(57)【要約】【課題】新たな抗腫瘍剤を提供を目的とする。【解決手段】ＩＬ−２３遺伝子の投与により抗腫瘍効果を発揮し、あるいはＩＬ−２３遺伝子導入腫瘍細胞の投与により著しい抗腫瘍効果が惹起され腫瘍特異的な獲得免疫が生じることから、ＩＬ−２３遺伝子投与あるいはＩＬ−２３遺伝子導入腫瘍細胞投与が、癌治療を行う上で安全かつ効果的な手段となり、他の治療法との併用をはじめとして一段と優れた癌治療の方法となる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）遺伝子を有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項２】
ＩＬ−２３遺伝子が、ＩＬ−２３遺伝子を発現し得るウイルスベクターあるいは非ウイルスベクターの形態にある請求項１の抗腫瘍剤。
【請求項３】
腫瘍に直接投与するための請求項１または２の抗腫瘍剤。
【請求項４】
ＩＬ−２３遺伝子が導入された細胞を有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項５】
細胞が、細胞分裂能を欠落された腫瘍細胞である請求項４の抗腫瘍剤。
【請求項６】
腫瘍細胞が、治療しようとする腫瘍と同じ腫瘍の細胞である請求項５の抗腫瘍剤。
【請求項７】
細胞が免疫担当細胞である請求項４の抗腫瘍剤。
【請求項８】
抗腫瘍免疫応答を活性化して腫瘍を治療するための請求項１から７のいずれかの抗腫瘍剤。
【請求項９】
ＩＬ−２３遺伝子が、ＩＬ−２３と同様の薬理作用を有するＩＬ−２３の変異体をコードする遺伝子である請求項１から８のいずれかの抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ＩＬ−２３遺伝子あるいはＩＬ−２３遺伝子を導入した細胞を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。更に詳細には、ＩＬ−２３遺伝子を発現し得るウイルスベクターあるいは非ウイルスベクター、あるいはＩＬ−２３遺伝子が導入された細胞で分裂能を欠落した腫瘍細胞またはＩＬ−２３遺伝子が導入された免疫担当細胞を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。本発明の抗腫瘍剤は、従来の手術等のがん治療との併用あるいは単独で使用し、生体の細胞性免疫応答を高め、直接的な腫瘍縮小効果、遠隔転移巣、あるいはがん治療後の再発予防等に広く応用でき得るものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来のがん治療は生体への侵襲が強く、本来生体が備わっている抵抗力（免疫力）を著しく低下せしめ、ひいては長期的な予後の改善に寄与しない場合が有ることが知られている。抗癌剤による化学療法や放射線療法は骨髄機能に傷害を与え、生体防御反応を低下させ日和見感染を起しうることはしばしば経験するところであり、この結果がん細胞に対する抗腫瘍免疫応答も同様に低下する。また、手術侵襲自体も各種免疫反応を抑制し、手術を契機として微少転移巣の拡大がみられることも少なくない。また、がん患者ではいくつかの理由により、免疫系が腫瘍の攻撃に立ち至らない「免疫寛容」に陥り、本来腫瘍を攻撃すべき免疫系の能力が抑制されていることが知られている。したがって、この担がん状態における免疫寛容、各種治療後に惹起される免疫抑制状態を打破することが、現在の免疫応答強化に基づくがん治療にとって大きな課題である。
【０００３】
上記の問題を解決する手段として、免疫応答の各段階において作用するサイトカイン分子を利用することによって、生体の免疫応答を操作しようとする試みが行われている。その一つが組換えサイトカインを人体に投与する方法であり、他の一つが遺伝子そのものを投与する遺伝子治療である（非特許文献１および非特許文献２）。サイトカイン分子は一般に半減期が短くまた生体におけるクリアランスが高いため、血中濃度の維持が難しく、また過剰投与による有害事象もあることから、組換えサイトカインを直接体内に投与する方法は著しい制限をうける。したがって体外における免疫担当細胞の培養に利用されることはあっても、人体への直接投与による抗腫瘍効果を期待することはできないのが現状である。それに対して、腫瘍細胞にウイルスやリポソーム脂質製剤等の利用、あるいは超音波や電気的穿孔法等物理的手法による方法で、容易に外来遺伝子を導入できることから、腫瘍細胞にサイトカイン遺伝子を導入し、この細胞よりサイトカインを分泌させることによって抗腫瘍効果を惹起させようとする試みなどがあり、これらはいわゆる遺伝子治療の範疇に入るものである。
