(57)【要約】【課題】　増殖させ、長期にわたって継代し、継代培養植することができるニューロン細胞集合集団を大規模で産生し維持できるであろう長期イン・ビトロ培養系。【解決手段】　少なくとも１種の栄養因子を補給した無血清基基礎培地を入れた容器中にてニューロン細胞を培養することからなり、ここに該容器の表面は該ニューロン細胞が付着できることを特徴とするイン・ビトロにおいて神経芽細胞を産生する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　少なくとも１種の栄養因子を補給した無血清基基礎培地を入れた容器中にてニューロン細胞を培養することからなり、ここに該容器の表面は該ニューロン細胞が付着できることを特徴とするイン・ビトロにおいて神経芽細胞を産生する方法。
【請求項２】
　該ニューロン細胞が、海馬、小脳、脊髄、皮質、線条、基底前脳、腹側中脳および青斑よりなる群から選択される神経芽細胞組織由来である請求項１記載の方法。
【請求項３】
　該栄養因子が、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロピン、繊維芽細胞成長因子、血小板由来増殖因子、上皮成長因子、インスリン成長因子およびトランスフォーミング成長因子よりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
　該繊維芽細胞成長因子が、塩基性繊維芽細胞成長因子である請求項３記載の方法。
【請求項５】
　該ニューロトロピンが、ニューロトロピン-３である請求項３記載の方法。
【請求項６】
　該容器の表面が、該ニューロン細胞が付着できるように多塩基性アミノ酸で処理されている請求項１記載の方法。
【請求項７】
　該多塩基性アミノ酸がポリオルニチンである請求項６記載の方法。
【請求項８】
　該容器の表面が、該ニューロン細胞が付着できるように細胞外マトリックス分子で処理されている請求項１記載の方法。
【請求項９】
　該細胞外マトリックス分子が、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチンよりなる群から選択される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
　該ニューロン細胞を、無血清培地中に培養する前に含血清培地中で培養することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
　(ａ)組成物および神経芽細胞よりなる成分をインキュベートし、ここに該インキュベートは該成分が十分に相互反応できる条件下で行い；次いで
　(ｂ)該組成物により引き起こされた該神経芽細胞に対する効果を測定することを特徴とする神経芽細胞に影響する組成物を同定するための方法。
【請求項１２】
　該効果が神経芽細胞の阻害である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
　該効果が神経芽細胞の刺激である請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
　該神経芽細胞が、海馬、小脳、脊髄、皮質、前脳基底野、腹側中脳および青斑よりなる群から選択される神経組織である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
　該神経芽細胞が不滅化されている請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
　該神経芽細胞が、少なくとも１種のオンコジーンの神経芽細胞への導入により不滅化されている請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
　該オンコジーンが、ｖ-ｍｙｃ、ＳＶ４０の大Ｔ抗原およびアデノウイルスのＥ１Ａよりなる群から選択される請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
　該神経芽細胞が、さらに少なくとも１種の外来遺伝子よりなる請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
　該外来遺伝子が受容体をコードしている請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
　該受容体が、アドレナリン、ノルアドレナリン、グルタメート、セロトニン、ドーパミン、ＧＡＢＡおよびアセチルコリンに結合する受容体よりなる群から選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
　(ａ)少なくとも１種の栄養因子を含有する無血清基本培地；および
　(ｂ)容器よりなり、ここに該容器の表面は神経芽細胞が付着できることを特徴とする神経芽細胞を産生し維持するのに有用な培養系。
【請求項２２】
　該神経芽細胞が、海馬、小脳、脊髄、皮質、前脳基底野、腹側中脳および青斑よりなる群から選択される神経組織由来である請求項２１記載の培養系。
【請求項２３】
　該栄養因子が塩基性繊維芽細胞成長因子である請求項２１記載の培養系。
【請求項２４】
　該栄養因子が約１ｎｇ/ｍl〜約１００ｎｇ/ｍlの濃度で存在する請求項２１記載の培養系。
【請求項２５】
　該栄養因子が約５ｎｇ/ｍl〜約７０ｎｇ/ｍlの濃度で存在する請求項２１記載の培養系。
【請求項２６】
　該栄養因子が約１５ｎｇ/ｍl〜約６０ｎｇ/ｍlの濃度で存在する請求項２１記載の培養系。
【請求項２７】
　グルコースが約０.０１％〜約１.５％の濃度で存在する請求項２１記載の培養系。
【請求項２８】
　グルコースが約０.１％〜約０.６％の濃度で存在する請求項２１記載の培養系。
【請求項２９】
　該容器中の表面が、多塩基性アミノ酸で処理されている請求項２１記載の培養系。
【請求項３０】
　該多塩基性アミノ酸がポリオルニチンである請求項２９記載の培養系。
【請求項３１】
　該容器中の表面が、細胞外マトリックス分子で処理されている請求項２１記載の培養系。
【請求項３２】
　該細胞外マトリックス分子が、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチンよりなる群から選択される請求項３１記載の培養系。
【請求項３３】
　治療的に有効な量の神経芽細胞を対象に投与することを特徴とするニューロン細胞疾患を持つ対象を治療する方法。
【請求項３４】
　該神経芽細胞が外来遺伝子を含有する請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
　該外来遺伝子がオンコジーンをコードしている請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
　該オンコジーンが、ｖ-ｍｙｃ、ＳＶ４０の大Ｔ抗原およびアデノウイルスのＥ１Ａよりなる群から選択される請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
　該外来遺伝子が受容体をコードしている請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
　該受容体が、アドレナリン、ノルアドレナリン、グルタメート、セロトニン、ドーパミン、ＧＡＢＡおよびアセチルコリンに結合する受容体よりなる群から選択される請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
　該外来遺伝子がリガンドをコードしている請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
　該リガンドが、アドレナリン、ノルアドレナリン、グルタメート、ドーパミン、アセチルコリン、ガンマ-アミノ酪酸およびセロトニンよりなる群から選択される請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
　該ニューロン疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、発作および脊髄外傷よりなる群から選択される請求項３３記載の方法。
【請求項４２】
　神経芽細胞の豊富化された集団よりなる細胞組成物。
【請求項４３】
　該神経芽細胞が、海馬、小脳、脊髄、皮質、前脳基底野、腹側中脳および青斑よりなる群から選択される神経組織由来である請求項４２記載の組成物。
【請求項４４】
　該神経芽細胞が不滅化されている請求項４２記載の組成物。
【請求項４５】
　該不滅化が、少なくとも１種のオンコジーンの細胞への導入によって達成される請求項４４記載の組成物。
【請求項４６】
　該オンコジーンが、ｖ-ｍｙｃ、ＳＶ４０の大Ｔ抗原およびアデノウイルスＥ１Ａよりなる群から選択される請求項４５記載の組成物。
【請求項４７】
　該神経芽細胞が、さらに少なくとも１種の外来遺伝子よりなる請求項４２記載の組成物。
【請求項４８】
　該外来遺伝子が受容体をコードしている請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
　該受容体が、アドレナリン、ノルアドレナリン、グルタメート、セロトニン、ドーパミン、ＧＡＢＡおよびアセチルコリンに結合する受容体よりなる群から選択される請求項４８記載の組成物。
【請求項５０】
　該外来遺伝子がリガンドをコードしている請求項４７記載の組成物。
【請求項５１】
　該リガンドが、アドレナリン、ノルアドレナリン、グルタメート、ドーパミン、アセチルコリン、ガンマ-アミノ酪酸およびセロオトニンよりなる群から選択される請求項５０記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本出願は、１９９３年１月６日出願の出願番号０８/００１,５４３号の一部継続出願である。
　本発明は、一般的に示された神経芽細胞であるニューロン由来の細胞集団、これら細胞集団の産生方法および長期イン・ビトロ培養方法、および種々のニューロン疾患の治療における神経芽細胞の使用ならびに神経芽細胞に影響する組成物の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
　わずかに数種のニューロン細胞型が成人脳において分裂すると報告されているにすぎず、成人ニューロンはイン・ビトロでは良好に生存しない。神経生物学、遺伝学、免疫学および分子生物学における全ての最近の進歩にも拘わらず、今日まで、不滅性を欠いた中枢神経系(ＣＮＳ)およびニューロン組織から細胞系を確立する信頼できる方法がない。脳の異なった領域からのクローン化細胞系の世代は重要であり、新規な神経栄養因子やその受容体の発見を顕著に容易ならしめ、それらの機能の理解を向上させるであろう。
【０００３】
　中枢神経系には、ニューロンおよび神経膠細胞として知られる２種の主要なクラスの細胞が含まれる。神経膠細胞には、神経星状膠細胞、乏突起膠細胞および小膠細胞が含まれる。数百種の異なった型のニューロン、ならびにその増殖性および分化に影響する多くの異なった神経栄養因子が存在する。ニューロンの型および該ニューロンが存在する脳の領域に依存して、異なった神経栄養因子または因子の特定の組合せが、該ニューロンの生存、増殖および分化に影響している。各型のニューロンは、異なった組合せの神経伝達物質、神経栄養因子およびその環境における他の分子に反応する。
【０００４】
　今日まで、潜在的に有用な神経活性化合物を研究するのに必要な細胞系の不足により、ＣＮＳにおける神経薬理学的研究は遅延してきた。生きた動物においては、脳の複雑さが、これらの化合物によりいずれの細胞性受容体が標的化されるかを効果的に測定するのを困難なものとしている。加えて、生きた動物の研究にかかる出費および動物擁権運動に起因する最近の論争が、初期研究におけるイン・ビボ(in vivo)の動物実験をより受け入れ難いものとしてきた。ニューロン組織からの初代細胞がしばしばＣＮＳ研究に用いられるが、初代ニューロンの長期培養は達成されていない。また、長期培養のみならず、ニューロン細胞の実際の増殖を達成しようとする試みは数件しか報告されていない。実際、ニューロン細胞の増殖は、非常につかまえどころのないものと証明されてきたため、ニューロン細胞はイン・ビトロでは増殖しないということが科学学会において深く根付いてきている。その結果、必要なニューロン細胞型を得るための各実験につき新鮮体の切開を行わなければならず、その結果として、実験結果に大きな変動を伴った費用のかかる研究となる。
【０００５】
　幾つかのニューロン腫瘍原細胞が存在する一方で、それらは数がほとんどなく、しかも特徴付けされていない。一般的に、これらの腫瘍細胞系は、それらが元来それから確立された初代ニューロンの生物性を模倣せず、その結果、薬剤発見のスクリーニング・プログラムには適していない。初代細胞をよりよく表現型的に表し、かつ増殖能を有する特定のニューロン細胞系の連続培養を可能とするであろうイン・ビトロの初代培養物は、神経生物学の研究およびＣＮＳ薬剤発見の試行ならびに治療には非常に価値あるものであろう。
【０００６】
　神経系のイン・ビトロ実験からの情報収率を向上させるであろうニューロン細胞系を産生するためには、培養方法学におけるはっきりとした条件および改善がさらに必要であることがますます明らかになってきている。培養中のニューロン細胞を維持するための細胞型および発生段階に特異的な要求性、ならびにより広い培養条件範囲の開発の認識が必要である。しかしながら、これらの目的に達するためには、通常の培養技術で用いる生物流体を欠いたイン・ビボ(in vivo)条件を模倣した最適な培養法を開発することが非常に重要である。
【０００７】
