(57)【要約】【課題】抗原物質と混合後投与すると、体内における抗原に対する抗体価が抗原物質のみ投与する場合より上昇する、ワクチンあるいは免疫療法に有用なアジュバント活性物質を提供する。【解決手段】メチルセルロースからなる熱可逆性ゲル溶液を有効成分に含むアジュバント。メチルセルロース及びポリエチレングリコールからなる可逆性熱ゲル溶液を有効成分に含むアジュバント。メチルセルロースの粘度が１２０００ｍＰａ・ｓ以下である上記アジュバント。ポリエチレングリコールの重量平均分子量は３００−５０，０００である上記アジュバント。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチルセルロースからなる熱可逆性ゲル溶液を有効成分に含むアジュバント。
【請求項２】
メチルセルロースおよびポリエチレングリコールからなる熱可逆性ゲル溶液を有効成分に含むアジュバント。
【請求項３】
メチルセルロースが、２Ｗ／Ｖ％水溶液の場合２０℃における粘度が１２０００ｍＰａ・ｓ以下のメチルセルロースである請求項１及び２記載のアジュバント。
【請求項４】
ポリエチレングリコールの重量平均分子量は３００−５０，０００である請求項１〜３記載のアジュバント。
【請求項５】
メチルセルロースの濃度は０．２−８（ｗ／ｖ）％の範囲内で、ポリエチレングリコールの量は、０．５−１３（ｗ／ｖ）％の範囲内で適宜組合わせることによって組成物のゲル化温度は室温またはそれ以下では液体であり哺乳類では体温（２０℃から４０℃）でゲル化する請求項１〜４記載のアジュバント。
【請求項６】
請求項１〜５記載のアジュバントに、更に抗原を含有させたワクチン製剤。
【請求項７】
抗原が細菌、ウィルス、真菌、原虫ならびに他の微生物に由来するものである請求項６記載のワクチン製剤。
【請求項８】
抗原が破傷風トキソイドである請求項６記載のワクチン製剤。
【請求項９】
注射、経鼻あるいは経口によって投与される請求項６記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ワクチン組成物用の新規アジュバント、すなわちメチルセルロース及び／又はポリエチレングリコールを有効成分とする熱可逆性アジュバント組成物およびこのアジュバントを用いるワクチン製剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
免疫現象には、骨髄に由来するＢ細胞が主として関与する体液性免疫と胸腺に由来するＴ細胞が関与する細胞性免疫がある。更にこれら免疫反応にはマクロファージの関与も知られている。
【０００３】
ウイルスや細菌等の微生物に対する防御手段としてワクチンがある。ワクチンは人あるいは動物にそれら病原微生物由来の抗原等、あるいは近縁の微生物を投与して生体にあらかじめ微生物に対する免疫を付与する事で微生物の感染を防御したり発症を阻止する目的で用いる。
【０００４】
ワクチンには不活化ワクチンと弱毒生ワクチンがある。不活化ワクチンの副作用を減ずるためには抗原の精製が重要である。しかし、高度な精製をした抗原はしばしば免疫原性が低くなり、十分な免疫を生体に惹起できない場合がある。また、複雑な精製過程はワクチンを高価なものにする。
【０００５】
このような時はワクチンにアジュバンドを添加して投与すると有効である。優れたアジュバンドは、ワクチンの有効性を高めるだけでなく、必要な抗原量を削減することが可能となり製造コストの軽減にも役立つ。
【０００６】
アジュバントの代表として、アルミニウム化合物（水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム又はリン酸アルミニウム）があるが金属の残留毒性が懸念されるほか、品質が変化し易い欠点を有している。
【０００７】
