(57)【要約】　【課題】　肥満症などの疾患の病態モデル動物として利用することができ、これらの病態機序の解明および疾患の治療方法の検討、ならびに予防・治療剤のスクリーニングを行うことが可能な遺伝子導入非ヒト哺乳動物を提供する。　【解決手段】　ＳＬＴ遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物を作出する。　【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物またはその生体の一部。
【請求項２】
　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物に、他の肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の病態モデル動物を交配することによって得られる動物またはその生体の一部。
【請求項３】
　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有し、かつ内因性ＳＬＣ−１遺伝子を欠損させた非ヒト哺乳動物またはその生体の一部。
【請求項４】
　非ヒト哺乳動物がマウスである請求項１〜３記載の動物またはその生体の一部。
【請求項５】
　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子が配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するヒトＳＬＴをコードする遺伝子である請求項１〜３記載の動物またはその生体の一部。
【請求項６】
　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子が配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるヒトＳＬＴをコードする遺伝子である請求項１〜３記載の動物またはその生体の一部。
【請求項７】
　内因性ＳＬＣ−１遺伝子が配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するＳＬＣ−１をコードする遺伝子である請求項３記載の動物またはその生体の一部。
【請求項８】
　内因性ＳＬＣ−１遺伝子が配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるマウスＳＬＣ−１をコードする遺伝子である請求項３記載の動物またはその生体の一部。
【請求項９】
　肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害を発症している請求項１〜８記載の動物またはその生体の一部。
【請求項１０】
　請求項１〜８のいずれかに記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、ＳＬＴアンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を検定することを特徴とするＳＬＴ拮抗薬または作動薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
　請求項１０記載のスクリーニング方法により得られうるＳＬＴ拮抗薬または作動薬。
【請求項１２】
　請求項１０記載のスクリーニング方法により得られうるＳＬＴ拮抗薬を含有してなる肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の予防・治療剤。
【請求項１３】
　請求項１０記載のスクリーニング方法により得られうるＳＬＴ作動薬を含有してなる食欲不振、食欲不振に伴う貧血または低蛋白症の予防・治療剤。
【請求項１４】
　請求項９記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の改善効果を検定することを特徴とする、肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の予防・治療のために用いられる物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
　請求項１４記載のスクリーニング方法により肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の改善効果を有すると判定される物質。
【請求項１６】
　請求項１４記載のスクリーニング方法により肥満症、摂食亢進症、情動障害、記憶障害または性機能障害の改善効果を有すると判定される物質を含有してなる肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の予防・治療用医薬。
【請求項１７】
　哺乳動物に対して、請求項１４記載のスクリーニング方法により肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の改善効果を有すると判定される物質の有効量を投与することを特徴とする肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の予防・治療法。
【請求項１８】
　肥満症、摂食亢進症、情動障害、記憶障害または性機能障害の予防・治療剤を製造するための、請求項１４記載のスクリーニング方法により肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の改善効果を有すると判定される物質の使用。
【請求項１９】
　肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の予防・治療のために用いられる物質をスクリーニングするための請求項９記載の動物またはその生体の一部の使用。
【請求項２０】
　飼育条件の変更により肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害が進展している請求項１〜９記載の動物またはその生体の一部。
【請求項２１】
　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を導入した非ヒト受精卵。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明はヒトＳＬＴ遺伝子導入非ヒト哺乳動物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
　生体のホメオスタシスの維持、生殖、個体の発達、代謝、成長、神経系、循環器系、免疫系、消化器系、代謝系の調節、感覚受容などの重要な機能調節は、様々なホルモンや神経伝達物質のような内在性因子あるいは光や匂いなどの感覚刺激をこれらに対して生体が備えている細胞膜に存在する特異的な受容体を介して細胞が受容し、それに応じた反応をすることによって行われている。このような機能調節に与るホルモンや神経伝達物質の受容体の多くはguanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇタンパク質と略称する場合がある）と共役しており、このＧタンパク質の活性化によって細胞内にシグナルを伝達して様々な機能を発現させることを特徴とする。また、これらの受容体タンパク質は共通して７個の膜貫通領域を有する。これらのことからこうした受容体はＧタンパク質共役型受容体あるいは７回膜貫通型受容体と総称される。このように生体機能の調節には様々なホルモンや神経伝達物質およびそれに対する受容体タンパク質が存在して相互作用し、重要な役割を果たしていることがわかっているが、未知の作用物質（ホルモンや神経伝達物質など）およびそれに対する受容体が存在するかどうかについてはいまだ不明なことが多い。
　近年、ヒトゲノムＤＮＡあるいは各種ヒト組織由来のｃＤＮＡのランダムな配列決定による配列情報の蓄積および遺伝子解析技術の急速な進歩によってヒトの遺伝子が加速度的に解明されてきている。それにともない、機能未知のタンパク質をコードすると予想される多くの遺伝子の存在が明らかになっている。Ｇタンパク質共役型受容体は、７個の膜貫通領域を有するのみでなくその核酸あるいはアミノ酸に多くの共通配列が存在するためそのようなタンパク質の中から明確にＧタンパク質共役型受容体として区分することができる。一方でこうした構造の類似性を利用したポリメラーゼ・チェーン・リアクション（Polymerase Chain Reaction：以下、ＰＣＲと略称する）法によってもこうしたＧタンパク質共役型受容体遺伝子が得られている。このようにしてこれまでに得られたＧタンパク質共役型受容体のうちには既知の受容体との構造の相同性が高いサブタイプであって容易にそのリガンドを予測することが可能な場合もあるが、ほとんどの場合その内在性リガンドは予測不能であり、これらの受容体は対応するリガンドが見いだされていない。このことからこれらの受容体はオーファン受容体と呼ばれている。このようなオーファン受容体の未同定の内因性リガンドは、リガンドが知られていなかったために十分な解析がなされていなかった生物現象に関与している可能性がある。そして、このようなリガンドが重要な生理作用や病態と関連している場合には、その受容体作動薬あるいは拮抗薬の開発が革新的な医薬品の創製に結びつくことが期待される（Stadel, J. et al.、TiPS、18巻、430-437頁、1997年、Marchese, A. et al.、TiPS、20巻、370-375頁、1999年、Civelli, O. et al.、Brain Res.、848巻、63-65頁、1999年）。しかし、これまで実際にオーファンＧタンパク質共役型受容体のリガンドを同定した例はそれほど多くない。
　最近、幾つかのグループによってこうしたオーファン受容体のリガンド探索の試みがなされ、新たな生理活性ペプチドであるリガンドの単離・構造決定が報告されている。ReinsheidらおよびMeunierらは独立に、動物細胞にオーファンＧタンパク質共役型受容体ＬＣ１３２あるいはＯＲＬ１をコードするｃＤＮＡを導入して受容体を発現させ、その応答を指標としてorphanin FQあるいはnociceptinと名付けられた新規ペプチドをブタ脳あるいはラット脳の抽出物より単離し、配列を決定した（Reinsheid, R. K. et al.、Science、270巻、792-794頁、1995年、Meunier, J.-C. et al.、Nature、377巻、532-535頁、1995年）。このペプチドは痛覚に関与していることが報告されたが、さらに、受容体のノックアウトマウスの研究により記憶に関与していることが明らかにされた（Manabe, T. et al.、Nature、394巻、577-581頁、1998年）。
　その後これまでに上記と同様な方法によりＰｒＲＰ（prolactin releasing peptide）、orexin、apelin、ghrelinおよびＧＡＬＰ（galanin-like peptide）などの新規ペプチドがオーファンＧタンパク質共役型受容体のリガンドとして単離された（Hinuma, S. et al.、Nature、393巻、272-276頁、1998年、Sakurai, T. et al.、Cell、92巻、573-585頁、1998年、Tatemoto, K. et al.、Bichem. Biophys. Res. Commun.、251巻、471-476頁、1998年、Kojima, M. et al.、Nature、402巻、656-660頁、1999年、Ohtaki, T. et al.、J. Biol. Chem.、274巻、37041-37045頁、1999年）。
　一方、これまで明らかでなかった生理活性ペプチドの受容体が同様な方法によって解明される場合もある。腸管収縮に関与するmotilinの受容体がＧＰＲ３８であることが明らかにされた（Feighner, S. D. et al.、Science、284巻、2184-2188頁、1999年）ほか、ＳＬＣ−１がメラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）の受容体として同定され（Chambers, J. et al.、Nature、400巻、261-265頁、1999年、Saito, Y. et al.、Nature、400巻、265-269頁、1999年、Shimomura, Y. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、261巻、622-626頁、1999年、Lembo, P. M. C. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、267-271頁、1999年、Bachner, D. et al.、FEBS Lett.、457巻、522-524頁、1999年）、またＧＰＲ１４（ＳＥＮＲ）がurotensin IIの受容体であることが報告された（Ames, R. S. et al.、Nature、401巻、282-286頁、1999年、Mori, M. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、265巻、123-129頁、1999年、Nothacker, H.-P. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、383-385頁、1999年、Liu, Q. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、266巻、174-178頁、1999年）。ＭＣＨはそのノックアウトマウスが羸痩のphenotypeを示すことから肥満に関与することが示されていたが（Shimada, M. et al.、Nature、396巻、670-674頁、1998年）、その受容体が明らかにされたことにより抗肥満薬としての可能性を有する受容体拮抗薬の探索が可能となった。また、urotensin IIはサルに静脈内投与することによって心虚血を惹起することから心循環系に強力な作用を示すことも報告されている（Ames, R. S. et al.、Nature、401巻、282-286頁、1999年）。
　このように、オーファン受容体およびそのリガンドは新たな生理作用に関与する場合が多く、その解明は新たな医薬品開発に結びつくことが期待される。しかし、オーファン受容体のリガンド探索においては多くの困難さが伴い、これまでに数多くのオーファン受容体の存在が明らかにされながらそのリガンドが明らかにされた受容体はごく一部に過ぎない。
　ＷＯ００／４９０４６号公報（特許文献１）には、ヒト海馬由来の受容体であるＳＬＴ（hSLT-1 like receptor in TAKEDA）およびそれをコードするＤＮＡが開示されている。ＷＯ０２／０３０７０号公報（特許文献２）には、ＳＬＴのリガンドがメラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）であることが記載されている。
