(57)【要約】　　　（修正有）【課題】特定の細胞を特異的に認識及び／又は破壊するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを含む形質転換された宿主細胞、及びこれらを有効成分として含有する医薬組成物の提供。【解決手段】特定の配列で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および該配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸を含み、かつ（活性形態において）細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質。前記特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、および該ＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ（活性形態において）細胞認識活性及び／又は細胞認識活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ活性形態において細胞認識活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
前記タンパク質が溶血活性を有しない、請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ活性形態において細胞障害活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
前記タンパク質が溶血活性を有しない、請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞認識活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
前記タンパク質が溶血活性を有しない、請求項９記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞障害活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
前記タンパク質が溶血活性を有しない、請求項１１記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項１４】
請求項１３記載のベクターを含有する形質転換体。
【請求項１５】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸を含み、かつ活性形態において細胞認識活性を有するタンパク質。
【請求項１７】
前記タンパク質が溶血活性を有しない、請求項１６記載のタンパク質。
【請求項１８】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸を含み、かつ活性形態において細胞障害活性を有するタンパク質。
【請求項１９】
前記タンパク質が溶血活性を有しない、請求項１８記載のタンパク質。
【請求項２０】
配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２１】
配列番号４で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸を含み、かつ細胞認識活性を有するタンパク質。
【請求項２２】
前記タンパク質が溶血活性を有しない、請求項２１記載のタンパク質。
【請求項２３】
配列番号４で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸を含み、かつ細胞障害活性を有するタンパク質。
【請求項２４】
前記タンパク質が溶血活性を有しない、請求項２３記載のタンパク質。
【請求項２５】
請求項１５〜２４のいずれか１項記載のタンパク質を含有する医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１５〜１７及び２０〜２２のいずれか１項記載のタンパク質を含有する細胞標識剤。
【請求項２７】
請求項１５、１８〜２０及び２３〜２４のいずれか１項記載のタンパク質を含有する抗癌剤。
【請求項２８】
請求項１５〜２４のいずれか１項記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項２９】
請求項１５〜２４のいずれか１項記載のタンパク質を生産する方法であって、以下の工程：
（ａ）該タンパク質を発現する細胞を培養する工程；及び
（ｂ）該タンパク質を回収する工程；
を包含する、方法。
【請求項３０】
請求項１５〜１７及び２０〜２２のいずれか１項記載のタンパク質が認識する細胞を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）培養培地中で、任意の細胞と該タンパク質とをインキュベートする工程；及び
（ｂ）該タンパク質が該細胞に対する細胞認識活性を有するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項１５、１８〜２０及び２３〜２４のいずれか１項記載のタンパク質が細胞障害活性を示す細胞を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）培養培地中で、任意の細胞と該タンパク質とをインキュベートする工程；及び
（ｂ）該タンパク質が該細胞に対する細胞障害活性を有するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項３２】
（ｃ）該タンパク質が溶血活性を有するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項３０又は３１記載の方法。
【請求項３３】
請求項１５〜２４のいずれか１項記載のタンパク質に対して親和性を有する物質を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）該タンパク質と被験物質とを接触させる工程；
（ｂ）該被験物質が、該タンパク質に対して親和性を有するか否かを決定する工程；
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物由来の有用なタンパク質に関し、詳細すれば、バチルス・チューリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：以下、ＢＴと略称することがある）Ａ１５４７株由来である、細胞認識及び細胞破壊能を持った新規タンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードしている遺伝子配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バチルス・チューリンジエンシスは、１９０１年に日本人研究者の石渡繁胤氏によって蚕の病原細菌として発見された。以来、本細菌が生産する殺虫活性を持つ結晶タンパク質は、微生物殺虫剤として幅広く農業害虫、衛生害虫の防除に利用されてきた。
【０００３】
これまでの研究によって、殺虫活性を持つ結晶性タンパク質は、アルカリによる可溶化後、必要に応じてプロテアーゼ処理によって活性化され、昆虫に対する毒性を発揮することが知られている。殺虫活性を持つ結晶性タンパク質は、（１）プロテアーゼによって活性化された状態において昆虫細胞に選択的な破壊活性を示すＣｒｙタンパク質（通常、活性化形態では分子量６０〜７５ｋＤａ）、及び（２）昆虫の細胞に対して非選択的な破壊活性を有し、かつ赤血球の溶血活性を有するＣｙｔタンパク質（通常、活性化形態では分子量２２〜３０ｋＤａ）に分類されることが明らかになっている。
【０００４】
細胞認識タンパク質としてのバチルス・チューリンジエンシスの結晶性タンパク質は、Ｃｒｙタンパク質に代表される選択性の高さ、数十の遺伝子型に基づく多様性の豊富さ、及び原核生物由来のタンパク質であるが故の遺伝子改変のし易さという、抗体等他の細胞認識タンパク質にない優れた特徴を持っている。しかし、その用途は、昆虫細胞を標的とした殺虫剤としての利用に限定されている。また、殺虫活性を有する結晶性タンパク質を発現している菌株は、ＢＴのうちわずか３０〜４０％にすぎず、ＢＴ菌株が生産する殺虫活性を有しない結晶性タンパク質の持つ性質については、これまで不明であった。
【０００５】