その他のアジュバンドとして、多様性を有するリポソーム又はエマルジョンがある。フロイントのアジュバントはミネラルオイル、マンニトールエステルおよび死滅したミコバクテリウムの混合物から作製する。等しい割合でフロイントのアジュバントと抗原と混合したワクチンは実験室の研究用に世界中で広く使用されている。しかしながら、このワクチンは油中水（Ｗ／Ｏ）エマルジョンの形態であるため極めて粘性が高く注射が困難である。また、長時間の放置はエマルジョンの形態が保てなくなる。
【０００８】
更に細菌トキシンなどの応用も進んでいるが、上記アジュバンと同様に、接種すると投与部位に浮腫、腫脹、硬結、壊死が生じる。このように従来のアジュバントには毒性が出現する場合があり使用に注意が必要である。
【０００９】
最近の報告に、親水性と疎水性を適宜調整した界面活性剤がアジュバントとして適当であるとの記載がある（特開２００１−１５１６９７）。また、単糖あるいは２糖類とミコール酸との糖エステルがアジュバント作用物質であることが記載されている（特開２００２−１７９５７４）。しかしながら、これらアジュバントはフロイントのアジュバントに使用されている物から改良されたものであり、違う観点からのアジュバントの開発も望まれる。
【００１０】
これらの上記アジュバントは抗原等を徐々に放出することが考えられ、同様に徐放性を有する新規の製剤からの開発が望まれる。
メチルセルロース水溶液は加熱によりゲル化し、冷却によってゾル状態に戻り、このゾルーゲル変換は可逆的であることはよく知られている。メチルセルロース水溶液のゲル化は、視覚的には溶液から粘弾性体への変化として観察され、ゲルの外観は白色ゼリー状を呈し、相分離や沈殿を生じない。
【００１１】
特許２７２９８５９号にはメチルセルロース及びポリエチレングリコール等の組み合わせよりなる製剤のゲル化温度をヒト体温付近（４０℃以下）に低下させることが記載されている。この製剤の特徴として、投与前は液体であるため投与が容易であり、投与後体温でゲル化し（熱可逆性ゲル）投与部位における薬物の滯留性が向上する。
特願２００２−５１７０７０には２ｗ／ｖ％水溶液の２０℃における粘度が１２ｍＰａ・ｓ以下であるメチルセルロース、を使用した同様の熱可逆性ゲルの記載がある。
しかしながら、これら熱可逆性ゲルがアジュバント活性を有することはどこにも記載されていない。
【００１２】
【特許文献１】
特開２００１−１５１６９７
【特許文献２】
特開２００２−１７９５７４
【特許文献３】
特許第２７２９８５９
【特許文献４】
特願２００２−５１７０７０
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、製造が比較的容易で、ワクチン抗原液と混合するだけの簡便な操作でワクチン製剤を作成でき、しかも抗原特異的抗体価を上昇させる効果を発揮し、かつそれ自身の抗体を惹起しにくいアジュバンドを提供する事にある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明のアジュバントはメチルセルロース及び／又はポリエチレングリコールからなることを特徴としている。実際にワクチン組成物として使用するときはメチルセルロースとポリエチレングリコールの溶液と抗原を溶解あるいは懸濁することにより容易に作製することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるメチルセルロースは市販されているものを、適宜使用することができる。例えば粘度で表せば、２％Ｗ／Ｖ水溶液の２０℃における粘度が１２０００ｍＰａ・ｓ（ミリパスカル秒）以下であればよく、好ましくは１２０ｍＰａ・ｓ以下であるものがより好ましい。いずれのメチルセルロースでも単独または混合して使用することができ、ポリエチレングリコールとの組み合わせにおいてゲル化する範囲のものであればよい。
【００１６】
