(57)【要約】【課題】本発明は、ヒスタミン含有試料からヒスタミンを効率よく抽出し、かつ測定妨害物質を除くことができるヒスタミンの測定法の提供を課題とする。【解決手段】（１）ヒスタミン含有試料とキレート剤とを混合して試料中のヒスタミンを抽出し、次いで抽出物中のヒスタミン量を測定することを特徴とする、ヒスタミンの測定法。（２）ヒスタミン含有試料とキレート剤とを液相中で混合した後、混合物を濾過し、次いで得られた濾液中のヒスタミン量を測定することを特徴とする、ヒスタミンの測定法。（３）ヒスタミン含有試料とキレート剤とを液相中で混合した後、加熱処理し、次いで混合物を濾過し、得られた濾液中のヒスタミン量を測定することを特徴とする、ヒスタミンの測定法。（４）ヒスタミン含有試料からヒスタミンを抽出するための有効成分としてキレート剤を含むことを特徴とする、ヒスタミンの測定用試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスタミン含有試料とキレート剤とを混合して試料中のヒスタミンを抽出し、次いで抽出物中のヒスタミン量を測定することを特徴とする、ヒスタミンの測定法。
【請求項２】
ヒスタミン含有試料とキレート剤とを液相中で混合した後、混合物を濾過し、次いで得られた濾液中のヒスタミン量を測定することを特徴とする、ヒスタミンの測定法。
【請求項３】
ヒスタミン含有試料とキレート剤とを液相中で混合した後、加熱処理し、次いで混合物を濾過し、得られた濾液中のヒスタミン量を測定することを特徴とする、ヒスタミンの測定法。
【請求項４】
濾液中のヒスタミン量を測定する方法が、濾液、ヒスタミンデヒドロゲナーゼおよび発色指示薬を混合して発色させ、次いで発色を検出する方法である、請求項２または３記載の測定法。
【請求項５】
キレート剤が、ＥＤＴＡ　２Ｎａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ，ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，　　　ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）、ＣｙＤＴＡ（ｔｒａｎｓ−１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ），　ＤＰＴＡ−ＯＨ（１，３−Ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＥＤＴＡ−ＯＨ（Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＧＥＤＴＡ（Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＨＤＴＡ（１，６Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ（１，２＝Ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＮＴＡ（Ｎｉｔｒｉｌｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），ＴＴＨＡ（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−ｈｅｘａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）から選択される１または２以上の物質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の測定法。
【請求項６】
ヒスタミン含有試料からヒスタミンを抽出するための有効成分としてキレート剤を含むことを特徴とする、ヒスタミンの測定用試薬
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、食品産業、水産業、食品衛生、医療及び分析機器産業などの広い分野で利用可能な、ヒスタミンの測定法および測定用試薬に関する。より具体的には、ヒスタミンと他の夾雑物質が混在する試料から、ヒスタミンを精度よく抽出して簡便、安価、短時間、かつ高感度に、しかも測定値の信頼性を損なうことなく、ヒスタミンを測定する方法および測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒスタミンは体内で起こるアレルギー反応の化学伝達物質であるため、ヒスタミンを多量蓄積した食品を摂取するとアレルギー様中毒が起こる。その症状は食後数分から数時間で顔面などに発赤が生じ、続いてかゆみ、じん麻疹や湿疹が出、ひどい場合はじん麻疹が全身に広がり気管支炎や血圧降下を起こす危険性を有する。これに対応して食品加工工場や食品衛生監視機関、臨床検査室などにおいてヒスタミン量を簡易且つ迅速に測定することができるヒスタミンの測定法が強く求められていた。