【０００４】
この治療方法では、腫瘍局所からサイトカインが持続的に分泌され、腫瘍に集積する細胞群が直接活性化される可能性があることから、組換え蛋白の投与よりも抗腫瘍効果が高まると想定されうる。また、実際にがん細胞に作用し抗腫瘍効果に関与するのは、腫瘍特異性を有する細胞傷害性Ｔ（キラーＴ）細胞や、非特異的なナチュラルキラー細胞であることから、これまで使用されたサイトカインは、これらの細胞の活性化と増殖に係わるものが大部分を占めている。
【０００５】
近年一部の腫瘍で腫瘍抗原ペプチドが同定され、免疫応答を利用したがん治療の可能性が確かに示唆されている。この治療のエフェクター細胞であるキラーＴ細胞の誘導には、抗原提示細胞である樹状細胞が抗原を獲得し、適切に活性化される必要がある（非特許文献３）。従来より、ＩＬ−１２が活性化樹状細胞より分泌され、タイプＩヘルパーＴ細胞の誘導をはじめ、抗腫瘍効果の惹起に重要な役割を果たすことが知られていたが、最近になって、この樹状細胞より分泌される新規サイトカインＩＬ−２３が同定された（非特許文献４）。ＩＬ−２３（ｐ１９分子＋ｐ４０分子）はＩＬ−１２（ｐ３５分子＋ｐ４０分子）とｐ４０分子が共有する２量体で、ｐ１９サブユニットとｐ３５サブユニットのアミノ酸配列の相同性が高いことなど、相互に構造が類似していることが明らかになっている。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，  １０；１８０−１９９  １９９２
【非特許文献２】
Ｔｅｐｐｅｒ  ＲＩ，  Ｍｕｌｅ  ＪＪ，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  ５；１５３−１６４，  １９９４
【非特許文献３】
Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  Ｊ，  Ｓｔｅｉｍａｎ  ＲＭ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２；２４５−２５２，  １９９８
【非特許文献４】
Ｏｐｐｍａｎｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３；７１５−７２５，  ２０００
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来よりがん治療に実際に応用された組換えサイトカインは、ＩＬ−２、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）などのサイトカインであり、いずれも明確な治療効果を発揮しているとは言いがたい状況である。また、直接遺伝子を導入して抗腫瘍効果をみる臨床試験研究は開発段階にあり、未だその臨床効果における治療成績は得られていない。
そこで本発明では、これまで使用されてきたサイトカインと異なり、免疫応答の初期相に焦点をあて、抗腫瘍効果を惹起するキラーＴ細胞誘導の必須条件である樹状細胞の活性化に注目し、この活性化にともなって分泌されるＩＬ−２３の遺伝子導入細胞が強い抗腫瘍効果を発揮することを見い出し、本発明を完成させた。すなわち、ＩＬ−２３はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてメモリーＴ細胞の増殖と活性化、Ｔ細胞よりのＩＦＮ−γの分泌を引き起こすことが報告されているが、実際に樹状細胞の活性化に伴って分泌され腫瘍特異的な獲得免疫をｉｎ  ｖｉｖｏに惹起すること、さらにＴ細胞を欠く免疫不全のヌードマウスにヒト腫瘍を移植する系においても、ＩＬ−２３は抗腫瘍効果を発揮することを明らかにした。
従って、本発明は、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）遺伝子を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。
また、本発明は、ＩＬ−２３遺伝子が導入された細胞を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