本発明者らは、土壌、耕地土壌、森林土壌，養蚕農家塵埃、貯穀塵埃、病死昆虫、植物、淡水等から分離された、５０種のＨ血清型と未知の血清型に属する約２０００株のバチルス・チューリンジエンシス菌株を用いて、そしてバチルス・チューリンジエンシス菌株に由来する活性が不明であった毒素タンパク質の中に、アルカリによる可溶化後にプロテアーゼによって活性化されると、脊椎動物細胞（癌細胞を含む）を選択的に認識及び破壊する一群の新規タンパク質が存在することを世界に先駆けて明らかにした（例えば、特許文献１及び２を参照）。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１１−２２２４９８号公報
【特許文献２】
特開２０００−２８１７００号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、脊椎動物細胞（癌細胞を含む）に対して選択的な認識活性及び障害活性を有する、一群のバチルス・チューリンジエンシス菌に由来する新規タンパク質のうち、バチルス・チューリンジエンシスＡ１５４７株の生産する毒素タンパク質についてアミノ酸配列及びそれをコードしている遺伝子配列を明らかにした。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、以下に示される通りである。
（１）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ活性形態において細胞認識活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（３）記載のＤＮＡ。
（５）配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ活性形態において細胞障害活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（６）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（５）記載のＤＮＡ。
（７）配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
（８）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（９）配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞認識活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１０）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（９）記載のＤＮＡ。
（１１）配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞障害活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１２）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（１１）記載のＤＮＡ。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれか１記載のＤＮＡを含有するベクター。
（１４）上記（１３）記載のベクターを含有する形質転換体。
（１５）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（１６）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸を含み、かつ活性形態において細胞認識活性を有するタンパク質。
（１７）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（１６）記載のタンパク質。
（１８）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸を含み、かつ活性形態において細胞障害活性を有するタンパク質。
（１９）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（１８）記載のタンパク質。
（２０）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（２１）配列番号４で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸を含み、かつ細胞認識活性を有するタンパク質。
（２２）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（２１）記載のタンパク質。
（２３）配列番号４で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸を含み、かつ細胞障害活性を有するタンパク質。
（２４）前記タンパク質が溶血活性を有しない、上記（２３）記載のタンパク質。
（２５）上記（１５）〜（２４）のいずれか１記載のタンパク質を含有する医薬組成物。
（２６）上記（１５）〜（１７）及び（２０）〜（２２）のいずれか１記載のタンパク質を含有する細胞標識剤。
（２７）上記（１５）、（１８）〜（２０）及び（２３）〜（２４）のいずれか１記載のタンパク質を含有する抗癌剤。
（２８）上記（１５）〜（２４）のいずれか１記載のタンパク質に対する抗体。
（２９）上記（１５）〜（２４）のいずれか１記載のタンパク質を生産する方法であって、以下の工程：
（ａ）該タンパク質を発現する細胞を培養する工程；及び
（ｂ）該タンパク質を回収する工程；
を包含する、方法。
（３０）上記（１５）〜（１７）及び（２０）〜（２２）のいずれか１記載のタンパク質が認識する細胞を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）培養培地中で、任意の細胞と該タンパク質とをインキュベートする工程；及び
（ｂ）該タンパク質が該細胞に対する細胞認識活性を有するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
（３１）上記（１５）、（１８）〜（２０）及び（２３）〜（２４）のいずれか１記載のタンパク質が細胞障害活性を示す細胞を同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）培養培地中で、任意の細胞と該タンパク質とをインキュベートする工程；及び
（ｂ）該タンパク質が該細胞に対する細胞障害活性を有するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
（３２）（ｃ）該タンパク質が溶血活性を有するか否かを決定する工程をさらに包含する、上記（３０）又は（３１）記載の方法。
（３３）上記（１５）〜（２４）のいずれか１記載のタンパク質に対して親和性を有する物質を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）該タンパク質と被験物質とを接触させる工程；
（ｂ）該被験物質が、該タンパク質に対して親和性を有するか否かを決定する工程；
を包含する方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を提供する。本発明はまた、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ活性形態において細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質を提供する。本発明はさらに、配列番号４で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質を提供する。好ましくは、本発明の上記タンパク質は、溶血活性を有しない。さらに、本発明は、上記タンパク質のうち少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも１５個、さらに好ましくは少なくとも１０個の連続するアミノ酸からなるペプチドを提供する。
【００１０】
「細胞障害活性」とは、特定の細胞を特異的に破壊する能力をいう。例えば、ＭＴＴアッセイ等の方法によって測定する場合に、特定の細胞に対する細胞障害活性が、ネガティブコントロールに対する細胞障害活性よりも有意に高い場合に、その細胞に対して細胞障害活性を有するものとみなされる。ネガティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞障害活性を示さない任意の細胞が挙げられる。
【００１１】