【０００３】
ヒスタミン量の測定法としては、蛍光分析法、薄相クロマトグラフィーやペーパークロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、酵素法、抗原抗体反応法等が知られている。蛍光分析法は、ヒスタミンと蛍光試薬のＯ−フタルアルデヒドとヒスタミンとの縮合作用により蛍光色素をつくり、その蛍光の強さを蛍光分光光度計で測定するものである。また、酵素法では、モノアミンオキシダーゼ固定化膜を被服した酵素電極法（Ｋａｒｕｂｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ．　Ｔｅｃｈｎｌ．　Ｖｏｌ．２、ｐｐ１１７−１２０、１９８０）、微生物由来のヒスタミンオキシダーゼ活性を有する酵素を用いた溶存酸素電極法（特許第２７１７７４５号）、ヒスタミンデヒドロゲナーゼを用いる方法（特開２００１−１５７５９７号）が知られている。
【０００４】
ヒスタミンの測定法では、通常、ヒスタミン含有試料からヒスタミンを抽出し、次いで抽出されたヒスタミン量を種々の方法で測定する。試料には、ヒスタミン以外に測定妨害物質が含まれることが多いため、非特異的反応が起こる場合があった。このため、ヒスタミン含有試料からヒスタミンを効率よく抽出し、かつ測定妨害物質を除くことは重要である。
【０００５】
ヒスタミンの抽出方法としては、トリクロロ酢酸抽出法、メタノール抽出法、中性リン酸塩緩衝液加熱抽出法などが知られている（特開２００１−０９９８０３号公報、食衛誌Ｖｏｌ．３７，Ｎｏ．２，１０９〜１１３頁「酸素センサーによる魚肉ヒスタミン定量法の改良及びＡＯＡＣ法との比較」）。また、特開２００１−１５７５９７号公報には、ヒスタミン含有試料を水、緩衝液などで抽出、濾過した後、ヒスタミンを含有する濾液を得ることが記載されている。試料の状態や採用する測定法の種類によっては、ヒスタミンをその他の測定妨害物質から分離するための抽出操作を複数回行うこともある。例えば、特開２００１−２７２３９５号公報には、血液由来のヒスタミン含有試料を煮沸した後、各種有機溶媒（酢酸エチル、クロロホルム）で抽出操作を行い、ヒスタミンを分離する方法が記載されている。
【０００６】
ところで、これら様々なヒスタミン抽出方法から試料に適した方法を選ぶことは非常に重要である。パルメザンチーズ中のヒスタミンは塩酸による抽出が適しており、メタノール抽出ではほとんど抽出されないとの報告例がある（Ｓ．Ｒ．Ｖａｌｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ．ＡＯＡＣ　Ｉｎｔ．，Ｖｏｌ．８０、Ｎｏ．５、１００６−１０１２　１９９７）。また水はエビ，チョコレート中のヒスタミン抽出には不向きであると思われる報告もある（Ｄ．Ｌ．Ｉｎｇｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ　Ａｇｒｉｃ．Ｖｏｌ３６、４０２−４０６　１９８５）。
【０００７】
以上のように、現在、ヒスタミンの測定法においては、ヒスタミン含有試料からヒスタミンを効率よく抽出し、測定感度を向上させることが求められている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒスタミン含有試料からヒスタミンを効率よく抽出し、かつ測定妨害物質を除くことができるヒスタミンの測定法の提供を課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒスタミンの測定法において、ヒスタミン含有試料とキレート剤とを混合すると、試料中のヒスタミンが効率良く抽出され、かつ試料中の測定阻害物質を効率的かつ汎用的に除去できることを見出した。また、本発明者らは、キレート剤が、以下の効果を有することを見出した。
・ヒスタミン含有試料からヒスタミンを効率的に抽出する効果
・測定阻害物質による測定法への影響を防止する効果
・濾過工程がある場合、濾過速度を向上させる効果
そして、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の測定法および測定用試薬に関する。
（１）ヒスタミン含有試料とキレート剤とを混合して試料中のヒスタミンを抽出し、次いで抽出物中のヒスタミン量を測定することを特徴とする、ヒスタミンの測定法。
（２）ヒスタミン含有試料とキレート剤とを液相中で混合した後、混合物を濾過し、次いで得られた濾液中のヒスタミン量を測定することを特徴とする、ヒスタミンの測定法。
（３）ヒスタミン含有試料とキレート剤とを液相中で混合した後、加熱処理し、次いで混合物を濾過し、得られた濾液中のヒスタミン量を測定することを特徴とする、ヒスタミンの測定法。
