(57)【要約】【課題】本発明は、ヒトの自然免疫系に作用する有効成分を感度よくスクリーニングすることができる方法を提供するものである。ヒトの自然免疫に作用する物質を探索することは、新たな免疫活性化剤や免疫抑制剤の開発のために極めて有用である。【解決手段】本発明は、ショウジョウバエの抗菌べプチド遺伝子、好ましくはディプテリシン遺伝子の転写制御領域の下流側にレポーター遺伝子を導入した外来遺伝子を導入したショウジョウバエの幼虫を開腹し、これをウシ胎児血清を含む培地で培養し、培養液中に被検物質を添加して培養し、その後培養液中のレポーター遺伝子の発現量を測定することからなる、自然免疫系に作用する物質をスクリーニングする方法に関する。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ショウジョウバエの抗菌ペプチド遺伝子の転写制御領域の下流側にレポーター遺伝子を導入した外来遺伝子を導入したショウジョウバエの幼虫を開腹し、これをウシ胎児血清を含む培地で培養し、培養液中に被検物質を添加して培養し、その後培養液中のレポーター遺伝子の発現量を測定することからなる、自然免疫系に作用する物質をスクリーニングする方法
【請求項２】
ショウジョウバエの抗菌ペプチド遺伝子が、ディプテリシン遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
培地が、シュナイダーショウジョウバエ液体培地である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
自然免疫系に作用する物質が、ほ乳類の自然免疫系に作用する物質である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ほ乳類が、ヒトである請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ショウジョウバエの抗菌ペプチド遺伝子の転写制御領域の下流側にレポーター遺伝子を導入した外来遺伝子を導入したショウジョウバエの幼虫を開腹し、これをウシ胎児血清を含む培地で培養し、培養液中に被検物質を添加して培養し、その後培養液中のレポーター遺伝子の発現量を測定することからなる、自然免疫系に作用する物質をスクリーニングする方法に関する。本発明の方法はショウジョウバエのＩｍｄ経路による自然免疫系を特異的にスクリーニングできることを特徴とするものであり、Ｉｍｄ経路による自然免疫系はヒトなどの哺乳類と共通しており、本発明の方法は医薬品や農薬などの開発に極めて結うような方法である。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトなどの高等脊椎動物が有する免疫機構は、自然免疫（ｉｎｎａｔｅ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ）と獲得免疫（ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ）に大別できる。自然免疫は、個体に遺伝的に備えられている免疫系であり、昆虫類はこの自然免疫系のみで身を守っている。地球上に生息している約１２０万種の動物のうち約８０％が昆虫であることを考えると、自然免疫系がいかに効率よく機能するものであるかということを理解することができる。一方、獲得免疫系は異物の侵入によってはじめて獲得される免疫であり、高等脊椎動物のみが有している。この獲得免疫を有する動物は地球上に生息する動物の僅か約４％に過ぎない。
【０００３】
自然免疫は生物が共通に有する感染防御機構であり、反応が素早いことが特徴である。このような素早い反応を可能にしているのが、自然免疫系を制御しているシグナル伝達カスケードである。このカスケードにはＴｏｌｌを中心にしたカスケードと、オーファンレセプターのリガンドになり得る脂質メディエーターによるカスケードがある。これらの二つのシグナル伝達カスケードは、いずれも昆虫、哺乳類などの動物のみならず植物においても普遍的に存在するものであり、自然免疫系は進化の過程においてきわめてよく保存されており、生物にとって極めて有効な免疫系である（非特許文献１参照）。
【０００４】
