(57)【要約】【課題】プラスミノゲン活性化作用を有する新規のトリプレニルフェノール化合物を提供する。【解決手段】式Ｉ：【化６】2004224737.tif 000012〔式中、Ｘは、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ３）２Ｚであり、Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ若しくは−ＯＨであるか、又は一緒になって単結合を形成し、ｍは、１又は２であり、ｍが１であるとき、点線（……）は結合を示さず、Ｒ１は、アミノ化合物から、１個のアミノ基を除いた残基であり、ｍが２であるとき、点線（……）は結合を示し、Ｒ２は、二価の結合基となり、２個のアミノ基を有するアミノ化合物から、２個のアミノ基を除いた残基である〕で示される化合物。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2004224737.tif 000011
〔式中、
Ｘは、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ３）２Ｚであり、
Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ若しくは−ＯＨであるか、又は一緒になって単結合を形成し、
ｍは、１又は２であり、
ｍが１であるとき、点線（……）は結合を示さず、
Ｒ１は、
（１）天然アミノ酸、
（２）天然アミノ酸のＤ体、及び
（３）天然アミノ酸又は天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、１個のアミノ基を除いた残基（但し、−（ＣＨ）２−ＯＨは除く）、
ｍが２であるとき、点線（……）は結合を示し、
Ｒ２は、二価の結合基となり、
（１）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸、
（２）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体、
（３）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸又は２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物、及び
（４）Ｈ２Ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（ｎは０〜９の整数である）で示される化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、２個のアミノ基を除いた残基であり、
但し、ｍが１であるとき、（１）の天然アミノ酸は、セリン、ロイシン、フェニルアラニン及びトリプトファンを含まず、
ｍが２であるとき、（１）の２個のアミノ基を有する天然アミノ酸は、リジン及びオルニチンを含まず、（４）の化合物は、Ｌ−リジン及びＬ−オルニチンを含まない〕
で示される、化合物又はその薬学的に許容され得る塩、エステル若しくは溶媒和物。
【請求項２】
ｍが１であり、
Ｒ１が、
（１）天然α−アミノ酸、
（２）天然α−アミノ酸のＤ体、及び
（３）天然α−アミノ酸若しくは天然α−アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基若しくはヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、１個のアミノ基を除いた残基である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
（１）、（２）及び（３）の天然α−アミノ酸が、グリシン、アラニン、スレオニン、バリン、イソロイシン、チロシン、システイン、シスチン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、シトルリン、ホモシステイン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、ホモシスチン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、セリン、ロイシン、フェニルアラニン又はトリプトファンである、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
ｍが２であり、
Ｒ２が、
（１）２個のアミノ基を有する天然α−アミノ酸、
（２）２個のアミノ基を有する天然α−アミノ酸のＤ体、及び
（３）２個のアミノ基を有する天然α−アミノ酸若しくは２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基若しくはヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、２個のアミノ基を除いた残基である、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
（１）、（２）及び（３）の天然α−アミノ酸が、ヒドロキシリジン、シトルリン、シスチン、ホモシスチン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、リジン又はオルニチンである、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５記載の少なくとも一つの化合物を有効成分として含む、血栓症、塞栓症及びそれらに関連する疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規トリプレニルフェノール化合物およびそれを含む医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日、血栓症、塞栓症及びそれらに関連する疾患の予防および治療の必要性が高まってきている。これら疾患の原因となる血栓の溶解に、プラスミノゲン／プラスミン系が関与している。
