(57)【要約】　　　（修正有）【課題】　新規RNA結合タンパク質Drb1と、このタンパク質の遺伝子操作材料および抗体を提供する。【解決手段】　特定のアミノ酸配列を有するヒト、ラット、およびマウスの神経性RNA結合タンパク質Drb1と、これらのタンパク質をコードする遺伝子、組み換えベクター、オリゴヌクレオチドプローブ、プライマーセットおよびこれらのDrb1タンパク質を特異的に認識する抗体。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　配列番号２または４のアミノ酸配列を有するヒトRNA結合タンパク質Drb1をコードするヒト遺伝子。
【請求項２】
　配列番号６のアミノ酸配列を有するラットRNA結合タンパク質Drb1をコードするラット遺伝子。
【請求項３】
　配列番号８のアミノ酸配列を有するマウスRNA結合タンパク質Drb1をコードするマウス遺伝子。
【請求項４】
　請求項１のヒト遺伝子のゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
　請求項２のラット遺伝子のゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
　請求項３のマウス遺伝子のゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
　請求項４、５または６のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項８】
　請求項４、５または６のポリヌクレオチドをPCR増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項９】
　請求項４、５または６のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項１０】
　請求項９の組換えベクターによる形質転換体細胞。
【請求項１１】
　請求項１のヒト遺伝子の発現産物であって、配列番号２または４のアミノ酸配列を有するヒトRNA結合タンパク質Drb1。
【請求項１２】
　請求項２のラット遺伝子の発現産物であって、配列番号６のアミノ酸配列を有するラットRNA結合タンパク質Drb1。
【請求項１３】
　請求項３のマウス遺伝子の発現産物であって、配列番号８のアミノ酸配列を有するマウスRNA結合タンパク質Drb1。
【請求項１４】
　配列番号２、４、６または８における連続５アミノ酸残基以上のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
【請求項１５】
　請求項１１、１２または１３のRNA結合タンパク質Drb1を認識する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　この出願の発明は、新規の神経性RNA結合タンパク質Drb1とこのタンパク質をコードする遺伝子に関するものである。さらに詳しくはこの出願の発明は、神経疾患や神経変性症の診断や治療に有用なタンパク質Drb1とその遺伝子材料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
　ニューロンとグリア細胞は、中枢神経系（CNS）の発達途中に、多能性の神経幹細胞から生成する（非特許文献1）。いくつかの塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス（bHLH）転写因子が、CNS発達における神経またはグリア細胞の分化の調節に関与している（非特許文献2）。
【０００３】
　神経系の発達においては転写制御の重要性が示されているが、最近の知見によれば、神経性RNA結合タンパク質による転写後制御もまた重要な役割を果たしていることが指摘されている（非特許文献3−8）。
【０００４】
　現在、RNA結合タンパク質においていくつかのRNA結合性モチーフが同定されている（非特許文献9）。特に、RNA認識モチーフ（RRM）型のRNA結合性ドメイン（RBD）は最も広範囲に見いだされ、特徴が解明されている。RRM型RBDは〜90個のアミノ酸から成り、2個のαヘリックスと４個のβストランド構造が構造的に保存されている（非特許文献10−12）。また、多くの事例でこのRRMがRNA結合性ドメインの核となるモチーフであることが示されている（非特許文献13−17）。
【０００５】
　「elav」および「musashi」は、ショウジョウバエにおける神経性RRM型RNA結合タンパク質の主要な遺伝子ファミリーである（非特許文献18、19）。elav遺伝子座内部の変異によって神経系の機能障害（神経芽球の増殖、分化不能、不適切な移行）が生じる（非特許文献20）。Huファミリーは哺乳類におけるElavタンパク質の相同体であるが、4種類の異なる成分により構成されている。すなわち、HuR（非特許文献21）、HuB/Hel-Nl（非特許文献22）、HuC（非特許文献23）、およびHuD（非特許文献24）である。そしてこれら4種類のHuタンパク質全てには、3個のPRM型RNA結合性ドメイン（RBD）とリンカー領域1個が含まれており、このリンカー領域によって2個のN末端RBD（RBD IとRBD II）とC末端RBD（RBD III）が分離されている。また、in vitro実験では、RBD IとRBD IIは様々なmRNAの3'非翻訳領域（UTR）におけるRNA安定性エレメント（AU-リッチエレメント、またはAREs）に強固に結合することが示されている(非特許文献25−28)。またHuB/Hel-Nl、HuCおよびHuDは、ラットPC12細胞中で神経成長因子（NGF）処理を行わずに過剰発現させた場合に、神経突起の伸張を誘導することが示されている（非特許文献29）。
【０００６】
　これらの結果から、Huタンパク質は、ARE結合による標的mRNAの安定性を調節することによって、神経前駆細胞から神経への分化に決定的な役割を果たしていることが示されている。
【０００７】
　神経のRRM型RNA結合タンパク質であるMsiファミリーのメンバーは神経幹細胞中で発現しており、これにはDrosophilaのd-msi（非特許文献30）、アフリカツメガエルのnrp-l（非特許文献31）、および哺乳類におけるそれらの相同体であるmsi1（非特許文献32）とmsi2（非特許文献33）などが含まれる。d-msiの機能消失性変異の結果として機械感受性組織の頻繁な成長が生じるが、これにはニューロンおよびグリア細胞の代わりに、特別なシャフトおよびソケット細胞が含まれている（非特許文献34）。またElavファミリーとは対照的に、Msiファミリーのメンバーは胚のCNS発達途中における未成熟な神経細胞の内部で発現しており、msi1およびmsi2遺伝子の発現レベルは発達途中では徐々に減少している（非特許文献32、33）。近年、Okano等が示した事実によれば、Msi1はNotchシグナル伝達を調節しているが、これはtramtrack69（ttk69）およびm-numb mRNAを3'-UTRへ結合させることによって、それらの翻訳を抑制することによるものである（非特許文献35。36）。
【０００８】
　これらの知見は、神経発達においてRNA結合性タンパク質が果たす重要な役割を示しているが、転写後調節のメカニズムは完全には理解されていない。Laskoはショウジョウバエのゲノムデータベースに対するスクリーニングを行い、117個の異なるタンパク質がRRMを含むことを報告したが、そのうち74個は未報告のものであった（非特許文献37）。
【０００９】
　以上のとおり、神経性RNA結合タンパク質は、中枢神経系の発生および発達に重要な役割を果たすことが知られている。従って、RNA結合タンパク質の変異が様々な神経疾患や変性疾患の原因であると想定される。従って、神経性RNA結合タンパク質は、例えば神経疾患や変性疾患の治療薬開発のターゲット分子等として期待されている。
【００１０】
