(57)【要約】【課題】より安価で、高性能なＤＮＡマイクロアレイ及び当該ＤＮＡマイクロアレイを用いたスクリーニング方法を提供することにある。【解決手段】本発明のＤＮＡＡマイクロアレイは、標的以外の遺伝子に７０％未満の相同性を有し、長さが７０塩基以下の塩基配列からなるプローブを備えたことを特徴とする。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的以外の塩基配列に７０％未満の相同性を有し、長さが７０塩基以下の塩基配列からなるプローブを備えたＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２】
前記塩基配列のＧＣ含量が５５％以下であることを特徴とする請求項１項記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３】
前記プローブが、不安定二次構造であることを特徴とする請求項１項又は２項記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４】
請求項１〜３項のいずれか１項に記載のＤＮＡマイクロアレイを用いて、被測定対象をスクリーニングするスクリーニング方法。
【請求項５】
被測定対象が標識物質を有する請求項１２記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイ及びそれを用いたスクリーニング方法に関し、特に、クロスハイブリダイゼーションを回避し得るＤＮＡマイクロアレイ及びそれを用いたスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来例として、基板上でオリゴＤＮＡを合成するという製法を用いたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐと、ＤＮＡを予め調整しておき、それを基板上に固定化するという製法を用いたＤＮＡマイクロアレイが存在する。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイは、さらに、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片をスライドガラス上にスポットするものと、ＨＰＬＣ精製を施した８０〜７０塩基のオリゴＤＮＡを合成するものの２種類に大別できる。前者は、比較的容易に作製できるという利点を有する。また、後者は、特異性に関して高い精度を有するという利点を有する。
【０００４】
また、ＤＮＡアレイの一般的な作製方法として、ＤＮＡ（ＰＣＲ産物、プラスミドＤＮＡまたはオリゴＤＮＡ）を機械的にスライドガラス上に固定化する方法と、フォトリソグラフの技術を用いてオリゴＤＮＡをｉｎ　ｓｉｔｕ合成する方法とを挙げることができる。フォトリソグラフ技術を用いたアレイの場合、〜１０７分子のオリゴＤＮＡを２４μｍ四方の領域に合成することが可能である。一方、機械的にＤＮＡを固定化する方法では約１ｎｇのＤＮＡを１００〜３００μｍの間隔でスポットできる。どちらの場合でも、標識されたサンプルとのハイブリダイゼーションの後アレイをスキャンし、得られた蛍光強度を用いることによりどの位置のＤＮＡスポットにどれだけの標識分子がハイブリダイズしたかを知ることができる（　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ａｒｒａｙｓ，　Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ４０５，　８２７−８３６，　１５　Ｊｕｎｅ，　２０００）。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ａｒｒａｙｓ，　Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ４０５，　８２７−８３６，　１５　Ｊｕｎｅ，　２０００
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述のＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片をスライドガラス上にスポットする方法は、標的以外の遺伝子等による相同遺伝子間のクロスハイブリダイゼーションを生ずる可能性があるという問題点を有する。すなわち、数ｋｂという長いＤＮＡを用いるため、その配列中に標的以外の遺伝子と相同な部分が存在する可能性が高く、標的以外の遺伝子とのハイブリダイゼーション（クロスハイブリダイゼーション）を起こす危険性がある。
