(57)【要約】【課題】　放射線増感のためのテキサフィリンを提供ならびにこのテキサフィリンによる放射線損傷を増強および先行技術の放射線増感剤の欠点の多くを克服。【解決手段】　放射線増感剤として使用するための薬学的組成物の調製におけるテキサフィリンの使用であって、ここで、テキサフィリンは、芳香族五座大員環「拡大ポルフィリン」であり、おそらくその固有の親油性のために、テキサフィリンは、新生物組織およびアテロームにおいて、非新生物組織および非アテロームプラークに関連して、より大きな生体局在化を示し、この新生物は良性または悪性の腫瘍であり得る、使用。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線増感剤として使用するための薬学的組成物の調製におけるテキサフィリンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　（発明の分野）
　本発明は、放射線増感剤、およびＸ線照射が治療に有効であることが判明した放射線増感および他の状態のためのテキサフィリン（ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）の使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
　（発明の背景）
　放射線増感剤は、放射線治療の効果を増強するために用いられる薬剤である。治療に有効と考えられる線量の放射線を送達するには、局所的に腫瘍を制御する必要性と、送達される放射線線量により周囲の正常組織に損傷を与える可能性との間のバランスをとることが必要である（Ｂｕｓｈら、１９７８）。従って、局所制御と両立できる最低限の放射線線量を用いることが望ましい。このことを達成するための１つの方法としては、送達放射線の腫瘍に対する細胞障害性を増強するために放射線増感剤を用いることが挙げられる。
【０００３】
　放射線照射は、細胞内の重大標的、最も一般的には染色体ＤＮＡに損傷を与えることにより細胞死を引き起こす（ＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎおよびＷｉｔｈｅｒｓ、１９９１）。放射線治療は、２つのタイプの電離放射線に依存する：（１）直接電離原子内粒子放射線（例えば、α粒子およびβ粒子（電子）、中性子、プロトン、中間子、重荷電イオンなど）、ならびに（２）間接電離電磁放射線（これは高周波Ｘ線またはγ線を包含する種々の周波数を有する波の一群として存在する）。しかし、これら２つのうち電磁放射線が今日、放射線治療においてより一般的に用いられている。組織において、Ｘ線またはγ線の形態の電磁放射線は、分子（特に水）と相互作用し得、高エネルギー電子の放出を引き起こす。この電子が、ＤＮＡ中の糖−リン酸結合を直接切断し得るか（直接的作用）、または電子放出の過程において、ＤＮＡ中の化学（糖−リン酸）結合を切断し得る遊離（非荷電）ラジカルを最終的に生じさせ得る（間接的作用）。間接的メカニズムを通して引き起こされる損傷がより重要である（ＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎおよびＷｉｔｈｅｒｓ、１９９１；Ｍｕｌｃａｈｙら、１９９３；ＲｕｂｉｎおよびＳｉｅｍａｎｎ、１９９３；Ｃｈａｐｍａｎら、１９７４）。これらの損傷効果は、以下に示されるような水の放射線生成物によって媒介される：
【０００４】
【化１】
2004091495.tif 000002
　放射線損傷は、主としてヒドロキシルラジカル、ＨＯ●、すなわち酸化ラジカルにより生成される。このラジカルは高い反応性を有し、短命である。このラジカルは、主としてそれが生成される周辺（±４ｎｍ）に損傷を引き起こす。ラジカルが水和電子（ｅ−ａｑ）と接触するような場合、このラジカルは、水酸化物イオン（ＯＨ−）への変換により不活性化される。水和電子は強い還元種であり、高エネルギー性である。水和電子は、ヒドロキシルラジカルに比較すると非常に可動性であり、即座に移動し得、そして直接的作用を通じてＤＮＡを損傷し得る。しかし、上述したように、水和電子もまたヒドロキシルラジカルを容易に不活性化させる。強い電子親和性を有する薬剤は、溶媒和電子を「吸収する（ｓｏａｋ　ｕｐ）」ことによって、それらがヒドロキシルラジカルを中和することを防ぎ、それによりヒドロキシルラジカルにそれらの効果を及ぼし得る（ＡｄａｍｓおよびＤｅｗｅｙ、１９６３）。従って、酸素および強い電子親和性を有する他の化合物が放射線増感剤として作用することが期待される。
【０００５】
　放射線照射により誘導された細胞損傷に対する生物学的応答は種々の内因性および外因性の化合物により調整され得るので、放射線治療が局所治癒を首尾良く達成できないことには種々の要因が考えられる。例えば、スルフヒドリル化合物（システイン、ジチオトレイトール、およびシステアミンを包含する）は、還元剤として作用し（ＲｕｂｉｎおよびＳｉｅｍａｎｎ、１９９３）、そしてイオン対の組換えを容易にすることにより、生細胞を電離放射線の致死効果に対して保護することが示されている。細胞性スルフヒドリル化合物の涸渇が放射線増感を生じ得ることもまた観察されている。
【０００６】
　放射線治療の失敗の原因となる主な要因の１つ、すなわち耐放射線性は、低酸素である。固形腫瘍中の低酸素細胞は、電離放射線の損傷効果に対して２．５〜３倍耐性であることが観察されている（Ｔａｎｎｏｃｋ、１９７２；Ｗａｔｓｏｎら、１９７８；両方ともＢｒｏｗｎ、１９８４に引用されている）。腫瘍の局所治癒／制御速度は、放射線線量が有効に増加すると共に増加し得る；しかし、このような増加は、周辺部の十分に酸素化された正常組織を腫瘍細胞より大きな程度で損傷させる（ＳｈｅｎｏｙおよびＳｉｎｇｈ、１９９２）。腫瘍放射線増感の特定の改変は、放射線量の分割照射（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）および放射線化学増感剤の使用の試みにより達成される腫瘍酸素化状態の変化を通じて行われた（Ｗａｎｇ、１９８８；ＳｈｅｎｏｙおよびＳｉｎｇｈ、１９９２）。
【０００７】
　この分割照射により、線量回分の間で細胞再集合（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）および致死量以下の損傷の修復が起こり、１回の激しい線量の照射に比較して、正常組織における放射線照射影響が減少される。悪性腫瘍組織では、放射線増感酸素化細胞が破壊されて、続いて腫瘍の大きさが減少する。続いて、機能的な脈管構造から離れた位置にある耐放射線性の低酸化細胞が再度酸素化され、従って放射線感受性になる。また、細胞周期内での細胞の再分類が生じ、これにより癌細胞をより放射線感受性にする。このように腫瘍細胞と正常細胞との間で応答の差異が生じるので、放射線の分割照射により、等線量の１回の放射線照射よりも殺腫瘍性となる。
【０００８】
　種々のタイプの電子親和性試薬は、酸素供給の漸減により細胞の放射線増感を促進することが知られている（ＳｈｅｎｏｙおよびＳｉｎｇｈ、１９９２）。しかし、これらのほとんどがインビボにおける非毒性線量の照射では活性を示さない。例えば、よりよく知られている薬剤の１つであるミソニダゾールを用いる臨床試験は、それが多くの動物およびヒトの腫瘍に対して非常に有効であることを示した（Ｔｈｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９７６；Ａｓｈら、１９７９；Ｄｅｎｅｋａｍｐら、１９８０；これら全てはＢｒｏｗｎ、１９８４に引用されている）。しかし、神経の副作用のために、その臨床有用性が深刻に制限される（Ｋａｌｌｍａｎ、１９７２；Ｄｉｓｃｈｅら、１９７７；Ｕｒｔａｓｕｎら、１９７８；Ｗａｓｅｒｍａｎら、１９７９；これら全てはＢｒｏｗｎ、１９８４に引用されている；およびＤｉｓｃｈｅら、１９７９）。ニトロイミダゾール治療指数を改善することを目的としたアプローチは、親油性を低下させて神経組織貫入および毒性を制限すること、および腎クリアランスを促進することを包含する（Ｂｅａｒｄら、１９９３）。これらのミソニダゾール第２世代アナログを用いる臨床試験もまた報告されており、現在続行中である（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９８４；Ｃｏｌｅｍａｎら、１９８４；Ｓａｕｎｄｅｒｓら、１９８４；Ｃｏｌｅｍａｎら、１９８６；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９８６；Ｎｅｗｍａｎら、１９８６；Ｄｉｓｃｈｅら、１９８６；Ｃｏｌｅｍａｎら、１９８７；Ｎｅｗｍａｎら、１９８８；Ｗｏｒｋｍａｎら、１９８９）。しかし、このアプローチは、まだ非常に有効な低酸素細胞増感剤を生成していない。
【０００９】
　ハロゲン化ピリミジンもまた放射線増感剤として研究されている。これらの薬剤は、ＤＮＡの構造変化を通して細胞の放射線感受性を変化させ、ＤＮＡを放射線不活化に対してより感受性にする。しかし、薬物は長期間にわたって細胞内に存在しなければならない。これは、放射線増感の程度がチミジン置換の程度に直接関連するからである。さらに、薬剤は、急速な肝分解および脱ハロゲン化を受け得る（ＳｈｅｎｏｙおよびＳｉｎｇｈ、１９９２）。ハロゲン化ピリミジンの長期使用を限定する主な要因は、骨髄毒性になることである（Ｋｉｎｓｅｌｌａら、１９８４ａ；Ｋｉｎｓｅｌｌａら、１９８４ｂ；Ｋｉｎｓｅｌｌａら、１９８５；ＳｈｅｎｏｙおよびＳｉｎｇｈ、１９９２に引用されている）。
【００１０】
　低酸素細胞増感剤は、癌治療の化学改変剤の広範なカテゴリーに入る。化学改変剤は通常それ自身細胞障害性ではないが、標準的な放射線治療に対する組織応答を改変または増強する。放射線治療または化学的治療の改変剤の最終的な有用性は、それが治療指数を改変する能力に依存する。
【００１１】
　テキサフィリンは以下に記載されている：米国特許第４，９３５，４９８号、第５，１６２，５０９号、第５，２５２，７２０号、第５，２９２，４１４号、第５，２７２，１４２号、および第５，２５６，３９９号；米国特許出願第０８／１３５，１１８号、第０８／１９６，９６４号、第０８／２９４，３４４号、および第０８／２２７，３７０号；ならびにＰＣＴ／ＵＳ９４／０６２８４、これらは全て本明細書中に参考として援用されている。種々のテキサフィリンの光物理的特性が米国特許第５，２５２，７２０号（本明細書中に参考として援用されている）に報告されており、これは６９０〜８８０ｎｍのスペクトル範囲の強い低エネルギー光吸収、高い三重項量子収率、および一重項酸素の効率的な生成を含む。米国特許第５，２５２，７２０号にはまた、種々の置換テキサフィリン金属錯体を用いる包膜ウイルスの光増感不活性化、ならびにアテローム、肝臓、腎臓、および腫瘍の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）が記載されている。これらの大員環の側鎖基の極性および電荷を変化させることにより、ＨＩＶ−１のような遊離包膜ウイルスおよびウイルス感染周辺単核細胞への結合の程度、速度、および部位が変化し、従って光増感剤の取り込み、および骨髄を汚染する白血病細胞またはリンパ腫細胞の光増感が調整される。有用な方法としては、アテロームならびに良性および悪性腫瘍の処置において、磁気共鳴画像法でこれらのテキサフィリンを用い、次いで光力学的腫瘍治療を行うことが包含される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
　本発明の目的は、放射線増感のためのテキサフィリンを提供することである。テキサフィリンは放射線損傷を増強し、先行技術の放射線増感剤の欠点の多くを克服する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
項目１．放射線増感剤として使用するための薬学的組成物の調製におけるテキサフィリンの使用。
項目２．前記テキサフィリン組成物がさらに、宿主中の新生物またはアテロームの局在化のために用いられる、項目１に記載の使用。
【００１４】
項目３．前記局在化が、蛍光手段、磁気共鳴画像手段、またはガンマカメラ身体走査手段により行われる、項目２に記載の使用。
【００１５】
項目４．前記テキサフィリンが感光性テキサフィリンであり、そして該感光性テキサフィリン組成物がさらに、新生物またはアテロームの光力学的治療のために用いられる、項目１、２、または３に記載の使用。
【００１６】
項目５．前記薬学的組成物の調製において感光性テキサフィリンをさらに含む、項目１、２、または３に記載の使用であって、該組成物がさらに、新生物またはアテロームの光力学的治療のために用いられる、使用。
【００１７】
項目６．前記テキサフィリンが金属と錯形成されている、項目１から５のいずれか１項に記載の使用。
【００１８】
項目７．前記金属がγ放出性金属である、項目６に記載の使用。
【００１９】
項目８．前記組成物がガンマカメラ身体画像法によるテキサフィリンの局在化のために用いられる、項目７に記載の使用。
【００２０】
項目９．前記金属が常磁性金属である、項目６に記載の使用。
【００２１】
項目１０．前記組成物が磁気共鳴画像法によるテキサフィリンの局在化のために用いられる、項目９に記載の使用。
【００２２】
項目１１．前記金属が放射性金属である、項目６に記載の使用。
【００２３】
項目１２．前記テキサフィリンが以下の構造ＡまたはＢを有する、項目１から１１のいずれか１項に記載の使用：
【００２４】
【化２】
2004091495.tif 000003
ここで、
　ＭはＨ、二価金属カチオン、または三価金属カチオンであり；
　Ｒ１からＲ４およびＲ６からＲ９は、独立して、水素、ヨーダイド以外のハライド、ヒドロキシル、アルキル、アリール、ヨードアルキル以外のハロアルキル、ニトロ、ホルミル、アシル、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、糖類、アミノアルキル、オキシアミノアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、部位指向性分子、または部位指向性分子に対するカップルであり；
　Ｒ５およびＲ１０は、独立して、水素、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、アミノアルキル、オキシアミノアルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、または部位指向性分子に対するカップルであり；
　Ｒ１１は、アルキル、アルケニル、オキシアルキル、またはヒドロキシアルキルであり、ここで、これらは約３個までの炭素原子を有し、そして第１結合炭素原子の周囲で回転可動性を有し；
　　ここでＲ６およびＲ９が水素以外である場合、Ｒ５およびＲ１０は水素またはメチルであり；
　　ここでＲ５およびＲ１０が水素以外である場合、Ｒ６およびＲ９は水素、ヒドロキシル、またはヨーダイド以外のハライドであり；そして
　Ｎは０、１、または２である。
【００２５】
項目１３．前記部位指向性分子が、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、ステロイド、ホルモン、ホルモン擬態、または大員環である、項目１２に記載の使用。
【００２６】
項目１４．Ｒ１が（ＣＨ２）２ＣＨ２ＯＨであり；Ｒ２およびＲ３がＣＨ２ＣＨ３であり；Ｒ４がＣＨ３であり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、およびＲ１０がＨであり；そしてＲ８が部位指向性分子、または部位指向性分子に対するカップルであり；そしてＲ１１がメチルである、項目１２または１３に記載の使用。
項目１５．Ｒ４がメチルであり、そしてＲ１からＲ３およびＲ５からＲ１０が、テキサフィリンＡ１からＡ３８に関する表１に記載の通りである、項目１２または１３に記載の使用。
【００２７】
項目１６．Ｒ２およびＲ３がエチルであり、Ｒ４がメチルであり、そしてＲ１およびＲ５からＲ１０が、テキサフィリンＢ１からＢ２８に関する表２に記載の通りである、項目１２または１３に記載の使用。
【００２８】
項目１７．Ｒ１が（ＣＨ２）２ＣＨ２ＯＨであり；Ｒ２およびＲ３がＣＨ２ＣＨ３であり；Ｒ４がＣＨ３であり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９、およびＲ１０がＨであり；Ｒ７およびＲ８がＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；そしてＲ１１がメチルである、項目１２に記載の使用。
【００２９】
項目１８．Ｒ１がＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；Ｒ２およびＲ３がＣＨ２ＣＨ３であり；Ｒ４がＣＨ３であり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９、およびＲ１０がＨであり；Ｒ７およびＲ８がＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり；そしてＲ１１がメチルである、項目１２に記載の使用。
【００３０】
項目１９．前記感光性テキサフィリンが反磁性金属と錯形成されており、そして該反磁性金属がＬｕ（ＩＩＩ）、Ｌａ（ＩＩＩ）、およびＩｎ（ＩＩＩ）からなる群から選択される、項目４または５に記載の使用。
【００３１】
