(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ネコアクチビンＡおよびその遺伝子工学による製造方法を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列もしくはその一部であるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖２本からなるホモダイマー蛋白質からなるアクチビンＡおよびその製造法、並びにそれをコードする遺伝子、すなわち、特定のアミノ酸配列もしくはその一部であるアミノ酸配列をコードする遺伝子により、ネコアクチビンＡを採取することによりネコアクチビンＡを製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコの赤血球に作用してヘモグロビンの誘導を促進する能力、及び／又は、ネコ膵臓のベータ細胞に作用してその分化およびインスリン分泌能を促進する能力を有するネコアクチビンＡ。
【請求項２】
配列番号１で表されるＤＮＡ配列でコードされるネコアクチビンＡのサブユニット。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる請求項１もしくは請求項２に記載のネコアクチビンＡ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のネコアクチビンＡのサブユニットをコードするＤＮＡ配列。
【請求項５】
配列番号３、４もしくは５で表されるＤＮＡ配列、または該ＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列。
【請求項６】
請求項４または５記載のＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を培養または飼育し、ネコアクチビンＡを採取することを特徴とする、ネコアクチビンＡの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、天然型および遺伝子組換え型のいずれをも包含するものであって、以下の（１）〜（３）の機能を有するネコアクチビンＡに関する。
（１）　　　　ネコの赤血球に作用し、ヘモグロビン誘導を行う。
（２）　　　　ネコの膵臓のベータ細胞に作用し、その分化を行う。
（３）　　　　ネコフォリスタチンとの結合能を有する。
本発明は、蛋白質の一次構造がネコの遺伝情報由来であるネコインヒビンサブユニットを遺伝子操作技術により作製し、その結果得られるネコアクチビンＡを量産し、以て動物用医薬品（慢性貧血、糖尿病治療薬、難治性骨疾患治療薬）とすることを目的とした、プラスミド、形質転換体、ネコアクチビン及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アクチビンＡはサブユニットであるインヒビンβＡ（アミノ酸１１６個のポリペプチド鎖）２本からなるホモダイマー構造を有するタンパク質で、分子量は約２５，０００ダルトンである。フォリスタチンと結合能を有し、下垂体培養細胞の濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）産生を促進する作用を有している（非特許文献１参照）。
【０００３】
アクチビンＡは赤血球の分化、骨形成、膵ベータ細胞の分化、性腺ステロイド生成に関わっているのではないかとの報告があり、またアクチビンＡを構成するインヒビンβＡｍＲＮＡは、精巣、胎盤、下垂体、副腎、骨髄、脳組織中に検出される。
【０００４】
アクチビンＡは卵胞液中に同定されそこから精製され、遺伝子操作技術によりクローニングが行われ、発現されている。（非特許文献２参照）
ネコの疾患の中には、慢性腎不全によるとされる腎性貧血が知られている。この腎性貧血では、ステロイド製剤やヒトエリスロポエチン製剤などが使用されているが、ネコ特有に治療薬はない。
【０００５】
またネコでは内分泌系、中でも糖尿病の症例も比較的多く報告があり、その治療薬としてブタインスリンを使用しているが、ネコ特有のタンパク医薬品はない。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｈｅｌｅｎｅ　Ｈ著：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１９８８．，　８５、　ｐ２４７−２５１
【０００７】
【非特許文献２】
Ｒｏｂｅｒｔ　Ｇ著：Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．ＵＳＡ．．、１９８６．，　８３、　ｐ３０９１−３０９５
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ネコのアクチビンＡを製造することにより、従来とは異なる作用によるネコの腎性貧血および糖尿病治療薬を提供することを目的としている。
すなわち、慢性腎疾患で生じる貧血を、アクチビンＡの作用の一つである赤血球に作用しヘモグロビンを誘導させる能力により改善する治療方法を提供する。
さらに、糖尿病を、膵臓のベータ細胞の分化を促進しインスリン分泌能を向上させる作用により改善する治療方法を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため、ネコインヒビンβＡ　ｃＤＮＡクローニングおよびそれを用いた大量生産を目的とし、創意工夫をなし、ネコのｃＤＮＡからネコインヒビンβＡをコードする遺伝子をクローニング及び全塩基コードを解読することに成功し、更にこれらを発現ベクターに連結したプラスミドを用いてネコアクチビンＡを生産する細胞の作製に成功し、以って簡単に大量にネコアクチビンＡを製造する方法を確立し、かくして本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、ネコの赤血球に作用してヘモグロビンの誘導を促進する能力、及び／又は、ネコ膵臓のベータ細胞に作用してその分化およびインスリン分泌能を促進する能力を有するネコアクチビンＡを本旨とするものである。又は、ネコアクチビンＡを生産させるプラスミド、これらのプラスミドを有する大腸菌の形質転換体、およびこのプラスミドにより形質転換された動物細胞、ならびにこれらの形質転換体から得られるネコアクチビンＡを提供するものである。さらに本発明はネコアクチビンＡをコードする遺伝子も提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のネコアクチビンＡを構成するサブユニットであるネコインヒビンβＡ蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだベクター（プラスミド等）は例えば次のようにして製造することができる。すなわち、ネコの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、これからネコインヒビンＡの遺伝子を選択的にクローニングした後、これをベクターに組み込むことにより得られる。前記ベクターを用いて宿主細胞を形質転換した形質転換体によりアクチビンＡ得ることができる。
