(57)【要約】【課題】水溶性極性溶媒中で十分な蛍光強度が得られ、安定性が高く、ストークスシフトが大きく、励起波長による干渉を受けにくいために高感度で蛍光検出を行える、蛍光プローブとして極めて有望な蛍光物質の提供。【解決手段】【請求項１】下記一般式［１］2004224716.tif 000007［式中、Ｒ１及びＲ２は夫々独立して水素原子又は−ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４及びＲ５は、炭素数１〜３のアルキル基を示す。）を示し、一方が水素原子の場合、他方は−ＮＲ４Ｒ５である。Ｒ３は炭素数１〜３のアルキル基を示す。］で示されるクロメン誘導体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式［１］
【式１】
2004224716.tif 000006
［式中、Ｒ１及びＲ２は夫々独立して水素原子又は−ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４及びＲ５は、炭素数１〜３のアルキル基を示す。）を示し、一方が水素原子の場合、他方は−ＮＲ４Ｒ５である。Ｒ３は炭素数１〜３のアルキル基を示す。］
で示されるクロメン誘導体。
【請求項２】
Ｒ１が水素原子で、Ｒ２が−Ｎ（ＣＨ３）２であってＲ３がメチル基である、請求項１記載のクロメン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、極性溶媒中でも測定可能な蛍光を発し、生体試料中の微量成分を測定する際の、蛍光標識化試薬の原料である蛍光プローブ等への応用が期待される、新規なクロメン誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光を利用した特定成分の分析・測定は、その測定感度が高いため特に微量成分の測定の際に良く利用されている。例えば、蛍光標識化試薬で測定対象物質を標識した後、その蛍光を利用して該物質を測定する方法は、試料中にナノモル〜ピコモル程度しか含まれていない微量物質の測定方法として広く利用されている。
【０００３】
しかしながら、蛍光標識化試薬の蛍光プローブとして従来から用いられている、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、構造上トリフェニルメタン上のメチンへ水酸化を受けやすく、安定性が悪い。また、ストークスシフト［励起波長（ｎｍ）と蛍光波長（ｎｍ）の差］は約５０ｎｍと小さい。
【０００４】
ストークスシフトが短い蛍光物質に由来する蛍光測定は、励起波長による干渉を受けることと蛍光エネルギーが励起エネルギーに取られる可能性があり、高感度の蛍光測定には使用しにくいという問題がある。
【０００５】
また、安定でない蛍光物質は、標識時、測定時あるいは保存等に注意が必要であり、使用しにくい。
【０００６】
一方、近年、蛍光強度が強く安定であるため、蛍光プローブとして使用されているａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（アルピコシアニン、ＡＰＣ）等の巨大蛍光タンパク質は、分子サイズが大きく抗原に結合し難いという問題点がある。また、ストークスシフトも約１０ｎｍと小さい。
【０００７】
そのため、ストークスシフトが大きく、安定性に優れ、標識物質としても有用な蛍光物質の開発が望まれていた。
【０００８】
本発明者らは、上記問題を解決する蛍光プローブを得るべく、フルオレセイン誘導体と並んで蛍光物質として使用されているクマリン誘導体に注目し研究を行った。そして、種々のクマリン誘導体を合成し、これらの蛍光挙動について合成化学的なアプローチから検討を加えてきた。その結果、３位置換基を修飾することにより、環境特異的な蛍光強度並びに蛍光波長を有するクマリン類のライブラリー化に成功した。しかし、クマリン誘導体は、水溶性極性溶媒では溶けにくく、蛍光強度も弱かった。また、ストークスシフトも大きくならなかった。また、クマリン骨格にも構造上環状エステル部分の加水分解という安定性に問題があることが分かっている。
【０００９】
そこで、クマリン骨格の耐化学反応性の向上と更なるストークスシフトの拡大を目的として、ラクトンカルボニル基の欠損した一連のクロメン誘導体について、新規蛍光団としての可能性について検討を行った。その結果、新規クロメン誘導体として６位並びに７位にメトキシ基を有するクロメン誘導体を合成した。しかし、このメトキシ基で置換されたクロメン誘導体では、水溶性極性溶媒中で十分な蛍光強度が得られなかった。