項目２０．前記薬学的組成物が、新生物またはアテロームを有するヒト患者に投与される、項目１から１９のいずれか１項に記載の使用。
【００３２】
項目２１．放射線増感剤を用いる新生物またはアテロームを有する患者の放射線治療の改善方法であって、該改善が放射線増感剤として有効量のテキサフィリンで該患者を処置する工程を包含する、方法。
【００３３】
項目２２．以下の構造を有するテキサフィリン：
【００３４】
【化３】
2004091495.tif 000004
ここで、
　Ｒ１からＲ４およびＲ６からＲ９は、独立して、水素、ヨーダイド以外のハライド、ヒドロキシル、アルキル、アリール、ヨードアルキル以外のハロアルキル、ニトロ、ホルミル、アシル、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、糖類、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、部位指向性分子、または部位指向性分子に対するカップルであり；
　Ｒ５およびＲ１０は、独立して、水素、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、または部位指向性分子に対するカップルであり；
　Ｒ１１は、アルキル、アルケニル、オキシアルキル、またはヒドロキシアルキルであり、ここで、これらは約３個までの炭素原子を有し、そして第１結合炭素原子の周囲で回転可動性を有し；
　　ここでＲ６およびＲ９が水素以外である場合、Ｒ５およびＲ１０は水素またはメチルであり；そして
　　ここでＲ５およびＲ１０が水素以外である場合、Ｒ６およびＲ９は水素、ヒドロキシル、またはヨーダイド以外のハライドである。
【００３５】
項目２３．前記部位指向性分子が、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、ステロイド、ホルモン、ホルモン擬態、または大員環である、項目２２に記載のテキサフィリン。
【００３６】
項目２４．Ｒ１が（ＣＨ２）２ＣＨ２ＯＨであり；Ｒ２およびＲ３がＣＨ２ＣＨ３であり；Ｒ４がＣＨ３であり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、およびＲ１０がＨであり；Ｒ８が部位指向性分子、または部位指向性分子に対するカップルであり；そしてＲ１１がメチルである、項目２２または２３に記載のテキサフィリン。
【００３７】
項目２５．Ｒ１が（ＣＨ２）２ＣＨ２ＯＨであり；Ｒ２およびＲ３がＣＨ２ＣＨ３であり；Ｒ４がＣＨ３であり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９、およびＲ１０がＨであり；Ｒ７およびＲ８がＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであるか、またはＲ７およびＲ８がＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり；そしてＲ１１がメチルである、項目２２に記載のテキサフィリン。
【００３８】
項目２６．項目２２または２３に記載のテキサフィリンを合成する方法であって、以下の工程を包含する、方法：
　　有機溶媒中で、非芳香族テキサフィリン、ブレンステッド塩基、および酸化体を混合する工程であって、ここで、該芳香族テキサフィリンは約３個までの炭素原子のアルキル、アルケニル、オキシアルキル、またはヒドロキシアルキルを有し、かつ中心トリピラン環窒素上の第１結合炭素原子の周囲で回転可動性を有する、工程；および
　　該混合物を、少なくとも２時間室温で撹拌するかまたは還流下で加熱して、芳香族テキサフィリンを形成する工程であって、該芳香族テキサフィリンは約３個までの炭素原子のアルキル、アルケニル、オキシアルキル、またはヒドロキシアルキルを有し、かつ中心トリピラン環窒素上の第１結合炭素原子の周囲で回転可動性を有する、工程。
【００３９】
項目２７．前記非芳香族テキサフィリンが、構造Ｉを有するジホルミルトリピロールと、構造ＩＩを有するオルト−フェニレンジアミンとを縮合させることにより生成される、項目２６に記載の方法：
【００４０】
【化４】
2004091495.tif 000005
ここで、
　Ｒ１からＲ４およびＲ６からＲ９は、独立して、水素、ヨーダイド以外のハライド、ヒドロキシル、アルキル、アリール、ヨードアルキル以外のハロアルキル、ニトロ、ホルミル、アシル、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、糖類、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、部位指向性分子、または部位指向性分子に対するカップルであり；
　Ｒ５およびＲ１０は、独立して、水素、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、または部位指向性分子に対するカップルであり；
　Ｒ１１は、アルキル、アルケニル、オキシアルキル、またはヒドロキシアルキルであり、ここで、これらは約３個までの炭素原子を有し、そして第１結合炭素原子の周囲で回転可動性を有し；
　　ここでＲ６およびＲ９が水素以外である場合、Ｒ５およびＲ１０は水素またはメチルであり；そして
　　ここでＲ５およびＲ１０が水素以外である場合、Ｒ６およびＲ９は水素、ヒドロキシル、またはヨーダイド以外のハライドである。
【００４１】
項目２８．Ｒ１１がメチルである、項目２７に記載の方法。
【００４２】
　（発明の要旨）
　本発明は、放射線増感剤としてのテキサフィリンを提供する。本発明はさらに新生物またはアテロームを有する宿主のための放射線治療方法を提供し、以下の工程を包含する：ｉ）宿主にテキサフィリンを投与する工程、およびｉｉ）新生物またはアテロームの近位部のテキサフィリンに電離放射線を照射する工程。テキサフィリンは、本明細書中で放射線増感特性を有することが示されている；それらは、コントロール実験と比較されるように、テキサフィリンの周辺部で電離放射線からの細胞障害性を増強する。電離放射線は、Ｘ線、内部および外部γ発光ラジオアイソトープ、およびイオン化粒子を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
　テキサフィリンは、芳香族五座大員環「拡大ポルフィリン」である。テキサフィリン、水溶性テキサフィリン、および調製方法は当該分野で公知であり、本明細書中に参考として先に援用されている米国特許および米国特許出願に開示されている。おそらくその固有の親油性のために、テキサフィリンは、新生物組織およびアテロームにおいて、非新生物組織および非アテロームプラークに関連して、より大きな生体局在化を示す。新生物は良性または悪性の腫瘍であり得る。
【００４４】
　上記方法は、検出可能なテキサフィリンに関連づけることにより、宿主における局在化部位を決定するさらなる工程を包含し得る。本明細書中で用いられる「検出可能なテキサフィリンに関連づけることにより」とは、位置が、以下のような局在化手段、例えば、蛍光分光法（特に、テキサフィリンが非メタル化されているか、または反磁性金属と錯形成されている場合）；磁気共鳴画像法（テキサフィリンが常磁性金属を含有する場合）；ガンマカメラ身体走査法（金属がγ放出性である場合）；または診断用Ｘ線、特にテキサフィリンに結合した金属のＫ電子の周囲にエネルギーを有する単色または多色Ｘ線を用いることにより見出され得ることを意味する。放射性免疫診断のためのγ放出性金属は、米国特許第５，２５２，７２０号に記載されており、これは本明細書中に参考として援用されている。好ましいγ放出性金属は１１１Ｉｎ（ＩＩＩ）である。
【００４５】
　これらの各方法において、テキサフィリンは金属と錯形成されているが、この金属がテキサフィリンの放射線増感特性の中心となるわけではない。金属は、テキサフィリン錯体の安定性にとって重要であり得る。電離放射線は、金属が放射性金属でない限り、外部由来である。ある場合では、電離放射線は放射性金属由来であり、外部からの放射線と組み合わせて用いられ得る。
【００４６】
　本発明のさらなる実施態様は、新生物またはアテロームの処置における放射線増感および光力学的治療の組合せ方法のためのテキサフィリンの使用である。この方法は、感光性テキサフィリンの投与、および新生物またはアテロームの近位に電離放射線および光を送達することを包含する。感光性テキサフィリンはメタルフリーのテキサフィリンまたはテキサフィリン−反磁性金属錯体である。あるいは、検出可能な第１のテキサフィリンが、検出可能なテキサフィリンに関連づけることにより局在化が行われ得るように投与され得る。第２の感光性テキサフィリンは、放射線増感および光力学的治療の両方が行われ得るように、第１のテキサフィリンと共にまたはその後に投与され得る。この方法は、以下の工程を包含する：ｉ）宿主に、第１の薬剤として検出可能なテキサフィリンを投与する工程、ｉｉ）検出可能なテキサフィリンに関連づけることにより宿主中の局在化部位を決定する工程、ｉｉｉ）宿主に、第２の薬剤として感光性テキサフィリンを投与する工程、およびｉｖ）新生物またはアテロームの近位に電離放射線照射および光照射を行う工程。第２の薬剤は、第１の薬剤と本質的に同一の生体局在化特性を有し、光への暴露の際に酸素を生成する能力を示す。光力学的効果は、無酸素性電子転移プロセスまたは有酸素性酸素ベースプロセスから誘導され得る。細胞障害性酸素生成物は、一重項酸素、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシド、またはヒドロパーオキシルラジカルであり得る。感光性テキサフィリンは、反磁性金属錯体またはメタルフリー種であり得る。本発明の好ましい反磁性金属テキサフィリン錯体は、Ｂ２Ｔ２（米国特許第５，２５２，７２０号を参照のこと、これは本明細書中に参考として援用されている）またはＴ２ＢＥＴ（本出願の実施例１を参照のこと）のＬｕ（ＩＩＩ）、Ｌａ（ＩＩＩ）、またはＩｎ（ＩＩＩ）錯体である。
【００４７】
　テキサフィリン金属錯体は、’７２０号特許に記載されるように、固有の生体局在化特異性を有しており、例えば、肝臓、腎臓、腫瘍、およびアテロームのような脂質リッチ領域に局在化している。非新生物組織および非アテロームプラークに比較して、新生物組織およびアテロームにおいて「より大きな生体局在化を示す」とは、非新生物組織および非アテロームプラークに関連して新生物組織およびアテロームに対してより大きな固有の親和性を有することを意味する。「本質的に同一の生体局在化特性」とは、第２の薬剤が、組織において第１の薬剤により示されるのとほぼ同様の選択標的特性を有するテキサフィリン誘導体であることを意味する。第１の薬剤および第２の薬剤は、同一のテキサフィリンであり得る。重要なことに、ヒドロキシル化テキサフィリンは、親油性領域への局在化に対して最適であり、さらに取り扱いを容易にするに十分な水溶性を示す脂質−水分配係数を有する。
【００４８】
　テキサフィリンは、以下の構造ＡまたはＢのテキサフィリンから選択され得る：
【００４９】
【化５】
2004091495.tif 000006
【００５０】
【化６】
2004091495.tif 000007
ここで、Ｍは、Ｈ、二価金属カチオン、または三価金属カチオンである。好ましい二価金属カチオンは、以下からなる群から選択される：Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｈｇ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｓｍ（ＩＩ）、およびＵＯ２（ＩＩ）。好ましい三価金属カチオンは、以下からなる群から選択される：Ｍｎ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｈｏ（ＩＩＩ）、Ｃｅ（ＩＩＩ）、Ｙ（ＩＩＩ）、Ｉｎ（ＩＩＩ）、Ｐｒ（ＩＩＩ）、Ｎｄ（ＩＩＩ）、Ｓｍ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｔｂ（ＩＩＩ）、Ｄｙ（ＩＩＩ）、Ｅｒ（ＩＩＩ）、Ｔｍ（ＩＩＩ）、Ｙｂ（ＩＩＩ）、Ｌｕ（ＩＩＩ）、Ｌａ（ＩＩＩ）、およびＵ（ＩＩＩ）。
【００５１】
　このテキサフィリン構造において、Ｒ１からＲ４およびＲ６からＲ９は、独立して、水素、ヨーダイド以外のハライド、ヒドロキシル、アルキル、アリール、ヨードアルキル以外のハロアルキル、ニトロ、ホルミル、アシル、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、糖類、アミノアルキル、オキシアミノアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、部位指向性分子、または部位指向性分子に対するカップルである。Ｒ５およびＲ１０は、独立して、水素、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、アミノアルキル、オキシアミノアルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、または部位指向性分子に対するカップルであり；そしてＲ１１は、アルキル、アルケニル、オキシアルキル、またはヒドロキシアルキルであり、ここで、これらは約３個までの炭素原子を有し、そして第１結合炭素原子の周囲で回転可動性を有する。上記のテキサフィリンにおいて、ここでＲ６およびＲ９が水素以外である場合、Ｒ５およびＲ１０は水素またはメチルである；そしてここでＲ５およびＲ１０が水素以外である場合、Ｒ６およびＲ９は水素、ヒドロキシル、またはヨーダイド以外のハライドである。Ｎは０、１、または２である。
【００５２】
　上記のテキサフィリンにおいて、ヨーダイド以外のハライドとは、フルオライド、クロライド、またはブロマイドであり得る。アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、糖類、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、または部位指向性分子は、炭素−炭素結合または炭素−酸素結合を介してテキサフィリンに共有結合している。アリールは、フェニル置換基、またはニトロ、カルボキシ、スルホン酸、ヒドロキシ、オキシアルキル、またはヨーダイド以外のハライドを有するフェニル置換基であり得る。この場合、フェニル基における置換基は、大員環を形成する縮合工程後の合成工程において添加され得る。
【００５３】
　本発明の１つの実施態様では、テキサフィリンは部位指向性分子にカップリングされて、標的インビボ送達のための複合体を形成する。「標的部位に対する特異性」とは、テキサフィリン複合体と標的部位とを、例えば、イオン強度、温度、ｐＨなどの生理的条件下で接触させた際に、特異的結合が生じることを意味する。この相互作用は、複合体の特定の残基と標的の特異的な残基との特異的な静電的相互作用、疎水的相互作用、エントロピー相互作用、または他の相互作用により生じ、この相互作用を促進するに有効な条件下で安定な錯体を形成し得る。
【００５４】
　本発明において意図されている代表的な部位指向性分子は、以下を包含するが、これらに限定されない：オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチドアナログ；ポリアミド（生物学的レセプターに対して親和性を有するペプチド、およびタンパク質（例えば、抗体、低密度リポタンパク質、およびリポタンパク質のＡＰＯタンパク質）を包含する）；ステロイドおよびステロイド誘導体；ホルモン（例えば、エストラジオールまたはヒスタミン）；ホルモン擬態（例えばモルヒネ）；ならびにさらなる大員環（例えば、サフィリン（ｓａｐｐｈｙｒｉｎ）およびルビリン（ｒｕｂｙｒｉｎ））。オリゴヌクレオチドは、インビボ安定性を促進するために、塩基、糖、鎖末端、または主骨格のリン酸基で誘導体化され得る。リン酸基の修飾は本発明の１つの実施態様において好ましい。これはリン酸結合がヌクレアーゼ活性に対して感受性であるからである。好ましい誘導体は、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、およびホスホルアミデートなどである。さらに、リン酸結合は、非リン酸結合（例えば、アミド結合）と完全に置換され得る。オリゴヌクレオチド鎖の末端への付加はまた、エキソヌクレアーゼ耐性を提供する。糖修飾は、リボヌクレオチドにおけるリボース部分の酸素に結合されるアルキル基を含み得る。特に、このアルキル基は、好ましくはメチル基であり、そしてこのメチル基は、リボースの２’酸素に結合している。他のアルキル基はエチルまたはプロピルであり得る。用語「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で用いられるように、天然に存在するヌクレオチドおよび合成ヌクレオチドの両方、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、ならびにそれらのアナログおよび誘導体のことをいう。
【００５５】
　用語「テキサフィリン−オリゴヌクレオチド複合体」とは、テキサフィリンが、複合体の内部残基となるように、オリゴヌクレオチドがテキサフィリンに５’結合または３’結合あるいはその両方のタイプの結合で結合されていることを意味する。このオリゴヌクレオチドまたは他の部位指向性分子は、結合基を介してテキサフィリンに直接結合され得るか、または可変長のカップルを介してテキサフィリンに直接結合され得るかのいずれかである。処理の間、例えば、テキサフィリン金属錯体−オリゴヌクレオチド複合体のテキサフィリン部分は、オリゴヌクレオチドがその相補的ＤＮＡに結合する際に標的組織の周辺に配置されることが想起される。
【００５６】
　カップルは、結合基、すなわちテキサフィリン大員環から離れて別の分子に共有結合されるように設計された反応基の反応により形成される共有結合生成物でとして記載され得る。代表的な結合基またはカップルは、アミド、アミン、チオエーテル、エーテル、またはオリゴヌクレオチドの結合についての実施例に記載されているようなリン酸共有結合である。最も好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドおよび他の部位指向性分子は、炭素−窒素結合、炭素−イオウ結合、または炭素−酸素結合を介してテキサフィリンに共有結合される。オリゴヌクレオチド、抗体、ホルモン、またはサフィリンは、処置部位への局在化に対する結合特異性を有し得、そして生物学的レセプターは処置部位に局在化され得る。
【００５７】
　用語「生物学的レセプターに対して親和性を有するペプチド」とは、ペプチドと生物学的レセプターとを、例えば、イオン強度、温度、ｐＨなどの適切な条件下で接触させた際に、特異的結合が生じることを意味する。この相互作用は、ペプチドの特定のアミノ酸またはグリコール酸残基とレセプターの特定のアミノ酸またはグリコール酸残基との特異的な静電的相互作用、疎水的相互作用、エントロピー相互作用、または他の相互作用により生じ、この相互作用を促進するに有効な条件下で安定な錯体を形成し得る。この相互作用は、３次元コンホメーション、ならびに相互作用に関与するペプチドおよびレセプターのいずれかまたは両方の機能または活性を変化させ得る。生物学的レセプターについて親和性を有するペプチドは、エンドルフィン、エンケファリン、成長因子（例えば、上皮成長因子）、ポリ−Ｌ−リジン、ホルモン、タンパク質のペプチド領域などを包含し得る。ホルモンは、例えばエストラジオールであり得る。
【００５８】
　上記構造ＡおよびＢが本発明において好ましいが、本発明はこれらに限定されず、いかなるテキサフィリンまたはテキサフィリン金属錯体が本発明の放射線増感方法において用いられ得る。
【００５９】
　本明細書中で提供されるテキサフィリンを用いる放射線治療方法は、処置の特異性を最適化するための多数の戦略を取り込んでいる。第１には、テキサフィリンの脂質リッチ組織への固有の生体局在化であり、第２には、部位指向性分子をテキサフィリンの周囲に複合体化させることが可能なことであり、そして第３には、特定の部位に放射線を照射することが可能なことである。例えば、相補的オリゴヌクレオチドは、標的基質と塩基対合するように設計され、そして投射放射線の位置決め（手動または機械的手段のいずれかによる）は、細胞障害性が特定の生体部位（例えば、深部腫瘍部位（ｄｅｅｐ−ｓｅａｔｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｓｉｔｅ））で効果を及ぼすことが必要とされる場合、特に有利となる。この場合において、光力学的治療は、処置のための放射線治療と有利に組み合わされ得る。テキサフィリンは、身体組織が比較的透過である波長（７００〜９００ｎｍ）の光を吸収するという事実が、特に有利である。この手順により、身体内の深部で放射線および光ベースのオリゴヌクレオチド戦略が遂行され得る。この手順は、テキサフィリンまたはテキサフィリン複合体が局在化されない場合に、他の組織の放射線照射による損傷または感光性を比較的ほとんど生じさせない。
【００６０】
　上記のテキサフィリン構造Ａにおいて、Ｎは典型的には２以下の整数である。二価または三価の金属カチオンを有する塩基性大員環の文脈においては、Ｎは１または２である；しかし、当業者は、本明細書の開示を考慮すれば、Ｎの値が置換基Ｒ１からＲ１０に存在する電荷、および共有結合した部位指向性分子に存在する電荷（例えば、オリゴヌクレオチドのリン酸基の電荷）によって変化することを認識し得る。
【００６１】
　アルキルとは、１〜１０個の炭素原子からなる直鎖状または分枝状のアルキル基を意味する。アルケニルとは、１〜１０個の炭素原子からなり、１または２個の二重結合を有する直鎖状または分枝状のアルケニル基を意味する。ヒドロキシアルキルとは、１〜２０個のヒドロキシル基が結合されているアルキル基を意味する。アルコキシとは、酸素に結合しているアルキル基を意味する。ヒドロキシアルコキシ基とは、エーテル結合、およびヒドロキシル基または置換ヒドロキシル基などを有するアルキル基を意味する。糖類は、酸化糖、還元糖、または置換糖を包含し、ヘキソース（例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、またはＤ−ガラクトース）；ペントース（例えば、Ｄ−リボースまたはＤ−アラビノース）；ケトース（例えば、Ｄ−リブロースまたはＤ−フルクトース）；二糖類（例えば、スクロース、ラクトース、またはマルトース）；誘導体（例えば、アセタール、アミン、ホスホリル化糖）；オリゴ糖、ならびに種々の糖の開環鎖形態などが挙げられる。アミン誘導体化糖の例には、ガラクトサミン、グルコサミン、シアリル酸、およびＤ−グルカミン誘導体（例えば、１−アミノ−１−デオキシソルビトール）がある。アミノアルキルとは、アミン基を有するアルキル基を意味する。オキシアミノアルキルとは、エーテル結合を有し、かつアミン基を有するアルキル基を意味する。カルボキシアミドアルキルとは、二級または三級アミド結合などを有するアルキル基を意味する。カルボキシアルキルとは、１つ以上のカルボキシル基、または１つ以上のエステル結合を有するアルキル基を意味する。
【００６２】
　上記のテキサフィリン構造について、ヒドロキシアルコキシは、独立してヒドロキシ置換基およびエーテル分枝を有するアルキル基であり得るか、またはＣ（ｎ−ｘ）Ｈ（（２ｎ＋１）−２ｘ）ＯｘＯｙまたはＯＣ（ｎ−ｘ）Ｈ（（２ｎ＋１）−２ｘ）ＯｘＯｙ（ここでｎは、１から１０までの正の整数であり、ｘは、０またはｎ以下の正の整数であり、そしてｙは、０または（（２ｎ＋１）−２ｘ）以下の正の整数である）であり得る。ヒドロキシアルコキシまたは糖類は、ＣｎＨ（（２ｎ＋１）−ｑ）ＯｙＲａｑ、ＯＣｎＨ（（２ｎ＋１）−ｑ）ＯｙＲａｑ、または（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒａ（ここでｎは、１から１０までの正の整数であり、ｙは、０または（（２ｎ＋１）−ｑ）未満の正の整数であり、ｑは、０または２ｎ＋１以下の正の整数であり、そしてＲａは、独立してＨ、アルキル、ヒドロキシアルキル、糖類、Ｃ（ｍ−ｗ）Ｈ（（２ｍ＋１）−２ｗ）ＯｗＯｚ、Ｏ２ＣＣ（ｍ−ｗ）Ｈ（（２ｍ＋１）−２ｗ）ＯｗＯｚ、またはＮ（Ｒ）ＯＣＣ（ｍ−ｗ）Ｈ（（２ｍ＋１）−２ｗ）ＯｗＯｚである）であり得る。この場合において、ｍは、１から１０までの正の整数であり、ｗは、０またはｍ以下の正の整数であり、ｚは、０または（（２ｍ＋１）−２ｗ）以下の正の整数であり、そしてＲは、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、またはＣｍＨ（（２ｍ＋１）−ｒ）ＯｚＲｂｒ（ここでｍは、１から１０までの正の整数であり、ｚは、０または（（２ｍ＋１）−ｒ）未満の正の整数であり、ｒは、０または２ｍ＋１以下の整数であり、そしてＲｂは、独立してＨ、アルキル、ヒドロキシアルキル、または糖類である）である。
【００６３】
　カルボキシアミドアルキルは、二級または三級アミド連結、または（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲａ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲａ、（ＣＨ２）ｎＣＯＮ（Ｒａ）２、またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＮ（Ｒａ）２を有するアルキル（ここでｎは、１から１０までの正の整数であり、そしてＲａは、独立してＨ、アルキル、ヒドロキシアルキル、糖類、Ｃ（ｍ−ｗ）Ｈ（（２ｍ＋１）−２ｗ）ＯｗＯｚ、Ｏ２ＣＣ（ｍ−ｗ）Ｈ（（２ｍ＋１）−２ｗ）ＯｗＯｚ、Ｎ（Ｒ）ＯＣＣ（ｍ−ｗ）Ｈ（（２ｍ＋１）−２ｗ）ＯｗＯｚ、または部位指向性分子である）である。この場合において、ｍは、１から１０までの正の整数であり、ｗは、０またはｍ以下の正の整数であり、ｚは、０または（（２ｍ＋１）−２ｗ）以下の正の整数であり、そしてＲは、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、またはＣｍＨ（（２ｍ＋１）−ｒ）ＯｚＲｂｒである。この場合において、ｍは、１から１０までの正の整数であり、ｚは、０または（（２ｍ＋１）−ｒ）未満の正の整数であり、ｒは、０または２ｍ＋１以下の整数であり、そしてＲｂは、独立してＨ、アルキル、ヒドロキシアルキル、または糖類である。好ましい実施態様では、Ｒａは、オリゴヌクレオチドである。
【００６４】
　カルボキシアルキルは、カルボキシル置換エーテル、アミド置換エーテル、あるいはエーテルまたはＣｎＨ（（２ｎ＋１）−ｑ）ＯｙＲｃｑまたはＯＣｎＨ（（２ｎ＋１）−ｑ）ＯｙＲｃｑから除去された三級アミドを有するアルキルであり得、ここでｎは、１から１０までの正の整数であり；ｙは、０または（（２ｎ＋１）−ｑ）未満の正の整数であり、ｑは、０または２ｎ＋１以下の正の整数であり、そしてＲｃは、（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒｄ、（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲｄ、（ＣＨ２）ｎＣＯＮ（Ｒｄ）２、または部位指向性分子である。この場合において、ｎは、１から１０までの正の整数であり、Ｒｄは、独立してＨ、アルキル、ヒドロキシアルキル、糖類、Ｃ（ｍ−ｗ）Ｈ（（２ｍ＋１）−２ｗ）ＯｗＯｚ、Ｏ２ＣＣ（ｍ−ｗ）Ｈ（（２ｍ＋１）−２ｗ）ＯｗＯｚ、またはＮ（Ｒ）ＯＣＣ（ｍ−ｗ）Ｈ（（２ｍ＋１）−２ｗ）ＯｗＯｚである。この場合において、ｍは、１から１０までの正の整数であり、ｗは、０またはｍ以下の正の整数であり、ｚは、０または（（２ｍ＋１）−２ｗ）以下の正の整数であり、そしてＲは、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、またはＣｍＨ（（２ｍ＋１）−ｒ）ＯｚＲｂｒである。この場合において、ｍは、１から１０までの正の整数であり、ｚは、０または（（２ｍ＋１）−ｒ）未満の正の整数であり、ｒは、０または２ｍ＋１以下の正の整数であり、そしてＲｂは、独立してＨ、アルキル、ヒドロキシアルキル、または糖類である。好ましい実施態様では、Ｒｃは、オリゴヌクレオチドである。
【００６５】
　本発明の現在好ましい実施態様は、新生物またはアテロームを有する宿主のための放射線治療方法であり、この方法は、ｉ）宿主に、薬学的に有効な量のテキサフィリンのＧｄ錯体を投与する工程、およびｉｉ）電離放射線を、新生物またはアテロームの近位のテキサフィリンに照射する工程を包含する。本発明のより好ましい実施態様は、テキサフィリンがＴ２Ｂ２のＧｄ錯体、４，５−ジエチル−１０，２３−ジメチル−９，２４−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−１６，１７−（３−ヒドロキシプロピルオキシ）−１３，２０，２５，２６，２７−ペンタアザペンタシクロ［２０．２．１．１３，６．１８，１１．０１４，１９］ヘプタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，（１９），１５，１７，２０，２２（２５），２３−トリデカエン、またはＴ２ＢＥＴのＧｄ錯体、４，５−ジエチル−１０，２３−ジメチル−９，２４−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−１６，１７−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］−ペンタアザペンタシクロ−［２０．２．１．１３，６．１８，１１．０１４，１９］ヘプタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８，２０，２２（２５），２３−トリデカエンである場合の上記方法である。特に好ましい実施態様は、テキサフィリンがＴ２ＢＥＴのＧｄ錯体である場合である。
【００６６】
　現在好ましいテキサフィリンにおいては、Ｒ１はヒドロキシアルキルであり、そしてＲ２、Ｒ３、およびＲ４はアルキルである。あるいは、Ｒ３は部位指向性分子または部位指向性分子に対するカップルであり得、好ましくは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに対するカップルであり得る。さらに好ましいテキサフィリンにおいては、Ｒ１は（ＣＨ２）２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ２およびＲ３はＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ４はＣＨ３であり、そしてＲ７およびＲ８はＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである。あるいは、Ｒ８は部位指向性分子、またはそれに対するカップルであり、好ましくは、オリゴヌクレオチド、またはそれに対するカップルであり、より好ましくは、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯ−オリゴヌクレオチド（ここでｎは１〜７であり、そして好ましくは１〜３である）であり；そしてＲ７はＨである。さらに現在好ましい実施態様においては、Ｒ１は（ＣＨ２）２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ２およびＲ３はＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ４はＣＨ３であり、Ｒ７およびＲ８はＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、あるいは、Ｒ８は部位指向性分子またはそれに対するカップルであり得、好ましくは、オリゴヌクレオチドまたはそれに対するカップルであり得、より好ましくは、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯ−オリゴヌクレオチド（ここでｎは１〜７であり、そして好ましくは１〜３である）である。他の現在好ましい実施態様においては、Ｒ１〜Ｒ１０は、テキサフィリンＡ１〜Ａ３８に関して表１に示されている通りである。
【００６７】
　ピロール窒素上に置換基を有する構造Ｂのテキサフィリンは、目的の新規な組成として提供される。実施例２の表２は、この誘導体化テキサフィリンについて意図される置換基の要約を示す。ピロール窒素置換基（Ｒ１１）は、約３個までの炭素原子を有するアルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、またはアルコキシ基であり得る；但し、この置換基は第１結合炭素の周囲で回転可動性を有し、残りの基をテキサフィリン平面の外側に位置させる。従って、好ましいアルケニルは、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である。ピロール窒素置換基は、最も好ましくはメチル基である。
【００６８】
　本発明のさらなる実施態様は、ピロール窒素上に置換基（Ｒ１１）を有するテキサフィリンの合成方法である。この方法は、ｉ）有機溶媒中で、ピロール窒素上に置換基を有する非芳香族テキサフィリン、ブレンステッド塩基、および酸化体を混合する工程；およびｉｉ）この混合物を少なくとも２時間、室温で撹拌するかまたは還流下で加熱する工程を包含する。非芳香族テキサフィリンは、構造Ｉを有するトリピランアルデヒドまたはケトン；および構造ＩＩを有する置換オルト−フェニレンジアミンにより生成される：
【００６９】
【化７】
2004091495.tif 000008
　Ｒ１からＲ４およびＲ６からＲ９は、独立して、水素、ヨーダイド以外のハライド、ヒドロキシル、アルキル、アリール、ヨードアルキル以外のハロアルキル、ニトロ、ホルミル、アシル、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、糖類、アミノアルキル、オキシアミノアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、部位指向性分子、または部位指向性分子に対するカップルである。Ｒ５およびＲ１０は、独立して、水素、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、アミノアルキル、オキシアミノアルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、または部位指向性分子に対するカップルであり；そしてＲ１１は、アルキル、アルケニル、オキシアルキル、またはヒドロキシアルキルであり、ここで、これらは約３個までの炭素原子を有し、そして第１結合炭素原子の周囲で回転可動性を有する。
【００７０】
