(57)【要約】　　　（修正有）【課題】細胞内小胞輸送に関与する細胞質膜局在シンタキシンファミリーのメンバーの新規結合パートナーであるタンパク質の単離、構造解析を行い、そのタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡを提供する。【解決手段】ヒト由来の特定のアミノ酸配列を有するタンパク質。該タンパク質において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または転移を含むアミノ酸配列を有し、かつシンタキシン−３との結合能を有するタンパク質。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのタンパク質。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または転移を含むアミノ酸配列を有し、かつシンタキシン−３との結合能を有するタンパク質。
【請求項２】
下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または転移を含むアミノ酸配列を有し、かつ、シンタキシン−３との結合能を有するタンパク質。
【請求項３】
下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７９〜１７１９の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７９〜１７１９の塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、シンタキシン−３との結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または転移を含むアミノ酸配列が、配列番号３〜９の配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
細胞内小胞輸送に関与する細胞質膜局在シンタキシンファミリーのメンバーの新規結合パートナーであるタキシリンタンパク質およびそれをコードするＤＮＡに関し、特に医薬の分野で有効に利用される。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内小胞輸送は、細胞内組織化、個々の細胞内オルガネラの生物発生、神経伝達物質、ホルモン及びサイトカインの放出、並びに、細胞分割及び運動性を含む機能にとって必須の重要な工程である（非特許文献１）。約２０年間、細胞内小胞輸送は、様々な種類の手法によって、広範囲に渡って研究されてきており、細胞内小胞輸送に寄与する多くのタンパク質が同定されてきた（非特許文献２−４）。これらのうち、ＳＮＡＲＥ３機構が細胞内小胞輸送、特に膜の接合及び融合において主要な役割を果たすことが示されている（非特許文献４）。ＳＮＡＲＥ機構は供与膜上に局在する膜タンパク質（ｖ−ＳＮＡＲＥ）及び目的区画上に局在する膜タンパク質（ｔ−ＳＮＡＲＥ）から構成される。ＳＮＡＲＥ仮説によれば、ｖ−ＳＮＡＲＥは同種であるｔ−ＳＮＡＲＥと安定な複合体を形成し（ＳＮＡＲＥ複合体と呼ばれる）、小胞は正確な目的先に標的される（非特許文献５）。ＳＮＡＲＥ複合体形成は、膜の接合及び融合に重要な工程であり、ｔ−ＳＮＡＲＥのメンバーであるシンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）ファミリーは、中心的な調整体として、ＳＮＡＲＥ複合体形成における様々なタンパク質−タンパク質相互作用に寄与することが示されている（非特許文献４）。
【０００３】
シンタキシンファミリーは、少なくとも１８個のメンバーで構成され、それぞれは特定の膜成分中に局在する（非特許文献４）。シンタキシンファミリーのメンバーの中で、シンタキシン−１ｓ（１ａ及び１ｂ）、−２、−３、および、−４が細胞膜に顕著に局在しており、エキソサイトーシスに関与している。シンタキシン−１ｓは、排他的に脳に発現しており、脳内伝達物質の放出に関与している（非特許文献６および７）。シンタキシン−２、−３、および、−４は偏在して発現している（非特許文献７）。シンタキシン−３および−４は、少なくとも分極化した上皮細胞中の頂側膜輸送および脂肪細胞におけるインシュリン誘導ＧＬＵＴ４移行に、それぞれ関与している（非特許文献８−１０）。他のシンタキシンファミリーのメンバーは、ＥＲ、ゴルジ体、エンドソームおよびリソソームを含むそれぞれ特異的な細胞内膜成分に局在しており、細胞内オルガネラの組織化と維持に関与していると考えられる（非特許文献４）。全てのシンタキシンファミリーのメンバーは、複数のコイルドコイルドメイン、Ｈａ、Ｈｂ、ＨｃおよびＨ３ドメインを有する（非特許文献４）。コイルドコイルドメインは、シンタキシンファミリーと相互作用する分子との相互作用に関与する（非特許文献４）。さらに、シンタキシンファミリーのメンバーの中でも特によく研究されているシンタキシン−１ａの結晶構造解析により、コイルドコイルドメインはアンチパラレルな４本ヘリックス束中に結合されており、そのためシンタキシン−１ａは閉じた構造である、ということが示された（非特許文献１１）。ＳＮＡＲＥ複合体の形成中、シンタキシン−１ａの閉じた構造は、開いたものに変化し、シンタキシン−１ａ　のＨ３ドメインは、１本のｖ−ＳＮＡＲＥである小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）のコイルドコイルドメインと、ｔ−ＳＮＡＲＥのメンバーである２５ｋＤａのシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）の２本のコイルドコイルドメインと、４本パラレルヘリックスを構成することが可能となる（非特許文献１２）。Ｍｕｎｃ１８、Ｍｕｎｃ１３、シンタフィリン（ｓｙｎｔａｐｈｉｌｉｎ）、シンコリン（ｓｙｎｃｏｌｉｎ）およびトモシン（ｔｏｍｏｓｙｎ）などを含む多くのシンタキシン−１ａ関連分子がＳＮＡＲＥ複合体形成を調節することが示唆されている（非特許文献１１および１３−１６）。さらに、本発明者等は最近、ブロットオーバーレイアッセイを用いて、亜膜性の細胞骨格の主要な成分であるα−フォドリン（α−ｆｏｄｒｉｎ）が、シンタキシン−１ａ、−３および−４と相互作用することを示し、α−フォドリンがＳＮＡＲＥ複合体形成を調節している可能性があることを提案した。
【０００４】
他方、Ｒａｂファミリーは、細胞の小胞輸送に関与するもう一つの重要な役割を果たす（非特許文献２）。Ｒａｂ　ＧＴＰアーゼは、ＧＴＰ−結合活性型とＧＤＰ−結合非活性型との間の転換をする。ＧＴＰ−結合活性型は、標的タンパク質と相互作用し、その機能を果たす。Ｒａｂファミリーは、細胞内小胞輸送において、多くの標的タンパク質との相互作用を通して、多岐に渡る機能を果たすことが示されている（非特許文献２）。最近、Ｒａｂファミリーの多くの機能のうちの一つがＳＮＡＲＥ複合体形成を調節するものであることが明らかとなった（非特許文献１７）。さらに、ＳＮＡＲＥ複合体形成が、Ｒａｂファミリーとシンタキシンファミリーの直接的および／または間接的相互作用により制御されている可能性がある（非特許文献１８および１９）。しかしながら、ＳＮＡＲＥ複合体形成が調節される正確な分子機構は、不明なままである。
【０００５】
ＳＮＡＲＥ複合体形成の分子機構および細胞内小胞輸送に関連する各種疾患の解明およびそれらの診断、治療薬の開発などの目的で、シンタキシンファミリーと相互作用する分子の単離および同定が望まれている。
【０００６】
【非特許文献１】Ｒｏｔｈｍａｎ，　Ｊ．　Ｅ．　（１９９４）　Ｎａｔｕｒｅ　３７２，　５５−６３
【非特許文献２】Ｚｅｒｉａｌ，　Ｍ．，　ａｎｄ　ＭｃＢｒｉｄｅ，　Ｈ．　（２００１）　Ｎａｔ．　Ｒｅｖ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２，　１０７−１１７
【非特許文献３】Ｐｆｅｆｆｅｒ，　Ｓ．　Ｒ．　（１９９９）　Ｎａｔ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１，　１７−２２
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ，　Ｙ．　Ａ．，　ａｎｄ　Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，　Ｒ．　Ｈ．　（２００１）　Ｎａｔ．　Ｒｅｖ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２，　９８−１０６
【非特許文献５】Ｒｏｔｈｍａｎ，　Ｊ．　Ｅ．，　ａｎｄ　Ｏｒｃｉ，　Ｌ．　（１９９２）　Ｎａｔｕｒｅ　３５５，　４０９−４１５
【非特許文献６】Ｓｕｄｈｏｆ，　Ｔ．　Ｃ．　（１９９５）　Ｎａｔｕｒｅ　３７５，　６４５−６５３
【非特許文献７】Ｂｅｎｎｅｔｔ，　Ｍ．　Ｋ．，　Ｇａｒｃｉａ−Ａｒｒａｒａｓ，　Ｊ．　Ｅ．，　Ｅｌｆｅｒｉｎｋ，　Ｌ．　Ａ．，　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，　Ｋ．，　Ｆｌｅｍｉｎｇ，　Ａ．　Ｍ．，　Ｈａｚｕｋａ，　Ｃ．　Ｄ．，　ａｎｄ　Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，　Ｒ．　Ｈ．　（１９９３）　Ｃｅｌｌ　７４，　８６３−８７３