　また、ＳＬＣ−１がＭＣＨの受容体として同定されている（Chambers, J. et al.、Nature、400巻、261-265頁、1999年（非特許文献１）、Saito, Y. et al.、Nature、400巻、265-269頁、1999年（非特許文献２）、Shimomura, Y. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、261巻、622-626頁、1999年（非特許文献３）、Lembo, P. M. C. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、267-271頁、1999年（非特許文献４）、Bachner, D. et al.、FEBS Lett.、457巻、522-524頁、1999年（非特許文献５）、ＷＯ００／４０７２５号公報（特許文献３））。ＳＬＴとＳＬＣ−１のアミノ酸レベルでの相同性は約３５％である。
　Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.99, p3240-3245, March 5, 2002（非特許文献６）には、ＳＬＣ−１と同一受容体であるＭＣＨ−１受容体の欠損マウスが記載されている。
【特許文献１】ＷＯ００／４９０４６号公報
【特許文献２】ＷＯ０２／０３０７０号公報
【特許文献３】ＷＯ００／４０７２５号公報
【非特許文献１】Chambers, J. et al.、Nature、400巻、261-265頁、1999年
【非特許文献２】Saito, Y. et al.、Nature、400巻、265-269頁、1999年
【非特許文献３】Shimomura, Y. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、261巻、622-626頁、1999年
【非特許文献４】Lembo, P. M. C. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、267-271頁、1999年
【非特許文献５】Bachner, D. et al.、FEBS Lett.、457巻、522-524頁、1999年
【非特許文献６】Proc. Natl. Acad. Sci. USA、99巻、3240-3245頁、2002年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
　新たな遺伝子導入（トランスジェニック）動物は、いろいろな疾患の予防や治療に役立つ新たな医薬品の開発を可能にする。
　したがって、本発明の分野では、ヒトＳＬＴ遺伝子導入非ヒト動物（以下、トランスジェニック動物と称することもある）を見出し、肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害、性機能障害などの疾患モデル動物を大量に生産する方法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
　本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、外来性のヒトＳＬＴを発現させた新規なトランスジェニックマウスを作製したところ、肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害などの表現型を示すことを見出した。
　本発明者は、これらの知見を基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
　すなわち、本発明は、
（１）　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物またはその生体の一部、
（２）　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物に、他の肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の病態モデル動物を交配することによって得られる動物またはその生体の一部、
（３）　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有し、かつ内因性ＳＬＣ−１遺伝子を欠損させた非ヒト哺乳動物またはその生体の一部、
（４）　非ヒト哺乳動物がマウスである上記（１）〜（３）記載の動物またはその生体の一部、
（５）　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子が配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するヒトＳＬＴをコードする遺伝子である上記（１）〜（３）記載の動物またはその生体の一部、
（６）　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子が配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるヒトＳＬＴをコードする遺伝子である上記（１）〜（３）記載の動物またはその生体の一部、
（７）　内因性ＳＬＣ−１遺伝子が配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するＳＬＣ−１をコードする遺伝子である上記（３）記載の動物またはその生体の一部、
（８）　内因性ＳＬＣ−１遺伝子が配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるマウスＳＬＣ−１をコードする遺伝子である上記（３）記載の動物またはその生体の一部、
（９）　肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害を発症している上記（１）〜（８）記載の動物またはその生体の一部、
（９ａ） 肥満が、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満食餌性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満または中心性肥満である上記（９）記載の動物またはその生体の一部、
（９ｂ）　肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害、性機能障害、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、心疾患、痛風、呼吸器疾患、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症または代謝性疾患を発症している上記（１）〜（８）記載の動物またはその生体の一部、
（１０）　上記（１）〜（８）のいずれかに記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、ＳＬＴアンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を検定することを特徴とするＳＬＴ拮抗薬または作動薬のスクリーニング方法、
（１１）　上記（１０）記載のスクリーニング方法により得られうるＳＬＴ拮抗薬または作動薬、
（１２）　上記（１０）記載のスクリーニング方法により得られうるＳＬＴ拮抗薬を含有してなる肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の予防・治療剤、
（１３）　上記（１０）記載のスクリーニング方法により得られうるＳＬＴ作動薬を含有してなる食欲不振、食欲不振に伴う貧血または低蛋白症の予防・治療剤、
（１４）　上記（９）記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の改善効果を検定することを特徴とする、肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の予防・治療のために用いられる物質のスクリーニング方法、
（１４ａ）　上記（９ｂ）記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害、性機能障害、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、心疾患、痛風、呼吸器疾患、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症または代謝性疾患の改善効果を検定することを特徴とする、上記疾患の予防・治療のために用いられる物質のスクリーニング方法、
（１５）　上記（１４）記載のスクリーニング方法により肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の改善効果を有すると判定される物質、
（１５ａ）　上記（１４ａ）記載のスクリーニング方法により肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害、性機能障害、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、心疾患、痛風、呼吸器疾患、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症または代謝性疾患の改善効果を有すると判定される物質、
（１６）　上記（１４）記載のスクリーニング方法により肥満症、摂食亢進症、情動障害、記憶障害または性機能障害の改善効果を有すると判定される物質を含有してなる肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の予防・治療用医薬、
（１６ａ）　上記（１４ａ）記載のスクリーニング方法により肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害、性機能障害、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、心疾患、痛風、呼吸器疾患、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症または代謝性疾患の改善効果を有すると判定される物質を含有してなる上記疾患の予防・治療用医薬、
（１７）　哺乳動物に対して、上記（１４）記載のスクリーニング方法により肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の改善効果を有すると判定される物質の有効量を投与することを特徴とする肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の予防・治療法、
（１８）　肥満症、摂食亢進症、情動障害、記憶障害または性機能障害の予防・治療剤を製造するための、上記（１４）記載のスクリーニング方法により肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の改善効果を有すると判定される物質の使用、
（１９）　肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の予防・治療のために用いられる物質をスクリーニングするための上記（９）記載の動物またはその生体の一部の使用、
（２０）　飼育条件の変更により肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害が進展している上記（１）〜（９）記載の動物またはその生体の一部、
（２０ａ）　飼育条件が、食餌である上記（２０）記載の動物またはその生体の一部、
（２０ｂ）　薬物投与、臓器破壊もしくは摘出、または自然発症モデル動物との交配により肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害が進展している上記（１）〜（９）記載の動物またはその生体の一部、
（２１）　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を導入した非ヒト受精卵などを提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
　本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物は、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満食餌性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害、性機能障害、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症（例、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害など）、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞など）、痛風、呼吸器疾患（例、Pickwick症候群、睡眠時無呼吸症候群など）、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症、代謝性疾患（例、視床下部機能低下症、下垂体機能低下症、副腎皮質機能低下症など）などの疾患の予防・治療剤の探索・評価、ＳＬＴ遺伝子異常患者の遺伝子治療用実験などに用いることができ、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物から採取した細胞などを培養し、ＳＬＴ阻害薬の評価に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
　本発明の遺伝子導入動物は、非ヒト哺乳動物の受精卵や、未受精卵、精子およびその前駆細胞（始原生殖細胞、卵原細胞、卵母細胞、卵細胞、精原細胞、精母細胞、精細胞等）などに、好ましくは受精卵の胚発生の初期段階（さらに好ましくは８細胞期以前）において、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などの遺伝子導入法によって、目的とする外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を目的とする細胞などに導入することにより作出される。また、該遺伝子導入法により、非ヒト哺乳動物の体細胞、組織、臓器などに目的とするＤＮＡを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、この細胞を上述の胚（もしくは生殖）細胞と公知の細胞融合法を用いて融合させることにより遺伝子導入動物を作出することもできる。あるいは、ノックアウト動物を作製する場合と同様に、非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に上記の遺伝子導入法を用いて目的とするＤＮＡを導入し、予め該ＤＮＡが安定に組み込まれたクローンを選択した後に、該ＥＳ細胞を胚盤胞に注入するかあるいはＥＳ細胞塊と８細胞期胚とを凝集させてキメラマウスを作製し、生殖系列に導入遺伝子が伝達されたものを選択することによっても遺伝子導入動物を得ることが可能である。
