(57)【要約】【課題】観察分子の退色を防止して、十分な画像観察を行うことができる顕微鏡を提供する。【解決手段】試料９内の分子を基底状態から第１励起状態へ励起させるための励起光を発生する励起光源１と、励起光源１からの励起光を試料９上に集光する集光光学系８と、励起された試料９内の分子が脱励起する際の発光を検出する検出手段１４とを有し、励起光源１はパルス光源であり、該パルス光源からの励起光の繰り返し周波数をν、パルス幅をＴ、試料９内の分子の第１励起状態の寿命をτ、試料９内の分子が基底状態から第１励起状態に励起されるときの吸収断面積をσ０、励起光の試料集光面におけるフォトンフラックスをＩ０とするとき、ν＜１／τ、１／（Ｉ０・σ０）＜Ｔ＜τ、を満たすよう構成する。【選択図】　　　　図１
2004029345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の分子を基底状態から第１励起状態へ励起させるための励起光を発生する励起光源と、
該励起光源からの励起光を試料上に集光する集光光学系と、
励起された試料内の分子が脱励起する際の発光を検出する検出手段とを有し、
上記励起光源はパルス光源であり、該パルス光源からの励起光の繰り返し周波数をν、パルス幅をＴ、試料内の分子の第１励起状態の寿命をτ、試料内の分子が基底状態から第１励起状態に励起されるときの吸収断面積をσ０、励起光の試料集光面におけるフォトンフラックスをＩ０とするとき、
【数１】
2004029345.tif 000003
を満たすよう構成したことを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料を観察する顕微鏡であって、
上記分子を基底状態から第１電子励起状態へ遷移させる第１の光を発生する第１の光源と、
上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態へ遷移させる第２の光を発生する第２の光源と、
上記第１の光および上記第２の光の照射領域を少なくとも一部分重ね合わせて上記試料に照射する光学系と、
上記分子が第１電子励起状態から基底状態に脱励起する際の発光を検出する検出手段とを有し、
上記第１の光源はパルスレーザーであり、該パルスレーザーからの第１の光の繰り返し周波数をν、パルス幅をＴ、上記分子の第１電子励起状態の寿命をτ、上記分子が基底状態から第１電子励起状態に励起されるときの吸収断面積をσ０、第１の光の試料集光面におけるフォトンフラックスをＩ０とするとき、
【数２】
2004029345.tif 000004
を満たすよう構成したことを特徴とする顕微鏡。
【請求項３】
上記パルス光源からの励起光の繰り返し周波数は、試料を走査するサンプリング周波数よりも大きいことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項４】
上記パルスレーザーからの第１の光の繰り返し周波数は、試料を走査するサンプリング周波数よりも大きいことを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項５】
上記第２の光源はパルスレーザーであり、該パルスレーザーからの第２の光のパルス幅は、上記第１の光源からの第１の光のパルス幅よりも長いことを特徴とする請求項２または４に記載の顕微鏡。
【請求項６】
上記第２の光源は連続発振レーザーであることを特徴とする請求項２または４に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザー光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の新しい光学顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザー技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、例えば特開平８−１８４５５２号公報において、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択し、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図３〜図６を参照して説明する。図３は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図３に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図４に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して図５に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図６に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図４の吸収過程や図６の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザー光等により共鳴波長λ１の光で図４のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図５のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λおよび波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図５の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合には画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図３に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、例えば特開２００１−１００１０２号公報において、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている。
【００１２】
図７は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、更に波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図７はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図７に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図８は、図７と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図８において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では蛍光自体が完全に抑制され、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザー顕微鏡等では、レーザー光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図８の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
さらに、顕微鏡の超解像性を高めるため、例えば特開平１１−９５１２０号公報において、超解像顕微鏡の機能を十分に活かすための蛍光ラベラー分子や、利用する波長λ１および波長λ２の２つの光の試料への照射タイミング等が開示されている。この先行技術では、少なくとも基底状態を含む３つの量子状態を有し、第１電子励起状態を除く高位のエネルギー状態から基底状態へ脱励起するときの遷移が蛍光による緩和過程よりも熱緩和過程が支配的である各種分子を染色する蛍光ラベラー分子と、生化学的な染色技術を施した生体分子とを化学結合させた試料を、染色する分子を励起する波長λ１の光でＳ１状態に励起し、続いて波長λ２の光により即座に高位の量子準位に励起することで、Ｓ１状態からの蛍光を抑制するようにしている。このように分子の光学的性質を利用して、空間的な蛍光領域を人為的に抑制することで、空間分解能の向上を図ることができる。
【００１８】
このような分子の光学的性質は、量子化学的な立場から説明することができる。すなわち、一般に、分子はそれを構成する各原子がσまたはπ結合によって結ばれている。言い換えると、分子の分子軌道は、σ分子軌道またはπ分子軌道を有していて、これらの分子軌道に存在する電子が各原子を結合する重要な役割を担っている。そのなかでも、σ分子軌道の電子は各原子を強く結合し、分子の骨格である分子内の原子間距離を決めている。これに対して、π分子軌道の電子は各原子の結合にほとんど寄与しないで、むしろ分子全体に極めて弱い力で束縛されている。
【００１９】
多くの場合、σ分子軌道にいる電子を光で励起すると、分子の原子間隔が大きく変化し、分子の解離を含む大きな構造変化が起こる。その結果、原子の運動エネルギーや構造変化のために、光が分子に与えたエネルギーのほとんどが熱エネルギーに変化する。したがって、励起エネルギーは蛍光という光の形態では消費されない。また、分子の構造変化は極めて高速（ピコ秒より短い）に起こるので、その過程で仮に蛍光が起きてもその寿命が極めて短い。
【００２０】
これに対し、π分子軌道の電子は、励起しても分子の構造自体はほとんど変化せず、高位の量子的な離散準位に長時間とどまり、ナノ秒オーダで蛍光を放出して脱励起する性質を有している。
【００２１】
量子化学によれば、分子がπ分子軌道をもつことと、二重結合をもつこととは同等であり、用いる蛍光ラベラー分子には、二重結合を豊富にもつ分子を選定することが必要条件となる。このことは、二重結合をもつ分子でもベンゼンやピラジン等の６員環分子において、Ｓ２励起状態からの蛍光が極めて弱いことが確かめられている（例えば、Ｍ．Ｆｕｊｉｉ　ｅｔ．ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１７１（１９９０）３４１）。
【００２２】