　最近、幾人かの研究者達が、脳の種々の領域および異なった発生段階から前駆細胞を単離し不滅化させている。ニューロンおよび神経膠細胞の表現型を有する細胞系を開発するために、嗅細胞系および小脳細胞系がウイルスmyc(v-myc)オンコジーンを用いて不滅化されている(ライダー(Ｒyder)ら、ジャーナル・オブ・ニューロバイオロジー(Ｊ.Ｎeurobiology)第２１巻:３５６頁、１９９０年)。スニダー(Ｓnyder)らによる同様な実験(セル(Ｃell)第６８巻:３３頁、１９９２年)では、ラット小脳に移植するとニューロンおよび神経膠細胞を形成する多能性のニューロン細胞系が得られた。その他の研究において、ｃ-ｍｙｃを含むレトロウイルス・ベクターを用いてネズミの神経上皮細胞が不滅化され、それを成長因子と共に培養して星状膠細胞およびニューロンに類似する分化細胞型が得られている(バートレット(Ｂartlett)ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８５巻:３２５５頁、１９８８年)。
【０００８】
　上皮成長因子(ＥＧＦ)は、成体マウス脳の線条から単離した少数の細胞のイン・ビトロ増殖を誘導するために用いられている(レイノルズ(Ｒeynolds)およびワイス(Ｗeiss)、サイエンス(Ｓcience)第２５５巻:１７０７頁、１９９２年))。これらの細胞クラスターは、神経上皮幹細胞の免疫原性を有し、適当な条件下でこれらの細胞は、イン・ビボにおける成体線条の表現型特性を有する神経星状膠細胞およびニューロンへの分化を誘導できた。しかしながら、これらの分化ニューロンは長期間は培養されておらず、これらの細胞を冷凍し、次いで解凍して再培養できたという証拠がないことは特記すべきである。
【０００９】
　カッタネオ(Ｃattaneo)およびマッケイ(Ｍckay)は、神経成長因子(ＮＧＦ)のニューロン前駆細胞の増殖に対する影響を測定するためにラット線条を用いて実験を行った(ネイチャー(Ｎature)第３４７巻:７６２頁、１９９０年)。ラット胎児線条から該細胞を摘出し、ＮＧＦおよび塩基性繊維芽細胞成長因子(ＦＧＦ２としても知られているｂＦＧＦ)の双方に露した。９日間だけこれらの細胞をイン・ビトロで培養し、その時点で、ニューロン特異的マーカーでのアッセイにより測定するとこれらの細胞がニューロンへと分化していた。
【００１０】
　１３日齢のラット胚の大脳半球からのニューロン前駆細胞を、５ｎｇ/ｍlのｂＦＧＦの存在下にて８日目まで培養した(ゲンスバーガー(Ｇensberger)ら、エフイィビィエス・レターズ(ＦＥＢＳ Ｌett.)第２１７巻:１頁、１９８７年)。この濃度では、ｂＦＧＦは短期間の増殖を刺激したにすぎなかった。ＮＧＦおよびｂＦＧＦの組合せまたはＥＧＦのみに反応しての、胎児および成体の線条からの初代ニューロンの増殖および分化も報告されている(カッタネオ(Ｃattaneo)ら、前掲；レイノルズ(Ｒeynolds)およびワイス(Ｗeiss)、前掲)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
　前記の観点より、増殖させ、長期にわたって継代し、継代培養植することができるニューロン細胞集合集団を大規模で産生し維持できるであろう長期イン・ビトロ培養系に対する要望がある。かかるイン・ビトロにおける同質のニューロン培養物が、細胞集団、これらの細胞間の相互作用および種々の神経活性組成物のこれら細胞に対する影響を研究するのに貴重であることが証明されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
　イン・ビトロにおいてニューロン細胞を産生し維持するための系の重要性を認識して、本発明者らは、胎児および成体のニューロン細胞系を連続産生するための方法および培養系を開発した。オンコジーンの不滅化を欠いた中で神経栄養因子を用いる、神経芽細胞として知られる細胞系として維持された初代ニューロン培養法の開発は、今や、これらの細胞の生化学的および細胞的特性に関する基本的な問題、ならびにそれらの細胞環境と化学環境との間の相互作用の動態の研究を可能とする。
【００１３】
　本発明の神経芽細胞は、例えば、ニューロン疾患を患った対象の治療における使用および種々の受容体、リガンドおよび神経伝達物質と相互作用する組成物を同定するためのこれらの分子をコードする遺伝子配列を安定に取り込ませるのに有利に用いることができる。
【００１４】
　本発明は、単離したニューロン細胞集団を産生するためのイン・ビトロ法を提供する。神経繊維芽と称されるこれらの細胞は、該細胞が付着できる容器を用いて、少なくとも１種の栄養因子を補給した無血清培地中でニューロン細胞を培養することよりなる方学を利用することにより産生できる。この方法により、増殖能を有する胎児および成体の両組織からの、脳の異なった領域からのニューロン細胞培養物を連続して得ることが可能となる。
【００１５】
　また、本発明は、神経芽細胞の増殖を阻害または刺激することによるごとき、神経芽細胞に影響する組成物を同定する方法も提供する。少なくとも１種の栄養因子を含有する無血清基礎培地および神経芽細胞が付着できる容器よりなる、神経芽細胞の産生および維持に有用な培養系も提供される。また、本発明の方法により産生した神経芽細胞の豊富化された集団も提供され、さらに、神経細胞疾患を持つ対象の治療または、別法として該神経芽細胞に影響する組成物をスクリーニングするのに利用することもできる。
【００１６】
　本明細書中で用いる「神経芽細胞」なる語は、不滅化されたニューロン系の非神経膠細胞をいう。ニューロンの「不滅化」とは、それにより、無期限にイン・ビトロで維持、成長および増殖できるよう成長因子でニューロン系の非-神経膠細胞を処理する方法をいう。典型的には、動物から摘出した組織を適当な流体培地を入れた培養容器に置いた、有限の寿命を有する初代培養物である。それに対して、連続細胞系は増殖し、従って継代培養できる(すなわち新たな培養容器に繰り返して継代できる)。また、連続細胞系は、低温保存剤、例えば１０％ジメチルスルホキシドまたはグリセリンが存在する場合、液体窒素の気相中にて冷凍状態で長期間保存することもできる。本発明の神経芽細胞は、オンコジーン不滅化をたよることがないのを除いて、初代培養物に酷似した細胞系として、長期培養にて維持できる。むしろ、「不滅化」は、特定の成長因子または成長因子の組合せを利用することにより初代ニューロン細胞から連続培養を確立する。この不滅化技術は、遺伝子移入または遺伝子操作を要せず、その結果、該細胞は初代培養物にさらに酷似する点で新規である。
【００１７】
　それぞれ区別される特性を有する数百の異なった型のニューロンがある。各型のニューロンは、異なった組合せの神経伝達物質および神経栄養因子を産生し、それに反応する。ニューロンは成体の脳では分裂せず、またそれらは一般的にイン・ビトロでは長期間生存しない。本発明の方法は、脳および脊髄の実質的にいずれもの領域からの不滅化ニューロンまたは神経芽細胞のイン・ビトロにおける単離および増殖を提供する。神経芽細胞系を開発するためには、胎児または成体のニューロンのいずれかが利用できる。神経芽細胞の産生に利用する本発明のニューロン細胞は、海馬、小脳、脊髄、皮質(例えば、運動皮質または体性感覚皮質)、線条、前脳基底野(コリン作動性ニューロン)、腹側中脳(黒質の細胞)、および青斑核(中枢神経系の神経性アドレナリン細胞)からの組織を包含する、いずれの胎児または成体のニューロン組織由来のものであってもよい。
【００１８】
　本発明の神経芽細胞を産生するための液体培地は、神経芽細胞の成長および増殖を支持するための少なくとも１種の栄養因子が補給されている。栄養因子は、ニューロンの発生および生存に関与する分子である。それらは、しばしば脳で合成され、特異的な受容体を有し、ニューロンのサブセットの生存および機能に影響する。かかる因子の例としては、神経成長因子(ＮＧＦ)、脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、ニューロトロピン-３,-４および-５(ＮＴＦ-３,-４,-５)、毛様体神経栄養因子(ＣＮＴＦ)、塩基性繊維芽細胞成長因子(ｂＦＧＦ)、酸性繊維芽細胞成長因子(ａＦＧＦ)、血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ)、上皮細胞成長因子(ＥＧＦ)、インスリン様成長因子-Ｉおよび-II(ＩＧＦ-Ｉ、-II)、トランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)およびリンパ球侵潤因子/コリン作動性分化促進因子(ＬＩＦ/ＣＤＦ)が含まれる。栄養因子の特異性および選択性は、その受容体により測定する。本発明で利用する該栄養因子は神経栄養因子が好ましい。本発明の神経芽細胞の産生のための基礎培地に添加する神経栄養因子はｂＦＧＦが好ましい。イン・ビトロにおいて該神経芽細胞を成長させ増殖できる神経栄養因子は、該神経芽細胞の組織起源に依存するであろう。しかしながら、ほとんどのニューロン細胞には、ｂＦＧＦが好ましい神経栄養因子であろう。
【００１９】
　神経芽細胞の産生に利用する容器は、該ニューロン細胞が粘着できる表面を提供しなければならない。また、かかる容器は、一度単離した神経芽細胞培養物を産生させたことがあるものが好ましい。該ニューロン細胞の付着性を高めるために用いる表面は、容器の実際の内部層あるいは、より間接的には、容器内に存在する補給挿入物または膜である。うちゃくは、該細胞が容器上で単層にて増殖できるいずれの方法でもなし得る。付着性を高める表面は、該容器に適するプラスチックポリマーを有利に選択することによるごとく直接的に作製するか、または、第二の化学処理により容器内の表面を処理するごとく間接的に作製できる。したがって、「付着」とは、細胞が組織培養容器の表面に付着できる能力をいい、ここに該付着促進性表面は、懸濁液中では三次元の細胞集合体にて増殖するであろうニューロン細胞と直接接触する。ニューロン細胞の容器表面への粘着または接着により、該細胞を不滅化させることができる。
【００２０】
　可溶性因子との相互作用に加えて、ニューロン細胞を含むほとんどのイン・ビボの細胞は、細胞間の間隙で局部的に分泌され複雑なネットワークに集合する相互活性蛋白質および多糖分子の複合配列である細胞外マトリックスと接触する。従って、細胞外マトリックス蛋白質を該培養容器の表面に添加して、イン・ビボ細胞外マトリックスにそっくり対応する様式にて培養物中のニューロン細胞が付着できるような不溶性マトリックスを形成させる。好ましくは、本発明の神経芽細胞は、初期粘着が可能な多塩基性アミノ酸組成物で組織培養皿またはフラスコのごとき容器の表面を被覆することにより産生させることができる。かかる組成物は当該分野でよく知られており、ポリオルニチンおよびポリリジンが含まれる。本発明の該塩基性ポリアミノ酸はポリオルニチンが最も好ましい。加えて、該容器の表面は、該神経芽細胞の増殖能を向上させ、基質上に突起を形成させる公知の細胞外マトリックス蛋白質組成物で被覆することもできる。かかる組成物には、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチンが含まれる。多塩基性アミノ酸と組み合わせて用いることができる他の細胞外マトリックス蛋白質は、当業者に明らかであろう。加えて、成体神経芽細胞の産生には、最初に、血清存在下にて該細胞を培養するのが好ましい。
【００２１】
　本発明の神経芽細胞は、神経芽細胞の生物学的機能に影響する神経薬理学的化合物のスクリーニング手段として有用である。かくして、もう一つの具体例において、本発明は、成分を相互作用させるに十分な条件下にて、試験すべき組成物および神経芽細胞を含む成分をインキュベートし、次いで、該組成物の該神経芽細胞に対する影響を測定することよりなる、神経芽細胞に影響する組成物を同定する方法を提供する。該神経芽細胞に対して観察される影響は、阻害性または刺激性のいずれかとなり得る。例えば、神経伝達物質に似ているか、または受容体に結合してアンタゴニストもしくはアゴニスト作用を示し、それにより神経芽細胞における生物学的反応を阻害または刺激する神経刺激性化合物が、本発明の方法を用いて同定できる。生物学的反応の発生は、当業者に知られている標準的な技術を用いてモニターできる。例えば、生物学的反応の阻害または刺激は、神経芽細胞におけるある遺伝子の発現レベルにより同定できる。かかる遺伝子には、ｆｏｓ、ｍｙｃまたはｊｕｎのごとき初期反応性遺伝子を含めることができる(グリーンバーグ,エム(Ｇreenberg,Ｍ.)およびツィフ,イィ(Ｚiff,Ｅ.)、ネイチャー(Ｎature)第３１１巻:４３３頁、１９８４年；ブルック(Ｂruck)ら編、オンコジーンズ(Ｏncogenes)、１９８８年、スシュププリンゲル-ファーラグ(Ｓpriner-Ｖerlag)、ニュー・ヨーク(Ｎew Ｙork))。細胞表面マーカーをコードするものを含む他の遺伝子を、本発明の神経芽細胞に対する神経薬理学的化合物の影響の指標として用いることもできる。かかる影響を測定する方法には、ＲＮＡのノザンブロッティング分析(転写)、蛋白質のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析(翻訳)、[３Ｈ]-チミジン取り込み(ＤＮＡ合成)および(細胞内および細胞外の)抗体反応性が含まれる。他の通常用いる方法は、当業者に明らかであろう。
【００２２】