【００１０】
【非特許文献１】Ｓ．  Ａｋｉｙａｍａ，  Ｈ．  Ａｋｉｍｏｔｏ，  Ｓ．  Ｎａｋａｔｓｕｊｉ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｂｕｌｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｊａｐ．，  ５８，  ｐ．２１９２−２１９６  （１９８５）（第２１９３頁右欄，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌの項１０行目〜第２１９４頁左欄１行目）
【非特許文献２】Ｍ．  Ａｎｄｏ，  Ｓ．  Ｅｍｏｔｏ，  Ｂｕｌｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｊａｐ．，  ５１（８），  ｐ．２４３３−２４３４  （１９７８），（第２４３４頁左欄１〜７行目）
【非特許文献３】Ｌ．  Ｒｅｎｅ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｒｏｙｅｒ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｒｉｃａ，  １０，  Ｎｏ．１，  ７２−７８  （１９７５），（第７４頁Ｔａｂｌｅａｕ  Ｉ，  Ｎｏ．１５）
【非特許文献４】Ａ．Ｔａｋａｄａｔｅ，  Ｔ．Ｍａｓｕｄａ，  Ｃ．Ｍｕｒａｔａ，  Ｍ．Ｓｈｉｂｕｙａ，Ａｎｄ  Ａ．ＩｓｏｂｅＣｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ（２）２５６−２６０（２０００），（第２５６頁右欄４８行目〜第２５７頁左欄６行目、第２５８頁右欄４１行目〜第２５９頁右欄１８行目）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、その課題は、水溶性極性溶媒中で十分な蛍光強度が得られ、安定性が高く、ストークスシフトの大きい、高感度で蛍光検出を行える蛍光物質を得ることを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
「下記一般式［１］
【００１３】
【式２】
2004224716.tif 000002
［式中、Ｒ１及びＲ２は夫々独立して水素原子又は−ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４及びＲ５は、炭素数１〜３のアルキル基を示す。）を示し、一方が水素原子の場合、他方は−ＮＲ４Ｒ５である。Ｒ３は炭素数１〜３のアルキル基を示す。］で示されるクロメン誘導体。」
の発明である。
【００１４】
即ち、本発明者らは、上記問題を解決する蛍光プローブを得るべく研究を行い、クマリン骨格の耐化学反応性の向上を目的として、ラクトンカルボニル基の欠損した一連のクロメン誘導体を合成し、更に新規蛍光団としての可能性について検討を行った。その結果、新規クロメン誘導体として６位並びに７位にメトキシ基を有するクロメン誘導体を合成し、続いて６位並びに７位にＮ、Ｎ−ジアルキルアミノ基を有するクロメン誘導体を合成した。そして、特にクロメンのジメチルアミノ体は、化学反応しやすいクマリン誘導体に比較して安定性が高く、且つ蛍光を発することが確認され、また先に合成したメトキシ基を有するクロメン誘導体よりも蛍光強度が強く、水溶性極性溶媒中でも溶けやすく、且つ水溶性極性溶媒中でも蛍光強度が強い等の優れた特長があることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１５】
【発明の実施の形態】
一般式［１］に於いて、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５で示される炭素数１〜３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、及びプロピル基が挙げられる。中でも、メチル基、エチル基が好ましく、メチル基が更に好ましい。
【００１６】
一般式［１］で表されるクロメン誘導体の具体例としては、３−アセチル−７−ジメチルアミノクロメン，３−アセチル−６−ジメチルアミノクロメン等のジメチル体、３−アセチル−７−ジエチルアミノクロメン，３−アセチル−６−ジエチルアミノクロメン等のジエチル体、３−アセチル−７−ジプロピルアミノクロメン，３−アセチル−６−ジプロピルアミノクロメン等のジプロピル体が挙げられるが、中でも３−アセチル−７−ジメチルアミノクロメン，３−アセチル−６−ジメチルアミノクロメン等のジメチル体、特に３−アセチル−７−ジメチルアミノクロメンが好ましい。