本発明者は、自然免疫活性化機構を調べるために、自然免疫の活性化を定量できる系を、遺伝子導入したショウジョウバエを用いて構築してきた。菌の感染に伴ってその発現が誘導される抗菌ペプチドであるジプテリシン（ｄｉｐｔｅｒｉｃｉｎ）遺伝子の転写制御領域にβ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子をつないだ外来遺伝子を導入したハエでは、菌の感染によりジプテリシン（ｄｉｐｔｅｒｉｃｉｎ）の発現が誘導されると、導入したレポーター遺伝子が発現し、β−ガラクトシダーゼが発現する。この遺伝子導入個体又は遺伝子導入個体から摘出した脂肪体を用いて、導入したレポーター遺伝子が発現量から、自然免疫を活性化する物質をスクリーニングする方法を発表してきた。例えば、グラム陰性菌の構成成分であるＬＰＳ（リポ多糖）を添加すると、高濃度のＬＰＳを必要とするものの、ＬＰＳの用量依存的にβ−ガラクトシダーゼが発現する。このとき、内在性のジプテリシン（ｄｉｐｔｅｒｉｃｉｎ）、ドロソマイシン（ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ）、アッタシン（ａｔｔａｃｉｎ）遺伝子の発現も同様に誘発される（非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３参照）。この方法により一応のスクリーニングはできるが、感度が十分でなく、実験誤差も大きく、実用的な方法ではなかった。
また、ショウジョウバエは、自然免疫系として、Ｉｍｄ経路と呼ばれる細菌防御経路と、Ｔｏｌｌ経路と呼ばれる真菌防御経路の二つの経路を有する。真菌に選択的に働くドロソマイシン（ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ）も、幅広い抗菌性を示すアッタシン（ａｔｔａｃｉｎ）もいずれもＴｏｌｌファミリーにより誘導されるものであり、前記の自然免疫の活性化の手法がどちらの経路によるものであるのかということは確定できなかった。
【０００５】
一方、最近の研究によりショウジョウバエのＩｍｄ経路は、Ｉｍｄ→ｄＴＡＫ１→ｄＩＫＫ複合体→Ｒｅｌｉｓｈといった因子群から構成されており、この経路はヒトの自然免疫系であるＴＮＦ経路と共通性を示しており、ヒトのＴＮＦ経路ではそれぞれＲＩＰ→ＴＡＫ１→ＩＫＫ複合体→ＮＦ‐ｋＢに相当することが報告された（非特許文献４参照）。
【０００６】
ところで、これまでの医薬品の開発は、獲得免疫をターゲットとしてきた。ところが近年、自然免疫が感染防御に極めて重要な役割を果たしていることが明らかとなった。したがって、ヒトの自然免疫に作用する物質を探索することは、新たな免疫活性化剤や免疫抑制剤の開発に直結する。これまでは、自然免疫に作用する物質を効率よくスクリーニングする系が存在しないために、自然免疫をターゲットとした医薬品の開発は皆無であった。
【０００７】
【非特許文献１】
倉田祥一朗、生体の科学、第５１巻３号、第２０２−２０７頁、２０００年
【非特許文献２】
日本生化学会　２０００年１０月１４日　（予稿集第１０３９頁　３Ｐ−３５５）
【非特許文献３】
日本薬学会　２００１年３月　　（予稿集第１４１頁　２９−ＰＡ−ＩＩＩ−０８０）
【非特許文献４】
アールエスキュッシュら、トレンドインイムノロジー、第２２巻５号、２６０−２６４、２００１年（Ｒ．Ｓ．Ｋｈｕｓｈ，ｅｔ　ａｌ．，　ＴＲＥＮＤＳ　ｉｎ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　２２（５），　２６０−２６４　（２００１））
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトの自然免疫系に作用する有効成分を感度よくスクリーニングすることができる方法を提供するものである。ヒトの自然免疫に作用する物質を探索することは、新たな免疫活性化剤や免疫抑制剤の開発のために極めて有用である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
これまでは、自然免疫に作用する物質を高感度で効率よくスクリーニングする系が存在しないために、自然免疫をターゲットとした医薬品の開発は皆無であった。自然免疫は、生物が共通に有する感染防御機構であり、たとえヒトと昆虫であっても、同様な機構から構成されている。本発明者らは、この共通性を利用して、遺伝子組換えショウジョウバエを用いて自然免疫スクリーニング系を開発したてきたが、開発してきたスクリーニング系は感度が十分ではなく実用的ではなかったし、またショウジョウバエのＩｍｄ経路に特異的に作用するものであることを確定できなかった。本発明者は、さらに検討してきた結果、高感度のスクリーニング方法を見出し、さらにこの方法がヒトを含むほ乳類の自然免疫系に作用する物質を特異的に検出できることを見出した。
