(57)【要約】【課題】臨床分離株のアモキシシリン耐性ヘリコバクター・ピロリの耐性機構を解明することにより、アモキシシリン耐性に関与している　ｐｂｐ１　遺伝子変異を明らかにすると共に、それらのヘリコバクター・ピロリ変異株を利用した薬物スクリーニングや　ｐｂｐ１　遺伝子の塩基配列とそれに基づいたアミノ酸配列の変異情報をもとにした薬剤耐性菌の診断と遺伝子配列情報を利用した新規抗生物質や遺伝子治療などの治療法開発への利用が課題である。【解決手段】本発明では、インビトロでヘリコバクター・ピロリにアモキシシリン耐性を誘起することにより、耐性株への形質転換は、ＰＢＰ１のＣ末端側半分に存在する　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｕｌｅ　領域における変異が重要であることが示された。これにより、作用メカニズムが明らかな薬物をスクリーニングや　ｐｂｐ１　遺伝子の塩基配列とそれに基づいたアミノ酸配列の変異情報をもとにした薬剤耐性菌の診断と遺伝子配列情報を利用した新規抗生物質や遺伝子治療などの治療法開発することが可能となる。【選択図】　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター・ピロリの　ｐｂｐ１　遺伝子の塩基配列とそれに基づいたアミノ酸配列、特にそのＣ末端側半分の領域に変異を有することにより、アモキシシリン（ｂ−ラクタム系抗生物質で、構造としてペニリシリン系、セフェム系、カルバペネム系、モノバクタムに共通のｂ−ラクタム環を持ち、ｐｂｐ１　遺伝子産物に結合することが本特許の請求に関与している作用活性である）耐性が発現することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ変異株とその　ｐｂｐ１　遺伝子の変異。
【請求項２】
ヘリコバクター・ピロリの　ｐｂｐ１　遺伝子の塩基配列とそれに基づいたアミノ酸配列、特にそのＣ末端側半分の領域に変異を有することにより、アモキシシリン（ｂ−ラクタム系抗生物質で、構造としてペニリシリン系、セフェム系、カルバペネム系、モノバクタムに共通のｂ−ラクタム環を持ち、ｐｂｐ１　遺伝子産物に結合することが本特許の請求に関与している作用活性である）耐性が発現することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ臨床分離変異株ＨＰＡ１１６とその　ｐｂｐ１　遺伝子の変異。
【請求項３】
ヘリコバクター・ピロリの　ｐｂｐ１　遺伝子のＣ末端側半分の領域に変異を有しているＰＢＰ１ゲノムＤＮＡ断片により、アモキシシリン感受性株を形質転換することによってアモキシシリン耐性が向上することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ変異株とその　ｐｂｐ１　遺伝子の変異。
【請求項４】
ヘリコバクター・ピロリ臨床分離変異株ＨＰＡ１１６の　ｐｂｐ１　遺伝子のＣ末端側半分の領域に変異を有しているＰＢＰ１ゲノムＤＮＡ断片により、アモキシシリン感受性株を形質転換することによってアモキシシリン耐性が向上することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ変異株ＨＰＯ１とその　ｐｂｐ１　遺伝子の変異。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のヘリコバクター・ピロリ変異株を用いた、アモキシシリン耐性のヘリコバクター・ピロリに有効な薬物のスクリーニングとその薬剤耐性の診断と遺伝子配列情報を利用した治療法開発への利用。
【請求項６】
ヘリコバクター・ピロリ変異株ＨＰＡ１１６または　ＨＰＯ１を用いた、アモキシシリン耐性のヘリコバクター・ピロリに有効な薬物のスクリーニングとその薬剤耐性の診断と遺伝子配列情報を利用した治療法開発への利用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
胃炎、消化性潰瘍（胃・十二指腸潰瘍）の重要な因子、胃癌のリスク　ファクターと見なされているヘリコバクター・ピロリのｂ−ラクタム系抗生物質アモキシシリン耐性株とその耐性の原因となる　ｐｂｐ１　遺伝子の塩基配列とそれに基づいたアミノ酸配列の変異に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ）はグラム陰性のらせん状桿菌であり、慢性の活動性胃炎（ａｃｔｉｖｅ　ｇａｓｔｒｉｔｉｓ）の患者の胃から単離された（非特許文献１）。ヘリコバクター・ピロリは、消化性潰瘍（ｐｅｐｔｉｃ　ｕｌｃｅｒ）において重要な因子と見なされているが、これは、除菌療法によりヘリコバクター・ピロリ陽性の胃・十二指腸潰瘍の再発率を、有意に減少させることができるからである（非特許文献２）。加えて、胃癌のリスクがヘリコバクター・ピロリの感染によって増加するという病因学的な証拠が存在し、胃癌との相関が示唆されている（非特許文献３）。さらに、ヘリコバクター・ピロリ感染症の治療は、ｇａｓｔｒｉｉｃ　ｍｕｃｏｓａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｉｄ　ｔｉｓｓｕｅ（ＭＡＬＴ）　ｌｙｍｐｈｏｍａ　の縮退と相関することが報告されている（非特許文献４）。
【０００３】
