(57)【要約】【課題】制がん剤となり得る化合物等の物質を簡便に選択することのできる制がん剤スクリーニング方法を提供する。【解決手段】被験物質の存在下に、ＧＤＰが結合されたＲａｎにＲＣＣ１を反応させ、そのＲＣＣによるＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応が阻害された場合に、当該被験物質を制がん剤の候補またはその前駆体として選択する。確認のための追加工程として、選択された被験物質が、細胞周期の特定段階に同調された培養細胞に未成熟染色体凝縮を起こすか否かを測定する。【選択図】　　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の存在下に、ＧＤＰが結合されたＲａｎにＲＣＣ１を反応させ、そのＲＣＣ１によるＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応が阻害された場合に、当該被験物質を制がん剤の候補またはその前駆体として選択することを特徴とする制がん剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
選択された被験物質が、細胞周期の特定段階に同調された培養細胞に未成熟染色体凝縮を起こすか否かを測定する工程を追加することを特徴とする請求項１の制がん剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、制がん剤（抗がん剤）となり得る物質を簡便に選択することのできる制がん剤のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
がん治療において化学療法は重要な地位を占めており、現在臨床で用いられている制がん剤は５０種以上にものぼるが、未だ充分ではなく、新しい制がん剤の開発が日夜続けられている。
【０００３】
制がん剤の効率的な開発のためには、本格的な薬理学的試験や臨床試験の前に、提示された物質が制がん剤となり得るか否かということをインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で簡便に判別するためのスクリーニング方法が不可欠である。しかし、この目的から案出された具体的な方法は数少ない。
【０００４】
最近、細胞機能や細胞周期を制御するシグナル伝達、特に、プログラム細胞死と言われるアポトーシスに至るシグナル伝達の機構とがんとの関連を解明する研究が盛んに行なわれている。このような探索研究は、既存の薬剤を母体としてそれを単に修飾する従来の開発手法とは異なり、新しい作用機序に基づく新しいタイプの制がん剤を導くものとして期待される。しかし、その研究成果を制がん剤のスクリーニング方法に適用した例は殆ど見当らない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、制がん剤となり得る化合物等の物質を簡便に選択することのできる新規な制がん剤スクリーニング方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、検討を重ねた結果、核と細胞質との間の物質輸送のためのシグナル伝達系に関与する低分子量Ｇタンパク質として知られるＲａｎのＧＥＦ（グアニンヌクレオチド交換因子：ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応促進因子）であるＲＣＣ１の酵素活性をインビトロ測定することにより、上記の目的を達成し、本発明を導き出した。
【０００７】
かくして、本発明は、被験物質の存在下に、ＧＤＰが結合されたＲａｎにＲＣＣ１を反応させ、そのＲＣＣ１によるＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応が阻害された場合に、当該被験物質を制がん剤の候補またはその前駆体として選択することを特徴とする制がん剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に従う制がん剤のスクリーニング方法において使用されるＲＣＣ１とは、ＲａｎのＧＥＦ（グアニンヌクレオチド交換因子：ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応促進因子）である。ここで、Ｒａｎは、Ｒａｓに類似する低分子量Ｇタンパク質（ＧＴＰ結合タンパク質：ＧＴＰアーゼ）であり、よく知られているように、そのオン−オフサイクルに応じて細胞質と核との間のタンパク質やＲＮＡの輸送を制御している。
