(57)【要約】【課題】カルボキシ基を有する複素環化合物を穏和な条件で安定・簡便に、かつ選択性よく高収率で得ることができる複素環カルボン酸誘導体の製造方法および新規な複素環カルボン酸誘導体を提供する。【解決手段】下記式（１）【化１】2004262819.tif 000016（式（１）中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素、水酸基、アルキル基等を表すか、または互いに結合してヘテロ原子を含んでもよい環を形成してもよい。）で示される化合物に、アンモニアの存在下、アンモニア−リアーゼまたは該アンモニア−リアーゼを含む組成物を作用させることを特徴とする下記式（２）【化２】2004262819.tif 000017（式（２）中、Ｒ１、Ｒ２は、前記と同じ意味を表す。）で示される複素環カルボン酸誘導体の製造方法および該製法により得られる新規な複素環カルボン酸誘導体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2004262819.tif 000011
（式（１）中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素、水酸基、炭素数１〜６個の直鎖または分岐のアルキル基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基、ハロゲン原子または−ＮＲ３Ｒ４（Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４個の直鎖または分岐のアルキル基を表す。）を表し、またＲ１、Ｒ２は、互いに結合してヘテロ原子を含んでもよい炭素数３〜７個の環を形成してもよい。Ｒ１、Ｒ２が環を形成する場合、２以上の不飽和結合を有する環であってもよく、環を構成する１または２以上の炭素原子が置換基を有していてもよい。）で示される化合物に、アンモニアの存在下、アンモニア−リアーゼまたは該アンモニア−リアーゼを含む組成物を作用させることを特徴とする下記式（２）
【化２】
2004262819.tif 000012
（式（２）中、Ｒ１、Ｒ２は、前記と同じ意味を表す。）で示される複素環カルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項２】
下記式（３）
【化３】
2004262819.tif 000013
（式（３）中、Ｒ５〜Ｒ８は、互いに独立に水素、水酸基、炭素数１〜６個の直鎖または分岐のアルキル基、メトキシ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基、ハロゲン原子または−ＮＲ９Ｒ１０（Ｒ９、Ｒ１０はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４個の直鎖または分岐のアルキル基を表す。）を表す。）で示される化合物に、アンモニアの存在下、アンモニア−リアーゼまたは該アンモニア−リアーゼを含む組成物を作用させることを特徴とする下記式（４）
【化４】
2004262819.tif 000014
（式（４）中、Ｒ５〜Ｒ８は、前記と同じ意味を表す。）で示されるイソキノリン誘導体の製造方法。
【請求項３】
Ｒ５〜Ｒ８が、いずれも水素である請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
アンモニア−リアーゼが、微生物由来であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
アンモニア−リアーゼが、植物由来であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
アンモニア−リアーゼが、動物由来であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
アンモニア−リアーゼが、微生物、動物または植物由来のアンモニア−リアーゼ遺伝子により形質転換された形質転換微生物由来であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
下記式（４）で示されるイソキノリン誘導体。
【化５】
2004262819.tif 000015
（式（４）中、Ｒ５〜Ｒ８は、互いに独立に水素、水酸基、炭素数１〜６個の直鎖または分岐のアルキル基、メトキシ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基、ハロゲン原子または−ＮＲ９Ｒ１０（Ｒ９、Ｒ１０はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４個の直鎖または分岐のアルキル基を表す。）を表す。）
【請求項９】
Ｒ５〜Ｒ８が、いずれも水素である請求項８に記載のイソキノリン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素の作用によりアクリル酸誘導体にアンモニアを付加し、対応する複素環カルボン酸誘導体を得る製法および新規な複素環カルボン酸誘導体に関する。複素環カルボン酸誘導体は、医薬、農薬、その他精密化学品の合成原料として有用である。特に、イソキノリン誘導体は、抗菌剤骨格や、アルカロイドや神経伝達物質周辺の医薬合成に有用である。
【０００２】
【発明の技術的背景】
