(57)【要約】【課題】　特異的生産性と共にバイオマスの高い生産率【解決手段】　（ａ）グルタチオン生産酵母の菌株を有酸素条件下で前培養することにより、バイオマス単位当りのグルタチオン含量が１．２重量％より高いバイオマス前培養を得ること、（ｂ）生じたバイオマス前培養を、培養によって生じるバイオマスの密度が５０ｇ／ｌより高くなるように、有酸素条件下で培養すること、（ｃ）前記培養バイオマスを活性化すること、及び（ｄ）６以下のｐＨでグルタチオンを抽出し、生じたグルタチオンを精製して前記培養バイオマスを回収することを含む、グルタチオンを生産するための発酵方法を開示する。該方法は、高い収率と比較的低いコストでグルタチオンを得ることを可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　（ａ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｂｕｌｌｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａから選択される酵母属の菌株又はその安定な突然変異株を有酸素条件下で前培養することにより、バイオマス単位当りのグルタチオン含量が１．２重量％より高い、バイオマス前培養を得ること、
　（ｂ）生じたバイオマス前培養を、培養によって生じるバイオマスの密度が５０ｇ／ｌより高くなるように、有酸素条件下で培養すること、
　（ｃ）前記培養バイオマスを活性化すること、及び
　（ｄ）段階（ｃ）から生じる培養バイオマスから、６以下のｐＨでグルタチオンを抽出し、生じたグルタチオンを精製することによってグルタチオンを回収すること
を含む、グルタチオンを生産するための発酵方法。
【請求項２】
　前記菌株がＰｉｃｈｉａ　ａｎｇｕｓｔａ　−ＮＣＹＣ　２９５７−（ＧＮ／２２１９）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
　前記菌株がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　−ＮＣＹＣ　２９５８−（ＧＮ／２２２０）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
　前記菌株がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｖａｒ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ　−ＮＣＹＣ　２９５９−（ＧＮ／２２２１）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
　前記菌株がＣａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉ、突然変異株２１　−ＮＣＹＣ　２９８３−（ＧＮ／２２２２）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
　段階（ａ）及び／又は（ｂ）及び／又は（ｃ）のいずれかを、次の化合物：
　（ｉ）Ｃｄ、Ｖ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｐｂ、Ａｌ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｏ、Ｈｇから選択される金属の化合物、
　（ｉｉ）過酸化物、
　（ｉｉｉ）アルデヒド、
　（ｉｖ）ヒドロペルオキシド、
　（ｖ）脂肪酸及び／又はその線状又は分枝、飽和又は不飽和誘導体
の少なくとも１つを含み、前記化合物（ｉ）から（ｖ）が炭素及び／又は窒素及び／又は少なくとも１つの鉱質塩の同化可能なソースでない及び／又は塩そのものでない場合には常に、少なくとも１つの同化可能なそのようなソースをさらに含む、水性の、液体又は固体栄養培地において実施する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
　前記化合物（ｉ）が鉱質無機水溶性塩である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
　前記培地が少なくとも１つのアミノ酸及び／又はリンソース及び／又はアルコールを含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
　段階（ａ）において、バイオマス単位当りのグルタチオン含量が１．６重量％より高い、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
　段階（ｂ）を２０℃から５０℃で１２時間から７２時間実施し、その結果生じる培養バイオマスの密度が５０ｇ／ｌから６５ｇ／ｌである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
　段階（ｂ）を２５℃から４５℃で１２時間から４８時間実施する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
　段階（ａ）及び／又は（ｂ）及び／又は（ｃ）のいずれかをバッチ方式で又は連続的に実施する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
