(57)【要約】【課題】高スループットで生化学物質の結合を測定できる光学薄膜の光干渉効果を利用した簡便なセンサを提供する。【解決手段】基板１４上に、屈折率が１．８以上３以下の光学薄膜上に、プローブ１７を設けたセンサに、サンプル１８を含む溶液を流し、プローブ１７とサンプル１８の結合を、反射光の強度変化により検出する。【効果】高スループットで、精度良く、生化学物質の結合を測定できる。【選択図】　図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生化学物質の検出を行う検出方法であって、
基板と、前記基板上に形成された、屈折率が１．８以上の光学薄膜と、前記光学薄膜に形成された第１の生化学物質からなるセンサチップを準備し、
前記センサチップに、前記第１の生化学物質と結合する第２の生化学物質を含む水溶液を供給し、
前記センサチップに光を照射し、
前記センサチップが乾燥する前の状態で、前記センサチップからの反射光を検出し、
前記反射光の強度変化を測定する工程を有することを特徴とする測定方法。
【請求項２】
前記センサチップが乾燥する前の状態は、反応液を供給した状態であることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記基板と前記光学薄膜との間には、反射層が設けられていることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項４】
前記光学薄膜の膜厚は、１０ｎｍ以上１０μｍ以下であることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項５】
前記光学薄膜は、屈折率が３以下であることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項６】
生化学物質の検出に使用される生化学センサ用キットであって、
基板と、
前記基板上に設けられ、内壁にプローブを固定化するための開口部を有する光学薄膜とを有することを特徴とする生化学センサ用キット。
【請求項７】
前記基板には、更に、前記入射する光を反射させる反射膜が設けられていることを特徴とする請求項６記載の生化学センサ用キット。
【請求項８】
前記光学薄膜の上面には、更に、前記入射する光を反射させる反射膜が設けられていることを特徴とする請求項６に記載の生化学センサ用キット。
【請求項９】
前記光学薄膜の上面には、更に、前記入射する光を反射させる反射膜が設けられていることを特徴とする請求項７に記載の生化学センサ用キット。
【請求項１０】
前記反射膜表面には、プローブが形成されていることを特徴とする請求項６記載の生化学センサ用キット。
【請求項１１】
前記光学薄膜の屈折率は、１．４以上１．６以下であることを特徴とする請求項６記載の生化学センサ用キット。
【請求項１２】
前記開口部の径は、１００ｎｍ以上４００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項６記載の生化学センサ用キット。
【請求項１３】
前記開口部と開口部との間の間隔は、５０ｎｍ以上３５０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項６記載の生化学センサ用キット。
【請求項１４】
前記光学薄膜の膜厚は、２０ｎｍ以上１．５μｍ以下であることを特徴とする請求項６記載の生化学センサ用キット。
【請求項１５】
生化学物質の検出を行う検出装置であって、
複数種類のプローブが形成された基板を設置する試料台と、
前記基板に、前記プローブと結合する物質を含む反応液を供給する供給口と、前記プローブの種類毎に、光を照射しその反射光を検出する複数の光ファイバと、
前記反射光の強度変化を測定する測定器とを有することを特徴とする検出装置。
【請求項１６】
前記反射光の強度変化を、リアルタイムで表示する表示部を、更に有することを特徴とする請求項１５記載の検出装置。
【請求項１７】
前記供給口近傍に、気泡を取り除くための空間部が設けられていることを特徴とする請求項１５記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学薄膜を利用した生化学センサ、センサの部材およびこれを利用した測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、抗原抗体反応などの生化学物質間の結合の測定は、一般的に、放射性物質や蛍光体などの標識を用いることで行われてきた。この標識には手間がかかり、特にタンパク質への標識は方法が煩雑な場合や標識によりタンパク質の性質が変化する場合があった。
【０００３】