窒素を骨格に含む複素環は、核酸や補酵素、ビタミン類など、様々な生体物質、生理活性物質に見出される構造である。また生体内での相互作用をねらい、ピリジン環、ピロール環、イミダゾール環、インドール骨格やキノリン・イソキノリン骨格などの複素環構造が、多くの医薬、農薬の部分構造に取り入れられていることは周知である。複素環化合物はまた、多くの化合物合成の出発原料、またその求電子性から反応触媒としても有用である。またこうした有用な構造をもつ化合物を人為的に合成すべく、古くから多くの有機合成反応が精力的に検討されてきた。たとえばピリジン誘導体を得る方法として、β−カルボニル化合物にアンモニアの存在下アルデヒドを作用させるＨａｎｔｚｃｈの方法（非特許文献１参照）、３−ブテン−１−オンまたはその誘導体に臭素化アセトニルピリジニウムを作用させるＫｒｏｈｎｋｅの方法（非特許文献２参照）など、またキノリン誘導体を得る方法としてはアルデヒド類の存在下アニリンにピルビン酸を作用させる方法Ｄｏｅｂｎｅｒ−ｖｏｎ  Ｍｉｌｌｅｒ反応（非特許文献３参照）、同じくアニリンにケト酸エステルを作用させるＣｏｎｒａｄ−Ｌｉｍｐａｃｈの反応（非特許文献４参照）、やＫｎｏｒｒの合成法（非特許文献５参照）、ニトロベンゼン、硫酸酸性下アニリンにグリセロールを作用させるＳｋｒａｕｐの反応（非特許文献６参照）など、またイソキノリン類を得る方法として、フェニルエチルアセトアミドを五酸化リン存在下加熱するＰｉｃｔｅｔ−Ｇａｍｓの反応（非特許文献７参照）、フェニルエチルアミンに還元下アルデヒドを作用させるＰｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒの反応（非特許文献８参照）などは代表的に知られるものである。古典的手法のみならず、比較的最近もなお、新しい手法が提案されており、複素環化合物の有用性とともに、新たな複素環合成技術への需要も根強い。
【０００３】
化合物に、複素環構造を導入する方法としては、複素環化合物を出発原料とするほか、上記のごとき各種の複素環形成反応を利用する方法が考えられる。しかし、複素環化合物を出発原料とする方法は、最終の構造が出発原料により限定される問題がある。また縮合環化反応を用いる方法では、原料物質中に、縮合反応に供するべき活性な官能基を安定に導入し、なおかつ縮合反応の前段まで、分子間反応を避け安定に保つ必要がある。しかし、環化反応に必要な、活性な含窒素基は元来、その活性の高さから副反応による消費を避けることが困難であり、収率が低下するだけでなく、複雑な分離精製を要する工程とならざるを得ない。また、目的物が、環上に官能基を有するような場合、特にアミンに活性なケト基や不飽和結合、また含窒素環の形成反応に競合するアミノ基を導入したい場合には、環化反応と競合しないよう、厳密な反応条件の制御や保護基の導入など、煩雑な工程が要求される。また環化反応の手法によっては、高温や強アルカリ・強酸、無水、還元条件など、過酷な条件、制御が困難な条件を要求する場合もあり、製法を煩雑にする要因となっている。
【０００４】
このような状況下、穏和な条件で安定・簡便に、かつ選択性よく高収率で複素環構造を形成する反応方法が求められていた。
本発明者らは、医薬、農薬、その他精密化学品の合成原料として有用な含窒素複素環化合物、特に、構造中にアミノ基、カルボキシ基を共に有する、下記式（２）
【０００５】
【化６】
2004262819.tif 000002
【０００６】
（式（２）中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素、水酸基、炭素数１〜６個の直鎖または分岐のアルキル基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基、ハロゲン原子または−ＮＲ３Ｒ４（Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４個の直鎖または分岐のアルキル基を表す。）を表し、またＲ１、Ｒ２は、互いに結合してヘテロ原子を含んでもよい炭素数３〜７個の環を形成してもよい。Ｒ１、Ｒ２が環を形成する場合、２以上の不飽和結合を有する環であってもよく、環を構成する１または２以上の炭素原子が置換基を有していてもよい。）で示される構造を有する物質、また抗菌剤の骨格、アルカロイドや神経伝達物質分野の研究に有用である、下記式（４）
【０００７】
【化７】
2004262819.tif 000003
【０００８】
（式（４）中、Ｒ５〜Ｒ８は、互いに独立に水素、水酸基、炭素数１〜６個の直鎖または分岐のアルキル基、メトキシ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基、ハロゲン原子、−ＮＲ９Ｒ１０（Ｒ９、Ｒ１０はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４個の直鎖または分岐のアルキル基を表す。）を表す。）で示される構造を有するイソキノリン誘導体の合成を検討した。しかし通常知られる有機合成反応によっては、環形成後の環上へのアミノ基、カルボキシル基の位置特異的な導入方法がなく、またあらかじめアミノ基の導入された中間体を閉環する方法も、前述のごとき副反応の制御の問題から、困難であった。
【０００９】
本発明者らは、複素環にかかる様々な知見を元に鋭意研究を行った結果、５−シアノペンタ−２，４−ジエン酸構造を有する前駆体に、アンモニアの存在下、アクリル酸類のα位に選択的にアミノ基を導入する酵素として知られるアンモニア−リアーゼを作用させることにより、簡便に複素環カルボン酸を生成することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
【非特許文献１】
Ａｎｎ．  ２１５，  １，  ７２  （１８８２）
【非特許文献２】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５１，  ８５０（１９８６）
【非特許文献３】
Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ４，  ２５（１９５２）
【非特許文献４】
Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ４，  ３０（１９５２）
【非特許文献５】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３４，  １７０９（１９６９）
【非特許文献６】
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  １，  ２６０，  ２６３（１９７２）
【非特許文献７】
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  １，  ５３９（１９７９）
【非特許文献８】
Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ  ３９，  ９０３（１９９４）
【００１１】
【発明の目的】
本発明は、カルボキシ基を有する複素環化合物を穏和な条件で安定・簡便に、かつ選択性よく高収率で得ることができる複素環カルボン酸誘導体の製造方法を提供することを目的としている。
