(57)【要約】【課題】所定時間以上にわたって細胞へ電気刺激を与え、この刺激によって細胞を分化誘導することができる細胞分化誘導法を提供する。【解決手段】細胞の分化を誘導する方法において、該細胞に対し電気刺激を所定時間以上にわたって加える。１〜５，０００ｍＶの電位で５０〜５，０００ＨｚＨｚ程度の低周波刺激を３〜３６０分程度加えるのが好適である。電極間距離は０．１〜３００ｍｍが好ましい。環境温度は０〜５０℃が好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の分化を誘導する方法において、該細胞に対し所定時間以上にわたって電気刺激を加えることを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項２】
請求項１において、電気刺激を３〜３６０分間にわたって加えることを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項３】
請求項１又は２において、温度０℃〜５０℃の環境下で前記電気刺激を加えることを特徴とする細胞分化誘導方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記電気刺激を加えるための電極間距離が０．１〜３００ｍｍであることを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、電気刺激が低周波電気刺激であることを特徴とする細胞分化誘導方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、刺激の強さを経時的に変化させることを特徴とする細胞分化誘導方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、細胞が幹細胞であることを特徴とする細胞分化誘導方法。
【請求項８】
請求項７において、幹細胞が胚性幹細胞であることを特徴とする細胞分化誘導方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、細胞の培養工程において前記電気刺激を加えることを特徴とする細胞分化誘導法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法による病変血管の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、原核細胞や動物細胞の分化誘導方法及び該方法を利用した病変血管の治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の分化は細胞分裂と異なり、いくつかの細胞へ変化する可能性があり、特に幹細胞のような多分化能を有する細胞の場合には多種多様な細胞へ分化することが可能である。組織工学においては、培養した細胞又は培養している細胞を目的とする細胞へ分化誘導する必要があり、従って、細胞を選択的に分化誘導することは重要な技術である。
【０００３】
従来、細胞培養時に適当な薬剤による刺激を行うことによって、選択的に目的の細胞へ分化誘導している。これら薬剤としては、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、インスリン様増殖因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、アンジオポイエチン、神経増殖因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、形質転換増殖因子β、アクチビン、骨形質タンパク、繊維芽細胞増殖因子、腫瘍増殖因子βなどのサイトカインがあり、主として細胞の培養系へ添加することで増殖と分化を同時に行う手法で行われている（例えば、特開２０００−２８７６８０）。
【０００４】
【特許文献１】
特開２０００−２８７６８０号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら薬剤には特定の細胞にしか効果がないものも多く、必ずしも目的とする細胞へ分化誘導することができるわけではなかった。また、単層培養、浸盪培養、浮遊培養など各細胞が培養液にほぼ均等に浸漬されている培養系であれば、均質性が良好であるものの三次元構造のスキャホールド材へ接着した細胞を分化誘導する場合、スキャホールド材の内部に生着した細胞まで刺激剤が浸透拡散しにくく、未分化の細胞が残る可能性があった。
【０００６】
胚性幹細胞は近年注目される再生医学、再生医療に利用できる可能性が大きい細胞であるが、未分化の状態で生体内へ移植された場合、腫瘍細胞となる危険性があることは公知の事実である。従って、再生医療において胚性幹細胞を未分化のものを残すことなく分化させること、特に、スキャホールド材へ生着させた細胞を均質に分化誘導する技術の確立は大きな課題である。
また，本発明の分化誘導方法はインビトロのみならず，インビボにおける使用，特に病変血管の治療や動脈硬化症の予防にも有用である．例えば，病変血管の平滑筋細胞を合成型から収縮型へ形質転換させることで，動脈硬化症の治療を行う場合，従来の薬剤を使用した細胞分化誘導法では，投与した薬剤が血流とともに瞬時に拡散してしまい，病変部位において細胞の分化誘導や形質転換をさせることが困難であり，局所的に投与さるようなドラッグデリバーシステムを利用しても効果を発現させるためには多量の薬剤を投与してしまう問題があった．
【０００７】
本発明は、かかる課題を達成することができる細胞分化誘導法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、細胞の分化を誘導する方法において、該細胞に対し所定時間以上にわたって電気刺激を加えることを特徴とするものである。この所定時間以上にわたる電気刺激によって細胞を分化誘導することができる。
【０００９】