【非特許文献８】Ｌａｆｏｎｔ，　Ｆ．，　Ｖｅｒｋａｄｅ，　Ｐ．，　Ｇａｌｌｉ，　Ｔ．，　Ｗｉｍｍｅｒ，　Ｃ．，　Ｌｏｕｖａｒｄ，　Ｄ．，　ａｎｄ　Ｓｉｍｏｎｓ，　Ｋ．　（１９９９）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．　Ｓ．　Ａ．　９６，　３７３４−３７３８
【非特許文献９】Ｌｏｗ，　Ｓ．　Ｈ．，　Ｃｈａｐｉｎ，　Ｓ．　Ｊ．，　Ｗｉｍｍｅｒ，　Ｃ．，　Ｗｈｉｔｅｈｅａｒｔ，　Ｓ．　Ｗ．，　Ｋｏｍｕｖｅｓ，　Ｌ．　Ｇ．，　Ｍｏｓｔｏｖ，　Ｋ．　Ｅ．，　ａｎｄ　Ｗｅｉｍｂｓ，　Ｔ．　（１９９８）　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．
１４１，　１５０３−１５１３
【非特許文献１０】Ｏｌｓｏｎ，　Ａ．　Ｌ．，　Ｋｎｉｇｈｔ，　Ｊ．　Ｂ．，　ａｎｄ　Ｐｅｓｓｉｎ，　Ｊ．　Ｅ．　（１９９７）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１７，　２４２５−２４３５
【非特許文献１１】Ｍｉｓｕｒａ，　Ｋ．　Ｍ．，　Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，　Ｒ．　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｗｅｉｓ，　Ｗ．　Ｉ．　（２０００）　Ｎａｔｕｒｅ　４０４，　３５５−３６２
【非特許文献１２】Ｓｕｔｔｏｎ，　Ｒ．　Ｂ．，　Ｆａｓｓｈａｕｅｒ，　Ｄ．，　Ｊａｈｎ，　Ｒ．，　ａｎｄ　Ｂｒｕｎｇｅｒ，
Ａ．　Ｔ．　（１９９８）　Ｎａｔｕｒｅ　３９５，　３４７−３５３
【非特許文献１３】Ｆｕｊｉｔａ，　Ｙ．，　Ｓｈｉｒａｔａｋｉ，　Ｈ．，　Ｓａｋｉｓａｋａ，　Ｔ．，　Ａｓａｋｕｒａ，　Ｔ．，　Ｏｈｙａ，　Ｔ．，　Ｋｏｔａｎｉ，　Ｈ．，　Ｙｏｋｏｙａｍａ，　Ｓ．，　Ｎｉｓｈｉｏｋａ，　Ｈ．，　Ｍａｔｓｕｕｒａ，　Ｙ．，　Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，　Ａ．，　Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，　Ｒ．　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｔａｋａｉ，　Ｙ．　（１９９８）　Ｎｅｕｒｏｎ　２０，　９０５−９１５
【非特許文献１４】Ｅｄｗａｒｄｓｏｎ，　Ｊ．　Ｍ．，　Ａｎ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｊａｈｎ，　Ｒ．　（１９９７）　Ｃｅｌｌ　９０，　３２５−３３３
【非特許文献１５】Ｌａｏ，　Ｇ．，　Ｓｃｈｅｕｓｓ，　Ｖ．，　Ｇｅｒｗｉｎ，　Ｃ．　Ｍ．，　Ｓｕ，　Ｑ．，　Ｍｏｃｈｉｄａ，　Ｓ．，　Ｒｅｔｔｉｇ，　Ｊ．，　ａｎｄ　Ｓｈｅｎｇ，　Ｚ．　Ｈ．　（２０００）　Ｎｅｕｒｏｎ　２５，　１９１−２０１
【非特許文献１６】Ｂｅｔｚ，　Ａ．，　Ｏｋａｍｏｔｏ，　Ｍ．，　Ｂｅｎｓｅｌｅｒ，　Ｆ．，　ａｎｄ　Ｂｒｏｓｅ，　Ｎ．　（１９９７）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７２，　２５２０−２５２６
【非特許文献１７】Ｌｕｐａｓｈｉｎ，　Ｖ．　Ｖ．，　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｓ，　Ｍ．　Ｇ．　（１９９７）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７６，　１２５５−１２５８
【非特許文献１８】Ａｌｌａｎ，　Ｂ．　Ｂ．，　Ｍｏｙｅｒ，　Ｂ．　Ｄ．，　ａｎｄ　Ｂａｌｃｈ，　Ｗ．　Ｅ．　（２０００）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８９，　４４４−４４８
【非特許文献１９】Ｌｉ，　Ｌ．，　Ｏｍａｔａ，　Ｗ．，　Ｋｏｊｉｍａ，　Ｌ．，　ａｎｄ　Ｓｈｉｂａｔａ，　Ｈ．　（２００１）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６，　５２６５−５２７３
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
細胞内小胞輸送に関与する細胞質膜局在シンタキシンファミリーのメンバーの新規結合パートナーであるタンパク質の単離、構造解析を行い、そのタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡを提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は先に、ＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣを用いたブロットオーバーレイアッセイにより、α−フォドリンがシンタキシン−３結合タンパク質であることを示した。その際、α−フォドリン以外のシンタキシン−３結合タンパク質は検出されなかった（１７）。しかしながら、１回目のＭｏｎｏ　Ｑカラムクロマトグラフィーにおいてブロットオーバーレイアッセイを行い、Ｘ線フィルムにシートを長時間露光したところ、わずかに分子量およそ７５，０００のシンタキシン−３結合タンパク質を検出した。この新たに同定したシンタキシン−３結合タンパク質（ラット　ｐ７５）は、Ｃ−末端コイルドコイルモチーフ上の残基に変異を有するシンタキシン−３である、シンタキシン−３ΔＣ−Ｍ１変異体に結合し、α−フォドリンと結合しなかった。しかしながら、ラットｐ７５は、同じモチーフ上の他の残基に変異を有する他のシンタキシン−３変異体である、シンタキシン−３ΔＣ−Ｍ２と結合しなかった。
【０００９】
したがって、本発明者等は、ラットｐ７５はシンタキシン−３の新規な結合パートナーであると考え、ラット肺の膜画分由来の界面活性剤抽出物から連続カラムクロマトグラフィーによりラットｐ７５を高度に精製した。
このラットｐ７５のヒトのホモログの断片をインシリコ（ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ）クローニングにより単離し、さらに、５’−および３’−レース法を用いて、ラットｐ７５のヒトのホモログの全オープンリーディングフレームをカバーするｃＤＮＡ断片を単離し、全構造を解析した。本発明者等は、このラットｐ７５およびそのホモログをタキシリン（Ｔａｘｉｌｉｎ）と名づけた。
【００１０】
本発明は上記のようにしてなされたものであり、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）　下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのタンパク質。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または転移を含むアミノ酸配列を有し、かつシンタキシン−３との結合能を有するタンパク質。
（２）　下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡ。（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または転移を含むアミノ酸配列を有し、かつ、シンタキシン−３との結合能を有するタンパク質。
（３）　下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡである（２）に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７９〜１７１９の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７９〜１７１９の塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、シンタキシン−３との結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）　１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または転移を含むアミノ酸配列が、配列番号３〜９の配列を含む、（１）に記載のタンパク質。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
以下に、本発明のタンパク質およびＤＮＡを取得する方法を例示する。
【００１２】