　かくして、ニューロン細胞に影響することがすでに知られているものと同様に作用する神経刺激性薬剤を同定することができる。例えば、重要な阻害性伝達物質であるガンマ-アミノ酪酸(ＧＡＢＡ)の作用を増大または刺激するバリウム(Ｖalium)に類似する、不安を緩和する新しい薬剤が同定できる。プロザック(Ｐrozac)のごとき抗鬱薬は、広範な種々の機能を有するインドールアミンであるセロトニンの作用を向上させる。本発明の方法による神経芽細胞を用いれば、他の薬剤も容易に同定することができる。他の例としては、精神刺刺激化合物が含まれる。例えば、コカインがドーパミンの作用を助長する一方、ある種の抗精神薬はこのカテコールアミンに拮抗するかまたは阻害する。もう一つの例は、大脳皮質全体にわたって分布しているアセチルコリン受容体を活性化するニコチンである。従って、脳の適当な領域からのニューロン細胞由来の神経芽細胞を用いることにより、種々の受容体に結合してニューロン細胞に同様の影響を及ぼす薬剤および栄養因子が、本発明の方法を用いて同定できる。
【００２３】
　前記のごとく、ニューロン細胞の不滅化は、オンコジーン用いることなく達成することができる。しかしながら、所望により、本発明の神経芽細胞を不滅化して、所定の発生段階で該細胞を維持することができる。典型的に、不滅化のための本技術には、オンコジーンの該細胞へのトランスフェクションが含まれ、従って、少なくとも１種のオンコジーンを神経芽細胞に導入することにより該神経芽細胞の不滅化が達成できる。該オンコジーンのトランスフェクションは、組換えレトロウイルス、化学的方法または物理的方法を用いることを包含する当業者によく知られた幾つかの常法により達成できる。組換えレトロウイルス移入が、神経芽細胞を不滅化させるための本発明の好ましい方法である。
【００２４】
　リン酸カルシウム共沈法のようなトランスフェクション法、マイクロインジェクションのごとき通常の機械的方法、リポソーム中に封入したプラスミドの挿入によって、またはウイルスベクターの使用によって、特定のオンコジーンで該宿主神経芽細胞を不滅化できる。例えば、１つの方法は、シミアンウイルス４０(ＳＶ４０)またはウシ乳頭腫ウイルスのごとき真核生物ウイルスベクターを用いて該神経芽細胞を一過的に感染するかまたは形質転換することである(「真核生物ウイルスベクターズ(Ｅukaryotic Ｖiral Ｖectors)」、コールド・スプリング・ハーバー研究所(Ｃold Ｓpring Ｈabor Ｌaboratory)、グルツマン(Ｇluzman)編、１９８２年)。
【００２５】
　本明細書中にて教示した不滅化のために利用できる種々のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、好ましくはレトロウイルスのごときＲＮＡウイルスが含まれる。該レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体が好ましい。その中に一個の外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例には、限定するものではないが：モロニーマウス白血病ウイルス(ＭoＭuＬＶ)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(ＨaＭuＳＶ)、マウス乳ガンウイルス(ＭuＭＴＶ)およびラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)が含まれる。さらに多数のレトロウイルスベクターが、複数の遺伝子を取り込むことができる。これら全てのベクターは、形質導入した細胞を同定しそれを得ることができる発生できるように、選択マーカー用の遺伝子を移入しまたは取り込むことができる。
【００２６】
　組換えレトロウイルスは欠損ウイルスであるため、感染性のベクター粒子を生成するためにはそれらは補助手段を要する。例えば、長鎖末端繰返し配列(ＬＴＲ)内の調節配列の制御下にある該レトロウイルスの全構造遺伝子(ｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌ遺伝子)をコードするプラスミドを含むヘルパー細胞系を用いることにより、この補助手段を提供できる。これらのプラスミドは、包膜のためのＲＮＡ転写物を認識するパッケージング機構を可能にするヌクレオチド配列を欠損している。該パッケージング・シグナルを欠損しているヘルパー細胞系には、限定するものではないが、例えば、Ψ２、ＰＡ３１７、ＰＡ１２、ＣＲＩＰおよびＣＲＥが含まれる。ゲノムがパッケージないため、これらの細胞系は空のビリオンを生成する。その中の該パッケージ・シグナルは無傷であるが構造遺伝子が他の目的遺伝子により置換されているかかる細胞にレトロウイルスベクターを導入しすると、該ベクターはパッケージングされ、ベクタービリオンを生成できる。次いで、この方法により生成したベクタービリオンを用いて、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞のごとき組織細胞系に感染させて大量のキメラウイルスビリオンを産生させることができる。
【００２７】
　別法として、通常のリン酸カルシウム共沈法またはリポフェクション・トランスフェクションにより、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドでＮＩＨ ３Ｔ３または他の組織培養細胞を直接トラスフェクションすることもできる。次いで、これらの細胞を目的の遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクションする。得られた細胞は該レトロウイルスベクターを培養培地中に放出する。
【００２８】
　また、ヘルペスウイルスに基づくベクターを用いて遺伝子を神経芽細胞に移入することもできる。ヘルペスウイルスは潜伏感染を確立でき、かつ幾つかのニューロン細胞と明らかな非病原性関係を確立できるため、例えば、ＨＳＶ-１に基づくかかるベクターを用いることができる。同様にして、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルスおよび他のパラミクソウイルスのごときＣＮＳの細胞に効率的に感染する他のヒトおよび動物ウイルス、ならびにヒト免疫不全症候群レトロウイルス(ＨＩＶ)さえもが、有用なデリバリーベクターおよび発現ベクターを開発するのに利用するのに有利であろう。
【００２９】
　組換えレトロウイルスを不滅化オンコジーンを含むよう設計する場合、該オンコジーンは不滅化することが知られているいずれのものであってもよい。例えば、かかる通常用いられる不滅化遺伝子には、ｍｙｃファミリーの遺伝子(ｃ-ｍｙｃおよびｖ-ｍｙｃの両方)が含まれる(バートレット(Ｂartlett)プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８５巻：３２５５頁、１９８８年)、アデノウイルス遺伝子(Ｅ１a １２sおよびＥ１a １３s)(ラリー(Ｒuley)ら、ネイチャー(Ｎature)第３０４巻：６０２頁、１９８３年)、ポリオーマウイルスの大Ｔ抗原およびＳＶ４０の大Ｔ抗原(フレデリクセン(Ｆrederiksen)ら、ニューロン(Ｎeuron)第１巻：４３９頁、１９８８年)。本発明の神経芽細胞を不滅化するのに用いる該オンコジーンはｖ-ｍｙｃが好ましい。例えば、細胞を不滅化するが、完全な形質転換には第二の遺伝子を必要とする他の核オンコジーンのような他の遺伝子も当業者に知られているであろう。
【００３０】
　神経芽細胞の不滅化のための前記と同一のトランスフェクション方法を利用して他の外来遺伝子を本発明の神経芽細胞に移入することができる。「外来遺伝子」とは、神経芽細胞に導入される該神経芽細胞の外に由来する遺伝物質をいう。神経薬理学的化合物を同定する方法に有用であろう望ましい外来遺伝子の例は、受容体分子の遺伝子である。例えば、かかるニューロン受容体には、ドーパミン、ＧＡＢＡ、アドレナリン、ノルアドレナリン、セロトニン、グルタメート、アセチルコリンおよび種々の他の神経ペプチドに結合する受容体が含まれる。特定の神経起源の神経芽細胞における特定の受容体の移入および発現によって、その神経芽細胞型およびその受容体が関与する疾患の治療に有用となり得る神経刺活性性薬剤および栄養因子を同定することが可能となろう。例えば、神経伝達物質に似ており、かつ受容体に結合してしてアンタゴニストまたはアゴニスト作用を示し、それにより神経芽細胞における反応を阻害または刺激する神経活性化合物が、本発明の方法を用いて同定できる。
【００３１】
　もう一つの具体例において、本発明は、少なくとも１種の栄養因子を含有する無血清基礎培地と神経芽細胞が粘着できる表面を有する容器とからなる、神経芽細胞を産生し維持するのに有用な培養系を提供する。該培養系を利用して前記した神経起源のいずれの組織からも神経芽細胞を産生することができる。本発明の「無血清基礎培地」とは、神経芽細胞を産生し維持できる溶液をいう。該基礎培地は、好ましくは、通常用いる液体組織培養培地であるが、無血清であって神経芽細胞が増殖できる種々の明確な成分が補給されている。本発明の培養系に有用な基礎培地は、特定なアミノ酸、ビタミン、無機塩、緩衝剤およびエネルギー源を含むダルベッコの最小必須培地のごとき当該分野でよく知られたいずれかの組織培養培地である。ホルモン、成長因子、輸送蛋白質、微量元素、ビタミンおよび下層修飾因子を包含する精製分子を基礎培地に添加して生物流体を置き換える。典型的には、例えば、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム、プトレッシン、インスリンおよびトランスフェリンを、該基礎培地に添加して神経芽細胞の成長および増殖を向上させる。本発明の培養系では、ニューロン単独の増殖を支持するのに２種の明確な補給物(トランスフェリンおよびインスリン)のみが必要であるが、前記の５種の補給物を組み合わせても高い相乗性の増殖刺激効果を有する。いずれか１種の補給物を欠くと、神経芽細胞の増殖は顕著に低下する。これらの要素を含む好ましいプロトタイプ培地の例はＮ２培地である(ボッテンシュタイン(Ｂottenstein)およびサト(Ｓato)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第７６巻：５１４頁、１９７９年)。該補給物の最適濃度は以下の通りである：５μｇ/ｍlのインスリン、１００μｇ/ｍlのトランスフェリン、２０ｎＭのプロゲステロン、１００μＭのプトレッシンおよび３０ｎＭの(Ｎａ２ＳｅＯ３)セレン。
【００３２】
　該培養系の基礎培地は、神経芽細胞の産生および維持のための少なくとも１種の栄養因子をさらに含有する。最も好ましくは、神経栄養因子を、特にｂＦＧＦを利用する。ｂＦＧＦは、約１ｎｇ/ｍlないし約１００ｎｇ/ｍl、より特別にはさらに特には約５ｎｇ/ｍlないし約７０ｎｇ/ｍl、最も好ましくは約１５ｎｇ/ｍlないし約６０ｎｇ/ｍlの濃度にて該基礎培地で利用する。神経培養物は、一般的にｐＨ７.２-７.６にて維持する。非神経細胞とは反対に、神経細胞には高グルコースという要件も要求される。従って、本発明の基礎培地は、約０.０１％ないし約１.０％の濃度のグルコース、好ましくは約０.１％ないし約０.６％の濃度のグルコースを含有する。
【００３３】
　また本発明は、神経芽細胞の豊富な集団よりなる細胞組成物も提供する。該組成物は、好ましくは、大部分は神経芽細胞を含むか、あるいは少なくとも約９０％の神経芽細胞を含有する。該神経芽細胞は、前記したごとく、脳のいずれかの領域のごとくいずれかのＣＮＳ神経組織由来であるか、または脊髄由来である。該神経芽細胞は、オンコジーンでさらに不滅化でき、あるいは受容体または受容体に対するリガンドをコードする外来遺伝子を含有することができる。
【００３４】
　また本発明は、治療有効量の本発明の神経芽細胞を対象に投与することからなるニューロン細胞疾患を患った対象を治療する方法も提供する。本明細書中で用いる「治療有効」とは、ニューロン疾患の原因を緩和させるのに十分な量の神経芽細胞量をいう。「緩和する」とは、該治療を受けている患者においてニューロン疾患の有害な効果を低減することをいう。本発明の対象は、好ましくはヒトであるが、しかしながら、本発明の神経芽細胞で治療できるニューロン疾患を持ったいずれの動物を想定することもできる。好ましくは、該神経芽細胞は、治療を受ける対象の種と同一種のニューロン組織由来である。
【００３５】
　ニューロン疾患を持つ対象を治療する方法は、当該疾患を有するＣＮＳ領域への神経芽細胞の大脳内移植を必然的に伴う。要すれば、神経芽細胞を遺伝子操作して外来遺伝子を含有させることができる。該疾患は、疾病または外傷(障害)のいずれでもよい。神経芽細胞移植または「移植術」には、中枢神経系または心室腔あるいは宿主脳の表面上の硬膜への細胞の移植が含まれる。移植術のかかる方法は、当業者に知られており、(出典明示して本明細書の一部とみなす)「哺乳動物ＣＮＳにおける神経移植(Ｎeural Ｇrafting in the Ｍammalian ＣＮＳ)」ビヨルクルンド(Ｂjorklund)およびステネビ(Ｓtenevi)編(１９８５年)に記載されている。当該方法は、移植時に脳実質に命中するように宿主脳内に組織を注射するかまたは沈載することにより達成される実質内移植(すなわち、宿主脳内)が含まれる。
【００３６】
　受容対象の脳の選択された領域への本発明の神経芽細胞の投与は、ドリルで硬膜に孔を空け、挿入すべきマイクロシリンジの針を通すことにより行うことができる。別法として、該神経芽細胞を脊髄領域にクモ膜下注射することもできる。本発明の神経芽細胞調製物により、神経芽細胞を脳または脊髄中のいずれかの予め決定した部位に移植することができ、かつ同細胞の懸濁液を用いて幾つかの異なったサイトに同時に複数移植でき、異なった解剖学的領域からの細胞混合物でも可能となる。本発明は、以前は利用できなかった増殖性神経芽細胞、ならびにイン・ビトロ遺伝子移入に続くイン・ビボ移植用の十分な数の細胞を増殖させるためにこれらの神経芽細胞を産生するための培養系を提供することにより、種々の神経組織を移植する方法を提供する。
