(57)【要約】【課題】解析効率が高いイネゲノムの構造解析方法を提供すること。【解決手段】イネゲノムに散在するトランスポゾン（以下、「ＭＩＴＥ」という）をマーカーとして利用することを特徴とする。切断したイネゲノムＤＮＡにアダプターを結合させ、ＭＩＴＥに対応するプライマーとアダプタープライマーとの間で増幅した断片を比較することを特徴とする。【選択図】　図１
2004121032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネゲノムに散在するトランスポゾン（以下、「ＭＩＴＥ」という）をマーカーとして利用することを特徴とするイネゲノムの構造解析方法。
【請求項２】
切断したイネゲノムＤＮＡにアダプターを結合させ、ＭＩＴＥに対応するプライマーとアダプタープライマーとの間で増幅した断片を比較することを特徴とするイネゲノムの構造解析方法。
【請求項３】
前記アダプタープライマーは、任意の３塩基を３’端に持つことを特徴とする請求項２記載のイネゲノムの構造解析方法。
【請求項４】
前記ＭＩＴＥに対応するプライマーは５’末端蛍光標識であることを特徴とする請求項２又は３記載のイネゲノムの構造解析方法。
【請求項５】
前記ＭＩＴＥは、Ｔａｂｌｔｏｌ１，Ｓｔｏｗａｗａｙ　ＯＳ−１，Ｏｎａｇａ１、Ｍａｓｈｕのいずれか１種であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載のイネゲノムの構造解析方法。
【請求項６】
前記イネは、ジャポニカ系であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載のイネゲノムの構造解析方法。
【請求項７】
前記イネは、インディア系であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載のイネゲノムの構造解析方法。
【請求項８】
前記イネは、インヂィア−ジャポニカ系であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載のイネゲノムの構造解析方法。
【請求項９】
前記切断は任意の制限酵素で行うことを特徴とする請求項２記載のイネゲノムの構造解析方法。
【請求項１０】
前記制限酵素はＴａｑｌであることを特徴とする請求項９記載のイネゲノムの構造解析方法。
【請求項１１】
前記増幅はＰＣＲで行うことを特徴とする請求項２記載のイネゲノムの構造解析方法。
【請求項１２】
前記比較は電気泳動で行うことを特徴とする請求項２記載のイネゲノムの構造解析方法。
【請求項１３】
前記配列は配列表の配列番号１乃至９であることを特徴とするイネゲノムの構造解析方法。
【請求項１４】
コピー数が１０００以上である請求項１乃至１３のいずれか１項記載のイネゲノムの構造解析方法。
【請求項１５】
配列表の配列番号１乃至９で示されることを特徴とする塩基配列。
【請求項１６】
配列表の配列番号１乃至９で示される塩基配列をマーカーとすることを特徴とするイネゲノムの構造解析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、イネゲノムの構造解析方法及び塩基配列に係る。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ゲノムの解析手法として、ＡＦＬＰが知られている。
【０００３】
ＡＦＰＬ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓ　ｍ，増幅断片多型）分析は、ＲＦＬＰ法とＲＡＰＤ法とを組み合わせた方法であり、制限酵素で切断されたＤＮＡ断片の長さの違いをＰＣＲにより選択的に増幅させて検定する方法＠である。この方法ではＲＡＰＤ法と比べて再現性が高く、一度に解析できる多型の情報も多い。
【０００４】
しかし、イネゲノムの検出においては、多型検出頻度の効率は必ずしも高くない。
【０００５】
一方、トランスポゾンを利用した検出技術として、植物のレトロトランスポゾン領域を含む塩基配列を利用する植物のＤＮＡレベルでの個体識別方法、が開示されている（特開平０６−２７７０６３号公報）。
【０００６】
しかし、この技術は、「トランスポゾン」を含む特定の遺伝子配列をターゲットとして、これをマーカーとして解析を行ういわば一対一の解析方法である。散在するトランスポゾンの一部を含む特定配列を使用するものにすぎず解析効率は高くはない。すなわち、いわばマーカーの数が少ない為、解析効率が劣る。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、解析効率が非常に高いイネゲノムの構造解析方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