【０００３】
プラスミノゲン／プラスミン系は、血栓溶解に関係するフィブリン溶解の他、炎症、組織リモデリング、排卵、腫瘍転移及び病原の組織浸潤など、様々な生理状態及び病理状態に関与する。この系において、チモーゲンであるプラスミノゲンは、ウロキナーゼや組織プラスミノゲン活性化因子などのプラスミノゲン活性化因子によって、蛋白分解を受けてプラスミンに活性化される。ＮＨ２−末端Ｇｌｕを備えた循環するプラスミノゲン（Ｇｌｕ１−プラスミノゲン；以後は単にプラスミノゲンと呼ぶ）は、ＮＨ２−末端ペプチドと、５個の相同クリングルドメインと、トリプシン様セリンプロテアーゼドメインとからなる単鎖糖蛋白質である。プラスミノゲンは、幾つかのクリングルドメイン内のリシン結合部位を介してフィブリン及び細胞表面に結合するため、フィブリン溶解活性は細胞表面に局在化される。ＮＨ２−末端ペプチド内のリシン残基（Ｌｙｓ５０及び／又はＬｙｓ６２）と、クリングル５のリシン結合部位（又はアミノへキシル部位）との分子内相互作用によって、プラスミノゲンは緊密ならせん構造を呈する。プラスミノゲンのコンホメーションが緊密であるため、プラスミノゲンの活性化とフィブリン及び細胞内リセプターへの結合の両者が低減する。
【０００４】
スタプラビンは、真菌スタキボトリス・ミクロスポラ（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）の代謝物であるが、プラスミノゲンコンホメーションを緩めることによって、プラスミノゲン−フィブリン結合とプラスミノゲンの活性化の両者を増強させることが発見された最初の低分子量化合物である。このため、プラスミノゲンのコンホメーション調整は、局在化するプラスミノゲン／プラスミン系を調節するための魅力的手段である。特許文献１では、Ｓ．  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａは、トリプトファンおよびリジンを添加した培地で培養すると、それらのアミノ酸部分を構造成分として有するトリプレニルフェノール化合物（以下「ＳＭＴＰ」という）を選択的に産生することが開示されている。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−６５２８８号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、プラスミノゲン活性化作用を有する新規のトリプレニルフェノール化合物を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
発明者は、鋭意研究を重ねた結果、プラスミノゲン活性化を増強する新規なトリプレニルフェノール化合物を見出し本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、式Ｉ：
【０００９】
【化２】
2004224737.tif 000002
【００１０】
〔式中、
Ｘは、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ３）２Ｚであり、
Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ若しくは−ＯＨであるか、又は一緒になって単結合を形成し、
ｍは、１又は２であり、
ｍが１であるとき、点線（……）は結合を示さず、
Ｒ１は、
（１）天然アミノ酸、
（２）天然アミノ酸のＤ体、及び
（３）天然アミノ酸又は天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、１個のアミノ基を除いた残基（但し、−（ＣＨ）２−ＯＨは除く）、
ｍが２であるとき、点線（……）は結合を示し、
Ｒ２は、二価の結合基となり、
（１）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸、
（２）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体、
（３）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸又は２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物、及び
（４）Ｈ２Ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（ｎは０〜９の整数である）で示される化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、２個のアミノ基を除いた残基であり、
但し、ｍが１であるとき、（１）の天然アミノ酸は、セリン、ロイシン、フェニルアラニン及びトリプトファンを含まず、
ｍが２であるとき、（１）の２個のアミノ基を有する天然アミノ酸は、リジン及びオルニチンを含まず、（４）の化合物は、Ｌ−リジン及びＬ−オルニチンを含まない〕
で示される、化合物又はその薬学的に許容され得る塩、エステル若しくは溶媒和物に関する。
【００１１】
上記の式Ｉの化合物において、ｍが１であるとき、式Ｉの化合物は、式ＩＩ：
【００１２】
【化３】
2004224737.tif 000003
【００１３】
（式中、Ｘ及びＲ１は上記で定義されたのと同じ意味である）
で表すこともでき、また、ｍが２であるとき、式Ｉの化合物は、式ＩＩＩ：
【００１４】
【化４】
2004224737.tif 000004
【００１５】
（式中、Ｘ、Ｒ２及びｎは上記で定義されたのと同じ意味である）
で表すこともできる。
【００１６】
また、本発明は、式Ｉ、式ＩＩ又は式ＩＩＩで示される、少なくとも一つの化合物を含む血栓溶解剤、並びに血栓症、塞栓症及びそれらに関連する疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