【００１２】
ネコの臓器や細胞、ネコの腎細胞由来のＣＲＦＫ細胞などよりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えばポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法があげられる。ネコ細胞からＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（文献１）、バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理した後フェノール抽出を行う方法（文献２）、グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理した後、塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選択して行うことができる。
【００１３】
得られたＲＮＡから塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから逆転写酵素やプライマーによるＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを合成する。
【００１４】
このｃＤＮＡを鋳型として、マウスやヒトの塩基配列を基にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによりネコインヒビンβＡ遺伝子をクローニングできる。また合成したｃＤＮＡをλファージベクターに連結した後、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでλファージのコート蛋白質などと混合することによりパッケージングし、その生成されたファージ粒子を宿主となる大腸菌に感染させる。λファージが感染した大腸菌は溶菌し、１個１個のクローンがプラークとして回収される。このプラークを適当なフィルター等の媒体に転写し、予め標識したオリゴマーもしくはＰＣＲで得られた遺伝子をプローブとしてハイブリダイゼーションによりネコインヒビンβＡ遺伝子をクローニングすることができる。
【００１５】
宿主としては原核生物もしくは真核生物を用いることができる。原核生物の例としては大腸菌を用いることができる。真核生物としては例えば、動物細胞や昆虫細胞などを使用することができる。
【００１６】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、ファージ、レトロウイルス等を使用できる。
【００１７】
前記の発現ベクターを宿主細胞（大腸菌などの細菌、カイコなどの昆虫細胞、ネコなどの動物細胞）に導入して、形質転換体とする。なお、発現ベクター中のプロモーター及び薬剤選択マーカーは宿主細胞に依存して選択される。例えば細菌ではｌａｃプロモーター、昆虫細胞ではバキュロウイルスプロモーター、動物細胞ではＳＶ４０プロモーター等である。また前記の発現ベクターが導入された形質転換体の培養は常法に従って行うことができる。
【００１８】
形質転換体より産生されたネコインヒビンβＡ（分子量は約１２，０００〜１５，０００）は、還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことにより、インヒビンβＡの二量体（ホモダイマー）であるアクチビンＡ（分子量約２４，０００〜２８，０００）となるが、真核生物細胞より産生された場合は、その細胞内でインヒビンβＡは代謝作用等により２量体のアクチビンＡとなる。なお、前記分子量に幅があるのは、特に真核生物細胞において産生された場合、ネコインヒビンβＡやネコアクチビンＡには、糖鎖で修飾されることが多く、それにより分子量が増加するからである。なお、ネコインヒビンβＡやネコアクチビンＡのポリペプチド構造を有するもの、又は、その構造において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたものでさえあれば、糖鎖やその他の修飾はあってもなくても良い。
【００１９】
生産されたネコアクチビンＡは、以下のような能力を持つ。すなわち、ヘモグロビン誘導能、ベータ細胞の分化、フォリスタチンとの結合能である。ヘモグロビン誘導は、ヒトの場合、赤白血球細胞（Ｋ５６２）を用いたヘモグロビンの定量により確認することができる。
【００２０】
またベータ細胞への作用は、膵臓のベータ細胞にアクチビンを処理したとき、ベータ細胞の分化が促進され、さらにインスリンの分泌能が向上することをインスリンの定量を行うことにより確認することができる。
【００２１】
ネコフォリスタチンと結合能を有するか否かは、フォリスタチンをラベルしたバインディング・アッセイにより確認することができる。すなわち、フォリスタチンを放射性ヨードでラベルし、アクチビンを加えることによりヨードラベル化されたフォリスタチンが結合させ、アクチビンと結合していないフォリスタチンのヨードの量を定量することにより結合能を確認する。
【００２２】
本発明は、蛋白質の一次構造がネコの遺伝情報由来であるネコインヒビンサブユニットを遺伝子操作技術により作製し、その結果得られるネコアクチビンＡを量産し、以て動物用医薬品（慢性貧血、糖尿病治療薬、難治性骨疾患治療薬）とすることを目的とした、プラスミド、形質転換体、ネコアクチビン及びその製造法に関する。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００２４】
実施例１　（ネコインヒビン遺伝子のクローニング）
（１）ネコｃＤＮＡの調製
