(57)【要約】【課題】モノクローナル抗体が認識する抗原を効率よく短時間で同定できる方法を提供すること。【解決手段】哺乳類培養細胞用発現ベクターに全長ｃＤＮＡを組み込み、全長ｃＤＮＡライブラリーを作製し、かかる全長ｃＤＮＡライブラリーを哺乳類動物細胞に導入して培養し、ｃＤＮＡにコードされたタンパク質を哺乳類培養細胞上に立体構造を形成した状態で発現させ、かかる立体構造を形成した状態でタンパク質を発現している哺乳類培養細胞を被検モノクローナル抗体で免疫染色することにより、抗原遺伝子ｃＤＮＡを同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃＤＮＡライブラリーを哺乳類培養細胞に導入し、前記ｃＤＮＡがコードするタンパク質を哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるタンパク質を発現した哺乳類培養細胞を被検モノクローナル抗体で免疫染色し、被検モノクローナル抗体により免疫染色された免疫陽性細胞を選択し、選択された免疫陽性細胞からｃＤＮＡクローンを単離し、前記哺乳類培養細胞上に発現したタンパク質をコードする遺伝子を同定することを特徴とするモノクローナル抗体の抗原分子同定法。
【請求項２】
ｃＤＮＡライブラリーが、哺乳類培養細胞用発現ベクターにｃＤＮＡを組み込むことにより調製したｃＤＮＡライブラリーであることを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法。
【請求項３】
ｃＤＮＡライブラリーが、哺乳類培養細胞用発現ベクターに全長ｃＤＮＡを組み込むことにより調製した全長ｃＤＮＡライブラリーであることを特徴とする請求項２記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法。
【請求項４】
哺乳類培養細胞用発現ベクターが、プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法。
【請求項５】
哺乳類培養細胞が、ＣＯＳ細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法。
【請求項６】
哺乳類培養細胞用発現ベクターに全長ｃＤＮＡをクローニングすることにより構築した全長ｃＤＮＡライブラリーを導入した哺乳類培養細胞を含むことを特徴とするモノクローナル抗体の抗原分子同定キット。
【請求項７】
哺乳類培養細胞用発現ベクターが、プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳであることを特徴とする請求項６記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定キット。
【請求項８】
哺乳類培養細胞が、ＣＯＳ細胞であることを特徴とする請求項６又は７記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定キット。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法により得られることを特徴とする抗原が同定されたモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項８記載のモノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする抗原に対する疾病の診断薬。
【請求項１１】
請求項８記載のモノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする抗原に対する疾病の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、モノクローナル抗体の抗原分子同定法、詳しくは、哺乳類細胞ｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いたモノクローナル抗体の抗原分子同定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
目的とするタンパク質に対する抗体を入手することは、その同定・機能解析において重要な位置を占めるが、動物に目的とする抗原を投与して免疫する従来の方法は、多種・多量の抗原と長い時間、多大な労力を要することから、近年、ファージ抗体ライブラリーを用いて抗体を作製する方法が確立されている。かかる方法は、繊維状ファージのコートタンパク質に抗体を融合させることにより、ファージの表面上に抗体を提示（ディスプレイ）するシステムを応用したもので、抗体遺伝子をＰＣＲで増幅して多種類の抗体遺伝子を含むライブラリーを作製し、これをファージ上に提示させることによってファージディスプレイライブラリーとするものであって、このファージシステム（例えば、非特許文献１参照。）によるとヒトの抗体の抗原を同定することが可能となる。このファージ抗体ライブラリーを用いるスクリーニング方法は、ファージディスプレイ法と呼ばれ、従来から種々の細胞表面レセプターと特異的に結合するリガンドや種々の抗原を同定するために使用されている。ファージ抗体ライブラリーの作製方法やそれを用いたイムノチューブ法、マグネティックビーズ法等のスクリーニング法についても既に数多く報告されている。（例えば、非特許文献２、３参照。）。
【０００３】
その他、膜分子のクローニング方法として、例えばＣＯＳ７細胞とＳＶ４０の複製起点を含んだ発現ベクターによる一過性発現を利用して、動物細胞発現ベクターで作製されたｃＤＮＡライブラリーをＣＯＳ７細胞に導入し、細胞表面上にｃＤＮＡライブラリー由来の膜蛋白質を発現させ、目的とする膜分子を発現している細胞をその膜分子に対する抗体やリガンドを用いてパニングあるいはＦＡＣＳで濃縮し、プラスミドＤＮＡを回収して再びＣＯＳ７細胞にトランスフェクションし、濃縮操作を繰り返す方法や、発現ベクターｃＤＮＡライブラリーをいくつかの小さなプールに分け、ＣＯＳ７細胞に導入し、アイソトープで標識した抗体やリガンドを用いて膜分子の発現を検出し、陽性プールをさらに少数のプラスミドからなるプールに分けてトランスフェクションを繰り返しクローン化する方法が知られている（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００４】
また、ヒト細胞からポリアデニル化ＲＮＡを単離し、単離されたポリアデニル化ＲＮＡを用いて２本鎖ｃＤＮＡを作り、この２本鎖ｃＤＮＡをクローニングベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製し、この組換え発現ベクターで宿主をトランスフォームして前記抗原を発現させ、リューマチ性関節炎患者の血清からの抗体を用いて、前記抗体が前記発現抗原に結合することを、抗ヒトＩｇＭ抗体−アルカリホフファターゼ複合体とアルカリホスファターゼ顕色基質とによって検出することによりトランスフォームされた宿主を選択する、リューマチ性関節炎関連抗体に対して反応性を有するリューマチ性関節炎の診断用抗原をコードする組換えＤＮＡの作製方法（例えば、特許文献１参照。）も知られている。
【０００５】
他方、神経軸索の成長等に関して以下の知見が報告されている。
神経系の発達は、軸索が活発に成長する能力によって特徴づけられており、成長円錐という特異化された先端によって率先されることにより、多くの軸索が胚脳中において活発に伸張する（例えば、非特許文献５、６参照。）。しかし、中枢神経系が成熟すると、軸索は成長能力を喪失する（例えば、非特許文献７参照。）。中枢軸索の再生に関する研究がこれまで盛んに行なわれてきたが、臨床において軸索の再生を誘導することはたいへん難しいとされている。胚軸索と成体軸索は成長能力に関して異なっているが、これは成体神経系における成長抑制環境が原因の一つであると考えられている（例えば、非特許文献８参照。）。例えば、インビボ及びインビトロの両方において調査を行なった過去の研究から、中枢ミエリンが成体神経系における軸索成長の阻止に関与していることがすでに知られている（例えば、非特許文献９、１０参照。）。
【０００６】
嗅覚体系は、嗅球及びそれが終脳中まで成長した嗅索（ＬＯＴ）とよばれるものから成り立っている。嗅索は単純であり（例えば、非特許文献１１、１２参照。）器官培養により簡単に再生できることから（例えば、非特許文献１３参照。）、軸索ガイダンスの細胞機構及び分子機構に関する有益な情報を提供してきた（例えば、非特許文献１４〜１７参照。）。また、ミエリンにおける軸索反発因子（ａｘｏｎａｌ　ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ　ｆａｃｔｏｒ）であるＮｏｇｏ（例えば、非特許文献１８〜２２参照。）が成体神経系中において希突起膠細胞により産出されることは、過去の研究からすでに知られている（例えば、非特許文献２３〜２５参照。）。また、Ｎｏｇｏが中枢軸索の成長を阻止することもすでに知られている（例えば、非特許文献２６、２７参照。）。
【０００７】
抗Ｎｏｇｏモノクローナル抗体として知られているＩＮ−１が、中枢神経系において軸索の再生をインビトロとインビボの両方で増進させることが報告されている（例えば、非特許文献１７、２３、２５〜３０参照。）。Ｎｏｇｏは、小胞体（ＥＲ）膜貫通蛋白質の一部であるレチキュロン（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）ファミリーに属している（例えば、非特許文献３１、３２参照。）。レチキュロンファミリーの他のメンバーと同様に、Ｎｏｇｏは主にＥＲに局在しているが、細胞表面にも存在している（例えば、非特許文献１９、２０、２３参照。）。Ｎｏｇｏには、３つのスプライシングアイソフォーム、Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−Ｂ及びＮｏｇｏ−Ｃがあり、これらはＣ−末端ドメインが共通しているが、Ｎ−末端配列が相違している。Ｎｏｇｏ−Ａは最も長いアイソフォームで、ラットでは１１６３個のアミノ酸残基からなっている。Ｎｏｇｏ−Ｂは、Ｎｏｇｏ−ＡのＮ−末端部分と、スプライスされた共通のＣ−末端ドメインを有している。Ｎｏｇｏ−Ｃは最も短いアイソフォームで、共通のＣ−末端ドメイン以外に、Ｎ−末端上にある独特の短いアミノ酸を含んでいる。最近の研究により、Ｎｏｇｏは、反発作用に対する２つの機能的ドメイン、すなわち、共通するＣ−末端ドメインにある６６アミノ酸配列と、Ｎｏｇｏ−Ａに特異的なＮ−末端配列をもつことがわかっている（例えば、非特許文献３３参照。）。
