(57)【要約】【課題】末梢血、骨髄、臍帯血等の単球を含む原料細胞液から高純度の単球を簡便かつ迅速に分離する方法の提供。【解決手段】原料細胞液を、入口と出口を有する容量に単球を捕捉する濾材を充填した細胞分離フィルターに通液させて単球を捕捉した後、この単球を回収する単球の採取方法において、この方法のいずれかの段階で原料細胞液中の顆粒球を不活性化する工程を合せる単球採取方法、顆粒球を不活性化する手段として、細胞を低張溶液と接触させる方法、細胞を凍結させ、さらに解凍させる方法がある。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球を含む原料細胞液を、入口と出口を有する容器に単球を捕捉する濾材を充填した細胞分離フィルターに通液させて、単球を捕捉した後、該単球を回収する単球の採取方法であって、該方法に顆粒球を不活化する工程を含むことを特徴とする単球採取方法。
【請求項２】
単球を含む原料細胞液を入口と出口を有する容器に単球を捕捉する濾材を充填した細胞分離フィルターに通液させて、単球を捕捉した後、洗浄液を通液させることにより、非捕捉細胞および／または細胞分解物をフィルター外に流出させることを特徴とする、請求項１記載の単球採取方法。
【請求項３】
細胞分離フィルターが、実質的に、リンパ球に比して単球を選択的に捕捉することを特徴とする、請求項１または２記載の単球採取方法。
【請求項４】
細胞分離フィルターが、単球捕捉率５０％以上、リンパ球通過率６０％以上である、請求項３記載の単球採取方法。
【請求項５】
細胞分離フィルターに捕捉された細胞を０℃から１０℃に冷却して回収することを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の単球採取方法。
【請求項６】
顆粒球を不活化する方法が、細胞を低張溶液に接触させる方法であることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の単球採取方法。
【請求項７】
低張液の浸透圧が、１０ｍＯｓｍ／ｌ以上２００ｍＯｓｍ／ｌ以下である請求項６記載の単球採取方法。
【請求項８】
顆粒球を不活化する方法が、細胞を凍結させ、さらに解凍する方法であることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の単球採取方法。
【請求項９】
単球を含む原料細胞液を細胞分離フィルターに通液させて単球を捕捉する工程、顆粒球を不活化する工程、非捕捉細胞および／または細胞分解物を洗浄液で洗浄する工程、捕捉された単球を回収する工程を、この順に実施することを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の単球採取方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の単球採取方法により得られた高純度の単球を含む細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、単球を含む原料細胞液から、単球を簡便かつ迅速に分離し、高純度に回収する単球採取方法及びこのようにして回収された高純度の単球組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
単球／マクロファージは多様な機能を持つ細胞で、特に外来の細菌や老朽化した自己細胞等への貪食能、血管新生のための各種メディエーター産生能およびタンパク質分解酵素産生能等に特徴がある。近年、これらの機能に着目して、末梢血または骨髄由来単球から分化誘導したマクロファージを用いた局部虚血性疾患治療が積極的に行われており、優れた治療効果も報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
また一方、単球／マクロファージは強い抗原提示能を有し、さらに末梢血単球から分化誘導した樹状細胞は、抗原未感作のネイティブＴ細胞をも刺激することのできる、強力な抗原提示細胞である。この機能を利用して、樹状細胞を用いた癌治療が盛んに行われ、優れた治療効果も報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
以上述べたような背景により、末梢血、骨髄等から単球を選択的に採取する技術が盛んに検討され始めている。これまでに知られている単球採取の最も一般的な方法としては、単球のプラスチック基材への付着しやすさを利用した方法で、密度勾配遠心法と呼ばれる比重液を用いた遠心分離により末梢血、骨髄等から単核球層を取り出し、これをプラスチック製のディッシュに播種して付着性の単球と非付着性の他の細胞を分離するという手順をもって行われるものがある。しかしこの方法は複雑で時間がかかり、また１枚のディッシュで一度に処理できる細胞（単核球）の数が最大１０７個程度であるため、得られる単球はせいぜい１０６個程度であり、例えば潰瘍治療に用いられる１０７個の細胞を採取しようとすれば、ディッシュを一度に１０枚以上処理しなければならず、臨床現場で日常的に行う方法としては現実的でない。
