(57)【要約】　　　（修正有）【課題】アルテリウイルスの細胞系への適応、および弱毒化方法の提供。【解決手段】ミドリザル細胞系における、ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＧＰ２ａの特定位置のアミノ酸を含むアルテリウイルスの複製能力決定方法。ミドリザル細胞系において、アルテリウイルスのビルレンスは維持され、ウイルスの収率は高まるアルテリウイルスの産生方法。ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＧＰ５の特定位置のアミノ酸及びＯＲＦ１ａｂの特定位置のアミノ酸の決定を含むアルテリウイルスの弱毒化の決定方法。前記アミノ酸を変化することによってアルテリウイルスのビルレンスを弱毒化する方法等以上の方法を提供する。【選択図】　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
許容細胞におけるアルテリウイルスの複製能力を決定する方法であって、ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＧＰ２ａのアミノ酸７５〜１０７位に対応する位置のアミノ酸の決定を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ミドリザル細胞におけるアルテリウイルスの複製能力を決定することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＧＰ２ａのアミノ酸８８位および／またはアミノ酸９５位に対応する位置のアミノ酸の決定を含むことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
許容細胞におけるアルテリウイルスの複製能力を高める方法であって、前記アミノ酸７５〜１０７位における、請求項１記載のアミノ酸を変えることを含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
ミドリザル細胞におけるアルテリウイルスの複製能力を高める方法であって、前記アミノ酸７５〜１０７位における、請求項１または２記載のアミノ酸を変えることを含むことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記アミノ酸８８位における請求項３記載のアミノ酸を、バリンから他のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニンに変えること、および／または前記アミノ酸９５位における請求項３記載のアミノ酸を、フェニルアラニンから他のアミノ酸、好ましくはロイシンに変えることを含むことを特徴とする請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
前記アルテリウイルスのビルレンスが維持されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記細胞からのウイルスの収率を高めることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに従って産生されたウイルスおよび／または核酸。
【請求項１０】
アルテリウイルスの弱毒化を決定する方法であって、ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＧＰ５のアミノ酸１２１〜１４８位に対応する位置のアミノ酸の決定を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＧＰ５のアミノ酸１３６位に対応する位置のアミノ酸の決定を含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
アルテリウイルスの弱毒化を高める方法であって、ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＧＰ５の前記アミノ酸１２１〜１４８位における、請求項１０記載のアミノ酸を変えることを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
アミノ酸１３６位における請求項１１記載のアミノ酸を、システインから他のアミノ酸、好ましくはチロシンに変えることを含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＯＲＦ１ａｂのアミノ酸６５１〜６７５位および／またはアミノ酸２３３１〜２３５５位に対応する位置のアミノ酸の決定を含むことを特徴とする請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１５】
ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＯＲＦ１ａｂのアミノ酸６６３位および／または２３４３位に対応する位置のアミノ酸の決定を含む請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＯＲＦ１ａｂのアミノ酸６５１〜６７５位および／またはアミノ酸２３３１〜２３５５位に対応する位置のアミノ酸を変えることを含むことを特徴とする請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１７】
前記アミノ酸６６３位における請求項１５記載のアミノ酸を、グルタミン酸から他のアミノ酸、好ましくはリシンに変えること、および／または前記アミノ酸２３４３位における請求項１５記載のアミノ酸を、バリンから他のアミノ酸、好ましくはアラニンに変えることを含むことを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記アルテリウイルスのビルレンスが弱化することを特徴とする請求項１０〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
