(57)【要約】【課題】そのままでは抗原性がないペオニフロリン（ＰＦ）とその関連化合物に対する抗体を作成することにより，簡便で，高感度なかつ再現性の高い抗原の定量分析方法を提供する。【解決手段】ＰＦ及び関連化合物に対する抗体は，ＰＦの糖部の一部を切断し，ＥＤＣを用いたカルボジイミド法により、ＰＦのカルボキシル基とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のタンパク質のリジン残基と結合して抗原性を付与した後，動物に免疫した。免疫後脾臓細胞を単離し、ポリエチレングリコールを用いてミエローマ細胞と融合する。ＨＡＴ培地で融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選抜する。ハイブリドーマを限界希釈法でクローニングする。これらの中から、ＰＥ−ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）複合体を用いて選抜し、抗ＰＥモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生産するハイブリドーマを単離する。定量分析法はタンパク質と共有結合した抗原を吸着させたウエル内に，ＰＦ及び関連化合物，抗体を加えてインキュベートした後にウエルを洗浄し，標識化免疫定量法により行われる。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペオニフロリン（ＰＦ）及び関連化合物に対する抗体。
【請求項２】
前記ＰＦ及び関連化合物はＰＦ，アルビフロリン，オキシペオニフロリン，ベンゾイルペオニフロリンである請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＰＦを構成する糖の一部を切断し，切断された末端をタンパク質と共有結合させたものを抗原ととして抗体を作成する抗体の製造方法。
【請求項４】
タンパク質と共有結合したＰＦ関連化合物を吸着させたウエルにＰＦ関連化合物溶液を添加し，更に請求項１に記載の抗体を加えてインキュベートした後にウエルを洗浄し，標識化免疫定量法を用いてＰＦ関連化合物溶液中のＰＦ関連化合物を定量する抗体を用いた抗原の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明に属する技術分野】
本発明は芍薬の主有効成分であるＰＥに対するＭＡｂを生産するハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞融合技術は、ケーラーとミルスタインの報告（Ｎａｔｕｒｅ，４９５−４９７頁、１９７５年）以来急速に発展した。哺乳動物の脾細胞と癌細胞であるミエローマ細胞を融合させた雑種細胞をハイブリドーマと称する。ハイブリドーマは用いた脾細胞が産生する抗体産生能を有することから、多くの蛋白質やペプチドの様な高分子化合物に対する抗体の生産に用いられてきた。
【０００３】
一方、本出願人は通常は抗原とは成りえない芍薬の配糖体に対するＭＡｂを産生するハイブリドーマを作製する。ＰＥは有用な薬理活性を有する芍薬の主要な配糖体である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
芍薬中のＰＦの含有量は少なく、その検出は容易ではない。ましてや漢方薬中の含有量を精査するためには前処理等に多大な労力を要する。このため前処理を必要とせず、再現性があり、かつ高感度なアッセイ系が要求される。これに対応出来うるのはＭＡｂ以外にない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上述の問題点を解決すべく研究を重ねた結果、細胞融合によりＰＦに対する、ＭＡｂを産生するハイブリドーマを得、本ハイブリドーマを培養することによって抗ＰＦ抗体を大量に生産することに成功した。本抗体を用いることによって高感度、再現性良好な、かつ前処理を必要としないアッセイ系を完結した
【０００６】
【実施の形態】抗ＰＥ　ＭＡｂを生産するハイブリドーマは以下の様に作成する。すなわち、（１）抗原としてＰＦ−ＢＳＡ複合体を免疫した動物の抗体産生脾臓細胞を作成する。（２）ミエローマ細胞を培養増殖し、調整する。（３）上記２種の細胞をポリエチレングリコールを媒体として融合する。（４）得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地にて選抜する。（５）抗ＰＦＭＡｂ生産ハイブリドーマを選抜する。（６）選抜ハイブリドーマをクローニングする。これらの行程について詳細に説明する。
【０００７】
（抗体産生細胞の調整）
ＰＦ−ＢＳＡ複合体を動物に免疫する。免疫法としてはフロイントのコンプリートアジュバンドを併用する手法がとられる。動物としてはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示される。抗体産生細胞としては脾臓、リンパ節、抹消血液等から分離した細胞が使用される。
【０００８】
（骨髄腫細胞の調整）