　前記炭素ソースが農業及び／又は産業廃棄物からのものである、請求項６から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
　前記炭素ソースが、次の物質：糖類、有機酸、アルコール、アルデヒド、グリセロール、脂肪、油、炭化水素及び乳清、の少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
　前記炭素ソースがビート糖蜜を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
　前記窒素ソースが、次の物質：麦芽抽出物、コーンスティープリカー、カゼインの酵素加水分解産物、黄粉、乾燥酵母、ペプトン、大豆ペプトン、肉抽出物、硝酸塩、アミノ酸、カゼイン及びアンモニウム塩、の少なくとも１つを含む、請求項６から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
　前記窒素ソースが硝酸アンモニウム又は硫酸アンモニウムを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
　段階（ａ）及び／又は（ｂ）及び／又は（ｃ）のいずれかを、空気又は酸素ガス及び／又はそれらの混合物で通気することによって実施する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
　上記活性化が、
　（α）上記培養バイオマス（５％から２０％乾燥バイオマス）を、０．４Ｍから１Ｍ炭素ソースを含む水溶液に再懸濁すること、
　（β）生じた懸濁液を３００ｒｐｍから６００ｒｐｍで攪拌すること、及び
　（γ）前記懸濁液を空気又は酸素ガス及び／又はそれらの混合物で通気すること
を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
　段階（α）において、前記水溶液が０．００１Ｍから０．０１Ｍのシステイン、グリシン及びグルタミン酸塩を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
　使用する発酵槽が通気攪拌型又はエアリフト型発酵層である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
　段階（ｄ）においてグルタチオンを０．５から３．０のｐＨ及び７０℃から９０℃の温度での溶解によって抽出する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
　段階（ｄ）においてグルタチオンを、強力なカチオン樹脂、続いて非イオン性樹脂を通して抽出する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、グルタチオンを生産するための方法に関する。特に、本発明は、高い収率と比較的低いコストでグルタチオン（以下ＧＳＨと称する）を入手することを可能にする、ＧＳＨを生産するための発酵及び活性化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　Ｎ−（Ｎ−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−システイニル）グリシンとしても知られるＧＳＨは、実質的にすべての細胞中に存在する、既知の細胞トリペプチドである。その多様な機能は、酵素学、輸送、薬理学、治療法、毒物学、内分泌学及び微生物学を含めた多くの生物医学分野、ならびに農業にとって重要である。
【０００３】
　ＧＳＨは、輸送と細胞保護に加えて、様々な代謝領域においても決定的に重要な役割を果たす。ＧＳＨは、タンパク質や他の分子のジスルフィド結合の還元、ＤＮＡのデオキシリボヌクレオチド前駆体の合成、及び代謝の様々な段階で形成される遊離基や多くの反応性酸素中間体（例えば過酸化物）の危険な作用に対する細胞の保護に役立つ。ＧＳＨ代謝の酵素的及び輸送現象は、非特許文献１の中で取り上げられている。
【０００４】
　様々な人体領域における細胞内ＧＳＨレベルの上昇は、純粋ＧＳＨの経口投与によって、又は水に溶解した後ある種のＧＳＨモノエステルの注射によって実現しうる（例えば特許文献１、２及び３参照）。
【０００５】
　ＧＳＨは、主として、この化合物を微生物細胞から抽出する発酵工程によって工業的に生産される。微生物からＧＳＨを生産する方法は、特許文献４及び５を含めて、様々な特許において開示されている。
【０００６】
　特許文献５は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属し、ＧＳＨを生産する能力と１，２，４−トリアゾール又はアジ化ナトリウムに対する耐性を併せ持つ菌株を、炭素、窒素及び無機塩の同化可能なソースを含有する培地で培養すること、該微生物細胞中にＧＳＨを蓄積すること、前記細胞を採集すること及びそこからＧＳＨを回収することを含む、高収率（乾燥細胞に関して約３％から４％、約０．７％ｇ／ｌから０．９％ｇ／ｌ）でＧＳＨを生産する方法を開示している。
【０００７】