（４）濾液中のヒスタミン量を測定する方法が、濾液、ヒスタミンデヒドロゲナーゼおよび発色指示薬を混合して発色させ、次いで発色を検出する方法である、上記（２）または（３）記載の測定法。
（５）キレート剤が、ＥＤＴＡ　２Ｎａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ，ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，　　　ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）、ＣｙＤＴＡ（ｔｒａｎｓ−１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ），　ＤＰＴＡ−ＯＨ（１，３−Ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＥＤＴＡ−ＯＨ（Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＧＥＤＴＡ（Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＨＤＴＡ（１，６Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ（１，２＝Ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＮＴＡ（Ｎｉｔｒｉｌｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），ＴＴＨＡ（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−ｈｅｘａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）から選択される１または２以上の物質である、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の測定法。
（６）ヒスタミン含有試料からヒスタミンを抽出するための有効成分としてキレート剤を含むことを特徴とする、ヒスタミンの測定用試薬
【００１１】
【発明の実態の形態】
１．ヒスタミンの測定法
本発明は、あらゆるヒスタミンの測定法に適用されうる。
本発明は、ヒスタミン含有試料とキレート剤とを混合して試料中のヒスタミンを抽出し、次いで抽出物中のヒスタミン量を測定することを特徴とする、ヒスタミンの測定法である。
本発明でいうヒスタミンにはヒスタミンの塩も含まれる。また、ヒスタミン含有試料としては、ヒスタミンを含有するものであれば、如何なるものでもよく、例えば液状および固形状の食品、尿や血漿などの生体内物質や生体組織などが挙げられる。特に本発明は脂質の多い生の魚介類などには最適に適用できる。
【００１２】
本発明でいうキレート剤とは、金属イオンと結合してキレート化合物を形成する多座配位子を意味する。キレート剤は、金属塩の分離、精製、分析などに用いるほか、洗浄剤、硬水軟化剤、金属イオン除去剤などとして利用されている。本発明で使用できるキレート剤としては、ＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｄｉａｍｉｎｅ　ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）などのアミノカルボン酸系キレート剤やＨＥＤＰ（Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ　ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）などのホスホン酸系キレート剤などがある。また環境中の金属イオン除去剤としては、有機系金属イオン封鎖剤有機系のピロリジン系イオウ化合物、イミン系イオン化合物、カルバミン酸系イオウ化合物などのキレート剤がある。さらに、生体系の金属吸収に関与するクエン酸のような低分子有機酸塩などのキレート剤も使用できる。
【００１３】
本発明では、具体的には、例えば、以下のキレート剤が１または２以上混合して使用できる。