そこで、生化学物質間の結合を簡便に標識を用いることなく直接的に測定する方法として、光学薄膜の干渉色変化を利用した生化学センサは知られている。この生化学センサは、Ｓａｎｄｓｔｒｏｍらの論文（ＡＰＰＬ．ＯＰＴ．，２４，４７２，１９８５）に述べられている。その例を図１を用いて説明する。基板１上に光学薄膜２を設ける。空気の屈折率は１．００であり、光学薄膜２が屈折率１．５０の材料であり、基板の屈折率は２．２５のものを用いている。光学薄膜の厚さを、可視光の波長λ０の４分の１またはその奇数倍（３／４λ０、５／４λ０など）の光学的長さとしておくと、光学薄膜は反射防止膜として働き、図２の反射スペクトルＡのように、波長λ０で光学薄膜に垂直方向の反射光の強度が０となる。これにより、センサが干渉色を生じる。この光学薄膜２の上に、第１の生化学物質３の単分子層を設ける。生化学物質をタンパク質とすると、屈折率は１．５程度、層の厚さは１０ｎｍ程度である。これにより、光にとっては光学薄膜が厚くなったことになり、反射スペクトルが図２の実線Ａから点線Ａ’のように変化し、干渉色が変化する。この第１の生化学物質３に第２の生化学物質４が生化学的に結合すると、更に膜厚が厚くなることになり、図２の点線Ａ’から破線Ａ’’の変化が生じ、干渉色が変化する。これにより、第２の生化学物質の結合が検出される。一般的な検出の手順は、まず基板１上の光学薄膜２を第１の生化学物質の単分子層３で覆ったものを準備する。これを第２の生化学物質の溶液の中に入れる。その後、溶液から取りだし、乾燥した後、図２の点線Ａ’から破線Ａ’’への干渉色の変化を調べる。このように従来はセンサを空気中に取り出して乾燥した後、干渉色を測定するものであった。
【０００４】
【発明の解決しようとする課題】
しかしながら、上記論文に記載されたセンサで、検出するためには、一旦空気中に取り出して乾燥後に干渉色を測定するため、乾燥工程の時間がかかり、高スループット化が望めないという問題がある。
【０００５】
また、反応開始後所定の時間経過後に測定を行うため、所定の時間の設定の仕方によっては、反応が飽和する前に空気中に取り出してしまうことも有るため、必ずしも精度のよい測定が行えない。一方で、反応が十分に飽和した後に測定するべく、所定の時間を長時間に設定した場合には、反応が飽和した後もセンサが溶液中に浸されているため、時間的効率が悪い。
【０００６】
本発明の目的は、高スループットで生化学物質の結合を測定できる光学薄膜の光干渉効果を利用した簡便なセンサを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的は、以下の構成により、達成される。即ち、
（１）基板上に形成された光学薄膜と、その光学薄膜表面に形成されたプローブからなるセンサチップに、そのプローブと相互作用するサンプルを含む液を供給し、この液体が供給された状態で、相互作用の前後で変化する反射光の強度を検出する。ここで、光学薄膜としては、サンプルを含む水溶液の屈折率とは大きく異なるもの、即ち、屈折率が１．８以上のような酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化ハフニウム、酸化タンタルのようなものを用いる。このような、水溶液の屈折率とは大きく異なる屈折率の光学薄膜を用いれば、プローブとサンプルの反応前後で、光の干渉による強度変化を水中でも検出できる。なお、屈折率は３．０以下であると望ましい。理由は、上記材料の屈折率が３以下であることと、光学薄膜の屈折率が高いほど生化学物質の結合による干渉色の変化が小さくなるからである。また、この透明層の膜厚は、１０ｎｍ以上１０μｍ以下である。理由は、膜厚が１０ｎｍ以下の場合には可視光領域に干渉色を得づらい。また、１０μｍよりも厚い場合は、反射スペクトルに現れる光干渉の構造が細かすぎるため本願のセンサには実用的ではない。
【０００８】
ここで、本発明では主に、生化学物質間の結合を溶液中で光学薄膜の干渉色変化を利用して検出する。ここで、この生化学物質とは、他の物質に生化学的に結合する物質のことを指し、タンパク質、核酸、脂質、糖などの生体内で生産される物質だけではなく、薬剤物質、内分泌錯乱化学物質などの生体内の分子と結合する外来物質も含む。
【０００９】
上記従来の生化学センサでは、大気中での測定であった。この大気中の測定では、Ｓａｎｄｓｔｒｏｍらの論文（ＡＰＰＬ．ＯＰＴ．，２４，４７２，１９８５）にあるように、屈折率が１．５以上の光学薄膜がセンサに適するとされてきた。一方、サンプルを含む溶液としては、生化学物質等が含まれた水溶液である。この水溶液の屈折率は、生化学物質等の濃度によって変化するが、純水の屈折率である１．３３３０前後である。溶液中では、大気の屈折率１．０と比べて０．３以上背景の屈折率が高くなるために、従来のように屈折率が１．５程度の光学薄膜を用いたのでは、背景と光学薄膜の屈折率差による光の反射率が小さくなる。一方、本願では、光学薄膜の屈折率が１．８以上であり、純水の屈折率１．３３３０とは、０．４６７以上と、大きく異なるので、センサを乾燥させる前に、反応を十分に検出できるのである。更に、背景の屈折率が１．３３３０の時に明瞭な干渉色が現れる様に、基板または基板上の反射層を選ぶことで、より反応の検出が容易になる。
