(57)【要約】【課題】Ｇ−Ｇミスマッチが連続するオリゴヌクレオチドに特異的に結合し、当該オリゴヌクレオチドが形成するヘアピンループ構造等を安定化等させるための化合物、およびその利用法を提供する。【解決手段】下記の一般式（２）で表される化合物。【化２】2004262828.tif 000008（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、Ｃ１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個以上のＣがＯ、Ｎ又はＳで置換可能アルキル基、Ｃ１〜１５のアルコキシル基であって当該アルコキシル基中の１個以上のＣがＯ、Ｎ又はＳで置換可能アルコキシル基、又は、Ｃ１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個以上のＣがＯ、Ｎ又はＳで置換可能モノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、Ｒ２およびＲ５は、Ｃ１〜２０のアルキレン基であって当該アルキレン基中の１個以上のＣがＯ、Ｎ又はカルボニル基で置換可能アルキレン基。）【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（２）、
【化２】
2004262828.tif 000005
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシル基であって当該アルコキシル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルコキシル基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、Ｒ２およびＲ５は、炭素数１〜２０のアルキレン基であって当該アルキレン基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキレン基を示す。）で表される化合物またはその固定化物。
【請求項２】
上記一般式（２）で表される化合物が、下記の構造式（３）、
【化３】
2004262828.tif 000006
である請求項１に記載の化合物またはその固定化物。
【請求項３】
下記の一般式（１）、
【化１】
2004262828.tif 000007
（式中、Ａ、Ｃは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂ、Ｄは正常な塩基対を形成することができない塩基の対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌ１は化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー構造を示し、Ｌ２は化学構造部分Ｃ及びＤを結合するリンカー構造を示し、Ｌ１とＬ２とは結合している。）で表される化合物またはその固定化物を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させる方法。
【請求項４】
上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物の化学構造部分Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが、擬似的に塩基対を形成する塩基と水素結合を形成し、かつ周囲の塩基とのスタッキング効果により安定化されることにより塩基と対を形成する化合物である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物の化学構造部分Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが、塩基との水素結合が可能な２個以上の化学構造部分を含有する複素環式芳香族基を有するものである請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物の化学構造部分Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの少なくともひとつが、ナフチリジン又はその誘導体である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物の化学構造部分ＡおよびＢとリンカー部分Ｌ１との結合、及び／又は化学構造部分ＣおよびＤとリンカー部分Ｌ２との結合が、カルボン酸アミド結合である請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物が、上記一般式（２）で表される化合物である請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記一般式（２）で表される化合物またはその固定化物におけるＲ２およびＲ５は、それぞれ窒素原子を有しており、それらの窒素原子間が、炭素−炭素結合で結合されている請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記オリゴヌクレオチド鎖が、ＤＮＡ鎖である請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記ＤＮＡ鎖が、テロメア領域のＤＮＡ鎖である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記テロメア領域のＤＮＡ鎖が、ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖における分子内の（相互の）塩基の対であって、正常な塩基対を形成することができない塩基の対が、Ｇ−Ｇミスマッチである請求項３〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
上記擬似的に塩基対を形成させられた構造が、ヘアピン構造である請求項３〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させる工程を含んでいる、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖における分子内の塩基の対であって正常な塩基対を形成することができない塩基の対を安定化させる方法。
【請求項１６】
上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を含んでおり、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させて、塩基対を安定化させるための、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖における相互の塩基の対の形成の安定化剤。
【請求項１７】
１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的な塩基対を形成させ得る、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を含んでいる、オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性阻害剤。
【請求項１８】
上記擬似的に塩基対を形成させる領域が、オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素におけるプライマー領域である請求項１７に記載の酵素の活性阻害剤。
【請求項１９】
上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、ＤＮＡの合成酵素である請求項１７または１８に記載の酵素の活性阻害剤。
【請求項２０】