細胞融合に使用する骨髄腫細胞は特に限定されず、各種の哺乳動物の細胞株が利用可能であるが、抗体産生細胞の調整に用いた動物と同種の細胞株を使用するのが好ましい。用いる細胞株は細胞融合の後に、未融合の骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマのみが増殖可能なようにすることによって、未融合細胞と融合細胞を選別することを考慮して、特定の薬剤抵抗性を有するものが好ましい。例えば８−アザグアニン抵抗性の細胞は、ＨＡＴ培地中で生育できない性質を有するため好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞株、ＰＡＩ，Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８，Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−ＵＩ，Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１，Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３．，ＳＰ２／０−Ａｇ１４，ＦＯ，Ｓ１９４／５ＸＸＯ，ＢＵ．１，ＭＰＣ１１−４５．６．，ＴＧ．１．７等が用いられる。
【０００９】
（融合細胞）
細胞融合は通常ＭＥＭ培地、ＲＭＩ１６４０培地、ＩＭＤＭ培地等のｅ−ＲＤＦ培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を混合（混合比は通常１：４−１：１０）することにより行われる。融合促進剤としては平均分子量１０００−６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が使用できる。ＰＥＧの使用濃度は通常３０−５０％である。
【００１０】
（ハイブリドーマの選択的増殖）
融合を終えた細胞は、１０％ＦＣＳ含有ｅ−ＲＤＦ培地などで適当に希釈し、遠心分離する。沈査を選択培地（例えばＨＡＴ培地）で浮遊し、９６穴ウエルマイクロプレートに接種した後に、５％炭酸ガス培養装置で培養する。選択培地で生育してくる細胞はハイブリドーマである。
【００１１】
（抗体産生ハイブリドーマの検索）
抗体産生ハイブリドーマの検索は常法に従えばよく、特に限定されない。例えばハイブリドーマの増殖した培養液を採取し、ＰＦ−ＨＳＡと反応させ、酵素、蛍光物質、発光物質などでラベルした２次抗体との反応により検索できる。
【００１２】
（クローニング）
抗体産生ハイブリドーマを含むことを確認した培養ウエル中の細胞を限界希釈法などによりクローニングを行い、ＭＡｂ産生ハイブリドーマを得る。以上の操作により抗ＰＦ　ＭＡｂ産生ハイブリドーマＣ３１Ｂ９を得た。このハイブリドーマはＰＦに対する特異的なＭＡｂを産生する新規な細胞である。
【００１３】
（抗ＰＦ　ＭＡｂの調整）
上記で得られたハイブリドーマを適切な培地中で培養することにより、その培養上清から本発明ＭＡｂが得られる。大量に生産する方法としては骨髄腫細胞由来動物と同種の動物にプリスタン等の鉱物油を腹腔内投与後、ハイブリドーマを接種する。接種後、腹水を採取し、通常の抗体分離操作により抗ＰＦ　ＭＡｂを得る。また、無血清培地で培養し、通常の手法で抗ＰＦ　ＭＡｂを得る。
【００１４】
（抗ＰＦ　ＭＡｂのキャラクタリゼーション）
精製した抗ＰＦ−ＭＡｂのサブクラス、軽鎖等を通常の方法で決定した。
【００１５】
（発明の効果）
本抗体は極めて特異性が高いので通常のＥＬＩＳＡに用いることにより、再現性が高く、高感度、かつ前処理が不要な定量が可能である。以下の実施例で示すように各種の芍薬のＰＦ含有量を簡便に定量出来る。
【００１６】
【実施例】
（抗ＰＥ　ＭＡｂ産生ハイブリドーマの製造）
（抗原の調整）
ＰＦ５ｍｇをメタノール４ｍｌに溶かした液を，５ｍｇの過ウ素酸ナトリウムを水０．６ｍｌに溶かした液に滴下し室温で１時間反応した。ＢＳＡ添加炭酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ９．６，１ｍｌ）を上記の反応液に加えて反応した。反応後水に対して４℃で透析を行い、凍結乾燥後ＰＦ−ＢＳＡ（４．８ｍｇ）を得た。なおＥＬＩＳＡで使用するＰＥ−ＨＳＡについても同様な方法で作製した。
【００１７】
（抗原中のハプテン数の検討）
得られたＰＦ−ＢＳＡ抱合体の微量をとり、過剰のシナピン酸を添加して混合する。混合物の小量をカセットのウエルに入れ、マルデイトフマスにて測定する（図１）。
【００１８】
（免疫脾細胞の調整）
ＰＦ−ＢＳＡ抱合体５０μｇをフロイント−コンプリート−アジュバントに乳濁化させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与した。以後、２週間の間隔で５０μｇのＰＦ−ＢＳＡ抱合体アジュバント溶液を２回同様に投与し、最後にＰＥ−ＢＳＡ抱合体のみを１００μｇ投与し免疫を完了した。３日後にマウスを麻酔下屠殺し、脾臓を摘出した。脾臓を細断した後、１００メッシュのナイロン網でろ過し、脾臓の単離細胞を得た。
【００１９】
（ハイブリドーマの調整）
単離した免疫脾細胞に低張液（１５５ｍＭ塩化アンモニューム）を加えて赤血球を溶血した後、ｅ−ＲＤＦ培地で細胞を３回洗う。マウス骨髄腫細胞もｅ−ＲＤＦ培地で３回洗浄した。両細胞数を計測し脾細胞と骨髄腫細胞を１０：１の割合として遠心をする。上清を捨て、沈殿した細胞を充分解きほぐし、ポロエチレングリコール（ＰＥＧ）４、０００を培地で希釈した５０％液を１．０ｍｌ滴下して融合を行った。３７℃、３０秒間静置した後、ｅ−ＲＤＦ培地５ｍｌを５分間かけて添加した。１、０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈殿を１０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭにより洗い、遠心して上清を捨てた。ヒポキサンチン１０−２Ｍ、アミノプテリン４ｘ１０−７Ｍおよびチミジン１．５ｘ１０−５Ｍを加えた（ＨＡＴ−）１０％ＦＣＳ添加ｅ−ＲＤＦ培地を用いて沈殿を再び浮遊させ、９６ウエルマイクロプレートに１００μｌずつ分注した。３日毎に同一培地を５０μｌ追加し、細胞の増殖を確認した。