請求項１０〜１８のいずれかに従って産生されたウイルスおよび／または核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はウイルス学の分野に関し、特にワクチン産生の分野、より詳細にはウイルスの生体外増殖、さらには細胞系へのウイルスの適応、およびウイルスの弱毒化に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＶ）および類人猿出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）とともに、アルテリウイルス（ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）属に属する、エンベロープのある小さいプラス鎖ＲＮＡウイルスである。この属はＡｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ科の唯一の属である。この科はＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科とともに、Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目に分類される。
【０００３】
ＰＲＲＳＶは欧州および米国で１９９１年に単離された（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，
１９９２，　Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９１）。
【０００４】
生体内において、ＰＲＲＳＶは、ブタ肺胞マクロファージおよび血中単球において第一に増殖することが可能である（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９１）。心臓、扁桃腺、脾臓、鼻甲介および脈絡叢のようなその他の組織からのマクロファージもまた、ＰＲＲＳＶに感染しやすい。
【０００５】
生体外において、ＰＲＲＳウイルスは、ブタ肺胞マクロファージおよび血中単球の初代培養物と、アフリカミドリザル腎臓細胞系ＭＡ−１０４ならびに誘導細胞系ＣＬ２６２１およびＭＡＲＣ−１４５の培養物とに継代され得る（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔ　ａｌ．，　１９９２，　Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９１）。ＢＨＫ−２１およびベロー細胞のような、いくつかの細胞系を用いることができ、これらの細胞系にウイルスは侵入できないが、そのゲノムが人工的にこれらの細胞に導入されると新しいウイルス粒子を複製かつ産生することが可能である（Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）。
【０００６】
ＰＲＲＳＶは、受容体依存性エンドサイトーシスによって、ブタ肺胞マクロファージおよびＭＡＲＣ−１４５細胞に侵入する。宿主細胞によるＰＲＲＳＶの取込みは多段階の過程であり、ここで１つまたは２つのウイルス成分が、ウイルスを含有するクラスリン被覆小胞が形成される前に少なくとも１つの宿主のタンパク質因子と相互作用しているようである（Ｋｒｅｕｔｚ，　１９９８）。ブタマクロファージへのＰＲＲＳＶの侵入過程は、ＭＡＲＣ−１４５細胞への結合およびインターナリゼーションとは異なる。２１０ｋＤａの膜タンパク質が、マクロファージにおけるＰＲＲＳＶのための推定受容体と同定された（Ｄｕａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）。ヘパリン様分子が、ＰＲＲＳＶのＭＡＲＣ−１４５細胞との結合に重要であることが示唆される（Ｊｕｓａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）。
【０００７】
ＰＲＲＳＶは、簡潔なゲノム構造を有する（Ｓｎｉｊｄｅｒ，　ａｎｄ　Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ，　１９９８）。ポリ（Ａ）尾部なしで長さ１５，０９８ｎｔのＰＲＲＳＶのゲノムは、９つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、それぞれ２２１、および１１４ヌクレオチドの５’および３’の非翻訳領域（ＮＴＲ）が両側に並ぶ。２つの５’末端ＯＲＦｓ（１ａ，１ｂ）は、ゲノムＲＮＡの約７５パーセントを占める。このＲＮＡの構造領域は、７つのＯＲＦｓ（２ａ，２ｂ，３〜７）を含み、このゲノムの第３番目の３’末端側を占める。ＯＲＦ１ａ／ｂは、ＲＮＡゲノムの複製とサブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の３’ネスティッドセット（３’
ｎｅｓｔｅｄ　ｓｅｔ）の形成とに関係する非構造タンパク質（ｎｓｐ）をコードする。ｎｓｐ１αおよびｎｓｐ１βと命名された、最初の２つのＮ末端タンパク質のみが、ＰＲＲＳＶに関して観察される。その他のｎｓｐの機能は、ＥＡＶによる配列相同性に由来する予測に基づく。ｎｓｐ１αおよびｎｓｐ１βは、パパイン様システインプロテアーゼであり、全体のポリタンパク質ＯＲＦ１（ａ／ａｂ）が、ｎｓｐ２およびｎｓｐ４と、システインプロテアーゼと、セリンプロテアーゼとそれぞれ一緒になって、１２のｎｓｐに分割されることが推測される。ｎｓｐ９および１０は、レプリカーゼのサブユニットであることが予測される。
【０００８】
ゲノムの３’末端は構造タンパク質をコードする。ＯＲＦ２ａ〜６は６つの構造膜関連タンパク質をコードし、大部分の３’末端ＯＲＦはＮタンパク質（ＯＲＦ７）をコードする。少数の糖タンパク質は、ＧＰ２ａ（正式にはＧＰ２と称される。）、ＧＰ３、およびＧＰ４である。ＧＰ２ａおよびＧＰ４タンパク質は、クラスＩ膜タンパク質であり、それぞれ２７〜３０および３１〜３５の分子質量を有する。これら両方のＮ−グリコシル化タンパク質はビリオンの成分である。その他少数の４２〜５０ｋＤａのＮ−グリコシル化構造タンパク質は、ＯＰＦ３によってコードされるＧＰ３であり、その性質は今日まで不明なままである。３つの多数の構造タンパク質は、ＧＰ５、Ｍタンパク質、およびＮタンパク質である。２４〜２６ｋＤａのＮ−グリコシル化タンパク質ＧＰ５は、配列中でもっとも変わりやすいタンパク質である。大部分の保存タンパク質は、非グリコシル化Ｍタンパク質である。この１８〜１９ｋＤａの内在性膜タンパク質は、ＧＰ５とビリオンに存在するヘテロ二量体を形成する、ウイルス感染機能を有するようである。Ｎタンパク質は、１４〜１５ｋＤａの小さいごく基本的なヌクレオキャプシドタンパク質であり、これは集合の間にウイルスＲＮＡと相互作用する（