【０００５】
一方、近年発達のめざましい細胞工学の技術をもって、単球に特異的に発現する抗原を認識するモノクローナル抗体が見出され、これを用いた単球分離技術も多く検討されている。フローサイトメーターを用いたソーティング、抗体ロゼット法、抗体結合フラスコ等、モノクローナル抗体を用いた単球分離技術は多数見られるが、これらの方法は、非常に高価であることと、採取した細胞集団に異種由来の抗体が残存する可能性があるため、臨床への応用という点では現実的でない。
【０００６】
またさらに、アフェーレシスによる単核球分離も多く試みられおり（例えば、非特許文献３）、この手法では比較的簡単に単球を得ることができるが、リンパ球との分離ができないため回収される細胞中の単球含有率は２５％に満たず、局部虚血性疾患に対する治療効果は期待できない。また悪性腫瘍に対する免疫療法においても、少ない採血回数で高純度の単球を得ることが、患者の身体的負担を軽減し、長期的に安定した治療システムを構築するという点で重要であり、単球の採取方法においては、簡便かつ迅速に大量の細胞を処理できると同時に、得られる単球が高純度であることが要求され、これらを兼ね備えた単球採取方法の開発が待望されていた。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｄａｖｉｄ　Ｄａｎｏｎ他、「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｕｌｃｅｒｓ　ｂｙ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　Ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　Ｂｌｏｏｄ　Ｕｎｉｔ」、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ、（米国）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．、１９９７年、第３２巻、第６号、ｐ．６３３−６４１
【非特許文献２】
定永、「樹状細胞を用いた癌ワクチン療法」、医学のあゆみ、医歯薬出版、平成１２年２月、第１９２巻、第９号、ｐ．８８３−８８６
【非特許文献３】
Ｘｕａｎ　Ｄｕｃ　Ｎｇｕｙｅｎ他、「Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ　ｆｏｒ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｐａｔｉｅｎｔ」、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、（米国）、２００２年４月、第４２巻、ｐ．４２８−４３２
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べたような問題点に鑑み、本発明は、単球を含む原料細胞液から単球を簡便かつ迅速に分離し、高純度に回収する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を重ね、単球を含む原料細胞液を、単球を捕捉する細胞分離フィルターに通液させ、細胞分離フィルターに捕捉させた単球を回収する方法において、該方法中に顆粒球を不活化する工程を加えることにより、単球純度を高められることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を含む。
（１）単球を含む原料細胞液を、入口と出口を有する容器に単球を捕捉する濾材を充填した細胞分離フィルターに通液させて、単球を捕捉した後、該単球を回収する単球の採取方法であって、該方法に顆粒球を不活化する工程を含むことを特徴とする単球採取方法。
（２）単球を含む原料細胞液を入口と出口を有する容器に単球を捕捉する濾材を充填した細胞分離フィルターに通液させた後、洗浄液を通液させることにより、非捕捉細胞および／または細胞分解物をフィルター外に流出させることを特徴とする、前記（１）記載の単球採取方法。
（３）細胞分離フィルターが、実質的に、リンパ球に比して単球を選択的に捕捉することを特徴とする、前記（１）または（２）記載の単球採取方法。
（４）細胞分離フィルターが、単球捕捉率５０％以上、リンパ球通過率６０％以上である、前記（３）記載の単球採取方法。
（５）細胞分離フィルターに捕捉された細胞を０℃から１０℃に冷却して回収することを特徴とする、前記（１）から（４）のいずれかに記載の単球採取方法。
【００１１】
（６）顆粒球を不活化する方法が、細胞を低張溶液に接触させる方法であることを特徴とする、前記（１）から（５）のいずれかに記載の単球採取方法。