本発明に用いられるポリエチレングリコールも市販されているものを適宜使用すればよい。重量平均分子量は３００−５０，０００が好ましいが、浸透圧、粘度から４００−２０，０００がより好ましい。なお、２種類以上のポリエチレングリコールを混合して重量平均分子量を上記の好適な範囲内に調整できる。重量平均分子量が３００より低い場合にはゲル化しにくく、重量平均分子量が５０，０００より高いと液体状態での粘度が高くなり好ましくない。
メチルセルロースの濃度はポリエチレングルコールの量（０．２−８（ｗ／ｖ）％の範囲内）に従い適宜決定することができる。またポリエチレングリコールの量は、０．５−１３（ｗ／ｖ）％の範囲内でメチルセルロースの量との関係で決定することができる。また組成物のゲル化温度は室温またはそれ以下では液体であり哺乳類では体温でゲル化することが必要であり、約２０℃から約４０℃であることが望ましいが、望ましくは約３０℃から約４０℃、より好ましくは約３５℃から約４０℃が望ましい。
ゲル化温度を調整するためクエン酸のような多価カルボン酸、乳酸、アミノ酸またはグルコン酸を加えることができる。多価カルボン酸には酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸あるいはマレイン酸等をあげることができる。アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アラニン、セリン、プロリン、メチオニン、タウリン、グリシン等があげられる。またこれら酸の適当な混合物でもよい。
【００１７】
このようなメチルセルロースとポリエチレングリコールからなる水溶液はアジュバントとしてそのまま、あるいは適当な溶媒で希釈でき、賦形剤と混合することにより用いることができる。その後は、抗原水溶液あるいは懸濁液と混合でき、抗原を吸着したアルミニウムのような不溶物と混合することもできる。製剤として液剤、リポゾーム、乳濁剤あるいは生理食塩水を用いた懸濁剤が考えられる。
【００１８】
このようにして得られたワクチン製剤は抗原特異的又は非特異的に免疫担当細胞に作用する。
また、本発明のワクチン製剤は一日一回から数回に分けて適用することができるが、ワクチン製剤の投与量は使用目的、症状に応じて適宜増減できるのは言うまでもない。
【００１９】
本発明のアジュバントは公知のアジュバントの１つ以上と同時に使用することができる。当業者ならば公知の方法を用いる試行実験により、好適な組み合わせを見い出すことができる。アジュバントと抗原は物理的混合物や抗原蛋白との化学的結合物とすることができる。また、リポソームなどのキャリアーにワクチン抗原とともに内包させることも可能である。混合比率は  ワクチンの種類に応じて好適な比率を決定して用いる。その結果、望ましい免疫反応を増強したり、望ましくない副反応を低下させたり、抗原の量を低下させたり、もう一方のアジュバントの量を低下させたりすることができる。
【００２０】
上記アジュバントならびにワクチン抗原、さらに保存剤や安定剤を組み合わせて製剤することにより、本発明によるアジュバントに基づいて、新規なワクチン製剤が提供される。
公知の安定剤としては、好ましくは０．２％程度のゲラチンやデキストラン、０．１−１．０％のグルタミン酸ナトリウム、あるいは約５％の乳糖や約２％のソルビトールなどが用いられる。公知の防腐剤としては、０．０１％程度のチメロサールや０．５％程度のフェノキシエタノールなどが好ましい。安定剤や保存剤を使用しなくても良い場合のあることは当然である。
ワクチンの調製は厳密に無菌的に行なわれる。ワクチン抗原、アジュバント、安定剤、保存剤、溶剤及びその他のワクチン成分をそれぞれ無菌的に調製する。ワクチン作用以外に必要のないパイロジェンやアレルゲンとなるような夾雑蛋白質は可能な限り除去しておくことが望まれる。当業者にとって、その為に必要な方法は公知である。
【００２１】