【０００９】
このようなＲａｎの作用は、そのＧＥＦであるＲＣＣ１が核内に局在するとともに、ＲａｎのＧＡＰ（ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質）が細胞質に局在することによって支えられている。すなわち、ＲＣＣ１はクロマチンに結合して核内にしか存在しないため、核内においてのみＲａｎはＧＴＰ型となり、このＧＴＰ型のＲａｎが核外輸送受容体であるＣｒｍｌ／ｅｘｐｏｒｔｉｎ１に結合する。Ｃｒｍ１は核質内の核外輸送シグナル配列をもつ分子（ｃａｒｇｏ）を認識して結合しており、Ｒａｎとの三者複合体が形成される。するとＣｒｍ１は核膜孔のタンパク質であるヌクレオポリン（ｕｎｃｌｅｏｐｏｒｉｎ）に結合できるようになり、複合体のままで核膜孔を通過する。一方、ＲａｎのＧＡＰは細胞質や核膜孔の細胞質側に局在するので、そこでＲａｎはただちにＧＤＰ型になり、ｃａｒｇｏが解離され、ｃａｒｇｏの核外への輸送が完了する。細胞質で形成されたＧＤＰ型のＲａｎはＮＴＦ２／ｐ１０というＧＤＩ様の制御因子に結合することにより、再び核膜孔を通って核内に返還される。一方、ｃａｒｇｏが解離したＣｒｍ１は再び核膜孔を通って核内に返還される。このようにして、物質の核外輸送が行なわれる。細胞質から核内への物質の逆輸送にもＲａｎが重要な働きをしている。
【００１０】
ＲＣＣ１は、Ｒａｎについて知られた唯一のＧＥＦであり、上述したように、核膜孔を通る物質の輸送において重要な役割を占める。ＲＣＣ１については、その遺伝子を欠損し細胞周期のＳ期に同調された培養細胞がアポトーシスの前兆である未成熟染色体凝縮を起こす（Ｔ．　Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ他、Ｃｅｌｌ　１５，　４７５−４８３　（１９７８））ことから、細胞周期の進行を制御することに関与していると考えられるが、その詳細については未だ充分に明らかにされてはいない。
【００１１】
一方、がんの化学療法の観点から、制がん剤の開発に際して検討されている最近の大きなテーマの一つは、がん細胞にアポトーシスを誘導させてがん細胞を排除し得るような物質を見出すことである。すなわち、がん細胞に潜在しているアポトーシス（細胞死プログラム）の活性化を図ることができれば、がん細胞を効率的に死滅排除でき、有効な治療効果が期待される。
【００１２】
しかし、実際には、細胞周期のチェックポイントコントロール機構に基づきがん細胞に獲得されているアポトーシス耐性機構に阻まれ所期の効果を奏し得ないことが多い。そこで、細胞周期のチェックポイントコントロールに打ち克ちアポトーシスに導くような物質は制がん剤と成る可能性を与えるとともに、該物質によってアポトーシスが導かれることが確認された系は、制がん剤となり得る他の物質を選別する手段としても利用することができると考えられる。
【００１３】
如上の点に関し、カフェインは、多くの薬理学的効果を呈することで知られているが、特に、がんの化学療法に関する研究においては、細胞周期のチェックポイントコントロールに打ち克ち未成熟染色体凝縮を起こしてアポトーシスを導くことから、制がん作用を調べる標準的な物質として用いられている。すなわち、高濃度のカフェインは、細胞周期の共役機構を乱し、Ｓ期に同調（停止）させた培養細胞の分裂を開始させアポトーシスに導くことが知られている（例えば、Ｃ．Ｅ．　Ｃａｎｍａｎ，　Ｃｕｒｒ．　Ｂｉｏｌ．　１１，　Ｒ１２１−１２４　（２００１））。本発明者は、このたび、ＲＣＣ１が不活性化されることによっても同様の現象が起こり得ることに注目し、被験物質の存在下におけるＲＣＣ１活性の阻害の有無が、当該被験物質の制がん剤としての当否の判断の１つの基礎になり得るものと考え、本発明を導き出したものである。
【００１４】