　特許文献６は、ＧＳＨを生産するための発酵工程においてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する亜鉛耐性酵母を使用することを開示しており、この方法では乾燥重量で４．１％から６．６％のＧＳＨが得られる；発酵中のＧＳＨの蓄積を改善することが知られているＬ−システインを使用すると、より高いパーセンテージが得られるが、Ｌ−システインはバイオマスの生産にマイナスの影響を及ぼす。
【０００８】
　非特許文献２は、高いＧＳＨを含有する酵母、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｓ−８Ｈを使用して、いかにしてＧＳＨの収率を最大化するか、そして１．６ｇ／ｌのＧＳＨ平均収率及び１７ｍｇ／ｇ乾燥バイオマスのＧＳＨ含量を得ることについて論じている。
【０００９】
　非特許文献３は、グルコース、ペプトン及び硫酸マグネシウムが酵母菌株における細胞増殖とＧＳＨ生産にとって適切な成分であり、ＧＳＨ生産は平均値で２６ｍｇ／ｌから２８ｍｇ／ｌ、最大値で１２４．９３ｍｇ／ｌにのぼることを報告している。
【００１０】
　非特許文献４は、発酵の間、反応器内のシステイン濃度を一定に保持して、約０．８ｇ／ｌに達する、総ＧＳＨ生産量を最大化することを教示している。
【特許文献１】米国特許第４，７１０，４８９号
【特許文献２】米国特許第４，７８４，６８５号
【特許文献３】米国特許第４，８７９，３７０号
【特許文献４】米国特許第４，５９６，７７５号
【特許文献５】米国特許第４，５８２，８０１号
【特許文献６】第ＦＲ−Ａ−２，６９２，２８０号
【非特許文献１】Ｍｅｉｓｔｅｒ「グルタチオン代謝の選択的調節（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｌｕｔａｃｈｉｏｎｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ　２２０，Ｎｏ．４５９６、４７２−４７７（１９８３）
【非特許文献２】Ｕｄｅｈ　Ｋ．Ｏ．とＡｃｈｒｅｍｏｗｉｃｚ　Ｂ．「高グルタチオン含有酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：生産の至適化（Ｈｉｇｈ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」より。Ａｃｔａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ　Ｐｏｌｏｎｉｃａ，１９７７，第４６巻，Ｎｏ．１，１０５−１１４
【非特許文献３】Ｃｈｉ−Ｈｓｉｅｎ　Ｌｉｕら、「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるグルタチオン生産のための培地の至適化（Ｍｅｄｉｕｍ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）」、Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３４巻、１９９９、１７−２３
【非特許文献４】Ａｌｆａｆａｒａ　Ｃ．ら、「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのフェッドバッチ培養におけるグルタチオンの最大生産のためのシステイン添加戦略（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）」、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９２、３７、１４１−１４６
【非特許文献５】Ｋｕｒｔｚｍａｎ　＆　Ｆｅｌｌ，「酵母、分類学試験（Ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔｓ，ａ　ｔａｘｏｎｏｍｙ　ｓｔｕｄｙ）」（第４版）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９９８
【非特許文献６】Ｊ．Ａ．Ｂａｒｎｅｔら、「酵母：特徴と特定（ＹＥＡＳＴ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、第３版、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０００
【非特許文献７】ＡｋｅｒｂｏｏｍとＳｉｅｓ、「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、２７巻、ｐ．３７３−３８４，１９８１，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
　これらの方法は既にＧＳＨの生産にとって１つの改善であるが、それらは時としてあまりに複雑であるか又は生産収率がまだ比較的低く、特異的生産性と共にバイオマスの高い生産率は今もＧＳＨの生産のための目標である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
　ここで、
　（ａ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｂｕｌｌｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａから選択される酵母属の菌株又はその安定な突然変異株を有酸素条件下で前培養することにより、バイオマス単位当りのＧＳＨ含量が１．２重量％より高い、バイオマス前培養を得ること、
