッセイまたは競合アッセイなどの免疫アッセイによって同定することができる。
【０００７】
本発明の１つの実施形態では、免疫測定アッセイは、
（ａ）固体支持体上にＴｆ様抗原を固定する工程と、
（ｂ）患者由来の血清サンプルのアリコートを前記固体支持体上に結合した前記Ｔｆ様抗原に添加し、インキュベートする工程と、
（ｃ）標識抗ヒト免疫グロブリンを前記固体支持体に添加する工程であって、前記ヒト免疫グロブリンがシグナル発生系の一部である工程と、
（ｄ）結合抗体から標的抗体を分離する工程と、
（ｅ）前記固体支持体を含む溶液によって発生したシグナルを測定する工程と、
（ｆ）シグナル強度の増加を患者の子宮内膜症診断と相関させる工程とを含む。
【０００８】
本発明の別の実施形態では、競合的免疫アッセイは、
（ａ）Ｔｆ様抗原に結合した一定量の標識抗体と患者由来の異なる濃度の血清サンプルとのインキュベーションによって反応混合物を調製する工程と、前記標識抗体がシグナル発生系の一部であることと、
（ｂ）遊離自己抗体から結合した標識抗体を分離する工程と、
（ｃ）前記反応混合物中の標識抗体によって発生されたシグナルを測定する工程と、
（ｄ）前記患者由来の血清サンプルの添加後のシグナル強度の減少を前記患者の子宮内膜症の診断と相関させる工程とを含む。
【０００９】
本発明の別の実施形態では、競合的免疫アッセイは、
（ａ）Ｔｆ様抗原に結合した第１の抗体と患者由来の異なる濃度の血清サンプルとのインキュベーションによって反応混合物を調製する工程と、
（ｂ）前記反応混合物に一定量の第２の抗体を添加する工程であって、前記第２の抗体が前記第１の抗体の重鎖の定常領域を認識し、前記第２の抗体が標識され、シグナル発生系の一部である工程と、
（ｃ）結合抗体から遊離の標識された第２の抗体を分離する工程と、
（ｄ）前記反応混合物中の前記第２の抗体によって発生したシグナルを測定する工程と、
（ｅ）シグナル強度レベルの減少を前記患者の子宮内膜症の診断と相関させる工程とを含む。
【００１０】
抗体が標識された酵素である場合、酵素標識抗体と反応する固体支持体に基質を添加し、その後インキュベートするさらなる工程を、発生したシグナルの測定前に行う。
【００１１】
本発明のさらなる態様では、子宮内膜症の治療方法が得られる。
【００１２】
１つの実施形態では、本発明は、Ｔｆ様抗原に特異的に結合する抗体の患者への投与によって患者の子宮内膜症を治療する方法を提供する。好ましくは、抗体は、ヒト化抗体である。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、患者へのＴｆ様抗原の投与による患者の子宮内膜症の治療方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１つの実施形態では、本発明は、患者の子宮内膜症を検出するための診断方法を提供する。診断方法は、患者の血清のＴｆ様抗原との反応における自己抗体の存在を検出する免疫アッセイに基づく。Ｔｆ様抗原と結合する自己抗体の正常な血清レベルと比較した場合、Ｔｆ様抗原に結合する血清サンプル中の自己抗体レベルの上昇を、患者の子宮内膜症診断と相関させる。
【００１５】
本明細書中で使用される、用語「Ｔｆ様抗原」は、Ｔｆ抗原からなるか本質的にＴｆ抗原からなる（すなわち、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ二糖類部分）分子または化合物を含む。用語「Ｔｆ様抗原」はまた、１つまたは複数のＴｆ抗原単位（すなわち、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ二糖類部分）またはＴｆ抗原の類似体もしくは機能性誘導体を含む分子または化合物を含む。
【００１６】
「Ｔｆ抗原の類似体もしくは機能性誘導体」は、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃの二糖類部分に類似であるかこれに由来し、Ｔｆ抗原に反応性を示す自己抗体に結合する炭水化物構造または化合物を意味する。Ｔｆ抗原の誘導体の例には、シアル酸化Ｔｆ抗原（すなわち、ガラクトシル残基に結合したシアル酸残基を含むＴｆ抗原）およびガラクトシル残基の硫酸化が含まれる。
【００１７】
静脈穿刺または他の適切な手段によって患者から血液サンプルを都合よく採取することができる。血清サンプルを、周知の方法を使用して、血液サンプルから調製することができる。
【００１８】
本発明の方法で使用することができる多数の異なる型の免疫アッセイが存在する。任意の周知の免疫アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫吸着アッセイ（ＦＩＡ）、化学的結合免疫吸着アッセイ（ＣＬＩＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、および免疫ブロッティングなど）を、Ｔｆ様抗原に反応する血清サンプル中の自己抗体レベルの検出に適応することができる。使用することができる異なる免疫アッセイの概説については、「免疫アッセイハンドブック」、Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４を参照のこと。好ましくは、固相分離を使用する競合免疫アッセイまたは抗体試験用の免疫測定アッセイを使用する。「免疫アッセイハンドブック」の第２章を参照のこと。
【００１９】
典型的なアッセイでは、試薬には、患者由来の血清サンプル、検出すべき自己抗体（血清サンプル中に含まれる）、Ｔｆ様抗原、および検出可能なシグナルを得るための手段が含まれる。
【００２０】
したがって、本発明の１つの実施形態では、患者の子宮内膜症の診断方法は、抗体試験用の免疫測定アッセイを使用する。この実施形態では、Ｔｆ様抗原を、ビーズ、プレート、スライド、またはマイクロタイター皿などの固体支持体または表面に固定する。患者由来の血清サンプルのアリコートを固体支持体に添加して、液相中でＴｆ様抗原とインキュベートする。Ｔｆ様抗原と反応した血清中に存在するヒト自己抗原の定常領域を認識する抗体を添加する。この抗体は抗ヒト免疫グロブリンであり、シグナル発生系の一部でもある。ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＭの重鎖定常領域に特異的な抗ヒト免疫グロブリンを使用することができる。液相からの固体支持体の分離後、支持相を、検出可能なシグナルについて試験する。固体支持体上のシグナルの存在は、血清サンプル中に存在するＴｆ様抗原に対する自己抗体が固体支持体上のＴｆ様抗原に結合することを示す。
【００２１】
シグナル発生系は、結合および／または非結合標識の量（すなわち、Ｔｆ様抗原に結合するか結合しない標識の量）に関して検出可能なシグナルを発生する１つまたは複数の成分（そのうちの少なくとも１つは標識である）から構成される。標識は、シグナルを発生するか発生するように誘導することができる分子である。標識の例には、蛍光物質、酵素、化学発光物質、光増感物質、または懸濁性粒子が含まれる。シグナルを検出し、これを、酵素活性、発光、または光吸収の検出によって測定することができる。放射性標識を使用することもでき、放射能レベルを検出し、これを、シンチレーションカウンターを使用して測定する。
【００２２】
抗ヒト免疫グロブリンの標識に使用することができる酵素の例には、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）が含まれる。抗ヒト免疫グロブリンの標識に使用することができる蛍光物質の例には、フルオレセイン、イソチオシアン酸塩、ローダミン化合物、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、およびフルオレサミンが含まれる。化学発光物質には、例えば、イソルミノールが含まれる。
【００２３】
遊離標識抗体を結合抗体から分離し、必要に応じて、標識（例えば、酵素）が反応する適切な基質を添加してインキュベートする。
【００２４】
好ましい実施形態では、抗ヒト免疫グロブリンは、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのいずれかで標識された酵素である。
【００２５】
反応物中に存在する色、蛍光、発光、または放射能（使用したシグナル発生系に依存する）の量は、Ｔｆ様抗原と反応する患者の血清中の自己抗体の量に比例する。分光光度法を使用して、光学密度の定量を行うことができる。シンチレーション計数を使用して、放射性標識のシグナルの定量を行うことができる。
【００２６】