請求項１に係る発明は、イネゲノムに散在するトランスポゾン（以下、「ＭＩＴＥ」という）をマーカーとして利用することを特徴とするイネゲノムの構造解析方法である。
【０００９】
請求項２に係る発明は、切断したイネゲノムＤＮＡにアダプターを結合させ、ＭＩＴＥに対応するプライマーとアダプタープライマーとの間で増幅した断片を比較することを特徴とするイネゲノムの構造解析方法である。
【００１０】
請求項３に係る発明は、前記アダプタープライマーは、任意の３塩基を３’端に持つことを特徴とする請求項２記載のイネゲノムの構造解析方法である。
【００１１】
請求項４に係る発明は、前記ＭＩＴＥに対応するプライマーは５’末端蛍光標識であることを特徴とする請求項２又は３記載のイネゲノムの構造解析方法である。
【００１２】
請求項５に係る発明は、前記ＭＩＴＥは、Ｔａｂｌｔｏｌ１，Ｓｔｏｗａｗａｙ　ＯＳ−１，Ｏｎａｇａ１、Ｍａｓｈｕのいずれか１種であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載のイネゲノムの構造解析方法である。
【００１３】
請求項６に係る発明は、前記イネは、ジャポニカ系であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載のイネゲノムの構造解析方法である。
【００１４】
請求項７に係る発明は、前記イネは、インディア系であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載のイネゲノムの構造解析方法である。
【００１５】
請求項８に係る発明は、前記イネは、インヂィア−ジャポニカ系であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載のイネゲノムの構造解析方法である。
【００１６】
請求項９に係る発明は、前記切断は任意の制限酵素で行うことを特徴とする請求項２記載のイネゲノムの構造解析方法である。
【００１７】
制限酵素（制限酵素により切断部位は異なります）により、任意の切断を行った後、切断配列（制限酵素により決まる）に合わせてアダプターを作成する。従って、非常に適用範囲が広い手法である。
【００１８】
請求項１０に係る発明は、前記制限酵素はＴａｑｌであることを特徴とする請求項９記載のイネゲノムの構造解析方法である。
【００１９】
請求項１１に係る発明は、前記増幅はＰＣＲで行うことを特徴とする請求項２記載のイネゲノムの構造解析方法である。
【００２０】
請求項１２に係る発明は、前記比較は電気泳動で行うことを特徴とする請求項２記載のイネゲノムの構造解析方法である。
【００２１】
請求項１３に係る発明は、前記配列は配列表の配列番号１乃至９であることを特徴とするイネゲノムの構造解析方法である。
【００２２】
請求項１４に係る発明は、コピー数が１０００以上である請求項１乃至１３のいずれか１項記載のイネゲノムの構造解析方法である。
【００２３】
請求項１５に係る発明は、配列表の配列番号１乃至９で示されることを特徴とする塩基配列である。
【００２４】
請求項１６に係る発明は、配列表の配列番号１乃至９で示される塩基配列をマーカーとすることを特徴とするイネゲノムの構造解析方法である。
【００２５】
【作用】
Ｔｒａｎａｐｏｓｏｎ−Ｄｉｓｐｌａｙ（ＴＤ）は、制限酵素で切断したゲノムＤＮＡアダプターを結合させ、特定のトランスポゾン配列内のプライマーとアダプタープライマーの間で増幅したＰＣＲ断片をゲル上で比較解析する実験手法である。ＡＦＬＰではアダプター間のＰＣＲ増幅断片を解析するが、この方法は片側にトランスポゾンの配列を利用する点が特徴である。ＴＤの場合、ゲノムに多数のコピーが散在し、コピー間で保存した構造を有するトランスポゾンの配列を利用することが、ゲノム全体の微細な構造を解析する上で重要となる。
【００２６】
