(57)【要約】【課題】真皮層線維芽細胞におけるコラーゲン産生を促進して皮膚の老化を防止及び／又は改善し得る物質を見出し、それを有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤を提供するとともに、シクロオキシゲナーゼ−２阻害作用を通じて炎症反応を抑制し、炎症を治療及び／又は予防し得る物質を見出し、それを有効成分として含有するシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤を提供する。【解決手段】コラーゲン産生促進剤及びシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤の有効成分として、バーベリー抽出物を含有させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バーベリー抽出物を有効成分として含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
バーベリー抽出物を有効成分として含有することを特徴とするシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、線維芽細胞によるコラーゲン産生を促進する作用を有するコラーゲン産生促進剤、炎症反応等に関与するシクロオキシゲナーゼ−２の活性を阻害する作用を有するシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するエラスチン、コラーゲン、ヒアルロン酸等の細胞外マトリックスにより構成されている。若い皮膚においては、これら皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【０００３】
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンの産生量が減少すると共に架橋による弾力低下を起こす。その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始めるから、肌は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。
【０００４】
このように、皮膚の老化に伴う変化、即ち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、コラーゲン等の真皮マトリックス成分の減少・変性が関与している。したがって、真皮層線維芽細胞におけるコラーゲンの産生を促進することにより皮膚の老化を防止及び／又は改善することができると考えられ、コラーゲン産生促進作用を有する植物抽出物として、甘草葉抽出物（特許文献１）、ハス胚芽抽出物（特許文献２）、五斂子抽出物（特許文献３）が知られている。
【０００５】
炎症は、発赤、浮腫、発熱、痛み、機能障害等の症状を示す複雑な反応であるが、微視的に見ると、血漿漏出を起こす血管反応、白血球の浸潤、炎症性細胞による組織破壊等、共通する反応からなる。さらに、発熱反応や痛覚過敏等中枢神経系も関与する全身の反応も引き起こす。このような炎症の個々の反応にはプロスタグランジンが重要な役割を果たしており、この炎症時におけるプロスタグランジンの産生には、主として誘導型のシクロオキシゲナーゼであるシクロオキシゲナーゼ−２の関与が明らかとなってきた。また、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤により血管新生を抑制できることから、炎症部位では、炎症惹起物質−シクロオキシゲナーゼ−２誘導−プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生−ＥＰ３受容体への結合−血管新生因子の産生誘導のようなサイクルで血管新生が促進すると考えられている（非特許文献２）。
【０００６】
炎症を治療及び／又は予防する目的で、アスピリンに代表される多くのシクロオキシゲナーゼ阻害剤が用いられており（非特許文献１）、植物由来のシクロオキシゲナーゼ阻害剤としては、マンゴスチン果皮抽出物中のα−マンゴスチン及びγ−マンゴスチン（特許文献４）が知られている。さらに、シクロオキシゲナーゼ−２阻害作用を示すのもとして、２−フェニル−１，２−ベンズイソセレナゾール−３（２Ｈ）−オン又はその塩若しくは水和物が知られている（特許文献５）。
【０００７】
一方、バーベリー抽出物の作用として、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ作用（特許文献６）、抗アレルギー作用及び活性酸素消去作用（特許文献７）、テストステロン５α−リダクターゼ阻害作用及びアンドロゲン受容体結合阻害作用（特許文献８）が知られている。
【０００８】
【特許文献１】
特開２０００−１９１４９８号
【特許文献２】
特開２００２−２９９８０号
【特許文献３】
特開２００２−２２６３２３号
【特許文献４】
特開２００２−４７１８０号
【特許文献５】
特開２０００−１６９３５号
【特許文献６】
特開２０００−２１９６３１号
【特許文献７】
特開２０００−２２９８７１号
【特許文献８】
特開２００２−１７９５８４号
【非特許文献１】
「薬理学アトラス」，福原武彦監訳，文光堂，ｐ１８４
【非特許文献２】
「ファルマシア」，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．２，２００２年，ｐ１４０−１４４
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第一の目的は、真皮層線維芽細胞におけるコラーゲン産生を促進して皮膚の老化を防止及び／又は改善し得る物質を見出し、それを有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤を提供することにある。
本発明の第二の目的は、シクロオキシゲナーゼ−２阻害作用を通じて炎症反応を抑制し、炎症を治療及び／又は予防し得る物質を見出し、それを有効成分として含有するシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明のコラーゲン産生促進剤及びシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤は、バーベリー抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明において、「バーベリー抽出物」とは、バーベリーを抽出原料として得られる抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１２】