（２）また、基板上に、開口部を有する光学薄膜を設ける。ここで、開口部の内壁はプローブを固定化するために修飾されている。実際に検出する際には、プローブが固定化された開口部を有する光学薄膜が基板上に設けられたキットに、このプローブと相互作用する生化学物質を含むサンプルを流し、その相互作用を光を用いて検出する。
【００１０】
ここでは、開口部の中の空間が、センサとして働く領域となるので、平坦な膜に比べてセンサとして働く領域が拡大するので、多くの生化学物質の結合により、干渉色のより大きい変化を得ることができる。
【００１１】
開口の大きさ（直径）ａは、タンパク質が入り込むために１０ｎｍより大きいことが望ましい。また、隣接する開口間の距離を光の波長以下にすることで、膜に平行な方向への構造が回折格子として働かないので、スペクトルが単純化される。従って、隣接する開口間の距離は、検出に用いる光の波長以下の距離が望ましい。また、凸部の大きさ（開口部間の間隔）ｂが小さいほうが、生化学物質の結合による実効的な光路長増加が大きくなる。これらのことから、可視光領域で検出するセンサの場合、望ましくは開口の大きさａは１００〜４００ｎｍおよび凸部の大きさｂは５０〜３５０ｎｍである。ここで、開口は円柱状とは限らない。例えば、逆に凸部を直径ｂの円柱状としても良いし、開口部を幅ａのストライプ状の溝としても良い。
【００１２】
このように、光学薄膜に開口部を設けた構成は、勿論、光学薄膜の屈折率が水溶液の屈折率と大きく異なる場合に用いることができるが、光学薄膜の上に半透明の反射層を加えることで、光学薄膜が、ＳｉＯ２，ポリスチレン、ＰＭＭＡのような屈折率が１．４〜１．６程度のもの、即ち背景である水の屈折率と比較的近いものを用いる場合でも、適用できる。
【００１３】
なお、光学薄膜に開口部を設けた構成でも、反応前後で干渉色の変化が大きいために、水溶液を流した状態で干渉色変化を検出できる。
【００１４】
この現象は、以下のようにして確認した。
【００１５】
溶液中での検出のために、光学薄膜が溶液中で明瞭な干渉色を示すようにする。図１を用いて説明した屈折率２．２５の基板１と屈折率１．５の光学薄膜２からなる構成では、センサの屈折率が溶液の屈折率ｎ０と近くなるために、溶液と光学薄膜の間での光の反射が弱くなり、明瞭な干渉色が得られない。ここで、溶液としては主に生化学物質や塩、界面活性剤の水溶液が用いられる。純水の屈折率は、１．３３３０であり、水溶液の屈折率は生化学物質や塩、界面活性剤の濃度等により変化する。そこで、ここでは、溶液と光学薄膜との界面での光の反射を強くするために、光学薄膜上に薄い反射層を設ける。なお、光学薄膜の屈折率と水溶液の屈折率との差が十分有れば、反射層を設ける必要はない。その例を、図３に示す。基板５は屈折率１．５のガラスとし、その上に反射層６を設ける。ここでは反射層６を厚さ２０ｎｍのアルミニウムとした。そして、反射層６上に透明な材料からなる光学薄膜７を設ける。なお、基板５に光反射性のものを用いた場合には、反射膜６は省略できる。ここでは、屈折率１．５、厚さ１５０ｎｍの透明な材料とした。その上に厚さ２５ｎｍの金からなる反射層８を設ける。ここでのｎ０は純水の屈折率１．３３３０とする。この構成では、図４および図５の実線Ｂで示した反射スペクトルの様に、波長６０５．５ｎｍで反射層６と反射層８間の干渉効果で反射減衰により反射率が極小となる。ここで、図５は、図４の横軸の光の波長の５６５ｎｍから６５５ｎｍの範囲を拡大した図面である。以下、この極小を与える波長を反射減衰波長λＡＲと呼ぶ。図３に示したように、反射層８の上に屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの第１の生化学物質の層９が形成されたときの干渉色の変化を計算すると、図４および図５の実線Ｂから点線Ｂ’の変化を生じるもののλＡＲが０．８ｎｍしか変化しない。同様に、第１の生化学物質９への第２の生化学物質の結合を、第１の生化学物質９の上に屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの第２の生化学物質の層が形成されたとして計算すると、λＡＲはＢ’のλＡＲから０．５ｎｍ長波長側へ変化するだけである。これは、干渉色が反射層６と反射層８との間の光干渉効果で特徴付けられているために、これら反射層の外に生化学物質層が加わったことによる屈折率の変化に対する干渉色の変化が小さいためだと考えられる。