前記の式中の置換基Ｘは、好ましくは、Ｙ及びＺがそれぞれ−ＯＨであるか、又は一緒になって単結合を形成した、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ３）２Ｚであり、特に好ましくは、Ｙ及びＺが一緒になって単結合を形成した、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ３）２Ｚである。
【００１８】
上記の式において、ｍが１であるとき、置換基Ｒ１は、
（１）天然アミノ酸、
（２）天然アミノ酸のＤ体、及び
（３）天然アミノ酸又は天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、１個のアミノ基を除いた残基（但し、−（ＣＨ）２−ＯＨは除く）である。
上記の、ｍが１であるときの（１）〜（３）の天然アミノ酸は、天然に存在し得るアミノ酸であれば、特に制限されず、例えば、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸及びδ−アミノ酸などがある。このようなアミノ酸は、天然物から得られるものであってもよく、又は人為的に有機合成などの手法により得られるものでもよい。但し、ｍが１であるときの（１）の天然アミノ酸は、セリン、ロイシン、フェニルアラニン及びトリプトファンを含まない。
【００１９】
上記の、ｍが１であるときの（１）の天然アミノ酸として、例えば、α−アミノ酸として、グリシン、アラニン、スレオニン、バリン、イソロイシン、チロシン、システイン、シスチン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、シトルリン、ホモシステイン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、ホモシスチン、ジアミノピメリン酸及びジアミノプロピオン酸などが挙げられ、β−アミノ酸として、β−アラニンなどが挙げられ、γ−アミノ酸として、γ−アミノ酪酸及びカルニチンなどが挙げられ、δ−アミノ酸として、５−アミノレブリン酸及び５−アミノ吉草酸などが挙げられる。
【００２０】
上記の、ｍが１であるときの（２）及び（３）の天然アミノ酸として、例えば、α−アミノ酸として、グリシン、アラニン、スレオニン、バリン、イソロイシン、チロシン、システイン、シスチン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、シトルリン、ホモシステイン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、ホモシスチン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、セリン、ロイシン、フェニルアラニン及びトリプトファンなどが挙げられ、β−アミノ酸として、β−アラニンなどが挙げられ、γ−アミノ酸として、γ−アミノ酪酸及びカルニチンなどが挙げられ、δ−アミノ酸として、５−アミノレブリン酸及び５−アミノ吉草酸などが挙げられる。
【００２１】
上記のｍが１であるときの（３）の天然アミノ酸若しくは天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基若しくはヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物として、例えばアミノアルコール及びアミンが挙げられる。このようなアミノアルコールとして、例えば２−アミノエタノール及びイソプロピルアルコールなどが挙げられる。
【００２２】
Ｒ１は、疎水性であることが好ましく、ｍが１であるときの（１）の天然アミノ酸として、例えば、イソロイシン及びバリンなどが好ましく、ｍが１であるときの（２）の天然アミノ酸として、例えば、トリプトファン、フェニルアラニン及びＤ−ロイシンなどが好ましく、ｍが１であるときの（３）の天然アミノ酸として、例えば、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン及びロイシンなどが好ましい。
【００２３】
上記の式において、ｍが２であるとき、置換基Ｒ２は、二価の結合基であり、Ｒ２は、二価の結合基となり、
（１）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸、
（２）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体、
（３）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸又は２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物、及び
（４）Ｈ２Ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（ｎは０〜９の整数である）で示される化合物
からなる群より選択される化合物から、２個のアミノ基を除いた残基である。
上記の、ｍが２であるときの（１）〜（３）の２個のアミノ基を有する天然アミノ酸は、天然に存在し得るアミノ酸で、２個のアミノ基を有していれば、特に制限されず、例えば、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸及びδ−アミノ酸などがある。このようなアミノ酸は、天然物から得られるものであってもよく、又は人為的に有機合成などの手法により得られるものでもよい。
但し、上記の、ｍが２であるときの（１）の２個のアミノ基を有する天然アミノ酸は、リジン及びオルニチンを含まず、（４）の化合物は、Ｌ−リジン及びＬ−オルニチンを含まない。
【００２４】
