(57)【要約】【課題】蛍光性物質による核酸標識方法の効率を上げ、それにより遺伝子の高感度な解析方法の提供。【解決手段】一般式（Ｉ）Ｌｎ−Ｓ−Ｎ　　　（Ｉ）（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）で表される蛍光性物質をヌクレオチド鎖中に取り込ませることにより核酸を標識する方法において、反応液中に界面活性剤を共存させることを特徴とする蛍光標識方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ　　　（Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）
で表される蛍光性物質をヌクレオチド鎖中に取り込ませることにより核酸を標識する方法において、反応液中に界面活性剤を共存させることを特徴とする蛍光標識方法。
【請求項２】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求項１記載の蛍光標識方法。
【請求項３】
非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルまたはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである請求項２記載の蛍光標識方法。
【請求項４】
界面活性剤の濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ以上である請求項１〜３のいずれかに記載の蛍光標識方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光性物質による核酸の標識方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物学的高分子の非アイソトープ標識におけるランタノイド金属イオンキレートの使用は、基礎研究の分野および診断の分野において大きな関心を集めている。この技術は、目的のシグナルを圧倒する通常の蛍光バックグラウンドに比較して長く持続するランタノイド元素の蛍光の利益を受けることができる。特に、バックグラウンド蛍光の蛍光崩壊時間がナノ秒オーダーであるのに対して、三価ランタノイドイオンであるユウロピウム〔Ｅｕ（ＩＩＩ）〕、テルビウム〔Ｔｂ（ＩＩＩ）〕およびサマリウム〔Ｓｍ（ＩＩＩ）〕は実にミリ秒オーダーの蛍光崩壊時間を有する。
【０００３】
適切な波長およびエネルギーレベルにおいて、サンプルに照射することによりバックグラウンド蛍光は既に崩壊しているが、ランタノイドを利用した標本はなお発光しているというタイムラグを利用して当該蛍光を測定することができる。この技術は、時間分解分光法として知られている。この技術の原理については、特許文献１および２ならびに非特許文献１に詳述されている。
【０００４】
本発明者らは、このランタノイドイオンの蛍光性を核酸プローブアッセイに利用すべく種々検討を行ってきた。ランタノイドイオンの蛍光性は、一般にそれらがキレート剤によって捕獲される時に増強される。これは、水溶液中イオンの水和が放出エネルギーを劇的に消失するからである。キレート化はまた、当該イオンを検出すべき標的の近傍へ運ぶためにも必要である。従って、ランタノイド金属イオンキレートを用いてＤＮＡ／ＲＮＡあるいは遺伝子プローブの直接標識を行うことができれば、核酸プローブアッセイの検出にランタノイドイオンの蛍光性を利用することができる。
【０００５】
本発明者らは、先に特定のキレート構造を選択することにより、蛍光強度が強く安定性の高い遺伝子プローブを調製し得る蛍光性物質が得られることを見出し、その利用方法を確立した（特許文献３参照）。その蛍光性物質とは、一般式（Ｉ）
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ　　　（Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）で表されるものである。
【０００６】
この蛍光性物質は従来の蛍光物質よりも蛍光強度が高く、なお且つ蛍光安定性に優れていることから、従来よりも蛍光強度が強く、安定性の高い遺伝子プローブの作製、高感度の核酸プローブアッセイが可能になった。
【０００７】
しかしながら、核酸プローブアッセイ、中でもＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等の染色体診断用途においては、蛍光強度が強ければ強いほどより高感度な検出が可能となるため、更なる高感度化が望まれる。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許第４，１５０，２９５号公報
【特許文献２】
米国特許第４，０５８，７３２号公報
【特許文献３】
特開２００１−２４７８５７号公報
【非特許文献１】
Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ｋｎａｐｐ　ｅｔ　ａｌ．　ｅｄｓ．　（１９７８：　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ）
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、蛍光性物質による核酸標識方法の効率を上げ、それにより遺伝子の高感度な解析方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討した結果、特定の反応条件を選択することにより、標識効率がより高い蛍光性物質の標識方法を見出し、これにより高感度な遺伝子プローブの検出方法を確立して本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）一般式（Ｉ）