【００１６】
それに比べて、図３の透明層の屈折率が変化した場合には、敏感にλＡＲが変化する。図３の第１の生化学物質の層による屈折率の変化では、厚さ１０ｎｍにわたって背景の屈折率１．３３３０から１．５へ屈折率が変化する。このときの屈折率の変化量Δｎは０．１６７である。Δｎと厚さの積が同じになるように、すなわち同じ光路長の変化を与えるように透明層７の屈折率を変化させて、このときのλＡＲの変化量の比較を行った。透明層７の厚さは１５０ｎｍなので、この条件に基づいて透明層７の屈折率を０．０１１だけ増加させて反射スペクトルを計算した。図４および図５の破線Ｂ’’は、透明層７の屈折率を１．５１１としたときの反射スペクトルである。図４および図５の実線Ｂから破線Ｂ’’へのλＡＲの変化量は、実線Ｂから点線Ｂ’　へのλＡＲの変化量に比べて約６倍となり、４．７ｎｍの長波長側への変化が得られた。同様に第２の生化学物質の結合に対するλＡＲの変化量の比較も行った。透明層７の屈折率を１．５１１から更に０．０１１だけ増加させてλＡＲを求めると、ここでも破線Ｂ’’から一点鎖線Ｂ’’’に変化し、Ｂ’’のλＡＲから４．７ｎｍのλＡＲの長波長側への変化を得た。可視光を用いて検出を行うための透明層７の厚さは、２０ｎｍから１．５μｍの間である。なぜなら、２０ｎｍ以下の厚さでは、主に紫外領域に干渉効果が現れるために、可視領域に干渉色を得づらい。また、１．５μｍ以上の厚さでは第２の生化学物質の結合量に対する干渉色の変化が小さくなるからである。これは、透明層７の厚さが１５０ｎｍの場合には、０．０１１の屈折率変化であったが、図６に示すようにこの屈折率変化と透明層７の厚さの関係は反比例であり、１．５μｍ以上の厚さでは屈折率変化が小さく、従って干渉色の変化が小さくなるからである。このように反射層間の光路長変化を利用することで、より良い感度で生化学物質を検出することが期待できる。
【００１７】
そこで、光学薄膜（透明層）の中に溶液と生化学物質を入れて屈折率を変化させることができるように、図７に示した様に、光学薄膜中に生化学物質が入るための開口１０を設ける。このように開口を設けることで、膜に平行な方向に構造を持つ光学薄膜となる。このような構造を持つ光学薄膜からの光の反射は、例えば井上・大高らの誘電体球の２次元規則配列の光散乱の理論（Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｂ，２５，６８９，１９８２）にあるように、構造に起因した複雑な光散乱現象が生じるが、第一近似的には、構造が持つ屈折率と水溶液の屈折率との平均化した膜の光干渉、即ち水の屈折率と開口部を有する透明層の屈折率の平均値の屈折率による光干渉が生じる。従って、開口１０内に固定化された第１の生化学物質１１への第２の生化学物質の結合により、実効的に反射層間の屈折率が増加することになり光路長の増加をもたらす。これにより、
λＡＲは長波長側に変化する。
（３）更に、複数種類のプローブ毎に、光を照射し、その反射光を検出する光ファイバと、反射光の強度変化を計測する測定器を設けた検出装置によって達成される。
【００１８】
ここでは、プローブの種類毎に光ファイバを設けるため、複数種の反応をほぼ同時に検出できる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
＜実施例１＞
以下、生化学物質間の結合を感度よく検出するためのセンサの製造方法を述べる。図１４にセンサの製造方法の一例を示す。平坦な表面を持つ屈折率１．５のガラス基板１４に、５ｎｍの厚さのアルミニウムの反射層１５を真空蒸着する。続いて、１２０ｎｍの厚さの酸化チタン（ＴｉＯｘ、屈折率２．４）の透明層１６を真空蒸着する。その後、３−アミノプロピルトリメトキシシランで表面処理を行い、透明層１６の表面にアミノ基を導入する。そして、２ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシイミドと１０ｍｇの水溶性カルボジイミドと１ｍｇの抗体を１ｍｌの脱イオン水に溶かし抗体のカルボキシル基を活性化し、この溶液をアミノ基を導入した箇所に滴下して、抗体をセンサ表面のアミノ基に共有結合により固定化する。この後、脱イオン水でセンサチップをすすぎ、窒素ガスを吹きかけて乾燥する。
【００２０】
