(57)【要約】　　　（修正有）【課題】アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング等の提供。【解決手段】複数の配列で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩およびｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号：１、配列番号：１７、配列番号：１９または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが、
（１）配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、または
（２）配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列中の連続する６〜２０個のアミノ酸からなるペプチドまたはその塩である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが、
（１）ａ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列、ｂ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）これらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、または
（２）ａ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目、第１番目〜２１番目、もしくは第５番目〜２１番目のアミノ酸配列、ｂ）該アミノ酸配列中の１〜６個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）該アミノ酸配列に１〜６個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）該アミノ酸配列中の１〜６個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、ｅ）またはこれらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなり、アミノ酸の数が６〜２０個であるペプチド（ただし、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目、第１番目〜２１番目または第５番目〜２１番目のアミノ酸配列からなるペプチドを除く）またはその塩である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが、
（１）配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、または
（２）配列番号：６で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目、第１番目〜２１番目、もしくは第５番目〜２１番目のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
（１）配列番号：１、配列番号：１７、配列番号：１９または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項６】
請求項１記載のスクリーニング方法または請求項５記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩と配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩。
【請求項７】
アゴニストである請求項６記載の化合物。
【請求項８】
アンタゴニストである請求項６記載の化合物。
【請求項９】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩と配列番号：１、配列番号：１７、配列番号：１９または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１０】
請求項７記載のアゴニストを含有してなる神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療剤。
【請求項１１】
アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療剤である請求項１０記載の予防・治療剤。
【請求項１２】
請求項７記載のアゴニストを含有してなる細胞死抑制剤。
【請求項１３】
（１）配列番号：１、配列番号：１７、配列番号：１９または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩と該レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項１４】
哺乳動物に対して、請求項７記載のアゴニストの有効量を投与することを特徴とする（ｉ）神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療方法、（ｉｉ）アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療方法または（ｉｉｉ）細胞死抑制方法。
【請求項１５】
（ｉ）神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療剤、（ｉｉ）アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療剤または（ｉｉｉ）細胞死抑制剤を製造するための請求項７記載のアゴニストの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２）とを用いるアゴニスト・アンタゴニストのスクリーニング方法などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプター蛋白質のうち多くは共役しているｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また、７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質あるいは７回膜貫通型レセプター蛋白質（７ＴＭＲ）と総称される。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レセプターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質、特にはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
【０００３】
例えば、生体の種々の器官では、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、それぞれに対応するレセプター蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。生体内には未知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、それらのレセプター蛋白質の構造に関しても、これまで報告されていないものが多い。さらに、既知のレセプター蛋白質においてもサブタイプが存在するかどうかについても分かっていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、医薬品開発に非常に重要な手段である。また、レセプター蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現しているレセプター蛋白質の遺伝子の機能を解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。
近年、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、このようにして得られたｃＤＮＡの断片配列がＥｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ（ＥＳＴ）としてデータベースに登録され、公開されている。しかし、多くのＥＳＴは配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
オーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の１つとして、ヒトＦＰＲＬ１が知られている（非特許文献１）。ＦＰＲＬ１のアゴニストとしては、これまでにバクテリア由来のｆＭＬＦ、ＨＩＶ由来のｇｐ４１あるいはｇｐ１２０の部分ペプチド、プリオンの部分ペプチド、内因性の物質としてはＡβ４２、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｉの部分ペプチド、Ａｃｕｔｅ　ｐｈａｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｈＣＡＰ１８、ＮＡＤＨ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅなどの部分ペプチド、脂質であるリポキシンＡ４などが報告されている（非特許文献２）。
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）は進行性痴呆および認知能力の失調を伴う神経変性疾患の代表的なものであるが、これまでに効果的な治療法は見出されていない。アルツハイマー病は高齢化社会を迎えつつある現在において最も重要な疾患の一つであることは言うまでもなくその治療薬の開発は医療経済的にも極めて大きな意義を有する。
最近、橋本らは、アルツハイマー病患者の後頭葉に病変が少ないことに着目して「デス・トラップ」法（Ｌ．　Ｄ’Ａｄａｍｉｏら、Ｓｅｍｉｎ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻、１７−２３頁、１９９７年）により家族性アルツハイマー病の原因遺伝子を導入した神経細胞の細胞死を抑制する遺伝子を後頭葉よりクローニングした（非特許文献３）。この遺伝子は、ｈｕｍａｎｉｎ（特許文献１）と名付けられた２４残基からなるペプチドをコードしており、合成ｈｕｍａｎｉｎペプチドは、家族性アルツハイマー病遺伝子を導入した神経細胞死を抑制したのみならず、アルツハイマー病の原因である可能性があると考えられているβアミロイド添加によって誘導される神経細胞死をも抑制した。ｈｕｍａｎｉｎは細胞外に分泌され、神経細胞に作用して細胞死を抑制するものと考えられているが、その受容体は明らかにされていなかった。
Ａβ４２がＦＰＲＬ１のアゴニストであり、ＦＰＲＬ１を介して走化性を示すこと、および、アルツハイマー病の特徴病変である老人班にＦＰＲＬ１が集積していることが報告されている。これらのことより、ＦＰＲＬ１とアルツハイマー病で見られる炎症反応との関連性が示唆されている（非特許文献４）。
Ａβ４２がＦＰＲＬ１を介してマクロファージ細胞内に取り込まれることにより、繊維素凝集（アミロイド様沈着）を形成することも報告されている（非特許文献５）。
さらに、オーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の１つとして、ヒトＦＰＲＬ２が知られている（非特許文献６）。
ヒトＦＰＲＬ２とｆＭＬＦ（ｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）のレセプターであるＦＰＲ１との相同性が大きいが、ヒトＦＰＲＬ２はｆＭＬＦと反応しないことが報告されている。また、ＦＰＲＬ２は単球に発現が認められたが、ＦＰＲ１およびＦＰＲＬ１の発現が認められた好中球には発現が認められなかったことが報告されている（非特許文献７）。
Ｗ−Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−ＮＨ２）がＦＰＲＬ１およびＦＰＲＬ２のアゴニストであり、ＦＰＲＬ２が単球で高発現していることが報告されている（非特許文献８）。
ヘリコバクターピロリ由来ペプチドＨｐ（２−２０）がＦＰＲＬ２のアゴニストであり、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を介して単球を活性化することが報告されている（非特許文献９）。
抗原提示細胞の一種である樹状細胞（成熟型、未成熟型）に機能を保持したＦＰＲＬ２が発現しており、樹状細胞のｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ（輸送）を制御しているのではないかと報告されている。（非特許文献１０）。
ラット型ｈｕｍａｎｉｎが神経保護活性を有することが記載されている（非特許文献１１）。
【０００４】
【特許文献１】
ＷＯ　０１／２１７８７
【非特許文献１】
Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６７（１１），　７６３７−７６４３（１９９２）
【非特許文献２】
Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．　２巻、１−１３頁、２００２年
【非特許文献３】
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、９８巻、６３３６−６３４１頁、２００１年
【非特許文献４】
Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，　２００１，　Ｖｏｌ．２１　ＲＣ１２３
【非特許文献５】
Ｔｈｅ　ＦＡＳＥＢ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　Ｖｏｌ．１５　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２００１，　２４５４−２４６２
【非特許文献６】
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１３　（２），　４３７−４４０　（１９９２）
【非特許文献７】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１９９４　Ｍａｙ　３０；２０１（１）：１７４−９
【非特許文献８】
Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６（２４），　２１５８５−２１５９３（２００１）
【非特許文献９】
Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　２００１　Ｏｃｔ；１０８（８）：１２２１−８
【非特許文献１０】
Ｊ．　Ｌｅｕｋｏｃ．　Ｂｉｏｌ．，　２００２　Ｓｅｐ；７２（３）：５９８−６０７
【非特許文献１１】
Ｔｈｅ　ＦＡＳＥＢ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　Ｖｏｌ．１６，　Ａｕｇｕｓｔ　２００２，　１３３１−１３３３
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来、Ｇ蛋白質共役型レセプターと生理活性物質（すなわち、リガンド）との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質（すなわち、リガンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、これらレセプターの特異的なアンタゴニストまたはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。従って、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の特異的リガンドを決定することは、医薬品開発の標的ともなりうるアゴニスト、アンタゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。
しかし、現時点でもなお、機能未知のＧ蛋白質共役型レセプター、また対応するリガンドが同定されていない、いわゆるオーファンレセプターが多数存在しており、Ｇ蛋白質共役型レセプターのリガンド探索および機能解明が切望されている。
Ｇ蛋白質共役型レセプターは、そのシグナル伝達作用を指標とする、新たな生理活性物質（すなわち、リガンド）の探索、また、該レセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストの探索に有用である。これら該レセプターに対するリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、Ｇ蛋白質共役型レセプターの機能不全や機能亢進に関連する疾患の予防・治療薬や診断薬として活用することが期待できる。
