(57)【要約】【課題】　流体の粘性変化を電気化学的に検出する方法およびデバイスを提供する。【解決手段】　この発明の方法では、流体サンプル（例えば全血サンプル）が、対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極の一方に一体化した微細針を用いて電気化学的検査細片の電気化学的セルに導入される。まずセルの定常電流を流すために、電気化学的セルには電位が与えられる。次に、セルの定常電流の低下が検出され、上記サンプルの粘性変化に関係付けられる。多くの実施の形態では、上記サンプルは血液であり、粘性変化は血液サンプルの凝固の到来、そして多くの場合、血液サンプルのプロトロンビン時間（ＰＴ）に関係付けられる。電気化学的検査細片は電気化学的セルおよびこれと一体化した微細針を含む。電気化学的セルは、対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極と、試薬混合物（例えば、レドックス対および凝固触媒因子）とを含む。微細針は電気化学的セルの作用電極および参照電極の一方に一体化されている。【選択図】　　　　図１
2004132966.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　（ａ）対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極を含み、当該作用電極および参照電極の一方がユーザーから流体サンプルを採取するための微細針と一体化した電気化学的セルに流体サンプルを導入するステップと、
　（ｂ）前記電気化学的セルに電位を与えて前記対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極と参照電極との間に定常電流を流すステップと、
　（ｃ）前記定常電流の変化を検出するステップと、
　（ｄ）前記定常電流の変化を前記流体サンプルの粘性変化に関係付けるステップと
　を含む流体サンプルの粘性変化を検出する方法。
【請求項２】
　（ａ）（ｉ）対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極と（ｉｉ）少なくとも１つのレドックス対を含む試薬混合物とを含み、前記作用電極および前記参照電極の一方がユーザーから血液サンプルを採取するための微細針と一体化した電気化学的セルに前記血液サンプルを導入するステップと、
　（ｂ）前記電気化学的セルに電位を与えて前記対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極と参照電極との間に定常電流を流すステップと、
　（ｃ）前記定常電流の変化を検出するステップと、
　（ｄ）前記定常電流の変化を前記血液サンプルの粘性変化に関係付けるステップと
　を含む血液サンプルの凝固の到来を検出する方法。
【請求項３】
　（ａ）対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極と、
　（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのレドックス対および（ｉｉ）凝固触媒因子を含む試薬混合物と
　を含む電気化学的セルと、
　前記作用電極および前記参照電極の一方に一体化した微細針と
　を含む電気化学的検査細片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　この発明は、凝固、特に凝固検査に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
　凝固は、液体またはゾルから柔らかな塊、半固形の塊あるいは固形の塊への変化として定義されている。血液は、外傷の状態または病気の容態が血管に損傷を起こすときに、必然的に凝固してバリアを形成するものである。広く認識された２つの凝固経路としては、外因性すなわちトロンボプラスチン制御凝固経路と、内因性すなわちプロトロンビン／フィブリノゲン制御凝固経路とがある。外因性経路および内因性経路の双方は、フィブリノゲンのフィブリンへの変換を触媒する蛋白質分解酵素であるトロンビンを結果として生成する。
【０００３】
　血液サンプルの塊すなわち凝固形成能を測定する凝固検査は以前から開発されており、血液サンプルのプロトロンビン時間（以下、ＰＴともいう）を測定するのに用いられてきた。このような検査は、一般に、ＰＴ検査と呼ばれている。ＰＴ検査は多くの異なる応用例に用いられている。例えば、ＰＴ検査は抗凝血療法を受ける患者をモニタするのに用いられている。ＰＴ検査が用いられる他の状況としては、血小板の後天性機能欠損症、血小板の先天性機能欠損症、プロテインＣまたはＳの先天性欠損症、深部脳内出血、ＤＩＣ（播種性血管内凝固）、第ＩＩ因子欠損症、第Ｖ因子欠損症、第ＶＩＩ因子欠損症、第Ｘ因子欠損症、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、血友病Ａ、血友病Ｂ、出血性発作、肝性脳症、肝腎症候群、高血圧性脳内出血、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、脳内出血、肺葉脳内出血、胎盤剥離、一過性虚血性発作、ウィルソン病およびこれらに類するものを確認する検査を含む。そういうものであるから、ＰＴ検査は種々の異なる応用例に用いられている。
【０００４】
　多くの異なるＰＴ確認検査およびデバイスは以前から開発されてきた。このようなデバイスおよび検査プロトコルは、アール・シャートル（R. Shartle）に付与された特許文献１に記述されたものなどの光学系デバイスと、エー・ジーナ（A. Jina）に付与された特許文献２、特許文献３および特許文献４に記述されたものなどの電気化学系デバイスの双方を含む。後者の特許群には、サンプルの液体粘性の変化を電気化学的に測定するのに適したデバイスが開示されており、当該デバイスは並列された電極の存在によって特徴付けられている。この構成は、比較的大量のサンプルと、バックグラウンド応答の時間依存逆重畳積分、すなわち信号がある期間にわたって測定された後にバックグラウンドと比較して識別されるステップを実行する測定プロトコルとを必要とする。このように、上記ジーナのデバイスを用いた上記プロトコルはより複雑であり、もしかすると、以下に記述されるこの発明で用いられるプロトコルよりも強固ではない。