　（ｂ）生じたバイオマス前培養を、培養によって生じるバイオマスの密度が５０ｇ／ｌより高くなるように、有酸素条件下で培養すること、
　（ｃ）前記培養バイオマスを活性化すること、及び
　（ｄ）段階（ｃ）から生じる培養バイオマスから、６以下のｐＨでＧＳＨを抽出し、生じたＧＳＨを精製することによってＧＳＨを回収すること
を含む発酵工程によってＧＳＨが生産できることが認められた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
　ＧＳＨ生産酵母として特に好ましいのは、２０００年７月１３日に「Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｙｅａｓｔ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ」（ＮＣＹＣ）に提出した、我々の菌株コレクションではＧＮ／２２１９と特定されるＰｉｃｈｉａ　ａｎｇｕｓｔａ、アクセス番号：ＮＣＹＣ　２９５７；２０００年７月１３日にＮＣＹＣに提出した、我々の菌株コレクションではＧＮ／２２２０と特定されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、アクセス番号：ＮＣＹＣ　２９５８；２０００年７月１３日にＮＣＹＣに提出した、我々の菌株コレクションではＧＮ／２２２１と特定されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｖａｒ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ、アクセス番号：ＮＣＹＣ　２９５９；２０００年１０月２４日にＮＣＹＣに提出した、我々の菌株コレクションではＧＮ／２２２２と特定されるＣａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉ、突然変異株２１、アクセス番号：ＮＣＹＣ　２９８３である。
【００１４】
　該酵母細胞は、突然変異誘発しないか、若しくは突然変異原（例えば紫外線、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、メタンスルホン酸エチルエステル（ＥＭＳ）等）で処理することができる。突然変異株選択のために使用しうる酵母細胞は、ＧＳＨ応答経路とは異なる経路において、元の野生株よりも低い酸化的ストレス応答を示しうる。
【００１５】
　Ｐｉｃｈｉａ　Ａｎｇｕｓｔａ　−ＮＣＹＣ　２９５７−ＧＮ／２２１９
　この菌株の形態学的、栄養学的及び性的特徴は、例えば非特許文献５に述べられているように、この種の典型的な特徴に合致する。
【００１６】
　特に：
　形態学的特徴
　５％麦芽抽出物中では、２５℃で３日間インキュベートした後、該細胞は、球状、単一、対又は小さなクラスターとして存在する。
【００１７】
　ダルモー平板寒天中では、２５℃で７日間インキュベートした後、カバーガラスの下に偽菌糸又は菌糸のいずれも認められない。
【００１８】
　２５℃で、２％麦芽抽出物又はＹＭ培地（酵母抽出物３ｇ／ｌ；麦芽抽出物３ｇ／ｌ；Ｄｉｆｃｏ−によって生産されるＢａｃｔｏペプトン５ｇ／ｌ；グルコース１０ｇ／ｌ；寒天２０ｇ／ｌ）において、子嚢胞子が認められる（子嚢胞子はふちのある帽子形で、通常は抱合していない）。
【００１９】
【表１】
2004129647.tif 000002
　増殖：１０％ＮａＣｌ　＋；５％グルコース　＋。
【００２０】
　他の特徴：デンプンは認められない；ゼラチンの液化は非常に弱い；最大増殖温度は４８℃である。
【００２１】
　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　−ＮＣＹＣ　２９５８−ＧＮ／２２２０
　この菌株の形態学的、性的及び栄養学的特徴は、例えば非特許文献６に述べられているように、これらの種の典型的な特徴に合致し、特に：
　「麦芽抽出物」中での増殖：２５℃で３日後、該細胞は楕円状から円柱状である。堆積物、時としては環が存在する。
【００２２】
　２０℃で１ヵ月後、堆積物が存在する。
【００２３】
　「麦芽寒天」上での増殖：２０℃で１ヵ月後、該画線培養はバター様で、クリーム色からわずかに褐色がかっている。
【００２４】
　子嚢胞子の形成：該子嚢は１個から４個の子嚢胞子を含む。
【００２５】
　酢酸寒天が胞子形成を誘導するための最良の培地である。
【００２６】
【表２】
2004129647.tif 000003
【００２７】
　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｖａｒ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ　−ＮＣＹＣ　２９５９−ＧＮ／２２２１
　この菌株の特徴は、炭素化合物の同化と発酵試験の２つを除いて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　−ＮＣＹＣ　２９５８−ＧＮ／２２２０について上記で報告したのと同じである。
【００２８】
【表３】