さらにまた、Ｇ蛋白質共役型レセプターの遺伝子変異に基づく、生体での該レセプターの機能の低下または昂進が、何らかの疾患の原因となっている場合も多い。この場合には、該レセプターに対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、該レセプター遺伝子の生体内（またはある特定の臓器）への導入や、該レセプター遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、遺伝子治療に応用することもできる。この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子上の欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、該レセプターの遺伝子は、該レセプターの機能不全に関与する疾患の予防・治療薬や診断薬に応用することもできる。
本発明は、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法もしくはスクリーニングキットを用いて得られうるｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩、およびｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）を含有してなる医薬などを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、新規なｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩がＦＰＲＬ１のリガンドであることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
〔１〕（１）配列番号：１（ヒトＦＰＲＬ１）、配列番号：１７（ラットＦＰＲＬ１）、配列番号：１９（マウスＦＰＲＬ２）または配列番号：２１（ヒトＦＰＲＬ２）で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２〕ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが、
（１）配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、または
（２）配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列中の連続する６〜２０個のアミノ酸からなるペプチドまたはその塩である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔３〕ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが、
（１）ａ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列、ｂ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）これらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、または
（２）ａ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目、第１番目〜２１番目、もしくは第５番目〜２１番目のアミノ酸配列、ｂ）該アミノ酸配列中の１〜６個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）該アミノ酸配列に１〜６個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）該アミノ酸配列中の１〜６個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、ｅ）またはこれらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなり、アミノ酸の数が６〜２０個であるペプチド（ただし、配列番号：１１または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目、第１番目〜２１番目または第５番目〜２１番目のアミノ酸配列からなるペプチドを除く）またはその塩である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４〕ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが、
（１）配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、または
（２）配列番号：６で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目、第１番目〜２１番目、もしくは第５番目〜２１番目のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５〕（１）配列番号：１、配列番号：１７、配列番号：１９または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔６〕上記〔１〕記載のスクリーニング方法または上記〔５〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩と配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩、
〔７〕アゴニストである上記〔６〕記載の化合物、
〔８〕アンタゴニストである上記〔６〕記載の化合物、
〔９〕ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩と配列番号：１、配列番号：１７、配列番号：１９または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬、
〔１０〕上記〔７〕記載のアゴニストを含有してなる神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療剤、
〔１１〕アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療剤である上記〔１０〕記載の予防・治療剤、
〔１２〕上記〔７〕記載のアゴニストを含有してなる細胞死抑制剤、
〔１３〕（１）配列番号：１、配列番号：１７、配列番号：１９または配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩と該レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
〔１４〕哺乳動物に対して、上記〔７〕記載のアゴニストの有効量を投与することを特徴とする（ｉ）神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療方法、（ｉｉ）アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療方法または（ｉｉｉ）細胞死抑制方法、および
〔１５〕（ｉ）神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療剤、（ｉｉ）アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療剤または（ｉｉｉ）細胞死抑制剤を製造するための上記〔７〕記載のアゴニストの使用を提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、
〔１６〕（ｉ）配列番号：１、配列番号：１７、配列番号：１９または配列番号：２１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（以下、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２と略記する）、その部分ペプチドまたはその塩と、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩とを接触させた場合と、（ｉｉ）ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩と、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩および試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔１７〕（ｉ）標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩および試験化合物をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩のＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔１８〕（ｉ）標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩および試験化合物をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩の該細胞に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔１９〕（ｉ）標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩および試験化合物をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩の該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔２０〕（ｉ）標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩を、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩および試験化合物を当該形質転換体の細胞膜に発現したＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩のＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔２１〕（ｉ）ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩および試験化合物をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合における、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔２２〕ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩を、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２に接触させた場合と、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩および試験化合物を当該形質転換体の細胞膜に発現したＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２に接触させた場合における、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔２３〕ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を活性化する化合物がｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドである上記〔２１〕または〔２２〕記載のスクリーニング方法、
〔２４〕ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞またはその膜画分を含有することを特徴とする上記〔５〕記載のスクリーニング用キット、および
〔２５〕ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有することを特徴とする上記〔５〕記載のスクリーニング用キット等を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明で使用されるＦＰＲＬ１は、配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質である。
本発明で使用されるＦＰＲＬ２は、配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質である。
ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２は、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、腸管、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、特に、脾臓、骨髄、腸管、単球、マクロファージなどの免疫担当臓器と免疫担当細胞に由来する蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよい。
【００１０】
配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列からなるＦＰＲＬ１と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列からなるＦＰＲＬ２と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
また、ＦＰＲＬ１としては、ａ）配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
ＦＰＲＬ２としては、ａ）配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
【００１１】
本明細書におけるＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するＦＰＲＬ１をはじめとするＦＰＲＬ１は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明のＦＰＲＬ１の具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ＦＰＲＬ１、配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列からなるラット由来ＦＰＲＬ１、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列からなるマウス由来ＦＰＲＬ２などが用いられる。このヒト由来ＦＰＲＬ１は、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６７（１１），　７６３７−７６４３（１９９２）に記載されている公知の蛋白質である。マウス由来ＦＰＲＬ２は、Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１６９，　３３６３−３３６９　（２００２）に記載されている公知の蛋白質である。
本発明のＦＰＲＬ２の具体例としては、例えば、配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ＦＰＲＬ２などが用いられる。このヒト由来ＦＰＲＬ２は、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１３　（２），　４３７−４４０　（１９９２）に記載されている公知の蛋白質である。
【００１２】
ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと略記する場合がある）としては、上記したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を有するＦＰＲＬ１の部分ペプチドまたは配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列を有するＦＰＲＬ２の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレセプター蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。ここで、「実質的に同質のレセプター活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
【００１３】
また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のＦＰＲＬ１、ＦＰＲＬ２またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１４】