このセンサは溶液中で明瞭な干渉色を示し、生化学物質の結合によりその干渉色が変化する。図１５に計算機シミュレーションに用いたモデルを示す。背景の屈折率ｎ０は１．３３３０とした。第一の生化学物質（プローブ）を、屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの層１７とした（図１５（ａ））。この生化学センサに対し、第２の生化学物質を含むサンプルを供給することにより、第１の生化学物質と第２の生化学物質とを結合させる（図１５（ｂ））。この第２の生化学物質を、屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの層１８として示した。図１６、図１７および図１８に反射スペクトルを示す。縦軸の反射減衰は、吸光度の計算の要領で、−ｌｏｇ１０Ｒとした。ここで、Ｒはセンサの反射率である。図１６は、波長が４００ｎｍから８３０ｎｍでの反射減衰を示し、図１７は図１６における波長５７５ｎｍから５８５ｎｍの部分的拡大図、図１８は図１６における波長５１０ｎｍから６１０ｎｍの部分的拡大図である。それぞれ、生化学物質層なしの反射スペクトルを実線Ｃで、第一の生化学物質層が施されたセンサの反射スペクトルを点線Ｃ’で、第２の生化学物質が結合した後の反射スペクトルを破線Ｃ’’で示した。図１６の反射スペクトルから、
λＡＲが５５０ｎｍ周辺であることが分かる。また、それぞれのスペクトルの概形は同じと分かる。反射減衰のピークの裾の部分で拡大した図１７とλＡＲ周辺を拡大した図１８とで、結合前と結合後の変化を確認することができる。図１７での変化からわかるように、単色光源を用いて、特定の波長でのセンサの反射強度の変化を測定することで第２の生化学物質の結合を検出することができる。一方、図１８から分かるように、λＡＲの位置が生化学物質の結合により長波長側に移動するのが分かる。この移動分を、定量的に示す方法を述べる。まず、反射スペクトルのλＡＲ付近に沿う関数で近似する。その関数には、線形の関数と擬似Ｖｏｉｇｔピーク関数の和で表わされる、
【００２１】
【数１】
2004132799.tif 000003
＜実施例２＞
基板１４に光反射性のもの、または透明層１６と屈折率差が大きいものを用いる場合、反射層１５なしでも基板１４と透明層１６の間で光の反射が生じるので、反射層１５を省略することができる。この実施例２では、反射層を設けない例を示す。
【００２２】
以下、このセンサの製造方法の一例を述べる。このセンサの製造は、平坦な表面を持つ屈折率１．５のガラス基板１４に、１２０ｎｍの厚さの酸化チタン（ＴｉＯｘ、屈折率２．４）の透明層１６を真空蒸着することで得られる。上記と同じく、３−アミノプロピルトリメトキシシランで表面処理を行い、透明層１６の表面にアミノ基を導入し、実施例１で述べた方法で第一の生化学物質を表面に固定化できる。
【００２３】
図２０、図２１および図２２に、図１５と同様の条件、すなわち背景の屈折率を１．３３３０、第１および第２の生化学物質層を屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの層とした計算機シミュレーションによる反射スペクトルとその変化を示す。それぞれ、生化学物質層なしの反射スペクトルを実線Ｄで、第一の生化学物質層が施されたセンサの反射スペクトルを点線Ｄ’で、第２の生化学物質が結合した後の反射スペクトルを破線Ｄ’’で示した。図２０の反射スペクトルから、λＡＲが５８０ｎｍ周辺であることが分かる。反射減衰のピークの裾の部分で拡大した図２１とλＡＲ周辺を拡大した図２２とで、結合前と結合後の反射スペクトルの変化を確認することができる。図２１での変化からわかるように、単色光源を用いて、特定の波長でのセンサの反射強度の変化を測定することで第２の生化学物質の結合を検出することができる。一方、図２２から分かるように、
λＡＲの位置が生化学物質の結合により長波長側に移動するのが分かる。実施例１と同様の近似を波長４７０ｎｍから８００ｎｍの範囲で行うことで求められる第２の生化学物質の結合によるλＡＲの変化量は５．３８ｎｍで、上記センサとほぼ同程度の検出感度である。また、透明な基板１４を用いているので、この反射スペクトルの変化は基板側からの光照射による反射スペクトルの測定によっても実施できる。透明層１６の屈折率が２．４以外の場合との感度の比較のために、図２３にλＡＲの変化量の透明層１６の屈折率依存性を示す。ここで、透明層１６の厚さは透明層１６の厚さとその屈折率の積が一定となるように決めた。図２３から分かるように、透明層１６の屈折率が高いほどλＡＲの変化が小さくなる。なお、透明層１６の屈折率が１．８より小さい領域では、水溶液との屈折率差が小さくなるため、非常に検出しづらい。図２４に透明層１６の屈折率を１．６から２．４の範囲で変化させて水（屈折率１．３３３０）中でのセンサの反射スペクトルを計算した結果を示す。ここでも、図２３の場合と同様に透明層１６の厚さは透明層１６の厚さとその屈折率の積が一定となるように決めた。各屈折率と反射スペクトルの対応は図中に示した。屈折率の減少に伴いセンサの反射率が減少するのがわかる。屈折率が１．８より小さい領域では、センサの反射率が数％以下しかないので、非常に検出しづらくなる。