【００３７】
　ニューロン疾患の治療に用いる該神経芽細胞は、所望により、例えば、オンコジーン、受容体をコードする遺伝子またはリガンドをコードする遺伝子のような外来遺伝子を含有させることもできる。かかる受容体には、前記したごとき、ドーパミン、ＧＡＢＡ、アドレナリン、ノルアドレナリン、セレトニン、グルタメート、アセチルコリンおよび他の神経ペプチドに反応する受容体が含まれる。ニューロン疾患において治療効果を提供できるリガンドの例としては、ドーパミン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、ガンマ-アミノ酪酸およびセロトニンが含まれる。供与神経芽細胞により分泌された後に必要なリガンドの拡散および取り込みは、かかる遺伝子産物の産生において対象の神経細胞が欠損している疾患において有利であろう。神経成長因子(ＮＧＦ)のごとき神経栄養因子を分泌するよう遺伝子的に修飾した神経芽細胞は、処理なしでは死滅し得るコリン作動性ニューロンの変性を防ぐのに用いることができよう。別法として、パーキンソン病のごとき基底星状膠細胞の疾患を持つ対象へ移植すべき神経芽細胞を修飾して、ドーパミンの前駆体であるＬ-ＤＯＰＡをコードする外来遺伝子を含有させることもできる。パーキンソン病は、その主な標的組器官としての基底星状膠細胞を有する、中脳の黒質におけるドーパミン・ニューロンの喪失により特徴付けられる。別法として、ドーパミンを産生する黒質ニューロン細胞由来の神経芽細胞をパーキンソン患者の脳に導入して「天然に」ドーパミンを産生する細胞を提供することもできる。
【００３８】
　本発明の方法により同様に治療できる他のニューロン疾患には、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、発作によるニューロン障害および脊髄における損傷が含まれる。アルツハイマー病は、前脳基底野のコリン作動性ニューロンの変性により特徴付けられる。これらのニューロンの神経伝達物質は、それらの生存に必要であるアセチルコリンである。コリン作動性神経芽細胞、またはこれらのニューロンの生存を促進するであろう因子についての外来遺伝子を含有する神経芽細胞の移植は、前記のごとき本発明の方法により達成することができる。発作の後には、海馬のＣＡ１における細胞の選択的な喪失、ならびにこれらの患者における認識機能および記憶喪失に関与し得る皮質細胞の喪失がある。一旦同定したら、ＣＡ１細胞死滅の原因である分子は本発明の方法により阻害できる。例えば、アンチセンス配列、またはアンタゴニストをコードする遺伝子を神経芽細胞に移入し、脳の海馬領域に移植することができる。
【００３９】
　また、ニューロン疾患を患った対象を治療する方法は、ＣＮＳの疾患を治療するのに有用な他の治療方法と組み合わせた神経芽細胞の移植も考えられる。例えば、成長因子、ガングリオシド、抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、毒素、神経突起促進分子および代謝阻害剤ならびにドーパミンの前駆体であるＬ-ＤＯＰＡのごときこれらの分子の前駆体と共に該神経芽細胞を投与することができる。　
【００４０】
　以下の実施例は、本発明を詳細に説明するものであって、限定するものではない。これらは用いることができる典型的なものであって、当業者に公知の他の方法も用いることができる。
【００４１】
実施例
　以下の実施例では、ｂＦＧＦで５ヶ月にわたり培養した胎児ラットからの海馬、脊髄、黒質、前脳基底野および他のニューロン組織細胞のニューロン増殖性を示す。さらに、成体海馬を合成培地中にてｂＦＧＦで７ヶ月を超えて培養した。これらの実施例は、胎児および成体のニューロン組織からの膨大な数の細胞型の発生、分化および長期培養の方法も提供し、成体ｂＦＧＦ処理培養物における増殖性の非ニューロン細胞型およびニューロン細胞型の形態学的、免疫細胞化学的、超微細構造学的および分子的な特性を記載する。
【００４２】
　ブロモデオキシウリジンを取り込む増殖性細胞は、ニューロン特異的エノラーゼに対して免疫陽性であった。良好に分化したニューロンに典型的な偏光形態を有する細胞は、成熟ニューロンに特徴的な高分子量のニューロフィラメント蛋白質(ＮＦｈ)のサブユニット、ニューロフィラメント蛋白質の中および低サブユニットならびに微小管結合蛋白質２(ＭＡＰ-２)に対して免疫陽性であった。成体哺乳動物の海馬からの細胞は、増殖能ならびにイン・ビトロにおける長期神経発生能および神経分化能を有する。これらの細胞は、ニューロン移植における置換細胞の源とすることができる。さらに、これらの細胞のイン・ビボにおける増殖および分化の誘導は、ニューロンの喪失または変性の置換または増強に有用であろう。
【００４３】
実施例１
材料および方法
　材料：ＤＭＥＭ:Ｆ１２培地、Ｎ２補給物およびラミリンはギブコ/ＢＲＬ社(Ｇibco/ＢＲＬ)(メリーランド州、ベセスダ(Ｂethesda,ＭＤ))から得た；ポリオルニチン(ＰＯＲＮ)はシグマ社(Ｓigma)(ミズーリ州、セントルイス(Ｓt.Ｌouis,ＭＯ))から入手した。組換えｂＦＧＦはシンテックス/シナージェン・コンソルティウム社(Ｓyntex/Ｓynergen Ｃonsortium)(コロラド州、ボウルダー(Ｂoulder,ＣＯ))から得た。ウシｂＦＧＦは、アール・アンド・ディ社(Ｒ＆Ｄ)、ミネソタ州、ミネアポオリス(Ｍinneapolis,ＭＮ)から購入した。ニューロタグＴＭ(ＮeuroＴagＴＭ)グリーンは、ベーリンガー・マンハイム社(Ｂoehringer Ｍannheim)インディアナ州、インディアナポリス(Ｉndianapolis,ＩＮ)から得た。ブロモデオキシウリジン(ＢrdＵ)、抗-ＢrdＵ抗体およびストレプトアビジン/テキサス・レッド(Ｔexas Ｒed)を含有する細胞増殖キットはアマーシャム社(Ａmersham)、インディアナ州、アーリントン・ハイツ(Ａrlington・Ｈeights,ＩＮ)から購入した。培養物中の細胞の表現型を同定するのに用いる抗体は、以下の供給源から得、示した希釈率にて用いた：ウサギ抗-ニューロフィラメント２００(ＮＦ)ポリクローナル抗体(１:５００;ケミコン・インターナショナル社(Ｃhemicon Ｉnternational)、カリフォルニア州、テメキュラ(Ｔemecula,ＣＡ))、抗-ニューロン特異的エノラーゼ(ＮＳＥ)モノクローナル抗体(１:５０;ダコ社(ＤＡＫＯ)、(カリフォルニア州、カーオペンテリア(Ｃarpenteria,ＣＡ)))、抗-膠細胞繊維質酸性蛋白質モノクローナル抗体(１:５００-１:１０,０００;アマーシャム社(Ａmersham)(インディアナ州、アーリントン・ハイツ(Ａrlington,Ｈeights,ＩＮ))、抗-ビメンチン・モノクローナル抗体(１:８００;ベーリンガー・マンハイム社(Ｂoehringer Ｍannheim)、インディアナ州、インディアナポリス(Ｉndianapolis,ＩＮ))、抗-ＯＸ-４２モノクローナル抗体(１:５０００;セロテック社(Ｓerotec)、インディアナ州、インディアナポリス(Ｉndianapolis,ＩＮ))、抗-ガラクトセレブロシド(ＧalＣ)ポリクローナル抗体(１:５０００；アドバンスド・イムノケミカル・サービシーズ社(Ａdvanced Ｉmmunochemical Ｓervices)、カリフォルニア州、ロングビーチ(Ｌong Ｂeach,ＣＡ))、抗-微小管結合蛋白質(ＭＡＰ ２)モノクローナル抗体(１:５００;シグマ・イムノケミカルズ社(Ｓigma Ｉmmunochemicals)、ミズーリ州、セントルイス(Ｓt.Ｌouis,ＭＯ))、抗-フィブロネクチンポリクローナル抗体(１:２０００;レリオス社(Ｒelios)、カリフォルニア州、ラ・ジョーラ(Ｌa Ｊolla,ＣＡ))。ネスティンポリクローナル抗体(１:１５,０００)は、マサチューセッツ州、ケンブリッジのＭＩＴのアール、マッケイ博士(Ｄr.Ｒ.ＭcＫay)から寄贈され、高アフィニティーのｂＦＧＦ受容体のモノクローナル抗体(１:２０)はカリフォルニア州、ラ・ジョーラのウィッティエル研究所(Ｗhittier Ｉnstitute)のエイ、バード博士から寄贈された。抗-ＧＦＡＰポリクローナル抗体(１:２０００)は、カリフォルニア州、パロ・アルトのスタンフォード大学のエル・エフ、エング博士(Ｄr.Ｌ.Ｆ.Ｅng)から寄贈された。
【００４４】
細胞培養　フィッシャー(Ｆisher)３４４ラット(Ｅ１６)の脳を切開し、髄膜を摘出し、海馬を単離した。海馬を１５ｍlの組織培養管に移し、その容量を０.６％のグルコースを補給したリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ-Ｇ)(ｐＨ７.４)で１-２ｍlに調整した。パスツール・ピペット(〜２０×)でトリチュレートし、続いて、焼成してピペット孔をかなり細くしたパスツールピペット(〜２０×)でトリチュレートすることにより、海馬を機械的に解離させた。該細胞懸濁液を、１０００ｒｐｍで室温にて５分間遠心することによりペレット化した。細胞を〜２０ｍlのＮ２培地(２０ｍＭのプロジゲステロン、３０ｍＭの亜セレン酸ナトリウム、１０0μＭのプテレッシン、３.９ｍＭのグルタミン、５μＭ/ｍlのインスリン、１００μｇ/ｍlトランスフェリンを含有するＤＭＥＭ:Ｆ１２の１:１混合物)に取り、ヘモサイトメーターで細胞数を定量した。組織培養プレートを、ポリオルニチン(ＰＯＲＮ;１０μｇ/ｍl)続いてラミニン(１０μｇ/ｍl)で被覆した。約０.５-１.０×１０６細胞/ウェルを、２０ｎｇ/ｍlのｂＦＧＦ(Ｎ２＋ｂＦＧＦ)を含有するＮ２培地を入れたＰＯＲＮ/ラミニン-被覆６ウェルプレートで平板培養し、５％ＣＯ２中３７℃にて培養した。培地は３-４日毎に新鮮なＮ２＋ｂＦＧＦで置き換えた。継代のために、細胞をトリプシン処理(ＡＴＶトリプシン、カリフォルニア州、サンタ・アナ(Ｓanta Ａna,ＣＡ)、アーバイン・サイエンティフィック社(Ｉrvine Ｓcientific))し、次いでＮ２＋ｂＦＧＦに取った。細胞を遠心によりペレット化し、トリプシンを含む上清を除去した。細胞を１０ｍlのＮ２＋ｂＦＧＦに再懸濁し、平板培養した。細胞は、Ｎ２＋ｂＦＧＦ＋１０％ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)中にて液体窒素中で冷凍することができた。培養のために、細胞を３７℃にて素早く解凍し、１０ｍlのＮ２＋ｂＦＧＦに添加し、遠心してＤＭＳＯを除去し、新鮮なＮ２＋ｂＦＧＦ中に再懸濁し、前記のごとく平板培養した。
【００４５】
ＢｒｄＵ取込み実験　初代ニューロン(継代５)を３日間増殖させ、その際に該培地を交換した。翌日に細胞をＢｒｄＵと共に１日または４日間インキュベートした。細胞を固定し、洗浄し、次いで、ＢｒｄＵに対するモノクローナル抗体で１時間処理した。洗浄した後に、細胞をビオチン化抗-マウス抗体(ベクター・ラボラトリーズ社(Ｖector Ｌaboratories)、カリフォルニア州、バーリンゲーム(Ｂurlingame,ＣＡ))、続いてストレプトアビジン/テキサス・レッド(Ｔexas Ｒed)複合体と反応させた。染色された培養物は、ＹＨＳフィルターセット(５６８ＥＸ、５８５ＬＰ)を用いたクリプトン-アルゴンレーザーを装備したバイオラドＭＲＣ６００(ＢioＲad ＭＲＣ６００)共焦点走査型レーザー顕微鏡で検鏡した。共焦点蛍光顕微鏡およびノマルスキー透過型顕微鏡で画像を収集し、アップル社(Ａpple)製マッキントッシュ・クアドラ(Ｍaintosh Ｑuadra)７００に移し、アドーブ・フォトショップ(Ａdobe Ｐhotoshop)２.０１を用いて合成し、ＧＣＣフィルムレコーダー上に印刷した。
【００４６】
ニューロタグＴＭ(ＮeurotagＴＭ)結合性　培養中にて６日間増殖させた初代ニューロン(継代５)を、Ｎ２＋ｂＦＧＦおよびウシ血清アルブミン(０.１ｍｇ/ｍl)中のフルオレセイン・イソチオシアネート(ニューロタグＴＭ)に結合させた組換えテタヌス毒Ｃ断片１０μｇ/ｍlと共に２時間インキュベートした。該細胞を洗浄した後に、ＢＨＳフィルター(４８８ＥＸ、５１５ＬＰ)を用いる以外はＢｒｄＵ染色細胞で記載したごとくバイオラド共焦点顕微鏡で検鏡した。
【００４７】
免疫組織化学　細胞を継代(継代３；平板培養後の培養４日目)し、２４ウェルプレートで増殖させ、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで、トリス緩衝化生理食塩水中の０.２５％のトリトン(Ｔriton)Ｘ-１００を浸透させた。１％正常ウマ血清(モノクローナル抗体用)または１０％正常ヤギ血清(ポリクローナル抗体用)の存在下、細胞をポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体と共に４℃にて一晩インキュベートした。洗浄した後に、細胞をビオチン結合ヤギ抗-ウサギＩｇＧまたはウマ抗-マウスＩｇＧ抗体(ベクター・ラボラトリーズ社(Ｖector Ｌaboratories)カリフォルニア州、バーリンゲーム(Ｂurlingame,ＣＡ))と共に室温にて１時間インキュベートし、続いてアビジン-ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(ベクタスタイン・エリート・エイビイシイ・キット(Ｖectastain Ｅlite ＡＢＣ kit))の予め形成させた混合物と共に室温にて１時間インキュベートした。該反応生成物をジアミノベンジジン(ＤＡＢ)組織化学で視覚化した。
【００４８】