また、本発明のタンパク質は、特定の細胞を特異的に認識し、かつ破壊することによって、特定の細胞に対して特異的な細胞障害活性を示す。従って、本発明のタンパク質は、特異的な「細胞認識活性」を有する。例えば、免疫沈降アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅを用いた相互作用解析により測定した場合に、特定の細胞に対する細胞認識活性が、ネガティブコントロールに対する細胞認識活性よりも有意に高い場合に、その細胞に対して細胞認識活性を有するものとみなされる。ネガティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞認識活性を示さない任意の細胞が挙げられる。当業者は、ネガティブコントロールとして使用し得る細胞を適宜選択することができる。
【００１２】
細胞認識活性は、例えば、免疫沈降アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅを用いた相互作用解析などによって測定される。免疫沈降アッセイでは、細胞の溶解液（リガンドの標的を含む）にリガンド（本発明の場合には、Ａ１５４７タンパク質）とその抗体及びプロテインＡビーズを加え、標的−リガンド−抗体−プロテインＡビーズ複合体を形成させて、遠心して分離する。この複合体について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットを行い、標的を同定する。当業者は、これら一連の実験条件を適切に設定可能である。ＢＩＡｃｏｒｅを用いた相互作用解析では、細胞上の標的を含む膜画分又は標的自体をセンサー表面に固定化し、これに作用する試料（本発明の場合にはＡ１５４７タンパク質）を、マイクロ流量系を介して添加して、センサー表面で起こる分子の結合及び解離により生じる微量な質量変化を、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）シグナルの変化としてリアルタイムに検出する。得られたデータから反応速度論の解析を行なう。免疫沈降アッセイ及びＢＩＡｃｏｒｅを用いた相互作用解析の詳細については、細胞工学別冊　実験プロトコールシリーズ　タンパク質実験プロトコール１（１）機能解析編（秀潤社、１９９７年）を参照のこと。細胞障害活性を測定するアッセイの例示として免疫沈降アッセイ及びＢＩＡｃｏｒｅを用いた相互作用解析を挙げたが、当業者は、これら以外のアッセイを使用して、細胞認識活性を測定することが可能である。
【００１３】
「活性形態において細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質」とは、特定の条件下で処理される場合に（例えば、アルカリ条件下、並びにアルカリ条件下及びプロテアーゼによって処理される場合に）、上記の活性を有する形態（活性形態）に変換される不活性形態（前駆体）のタンパク質、並びに特定の条件下で処理されなくとも上記の活性を有するタンパク質（即ち、最初から活性形態で存在するタンパク質）をいう。例えば、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質は、特定の処理に付されない限り通常は不活性形態で存在するが、アルカリ条件下、又はアルカリ条件下及びプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）によって処理されると活性形態のタンパク質（約３０〜３１ｋＤａ）に変換され、細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するようになる。従って、配列番号２のアミノ酸からなるタンパク質は、活性形態において細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質である。しかし、特定の処理を施さずとも、細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質は、その状態で活性形態であるとされる。尚、本発明においては、「細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質」は、特定の処理に付されることを必要としない。
【００１４】
本発明のタンパク質が特異的に認識及び／又は破壊する細胞としては、脊椎動物由来の細胞、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル等）に由来する細胞が挙げられる。例えば、ヒトに由来する細胞として、Ｔ細胞（例えば、正常Ｔ細胞、白血病Ｔ細胞（好ましくはＭＯＬＴ−４及びＪｕｒｋａｔ細胞）、前骨髄性白血病細胞（好ましくはＨＬ６０細胞））、子宮細胞（好ましくは、子宮頸癌細胞を除く子宮癌細胞及び子宮由来の正常平滑筋細胞、より好ましくはＳａｗａｎｏ細胞及びＵｔＳＭＣ細胞）、肝細胞（好ましくは肝癌細胞、より好ましくはＨｅｐＧ２細胞）、肺細胞（好ましくは正常胎児繊維芽細胞、より好ましくはＭＲＣ−５細胞）、及び結腸細胞（好ましくは結腸腺癌細胞、より好ましくはＣＡＣＯ−２細胞）が挙げられる。また、本発明のタンパク質は、例えば、ヒト以外の哺乳動物の細胞では、マウス由来の繊維芽細胞（好ましくはＮＩＨ３Ｔ３細胞）を認識及び／又は破壊することができる。しかし、当業者は、上に挙げた以外の細胞に対しても、本発明のタンパク質が細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有することを理解する。また本発明のタンパク質は、これら活性を単独で、又は複数組み合わせて有していてもよい。例えば、本発明のタンパク質は、前骨髄性白血病細胞及び肝癌細胞の障害活性、又は前骨髄性白血病細胞の障害活性及び肝癌細胞の認識活性を有する。本発明のタンパク質には、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる不活性形態のタンパク質に加え、当該タンパク質をアルカリ処理して得られるタンパク質、及びアルカリ処理に加えてプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）処理することによって得られる活性形態のタンパク質（約３０〜３１ｋＤａ）（例えば、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質）も含まれる。これらアルカリ処理及びプロテアーゼ処理の条件及び手順は、当業者が適宜設定し得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等によって活性形態（約３０〜３１ｋＤａ）タンパク質（例えば、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質）が得られたか否かを確認することができる。より具体的には、これら処理条件及び手順は、実施例に記載の方法に従う。
【００１５】
また、「溶血活性を有しない」とは、哺乳動物（例えば、ウサギ、ヒツジ及びヒト等、好ましくはヒト）の赤血球に対して実質的に溶血活性を有しないことをいい、具体的には、実施例４に記載の方法を使用した場合に、対照実験との吸光度と比較して吸光度差が０．５以下の場合に溶血活性がないものとされる。本発明のタンパク質としては、細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有し、かつ溶血活性を有しないタンパク質が好ましい。好ましくは、本発明のタンパク質は、バチルス属に由来するタンパク質であり、より好ましくは、バチルス・チューリンジエンシスに由来するタンパク質であり、さらに好ましくは、バチルス・チューリンジエンシスＡ１５４７株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０４６；当該株は、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１　中央第６）に寄託されている、原寄託日平成１４年９月２６日）に由来するタンパク質である。
【００１６】
本発明のタンパク質以外の他の細胞認識タンパク質としては、例えば、免疫グロブリンが挙げられる。しかし本発明のタンパク質は、免疫グロブリンと比較して非常に低分子量であり、かつ原核生物由来のタンパク質であるため改変し易い等の利点を有する。上記特徴に加え、本発明のタンパク質は、非常に選択性が高いため薬物送達システムにも利用され得る。例えば、本発明のタンパク質は、他の物質との融合によって、特異的な指向性をその物質に付与し得る。本発明のタンパク質は優れた選択性を有することから、免疫グロブリン（抗体）と同様にターゲッティング療法に使用され得ることが理解される。
【００１７】
