(57)【要約】【課題】水中に希薄に含まれるウイルスの濃縮方法の提供。【解決手段】好ましい態様においては、本発明の方法は、以下のステップ：ＤＥＡＥセルロース充填剤を１〜８０％の容積率でその内に含むカラムを用意し；所定流量の下水放流水を、上記カラムに、上記カラムの下部から上部に向う方向で、通水して、上記水中のＳＲＳＶを上記充填剤に吸着せしめ、ここで、上記流量は、上記充填剤が上記カラム内で流動状態を保持するために十分なものであり；所定量の上記水の通水を停止して、上記カラム内に残存する上記水を廃棄し；上記カラム内に略カラム容量のアルカリ液を入れて、上記充填剤に吸着されたＳＲＳＶを、上記アルカリ液による溶出液として回収して、上記アルカリ液中のＳＲＳＶ濃度を、上記所定量の上記水中のＳＲＳＶ濃度に対して濃縮する、を含む。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中に希薄に含まれるウイルスの濃縮方法であって、以下のステップ：
陰イオン交換能を有する充填剤を１〜９５％の容積率でその内に含むカラムを用意し；
所定流量の上記水を、上記カラムに、上記カラムの下部から上部に向う方向で、通水して、上記水中のウイルスを上記充填剤に吸着せしめ、ここで、上記流量は、上記充填剤が上記カラム内で流動状態を保持するために十分なものであり；
所定量の上記水の通水を停止して、上記カラム内に残存する上記水を廃棄し；
上記カラム内に略カラム容量のアルカリ液を入れて、上記充填剤に吸着されたウイルスを、上記アルカリ液による溶出液として回収して、上記アルカリ液中のウイルス濃度を、上記所定量の上記水中のウイルス濃度に対して濃縮する、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記水が下水処理（放流）水である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスがＳＲＳＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記陰イオン交換能を有する充填剤が、ＤＥＡＥセルロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記容積率が１〜８０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記容積率が１０〜５０％である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アルカリ液がｐＨ９以上の緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アルカリ液が０．５質量％肉エキスを添加した５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．５）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記カラムに通水する前に、前記水中の夾雑物を予め除去するための前ろ過ステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
水中に希薄に含まれるウイルスの検定方法であって、以下のステップ：
陰イオン交換能を有する充填剤を１〜９５％の容積率でその内に含むカラムを用意し；
所定流量の上記水を、上記カラムに、上記カラムの下部から上部に向う方向で、通水して、上記水中のウイルスを上記充填剤に吸着せしめ、ここで、上記流量は、上記充填剤が上記カラム内で流動状態を保持するために十分なものであり；
所定量の上記水の通水を停止して、上記カラム内に残存する上記水を廃棄し；
上記カラム内に略カラム容量のアルカリ液を入れて、上記充填剤に吸着されたウイルスを、上記アルカリ液による溶出液として回収して、上記アルカリ液中のウイルス濃度を、上記所定量の上記水中のウイルス濃度に対して濃縮し；
得られたアルカリ液溶出液に、ポリエチレングリコールを添加して、ウイルスを沈殿分離させ；
上記ウイルスからＲＮＡを抽出し；
ＲＴ−ＰＣＲを行い；
ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行い；
上記各ＰＣＲにより増幅されたウイルスＤＮＡ断片を電気泳動により分離し、電気泳動ゲル上のバンドを可視化して、上記ウイルスの存在を確認し、かつ、バンド強度により上記ウイルスの濃度を推定する、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水中に希薄に含まれるウイルスの濃縮方法に関する。より特に、本発明は、ＤＥＡＥセルロース・カラムを用いた下水処理（放流）水中に希薄に含まれるＳＲＳＶの濃縮方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