　透過型電子顕微鏡(ＴＥＭ)　ラブテック(ＬabＴek)ＴＭパーマノックス・スライド(テッド・ペラ社(Ｔed Ｐella,Ｉnc.)、カリフォルニア州、レディング(Ｒedding,ＣＡ))上で増殖させた培養物(継代３；平板培養４日目)を、１００ｍＭのＰＯ４中の２％グルタルアルデヒド中、３７℃にて２時間固定し、次いで、濯いで、ＯｓＯ４の１％水溶液中で１時間室温にて後固定した。次いで、培養物を一連のエタノール濃度勾配中にて脱水し、アラルダイト樹脂で包埋し、イン・サイチューにて重合させた。それから培養細胞塊を切断し、樹脂空間に接着した重合樹脂からガラススライドを分離した。７０ｎｍの厚みで、該培養基材に対して平行に切片を切断した。３００メッシュ銅グリッド上に採取した切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、８０ｋＶにてフィリップス(Ｐhillips)ＣＭ１０透過型電子顕微鏡で検鏡した。
【００４９】
走査型電子顕微鏡(ＳＥＭ)　ラブテック・ガラススライド上で増殖させた培養物(継代２；平板培養後４日)をエタノール脱水を通してＴＥＭ用に調製した。次いで、シールガスケットを所定位置に残しつつプラスティックチャンバーを取り出して、該スライドをペルコ臨界点乾燥機(Ｐelco critical point dryer)中に置いた。乾燥させ後に、該スライドを金-パラジウムで被覆してテクニクス・スパッター・コーター(Ｔechnics sputter coater)中にて３００Åの厚みとした。１０ｋＶのケンブリッジ・ステレオスキャン(Ｃambridge Ｓtereoscan)３６０走査型電子顕微鏡で該細胞を検鏡した。
【００５０】
ニューロンへの遺伝子移入　約１×１０６個の産生細胞を６ウェルプレート中のＰＯＲＮ/ラミニン被覆ウェル上に平板培養し、５％ＣＯ２中、３７℃にて一晩増殖させた。５％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)または５％新生コウシ胎児血清(ＢＣＳ)を含有するＤＭＥＭ(ダルベッコの最小必須培地)中で一晩インキュベートさせた後に、産生細胞からのウイルスを採取した。ウイルスを含む培地を０.４５μｍのフィルターを通して濾過し、次いで、ポリブレン(８μｇ/ｍl)およびｂＦＧＦ(２０ｎｇ/ｍl)と混合した。ニューロン培養物から培地を除去し、ウイルスを含む培地をニューロン培養物に添加し、５％ＣＯ２中、３７℃にて一晩インキュベートした。この感染期間の後に該培地を除去し、２０ｎｇ/ｍlのｂＦＧＦを含有するＮ２培地で置き換えた。発現ベクターがネオマイシン抵抗性遺伝子を含む場合には、Ｇ４１８(４００μｇ/ｍl)の存在下にて感染細胞を選抜した。前記のごとく細胞を継代し、維持した。
【００５１】
用いた発現ベクターおよび産生細胞は以下の通りである：
１．トリｖ-ｍｙｃ遺伝子はＭＬＶ-ＬＴＲプロモーターから発現させ、細菌ネオマイシン抵抗性遺伝子はチミジンキナーゼ(ＴＫ)プロモーターから発現させた
(ライダー(Ｒyder)ら、ジャーナル・オブ・ニューロバイオロジー(Ｊ.Ｎeurobiol.)第２１巻:３５６-３７５頁、１９８９年；カプラン(Ｋaplan)ら、ジャーナル・オブ・ウイロロジー(Ｊ.Ｖirol.)第６１巻:１７３１-１７３４頁、１９８７年；およびランド(Ｌand)ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Ｍol.Ｃell.Ｂiol.)第６巻:１９１７-１９２５頁、１９８６年)。産生細胞系はΨ２細胞から得た。１０％ＦＣＳおよび４００μｇ/ｍlのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ中にてこれらの細胞を増殖させた。感染させる前日に、５％ＦＣＳを含有する新鮮なＤＭＥＭで培地を置き換えた。
【００５２】
２．細菌のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子はＭＬＶ-ＬＴＲプロモーターから発現させた。この発現ベクターは、ｇａｇ遺伝子の一部分を含み、非常に高い力価のウイルスを産生する。このベクター中にはネオマイシン抵抗性遺伝子がない。このベクターは、マサチューセッツ州、ケンブリッジのＭＩＴのリチャード、マリガン博士(Ｄr.Ｒichard Ｍulligan)から寄贈された。
【００５３】
　プロモーター系はＣＲＩＰ細胞から得た。これらの細胞を、１０％ＢＣＳを含有するＤＭＥＭ中にて増殖させた。感染の前日に、５％ＢＣＳを含有するＤＭＥＭで培地を置き換えた。
【００５４】
実施例２
イン・ビトロにおけるニューロンの増殖
　化学的に成分の明確な培地であるＮ２(ボッテンシュタイン(Ｂottenstein)およびサト(Ｓato)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第７６巻:５１４-５１７頁、１９８０年;ボッテンシュタイン,ジェイ・イィ(Ｂottenstein,Ｊ.Ｅ):「神経科学における細胞培養(Ｃell culture in the neurosciences)」中:ジェイ・イィ、ボッテンシュタイン(Ｊ.Ｅ.Ｂottenstein)およびジィ・エイチ、サト(Ｇ.Ｈ.Ｓato)編、プレナム・プレス社(Ｐlenum Ｐress)、ニュー・ヨーク州、ニュー・ヨーク(Ｎew Ｙork,Ｎ.Ｙ.)３-４３頁、１９８５);ジ・ポリゾ(di Ｐorizo)ら、ネイチャー(Ｎature)第２８８巻:３７０-３７３頁、１９８０年)は、実質的に純粋なニューロン培養物を短期間で再現性よく得るために用いられてきたものである(ボッテンシュタイン(Ｂottenstein)ら、エクスペリメンタル・アンド・セル・リサーチ(Ｅxp.Ｃell Ｒes.)第１２５巻:１８３-１９０頁、１９８０年;バーンズ(Ｂarnes)およびサト(Ｓato)、アナリティカル・バイオケミストリー(Ａnal.Ｂiochem.)第１０２巻:２５５-３０２頁、１９８０年)。この培地は、非ニューロン細胞の生存または増殖を支持せず、＞９５％純度のニューロン培養物を得ることができる。成分の明確な培地中では、海馬ニューロンの初代培養物は７日以内に死滅するが、星状細胞条件培地中の海馬外植体である星状細胞のフィーダー層の存在下(バンカー,ジイ・エイ(Ｂanker,Ｇ.Ａ.)、サイエンス(Ｓcience)第２０９巻:８０９-８１０頁、１９８０年)、またはｂＦＧＦの存在下(ワリック(Ｗalicke)およびベイアード(Ｂaird)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８３巻:３０１２-３０１６頁、１９８６年;ワリック,ピィ・エイ(Ｗalicke,Ｐ.Ａ.)ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス(Ｊ.Ｎeurosci)第８巻:２６１８-２６２７頁、１９８８年;ワリック(Ｗalicke)ら、プログ・ブレイン・レス(Ｐrog.Ｂrain Ｒes.)第７８巻中、ディイ・エム、ガッシュ(Ｄ.m.Ｇash)およびジェイ・アール、スラデク(Ｊ.Ｒ.Ｓladek)編(エルセビアー・サイエンス・パブリッシャーズ・ビイ・ブイ(Ｅlsevier Ｓcience Ｐublishers Ｂ.Ｖ.)３３３-３３８頁、１９８８年))では２-４週間維持できる。しかしながら、細胞は徐々に死滅し続け、１カ月後にはほとんど細胞が残存していない(ワリック,ピィ(Ｗalicke,Ｐ.)ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８３巻:３０１２-３０１６頁、１９８６年)。
【００５５】
　軸索の生存性および伸長性を実験(ワルック,ピィ(Ｗalicke,Ｐ.)ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・
ユーエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８３巻:３０１２-３０１６頁、１９８６年;ワリック,ピィ・エイ(Ｗalicke,Ｐ.Ａ.)、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス(Ｊ.Ｎeurosci.)第８巻:２６１８-２６２７頁、１９８８年)するために以前に用いられたたよりも約１００倍高い濃度である２０ｎｇ/ｍlのｂＦＧＦは、海馬細胞に対して顕著な増殖効果を示した。ｂＦＧＦのこの増殖特性を用いて、初代海馬細胞の連続した増殖を促進させて長期培養を形成させた。２０ｎｇ/ｍlのｂＦＧＦで培養した細胞は、２日までに増殖し始め、倍加時間は４日である。集塊中では増殖し続けるにも拘わらず、初代細胞は成長が接触阻止され、７日後にプラトーに達した(図２Ｃ)。
【００５６】
　分裂はすべての細胞で起こるかあるいは部分集団のみで起こるかあるかを試験するため、培養物をＢｒｄＵと共に１または４日間インキュベートし、抗-ＢｒｄＵ抗体を用いた間接免疫蛍光法によって、標識した核を視覚化した(図１Ａ、Ｂ)。
【００５７】
　図１は、培養物中の初代ニューロンのＢｒｄＵ染色性およびニューロ・タグＴＭ結合性を示す。初代ニューロンをＢｒｄＵで１日(Ａ)および４日間(Ｂ)の間標識した。１日目はわずかな細胞のみが染色されたが、４日目までに全細胞が染色され、これは培養物中の全細胞が増殖していることを示した。初代細胞のニューロンの性質は、テタヌス毒(ニューロタグＴＭ)との結合性により測定した(Ｃ)。培養物中の全細胞の細胞体および突起が染色された。補正バー＝２０μｍ。１日後に、小画分の細胞のみが免疫染色された(図１Ａ)が、ほぼ全ての細胞集団がＢrdＵとのインキュベート４日後に免疫染色された(図１Ｂ)。
【００５８】
　長期培養を確立するため、細胞をトリプシン処理し、継代した。(試験した６継代までの)継代細胞は、元の培養物と同程度に増殖した。細胞を液体窒素中で冷凍し、解凍して再度培養した。異なった継代数の細胞を解凍して再培養した場合、該継代数に関係無く等しく良好に増殖した。冷凍-解凍した細胞は、連続して培養し続けた細胞と同一の形態を示した。
【００５９】
　ニューロン組織由来の他の細胞についてもそれらの増殖能につき実験し、ｂＦＧＦの存在下のＮ２培地中で維持した。表１は、種々の細胞系の培養のためのｂＦＧＦの最適濃度を示す。
【００６０】
【表１】
2004121258.tif 000002
【００６１】
実施例３
細胞の特徴付け
　幾つか独立した基準を用いて、培養物中の細胞が実際にニューロンであることを示した。これらには、増殖中のそれらの形態特性、ニューロンマーカーの発現性および透過型電子顕微鏡および走査型電子顕微鏡による超微細構造分析が含まれる。
【００６２】
　培養物中の細胞形態は、ニューロンの短期培養に記載されたものと同様であった(バンカー(Ｂanker)およびコーワン(Ｃowan)、ブレイン・リサーチ(Ｂrain Ｒes.)第１２６巻:３９７-４２５頁、１９７７年;バンカー(Ｂanker)およびコーワン(Ｃowan)、ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ニューロロジー(Ｊ.Ｃomp.Ｎeurol.)第１８７巻:４６９-４９４頁、１９７９年)(図２Ａ、Ｂ、Ｃ)。図２は、初代ニューロンの培養および継代の間に起こる形態変化を示す光学顕微鏡写真を図示する。Ａは、多数の増殖細胞および突起を出した細胞を含有するＮ２＋ｂＦＧＦ中の平板培養４日後の初代細胞培養物を示す。Ｂは、継代(継代３)４日後の培養物中の初代細胞を示す。細胞はより大きく、やはり大きさが増大した突起によって相互連結していた。小さな増殖細胞が培養物中に観察された。Ｃは、継代(継代３)し、ｂＦＧＦの存在下で〜１４日間培養を維持した細胞が集塊を形成し、かつ格子型模様を形成する突起の伸長したネットワークにより相互連絡したのを示す(ネガティブにて倍率　３３×)。
【００６３】
　幾つかの異なった抗原マーカーにつき細胞を免疫染色した。細胞を抗-ＮＦ(２００ＫＤ)抗体(Ｄ)；抗-ＮＳＥ抗体(Ｅ)または抗-ＧＦＡＰ抗体(Ｆ)で染色した。全細胞が抗-ＮＦまたは抗-ＮＳＥ抗体で染色されたにも拘わらず、抗-ＧＦＡＰ抗体で染色された細胞はなかった(ネガティブにて倍率　３３×(Ｄ、Ｅ)；６６×(Ｆ))。
【００６４】
　細胞は２日目までには増殖し始め、新たに発生した細胞は小さく、形状は二極性であった。細胞体に大まか等しい長さの短い突起が親細胞から出現し始めた。次ぎの２-３日にわたって、１もしくは２個の突起が急速に接触し始め、近隣の細胞と連結し始めた(図２Ａ)。７日目までには細胞体および突起が共にサイズが増大し、突起の伸長した相互連結ネットワークが形成された。この形態的進行は、イン・ビトロにおいて以前に記載されている海馬錐体ニューロンの形態(バンカー(Ｂanker)およびコーワン(Ｃowan)ウレイン・リサーチ(Ｂrain Ｒes.)第１２６巻:３９７-４２５頁、１９７７年;バンカー(Ｂanker)およびコーワン(Ｃowan)ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ニューロロジー(Ｊ.Ｃomp.Ｎeurol.)第１８７巻：４６９-４９４頁、１９７９年)に似ていた。１-２週間の培養物中で増殖する細胞を継代した場合、これら細胞の多くが、脳から新たに培養した細胞より突起を多く有していた(図２Ｂ)。たとえ部分的には脱落するとしても、これら突起の多くを継代で生存させることが可能である。ｂＦＧＦの存在下にて継代し、１４日間培養を維持した細胞は集塊を形成し、格子型模様を形成する突起の伸長したネットワークによって相互連結していた(図２Ｃ)。
【００６５】