【０００８】
また、嗅球の神経細胞の軸索は、終脳の特定領域を選択的に伸長し（例えば、非特許文献１３、３４参照。）、この軸索の道標となる神経細胞（道標細胞）を特異的に標識するマーカー抗体としてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ｌｏｔ１が知られている（例えば、非特許文献３５参照。）。道標細胞は、軸索の伸長に先だって、将来の軸索伸長経路に並び、軸索をこの経路へと誘導するが、モノクローナル抗体ｌｏｔ１がどのような抗原分子を認識しているのかは不明であった。この抗原分子は、少なくとも発生期の終脳においては道標細胞のみで発現されており、道標細胞特有の何らかの機能と関係する可能性が考えられている。
【０００９】
そしてまた、グルタミン酸は、神経終末より放出され、シナプス後膜あるいは神経終末に存在するグルタミン酸受容体を介して神経細胞活性あるいは神経伝達物質の放出を調節するなど、高等動物の中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であると考えられており、グルタミン酸受容体は、中枢における興奮性シナプス伝達に中心的役割を担っていることが知られている。グルタミン酸受容体は、シグナル伝達機構等から、イオンチャネルを内蔵して速いシナプス伝達を担うイオンチャネル型グルタミン酸の受容体と、Ｇタンパク質と共役することにより間接的にシグナルを伝える代謝調節型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）とに大別され、遺伝子のクローニングによりｍＧｌｕＲには異なる８種類のサブタイプｍＧｌｕＲ１〜ｍＧｌｕＲ８が存在することも知られている。ｍＧｌｕＲ１〜ｍＧｌｕＲ８はそれぞれ異なる脳内分布を示し、ｍＧｌｕＲ１及びｍＧｌｕＲ５はＧタンパク質を介してホスホリパーゼ、イノシトール３リン酸、カルシウムと情報を伝える受容体とされ、ｍＧｌｕＲ１は長い細胞該ドメインをもつ７回膜貫通タンパク質で、神経伝達物質グルタミン酸のレセプターとして機能すると考えられている（例えば、非特許文献３６、３７参照。）。
【００１０】
【特許文献１】
特表平１０−５１３２５７号公報
【非特許文献１】
Ｐｒｏｃ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８０，　１１９４−１１９８，　１９８３
【非特許文献２】
Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，　３８６−３９０，　１９９０
【非特許文献３】
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２１７，　２２８−２５７，　１９９３
【非特許文献４】
Ｐｒｏｃ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８４，　３３６５−３３６９，　１９８７
【非特許文献５】
Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３，　７４０−７４６，　１９８６
【非特許文献６】
Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４，　１１２３−１１３１，　１９９６
【非特許文献７】
Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　１１，　８９−９４，　２００１
【非特許文献８】
Ｎａｔｕｒｅ　２９６，　１５０−１５２，　１９８２
【非特許文献９】
Ｎｅｕｒｏｎ　２４，　６３９−６４７，　１９９９
【非特許文献１０】
Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　８，　２３８１−２３９３，　１９８８
【非特許文献１１】
Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　Ｒｅｖ．　１１，　１−４５，　１９８６
【非特許文献１２】
Ｊ．　Ｃｏｍｐ．　Ｎｅｕｒｏｌ．　２２３，　１７７−２０２，　１９８４
【非特許文献１３】
Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　２９，　１２７−１３７，　１９９６
【非特許文献１４】
Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　３２，　４１５−４２５，　１９９７
【非特許文献１５】
Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　３８，　９３−１０４，　１９９９
【非特許文献１６】
Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　２１，　２３７３−２３７９，　２００１
【非特許文献１７】
Ｎａｔｕｒｅ　３４３，　２６９−３４３，　１９９０
【非特許文献１８】
Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１０６，　１２８１−１２８８，　１９８８
【非特許文献１９】
Ｎａｔｕｒｅ　４０３，　４３４−４３８，　２０００
【非特許文献２０】
Ｎａｔｕｒｅ　４０３，　４３９−４４４，　２０００
【非特許文献２１】
Ｎａｔｕｒｅ　４０３，　３８３−３８４，　２０００
【非特許文献２２】
Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７３，　１９２８３−１９２９３，　１９９８
【非特許文献２３】
Ｎｅｕｒｏｎ　１，　８５−９６，　１９８８
【非特許文献２４】
Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．　２３，　２０９−２１７，　１９９４
【非特許文献２５】
Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　９，　１１２６−１１３３，　１９８９
【非特許文献２６】
Ｎａｔｕｒｅ　３７８，　４９８−５０１，　１９９５
【非特許文献２７】
Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２０，　８０６１−８０６８，　２０００
【非特許文献２８】
Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２０，　２２７５−２２８６，　２０００
【非特許文献２９】
Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１２，　２１１２−２１１９，　１９９２
【非特許文献３０】
Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　９，　１１２６−１１３３，　１９８９
【非特許文献３１】
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　３２，　１９１−１９９，　１９９６
【非特許文献３２】
Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６８，　１３４３９−１３４４７，　１９９３
【非特許文献３３】
Ｎａｔｕｒｅ　４０９，　３４１−３４６，　２００１
【非特許文献３４】
Ｎｅｕｒｏｌ．　２２３，　１７７−２０２，　１９８４
【非特許文献３５】
Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１８，　７８００−７８１０，　１９９８
【非特許文献３６】
Ｎａｔｕｒｅ　３４９，　７６０−７６５，　１９９１
【非特許文献３７】
Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２，　１３１８−１３２１，　１９９１
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、これまでモノクローナル抗体の抗原分子同定法には、ファージライブラリーを用いた発現スクリーニングの系が実用化されていたが、この系では半ば変性した蛋白質断片を抗体に認識させるので、抗原蛋白質の立体構造を認識するような抗体については適用できず、かかる方法では同定できない抗原が多数存在していた。そのため、抗原タンパク質に対する疾病の診断薬・治療薬に有効なモノクローナル抗体を立体構造の視点から同定することができなかった。本発明の課題は、モノクローナル抗体が認識する抗原を効率よく短時間で同定できる方法を提供することにある。抗原が明らかとなったモノクローナル抗体は、その抗原の機能や性質によって、例えば、疾患の診断マーカー、再生医療、疾患治療などへの応用が期待できる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
モノクローナル抗体ｌｏｔ１の認識する抗原は、免疫染色のパターンから膜タンパク質であると予想されたが、ウエスタンブロットでも免疫沈降でも、この抗原分子を検出することはできなかった。このことは、モノクローナル抗体ｌｏｔ１の抗原決定部位が、膜からの抽出や可溶性にともなって破壊されたためであると考えられていた。このような性質の抗原決定部位をもつモノクローナル抗体の場合、その抗原分子を同定することは極めて困難である。免疫沈降により抗原タンパク質を精製することはもちろん不可能であるし、ファージライブラリーを用いた発現検索系でも抗原を同定できる可能性は極めて低い。そこで発想を変えて、タンパク質をなるべく本来の立体構造に近い形で発現することにより、抗原分子を検索しようと考えた。具体的には、モノクローナル抗体ｌｏｔ１の抗原物質を豊富に発現する領域からｍＲＮＡを調製して全長ｃＤＮＡを合成し、これを哺乳類用発現ベクターに組み込んでライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーを哺乳類培養株細胞（ＣＯＳ細胞）に導入し、コードするタンパク質を強制発現させた。この方法であれば、たとえそのｃＤＮＡに膜タンパク質がコードされていたとしても、その産物は通常どおり細胞膜に組み込まれていて本来の立体構造を取りうるはずである。このように考えて、ｃＤＮＡライブラリーを導入したＣＯＳ細胞を、モノクローナル抗体ｌｏｔ１を用いて免疫染色し、顕微鏡下で染色される細胞を検索した。