(57)【要約】【構成】マツヨイグサ属植物の抽出物又はＬ−システイン又はグルタチオン又はＮ−アセチルシステインを含有してなるトランスグルタミナーゼ活性亢進剤又は表皮角化正常化剤及びこれを含有してなる皮膚外用剤に関する。【効果】本発明によれば、トランスグルタミナーゼ活性を亢進し、角化細胞の分化誘導活性を有し、表皮の不全角化を抑制することにより、表皮角化を正常化し、皮膚の老化防止が図られ、肌荒れ改善効果、角質改善効果、美肌効果（滑らかさ、しっとり感、張り、艶、透明感など）といった若々しい肌を与える効果をもち、安全性の高い皮膚外用剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルシステイン、Ｌ−システイン、グルタチオン、及びマツヨイグサ属植物の抽出物から選ばれる１種又は２種以上からなるトランスグルタミナーゼ活性亢進剤。
【請求項２】
Ｎ−アセチルシステイン、Ｌ−システイン、グルタチオン、及びマツヨイグサ属植物の抽出物から選ばれる１種又は２種以上からなる表皮角化正常化剤。
【請求項３】
請求項１項記載のトランスグルタミナーゼ活性亢進剤、及び／又は請求項２項記載の表皮角化正常化剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項４】
保湿剤を含有することを特徴とする請求項１記載のトランスグルタミナーゼ活性亢進剤、又は請求項２記載の表皮角化正常化剤、又は請求項３記載の皮膚外用剤。
【請求項５】
マツヨウグサ属植物が月見草であることを特徴とする請求項１記載のトランスグルタミナーゼ活性亢進剤、及び請求項２記載の表皮角化正常化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トランスグルタミナーゼ活性亢進剤、及び表皮角化正常化剤に関し、更に詳しくは、Ｎ−アセチルシステイン、Ｌ−システイン、グルタチオン、マツヨイグサ属植物の抽出物から選ばれる１種又は２種以上からなるトランスグルタミナーゼ活性亢進剤、及び表皮角化正常化剤を有効成分として含有する皮膚外用剤に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】表皮の最も重要な生理機能の一つとして、外界からの様々な刺激、例えば、乾燥、紫外線、その他の物理的、化学的刺激に対する防御機能が挙げられ、その防御機能の役割を担うのが角質層である。この角質層を形成する角質細胞は、表皮角化細胞の分化によって次々と新しく作られ、古くなった角質細胞は表皮から離脱していく。これが、皮膚のターンオーバーと言われる現象である。この皮膚のターンオーバーが、何らかの原因でこの分化が阻害されたり、或いは異常に亢進されたりすると、正常な皮膚ターンオーバーが行なわれなくなり、様々な角化異常症、例えば乾皮症やざ瘡を引き起こす。
【０００３】このような皮膚疾患以外にも、加齢に伴い皮膚のターンオーバーが遅くなり、そのために機能的にやや劣った古い角質細胞が皮膚表面に遺残し、水分保持機能の低下につながり乾燥肌を引き起こす。又、加齢に伴い、表皮代謝機能の低下又は異常により、不全角化、表皮肥厚がしばしば誘発され、肌のくすみを引き起こす原因となっている。そして、皮膚のターンオーバーが遅くなり、角化が正常に機能しないことにより、皮膚疾患を起こし、引いては外観的美しさをも失う可能性がある。このように、健康で美しい肌の実現には角化を正常化することは非常に重要であると言える。
【０００４】従来、様々な肌トラブルを解消する手段として、種々の外的刺激や加齢により失われるアミノ酸等のＮＭＦ、コラーゲン、ヒアルロン酸等の成分を皮膚に補給する目的でそれらの成分を配合した皮膚外用剤、及び外的刺激である紫外線や活性酸素から皮膚を守るための防御物質を配合した皮膚外用剤を用いることが主流であった。しかし、これらは皮膚そのものが持つ機能を改善するものではなく、十分な効果を有するものではなかった。
【０００５】
【問題を解決する手段】トランスグルタミナーゼ（以下ＴＧａｓｅと記す。）は、インボルクリン、ロリクリンなどの皮膚のコーニファイドエンベロープ（ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ　ｃｅｌｌ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ：以下ＣＥと記す。）構成タンパク質を架橋することにより、皮膚の角質化に関与していることが知られている。１９９８年、ＴＧａｓｅファミリーの中で初めてケラチノサイトＴＧａｓｅのノックアウトマウスがつくられ、この酵素が皮膚の形成と個体の生存に必須有であることが明らかにされた（Ｍａｓｕｋｉ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ：Ｒｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９９８）１８：１１１−１１７）。