　しかしながら、従来知られているRNA結合タンパク質遺伝子の発現は、神経発達の全ての過程をカバーするものではない。すなわち、msi1遺伝子は胎齢12日（E12）の脳において最大の発現を示し（非特許文献32）、Hu遺伝子の発現は、有糸分裂後の神経細胞で観察されている（非特許文献38）。
【非特許文献１】Davis, A. A., and Temple, S. (1994) Nature 372, 263-266
【非特許文献２】Lee, J. E (1997) Curr.Opin. Neurobiol. 7,13-20
【非特許文献３】Levine, T. D. et al. (1993) Mol Cell.Biol. 13,3494-3504
【非特許文献４】Liu, J. et al. (1995) Neurology 45, 544-550
【非特許文献５】Peng, S. S. et al. (1998) EMBOJ.17,3461-3470
【非特許文献６】Kasashima, K. et al. (1999) Genes to Cells 4, 667-683
【非特許文献７】Okabe, M. et al. (2001) Nature 411, 94-98
【非特許文献８】Imai, T. et al. (2001) Mol.Cell. Biol. 21, 3888-3900
【非特許文献９】Siomi, H., and Dreyfuss, G. (1997) Curr. Opin. Genet. Dev.7, 345-353
【非特許文献１０】Kenan, D. J., Query, C. C., and Keene, J. D. (1991) Trends. Biochem. Sci.16, 214-220
【非特許文献１１】Birney, E., Kumar, S., and Krainer, A. R. (1993) Nucleic Acids Res, 21, 5803-5816
【非特許文献１２】Burd, C. G., and Dreyfuss, G. (1994) Science 265,615-621
【非特許文献１３】Query, C. C., Bentley, R. C., and Keene, J. D. (1989) Cell 57, 89-101
【非特許文献１４】Burd, C. G., Matunis, E. L., and Dreyfuss. G. (1991) Mol. Cell. Biol. 11, 3419-3424
【非特許文献１５】Hall, K. B. (1994) Biochemistry 33, 10076-10088
【非特許文献１６】Kanaar, R. et al. (1995) EMBO J. 14, 4530-4539
【非特許文献１７】Sakashita, E., and Sakamoto, H. (1996) J. Biochem. 120, 1028-1033
【非特許文献１８】Szabo, A. et al. (1991) Cell 67, 325-333
【非特許文献１９】Nakamura, M. et al. (1994) Neuron 13, 67-81
【非特許文献２０】Robinow, S. et al.(1988) Science 242, 1570-1572
【非特許文献２１】Ma, W. J. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 8144-8151
【非特許文献２２】Levine, T. D. et al. (1993) Mol Cell.Biol. 13,3494-3504
【非特許文献２３】Sakai, K. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 199, 1200-1208
【非特許文献２４】Szabo, A. et al. (1991) Cell 67, 325-333
【非特許文献２５】Abe, R. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 4895-4901
【非特許文献２６】Chung, S. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 6593-6598
【非特許文献２７】Joseph, B., Orlian, M., and Furneax, H. (1998) J.Biol. Chem. 273,20511-20516
【非特許文献２８】Antic, D., Lu, N., and Keene, J. D. (1999) Genes. Dev. 13, 449-461
【非特許文献２９】Kasashima, K. et al. (1999) Genes to Cells 4, 667-683
【非特許文献３０】Nakamura, M. et al. (1994) Neuron 13, 67-81
【非特許文献３１】Richter, K., Good, P. J., and Dawid, I. B. (1990) New Biol. 2, 556-565
【非特許文献３２】Sakakibara, S. et al. (1996) Dev. Biol. 176, 230-242
【非特許文献３３】Sakakibara, S. et al. (2001) J. Neurosci. 21, 8091-8107
【非特許文献３４】Siomi, H., and Dreyfuss, G. (1997) Curr. Opin. Genet. Dev.7, 345-353
【非特許文献３５】Okabe, M. et al. (2001) Nature 411, 94-98
【非特許文献３６】Imai, T. et al. (2001) Mol.Cell. Biol. 21, 3888-3900
【非特許文献３７】Lasko, P. (2000) J.Cell.Biol. 150, 51-56
【非特許文献３８】Antic, D., and Keene, J. D. (1997) Am.J.Hum. Genet. 61, 273-278
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
　前記のとおり、神経性RNA結合タンパク質は、例えば神経疾患や変性疾患の治療薬開発のターゲット分子等としてその有用性が期待されているが、従来知られているRNA結合タンパク質遺伝子の発現は、神経発達の全ての過程をカバーするものではない。
【００１２】
　この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、従来のRNA結合タンパク質とは発現時期の異なる新規のRNA結合タンパク質を提供することを課題としている。
【００１３】
　またこの出願の発明は、このRNA結合タンパク質の遺伝子操作材料と、抗体を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
　この出願は、前記の課題を解決するための発明として、以下の(1)〜(15)の発明を提供する。
(1)  配列番号２または４のアミノ酸配列を有するヒトRNA結合タンパク質Drb1をコードするヒト遺伝子。
(2)  配列番号６のアミノ酸配列を有するラットRNA結合タンパク質Drb1をコードするラット遺伝子。
(3)  配列番号８のアミノ酸配列を有するマウスRNA結合タンパク質Drb1をコードするマウス遺伝子。
(4)  前記発明(1)のヒト遺伝子のゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
(5)  前記発明(2)のラット遺伝子のゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
(6)  前記発明(3)のマウス遺伝子のゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