正常な血清レベルを超えるＴｆ様抗原と反応する自己抗体レベルの増加を、患者の子宮内膜症の診断と相関させる。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、患者の子宮内膜症の診断方法は、既知の抗体および患者の自己抗体がＴｆへの結合を競合する競合的免疫アッセイを使用する。この実施形態では、Ｔｆ様抗原に結合することが公知の一定量の公知の標識抗体を異なる濃度の患者由来の血清サンプルとインキュベートする。例えば、Ｔｆに結合することが公知のマウスモノクローナル抗体４９Ｈ．８（Ｒａｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ、１９８２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．、１２９（５）：２０２１〜４）を使用することができる。Ｔｆ様抗原に結合し、且つ競合的免疫アッセイでの抗体として使用することができる他のモノクローナル抗体には、１５５Ｈ７および１７０Ｈ８２（Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒら、１９８７、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、７８（３）：４８９〜９６）、Ａ７８−Ｇ／Ａ７（Ｋａｒｓｔｅｎら、１９９５、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１４（１）、３７〜４４）、ＨＢ−Ｔ１（ＤＡＫＯ  Ｃｏ．）、ＲＳ１−１１４およびＡＨＢ−２５Ｂ（Ｓｔｅｉｎら、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４９（１）：３２〜７）、ＨＴ８（Ｍｅｔｃａｌｆｅら、１９８４、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４９（３）、３３７〜４２）、１６１Ｈ４（Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒら、１９８７）、ＨＨ８（Ｃｌａｕｓｅｎら、１９８８）、ならびにＢＷ８３５（Ｈａｎｉｓｈら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５５（１８）：４０３６〜４０）が含まれる。上記のように、抗体を、蛍光物質、酵素、化学発光物質、光増感物質、懸濁性粒子、または放射性同位体で標識することができる。好ましくは、公知の抗体は、標識された酵素である。インキュベーション後、結合した標識抗体を、遊離の自己抗体から分離する。使用したシグナル発生系に依存して、必要に応じて、標識抗体と反応する適切な基質を添加してインキュベートする。次いで、サンプルによって発生されたシグナルを測定する。血清サンプルの添加前後または実験サンプルとコントロールサンプルとの間の光学密度または放射能の減少は、血清サンプル中の自己抗体がＴｆに結合したことを示す。実験血清サンプルと正常な患者のサンプルとを比較した場合の光学密度または放射性標識シグナルの減少を、患者の子宮内膜症診断と相関させる。
【００２８】
競合的免疫アッセイの好ましい実施形態では、２つの抗体を使用した直接的方法を使用する。第１の抗体は、標識しないこと以外は、前段落に記載のＴｆ様抗原特異的抗体である。第１の抗体を、患者由来の異なる濃度の血清サンプルとインキュベートする。次いで、一定量の第２の抗体をサンプルに添加する。第２の抗体は、第１の抗体の重鎖の定常領域を認識する。例えば、第２の抗体は、Ｔｆ様抗原と反応したマウス免疫グロブリンの重鎖の定常領域を認識する抗体であり得る（抗マウス免疫グロブリン）。第２の抗体を、上記の蛍光発色団、化学発色団、または放射性同位体で標識する。遊離の標識された第２の抗体を、結合抗体から分離する。酵素標識抗体を使用する場合、酵素標識が反応する適切な基質を添加してインキュベートする。血清サンプルの添加前後または実験サンプルとコントロールサンプルとの間の光学密度または放射能の減少は、血清サンプル中の自己抗体がＴｆに結合したことを示す。実験血清サンプルと正常な患者のサンプルとを比較した場合の光学密度または放射性標識シグナルの減少を、患者の子宮内膜症診断と相関させる。
【００２９】
周知の方法を使用して、本発明の方法で使用するために、酵素をＴｆ様抗原反応性抗体に共有結合することができる。周知の結合方法が多数存在する。例えば、グルタルアルデヒドを使用して、アルカリホスファターゼおよびホースラディシュ・ペルオキシダーゼを、抗体に結合させることができる。過ヨウ素酸法を使用して、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼを結合させることもできる。酵素結合抗体用の市販のキットが広く販売されている。酵素結合抗ヒトおよび抗マウス免疫グロブリン特異的抗体は、多数の販売業者から入手可能である。
【００３０】
ビオチン標識抗体を、酵素結合抗体の代替物質として使用することができる。このような場合、結合抗体を、市販のストレプトアビジン−ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ検出系を使用して検出する。
【００３１】
酵素標識抗体は、基質に依存して異なるシグナル供給源を産生する。シグナル発生は、反応混合物への基質の添加を含む。一般的なペルオキシダーゼ基質には、ＡＢＴＳ（登録商標）（２、２’−アジノビス（エチルベンゾチアゾリン−６−スルホナート））、ＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン）、およびＴＭＢ（３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン）が含まれる。これらの基質は、過酸化水素の存在が必要である。ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、一般的に使用されるアルカリホスファターゼ基質である。インキュベーション中、酵素は段階的に基質の割合をその最終生成物に変換する。インキュベーションの終了時に、酵素活性を停止させる停止試薬を添加する。通常、分光光度計を介した光学密度の測定によってシグナル強度を同定する。
【００３２】
アルカリホスファターゼ標識抗体を、分光光度法によって測定することもできる。したがって、本発明の免疫アッセイでは、基質４−メチルウンベレイフェリルホスフェート（４−ＵＭＰ）を使用することができる。アルカリホスファターゼが４−ＵＭＰを脱リン酸化して、４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）（蛍光発色団）を形成した。入射光は３６５ｎｍであり、放射光は４４８ｎｍである。
【００３３】
本発明の方法で使用するために、種々の供給源からＴｆ様抗原を得ることができる。例えば、Ｔｆ様抗原を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な腺癌細胞株ＬＳ１７４Ｔなどの腫瘍細胞株を培養するために使用される条件培養培地から精製することができる。伝統的な細胞癌株もまた、Ｔｆ様抗原の供給源として使用することができる。Ｔｆ様抗原を、ＭＡｂ  ４９Ｈ．８−ＣｎＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用したアフィニティクロマトグラフィによってこのような条件培養培地から精製することができる。さらなる精製のためにゲルろ過も行うことができる。Ｔｆ様抗原のなおさらなる精製を、不溶化ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）または他のレシチンを使用したレシチンアフィニティクロマトグラフィの利用によって行うことができる。Ｅ−Ｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ、ＣａｌｆｏｒｎｉａからＰＮＡを得ることができる。
【００３４】
ＩｇＡ、ヘモペキシン、およびアルファ−２−ヘーレマンス・シュミットなどのＴｆ様抗原を保有する精製血清タンパク質も抗原として使用することができる。Ｔｆ様抗原の好ましい供給源は、ウシ血清アルブミンに共有結合させた市販用に合成されたＴｆ抗原または類似体もしくは機能性誘導体である。Ｔｆ様抗原およびその糖形態は、最近、Ｄａｈｌｅｎｃｏｒｇら、１９９７、Ｉｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７０、６３〜７１に記載のＢｉｏＣａｒｂなどの販売業者から入手可能である。あるいは、Ｔｆ様抗原を、販売業者への特注によって得ることができる。
【００３５】
Ｔｆ様抗原と反応するモノクローナル抗体を容易に利用可能である。Ｒａｈｍａｎら、１９８２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２９：２０２１〜２０２４およびＬｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒら、１９８４、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、３３、１２３〜１２９によって報告されているように、ＭＡｂ４９．Ｈ（イソ型ＩｇＭ）を調製および精製することができる。本出願中のこれらの論文および他の論文の開示は、全文が記載されているかのように本明細書中で参考として援用される。
【００３６】
本発明の方法を実施するために、関連する免疫アッセイを標準化しなければならない。通常、Ｔｆ様抗原は糖タンパク質と会合しているので、本来は不均一である。このような不均一性の源には、シアル酸化が含まれる。このために、国際標準（ＩＳ）または国際基準調製（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）（ＩＲＰ）のアンプルを得るべきである。国立生物学的標準品・規制研究所（ＮＩＢＳＣ、Ｂｌａｎｃｈｅ  Ｌａｎｅ、Ｓｏｕｔｈ  Ｍｉｍｍｓ、Ｐｏｔｔｅｒｓ  Ｂａｒ、Ｈｅｒｔｓ  ＥＮ６３ＱＧ）は、このようなＴｆ様抗原のサンプルを調製し、国際単位（ＩＵ）を指定することができる。さらなる多数の標準物質が指定された値であり得る多数の二次標準物質組も調製すべきである。
【００３７】