Ｓｎｉｊｄｅｒ　＆　Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ，　１９９８）。
【０００９】
ＰＲＲＳＶ株の抗原性質に関する、配列比較および研究により、２つの異なるグループが明らかとなり、これらはＥＵ（ヨーロッパ）株およびＵＳ（北米）株と指定された（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９２，　Ｓｎｉｊｄｅｒ　＆　Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ，　１９９８）。両大陸からの株間での観察された相違について、ＥＵ領域単離物が肺胞マクロファージにおいて相対的に容易に複製するのに対し、ＵＳ単離物はアフリカミドリザル腎臓細胞系ＭＡ−１０４、またはその誘導体、たとえばＣＬ２６２１もしくはＭＡＲＣ−１４５細胞などにおいて相対的に容易に再生されるという事実も、さらに指摘されている（Ｂａｕｔｉｓｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３）。この理由は今日まで不明のままである。
【００１０】
許容細胞の宿主細胞表面に吸収する候補的タンパク質は、ＧＰ２ａ、ＧＰ２ｂ、ＧＰ３、ＧＰ４、ＧＰ５、Ｍタンパク質、またはＧＰ５とＭタンパク質とのヘテロ二量体のいずれかである。
【００１１】
通常、ウイルスが異種由来の細胞系において生体外で複製されると、これらのウイルスはこの細胞系への適応過程で弱毒化する傾向にある。この特性は、ワクチン開発に広く使用され、サル細胞系におけるＰＲＲＳウイルスに関しては、確かにあたっている（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９２）。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
好適な実施形態において、適応過程中に生じる、ＰＲＲＳウイルスゲノムにおけるいくつかの変化は、細胞への適応に関係する。この特徴は、ＰＲＲＳウイルスがビルレンスのさらなる損失なしに許容細胞内で複製するよう適応され得るので、非常に有用である。
【００１３】
別の実施形態において、ゲノムのその他の部位での変化は、弱毒化にさらに関係する。この特徴は当業者にＰＲＲＳウイルスの弱毒レベルを制御することを可能にするので、非常に有用である。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
ここで、許容細胞、好ましくはミドリザル細胞におけるアルテリウイルスの複製能力を決定する方法を開示し、この方法は、ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＧＰ２ａのアミノ酸７５〜１０７位に対応する位置のアミノ酸の決定、好ましくはＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＧＰ２ａのアミノ酸８８位および／またはアミノ酸９５位に対応する位置のアミノ酸の決定を含む。前記の知識および方法は、あらゆる当業者に、許容細胞、好ましくはミドリザル細胞におけるＰＲＲＳウイルスの複製能力を同定させることができる。
【００１５】
さらに、許容細胞、好ましくはミドリザル細胞におけるアルテリウイルスの複製能力を高める方法を開示し、この方法は、前記アミノ酸７５〜１０７位のアミノ酸を変えること、好ましくは、前記アミノ酸８８位におけるアミノ酸を、バリンから他のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニンに変えること、および／または前記アミノ酸９５位におけるアミノ酸を、フェニルアラニンから他のアミノ酸、好ましくはロイシンに変えることを含む。本願は、前記２つのＧＰ２ａの部位において相伴うアミノ酸の変化が、許容細胞、好ましくはミドリザル細胞に関するＰＲＲＳウイルスの適応を高めることをさらに開示する。前記方法は、許容細胞および／または許容細胞系におけるアルテリウイルスおよび／または核酸の産生に適しており、この方法で前記アルテリウイルスのビルレンスは維持され、かつ前記許容細胞および／または許容細胞系からのウイルスおよび／または核酸の収率は高まる。
【００１６】
別の実施形態において、本願は、アルテリウイルスの弱毒化を決定する方法を教示し、この方法は、ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＧＰ５のアミノ酸１２１〜１４８位、好ましくはＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＧＰ５のアミノ酸１３６位に対応する位置のアミノ酸の決定を含む。本願はまた、アルテリウイルスの弱毒化を制御かつ／または増進させる方法を教示し、この方法は、前記ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＧＰ５のアミノ酸１２１〜１４８位の前記アミノ酸を変えること、好ましくはアミノ酸１３６位におけるアミノ酸を、システインから他のアミノ酸、好ましくはチロシンに変えることを含む。
【００１７】
別の実施形態において、本願はアルテリウイルスの弱毒化を決定する方法を教示し、この方法は、ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＯＲＦ１ａｂのアミノ酸６５１〜６７５位および／またはアミノ酸２３３１〜２３５５位に対応する位置のアミノ酸の決定、好ましくはＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＯＲＦ１ａｂのアミノ酸６６３位および／またはアミノ酸２３４３位に対応する位置のアミノ酸の決定を含む。