本発明者は、先にイネのｗａｘｙ座周辺に存在する反復配列の詳細な構造解析を行った。その結果、５００ｂｐ以下の小さなＤＮＡ型トランスポゾン（ＭＩＴＥ）が同領域の反複配列の大部分を占めていることを突き止めた。ＭＩＴＥトウモロコシで詳細に解析されており、イネの同領域においてもトウモロコシと類似の構造をなすトランスポゾンが多数見い出された。本発明者はトウモロコシで固定された３種類の代表的ＭＩＴＥファミリー（Ｔｏｕｒｉｓｔ，Ｓｔｏｗａｗａｙ，Ｍｕ）と類似の構造を持ち、イネゲノムで最もコピー数の多いサブファミリー：Ｔａｂｌｔｏｌ１，Ｓｔｏｗａｗａｙ　ＯＳ−１，Ｏｒａｇａ１に加え、当グループが新規に同定したＭａｓｈｕの合計４種類のＭＩＴＥに対してプライマーを設計し、ＴＤに供試した。
【００２７】
純系のジャポニカ３系統とインディカ４系統について、Ｔａｑｌで切断したグノムＤＮＡにアダプターを付加し、それぞれのＭＩＴＥこ対応するプライマーと３種類のアダプタープライマー（任意の３塩基を３’端に持つ）を用いてＴＤを行った。その結果、得られたバンド数は、同一ＭＩＴＥでは系統間で殆ど差はなかった。４つのＭＩＴＥはＯｒｙｚａＡＡ−ゲノム種間でも大きな変動がないことから、４種はＡＡゲノム内で極めて安定しており、転移する可能性は極めて低い。一方、ＭＩＴＥ間ではバンド数に明瞭な違いが認められた。ジャポニカとインディカゲノム（ｎ）当たりの各ＭＩＴＥコピー数を算出したところ、ＴａｂｉｔｏｌｌとＭａｓｎｕは４１００−４５００コピーと多く、次いでＳｔｏｗａｗａｙ　ＯＳ−１が２６００−３０００コピー、Ｏｎａｇａ１は１７００前後といずれも１０００コピー以上と推定された。
【００２８】
次いで、多系検出頻度について調査した。ジャポニカーインディカ間では、Ｍａｓｈｕが全体の７割のバンドで多系を生じ、残りの３つのＭＩＴＥは５割のバンドが多系であった。Ｍａｓｈｕはジャポニカ間およびインディカ間でもそれぞれ１７％および５０％と高い頻度で多系を創出した。これらの頻度値はＡＦＬＰの７倍以上に匹敵する。
【００２９】
ここで用いたＭＩＴＥは、すでにゲノムに安定して散在する反復因子であるが、変異の蓄積は進んでいない。したがって、効率的に多系を検出することができ、イネゲノムの微細なマッピングを進める上で極めて有効な分子マーカーとして利用できる。
【００３０】
結局、コメの遺伝子の解析の為には、コメの遺伝子の解析の座標となる「遺伝子マーカーが非常に重要であり、この遺伝子マーカーについて、転移性遺伝子である「トランスポゾン」（動く遺伝子）の一種が有効である事を発見することにより本発明はなされたものである。既知のトランスポゾンに対して、新たなトランスポゾンが有効なマーカーとなる事をつきとめ、この遺伝子を利用した、コメ遺伝子の解析技術を構築しましたものである。
【００３１】
この解析技術は、コメの有用遺伝子や品種の特性の解析を遺伝子レベルで行う上で有効である他、コメの品種の遺伝子レベルでの識別検査（先の黒豚識別と同様に、品種毎の識別を可能とする）を可能とします。（この解析技術により、品種に特異な遺伝子配列を解析し、その配列を検査する事で、コメの品種を特定できる。
【００３２】
なお、特開平０６−２７７０６３号公報記載技術は、「トランスポゾン」を含む特定の遺伝子配列をターゲットとして、これをマーカーとして解析を行ういわば一対一の解析方法である。一方、本発明は、「トランスポゾンを含む特定領域」ではなく、トランスポゾンそのものをマーカーとして遺伝子全体から一斉にスクリーニングするというものであり、解析の効率が飛躍的に高いものとなる。トランスポゾンそのものは、全遺伝子中に多数散在しているが、特開平０６−２７７０６３号公報記載技術は、その散在するトランスポゾンの一部を含む特定配列を使用するものであるので、いわばマーカーの数が遙かにすくない為、解析効率が劣る。それに対し、本発明は、散在するトランスポゾン（特定のトランスポゾン）すべてを対象に解析する手法である。従って、きわめて多数の箇所を同時に解析する方法であり、解析効率が非常に高い。
【００３３】
【発明の実施の形態】
本発明の手順を説明する。
【００３４】
ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｄｉｓｐｌａｙは、ＭＩＴＥおよび制限酵素サイトの有無によって多型を検出する手法であり、基本的には、ＤＮＡ濃度チェック、ＤＮＡの制限酵素処理、アダプターのライゲーション、１ｓｔＰＣＲ、２ｎｄＰＣＲ、電気泳動、スキャナによる画像の取り込みおよび解析という手順からなる。
【００３５】
以下各手順を説明する。
【００３６】
＜ＤＮＡ濃度チェック＞
１）０．８％アガロースゲルを作成する
２）　ＤＮＡを４０倍に希釈する（ＤＮＡ２μｌ＋滅菌水７８μｌ）
３）　０．８％アガロースゲルに、λＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）を順に１，２，３，４，５μｌずつアプライし、その横に４０倍希釈したＤＮＡを順に２，４，８μｌずつアプライする