本発明のタンパク質は、抗癌剤として使用され得る。抗癌剤としての使用において、本発明のタンパク質は単独でも有効であるが、効果を増強するために、他の抗癌剤との複合体（共有結合性でも非共有結合性でもよい）又は併用剤としても使用され得る。例えば、免疫グロブリンと抗癌剤との複合体が報告されているが、本発明のタンパク質も同様に、他の抗癌剤との複合体として使用され得る。また、本発明のタンパク質は、放射性同位体（例えば、１３１Ｉ）で標識され得る。例えば、１３１Ｉで標識された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体での治療によって、Ｂ細胞リンパ腫患者において非常に良好な結果が得られたことが報告されている。本発明のタンパク質も同様に、１３１Ｉで標識されると癌細胞に対する破壊効果が増強され得る。また、本発明のタンパク質は、毒素（例えば、リシン）との複合体として使用され得る。例えば、抗ＣＤ５抗体とリシンＡ鎖との複合体によって、Ｔ細胞リンパ腫の患者において顕著な効果が確認されたとの報告がある。本発明のタンパク質も同様に、リシンＡ鎖との複合体として使用され得る。本発明の抗癌剤は、本発明のタンパク質が特異的に破壊する癌細胞から構成される癌に対して治療効果を発揮する。
【００１８】
また、本発明のタンパク質は、細胞標識剤としても使用され得る。例えば、インビボでの適用において、本発明のタンパク質は、適切な画像化物質（例えば、核磁気共鳴により検出される物質）で標識することによって、腫瘍（特定の癌細胞からなる）を画像化し得る。腫瘍の画像化に使用される放射性同位体としては、例えば、イットリウム、インジウム、テクネチウム等が挙げられる。当業者は、被験体に注射する放射線量を適宜設定することができる。インビトロでの適用においては、本発明のタンパク質は、例えば、特定の細胞に対するマーカーとして使用される。本発明の細胞標識剤は、本発明のタンパク質が特異的に認識する細胞に対して用いられる。
【００１９】
本発明は、配列番号２又は４で示されるアミノ酸からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、好ましくは、配列番号１又は３で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを提供する。本発明はまた、配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ活性形態において細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、配列番号３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、本発明の上記ＤＮＡは、溶血活性を有しないタンパク質をコードする。
【００２０】
さらに、本発明は、上記ＤＮＡのうち少なくとも約２０個、好ましくは約１８個、より好ましくは少なくとも約１６個、最も好ましくは少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを提供する。これらオリゴヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、本発明により提供される。また、本発明は、本発明のＤＮＡを増幅するためのプライマー対を提供する。このプライマー対は各々、センス鎖又はアンチセンス鎖に相補的である、少なくとも２０個以上、好ましくは少なくとも１５個以上のオリゴヌクレオチドの対からなる。
【００２１】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、塩基配列において約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約７５％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらにより好ましくは約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、最も好ましくは約９９％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいう。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション反応や洗浄の際の塩濃度および温度等を適宜変化させることにより調節することができる。例えば、「ストリンジェントな条件」におけるハイブリダイゼーション反応や洗浄の条件の例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ　ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩のインキュベーション、続いて０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィルターを洗浄する条件が挙げられる。尚、相同性の程度は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ検索をデフォルトで使用することによって算定される。
【００２２】
本発明のタンパク質が細胞障害活性を示す細胞は、（ａ）培養培地中で、任意の細胞と上記タンパク質とをインキュベートする工程；及び（ｂ）上記タンパク質が上記細胞に対する細胞障害活性を有するか否かを決定する工程を包含する方法によって同定される。好ましくは、この同定方法は、上記タンパク質が溶血活性を有するか否かを決定する工程をさらに包含していてもよい。例えば、ＭＴＴアッセイ等の方法によって測定する場合に、ネガティブコントロールよりも有意に破壊される細胞を、本発明のタンパク質が細胞障害活性を示す細胞とみなす。ネガティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞障害活性を示さない任意の細胞が挙げられる。また、ポジティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞障害活性を示す任意の細胞が挙げられ、ポジティブコントロールと同程度又はそれよりも破壊される細胞が、本発明のタンパク質が細胞障害活性を示す細胞としてより好ましい。本発明のタンパク質は、例えば、医学的な目的のために、この方法によって同定された細胞に関連する疾患に対して適用される。
【００２３】
本発明のタンパク質が細胞認識活性を示す細胞は、（ａ）培養培地中で、任意の細胞と上記タンパク質とをインキュベートする工程；及び（ｂ）上記タンパク質が上記細胞に対する細胞認識活性を有するか否かを決定する工程を包含する方法によって同定される。好ましくは、この同定方法は、上記タンパク質が溶血活性を有するか否かを決定する工程をさらに包含していてもよい。例えば、免疫沈降アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅを用いた相互作用解析により測定した場合に、ネガティブコントロールよりも有意に認識される細胞を、本発明のタンパク質が細胞認識活性を示す細胞とみなす。ネガティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞認識活性を示さない任意の細胞が挙げられる。当業者は、ネガティブコントロールとして使用し得る細胞を適宜選択することができる。また、ポジティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞認識活性を示す任意の細胞が挙げられ、ポジティブコントロールと同程度又はそれよりも認識される細胞が、本発明のタンパク質が細胞認識活性を示す細胞としてより好ましい。本発明のタンパク質は、例えば、医学的な目的のために、この方法によって同定された細胞に関連する疾患に対して適用される。
【００２４】
本発明はまた、本発明のタンパク質に対して親和性を有する物質を同定する方法を提供する。この方法は、（ａ）上記タンパク質と被験物質とを接触させる工程、及び（ｂ）上記被験物質が、上記タンパク質に対して親和性を有するか否かを決定する工程を包含する。本発明のタンパク質と接触される被験物質の例としては、糖類、脂質、タンパク質、核酸、合成化合物などが挙げられるがこれらに限定されない。また、好ましい親和性としては、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満又は１０−１２Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する親和性が挙げられる。かかる親和性は、例えば、本発明のタンパク質を放射性同位体で標識し、次いで被験物質との結合アッセイ（ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ）に供することにより測定される。本発明のタンパク質と親和性を有する物質は、例えば、本発明のタンパク質を精製する場合に利用される。