【００１８】
本願はまた、アルテリウイルスの弱毒化を制御かつ／または増進する方法を教示し、この方法は、ＰＲＲＳＶ単離物Ｉ−１１０２のＯＲＦ１ａｂのアミノ酸６５１〜６７５位および／またはアミノ酸２３３１〜２３５５位に対応する位置のアミノ酸を変えること、好ましくはアミノ酸６６３位におけるアミノ酸を、グルタミン酸から他のアミノ酸、好ましくはリシンに変えること、および／またはアミノ酸２３４３位におけるアミノ酸を、バリンから他のアミノ酸、好ましくはアラニンへのアミノ酸に変えることを含む。前記方法はまた、弱毒化されたアルテリウイルスの産生を可能にする。
【００１９】
【発明の実施の形態】
（材料および方法）
細胞およびウイルス。
ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭｓ）は、５％のＦＢＳと、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンと、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＭＣＡ−ＲＰＭＩ−１６４０培地中で保存された。ＣＬ２６２１細胞は、ハンクス（Ｈａｎｋｓ）塩（ギブコＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ））と、１０％のＦＢＳと、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンと、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンと、１．５％の重炭酸ナトリウムと、１％のＬ−グルタミンとを補った、イーグル（Ｅａｇｌｅ）の最少必須培地で増殖された。組換えＰＲＲＳウイルスｖＡＢＶ６８８およびｖＡＢＶ４３７の連続継代は前述のように実行された（Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）。ＰＲＲＳＶの感染性ヨーロッパ野生型単離物である、対抗ウィルスＬＶ−Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅは、オランダでＰＲＲＳの臨床事例から１９９１年の家畜流行病の間に単離され、かつＰＡＭｓで増殖された（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９１）。ＰＲＲＳＶの感染性アメリカ野生型単離物（ＣＬ２６２１細胞における継代３）である、ＳＤＳＵ＃７３は、Ｄｒ．Ｅ．Ｖａｕｇｈｎによって好意的に提供され（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ａｍｅｓ，　Ｉｏｗａ）、ＭＡ−１０４細胞で増殖された。ウイルス力価（１ｍＬあたりの５０％組織培養物感染量［ＴＣＩＤ５０］で表される。）は、終点希釈によってＰＡＭｓにおいて決定され（Ｗｅｂｓｖｏｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８６）、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈによって算定された（Ｒｅｅｄ　ｅｔ　ａｌ．，　１９３８）。
【００２０】
ＰＲＲＳＶ組換え体によるブタの接種およびこれらの組換え体における生体内安定性実験。
ＰＲＲＳＶに対する抗体なしで実験された、３頭の８週齢のオランダランドレース／ヨークシャ（ＬＹ）ＳＰＦブタの３つのグループに、１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価をそれぞれ含む、継代５の組換えウイルス株２ｍＬを同じ日に鼻腔内に接種した。これらのグループを隔離された囲いに収容した。実験手順および動物管理手順はオランダ動物実験法に従って行われた。血清サンプルを、０日目、２日目、４日目、７日目、９日目、１１日目、１４日目、１６日目、１８日目、および２１日目に採集した。２１日目に、これらのブタを殺した。
【００２１】
ｖＡＢＶ６８８によるブタの免疫ならびにＬＶ−Ｔｅｒ　ＨｕｕｒｎｅおよびＳＤＳＵ＃７３による対抗投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）。
各組換えウイルスに関して、ＰＲＲＳＶに対する抗体を欠いた、５頭の８週齢のオランダＬＹＳＰＦブタの２つのグループに、１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬのウイルス株２ｍＬを筋肉内（右耳介と右肩甲骨の頭側隆起との中間）に接種した。すべてのグループは、隔離された囲いに収容された。実験手順および動物管理手順は、オランダ動物実験法に従って行われた。これらの接種されたブタから組換えウイルスの感染を決定するために、１頭の未接種の歩哨ブタを、ワクチン接種の２４時間後に、接種されたブタの各グループに導入し、それから２８日後に殺した。ワクチン接種の２８日後に、２頭が各突然変異体の一方のグループから分離され、２ｍＬの１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＬＶ−Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅを鼻腔内に対抗投与した。同様に、２頭が他方のグループから分離され、２ｍＬの１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＳＤＳＵ＃７３を鼻腔内に対抗投与した。これらの対抗投与された動物を、２４時間後にワクチン接種を受けた残りの３頭に加えた。対抗投与から２８日後に、すべてのブタは殺された。実験設定の略図は図１に示される。対抗投与の有効性を確認するために、２頭の非接種動物が、１０５ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＬＶ−Ｔｅｒ　ＨｕｕｒｎｅまたはＳＤＳＵ＃７３のいずれか２ｍＬを鼻腔内に接種された。これらの対抗投与された動物を、２４時間後に３頭の歩哨動物に加え、対抗投与時から２週間観察された。血清サンプルを、０日目から１週間に３回すべての動物に関して採集した。この実験の間、これらの動物は病気、すなわち発熱（３９．７℃を超える直腸体温）、下痢および呼吸障害の徴候に関して毎日観察された。