魚介類や飲料水に起因する食中毒の病原体として微小球形ウイルス（以下、ＳＲＳＶ（Ｓｍａｌｌ　Ｒｏｕｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ　Ｖｉｒｕｓ）という。）が問題にされている。特に、養殖カキにおいてＳＲＳＶが検出された場合、生カキとしての商品価値が著しく低下し、漁業を主要産業とする地域経済にかなりのダメージを与える。
【０００３】
ＳＲＳＶは、魚介類の体内で増殖することはないと考えられている。したがって、例えば、カキの体内にＳＲＳＶが検出されるということは、下水などを経由してカキの生育水域に入り、カキの摂食行動の結果、カキ体内に濃縮・保持されていることを意味する。そこで、ＳＲＳＶ汚染源である下水放流水中のＳＲＳＶを除去する技術が切望されている。
【０００４】
一般に、ウイルスは、塩素消毒により不活化することは困難であるといわれている。ＳＲＳＶに関しても１０ｍｇ／Ｌの塩素濃度では不活化できないと報告されている。一方、紫外線（ＵＶ）消毒は、ウイルスの遺伝子を光化学的に傷つけるため一般に有効であると考えられている。しかしながら、ＳＲＳＶに関して、ＵＶ消毒の効果を検討した報告はない。
【０００５】
本発明者らは、紫外線、光触媒などを利用してウイルスを分解することによる下水放流水中のウイルス消毒方法及び装置を開発した。当該装置の開発においては、まず、消毒すべき水中に希薄に含まれるウイルスを濃縮し、そしてその後、濃縮液中のウイルスの存在を確認する方法を確立し、かかる方法を使用して、当該方法及び装置の性能評価を実施する必要があった。一般にウイルスが高濃度で含まれる魚介類中のウイルスの検出方法についての報告例は多数あるが、ウイルスが非常に希薄に含まれる水中の、特に夾雑物が多量に含まれる下水放流水中のウイルスを検出する方法についての報告例は少なく、特に、ＳＲＳＶに関する報告は全くない。
【０００６】
以下に列記する非特許文献１は、試料水中に陰イオン交換体であるＤＥＡＥ−セルロースを直接添加（０．０３％）し、水中ウイルスを吸着させ、その後、アニオン系有機凝集剤でセルロースを凝集させ、凝集塊をナイロンメッシュで回収して、ビーフエキストラクト溶液でウイルスを誘出させる方法を、記載している。非特許文献１において使用されたウイルスは弱毒ポリオウイルス１型（Ｌｓｃ，２ａｂ株）である。上記方法は、バッチ処理であるため、大水量の処理に向いていない。また、被験水に応じて凝集剤の最適注入量を適宜検討する必要がある。
【０００７】
以下に列記する非特許文献２は、特殊なグラスウール、ｏｉｌｅｄ　ｓｏｄｏｃａｌｃｉｃ　ｇｌａｓｓ　ｗｏｏｌ（Ｓａｉｎｔ　Ｇｏｂａｉｎ　Ｒ．７２５）を使用した１００〜１０００Ｌのサンプル水中のエンテロウイルスを濃縮する方法を記載している。上記グラスウール・フィルターは、水道水に添加されたいくつかのエンテロウイルス（実験室株又は野生株）及びロタウイルスＳＡ１１の６２〜７５％を回収した。上記方法は、河川水と処理廃水に添加されたポリオウイルスをそれぞれ６２％と５７％回収した。上記方法は、イオン交換体を使用しないので、処理水のｐＨを変更する必要がないという利点があるが、処理流量が小さく、さらに当該特殊なグラスウールの入手が困難であるという欠点をもつ。
【０００８】
以下に列記する非特許文献３は、粒状活性炭（ＧＡＣ）を充填した濾過カラムを通すことにより飲料水サンプルからエンテロウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、及びロタウイルスを同時濃縮する方法を開示している。ｐＨ９．０の溶出液として尿素−アルギニン・ホスフェート・バッファー（ＵＡＰＢ）を、ＧＡＣからの有効な脱着及び溶出のために使用する。塩化マグネシウムによりさらに上記ウイルスを濃縮することにより、核酸抽出、ｃＤＮＡ合成、各ウイルスに特異的なプライマー・セットを用いた合成が可能になる。ポリオウイルス−１を接種した水サンプル１００Ｌにおける上記方法の効率は、上記活性炭ベースのＵＡＰＢ−ＲＴ−ＰＣＲにおいて７４％であった。しかしながら、上記方法のＳＲＳＶへの適用可否については不明である。
【０００９】
以下に列記する特許文献１は、ウイルスに対する抗体を表面に有するウイルス濃縮用材料、及び当該材料を用いるウイルス濃縮方法を、記載している。しかしながら、上記方法においては、分離濃縮対象のウイルス種ごとに抗体を準備する必要があり、また、大水量の水処理には向かない。
【００１０】