本発明のＦＰＲＬ１またはその塩は、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のレセプター蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載する本発明のＦＰＲＬ１をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載する蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１５】
本発明のＦＰＲＬ１もしくはその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１６】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
【００１７】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１８】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１９】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質とを製造し、この両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質を得ることができる。この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることができる。
蛋白質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質のアミド体と同様にして、所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。
【００２０】
本発明のＦＰＲＬ１の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のＦＰＲＬ１を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のＦＰＲＬ１を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下のａ）〜ｅ）に記載された方法が挙げられる。
ａ）Ｍ．　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ　および　Ｍ．Ａ．　Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド　シンセシス　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６６年）
ｂ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ　ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ），　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６５年）
ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、　丸善（株）　（１９７５年）
ｄ）矢島治明　および榊原俊平、生化学実験講座　１、　蛋白質の化学ＩＶ、　２０５、（１９７７年）
ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発　第１４巻　ペプチド合成　広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明のＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩も上記と同様の方法で製造することができる。
【００２１】
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のｍＲＮＡを定量することができる。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明のＦＰＲＬ１をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：１８または配列番号：２０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列からなるＦＰＲＬ１と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２、配列番号：１８または配列番号：２０で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：１８または配列番号：２０で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明のＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列からなるＦＰＲＬ２と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２２で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２２で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＲＬ１をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列からなるラットＦＰＲＬ１をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列からなるマウスＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２０で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
【００２３】
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、ＦＰＲＬ１遺伝子またはＦＰＲＬ２遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、ＦＰＲＬ１遺伝子またはＦＰＲＬ２遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいはＦＰＲＬ１関連ＲＮＡまたはＦＰＲＬ２関連ＲＮＡとの相互作用を介してＦＰＲＬ１遺伝子またはＦＰＲＬ２遺伝子の発現を調節・制御することができる。ＦＰＲＬ１関連ＲＮＡまたはＦＰＲＬ２関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およびＦＰＲＬ１関連ＲＮＡまたはＦＰＲＬ２関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外でＦＰＲＬ１遺伝子またはＦＰＲＬ２遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。ＦＰＲＬ１遺伝子またはＦＰＲＬ２遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、ＦＰＲＬ１遺伝子またはＦＰＲＬ２遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００２４】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えばＪ．　Ｋａｗａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ　Ｔｅｃｈ　Ｊａｐａｎ，　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．２４７，　１９９２；　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．３９５，　１９９２；　Ｓ．　Ｔ．　Ｃｒｏｏｋｅ　ｅｔ　ａｌ．　ｅｄ．，　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９３　などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった粗水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００２５】
本発明のＦＰＲＬ１の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した本発明のＦＰＲＬ１の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明のＦＰＲＬ１の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２、配列番号：１８または配列番号：２０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：２、配列番号：１８または配列番号：２０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１、配列番号：１７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列からなるＦＰＲＬ１と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：１８または配列番号：２０で表わされる塩基配列ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：１８または配列番号：２０で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明のＦＰＲＬ２の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：２２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列からなるＦＰＲＬ２と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２２で表わされる塩基配列ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２２で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００２６】
本発明のＦＰＲＬ１またはその部分ペプチド（以下、ＦＰＲＬ１と略記する場合がある）または本発明のＦＰＲＬ２またはその部分ペプチド（以下、ＦＰＲＬ２と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２７】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））などを用いて、ＯＤＡ−ＬＡ　ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００２８】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２９】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプター蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００３０】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス　ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア　パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。
【００３１】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ　ＦｉｖｅＴＭ　細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ　ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，　Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ），１３，　２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００３２】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３３】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル　アクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，　Ｋ．　Ｌ．　ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，　Ｇ．　Ａ．　ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００３４】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，　Ｔ．Ｃ．Ｃ．，　ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），　１９５，　７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ　１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を生成せしめることができる。
【００３５】
上記培養物から本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３６】
かくして得られるＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を、精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の活性は、標識したリガンド（ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド）との結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００３７】
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のリガンドはｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその塩である。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとしては、配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（以下、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと略記する）などが用いられる。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドは、ヒトや非ヒト温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞等）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、唾液腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、軟骨、関節、骨格筋等に由来するポリペプチドであってもよく、組換えポリペプチドであってもよく、合成ポリペプチドであってもよい。
【００３８】
「実質的に同一」とはｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの活性、例えば、細胞死抑制作用（例、各種疾患に伴う細胞死に対する抑制作用）、細胞生存維持作用、または神経変性疾患、癌、免疫疾患、感染症、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の予防・治療活性（作用）など、生理的な特性などが、実質的に同じことを意味する。アミノ酸の置換、欠失、付加あるいは挿入が、ポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化をもたらさない限り、当該置換、欠失、付加あるいは挿入を施されたポリペプチドは、当該置換、欠失、付加あるいは挿入のされていないものと実質的に同一である。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するところのクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができる。
非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどがあげられる。極性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどがあげられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどがあげられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００３９】
