(57)【要約】【課題】人体に対して安全な化合物から成る新しい腫瘍壊死因子機能阻害を提供する。【解決手段】下記の式（１）で表わされるフレキシビリドもしくは式（２）で表されるフレキシビリド誘導体またはそれらの薬理学上許容される塩を含有する腫瘍壊死因子機能阻害剤。式（２）中、Ｒは水素原子、ヒドロキシル基、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、または置換基を有してもよい低級アルコキシ基を表す。また、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基、置換基を有してもよい低級アルコキシ基、置換基を有してもよい低級アシロキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、または５ないし６員環の含酸素もしくは含窒素異項環を表す。【化１】2004262849.tif 000012【化２】2004262849.tif 000013【選択図】        図１
2004262849.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で表わされるフレキシビリドもしくは式（２）で表されるフレキシビリド誘導体またはそれらの薬理学上許容される塩を含有することを特徴とする腫瘍壊死因子機能阻害剤。
【化１】
2004262849.tif 000010
【化２】
2004262849.tif 000011
〔式（２）中、Ｒは水素原子、ヒドロキシル基、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、または置換基を有してもよい低級アルコキシ基を表し、また、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基、置換基を有してもよい低級アルコキシ基、置換基を有してもよい低級アシロキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、または５ないし６員環の含酸素もしくは含窒素異項環を表す。〕
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腫瘍壊死因子機能阻害剤に関し、特に、海洋生物由来のジテルペノイドまたはその誘導体を有効成分とする新規な腫瘍壊死因子機能阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα：本明細書中では特に言及しない限り、腫瘍壊死因子とはＴＮＦαを指称する。）は当初、腫瘍の壊死を引き起こす物質として１９７５年にＣａｒｓｗｅｌｌ等［Ｅ．  Ａ．  Ｃａｒｓｗｅｌｌ等，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ７２，  ３６６６  （１９７５）：非特許文献１］が血中の生理活性蛋白質として報告されたが、その後の研究により炎症や細胞性免疫反応を通し、様々な疾患に関与することが明らかとなり、現在では生体防御にかかわるサイトカインとして理解されている。例えば敗血症性ショック、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、ＲＡ（慢性関節リウマチ）などの膠原病、アレルギー疾患、動脈硬化、インスリン抵抗性糖尿病などの代謝性疾患や多発性硬化症、移植、ウィルス性肝炎、ＨＩＶ感染などの各種感染症など多くの病態にＴＮＦαの過剰産生が関与している。このような疾患に対して、腫瘍壊死因子の機能阻害作用を有する物質を投与することにより病態の改善が行える。
【０００３】
マクロファージをはじめとする各種細胞に対して腫瘍壊死因子の産生もしくは分泌を阻害する化合物は数多く知られているが、既に過剰に血中に産生された可溶型腫瘍壊死因子や活性化マクロファージの膜表面に過剰に発現した膜結合型腫瘍壊死因子に対しては無効である。現在、過剰産生あるいは発現した腫瘍壊死因子の機能阻害物質としては天然及び／又は組換えヒト腫瘍壊死因子と反応するモノクローナル抗Ｓ．  Ａ．  Ｓｉｅｇｅｌ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  ７，  １５  （１９９５）：非特許文献２；Ｂ．  Ｊ．  Ｓｃａｌｌｏｎ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  ７，  ２５１  （１９９５）：非特許文献３〕、ヒト尿中より精製された腫瘍壊死因子受容体の一部が知られているだけである（特許第２７５８３９４号公報：特許文献１）。これらの抗ＴＮＦ活性阻害物質に関しては高い有効率を示す一方で、安全性に関するデータは十分とは言えず、敗血症や肺炎、結核などの重篤な感染症にかかる副作用がある。また、いずれもタンパク質であることから、製剤としての安定性、ヒトへ投与する場合の投与形態、抗原性の問題など多くの点で問題が残っており、医療現場ではより有効で副作用の少ない、新しい作用機序を有する薬剤が求められている。
【非特許文献１】Ｅ．  Ａ．  Ｃａｒｓｗｅｌｌ等，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ７２，  ３６６６  （１９７５）
【非特許文献２】Ｓ．  Ａ．  Ｓｉｅｇｅｌ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  ７，  １５  （１９９５）
【非特許文献３】Ｂ．  Ｊ．  Ｓｃａｌｌｏｎ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  ７，  ２５１  （１９９５）
