(57)【要約】【課題】Ｌｐ（ａ）とＬＤＬの血漿濃度が高いこととアテローム硬化症のリスク上昇との関係を明らかにすること、及び、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギのアテローム性病変を病理学的に解析し、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギがｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギに比べて広範な進行性病変を形成することを明らかにすること。【解決手段】大動脈弓及び胸／腹大動脈に進行性アテローム病変を有すること、又は、血管におけるカルシウム沈着又は石灰化が見られることを特徴とする、ヒトアポリポタンパク（ａ）を発現するトランスジェニックウサギとホモ接合Ｗａｔａｎａｂｅ家族性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギとの交配から得られたウサギ（［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／−］又は［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／＋］）。【選択図】　図４
2004121152.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大動脈弓及び胸／腹大動脈に進行性アテローム病変を有することを特徴とする、ヒトアポリポタンパク（ａ）を発現するトランスジェニックウサギとホモ接合Ｗａｔａｎａｂｅ家族性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギとの交配から得られたウサギ（［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／−］又は［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／＋］）。
【請求項２】
血管におけるカルシウム沈着又は石灰化が見られることを特徴とする、ヒトアポリポタンパク（ａ）を発現するトランスジェニックウサギとホモ接合Ｗａｔａｎａｂｅ家族性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギとの交配から得られたウサギ（［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／−］又は［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／＋］）。
【請求項３】
リポタンパク（ａ）から成る、血管の石灰化を促進する因子。
【請求項４】
リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞におけるカルシウム蓄積を亢進する因子。
【請求項５】
リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞における基質Ｇｌａタンパク（ＭＧＰ）のｍＲＮＡ発現を増加する因子。
【請求項６】
リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞におけるオステオポンチン（ＯＰＮ）のｍＲＮＡ発現を減少させる因子。
【請求項７】
リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞におけるアルカリフォスファターゼ活性を増強させる因子。
【請求項８】
リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞における骨芽細胞特異因子−２（Ｏｓｆ２）のｍＲＮＡ発現を誘導させる因子。
【請求項９】
リポタンパク（ａ）がヒト由来である、請求項３ないし８のいずれか一項に記載の因子。
【請求項１０】
リポタンパク（ａ）が、ヒトアポリポタンパク（ａ）を発現するトランスジェニックウサギ由来である、請求項３ないし８のいずれか一項に記載の因子。
【請求項１１】
リポタンパク（ａ）の機能を阻害又は抑制する因子を含む医薬組成物。
【請求項１２】
血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する作用を有することを特徴とする、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
アテローム硬化症の治療薬であることを特徴とする、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項３ないし１０のいずれか一項に記載の因子に対する抗体。
【請求項１５】
ヒトアポリポタンパク（ａ）に対する抗体。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載の抗体から成る、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化の抑制剤。
【請求項１７】
請求項１４又は１５に記載の抗体から成る、アテローム硬化症の治療剤。
【請求項１８】
アポリポタンパク（ａ）遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
ＤＮＡオリゴマーである請求項１８記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化の抑制剤。
【請求項２１】
請求項１８又は１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る、アテローム硬化症の治療剤。
【請求項２２】
リポタンパク（ａ）の作用を阻害することにより、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する方法。
【請求項２３】
請求項１４又は１５に記載の抗体との反応によってリポタンパク（ａ）の作用を阻害することにより、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する方法。
【請求項２４】
リポタンパク（ａ）の産生を抑制することにより、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する方法。
【請求項２５】
アポリポタンパク（ａ）遺伝子の発現を制御することにより、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する方法。
【請求項２６】
請求項１８又は１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドとの反応によって、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制することを特徴とする、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２７】
リポタンパク（ａ）の作用を阻害することにより、アテローム硬化症を治療する方法。
【請求項２８】
請求項１４又は１５に記載の抗体との反応によってリポタンパク（ａ）の作用を阻害することにより、アテローム硬化症を治療するする方法。
【請求項２９】
リポタンパク（ａ）の産生を抑制することにより、アテローム硬化症を治療する方法。
【請求項３０】
アポリポタンパク（ａ）遺伝子の発現を制御することにより、アテローム硬化症を治療する方法。
【請求項３１】
請求項１８又は１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドとの反応によって、アテローム硬化症を治療することを特徴とする、請求項２９又は３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）とアポリポタンパク（ａ）との非共有結合により形成されるリポタンパク（ａ）（Ｌｐ（ａ））の発現、（Ｌｐ（ａ））が血管（平滑筋細胞）の硬化へ関与していること、（Ｌｐ（ａ））が石灰化形成を促進する機能を持つ因子であること、（Ｌｐ（ａ））により動脈硬化複合病変をはじめとする血管石灰化が誘導されること、及び、ＬＤＬ受容体以外のＬｐ（ａ）受容体が存在すること等の発見、並びに、血管石灰化は骨形成に関与することが知られている因子群の発現調節と同様の基盤のうえに成り立つ疾患であることの発見に基づくものである。
【０００２】
【従来の技術】
１９６３年、Ｂｅｒｇ（１）がリポタンパク（ａ）［Ｌｐ（ａ）］を発見して以来、多くの臨床的、疫学的、遺伝的研究によって、Ｌｐ（ａ）の血漿濃度が高いと冠動脈心疾患、卒中、再狭窄などヒトの心血管疾患をきたすことがわかっているが（２−４）、これに対していくつかの研究ではそのような関連を立証することができなかった（５，６）。アテローム硬化症の病因におけるＬｐ（ａ）の関与は、まずヒトのアテローム性病変にＬｐ（ａ）が存在することによって示唆され（７，８）、その後の多くの研究からもアテローム性プラークでのＬｐ（ａ）沈着は不安定な冠動脈症候群の重症度に相関することが指摘されている（９）。それにもかかわらず、Ｌｐ（ａ）がアテローム性血管疾患のリスクを上昇させる機序はほとんど未解明である。
【０００３】