以下に列記する特許文献２は、ウイルスを含有する流体よりウイルスを捕捉する方法において、アニオン性基を分子内に有する単量体を１構成成分とした重合体を基材の少なくとも一部に保持させてなるウイルス捕捉体に、該ウイルスを含有する流体を通過させ、該ウイルスを該ウイルス捕捉体に吸着させることを特徴とするウイルス捕捉方法を記載している。上記方法は、従来の方法では捕捉が困難であったポリオウイルスの捕捉率を高めることを目的としており、ｐＨ４〜９の領域においてはポリオウイルスの捕捉率は９０％以上に向上されている。しかしながら、上記方法のＳＲＳＶへの適用可否については不明である。
【００１１】
以下に列記する非特許文献４は、飲料水及び廃水サンプル中のコリファージを、正に帯電した膜フィルター上に吸着させ、尿素−アルギニン・ホスフェートバッファー（ＵＡＰＢ）で溶出させ、再濃縮し、そしてＥｓｃｈｅｒｉａ　ｃｏｌｉ　Ｃ（ＡＴＣＣ　１３７０６）により検出する方法を記載している。上記コリファージの濃縮及び検出のための膜フィルター−ベースのＵＡＰＢ法は、Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆＷａｔｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ中に記載されるビーフエクストラクト及び再濃縮手順並びにコリファージ検出に匹敵する。特に、ファージ力価が非常に低い場合、非特許文献４に記載の方法は、濃縮されたサンプルの全量をテストするため、正に帯電した膜フィルターからのＵＡＰＢの使用により、上記標準法よりも、高いコリファージ回収率を与える。しかしながら、非特許文献４に記載の方法は、被験水中の懸濁成分によりフィルターが目詰まりしやすいという欠点をもち、また、ＳＲＳＶへの適用可否については不明である。
【００１２】
以下に列記する非特許文献５は、環境汚染されたカキを含むＭｏｌｌｕｓｃａｎ　Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ中のＳＲＳＶの検出のためのＮｅｓｔｅｄ逆転写酵素ＰＣＲアッセイ法を記載している。
【００１３】
以下に列記する非特許文献６は、ＳＲＳＶは食品（魚介類）では増殖せず又は毒素を生産せず、食品は単にＳＲＳＶの受動的輸送のための媒体として働くこと、下水が、それが流入する沿岸に生息する魚介類の主要な汚染経路であることなどを記載する、ＳＲＳＶ等に関する総説である。
【００１４】
【非特許文献１】
矢野ら「セルロース吸着・凝集法による水中ウイルス試験方法の検討」水道協会雑誌、「第６０巻、第５号（第６８０号）、第１０〜２３頁（１９９１）
【非特許文献２】
Ｐｈ．　Ｖｉｌａｇｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　”Ｇｌａｓｓ　ｗｏｏｌ　ｆｏｒ　ｖｉｒｕｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｔ　ａｍｂｉｅｎｔ　ｗａｔｅｒ　ｐＨ　ｌｅｖｅｌ”，　Ｗａｔ．　Ｓｃｉ．　Ｔｅｃｈ．　Ｖｏｌ．２７，　Ｎｏ．３−４　ｐｐ．２９９−３０６　（１９９３）
【非特許文献３】
Ｎ．　Ｊｏｔｈｉｋｕｍａｒ　ｅｔ　ａｌ．，　”Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｄｅｖｉｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ，　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｅ　ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　ｆｒｏｍ　ｗａｔｅｒ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｂｙ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｔｉｏｎ”，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　５５　（１９９５）　４０１−４１５
【非特許文献４】
Ｎ．　Ｊｏｔｈｉｋｕｍａｒ　ｅｔ　ａｌ．，　”Ｅｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｉｐｈａｇｅｓ　ｉｎ　ｗａｔｅｒ　ｆｒｏｍ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　ｃｈａｒｇｅｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｆｉｌｔｅｒｓ　ｗｉｔｈ　ｕｒｅａ−ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ”，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　６５　（１９９７）　２８１−２８６