現在、利用可能なヘリコバクター・ピロリ感染症の除菌療法の処方は、プロトンポンプ阻害剤と２種類の抗菌剤からなる３剤併用療法であり、この処方により７０−９０％の治癒率が得られている（非特許文献５）。クラリスロマイシンとメトロニダゾールは、除菌療法において一般的に用いられている抗菌剤であるが、ヘリコバクター・ピロリ菌はこれらの薬剤に容易に耐性となってしまい、これらの耐性菌が除菌率を減少させている（非特許文献６）。クラリスロマイシンに対する抵抗性獲得のメカニズムに関しては、遺伝子解析により、２３Ｓ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＲＮＡ　遺伝子の点突然変異により抵抗性は進展することが示された（非特許文献７）。ヘリコバクター・ピロリのメトロニダゾール耐性は、メトロニダゾールを還元して活性化する酵素　ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ　をコードしているｒｄｘＡ　遺伝子の突然変異による不活性化に起因することが示されている（非特許文献８）。ヘリコバクター・ピロリは、アモキシシリン（ｂ−ラクタム系抗生物質で、構造としてペニリシリン系、セフェム系、カルバペネム系、モノバクタムに共通のｂ−ラクタム環を持ち、ｐｂｐ１　遺伝子産物に結合することが本特許の請求に関与している作用活性である）に対しては、めったに耐性にはなりにくいと考えられてきた。しかしながら、この数年間に、特定の地域における耐性菌の分離に関する報告が、世界中で増加している（非特許文献９）。また、アモキシシリン耐性菌の出現は、成功しなかった治療法が原因と結論づけている多数の論文を、容易に入手できる状況にある（非特許文献１０）。もしもヘリコバクター・ピロリのアモキシシリン耐性菌が更に広まって行ったならば、治療法の失敗例の増加により、重大な問題が生じるであろう。
【０００４】
【非特許文献１】Ｍａｒｓｈａｌｌ　＆　Ｗａｒｒｅｎ，　Ｌａｎｃｅｔ　８３３６，　１２７３−５，　１９８３
【非特許文献２】ＪＡＭＡ　２７２，　６５−９，　１９９４
【非特許文献３】Ｌａｎｃｅｔ　８８５７，　１３５９−６２，　１９９３
【非特許文献４】Ｂａｙｅｒｄｏｒｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｎｃｅｔ　８９６５，　１５９１−４，　１９９５；　Ｗｏｔｈｅｒｓｐｏｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｎｃｅｔ　８８７１，　５７５−７，　１９９３
【非特許文献５】Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｈｕｌｓｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　１，　６−１９，　１９９６
【非特許文献６】Ｍｅｇｒａｕｄ，　Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　５４，　２０７−１６，　１９９８
【非特許文献７】Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４０，　４７７−８０，　１９９６　；　Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４０，　２８３−６，　１９９７
【非特許文献８】Ｇｏｏｄｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　２８，　３８３−９３，　１９９８　；　Ｄｅｂｅｔｓ−Ｏｓｓｅｎｋｏｐｐ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４３，　２６５７−６２，　１９９９
【非特許文献９】Ｖａｎ　Ｚｗｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｎｃｅｔ　３５２，　１５９５，　１９９８　；　Ｄｏｒｅｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４３，　４７−５４，　１９９９　；　Ｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３７，　２７４０−１，　１９９９　；　Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４６，　１２１−３，　２０００　；　Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　３６，　６７−８，　２００１
【非特許文献１０】Ｄｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　＆　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　１２，　６３５−９，　１９９８　；　Ｒｅａｌｄｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　４，　１０６−１２，　１９９９
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