本発明によれば、均質な薬剤刺激が行いにくい三次元のスキャホールド材へ接着したＥＳ細胞の分化誘導も可能である。また、本発明によれば、生体内組織内の細胞を分化誘導、形質転換することで種々の疾病の治療を行うことも可能である。例えば、冠状動脈の動脈硬化部位において、冠状動脈まで誘導したカテーテルに装着した電極から電気的刺激を印加することで硬化部位の血管平滑筋細胞を合成型から収縮型へと形質転換させて狭窄を防止するなど病変血管の予防的な治療を行うこともできる。
また，病変の程度によっては，これら電気的刺激は切開を伴わずに経皮的に印加することでも効果の発現を期待でき，侵襲の小さい療法を提供することが可能である．
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の細胞分化誘導法は、細胞の分化を誘導する方法において、該細胞に対し所定時間以上にわたり電気刺激を加えることを特徴とするものであり、好ましくは温度０〜５０℃の環境下で電気刺激を加える。電気刺激時間は３〜３６０分程度が好ましいが、これよりも短くても、また長くてもよい場合もある。
【００１１】
電気刺激のための周波数は５０〜５，０００Ｈｚ程度の低周波が好ましい。印加電圧としては、細胞形質膜への刺激によってイオンチャンネルを開放しイオン流出を惹起するか又は細胞活動を制御していると考えられているイオンの流動、拡散による刺激を模倣する電気刺激である１〜５０００ｍＶの電位、好ましくは３０〜１５０ｍＶの電位が各細胞へ負荷される必要がある。なお、周波数、電圧や時間は、分化させる細胞の種類、すなわち細胞サイズ、細胞膜の構成及び分化させたい目的細胞の種類並びに電極間距離、培養液の組成、スキャホールド材の孔径や密度及び細胞間マトリックスの種類、電極抵抗や、培養液の電気伝導度、経皮的に印加する場合には体脂肪率、皮下脂肪組織の厚みなどを考慮し、適宜調整される。例えば、電極間距離が１０ｍｍの場合、原核細胞などでは１ｍＶ〜５Ｖ、動物細胞においては１ｍＶ〜５０００ｍＶ程度の振幅が好適に使用できる。刺激継続時間は、原核細胞などでは１〜１００分、動物細胞においては１〜６００分程度が好適であり、このような刺激によって細胞形質膜のイオンチャンネルを開放させてイオン流出をさせたり、細胞活動を制御するイオン流動、拡散による刺激を模倣することによって分化誘導、形質転換が行われるのである。
【００１２】
電極間距離は０．１〜３００ｍｍ，特に１〜１０ｍｍが好ましいが、細胞の存在する系の容積、培養液の組成、電極面積、電極抵抗によって適宜調整することができる。また、病変血管の予防又は治療に使用する場合には、部位の大きさに合わせて電極間距離を調整する。
【００１３】
なお、刺激の強さを経時的に変化させてもよい。例えば、電圧や周波数は経時的に変化や変調させてもよく，休止時間を設定することも可能である。例えば、刺激にリズムをつけてもよい。
【００１４】
細胞を培養液中で分化誘導するインビトロの場合、培地としてはＤａｉｇｏ’Ｔ培地，Ｈａｎｋ’ＢＳＳ培地，Ｈａｍ’Ｆ１０培地，Ｈａｍ’Ｆ１２培地，ＢＩＯＳ１０培地他、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができ、この培地に細胞を１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度播き、電極としてはプラチナ又はカーボン製のものを用いるのが好ましい。
【００１５】
インビボの場合、送電はカテーテル等を用いて経皮的に患部まで誘導する；ステントなどに送電線を組み込み電極としても利用する；または、体外からの電磁誘導などにより非侵襲的に誘導する方法が可能である。
【００１６】
本発明の分化誘導方法は、あらゆる細胞に適用できるが、増殖型・非増殖型など形質転換する血管平滑筋細胞などや、未分化細胞、好ましくは多分化能のある幹細胞、特に胚性幹細胞に好適である。
【００１７】
本発明は、電気刺激によって細胞を分化誘導又は形質転換することで疾病部位を治療する病変血管の治療方法でもある。
【００１８】
すなわち、血管内カテーテルに電極を２ヵ所以上設置することでインビトロのみならずインビボでも細胞分化、形質転換を制御することができる。
例えば、ＰＴＣＡ療法を経験した症例において、血管拡張、ステント留置の際、さらに留置後しばらく電気刺激を印加することで、血管平滑筋細胞を増殖型から収縮型へ形質転換させ再狭窄を防止することができるのである。
【００１９】
【実施例】
次に、インビトロの細胞分化誘導の実施例について説明する。
【００２０】
まず、培地温度によって形質転換されることが確認されている株化平滑筋細胞を、培地温度３３℃と３９℃の２条件で培養した。培養後、平滑筋細胞に特異的タンパク質である平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１、カルポニンの発現をノーザンブロット法及びウエスタンブロット法で確認すると、３３℃培養系では形質マーカーの発現が低く、増殖能は高かった。一方、３９℃培養地ではｍＲＮＡ、タンパク質レベルはいずれも３３℃培養系よりも１０倍程度の高値を示し、かつ増殖能は低下していた。
【００２１】
続いて、先に３３℃で培養した株化平滑筋細胞を、電極間距離０．４ｃｍにおいて電位８０ｍＶ、周波数２，０００Ｈｚの低周波刺激を３６０分加えた直後にミオシン重鎖ＳＭ１、カルポニンの発現をノーザンブロット法及びウエスタンブロット法で確認するとｍＲＮＡ、タンパク質レベルのいずれも上昇していることが確認された。
【００２２】
以上より、本発明の細胞分化誘導方法によって、平滑筋細胞が合成型から収縮型へ形質転換されていることが示唆された。
【００２３】
また、インビボにおいても、合成型の平滑筋細胞が占有する動脈硬化部位において血管内カテーテルに装着した電極による電気刺激によって、筋フィラメントの多い収縮型の平滑筋細胞へ形質転換できる可能性が示唆され、低侵襲型の病変血管の治療方法となり得ることが示唆された。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によると、所定時間以上にわたって細胞へ電気刺激を与え、この刺激によって細胞を分化誘導することができる。本発明によれば、電気刺激によって細胞を分化誘導又は形質転換することで疾病部位を治療することもできる。