ｉｎ　ｖｉｖｏ実験でＬｐ（ａ）の機能的役割を解明する上での大きな問題点は、適切な実験動物がいないことに帰する。つまり、Ｌｐ（ａ）はサルとヒトにのみに存在することが知られており、霊長類以外ではハリネズミが唯一Ｌｐ（ａ）様タンパクを産生する動物である（１０）。トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを用いた４つの報告では、アポリポタンパク（ａ）［ａｐｏ（ａ）］Ｔｇマウスに高脂肪食を与えると、ａｐｏ（ａ）が大動脈脂肪斑の形成を促進する可能性を示唆している（１１−１４）。ただし、異なる２つの研究ではａｐｏ（ａ）のみまたはヒトａｐｏ（ａ）およびａｐｏＢのいずれかを発現するＴｇマウスでａｐｏ（ａ）のアテローム形成を促進する効果は確認されなかった（１５，１６）。
【０００４】
当実験室（１７）では、ヒトａｐｏ（ａ）を発現するＴｇウサギを作製し、ヒトａｐｏ（ａ）がウサギＬＤＬと結合することによりＬｐ（ａ）を形成することを明らかにした。これはヒトａｐｏ（ａ）Ｔｇマウスとは対照的で、ヒトａｐｏ（ａ）はマウスＬＤＬに結合しないためにこのマウス血漿中にはＬｐ（ａ）は存在しない（１９）。我々は最近、高コレステロール食を与えたＴｇウサギで、Ｌｐ（ａ）によって大動脈および冠動脈硬化病変の形成が促進することを報告した（２０，２１）。ＴｇウサギまたはＴｇマウスを対象とするこのような実験では、ａｐｏＢと結合する（Ｔｇウサギの場合）結合しない（Ｔｇマウスの場合）に関係なく、高コレステロール食の場合にａｐｏ（ａ）が動脈硬化病変の形成を促進する因子であることが明らかになったが、このような研究ではＬｐ（ａ）が動脈硬化複合病変を悪化させる因子になり得るかどうかという問いに答えられなかった。コレステロールを与えた動物で形成される病変は主に脂肪斑で、初期病変として定義されるが、これに対してヒトの動脈硬化複合病変はさらに進行しており、破裂および石灰化に関与していることが多いため、このようなモデルで回答を得るのは困難な問題である（２２）。虚血性発作および冠動脈心疾患のリスクを高め、多くの臨床徴候をもたらすのはこのような動脈硬化複合病変なのである。もうひとつの問題点は、コレステロールを与えた動物では、肝および腸に由来するレムナントリポタンパク（いわゆるβ−ＶＬＤＬ）が多く存在しているために、ヒトのように高ＬＤＬ値が原因で起こる動脈硬化症の成因と異なる可能性も否定できないということにある（２３）。
【０００５】
以下の非特許文献の番号は、本明細書中で括弧内で示された番号と一致するものである。
【非特許文献１】
Ｂｅｒｇ，　Ｋ．　（１９６３）　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　Ｓｃａｎｄ　５９，　３６９−３８２
【非特許文献２】
Ｍａｈｅｒ，　Ｖ．　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｂｒｏｗｎ，　Ｂ．　Ｇ．　（１９９５）　Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｌｉｐｉｄ　６，　２２９−２３５
【非特許文献３】
Ｄｊｕｒｏｖｉｃ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，　Ｋ．（１９９７）　Ｃｌｉｎ　Ｇｅｎｅｔ　５２，　２８１−２９２
【非特許文献４】
Ｍａｒｃｏｖｉｎａ，　Ｓ．　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｋｏｓｃｈｉｎｓｋｙ，　Ｍ．　Ｌ．　（１９９８）　Ａｍ　Ｊ　Ｃａｒｄｉｏｌ　８２，　５７Ｕ−６６Ｕ；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ　８６Ｕ．
【非特許文献５】
Ｒｉｄｋｅｒ，　Ｐ．Ｍ．，　Ｈｅｎｎｅｋｅｎｓ，　Ｃ．　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｓｔａｍｐｆｅｒ，　Ｍ．　Ｊ．　（１９９３）　ＪＡＭＡ　２７０，２１９５−２１９９
【非特許文献６】
Ｇｕｒｅｗｉｃｈ，　Ｖ．，　ａｎｄ　Ｍｉｔｔｌｅｍａｎ，　Ｍ．　（１９９４）．ＪＡＭＡ　２７１，　１０２５−１０２６
【非特許文献７】
Ｒａｔｈ，　Ｍ．，　Ｎｉｅｎｄｏｒｆ，　Ａ．，　Ｒｅｂｌｉｎ，　Ｔ．，　Ｄｉｅｔｅｌ，　Ｍ．，　Ｋｒｅｂｂｅｒ，　Ｈ．　Ｊ．，　ａｎｄ　Ｂｅｉｓｉｅｇｅｌ，　Ｕ．（１９８９）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　９，　５７９−５９２
【非特許文献８】
Ｊｕｒｇｅｎｓ，　Ｇ．，　Ｃｈｅｎ，　Ｑ．，　Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ，　Ｈ．，　Ｍａｉｒ，　Ｓ．，　Ｌｅｄｉｎｓｋｉ，　Ｇ．，　ａｎｄ　Ｄｉｎｇｅｓ，．　Ｈ．　Ｐ．（１９９３）　Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ　Ｔｈｒｏｍｂ　１３，　１６８９−１６９９
【非特許文献９】
Ｄａｎｇａｓ，　Ｇ．，　Ｍｅｈｒａｎ，　Ｒ．，　Ｈａｒｐｅｌ，　Ｐ．　Ｃ．，　Ｓｈａｒｍａ，　Ｓ．　Ｋ．，　Ｍａｒｃｏｖｉｎａ，　Ｓ．　Ｍ．，　Ｄｕｂｅ，Ｇ．，　Ａｍｂｒｏｓｅ，　Ｊ．　Ａ．，　ａｎｄ　Ｆａｌｌｏｎ，　Ｊ．　Ｔ．　（Ｉ９９８）Ｊ　Ａｍ　Ｃｏｌｌ　Ｃａｒｄｉｏｌ　３２，　２０３５−２０４２．
【非特許文献１０】
Ｌａｐｌａｕｄ，　Ｐ．Ｍ．，　Ｂｅａｕｂａｔｉｅ，　Ｌ．，　Ｒａｌｌ，　Ｓ．Ｃ．，　Ｊｒ．，　Ｌｕｃ，　Ｇ．，　ａｎｄ　Ｓａｂｏｕｒｅａｕ，　Ｍ．
（１９８８）　Ｊ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ　２９，　１１５７−１１７０
【非特許文献１１】
Ｌａｗｎ，　Ｒ．　Ｍ．，　Ｗａｄｅ，　Ｄ．　Ｐ．，　Ｈａｍｍｅｒ，　Ｒ．　Ｅ．，　Ｃｈｉｅｓａ，　Ｇ．，　Ｖｅｒｓｔｕｙｆｔ，　Ｊ．　Ｇ．，　ａｎｄ　Ｒｕｂｉｎ，．　Ｅ．　Ｍ．　（１９９２）　Ｎａｔｕｒｅ　３６０，　６７０−６７２
【非特許文献１２】
Ｌｉｕ，　Ａ．　Ｃ．，　Ｌａｗｎ，　Ｒ．　Ｍ．，　Ｖｅｒｓｔｕｙｆｔ，　Ｊ．　Ｇ．，　ａｎｄ　Ｒｕｂｉｎ，　Ｅ．Ｍ．（１９９４）Ｊ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ　３５，　２２６３−２２６７
【非特許文献１３】
Ｌａｗｎ，　Ｒ．　Ｍ．，　Ｐｅａｒｌｅ，　Ａ．Ｄ．，　Ｋｕｎｚ，　Ｌ．　Ｌ，　Ｒｕｂｉｎ，　Ｅ，　Ｍ．，　Ｒｅｃｋｌｅｓｓ，　Ｊ．，　Ｍｅｔｃａｌｆｅ，　Ｊ．Ｃ．，　ａｎｄ　Ｇｒａｉｎｇｅｒ，　Ｄ．　Ｊ．　（１９９６）　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７１，　３１３６７−３１３７１
【非特許文献１４】
Ｂｏｏｎｍａｒｋ，　Ｎ．　Ｗ．，　Ｌｏｕ，　Ｘ．　Ｊ．，　Ｙａｎｇ，　Ｚ．　Ｊ．，　Ｓｃｈｗａｒｔｚ，　Ｋ．，　Ｚｈａｎｇ，　Ｊ．　Ｌ．，　Ｒｕｂｉｎ，　Ｅ．Ｍ．，　ａｎｄ　Ｌａｗｎ，　Ｒ．　Ｍ．　（１９９７）　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１００，　５５８−５６４
【非特許文献１５】
Ｍａｎｃｉｎｉ，　Ｆ．　Ｐ．，　Ｎｅｗｌａｎｄ，　Ｄ．　Ｌ．，　Ｍｏｏｓｅｒ，　Ｖ．，Ｍｕｍｔａ，　Ｊ．，　Ｍａｒｃｏｖｉｎａ，　Ｓ．，　Ｙｏｕｎｇ，　Ｓ　Ｇ．，　Ｈａｍｍｅｒ，　Ｒ．　Ｅ．，　Ｓａｎａｎ，　Ｄ．　Ａ．，．　ａｎｄ　Ｈｏｂｂｓ，．Ｈ．Ｈ．（１９９５）　Ａｒｔｅｒｉｓｃｌｅｒ．　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｖａｓｃ．　Ｂｉｏｌ．　１５，　１９１１−１９１６
【非特許文献１６】
Ｓａｎａｎ，　Ｄ．　Ａ．，　Ｎｅｗｌａｎｄ，　Ｄ．　Ｌ．，　Ｔａｏ，　Ｒ．，　Ｍａｒｃｏｖｉｎａ，　Ｓ．，　Ｗａｎｇ，　Ｊ．，　Ｍｏｏｓｅｒ，　Ｖ．，　Ｈａｍｍｅｒ，　Ｒ．　Ｅ．，　ａｎｄ　Ｈｏｂｂｓ，　Ｈ．　Ｈ．　（１９９８）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　９５，　４５４４−４５４９
【非特許文献１７】
Ｆａｎ，　Ｊ．，　Ａｒａｋｉ，　Ｍ．，　Ｗｕ，Ｌ．，　Ｃｈａｌｌａｈ，Ｍ．，　Ｓｈｉｍｏｙａｍａｄａ，　Ｈ．，　Ｌａｗｎ，　Ｍ．　Ｒ．，
Ｋａｋｕｔａ，　Ｈ．，　Ｓｈｉｋａｍａ，　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｔ．　（１９９９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙ．　Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．　２５５，　６３９−６４４
【非特許文献１８】
Ｒｏｕｙ，　Ｄ．，　Ｄｕｖｅｒｇｅｒ，　Ｎ．，　Ｌｉｎ，　Ｓ．　Ｄ．，　Ｅｍｍａｎｕｅｌ，　Ｆ．，Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，　Ｌ．Ｍ．，　Ｄｅｎｅｆｌｅ，　Ｐ．，　Ｖｉｇｌｉｅｔｔａ，　Ｃ．，　Ｇｏｎｇ，　Ｅ．，　Ｒｕｂｉｎ，　Ｅ．　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｈｕｇｈｅｓ，　Ｓ．　Ｄ．　（１９９８）　ＪＢｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７３，　１２４７−１２５１．
【非特許文献１９】
Ｃｈｉｅｓａ，　Ｇ．，　Ｈｏｂｂｓ，　Ｈ．　Ｈ．，　Ｋｏｓｃｈｉｎｓｋｙ，　Ｍ．　Ｌ．，　Ｌａｗｎ，　Ｒ．　Ｍ．，　Ｍａｉｋａ，　Ｓ．　Ｄ．，　ａｎｄ　Ｈａｍｍｅｒ，　Ｒ．　Ｅ．　（１９９２）　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６７，　２４３６９−２４３７４
