(57)【要約】【課題】　ゲル電気泳動によりフィブリノゲンおよびフォンウィルブランド因子のマルチマーの定性的および定量的測定方法の提供。【解決手段】　フォンウィルブランド因子(ｖＷＦ)またはフィブリノゲンを含有する試料が、連続的、均質な、塊を含まないアガロースゲルを使用したサブマリン電気泳動により分画され、そしてマルチマーバンドが、ブロッティング膜上の特異抗体-酵素結合体によるウェスタンブロット分析の後に免疫化学的にか、又はゲルにおいて適切な色素により、好ましくはブルー染色を用いて、可視化することから成る。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　フォンウィルブランド因子(ｖＷＦ)またはフィブリノゲンを含有する試料が、連続的、均質な、塊を含まないアガロースゲルを使用したサブマリン電気泳動により分画され、そしてマルチマーバンドが、ブロッティング膜における特異抗体−酵素結合体によるウェスタンブロット分析の後に免疫化学的にか、又はゲルにおける適切な色素により好ましくはブルー染色を用いて、可視化される、ゲル電気泳動によりマルチマー−形成治療タンパク質のマルチマーの定性的および定量的測定方法。
【請求項２】
　マルチマー−形成治療タンパク質がフィブリノゲンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
　マルチマー−形成治療タンパク質がフォンウィルブランド因子(ｖＷＦ)である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
　１.６〜３重量％、好ましくは１.８〜２.４重量％のアガロース濃度であるアガロースゲルがフィブリノゲンマルチマーを分離するために使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
　０.７〜１.８重量％、好ましくは０.８〜１.２重量％のアガロース濃度であるアガロースゲルがｖＷＦマルチマーを分離するために使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
　ゲル電気泳動が６℃〜１４℃、好ましくは８〜１２℃の温度で実施される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
　免疫染色がブロッティング膜上のマルチマーバンドを染色するために使用される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
　色素クマシーブルーがゲルにおけるマルチマーバンドのブルー染色のために使用される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
　バッキングシート上のアガロースゲルがゲルにおけるブルー染色のために使用される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
　バッキングシートなしのアガロースゲルがブロッティング膜上の免疫染色のために使用されるか、またはそのバッキングシートがブロッティングプロセス前にゲルから除去される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
　バンドがデンシトメトリーにより定量される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
　バンドがゲルのブルー染色の後に定量される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
　バンドがブロッティング膜の免疫染色の後に定量される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
　ゲルが染色の後のラミネート加工により保存される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
　ブロッティング膜が免疫染色の後のラミネート加工により保存される、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、ゲル電気泳動による血漿タンパク質のマルチマーの定性的及び定量的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　凝固にも重要である血漿の成分は、血漿中でモノマー形態だけでなくマルチマー分子としてもまた存在することが知られている。場合によって、異なる治療効果は、個々のモノマーによるものとすることができる。このようなマルチマー−形成治療タンパク質の例は、フィブリノゲンおよびフォンウィルブランド因子である。マルチマーの定量的および定性的測定は、一方で凝固欠陥の原因を診断するのに非常に重要であるが、他方で凝固産物の特性を同定するためにもまた非常に重要である。従って、フィブリノゲンおよびフォンウィルブランド因子マルチマーの測定は、特に注目に値する。
【０００３】
