(57)【要約】【課題】イチジクの不定根及び不定芽を得る。【解決手段】フロログルシノールの存在下でイチジク由来の組織片を培養することで不定根を誘導でき、また、フロログルシノール及びサイトカイニンの存在下で当該組織片を培養することで不定芽を誘導できる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イチジク（フィカス・カリカ（Ｆｉｃｕｓ　ｃａｒｉｃａ　Ｌ．））由来の組織片を、フロログルシノール存在下にて培養することを特徴とするイチジクの不定根誘導方法。
【請求項２】
フロログルシノールの濃度を０．１〜１．０ｍＭの範囲とすることを特徴とする請求項１記載のイチジクの不定根誘導方法。
【請求項３】
フロログルシノールを有効成分とするイチジクの不定根誘導剤。
【請求項４】
イチジク（フィカス・カリカ（Ｆｉｃｕｓ　ｃａｒｉｃａ　Ｌ．））由来の組織片を、フロログルシノール及びサイトカイニン存在下にて培養することを特徴とするイチジクの不定芽誘導方法。
【請求項５】
フロログルシノールの濃度を０．１〜１．０ｍＭの範囲とし、サイトカイニンの濃度を０．０１〜１０．０　ｐｐｍの範囲とすることを特徴とする請求項４記載のイチジクの不定芽誘導方法。
【請求項６】
上記サイトカイニンがチジアズロンであることを特徴とする請求項４又は５記載のイチジクの不定芽誘導方法。
【請求項７】
フロログルシノール及びサイトカイニンを有効成分とするイチジクの不定芽誘導剤。
【請求項８】
上記サイトカイニンがチジアズロンであることを特徴とする請求項７記載のイチジクの不定芽誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イチジク（フィカス・カリカ（Ｆｉｃｕｓ　ｃａｒｉｃａ　Ｌ．））の不定根及び不定芽の誘導方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、いくつかの果樹で不定芽、不定根ならびに不定胚が植物片より誘導され、さらにはアグロバクテリウム法によって遺伝子組換え体の作出が報告されている。しかし、イチジクでは、これまで不定芽誘導、不定胚誘導やプロトプラストからの植物体再生した報告例はない。したがって、イチジクに関しては、遺伝子組換え体の作出技術が確立されていない。
【０００３】
イチジクは近年生長著しい樹種の一つであるが、耐病性や耐寒性などの克服や生理機能の解明のためには、遺伝子組換え体の作出技術の確立が不可欠である。イチジク（Ｆｉｃｕｓ　ｃａｒｉｃａ　Ｌ．）の組織培養では、成長点培養（非特許文献１、２及び３参照）、腋芽培養（非特許文献４参照）、花蕾からのシュート形成（非特許文献５及び６参照）の報告がある。しかしながら、いずれの方法も器官形成を伴っていない。加えて、プロトプラストからの植物体再生や不定胚誘導についても報告はない。
イチジクに関する不定芽・不定根誘導技術の確立によって、遺伝子組換え体作出技術の重要な制約条件を解決でき、今後のイチジク遺伝子組換え技術の中核技術の一つになり得る。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｍｕｒｉｉｔｈｉ　ＬＭ，　Ｒａｎｇａｎ　ＴＳ，　Ｗａｉｔｅ　ＢＨ　（１９８２）　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｉｇ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｈｏｏｔ　ｔｉｐ　ｃｕｌｔｕｒｅ．　ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ　１７：　８６−８７．
【非特許文献２】
Ｐｏｎｔｉｋｉｓ　ＣＡ，　Ｍｅｌａｓ　Ｐ　（１９８６）　Ｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｉｃｕｓ　ｃａｒｉｃａ　Ｌ．　ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ　２１：　１５３．
【非特許文献３】
古川　真（１９９６）　イチジクにおける生長点培養について．平成８年度園芸学会近畿支部研究発表要旨：４．
【非特許文献４】