本発明の免疫アッセイには、未知のサンプルに値または濃度を割り当てるための標準物質の使用が必要である。典型的には、未知のサンプルを使用する前に約６つの標準物質の組を使用して検量線をプロットする。未知のサンプルの濃度を、導入することによって決定する。コンピュータプログラムによって導入することが最良である。較正についての考察については、「免疫アッセイハンドブック」の第２章を参照のこと。
【００３８】
本発明のさらなる態様では、患者の子宮内膜症の治療方法を提供する。「子宮内膜症の治療」は、子宮外部位での子宮内膜細胞の増殖の予防、阻害、もしくは排除および／または子宮内膜細胞の異所性成長に関連する症状の改善を意味する。
【００３９】
１つの実施形態では、本発明の治療方法は、患者にＴｆ様抗原に特異的に結合する精製抗体を投与する工程を含む。
【００４０】
Ｔｆ様抗原に対する抗体の特異性は、例えば、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ二糖類部分またはその類似体もしくは機能性誘導体を含む１つまたは複数の分子または化合物へのその結合ならびに二糖類部分またはその類似体もしくは機能性誘導体を欠く同一の分子（単数または複数）へのその結合の欠如によって証明される。
【００４１】
本発明の治療方法での使用に適切な抗体には、Ｔｆ様抗原に特異的に結合することが公知のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体４９Ｈ．８、（Ｒａｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ、１９８２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．、１２９（５）、２０２１〜４）、１５５Ｈ７および１７０Ｈ８２（Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒら、１９８７、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、７８（３）、４８９〜９６）、Ａ７８−Ｇ／Ａ７（Ｋａｒｓｔｅｎら、１９９５、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１４（１）、３７〜４４）、ＨＢ−Ｔ１（ＤＡＫＯ  Ｃｏ．）、ＲＳ１−１１４およびＡＨＢ−２５Ｂ（Ｓｔｅｉｎら、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４９（１）：３２〜７）、ＨＴ８（Ｍｅｔｃａｌｆｅら、１９８４、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４９（３）：３３７〜４２）、１６１Ｈ４（Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒら、１９８７）、ＨＨ８（Ｃｌａｕｓｅｎら、１９８８）、ならびにＢＷ８３５（Ｈａｎｉｓｈら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（１８）：４０３６〜４０））が含まれる。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、本発明で使用される抗体は、ヒト化抗体である。「ヒト化抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の少なくとも一部を含むヌクレオチド配列によってコードされる抗体を意味する。ヒト化抗体には、ヒト免疫グロブリンの定常領域に連結したマウスｍＡｂの可変領域を含むマウス−ヒトキメラ抗体が含まれる。キメラ抗体およびこれらの産生方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５０２３号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、欧州特許出願第１７１４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、国際出願第ＷＯ８６／０１５３３号；Ｋｕｄｏら、欧州特許出願第１８４１８７号；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際公開第ＷＯ８７０２６７１号；Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、３４３９〜３４４３（１９８７）；Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２１４〜２１８（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１〜１０４３（１９８８）を参照のこと。これらの引例は、本明細書中で参考として援用される。一般に、マウスｍＡｂの抗原結合領域の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡセグメントをｍＡｂ産生ハイブリドーマ細胞からクローン化し、ヒト免疫グロブリンのＣＨおよびＣＬ領域をそれぞれコードするＤＮＡセグメントに連結させてマウス−ヒトキメラ免疫グロブリンコード遺伝子を作製することができる。ヒト化抗体を、Ｍａｅｄａら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ２：１２４〜１３４、１９９１およびＰａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８、４８９〜４９８、１９９１に記載の高次構造構築アプローチを使用して作製することもできる。あるいは、国際出願第ＷＯ２００００４６２５１号に開示のように、ヒト化ポリクローナル抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を含むトランスジェニック動物から作製することができる。
【００４３】
本発明によれば、抗体を、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて患者に投与することができる。キャリアは、液体、半固体（例えば、ペースト）、または固体のキャリアであり得る。任意の従来の媒体、薬剤、希釈剤、またはキャリアが受容者またはこれらに含まれる抗体の治療有効性に悪影響を与えない範囲で、本発明の方法の実施において使用されることが適切である。キャリアの例には、脂肪、油、水、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、および充填剤など、またはその組み合わせが含まれる。本方法で使用されるキャリアには、徐放性マトリクス（これらに混合された基質を制御放出する材料）も含まれる。このような徐放性マトリクスの例には、米国特許第４、８４９、１４１号、同第４、７７４、０９１号、同第４、７０３、１０８号、およびＢｒｅｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、７４：４４１〜４４６、１９９１（その全てが本明細書中で参考として援用される）に記載の徐放性生分解性処方物が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明によれば、Ｔｆ様抗原特異的抗体を、任意の従来の実践的様式（例えば、溶液、懸濁液、乳化、混合、カプセル化、および吸着など、必要に応じて、組み合わせた組成物のペレットまたは錠剤への成型による）においてキャリアと組み合わせることができる。このような手順は、当業者の日常的作業である。
【００４５】
治療に有効な抗体の量は、抗体の活性ならびに被験体の体重および健康状態、被験体の治療に対する応答、処方物の型、および投与経路などの他の臨床要因に依存する。当業者は、治療に有効な正確な抗体の投薬量を決定することができる。原則として、抗体の治療有効量は、約０．５μｇ〜約２ｇ／単位投薬形態の範囲であり得る。単位投薬形態は、治療単回容量として適切な物理的に個別の単位（任意の必要な薬学的キャリアと組み合わせた所望の治療効果が得られるように計算された所定量の活性材料を含む各単位）をいう。本発明の方法は、単回投与ならびに同時または長期間にわたって投与される複数回投与を意図する。
【００４６】
Ｔｆ様抗原に特異的な抗体を、経口、眼内、鼻腔内、局所、非経口注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、または筋肉内）を含む標準的経路および予め選択した組織部位への直接注射を介して投与することができる。
【００４７】
別の実施形態では、本発明の子宮内膜症の治療方法は、Ｔｆ様抗原を患者に投与する工程を含む。
【００４８】
いかなる特定の理論に拘束されることを意図しないが、注射されたＴｆ様抗原が患者の子宮内膜症に存在するＴｆ様抗原と自己抗体結合について競合し、それにより子宮内膜症を予防するか子宮内膜症に関連する症状を改善すると考えられる。
【００４９】