本発明のタンパク質の一例は、シンタキシン−３を用いたブロットオーバーレイアッセイによりラット肺の膜画分由来の界面活性剤抽出物より取得された。このタンパク質（ラットｐ７５）を連続カラムクロマトグラフィーにより高度に精製し、部分アミノ酸配列を決定した。このラットｐ７５タンパク質の部分アミノ酸配列を用いた、データバンクサーチ（ＭＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ　：　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　；　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）によるヒトアミノ酸配列データベースのインシリコクローニングによりこのタンパク質のヒトホモログの部分アミノ酸配列を単離した。得られた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列情報に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、目的とするクローンを単離した。
【００１３】
上記のようにして得られるラットのタンパク質の部分アミノ酸配列の例を配列番号３〜９に示す。
上記のようにして得られるヒトｃＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号１に示す。また、この配列によってコードされると予想されるアミノ酸配列を配列番号１及び２に示す。
【００１４】
配列番号１の配列は、上記のようにラットｐ７５タンパク質のアミノ酸配列の一部の配列をもとにしたデータベースサーチおよび得られた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列に基づくプライマーを用いたヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲにより全長が取得されたものであるが、本発明の塩基配列は、本発明によりヒトタキシリンｃＤＮＡの塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列の一例が明らかにされたので、それに基づいて、適当なプライマーを作製しヒトｃＤＮＡライブラリーなどからＰＣＲによって増幅することによって取得することができる。ヒトｃＤＮＡライブラリーは特に制限されず、例えば、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ，　クロンテック）等の市販のライブラリーを用いることもできる。あるいは化学合成によって取得することができる。
【００１５】
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、標準的なプロトコールに従って行うことができ、例えば、Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ（クロンテック，　Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）などのｃＤＮＡを用いて製造者の指示に従って行うことができる。
【００１６】
なお、ＰＣＲ、ＰＣＲに用いるプライマーの設計、ハイブリダイゼーション等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．　Ｆ．　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　（１９８９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　ｅｄ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ．等に記載されている当業者によく知られている通常の方法により、行うことができる。
【００１７】
通常、タンパク質には、種、個体などの違いによって１若しくは複数の位置での１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または転移などの相違が当然存在する。本発明のタンパク質は、シンタキシン−３との結合能が損なわれない限り、このような１若しくは複数の位置での１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または転移を含むものであってもよい。このような１若しくは複数の位置での１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または転移を含む、本発明のタンパク質の例として、ラット由来のものなどが挙げられる。本発明のラット由来のタンパク質として、具体的には、例えば、配列番号３〜９の配列を含むものが挙げられる。本発明のラット由来のタンパク質は、本発明により配列番号３〜９の配列が明らかにされたので、同アミノ酸配列をコードする塩基配列に基づいて、適当なプライマーを作製しラットｃＤＮＡライブラリーなどからＰＣＲによって増幅することによって得られる塩基配列がコードするアミノ酸配列として取得することができる。ラットｃＤＮＡライブラリーは特に制限されず、例えば、ラットｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ，　クロンテック）等の市販のライブラリーを用いることもできる。あるいは化学合成によって取得することができる。
また、ここで「複数」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から１６０個、好ましくは、２から１３５個、より好ましくは２から１１０個である。
【００１８】
本発明のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または転移を含むように塩基配列を改変することによっても得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている他の変異処理によっても取得され得る。
【００１９】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、該細胞により合成されるタンパク質のシンタキシン−３との結合能を調べることにより、本発明のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
また、変異を有する本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち少なくとも塩基番号７９〜１７１９からなる塩基配列またはその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、シンタキシン−３との結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、本発明のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。なお、ここでいう「一部」とはプローブとして使用するのに有効な長さのことである。また、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、例えば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば、配列番号１に示す塩基配列のうち、少なくとも塩基番号７９〜１７１９と約７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは５５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩条件（洗浄の条件として）でハイブリダイズする条件が挙げられる。なお、相同性はＢＬＡＳＴにより計算した場合である。
【００２０】
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎ、シンタキシン−３との結合能を以下の実施例で詳細に述べられるアッセイなどで測定することによって容易に取り除くことができる。
【００２１】
本発明のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、シンタキシン−３との結合能を有し、より好ましくは細胞膜上に局在するシンタキシンファミリーのメンバーとの結合能を有する。シンタキシン−３との結合能とは具体的には、通常の条件下でシンタキシン−３のＣ末端コイルドコイル領域、より具体的にはシンタキシン−３のアミノ酸配列１９１−２３９と結合する能力のことを示す。シンタキシン−３との結合能は、例えば、シンタキシン−３ΔＣを結合させたビーズを、例えば、２０　ｍＭ　トリス−塩酸　ｐＨ　７．５，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１　ｍＭ　ＤＴＴ，　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌなどを含むバッファーで平衡化し、タンパク質とともにインキュベートし、同バッファーで溶出することにより試験することができる。例えば、この場合タンパク質が溶出しないことを指標に、そのタンパク質がシンタキシン−３との結合能を有すると判断することができる。