（７）低張液の浸透圧が、１０ｍＯｓｍ／ｌ以上２００ｍＯｓｍ／ｌ以下である前記（６）記載の単球採取方法。
（８）顆粒球を不活化する方法が、細胞を凍結させ、さらに解凍する方法であることを特徴とする、前記（１）から（５）のいずれかに記載の単球採取方法。
（９）単球を含む原料細胞液を細胞分離フィルターに通液させて単球を捕捉する工程、顆粒球を不活化する工程、非捕捉細胞および／または細胞分解物を洗浄液で洗浄する工程、捕捉された単球を回収する工程を、この順に実施することを特徴とする、前記（１）から（８）のいずれかに記載の単球採取方法。
（１０）前記（１）から（９）のいずれかに記載の単球採取方法により得られた高純度の単球を含む細胞組成物。
単球を含む原料細胞液を細胞分離フィルターに通液し、捕捉細胞を回収するという方法では、回収液への顆粒球の混入が避けられず単球純度の向上に限界があったのに対し、本発明によるとこれを解決できる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明について、以下具体的に説明する。
本発明でいう単球とは、造血幹細胞由来の単球系細胞、詳しくは単芽球、前単球、単球、マクロファージおよび単球由来の樹状細胞をいい、単球を含む原料細胞液とは、少なくとも単球および顆粒球を含有する細胞浮遊液をいい、末梢血、骨髄、臍帯血、またはこれらに遠心分離等の処理を施したものが例示できる。
【００１３】
本発明でいう細胞分離フィルターとは、原料細胞液の入口と出口を有する容器内に単球を捕捉する濾材を充填したものを指す。濾材としては、単球を捕捉するものならばいかなる材料も使用できるが、成形性や滅菌性に優れ、細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニム等の金属があげられる。
【００１４】
また、濾材の形状としては、粒子、織布、不織布、繊維塊、スポンジ状構造体（膜を含む）等があげられるが、中でも不織布が好ましく用いられる。不織布の場合、後述する抗体等の特定の細胞に特異的に結合するいわゆるバイオリガンド類を表面に固定しない場合は、通常、繊維径は１．０μｍ以上３０μｍ以下であり、好ましくは１．０μｍ以上２０μｍ以下であり、さらにより好ましくは１．５μｍ以上１０μｍ以下である。１．０μｍ未満では回収必要細胞が強固に捕捉されてしまい回収困難となる傾向がある。また、３０μｍを超えると回収必要細胞が繊維に捕捉されず素通りする傾向が強くなる。いずれの場合も回収率の低下につながるおそれがあるので好ましくない。フィルターの充填密度は０．０５〜０．５ｇ／ｃｍ３が好ましい。０．５ｇ／ｃｍ３より大きいと流体の流れ性が著しく劣り、通液自体が困難になるおそれがあり、０．０５ｇ／ｃｍ３より小さいと、単球が繊維に捕捉されず素通りする傾向が強くなり、回収率の低下につながるおそれがあるので好ましくない。
【００１５】
これらの濾材はそのままでも使用することができるが、細胞の選択的通過または捕捉を行う等の必要に応じて表面改質を施したものでもよい。例えば、血小板通過性を高めるにはＷＯ８７／０５８１２公報で提案されている非イオン性親水基と塩基性含窒素官能基とを有するポリマーのコートによる方法があげられる。細胞の選択的捕捉を行う場合、その方法としてアミノ酸、ペプチド、糖類、糖タンパク（抗体、接着分子等のバイオリガンドを含む）といった特定の細胞に親和性のあるリガンドを、例えば特開平２−２６１８３３号公報で提案されているハロアセトアミド法により固定する方法等があげられる。ただし単球に親和性をもつリガンドを選択する際には、滅菌処理に対する安定性に欠けるバイオリガンドや、細胞を回収する際に回収率の低下を招くほど強い親和性をもつものは避けた方がよい。
【００１６】
このような濾材を複数枚積層して充填する、原料細胞液の入口と出口を有する容器の材質としては、成形性や滅菌性に優れ、細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル等の合成高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属があげられるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
容器の構造としては、形状は直方体、立方体、円柱形、楕円柱形などがあげられるが、いずれの形状でもよい。また、原料細胞液の入口と出口の位置としては、入口は濾材の最上層に液体を導入できる位置であればよく、また出口は濾材の最下層から液体を導出できる位置であればよい。
【００１８】