【非特許文献２０】
Ｆａｎ，　Ｊ．，　Ｓｈｉｍｏｙａｍａｄａ，　Ｈ．，　Ｓｕｎ，　Ｈ．，　Ｍａｒｃｏｖｉｎａ，　Ｓ．，　Ｈｏｎｄａ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｔ．　（２００１）　Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｖａｓｃ　Ｂｉｏｌ　２１，　８８−９４
【非特許文献２１】
Ｉｃｈｉｋａｗａ，　Ｔ．，　Ｕｎｏｋｉ，　Ｈ．，　Ｓｕｎ，　Ｈ．，　Ｓｈｉｍｏｙａｍａｄａ，　Ｈ．，　Ｍａｒｃｏｖｉｎａ，Ｓ．　Ｍ．，
Ｓｈｉｋａｍａ，　Ｈ．，　Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｔ．，　ａｎｄ　Ｆａｎ，　Ｊ．　（２００２）　Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ　１６０，　２２７−２３６
【非特許文献２２】
Ｓｔａｒｙ，　Ｈ．　Ｃ．，　Ｃｈａｎｄｌｅｒ，　Ａ．　Ｂ．，　Ｄｉｎｓｍｏｒｅ，　Ｒ．　Ｅ．，　Ｆｕｓｔｅｒ，　Ｖ．，　Ｇｌａｇｏｖ，　Ｓ．，　Ｉｎｓｕｌｌ，Ｗ．，　Ｊｒ．，　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，　Ｍ．　Ｅ．，　Ｓｃｈｗａｒｔｚ，　Ｃ．　Ｊ．，　Ｗａｇｎｅｒ，　Ｗ．　Ｄ．，　ａｎｄ　Ｗｉｓｓｌｅｒ，　Ｒ．　Ｗ．（１９９５）　Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｖａｓｃ　Ｂｉｏｌ　１５，　１５１２−１５３１．
【非特許文献２３】
Ｋｒｏｏｎ，　Ｐ．　Ａ．，　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，　Ｇ．Ｍ．，　ａｎｄ　Ｃｈａｏ，　Ｙ．　Ｓ．（１９８５）　Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．　５６，
３２３−３２９．
【非特許文献２４】
Ｙａｍａｍｏｔｏ，　Ｔ．，　Ｂｉｓｈｏｐ，　Ｒ．　Ｗ．，　Ｂｒｏｗｎ，　Ｍ．　Ｓ．，　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，　Ｊ．　Ｌ．，　ａｎｄ　Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．　（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２，　１２３０−１２３７
【非特許文献２５】
Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｙ．　（１９８０）　Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　３６，　２６１−２６８
【非特許文献２６】
Ｆａｎ，　Ｊ．，　Ｃｈａｌｌａｈ，　Ｍ．，　Ｓｈｉｍｏｙａｍａｄａ，　Ｈ．，　Ｓｈｉｏｍｉ，　Ｍ．，　Ｍａｒｃｏｖｉｎａ，　Ｓ．，　ａｎｄ
Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｔ．　（２０００）　Ｊ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ　４１，　１００４−１０１２
【非特許文献２７】
Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，　Ｖ．　Ｗ．，　Ｃｒｅｍｅｒ，　Ｐ．，　Ｅｂｅｒｌｅ，．　Ｅ．，　Ｍａｎｋｅ，．　Ａ．，　Ｓｃｈｕｌｚｅ，　Ｆ．，　Ｗｉｅｌａｎｄ，　Ｈ．，Ｋｒｅｕｚｅｒ，　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｓｅｉｄｅｌ，　Ｄ．　（１９８６）　Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　６２，　２４９−２５７
【非特許文献２８】
Ｓｅｅｄ，　Ｍ．，　Ｈｏｐｐｉｃｈｌｅｒ，　Ｆ．，　Ｒｅａｖｅｌｅｙ，　Ｄ．，　ＭｃＣａｒｔｈｙ，　Ｓ．，　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，　Ｇ．Ｒ．，
Ｂｏｅｒｗｉｎｋｌｅ，　Ｅ．，　ａｎｄ　Ｕｔｅｒｍａｎｎ，　Ｇ．　（１９９０）　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　３２２，　１４９４−１４９９
【非特許文献２９】
Ｃａｎｔｉｎ，　Ｂ．，　Ｇａｇｎｏｎ，　Ｆ．，　Ｍｏｏｒｊａｎｉ，　Ｓ．，　Ｄｅｓｐｒｅｓ，　Ｊ．Ｐ．，　Ｌａｍａｒｃｈｅ，　Ｂ．，　Ｌｕｐｉｅｎ，　Ｐ．　Ｊ．，　ａｎｄ　Ｄａｇｅｎａｉｓ，　Ｇ．　Ｒ．　（１９９８）Ｊ　Ａｍ　Ｃｏｌｌ　Ｃａｒｄｉｏ１　３１，　５１９−５２５．
【非特許文献３０】
Ｆａｎ，　Ｊ．，　Ｊｉ，　Ｚ．−Ｓ．，　Ｈｕａｎｇ，　Ｙ．，　ｄｅ　Ｓｉｌｖａ，　Ｈ．，　Ｓａｎａｎ，　Ｄ．，　Ｍａｈｌｅｙ，　Ｒ．，　Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ，　Ｔ，　ａｎｄ　Ｔａｙｌｏｒ，　Ｊ．　（１９９８）　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１０１，　２１５１−２１６４
【非特許文献３１】
Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ．，　Ｈｉｎｍａｎ，　Ｊ．，　Ｍａｒｃｏｖｉｎａ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｓｃａｎｕ，Ａ．Ｍ．　（２００１）Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　２８８，２０１−２０８．
【非特許文献３２】
Ｐａｒｈａｍｉ，　Ｆ．，　Ｍｏｒｒｏｗ，　Ａ．Ｄ．，　Ｂａｌｕｃａｎ，　Ｊ．，　Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒ，　Ｎ．，　Ｗａｔｓｏｎ，　Ａ．Ｄ．，　Ｔｉｎｔｕｔ，Ｙ．，　Ｂｅｒｌｉｎｅｒ，　Ｊ．　Ａ．，　ａｎｄ　Ｄｅｍｅｒ，　Ｌ．Ｌ．　（１９９７）　Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ　ＶａｓｃＢｉｏｌ　１７，６８０−６８７．
【非特許文献３３】
Ｖｅｎｉａｎｔ，　Ｍ．　Ｍ．，　Ｓｕｌｌｉｖａｎ，　Ｍ．　Ａ．，　Ｋｉｍ，　Ｓ．　Ｋ．，　Ａｍｂｒｏｚｉａｋ，　Ｐ．，　Ｃｈｕ，　Ａ．，　Ｗｉｌｓｏｎ，　Ｍ．Ｄ．，　Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ，　Ｍ．　Ｋ．，　Ｒｕｄｅｌ，　Ｌ．　Ｌ．，　Ｗａｌｚｅｍ，　Ｒ．　Ｌ．，　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ，　Ｓ．Ｇ．　（２０００）Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　１０６，　１５０１−１５１０．
【非特許文献３４】
Ｕｔｅｒｍａｎｎ，　Ｇ．　（１９９５）　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｓｅｓ　ｏｆ　ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ
Ｄｉｓｅａｓｅ　（Ｓｃｒｉｖｅ　ＣＲ，　Ｂ．　Ａ．，　Ｓｌｙ　ＷＳ，，　ｅｄ），　ｐｐ．　１８８７−１９１２，　ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，　ＮｅｗＹｏｒｋ
【非特許文献３５】
Ｈｓｕ，　Ｈ．　Ｈ．，　Ｃａｍａｃｈｏ，　Ｎ．Ｐ．，　Ｓｕｎ，　Ｆｉ．，Ｔａｗｆｉｋ，　Ｏ．，　ａｎｄ　Ａｏｎｏ，　Ｈ．（２０００）　Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　１５３，　３３７−３４８．
【非特許文献３６】
Ｄｅｍｅｒ，　Ｌ．　Ｌ．　（１９９１）　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８３，　２０８３−２０９３．
【非特許文献３７】
Ｄｏｈｅｒｔｙ，　Ｔ．　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｄｅｔｒａｎｏ，　Ｒ．　Ｃ．　（１９９４）　Ｃａｌｃｉｆ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｉｎｔ　５４，　２２４−２３０．
【非特許文献３８】
Ｐａｒｈａｍｉ，　Ｆ．，　Ｔｉｎｔｕｔ，　Ｙ．，　Ｐａｔｅｌ，　Ｊ．　Ｋ．，　Ｍｏｄｙ，　Ｎ．，　Ｈｅｍｍａｔ，　Ａ．，　ａｎｄ．Ｄｅｍｅｒ，Ｌ．Ｌ．（２００１）　Ｚ　Ｋａｒｄｉｏｌ　９０，　２７−３０．
【非特許文献３９】
Ｔｉｎｔｕｔ，　Ｙ．，　ａｎｄ　Ｄｅｍｅｒ，．　Ｌ．　Ｌ．　（２００１）　Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｌｉｐｉｄｏｌ　１２，　５５５−５６０．
【非特許文献４０】
Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，　Ｄ．，　Ｓｋｅｐｐｅｒ，　Ｊ．　Ｎ．，　Ｓｈａｎａｈａｎ，　Ｃ．　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇ，　Ｐ．　Ｌ．　（１９９８）　Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｖａｓｃ　Ｂｉｏｌ　１８，　３７９−３８８