配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、該アミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと実質的に同一の活性（性質）を有する限り、特に限定されるものではなく、例えば配列番号：６で表されるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
上記の実質的に同質の活性（性質）としては、例えば、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含有するｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの有する細胞死抑制作用（例、各種疾患に伴う細胞死に対する抑制作用）、細胞生存維持作用、または神経変性疾患、癌、免疫疾患、感染症、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の予防・治療活性（作用）などが定性的に同質であることを示す。
また、配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとしてより具体的には、例えば、ａ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜６個程度、より好ましくは１〜３個程度、さらに好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜６個程度、より好ましくは１〜３個程度、さらに好ましくは１または２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５個程度、より好ましくは１〜３個程度、さらに好ましくは１または２個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなるポリペプチドなども含まれるが、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは含まれない。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、特に限定されない。
具体的には、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとしては、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列からなるポリぺプチドなどが用いられる。
【００４０】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドは、上記したポリペプチドの部分ペプチドであってもよい。ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの部分ペプチドとしては、前記したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと実質的に同質の活性（「実質的に同質の活性」は上記と同意義を示す）ものなどが好ましく用いられる。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの部分ペプチドとしてより具体的には、前記した配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドなどが挙げられ、好ましくは前記した配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列中の連続する６〜２０個程度、好ましくは６〜１５個程度、より好ましくは６〜１０個程度のアミノ酸配列からなる部分ペプチドなどが用いられる。
「実質的に同一」とは、上記のｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの説明における「実質的に同一」と同意義を示す。
また、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの部分ペプチドとしてより具体的には、例えば、ａ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の６〜２０個程度、好ましくは６〜１５個程度、より好ましくは６〜１０個程度のアミノ酸配列からなるペプチド、またはｂ）該アミノ酸配列中の１または２個以上（例、１〜６個程度、好ましくは１〜３個程度、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）該アミノ酸配列に１または２個以上（例、１〜６個程度、好ましくは１〜３個程度、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）該アミノ酸配列中の１または２個以上（例、１〜６個程度、好ましくは１〜３個程度、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）それらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなる部分ペプチドなども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、特に限定されない。ただし、上記の置換に関しては、配列番号：６で表されるアミノ酸配列の第３、１２、１４、１５、１６または２４番目のアミノ酸の置換は含まれない。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの部分ペプチドの具体例として、例えば、ａ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目、第１番目〜２１番目、または第５番目〜２１番目のアミノ酸配列、またはｂ）該アミノ酸配列中の１または２個以上（例、１〜６個程度、好ましくは１〜３個程度、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）該アミノ酸配列に１または２個以上（例、１〜６個程度、好ましくは１〜３個程度、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）該アミノ酸配列中の１または２個以上（例、１〜６個程度、好ましくは１〜３個程度、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）それらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなり、アミノ酸の数が６〜２０個程度、好ましくは６〜１５個程度、より好ましくは６〜１０個程度である部分ペプチドなどが挙げられる。ただし、上記の置換に関しては、配列番号：６で表されるアミノ酸配列の第３、１２、１４、１５、１６または２４番目のアミノ酸の置換は含まれない。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの部分ペプチドのより好ましい具体例として、例えば、配列番号：６で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目（配列番号：９）、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目、第１番目〜２１番目、または第５番目〜２１番目のアミノ酸配列からなるペプチドなどが挙げられる。
【００４１】
また、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその部分ペプチドには、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
さらに、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドは、それぞれ単量体の他に、２量体、３量体、４量体などとして存在していてもよく、具体的には、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド同士で２量体を形成する場合、本発明の部分ペプチド同士で２量体を形成する場合、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明の部分ペプチドとで２量体を形成する場合などが挙げられる。
さらに、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその部分ペプチド（以下、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと略記する）には、おのおののＮ末端またはＣ末端などにエピトープ（抗体認識部位）となりうる任意の外来ペプチド配列（例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ＨＳＶタグなど）を有しているものも含まれる。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをはじめとするｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基等が用いられる。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本願明細書におけるｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。
【００４２】
さらに、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等のＣ１−６アルカノイル等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等のＣ１−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ポリペプチド等の複合ポリペプチド等も含まれる。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。
以下、明細書では、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド、その部分ペプチドまたはその塩をｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと略記する。
【００４３】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドは、前述したヒトや非ヒト温血動物の細胞または組織から公知のポリペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述するｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドをコードするポリペプチド（ＤＮＡ等）を含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや非ヒト哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや非ヒト哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸等で抽出を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはそのアミド体の合成には、通常市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂等をあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミド等が用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対応する酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００４４】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドン等の酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリル等のニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチル等のエステル類あるいはこれらの適宜の混合物等が用いられる。反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃ等が用いられる。
【００４５】
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチル等の直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化等によって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基等の低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基等のアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等の炭酸から誘導される基等が用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基等である。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチル等が用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃ等が用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕等が用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
【００４６】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素等の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液等による酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジン等による塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元等も用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオール等のようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオール等の存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア等によるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化等は公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００４７】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の類似ペプチドのアミド体を得ることができる。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ｈｕｍａｎｉｎのアミド体と同様にして、所望の類似ペプチドのエステル体を得ることができる。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドは、公知のペプチドの合成法に従っても製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、ｈｕｍａｎｉｎを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法などが挙げられる。
▲１▼Ｍ．　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ　および　Ｍ．Ａ．　Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６６年）、
▲２▼ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ），　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６５年）、
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、　丸善（株）　（１９７５年）、
▲４▼矢島治明　および榊原俊平、生化学実験講座　１、　タンパク質の化学ＩＶ、　２０５、（１９７７年）、および
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店。