　また、このようにして作製された遺伝子導入動物の生体の一部（例えば、(i)外来性ＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する細胞、組織、臓器など、(ii)これらに由来する細胞または組織を培養し、必要に応じ、継代したものなど、(iii)該遺伝子導入動物から単離し得る各種タンパク質またはＤＮＡなど）も、本発明の「外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物の生体の一部」として、本発明の「外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることが出来る。
　遺伝子導入動物の生体の一部である組織としては、脂肪組織、脳組織（例、偏桃、大脳皮質、海馬、視床下部、延髄、小脳など）、下垂体、副腎、膵臓、脾臓、小腸、精巣、筋肉などが好ましい。
　遺伝子導入動物の生体の一部である細胞としては、脂肪細胞、神経細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞など）、上皮細胞、内皮細胞、表皮系細胞、筋細胞などが好ましい。
【０００８】
　本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどが挙げられる。好ましくは、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウスまたはラットであり、なかでも齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）が好ましく、とりわけマウス（Ｗｉｓｔａｒ、ＳＤなど）、特にＷｉｓｔａｒ系統のマウスが疾患モデル動物として最も好ましい対象動物である。他に鳥類動物として、ニワトリなども本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることが出来る。
　外来性ヒトＳＬＴとしては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が用いられる。配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１ないし３０個、好ましくは１ないし１０個、さらに好ましくは１ないし５個、より好ましくは１または２個のアミノ酸に置換、付加または欠損が生じているが、ＳＬＴの機能を失わないアミノ酸配列をいう。さらに、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質も用いられる。
　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子とは、遺伝子導入対象動物が有する内在性の遺伝子とは異なる遺伝子であり、具体的には前記の哺乳動物から単離・精製したＳＬＴ遺伝子または合成したＳＬＴ遺伝子などが用いられる。
　本発明の外来性ヒトＳＬＴ遺伝子の変異遺伝子としては、本発明のＤＮＡに変異（例えば、突然変異、部位特異的突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じた遺伝子が挙げられる。より具体的には、該塩基の付加、欠損、他の塩基への置換の結果、ＳＬＴを構成するアミノ酸配列において、１ないし３０個、好ましくは１ないし１０個、さらに好ましくは１ないし５個、より好ましくは１または２個のアミノ酸に置換、付加または欠損が生じるように変異させることが好ましく、ＳＬＴの機能を失わない変異であれば何れの変異であってもよい。
　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるヒトＳＬＴをコードする、配列番号：２で表される塩基配列からなる遺伝子（ＷＯ００／４９０４６号公報）などが用いられる。さらに、配列番号：２２で表される塩基配列からなる遺伝子（Mol Pharmacol 60巻、632-639頁、2001年）なども用いられる。
【０００９】
　本発明における外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子（以下、単にＳＬＴ遺伝子と称することもある）は、導入または発現の対象とする非ヒト哺乳動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよいが、異種の哺乳動物由来のものであることが好ましい。該遺伝子を対象動物に導入させるにあたっては、当該遺伝子を対象となる動物の細胞で発現させうるプロモーターの下流に連結した遺伝子コンストラクト（例、ベクターなど）として用いるのが一般に有利である。具体的には、ヒトのＳＬＴ遺伝子を導入させる場合、ヒトＳＬＴ遺伝子と相同性が高いＳＬＴ遺伝子を有する各種哺乳動物（ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど（好ましくはマウスなど））に由来し、ヒトのＳＬＴ遺伝子を発現させうる各種プロモーターの下流に、該遺伝子を連結したベクターを、対象となる非ヒト哺乳動物の受精卵（例えばラット受精卵）へマイクロインジェクションすることによって、目的とするヒトＳＬＴ遺伝子を高発現する遺伝子導入非ヒト哺乳動物を作出できる。
　ＳＬＴ遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられ、特に大腸菌由来のプラスミドが好ましい。
【００１０】
　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子の遺伝子発現調節を行うプロモーターとしては、例えば、ウイルス（サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルスなど）に由来する遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）に由来する遺伝子（例えば、アルブミン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲン、サイクリックＡＭＰ依存蛋白キナーゼβＩサブユニット、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖伸長因子１α（ＥＦ１−α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン塩基性蛋白、血清アミロイドＰコンポーネント、レニンなど）のプロモーターなどが挙げられ、なかでもニワトリアクチンプロモーターを含むＣＡＧプロモーターなどを用いることができる。
　さらに好ましくは、目的とする疾患モデルに応じて、標的組織で外来性ヒトＳＬＴ遺伝子を特異的もしくは高発現させ得るプロモーター（例：肝臓で高発現可能な血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）、アルブミン、トランスフェリン、アンチトロンビンＩＩＩ、α１−アンチトリプシンなどの遺伝子プロモーター；心臓で高発現可能なαおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２などの遺伝子プロモーター；腎臓で高発現可能なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体などの遺伝子プロモーター；副腎で高発現可能なＡＣＴＨ受容体などの遺伝子プロモーター；消化管で高発現可能な脂肪酸結合タンパク質などの遺伝子プロモーター；脳で高発現可能なミエリン塩基性蛋白、グリア線維性酸性蛋白などの遺伝子プロモーター等）を適宜選択することができる。例えば、本発明の遺伝子導入動物が腎疾患モデルである場合、腎臓で高発現可能なプロモーターを用いることが好ましい。
【００１１】
　上記ベクターは、遺伝子導入哺乳動物において、目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（ポリＡ、一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来、各種哺乳動物および鳥類由来の各遺伝子の配列を用いて遺伝子発現を操作することが出来る。好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。その他、目的の遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモーター領域の５'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３'下流に連結することも目的により可能である。
　また、上記のベクターは、導入遺伝子が安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例：ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性などの薬剤耐性遺伝子）をさらに含むことが好ましい。さらに、相同組換えにより宿主染色体の特定の部位に導入遺伝子を組み込むこと（即ち、ノックイン動物の作製）を意図する場合には、上記のベクターは、ランダムな挿入を排除するために、標的部位と相同なＤＮＡ配列の外側に単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子やジフテリア毒素遺伝子をネガティブ選択マーカー遺伝子としてさらに含むことが好ましい。これらの実施態様については後で詳述する。
【００１２】
　ＳＬＴの翻訳領域は、ヒトや各種非ヒト哺乳動物（ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）の肝臓、腎臓、繊維芽細胞などに由来するＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーに由来するゲノムＤＮＡの全てあるいは一部を原料として用い、あるいはヒトや各種非ヒト哺乳動物の脳、肝臓、腎臓、繊維芽細胞などの臓器あるいは細胞に由来するＲＮＡから公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として用いて、取得することが出来る。また、上記の細胞あるいは組織などから得られたＳＬＴの翻訳領域を用いて、点突然変異誘発法などにより変異した翻訳領域を作製することもできる。これらは何れも遺伝子導入動物に利用可能な材料である。
　以上の翻訳領域は、導入動物において発現しうる遺伝子コンストラクト（例、ベクターなど）として前記のプロモーターの下流（好ましくは、転写終結部位の上流）に連結させる通常の遺伝子工学的手法により、ＳＬＴ遺伝子を組み込んだＤＮＡを作製することができる。
　具体的には、ニワトリアクチンプロモーターを含むＣＡＧプロモーター、ウサギグロビンポリＡ付加シグナルを含む領域、ＳＶ４０複製開始領域、アンピシリン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＣＸＮ２に、ＳＬＴ遺伝子を挿入したベクターなどが用いられる。
【００１３】
　好ましい一実施態様においては、上記のようにして得られる外来性ヒトＳＬＴをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒト哺乳動物の初期胚に導入される。
　対象非ヒト哺乳動物の初期胚は、同種の非ヒト哺乳動物の雌雄を交配させて得られる体内受精卵を採取するか、あるいは同種の非ヒト哺乳動物の雌雄からそれぞれ採取した卵と精子を体外受精させることにより得ることができる。
　用いる非ヒト哺乳動物の齢や飼育条件等は動物種によってそれぞれ異なるが、例えばマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ1など）を用いる場合は、雌が約４〜約６週齢、雄が約２〜約８月齢程度のものが好ましく、また、約１２時間明期条件（例えば７：００−１９：００）で約１週間飼育したものが好ましい。
　体内受精は自然交配によってもよいが、性周期の調節と１個体から多数の初期胚を得ることを目的として、雌非ヒト哺乳動物に性腺刺激ホルモンを投与して過剰排卵を誘起した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の排卵誘発法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般にＰＭＳＧと略する）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般にｈＣＧと略する）を、例えば腹腔内注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ1など）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、直ちに雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は約２０〜約５０ＩＵ／個体、好ましくは約３０ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与量は約０〜約１０ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体である。
　一定時間経過後、膣栓の検査等により交配を確認した雌非ヒト哺乳動物の腹腔を開き、卵管から受精卵を取り出して培地（例：Ｍ１６培地、修正Whitten培地、ＢＷＷ培地、Ｍ２培地、ＷＭ−ＨＥＰＥＳ培地、ＢＷＷ−ＨＥＰＥＳ培地等）中で洗って卵丘細胞を除き、微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下でＤＮＡ顕微注入まで培養する。直ちに顕微注入を行い場合、採取した受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００１４】
　一方、体外受精の場合は、採卵用雌非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）に上記と同様に卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンを投与して排卵を誘発させた後、卵子を採取して受精用培地（例：ＴＹＨ培地中で体外受精時まで微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で培養する。他方、同種の雄非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）から精巣上体尾部を取り出し、精子塊を採取して受精用培地中で前培養する。前培養終了後の精子を卵子を含む受精用培地に添加し、微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で培養した後、２個の前核を有する受精卵を顕微鏡下で選抜する。直ちにＤＮＡの顕微注入を行い場合は、得られた受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００１５】
　受精卵へのＤＮＡの顕微注入は、マイクロマニピュレーター等の公知の装置を用いて常法に従って実施することができる。簡潔に言えば、胚培養用培地の微小滴中に入れた受精卵をホールディングピペットで吸引して固定し、インジェクションピペットを用いてＤＮＡ溶液を雄性もしくは雌性前核、好ましくは雄性前核内に直接注入する。導入遺伝子はＣｓＣｌ密度勾配超遠心等で高度に精製したものを用いることが好ましい。また、導入遺伝子は制限酵素を用いてベクター部分を切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。