【非特許文献４１】
Ｈａｎｓｅｎ，　Ｐ．　Ｒ．，　Ｋｈａｒａｚｍｉ，　Ａ，　Ｊａｕｈｉａｉｎｅｎ，　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｅｈｎｈｏｌｍ，　Ｃ．　（１９９４）　Ｅｕｐ　ＪＣｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　２４，　４９７−４９９
【非特許文献４２】
Ｇａｌｌｅ，　Ｊ．，　Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，　Ｒ．，　Ｈｅｉｎｌｏｔｈ，　Ａ．，　Ｗａｎｎｅｒ，　Ｃ．，　Ｇａｌｌｅ，　Ｐ．　Ｒ．，　Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ，　Ｅ．，　Ｄｉｍｍｅｌｅｒ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｈｅｅｒｍｅｉｅｒ，　Ｋ．　（１９９９）　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ５５，　１４５０−１４６１．
【非特許文献４３】
Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，　Ｄ．，　Ｓｋｅｐｐｅｒ，　Ｊ．　Ｎ．，　Ｈｅｇｙｉ，　Ｌ．，　Ｂｅｎｎｅｔｔ，　Ｍ．　Ｒ．，　Ｓｈａｎａｈａｎ，　Ｃ．　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇ，　Ｐ．　Ｌ．　（２０００）　Ｃｉｒｃ　Ｒｅｓ　８７，　１０５５−１０６２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、さらにＬｐ（ａ）の動脈硬化複合病変への関与を調べるために、ヒトａｐｏ（ａ）Ｔｇウサギとヒトの家族性高コレステロール血症（ＦＨ）の動物モデルであるＷＨＨＬウサギとを交配して、ａｐｏ（ａ）Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギを作製した。ＷＨＨＬウサギはＬＤＬ受容体機能が欠損している（２４）。このａｐｏ（ａ）Ｔｇ　ＷＨＨＬモデルは普通食餌でＬＤＬコレステロールの血漿濃度が高くなり、ヒトに類似した動脈硬化病変を形成するため、Ｌｐ（ａ）の動脈硬化病変への関与を調べる理想的な動物モデルである（２５）。さらに、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギはＬＤＬ受容体が欠損するため、野生型ａｐｏ（ａ）Ｔｇウサギに比べて、血漿中のＬｐ（ａ）濃度が４倍高い（２６）。一方、疫学的研究により、家族性高コレステロール血症患者は健常集団よりＬＰ（ａ）値が高いことが明らかにされており、ＬＤＬコレステロール値が高いとＬｐ（ａ）濃度が有意に上昇することが示唆されている（２７，２８）。それ故、高値のＬｐ（ａ）はＬＤＬコレステロール値が高い患者にとって、冠動脈心疾患のより一層強い危険因子になるのではないかと示唆する研究者らもいる（２９）。
【０００７】
したがってａｐｏ（ａ）Ｔｇ　ＷＨＨＬモデルを用いて、Ｌｐ（ａ）とＬＤＬの血漿濃度が高い状態での動脈硬化複合病変形成における影響を明らかにすることも可能である。我々は本研究により、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギではｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギに比べて広範な動脈硬化複合病変を形成していることを明らかにした。我々の知る限り、本発明はＬｐ（ａ）が動脈硬化複合病変形成と石灰化を促進する作用をもつことを示した世界で最初の知見に基づくものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、以下の各態様に係る。
１．大動脈弓及び胸／腹大動脈に進行性アテローム病変を有することを特徴とする、ヒトアポリポタンパク（ａ）を発現するトランスジェニックウサギとホモ接合Ｗａｔａｎａｂｅ家族性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギとの交配から得られたウサギ［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／−］又は［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／＋］）。
２．血管におけるカルシウム沈着又は石灰化が見られることを特徴とする、ヒトアポリポタンパク（ａ）を発現するトランスジェニックウサギとホモ接合Ｗａｔａｎａｂｅ家族性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギとの交配から得られたウサギ［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／−］又は［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／＋］）。
３．リポタンパク（ａ）から成る、血管の石灰化を促進する因子。
４．リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞におけるカルシウム蓄積を亢進する因子。
５．リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞におけるＭＧＰのｍＲＮＡ発現を増加する因子。
６．リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞におけるＯＰＮのｍＲＮＡ発現を減少させる因子。
７．リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞におけるアルカリフォスファターゼ活性を増強させる因子。
８．リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞におけるＯｓｆ２のｍＲＮＡ発現を誘導させる因子。
９．リポタンパク（ａ）がヒト由来である、態様３ないし８のいずれか一項に記載の因子。
１０．リポタンパク（ａ）が、ヒトアポリポタンパク（ａ）を発現するトランスジェニックウサギ由来である、態様３ないし８のいずれか一項に記載の因子。
１１．リポタンパク（ａ）の機能を阻害又は抑制する因子を含む医薬組成物。
１２．血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する作用を有することを特徴とする、態様１１記載の医薬組成物。
１３．アテローム硬化症の治療薬であることを特徴とする、態様１１記載の医薬組成物。
１４．態様３ないし１０のいずれか一項に記載の因子に対する抗体。
１５．ヒトアポリポタンパク（ａ）に対する抗体。
１６．態様１４又は１５に記載の抗体から成る、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化の抑制剤。
１７．態様１４又は１５に記載の抗体から成る、アテローム硬化症の治療剤。
１８．アポリポタンパク（ａ）遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１９．ＤＮＡオリゴマーである態様１８記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２０．態様１８又は１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化の抑制剤。
２１．態様１８又は１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る、アテローム硬化症の治療剤。
２２．リポタンパク（ａ）の作用を阻害することにより、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する方法。
２３．態様１４又は１５に記載の抗体との反応によってリポタンパク（ａ）の作用を阻害することにより、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する方法。
２４．リポタンパク（ａ）の産生を抑制することにより、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する方法。
２５．アポリポタンパク（ａ）遺伝子の発現を制御することにより、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する方法。
２６．態様１８又は１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドとの反応によって、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制することを特徴とする、態様２３又は２４に記載の方法。
２７．リポタンパク（ａ）の作用を阻害することにより、アテローム硬化症を治療する方法。
２８．態様１４又は１５に記載の抗体との反応によってリポタンパク（ａ）の作用を阻害することにより、進行性アテローム硬化症を治療するする方法。
２９．リポタンパク（ａ）の産生を抑制することにより、アテローム硬化症を治療する方法。
３０．アポリポタンパク（ａ）遺伝子の発現を制御することにより、アテローム硬化症を治療する方法。