＜実施例３＞
本実施例では、透明層に開口部を設けた実施例を示す。
【００２４】
図８はセンサチップの製造方法の一例を示すものである。以下、図８を用いて、センサの製造方法を述べる。基板５には、大きさ２６ｍｍ×２０ｍｍ、厚さ０．４〜０．６ｍｍの血球計算用カバーガラスを用いた。ガラス基板表面（図８（ａ））に２０ｎｍの厚さのゲルマニウムを真空蒸着し反射層６を得た（図８（ｂ））。透明層７を形成するために、超ＬＳＩ用低誘電率層間膜材料ＨＳＧ−Ｒ７（日立化成（株））をゲルマニウム層の上にスピンコートした（図８（ｃ））。得られた透明層の厚さは約２００ｎｍであった。サブミクロンスケールでの開口１０形成のために、サブミクロンサイズのシリカビーズを用いたナチュラルリソグラフィーを採用した。シリカビーズ１２の単層膜を透明層７の上に設け（図８（ｄ））、酸素ガスによる反応性イオンエッチングでＨＳＧ−Ｒ７の透明層７とシリカビーズ１２のエッチング速度の違いを利用し、透明層７を選択的に膜に垂直方向に異方性ドライエッチングして開口１０を得た（図８（ｅ））。ドライエッチング後、エタノールを染み込ませたレンズクリーニングペーパーで表面のシリカビーズ１２をふき取った（図８（ｆ））。この表面に接着のための厚さ３ｎｍのクロムと反射層８となる厚さ２０ｎｍの金を真空蒸着した（図８（ｇ））。以上により、開口１０内部にも金が蒸着されるが、透明層７を挟む金とゲルマニウムの反射層間の光干渉効果により発色し、センサとして図７に示した構造と本質的に同じ効果が得られる。図９に作製されたセンサチップの上面図を示す。上記方法によって、基板５の上に、直径約３ｍｍの４つのセンサ部１３を４ｍｍ間隔で一列に設けた。センサ部１３は赤く発色した。これは、センサ部１３のλＡＲが５３０ｎｍ周辺であることから、赤い光が強く反射されるためである。以下、このセンサへの第１の生化学物質１１の固定化の一例として、抗体の固定化法の手順を述べる。上記センサチップを０．１ｍＭの１１−アミノ−１−ウンデカンチオールのエタノール溶液に１０時間以上浸した。これにより、真空蒸着された金表面に１１−アミノ−１−ウンデカンチオールの自己組織化膜が形成され、開口１０内部も含めた表面にアミノ基が導入された。２ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシイミドと１０ｍｇの水溶性カルボジイミドと１ｍｇの抗体を１ｍｌの脱イオン水に溶かし抗体のカルボキシル基を活性化し、この溶液をアミノ基を導入したセンサ部１３に滴下して、抗体をセンサ表面のアミノ基に共有結合により固定化した。この後、脱イオン水でセンサチップをすすぎ、窒素ガスを吹きかけて乾燥した。
【００２５】
以下、上記の方法で製作されたセンサチップを用いた、タンパク質とそのタンパク質に結合する抗体の相互作用測定を述べる。タンパク質にはＡＶＩＤＩＮ　Ｄ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を、抗体にはＡＮＴＩ−ＡＶＩＤＩＮ　Ｄ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。抗体を、上記に述べた方法でセンサ表面に固定化した。試料溶液は１ｍｇ／ｍｌ（約１０μＭ）のタンパク質（ＡＶＩＤＩＮ　Ｄ）のＰＢＳ溶液とした。この試料溶液をセンサ表面に約４分間流した。この時間の間にタンパク質と抗体の結合は飽和する。図１０、図１１および図１２に、タンパク質結合前のＰＢＳ緩衝液中での反射スペクトルを実線で、タンパク質結合後の反射スペクトルを点線で示す。縦軸の反射減衰は、吸光度の計算の要領で、−ｌｏｇ１０（Ｉ／Ｉ０）＋αとした。ここで、Ｉはセンサの反射光の強度、Ｉ０は標準白色板の反射強度、αは定数である。図１０は、波長４００ｎｍから９００ｎｍの反射減衰を示す図であり、図１１は、５９０ｎｍから５９２ｎｍの反射減衰を示す図１０の拡大図、図１２は、波長５１０ｎｍから波長５５０ｎｍの反射減衰を示す図１０の拡大図である。図１０から分かるように、λＡＲが約５３０ｎｍに現れた。また、図１０では結合前と結合後の反射スペクトルが重なっており、スペクトルの概形がほとんど同じと分かる。しかし、反射減衰のピークの裾の部分で拡大した図１１とλＡＲ周辺を拡大した図１２とで、結合前と結合後の変化を確認することができる。図１１での反射強度の変化からわかるように、単色光源を用いて、特定の波長でのセンサの反射強度の変化を測定することで第２の生化学物質の結合を検出することが可能である。ここで、図１１の実線、点線が滑らかではないのは、単色光源を用いた検出のための評価を行うために、図１１の反射スペクトルには波長方向の平滑化を行わなかったからである。