　好ましい合成方法においては、Ｒ１１はメチルであり、ブレンステッド塩基はトリエチルアミンまたはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，８−ジアミノナフタレン（「プロトンスポンジ（ｐｒｏｔｏｎ　ｓｐｏｎｇｅ）」）であり、酸化体は空気であり、そしてこの空気は有機溶媒を飽和しており、または酸化体は、酸素、酸化白金、ｏ−クロロニル、または２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノンであり得る。撹拌工程または還流下での加熱工程は、少なくとも２時間かつ約２４時間まで混合物を撹拌または還流下で加熱することを包含し、そして有機溶媒はメタノール、メタノールおよびクロロホルム、またはメタノールおよびベンゼン、またはメタノールおよびジメチルホルムアミドを含み得る。
【００７１】
　本発明の薬学的調製物は、単独でまたは薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、単回投与または複数回投与のいずれかで投与され得る。適切な薬学的キャリアは、不活性の固体希釈剤または充填剤、滅菌水溶液、および種々の有機溶媒を含み得る。次いで、本発明のテキサフィリンと薬学的に受容可能なキャリアとを組み合わせることにより形成される薬学的組成物は、次いで、種々の投与剤形（例えば、注射用溶液）で容易に投与され得る。
【００７２】
　非経口投与のために、ゴマ油またはラッカセイ油、プロピレングリコール水溶液、または滅菌水溶液中のテキサフィリンの溶液が用いられ得る。このような水溶液は、必要であれば適切に緩衝化され、そして液体希釈剤はまず十分な生理食塩水またはグルコースにより等張とされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、および腹膜腔内投与に適切である。これに関連して、用いられ得る滅菌水性媒体は、本明細書の開示を考慮すれば当業者に公知である。
【００７３】
　注射用途に適した薬学的剤形は、滅菌水性溶剤または分散剤、および滅菌注射用溶剤または分散剤の即座の調製のための滅菌散剤を包含する。全ての場合において、剤形は、滅菌されていなければならず、そして注射器で容易に使用できる程度に流体でなければならない。それはまた製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば、細菌および真菌）の混入作用に対して保護されねばならない。キャリアは、溶媒または分散媒であり得、これらは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含む。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、必要粒子サイズの維持により（分散剤の場合）、および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって防止され得る。多くの場合、等張性物質、例えば糖（例えばマンニトールまたはデキストロース）または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。より好ましい等張性物質は、約２〜８％濃度のマンニトール溶液であり、最も好ましくは約５％濃度のマンニトール溶液である。注射用組成物吸収は、組成物において、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを用いることにより延期され得る。
【００７４】
　滅菌注射用溶液は、活性化合物を、上記で列挙した種々の他の成分と共に、適切な溶媒中に必要量入れ、必要であれば滅菌濾過することにより調製される。一般に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、基本分散媒および上記で列挙したものの必要とされる他の成分を含有する滅菌媒体中に入れることにより調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法には、真空乾燥法および凍結乾燥法があり、これにより、既に滅菌濾過したそれらの溶液から、任意の所望される付加成分を加えた活性成分の粉末が得られる。
【００７５】
　本明細書で用いられるように、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張性物質、および吸収遅延剤などを包含する。このような媒体および薬剤を薬学的に活性な物質に対して用いることは当業者に周知である。従来の媒体または薬剤が活性成分と適合しない場合を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。補足的な活性成分もまた組成物中に取り込まれ得る。
【００７６】
　適用されている特許法の条約に従って、用語「ａ」および「ａｎ」は、請求の範囲を含む本出願において用いられる場合「１つ以上」を意味する。
【発明の効果】
【００７７】
　本発明によって、放射線増感のためのテキサフィリンが提供された。テキサフィリンは放射線損傷を増強し、先行技術の放射線増感剤の欠点の多くを克服する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７８】
　（好ましい実施態様の詳細な説明）
　本発明は、放射線治療における放射線増感、および放射線治療および光力学的腫瘍治療を含む２方面の（ｔｗｏ−ｐｒｏｎｇｅｄ）処置プロトコルへのテキサフィリンの使用を包含する。より詳細には、本発明は、テキサフィリン存在下での、放射線照射により増強された細胞毒性および増強された核酸鎖切断を示す。実施例１〜４は、好ましいテキサフィリン、および部位指向性分子に結合したテキサフィリンの合成を記載する。実施例５〜８は、放射線増感、放射線治療、および光力学的腫瘍治療を伴う放射線治療へのテキサフィリンの使用を記載する。
【００７９】
　テキサフィリンの合成は、米国特許第４，９３５，４９８号、同第５，１６２，５０９号、同第５，２５２，７２０号、および米国特許出願第０８／０９８，５１４号、同第０８／１３５，１１８／号、同第０８／１９６，９６４号、同第０８／２２７，３７０号、および同第０８／２９４，３４４号に記載され、これらは全て本明細書に参考として援用されている。大員環のＢ（ベンゼン環）部分のＲ６−Ｒ９位の置換基は、それらが前駆体（分子の３、４、５および６位のオルト−フェニレンジアミン）に結合することにより大員環に取り込まれる。分子のＴ（トリピラン）部分の置換基の導入は、ピロール環の適切な官能化により達成され、Ｒ５位およびＲ１０位の置換基は、置換オルト−フェニレンジアミンとの縮合前の合成工程で５位のトリピレンの適切な官能化によって取り込まれる。より好ましくは、官能化は：Ｒ６およびＲ９が水素以外の場合には、Ｒ５およびＲ１０は水素またはメチルであり；Ｒ５およびＲ１０が水素以外の場合には、Ｒ６およびＲ９は、水素、ヒドロキシ、またはヨウ化物以外のハロゲン化物である。
【００８０】
　任意のテキサフィリンまたはテキサフィリン金属錯体を放射線増感剤として用い得る。放射線増感に好ましい構造Ａのテキサフィリンの代表的な置換基を表１に挙げる。これらの化合物に対しては、Ｒ４は好ましくはメチルである。
【００８１】
【表１−１】
2004091495.tif 000009
【００８２】
【表１−２】
2004091495.tif 000010
【００８３】
【表１−３】
2004091495.tif 000011
【００８４】
【表１−４】
2004091495.tif 000012
　大員環のＲ５位またはＲ１０位の置換基は、大員環の縮合の前または後のいずれかに誘導体化され得る。置換基は５個までの炭素原子を有するアルキル基、またはニトロ、カルボキシル、硫酸、ヒドロキシル、ハライドまたはアルコキシ（このアルコキシのアルキルはヒドロキシアルキルなどであり得る）によってさらに誘導体化され得るフェニル基を含み得る。
【００８５】
　テキサフィリンの二価または三価の金属錯体は、慣例によりＮ＋の形式電荷で示され、Ｎはそれぞれ１または２である。本発明に記載される錯体は、金属イオンに対する電荷の中和および／または配位の飽和を与える１以上のリガンドをさらに有し得ることが当業者に理解される。そのようなリガンドには、クロライド、ニトレート、アセテート、およびヒドロキシド等が挙げられる。
【００８６】
　金属の存在は、テキサフィリンの放射線増感特性にとって重要ではない；しかし、金属は、テキサフィリン錯体の安定性に寄与する。金属テキサフィリンとその対イオンとの錯体は、本出願の目的のための中性の錯体であるとみなされる；例えば、ＧｄＴ２Ｂ２（ＯＡｃ）２は、中性の錯体である。ＧｄＴ２Ｂ２２＋のようなテキサフィリンの金属錯体は、２価の正電荷を有する。ＧｄＴ２Ｂ２２＋が電子を得ると、それは短命なπラジカルカチオンであるＧＤＴ２Ｂ２２＋●となる。このカチオンはプロトンを得るかまたは再調整されテキサフィリンラジカルＧｄＴ２Ｂ２（Ｈ●）（実施例５に記載されるように有意な安定性を有する）となる。
【００８７】
　酸素は、生理学的システムにおける最終的な電子受容体である。しかし、テキサフィリンは、酸素のレドックス電位より低いレドックス電位を有する。全ての還元体はテキサフィリンを還元し、以下に挙げるレドックス電位から理解され得るように、スーパーオキシドでさえ還元する：
　　　　　　　　　　　　　　　ｅ−ａｑ＝−２．８０Ｖ
　　　　　　　　　　　　ポルフィリン＝−０．６〜−１．８Ｖ
　　　　　　　　　　　　　　　キノン＝−０．２〜−１．０Ｖ
　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ−２＝−０．１８Ｖ
　　　　　　　　　　　　ＧｄＴ２Ｂ２●＝＋０．０８Ｖ
従って、ガドリニウムテキサフィリンは容易に電子を「吸収」し、それらがヒドロキシルラジカルまたは他の酸化された種との反応を防止する。このガドリニウムテキサフィリンの低いレドックス電位は、テキサフィリンの部位で受けた放射線照射の損傷の量を増強するテキサフィリンの特性である；テキサフィリン非存在下では、ヒドロキシルラジカルおよび水和電子が再化合し放射線照射損傷はほとんど起こらないが、一方テキサフィリン存在下では、ヒドロキシルラジカルは遊離であり、損傷を引き起こす。さらに、テキサフィリンによる電子の捕捉は、水和電子がヒドロキシルラジカルに誘導された損傷部位と相互作用してその損傷を修復することを妨げる。
【００８８】
　他に規定しない限り、本明細書中で用いる全ての専門用語および技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって理解される一般的な意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同じかまたは類似したあらゆる方法および材料が本発明の実施もしくは試験において用いられ得るが、ここでは好ましい方法および材料について説明する。他に言及しない限り、本明細書中で用いられる技術は、当業者に周知の標準的方法論である。
【実施例】
【００８９】
　（実施例１）
　テキサフィリンＴ２ＢＥＴの合成
　本実施例は、エトキシ基を含む置換基を有する好ましいテキサフィリン（Ｔ２ＢＥＴと称される）の合成を提供する。
【００９０】
　ルテチウム（ＩＩＩ）アセテート（ｌｕｔｅｔｉｕｍ（ＩＩＩ）ａｃｅｔａｔｅ）水和物をＳｔｒｅｍ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ，ＭＡ）から、ガドリニウム（ＩＩＩ）アセテート四水和物をＡｅｓａｒ／Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｍａｔｔｈｅｙ（Ｗａｒｄ　Ｈｉｌｌ，ＭＡ）から購入した。ＬＺＹ−５４ゼオライトをＵＯＰ（Ｄｅｓ　Ｐｌａｉｎｓ，ＩＬ）から購入した。アセトン、氷酢酸、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、およびｎ−ヘプタンをＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｅｒｇ，ＮＪ）から購入した。トリエチルアミンおよびアンバライト９０４アニオン交換樹脂をＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。全ての化学物質はＡＣＳグレードであり、更なる精製を行わずに用いた。
【００９１】
　４，５−ジエチル−１０，２３−ジメチル−９，２４−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−１６，１７−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］−ペンタアザペンタシクロ［２０．２．１．１３，６．１８，１１．０１４，１９］ヘプタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８，２０，２２（２５），２３−トリデカエンのガドリニウム（ＩＩＩ）錯体の合成（１Ｉ、図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃ）。重要な中間体である１，２−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エトキシ］−４，５−ジニトロベンゼン１Ｅを、図１Ａに概略した３工程の合成プロセスに従って調製した。
【００９２】
　トリエチレングリコールモノメチルエーテルモノトシレート１Ｂの合成：マグネチックスターラーバーおよび１０００ｍＬ圧力等化滴下漏斗（ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｅｑｕａｌｉｚｉｎｇ　ｄｒｏｐｐｉｎｇ　ｆｕｎｎｅｌ）を備えた、オーブンで乾燥した１２Ｌの三口丸底フラスコ内に、水（１８００ｍＬ）中のＮａＯＨ（４４０．０ｇ、１１．０モル）溶液を添加し、混合物を０℃に冷却した。ＴＨＦ（１０００ｍＬ）中のトリエチレングリコールモノメチルエーテル１Ａ（６５６．８４ｇ、４．０モル）を添加した。清澄な溶液を０℃で１５分間激しく撹拌し、そしてＴＨＦ（２．０Ｌ）中の塩化トシル（９１５．１２、４．８モル）を１時間にわたって滴下した。反応混合物をさらに１時間０℃で撹拌し、１０％ＨＣｌ（５．０Ｌ）を添加して（ｐＨ５〜７まで）　反応を停止した。二相の混合物を４Ｌの分液漏斗に分けて移し、有機層を取り出し、そして水層をｔ−ブチルメチルエーテル（３×２５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（２×３５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、そして減圧下でエバポレートし、明るい色のオイルとして１２１７．６ｇ（９５％）の１Ｂを得た。この物質をさらに精製することなく次の工程に用いた。
【００９３】
　１，２−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ−ベンゼン１Ｄの合成。オーバーヘッド撹拌機、還流冷却器およびガス管を備えた乾燥した５Ｌの丸底フラスコ中で、Ｋ２ＣＯ３（４３９．４７ｇ、３．１８モル）およびＭｅＯＨ（１８００ｍＬ）をアルゴン雰囲気下で混合した。この充分に撹拌された懸濁液に、カテコール１Ｃ（１４０．２４ｇ、１．２７モル）を添加し、そして混合物を加熱還流した。次いで、１Ｂ（１０１２．６８ｇ、３．１８モル）を一度に添加した。この懸濁液を２４時間還流しながら撹拌し、室温まで冷却して、セライトによって濾過した。このパッドを５００ｍＬのメタノールですすぎ、合わせた濾液を減圧下でエバポレートした。得られた茶色の残渣を１０％ＮａＯＨ（８００ｍＬ）に溶解し、塩化メチレン（８００ｍＬ）を撹拌しながら添加した。この混合物を２Ｌの分液漏斗に移し、有機層を取り出し、水層を塩化メチレン（３×３５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせてブラインで洗浄し（３５０ｍＬ）、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、減圧下でエバポレートし、そして残渣を数時間真空で乾燥させ４８５．６ｇ（９５％）の１，２−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ−ベンゼン１Ｄを得た。１Ｄについて：ｂｐ．１６５−２２０℃、（０．２−０．５ｍｍＨｇ）、ＦＡＢ　ＭＳ、Ｍ＋：ｍ／ｅ　４０２；ＨＲＭＳ、Ｍ＋：４０２．２２５８（Ｃ２０Ｈ３４Ｏ８に関する計算値、４０２．２２５３）。
【００９４】
　１，２−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］−４，５−ジニトロベンゼン１Ｅの合成。オーブンで乾燥させた１Ｌの丸底フラスコ内で、１Ｄ（１０４ｇ、０．２６モル）および氷酢酸（１２０ｍＬ）を合わせて５℃に冷却した。このよく撹拌した溶液に濃硝酸（８０ｍＬ）を１５〜２０分間かけて滴下した。混合物の温度を、冷却および酸の添加の速度を調節することにより４０℃未満に保持した。添加後、反応物をさらに１０〜１５分間撹拌し、次いで０℃に冷却した。発煙硝酸（２６０ｍＬ）を３０分間にわたって滴下しその間溶液の温度を３０℃未満に保持した。添加が完了した後、反応が完了するまで赤色の溶液を室温で撹拌し（約５時間、ＴＬＣ：９５／５；ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）、次いで、よく撹拌した氷水（１５００ｍＬ）に注いだ。塩化メチレン（４００ｍＬ）を添加し、二相の混合物を２Ｌの分液漏斗に移し、有機層を取り出した。水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を１０％ＮａＯＨ（２×１５０ｍＬ）およびブライン（２５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、そして減圧下で濃縮した。得られたオレンジ色のオイルをアセトン（１００ｍＬ）に溶解し、その溶液にｎ−ヘキサン（５００ｍＬ）を重層してフリーザー内で保存した。得られた沈殿物を濾過して回収し１０１．６９ｇ（８０％）の１Ｅを黄色い固体として得た。１Ｅについて：　ｍｐ　４３−４５℃；ＦＡＢ　ＭＳ、（Ｍ＋Ｈ）＋：ｍ／ｅ　４９３；ＨＲＭＳ、（Ｍ＋Ｈ）＋：４９３．２０３０（Ｃ２０Ｈ３３Ｎ２Ｏ１２に関する計算値、４９３．２０３３）。