　フィブリノゲンは、止血に極めて必須の機能を有する。このフィブリノゲンは、トロンビンの作用を介してフィブリンに変換され、このフィブリンは架橋してXIII因子によって安定化される微細な(fine)フィブリンファイバーを与える。止血を確実にする血餅は、それから形成される。フィブリノゲンの完全性および構造が止血効果に非常に重要である。
【０００４】
　フィブリノゲン自体は重合する傾向はないが、適当な条件下、例えば高濃度、低イオン強度および４℃での長期インキュベーションにおいてもまた、フィブリンに類似のフィブリノゲンマルチマーを形成する。このタイプのフィブリノゲンは、国際特許出願WO 01/12244に記載されるウェスタンブロッティングおよび免疫化学染色を用いたＳＤＳアガロースゲル電気泳動により分析および可視化することができる。
【０００５】
　ＳＤＳアガロースゲル電気泳動によるフィブリノゲンマルチマーを分離する方法は、Connaghanら(１)およびProiettiら(２)により紹介された。次いでこれらの方法は、国際特許出願WO 01/12244に記載される方法により改善され、ここでRainesら(３)により記載されるフォンウィルブランドマルチマーを分離するための方法は、フィブリノゲン電気泳動のために変更されそして利用された。本発明は、基本的に(３)において記載されるように実施される水平電気泳動、および基本的に(２)に記載されるように実施されるフィブリノゲンマルチマーの検出を伴なう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
　しかし、WO 01/12244の電気泳動方法は、かなり複雑であり、時間がかかり、かつとても特別な経験を要する。さらに、３つの異なるゲル、すなわちスタッキングゲル(７０mM トリスに溶解された１％アガロース、４mM ＥＤＴＡ、４％ＳＤＳ)、カソードゲル(１００mMトリスに溶解された１.６％アガロース、１５０mMグリシン、０.１％ＳＤＳ)および分離ゲル(２００mMトリスに溶解された２％アガロース、１００mMグリシン、０.４％ＳＤＳ)を要し、これらは５０℃を超える温度で注型され、そして重合のために少なくとも２時間放置しなければならない。試料を１レーンあたり０.６〜０.９μlロードする。電気泳動は、６００〜６５０Ｖおよび１６℃の温度で、フラットベッドの装置において実施される。このランニングバッファーは、電極バッファー中に浸漬されたある長さの４〜８枚のろ紙上のゲルに接続される。
【０００７】
　異なる３つのアガロースゲルの調製には、アガロースが膨潤過程を水の沸点近くで行なわなければならないことから、かなりの経験が必要とされる。さらに、一方ではもはや塊(固体残留物)が存在しなくなるようアガロースを十分に溶解し、そして他方ではアガロースがガラスの上部、冷たいヘリで沈殿物としてもう再び堆積しない、最適な時間を見つけることが必須である。ゲルを注型するには、特別な技術、特にローディングウェルの導入に技術を要する。冷却して固まったゲルからローディングウェルを形成するのに必要なコームを除去する際、たやすくアガロースゲルに損傷を与えてしまい、従って注型ゲルが使用できなくなってしまう。
【０００８】
　類似の困難がまた、フォンウィルブランド因子(ｖＷＦ)マルチマーを分画するための現在までの慣用の方法においても起こる。
【０００９】
　糖タンパク質である機能的なフォンウィルブランド因子は、マルチマーと呼ばれる多様な分子量分布を伴なって血流中を循環し、このマルチマーは、５００kD〜２０,０００kDまでの分子量分布を有することができる。その最も最小な単位は、約５５０kDの分子量を有するダイマーであり、これはジスルフィド架橋により共に連結される２つのモノマーからなる。２０,０００kDまでの分子量を伴なうマルチマーと呼ばれるポリマーは、さらにジスルフィド架橋によりこれらのダイマーから産生される。
【００１０】
　フォンウィルブランド疾患の臨床兆候は非常に異質であり、そして軽い型、例えばタイプ１から、タイプ３における出血を自然に起こす非常に重篤な欠損状態までにわたる。出血しやすさは、ｖＷＦの２つの主な機能：血小板同士の接着および損傷した血管壁への接着を仲介することならびにVIII凝固因子の安定化、の定量的および／または定性的欠陥により引き起こされる。従って、初期の一次止血およびより開始の遅い二次止血の両方の機能が低下する可能性がある。
【００１１】
　しかし、VIII因子欠損により引き起こされる二次凝固欠陥において、VIII因子は必ずしも低下せず、逆に、凝固欠陥が、フォンウィルブランド因子の定量的および／または定性的欠陥の発現でありうる。
【００１２】
　凝固欠陥の複雑さに起因して、フォンウィルブランド疾患を種々の重篤性の程度に診断および分類することが、全ての凝固研究における課題である。正確な診断、すなわちサブタイプの決定は、患者自身にとって重要な結果を有する。なぜならこのとき、最適な治療を選択することを可能とするだけでなく、遺伝的欠陥の場合にはより詳細なアドバイスを与えることが可能だからである。従って、タイプ１疾患に目立って効果のあるデスモプレシンによる治療は、タイプ３の重篤なフォンウィルブランド疾患およびタイプ２型の多くに対しては不適切であり、または禁忌でありさえし、その結果ｖＷＦ含有VIII因子濃縮物が、これらの場合に与えられなければならない。優れた治療効果は、これらの場合、特に大きいｖＷＦマルチマーを含むVIII因子濃縮物により示される。