【特許文献１】特許第２７５８３９４号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は過剰産生あるいは発現した腫瘍壊死因子の機能を阻害し、腫瘍壊死因子の過剰産生あるいは発現が関与している多くの疾患の治療に対して有効な化合物を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、腫瘍壊死因子のＬ９２９細胞に対する殺細胞作用の抑制を活性の指標に日本近海に生息する海洋生物を対象に化合物の探索と評価を行なった結果、沖縄近海に生息するソフトコーラル（Ｓｉｎｕｌａｒｉａ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｓ）からセンブラン型ジテルペノイド（フレキシビリド（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｄｅ））を単離し、その化学構造を解明し、且つこの物質が優れた腫瘍壊死因子機能阻害作用を有することを見出した。
【０００６】
かくして、本発明に従えば、下記の式（１）で表されるフレキシビリドもしくは式（２）で表されるフレキシビリド誘導体またはそれらの薬理学上許容される塩を含有することを特徴とする腫瘍壊死因子機能阻害剤が提供される。
【０００７】
【化３】
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【０００８】
【化４】
2004262849.tif 000004
【０００９】
式（２）中、Ｒは水素原子、ヒドロキシル基、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、または置換基を有してもよい低級アルコキシ基を表し、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基、置換基を有してもよい低級アルコキシ基、置換基を有してもよい低級アシロキシ基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、または５ないし６員環の含酸素、もしくは含窒素異項環を表す。なお、ここで、低級アルコキシ基、低級アシロキシ基、低級アルキルアミノ基、および低級ジアルキルアミノ基における低級とは、通常、炭素数が１〜４であることを指称する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の物質フレキシビリド（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｄｅ）は、Ｒ．Ｋａｚｌａｕｓｋａ等［Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．  ３１，  １８１７  （１９７８）］及びＡ．Ｊ．Ｗｅｉｎｈｅｉｍｅｒ等［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３４，  ２９２３  （１９７７）］が報告したシヌラリン（Ｓｉｎｕｌａｒｉｎ）と同一であるが、現在までに、このフレキシブリドが腫瘍壊死因子機能阻害作用を有するという報告はない。
【００１１】
本発明の腫瘍壊死因子機能阻害剤を構成する上記式（１）のフレキシビリドはソフトコーラルより高収量で得られるので、多くの天然物由来の医薬品開発に見られるような原料供給に関する問題も克服できる。
また、式（２）で表わされるフレキシビリド誘導体は、既知の反応を利用することによって容易に合成することができる。例えば、上記の式（１）のフレキシビリド式をＧ．  Ｂｅｒｔｉらの方法に従い０．３モルの水酸化カリウム（ＫＯＨ）でジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）／水中、１００℃で６時間加熱すれば下記の式（３）のフレキシビリド誘導体が得られる〔Ｇ．  Ｂｅｒｔｉ，  Ｂ．  Ｍａｃｃｈｉａ，  ａｎｄ  Ｆ．  Ｍａｃｃｈｉａ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３４２１  （１９６５）〕。さらに、式（１）のフレキシビリドをＧ．  Ｂｅｒｔｉらの方法に従いトリクロロ酢酸（ＣＣｌ３ＣＯ２Ｈ）を用いベンゼン中加水分解すれば下記の式（４）のフレキシビリド誘導体が得られる〔Ｇ．  Ｂｅｒｔｉ，  Ｂ．  Ｍａｃｃｈｉａ，  ａｎｄ  Ｆ．  Ｍａｃｃｈｉａ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３４２１  （１９６５）〕。また、式（１）のフレキシビリドをＣ．  Ｗ．  Ｓｈｏｐｐｅｅらの方法に従いクロロフォルム（ＣＨＣｌ３）中、１５℃で塩酸（ＨＣｌ）すれば下記の式（５）のフレキシビリド誘導体が得られる〔Ｃ．  Ｗ．  Ｓｈｏｐｐｅｅ，  Ｒ．  Ｈ．  Ｊｅｎｋｉｎｓ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｈ．  Ｒ．  Ｓｕｍｅｒｓ，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １６５７  （１９５８）〕。
【００１２】
【化５】
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【００１３】
【化６】
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【００１４】
【化７】
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【００１５】
本発明の腫瘍壊死因子機能阻害剤は、式（１）で表されるフレキシビリドまたは式（２）で表されるフレキシビリド誘導体の薬理学上許容される塩を包含する。適用可能な塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム等の金属との塩が挙げられる。
【００１６】