抽出原料として使用する植物はバーベリー（マホニア・ネパレンシス（Ｍａｈｏｎｉａ  ｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ  ＤＣ．））である。バーベリーは、ガルワールからブータンの温帯ヒマラヤの海抜１２００〜２４００ｍに生える常緑低木であり、それらの地域から容易に入手可能である。
【００１３】
抽出原料として使用するバーベリーの構成部位は特に限定されるものではなく、例えば、葉、花、根、樹皮、枝等を使用することができるが、樹皮を使用することが好ましい。
【００１４】
抽出原料として使用するバーベリーは、採取後ただちに乾燥し粉砕したものが適当である。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、バーベリーの極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１５】
抽出処理の際には、抽出溶媒として極性溶媒を使用することが好ましい。バーベリーに含まれるコラーゲン産生促進作用又はシクロオキシゲナーゼ−２阻害作用を示す成分は、極性溶媒を抽出溶媒とする抽出処理によって容易に抽出することができる。
【００１６】
好適な抽出溶媒の具体例としては、水、低級脂肪族アルコール、含水の低級脂肪族アルコール等が挙げられ、これらを単独で又はこれら２種以上の混合物として使用することができる。好適な低級脂肪族アルコールの具体例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール等が挙げられる。
【００１７】
抽出溶媒として使用し得る水には、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、滅菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１８】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水と低級脂肪族アルコールとの混合比を７：３〜２：８（重量比）とすることができる。
【００１９】
抽出処理は、バーベリーに含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定されず、常法に従って行うことができる。抽出処理の際には、特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下において任意の装置を使用することができる。
【００２０】
例えば、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料を投入し、ときどき攪拌しながら可溶性成分を溶出させる。この際、抽出条件は抽出原料等に応じて適宜調整し得るが、抽出溶媒量は通常、抽出原料の５〜１５倍量（重量比）あり、抽出時間は通常１〜３時間であり、抽出温度は通常、常温〜９５℃である。
【００２１】
抽出処理により可溶性成分を溶出させた後、ろ過して抽出残渣を除くことによって、抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２２】
得られた抽出液はそのままでもコラーゲン産生促進剤又はシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が利用しやすい。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。
【００２３】
バーベリー抽出物は特有の匂いと味を有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚外用剤や美容用食品に添加する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。精製は、具体的には活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。
【００２４】
以上のようにして得られるバーベリー抽出物は、コラーゲン産生促進作用又はシクロオキシゲナーゼ−２阻害作用を有しており、それぞれの作用を利用してコラーゲン産生促進剤又はシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤の有効成分として使用することができる。
【００２５】
バーベリー抽出物はそのままでもコラーゲン産生促進剤又はシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤として使用することができるが、常法に従って製剤化して使用することもできる。製剤化する場合、保存や取扱いを容易にするために、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容され得るキャリアーその他任意の助剤を添加することができる。バーベリー抽出物は、製剤化により粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形とすることができる。
【００２６】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、真皮層線維芽細胞におけるコラーゲン産生を促進して皮膚の老化を防止及び／又は改善できるので、皮膚外用剤に配合するのに好適である。また、本発明のシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤は、シクロオキシゲナーゼ−２阻害作用を通じて炎症反応を抑制し、炎症を治療及び／又は予防できるので、皮膚外用剤に配合するのに好適である。ここで、「皮膚外用剤」とは、皮膚に適用される各種薬剤を意味し、例えば、化粧料、医薬部外品、医薬品等が含まれる。皮膚外用剤の具体例としては、肌に対するものとして、軟膏、パップ、クリーム、乳液、ローション、パック、ゼリー等が挙げられ、頭皮に対するものとして、トニック、リンス、シャンプー、アストリンゼント等が挙げられる。皮膚外用剤におけるバーベリー抽出物の配合量は、皮膚外用剤の種類や抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、好適な配合率は標準的な抽出物に換算して０．００１〜１０重量％である。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲はこれらの実施例等に限定されるものではない。