４）　１００Ｖで約３０分間泳動した後、トランスイルミネーターによってＵＶを照射し、泳動像を確認してからポラロイドカメラあるいはデジカメで写真を撮る
５）　λＤＮＡと、濃度を知りたいＤＮＡの光り方を比較し、濃度を決定する
【００３７】
＜ＤＮＡ制限酵素処理＞
１）　冷蔵庫横の恒温槽を６５℃に設定する（６５℃になるまで３０分程度かかる）
２）　以下の反応液を調整する（０．５μｌエッペン）
制限酵素処理反応液
ｔｏｔａｌ　ＤＮＡ　　　　　　１μｇ
Ｔａｑ　１　　　　　　　　　１．５μｌ（８〜１０ｕｎｉｔ）
１０×ｂｕｆｆｅｒ　　　　　　　５μｌ
滅菌水
計　　　　　　　　　　　５０μｌ
３）恒温槽が６５℃になっていることを確認し、反応液を入れたエッペンを恒温槽に入れ、１２時間−１６時間反応させる
４）　制限酵素処理後のエッペンに、フェノクロ（フェノール：クロロホルム＝１：１）を等量加える（５０μｌの反応液の場合、５０μｌのフェノクロを加える）
５）　２０秒間ボルテックスで混合した後、１３０００ｒｐｍで５分間遠心する
６）　イエローチップを使用し、上清を別のエッペンに移すｃ）
７）　１／１０量の３Ｍ　ＮａＯＡｃと２．５倍量の９９．５％エタノールを加え（５０μｌの反応　　　液の場合、３Ｍ　ＮａＯＡｃ　５μｌ、９９．５％エタノール　１２５μｌ）転倒混和した後、−３０℃にしばらく保管する
８）　１３０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を捨てる
９）　沈殿したＤＮＡに触れないよう注意しながら、イエローチップあるいはシリンジを使用し、残った上清を取り除く
１０）　５〜１０分間バキュームにかける
１１）ＤＮＡが乾燥したことを確認した後、５μｌの滅菌水を加え、ＤＮＡを完全に溶解する
１２）　５μｌ中の１μｌを０．８％アガロースゲルで泳動し、濃度チェックを行う
１３）滅菌水に溶解したＤＮＡは−２０℃で保存する
【００３８】
＜アダプターのライゲーション＞
１）以下の手順でアダプターを作成する
▲１▼それぞれ５０μＭに希釈したＴａｑ　Ｉ　ａｄａｐｔｅｒ　１とＴａｑ　Ｉ　ａｄａｐｔｅｒ　２を等量混合する（０．５μｌエッペン）
▲２▼沸騰した湯の中にエッペンを入れ、２分間保つ
▲３▼水温が室温と等しくなるまで、約半日そのまま放置する
▲４▼完成したアダプターは４℃で保存する
２）　ウォーターバスを１６℃に設定す
３）　以下の反応液を調整する（０．５μｌエッペン）
Ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ＤＮＡ　　　　２００ｎｇ
アダプター（５０μＭ）　１μｌ
ＡＴＰ（１０ｍＭ）　　　　０．５μｌ
１０×ｂｕｆｆｅｒ　　　　　１μｌ
滅菌水
計　　　　　　　　　　１０μｌ
４）　ウォーターバスが１６℃になっていることを確認した後、エッペンを入れて、１２時間〜１６時間反応させる
５）ライゲーション後の反応液は、−２０℃で保存する
【００３９】
＜１ｓｔ　ＰＣＲ＞
１）　１．２％アガロースゲルを作成する
２）　ライゲーション後のＤＮＡを滅菌水で４倍に希釈する
３）　以下の反応液および反応サイクルでＰＣＲを行うｇ）
2004121032.tif 000003
４）　反応後のサンプルは、２０μｌ中７μｌを１．２％アガロースゲルで電気泳動し、ＤＮＡ断片が増幅されていることを確認する（スメアバンドになる）
５）　１ｓｔＰＣＲ産物は４℃で保存する
【００４０】
＜２ｎｄ　ＰＣＲ＞
１）　１ｓｔＰＣＲ産物を滅菌水で２０倍に希釈する
２）　以下の反応液および反応サイクルでＰＣＲを行う
2004121032.tif 000004
３）　２ｎｄＰＣＲ産物は遮光して４℃で保存する（２？３週間は保存可能）
【００４１】
＜電気泳動＞
ポリアクリルアミドゲルの作成
１）ガラス板、スペーサーおよびコームを洗浄し、ペーパータオルの上にのせ、乾燥させる
以下のポリアクリルアミドゲルの組成のうち、尿素、１０×ＴＢＥ　ｂｕｆｆｅｒ、Ｌｏｎｇ　Ｒａｎｇｅｒを超純粋で溶解し、５０ｍｌにメスアップしてからビーカーに移す
３．５％ポリアクリルアミドゲル組成
尿素　　　　　　　　２１ｇ
１０×ＴＢＥｂｕｆｆｅｒ　　５ｍｌ
Ｌｏｎｇ　Ｒａｎｇｅｒ　　　　３．５ｍｌ
１０％ＡＰＳ　　　　　２５０μｌ
ＴＥＭＥＤ　　　　　　　２５μｌ
超純水
計　　　　　　　　　　５０ｍｌ
３）　５分〜１０分バキュームにかけ、気泡を取り除く