臨床分離株のアモキシシリン耐性ヘリコバクター・ピロリの耐性機構を解明することにより、ｂ−ラクタム系抗生物質アモキシシリン耐性に関与している　ｐｂｐ１　遺伝子変異を明らかにすると共に、それらのヘリコバクター・ピロリ変異株や　ｐｂｐ１　遺伝子の塩基配列とそれに基づいたアミノ酸配列の変異を利用した薬物スクリーニングとその薬剤耐性の診断と遺伝子配列情報を利用した新規抗生物質や遺伝子治療などの治療法開発への利用が課題である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
アモキシシリン耐性ヘリコバクター・ピロリの単離に関する報告は、世界中で増加している。これにより、除菌療法における重大な問題の原因となるかもしれない。ヘリコバクター・ピロリのアモキシシリン耐性機構を解明するため、韓国で分離されたアモキシシリン耐性株の　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＢＰ）を分析した。これら３種類のＰＢＰ（６６，　６３　および　６０　ｋＤａ　）は、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（ＢＩＯ−ＡＭＰ）を用いて、アモキシシリン耐性菌およびアモキシシリン感受性菌の両方に確認できた。またＰＢＰプロファイルは、アモキシシリン感受性における違いに係わらず、非常に良く似ていた。本発明者らは、アモキシシリン耐性株ＨＰＡ１１６由来のゲノムＤＮＡで形質転換することにより、アモキシシリン感受性のＨＰＫ５から、耐性を有するクローンを得た。耐性を誘導したクローンＨＰＯ１においては、アモキシシリンに対するＰＢＰ１の親和性は減少した。ＨＰＡ１１６、ＨＰＯ１およびＨＰＫ５由来の　ｐｂｐ１　遺伝子をクローニングして、塩基配列分析を行った。ＨＰＡ１１６およびＨＰＯ１由来の　ｐｂｐ１　遺伝子のヌクレオチド配列はほとんど同一であったのに対し、ＨＰＫ５のヌクレオチド配列はまったく異なっていた。ＨＰＡ１１６およびＨＰＯ１の　ｐｂｐ１　遺伝子のオープン　リーディング　フレーム（ＯＲＦ）は共に、ＨＰＫ５やその他の感受性株と比較して、アミノ酸残基の４つの置換と１つの挿入を有していた。１つを除くすべての変異は、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｕｌｅが存在する６５９アミノ酸配列中のＣ末端側の半分の領域に存在しており、これは、韓国で分離されたヘリコバクター・ピロリのアモキシシリン耐性に、ＰＢＰ１の　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃｏｒｅ　における変異が関係していることを示している。
【０００７】
グラム陰性細菌は、染色体またはプラスミド上にβ−ｌａｃｔａｍａｓｅ　遺伝子を獲得することにより、β−ｌａｃｔａｍ　耐性になるケースが多いという報告がある（Ｔｈｅｒｒｉｅｎ　＆　Ｌｅｖｅｓｑｕｅ，　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　２４，　２５１−６２，　２０００）。しかしながら、これまでに報告されたヘリコバクター・ピロリの臨床分離株において、アモキシシリン耐性株はβ−ｌａｃｔａｍａｓｅ　を産生していなかったと思われる（Ｖａｎ　Ｚｗｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｎｃｅｔ　３５２，　１５９５，　１９９８　；　Ｄｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４３，　４７−５４，　１９９９　；　Ｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３７，　２７４０−１，　１９９９　；　Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４６，　１２１−３，　２０００）。グラム陰性細菌のβ−ｌａｃｔａｍ　耐性は、ＰＢＰの突然変異とも関連しており、薬剤の浸透性、多剤排出機構等の変化が関連しているかもしれない。臨床分離株由来の耐性菌、およびインビトロでの耐性誘発菌に関する報告は、ＰＢＰにおける変化が関与していることを示唆している。本発明において、韓国で分離されたヘリコバクター・ピロリのアモキシシリン耐性には、ＰＢＰ１における変化が関与していることを示した。
【０００８】
ＰＢＰは、細菌の細胞壁（セルウォール）のペプチドグリカン層の生合成に関与している１セットの酵素である。ヘリコバクター・ピロリにおける３つのＰＢＰ、すなわちＰＢＰ１（６６　ｋＤａ）、ＰＢＰ２（６３　ｋＤａ）、ＰＢＰ３（６０　ｋＤａ）は、池田らによって初めて報告された（Ｉｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　３４，　２４２６−８，　１９９０）。Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１８１，　５１０７−１０，　１９９９）は、ヘリコバクター・ピロリ２６６９５株の全ゲノム配列において、ＰＢＰ１、ＰＢＰ２およびＰＢＰ３はそれぞれ、ＨＰ０５９７（大腸菌のＰＢＰ１ａホモログ）、ＨＰ１５５６（ＦｔｓＩホモログ）およびＨＰ１５６５（ＰＢＰ２ホモログ）に対応することを報告している。