以上述べた細胞分離フィルターにおける単球の捕捉率は好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上である。単球の捕捉率が５０％以下では最終的な単球の回収率が低下する傾向があるので好ましくない。またリンパ球の通過率は、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上である。リンパ球の通過率が６０％以下では、回収液中の単球純度が低下する傾向があるので好ましくない。
【００１９】
本発明における単球を含む原料細胞液（以下、原料細胞液ということがある）の通液方法は、細胞分離フィルターに液体を導入し、一定方向に通液させればよい。原料細胞液を細胞分離フィルターに導入する手段は、シリンジポンプ、ブラッドポンプ、ペリスタポンプ等の装置を用いるものや、簡便法としてシリンジを手で押す方法、液体を貯留したバッグを押しつぶして液流を惹起する方法、落差処理等があげられるが、この限りではない。
【００２０】
本発明でいう捕捉細胞を回収する方法とは、細胞分離フィルターに原料細胞液の通液方向と同一方向または逆方向に向かって回収液を送り出し、細胞分離フィルターに捕捉された細胞を回収することを言う。このとき回収液を送り出す方向は、原料細胞液を通液させる方向と逆方向の方が、回収率向上の点で有効である傾向が見られるので、より好ましい。回収液を細胞分離フィルターに導入する手段は、シリンジポンプ、ブラッドポンプ、ペリスタポンプ等の装置を用いるものや、簡便法としてシリンジを手で押す方法、液体を貯留したバッグを押しつぶして液流を惹起する方法、落差処理等があげられるが、この限りではなく、さらに、単球の回収率をより高めるために、フィルターに振動を加えるとか、ストップドフロー等を行ってもよい。
【００２１】
回収液としては、細胞に損傷を与えず、かつ高率に回収できるものならば特に限定しないが、好ましいものを例示すると、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）やＨＢＳＳ（ハンクス液）等の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０等の細胞培養用培地、ポリエチレンングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子溶液、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルスターチ、デキストラン、コラーゲン、フィブロネクチン、アルブミン、グロブリン等の天然高分子溶液、グルコース、サッカロース、マルトース、ソルビトール、グリセリン、ジメチルスルホキシド等の有機物溶液およびこれらの混合物があげられる。
【００２２】
また、２価カチオンを除去して細胞剥離を容易にする目的でＥＤＴＡ等のキレート剤が含有されていてもよい。デキストランやヒドロキシエチルスターチ等の高分子溶液は、生理食塩水等に比し高い粘性を有しているので回収率向上により有効であり、回収液としてより好ましい。
【００２３】
本発明でいう顆粒球を不活化する工程とは、物理的あるいは化学的に顆粒球を刺激することにより、顆粒球の細胞膜を破り、あるいは溶かして、顆粒球の細胞としての機能を損なわせることをいう。物理的あるいは化学的刺激を例示すると、低張溶液による刺激、細胞膜溶解液による刺激、凍結融解による刺激、超音波による刺激等が例示できる。中でも低張溶液による刺激、凍結融解による刺激が好ましく用いられる。
【００２４】
顆粒球を不活化する工程は、単球を含む原料細胞液の段階で行ってもよいし、細胞分離フィルターに単球を捕捉させた段階で行ってもよいし、細胞分離フィルターに捕捉させた捕捉細胞を回収した後に行ってもよいが、細胞分離フィルターに単球を捕捉させ、捕捉細胞に顆粒球を不活化するための刺激を加え、該細胞分離フィルターに以下に述べるような洗浄操作を加えた後、捕捉細胞を回収する、という順番で行うと、例えば顆粒球不活化の刺激が低張溶液を用いた方法であった場合、用いる低張溶液の容量が少なくてすみ、また低張溶液を通液させることによる非捕捉細胞洗浄効果が期待でき、さらに操作時間が短縮できるため、より好ましく、推奨できる。
【００２５】
以上述べた、単球を含む原料細胞液を、入口と出口を有する容器に単球を捕捉する濾材を充填した細胞分離フィルターに通液させて単球を捕捉した後、該単球を回収する単球の採取方法であって、該工程に顆粒球を不活化する工程を含むことを特徴とする単球採取方法によれば、原料細胞液から単球を簡便かつ迅速に分離し、単球を高純度で含む細胞組成物を得ることができる。このとき得られる細胞組成液には、単球の他にリンパ球、顆粒球、赤血球および／または血小板を含むことがある。リンパ球、赤血球、血小板は、フィルターで濾過するのみでは完全に除去することは困難であり、顆粒球は、不活化工程によりほとんど除くことができるが、完全除去は困難なので、該細胞組成物に混入することがある。
【００２６】
上記単球採取方法に、さらに、細胞分離フィルターに原料細胞液を通液させた後、該細胞分離フィルターを洗浄する工程を加えることにより、回収した単球の純度をさらに向上させることができるので、好ましく、推奨できる。
