(57)【要約】【課題】エレウスロシド関連化合物の検出及び定量を容易に行うことができる抗体、その製造方法及びエレウスロシド関連化合物の定量方法を提供する。【解決手段】抗体は、エレウスロシドＥを構成する糖の一部を切断し、その切断された末端に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等の抗原性担体を共有結合させた抱合体を抗原として免疫動物に免疫することにより製造される。この抗体は、エゾウコギ中に含まれる有効成分であるエレウスロシド関連化合物（エレウスロシドＥ、エレウスロシドＢ、メディオレシノールジグルコシド、ピノレシノールジグルコシド）に対して結合する。また、エレウスロシドＢ、メディオレシノールジグルコシド又はピノレシノールジグルコシドを用いて抱合体を作製し、その抱合体を抗原として抗体を製造してもよい。エレウスロシド関連化合物の定量方法は、前記抗体を用いた競合的ＥＬＩＳＡによって行われる。【選択図】      図１
2004346051.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エレウスロシド関連化合物に対する抗体であって、
エレウスロシドＥ、エレウスロシドＢ、メディオレシノールジグルコシド又はピノレシノールジグルコシドに結合することを特徴とする抗体。
【請求項２】
エレウスロシド関連化合物に対する抗体を製造する方法であって、エレウスロシドＥ、エレウスロシドＢ、メディオレシノールジグルコシド又はピノレシノールジグルコシドを構成する糖の一部を切断し、その切断された末端に抗原性担体を共有結合させたものを抗原として抗体を作製することを特徴とする抗体の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体を用いて、競合的ＥＬＩＳＡにてエレウスロシド関連化合物の濃度を定量することを特徴とするエレウスロシド関連化合物の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、エゾウコギに含まれる薬効成分であるエレウスロシドＥやＢ等のエレウスロシド関連化合物に対する抗体及びその製造方法、並びにその抗体を用いてエレウスロシド関連化合物の濃度を定量するエレウスロシド関連化合物の定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、エタノール等を用いてエゾウコギから有効成分を抽出したエゾウコギエキスが知られている（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】
特開平５−１８６３６０号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来のエゾウコギエキスでは、有効成分の含有量が極めて微量であることから、ＨＰＬＣ等の精密な分析機器を用いて検出する以外には、その存在を検出する手段がなかった。また、前記有効成分の濃度を定量する場合も全く同様である。しかしながら、前記分析機器では、試料の調製や操作が非常に煩雑であることから、迅速かつ容易な検出又は定量を行うことはできなかった。
【０００５】
この発明は、上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、エレウスロシド関連化合物の検出を容易に行うことができる抗体及びその製造方法を提供することにある。その他の目的とするところは、エレウスロシド関連化合物の定量を容易かつ高精度に行うことができるエレウスロシド関連化合物の定量方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明の抗体は、エレウスロシド関連化合物に対する抗体であって、エレウスロシドＥ、エレウスロシドＢ、メディオレシノールジグルコシド又はピノレシノールジグルコシドに結合することを特徴とするものである。
【０００７】
請求項２に記載の発明の抗体の製造方法は、エレウスロシド関連化合物に対する抗体を製造する方法であって、エレウスロシドＥ、エレウスロシドＢ、メディオレシノールジグルコシド又はピノレシノールジグルコシドを構成する糖の一部を切断し、その切断された末端に抗原性担体を共有結合させたものを抗原として抗体を作製することを特徴とするものである。
【０００８】
請求項３に記載の発明のエレウスロシド関連化合物の定量方法は、請求項１に記載の抗体を用いて、競合的ＥＬＩＳＡにてエレウスロシド関連化合物の濃度を定量することを特徴とするものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