【００９５】
　１，２−ジアミノ−４，５−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］ベンゼン１Ｆ（図１Ｂ）の合成。クライゼンアダプター、圧力等化滴下漏斗、および還流冷却器を備えた、オーブンで乾燥した５００ｍＬの丸底フラスコ内で、１，２−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］−４，５−ジニトロベンゼン１Ｅ（２０ｇ、０．０４モル）を無水エタノール（２００ｍＬ）に溶解した。この清澄な溶液に、１０％炭素担持パラジウム（４ｇ）を添加し、暗黒色の懸濁液をアルゴン雰囲気下で加熱還流した。ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）中のヒドラジン水和物（２０ｍＬ）を、突沸を避けるように１０分間かけて滴下した。得られた茶色の懸濁液を１．５時間加熱還流したところ、その時点で反応混合物は色を失い、そしてＴＬＣ分析（９５／５；ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）は、ジアミンに相当する低いＲｆ値のＵＶ活性スポットを示した。従って、この混合物をセライトにより熱次濾過して、パッドを無水エタノール（５０ｍＬ）ですすいだ。溶媒を減圧下で除去して、得られた明るい茶色のオイルを真空（暗所）で２４時間乾燥し、１５．５５ｇ（８９％）の１，２−ジアミノ−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］ベンゼン１Ｆを得た。１Ｆについて：ＦＡＢ　ＭＳ、Ｍ＋：ｍ／ｅ　４３２；ＨＲＭＳ、Ｍ＋：４３２．２４７１（Ｃ２０Ｈ３６Ｎ２Ｏ８に関する計算値、４３２．２４８２）。この物質をさらなる精製をすることなしに次の工程に用いた。
【００９６】
　４，５−ジエチル−１０，２３−ジメチル−９，２４−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−１６，１７−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］−１３，２０，２５，２６，２７−ペンタアザペンタシクロ［２０．２．１．１３，６．１８，１１．０，１４，１９］ヘプタコサ−３，５，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４−ウンデカエン（１Ｈ）の合成。オーブンで乾燥した１Ｌの丸底フラスコに、２，５−ビス［（５−ホルミル−３−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチル−ピロール−２−イル）メチル］−３，４−ジエチルピロール１Ｇ（１Ｇの合成は、米国特許第５，２５２，７２０号において提供され、本明細書中に参考として援用される）（３０．９４ｇ、０．０６４４モル）および４，５−ジアミノ−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］ベンゼン１Ｆ（２８．７９ｇ、０．０６４４モル）を、アルゴン雰囲気下、無水メタノール（６００ｍＬ）中で合わせた。よく撹拌したこの懸濁液に、無水メタノール中（２００ｍＬ）の濃塩酸（６．７ｍＬ）の混合物を一度に加えた。この混合物を５０℃まで徐々に加熱し、その時点で、反応物は出発物質の濁った懸濁液から反応が進むにつれて暗赤色の一様な溶液に変わった。３時間後、ＴＬＣ分析およびＵＶ／可視分光法（λｍａｘ３６９ｎｍ）により反応が完了したと判断した。反応混合物を室温まで冷却し、６０ｇの活性炭（ＤＡＲＣＯＴＭ）を添加し、得られた懸濁液を２０分間撹拌した。暗い色の懸濁液をセライトによって濾過して活性炭を除き、乾燥状態まで溶媒をエバポレートし、そして１Ｈの粗生成物を真空下で一晩乾燥した。１Ｈをイソプロピルアルコール／ｎ−ヘプタンから再結晶させ、５０ｇ（８５％）の深紅の固体を得た。１Ｈについて：１Ｈ　ＮＭＲ　（ＣＤ３ＯＤ）：σ　１．１１（ｔ，６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），１．７６（ｐ，４Ｈ，ｐｙｒｒ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ），２．３６（ｓ，６Ｈ，ｐｙｒｒ−ＣＨ３），２．４６（ｑ，４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），２．６４（ｔ，４Ｈ，ｐｙｒｒ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ），３．２９［ｓ，６Ｈ，（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３ＣＨ３］，３．３１（ｔ，４Ｈ，ｐｙｒｒ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ），３．４３−３．８５（ｍ，２０Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２　ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ），４．１０（ｓ，４Ｈ，（ｐｙｒｒ）２−ＣＨ２），４．２２（ｔ，４Ｈ，ＰｈＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ），７．４５（ｓ，２Ｈ，ＰｈＨ），８．３６（ｓ，２Ｈ，ＨＣ＝Ｎ）；ＵＶ／ｖｉｓ：［（ＭｅＯＨ）λｍａｘ，ｎｍ］：３６９；ＦＡＢ　ＭＳ，［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｅ　８７８．５；ＨＲＭＳ，［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｅ　８７８．５２７４（［Ｃ４８Ｈ７２Ｎ５Ｏ１０］＋に対する計算値、８７８．５２７９）。
【００９７】
　４，５−ジエチル−１０，２３−ジメチル−９，２４−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−１６，１７−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］−ペンタアザペンタシクロ［２０．２．１．１３，６．１８，１１．０，１４，１９］ヘプタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８，２０，２２（２５），２３−トリデカエン（１Ｉ）のガドリニウム（ＩＩＩ）錯体の合成。１Ｉを図１Ｃに概略したプロセスに従って調製した。乾燥した２Ｌの三口丸底フラスコ内で、１Ｈ（３３．０ｇ、０．０３６モル）およびガドリニウム（ＩＩＩ）アセテート四水和物（１５．４ｇ、０．０３８モル）をメタノール（８２５ｍＬ）中で合わせた。よく撹拌したこの赤色溶液に、ガドリニウム（ＩＩＩ）アセテート四水和物（１５．４ｇ、０．０３８モル）およびトリエチルアミン（５０ｍＬ）を添加し、反応物を加熱還流した。１．５時間後、ガス分散チューブ（ｇａｓ　ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ　ｔｕｂｅ）の補助により空気を４時間にわたって（すなわち、還流しながら）暗緑色の反応溶液に吹きこんだ（流速＝２０ｃｍ３／分）。この時点で、反応混合物をＵＶ／可視分光法により注意深くモニターした（すなわち、０．５〜１時間毎に、約１滴を４〜５ｍＬのＭｅＯＨに希釈してスペクトルをとった）。反応は、ＵＶ／可視（ＭｅＯＨ比が３４２ｎｍ／４７２ｎｍ＝０．２２−０．２４）により４時間後に完了したとみなした。暗緑色の反応物を室温まで冷却し、セライトによって濾過して２Ｌの丸底フラスコに入れ、溶媒を減圧下で除去した。暗緑色の固体をアセトン（１Ｌ）に懸濁し、得られたスラリーを室温で１時間撹拌した。懸濁液を濾過して赤色／茶色の不純物（不完全な酸化生成物）を除去し、固体をアセトン（２００ｍＬ）ですすぎ、そして風乾した。この複合体粗生成物（３５ｇ）をＭｅＯＨ（６００ｍＬ）に溶解して１５分間激しく撹拌し、セライトによって濾過して２Ｌの三角フラスコに移した。さらに３００ｍＬのＭｅＯＨおよび９０ｍＬの水をこのフラスコに添加して、酢酸で洗浄したＬＺＹ−５４ゼオライト（１５０ｇ）も加えた。この懸濁液を、約３〜４時間オーバーヘッドメカニカルスターラーによって撹拌した。ゼオライト抽出は、遊離のＧｄ（ＩＩＩ）が非存在となることにより完了したとみなした。［遊離のガドリニウムについてテストするために、１Ｉの粗生成物を逆相ＴＬＣプレート（Ｗｈａｔｍａｎ　ＫＣ８Ｆ、１．５×１０ｃｍ）に多量にスポットして、メタノール中の１０％酢酸を用いてクロマトグラムを展開した。緑色の複合体は、溶媒の先端近くまでＴＬＣプレートを上昇した。このような条件下では、全ての遊離ガドリニウム金属は起点に残る。クロマトグラムを展開した後、プレートを乾燥し、プレートの下側１／４をメタノール中のＡｒｓｅｎａｚｏ　ＩＩＩ溶液（１０ｍＬメタノール中４ｍｇ　Ａｒｓｅｎａｚｏ　ＩＩＩ）で染色した。ピンク色のバックグラウンドに対して、非常にかすかな青色のスポット（遊離の金属を示す）が起点において観察され、遊離のガドリニウム金属がほとんどないことを示した。］ゼオライトをＷｈａｔｍａｎ　＃３濾紙を通して除去し、回収した固体をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）ですす���だ。暗緑色の濾液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＡ−９０４アニオン交換樹脂のカラム（長さ３０ｃｍ×直径２．５ｃｍ）にかけてその樹脂から溶出させ（流速約１０ｍＬ／分）、３００ｍＬの１−ブタノールと共に２Ｌの丸底フラスコに入れた。この樹脂を、さらに１００ｍＬのＭｅＯＨですすぎ、合わせた溶出物を乾燥状態まで減圧下でエバポレートした。緑色の光沢のある固体１Ｉを４０℃で数時間真空乾燥した。よく撹拌した５５〜６０℃の１Ｉのエタノール溶液　（２６０ｍＬ）に、１Ｌの圧力等化滴下漏斗からｎ−ヘプタン（約６００ｍＬ）を滴下した（流速４ｍＬ／分）。１．５時間のコース（３００ｍＬ添加）の間に、緑色の錯体１Ｉが、暗い色の混合物から結晶化し始めた。添加が完了した後、緑色の懸濁液を冷却し、室温で１時間撹拌した。懸濁液を濾過し、固体をアセトン（２５０ｍＬ）ですすぎ、２４時間真空乾燥して２６ｇ（６３％）を得た。ＵＶ／ｖｉｓ：［（ＭｅＯＨ）λｍａｘ，ｎｍ］：３１６，３５０，４１５，４７３，７３９；ＦＡＢ　ＭＳ，（Ｍ−２０Ａｃ）＋：ｍ／ｅ　１０３０；ＨＲＭＳ，（Ｍ−２０Ａｃ）＋：ｍ／ｅ：１０２７．４０３６（Ｃ４８Ｈ６６１５５ＧｄＮ５Ｏ１０に関する計算値、１０２７．４０１６）。分析［Ｃ５２Ｈ７２ＧｄＮ５Ｏ１４］・０．５Ｈ２Ｏに関する計算値：Ｃ，５３．９６；Ｈ，６．３６；Ｎ，６．０５；Ｇｄ，１３．５９。実測値：Ｃ，５３．７３；Ｈ，６．２６；Ｎ，５．８２；Ｇｄ，１３．９２。
【００９８】
　１Ｈのルテチウム（ＩＩＩ）複合体の合成。大員環のリガンド１Ｈ（１４ｇ、０．０１５３モル）を、ルテチウム（ＩＩＩ）アセテート水和物（９．７５ｇ、０．０２３０モル）およびトリエチルアミン（２２ｍＬ）を用いて、空気で飽和させた（ａｉｒ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ）メタノール（１５００ｍＬ）中で還流し酸化的に金属化した。３〜４時間還流した後、ガス分散チューブの補助により４０分間にわたって暗茶色／緑色反応溶液に空気を吹き込んだ（流速＝２０ｃｍ３／分）。この時点で、還流を一晩継続した。２３時間後、空気をさらに４０分間にわたって再び吹き込み、酸化／金属化を完了した。反応を還流で５時間継続し、次にＵＶ−可視スペクトルの特徴により反応の完了を判断した。深緑色の溶液を室温にまで冷却し、セライトのパッドを通して濾過し、溶媒を減圧下で除去した。深緑色の固体をアセトン（６００ｍＬ）に懸濁し、室温で３０分間撹拌し、次いで濾過して赤色／茶色不純物（不完全な酸化生成物および過剰なトリエチルアミン）を洗い流した。錯体の粗生成物をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し、約３０分間撹拌し、次いでセライトによって濾過して１Ｌの三角フラスコに入れた。さらに５０ｍＬのＭｅＯＨおよび５０ｍＬの水をフラスコに加え、酢酸で洗浄したＬＺＹ−５４ゼオライト（４０ｇ）も加えた。得られた混合物を３時間撹拌するかまたは振盪し、次に濾過してゼオライトを除去した。ゼオライトケーキをＭｅＯＨ（１００ｍＬ）ですすぎ、すすいだ溶液を濾液に加えた。濾液を最初に１５０ｍＬまで濃縮し、次に、予め処理したアンバライト　ＩＲＡ−９０４アニオン交換樹脂（アセテート形態の樹脂）のカラム（長さ３０ｃｍ×直径２．５ｃｍ）にかけた。ビスアセテートルテチウム（ＩＩＩ）テキサフィリン錯体を含む溶出物を回収し、減圧下で乾燥するまで濃縮し、そして無水メタノール／ｔ−ブチルメチルエーテルから再結晶させて１１．７ｇ（６３％）の光沢のある緑色の固体を得た。複合体について：ＵＶ／ｖｉｓ：［（ＭｅＯＨ）λｍａｘ，ｎｍ（ｌｏｇε）］：３５４，４１４，４７４（５．１０），６７２，７３２；ＦＡＢ　ＭＳ，［Ｍ−０Ａｃ−］＋：ｍ／ｅ　１１０６．４；ＨＲＭＳ，［Ｍ−０Ａｃ−］＋：ｍ／ｅ　１１０６．４３３０（［Ｃ４８Ｈ６６ＬｕＮ５Ｏ１０（ＯＡｃ）］＋に関する計算値、１１０６．４３５１）。分析［Ｃ５２Ｈ７２ＬｕＮ５Ｏ１４］　Ｈ２Ｏ　に関する計算値：Ｃ，５２．７４；Ｈ，６．３０；Ｎ，５．９１。実測値：Ｃ，５２．７４；Ｈ，６．１８；Ｎ，５．８４。
【００９９】
　（実施例２）
　ピロール窒素でのテキサフィリンの誘導体化
　さらなるテキサフィリンの大員環は、ピロール窒素が誘導体化されている大員環である。図２は、そのようなＮ−置換テキサフィリンの合成を示し、ここで、Ｒ１１基は、前駆体トリピロール２Ｅの中央のピロールの窒素に結合している。Ｗａｎｇら（１９７７）は、ピロールのＮ−アルキル化のための１つの方法を提供している。図２に示すような置換基Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９、およびＲ１０を有するテキサフィリン化合物の合成は米国特許出願第０８／１９６，９６４号に記載され、本明細書中で参考として援用されている。遊離のベース大員環は、蛍光検出を放射線照射増感の局在化手段として用いる場合に、特に有用である。種々のテキサフィリン複合体の光学的特徴は、Ｓｅｓｓｌｅｒら（１９９１）において記載され、本明細書中で参考として援用されている。
【０１００】
　表２は、ピロール−窒素誘導体化テキサフィリン２Ｇについて意図される置換基の概略を示す。このテキサフィリンに関して、Ｒ２およびＲ３は、好ましくはエチルであり、Ｒ４は好ましくはメチルである。Ｒ１１は、低級アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、または約３個までの炭素原子を有するアルコキシ基であり得る；ただし、この基は第１番目の結合炭素の周りで回転可能であり、基の残りの部分はテキサフィリン平面の外側に位置し得る。従って、好ましいアルケニルは、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である。Ｒ１１は、最も好ましくはメチル基である。
【０１０１】
【表２−１】
2004091495.tif 000013
【０１０２】
【表２−２】
2004091495.tif 000014
【０１０３】
【表２−３】
2004091495.tif 000015
　（実施例３）
　テキサフィリン部位指向性複合体
　テキサフィリンを放射線照射増感剤として治療手順の一部としてインビボで用いることは、処置部位に対するテキサフィリンの効果的な局在化に依存する。テキサフィリンは、本来生体局在化特性を有し、肝臓のような脂肪親和性組織、腫瘍およびアテロームに局在化する（例えば、米国特許第５，２５２，７２０号に記載され、本明細書中で参考として援用する）。さらなる局在化特異性は、テキサフィリンまたはテキサフィリン−金属錯体を、部位指向性分子（例えば、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、例えば、実施例４に記載されたようなアンチセンスオリゴヌクレオチド；生物学的レセプターまたはタンパク質（例えば、抗体、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）またはＬＤＬのアポタンパク質；に親和性を有するペプチドを含むポリアミド；ステロイドまたはステロイド誘導体；エストラジオールまたはヒスタミンのようなホルモン；モルヒネのようなホルモン擬態；標的に結合特異性を有する発色団または他の化合物；または、サフィリンまたはルビリンのようなさらなる大員環、と複合体化させることにより達成し得る。