したがって、ベンゼンやピラジン等の６員環分子を含む分子を蛍光ラベラー分子として選定すれば、Ｓ１状態からの蛍光寿命が長く、しかも光励起によりＳ１状態からＳ２状態に励起することで、分子からの蛍光を容易に抑制できるので、超解像性を効果的に利用することができる。すなわち、これら蛍光ラベラー分子により染色して観察を行なえば、高空間分解能で試料の蛍光像を観察することができるのみならず、その分子の側鎖の化学基を調整することにより、生体試料の特定の化学組織のみを選択的に染色できるので、試料の詳細な化学組成までも分析可能となる。
【００２３】
また、一般に、二重共鳴吸収過程は２つ光の波長や偏光状態等が特定の条件を満たすときにのみ起こるので、これを用いることで分子の構造を非常に詳細に知ることができる。すなわち、光の偏光方向と分子の配向方向とは強い相関関係があり、２つ波長の光のそれそれの偏光方向と分子の配向方向とが特定の角度をなすとき、二重共鳴吸収過程が強く起こる。したがって、２つ波長の光を試料に同時に照射して、それぞれの光りの偏光方向を回転することにより、蛍光の消失の程度が変化するので、その様子から観測しようとする組織の空間配向の情報も得ることができる。このことは、２つ光の波長を調整することでも可能である。
【００２４】
以上のように、上記の特開平１１−９５１２０号公報記載の技術によると、超解像性以外にも、高い分析能力を有していることがわかる。さらに、波長λ１と波長λ２との２つの光の照射タイミングを工夫することで、Ｓ／Ｎを改善し、かつ蛍光抑制を効果的に起すことができ、超解像性をより効果的に発現することが可能となる。
【００２５】
このような超解像顕微鏡法の具体例として、例えば特開２００１−１００１０２号公報には、蛍光ラベラー分子をＳ０状態からＳ１状態へ励起する波長λ１の光（特にレーザー光）をポンプ光とし、Ｓ１状態からＳ２状態へ励起する波長λ２の光をイレース光として、図９に示すように、光源８１からポンプ光を、光源８２からイレース光をそれぞれ放射させ、ポンプ光はダイクロイックミラー８３で反射させた後、輪帯光学系８４により試料９５上に集光させ、イレース光は位相板８６で中空ビーム化した後、ダイクロイックミラー８３を透過させてポンプ光と空間的に重ね合わせて輪帯光学系８４により試料９５上に集光させるようにしたものが提案されている。
【００２６】
この顕微鏡によると、イレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光は抑制されるので、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域（Δ＜０．６１・λ１／ＮＡ、ＮＡは輪帯光学系８４の開口数）に存在する蛍光ラベラー分子のみが観察されることになり、結果的に超解像性が発現することになる。なお、イレース光を中空ビーム化する位相板８６は、例えば、図１０に示すように、光軸に対して点対称な位置で位相差πを与えるように構成したものや、液晶面を用いた液晶空間変調器を用いることができる。
【００２７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、超解像顕微鏡法を含む蛍光検出型の顕微鏡においては、蛍光色素の退色の問題がある。特に、市販のレーザー顕微鏡では、励起光源すなわちポンプ光光源として主に連続発振（ＣＷ）レーザーを用いているが、観測中にしばしば退色現象が発生して、十分な画像観察を行う前にコントラストが低下してしまうという問題がある。
【００２８】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、観察分子の退色を防止して、十分な画像観察を行うことができる顕微鏡を提供することにある。
【００２９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する請求項１に係る顕微鏡の発明は、試料内の分子を基底状態から第１励起状態へ励起させるための励起光を発生する励起光源と、
該励起光源からの励起光を試料上に集光する集光光学系と、
励起された試料内の分子が脱励起する際の発光を検出する検出手段とを有し、上記励起光源はパルス光源であり、該パルス光源からの励起光の繰り返し周波数をν、パルス幅をＴ、試料内の分子の第１励起状態の寿命をτ、試料内の分子が基底状態から第１励起状態に励起されるときの吸収断面積をσ０、励起光の試料集光面におけるフォトンフラックスをＩ０とするとき、
【数３】
ν＜１／τ　　　　　　　　　・・・（１）
１／（Ｉ０・σ０）＜Ｔ＜τ　　　　・・・（２）
を満たすよう構成したことを特徴とするものである。
【００３０】
請求項２に係る発明は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料を観察する顕微鏡であって、
上記分子を基底状態から第１電子励起状態へ遷移させる第１の光を発生する第１の光源と、
上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態へ遷移させる第２の光を発生する第２の光源と、