【００１７】
本発明の一般式［１］で表されるクロメン誘導体の合成法を、３−アセチル−７−ジメチルアミノクロメンの合成法を例にとって説明すると、例えば以下のようになる。
【００１８】
まずＡｋｉｙａｍａ等の方法（Ｓ．  Ａｋｉｙａｍａ，  Ｈ．  Ａｋｉｍｏｔｏ，  Ｓ．  Ｎａｋａｔｓｕｊｉ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｎａｋａｓｈｉｍａ，  Ｂｕｌｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｊａｐ．，  ５８，  ２１９２−２１９６  （１９８５））を一部改変して、以下の方法により４−（ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドを得る。
即ち、出発原料として容易に入手できるｍ−ジメチルアミノフェノールと、これに対して１〜１０倍好ましくは４〜６倍モルのオルトギ酸エチル等のオルトエステル類とを、乾燥ジクロロメタン等の溶媒に溶解させる。次いでこの溶液を、予め調製した塩化アルミニウム等の触媒を含有する乾燥ジクロロメタン等の溶媒に滴下する。滴下後、室温で約５分〜６００分、好ましくは１０分〜２００分、より好ましくは３０分〜１２０分程度攪拌下に反応させる。反応終了後、冷却下に１０％  ＨＣｌをゆっくり滴下し、次いで１０％  ＮａＨＣＯ３を添加して、反応液を中和する。析出結晶を除去後、反応物をジクロロメタン等で抽出し、食塩水等で洗浄後、乾燥する。得られた反応物をクロロホルム等の溶媒に溶解し、溶媒を用いてシリカゲルカラムに通液後、クロロホルム等の適当な溶媒から再結晶し、４−（ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドを得る。
【００１９】
次いで、Ｌ．  Ｒｅｎｅ等の方法（Ｌ．  Ｒｅｎｅ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｒｏｙｅｒ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｒｉｃａ，  １０，  Ｎｏ．１，  ７２−７８  （１９７５））に従い、上記で得られた４−（ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドと、これに対して約１．５倍モルのメチルビニルケトンとを、乾燥ジオキサン溶液中で炭酸カリウム存在下に約１２時間、窒素を通気しながら還流下に反応させる。反応応終了後、ジオキサンを除去し、ジクロロメタンに溶解する。次いで２Ｍ  ＮａＯＨ水溶液、食塩水で洗浄する。得られた反応物をジクロロメタン等の溶媒に溶解し、溶媒を用いてシリカゲルカラムに通液後、適当な溶媒（例えばエタノールとｎ−ヘキサンの混合溶媒等）から再結晶すれば、目的の３−アセチル−７−ジメチルアミノクロメンが得られる。
【００２０】
また、本発明に係る３−アセチル−６−ジメチルアミノクロメンは合成法は、例えば以下のようにして容易に合成し得る。
【００２１】
まずＡｎｄｏ等の方法（Ｍ．  Ａｎｄｏ，  Ｓ．  Ｅｍｏｔｏ，  Ｂｕｌｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｊａｐ．，  ５１（８），  ２４３３  （１９７８））を一部改変して、以下の方法により５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドを得る。
即ち、出発原料として容易に入手できる５−ニトロサリチルアルデヒドと、これに対して２〜１０好ましくは５〜８倍モルのホルムアルデヒド及びエタノール（ホルムアルデヒドの２〜２０倍容、好ましくは５〜１０倍容）との混合溶液を調製し、これをＰｄ−Ｃ等の触媒存在下にＨ２雰囲気下反応させた。反応の進行具合は反応液を薄層クロマトグラフィー等に付すことにより確認すればよい。反応終了後、反応液を濾過し、ＨＣｌで酸性にした後、濃縮する。得られた残渣を蒸留水で希釈後、水酸化ナトリウム水溶液で中和する。反応物を、エーテル等で抽出、乾燥する。得られた反応物をシクロヘキサンと酢酸エチルとの混合溶媒等に溶解し、溶媒を用いてシリカゲルカラムに通液して、５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドを得る。
【００２２】