(7)  前記発明(4)、(5)または(6)のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
(8)  前記発明請求項(4)、(5)または(6)のポリヌクレオチドをPCR増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
(9)  前記発明(4)、(5)または(6)のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
(10)　前記発明(9)の組換えベクターによる形質転換体細胞。
(11)　前記発明(1)のヒト遺伝子の発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトRNA結合タンパク質Drb1。
(12)　前記発明(2)のラット遺伝子の発現産物であって、配列番号４のアミノ酸配列を有するラットRNA結合タンパク質Drb1。
(13)　前記発明(3)のマウス遺伝子の発現産物であって、配列番号６のアミノ酸配列を有するマウスRNA結合タンパク質Drb1。
(14)　配列番号２、４、６または８における連続５アミノ酸残基以上のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
(15)　前記発明(11)、(12)または(13)のRNA結合タンパク質Drb1を認識する抗体。
【００１５】
　すなわちこの出願の発明者らは、後記の実施例に示したように、新規のRNA結合タンパク質Drb1と、このDrb1タンパク質をコードする遺伝子（以下「drb1遺伝子」と記載することがある）について以下の知見を見出し、この出願の発明を完成させた。
【００１６】
　Drb1タンパク質は、他のRNA結合タンパク質（HuB、HuC）と構造的に類似した４個のRRM型RBDを有している。そして、drb1遺伝子は胎児脳において主として発現し、この発現レベルは脳の発育途中で徐々に減少する。またdrb1遺伝子は培養神経前駆細胞や、胎児および生後の神経細胞においても発現する。さらに、発現産物であるDrb1タンパク質は培養細胞の細胞質中に見いだされ、poly(C)RNAに選択的に結合する。これらの事実は、Drb1タンパク質が神経系の発生過程において重要な役割を果たしていることを強く示すものである。
【００１７】
　さらに、Drb1タンパク質の構造は4個のRRM型RBDによって特徴づけられる。第１および第２のドメインはマウスHuBおよびHuCのRBDと類似性を示すが、第３ドメインのタンパク質シーケンスから、これが疑似RBDであることが示唆される。これまでの報告ではいくつかのRRM型RNA結合タンパク質が4個のRBDを含むことが知られている。すなわち、poly(A)結合タンパク質（Adam, S. A. et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6, 2932-2943）、ポリピリミジン配列結合タンパク質（Gil, A. et al. (1991) Genes Dev. 5, 1224-1236）、酵母核小体タンパク質nop 4（Sun, C., and Woolford, J. L. Jr. (1994) EMBOJ. 13, 3127-3135）、およびマウスnucleolin（Bourbon, H. M., Lapeyte, B., and Amalric, F. (1998) J. Mol. Biol. 200, 627-638）である。しかしながらこれらのタンパク質が神経タンパク質であることは示されておらず、例えばHuやMsiなどといった、他の神経性RNA結合タンパク質の構造編成には4個のRBDが存在しない。これらの事実から、Drb1タンパク質はこれまで未報告の神経性RRM型RNA結合タンパク質ファミリーの一員であると結論づけることができる。
【００１８】
　さらに、Drb1タンパク質の最も著しい特徴は、神経発生の途中でその遺伝子発現が発生段階において調節されていることである。これまでの報告ではm-msi1遺伝子はE12脳において最大の発現を示し（Sakakibara, S. et al. (1996) Dev. Biol. 176, 230-242）、Hu遺伝子の発現は、有糸分裂後の神経細胞で観察されている（Antic, D., and Keene, J. D. (1997) Am.J.Hum. Genet. 61, 273-278）。一方、後記の実施例に示したように、ラットdrb1遺伝子の発現はE16脳において最も顕著であり、以後は発達途中で徐々に減少してゆく（図４）。さらにdrb1遺伝子は神経前駆細胞において発現するが、分化した神経細胞中では発現は減少している（図５）。このことは、神経細胞内で発現し神経の分化を誘導するHuタンパク質とは対照的である。すなわち、drb1遺伝子発現の時間的調節は「Huの発現の前」であり、かつ「msi発現の後」であり、従来知られている神経性RNA結合タンパク質とは異なる時系列において神経系発達に重要な役割を果たしていることが確認された.
　この出願の発明は、以上のとおりの新規な知見に基づいてなされたものである。
なお、この出願の発明において、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は特定塩基数の断片を意味するものでなく、一応の目安として100bp以上の断片をポリヌクレオチド、100bp未満の断片をオリゴヌクレオチドとするが、例外も存在する。同様に、オリゴペプチドについても特定範囲のアミノ酸残基数に限定されるものではない。
【００１９】
　この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA技術）」、東京化学同人(1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987); J. H. Miller ed., "Methods in Enzymology", Vol. 204, Academic Press, New York (1991); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 218, Academic Press, New York (1993); S. Weissman (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 303, Academic Press, New York (1999); J. C. Glorioso et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 306, Academic Press, New York (1999)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。
【発明の効果】
【００２０】
　以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、新規RNA結合タンパク質Drb1と、このタンパク質の遺伝子操作材料および抗体が提供される。これらの発明によって、各種の神経疾患や神経変性症の診断や治療法、あるいは治療薬剤の開発が促進される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
　発明(1)から(3)は、それぞれ、ヒト、ラットおよびマウスのRNA結合タンパク質Drb1をコードするゲノムdrb1遺伝子である。
【００２２】
　さらに具体的には、発明(1)のヒトdrb1遺伝子は、配列番号２または４のアミノ酸配列を有するヒトDrb1タンパク質をコードし、この遺伝子から転写されるmRNAからは配列番号１または３の塩基配列を有するcDNAが合成される。
【００２３】