３１．態様１８又は１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドとの反応によって、アテローム硬化症を治療することを特徴とする、態様２９又は３０に記載の方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明に係るウサギ（［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／−］又は［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／＋］）は、トランスジェニックウサギとホモ接合Ｗａｔａｎａｂｅ家族性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギとから、当業者に公知の連続育種法により得られたものである。このウサギは、実施例に記載されているような特徴を有し、例えば、大動脈弓及び胸／腹大動脈に進行性アテローム病変を有し、又、血管におけるカルシウム沈着又は石灰化が見られる。このウサギは、高Ｌｐ（ａ）患者のアテローム硬化症治療において、いくつかの薬剤の利点を試験するためのきわめて有用なモデルである。
【００１０】
リポタンパク（ａ）から成る本発明に係る因子は、血管の石灰化を促進する機能、大動脈平滑筋細胞におけるカルシウム蓄積を亢進する機能、大動脈平滑筋細胞におけるＭＧＰのｍＲＮＡ発現を増加する機能、大動脈平滑筋細胞におけるオステオポンチン（ＯＰＮ）のｍＲＮＡ発現を減少させる機能、大動脈平滑筋細胞におけるアルカリフォスファターゼ活性を増強させる機能、及び、大動脈平滑筋細胞におけるＯｓｆ２のｍＲＮＡ発現を誘導させる機能などを有するものである。
このリポタンパク（ａ）は各種動物、特にヒト及びヒトアポリポタンパク（ａ）を発現するトランスジェニックウサギ由来である。又、大動脈平滑筋細胞はヒト及びウサギ等の哺乳類由来のものである。
【００１１】
本発明の医薬組成物は、上記に示されたようなリポタンパク（ａ）の各種機能を阻害又は抑制する因子を有効成分として含有するものである。
この医薬組成物生物は、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する作用を有し、又は、アテローム硬化症の治療薬として有用である。
このような因子は、例えば、本明細書に記載された大動脈平滑筋細胞を用いる各ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養系を利用して、リポタンパク（ａ）の機能を阻害又は抑制する作用に基づいて、当業者であれば容易にスクリーニングし、同定・単離することが出来る。
医薬組成物中には、当業者に公知の薬学上許容できる任意の各種補助剤を適当量含有させることができる。
医薬組成物中の有効成分及び各種補助剤の含有量は、それら各成分の種類、治療目的、治療対象の体重、年齢、及び性別、並びに疾患の程度等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。
【００１２】
ヒトアポリポタンパク（ａ）又はヒトリポタンパク（ａ）から成る因子に対する本発明の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル等の任意の種類の抗体であり得る。これらの各種抗体は、当業者に公知の適当な方法で容易に作製することが出来る。こうして得られる抗体は、例えば、血管におけるカルシウム沈着或いは石灰化の抑制剤、又は、アテローム硬化症の治療剤として有用である。
【００１３】
本発明のアポリポタンパク（ａ）遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知である当該遺伝子配列に基づき当業者が容易に設計し製造することが出来る。それは、例えば、ＤＮＡオリゴマー又はｓｃＲＮＡである。
こうして得られるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、血管におけるカルシウム沈着或いは石灰化の抑制剤、又は、アテローム硬化症の治療剤として有用である。
【００１４】
本発明の抑制剤及び治療剤中には、当業者に公知の薬学上許容できる任意の各種補助剤を適当量含有させることができる。
各薬剤中の有効成分及び各種補助剤の含有量は、それら各成分の種類、治療目的、治療対象の体重、年齢、及び性別、並びに疾患の程度等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。
【００１５】
本発明は、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制したり、又は、進行性アテローム硬化症を治療する方法に係る。
これらの本発明方法は、例えば、上記の医薬組成物、若しくは本発明の抗体を使用することによってリポタンパク（ａ）の作用を阻害したり、更に、例えば、上記の医薬組成物、若しくは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することによってリポタンパク（ａ）の産生を抑制したり、アポリポタンパク（ａ）遺伝子の発現を制御することにより、実施することが出来る。
本発明方法において、医薬組成物、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は各種薬剤の使用時期、使用頻度、及び使用量等は、治療目的、治療対象の体重、年齢、及び性別、並びに疾患の程度等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。
【００１６】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１７】
実験方法
ヒトａｐｏ（ａ）　Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギ
ヒトａｐｏ（ａ）を発現するＴｇウサギは、既報の方法（２６）に従いホモ接合ＷＨＨＬウサギと交配した。連続育種法を用いて、ｎｏｎ−Ｔｇ（野生型）ホモ接合ＷＨＨＬウサギ［ＬＤＬｒ−／−］およびヒトａｐｏ（ａ）を発現するホモ接合Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギ［ＬＤＬｒ−／−，　ａｐｏ（ａ）＋／−］の２群のＷＨＨＬウサギを得た。ヒトａｐｏ（ａ）導入遺伝子の存在はヒトａｐｏ（ａ）ｃＤＮＡプローブを用いたサザンブロッティング法で確認し、ＬＤＬ受容体の遺伝型はＰＣＲ解析法で同定した（２６）。計８匹のＴｇ　ＷＨＨＬウサギと７匹の同腹ｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギを得て、７〜８ヵ月齢時に動脈硬化病変の病理学的解析を行った。
【００１８】
血漿中の脂質、リポタンパク、アテローム性病変の解析
７ヵ月齢のＴｇ　ＷＨＨＬウサギの血漿中の脂質およびリポタンパクの分布を同月齢のｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギと比較した（３０）。Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギの血漿Ｌｐ（ａ）値を測定した（２６）。大動脈病変の解析はズダンＩＶで染色した後、画像解析装置を用いて病変面積を測定した（２０）。大動脈の病変部位を病理学的に解析するため、大動脈弓、胸大動脈、腹大動脈の重複しない３部位から、大動脈の各部を横断面に切除した（２１）。すべての切片をパラフィン包埋し、ヘマトキシリン・エオジンおよびエラスチカ・ワンギーソンで染色した。各切片の内膜肥厚の程度はコンピュータによる画像解析システムで測定した。
病変部の細胞成分およびリポタンパク沈着を調べるために、既報の方法（２１）に従い免疫組織化学的染色を行った。さらに、筑波大学附属病院から急性心筋梗塞で死亡した患者の剖検冠動脈検体１２例を入手し、上記の方法で石灰化とＬＰ（ａ）蓄積の相関を評価した。
【００１９】
ＳＭＣ石灰化のｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験
ウサギ大動脈より平滑筋細胞（ＳＭＣ）を分離し、２０％ＦＢＳを含む最小必須培地（ＭＥＭ，　Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）で培養した。当研究室の健常者６名から血漿を採取し、既報（３１）に従い一連の超遠心分離とゲルろ過クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−４００，　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）によってヒトＬＰ（ａ）を精製した。抗ａｐｏ（ａ）および抗ａｐｏＢ抗体（Ａｂ）を用いたウェスタンブロッティング法により、精製したタンパク質がＬｐ（ａ）であることを確認した。Ｌｐ（ａ）が内毒素に汚染されていないことを確認した（＜１０ｐｇ／ｍＬ）。
Ｌｐ（ａ）で処理後、既報（３２）にしたがって、ＳＭＣの細胞関連アルカリホスファターゼ活性およびカルシウムの蓄積を測定した。カルシウム沈着を直接視覚化するために、５〜３０ｍｇ／ｄｌのＬｐ（ａ）にＳＭＣを１３日間曝露し、ファン・コッサ染色法で染色した（３２）。
【００２０】
逆転写ＰＣＲ解析