本発明のタンパク質のシンタキシン−３との結合能はさらに以下の実施例に詳細に示すウェスタンブロッティング、ブロットオーバーレイ法、プルダウンアッセイなどの方法によっても試験することができる。
【００２２】
本発明によりタキシリンタンパク質が提供されるため、タキシリンタンパク質または抗原性を有する該タンパク質の一部を抗原として、当業者によく知られる標準的な方法にて坑タキシリン抗体を作製することができる。
タキシリンタンパク質、それをコードするＤＮＡおよび坑タキシリン抗体は、細胞内小胞輸送、特にＣａ２＋依存性エキソサイトーシス機構およびそれに関連する各種疾患解明の試薬として、さらに同疾患の治療、診断薬として用いることができる。
【００２３】
シンタキシンファミリーは、それぞれ特定の細胞内膜構造上に局在する、少なくとも１８個のメンバーで構成される（４）。これらのうち、シンタキシン−１ｓ、−２、−３および−４などは、顕著に細胞膜に局在し、エキソサイトーシスに関与する。本研究においてわれわれは、シンタキシンファミリーの新規結合パートナーを同定し、タキシリンと名付けた。タキシリンは、シンタキシン−１ａ、−２、−３および−４と結合するが、エンドソームに局在するシンタキシンファミリーのメンバーであるシンタキシン−７とは結合しない。タキシリンは際だって長いコイルドコイルドメインを有し、それによりタキシリンはシンタキシン−３と相互作用する。逆に、シンタキシン−３はタキシリンとそのＣ−末端コイルドコイル領域を通じてタキシリンと相互作用する。シンタキシン−３のタキシリン結合領域に含まれる残基の変異により、シンタキシン−３のタキシリンとの相互作用能が失われた。さらに、タキシリンは、両タンパク質を過剰発現するＨｅｌａ細胞において全長シンタキシン−４と相互作用する。本発明者等の研究は、タキシリンが細胞膜に局在するシンタキシンファミリーのメンバーと相互作用することを強力に示唆する。
【００２４】
本発明者等は、全長タキシリンの過剰発現がＰＣ１２細胞からのＣａ２＋依存性ＧＨ放出を阻害するのに対し、シンタキシン−３結合領域を欠損するその断片がＧＨ放出を阻害しないことを示した。したがって、シンタキシン−３同様シンタキシン−１ａは、タキシリンのコイルドコイル領域と相互作用すると考えられ、少なくともこの結果により、内因性シンタキシン−１ａとの相互作用により、タキシリンが神経内分泌細胞のＣａ２＋依存性エキソサイトーシスに関与することが示唆される。タキシリンがＣａ２＋依存性エキソサイトーシスを制御する正確な分子メカニズムは分かっていない。しかしながら、シンタキシン−１ａのＣ末端コイルドコイル領域は、シンタキシン−１ａ　とＳＮＡＲＥの他の構成成分とその附属タンパク質との相互作用に関与していることから（４）、タキシリンがＳＮＡＲＥ複合体の構造を制御することにより、Ｃａ２＋依存性エキソサイトーシスに関係している可能性がある。
【００２５】
他方、ノーザンブロット分析によりタキシリンが偏在して発現することが示された。さらに、タキシリンは、偏在して発現するシンタキシン−２、−３および−４と相互作用する。従って、タキシリンは神経内分泌細胞以外の細胞のエキソサイトーシスにも関与している可能性がある。
【００２６】
近年の研究の多くは、ＳＮＡＲＥ機構というより接合および結合タンパク質が主に標的とする膜に対する小胞の標的と連結の特性を仲介する可能性があることを示す（３）。酵母のタンパク質であり、顕著に長いコイルドコイルドメインを有し、細胞内小胞輸送に接合因子として関係するＵｓｏ１およびＳｙｓ３（２６，３０）と、タキシリンは相同である。Ｕｓｏ１とＳｙｓ３は、それぞれＲａｂファミリーのＧＴＰａｓｅであるＹｐｔ１とＹｐｔ６と遺伝的に相互作用する（２６，３０）。さらに、Ｕｓｏ１の哺乳類のホモログであるｐ１１５は、ＲａｂファミリーのＧＴＰアーゼであるＲａｂ１の標的タンパク質であり、小胞体−ゴルジ輸送を制御する（１９）。ＲａｂによるＣＯＰＩＩ小胞の出芽のためのｐ１１５が集められ、それによって直接シンタキシン−５、ｓｌｙ１およびメンブリンと相互作用する（１９）。タキシリンとＲａｂファミリーとの関係は知られていない。しかしながら、シークエンスホモロジー、ドメイン構造および生化学的特性に基づくと、接合因子であるＵｓｏ１およびＳｙｓ１のようにタキシリンは機能的にシンタキシンおよびＲａｂファミリーとを連結するかも知れない。
【００２７】
【実施例】
以下に実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例においては特に断わりのない場合、タキシリンとはヒトタキシリンを示す。
（材料および化合物）
抗シンタキシン−３抗体は、文献（１７）に従って調製した。ＧＳＴ−融合タンパク質は、製造者の指示に従ってエシェリヒア・コリから精製した。インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）翻訳は、ＴＮＴ　Ｔ７−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　ｌｙｓａｔｅ　ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ、マディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて製造者の指示に従って行った。シンタキシン−３および−４をコードするｃＤＮＡ断片は、ラット腎ｃＤＮＡライブラリーから文献（１７）に従って調製した。ｐＧＥＸ／シンタキシン−ｌａΔＣ（アミノ酸　４−２６６）、ｐＧＥＸ／シンタキシン−２ΔＣ（アミノ酸　４−２６４）およびｐＧＥＸ／シンタキシン−７ΔＣ（アミノ酸　１−２３９）は、Ｒ．Ｈ．　Ｓｃｈｅｌｌｅｒ博士から供与された（スタンフォード大学、ＣＡ、ＵＳＡ）。シンタキシン−３ΔＣ−Ｍ１および−Ｍ２は、２０８および２３２番目のイソロイシンがアラニンでそれぞれ置換されたシンタキシン−３ΔＣ（アミノ酸　１−２６３）変異体である。シンタキシン−４ΔＣ−Ｍ１および−Ｍ２は、２１７および２４１番目のイソロイシンがアラニンでそれぞれ置換されたシンタキシン−４ΔＣ（アミノ酸　１−２７３）変異体である。シンタキシン−４ΔＣ−Ｍ１および−Ｍ２の変異残基は、シンタキシン−３ΔＣ−Ｍ１および−Ｍ２のそれに相当する（７）。変異をコードするｃＤＮＡ断片は、ＰＣＲによるサイトダイレクトミュータジェネシス法により作製した。ｐｃＤＮＡ−Ｍｙｃおよび−ＨＡは、Ｎ−末端ＭｙｃおよびＨＡエピトープとのそれぞれの融合タンパク質を発現させるために作製した。全ての組換え配列は、ＤＮＡシークエンス分析により、ＰＣＲによる誤りがないことを確認した。他の材料は市販のものを用いた。
【００２８】
（プラスミド構築）
標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて以下の発現構築物を構築した：ｐｃＤＮＡ−ＨＡ／シンタキシン−４（全長）、ｐＧＥＸ−６ｐ／シンタキシン−３ΔＣ（アミノ酸１−２６３）、ｐＧＥＸ−６ｐ／シンタキシン−３ΔＣ−１（アミノ酸１−２３９）、ｐＧＥＸ−６ｐ／シンタキシン−３ΔＣ−２（アミノ酸１−１２０）、ｐＧＥＸ−６ｐ／シンタキシン−３ΔＣ−４（アミノ酸１９１−２６３）、ｐＧＥＸ−６ｐ／シンタキシン−３ΔＣ−５（アミノ酸２２１−２６３）、ｐＧＥＸ−６ｐ／シンタキシン−３ΔＣ−６（アミノ酸１９１−２３９）、ｐＧＥＸ−６ｐ／シンタキシン−３ΔＣ−７（アミノ酸１９１−２２０）、ｐＧＥＸ−６ｐ／シンタキシン−３ΔＣ−Ｍ１（アミノ酸１−２６３）、ｐＧＥＸ−６ｐ／シンタキシン−３ΔＣ−Ｍ２（アミノ酸１−２６３）、ｐＧＥＸ−６ｐ／シンタキシン−４ΔＣ（アミノ酸１−２７３）、ｐＧＥＸ−６ｐ／シンタキシン−４ΔＣ−Ｍ１（アミノ酸１−２７３）、ｐＧＥＸ−６ｐ／シンタキシン−４ΔＣ−Ｍ２（アミノ酸１−２７３）、ｐｃＤＮＡ／タキシリン（全長）、ｐｃＤＮＡ−Ｍｙｃ／タキシリン（全長）、ｐｃＤＮＡ−Ｍｙｃ／タキシリンΔＣ（アミノ酸１−２０６）、ｐｃＤＮＡ−Ｍｙｃ／タキシリンΔＮ（アミノ酸１９２−５４６）、ｐＧＥＸ−Ｍｙｃ／タキシリンΔＣ−１（アミノ酸１−１４０）。構築物は、ＰＣＲまたは制限消化によって生成した断片をベクターに挿入して行った。全てのＰＣＲ産物をシークエンスし、全てのプラスミドの構造を制限分析で確認した。
【００２９】
（その他の工程）
タンパク質の濃度は文献（２２）に従ってＢＳＡを基準タンパク質として用いて決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは文献（２３）に従って行った。ウェスタンブロッティングはＥＣＬイムノブロッティング検出システム（アマシャム　バイオサイエンス　Ｌｔｄ．）を用いて製造者の指示に従って行った。
【００３０】
【実施例１】新規シンタキシン−３結合タンパク質の同定および精製
ラット肺からのラットｐ７５の精製およびラットｐ７５のペプチドマッピングは、以下のようにして行った。