本発明のワクチン製剤は、狭義及び広義の意味を含む。すなわち、１）ヒト及び動物に感染するウイルス、細菌、真菌、原虫並びにその他の微生物に有効な狭義のワクチンを含む。その一部を例示すれば、百日せきワクチン、精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン、及びヘモフィルスインフルエンザワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、ロタワクチン、経口ポリオワクチン、不活化ポリオワクチン、麻しんワクチン、風しんワクチン、おたふくかぜワクチン、麻しん風しんおたふくかぜ三種混合ワクチン及び麻しん風しん二種混合ワクチン等の各種ワクチンが挙げられる。さらには、結核ワクチン、多剤耐性黄色ブドウ状球菌（ＭＲＳＡ）ワクチン、ヘリコバクター・ピロリワクチン、出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）ワクチン、サルモネラワクチン、クラミジアワクチン、マイコプラズマワクチン、エイズワクチン、マラリアワクチン、コクシジウムワクチンあるいは住血吸虫ワクチンを含む。２）さらに広義のワクチンとして、がんワクチン、不妊ワクチン、胃潰瘍ワクチン、糖尿病ワクチン及び動脈硬化症ワクチンなど非感染症の予防や治療に有効なワクチンを含む。
【００２２】
これらのワクチンは製造方法により分類される種々のワクチンを含む。すなわち、弱毒生ワクチン、不活化ワクチン、コンポーネントワクチン、ＤＮＡに基づくワクチンなどを含む。ＤＮＡに基づくワクチンの中には、プラスミドなどのキャリヤーに組み込んだＤＮＡ断片を含むワクチンのほか、リボザイムやアンチセンスオリゴヌクレオチドなどを併用するワクチンが含まれる。これらのワクチンは、治療用でも予防用でも良い。また、ワクチンの効果にとって有効な抗原成分を遺伝子操作技術により組み換え生物細胞に生産させたものを用いる組み換えワクチンも含まれる。
【００２３】
ワクチンは液状または粉末状で提供される。これら本発明のワクチンに含まれる熱可逆性ゲルの効果を十分に発揮させるには液状の方が鼻腔内投与（鼻腔内スプレー、滴下、塗布など）や注射の場合に適している場合が多い。粉末スプレー方式も使用可能である。
【００２４】
本発明によるワクチンの接種方法は公知のどの方法も使用できる。
接種量はマウスの場合、鼻腔内で５μＬ〜５０μＬ、ヒトの場合は鼻腔内投与、注射いずれの場合も０．１〜１．０ｍＬが好適である。これらの量は適宜変更し得る。また、次に例示するワクチンは、効果の点で、あるいは、接種操作の点で、経口接種あるいは経鼻接種が強く要望されている例をふくむ：インフルエンザワクチン、百日せきワクチン、ジフテリアワクチン、ロタワクチン、麻しんワクチン、風しんワクチン、おたふくかぜワクチン、ヘリコバクター・ピロリワクチン、出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）ワクチン、クラミジアワクチン、マイコプラズマワクチン、コクシジウムワクチン、エイズワクチン、マラリアワクチン、および住血吸虫ワクチン。
【００２５】
これらのワクチンは、単独で接種される場合もあるし、百日せき・ジフテリア・破傷風三種混合ワクチン、あるいは、麻疹・風疹・二種混合ワクチンのように、複数のワクチンを混合して、同時に接種する方法を採用することもできる。
【００２６】
【実施例】
［試験例１］メチルセルロースおよびポリエチレングリコールの破傷風トキソイドに対するアジュバント効果Ｉ
１）投与試料の調整：
▲１▼メチルセルロースおよびポリエチレングリコール溶液の作製
ｉ）溶液１：メチルセルロース（信越化学工業製、メトローズ（登録商標：ＳＭ−４）４７ｇ、、マクロゴール４０００（日本油脂製）５２ｇ、クエン酸ナトリウム３９ｇを水に溶解し、塩酸でｐＨを６．５とした後、更に水を加えて１０００ｍＬとした。