【００１６】
　ＤＮＡ導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で１細胞期〜胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト哺乳動物は移植される初期胚が由来する動物と同種のものであればよく、例えば、マウス初期胚を移植する場合は、ＩＣＲ系の雌マウス（好ましくは約８〜約１０週齢）などが好ましく用いられる。受胚用雌非ヒト哺乳動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除（結紮）雄非ヒト哺乳動物（例えば、マウスの場合、ＩＣＲ系の雄マウス（好ましくは約２月齢以上））と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られている。
　受胚用雌は自然排卵のものを用いてもよいし、あるいは精管切除（結紮）雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一般にＬＨＲＨと略する）もしくはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。ＬＨＲＨ類縁体としては、例えば、[3,5-DiI-Tyr5]-LH-RH、[Gln8]-LH-RH、[D-Ala6]-LH-RH、[des-Gly10]-LH-RH、[D-His(Bzl)6]-LH-RHおよびそれらのEthylamideなどが挙げられる。ＬＨＲＨもしくはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＩＣＲ系のマウスなど）の場合には、通常、ＬＨＲＨもしくはその類縁体を投与した後、約４日目に雄マウスと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量は、通常、約１０〜６０μｇ／個体、好ましくは約４０μｇ／個体である。
【００１７】
　通常、移植される初期胚が８細胞期胚以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前（例えば、１細胞期〜４細胞期胚）であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植胚の発生段階に応じて偽妊娠からある日数が経過したものが適宜使用される。例えばマウスの場合、２細胞期胚を移植するには偽妊娠後約０．５日の雌マウスが、胚盤胞期胚を移植するには偽妊娠後約２．５日の雌マウスが好ましい。受胚用雌を麻酔（好ましくはAvertin等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養用培地に懸濁した初期胚（約５〜約１０個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。
　移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開により仔非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（例えばマウスの場合、通常に交配・分娩した雌マウス（好ましくはＩＣＲ系統の雌マウス等））に哺乳させることができる。
【００１８】
　受精卵細胞段階における外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子の導入は、導入遺伝子が対象非ヒト哺乳動物の生殖系列細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。導入遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かは、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト哺乳動物（Ｆ0）の生殖系列細胞において外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子が存在することは、その後代（Ｆ1）の動物全てが、その生殖系列細胞および体細胞のすべてに外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子が存在することを意味する。
　通常、Ｆ0動物は相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のＦ0個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子を有するホモ接合体を得るためには、Ｆ0動物と非トランスジェニック動物とを交雑してＦ1動物を作出し、相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。１遺伝子座にのみ導入遺伝子が組み込まれていれば、得られるＦ2動物の１／４がホモ接合体となる。
【００１９】
　別の好ましい一実施態様においては、外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子を含む発現ベクターは、エレクトロポレーション法等の公知の遺伝子導入法により対象となる非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入される。
　ＥＳ細胞は胚盤胞期胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ＩＣＭの細胞は胚節を経て将来、胚体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株ものを用いてもよく、また、EvansとKaufmanの方法（ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年）に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系マウス由来のＥＳ細胞が使用されているが、従来から機能解析によく用いられている純系で遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスやＣ５７ＢＬ／６系統とＤＢＡ／２系統と交雑したＢＤＦ1系統マウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統とＤＢＡ／２系統とのＦ1）から樹立されるＥＳ細胞なども良好に用いることができる。ＢＤＦ1系統マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスを背景に持つので、これ由来のＥＳ細胞は疾患モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６系統マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
【００２０】
　ＥＳ細胞の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。交配後の雌非ヒト哺乳動物［例えばマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ1など）を用いる場合は、約２ヶ月齢以上の雄マウスと交配させた約８〜約１０週齢程度の雌マウス（妊娠約３．５日）が好ましく用いられる］の子宮から胚盤胞期胚を採取して（あるいは８細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地中で上記と同様にして胚盤胞期まで培養してもよい）、適当なフィーダー細胞（例えばマウスの場合、マウス胎仔から調製される初代繊維芽細胞が望ましい）層上で培養すると、胚盤胞の一部の細胞が集合して将来胚に分化するＩＣＭを形成する。この内部細胞塊をトリプシン処理して単細胞を解離させ、適切な細胞密度を保ち、培地交換を行いながら、解離と継代を繰り返すことによりＥＳ細胞が得られる。
【００２１】
　ＥＳ細胞は雌雄いずれを用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行うことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
　また、第二次セレクションとして、例えば、Ｇ−バンディング法による核型分析等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の核型は１００％正常であることが望ましいが、細胞株樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞への遺伝子導入の後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが可能である。
【００２２】
　このようにして得られるＥＳ細胞株は、未分化幹細胞の性質を維持するために注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で、分化抑制因子として知られるＬＩＦ（１〜１０，０００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス／９５％空気または５％酸素／５％炭酸ガス／９０％空気）で、約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１〜０.５％トリプシン／０.１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行うが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
　ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin　プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明の外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子を導入されたＥＳ細胞を分化させて得られる外来性ヒトＳＬＴ発現非ヒト哺乳動物細胞は、インビトロにおける外来性ヒトＳＬＴの細胞生物学的検討において有用である。
【００２３】
　ＥＳ細胞への遺伝子導入には、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などのいずれも用いることができるが、簡便に多数の細胞を処理できること等の点からエレクトロポレーション法が一般的に選択されている。エレクトロポレーションには通常の動物細胞への遺伝子導入に使用されている条件をそのまま用いればよく、例えば、対数増殖期にあるＥＳ細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、１０6〜１０8細胞／ｍｌとなるように培地に懸濁してキュベットに移し、外来性ヒトＳＬＴをコードするＤＮＡを含むベクターを１０〜１００μｇ添加し、２００〜６００Ｖ／ｃｍの電気パルスを印加することにより行うことができる。
【００２４】
　導入遺伝子が組み込まれたＥＳ細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることによっても検定することができるが、ＥＳ細胞を用いるトランスジェニック系の最大の長所は、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子の発現を指標として細胞段階で形質転換体を選択できることである。したがって、ここで使用される導入ベクターは、外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子を含む発現カセットに加えて、薬剤耐性遺伝子（例：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子など）やレポーター遺伝子（例：β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子など）等の選択マーカー遺伝子をさらに含むことが望ましい。例えば、選択マーカー遺伝子としてｎｐｔＩＩ遺伝子を含むベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後のＥＳ細胞をＧ４１８などのネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養用として残し、残りをＰＣＲもしくはサザンハイブリダイゼーションにかけて導入遺伝子の存在を確認する。
【００２５】
　導入遺伝子の組込みが確認されたＥＳ細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すと、宿主胚のＩＣＭに組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親（受胚用雌）に移植してさらに発生を続けさせることにより、キメラトランスジェニック動物が得られる。キメラ動物の中でＥＳ細胞が将来卵や精子に分化する始原生殖細胞の形成に寄与した場合には、生殖系列キメラが得られることとなり、これを交配することにより導入遺伝子が遺伝的に固定された遺伝子導入非ヒト哺乳動物を作出することができる。
【００２６】
　キメラ胚の作製方法としては、桑実胚期までの初期胚同士を接着させて集合させる方法（集合キメラ法）と、胚盤胞の割腔内に細胞を顕微注入する方法（注入キメラ法）とがあるが、ＥＳ細胞によるキメラ胚の作製においては従来から後者が広く行なわれているが、最近では、８細胞期胚の透明帯内へのＥＳ細胞の注入により集合キメラを作る方法や、マイクロマニピュレーターが不要で操作が容易な方法として、ＥＳ細胞塊と透明帯を除去した８細胞期胚とを共培養して凝集させることによって集合キメラを作製する方法も行われている。
　いずれの場合も、宿主胚は受精卵への遺伝子導入における採卵用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、キメラマウス形成へのＥＳ細胞の寄与率を毛色（コートカラー）で判定し得るように、ＥＳ細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウスから宿主胚を採取することが好ましい。例えば、ＥＳ細胞が１２９系統マウス（毛色：アグーチ）由来であれば、採卵用雌としてＣ５７ＢＬ／６系統マウス（毛色：ブラック）やＩＣＲ系統マウス（毛色：アルビノ）を用い、ＥＳ細胞がＣ５７ＢＬ／６系統もしくはＤＢＦ1系統マウス（毛色：ブラック）由来やＴＴ２細胞（Ｃ５７ＢＬ／６系統とＣＢＡ系統とのＦ1（毛色：アグーチ）由来）であれば、採卵用雌としてＩＣＲ系統マウスやＢＡＬＢ／ｃ系統マウス（毛色：アルビノ）を用いることができる。