　異なった抗原マーカーについての免疫染色により該培養物を特徴付けした(図２Ｄ、Ｅ、Ｆ；表１)。すべての細胞体およびそれらの突起が、ニューロンにより特異的に発現されるＮＦ蛋白質に対する抗体で強く免疫染色された(図２Ｄ)。同様に、抗-ＮＳＥ抗体も本発明者らの培養物においてすべての細胞を染色した(図２Ｅ；表１)。ｂＦＧＦに反応して増殖する細胞のニューロン特性を、ニューロンについての特異的マーカーであるテタヌス毒の結合性によりさらに証明した(ニール(Ｎeale)ら、ソック・ニューロサイ・アブスト(Ｓoc.Ｎeurosci.Ａbst.)第１４巻：５４７頁、１９８８年)。培養物中のすべての細胞の細胞体および突起がニューロタグＴＭ-グリーンで染色されたこと(図１Ｃ)は、当該細胞がニューロンであって、培養物中には全くもしくはほとんど非-ニューロン細胞が存在しないことを示した。用いた対象物の視野の大きな光学深度(１０×)により、膜結合物としてのニューロタグＴＭシグナルの局在性は証明できなかった。
【００６６】
　培養物を、非ニューロン細胞の存在につき免疫染色により試験した(表２)。ＧＦＡＰに対する抗体で免疫染色されないことは、星状膠細胞が存在しないことを示していた(図２Ｆ)。対照実験において、同一濃度(１:１０,０００)の抗-ＧＦＡＰ抗体(アマーシャム社(Ａmersham))でラットＣ６および９ＬならびにヒトＵ３７３神経膠腫細胞を免疫染色した。本発明者らの培養物には乏突起膠細胞および繊維芽細胞が存在しないことが、ＧalＣ、ビメンチンまたはフィブロネクチンにつき染色されないことによって証明された(表２)。対照としてラットＣ６、９ＬおよびヒトＵ３７３神経膠腫細胞を、ニューロン培養で用いたのと同一濃度のビメニン(１:８００)で染色した。他の抗原マーカーについての免疫染色性の結果を表２に示す；これらのデータは、培養物が非ニューロン細胞により汚染されていないニューロンよりなるという結論を支持する。
【００６７】
【表２】
2004121258.tif 000003
【００６８】
実施例４
イン・ビトロにおける不滅化ニューロンの分析
　培養物中の初代ニューロンの超微細構造レベルでの分析によって、これらの細胞の組織型ニューロン形態が、以前の超微細構造実験のもの(バートレット(Ｂartlett)およびバンカー(Ｂanker)、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス(Ｊ.Ｎeurosci.)第４巻:１９４４０-１９４５３頁、１９８４年;ロスマン(Ｒothman)およびコーワン(Ｃowan)、ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ニューロロジー(Ｊ.Ｃomp.Ｎeurol.)第１９５巻:１４１-１５５頁、１９８１年;ピーコック(Ｐeacock)ら、ブレイン・リサーチ(Ｂrain Ｒes.)第１６９巻:２３１-２４６頁、１９７９年)と同一であることが証明された。図３は、培養物中の初代ニューロンの透過型電子顕微鏡写真を示す。Ａは、細胞体ならびに主頂端突起(矢印)および細径突起(矢印根元)を含む突起の双方を示している錐体型第一海馬ニューロンを示す。バー＝１０μｍ。Ｂは、パネルＡで示したニューロン細胞体の拡大図を示す。バー＝１μｍ。Ｃは、パネルＡで示したニューロンの主頂端突起の一部分を示す。この突起は、それを初代樹状突起として同定する微小管およびポリソーム・リボソームにより特徴付けられる。バー＝１μｍ。Ｄは、２個のニューロン突起間の接触を示す。バー＝０.１μｍ。
【００６９】
　良好に分化したニューロンは、複数の樹枝を有する初代の先端樹状突起、細径軸索および特徴的な核形態を含む組織型錐体形態を示す(図３および４)。錐体形状の初代海馬ニューロンのＴＥＭ顕微鏡写真を図３Ａに示す。この切片レベルは、体細胞ならびに主頂端突起(矢印)および該体細胞の基底層から出現した細径突起(矢印根元)を含む突起の双方を包含している。隣接ニューロンからの他の突起も認められる。
【００７０】
　該ニューロンの体細胞は、ヘテロクロマチンの辺縁および幾分網状の核小体を有するユークロマチン核を有する(図３Ｂ)。ミトコンドリアおよび微小管は、ロゼット型のポリソーム・リボソームが多い核周部細胞質に存在する。ニューロンの主頂端突起の一部分は、それを初代樹状突起として同定する微小管およびポリソーム・リボソームが多い(図３Ｃ)。２個のニューロン突起間の接触を図３Ｄに示す。ミトコンドリア、微小管および液胞を含有する大きな突起は、細径突起から発生する膨張したボタン様の構造物によって接触している。かかる突起の間の結合点は、典型的に、この齢の培養物でははっきりせずかつ未熟である。接触サイトにおける膜は均一に平行のようであるが、シナプス構造のさらなる集合体の示唆はほとんどない。ボタン様突起末端の内容物は、不明瞭であり、液胞の蓄積物のようであるが、接触サイトの付くには恐らく被覆された液胞がある。
【００７１】
　図４は、培養物中の初代ニューロンの走査型電子顕微鏡写真を示す。Ａは、複数レベルの分岐を含む大きな突起を有する良好に分化した錐体型細胞体(矢印)および大きな伸長した突起を有する分化の低い丸いニューロン(矢印根元)を含む培養物中の初代海馬ニューロンの全体図を示す。バー＝５０μｍ。Ｂは、恐らくは第一分岐から出現した軸索である幾つかの小さな突起を有する第一(主な)分岐の側近に滑らかで規則正しい径の突起を示す良好に分化した錐体型ニューロンから出現した主頂端樹状突起を示す。ＰＯＲＮ/ラミニン被覆容器の表面は、幾分斑点が欠けている多孔性カーペットのように見える。バー＝２μｍ。Ｃは、(図３Ａに比して)大きな錐体型細胞体、および他のニューロンからの多数の突起により接触した大きな頂端樹状突起(矢印根元)を保有する(視野中央の)良好に分化したニューロンを示す。分裂の過程で固定された他の未分の低いニューロンも存在した(矢印)。バー＝２０μｍ。Ｄは、パネルＣの図の上方視野における分裂中のニューロンの拡大図を示す。細胞分裂が明らかに起こっているにも拘わらず、２個の娘細胞成分を連結する膜が明らかに連続している。この分化の低いニューロンからの突起の伸長が、有糸分裂の間のある程度の分化を示していることを注記する。バー＝１０μｍ。
【００７２】
　培養物中の初代海馬ニューロンの走査型ＥＭは、複数レベルの分岐を示す大突起を伸長する幾つかの良好に分化した錐体体細胞および幾つかの分化の低い丸いニューロンがあり、形態の多様性の存在を示した。これらの丸いニューロンでさえ大きな伸長した突起を有する(図４Ａ;矢印根元)。良好に分化したニューロンから発生した主要樹状突起のさらに詳細な検鏡は、鋭利な分岐を有する大径突起を示す(図４Ｂ)。数多くの小径で軸索様の突起が、これらの主頂端樹状突起から発生しているところが認められる(図４Ｂ)。良好に分化したニューロンは、典型的には、大きな錐体体細胞を有する(図３Ａに比しての図４Ｃ)。分化の低いニューロンを検鏡した場合には、これらの多くが分裂の過程で固定されたのが認められる(図４Ｃ；矢印)。分裂中のニューロンのさらに詳細な図は、細胞分裂が明らかに起きているにも拘わらず、２個の娘細胞成分を連結する膜が明らかに連続していることを示している。右側の娘細胞成分は細直径のおそらく軸索である突起を前方に伸長している。この成分から視野の右上に伸長しているのは、もう一つの太い、幾つかのレベルで分岐している樹状様突起である。
【００７３】
　以前の超微細構造の報告(バンカー(Ｂanker)およびコーエン(Ｃowen)、ブレイン・リサーチ(Ｂrain Ｒes.)第１２６巻:３９７-４２５頁、１９７７年;バンカー(Ｂanker)およびコーエン(Ｃowen)、ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ニューロロジー(Ｊ.Ｃomp.Ｎeurol.)第１８７巻:４６９-４９４頁、１９７９年;２９　ロスマン(Ｒothman)ら、ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ニューロロジー(Ｊ.Ｃomp.Ｎeurol.)第１９５巻：１４１-１５５頁、１９８１年))とは対照的に、不滅化ニューロンは、樹状起源に加えて組織型様式で体細胞から出現する細径軸索突起を有していた(図３Ａおよび４Ｄ)。これらの体細胞軸索の伸長は、高レベルの栄養因子の支持の結果であろう。分化の低いニューロンは、典型的に、わずかのほとんど同化していない突起を有する丸い体細胞を有していた。丸いニューロンでさえ突起を伸長するのに十分に分化しており、増殖できるようであった(図４Ｄ)。超微細構造の表面形態およびオルガネラ内容物の両方に基づいてニューロンの突起および体細胞が同定されたことは、良好に分化した細胞および増殖し分化の低い細胞の両方がニューロンであることを明らかに証明している。
【００７４】
実施例５
細胞培養に対する異なった成長因子の影響
　中枢神経系(ＣＮＳ)の特定領域から摘出した組織を、実施例１に記載したごとく解離させた。遠心した後に、細胞をＮ２培地に再懸濁し、細胞を計数した。約０.５-１.０×１０６細胞を、該ＣＮＳの特定領域に応じて、異なる濃度の異なる成長因子を含有するＮ２培地を入れたＰＯＲＮ/ラミリン被覆２４ウェルプレート上に平板培養した。細胞は、５％ＣＯ２下、３７℃にてインキュベートした。細胞を調べ、要すれば、１、４および７日目にウェル中の５ヶ所の別々の領域で計数して、種々の成長因子の存在下における増殖率を測定した(表３)。
【００７５】
　幾つかの実験において、ある種の成長因子の存在下では細胞の増殖が認められなかった。幾つかの場合において、小細胞集団は４日目まで生存したにも拘わらず、かなりの細胞死滅があった。これらの生存細胞は健全に見えなかったが、(組織の起源に依存して)２０-１００ｎｇ/ｍlのｂＦＧＦをＮ２培地中に添加すると、この増殖により明らかなごとくこれらの生存細胞を救出した(表３参照)。
【００７６】
【表３】
2004121258.tif 000004
【００７７】
実施例６
成体ニューロン培養物の調製
　正常な成体フィッシャー(Ｆisher)ラットの海馬を摘出し、実施例１に記載したごとくｂＦＧＦを含有する無血清培地中にて増殖させた。簡単に述べると、海馬を正常な成体(＞３ヶ月)ラット脳から摘出した。脈絡集網、上衣ライニングおよび亜上衣領域のうちのほとんどを取り出した。パパイン-プロテアーゼ-ＤＮアーゼエ(ＰＰＤ)溶液(４ｍＭのＭｇＳＯ４および０.０１％のパパイン、０.１％の中性プロテアーゼおよび０.０１％のＤＮアーゼエを補充したハンクスバランス塩溶液)中で酵素的に解離した後に、細胞を１０００ｇで３分間遠心し、ＤＭＥＭ：Ｆ１２(１;１)の高グルコース培地(アーバイン・サイエンティフィック社(Ｉrvine Ｓcientific))+１０％ウシ胎児血清(１０％ＦＢＳ)(シグマ社(Ｓigma))１ｍl中に再懸濁し、トリチュレートするという就職を施し、以前に記載されている方法を用いて細胞を機械的および酵素的に解離した。１０％ＦＢＳ培地を入れたフラスコ当たり１×１０６生細胞にて、細胞を非被覆プラスチックＴ-７５培養フラスコ(コスター社(Ｃostar))上に一晩平板培養した。小さな培養フラスコまたはラブ-テック・スライド・チャンバー(ナンク社(Ｎunc))には低細胞密度を用いた。場合によっては、実施例１に記載したごとくポリオルニチン/ラミニンで予め被覆したカルチャーウェア(cultureware)上に細胞を平板培養した。翌朝、該培地を取り出し、１ｍl/１００ｍl培地(Ｎ２)のＤＭＥＭ:Ｆ１２＋Ｎ２(ギブコ社(GIBCO))＋２０ｎｇ/ｍlのｂＦＧＦ(組換えヒトｂＦＧＦ(シンテックス/シナージェン・コンソルティウム社(Ｓyntex/Ｓynergen Ｃonsortium)；(レイ(Ｒay)ら、前掲)))である無血清培地で置き換えた。フラスコを１-３週間インキュベートし、その時点で培地の半分を除去し、同容量の新鮮なＮ２＋ｂＦＧＦで置き換えた。部分的な培地の交換は、１-２週間毎または必要に応じて行った。位相差顕微鏡(ニコン-ダイアホット社(Ｎikon Ｄiaphot))を用いて培養物を検査し、写真撮影した。
【００７８】
　多数の実験において、細胞を採取し、それらがそこで直ちに付着し増殖し始める新たなフラスコまたはラブ-テック・スライド・チャンバーに直接移すか、または、場合によっては、ＡＴＶトリプシン(アーバイン・サイエンティフィック社(Ｉrvine Ｓcientific))でのトリプシン処理を用いて継代し、次いで水洗し、遠心してＮ２＋ｂＦＧＦで再度平板培養した。
【００７９】
　成体ラット海馬からのニューロンの初代培養物は１５回を超えて複製させた。１０％ＰＢＳまたはＮ２培地のいずれ観察された効果を説明するかを決定するために、幾つかの培養物を１０％ＦＢＳまたはＮ２中で増殖させた。ｂＦＧＦを用いた培養物のみが多数のニューロンを生じた。ＣＡ１、ＣＡ３および歯状回領域の幾つかの切片を作製した。全３領域からニューロンが発生した。培養物は、３つの重複する時間段階：初期、中期および後期で表す。
【００８０】
　初期培養物(１-２１日)は、基体に対する細胞付着性、成体ニューロンの特徴である細胞増殖および発現により特徴付けられた。該培地中の細胞夾雑物を除去した後に、細胞分裂を示す、相の明白な丸い単一の細胞および二重の細胞が、イン・ビトロ２日目(d.i.v.)に認められた。相の明白な多数の細胞体が、成長円錘を有する先端に突起を示した。ニューロン形態の細胞、すなわち、細い分岐突起を有する相の明白な多極性細胞体が５d.i.v.に認められた。複雑な分岐パターンを表す突起ならびに不完全な細胞分裂または推定される姉妹ニューロン間の潜在的なシナプス形成の証拠が、８d.i.v.に認められた(ニコン位相差-２顕微鏡/ネガティブにて倍率 ３３×-６６×)。
【００８１】
　ＳＥＭについては、０.１ＭのＰＢＳ中の２％グルタルアルデヒドで培養物を固定し、１％四酸化オスミニウム水溶液中でオスミニウム処理し、一連のエタノール勾配中で脱水処理し、液体二酸化炭素で臨界点乾燥し、銀ペーストを載せたスタブに付着させ、金/パラジウムで３００Åにスパッタリング被覆して、ケンブリッジ型(Ｃambridge)走査型電子顕微鏡(ステレオスキャン(Ｓtereoscan)３６０)で検鏡し写真撮影した。