４）　ガラス板を７０％エタノールできれいに拭き（キムワイプまたはケイドライを使用）、両端にスペーサーを乗せ、ガラス板上に埃がついていないことを確認してからガラス板を重ね合わせ、クリップでとめる
５）　ゲル溶液に１０％　ＡＰＳ　２５０μｌとＴＥＭＥＤ　２５μｌを加え、すばやくインジェクターに移し替え、ガラス板にゲルを注ぎこむ
６）　コームを反対向き（歯がない方を下にする）に差し込み、両端に付いた黒いラインのところでとめる
７）　ガラス板の上下にラップをかけ、ゲルが固まるまで約２時間放置する
【００４２】
サンプル調製および電気泳動
１）　ゲルが固まったのを確認してから、静かにコームを引き抜く
２）　コームを抜いたくぼみ（ウェル）の部分を何度か超純水で洗い、析出した尿素を取り除く
３）　コームを静かに差し込み、コームの先がゲルに１ｍｍ程度刺さったところでとめる
４）　クリップを使って、ガラス板を電気泳動装置（ＤＮＡシーケンシング用電気泳動装置ＥＰ６０００）に取り付ける（耳付ガラス板のくぼみの部分と泳動装置のアッパーチャンバーのくぼみの部分がぴったり合うように）
５）　ガラス板の裏側に放熱板をクリップで取り付ける
６）　１．３　ｌの１×ＴＢＥ　ｂｕｆｆｅｒを作成し、アッパーチャンバーとロアーチャンバーに注ぎ込む
７）　シリンジを用い、レーン内の気泡や尿素を取り除いてから（フラッシュ）、泳動槽のふたを閉め、１５００Ｖで約３０分間プレランを行う
８）　サンプル調製液（脱イオンホルムアミド：０．５Ｍ　ＥＤＴＡ：滅菌水＝９５：４：１）を作成する
９）　２ｎｄ　ＰＣＲ産物５μｌに対し、サンプル調製液を５μｌ加え、よく混ぜる（０．５μｌエッペンを使用）
１０）　エッペンを沸騰した湯の中に２分間入れた後、氷に入れ、急冷する（ヒートショック）
１１）　プレランが終わった後、いったんパワーサプライの電源を切り、泳動槽のふたを開け、再度シリンジを用いてレーン内の気泡や析出した尿素を取り除く
１２）　ホワイトチップを用い、調製したサンプル１０μｌ中３μｌをアプライする
１３）　サンプルをアプライした隣のレーンにｓｉｚｅ　ｍａｋｅｒ　３μｌをアプライし、余ったレーンにはサンプル調製液を３μｌアプライする
１４）　泳動槽のふたを閉め、１７００Ｖで約１時間２０分泳動する（ＢＰＢがロアーチャンバー付近に移動するまで）
１５）　パワーサプライの電源を切ってから、泳動槽のふたを開け、アッパーチャンバーのバッファーの一部をロアーチャンバーに移し、ガラス板を取り外す　ｓ）
１６）　ガラス板を７０％エタノールできれいに拭く
【００４３】
（塩基配列）
次に塩基配列を示す。
【００４４】
配列番号１
ＴａｂｉｔｏＩ
ＧＧＧＣＴＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＧＡＧＲＣＣＴＡＡＡＴＴＡＧＲＣＴＴＡＣＣ
ＡＡＴＡＴＴＴＧＲＴＡＡＴＴＴＹＡＡＴＡＧＴＧＴＴＴＡＧＴＧＴＣＴＡＴＴ
ＴＧＧＴ
ＴＴＧＡＡＧＣＣＡＡＡＴＴＴＴＧＡＣＡＴＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＧＴ
ＣＡＴＴＴＣＡＡＴＡＧＴＧＡＡＣＴＴＡＧＧＣＴＡＴＴＴＴＧＲＣＴＴＣＡＡ
ＴＣＣＡ
ＡＡＣＡＣＡＡＣＴＴＴＲＣＣＴＴＡＣＣＡＡＡＡＴＴＡＧＴＣＡＴＧＣＣＡＡ
ＡＡＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＧＴＡＡ
ＧＧＣＣ
ＴＡＴＴＴＡＧＧＣＣＡＣＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣ
２５５ｂｐ
ＴＩＲ　４４ｂｐ　（ＴＩＲはＴｅｒｍｉｎａｌ　Ｉｎｖｅｒｔｅｄ　Ｒｅｐｅａｔｓで配列の末端にある逆位反復配列）
【００４５】
配列番号２
ＴａｂｉｔｏＩＩ
ＧＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＧＴＴＣＣＡＡＡＡＴＴＴＴＴＣＴＴＣＡＡＡＣＴＴＹ
ＣＡＡＣＴＴＴＴＹＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＡＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＡＣＡＣＡＣ
ＡＡＡＣ
ＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＴＣＣＧＴＣＡＣＡＴＣＧＴＴＹＣＡＡＴＴＴＹＡＡＹＣ
ＡＡＡＣＴＴＹＹＡＡＴＴＴＴＲＲＹＧＴＧＡＡＣＴＡＡＡＣＡＣＡＣＣＣ
