(57)【要約】【課題】細胞を劣化させることなく、感染検査の信頼性を向上する。【解決手段】培地を貯留した培養容器内において、所定の培養期間にわたり、細胞を培養する培養方法であって、培養期間の終了時から所定時間前に、培養された細胞の一部を取り出す（Ｓ８）とともに、その後、培養期間の終了時までの間、培養容器内への外部からの物質の供給を遮断して培養を継続する培養方法を提供する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地を貯留した培養容器内において、所定の培養期間にわたり、細胞を培養する培養方法であって、
前記培養期間の終了時から所定時間前に、培養された細胞の一部を取り出すとともに、その後、培養期間の終了時までの間、培養容器内への外部からの物質の供給を遮断して培養を継続する培養方法。
【請求項２】
培地を貯留した培養容器内において、所定の培養期間にわたり、生体組織補填材に付着させた細胞を培養する培養方法であって、
前記培養期間の終了時から所定時間前に、培養された細胞の一部を取り出すとともに、その後、培養期間の終了時までの間、培養容器内への外部からの物質の供給を遮断して培養を継続する培養方法。
【請求項３】
供給を遮断される物質が新たな培地のみである請求項１または請求項２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記所定時間が、細胞の検査に必要な検査期間である請求項１から請求項３のいずれかに記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞を培養するために用いられる培養方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。培養されることにより骨補填材を足場にして増殖した多くの骨髄間葉系細胞を含む培養骨を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
【非特許文献１】
植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、培養された細胞を患者の欠損部に補填するには、当該細胞が細菌やウィルスに感染していないことを充分に確認してから補填する必要がある。このため、培養された細胞に対しては、多数項目に及ぶ検査が必要であり、最終的な検査結果を得るまでには、比較的長時間を要する。
【０００６】
すなわち、培養終了後の細胞から検査用の細胞を採取して検査を行う場合には、検査結果がでるまで出荷を停止しておく必要があり、その間における細胞の劣化が問題となる。一方、培養途中において検査用の細胞を採取する場合には、その後の培養工程において混入した新たな細菌やウィルス等を発見する機会が無くなるという不都合がある。
【０００７】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞を劣化させることなく、確実に感染検査を実施することを可能とする培養方法を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、培地を貯留した培養容器内において、所定の培養期間にわたり、細胞を培養する培養方法であって、前記培養期間の終了時から所定時間前に、培養された細胞の一部を取り出すとともに、その後、培養期間の終了時までの間、培養容器内への外部からの物質の供給を遮断して培養を継続する培養方法を提供する。
【０００９】
この発明によれば、培養途中において細胞の一部が取り出されるので、その取り出された細胞を検査工程に送り、残りの細胞の培養を継続することで、細胞の劣化を防止することが可能となる。この場合において、細胞の一部が取り出された後の培養工程では、培養容器内への外部からの物質の供給が遮断されるので、新たな感染源が培養中の細胞に混入する機会を無くすことが可能となる。
【００１０】
請求項２に係る発明は、培地を貯留した培養容器内において、所定の培養期間にわたり、生体組織補填材に付着させた細胞を培養する培養方法であって、前記培養期間の終了時から所定時間前に、培養された細胞の一部を取り出すとともに、その後、培養期間の終了時までの間、培養容器内への外部からの物質の供給を遮断して培養を継続する培養方法を提供する。
【００１１】
この発明によれば、上記と同様にして、細胞の劣化を防止しながら、新たな感染源の混入を防止し、検査される細胞と同じ細胞を備えた生体組織補填体を製造することが可能となる。
【００１２】
請求項３に係る発明は、請求項１または請求項２に記載の培養方法において、供給を遮断される物質が新たな培地のみである培養方法を提供する。
この発明によれば、細胞の一部を取り出した後、残りの細胞に対する培養工程においては、培養容器内へ新たな培地の供給を遮断することを除き、他の培養条件が維持される。したがって、細胞取り出し前に、充分な量の、あるいは充分な栄養分を含有した培地を培養容器内に貯留しておくことにより、新たな培地の供給無しに、培養期間終了時まで、細胞の健全な培養状態を維持することが可能となる。