上記の、ｍが２であるときの（１）の２個のアミノ基を有する天然アミノ酸として、例えば、α−アミノ酸として、ヒドロキシリジン、シトルリン、シスチン、ホモシスチン、ジアミノピメリン酸及びジアミノプロピオン酸などが挙げられる。
【００２５】
上記の、ｍが２であるときの（２）及び（３）の２個のアミノ基を有する天然アミノ酸として、例えば、α−アミノ酸として、ヒドロキシリジン、シトルリン、シスチン、ホモシスチン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、リジン及びオルニチンなどが挙げられる。
【００２６】
上記の、ｍが２であるときの（３）の２個のアミノ基を有する天然アミノ酸若しくは２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基若しくはヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物として、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｌ−ＮＨ２（ｌは１〜１０、好ましくは２〜６、より好ましくは３又は４の整数である）が挙げられる。
【００２７】
上記のｎが２であるときの（４）の化合物は、ｎは０〜９、好ましくは１〜５、より好ましくは２又は３の整数である。
【００２８】
又、Ｒ２は、上記のｎが２であるときの（４）の化合物において、カルボキシル基を水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物から２個のアミノ基を除いた残基であってもよい。
【００２９】
本発明の化合物には、式Ｉ〜ＩＩＩで示される化合物の鏡像異性体又はこれらの鏡像異性体が混在してなるラセミ混合物も含まれる。好ましい鏡像異性体として、式ＩＶ：
【００３０】
【化５】
2004224737.tif 000005
【００３１】
で示される、本発明の化合物が挙げられる。
【００３２】
本発明の化合物としては、図３〜５に示すように、２７位の炭素原子を不斉中心としたＲ配置をとる、ＳＭＴＰ−３Ｄ、ＳＭＴＰ−４Ｄ、ＳＭＴＰ−５Ｄ、ＳＭＴＰ−６Ｄ、ＳＭＴＰ−７Ｄ、ＳＭＴＰ−８Ｄ、ＳＭＴＰ−９Ｄ、ＳＭＴＰ−１０Ｄ及びＳＭＴＰ−１１Ｄ；並びに、化学式中、２７位の炭素原子を不斉中心としたＳ配置をとる、ＳＭＴＰ−９Ｌ、ＳＭＴＰ−１０Ｌ及びＳＭＴＰ−１１Ｌが挙げられる。
【００３３】
化学式中２７位の炭素原子を不斉中心としたＲ配置をとるＳＭＴＰをＳＭＴＰ−Ｄと、化学式中２７位の炭素原子を不斉中心としたＳ配置をとるＳＭＴＰをＳＭＴＰ−Ｌと表現する。
【００３４】
本発明の化合物は、有機化学的合成手法により得てもよいが、好ましくは特許文献１に記載されたように、真菌を培養し、その代謝物より得ることができる。
詳細には、生産菌としては、スタキボトリス属などの糸状菌が選択され、好ましくはスタキボトリス属の糸状菌が選択される。特に好ましい生産菌は、スタキボトリス・ミクロスポラ（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）などであり、より好ましくはスタキボトリス・ミクロスポラ（Ｓ．  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）ＩＦＯ３００１８株であるが、本発明は、この菌に限定されるものではない。基本培地は、以下組成を示すＡ培地が好ましいが、本発明はこの組成の培地に限定されるものではない。Ａ培地：グルコース２０ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸二カリウム３ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇを１リットルの精製水に溶解し、塩酸あるいは水酸化ナトリウムでｐＨを５．５に調整する。培地組成で最も重要な点は、目的とする本発明の化合物に応じて、適切なアミノ酸、アミノアルコール又はアミンを培地に添加することである。
例えば、ＳＭＴＰ−３ＤはＤ−セリンを、ＳＭＴＰ−４ＤはＤ−フェニルアラニンを、ＳＭＴＰ−５ＤはＤ−ロイシンを、ＳＭＴＰ−６ＤはＤ−トリプトファンを、ＳＭＴＰ−７ＤはＤ−オルニチンを、ＳＭＴＰ−８ＤはＤ−リジンを、ＳＭＴＰ−９ＤはＤ−シスチンを、ＳＭＴＰ−１０ＤはＤ−イソロイシンを、ＳＭＴＰ−１１ＤはＤ−バリンを、ＳＭＴＰ−９ＬはＬ−シスチンを、ＳＭＴＰ−１０ＬはＬ−イソロイシンを、ＳＭＴＰ−１１ＬはＬ−バリンを、ＳＭＴＰ−９ＤＬはＤＬ−シスチンを、ＳＭＴＰ−１０ＤａｌｌｏはＤ−ａｌｌｏ−イソロイシンを、ＳＭＴＰ−１０ＬａｌｌｏはＬ−ａｌｌｏ−イソロイシンを、それぞれ培地に添加することにより選択的に生産することができる。アミノ酸あるいはアミノアルコールの添加濃度は、０．５から２ｍｇ／ｍｌが望ましいが、本発明はこの濃度に限定されるものではない。アミノ酸あるいはアミノアルコールの添加時期は、培養直後から培養３日目までが望ましい。培養温度は２５℃が最適であるが、この温度に限定されるものではない。培養時間は、アミノ酸あるいはアミノアルコール添加後３から６日で充分な生産量が得られる。通気攪拌条件は、５００ｍｌ容の三角フラスコに１００ｍｌのＡ培地を入れ、適当な通気栓をした場合、１８０ｒｐｍの旋回培養で得られる条件が適当である。ジャーファーメンターを用いる場合、これに相当する条件が望ましい。本発明の方法により、極めて多様なトリプレニルフェノール化合物の一群を生産できる。
【００３５】
本発明の化合物は、遊離形態、薬学的に許容され得る塩若しくはエステルの形態、又は溶媒和物の形態で用いることができる。塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、またはクエン酸、ギ酸、フマール酸、リンゴ酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の無機酸または有機酸が、本発明の化合物の薬学的に許容され得る塩の形成に好適である。また、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属を含む化合物、塩基性アミン、または塩基性アミノ酸も、本発明の化合物の薬学的に許容され得る塩の形成に好適である。