【００２７】
細胞分離フィルターの洗浄方法は、該フィルターに原料細胞液の通液方向と同一方向あるいは逆方向から洗浄液を送り出せばよい。このとき洗浄液を送り出す方向は、原料細胞液を通液させる方向と同一方向の方が、フィルター上の捕捉単球流出防止の点で有効である傾向が見られるので、より好ましい。洗浄液として、細胞に損傷を与えず、少なくともリンパ球および赤血球を流出させるものならば特に限定しないが、好ましいものを例示すると、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）やＨＢＳＳ（ハンクス液）等の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０等の細胞培養用培地があげられ、これらの液体に、細胞保護、栄養補給、抗凝固性付与、粘度向上（リンパ球および赤血球の除去率向上に有効な場合がある）等の目的で必要に応じ、血漿、血清、アルブミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレハロース、クエン酸化合物、ＥＤＴＡ、デキストラン、ゼラチン等を添加してもよい。また、洗浄液を細胞分離フィルターに導入する手段は、シリンジポンプ、ブラッドポンプ、ペリスタポンプ等の装置を用いるものや、簡便法としてシリンジを手で押す方法、液体を貯留したバッグを押しつぶして液流を惹起する方法、落差処理等があげられるが、この限りではない。
【００２８】
顆粒球を不活化する工程に推奨できる顆粒球不活化方法である、細胞を低張溶液に接触させる方法、および細胞を凍結させ、さらに解凍する方法をさらに詳細に説明する。
【００２９】
本発明でいう細胞を低張溶液に接触させる方法とは、細胞をその膜表面を介して細胞質より低張性の液体に接触させる方法であればよく、例えば、原料細胞液に低張性の溶液を加えて混合し、細胞を低張溶液に接触させる方法、細胞を捕捉したフィルターに低張性の溶液を導入し、細胞を低張溶液に接触させる方法、回収した細胞を含む細胞浮遊液に低張性の溶液を加えて混合し、細胞を低張溶液に接触させる方法等があり、細胞を捕捉したフィルターに低張性の溶液を導入する方法の場合、該溶液がフィルターの洗浄液の代用として用いられてもよい。細胞を低張溶液に接触させる時間としては、１０秒以上６００秒以下、好ましくは１０秒以上３００秒以下、さらに好ましくは２０秒以上１８０秒以下である。接触させる時間が１０秒以下の場合、顆粒球がほとんど不活化されず残留する傾向があり、回収細胞浮遊液中の単球純度が低下するおそれがあるため好ましくない。また６００秒以上の場合、単球に過度のストレスがかかり、損傷され、または不活化されてしまう傾向があるため好ましくない。低張溶液としては、単球に過度のストレスを与えず、顆粒球を不活化できるものならば特に限定しないが、通常、細胞に接触する液体の浸透圧が１０ｍＯｓｍ／ｌ以上２００ｍＯｓｍ／ｌ以下、好ましくは１０ｍＯｓｍ／ｌ以上１５０ｍＯｓｍ／ｌ以下、より好ましくは２０ｍＯｓｍ／ｌ以上６０ｍＯｓｍ／ｌ以下である。
【００３０】
２００ｍＯｓｍ／ｌ以上の溶液では、細胞を長時間接触させても顆粒球が不活化されずに残留する傾向があり、回収細胞浮遊液中の単球純度が低下するおそれがあるため好ましくない。１０ｍＯｓｍ／ｌ以下の溶液では、過度のストレスで単球が不活化されてしまう傾向があるため好ましくない。低張性の溶液として好ましいものを例示すると、希釈した生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）やＨＢＳＳ（ハンクス液）等の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０等の細胞培養用培地などがあり、または蒸留水をそのまま用いてもよい。これらの液体に、単球を過度のストレスから保護し、栄養補給を行う等の目的で、血漿、血清、アルブミン、グロブリン、グルコース、サッカロース等を添加してもよい。細胞が接する低張溶液をすみやかに等張するには、原料細胞液または回収細胞浮遊液を低張性にした場合は、該液体に高張性の液体を加えればよく、フィルターに低張性の溶液を通液した場合は、該フィルターにさらに等張液を通液させて低張性の溶液を流出させればよいが、いずれの場合もこの限りではない。
【００３１】
本発明でいう細胞を凍結させ、さらに解凍する方法における、細胞の凍結方法とは、一般的な細胞の凍結方法、すなわち、プログラムフリーザーで−１℃〜−３℃／分で徐冷してから液体窒素中で静置する方法、発泡スチロール容器に被凍結物を入れて、直接−８０℃の冷凍庫中に静置する方法（発泡スチロールにより徐冷が達成される）、など公知の方法を採用すればよいが、これに限るものではない。また同様に解凍方法としては、一般に細胞内に形成された氷晶による細胞の物理的損傷を防ぐために急速解凍が好ましいとされており、３７〜４０℃の水浴中での解凍が広く行われているので、これを採用すればよいが、この方法に限定するものではない。