Ｋｕｍａｒ　Ｖ，　Ｒａｄｈａ　Ａ，　Ｋｕｍａｒ　Ｃｈｉｔｔａ　Ｓ　（１９９８）　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐｌａｎｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆｆｉｇ　（Ｆｉｃｕｓ　ｃａｒｉｃａ　Ｌ．　ｃｖ．　ｇｕｌａｒ）　ｕｓｉｎｇ　ａｐｉｃａｌ　ｂｕｄｓ　ｆｒｏｍ　ｍａｔｕｒｅ　ｔｒｅｅｓ．　Ｐｌａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１７：　７１７−７２０．
【非特許文献５】
宇都宮直樹・高野秦信・中原　香（１９９６）Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのイチジク花蕾からのシュート形成．平成８年度園芸学会近畿支部研究発表要旨：２．
【非特許文献６】
仙頭　愛・神崎真哉・高松善博・宇都宮直樹（２０００）Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ下におけるイチジク幼果からのシュート形成に関する研究．園芸学会雑誌（別冊２）６９：１３０．
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、イチジクの不定根及び不定芽を得ることができる全く新規なイチジクの不定根誘導方法及び不定根誘導剤、並びにイチジクの不定芽誘導方法及び不定芽誘導剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、フロログルシノールの存在下でイチジク由来の組織片を培養することで不定根を誘導でき、また、フロログルシノール及びサイトカイニンの存在下で当該組織片を培養することで不定芽を誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
【０００７】
（１）　イチジク（フィカス・カリカ（Ｆｉｃｕｓ　ｃａｒｉｃａ　Ｌ．））由来の組織片を、フロログルシノール存在下にて培養することを特徴とするイチジクの不定根誘導方法。
（２）　フロログルシノールの濃度を０．１〜１．０ｍＭの範囲とすることを特徴とする（１）記載のイチジクの不定根誘導方法。
（３）　フロログルシノールを有効成分とするイチジクの不定根誘導剤。
【０００８】
（４）　イチジク（フィカス・カリカ（Ｆｉｃｕｓ　ｃａｒｉｃａ　Ｌ．））由来の組織片を、フロログルシノール及びサイトカイニン存在下にて培養することを特徴とするイチジクの不定芽誘導方法。
（５）　フロログルシノールの濃度を０．１〜１．０ｍＭの範囲とし、サイトカイニンの濃度を０．０１〜１０．０　ｐｐｍの範囲とすることを特徴とする（４）記載のイチジクの不定芽誘導方法。
【０００９】
（６）　上記サイトカイニンがチジアズロンであることを特徴とする（４）又は（５）記載のイチジクの不定芽誘導方法。
（７）　フロログルシノール及びサイトカイニンを有効成分とするイチジクの不定芽誘導剤。
（８）　上記サイトカイニンがチジアズロンであることを特徴とする（７）記載のイチジクの不定芽誘導剤。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
イチジクの不定根を誘導するには、先ず、イチジクから採取した組織片をフロログルシノール存在下で培養する。一方、イチジクの不定芽を誘導するには、先ず、イチジクから採取した組織片をフロログルシノール及びチジアズロン存在下で培養する。すなわち、イチジクから採取した組織片をフロログルシノール存在下で培養することで不定根を誘導することができ、当該組織片をフロログルシノール及びチジアズロン存在下で培養することで不定芽を誘導することができる。
ここで、イチジクとは、学名をフィカス・カリカ（Ｆｉｃｕｓ　ｃａｒｉｃａ　Ｌ．）とするものであり、フィカス・カリカに属するものであれば如何なる細分類に属するものであってもよい。
【００１１】
組織片としては、例えば、イチジクの成長点培養から継代培養中植物の葉片を用いることができる。その他、組織片としては、イチジク植物体の如何なる器官から採取しても良い。例えば、葉、葉柄、種子胚、果柄、花托、花、花柄、又は根などの組織片を用いることができる。また、採取した組織片を滅菌処理したもの、あるいは、無菌幼苗、当該無菌幼苗を育成させたイチジク植物体の芽、根、根茎、葉柄又は葉の切片などが好適に利用される。これらの中でも、特に葉の組織片が好ましい。
【００１２】