　また、生殖系列キメラ形成能はＥＳ細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するので、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えばマウスの場合、１２９系統由来のＥＳ細胞に対してはＣ５７ＢＬ／６系統由来の宿主胚等を用いることが好ましく、Ｃ５７ＢＬ／６系統由来のＥＳ細胞に対してはＢＡＬＢ／ｃ系統由来の宿主胚等が好ましい。
　採卵用雌マウスは約４〜６週齢程度が好ましく、交配用の雄マウスとしては約２〜約８カ月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によってもよいが、好ましくは性腺刺激ホルモン（卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン）を投与して過剰排卵を誘起した後に行なわれる。
【００２７】
　胚盤注入法による場合は、胚盤胞期胚（例えばマウスの場合、交配後約３．５日）を採卵用雌の子宮から採取し（あるいは４細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で胚盤胞期まで培養してもよい）、マイクロマニピュレーターを用いて胚盤胞の割腔内に外来性ヒトＳＬＴをコードするＤＮＡが導入されたＥＳ細胞（約１０〜約１５個）を注入した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。受胚用雌非ヒト哺乳動物は受精卵への遺伝子導入における受胚用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物を同様に用いることができる。
　共培養法による場合は、例えば８細胞期胚（および桑実胚）（例えばマウスの場合、交配後約２．５日）を採卵用雌の卵管および子宮から採取して（あるいは４細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で８細胞期または桑実胚期まで培養してもよい）酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚培養用培地の微小滴中に外来性ヒトＳＬＴをコードするＤＮＡが導入されたＥＳ細胞塊（細胞数約１０〜約１５個）を入れ、さらに上記８細胞期胚（または桑実胚）（好ましくは２個または３個）を入れて一晩共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。
【００２８】
　移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開によりキメラ非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（通常に交配・分娩した雌非ヒト哺乳動物）に哺乳させることができる。
　生殖系列キメラの選択は、まずＥＳ細胞の雌雄が予め判別されている場合はＥＳ細胞と同じ性別のキメラマウスを選択し（通常は雄性ＥＳ細胞が使用されるので、雄キメラマウスが選択される）、次いで毛色等の表現型からＥＳ細胞の寄与率が高いキメラマウス（例えば、５０％以上）を選択する。例えば、１２９系マウス由来の雄性ＥＳ細胞であるＤ３細胞とＣ５７ＢＬ／６系統マウス由来の宿主胚とのキメラ胚から得られるキメラマウスの場合、アグーチの毛色の占める割合の高い雄マウスを選択するのが好ましい。選択されたキメラ非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物との交雑により得られるＦ1動物の表現型に基づいて行うことができる。例えば、上記キメラマウスの場合、アグーチはブラックに対して優性であるので、雌Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスと交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られるＦ1の毛色はアグーチとなる。
【００２９】
　上記のようにして得られる外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子が導入された生殖系列キメラ非ヒト哺乳動物（ファウンダー）は、通常、相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のファウンダーは相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子を有するホモ接合体を得るためには、上記のようにして得られるＦ1動物のうち相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。ヘテロ接合体の選択は、例えばＦ1動物の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。１遺伝子座にのみ導入遺伝子が組み込まれていれば、得られるＦ2動物の１／４がホモ接合体となる。
【００３０】
　本発明の遺伝子導入動物は、外来性ヒトＳＬＴに対する被験物質の作用を定量的に測定可能な程度に外来性ヒトＳＬＴの発現量が確保される限り、内因性ＳＬＴの発現については特に制限はない。しかしながら、本発明の遺伝子導入動物を外来性ヒトＳＬＴだけでなく内因性ＳＬＴにも作用し得る薬剤の評価にも使用する場合は、内因性ＳＬＴの発現を不活性化することが望ましい。内因性ＳＬＴの発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、公知の方法（例えば、Lee S.S.ら、モレキュラー・アンド・セルーラー・バイオロジー（Mol. Cell. Biol.）、第15巻、第3012頁、1995年を参照）により選択されるＳＬＴ遺伝子がノックアウトされたＥＳ細胞、あるいは該ＥＳ細胞から上記の方法に従って作出されるＳＬＴノックアウト動物由来の初期胚もしくはＥＳ細胞に、上記の方法に従って外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子を導入することによって得ることができる。ＳＬＴ遺伝子をノックアウトする具体的な手段としては、対象非ヒト哺乳動物由来のＳＬＴ遺伝子を常法に従って単離し、例えば、そのエクソン部分に他のＤＮＡ断片（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）等のレポーター遺伝子等）を挿入することによりエクソンの機能を破壊するか（この場合、前述のように導入遺伝子の組込みは薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を指標として選択され得る）、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系やＦｌｐ−ｆｒｔ系を用いてＳＬＴ遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させるか、タンパク質コード領域内へ終止コドンを挿入して完全なタンパク質の翻訳を不能にするか、あるいは転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ポリＡ付加シグナルなど）を挿入して、完全なｍＲＮＡの合成を不能にすることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、相同組換えにより対象非ヒト哺乳動物のＳＬＴ遺伝子座に組み込ませる方法が好ましく挙げられる。
【００３１】
　通常、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入されたＤＮＡは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を検出するなどの選択によっては相同組換えにより標的となる内因性ＳＬＴ遺伝子にターゲッティングされたクローンのみを効率よく選択することができず、選択されたすべてのクローンについてサザン法もしくはＰＣＲ法による組み込み部位の確認が必要となる。そこで、ターゲッティングベクターの標的配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を連結しておけば、該ベクターがランダムに挿入された細胞はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地では生育できないが、相同組換えにより内因性ＳＬＴ遺伝子座にターゲッティングされた細胞はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される。あるいは、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。
【００３２】
　あるいは、内因性ＳＬＴの発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、相同組換えを用いた遺伝子ターゲッティングにより外来性ヒトＳＬＴ遺伝子をコードするＤＮＡで内因性ＳＬＴ遺伝子を置換したノックイン動物であってもよい。
　ノックイン動物はノックアウト動物と基本的に同様の手法に従って作製することができる。ＳＬＴのＯＲＦは第１エクソンから第５エクソンに存在するので、例えば、対象非ヒト哺乳動物由来のＳＬＴ遺伝子のこれらの領域を適当な制限酵素を用いて切除し、代わりに外来性ヒトＳＬＴ遺伝子の対応する領域を挿入することにより得られるＤＮＡを含むターゲティングベクターを、上記の方法に従って対象非ヒト哺乳動物由来のＥＳ細胞に導入し、相同組換えにより該動物の内因性ＳＬＴ遺伝子座に外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子が組み込まれたＥＳ細胞クローンを選択すればよい。クローン選択はＰＣＲ法やサザン法を用いて行うこともできるが、例えば、ターゲッティングベクターのＳＬＴ遺伝子の３'非翻訳領域などにネオマイシン耐性遺伝子等のポジティブ選択用マーカー遺伝子を挿入し、さらに標的配列と相同な領域の外側にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子やジフテリア毒素遺伝子等のネガティブ選択用マーカー遺伝子を挿入すれば、薬剤耐性を指標にして相同組換え体を選択することができる。
　また、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が導入された外来性ヒトＳＬＴの発現を妨げる場合があるので、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端にｌｏｘＰ配列もしくはｆｒｔ配列を配したターゲッティングベクターを用い、相同組換え体選択後の適当な時期にＣｒｅもしくはＦｌｐリコンビナーゼまたは該リコンビナーゼ発現ベクター（例：アデノウイルスベクターなど）を作用させることにより、ポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出すことが好ましい。あるいは、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系やＦｌｐ−ｆｒｔ系を用いる代わりに、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端に標的配列と相同な配列を同方向に繰り返して配置し、該配列間での遺伝子内組換えを利用してポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出してもよい。
【００３３】
　また、本発明の遺伝子導入動物は、外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有し、かつＳＬＴの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を有する疾患モデルであってもよい。
　「ＳＬＴの活性調節が関与する疾患」とは、ＳＬＴ活性の異常に起因するかもしくは結果的にＳＬＴ活性の異常を生じる疾患だけでなく、ＳＬＴ活性を調節することにより予防および／または治療効果が得られ得る疾患をも含めた概念として把握されるべきである。例えば、ＳＬＴを活性化することにより予防・治療可能な疾患としては、例えば、食欲不振（例、神経性食欲不振症など）、食欲不振に伴う貧血、低タンパク症、うつ病などが挙げられる。ＳＬＴの機能、活性を阻害することにより予防・治療可能な疾患としては、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満食餌性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害、性機能障害、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症（例、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害など）、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞など）、痛風、呼吸器疾患（例、Pickwick症候群、睡眠時無呼吸症候群など）、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症、代謝性疾患（例、視床下部機能低下症、下垂体機能低下症、副腎皮質機能低下症など）などが挙げられる。
　「他の遺伝子改変」とは、外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子が導入される以外の遺伝子改変を意味し、自然突然変異により内因性遺伝子が改変された自然発症疾患モデル動物、他の遺伝子をさらに導入されたトランスジェニック動物、内因性遺伝子を不活化されたノックアウト動物（挿入突然変異等による遺伝子破壊のほか、アンチセンスＤＮＡや中和抗体をコードするＤＮＡの導入により遺伝子発現が検出不可能もしくは無視し得る程度にまで低下したトランスジェニック動物を含む）、変異内因性遺伝子が導入されたドミナントネガティブ変異体などが含まれる。したがって、内因性ＳＬＴ遺伝子の改変もまた、本発明における「他の遺伝子改変」に該当する。
【００３４】