【００８２】
　走査型電子顕微鏡(ＳＥＭ)を用いた初期/中期段階の培養物の三次元形態の検鏡により、ニューロン細胞および上皮様細胞の両表現型の多くの細胞が明らかとなった。位相差顕微鏡を用いると、レース状の神経ネットワークが認められた。分裂しているらしい細胞も認められた。さらに高拡大すると、光学顕微鏡レベルでは１個の突起であると解釈されていた細胞間の突起および細胞集塊が、しばしば２またはそれを超える束生突起(fasciculated process)であることが明らかとなった。
【００８３】
　中期培養物(約１４-６０日)は、細胞数の増加、神経芽細胞ネットワークの存在、成体ニューロンの進展および初期細胞集塊物の形成によって特徴付けられた。小さな細胞クラスターを連結する細突起の未発達ネットワークが、１４d.i.v.もと早期に認められた。ニューロン形態を示す細胞のネットワークはさらに広範かつ複雑となった。神経ネットワークのここの斑は均一な形態表現型を示すが、培養物中の細胞は不均一であった。クラスターまたはネットワークから離れた個々の細胞も、大きな相の明白な多極性細胞体および繰り返し分岐する長く細い突起を有する成体ニューロンに特徴的な良好に分化した形態特徴を呈した。これらの細胞の突起は、しばしば１０００μｍ近くのものが測定され、異なった焦平面において大きなくぼんだ(indented)核および突起した(prominent)核小体が認められた。幾つかのニューロンは、突起上の樹状突起棘とは区別できない小さな棘様突出物を示していた。
【００８４】
　後期培養物(約２ないし７ヶ月)は、密集する細胞数の増加、突起によって連結する細胞集塊および個々の細胞のバックグラウンドの増加によって特徴付けられた。基体空間が利用できる場合には、初期段階に特徴的な複数の細突起を有する細胞が連続的に観察認された。細胞集塊はケーブル様の神経突起によって連結していた。多数の細胞集塊が発達し、基体全体が細胞集塊および該細胞集合から移動したと考えられる個々の細胞で覆われるようになった。多くのバックグラウンド細胞がニューロンに典型的な特徴を示す一方、幾つかの細胞は星状膠細胞に典型的な特徴を示した。
【００８５】
実施例７
培養ニューロン細胞における遺伝子発現
　ＮＦｈおよびＧＦＡＰの存在は、異なった培養期間後に採取した細胞から得たＲＮＡでの逆転写酵素-ポリメラーゼ鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)によりさらに確認した。　ＲＮＡはグアニジニウム-塩化セシウム(ＣｓＣl)法を用いて抽出した(「分子生物学における最近のプロトコール(Ｃurrent Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiolo-gy)」第１巻、ウイリー・インターサイエンス(Ｗiley Ｉnterscience)ニュー・ヨーク(ＮＹ)、エフ・エム、アウスベル(Ｆ.Ｍ.Ａusubel)ら編、１９８８年)。解凍した後に、該ペレットを１ｍlの溶液Ｄ(４.０Ｍのグアニジンイソシアネート、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０.５％のサルコシルおよびＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ)に可溶化し、穏やかにトリチュレートし、細胞溶解物を予め遠心管に注入したＣｓＣlに移した。ＣｓＣlのレベルに印を付け、該管の重量を測定し、平衡化した。ベックマン(Ｂeckman)超高速遠心機で該管を、４０,０００rpm、２０℃にて一晩遠心した。翌朝に、溶液Ｄを除去し、溶液Ｄで界面を洗浄した。ＣｓＣl溶液を注意深く取り出し、該ＲＮＡペレットを(ＤＥＰＣ水で作製した)７０％ＥtＯＨで濯いだ。該ペレットが乾燥した後に、それをＤＥＰＣ-Ｈ２Ｏ中に可溶化し、残りを-７０℃のＥtＯＨ中にて保存した。
【００８６】
　ＲＴ-ＰＣＲ法を用いてｃＤＮＡを得た(アウスベル(Ａusubel)ら、１９８８年、前掲)。該反応管には、４μlのＲＮＡ(１０-１００ｎｇ)、８μl(バランス量のＤＥＰＣ-Ｈ２Ｏで容量を２０μlとする)、２μlの１０×ＰＣＲ緩衝液、２μlの１０ｍＭ ｄＮＴＰ類、１μlのランダムヘキサマー、３μlの２４ｍＭ ＭｇＣl、０.１２５μlのＡＭＶ-ＲＴおよび０.５μlのＲＮエーシンが含まれていた。各管に１滴のヌジョール鉱油を添加し、パーキンエルマー・サーマル・サイクラー(Ｐarkin Ｅlmer Ｔhermal Ｃycler):４２℃-７５分；９５℃-１０分；次いで４℃に固定して反応を進行させた。
【００８７】
　ＰＣＲ法を用いて、特別に望むｃＤＮＡを前期のごとく得たｃＤＮＡからさらに増幅させた。各反応管には、５μlのｃＤＮＡ、９.５μlのＰＣＲ緩衝液、７.２５μlのＭｇＣl２、０.２もしくは０.３μlの３２Ｐ-ｄＣＴＰ、１.５μlの１０ｍＭ ｄＮＴＰ類、０.５のタック・ポリメラーゼ、６μlのプライマー(２μl[１μl(Ｆ(フォワード・アールエックス(Ｆow〓rd rx):５')＋１μlのＲ(逆転写:３')各ＲＰＬ２７、ＮＦｈ、ＧＦＡＰ、ＮＧＦもしくはｂＦＧＦ)が含まれ、バランス量のＨ２Ｏで容量を１００μlとした。該反応は、パーキンエルマー・サーマル・サイクラー：９４℃-１０分、次いで４℃に固定して進行させた。
【００８８】
　アンプリタック(ＡmpliＴaq)ＤＮＡポイメラーゼはパーキンエルマー社から、ＡＭＶ-逆転写酵素、ランダム・オリゴヌクレオチド・ヘキサマー・プライマーおよび組換えＲＮエーシン・リボヌクレアーゼ阻害剤はプロメガ社(Ｐromega)から、特異的なプライマーは注文して入手した。ｄＮＴＰはニュー・イングランド・ニューキュラー社(Ｎew Ｅngland Ｎuclear)から入手した。該プライマーは以下の通りである：
【００８９】
【化１】
2004121258.tif 000005
【００９０】
　ＰＣＲ増幅から得たｃＤＮＡ試料のゲル電気泳動は、６％非変性ポリアクリルアミドゲル上で行った。幾つかの試料およびそれらの対応する分解物は、エチジウムブロマイドを用いたアガロースゲル上で泳動させて、ＤＮＡを結合させ、ＵＶ光を照射した。該試料の側のレーンにおいて、１２３ｂｐの分子量マーカーを泳動した。種々の時間で電気泳動を行い、得られたゲルをゲルドライヤー上で１時間乾燥した。乾燥したアクリルアミドゲルのオートラジオグラフ・フィルムは、数時間から１０日間までの範囲の時間感光させた。
【００９１】
　３６日から１１７日増殖させた培養物のノザンブロットからＮＦｈ、ＧＦＡＰ、ＮＧＦ、ｂＦＧＦとして同定したｃＤＮＡバンドにわたり、デンシトメトリーを用いて定量的にｍＲＮＡの相対レベルを分析した。ｍＲＮＡ発現の多様なパターンは明らかであった。ＮＦｈについてのメッセージ発現は比較的低かった。約２ヶ月後、相対レベルが転換してＧＦＡＰに対するｍＲＮＡの発現が経時的に上昇し、次いで培養約４ヶ月後に劇的に低下した。一方、ＮＦｈの発現は経時的に低下し、次いで培養４ヶ月後にわずかに上昇した。
【００９２】
　ＮＦｈの消化は、４０μlの試料、５μlの反応(Ｒeact)＃６緩衝液(５０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７.４、６ｍｍのＭｇＣl２、５０ｍＭのＫＣl、５０ｍＭのＮａＣl)および５μlのＰvuII制限酵素よりなるカクテルを用いて、初期反応の残りの試料に対して行い、３７℃にて１時間反応させた。該生成物を１２３ｂｐ分子量マーカーに沿って６％アクリルアミドゲル上で泳動させた。ゲルを乾燥させ、異なった時間フイルム上に暴露し、予想分子量レベルのバンドにつき、得られたオートラジオグラフを検査した。ＮＦｈおよびＧＦＡＰの両方に対するｍＲＮＡが、検査した時間の全培養物に存在した。
【００９３】
実施例８
免疫細胞化学
　神経組織に典型的な抗原を細胞が発現するか否かを確認するために、培養物を免疫細胞化学用に加工した。細胞を、室温もしくは３７℃にて４％パラホルムアルデヒド中で３０分間固定し、ＴＢＳ中の０.６％Ｈ２Ｏ２と共にインキュベートし、続いてブロッキング溶液中でインキュベートした。該培養物を、適当な希釈率の一次抗体と共に４℃にて一晩インキュベートした。翌日、細胞を希釈液で濯ぎ、二次抗体と共に室温にて１時間インキュベートし、ＴＢＳで濯ぎ、ＡＢＣ溶液(等量のアビジンおよびビオチン)中で室温にて１時間インキュベートした。それらをＴＢＳで濯ぎ、ＤＡＢ-ＮiＣlと共に種々の反応時間インキュベートし、ＴＢＳで濯ぎ、一晩乾燥し、一連のアルコール勾配を通して脱水処理し、ヒストクリアー(histoclear)中に設置した。抗体は以下に示した起源のものであり、以下に示した希釈率にて用いた。モノクローナル抗体：ニューロフィラメント蛋白質の高分子量サブユニット(ＮＦ-Ｈ ２００ｋＤ;１:２４)；ニューロフィラメント蛋白質の中分子量サブユニット(ＮＦ-Ｍ １６０;１:１０)；膠フィラメント酸性蛋白質(ＧＦＡＰ；１:１００)およびシナプトフシン(１:１０)(ベーリンガー・マンハイム社(Ｂoehringer Ｍannheim));カルビンジン(Ｃal-b；１:２００)および微小管結合蛋白質２(ＭＡＰ２；１:５００)(シグマ社(Ｓigma));ニューロン特異的エノラーゼ(ＮＳＥ；１:２００)(ダコ社(ＤＡＫＯ))。ポリクローナル抗体:ＮＦ-Ｈ ２００(１:２５０);ＮＦ-Ｍ １５０(１:５００)；ＮＦ-Ｌ ６８(１:１２５);ＧＦＡＰ(１:１０００)およびガンマ-アミノ酪酸(ＧＡＢＡ；１:２００)(ケミコン社(Ｃhemicon))；ＮＳＥ(１：８００)(ポリサイエンシーズ社(Ｐolysciences))；ガラクトロセレブロシド(Ｇal-Ｃ；１:５０００)(アドバンスド・イムノ・ケム社(Ａdvanced Ｉmmuno Ｃhem.))；ｂＦＧＦ(１：１０００);(ウィター・インスティチュート社(Ｗhittier Ｉnstitute)、カルフォルニア州、ラ・ジョーラ(Ｌa Ｊolla,ＣＡ))。正常ウマおよびヤギ血清、ビオチン化ヤギ抗-ウサギＩgＧ、ウマ抗-マウスＩgＧおよびＡＢＣベクタステイン・エリートキット(Ｖectastain Ｅlite kit)は、ベクター・ラボラトリーズ社(Ｖector Ｌaboratories(カリフォルニア州、バーリンガム(Ｂurlingame,ＣＡ)))から入手した。一次抗体を省略したり、非免疫血清で置き換えた場合には、染色は検出されなかった。
【００９４】
　初期培養物においてニューロン-特異的エノラーゼ(ＮＳＥ)-陽性細胞が認められた。１７０d.i.v.までに、成体ニューロンに特徴的である高分子量ニューロフィラメント蛋白質(ＮＦｈ、２００ｋＤ)、ならび中分子量および低分子量のＮＦに対して、ほとんどの細胞が免疫反応性であった。ほとんどのＮＦ-陽性細胞も、ニューロンの形態特性を有していた。小亜集団の細胞(１０％未満)が、顆粒細胞に特異的なカルビンジンに対して免疫陽性であった。ニューロン表現型を有する細胞も、細胞体および頂端突起の細胞質に局在する反応生成物を有するＭＡＰ２に対して免疫陽性であった。星状膠細胞の形態を有する細胞は、ＧＦＡＰに対して染色された。１％未満の細胞がＧＡＢＡに対して染色された。多くの細胞がｂＦＧＦに対して免疫陽性であり、わずかな小さく丸い細胞がガラクトセレブロシドに対して免疫陽性であった。
【００９５】
実施例９
イン・ビトロにおけるニューロン細胞増殖性の特徴付け
　細胞が増殖するか否かを確認するため、もしそうである場合にはかかる細胞型の性質を評価するために、培養物をブロモデオキシウリジン(ＢrdＵ)中にて３６時間インキュベートし、次いで、ＢrdＵおよびニューロン特異的エノラーゼ(ＮＳＥ)もしくは膠フィラメント酸性蛋白質(ＧＦＡＰ)での免疫蛍光のために二重標識した。
【００９６】
　ＢrdＵ取込みには、細胞をガラス製のラブ-テック・スライド・チャンバー中にて１１日間培養した。ブロモデオキシウリジン(ＢrdＵ)標識試薬(１μl/ｍl培地；アマーシャム社(Ａmersham))を含む新鮮なＮ２＋ｂＦＧＦで該培地を置き換え、該培養物をさらに１もしくは４日間(合計１２もしくは１５日間)インキュベートした。細胞を、リン酸緩衝液生理食塩水(ＰＢＳ)中の４％パラホルムアルデヒド中にて３０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の１０％の正常ロバ血清(ジャクソン・イムノリサーチ・ラボズ社(Ｊackson ＩmmunoＲesearch Ｌabs))でブロッキングし、ＢrdＵに対するモノクローナル抗体(ＢrdＵ；未希釈液；アマーシャム社(Ａmersham))、続いてＣy-５にカップリングさせたロバ抗-マウスＩgＧ抗体(ジャクソン・イムノリサーチ・ラボズ社(Ｊackson ＩmmunoＲesearchＬabs))と反応させた。幾つかの培養物は、ニューロン特異的エノラーゼ(ＮＳＥ;１:８００)に対するポリクローナル抗体もしくは膠フィラメント酸性蛋白質(ＧＦＡＰ；１：１０００)に対する抗体で二重標識された。該ポリクローナル抗体に対する二次抗体は、フルオレセイン・イソチオシアネート(ＦＩＴＣ；ジャクソン・イムノリサーチ・ラボズ社(Ｊackson ＩmmunoＲesearch Ｌabs))に結合させたロバ抗-ウサギＩgＧ抗体であった。スライドをスロー-フェード・マウンティング(Ｓlow-Ｆade mounting)試薬(モレキュラー・プローブス社(Ｍolecular Ｐrobes))に設置した。バイオラド・ＭＲＣ６００・共焦点走査型レーザー顕微鏡を用いて細胞を視覚化した。画像を採取し、アップル社(Ａpple)マッキントッシュ・クアドラ７００(Ｍacintosh Ｑuadra 700)に移して、アドーブ・フォトショップ(Ａdobe Ｐhotoshop)２.０１を用いて合成し、ＧＣＣフィルム・レコーダー上に印刷した。