　発明(2)のラットdrb1遺伝子は、配列番号６のアミノ酸配列を有するラットDrb1タンパク質をコードし、そのmRNAからは配列番号５の塩基配列を有するcDNAが合成される。
【００２４】
　さらに発明(3)のマウスdrb1遺伝子は、配列番号８のアミノ酸配列を有するマウスDrb1タンパク質をコードし、そのmRNAからは配列番号７の塩基配列を有するcDNAが合成される。
【００２５】
　発明(1)、(2)および(3)のdrb1遺伝子は、例えば、それぞれ配列番号１、３、５および７の塩基配列またはその一部配列からなる精製ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとしてヒト、ラットおよびマウスのゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離するすることができる。得られたゲノム遺伝子は、例えば、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、NASBN（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法およびSDA（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００２６】
　なお、この発明(1)〜(3)の遺伝子には、それがコードするタンパク質の発現に対する制御領域（プロモーター／エンハンサー、サプレッサー等）も含まれる。これらの発現制御領域は、Drb1タンパク質やdrb1遺伝子の更なる機能や遺伝子の欠失変異等のメカニズムを解明するためにも有用である。
【００２７】
　発明（4）〜(6)は、それぞれ前記のゲノムdrb1遺伝子やこのdrb1遺伝子から転写されるmRNA、mRNAから合成したcDNAから精製されたポリヌクレオチド（DNA断片やRNA断片）である。例えば、cDNAはヒト、ラットおよびマウスのそれぞれの細胞から抽出したポリ(A)＋RNAを鋳型として合成することができる。例えばヒト細胞としては、人体から手術などによって摘出されたものでも培養細胞でもよい。cDNAは、公知の方法（Mol. Cell Biol. 2, 161-170, 1982； J. Gene 25, 263-269, 1983； Gene, 150, 243-250, 1994）を用いて合成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマ−として、ヒト、ラットおよびマウスのそれぞれの細胞から単離したmRNAを鋳型とするRT-PCR法を用いて、目的cDNAを合成することもできる。このようにして調製されるヒトdrb1 cDNA、ラットdrb1 cDNAおよびマウスdrb1 cDNAは、具体的にはそれぞれ配列番号１、３（ヒト）、配列番号５（ラット）および配列番号７（マウス）の塩基配列を有している。これらのポリヌクレオチドは、例えばこの発明のDrb1タンパク質の遺伝子工学的な製造に使用することができる。また、ヒトdrb1遺伝子やそのポリヌクレオチドは各種の神経疾患に対する診断や治療材料等としても有用である。さらに、ラットおよびマウスdrb1遺伝子やポリヌクレオチドは、例えばDrb1タンパク質の機能不全動物（例えばdrb1ノックアウト動物）やDrb1タンパク質過剰発現動物（例えばdrb1遺伝子導入動物）の作出のための材料としても有用である。
【００２８】
　発明(7)のオリゴヌクレオチドプローブは、前記のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするDNA断片またはRNA断片であり、例えば、配列番号１、３、５または７の塩基配列もしくはその相補配列における連続10〜100bpのDNA断片等である。ここで、ストリンジェント条件とは、前記のポリヌクレオチドとプローブとの特異的なハイブリッド形成を可能とする条件であり、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアミド等）の濃度、温度条件によって規定される。詳しくは、米国特許No. 6,100,037等に詳しく規定されている。
【００２９】
　発明(8)のプライマーセットは、前記のポリヌクレオチドをPCR増幅するための１対のオリゴヌクレオチドである。これらのプライマーセットは、配列番号１、３、５または７の塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型DNAとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、15-40塩基、望ましくは15-30塩基である。ただし、LA（long accurate）PCRを行う場合には、少なくとも30塩基が効果的である。センス鎖（5'末端側）とアンチセンス鎖（3'末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型DNAとの安定な結合を確保するためGC含量を約50％にし、プライマー内においてGC-richあるいはAT-richが偏在しないようにする。アニーリング温度はTm（melting temperature）に依存するので、特異性の高いPCR産物を得るため、Tm値が55-65℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約0.1〜約１μMになるよう調整する等を留意すうことも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばOligoTM［National Bioscience Inc.（米国）製］、GENETYX［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００３０】
　発明(9)の組換えベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。例えば、cDNAまたはそのORF領域をインサートとしてこの発明のDrb1タンパク質を生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することができる。また、前記のゲノム遺伝子DNAをインサートとする場合には、BAC（Bacterial Artificial Chromosome）ベクターやコスミドベクター等を使用することもできる。
【００３１】
　発明(10)の形質転換体細胞は、例えば、前記発明(9)の組換えベクターを用いてDrb1タンパク質を製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。
【００３２】
　発明(11)は、発明(1)のヒトdrb1遺伝子の発現産物であり、配列番号２または４のアミノ酸配列を有する精製タンパク質（ヒトDrb1）である。すなわち、これらのタンパク質は、発明(1)のヒトdrb1遺伝子から発現される２つのアイソフォーム（スプライシングバリアント）である。
【００３３】
　発明(12)は、発明(2)のラットdrb1遺伝子の発現産物であり、配列番号６のアミノ酸配列を有する精製Drb1タンパク質である。また発明(13)は発明(3)のマウスDrb1遺伝子の発現産物であり、配列番号８のアミノ酸配列を有する精製Drb1タンパク質である。
【００３４】
　これらDrb1タンパク質は、抗体作製のための免疫源として、あるいはDrb1タンパク質の欠損や変異が関与する各種の神経疾患や変性疾患の治療薬を開発するための標的分子等として有用である。また、Drb1タンパク質は、多能性幹細胞の分化促進機能を有することから、例えば、ニューロンまたはグリア細胞の生存を促進したり、未分化脳幹細胞のニューロンへの分化誘導等のために使用することができる。また特殊なニューロン等を識別するマーカータンパク質としても有用である。
【００３５】