本発明の方法は、ショウジョウバエが持つ二つの自然免疫経路のうち、Ｉｍｄ経路に作用する物質を特異的にスクリーニング出来、Ｉｍｄ経路は、ヒトのＴＮＦ経路と共通性を示すことから、このスクリーニング系で同定した物質は、ヒトの自然免疫を制御する免疫活性化剤や免疫抑制剤などの感染症に対する医薬品として、あるいは昆虫の自然免疫をターゲットとした農薬として開発出来ることになる。
【００１０】
本発明は、ショウジョウバエの抗菌ペプチド遺伝子、好ましくはディプテリシン遺伝子の転写制御領域の下流側にレポーター遺伝子を導入した外来遺伝子を導入したショウジョウバエの幼虫を開腹し、これをウシ胎児血清を含む培地で培養し、培養液中に被検物質を添加して培養し、その後培養液中のレポーター遺伝子の発現量を測定することからなる、自然免疫系に作用する物質をスクリーニングする方法に関する。
本発明の遺伝子組換えショウジョウバエでは、感染により自然免疫が活性化すると、抗菌ペプチドが産生されると同時に、導入したレポーター遺伝子も発現し、自然免疫の活性化を酵素活性として鋭敏かつ迅速に測定できる。
【００１１】
本発明のレポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子やβ−ガラクシトダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子などのレポーター遺伝子を使用することができる。定量化の容易性からβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が好ましい。以下、レポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を使用した場合について、本発明の方法をより詳細に説明するが、本発明は以下に説明する具体例に限定されるものではない。
本発明の遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を開腹し、２０％ウシ胎児血清並びに抗生物質を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地で、２５℃、１２時間培養する（１匹を約２００μＬの培地で培養する）。その後、培養した幼虫をリン酸バッファーからなる反応液中でホモジネートし遠心上清の酵素活性を測定する。培地に添加する物質が自然免疫を活性化する場合、β−ガラクトシダーゼの酵素活性がコントロール（添加しない場合）より上昇することで判断できる。また、自然免疫を抑制する物質をスクリーニングする場合は、検体を自然免疫を活性化するエンドトキシン（リポ多糖）と同時に培地に添加し行う。この場合は、エンドトキシンで活性化される自然免疫の活性化を検体がどの程度抑制するのか、コントロール（エンドトキシン単独添加）に比較して、検体とエンドトキシンを同時に添加した場合に、酵素活性がどの程度低下するのかどうかで判断できる。
【００１２】
本発明のスクリーニング系は、極めて鋭敏であるので、培養はエンドトキシンフリーの条件で行う必要がある。ショウジョウバエはＩｍｄ経路とＴｏｌｌ経路の二つの自然免疫経路を有している。本発明のスクリーニング系がどちらの経路に作用する物質をスクリーニング出来るのかを、Ｉｍｄ経路とＴｏｌｌ経路がそれぞれ機能しない変異体ショウジョウバエを用いて解析した。
実験にはＩｍｄ経路に異常のある突然変異体（ｉｍｄ）、及びＴｏｌｌ経路に異常のある突然変異体（Ｊ４）を使用した。コントロールとして正常ショウジョウバエを使用した。これらのショウジョウバエに同じように抗菌ペプチドディプテリシン遺伝子の転写制御領域（２．２ｋｂ）の下流側にレポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した。これらの遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を開腹し、ＬＰＳ（リポ多糖）１０μｇ／ｍｌを添加した場合と添加しない場合で、２０％ウシ胎児血清並びに抗生物質を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地で、２５℃、１２時間、それぞれ培養した（１匹を約２００μＬの培地で培養した。）。その後、培養した幼虫をリン酸バッファーからなる反応液中でホモジネートし遠心上清のβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定した。この結果を図１に示す。図Ａは、正常ショウジョウバエ（Ｄｐｔ−ｌａｃＺ）とＩｍｄ経路に異常のある突然変異体（Ｄｐｔ−ｌａｃＺ：ｉｍｄ）を比較したものである。縦軸はタンパク質当たりのβ−ガラクトシダーゼ（ｎｇ／ｍｇ）を示し、横軸は正常ショウジョウバエ（Ｄｐｔ−ｌａｃＺ）の場合とＩｍｄ経路に異常のある突然変異体（Ｄｐｔ−ｌａｃＺ：ｉｍｄ）を示し、白抜き部分はＬＰＳを添加しない場合を示し（ＬＰＳ（−））、黒抜き部分はＬＰＳを添加した場合を示し（ＬＰＳ（＋））ている。この結果、ＬＰＳを添加しない場合には、両者ともレポ−ター遺伝子であるβ−ガラクトシダーゼをほとんど発現していないが、ＬＰＳの存在下では、正常ショウジョウバエの場合にはＬＰＳ依存的にレポーター遺伝子の活性化が誘導されるが（Ｄｉｐ‐ｌａｃＺ）、Ｉｍｄ経路に異常のある突然変異体（Ｄｉｐ‐ｌａｃＺ；ｉｍｄ）では、その活性化が抑制されていることがわかった。