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ　　　（Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）
で表される蛍光性物質をヌクレオチド鎖中に取り込ませることにより核酸を標識する方法において、反応液中に界面活性剤を共存させることを特徴とする蛍光標識方法。
（２）界面活性剤が非イオン性界面活性剤である上記（１）記載の蛍光標識方法。
（３）非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルまたはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである上記（２）記載の蛍光標識方法。
（４）界面活性剤の濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ以上である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の蛍光標識方法。
【００１１】
本発明において「蛍光性物質」とは、ランタノイド金属イオンに配位して錯体となったときに錯体由来の蛍光を発することのできる化合物をいう。ここで使用可能なランタノイド金属イオンとしては、ユウロピウム、サマリウム、テルビウム、ジスプロシウム等が挙げられる。標識体の蛍光検出にはこれらのランタノイド金属イオンを単独で、もしくは複数種混合して使用することができる。
【００１２】
本発明において「誘導体」とは、基本構造に官能基等の化合物を置換もしくは付加せしめるよう合成されたものを意味する。より具体的には４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニル〔４，４’−ｂｉｓ（１”，　１”，　１”，　２”，　２”，　３”，　３”−ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｏ−４”，　６”−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｎ−６”−ｙｌ）−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏ−ο−ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ；以下ＢＨＨＣＴとも略す〕の誘導体としては、４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）テルフェニルや４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ｐ−テルフェニル等が挙げられる。
【００１３】
本発明において「スペーサー分子」とは、一般式（Ｉ）で表される蛍光性物質においてＬｎ、すなわち、４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，　２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体、およびＮ、すなわちヌクレオチドの両者に結合可能であり、当該結合によりそれらをつなぐことができる二価の基であれば特に限定されない。好適なスペーサー分子として、炭素と炭素の間に７以下のアミド結合を有していてもよい炭素数５以上２５以下の二価の脂肪族炭化水素基が挙げられる。さらに具体的には、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−（ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ）２−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−等が挙げられる。
【００１４】
本発明に利用される蛍光性物質に含められるヌクレオチドとしては、種々のデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ）、種々のリボヌクレオチド（ｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＴＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ）およびそれらの誘導体が挙げられる。ここで、誘導体とは、基本構造に官能基等の化合物を置換もしくは付加せしめるよう合成されたものを意味し、具体的にはｄＩＴＰ、ＩＴＰ、７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ等が挙げられる。
【００１５】
本発明に利用される蛍光性物質を取り込ませるヌクレオチド鎖としては、上記種々のヌクレオチドが連続したヌクレオチド鎖（ＤＮＡやＲＮＡ）を使用することができる。具体的には、当該ヌクレオチド鎖としては、細胞内に発現するｍＲＮＡと特異的にハイブリッドを形成し得るｃＤＮＡあるいはアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。また、細胞内の核酸あるいは染色体の一部の特異的配列と相補的なヌクレオチド鎖を使用することができる。
【００１６】
本発明に利用される蛍光性物質をヌクレオチド鎖中に取り込ませる工程は、試験管内酵素触媒ポリメリゼーションを利用することにより為される。具体的には、鋳型となる遺伝子ＤＮＡを基に、市販の耐熱性ポリメラーゼを用いたポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す場合もある）またはポリメラーゼ・チェーン・リアクション・キットを用いて取り込ませる方法、市販のＤＮＡポリメラーゼを用いたランダムプライマー法を用いて取り込ませる方法、市販のＤＮＡポリメラーゼを用いたニックトランスレーションまたは市販のニックトランスレーションキットを用いて取り込ませる方法等がある。
【００１７】