【００１３】
　ｖＷＦは、血漿凝固タンパク質(VIII又はIX因子のような)ではないが、損傷した血管壁と１次止血の重要な成分としての血小板との間に架橋を形成することにより、およびいわゆる血小板に対する接着剤として作用する。さらに、ｖＷＦはVIII因子を安定化し、そうでなければすばやく分解されてしまうVIII因子を、ｖＷＦに結合することなくほんの非常に短い時間で血液中を循環することが可能となる。
【００１４】
　ｖＷＦ分子における構造変化についての情報は、ＳＤＳアガロースゲル電気泳動を使って、ウェスタンブロット免疫染色分析を用いるか(SAGE-WISA)またはゲルのクマシーブルー染色により(SAGE-CB)、マルチマーを可視化することによって本発明に従って得られる。次いで、マルチマーの電気泳動による可視化は、構造的特性について結論を導くことを可能とする。コラーゲン結合アッセイを使用して、大きいマルチマーが存在しないｖＷＦ分子を非常に高い感度で検出可能であるばかりでなく、マルチマー分析は、遺伝性だけでなく特に後天性のｖＷＦにおける変化を有する患者にとって重要な診断試験である。マルチマー組成物の確立もまた、VIII因子凝固産物を評価するために非常に重要である。
【００１５】
　ＳＡＧＥ−ＷＩＳＡによるｖＷＦマルチマー分析は、本技術分野で知られたものであり、そしてMetznerら(４)によって記載されている。しかし、そこに記載されている方法は、複雑でありかつ時間がかかる。さらに、再現性の欠如という問題があり、マルチマーバンドの確実な定量化を困難にしている。またさらに、塊のない均質なアガロースゲルを注型する困難およびいくつかの異なるアガロースゲルを使用する必要性が存在する。(４)の方法および類似の方法(５,６,７)の両方において、常にそれら方法で異なる分離ゲルおよびスタッキングゲルを必要とする。例えば、(４)は、０.９％アガロース分離ゲルおよび０.８％アガローススタッキングゲルを使用し、一方(５)は、２％アガロース分離ゲルおよび１％アガローススタッキングゲルを用いる。
【００１６】
　さらに、異なるアガロースタイプが、スタッキングゲルおよび分離ゲルに対して指定される。従って(４)は、スタッキングゲルに関してＨＧＴ(高ゲル化温度)アガロースおよび分離ゲルに対してＬＧＴ(低ゲル化温度)アガロースを指定する一方、他のアガロースタイプは、他の公知の分離方法において使用される。
【００１７】
　従来のゲル電気泳動分離方法によりしばしば生じるさらなる困難は、アガロースゲルが浮かぶ傾向を示すことである。この場合、アガロースゲルは、電気泳動チャンバの底との接着を失い、傾斜して歪んだレーンパターンの形成を生じるか、又はゲルの外にタンパク質が電気泳動時に移動してしまうことさえあり、従ってタンパク質バンドが失われてしまう。ゲルのカタマラン様の重しによりアガロースゲルの浮きを防ぐことが可能であるが、これはゲルを圧迫し、次にバンドの分離を損なうかまたは各ゲルにおいて使用することができるレーンの数を減少させるどちらかとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
　今般、前述の困難は、フォンウィルブランド因子(ｖＷＦ)またはフィブリノゲンを含む試料を、８℃〜１２℃まで冷却しながら、塊のない連続的で均質なアガロースゲルを使用してサブマリン電気泳動により分画し、そしてブロッティング膜における特異抗体−酵素結合体によるウェスタンブロット分析の後に免疫化学的に、またはゲルにおける適切な色素、好ましくはブルー染色によりマルチマーバンドを可視化する、ゲル電気泳動によるフィブリノゲンのマルチマーまたはフォンウィルブランド因子のマルチマーの定性的および定量的測定方法により解決することができた。
【００１９】
　本発明により使用される塊のない均質なアガロースゲルの自作は、十分な経験から可能であるが、一般的にそれらは例えばＥｌｃｈｒｏｍまたはＢｉｏ−Ｒａｄから購入される。ＤＮＡ又はＲＮＡ試料を分画するために現在までほぼ例外なく使用されてきたこの種のアガロースゲルには、均一のアガロース濃度を有する分離ゲルのみがあり、分離スタッキングゲルを必要としない。この場合の分離は、以下の方法で実施される。
【００２０】
Ａ. ｖＷＦマルチマーの分画
　ｖＷＦマルチマーを分離するために用いられるアガロースゲルは、０.７〜１.８重量 ％、好ましくは０.８〜１.２重量％のアガロース濃度を有した。(例えばBio-Radの)バッキング(backing)なしのアガロースゲルは、後のウェスタンブロット免疫染色分析(ＷＩＳＡ)に特に有利であることがわかった。クマシーブルー染色に特に有利であるとわかったアガロースゲルは、(例えば、Elchrom Scientific AGの)バッキングシートに適用されるゲルであった。なぜならこれは、アガロースを、高温、好ましくは３０℃〜５０℃でより良く乾燥し、そしてこの目的のために特に好ましい色素であるクマシーブルーでより迅速