又、ヒトの先天性葉状魚鱗癬の原因はケラチノサイトＴＧａｓｅ遺伝子の欠陥であることが最近解明された。更に、２００１年９月４日発行の化学工業日報記事中の報告では、ＣＥの成熟度と皮膚バリア機能の関係を明らかにし、皮膚バリア機能が低下した肌では未熟なＣＥが存在することを確認したことが記載されおり、その未熟なＣＥが形成される要因が、乾燥している状況下において、ＣＥ形成に関与するＴＧａｓｅが働きにくいためである結論づけている。
【０００６】そこで、本発明者らは、かかる実情に鑑み鋭意検討した結果、Ｎ−アセチルシステイン、Ｌ−システイン、グルタチオン、及びマツヨイグサ属植物の抽出物にトランスグルタミナーゼの活性を亢進する効果を見出し、皮膚角化を正常化することによって、加齢による角化不全を正常化し、肌のくすみを改善し、透明感のある健康で美しい肌を実現して、本発明を完成するに至った。従って、本発明の皮膚外用剤を化粧用クリーム、乳液等に調製・使用することにより、皮膚の老化を防止し、しわのない、滑らかで潤いのある若々しい肌を与えることができるものであり、このように本発明の皮膚外用剤は、優れた表皮角化促進、かつ安全性が高いことから、医薬品、医薬部外品、化粧品等の各種用途に使用することができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明する。本発明で使用することができるマツヨイグサ属植物とは、アカバナカ科マツヨイグサ属の植物であれば限定されず、例えば、ツキミソウ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａｔｅｔｒａｐｔｅｒａ）、メマツヨイグサ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ　ｂｉｅｎｎｉｓ）、コマツヨイグサ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ　ｌａｃｉｎｉａｔａ）、マツヨイグサ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ　ｓｔｒｉａｔａ）、オオマツヨイグサ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ　ｅｒｙｔｈｒｏｓｅｐａｌａ）等が挙げられる。又、本発明では当該植物の茎、葉、花、花蕾、種子等を利用することができ、特に種子を好適に用いることができる。
【０００８】抽出物は、植物体をそのまま或いは粉砕後、搾取したもの、又はそのまま或いは粉砕後、溶媒で抽出する。抽出溶媒としては、水、アルコール類（例えば、メタノール、無水エタノール、エタノールなどの低級アルコール、或いはプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール）、アセトンなどのケトン類、エチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステルなどの有機溶媒を、単独又は２種類以上を任意に組み合わせて使用することができる。
【０００９】マツヨイグサ属植物の抽出物は、応用する剤型・形態に従い、乾燥、濃縮、或いは希釈、他成分との混合などを任意に調製することができる。
【００１０】抽出方法は、通常、常圧下で行い、効率を上げるため加熱することもできる。抽出後は濾過及び／又はイオン交換樹脂等のカラムを用い精製して溶液状、ペースト状、ゲル状、又は粉末状とする。多くの場合は抽出液のままの状態で利用できるが、必要に応じて本発明効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色などの精製処理を行うことも可能である。尚、脱臭、脱色などの精製処理手段としては、活性炭カラム等を使用できる。
【００１１】本発明に用いることができるＮ−アセチルシステインは、特に限定はなく、化粧品種別配合成分規格収載のＮ−アセチルシステインが好ましい。本発明に用いることができるＬ−システインは、特に限定はなく、化粧品種別配合成分規格収載のＬ−システインが好ましい。本発明に用いることができるグルタチオンは特に限定はなく、化粧品種別配合成分規格収載のグルタチオンが好ましい。
【００１２】
アセチルシステイン、Ｌ−システイン、グルタチオン、及びマツヨイグサ属植物の抽出物は、トランスグルタミナーゼ活性亢進剤、表皮角化正常化剤、又は皮膚外用剤への配合原料として利用できる。その含有量は有効量含有されておれば問題なく、応用剤型の種類、使用法、期待する作用の程度によって多少異なる。固形分として０．００１質量％以上（以下、％で表わす。）が好ましく、更に好ましくは０．０１％以上である。