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶等を組み合わせて本発明のポリペプチド、本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるポリペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００４８】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、これらを総称して、本発明のポリヌクレオチドと称する場合がある）としては、前述したｈｕｍａｎｉｎをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）。該ポリヌクレオチドとしては、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、前記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等いずれであってもよい。また、前記した細胞または組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドをコードするＤＮＡとして、具体的には、配列番号：５で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどが挙げられる。配列番号：５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡもｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドをコードするＤＮＡとして挙げることができ、例えば、配列番号：５で表される塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が用いられる。
【００４９】
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法等に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。
配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるるｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：５で表される塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの部分ペプチドをコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。具体例には、配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１０で表される塩基配列からなるＤＮＡなどが挙げられる。
【００５０】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によってゲノムＤＮＡやｃＤＮＡを増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡ（ライブラリー）をｈｕｍａｎｉｎの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いてラジオアイソトープや酵素で標識したもの（ＤＮＡプローブ）とのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法等に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の置換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ　ＰＣＲ法やＧｕｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００５１】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの発現ベクターは、例えば、（イ）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルス等の動物ウイルス等の他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、β−アクチン等が挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーター等を用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター等が好ましい。
【００５２】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、組換え体細胞をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列等が、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列等が、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列等、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列等がそれぞれ利用できる。
このようにして構築された類似ペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００５３】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕等が用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１等が用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ　ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ　ａｃｒｅａ由来の細胞等が用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ　細胞；ＢｍＮ細胞）等が用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，　Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ），１３，　２１３−２１７，（１９７７））等が用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫等が用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞，ヒトＦＬ細胞等が用いられる。
【００５４】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）等に記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）等に記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）等に記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８８）等に記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８　新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
【００５５】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖等、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等の無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子等を添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，　Ｋ．　Ｌ．　ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，　Ｇ．　Ａ．　ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，　Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたもの等が用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ　１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外（好ましくは細胞外）にｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを生成せしめることができる。
【００５６】
上記培養物からｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの粗抽出液を得る方法等が適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭ等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が用いられる。
かくして得られるｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素または蛋白質分解酵素等を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを部分的に除去することもできる。これらの酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼ等が用いられる。かくして生成するｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロット解析等により測定することができる。
また、上述のとおり、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドのＮ末端またはＣ末端などにエピトープ（抗体認識部位）となりうる任意の外来ペプチド配列（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＩＳタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＨＳＶタグなど）を融合させ、該ペプチド配列を認識する抗体を用いて、化学発光等を検出することにより、ｈｕａｎｉｎ類似ペプチドの存在を測定することも可能である。
【００５７】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドは細胞死抑制作用、細胞生存維持作用などを有しているので、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと受容体である本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２は以下の用途を有している。
【００５８】
すなわち、本発明は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２とｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとの結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法、および本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２とｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとの結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬を提供する。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を用いるか、または組換え型ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、リガンドであるｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、（イ）ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆる、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニスト）、（ロ）ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞刺激活性を阻害する化合物（いわゆる、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアンタゴニスト）、（ハ）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を減少させる化合物などが含まれる。
具体的には、本発明は、（ｉ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２とｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとを接触させた場合と（ｉｉ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２とｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、例えば、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性などが挙げられるが、なかでも細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性が好ましい。
【００５９】
より具体的には、本発明は、
ａ）標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合と、標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドおよび試験化合物を本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
ｂ）標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドおよび試験化合物を本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
ｃ）標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを、本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合と、標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドおよび試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００６０】
ｄ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩（例えば、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドなど）を本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩および試験化合物を本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合における、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
ｅ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩（例えば、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドなど）を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合と、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合における、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
さらに、リガンドとしては、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドに代えて、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることもできる。このｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物またはその塩は、例えば、リガンドとしてｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを用いて、後述する本発明のスクーニング方法を実施することによって得ることができる。以下のスクリーニング方法においては、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物またはその塩を含めて、単にｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと表記する。