以下、全ての工程は、４℃で行った。ＧＳＴ−またはＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣ（アミノ酸　１−２６３）（各２　ｎｍｏｌ）を０．２　ｍｌのグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（アマシャム　バイオサイエンス　Ｌｔｄ．，　バッキンガムシア，　ＵＫ）に固定し、アフィニティーカラムを作製した。ラット肺（２５　ｇ　湿重量）を、１２５　ｍｌのバッファーＡ（２０　ｍＭ　トリス−塩酸　ｐＨ　７．５，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１　ｍＭ　ＤＴＴ，　１０　％　シュークロース，　１０μＭ　ｐ−アミジノフェニルメタンスルホニルフロライド，　５０μＭ　ロイペプチン）中で、ポリトロン組織グリンダーでホモジナイズし、さらにＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートを１，０００×ｇで１０分間遠心し、さらに上清を１００，０００×ｇで１時間遠心した。沈殿は、バッファーＡにタンパク質濃度１０　ｍｇ／ｍｌとなるように再懸濁し、２　％　コール酸ナトリウムを含む等量（体積）のバッファーＡと共に１時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを１００，０００×ｇで１時間遠心した。上清を膜画分の抽出物として、使用するまで−８０℃で保存し、用いた。抽出物（６４　ｍｌ，　タンパク質として１６０　ｍｇ）を等量（体積）のバッファーＢ（２０　ｍＭ　トリス−塩酸　ｐＨ　８．０，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１　ｍＭ　ＤＴＴ，　１　％コール酸ナトリウム）で希釈し、希釈したサンプルを、バッファーＢで平衡化したＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ１０／１０カラム（１×１０ｃｍ；アマシャム　バイオサイエンス　Ｌｔｄ．）に添加した。溶出は、ＮａＣｌの直線勾配（０−０．５Ｍ）をかけた１２０　ｍｌのバッファーＢで行った。４　ｍｌづつ画分を回収した。ラットｐ７５は、画分３および４に表れた。上記と同じ工程を９回行い、９回のＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ１０／１０カラムクロマトグラフィーの活性画分を統合した。統合したサンプルの１／３（２４　ｍｌ，　タンパク質として２４　ｍｇ）を２倍量（体積）のバッファーＣ（２０　ｍＭ　トリス−塩酸　ｐＨ　８．０，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１　ｍＭ　ＤＴＴ，　１　％　チャップス（ＣＨＡＰＳ））で希釈し、希釈したサンプルを、バッファーＣで平衡化したＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５／５カラム（０．５×５ｃｍ；アマシャム　バイオサイエンス　Ｌｔｄ．）に添加した。溶出は、ＮａＣｌの直線勾配（０−０．５Ｍ）をかけた１０　ｍｌのバッファーＣで行った。０．５　ｍｌづつ画分を回収した。ラットｐ７５は、画分５−７に表れた。上記と同じ工程を３回行い、３回のＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５／５カラムクロマトグラフィーの活性画分を統合した。統合したサンプル（４．５　ｍｌ，　タンパク質として０．６　ｍｇ）をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（ミリポア　Ｃｏｒｐ．　Ｂｅｄｆｏｒｄ，　ＭＡ，　ＵＳＡ）を用いて濃縮し、５０　μｌとした。濃縮したサンプルを０．５　％チャップス（ＣＨＡＰＳ）を含むバッファーＤ（２０　ｍＭ　トリス−塩酸　ｐＨ　７．５，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１　ｍＭ　ＤＴＴ，　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，　０．１　％　ツィーン　２０（Ｔｗｅｅｎ２０））で平衡化したＦａｓｔ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　ＰＣ３．２／１０カラム（０．３２×１０ｃｍ；アマシャムバイオサイエンス　Ｌｔｄ．）に添加した。溶出を同じバッファーで行った。０．１　ｍｌづつ画分を回収した。ラットｐ７５は、画分３に表れた。活性画分を３倍量のバッファーＤで希釈した。希釈したサンプルの溶液（２５　μｌ）を０．１２５　％チャップス（ＣＨＡＰＳ）を含むバッファーＤで平衡化したＧＳＴまたはＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣカラムに添加した。同じバッファーでカラムを徹底して洗浄した後、カラムに結合したタンパク質を０．２　ｍｌのレムリーサンプルバッファーで溶出した。溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、坑シンタキシン−３抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。ＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣカラムからの溶出物には分子量約７５，０００のバンドが検出されたが、ＧＳＴカラムからの溶出物には検出されなかった。すなわち、ラットｐ７５は、ＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣカラムから溶出したが、ＧＳＴカラムからは溶出しなかった。そこで、希釈したサンプルの残りをＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣカラムに添加し、溶出物を上記と同じ方法にて得た。溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０　％　ポリアクリルアミドゲル）に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。分子量約７５，０００に相当するタンパク質のバンドをゲルから切り出し、リジルエンドペプチダーゼで消化し、消化されたペプチドをＣ１８逆層高圧液体カラムクロマトグラフィー（１３）により分離した。７個のペプチドのアミノ酸配列をペプチドシークエンサー（島津　ＰＳＱ−ガス層シークエンサー）で決定した。
【００３１】
ブロット−オーバーレイアッセイは以下のようにして行った。
試験するサンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜上にブロットした。膜を５％スキムミルクおよび０．１％　ツィーン　２０を含むＰＢＳを用いて、室温で２時間ブロックした。膜を同バッファー中で、０．３μＭ　ＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣと共に４℃で１２時間インキュベートした。インキュベーション後、膜を０．１％　ツィーン　２０を含むＰＢＳを用いて、４℃で５分間、３回洗浄した。膜に結合したＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣは、抗シンタキシン−３抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検出した。
【００３２】
１回目のＭｏｎｏ　Ｑカラムクロマトグラフィーにおいてブロットオーバーレイアッセイを行い、Ｘ線フィルムにシートを長時間露光したところ、わずかに分子量およそ７５，０００のシンタキシン−３結合タンパク質を検出した。この新たに同定したシンタキシン−３結合タンパク質（ラット　ｐ７５）を上記のように連続カラムクロマトグラフィーにより精製し、部分アミノ酸配列を同定した。（配列番号３〜９）
【００３３】
【実施例２】ラットｐ７５のヒトホモログのインシリコクローニング
実施例１で決定したラットｐ７５の部分アミノ酸配列を用いて、データバンクサーチを行った。７個のペプチドのうち、５個のペプチドのアミノ酸配列は、６個のアミノ酸以外について、インシリコクローニングにより推定されたヒト遺伝子の推定アミノ酸配列に含まれることを示した。さらに、残り２個のペプチドのアミノ酸配列は、１０個のアミノ酸以外について、２個の発現シークエンスタグの推定アミノ酸配列に含まれることが、データバンクサーチ分析により明らかとなった。両方のヒト発現シークエンスタグは、同じヒト染色体上の上記ヒト遺伝子の上流に局在した。さらに１個のヒト発現シークエンスタグの３’−末端核酸配列の一部は、上記ヒト遺伝子の３’−末端に含まれることが分かった。
【００３４】
【実施例３】タキシリンｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、クローニングおよびシークエンシング
実施例２で得られた配列情報に基づいて、５’−および３’−レース法を用いて、ラットｐ７５のヒトのホモログの全オープンリーディングフレームをカバーするｃＤＮＡ断片の単離を行った。
５’−および３’−レースは以下のようにして行った。
Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ（クロンテック，　Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を用いて、５’−および３’−レースを行った。ネスティッドＰＣＲを、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ，　クロンテック）を鋳型とし、ＡＰ１、ＡＰ２（Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡに含まれて供給される）および内部オリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲプライマーとして用いて製造者の指示に従って行った。得られたＤＮＡ断片をサブクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した。ラットｐ７５のヒトのホモログのオープンリーディングフレームを網羅するＤＮＡ断片を５’−および３’−非翻訳領域に相当するオリゴヌクレオチドプライマーで同じヒト脳ｃＤＮＡライブライリーを鋳型として、製造者の指示に従って、ＰＣＲで増幅した。少なくとも３回の独立したＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片をサブクローニングし、そのＤＮＡ配列を決定した。
【００３５】
ｃＤＮＡの全配列は、１，６４１ｂｐのオープンリーディングフレームを示し、７８ｂｐの５’−非翻訳領域および２７４ｂｐの３’−非翻訳領域を両側に伴う。始めのＡＴＧに隣り合う配列は、Ｋｏｚａｋにより提案された翻訳開始部位を構成するものである。予想された始めのＡＴＧの上流の７８ｂｐにはインフレームストップコドンまたは他のＡＴＧは見つからない。５４６アミノ酸からなるコードされたタンパク質は、計算上の分子量６１，８９０を示した（配列番号２）。それは、１６個のアミノ酸を除くラットｐ７５の全ての部分アミノ酸配列を含む。（配列番号３〜９）アミノ酸配列のわずかな違いは種の違いによる違いであると考えられる。これらの結果は、少なくともこのｃＤＮＡはラットｐ７５のヒトホモログの全体をコードすることを示す。このラットｐ７５およびそのホモログをタキシリンと名づけた。タキシリンの構造解析は、タキシリンが顕著な長さのコイルドコイル領域をそのＣ末端側の半分に有し、膜貫通部を有さないことを示した。
【００３６】
タキシリンタンパク質と関連するタンパク質の中で最も高いスコアを有するものは、酵母のタンパク質であるＵｓｏ１およびＳｙｓ３（２５，２６）である。タキシリンと顕著な長さのコイルドコイル領域を共有するこれらのタンパク質は、膜の末梢性に関連し、細胞内小胞輸送に寄与する（２６−２８）。
【００３７】
【実施例４】原タキシリンと組換えタキシリンのシンタキシン−３に対する結合の確認
実施例３で得られたｃＤＮＡがコードするタキシリンタンパク質の計算された分子量値はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定されたものよりも小さかった。そこで、このｃＤＮＡがタキシリンの全長のｃＤＮＡを含んでいるかどうかを確認した。
ウェスタンブロッティングに用いる坑タキシリン抗体は以下のように作製した。
ＧＳＴ−タキシリンΔＣ−１（アミノ酸１−１４０）に対するウサギ坑血清は文献（２１）に従って作製した。坑タキシリン抗体は、同じ断片を用いて坑血清から親和精製した（２１）。
【００３８】
前記ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質を、インビトロにおいてＴＮＴ　Ｔ７−ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　ｌｙｓａｔｅ　ｓｙｓｔｅｍを用いて発現させた。形質転換されていないＨｅｌａ細胞のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００可溶化画分および前記ｃＤＮＡ　断片を含むｐｃＤＮＡプラスミドのインビトロ転写産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、坑タキシリン抗体を用いたウェスタンブロッティングを行ったところ、組換えタンパク質はＨｅｌａ細胞中の原タキシリンと同様の移動度を示した。少なくともこのｃＤＮＡはタキシリン全長をコードすることがこの結果により示された。
【００３９】
したがって、前記ｃＤＮＡ　断片を含むｐｃＤＮＡプラスミドをＨｅｌａ細胞に形質導入し、組換えタキシリンを作製した。
Ｈｅｌａ細胞への形質導入、Ｈｅｌａ細胞のトリトンＸ−１００可溶化画分の調製は以下のようにして行った。
Ｈｅｌａ細胞は３７℃で１０　％牛胎児血清（インビトロジェンＣｏｒｐ．，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）、ストレプトマイシン１００　μｇ／ｍｌおよびペニシリン１００　ユニット／ｍｌを含むダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。発現プラスミドのＨｅｌａ細胞への一過性形質導入はＬｉｐｏｆｅｃｔＴＭ　２０００試薬（インビトロジェン　Ｃｏｒｐ．）を用いて製造者の指示に従って行った。形質導入した細胞を形質導入の２４時間後に回収した。回収した細胞を氷上で６０分間バッファーＥ（２０　ｍＭ　トリス−塩酸　ｐＨ　７．５，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１　ｍＭ　ＤＴＴ，　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，　１　％　トリトンＸ−１００，　１０　μＭ　ｐ−アミジノフェニルメチルスルフォニルフルオライド，　１０　μＭ　ロイペプチン）で可溶化した。可溶化物を１００，０００×ｇで１時間、４℃で遠心し、上清をトリトンＸ−１００可溶化画分として用いた。形質導入していないＨｅｌａ細胞のトリトンＸ−１００可溶化画分は上記と同様の方法で調製した。
【００４０】
ＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣを用いたプルダウンアッセイを用いて原タキシリンと組換えタキシリンが実際にシンタキシン−３に結合するかどうか試験した。
プルダウンアッセイは以下のようにして行った。
ＧＳＴまたはＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣ（０．３　ｎｍｏｌ）を２０　μｌのグルタチオンセファロース４Ｂビーズに固定化した。ビーズをバッファーＥで平衡化し、Ｈｅｌａ細胞のトリトンＸ−１００可溶化画分と共に１２時間、４℃でインキュベートした。ビーズをプロテアーゼ阻害剤を含まないバッファーＥで徹底して洗浄した後、ビーズに結合したタンパク質を３０　μｌのレムリーサンプルバッファーで溶出した。
【００４１】
まず、Ｈｅｌａ細胞中の原タキシリンがシンタキシン−３に結合するかどうかを試験した。形質導入されていないＨｅｌａ細胞のトリトンＸ−１００可溶化画分を、グルタチオンセファロース４Ｂビーズに固定化したＧＳＴまたはＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣと共にインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、続いて坑Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングを行ったところ、ＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣとのインキュベート物にはバンドが検出され、ＧＳＴとのインキュベート物にはバンドが検出されなかった。すなわち、原タキシリンはＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣと結合し、ＧＳＴには結合しなかった。
【００４２】
次に、組換えタキシリンがシンタキシン−３に結合するかどうかを試験した。Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンを発現するＨｅｌａ細胞のトリトンＸ−１００可溶化画分を、同様に試験したところ、Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンと共に、より小さなバンドが検出された。小さなバンドは、Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンの分解産物の可能性がある。そこで、Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンおよびその分解産物を含むトリトンＸ−１００可溶化画分を同様に試験したところ、Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンおよびその分解産物は両方ともＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣと結合し、ＧＳＴには結合しなかった。これらの結果は、原タキシリンおよび組換えタキシリンの両方ともシンタキシン−３と結合することを示す。