【００２８】
〔製造例１〕
バーベリーの樹皮の粗粉砕物３００ｇを抽出溶媒３０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った。その後、ろ過し、ろ液を４０℃で減圧下にて濃縮し、さらに減圧乾燥機で乾燥してバーベリー樹皮抽出物を得た。４種類の抽出溶媒を用いて上記抽出処理を行ったところ、抽出物の収率は表１のとおりであった。なお、抽出溶媒が混合物の場合、以下に示す混合比は重量基準によるものである。
【００２９】
2004346019.tif 000002
【００３０】
〔製造例２〕
製造例１で用いたものと同じバーベリー樹皮の粗粉砕物３００ｇを抽出溶媒３０００ｍＬに投入し、攪拌しながら８０℃で２時間保持した後、ろ過して抽出液を得た。３種類の抽出溶媒を用いて上記抽出を行い、表２に示す固形分濃度の抽出液約１５００ｍＬを得た。なお、抽出溶媒が混合物の場合、以下に示す混合比は重量基準によるものである。
【００３１】
2004346019.tif 000003
【００３２】
〔試験例１〕コラーゲン産生促進作用の試験
製造例１及び２で得られた試料１〜７について、コラーゲン産生促進作用の試験を行った。具体的には、以下のようにして試験を行った。
ヒトの線維芽細胞を９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下にて、試料添加培地（試料濃度：１００μｇ／ｍＬ及び２５μｇ／ｍＬ）で数日間培養した後、上清９０μＬをＥＬＩＳＡプレートに移し換え、４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレートに吸着させた後、溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行った。その後、１％  ウシ血清アルブミンを含むリン酸生理緩衝液で、ブロッキング操作を行った。溶液を捨て、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行い、抗ヒトコラーゲンタイプＩ抗体（ウサギＩｇＧ；ケミコン社製）を反応させた。溶液を捨て、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて、洗浄を行い、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させた後、同様の洗浄操作を行い、発色反応を行った。
【００３３】
コラーゲン産生促進率は、標準品を用いて上記ＥＬＩＳＡを行い、検量線を作成し、試料無添加時のコラーゲン産生量を１００％として算出した。各試料のコラーゲン産生促進率（％）を表３に示す。なお、試料が製造例２による抽出液の場合、「試料濃度」は固形分換算濃度である。
【００３４】
2004346019.tif 000004
【００３５】
表３に示される結果より、バーベリー樹皮からの抽出物が線維芽細胞のコラーゲン産生を促進する作用を有することが確認された。また、かかるバーベリー樹皮抽出物のコラーゲン産生促進作用の強さは、バーベリー樹皮抽出物の濃度に依存して変化し、バーベリー樹皮抽出物の濃度を調節することによりコラーゲン産生促進作用の強さを調節できることが確認された。
【００３６】
〔試験例２〕シクロオキシゲナーゼ−２阻害作用の試験
製造例１及び２で得られた試料１〜７について、シクロオキシゲナーゼ−２阻害作用の試験を行った。具体的には、以下のようにして試験を行った。
【００３７】
Ｈｗａｎｇ  Ｂ．Ｙ．らの方法（Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ  ６７  （２００１）  ｐ４０６−４１０）に一部修正を加えて行った。即ち、マウス由来マクロファージ様細胞（ＲＡＷ２６４．７）を前培養後、細胞を集め、１×１０５個／ｍｌに調製し、９６穴プレートに１００μＬづつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間培養した。培養後、既に存在するシクロオキシゲナーゼ−１及び少量発現しているシクロオキシゲナーゼ−２をアセチル化し失活させるため、５００μｍｏｌ／Ｌ  アスピリン含有培地に交換し４時間培養した。細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、１μｇ／ｍＬ  ＬＰＳを含む培地で溶解した試料２００μＬを添加し、１８時間培養した。培養後、上清中のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）をＰＧＥ２ＥＩＡ  Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ，  ＵＳＡ）を用いて定量し、対照と比較することによりＰＧＥ２産生抑制率を算出した。
【００３８】
ＰＧＥ２はシクロオキシゲナーゼを律速段階とする酵素反応で産生され、シクロオキシゲナーゼには、恒常的に活性を示す１型と、炎症時に誘導されて活性を示す２型が存在する。マウス由来マクロファージ様細胞をアスピリンで処理し、既に存在するシクロオキシゲナーゼ−１及び２を失活させた後、ＬＰＳで処理すると、シクロオキシゲナーゼ−２が誘導され、ＰＧＥ２が産生される。すなわち、ＬＰＳ誘導ＰＧＥ２産生は、シクロオキシゲナーゼ−２を介するＰＧＥ２産生と考えられ、ＰＧＥ２産生抑制作用をシクロオキシゲナーゼ−２阻害作用ということができる。そこで、ＰＧＥ２産生を５０％抑制する濃度（μｇ／ｍＬ）から、シクロオキシゲナーゼ−２活性を５０％阻害する濃度（「５０％阻害濃度」という）（μｇ／ｍＬ）を算出した。結果を表４に示す。
【００３９】
2004346019.tif 000005
【００４０】
表４に示される結果より、バーベリー樹皮からの抽出物がシクロオキシゲナーゼ−２阻害作用を有することが確認された。また、かかるバーベリー樹皮抽出物のシクロオキシゲナーゼ−２阻害作用の強さは、バーベリー樹皮抽出物の濃度に依存して変化し、バーベリー樹皮抽出物の濃度を調節することによりシクロオキシゲナーゼ−２阻害作用の強さを調節できることが確認された。
【００４１】
【発明の効果】
本発明により、コラーゲン産生促進剤及びシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤が提供される。本発明のコラーゲン産生促進剤は皮膚老化の防止及び／又は改善に有用であり、本発明のシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤は炎症の治療及び／又は予防に有用である。