ネコ腎由来細胞ＣＲＦＫを１５０ｃｍ２フラスコでゴナトロピン存在下、３〜４日培養し、５×１０７ｃｅｌｌｓの細胞沈殿物を調製する。ｍＲＮＡ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｓｔｒｔａｇｅｎｅ社）によりｍＲＮＡを調製する。すなわち、ＣＲＦＫの沈殿物にグアニジン・チオシアネートを含むｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、２１Ｇニードルで混入しているＤＮＡをせん断する。次にｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒを加え遠心を行い、その上清を得る。得られた上清をオリゴｄＴセルロースカラムにアプライし、カラムの洗浄を行った後、予め６８℃に加温しておいたｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒによりポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。次に得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて、Ｒｅｖｅｒ　Ｔｒａ−Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）によりｃＤＮＡを合成した。すなわちＲＮａｓｅ　ＦｒｅｅのマイクロチューブにｍＲＮＡおよびｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ、オリゴｄＴプライマー、ＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　Ｈ２Ｏを加えてメスアップし、逆転写酵素であるＲｅｖｅｒＴｒａ−Ａｃｅを添加し、４２℃、２０分処理する。９９℃で処理して酵素を失活させて、反応を停止させ、氷上で５分置いた。
【００２５】
（２）ネコインヒビンβＡ遺伝子のクローニング
ヒトインヒビンβＡの塩基配列（文献３）をもとに、配列番号　６と配列番号７の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のＣＲＦＫｃＤＮＡを０．５ｍＬのマイクロチューブに１μＬを入れ、各プライマー２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ　ＫＣｌ、５０μＭ各ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製ＫＯＤ）を添加し、全量５０μＬとする。ＤＮＡの変性条件９４℃，３０秒、プライマーのアニーリング条件を６０℃，３０秒、プライマーの伸張条件を６８℃，１分の各条件でＢｉｏ−ＲＡＤ社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約３００ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献４）に従って調製した。
【００２６】
このＤＮＡ断片をｐＵＣ１０８（アマシャムファルマシア社）にＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同条件のＰＣＲおよびＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる制限酵素処理により確認し、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（文献５）でヒトやマウスなどのインヒビンβＡとのホモロジーを確認し、ネコインヒビンβＡと推定されるＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００２７】
この配列を配列番号２に示す。また、この配列を含む、３００ｂｐのＤＮＡ断片に日本ロッシュ社製のＤＩＧ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔを用いてＤＩＧ標識し、プローブを作製した。　次にネコ腎由来細胞ＣＲＦＫを１５０ｃｍ２フラスコで３〜４日培養し、５×１０７ｃｅｌｌｓの細胞沈殿物を調製した。ｍＲＮＡ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｓｔｒｔａｇｅｎｅ社）によりｍＲＮＡを調製した。すなわち、ＣＲＦＫの沈殿物にグアニジン・チオシアネートを含むｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、２１Ｇニードルで混入しているＤＮＡをせん断した。次にｅｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒを加え遠心を行い、その上清を得た。得られた上清をオリゴｄＴセルロースカラムにアプライし、カラムの洗浄を行った後、予め６８℃に加温しておいたｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒによりポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。次に得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて、ＺＡＰ−ＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）によりｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。すなわちｋｉｔのマニュアルに従い２本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを連結した。次にＵｎｉ−ＺＡＰ　ＸＲ　ｖｅｃｔｏｒに連結した後、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてパッケージングを行い、組換え体ファージライブラリーを作製した。この組換え体ファージライブラリーを大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’上でプラークとして形成させ、日本ロシュ社製のナイロンメンブレンに常法に従って転写した。転写したナイロンメンブレンは、ＤＮＡの固定を行った後、２ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液中に浸し、３７℃１時間インキュベートした。