上記の発現検索系を用いてｃＤＮＡクローンを検索したところ、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で強く染色される細胞を生じるｃＤＮＡクローンを単離し、このクローンの塩基配列を決定したところ、代謝型グルタミン酸レセプター１（ｍＧｌｕＲ１）をコードしていることが明らかになった。すなわち、本発明者らは、哺乳類培養細胞用発現ベクターに全長ｃＤＮＡを組み込み、全長ｃＤＮＡライブラリーを作製し、かかる全長ｃＤＮＡライブラリーを哺乳類動物細胞に導入して培養し、ｃＤＮＡにコードされたタンパク質を哺乳類培養細胞上に立体構造を形成した状態で発現させ、かかる立体構造を形成した状態でタンパク質を発現している哺乳類培養細胞を被検モノクローナル抗体で免疫染色することにより、抗原遺伝子ｃＤＮＡを同定することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、ｃＤＮＡライブラリーを哺乳類培養細胞に導入し、前記ｃＤＮＡがコードするタンパク質を哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるタンパク質を発現した哺乳類培養細胞を被検モノクローナル抗体で免疫染色し、被検モノクローナル抗体により免疫染色された免疫陽性細胞を選択し、選択された免疫陽性細胞からｃＤＮＡクローンを単離し、前記哺乳類培養細胞上に発現したタンパク質をコードする遺伝子を同定することを特徴とするモノクローナル抗体の抗原分子同定法（請求項１）や、ｃＤＮＡライブラリーが、哺乳類培養細胞用発現ベクターにｃＤＮＡを組み込むことにより調製したｃＤＮＡライブラリーであることを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法（請求項２）や、ｃＤＮＡライブラリーが、哺乳類培養細胞用発現ベクターに全長ｃＤＮＡを組み込むことにより調製した全長ｃＤＮＡライブラリーであることを特徴とする請求項２記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法（請求項３）や、哺乳類培養細胞用発現ベクターが、プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法（請求項４）や、哺乳類培養細胞が、ＣＯＳ細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法（請求項５）に関する。
【００１４】
また本発明は、哺乳類培養細胞用発現ベクターに全長ｃＤＮＡをクローニングすることにより構築した全長ｃＤＮＡライブラリーを導入した哺乳類培養細胞を含むことを特徴とするモノクローナル抗体の抗原分子同定キット（請求項６）や、哺乳類培養細胞用発現ベクターが、プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳであることを特徴とする請求項６記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定キット（請求項７）や、哺乳類培養細胞が、ＣＯＳ細胞であることを特徴とする請求項６又は７記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定キット（請求項８）や、請求項１〜５のいずれか記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法により得られることを特徴とする抗原が同定されたモノクローナル抗体（請求項９）や、請求項８記載のモノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする抗原に対する疾病の診断薬（請求項１０）や、請求項８記載のモノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする抗原に対する疾病の治療薬（請求項１１）に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体の抗原分子同定法としては、ｃＤＮＡライブラリーを哺乳類培養細胞に導入し、前記ｃＤＮＡがコードするタンパク質を哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるタンパク質を発現した哺乳類培養細胞を被検モノクローナル抗体で免疫染色し、被検モノクローナル抗体により免疫染色された免疫陽性細胞を選択し、選択された免疫陽性細胞からｃＤＮＡクローンを単離し、前記哺乳類培養細胞上に発現したタンパク質をコードする遺伝子を同定する方法であれば特に制限されるものではなく、上記被検モノクローナル抗体は、例えば、所定の組織、器官、臓器の一部又は全部を用いて免疫したラットのリンパ球と、マウスのミエローマ細胞とを用いて常法により作製することができる。
【００１６】
上記ｃＤＮＡライブラリーとしては、哺乳類培養細胞用発現ベクターにｃＤＮＡ、好ましくは全長ｃＤＮＡを組み込むことにより調製したｃＤＮＡライブラリー、好ましくは全長ｃＤＮＡライブラリーを挙げることができる。ｃＤＮＡライブラリーは、前記被検モノクローナル抗体の作製に用いた所定の組織、器官、臓器と同じ組織、器官、臓器等から抽出したｍＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴをプライマーとした逆転写により相補的ＤＮＡを合成し、これを二本鎖ＤＮＡとしてクローニングベクターに組み込むことにより調製することが好ましい。
【００１７】
上記ｃＤＮＡライブラリーの作製に用いられる哺乳類培養細胞用発現ベクターとしては、真核細胞中に蛋白質を効率的に発現可能とし、且つコンピテント細胞に形質転換することができるプラスミドベクターやトランスフェクションすることができるファージベクターであればどのようなものでもよく、発現ベクタ−の複製を可能とする複製オリジン、発現のためのプロモ−タ−、スプライスシグナル、ポリＡ付加シグナル、薬剤選択マ−カ−、エンハンサ−等を必要に応じて選択し、組み合わせて構築することができる。発現ベクタ−の複製を可能とする複製オリジンとしては、ＳＶ４０ウィルス、パピロ−マウィルス、ＥＢウィルス等を挙げることができ、また発現のためのプロモ−タ−としては、β−アクチンプロモ−タ−、チミジンキナ−ゼプロモ−タ−、ＳＶ４０プロモ−タ−、アデノウィルス主要後期プロモ−タ−、サイトメガロウィルスプロモ−タ−等を挙げることができる。さらに、スプライスシグナル、ポリＡ付加シグナル、クローン選択を効率化するための薬剤選択マ−カ−、細胞特異的に働くエンハンサ−の他、導入遺伝子の発現を制御する転写制御遺伝子等を付加してもよい。具体的には、上記プラスミドベクターとしてｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ　１０８，　１９３−２００，　１９９１）、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　８，　４６６−４７２，　１９８８）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１８，　５３２２，　１９９０）等を好適に例示することができるが、これらの中でも、サイトメガロウィルスのエンハンサ−、チキンβ−アクチンプロモ−タ−、ラビットβ−グロビン３’スプライスシグナル、ラビットβ−グロビン３’隣接領域、ＳＶ４０複製オリジンを有し、哺乳動物細胞中で組込んだ遺伝子を高い効率で発現することができるｐＣＡＧＧＳ（図１１参照）が特に好ましい。また、上記哺乳類培養細胞としては、哺乳類培養細胞用発現ベクターにｃＤＮＡを組み込んだｃＤＮＡライブラリー由来の膜抗原タンパク質をトランジェントにあるいはステイブルに細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現させることができる、哺乳類由来の培養細胞であれば特に制限されるものではなく、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ｎｅｕｒｏ２ａ細胞等を例示することができるが、上記膜抗原タンパク質を効率よくトランジェントに発現させうる点でＣＯＳ細胞が好ましい。
【００１８】
また、モノクローナル抗体での免疫染色方法としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等で酵素標識されたモノクローナル抗体を、抗原抗体反応により細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現している膜タンパク質に反応させた後、前記酵素の基質及び発色剤の添加によって色素を生成させ、呈色した色素を観察する酵素免疫染色方法や、ＦＩＴＣ等で蛍光標識されたモノクローナル抗体を、抗原抗体反応により細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現している膜タンパク質に反応させた後、蛍光顕微鏡で観察する蛍光免疫染色方法を挙げることができる。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体の抗原分子同定キットとしては、前記プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ等の哺乳類培養細胞用発現ベクターに全長ｃＤＮＡをクローニングすることにより構築した全長ｃＤＮＡライブラリーを導入したＣＯＳ細胞等の哺乳類培養細胞を含むものであればどのようなものでもよく、また、本発明の抗原が同定されたモノクローナル抗体としては、上記本発明のモノクローナル抗体の抗原分子同定法により、はじめて抗原分子が明らかにされたモノクローナル抗体であれば特に制限されず、具体的には、ミエリンにおける軸索反発因子であるＮｏｇｏ−Ａを特異的に認識するモノクロナール抗体ＮＧ１や、膜蛋白質Ｍ６ａを特異的に認識するモノクロナール抗体Ｈ１−１Ｂ４や、ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ　１を特異的に認識するモノクロナール抗体９−４ｃ１や、プロゲステロン結合タンパク質（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を特異的に認識するモノクロナール抗体８−２ｆ６や、ＧＡＰ−４３を特異的に認識するモノクロナール抗体Ｈ２−１Ａ７や、代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）を特異的に認識するモノクロナール抗体ｌｏｔ１や、膜蛋白質Ｎ−ＣＡＭを特異的に認識するモノクロナール抗体Ｈ２−３Ｆ２や、ｃ−ｋｉｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒを特異的に認識するモノクロナール抗体ｈ１２ｃ７や、ＮＥＤＤ結合タンパク質を特異的に認識するモノクロナール抗体７−１ｄ８や、ｍＮａｐｏｒを特異的に認識するモノクロナール抗体ａ−ｐａｌｅｏや、ＣＤ５９を特異的に認識するモノクロナール抗体８−１ｇ８等を挙げることができる。