さらに本発明は、抗菌剤の骨格、アルカロイドや神経伝達物質分野の研究に有用である、新規な複素環カルボン酸誘導体を提供することを目的としている。
【００１２】
【発明の概要】
すなわち、本発明は以下のとおりに要約される。
［１］    下記式（１）
【００１３】
【化８】
2004262819.tif 000004
【００１４】
（式（１）中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素、水酸基、炭素数１〜６個の直鎖または分岐のアルキル基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基、ハロゲン原子または−ＮＲ３Ｒ４（Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４個の直鎖または分岐のアルキル基を表す。）を表し、またＲ１、Ｒ２は、互いに結合してヘテロ原子を含んでもよい炭素数３〜７個の環を形成してもよい。Ｒ１、Ｒ２が環を形成する場合、２以上の不飽和結合を有する環であってもよく、環を構成する１または２以上の炭素原子が置換基を有していてもよい。）で示される化合物に、アンモニアの存在下、アンモニア−リアーゼまたは該アンモニア−リアーゼを含む組成物を作用させることを特徴とする下記式（２）
【００１５】
【化９】
2004262819.tif 000005
【００１６】
（式（２）中、Ｒ１、Ｒ２は、前記と同じ意味を表す。）で示される複素環カルボン酸誘導体の製造方法。
［２］    下記式（３）
【００１７】
【化１０】
2004262819.tif 000006
【００１８】
（式（３）中、Ｒ５〜Ｒ８は、互いに独立に水素、水酸基、炭素数１〜６個の直鎖または分岐のアルキル基、メトキシ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基、ハロゲン原子または−ＮＲ９Ｒ１０（Ｒ９、Ｒ１０はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４個の直鎖または分岐のアルキル基を表す。）を表す。）で示される化合物に、アンモニアの存在下、アンモニア−リアーゼまたは該アンモニア−リアーゼを含む組成物を作用させることを特徴とする下記式（４）
【００１９】
【化１１】
2004262819.tif 000007
【００２０】
（式（４）中、Ｒ５〜Ｒ８は、前記と同じ意味を表す。）で示されるイソキノリン誘導体の製造方法。
［３］    Ｒ５〜Ｒ８が、いずれも水素である［２］に記載の製造方法。
［４］    アンモニア−リアーゼが、微生物由来であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］    アンモニア−リアーゼが、植物由来であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［６］    アンモニア−リアーゼが、動物由来であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［７］    アンモニア−リアーゼが、微生物、動物または植物由来のアンモニア−リアーゼ遺伝子により形質転換された形質転換微生物由来であることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［８］    下記式（４）で示されるイソキノリン誘導体。
【００２１】
【化１２】
2004262819.tif 000008
【００２２】
（式（４）中、Ｒ５〜Ｒ８は、互いに独立に水素、水酸基、炭素数１〜６個の直鎖または分岐のアルキル基、メトキシ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基、ハロゲン原子または−ＮＲ９Ｒ１０（Ｒ９、Ｒ１０はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４個の直鎖または分岐のアルキル基を表す。）を表す。）
［９］    Ｒ５〜Ｒ８が、いずれも水素である［８］に記載のイソキノリン誘導体。
【００２３】
【発明の具体的説明】
以下、本発明の複素環カルボン酸誘導体の製造方法および新規な複素環カルボン酸誘導体について具体的に説明する。
本発明の製造方法では、上記式（１）で示される化合物を原料として、この化合物に、アンモニアの存在下、アンモニア−リアーゼまたは該アンモニア−リアーゼを含む組成物を作用させて上記式（２）で示される複素環カルボン酸誘導体を得ている。
【００２４】
＜原料化合物＞
本発明の反応原料である上記式（１）で示されるアクリル酸誘導体および上記式（３）で示される桂皮酸誘導体は、置換オレフィンの一般的製法として知られるＫｎｏｅｖｅｎａｇｅｌ反応（Ｃｏｍｐ．  Ｏｒｇ．  Ｓｙｎ．  ２，  ３４１（１９９１）等）、また任意の置換基が導入されたアルデヒド化合物に無水酢酸を作用させる、いわゆるパーキン反応による方法（Ａｒｃｈ．  Ｐｈａｒｍ．（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）  ３２７（１０），  ｐ６１９−６２５（１９９４）等）、もしくはピリジン溶媒中、ピペリジンの存在下マロン酸などを作用させる方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  ｐ３５７−３６０（１９３９）等）、ほか種々の改法（Ｓｙｎｔｈ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２９（４），  ｐ５７３−５８１（１９９９）等）により製造することができる。
【００２５】
上記式（１）中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素、水酸基、炭素数１〜６個の直鎖または分岐のアルキル基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基、ハロゲン原子または−ＮＲ３Ｒ４（Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４個の直鎖または分岐のアルキル基を表す。）を表し、またＲ１、Ｒ２は、互いに結合してヘテロ原子を含んでもよい炭素数３〜７個の環を形成してもよい。