定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは次のとおりである。（１）オステオポンチン（ＯＰＮ）５’−ＴＴＣ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＧＴＣ　ＧＴＴ　ＣＣＣ　ＡＣ−３’および５’−ＴＴＴ　ＣＡＴ　ＡＴＴ　ＧＧＣ　ＴＧＧ　ＣＡＴ　ＣＴＴ　Ｇ−３’。（２）骨芽細胞特異因子−２（Ｏｓｆ２）５’−ＡＣＡ　ＴＡＴ　ＴＣＣ　ＧＣＧ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＴＣ−３’および５’−ＡＴＴ　ＣＧＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＣＧＴ　ＧＴＣ　ＴＣ−３’。（３）基質Ｇｌａタンパク（ＭＧＰ）５’−ＧＣＣ　ＴＧＣ　ＴＴＣ　ＴＴＣ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＴＴＣ−３’および５’−ＧＴＡ　ＣＡＴ　ＡＴＣ　ＡＧＴ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＧＣ−３’。（４）β−アクチン５’−ＡＴＣ　ＴＧＧ　ＣＡＣ　ＣＡＣ　ＡＣＣ　ＴＴＣ　ＴＡＣ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＣＧ−３’および５’−ＣＧＴ　ＣＡＴ　ＡＣＴ　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＴＧＣ　ＴＧＡ　ＴＣＣ　ＡＣＡ　ＴＣＴ　ＧＣ−３’。
【００２１】
トリゾール試薬（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を用いて、ＳＭＣからＲＮＡを単離し、ＱＩＡＧＥＮ　ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲキットを用いてＲＴ−ＰＣＲ法で解析した。各ＲＴ−ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲルで電気泳動し、Ｖｉｓｔｒａ　Ｇｒｅｅｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で染色した。ＲＴ−ＰＣＲ生成物の濃度はＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ　５９５（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて測定した。ＲＴ−ＰＣＲ産物がプライマー特異的増幅産物であることをＤＮＡ塩基配列解析により確認した。
【００２２】
統計解析
血漿中の脂質とｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験のデータは、スチューデントのｔ検定を用いて統計的有意性を評価した。動脈硬化病変面積の解析結果はマン・ホイットニーのＵ検定を用いて、統計的有意差を評価した。全例について統計的有意性をＰ＜０．０５に設定した。
【００２３】
結果
血漿中の脂質とリポタンパク
普通食餌によって、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギおよびｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギが同等に高脂血症を発症した（総コレステロール：７９１±１４１ｍｇ／ｄＬ，　Ｔｇ（ｎ＝８）と７１７±１３５ｍｇ／ｄＬ，　ｎｏｎ−Ｔｇ（ｎ＝７）、トリグリセリド：２１６±５２ｍｇ／ｄＬ，　Ｔｇと２５０±５５ｍｇ／ｄＬ，　ｎｏｎ−Ｔｇ，　Ｐ＞０．０５）。Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギにおけるＬｐ（ａ）の平均血漿濃度は１５．４±２．２ｍｇ／ｄＬであった。アガロースゲル電気泳動によるリポタンパク分布を解析することによって、ＷＨＨＬウサギはＴｇでもｎｏｎ−Ｔｇでも、正常な野生型ウサギに比べて、βに移動するリポタンパクが著しく増加し、αに移動するリポタンパクが減少していることが示された（図１Ａ）。非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、ウェスタンブロッティングを行い、ヒトａｐｏ（ａ）がウサギＬＤＬに結合して、Ｌｐ（ａ）複合体を形成することがわかった（図１Ｂ）。非還元条件下、高分子として存在するごく少量（約２０％）の血漿ａｐｏ（ａ）がウサギａｐｏＢと共存しており、このことは共有結合および共有結合以外の結合によって、ＴｇウサギのＬｐ（ａ）様粒子［ヒトａｐｏ（ａ）／ウサギａｐｏＢ］が産生されることを示唆している（図１Ｃ）。異なる密度でリポタンパク画分を解析することによって、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギがｎｏｎ−Ｔｇウサギとほぼ同量のａｐｏＢ，　ＡｐｏＥおよびＡｐｏＡＩを有していることが明らかになった（図１Ｄ）。Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギでは、ヒトａｐｏ（ａ）が主にｄ＝１．０２〜１．０８ｇ／ｍＬ（Ｆ３〜Ｆ５）で分布し、ａｐｏＢを含有するリポタンパクもこの範囲に分布する（図１Ｄ）。注目すべきは、少量のヒトａｐｏ（ａ）がたとえばＶＬＤＬ（ｄ＜１．００６ｇ／ｍＬ）および中間密度リポタンパク（ｄ＝１．００６〜１．０２ｇ／ｍＬ，　Ｆ２）画分など、密度の低い画分でも確認されており、このことはＬＤＬのほかに、ａｐｏ（ａ）がａｐｏＢを含有する他の大きい粒子に結合できることを示唆している。密度による血漿画分中の脂質を定量化することによって、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギがｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギとほぼ同じリポタンパクの分布パターンを有することがわかった。
【００２４】
大動脈アテローム硬化
病変発現の組織分布的かつ空間的評価を行うために、我々はスダン好性ｅｎ　ｆａｃｅ（正面）病変面積及び内膜肥厚を測定した。大動脈全体のｅｎ　ｆａｃｅ病変部はＴｇウサギとｎｏｎ−Ｔｇウサギに有意差がなく、２７．７±８．４％，　Ｔｇ　ＷＨＨＬ，　ｎ＝７と２６．６±８．４％，　ｎｏｎ−Ｔｇ，　ｎ＝８，　ｐ＝０．３であった。Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギのスダン染色病変は、ｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギより著明に厚かったので、さらに各部位の内膜病変を定量的に評価した。Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギの内膜病変部はｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギに比べて有意に多く、大動脈弓で３．３倍（Ｐ＜０．０１）、胸／腹大動脈で２倍（Ｐ＝０．０８）であった（図２Ａ）。Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギのアテローム性病変の病理学的特徴はｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギとは著明に異なった。ｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギでは、アテローム性病変は脂肪斑であり、混在したＳＭＣの小個体群とともにマクロファージ由来の泡沫細胞に富んでいた（図２Ｂ、上の写真）。明確に異なるのは、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギでは進行病変が形成されており、アテローム、線維性アテロームおよび石灰化を含んでいることである（図２Ｂ、下３つの写真）。このような病変は線維性の被膜層で覆われ、カルシウム沈着または石灰化に関係することが多い壊死性コアまたは脂質コアを含むため、進行性アテローム性病変とした。免疫組織化学的染色法によって、壊死性コアがマクロファージ由来泡沫細胞を含むのに対して、肥厚した線維性の被膜層は主にＳＭＣから成っていた（図２Ｂ）。
【００２５】
病変の質がＴｇ　ＷＨＨＬウサギとｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギとできわめて異なるため、さらに大動脈弓で各種病変が占める領域を定量化し、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギの病変分布とｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギのそれを比較した。そのため米国心臓学会の分類（２２）をもとにこの病変を３つのカテゴリーに恣意的に分類した。その３つのカテゴリーとは、脂肪斑（ＩＩ型）、アテローマ（ＩＶ型）および線維性アテローマ（Ｖａ型）を含む線維性プラーク、カルシウム沈着または石灰化のいずれかを含む合併プラーク（Ｖｂ型）である。図２Ｃに示すように、脂肪斑の病変面積はＴｇ　ＷＨＨＬウサギとｎｏｎ−ＴｇＷＨＨＬウサギで著明な差がない。しかし、線維性プラークの病変部および進行性病変（ＩＶ型およびＶ型）はｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギに比べ、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギで著しく大きかった。