実施形態の抗体は、エレウスロシド（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｓｉｄｅ）関連化合物（以下、Ｅ関連化合物と記載する）に対して結合するものである。前記結合するとは、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）等の検出手段により特異的な抗原抗体反応が検出可能であることを意味する。前記Ｅ関連化合物としては、下記化１に示されるエレウスロシドＥ（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｓｉｄｅ  Ｅ）、下記化２に示されるエレウスロシドＢ（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｓｉｄｅ  Ｂ）、下記化３に示されるメディオレシノールジグルコシド（ｍｅｄｉｏｒｅｓｉｎｏｌ−ｄｉ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、下記化４に示されるピノレシノールジグルコシド（ｐｉｎｏｒｅｓｉｎｏｌ−ｄｉ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）等が挙げられる。なお、下記化１〜化４に示されるＧｌｃはグリコシル基を示す。
【００１０】
【化１】
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【００１１】
【化２】
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【００１２】
【化３】
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【００１３】
【化４】
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これらＥ関連化合物はいずれも、アグリコンと、該アグリコンにグリコシド結合で繋がれた糖とからなる配糖体である。また、これらのＥ関連化合物は、いずれもリグナン類の骨格（リグナン骨格）を有する配糖体である。これらＥ関連化合物は、ウコギ科の植物エゾウコギ（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ  ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ  Ｈａｒｍｓ＝Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ  Ｍａｘｉｍ．）中に含まれる主要な有効成分であり、滋養強壮作用、鎮静作用、抗炎症（腫瘍抑制）作用、鎮痛・解熱作用、白血球増大作用、血圧降下（調整）作用、血糖降下作用、白髪防止・改善等の種々の薬理作用を発揮する。
【００１４】
これらのＥ関連化合物は、エゾウコギ等の植物組織中に極めて微量しか含有されていないうえ、抗原性がほとんどないことから、そのままの状態で免疫動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ等）に免疫しても抗体が産生されず、さらに各種アジュバントとともに免疫しても抗体が産生されない。ところが、これらのＥ関連化合物は、抗原性担体と共有結合した状態の抱合体を前記免疫動物に免疫することにより、強い抗原性が発揮されて抗体の産生が促進される。前記抗原性担体としては、それ単独で免疫動物に対して抗体産生を引き起こさせる性質を有しているうえ、アミノ基を備えたものが用いられる。さらに、この抗原性担体としては、比較的分子量が大きく、かつ免疫動物を死傷させないものであるが好ましく、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の蛋白質が入手容易であることから好適に用いられる。なお、前記蛋白質は、抗原性を高めるために免疫動物とは異なる種由来のものであるのが好ましい。
【００１５】
前記抱合体を作製する際には、例えば図１に示されるような反応が行われる。図１は、エレウスロシドＥとＢＳＡとからなる抱合体を作製する際の反応を模式的に示したものである。前記抱合体は、まず、エレウスロシドＥの末端（一端又は両端）に存在するβ−Ｄ（＋）−グリコシル基における２位の炭素原子と３位の炭素原子との間のＣ−Ｃ結合を過ヨウ素酸ナトリウム等の強力な酸化剤を用いて切断した後、ＢＳＡのポリペプチド鎖内のアミノ基と共有結合させることにより得られる。前記アミノ基としては、ＢＳＡのポリペプチド鎖のＮ末端に存在するα−アミノ基、又はポリペプチド鎖内の特にリシン、アルギニン等のアミノ酸側鎖に存在するアミノ基が挙げられる。
【００１６】
この抗体は、前記抱合体を抗原として用い常法に従って製造される。この抗体としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が挙げられるが、抗原抗体反応の特異性が高く、Ｅ関連化合物の含有量をより正確かつ詳細に調査できることから、ＭＡｂであるのが好ましい。さらに、抗体のクラスとしては、抗原に対する結合定数が高く、より特異的に抗原と結合することができることから、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であるのが好ましい。