【００２０】
本発明の抗原分子が明らかにされたモノクローナル抗体は、抗原分子の細胞外ドメインに結合することを特徴とし、所定の組織、器官、臓器の一部又は全部を用いて免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の所定の組織、器官、臓器の一部又は全部の切片上で反応させる、免疫組織化学的方法によりスクリーニングすることができるが、抗原分子のｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記抗原分子を哺乳類培養細胞上に発現させ、かかる抗原分子をその表面に発現した哺乳類培養細胞を、上記免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することにより、抗原分子の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を再現性よく製造することができる。例えば、ｍＧｌｕＲ１のｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記ｍＧｌｕＲ１を哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるｍＧｌｕＲ１を発現した哺乳類培養細胞を、嗅球で免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することにより、ｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を再現性よく製造することができる。ｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとしては特に制限されないが、Ｒａｔ−Ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｌｏｔ１を好適に例示することができる。このＲａｔ−Ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｌｏｔ１は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８２６４として寄託されている。
【００２１】
また、例えばＮｏｇｏ−ＡのｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記Ｎｏｇｏ−Ａを哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるＮｏｇｏ−Ａを発現した哺乳類培養細胞を、嗅球軸索で免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することにより、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を再現性よく製造することができる。ミエリンにおける軸索反発因子であるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインを特異的に認識するモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマとしては特に制限されないが、Ｈａｍｓｔｅｒ−Ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＮＧ１を好適に例示することができる。このＨａｍｓｔｅｒ−Ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＮＧ１は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８２６３として寄託されている。
【００２２】
本発明の抗原に対する疾病の診断薬や抗原に対する疾病の治療薬は、本発明のモノクローナル抗体の抗原分子同定法により、はじめて抗原分子が明らかにされたモノクローナル抗体を有効成分とするものであればどのようなものでもよく、具体的には、抗原ｍＧｌｕＲ１に起因する神経変性疾患、精神分裂病、てんかん等の疾病や、抗原Ｎｏｇｏ−Ａに起因する神経変性疾患、神経損傷等を挙げることができる。
【００２３】
また、本発明の上記予防・治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら予防・治療薬を用いる予防・治療方法においては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量の上記予防・治療薬を、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１［モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原分子の同定］
実施例１Ａ（実験材料と方法）
（マウス）
日本エスエルシー株式会社からＩＣＲマウスを購入した。腟栓が見つかった日の昼を、胚日齢０．５日（Ｅ０．５）とみなした。生後２〜３ヶ月の成体マウスを本実験において用いた。また、オリエンタル酵母工業株式会社から、生後８週間のアルメニアンハムスターを購入した。本実験における手法は、国立遺伝学研究所動物委員会による承認をうけている。
【００２５】
（モノクロナール抗体の作製）
Ｅ１４．５である約３００個のマウス胚から嗅索（ＬＯＴ）を機械的に切除し、リン酸バッファー（ＰＢＳ）中で４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて固定し、ＰＢＳ中で洗浄及び懸濁をした後、これを免疫源としてアルメニアンハムスターの後足に注射した。この免疫処理を３週間ごとに４回繰り返し、最後の追加抗原刺激免疫処理を行なってから３日後に、鼠径リンパ節及び膝窩リンパ節を回収して、それらをマウス骨髄腫細胞（ＮＳ１）と公知の方法を用いて融合させた（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１３０，　３０９−３１２，　１９８３、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１８，　７８００−７８１０，　１９９８、Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．　１２２，　９０−１００，　１９８７）。胚日齢１４．５日のマウス終脳由来の免疫ハイブリドーマ培養物の培養上澄液を免疫組織化学的方法によってスクリーニングした。クローニングを行なうため、先端の尖ったガラス製キャピラリーを用いてハイブリドーマ細胞個体を取りだし、１０％のウシ胎児血清（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及び１０％のハイブリドーマクローニング因子（Ｉｇｅｎ社製）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ社製）を含む９６ウェル細胞プレート（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上に蒔いた。
【００２６】
（免疫組織化学法）
マウス胚の脳を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳに４℃下で一晩固定し、２０％スクロースを含むＰＢＳに一晩浸し、ＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ　Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ社製）中で凍結させた。これを凍結切片作製装置（クリオスタット）上で厚さ１４〜２０μｍの切片に分け、ガラススライド（松浪ガラス社製）上に載せた。かかる切片を、１％スキムミルク／ＴＢＳＴ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４、１３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）を有するモノクローナル抗体ＮＧ１ハイブリドーマクローンの培養上澄液を１／１０に希釈した溶液中で一晩インキュベーションし、ＴＥＳＴを用いて洗浄した後、蛍光発光（ＦＩＴＣ）が結合している抗アルメニアンハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて結合抗体を視覚化した。ラビット抗グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼπ抗体（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）及びＣｙ３結合抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）を用いてラビット抗希突起膠細胞を染色した。ホールマウント免疫染色法は、公知の方法（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　２９，　１２７−１３７，　１９９６、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２０，　５８０２−５８１２，　２０００）に準拠した方法で行った。すなわち、Ｅ１３．５マウス胚の終脳半球を切断し、２４〜２８時間、５％のスキムミルク／ＴＢＳＴを用いてモノクローナル抗体ＮＧ１培養上澄液を１０倍に希釈した溶液中においてインキュベーションした。この免疫反応を視覚化するために、ビオチン化した抗アルメニアンハムスターＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）及びＥｌｉｔｅ　ＡＢＣ　Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて処理した。
【００２７】
（嗅球神経の分離培養）