【０００５】
　さらに、現時点での凝固管理デバイスは、ＰＴ分析を実行するのに比較的大量の血液（２０μＬ以上）を必要とする。このような大量の血液を得るためには、従来のランセットを使用する必要がある。しかしながら、従来のランセットの使用はユーザーに痛みおよび外傷を引き起こすことになり、場合によっては抗凝血療法の不適当な遵守につながることになる。
【０００６】
　多くの異なるＰＴ確認検査およびデバイスが以前から開発されてきたが、特別なプロトコルおよびデバイスは依然として必要とされ続けている。その特定の関心事は、使い捨ての試薬検査細片等の高価でないデバイス構成要素を用いて少量のサンプルで迅速かつ精確にＰＴを確認するＰＴシステムの開発である。さらに高い関心事は、上記所望のパラメータを示し、少量のサンプルでの使用に適し、ユーザーの痛みを最小限に止め、定常値に収斂する平易な解釈が可能な信号を与えることができる電気化学的デバイスおよびプロトコルの開発である。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，０８４，６６０号
【特許文献２】米国特許第６，０４６，０５１号
【特許文献３】米国特許第６，０６０，３２３号
【特許文献４】米国特許第６，０６６，５０４号
【特許文献５】米国特許第５，９４２，１０２号
【特許文献６】米国特許第５，９１６，５２２号
【特許文献７】米国特許第５，６２８，９６１号
【特許文献８】米国特許第５，５５４，５３１号
【特許文献９】米国特許第５，３００，７７９号
【特許文献１０】国際特許出願　９７／１８４６５号
【特許文献１１】国際特許出願　９５／０６８６８号
【特許文献１２】欧州特許第９７４８４０号
【特許文献１３】英国特許第１，２９９，３６３号
【特許文献１４】米国特許第６，１９３，８７３Ｂ１号
【特許文献１５】米国特許出願第０９／９１９，９８１号（２００１年８月１日出願）
【特許文献１６】米国特許出願第０９／９２３，０９３号（２００１年８月６日出願）
【特許文献１７】米国特許出願第１０／１４３，３９９号（２００２年５月９日出願）
【特許文献１８】米国特許出願第１０／１４３，１２７号（２００２年５月９日出願）
【特許文献１９】米国特許出願第１０／１４３，４２２号（２００２年５月９日出願）
【特許文献２０】米国特許出願第０９／７３６，７８８号（２０００年１２月１３日出願）
【特許文献２１】国際特許出願ＷＯ　９７／１８４６５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
　この発明は、従来の電気化学的デバイスの欠点を克服するためになされたもので、その目的とするところは、少量のサンプルでの使用に適し、ユーザーの痛みを最小限に止め、定常値に収斂する平易な解釈が可能な信号を与えることができる電気化学的検査細片（デバイス）およびこれに関連した方法（プロトコル）を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
　流体（例えば全血サンプル）の粘性変化を電気化学的に検出する方法およびデバイスが提供される。この発明の方法では、流体サンプルが、対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極を有する電気化学的セルに導入される。まず、電気化学的セルの定常電流を流すために、電気化学的セルには電位が与えられる。次に、電気化学的セルの定常電流の低下が検出され、上記サンプルの粘性変化に関係付けられる。多くの実施の形態では、上記サンプルは血液であり、粘性変化は血液サンプルの凝固の到来、そして多くの場合、血液サンプルのＰＴに関係付けられる。また、この発明の方法を実施するのに使用される検査細片、そのキットおよび計測器が提供される。
【００１０】
　この発明による電気化学的検査細片の一実施の形態は、電気化学的セルと、これと一体化した微細針とを含む。電気化学的セルは、対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極と、試薬混合物（例えば、レドックス対および凝固触媒因子）とを含む。この実施の形態では、微細針が電気化学的セルの作用電極および参照電極の一方に一体化されている。
【００１１】
　なお、請求項１記載の発明は、流体サンプルの粘性変化を検出する方法であって、（ａ）対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極を含み、当該作用電極および参照電極の一方がユーザーから流体サンプルを採取するための微細針と一体化した電気化学的セルに流体サンプルを導入するステップと、（ｂ）上記電気化学的セルに電位を与えて上記対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極と参照電極との間に定常電流を流すステップと、（ｃ）上記定常電流の変化を検出するステップと、（ｄ）上記定常電流の変化を上記流体サンプルの粘性変化に関係付けるステップとを含むものである。
【００１２】
　請求項２記載の発明は、血液サンプルの凝固の到来を検出する方法であって、（ａ）（ｉ）対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極と（ｉｉ）少なくとも１つのレドックス対を含む試薬混合物とを含み、上記作用電極および上記参照電極の一方がユーザーから血液サンプルを採取するための微細針と一体化した電気化学的セルに上記血液サンプルを導入するステップと、（ｂ）上記電気化学的セルに電位を与えて上記対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極と参照電極との間に定常電流を流すステップと、（ｃ）上記定常電流の変化を検出するステップと、（ｄ）上記定常電流の変化を上記血液サンプルの粘性変化に関係付けるステップとを含むものである。