これらの高分子量ＰＢＰは、一つのペプチド中にｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ　活性と　ＤＤ−ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ　活性の２つの機能を有しており、後者はペニシリン結合モジュールも有していた（Ｇｏｆｆｉｎ　＆　Ｇｈｕｙｓｅｎ，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　６２，　１０７９−９３，　１９９８）。マイナーなＰＢＰとして、４７−ｋＤａ　ＰＢＰおよび　３２−　から　３０ｋＤａ−ＰＢＰもまた報告されている（Ｈａｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４５，　５９１−８，　２０００）。
【０００９】
本発明者らは、アモキシシリンに対するＰＢＰ１の親和性の減少は、少なくとも部分的には、韓国で単離されたヘリコバクター・ピロリのアモキシシリン耐性という形質に起因すると結論づけた。この結論は、（ｉ）アモキシシリン存在下における　ＢＩＯ−ＡＭＰラベリングの減少、（ｉｉ）アモキシシリン耐性株のＰＢＰ１遺伝子配列中のペニシリン結合モジュールにおけるいくつかの変異の存在、（ｉｉｉ）アモキシシリン耐性株（ＭＩＣ　８　ｍｇ／Ｌ）からＰＣＲにより増幅させた完全長のＰＢＰ１遺伝子またはペニシリン結合モジュールを含むＰＢＰ１遺伝子断片により、アモキシシリン感受性株（ＭＩＣ　０．０３　ｍｇ／Ｌ）を形質転換させることにより、アモキシシリン耐性株（ＭＩＣ　２　ｍｇ／Ｌ）が得られたことに基づいている。
【００１０】
Ｄｏｒｅ　らは、アモキシシリン感受性株で観察された　３０−３２　ｋＤａ　ＰＢＰ（ＰＢＰＤ）のバンドが、種々のソースからのアモキシシリン耐性株には検出されなかったことから、ＰＢＰ　Ｄタンパク質がヘリコバクター・ピロリのアモキシシリン耐性形質において役割を果たしていると提案している（Ｄｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　４，　１５４−６１，　１９９９）。ただし、ＰＢＰ　Ｄタンパク質のバンドの消失がＰＢＰ　Ｄタンパク質の欠失に起因するのか、それともＰＢＰ　Ｄにおける変化のために　３Ｈ−ｂｅｎｚｙｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　に対する親和性が減少したものなのかは議論していない。対照的に本発明者らは、アモキシシリン耐性のＨＰＡ１１６においてのみ、低分子量バンド（３１　ｋＤａ）を検出した（図１）。興味あることに、この観察は再現性がなかった（図２）。それに加えて、ＢＩＯ−ＡＭＰによるＰＢＰ　Ｄのラベリングはアンピシリンの存在下で減少せず、低分子量バンドはＢＩＯ−ＡＭＰの非特異的な結合の結果として出現したものと推測される。これらの不一致は、菌株　および／または　ラベリング法の違いによるものかもしれない。
【００１１】
インビトロでヘリコバクター・ピロリにアモキシシリン耐性を誘起することは困難であると信じられていた（Ｈａａｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　３４，　１６３７−４１，　１９９０　；　Ａｋａｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４３，　１０７２−６，　１９９９）。しかしながら、アモキシシリンを含有するプレート上で、非常に多くの世代にわたり繰り返し培養することにより、アモキシシリン耐性を誘起することが可能であることが、最近、報告された（ＤｅＬｏｎｅｙ　＆　Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４４，　３３６８−７３，　２０００　；　Ｐａｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４５，　９６２−５，　２００１）。Ｄｅｌｏｎｅｙ　とＳｃｈｉｌｌｅｒ　は、感受性の菌株（ＭＩＣ　０．０３−０．０６　ｍｇ／Ｌ）に対しアモキシシリン濃度を徐々に増加させながらの３９回の繰り返し培養の後に、安定なアモキシシリン耐性クローン（ＭＩＣ　４−８　ｍｇ／Ｌ）を得た。ビオチン化アモキシシリンによるアモキシシリン耐性クローンのＰＢＰ１ラベリングは、アモキシシリン親和性の減少が原因で有意に減少した。これに加えて部分的ではあるが、アモキシシリン耐性は、耐性クローンにおけるβ−ｌａｃｔａｍ　抗菌剤に対する拡散バリアの増大に起因していることが示されている（ＤｅＬｏｎｅｙ　＆　Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４４，　３３６８−７３，　２０００）。同様にして　Ｐａｕｌ　らは（Ｐａｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４５，　９６２−５，　２００１）、１１回の繰り返し培養により、感受性株（ＭＩＣ　０．０５　ｍｇ／Ｌ）から安定なアモキシシリン耐性株（ＭＩＣ　１５　ｍｇ／Ｌ）を得て、耐性クローンはＰＢＰ１のｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ領域に位置する４アミノ酸の変化を有することを示した（表２）。さらに、変異　ｐｂｐ１　遺伝子を用いた形質転換は、中程度のアモキシシリン耐性（ＭＩＣ　０．５−１　ｍｇ／Ｌ）を賦与するに過ぎず、ｐｂｐ１　遺伝子の変異が、獲得したアモキシシリン耐性の唯一の原因ではないことを示唆している（Ｐａｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４５，　９６２−５，　２００１）。