【００１３】本発明で用いられる保湿剤としては、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ソルビトール、ポリグリセリン、ポリエチレングリコール２０００、ジプロピレングリコールなどの多価アルコール類、トリメチルグリシンなどのアミノ酸誘導体、乳酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸カリウム、アミノ酸などのＮＭＦ成分、ヒアルロン酸ナトリウム、トレハロース、ヘパリノイド、コンドロイチン硫酸ナトリウムなどの糖類、コラーゲン加水分解物、セラミド類、尿素などを、１種又は２種以上配合することができる。配合量は通常、各種皮膚外用剤中に０．０５〜３０％配合するのが好ましい。０．０５％未満ではその効果は発揮されず、３０％を超える配合は製剤の使用感を悪くするなどの不都合を生じるおそれがある。
【００１４】本発明の表皮のトランスグルタミナーゼ活性亢進剤及び表皮角化正常化剤は、薬用皮膚外用剤、化粧料等の種々の使用形態をとることができる。薬用皮膚外用剤としては、例えば、薬効成分を含有する各種の軟膏剤が挙げられる。軟膏剤としては、油性基剤をベースとするもの、油／水、水／油型の乳化系基剤をベースとするもののいずれであってもよい。上記油性基剤としては、特に制限はなく、例えば、植物油、動物油、合成油、脂肪酸、及び天然又は合成のグリセライド等が挙げられる。又、上記薬効成分としては、特に制限はなく、例えば、鎮痛消炎剤、鎮痒剤、殺菌消毒剤、収斂剤、皮膚軟化剤、ホルモン剤等を必要に応じて適宜使用することができる。
【００１５】又、化粧料として使用する場合は、化粧料成分として一般に使用されている油分、保湿剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等を任意に組み合わせて配合することができる。化粧料としては、種々の用途及び形態、例えば、水／油、油／水型乳化化粧料、クリーム、化粧乳液、化粧水、油性化粧料、口紅、ファンデーション、皮膚洗浄剤、ヘアートニック、整髪剤、養毛剤、育毛剤等として用いることができる。
【００１６】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１７】（月見草抽出物の製法）
月見草（１００ｇ）を７０％エタノール溶液（１ｋｇ）、又は３０％１，３−ブチレングリコール溶液（１ｋｇ）、又は３０％プロピレングリコール溶液（１ｋｇ）、又は精製水（１ｋｇ）に浸漬し、室温にて５昼夜抽出した後、濾過して抽出液（乾燥固形分換算：約０．３〜３．０質量％）を約１ｋｇ得る。又、必要によりイオン交換樹脂による吸着及び／又はゲル濾過を行い精製することもできる。更に濃縮，乾燥を行うことにより粉末状態の抽出物を得ることも可能である。
【００１８】（トランスグルタミナーゼ活性亢進作用試験）
〔試験方法及び評価方法〕
ＴＧａｓｅの活性測定は、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシン（以下ＣＢＺ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙと記す。）とヒドロキシルアミンを基質として反応を行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下で鉄と反応させて鉄錯体を形成させ、５００ｎｍの吸光を測定し、ヒドロキサム酸の量を検量線より求め活性を算出する。ＴＧａｓｅ活性は特に記載しない限り以下に記載する方法により測定した。
〔活性測定法〕
試薬Ａ：１．０Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１８μｌと２．０Ｍヒドロキシルアミン６μｌと０．４Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）２．４μｌと０．２ＭＣＢＺ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ１８μｌと０．１Ｍ塩化カルシウム６μｌと蒸留水６９．６μｌを混合する。
試薬Ｂ：２．５Ｎ塩酸１５％とトリクロロ酢酸５％とＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（０．１ＮＨＣｌに溶解）を１：１：１の比率で混合しする。