かくして、本発明に従えば、インビトロで、被験物質の存在下に、ＧＤＰが結合されたＲａｎにＲＣＣ１を反応させ、そのＲＣＣ１のＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応に対する阻害の有無を測定するという極めて簡単な方法により、制がん剤の候補またはその前駆体を選択することができる。測定に用いられるＲａｎやＲＣＣ１は、既知の遺伝子組換え技術により、大腸菌で発現させ精製することによりヒト由来の実質的に純粋なタンパク質として入手することができる（例えば、Ｍ．　Ｄａｓｓｏ，　Ｔ．　Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ他、ＥＭＢＯ　Ｊ．　１３，　５７３２　（１９９４）参照）。
【００１５】
Ｒａｎに対するＲＣＣ１のＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応は、ＲＣＣ１を含有する適当な緩衝溶液に、被験物質、および標識（ラベル）を付けたＧＤＰが結合されたＲａｎを添加して、所定時間反応させ、標識信号を追跡することにより簡単に測定することができる。ＧＤＰの標識化には、当該分野で周知の各種の方法が適用可能であるが、一般的には、トリチウムで標識された［３Ｈ］ＧＤＰまたは蛍光性のＧＤＰアナログ（２’，３’−ｂｉｓ−Ｏ−（Ｎ−メチルアンスラニロイル）グアノシンジフォスフェート：ｍａｎｔＧＤＰ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社から入手できる）を用い、これを精製されたＲａｎと適当な緩衝溶液中で混合することにより、ＧＤＰが結合されたＲａｎ（Ｒａｎ−［３Ｈ］ＧＤＰまたはＲａｎ−ｍａｎｔＧＤＰ）が得られる。
【００１６】
本発明に従えば、以上のようなインビトロ実験系において、反応終了後、残留しているＲａｎ−ＧＤＰを測定する、例えば、Ｒａｎ−［３Ｈ］ＧＤＰを用いた場合にはその放射活性を測定し、また、Ｒａｎ−ｍａｎｔＧＤＰを用いた場合にはその蛍光強度を測定することにより、ＲＣＣ１によるＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応が阻害されているか否かを知ることができる。すなわち、ＲＣＣ１がＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応に対して酵素活性を発揮していれば、Ｒａｎ−ＧＤＰは少なくなり放射活性や蛍光強度が減少するが、反対にＲＣＣ１の活性が阻害されていればＧＤＰの標識に由来する信号は変化しないことになる。
【００１７】
このようにして、本発明の制がん剤のスクリーニング方法においては、ＲＣＣ１によるＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応が阻害された場合に、用いた被験物質を制がん剤の候補またはその前駆体として選択する。すなわち、制がん剤候補として、更なる薬理学的試験や臨床試験に供して薬剤としての適否を調べる。あるいは、選択した被験物質を前駆体としその化学構造を修飾した誘導体を制がん剤候補として改良を図る。例えば、本発明に従うスクリーニング法において更に少量の投与量でもＲＣＣ１活性を阻害するように化学構造を改変したものを更なる薬理学的試験や臨床試験に供して制がん剤としての適否を調べる。
【００１８】
本発明は、如上の簡便なインビトロ試験により、制がん剤となり得る物質を選択することのできる、制がん剤の一次スクリーニング法を提供するものである。さらに、本発明の好ましい態様として、選択された被験物質は、細胞周期の特定段階に同調された（停止された）培養細胞に未成熟染色体凝縮を起こすか否かを測定する工程に供される。この追加の工程は、上述したようなインビトロ試験による一次スクリーニング法に対して確認のための二次スクリーニング法としての意義を有し、このインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）試験において培養細胞に未成熟染色体凝縮を起こす被験物質は制がん剤となり得る可能性がより高いことを示すことになる。
【００１９】
本発明に従うこの追加工程には、細胞周期の特定段階に同調（停止）された培養細胞として従来より提示されているような各種のものが原理的には使用できるが、一般的には、ハムスターやマウスなどのげっ歯類由来の培養細胞（例えば、ＢＨＫ−２１細胞やＣＨＯ細胞など）であって、細胞周期のＳ期に同調されたものが好ましく、特に、未成熟染色体凝縮の観察の容易なＢＨＫ−２１細胞が好ましい。