【００６１】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２としては、上記した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有するものであれば何れのものであってもよいが、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２などが適している。
【００６２】
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を製造するには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Ｎａｍｂｉ，Ｐ．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．），２６７巻，１９５５５〜１９５５９頁，１９９２年〕に記載の方法に従って行なうことができる。したがって、本発明のスクリーニング方法において、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２であってもよいし、該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞を用いてもよく、また該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法において、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞としては、該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞や膜画分中のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００６４】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングする上記のａ）〜ｃ）を実施するためには、例えば、適当なＦＰＲＬ１画分またはＦＰＲＬ２画分と、標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが必要である。
ＦＰＲＬ１画分またはＦＰＲＬ２画分としては、天然型のＦＰＲＬ１画分またはＦＰＲＬ２画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＦＰＲＬ１画分またはＦＰＲＬ２画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとしては、例えば〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識されたｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドなどが用いられる。
具体的には、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングを行なうには、まず本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりＦＰＲＬ１標品またはＦＰＲＬ２標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのｈｕｍａｎｉｎとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識したｈｕｍａｎｉｎを添加し、同時に１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを加えた反応チューブも用意する。反応は約０〜５０℃、望ましくは約４〜３７℃で、約２０分〜２４時間、望ましくは約３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００６５】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングする上記のｄ）〜ｅ）の方法を実施するためには、例えば、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞刺激活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、ｃＡＭＰ、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現した細胞が必要である。本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現した細胞としては、天然型の本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を有する細胞株、上記の組換え型ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
また、試験化合物としては、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物が好ましく用いられる。ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置の測定は、公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行うことができる。
【００６６】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物またはその塩がアゴニストかアンタゴニストであるかは、「ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物またはその塩をＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合における、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介した細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とするＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストの決定方法」を用いて確認することができる。
具体的には、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニスト決定方法は、本発明の組換え型ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を有する化合物またはその塩を決定する方法である。
より具体的には、
（１）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物またはその塩をＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合における細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とするＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストの決定方法、および
（２）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物またはその塩をＦＰＲＬ１ＤＮＡまたはＦＰＲＬ２ＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合におけるＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とするＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストの決定方法である。
【００６７】
このアゴニスト決定方法において、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞の膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
【００６８】
ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞やその細胞膜画分中のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
本発明のアゴニスト決定方法を実施するためには、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。アゴニスト決定を行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、ｃＡＭＰなど）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。
このアゴニスト決定方法を用いることによって、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を示す化合物をＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストとして、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を示さない化合物をＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアンタゴニストとして選択することができる。
【００６９】
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞、または本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
ａ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
ｂ）ＦＰＲＬ１標品またはＦＰＲＬ２標品
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
ｃ）標識ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド
市販の〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
ｄ）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド標準液
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００７０】
２．測定法
ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
ｂ）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識ｈｕｍａｎｉｎを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０−３Ｍのｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを５μｌ加えておく。
ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを０．２Ｎ　ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Ｐｅｒｃｅｎｔ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次の式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Ｐｅｒｃｅｎｔ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂ　　：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ０　　：最大結合量
【００７１】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる作用を有する化合物またはその塩であり、具体的には、（イ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆる、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物またはその塩（いわゆる、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアンタゴニスト）、（ハ）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を増強する化合物またはその塩、または（ニ）ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を減少させる化合物またはその塩である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００７２】
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストは、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが有する生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアンタゴニストは、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが有する生理活性を抑制することができるので、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を増強する化合物またはその塩は、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を減少させる化合物またはその塩は、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドが有する生理活性を減少させるためのｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
具体的には、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られるアゴニストまたはｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を増強する化合物またはその塩は、例えば、細胞死抑制剤として、さらには、例えば神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の種々の疾病の予防・治療剤、好ましくは神経変性疾患、脳機能障害の予防・治療剤として、さらに好ましくはアルツハイマー病の予防・治療剤として、低毒性で安全な医薬として使用することができる。
一方、上記スクリーニング方法で得られるアンタゴニストまたはｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を減少させる化合物またはその塩は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現過多に起因する疾患の予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
さらに、上記スクリーニング方法で得られるアンタゴニストのうち、β−アミロイド（１−４２）とＦＰＲＬ１との結合を阻害するものは、例えば、細胞死抑制剤として、さらには、例えば神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の種々の疾病の予防・治療剤、好ましくは神経変性疾患、脳機能障害の予防・治療剤として、さらに好ましくはアルツハイマー病の予防・治療剤として、低毒性で安全な医薬として使用することができる。
【００７３】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物またはその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００７４】
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストを約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストを約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７５】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
Ａ　　　　　　：アデニン