【００１３】
　請求項３記載の発明は、電気化学的検査細片であって、（ａ）対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極と（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのレドックス対および（ｉｉ）凝固触媒因子を含む試薬混合物とを含む電気化学的セルと、上記作用電極および上記参照電極の一方に一体化した微細針とを含むものである。
【発明の効果】
【００１４】
　この発明によれば、（ａ）対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極を含み、当該作用電極および参照電極の一方がユーザーから流体サンプルを採取するための微細針と一体化した電気化学的セルに流体サンプルを導入するステップと、（ｂ）上記電気化学的セルに電位を与えて上記対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極と参照電極との間に定常電流を流すステップと、（ｃ）上記定常電流の変化を検出するステップと、（ｄ）上記定常電流の変化を上記流体サンプルの粘性変化に関係付けるステップとを含むように構成したので、流体サンプルの粘性変化を迅速かつ精確に検出することができるという効果がある。
【００１５】
　この発明によれば、（ａ）（ｉ）対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極と（ｉｉ）少なくとも１つのレドックス対を含む試薬混合物とを含み、上記作用電極および上記参照電極の一方がユーザーから血液サンプルを採取するための微細針と一体化した電気化学的セルに上記血液サンプルを導入するステップと、（ｂ）上記電気化学的セルに電位を与えて上記対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極と参照電極との間に定常電流を流すステップと、（ｃ）上記定常電流の変化を検出するステップと、（ｄ）上記定常電流の変化を上記血液サンプルの粘性変化に関係付けるステップとを含むように構成したので、血液サンプルの凝固の到来を迅速かつ精確に検出することができるという効果がある。
【００１６】
　この発明によれば、（ａ）対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極と（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのレドックス対および（ｉｉ）凝固触媒因子を含む試薬混合物とを含む電気化学的セルと、上記作用電極および上記参照電極の一方に一体化した微細針とを含むように構成したので、上記方法に好適に使用可能な電気化学的検査細片を得ることができるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
　流体の粘性変化を電気化学的に検出する方法、デバイスおよび検査細片が提供される。この発明の方法では、流体サンプルが、対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極を有する電気化学的セルに導入される。ある実施の形態では、流体サンプルを採取するための微細針が作用電極または参照電極の一方に一体化されている。
【００１８】
　まず、電気化学的セルの定常電流を流すために、電気化学的セルには電位が与えられる。次に、電気化学的セルの定常電流の低下が検出され、上記サンプルの粘性変化に関係付けられる。多くの実施の形態では、上記サンプルは血液であり、粘性変化は血液サンプルの凝固の到来、そして多くの場合、血液サンプルのＰＴに関係付けられる。また、この発明の方法を実施するのに使用される検査細片、そのキットおよび計測器が提供される。
【００１９】
　この発明が更に記述される前に、この発明が以下に記述される特定の実施の形態に限定されず、その特定の実施の形態のバリエーションが添付された特許請求の範囲内に収まるようになされる可能性があることが理解されるべきである。また、この明細書での術語が特定の実施の形態を記述する目的で用いられ、限定する意図がないことが理解されるべきである。それよりむしろ、この発明の範囲は添付された特許請求の範囲によって確立されるはずである。
【００２０】
　この明細書および添付された特許請求の範囲において、単数形による参照は、文脈が明白に他の方法で規定しない場合には、複数形の意を含むものである。他の方法で定義されない場合には、この明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、この発明の属する技術分野における通常の知識を有する者（以下、当業者という）の一人に一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００２１】
方法
　上記で要約したように、この発明は流体サンプル（例えば全血サンプル）の粘性変化を確認する方法を提供する。多くの場合、この発明は流体サンプルの粘度の増加を検出する手段を提供する。この発明の方法は、約１ｃｐｓ未満、多くの場合には約０．５ｃｐｓ未満の大きさの粘性増加を検出するのに十分な感度を有している。そういうものであるから、この発明の方法は流体サンプルの粘性変化を検出する感度を有する方法である。
【００２２】
　この発明の方法の他の特徴は、流体サンプルの粘性の変化、多くの場合、粘度の増加を確認する電気化学的方法である。電気化学的方法とは、この発明の方法が作用電極および参照電極を用いるという意味である。詳細には、この発明の方法は、作用電極と参照電極との間に生じた電流およびその変化を用いて、以下にさらに詳述されるように流体サンプルの粘性変化を確認するものである。