【００２２】
組換えウイルスの遺伝的安定性分析。
ブタの組換えウイルスの遺伝的安定性は、ウイルス陽性最終日にこれらのブタから採取された血清によるＰＡＭｓの接種によって、続いてウイルスＲＮＡの配列分析によって検査された。つまり、細胞変性効果（ｃｐｅ）が検出されるとすぐに、培養物上清は収集され、ウイルスＲＮＡは前述したように単離された［１６］。ＲＮＡはプライマーＬＶ７６（５’−ＴＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＣＧＡＴＣＧ（Ｔ）４０−３’，アンチセンス，ヌクレオチド（ｎｔ）１５０８８）によって逆転写された。導入された突然変異体を側面に並べる領域は、ｖＡＢＶ６８８に関してプライマーＬＶ９（５’−ＣＴＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＧＣＣ−３’，センス，ｎｔ１１７４６）およびプライマーＬＶ２２（５’−ＣＡＴＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣＡＡＧＴＴＧ−３’，アンチセンス，ｎｔ１２７１５）を使用してＰＣＲによって増幅された。ｎｔ数は、ＧｅｎＢａｎｋ（寄託番号Ｍ９６２６２）に寄託されたように、ＬＶ単離物の配列に基づく。これらの増幅されたフラグメントは、２％のアガロースゲル中で分析され、ＰＣＲフラグメントがこのゲルから摘出され、かつＳｐｉｎＸカラム（コスター社（Ｃｏｓｔａｒ））で純化された。これらのフラグメントの配列分析は、プライマーＬＶ２４（５’−ＡＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡ−３’，アンチセンス，ｎｔ１２４１９）が使用されたｖＡＢＶ６８８を除いて、ＰＣＲのアンチセンスプライマーを使用して行われた。ＰＲＩＳＭ　Ｒｅａｄｙ　Ｄｙｅ　Ｄｅｏｘｙ　ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクルシークエンシングキットおよびＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ））が、前記配列を決定するために使用された。
【００２３】
ウイルス単離。
１０５ＰＡＭｓ／９６ｍｍ２を、９６ウェルプレートに播種し、１日後に、各血清サンプルの１０倍および１００倍の連続希釈液５０μＬを、ＰＡＭｓに感染させるために使用した。４８時間後に、培養物上清２５μＬを、インキュベーションの１６〜２４時間前に播種された、新しいＰＡＭｓに転移した。２４時間後に、この培地を廃棄し、細胞を０．０５ＭのＮａＣｌで洗浄し、乾燥し、かつＩＰＭＡのために冷凍した（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，　１９８６）。
【００２４】
ウイルス滴定。
ウイルス力価を、ＰＡＭｓの終点希釈によって決定した（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ，　１９８６）。検出レベル（１、８）以下のウイルス力価を含むサンプルは、陰性とみなされた。時間に対する力価曲線の下の領域から、ワクチン接種後の総合ウイルス力価を決定した。統計分析は、一方的にペアにされた研究者のｔ検定によって行われた。結果はＰ値が≦０．０５であるときに統計的に有意とみなされた。
【００２５】
イムノペルオキシダーゼ単層検定法（ＩＰＭＡ）。
ＰＡＭｓの免疫染色を、記載された方法に従って行った（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ，　１９８６）。ＥＵ−ＰＲＲＳＶおよびＵＳ−ＰＲＲＳＶ両方のＮタンパク質の発現が、単クローン性抗体（ＭＡｂ）１２２により検出された。
【００２６】
抗体の検出。
ブタ血清中のＰＲＲＳＶに対する抗体の存在を、ＥＬＩＳＡ（アイデックス社（ＩＤＥＸＸ，　Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，　Ｍｎ，　ＵＳ））によって決定した。
【００２７】
【実施例】
（実施例１）
適応部位の同定。
適応に重要なゲノム領域を同定するために、野外単離レリスタッド（Ｌｅｌｙｓｔａｄ）ウイルスを、ＣＬ２６２１細胞で６回継代し、続いて同一細胞において３回プラーク純化した。このウイルスはＬＶ４．２．１と指定された。細胞系に適応された株ＬＶ４．２．１のゲノムの全配列を決定した。ＲＮＡ単離、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲが実行され、長さ約１．５ｋｂのオーバーラップｃＤＮＡフラグメントが生じた。すべてのフラグメントは、ＴＡクローニング法によってプロメガ社（ＰＲＯＭＥＧＡ）のｐＧＥＭ−Ｔベクターへクローニングされた。全配列に達すると、すべてのヌクレオチドを少なくとも２回決定した。ＰＣＲ−ミスマッチによって導入された突然変異を排除するために、第３または第４のｃＤＮＡ構築物を形成した。野外株レリスタッドウイルスと比較すると、コードされた領域と５’および３’非翻訳領域でない領域とにおいて、翻訳後に８アミノ酸の相違をもたらす、２７ヌクレオチドの相違を特定した（表１）。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
ＬＶ４．２．１と野外ウイルス株レリスタッドウイルスとの、観測された増殖特性の相違が、非構造もしくは構造タンパク質における、または２以上のアミノ酸変化の組合せにおける、アミノ酸配列の相違を原因とするという結論を下した。
【００３０】
非構造遺伝子突然変異または構造遺伝子突然変異のいずれかによる完全長ｃＤＮＡの構築。
【００３１】