【０１０４】
　テキサフィリンは特に、抗体複合体化を基にした治療において、二官能性キレート剤として作用するのに適している。なぜなら、テキサフィリンには抗体との複合体化に適した官能基があるからである。それらはインビボで安定で、抗体の免疫学的反応能を破壊しない共有結合を形成し、それらは比較的非毒性であり、それらは、金属に結合して目的の金属を生理学的環境下に保持し、それらは生理学的環境に容易に溶解し得る。これらのテキサフィリンのさらなる利点は、多くがさらなる機能化に適切であることである。カルボキシル化テキサフィリンの、塩化チオニルまたはｐ−ニトロフェノールアセテートによる処理は、モノクローナル抗体または目的の他の部位指向性分子への結合に適した活性化したアシル種を生成する。標準インサイチュカップリング法（例えば、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ））を用いて複合体化に効果を及ぼし得る。
【０１０５】
　選択性を得る別の手段は、テキサフィリン複合体のサフィリン分子への共有結合であり得る（Ｓｅｓｓｌｅｒら、１９９２；Ｆｕｒｕｔａら、１９９１；Ｓｅｓｓｌｅｒら、１９９１；米国特許第５，１５９，０６５号；米国特許第５，１２０，４１１号；同第５，０４１，０７８号）。サフィリンはＤＮＡに結合し、Ｋは約１０６Ｍ−１（Ｕ．Ｓ．ＳＮ　０７／９６４，６０７、本明細書中で参考として援用する）であり、結合したテキサフィリン−サフィリン複合体は、サフィリン結合部位に隣接した位置のテキサフィリン濃度を効果的に増加させ得た。サフィリンは、テキサフィリンより高い蛍光量子収量を有するので、より多くの蛍光検出が可能である。分子がレーザーの波長に対して最適化されているレーザーシステムが用いられ得る。励起状態のサフィリンはそのエネルギーを、検出のために、複合体化したテキサフィリンに移し得る。このテキサフィリン分子はさらに、選択的放射線増感のために細胞膜を通過するように設計され得る。
【０１０６】
　（実施例４）
　テキサフィリン−オリゴヌクレオチド複合体
　本実施例は、テキサフィリンがオリゴヌクレオチドまたはそのアナログにカップリングするかまたはテキサフィリンがオリゴヌクレオチドまたはそのアナログの合成スキームに取り込まれて、相補的なオリゴヌクレオチドに結合特異性を有するテキサフィリン−オリゴヌクレオチドまたはテキサイフィリン−オリゴヌクレオチドアナログ複合体を提供する合成手順を提供する。
【０１０７】
　アミド、エーテル、およびチオエーテルは、オリゴヌクレオチドのような部位指向性分子をテキサフィリンにカップリングするために用いられ得る結合の代表である。５’末端、３’末端、もしくは糖残基または塩基残基の内部にアミンで官能化したオリゴヌクレオチドまたは他の部位指向性分子は、テキサフィリンの活性化カルボン酸エステル誘導体で合成後に改変される。ＦｅＢｒ３のようなルイス酸の存在下において、ブロマイド誘導体化テキサフィリンは、オリゴヌクレオチドのヒドロキシル基と反応し、テキサフィリン結合基とオリゴヌクレオチドとの間にエーテル結合を形成し得る。あるいは、１またはそれ以上のチオホスフェート基またはチオール基を含むオリゴヌクレオチドアナログが、単数または複数のイオウ原子でテキサフィリンのアルキルハライド誘導体と選択的にアルキル化される。オリゴデオキシヌクレオチド−錯体複合体は、標的化ＤＮＡホスホジエステル骨格とテキサフィリンとの間に任意の触媒相互作用を提供するように設計される。
【０１０８】
　ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらのアナログの合成の一般的な論評について、以下を参照のこと：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、１９９１，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；　Ｃａｒａｃｃｉｏｌｏら、（１９８９）；　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．（１９９０）；またはホスホネート合成、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，ＭＤ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：５３９９（１９８６）（参考文献は、本明細書に参考として援用される）。
【０１０９】
　一般に、従来の５’−３’結合を含むオリゴヌクレオチドの合成のために一般に用いる３つの固相に基づくアプローチがある。これらは、ホスホルアミダイト法、ホスホネート法、およびトリエステル法である。
【０１１０】
　オリゴマーＤＮＡを合成するために商業的に用いられる現在の方法の簡単な説明は、以下のとおりである：長さが約１００残基までのオリゴマーを、市販の合成機、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．（ＡＢＩ）モデル３９２（ホスホルアミダイト化学を用いる）で調製する。ＤＮＡは、ホスホルアミダイトと称される高反応性のリン（ＩＩＩ）試薬の連続した添加により３’から５’方向に合成される。最初の３’残基は、制御孔シリカ固体支持体に共有結合され、これによりポリマーの操作が大いに容易になる。各残基が伸長中のポリマー鎖にカップリングした後、リン（ＩＩＩ）は、ヨウ素溶液での短期処理により、さらに安定なリン（Ｖ）状態に酸化される。未反応残基は無水酢酸でキャップされ、５’保護基は弱酸で除去される。このサイクルは、所望のＤＮＡポリマーが合成されるまで、さらに残基を付加することを繰り返し得る。全長のポリマーは、塩基に曝すことにより、残っている保護基を除去しながら、固体支持体から脱離される。一般的なプロトコールは、飽和エタノール性アンモニアを用いる。
【０１１１】
　ホスホネートを基にした合成は、ホスホン酸エステル結合（これは酸に対して安定である）を得るために適切なアクチベーターの存在下で、遊離ヒドロキシル基を有する固相−誘導体化ヌクレオチド鎖とカップリングされるべき位置で、ホスホン酸部分を含む適切に保護されたヌクレオチドの反応により行われる。従って、ホスフェートまたはチオホスフェートへの酸化は、オリゴヌクレオチドの合成の間、またはオリゴヌクレオチドの合成の完了後の任意の時点で行われ得る。ホスホネートはまた、四塩化炭素の存在下で第一級アミンまたは第二級アミンとの反応によりホスホルアミデート誘導体に転化される。
【０１１２】
　トリエステル合成では、保護ホスホジエステルヌクレオチドが、カップリング剤の存在下で、固体支持体に誘導体化された伸長中のヌクレオチド鎖の遊離ヒドロキシル基で縮合される。この反応は、保護リン酸結合を生じ、この結合は、保護されていないオリゴヌクレオチドを形成するために、オキシメート溶液で処理され得る。
【０１１３】
　３つのアプローチを一般的に示すために、取り込まれるヌクレオチドは、「活性化」亜リン酸／リン酸基を有するとして認識される。一般的に用いられる固相合成法の使用に加えて、オリゴヌクレオチドはまた、ジエステル合成のような液相方法を用いて合成され得る。このような方法は実行可能であるが、一般に、任意の実質的な長さのオリゴヌクレオチドを得るには効率が悪い。
【０１１４】
　インビボでの加水分解に耐性である好ましいオリゴヌクレオチドは、各塩基でホスホロチオエート置換を含み得る（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５：４６９３−４６９９，（１９９０）およびＡｇｒａｗａｌ，（１９９０））。オリゴデオキシヌクレオチドまたはそれらのホスホロチオエートアナログは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて合成され得る。
【０１１５】
　さらなる合成手順は、テキサフィリンを核酸合成スキームに直接的に、好ましくは固体支持体上で挿入する。テキサフィリン大員環は、オリゴヌクレオチドの合成で使用される塩基性条件下で安定であるとは知られていなかった。例えば、本明細書に示される結果が得られるまで、シッフ塩基であるテキサフィリンは、オリゴヌクレオチド合成の間、特にアンモニアおよびエタノールの開裂ならびに脱保護工程の間に用いられる塩基性条件で不安定であり得ると考えられていた。
【０１１６】
　本明細書に提供された段階合成は、手動で行われ得るか、または自動化され得、そして液相中または固体支持体上で行われ得ることが意図される。固体支持体合成は、自動化または手動式核酸シンセサイザーを用いて行われ得る。一般的な支持体は、ＣＰＧ（制御孔ガラス）およびＣＰＳ（制御孔シリカ）である。他の可能な固体支持体はポリスチレン、ポリアミド／Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ、およびセルロース紙を含む。この方法の好ましい実施態様は、固体支持体上での自動合成である。段階合成の間にテキサフィリンをオリゴヌクレオチドに結合させることにより、改変後プロトコールおよび生成物の第二の精製は必要でなくなる。これは、収率の向上を生じ、規模の拡大を非常に容易にする。テキサフィリンは、遊離塩基性テキサフィリンであり得るか、またはテキサフィリン金属錯体であり得る。
【０１１７】
　Ｌｎ（ＩＩＩ）テキサフィリン、特にＤｙＴ２Ｂ２２＋およびＥｕＴ２Ｂｌ２＋が、２４時間室温でのエタノール性アンモニアでの処理に対して安定であるという所見は、段階合成の間にランタニド（ＩＩＩ）テキサフィリン錯体でオリゴマーを誘導体化することが可能であることを示唆する。
【０１１８】
　テキサフィリンまたはその金属錯体は、種々の方法で、オリゴヌクレオチドの合成スキームに組み込まれ得る。可能な結合は、アミド結合、リン酸結合、チオエーテル結合、アミノ結合、およびエーテル結合を含む。アミド結合は、大員環の活性化カルボン酸誘導体とオリゴヌクレオチドに結合したアミノ結合基との反応を表す。活性化は、ＤＣＣおよびＮＨＳ、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、またはＮＨＳ、ニトロフェニル、ペンタクロロフェニルの活性化エステル、酸無水物、または塩化スルホニルを用いて、液層中または固体支持体上で達成され得る。さらに、固体支持体反応のために、活性化は酸クロライドの形態であり得る。リン酸結合は、大員環の活性化ホスフェート誘導体とオリゴヌクレオチド上の５’ヒドロキシル基との反応を表す。活性化ホスフェートは、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、トリエステル、またはジエステルであり得る。
【０１１９】
　代表的な合成スキームをここに示す。図３Ａに記載のアプローチにおいて、金属−テキサフィリン錯体３Ａ２は、６炭素アミン結合基を介して、固体支持体３Ａ１に結合している。このアミド形成カップリング反応は、現在では、錯体を合成後に結合させるために用いられる。テキサフィリンヒドロキシル基が、段階合成のために３Ａ３上でエステルとして保護されることに留意することが重要である。これらの保護基は、エタノール性アンモニア処理に対して不安定である。このような金属テキサフィリン誘導体化支持体を段階合成のために用い得、そして開裂および脱保護の際に、３’結合金属テキサフィリン−ＤＮＡ複合体３Ａ４を生じる。アミド形成反応はまた、脱保護および固体支持体からの開裂の前のＤＮＡ合成の終わりに生じ得る。
【０１２０】
　図３Ｂに記載のとおり、金属テキサフィリン錯体３Ｂ２のホスホルアミダイト誘導体は、ホスファイト化剤およびジイソプロピルエチルアミンとのモノアルコール３Ｂ１の反応により調製される。ヒドロキシル基は、この合成のためにエステルとして再度保護される。生じるホスホルアミダイトは、最終残基としてシンセサイザー上でカップリングされ、３Ｂ３を形成する。このアプローチにおいて、脱保護は、５’結合テキサフィリン金属錯体−ＤＮＡ複合体３Ｃ２を生じる。このテキサフィリン複合体は、結合基にアミド結合を有さない。
【０１２１】
　オリゴヌクレオチドへの内部結合にテキサフィリンを有するテキサフィリン−ＤＮＡ複合体は、この段階アプローチを用いて合成され得る。ジヒドロキシテキサフィリンを、ジメチルアミノピリジンおよびピリジンの存在下でジメトキシトリチルクロライドで処理する。得られたモノ保護テキサフィリンを、ホスファイト化剤およびジイソプロピルエチルアミンで処理し、モノ保護ホスホルアミダイトを得る。この生成物を、ヌクレオチド残基の代わりに、合成の間伸長中のオリゴヌクレオチドにカップリングさせて、内部結合にテキサフィリンを挿入する。次いで、モノ複合体を、ヌクレオチドにさらにカップリングさせて、オリゴヌクレオチドへの内部結合にテキサフィリンを有するテキサフィリン−ＤＮＡ複合体を生成させ得る。さらに、テキサフィリンのホスホネートまたはホスホジエステル誘導体が、それぞれホスホネートまたはトリエステル法により同様の内部、３’、または５’結合を形成させるために利用され得る。
【０１２２】
　オリゴヌクレオチドアナログ複合体は、本明細書に記載のように、同様の様式でテキサフィリンにカップリングし得る。特に、ホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチル化リボヌクレオチド、または他の核酸アナログ（例えば、メチルホスホネート誘導体）は、安定性が増強されるために好ましく、誘導体化は、インビボでのヌクレアーゼに対して備えられる。誘導体化ＲＮＡ（例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡアナログ）のテキサフィリン−オリゴヌクレオチド複合体は、自己開裂に対して安定性を提供する。ＲＮＡは、Ｌｕと錯体形成したテキサフィリンにより加水分解される；しかし、２’−Ｏ−Ｍｅ　ＲＮＡは２’−ＯＨを欠き、それ故、加水分解に対して安定である。従って、ＲＮＡアナログオリゴマーは、テキサフィリン−オリゴヌクレオチド複合体についてＤＮＡオリゴマーより安定であり得る。ＲＮＡアナログ複合体の合成は、既に本明細書に記載したテキサフィリン−ＤＮＡ複合体と同様である。ＲＮＡアナログ複合体は、ＤＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖と相補的であり得、二重らせんへの結合の過程で三重らせんを形成する。
【０１２３】
　テキサフィリン−オリゴヌクレオチド複合体の合成のためのさらなる方法は、ヌクレオチドを酵素的に取り込むことである。種々のＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼが用いられ得るが、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントおよびターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼが好ましい。Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．（１９９０）は、オリゴヌクレオチドの酵素合成の一般的な説明を提供し、本明細書に参考として援用される。
【０１２４】
　（実施例５）
　ネズミ白血病細胞株の放射線増感
　本実施例は、マウスＬ１２１０白血病細胞株の放射線分解を促進するための放射線増感剤としてＧｄＴ２Ｂ２２＋の使用を記載する。金属の存在は、テキサフィリンの放射線増感特性に重要でない；しかし、金属はテキサフィリン錯体に安定性を与える。
対イオンを有する金属テキサフィリン錯体は、本出願の目的のために中性錯体と意図される；例えば、ＧｄＴ２Ｂ２（ＯＡｃ）２は、中性錯体である。ＧｄＴ２Ｂ２２＋のようなテキサフィリンの金属錯体は、２つの正電荷を有する。ＧｄＴ２Ｂ２２＋が１つの電子を享受する場合、それは短命π−ラジカルカチオン、ＧｄＴ２Ｂ２＋●となる。π−ラジカルカチオンは１つのプロトンを享受するか、またはテキサフィリンラジカルＧｄＴ２Ｂ２（Ｈ）２＋●に転位し、以下に記載のように有意な安定性を有する。
【０１２５】
　物理学的研究
　Ｇｄ−Ｔ２Ｂ２２＋の放射線化学を、パルス放射線分解法により研究し、短バーストの電離放射線（４ＭｅＶで１００ｎｓ持続時間）をＧｄ−Ｔ２Ｂ２２＋水溶液に照射し、続く反応を吸収スペクトル分析によりモニターした。溶液の条件は、ヒドロキシルラジカルまたは水和電子との反応のために放射線化学を最適化するように変化させた。第一に、Ｇｄ−Ｔ２Ｂ２２＋（１×１０−４Ｍ）含有水溶液（ｐＨ７）を、第二群のヒドロキシルラジカルに水和電子を転化するように亜酸化窒素で飽和した：
ｅａｑ−＋Ｎ２Ｏ＋Ｈ２Ｏ→Ｎ２＋ＯＨ−＋ＯＨ●
　吸収スペクトル分析によると、これらの条件下でヒドロキシルラジカルとＧｄ−Ｔ２Ｂ２２＋との間に明らかな反応はなかった。第二に、Ｇｄ−Ｔ２Ｂ２２＋（１×１０−４Ｍ）含有水溶液（ｐＨ７）を、イソプロパノール（０．１Ｍ）の添加後、窒素で飽和した。この場合、第一の放射線分解事象で形成されたヒドロキシルラジカルは、イソプロパノールから第三水素原子を引き抜き、アセトンケチルラジカルを形成する：
ＯＨ●＋（ＣＨ３）２ＣＨＯＨ→Ｈ２Ｏ＋（ＣＨ３）２Ｃ●ＯＨ
　この後者の種は、強力な還元剤であり、その結果としてこれらの反応条件は、還元環境を提供する。水和電子およびアセトンケチルラジカルの両方が、１電子プロセスでＧｄ−Ｔ２Ｂ２２＋を還元する。Ｇｄ−Ｔ２Ｂ２２＋についてサイクリックボルタンメトリーにより測定された１電子還元電位は、約０．０８Ｖ対ＮＨＥであることが見出され、従って、化合物は、水溶液中で容易に還元される。