ＥＤＴＡ　２Ｎａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ，ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）、ＣｙＤＴＡ（ｔｒａｎｓ−１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ），　ＤＰＴＡ−ＯＨ（１，３−Ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＥＤＴＡ−ＯＨ（Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＧＥＤＴＡ（Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＨＤＴＡ（１，６Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ（１，２＝Ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＮＴＡ（Ｎｉｔｒｉｌｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），ＴＴＨＡ（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−ｈｅｘａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）。
【００１４】
ヒスタミン含有試料とキレート剤を混合することにより、混合物中にヒスタミンが抽出される。混合はどのような方法でもかまわない。キレートを粉末の状態でヒスタミン含有試料に混合してもかまわないが、取り扱い上、ヒスタミン含有試料とキレート剤とを液相中で混合することが好ましい。この場合、望ましくは、キレート剤を水や緩衝液などの溶媒に溶かしてキレート剤溶液とし、ヒスタミン含有試料と混合する。その後、混合物を濾過し、次いで得られた濾液中のヒスタミン量を測定すればよい。
【００１５】
ヒスタミン含有試料とキレート剤を混合した後に、混合物を振盪あるいは攪拌することにより抽出効率は高まる。
キレート剤溶液を用いて試料を抽出する場合の抽出倍率に関し、より好ましい態様は１０倍以上の希釈を行うことである。特に粉末状の試料については、キレート剤溶液を吸水しヒスタミンがうまく抽出されない可能性もあるため十分な液量で抽出するのが望ましい。
【００１６】
キレート剤溶液のｐＨについては、使用するキレート剤ごとに、本発明効果が認められるｐＨに設定すればよい。しかし、ヒスタミンはアルカリ側では構造上不安定なため、キレート剤溶液をｐＨ８以下にするのが望ましい。
キレート剤の濃度についても特に制限はないが、より好ましい態様は前記キレート剤が５０　ｍＭ以上の濃度で使用する。
【００１７】
ヒスタミン含有試料とキレート剤溶液を混合したのちは、混合物を加熱処理することが望ましい。加熱処理により、ヒスタミンの抽出効率が高まる。この場合は、ヒスタミン含有試料とキレート剤とを液相中で混合した後、加熱処理し、次いで混合物を濾過し、得られた濾液中のヒスタミン量を測定することを特徴とする。好ましい様態としては、沸騰水中で１０〜２０分加熱処理する。加熱温度も特に規制はないが沸騰水などを利用して加熱することが望まれる。なお、ヒスタミン含有試料の種類によっては、特に加熱処理する必要はない場合もある。
加熱処理後、必要により混合物を冷却する。その方法については特に制限はない。扱いやすい程度に試料が冷却できていれば問題はないが好ましくは微生物汚染による抽出液の腐敗防止など考慮して１０℃以下まで冷却する。
【００１８】
本発明においてヒスタミン含有試料とキレート剤を混合した後、必要により固液分離する。固液分離はいずれの方法でもかまわない。望ましくは遠心分離（１００００ｒｐｍ，１０分）あるいは濾紙（Ｎｏ２など）による濾過が良い。
【００１９】
本発明において、ヒスタミンを含む抽出物あるいは濾過工程を経た濾液中のヒスタミン量を測定するための方法に制限はない。ヒスタミン量を測定する方法としては例えば、濾液、ヒスタミンデヒドロゲナーゼおよび発色指示薬を混合して発色させ、次いで発色を検出する方法が挙げられる。
【００２０】
ヒスタミン量の測定法の具体例として、以下▲１▼〜▲３▼の反応試薬の組合せが挙げられる。
▲１▼終濃度０．０２〜２Ｕ／ｍｌのヒスタミンデヒドロゲナーゼ及び１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含有するｐＨ８〜１０の系。
▲２▼終濃度０．２〜２０μＭの電子キャリアー（例えば１−Ｍｅｔｈｏｘｙ　ＰＭＳ）及び１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含有するｐＨ８〜１０の系。
▲３▼終濃度５〜５００μＭのテトラゾリウム系の還元系発色試薬（例えばＷＳＴ−８）を含有する１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含有するｐＨ８〜１０の系。
ヒスタミンデヒドロゲナーゼとしては、ヒスタミンに特異的に作用する特徴があればどのヒスタミン脱水素酵素でも良い。例えば、特開２００１−１５７５７９「ヒスタミンデヒドロゲナーゼおよびその製造法」記載のヒスタミンデヒドロゲナーゼが使用できる。還元型電子キャリアーの制限は無いが、フェナジンメトサルフェートやメルドラブルーなどのテトラゾリウム系の電子キャリアーが使用できる。