本発明の標識方法においては、蛍光性物質の標識用酵素への親和性が上がる等の推定される原因により、標識効率が上がることから界面活性剤を共存させる。本発明に用いられる界面活性剤としては、非イオン性またはイオン性のいずれでもよいが、標識に用いる酵素に対する作用が温和であることから非イオン性界面活性剤の方がより好ましい。非イオン性界面活性剤の中でも、親水疎水比（ＨＬＢ）価が高いことから、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルまたはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが特に好ましい。具体例としてはＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ　２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０等が挙げられる。これらの界面活性剤を単独で、もしくは複数種混合して使用することができる。用いられる界面活性剤の反応液中の濃度は０．１〜５０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌである。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例にて具体的且つ詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
以下の実施例において、ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰとはＢＨＨＣＴが、炭素と窒素の合計の原子数が１１のスペーサー分子を介してｄＵＴＰと結合している蛍光性物質を意味し、特開２００１−２４７８５７号公報に従って合成した。
また、ＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰとはＢＨＨＣＴが、炭素と窒素の合計の原子数が４のスペーサー分子を介してｄＵＴＰと結合している蛍光性物質を意味し、以下に示す方法により合成した。
【００１９】
（１）ＢＨＨＣＴの合成
特開平９−２４１２３３号公報に従いＢＨＨＣＴを合成した。ｏ−テルフェニル２．６３ｇからＢＨＨＣＴ６．５ｇを得た。
【００２０】
（２）Ｈｇ−ｄＵＴＰの合成
ｄＵＴＰ−ナトリウム塩３００ｍｇを０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．０）６０ｍｌに溶解した。酢酸水銀８５１．９ｍｇを加え、５０〜５５℃で４時間攪拌した。反応液を冷却した後、塩化リチウム２０３．９８ｍｇを加え、生成した塩化水銀を除くために反応液を酢酸エチルで洗浄し、５倍量のエタノールを加え−２０℃で結晶を析出させた。この結晶を減圧濾過し、室温で減圧乾燥してＨｇ−ｄＵＴＰの白色結晶４０２．９ｍｇを得た。
【００２１】
（３）アリルアミン−ｄＵＴＰの合成
０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ＝５．０）で２０ｍＭに調製したＨｇ−ｄＵＴＰ１８．５ｍｌに水２．７ｍｌ中のテトラクロロパラジウム（ＩＩ）酸カリウム１２１．１７ｍｇを加え、次いで２Ｍアリルアミン水溶液（ｐＨ＝７．０）２．２２ｍｌを加え室温で２４時間攪拌した。この反応液を濾過して黒色固形のパラジウムを除去し、濾液をそのままカラムクロマト（ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−２５；酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ＝８．５）の０．１−０．６Ｍグラジエント）にかけ、精製した。精製されている画分を合わせて５倍量のエタノールを加え、−２０℃で結晶を析出させた。この結晶を減圧濾過し、室温で減圧乾燥してアリルアミン−ｄＵＴＰの白色結晶５９．９ｍｇを得た。
【００２２】
（４）ＮＨＳ−ＢＨＨＣＴの合成
ＴＨＦ５０ｍｌ中にＢＨＨＣＴ１．７ｇおよびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）０．２１ｇを溶解した。この溶液にＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）０．３８ｇを添加し、次いでトリエチルアミン０．２ｇを滴下し、室温で１時間攪拌した。この反応液を処理し、シリカゲルカラムにかけ精製し、ＮＨＳ−ＢＨＨＣＴの黄色粘性液体０．５ｇを得た。
【００２３】
（５）ＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰの合成
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ＝８．５）２０ｍｌ中にアリルアミン−ｄＵＴＰ６０ｍｇを溶解した。この溶液にＤＭＦ２ｍｌに溶解したＮＨＳ−ＢＨＨＣＴ１０１ｍｇを滴下し、室温で４時間攪拌した。この反応液に５倍量のエタノールを加え、−２０℃で２４時間放置し結晶を析出させた。この結晶を減圧濾過し、室温で減圧乾燥してＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰの薄黄色結晶４６ｍｇを得た。また、減圧濾過後の濾液を濃縮し、エタノールを加え、２次晶１７９．３ｍｇを得た。
【００２４】
実施例１
（１）ＰＣＲ法によるＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ標識反応