　これらの精製Drb1タンパク質は、ヒト、ラットまたはマウスの細胞から単離する方法、配列番号２、４、６または８のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法等によって得ることができるが、好ましくは、前記発明(9)の発現ベクターおよび／または発明(10)の形質転換細胞を用いた遺伝子工学的方法（たとえば、in vitro転写系や宿主-ベクター系を用いる方法）によって大量に生産することができる。例えば、宿主-ベクター系を用いる方法の場合には、形質転換体細胞を培養し、その培養物から、例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等によって単離、精製することによりこの発明の精製Drb1タンパク質を大量に得ることができる。なお、このような遺伝子工学的手法によって得られたDrb1タンパク質には、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ（GST）や緑色蛍光蛋白質（GFP）との融合蛋白質などが例示できる。さらに、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明のMASKの範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などである。
【００３６】
　発明(14)のオリゴペプチドは、それぞれ配列番号２、４、６および８における連続５アミノ残基以上のアミノ酸配列からなるペプチドである。このペプチドは、前記発明(11)〜(13)のDrb1タンパク質を適当な分解酵素で分解する方法や、公知の固相ペプチド合成法によって調製することができる。これらのペプチドはこの発明のDrb1タンパク質に対する抗体作製の抗原として有用である。
【００３７】
　発明(15)の抗体は、それぞれ前記のDrb1タンパク質を認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、Drb1タンパク質のエピトープに結合することができる全体分子、およびFab、F(ab')2、Fv断片等が全て含まれる。このような抗体は、前記の精製Drb1タンパク質またはそれらのペプチドを抗原として用いて動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。免疫した動物の脾臓から採取したＢ細胞をミエロ−マと融合させてハイブリド−マを作製すれば、モノクロ−ナル抗体を産生することができる。
【００３８】
　以下、実施例として、この発明のdrb1遺伝子クローニングやその機能解析の実験的データを示し、この発明についてさらに詳細かつ具体的に説明する。
【実施例】
【００３９】
(1)  方法
(1-1)  RRMオリゴペプチドに対するポリクローナル抗体の作成
　iPABPのRRM1に対応するペプチド断片（KGYAFVHFETQEAADKA）を合成した。約200μgのKeyhole Limpetヘモシアニン結合合成ペプチドを用いてウサギを免疫した。
(1-2)  ライブラリーのスクリーニング
　λgt11にパッケージされたラット胚（胎齢17日）の大脳発現ライブラリー（Clontech, Palo Alto、CA）を、150mmプレート5×105プラーク形成単位の大腸菌Y1090密度でスクリーニングした。37℃、7時間のインキュベーション後、10mMのイソプロピルチオ-β-D-ガラクトース（IPTG）に浸したフィルターをプレートに積層し、37℃でさらに4時間インキュベートした。その後フィルターを取り除き、室温で1時間にわたり、抗-iPABP抗体存在下でインキュベートした。次にこのフィルターをPBS-T（Tween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水−10mMリン酸緩衝液、2.7mM KCl、0.137M NaCl、0.05% Tween 20）を用いて洗浄し、picoBlue Immunoscreening Kit TM（Strategene、La Jolla、CA）を用いて検出を行った。
(1-3)  DNA配列解析とコンピュータ分析
　λgt11クローン由来のインサートをpBluescript II SK+（Stratagene）のEcoRI部位にサブクローンし、両鎖のシーケンス解析をBigDye TM Terminator（Applied Biosystems、Foster City、CA）を用いたジデオキシ連鎖停止法により行った。M13フォワードプライマーおよびリバースプライマー、および内部遺伝子特異的プライマをシーケンスプライマーとして用いた。シーケンス解析をマージし、GenetyxMac Analyis Software TM（Software Development Co., Ltd., Tokoyo, Japan）を用いて分析を行い、ORFと機能性モチーフを探した。相同性検索はGenbank TMデータベースを対象として行った。
(1-4)  RNAブロット分析
　トータルRNAの調製は、文献（Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem 162, 156-159）の記述に従い、各発達段階でのラットの様々な組織、あるいは培養された神経前駆細胞から行った。ラット組織と培養細胞に対するRNAブロット分析では、レーンあたり約10μgのトータルRNAを添加した。RNAは1%アガロース-ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動により分離し、ナイロン膜に転写した。480の位置から1700の位置まで伸張したラットdrb1 DNA断片に対するラベリングを、[α-32P]-dCTPを用いて、Ready-To-Go-DNA Labelling Beads TM（Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ）により行い、プローブとして用いた。
(1-5)  In vitro転写およびRNA結合分析
　1μgの全長ヒトdrb1 cDNAのin vitro転写は、TNT-coupled reticulocyte lysate systems TM（TNT-結合網状赤血球溶解物システム；Promega、Madison、WI）を用いて、40μCiの[35S]-メチオニン（Amersham Biosciences）存在下で、製造元の指示に従って行った。[35S]でラベルされたヒトDrb1の、poly(A)-結合性セファロースビーズ、あるいはPoly(C)-、(G)-、または(U)-結合性アガロースビーズ（Sigma、St. Louis、MO）に対する結合は、文献（Burd, C. G., Matunis, E. L., and Dreyfuss. G. (1991) Mol. Cell. Biol. 11, 3419-3424）の記載に従って行った。概略は、RNAホモポリマー（RHP）ビーズを製造元のプロトコルに従って調製し、1 mlあたり100μg（乾燥重量）の濃度で、0.1Mから1Mまでの範囲のKCl濃度の結合緩衝液（10mM Tris-HCl、pH7.4；2.5mM MgCl2；0.5% Triton X-100）中に再懸濁した。25μlのRHPビーズを5μlのin vitro転写産物と共に、300μlの結合緩衝液中で混合した。最終濃度1mg/mlのヘパリンを非特異的競合剤として添加した。結合反応は4℃で10分間にわたり行い、次にRHPビーズを結合緩衝液を用いて4回洗浄した。試料は試料緩衝液中に再懸濁し、2分間煮沸し、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む12%ポリアクリルアミドゲル上に添加した。電気泳動後にゲルを乾燥させ、BAS2000 Bioimaging Analyzer TM（FUJIFILM Inc., Tokyo, Japan）を用いて可視化した。
(1-6)  エピトープのタグ化