【０００７】
また、ガラス上で直接オリゴＤＮＡを合成する方法は、非常に高価であるという問題点を有する。さらに、機械的に固定化するタイプのアレイでは、技術的な問題から２つの異なるサンプル間での転写産物の相対量（比）しか知ることはできない。したがって、より安価で、高性能なＤＮＡマイクロアレイが望まれていた。
【０００８】
そこで、本発明は、より安価で、高性能なＤＮＡマイクロアレイ及び当該ＤＮＡマイクロアレイを用いたスクリーニング方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、発明者らは、クロスハイブリダイゼーションを回避し得る高性能なプローブについて鋭意研究した結果、本発明のＤＮＡマイクロアレイ及び当該ＤＮＡマイクロアレイを用いたスクリーニング方法を見出すに至った。
【００１０】
本発明のＤＮＡマイクロアレイは、標的以外の遺伝子に７０％未満の相同性を有し、長さが７０塩基以下の塩基配列からなるプローブを備えることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明のＤＮＡマイクロアレイの好ましい実施態様において、前記塩基配列のＧＣ含量が５５％以下であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明のＤＮＡマイクロアレイの好ましい実施態様において、前記プローブが、不安定二次構造であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明のスクリーニング方法は、請求項１〜３項のいずれか１項に記載のＤＮＡマイクロアレイを用いて、被測定対象をスクリーニングすることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、被測定対象が標識物質を有することを特徴とする。
【００１５】
【発明の実施の形態】
まず、本発明のＤＮＡマイクロアレイについて説明する。本発明のＤＮＡマイクロアレイは、標的以外の塩基配列に７０％未満の相同性を有し、長さが７０塩基以下の塩基配列からなるプローブを備える。ここで、標的以外の塩基配列とは、標的とする遺伝子以外の塩基配列を意図する。全ゲノム配列又は一部のゲノム配列中の標的以外の塩基配列に７０％未満の相同性を有するか否かを判断する方法は、特に限定されない。たとえば、後述するようにコンピュータ−上で容易に決定することができる。これによれば、スクリーニング時に標的遺伝子以外の遺伝子又は塩基配列部分が大量に存在していたとしても７０％未満の相同性を容易に検索することができる。
【００１６】
また、標的以外の遺伝子に７０％未満の相同性を有することに関して、条件を規定しているが、他の条件、例えば、ＧＣ含量などを変更することにより標的以外の遺伝子に７０％以上の相同性を有するものをＤＮＡマイクロアレイとして使用することができる。
【００１７】
また、本発明のＤＮＡマイクロアレイは、長さが７０塩基以下の塩基配列からなるプローブを備える。７０塩基以下としたのは、７０塩基を超えると、標的遺伝子以外の遺伝子等によるクロスハイブリダイゼーションを引き起こす確立が高くなり、アレイ作製コストも高くなるからである。
【００１８】
さらに、本発明の好ましい態様において、ＤＮＡマイクロアレイを構成するプローブの塩基配列についてのＧＣ含量が５５％以下とすることができる。これは、５５％を超えると、相同遺伝子間のクロスハイブリダイゼーションの度合いが高くなる傾向が見られるからである。但し、他の条件、例えば、相同性を変更することによりこれ以上のＧＣ含量とすることは可能である。
【００１９】
また、本発明のＤＮＡマイクロアレイの好ましい実施態様において、前記プローブが、不安定二次構造であることを特徴とする。不安定二次構造とは、例えば、前記プローブの自由エネルギーが−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であること等が挙げられる。
【００２０】
次に、本発明のＤＮＡマイクロアレイの作製の一例について説明する。図１を参照してＤＮＡマイクロアレイ作製の手順について説明する。分かりやすくするため、図１には１つの標的遺伝子のみを示している。まず標的遺伝子１内から図に記す４つの条件を満たす塩基配列をゲノム配列に対してコンピューターで検索する。条件を満たす塩基配列の検索は、標的により、条件１のみを満たすもの、条件２のみ満たすもの、条件３のみ満たすもの、条件４のみ満たすものなど、又は条件のいずれかを組み合わせたものについても検索することができる。その塩基配列を持つオリゴＤＮＡ２を合成し、ゲルろ過精したものをスライドガラス３の表面に固定化する。なお、表面への固定化は特に限定されず、例えば、ビオチン−アビジン系などの常法を用いて固定化することができる。このように、本発明のＤＮＡマイクロアレイを作製することができる。