に染色することを可能とするからである。
【００２１】
　サブマリン電気泳動を、１０℃まで冷却し、ＳＥＡ ２,０００ ＨＩＰＥＲ電気泳動チャンバ(Elchrom Scientific, Cham, Switzerland)において、０.８〜１.５％アガロースゲルおよび例えば０.１％ＳＤＳ(混合物：１２.１２ｇのトリス、５７.８ｇのグリシンおよび２ｇのＳＤＳを、脱イオン水により２,０００mlにした)を含むトリス−グリシンバッファーからなる電気泳動バッファーを用いて行った。電気泳動チャンバに２,０００mlの電気泳動バッファーを装荷した。次いで、ゲルを挿入しそして予備の電気泳動において再平衡化した。この予備の電気泳動は、２５Ｖ／最大ワット／０.５時間(できるかぎり迅速にゲルの再平衡化を行うために循環ポンプを運転する)で行った。
【００２２】
　この電気泳動に関して、ゲルは、ロードする場所が陰極に向けられるように電気泳動チャンバに置かれ、そしてこのゲルは電気泳動の間中使用される電圧に対して水平かつ面平行に置かれる。温度が電気泳動の間８℃以下にならないよう、そして１４℃を超えないように気をつけた。
【００２３】
　試料のロードは、予備の電気泳動の後に行った。試料を、試料バッファー(好ましくは、例えばＡｎａｍｅｄまたはＮｏｖｅｘのＳＤＳ−およびブロモフェノールブルー含有試料バッファー)中においてウォーターバスで３分間ボイルし、そして１レーンあたり２０μlに分けてゲルウェルにロードした。
【００２４】
　試料電気泳動は、２５Ｖ／最大ワット／０.５時間で行った。これにより、ゲルマトリックスへの試料の浸透が引き起こされた。
　メインの電気泳動は、５０Ｖ／最大パワーでブロモフェノールブルーの前方がゲルの終わりに到達するまで行った(試料電気泳動の後すぐ)。
【００２５】
　クマシーブルー染色(SAGE-CB)に関して、ゲル(好ましくはシート上のアガロースゲル)を、例えばエタノール、酢酸および水の混合物(２５／３／７２；v／v)中で０.５時間固定した。次いでゲルを、アガロースが濁って見えるようになるまで(約２〜３時間)ろ紙の層で圧力下に(例えば１０Ｌの中が満たされた実験用ボトルを置くことにより)圧縮し、次いでアガロースが透き通って見えるまで(約１〜２時間)４０℃の乾燥オーブン中でさらに乾燥した。その後、このゲルを、一晩、４０℃で穏やかに振盪しながらクマシーブルーで染色した(０.０１％ Ｓｅｒｖａ ｂｌｕｅ Ｇ、６％硝酸アンモニウム、０.２％酢酸ナトリウム、４ ml/ｌ ６５％ ＨＮＯ3)。翌朝、ゲルを水で一度簡単にリンスした。ゲル支持体に付着した色素をアルコールを染み込ませたろ紙上にバッキング側を外すことにより除去した。次いでこのゲルを再度アガロースゲルが濁るまで(約１時間)圧力下に圧縮し、次いでアガロースが透き通って見えるまで(約１〜２時間)４０℃の乾燥オーブンでさらに乾燥した。
【００２６】
　最後に、乾燥したゲルを評価並びに長期間のドキュメンテーションおよび保管するためにそれを保存するため、特別なフィルム中に密封するか又はラミネート加工した。
【００２７】
　ウェスタンブロット免疫染色(SAGE-WISA)に関して、ここではバッキングのないアガロースゲルが好ましくは用いられ、ブロットバッファーが分析の日の朝に新しく作製され(３５.６ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4×２Ｈ2Ｏ、６.９ｇ ＮａＨ2ＰＯ4×Ｈ2Ｏおよび１０mlの２０％濃度のＳＤＳ水溶液は、脱イオン水を用いて５,０００mlにした)、冷蔵庫で＋１２℃〜＋１４℃に冷却され(約３時間の期間)、次いでブロットチャンバーおよび反応皿に入れられた。ブロットチャンバーの冷却を＋８℃に調整した。膜(ニトロセルロースまたは−好ましくは−ＰＶＤＦ膜、好ましくはMilliporeのImmobilon-P ０.４５μmトランスファーメンブレン)および１００×１００mmにカットされた１枚のペーパーボード(例えば１６５×６５，Sarstedt AG)を、少なくとも０.５時間穏やかに振盪する間にブロットバッファーでのブロッティング前に平衡化した。
【００２８】
　完全なブロットサンドイッチを、以下のように、ブロットバッファーで満たされたブロットバッファーディッシュ中で組み立てた:
　１. ブロットフレーム(マイナスフレーム)
　２. 薄いスポンジシート
　３. ペーパーボード(１００×１００mm)
　４. ブロット保護膜
　５. (好ましくは２つのフィルターストリップ(１００×１０mm)がゲルの左右に各場合置かれ)泡が除去されたアガロースゲル
　６. ブロット膜(０.４５μm)
　７. ぺーパーボード(１００×１００mm)
　８. ブロットフレーム(プラスフレーム)。
【００２９】