　Drb1タンパク質の細胞レベル下の局在を評価するため、ヒトDrb1タンパク質（配列番号１）の2-476残基をコードするcDNAの5'末端を、以下のプライマーセットを用いたPCR方によってFLAGタグ化した。
5'プライマー：5'-CGGAATTCCGACGAAGCTGGCAGCTCTGCGAG-3'
（下線部はEcoRI制限部位）
3'プライマー：5'-CGGGATCCTCAGTAAGTTCTTTGCCGTTTGTT-3'
（下線部はBamHI制限部位）
　増幅した断片はEcoRIおよびBamHIを用いて消化し、pFLAG-CMV-2発現ベクター（Eastman Kodak、Rochester、NY）に挿入結合した。
(1-7)  細胞培養
　ラットのクロム親和性細胞系列（PC12）とマウスの奇形癌細胞系列（P19）は、American Type Culture Collection（ATCC、Manassas、VA）から取得した。PC12細胞は、10%ウマ血清と5%胎仔ウシ血清（FBS）を添加したDMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）中で培養した。PC12細胞の神経性分化のために、50ng/mlの神経成長因子（NGF、TAKARA BIO INC., Shiga, Japanより取得）を用いて細胞を処理した。P19細胞は10% FBSを添加したαMEM（Eagle's Minimum Essential Medium-α）中で培養した。P19細胞の神経性分化のために、0.3μMの全transレチノイン酸（Sigma）を用いて細胞を処理した。細胞培養の維持は5% CO2下、37℃で行った。
（1-8）　DNAトランスフェクション
　PC12細胞は上記の条件で、NGF非存在下でDNAトランスフェクションを行う日に〜80%集団となるように育成した。LipofectAMINE 2000 reagent TM（Invitrogen、Carlsbad、CA）を製造元の指示に従って使用し、プラスミドDNAのトランスフェクションを行った。
(1-9)  免疫細胞化学
　免疫細胞化学的染色を行い、FLAG-タグ化ヒトDrb1タンパク質の細胞レベル下の局在を決定した。細胞は24時間にわたりガラス底の皿の上に回収し、4%パラホルムアルデヒド（PFA）および0.4% Triton X-100を含むPBS中で、室温で20分にわたり固定した。次にこの細胞を、最終濃度0.3μg/mlのマウス抗FLAG抗体（M2、Sigma）存在下で、2% FBSを含むPBS-T中で１時間にわたりインキュベートし、洗浄し、最終濃度2μg/mlのAlexa-488を結合させたヤギ抗マウスIgG（Molecular Probes、Eugene、OR）を用いて染色した。免疫蛍光像の可視化は、μRadiance TM Laser Scanning Confocal Microscope System（BioRad、Hercules、California）を用いて行った。
(1-10)　組織切片に対するin situハイブリダイゼーション
　cRNAプローブを調製するため、ラットdrb1 cDNA（配列番号５の480-1700塩基配列）の1221塩基対（bp）の長さを持つ断片を、pCMV-SPORTベクター（Invitrogen）中にクローニングし、このプラスミドをHindIIIを用いて直線化し、SP6 RNAポリメラーゼを用いて転写してセンスプローブを調製した。同じプラスミドをPstIを用いて直線化し、T7 RNAポリメラーゼを用いて転写してアンチセンスプローブを調製した。cRNA転写は、RNA Colour Kit TM（Amersham Biosciences）とフルオレセインラベル化ヌクレオチドを用いて行った。成体および胎児ラットから得た脳の固定をPBS中の4% PFAを用いて12時間にわたり4℃で行い、次に液体窒素中でこれを凍結した。低温槽を用いて薄層（20μm）を取得し、APSコーティングを施したSuperfrost TMスライド（Matsunami Glass Ind、Osaka、Japan）上に収集した。易透化緩衝液（100mM Tris-HCl、pH 8.0；50mM EDTA；1μg/ml RNase非含有プロテイナーゼK）中で37℃で20分にわたる易透化を行った後、スライド上の組織切片のハイブリダイゼーションを、50%ホルムアミド、10mM Tris-HCl（pH7.6）、1mM EDTA、600mM NaCl、10mMジチオスレイトール、1×Denhardt溶液、0.25% SDS、10%デキストラン硫酸、およびE.coli tRNA（0.2mg/ml；Sigma）を含む緩衝液中で、フルオレセインラベル化プローブ（200ng/ml）存在下で行った。ハイブリダイゼーション後、切片は室温で10分間にわたり1×SSC中で洗浄し、37℃で20分間にわたり10μg/mlのRNase Aを用いて消化した。切片は5%ウシ血清アルブミンを含むPBS中で30分にわたり、そしてアルカリホスファターゼ結合性抗フルオレセイン抗体の1:200稀釈液中で１時間にわたり順次インキュベートした。発色は、ニトロブルーテトラゾリウムおよび5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphateを用いて3時間にわたり行った。
(1-11)　免疫組織化学
　ニューロン特異的抗体を用いてニューロンを検出するため、文献（Shimazaki, K. et al. (2000) Gene Therapy 7, 1244-1249）に記載されたアビジン-ビオチン複合体（ABC）方法によって組織切片の免疫細胞化学（IHC）を行った。概略としては、ペントバルビタール麻酔条件下においてラットに0.9% NaClを潅流し、続いて0.1Mリン酸塩緩衝液（PB）中に溶解した4% PFAを用いて潅流を行った。脳を除去し、固定剤中で一晩保存した。次に、これらの脳を15%スクロースを含む0.1M PBに移した。凍結ミクロトームにより脳切片（50μm）を調製した。切片はブロック溶液（PBS中の3%正常ヤギ血清）中で1時間インキュベートした後、抗ラットネスチン（BD Bioscience、Lexington、KY；ブロック溶液中1:50稀釈液）および抗ラットNeuN（CHEMICON International Inc.、Temecula、CA；ブロック溶液中1:100稀釈液）の存在下、4℃で一晩にわたりインキュベートした。切片はPBS中で2回、15分間にわたり洗浄し、ビオチンの結合した抗ラットIgG（Vector Laboratories、Burlingame、CA）と共に1時間にわたりインキュベートした。切片はPBSを用いて洗浄し、製造元の指示に従って適用したアビジン-ビオチン複合体（Vector Laboratories）の存在下で、さらに１時間インキュベートした。PBS中での最終洗浄を行った後、VIP staining kit（Vector Laboratories）を用いて、染色が発現するまで5-10分間にわたり切片の染色を行った。PB中で5分間にわたる洗浄を2回行うことにより染色を終了させた。
(1−12)  ヒトDrb1タンパク質の発現と抗ヒトDrb1抗体の作成
　大腸菌発現用プラスミドpQE80LにヒトDrb1 cDNA（配列番号１）を挿入して組換え発現ベクターを作成し、これを用いて大腸菌BL21を形質転換し、IPTGにて発現誘導した後、Ni-NTAアフィニティーカラムを用いてヒスチジン融合Drb1タンパク質を大量に精製した。この融合タンパク質をウサギに免疫し、抗血清を得た。
【００４０】
　次に、プラスミドpGEX6PにヒトDrb1 cDNAの一部（配列番号１の第46−681位）を挿入し、これを大腸菌に導入して発現させ、融合タンパク質GST-hDrb1（1-212AA）を作成した。グルタチオンセファロースを用いてアフィニティー精製を行い、得られた精製タンパク質を用いてアフィニティーカラムを作成した。このカラムを用いてウサギ抗血清から抗ヒトDrb1抗体を精製した。この抗ヒトDrb1抗体を、ウェスタンブロット分析および神経組織の免疫染色を実施した。