【００２６】
Ｒ１、Ｒ２における炭素数１〜６個の直鎖または分岐のアルキル基としては、具体的には、たとえばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、イソヘキシル基が挙げられる。
【００２７】
Ｒ３、Ｒ４における炭素数１〜４個の直鎖または分岐のアルキル基としては、具体的には、たとえばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基が挙げられる。
Ｒ１、Ｒ２が、炭素数３〜７個の環を形成する場合、２以上の不飽和結合を有する環であってもよく、環を構成する１または２以上の炭素原子が互いに独立に水酸基、炭素数１〜４個の直鎖または分岐のアルキル基、メトキシ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基、ハロゲン原子または−ＮＲ１１Ｒ１２（Ｒ１１、Ｒ１２はそれぞれ独立に水素または炭素数１〜４個の直鎖または分岐のアルキル基を表す。）で置換されていてもよい。Ｒ１、Ｒ２が環を形成している式（１）の化合物としては、具体的には、たとえば（４−（５−シアノイミダゾール））−アクリル酸、２’−シアノ桂皮酸、２’，３’−シアノ桂皮酸、２’，４’−シアノ桂皮酸、２’，５’−シアノ桂皮酸、２’，６’−シアノ桂皮酸、（３−（２−シアノピリジン））−アクリル酸が挙げられる。
【００２８】
特に、上記式（１）の化合物のうち、上記式（３）で示される桂皮酸誘導体を原料として、上記式（４）で示される新規なイソキノリン誘導体を製造することができる。具体的な例としては、たとえばフェニルアラニン  アンモニア−リアーゼを用いる場合、出発原料として２’−シアノ桂皮酸、２’，３’−シアノ桂皮酸、２’，４’−シアノ桂皮酸、２’，５’−シアノ桂皮酸、２’，６’−シアノ桂皮酸を用い、それぞれ対応して、１−アミノ−３，４−ジヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、１−アミノ−８−シアノ−３，４−ジヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、１−アミノ−７−シアノ−３，４−ジヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、１−アミノ−６−シアノ−３，４−ジヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、１−アミノ−５−シアノ−３，４−ジヒドロイソキノリン−３−カルボン酸を好適に得ることができる。
【００２９】
＜アンモニア−リアーゼ＞
アンモニア−リアーゼは、動物、植物、微生物など生物界全般に広く存在が知られる酵素である。生体内では通常、フェニルアラニンなどのアミノ酸の代謝に関与しており、アミノ酸のアミノ基を脱離しアクリル酸類に導く反応を触媒している。一方本酵素は、その逆反応、すなわちアクリル酸類のα位に、アンモニアの存在下、アミノ基を導入する反応を触媒することもできる可逆反応酵素であることが知られている。対応する基質、またアミノ基導入反応の生成物の種類により、フェニルアラニン  アンモニア−リアーゼ（ＥＣ  ４．３．１．５）、ヒスチジン  アンモニア−リアーゼ（ＥＣ  ４．３．１．３）、アスパラギン酸  アンモニア−リアーゼ（ＥＣ  ４．３．１．１）、メチルアスパラギン酸  アンモニア−リアーゼ（ＥＣ  ４．３．１．２）等が知られている。これらいずれに関しても、このような環化反応による複素環アミノカルボン酸生成を触媒するという知見はない。
【００３０】
本発明は、５−シアノペンタ−２，４−ジエン酸構造を有する出発物質に、アンモニアの存在下、当該酵素を作用させるのみで複素環アミノカルボン酸が得られる、きわめて簡便な手法であるが、このような反応は、本来のこれら酵素に知られる触媒反応、すなわちアクリル酸類のα位へのアミノ基付加反応のみからでは説明できない現象である。
【００３１】
本発明に用いられるアンモニア−リアーゼの種類には、特に制限はなく、反応基質のカルボキシル基のα位炭素にアミノ基を導入する反応を触媒するものであればよい。目的とする反応原料、生成物に対する基質特異性により、適切な種類のアンモニア−リアーゼを選択することができる。たとえばフェニルアラニン  アンモニア−リアーゼをもつ生物としては、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ、  Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｅｘｅｎｓｉｓ、  Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ、  Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ、  Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ、  Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｕｓ、  Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ、  Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、  Ｐｉｃｈｉａ  ｆａｒｉｎｏｓａ、  Ｐｉｃｈｉａなどの酵母；Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｏｌｏｃａｓｉａｅ、  Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、  Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ、  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、  ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ、  Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｔｕｃｕｍａｎｅｎｓｉｓなどの糸状菌；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ    ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、  ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ    ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ    ｌｉｍｏｎｉｓ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）、ムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ）、  トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、  イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ、Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｈｏｒｔｅｎｓｅ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｋｉｔａｋａｍｉｅｎｓｉｓ  等）、サクランボ（Ｐｒｕｎｕｓ    ａｖｉｕｍ）、キイチゴ（Ｒｕｂｕｓ  ｉｄａｅｕｓ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ    ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、  （Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｅｓ  ｈｕｍｉｌｉｓ）、シャジクソウ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）などの植物が例示される。
【００３２】
ヒスチジン  アンモニア−リアーゼを持つ生物としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍなどのバクテリア；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）などの動物が例示される。
【００３３】
アスパラギン酸アンモニア−リアーゼを持つ生物としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｄａｖｅｒｉｓ、  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅなどのバクテリアが例示される。
メチルアスパラギン酸  アンモニア−リアーゼを持つ生物としては、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍａｌｏｎａｔｃｕｓ、  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ、  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｄａｖｅｒｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉなどのバクテリアが例示される。
【００３４】
また、前記のごとき生物を由来とするアンモニア−リアーゼ酵素遺伝子により形質転換された微生物、微生物の処理物、該微生物により生産されたアンモニア−リアーゼを含む組成物もまた、好適に用いることができる。遺伝子発現に用いる宿主生物は、外来遺伝子を取り込み、発現する方法が知られているものであれば特に制限は無い。このような生物としては、たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属などの細菌；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属などの酵母；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属などの糸状菌を用いることができる。該酵素遺伝子ｃＤＮＡの単離、および該遺伝子を用いた形質転換微生物の作成方法、また該形質転換微生物より該酵素を分取する方法等は公知であり、たとえばＬｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎを用いた事例として  Ｙａｚａｋｉらの報告（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （１９９７）  ，  ６１（１２），  １９９５−２００３）、またＰｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｃｒｉｓｐｕｍを用いた事例としてＷ．  Ｓｃｈｕｌｚらの報告（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ  （１９８９），  ２５８（２），  ３３５−３３８）等があり、多数の事例が知られている。
【００３５】
アンモニア−リアーゼの利用の形態としては、酵素そのものでも、該酵素を含む処理物、組成物でもよい。処理物としては、酵素由来生物体の栽培・培養回収物、生物体の摩砕物、抽出物、これらの固定化物、等を含む。組成物としては、該酵素を含む溶液や製剤を含む。
＜反応機構、反応条件＞
以下、本発明の方法における反応機構および反応条件を説明するが、本発明の範囲は、その反応の原理・機構の知見によりなんら制限されるものではない。
【００３６】