ＰＣＲ反応を用いＤＮＡをＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰにより標識した。鋳型ＤＮＡとしてｐＵＣ１９（東洋紡）、プライマーとしてＭ１３　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐ７（東洋紡）、Ｍ１３　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐ８（東洋紡）を用い、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の濃度を０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌと変えて以下の組成の試薬（５０μｌ）を調製した。ＰＣＲ用酵素としては、ｒＴａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）を用いた。
１０ｎｇ　ｐＵＣ１９
０．３μＭ　各Ｐｒｉｍｅｒ
５μｌ　１０×　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ
４．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．０４ｍＭ　ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ
０．２ｍＭ　ｄＧＴＰ
０．２ｍＭ　ｄＡＴＰ
０．２ｍＭ　ｄＴＴＰ
０．２ｍＭ　ｄＣＴＰ
５Ｕ　ｒＴａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
すべての試薬を以下の条件で反応させた。
９４℃，２分間の後、以下の３ステップを３０サイクル繰り返した。
９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、６８℃，２分３０秒間。
【００２５】
（２）電気泳動による増幅確認
２０ｇ／ｌアガロース・ゲル（ＴＡＥ　ｂｕｆｆｅｒ）を用い、（１）の反応後の溶液を電気泳動した（図１）。すべての試薬で、１４９ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた。
【００２６】
（３）標識の確認
標識反応後の溶液３０μｌに蒸留水３μｌを添加した後、エタノール沈澱により未反応のＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰを除去した。エタノール沈澱による沈澱を乾燥した後、１１０μｌのユウロピウム水溶液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．４、０．１ｍＭ　ＥｕＣｌ３、０．０１ｍＭ　ＴＯＰＯ（トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド）、０．１ｍｇ／ｍｌ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）で溶解した。溶解液１００μｌの蛍光強度を遮光保存３０分間経過後に、蛍光光度計（大日本製薬　フルオロスキャンＩＩ）で、励起波長３１５ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍの条件にて測定した（表１）。ＰＣＲ反応液中にＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含んでいない試薬よりもＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含んでいる試薬の方が蛍光強度が高くなり、より高頻度にＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰで標識されていることが確認できた。
【００２７】
【表１】
2004129554.tif 000002
【００２８】
実施例２
（１）ＰＣＲ法によるＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰ標識反応
ＰＣＲ反応を用いＤＮＡをＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰにより標識した。鋳型ＤＮＡとしてｐＵＣ１９（東洋紡）、プライマーとしてＭ１３　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐ７（東洋紡）、Ｍ１３　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐ８（東洋紡）を用いた。以下の組成を基本とし、界面活性剤の異なる（１ｍｇ／ｍｌ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍｌＴｗｅｅｎ　２０、１ｍｇ／ｍｌ　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０、界面活性剤なし）４種類の試薬（５０μｌ）を調製した。ＰＣＲ用酵素としては、ＫＯＤ　−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）を用いた。
１０ｎｇ　ｐＵＣ１９
０．３μＭ　各Ｐｒｉｍｅｒ
５μｌ　１０×　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ
３ｍＭ　ＭｇＳＯ４
０．２ｍＭ　ＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰ
０．２ｍＭ　ｄＧＴＰ
０．２ｍＭ　ｄＡＴＰ
０．２ｍＭ　ｄＴＴＰ
０．２ｍＭ　ｄＣＴＰ
１Ｕ　ＫＯＤ　−Ｐｌｕｓ−
すべての試薬を以下の条件で反応させた。
９４℃，２分間の後、以下の３ステップを３０サイクル繰り返した。
９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，７分間。
【００２９】
（２）電気泳動による増幅確認
２０ｇ／ｌアガロース・ゲル（ＴＡＥ　ｂｕｆｆｅｒ）を用い、（１）の反応後の溶液を電気泳動した（図２）。すべての試薬で、１４９ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた。