さらにそのナイロンメンブレンを、最終濃度２０ｎｇ／ｍＬになるように前記プローブを加えたＤＩＧ　ＥＡＳＹ　ＨＹＢ（日本ロシュ社製）中に入れ、４２℃で１晩インキュベートを行い、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたナイロンメンブレンを、２×ＳＳＣ（３０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中５分、２回洗浄を行い、さらに０．５×ＳＳＣ（７．５ｍＭＮａＣｌ、０．７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中６５℃下、１５分、２回洗浄を行った。ナイロンメンブレンをＣＤＰ−Ｓｔａｒによる化学発光により陽性プラークの検出を行った。すなわち、洗浄したナイロンメンブレンをブロッキング溶液（日本ロシュ社製）に室温下３０分以上インキュベートした後、アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（日本ロシュ社製）を含むブロッキング溶液内に入れてさらに３０分インキュベートした。抗体溶液を捨て、洗浄バッファー（１００ｍＭマレイン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０）で１５分間、各２回ずつナイロンメンブレンを洗浄し、検出バッファー（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭＮａＣｌ）内に溶解させたＣＤＰ−Ｓｔａｒをナイロンメンブレンに処理し、５分間室温で、さらに１５分間３７℃下でインキュベートした。得られたナイロンメンブレンをＸ−ｒａｙ　Ｆｉｌｔｅｒに露光し、陽性シグナルを有するプラークを常法に従い再スクリーニングした。３回のスクリーニングの結果、陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージのプラークを得た。この組換え体ファージよりｉｎ　ｖｉｖｏ　ｅｘｉｓｉｏｎ法により、組換えプラスミドを含む大腸菌を得た。この大腸菌を培養し、常法に従いプラスミドを調製し、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法でヒトやマウスなどのインヒビンβＡとのホモロジーを確認し、３‘末端側を含むネコインヒビンβＡ　ＤＮＡの部分塩基配列（配列番号４）を決定した（但し、この塩基配列には、プライマーに用いたヒトインヒビン部分配列により一部置換されている）。
【００２８】
（３）５’ＲＡＣＥ法によるネコインヒビンβＡ遺伝子５’末端のクローニング
（２）で得られたネコインヒビンβＡの部分塩基配列をもとに、配列番号８と配列番号９と配列番号１０の３種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のＣＲＦＫｍＲＮＡを０．５ｍＬのマイクロチューブに２μＬを入れ、５’ＲＡＣＥｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてネコインヒビンβＡの５’側末端を含むＤＮＡを調製した。すなわち、ＣＲＦＫｍＲＮＡおよびＲＮａｓｅを不活化するためのＤＥＰＣ水、プライマー２５ｐｍｏｌ（配列番号８）を加え、７０℃１０分間処理した。次に氷上で１分間おき、１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ、０．１Ｍ　ＤＴＴをそれぞれ添加し４２℃で１分加温した。次にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＴを添加し、さらに４２℃で３０分処理し続けて７０℃１５分処理して、ｃＤＮＡへの逆転写を行った。最後にＲＮａｓｅＭｉｘを加え３７℃で２０分処理を行ってＲＮＡを分解した。こうして得られたサンプルを用いて、Ｓｐｉｎ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅにより逆転写されたｃＤＮＡの精製を行った。すなわち、Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（６Ｍ　ＮａＩ）をサンプルに添加し、Ｓｐｉｎ　ｃａｒｔｒｉｄｇｅにセットした後１３，０００Ｇ、２０秒遠心を行った。４００μＬ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒで洗浄を繰り返し、さらに７０％エタノールで洗浄を加えた後、予め６５℃に熱しておいた滅菌水を加えて１３，０００Ｇ、２０秒遠心を加えた。溶出したサンプル１０μＬ、ＤＥＰＣ処理水６．５μＬ、ｔａｉｌｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ５μＬ、２ｍＭｄＣＴＰ２．５μＬを混合し、９４℃、３分処理した後、氷上で１分静置した。次に５’ＲＡＣＥ　ｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ社製）のｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１μＬを加え、３７℃１０分処理し、さらに６５℃、１０分処理して、後述のアダプタープライマーと塩基配列が相補的な塩基配列を前記ｃＤＮＡ５’末端に付加させた。得られたサンプルを用いて、プライマー２０ｐｍｏｌ（配列番号９）およびアダプタープライマー２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ　ＫＣｌ、５０μＭ各ｄＮＴＰ、ＫＯＤを添加し、全量５０μＬとした。ＤＮＡの変性条件９４℃，３０秒、プライマーのアニーリング条件を６２〜５０℃，３０秒、プライマーの伸張条件を６８℃，１分の各条件でＢｉｏ−ＲＡＤ社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、３５サイクル反応させた。得られたＰＣＲ産物を用いてプライマー２０ｐｍｏｌ（配列番号１０）およびアダプタープライマー２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ　ＫＣｌ、５０μＭ各ｄＮＴＰ、ＫＯＤを添加し、全量５０μＬとした。ＤＮＡの変性条件９４℃，３０秒、プライマーのアニーリング条件を６２〜５０℃，３０秒、プライマーの伸張条件を６８℃，１分の各条件でＢｉｏ−ＲＡＤ社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約４００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００２９】