本発明によれば、本発明の治療法での使用に適切なＴｆ様抗原には、本発明の診断方法と関連する上記の抗原が含まれる。例えば、Ｔｆ様抗原を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な腺癌細胞株ＬＳ１７４Ｔまたは移行上皮癌株などの腫瘍細胞株を培養するために使用される条件培養培地から精製することができる。Ｔｆ様抗原を、ＭＡｂ  ４９Ｈ．８−ＣｎＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用したアフィニティクロマトグラフィによってこのような条件培養培地から精製することができる。さらなる精製のためにゲルろ過も行うことができる。Ｔｆ様抗原のなおさらなる精製を、不溶化ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）または他のレシチンを使用したレシチンアフィニティクロマトグラフィの利用によって行うことができる。
【００５０】
ＩｇＡ、ヘモペキシン、およびアルファ−２−ヘーレマンス・シュミットなどのＴｆ抗原または類似体もしくは機能性誘導体を保有する精製血清タンパク質もＴｆ様抗原として使用することができる。Ｔｆ様抗原の好ましい供給源は、ウシ血清アルブミンに共有結合させた市販用に合成されたＴｆ抗原または類似体もしくは機能性誘導体である。Ｔｆ様抗原およびその糖形態は、最近、Ｄａｈｌｅｎｂｏｒｇら、１９９７、Ｉｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７０：６３〜７１に記載のＢｉｏＣａｒｂなどの販売者から利用可能である。あるいは、Ｔｆ様抗原を、販売者への特注によって得ることができる。
【００５１】
好ましい実施形態では、複数のＴｆ抗原を含むＴｆ様抗原または類似体もしくは機能性誘導体を、患者への投与で使用する。
【００５２】
本発明によれば、Ｔｆ様抗原を、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて患者に投与することができる。適切な薬学的に許容可能なキャリアを上に記載している。
【００５３】
治療に有効なＴｆ様抗原の量は、被験体の体重および健康状態、被験体の治療に対する応答、処方物の型、および投与経路などの一定の臨床要因に依存する。当業者は、治療に有効な正確なＴｆ様抗原の投薬量を決定することができる。原則として、Ｔｆ様抗原の治療有効量は、約０．５μｇ〜約２ｇ／単位投薬形態の範囲であり得る。単位投薬形態は、治療単回容量として適切な物理的に個別の単位（任意の必要な薬学的キャリアと組み合わせた所望の治療効果が得られるように計算された所定量の活性材料を含む各単位）をいう。本発明の方法は、単回投与ならびに同時または長期間にわたって投与される複数回投与を意図する。
【００５４】
Ｔｆ様抗原を、経口、眼内、鼻腔内、局所、非経口注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、または筋肉内）を含む標準的経路および予め選択した組織部位への直接注射を介して投与することができる。
【００５５】
以下の実施例で本発明をさらに例示する。
【実施例１】
【００５６】
材料と方法
組織ホモジネートの調製
新鮮な異所性および正所性子宮内膜、腹水、および血清を、インフォームドコンセントを受けた子宮摘出患者から得た。新鮮な組織（１〜２ｇ）を、完全プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含む１０ｍｌ氷冷ＰＢＳに添加し、調製中４℃に維持した。組織を、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ、Ｌｕｃｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で１分間ホモジナイズし、その後に１３０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、Ｂｒａｎｓｏｎ２５０超音波処理機（Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）を使用して超音波処理した。組織ホモジネートを、０．２２ｍｍのフィルターで濾過し、２０℃で保存した。
【００５７】
血清の調製
末梢静脈血（６０ｍｌ）を健常なボランティアからガラス吸引管（添加物無し）に採取し、室温で４時間凝固させた。次いで、滅菌チューブに血清を取り出し、４℃、１２０００ｇで３０分間の遠心分離によって脱脂した。
【００５８】
組織自己抗原の精製
ホモジナイズ後、組織抗原をプロテインＧ  ＦＰＬＣカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に通過させてＩｇＧを除去した。次いで、プロテインＧカラムに保持されなかったタンパク質を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ  ＦＰＬＣ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にアプライした。結合したタンパク質を、同一の緩衝液での０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配およびその後に同一のサンプルでの１Ｍ  ＮａＣｌの段階的勾配を使用してカラムから溶離した。１Ｍ  ＮａＣｌ勾配の前に、目的の全タンパク質が溶離した。
【００５９】
血清自己抗原の精製
ＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＱＸＬカラムを使用した組織抗原のために上に記載した陰イオン交換クロマトグラフィによって正常な全ヒト血清からα２−ＨＳＧを精製した。この部分精製α２−ＨＳＧを、試験に示されるいくつかの実験で使用した。２０ｍＭのピペラジン緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化し、上記のＮａＣｌ勾配を使用した同一の緩衝液で溶離する第２の陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ）によってさらに精製した。ＦＰＬＣ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）でのゲル濾過後にα２−ＨＳＧの均一な最終調製物を得た。α２−ＨＳＧ濃度を、ＥＬＩＳＡでモニターした。
【００６０】
以前に（Ｙｅａｍａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、６８：２００、１９８７）記載のイオン交換クロマトグラフィおよびジャカリンアガロースアフィニティクロマトグラフィによって全血からＩｇＡ１を精製した。
【００６１】
Ｚｎ２＋イオンで帯電させたＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）をパッケージングしたカラムでの金属キレートクロマトグラフィによって、全血からトランスフェリンおよびヘモペキシンを精製した。カラムおよび血清を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で予備平衡化した。同一の緩衝液での０〜０．５Ｍイミダゾール直線勾配を使用して、亜鉛結合タンパク質を溶離した。得られたトランスフェリンおよびヘモペキシン含有画分（ウェスタンブロット分析による）を、個別にプールし、前述のようにｍｏｎｏＱ陰イオン交換カラムにてさらに精製した。このプロトコールにより、電気泳動的に純粋なヘモペキシン調製物が得られた。しかし、トランスフェリン調製物中のヘモペキシンからトランスフェリンは分離されなかった。
【００６２】
糖タンパク質上の炭水化物−エピトープの修飾
アガロース結合ノイラミニダーゼでの処理によって末端シアル酸部分を糖タンパク質から除去した。１ｍｇのタンパク質を含む０．５ｍｌの溶液を、５単位のノイラミニダーゼを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、４ｍＭの塩化カルシウム（ｐＨ５．５）と３７℃で一晩インキュベートした。４０００ｇで５分間の遠心分離によって、アガロースビーズを除去した。上清を除去し、４℃で保存した。
【００６３】
エンドグリコシダーゼＦ（ＥｎｄｏＦ）およびペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧ’ａｓｅＦ）での処理によって、中心の炭水化物基を糖タンパク質から除去した。これを、Ｇｌｙｋｏ（Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）の市販キットとして得た。２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ｖ／ｖＳＤＳ、０．５％β−メルカプトエタノールの存在下で１００℃で２分間の加熱によって、４０ｍｇのノイラミニダーゼ処理タンパク質を変性させた。ＳＤＳによるＰＮＧ’ａｓｅの阻害を回避するために、冷却後、変性サンプルに０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を添加した。次いで、変性タンパク質を、６６７脱グリコシル化単位（ＤＧＵ）のＥｎｄｏＦ／ＰＮＧ’ａｓｅＦ混合物と３７℃で１８時間インキュベートした。
【００６４】
過剰なジャカリン結合アガロースビーズ（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）での予備吸着により、サンプルからのジャカリン反応性糖タンパク質の除去を行った。サンプルをジャカリン結合アガロースと室温で３０分間インキュベートした後、４０００ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、４℃で保存した。
【００６５】
抗体および糖タンパク質