【００１７】
実施形態のＥ関連化合物の定量方法は、Ｅ関連化合物の含有量を迅速かつ容易に定量するために標識化免疫定量法を用いて行われる。前記標識化免疫定量法としては、酵素免疫定量法（ＥＩＡ）や蛍光免疫定量法（ＦＩＡ）が挙げられるが、取り扱いが容易でかつ高感度であることからＥＩＡを用いるのが好ましく、取り扱い性及び感度に優れていることから競合的ＥＬＩＳＡで定量するのが最も好ましい。
【００１８】
この定量方法は、まず、一定量の抱合体を含む溶液を標識化免疫定量法に適したウェルに入れて静置し、該抱合体をウェルに吸着させた後、緩衝液等を用いてウェルを洗浄し、吸着されなかった抱合体を除去する。なお、前記抱合体としては、上記抗原性担体とＥ関連化合物とが共有結合された抱合体を用いても構わないが、非特異的な抗原抗体反応を抑えて定量精度を高めるために、上記抗体の製造に使用したものとは異なる担体とＥ関連化合物とが共有結合したものを用いるのが好ましい。この担体としては、抗原性を有さないもの、又は前記抗原性担体とは異なる蛋白質若しくは同抗原性担体とは異なる種由来の蛋白質が好適に用いられる。なお、前記ウェルを洗浄した後、スキンミルク等のブロッキング剤を含有する緩衝液をウェルに加えて静置し、ブロッキング操作を行うのが好ましく、この場合には非特異的な抗原抗体反応を効果的に抑制することが可能となって定量精度がより一層向上する。
【００１９】
続いて、Ｅ関連化合物を含有する濃度未知の溶液とともに一定量の抗体をウェルに添加してインキュベートし、抗原抗体反応を行わせる。その後、ウェルから溶液全てを除去し、標識化免疫定量法において使用される緩衝液で数回ウェルを洗浄し、好ましくはＥＬＩＳＡにて発色させて定量を行う。ＥＬＩＳＡで定量する場合、ウェル内の発色した溶液の吸光度を測定し、予め濃度既知のＥ関連化合物溶液の希釈系列から作製した検量線を利用して、濃度未知溶液中に含有されるＥ関連化合物の含有量が求められる。
【００２０】
以上のようなＥ関連化合物の定量方法は、濃度未知溶液に存在するＥ関連化合物と前記抱合体とが、抗体に対して競合的に結合する性質を利用している。即ち、ウェルに吸着されている抱合体の量は一定であることから、ウェル内に遊離しているＥ関連化合物量に反比例して抱合体に結合する１次抗体の量が決定される。そして、１次抗体が結合した抱合体量に比例して標識化２次抗体が結合し、吸光度等の上昇によって濃度未知溶液中のＥ関連化合物含有量が定量される。
【００２１】
次に、上記実施形態によって発揮される効果について説明する。
・  実施形態のＥ関連化合物に対する抗体は、Ｅ関連化合物のうちの１種類又は複数種類に対し抗原抗体反応により特異的に結合するものである。この抗体は、エゾウコギエキス等に極めて微量にしか含有されていない有効成分としてのＥ関連化合物を迅速かつ容易に検出することができるうえ、Ｅ関連化合物の含有量を迅速かつ容易に定量することができる。このとき、極めて再現性の高いＥ関連化合物の検出又は定量を容易に行うことができることから、エゾウコギエキスを含む製品の品質管理を著しく容易に行うことができる。
【００２２】
・  実施形態の抗体の製造方法は、Ｅ関連化合物を構成する糖の一部を切断し、その切断された末端にアミノ基を有する抗原性担体を共有結合させた抱合体を抗原として用いて抗体を作製するものである。このため、この製造方法では、前記抱合体を抗原として用いることによって、抗原性がないＥ関連化合物の抗原性を飛躍的に高めることができ、Ｅ関連化合物に対する特異性の高い抗体を容易かつ確実に得ることができる。
【００２３】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例及び比較例について説明する。
＜抗エレウスロシドＥ  ＭＡｂ産生ハイブリドーマの製造＞
１）抗原の調製：エレウスロシドＥ５ｍｇをメタノール４ｍｌに溶解した後、５ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを水０．６ｍｌに溶かした液を攪拌しながら滴下し、室温で１時間反応させた。前記エレウスロシドＥは、中国産エゾウコギの粉砕物から３０％エタノールで抽出した後に逆相ＨＰＬＣにて精製したものである。次に、市販のＢＳＡを溶解させた５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）１ｍｌを添加し、撹拌しながら５時間反応させた。この反応液を水中（４℃）にて透析した後に凍結乾燥したところ、エレウスロシドＥ−ＢＳＡ抱合体（以下、Ｅ−ＢＳＡ抱合体と記載する）４．８ｍｇが得られた。また、その後のスクリーニングや定量等に使用するための抗原として、ＢＳＡの代わりにＨＳＡを用いて上記と同様にエレウスロシドＥ−ＨＳＡ抱合体（以下、Ｅ−ＨＳＡ抱合体と記載する）を作製した。