【００２０】
【実施例】
本発明の特徴を更に明らかにするため、以下に実施例を記すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
実施例１は、本発明に従い制がん剤候補またはその前駆体を選択するためにインビトロでＲＣＣ１の阻害活性を測定する具体的方法を例示するとともに、アポトーシスを誘導する制がん作用の標準的物質として従来より知られているカフェインおよびその類縁化合物がＲＣＣ１酵素活性を阻害することを示すものである。
また、実施例２は、実施例１のようなインビトロ試験で選択された物質について実施するインビボの追加工程の具体的方法を例示するものであり、インビトロ試験でＲＣＣ１阻害活性を有することが明らかにされた物質は培養細胞に未成熟染色体凝縮を起こし得ることを示している。
【００２１】
実施例１：ＲＣＣ１活性の測定
大腸菌でＲＣＣ１、Ｒａｎを発現させて高度に精製した。このヒト由来のＲＣＣ１およびＲａｎを用いて次の実験を行なった：所定濃度のＲＣＣ１を反応液（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣＨＡＰＳ、１５μＭのＤＴＴ、５ｍＭのＧＴＰを含有）に加えた。この反応液に最終濃度５ｍＭのカフェイン（ｃａｆｆｅｉｎｅ）、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）および２’−デオキシアデノシン（２−ｄＡ）を加えた混合液、またはなんの薬剤も加えないサンプル（ｂｕｆｆｅｒ）を作成し、これに［３Ｈ］ＧＤＰを結合したＲａｎ−［３Ｈ］ＧＤＰ（最終濃度、５０ｎＭ）を加え３７℃で２０分間、反応させた。反応は氷冷した反応終止液（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２および１００ｍＭのＮａＣｌを含有）を加えることで停止させた。反応終了後、反応液をニトロセルロースフィルター（０．４５μｍ、ＮＣ４５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ）でろ過してＲａｎ−［３Ｈ］ＧＤＰを回収し残留している放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
測定結果を図１に示す。横軸には用いたＲＣＣ１の濃度（ｆｍｏｌ）を示し、縦軸には使用したＲＣＣ１濃度で反応させた後に残留しているＲａｎ−［３Ｈ］ＧＤＰの放射活性を示している。この結果より、カフェインおよび２’−デオキシアデノシンはＲＣＣ１の酵素活性であるＲａｎ−ＧＤＰ／ＧＴＰ交換機能を阻止することが理解される。
【００２２】
実施例２：未成熟染色体凝縮の測定
ハムスター由来ＢＨＫ−２１細胞をイソロイシン欠損培地で２８時間培養してＧ１期に同調した後に、ＤＮＡ合成阻害剤であるハイロドキシウレア（ＨＵ）を２．５ｍＭ（最終濃度）添加した培地で１６時間培養してＳ期にＢＨＫ−２１細胞を同調した。これらＳ期に同調したＢＨＫ−２１細胞にカフェインを加え、さらに所定量のＲＣＣ１を注入して５時間培養した。
その後、未成熟染色体凝縮（ＰＣＣ）が起こったか否かを調べた。すなわち、細胞を−２０℃のメタノールで固定しｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２でＤＮＡ染色を行ない、ＤＮＡが凝縮して円くなっている細胞の割合（％）を測定した。測定結果を図２に示す。図２に示されるように、カフェインはＳ期に同調されたＢＨＫ−２１細胞に未成熟染色体凝縮（ＰＣＣ）を起こすが、このカフェインで誘導されたＰＣＣはＲＣＣ１によって防止され、ＰＣＣの一因がＲＣＣ１活性が阻害されることにあることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従い抗がん剤をスクリーニングするために行なうＲＣＣ１の活性測定の結果の１例を示す。
【図２】本発明に従い抗がん剤をスクリーニングするために行なう未成熟染色体凝縮測定結果の１例を示す。
【図１】
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【図２】
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