【００９７】
　共焦点走査型顕微鏡により、ＮＳＥおよびＢrdＵに対して免疫反応性である細胞、ならびにこれらの培養物中で分裂しているニューロン・マーカーおよび神経膠細胞マーカーを細胞が発現していることを示すＢrdＵおよびＧＦＡＰ陽性細胞が明らかとなった。
【００９８】
　培養物中の細胞数が増加しているのか否かを確認するために、１０ヶ所のランダムなIVやにおいて２週間にわたり細胞を計数した。元来付着していた細胞の３７％が、培養２日目まで生存していた。５日以内に細胞数がその元来のレベルより僅かに増加し、７日目の最後までにほぼ２倍の細胞数となった。２週間の最後までに、培養初日に比してほぼ５倍の細胞数となった。
【００９９】
　この実験の最も重要な結果は、ｂＦＧＦで培養した場合に正常な成体海馬からのニューロンが増殖することが証明された点にある。２００d.i.v.を超える長期にわたり、ニューロンが生存し、かなり増殖した；これは最初のかかる証明である。
【０１００】
　培養物中の単離した成体脳の(線条)細胞の細胞分裂の開始には上皮細胞成長因子(ＥＧＦ)を要するが、２０ｎｇ/ｍlのｂＦＧＦおよび非粘着基体を要しないことが報告されている(レイノルズ(Ｒeynolds)およびワイス(Ｗeiss)、サイエンス(Ｓcience)第７５５巻:１７０７頁、１９９２年)。対照的に、今回のデータは：１）２０ｎｇ/ｍlのｂＦＧＦが、成体ならびに胎児の海馬培養物において、強力な細胞分裂促進剤および生存因子として作用すること；２）基体結合細胞および集塊、すなわち懸濁していない細胞において増殖が起こること、ならびに３）ほとんどではないにせよ多くの付着する細胞がｂＦＧＦ反応性であること、を支持する。
【０１０１】
　限定されたニューロン分裂が、成体脳の他の培養系において短期にわたり報告されている(レイノルズ(Ｒeynolds)、前掲；リチャーズ(Ｒichards)ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８９巻：８５９１頁、１９９２年)。今回の実験において、ＢrdＵの取込みおよび２週間にわたりほぼ５００％も細胞数が増加するという知見により増殖性が確認された。最初に平板培養した１％未満の成体線条細胞が増殖するということが報告されている(レイノルズ(Ｒeynolds)ら、前掲)が、本明細書に記載した培養においては、最初に付着した細胞の４０％近くが培養２日目まで生存していることは、多くの細胞が増殖能を有する成体海馬中に存在することを示している。
【０１０２】
　幾つかの独立した実験の証拠は、これらの培養物中のほとんどの細胞がニューロンであることのみならず、成体ニューロンに特徴的な形態学的、生化学的および分子的な特徴を発現する成体ニューロンでもあるという考えを支持している。神経膠細胞も発生するが、神経膠細胞は、ほとんどの培養物において少数の表現型であった。同様な知見が、ｂＦＧＦと共に培養した胎児ラット海馬ニューロンに関しても報告されている(レイ(Ｒay)ら、１９９３年、前掲)。
【０１０３】
　成体脳についての増殖性ニューロンの入手源は、決定すべき点として残っている。該細胞は、高濃度のｂＦＧＦによって救出され、増殖が誘導される成体機能性のニューロンとすることができる；該細胞は予想される増殖ゾーンの幹細胞とすることができる;あるいは、該細胞は、胚性脳にのみ存在する高濃度のｂＦＧＦの低下および/または接触阻止のために静止状態となる部分的に関与するニューロン(神経芽細胞)とすることができる。観察し発生した全てのニューロンが平板培養後に救出された成体ニューロンを説明できそうではないが、成体分化したニューロンが脱分化を通してイン・ビトロで生存し増殖できるか否かを決定する実験が進行している。哺乳動物の前脳のサブベントリキュラー・ゾーン(subventricular zone)(ＳＶＺ)が成体マウスのニューロンおよび神経膠細胞に分化する細胞の起源であることが明らかにされているため、該ＳＶＺをこれらの細胞の起源とすることができる(クロイス(Ｃlois)ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第７９巻：２０７４頁、１９９３年)。しかしながら、上衣細胞ライニング/ＳＶＺは脈絡集網と共に剥がれ落ちるため、本発明の培養中の増殖細胞の主起源としてＳＶＺを供することができそうにはない。これらのニューロンは、成体マウスの線条に存在することが示されている(レイノルズ(Ｒeynolds)ら、前掲)休眠状態で非増殖性状態の成体脳に生存する小集団の胚性幹細胞由来とできる。別法として、これらのニューロンは、成体マウス脳で予想されたごとき(リチャーズ(Ｒichards)ら、前掲)、それらの増殖性および分化性について区別される後生的なシグナルを要する成体哺乳動物脳に存在するニューロン前駆細胞とすることもできる。
【０１０４】
　ＳＶＺの幹細胞に加えて、適当なイン・ビトロ条件下で長期にわたり多数のニューロンの発生を誘導できる正常な成体哺乳動物の海馬中には大集団の神経芽細胞がある。基礎および臨床の神経科学についての深い含蓄を有する概念を、イン・ビボにおいて真実とできることも可能である。このことは、正常な海馬および、拡大するなら、正常なＣＮＳが、適当な条件下において活性化され多数のニューロンを複製できる細胞の貯蔵所を有することを意味し得る。かくして、神経芽細胞は胎児ＣＮＳの培養物のみならず、成体ＣＮＳの培養物およびイン・サイチュー(in situ)における成体ＣＮＳにも存在し得る。
【０１０５】
実施例１０
成体海馬からのニューロンの長期培養
　成体フィッシャーラット(＞３ヶ月齢)の脳を切開し、髄膜を取り除いて海馬を摘出した。該組織を１５ｍlの組織培養管に移し、５ｍlのダルベッコのリン酸緩衝液生理食塩水(Ｄ-ＰＢＳ)で３回洗浄した。最後の洗浄の後に、１０００ｇで３分間遠心することにより該組織をペレット化し、該洗液を除去した。該組織を５ｍlのパパイン-中性プロテアーゼ-ＤＮアーゼ(ＰＰＤ)溶液に懸濁し、時々振盪しつつ３７℃にて２０-３０分間インキュベートした。該溶液は、０.０１％のパパイン、０.１％の中性プロテアーゼおよび０.０１％のＤＮアーゼＩを含む１２.４ｍＭのＭｇＳＯ４を補給したハンスクのバランス塩溶液で作製した(ロンドン,アール・エム(Ｌondon,Ｒ.Ｍ.)およびロビンス,アール・ジェイ(Ｒobbins,Ｒ.Ｊ.)メソッズ・イン・エンザイモロジー(Ｍethod.Ｅnzymol.)第１２４巻：４１２-４２４頁、１９８６年)。
【０１０６】
　中程度の孔をあけたパスツールピペットでトリチュレートすることにより(約２０回)、海馬を機械的に解離させた。１０００ｇで３分間遠心することにより細胞をペレット化した。該細胞を、１０％のウシ胎児血清、３.９ｍＭのグルタミンを含むＤＭＥＭ:Ｆ１２培地(１:１)(完全培地)１ｍlに再懸濁した。培地で細孔パスツールピペットにトリチュレートすることにより(各々約２０回)、細胞凝集物を機械的に解離させた。細胞は、遠心によって５-１０ｍlの完全培地で２回洗浄した。細胞を１ｍlの完全培地に採り、トリチュレートすることによって解離させ、ヘモサイトメーターで計数した。１×１０６細胞/Ｔ７５フラスコ(コースター社(Ｃoaster)製)の密度で細胞を平板培養し、５％ＣＯ２/９５％空気インキュベーター中、３７℃にてインキュベートした。１８-２４時間インキュベートした後に、２０ｎｇ/ｍlのＦＧＦ-２(ｂＦＧＦ)を含有するＮ２培地[２０ｎＭのプロゲステロン、３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、１００μＭのプトレッシン、３.９ｍＭのグルタミン、インスリン(５μｇ/ｍl)およびトランスフェリン(１００μｇ/ｍl)を含有するＤＭＥＮ/Ｆ-１２の１:１混合物]で該培地を置き換えた。現在までのところ、細胞を少なくとも７ヶ月培養しており、１５種の異なった独立した切片から培養している。
【０１０７】
　光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡レベルで形態を検鏡することにより細胞のニューロン特性を分析した。免疫細胞化学的分析によって、これらの細胞がニューロン特異的エノラーゼ、ニューロフィラメント媒質および高分子量蛋白質、ＭＡＰ-２ならびに(小集団のみの)カルビンジンを発現することが示された。これらの培養物中の幾つかの細胞もＧＦＡＰに対して染色されることは、これらの培養物中に神経星状膠細胞が存在することを示している。培養物中における成体ニューロン細胞の増殖性は、ブロモデオキシウリジン(ＢrdＵ)の取込みによって測定した。ニューロン特異的エノラーゼを発現する細胞の核がＢrdＵに対する抗体で免疫染色されることは、培養物中での細胞増殖を示している。
【０１０８】
実施例１１
成体脳における移植後の不滅化海馬ニューロンのイン・ビボ生存性
　胚性海馬ニューロンを、２０ｎｇ/ｍlのｂＦＧＦを含有するＮ２培地にて培養した。細胞を継代し、７０-８０％密集性となるまで増殖させた。該培地を３Ｈ-チミジン(１μＣi/ｍl;特異活性:２５Ｃi/mmol)を含む新鮮な培地(Ｎ２+bＦＧＦ)で置き換え、３.５日間増殖させた。トイプシン処理によりフラスコから細胞を採取し、Ｄ-ＰＢＳで遠心によって３回洗浄した。細胞を２０ｎｇ/ｍlのｂＦＧＦを含有する２ｍlのＤ-ＰＢＳに再懸濁し、トリチュレートすることにより解離させ、ヘモサイトメーターで計数した。遠心して該上清を除去した後に、６０,０００細胞/μlの濃度にて細胞を再懸濁した。１μlの細胞懸濁液を、成体フィッシャーラット(＞３ヶ月齢)の海馬に注射した。４％パラホルムアルデヒドを動物に潅流させ、該脳を取り出した。脳切片を、カルビンジン、ＧＦＡＰおよびＮＦ-Ｈ蛋白質と共に抗体で処理した。該切片を乳化液に浸漬し、６週間後に展開した。細胞上に少なくとも１２個の粒状物を有する当該細胞の数は、各動物(全３動物)につき毎１２切片と計数された。３週間後に、該脳に移植した細胞の平均１７％が生存していた(表４)。
【０１０９】
【表４】
2004121258.tif 000006
【０１１０】
　本発明は、現在において好ましい具体例に参照して記載したものであって、本発明の精神から離れることなしに種々の修飾を作ることができることは理解されるであろう。
【０１１１】
　配列番号表
　配列番号１および２は、ＲＮＡで逆転写酵素-ポリメラーゼ鎖反応させてＮＦhを同定するための、各々、フォワード・プライマーおよびリバース・プライマーのヌクレオチド配列である。
【０１１２】
　配列番号３および４は、ＲＮＡで逆転写酵素-ポリメラーゼ鎖反応させてＧＦＡＰを同定するための、各々、フォワード・プライマーおよびリバース・プライマーのヌクレオチド配列である。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、培養物中の初代ニューロンのＢrdＵ染色およびニューロタグＴＭ(ＮeuroＴagＴＭ)結合を示す図である。Ａ．初代ニューロンをＢrdＵで１日間；Ｂ．４日間標識した図。Ｃ．初代細胞のニューロン性をテタヌス毒(ニューロタグＴＭ)との結合により測定した図。培養物中の全細胞の細胞体および突起を染色した。較正バー＝２０μｍ。
【図２】図２は、初代ニューロンの培養および継代の間に起こる形態学的変化を示した顕微鏡写真を示す図である。Ａ．Ｎ２＋ｂＦＧＦ中に平板培養して４日後の初代細胞培養物。Ｂ．継代(継代３)後培養４日目の初代細胞。細胞はさらに大きくなっており、やはり大きさが増大した突起により相互連結している。小さな増殖中の細胞が培養物中に確認できた。Ｃ．ｂＦＧＦの存在下にて〜１４日継代(継代３)し、培養保持した細胞。ネガティブにて倍率　３３×。
【図３】図３は、培養物中の初代ニューロンの透過型電子顕微鏡写真を示す図である。Ａ．主頂端突起(矢印)および細径突起(矢印根元)を含む細胞体および突起の両方を示す錐体型の初代海馬ニューロン。バー＝１０μｍ。Ｂ．パネルＡに示したニューロン細胞体の拡大図。バー＝１μｍ。Ｃ．パネルＡに示したニューロンの主頂端突起の一部分である。バー＝１μｍ。Ｄ．２つの神経細胞突起の接触点。バー＝０.１μｍ。
【図４】図４は、培養中の初代ニューロンの走査型電子顕微鏡写真を示す図である。Ａ．複数レベルの分岐を含む大きな突起を有する良好に分化した錐体型細胞体(矢印)と、大きく、伸長した突起を有する丸い分化の低いニューロン(矢印根元)を含む培養中の初代海馬ニューロンの全体図である。バー＝５０μｍ。Ｂ．(恐らく細径突起から出現した軸索である)幾つかの小突起を有し、第一(主)分岐に隣接した滑らかかつ規則的な径の突起を示す良好に分化した錐体型ニューロンから出現した主頂端樹状突起。容器表面を被覆するＰＯＲＮ/ラミニンが、幾つかの斑点を欠く多孔性の絨毯状物として観察できた。Ｃ．(図３Ａに比して)大きな錐体細胞体を有するよく分化したニューロン(図面中央)および他のニューロンからの多数の突起により接触した大頂端樹状突起(矢印の根元)。細胞分裂過程の間に固定された他の分化の低いニューロンも存在する(矢印)。バー＝２０μｍ。Ｄ．パネルＣの図の上部視野における細胞分裂しているニューロンの拡大図。バー＝１０μｍ。
【図１】
2004121258.tif 000007
【図２】
2004121258.tif 000008
【図３】
2004121258.tif 000009
【図４】
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【配列表】
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