【００１２】
本発明においては、アモキシシリン耐性の臨床分離株のアモキシシリンに対するＭＩＣは　８　ｍｇ／Ｌであり、抵抗性獲得トランスフォーマントのＭＩＣは　２　ｍｇ／Ｌであった。インビトロで作製されたアモキシシリン耐性株（Ｐａｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４５，　９６２−５，　２００１）の場合と同様に、耐性形質の一部分だけが形質転換可能であった。Ｄｅｌｏｎｅｙ　と　Ｓｃｈｉｌｌｅｒ（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４４，　３３６８−７３，　２０００）　による指摘のように、獲得された抵抗性は、インビトロで得られた耐性株と同様な様式で進化したかもしれない外膜の薬物透過性における変化によって獲得されたとは考えにくく、アモキシシリン親和性を減少させるようなＰＢＰ１遺伝子の変異によるところが主要な原因であることを示した。韓国の臨床分離株でのＰＢＰの変異は、薬物の濃度を増加させつつプレート上で繰り返し培養した場合と同様な条件下において、患者が長期間内服したβ−ｌａｃｔａｍ　系抗菌剤への繰り返し暴露の結果として製造されたかもしれないという仮説を立てることができる。さらに我々の結果は、アモキシシリン耐性という形質は、天然の形質転換によって感受性の菌株に移し得ることを示しており、近未来において耐性株がまん延する可能性を示唆している。
【００１３】
本発明により　ｐｂｐ１　遺伝子の変異が、アモキシシリン感受性株を耐性株に形質転換できることが示された。また、耐性株への形質転換は、ＰＢＰ１のＣ末端側半分に存在する　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｕｌｅ　領域における変異が重要であることが示された。アモキシシリン耐性クローンの内の一つであるＨＰＯ１は、アモキシシリン２ｍｇ／ＬというＭＩＣを有しており、感受性株ＨＰＫ５のＭＩＣ（０．０３１ｍｇ／Ｌ）の６４倍という高いレベルであった。ただし、臨床分離株である耐性株ＨＰＡ１１６のＭＩＣ（８ｍｇ／Ｌ）と比較すると、４分の１の値であった。この結果から、耐性株ＨＰＡ１１６の場合は、ＰＢＰ１のＣ末端側半分に存在する　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｕｌｅ　領域における変異以外に存在する別の変異が、ＨＰＡ１１６のアモキシシリン耐性を増強させていることが容易に推定できる。分子レベルの実験技術の進歩により、ヘリコバクター・ピロリのアモキシシリン耐性が分子レベルで解明可能となった現在、従来法のようにヘリコバクター・ピロリの臨床分離株を用いたＭＩＣ値を指標として、ヘリコバクター・ピロリに有効な薬物のスクリーニングを行うことがＰＣＲ法により増幅した　ｐｂｐ１遺伝子の変異を解析することでより簡便となるであろうというのは時代遅れと言えるであろう。本発明による耐性株ＨＰＯ１のように、ＰＢＰ１のＣ末端側半分に存在する　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｕｌｅ　領域における変異という明らかな指標をもった耐性株を用いて、ヘリコバクター・ピロリに有効な薬物のスクリーニングしたり、耐性菌の診断や新規抗生物質や遺伝子治療などの治療法開発を行うことにより、作用メカニズムが明らかな薬物をスクリーニングすることが可能となる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
発明の実施の形態を、実施例にもとづき図面を参照して説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００１５】
【実施例】
本発明の実施例に用いたヘリコバクター・ピロリ菌株とその由来を、表１に示した。ＨＰＡシリーズの菌株は、韓国の　Ｋｏｓｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　で分離された。Ｋｏｓｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒにおいては、アモキシシリン耐性株は胃癌患者の１１．２％から分離された（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｋｏｒｅａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３３，　４０７−１４，　１９９８）。一方、ＨＰＫ５およびＣＹＰ３４０１は、山口大学付属病院で分離された。分離されたヘリコバクター・ピロリは、２０％グリセロールを補充した　ｂｒｕｃｅｌｌａ　ｂｒｏｔｈ　中、−８０℃で保存した。ヘリコバクター・ピロリの培養は、ｂｒｕｃｅｌｌａ　ｂｒｏｔｈ　中、または　３％　ｈｏｒｓｅ　ｓｅｒｕｍ　と　０．１％　β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ　を添加した　ｂｒｕｃｅｌｌａ　ａｇａｒ　上、３７℃、加湿下、微好気的条件下（Ｏ２　５％，ＣＯ２　１０％，Ｎ２　８５％）で行った。