一方、組織片を培養するための培地としては、植物の組織培養に一般的に用いられる培地であれば如何なる培地を使用することができる。具体的に培地としては、例えば、ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ）培地、ＬＳ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ　＆　Ｓｋｏｏｇ）培地、Ｂ５培地、Ｎｉｔｓｃｈ＆Ｎｉｔｓｃｈ培地、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｔｕｌｅｅｋｅ培地及びこれらの改変培地などを用いることができる。
【００１３】
特に、不定根を誘導する場合、フロログルシノールを含む培地を用いる。フロログルシノールとしては、市販品、合成物を使用することができる。市販品としては、フロログルシノール二水和物、フロログルシノール、フロログルシノール（無水）を使用することができる。また、これら市販品は、関東化学株式会社及び和光純薬工業株式会社から購入できる。
【００１４】
不定根を誘導する場合、フロログルシノールの濃度は、０．１〜１．０ｍＭの範囲とすることが好ましい。フロログルシノールの濃度が０．１ｍＭ未満の場合、不定根を誘導できない虞がある。また、フロログルシノールの濃度が１．０ｍＭを超える場合、組織片の生長阻害や枯死といった不都合がある。
【００１５】
一方、不定芽を誘導する場合、フロログルシノール及びサイトカイニンを含む培地を用いる。サイトカイニンとしては、天然のサイトカイニン及び合成サイトカイニンのいずれであっても良い。具体的にサイトカイニンとしては、チジアズロン（ＴＤＺ）、フルフリルアミノプリン（カイネチン）、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）、２−クロロ−４−ピリジル−フェニルウレア（ＣＰＰＵ）、イソペンテニルアデニン（２ｉＰ）及びゼアチンを挙げることができ、それを単独でまたは２種類以上を組み合わせて使用することができる。特に、サイトカイニンとしては、チジアズロン（ＴＤＺ）を使用する事が好ましい。ＴＤＺは、正式名称を１−フェニル−３−１，２，３−チアジアゾル−５−イルウレアとし、例えばシグマ社及び和光純薬工業株式会社から購入できる。
【００１６】
不定芽を誘導する場合、フロログルシノールの濃度は、０．１〜１．０ｍＭの範囲とし、チジアズロンの濃度は、０．１〜５．０　ｐｐｍの範囲とすることが好ましい。フロログルシノールの濃度が０．１ｍＭ未満の場合、不定芽を誘導できない虞がある。また、フロログルシノールの濃度が１．０ｍＭを超える場合、組織片の生長阻害や枯死といった不都合がある。チジアズロンの濃度が０．０１　ｐｐｍ未満の場合、不定芽を誘導できない虞がある。また、チジアズロンの濃度が１０．０　ｐｐｍを超える場合、組織片の生長阻害や枯死といった不都合がある。
【００１７】
また、培地には、オーキシン類及びサイトカイニン類が含まれていても良い。オーキシン類としては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、α−ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、４−クロロフェノキシ酢酸（４−ＣＰＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ）、ピクロラムなどが挙げることができ、それを単独でまたは２種類以上を組み合わせて使用することができる。また、サイトカイニン類としては、チジアズロン（ＴＤＺ）、フルフリルアミノプリン（カイネチン）、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）、２−クロロ−４−ピリジル−フェニルウレア（ＣＰＰＵ）、イソペンテニルアデニン（２ｉＰ）及びゼアチンなどが挙げることができ、それを単独でまたは２種類以上を組み合わせて使用することができる。オーキシン類の濃度としては、０．１〜５０　ｐｐｍが好適な範囲として挙げられ、また、サイトカイニン類の濃度としては、０．０１〜５０　ｐｐｍが好適な範囲として挙げられる。
【００１８】
さらに、培地には、オーキシン類及びサイトカイニン類の他に、炭素源として、ショ糖、ブドウ糖、果糖などの組織培養に一般に用いられる糖類を使用することができる。糖類の濃度としては、１０〜５０　ｇ／ｌが好適なものとして挙げられる。また、培地は、必要に応じてその構成成分の含量を変えたり、ビタミンやアミノ酸などを加えたり、削除することも有効である。なお、培地には、さらにジベレリン類、アブシジン酸、ブラシノライド類及びエチレン等を含んでもよい。