Ｇｄ−ｔｅｘ２＋＋ｅａｑ−→Ｇｄ−ｔｅｘ＋●
Ｇｄ−ｔｅｘ２＋＋（ＣＨ３）２Ｃ●ＯＨ→Ｇｄ−ｔｅｘ＋●＋（ＣＨ３）２ＣＯ＋Ｈ＋
　結果として生じたＧｄ−Ｔ２Ｂ２２＋のπラジカルカチオン、Ｇｄ−Ｔ２Ｂ２＋●は吸収スペクトルの変化から容易に検出され、約２００マイクロ秒にわたって崩壊することが見出された。この反応は、Ｇｄ−Ｔ２Ｂ２２＋の回復を生じず、その割合は、ｐＨの減少にともなって増加する。この基準において、観察される反応は、πラジカルカチオンのプロトン付加による：
Ｇｄ−ｔｅｘ＋●＋Ｈ＋→Ｇｄ−ｔｅｘ（Ｈ）２＋●
　プロトン付加されたラジカルであるＧｄ−Ｔ２Ｂ２（Ｈ）２＋●は、もとのＧｄ−Ｔ２Ｂ２２＋を復活しない錯体反応により、約３０秒の寿命を有しながら非常にゆっくりと崩壊する。このラジカルの寿命は、酸素の存在により影響されない。
【０１２６】
　追加のパルス放射線分解実験は、Ｇｄ−Ｔ２Ｂ２＋●がスーパーオキシドイオン（Ｏ２−）、二酸化炭素πラジカルアニオン（ＣＯ２−）、ならびにエタノールおよびメタノールからの水素引抜により形成された炭素中心ラジカルによるＧｄ−Ｔ２Ｂ２２＋の還元により形成されたことを示した。さらに、プロトン付加されたラジカルが、水素原子とＧｄＴ２Ｂ２２＋との間の反応により形成されることが示された。
Ｇｄ−ｔｅｘ２＋＋Ｈ●→Ｇｄ−ｔｅｘ（Ｈ）２＋●
　従って、放射線分解条件下で、全ての還元当量はＧｄ−Ｔ２Ｂ２２＋をＧｄ−Ｔ２Ｂ２（Ｈ）２＋●に還元するために、反応条件にかかわらず利用され得る。
【０１２７】
　実験条件。細胞障害の研究のための放射線供給源は、Ｍａｃｈｌｅｔｔ　ＯＥＧ６０　Ｘ線管を装備したＰｈｉｌｌｉｐｓ　５０　ＫＶＰ定電圧Ｘ線発生器、モデル１２０．１０２．１であった。線量測定は、Ｆｒｉｅｃｋｅ線量計を用いて行った。このシステムは、約２ｃｍの直径の標的域に１１０ラド／分を送達する。サンプルを、１２ウエルトレーを装備するペトリ皿に入れた。３枚の非放射線照射皿およびＧｄＴ２Ｂ２２＋を有さない細胞を含む３枚の皿をコントロール実験として供した。細胞およびＧｄＴ２Ｂ２２＋を含む６枚の皿を所定の期間放射線に曝した。各被曝後にトレーを機械アームで動かした。放射線分解後、細胞を２４時間インキュベートし、細胞生存率を、従来の細胞計測技術を用いて、メチルレッド濃度およびトリパンブルー排除法により算出した。全ての実験は対数増殖期の細胞（５×１０５細胞／ｍＬ）を用いて行った。マウス白血病Ｌ１２１０細胞をＲＰＭＩ１６４０細胞培地で維持した。
【０１２８】
　ＧｄＴ２Ｂ２２＋の保存溶液（１ｍＭ）を精製水中で調製し、そして小アリコートを細胞懸濁液（５×１０５細胞／ｍＬ）に添加した。この混合物を３７℃で１時間インキュベートし、その後単離し、洗浄し、そして栄養溶液で懸濁した。ほとんどの場合、ＧｄＴ２Ｂ２２＋の濃度は、吸収スペクトル分析により測定されたとおり８０μＭであった。
【０１２９】
　細胞内ＤＮＡ（またはＲＮＡ）の放射線誘導開裂を、アルカリ溶出クロマトグラフィーにより測定した。ポリ塩化ビニルフィルター（孔サイズ２μｍ）を用いた。サンプルは、合計２０Ｇｙの放射線に曝した。
【０１３０】
　結果。イソプロパノール水溶液中でＧｄＴ２Ｂ２２＋を用いて実施したパルス放射線分解実験を、図４、５Ａ、および５Ｂに示す。図４は、ＧｄＴ２Ｂ２２＋●πラジカルカチオン形成を示す。図５Ａは、酸素を含まない溶液中でのπラジカルカチオンの崩壊を示し、そして５Ｂでは、Ｏ２の存在下での崩壊を示す。データは、ＧｄＴ２Ｂ２＋●πラジカルカチオンの顕著な安定性を示し、そしてＧｄＴ２Ｂ２＋●がその電子を酸素に渡さず、かつ酸素の存在により影響されないことを示す。このデータは、以下にＧｄＴ２Ｂ２２＋についての中間放射線分解生成物を示唆する：
　表３．イソプロパノール水溶液中でのパルス放射線分解
【０１３１】
【表３】
2004091495.tif 000016
ＧｄＴ２Ｂ２＋●πラジカルカチオンは、２ミリ秒未満の半減期を有する。それは、プロトンを享受するか、またはテキサフィリンラジカルＧｄＴ２Ｂ２（Ｈ）２＋●に転位し、ＧｄＴ２Ｂ２（Ｈ）２＋●は十分な安定性および約３０秒の相対的に長い半減期を有する。
【０１３２】
　図６のデータは、ＤＮＡおよびＲＮＡの４つのヌクレオチド塩基の１つであるシトシンとＧｄＴ２Ｂ２（Ｈ）２＋●ラジカルとの反応についての速度定数を示す。ＧｄＴ２Ｂ２（Ｈ）２＋●はシトシンと共有結合を形成し、おそらく、この反応は、ＧｄＴ２Ｂ２（Ｈ）２＋●が結合した核酸を不活性化すると考えられる。
【０１３３】
　従って、テキサフィリンは、放射線増感剤として使用するために３つの有益な特性を有する：
ｉ）テキサフィリンの低レドックス電位により、水和電子がテキサフィリンに流れ、ＯＨ●に対し損傷を生じさせ得る。
ｉｉ）テキサフィリンラジカルは比較的安定であるが、しかし隣接分子を共有結合的に変性するために容易に反応する。
ｉｉｉ）テキサフィリンは、固有の生体局在化を有しおよびＯ２の存在または非存在に無関係であるために、固形新生物の低酸素領域の処置に特に有効である。それは、レドックスサイクルとして酸素を「戻し」得る。
【０１３４】
　図７は、マウスＬ１２１０細胞を２０μＭ　ＧｄＴ２Ｂ２２＋および放射線照射に曝した実験からのデータを示す。コントロールカーブは、ＧｄＴ２Ｂ２２＋の非存在下での細胞の殺傷を示し、ＧｄＴＸＰを標識したカーブは、ＧｄＴ２Ｂ２２＋の存在下での細胞の殺傷を示す。増感剤促進比（ＳＥＲ）は、ＧｄＴ２Ｂ２２＋を有さない９５％の細胞を殺すのに必要な線量をＧｄＴ２Ｂ２２＋を有する９５％の細胞を殺すのに必要な線量で割った比である。増感剤に効果がない場合、比は１．０である；非常に効果的な増感剤は、３．０の比を有する。図７のデータは、２０μＭでＧｄＴ２Ｂ２２＋は１．６２のＳＥＲを有することを示す。（１．５より大きいＳＥＲが、臨床上有意である）。ＳＥＲを測定するための２つのさらなる方法は以下のとおりである：ｉ）カーブが直線である場合、傾きを比較する；ＳＥＲはこの化合物の傾き対コントロールの傾きの比である、またはｉｉ）有用または臨床上重要である特定の線量で、コントロールにおいて殺傷した細胞数（または％）の比を、この化合物により殺傷した細胞数（または％）と比較する。
【０１３５】
　ＳＥＲは、図８に示すようにＧｄＴ２Ｂ２２＋の濃度の増加に伴い増加する。例えば、８０μＭで、ＳＥＲは２．２より大きく、生理学的に容認可能な最も高いレベルのＧｄＴ２Ｂ２２＋が、放射線増感の目的のために所望されることを示す。
【０１３６】
　合計２０グレイの放射線および種々のレベルのＧｄＴ２Ｂ２２＋に曝したＬ１２１０細胞から得た全核酸サンプルをサイズ選択フィルターに通した（１グレイは、１００ラドに等しい吸収放射線線量の単位である）。図９のデータは、核酸はＧｄＴ２Ｂ２２＋の非存在下ではフィルターを通らなかったこと、およびＧｄＴ２Ｂ２２＋の存在下で核酸はフィルターを通るフラグメントに開裂されたことを示す。より高いレベルのＧｄＴ２Ｂ２２＋に曝して大量のフラグメントを生成した。明らかに、核酸鎖の切断は、ＧｄＴ２Ｂ２２＋の存在下で放射線の結果として生じる。ヒドロキシルラジカルは鎖切断の原因でありそうである。
【０１３７】
　本明細書に記載のテキサフィリンの放射線増感特性は、個体の治療に有効な放射線線量の減少を可能にし得る。従って、処置が本発明のテキサフィリンの使用を含む場合、悪心および正常な細胞に対する損傷のような放射線の副作用は減少し得る。個体について予測される用量のレベルは、複数回投与で投与される２〜２０μｍｏｌ／ｋｇの範囲であり得る（例えば、各分割照射の前）。
【０１３８】
　テキサフィリンのこの放射線増感特性は、挿入された金属に依存せず、テキサフィリンリガンドのみの機能である（すなわち、Ｇｄ（ＩＩＩ）イオンは、このプロセスで還元されない）。ガドリニウムテキサフィリン錯体についてのインビトロおよびインビボでの研究はまた、放射線損傷を増強する可能性を示唆し、そしてこの増強が酸素の存在により影響されないので、テキサフィリンは、酸素性および低酸素性の両方の腫瘍細胞で損傷を増加する可能性を有する。
【０１３９】
　（実施例６）
　ヒト癌細胞株の放射線増感
　本実施例は、インビトロでのヒトＨＴ−２９結腸腺癌細胞株の放射線分解を促進するための放射線増感剤として、本発明による３つのテキサフィリンの使用を記載する。
【０１４０】
　ＲＭＰＩ　１６８０栄養培地で維持されたＨＴ−２９細胞を種々の濃度のＧｄＴ２Ｂ２２＋、ＧｄＴ２ＢＥＴ２＋、またはＬｕＴ２ＢＥＴ２＋テキサフィリンのいずれかで２４時間３７℃でインキュベートした。インキュベート後、細胞を回収し、洗浄し、そして栄養培地に再懸濁した。細胞懸濁液のアリコート（５ｍＬ；５×１０５細胞／ｍＬ）を滅菌ペトリ皿にいれ、そして種々の時間放射線分解に曝した。放射線線量をＦｒｉｃｋｅ線量測定により換算した。放射線分解後、細胞を３７℃で７日間インキュベートし、その後、細胞生存率をトリパンブルー排除法により評価した。結果は、非照射細胞に対する生存割合の対数により示した。コントロールは、テキサフィリンに曝さないが、同じ条件下で照射した細胞を用いて実施した。
【０１４１】
　２０μＭ濃度での化合物についての結果は図１０Ａに示し、各テキサフィリン（ＧｄＴ２Ｂ２２＋、黒三角；ＧｄＴ２ＢＥＴ２＋、黒菱形；およびＬｕＴ２ＢＥＴ２＋、黒四角）の存在下で、細胞の殺傷の促進が生じたことを示す。
【０１４２】
　ＧｄＴ２Ｂ２２＋についてそうであるように、増感剤促進比（ＳＥＲ）は、下記の表４および図１０Ｂに示すように、ＧｄＴ２ＢＥＴ２＋およびＬｕＴ２ＢＥＴ２＋の各濃度の増加とともに増加した。図１０Ｂはまた、ＧｄＴ２ＢＥＴ２＋の非存在下（ａ）および３つの濃度（ｂ、１０μＭ；ｃ、２０μＭ；ｄ、４０μＭ）でのＧｄＴ２ＢＥＴ２＋の存在下で細胞の殺傷を示す。
表４．
ＨＴ−２９細胞の感作
【０１４３】
【表４】
2004091495.tif 000017
　種々のヒト（ＨＴ２９）細胞株およびマウス（Ｌ１２１０、ＶＡ１３、およびＲＩＦ−１）細胞株を用いて２０μＭ　ＧｄＴ２Ｂ２２＋についてＳＥＲを決定するために行ったインビトロ研究は、有意な放射線増感を示す（それぞれ、１．９２、１．６２、１．５２、および１．０５のＳＥＲ）。特筆すべきは、１．９２のＳＥＲである。なぜなら、これはＧｄＴ２Ｂ２２＋がヒト細胞株、ヒト結腸癌細胞株ＨＴ２９に有意な放射線増感を提供することを示唆するからである。
【０１４４】
　Ｔ２Ｂ２ガドリニウム錯体およびＴ２ＢＥＴガドリニウム錯体の比較は、全ての測定された濃度でＨＴ２９細胞において同等のＳＥＲを提供した。２０μＭのＴ２Ｂ２（ＳＥＲ＝１．９２）およびＴ２ＢＥＴ（ＳＥＲ＝２．０８）でのＨＴ２９細胞の同等の放射線増感が表４に示される。これらの結果に基づき、２つの化合物は、同等の放射線増感剤と考えられる。さらに、１０、２０、および４０μＭのＴ２ＢＥＴにＨＴ２９細胞を曝した後の放射線増感（表４）は、Ｔ２ＢＥＴとの有意な放射線増感を示す（それぞれ、ＳＥＲ＝１．５９、２．０８、および２．４５）。
【０１４５】
　これらの実験は、ガドリニウムテキサフィリン錯体が、パルス放射線分解条件下で非常に容易に還元されることを示す。このプロセスは、酸素に依存しない。還元ガドリニウムテキサフィリンラジカルは、シトシンの共有結合を変性し得、あるいは細胞内ＤＮＡを変性し得る。ヒトおよびマウス細胞株を用いるインビトロでの研究は、有意な放射線増感を示す。ＤＮＡへの取り込みが、テキサフィリン誘導性放射線増感の機構に関与しないので、この放射線増感は、酸素または細胞複製に依存しない。
【０１４６】
　（実施例７）
　インビボでの放射性感作
　本実施例は、テキサフィリンＴ２ＢＥＴのインビボでの放射性増感剤の効果を示すデータを提供する。
【０１４７】
　ＳＭＴ６腫瘍を有するドナーマウスを安楽死させ、そして腫瘍を無菌条件下で脚から取り出した。生存細胞数を顕微鏡下で算出し、そして次いで４〜６百万の細胞を、麻酔下でレシピエント無腫瘍マウス下肢に注入した。レシピエントマウスの腫瘍は、放射線処理前では、細胞の成長速度に依存して、４〜７日の成長期を経た。
【０１４８】
　放射線処理の日に、ほぼ同じサイズの腫瘍を有するマウスを選択した。ガドリニウムテキサフィリンＧｄＴ２ＢＥＴ２＋（２μｍｏｌ／ｍＬ）を、尾静脈に注射することにより静脈内に投与した。マウスを２または５時間後に照射処理した。２５０ＫＶ　Ｐｈｉｌｌｉｐｓ　Ｘ線機械およびリードシールドを有する特別なマウス下肢ジグを用いた。腫瘍を有する右脚のみをＸ線に曝すように、ジグの内側にマウスをうつ伏せにして配置した。単回線量が１０、２０、３０、４０、または５０グレイの放射線を照射した。６つの研究は、各コントロールおよび線量のグループにおいて平均して４匹の実験動物で行った。死亡数および病気でない生存データは、放射線治療後７５日間までの間に、腫瘍サイズの定期的な測定と同時に得た。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存カーブをプロットし、ｐ値をカーブのログランク分析（ｌｏｇ　ｒａｎｋ　ａｎａｌｙｓｅｓ）により決定した。
【０１４９】
　実験は、ＧｄＴ２ＢＥＴ２＋注射および放射線照射が、コントロールと比較して評価された全てのグループにおいて治療結果を改善することを示した。放射線だけを受けた動物と比較して、統計学的有意性は、３０グレイの放射線線量を受ける動物でのみ得られた。１０グレイ（ｐ＝０．８６）および２０グレイ（ｐ＝０．５０）の動物についてのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存カーブのログランク分析（図１１Ａ〜１１Ｂ）は、ＧｄＴ２ＢＥＴ２＋を有しても有さなくてもそれほど異ならないが、３０グレイ（ｐ＝０．０３）の動物についてのカーブは分岐した（図１１Ｃ〜１１Ｄ）。４０（ｐ＝０．６０）および５０グレイ（ｐ＝０．９７）についてのカーブは、処理においていかなる統計学的有意差をも示さない。しかし、統計学的有意性を示さなかった研究は、より少数の動物に基づく。
【０１５０】
　データは、３０グレイ線量の放射線が、腫瘍成長の部分的な制御を生じることを示し、これはＴ２ＢＥＴ注射により効果を増し得る（図１１Ｃ〜１１Ｄ）。低線量の放射線は、Ｔ２ＢＥＴ注射投与から利益を得るには十分でない。より高い線量では、腫瘍応答は、コントロール（放射線照射のみ）動物ならびにＴ２ＢＥＴ注射および放射線処理した動物の両方で非常に良く、増感剤での処理の利益を観察することが難しかった。
【０１５１】
　放射線増感剤としてのＴ２ＢＥＴ注射の効果はまた、生存および癌のない（最初の部位）生存をプロットすることによりこれらの研究で示された（図１１Ａ〜１１Ｄ）。腫瘍成長の遅れもまた、放射線（３０、４０、および５０グレイ）およびＴ２ＢＥＴを注入した放射線増感剤の両方を受ける動物でより大きかった。
【０１５２】
　（実施例８）
　局在化および／または光力学的治療を合わせた放射線増感
　本実施例は、局在化および放射線増感を合わせた方法、ならびに新生物組織およびアテロームの破壊のためにＰＤＴと合わせた放射線増感におけるテキサフィリンの使用を記載する。検出可能なテキサフィリンと関連づけることによる局在化と合わせた放射線増感の方法は、以下のとおりである。検出可能なテキサフィリンを、新生物またはアテロームを有する宿主に投与する。宿主の局在化部位を、テキサフィリンに関連づけることにより決定する。局在化手段は、特に、テキサフィリンが非メタル化であるか、または反磁性金属と錯形成されている場合、蛍光スペクトル分析；テキサフィリンが常磁性である金属を含む場合、磁気共鳴画像法；金属がγ放出性である場合、ガンマカメラ身体走査法であり得るか；または診断用Ｘ線、特に、テキサフィリンに結合した金属のＫ電子の周囲にエネルギーを有する単色または多色Ｘ線を用いることによる。放射性免疫診断用γ放出性金属は、本明細書に参考として援用される米国特許第５，２５２，７２０号に記載されている。好ましいγ放出性金属は、１１１Ｉｎ（ＩＩＩ）である。テキサフィリン常磁性金属錯体は、ＭＲＩにより腫瘍を視覚化する利益を提供する。好ましい常磁性金属は、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、またはＭｎ（ＩＩ）であり、そして最も好ましい常磁性金属はガドリニウムである。処理映像面の明瞭度が、放射線治療送達の重要な成分であるので、放射線治療と画像法とを合わせる機会がアピールされる。マウスおよびウサギにおけるＧｄＴ２ＢＥＴ２＋注射をともなうインビボ実験は、ＧｄＴ２ＢＥＴ２＋注射が、５μｍｏｌ／ｋｇ程度の低用量で腫瘍の良好なコントラスト増強を生じ、１４Ｃ標識したＧｄＴ２ＢＥＴ２＋を用いる生体分布研究は、腫瘍と周辺組織の間に良好な差異を示した。
【０１５３】
　ＧｄＴ２ＢＥＴ２＋は、その電子スペクトルの可視部分で光吸収能を有する　（主要吸収ピークが約４１５、４７３、および７３９ナノメーター）が、ＧｄＴ２ＢＥＴ２＋は、Ｇｄ非対合電子が、光により誘導された有機リガンドの励起状態を直ぐに失活するので、光増感剤ではない。遊離塩基テキサフィリンまたは反磁性金属と錯形成したテキサフィリンは感光性であり、そして光照射の際に一重項酸素を生じる。
【０１５４】