Ｍａｓｕｄａ−Ｎａｋａｇａｗａ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　Ｒｅｓ．　２３，　１７１，　１９９９）及びＭｏｒｉ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　Ｒｅｓ．　２４，　１６０，　２０００）に記載の方法に従い、Ｅ１４．５の嗅球をトリプシン処理し、穏やかなピペット処理を行なうことにより単一細胞に分離した。ポリリシン（Ｓｉｇｍａ社製）によりコーティングした４ウェルチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ　Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに細胞密度が１×１０５細胞となるように調整した。神経膠細胞を用いて条件づけ、Ｂ−２７　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を補った神経細胞培養用基礎培地Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍを用いてＣＯ２インキュベーター中において５日間、かかる細胞を培養した。培養が終了してから２時間、４％のＰＦＡで得られた細胞を固定し、上記方法によりモノクロナール抗体を用いてかかる細胞に対して免疫染色を行なった。
【００２８】
（モノクローナル抗体ＮＧ１の抗原の発現クローング）
モノクローナル抗体ＮＧ１の抗原の発現クローングは以下のように行った。Ｅ１４．５のマウス胚の背軸嗅球から得たポリＡ　ＲＮＡを、ｃＤＮＡライブラリー構築キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。真核細胞中に蛋白質を効率的に発現可能とし、且つコンピテント細胞に形質転換するプラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ（大阪大学宮崎純一博士より供与）中に、前記ｃＤＮＡを挿入することにより、約１００クローンのプラスミドのプールを調製し、トランスフェクション試薬（ＦｕＧｅｎｅ　６；　Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクションした。続けて２日間、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡを用いて固定し、モノクローナル抗体ＮＧ１を用いて免疫染色した。免疫応答細胞は、蛍光顕微鏡を用いてスクリーニングした（Ａｘｉｏｐｌａｎ　２；　Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ社製）。スクリーニングで得た約２４０個のプールから、強い免疫陽性細胞を産出するプールを同定した。かかるプールをさらに小さなプールに分け、単一ポジティブｃＤＮＡクローンが得られるまでアッセイを繰り返した。単離したｃＤＮＡクローンをサブクローンし、ＤＮＡシーケンサー（ＣＥＱ２０００；Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて配列を決定した。また、マウスＮｏｇｏ−Ａのヌクレオチド配列をデータベースに登録した（受入番号：ＡＢ０７３６７２）。
【００２９】
実施例１Ｂ（結果）
（モノクローナル抗体ＮＧ１の作製）
Ｅ１４．５のマウスの終脳から機械で切除した嗅球軸索を用いてハムスターを免疫した。かかるハムスターから調製したリンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞の培養上澄液を、嗅球軸索からなるＬＯＴに結合させるため、切片上で免疫組織化学的にスクリーニングした（図１Ａ、Ｂ）。スクリーニングを行った約２０００のハイブリドーマ細胞株から、ＬＯＴへの強い結合を示したモノクローナル抗体ＮＧ１を単離した。かかるモノクローナル抗体ＮＧ１を用いた免疫染色パターンを以下に示す。
【００３０】
（モノクローナル抗体ＮＧ１による中枢嗅覚系の免疫染色）
嗅球軸索の盛んな伸長が、Ｅ１４．５の終脳に認められている（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　２９，　１２７−１３７，　１９９６）が、モノクローナル抗体ＮＧ１は、ＬＯＴにおける成長中の軸索を強く標識した（図１Ｃ）。これらの軸索は均一には染色されず、ところどころに強く標識される部位が斑点状に認められた（図１Ｄ）が、こうした斑点に対応する構造は同定できなかった。ＬＯＴのより深い領域では、嗅覚皮質中で腺維の染色も認められた（図１Ｃ）。これは、嗅覚皮質の内在ニューロン（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｎｅｕｒｏｎ）の突起部が染色されたものと思われる。嗅球においては、嗅球を通る多くの腺維が至るところで染色されていた（図１Ｅ）。ＬＯＴへと伸長している軸索も同様に染色されているが、こうした伸長ニューロンの細胞体は、はっきりとは染色されていなかった（図１Ｅ）。
【００３１】
胚形成期の終脳のホールマウント調製物において、嗅球軸索がモノクローナル抗体ＮＧ１によって強く染色されているのが認められた（図１Ｅ）。標識した軸索は、嗅覚皮質でアーチ形の突起部を形成しており、これは、以前に報告（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２１，　２３７３−２３７９，　２００１、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　２９，　１２７−１３７，　１９９６）されている嗅球軸索用マーカーによる染色と類似している。しかし、終脳の他の部分では、モノクローナル抗体ＮＧ１による標識は弱いものだった。このことは、弱いものではあるが至るところで生じている抗原の発現が、発生期の神経系において、モノクローナル抗体ＮＧ１に認識されたことを示唆している。
出生後も、ＬＯＴはモノクローナル抗体ＮＧ１により染色された（図１Ｇ）。しかし、その場合は、終脳の他の部位で染色が広範囲に及ぶことは少なかった。それ以前の発生ステージの場合と比較して、軸索には斑点が見られず、もっと均一に染色されていた。
【００３２】
（神経系の他の部位の免疫染色パターン）
一般に、モノクローナル抗体ＮＧ１は、長く成長した軸索を強く標識していた。内包、前交連、脳梁、分界条といった主要な軸索経路はすべて、胚形成期中に強く染色された（図２Ａ、Ｂ）。分化したニューロンが豊富な、皮質板などの領域も染色された（図１Ｃ、２Ａ）。脳とは別個に、嗅神経及び視神経は、かかるモノクローナル抗体に強く染色された（図２Ｃ、Ｄ）。モノクローナル抗体ＮＧ１は、末梢神経及び筋肉も標識したが、他の非神経組織は標識しなかった（図２Ｄ）。これは、神経系及び筋肉においてかかる抗原の特異的発現がモノクローナル抗体ＮＧ１に認識されたことを示唆している。発生が進行するにつれ、モノクローナル抗体ＮＧ１による軸索の標識の鮮明度は低下していった。Ｐ７の時点で、まだ基線レベルより強く染色される軸索もあった（図２Ｅ、Ｆ）が、周辺部に弱い染色部位が偏在していたため、不鮮明だった。
【００３３】
（モノクローナル抗体ＮＧ１による成長円錐の標識）
モノクローナル抗体ＮＧ１は、発生期の神経系における成長中の軸索を強く標識するため、培養中に盛んに伸長する神経突起における、モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原の細胞中の局在について調べた。モノクローナル抗体ＮＧ１は、嗅球ニューロンの神経突起の遠位部分を優先的に標識した（図３）。遠位末端（ｄｉｓｔａｌ　ｔｉｐ）の成長円錐はとくに強く標識された。細胞体及び神経突起で、小胞染色が明瞭に認められることもあった。生存ニューロンを、固定を行わずにモノクローナル抗体と共にインキュベーションしたところ、細胞表面の標識は検出されなかった。これは、モノクローナル抗体ＮＧ１に対するエピトープが、これらのニューロンの細胞質中に存在することを示唆している。
【００３４】
（モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原分子の同定）
モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原を同定するため、ＣＯＳ７細胞中でｃＤＮＡライブラリーを発現させ、モノクローナル抗体ＮＧ１に免疫反応性をもつ生成物を産生するクローンをスクリーニングした。およそ２４，０００のｃＤＮＡクローンを分析した後、＃４−１Ｄ９というクローンが、強い免疫陽性をもつ物質を産生することがわかった（図４Ｂ）。挿入物のヌクレオチド配列から、Ｎｏｇｏのマウス相同物をコードする１つのオープンリーディングフレームが判明した。単離したｃＤＮＡクローンである＃４−１Ｄ９は、Ｎｏｇｏ−Ａを部分的にコードしており、完全な配列の３’側半分をカバーしている（図４Ａ）。ＣＯＳ−７でかかるクローンを発現させたとき、Ｎ−末端から推定５９３番目の残基上の内部メチオニンで翻訳が始まり、Ｃ−末端の最後まで続くと推測された（図４Ａの＃４−１Ｄ９）。Ｎｏｇｏの共通するＣ−末端ドメインには、２つの疎水性ドメインが含まれており、これらはＥＲ中で膜貫通ドメインとして機能すると考えられている（Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｓｃｉ．　１０７，　２４０３−２４１６，　１９９４）。＃４−１Ｄ９クローンが産生した免疫反応性生成物は、実際に、ＣＯＳ−７細胞中に広がるレース様の網状組織に分布していた（図４Ｂ）。これは、ＥＲの典型的な分布を示すものである。
【００３５】
モノクローナル抗体ＮＧ１があらゆる形のＮｏｇｏを認識するのか、それともＮｏｇｏ−Ａだけを認識するのかを調べるため、ｃＤＮＡクローンから共通のＣ−末端ドメインを切除した（図４Ａの＃４−１Ｄ９ΔＣ）。その場合もやはりモノクローナル抗体ＮＧ１は、前記の切除を受けた蛋白質を認識したが、Ｃ−末端上のＥＲにおける保存シグナルの欠失により、その分布は細胞質全体に広がった（図４Ｃ）。この結果により、モノクローナル抗体ＮＧ１はＮｏｇｏ−Ａに特異的に結合するが、その他の形のＮｏｇｏには結合しないことがわかった。モノクローナル抗体ＮＧ１が認識するＮｏｇｏ−Ａ特異的ドメインには、レチキュロンファミリーの他のメンバーとの相同性がまったくない。そのため、モノクローナル抗体ＮＧ１が他のレチキュロン蛋白質とも結合するとは考えにくい。事実、本発明者らは、モノクローナル抗体ＮＧ１がＣＯＳ−７細胞中で発現しているレチキュロン１Ａとは結合しないことを確認している。