次いで、上記で得られた５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドと、これに対して約１．５倍モルのメチル  ビニル  ケトンに溶解し、乾燥ジオキサン溶液中で炭酸カリウム存在下に約１２時間、窒素を通気しながら還流下に反応させる。得られた反応物をジクロロメタン等の溶媒に溶解し、溶媒を用いてシリカゲルカラムに通液後、適当な溶媒（例えばエタノール等）から再結晶すれば、目的の３−アセチル−６−ジメチルアミノクロメンが得られる。
【００２３】
本発明のクロメン誘導体は、従来良く用いられているＦＩＴＣや、対応するクマリン誘導体よりもストークスシフトが大きく、励起波長による干渉を受けにくいため、高感度測定に適している。
また、対応するクマリン誘導体より高極性溶媒中で強く蛍光を発する。更に、構造的に安定である。
以上のことから、本発明のクロメン誘導体は、蛍光プローブとして極めて有望であり、例えば本発明のクロメン誘導体を蛍光プローブとして用いて蛍光標識化試薬を作製すれば、血清、血漿、尿、髄液等の生体由来試料中の微量成分を高感度に且つ構造的に安定であるので幅広い条件下の溶媒中で標識、測定あるいは保存できることが可能になると期待される。
更にまた、本発明に係るクロメン誘導体は、蛍光特性を有する新規化合物である。
【００２４】
以下、実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれによって何等限定されるものでない。
尚、実施例に於いて用いた、本発明に係るクロメン誘導体及び対応するクマリン誘導体の略号は、夫々下記表の通りである。
【００２５】
【表１】
2004224716.tif 000003
【００２６】
【実施例】
実施例１．３−アセチル−７−ジメチルアミノクロメン（３−Ｃｈｒ）の合成
（１）４−（ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドの合成
ｍ−ジメチルアミノフェノールを出発原料とし、Ａｋｉｙａｍａ等の方法（Ｓ．  Ａｋｉｙａｍａ，Ｈ．  Ａｋｉｍｏｔｏ，  Ｓ．  Ｎａｋａｔｓｕｊｉ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｎａｋａｓｈｉｍａ，  Ｂｕｌｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｊａｐ．，  ５８，  ２１９２−２１９６  （１９８５））を一部改変し、下記の方法により、４−（ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドを合成した。
【００２７】
まず、ｍ−ジメチルアミノフェノール６．８５ｇ（５０ｍｍｏｌ）とオルトギ酸エチル５０ｍＬ（３００ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン５０ｍＬに溶解した溶液を、予め調製した塩化アルミニウム１０ｇ（７５ｍｍｏｌ）を含有する乾燥ジクロロメタン２０ｍＬに、冷却下に滴下した。滴下後、３０分間、室温で攪拌しながら反応させた。反応終了後、冷却下に１０％  ＨＣｌ  ２５ｍＬを少しずつ滴下した。次に、反応液を１０％  ＮａＨＣＯ３水溶液で中和した。析出結晶を除き、反応物をジクロロメタンで抽出し、次いで食塩水で洗浄後、乾燥した。
得られた反応物をクロロホルムに溶解し、クロロホルムを溶出液としてシリカゲルオープンカラムに通したのち、クロロホルムにより再結晶し、目的物５．２ｍｇを得た（収率６３％）。
融点：７８〜７９℃。
１ＨＮＭＲ（５００  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１１．６１  （ｓ，  １Ｈ，  Ｃ１−ＣＨＯ），  ９．５３  （ｓ，  １Ｈ，  Ｃ２−ＯＨ），  ７．３０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｃ６−Ｈ），  ６．２９  （ｄｄ，  １Ｈ，  Ｃ５−Ｈ），６．０９（ｄ，  １Ｈ，  Ｃ３−Ｈ），  ３．０１（ｓ，  ６Ｈ，  −ＣＮ（ＣＨ３）２）。
【００２８】
（２）３−Ｃｈｒの合成
（１）で得られた４−（ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドの結晶３．３ｇ（２０ｍｍｏｌ）をメチル  ビニル  ケトン２５ｍｌ（３０ｍｍｏｌ）に溶解し、乾燥ジオキサン溶液中で炭酸カリウム２．８ｇ（２０ｍｍｏｌ）存在下、窒素を通気しながら、１２時間還流下に反応させた。