2004129647.tif 000004
【００２９】
　Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉ（突然変異株２１）−ＮＣＹＣ　２９８３−ＧＮ／２２２２
　この菌株の形態学的、性的及び栄養学的特徴は、例えば非特許文献６に述べられているような、これらの種の典型的な特徴に合致し、特に：
　グルコース−酵母抽出物−ペプトン水中での増殖：２５℃で３日後、該細胞は、わずかに湾曲した後、長卵形から円柱状である。
【００３０】
　グルコース−酵母抽出物−ペプトン寒天上での増殖：２５℃で１ヵ月後、該画線培養は黄色がかったクリーム色で、やわらかく、精緻にしわが寄っている。
【００３１】
　コーンミール寒天上でのダルモー平板培養：偽菌糸体が、渦巻状の鎖と卵形分芽胞子群を担う短い分枝菌糸と共に存在する。
【００３２】
【表４】
2004129647.tif 000005
【００３３】
　本発明の方法は、ＧＳＨ生産酵母の生産性を改善すること、ならびにＧＳＨ過剰生産突然変異株の速やかな単離、そのような突然変異株の安価な培養、バイオマスのＧＳＨ含量の増加及び前記バイオマスからのＧＳＨの迅速で効果的な抽出を可能にする、ＧＳＨを生産するための経済的な方法を提供する。
【００３４】
　本発明の方法を実施するのに適した酵母の細胞は一倍体である。
【００３５】
　本発明の方法の段階（ａ）及び／又は（ｂ）及び／又は（ｃ）のいずれも、次の化合物：
　（ｉ）Ｃｄ、Ｖ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｐｂ、Ａｌ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｏ、Ｈｇから選択される金属の化合物、
　（ｉｉ）過酸化物（例えば、Ｈ２Ｏ２、ｔ−ブチルペルオキシド等）、
　（ｉｉｉ）アルデヒド（例えばメチルグリオキサル、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド等）、
　（ｉｖ）ヒドロペルオキシド（例えば、ｔ−ブチル−ＨＯＯＨ等）、
　（ｖ）脂肪酸（例えば、オレイン酸、リノレン酸、アラキドン酸等）及び／又はその線状又は分枝、飽和又は不飽和誘導体、
の少なくとも１つを含み、前記化合物（ｉ）から（ｖ）が炭素及び／又は窒素及び／又は少なくとも１つの鉱質塩の同化可能なソースでない及び／又は塩そのものでない場合には常に、少なくとも１つの同化可能なそのようなソースをさらに含む、水性の、液体又は固体栄養培地において実施することができる。
【００３６】
　前記炭素ソースは、例えば農業及び／又は産業廃棄物からのものでありうる；特に、それらは、次の物質：デキストロース、デキストリン、グルコース、フルクトース、サッカロース、マンニトール、マンノースのような糖類；有機酸；アルコール；アルデヒド；グリセロール；デンプン；脂肪；油；炭化水素及び乳清等、の少なくとも１つを含みうる；特に、本発明によるＧＳＨの生産は、ビート糖蜜のような比較的安価な炭素ソースを使用する好都合な条件下で実施することができる。
【００３７】
　前記窒素ソースは、例えば、次の物質：麦芽抽出物、コーンスティープリカー、カゼインの酵素加水分解産物、黄粉、乾燥酵母、ペプトン、大豆ペプトン、肉抽出物、硝酸塩、アミノ酸、カゼイン、アンモニウム塩等、の少なくとも１つを含みうる。硝酸アンモニウム及び硫酸アンモニウムのようなアンモニウム塩を使用して良好な結果が得られる。
【００３８】
　該生産のために使用する鉱質塩は培地に依存して変化しうる；ナトリウム、カリウム、マグネシウム、硫酸、塩化物、硝酸イオンを提供する可溶性無機塩が使用できる。そのような塩は、例えば、一塩基リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、一塩基硫酸カリウム、硝酸ナトリウムでありうる。炭酸カルシウムの添加も有用である。
【００３９】
　さらに、該培地は、少なくとも１つのアミノ酸（例えばシステイン、メチオニン、グルタミン酸塩、グルタミン、グリシン、ロイシン、アセチルシステイン等）及び／又はリンソース（例えばリン酸カリウム等）及び／又はアルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等）を含みうる。
【００４０】
　好ましくは、段階（ａ）において、バイオマス単位当りのＧＳＨ含量は１．６重量％より高く、一方、段階（ｂ）は、好ましくは２０℃から５０℃で１２時間から７２時間、特に２５℃から４５℃で１２時間から４８時間実施し、培養したバイオマスの密度は、好ましくは５０ｇ／ｌから６５ｇ／ｌである。
【００４１】
　本発明の方法、具体的に、段階（ａ）及び／又は（ｂ）及び／又は（ｃ）のいずれも、バッチ方式で又は連続的に実施しうる。
【００４２】
　本発明の方法の段階（ａ）及び／又は（ｂ）及び／又は（ｃ）は、空気又は酸素ガス及び／又はそれらの混合物で通気することによって実施することができる；本発明の方法は、好都合には、顕著な量のＧＳＨを得るために通気発酵槽において実施する。好ましい発酵槽は、通気攪拌型又はエアリフト型発酵槽である。さらに、該方法は、１つのフラスコ内で、及び異なる容量の複数の発酵槽において実施することができる。
【００４３】