原料である式（１）、（３）の化合物から、アンモニアの存在下、アンモニア−リアーゼまたは該アンモニア−リアーゼを含む組成物を作用させて目的物である式（２）、（４）の化合物を生成する反応は、原料化合物の５−シアノペンタ−２，４−ジエン酸構造への、前記酵素によるアミノ基導入反応、そしてそのアミノ基とシアノ基との分子内縮合反応がいずれもｐＨ１０前後の弱アルカリ性、アンモニアの存在下により好適に生じることにより進行する。シアノ基は通常、アンモニア程度の弱アルカリ性下では、安定に保たれ、共存する他の物質との反応などにより消費されることはない。一方、このような弱アルカリ条件下、アンモニア−リアーゼにより、シアノ基に立体的に近接するようにカルボキシ基のα位にアミノ基が導入されることによりはじめて、穏和な条件下でも比較的進行しやすい分子内反応、すなわち分子内アミノ基−シアノ基間の縮合反応が進行することになる。このように、２段階の反応、すなわち、シアノ基近傍へのアミノ基の導入と、シアノ基−アミノ基間の分子内自動反応が、同一の弱アルカリ条件下、ワンポットで、逐次的に、かつ速やかに進行することより、上記の反応が達せられる。
【００３７】
本発明の酵素反応条件は、選択される酵素や、基質により変化するが、温度は２０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４０℃、ｐＨは概ねｐＨ８．５〜ｐＨ１１の範囲が好ましい。またアンモニア濃度は１Ｍ〜１２Ｍ、更に好ましくは１．５Ｍ〜８Ｍである。当該濃度のアンモニアの影響によりｐＨが前述の範囲を超える場合は、塩酸、硝酸、硫酸、酢酸、炭酸等、各種の無機酸、有機酸を用いて調節することができる。
【００３８】
分子内のシアノ基と、導入されたアミノ基間の分子内反応は、そのための特別な条件設定を要せず、上記の酵素反応条件によりそのまま進行するが、加温することにより促進することもできる。加温の温度は、生じる中間反応物の反応性に応じて任意に決めることができるが、酵素反応に引き続き、中間体の精製や取り上げ等を要せず逐次的に反応できる利点を生かせる範囲としては、前段の酵素反応と同温度から＋５０℃程度までが好ましい。
【００３９】
なお、アンモニア−リアーゼによるアミノ基導入は平衡反応であることが知られる。よって通常、生成物の蓄積により反応速度は低下する。しかし、このような分子内反応が進行した化合物はもはや基質としての酵素のとの相互作用を示さないため、事実上反応系外に除かれる。よって、平衡反応を利用していながら生成物阻害を受けることなく高い転化率で生成物を得ることができる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明の反応は、きわめて簡便かつ高い選択率・原料転化率で含窒素複素環化合物を得られるのみでなく、アンモニアアルカリ性という穏和な弱アルカリ環境下で運用することができることから、不安定・活性な官能基を有する誘導体の合成においても副反応を低減できること、保護基の導入を省略できること、あるいは反応条件の自由度や安全性、環境親和性を高めることができること、など数々の優れた特徴を有し、複素環化学品産業の新規技術として貢献する。
【００４１】
本発明により得られる複素環カルボン酸は、医薬、農薬、その他精密化学品の合成原料として有用である。特に、本発明により得られるイソキノリン誘導体は、抗菌剤骨格や、アルカロイドや神経伝達物質周辺の医薬合成に有用である。
【００４２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
なお実施例において、アンモニア−リアーゼ活性は、０．１Ｍ  ホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５、基質１０ｍＭの条件下、３０℃において、基質化合物より毎分１μｍｏｌｅのアンモニアを遊離する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。
【００４３】
【参考例】２’−シアノ桂皮酸の製造
市販２−シアノベンズアルデヒド２ｇ、マロン酸３ｇを、ピペリジン０．３ｇを含むピリジン３０ｍＬに溶解し、１００℃、５時間の加熱還流ののち、０．１Ｎ塩酸１００ｍＬを加え、生じた白色沈殿を濾別した。濾紙上でさらに５００ｍＬの０．１Ｎ塩酸を通じ洗浄後、残分を乾固、酢酸で再結晶し、１．５ｇの２’−シアノ桂皮酸を得た。
【００４４】
【実施例１】アンモニア−リアーゼ活性微生物による１−アミノ−３，４−ジヒドロイソキノリン−３−カルボン酸の製造
フェニルアラニン  アンモニア−リアーゼ生産菌Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｏｌｏｃａｓｉａｅ  ＩＦＯ６６９８（財団法人  発酵研究所より分譲）を、ポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に接種し、２５℃の恒温槽で７２時間培養した。形成された微生物菌体をかきとり、５００ｍＬ容のバッフル付きフラスコ中の、下記の組成の液体培地１００ｍＬに懸濁した。
［培地組成］
グルコース          １０ｇ
ペプトン              ５ｇ
酵母エキス            ３ｇ
モルトエキス          ３ｇ
Ｌ−フェニルアラニン    ０．５ｇ
蒸留水                １Ｌ    ｐＨ＝６．０
フラスコを、２５℃の恒温回転振盪培養器に設置し、毎分１５０回転、３日間培養した。培養液あたりのフェニルアラニン  アンモニア−リアーゼ活性は約０．１０５Ｕ／ｍＬであった。得られた微生物菌体を、１０，０００ｇの遠心により回収した。培養液と等容の４Ｍアンモニア／炭酸アンモニウム（ｐＨ１０）に懸濁した。菌懸濁液に、２’−シアノ桂皮酸を１％（ｗ／ｖ）相当添加し、３０℃の恒温回転振盪培養器に設置し、毎分１５０回転、４８時間反応した。温度を５５℃まで上げ、更に４８時間反応を継続した後、反応液を逆相ＨＰＬＣに供したところ、原料２’−シアノ桂皮酸のピークは消失しており、保持時間の異なる新たなピークが出現していた。反応ろ液を減圧濃縮後、酢酸エチルにより抽出して乾固した。得られた固形分をメタノールで再結晶し、目的物を得た。  １Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ（ｐｐｍ）：  ３．０２−３．２８（２Ｈ，  ｍ），  ４．２０−４．４１（１Ｈ，  ｍ），  ７．２３−７．６０（４Ｈ，  ｍ）、元素分析：  （Ｃ１０Ｈ１０Ｎ２Ｏ２）  Ｃ    ６３．３％，  Ｈ    ５．２％，  Ｎ    １４．８％，  Ｏ    １６．７％
【００４５】