上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、テロメラーゼである請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の酵素の活性阻害剤。
【請求項２１】
上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させる工程を含んでいる、オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性を阻害する方法。
【請求項２２】
上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、ＤＮＡの合成酵素である請求項２１に記載の酵素の活性を阻害する方法。
【請求項２３】
上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、テロメラーゼである請求項２２に記載の酵素の活性を阻害する方法。
【請求項２４】
１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的な塩基対を形成させ得る、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を含んでいる医薬組成物。
【請求項２５】
上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性化による疾患の治療、処置または予防のための請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、テロメラーゼである請求項２４または２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性化による疾患が、ガンである請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を用いて、オリゴヌクレオチド鎖の塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定する工程を含んでいる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法。
【請求項２９】
上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を含んでいる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定するための試薬。
【請求項３０】
上記一般式（１）で表される化合物を固定化させた器具。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、テロメア等の１本鎖のオリゴヌクレオチドに結合し得る分子、およびその利用法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
テロメアは染色体の末端に存在するＤＮＡ配列であり、ヒト染色体の場合にはＴＴＡＧＧＧ配列が繰り返し続き、初期の状態では約１０ｋｂほどの長さのＤＮＡ配列である。このテロメアには種々の結合タンパク質が結合して、ＤＮＡの末端同士が結合して環状のＤＮＡになることを抑制したり、核膜との結合などの働きをしたりしている。このうちの大部分は２本鎖であるが、最末端の数十塩基は３’末端側が１本鎖で突出している。細胞分裂の際にはＤＮＡが複製されるが、この複製機構において複製のたびに、約５０〜１５０塩基程度のテロメアの配列が短縮されることがわかっている。そして、テロメア部分の長さが約５ｋｂ程度になると、細胞は分裂寿命を迎え（Ｍ１期）、細胞の分裂を停止する。
【０００３】
正常細胞においては、テロメアの２本鎖部分にテロメア結合タンパク質の１種であるＴＲＦ１が結合して、テロメアの延長を抑制しており、分裂寿命を迎えた細胞は、テロメアＤＮＡが次第に不安定となり、遂に染色体の安定性を保つことができなくなり、そして自然死（アポトシス）（Ｍ２期）する。
【０００４】
一方、ガン細胞では、テロメアの配列を伸張させる酵素「テロメラーゼ」が活性化され、細胞分裂により短くなったテロメア配列を長くする。このテロメラーゼは、テロメアＤＮＡの１本鎖部分を延長する逆転写酵素であり、ＴＴＡＧＧＧの１．５回分に相当する相補鎖の鋳型ＲＮＡを内在しており、これをプライマーとして伸長反応を行う。このため、ガン細胞ではテロメアの短縮が抑制され、無限に細胞増殖を繰り返すことができるとされている。これが、ガン細胞が正常細胞とは異なり、前記したＭ１期やＭ２期を迎えることなく異常に増殖を繰り返すことができる理由だと考えられている。
【０００５】
このことから、ガン細胞に特有のテロメラーゼによるテロメア配列の伸長反応を阻害する化合物が、次世代の抗ガン剤として注目されている。特に、テロメア配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、４本のＤＮＡが集まり４重鎖（クアドラプレックス）構造、特にグアニン４重鎖構造を形成することが知られている。このため、グアニン４重鎖構造を安定化できれば、テロメラーゼによるテロメア配列の伸張を阻害できるとの考えのもと、テロメアＤＮＡのグアニン４重鎖構造に結合するテロメア伸長阻害物質が数多く設計された。しかし、細胞核内において、テロメアＤＮＡがクアドラプレックス構造（特に、グアニン４重鎖構造）を形成している証拠はなく、従来のテロメア伸長阻害物質の分子ターゲットは明確ではなかった。
【０００６】
そこで、本発明者らは、以前に、テロメアＤＮＡの１本鎖部分における相互の塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基対（ミスマッチ塩基対）に擬似的に塩基対を形成させ、ヘアピン構造等の２本鎖構造等を安定化させることによりテロメラーゼの作用を阻害することができる方法等を開発した（特許文献１参照）。
【０００７】
上記方法について簡単に説明する。まず、図１に示すＤＮＡの塩基配列は、テロメアの３’末端側の１本鎖の部分がヘアピン構造を形成した場合を模式的に示したものであり、同図の右側はヘアピン構造のループ部分で全体としては１本鎖である。この１本鎖のテロメア末端の５’側が２本鎖ＤＮＡになっており、３’側はテロメアの末端、すなわち染色体の末端である。同図の縦線は相補的な配列であることを示すが、その他はミスマッチの配列となっていることを示す。すなわち、１本鎖のテロメア配列は、上述のとおりＴＴＡＡＧＧＧの繰り返し配列であるため、１本鎖のテロメア配列がヘアピン構造を形成する場合に発生する相補的な配列は「ＴＡ」の部分しかない。例えば、図１に示すようにこの「ＴＡ」の部分において相補鎖を形成してもその前後においてＧ−Ｇミスマッチ（グアニン−グアニンミスマッチ）などの塩基のミスマッチが生じることになる。このように、テロメアの１本鎖部分において安定なヘアピン構造を形成させることは通常は困難であり、ガン細胞においては、このテロメアの１本鎖部分にテロメラーゼが作用してテロメアの伸長反応が生起することになる。
【０００８】
しかし、テロメアの１本鎖部分におけるＧ−Ｇミスマッチなどの塩基のミスマッチを解消することができれば、テロメアの１本鎖部分において安定なヘアピン構造を形成させることができ、テロメラーゼの作用を阻害することができる。そこで、本発明者らは、テロメアのヘアピン構造等における２本鎖ＤＮＡ中に生成するＧ−Ｇミスマッチに特異的に結合し、安定化する分子であるＤＮＡ認識分子を用いて、テロメアＤＮＡの１本鎖ＤＮＡが安定なヘアピン構造や４本鎖構造等を形成できる方法等を開発した。テロメラーゼは、上述したようにテロメアＤＮＡの１本鎖部分と作用し、これを延長するものであるから、上記方法等を利用することで、テロメラーゼの活性を阻害することができ、ひいてはガン細胞の増殖を抑制できることになる。
【０００９】
【特許文献１】