【００２３】
　この発明による方法の一実施の形態における第１のステップでは、ある分量の分析されるべき流体すなわち流体サンプルを、対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極を含む電気化学的セルへ導入する。上記流体の性質は、その流体が導電体、例えば電解質である限り、変更することが可能である。多くの実施の形態では、上記流体は水性流体であり、その特定の対象は生理学的サンプルである。上記流体が生理学的サンプルである場合には、多くの実施の形態における上記サンプルは全血または、凝血／凝固時間およびその結果、ＰＴ時間を導き出せる上記全血の誘導体である。
【００２４】
　電気化学的セルへ導入される流体、例えば血液の量は一様ではないが、概ね少量である。そういうものであるから、電気化学的セルへ導入される流体の量は、典型的には約０．１μＬ乃至１０μＬの範囲であり、通常は約０．２μＬ乃至５．０μＬの範囲であり、より通常では約０．３μＬ乃至１．６μＬの範囲である。上記サンプルは、任意の簡便なプロトコルを用いて電気化学的セルへ注入されるが、上記サンプルは、簡便でかつこの発明の方法が実施されるデバイス／システムの性質に依存するように、電気化学的セルへ注入され、毛管作用により電気化学的セルへ導入され、およびこれらに類する方法で導入されてもよい。上記サンプルは、一体化した微細針および毛細管（図３乃至図５の電気化学的検査細片に関して以下に記述されるように）を用いて電気化学的セルへの導入が可能である。一体化した微細針および毛細管を備えた電気化学的セルの使用は、有効に使用される１００ｎＬ（ナノリットル）乃至１５０ｎＬの範囲での並外れて少量のサンプルを提供する。
【００２５】
　この発明の方法では、原則的に、対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極を有する電気化学的セルの任意タイプの使用が可能であるが、多くの実施の形態ではこの発明の方法は電気化学的検査細片を用いる。この発明の方法による実施の形態で使用される電気化学的検査細片は、薄層のスペーサによって隔てられた２つの対向金属電極で構成されており、ここで、これらの構成要素は電気化学的セルを構成する反応領域または区域を規定するものである。他の実施の形態では、また、電気化学的検査細片は作用電極または参照電極のいずれかと一体化した微細針と毛細管とを含むものである（図３乃至図５およびこれらに関連した記述参照）。
【００２６】
　上記電気化学的検査細片の特定の実施の形態では、作用電極および参照電極は概ね引き延ばされた長方形状の細片で構成されている。典型的には、電極の長さは約１．９ｃｍ乃至４．５ｃｍの範囲であり、通常は約２．０ｃｍ乃至２．８ｃｍの範囲である。電極の幅は約０．０７ｃｍ乃至０．７６ｃｍの範囲であり、通常は約０．２４ｃｍ乃至０．６０ｃｍの範囲である。作用電極および参照電極は、典型的には約１０ｎｍ（ナノメートル）乃至１００ｎｍの範囲の厚さを有し、通常は約１０ｎｍ乃至２０ｎｍの範囲の厚さを有している。図１、図３および図４は、この発明の実施の形態による電気化学的検査細片の分解斜視図である。
【００２７】
　さらに、作用電極および参照電極は、検査細片内の電気化学的セルの反応領域に向いた電極の少なくとも表面が、パラジウム、金、白金、銀、イリジウム、炭素（導電性炭素インク）、ドープ錫酸化物、ステンレス鋼およびこれらに類するものを含む金属である点に特徴がある。多くの実施の形態では、金属は金またはパラジウムである。原則的に、電極全体は金属で形成されてもよいが、各電極は概ね、電極の金属構成要素である薄層が存在する下側の表面上に形成された化学変化を起こさない（不活性な）支持材料で構成されている。これらの共通した実施の形態では、不活性な背面材料の厚さは典型的には約２５μｍ乃至５００μｍの範囲であり、通常は５０μｍ乃至４００μｍの範囲、例えば約１２７μｍ乃至１７８μｍの範囲である。一方、金属層、例えばスパッタリングによる金属層の厚さは典型的には約１０ｎｍ乃至１００ｎｍの範囲であり、通常は約１０ｎｍ乃至４０ｎｍの範囲である。都合のよい任意の背面材料はこの発明の電気化学的検査細片における電極に使用されてもよい。ここで、上記背面材料は、典型的には、電極を構造的に支持し、その結果として全体的に見て電気化学的検査細片を支持することが可能な剛性材料である。背面基板として使用可能な適切な材料は、例えばポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ＰＥＴＧ等のプラスチック、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、シリコン、セラミック、ガラスおよびこれらに類するものを含む。
【００２８】
　この発明の方法による実施の形態で使用される電気化学的検査細片の特徴は、作用電極および参照電極が上述のように互いに対向しかつある短い距離を隔てて離間し、その結果、電気化学的検査細片の反応領域または区域内に存在する作用電極と参照電極との間の距離が極めて短いという点にある。この発明の検査細片における作用電極と参照電極との間に存在する最小スペースは、作用電極と参照電極との間に配置されまたは挟まれた薄層であるスペーサ層の存在の所産である。このスペーサ層の厚さは５０μｍ乃至７５０μｍの範囲であり、多くの場合には５００μｍまたはそれより薄いものである。このスペーサ層は、反応領域へ導かれる少なくとも１つの入口と、これに加えて反応領域から導き出される一般的な出口とを備えた反応領域を与えるように、切除されている。スペーサ層は、側方を切除して形成した入口および出口を備えた円形状の反応領域、あるいは他の形状、例えば正方形状、三角形状、楕円形状、長方形状、不規則形状等の反応領域を有してもよい。スペーサ層は都合のよい任意の材料から製造されてもよい。ここで、適切な材料の代表例はＰＥＴ、ＰＥＴＧ、ポリイミド、ポリカーボネートおよびこれらに類するものを含み、スペーサ層の表面は、各電極を貼り付けて電気化学的検査細片の構造を維持するように処理されてもよい。その特定の対象はスペーサ層としての打抜き両面粘着細片の使用である。