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＜実施例４＞
以下、本発明の光学薄膜センサの干渉色変化を溶液中でリアルタイムに検出する装置を、図面を用いて説明する。図２５は、本発明の一実施例を示すブロック図、図２６は本発明の検出装置の計算機の表示画面の一実施例を示す図、図２７は、本発明の検出装置の光学系の一実施例を示す斜視図、図２８は本発明の検出装置の反応層の一実施例を示す斜視図、図２９は図２８のＥ−Ｅ’での断面図、図３０は図２８のＦ−Ｆ’での断面図である。
【００２６】
本発明の検出装置は、図２５のように、タングステンランプなどの白色光源１９からの光が光ファイバからなる照射光学系２０を経て、反応層２１に入った基板２２上の実施例１〜実施例３で述べた光学薄膜センサ部２３複数に照射され、その光学薄膜センサ部２３からの反射光が光ファイバからなる集光光学系２４を経て、複数の分光器２５と複数のＣＣＤやフォトダイオードアレイなどの多チャンネル受光機２６でリアルタイムに反射スペクトルとして測定され、計算機２７に反射スペクトルのデータが取りこまれる。計算機２７により、実施例１〜３で述べた、光学薄膜センサ部２３の反射スペクトルの反射減衰の曲線に沿う関数（１）での最小自乗法による近似を自動的に行い、図２６のグラフ２８のように表示する。この近似から得られる関数の極値を与える波長、すなわちλＡＲを時間に対して図２６のグラフ２９の様にリアルタイムにプロットし記録する。通常、ＣＣＤやフォトダイオードアレイなどの多チャンネル受光機のピクセルの間隔により、測定できる波長の間隔は制限されるが、近似の計算結果の波長位置をプロットすることで、より細かくλＡＲを決定できる。すなわち、結合量の計測のダイナミックレンジを拡大することができる。また、通常、同じ多チャンネル受光機２６を用いてより細かくλＡＲを決定するには、より長い分光器を要する。よって、この近似の計算により、通常よりも短い分光器で同程度のダイナミックレンジが得られることから、装置の小型化ができる。さらに、通常、ＣＣＤやフォトダイオードアレイなどの多チャンネル受光機２６で生じる雑音が反射スペクトルに反映されるが、この関数による近似は雑音を平均化するので、Ｓ／Ｎ比の向上につながり、実効的なダイナミックレンジを拡大することができる。グラフ２９の時間微分をグラフ３０に表示し記録する。これにより、結合の開始と、飽和が分かり易くなる。
【００２７】
図２７に光ファイバを用いた照射光学系２０、集光光学系２４の一実施例を示す。直径２ｍｍの金属のパイプ３１に直径３０ミクロンのガラス製の光ファイバが詰まった光ファイバ束を用意する。光ファイバ束の中心部分を占める光ファイバ３２の反対側の端は、分光器２５のスリットの前に置かれる。光ファイバ束の外側部分を占める光ファイバ３３の反対側の端は、白色光源１９の前に置かれる。
【００２８】
図２８，２９，３０に、図２７に示したバンドルファイバ３４を用いた検出装置の一実施例を示す。図２８，２９，３０のように、バンドルファイバ３４を反応層２１と冷却水または温水３５を循環させることで温調を行う冷却・加熱機３６を固定した台３７に取りつけられた可動台３８に固定し、光学薄膜センサ部２３の直上に置く。このようにして、それぞれのバンドルファイバ３４からそれぞれの真下の光学薄膜センサ部２３に光が照射されるようにする。可動台３８にはバンドルファイバ３４の光学薄膜センサ部２３に対する位置が再現されるように、停止機構３９が取り付けられる。一般に、光学薄膜の干渉色は測定に用いる光の入射・反射角度に依存する。停止機構３９を利用してバンドルファイバ３４の位置を再現することで、照射光学系２０用の光ファイバ３３から照射される光と光学薄膜センサ部２３で反射され集光光学系２４用の光ファイバ３２で集光される光の角度が再現される。使用する光ファイバの開口数から決まる光照射角、集光角の範囲内でこの角度を決めて使用するのが望ましい。また、図２７のように集光用光ファイバ３２を照射用光ファイバ３３が囲む配置にすることで、光学薄膜センサ部２３に対するバンドルファイバ３４の取りつけの傾きがある場合に、その影響がその配置により平均化されるので、得られる反射スペクトルの再現性が良くなる。一度により多くの種類の生化学物質の結合を調べるには、光学薄膜センサ部２３とバンドルファイバ３４の数を増やすことで対応できる。バンドルファイバ３４の先端と反応層の窓４０の間に液体を入れるための空間４１を設ける。これにより、バンドルファイバ３４の先端および反応層の窓４０での界面の光の反射を低減でき、反射スペクトル測定への影響を少なくできる。また、冷却時に反応層２１の周りに水滴や霜が付着することがあるが、この空間４１に液体を入れることで水滴や霜の付着による反射スペクトル測定への影響を防ぐことができる。