【００３６】
また、炭素数１〜１０個のアルコールまたはカルボン酸など、好ましくは、メチルアルコール、エチルアルコール、酢酸、又はプロピオン酸などが、本発明の化合物の薬学的に許容され得るエステルの形成に好適である。
【００３７】
また、水などが、本発明の化合物の薬学的に許容され得る溶媒和の形成に好適である。
【００３８】
本発明の化合物は、強いプラスミノゲン活性化促進作用を有するので、血栓溶解剤として使用できる。血栓溶解剤として、血栓の形成により起こるすべての疾病に有用である。例えば、血栓症、塞栓症及びそれらに関連する疾患の予防と治療に有用である。血栓症、塞栓症及びそれらに関連する疾患とは、例えば心筋梗塞、脳梗塞、肺梗塞（エコノミークラスシンドロームを含む）、深部静脈血栓症、虚血性腎障害などが挙げられる。
【００３９】
本発明の化合物を血栓症などの予防及び治療用医薬組成物として用いることができる。これら化合物を成分とする医薬組成物の投与形態は経口的あるいは非経口的に投与でき、経口投与に適する製剤の例としては、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤又はシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する製剤の例としては、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、貼付剤等を挙げることができる。これら化合物を成分とする薬剤の投与量は特に制限されないが、投与形態、年齢、体重、症状に応じて適宜選択すればよい。例えば静脈内投与の場合には、成人１日当り有効成分量として１から２５ｍｇ／ｋｇの投与、経口投与の場合には、成人１日当り有効成分量として２から２００ｍｇ／ｋｇの投与が望ましい。投与期間は、年齢、症状に応じて任意に定めることができる。
【００４０】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００４１】
ＳＭＴＰの産生方法
Ｓ．  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ  ＩＦＯ  ３００１８の斜面培養のループフル（ｌｏｏｐｆｕｌ）を、３％グルコース、１％大豆粉、０．３％ペプトン、０．３％肉エキス、０．３％酵母エキス、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び０．０１％ＣＢ４４２（消泡剤、日本油脂（日本））からなる培地１００ｍｌを含む５００ｍｌ三角フラスコに播種した。そのフラスコを、１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで２５℃で３日間インキュベートした。種培養物のうちの１ｍｌを、２％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、アミノ酸１００ｍｇ、及び０．０１％ＣＢ４４２（ｐＨ５．５）からなる培地１００ｍｌを含む５００ｍｌ三角フラスコに播種し、そのフラスコを４〜６日間上記のようにインキュベートした。
【００４２】
一般的手順
ＵＶスペクトルは、３２０分光光度計（日立（日本、東京））にてＭｅＯＨ中で、ＩＲスペクトルは、ＮａＣｌを用いＩＲ８１０赤外分光光度計（日本分光（日本、東京））にて測定した。ＦＡＢ−ＭＳスペクトルは、ＳＸ−１０２Ａ質量分析計（日本電子（日本、東京））にてグリセロールをマトリックスとして用いて採取した。ＮＭＲスペクトルは、２７０ＭＨｚ（１Ｈ用）及び６８ＭＨｚ（１３Ｃ用）のＥＸ−２７０核磁気共鳴装置（日本電子）にて４０℃のＤＭＳＯ−ｄ６中で測定した。旋光度は、ＤＩＰ−３６０（日本分光）にてＭｅＯＨ中で測定した。
【００４３】
プラスミノゲン活性化の測定方法
ヒトネイティブプラスミノゲン（Ｇｌｕ１−プラスミノゲン）を、記載されたリシン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーによって単離した。Ｈ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（ＶＬＫ−ｐＮＡ）は、バッケム（スイス、ブーベンドルフ）から、ウロキナーゼ（２鎖型；高分子量）は日本ケミカルリサーチ（日本、神戸）から供与された。インビトロでの実験に利用するため、本発明の化合物を緩衝液（ＴＢＳ／Ｔ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４）に直接溶解した。
【００４４】
プラスミノゲンの発色基質であるＶＬＫ−ｐＮａを用いて、プラスミン生成の初速度を測定することにより、ウロキナーゼ触媒によるプラスミノゲン活性化を測定した。５０μｌのＴＢＳ／Ｔ中に５０ｎＭプラスミノゲンと５０Ｕ／ｍｌウロキナーゼと０．１ｍＭ  Ｓ−２２５１とからなる反応混合物を、９６穴マイクロプレートのウェルで３７℃で最長４０分間インキュベートした。４５０マイクロプレートリーダー（バイオラッド）を用いて、４０５ｎｍの吸光度を１〜２分の間隔で測定した。ｔ２に対するＡ４０５ｎｍのプロットの傾きから、プラスミン生成の初速度を計算した。
【００４５】
実施例１  ＳＭＴＰ−４Ｄの合成