【００２９】
　この発明の実施の形態で使用される電気化学的検査細片は、上述したように作用電極、参照電極およびスペーサ層によって規定される反応領域または区域を含むものである。詳細には、作用電極および参照電極は反応領域の上部および底部を規定する一方、スペーサ層は反応領域の壁を規定する。反応領域の容量は、典型的には約０．１μＬ乃至１０μＬの範囲であり、通常は約０．２μＬ乃至５．０μＬの範囲であり、より通常では約０．３μＬ乃至１．６μＬの範囲である。上述したように、反応領域は、概ね少なくとも１つの入口を含むものであり、多くの実施の形態では出口をも含むものである。入口および出口の断面積は、反応領域への流体の有効な入口または反応領域からの流体の有効な出口を提供するのに十分大きいものである限り、一様ではないが、概ね、約９×１０-4ｃｍ2 乃至５×１０-3ｃｍ2 の範囲であり、通常は約５×１０-4ｃｍ2 乃至２．５×１０-3ｃｍ2 の範囲である。
【００３０】
　多くの実施の形態では、試薬システムは反応領域内に存在しており、試薬システムは分析中に流体サンプル内の構成成分と相互作用する。例えば、この発明の方法が凝固事象の検出、例えばサンプルのＰＴの測定に用いられる場合における実施の形態では、反応領域または区域は、少なくともレドックス対を含み、多くの場合には凝固触媒因子をも含む試薬システムを含む。
【００３１】
　試薬組成物のレドックス対が存在している場合には、そのレドックス対は１つまたはそれ以上のレドックス対試薬で構成されている。種々の異なるレドックス対試薬は当業者に公知であり、フェリシアニド、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、１−メトキシ−フェナジン−メトサルフェート、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、フェロセン誘導体、オスミウムビピリジル錯体、ルテニウム錯体およびこれらに類するものを含む。多くの実施の形態では、特定の対象のレドックス対はフェリシアニド／フェロシアニドおよびこれらに類するものである。
【００３２】
　多くの実施の形態では、試薬組成物は凝固触媒因子をも含む。凝固触媒因子とは、流体サンプル、例えば全血中に存在する構成成分と関係するか、あるいは相互作用して血液サンプル中の凝血過程を開始させる１つまたはそれ以上の構成成分または試薬を意味する。ＰＴ分析に関して、凝固触媒因子は、概ね、トロンボプラスチンを含むもので、そのトロンボプラスチンは、天然由来源、例えばアセトン乾燥脳組織の水性抽出物または遺伝子組換えによる合成トロンボプラスチン（ｒ−ＤＮＡトロンボプラスチン）から精製されてもよい。トロンボプラスチンは、概ね、精製された遺伝子組換え組織因子蛋白質および精製された人工脂質成分を含むものである。凝固触媒因子の代表例は、米国フロリダ州マイアミのデードインターナショナル（Dade International）により商品名インノビン（登録商標）（INNOVIN）で販売されているカルシウム含有トロンボプラスチン−ＸＳである。
【００３３】
　反応領域中に存在する可能性のある他の試薬は緩衝剤、例えばシトラコン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、グッドの緩衝液およびこれらに類するものを含む。存在してもよい更に他の試薬は、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム等のニ価カチオン、トリトン（Triton）、マコール（Macol）、テトラニック（Tetranic）、シルウェット（Silwet）、ゾニル（Zonyl）およびプルロニック（Pluronic）等の界面活性剤、アルブミン、蔗糖、トレハロース、マンニトール、ラクトース等の安定化剤を含むものである。
【００３４】
　試薬システムが存在する場合には、その試薬システムは概ね、乾燥した状態で存在する。種々の構成成分の量は変更可能であり、酸化されたレドックス対の成分量は、典型的には約５ｍＭ（ミリモル）乃至１０００ｍＭの範囲であり、通常は約９０ｍＭ乃至９００ｍＭの範囲である。還元されたレドックス対の成分量は、典型的には約１ｍＭ乃至２０ｍＭの範囲であり、通常は約５ｍＭ乃至１５ｍＭの範囲である。緩衝液の量は、典型的には約０ｍＭ乃至３００ｍＭの範囲であり、通常は約５０ｍＭ乃至１００ｍＭの範囲である。凝固触媒因子の成分量は、典型的には約０．００５ｍｇ／ｃｍ2 乃至５０ｍｇ／ｃｍ2 の範囲であり、通常は約０．０５ｍｇ／ｃｍ2 乃至５ｍｇ／ｃｍ2 の範囲である。これらの実施の形態における反応領域または区域内に存在する乾燥試薬の全量は、概ね、約４ｎｇ／ｃｍ2 乃至７００ｎｇ／ｃｍ2 の範囲であり、通常は約８ｎｇ／ｃｍ2 乃至３５０ｎｇ／ｃｍ2 の範囲である。
【００３５】
　この発明の方法で使用される電気化学的検査細片の代表例は図１および図３乃至図５に描写されている。
　サンプルの電気化学的セルへの導入後に、電気化学的セルには、このセルの作用電極と参照電極との間に定常電流を流すのに十分な方法で一定の電位が与えらる。より詳細には、上記作用電極と参照電極との間に定常電流を流すように両電極間に一定の電位が与えられる。印加される電位の大きさは、概ね、約０Ｖ乃至−０．６Ｖの範囲であり、通常は約−０．２Ｖ乃至−０．４Ｖの範囲である。電気化学的セルが上述のようにレドックス対を含む場合における多くの実施の形態では、上述したように一定の電位の印加は次の数式１によって記述される定常電流の生成という結果となる。
ｉss＝ｎ２ＦＡＤＣｏ／Ｌ