【００３２】
なお細胞を凍結する際には、単球を冷却ショックによる障害から保護するため、凍害保護剤を加えるとより好ましい。凍害保護剤としては、一般的に細胞の凍結保存に用いられるものであればいかなるものでもよいが、凍害保護作用が高く、細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ジメチルスルホキシド、グリセリン、サッカロース、トレハロース等の低分子有機化合物、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デンプン、ヒドロキシエチル化デンプン、デキストランなどの高分子化合物があげられるがこれらに限定されるものではない。
【００３３】
また、本発明を実施するに当たり、細胞分離フィルターに捕捉された細胞を冷却してから回収操作を行うことは、単球の回収率が上がるため好ましく、推奨できる。上述した回収工程に入る前に、細胞を０℃以上１０℃以下、より好ましくは０℃以上８℃以下に冷却することにより、捕捉された細胞がフィルターから剥離しやすくなるという傾向があり、該操作を加えることにより細胞の回収率が向上する。細胞を冷却する方法としては、細胞を捕捉したフィルターを冷蔵庫、氷浴等に静置させる方法のほか、あらかじめ冷却した液体をフィルターに導入してもよく、該液体がフィルターの洗浄に用いるものであってもよい。回収液が冷却されているとさらに好ましい。
【００３４】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
ヒト末梢全血から単球を分離する場合の細胞分離フィルターおよび細胞分離方法を示す。この際、顆粒球除去のため、フィルターから回収した細胞に低張刺激を加えた。
１．細胞分離フィルター
高さ２３ｍｍ×直径７ｍｍφの円筒型ポリエチレンカラムの入口側から順番に平均繊維径３３μｍ（目付約５０ｇ／ｍ２、嵩高約０．２５ｍｍ）のポリエステル不織布１０枚、平均繊維径１２μｍ（目付約３０ｇ／ｍ２、嵩高約０．２１ｍｍ）のポリエステル不織布１０枚、平均繊維径３μｍ（目付約９０ｇ／ｍ２、嵩高約０．３８ｍｍ）のポリエステル不織布３枚を充填し、細胞分離フィルターとした。なお、高さ３ｍｍ×内径５ｍｍφ（外径７ｍｍφ）の中空状のシリコン製チューブを不織布上下で押さえ、不織布が動かないように固定した。また、該細胞分離フィルターにおけるリンパ球通過性能を高める目的で、ウシ胎児血清のコーティングを行った。すなわち、市販のウシ胎児血清をフィルター内に充填し、室温で２時間静置してからリン酸緩衝液を通液して洗浄した。フィルターは、内部に充填した不織布が湿潤した状態で使用した。
【００３５】
２．細胞分離方法
原料細胞液入口からＡＣＤ加ヒト末梢全血５ｃｍ３を、シリンジポンプによりフィルターに通液（流速０．１ｃｍ３／分）して単球を捕捉し、濾液は濾液排出口から排出した。続いて原料細胞液入口から５％ウシ胎児血清加リン酸緩衝液２ｃｍ３を流してフィルターに残存する赤血球、血小板を洗い流し、濾液排出口から排出し、さらに０．２％ＥＤＴＡおよび５％ウシ胎児血清加リン酸緩衝液１ｃｍ３を流してフィルター内に充填した。このフィルターを、溶液を充填したまま４℃の冷蔵庫に１５分間静置し、細胞およびフィルターを冷却した後、４℃に冷却した市販の１０％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字社製「デキストラン４０注」）３ｃｍ３が入ったシリンジを原料細胞液入口に接続し、シリンジを強く押してフィルターに通液し、濾液排出口から細胞を回収した。回収した細胞浮遊液を１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を取り除き、５％ウシ胎児血清加リン酸緩衝液０．５ｃｍ３に浮遊させ、これに蒸留水７ｃｍ３を加え（混合後の溶液の浸透圧２０ｍＯｓｍ／ｌ）、１８０秒間静置し、さらに９％塩化ナトリウム溶液０．８ｃｍ３を加えて、等張に戻した。これを最終的な回収細胞液とした。
【００３６】
３．結果
単球回収率、単球捕捉率、リンパ球通過率は以下の式により算出した。
単球回収率（％）＝１００×（回収細胞液中単球数／原料細胞液中単球数）
単球捕捉率（％）＝１００×［（原料細胞液中単球数−濾液中単球数−洗浄液中単球数）／（原料細胞液中単球数）］
リンパ球通過率（％）＝１００×［（濾液中リンパ球数＋洗浄液中リンパ球数）］／（原料細胞液中リンパ球数）］
またこのとき、単球またはリンパ球の数は以下の式により算出した。
単球数＝細胞浮遊液中白血球数×単球純度（％）／１００
リンパ球数＝細胞浮遊液中白血球数×リンパ球純度（％）／１００