ＩＬ−２３は、ＩＬ−１２を構成するサブユニットであるｐ４０分子と、ＩＬ−１２を構成する他のサブユニットであるｐ３５分子と相同性の高いｐ１９分子とからなる、樹状細胞から分泌されるサイトカインである（非特許文献４参照）。本発明で用いるＩＬ−２３遺伝子は、例えば、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するヒトｐ１９分子をコードする、配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子、および配列番号２に示すアミノ酸配列を有するヒトｐ４０分子をコードする、配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子からなり、ヒトＩＬ−２３蛋白質を発現できる遺伝子である。
また、ＩＬ−２３遺伝子としては、ＩＬ−２３と同様の薬理作用を有するＩＬ−２３の変異体をコードする遺伝子を用いることもできる。このような変異体をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加したアミノ酸配列であってヒトｐ１９分子と同様の薬理作用を有するヒトｐ１９分子の変異体をコードする遺伝子、および配列番号２に示すアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加したアミノ酸配列であってヒトｐ４０分子と同様の薬理作用を有するヒトｐ４０分子の変異体をコードする遺伝子からなる遺伝子を挙げることができる。また、配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子とストリジェントな条件でハイブリダイズしヒトｐ１９分子と同様の薬理作用を有するヒトｐ１９分子の変異体をコードする遺伝子、および配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子とストリジェントな条件でハイブリダイズしヒトｐ４０分子と同様の薬理作用を有するヒトｐ４０分子の変異体をコードする遺伝子から遺伝子を挙げることができる。ここでいうストリジェントな条件とは、例えば、６×ＳＳＰＥ、２×デハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液で６５℃、１２時間反応させる条件下でサザンハイブリダイゼーションを行なうことが挙げられる。
上記した遺伝子は、配列表に示したヒトｐ１９分子およびヒトｐ４０分子の遺伝子の塩基配列に基づきＰＣＲ法を利用する周知の方法により得ることができる。これらの方法は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。また、上記した変異体をコードする遺伝子は、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法あるいは通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができ、具体的には上記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ等の基本書を参考にして行うことができる。
【０００９】
本発明では、このようなＩＬ−２３遺伝子は、通常、ＩＬ−２３蛋白質を発現できるウイルスベクターあるいは非ウイルスベクターの形態で用いられる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターが代表的なものである。具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスを挙げることができる。これらのうち、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスを用いた場合よりもはるかに高いことから、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
非ウイルスベクターとしては、哺乳動物の生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターであってもよく、例えばｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）やｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００，  １９９１）などの発現ベクターが挙げられる。
これらのベクターに発現可能なように上記遺伝子を挿入することにより、本発明の抗腫瘍剤を調製することができる。これらの非ウイルスベクターおよびウイルスベクターの調製法、投与法などは既に当業者に公知であり、例えば、別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、１９９６；別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、１９９７；日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９などが参考とされる。