Ｔ　　　　　　：チミン
Ｇ　　　　　　：グアニン
Ｃ　　　　　　：シトシン
ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
【００７６】
Ｇｌｙ　　　　　　：グリシン
Ａｌａ　　　　　　　　　：アラニン
Ｖａｌ　　　　　　　　　：バリン
Ｌｅｕ　　　　　　　　　：ロイシン
Ｉｌｅ　　　　　　　　　：イソロイシン
Ｓｅｒ　　　　　　　　　：セリン
Ｔｈｒ　　　　　　　　　：スレオニン
Ｃｙｓ　　　　　　　　　　：システイン
Ｍｅｔ　　　　　　　　　：メチオニン
Ｇｌｕ　　　　　　　　　：グルタミン酸
Ａｓｐ　　　　　　　　　：アスパラギン酸
Ｌｙｓ　　　　　　　　　：リジン
Ａｒｇ　　　　　　　　　：アルギニン
Ｈｉｓ　　　　　　　　　：ヒスチジン
Ｐｈｅ　　　　　　　　　：フェニルアラニン
Ｔｙｒ　　　　　　　　　：チロシン
Ｔｒｐ　　　　　　　　　：トリプトファン
Ｐｒｏ　　　　　　　　　：プロリン
Ａｓｎ　　　　　　　　　：アスパラギン
Ｇｌｎ　　　　　　　　　：グルタミン
ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
＊　　　　　　　：終止コドンに対応する
Ｍｅ　　　　　　：メチル基
Ｅｔ　　　　　　：エチル基
Ｂｕ　　　　　　：ブチル基
Ｐｈ　　　　　　：フェニル基
ＴＣ　　　　　　：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
【００７７】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
2004121224.tif 000002
【００７８】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒト由来ＦＰＲＬ１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ヒト由来ＦＰＲＬ１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
参考例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
参考例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
参考例１で得られたｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
参考例１で得られたｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド（ＨＮ３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
参考例１で用いられたクエリーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
参考例１で得られた配列番号：７を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
参考例１で得られたｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドＮＨ３（配列番号：６）の部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
配列番号：９をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
ヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
［Ｇｌｙ１４］−ヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２１）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
ラット型ｈｕｍａｎｉｎ（１−３８）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ラット型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ラット型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２１）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ラット由来ＦＰＲＬ１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
ラット由来ＦＰＲＬ１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
マウス由来ＦＰＲＬ２（ＦＰＲＬ１）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２０〕
マウス由来ＦＰＲＬ２（ＦＰＲＬ１）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
ヒト由来ＦＰＲＬ２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２〕
ヒト由来ＦＰＲＬ２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
参考例５で用いたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
参考例５で用いたプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
参考例６で用いたプライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
参考例６で用いたプライマー４の塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
参考例６で用いたプライマー５の塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
参考例６で用いたプライマー６の塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
参考例６で用いたプライマー７の塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
参考例６で用いたプライマー８の塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
Ｗ−Ｐｅｐｔｉｄｅのアミノ酸配列を示す。
後述の参考例１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐｃＤＮＡ−ｈｎ３　は、２００１年７月１９日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６７４として、２００１年７月３日から日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６６７３として寄託されている。
後述の参考例６で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＵＣ１８−ｒＦＰＲＬ１は２００３年１月１０日から茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８２７４として寄託されている。
【００７９】
【実施例】
以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
【００８０】
【参考例１】
配列番号：７で表されるヒトｈｕｍａｎｉｎ遺伝子コード領域をクエリーにしてＧＥＭＢＬＥに対してデータベースサーチを行ったところ、アクセッション番号ＡＬ３５６１３５の配列中にｈｕｍａｎｉｎ遺伝子のコード領域に対応した開始および終止コドンを含むｈｕｍａｎｉｎ遺伝子に類似した遺伝子領域が存在することが見出された。この遺伝子が実際に存在し、また転写されて機能していることを確認するため、ヒト全脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ　（クロンテック社）　１．０μｇを鋳型に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　（ギブコ　ＢＲＬ社）を用い、マニュアルにしたがって、ｏｌｉｇｏ　（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写を行ってｃＤＮＡを作成し、アクセッション番号ＡＬ３５６１３５の配列中のｈｕｍａｎｉｎ類似配列のコード領域の５’上流および３’下流に相当する順に、ＴＡＣＣＣＴＡＡＣＣＧＴＧＣＡＡＡＧＧＴＡＧＣＡＴＧ（配列番号：３）、ＧＴＧＧＧＣＴＴＡＴＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＡＴＴＧＧ（配列番号：４）のプライマーを設定して２０μｌの液量でＰＣＲ反応を行った。組成は、ｃＤＮＡ調製液から１０ｎｇ　ｍＲＮＡ相当分を鋳型に両ｐｒｉｍｅｒ　０．５μＭ、２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、　ｄＮＴＰ　０．２ｍＭ，　ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　　（パーキンエルマー社）　１／１００　ｖｏｌｕｍｅ　、１０倍濃縮ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　１／１０　ｖｏｌｕｍｅで行った。反応は、９５℃で１０分保温した後、９５℃１５秒、６７℃１５秒、７２℃１５秒のサイクルを４０回繰り返した後、７２℃で５分保温した。得られた反応液を用い、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ＴＯＰＯ　ＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ　（インビトロジェン社）を用いてプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓ−ＴＯＰＯへサブクローニングし、大腸菌ＴＯＰ１０へ導入した。生じた形質転換体からＱＩＡ　ｐｒｅｐ８　ｍｉｎｉ　ｐｒｅｐ　（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。塩基配列決定のための反応は、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（パーキンエルマー社）を用いて行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。その結果、検索で見出されたｈｕｍａｎｉｎ類似配列のコード領域（配列番号：５）を含む配列番号：８で表される塩基配列が得られたことから、この遺伝子がヒト全脳において発現していることが確認された。
この配列には、ｈｕｍａｎｉｎ類似配列のコード領域全長が含まれていたので、上記プラスミドで大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐｃＤＮＡ−ｈｎ３を得た。
【００８１】
【参考例２】
配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含有するＨｕｍａｎｉｎ類似ペプチド（ＨＮ３）を以下の方法で製造した。
市販の２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ、１．３３　ｍｍｏｌ／ｇ）　にＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを導入したＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｏ−Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ　（０．５２７　ｍｍｏｌ／ｇ）　０．２５　ｍｍｏｌ分をペプチド合成機ＡＢＩ　４３３Ａ　の反応槽に入れ、Ｆｍｏｃ／　ＤＣＣ／　ＨＯＢｔ法を用い、固相合成を行なった。Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖保護基はＡｒｇにはＰｂｆ基、ＬｙｓにＢｏｃ基、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＳｅｒにｔＢｕ基、ＣｙｓにＴｒｔ基を用いた。他のアミノ酸は側鎖無保護のものを用い、上記に示す配列の１３位Ｔｈｒまでペプチド鎖を伸長した。得られたＦｍｏｃ−　ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド（１３−２４）−Ｏ−Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎにＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ（ＮＯＶＡ社製、製品番号０５−２０−１００４）をＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＡｔで導入した後、１０位ＬｅｕからＮ末端側へ配列順にＤＣＣ／　ＨＯＢｔで導入し、目的の保護ペプチド樹脂を得た。
この樹脂１００　ｍｇをＴＦＡ、ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ、ｍ−ｃｒｅｓｏｌ、水、ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ、ｅｔｈａｎｄｉｔｈｉｏｌ（８０：５：５：５：２．５：２．５）の混合液（ｔｏｔａｌ　１．５　ｍｌ）で室温、１．５時間攪拌した後、反応溶液にエーテルを加え、白色粉末を析出させ遠心分離後、上清を除く操作を３回繰り返した。残渣を水で抽出後、凍結乾燥し白色粉末を得た。得られた粗ペプチドをＹＭＣ　Ｐａｃｋ　Ｒ＆Ｄ−ＯＤＳ−５−Ｂ　Ｓ−５、１２０Ａカラム（３０　ｘ　２５０ｍｍ）を用いた分取ＨＰＬＣで、Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルによるＡ／Ｂ：　７８／２２〜６８／３２への直線型濃度勾配溶出（６０分）を行ない、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末２１．８　ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：　Ｍ＋　２６９２．８　（理論値　２６９２．５）
ＨＰＬＣ溶出時間　１０．５分
溶出条件
カラム　ＹＭＣ　ＡＭ　３０１　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液　　Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、Ａ／Ｂ：　８０／
２０〜３０／７０へ　　　　　　　　　　　　　直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速　１．０ｍｌ／分
【００８２】
【参考例３】
Ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドによるラット副腎髄質由来褐色細胞腫細胞ＰＣ１２ｈに対するグルタミン酸誘発細胞死抑制活性
コラーゲンコート済み９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）に１０％ウシ胎児血清および５％馬血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＤＭＥＭ）を培地としてＰＣ１２ｈ細胞（大阪大学蛋白質研究所・畠中寛教授より供与、Ｈａｔａｎａｋａ，　Ｈ．，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２２巻、２２５−２３３頁、１９８１年）を２　ｘ　１０４　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度でまいた。２４時間後に１００μｌの２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ　７．５）を含むＤＭＥＭに培地を交換し、同時に、各種濃度の実施例２で製造したｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド（配列番号：４）および添加後の濃度が１　ｍＭとなるようにグルタミン酸を添加した。７２時間後に０．２％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ　１００μｌを用いて細胞を溶解し、抽出液の乳酸脱水酵素（ＬＤＨ）活性をＬＤＨ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔｅｓｔ　ＷＡＫＯ（和光純薬）によって測定した。結果を図１に示す。