特開２００２−３００９４号公報（公開日  平成１４年  １月２９日）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
上述のような従来のテロメアＤＮＡの１本鎖ＤＮＡが安定なヘアピン構造や４本鎖構造等を形成できる方法等は、一般式（Ｉ）、Ａ−Ｌ−Ｂ  （Ｉ）（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂは正常な塩基対を形成することができない塩基の対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー構造を示す。）で表される、その各々の塩基と対を形成し得る化学構造部分Ａ及び化学構造部分Ｂ、並びに当該化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー部分Ｌを有する化合物を用いていた。
【００１１】
しかしながら、ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列からなる１本鎖のテロメアＤＮＡが形成するヘアピンループ構造では、Ｇ−Ｇミスマッチが連続して多数存在するため、上記化合物では十分にヘアピンループ構造を安定化することができないという問題点がある。
【００１２】
したがって、Ｇ−Ｇミスマッチが連続して多数存在する１本鎖のテロメアＤＮＡが形成するヘアピンループ構造等を安定化させるための化合物、方法、および薬剤等が強く望まれていた。
【００１３】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、不対塩基、特にＧ−Ｇミスマッチが連続して多数存在するオリゴヌクレオチド（例えば、１本鎖のテロメアＤＮＡ）に特異的に結合し、当該オリゴヌクレオチドが形成するヘアピンループ構造等を安定化等させるための化合物、およびその利用法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトのテロメアＤＮＡの１本鎖部分に特徴的な配列であるＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列がヘアピン構造等により２本鎖や４本鎖構造を形成する場合、塩基のミスマッチ（特にＧ−Ｇミスマッチ）が連続して存在することに着目し、これらの連続する塩基のミスマッチ部分に特異的に結合し、擬似的に塩基対を形成することができる化合物、ビスナフチリジンダイマーを作製した。そして、この化合物とヒトのテロメアＤＮＡの１本鎖ＤＮＡとを混合したところ、従来のＧ−Ｇミスマッチ認識（結合）分子と比較して、より強力に塩基のミスマッチ部分に特異的に結合し、その結果、テロメアＤＮＡの１本鎖部分におけるヘアピン構造等の形成をより安定化することを見出した。すなわち、上記化合物を用いることにより、より強力にテロメラーゼの作用を阻害することができる。
【００１５】
すなわち、本発明にかかる化合物またはその固定化物は、上記の課題を解決するために、下記の一般式（２）、
【００１６】
【化２】
2004262828.tif 000002
【００１７】
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシル基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルコキシル基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、Ｒ２およびＲ５は、炭素数１〜２０のアルキレン基であって当該アルキレン基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキレン基を示す。）で表される化合物またはその固定化物である。
【００１８】
上記の化合物またはその固定化物は、Ｇ−Ｇミスマッチ、特に連続して存在するＧ−Ｇミスマッチに強力に結合することができる。これによって、例えば、Ｇ−Ｇミスマッチ、特に連続して存在するＧ−Ｇミスマッチを感度よく検出、同定することができる。さらに、Ｇ−Ｇミスマッチが連続して存在するテロメアＤＮＡの１本鎖部分におけるヘアピン構造等の形成をより安定化することが可能である。したがって、より強力にテロメラーゼの作用を阻害することができる。
【００１９】
また、本発明でいう「固定化物」とは、化合物をチップ、センサー、またはプレート等の担体（化合物の機能を阻害しないもの）に固定化したもの又は固定化され得るように「枝」をのばした状態の化合物をいう。なお、化合物の担体への固定化には、リンカー部分から担体に固定化するための枝を結合させる等の従来公知の化学的、物理的な方法を利用することができ、特に限定されるものではない。また、上記のように、硫黄を含む化合物（特にメルカプト基を含む化合物）は、その分子を固定化（例えばチップなどに固定化）するときに、その固定化が容易である。
【００２０】
また、本発明にかかる化合物は、上記一般式（２）で表される化合物またはその固定化物が、下記の構造式（３）、
【００２１】
【化３】
2004262828.tif 000003
【００２２】
であることが好ましい。
【００２３】
また、本発明にかかる、擬似的塩基対形成方法は、下記の一般式（１）、
【００２４】
【化１】
2004262828.tif 000004
【００２５】
（式中、Ａ、Ｃは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂ、Ｄは正常な塩基対を形成することができない塩基の対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌ１は化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー構造を示し、Ｌ２は化学構造部分Ｃ及びＤを結合するリンカー構造を示し、Ｌ１とＬ２とは結合している。）で表される化合物またはその固定化物を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させる方法である。
【００２６】
上記の方法によれば、従来のミスマッチ認識分子を用いる場合に比べて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、連続して存在する正常な塩基対を形成することができない塩基の対に、より強力に擬似的な塩基対を形成させることができる。
【００２７】
また、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物の化学構造部分Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが、擬似的に塩基対を形成する塩基と水素結合を形成し、かつ周囲の塩基とのスタッキング効果により安定化されることにより塩基と対を形成する化合物であることが好ましい。さらに、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物の化学構造部分Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが、塩基との水素結合が可能な２個以上の化学構造部分を含有する複素環式芳香族基を有するものであることが好ましい。
【００２８】
また、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物の化学構造部分Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの少なくともひとつが、ナフチリジン又はその誘導体であるであることが好ましい。さらに、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物の化学構造部分ＡおよびＢとリンカー部分Ｌ１との結合、及び／又は化学構造部分ＣおよびＤとリンカー部分Ｌ２との結合が、カルボン酸アミド結合であることが好ましい。