【非特許文献５】
Ｊ．　Ｇｒｅｅｎ，　ｅｔ　ａｌ．，　”Ａ　ｎｅｓｔｅｄ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｍａｌｌ　ｒｏｕｎｄ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｉｎ　ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ　ｍｏｌｌｕｓｃａｎ　ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ”，　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏ．６４，　Ｎｏ．３，　Ｍａｒ，　１９９８，　ｐ．８５８−８６３
【非特許文献６】
Ｈａｚｅｌ　Ａｐｐｌｅｔｏｎ，　”Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｆｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ　ｖｉｒｕｓｅｓ”，　Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　２０００；　５６　（Ｎｏ．１），　１７２−１８３
【非特許文献７】
片山ら（１９９７）ＵＶ照射により不活性化されたＲＮＡファージのＲＴ−ＰＣＲによる定量、環境工学研究論文、３４：８３−９１
【非特許文献８】
北橋智子ら（１９９９）千葉市沿岸の自生カキからのＨＡＶ、ＳＲＳＶ、アストロウイルス遺伝子の検出、感染症学雑誌、７３（６）：５５９−５６４
【特許文献１】
特開２００２−７８４８５号公報
【特許文献２】
特開平５−８４０７１号公報
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
以上、紫外線、光触媒などを利用してウイルスを分解することによる下水放流水中のウイルス消毒方法及び装置の開発において、当該方法及び装置の性能評価のために、消毒すべき水中に希薄に含まれるウイルス、特にＳＲＳＶを濃縮し、そしてその後、濃縮液中の当該ウイルスの存在を確認する方法を確立する必要性が在る。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、上記課題を解決すべく実験を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明の１の態様においては、水中に希薄に含まれるウイルスの濃縮方法であって、以下のステップ：
陰イオン交換能を有する充填剤を１〜９５％の容積率でその内に含むカラムを用意し；
所定流量の上記水を、上記カラムに、上記カラムの下部から上部に向う方向で、通水して、上記水中のウイルスを上記充填剤に吸着せしめ、ここで、上記流量は、上記充填剤が上記カラム内で流動状態を保持するために十分なものであり；
所定量の上記水の通水を停止して、上記カラム内に残存する上記水を廃棄し；
上記カラム内に略カラム容量のアルカリ液を入れて、上記充填剤に吸着されたウイルスを、上記アルカリ液による溶出液として回収して、上記アルカリ液中のウイルス濃度を、上記所定量の上記水中のウイルス濃度に対して濃縮する、
を含む前記方法が、提供される。
【００１８】
前記水は下水処理（放流）水であることができる。また、前記ウイルスはＳＲＳＶであることができる。好ましくは、前記陰イオン交換能を有する充填剤は、ＤＥＡＥセルロースである。前記容積率は、好ましくは、１〜８０％であり、より好ましくは、１０〜５０％である。前記アルカリ液は、ｐＨ９以上の緩衝液であり、好ましくは、０．５質量％肉エキスを添加した５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．５）である。前記カラムに通水する前に、前記水中の夾雑物を予め除去するための前ろ過ステップを含むこともできる。
【００１９】
本発明の他の態様においては、水中に希薄に含まれるウイルスの検定方法であって、以下のステップ：
陰イオン交換能を有する充填剤を１〜９５％の容積率でその内に含むカラムを用意し；
所定流量の上記水を、上記カラムに、上記カラムの下部から上部に向う方向で、通水して、上記水中のウイルスを上記充填剤に吸着せしめ、ここで、上記流量は、上記充填剤が上記カラム内で流動状態を保持するために十分なものであり；