ヒツジ抗ヒトα２−ＨＳＧおよびヒツジ抗ヒトトランスフェリンの免疫グロブリン画分を、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ、ＭＥ）から入手した。ヤギ抗ヒトヘモペキシン抗血清を、Ｋｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）から入手した。ＨＲＰ結合ウサギ抗ヒツジＩｇＧおよびＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧは、共にＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から入手した。ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＡ（α鎖特異的）およびＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）を、（Ｓｉｇｍａ）から購入した。市販のα２−ＨＳＧを、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から入手した。
【００６６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０、１９７０）の方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。簡単に述べれば、同量の２×ゲルローディング緩衝液をタンパク質サンプルに添加し、５分間ボイルした。必要に応じて、還元条件下（５％ｖ／ｖβ−メルカプトエタノールを含むゲルローディング緩衝液）でタンパク質を分離した。還元タンパク質の再会合を、ボイル後のサンプルへのヨードアセトアミド（最終濃度６０ｍＭ）の添加によって防止した。４％〜１５％の勾配のゲル（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、タンパク質サンプルを分離した。タンパク質の直接的視覚化のために、０．０２％ｖ／ｖ  ＳＹＰＲＯ−Ｏｒａｎｇｅ（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含む７．５％ｖ／ｖ酢酸に３０分間ゲルを入れた。ゲルを、７．５％酢酸でリンスし、ｇｅｌ  ｉｍａｇｅｒ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）で視覚化した。
【００６７】
免疫ブロッティング
Ｂｉｏｒａｄ  ＴｒａｎｓｂｌｏｔＳＤセミドライブロッターを使用して、タンパク質をＳＤＳゲルからニトロセルロースメンブレンに移した。Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｒｅｄ染色によって、タンパク質のニトロセルロースメンブレンへの移行を確認した。メンブレンを４℃の５％ｗ／ｖ無脂肪粉乳および０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で一晩ブロックした。ブロッキング溶液に一次抗体および血清を添加し、室温で２時間インキュベートした。メンブレンを、ＰＢＳで１回あたり５分間の洗浄を６回行った。ＨＲＰ結合二次抗体を、３％ｗ／ｖ無脂肪粉乳を溶解した０．０５％ｖ／ｖｇＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで希釈した。メンブレンを、室温で２時間インキュベートし、記載のように５分間の洗浄を６回行った。次いで、タンパク質を、高感度化学発光（ＥＣＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって検出した。必要に応じて、ニトロセルロースメンブレンを切り出し、０．９％ｗ／ｖＮａＣｌで１回あたり５分間の洗浄を２回行い、その後室温の１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）で３０分間の浸透によって再探索した。次いで、メンブレンを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１回あたり５分間の洗浄を３回行った。記載のようにメンブレンをブロックし、抗体で探索した。
【００６８】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
Ｆａｌｃｏｎ  ＭｉｃｒｏｔｅｓｔＩＩＩマイクロタイタープレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｏｘｎａｒｄ、ＣＡ）のウェルに、１００ｍｌの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．２）で希釈した１０ｍｌのタンパク質を４℃で一晩コートした。次いで、プレートを、０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。ウェルを、３％ｗ／ｖＢＳＡを含むＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０（ブロッキング緩衝液）にて３７℃で１時間ブロックし、その後３回洗浄した。一次抗体または試験血清を、必要に応じてブロッキング緩衝液で希釈し、１００ｍｌを各ウェルに添加した。プレートを、３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。ＨＲＰ結合二次抗体をブロッキング緩衝液で希釈し、１００ｍｌを各ウェルに添加した。次いで、プレートを、３回洗浄した。１００ｍｌの比色分析ＨＲＰ−基質であるＡＢＴＳを各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、Ｄｙｎａｔｅｃｈプレートリーダー（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）にて４０５ｎｍで読み取った。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。
【実施例２】
【００６９】
異所性子宮内膜、正所性子宮内膜、腹水、および血清における自己抗原の同定
可溶性子宮内膜タンパク質を、材料と方法に記載のように子宮摘出組織から調製し、タンパク質Ｇクロマトグラフィに供してＩｇＧを除去した。次いで、得られた無ＩｇＧ調製物を、陽イオン交換クロマトグラフィに供した（図１Ａ）。次いで、このカラム由来の画分を、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図１Ｂ）。同一のゲル上のタンパク質バンドを、ウェスタンブロット分析用のニトロセルロースに移した。プールした子宮内膜症患者由来の血清および一次抗体供給源としてのプールした正常な雄ドナー由来の血清を使用して、ウェスタンブロットを発色させた。図１Ｃは、患者由来の増殖期の正所性子宮内膜で同定された抗原の典型的な例を示す（Ｗ１３４５）。正常な雄ドナー由来のコントロール血清で探索した同一のプローブ（示さず）と比較して、自己反応性ＩｇＧは子宮内膜症患者の血清（図１Ｃ）に限定された。
【００７０】
コントロール血清を使用したｍｏｎｏＱカラムの画分２４に対してＩｇＧγ鎖結合が検出されたが、他の画分では検出されなかった（示さず）。興味深いことに、画分２４に対する類似の反応性は、子宮内膜症血清を使用して発色させたブロットでは存在しなかった。プールした子宮内膜症血清を使用して検出された反応性タンパク質の分子量は、他の研究者（６、１０）によって記述されたものと十分に相関している。プールした子宮内膜症血清で探索したウェスタンブロットにおいて、全部で１０本の自己反応性バンドが検出された。ＩｇＡ鎖特異的およびＩｇＧ鎖特異的二次抗体を使用して、画分２３で７２ｋＤａのバンドが検出された（図１Ｃおよび１Ｄ）。このバンドは、その分子量およびＭｏｎｏＱカラムから溶離されたＮａＣｌ濃度に基づいて、最初にトランスフェリンと同定された（この測定点でのトランスフェリンの溶離を、ヒツジ抗トランスフェリン抗体を使用したウェスタンブロット分析によって確認した（示さず））。ＩｇＧのｇ鎖特異的抗体を使用してこの画分中に５４ｋＤａのタンパク質が検出されたが、抗ＩｇＡのａ鎖特異的抗体では検出されなかった。部分的に脱シアル酸化されたａ２−ＨＳＧと同一の位置にこのタンパク質が溶離する（データ示さず）。ａ２−ＨＳＧは、以前に、子宮内膜症タンパク質において自己抗原として同定されている（Ｐｉｌｌａｉｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、３５：４８３、１９９６）。画分２６および２９で認められた５９ｋＤａのＩｇＧ反応性バンドは、ＩｇＡのα鎖であり、これらの溶離条件下で、溶離点はそれぞれ単量体および二量体ＩｇＡの公知の溶離点に対応する。このタンパク質のＩｇＡのα鎖との同一性を、ブロットの切り出しおよび抗α鎖得的抗体での再探索によって確認した（示さず）。このブロットはまた、画分２３（トランスフェリン含有画分）中に抗α鎖反応性バンドの存在を示した。この画分中のＩｇＡ抗原の存在は、他の血清タンパク質と共有結合によって複合体化したＩｇＡから得られる可能性が最も高い（Ｓｔｒｕｔｈｅｒｓら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ、４８：３０、１９８９；Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、７９：３２８、１９９０）。画分２６はまた、７２ｋＤａの反応性バンドを含み、画分２８および画分２９は６９ｋＤａのバンドを含んでいた。これらの後ろのバンドは、ａ鎖特異的ブロットに対する活性を示さなかった。ＩｇＡのα鎖を認識する子宮内膜症患者のＩｇＧ抗体の存在を、高度に精製した血清ＩａＡ１を使用したウェスタンブロットによって確認した（図７を参照のこと）。対照的に、ＩｇＡのα鎖を含むこれらの画分以外の子宮内膜抗原に対するＩｇＡ自己抗体は認められなかった。