反応終了後、ジオキサンをエバポレーターでとばし、ジクロロメタンに溶解した。２Ｍ  ＮａＯＨ水溶液、次いで食塩水で洗浄後、乾燥した。
得られた反応物をジクロロメタンに溶解し、ジクロロメタンを溶出液として、シリカゲルオープンカラムに通したのち、エタノールで再結晶し、目的とする３−Ｃｈｒ  ０．９ｇを得た（収率２０％）。
融点：１３０〜１３１℃。
質量分析：ＥＩ−ＭＳ，  ｍ／ｚ：２１７（Ｍ＋）。
元素分析：Ｃ１３Ｈ１５ＮＯ２として
計算値（％）；Ｃ  ７１．８７；Ｈ  ６．９６；Ｎ  ６．４５。
実測値（％）；Ｃ  ７１．８５；Ｈ  ６．８５；Ｎ  ６．５３。
１ＨＮＭＲ（５００  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：７．３０  （ｓ，  １Ｈ，  Ｃ４−Ｈ），  ７．０３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｃ５−Ｈ），  ６．２９  （ｄｄ，  １Ｈ，  Ｃ６−Ｈ），  ６．１７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｃ８−Ｈ），  ４．９８（ｓ，  ２Ｈ，  Ｃ２−Ｈ），  ３．０１（ｓ，  ６Ｈ，  −ＣＮ（ＣＨ３）２）  ２．３６（ｓ，  ３Ｈ，  −ＣＯＣＨ３）。
【００２９】
参考例１．３−アセチル−７−ジメチルアミノクマリン（３−Ｃｏｕ）の合成
（１）４−（ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドの合成
ｍ−ジメチルアミノフェノールを出発原料とし、実施例１と同様の方法にて４−（ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドを合成した。
（２）３−Ｃｏｕの合成
（１）で得られた４−（ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドの結晶３．３ｇ（２０ｍｍｏｌ）をエチルアセト酢酸３．９ｇ（３０ｍｍｏｌ）に溶解し、乾燥エタノール（２０ｍｌ）溶液中でピペリジン（２滴）存在下、１０分間還流下に反応させた。
反応終了後、得られた反応物をエタノールにより再結晶し、橙色の３−Ｃｏｕの結晶３．７ｍｇを得た。（収率８１％）。
質量分析：ＥＩ−ＭＳ，  ｍ／ｚ：２３１（Ｍ＋）。
元素分析：Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ３として
計算値（％）；Ｃ  ７２．５４；Ｈ  ６．０９；Ｎ６．５１、
実測値（％）；Ｃ  ７２．５０；Ｈ  ６．１９；Ｎ  ６．４２。
１ＨＮＭＲ（５００  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．４５  （ｓ，  １Ｈ，  Ｃ４−Ｈ），  ７．４２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｃ５−Ｈ），  ６．６５  （ｄｄ，  １Ｈ，  Ｃ６−Ｈ），  ６．４８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｃ８−Ｈ），  ３．１３  （ｓ，  ６Ｈ，  −ＣＮ（ＣＨ３）２），  ２．６９  （ｓ，  ３Ｈ，  −ＣＯＣＨ３）。
【００３０】
実施例２．３−アセチル−６−ジメチルアミノクロメン（４−Ｃｈｒ）の合成
（１）５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドの合成
５−ニトロシアリルアルデヒドを出発原料とし、Ａｎｄｏ等の方法（Ｍ．  Ａｎｄｏ，  Ｓ．  Ｅｍｏｔｏ，  Ｂｕｌｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｊａｐ．，  ５１（８），  ２４３３  （１９７８））を一部改変し、下記の方法により、５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドを合成した。
【００３１】
まず、５−ニトロサリチルアルデヒド１０ｇ（６４．５ｍｍｏｌ）と３７％  ホルムアルデヒド４０ｍＬ（４９０ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２５０ｍＬ）を調製し、これに１０％  Ｐｄ−Ｃ  ３．０ｇを混合し、Ｈ２雰囲気下で一週間かけて還元下に反応させた。途中、反応液についてシリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行い、反応の進行具合をチェックした。ＴＬＣのスポットの検出は、シクロヘキサン：酢酸エチル＝１：１で行い、オレンジ色のスポットを確認した。