　光力学的治療と組み合わせた放射線増感の方法は以下の通りである。テキサフィリンを、良性または悪性の新生物細胞またはアテロームを有する宿主に投与する。テキサフィリンは、放射線増感特性、および周辺組織に関連して良性または悪性の新生物細胞またはアテロームプラークに対する選択的生体局在化を示す。宿主の局在化部位を、以下の例を用いて、テキサフィリンに関連づけることにより決定する：例えば、テキサフィリンの常磁性金属錯体が投与される場合、磁気共鳴画像法；遊離塩基テキサフィリンまたはテキサフィリン反磁性金属錯体が投与される場合、蛍光；またはγ放出性金属が投与されたテキサフィリン内で錯形成される場合、ガンマカメラ（またはＳＰＥＣＴ、シングルフォトン断層撮影）身体走査法。好ましい常磁性金属は、Ｇｄ（ＩＩＩ）である。好ましい反磁性金属は、Ｌｕ（ＩＩＩ）、Ｉｎ（ＩＩＩ）、またはＬａ（ＩＩ）である。好ましいγ放出性金属は、１１１Ｉｎ（ＩＩＩ）である。
【０１５５】
　テキサフィリンの固有の放射線増感特性は、テキサフィリンの近位に照射される場合、電磁放射線をより効果的および選択的にし得る。従って、より低い線量の放射線を用い得る。放射線は、外部に由来し得るか、またはテキサフィリンに結合した放射性金属のような内部に由来し得る。放射性金属の例は、１５３Ｇｄ、１１１Ｉｎ、または９０Ｙを含む。あるいは、本質的に同一の生体局在化特性を有し、光に曝される際に一重項酸素を生じる能力を示す第二テキサフィリン金属錯体を投与する。第二のテキサフィリン金属錯体を、良性または悪性の新生物細胞またはアテロームの近接部で光照射し、あるいは光ファイバー（ｆｉｂｅｒ　ｏｐｔｉｃｓ）またはレーザーを用いて光照射し、生成した一重項酸素から新生物組織破壊またはアテロームプラーク破壊を引き起こす。第二のテキサフィリン金属錯体中の金属は、反磁性金属であり、好ましくはＬａ（ＩＩＩ）、Ｌｕ（ＩＩＩ）、またはＩｎ（ＩＩＩ）である。
【０１５６】
　さらなる実施態様は、テキサフィリン放射線増感剤および処置用感光性テキサフィリンの使用である。この金属は放射線増感にとって重要でないので、この分子は単一のテキサフィリン反磁性金属錯体であり得る。次いで、光力学的治療のために光を用い、その後に電磁放射線照射するかまたは同時に電磁放射線照射することにより、細胞の共同作用的殺傷が達成される。別の実施態様は、内在性放射性キレート化テキサフィリンおよび外部より適用した放射線による共同作用性殺傷である。放射線増感および放射線治療の方法のインビトロでの使用は、骨髄の処置、輸血または器官の移植における滅菌を含む。
【０１５７】
　テキサフィリン−金属錯体は、それ自身が、新生物、新生物組織、またはアテロームに対し高い固有の生体局在化選択性を示すことについて選択される。例えば、Ｂ２Ｔ２およびＴ２ＢＥＴテキサフィリンは、脂質含有量の高い組織、アテローム、肝臓、腎臓、および新生物にインビボ親和性を示す。
【０１５８】
　テキサフィリン錯体は、このような生体医用放射線増感剤および光増感剤の良い候補である。それらは、ヒドロキシルラジカルが放射線損傷を引き起こし得る照射域で電子を「吸収し」、そしてテキサフィリンラジカルは隣接分子と共有結合的に反応し、さらに放射線損傷を起こす。それらは、容易に入手され、低い固有の細胞性障害、長い波長の吸収を有し、一重項酸素を生成し、生理学的環境で可溶性であり、部位特異的に移動する分子に複合体化される能力を有し、迅速な排除を有し、安定であり、そして合成的な変性に容易に供される。細胞の画像化および破壊のためにテキサフィリンを用いる有意な利点は、以下のとおりである：
ｉ）１つのテキサフィリンが、両方の機能のために用いられ得る；
ｉｉ）テキサフィリンは、固有の選択的生体局在化を有し、誘導体化のための電位を有し、この局在化を促進する；
ｉｉｉ）テキサフィリンは、放射線増感剤であるので、放射線照射はより効果的であり、そして低線量の放射線が用いられ得、従って、ほとんど副作用を経験しない；および
ｉｖ）金属錯体は、放射線増感に必要でない。
【０１５９】
　本発明は、生体局在化選択性および放射線増強特性を有する単一な薬剤とともに、特定の細胞を「見」て、「殺傷する」方法を提供する。
　以下の参考文献は、以下に引用される理由のために、本明細書中に参考としてその関連部分が援用されている。
【０１６０】
【数１−１】
2004091495.tif 000018
【０１６１】
【数１−２】
2004091495.tif 000019
【０１６２】
【数１−３】
2004091495.tif 000020
【０１６３】
【数１−４】
2004091495.tif 000021
　本明細書中に記載される実施例および実施態様は説明のみを目的としており、そして、その観点における種々の改変が当業者において示唆され、本出願の意図および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に包含されることが理解される。
【０１６４】
　以下の図面は本明細書の一部をなし、本発明の特定の局面をさらに説明するために含まれる。本発明は、１以上のこれらの図面を本明細書中の特定の態様の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、より一層理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１Ａ】図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃは、本発明の好ましいテキサフィリン、Ｔ２ＢＥＴ２＋、４，５−ジエチル−１０，２３−ジメチル−９，２４−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−１６，１７−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］−１３，２０，２５，２６，２７−ペンタアザペンタシクロ［２０．２．１．１３，６．１８，１１．０１４，１９］ヘプタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４（１９），１５，１７，２０，２２（２５），２３−トリデカエンの合成を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の好ましいテキサフィリン、Ｔ２ＢＥＴ２＋、４，５−ジエチル−１０，２３−ジメチル−９，２４−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−１６，１７−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］−１３，２０，２５，２６，２７−ペンタアザペンタシクロ［２０．２．１．１３，６．１８，１１．０１４，１９］ヘプタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４（１９），１５，１７，２０，２２（２５），２３−トリデカエンの合成を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明の好ましいテキサフィリン、Ｔ２ＢＥＴ２＋、４，５−ジエチル−１０，２３−ジメチル−９，２４−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−１６，１７−ビス［２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］−１３，２０，２５，２６，２７−ペンタアザペンタシクロ［２０．２．１．１３，６．１８，１１．０１４，１９］ヘプタコサ−１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４（１９），１５，１７，２０，２２（２５），２３−トリデカエンの合成を示す。
【図２】図２は、ピロール窒素に置換基を有する誘導体化されたテキサフィリン２Ｇを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、テキサフィリン金属錯体−オリゴヌクレオチド複合体を調製するための段階的合成スキームを示す。図３Ａは、テキサフィリン金属錯体３’−結合−オリゴヌクレオチド複合体の合成を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、テキサフィリン金属錯体−オリゴヌクレオチド複合体を調製するための段階的合成スキームを示す。図３Ｂは、５’結合オリゴヌクレオチド複合体を得るアプローチを示す。波線のついた丸は、結合基を有する制御された細孔のシリカを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、テキサフィリン金属錯体−オリゴヌクレオチド複合体を調製するための段階的合成スキームを示す。図３Ｃは、５’結合オリゴヌクレオチド複合体を得るアプローチを示す。波線のついた丸は、結合基を有する制御された細孔のシリカを示す。
【図４】図４は、水性イソプロピルアルコール中でのパルス放射線分解を示す。光学密度は、ガドリニウムテキサフィリンπラジカルカチオン、ＧｄＴ２Ｂ２＋●の形成の時間（μ秒）に対してプロットされている。
【図５Ａ】図５Ａおよび図５Ｂは、図４で形成されるπラジカルカチオンの時間（ｍ秒）に対する減衰を示す。図５Ａのプロットは、このカチオンが、図５Ｂ［Ｋ＝（１．９±０．７）×１０９Ｍ−１ｓ−１］に示されるような酸素の存在による影響を受けない長い半減期［Ｋ＝（１．７±０．５）×１０９Ｍ−１ｓ−１］を有することを示す。これらのデータは、ＧｄＴ２Ｂ２＋●πラジカルカチオンが酸素より低い還元ポテンシャルを有し、従って、その電子を酸素に供与しないことを示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび図５Ｂは、図４で形成されるπラジカルカチオンの時間（ｍ秒）に対する減衰を示す。図５Ａのプロットは、このカチオンが、図５Ｂ［Ｋ＝（１．９±０．７）×１０９Ｍ−１ｓ−１］に示されるような酸素の存在による影響を受けない長い半減期［Ｋ＝（１．７±０．５）×１０９Ｍ−１ｓ−１］を有することを示す。これらのデータは、ＧｄＴ２Ｂ２＋●πラジカルカチオンが酸素より低い還元ポテンシャルを有し、従って、その電子を酸素に供与しないことを示す。
【図６】図６は、テキサフィリンラジカルＧｄＴ２Ｂ２（Ｈ●）によるシトシンの共有結合的変性の速度定数（ｋ２＝約１０６Ｍ−１ｓ−１）を示す。これらのデータは、比較的安定であるにも関わらずテキサフィリンラジカルが反応性であり、そして隣接する分子に損傷を引き起こすことを示す。
【図７】図７は、２０μＭのＧｄＢ２Ｔ２２＋存在下または非存在下での放射線線量（グレイ単位）に対するマウスＬ１２１０細胞の殺傷を示す。増感剤促進比（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｒａｔｉｏ）は１．６２である。
【図８】図８は、ＧｄＢ２Ｔ２２＋がＬ１２１０細胞の殺傷に与える影響を示す。増感剤促進比をＧｄＢ２Ｔ２２＋濃度に対してプロットする。１．５より大きいＳＥＲは、臨床的に有意である。これらのデータは、増感剤としてのＧｄＢ２Ｔ２２＋の効果は、濃度と共に増加することを示す。
【図９】図９は、２５グレイでの放射線分解において、ＧｄＢ２Ｔ２２＋が核酸の鎖切断に及ぼす効果を示す。Ｌ１２１０細胞を、指示された濃度のＧｄＢ２Ｔ２２＋に曝し、溶解し、そして核酸物質をサイズ選択フィルターを通過させた。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、テキサフィリンを用いるヒトＨＴ−２９の放射線照射増感を示す。図１０Ａは、テキサフィリン非存在下（黒丸）、ならびにＧｄＴ２Ｂ２２＋（黒三角）、ＧｄＴ２ＢＥＴ２＋（黒菱形）、およびＬｕＴ２ＢＥＴ２＋（黒四角）での細胞の殺傷を示す。図１０Ｂは、ＧｄＴ２ＢＥＴ２＋非存在下（黒丸）、ならびに１０μＭ（黒四角）、２０μＭ（黒菱形）、および４０μＭ（黒三角）の濃度での存在下における細胞の殺傷を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、テキサフィリンを用いるヒトＨＴ−２９の放射線照射増感を示す。図１０Ａは、テキサフィリン非存在下（黒丸）、ならびにＧｄＴ２Ｂ２２＋（黒三角）、ＧｄＴ２ＢＥＴ２＋（黒菱形）、およびＬｕＴ２ＢＥＴ２＋（黒四角）での細胞の殺傷を示す。図１０Ｂは、ＧｄＴ２ＢＥＴ２＋非存在下（黒丸）、ならびに１０μＭ（黒四角）、２０μＭ（黒菱形）、および４０μＭ（黒三角）の濃度での存在下における細胞の殺傷を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃおよび図１１Ｄは、２０グレイ（図１１Ａおよび図１１Ｂ）および３０グレイ（図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の線量で放射線照射した全ての動物について、放射線照射およびＴ２ＢＥＴ（４０μｍｏｌ／ｋｇ注射）を与えた動物と、放射線照射のみを与えた動物（コントロール）とに関する全体的な生存および初期の癌のない生存（ｐｒｉｍａｒｙ　ｃａｎｓｅｒ−ｆｒｅｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ）（完全応答物）を示す。各グループには４匹の動物がいて、放射線照射はテキサフィリンの注入の２時間後に行った。記号は：白丸、放射線照射のみ（全体的な生存）；黒丸、放射線照射のみ（初期の癌のない生存）；白三角、Ｔ２ＢＥＴおよび放射線照射（全体的な生存）；黒三角、Ｔ２ＢＥＴおよび放射線照射（初期の癌のない生存）である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃおよび図１１Ｄは、２０グレイ（図１１Ａおよび図１１Ｂ）および３０グレイ（図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の線量で放射線照射した全ての動物について、放射線照射およびＴ２ＢＥＴ（４０μｍｏｌ／ｋｇ注射）を与えた動物と、放射線照射のみを与えた動物（コントロール）とに関する全体的な生存および初期の癌のない生存（ｐｒｉｍａｒｙ　ｃａｎｓｅｒ−ｆｒｅｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ）（完全応答物）を示す。各グループには４匹の動物がいて、放射線照射はテキサフィリンの注入の２時間後に行った。記号は：白丸、放射線照射のみ（全体的な生存）；黒丸、放射線照射のみ（初期の癌のない生存）；白三角、Ｔ２ＢＥＴおよび放射線照射（全体的な生存）；黒三角、Ｔ２ＢＥＴおよび放射線照射（初期の癌のない生存）である。
【図１１Ｃ】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃおよび図１１Ｄは、２０グレイ（図１１Ａおよび図１１Ｂ）および３０グレイ（図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の線量で放射線照射した全ての動物について、放射線照射およびＴ２ＢＥＴ（４０μｍｏｌ／ｋｇ注射）を与えた動物と、放射線照射のみを与えた動物（コントロール）とに関する全体的な生存および初期の癌のない生存（ｐｒｉｍａｒｙ　ｃａｎｓｅｒ−ｆｒｅｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ）（完全応答物）を示す。各グループには４匹の動物がいて、放射線照射はテキサフィリンの注入の２時間後に行った。記号は：白丸、放射線照射のみ（全体的な生存）；黒丸、放射線照射のみ（初期の癌のない生存）；白三角、Ｔ２ＢＥＴおよび放射線照射（全体的な生存）；黒三角、Ｔ２ＢＥＴおよび放射線照射（初期の癌のない生存）である。
【図１１Ｄ】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃおよび図１１Ｄは、２０グレイ（図１１Ａおよび図１１Ｂ）および３０グレイ（図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の線量で放射線照射した全ての動物について、放射線照射およびＴ２ＢＥＴ（４０μｍｏｌ／ｋｇ注射）を与えた動物と、放射線照射のみを与えた動物（コントロール）とに関する全体的な生存および初期の癌のない生存（ｐｒｉｍａｒｙ　ｃａｎｓｅｒ−ｆｒｅｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ）（完全応答物）を示す。各グループには４匹の動物がいて、放射線照射はテキサフィリンの注入の２時間後に行った。記号は：白丸、放射線照射のみ（全体的な生存）；黒丸、放射線照射のみ（初期の癌のない生存）；白三角、Ｔ２ＢＥＴおよび放射線照射（全体的な生存）；黒三角、Ｔ２ＢＥＴおよび放射線照射（初期の癌のない生存）である。
【図１Ａ】
2004091495.tif 000022
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
2004091495.tif 000030
【図５Ｂ】
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【図６】
2004091495.tif 000032
【図７】
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【図８】
2004091495.tif 000034
【図９】
2004091495.tif 000035
【図１０Ａ】
2004091495.tif 000036
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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