【００１０】
これらのＩＬ−２３遺伝子が発現可能なように挿入されたウイルスベクターあるいは非ウイルスベクターは、そのままの形態で、あるいは医薬的に許容できる通常使用されている賦形剤とともに、溶液、懸濁液、ゲル等の形態に製剤化したのちに投与することができる。投与形態としては、腫瘍患者の腫瘍病巣に対して、あるいは腫瘍の種類に対応した予想転移部位に対して、局所注射などにより投与することができる。また、通常の静脈内、動脈内等の全身投与により投与することもできる。投与量は、患者の症状、年齢、性別、投与経路、剤型などによって異なるが、一般に、成人では一日当たりＩＬ−２３遺伝子の重量として、通常、約１０μｇから５００ｍｇである。
【００１１】
本発明では、上記したＩＬ−２３遺伝子を、患者に投与する前に、細胞に導入して該細胞がＩＬ−２３蛋白質を発現できるように形質転換した後に、この細胞を腫瘍患者に投与することもできる。このような細胞としては、腫瘍細胞あるいは免疫担当細胞を挙げることができる。腫瘍細胞としてはいずれでもよく、例えば、大腸癌細胞、膵癌細胞、腎癌細胞、メラノーマ細胞、乳癌細胞、扁平上皮癌細胞、移行上皮癌細胞、肉腫、神経膠腫細胞などが挙げられる。特に、治療しようとする腫瘍と同じ腫瘍の細胞が好ましく、また、同種の腫瘍細胞、即ちヒトに適用する場合にはヒトの腫瘍細胞が好ましく、特に同種同系の腫瘍細胞が好ましい。免疫担当細胞としては、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、あるいは抗原提示細胞をはじめ末梢血中のすべての有核細胞などが挙げられる。また、同種の免疫担当細胞、即ちヒトに適用する場合にはヒトの免疫担当細胞が好ましく、特に同種同系の免疫担当細胞が好ましい。
【００１２】
腫瘍細胞にＩＬ−２３遺伝子を導入するには、ＩＬ−２３遺伝子を含む上記したウイルスベクター、非ウイルスベクターにより導入することができる。例えば、ＬＸＳＮ（Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ，  Ｒｏｓｍａｎ  ＧＪ，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７；９８０−９９０，  １９８９）、ＭＧＦ、α−ＳＣＧ、ＰＬＪ、ｐＥｍ（特表平６−５０３９６８号公報）などのレトロウイルスのクローニング部位に、発現可能なように挿入し、次いでレトロウイルスをパッケージング細胞に導入し、培養して目的とするＩＬ−２３遺伝子を導入された細胞を採取し、この細胞の培養上清を用いて、腫瘍細胞を感染させることにより、腫瘍細胞にＩＬ−２３遺伝子を導入することができる。ＩＬ−２３遺伝子が導入された腫瘍細胞は、通常、Ｘ線などの放射線照射等により細胞分裂能を欠落させた後に、投与される。
免疫担当細胞にＩＬ−２３遺伝子を導入するには、ＩＬ−２３遺伝子を含む上記したウイルスベクター、非ウイルスベクターにより導入することができる。例えば、ヒト５型アデノウイルス由来のＡｄｅｘ１（Ｓａｉｔｏ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｏｌ．，  ５４，  ７１１−７１９，  １９８５）などのアデノウイルスベクターのクローニング部位にＩＬ−２３遺伝子を発現可能なように挿入して、得られるアデノウイルスベクターを用いて通常の方法により免疫担当細胞に導入することができる。
【００１３】
これらのＩＬ−２３遺伝子が導入された腫瘍細胞あるいは免疫担当細胞は、そのままの形態で、あるいは医薬的に許容できる通常使用されている賦形剤とともに、溶液、懸濁液、ゲル等の形態に製剤化したのちに投与することができる。投与形態としては、腫瘍患者の腫瘍病巣に対して、あるいは腫瘍の種類に対応した予想転移部位に対して、局所注射などにより投与することができる。また、通常の静脈内、動脈内等の全身投与により投与することもできる。投与量は、患者の症状、年齢、性別、投与経路、剤型などによって異なるが、一般に、成人では一日当たり腫瘍細胞あるいは免疫担当細胞の個数として、通常、約１０５から１０９個である。
【００１４】
本発明によれば、ＩＬ−２３遺伝子あるいはＩＬ−２３遺伝子を導入した腫瘍細胞または免疫担当細胞を投与することにより、抗腫瘍免疫応答を活性化して、抗腫瘍効果を発揮し、腫瘍を治療し、腫瘍転移を抑制することができる。また、ＩＬ−２３遺伝子を導入した腫瘍細胞を投与することにより、腫瘍特異的に抗腫瘍免疫応答を活性化することができる。更には、免疫不全の患者に対しても抗腫瘍効果を発揮することができる。