反応終了後、反応溶液を濾過し、濾液を希塩酸（０．１〜１０％）で酸性にした後、溶媒をエバポレーターでとばして濃縮した。得られた残渣を蒸留水で希釈し、ＮａＯＨ水溶液で中和し、次いでエーテルで反応物を抽出し乾燥した。
得られた反応物をシクロヘキサン：酢酸エチル＝１：１の混合溶媒に溶解し、この混合溶媒を溶出液としてシリカゲルオープンカラムに通して精製した後、減圧蒸留（１２３〜１２６℃／４ｍｍＨｇ）して、目的物  ７．５ｇを得た。その後、反応物を冷凍庫に保存した。（収率７０％）。
融点：３２〜３３℃。
１ＨＮＭＲ（５００  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：１０．４５  （ｓ，  １Ｈ，  Ｃ１−ＣＨＯ），  ９．８７  （ｓ，  １Ｈ，  Ｃ２−ＯＨ），  ７．０８  （ｄｄ，  １Ｈ，  Ｃ４−Ｈ），  ６．９２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｃ３−Ｈ），６．８５（ｄ，  １Ｈ，  Ｃ６−Ｈ），  ２．９１（ｓ，  ６Ｈ，  −ＣＮ（ＣＨ３）２）。
【００３２】
（２）４−Ｃｈｒの合成
実施例２の（１）で得られた５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）サリチルアルデヒド３．３ｇ  （２０ｍｍｏｌ）をメチル  ビニル  ケトン２．５ｍｌ（３０ｍｍｏｌ）を乾燥ジオキサンに溶解し炭酸カリウム（２０ｍｍｏｌ）存在下、窒素を通気しながら１２時間還流下に反応させた。
反応終了後、ジオキサンをエバポレーターでとばし、ジクロロメタンに溶解した。２Ｍ  ＮａＯＨ水溶液、次いで食塩水で洗浄後、乾燥した。
得られた反応物をジクロロメタンに溶解し、ジクロロメタンを溶出液として、シリカゲルオープンカラムに通したのち、エタノールで再結晶し、目的とする４−Ｃｈｒ  ０．９６ｇを得た（収率２２％）。
融点：６０〜６１℃。
質量分析：ＥＩ−ＭＳ，  ｍ／ｚ：２１７（Ｍ＋）。
元素分析：Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ２として
計算値（％）；Ｃ  ７１．８７；Ｈ  ６．９６；Ｎ  ６．４５、
実測値（％）；Ｃ  ７１．６８；Ｈ  ７．０１；Ｎ  ６．４１、
１ＨＮＭＲ（５００  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：７．３２  （ｓ，  １Ｈ，  Ｃ４−Ｈ），  ６．８１  （ｄ，  １Ｈ，  Ｃ８−Ｈ），  ６．７５  （ｄｄ，  １Ｈ，  Ｃ７−Ｈ），  ６．５８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｃ５−Ｈ），  ４．９３（ｓ，  ２Ｈ，  Ｃ２−Ｈ），  ２．９０（ｓ，  ６Ｈ，  −ＣＮ（ＣＨ３）２）  ２．４１（ｓ，  ３Ｈ，  −ＣＯＣＨ３）。
【００３３】
参考例２．４−Ｃｏｕの合成
（１）５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドの合成
５−ニトロシアリルアルデヒドを出発原料とし、実施例２と同様の方法にて５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）サリチルアルデヒドを合成した。
（２）４−Ｃｏｕの合成
（１）で得られた５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）サリチルアルデヒド３．３ｇ（２０ｍｍｏｌ）をエチルアセト酢酸３．９ｇ（３０ｍｍｏｌ）に溶解し、乾燥エタノール（２０ｍｌ）溶液中でピペリジン（２滴）存在下、１０分間還流下に反応させた。
反応終了後、得られた反応物をエタノールにより再結晶し、目的とする４−Ｃｏｕ３．５ｍｇを得た（収率７６％）。
融点：１９２〜１９４℃。
質量分析：ＥＩ−ＭＳ，  ｍ／ｚ：２３１（Ｍ＋）。
元素分析：Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ３として
計算値（％）；Ｃ  ７２．５４；Ｈ  ６．０９；Ｎ  ６．５１、
実測値（％）；Ｃ  ７２．７７；Ｈ  ６．１１；Ｎ  ６．４３、