【００２９】
また、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物が、上記一般式（２）で表される化合物であるであることが好ましい。さらに、上記一般式（２）で表される化合物またはその固定化物におけるＲ２およびＲ５は、それぞれ窒素原子を有しており、それらの窒素原子間が、炭素−炭素結合で結合されていることが好ましい。
【００３０】
また、上記オリゴヌクレオチド鎖が、ＤＮＡ鎖であることが好ましい。さらに、上記ＤＮＡ鎖が、テロメア領域のＤＮＡ鎖であることが好ましい。また、上記テロメア領域のＤＮＡ鎖が、ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列であることが好ましい。
【００３１】
また、上記１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖における分子内の（相互の）塩基の対であって、正常な塩基対を形成することができない塩基の対が、Ｇ−Ｇミスマッチであることが好ましい。さらに、上記擬似的に塩基対を形成させられた構造が、ヘアピン構造であることが好ましい。
【００３２】
また、本発明にかかる安定化方法、すなわち、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における（相互の）塩基の対であって正常な塩基対を形成することができない塩基の対を安定化させる方法は、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させる工程を含んでいる、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖における分子内の塩基の対であって正常な塩基対を形成することができない塩基の対を安定化させる方法である。また、本発明にかかる安定化剤は、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を含んでおり、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させて、塩基対を安定化させるための、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖における相互の塩基の対の形成の安定化剤である。
【００３３】
上記の方法等によれば、従来のミスマッチ認識分子を用いる場合に比べて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内（相互の）における塩基の対であって正常な塩基対を形成することができない塩基の対をより強力に安定化させることができる。
【００３４】
また、本発明にかかる酵素活性阻害剤は、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的な塩基対を形成させ得る、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を含んでいる、オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性阻害剤である。また、本発明にかかる酵素活性阻害方法は、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させる工程を含んでいる、オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性を阻害する方法である。
【００３５】
上記の構成によれば、従来のミスマッチ認識分子を用いている場合よりも、より強力にオリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性を阻害することができる。
【００３６】
また、上記酵素活性阻害剤は、上記擬似的に塩基対を形成させる領域が、オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素におけるプライマー領域であることが好ましい。また、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、ＤＮＡの合成酵素であることが好ましい。さらに、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、テロメラーゼであることが好ましい。
【００３７】
また、上記酵素活性阻害方法は、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、ＤＮＡの合成酵素であることが好ましい。さらに、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、テロメラーゼであることが好ましい。
【００３８】
また、本発明にかかる医薬組成物は、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的な塩基対を形成させ得る、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を含んでいる医薬組成物である。また、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性化による疾患の治療、処置または予防のためのものであることが好ましい。さらに、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、テロメラーゼであることが好ましい。また、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性化による疾患が、ガンであることが好ましい。
【００３９】
上記の構成によれば、従来のミスマッチ認識分子を用いる場合よりも、より強力に疾患を予防、治療、または処置することができる。
【００４０】
さらに、本発明にかかる不対塩基対検出同定方法は、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を用いて、オリゴヌクレオチド鎖の塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定する工程を含んでいる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法である。また、本発明にかかる不対塩基対検出同定試薬は、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を含んでいる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定するための試薬である。
【００４１】
上記の構成によれば、従来のミスマッチ認識分子を用いているものよりも、正常な塩基対を形成することができない塩基の対、特に連続して存在する正常な塩基対を形成することができない塩基の対を、より感度よく検出、同定することができる。
【００４２】
本発明にかかる器具は、上記一般式（１）で表される化合物を固定化させたものである。この固定化された器具を用いることにより、テロメア長の違いを検出することができ、ひいては、ガンの診断に使用することができる。
【００４３】
なお、上記器具としては、例えば、何らかの化学結合によって、上記一般式（１）で表される化合物を基盤（担体）上に固定化したチップ、センサー、キュベット、またはプレート等が挙げられる。そして、何らかの化学結合によって上記一般式（１）で表される化合物を基盤（担体）上に固定化するとき、硫黄を一般式（１）で表される化合物（特にメルカプト基（−ＳＨ）を含む化合物）を用いれば、その固定化が容易となる。
【００４４】
【発明の実施の形態】