発色指示薬についての制限は無いが、望ましくはＭＴＴ、Ｎｉｔｒｏ−ＴＢ、ＷＳＴ−８などのテトラゾリウム系の還元系発色試薬を使用する。
発色を検出する方法についても制限は無いが、分光光度計を利用する方法が望ましい。
【００２１】
２．ヒスタミンの測定用試薬
本発明は、ヒスタミン含有試料からヒスタミンを抽出するための有効成分としてキレート剤を含むことを特徴とする、ヒスタミンの測定用試薬に関する。キレート剤としては、ＥＤＴＡ　２Ｎａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ，ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，　　　ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）、ＣｙＤＴＡ（ｔｒａｎｓ−１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ），　ＤＰＴＡ−ＯＨ（１，３−Ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＥＤＴＡ−ＯＨ（Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＧＥＤＴＡ（Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＨＤＴＡ（１，６Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ（１，２＝Ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），　ＮＴＡ（Ｎｉｔｒｉｌｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），ＴＴＨＡ（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ−　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−ｈｅｘａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）から選択される１または２以上の物質が挙げられる。該測定用試薬には、キレート剤の他、試薬の保存料、ｐＨ安定剤、防腐剤などを含有していてもよい。
【００２２】
【実施例】
次に、本発明の測定法の実施例を示す。しかし，本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【００２３】
＜実施例１＞
（ヒスタミン測定用試薬の調製例）
精製水に以下の３の成分をそれぞれ以下の濃度又は単位で溶解し、３つの成分からなる試薬を調製した。
（１）１００ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）　　　２．４ｍｌ
（２）０．０６ｍＭ　１−Ｍｅｔｈｏｘｙ　ＰＭＳ（電子キャリアー）　０．１ｍｌ
（３）０．５ｍＭ　ＷＳＴ−８（還元型発色剤）　　０．３ｍｌ
【００２４】
＜実施例２＞
（ヒスタミン含有試料に、酵素としてヒスタミンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型発色剤を測定するヒスタミンの測定法）
上記（１）〜（３）の試薬を測定直前に混合することにより、ヒスタミン測定用試薬（反応試薬液）を調製した。
このヒスタミン測定用試薬を用いて既知濃度のヒスタミン測定を行った。
【００２５】
先ず反応試薬液２．８ｍｌにヒスタミンデヒドロゲナーゼ（０．５Ｕ／ｍｌ）を０．１　ｍｌ添加し、続いてヒスタミン標準溶液あるいは検液を０．１ｍｌ加え、３７℃で１５分間作用させた。
反応後、反応液の４６０ｎｍにおける吸光度を分光光度計にて測定し、該吸光度増加量（△ＯＤ）の値を求めた。
【００２６】
＜実施例３＞
（生マグロを用いたＥＤＴＡ　２Ｎａ水溶液加熱抽出によるヒスタミン添加試験）
生マグロ（サンプル）１　ｇに、ヒスタミンを１００　ｐｐｍになるように先に添加し、これをヒスタミン含有試料とした。ヒスタミン含有試料と、水あるいはキレート剤（０．１　Ｍ　　ＥＤＴＡ　２Ｎａ　（ｐＨ８）　）９ｍｌとを混合してヒスタミンを抽出した（混合物中のヒスタミン終濃度は１０　ｐｐｍ）。ついで沸騰水を用いた湯浴にて加熱処理その後冷却し、次いで混合物を濾紙にて濾過し、得られた濾液中のヒスタミン量を測定した。
【００２７】
加熱時間は、１（水抽出のみ）、１０、２０分とした。ヒスタミン測定用試薬の調製およびヒスタミン量の測定法については上記方法で行った。抽出効果（回収率）については、ヒスタミン１０　ｐｐｍ標準液を用いた時の吸光度と各検液を用いた時の吸光度を対比させ百分率で示した。