【００２５】
本発明はまた、本発明のタンパク質に対して特異的親和性を有する抗体を提供する。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。この抗体は、完全な抗体分子だけでなく、本発明のタンパク質に対する抗原結合部位（ＣＤＲ）を有する限りいかなるフラグメントであってもよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ等が挙げられる。例えば、本発明の抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ等で標識されて、本発明のタンパク質が特定の細胞に結合しているか否かを検出するために使用される。
【００２６】
例えば、ポリクローナル抗体は、本発明の蛋白質あるいはそのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
【００２７】
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法により作成することができる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１，　Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法でも電圧パルス法であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
【００２８】
本発明はまた、本発明のＤＮＡ配列情報及びアミノ酸配列情報を使用して、コンピュータ上で処理する方法をも包含する。本発明は、例えば、本発明のＤＮＡ配列情報及びアミノ酸配列情報を使用して、相同性のあるＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を検索すること（例えば、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡプログラムの使用）を提供する。また、本発明は、分子モデリング及び遺伝子シャッフリング等において、本発明のＤＮＡ配列情報及びアミノ酸配列情報を利用して、より最適な配列情報を入手することを提供する。本発明はさらに、本発明のＤＮＡ配列情報及びアミノ酸配列情報を利用して得られた配列からなるＤＮＡ及びタンパク質に関する。
【００２９】
本発明はまた、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクター及び発現ベクターを提供する。本発明の組換えベクターは原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターやウイルスベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡便には当該技術分野において入手可能な公知のクローニングベクターまたは発現ベクターに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより調製することができる。このようなベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えばｐＢＲ３２２，　ｐＢＲ３２５，　ｐＵＣ１８，　ｐＵＣ１９など、酵母由来プラスミドとして、例えばｐＳＨ１９，　ｐＳＨ１５など、枯草菌由来プラスミドとして、例えばｐＵＢ１１０，　ｐＴＰ５，　ｐＣ１９４　などが挙げられる。バチルス・チューリンジエンシス由来プラスミドとして、ｐＨＴ３１０１、ｐＨＴ３１５などが挙げられる。また、ウイルスとして、λファージなどのバクテリオファージや、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等のパポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）等のレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイルスが例示される。
【００３０】
特に、本発明は、目的の宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが配置された発現ベクターを提供する。使用されるベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得るプロモーター領域（例えば宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｅｃＡプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等、宿主が哺乳動物細胞の場合、ＳＶ４０由来初期プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ由来ロングターミナルリピート、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター）と、該遺伝子の転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが、少なくとも１つの制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターをその箇所のみで切断するユニークな制限部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有していることが好ましい。さらに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含むベクターが好ましく使用される。
【００３１】
宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を包含する。
【００３２】
また、形質転換体の培地中に本発明のタンパク質を分泌させる場合において、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡがシグナルペプチドのコード配列を含まない場合は、ベクターとして、開始コドンに続いて適当なシグナルコドンをさらに含む分泌発現用ベクターが好ましく使用される。
【００３３】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡがゲノミックＤＮＡから単離され、本来のプロモーターおよびターミネーター領域を含む形態で得られる場合には、本発明の発現ベクターは、目的の宿主細胞内で複製保持または自律増殖できる公知のクローニングベクターの適当な部位に該ＤＮＡを挿入することにより調製することができる。
【００３４】
本発明はまた、上記の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体を提供する。本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞あるいは人工的に樹立された変異細胞または組換え細胞など種々の細胞（例えば、細菌（大腸菌、枯草菌、乳酸菌、バチルス・チューリンジエンシスまたはその変異株等（好ましくは、毒素タンパク質（即ち、細胞障害活性を有するタンパク質）を生産しないバチルス・チューリンジエンシス株））、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属、クリベロマイセス属等）、動物細胞または昆虫細胞など）が例示されるが、原核生物細胞がより好ましい。また、本発明のタンパク質を発現するのに適したバチルス・チューリンジエンシス変異株を、当業者は自ら作製することができる。例えば、毒素タンパク質を生産するバチルス・チューリンジエンシス株からキュアリングを行い、プラスミドＤＮＡを除くことによって、毒素タンパク質を生産しないバチルス・チューリンジエンシス株が得られる。当業者は、上記手法を用いて、毒素タンパク質を生産せずに本発明のタンパク質を生産する任意のバチルス・チューリンジエンシス株を取得することができる。詳細については、Ｇｏｎｚａｌｅｚ，　Ｊ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　ＰＬＡＳＭＩＤ　５，　３５１−３６５（１９８１）を参照のこと。
【００３５】