所定量の上記水の通水を停止して、上記カラム内に残存する上記水を廃棄し；
上記カラム内に略カラム容量のアルカリ液を入れて、上記充填剤に吸着されたウイルスを、上記アルカリ液による溶出液として回収して、上記アルカリ液中のウイルス濃度を、上記所定量の上記水中のウイルス濃度に対して濃縮し；
得られたアルカリ液溶出液に、ポリエチレングリコールを添加して、ウイルスを沈殿分離させ；
上記ウイルスからＲＮＡを抽出し；
ＲＴ−ＰＣＲを行い；
ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行い；
上記各ＰＣＲにより増幅されたウイルスＤＮＡ断片を電気泳動により分離し、電気泳動ゲル上のバンドを可視化して、上記ウイルスの存在を確認し、かつ、バンド強度により上記ウイルスの濃度を推定する、
を含む前記方法が、提供される。
【００２０】
大量の水中に混入している微量のウイルスは、水中では通常マイナスに帯電した状態で浮遊し又は固形物に付着している。したがって、試料水中に陰イオン交換体であるＤＥＡＥ−セルロースを直接添加すれば、ウイルスはＤＥＡＥに吸着される。
【００２１】
北橋らは、非特許文献８中に、自然水域より採取した試料に陰イオン交換繊維（ＤＥＡＥセルロース）を添加し、凝集沈殿分離することによりウイルスを濃縮することを記載している。本発明者は、このＤＥＡＥ繊維をカラム充填剤として使用することにより、多量の下水処理水中のウイルスを効率よく濃縮できるのではないかと考えた。
【００２２】
しかしながら、ウイルス、例えば、ＳＲＳＶは、夾雑物を含む下水処理水に非常に希薄に含まれると考えられるので、上記ＤＥＡＥ繊維充填カラムを使用して多量の供試水（試料）からウイルスを濃縮するためには、ウイルス濃縮率を著しく高める必要がある。また、多量の供試水を定常的に分析するためには、簡単な操作でウイルスを濃縮する必要がある。
【００２３】
図１に、多量の水に希薄に含まれるウイルスの検査フローの概略図を示す。上述のように、例えば、ＤＥＡＥセルロースを充填した５０ｍＬ容積のカラムに、前ろ過等の手段により予め夾雑物を除去した供試水（試料）を、例えば、１０Ｌ／時で通水し（濃縮工程）、その後、少量、例えば、６０ｍＬのアルカリ液で、ＤＥＡＥに吸着したウイルスを溶出させる（溶出工程）。この溶出液からポリエチレングリコールを用いてウイルスを沈殿分離し（沈殿分離工程）、この沈殿物からＲＮＡを抽出し（ＲＮＡ抽出工程）、これをＲＴ−ＰＣＲ及び／又はｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲにより増幅して、増幅されたＤＮＡ断片を、電気泳動写真上で観察する。
【００２４】
図３に、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）とｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ（入れ子型ＰＣＲ）の原理を示す。図３から分かるように、ＲＴ−ＰＣＲの後に、ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行うことにより、微量のウイルスＲＮＡがあれば、ウイルスに特異的な断片を多量に増幅することができることが分かる。
【００２５】
しかしながら、非常に希薄に含まれるウイルスを分析しようとする場合には、これらのＰＣＲを行う前に、予めウイルスを濃縮しておくことが、分析・検査の感度を高めるために、非常に重要なこととなる。また、供試水に添加したＤＥＡＥセルロース繊維を凝集剤の添加により再び沈殿分離するといったバッチ操作を回避しながら、多量の供試水を定常的に分析するために、簡単な操作でウイルスを濃縮する必要もある。
【００２６】
図２に示すように、本発明に係るウイルス濃縮方法は、場合により前ろ過工程、濃縮（吸着）工程、及び溶出工程を含む。
【００２７】
前ろ過工程は、供試（被験）水が夾雑物を多く含む水、例えば、下水処理水などの場合、予め被験水をろ過して、濁質を除去するために場合により行われることができる。
【００２８】