１組の完全長構築物（ｐＡＢＶ６４７、６８８、６８９および６９０）を、突然変異が導入されたｐＡＢＶ４３７に基づいて構築した。生体外で転写された完全長ＲＮＡが、陽イオン試薬にリポフェクチンを使用して非許容ＢＨＫ−２１細胞へトランスフェクションされた。２４時間後に、上清（ｐ０）を、ＭＡＲＣ−１４５細胞に転移し、２４〜４８時間後に、免疫染色を、導入された突然変異の効果を検出するために、Ｎタンパク質を対象としたＭＡｂ１２２．１７を使用して行った。適応の原因となる物質を含有する組換えウイルスは、陽性対照のＬＶ４．２．１と類似して、ＭＡＲＣ−１４５細胞において表現型適応した細胞系を示した。対照に関して、ＰＡＭｓは、ＰＲＲＳＶの一次標的細胞で感染を示すように同量のｐ０で感染した。ｐＡＢＶ４３７の上清ｐ０とＬＶ４．２．１ウイルスとは、感染実験において陽性対照としての機能を果たした。
【００３２】
非構造領域、または構造領域のいずれかにおける突然変異が導入された、２つの完全長ｃＤＮＡクローンが構築され、それぞれｐＡＢＶ６４７およびｐＡＢＶ６９０であった（図１Ｂ）。これら２つの構築物の生体外分析は、ｐＡＢＶ６９０のＲＮＡ転写物がＬＶ４．２．１のような表現型を生じさせることを明らかにした。適応の原因となる突然変異はゲノムの構造部分に位置するという結論を下した。次のステップは、ＧＰ２ａまたはＧＰ５における突然変異が、観測された細胞系適応に何らかの影響を与えるか否かを決定することであった。ｐＡＢＶ６８８は、ＧＰ２ａにおいて２つのアミノ酸の相違を含み、ｐＡＢＶ６８９は、ＧＰ５においてただ１つのアミノ酸変化を含む（図１Ｂ）。スクリーニング検定を行った後、ＧＰ２ａにおいて２つの突然変異を有するｐＡＢＶ６８８は、ＬＶ４．２．１のような細胞系適応の表現型を生じさせた一方で、ＧＰ５組換えのｐＡＢＶ６８９は生じさせなかった。細胞系への適応が、大多数においてＧＰ２ａの２つの突然変異によって引起されるという結論を下した。
【００３３】
ＧＰ２ａの突然変異による完全長ゲノム構築物。
ＧＰ２ａにおける２つのアミノ酸相違を観察した。２つの新しい構築物、アミノ酸８８位にフェニルアラニンを含むｐＡＢＶ７７２と、ＧＰ２ａにおいて９５位にロイシンを含むｐＡＢＶ７７３とを産生した（図１Ｂ）。生体外で、両物質は、陽性対照ｐＡＢＶ４３７よりも、ＭＡＲＣ−１４５細胞での増殖に良く適応する一方で、ｖＡＢＶ６８８よりも細胞変性効果（ｃｐｅ）を生じさせない。多段階および一段階の増殖曲線が感染過程で導入されたアミノ酸残基の効果を観察するために行われた。ｐＡＢＶ４３７／６８８／７７２／７７３から誘導された組換えウイルスのｐ０培地を、ウイルス量を増加させるために、ＬＶ４．２．１と平行して、収集し、ＰＡＭｓに転移し、３回継代した（ｐ３）。さらなる増殖特性のために、配列分析により、導入された突然変異の存在を確認し、かつＴＣＩＤ５０／ｍＬを決定した（示されていないデータ）。ＰＡＭｓおよびＭＡＲＣ−１４５の両方における多段階増殖曲線は、ｖＡＢＶ４３７／６８８／７７２／７７３およびＬＶ４．２．１について０．０５の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）によって表された。１０６個の細胞を２ｃｍ２あたりの増殖曲線で使用した。異なる時点で、ウイルスを、ＴＣＩＤ５０／ｍＬのウイルス力価が決定されるまでに収集かつ蓄積した。アミノ酸８８位および９５位でのＧＰ２ａにおけるフェニルアラニンおよびロイシンの導入はそれぞれ、ＭＡＲＣ−１４５細胞におけるＰＲＲＳＶヨーロッパ株の増殖特性に積極的な影響を与えた（図２）。ＰＡＭｓにおける多段階増殖曲線では、相違は観測されなかった（図３）。観測結果を確実にするために、２ｃｍ２あたり１０６個のＭＡＲＣ−１４５細胞の総量が、ｖＡＢＶ４３７／６８８／７７２／７７３の上清ｐ３およびＬＶ４．２．１について０．１のｍ．ｏ．ｉ．で感染した。１２時間後、免疫染色を、ヌクレオキャプシドタンパク質に対するＰＲＲＳＶに特異的なＭＡｂ（１２２．１７）によって行い、陽性の細胞の総量を２ｃｍ２毎に計数した（図４）。
【００３４】
結論として、ＰＲＲＳＶの少数の糖タンパク質ＧＰ２ａにおける８８位および９５位のアミノ酸残基は両者とも、ＭＡＲＣ−１４５細胞への適応に重要である。
【００３５】
許容細胞におけるアルテリウイルス増殖過程を定義すると、７つのステップに区別され得る。ＰＡＭｓまたはＭＡ−１０４（またはこれらの誘導体）の細胞表面へのウイルスの付着（Ａ）、およびウイルスの細胞膜の侵入（Ｂ）は、第１の２つの過程であり、ウイルスエントリー（ｖｉｒａｌ　ｅｎｔｒｙ）とも呼ばれる。アルテリウイルスは、複製、転写および翻訳（Ｄ）が生じ得る前に、細胞質内で脱外被（Ｃ）される必要がある。ＲＮＡ包膜および集合（Ｅ）、ならびに細胞外空間への成熟ウイルス粒子の放出（Ｆ）は、ウイルスの拡散（Ｇ）が行われ得る前の過程である。一段増殖曲線の１２時間の時点と、ＰＲＲＳＶのウイルス増殖サイクルが約１０時間かかることとからすると、陽性の染色された細胞の量の観測された相違は、（Ａ）〜（Ｄ）で順調に感染した細胞の数の増加によって生じている。この観測された相違は、ＲＮＡの包膜、新しく産生されたビリオンの放出、またはＭＡＲＣ−１４５細胞の単層を通過するウイルスの拡散（Ｅ〜Ｇ）での相違を原因としない。細胞質へのウイルスＲＮＡの放出、脱外被（Ｃ）、または転写および翻訳（Ｄ）における糖タンパク質ＧＰ２ａの役割は全くありそうにないので、前記両残基またはこれら両方が存在するドメインが、エントリー過程、すなわちウイルスの付着および／または侵入（ＡおよびＢ）に重要であるという結論を下した。
【００３６】
（実施例２）
細胞系適応された組換えＰＲＲＳＶ、ｖＡＢＶ６８８による動物実験。
組換えｖＡＢＶ６８８において、少数の、エンベロープのある糖タンパク質ＧＰ２ａのアミノ酸８８位および９５位が突然変異され、ＭＡＲＣ−１４５細胞での増殖を向上させた。この特性はウイルスの産生を促進させる。細胞培養物において、これらの組換えウイルスは、遺伝学的に安定となるように、かつウイルス力価を上げるように示され、これらは動物実験を行うのに十分である。ここでは、動物実験の安全性および予防効果に関する、これらのＰＲＲＳＶ組換え体の特性を観察した。これらの特性は、感染性ｃＤＮＡコピー、ｖＡＢＶ４３７から誘導されたウイルスと比較された。このウイルスは、野生型ウイルスと、ＰａｃＩ制限部位を除いて、同一であり、したがって野生型ウイルスと類似する特性を有すると推測される。第一に、ｖＡＢＶ６８８の生体内遺伝的安定性は８週齢のブタで決定された。その後、これらのウイルスの免疫原性、弱毒化、および有効性が、若いブタにおける、相同および異型の免疫対抗投与実験で検査された。