　「ＳＬＴの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を有する疾患モデル」としては、例えば、高脂血症または動脈硬化症モデルとしてＷＨＨＬウサギ（低比重リポタンパクレセプター（ＬＤＬＲ）に変異を有する；Watanabe Y.、Atherosclerosis、第36巻、第261頁、1980年）、ＳＨＬＭ（apoE欠損変異を有する自然発症マウス；Matsushima Y.ら、Mamm. Genome、第10巻、第352頁、1999年）、ＬＤＬＲノックアウトマウス（Ishibashi S.ら、J. Clin. Invest.、第92巻、第883頁、1993年）、ａｐｏＥノックアウトマウス（Piedrahita J.A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第89巻、第4471頁、1992年）、ヒトａｐｏＢ導入マウス（Callow M.J.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、第2130頁、1994年）等が、虚血性心疾患モデルとしてＣＤ５５ ＣＤ５９ダブルトランスジェニックマウス（Cowan P.J.ら、 Xenotransplantation、第5巻、第184-90頁、1998年）等が、皮膚炎モデルとしてinterleukin 1トランスジェニックマウス（Groves R.W. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第92巻、11874頁、1995年）等が、免疫不全モデルとしてＣＤ１９ノックアウトマウス（Spielman J.ら、Immunity、第3巻、39頁、1995年）等が、低血糖モデルとしてＳＰＣ２ノックアウトマウス（Furuta M. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第94巻、6646頁、1997年）等が、脂肪肝モデルとしてｏｂ／ｏｂマウス（Herberg L.及びColeman D.L.、Metabolism、第26巻、第59頁、1977年）、ＫＫマウス（Nakamura M.及びYamada K.、Diabetologia、第3巻、第212頁、1967頁）、ＦＬＳマウス（Soga M.ら、Lab. Anim. Sci.、第49巻、第269頁、1999年）、糖尿病モデルとしてＮＯＤマウス（Makino S.ら、Exp. Anim.、第29巻、第1頁、1980年）、ＢＢラット（Crisa L.ら、Diabetes Metab. Rev.、第8巻、第4頁、1992年）、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス（Hummel L.ら、Science、第153巻、第1127頁、1966年）、ＫＫマウス、ＧＫラット（Goto Y.ら、Tohoku J. Exp. Med.、第119巻、第85頁、1976年）、Zucker fattyラット（Zucker L.M.ら、Ann. NY Acad. Sci.、第131巻、第447頁、1965年）、ＯＬＥＴＦラット（Kawano K.ら、Diabetes、第41巻、第1422頁、1992年）等が、肥満モデルとしてｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、ＫＫマウス、Zucker fattyラット、ＯＬＥＴＦラット等が、アルツハイマー病モデルとして変異アミロイド前駆体タンパク質遺伝子導入マウス等が、貧血性低酸素症モデルとしてbeta SAD（beta S-Antilles-D Punjab）トランスジェニックマウス（Trudel M.ら、 EMBO J.、第10巻、3157頁、1991年）等が、性腺障害モデルとしてSteroidogenic factor 1ノックアウトマウス（Zhao L.ら、Development、第128巻、147頁、2001年）等が、肝臓癌モデルとしてｐ５３ノックアウトマウス（Kemp C.J. Molecular Carcinogenesis, 第12巻、132頁、1995年）等が、乳癌モデルとしてｃ−ｎｅｕトランスジェニックマウス（Rao G.N.ら、Breast Cancer Res. Treat., 第48巻、265頁、1998年）等が、子宮内膜炎モデルとしてperforin, Fas-ligandダブルノックアウトマウス（Spielman J.ら、J. Immunol. , 第161巻、7063頁、1998年）等が挙げられる。
　これらの「他の遺伝子改変を有する」疾患モデル非ヒト哺乳動物は、例えば、米国のJackson研究所などから購入可能であるか、あるいは周知の遺伝子改変技術を用いて容易に作出することができる。
　本発明の非ヒト哺乳動物は、「ＳＬＴの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変」に加えて、同一もしくは他の疾患モデルを作製し得る非遺伝的処理を施されていてもよい。「非遺伝的処理」とは対象非ヒト哺乳動物における遺伝子改変を生じさせない処理を意味する。このような処理としては、例えば、高脂肪食負荷処理、糖負荷処理、飢餓処理、血管結紮／再灌流等が挙げられる。
【００３５】
　外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子を導入された非ヒト哺乳動物に、ＳＬＴの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を導入する方法は特に制限はなく、例えば、外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子を導入された非ヒト哺乳動物と、ＳＬＴの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を有する同種の疾患モデル非ヒト哺乳動物とを交雑する方法；ＳＬＴの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を有する疾患モデル非ヒト哺乳動物の初期胚やＥＳ細胞に、上述の方法により外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子を導入してトランスジェニック動物を得る方法；外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子を導入された非ヒト哺乳動物の初期胚やＥＳ細胞に、上述の方法により、あるいはノックアウト技術により、ＳＬＴの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を導入する方法等が挙げられる。また、ＳＬＴの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変が外来遺伝子やドミナント変異遺伝子の導入による場合、野生型非ヒト哺乳動物の初期胚やＥＳ細胞に、該外来遺伝子等と外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子とを同時にもしくは順次導入してトランスジェニック動物を得てもよい。さらに、ＳＬＴの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変が内因性遺伝子の破壊による場合は、外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子を破壊すべき内因性遺伝子にターゲッティングされ得るようにデザインして野生型非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞に導入してもよい。この場合、ターゲッティングベクターは、内因性ＳＬＴ遺伝子を破壊されるべき内因性遺伝子に置換る以外は、上記のノックイン動物の作製に関して例示したものが好ましく使用され得る。
【００３６】
　外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子を導入された非ヒト哺乳動物と、ＳＬＴの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を有する同種の疾患モデル非ヒト哺乳動物とを交雑する場合、ホモ接合体同士を交雑することが望ましい。例えば、外来性ＳＬＴをコードする遺伝子が１遺伝子座に組み込まれたホモ接合体と、ａｐｏＥホモ欠損高脂血症（動脈硬化）モデルとを交雑して得られるＦ1は両遺伝子についてヘテロである。このＦ1同士を兄妹交配して得られるＦ2個体の１／１６は外来性ＳＬＴホモ導入・ａｐｏＥホモ欠損となる。
【００３７】
　さらに、本発明は、前記した外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物に、他の病態モデル動物、例えば肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の病態モデル動物を交配することによって得られる動物またはその生体の一部を提供する。
　他の病態モデル動物、例えば肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の病態モデル動物を交配することによって得られる動物は、例えば、米国のJackson研究所などから購入可能であるか、あるいは周知の技術を用いて容易に作出することができる。
【００３８】
　さらに、本発明は、外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有し、かつ内因性ＳＬＣ−１遺伝子を欠損させた非ヒト哺乳動物またはその生体の一部を提供する。
　ＳＬＴとＳＬＣ−１はアミノ酸レベルで約３５％の相同性を有していることから、ＳＬＴに特異的に作用する医薬をスクリーニングするには、使用する非ヒト動物の内因性ＳＬＣ−１遺伝子を欠損させておくのが好ましい。
　外来性ヒトＳＬＴ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを非ヒト哺乳動物に導入する方法は前記のとおりである。
　また、内因性ＳＬＣ−１を欠損させる方法は、前記した内因性ＳＬＴの発現が不活性化された遺伝子導入動物の作製方法と同様である。
　内因性ＳＬＣ−１としては、例えば、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質が用いられる。配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：３で表されるアミノ酸配列において、１ないし３０個、好ましくは１ないし１０個、さらに好ましくは１ないし５個、より好ましくは１または２個のアミノ酸に置換、付加または欠損が生じているが、ＳＬＣ−１の機能を失わないアミノ酸配列をいう。内因性ＳＬＣ−１としては、具体的には、配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるマウスＳＬＣ−１、配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるラットＳＬＣ−１などが挙げられる。
　内因性ＳＬＣ−１遺伝子としては、上記のアミノ酸配列からなるＳＬＣ−１をコードする遺伝子が用いられ、具体的には、
（１）配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるマウスＳＬＣ−１をコードする、配列番号：４で表される塩基配列を含有する遺伝子、
（２）配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるラットＳＬＣ−１をコードする、配列番号：６で表される塩基配列（ＷＯ００／４９０４６号公報）を含有する遺伝子などが用いられる。
【００３９】
　上記のようにして得られる本発明の非ヒト哺乳動物は、内因性ＳＬＴに加えて（あるいはそれに代えて）外来性ヒトＳＬＴを発現するので、外来性ヒトＳＬＴに対してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するが、内因性ＳＬＴに対しては活性を有しない外来性ヒトＳＬＴ特異的作動薬または拮抗薬について、その薬効をインビボで評価することを可能にする。
　本発明のヒトＳＬＴ遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物（以下、本発明の非ヒト哺乳動物と略記する場合がある）は、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食餌性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害、性機能障害、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症（例、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害など）、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞など）、痛風、呼吸器疾患（Pickwick症候群、睡眠時無呼吸症候群）、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症、代謝性疾患（例、視床下部機能低下症、下垂体機能低下症、副腎皮質機能低下症など）などの疾患を発症している。
　本発明の非ヒト哺乳動物は、上記のような極めてユニークな特徴を有しているので、以下に示す有用な用途を有している。
【００４０】
（１）本発明の非ヒト哺乳動物は、外来性ヒトＳＬＴ遺伝子が高発現させられているので、ＳＬＴ拮抗薬またはＳＬＴ作動薬、主にＳＬＴ拮抗薬の評価のために用いることができる。
　すなわち、本発明は、
i）本発明の非ヒト哺乳動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、ＳＬＴアンタゴニスト活性またはＳＬＴアゴニスト活性を検定することを特徴とするＳＬＴ作動薬のスクリーニング方法、
ii）本発明の非ヒト哺乳動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満食餌性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害、性機能障害、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症（例、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害など）、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞など）、痛風、呼吸器疾患（例、Pickwick症候群、睡眠時無呼吸症候群など）、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症、代謝性疾患（例、視床下部機能低下症、下垂体機能低下症、副腎皮質機能低下症など）などの疾患の改善効果を検定することを特徴とする、上記疾患の予防・治療のために用いられるＳＬＴ拮抗薬のスクリーニング方法、
iii）本発明の非ヒト哺乳動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、食欲不振（例、神経性食欲不振症など）、食欲不振に伴う貧血、低タンパク症、うつ病などの疾患の改善効果を検定することを特徴とする、上記疾患の予防・治療のために用いられるＳＬＴ作動薬のスクリーニング方法を提供する。
　ＳＬＴ拮抗薬またはＳＬＴ作動薬の候補化合物は、ＳＬＴとの結合実験により選定することができる。
　具体的には、本発明のスクリーニング方法では、本発明の非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する。被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡライブラリーなどの他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。