【００１６】
【表１】
2004121141.tif 000003
【００１７】
ＮＣＣＬＳ標準（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｆｏｒ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｔｅｓｔｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｔｈａｔ　Ｇｒｏｗ　Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ−Ｆｏｒｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　；　Ａｐｐｒｏｖｅｄ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｍ７−Ａ４．，　１９９７）に従って、５％　ｓｈｅｅｐ　ｂｌｏｏｄ　を添加した　Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　を用いて、ａｇａｒ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　によりＭＩＣを決定した。２．０％　ＭａｃＦａｒｌａｎｄ　ｓｔａｎｄａｒｄ（１×１０７−１×１０８　ＣＦＵ／ｍｌ）に等価なヘリコバクター・ピロリの懸濁液を、ｂｌｏｏｄａｇａｒ　ｐｌａｔｅ　上での７２時間後のサブカルチャーより、生理食塩水を用いて調製した。アモキシシリン濃度を連続的に倍数希釈したプレート上に、調製したヘリコバクター・ピロリ懸濁液１−３μｌをスポットした。７２時間の微好気的培養後にコロニー増殖の有無によりＭＩＣを測定した。
【００１８】
種々のソースから得られたヘリコバクター・ピロリに対するアモキシシリンのＭＩＣ測定結果を、表１に示した。アモキシシリン耐性株のＨＰＡ１１６およびＨＰＡ１７５の２つの菌株は、他の菌株よりも１００倍も高いＭＩＣ値を示した。
【００１９】
試験に用いたヘリコバクター・ピロリによるβ−ｌａｃｔａｍａｓｅ産生の有無を調べるため、Ｐ／Ｃ　Ａｓｅ　ｔｅｓｔ　ｋｉｔ（日水製薬製）を用い、ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ　ｍｅｔｈｏｄ　により試験した。その結果、β−ｌａｃｔａｍａｓｅ　活性は、アモキシシリン耐性株であるＨＰＡ１１６およびＨＰＡ１７５には検出されず、アモキシシリン感受性株にも検出されなかった。
【００２０】
アモキシシリン耐性株にはβ−ラクタマ−ゼ活性が検出されなかったので、ヘリコバクター・ピロリのＰＢＰタンパク質の分析を行った。まず、３００　ｍｌの　ｂｒｕｃｅｌｌａ　ｂｒｏｔｈ　中で菌株を培養し、初期対数増殖期（ＯＤ５９０＝０．４）の培養液から集菌した後、細胞膜画分は　Ｄｅｌｏｎｅｙ　らの方法により調製した（ＤｅＬｏｎｙ　＆　Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４３，　２７０２−９，　１９９９）。調製法を、以下に簡単に述べる。集菌した細胞を、５０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）で２回洗浄した後、ｐＨ７．２の１０ｍＭ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に再懸濁した。この懸濁液５ｍｌにリゾチームを１ｍｇの割合で添加した後、室温で２０分間反応させた。次に超音波破砕により、光学顕微鏡下でほとんどの細胞が破砕されている状態まで破砕を行った。８，０００ｇ、１５分間の遠心分離により破砕されていない細胞を除去した後、上清を１００，０００ｇ、４５分間の遠心にかけて沈殿を回収した。得られた沈殿には、内膜と外膜の両方が含まれていた。沈殿を０．１Ｍ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）で洗浄した後、同じバッファーに懸濁してタンパク質濃度が　１０−２０ｍｇ／ｍｌになるように調整した。なお、タンパク質濃度の測定には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ　を用いた。得られた膜懸濁液は、使用するまで−８０℃で保存した。
【００２１】
ビオチン　ラベルされたアンピシリン（ｂｉｏｔｉｎ−ｌａｂｅｌｅｄ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　；　ＢＩＯ−ＡＭＰ）は、Ｄａｒｇｉｓ　と　Ｍａｌｏｕｉｎ　（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　３８，　９７３−８０，　１９９４）の方法により調製した。アンピシリン（明治製菓製）と　ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃ　ａｃｉｄ　３−ｓｕｌｆｏ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を１：５のモル比で、０．１Ｍ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）に溶解させ、室温で３０分間、穏やかに攪拌して反応させた。１０倍モルのグリシンを添加して反応を停止し、さらに３０分間、穏やかに攪拌した。得られたＢＩＯ−ＡＭＰは、使用するまで−８０℃で保存した。