【００７１】
同一の患者由来の卵巣異所性子宮内膜サンプル（ｗ１３４５）は、分子量５４、４７、４３、および３４ｋＤａの自己抗原性タンパク質を有していた（示さず）。ヒツジ抗α２−ＨＳＧ特異的抗体を使用して発色させたウェスタンブロットによって同定したところ、５４ｋＤａのタンパク質はα２−ＨＳＧであった。α２−ＨＳＧはまた、ウェスタンブロットによって異なる患者由来の腹腔洗浄液中でも検出された。５４ｋＤａの抗原に加えて、１８６、１２６、６８、４３、３７、および３４ｋＤａの抗原が腹水中に存在した（図２）。プールした患者の血清および各血清の両方で、２つの分子量マーカーとの反応性が認められた（図１Ｃおよび図３を参照のこと）。これらのマーカーは、２０５ｋＤａのミオシンおよび４２ｋａの炭酸脱水酵素ＩＩであった。プールした雄コントロール血清およびいくつかの各雄血清の両方においてミオシンバンドとの反応性も認められた。対照的に、脱水酵素ＩＩとの反応性は、子宮内膜症血清に特異的であり、このタンパク質は、他の研究者によって、子宮内膜症における自己抗原として報告されている（Ｄ’Ｃｒｕｚら、Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ、６６、５４７、１９９６；Ｋｉｅｃｈｌｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ、１０１：６１１、１９９４）。
【００７２】
まとめると、正所性および異所性子宮内膜ならびに腹腔洗浄液由来の調製物中の自己抗原が同定された。以前に公開された報告と一致して、α２−ＨＳＧ、トランスフェリン、および炭酸脱水酵素ＩＩは、子宮内膜症患者由来の血清によって認識される自己抗原である。さらに、本明細書中で得られた結果もまた、ＩｇＡのα鎖もまた同一の血清によって認識される自己抗原であることを証明する。これらのタンパク質がタンパク質レベルで有意な相同性を示さないので、共通のペプチドエピトープは４つ全てのタンパク質で共有されている可能性が低い。しかし、４つのタンパク質のうちの３つ（α２−ＨＳＧ、ＩｇＡ１のα鎖、およびおそらく炭酸脱水酵素ＩＩ）は、共通の炭水化物エピトープを共有している。このＯ結合炭水化物構造は、バラミツ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）レシチンジャカリンによって認識されるＧａｌβ１−３ＮＡｃＧａｌエピトープを含む。本明細書中で示された結果は、α２−ＨＳＧおよび炭酸脱水素酵素は、子宮内膜症血清中に存在する自己抗体によって認識される自己抗原に共通することを報告する。本発明の研究により、これらの結果がＩｇＡ１およびヘモペキシンもまた子宮内膜症患者由来の血清によって認識される自己抗原であることを示すように拡大される。
【実施例３】
【００７３】
ジャカリン予備吸着により自己抗原結合が除去される
子宮内膜症自己抗体応答におけるジャカリン反応性炭水化物についての潜在的役割を調査するためのモデル抗原として、α２−ヘーレマンス・シュミット糖タンパク質（α２−ＨＳＧ）を選択した。業者から購入したα２−ＨＳＧを使用した最初の実験により、不満足であることが証明された。これは、これらの調製物中に存在する糖形態の変動性による。ほとんどシアル酸化された糖タンパク質と同様に、α２−ＨＳＧは保存中に末端シアル酸残基を損失する。正常なヒト血清由来の完全にシアル酸化されたα２−ＨＳＧを新たに調製した。この炭水化物含有量に関する調製物の偏りを回避するために、レシチンベースの親和性精製プロトコールを回避し、代わりに陰イオン交換クロマトグラフィとゲル濾過クロマトグラフィとの組み合わせを使用した。ｐＨ８．０でのＭｏｎｏＱカラムおよびその後のｐＨ５．０での第２のＭｏｎｏＱカラムによる陰イオン交換ならびにｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムでの最後のゲル濾過工程からなる３工程の手順により、分子量５８ｋＤａのα２−ＨＳＧの完全にシアル酸化された糖形態が精製された。
【００７４】
第１の陰イオン交換カラム由来の部分精製α２−ＨＳＧ画分を使用して実験を行った場合、ジャカリンアガロースとの予備インキュベーション後に、ウェスタンブロットでの子宮内膜症血清との自己反応性は消滅した（図３）。ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に１４本のタンパク質バンドが認められた（図３ａ）。５つのタンパク質で子宮内膜症血清との反応性が認められた（図３ｂ）。反応性タンパク質のおおよその分子量は、２３０、１８８、１６８、１２０、および５８ｋＤａであった（５８ｋＤａはα２−ＨＳＧである）。これら全５バンドの子宮内膜症血清中のＩｇＧによる結合は、ジャカリンアガロースとのインキュベーション後に消滅し（図３ｄ）、これは、自己抗体の結合は、α２−ＨＳＧに対してだけでなく画分中に存在する全ジャカリン結合タンパク質に対してであることを示す。予備吸着および吸着後の画分１３のゲルのタンパク質染色は、活性の除去は画分中のタンパク質の非特異的除去に起因しないことを示す。吸着および非吸着タンパク質の濃度を、ウェスタンブロッティングのために使用されるゲルへの全タンパク質ローディングが均一となるように調整した。
【００７５】
ジャカリンによって認識される炭水化物構造は非常に特異的であり、その結合はＴｆの存在に依存する。ジャカリンは、いくつかのＯ結合少糖類内に存在する二糖類Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃを認識する。多数の血漿タンパク質のうちの非常に限られた数の血漿タンパク質がＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃを発現する。これらのタンパク質には、ＩｇＡ１、ＩｇＤ、Ｃ１インヒビター、ヘモペキシン、プラスミノーゲン、α１−抗トリプシン、α２−マクログロブリン、８Ｓ−α３糖タンパク質、絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、およびα２−ＨＳＧ（１５）が含まれる。ｈＣＧに関して、ｈＣＧの受容体もまたＴｆ様抗原を発現し、随伴性子宮内膜症を罹患しているか罹患していない不妊症の親で見出された自己抗体が受容体に結合することが目的である（Ｍｏｎｃａｙｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、８４：１８５７、１９８９）。
【実施例４】
【００７６】
炭水化物の除去により自己抗体結合が消滅する
ジャカリンによる自己抗体によって認識されるタンパク質の除去自体では、共通の炭水化物エピトープが関与するかどうかは同定されない。炭水化物が子宮内膜症の自己抗体によるα２−ＨＳＧの認識に不可欠であるかどうかを同定するために、脱グリコシル化α２−ＨＳＧとの反応性を調査した。２工程の手順においてα２−ＨＳＧ炭水化物を除去した。第１に、ノイラミニダーゼを使用して、末端シアル酸を切断した。第２に、さらなるＥｎｄｏＦ／ＰＮＧ’ａｓｅ消化工程を使用して、炭水化物を完全に除去した。未処理、ノイラミニダーゼ処理、および脱グリコシル化α２−ＨＳＧを、同量のタンパク質ロードでのウェスタンブロット分析に供した（図４）。ヒツジ抗α２−ＨＳＧとの反応性によって示されるように、分子量の減少によってシアル酸および全炭水化物の除去を確認した（図４のレーンＡ〜Ｃ）。
【００７７】
二重免疫拡散法により、ヒツジ抗α２−ＨＳＧ抗体はペプチドに反応性を示し、他のジャカリン結合タンパク質に反応性を示さない（データ示さず）。ノイラミニダーゼでの末端シアル酸の除去により、患者の血清との反応性が減少した（図４のレーンＤおよびＥ）。この画分中に残存する反応性は、非消化α２−ＨＳＧと同一の分子量であり、自己抗体結合が末端シアル酸の存在に依存することを示す。ノイラミニダーゼ処理およびその後のＥｎｄｏＦ／ＰＮＧ’ａｓｅ消化による炭水化物の完全な除去により、反応性が完全に消滅した（図４のレーンＦ）。部分精製α２−ＨＳＧ画分の類似の処理により、５つ全てｌの反応性タンパク質への結合が減少するので、ノイラミニダーゼ後の自己抗体結合のこの減少はα２−ＨＳＧに制限されなかった（図３ｃ）。
【表１】
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【００７８】
これらの結果は、（トランスフェリン以外は）α２−ＨＳＧ、炭酸脱水素酵素、ヘモペキシン、およびＩｇＡ１のα鎖上の共通の炭水化物エピトープが認識されることを示す（本発明および公開された研究で同定された抗原ならびにそのジャカリン反応性については表１を参照のこと）。全ての同定された抗原（トランスフェリンおよび炭酸脱水酵素ＩＩ以外）はレシチンジャカリンに結合することおよび抗原由来の炭水化物の除去により子宮内膜症血清のこれらの抗原に結合する能力が除去されることに基づいて、この結論に到達した。
【実施例５】
【００７９】
自己抗体のウシフェチュインへの結合