【００３６】
（モノクローナル抗体ＮＧ１による、成体神経系中の希突起膠細胞の標識）
モノクローナル抗体ＮＧ１が切片中のＮｏｇｏ−Ａを認識するかどうかを調べるため、成体の中枢神経系の切片をモノクローナル抗体ＮＧ１で免疫染色した。成体神経系の軸索は、モノクローナル抗体ＮＧ１によってはほとんど染色されなかった。そのかわり、脳全体に散在する細胞体が強く染色されているのが観察された（図５Ａ、Ｂ）。モノクローナル抗体ＮＧ１陽性細胞の形態及び分布から、それらが希突起膠細胞であることがわかった。このことは、希突起膠細胞のマーカーであるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）π（ＥＭＢＯ　Ｊ．　１９，　３４１−３４８，　２０００）によるかかる切片の二重免疫染色で確認された（図５Ｃ、Ｄ）。
【００３７】
成体の脊髄におけるＮｏｇｏ−Ａ蛋白質の分布については、これまでにいくつかの研究報告がある（Ｎａｔｕｒｅ　４０３，　４３４−４３８，　２０００、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．　２３，　２０９−２１７，　１９９４）。それらに従い、成体の脊髄切片をモノクローナル抗体ＮＧ１で染色した。かかるモノクローナル抗体により、脊髄の白質全体に分布している希突起膠細胞及びその突起部分が強く染色された（図５Ｅ）。この染色パターンは、報告されている、Ｎｏｇｏ−Ａに対するポリクローナル抗体を用いた場合の免疫染色（Ｎａｔｕｒｅ　４０３，　４３４−４３８，　２０００）と同一だった。しかし、本来Ｎｏｇｏ−Ａに対する抗体であるモノクローナル抗体ＩＮ−１を用いた染色（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．　２３，　２０９−２１７，　１９９４）と比較すると、モノクローナル抗体ＮＧ１による染色では、希突起膠細胞の細胞体がより鮮明に浮かびあがっており、かかる抗体自体は、ミエリン化軸索にはほとんど結合していなかった。染色パターンがこのように異なる理由は、現在のところ不明である。
【００３８】
本実施例において、本発明者らは、発生期の神経系における成長中の軸索と強く結合するモノクローナル抗体ＮＧ１を作製し、このモノクローナル抗体がＮｏｇｏ−Ａ蛋白質と特異的に結合することを示した。成体の神経系をこのモノクローナル抗体で染色した場合の染色パターンは、報告されているＮｏｇｏ−Ａの発現と一致するものだった（Ｎａｔｕｒｅ　４０３，　４３４−４３８，　２０００、Ｎａｔｕｒｅ　４０３，　４３９−４４４，　２０００）。発生期のニューロンにはＮｏｇｏ　ｍＲＮＡの強い発現が見られるとの最近の報告（Ｅｘｐ．　Ｎｅｕｒｏｌ．　１６９，　３１９−３２８，　２００１）と考えあわせ、モノクローナル抗体ＮＧ１は発生期の神経系中のＮｏｇｏ−Ａを認識すると結論づけることができる。本発明により、モノクローナル抗体ＮＧ１が発生期の神経系中のＮｏｇｏ−Ａを認識するということから、盛んに成長している軸索中で、軸索成長の阻害因子であるＮｏｇｏが強く発現しているという、やや意外な新たな知見が得られた。
【００３９】
実施例２［モノクローナル抗体ｌｏｔ１が認識する抗原分子の同定］
実施例２Ａ（実験材料と方法）
（動物）
中部科学資材社（日本国、名古屋）からＩＣＲ系統マウス及びＷｉｓｔａｒ系ラットを購入した。膣栓が検出された日をＥ０．５とした。エーテル深麻酔下で雌親の胚をＨＢＳＳ中で解離した。次に、全ての胚の発達段階をＴｈｅｉｌｅｒ　（１９８９）の定義に従って決定した（ＴＨＥ　ＨＯＵＳＥ　ＭＯＵＳＥ：　ＡＴＬＡＳ　ＯＦ　ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ　ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ，　ｓｐｒｉｎｇｅｒ，　１９８９）。また、抗ｍＧｌｕＲ１抗体は、フナコシ社から購入したラビットポリｍＧｌｕＲ１αの他、生理学研究所の重本隆一博士から供与を受けた抗ｍＧｌｕＲ１抗体を用いた。
【００４０】
（モノクロナール抗体の作製）
Ｅ１４．５のマウス胚から得た約３０個の嗅球を、０．１ｍｌのＨＢＳＳ中に懸濁し、２７ゲージ針を用いて粉砕し、ラットの左後足に注入した。３週間おきに４回、ラットを免疫した。追加抗原を用いて最終免疫を行なってから３日間経過後に、既知の方法（ＳＥＬＥＣＴＥＤ　ＭＥＴＨＰＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬＵＬＡＲ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　３５１−３７２，　Ｆｒｅｅｍａｎ，　１９８１、Ｄｅｖ　Ｂｉｏｌ　１２２，　９０−１００，　１９９６）を用いて、左鼠径リンパ節及び左膝窩リンパ節をミエローマ細胞と融合させた（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）。ハイブリドーマ培養物の上清をＥ１４．５マウス終脳の切片上で免疫組織化学的方法を用いてスクリーニングした。先端が尖ったガラス製キャピラリーを用いて細胞を１個ずつ回収し、１０％のウシ血清（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｌｅｎｅｘａ，　ＫＳ）及び１０％のハイブリドーマ細胞・クローニング因子（Ｉｇｅｎ社製）を加えたＤＭＥＭ（日水社製、東京、日本国）を加えた９６ウェル培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）の各ウェルに移して、クローニングした。
【００４１】
（免疫組織化学法）
マウス胚の脳を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳに４℃下で一晩固定し、２０％スクロースを含むＰＢＳに一晩浸し、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、　Ｓａｋｕｒａ　Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ社製）で凍結した。クリオスタットで冠状切片を１４μｍ厚さに切り分け、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングしたグラススライド（Ｓｉｇｍａ社製）上に置いた。かかる切片を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）共存下で１０分間インキュベートしてＯＣＴ化合物を除去し、その後さらにハイブリドーマ培養物上清共存下で１時間培養した。結合抗体をＣｙ３で標識した抗ラットＩｇ抗体（１：５００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用い、視覚化した。
ホールマウント免疫染色は、文献（Ｊ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　２９，　１２７−１３７，　１９９６）記載の手法に従って行った。簡潔に説明すると、終脳及び培養物を、４％ＰＦＡを含むＰＢＳに４℃下で１２時間固定し、５％スキムミルクを含むＴＢＳＴにおいて１時間インキュベートして抗体の非特異的結合を阻害した。プロテインＡカラム（Ａｆｆｉｇｅｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＭＡＰｓ　ｋｉｔ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を通過させることにより親和精製したモノクローナル抗体ｌｏｔ１（１０μｇ／ｍｌ）共存下において上記標本をインキュベートした。結合抗体をＣｙ３又はＣｙ２で標識した抗ラットＩｇ抗体（１：５００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて視覚化した。
【００４２】
免疫染色処理には以下の抗体も用いた。ウサギ抗ニューロピリン−１抗体（２μｇ／ｍｌ）、マウス抗ＭＡＰ２抗体（１：５００、Ｓｉｇｍａ社製）、マウス抗リーリンモノクローナル抗体ＣＲ−５０（２μｇ／ｍｌ；Ｎｅｕｒｏｎ　１４，　８９９−９１２，　１９９５、Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　１７，　２３−３１，　１９９７）、マウス抗ニューロフィラメントモノクローナル抗体２Ｈ３（１：１００ハイブリドーマ上清、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍ　Ｂａｎｋ）、ウサギ抗カルレチニン抗体（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、ウサギ抗ネスチン抗体（１：５００、大阪大学吉川博士から供与）。二次抗体として、ＦＩＴＣ標識化抗マウスＩｇ抗体（１：１００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）又はＦＩＴＣ標識化抗ウサギＩｇ抗体（１：１００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用した。
【００４３】
（全胚培養法）
既知の方法（Ｊ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　２９，　１２７−１３７）を用いて、器官型培養を行った。具体的には、Ｅ１２．５マウスから得た終脳半球を切片に分け、軟膜を除去し、表面がコラーゲンで覆われている膜フィルター（Ｔｒａｎｓｗａｌｌ−ＣＯＬ　３４１８，　Ｃｏｓｔａｒ社製）上に、心室側を下にして置いた。Ｅ１３．５終脳から嗅球を分離し、Ｅ１２．５終脳片のＬＯＴ部位と結合させて共培養を行った。１０％のウシ血清を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２ミディアム（混合比１：１、日水社製）において、ＣＯ２濃度５％の雰囲気下、３７℃で２〜３日間外植片を培養した。（Ｈｉｒａｔａ　ａｎｄ　Ｆｕｊｉｓａｗａ，　１９９７）に記載の方法で、嗅球を培養した（Ｊ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　３２，　４１５−４２５，　１９９７）。
【００４４】
実施例２Ｂ（結果）
（モノクローナル抗体ｌｏｔ１の作製）