【００１５】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１
活性化樹状細胞より分泌されるＩＬ−２３の量とＩＬ−１２の量の比較
マウス骨髄よりＴ、Ｂ細胞、マクロファージ等を抗体を用いて除去した後、培養デッシュ非付着性細胞をＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦ（各自２０ｎｇ／ｍｌ，  ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）添加培地で１０日間培養し、樹状細胞を調整した。この細胞の表面マーカーをセルソーターを用いて分析したところ、主要組織適合抗原クラスＩＩ分子やＣＤ８６等の活性化マーカーが弱陽性であり、未熟な樹状細胞の定義にあてはるものであることを確認した。
この細胞（６ｘ１０５／２４穴プレート）をＣＤ４０ｌｉｇａｎｄ遺伝子導入肺がんＡ１１細胞（Ａ１１／ＣＤ４０Ｌ）（２ｘ１０５／２４穴プレート）と２４時間共培養すると、樹状細胞のＣＤ８６マーカー等が上昇し活性化されることが判明した。このときその培養上清中にｐ４０サブユニット分子がＥＬＩＺＡ法（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製）により検出されたが、コントロールとして用いたＦａｓＬｉｇａｎｄ遺伝子導入Ａ１１細胞（Ａ１１／ＦａｓＬ）と共培養した樹状細胞からは全く検出されなかった。（図１）。ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてこの細胞群における各サイトカイン遺伝子の発現を検討したところ、ＩＬ−２３のサブユニットであるｐ１９、ＩＬ−１２のサブユニットであるｐ３５のＲＮＡ発現が共に検出された（図２）。一定量のＲＮＡより作成したｃＤＮＡを希釈してＲＴ−ＰＣＲをおこなう定量法により、このＩＬ−２３ｐ１９の発現量は従来より抗腫瘍効果があるとされているＩＬ−１２  ｐ３５の発現量よりも多いものであることが判明した（図３）。
すなわち、抗腫瘍効果のエフェクター細胞の誘導の初期相において必須の役割を果たす活性化樹状細胞からは、ＩＬ−２３の方がＩＬ−１２よりも分泌量が多く、このことはＩＬ−２３のほうがＩＬ−１２よりも重要である可能性を示唆している。
【００１６】
実施例２
ＩＬ−２３遺伝子導入細胞の確立
ＢＡＬＢ／ｃマウスに移植した皮下腫瘍のＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によって、完全長の配列番号３に示す塩基配列を有するｐ１９ｃＤＮＡおよび配列番号４に示す塩基配列を有するｐ４０ｃＤＮＡを単離し、これをレトロウイルスベクターＬＸＳＮ（Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ，  Ｒｏｓｍａｎ  ＧＪ，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７；９８０−９９０，  １９８９）のクローニング部位（Ｅｃｏ  ＲＩ／Ｂａｍ  ＨＩ）にｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）（Ｄｕｋｅ  ＧＭ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６６：１６０２−１６０９，  １９９２）を用いて挿入した。したがって、５’ＬＴＲの下流にｐ１９／ＩＲＥＳ／ｐ４０の順で遺伝子が並び、ｐ１９、ｐ４０共に５’ＬＴＲによって転写が行われることになる。
このＤＮＡをパッケージング細胞Ｐｓｉ−２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  ＡＴＣＣ）にリポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて導入後、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）添加培地で選択し、その培養上清とポリブレン（８μｇ／ｍｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いてさらにＰＡ３１７細胞（ＡＴＣＣ）に遺伝子導入をおこない、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）添加培地で選択し、ＰＡ３１７細胞培養上清中のレトロウイルスを得た。