ウシフェチュイン（ヒトα２−ＨＳＧのホモログ）は、ヒトα２−ＨＳＧと同一のジャカリン結合炭水化物部分を保有する。ヒトＳＧペプチドに対して惹起したヒツジ抗血清はウシフェチュインとの交差反応性を示さず、これにより、高い配列相同性にもかかわらず２つの種間に有意な抗原性の相違が示唆される。子宮内膜症患者由来の血清は、ウシフェチュインを使用したＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットによって正の反応性を示す（図５）。−ＨＳＧと対照的に、フェチュインのノイラミニダーゼ処理により、ＥＬＩＳＡでの自己抗体反応性がわずかに減少した（図５）。しかし、フェチュインのより完全な脱シアル酸化または完全な脱グリコシル化により抗体結合が消滅し、これにより、子宮内膜症患者における自己抗体応答は炭水化物依存性であるという証拠がさらに得られる（示さず）。不完全なノイラミニダーゼ処理後のフェチュインへの結合の増加は、ウシフェチュインがそのヒト対照物よりも高くシアル酸化されることに起因し得る。
【実施例６】
【００８０】
自己抗体結合のＤ−ガラクトース依存性
ジャカリン結合は、Ｇａｌβ１−３ＮａｃＧａｌ部分の存在に依存する。自己抗体応答はこのエピトープに関与し、ジャカリン結合の場合と同様に、結合はＤ−ガラクトースによって完全に阻害されるはずである。ウェスタンブロットでのα２−ＨＳＧへの子宮内膜症ＩｇＧの結合は、０．８ＭのＤ−ガラクトースの存在下で完全に消滅し、これは、Ｄ−ガラクトースが自己抗体によって認識されるエピトープの一部を形成し得ることを示す（示さず）。
【実施例７】
【００８１】
子宮内膜症血清によって認識される血清自己抗原は共通のエピトープを有する
共通の炭水化物エピトープは上記で同定された異なる抗原との自己反応性で説明されるので、自己抗体結合は過剰の異なる抗原の存在下で遮断されるはずである。これにより、以下の事項が証明された：１０倍過剰の高度に精製されたα２−ＨＳＧまたはウシフェチュインにより炭酸脱水酵素ＩＩおよび７２ｋＤａ抗原への自己抗体の結合が阻害された（図６）。
【００８２】
ヘモペキシンはトランスフェリンよりもむしろ子宮内膜症における７２ｋＤａの自己抗原なのであろうか。これまでに記載した抗原のうち、トランスフェリン以外は、ジャカリンによって認識されるＯ結合炭水化物を発現する。このような炭水化物構造はトランスフェリン上では発現されず、ジャカリンはトランスフェリンに結合しない（Ｋａｂｉｒ、Ｓ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１２：１９３、１９９８）。これにより３つの可能性が得られる：ジャカリン炭水化物応答と異なる抗トランスフェリン応答が子宮内膜症血清中に存在するか、トランスフェリンで除去される反応性がトランスフェリン調製物中の夾雑物に対するものであるか、あるいはその両方であるか。約７０ｋＤａの２つの反応性タンパク質が、正所性子宮内膜の陰イオン交換画分（Ｗ１３４５）で見出された。一方は、塩勾配初期にトランスフェリンと同一の画分に溶離された。他方のタンパク質は、より高い塩濃度でＩｇＡと同一の画分に溶離された。Ｓｗｉｓｓ２Ｄデータベース試験は、類似の分子量および等電点のジャカリン結合タンパク質にはヘモペキシンが含まれることを示す。ヘモペキシンがＺｎ２＋金属キレートクロマトグラフィおよび陰イオン交換クロマトグラフィによって精製される場合、均一な調製物が得られる。ヘモペキシン特異的抗体を含む画分のウェスタンブロッティングによって同一性を確認した。子宮内膜症患者の血清に対して試験した場合、このタンパク質は自己抗原として認識された（図７）。トランスフェリンに特異的な抗体を使用した同一のタンパク質のウェスタンブロット分析では、精製ヘモペキシンに対する反応性は認められなかった。同一のカラム由来の画分をトランスフェリン反応性について調査した場合、陰イオン交換カラム由来のより早いピークはトランスフェリンを含むことが見出された。抗ヘモペキシンを使用したトランスフェリン含有画分のウェスタンブロット分析により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にトランスフェリンに類似の移動度でヘモペキシンの存在が明らかとなった。二重免疫拡散法では、ピークトランスフェリン画分に対して抗ヘモペキシンおよび抗トランスフェリンが沈殿する場合には同一性を示すラインは認められず、これは、抗血清が抗原特異的であることを示す（示さず）。このトランスフェリン調製物中のジャカリン結合活性を、ジャカリンに対する二重免疫拡散法における沈降素の存在によって確認した（示さず）。トランスフェリンで同時除去される抗原の性質を同定するためのさらなる実験は現在進行中であるが、α２−ＨＳＧ調製物の添加によって７２ｋＤａの結合活性を阻害することが目的である。
【実施例８】
【００８３】
ヌードマウス子宮内膜症モデル：実験手順
動物
６週齢の卵巣摘出した胸腺欠損ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に、エストロゲンペレットを皮下移植した。各マウスの臀部の皮下に１７β−エストラジオールを６０日で放出する１つの１．５ｍｇのペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、カタログ番号ＳＥ−１２１）を無菌的に投与した。皮膚をはさみで切り取って持ち上げ、ペレットをピンセットで挿入し、傷口をステンレススチール製の外科用クリップで縫合した。マウスを、実験を通して無菌条件にてヴァンダービルト医療センター動物実験施設（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）に維持し、全手順を無菌的に行った。
【００８４】
ヒト子宮内膜組織移植片の調製および治療
子宮内膜生検によって月経周期の増殖中期中のドナーからヒト子宮内膜組織を得た。組織を、直ちにハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１７５〜０９５）で洗浄して過剰な血液を除去し、０．５〜１．０ｍｍ片に切断した。ウェルあたり１０〜１２片を、９６ウェル滅菌組織培養プレートのウェルに移した。ＨＢＳＳを除去し、以下の移植片培地と交換した：１％抗生物質／抗カビ溶液（ＳｉｇｍａＡ−４６６８）、１０ｎＭエストロゲン（０．１％の１０−５エストロゲンを含む１０：１エタノール／ＤＭＳＯ）、１％ＩＴＳ＋（インスリン−トランスフェリン−セレン−Ｘ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号５１５００〜０５６）、および０．１％ＥＸ−ＣＹＴＥ  ＶＬＥ成長増強培地サプリメント（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉｎｃ．、カタログ番号８１−１２９−１）を含むダルベッコ改変イーグル培地栄養混合物Ｆ−１２Ｈａｍ（ＳｉｇｍａＤ−２９０６）。１μｇの試験物質を含む１０μｌのＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水）または１μｇのコントロール基質を含む１０μｌのＤＰＢＳ、または１０μｌのＤＰＢＳのみのいずれかの添加によってウェルを処理した。組織外植片を、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベート後、マウスに注射した。
【００８５】
マウスにおけるヒト病変の皮下形成
処理された外植片を、メトキシフルラン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈカタログ番号ＮＤＣ００６１−５０３８−０１）麻酔マウスの腹部中央領域に皮下注射した。ツベルクリンシリンジ（１ｍｌ）に、１０個の外植片を含む１００μｌのＤＰＢＳを充填した。次いで、各マウスに１０個の外植片を含む１００μｌ（全体積）のＤＰＢＳを１８１／２標準規格注射針によって注射した。
【００８６】
病変含有マウスの処置
各マウスの腹部領域に、最初にこのマウスに注射した移植片の処置のために使用したものと同一の物質（すなわち、試験物質、コントロール物質、またはＤＰＢＳのいずれか）を含む１００μｌのＤＰＢＳを毎日皮下注射した。各１００μｌの１日量は、１０μｇの試験物質もしくは１０μｇのコントロール物質を含んでいるか、物質を含んでいないＤＰＢＳからなった。腹部の四分円をローテーションさせる注射を右下から開始した。
【００８７】
屠殺および病変の調査
１０日後、マウスを麻酔し、頚部脱臼によって屠殺した。ヒト子宮内膜組織移植片によって形成された皮下病変を調査するために、腹部の皮膚を除去した。各病変の脈管化のサイズおよび程度を記録し、写真撮影し、さらなる研究のために摘出した。各被験体マウスのエストロゲン化（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）の相対的な程度の指標として子宮のサイズを記録した。
【実施例９】
【００８８】
ヌードマウス移植モデルにおけるＴＦエピトープに対するモノクローナル抗体による子宮内膜病変発症の予防