　ＳＬＴアンタゴニスト活性としては、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満食餌性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害、性機能障害、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症（例、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害など）、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞など）、痛風、呼吸器疾患（例、Pickwick症候群、睡眠時無呼吸症候群など）、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症、代謝性疾患（例、視床下部機能低下症、下垂体機能低下症、副腎皮質機能低下症など）など、好ましくは肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、心疾患、情動障害、記憶障害、性機能障害または代謝性疾患などの疾患の改善作用が挙げられる。
　ＳＬＴアゴニスト活性としては、食欲不振（例、神経性食欲不振症など）、食欲不振に伴う貧血、低タンパク症またはうつ病などの疾患の改善作用が挙げられる。
　本発明の非ヒト哺乳動物が本来的に有するＳＬＴによる上記作用の変動は無視してよい。
【００４１】
　このようにして選択されたＳＬＴ拮抗薬（ＳＬＴアンタゴニスト）は、安全で低毒性な、例えば肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満食餌性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害、性機能障害、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症（例、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害など）、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞など）、痛風、呼吸器疾患（例、Pickwick症候群、睡眠時無呼吸症候群など）、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症、代謝性疾患（例、視床下部機能低下症、下垂体機能低下症、副腎皮質機能低下症など）など、好ましくは肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、心疾患、情動障害、記憶障害、性機能障害または代謝性疾患などの予防・治療剤として使用することができる。
　一方、選択されたＳＬＴ作動薬（ＳＬＴアゴニスト）は、安全で低毒性な食欲不振（例、神経性食欲不振症など）、食欲不振に伴う貧血、低タンパク症またはうつ病などの予防・治療剤として使用することができる。
　選択されたＳＬＴ拮抗薬またはＳＬＴ作動薬は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、予防・治療用医薬として選択された物質を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
　錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
　注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００４２】
　また、選択された物質がＤＮＡである場合、当該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。当該ＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
　このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは非ヒト温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
　選択された物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、肥満症の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＳＬＴ拮抗薬（ＳＬＴアンタゴニスト活性を有する物質）を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、当該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肥満症の治療目的で注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき当該物質を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４３】
（２）また、本発明の非ヒト哺乳動物は、外来性ヒトＳＬＴ遺伝子が高発現している場合、上記した肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満食餌性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害、性機能障害などを発症している。また、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症（例、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害など）、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞など）、痛風、呼吸器疾患（例、Pickwick症候群、睡眠時無呼吸症候群など）、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症、代謝性疾患（例、視床下部機能低下症、下垂体機能低下症、副腎皮質機能低下症など）などを発症している場合もある。
　したがって、本発明の非ヒト哺乳動物は、上記疾患の予防剤または治療剤の評価のために用いることができる。
　すなわち、本発明は、本発明の非ヒト哺乳動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、上記疾患の改善効果を検定することを特徴とする、上記疾患の予防・治療のために用いられる物質のスクリーニング方法を提供する。
　具体的には、本発明のスクリーニング方法では、本発明の非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する。被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡライブラリーなどの他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。
　本発明のスクリーニング方法において、被検物質の投与により、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満食餌性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害、性機能障害、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症（例、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害など）、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞など）、痛風、呼吸器疾患（例、Pickwick症候群、睡眠時無呼吸症候群など）、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症、代謝性疾患（例、視床下部機能低下症、下垂体機能低下症、副腎皮質機能低下症など）などの疾患の改善効果があると判定された場合、その被検物質はこれら疾患の予防・治療用医薬として選択することができる。
【００４４】
　選択された物質は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、予防・治療用医薬として選択された物質を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
　錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
　注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００４５】
　また、選択された物質がＤＮＡである場合、当該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。当該ＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
　このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは非ヒト温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
　予防・治療用医薬として選択された物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、肥満症の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＳＬＴアンタゴニスト活性を有する物質を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、当該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肥満症の治療目的で注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき当該物質を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４６】
　以上の本発明の遺伝子導入哺乳動物を、組織培養のための細胞源として使用することも可能である。また例えば、本発明の遺伝子導入マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、あるいは遺伝子により発現されたタンパク組織を分析することにより、核内レセプターの複雑な作用の転写因子との関連性について解析することもできる。あるいは、遺伝子を有する組織の細胞を、標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、例えば脂肪組織を形成する細胞などの一般に培養が困難な組織に由来する細胞の機能を研究することもできる。さらに、その細胞を用いることにより、例えば細胞の機能を高めるような薬剤の選択も可能である。また、高発現細胞株があれば、そこから、ＳＬＴを大量に単離精製すること、ならびにその抗体を作製することも可能である。
【００４７】
　本願明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。
　ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
　ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
　　Ａ　　　　　　：アデニン
　　Ｔ　　　　　　：チミン
　　Ｇ　　　　　　：グアニン
　　Ｃ　　　　　　：シトシン
　ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
　ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
　ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
　ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
　ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
　ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
　ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
　ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
　ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
　Ｇｌｙ ：グリシン
　Ａｌａ   ：アラニン
　Ｖａｌ    ：バリン
　Ｌｅｕ   ：ロイシン
　Ｉｌｅ ：イソロイシン
　Ｓｅｒ ：セリン
　Ｔｈｒ　 ：スレオニン
　Ｃｙｓ ：システイン
　Ｍｅｔ ：メチオニン
　Ｇｌｕ ：グルタミン酸
　Ａｓｐ ：アスパラギン酸
　Ｌｙｓ ：リジン
　Ａｒｇ ：アルギニン
　Ｈｉｓ ：ヒスチジン
　Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
　Ｔｙｒ ：チロシン
　Ｔｒｐ ：トリプトファン
　Ｐｒｏ ：プロリン
　Ａｓｎ ：アスパラギン
　Ｇｌｎ ：グルタミン
　ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
　Ｍｅ　　　　　　：メチル基
　Ｅｔ　　　　　　：エチル基
　Ｂｕ　　　　　　：ブチル基
　Ｐｈ　　　　　　：フェニル基
　ＴＣ　　　　　　：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
【００４８】
　また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
　Ｔｏｓ　　　　　：ｐ−トルエンスルフォニル
　ＣＨＯ　　　　　：ホルミル
　Ｂｚｌ　　　　　：ベンジル
　Cl2Bzl ：２，６−ジクロロベンジル
　Ｂｏｍ　　　　　：ベンジルオキシメチル
　Ｚ　　　　　　　：ベンジルオキシカルボニル
　Ｃｌ−Ｚ　　　　：２−クロロベンジルオキシカルボニル
　Ｂｒ−Ｚ　　　　：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
　Ｂｏｃ　　　　　：ｔ−ブトキシカルボニル
　ＤＮＰ　　　　　：ジニトロフェノール
　Ｔｒｔ　　　　　：トリチル
　Ｂｕｍ　　　　　：ｔ−ブトキシメチル
　Ｆｍｏｃ　　　　：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
　ＨＯＢｔ　　　　：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
　ＨＯＯＢｔ　　　：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン
　ＨＯＮＢ　　　　：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