１ＨＮＭＲ（５００  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．４６  （ｓ，  １Ｈ，  Ｃ４−Ｈ），  ７．２６  （ｄ，  １Ｈ，  Ｃ８−Ｈ），  ７．０９  （ｄｄ，  １Ｈ，  Ｃ７−Ｈ），  ６．７７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｃ５−Ｈ），    ２．９９（ｓ，  ６Ｈ，  −ＣＮ（ＣＨ３）２）  ２．７３（ｓ，３Ｈ，  −ＣＯＣＨ３）。
【００３４】
実施例３．
実施例１で得られた３−Ｃｈｒをメタノール（同人化学（株）、無蛍光溶媒）に溶解して１０−６Ｍ溶液とし、これを用いて、日立Ｕ−３２１０型分光光度計で吸光スペクトルを測定した。３−Ｃｈｒのλｍａｘは４０３ｎｍであった。
次に、同じ溶液を用いて、λｍａｘを励起波長（Ｅｘ）として日立Ｆ−４５００型分光蛍光光度計で蛍光スペクトルを測定した。結果を図１の▲２▼に実線（−）で示す。図１に於いて、縦軸は蛍光強度を、横軸は波長（ｎｍ）を示す。３−Ｃｈｒの蛍光波長（Ｅｍ）は、５１１ｎｍであった。
更に、同じ溶液を用いて、上記検討で求めた蛍光波長（Ｅｍ）５１１ｎｍを用いて日立Ｆ−４５００型分光蛍光光度計で励起波長を変化させた時の蛍光スペクトルを測定した。結果を図１の▲１▼に実線（−）で示す。３−Ｃｈｒの励起波長（Ｅｘ）は、４０７ｎｍであった。
【００３５】
比較例１．
参考例１で得られた３−Ｃｏｕをメタノールに溶解して１０−６Ｍ溶液とし、これを用いて実施例３と同様の方法でλｍａｘを求め、蛍光スペクトルを測定した。尚、λｍａｘは４２７ｎｍであった。
また、蛍光スペクトルの測定結果を図１に波線（−−−−）で併せて示す。図１に於いて、▲１▼’（−−−−）は３−Ｃｏｕの励起波長を変化させた時の蛍光スペクトル、▲２▼’（−−−−）は３−Ｃｏｕの蛍光スペクトルを夫々示す。３−ＣｏｕのＥｘは４３０ｎｍ、Ｅｍは４８２ｎｍであった。
実施例３及び比較例１の結果から明らかな如く、本発明に係るクロメン誘導体である３−Ｃｈｒのストークスシフトは１０４ｎｍであるのに対し、対応するクマリン誘導体である３−Ｃｏｕのストークスシフトは５２ｎｍであり、クロメン誘導体の方がストークスシフトが大きいことが判った。
また、図１より明らかな如く、この２つの物質のＥｍに於ける蛍光強度（▲２▼と▲２▼’）とを比較したところ、本発明に係るクロメン誘導体の方が蛍光強度が５倍以上高いことが分かった。
【００３６】
実施例４．
実施例２で得られた４−Ｃｈｒをヘキサン（同人化学（株）、無蛍光溶媒）に溶解して１０−６Ｍ溶液とし、実施例３と同様の方法でλｍａｘを求め、蛍光スペクトルを測定した。尚、λｍａｘは４２０ｎｍであった。
蛍光スペクトルの測定結果を図２に実線（−）で示す。図２に於いて、▲１▼（−）は４−Ｃｈｒの励起波長を変化させた時の蛍光スペクトル、▲２▼（−）は４−Ｃｈｒの蛍光スペクトルを夫々示す。４−ＣｈｒのＥｘは４２７ｎｍ、Ｅｍは５４２ｎｍであった。
尚、図２に於いて、縦軸は蛍光強度、横軸は波長（ｎｍ）を夫々示す。
【００３７】
比較例２．
参考例２で得られた４−Ｃｏｕをヘキサン（同人化学（株）、無蛍光溶媒）に溶解して１０−６Ｍ溶液とし、実施例３と同様の方法でλｍａｘを求め、蛍光スペクトルを測定した。尚、λｍａｘは、４４４ｎｍであった。
蛍光スペクトルの測定結果を図２に波線（−−−−）で併せて示す。図２に於いて、▲１▼’（−−−−）は４−Ｃｏｕの吸光スペクトル、▲２▼’（−−−−）は４−Ｃｏｕの蛍光スペクトルを夫々示す。４−ＣｏｕのＥｘは４４０ｎｍ、Ｅｍは５３８ｎｍであった。
図２の結果から明らかな如く、本発明に係るクロメン誘導体である４−Ｃｈｒは蛍光特性があり、蛍光物質であることが判った。また、このＥｍに於ける蛍光強度は、対応するクマリン誘導体である４−Ｃｏｕほど強くはなかった。しかしながら、４−Ｃｈｒのストークスシフトは１１５ｎｍであるのに対し、４−Ｃｏｕのストークスシフトは９８ｎｍ
であり、クロメン誘導体の方がストークスシフトが大きいことが判った。
【００３８】
実施例５．
実施例１で合成した３−Ｃｈｒを蒸留水（同人化学（株）、無蛍光水）とメタノールの混合溶媒（蒸留水濃度：０〜１００％ｖ／ｖ）に溶解して１０−６Ｍの溶液を作製し、検体とした。次に、実施例３と同様の方法で、Ｅｘ  ４０７ｎｍとして、各溶液のＥｍと蛍光強度（Ｉｒｅｌ）を測定した。
結果を図３に示す。図３に於いて△はＥｍを、○はＩｒｅｌを夫々示し、縦軸はＩｒｅｌ若しくはＥｍを、横軸は蒸留水とメタノールの混合溶媒中の、蒸留水の濃度（％ｖ／ｖ）を夫々示す。