【００１３】
図１Ｂは、正常ショウジョウバエとｉｍｄとＪ４の３者のショウジョウバエについて、ＬＰＳの存在下及び非存在下でのディプテリシン（Ｄｐｔ）の発現量を調べた。結果を図１Ｂに示す。図１Ｂの縦軸は相対量（Ｄｐｔ／ｒｐ４９）を示し、横軸は正常ショウジョウバエ（Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）の場合、Ｉｍｄ経路に異常のある突然変異体（ｉｍｄ）の場合、及びＴｏｌｌ経路に異常のある突然変異体（Ｊ４）を示し、それぞれ白抜き部分はＬＰＳを添加しない場合を示し（ＬＰＳ（−））、黒抜き部分はＬＰＳを添加した場合を示し（ＬＰＳ（＋））ている。この結果、内在性のディプテリシンの発現は、Ｉｍｄ経路に異常のある突然変異体（ｉｍｄ）ではＬＰＳの存在、非存在にかかわらずほとんど発現しないのに対して、Ｔｏｌｌ経路に異常のある突然変異体（Ｊ４）では正常ショウジョウバエと同様の挙動を示し、ＬＰＳによる影響をほどんど受けないことがわかった。
【００１４】
次に、正常ショウジョウバエの抗菌ペプチドディプテリシン遺伝子の転写制御領域の下流側にレポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した。これらの遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を開腹し、種々の濃度のＬＰＳ（リポ多糖）を添加し、２０％ウシ胎児血清並びに抗生物質を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地で、２５℃、１２時間、培養した（１匹を約２００μＬの培地で培養した。）。その後、培養した幼虫をリン酸バッファーからなる反応液中でホモジネートし遠心上清のβ−ガラクトシダーゼの酵素活性およびデイプテリシンの発現量を測定した。
β−ガラクトシダーゼの量の結果を図２Ａに示し、内在性のデイプテリシンの発現量の結果を図２Ｂに示す。図２Ａの縦軸はタンパク質当たりのβ−ガラクトシダーゼ（ｎｇ／ｍｇ）を示し、横軸はＬＰＳの濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。図２Ｂの縦軸は相対量（Ｄｐｔ／ｒｐ４９）を示し、横軸はＬＰＳの濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。この結果、エンドトキシン（ＬＰＳ）の濃度依存的にレポーター遺伝子Ｄｉｐ−ｌａｃＺの活性化が検出された。そのＬＰＳ依存性は、ＬＰＳで誘導される内在性のデイプテリシンの発現（図２Ｂ）と一致した。
【００１５】
次に同様の実験をＬＰＳの存在下及び非存在下において培養時間を変えて行った。内在性のデイプテリシンのｍＲＮＡの発現量は定量的ＲＴ−ＰＣＲにより定量した。β−ガラクトシダーゼの量の結果を図３Ａに示し、内在性のデイプテリシンの発現量の結果を図３Ｂに示す。図３Ａの縦軸はタンパク質当たりのβ−ガラクトシダーゼ（ｎｇ／ｍｇ）を示し、横軸はＬＰＳの培養時間（時間）を示す。図３Ｂの縦軸は相対量（Ｄｐｔ／ｒｐ４９）を示し、横軸はＬＰＳの培養時間（時間）を示す。この結果、本発明の自然免疫スクリーニング系におけるＬＰＳに対するレポーター遺伝子Ｄｉｐ‐ｌａｃＺの活性化は、培養時間に依存しており、それは、ＬＰＳで誘導される内在性のデイプテリシンの発現（図３Ｂ）と一致した。
【００１６】
以上のことから、本発明の自然免疫についてのスクリーニング方法は、内在性のディプテリシン発現のＩｍｄ経路の依存性と一致し、かつＩｍｄ経路に特異的に依存するものであることが判明した。
次に、本発明のスクリーニング方法により、昆虫寄生菌が産生するシクロデプシペプチドであるデストラキシンの自然免疫についてスクリーニングした。デストラキシンは自然免疫を抑制するものであり、デストラキシンを自然免疫を活性化するエンドトキシン（リポ多糖）と同時に培地に添加して実験した。結果を図４に示す。図４の縦軸はコントロールに対する相対活性（％）を示し、横軸はデストラキシの濃度（μＭ）を示す。この結果、昆虫寄生菌が産生するシクロデプシペプチドであるデストラキシンは、用量依存的に自然免疫抑制活性を有する（ＩＣ５０：１μＭ）ことがわかった。