【００２１】
ついで、図２において作成したＤＮＡマイクロアレイの使用法の一例、例えば、本発明のＤＮＡマイクロアレイを用いたスクリーニング方法について説明する。本発明のスクリーニング方法は、請求項１〜３項のいずれか１項に記載のＤＮＡマイクロアレイを用いて、被測定対象をスクリーニングする。ＤＮＡマイクロアレイに関しては、上記説明のとおりである。スクリーニング方法は、まず、細胞からＲＮＡを抽出し、それを鋳型にして蛍光標識などのラベルしたｃＤＮＡを合成することからはじまる。標的遺伝子のｍＲＮＡ１を鋳型とする標識ｃＤＮＡ４はスライドガラスに固定化されたオリゴＤＮＡ５と１００％相補的な同列を持つため、ハイブリダイゼーションを起こす。しかし、標的以外の遺伝子由来のｍＤＮＡ３を鋳型とする標識ｃＤＮＡは７０％以上の相同性を示す配列は含まれないため、これらが固定化したオリゴＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを起こすことはない。このようにして、精度よくスクリーニングを行なうことができる。
【００２２】
また、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、被測定対象が標識物質を有する。標識物質を有することで、被測定対象のスクリーニングが可能となる。標識物質としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５などを挙げることができる。
【００２３】
【実施例】
ここで、本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能であることは言うまでもない。
【００２４】
実施例１
まず、テストケースとして、全ゲノム配列が判明しているＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．６８０３の時計遺伝子を用いてオリゴアレイを作製した。作製したオリゴアレイを用いて標的遺伝子をスクリーニングした結果を図３に示す。これらの時計遺伝子は、ノーザンブロッティング法ではＲＮＡプローブが無ければ、検出できないくらい発現量が低いが、本発明のオリゴアレイにより正確に検出できることが判明した。また、これらの遺伝子のシグナル強度はＰＣＲ産物をスポットしたアレイのものと比較しても同等かそれ以上であった。
【００２５】
実施例２
次に、アレイスライド間での再現性の高さを調べるために、別々の２枚のオリゴアレイを同じラベルｃＤＮＡでハイブリダイズした。結果を、図４に示す。スポットの数は少ないがすべてのスポットが２倍から２分の１の範囲内に納まり、ロット間の品質も均一であることが示された。
【００２６】
実施例３
実施例２で用いたアレイは、７０ｍｅｒのＨＰＬＣ精製したオリゴを用いたが、作製コストをさらに削減できるか否かを検討するために、ＨＰＬＣ精製を省略できるか、オリゴをもっと短くできないか等について検討した。
【００２７】
具体的には、全く同じ配列のオリゴでＨＰＬＣ有りのものと無し（ゲルろ過精製のみ）のものをスポットしたアレイを作製した。図５は、ＨＰＬＣ無しのシグナル強度をＨＰＬＣ有りのもので割った値を示している。ＨＰＬＣ精製無しでシグナル強度が低下するならば、値は１．０より小さくなる。７つの遺伝子を試した中で、有意に１より小さかったものが２つ存在した。しかし１より大きくなったものも２つ存在した。この変動は、ＨＰＬＣの有無から生じた差というよりはむしろスポットしたオリゴＤＮＡの濃度のばらつきと判断した。よって、ＨＰＬＣ精製を省略してもシグナル強度には影響を与えないと結論した。
【００２８】
実施例４
次に、オリゴの長さとシグナルの強度の関係を調べた。オリゴの長さとシグナルの強度の関係を図６に示す。３つの遺伝子について試したが、結果は、２つのパターンに分かれた。１つ目は長さが短くなるにつれて、シグナル強度も低くなるパターンであり、これは実験前に予想していた結果であった。もう１つは、４５ｍｅｒでピークを取るというものであり、予想外の結果であった。３つの遺伝子のうち１つが前者であり、２つが後者であった。前者のパターンでも４５ｍｅｒで十分検出可能なシグナルを得られたことから、スポットするオリゴの長さは４５ｍｅｒで十分可能であると結論した。４５ｍｅｒの辺りにピークが見られる原因ははっきりわからないが、オリゴの２次構造の影響がハイブリダイゼーションに影響しているのではないかと思われる。