このレトロウイルスをマウス大腸癌細胞（Ｃｏｌｏｎ  ２６）に感染させ、ＩＬ−２３遺伝子導入細胞のクローン化を行った（樹立細胞：Ｃｏｌｏｎ  ２６／ＩＬ−２３＃１，  ＃４，  ＃９，  ＃１２）。この遺伝子導入細胞のｐ１９，  ｐ３５，  ｐ４０遺伝子の発現と（代表的クローンのノザンブロット解析結果：図４）、培養上清中に分泌ｐ４０分子が存在することを確認した（分泌量はいずれのクローンも０．８−１．１ｎｇ／ｍｌ／１ｘ１０６／４８時間）。また腫瘍抗原の提示に重要な主要組織適合抗原のＨ−２Ｋ／Ｈ−２Ｄ発現が、親株と大差ないこと、さらに遺伝子導入細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖も親株と同一であることを確認した。
【００１７】
実施例３
ＩＬ−２３遺伝子導入細胞の抗腫瘍効果
２種類のＣｏｌｏｎ  ２６／ＩＬ−２３クローン（＃１，  ＃９）１ｘ１０６個を同系マウスＢＡＬＢ／ｃの皮下に接種したところ、腫瘍は一旦生着するものの、時間経過とともに全例退縮し、最終的に腫瘍は完全に拒絶された（図５）。このときコントロールであるベクターＤＮＡ導入細胞、遺伝子未導入の親株細胞は腫瘍を形成し、この接種マウスは死亡した。また、この抗腫瘍効果は他のクローン（＃４，  ＃１２）５ｘ１０５個を接種しても同様であった（図６）。また、Ｃｏｌｏｎ  ２６（１ｘ１０６個）を同系マウスの腹腔内に投与するとマウスは全例２０日以内に死亡したが、Ｃｏｌｏｎ  ２６／ＩＬ−２３＃９あるいは＃１２を同数（１ｘ１０６個）腹腔内投与した場合、大多数のマウスは４０日を越えて生存した（χ２＝３．５，  ｄｆ＝１，  Ｐ＝０．０３７；  ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ，  Ｐ＝０．０４６）。すなわちＩＬ−２３遺伝子導入によって著しい抗腫瘍効果が惹起された。
Ｃｏｌｏｎ  ２６／ＩＬ−２３＃９とＣｏｌｏｎ  ２６を１：９の比率で混和して（総細胞数１ｘ１０６個）同系マウスの皮下に接種すると、腫瘍は形成されたが、その増殖は親株のみを接種した場合（総細胞数１ｘ１０６個）に比較して、有意に遅延していた（Ｐ＜０．０５）（図７）。すなわち、ＩＬ−２３分泌細胞が腫瘍局所に投与されれば抗腫瘍効果が惹起されることが示された。
【００１８】
実施例４
ＩＬ−２３遺伝子導入細胞による治療効果
同系マウスの腹側皮下にＣｏｌｏｎ  ２６（１ｘ１０６個）を接種し、他方の腹側にＣｏｌｏｎ  ２６／ＩＬ−２３＃９（１ｘ１０６個）を接種すると、Ｃｏｌｏｎ  ２６／ＩＬ−２＃９腫瘍は拒絶され、さらに反対側のＣｏｌｏｎ  ２６腫瘍の増殖は、Ｃｏｌｏｎ  ２６腫瘍のみを接種したマウスに比較して、有意に遅延していた（図８）。すなわち、ＩＬ−２３遺伝子導入細胞の投与は遠隔に存在する親株の腫瘍に対しても十分な免疫応答を惹起し、治療効果を有することが判明した。
【００１９】
実施例５
ＩＬ−２３遺伝子導入細胞接種による腫瘍特異的獲得免疫の成立
ＩＬ−２３遺伝子導入Ｃｏｌｏｎ  ２６腫瘍を拒絶したマウスに対して、最初の腫瘍接種より６０日後に、致死量（１ｘ１０６個）のＣｏｌｏｎ  ２６細胞を接種しても、マウスには腫瘍が形成されず、マウスは１２０日以降も長期生存した（表１）。しかし、Ｃｏｌｏｎ  ２６／ＩＬ−２３を拒絶したマウスにＣｏｌｏｎ  ２６とは同系マウス由来だが異なる腫瘍ＲＬｍａｌｅ−１を致死量（１ｘ１０６個）接種すると、腫瘍は形成され大部分のマウスは死亡した（表１）。すなわち、腫瘍へのＩＬ−２３遺伝子導入により惹起された免疫応答により、Ｔ細胞を中心とする腫瘍特異的獲得免疫の成立したことが判明した。
【００２０】
【表１】
2004262797.tif 000002
【００２１】
実施例６
ＩＬ−２３遺伝子導入細胞接種後のＩＦＮ−γ産生
Ｃｏｌｏｎ  ２６／ＩＬ−２３＃９を接種し、腫瘍が退縮しつつあるマウス由来の脾臓細胞（１ｘ１０７／ｍｌ）と、５０Ｇｙの放射線処理したＣｏｌｏｎ  ２６細胞（１ｘ１０６／ｍｌ）と２４時間培養すると、その培養上清中に抗腫瘍効果に係わるＩＦＮ−γが大量に分泌されていた（表２）。しかし放射線処理したＲＬｍａｌｅ−１と培養した場合、分泌されるＩＦＮ−γは僅かであり、腫瘍未接種のナイーブなマウス由来の脾臓細胞との培養ではＩＦＮ−γは産生されなかった（表２）。したがって、ＩＬ−２３産生細胞の接種により、その腫瘍特異的なキラーＴ細胞が誘導されていることが示唆された。
【００２２】
【表２】
2004262797.tif 000003