【００１９】酵素液の０．０１５ｍｌと１％試験試液０．０１５ｍｌに試薬Ａ０．１２　ｍｌを加えて混合し３７℃で６０分間反応後、試薬Ｂ０．１５ｍｌを加えて反応停止と鉄錯体の形成を行った後、５００ｎｍの吸光度を測定する。対照としてあらかじめ熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたものの吸光度を測定し、酵素液との吸光度差を求める。別に酵素液の代わりにＬ−グルタミン酸γ−モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求め１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を１単位とした。無添加（コントロール）の活性を１００とした時の各試験試液を添加した時の酵素活性を算出した結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
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【００２１】上記表１に示した結果のように、マツヨイグサ属植物抽出物である月見草抽出物では、コントロールに対して約３．２倍という高いトランスグルタミナーゼ活性亢進効果が認められた。従って、Ｌ−システイン、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、特に月見草抽出物はトランスグルタミナーゼを活性化することによって角化細胞の分化誘導活性を有し、表皮の不全角化を抑制することが示唆された。
【００２２】（損傷治癒皮膚の状態改善効果試験）
皮膚の角化正常化効果を調べるために、下記実施例１〜実施例４、及び比較例１に示す組成の化粧水を用いて、以下の方法により、損傷治癒皮膚の状態改善効果について評価試験を行った。
【００２３】
【表２】
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【００２４】１群６匹６群の白色ハートレイ系雌性モルモット（体重３５０〜５００ｇ）の背部を剃毛し、ガムテープで４回ストリッピングした後、その部分が瘡蓋状になるまで、５日間放置した。その後、各群のモルモットの上記部分に表２記載の０．００１％月見草抽出物配合の実施例１、０．００１％Ｌ−システイン配合の実施例２、０．００１％グルタチオン配合の実施例３、０．００１％Ｎ−アセチルシステイン配合の実施例４の化粧水をそれぞれ０．０５ｍｌ／ｄａｙで３日間塗布した。又、同様にして、コントロール群には比較例１の化粧水を経皮塗布した。
【００２５】塗布終了後、上記部分を毎日観察し周囲の皮膚と変わりなくなるまでにかかった日数を調べた。表３に各群のモルモット６匹の平均治癒日数を示す。
【００２６】
【表３】
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【００２７】表３に示す結果から明らかなように、本発明のトランスクルタミナーゼ活性亢進剤又は表皮角化正常化剤を構成する物質を含有する実験例１〜実施例４の化粧水を経皮投与されたモルモット群はいずれも、比較例１のコントロール化粧水を経皮投与されたモルモット群に比べて、瘡蓋状から通常の皮膚状態になるまでに要する日数が短い。
【００２８】（皮膚光老化改善効果試験）
１群２匹のヘアレスマウス（ｈｏｓ：ＨＲ−１、９〜１０週齢、雌）背部皮膚に紫外線（ＵＶ−Ｂ）を１日１回５０ｍＪ／日・ｃｍ２となるように照射したのち、表４に示した被験溶液（比較例２〜比較例５、実施例５〜実施例１２）１００μｌを均一になるように塗布し、これを週５日、５週間行った。尚、紫外線照射時には、皮膚上に残っている被験物質を３０％エタノール溶液で良く拭き取ってから照射を行った。５週間の紫外線照射と塗布が終了したところで、角層水分量をＳｋｉｃｏｎ−２００〔アイ・ビィ・エス（株）社製〕、経表皮水分喪失（以下、ＴＥＷＬと記す。）をＴＥＷＡＭＥＴＥＲ　ＴＭ２１０（Ｃｏｕｒａｇｅ＆　Ｋｈａｚａｋａ社製）、皮膚弾力性をＣｕｔｏｍｅｔｅｒ　ＳＥＭ５７５（Ｃｏｕｒａｇｅ　＆　Ｋｈａｚａｋａ社製）を用いて評価した。
【００２９】評価した３指標については、各指標のコントロール群（比較例２）の値と比較し、表４の評価基準にて評価し、その結果を表５に示す。尚、ＴＥＷＬについては、コントロール群の経表皮水分喪失量を１００として各実施例及び各比較例の経表皮水分喪失量を示し評価基準とした。
【００３０】
【表４】
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【００３１】
【表５】