【００１７】
本発明者らは、既にショウジョウバエを用いた自然免疫系のスクリーニング方法を発表してきた（非特許文献１〜３参照）。しかし、これらの方法は感度が十分ではなかった。本発明者は、培地にウシ胎児血清を添加することにより飛躍的に感度が上がることを見出した。
レポーター遺伝子を導入した幼虫（Ｄｐｔ−ｌａｃＺ）を開腹し、従来の培地と２０％ウシ胎児血清を含む培地で培養した。これらの培地におけるＬＰＳに対する自然免疫の活性化を調べた。結果を図５に示す。図５の縦軸はβ−ガラクトシダーゼの発現量（ｎｇ／ｍｇ）を示し、横軸は左からウシ胎児血清を添加した添加後４８時間後の培地を用いた場合、ウシ胎児血清を添加した添加後７日後の培地を用いた場合、従来の培地を用いた場合を示し、それぞれＬＰＳ濃度が０、１０、及び１００μｇ／ｍＬの場合を示している。この結果、本発明のウシ胎児血清を添加した培地を用いた方法では、１０μｇ／ｍＬの濃度においても感度よく自然免疫の活性化を検出することができることがわかった。さらに、本発明の方法では実験誤差も少なく、高感度で効率的なスクリーニングができることもわかった。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法は、ヒトなどの哺乳類の自然免疫系と共通すると考えられるショウジョウバエのＩｍｄ経路の自然免疫系をスクリーニングできる方法であり、自然免疫系の医薬品や農薬などの開発に極めて有用なものである。近年の生活環境の変化に伴う各種アレルギー疾患の増加、重篤な疾患への臓器移植による治療機会の増大、再興感染症の増加、あるいは、特に発展途上国で深刻なエイズなどの免疫不全症の多発などにより、免疫抑制剤や活性化剤といった、免疫系を人為的に制御できる医薬品の需要が世界的に増大している。これまでの、これら医薬品の開発は、獲得免疫をターゲットにしたものであり、感染防御の要として機能する自然免疫をターゲットとしたものは皆無であった。本発明により自然免疫をターゲットとした医薬品や農薬の開発が初めて可能となった。
【００１９】
本発明の方法におけるショウジョウバエの抗菌ペプチド遺伝子としては、Ｉｍｄ経路に特異的な抗菌ペプチドであり、好ましい抗菌ペプチド遺伝子としては、ディプテリシン遺伝子が挙げられる。本発明の抗菌ペプチド遺伝子の転写制御領域としては、抗菌ペプチドの転写を制御できる領域であればよく、例えば、ディプテリシン遺伝子の場合には約２．２ｋｂの転写制御領域が挙げられる。
本発明のレポーター遺伝子としては、レポーター遺伝子の発現を検出、又は同定できるものであればよく、好ましくは発現量を定量化できる遺伝子がよい。このような遺伝子としては、各種の蛍光タンパク質遺伝子やβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が挙げられるが、定量化の容易性からβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が好ましい。
【００２０】
本発明の方法は、培養に際してウシ胎児血清を含む培地を用いることを特徴とするものである。好ましい培地としては、ウシ胎児血清を添加後、４８時間を経過した培地であり、その後２週間、好ましくは１週間以内の培地が挙げられる。培地におけるウシ胎児血清の濃度は、特に制限はないが５〜５０％、好ましくは１０〜３０％のものが挙げられる。通常はウシ胎児血清の濃度が２０％程度が好ましい。
培地としては、通常のショウジョウバエ用の培地、例えばシュナイダーショウジョウバエ液体培地を使用することができる。当該培地には必要により、さらに抗生物質などを添加することができる。
本発明の方法のもう一つの特徴は、開腹したショウジョウバエの幼虫をそのまま使用することである。これにより生体の状態で使用することができ、感度の上昇と試験結果の安定性が確保できるのみならず、スクリーニングの効率を飛躍的に上昇することが可能となる。
本発明の方法によりスクリーニングされる物質は、ショウジョウバエのＩｍｄ経路に特異的な自然免疫系に有効な物質であり、このようにしてスクリーニングされた物質は、ほ乳類の自然免疫系にも共通して作用する物質であり、ヒトなどの哺乳類の自然免疫系の医薬品や農薬などとして有用である。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２２】