図３から明らかな如く、Ｉｒｅｌはメタノール中に３０〜５０％蒸留水が含まれるとき最高値を示した。Ｅｍは、蒸留水１００％の時に最も長波長側にシフトした。
以上のことより、本発明に係る３−Ｃｈｒは、高極性溶媒中でも蛍光を発し、蛍光の測定を行えることが判った。
【００３９】
比較例３．
参考例１で合成した３−Ｃｏｕを、メタノールとベンゼンの混合溶媒（メタノール濃度：０〜１００％ｖ／ｖ）に溶解し、実施例３と同様の方法で、各溶液のＥｍとＩｒｅｌを測定した。結果を図４に示す。図４に於いて△はＥｍを、●はＩｒｅｌを夫々示し、縦軸はＩｒｅｌ若しくはＥｍを、横軸はメタノールとベンゼンの混合溶媒中の、メタノールの濃度（％ｖ／ｖ）を夫々示す。
図４から明らかな如く、溶媒中にメタノールが含有されると（極性を持つようになると）、Ｉｒｅｌは速やかに減少した。Ｅｍは、メタノール濃度５０％の時に最も長波長側にシフトした。
以上のことより、クマリン誘導体である３−Ｃｏｕは、本発明に係るクロメン誘導体である３−Ｃｈｒとは異なり、極性溶媒中では蛍光強度が減少し、このような条件下での蛍光の測定には不向きであることが判った。
【００４０】
実施例６．
実施例１〜２で得られた本発明に係るクロメン誘導体及び参考例１〜２で得られた対応するクマリン誘導体を、各種溶媒に溶解し、実施例３と同様の方法で、λｍａｘを測定した。次にλｍａｘをＥｘとしてＥｍを求め、その蛍光強度（Ｉｒｅｌ）を測定した。
尚、各種溶媒中の本発明に係るクロメン誘導体又は対応するクマリン誘導体の濃度は、下記表２の通りである。
【００４１】
【表２】
2004224716.tif 000004
【００４２】
結果を表３に示す。表中、（Ｅｔ）は、各溶媒の溶媒極性のパラメータを夫々示す。ＴＨＦはテトラヒドロフランを示す。また、表３中、ｎ．ｄ．は、測定を行わなかった場合を示す。
【００４３】
【表３】
2004224716.tif 000005
【００４４】
表３から明らかな如く、クマリン誘導体である３−Ｃｏｕはメタノール中では蛍光が低くなったが、本発明に係る３−Ｃｈｒは、水溶性極性溶媒中でも強い蛍光を発することが判った。また、４−Ｃｈｒは、ベンゼンやヘキサンのような極性の低い溶媒中では黄色の蛍光が、一方アセトニトリルやジクロロメタン等の極性の高い溶媒中では橙色の蛍光が観測され、興味深い蛍光スペクトル特性を有していることが判った。
【００４５】
【発明の効果】
本発明に係るクロメン誘導体は、すべて蛍光特性を有しており、対応するクマリン誘導体に比べ、ストークスシフトが大きく、測定系の感度向上が期待できる等のユニークな蛍光特性を有し、今後様々な分析試薬の蛍光プローブとして利用できるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた３−アセチル−７−ジメチルアミノクロメン（３−Ｃｈｒ）の蛍光スペクトルを測定した結果、及び参考例１で得られた３−アセチル−７−ジメチルクマリン（３−Ｃｏｕ）の蛍光スペクトルを測定した結果である。
【図２】実施例２で得られた３−アセチル−６−ジメチルアミノクロメン（４−Ｃｈｒ）の蛍光スペクトルを測定した結果、及び比較例２で得られた３−アセチル−６−ジメチルクマリン（４−Ｃｏｕ）の蛍光スペクトルを測定した結果である。
【図３】実施例１で得られた３−Ｃｈｒの、蒸留水／メタノール：０〜１００％ｖ／ｖ混合溶媒中に於ける蛍光波長（Ｅｍ）と蛍光強度（Ｉｒｅｌ）を測定した結果である。
【図４】参考例１得られた３−Ｃｏｕの、メタノール／ベンゼン：０〜１００％ｖ／ｖ混合溶媒中に於けるＥｍとＩｒｅｌを測定した結果である。
【符号の説明】
図１に於いて、▲１▼の実線（−）は、３−Ｃｈｒの励起波長を変化させた時の蛍光スペクトル、▲２▼の実線（−）は３−Ｃｈｒの蛍光スペクトルを、▲１▼の点線（−−−−）は３−Ｃｏｕの励起波長を変化させた時の蛍光スペクトル、▲２▼の点線（−−−−）は３−Ｃｏｕの蛍光スペクトルを夫々示す。
図２に於いて、▲１▼の実線（−）は、４−Ｃｈｒの励起波長を変化させた時の蛍光スペクトル、▲２▼の実線（−）は４−Ｃｈｒの蛍光スペクトルを、▲１▼の点線（−−−−）は４−Ｃｏｕの励起波長を変化させた時の蛍光スペクトル、▲２▼の点線（−−−−）は４−Ｃｏｕの蛍光スペクトルを夫々示す。
図３に於いて△はＥｍを、○はＩｒｅｌを夫々示す。
図４に於いて△はＥｍを、●はＩｒｅｌを夫々示す。
【図１】
2004224716.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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