(2)  結果
(2-1)  ラット、マウスおよびヒトdrb1 cDNAの単離
　新しい脳特異的RNA結合タンパク質を検索するために、胎齢17日（E17）の胎児脳をもとに構築したラット胎児の大脳発現cDNAライブラリーに対して、ポリクローナル抗体を用いたスクリーニングを行った。抗体はiPABPのRRM1シーケンスを元にした合成オリゴペプチドを抗原として作成した。いくつかのスクリーニングを行った結果、5×105個のファージプラークから32種類のポジティブクローンが得られた。全てのポジティブクローンに対してシーケンス解析を行ったところ、一つの部分cDNAクローンが新しいRRM型RNA結合タンパク質をコードしていることが明らかになった。初期クローンは全長cDNAを含んでいなかったため、ラット全長cDNAを再クローンし、ヒトとマウスのオーソログをPCRによりクローニングした。この作業は、ESTからの相同性情報と、ヒトゲノムデータベースを根拠にして行った。ラット、マウス、およびヒトDrb1タンパク質の予測アミノ酸シーケンスは476残基から構成され、対応する分子量は53kDaであり、4種類のRRM型RNA結合領域が存在していた（図１）。AUG開始コドンの側面にある塩基配列はKozakの法則（Kozak, M. (1991) J.Cell. Biol. 115, 887-903）に一致していた。ラット、マウスおよびヒトのDrb1オーソログを比較すると、マウスとヒトのタンパク質はラットDrb1に非常に類似していることが示された（それぞれ91.8%および91.6%の同一性；図２）。
【００４１】
　BLASTTMプログラムを用いたラットdrb1遺伝子の相同性検索によれば、いくつかのESTクローンがこのシーケンスと同一であった。BLASTXTMプログラムを用いてラットDrb1タンパク質配列をGenBankTMデータベースと比較することにより、ショウジョウバエの推定RNA結合タンパク質CG1316との間に、広範囲にわたるアミノ酸配列の類似性が存在することが示された（47%の同一性；図２）。RRM型RNA結合ドメインの長さは、一般的におよそ90個のアミノ酸残基であるにも関わらず、Drb1タンパク質のRBDIIIは約120個のアミノ酸残基から構成されており、進化的に保存されたコンセンサスシーケンスに対して類似性が比較的低いことが示されている。さらにショウジョウバエの推定相同体CG1316にはRRM2を含むアミノ末端領域が存在しない。これらの結果から、Drb1タンパク質のRBDIIIは擬似的なRNA結合ドメインであることが示唆される。
【００４２】
　BLASTPTMプログラムを用いた相同性検索でも、マウス神経のRNA結合タンパク質HuBとHuCに共通した広範囲のアミノ酸配列相同性がRBDIとIIに存在することが示されている（共に50%の類似性）。
【００４３】
　以上の結果から、新たにクローニングされたdrb1遺伝子は、神経性RRM型RNA結合タンパク質をコードする遺伝子であることが確認された。
(2-2)  ラットdrb1遺伝子発現の特性
　ラットdrb1遺伝子発現の組織分布パターンを調べるため、それぞれのE21ラット胎児組織に由来する10μgのトータルRNAを用いて、ラットdrb1 cDNAの3'半分をプローブとしてRNAブロット分析を行った。3種類のdrb1転写産物がラット組織中に検出された（図３）。一つは長さが〜2kbである主要な転写産物であるが、この長さはほぼラット全長cDNAクローンの評価サイズである。長さが約3kbと4.4kbである他の2種類の転写産物はこれより発現量が少なく、これらは明らかに他のpoly(A)付加部位を利用している。RNAブロット分析においても、大量のdrb1遺伝子発現は脳組織のみに限定されていることが示されているが、腎臓と脾臓でもこれより少ない発現が観察されている。肺と心臓での発現はごくわずかである（図３）。これらの結果が示すのは、ラットdrb1遺伝子は主としてE21胎児脳において発現するという事実である。
【００４４】
　次に、ラット脳におけるdrb1の空間時間的発現プロファイルをRNAブロット分析により分析した。drb1の発現はE16脳において最大となり、以後は脳の発達に伴って徐々に減少している（図４、左半分）。drb1遺伝子の発現量が成体の脳内において減少している場合、この発現は成体ラットの非神経組織（例えば腎臓、脾臓、心臓および肺；データは示さず）において相対的に増加している。成体脳における総発現レベルが減少してるにもかかわらず、成体脳の限られた領域−小脳、嗅球、および海馬−においてdrb1遺伝子はなお発現している（図４、右半分）。これらの結果から示されるのは、ラット脳内におけるdrb1遺伝子の発現は発達段階的、および空間的に調節されており、そしてこの精密な発現レベルの調節から、脳の発達におけるこの現象の生理学的役割の重要性が示唆されるということである。
【００４５】
　ここではまた、培養PC12（ラット褐色細胞腫）およびP19（マウス奇形癌）細胞においても、神経分化誘導の前後におけるdrb1遺伝子の発現調節が見られるかどうかについて調べた。神経成長因子（NGF）を用いた処理によりP12細胞は神経に分化し、またレチノイン酸（RA）を用いた処理によりP19細胞はニューロンに分化する。drb1遺伝子は誘導前のPC12およびP19細胞では豊富に発現しており（図５）、これらの細胞をそれぞれNGFおよびRAにより処理した場合にdrb1遺伝子の発現が徐々に減少した。これらの結果から、drb1の転写物は神経前駆細胞の維持に関連していることが示唆される。
(2-3)  Drb1タンパク質のpoly(C) RNAに対する特異的結合
　Drb1タンパク質のRNA結合活性を調べるため、RNAホモポリマー（RHP）ビーズを用いたRNA結合アッセイを行った。Drb1タンパク質の合成は、[35S]-メチオニンを用いたヒト全長drb1 cDNAからのin vitro翻訳により行った。分子量が約53kDaと37kDaである2種類のタンパク質生成物が検出されたが、分子量が相対的に大きいもの（配列番号４のヒトDrb1タンパク質）は未変化Drb1タンパク質に対応している。分子量が相対的に小さい産物（配列番号２のDrb1タンパク質）は、分解された形態か、未成熟なストップ産物の可能性がある（図６）。これらの標識されたタンパク質をいくつかのRHPビーズと共にインキュベートした。すなわちこれらは、poly(A)結合セファロース、あるいはpoly(C)-、poly(G)-、またはpoly(U)結合アガロースである。RNA結合タンパク質の評価は前記(1)の方法に記載したように行った。図７に示すのは、4種類のRNAホモポリマーのうち、Drb1はpoly(C) RNAに好んで結合している点であり、この時の結合特異性の順位はpoly(C)>poly(G)=poly(U)>>poly(A)であった。
(2-4)  Drb1の細胞内局在
　Drb1の細胞レベル下の局在を評価するため、PC12細胞を用いて免疫組織化学を行った。ヒト発現ベクター中のFLAGタグ化ヒトdrb1 cDNAをPC12細胞にトランスフェクトし、24時間後にFLAGタグ化ヒトDrb1タンパク質を抗FLAG抗体により検出した。FLAG-hDrb1タンパク質は主として細胞質中に見いだされたが（図８）、このときごく少量の細胞では核と細胞質における二重の細胞レベル下分布を示していた（データ示さず）。これらの結果から、Drb1はまず細胞質中に位置しており、時々核と細胞質の間を移動する可能性があることが示されている。
(2-5)  Drb1の神経細胞特異的発現
　Drb1タンパク質のラットCNS内における空間的局在を決定するため、ラットDrb1タンパク質をコードするcDNAから合成したアンチセンスRNAプローブを用いて、in situハイブリダイゼーション（ISH）を行った。その結果、E16胎児ラットCNSの脳室下領域と神経管に強いシグナルが検出された（図９AとC、対象との比較、９BとD）。対照（図９F）と比較して有意に大きなシグナルが、生後3日（P3）ラットCNSの海馬錐体細胞と皮質ニューロンにも生じていた（図９E）。