１４６ｂｐ
ＴＩＲ　１５ｂｐ
【００４６】
配列番号３
ＴａｂｉｔｏＩＩＩ
ＧＧＣＣＴＴＧＴＴＣＧＧＴＴＴＲＧＡＧＧＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴ
ＡＧＧＧＧＡＴＴＧＡＧＧＧＧＧＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＣＡＣＡＡＡＴＡ
ＧＧＴＧ
ＴＧＧＡＡＴＡＡＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＣ
９８ｂｐ
ＴＩＲ　１４ｂｐ
【００４７】
配列番号４
ＴａｂｉｔｏＩＶ
ＧＧＧＧＳＴＧＴＴＴＲＧＷＴＫＣＣＡＧＧＧＣＴＷＡＡＡＴＴＹＹＷＴＡＧＹ
ＣＣＭＴＧＴＣＡＣＡＴＣＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＡＣＡＣＴＡＡＴＴＴＲＧＡＧ
ＴＡＴＴ
ＡＡＡＣＡＴＡＳＡＣＴＡＡＴＷＡＭＡＡＡＡＣＹＭＡＴＴＹＣＡＴＡＡＲＣＴ
ＫＲＧＡＧＣＴＡＡＴＴＣＧＣＧＡＧＡＣＧＡＡＴＹＴＴＴＴＲＡＧＹＣＴＡＡ
ＴＴＡＭ
ＫＣＣＡＴＲＡＴＴＷＴＧＡＭＡＡＴＧＴＫＴＡＣＴＧＣＴＡＧＣＡＧＴＣＡＭ
ＡＣＴＴＧＴＴＲＡＴＡＡＴＴＡＴＧＲＭＫＴＡＡＴＴＡＧＲＣＴＹＡＡＡＡＲ
ＡＴＹＣ
ＧＴＣＴＣＧＣＧＲＡＴＴＡＧＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＡＴＧＡＡＡＴＫＲＧＴＴ
ＴＴＫＴＴＡＴＴＡＧＴＳＹＡＴＲＴＴＴＡＡＴＡＣＴＣＴＡＡＡＴＴＡＧＹＧ
ＴＣＣＡ
ＡＡＣＡＴＣＣＧＡＴＧＴＧＡＣＡＫＧＧＲＣＴＡＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＧＣＣ
ＣＴＧＫＭＡＷＣＹＡＡＡＣＡＣＣＣＣＣ
３５９ｂｐ
ＴＩＲ　１６０ｂｐ
【００４８】
配列番号５
ＴａｂｉｔｏＶ
ＧＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＲＡＧＡＧＧＡＧＡＴＷＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＧ
ＧＡＡＧＡＴＡＣＧＣＡＡＡＡＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＡＴＴＡＧＣＧＣＡＴＧ
ＡＴＴＡ
ＡＴＴＧＡＧＴＡＴＴＡＡＣＴＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＣ
ＴＡＡＴＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＴＣＣＴＡＴＡＧＡＡＷＴ
ＴＴＴＴ
ＴＧＣＡＡＡＡＡＡＣＡＣＡＣＣＧＴＴＴＡＧＴＡＧＴＴＴＧＧＧＡＡＧＣＧＴ
ＧＣＧＣＧＣＧＧＡＡＡＡＣＧＡＧＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＹＣＣＡＡＴＣＴＣＣ
ＴＹＴＧ
ＡＡＭＧＡＡＣＲＣＡＧＣＣ
２４１ｂｐ
ＴＩＲ　９ｂｐ
【００４９】
配列番号６
ＴａｂｉｔｏＶＩ
ＧＧＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＴＴＣ
ＡＧＴＣＣＴＴＴＴＹＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＡＣＭＴＧＴＣＡＴＡＣＡＣＡＣＡ
ＣＡＡＣ
ＴＴＴＴＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＡＴＴＴＹＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴ
ＣＡＡＡＣＴＴＴＡＣＧＣＴＧＡＡＣＴＡＡＡＣＡＣＡＧＣＣ
１４０ｂｐ
ＴＩＲ　１２ｂｐ
【００５０】
配列番号７
ＫｉｓｅｒｕＩ
ＣＴＣＣＣＴＣＣＡＴＡＣＴＣＲＴＡＡＡＧＧＡＡＧＴＣＧＴＴＴＡＧＧＡＣＡ
ＧＣＧＡＣＡＣＧＧＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＡＣＡＡＣＴＴＴＧＡＣＴＴＣＴＴＧ
ＴＴＴＣ
ＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＣ
ＴＴＴＴＡＴＡＡＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＧＡＣＡＡＡＴＣＴＡＴＴＣＡＴ
ＡＴＡＡ