発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌の場合は、Ｃｏｈｅｎ　らの方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　６９，２１１０　（１９７２））、プロトプラスト法、コンピテント法等によって、酵母の場合は、Ｈｉｎｎｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　７５，　１９２７　（１９７８））、リチウム法等によって、動物細胞の場合は、Ｇｒａｈａｍの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　５２，　４５６　（１９７３））等によって、また昆虫細胞の場合は、Ｓｕｍｍｅｒｓ　らの方法（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．３，２１５６−２１６５　（１９８３）　）等によって、それぞれ形質転換することができる。
【００３６】
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を発現する細胞から得られる。本発明のタンパク質を発現する細胞としては、例えば、本発明のタンパク質を天然で発現する細胞（好ましくは、バチルス・チューリンジエンシスＡ１５４７株）、及び本発明のタンパク質を発現するＤＮＡをコードする発現ベクターを含有する形質転換体が挙げられる。本発明のタンパク質は、上記のようにして調製される発現ベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から本発明のタンパク質を回収することによって製造することができる。また、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を天然で発現する細胞（好ましくは、バチルス・チューリンジエンシスＡ１５４７株）を培養し、得られる培養物から本発明のタンパク質を回収することによって得られる。好ましくは、本発明のタンパク質は、アルカリ緩衝液での可溶化後に、必要に応じてプロテアーゼによって処理されて、活性化されてもよい。
【００３７】
使用される培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばテトラサイクリン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでいてもよい。
【００３８】
培養は当分野において知られている方法により行われる。下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、本発明における培養条件はこれらに何ら限定されるものではない。
【００３９】
宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌等である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒ．　Ｊ．，　Ｅｘｐ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ，　ｐ．４３１，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７２））等が例示される。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常１４〜４３℃で約３〜２４時間行うことができる。宿主が枯草菌の場合、必要により通気・攪拌をしながら、通常３０〜４０℃で約１６〜９６時間行うことができる。宿主がバチルス・チューリンジエンシス又はその変異株（好ましくはバチルス・チューリンジエンシスＢＦＲ１）の場合、好ましい培地としては、ＣＹＳ培地（Ｙａｍａｍｏｔｏ，　Ｔ．，　ＡＣＳ　Ｓｙｍｐ．　Ｓｅｒ．　４３２，　４６−６０（１９９０））が挙げられる（この場合、培養は、例えば、寒天平板上で２０℃で９６時間行なわれる）。宿主が酵母の場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最少培地（Ｂｏｓｔｉａｎ．　Ｋ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７７，　４５０５　（１９８０））が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００４０】
宿主が動物細胞の場合、培地として、例えば約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１２２，　５０１　（１９５２））、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　８，　３９６　（１９５９）　）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．　Ａｍ．　Ｍｅｄ．　Ａｓｓｏｃ．，　１９９，　５１９　（１９６７）　）、１９９培地（Ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｅｘｐ．　Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ．，　７３，　１　（１９５０））等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００４１】
本タンパク質の精製は、通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。本発明のタンパク質は、例えば、塩析、溶媒沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことにより得ることができる。
【００４２】
本発明の組換えタンパク質を迅速且つ簡便に取得する手段として、本発明のタンパク質のコード配列のある部分（好ましくはＣ末端）に、金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列（例えば、ヒスチジン、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸からなる配列、好ましくはヒスチジンからなる配列）をコードするＤＮＡ配列を、遺伝子操作により付加して宿主細胞で発現させ、該細胞の培養物の上記活性画分から、該金属イオンキレートを固定化した担体とのアフィニティーにより本発明のタンパク質を分離回収する方法が好ましく例示される。金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングする過程で、このタンパク質のＣ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に該ＤＮＡ配列を連結したハイブリッドプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ったり、あるいは該ＤＮＡ配列を終止コドンの前に含む発現ベクターに本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをインフレームで挿入することにより、コード配列に導入することができる。また、精製に使用される金属イオンキレート吸着体は、遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル、鉄の二価イオン、あるいは鉄、アルミニウムの三価イオン等、好ましくはコバルトまたはニッケルの二価イオン含有溶液を、リガンド、例えばイミノジ酢酸（ＩＤＡ）基、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）基、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）基等を付着したマトリックスと接触させて該リガンドに結合させることにより調製される。キレート吸着体のマトリックス部は通常の不溶性担体であれば特に限定されない。
【００４３】
本発明は、本発明のタンパク質、発現ベクターまたは形質転換体を有効成分とする医薬組成物、具体的には、抗癌剤及び細胞標識剤を提供する。本発明はまた、免疫異常疾患治療剤、好ましくは白血病治療剤を提供する。本発明のタンパク質は、正常な免疫系細胞よりも異常な免疫系細胞（好ましくは白血病Ｔ細胞及び前骨髄性細胞）に対して、より低用量で細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を示すため、これらに起因する疾患の治療に有用である。
【００４４】