アミノ酸にＤ−フェニルアラニンを使用して、前記のようにして培養物を得た。培養物の上清（０．９リットル）を２−ブタノンで抽出し（等量で１回と半量で２回）、ひとまとめにした有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。得られた油状残渣（３７９ｍｇ）を、ＭｅＯＨで約１００ｍｇ／ｍｌに溶解して、ＬｉＣｈｒｏｌｕｔ（登録商標）ＲＰ−１８固相抽出カラムに通して、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＰＲＥＰ−ＯＤＳカラム（３０ｘ２５０ｍｍ；ＧＧＬサイエンス（日本、東京））での分取ＨＰＬＣに供試した。７０％の水性ＭｅＯＨ中の５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて、そのカラムを４０℃で２５ｍｌ／分の速度で展開した。保持時間４６．５〜５０分で溶出された分画を蒸発させてＭｅＯＨを除去し、酢酸エチルで抽出して、精製ＳＭＴＰ−４Ｄを４２．４ｍｇ得た。
【００４６】
実施例２  ＳＭＴＰ−５Ｄの合成
アミノ酸にＤ−ロイシンを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．６リットルの培養液から得られた油状残渣（２３６ｍｇ）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間５９〜６２分で溶出された分画からＳＭＴＰ−５Ｄを１５．７ｍｇ得た。
【００４７】
実施例３  ＳＭＴＰ−６Ｄの合成
アミノ酸にＤ−トリプトファンを使用して、前記のようにして培養物を得た。培養物の上清（１．６リットル）を２−ブタノンで抽出し（等量で１回と半量で２回）、ひとまとめにした有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。得られた油状残渣（７８９ｍｇ）を、シリカゲルカラム（３０ｘ２４０ｍｍ）に負荷し、そのカラムをヘキサン２００ｍｌ、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（６０：４０及び２０：８０）３００ｍｌ、及び酢酸エチル−ＭｅＯＨ（１００：０、９８：２、９５：５、９０：１０）３００ｍｌで逐次展開した。ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（２０：８０）分画を濃縮して精製ＳＭＴＰ−６Ｄを７９．５ｍｇ得た。
【００４８】
実施例４  ＳＭＴＰ−７Ｄの合成
アミノ酸にＤ−オルニチンを使用し、８０％の水性ＭｅＯＨ中の５０ｍＭ酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．９リットルの培養液から得られた油状残渣（１６５ｍｇ）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間３４〜３９分で溶出された分画からＳＭＴＰ−７Ｄを１７．９ｍｇ得た。
【００４９】
実施例５  ＳＭＴＰ−８Ｄの合成
アミノ酸にＤ−リジンを使用して、前記のようにして培養物を得た。培養物の上清（１．８リットル）を２−ブタノンで抽出し（等量で１回と半量で２回）、ひとまとめにした有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。
得られた油状残渣（７５２ｍｇ）を、シリカゲルカラム（３０ｘ２４０ｍｍ）に負荷し、そのカラムをヘキサン２００ｍｌ、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（６０：４０及び２０：８０）３００ｍｌ、及び酢酸エチル−ＭｅＯＨ（１００：０、９８：２、９５：５、９０：１０）３００ｍｌで逐次展開した。酢酸エチル−ＭｅＯＨ（９５：５及び９０：１０）分画を濃縮して残渣１６３ｍｇを得た。その残渣をシリカゲルカラム（３０ｘ２４０ｍｍ）のクロマトグラフィーに再度供試し、ヘキサン１００ｍｌ、酢酸エチル２００ｍｌ、及び酢酸エチル−ＭｅＯＨ（９８：２及び９５：５）で逐次展開した。酢酸エチル−ＭｅＯＨ  （９５：５）分画を濃縮して、残渣１４３ｍｇを得た。Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＰＲＥＰ−ＯＤＳカラム（３０ｘ２５０ｍｍ）による分取ＨＰＬＣでは、８０％水性ＭｅＯＨ中の５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて、４０℃で２５ｍｌ／分の速度で展開し、その残渣を更に精製した。ＳＭＴＰ−８Ｄを含む分画（保持時間４２〜５０分）を蒸発させてＭｅＯＨを除去し、酢酸エチルで抽出して精製ＳＭＴＰ−８Ｄを３３．７ｍｇ得た。
【００５０】
実施例６  ＳＭＴＰ−９Ｌの合成
アミノ酸にＬ−シスチンを使用し、７０％の水性ＭｅＯＨ中の５０ｍＭ酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．９リットルの培養液から得られた油状残渣（３５８ｍｇ）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間４９．５〜５１．３分で溶出された分画からＳＭＴＰ−９Ｌを２３．４ｍｇ得た。
【００５１】
実施例７  ＳＭＴＰ−１０Ｌの合成
アミノ酸にＬ−イソロイシンを使用し、６０％の水性ＭｅＯＨ中の５０ｍＭ酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．６リットルの培養液から得られた油状残渣（１６０ｍｇ）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間４１〜４５分で溶出された分画からＳＭＴＰ−１０Ｌを１９．０ｍｇ得た。
【００５２】
実施例８  ＳＭＴＰ−１１Ｌの合成
アミノ酸にＬ−バリンを使用し、７０％の水性ＭｅＯＨ中の５０ｍＭ酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．６リットルの培養液から得られた油状残渣（１９３ｍｇ）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間２８〜３２分で溶出された分画からＳＭＴＰ−１１Ｌを４．４ｍｇ得た。
【００５３】
物理化学的特性及び構造解明