【００３０】
（３）標識の確認
反応後の溶液３０μｌに蒸留水３μｌを添加した後、エタノール沈澱により未反応のＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰを除去した。エタノール沈澱による沈澱を乾燥した後、１１０μｌのユウロピウム水溶液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．４、０．１ｍＭ　ＥｕＣｌ３、０．０１ｍＭ　ＴＯＰＯ、０．１ｍｇ／ｍｌ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）で溶解した。溶解液１００μｌの蛍光強度を遮光保存３０分間経過後に、蛍光光度計（大日本製薬　フルオロスキャンＩＩ）で、励起波長３１５ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍの条件にて測定した（表２）。ＰＣＲ反応液中に界面活性剤を含んでいない試薬よりも界面活性剤を含んでいる試薬の方が蛍光強度が高くなり、より高頻度にＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰで標識されていることが確認できた。
【００３１】
【表２】
2004129554.tif 000003
【００３２】
実施例３
（１）ランダムプライマー法によるＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ標識反応
ランダムプライマー法を用いＤＮＡをＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰにより標識した。鋳型ＤＮＡとしてλ／ＨｉｎｄＩＩＩ　ｄｉｇｅｓｔ（東洋紡）、プライマーとして５’末端をビオチン化した６ｍｅｒのランダムプライマーを用い、以下の組成で試薬（１２５μｌ）を２本調製した。
１１ｍｇ　λ／ＨｉｎｄＩＩＩ　ｄｉｇｅｓｔ
０．２ｍＭ　５’ビオチン化ランダムプライマー
１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．４）
２４ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．２４ｍＭ　ＤＴＴ
２本の調製液を９４℃で５分間熱処理を行い、処理後ただちに氷上で冷却した。氷冷後の溶液に、以下の組成を基本として、それぞれＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の濃度が０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌとなるように試薬を添加混合し、反応液（３００μｌ）を調製した。反応酵素としてＫｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ（東洋紡）を用いた。
０．０３５ｍＭ　ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ
０．１ｍＭ　ｄＧＴＰ
０．１ｍＭ　ｄＡＴＰ
０．０６５ｍＭ　ｄＴＴＰ
０．１ｍＭ　ｄＣＴＰ
４５Ｕ　Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ
調製した試薬を１６℃で３時間反応させ、７０℃、１０分間の熱処理を行い、反応を停止させた。
【００３３】
（２）標識の確認
反応終了後の標識反応液をストレプトアビジンコート・マイクロタイタープレート（ロッシュ製）に１００μｌ／ウェルで分注した。３７℃で１時間インキュベーションした後、マイクロタイタープレートから標識反応液を除き、３５０μｌ／ウェルのトリス緩衝生理食塩水で３回洗浄を行った。１００μｌ／ウェルでユウロピウム水溶液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．４、０．１ｍＭ　ＥｕＣｌ３、０．０１ｍＭ　ＴＯＰＯ、０．１ｍｇ／ｍｌ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）を分注し、遮光保存３０分間経過後に、蛍光光度計（大日本製薬　フルオロスキャンＩＩ）で、励起波長３１５ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍの条件にて蛍光強度を測定した（表３）。標識反応時のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００濃度が０ｍｇ／ｍｌの場合よりも、１ｍｇ／ｍｌの方が高い蛍光強度となった。
【００３４】
【表３】
2004129554.tif 000004
【００３５】
【発明の効果】
本発明の方法を利用することにより、蛍光強度が強い遺伝子プローブの作製、高感度な核酸プローブアッセイが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｒＴａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲ法によるＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ標識反応で、アガロース・ゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅を確認したものである。
【図２】図２は、ＫＯＤ　−Ｐｌｕｓ−を用いたＰＣＲ法によるＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰ標識反応で、アガロース・ゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅を確認したものである。
【図１】
2004129554.tif 000005
【図２】
2004129554.tif 000006