【００２０】
（抗体産生ハイブリドーマの検索）
ハイブリドーマが増殖したウエルの液を採取し、ＰＦ−ＨＳＡ抱合体を結合させた別のウエルに添加し、直接ＥＬＩＳＡによりＰＦに対するＭＡｂ産生ハイブリドーマを検索した。即ち、９６ウエルマイクロプレートにＰＦ−ＨＳＡ抱合体０．１μｇ／１００μｌ／ウエルを分注し、３７℃で１時間インキュベートしてウエルに吸着させた。このウエルに培養上清を１００μｌずつ分注し抗原抗体反応を行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝食塩水（Ｔ−ＰＢＳ）で３回洗浄した。パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体１０００倍希釈液をウエルあたり１００μｌ添加し、１時間後にＴＰＢＳで洗浄した。０．００３％過酸化水素、ＡＢＴＳ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。２０分後プレートリーダーを用いて４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。発色したウエルの細胞を採取した。
【００２１】
（抗ＰＦ　ＭＡｂ産生ハイブリドーマのクローニング）
抗体産生ハイブリドーマを限界希釈してウエルに分注した。抗体産生能を持ち、かつ増殖したハイブリドーマを同様に３回クローニングしてクローンを得た。
【００２２】
（抗ＰＥ　ＭＡｂの調整）
上記の抗体産生ハイブリドーマを無血清培地（１０μｇ／ｍｌインスリン、３５μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭセレニューム添加ｅＲＤＦ培地）で３７℃、炭酸ガス培養器で培養した。上清をプロテインＧＦＦカラムを用いて精製した。即ち、上清をトリス緩衝液でｐＨ７に調整し、カラムに付す。カラムを１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄後、吸着している抗体を１００ｍＭクエン酸緩衝液で溶出する。得られた抗体溶液は水に対して４回透析し、最後に凍結乾燥して精製抗体をえた。
【００２３】
（競合的ＥＬＩＳＡによる定量）
ＰＦ−ＨＳＡ抱合体溶液（１μｇ／ｍｌ）を５０μずつウエルに添加し１時間反応し吸着させる。比特異的結合を除去するために５％スキンミルク添加ＰＢＳ溶液３００μｌを加え１時間反応してブロッキングする。５０μｌの各種濃度の試料溶液を加え、さらに抗ＰＥＭＡｂ溶液（１μｇ／ｍｌ）５０μｌを添加して１時間インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄し、１０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウス抗体１００μｌを加え１時間反応した。１時間後にＴＰＢＳで洗浄した。０．００３％過酸化水素、ＡＢＴＳ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。１５分後に発色を４０５ｎｍで測定。各濃度のＰＥの吸光度から検量線を作成した（図２）。
【００２４】
（交差反応性の調査）
ＰＦおよびモノテルペン配糖体の芍薬固有の配糖体類、およびその他のテルペン類を測定した。表１に見られる通り、芍薬の薬理活性を代表している主活性成分であるＰＦとアルビフロリン（ＡＬ）に特異的に親和性を持つ抗体であることが明らかとなった。また，ベンジルペオニフロリンに約３０％の交差反応性が認められたが，その他の成分には殆ど交差反応性を示さなかった（図３の構造式参照）。
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【００２５】
（各種芍薬のＰＦおよびアルビフロリン（ＡＬ）含有量）
各種芍薬の乾燥粉末５ｍｇをメタノール０．５ｍｌで５回抽出する。抽出液を合わせて遠心にかける。上清を１０％メタノール溶液で適切な濃度に希釈して実施例に準じて定量する。結果を表２に示す。ＰＦおよびＡＬ含有量を通常の方法によりＨＰＬＣで分析した。それらの分析値と抗体を用いて分析した結果（ＥＬＩＳＡ）と比較したところ両者は非常に良好な一致をみた。このことから今回開発した芍薬の活性本体であるＰＦおよびＡＬ含量の分析法は信頼性が高く，また，高感度かつ再現性が良好なことが明らかとなった。
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例の抗原のハプテン数を調査したマルジマススペクトログラフ。
【図２】実施例の抗体Ｃ３１Ｂ９の検量線を示す片対数グラフ。
【図３】ペオニフロリンと関連化合物の構造式。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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