濃縮（吸着）工程において使用する陰イオン交換能を有する繊維状又は粒状のカラム充填剤は、ＤＥＡＥセルロースであることができる。イオン交換カラム充填剤は、酸処理及びその後のアルカリ処理により陰イオン交換能を予め活性化されている必要がある。カラム内部に上記充填剤を、被験水が流れる方向に圧密すると、被験水の流れが悪くなり又は被験水が上記充填剤層内を短絡して流れたりするために、ウイルスの吸着効率が低下する。そこで、カラム内に上記充填剤を１〜９５％、好ましくは１〜８０％、より好ましくは１０〜５０％の容積率で充填することが望ましい。通水方法としては、下向流では上記充填剤がカラムの下部に圧密されやすいので、上向流が望ましい。さらに、被験水を流した際に上記充填剤がカラム内部で流動状態となるように被験水の通水流量を調節することが望ましい。通水の際に、このような流動状態を保つことにより、カラム内での上記充填剤の目詰まりや圧密を回避することができる、さらに、充填剤の表面と被験水中に希薄に含まれるウイルスとの接触頻度を高めてウイルスをより高濃度に充填剤表面に吸着させることができる。これは、所定量のアルカリ液により溶出を行う場合、そのアルカリ液中に含まれるウイルス数が増大することになるので、ウイルス濃縮率を高めるという観点から、非常に望ましい結果を導く。カラム内部に空気を通気して、上記充填剤のカラム内での流動状態を保持することもできる。上記充填剤がカラム内で被験水の流れ方向に圧密された場合には、一時的又は定期的に被験水の流れの方向を反転させて、圧密された上記充填剤を分散させることもできる。
【００２９】
溶出工程においては、所定量の被験水をカラム内に通水した後、カラム容積と同等の容積のアルカリ液を、上記のウイルスが吸着された充填剤に接触させて、吸着されたウイルスを回収する。このアルカリ液は、好ましくは、ｐＨ９以上の緩衝液であり、例えば、０．５質量％肉エキスを添加した５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．５）であることができる。
【００３０】
以下の実施例及び添付図面により、本発明を詳細に説明するが、これらにより、本発明の範囲が限定されるものと解釈されるべきではない。
【００３１】
【実施例】
実施例１：大腸菌ファージＱβを用いた回収効率の確認
各種濃度で大腸菌ファージＱβを含む被験水についてセルロースカラム吸着実験を行い、回収率を求めた。手順を以下に示す：
（１）カラムの作成
ＤＥＡＥセルロース（Ｓｉｇｍａ社）１ｇを純水で膨潤させ、１Ｎ塩酸で酸洗浄し、その後１Ｎ苛性ソーダでアルカリ洗浄し、ｐＨが中性になるまで純水で洗浄した。洗浄を経た当該セルロースを、容積５０ｍＬのガラス製カラムに充填し、上記ウイルス吸着分離用カラムを作成した。
（２）供試水の調製
水道水１０Ｌに大腸菌ファージＱβを、１０，１００，及び１０００ｐｆｕ／ｍＬの濃度で添加して、供試水を調製した。
（３）供試水のカラム吸着分離
前記カラムの底部より通水量１０Ｌ／時の上向流で供試水を通水した。供試水１０Ｌの通水完了後、カラムに、６０ｍＬのアルカリ液（０．５％肉エキス添加５０ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ９．５）を通水し、溶出液を回収した。
（４）溶出液のウイルス再濃縮
前記溶出液にポリエチレングリコール６０００と塩化ナトリウムを最終濃度で、それぞれ、１３質量％と０．２Ｍとなるように添加し、４℃で一夜静置した後、遠心分離（１２，０００ｇ、３０分）して沈殿物を得、この沈殿物を１ｍＬの緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍＭ塩化カリウム）に溶解させた。
（５）ＲＮＡ抽出
前記沈殿溶解液５６０μＬについて、ＱＩＡＧＥＮ社ＱＩＡａｍｐ　ｖｉｒａｌ　ＲＮＡ　Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶液６０μＬを得た。
（６）ＲＴ−ＰＣＲ反応
前記ＲＮＡ溶液２５μＬについて、宝酒造Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＲＮＡ　ＰＣＲＫｉｔ（ＡＭＶ）を用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。反応に用いたプライマーは、以下の表１：
【００３２】
【表１】
2004129548.tif 000002
【００３３】
に示す非特許文献７に記載されたプライマーｓｅｔＩ−とｓｅｔＩ＋であった。
【００３４】
反応液組成：キット標準組成（但し、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）
反応液量：５０μＬ
2004129548.tif 000003
＊［９５℃：３秒→５０℃：３０秒→７２℃：３０秒］×２５反復
（７）Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ反応
ＲＴ−ＰＣＲ反応液５０μＬ中の５μＬについて、宝酒造Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＲＮＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＡＭＶ）付属の酵素及び試薬を用いてｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ反応を実施した。反応に用いたプライマーは、非特許文献７に記載されたプライマーｓｅｔＩＩ−とｓｅｔＩＩ＋であった（表１参照）。