本発明は、連続した塩基対のミスマッチを検出、同定し得る化合物、および当該化合物を用いて、ミスマッチの配列を有する１本鎖のＤＮＡやＲＮＡなどの核酸類に安定なヘアピン構造や４本鎖構造等を形成させる方法を提供するものである。また、本発明は、１本鎖のテロメア配列に安定なヘアピン構造や４本鎖構造などを形成させてテロメラーゼ等の酵素活性を阻害する方法、そしてガン細胞の増殖を抑制する方法及びガン増殖抑制剤を提供するものである。さらに、本発明は、正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定するための方法、および当該試薬を提供するものである。
【００４５】
そこで、以下に、まず当該化合物について説明し、その後、その利用方法等について説明することとする。
【００４６】
なお、以下の説明においては、前記した「正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分（一般式（１）におけるＡ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤの部分）」のことを単に「塩基認識部位」ということもある。
【００４７】
（１）本発明にかかる化合物
本発明にかかる化合物は、上記一般式（２）で表される化合物であればよい。なお、式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシル基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルコキシル基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、Ｒ２およびＲ５は、炭素数１〜２０のアルキレン基であって当該アルキレン基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキレン基を示す。なかでも、上記構造式（３）で表される化合物であることが好ましい。
【００４８】
上記化合物は、低分子有機化合物であり、通常の有機合成法により適宜製造することができ、特に限定されるものではない。例えば、前記した１，８−ナフチリジン誘導体は、２−アミノ−１，８−ナフチリジン又は２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジンをＮ−保護−４−アミノ−酪酸の反応性誘導体、例えば酸塩化物を反応させて、２位のアミノ基をアシル化した後、アミノ基を保護基を脱保護して製造することができる。この際の保護基としては、塩酸塩やアシル基やアルコキシカルボニル基などのペプチド合成において使用されるアミノ保護基を使用することができる。このようにして得られた塩基認識部位を、両末端にカルボキシル基又はその反応性誘導体基を有するリンカー用の化合物と反応させることにより目的のミスマッチ塩基認識分子を得ることができる。この際に、リンカー用化合物の分子中に窒素原子などの反応性の基が存在している場合には、前記した保護基などで適宜保護して使用することができる。なお、上記構造式（３）で表される化合物の詳細な合成方法は、後述の実施例に示す。
【００４９】
上記化合物は、グアニンと水素結合を形成し、かつ周囲の塩基とスタッキング効果により安定化され得る１，８−ナフチリジン誘導体を用いて、これをリンカーにより結合させ、合成された四量体の化合物である。上記化合物は、不対塩基と水素結合をするだけでなく、２本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩基（バルジ塩基）の存在により生じてくる空間に、芳香環とバルジ近傍の塩基とのスタッキング相互作用を利用してインターカーレーションし、安定化される。さらに、バルジ塩基を有するＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異的に結合し、安定化する分子であるバルジＤＮＡ認識分子でもある。また、塩基対のミスマッチが生じている箇所においても、塩基と対を形成し得る分子種を４個有する化合物がこのようなスタッキング効果により比較的安定に取り込まれ得る。そして、ＤＮＡの２本鎖に取り込まれた上記化合物は、比較的安定な対を形成し、このような対の形成により天然の酵素が認識することができない塩基の配列を新たに形成していると考えられる。
【００５０】
したがって、上記化合物は、Ｇ−Ｇミスマッチ、特に連続して存在するＧ−Ｇミスマッチを感度よく認識することができる。また、上記化合物は、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対が存在するために安定なヘアピン構造のような２本鎖構造をとることができない１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖の正常な塩基対を形成することができない塩基の対（ミスマッチの塩基対）を安定化させて安定な擬似的な塩基対を形成させる方法、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖の正常な塩基対を形成することができない塩基の対（ミスマッチの塩基対）を安定化させる方法に利用可能である。また、上記化合物は、このような擬似的な塩基対を形成させて比較的安定なヘアピン構造のような２本鎖構造を形成させることにより、当該１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖の相補的なオリゴヌクレオチド鎖を合成する酵素の活性を阻害する方法にも利用可能である。さらに、当該相補的なオリゴヌクレオチド鎖を合成する酵素の活性を阻害することにより、それに関連する各種の疾患（例えば、ガン等）を治療、予防、処置するための医薬組成物への応用が可能である。
【００５１】
以下に、上記化合物をはじめとした、オリゴヌクレオチドに結合し得る分子を用いた応用方法を順に説明する。
【００５２】
（２）オリゴヌクレオチドに結合し得る分子の利用方法
まず、本発明にかかる各種方法に用いられる、オリゴヌクレオチドに結合し得る分子について説明する。
【００５３】
上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子は、上記一般式（１）で表される化合物であればよい。上記一般式（１）で表される化合物は、４個の塩基認識部位（式中のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を適当な長さで、かつ適当な自由度を有するリンカー（式中のＬ１、Ｌ２）で結合させた化合物であればよく、当該塩基認識部位Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、グアニンを認識するものに限定されるものではない。すなわち、上記の例では、グアニン（Ｇ）−グアニン（Ｇ）のミスマッチを例に取り、グアニン塩基と安定な水素結合を形成する１，８−ナフチリジン誘導体を塩基認識部位に用いた化合物を示したが、ミスマッチの認識、または擬似塩基対を形成できる箇所は、Ｇ−Ｇミスマッチの箇所に限定されるものではない。つまり、上記塩基認識部位は、ミスマッチの塩基の片方を認識し当該塩基とワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）型の塩基対を形成することができ、周囲の塩基によるスタッキング効果を得られる分子種を選択することにより、例示したグアニンに限らず、各種の塩基と塩基対を形成し得るものであればよい。例えば、ミスマッチの塩基がシトシンの場合には、塩基認識部位として２−アミノナフチリジン−４−オン又はその誘導体等が、ミスマッチの塩基がアデニンの場合には、２−キノロン誘導体、例えば３−（２−アミノエチル）−２−キノロン又はその誘導体等が、また、ミスマッチの塩基がチミンの場合には、２−アミノナフチリジン−７−オン又はその誘導体等が用いられるが、特に限定されるものではない。したがって、上記塩基認識部位（一般式（１）におけるＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤの化学構造部分）は、単に目的の塩基と水素結合ができるということのみではなく、前後又は周囲の塩基によるスタッキング効果が得られる化学構造であることが好ましい。