ＴＦエピトープを認識する抗体の治癒的価値を、実施例８に記載のヌードマウス移植モデルを使用して評価した。この実験では、月経周期の増殖期の正常な女性の子宮から得た子宮内膜フラグメントを一晩培養し、その後、ＩｇＭ抗ＴＦ抗体（クローンＡ７８−Ｇ／Ａ７、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ；２０μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ−ＤＦ１２培地）またはマウスＩｇＭκイソ型コントロール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で皮下注射した（マウス４匹／群；１０病変／マウス）。ヒト子宮内膜フラグメントの皮下注射の少なくとも２４時間前に、卵巣摘出した８〜１２週齢の胸腺欠損ヌードマウスにエストラジオールペレットを移植した。ヒト子宮内膜フラグメントの注射後、マウスに抗ＴＦまたはイソ型コントロール抗体（１０μｇ／１００μｌ）を毎日注射した。ヒト子宮内膜フラグメント注射の１０日後、マウスを屠殺し、固定および視覚化した病変数を評価した。
【００８９】
図８に示すように、抗Ｔ抗体処理により、イソ型コントロール処置と比較して、病変数が統計的に有意に減少した（ｐ＜０．０４、スチューデントｔ検定）。図１０に示すように、コントロールＩｇＭ抗体で処理したマウスは十分に脈管化した病変が認められ（パネルＣ）、ＴＦ抗体処置マウスで認められた少数の病変はよりサイズおよび脈管化が小さかった（パネルＤ）。
【実施例１０】
【００９０】
ヌードマウス移植モデルにおける高分子ＴＦによる子宮内膜病変発症の予防
ＴＦ抗原の治癒的価値を、実施例８に記載のヌードマウス移植モデルを使用して評価した。この実験では、月経周期の増殖期の正常な女性の子宮から得た子宮内膜フラグメントを一晩培養し、その後、高分子ＴＦ抗原（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα−ＰＡＡ、Ｇｌｙｃｏｔｅｃ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ；１００μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ−ＤＦ１２倍値）またはコントロール高分子炭水化物（Ｇａｌα１−６Ｇｌｃβ−ＰＡＡ、Ｇｌｙｃｏｔｅｃ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ；１００μｇ／ｍｌ）の存在下で皮下注射した（マウス４匹／群；１０病変／マウス）。ヒト子宮内膜フラグメントの皮下注射の少なくとも２４時間前に、卵巣摘出した８〜１２週齢の胸腺欠損ヌードマウスにエストラジオールペレットを移植した。ヒト子宮内膜フラグメントの注射後、マウスに高分子ＴＦ抗原またはコントロール高分子抗原（１５μｇ／５０μｌ）を毎日注射した。ヒト子宮内膜フラグメント注射の１０日後、マウスを屠殺し、固定および視覚化した病変数を評価した。
【００９１】
図９に示すように、ＴＦ抗原処置により、コントロール炭水化物処置と比較して、病変数が統計的に有意に減少した（ｐ＜０．０４、スチューデントｔ検定）。図１０に示すように、高分子コントロール抗原で処置したマウスで十分に脈管化した病変が認められ（パネルＡ）、高分子ＴＦ抗原で処置したマウスでは病変は認められなかった（パネルＢ）。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１Ａは、子宮内膜症患者由来のホモジナイズした正所性子宮内膜のＭｏｎｏＱ陰イオン交換クロマトグラフィを示す溶離プロフィールを示す図である。ホモジネートをプロテインＧカラムに通してＩｇＧを除去後、ＭｏｎｏＱカラムにロードした。塩勾配開始前の最初のピークは、複数の１ｍｌのホモジネートロードを示す。溶離条件：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）。同一の緩衝液を使用した０〜０．５ＮａＣｌの直線勾配（１Ｍ  ＮａＣｌにする）で溶離を行い、これを破線で示す。ゲルローディングに対応する画分（図１Ｂ〜Ｄ）を、グラフ上部に示す。図１Ｂは、還元条件下で泳動し、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅで染色した、図１Ａで示した選択カラム画分の５〜１５％勾配ゲルを示す図である。図１Ｃは、プールした子宮内膜症血清中に存在するＩｇＧによって認識されるホモジネート画分中のタンパク質を示すオートラジオグラフを示す図である。プールした正常な雄血清を使用した同一のブロットのストリッピングおよび再探索では同一のバンドとの反応は認められなかった。コントロール血清を使用して画分２４でＩｇＧ結合活性が検出されたが、子宮内膜症血清では類似の結合は認められなかった。４５．２ｋＤａの分子量マーカーである炭酸脱水素酵素ＩＩをそれぞれ示す。この同一の反応はコントロール血清では認められなかった。図１Ｄは、子宮内膜症血清のＩｇＡ結合活性を示すオートラジオグラフを示す図である。一次血清の非存在下での抗ＩｇＡａ鎖特異的抗体を使用したブロットの探索により、これらの画分中にＩｇＡが存在することが示された。
【図２】還元条件下およびアルキル化条件下で５〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した腹水（Ｗ１５１７）のウェスタンブロットを示す図である。次いで、ウェスタンブロットを、ヒツジ抗ヒトα２−ＨＳＧおよびその後のＨＲＰ−ヤギ抗ヒツジ（レーンａ）または１００倍希釈の子宮内膜症領域およびその後のＨＲＰ−ヤギＩｇＧγ鎖特異的抗体（１０００倍希釈）とインキュベートした。レーンａにα２−ＨＳＧおよびレーンｂに等しい分子量のバンドが明らかに認められた。
【図３】図３ａは、α２−ＨＳＧの部分精製画分（ＭｏｎｏＱカラム、ｐＨ８．０）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ染色後に１４本のタンパク質バンドが認められた。図３ｂは、α２−ＨＳＧの部分精製画分および子宮内膜症血清をＨＲＰヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で探索したゲル泳動のウェスタンブロットを示す図である。５本のタンパク質バンドが検出された。図３ｃは、電気泳動前にタンパク質画分をノイラミニダーゼで処理したこと以外は図３ｂで記載のウェスタンブロットを示す図である。全タンパク質への抗体結合が明確に減少している。図３ｄは、電気泳動前にα２−ＨＳＧ画分をジャカリンアガロースでの予備吸着に供したこと以外は図３ｂに記載のウェスタンブロットを示す図である。全抗体結合が除去されている。図３ｅは、分子量マーカー中のミオシンおよび炭酸脱水素酵素ＩＩとの自己反応性を示す図である。
【図４】α２−ＨＳＧの脱グリコシル化によって自己抗体結合が消滅することを示すα２−ＨＳＧの部分精製画分および子宮内膜症血清をＨＲＰヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で探索したゲル泳動のウェスタンブロットを示す図である。ノイラミニダーゼを使用して、末端シアル酸を切断した（レーンＢ、Ｅ、Ｈ）。次いで、ＥｎｄｏＦ／ＰＮＧ’ａｓｅ消化を使用して炭水化物を完全に除去した（レーンＣ、Ｆ、Ｈ）。ヤギ抗α２−ＨＳＧとの反応性によって示される分子量の減少によって、シアル酸および全炭水化物の除去を確認した（レーンＡ〜Ｃ）。レーンＡ、Ｄ、およびＧは未処理であった。ノイラミニダーゼでの末端シアル酸除去により、タンパク質血清との反応性が減少した（レーンＥに対するＤ）。この画分に残存する反応性は、非消化α２−ＨＳＧと同一の分子量であり、これは、自己抗体結合は末端シラン酸の存在に依存することを示す。ノイラミニダーゼ処理およびその後のＥｎｄｏＦ／ＰＮＧ’ａｓｅ消化による炭水化物の完全な除去により、完全に反応性が排除された（レーンＦ）。プールした雄コントロール血清を使用して、等価な反応性は認められなかった（レーンＧ〜Ｉ）。
【図５】図５Ａは、ウシフェチュインの脱シアル酸化によって子宮内膜症血清との反応性が増加することを示す図である。ＥＬＩＳＡによって測定したところ、ノイラミニダーゼでの処理後にわずかであるが有意な結合の増加が認められる。図５Ｂは、ノイラミニダーゼ処理後のフェチュイン分子量の減少を示すＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ染色ゲルを示す図である。レーンＡは未処理であり、レーンＢはノイラミニダーゼ処理である。
【図６】α２−ＨＳＧの存在下で７２ｋＤａの抗原および炭酸脱水素酵素ＩＩへの結合が阻害されることを示すグラフおよびオートラジオグラフィである。
【図７】還元およびアルキル化条件下で泳動された５〜１５％勾配のゲルからニトロセルロースへの移行後の精製タンパク質のウェスタンブロット分析を示す図である。精製ヘモペキシン（レーンＡ）、α２−ＨＳＧ（レーンＢ）、および血清ＩｇＡ１（レーンＣ）は、子宮内膜症血清中のＩｇＧ抗体によって認識される自己抗原である。
【図８】ヌードマウスにおける病変数に対する抗Ｔ抗体処置の効果を示す図である。
【図９】ヌードマウスにおける病変数に対するＴｆ抗原処置の効果を示す図である。
【図１０】抗ＴＦ抗体およびＴＦ抗原での処置の結果としての脈管化の阻害を示す図である。パネルＡ、高分子コントロール抗原処置理したマウス；パネルＢ、高分子ＴＦ抗原で処置したマウス；パネルＣ、コントロールＩｇＭ抗体で処置したマウス；パネルＤ、ＴＦ抗体で処置したマウス。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【外国語明細書】
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