【００４６】
　E16およびP3ラット脳の同様な領域における神経細胞の発達段階を、免疫組織化学的（IHC）分析により調べたが、これには神経幹細胞のマーカータンパク質であるネスチンと、神経細胞のマーカーであるNeuNに対するモノクローナル抗体を用いて行った。E16ラット胎児において、脳の脳室下領域と神経管の神経細胞は、抗ネスチン抗体によって顕著に染色され（図10、AとD部分）、抗NeuN抗体によって中程度に染色された（図10、BとE部分）。一方、P3大脳皮質とP3海馬のCA領域における介在ニューロンは、抗NeuN抗体により顕著に染色され、抗ネスチン抗体によって弱く染色されるようであった（図10GおよびH、対照との比較、図10I）。2種類の抗体を用いたIHC染色パターンと、drb1リボプローブを用いたISHシグナルパターンは非常に類似していた。特に、P3海馬のCA領域におけるISHシグナルパターンは抗NeuN抗体により染色された神経分布パターンと同じであると思われ、グリア細胞の場合とは異なっていた。これらの結果からラットdrb1遺伝子は、胎児および生後の脳の両方の神経細胞において、特異的に発現していることが示唆される。
【００４７】
　さらに以前行われたRNAブロット分析によれば、脳内のdrb1遺伝子発現はE16胎児でピークとなり、これは未成熟な神経細胞と神経幹細胞が豊富である時点であるが（Hockfield, S., and McKay, R. (1985) J. Neurosci. 5, 3310-3328）、これによると、drb1遺伝子は未成熟な神経と神経幹細胞の両方において発現していることになる。
(2-6)  ウエスタンブロット分析
　抗ヒトDrb1抗体を用いてPC12細胞抽出液およびHeLa細胞抽出液を対象としてウエスタンブロット分析を行った。結果は図11に示したとおりであり、PC12細胞抽出液に抗Drb1抗体が結合するタンパク質バンドが検出された。
(2-7)  抗ヒトDrb1抗体を用いた神経組織の免疫染色
　胎齢16日のラット胎児の神経管を抗ヒトDrb1抗体で免疫染色した。コントロールとして未分化な神経幹細胞に染色性の高い抗Nestin抗体、および分化したニューロンに染色性の高い抗MAP抗体を用いて二重染色を行った。
【００４８】
　結果は図12に示したとおりである。未分化で増殖性のあるNestin陽性細胞は脳室内腔側に、分化した既に増殖を終えたニューロンであるMAP2陽性細胞は脳膜側に存在する。これに対して、Drb1陽性細胞は脳室内腔側から脳膜側にまたがって存在した。以上の結果から、抗Drb1抗体によって認識されるDrb1陽性細胞は神経幹細胞がニューロンへと分化する過程で一過的に出現する神経前駆細胞であることが確認された。
【００４９】
　また抗Drb1抗体を用いて成体ラットの神経組織を免疫染色した。その結果、小脳、大脳皮質、海馬、嗅球において神経細胞が染色された。図13は小脳のプルキンエ細胞の染色状態を示しており、Drb1は主に細胞質に存在することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ラット、マウス、およびヒトのそれぞれのDrb1タンパク質の配列比較である。ラット、マウス、およびヒトDrb1タンパク質を、それぞれrDrb1、mDrb1、およびhDrb1として示す。RNA結合領域（RBDs）IからIVまで（カゲ付き領域）、RNA認識モチーフ（RRM）コンセンサスシーケンス（箱部分）、同一アミノ酸（星印）、および保存されたアミノ酸変化（点とコロン）が示されている。
【図２】ラット、マウス、およびヒトDrb1、並びにショウジョウバエCG1316のドメイン構造比較である。RBDsは閉じた箱で示されており、rDrb1タンパク質の対応するRBDsに対する類似性をそれぞれのRBDの上に示す。rDrb1に対する全体の類似性をタンパク質の模式図の右側に示す。
【図３】ラットにおけるdrb1 mRNAの組織分布である。様々なラットE21組織について、drb1 mRNAに対するRNAブロット分析を示す。上図にはdrb1 cDNAに対するブロットを示す。下図にはエチジウムブロマイド染色したrRNAを示す。
【図４】drb1遺伝子の発現は発達過程で調節されていることを示す結果である。左半分は脳全体でのラットdrb1遺伝子発現、右半分は成熟した脳でのdrb1遺伝子の空間的発現である。上図にはdrb1 cDNAについてのブロットを、下図にはエチジウムブロマイド染色したrRNAを示す。
【図５】培養神経前駆細胞におけるdrb1遺伝子の発現を調べた結果である。PC12およびP19細胞におけるdrb1遺伝子の発現を、分化誘導の前後で示した。上図にはdrb1 cDNAに対するブロットを、下図にはエチジウムブロマイド染色したrRNAを示す。
【図６】ヒトDrb1タンパク質のin vitro翻訳の結果である。RNA結合アッセイに先立ち、ヒト全長drb1 cDNAのin vitro翻訳産物をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した（レーン1）。In vitroで翻訳されたルシフェラーゼを正の対照とした（レーン2）。
【図７】poly(A)結合性セファロースビーズ、あるいはpoly(C)-、poly(G)-、poly(U)-結合性アガロースビーズに対する、[35S]-メチオニン標識されたhDrb1の結合分析の結果である。結合緩衝液のKCl濃度は、0.1Mから1Mの範囲で変化している。「Input」と表示したレーンは、結合反応で使用されたin vitro翻訳産物の容積の25%を泳動した。
【図８】PC12細胞におけるDrb1タンパク質の細胞レベル下の局在を調べた結果である。FLAG-タグ化drb1 cDNAをトランスフェクトされたPC12細胞は、抗FLAGモノクローナル抗体による細胞質染色を示している。TI（透過画像）と抗FLAG（蛍光）画像を示す。
【図９】ラット脳におけるdrb1 mRNAのin situハイブリダイゼーションの結果である。rDrb1をコードするcDNAをテンプレートとして用いてセンスおよびアンチセンスRNAプローブを調製し、また正常胎児または出生後のラット脳の20μmの凍結切片を用いてハイブリダイゼーションを行った。A、Bは胎齢16日（E16）のラット脳の脳室の矢状切断図、C、Dはおよび神経管の冠状切断図である。EおよびF部分には、生後3日（P3）のラット海馬の矢状切断図を示す。ASはアンチセンスプローブ、；Sはセンスプローブ、Vは脳室、Cbは小脳、CA1はアンモン角1、CA3はアンモン角3、DGは歯状回である。
【図１０】ラット脳の免疫組織化学的染色の結果である。ラット抗ネスチン抗体（anti-Nestin）または抗NeuN抗体（anti-NeuN）を用いて、免疫組織化学的染色を行った。右（Blank）は一時抗体を用いない染色を示す。A-Cは胎齢16日（E16）のラット脳の脳室の矢状切断図、D-Fは神経管の冠状切断図である。G-Iには、生後3日（P3）のラット海馬の矢状切断図を示す。Vは脳室、Cbは小脳、CA1はアンモン角1、CA3はアンモン角3、DGは歯状回である。
【図１１】抗ヒトDrb1抗体を用いたウェスタンブロット分析の結果である。レーン1はHeLa細胞抽出物、レーン２はPC12細胞抽出物である。
【図１２】胎齢16日のラット胎児の神経管を抗ヒトDrb1抗体で免疫染色した結果ある。mergeは二重染色の結果である。
【図１３】抗Drb1抗体を用いて成体ラットの小脳プルキンエ細胞を免疫染色した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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