【００５４】
特定のミスマッチの塩基を特異的に認識等できる、上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子における塩基認識部位は、水素結合を形成するための水素結合部位と、近傍の塩基にスタッキングされるための平面構造を有している複素環式芳香族基を有するものが好ましいが、さらに、塩基に対する選択性を増強するためにある程度の立体障害を有する置換基を有する複素環式芳香族基が好ましい。このような置換基としては、例えば、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基からなるアルコキシル基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基でモノ又はジ置換されているモノ若しくはジアルキルアミノ基などが挙げられる。これらのアルキル基、アルコキシル基又はモノ若しくはジアルキルアミノ基における１個又はそれ以上の炭素原子は、酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されていてもよい。
【００５５】
また、上記一般式（１）で表される化合物におけるリンカー部Ｌ１、Ｌ２としては、２個の塩基認識部位（例えば、ＡとＢ、またはＣとＤ）を適当な長さ、かつ適当な自由度を与えて結合させるとともに、Ｌ１とＬ２とが適当な長さかつ適当な自由度で結合するものであれば特に制限されるものではない。例えば、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１２の直鎖状又は分枝状の飽和又は不飽和のアルキレン基であって、当該アルキレン基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキレン基が挙げられる。好ましいリンカーとしては、前記した式（３）の化合物のように、両端がアミド結合の部分を有し、中央部に窒素原子を有し、この窒素原子同士によって、Ｌ１とＬ２とが結合しているものが挙げられる。なお、このリンカー部Ｌ１、Ｌ２は、２個の塩基認識部位を結合させるだけでなく、このリンカー部分から担体に固定化するための枝を結合させることもできる。
【００５６】
また、上記一般式（１）における塩基認識部位ＡまたはＢとリンカー部Ｌ１との結合、ＣまたはＤとリンカー部Ｌ２との結合は、炭素−炭素結合であってもよいが、合成の簡便さから官能基による結合が好ましい。官能基による結合としては、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、リン酸による結合など種々のタイプのものを選択することができるが、アミド結合が好ましい。
【００５７】
また、Ｇ−Ｇミスマッチに対する好ましい一般式（１）の化合物として、上記一般式（２）で表される化合物を挙げることができる。なお、式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシル基であって当該アルコキシル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルコキシル基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、Ｒ２、Ｒ５は、炭素数１〜２０のアルキレン基であって当該アルキレン基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキレン基を示す。）で表される化合物又はその固定化物が挙げられる。ここにおける「固定化物」とは、前記した化合物が担体に固定化されている状態のもの又は固定化され得るように前記した「枝」をのばした状態の化合物をいう。なお、Ｒ２、Ｒ５におけるアルキレン基は、一般式（２）に示されているように２価のアルキレン基である。
【００５８】
また、上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子は、これを単独で使用することもできるが、分子中の適当な位置に、例えばリンカー部分やリンカーから固定化のためなどのための延ばされた枝などに、放射性元素を導入したり、化学発光又は蛍光を発する分子種を導入したりするなどして、標識化して使用することもできる。なお、測定手段としての標識化は、検出対象のＤＮＡやＲＮＡなどの核酸部分の標識化によることもできる。さらに、本発明のミスマッチ塩基認識分子の適当な位置においてポリスチレンなどの高分子材料と直接又はアルキレン基などを用いて結合させて、これを固定化して使用することもできる。
【００５９】
また、上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子は、低分子有機化合物であるため、上記（１）で述べた通常の有機合成法により適宜製造することができる。
【００６０】
（２−１）本発明にかかる擬似的塩基対形成方法、安定化方法、安定化剤
本発明にかかる擬似的塩基対形成方法は、上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対が存在するために安定なヘアピン構造のような２本鎖構造をとることができない１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の正常な塩基対を形成することができない塩基の対（ミスマッチの塩基対）を安定化させて、安定な擬似的な塩基対を形成させる方法である。
【００６１】
また、本発明にかかる安定化方法は、上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対が存在するために安定なヘアピン構造のような２本鎖構造をとることができない１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の正常な塩基対を形成することができない塩基の対（ミスマッチの塩基対）を安定化させる方法であり、本発明にかかる安定化剤は、上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対が存在するために安定なヘアピン構造のような２本鎖構造をとることができない１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の正常な塩基対を形成することができない塩基の対（ミスマッチの塩基対）を安定化させるものである。
【００６２】
本発明にかかる擬似的塩基対形成方法、安定化方法、および安定化剤には、上記した一般式（１）で表される化合物の１種又は２種以上をそのまま使用してもよいし、適当な担体と共に使用することもできる。また、標的細胞に特異的に作用するように、標的細胞に親和性を有する物質で修飾して使用することもできる。さらに、使用状況を計測するために適当なマーカーで修飾して使用することもできる。
【００６３】
上記１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖としては、ｍＲＮＡやｒＲＮＡなどの全体が１本鎖のものであってもよいし、その一部においてヘアピン構造のような２本鎖部分を有するものであってもよいし、末端が平滑端でない２本鎖ＤＮＡの末端部分の１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖であってもよい。
【００６４】