【実施例２】アンモニア  リアーゼ活性微生物による４−アミノ−６，７−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−カルボン酸の製造
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株を、Ｌ寒天培地に接種し、３０℃の恒温槽で２４時間培養した。形成された微生物菌体をかきとり、５００ｍＬ容のバッフル付きフラスコ中の、Ｌブロス１００ｍＬに懸濁した。培養液あたりのヒスチジン  アンモニア−リアーゼ活性は約０．０５５Ｕ／ｍＬであった。
【００４６】
フラスコを、３０℃の恒温回転振盪培養器に設置し、毎分１５０回転、２４時間培養した。得られた微生物菌体を、１０，０００ｇの遠心により回収し、培養液と等容の４Ｍアンモニア／炭酸アンモニウム（ｐＨ１０）に懸濁した。菌懸濁液に、（４−（５−シアノイミダゾール））−アクリル酸１％（ｗ／ｖ）相当添加し、３０℃の恒温回転振盪培養器に設置し、毎分１２０回転、４８時間反応した。温度を５５℃まで上げ、更に４８時間反応を継続した後、反応液を逆相ＨＰＬＣに供したところ、原料（４−（５−シアノイミダゾール））−アクリル酸のピークが減少し、保持時間の異なる新たなピークが出現していた。反応ろ液を酸性とし、原料を沈殿除去後、減圧濃縮を行い、次いで酢酸エチルにより抽出して乾固した。得られた固形分をメタノールで再結晶し、目的物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ（ｐｐｍ）：  ２．７０−２．９５（３Ｈ，  ｍ），  ７．４２−７．５４（１Ｈ，  ｄ）、元素分析：  （Ｃ７Ｈ８Ｎ４Ｏ２）  Ｃ    ４７．３％，  Ｈ    ４．５％，  Ｎ    ３０．５％，  Ｏ    １７．７％
【００４７】
【実施例３】植物アンモニア−リアーゼによる１−アミノ−７−ニトロ−３，４−ジヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸の製造
フェニルアラニン  アンモニア−リアーゼを有する植物であるキュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）種子を、水で湿らせた濾紙を敷いたシャーレ上で２５℃、７２時間培養し発芽させた。さらに４時間の蛍光灯光照射ののち、約５０ｇの胚軸を収穫した。
【００４８】
得られた胚軸組織を、氷冷下、乳鉢にて摩砕したのち、さらに摩砕物を全量、１ｍＭのグルタチオンを含む０．１Ｍ  ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８．８）  １００ｍｌに懸濁後、２０分間の超音波破砕処理を行った。処理物より、不溶分を、１０，０００ｒｐｍ、１５分の遠心により沈降し、上清を分取した。
得られた抽出液に、氷冷下、撹拌しながら、粉砕した硫酸アンモニウムを３０％飽和となるまで３０分かけて徐々に添加し、溶液を１０，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し沈澱を除去した。得られた上清に同様にして硫酸アンモニウムを７０％飽和となるまで添加し、溶液を１０，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、沈澱を回収した。沈澱を２０ｍｌの０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、１００倍容の同緩衝液中で４℃、２４時間透析した。透析後の溶液２．２ｍｌを粗酵素抽出液として得た。総タンパク質量４２．６ｍｇ（ビウレット法、ウシ血清アルブミンを基準として）、フェニルアラニン  アンモニア−リアーゼとしての比活性は０．０４１Ｕ／ｍｇであった。
【００４９】
得られた粗抽出液０．１ｍｌと、２Ｍ  アンモニア／炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ＝１０）（２Ｍ  アンモニア水と２Ｍ  炭酸アンモニウム水溶液を合わせてｐＨを調整したもの）９．９ｍｌとの混合液に、２’−シアノ−４’−ニトロ桂皮酸を０．５％となるよう添加し、３０℃、２４時間の撹拌により反応を行った。温度を５５℃まで上げ、更に４８時間反応を継続した後、反応液を逆相ＨＰＬＣに供したところ、原料２’−シアノ−４’−ニトロ桂皮酸のピークが減少し、保持時間の異なる新たなピークが出現していた。反応ろ液を酸性とし、原料を沈殿除去後、減圧濃縮を行い、次いで酢酸エチルにより抽出して乾固した。得られた固形分をメタノールで再結晶し、目的物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ（ｐｐｍ）：  ２．９０−３．１８（２Ｈ，  ｍ），  ４．３５−４．４７（１Ｈ，  ｍ），  ７．４０−７．６０（１Ｈ，  ｄ）、８．３０−８．６２（２Ｈ，  ｄ）、元素分析：  （Ｃ１０Ｈ９Ｎ３Ｏ４）  Ｃ    ５０．５％，  Ｈ    ３．８０％，  Ｎ    １８．３％，  Ｏ    ２７．４％
【００５０】
【実施例４】植物アンモニア−リアーゼ形質転換微生物による８−アミノ−５，６−ジヒドロ−［１，７］ナフチリジン−６−カルボン酸の製造
ムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ）の細胞培養、ｃＤＮＡライブラリーの作成およびフェニルアラニン  アンモニア−リアーゼ遺伝子の取得はＹａｚａｋｉらの報告（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （１９９５），  ３６，  １３１９−１３２９；  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （１９９７）  ，  ６１（１２），  １９９５−２００３）に詳細に記載されている。本発明者はこれら既存情報を参考に、いくつかの変更を加えてそれぞれの植物よりフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ遺伝子を取得した。一連の手法は、塩基配列が明らかな全ての植物由来フェニルアラニン  アンモニア−リアーゼに応用可能である。ｍＲＮＡの取得材料としては培養細胞の他、フェニルアラニン  アンモニア−リアーゼ遺伝子発現条件下の植物組織も利用可能である。