ここで細胞浮遊液とは、原料細胞液、濾液、洗浄液および回収細胞液を指し、これらにおける単球またはリンパ球の純度は、原料細胞液および濾液にあっては一般的な塗沫標本の作成法により塗沫標本を作成し、洗浄液および回収細胞液にあっては遠心塗沫法により塗沫標本を作成し、これをメイグリュンワルドギムザ染色法にて染色して、光学顕微鏡（オリンパス社製ＢＨ−２）で検鏡し、白血球１００個に対する単球またはリンパ球の割合として得た。
原料細胞液の単球純度６．９％、回収細胞中の単球純度４２．５％、単球回収率３０．０％であり、細胞分離フィルターの単球捕捉率およびリンパ球通過率は、それぞれ８７．６％、７０．９％であった。
【００３７】
【実施例２】
ヒト末梢全血から単球を分離する際、まず末梢全血に低張刺激を加えた後、フィルターに通液する場合を示す。
１．細胞分離フィルター
実施例１と同じ。
【００３８】
２．細胞分離方法
ＡＣＤ加ヒト末梢全血５ｃｍ３に蒸留水７０ｃｍ３を加え（混合後の溶液の浸透圧２０ｍＯｓｍ／ｌ）、１８０秒間静置し、さらに９％塩化ナトリウム溶液８．３ｃｍ３を加えて、等張に戻した。これを原料細胞液入口からシリンジポンプによりフィルターに通液（流速０．１ｃｍ３／分）して、単球を捕捉し、濾液は濾液排出口から排出した。続いて原料細胞液入口から５％ウシ胎児血清加リン酸緩衝液２ｃｍ３を流してフィルターに残存する赤血球、血小板を洗い流し、濾液排出口から排出し、さらに０．２％ＥＤＴＡおよび５％ウシ胎児血清加リン酸緩衝液１ｃｍ３を流してフィルター内に充填した。このフィルターを、溶液を充填したまま４℃の冷蔵庫に１５分間静置し、細胞およびフィルターを冷却した後、４℃に冷却した市販の１０％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字社製「デキストラン４０注」）３ｃｍ３が入ったシリンジを原料細胞液入口に接続し、シリンジを強く押してフィルターに通液し、濾液排出口から細胞を回収した。
【００３９】
３．結果
単球純度、単球回収率および細胞分離フィルターの単球捕捉率とリンパ球通過率の計算方法は実施例１と同じとした。原料細胞液の単球純度６．９％、回収細胞中の単球純度４０．５％、単球回収率２８．６％、細胞分離フィルターの単球捕捉率およびリンパ球通過率は、それぞれ９３．８％、７２．８％であった。
【００４０】
【実施例３】
ヒト末梢全血から単球を分離する際、フィルターに捕捉した細胞に低張刺激を加えた場合を示す。
１．細胞分離フィルター
実施例１と同じ。
【００４１】
２．細胞分離方法
原料細胞液入口からＡＣＤ加ヒト末梢全血５ｃｍ３を、シリンジポンプによりフィルターに通液（流速０．１ｃｍ３／分）して単球を捕捉し、濾液は濾液排出口から排出した。続いて原料細胞液入口から蒸留水を用いて１０倍に希釈した５％ウシ胎児血清加リン酸緩衝液（浸透圧２９ｍＯｓｍ／ｌ）２ｃｍ３を流して（流速１．０ｃｍ３／分、低張溶液の細胞への接触時間約１２０秒間、低張溶液の浸透圧２９ｍＯｓｍ／ｌ）フィルターに残存する赤血球、血小板を洗い流し、濾液排出口から排出し、さらに０．２％ＥＤＴＡおよび５％ウシ胎児血清加リン酸緩衝液１ｃｍ３を流してフィルター内に充填した。このフィルターを、溶液を充填したまま４℃の冷蔵庫に１５分間静置し、細胞およびフィルターを冷却した後、４℃に冷却した市販の１０％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字社製「デキストラン４０注」）３ｃｍ３が入ったシリンジを原料細胞液入口に接続し、シリンジを強く押してフィルターに通液し、濾液排出口から細胞を回収した。
【００４２】
３．結果
単球純度、単球回収率および細胞分離フィルターの単球捕捉率とリンパ球通過率の計算方法は実施例１と同じとした。原料細胞液の単球純度６．９％、回収細胞液の単球純度３９．８％、単球回収率２２．７％、細胞分離フィルターの単球捕捉率およびリンパ球通過率は、それぞれ７８．２％、７３．７％であった。
【００４３】
【実施例４】
ヒト末梢全血から単球を分離する際、フィルターから回収した細胞を凍結し、さらに解凍した場合を示す。
１．細胞分離フィルター
実施例１と同じ。
【００４４】
２．細胞分離方法
原料細胞液入口からＡＣＤ加ヒト末梢全血５ｃｍ３を、シリンジポンプによりフィルターに通液（流速０．１ｃｍ３／分）して単球を捕捉し、濾液は濾液排出口から排出した。続いて原料細胞液入口から５％ウシ胎児血清加リン酸緩衝液２ｃｍ３を流してフィルターに残存する赤血球、血小板を洗い流し、濾液排出口から排出し、さらに０．２％ＥＤＴＡおよび５％ウシ胎児血清加リン酸緩衝液液１ｃｍ３を流してフィルター内に充填した。このフィルターを、溶液を充填したまま４℃の冷蔵庫に１５分間静置し、細胞およびフィルターを冷却した後、４℃に冷却した市販の１０％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字社製「デキストラン４０注」）３ｃｍ３が入ったシリンジを原料細胞液入口に接続し、シリンジを強く押してフィルターに通液し、濾液排出口から細胞を回収した。回収した細胞浮遊液をポリプロピレンチューブに入れ、１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を取り除き、１０％ジメチルスルホキシド加ＲＰＭＩ１６４０培地２ｃｍ３を加え、よく懸濁し、バイセル（日本フリーザー社製）に入れ、そのまま−８０℃の冷蔵庫へ入れて２時間静置して凍結させた。凍結した細胞を３７℃の恒温槽につけて解凍し、これを最終的な回収細胞液とした。