【００３７】
８週齢のブタにおけるＰＲＲＳＶ組換えｖＡＢＶ６８８の遺伝的安定性。
第１実験において、生体内におけるＰＲＲＳＶ組換え体の遺伝的安定性が決定された。したがって、ウイルス陽性の最終日に組換えウイルスの接種を受けたブタの血清から単離されたウイルスＲＮＡの配列分析を行った。ｖＡＢＶ６８８の接種を受けたブタについて、これは接種の１４日後（ｄｐｉ）からすべての接種を受けたブタに関して行われた。ＲＴ−ＰＣＲによって得られたフラグメントの配列分析は、導入された突然変異がまだ存在していること、および追加の変化がＧＰ２ａの前記ドメインに導入されないことを示し、組換えウイルスが生体内で遺伝的安定性を有することを示した。
【００３８】
ウイルス接種を受けたブタおよび歩哨ブタの血清変換。
第２実験において、ブタがＰＲＲＳＶ組換え体の接種を受けたか否か、続いて接種を受けたグループに導入された歩哨ブタが血清変換したかどうかについて決定された。したがって、ＰＲＲＳＶ抗体の存在をアイデックス社のＥＬＩＳＡで測定した。抗体は組換えウイルスの接種を受けたブタで検出され（すなわちＥＬＩＳＡのサンプル対陽性比（Ｓ／Ｐ）＞０．４）、これは動物へのウイルスの正確な被曝量を示した。ウイルス感染は、ビルレンスの特性の１つである。歩哨動物は、１４日目で血清変換し（ｖＡＢＶ６８８）、これは接種を受けた動物からこれらの歩哨動物へのウイルス感染、およびビルレンスの保存を示す。
【００３９】
接種後のウイルス血症の持続時間および高さ。
接種を受けた動物の血清中のウイルスの存在を決定するために、ウイルス単離を、採集されたすべての血清に関して行った。ウイルス陽性の血清から、ウイルス力価が決定された（図５）。すべてのウイルスは、２ｄｐｉ〜２５ｄｐｉの範囲で、ブタにウイルス血症を生じさせた。
【００４０】
歩哨ブタのウイルス感染後のウイルス血症。
接種を受けていないブタへの組換えウイルスの拡散を決定するために、１頭の歩哨動物が接種の２４時間後に、接種を受けた各グループに導入された。すべてのウイルス陽性の血清のウイルス滴定は、最大のウイルス力価が接種を受けたブタと歩哨ブタとで相違しないことを示した（示されていないデータ）。
【００４１】
相同および異型のＰＲＲＳＶによるウイルス接種を受けた動物の対抗投与と対抗ウイルスの感染。
組換えウイルスによる接種が野生型ＰＲＲＳＶに対してブタを防御するか否かを検査するために、接種を受けたブタにＥＵ−ＰＲＲＳＶおよびＵＳ−ＰＲＲＳＶによって対抗投与した。ｖＡＢＶ４３７の接種を受けたブタは、ＬＶ−ＴｅｒＨｕｕｒｎｅによる対抗投与後、ウイルス陰性を維持した。ｖＡＢＶ６８８の接種を受けたブタのうち１頭のみが１日間ウイルス陽性になった。ＳＤＳＵ＃７３による対抗投与後、接種を受けたすべての動物はウイルス血症になった。接種を受け、対抗投与されなかったすべての動物は、これらの動物がＬＶ−Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅを対抗投与されたグループメンバーと一緒にされた後でも、ウイルス陰性を維持した。ｖＡＢＶ６８８の接種を受けたブタでは、ウイルス血症がＳＤＳＵ＃７３を対抗投与されたブタと一緒にされた後に生じた。対抗投与対照に使用されたブタでは、ウイルス血症が、ＬＶ−Ｔｅｒ　ＨｕｕｒｎｅおよびＳＤＳＵ＃７３を対抗投与されたブタと、すべての歩哨動物とにおいて生じた（示されていないデータ）。
【００４２】
臨床観察。
ウイルスの接種後、病気の深刻な臨床的症状は観測されなかった。適度の直腸温度の上昇のみが、接種を受けたすべてのグループで認められた（示されていないデータ）。ｖＡＢＶ６８８の接種を受けた動物およびＳＤＳＵ＃７３を対抗投与されたすべての動物における、ＬＶ−Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅの対抗投与後、体温上昇は測定されなかった。
【００４３】
（実施例３）
ＧＰ５における突然変異、および／またはＯＲＦ１ａｂ、さらにＧＰ２ａにおける突然変異（ＬＶ４．２．１）によるＰＲＲＳ突然変異ウイルス株の弱毒化。動物モデルにおける３つのＰＲＲＳウイルス株のビルレンス比較。
ＰＲＲＳＶへのブタの被曝後、ＰＲＲＳの臨床的症状は株によって異なり得る。ＵＳ−ＰＲＲＳＶ株は呼吸・繁殖問題をしばしば引起す一方、ＥＵ−ＰＲＲＳＶ株は主に繁殖問題を引起す（Ｓｔｅｖｅｒｉｎｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）。呼吸の症状および肺が関与する程度は、株によって様々であり、実験条件下で常に再現されていない。感染モデルは、臨床的症状の頻度および重症度と、ウイルス数値（ウイルス血症、ウイルス排泄およびウイルス感染）と、血清変換とに基づいた、ウイルスのビルレンスを観察かつ定量化するための数値を含むだろう。さらに、ワクチン接種後のウイルス血症およびウイルス排泄の持続期間、高さおよび頻度は、ワクチンの安全性を観察するための重要な数値となり得る。ブタの間でのウイルス発散およびウイルス感染の減少が、ＰＲＲＳの制御を目指す重要な目標であるから、ワクチン接種を受けた動物のＰＲＲＳＶ対抗投与後の同数値は、ワクチンの有効性に重要である。したがって、６〜８週齢および６ヶ月齢のブタが、３つの異なるＰＲＲＳＶ株、すなわちＬＶ−Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅ、ＳＤＳＵ＃７３およびＬＶ４．２．１に感染した。
【００４４】