例えば、真核細胞における染色体の末端部分であるテロメア領域においては、その末端の数十塩基が１本鎖の状態にあり、この部分を本発明における１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖として使用することができる。例えば、ヒトのテロメア配列における１本鎖部分において、ヘアピン構造を形成するのに必要な相補的な配列はＴＡの部分しかなく、図１に示すように、この「ＴＡ」の部分において相補鎖を形成してもその前後において、Ｇ−Ｇミスマッチなどの塩基のミスマッチが連続して生じることになる。
【００６５】
ここで、本発明にかかる擬似的塩基対形成方法を用いることによって、このテロメア配列の１本鎖部分における、ミスマッチとなっているＧ−Ｇミスマッチ、及び／又はＧ−Ｔミスマッチに、擬似的な塩基対を形成させることができる。これによって、このテロメア配列の１本鎖部分において安定なヘアピン構造を形成させることが可能となる。
【００６６】
（２−２）本発明にかかる酵素活性阻害方法、酵素活性阻害剤
本発明にかかる酵素活性阻害方法、および酵素活性阻害剤は、テロメアの末端のように、１本鎖の状態のオリゴヌクレオチド鎖において、通常の状態では生起しない擬似的な塩基対を形成させることにより、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性を阻害するものである。
【００６７】
相補鎖を合成する酵素の活性を阻害できるのであれば、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖のどの部分に擬似的な塩基対を形成させてもよい。例えば、プライマー領域や伸長反応が進行する領域であってもよい。また、相補鎖を合成する酵素としてはＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡ合成酵素であってもよいし、ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡ合成酵素であってもよいし、さらに逆転写酵素であってもよい。
【００６８】
また、本発明にかかる酵素活性阻害方法、酵素活性阻害剤には、上記した一般式（１）で表される化合物の１種又は２種以上をそのまま使用してもよいし、適当な担体と共に使用することもできる。また、標的細胞に特異的に作用するように、標的細胞に親和性を有する物質で修飾して使用することもできる。さらに、使用状況を計測するために適当なマーカーで修飾して使用することもできる。
【００６９】
また、上記「１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖」としては、上記（２−１）に記載のものを用いることができる。ここで、ヒトテロメアの構造、特に１本鎖の部分が通常はどのような構造となっているのかということは充分には解析されてきていないが、ヘアピン構造のような形態や四重鎖構造（クアドプレックス）のような形態をしていると考えられている。しかし、上記構造においても、このような構造を安定に保つために必要な充分な塩基対を形成することはできず、テロメラーゼなどの作用により簡単に１本鎖構造に戻ることができ、テロメラーゼにより末端のテロメアの伸長反応が進行することになる。
【００７０】
しかし、本発明にかかる酵素活性阻害方法、酵素活性阻害剤により、テロメアの末端部分に、本発明のオリゴヌクレオチドに結合し得る分子を添加することによって、通常はミスマッチである塩基対においても（例えば、Ｇ−Ｇミスマッチ）、擬似的に塩基対を形成させることができ、一部の塩基対により形成されているヘアピン構造や四重鎖構造（クアドプレックス）を当該擬似的な塩基対の形成により酵素が作用できない程度に安定な構造にすることができる。
【００７１】
したがって、オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性を阻害することができる。
【００７２】
（２−３）本発明にかかる医薬組成物
本発明にかかる医薬組成物は、塩基対のミスマッチにより安定な２本鎖又は４重鎖の構造をとることができない１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖において、当該ミスマッチ部分に一般式（１）で表される分子を用いて「擬似的な塩基対」を形成させて、安定な２本鎖又は４重鎖の構造を形成させて、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖が有する機能、例えばその相補鎖を合成する酵素による相補鎖の合成などを阻害することにより、当該１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖の機能に起因する各種の疾患を治療、予防及び／又は処置することができるものである。
【００７３】
また、本発明の医薬組成物としては、前記した一般式（１）で表される化合物の１種又は２種以上をそのまま使用してもよいし、適当な担体と共に使用することもできる。担体としては薬学的に許容される担体であればよい。本発明の医薬組成物は、経口又は非経口投与することができる。
【００７４】
また、上記「１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖」としては、上記（２−１）に記載のものを用いることができる。例えば、ヒトテロメアの場合、本発明の医薬組成物を用いることによって、テロメアの末端部分における、通常はミスマッチである塩基対においても（例えば、Ｇ−Ｇミスマッチ）、擬似的に塩基対を形成させることができ、一部の塩基対により形成されているヘアピン構造や四重鎖構造（クアドプレックス）を当該擬似的な塩基対の形成により酵素が作用できない程度に安定な構造にすることができる。そして、その結果としてテロメラーゼによるテロメア末端の伸長反応を阻害することができ、テロメアの伸長が行われない細胞はやがて増殖の寿命が尽きることになる。その結果、ガン細胞も通常細胞と同様に増殖が停止して死滅することになる。
【００７５】
（２−４）本発明にかかる不対塩基対検出同定方法、不対塩基対検出同定試薬本発明にかかる不対塩基対検出同定方法、不対塩基対検出同定試薬は、塩基対のミスマッチ部分においてバルジ塩基と同様な塩基対を形成し、しかもこれらのバルジ認識分子が２本鎖を形成しているＤＮＡやＲＮＡの鎖の中に比較的安定に取り込まれることにより、ハイブリダイズしている核酸の中で塩基対がミスマッチを生じている箇所を簡便に特定し得るものである。
【００７６】
本発明の不対塩基対検出同定方法、不対塩基対検出同定試薬に用いる、化合物としては、不対塩基対の位置や量を特定するために、上記した一般式（１）で表される化合物の１種又は２種以上を、検出または計測するために適当なマーカーで修飾して使用することが好ましい。具体的には、上記化合物分子中の適当な位置に、例えばリンカー部分やリンカーから固定化のためなどのための延ばされた枝などに、放射性元素を導入したり、化学発光又は蛍光を発する分子種を導入したりするなどして、標識化して使用することもできる。なお、測定手段としての標識化は、検出対象のＤＮＡやＲＮＡなどの核酸部分の標識化によることもできる。さらに、本発明のミスマッチ塩基認識分子の適当な位置においてポリスチレンなどの高分子材料と直接又はアルキレン基などを用いて結合させて、これを固定化して使用することもできる。さらに、標的細胞に特異的に作用するように、標的細胞に親和性を有する物質で修飾して使用することもできる。
【００７７】