【００４５】
３．結果
単球純度、単球回収率および細胞分離フィルターの単球捕捉率とリンパ球通過率の計算方法は実施例１と同じとした。原料細胞液の単球純度６．９％、回収細胞液の単球純度３０．５％、単球回収率は２１．０％、細胞分離フィルターの単球捕捉率およびリンパ球通過率は、それぞれ８４．４％、７１．８％であった。
【００４６】
【比較例１】
ヒト末梢全血から単球を分離する際、顆粒球を不活化する工程を加えない場合を示す。
１．細胞分離フィルター
実施例１と同じ。
【００４７】
２．細胞分離方法
原料細胞液入口からＡＣＤ加ヒト末梢全血５ｃｍ３を、シリンジポンプによりフィルターに通液（流速０．１ｃｍ３／分）して単球を捕捉し、濾液は濾液排出口から排出した。続いて原料細胞液入口から５％ウシ胎児血清加リン酸緩衝液２ｃｍ３を流してフィルターに残存する赤血球、血小板を洗い流し、濾液排出口から排出し、さらに０．２％ＥＤＴＡおよび５％ウシ胎児血清加リン酸緩衝液１ｃｍ３を流してフィルター内に充填した。このフィルターを、溶液を充填したまま４℃の冷蔵庫に１５分間静置し、細胞およびフィルターを冷却した後、４℃に冷却した市販の１０％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字社製「デキストラン４０注」）３ｃｍ３が入ったシリンジを原料細胞液入口に接続し、シリンジを強く押してフィルターに通液し、濾液排出口から細胞を回収した。
【００４８】
３．結果
単球純度、単球回収率および細胞分離フィルターの単球捕捉率とリンパ球通過率の計算方法は実施例１と同じとした。原料細胞液の単球純度６．９％、回収細胞液中の単球純度７．７％、単球回収率３３．３％、細胞分離フィルターの単球捕捉率およびリンパ球通過率は、それぞれ８４．４％、７０．９％であった。
【００４９】
【実施例５】
１．細胞分離フィルター
高さ２３ｍｍ×直径７ｍｍφの円筒型ポリエチレンカラムの入口側から順番に平均繊維径３３μｍ（目付約５０ｇ／ｍ２、嵩高約０．２５ｍｍ）のポリエステル不織布１２枚、平均繊維径１２μｍ（目付約３０ｇ／ｍ２、嵩高約０．２１ｍｍ）のポリエステル不織布１３枚、平均繊維径３μｍ（目付約９０ｇ／ｍ２、嵩高約０．３８ｍｍ）のポリエステル不織布２枚を充填し、細胞分離フィルターとした。なお、高さ３ｍｍ×内径５ｍｍφ（外径７ｍｍφ）の中空状のシリコン製チューブを不織布上下で押さえ、不織布が動かないように固定した。
【００５０】
２．細胞分離方法
原料細胞液入口からＡＣＤ加ヒト末梢全血３ｃｍ３を、シリンジポンプによりフィルターに通液（流速０．１ｃｍ３／分）して単球を捕捉し、濾液は濾液排出口から排出した。続いて原料細胞液入口から生理食塩水１０ｃｍ３を流してフィルターに残存する赤血球、血小板を洗い流し、濾液排出口から排出した後、１０％ウシ血清アルブミン加生理食塩水３ｃｍ３が入ったシリンジを原料細胞液入口に接続し、シリンジを強く押してフィルターに通液し、濾液排出口から細胞を回収した。回収した細胞浮遊液を１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を取り除き、５％ウシ胎児血清加リン酸緩衝液０．５ｃｍ３に浮遊させ、これに蒸留水７ｃｍ３を加え（混合後の溶液の浸透圧２０ｍＯｓｍ／ｌ）、１８０秒間静置し、さらに９％塩化ナトリウム溶液０．８ｃｍ３を加えて、等張に戻した。これを最終的な回収細胞液とした。
【００５１】
３．結果
単球純度、単球回収率および細胞分離フィルターの単球捕捉率とリンパ球除去率の計算方法は実施例１と同じとした。原料細胞液の単球純度４．３％、回収細胞中の単球純度４２．０％、単球回収率１８．１％、細胞分離フィルターの単球捕捉率およびリンパ球除去率は、それぞれ６５．５％、７９．９％であった。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によれば、原料細胞液から単球を簡便かつ迅速に分離し、高純度の単球画分を採取することができる。また、本発明によれば、フィルターを用いることにより大量の細胞を一度に処理でき、またフィルターを回路に組み込むことにより、密閉系で単球画分を分離濃縮できるため、実験室レベルの研究のみならず、ルーチンの医療行為への発展に大いに貢献することができる。