上記第１の光および上記第２の光の照射領域を少なくとも一部分重ね合わせて上記試料に照射する光学系と、
上記分子が第１電子励起状態から基底状態に脱励起する際の発光を検出する検出手段とを有し、
上記第１の光源はパルスレーザーであり、該パルスレーザーからの第１の光の繰り返し周波数をν、パルス幅をＴ、上記分子の第１電子励起状態の寿命をτ、上記分子が基底状態から第１電子励起状態に励起されるときの吸収断面積をσ０、第１の光の試料集光面におけるフォトンフラックスをＩ０とするとき、上記（１）式および（２）式を満たすよう構成したことを特徴とするものである。
【００３１】
請求項３に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、上記パルス光源からの励起光の繰り返し周波数は、試料を走査するサンプリング周波数よりも大きいことを特徴とするものである。
【００３２】
請求項４に係る発明は、請求項２に記載の顕微鏡において、上記パルスレーザーからの第１の光の繰り返し周波数は、試料を走査するサンプリング周波数よりも大きいことを特徴とするものである。
【００３３】
請求項５に係る発明は、請求項２または４に記載の顕微鏡において、上記第２の光源はパルスレーザーであり、該パルスレーザーからの第２の光のパルス幅は、上記第１の光源からの第１の光のパルス幅よりも長いことを特徴とするものである。
【００３４】
請求項６に係る発明は、請求項２または４に記載の顕微鏡において、上記第２の光源は連続発振レーザーであることを特徴とするものである。
【００３５】
以下、本発明の原理について、図２を参照して説明する。
【００３６】
図２は、分子一般の量子準位を示すエネルギーダイヤグラムである。例えば、共鳴する波長で、分子をまず基底状態Ｓ０から第１電子励起状態Ｓ１に励起すると、分子は所定の蛍光収量で蛍光を発して基底状態に緩和する。ここで、Ｓ１状態に止まる寿命をτとすると、その緩和速度は、１／τで与えられる。蛍光性の分子の場合、通常、τは凝集相中でナノ秒のオーダーであり、緩和速度は１０８〜１０９／ｓｅｃのオーダーである。
【００３７】
この時、Ｓ１状態にある分子に、二重共鳴吸収過程の条件を満たす波長のイレース光を照射すると、Ｓ１状態の分子はσＩの速度で減少する。ここで、σはイレース光に対するＳ１状態の分子の吸収断面積であり、Ｉはイレース光のフォトンフラックスである。遷移先は、Ｓ２状態またはそれ以上の遷移可能な量子状態であったり、３重項状態であったりするが、いずれにしろ蛍光収量が極めて小さい量子状態に遷移する。これが二重共鳴吸収過程であるが、一般に分子はＳ１状態以外からは蛍光を発しないので、二重共鳴吸収過程が起こると分子からの蛍光は抑制される。上述したように、超解像顕微鏡は、この原理を基礎にしている。
【００３８】
ところで、色素分子にポンプ光を長時間照射すると、色素分子の退色を招く。これも、ポンプ光の単独照射による一種の二重共鳴吸収現象である。すなわち、Ｓ１状態にある分子が更にポンプ光を吸収して、イオン化してしまう現象が発生する。これは、分子解離を伴う化学反応であり、もはや分子は以前の光学的な性質を失ってしまう。特に、蛍光分子の場合には、蛍光収量が低下して蛍光ラベラーとして機能しなくなる。
【００３９】
一般に、分子の励起過程が終了するまでの時間は、数ピコ秒あれば十分であり、大体の分子は励起後、数ナノ秒以内に蛍光を発してＳ０状態に戻る。この過程を更に詳しく説明する。分子がポンプ光によりＳ０状態からＳ１状態に励起するときの吸収断面積をσ０、ポンプ光の照射時間をＴ、ポンプ光のフォトンフラックスをＩ０とすると、Ｔ＞１／（Ｉ０・σ０）を満たす条件では、１分子が６３％以上の確率でＳ１状態に励起する。例えばローダミン６Ｇの場合には、σ０が１０−１７ｃｍ２であるから、ポンプ光として例えば波長５３２ｎｍで、光強度が１ｎＷの微弱な光を１μｍに集光させると、Ｔ＞１０−１７ｓｅｃなる条件が実現して、分子は瞬時に励起する。
【００４０】
したがって、原理的には、ポンプ光光源として、フェムト秒やピコ秒のパルス幅を有する市販のパルスレーザーが使用可能である。しかし、励起後の励起寿命τの間に、ポンプ光が入射すると分子がイオン化して退色するおそれがある。したがって、ポンプ光光源のパルス幅は、分子の励起寿命τよりもできるだけ短い方が望ましい。
【００４１】
また、蛍光が終了する励起寿命後にポンプ光を再び照射すれば、分子は退色することなくＳ１状態に励起するので、非常に高い頻度で蛍光を発することになる。したがって、次に照射するポンプ光の時間間隔はτ以上であることが望ましく、特にτ間隔でフェムト秒やピコ秒のパルス幅のポンプ光を照射すれば、退色する確率が非常に少ない状態で分子を常時Ｓ１状態に維持することができ、これにより時間平均での蛍光の発生確率を最大にすることができ、十分な画像観察を行うことが可能になる。
【００４２】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明による顕微鏡の一実施の形態について説明する。
【００４３】