　ゲル下の気泡は、指(保護手袋)で除去した。
　ブロッティングは、７５分間、２０Ｖプラス最大パワーで、８±２℃に冷却および攪拌しながら、当業者に本質的に公知の方法により行った。
【００３０】
　次いで、ブロットサンドイッチを分解し、ブロット膜をブロッキング溶液と共に反応皿に置いた(ゲル上に置かれた側が上でなければならない)。ブロット膜を１５分間振盪しながらＢＳＡバッファー(トリス−緩衝化生理食塩水、ｐＨ８.０中に１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ))中でブロックした。次いで免疫染色を実施した。
【００３１】
　１. １次抗体(０.５％ＢＳＡバッファー中の５０μlのウサギ抗−ｖＷＦ(例えばウサギ／抗−ヒト／ヒト、ＤＡＫＯ))と一緒に４５分間インキュベーション。
　２. 脱塩水で簡単に膜を３回リンス。
　３. ０.５％ＢＳＡバッファーを含む５０mlのトリス−緩衝化生理食塩水で１５分間洗浄。
　４. ２次抗体(例えば５０mlの０.５％ＢＳＡバッファー中５０μlのヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＡＰ(アルカリフォスファターゼ標識; Sigma)と一緒に４５分間インキュベーション。
　５. 脱塩水で簡単に膜を３回リンス。
　６. ５０mlのＢＳＡバッファーで１５分間洗浄。
　７. タブ中で膜を５０mlの基質溶液(５０mlの０.５％ＢＳＡバッファーまで２錠のＢＣＩＰ／ＮＰＴ (Sigma))と一緒に室温で１５分間インキュベーション。
　８. 脱塩水を用いて数回洗浄することにより反応を停止。
　９. ＋４０℃まで加熱されたホットプレート上にブロッティング膜を置き、１枚のペーパーボードで覆い、そしてローラーを用いて余分な水分を除去。
　１０. 最後に、ブロット膜を、評価並びに長期間のドキュメンテーションおよび保管のためにそれを保存するため、特別なフィルム中に密封するかまたはラミネート加工した。
【００３２】
　ブロットまたはクマシーブルーで染色されたゲルのドキュメンテーションは、ラミネート加工形態で原物としてまたは写真もしくは走査により行った。
【００３３】
　(ラミネート加工された)染色されたゲルまたは(ラミネート加工された)免疫染色されたブロット膜をスキャナーに通し、適切なソフトウェア(例えばPharmaciaの「1-D-Elite」,
Version Image Master 4.10ソフトウェアを使用)を用いてデンシトメトリーにより評価し、そして例えば以下のような通常の方法で判断した：
　−バンド１〜５、６〜１０および１１以上の含量(content)を評価ソフトウェアにより総計し、そしてこれを、１００％基準として使用されるコンプリートレーンに対し、各場合において百分率含量として関連づけた。
　−各サンプルのバンド１１以上の含量は、標準ヒト血漿(＝１００％)のバンド１１以上に対し、百分率含量として関連づけた。
【００３４】
Ｂ.フィブリノゲンマルチマーの測定
　フィブリノゲンマルチマーを分離するために使用されるアガロースゲルは、１.６〜３.０重量％、好ましくは１.８〜２.４重量％のアガロース濃度を有した。(例えばBio-Radの)バッキングなしのアガロースゲルは、後のウェスタンブロット免疫染色分析(ＷＩＳＡ)に特に有利であることがわかった。クマシーブルー染色に特に有利であることがわかったアガロースゲルは、バッキングシートに適用される(例えばElchrom Scientific AGの)ゲルであった。なぜならこれは、アガロースを、高温、好ましくは３０℃〜５０℃でより良く乾燥し、そしてクマシーブルーでより速く染色することを可能にするからである。
【００３５】
　サブマリン電気泳動は、ＳＥＡ ２,０００ ＨＩＰＥＲ電気泳動チャンバー(Elchrom Scientific, Cham, Switzerland)において、１.６〜３重量％、好ましくは１.８〜２.４重量％のアガロースゲルおよび、例えば０.１％ＳＤＳを含むトリス−グリシンバッファーからなる電気泳動バッファー(混合物:１２.１２ｇのトリス、５７.８ｇのグリシンおよび２ｇのＳＤＳを脱イオン水で２,０００mlにした)を用い、１０℃に冷却して行った。電気泳動セルに２,０００mlの電気泳動バッファーを装荷した。次いでゲルを挿入し、予備の電気泳動において再平衡化した。この予備的電気泳動は、２５Ｖ／最大ワット／０.５時間(できるかぎり迅速にゲルを再平衡化するために循環ポンプを運転する)で行った。
【００３６】
　この電気泳動に関して、ゲルは、ロードする場所が陰極に向けられるように電気泳動チャンバに置かれ、そしてそのゲルは電気泳動の間中使用される電圧に対して水平かつ面平行に置かれる。温度が電気泳動の間８℃以下にならずそして１４℃を超えないように気をつけた。
【００３７】
　試料のロードは、予備の電気泳動の後に行った。試料を、試料バッファー(好ましくは、例えば、AnamedまたはNovexからのＳＤＳ−およびブロモフェノールブルー含有試料バッファー)中においてウォーターバスで３分間ボイルし、そして１レーンあたり２０μlに分けてゲルウェルにロードした。