【００３５】
反応液組成：キット標準組成（但し、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ＲＮａｓｅ阻害剤・ＲＴａｓｅなし）
反応液量：ＲＴ−ＰＣＲ反応液を５μＬ添加して、反応液量を５０μＬとした。
【００３６】
ＰＣＲ条件：ＰＣＲ反応＝９５℃：３分→＊→７２℃：５分
＊［９５℃：３秒→５０℃：３０秒→７２℃：３０秒］×３０反復
（８）電気泳動によるＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の確認
アガロース電気泳動（３．０質量％ＮｕＳｉｅｖｅ　３：１アガロース／１×ＴＢＥ緩衝液系）によりｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ反応液１０μＬについて分析した。電気泳動後のアガロースゲルを蛍光色素、臭化エチジウムで染色し、トランスイルミネーター上で可視化して、ＤＮＡバンドの強度を観察した。
【００３７】
比較実験：
上記（３）におけるファージ濃縮効果を確認するために、カラムからのウイルス溶出に用いたアルカリ液（０．５質量％肉エキス添加５０ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ９．５）に、大腸菌Ｑβファージを、希釈率（６０ｍＬアルカリ液／（６０ｍＬアルカリ液＋１０Ｌ供試水））をもって、１０，１００，及び１０００ｐｆｕ／ｍＬの濃度で、６０ｍＬアルカリ液に添加した試料について、上記（４）〜（８）を行った。
【００３８】
結果：
大腸菌ファージＱβのＤＮＡ量を、上記（８）におけるアガロースゲル上の蛍光強度に基づき４段階（−、＋、＋＋、＋＋＋）に判定した。結果を以下の表２に示す：
【００３９】
【表２】
2004129548.tif 000004
【００４０】
上記表から、本発明に係るウイルス濃縮法を使用することにより、供試水中の着目のウイルスを効率よく濃縮できることが分かる。
【００４１】
実施例２：下水処理水中のＳＲＳＶ濃縮の確認
平成１４年２月に、ＳＲＳＶを含むと疑われる下水処理場からの放流水を１０Ｌ程度採取し、冷蔵保存した。本実施例において、この下水処理水について、ＤＥＡＥセルロースカラム吸着・分離によりＳＲＳＶが濃縮できるかどうかを確認した。
【００４２】
図２に、本発明に係るウイルス濃縮操作のフローを示す。図２中の前ろ過残渣からの誘出液１、ＤＥＡＥカラム溶出液２、及びＤＥＡＥカラム残渣からの溶媒抽出液３について、実施例１における手順（４）に記載したポリエチレングリコール沈殿によるウイルス再濃縮後、以下に示すＲＮＡ抽出、ＰＣＲ分析を実施した。
【００４３】
前ろ過において、上記下水処理水をフィルター（Ｎｏ．５Ａ）に通して除塵した後、実施例１における手順（３）に記載したように、ＤＥＡＥカラムに通水した（１０Ｌ／時）。前ろ過残渣からの誘出液１、ＤＥＡＥカラム溶出液２、及びＤＥＡＥカラム残渣からの溶媒抽出液３（それぞれ、上記手順（３）に記載したアルカリ液で抽出されたもの）について、ＳＲＳＶの存在を検定した。
【００４４】
使用したＰＣＲ反応及び電気泳動の条件を以下に示す：
（１）ＲＮＡ抽出
前記前ろ過残渣からの誘出液１、ＤＥＡＥカラム溶出液２、及びＤＥＡＥカラム残渣からの溶媒抽出液３を、実施例１における手順（４）に記載したポリエチレングリコール沈殿によるウイルス再濃縮して得られた各沈殿溶解液１４０μＬについて、ＱＩＡＧＥＮ社ＱＩＡａｍｐ　ｖｉｒａｌ　ＲＮＡ　ＭＩＮＩ　Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ溶液６０μＬを得た。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ反応
ＴａＫａＲａ　ＲＮＡ　ＬＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＡＭＶ）ｖｅｒ．１．１を用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。
【００４５】
ｉ）ＲＴ反応
反応液組成（２０μＬ）：上記Ｋｉｔ取扱説明書の通りであるが、以下の点を変更した：
使用ＲＮＡ溶液量：５μＬ
使用プライマー：上記Ｋｉｔに付属のＮ９、及びＳＭ３１
反応条件：３０℃：１０分→４２℃：３０分→９９℃：５分→５℃：∞
ｉｉ）ＰＣＲ反応