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ＧＴＹＣ
ＴＡＡＡＣＧＡＣＴＴＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＴＡＣＧＧＡＧＧＧＡＧ
２５９ｂｐ
ＴＩＲ　３６ｂｐ
【００５１】
配列番号８
ＫｉｓｅｒｕＩＩ
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２５９ｂｐ
ＴＩＲ　３１ｂｐ
【００５２】
配列番号９
ＫｉｓｅｒｕＩＩＩ
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ＧＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＡＴＴＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＧＧＡＧ
２５７ｂｐ
ＴＩＲ　２７ｂｐ
【００５３】
配列番号１０
ＫｉｓｅｒｕＩＶ
ＣＴＣＣＣＴＣＣＧＴＣＣＣＡＴＡＡＴＡＷＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＡＧＴＴ
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ＡＣＧＧＡＧＧＧＡＧ
２３８ｂｐ
ＴＩＲ　３０ｂｐ
【００５４】
配列番号１１
Ａｋａｎ
ＣＡＡＧＧＴＴＧＴＣＡＧＴＡＴＣＣＣＧＡＴＹＹＧＴＡＴＹＣＴＡＧＴＡＴＣ
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ＣＴＡＣＴＡＴＴＣＡＴＴＡＣＴＡＣＡＣＧＡＴＣＣＴＡＣＲＡＡＡＴＹＴＴＡ
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ＣＴＡＣＣＴＡＧＴＡＴＣＣＣＧＡＴＣＣＴＧＡＣＡＡＣＣＴＴＧ
４８６ｂｐ
ＴＩＲ　１２ｂｐ
【００５５】
配列番号１２
Ｍａｓｈｕ
ＧＡＧＣＡＣＣＣＲＣＡＡＴＧＧＴＡＡＡＧＴＡＡＧＧＴＧＣＴＣＴＣＴＡＴＡ
ＡＡＡＣＡＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＡＧＡＣＴＡＧＡＴＴＡＡＴＡＧ
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ＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＡＧＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＧＴＡＴＣＴＡＴＡＧＣ
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ＣＴＣＴ
ＴＧＴＡＧＡＧＡＧＣＴＴＡＴＡＧＡＴＡＡＣＣＡＴＴＧＹＧＧＧＴＧＣＣＣ
２６３ｂｐ
ＴＩＲ　１５ｂｐ
【００５６】
配列番号１３
Ｓａｒｏｍａ
ＴＷＷＧＡＧＴＡＡＡＴＴＴＣＡＴＡＡＡＡＣＴＡＣＡＫＡＴＡＣＴＴＴＧＣＡ
ＴＧＡＴＣＴＡＴＣＡＣＡＡＡＡＣＴＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＴ
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ＣＴＡＣＡＧＧＴＡＣＴＴＴＧＡＡＣＡＣＴＡＴＡＴＣＡＣＡＡＡＡＣＴＡＣＡ
ＧＡＴＴ
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ＴＴＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＡＣＴＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＴＡＴＣＴＴＣＡ
ＴＴＴＡ
ＴＣＡＣＡＡＡＡＣＴＡＣＡＧＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＣＴＣＡＣＡ
ＡＡＡＣＴＡＣＡＣＧＴＴＴＴＡＡＣＡＷＴＧＣＴＷＡＡＡＣＣＴＧＴＡＧＴＴ
ＴＴＧＴ
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ＡＴＡＣ
ＡＣＴＡＡＡＴＣＴＡＴＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＡＣＡＡＧＴＴＣＴＴＡＡＡＴ
ＣＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＴＧＡＴＡＧＡＴＴＧＴＡＹＡＡＡＧＴＡＣＣＴＧＴＡ
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ＧＴＧＣ
ＡＡＡＡＴＡＣＭＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＡＣＴＣＴＡＷ
５６５ｂｐ
ＴＩＲ　１８３ｂｐ
【００５７】
配列番号１４
Ｓｈｉｋｏｔｓｕ
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ＣＧＣＧＧＴＴＡＣＣＧＧＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＧＧＧＧＴＡＣＧＧＴＡＡＴＡ
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ＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＴＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧ
２４４ｂｐ
ＴＩＲ　１１ｂｐ
【００５８】
配列番号１５
Ｔｏｙａ
ＣＡＧＴＧＧＣＧＧＡＴＴＴＡＧＧＣＣＡＴＴＴＣＴＧＴＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴ
ＧＡＣＣＣＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＹＣＹＴＡＴＡＡＡＹＣＴ
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ＣＡＧＧ
ＴＷＴＡＡＡＷＴＣＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＴＧ
１７６ｂｐ
ＴＩＲ　１０ｂｐ
【００５９】
（プライマー配列）
本発明で用いられるプライマー配列を例示する。
2004121032.tif 000005
【００６０】
【実施例】
３種類のＭＩＴＥを用い、ＡＡダノムを有する６種２０系統とＣＣゲノムを有する１系統の計２１系統についてＭＩＴＥ　ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｄｉｓｐｌａｙを行ったところ、どのＭＩＴＥを用いた場合にも、全ての系統で明瞭かつ再現性のあるバンドパターンが検出された（図１）。また、ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの異なるプライマー（３塩基付加＝６４通り）で算出した各系統間の遺伝的類似度は、高い相関を示した（ｒ＝０．８８〜０．９７，ｄｆ＝２０９）。
【００６１】
ＭＩＴＥ−ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｄｉｓｐｌａｙは、マーカー作成が困難とされるＩｎｄｉｃａ−ｊａｐｏｎｉｃａ系統間においても、高い多型検出頻度を示した。例えば、Ｍａｈｅｓｗａｒａｎ　ｅｔ　ａｌ（１９９７）が報告したＡＦＬＰによるＩｎｄｉｃａ−Ｊａｐｏｎｉｃａ系統間の多型検出頻度と比較すると、表１に示すように、ＭＩＴＥプライマーペア当たり、いずれも２〜３倍以上の効率で多型を生じた。
【００６２】
以上の結果より、ＭＩＴＥ−ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｄｉｓｐｌａｙは、イネにおける今後のマーカー作成において、極めて有効な手法になると考えられる。
【００６３】
【表１】
2004121032.tif 000006
図１〜図４に電気泳動の結果を示す。
【００６４】
【発明の効果】
本発明によれば非常に高い解析効率でイネゲノムの構造解析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例（Ｍａｓｈｕ−ａａｔ）におけるバンドパターン図である。
【図２】実施例（Ｏｎａｇａ　Ｉ−ａａｔ）におけるバンドパターン図である。
【図３】実施例（ＳｔｏｗａｗａｙＯｓ１）におけるバンドパターン図である。
【図４】実施例（Ｔａｂｉｔｏ　ＩＩ−ａａｔ）によるバンドパターン図である。
【図１】
2004121032.tif 000007
【図２】
2004121032.tif 000008
【図３】
2004121032.tif 000009
【図４】
2004121032.tif 000010