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【００３２】表５の結果から明らかなように、月見草抽出物、Ｌ−システイン、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステインを含む実施例５〜実施例１２は、何れも皮膚光老化に対して高い予防効果を示し、保湿剤との併用においては（実施例９〜実施例１２）では極めて顕著な効果を示すことが判明した。
【００３３】（くすみ改善効果）
顔がくすんでいることを自覚している年齢２５〜６０歳の健常な女性１０名を被験者とし、下記実施例１３化粧用クリームを左顔面に下記比較例６化粧用クリームを右顔面に連日、１日２回塗布して１ヵ月間使用した後、くすみ改善効果について調べた。
【００３４】
（実施例１３及び比較例６）
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製法：前記水相の原料を混合し、加熱して７０゜Ｃに保ち水層部とする。一方、他の成分を混合し、加熱溶解して７０゜Ｃとして油相部とする。この油相部を前述の水層部に加えて予備乳化を行い、ホモミキサーで均一に乳化し、３０゜Ｃまで冷却しクリームを得る。
【００３５】
（くすみ改善効果）
肌の明るさ、透明感、くすみ具合の変化を本人の実感アンケート調査にて評価した。評価方法は下記の判断基準にて行い、結果は表６の通りで表中の数値は人数を表す。尚、使用期間中に皮膚トラブル等の異常を訴えた者はなかった。
（判定基準）
有効：　肌が明るくなった、透明感が感じられる、くすみが薄くなった。
やや有効：　肌がやや明るくなった、透明感がやや感じられる、くすみがやや薄くなった。
効果なし：肌に変化がない、くすみがある。
【００３６】
【表６】
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【００３７】表６から明らかなように、実施例１３で得られた化粧用クリームを用いた場合には、比較例６で得られた化粧用クリームを用いた場合よりも、肌の明るさ、透明感アップ、くすみ具合が薄くなり、改善されていることが認められる。このことは、月見草抽出物を含有する処方が皮膚のくすみを改善し、透明感のある肌に導くのに極めて有用であることを示すものである。
【００３８】以下、本発明皮膚外用剤を配合した処方例を示す。下記の例は、いずれも肌荒れ改善効果、角質改善効果、美肌効果（滑らかさ、しっとり感、張り、艶など）といった優れた効果を示し、安全性も良好なものであった。
【処方例】以下に本発明の処方例を挙げる。
【００３９】
（処方例１）ジェル
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〔製法〕（１２）に（４）を均一に溶解した（水相）。一方、（１）に（７）と（３）を溶解し、これを水相に添加した。次いでここに、（２）、（８）〜（１１）を加えた後、（５）、（６）で中和させ増粘させ、ジェルを得る。
【００４０】
（処方例２）美容液
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〔製法〕Ａ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ｃ相にＡ相を加えて可溶化した。次いでＢ相を加え美容液を得る。
【００４１】
（処方例３）乳液
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〔製法〕前記水相の原料を混合し、加熱して７０゜Ｃに保ち水層部とする。一方、他の成分を混合し、加熱溶解して７０゜Ｃとして油相部とする。この油相部を前述の水層部に加えて乳化し、３０゜Ｃまで冷却し乳液を得る。
【００４２】
（処方例４）パック剤
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〔製法〕水相の原料を混合し、均一にする。さらに他成分を混合し、均一になるまで攪拌し、パック剤を得る。
【００４３】
（処方例５）クリーム状ファンデーション
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〔製法〕顔料を混合し粉砕する。水相を調整し、これに混合した顔料を加え分散させた後、７５゜Ｃに加熱する。油相を調整し８０゜Ｃに加熱する。油相を水相に攪拌しながら加え乳化した後冷却し、５０゜Ｃで香料を加えさらに３０゜Ｃまで冷却しクリーム状ファンデーションを得る。
【００４４】
【発明の効果】本発明によれば、トランスグルタミナーゼ活性を亢進し、角化細胞の分化誘導活性を有し、表皮の不全角化を抑制することにより、表皮角化を正常化し、皮膚の老化防止が図られ、肌荒れ改善効果、角質改善効果、美肌効果（滑らかさ、しっとり感、張り、艶、透明感など）といった若々しい肌を与える効果をもち、安全性の高い皮膚外用剤が提供される。