　本発明の方法は、培養したバイオマスの活性化−段階（ｃ）−を包含する。この明細書では、「活性化」は、非増殖条件下にある休止細胞を用いて実施する、バイオマスの細胞内ＧＳＨ含量の濃縮を指すことが意図されている。
【００４４】
　好都合には、前記活性化は：
　（α）培養バイオマス、例えば５％から２０％の乾燥バイオマスを、０．４Ｍから１Ｍ炭素ソースを含む水溶液に再懸濁すること、
　（β）生じた懸濁液を３００ｒｐｍから６００ｒｐｍで攪拌すること、及び
　（γ）前記懸濁液を空気又は酸素ガス及び／又はそれらの混合物により、好ましくは１−４ｖｖｍで通気すること
を含む。
【００４５】
　好ましくは、段階（α）において、前記水溶液は０．００１Ｍから０．０１Ｍシステイン、グリシン及びグルタミン酸塩を含む。
【００４６】
　もう１つの好ましい実施態様では、本発明の方法の段階（ｄ）において、ＧＳＨを０．５から３．０のｐＨ及び７０℃から９０℃の温度での溶解によって抽出する。
【００４７】
　段階（ｂ）から生じる培養バイオマスは約０．９％から１．２％のＧＳＨ生産性を示し、一方本発明の方法の段階（ｃ）から生じる活性化培養バイオマスは、乾燥条件下で２．７％から３．９％へのＧＳＨ生産性の上昇を示す。
【００４８】
　段階（ｄ）におけるＧＳＨの抽出は、好都合には、例えばＲｈｏｍ　＆　Ｈａａｓによって製造されるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲ　１２０−２００−２２０又は三菱化学株式会社（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって製造されるＲｅｌｉｔｅ（登録商標）ＣＦのような強力なカチオン樹脂、続いて、例えばＳＰ　２０７（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ，Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）のような非イオン性樹脂を通して実施することができる。該ＧＳＨ抽出は、好ましくはＨ２ＳＯ４の存在下に塩の沈降反応を通して得られ、この反応において該塩は、Ｈ２ＳＯ４の塩形成後、不溶性となる。
【００４９】
　下記の実施例は、本発明を限定することなく本発明を例示するものである。
【実施例１】
【００５０】
　土壌試料から単離したＰｉｃｈｉａ　ａｎｇｕｓｔａの１つの野生株、すなわち同体性株一倍体を使用した。
【００５１】
　ステージ１
　前記株を、次の組成（ｇ／ｌ）：
　グルコース　　　　　２０
　ペプトン　　　　　　２０
　酵母抽出物　　　　　１０
を有するリッチ培地（ＲＭ）１００ｍｌ中、３７℃で２０時間（２５０ｍｌ円錐フラスコ、２００ｒｐｍ旋回インキュベーション）培養した。
【００５２】
　ステージ２
　酵母培養２５ｍｌを蒸留水中で２回攪拌洗浄し、再び蒸留水に懸濁した。
【００５３】
　５×１０７細胞を、一水和塩化カドミウム（ＭＭＣ）８ｍＭを含有し、次の組成（ｇ／ｌ）：
　グルコース　　　　　　２０
　酵母窒素基剤　　　　　７
　一水和塩化カドミウム　１．６１
を有するグルコースミネラル培地（ＧＭ）で平板培養した。
【００５４】
　該平板を９０％死亡率まで紫外線照射し、暗所において３７℃で２０日間インキュベートした。
【００５５】
　ステージ３
　インキュベーション後、代表的な平板は８００コロニーから１０００コロニーを示し、そのうち約５０％が直径Ｆ＜１ｍｍ（「小」）で、約５０％がＦ＞１ｍｍ（「大」）であった。１０個の大コロニーを単離し、ＲＭ平板で画線精製し、再びＭＭＣで試験した。１０個のコロニーのうち５個について、それらのカドミウム耐性表現型を確認した。
【００５６】
　ステージ４
　ステージ３で単離した５個のコロニーを上述したように処理したが、但しこの場合には、カドミウムをオルトバナジン酸ナトリウム２００ｍＭに置き換えた。最後に、５個のコロニーを単離して、それらのカドミウム−バナジン酸耐性表現型を確認した。
【００５７】
　ステージ５
　先のステージの５個のカドミウム−バナジン酸耐性コロニーの各々（以下ＣＶＣｄＡ、ＣＶＣｄＢ、ＣＶＣ、ＣＶＤ、ＣＶＥ）をミネラル培地（ＭＭ）７．５ｍｌ中で前培養し、３７℃で１６時間インキュベートした（旋回、２００ｒｐｍ）。次に、５×１０６細胞／ｍｌで開始するために、これらの前培養からの細胞を使用して、ＭＭ　２０ｍｌを含む１００ｍｌフラスコにインキュベートした。前記フラスコを３７℃で２４時間インキュベートした（旋回、２００ｒｐｍ）；この実験を３回実施した。
【００５８】
　ステージ６
　各々のフラスコの細胞内容物を遠心分離によって収集し、２回洗って、２つのアリコートに分けた。１つのアリコートはバイオマスの乾燥重量を測定するために使用し、他方は、非特許文献７の方法に従って、該細胞を過塩素酸１ｍｌに懸濁し、ガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｎｏ．Ｇ−９２６８）０．５ｇを加えて１分間×３回攪拌し、固相を遠心分離によって沈殿させ、抽出物上にピペットで分注することによって得られる、細胞抽出物のＧＳＨ含量を測定するために使用した。
【００５９】
　表１は、単位バイオマス当りの重量レベルのパーセンテージで表した、５つの培養に関して得られた一部の有意の結果を示す。