このＤＮＡ断片をｐＵＣ１０８（アマシャムファルマシア社）にＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同条件のＰＣＲにより確認し、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法で５’末端を含むネコインヒビンβＡのＤＮＡの一部と推定される塩基配列を決定した（配列番号５）。
【００３０】
（４）ネコインヒビンβＡのｃＤＮＡ配列
上記の（２）および（３）により、決定された塩基配列をつき合わせて、ネコインヒビンβＡのｃＤＮＡ完全配列が明らかになった（配列番号１）。
【００３１】
得られた得られたネコインヒビンβＡ遺伝子のホモロジー検索の結果、Ｅｑｕｕｓ　ｃａｂａｌｌｕｓ（ウマ）：９１％、Ｏ　ａｒｉｅｓ（ヒツジ）：９０％、Ｐｏｒｃｉｎｅ（ブタ）：９３％、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）：９０％、Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）：８８％、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）：８８％であった。
実施例２
（ネコアクチビンＡの生産）
（１）ネコインヒビンβＡトランスファーベクターの調製およびｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
ネコインヒビンβＡＤＮＡ断片は配列番号１１と配列番号１２の２種類のプライマー（それぞれ、制限酵素ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩの切断部位に相当する塩基配列を有する）を作製し、実施例１の（２）と（３）で調製したｃＤＮＡ断片を鋳型とし、ＤＮＡの変性条件９４℃，３０秒、プライマーのアニーリング条件を６０℃，３０秒、プライマーの伸張条件を６８℃，１分の各条件でＢｉｏ−ＲＡＤ社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、３５サイクル反応させた。エタノール沈殿後、１％アガロースゲル電気泳動にて約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をＴ４　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅによりリン酸化した後、予めＳｍａＩ処理し、脱リン酸化処理したｐＵＣ１０８に挿入した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。さらに、作製したプラスミド中のネコインヒビンβＡＤＮＡの塩基配列を確認した。
【００３２】
本プラスミドを２種類の制限酵素（ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ）で処理し、電気泳動法によりネコインヒビンβＡＤＮＡ断片を得た。一方、哺乳動物細胞用トランスファーベクターｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、調製した。こうして得られたネコインヒビンβＡＤＮＡ断片と切断されたベクターにＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２を用いて連結させた。この連結させたベクターを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。さらに、作製したプラスミド中のネコインヒビンβＡＤＮＡの塩基配列を確認した。次にこのプラスミドをＣＨＯ−Ｋ１細胞にＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔを用いてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った。
【００３３】
（２）ＣＨＯ−Ｋ１でのネコアクチビンＡの発現
上記（１）で得られた細胞を、３７℃下４〜５日間培養を行い、その培養上清を回収し、１２，０００ｒｐｍ、２０分間遠心を行い、ネコアクチビンＡを含む上清画分を得た。
【００３４】
（３）ネコアクチビンＡの活性測定
上記（２）で生産されたネコアクチビンＡの活性測定は以下のようにして行った。すなわちアクチビンＡによるＫ５６２細胞のヘモグロビン放出により行った。（文献６）
９６穴プレートにＫ５６２細胞（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地により、（３）で得られたアクチビンＡを含む培養上清非存在下または存在下、４日間培養を行う。次に細胞をＰＢＳにより２回Ｗａｓｈし、滅菌した水５０μＬに懸濁し、遠心操作により上清画分４０μＬを得る。得られた上清に０．５ｍｇ／ｍＬ　Ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ　と０．０３％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液２００μＬを加え、暗下１５分処理した。その後２．５Ｍ硫酸を５０μＬ加え、４９０ｎｍの吸光度の測定を行った。その結果、ネコアクチビンＡ存在下の方の実施サンプル（Ａｃｔ）は、非存在下の方のコントロールサンプル（ｃｏｎｔ）に比べて有意にヘモグロビンの誘導を行った（図１）。
【００３５】
参考文献
１．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９７９．　１８．　５２９４−５３０４
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【００３６】
【発明の効果】
本発明によりネコアクチビンＡを効率良く産生させることができる。
【００３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ネコアクチビンＡを用いたヘモグロビン誘導を示す図である。
【図１】
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