　ここで、ｎは移動電子数に等しく、Ｆはファラデー定数すなわち９．６４８５×１０4 Ｃ／ｍｏｌであり、Ａは作用電極の面積（ｃｍ2 ）であり、Ｄはフェリシアニドイオンの拡散係数（ｃｍ2 ／秒）である。ここで、この係数はフィック（Fick）の第一法則すなわちＪ（ｘ，ｔ）＝−ＤdCo(x,t)/dx から決定されてもよい。Ｊは流速であり、ｘは電極からの位置であり、ｔは時間（秒）である。また、Ｃｏはレドックス対の濃度すなわちフェリシアニド濃度であり、Ｌは電極間の距離、例えばスペーサ層の厚さである。
【００３６】
　必要な定常電流を得るために必要とされる全時間は、上述のように、特定の実施の形態では比較的短い。このような実施の形態では、定常電流を得るために必要とされる全時間すなわちセル内にサンプルが入ってから定常電流の確立までの時間は約１５秒未満、通常は約１０秒未満、そして多くの場合には約４秒乃至１５秒の範囲である。
【００３７】
　図２は血液が細片に導入され、電流が時間でモニタされた場合における典型的なデータ一式についての時間と電流との関係を示している。
【００３８】
　この発明の方法における次のステップは、上記定常電流の変化を検出し、この変化をサンプルの粘性変化に関係付けるものである。多くの実施の形態では、検出される変化は定常電流の低下である。このステップで検出される定常電流の低下の大きさは、多くの実施の形態では少なくとも約２％であり、通常は約１０％であり、多くの実施の形態における低下の大きさは約２％乃至９０％の範囲である。他の実施の形態では、興味の対象は、２つの定常値間すなわち凝固事象前後間の変化率、および凝固事象の存在と見なされる変化の関係である。
【００３９】
　上述した定常電流の低下の検出は、その後、電気化学的セル内の流体サンプルの粘度の増加に関係付けられる。粘性の比較的小さな増加は定常電流の検出可能な低下を齎すことから、この発明の方法に検出可能である。ここで、粘度の増加の大きさは、特定の実施の形態において０．５ｃｐｓまたはそれより小さい可能性がある。
【００４０】
　電気化学的セル内に存在するサンプルが全血であり、試薬組成物が凝固触媒因子を含む多くの実施の形態では、粘度の増加はその後、血液サンプル中の凝固の到来、すなわち血液サンプル中に凝固事象または凝血の発生に関係付けられる。
【００４１】
　特定の実施の形態では、分析されている血液サンプル中の粘度の増加およびこれに付随する凝固の到来の検出は、血液サンプルのＰＴを確認するために用いられる。これらの実施の形態では、反応領域または区域へのサンプルの初期導入からの時間、および／または定常電流の確立、および粘度の増加／凝固の到来が確認され、血液サンプルのＰＴが上記時間から導き出される。サンプルが電気化学的セルへ入る時間は、簡便な任意のプロトコルを用いて検出可能である。ここで、使用される特定のプロトコルは、電気化学的セルで使用される計測器の性質に少なくとも部分的に依存してもよい。特定の実施の形態では、サンプルが上記反応セル内に直接導入された時間は手入力での記録が可能である。これに代えて、上記計測器は、例えば上記電気化学的セルの作用電極と参照電極との間に一定の電流を流すために要求される電圧の初期低下を検出することによって、電気化学的セルへのサンプル導入を自動的に検出することが可能である。（参照によってこの明細書に組み込まれる米国特許第６，１９３，８７３Ｂ１号参照）また、上記セルでのサンプル検出用の他のプロトコルが用いられてもよい。
【００４２】
　この発明の方法における、例えばサンプル導入から凝固の到来への時間を血液サンプルのＰＴに関係付けるような上記計算ステップは手動で、あるいは自動計算手段の使用を通じて成し遂げられてもよい。ここで、多くの実施の形態では、自動計算手段等の使用は、以下に論じられ、興味の対象であるこの発明のデバイスとの関連で記述される。
【００４３】
　上述のプロトコルは室温またはそれよりも高い温度で実行されてもよい。典型的には、上記プロトコルは約２０℃乃至４０℃の範囲、例えば約３７℃で実行される。
【００４４】
　上記方法は流体サンプル中の粘度変化の確認が望ましい任意の応用例で使用する。そういうものであるから、血液サンプルのＰＴ確認での使用に適したこの発明の方法は、ＰＴ確認が望ましい任意の応用例、例えばバックグラウンド部分の上に記述される応用例で使用する。
【００４５】
電気化学的検査細片
　図３乃至図５を参照すると、この発明による電気化学的検査細片３００は、電気化学的セル３１０と、一体型の微細針３２０と、一体型の毛細管３８０とを含むものである。電気化学的セル３１０は、作用電極３５０と、参照電極３４０と、分配溝３６０と、試薬混合物３３０とを含むものである。
【００４６】
　作用電極３５０と参照電極３４０とは、分割されたスペーサ層３７０によって対向する位置に間隔をおいて配置されている。分割されたスペーサ層３７０は、作用電極３５０および参照電極３４０に沿って、電気化学的セル３１０の境界を規定する役割を果たしている。
【００４７】
　作用電極３５０および参照電極３４０は、上述したような任意の適切な材料で形成されることが可能である。試薬混合物３３０（試薬システムとも呼ばれる）は、上述された凝固試薬とレドックス対とを含むものである。試薬混合物３３０は、例えば噴霧技術、インクジェット技術およびスロット被覆技術を含む任意の従来技術によって作用電極３５０および参照電極３４０の一方または双方上に付着されることが可能であるが、上記試薬混合物３３０は、好ましくは作用電極３５０上に付着されるべきである。
【００４８】
　一体型の微細針３２０は、ユーザーから全血サンプルを採取し、電気化学的検査細片３００の一体型の毛細管３８０を経由して電気化学的セル３１０に上記全血サンプルを導入するのに適合したものである。一旦、電気化学的セル３１０へ導入されると、全血サンプルは、分配溝３６０の端から端まで均一に行き渡る。
【００４９】
　一体型の微細針３２０は、例えば貴金属（例えば、金、パラジウム、イリジウムまたは白金）でスパッタリングまたはメッキされたプラスチックまたはステンレス鋼を含む任意の適切な材料で製作されることが可能である。微細針３２０の形状、寸法および表面上の特徴、並びにユーザーの表皮／真皮の皮膚層への微細針３２０の実用的な突刺し深度は、ユーザーからの全血サンプルの採取に関連した如何なる痛みを最小限に止めるように構成されている。