本発明の腫瘍壊死因子機能阻害剤を構成するフレキシビリドは、腫瘍壊死因子機能阻害作用に基づいて、各種疾患に適用でき、所望の薬理効果を期待できる。適用疾患としては、より具体的には例えば、敗血症性ショック、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、ＲＡ（慢性関節リウマチ）などの膠原病、アレルギー疾患、動脈硬化、インスリン抵抗性糖尿病などの代謝性疾患や多発性硬化症、移植、ウィルス性肝炎、ＨＩＶ感染などの各種感染症を例示できる。
【００１７】
本発明の腫瘍壊死因子機能阻害剤は、そのまま、または公知の薬学的に許容される担体、賦形剤などと混合した医薬組成物〔例えば、鍵剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤〕として経口的もしくは非経口的に安全に投与することができる。投与量は投与対象、投与ルート、症状などによっても異なるが、例えば、成人には１日あたり通常０．１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度である。
【００１８】
【実施例】
以下に本発明に従う腫瘍壊死因子機能阻害剤の特徴を更に具体的に明らかにするため実施例を示す。
製造例１：フレキシビリドの調製
沖縄県本部町瀬底島、水深１〜２ｍで採取したソフトコーラル（Ｓｉｎｕｌａｒｉａ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｓ）５．７ｋｇをエタノール３Ｌでミキサーにて粉砕し、２４時間、室温で抽出し、ろ過後、残査をさらにアセトン３Ｌで２回抽出し、ろ過後、ろ液を併せ、減圧下溶媒留去し、含水エタノール抽出エキス１Ｌを得た。得た含水エタノール抽出エキスに水１Ｌを加え２Ｌの水溶液を調整し、これをジエチルエーテル３Ｌ、３Ｌ、２Ｌの計３回分配し、このジエチルエーテル８Ｌを減圧下濃縮しジエチルエーテルエキス３６．１０９ｇを得た。このジエチルエーテルエキス１．１６８ｇをクロロフォルムに溶解し、ゲルろ過（セファデックスＬＨ−２０、ファルマシア社、３．５×５５ｃｍ）を用いてカラムクロマトグラフィーに付し、クロロフォルム−メタノール（１：１）で溶出し得られた、５０フラクション（各１０ｍＬ）を薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｆ２５４、メルク社）により検討し、３個のフラクションＦｒ．１（３６９．２ｍｇ）、Ｆｒ．２（８５９．７ｍｇ）、Ｆｒ．３（２１．５ｍｇ）に分画した。
【００１９】
このうち腫瘍壊死因子機能阻害作用の確認されたＦｒ．２（８５９．７ｍｇ）をクロロフォルムに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０、メルク社、５×５５ｃｍ）に付し、ｎ―ヘキサン−酢酸エチル（７５：２５）次に（３０：７）で溶出し、得られた８０フラクション（各１０ｍＬ）を薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｆ２５４、メルク社）により検討し、３個のフラクションＦｒ．２−１（４７６ｍｇ）、Ｆｒ．２−２（２４５ｍｇ）、Ｆｒ．２−３（２６８ｍｇ）に分画した。このうち腫瘍壊死因子機能阻害作用の確認されたＦｒ．２−２（２４５ｍｇ）を逆相カラムクロマトグラフィー（Ｌｏｂａｒ  ＲＰ−８（Ｂ）、メルク社、３．５×２６ｃｍ）に付し、６０％メタノール−水で溶出し、得られた１００フラクション（各２．５ｍＬ）を薄層クロマトグラフィー（ＲＰ−８Ｆ２５４、メルク社）により検討し、４個のフラクションＦｒ．２−２−１（２ｍｇ）、Ｆｒ．２−２−２（４．６ｍｇ）、Ｆｒ．２−２−３（７．１ｍｇ）、Ｆｒ．２−２−４（７６ｍｇ）に分画した。
【００２０】
このうち腫瘍壊死因子機能阻害作用の確認されたＦｒ．２−２−４（７６ｍｇ）をクロロフォルムに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０、メルク社、２．５×３３ｃｍ）に付し、ｎ―ヘキサン−酢酸エチル（６０：４０）、で溶出し、得られた１００フラクション（各８ｍＬ）を薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｆ２５４、メルク社）により検討し、４個のフラクションＦｒ．２−２−４−１（１１ｍｇ）、Ｆｒ．２−２−４−２（１０ｍｇ）、Ｆｒ．２−２−４−３（２８ｍｇ）、Ｆｒ．２−２−４−４（２４ｍｇ）に分画した。このうち、Ｆｒ．２−２−４−２（１０ｍｇ）に腫瘍壊死因子機能阻害作用が確認され、フレキシビリドと同定した。同定データは以下のとおりである。
【００２１】
比旋光度：［α］Ｄ２８、−１００．４°（ＣＨＣｌ３、  ｃ＝０．９）、マススペクトル（ＥＩ−ＭＳ）；ｍ／ｚ＝３４４（Ｍ）＋，  ３１９，  ３１６，  ３０１，  ２８３，  ２７３，  １６５，  １３３，  １２１，  １０７，  ９３，  ８１，  ６７，  ５５赤外吸収スペクトル（ＩＲ，ＣＨＣｌ３，  ｃｍ−１）；３５８５，  ３０１２，  ２９３４，  １７１７，  １６１９；  １Ｈ−ＮＭＲ  （６００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ（ｐｐｍ）：２．０８（１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−１），  １．３６（１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−２），  ２．０９（１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−２），  ３．９７（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１１．０，  Ｈ−３），  １．６０（１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−５），  １．８３（１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝５．６，  ８．５，  Ｈ−５），  １．