【００２３】
この事実を確認するため、Ｃｏｌｏｎ  ２６／ＩＬ−２３＃９を拒絶したマウスの脾細胞を抗アシアロＧＭ１抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体と補体で処理し、それぞれナチュラルキラー細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去した細胞群について、ＩＦＮ−γ産生を検討した（図９）。放射線処理したＣｏｌｏｎ  ２６細胞と共培養させた場合、抗ＣＤ８抗体処理をおこなった脾細胞群におけるＩＦＮ−γ産生は著しく低下したことから、ＩＬ−２３によって誘導される抗腫瘍効果はＣＤ８陽性のキラーＴ細胞によることが確認された。
【００２４】
実施例７
免疫不全状態におけるＩＬ−２３遺伝子導入細胞の抗腫瘍効果
Ｔ細胞を欠くＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにＣｏｌｏｎ  ２６／ＩＬ−２３＃９（１ｘ１０６個）を接種した場合、ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔなＢＡＬＢ／ｃマウスに接種した場合と異なり、腫瘍は形成された（図１０）。すなわち、ＩＬ−２３遺伝子導入によって腫瘍が拒絶されるにはα／βＴ細胞の関与が必須の条件であること判明した。また、Ｃｏｌｏｎ  ２６／ＩＬ−２３＃９腫瘍の増殖は、親株をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに接種して生着した腫瘍の増殖に比較して有意に遅延していた（Ｐ＜０．００１、図１０）。したがって、ＩＬ−２３遺伝子導入による抗腫瘍効果は、α／βＴ細胞が存在しない免疫不全状態においても観察された。
【００２５】
ヒト膵がん細胞（ＡｓＰＣ−１）に実施例２で示した方法と同様な手法により、ＩＬ−２３遺伝子を発現させたクローンを確立した（ＡｓＰＣ−１／ＩＬ−２３＃１０、＃６）。この細胞はｐ１９、ｐ４０遺伝子を発現し（図１１）、ＡｓＰＣ−１／ＩＬ−２３＃１０細胞は培養上清中にｐ４０分子を２ｎｇ／ｍｌ／５ｘ１０５／４８時間分泌する。この細胞を３５Ｓ−メチオニン／システインで代謝的にラベルをして、抗Ｐ４０抗体で免疫沈降を行った結果、ｐ１９＋ｐ４０複合体であるＩＬ−２３が培養上清中に分泌されていることを確認した。またｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖、クラスＩ主要組織適合抗原（ＨＬＡ−Ａ，  Ｂ，  Ｃ）の発現も、遺伝子導入細胞と親株とでは変わらなかった。
この細胞を１ｘ１０６個ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に接種すると、その腫瘍増殖は親株腫瘍（１ｘ１０６個接種）の増殖に比較して遅延していた（図１２）。さらにＡｓＰＣ−１／ＩＬ−２３＃１０細胞をＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞を欠くＳＣＩＤマウスに投与すると、抗腫瘍効果は観察されなかった（図１３）。
したがって、この場合の抗腫瘍効果は、γ／δＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞であることが推定された。またこのＡｓＰＣ−１／ＩＬ−２３＃１０を接種したヌードマウスの脾細胞（２ｘ１０７個）を、５０Ｇｙの放射線処理したＡｓＰＣ−１細胞（２ｘ１０６）と５日間培養すると、ナイーブなマウスあるいは親株腫瘍を接種したマウス由来の脾細胞を培養した場合に比べて、ＡｓＰＣ−１細胞に対する細胞傷害活性が有意に高く検出された（図１４）。またほぼ同様な条件で２４時間培養した上清中にＩＦＮ−γが含まれていたが、５０Ｇｙ放射線処理したヒト肺がん細胞ＱＧ−５６と共に培養した場合の分泌ＩＦＮ−γ量は少なかった（表３）したがってヒト腫瘍を用いた実験でも、α／βＴ細胞を欠くヌードマウスにおいてＩＬ−２３遺伝子導入細胞は抗腫瘍効果を惹起し、細胞傷害活性を誘導しうることが明かとなった。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
【発明の効果】
ＩＬ−２３遺伝子の腫瘍への遺伝子導入、ＩＬ−２３遺伝子導入細胞の投与により著しい抗腫瘍効果が惹起され腫瘍特異的な獲得免疫が生じることから、本発明のＩＬ−２３遺伝子導入、ＩＬ−２３遺伝子導入細胞はがん治療を行う上で安全かつ効果的な手段となり、他の治療法との併用をはじめとして一段と優れたがん治療の方法を提供することができる。