【００６０】
【表５】
2004129647.tif 000006
【００６１】
　突然変異株ＣＶＣｄＡ及び、際立って、ＣＶＣｄＢ（我々の菌株コレクションではＧＮ／２２１９と特定される、Ｐｉｃｈｉａ　ａｎｇｕｓｔａ、ＮＣＹＣ　２９５７）は、細胞内ＧＳＨ含量の有意の上昇を示すことが認められる。
【００６２】
　ステージ７
　３ｌ発酵槽での、表２において突然変異株Ｂとして示す突然変異株ＣＶＣｄＢ　ＧＮ／２２１９、ＮＣＹＣ　２９５７を使用したＧＳＨの生産を、２つの異なる培地（ＧＭ、ＧｌｙＭ−ＧＭであるが、グルコースを２％グリセロールに置き換える−及びｍＭ−ＧＭであるが、グルコースをサッカロース９％に相当する１８％糖蜜に置き換える）、及び次の培養条件：容量：２ｌ、温度：３５℃、空気：１ｖｖｍ、ｐＨ：５．０を用いて実施した。
【００６３】
　ＧＳＨ及びバイオマスの経過を６２時間追跡し、同じ対照培養（野生株）と比較した。その結果を表２に示す。
【００６４】
【表６】
2004129647.tif 000007
【００６５】
　突然変異株Ｂの場合に細胞生産性が野生株よりも高いが、２つの培地間での収率の差は関係しないことが認められる。
【００６６】
　これらの試験は、本発明の方法が様々な培地を用いる好都合な条件下で、長期間にわたって実施できることを示している。
【００６７】
　発酵段階後、該バイオマスを回収し、洗浄して、次に、さらにＧＳＨ収率を高めることを目指して、活性化段階を開始するために濃縮形態で再懸濁するか（実施例２で述べる）、若しくはＧＳＨを抽出して精製するために処理した（下記のステージ８で述べる）。
【００６８】
　ステージ８
　先のステージから得たバイオマスを、鉱物質除去水に７ｇ／ｌ（バイオマス乾燥重量）の濃度で再懸濁した。この濃縮バイオマス懸濁液（ＣｏＢＳ）１０ｌを、低いｐＨ（濃硫酸を用いて、１から６．５）と高い温度（７５℃×３分間）の組合せを用いて透過性を上げた。次に該バイオマスをろ過（０．２ｍｍセラミック膜）によって除去し、約６ｇ／ｌ　ＧＳＨに達するように該ＧＳＨ含有溶液を逆浸透によって濃縮した。
【００６９】
　表３は、上述したＣｏＢＳを使用して、様々なｐＨで得られたＧＳＨ収率（％）をまとめたものである。
【００７０】
【表７】
2004129647.tif 000008
【００７１】
　これらの試験は、使用した条件下で、細胞の透過性上昇が低いｐＨによって促進されることを示している。
【００７２】
　ステージ９
　Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（１ｌ、ＩＲ１２０Ｈ）を充填したカラムにおいて、１ＢＶ／時の流速で濃縮ＧＳＨ溶液（約６ｇ／ｌ）１ｌを浸出ろ過することによってＧＳＨの精製を行った。次に鉱物質除去水３０ＢＶを加えて前記樹脂を洗った後、１％Ｈ２ＳＯ４でＧＳＨを溶出した。生じた溶出物６ｌを逆浸透によって５ｌに濃縮し、約８５％の初期ＧＳＨを生成した。
【００７３】
　ステージ１０
　前記濃縮溶出物を、あらかじめ１ＢＶ／時で再生した、非イオン性多孔性樹脂、すなわちＳＰ２０７（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ，Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）１ｌを充填したカラムにおいて浸出ろ過した。次にＧＳＨを水で溶出し、分画２から９を収集した。そのようにして得たＧＳＨ水溶液を５００ｇ／ｌに濃縮した。最後にＧＳＨを５０％エタノール溶液によって沈殿させた。９８％のＧＳＨ含量の白色結晶性粉末４ｇを得た。
【実施例２】
【００７４】
　１．４重量％より高いバイオマス単位当りのＧＳＨ含量を有する、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの非胞子形成性偶発突然変異株（我々の菌株コレクションではＧＮ／２２２０と特定される、ＮＣＹＣ　２９５８）を使用した。
【００７５】
　ステージ１
　前記菌株を、３つの異なる培地、すなわち（量はｇ／ｌで表している）ＹＰ（２０ペプトン、１０酵母抽出物、１０グリセロール、ｐＨ５）、ＹＰＧ（２０ペプトン、１０酵母抽出物、２０グルコース、ｐＨ５）及びＢ（６０ビート糖蜜−３０スクロースに等しい−、５（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ＫＨ２ＰＯ４、０．５酵母抽出物、０．２ＭｇＳＯ４、ｐＨ５．８）を使用して、１４ｌの発酵槽で２４時間バッチ培養した。培養条件は次の通りであった：２８℃、１ｖｖｍ空気、４００ｒｐｍ。泡止め剤：Ｓｉｇｍａ　ＰＰＧ　Ｎｏ．２０００。　ＹＰでの静止期フラスコ培養の接種物１０％（Ｖ／Ｖ）。
【００７６】
　表４は、７つの異なるバッチの結果を要約したものである。
【００７７】
【表８】
2004129647.tif 000009
【００７８】
　培地Ｂの場合には、細胞生産性が他の２つの培地の場合の２倍以上であることが認められる；また相対的最終収率は、３つの培地間でかなり異なるが、Ｂが最良の結果をもたらすことを示している。
【００７９】
　ステージ２
　先のステージから得たバイオマスを、１０，０００ｒｐｍで１０分間（５℃）遠心分離して収集し、脱イオン水で２回洗って、次の溶液（ｇ／ｌ）：