【００１３】
請求項４に係る発明は、請求項１から請求項３のいずれかに記載の培養方法において、前記所定時間が、細胞の検査に必要な検査期間である培養方法を提供する。
この発明によれば、一部の細胞を取り出す時期を、培養期間の終了時から当該細胞の検査に必要な検査期間だけ前に設定することにより、細胞あるいは生体組織補填体の出荷段階において、細胞の検査結果を同時に得ることが可能となる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明の各実施形態に係る培養方法について説明する前に、生体組織補填体としての骨補填体の製造工程について概略的に説明する。骨補填体を製造するには、図２に示されるように、まず、患者の腸骨等から骨髄液を採取する。採取された骨髄液は遠心分離機にかけられて、旋回されることにより、比重の重い骨髄細胞を抽出される。
【００１５】
抽出された骨髄細胞は、予め調製されている培地とともに培養容器内に投入され混合される。培地の一部は取り出されて感染検査に回される。
この後に、混合された骨髄液および培地を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）およびＣＯ２濃度（例えば、５％）等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が一次培養される。細胞の培養途中の所定の交換時期には、培養容器内から培地が廃棄される。そして、再度培地を混合されて培養工程が繰り返し継続される。廃棄された培地の一部は感染検査に回される。
【００１６】
所定の培養期間が終了すると、培養容器内から培地が廃棄された後に、培養容器内にトリプシンのような蛋白質分解酵素が投入・混合される。これにより、培養容器の底面に付着して成長していた間葉系幹細胞が、主培養容器の底面から剥離される。そして、このように剥離された間葉系幹細胞は、遠心分離機にかけられることにより抽出される。
【００１７】
抽出された間葉系幹細胞は、細胞数調整が行われた後に、骨補填材と適当な培地が投入された培養容器内に混合される。実際には、間葉系幹細胞を骨補填材に付着させ、培地内に投入する。そして、上記と同様にして、混合された間葉系幹細胞と培地を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）およびＣＯ２濃度（例えば５％）等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が二次培養される。
【００１８】
二次培養工程においても、一次培養工程と同様にして、定期的に培地の交換が行われ、投入される培地の一部および廃棄される培地の一部がそれぞれ、感染検査に回される。そして、所定の培養期間が経過したところで、出荷用の品質検査と感染検査のための検体抽出が行われ、製造された骨補填材は密封されて製品として提供される。
【００１９】
以下に説明するこの発明の一実施形態に係る培養方法は、上述した培養工程の内、二次培養工程において行われるものとして説明するが、一次培養工程において行われてもよい。
【００２０】
この発明の一実施形態に係る培養方法について、図１を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る培養方法は、骨髄液から抽出され、一次培養工程において充分な細胞数まで増殖した間葉系幹細胞を培養容器内に、骨補填材および適当な培地とともに投入し、所定の培養条件において所定の培養期間にわたり行われる培養工程（Ｓ２）を備えている。培養工程（Ｓ２）を開始するに際しては、細胞が出荷検査に送られているか否かを示すフラグＫＥＮＳＡが０に設定される（Ｓ１）。
【００２１】
骨補填材は、例えば、ブロック状のβリン酸三カルシウム多孔体である。なお、これに代えて、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。
【００２２】
また、培地としては、例えば、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）、抗生剤を所定の配合比率で混合したものである。また、成長因子、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を混合することにしてもよい。また、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤を混合することにしてもよい。
なお、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。
また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
【００２３】
また、図１に示されるように、本実施形態に係る培養方法は、培養終了時期の３日（所定時間）前に達したか否かを判断する第１の判断ステップ（Ｓ３）と、培養終了時期に達したか否かを判断する第２の判断ステップ（Ｓ４）と、出荷検査工程が行われているか否かを判断する第３の判断ステップ（Ｓ５）と、培地交換時期に達したか否かを判断する第４の判断ステップ（Ｓ６）とを備えている。