実施例１　ショウジョウバエの準備
オレゴンＲバエをショウジョウバエの標準の野生型として使用した。Ｉｍｄ経路に異常のあるｉｍｄ系のショウジョウバエは、Ｌｅｍａｉｔｒｅ，　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９２，　９４６５−９４６９　（１９９５）に記載のものを使用した。Ｔｏｌｌ経路に異常があるＪ４系のショウジョウバエは、Ｍｅｎｇ，　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．１３，　７９２−７９７　（１９９９）に記載のものを使用した。
【００２３】
実施例２　（Ｄｐｔ−ｌａｃＺ）の調製
ライヒハートらの方法（Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ，　ｅｔ　ａｌ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．，　１１，　１４６９−１４７７　（１９９２））によりＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡをショウジョウバエの胚にインジェクションして、その後１日間は１８℃で保存して、目的のショウジョウバエ（Ｄｐｔ−ｌａｃＺ）を発生させた。
【００２４】
実施例３　ＬＰＳの存在下又は非存在下におけるレポーター遺伝子の発現
正常体（Ｄｐｔ−ｌａｃＺ）とｉｍｄ経路に変異のある突然変異体（Ｄｐｔ−ｌａｃＺ；ｉｍｄ）幼虫を開腹して２０％ウシ胎児血清を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地で培養した。ＬＰＳ存在下（１０μｇ／ｍｌ）、非存在下に培養し、自然免疫の活性化をレポーター遺伝子の発現により調べた。
結果を図１Ａに示す。
【００２５】
実施例４　ＬＰＳの存在下又は非存在下における抗菌ペプチドの発現
正常体（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）とｉｍｄ経路に変異のある突然変異体（ｉｍｄ）、Ｔｏｌｌ経路に変異のある突然変異体（Ｊ４）幼虫を開腹して２０％ウシ胎児血清を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地で培養した。ＬＰＳ存在下（１０μｇ／ｍｌ）、非存在下に培養し、抗菌ペプチドディプリシンの発現をＲＴ−ＰＣＲにより定量した。
結果を図１Ｂに示す。
【００２６】
ＲＴ−ＰＣＲは以下の方法により行った。
全ＲＮＡ（１μｇ）を逆転写酵素によりｃＤＮＡ（０．５μＬ）とし、これをテンプレートとしてＰＣＲを行った。使用したプライマーは、ディプテリシンについては、５’−ｇｔｔｃａｃｃａｔｔｇｃｃｇｔｃｇｃｃｔｔａｃ−３’、及び５’−ｃｃｃａａｇｔｇｃｔｇｔｃｃａｔａｔｃｃｔｃｃ−３’を用い、ドロソマイシンについては。、５’−ｔｔｇｔｔｃｇｃｃｃｔｃｔｔｃｇｃｔｇｔｃｃｔ−３’、及び５’−ｇｃａｔｃｃｔｔｃｇｃａｃｃａｇｃａｃｔｔｃａ−３’を用い、アッタシンについては、５’−ｇｔｇｇｔｇｇｇｔｃａｇｇｔｔｔｔｃｇｃ−３’、及び５’−ｔｇｔｃｃｇｔｔｇａｔｇｔｇｇｇａｇｔａ−３’を用い、ｒｐ４９については、５’−ａｇａｔｃｇｔｇａａｇａａｇｃｇｃａｃｃａａｇ−３’、及び５’−ｃａｃｃａｇｇａａｃｔｔｃｔｔｇａａｔｃｃｇｇ−３’を用いた。
目的の遺伝子のＲＮＡのコピー数は、各サンプル中のｒｐ４９をコードするＲＮＡにより標準化した。
【００２７】
実施例５　ＬＰＳの濃度依存的レポーター遺伝子の発現
レポーター遺伝子を導入した幼虫を開腹し、２０％ウシ胎児血清を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地で培養した。ＬＰＳ濃度を変えて培地に添加し、自然免疫の活性化をレポーター遺伝子の発現により調べた。
結果を図２Ａに示す。
【００２８】
実施例６　ＬＰＳの濃度依存的抗菌ペプチドの発現
野生型幼虫を開腹し、２０％ウシ胎児血清を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地で培養した。ＬＰＳ濃度を変えて培地に添加し、抗菌ペプチドディプテリシンの発現を、実施例４に記載の方法と同様にＲＴ−ＰＣＲにより定量した。
培養した幼虫よりｍＲＮＡを調製し、リバーストランスクリプターゼにより１本鎖ｃＤＮＡを合成した。ディプテリシン遺伝子に特異的なプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行った。内部標準としてｒｐ４９遺伝子の発現を定量し、全ての値は、ｒｐ４９遺伝子の発現で標準化した。ＰＣＲの特異性はメルティングカーブ解析とＰＣＲ産物の分子量により確認した。