　グルコース　　　　　　８２
　酒石酸ナトリウム　　　１０
　アデニン　　　　　　　４
　システイン　　　　　　４
　メチオニン　　　　　　３．５
　ＫＨ２ＰＯ４　　　　　　３．５
中に７％濃度（乾燥バイオマス、ｗ／ｖ）で懸濁した。
【００８０】
　次に「バイオマス活性化」工程を、次の操作条件で３ｌ発酵槽において２４時間開始した：攪拌速度、５００ｒｐｍ；通気率、３ｖｖｍ；温度、２８℃。
【００８１】
　表５は、Ｂ培地又はＹＰＧ培地で得たバイオマスを使用した、４つの活性化実験のＧＳＨ収率をまとめたものである。
【００８２】
【表９】
2004129647.tif 000010
【００８３】
　初期ＧＳＨ含量に関わりなく、上述した２４時間の活性化工程は有意のＧＳＨ収率上昇を可能にすることが認められる。
【実施例３】
【００８４】
　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＮＣＹＣ　２９５８の菌株を、培地Ｂ（実施例２）を使用して５０ｌ発酵槽で３０時間バッチ培養した。静止期の接種物２０％。培養条件は実施例２の通りであった。
【００８５】
　増殖の間、１２時間目から開始して、２４時間目までサッカロースの濃度を１０％より高く保持するために、糖蜜の５回の添加（３時間ごと）を行った。
【００８６】
　どちらも乾燥重量で５８．８９ｇ／ｌのバイオマスと１．４５％のＧＳＨを得た。
【００８７】
　遠心分離で収集したバイオマス（実施例２）を１０％の濃度で再び懸濁し、次の溶液（ｇ／ｌ）：
　グルコース　　　　　　　　８２
　酒石酸ナトリウム　　　　　１０
　アデニン　　　　　　　　　４
　システイン　　　　　　　　４
　グルタミン酸ナトリウム　　５
　グリシン　　　　　　　　　５
　メチオニン　　　　　　　　３
　８５％　Ｈ３ＰＯ４　　　　　０．２５ｍｌ
中で「活性化」した。
【００８８】
　実施例２と同じ条件で、３．７ｇ／ｌの「活性化」に等しい、乾燥条件下で３．７％　ＧＳＨを得た。
【実施例４】
【００８９】
　植物材料から単離したＣａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉの１つの野生株を突然変異誘発し、実施例１で述べたのと同様の手順に従って、但しメチルグリオキサルを選択剤として使用して、突然変異株Ｎｏ．２１を選択した。この菌株は、Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉ、突然変異株２１、ＮＣＹＣ　２９８３、内部菌株コレクション　ＧＮ／２２２２と特定され、１．５重量％より高いバイオマス単位当りＧＳＨ含量を示した。
【００９０】
　ステージ１
　前記菌株を、培地Ｂを使用して１４ｌ発酵槽で２４時間バッチ培養したが、実施例３におけるように１８０ｇ／ｌ（サッカロースとして９０ｇ／ｌ）まで糖蜜を添加した。培養条件は次の通りであった：２８℃、１ｖｖｍ空気、４００ｒｐｍ。泡止め剤：Ｓｉｇｍａ　ＰＰＧ　Ｎｏ．ＹＰでの静止期フラスコ培養の接種物１０％（Ｖ／Ｖ）。
【００９１】
　表６は発酵の結果をまとめたものである。
【００９２】
【表１０】
2004129647.tif 000011
【００９３】
　ステージ２
　濃縮ＧＳＨ溶液（約６ｇ／ｌ）を得るために、上記のバッチから得たバイオマスを実施例１（ステージ８）で述べたように処理した。この溶液１ｌをＨ２ＳＯ４によってｐＨ１．８に調整し、次いで水中にＣｕ２Ｏ　１．４ｇを含む懸濁液１０ｍｌで処理した。温度を４℃に維持しながら、前記懸濁液を非常に静かに滴下した。次にこの溶液を４℃で２時間静かに攪拌し、その後一晩静かに放置した。
【００９４】
　ステージ３
　ろ過した後、沈殿物（９ｇ）を溶解した希硫酸で数回洗い、その後室温でＨ２Ｓによって可溶化した。ＧＳＨ４．５ｇを含む溶液を、三菱化学（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）によって製造される非イオン性樹脂、ＳＰ　２０７　１ｌに加えて、その後鉱物質除去水１０ＢＶで溶出した。分画を収集して（６ｌ）、濃縮し、水中５０％エタノールで処理してＧＳＨを沈殿させた。９９％の純度を示すＧＳＨ　３．５ｇを得た。
【実施例５】
【００９５】
　ＧＳＨの濃縮溶液（約６ｇ／ｌ）を得るために、実施例１及び４により得たバイオマスを実施例１（ステージ８）で述べたように処理した。この溶液１ｌをＨ２ＳＯ４によってｐＨ１．８に調整し、水浴で４０℃に加熱した。
【００９６】
　４０℃の温度で、Ｃｕ２Ｏ懸濁液１０ｍｌ（１．５ｇ）を水に加えた。
【００９７】
　３分後、生じた溶液を速やかに４℃にして、２時間攪拌下に保持した。
【００９８】
　２時間後、実施例３（ステージ３）におけるようにろ過した。ろ過後、沈殿物（０．５ｇ）をＨ２Ｓに溶解し、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ　Ｃｈｅｍｉｃａｌによって製造される非イオン性樹脂、ＳＰ　２０７で精製して、エタノール中で沈殿させた。９９％の純度のＧＳＨ　３．６ｇを得た。
【外国語明細書】
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