図１は、本発明の一実施の形態における顕微鏡の構成を示す図である。本実施の形態の顕微鏡は、イレース光を中空ビーム化して超解像性を発現させて空間分解能を向上させたレーザー走査型の顕微鏡で、ローダミン６Ｇで染色された生体試料を観察するものである。
【００４４】
ここで、ローダミン６Ｇは、５３０ｎｍの波長帯域で吸収が最大となり、また、第１電子励起状態（Ｓ１）から、よりエネルギー的に高い高位の電子励起状態に励起できる吸収帯が、波長６００〜６５０ｎｍの領域に存在する。
【００４５】
そこで、本実施の形態では、第１の光源としてレーザーダイオード（ＬＤ）励起型のモードロックＮｄ：ＹＡＧレーザー１を用い、その２倍高調波（５３２ｎｍ）をポンプ光として用いる。このＬＤ励起型のモードロックＮｄ：ＹＡＧレーザー１は、レーザー共振器の設計パラメータの調整により、ＭＨｚオーダーの繰り返し周波数で、ピコ秒のレーザーパルスを発振することができる。例えば、スイス：Ｔｉｍｅ−Ｂａｎｄｗｉｄｔｈ社製のＧＥ−１００シリーズは、標準仕様で、１００ＭＨｚの繰り返し周波数において、パルス幅：６ｐｓｅｃのパルス光を平均出力５０ｍＷで発振することができる。これは、１パルスの持つエネルギーが、５００ｐＪに対応する。また、共振器を設計変更することで、繰り返し周波数を、２５ＭＨｚ〜１ＧＨｚの間で調整することができる。
【００４６】
また、第２の光源は、市販で廉価かつ信頼性の高いＣＷのＨｅ−Ｎｅレーザー２を用い、その基本波（６３３ｎｍ）をイレース光として用いる。
【００４７】
ＬＤ励起型のモードロックＮｄ：ＹＡＧレーザー１からのポンプ光は、キューベット型のハーフミラーからなるビームコンバイナー３に入射させる。また、ＣＷのＨｅ−Ｎｅレーザー２からのイレース光は、図１０に示したような位相板４を通すことで中空ビーム化してビームコンバイナー３に入射させてポンプ光と同軸上に合成し、これらポンプ光およびイレース光を、キューベット型のハーフミラーからなるビームセパレーター５を透過させた後、互いに直交する軸を中心に揺動可能なガルバノミラー６および７で順次反射させて対物レンズ８によりローダミン６Ｇで染色された生体試料９の表面に集光させ、その集光点をガルバノミラー６，７の揺動により移動させて試料面上を２次元走査する。なお、図１では、図面を簡略化するために、ガルバノミラー６，７を互いに平行な軸を中心に揺動するように示している。また、位相板４は、図１０に示すような位相分布をイレース光に与えるべく、蒸着膜がコートされている。これにより、光軸で光強度をキャンセルして中空状のビームに整形される。
【００４８】
一方、ポンプ光およびイレース光の照射により試料９から発する蛍光は、対物レンズ８によりコリメートしたのち、入射光路とは逆の経路を辿って、ガルバノミラー７および６を経てビームセパレーター５に入射させ、該ビームセパレーター５で反射される蛍光を投影レンズ１０によりピンホール１１に集光させる。
【００４９】
ピンホール１１は、試料９の蛍光発光点に対して共焦点位置に配置し、このピンホール１１を透過した蛍光を、ポンプ光カットノッチフィルター１２およびイレース光カットノッチフィルター１３を透過させて、それぞれポンプ光およびイレース光を除去した後、光電子増倍管１４で受光して蛍光信号を得る。
【００５０】
光電子増倍管１４から得られる蛍光信号は、Ａ／Ｄ変換して顕微鏡を制御する図示しないコンピュータのビデオフレームメモリに格納し、このビデオフレームメモリに格納された映像信号をＤ／Ａ変換して、試料９の蛍光２次元画像を図示しないＣＲＴ等のモニタにリアルタイムで表示する。なお、ガルバノミラー６，７は、モニタに表示する蛍光２次元画像のビデオレートに同期して揺動させる。
【００５１】
本実施の形態では、生体試料９を染色するローダミン６Ｇの励起寿命（τ）が３ｎｓｅｃであることから、上記（１）式を満足するため、ＬＤ励起型のモードロックＮｄ：ＹＡＧレーザー１からのポンプ光の繰り返し周波数（ν）を、３３３ＭＨｚ以下とする。
【００５２】
また、対物レンズ８は、開口数（ＮＡ）が０．９のものを用いる。この場合、試料９上でのポンプ光（波長λ１＝５３２ｎｍ）の集光径（ｄ）は、レイリーの式から、
【数４】
ｄ＝１．２２・λ１／ＮＡ
＝０．７２（μｍ）
となり、その集光面積は、約４×１０−９ｃｍ２となる。
【００５３】
したがって、単位時間、単位面積あたりに試料集光面を通過する光子数、すなわちフォトンフラックスＩ０は、６．５×１０２８ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２／ｓｅｃとなる。また、ローダミン６Ｇのポンプ光に対するＳ０状態からＳ１状態への分子の吸収断面積（σ０）は、１０−１７ｃｍ２であることから、この場合の１／（σ０・Ｉ０）は、約１．５ｐｓｅｃとなる。そこで、本実施の形態では、上記（２）式を満足するため、ＬＤ励起型のモードロックＮｄ：ＹＡＧレーザー１から発生するポンプ光のパルス幅（Ｔ）を、６ｐｓｅｃ（＞１．５ｐｓｅｃ）とする。
【００５４】
このようにすれば、基底状態のローダミン６Ｇ分子をＳ１状態に十分な確率で励起することができると共に、ポンプ光のパルス幅（Ｔ＝６ｐｓｅｃ）は、ローダミン６Ｇ分子の励起寿命（τ＝３ｎｓｅｃ）よりも遥かに短いので、再励起は発生せず、退色の影響も無視することができる。