以上の説明では、主にＧ−Ｇミスマッチの場合を具体的に説明してきたが、一般式（１）で表される化合物の塩基認識部位Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの部分を他の塩基と対を形成できるものに代えることにより、Ｔ（チミン）−Ｇ（グアニン）ミスマッチ、Ｔ（チミン）−Ｔ（チミン）ミスマッチ、Ｔ（チミン）−Ｃ（シトシン）ミスマッチ、Ａ（アデニン）−Ｇ（グアニン）ミスマッチ、Ｃ（シトシン）−Ｃ（シトシン）ミスマッチ、Ａ（アデニン）−Ａ（アデニン）ミスマッチ、またはＡ（アデニン）−Ｃ（シトシン）ミスマッチ等についても同様な手法により行うことができる。さらに、Ｕ（ウラシル）−Ｔ（チミン）ミスマッチ、Ｕ（ウラシル）−Ｃ（シトシン）ミスマッチ、Ｕ（ウラシル）−Ｇ（グアニン）ミスマッチについても、同様な手法により行うことができる。
【００７８】
なお、本明細書において使用している「擬似的な塩基対」というのは、天然に存在する塩基の対とは異なる塩基の対であるという意味であり、塩基対の強度を意味するものではない。また、本明細書において使用される「正常な塩基対」とは天然に存在する塩基の対であって、Ｇ（グアニン）−Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）、またはＡ（アデニン）−Ｕ（ウラシル）の塩基対をいう。
【００７９】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８０】
【実施例】
〔１〕ヒトのテロメア配列に結合し得る化合物の合成
まず、ヒトのテロメア配列中の１本鎖ＤＮＡ部分における、不対塩基対部分に特異的に結合し得る化合物、すなわち、上記構造式（３）で表される化合物を合成した。
【００８１】
具体的な合成スキームを図３に示す。具体的な方法は、以下のように行った。まず、２５％  のグルタルアルデヒド水溶液に食塩を加え、クロロホルムで抽出、乾燥後濃縮することによりグルタルアルデヒドを調製した。ナフチリジンダイマー（化合物１）（１１０  ｍｇ）のメタノール溶液に酢酸数滴を加えｐＨ  ５とした。この溶液にグルタルアルデヒド（１２  ｍｇ）を加え、続いて水素化シアノホウ素ナトリウム（１８．７  ｍｇ）を加え室温で１０分反応させた。反応混合物を水−クロロホルムで分配し、有機層を乾燥後濃縮した。粗生成物を、分取ＴＬＣを使って精製し、ビスナフチリジンダイマー（化合物２、構造式（３））を白色固体として得た（３４．５  ｍｇ）。
【００８２】
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ，  ４００  ＭＨｚ）  ｄ  ＝  ８．１０  （ｄ，  ４Ｈ，  Ｊ  ＝  ８．８  Ｈｚ），  ７．８３  （ｄ，  ４Ｈ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ），  ７．８３  （ｄ，  ４Ｈ，  Ｊ  ＝  ８．８  Ｈｚ），  ７．１３  （ｄ，  ４Ｈ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ），  ２．７９  （ｔ，  ８Ｈ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ），  ２．５９  （ｓ，  １２Ｈ），  ２．５８  （８Ｈ），  ２．５３  （ｔ，  ４Ｈ，  Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ），  １．６７  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４４  （ｍ，  ２Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤ３ＯＤ，  １００  ＭＨｚ）  ｄ  ＝  １７４．１，  １６３．７，  １５５．０，  １５４．９，  １３９．６，  １３８．２，  １２２．４，  １１９．４，  １１５．５，  ５５．２，  ５０．４，  ３５．５，  ２７．４，  ２６．５，  ２５．０．
〔２〕構造式（３）で示される化合物の解析
次に、上記〔１〕で合成し精製して得た構造式（３）で示される化合物の解析を行った。具体的には、ヒトテロメア配列ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列を持つ一本鎖ＤＮＡ  ｄ（ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡ）の融解温度（Ｔｍ）を、ナフチリジンダイマー（１）とビスナフチリジンダイマー（２）とで比較した。
【００８３】
具体的な実験条件は、  ｄ（ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡ）（５  ｍＭ，  ｓｔｒａｎｄ  濃度）の食塩（１００  ｍＭ）を含むカコジル酸バッファー（ｐＨ  ７．０）溶液に、ナフチリジンダイマー（化合物１）を３０  ｍＭ、もしくはビスナフチリジンダイマー（化合物２）を１５  ｍＭ加え、温度変化に対する２６０ｎｍの吸収変化を測定し、変曲点から融解温度（Ｔｍ）を算出した。
【００８４】
既にテロメラーゼによる伸張阻害が確認されているナフチリジンダイマー（化合物１）を加えた場合の融解温度は６３．６℃であったが、ビスナフチリジンダイマー（化合物２）ではさらに融解温度が上昇し、７２．１℃であった。また、化合物１，２を加えない場合、融解温度は測定限界（４℃）以下であった。このことは、ビスナフチリジンダイマー（化合物２）が、ナフチリジンダイマー（化合物１）に比べ強くヒトテロメア配列に結合していることを示すものであり、その結果として、テロメラーゼに対するより強い伸張阻害が期待される。
【００８５】
【発明の効果】
以上のように、一般式（２）で表される化合物は、不対塩基対、特に連続して存在するＧ−Ｇミスマッチに特異的、かつ強力に結合することができるという効果を奏する。この性質により、種々の応用が可能である。すなわち、本発明にかかる方法により、一般式（１）で表される化合物を用いて、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖に擬似的な塩基対を形成させることにより、当該１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖中に比較的安定な２本鎖又は４本鎖の構造を簡便に形成させることができるという効果を奏する。１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖中にこのような比較的安定な構造を形成させることにより、当該１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖が有する機能を阻害することができ、例えば、染色体の末端におけるテロメア領域の伸長反応を阻害することができ、当該１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖が有する機能に起因する各種の疾患、例えばガンなどの治療、予防、処置に有用となるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】１本鎖のテロメア配列におけるヘアピン構造の形成、およびその際の相補的な配列関係を模式的に示した図である。
【図２】上記構造式（３）で表されるビスナフチリジンダイマーの合成スキームを示す図である。
【図３】ヒトテロメア配列ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列の融解温度（Ｔｍ）に対する、ナフチリジンダイマー（化合物１）およびビスナフチリジンダイマー（化合物２）の影響を調べた結果を示す図である。
【図１】
2004262828.tif 000009
【図２】
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【図３】
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