免疫処理したマウス３匹から得たリンパ球とマウスミエローマ細胞を融合させ、ハイブリドーマ細胞株を得た。Ｅ１４．５マウス終脳の切片を免疫染色し、約２０００個のハイブリドーマ細胞株を含有している培養上清をスクリーニングした。なお、ＬＯＴ周辺にある細胞サブセットを特異的に染色するモノクローナル抗体ｌｏｔ１を単離した。他のハイブリドーマ細胞株では、同様の染色パターンはみられなかった。かかるモノクローナル抗体ｌｏｔ１を用いた免疫染色パターンを以下に示す。
【００４５】
（道標細胞の起源）
嗅球の神経細胞の軸索は、終脳の特定領域を選択的に伸長する（図６Ａ、Ｊ．Ｃｏｍｐ．　Ｎｅｕｒｏｌ．　２２３，　１７７−２０２　１９８４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　２９，　１２７−１３７　１９９６）。この軸索の道標となるのが、モノクローナル抗体ｌｏｔ１が認識する神経細胞である（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１８，　７８００−７８１０，　１９９８）。この道標細胞は、軸索の伸長に先立って、将来の軸索伸長経路に並び、軸索をこの経路へと誘導する。Ｅ１２．５の終脳をモノクローナル抗体ｌｏｔ１でホールマウント免疫染色した結果、道標細胞のマーカーであるモノクローナル抗体ｌｏｔ１で赤く染色された道標細胞がつくる帯の上を嗅球の軸索が伸長していた（図６Ｂ）。そこで、道標細胞の起源を探索するため、道標細胞が分裂をしているＥ１０．５の終脳新皮質から細胞を解離して、チミジン類似体のＢｒｄＵ存在下で５日間培養し、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で免疫染色したところ、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で染色される細胞は、終脳新皮質と呼ばれる領域を培養したときに限って、分化してくることが示された（図７Ａ）。さらに、終脳新皮質領域の神経幹細胞を１つ１つ単離して、クローン増殖させても、その中から一定の確率で道標細胞が分化してくることがわかった（図７Ｂ）。したがって、道標細胞を生み出す能力は、終脳新皮質の幹細胞に自律的に備わっていると考えられた。新皮質と隣接する線状体原基の幹細胞を、同様にしてクローン培養しても、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で染色される細胞は、決して現れてこなかった。
【００４６】
（道標細胞の移動）
終脳新皮質は、将来道標細胞が並ぶ軸索経路に比較すると、はるかに背側に位置する、かなり広い領域であるが、この中ではどこの領域をとっても、道標細胞は同じように分化してくる（図７Ｂ）。もし実際の生体内でも、新皮質全体から道標細胞が発生してくるとすれば、これらの細胞は、将来の軸索経路に並ぶために、かなりの距離にわたって終脳半球を腹側方向に移動しなければならない。しかし、このような方向の細胞移動は、これまで報告されていなかった。そこで、この時期の終脳における実際の細胞移動の様子を、マウス胚全体を子宮外で培養する全胚培養法を用いて解析した。Ｅ１０．５の胚の終脳新皮質の神経幹細胞を、蛍光色素で標識し、その胚を２日間全胚培養した。その結果、終脳新皮質で生まれた細胞が確かに腹側方向へと選択的に移動し、将来の軸索経路に並ぶことが確かめられた（図８Ａ）。このようにして移動した細胞の少なくとも一部は、モノクローナル抗体ｌｏｔ１陽性の道標細胞へと分化することも示された（図８Ｂ、Ｃ）。以上の結果を総合すると、道標細胞は終脳新皮質全体で発生し、腹側方向に移動して、将来の軸索経路に並ぶという興味深い発生過程をたどると考えられる。
【００４７】
（Ｘｔ突然変異マウスにおける道標細胞の分布異常）
道標細胞発生の分子機構の手がかりを得るために、終脳の発生に異常を示す様々な突然変異マウスを入手して、これらのマウス脳における道標細胞の動態を観察した。その結果、Ｅｘｔｒａ−ｔｏｅｓ（Ｘｔ）と呼ばれる突然変異マウスにおいて、道標細胞が終脳新皮質全体に散在していることを見い出した。すなわち、野生型マウス（＋／＋）胚において、道標細胞は、終脳新皮質の広い領域から発生し、腹側方向に移動して、将来の軸索経路に配列するが、Ｘｔ突然変異マウス（Ｘｔ／Ｘｔ）においては、終脳の細胞が移動せず、道標細胞が新皮質全体に散在する（図９）。この突然変異マウスの終脳では、腹側方向に向かう細胞移動も観察されず、この細胞移動の異常が道標細胞の分布異常の直接の原因であると考えられた。なお、Ｘｔ突然変異の原因遺伝子は転写制御因子Ｇｌｉ３であることが明らかにされており（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１１６，　７９９−８０４，　１９９２、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．　３，　２４１−２４５，　１９９３）、またこの変異により脳の背腹軸に乱れが生じるといわれている（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２５，　２３１５−２３２５，　１９９８、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２６，　３５６１−３５７１，　１９９９）。
【００４８】
（モノクローナル抗体ｌｏｔ１が認識する抗原分子の同定）
モノクローナル抗体ｌｏｔ１の抗原物質を豊富に発現する発生期の終脳領域からｍＲＮＡを調製して全長ｃＤＮＡを合成し、これを哺乳類用発現ベクターｐＣＡＧＧＳに組み込んでライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーをＣＯＳ細胞に導入し、コードするタンパク質を強制発現させた。ｃＤＮＡライブラリーを導入したＣＯＳ細胞を、モノクローナル抗体ｌｏｔ１を用いて免疫染色し、顕微鏡下で染色される細胞を検索し、約２０００００のｃＤＮＡクローンを検索したところ、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で強く染色される細胞を生じるｃＤＮＡクローン♯６−２Ｅ１０を単離することができた。このクローンの塩基配列を決定したところ、代謝型グルタミン酸レセプター１（ｍＧｌｕＲ１）をコードしていることが明らかになった。ｃＤＮＡクローン＃６−２Ｅ１０を導入し、ｍＧｌｕＲ１タンパク質を発現するＣＯＳ細胞をモノクローナル抗体ｌｏｔ１と２種類の抗ｍＧｌｕＲ１抗体で免疫染色した。モノクローナル抗体ｌｏｔ１（図１０Ａ）と重本博士供与の抗ｍＧｌｕＲ１抗体（図１０Ｂ）では免疫染色が認められたが、市販の抗ｍＧｌｕＲ１抗体では免疫染色が認められなかった。また、細胞内ドメインを欠失させたｍＧｌｕＲ１変異タンパク質を発現するＣＯＳ細胞をモノクローナル抗体ｌｏｔ１と２種類の抗ｍＧｌｕＲ１抗体で免疫染色した。モノクローナル抗体ｌｏｔ１（図１０Ｃ）と重本博士供与の抗ｍＧｌｕＲ１抗体（図１０Ｄ）では免疫染色が認められたが、市販の抗ｍＧｌｕＲ１抗体では免疫染色が認められなかった。これらの結果から、モノクローナル抗体ｌｏｔ１はｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合することが示された。また、市販の抗ｍＧｌｕＲ１抗体はｍＧｌｕＲ１の細胞内ドメインの一部を認識すると考えられた。さらに、このｍＧｌｕＲ１が本当にモノクローナル抗体の抗原分子であるのかを確かめるために、ｍＧｌｕＲＩ遺伝子欠損マウス（Ｃｅｌｌ　７９，　３６５−３７５，　１９９４、Ｎａｔｕｒｅ　３７２，　２３７−２４３，　１９９４）を入手して、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で免疫染色した。その結果、ホモ欠損マウス胚の脳において染色性が完全に欠失していることが示された。その結果、ホモ欠損マウス胚の脳において、染色性が完全に欠失していることが示された。
【００４９】
実施例３［モノクローナル抗体９−４ｃが認識する抗原分子の同定］
（モノクローナル抗体９−４ｃの作製）
マウス胎児における嗅覚皮質の発生を調べるために、新規モノクローナル抗体９−４ｃを作製した。実施例１と同様にして、マウスの嗅覚皮質で免疫したラットのリンパ球とマウスのミエローマ細胞との融合によりハイブリドーマクローンを産生した。およそ５０００個のハイブリドーマから、胚日齢が１４．５日のマウス終脳の冠状切片における免疫組織化学スクリーニング法により選択し、モノクローナル抗体９−４ｃを作製した。
【００５０】
（モノクローナル抗体９−４ｃにより認識される抗原の同定）
モノクローナル抗体９−４ｃにより認識された抗原を同定するため、ＣＯＳ−７細胞でｃＤＮＡライブラリーを発現し、モノクローナル抗体９−４ｃと免疫反応する抗原を産生するクローンを選択した。胚日齢１４．５日のマウス胚の背軸嗅球から得たポリアデニル化ＲＮＡを、ｃＤＮＡライブラリー構築キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。真核細胞中に蛋白質を効率的に発現可能とし、且つコンピテント細胞に形質転換するプラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ中に、前記ｃＤＮＡを挿入することにより、約１００クローンのプラスミドのプールを調製し、トランスフェクション試薬（ＦｕＧｅｎｅ　６；　Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクションした。続けて２日間、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡを用いて固定し、モノクローナル抗体９−４ｃを用いて免疫染色した。免疫応答細胞は、蛍光顕微鏡を用いてスクリーニングした（Ａｘｉｏｐｌａｎ　２；　Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ社製）。スクリーニングで得た約２００００個のプールから、強い免疫陽性細胞を産出するプールを同定した。かかるプールをさらに小さなプールに分け、単一ポジティブｃＤＮＡクローンが得られるまでアッセイを繰り返した。単離したｃＤＮＡクローン＃４−８Ｅ９をサブクローンし、ＤＮＡシーケンサー（ＣＥＱ２０００；Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて配列を決定し、モノクローナル抗体９−４ｃにより認識される抗原がＲｔｎ１であることを同定した。このマウスＲｔｎ１−Ａのヌクレオチド配列をデータベースに登録した。