その結果を表１に示す。０．１Ｍ　ＥＤＴＡ　２Ｎａ水溶液による１０分間の加熱抽出が、最も良いヒスタミン回収率（９０％以上）を示した。水よりも、キレート剤であるＥＤＴＡ　２Ｎａ水溶液の方が、ヒスタミンの抽出効率に優れていることが分かった。
【００２８】
ところで、マグロなどの赤身魚に多量に含まれている中性脂質やリン脂質は、ヒスタミン測定に大きく影響することが考えられる。例えばリン脂質などの極性脂質はヒスタミンと電荷的に結合し、また中性脂質などはミセル構造を形成する際にヒスタミンを取り込み、ヒスタミンの抽出を阻害する。また脂質は濾紙濾過の際に目づまりを起こし、濾過を困難にさせる。ＥＤＴＡ−２Ｎａ水溶液加熱抽出による結果が良好だったのは脂質とヒスタミンの結合や凝集を抑制し上記問題を解決したためと考える。またこの抽出では残渣はヒスタミンを取り込まず、逆に脂質を取り込んで容易に凝集した。このため、濾紙濾過による残渣除去が簡単に行え、得られた濾液は他の抽出方法のものと比べ澄明であった。従ってＥＤＴＡ　２Ｎａ水溶液による加熱抽出は濾過効率を向上させる効果があることがわかった。
【００２９】
【表１】
2004129597.tif 000002
【００３０】
＜実施例４＞
（各生魚を用いたＥＤＴＡ　２Ｎａ水溶液加熱抽出によるヒスタミン添加試験）
メバチマグロ、インドマグロ、イワシ、サバ、カツオ、アジ、サンマの７種類の生魚をサンプルとし、ヒスタミンを１００　ｐｐｍになるように先に添加し、これをヒスタミン含有試料とした。試験方法については、実施例１と同様に行った。なお抽出は水と０．１Ｍ　ＥＤＴＡ　２Ｎａ水溶液（ｐＨ８）を用い、沸騰水における加熱時間を２０分とした。
その結果を表３に示す。いずれの試料も８０％以上の回収率が得られ、このことから、生魚の抽出には０．１Ｍ　ＥＤＴＡ　２Ｎａ水溶液による加熱抽出が効果的であることがわかった。
【００３１】
【表２】
2004129597.tif 000003
【００３２】
＜実施例５＞
（各キレート剤加熱抽出によるヒスタミン添加試験）
様々な５０ｍＭキレート剤（ＥＤＴＡ−２Ｎａのみ５０および１００ｍＭ）を用いて、実施例１または２と同様の方法で、生マグロをサンプルとするヒスタミン添加試験を行った。
ところでこれまで抽出に関する種々の検討で、抽出倍率をこれまでの１０倍から２５倍に変更したことにより抽出が安定し回収率が向上することがわかった。そこで今回は２５倍の抽出倍率で実施した。
【００３３】
つまり生マグロ（サンプル）１　ｇに、ヒスタミンを１００　ｐｐｍになるように先に添加し、これをヒスタミン含有試料とした。ヒスタミン含有試料と、水あるいはキレート剤溶液（５０　ｍＭ　（ｐＨ８））２４ｍｌ　とを混合してヒスタミンを抽出した（混合物中のヒスタミン終濃度４　ｐｐｍ）。ついで沸騰水を用いた湯浴にて２０分加熱処理し、氷冷した後、遠心濾過し、得られた濾液中のヒスタミン量を測定した。
本試験は２度実施した。抽出効果（回収率）については、ヒスタミン４　ｐｐｍ標準液を用いた時の吸光度と各検液を用いた時の吸光度を対比させ百分率で示した。
【００３４】
その結果を表４に示す。今回水加熱抽出では約９０％の回収率であったが、これまでの試験では２０〜７０％と極端に低く検出されることが多く、また回収率のばらつきが目立った。これに対しキレート剤による抽出では回収率が±２０％（８０％〜１２０％）と比較的安定な結果が得られた。また前述のように、キレート剤を用いる場合は濾過スピードが早く、濾過が目詰まりなく行えるのに対し、水加熱抽出では脂質や細かい残渣が濾紙を目詰まりさせるため、濾液を得るのに何度も濾紙を替えなくてはならないことがある。
よって以上のことから、試料の抽出法としては、水よりもキレート剤を用いる方法が優れていると考えられた。ＣｙＤＴＡ以外のキレート剤では、ヒスタミンの回収率は９６〜１１２％であった。従ってキレート剤の多くがＥＤＴＡ　２Ｎａ同様、効率的にヒスタミンを抽出できることが示された。
【００３５】
【表３】
2004129597.tif 000004
【００３６】
【発明の効果】
本発明のヒスタミンの測定法において、ヒスタミン含有試料とキレート剤とを混合すると、試料中のヒスタミンが効率良く抽出され、かつ試料中の測定阻害物質を効率的かつ汎用的に除去できることが示された。また、キレート剤が、以下の効果を有することが示された。
・ヒスタミン含有試料からヒスタミンを効率的に抽出する効果
・測定阻害物質による測定法への影響を防止する効果
・濾過工程がある場合、濾過速度を向上させる効果
本発明は、ヒスタミン含有試料からヒスタミンを効率よく抽出し、かつ測定妨害物質を除くことができるヒスタミンの測定法、および測定用試薬として有用である。