【００２９】
実施例５
次に、どのくらい相同性が高ければ、クロスハイブリダイゼーションが起こるかを調べた。具体的に、Ｃｙ５で標識したオリゴＤＮＡを用意して、それに完全に相補的なオリゴ、また、それに９０％から４０％相同なオリゴをスポットしたアレイを作製した。標識オリゴを用いてハイブリダイゼーションを行い、シグナル強度を定量した。この配列はｋａｉＡ遺伝子でＧＣ含量約５５％だが、同時にＧＣ含量６５％と３５％の配列についても試した。スポットしたアレイを図７に、相同性とシグナル強度の関係を図８に示す。図８の縦軸は、１００％相同なオリゴのシグナル強度を１００としてパーセント表示したものである。ＧＣリッチなオリゴはホモロジーが低くなってもシグナル強度が低下しにくい傾向があるが、それでも相同性が７０％以下になるとシグナル強度は、１０分の１に低下した。つまり他の遺伝子に対して７０％未満の相同性を有する４５塩基の配列を探せば、クロスハイブリダイゼーションを回避することができることが判明した。ラン藻全ゲノムに対してこのサーチを行ったが難しいことではなかった。
【００３０】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡマイクロアレイによれば、標的以外の遺伝子とのクロスハイブリダイゼーションを防ぐことができるので、信頼性の高いデータを得ることができるという有利な効果を奏する。
【００３１】
本発明のＤＮＡマイクロアレイによれば、ゲルろ過精製品のオリゴＤＮＡは特殊な技術を必要とせずに安価に入手することができるため、ＤＮＡマイクロアレイの作製コストを大幅に削減することができるという有利な効果を奏する。
【００３２】
本発明のＤＮＡマイクロアレイによれば、配列の情報さえあれば、コンピュータ上で特異的な配列を検索し、プローブを合成し、それをスポットするだけで、ＤＮＡマイクロアレイの非常に簡便で迅速な作製がができるという有利な効果を奏する。
【００３３】
また、従来のアレイのようにＰＣＲを行なわなくとも特異的なＤＮＡ断片が得られるので安価にＤＮＡマイクロアレイを作製できるという有利な効果を奏する。また、エタノール沈殿等の精製が必要ないので、ＤＮＡの質も均一である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の一実施態様によるオリゴＤＮＡを用いたマイクロアレイの作製手順を示す図である。
【図２】図２は、本発明の一実施態様によるＤＮＡマイクロアレイの使用方法を説明する図である。
【図３】図３は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ　Ｐｃｃ　６８０３株の時計遺伝子のオリゴアレイの一例を示す図である。
【図４】図４は、アレイスライド間での再現性の高さを示す図である。
【図５】図５は、オリゴＤＮＡの精製とシグナル強度の関係を示す図である。ｍａ
【図６】図６は、オリゴＤＮＡの長さとシグナル強度の関係を示す図である。
【図７】図７は、種々の相同性を有するオリゴＤＮＡの例を示す図である。
【図８】図８は、相同性とシグナル強度の関係を示す図である。
【符号の説明】
１　標的遺伝子の塩基配列
２　検索により同定された塩基配列をもつオリゴＤＮＡ
３　スライドガラス
１　標的遺伝子のｍＲＮＡ
２　標的遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として合成された標識ｃＤＮＡ
３　標的以外の遺伝子のｍＲＮＡ
４　標的以外の遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として合成された標識ｃＤＮＡ
５　検索により同定された塩基配列をもつオリゴＤＮＡ
【図１】
2004121009.tif 000002
【図２】
2004121009.tif 000003
【図３】
2004121009.tif 000004
【図４】
2004121009.tif 000005
【図５】
2004121009.tif 000006
【図６】
2004121009.tif 000007
【図７】
2004121009.tif 000008
【図８】
2004121009.tif 000009