８５（１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−６），  ２．３４（１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−６），  ５．２２（１Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．９，  Ｈ−７），  ２．０５（１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−９），  ２．３０（１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−９），  １．４８（１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−１０），  ２．０７（１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−１０），  ２．７８（１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝４．０，  ４．９，  Ｈ−１１），  １．２２（１Ｈ，  ｍ．  Ｈ−１３），  ２．０５（１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−１３），  １．４７（１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−１４），  １．８８（１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−１４），  ５．６７（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝２．２，  Ｈ−１７），  ６．４５（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝２．２，  Ｈ−１７），  １．４３（３Ｈ，  ｓ，  Ｈ−１８），  １．６４（３Ｈ，  ｓ，  Ｈ−１９），  １．２９（３Ｈ，  ｓ，  Ｈ−２０）；  １３Ｃ−ＮＭＲ  （１５０ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３３．８（ｄ，  Ｃ−１），  ２７．８（ｔ，  Ｃ−２），  ８２．７（ｄ，  Ｃ−３），  ７４．１（ｓ，  Ｃ−４），  ３８．６（ｔ，  Ｃ−５），  ２２．６（ｔ，  Ｃ−６），  １２５．６（ｄ，  Ｃ−７），  １３４．５（ｓ，  Ｃ−８），  ３５．９（ｔ，  Ｃ−９），  ２５．４（ｔ，  Ｃ−１０），  ６２．９（ｄ，  Ｃ−１１），  ５８．９（ｓ，  Ｃ−１２），  ３４．８（ｔ，  Ｃ−１３），  ３３．０（ｔ，  Ｃ−１４），  １４０．１（ｓ，  Ｃ−１５），  １６７．２（ｓ，  Ｃ−１６），  １２７．９（ｔ，  Ｃ−１７），  ２４．９（ｑ，  Ｃ−１８），  １５．４（ｑ，  Ｃ−１９），  １５．４（ｑ，  Ｃ−２０）。
【００２２】
試験例１：腫瘍壊死因子機能阻害試験
ＴＮＦα感受性マウス繊維芽細胞Ｌ９２９（理化学研究所細胞バンク、ＲＣＢ１４２２）（１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を１０％馬血清（ＨＳ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）を加えた０．２ｍＬの培養液［Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＭＥＭ），  旭テクノグラス社］に浮遊させ、９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社）に入れ、５％炭酸ガスインキュベーター（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で２４時間培養後、培地を１ｎｇ／ｍＬＴＮＦα（和光純薬）、０．５μｇ／ｍＬアクチノマイシンＤ（和光純薬）を加えた培地０．１８ｍＬで交換し、これに、種々の濃度で調整したフレキシビリドの１％エタノール水溶液０．０２ｍＬを加え、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーターで１８時間培養した。
これに２ｍｇ／ｍＬの３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍａｉｄｅ（ＭＴＴ）（シグマ社）０．０２５ｍＬを加え、さらに４時間培養した。培地を除去し、生成したテトラゾリウム塩をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ，和光純薬）０．２ｍＬで溶解し、５４０ｎｍの波長における吸光度（ＯＤ５４０）をマイクロプレートリーダー（ＩｍｍｕｎｏＭｉｎｉＮＪ−２３００，ＩｎｔｅｒＭｅｄ社）で測定した。ＴＮＦαによるＬ９２９の細胞毒性阻害活性を図１に示す。また、ＴＮＦα機能阻害率は以下の式により算出し、下記の表１に示す。
【００２３】
【数１】
2004262849.tif 000008
【００２４】
上記算出式において、（［ＯＤ５４０］ＴＮＦ＋フレキシビリド）、（［ＯＤ５４０］ＴＮＦ）、および（［ＯＤ５４０］コントロール）は、それぞれ、ＴＮＦにフレキシビリドを加えたもの、ＴＮＦのみ、およびコントロール（対照）の５４０ｎｍにおける吸光度の測定値を表す。図１および表１から理解されるように、適当量のフレキシビリドを使用することによりＴＮＦαの機能が効果的に阻害されている。
【００２５】
【表１】
2004262849.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従って行なったフレキシビリドを用いる腫瘍壊死因子機能阻害実験の結果を示すモノグラフである。
【図１】
2004262849.tif 000014