これらの動物は、デンマークでＰＲＲＳＶのない農場から得られ、かつＰＲＲＳＶワクチン未接種の雌ブタから生まれた、平凡なランドレース種のブタであった。これらのブタは、ＥＲＩＳＡ（アイデックス社）によって測定されるように、ＰＲＲＳＶに対する抗体がない。ウイルス血症は、ＬＶ４．２．１に感染した６ヶ月齢のグループを除いては、３ｄｐｉにすべてのブタで第一に検出され、この６ヶ月齢グループにおいて、７ｄｐｉに第一に検出され、このグループ中１頭は全く検出されなかった。６〜８週齢のブタにおいて、ウイルス血症は、８８％の陽性動物の最大頻度で、かつ３または４ｄｐｉ、７ｄｐｉ、１０または１１ｄｐｉ、および１４ｄｐｉに２．１〜２．６のウイルス力価範囲で、４２ｄｐｉまでに検出された。６ヶ月齢のブタにおいて、ウイルス血症は、時点あたり６５％の陽性動物の最大頻度で、かつ０．７〜１のウイルス力価範囲で２８ｄｐｉまでに検出された。２４ｄｐｉ後、ＬＶ−Ｔｅｒ　ＨｕｕｒｎｅおよびＳＤＳＵ＃７３の両方をブタの血清において断続的に検出した。ＬＶ４．２．１に感染したブタは、ウイルス血症の相対的に短い持続期間を示し、２１ｄｐｉにおいて最後に検出された。７〜１０ｄｐｉにおける陽性ブタの頻度は極めて低く、４１％の最大頻度（Ｐ≦０．０５）と、ＬＶ−Ｔｅｒ　ＨｕｕｒｎｅおよびＳＤＳＵ＃７３と比較して低い１０ｌｏｇウイルス力価とを有した。ウイルス血症の反応速度は、ＬＶ−Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅに感染したブタとＳＤＳＵ＃７３に感染したブタとで１４ｄｐｉにおいて著しく異なった。
【００４５】
６〜８週齢のブタは、６ヶ月齢のブタよりも（最高３７％）ウイルスを排泄する頭数が多かった（時点あたり陽性動物の最高５０％）。さらに、６〜８週齢のブタは、３または４日目、７日目、１０または１１日目、および１４日目において、扁桃の標本中で６ヶ月齢のブタよりも（０．０〜０．３の範囲）高い１０ｌｏｇウイルス力価を示した（０．２〜１．９）。ＬＶ４．２．１（最大１７％）およびＳＤＳＵ＃７３（最大５０％）と比較して、ＬＶ−Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅに感染したブタは、時点あたりのウイルスを排泄する頭数が多かった（最大１００％）。さらに、ＬＶ−Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅに感染したすべてのブタは、ウイルスを排泄したが、ＬＶ４．２．１またはＳＤＳＵ＃７３に感染したすべてのブタがウイルスを排泄するとは限らなかった。扁桃の標本における１０ｌｏｇウイルス力価は、ＬＶ−Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅに感染したブタが相対的に高く、０．０〜３．０の範囲である一方で、Ｌｖ４．２．１に感染したグループの１０ｌｏｇ力価は０．０、ＳＤＳＵ＃７３に感染したブタの１０ｌｏｇ力価は０．０〜０．５の範囲であった。１４ｄｐｉにおいて、ブタはまだウイルスを排泄していた。
【００４６】
ＬＶ−Ｔｅｒ　ＨｕｕｒｎｅおよびＳＤＳＵ＃７３は、両株のウイルス陽性ブタの高い発生率およびウイルス血症の長い持続時間と、ＳＤＳＵ＃７３のの最も深刻な臨床的症状の誘因と、ＬＶ−Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅに関する高度のウイルス排泄との結果、最もビルレンスが強いようである。ＬＶ４．２．１は、臨床的症状が相対的に軽く、低いウイルス血症およびウイルス排泄を示したので、ビルレンスは相対的に弱かった。ＬＶ４．２．１のビルレンスの弱化は、ＬＶ−Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅと比較して妊娠中の雌ブタに関する繁殖問題を引起す能力の減少によって確認された（Ｓｔｅｖｅｒｉｎｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）。ＬＶ−Ｔｅｒ　ＨｕｕｒｎｅおよびＬＶ４．２．１に感染した雌ブタは同数の子ブタをもたらすが、ビルレンスの強い株に感染した雌ブタの子ブタは、相対的に弱い。さらに、ビルレンスの強い株ＬＶ−Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅに感染したグループは、出産２８日後までに高頻度のウイルス陽性子ブタを示した（Ｓｔｅｖｅｒｉｎｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）。マクロファージにおける生体外ＬＶ４．２．１の増殖曲線はＬＶ−Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅの増殖曲線と類似するので、ＬＶ４．２．１の相対的に弱いビルレンスは、マクロファージ感染に関係しないようである。
【００４７】
【発明の効果】
本発明に従えば、適応過程中に生じる、ＰＲＲＳウイルスゲノムにおけるいくつかの変化によって、ＰＲＲＳウイルスがビルレンスのさらなる損失なしに許容細胞内で複製するよう適応され得るので、非常に有用である。
【００４８】
また、本発明に従えば、ゲノムのその他の部位での変化によって、ＰＲＲＳウイルスの弱毒レベルを制御することを可能にするので、非常に有用である。
【００４９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＡ−１０４細胞に適応されたＬＶ４．２．１株と、野外株Ｔｅｒ　Ｈｕｕｒｎｅの感染性ｃＤＮＡクローンであるｐＡＢＶ４３７とのアミノ酸相違の概略図（Ａ）。適応表現型の原因となる突然変異を観察するための、ｐＡＢＶ４３７に基づく産生完全長構築物の概略図（Ｂ）。帯に記載された数字は、９つのオープンリーディングフレームに対応する。
【図２】ＭＡＲＣ−１４５細胞における多段階増殖曲線を示す。ＴＣＩＤ５０／ｍＬにおけるウイルス力価。
【図３】ＰＡＭｓにおける多段階増殖曲線を示す。ＴＣＩＤ５０／ｍＬにおけるウイルス力価。
【図４】ヌクレオキャプシドタンパク質に対するＰＲＲＳＶに特異的なＭａｂ（１２２．１７）による、感染した細胞の免疫染色を示す。ウイルス陽性細胞の総量は２ｃｍ２毎に計数された。
【図５】終点希釈によって決定された、ｖＡＢＶ６８８、ｖＡＢＶ７０７、ｖＡＢＶ７４６およびｖＡＢＶ４３７接種後のブタのグループ毎の平均ウイルス力価。ウイルスグループ間の相違の有意性はカイ検定によって決定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【外国語明細書】
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