本明細書中で用いられる用語「組成物」又は「剤」とは、特定の物質を有効成分として含有することを特徴とするものをいう。例えば、本発明の医薬組成物は、有効成分として本発明のタンパク質を含有し、特定の疾患の治療効果を奏する。このような医薬組成物は、有効成分としての本発明のタンパク質を、経口又は非経口適用に適した有機または無機の担体又は賦形剤との混合物として含有する固体、半固体又は液体形態の医薬製剤の形で使用できる。該有効成分は、例えば、散剤、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、坐剤、液剤、乳濁液、懸濁液、エアロゾル剤、スプレー剤、その他の使用に適した形態用の、通常の、無毒性で、医薬として許容しうる担体と混ぜ合わせることができる。更に、必要ならば、助剤、安定剤、増粘剤等を使用してもよい。これらの担体、賦形剤は、必要に応じて無菌化処理を施したものを使用してもよく、また製剤化した後に無菌化処理を行なうこともできる。有効成分である本発明のタンパク質の治療上有効な用量は、その精製度、活性及び投与法、並びに処置すべき個々の患者の年齢、健康状態、体重、性別及び疾患の種類によっても相違するが、当業者は、それらの因子を考慮して、用量を適宜決定することができる。
【００４５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００４６】
［材料］
実験に用いた細胞を以下から購入した。ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸部癌細胞）、Ｓａｗａｎｏ細胞（ヒト子宮内膜腺癌細胞）、ＴＣＳ細胞（ヒト角化型扁平上皮癌細胞）、ＨｅｐＧ２細胞（肝臓癌細胞）、Ｔ−ｃｅｌｌ（正常Ｔ細胞）、ＭＯＬＴ−４細胞（ヒト白血病Ｔ細胞）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒト白血病Ｔ細胞）、ＨＬ６０細胞（ヒト前骨髄性白血病細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞）、Ａ５４９細胞（ヒト肺癌細胞）、ＣＡＣＯ−２細胞（ヒト結腸癌細胞）、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）及びＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス胎児由来繊維芽細胞）を理化学研究所から購入した。ＵｔＳＭＣ細胞（ヒト正常子宮平滑筋細胞）を宝酒造株式会社から購入した。ＨＣ細胞（ヒト正常肝細胞）をセルシステムズ社から購入した。ヒツジ血液を、日本バイオテスト研究所から購入した。
【００４７】
［実施例１：毒素タンパク質の同定］
１．１．菌株の培養
土壌から単離されたＡ１５４７株（鞭毛抗原血清型：ｄａｋｏｔａ（Ｈ１５））（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０４６）を培養した。具体的には、栄養培地（１％肉エキス、１％ポリペプトン、０．２％ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）で３７℃にて７日間培養後、４℃にて３日間さらに培養した。
【００４８】
１．２．結晶タンパク質の調製と活性化
上述のように培養された菌株を集菌し、洗浄した後に、純水に懸濁した。凍結融解により菌体を破壊後、デキストラン／ポリエチレングリコールを用いた２層分離法により結晶タンパク質を調製した。結晶タンパク質が１ｍｇ／ｍｌになるよう純水に懸濁させ、−２０℃で保存した。
次いで、調製した結晶タンパク質を１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ存在下に５０ｍＭ　Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ１０．０）で３７℃にて１時間処理し可溶化した。遠心分離（１，３００×ｇ、１５分間）により不溶物を除いた上清に、種々の濃度のプロテイナーゼＫを加えプロセシング（３７℃、３０分間）を行なった後、ＰＭＳＦ（終濃度１ｍＭ）により反応を停止し、この結晶タンパク質を活性化させた。（ｉ）調製した結晶タンパク質、（ｉｉ）可溶化された結晶タンパク質、（ｉｉｉ）可溶化後にさらに種々の濃度のプロテイナーゼＫで処理した結晶タンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動パターンとＭＯＬＴ−４細胞に対する毒性との関係を図１に示す。尚、ＭＯＬＴ−４細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ウシ胎児血清添加）にて３７℃で培養したものを用いた。また、細胞生存率の測定は、ＭＴＴ法による細胞呼吸活性測定により評価した。具体的には、ＭＯＬＴ−４細胞を２×１０４個含んだ懸濁液９０μｌを９６穴プレートで１２時間培養したものに、上記の結晶タンパク質を添加した後、ＭＴＴ　１５μｌを添加して３７℃、２時間インキュベートし不溶性のホルマザン色素を溶かし、５７０ｎｍの吸光度を測定した。
図１に示される結果から、結晶タンパク質は極めて多種類のタンパク質から構成されているが、アルカリでの可溶化により数種類のタンパク質が主成分となることが理解される。また、これらのタンパク質は細胞障害活性を有しないが、プロテイナーゼＫ（１０μｇ／ｍｌ）での消化によって細胞障害活性を示すようになることが確認された。
【００４９】
１．３．ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製
上記の結果は、プロテイナーゼＫ（１０μｇ／ｍｌ）処理の画分中に、細胞障害活性を有するタンパク質（即ち、毒素タンパク質）が含まれることを示す。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果により、この画分は、数種類のタンパク質の混合物からなることが理解される。従って、毒素タンパク質を同定するため、さらなる精製を試みた。まず、プロテイナーゼＫ（１０μｇ／ｍｌ）処理画分をセルロファインＧＣ−７００のゲルろ過クロマトグラフィーにかけた（図２）。その結果、細胞障害活性はフラクション２０前後が最も高いことが明らかとなった。一方、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動パターンに着目すると、見かけの分子量約３０ｋＤａのタンパク質（図２において＊で示す）が、フラクション２０前後において最も多量に存在した。さらに、図２の結果により、このタンパク質の量と細胞障害活性との間に相関関係があることが示された。以上の結果より、約３０ｋＤａ（見かけの分子量）のタンパク質が、細胞障害活性を有することが示唆された。
【００５０】
１．４．陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製
ゲルろ過後の標品においても混入タンパク質が認められたので、単一のタンパク質として得るため、さらに陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行なった（図３）。具体的には、ゲルろ過クロマトグラフィー精製後の活性画分をＤＥ５２カラムにかけ、０ｍＭから５００ｍＭまでの濃度のＮａＣｌを用いてステップワイズ溶出を行なった。その結果、２０ｍＭ　ＮａＣｌ溶出画分のみに細胞障害活性が認められた。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を参照すると、約３０ｋＤａのタンパク質が、この画分にのみ含まれることが明らかとなった。従って、以上の結果から、約３０ｋＤａのタンパク質が細胞障害活性を有することが明らかとなった。なお、６０ｋＤａ付近にバンドが見られるが、このバンドはＳＤＳ電気泳動上のアーティファクトと考えられる。
【００５１】
１．５．毒素タンパク質のアミノ末端アミノ酸配列の決定
次いで、このタンパク質のｃＤＮＡをクローニングするため、アミノ末端部のアミノ酸配列を決定した。初めに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ブロッティングした後、目的タンパク質を切り取り、アミノ酸シーケンサーにアプライした。その結果、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−（配列番号６）の配列が得られた。この配列はこれまでのデータベースには見当たらず、新規タンパク質であると考えられた。
【００５２】
〔実施例２：毒素タンパク質をコードする遺伝子のクローニング〕