　ＤＣＣ　　　　　：Ｎ、Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【００４９】
　本発明の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
　〔配列番号：１〕ヒト海馬由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＳＬＴのアミノ酸配列を示す。
　〔配列番号：２〕ヒト海馬由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＳＬＴをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
　〔配列番号：３〕マウス由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＳＬＣ−１のアミノ酸配列を示す。
　〔配列番号：４〕マウス由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＳＬＣ−１をコードするゲノムＤＮＡの塩基配列を示す。
　〔配列番号：５〕ラット由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＳＬＣ−１のアミノ酸配列を示す。
　〔配列番号：６〕ラット由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＳＬＣ−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
　〔配列番号：７〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：８〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：９〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１０〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１１〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１２〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１３〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１４〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１５〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１６〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１７〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１８〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１９〕後述の実施例２で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：２０〕後述の実施例２で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：２１〕後述の実施例２で行われたＰＣＲ法に用いられたプローブの塩基配列を示す。〔５'末端にリポーター色素としてFAM（6-carboxy-fluorescein）を、３'末端にはクエンチャーとしてTAMRA（6-carboxy-tetramethyl-rhodamine）を標識した〕
　〔配列番号：２２〕ヒト脳由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＳＬＴをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。（Mol Pharmacol 60巻、632-639頁、2001年）
　〔配列番号：２３〕配列番号：２２で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【００５０】
　以下に参考例および実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【００５１】
参考例１　ヒトSLT遺伝子のクローニング
　ヒトSLT遺伝子のクローニングを行うためhuman male BACライブラリー（RPCI-11）のＰＣＲスクリーニングを行い、陽性クローン５個を取得した。これらクローンのクローニング領域を特定するため、ベクターpBACe3.6上のカスタムプライマー（SP6、T7）とSLTコーディング領域のプライマー（LT1、LT10）を用いて、クローニング領域のシーケンスを確認した。BACクローン＃107-F15、107-L15、107-M12、173-E1、173-F1シーケンスで確認した配列をそれぞれGenBankヒトゲノムデータ（Genomic Contig:#NT 019424）と照合した。その結果、クローン＃107-L15、173-E1（株式会社インターバイオテクノから購入）にSLT遺伝子が含まれていることがわかった。これらのクローンのサイズは約180Kbpで、SLT上流が56Kbp、下流がそれぞれ88Kbpおよび80Kbpであり、ほぼ同じ領域をクローニングしていることが明らかとなった。その結果、２クローン（＃107-L15、＃173-E1）がSLT遺伝子を含んでおり、これら２クローンのクローニング領域はほぼ同じであることが判明した。
【００５２】
実施例１
　BACクローンを用いたトランスジェニックマウス作製
　クローン＃RP11-107L15を制限酵素Sal I切断により直鎖上にした後、60℃、15分間加熱処理によりSal Iを失活させ、QIAGEN　miniカラム（QIAGEN社製）で精製した断片を10倍希釈TEバッファーで1μg/mlに濃度調製した。常法に従って上記BACクローンをC57BL/6J系統マウス受精卵前核にマイクロインジェクションして産仔41匹が得られた。
　3週齢産仔の尾よりゲノムDNAを常法に抽出し、PCRキットを用いて導入遺伝子の検出を行った。プライマーLT7およびLT10の組み合わせによる一次選抜において個体番号＃130,163,164においてSLT由来のPCR陽性バンドが検出された。この個体についてさらにLT17-LT18, LT19-LT20, LT25-LT26, LT33-LT34およびLT35-LT36のプライマー組合せによってPCRを行った。
　その結果、個体番号＃130,163,164は今回設定したプライマーすべての組み合わせでPCR陽性バンドが認められたことより、＃RP11-107L15全長が染色体に導入されていることが分かった。
LT7：5'-CAATCCCAGTGTACCAAAAC-3'　　 （配列番号：７）
LT10：5'-AAAGTGTGATTTCAGAGTGT-3'　　（配列番号：８）
LT17：5'-CAGGATTGATTTCCACCCTTGG-3'　（配列番号：９）
LT18：5'-GACTATTCCATTATATTGCCAG-3'　（配列番号：１０）
LT19：5'-ACTATGGTTCCAAGAACTGCCC-3'　（配列番号：１１）
LT20：5'-TCTCTCACTACACTGCAGATAC-3'　（配列番号：１２）
LT25：5'-CTCTGGAATTGAGGCTTCAG-3'　　（配列番号：１３）
LT26：5'-GACACTCCTCAATATCCCTG-3'　　（配列番号：１４）
LT33：5'-ATGCTGCCACCAGTGGTGGG-3'　　（配列番号：１５）
LT34：5'-GAAAGTCAAGTCTCAGAGTG-3'　　（配列番号：１６）
LT35：5'-TACCTGTTCACTCTCATGAC-3'　　（配列番号：１７）
LT36：5'-TGATCTATGACAAATCTGAC-3'　　（配列番号：１８）
　ヒトSLTトランスジェニックマウスであることが確認された雄マウス、個体番号＃130は成熟齢に達したので、C57BL/6J系統雌マウスと交配を行った。個体番号＃130由来の産仔17個体を得ることができた。それぞれの産仔について3週齢産仔の尾よりゲノムDNAを常法に抽出し、PCRキットおよび上記のプラーマー組合せを用いて導入遺伝子の検出を行った。その結果、17個体の産仔から雄1個体および雌4個体のヒトSLTトランスジェニックマウスを得た。
【００５３】
実施例２
　ヒトSLTトランスジェニックマウス（ヒトSLT Tgマウスと略す）の発現解析
　ヒトSLT Tgマウス各F1系統マウスを頚椎脱臼により屠殺し、脳を採取した。脳サンプルはIsogen（和光純薬製）中でホモジナイズしてtotal RNAを調製した。次にRNase-free DNaseセットとRNeasy Mini kit（キアゲン社製）を用いてDNAの除去およびtotal RNA精製を行った。各臓器のRNAレベルの遺伝子発現はリアルタイムPCR（TaqMan PCR）によって評価した。以上のtotal RNA はoligo dTプライマーおよびTaqMan　Transcription Reagents（アプライドパーキンエルマー社製）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを作製した。次にcDNAを鋳型として、2種のプライマー（配列番号：１９および配列番号：２０）、プローブ（配列番号：２１；(FAM)-tatcctggcattgcctgtctgggtcta-(TAMRA)）、酵素としてAmplyTaq Gold DNA polymerase（アプライドバイオシステムズ社製)を使用し、所定の溶液を調製した。以上の溶液をPrism 7700 Sequence Detector (アプライドパーキンエルマー社製) によって50℃ 2分および95℃ 10 分間加熱後、95℃ 15 秒、60℃ 60 秒 のサイクルを40回反復してPCR反応を行った。PCR産物の定量はPrism 7700 Sequence Detectorのプロトコールに従って算出した。
　その結果、ヒトSLT Tgマウスの脳において、ヒトSLT遺伝子の発現がみられたが、Non Tgマウス〔ヒトSLT Tgマウス（ヘテロ接合体）同士の交配で得られた個体群のなかでヒトSLT遺伝子を持たないマウス〕においてヒトSLT遺伝子の発現はみられなかった。
【００５４】
実施例３
　ヒトSLT Tgマウスの体重変化および摂食量
　ヒトSLT Tgマウス（実施例１で得られたマウスの後代）およびNon Tg マウス雌雄それぞれ6週齢を高脂肪食（40.7 fat wt. Cal%）飼育を行って、体重および摂食量変化を調べた。
体重は6週齢より、Tgマウスは雌雄ともにNon Tgマウスに比べて有意に高くなった。摂食量は雌雄ともにNon Tgマウスに比べて高くなった。
【００５５】
実施例４
　ヒトSLT Tgマウスの血漿のレプチン値
高脂肪食飼育前（CE-2食飼育）および飼育後8週目（マウス14週齢時）に眼底採血を行い、血漿生化学パラメータを測定した。
　飼育前の血漿レプチン値はTgマウスとNon  Tgマウス間に差異はなかった。飼育8週目において、Tgマウスの血漿レプチン値は雌雄ともにNon Tgマウスに比べて有意に高かった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
　本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物から採取した細胞などを培養し、ＳＬＴ阻害薬の評価に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＳＬＴ遺伝子、ＰＣＲプライマーの位置、配列および判定系を示す。SLT遺伝子第5エクソンを検出するためにプライマーLT7およびLT10、SLT遺伝子の5' 56Kbp上流域を検出するためにプライマーLT19-LT20、SLT遺伝子の5' 8Kbp上流域を検出するためにプライマーLT33-LT34、SLT遺伝子の5' 5Kbp上流域を検出するためにプライマーLT35-LT36、SLT遺伝子の3' 9Kbp下流域を検出するためにプライマーLT25-LT26、およびSLT遺伝子の3' 88Kbp下流域を検出するためにプライマーLT18-LT17をそれぞれ用いたＰＣＲ反応によって遺伝子の挿入等を調べる。＃RP11-107L15全長が染色体にインテグレイトされていると考えられた。以上のすべての反応において陽性の場合、＃RP11-107L15のほぼ全長が染色体に挿入されていると判断する検出系である。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
　〔配列番号：７〕実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：８〕実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：９〕実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１０〕実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１１〕実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１２〕実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１３〕実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１４〕実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１５〕実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１６〕実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１７〕実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１８〕実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：１９〕実施例２で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：２０〕実施例２で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
　〔配列番号：２１〕実施例２で行われたＰＣＲ法に用いられたプローブの塩基配列を示す。〔５'末端にリポーター色素としてFAM（6-carboxy-fluorescein）を、３'末端にはクエンチャーとしてTAMRA（6-carboxy-tetramethyl-rhodamine）を標識した〕
【図１】
2004121241.tif 000002
【配列表】
2004121241000001.app