ｉｉ）溶液２：特許文献  特許第２７２９８５９に従った。メチルセルロース（信越化学工業製、メトローズ（登録商標）：ＳＭ−１５と信越化学工業製、メトローズ（登録商標）：ＳＭ−４００を１：１の割合で混合したもの）１８．２ｇとマクロゴール４０００  ２６ｇ、クエン酸ナトリウム  ４５．５ｇを水に溶解し、塩酸ｐＨを７．０とした後、更に水を加えて１０００ｍＬとした。
【００２７】
▲２▼抗原の調整
破傷風トキソイド（Ｂ）及び沈降破傷風トキソイド（Ａ）（破傷風トキソイド「北研」社団法人北里研究所製）を使用した。
▲３▼投与試料の調整
ｉ）溶液１または溶液２と破傷風トキソイド（Ｂ）をそれぞれ４：１の容量で混合したものを用いた（それぞれ（Ｃ）または（Ｄ））。
ｉｉ）沈降破傷風トキソイド（Ａ）はｉ）の破傷風トキソイド（Ｂ）と同等の力価になるように調整し使用した。
【００２８】
▲４▼投与試料
【表１】
2004262847.tif 000002
【００２９】
２）動物：ｄｄｙマウス  ４週齢  雌を使用した
３）免疫方法
各試料をマウス大腿部、皮下に０．５ｍＬの一回投与により免疫した。
４）抗体価測定
免疫４週後に眼底より採血し、採血した血液中の破傷風抗体価を抗体測定キット（破傷風抗体価キット「化血研」財団法人化学及血清療法研究所製）で測定した。
【００３０】
５）毒素攻撃
採血日の翌日に免疫と同様に０．５ｍＬの１００ＬＤ５０（５０％致死量の１００倍量）０．５ｍＬの破傷風毒素を接種し、１週間（１，３，７日目）観察し、発症の程度、未発症を以下に従いスコアで表現した。
2004262847.tif 000003
【００３１】
６）判定
抗体価と、毒素攻撃試験の結果より効果を判定した。
【００３２】
７）結果
▲１▼破傷風抗体価に及ぼす影響
【表２】
2004262847.tif 000004
【００３３】
▲２▼破傷風毒素攻撃に及ぼす影響
【表３】
2004262847.tif 000005
【００３４】
［試験例２］メチルセルロースおよびポリエチレングリコールの破傷風トキソイドに対するアジュバント効果
１）投与試料の調整：
▲１▼メチルセルロースおよびポリエチレングリコール溶液の作製
ｉ）溶液１：メチルセルロース（信越化学工業製、メトローズ（登録商標：ＳＭ−４））２．２５ｇ、マクロゴール４０００  ３．０ｇ、グリシン  ０．８ｇおよびＮａＣｌ  ０．５５ｇを水に溶解し、ＮａＯＨでｐＨを７．０とした後、更に水を加えて１００ｍＬとした。
ｉｉ）溶液２：メチルセルロース（信越化学工業製、メトローズ（登録商標：ＳＭ−４））３．０ｇ、マクロゴール４０００  ３．０ｇ、グリシン  ０．８ｇおよびＮａＣｌ  ０．５５ｇを水に溶解し、ＮａＯＨでｐＨを７．０とした後、更に水を加えて１００ｍＬとした。
【００３５】
▲２▼抗原の調整
破傷風トキソイド（Ｂ）及び沈降破傷風トキソイド（Ａ）は北里研究所製を使用した。
▲３▼投与試料の調整
ｉ）上記溶液１及び２にそれぞれ破傷風トキソイド（Ｂ）を４：１の容量で混合したものを用いた（それぞれ（Ｃ）または（Ｄ））。
ｉｉ）沈降破傷風トキソイド（Ａ）はｉ）の破傷風トキソイド（Ｂ）と同等の力価になるように調整し使用した。
【００３６】
▲４▼投与試料
【表４】
2004262847.tif 000006
【００３７】
２）動物：ｄｄｙマウス  ４週齢  雌を使用した
３）免疫方法
各試料をマウス大腿部、内測皮下に０．５ｍＬの一回投与により免疫した。
４）抗体価測定
免疫４週後に眼底より採血し、採血した血液中の破傷風抗体価を抗体測定キット（破傷風抗体価キット「化血研」財団法人化学及血清療法研究所製）で測定した。
【００３８】
６）判定
抗体価の結果より判定した。
【００３９】
７）結果
破傷風抗対価に及ぼす影響
【表５】
2004262847.tif 000007
【００４０】
【発明の効果】
表２、３および５に示すように破傷風トキソイドに対するメチルセルロース及びポリエチレングリコールのアジュバント効果が確認された。