前記の実施例１〜５に係わる本発明の化合物のそれぞれの旋光度以外の物理化学的特性（ＮＭＲ、ＵＶ、及びＩＲスペクトルなど、表１及び２）は、それぞれに対応するＳＭＴＰ−Ｌシリーズの特性と非常に類似していた。これらの対応する化合物のデータと比較することにより、ＳＭＴＰ−Ｄの３Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲデータを、表２に示すように合理的に割り当てた。
【００５４】
【表１】
2004224737.tif 000006
【００５５】
【表２】
2004224737.tif 000007
【００５６】
【表３】
2004224737.tif 000008
【００５７】
これらの結果から、ＳＭＴＰ−４Ｄ、−５Ｄ、−６Ｄ、−７Ｄ、及び−８Ｄが、それぞれＳＭＴＰ−４Ｌ、−５Ｌ、−６Ｌ、−７Ｌ、及び−８Ｌと同一の平面構造式を有することが示唆される。Ｌ−アミノ酸供給培養液中に選択的に蓄積されたＳＭＴＰ−４Ｌ、−５Ｌ、−６Ｌ、−７Ｌ、及び−８Ｌの物理化学的特性並びにクロマトグラフィー挙動は、各自然産物のものと同一であった。その一方で、ＳＭＴＰ−Ｄのクロマトグラフィー挙動は、自然発生の相対物のものと明らかに異なっていた。例えば図１に示すように、シリカＣ１８カラムを用いた分析ＨＰＬＣでのＳＭＴＰ−６Ｄの保持時間は、ＳＭＴＰ−６Ｌのものよりも有意に長かった。同様に、残りのＳＭＴＰ−Ｄは全て、各天然相対物よりも緩やかに溶出された。したがって、ＳＭＴＰ−Ｄのアミノ酸部分のα炭素の立体配置は、それらの合成のために培養に添加したアミノ酸と同じＲ配置であり、Ｓ配置が天然相当物に割り当てられる可能性が強く示唆された。
【００５８】
本発明の化合物のジヒドロピラン部分の立体化学について、モデル化合物としてスタプラビンを用いて取り組んだ。δ１．３３の２５−Ｈ３とδ２．８０のＨ−７の間のＮＯＥから、２５−Ｈ３が軸方向に配向することが示され、２５−Ｈ３とδ３．９０の８−Ｈの間のＮＯＥから、８−Ｈが赤道方向に配向し、８−ＯＨが２５−Ｈ３のトランス位にあることが実証された（図２）。これらの割り当ては、化学シフト及び結合定数データ（δ２．８０の軸方向７−Ｈとδ２．９３の赤道方向７−Ｈの両者ともＪ＝４．４Ｈｚ）と一致した。総括すると、実施例１〜５のＳＭＴＰ−Ｄの構造は、図３に示すように解明された。
【００５９】
前記の実施例６〜８のＳＭＴＰ−９Ｌ、−１０Ｌ、及び−１１Ｌの物理化学的特性を、表４に要約した。
【００６０】
【表４】
2004224737.tif 000009
【００６１】
ＳＭＴＰ−１０Ｌ及び−１１Ｌの分子量は、培養物に供給されたアミノ酸が各分子に直接組込まれるというこれまでの観察に基づく予測値と一致していた。ＳＭＴＰ−９ＬのＦＡＢ−ＭＳスペクトルから、その分子が、２個のトリプレニルフェノール単位だけでなくその２単位を架橋し得るシスチンを含むことが示唆された。分子式は、ＮＭＲ及びＭＳの結果から作成した。３種の化合物のＵＶ及びＩＲスペクトルも、これらの化合物がスタプラビン及びＳＭＴＰに共通のトリプレニルフェノール単位を有するという概念に一致していた。
【００６２】
ＳＭＴＰ−９Ｌの１３Ｈ  ＮＭＲスペクトルでは（表５）、分子式から予測されるシグナルの半分しか観察されず、その分子が対称構造であることが示唆された。
【００６３】
【表５】
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【００６４】
ＳＭＴＰ−９Ｌのトリプレニルフェノール単位の化学シフト及び結合定数などの１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルデータは、他のＳＭＴＰのスペクトルデータと類似していた。残りのカルボニル（δＣ１７４．０１）、メチン（δＣ５５．５６；δＨ４．６７）、及びメチレン（δＣ２４．２７；δＨ３．０５及び１．５１）シグナルは、シスチンの部分に合理的に割り当てた。
【００６５】
ＳＭＴＰ−１０ＬのＮＭＲスペクトルでは（表５）、トリプレニルフェノール単位に対応するシグナルに加えて、カルボニル（δＣ１７１．９２）、２個のメチン（δＣ５８．５１；δＨ４．４８及びδＣ３３．９９；δＨ２．５０）、メチレン（δＣ２５．０２；δＨ１．１５）、及び２個のメチル（δＣ１５．６８；δＨ０．９３及びδＣ１０．５０；δＨ０．８１）シグナルが観察された。これらのシグナルは、イソロイシン部分に割り当てることができた。同様に、ＳＭＴＰ−１１ＬのＮＭＲスペクトルでは（表５）、カルボニル（δＣ１７１．９２）、２個のメチン（δＣ６０．２５；δＨ４．３７及びδＣ２８．１９；δＨ２．２４）、及び２個のメチル（δＣ１９．５７；δＨ０．９７及びδＣ１９．２３；δＨ０．７８）シグナルが、バリン部分に割り当てた。
【００６６】
したがって、図４に示すようなＳＭＴＰ−９Ｌ、−１０Ｌ、及び−１１Ｌの構造がわかった。これまでの観察に基づくと、これらの構造では、ジヒドロピラン環及びアミノ酸部分の立体配置が、それぞれ相対的及び絶対的なものであることが示唆された。
【００６７】
ＳＭＴＰ−４Ｄ〜８Ｄのプラスミノゲン活性化への影響
実施例１〜５のフィブリン溶解を増加させる活性は、ウロキナーゼ触媒によるプラスミノゲン活性化を増強する活性として評価し、対照に対するプラスミン生成の初速度を図５に示した。構造成分としてそれぞれＤ−Ｐｈｅ及びＤ−Ｌｅｕを有するＳＭＴＰ−４Ｄ及び−５Ｄは、穏やかな活性があり、約３００μＭで３０倍の増強に達した。Ｄ−Ｔｒｐ部分を含むＳＭＴＰ−６Ｄの活性は、より低濃度ではＳＭＴＰ−４Ｄ及び−５Ｄの活性と同等であったが、ＳＭＴＰ−６Ｄは、２５０μＭで５０倍の増強を誘引した。この活性は、立体異性体ＳＭＴＰ−６Ｌと同様であった。それぞれＤ−Ｏｒｎ及びＤ−Ｌｙｓで架橋された擬対称構造を有するＳＭＴＰ−７Ｄ及び−８Ｄは、規模と増強に必要な濃度の両者においてＳＭＴＰ−４Ｄ〜６Ｄよりも強い作用を示した。プラスミノゲン活性化の５倍増強は、ＳＭＴＰ−７Ｄでは７０μＭで、ＳＭＴＰ−８Ｄでは１００μＭで観察され、それぞれ約１００及び１４０μＭで１００倍増強に達した。ＳＭＴＰ−７Ｄの活性は、異性体ＳＭＴＰ−７Ｌの活性と同等であった。ＳＭＴＰ−８Ｄは、同じ増強規模を発揮する濃度では、ＳＭＴＰ−８Ｌよりも約３０％低い活性であった。