（ムラサキｃＤＮＡライブラリの作成）
ムラサキの組織から調整した細胞を、ＬＳ培地（通常生育培地；インドール酢酸１０μＭおよびカイネチン０．１μＭを含む）で一週間、２５℃で培養した。得られた培養細胞を次にＭ９培地（シコニン生成培地；インドール酢酸１０μＭおよびカイネチン０．１μＭを含む）に植え継ぎ、さらに２日間培養した。得られた培養細胞から、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、Ｋｉｔ標準の使用方法に従いｍＲＮＡを調整した。次に得られたｍＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲをＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）とＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマーを用いて行った。生成したＤＮＡ断片の混合物を遺伝子増幅ＰＣＲ鋳型用のｃＤＮＡライブラリーとした。
（フェニルアラニン  アンモニア−リアーゼ遺伝子の取得）
ムラサキに存在する２種のフェニルアラニン  アンモニア−リアーゼ遺伝子のうち、Ｄ８３０７６としてＧｅｎＢａｎｋ，  ＥＭＢＬ等のデータベースに公開されているものについて、その５’末端と３’末端の配列を用いてｐａｌ遺伝子特異的プライマーを作成した。その際、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターに接続できるよう、適当な制限酵素サイトを両端に持つようにプライマーを設計した。
【００５１】
各種プラスミドベクターのマルチクローニングサイトに頻用される制限酵素の中から、適当なもの（フェニルアラニン  アンモニア−リアーゼ遺伝子配列中に切断部位の無いもの）を検索し、５’末端側にＥｃｏＲＩサイト、３’末端側にＳａｌＩサイトを、用いることにした。
プライマーの配列：
配列番号１：５’側（ＥｃｏＲＩサイト付）；ａａｇａａｔｔｃａｔ  ｇｇａａａａｔｇｇａ  ａａｔｇｇの配列を有する２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチド
配列番号２：３’側（ＳａｌＩサイト付）  ；ｔｔｇｔｃｇａｃｔａ  ａｃａｔａｔｔｇｇａ  ａｇａの配列を有する２３ｍｅｒのオリゴヌクレオチド
反応液組成：
鋳型ｃＤＮＡ              ０．５〜２μｇ
プライマー                各１００ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ溶液              各１ｍＭ
１０ｘ反応バッファー      １０μｌ
ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．５Ｕ    計５０μｌ
反応条件：
熱変性                    ９４℃、３０秒
アニーリング              ５５℃、６０秒
伸長                      ７２℃、１２０秒
サイクル数                ２４回
以上のような条件により鋳型ｃＤＮＡ量を数点ふって遺伝子断片増幅を試みたところ、理論的に算出される断片長約２．１ｋｂの断片がほぼ特異的に増幅された。断片をアガロースゲル電気泳動した後抽出・回収して精製した後、増幅に用いたプライマーを用いて塩基配列の解析を行ったところ、既知の配列情報と一致していることが確認できた。
【００５２】
得られた遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動し、抽出・回収した。得られた制限酵素切断サイト付き断片をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断した後、再度アガロースゲル電気泳動し、抽出・回収した。これらの断片をＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩカット後アガロースゲル電気泳動し、抽出・回収したｐＵＣ１８とライゲーションした（図１）。
【００５３】
これらのプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して得られた形質転換体をイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．１ｍＭと０．１％Ｘ  Ｇａｌを含むＬ寒天平板培地に塗布し、３７℃で２４時間培養した。生じたコロニーのうち白色を呈しているものを数個選択し、そのプラスミドを調製し制限酵素切断パターンを確認したところ、目的のプラスミドを持つ形質転換体が複数得られた。
【００５４】
得られた形質転換体一株を、実施例２に記載と同様に培養した。得られた微生物菌体を、１０，０００ｇの遠心により回収し、培養液と等容の４Ｍアンモニア／炭酸アンモニウム（ｐＨ１０）に懸濁した。菌懸濁液に、（３−（２−シアノピリジン））−アクリル酸０．５％（ｗ／ｖ）相当を添加し、３０℃の恒温回転振盪培養器に設置し、毎分１２０回転、４８時間反応した。温度を５５℃まで上げ、更に４８時間反応を継続した後、反応液を逆相ＨＰＬＣに供したところ、原料（３−（２−シアノピリジン））−アクリル酸のピークが減少し、保持時間の異なる新たなピークが出現していた。反応ろ液を酸性とし、原料を沈殿除去後、減圧濃縮を行い、次いで酢酸エチルにより抽出して乾固した。得られた固形分をメタノールで再結晶し、目的物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ（ｐｐｍ）：  ２．２０−２．５４（３Ｈ，  ｍ），  ７．６０−７．８８（２Ｈ，  ｍ）、８．４０−８．６２（１Ｈ，  ｍ）、元素分析：  （Ｃ１０Ｈ９Ｎ３Ｏ４）  Ｃ    ５５．５％，  Ｈ    ４．６％，  Ｎ    ２２．３％，  Ｏ    １７．６％
【００５５】
【配列表】
2004262819.tif 000009
2004262819.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドの構築を示した説明図である。
【図１】
2004262819.tif 000018