反応層２１をつや消し黒で塗装した。これにより、反応層内での散乱光や室内光の集光光学系２４への入射を防ぐことができる。溶液の入り口４２から溶液の出口４３へ送液ポンプとサンプルインジェクターなどを用いて生化学物質を含む試料溶液４４を反応層２１へ送液し、ある時間の間だけ生化学物質を含む試料溶液４４が反応層を通過する状態を作ることで、生化学物質の結合および解離のリアルタイム検出を行うことができる。反応層の上方に、溶液の入り口４２および溶液の出口４３を配置し、溶液の入り口４２側に気泡を取り除くための空間４５を設けることで、対象生化学物質を含む試料溶液４４に気泡が含まれていた場合に、その気泡の反応層２１への進入を防ぐことができ、また、気泡が反応層２１に進入した場合や発生した場合には、その排出を促進することができる。一般に生化学物質間の結合には、環境の温度依存性がある。冷却・加熱機３６により反応層２１の温度を調節し、対象生化学物質の結合の温度依存性を調べることができる。冷却・加熱機３６はペルティエ素子などでもよい。
【００２９】
図３１に、実施例３で述べたセンサと本検出装置を用いたλＡＲの変化のリアルタイム測定の結果を示す。センサ表面に固定化した抗体、固定化法、試料溶液については実施例３で述べたとおりである。図３１のＧまでの時間はセンサ表面にＰＢＳ緩衝液が送液されている。このＰＢＳ緩衝液送液中のλＡＲは５３０．３０ｎｍであった。縦軸はλＡＲの５３０．３０ｎｍからの変化量を表わしている。図３１のＧで示した時点からＡＶＩＤＩＮ　ＤのＰＢＳ溶液がセンサ上を流れ結合が始まり、破線で示した指数関数に沿うようにλＡＲが増加している。これにより、結合量の飽和が確かめられた。Ｈで示した時点で、１０ｍＭの塩酸を送液し結合を解離させたところ、解離の後は元のλＡＲに戻った。結合と解離の測定に要した時間は、約２０分であった。タンパク質結合によるλＡＲの変化量が０．０７ｎｍと小さいのは、結合したＡＶＩＤＩＮ　Ｄの量が単層膜を形成するほど密ではなかったからだと考えられる。
【００３０】
なお、このリアルタイムで反射光を検出する方法については、上記実施例１、２のように、開口部を形成しない屈折率の大きな光学薄膜を用いる場合でも、開口部を形成する実施例３の場合にも、用いることができる。
【００３１】
この実施例では、リアルタイムで反応が検出できるので、より高スループットで生化学物質の結合を測定できる。
【００３２】
【発明の効果】
上記構成により、高スループットで、精度良く、生化学物質の結合を測定できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の生化学センサの構成を示す図。
【図２】従来の生化学センサの干渉色変化を示す図。
【図３】本発明の原理を示す図。
【図４】本発明の干渉色変化を示す図。
【図５】本発明の干渉色変化を示す図。
【図６】本発明の原理を示す図。
【図７】本発明の生化学センサの構成を示す図。
【図８】本発明の生化学センサの製造工程図。
【図９】本発明の生化学センサの上面図。
【図１０】蛋白結合前と結合後の反射減衰を示す図。
【図１１】蛋白結合前と結合後の反射減衰を示す図。
【図１２】蛋白結合前と結合後の反射減衰を示す図。
【図１３】蛋白結合前の反射スペクトルを近似した図。
【図１４】本発明の生化学センサの製造工程図。
【図１５】本発明の生化学センサの構成を示す図。
【図１６】本発明の干渉色変化を示す図。
【図１７】本発明の干渉色変化を示す図。
【図１８】本発明の干渉色変化を示す図。
【図１９】結合前の反射スペクトルを近似した図。
【図２０】本発明の干渉色変化を示す図。
【図２１】本発明の干渉色変化を示す図。
【図２２】本発明の干渉色変化を示す図。
【図２３】本発明の生化学センサの感度を示す図。
【図２４】本発明の生化学センサの反射スペクトルを示す図。
【図２５】本発明の装置を示すブロック図。
【図２６】本発明の検出装置の計算機の表示画面を示す図。
【図２７】本発明の検出装置の光学系を示す斜視図。
【図２８】本発明の検出装置の反応層を示す斜視図。
【図２９】図２８のＥ−Ｅ’での断面図。
【図３０】図２８のＦ−Ｆ’での断面図。
【図３１】本発明の検出装置を用いた測定結果を示す図。
【符号の説明】
１：基板、２：光学薄膜、３：第１の生化学物質、４：第２の生化学物質、５：基板、６：反射層、７：光学薄膜、８：反射層、９：第１の生化学物質、１０：開口部、１１：第１の生化学物質、１２：シリカビーズ、１３：センサ部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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