【００４３】
【実施例５】タキシリンのシンタキシン−３に対する結合領域の決定
コイルドコイル領域がタンパク質−タンパク質相互作用に関与することから、タキシリンのコイルドコイル領域がタキシリンのシンタキシン−３との相互作用に関与している可能性がある。そこで、実施例１と同様にしてブロットオーバーレイアッセイを用いて、タキシリンのコイルドコイル領域が、タキシリンのシンタキシン−３との相互作用に関与しているかどうかを試験した。
【００４４】
コイルドコイル領域を欠損するＭｙｃ−タグタキシリンΔＣ、およびコイルドコイル領域を含むＭｙｃ−タグタキシリンΔＮをそれぞれ発現する２個のプラスミドを構築した。これらの発現プラスミドをＨｅｌａ細胞にそれぞれ一過的に形質導入したところ、両Ｍｙｃ−タグタンパク質が細胞中に発現した。さらに、Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンの発現プラスミドも同様に形質導入した。Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンまたは変異体を発現するＨｅｌａ細胞のトリトンＸ−１００可溶化画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、続いて、ＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣを用いたブロットオーバーレイを行った。全長タキシリンとタキシリンΔＮ　を発現する細胞の可溶化画分にバンドが検出され、タキシリンΔＣを発現する細胞の可溶化画分にバンドが検出されなかった。
すなわち、ＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣは、Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンおよびＭｙｃ−タグタキシリンΔＮに結合したが、Ｍｙｃ−タグタキシリンΔＣに結合しなかった。同様の結果がプルダウンアッセイを用いた場合にも得られた。これらの結果は、シンタキシン−３がタキシリンのコイルドコイル領域に結合することを示す。
【００４５】
【実施例６】シンタキシン−３のタキシリンに対する結合領域の決定
次に、シンタキシン−３のタキシリンに対する結合領域を決定した。グルタチオンセファロース４Ｂビーズに固定化した様々なシンタキシン−３のＧＳＴ−融合末端切断の形態［シンタキシン−３ΔＣ（アミノ酸１−２６３）、シンタキシン−３ΔＣ−１（アミノ酸１−２３９）、シンタキシン−３ΔＣ−２（アミノ酸１−１２０）、シンタキシン−３ΔＣ−４（アミノ酸１９１−２６３）、シンタキシン−３ΔＣ−５（アミノ酸２２１−２６３）、シンタキシン−３ΔＣ−６（アミノ酸１９１−２３９）、シンタキシン−３ΔＣ−７（アミノ酸１９１−２２０）］を、Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンを発現しているＨｅｌａ細胞のトリトンＸ−１００可溶化画分と共にインキュベートした。徹底した洗浄後、ビーズに結合したタンパク質を溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、坑Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。アミノ酸１９１−２３９を含む末端切断形態のバンドが確認された。すなわち、これらがＭｙｃ−タグ全長タキシリンに結合した。この結果は、タキシリンがシンタキシン−３のＣ−末端コイルドコイル領域に結合することを示す。
【００４６】
【実施例７】細胞膜に局在するシンタキシンファミリーメンバーとタキシリンの相互作用の検討
（１）シンタキシンファミリーのメンバーとタキシリンの相互作用の検討
シンタキシンファミリーのメンバーは、少なくとも１８個のメンバーで構成される（４）。シンタキシン−３は、シンタキシン−１ｓ（１ａおよび１ｂ）、−２および−４などの細胞膜に局在するシンタキシンファミリーのメンバーの一つである。他方、シンタキシン−７を含む他のシンタキシンファミリーメンバーは、それぞれ特定の細胞内膜構造上に局在する。そこで、実施例４と同様の方法でプルダウンアッセイを行い、シンタキシン−３以外の他のシンタキシンファミリーのメンバーがタキシリンに結合するかどうかを試験した。
【００４７】
グルタチオンセファロース４Ｂビーズに固定化した様々なシンタキシンファミリーのメンバーのＧＳＴ−融合タンパク質（５０　ｐｍｏｌ）［シンタキシン−１ａΔＣ、シンタキシン−２ΔＣ、シンタキシン−３ΔＣ、シンタキシン−４ΔＣ、シンタキシン−７ΔＣ　］を、Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンを発現しているＨｅｌａ細胞のトリトンＸ−１００可溶化画分を共にインキュベートした。徹底した洗浄後、ビーズに結合したタンパク質を溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、坑Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。シンタキシン−１ａΔＣ、シンタキシン−２ΔＣ、シンタキシン−３ΔＣ、シンタキシン−４ΔＣを発現する細胞の可溶化画分にバンドが検出されたが、シンタキシン−７ΔＣを発現する細胞の可溶化画分にバンドが検出されなかった。すなわち、ＧＳＴ−シンタキシン−３ΔＣ　と同様、ＧＳＴ−シンタキシン−１ａΔＣ、−２ΔＣおよび−４ΔＣはタキシリンに結合したが、ＧＳＴ−シンタキシン−７ΔＣは結合しなかった。この結果は、タキシリンが特異的に細胞膜に局在するシンタキシンファミリーのメンバーと相互作用することを示す。
【００４８】
（２）シンタキシン−３変異体とタキシリンの相互作用の検討
ラットｐ７５はシンタキシン−３の変異体の一つである、シンタキシン−３ΔＣ−Ｍ１と結合したが、他の変異体シンタキシン−３ΔＣ−Ｍ２と結合しない。そこで、これらのシンタキシン−３変異体にタキシリンが結合するかどうかを実施例４と同様の方法でプルダウンアッセイにより試験した。グルタチオンセファロース４Ｂビーズに固定化したシンタキシン３ΔＣ−Ｍ１および−Ｍ２のＧＳＴ−融合タンパク質を、Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンを発現しているＨｅｌａ細胞のトリトンＸ−１００可溶化画分を共にインキュベートした。徹底した洗浄後、ビーズに結合したタンパク質を溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、坑Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。シンタキシン３ΔＣ−Ｍ１を発現する細胞の可溶化画分にバンドが検出されたが、シンタキシン３ΔＣ−Ｍ２を発現する細胞の可溶化画分にバンドが検出されなかった。すなわち、Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンは、ＧＳＴ−シンタキシン３ΔＣ−Ｍ１と結合したが、ＧＳＴ−シンタキシン３ΔＣ　−Ｍ２と結合しなかった。
この結果は、タキシリンがラットｐ７５のヒトのホモログであることを強く支持する。
さらに、同様のプルダウンアッセイをＧＳＴ−シンタキシン３ΔＣ−Ｍ１および−Ｍ２の代わりに、シンタキシン４ΔＣ−Ｍ１および−Ｍ２を用いて行うと、シンタキシン４ΔＣ−Ｍ１を発現する細胞の可溶化画分にバンドが検出されたが、シンタキシン４ΔＣ−Ｍ２を発現する細胞の可溶化画分にバンドが検出されなかった。すなわち、Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンは、ＧＳＴ−シンタキシン４ΔＣ−Ｍ１と結合したが、ＧＳＴ−シンタキシン４ΔＣ　−Ｍ２と結合しなかった。結果は、シンタキシン−４も、シンタキシン−３と同様の方式で、相互作用をすることを示す。
【００４９】
【実施例８】タキシリンの組織分配の検討
タキシリンＣ−末端側の３／４をコードする３２Ｐ標識１．２ｋｂのＤＮＡ断片を、ＲＮＡブロットメンブレン（クロンテック）に製造者の指示に従ってハイブリダイゼーションさせた。
タキシリンのｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析は、１個の主要なバンドとより量の少ないバンドを示し、それぞれ約５．１、２．１および１．５ｋｂと計算された。５．１ｋｂのバンドは心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓およびすい臓を含む試験された全てのヒトの組織のＲＮＡ中に検出された。特に、５．１ｋｂのバンドのＲＮＡのレベルは、心臓、肺、肝臓、腎臓およびすい臓で高かった。２．１および１．５ｋｂのバンドは、心臓、肝臓およびすい臓のＲＮＡに検出された。しかしながら、これらのバンドがなぜ検出されたかについて確かな根拠はわからないが、３個のｍＲＮＡが、１個の遺伝子の初期転写物の選択的スプライシングに起因している可能性がある。この結果は、タキシリンが偏在して発現することを示唆する。さらに、実施例７の結果を考え合わせると、タキシリンは偏在して発現し、様々な組織においてエキソサイトーシスに関与することを示唆する。