【００５０】
　この発明による電気化学的検査細片で用いられる微細針は、米国特許出願第０９／９１９，９８１号（２００１年８月１日出願）、同第０９／９２３，０９３号（２００１年８月６日出願）、同第１０／１４３，３９９号（２００２年５月９日出願）、同第１０／１４３，１２７号（２００２年５月９日出願）および同第１０／１４３，４２２号（２００２年５月９日出願）に記述され、これらを参照することによってこの明細書に組み込まれた形状を含む、いわゆる当業者の一人に知られた任意の適切な形状を採ることができる。
【００５１】
　電気化学的検査細片３００の使用中に、ユーザーの皮膚が一体型の微細針３２０によって穿刺されたときに、サンプル（すなわち、全血）は一体型の毛細管３８０を経由して電気化学的セル３１０に導入され、分配溝３６０によって電気化学的セル３１０内に均一に分配される。電気化学的検査細片３００は、この発明による方法並びに参照によってこの明細書に組み込まれる米国特許出願第０９／７３６，７８８号（２０００年１２月１３日出願）による方法で使用可能である。
【００５２】
　図３乃至図５では、一体型の微細針３２０は参照電極３４０と一体化された状態で図示されている。しかしながら、一旦、この開示内容を通告すると、いわゆる当業者の一人は一体型の微細針３２０が上記構成に代えて作用電極３５０と一体化されることが可能であることを認識するはずである。
【００５３】
　この発明による一体型の微細針を含む電気化学的検査細片の有利な点は、上記一体型の微細針によってユーザーの皮膚が穿刺された後の血液残査が極めて最少であるということである。さらに、上記一体型の微細針で採取された全血サンプルは一体型の毛細管を経由して電気化学的セルへ簡単かつ有効に、直接的に運ばれるということである。従って、ユーザーが検査を行うために皮膚上に全血の懸滴を形成する必要がなく、これによって全血の懸滴を形成した穿刺部位から流れる血液を止めることに関連した面倒を回避することができる。加えて、この発明による電気化学的検査細片の一体型の微細針は、約１００ｎＬ（ナノリットル）（＝０．１μＬ）乃至１４０ｎＬの範囲内の量で全血サンプルを採取するのに適合されることが可能である。ユーザーから採取される全血の増量と痛覚の増加との間には直接的な相関関係が存在するので、この発明による方法および電気化学的検査細片は使用時における痛みを減らすことができる。
【００５４】
デバイス
　この発明を実施するのに使用される計測器も、この発明によって提供される。この発明の計測器は、典型的には流体サンプルの粘性変化を測定するための計測器であり、多くの実施の形態では血液サンプルのＰＴを測定するための計測器である。この発明の計測器は、典型的には、（ａ）上記サンプルが導入された電気化学的セルに電位を与える手段と、（ｂ）上記セル中の定常電流を含むセル中のセル電流を測定する手段と、（ｃ）上記セル中の定常電流の変化、例えばセル中の定常電流の低下を検出する手段と、（ｄ）定常電流の変化を上記セルの粘性の変化に関係付ける、例えばセル中の定常電流の低下をセル中の粘度の増加に関係付ける手段とを含むものである。
【００５５】
　上記電気化学的セルに電位を与える手段、上記セル中の定常電流を測定する手段および上記セル中の定常電流の変化を検出する手段は都合のよい任意の手段であってもよい。ここで、これらの手段の代表例は、国際特許出願ＷＯ　９７／１８４６５号および米国特許第５，９４２，１０２号に記述されており、これらの開示内容は参照によってこの明細書に組み込まれるものである。また、米国特許第６，０６６，５０４号、同第６，０６０，３２３号および同第６，０４６，０５１号も参照されたい。これらの開示内容は参照によってこの明細書に組み込まれるものである。定常電流の変化を粘性の変化に関係付ける手段は、典型的には、定常電流の測定された変化を流体サンプルの粘性変化に関係付けることが可能な計測器内に存在する計算手段である。多くの実施の形態では、この手段は、電流／粘性の変化をさらに凝固の到来に関係付ける手段である。米国特許第６，０６６，５０４号も参照されたい。この開示内容は参照によってこの明細書に組み込まれるものである。
【００５６】
キット
　この発明の方法を実施するのに使用されるキットも提供される。この発明のキットは、上述したように、少なくとも電気化学的検査細片を含むものである。この発明のキットは、生理学的サンプルを採取する手段をさらに含むものである。例えば、上記生理学的サンプルが血液である場合には、この発明のキットは、指を穿刺するためのランセット、ランセット駆動手段およびこれらに類する手段等の血液サンプル採取手段をさらに含むものである。さらに、この発明のキットは、機器の較正を行う較正手段、例えば対照溶液または標準の、例えば公知のＰＴ時間を有する凝固制御溶液を含めてもよい。特定の実施の形態では、キットは、サンプル塗布後に細片上に生成された生成物量を検出し、検出された生成物を上記サンプル中の特定成分の量に関係付けるための上述の自動機器をも含むものである。最後に、上記キットは、生理学的サンプル中の特定成分の濃度を決定するにあたって、この発明のキットの構成要素を使用するための指示を含むものである。これらの指示は、包装、ラベル挿入物、キット内に存在する容器およびこれらに類するものの１つまたはそれ以上の上に存在するものでよい。
【００５７】
　次の実施例は図示によって限定することなしに示されている。
【００５８】
実施例
Ｉ．電気化学的検査細片の調製