【００６８】
ＳＭＴＰの構造は、置換されたクロマン環に結合したプレニル側鎖を有する点でα−トコフェロールの構造に類似している。そのため、プラスミノゲン活性化を増強する能力についてα−トコフェロールをテストした。図５に示すように、α−トコフェロールは調べた範囲の濃度では促進作用を示さなかった。この結果を、ＳＭＴＰにアミノアルコール又は親水性アミノ酸を加えるとかなり低い活性になるというこれまでの観察と考え合わせると、ＳＭＴＰの活性におけるアミノ酸部分の役割が示唆された。
【００６９】
今回の結果から、ＳＭＴＰ−Ｄが、対応するＳＭＴＰ−Ｌとほぼ同等であることが実証された。２つのトリプレニルフェノール単位を備えた同族体が、１つのトリプレニルフェノール単位からなる同族体よりも活性が高いことも確認された。本実験での増強規模は、これまでの研究で観察されたものよりも有意に高かった。これは、活性化し易い市販のプラスミノゲンと比較して、今回用いたものは、慎重に精製したネーティブコンホメーションのプラスミノゲン調製物であったことが要因と考えられる。
【００７０】
ＳＭＴＰ−９Ｌ、−１０Ｌ、及び−１１Ｌのプラスミノゲン活性化への影響
フィブリン溶解を増加させるＳＭＴＰ−９Ｌ、−１０、及び−１１の活性は、ウロキナーゼに触媒されたプラスミノゲン活性化の初速度を上昇させる活性として評価した。ＳＭＴＰ−９Ｌの効果は、１２０μＭという低濃度で観察され（１．９倍増強）、それぞれ１８０及び２４０μＭの濃度で、プラスミノゲン活性化が１０倍及び４０倍増強した（図６）。この活性は、規模に関してはＳＭＴＰ−１０Ｌ及び−１１Ｌの活性よりも有意に高かった。ＳＭＴＰ−１０Ｌ及び−１１Ｌは、両者とも３００μＭで１０倍の活性増強が観察されたが、プラスミノゲン活性化を増強する限界濃度は、約１００μＭでありＳＭＴＰ−９Ｌと同等であった。これらの結果は、疎水性側鎖のあるアミノ酸部分を備えたＳＭＴＰが２００〜３００μＭで活性を示し、２個のトリプレニルフェノール単位を備えたＳＭＴＰが１個のトリプレニルフェノール単位からなるＳＭＴＰよりも活性が高いという過去の観察と一致していた。これまで同定された最も強力なＳＭＴＰであるＳＭＴＰ−７Ｌ及び−８Ｌは、同じく各分子内に２個のトリプレニルフェノール単位を有し７０〜８０μＭで１０倍増強するが、ＳＭＴＰ−９Ｌは、これらよりも２〜２．５倍弱いと想定される。２化合物とＳＭＴＰ−９Ｌとの構造的差違は、架橋単位にある。ＳＭＴＰ−７Ｌ及び−８Ｌは１個のカルボキシルを有するが、ＳＭＴＰ−９Ｌは２個有し、その架橋単位にあるもう一方のカルボキシルが、活性に悪影響を及ぼす可能性がある。ＳＭＴＰ−９ＬはＳＭＴＰ−７Ｌ及び−８Ｌほど強力でないが、水性溶媒への溶解度が良好であり、インビボでの適用に有利である。
【００７１】
【発明の効果】
本発明によれば、新規のスタプラビン系化合物を選択的に、大量に得ることができる。また、本発明の化合物は、プラスミノーゲン活性化作用を有し、血栓症及び血栓症関連疾患の治療と予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＭＴＰ−６Ｌ及びＳＭＴＰ−６Ｄのクロマトグラフィー溶出プロファイルを表す図である。
ＳＭＴＰ−６Ｌ及びＳＭＴＰ−６Ｄ（各５μｇ）をＩｎｅｒｔｓｉｌ−ＰＲＥＰ−ＯＤＳカラム（６ｘ２５０ｍｍ；ＧＬサイエンス（日本、東京））での分取ＨＰＬＣに負荷して、以下のような５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液中の勾配ＭｅＯＨで４０℃で１ｍｌ／分の速度で展開した：ＭｅＯＨ濃度は最初の５５分間は６０％を保持し、次の１５分間でＭｅＯＨ濃度を８８％に直線的に増加させた。２６０ｎｍの吸光度で溶出をモニタリングした。
【図２】ジヒドロピラン部分の相対的立体配置を表す図である。
スタプラビン及びＳＭＴＰのジヒドロピラン部分のＮＭＲスペクトルは、互いに非常に類似しており、スタプラビンをモデル化合物として用いた。化学シフト及び結合定数のデータは、ＣＤＣｌ３中での測定から得た。点線の矢印は、重要なＮＯＥ相関を表す。
【図３】ＳＭＴＰ−４Ｄ、−５Ｄ、−６Ｄ、−７Ｄ、及び−８Ｄの構造を表す図である。
ジヒドロピラン環及びアミノ酸部分での立体配置は、それぞれ相対的及び絶対的なものである。
【図４】ＳＭＴＰ−９Ｌ、−１０Ｌ、及び−１１Ｌの構造を表す図である。
ジヒドロピラン及びアミノ酸部分の立体配置が、それぞれ相対的及び絶対的なものである。
【図５】ＳＭＴＰ−１、−２、及び−３の構造を表す図である。
【図６】ウロキナーゼ触媒によるプラスミノゲン活性化の増強に対するＳＭＴＰ−４Ｄ、−５Ｄ、−６Ｄ、−７Ｄ、及び−８Ｄの影響を表す図である。
ウロキナーゼ触媒によるプラスミン活性化を、記載した濃度のＳＭＴＰの存在下で測定した。プラスミン生成の初速度は、ＳＭＴＰの非存在下でインキュベートした対照に対するパーセンテージで示している。各値は、三重測定で実施した複数の実験の平均を表している。
【図７】ＳＭＴＰ−９Ｌ、−１０Ｌ、及び−１１Ｌによるウロキナーゼ触媒でのプラスミノゲン活性化の増強を表す図である。
ウロキナーゼ触媒によるプラスミノゲン活性化を、記載する濃度のＳＭＴＰ−９Ｌ、−１０Ｌ、及び−１１Ｌの存在下で測定した。プラスミン生成の初速度は、ＳＭＴＰの非存在下でインキュベートした対照に対するパーセンテージで示している。各値は、三重測定の平均を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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