反応液組成：上記Ｋｉｔ取扱説明書の通りであるが、以下の点を変更した：
使用ＲＮＡ溶液量：５０μＬ（内２０μＬがＲＴ反応液）
Ｍｇ濃度：約１．５〜２ｍＭ
使用プライマー：Ｇ１とＧ２（及び上記ＲＴ反応液由来ＳＭ３１）
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（３）Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ反応
反応液組成（５０μＬ）：上記Ｋｉｔ取扱説明書の通りであるが、以下の点を変更した：
鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ反応液を５μＬ使用した。
【００４６】
使用プライマー：ＮＩとＥ３
2004129548.tif 000006
（４）電気泳動によるＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の確認
アガロース電気泳動（３．０質量％ＮｕＳｉｅｖｅ　３：１アガロース／０．５×ＴＢＥ緩衝液系）により、ＲＴ−ＰＣＲ反応液、ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ反応液、それぞれ、１０μＬを泳動させた。電気泳動後のアガロースゲルを蛍光色素、臭化エチジウムで染色し、トランスイルミネーター上で可視化して、ＤＮＡバンドの強度を観察した。
【００４７】
上記ＰＣＲ反応に使用したプライマーを、非特許文献５に従って作成した。使用したプライマーは以下の表３に示す塩基配列をもつ：
【００４８】
【表３】
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【００４９】
図４に、ＰＣＲ分析の標的としたＳＲＳＶのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子についてＰＣＲにより増幅されるＤＮＡ断片を模式的に示す。ＳＲＳＶはｇｅｎｏｔｙｐｅ　Ｉとｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＩＩに大別されるため、いずれの遺伝子型についても検出できるＰＣＲプライマー・セットを使用した。図４中、Ｇ１、Ｇ２、ＳＭ３１は、ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーを示し、ＮＩ、Ｅ３は、ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ用プライマーを示す。
【００５０】
結果：図５に、ＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動写真を示す。ＳＲＳＶ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　１に相当する約２００塩基対のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片が観察され、かつ、ＤＥＡＥカラム溶出液２について最も顕著であることから、本発明に係るウイルス濃縮方法により、下水処理水中のＳＲＳＶを濃縮することができることは明らかである。図６においても、約１１０塩基対のＰＣＲ増幅ＤＮＡが観察され、同様にＤＥＡＥカラム溶出液２について最も顕著であることから、本発明に係るウイルス濃縮方法により、下水処理水中のＳＲＳＶを濃縮することができるこが分かる。
【００５１】
【発明の効果】
消毒すべき水中に希薄に含まれるウイルス、特にＳＲＳＶを濃縮し、その濃縮液中の当該ウイルスの存在を確認する方法を確立したことにより、特に下水放流水中のウイルス消毒方法及び装置の開発における評価手法を提供することができる。
【００５２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るウイルス検査法のフロー図。
【図２】本発明に係るウイルス濃縮操作のフロー図。
【図３】ＲＴ−ＰＣＲ及びｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲの原理を示す模式図。
【図４】ＰＣＲ分析の標的遺伝子に関する模式図。
【図５】図面に代わるＲＴ−ＰＣＲの電気泳動写真。
【図６】図面に代わるｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲの電気泳動写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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