グルタミン酸処理７２時間後において、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド無添加区の細胞生存率が３４．０％であったのに対し、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドを１μＭまたは１０μＭ添加することにより、細胞生存率は、それぞれ５９．３％または７４．６％に上昇した。なお、細胞生存率は、グルタミン酸無添加区を１００％としたときの比率によって表わす。
これより、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドにより、ラット副腎髄質由来褐色細胞腫細胞ＰＣ１２ｈのグルタミン酸誘発細胞死が抑制されることが明らかである。
【００８３】
【参考例４】
Ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド（１９−２４）（配列番号：９）：Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｈｒの製造
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｏ−Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎを用い、目的配列の保護ペプチド樹脂を調製し、実施例２に記載のｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドの精製法と同様の方法により精製して白色粉末２９　ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：　Ｍ＋　　７５６．５　（理論値　７５６．５）
ＨＰＬＣ溶出時間　１０．２分
溶出条件
カラム　ＹＭＣ　ＡＭ　３０１　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液　　Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、Ａ／Ｂ：　８０／
２０〜３０／７０へ　　　　　　　　　　　　　直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速　１．０ｍｌ／分
【００８４】
【参考例５】マウス脾臓由来ＦＰＲＬ２をコードするｃＤＮＡのクローニングと発現ベクターの構築
マウス脾臓ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型として、マウスＦＰＲＬ２の配列情報（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　＃０７１１８０；ＮＣＢＩ）をもとに設計した２個のプライマー、プライマー１（配列番号：２３）及びプライマー２（配列番号：２４）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、▲１▼９８℃・１分の後、▲２▼９８℃・１０秒、５５℃・３０秒、７２℃・６０秒を３５回の後、▲３▼７２℃・２分の伸長反応を行なった。反応後、増幅産物を制限酵素Ｓａｌ　Ｉ及びＸｂａＩで切断した後、プラスミドベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈに挿入して発現ベクターを構築した。その塩基配列を解析した結果、配列番号：１９で表されるアミノ酸配列からなるマウスＦＰＲＬ２をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：２０）を得た。
【００８５】
【参考例６】ラット脾臓由来ＦＰＲＬ１をコードするｃＤＮＡのクローニングとその塩基配列の決定及び発現ベクターの構築
ラット脾臓ｍＲＮＡからＭａｒａｔｈｏｎＴＭ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてｃＤＮＡを合成し、その末端にアダプターを付加した。これを鋳型として、２個のプライマー、プライマー３（配列番号：２５）及びプライマー４（配列番号：２６）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲにはＡｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、▲１▼９６℃・１分、▲２▼９６℃・１０秒、７２℃・２分を５回、▲３▼９６℃・１０秒、７０℃・２分を５回、▲４▼９６℃・１０秒、６８℃・２分を２５回の後、▲５▼７２℃・５分の伸長反応を行なった。反応後、増幅産物をＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方にしたがってプラスミドベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、これを大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造）に導入してクローニングした。個々のクローンの塩基配列を解析した結果、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の一部をコードするｃＤＮＡ配列を得た。この配列情報をもとに２個のプライマー、プライマー５（配列番号：２７）及びプライマー６（配列番号：２８）を設計し、上述のラット脾臓ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型としてＭａｒａｔｈｏｎＴＭ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の処方に従ってそれぞれ５’−ＲＡＣＥ及び３’−ＲＡＣＥを行なった。ＰＣＲは上述のものと同様に行ない、反応後増幅産物をＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方にしたがってプラスミドベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、これを大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造）に導入してクローニングした。個々のクローンの塩基配列を解析した結果、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の一部をコードするｃＤＮＡ配列を得た。これらの配列情報からさらに２個のプライマー、プライマー７（配列番号：２９）及びプライマー８（配列番号：３０）を設計し、上述のラット脾臓ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、▲１▼９８℃・１分の後、▲２▼９８℃・１０秒、５５℃・３０秒、７２℃・６０秒を３５回の後、▲３▼７２℃・２分の伸長反応を行なった。反応後、増幅産物を制限酵素Ｓａｌ　Ｉ及びＸｂａＩで切断した後、プラスミドベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈに挿入して発現ベクターを構築した。これを制限酵素Ｓａｌ　Ｉ及びＮｈｅ　Ｉで切断して挿入断片を切出し、プラスミドベクターｐＵＣ１１９に挿入してこれらの塩基配列を解析した結果、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列からなるラットの新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１８）を得た。このｃＤＮＡより導き出されるアミノ酸配列（配列番号：１７）を含有する新規タンパク質をラットＦＰＲＬ１と命名した。また、このプラスミドを保持する形質転換体を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＵＣ１１９−ｒＦＰＲＬ１と命名した。
【００８６】
【参考例７】ラット脾臓由来ＦＰＲＬ１をコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドの作製
参考例６で得られた発現ベクターを制限酵素Ｓａｌ　Ｉ及びＮｈｅ　Ｉで切断して挿入断片を切出し、プラスミドベクターｐＵＣ１８に挿入してこれらの塩基配列を解析した結果、参考例５と同様に配列番号：１７で表されるアミノ酸配列からなるラットの新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１８）であることが確認できた。また、このプラスミドを保持する形質転換体を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＵＣ１８−ｒＦＰＲＬ１と命名した。
【００８７】
【実施例１】ＦＰＲＬ１−ＧＦＰを発現させたＣＨＯ細胞における、ホルスコリン添加によって増加させた細胞内ｃＡＭＰ量のｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド（ＨＮ３）（配列番号：６）による抑制
ＦＰＲＬ１−ＧＦＰを発現させたＣＨＯ細胞をアッセイ用培地（ＨＢＳＳに０．１％ウシ血清アルブミン、および、０．２ｍＭ　ＩＢＭＸを添加したもの）にて洗浄した後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０分培養した。アッセイ用培地にて希釈した各濃度のＨＮ３、およびフォルスコリンを１μＭとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０分培養した。培養上清を捨てて、ｃＡＭＰｓｃｒｅｅｎ　ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）のプロトコールに従い、細胞内のｃＡＭＰ量をプレートリーダー（ＡＲＶＯ　ｓｘマルチラベルカウンター、Ｗａｌｌａｃ社）を用いて測定した。
その結果、ベクターのみを導入したＣＨＯ細胞（ｍｏｃｋ）に比べ（図３）、ＦＰＲＬ１−ＧＦＰ遺伝子を導入したＣＨＯ細胞特異的に、ホルスコリン添加によって増加させた細胞内ｃＡＭＰ量のＨＮ３による用量依存的かつ特異的な減少が検出された（図２）。
【００８８】
【実施例２】ヒトＦＰＲ１発現ＣＨＯ細胞（Ｎｏ．１４）、ヒトＦＰＲＬ１発現ＣＨＯ細胞（Ｎｏ．８）、ヒトＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ細胞（Ｎｏ．１７）、マウスＦＰＲＬ２（Ｎｏ．１５）およびラットＦＰＲＬ１発現ＣＨＯ細胞（Ｎｏ．１５）における、ホルスコリン添加によって増加させた細胞内ｃＡＭＰ量の各アゴニストによる抑制
上記の受容体を発現させたＣＨＯ細胞をアッセイ用培地（ＨＢＳＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に０．１％ウシ血清アルブミン、および、０．２ｍＭ　ＩＢＭＸを添加したもの）にて洗浄した後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０分培養した。アッセイ用培地にて希釈した各濃度のｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド（ＨＮ３）、その後フォルスコリン１μＭとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０分培養した。培養上清を捨てて、ｃＡＭＰ　ｓｃｒｅｅｎ　ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）のプロトコールに従い、細胞内のｃＡＭＰ量をプレートリーダー（ＡＲＶＯ　ｓｘマルチラベルカウンター、Ｗａｌｌａｃ社）を用いて測定した。フォルスコリン１μＭ添加した細胞におけるｃＡＭＰの産生量を１００％とし、フォルスコリンを添加していない細胞のｃＡＭＰ産生量を０％として、各アゴニストを添加したときのｃＡＭＰ量を％表示した。ｃＡＭＰ産生量を５０％阻害する濃度（ＥＣ５０）を、ｌｏｇｉｔ−ｌｏｇプロットより算出した。結果、ＨＮ３はｈＦＰＲＬ１に対してのみでなく、ｈＦＰＲＬ２に対しても強く反応すること、また、ｍＦＰＲＬ２およびｒＦＰＲＬ１に対しても反応することが分かった（図４）。
【００８９】
【発明の効果】
本発明のＦＰＲＬ１、ＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩とｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドとを用いることによって、ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドと本発明のＦＰＲＬ１、ＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物を効率良くスクリーニングすることができる。
【００９０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】各種濃度のｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドＨＮ３（配列番号：６）によるラット副腎髄質由来褐色細胞腫細胞ＰＣ１２ｈに対するグルタミン酸誘発細胞死抑制活性を示す。細胞の生存率は、グルタミン酸無添加区を１００％としたときの比率によって表わした。＊はｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドＨＮ３無添加区に対して有意な（ｐ＜０．０５）差であることを示す。
【図２】細胞内ｃＡＭＰ量によるＦＰＲＬ１−ＧＦＰ受容体発現させたＣＨＯ細胞に特異的なｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド（ＨＮ３）のリガンド活性の用量依存性を調べた結果を示す。ホルスコリンで刺激しない状態（Ｂａｓａｌ）に対し、ホルスコリンを１μＭ添加（ＦＳＫ）、および図中に表示の濃度（μＭ）のＨＮ３をホルスコリン存在下でインキュベーションし、細胞内ｃＡＭＰ量を比較した結果である。Ｂａｓａｌはホルスコリン（ＦＳＫ）およびリガンドを添加していない場合を示す。ＦＳＫはホルスコリンを添加した場合を示す。Ｌｉｇａｎｄ（μＭ）＋ＦＳＫはＨＮ３とホルスコリンを添加した場合を示す。横軸の数字は添加したＨＮ３の濃度（μＭ）を示す。縦軸のｃＡＭＰ（ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）は細胞内ｃＡＭＰ量（ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）を示す。
【図３】細胞内ｃＡＭＰ量によるＦＰＲＬ１−ＧＦＰ受容体を発現させていないＣＨＯ細胞（ｍｏｃｋ）に特異的なｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド（ＨＮ３）のリガンド活性の用量依存性を調べた結果を示す。ホルスコリンで刺激しない状態（Ｂａｓａｌ）に対し、ホルスコリンを１μＭ添加（ＦＳＫ）、および図中に表示の濃度（μＭ）のｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド（ＨＮ３）をホルスコリン存在下でインキュベーションし、細胞内ｃＡＭＰ量を比較した結果である。Ｂａｓａｌはホルスコリン（ＦＳＫ）およびリガンドを添加していない場合を示す。ＦＳＫはホルスコリンを添加した場合を示す。Ｌｉｇａｎｄ（μＭ）＋ＦＳＫはＨＮ３とホルスコリンを添加した場合を示す。横軸の数字は添加したＨＮ３の濃度（μＭ）を示す。縦軸のｃＡＭＰ（ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）は細胞内ｃＡＭＰ量（ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）を示す。
【図４】各レセプター蛋白質を発現するＣＨＯ細胞に各種リガンドを反応させた時の細胞内ｃＡＭＰ量を測定し、ＥＣ５０値（ｎＭ）を求めた結果を示す。ＥＣ５０　ＶａｌｕｅｓはＥＣ５０値を示す。Ｓａｍｐｌｅは使用したリガンド試料を示す。ＨＮ３は配列番号：６で表わされるアミノ酸配列からなるｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチド（ＨＮ３）を示す。Ｗ−ＰｅｐｔｉｄｅはＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−ｄＭｅｔ−ＮＨ２（配列番号：３１）を示す。ｄＭｅｔはＤ体のＭｅｔを示す。β−Ａｍｙｌｏｉｄ（１−４２）はβ−アミロイド（１−４２）を示す。ｈＦＰＲ１はヒト由来ＦＰＲＬを示す。ｈＦＰＲＬ１はヒト由来ＦＰＲＬ１を示す。ｈＦＰＲＬ２はヒト由来ＦＰＲＬ２を示す。ｍＦＰＲＬ２はマウス由来ＦＰＲＬ２（ＦＰＲＬ１）を示す。ｒＦＰＲＬ１はラット由来ＦＰＲＬ１を示す。＞１００００は１００００ｎＭ以上を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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