【００１９】
不定根を誘導する場合、培地のｐＨを５．０〜６．５の範囲とすることが好ましく、培養温度を１５〜３５℃の範囲とすることが好ましく、培養時間を２０〜６０日間の範囲とすることが好ましく、暗黒下での培養が好ましい。また、不定芽を誘導する場合、培地のｐＨを５．０〜６．５の範囲とすることが好ましく、培養温度を１５〜３５℃の範囲とすることが好ましく、培養時間を２０〜９０日間の範囲とすることが好ましく、暗黒下での培養が好ましい。
【００２０】
上述したように、フロログルシノールを含む培地を用いることによって、イチジクの組織片を用いて不定根及び不定芽を誘導することができる。また、得られた不定芽を用いて、通常の方法を適用してイチジク植物体へ再生することができる。具体的に、例えば、得られた不定芽をサイトカイニンとオーキシンの混用培地に移植して成長させる。その後、茎長が１〜２ｃｍになったときにＭＳ培地あるいはオーキシンを含んだＭＳ培地に移植する。そして、発根後、馴化・鉢上げすることでイチジク植物体へ再生させることができる。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕不定根の誘導
先ず、イチジクの成長点培養から継代培養中植物の葉片を採取した。イチジクの成長点培養は以下のように行った。圃場で栽培したイチジク品種「桝井ドーフィン」の新梢先端部を用いた。Ｔｗｅｅｎ２０を数滴たらした次亜塩素酸ナトリウム水溶液（有効塩素含量約０．５％に希釈）に、「桝井ドーフィン」の葉を取り除いた新梢先端部を約１５分間浸漬し、その後、滅菌蒸留水で３回洗浄した。実体顕微鏡下で約０．５ｍｍの成長点部を切り取り、成長点育成培地に植え付けた。成長点育成培地として、３％のショ糖、０．７％の寒天、１．０　ｐｐｍの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）を加え、ｐＨ５．８に調整したＭＳ培地を用いた。
また、継代培養は以下の条件で行った。成長点育成培地で伸長した植物体を、３％のショ糖、０．９％の寒天、０．０４　ｐｐｍのインドール酪酸（ＩＢＡ）と１．０　ｐｐｍのＢＡを加え、ｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に移植し、継代培養した。
【００２２】
次に、採取した葉片を、様々な濃度の２、４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）と０．５　ｍＭのフロログルシノール（ＰＧ、和光純薬工業株式会社製）を添加したＭＳ培地（３％ショ糖、０．８％寒天、ｐＨ　５．８）に植え付けた。本例では、２，４−Ｄの濃度を０．０（無添加）、０．１、０．５、１．０或いは５．０　ｐｐｍとした。なお、各試験区においては、１２個の葉片を用いて４回反復試験で行った。
葉片を植え付けた後、２５℃暗黒化で３０日間培養した。各試験区で観察された発根率及び発根数を表１に示す。
【００２３】
【表１】
2004121133.tif 000002
【００２４】
表１から、２，４−Ｄを単独で含む培地を用いても葉片から不定根を誘導できることが明らかとなった（図１参照）。さらに表１から、２，４−Ｄに加えてＰＧを添加した培地を用いた場合には、不定根発生率を大幅に高められることも明らかとなった。特に、２，４−Ｄ　１．０　ｐｐｍとＰＧ　０．５　ｍＭで最も効率よく不定根を誘導できた。
以上の結果から、ＰＧは、イチジクの不定根をより効果的に誘導する作用を有することが判明した。
【００２５】
〔実施例２〕不定芽の誘導
実施例１と同様に採取した葉片を、様々な濃度の２，４−Ｄとチジアズロン（ＴＤＺ、シグマ社製）を添加したＭＳ培地（３％ショ糖、０．８％寒天、ｐＨ　５．８、０．５　ｍＭ　ＰＧを含む）に植え付けた。なお、本例においては、２，４−Ｄの濃度を０．０（無添加）、０．５、１．０、２．０或いは５．０　ｐｐｍとし、ＴＤＺの濃度を０．０（無添加）、０．５、１．０、２．０或いは５．０　ｐｐｍとした。なお、各試験区においては、１０〜１２個の葉片を用いて３回以上の反復試験で行った。
葉片を植え付けた後、２５℃暗黒化で４９日間培養した。各試験区で観察された発芽率及び発芽数を表２に示す。
【００２６】
【表２】