第１の判断ステップ（Ｓ３）において、培養終了時期の３日前ではないと判断されたときには、第２の判断ステップ（Ｓ４）に進んで、培養終了時期か否かが判断される。
【００２４】
第１の判断ステップ（Ｓ３）において、培養終了時期の３日前に達したと判断されたときには、細胞の一部抽出ステップ（Ｓ８）に進む。細胞の一次抽出ステップ（Ｓ８）においては、骨補填材を足場にして成長している培養中の細胞の一部が培養容器内から取り出される。取り出された細胞は、図示しない検査工程に送られる。取り出された細胞が検査工程に送られた場合には、フラグＫＥＮＳＡが１に設定される（Ｓ９）。
【００２５】
第２の判断ステップ（Ｓ４）において、培養終了時期である場合には、全ての培養工程が終了するが、培養終了時期でない場合には、第３の判断ステップに（Ｓ５）に進んで、検査工程が行われているか否かが判断される。
第３の判断ステップ（Ｓ５）において、フラグＫＥＮＳＡが１である場合、すなわち、既に検査工程が行われていると判断された場合には、培地交換時期であるか否かが判断されることなく培養工程（Ｓ２）に戻される。
【００２６】
また、第３の判断ステップ（Ｓ５）において、検査工程が行われていないと判断された場合には、第４の判断ステップ（Ｓ６）に進んで培地の交換時期に達したか否かが判断される。
培地の交換時期である場合には、培養容器内の培地が排出されるとともに、該培養容器に接続された培地容器から新たな培地が供給される。培地の交換時期は、例えば、培養開始後１，３，６，８日目である。培地交換時期ではない場合には、培養ステップ（Ｓ２）に戻って培養工程が続行される。
【００２７】
この場合において、第１の判断ステップ（Ｓ３）において、一旦、培養期間終了３日前であると判断された後は、その後に培地交換時期に達したとしても培地交換ステップ（Ｓ７）に移行しないようになっているので、一部の細胞が抽出された後の残りの細胞に対しては、何ら新たな物質が加えられることがない。
【００２８】
すなわち、培養容器内から抽出されて検査工程に送られた一部の細胞と、培養容器内に残って培養期間終了まで培養された残りの細胞とは、外部からの細菌やウィルス等の感染という観点からみて全く同一の条件下に配されていると考えることができる。したがって、抽出した一部の細胞を検査することが、外部からの細菌やウィルス等の感染に関してみれば、他の全ての細胞について検査することと同視できるので、検査結果の信頼性を向上することができる。
【００２９】
検査用の細胞が培養終了時期の３日前に抽出されるので、充分な検査期間を確保して、残りの細胞の培養終了時には、検査結果を揃えることができることになる。なお、３日としたのは、充分な検査結果を確保するためであるが、検査手法の進歩に合わせて、適宜調整して適正な検査期間を確保することにしてもよい。
【００３０】
また、検査用の細胞が抽出された後の残りの細胞については、培養が中止されるのではなく、外部からの物質の供給を遮断した状態で継続されるので、検査期間中に細胞が劣化する等の不都合を生ずることなく、健全な骨補填体を提供することが可能となる。
なお、細胞を培養容器内において密封状態のまま細胞を培養する手法としては、充分な量または充分な栄養分を備えた培地を培養容器内に貯留しておくことの他、製造された骨補填体をポリフェノール内に投入しておく手法も考えられる。
【００３１】
なお、この実施形態においては、生体組織として骨を例に挙げ、骨髄液から抽出して培養した間葉系幹細胞を培養する場合について説明したが、骨髄液のみならず末梢血や臍帯血から抽出することにしてもよい。また、間葉系幹細胞に限定されるものではなく、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の体細胞の培養にも使用できる。
【００３２】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明によれば、培養された細胞への細菌やウィルス等の感染についての検査結果が出揃う時点で、細胞の培養が終了するので、製造された培養細胞または生体組織補填体をその検査結果とともに出荷することができる。その結果、製品としての培養細胞または生体組織補填体の信頼性を向上することができる。また、検査を行っている間においても細胞が劣化することがないので、健全な培養細胞または生体組織補填体を提供することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施形態に係る培養方法を示すフローチャートである。
【図２】この発明を適用する培養工程を説明する説明図である。
【符号の説明】
Ｓ２　培養ステップ
Ｓ３　第１の判断ステップ
Ｓ４　第２の判断ステップ
Ｓ６　第４の判断ステップ
【図１】
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【図２】
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