結果を図２Ｂに示す。
【００２９】
実施例７　ＬＰＳの培養時間依存的レポーター遺伝子の発現及び抗菌ペプチドの発現
レポーター遺伝子を導入した幼虫（Ａ）あるいは野生型幼虫（Ｂ）を開腹し、２０％ウシ胎児血清を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地でＬＰＳ存在下（１０μｇ／ｍｌ）、非存在下に培養した。培養時間に伴い、サンプルを回収し、レポーター遺伝子（Ａ）あるいは抗菌ペプチドディプテリシン（Ｂ）の発現を定量した。
結果を図３Ａ及び図３Ｂにそれぞれ示す。
【００３０】
実施例８　デストラキシンを自然免疫活性のスクリーニング
レポーター遺伝子を導入した幼虫（Ｄｉｐ−ｌａｃＺ）を開腹し、２０％ウシ胎児血清を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地で培養した。ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）と共にデストラキシンを培地に加え、自然免疫の活性化をレポーター遺伝子の発現により調べた。
結果を図４に示す。
【００３１】
実施例９　従来の手法と本発明の手法での感度の比較
レポーター遺伝子を導入した幼虫（Ｄｐｔ−ｌａｃＺ）を開腹し、従来の培地と２０％ウシ胎児血清を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地で培養した。ＬＰＳに対する自然免疫の活性化をレポーター遺伝子の発現により調べた。
結果を図５に示す。図５のは、本発明の手法（左）：ウシ胎児血清を添加後４８時間後の培地、本発明の手法（中）：ウシ胎児血清を添加後７日後の培地、及び従来の培地（右）の結果をを示す。この結果、ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌにおいて本発明の方法が高感度で、安定して自然免疫系の活性化を検出できることが分かる。
【００３２】
【発明の効果】
近年の生活環境の変化に伴う各種アレルギー疾患の増加、重篤な疾患への臓器移植による治療機会の増大、再興感染症の増加、あるいは、特に発展途上国で深刻なエイズなどの免疫不全症の多発などにより、免疫抑制剤や活性化剤といった、免疫系を人為的に制御できる医薬品の需要が世界的に増大している。これまでの、これら医薬品の開発は、獲得免疫をターゲットにしたものであり、感染防御の要として機能する自然免疫をターゲットとしたものは皆無であった。
本発明は、自然免疫系に作用する物質を高感度かつ効率的、高信頼性でスクリーニングすることができる実用的な方法を提供するものであり、本発明の方法により自然免疫をターゲットとした医薬品の開発が初めて可能となった。
【００３３】
【配列表】
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2004121155.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のスクリーニング方法が、ショウジョウバエのＩｍｄ経路に特異的なものであることを示す実験結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明のスクリーニング方法が、濃度依存的であることを示す実験結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のスクリーニング方法が、培養時間依存的であることを示す実験結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明のスクリーニング方法により、デストラキシンの自然免疫の活性をスクリーニングした結果を示すグラフである。
【図５】図５は、従来の培地と本発明のウシ胎児血清を含む培地でのＬＰＳに対する自然免疫の活性化を調べた結果を示す。図５の縦軸はβ−ガラクトシダーゼの発現量（ｎｇ／ｍｇ）を示し、横軸は左からウシ胎児血清を添加した添加後４８時間後の培地を用いた場合、ウシ胎児血清を添加した添加後７日後の培地を用いた場合、従来の培地を用いた場合を示し、それぞれＬＰＳ濃度が０、１０、及び１００μｇ／ｍＬの場合を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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