2004121133.tif 000003
【００２７】
表２から、ＰＧの存在下において、ＴＤＺを単独で含む培地を用いた場合、如何なる器官形成も認められず、不定芽を誘導できないことが明らかとなった。また、表２から、ＰＧの存在下において、２，４−ＤとＴＤＺとを含む培地を用いた場合、不定芽を誘導できることが明らかとなった（図２参照）。特に、ＰＧの存在下においてＴＤＺ　１．０　ｐｐｍ及び２，４−Ｄ　１．０　ｐｐｍを含む培地を用いた場合には、不定芽を最も効果的に誘導できることが明らかとなった。
一方、不定芽の誘導に対するＰＧの影響を検討するために、ＰＧの濃度を０．０（無添加）、０．５或いは１．０　ｍＭとした培地に葉片を植え付け、同様に培養した。なお、使用した培地に含まれるＴＤＺの濃度を１．０　ｐｐｍとし、２，４−Ｄの濃度を１．０　ｐｐｍとした。また、培養は２５℃暗黒化で６０日間とした。結果を表３に示す。
【００２８】
【表３】
2004121133.tif 000004
【００２９】
表３から、ＰＧ無添加区では、不定芽が誘導されなかったのに対し、ＰＧを添加した試験区では、不定芽が誘導されることが明らかとなった。また、表３から、ＰＧの濃度が０．５　ｍＭの試験区では、ＰＧの濃度が１．０　ｍＭの試験区よりも優れた発芽率を示すことが明らかとなった。
以上、表２及び表３の結果から、イチジクから不定芽を誘導するには、ＴＤＺ及びＰＧを含む培地が有効であることが判明した。
【００３０】
〔実施例３〕不定芽からの植物体再生
実施例２で得られた不定芽を用いて以下のように植物体を再生した。具体的には、先ず、得られた不定芽を６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）とα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を含むＭＳ培地に移植して成長させた。このとき、培養条件としては、温度２５±２℃、白色蛍光管下（５５．６μｍｏｌ／ｓ／ｍ２）の１６時間日長とした。
【００３１】
その後、茎長が１〜２ｃｍになったときに、発根培地としてインドール酪酸（ＩＢＡ）１．０　ｐｐｍを含むＭＳ培地または植物ホルモンを含まないＭＳ培地に移植した。このとき、培養条件としては、温度２５±２℃、白色蛍光管下（５５．６μｍｏｌ／ｓ／ｍ２）の１６時間日長とした。移植１０〜３０日後に発根を確認することができた（図３参照）。
【００３２】
そして、発根後、馴化・鉢上げすることでイチジク植物体へ再生させることができた（図４参照）。具体的に馴化は、以下のように行った。根に付いた寒天を取り除いた後、イチジク植物体をバーミキュライトの入ったプラスチック製ポットに移植した。そのポットを密閉可能な透明プラスチック容器に入れ、約２週間の間、高湿度条件を保つために密閉状態で育成した。その後、イチジク植物体の生育状況を見ながら上部のふたを順次ずらして外部の湿度（相対湿度６０〜７５％）に馴化させた。このときの培養条件としては、温度２５±２℃、白色蛍光管（２９．４μｍｏｌ／ｓ／ｍ２）の１６時間日長にした。
また、具体的に鉢上げは以下のように行った。外部の湿度に十分馴化したイチジク植物体を培養土の入った素焼き鉢に移植し、自然光下の温室内で育成した。
【００３３】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明により、イチジクにおける不定根及び不定芽を誘導できる全く新規な方法及び誘導剤を提供することができる。すなわち、本発明に係るイチジクの不定根誘導方法及び不定根誘導剤によれば、従来において得ることができなかったイチジク不定根を作出することができる。また、本発明に係るイチジクの不定芽誘導方法及び不定芽誘導剤によれば、従来において得ることができなかったイチジク不定芽を作出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で作出した不定根の写真である。
【図２】実施例２で作出した不定芽の写真である。
【図３】実施例３で作出した発根培地における不定芽由来植物の写真である。
【図４】実施例３で作出した鉢上げ後の不定芽由来植物の写真である。
【図１】
2004121133.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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