【００５１】
神経内分泌特異的タンパク質（ＮＳＰ）としてよく知られているＲｔｎ１は、膜貫通型ＥＲタンパク質である（図２Ａ）。Ｒｔｎ１の機能は未だ明らかにされていないが、Ｒｔｎ１は神経及び神経内分泌において発現すること（Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ　ａｎｄ　Ｈｕｇｈｅｓ，　１９９１、ｖａｎ　ｄｅ　Ｖｅｌｄｅ，　１９９４ｂ）や、３つの異なったスプライシングアイソフォーム、Ｒｔｎ１−Ａ、Ｒｔｎ１−Ｂ及びＲｔｎ１−Ｃが存在することも知られている（Ｒｏｅｂｒｏｅｋ，　１９９６）。かかる３つのアイソフォームは、共通したＣ−末端ドメインと変異したＮ末端配列とを有している。Ｒｔｎ１−Ａは、最も長いアイソフォームであって、Ｒｔｎ１−Ｂの３６０アミノ酸を全て含む７６０アミノ酸から構成されている。また、Ｒｔｎ１−Ｃは、共通したＣ−末端ドメインに加えてアミノ酸の伸長が短いＮ末端を含んでいる。単離されたｃＤＮＡクローン＃４−８Ｅ９は、開始メチオニンを含むＲｔｎ１−Ｂの全てのアミノ酸配列を含んでいるが、Ｒｔｎ１−Ｂに対する５′非翻訳領域のヌクレオチド配列を欠損していた（図２Ａ）。このことから、かかるクローンは、Ｒｔｎ１−Ａ又はＲｔｎ１−ＢのｍＲＮＡのどちらかを発現することができるが、Ｒｔｎ１−Ｂは癌細胞のみにおいて発現し、正常組織においては発現しないことが既に報告されている（Ｒｏｅｂｒｏｅｋ，　１９９３）ことから、Ｒｔｎ１ＡのｍＲＮＡに由来すると考えられる。いずれにしても、クローン＃４−８Ｅ９がＣＯＳ−７細胞において発現する際、Ｒｔｎ−１Ｂタンパク質が産生されるのではないかと考えられる。
【００５２】
Ｒｔｎ１に共通するＣ−末端ドメインは、疎水性アミノ酸を親水性部分で分けた２つの伸長を含んでいる（図２Ａ）。このことから、かかるドメインは、ＥＲにおいて保持したシグナルとして機能することが示唆される。実際、クローン＃４−８Ｅ９をＣＯＳ−７細胞で発現させると、モノクローナル抗体９−４ｃは、かかる細胞においてレース様のネットワーク伸長、すなわち、ＥＲの典型的な分布を標識していた（図２Ｂ）。共通するＣ−末端ドメインを切除しても、なお、モノクローナル抗体９−４ｃはトランケート体を認識していたが、その分布は細胞質間で散布し（図２Ｃ）、モノクローナル抗体９−４ｃは、Ｒｔｎ１Ａ及びＢに結合していたが、Ｒｔｎ１Ｃには結合していなかった。また、モノクローナル抗体９−４ｃは、終脳の他、ＬＧＥ及びＭＧＥの脳室帯や視索前部及び隔膜に対して免疫反応することや、脳室領域であるＶＰと反応する。
【００５３】
【発明の効果】
本発明によると、モノクローナル抗体が認識する抗原を効率よく短時間で同定することができ、組織的・網羅的なモノクローナル抗体の作製と応用に役立つばかりでなく、抗原の決定できた抗体については、その抗原の機能や性質によってはさまざまな応用、例えば、疾患の診断マーカー、再生医療、疾患治療などへの応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】モノクローナル抗体ＮＧ１による中枢嗅覚系の免疫染色の様子を示す図である。
（Ａ、Ｂ）：終脳の側面（Ａ）及び冠状面（Ｂ）の概略図。（Ａ）の左部分が吻側であり、（Ｂ）の左部分が側面である。（Ａ）（Ｂ）共にその上部が背面となっている。嗅球（ＯＢ）軸索が、終脳内部の尾側に伸長し、終脳表面で外側嗅索（ＬＯＴ）を形成している。
（Ｃ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色したＥ１４．５の終脳の冠状切片。ＬＯＴ（矢印）が強く染色されている点に注意。嗅覚皮質（矢頭）及び皮質板も、かかるモノクローナル抗体で染色されている。
（Ｄ）：高拡大率でのＬＯＴ。軸索は均一に染色されておらず、強く標識された部位が斑点となっている。
（Ｅ）：前記モノクローナル抗体で染色した、大量の繊維をもつＥ１４．５の嗅球。
（Ｆ）：モノクローナル抗体ＮＧ１による、Ｅ１３．５の終脳の全量免疫染色。他の終脳部位と同様に、ＬＯＴ（矢印）を形成している嗅球軸索でも染色が認められる。
（Ｇ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色したＰ０の終脳。ＬＯＴ（矢印）は、やはり他の部位よりも強く染色されている。
スケールバーは５０μｍ（Ａ−Ｄ及びＦ）、５００μｍ（Ｅ）を表す。
【図２】モノクローナル抗体ＮＧ１による、神経系の他部位の免疫染色の様子を示す図である。
（Ａ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色したＥ１４．５の前脳の冠状切片。内包（矢印）及び髄条（矢頭）において軸索が強く染色されている点に注意。
（Ｂ）：Ｅ１４．５の前脳の後部水平部位（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ　ｌｅｖｅｌ）上の切片。分界条（矢印）中の軸索の束が強く標識されている。
（Ｃ）：Ｅ１４．５の嗅上皮から伸長している嗅覚神経（矢頭）の強い染色。
（Ｄ）：Ｅ１４．５の眼球の、強く標識された視神経（矢印）。眼筋（矢頭）も前記モノクローナル抗体によって染色されている。
（Ｅ）：Ｐ７の前交連（矢印）は、やはり前記モノクローナル抗体によって強く染色されている。
（Ｆ）：Ｐ７の脳梁（矢印）は、周辺部位よりもやや強いレベルで染色されている。
スケールバーは５０μｍを表す。
【図３】モノクローナル抗体ＮＧ１による、培養した嗅球ニューロンの免疫染色の様子を示す図である。
Ｅ１４．５の嗅球ニューロンを解離し（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ）、５日間培養した。神経突起の成長円錐（矢印）が、モノクローナル抗体ＮＧ１によって強く標識されている。スケールバーは５０μｍを表す。
【図４】モノクローナル抗体ＮＧ１によるＮｏｇｏ−Ａ蛋白質の認識の様子を示す図である。
（Ａ）：Ｎｏｇｏの３つのアイソフォームの蛋白質構造。Ｎｏｇｏ−Ａには、Ｎｏｇｏ−Ｂのアミノ酸配列がすべて含まれている。Ｎｏｇｏ−Ｃは、Ｎ−末端（縞のボックス）上に、独特の配列を有している。３種類のアイソフォームすべてに共通するＣ−末端領域におけるグレーのボックスは、ＥＲ中で膜貫通ドメインとして機能する疎水性アミノ酸配列を示している。単離したｃＤＮＡクローンである＃４−１Ｄ９の構造が、かかる３つのＮｏｇｏアイソフォームの下に示されている。翻訳は、左側の点線部分、すなわちＮｏｇｏ−Ａのほぼ中央にあたる位置で始まるとされている。底部にあるｃＤＮＡ構造物の＃４−１Ｄ９ΔＣにおいては、共通するＣ−末端ドメインは、右側の点線部分で欠失し、Ｎｏｇｏ−Ａ特異的な３１６のアミノ酸からなるトランケート蛋白質が後に残っている。
（Ｂ）：＃４−１Ｄ９クローンを用いてトランスフェクションし、モノクローナル抗体ＮＧ１で免疫染色を行ったＣＯＳ細胞。ＥＲの特徴であるレース様の網状組織が染色されている。
（Ｃ）：＃４−１Ｄ９ΔＣを用いてトランスフェクションし、モノクローナル抗体ＮＧ１で免疫染色を行ったＣＯＳ細胞。細胞質が広く染色されている。
スケールバーは５０μｍを表す。
【図５】モノクローナル抗体ＮＧ１による成体神経系の免疫染色の様子を示す図である。
（Ａ、Ｂ）：脳梁近辺の成体終脳の切片。モノクローナル抗体ＮＧ１は、終脳全体に散在する細胞体を染色している。切片（Ｂ）は、（Ａ）の拡大率を高くしたものである。
（Ｃ、Ｄ）：抗ＧＳＴ抗体で染色して希突起膠細胞を視覚化した（Ａ、Ｂ）の同一の図。同じ細胞（矢頭）が、（Ｂ）及び（Ｄ）において標識されている。
（Ｅ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色した成体の脊髄切片。白質中の希突起膠細胞及びその突起部が強く染色されていることに注意。灰白質中でいくつかのニューロンが染色されているのは、二次抗体の非特異的結合によるものである。
スケールバーは５０μｍを表す。
【図６】嗅球軸索と道標細胞の様子を示す図である。
（Ａ）：胎生１２日目頃のマウス終脳の外側図。左が吻側、上が背側を示す。嗅球の軸索（緑）は、道標細胞（赤）がつくる帯の上を伸長する。
（Ｂ）：胎生１２．５日目の終脳。嗅球から最初に伸び出す軸索を、緑の色素で標識した（矢印）。道標細胞はモノクローナル抗体ｌｏｔ１で赤く染色されている。
スケールバーは１００μｍを表す。
【図７】培養下における道標細胞の発生の様子を示す図である。
（Ａ）：道標細胞が分裂をしている胎生１０．５日目の終脳新皮質から細胞を解離して、チミジン類似体のＢｒｄＵ存在下で５日間培養した。モノクローナル抗体ｌｏｔ１で染色される道標細胞が分化している（赤）。そのうち半数以上の細胞は、ＢｒｄＵ（緑）を核に取り込んでおり、培養下で分裂したことがわかる（矢頭）。
（Ｂ）：培養下で道標細胞を生み出す終脳領域。数字は、その領域を培養したときにモノクローナル抗体ｌｏｔ１陽性の道標細胞が分化した確率（％）を示す。赤字が終脳新皮質領域、黒字が線状体原基領域。赤の斜線は予想される将来の嗅球軸索経路の位置を示す。
【図８】道標細胞が終脳新皮質から腹側方向に移動する様子を示す図である。
（Ａ）：胎生１０．５日目胚の終脳新皮質の神経幹細胞を、蛍光色素で標識し（星印）、その胚を２日間全胚培養した。色素標識された細胞が、腹側方向に移動し（矢印）、逆Ｔ字を描いて将来の軸索経路に配列している（矢頭）。
（Ｂ）：終脳新皮質から移動し、軸索領域に並んだ標識細胞（矢頭）。長い突起を将来の軸索経路の方向に伸長している。
（Ｃ）：（Ｂ）の標本をモノクローナル抗体ｌｏｔ１で免疫染色した写真。標識細胞は道標細胞と入り交じって、細胞の帯を形成している。
スケールバーは、（Ａ）５００μｍ、（Ｂ）（Ｃ）１００μｍを表す。
【図９】野生型およびＸｔ突然変異マウスにおける道標細胞の誕生と移動の様子を示す図である。
【図１０】モノクローナル抗体ｌｏｔ１がｍＧｌｕＲ１を認識する様子を示す図である。
（Ａ）（Ｂ）：ｃＤＮＡクローン＃６−２Ｅ１０を導入したＣＯＳ細胞。モノクローナル抗体ｌｏｔ１（Ａ）と抗ｍＧｌｕＲ１抗体（Ｂ）による二重免疫染色像。
（Ｃ）（Ｄ）：細胞内ドメインを欠失させたｍＧｌｕＲ１変異タンパク質を発現するＣＯＳ細胞。モノクローナル抗体ｌｏｔ１（Ｃ）も抗ｍＧｌｕＲ１抗体（Ｄ）もよく似た染色を示す。
【図１１】発現ベクターｐＣＡＧＧＳを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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