　サンドイッチ構成に向けられた２つの金属電極からなる電気化学的検査細片を次のように調製した。検査細片の上層は、金をスパッタリングしたマイラー（Mylar）細片とした。中間層は、反応区域または領域を規定し、打抜き穴を有する両面粘着物とした。上記打抜き穴は、２つ並列した長方形状の導入路および排出路を備えた円形とした。蒸気検査細片の下層は、マイラー上にパラジウムをスパッタリングして形成した。シトラコン酸塩の緩衝液、フェリシアニド、フェロシアニドおよび複製された遺伝子組換え組織因子を含む試薬はパラジウムでスパッタリングして形成した表面上にインクジェットにより噴霧した。パラジウムスパッタ表面上にインクジェットで噴霧された試薬量は５９７ｎｇ／ｃｍ2 であった。そういうものであるから、シトラコン酸塩の緩衝液の量は１２０ｎｇ／ｃｍ2 であり、フェリシアニドの量は４６０ｎｇ／ｃｍ2 であり、フェロシアニドの量は８ｎｇ／ｃｍ2 であり、遺伝子組換え組織因子の量は９ｎｇ／ｃｍ2 であった。上記検査細片の分解斜視図は図１に示されている。
【００５９】
ＩＩ．ＰＴ検出
　上記検査細片は次のように血液サンプルのＰＴを確認するのに用いられる。１．５μＬの血液サンプルを検査細片の反応領域または区域に導入し、サンプル導入からの時間を記録する。作用電極と参照電極との間に−０．３Ｖの定電位を与え、両電極間に結果的に生じる電流をモニタする。まず、定常電流の出現を検出し、次いで定常電流の低下を検出する。サンプルの初期導入から定常電流の低下までの時間を確認した後、その時間を血液サンプルのＰＴ時間に関係付ける。図２は血液が電気化学的検査細片に導入され、電流が時間でモニタされた場合における典型的なデータ一式についての時間と電流との関係を示すグラフである。
【００６０】
　この発明を実証する上記結果および議論は、血液サンプルのＰＴを確認するための簡単で強力なツールを提供する。非電気化学的な凝固検出方法に対するこの発明の有利な点は、低コスト材料の使用と、血漿系の対照品を含む幅広い対照品の使用機会とを含むことである。この発明の更なる有利な点は、少量サンプルを用いる能力と、この発明の方法によってなされた電気化学的測定が定常値に収斂する平易な解釈が可能な信号を与えるという事実とを含むことである。また、この発明の更なる有利な点は、低コストの電気化学的計測器を用いる能力であり、この電気化学的計測器は有意なコスト削減を与えるものである。そういうものであるから、この発明は、当該技術分野にかなりの貢献を意味するものである。
【００６１】
　この明細書で引用された全ての刊行物および特許文献は、あたかも各刊行物または特許文献が参照によって組み込まれるように詳細にかつ個別的に表示されたかのように、参照によってこの明細書に組み込まれたものとする。任意の刊行物の引用は出願日前に開示されたものであり、この発明が先行発明による上記刊行物の日付に遡及する権利が与えられていないことを事実として解釈されるべきではない。
【００６２】
　前述の発明は理解を明確にする目的で図面および例示によっていくらか詳細に記述されたが、特定の変更および修正がこの明細書に添付された請求項における意図および範囲から逸脱することなくなされ得ることは、この発明の教示に照らして当業者にとってすぐに明白である。
【００６３】
　この発明の具体的な実施態様は以下の通りである。
　（１）上記導入ステップは上記微細針および電気化学的セルに一体化した毛細管を経由して上記サンプルを導入するステップを含む請求項１記載の方法。
　（２）上記導入ステップは１００ｎＬ乃至１５０ｎＬの範囲の容量でサンプルを導入するものである請求項１記載の方法。
　（３）上記流体サンプルは生理学的サンプルである請求項１記載の方法。
　（４）上記生理学的サンプルは血液である実施態様（３）記載の方法。
　（５）上記粘性変化を上記血液のプロトロンビン時間に関係付けるステップをさらに含む実施態様（４）記載の方法。
【００６４】
　（６）上記電気化学的セルは少なくとも１つのレドックス対を含む請求項１記載の方法。
　（７）上記変化は電流の低下である請求項２記載の方法。
　（８）上記試薬は凝固触媒因子を含む請求項２記載の方法。
　（９）上記凝固触媒因子はトロンボプラスチンを含む実施態様（８）記載の方法。
　（１０）上記凝固の到来を上記血液サンプルのプロトロンビン時間に関係付けるステップをさらに含む実施態様（８）記載の方法。
【００６５】
　（１１）上記対向する位置に間隔をおいて配置された作用電極および参照電極は５０μｍ乃至５００μｍの範囲の距離だけ離間している請求項３記載の電気化学的検査細片。
　（１２）上記凝固触媒因子はトロンボプラスチンを含む実施態様（１１）記載の電気化学的検査細片。
　（１３）上記レドックス対はフェリシアニドおよびフェロシアニドを含む請求項３記載の電気化学的検査細片。
　（１４）上記微細針から上記電気化学的セルへ流体サンプルを運ぶのに適合した毛細管をさらに含む請求項３記載の電気化学的検査細片。
　（１５）上記微細針はユーザーからの全血サンプルを採取するのに適合したものである請求項３記載の電気化学的検査細片。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】この発明による電気化学的検査細片の分解斜視図である。
【図２】血液が電気化学的検査細片に導入され、電流が時間でモニタされた場合における典型的なデータ一式についての時間と電流との関係を示すグラフである。
【図３】この発明による微細針を一体化した電気化学的検査細片の分解斜視図である。
【図４】図３に示した電気化学的検査細片を下から見た分解斜視図である。
【図５】図３に示した電気化学的検査細片の組立状態を示す斜視図である。
【符号の説明】
【００６７】
　３００　電気化学的検査細片
　３１０　電気化学的セル
　３２０　微細針
　３３０　試薬混合物
　３４０　参照電極
　３５０　作用電極
　３６０　分配溝
　３７０　スペーサ層
　３８０　毛細管
【図１】
2004132966.tif 000003
【図２】
2004132966.tif 000004
【図３】
2004132966.tif 000005
【図４】
2004132966.tif 000006
【図５】
2004132966.tif 000007
【外国語明細書】
2004132966000001.pdf