【００５０】
【実施例９】Ｈｅｌａ細胞におけるシンタキシン−４とタキシリンの共局在の確認
間接免疫蛍光および共焦点顕微鏡観察にて、タキシリンが全長シンタキシン−４に結合するかどうかを試験した。
免疫蛍光顕微鏡観察は、以下のようにして行った。
Ｈｅｌａ細胞を３．７　％ホルムアミド／ＰＢＳ中で１０分間固定した。固定した細胞を０．１％トリトンＸ−１００／ＰＢＳで１０分間透過化した。１　％ＢＳＡ／ＰＢＳに１時間浸した後、細胞を１　％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の一次抗体（坑Ｍｙｃ−ポリクローナル抗体、坑ＨＡ−モノクローナル抗体）で１時間処理した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１　％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の二次抗体（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８結合抗ウサギＩｇ抗体、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４結合坑マウスＩｇ抗体）で１時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をＦＶ５００共焦点レーザースキャニング顕微鏡（オリンパス，　東京，　日本）を用いて試験した。
Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンまたはシンタキシン−３−結合領域のみを欠損しているＭｙｃ−タグタキシリンΔＣは、Ｈｅｌａ細胞において発現させた場合、発現させたＭｙｃ−タグタンパク質は両方ともサイトゾル内に拡散して染色された。これらの結果は、タキシリンの構造的な特徴とも一致し、タキシリンが膜貫通タンパク質ではないことを示唆する。ＨＡタグシンタキシン−４単独を同細胞で発現させた場合、発現させたＨＡタグシンタキシン−４は、細胞膜上に格子状のパターンで染色された。Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンおよびＨＡタグシンタキシン−４を細胞内に共発現させたところ、発現させたＭｙｃ−タグ全長タキシリンは、ＨＡタグシンタキシン−４と同じ格子状のパターンにおいて共局在した。しかしながら、発現させたＭｙｃ−タグタキシリンΔＣは、ＨＡタグシンタキシン−４と共局在しなかった。
【００５１】
Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンおよびＨＡタグシンタキシン−４のＨｅｌａ細胞内における共局在は、それらの提携によるものであることを確認するために、免疫沈降アッセイを行った。
免疫沈降アッセイは以下のようにして行った。
Ｍｙｃ−タグタンパク質［Ｍｙｃ−タグ全長タキシリン、Ｍｙｃ−タグタキシリンΔＣ］をトリトンＸ−１００可溶化画分から、プロテインＡ−セファロースビーズ（アマシャム　バイオサイエンス　Ｌｔｄ．）に結合させた坑Ｍｙｃ−モノクローナル抗体を用いて免疫沈降した。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、坑Ｍｙｃ−モノクローナル抗体および坑ＨＡ−モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。
ＨＡタグシンタキシン−４とＭｙｃ−タグ全長タキシリンまたはＭｙｃ−タグタキシリンΔＣ　を発現するＨｅｌａ細胞のトリトンＸ−１００可溶化画分を用意した。坑Ｍｙｃ抗体を用いた場合には、両Ｍｙｃ−タグタンパク質のバンドが検出された。しかし、坑ＨＡ抗体ではＭｙｃタグタキシリン全長タンパク質を発現する細胞の可溶化画分でバンドが検出されたが、ＭｙｃタグタキシリンΔＣを発現する細胞の可溶化画分でバンドが検出されなかった。すなわち、各トリトンＸ−１００可溶化画分由来のＭｙｃ−タグタンパク質は両方とも坑Ｍｙｃモノクローナル抗体により免疫沈降した。ＨＡタグシンタキシン−４はＭｙｃ−タグ全長タキシリンにより免疫沈降したが、Ｍｙｃ−タグタキシリンΔＣによって免疫沈降しなかった。これらの結果は無処置の細胞内で全長シンタキシン−４とタキシリンが相互に作用することを示唆する。
【００５２】
【実施例１０】ＰＣ１２細胞からのＣａ２＋依存性エキソサイトーシスのタキシリンのによる増進の確認
タキシリンは、ＰＣ１２細胞におけるＣａ２＋依存性エキソサイトーシスに関与するシンタキシン−１ａ（６，１３）と相互作用する。そこで、われわれは最終的に、ＧＨ共形質導入分泌アッセイにより、ＰＣ１２細胞からの制御されたヒトＧＨの分泌におけるタキシリンの過剰発現の影響を試験した。このシステムでは、ヒトＧＨおよび試験されるサンプルをＰＣ１２細胞に共形質導入し、共発現させたヒトＧＨを制御されたエキソサイトーシスのレポーターとして用いた。このシステムは、Ｃａ２＋依存性エキソサイトーシスに関与するタンパク質の機能研究に広く用いられている（２９）。
【００５３】
具体的には、ＧＨ放出アッセイは以下のようにして行った。
ＰＣ１２細胞を、ポリＬ−リジンでコートした３５　ｍｍ皿に７．５×１０５細胞の密度となるように蒔き、３７℃で１０　％牛胎児血清（インビトロジェンＣｏｒｐ．）、５　％馬血清（インビトロジェンＣｏｒｐ．）、ストレプトマイシン１００　μｇ／ｍｌおよびペニシリン１００　ユニット／ｍｌを含むダルベッコ改変イーグル培地中で１８−２４時間培養した。細胞をヒトＧＨをコードする２　μｇのｐＸＧＨ５および２　μｇの発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ−Ｍｙｃ／ＭＯＣＫ、ｐｃＤＮＡ−Ｍｙｃ／タキシリン、ｐｃＤＮＡ−Ｍｙｃ／タキシリンΔＣ）をＬｉｐｏｆｅｃｔＴＭ　２０００試薬を用いて製造者の指示に従って共形質導入した。ＧＨ放出実験は形質導入の２４時間後に行った。細胞を１４０　ｍＭ　ＮａＣｌおよび４．７　ｍＭ　ＫＣｌを含むＰＳＳ（２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ　ｐＨ　７．４，　２．５　ｍＭ　ＣａＣｌ２，　１．２　ｍＭ　ＭｇＳＯ４，　１．２　ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，　１１　ｍＭ　グルコース）で洗浄し、３７℃で２０分間高Ｋ＋溶液（６０　ｍＭ　ＫＣｌおよび８５　ｍＭ　ＮａＣｌを含むＰＳＳ）または低Ｋ＋溶液（４．７　ｍＭ　ＫＣｌおよび１４０　ｍＭ　ＮａＣｌを含むＰＳＳ）でインキュベートした。培地中へ放出されたＧＨの量および細胞内に保持されたＧＨの量を酵素イムノアッセイキット（ロシュ　ダイアグノスティック　ＧｍｂＨ，　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。
【００５４】
共発現されたＧＨは、細胞外Ｃａ２＋依存性の様式において有芯小胞に蓄積され、高Ｋ＋刺激に応答して放出される。Ｍｙｃ−タグ全長タキシリンを過剰発現すると、高Ｋ＋誘導放出が約４０％阻害された。しかしながら、シンタキシン−３結合領域を欠損するＭｙｃ−タグタキシリンΔＣを発現したところ、高Ｋ＋誘導放出は影響を受けなかった。他方、いずれのタンパク質も低Ｋ＋誘導放出に影響をおよぼさなかった。これらの結果は、タキシリンの過剰発現はＰＣ１２細胞におけるＣａ２＋依存性エキソサイトーシスに影響を及ぼすことを示唆する。
【００５５】
【実施例１１】タキシリンの発現部位の検討
抗タキシリン抗体を用いて消化管切片標本の免疫染色を行い、タキシリンの発現部位について検討した。その結果、タキシリンは大腸の腺管及び胃の腸上皮化腺管で発現が多く見られ、幽門腺及び胃底腺の一部にも認められた。陽性細胞の分布からタキシリンを発現している細胞は内分泌細胞（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　ｃｅｌｌ）と推定され、このことはクロモグラニン（ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ）染色で確認された。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
【表２】
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【００５８】
【発明の効果】
本発明により、細胞内小胞輸送に関与する細胞質膜局在シンタキシンファミリーのメンバーの新規結合パートナーであるタンパク質およびそれをコードするＤＮＡが提供される。
【配列表】
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