【００２８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＣＤ４０ｌｉｇａｎｄ刺激によって樹状細胞よりｐ４０サブユニットが分泌されることを示すグラフである。
【図２】図２は、ＣＤ４０ｌｉｇａｎｄ刺激によって樹状細胞よりｐ１９、ｐ３５サブユニットが発現することを示すＲＴ−ＰＣＲ法の図である。ＭｉｇはＩＦＮ−γ誘導モノカイン、ＧＡＰＤＨはグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの略称で、ＧＡＰＤＨは解析したｃＤＮＡ量が一定であることを示すコントロールである。
【図３】図３は、ＣＤ４０ｌｉｇａｎｄ刺激によって活性化された樹状細胞より、ｐ１９サブユニットがｐ３５サブユニットより多く分泌されることを示したＲＴ−ＰＣＲ法の図である。一定量のｃＤＮＡを希釈して鋳型として使用している。
【図４】図４は、ＩＬ−２３遺伝子導入Ｃｏｌｏｎ  ２６細胞の代表的なクローンにおけるｐ１９、ｐ４０サブユニットの発現をノザンブロット法にて示す図である。ＥＦ−１αは使用したＲＮＡ（１５μｇ）が等しくブロットされていることを示すコントロールである。
【図５】図５は、ＩＬ−２３遺伝子導入Ｃｏｌｏｎ  ２６細胞（１ｘ１０６）をＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に接種後、その腫瘍体積を計測したもので、抗腫瘍効果が惹起されていることを示す図である。
【図６】図６は、ＩＬ−２３遺伝子導入Ｃｏｌｏｎ  ２６細胞（５ｘ１０５）をＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に接種後、その腫瘍体積を計測したもので、抗腫瘍効果が惹起されていることを示す図である。
【図７】図７は、ＩＬ−２３遺伝子導入Ｃｏｌｏｎ  ２６細胞（１ｘ１０５）と親株（９ｘ１０５）を混和して接種した場合、その腫瘍体積の増加は親株（１ｘ１０６）のみを接種した場合より低下していることを示す図である。
【図８】図８は、親株のＣｏｌｏｎ  ２６細胞（１ｘ１０６）を一側のＢＡＬＢ／ｃマウス腹部の皮下に、ＩＬ−２３遺伝子導入Ｃｏｌｏｎ  ２６細胞（１ｘ１０６）を対側の皮下に接種後、親株腫瘍体積を計測したもので、ＩＬ−２３遺伝子導入Ｃｏｌｏｎ  ２６細胞接種によって抗腫瘍効果が惹起されていることを示す図である。
【図９】図９は、ＩＬ−２３遺伝子導入Ｃｏｌｏｎ  ２６細胞（１ｘ１０６）を拒絶したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞を抗アシアロＧＭ１抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体と補体で処理し、放射線処理後のＣｏｌｏｎ  ２６あるいはＲＬ  ｍａｌｅ−１細胞と共培養して、その培養上清中に分泌されたＩＦＮ−γ産生量を示した図である。
【図１０】図１０は、ＩＬ−２３遺伝子導入Ｃｏｌｏｎ  ２６細胞（１ｘ１０６）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に接種後、その腫瘍体積を計測したもので、抗腫瘍効果が惹起されていることを示す図である。
【図１１】図１１は、ＩＬ−２３遺伝子導入ＡｓＰＣ−１細胞の代表的なクローンにおけるｐ１９、ｐ４０サブユニットの発現をノザンブロット法にて示す図である。ＥＦ−１αは使用したＲＮＡ（１５μｇ）が等しくブロットされていることを示すコントロールである。
【図１２】図１２は、ＩＬ−２３遺伝子導入ＡｓＰＣ−１細胞（１ｘ１０６）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に接種後、その腫瘍体積を計測したもので、抗腫瘍効果が惹起されていることを示す図である。
【図１３】図１３は、ＩＬ−２３遺伝子導入ＡｓＰＣ−１細胞（１ｘ１０６）をＳＣＩＤマウスの皮下に接種後、その腫瘍体積を計測したもので、抗腫瘍効果が惹起されていないことを示す図である。
【図１４】図１４は、未処理のヌードマウス、あるいはＡｓＰＣ−１細胞またはＩＬ−２３遺伝子導入ＡｓＰＣ−１細胞（１ｘ１０６）を接種したヌードマウスの脾細胞をエフェクター細胞とし、ＡｓＰＣ−１細胞をターゲット細胞としたときの、細胞傷害活性を５１Ｃｒ放出法にて検討した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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