【００３８】
　試料電気泳動は、２５Ｖ／最大ワット／０.５時間で行った。これにより、ゲルマトリックスへの試料の浸透が引き起こされた。
　メインの電気泳動は、５０Ｖ／最大パワー／０.５時間；次いで７５Ｖ／最大ワットでブロモフェノールブルーの前方がゲルの終わりに到達するまで行った(試料電気泳動の後すぐ)。
【００３９】
　クマシーブルー染色に関して、ゲル(好ましくは例えばElchrom Scientificのシート上のアガロースゲル)を、例えばエタノール、酢酸および水の混合物(２５／３／７２; v／v)中で０.５時間固定した。次いでゲルを、アガロースが濁って見えるようになるまで(約２〜３時間)ろ紙の層で圧力下に圧縮した。次いでそのゲルをアガロースが透き通って見えるまで(約１〜２時間)４０℃の乾燥オーブン中でさらに乾燥した。その後、このゲルを、一晩４０℃で穏やかに振盪しながらクマシーブルーで染色した(０.０１％ Serva blue G、６％硝酸アンモニウム、０.２％酢酸ナトリウム、４ml／ｌ ６５％ＨＮＯ3)。翌朝、ゲルを水で一度簡単にリンスした。ゲル支持体に付着した色素をアルコールを染み込ませたろ紙上でバッキング側を外すことにより除去した。次いでこのゲルを再度アガロースが濁るまで(約１時間)圧力下に圧縮し、次いでアガロースが透き通って見えるまで(約１〜２時間)４０℃の乾燥オーブンでさらに乾燥した。
【００４０】
　最後に、乾燥したゲルを評価並びに長期間のドキュメンテーションおよび保管するため
にそれを保存するため、特別なフィルム中に密封するか又はラミネート加工した。
【００４１】
　ウェスタンブロット免疫染色(SAGE-WISA)に関して、ここではバッキングのないアガロースゲルが好ましくは用いられ、ブロットバッファーが分析の日の朝に新しく作製され(３５.６ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4×２Ｈ2Ｏ、６.９ｇ ＮａＨ2ＰＯ4×Ｈ2Ｏおよび１０mlの２０％強度のＳＤＳ水溶液は、脱イオン水を用いて５,０００mlにした)、冷蔵庫で＋１２℃〜＋１４℃に冷却され(約３時間の期間)、次いでブロットチャンバーおよび反応皿に入れられた。ブロットチャンバーの冷却を＋８℃に調整した。膜(ニトロセルロースまたは−好ましくは−ＰＶＤＦ膜、好ましくはMilliporeのImmobilon-P ０.４５μmトランスファーメンブレン)および１００×１００mmにカットされた１枚のペーパーボード(例えば１６５×６５, Sarstedt AG)を、少なくとも０.５時間穏やかに振盪する間にブロットバッファーでのブロッティング前に平衡化した。
【００４２】
　完全なブロットサンドイッチを、以下のように、ブロットバッファーで満たされたブロットバッファーディッシュ中で組み立てた:
　１. ブロットフレーム(マイナスフレーム)
　２. 薄いスポンジシート
　３. ペーパーボード(１００×１００mm)
　４. ブロット保護膜
　５. (好ましくは２つのフィルターストリップ(１００×１０mm)がゲルの左右に各場合置かれ)泡が除去されたアガロースゲル
　６. ブロット膜(０.４５μm)
　７. ぺーパーボード(１００×１００mm)
　８. ブロットフレーム(プラスフレーム)。
【００４３】
　ゲル下の気泡は、指(保護手袋)で除去した。
　ブロッティングは、７５分間、最大パワーにおいて２０Ｖで、８±２℃に冷却および攪拌しながら、当業者に本質的に公知の方法により行った。
【００４４】
　次いで、ブロットサンドイッチを分解し、ブロット膜をブロッキング溶液と共に反応皿に置いた(ゲル上に置かれた側が上でなければならない)。膜を１５分間振盪しながらＢＳＡバッファー(トリス−緩衝化生理食塩水、ｐＨ８.０中に１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ))中でブロックした。次いで免疫染色を実施した。
【００４５】
　１. １次抗体(０.５％ＢＳＡバッファー中の５０μlのウサギ抗−フィブリノゲン(例えばウサギ／抗−ヒト／ヒト、ＤＡＫＯ))と一緒に４５分間インキュベーション。
　２. 脱塩水で簡単に膜を３回リンス。
　３. ０.５％ＢＳＡバッファーを含む５０mlのトリス−緩衝化生理食塩水で１５分間洗浄。
　４. ２次抗体(例えば５０mlの０.５％ＢＳＡバッファー中５０μlのヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＡＰ(アルカリフォスファターゼ標識; Sigma)と一緒に４５分間インキュベーション。
　５. 脱塩水で簡単に膜を３回リンス。
　６. ５０mlのＢＳＡバッファーで１５分間洗浄。
　７. タブ中で膜を５０mlの基質溶液(５０mlの０.５％ＢＳＡバッファーまで２錠のＢＣＩＰ／ＮＰＴ(Sigma))と一緒に室温で１５分間インキュベーション。
　８. 脱塩水を用いて数回洗浄することにより反応を停止。