実施例１に記載されるように、このタンパク質のｃＤＮＡをクローニングするため、アミノ末端部のアミノ酸配列を決定した。初めに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ブロッティングした後、目的タンパク質を切り取り、アミノ酸シーケンサーにアプライした。その結果、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−（配列番号６）の配列が得られた。この配列はこれまでのデータベースには見当たらず、新規タンパク質であると考えられた。
上記のアミノ末端アミノ酸配列に基づき、以下に示される２種類の縮退オリゴヌクレオチドを作成した。設計の概要については図４に示す。
５’−ＧＡＹＧＴＮＡＴＨＹＧＮＧＡＲＴＡ−３’（配列番号７）
５’−ＴＴＲＡＡＣＡＴＮＡＲＲＴＡＹＴＣＮＣ−３’（配列番号８）
【００５３】
次いで、プラークハイブリダイゼーション法において、これらのオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、Ａ１５４７株由来の遺伝子ライブラリーから目的遺伝子のスクリーニングを行なった。
プラークハイブリダイゼーションを行なった結果、１次スクリーニングにおいてポジティブと思われた１０個のプラークのうち、２次スクリーニングにおいてシグナルが検出されたプラークは３個であった。従って、それらのうちの１個について詳細な解析を進めた。
【００５４】
得られたＤＮＡの制限酵素マップに従いサブクローニングした断片の中で、ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩの断片が、用いたオリゴプローブに対しサザンハイブリダイゼーションでポジティブな結果を示した。よって、この部分にアミノ末端があると考え、この部分を中心に塩基配列を決定した。得られた塩基配列及びアミノ酸配列を図５に示す。活性化タンパク質（プロテイナーゼＫ処理により切断されたもの）のアミノ末端から８６４塩基下流に終止コドンが、１５３塩基上流に開始メチオニンコドンが確認され、また、開始メチオニンの１２塩基上流にＳＤ配列と思われる塩基配列ＧＧＡＧＧも確認された（図５（Ａ）及び（Ｂ））。今回同定されたタンパク質のコード領域は３３８個のアミノ酸からなり、それらから推定される分子量は３７ｋＤａであった。また、活性化後のタンパク質は、２８７個のアミノ酸からなり、その分子量は３１ｋＤａと推定された。従って、ＳＤＳ電気泳動上での見かけの分子量（約３０ｋＤａ）を支持する結果が得られた。
【００５５】
上記のアミノ酸配列について、データベースにより相同性検索を行なったところ、チョウやガ等の鱗翅目に毒性を示す約３４ｋＤａのタンパク質であるｃｒｙ１５Ａタンパク質と高い相同性が認められた（図６）。特に、その前半部約１５０アミノ酸部と２４％の相同性、４１％の類似性が認められた。
【００５６】
［実施例３：種々の細胞株に対する活性化タンパク質の効果］
次いで、種々の細胞株を表１に示される条件で培養し、それら培養された各細胞について、活性化タンパク質の細胞障害活性を、ＭＴＴ法による細胞生存率で測定した。結果を表２に示す。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
【表２】
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【００５９】
この表２に示される結果から、本発明の活性化タンパク質は、特定の細胞を特異的に認識することが明らかとなった。また、本発明の活性化タンパク質は、これらの認識した細胞に対して細胞障害性を示すことが明らかになった。
【００６０】
［実施例４：溶血活性の測定］
ヒツジ血液を、赤血球濃度２％（ｖ／ｖ）になるよう２０ｍＭトリス緩衝液で調製した。この２％（ｖ／ｖ）赤血球溶液４０μｌに対し実施例１で調製した活性化タンパク質溶液を２０μｌずつ添加し、２７℃で１８時間放置した。さらに８００×ｇで１０分間遠心した上清の吸光度（５４０ｎｍ）を測定した。対照実験では、タンパク質溶液の代わりに２０ｍＭトリス緩衝液を添加した。対照実験での吸光度と比較して吸光度差が０．５以下の場合に、溶血活性がないものとした。その結果、上記活性化タンパク質は、ヒツジ赤血球に対する溶血活性を有しないことが明らかになった。
【００６１】
【発明の効果】
本発明は、細胞認識活性及び／又は細胞障害活性を有するタンパク質について遺伝子レベル、分子レベルでの研究開発を可能にする。本発明はまた、それらのタンパク質の大量生産技術も確立することができる。従って、本発明は、薬学分野におけるＤＤＳ技術の開発、診断薬の開発、農林水産分野における特定の細胞の開発、組織の選択的破壊による動植物の育種、さらに化学工業分野における新規有害生物制御剤の開発等、幅広い分野の技術に関して大いに貢献するものと考えられる。本発明のタンパク質はまた、選択性が非常に高いため、特定の細胞を特異的に認識及び／又は破壊するために有用である。また、本発明のタンパク質は、特定の癌細胞に対する特異性が高いことから、医薬組成物（具体的には、抗癌剤及び細胞標識剤）として有用である。
【００６２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号７：配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号８：配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ
【００６３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１（Ａ）は、（ｉ）調製した結晶タンパク質、（ｉｉ）可溶化された結晶タンパク質、（ｉｉｉ）可溶化後にさらに種々の濃度のプロテイナーゼＫで処理した結晶タンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動パターンを示す。
図１（Ｂ）は、（ｉ）調製した結晶タンパク質、（ｉｉ）可溶化された結晶タンパク質、（ｉｉｉ）可溶化後にさらに種々の濃度のプロテイナーゼＫで処理した結晶タンパク質についてのＭＯＬＴ−４細胞に対する毒性を示す。
【図２】図２（Ａ）は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製における各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンを示す。
図２（Ｂ）は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製における各フラクションの細胞障害活性を示す。
【図３】図３（Ａ）は、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製における各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンを示す。
図３（Ｂ）は、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製における各フラクションの細胞障害活性を示す。
【図４】図４は、毒素タンパク質のＮ末端アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ設計の概要を示す。
【図５】図５（Ａ）は、毒素タンパク質をコードする遺伝子の構成を示す。
図５（Ｂ）は、毒素タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。ここで、配列番号１は、図５Ｂに示される３３８個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列に対応し、配列番号２は、該タンパク質のアミノ酸配列に対応する。また、配列番号３は、活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列（下線部）に対応し、配列番号４は、該活性化タンパク質のアミノ酸配列（下線部）に対応する。一方、配列番号５は、図５Ｂに示される全ヌクレオチド配列に対応する。
【図６】図６は、毒素タンパク質とＣｒｙ１５Ａタンパク質との間のアミノ酸配列の比較を示す。なお、図中のＣｒｙ３０Ｋは、本発明の毒素タンパク質を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月6日(2002.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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