【００２２】
アモキシシリンに対するＰＢＰの親和性を決定するために、アモキシシリン濃度０．０５、０．５、５、５０ｍｇ／Ｌの溶液中で、膜画分を室温、１０分間プレインキュベーションした。次に、ＢＩＯ−ＡＭＰ（１０ｍｇ／Ｌのラベルしたアンピシリン、膜タンパク質２００μｇ当たり１μｇのラベルしたアンピシリン）を加えて、室温で２０分間のインキュベーションを行った。これにより、ビオチン　ラベルされたＰＢＰは、ケミルミネッセンスにより可視化され、ＰＢＰの親和性はビオチン　ラベルの強度により定量化された。アモキシシリン耐性株ＨＰＡ１１６およびＨＰＡ１７５、アモキシシリン感受性株ＡＴＣＣ４３５０４のそれぞれから調製した膜をＢＩＯ−ＡＭＰによりラベルした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。その結果を、図１に示した。総ての菌株において、いくつかの薄いバンドと共に、３つの明瞭なバンドが検出された。これらの明瞭な３つのバンドは、ラベリングが競合するアンピシリンの存在下で行われた場合には消失したことから、ＰＢＰ１（６６　ｋＤａ）、ＰＢＰ２（６３　ｋＤａ）およびＰＢＰ３（６０　ｋＤａ）として同定された。ＨＰＡ１１６の　３１　ｋＤａのバンドを含むその他のバンドは、アンピシリンの存在により影響されなかった。３１　ｋＤａのバンドは、同じ菌株から調製した異なるロットの膜に関しては観察されなかったことを、注記しておかねばならない。
【００２３】
２つのアモキシシリン耐性株および９つのアモキシシリン感受性株に関し、ＰＢＰプロファイルを比較した（図２）。韓国およびその他の国からの耐性株と感受性株の間には、主たる違いは観察されなかった。ただし、見かけの分子量に関しては、ＰＢＰに多少の違いが存在していた。
【００２４】
ＩＳＯＰＬＡＮＴ（日本ジーン製）を用いて、ゲノムＤＮＡを単離した。完全長の　ｐｂｐ１遺伝子の上流１２１ヌクレオチド（ｎｔ）およびＣ末端の下流９８ｎｔ　の領域を含む２１９９ｂｐ　フラグメント、および　ｐｂｐ１　遺伝子の開始コドンの１０１２ｎｔ　下流からＣ末端の下流９８ｎｔ　の領域を含む１０６７ｂｐ　フラグメント（　ｐｂｐ１　遺伝子のＣ末端側の半分に相当）を、ＨＰＡ１１６またはＡＴＣＣ４３５０４由来の遺伝子をテンプレートとして、ＰＣＲにより増幅した。５μｇのゲノムＤＮＡまたは１μｇのＰＣＲ産物をアガロース　ゲル電気泳動により精製し、初期対数増殖期（ＯＤ５９０＝０．４）のＨＰＫ５株の培養液　５００μｌに添加した後、微好気的な条件下に１２時間培養した。集菌後、細胞を　１ｍｇ／Ｌのアモキシシリンを含む　ｂｒｕｃｅｌｌａ　ａｇａｒ　ｐｌａｔｅ　上にスプレッドして、微好気的な条件下に７２時間培養し、アモキシシリン耐性クローンを得た。
【００２５】
ＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（東洋紡製）を用いてＰＣＲにより増幅した、ＨＰＡ１１６、ＨＰＫ５およびＨＰＯ１由来の完全長　ｐｂｐ１　遺伝子を、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉ　ａｎｄ　ｓｈｒｉｍｐ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｐｈａｔａｓｅ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて酵素的にクリーンナップした。精製したＰＣＲ産物は、ＢｉｇＤｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔｓ　を用いて直接シークエンシングを行った後、ＡＢＩ　　ＰＲＩＳＭ　３７７　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。変異は、再増幅とシークエンシングを少なくとも３回繰り返すことにより確認した。得られたＤＮＡ配列より、アミノ酸配列を推定した。なお、ＨＰＡ１１６、ＨＰＯ１およびＨＰＫ５の　ｐｂｐ１　遺伝子の配列は、それぞれ　ＧｅｎＢａｎｋ　の　ＡＢ０７５０１４、ＡＢ０７５０１５、ＡＢ０７５０１６　として登録してある。
【００２６】
今回の実施例では、５　μｇのＨＰＡ１１６ゲノムＤＮＡにより感受性株ＨＰＫ５を形質転換して、２６個のアモキシシリン耐性クローンを得た。なお、感受性株ＡＴＣＣ４３５０４のゲノムＤＮＡにより形質転換した場合は、アモキシシリン耐性クローンは得られなかった。２６個のアモキシシリン耐性クローンの内の一つであるＨＰＯ１は、アモキシシリン２ｍｇ／ＬというＭＩＣを有しており、感受性株ＨＰＫ５のＭＩＣ（０．０３１ｍｇ／Ｌ）の６４倍というレベルであった。ただし、耐性株ＨＰＡ１１６のＭＩＣ（８ｍｇ／Ｌ）と比較すると、４分の１の値であった。ＨＰＫ５、ＨＰＡ１１６および５つの形質転換株から膜画分を調製し、それらのＰＢＰプロファイルを比較した（図３）。ＨＰＫ５由来のアモキシシリン耐性形質転換株は、ＨＰＫ５およびＨＰＡ１１６に、非常に良く似たＰＢＰプロファイルを示した。