【００５５】
また、試料９の蛍光２次元画像を表示するモニタとしてＣＲＴを用いる場合、一般に、ＣＲＴは５２５本の走査線を有しており、１フレームを１／３０ｓｅｃとすると、１ラインの走査期間は６３．５μｓｅｃである。したがって、光電子増倍管１４から得られる蛍光信号をデジタル化して、コンピュータのビデオフレームメモリに格納するには、上記の走査期間に同期して蛍光信号をＡ／Ｄ変換する必要があり、そのためにはガルバノミラー６，７をビデオレートに完全に同期して揺動させる必要がある。
【００５６】
ここで、例えばＣＲＴの画素の縦横比を１対１にする場合には、１ライン走査期間すなわち６３．５μｓｅｃを更に５２５画素にサンプリングする必要があり、このサンプリング周波数がビデオレート（ω）に対応し、この場合には８．２７ＭＨｚとなる。したがって、この場合には、ポンプ光の繰り返し周波数（ν）が８．２７ＭＨｚよりも大きくないと、１画素当たりにポンプ光を１パルス以上照射できなくなり、このため変動の少ない良好な蛍光信号が得られず、顕微鏡画像をリアルタイムでＣＲＴに表示することが困難になる。
【００５７】
このため、本実施の形態では、ポンプ光の繰り返し周波数（ν）を、３３３ＭＨｚ以下で、ω＜νを満足する１００ＭＨｚとする。このようにすれば、１画素当たりにポンプ光を１０パルス以上照射できるので、各パルスによる蛍光を積算した統計変動の極めて少ない良好な蛍光信号を得ることができ、退色を防ぎつつ、コントラストの良好な顕微鏡画像をＣＲＴ上にリアルタイムで表示することができる。
【００５８】
さらに、本実施の形態では、イレース光光源としてＣＷのＨｅ−Ｎｅレーザー２を用いているので、時間領域においてポンプ光とイレース光とを完全にオーバーラップさせることができる。したがって、超解像顕微鏡において超解像性の基礎となる蛍光抑制効果を極めて有効に誘起でき、空間分解能の向上に効果的に寄与することができる。
【００５９】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記実施の形態では試料９の染色色素としてローダミン６Ｇを用いたが、他のクマリン系の色素や蛍光蛋白等の蛍光標識を用いることもできる。また、イレース光光源はＣＷレーザーに限らず、パルスレーザーを用いることもできる。この場合には、パルスレーザーからのイレース光の繰り返し周波数をポンプ光の繰り返し周波数と同期させ、かつイレース光のパルス幅をポンプ光のそれよりも長くする。このようにすれば、時間領域においてイレース光とポンプ光とを完全にオーバーラップさせることができるので、上記実施の形態と同様に、蛍光抑制効果を極めて有効に誘起でき、空間分解能の向上に効果的に寄与することができる。
【００６０】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、試料内の分子を基底状態から第１励起状態へ励起させるための励起光を発生する励起光源をパルス光源として、該パルス光源からの励起光の繰り返し周波数をν、パルス幅をＴ、試料内の分子の第１励起状態の寿命をτ、試料内の分子が基底状態から第１励起状態に励起されるときの吸収断面積をσ０、励起光の試料集光面におけるフォトンフラックスをＩ０とするとき、ν＜１／τ、および、１／（Ｉ０・σ０）＜Ｔ＜τ、を満たすように構成したので、観察分子の退色を防止でき、十分な画像観察を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態における顕微鏡の構成を示す図である。
【図２】本発明の原理を説明するための図である。
【図３】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図４】図３の分子の第１電子励起状態を示す概念図である。
【図５】同じく、第２電子励起状態を示す概念図である。
【図６】同じく、第２電子励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図７】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図８】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図９】従来の超解像顕微鏡の一例の構成を示す図である。
【図１０】図９に示す位相板の構成を示す平面図である。
【符号の説明】
１　Ｎｄ：ＹＡＧレーザー
２　Ｈｅ−Ｎｅレーザー
３　ビームコンバイナー
４　位相板
５　ビームセパレーター
６，７　ガルバノミラー
８　対物レンズ
９　試料
１０　投影レンズ
１１　ピンホール
１２　ポンプ光カットノッチフィルター
１３　イレース光カットノッチフィルター
１４　光電子増倍管
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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