本研究により、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギのいくつかの病変で血管の石灰化が病変の侵食または破裂を明らかに増強しているように思われるため、我々はＴｇ　ＷＨＨＬウサギの進行性病変に関連する著しい血管の石灰化に特に関心を持った（図３Ａ）。ａｐｏ（ａ）およびａｐｏＢに対するＡｂを用いた免疫染色によって、ａｐｏ（ａ）が石灰化領域の周囲に蓄積し、ａｐｏＢと共存することが多いことがわかった（図３Ｂ）。ａｐｏ（ａ）はＴｇＷＨＨＬウサギの線維性プラークの脂質コアでも確認されているが、これは石灰化に関連することが多い（図３Ｃ）。大動脈全体のＸ線解析によって、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギで大動脈、特に病変の生じやすい部位（肋間動脈口）に多くの石灰化部位が存在したが、ｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギではそのような部位は認められなかった（図３Ｄ）。
【００２６】
ＳＭＣの石灰化に対するＬｐ（ａ）の作用
Ｌｐ（ａ）がＴｇ　ＷＨＨＬウサギで認められる血管の石灰化を加速する制御因子として働くかどうかという論点に答えるため、培養ＳＭＣでカルシウム蓄積に対するヒトＬｐ（ａ）の作用を調べた。生理的濃度のＬｐ（ａ）を添加することによって、ＳＭＣのカルシウム取り込みが著しく増加し、その作用は用量依存的かつ時間依存的であった（図４Ａ）。さらに、Ｌｐ（ａ）で処理したＳＭＣは、２日目および４日目にカルシウム結合タンパクである基質Ｇｌａタンパク（ＭＧＰ）のｍＲＮＡ発現を増強した（図４Ｂ、左）。２日目にオステオポンチン（ＯＰＮ）発現がやや増加したが、４日目に著しく低下した（図４Ｂ、右）。しかもＬｐ（ａ）は細胞内アルカリホスファターゼ活性を増強しながら、骨芽細胞特異因子−２（Ｏｓｆ２　）ｍＲＮＡ発現を誘導して、骨芽細胞の分化誘導と同様の現象が観察された（図５Ｃ）。比較的高濃度である３０ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）でＳＭＣを３日間インキュベートすると、このＳＭＣは小結節性形成物の数が対照に比べて多くなった（図５Ｄ）。Ｌｐ（ａ）添加１３日後、ファン・コッサ染色によってカルシウム沈着が明瞭に示された（図５Ｅ）。
【００２７】
ヒトアテローム硬化症にみるＬｐ（ａ）の沈着と石灰化
Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギの方が広範な進行性病変を有するという知見と培養ＳＭＣでのＬｐ（ａ）のカルシウム沈着誘導能とが、石灰化がヒトのアテローム硬化症をきたした血管壁のＬｐ（ａ）沈着に関連するのか、我々が調べる契機となった。複数の患者から得た典型的冠動脈アテローム硬化症の３検体では種々の程度の石灰化が認められ、び漫性（陳旧性）石灰化（図６Ａ，Ｂ）または細胞成分に関連する低密度のカルシウム沈着（図６Ｃ）を認めるいずれかの部位の近傍でＬｐ（ａ）が検出されることを確認した。
【００２８】
考察
我々は本研究によって初めてＴｇ　ＷＨＨＬウサギでＬｐ（ａ）が進行性病変の進展を促していることを示した。Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギは、血漿ＬＤＬコレステロール値が高く、この点はｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギと同じであるが、ヒトＬｐ（ａ）濃度も比較的高い。この点で２つのモデル（ａｐｏ（ａ）Ｔｇおよびｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬ）によって、１つの危険因子と２つの危険因子、つまり、高ＬＤＬコレステロール血症単独と高ＬＤＬコレステロールおよび高Ｌｐ（ａ）血症のアテローム生成性を比較することができると言えよう。Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギはｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギに比べて、大動脈弓および胸／腹大動脈でアテローム性病変がそれぞれ多く、その病変はアテローム、線維性アテロームおよび石灰化など進行性病変から成る。Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギの広範な進行性アテローム病変の知見は、Ｌｐ（ａ）がアテローム硬化症を進展させる危険因子であるという意見を支持するばかりでなく、アテローム硬化症に対する高コレステロール血症のリスクが高Ｌｐ（ａ）の状況で有意に上昇するという一般的な見解を強化するものでもある。
【００２９】
Ｌｐ（ａ）によってＴｇ　ＷＨＨＬウサギのスダン好性病変の範囲が有意に拡大することがないのは驚くべきことであり、我々がコレステロールを与えたａｐｏ（ａ）Ｔｇウサギで確認した結果とは異なる（２０）。コレステロールを与えたＴｇウサギとＷＨＨＬ　Ｔｇウサギの間にみられるこの矛盾は、そのアテローム生成性粒子（大β−ＶＬＤＬと小ＬＤＬ）の差によるものか（３３）、あるいはＷＨＨＬウサギのきわめて高いＬＤＬ濃度が初期の病変形成に対するＬｐ（ａ）の作用を上回ったのではないかと考えている。ヒトでは、３０ｍｇ／ｄＬを超えるＬｐ（ａ）値がアテローム生成性であると考えられている（３４）。ＴｇＷＨＨＬウサギでは、血漿Ｌｐ（ａ）値（１５ｍｇ／ｄＬ）がこの恣意的な閾値より低くとも、それでも尚この値が通常内因性Ｌｐ（ａ）を持たないウサギにとって著しくアテローム形成を促進する要因であると思われる。ＴｇＷＨＨＬウサギとｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギのリポタンパク分布は本質的に同じで、コレステロールおよびＬＤＬ中ａｐｏＢの量がＴｇ　ＷＨＨＬウサギの進行性アテローム硬化症を促進させる可能性は否定できる。したがって、血漿Ｌｐ（ａ）の存在がＴｇ　ＷＨＨＬウサギの病変を著しく増悪させる主要因子であると考える。Ｔｇ　ＷＨＨＬの進行性病巣における脂質コアおよび線維性被膜層の存在はヒトのアテローム硬化症の特徴に似ている（２２）。
【００３０】
本研究に関するひとつの重要な知見は、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギで著明な血管の石灰化を示したことであり、これがｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギでは確認されなかった。我々はＴｇ　ＷＨＨＬウサギの石灰化が血漿リン酸塩またはカルシウムの上昇および／またはアルカリホスファターゼ活性の増強によるものでないことを確認している。血管の石灰化がヒトａｐｏ（ａ）Ｔｇマウス（１１）またはコレステロールを与えたＴｇウサギ（２０）のいずれにも観察されないことは注目に値する。かなりコレステロール値の高い（２％）飼料を与えた正常なウサギでは、石灰化病変ではなく、石灰化可能な基質小胞の形成が大動脈で報告されており（３５）、一方、ｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギは、コレステロール、ビタミンＤおよびカルシウムを多く含む飼料を与えた場合（３８）または平均年齢が１５ヵ月に達すると、血管の石灰化を生ずることが確認されている。血管の石灰化はヒトのアテローム硬化病変によくみられる特徴であり、冠動脈心疾患および大動脈破裂など多くの臨床問題の一因である（３７）。この点について、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギの病変はヒトの進行性アテローム硬化症でみられる石灰化の多くの特徴に共通しているため、このウサギはアテローム硬化症に関連する血管の石灰化を試験するための理想的なモデルとして使用できよう。Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギの病変に石灰化が存在し、ヒトのアテローム性病変にみるＬｐ（ａ）と石灰化の深い関連によって、我々はＬｐ（ａ）が血管の石灰化プロセスの潜在的なメディエイターであるという仮説を提唱するに至った。血管の石灰化の原因は、加齢の末期的、受動的または変性プロセスというより（３８，３９）、むしろ能動的なプロセスである可能性が本研究により示唆された。
【００３１】
重大な問題は、Ｌｐ（ａ）がＳＭＣのような血管細胞で本当に石灰化を誘発することができるのかということである。この問いに答えるため、我々は複数の段階を踏み、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養ＳＭＣの石灰化に対するＬｐ（ａ）の作用を調べた。まず、生理的濃度のＬｐ（ａ）でＳＭＣを処理することによって、用量依存的かつ時間依存的にカルシウム蓄積が亢進した。次にＬｐ（ａ）は４日目にＳＭＣのＭＧＰ　ｍＲＮＡ発現を有意にアップレギュレートしたのに対して、ＳＭＣのＯＰＮ発現をダウンレギュレートした。骨原性タンパク発現のこのパターン（ＭＧＰの増加とＯＰＮの減少）は、ＳＭＣの石灰化がヒトの血管ＳＭＣの高ＭＧＰおよび低ＯＰＮに関連するこという見解と一致する（４２）。さらに、Ｌｐ（ａ）で処理したＳＭＣにおいて、Ｏｓｆ２がアップレギュレートされると同時にアルカリホスファターゼ活性が増強したため、Ｌｐ（ａ）はＳＭＣの骨芽細胞への分化を誘導することによって、石灰化を亢進すると思われる。以上のことから、このような結果はＬｐ（ａ）が血管の石灰化プロセスに関与している可能性があることを強く示唆する。
【００３２】
Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギでＬｐ（ａ）による進行性アテローム性病変の形成が促される機序は未解明であるが、病変に壊死性コアまたは脂質コアが存在することによって、壊死またはアポトーシスのいずれかによる細胞死が生じることが示されており、これによってＬｐ（ａ）が直接的または間接的にそのような細胞死を誘導するのか、細胞死も次の石灰化プロセスに関与または必要であるのかという興味深い疑問がわく。従来の研究から、Ｌｐ（ａ）は単球でのスーパーオキサイド産生を亢進し（４１）、ヒトの内皮細胞およびウサギの大動脈でアポトーシスを誘導することがわかっている（４２）。この機序が実際にｉｎ　ｖｉｖｏで働いているとすれば、確かにＴｇ　ＷＨＨＬウサギで観察された知見を説明するのに有用である。この可能性に一致するように、培養ＳＭＣを用いたいくつかの試験で、ＳＭＣの石灰化より前にアポトーシスが生じ、アポトーシス小体に血管の石灰化を開始する能力があることがわかっている（４３）。
【００３３】
結論として、我々の今回の研究では、Ｌｐ（ａ）がアテローム硬化症の発症に対する危険因子であるばかりでなく、病変形成の進行を促す誘発物質でもあるという証拠がさらに得られた。しかも、我々はＬｐ（ａ）がアテローム硬化症に関連する血管の石灰化において潜在的な制御因子であることを示している。Ｌｐ（ａ）のアテローム生成性と石灰化に関する分子機構は十分に解明されていないが、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギでの進行性アテローム硬化症の形成は、ヒトのアテローム硬化症の研究や、プラークの破裂および動脈瘤などアテローム硬化症の合併症を研究するために有益であると明確に証明された。今後の研究では、Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギが心筋梗塞の発症率を増加させるかどうか、評価することも興味深い。我々は高Ｌｐ（ａ）で進行性アテローム硬化症のＴｇ　ＷＨＨＬモデルが、高Ｌｐ（ａ）患者のアテローム硬化症治療において、いくつかの薬剤の利点を試験するためのきわめて有用なモデルであろうと考えている。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によって、Ｌｐ（ａ）における石灰化の関与は、生活習慣病におけるマルチプルリスクファクター症候群のように、骨粗鬆症と動脈硬化．血管石灰化が共通の上に立つ疾患である可能性を示唆した。従って、両者を総合的に制御する因子群の発見、ひいては骨粗鬆症の病態解明につながるものと期待される。加えて、膨大な数の調節因子群の関与が想像できることから、医学関連産業に及ぼす影響力は極めて大きい。即ち、本発明は、動脈硬化複合病変により惹起される循環障害、虚血性心疾患、脳梗塞の新しい治療原理、予防法、診断法、薬剤の開発を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】血漿リポタンパクの解析
Ａ．普通食餌を与えたＷＨＨＬウサギおよび正常ウサギから得た血漿のアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。血漿（２μｌ）をＦａｔ　Ｒｅｄ　７Ｂ　により染色した結果（上）、ヒトａｐｏ（ａ）モノクロ−ナル抗体を用いたウェスタンブロッティング解析の結果（下）。
Ｂ−Ｃ．Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギおよびヒト血漿ａｐｏ（ａ）のウェスタンブロッティング法による解析の結果を示す写真である。
３．５％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｂ）あるいは非還元条件下（Ｃ、左）または還元条件下（Ｃ、右）の４％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥのいずれかの方法で、血漿を分離した。ウェスタンブロッティングを行った同じ膜をストリッピングの後、ａｐｏＢ　抗体で再プローブした。＊はａｐｏ（ａ）とａｐｏＢとが共有結合してＬｐ（ａ）を成していることを示し、＊＊は非共有結合により会合するＬｐ（ａ）と遊離ａｐｏ（ａ）を示す。
Ｄ．血漿リポタンパクの密度による７画分（Ｆ１〜Ｆ７）を分離し、１％アガロースゲル電気泳動法によって解析した結果を示す写真である。Ｆ１はｄ＜１．００６ｇ／ｍｌ、Ｆ２はｄ＝１．００６〜１．０２ｇ／ｍｌ、Ｆ３はｄ＝１．０２〜１．０４　ｇ／ｍｌ、Ｆ４はｄ＝１．０４〜１．０６、Ｆ５はｄ＝１．０６〜１．０８、Ｆ６はｄ＝１．０８〜１．１０ｇ／ｍｌ、Ｆ７はｄ＝１．１０〜１．２１ｇ／ｍｌである。リポタンパクはＦａｔｒｅｄ　７Ｂで染色し、各アポリポタンパクはウェスタンブロッティング法で検出した（３０）。
【図２】大動脈におけるアテローム性病変の定量解析と組織学的解析
Ａ．大動脈弓または胸大動脈および腹大動脈から得た最もスダン好性の病変５切片を試験し、画像解析システムを用いて内膜病変部を評価した。＊ｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬに対してＰ＜０．０１
Ｂ．アテローム性病変の組織学的試験と免疫組織化学的試験の結果を示す写真である。パラフィン包埋した大動脈弓の連続断片をヘマトキシリンイオジン（ＨＥ）またはマクロファージ（ＭФ）およびＳＭＣ（ＳＭ−α−アクチン）に対する抗体のいずれかを用いて染色した。上段写真：典型的脂肪線条、ＩＩ型病変（ｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬ）。下３つのうち上段写真：被覆および壊死性コアを伴う典型的線維性プラーク、ＩＶ型病変（Ｔｇ　ＷＨＨＬ）。下３つのうち中段写真：著明な脂質コアおよびカルシウム沈着を伴うＶａ型病変（Ｔｇ　ＷＨＨＬ）。下３つのうち下段写真：著明な石灰化を伴うＶｂ型病変（Ｔｇ　ＷＨＨＬ）。目盛りは２００μｍを表す。
Ｃ．大動脈における種々の病変の定量。この病変を主に泡沫細胞である脂肪斑、典型的な壊死性コアおよび線維性被覆を含む線維性プラーク（ＩＶ型およびＶａ型を含む）、カルシウム沈着症または完全な石灰化を含む合併プラーク（Ｖｂ型病変）に分類した。切片上で各種病変の占める面積を測定した。＊ｎｏｎ−Ｔｇ　ＷＨＨＬに対してＰ＜０．０５
【図３】Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギの石灰化に関連する進行性病変像を示す写真である。
Ａ．大動脈病変をＨＥで染色し、血管の石灰化（矢印）が病変の侵食または破裂を増強しているように思われる。目盛りは２００μｍを表す。
Ｂ．石灰化（Ｖｂ型）を伴う大動脈弓の連続凍結切片をａｐｏ（ａ）およびａｐｏＢに対する抗体を用いて免疫染色した。ａｐｏ（ａ）およびａｐｏＢが石灰化の近傍で検出された。目盛りは２００μｍを表す。
Ｃ．Ｔｇ　ＷＨＨＬウサギの典型的線維性プラークの壊死性コアにみる石灰化像。このカルシウム沈着はフォン・コッサ染色によって検出され、ａｐｏ（ａ）が近傍に検出された（Ｃ上段）。病変の中心にはマクロファージを含み、ＳＭＣによって覆われている（Ｃ下段）。目盛りは２００μｍを表す。
Ｄ．大動脈石灰化の放射線像。Ｔｇ　ＷＨＨＬ大動脈には多くの石灰化部位（白の矢印で示す）があることに注目。
【図４】ＳＭＣにおけるカルシウム沈着に対するＬｐ（ａ）の作用
Ａ．Ｌｐ（ａ）は用量依存的かつ時間依存的にカルシウム沈着を亢進する。ウサギの大動脈ＳＭＣへのカルシウム沈着は、４８時間Ｌｐ（ａ）を記載の濃度で処理し（左図）、１０ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）または同量のＬＤＬの存在下、記載の期間にわたりインキュベートした（右図）。＊対照に対してＰ＜０．０１
Ｂ．ＭＧＰ（左）およびＯＰＮ（右）のｍＲＮＡ発現に対するＬｐ（ａ）の作用。１０ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）の存在下、ＳＭＣを４８時間インキュベートした。結果をβ−アクチンに対するＭＧＰ発現量およびβ−アクチンに対するＯＰＮ発現量の比で示す。＊対照に対してＰ＜０．０５
【図５】Ｃ．Ｌｐ（ａ）はＳＭＣでＯｓｆ２ｍＲＮＡの発現（左）と細胞内アルカリホスファターゼ活性（右）を増強する。記載した濃度でのＬｐ（ａ）存在下、ＳＭＣを３日間インキュベートした。Ｏｓｆ２　ｍＲＮＡ発現は定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析で測定した。結果はβ−アクチンに対するＯｓｆ２発現量で表す。ＰＣＲ産物のゲル電気泳動の結果を示す写真を上に示す。＊対照に対してＰ＜０．０１
Ｄ．３０ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）を用いて３日間処理したＳＭＣを示す写真であり、小結節性形成物の数が増えた（右）。目盛りは２００μｍを表す。
Ｅ．Ｌｐ（ａ）で１３日間ＳＭＣを処理した後を示す写真であり、フォン・コッサ染色によってカルシウム沈着が示された（右）。目盛りは２００μｍを表す。
【図６】ヒト冠動脈中の石灰化とＬｐ（ａ）の密接な関係を示す写真である。
Ａ．右の写真に石灰化領域の表面に沿って認められるＬｐ（ａ）沈着（矢印で示す）を示す。
Ｂ．陳旧性石灰化の周囲に存在するＬｐ（ａ）を示す。
Ｃ．この病変ではカルシウム沈着が泡沫細胞の下に低密度に分布し、Ｌｐ（ａ）沈着がＳＭＣに混在する。もとの倍率：目盛りは２００μｍを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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