【００２７】
アモキシシリンに対するＰＢＰの親和性を、ＢＩＯ−ＡＭＰとアモキシシリンとの間の競合をベースとして決定した（図４）。感受性株ＨＰＫ５において、アモキシシリン濃度の増加に伴い、ＰＢＰのラベリングは有意に減少した。対照的に、アモキシシリン耐性の形質転換株ＨＰＯ１においては、ＰＢＰ１のラベリングはアモキシシリンによって阻害されなかった。ただし、ＰＢＰ２およびＰＢＰ３のラベリングは、アモキシシリンによって阻害された。これらの結果は、ＨＰＯ１におけるＰＢＰ１の親和性は、アモキシシリン感受性株ＨＰＫ５と比較して、かなり減少していることを示している。同様の結果が、臨床的に単離されたアモキシシリン耐性株ＨＰＡ１１６においても得られている。
【００２８】
アモキシシリンに対するＰＢＰ１の親和性の減少が、ｐｂｐ１　遺伝子における変異に起因しているか否かを決定するため、ＨＰＡ１１６、ＨＰＫ５およびＨＰＯ１由来の完全長　ｐｂｐ１　遺伝子をＰＣＲによりクローン化して、遺伝子配列分析を行った。ＨＰＯ１由来の　ｐｂｐ１　遺伝子のヌクレオチド配列は、ＨＰＫ５の配列とは全く異なっていたが、ＨＰＡ１１６の配列とは本質的に同じであった。１２１番目のアミノ酸だけが異なっており、ＨＰＡ１１６ではＬｅｕであるのに対し、ＨＰＯ１ではＩｌｅに変化していた。ＰＢＰ１の推定アミノ酸配列を、６９Ａ（Ｐａｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４５，　９６２−５，　２００１）、６９Ａ／ＡＭＸｒ（Ｐａｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　４５，　９６２−５，　２００１）、２６６９５（Ｔｏｍｂ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３８８，　５３９−４７，　１９９７）、Ｊ９９（Ａｌｍ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３９７，　１７６−８０，　１９９９）と比較してみた（表２）。アモキシシリン感受性のＨＰＫ５、２６６９５、Ｊ９９、６９Ａではアミノ酸配列は保存されていたのに対し、アモキシシリン耐性（ＡＭＸｒ）のＨＰＡ１１６、ＨＰＯ１、６９Ａ／ＡＭＸｒではアミノ酸配列が異なっていた（表２）。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
ＰＢＰ１の変異が、本当にアモキシシリン耐性に関与しているか否かを確認するため、アモキシシリン耐性株ＨＰＡ１１６から、ＰＣＲにより、完全長の　ｐｂｐ１　ＤＮＡ　および　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｕｌｅ　を含むＣ末端側半分の　ｐｂｐ１　ＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡによりアモキシシリン感受性株ＨＰＫ５を形質転換させた。コントロールとして、アモキシシリン感受性株ＡＴＣＣ４３５０４由来のＤＮＡ断片も用いて、アモキシシリン感受性株ＨＰＫ５を形質転換させた。ｐｂｐ１　遺伝子の完全長またはＣ末端側半分を含むＤＮＡ断片は、ＨＰＫ５を形質転換させたことによりアモキシシリン耐性を持たせることができた。一方、コントロールのＡＴＣＣ４３５０４由来のＤＮＡで形質転換させた場合には、アモキシシリン耐性株は出現しなかった。この結果から、ＰＢＰ１の　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｕｌｅ　領域における変異が、アモキシシリン耐性に関与していることを明らかにできた。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により、ＰＢＰ１の　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｕｌｅ　領域における変異が、アモキシシリン耐性に関与していることを明らかにできた。これにより、作用メカニズムの明確な薬物スクリーニングへの利用やその薬剤耐性菌の診断と遺伝子配列情報を利用した新規抗生物質や遺伝子治療などの治療法開発への利用が可能となった。
【００３２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＢＩＯ−ＡＭＰにより検出されたヘリコバクター・ピロリのＰＢＰプロファイルを示す図である。
【図２】アモキシシリン耐性株およびアモキシシリン感受性株のＰＢＰプロファイルを示す図である。
【図３】ＨＰＫ５由来のアモキシシリン耐性形質転換株のＰＢＰプロファイルを示す図である。
【図４】ＨＰＫ５（ＭＩＣ　０．０３　ｍｇ／Ｌ）とＨＰＯ１（ＭＩＣ　２　ｍｇ／Ｌ）との　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　におけるＰＢＰプロファイルの比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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