　９. ＋４０℃まで加熱されたホットプレート上にブロッティング膜を置き、１枚のペーパーボードで覆い、そしてローラーを用いて余分な水分を除去。
　１０. 最後に、ブロット膜を、評価並びに長期間のドキュメンテーションおよび保管のためにそれを保存するため、特別なフィルム中に密封するかまたはラミネート加工した。
【００４６】
　ブロットまたはクマシーブルーで染色されたゲルのドキュメンテーションは、ラミネート加工形態で原物としてまたは写真もしくは走査により行った。
【００４７】
　(ラミネート加工された)染色されたゲルまたは(ラミネート加工された)免疫染色されたブロット膜をスキャナーに通し、適切なソフトウェア(例えばPharmaciaの「1-D-Elite」,
Version Image Master 4.10ソフトウェアを使用)を用いてデンシトメトリーにより評価した。
【００４８】
Ｃ. ｖＷＦマルチマーの画分の評価
【実施例１】
【００４９】
Bio-Radプレキャスト１％アガロースゲルにおける標準ヒト血漿の連続希釈物のSAGE-WISA
　標準ヒト血漿(Dade Behring)を連続幾何学的希釈において脱塩水を用いて希釈した。この希釈物を、図１で示される最終濃度が得られるように、１：１ (v／v)で試料バッファーと混合した。この試料を、試料バッファー(好ましくは、例えばAnamedまたはNovexの、ＳＤＳ−およびブロモフェノールブルー含有の試料バッファー)中においてウォーターバスで３分間ボイルし、そしてゲルウェルに１レーンあたり２０μlに分けてロードした。染色されたブロッティング膜のスキャンが図１に示され、そしてそのデンシトメトリー評価が図２に示される。そのピーク群が、(４)と同様に定量された。
【実施例２】
【００５０】
Bio-Radプレキャスト１％アガロースゲルにおけるHaemate-HS(R)の連続希釈物のSAGE-WISA
　Haemate-HS(R)(Aventis Behring)を、連続幾何学的希釈で脱塩水を用いて希釈した。この希釈物を、図３で示される最終濃度が得られるように、１：１(v／v)で試料バッファーと混合した。この試料を、ウォーターバスで３分間ボイルし、そしてゲルウェルに１レーンあたり２０μlに分けてロードした。染色されたブロッティング膜のスキャンが図３に示され、そしてそのデンシトメトリー評価が図４に示される。そのピーク群が、(４)と同様に定量された。
【実施例３】
【００５１】
Elchrom Scientific AGプレキャスト１％アガロースゲルにおけるHumate-P(R)およびHaemate-HS(R)のSAGE-CB
　Humate-P(R)およびHaemate-HS(R)を、図５で示される濃度に試料バッファーを用いて希釈し、ウォーターバスで３分間ボイルし、そしてゲルウェルに１レーンあたり２０μlに分けてロードした。染色されたゲルのスキャンが図５に示され、そしてそのデンシトメトリー評価が図６に示される。そのピーク群が、(４)と同様に定量された。
　図４(ブロット膜)および図６(ゲルのブルー染色)からのｖＷＦ試料のデンシトメトリー評価の比較は、ウェスタンブロットにおけるバンド１１以上の百分率含量は約１８％であるが、ブルー染色ではほとんど２倍近く大きい、約４０％であることを示す。この所見は、高分子量バンドがあまりよくブロットされないという(８)に開示されている観察を強調する。Perutelliは、放射性抗体結合体(オートラジオグラフィーまたはルミノグラフィー)を使用してゲルにおけるマルチマーバンドの直接的染色によりこのウェスタンブロットの弱点を克服している。それに対して、本発明により使用されたブルー染色は、感度が弱いが、全く害を及ぼさないという利点を有する。
【００５２】
Ｄ. フィブリノゲンマルチマーの画分の評価
【実施例４】
【００５３】
Elchrom Scientific AGプレキャスト２％アガロースゲルにおけるフィブリノゲンのSAGE-CB
　試料を、試料バッファーと１：１ (v／v)で混合し、ウォーターバスで３分間ボイルし
、そしてゲルウェルに１レーンあたり２０μl(≒３６０μgフィブリノゲン；１８mg／ml)に分けてロードした。クマシーブルーで染色されたゲルのスキャンが図7に示される。
【実施例５】
【００５４】
Elchrom Scientificプレキャスト２％アガロースゲルにおけるフィブリノゲンのSAGE-WISA
　フィブリノゲン試料(９０ｇ／ｌ)を、脱塩水で１：１００(v／v)に希釈し、次いで試料バッファーで１：１２(v／v)に希釈し、ウォーターバスで３分間ボイルし、そしてゲルウェルに１レーンあたり２０μlに分けてロードした。
　免疫染色ブロッティング膜のスキャンが図８に示される。この場合、このアガロースゲルは、ブロッティングのためにバッキングシートから取り外される。
【実施例６】
【００５５】
Elchrom Scientificプレキャスト２％アガロースゲルにおけるHumate-P(R)のSAGE-WISA
　Humate試料を実施例２と同様にＭＱ水で予備希釈し、そして図３、レーン２で示される最終濃度が得られるように(０.１IU／ml)、１：１で試料バッファーと混合した。このHumate試料をウォーターバスで３分間ボイルし、そしてElchrom Scientificの２％アガロースゲルにおいて、ゲルウェル２〜７において１レーンあたり２０μlに分け、標準ヒト血漿(レーン１およびレーン８)と対比して測定した。メインの電気泳動は、１％ゲルにおける測定と比較して３〜４.５時間増加させた。ブロッティングおよびゲル染色は、実施例２と同様に行った。レーン１〜４の低分子量領域の、染色されたブロッティング膜のスキャンおよびデンシトメトリー評価が、図９に示される。この場合、アガロースゲルはブロッティングのためのバッキングシートから外された。標準ヒト血漿と比較して、Humate-Pの低分子量マルチマーバンドは、微細な構造(ダブルバンドへの分割)を示した。
【００５６】
参考文献リスト:
　1. Connaghan, D.G., Francis, C.W., Lane, D.A.;Marder, V.J. (1985) Specific identification of fibrin polymers, fibrinogen degradation products and crosslinked fibrin degradation products in plasma and serum with a new sensitive technique. Blood 65 (3) 589 - 97.
　2. Proietti, A.B.; McGuire, M. ; Bell, W. (1990) Specific identification of fibrin(ogen) degradation products in plasma and serum using blotting and peroxidase labeled antiserum. American Journal of Hematology 34 (4) 270 - 4.
　3. Raines, G.; Aumann, H.; Sykes, S.; Street A. (1990) Multimeric analysis of von Willebrand factor by molecular sieving electrophoresis in sodium dodecyl sulphate agarose gel. Thrombosis Research 60 (3) 201 - 12.
　4. Metzner, H.J.; Hermentin, P.; Cuesta-Linker, T.; Langner, S.; Mueller, H.-G. and Friedebold, J. (1998)“Characterization of factor VIII/von Willebrand factor concentrates using a modified method of von Willebrand factor multimer analysis”Haemophilia (1998), 4 (Suppl. 3), 25 - 32.
　5. Coon and Bayer (1995) Clin. Appi. Thrombosis/Hemostasis 1, 31-3
　6. Tatewaki et al., (1989) Thromb. Res. 56, 191 - 9
　7. Ruggeri and Zimmermann (1981) Blood 57: 1140 - 3
　8. Perutelli, P., Haematologica 2002; 87:223-224
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】標準ヒト血漿の連続希釈物におけるSAGE-WISAで染色されたブロッティング膜のスキャンである。
【図２】標準ヒト血漿の連続希釈物におけるSAGE-WISAのデンシトメトリー評価である。
【図３】Haemate-HS(R)の連続希釈物におけるSAGE-WISAで染色されたブロッティング膜のスキャンである。
【図４】Haemate-HS(R)の連続希釈物におけるSAGE-WISAのデンシトメトリー評価である。
【図５】Humate-P(R)およびHaemate-HS(R)におけるSAGE-CBで染色されたゲルのスキャンである。
【図６】Humate-P(R)およびHaemate-HS(R)におけるSAGE-CBのデンシトメトリー評価である。
【図７】フィブリノゲンのSAGE-CBで染色されたゲルのスキャンである。
【図８】フィブリノゲンのSAGE-WISAで染色されたブロッティング膜のスキャンである。
【図９】Humate-P(R)のSAGE-WISAのデンシトメトリー評価である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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