【００２４】
２）抗原中のハプテン数の検討：得られたＥ−ＢＳＡ抱合体を微量とり、過剰量のシナピン酸を加えて混合した後、その一部をマルデイトフマス・マススペクトログラフィー（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  ＬａｓｅｒＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｐｈｙ）にて質量（ｍ／ｚ）を測定し、抗原（抱合体）のハプテン数を推定した。結果を図３に示す。図３より、質量７４３２１ｍ／ｚを頂点とするピークが抗原（Ｅ−ＢＳＡ）の質量を表している。ＢＳＡの分子量が６６４３３、エレウスロシドＥの分子量が７４２であることから、１分子のＢＳＡに対して平均１０．６分子のエレウスロシドＥが共有結合していることが示された。
【００２５】
３）免疫脾細胞の調製：Ｅ−ＢＳＡ抱合体５０μｇをフロイントの完全アジュバントに乳濁化させ、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内に投与した。２週間及び４週間経過後、前記と同様にＥ−ＢＳＡ抱合体アジュバント溶液を腹腔内投与し、６週間後にＥ−ＢＳＡ抱合体１００μｇを投与して免疫を完了した。３日後、マウスを麻酔下屠殺し、外科的に脾臓を摘出した。摘出された脾臓を細断した後、１００メッシュのナイロン網で濾過して脾細胞を単離した。
【００２６】
４）ハイブリドーマの調製：単離された脾細胞に低張液である１５５ｍＭ塩化アンモニウム水溶液を加えて赤血球を溶血させた後、ｅ−ＲＤＦ培地（ワコー純薬工業社製）を用いて脾細胞を３回洗浄した。同様に、培養したマウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３．（ＨＧＰＲＴ−  ）をｅ−ＲＤＦ培地にて３回洗浄した。そして、適量のｅ−ＲＤＦ培地に懸濁した脾細胞及び骨髄腫細胞の細胞数を計測し、脾細胞と骨髄腫細胞とを１０対１の割合で混合した後、軽く遠心した。上清を除去した後、遠心管の底部に沈澱している細胞を充分に解きほぐし、ＰＥＧ４０００をｅ−ＲＤＦ培地に溶解した溶液（ＰＥＧ４０００の濃度は５０重量％）を１．０ｍｌ滴下し、３７℃で３０秒間静置して細胞融合を行った。次に、ｅ−ＲＤＦ培地５ｍｌを５分間かけてゆっくりと添加した後、１０００ｒｐｍで１０分間遠心した。１０容量％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地（ワコー純薬工業社製）を用いて沈澱した細胞を洗浄し、軽く遠心して上清を捨てた。次に、１０−２Ｍヒポキサンチン、４×１０−７Ｍアミノプテリン、１．５×１０−５Ｍチミジン及び１０容量％ＦＣＳを含有するｅ−ＲＤＦ培地（ＨＡＴ培地）を加えて沈澱した細胞を浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注した。以後、３日毎にＨＡＴ培地を５０μｌずつ交換し、細胞（ハイブリドーマ）の増殖を確認した。
【００２７】
５）ＭＡｂ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング：ハイブリドーマの増殖が確認されたウェル内にある培養上清を採取し、予めＥ−ＨＳＡ抱合体を結合させた別のウェルに添加した。それらのウェルに対してＥＬＩＳＡにより発色させ、エレウスロシドＥに対するＭＡｂ産生ハイブリドーマをスクリーニングした。即ち、９６ウェルマイクロプレートに１μｇ／ｍｌのＥ−ＨＳＡ抱合体溶液を１００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートしてＥ−ＨＳＡ抱合体をウェルに吸着させた。そして、これらのウェル内にハイブリドーマの培養上清を１００μｌずつ添加して抗原抗体反応を行った後、０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液（以下、Ｔ−ＰＢＳと記載する）を用いて３回洗浄した。次に、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（オルガノンテクニカチャペルプロダクツ社製）の１０００倍希釈液（希釈はＴ−ＰＢＳにより行われた）を１ウェル当たり１００μｌずつ添加し、１時間後にＴ−ＰＢＳで洗浄した。その後、０．００３容量％過酸化水素及び０．３ｍｇ／ｍｌの基質である２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾ−チアゾリン−６−スルフォニックアシッド）ジアンモニウムサルト（ＡＢＴＳ）を含有するクエン酸緩衝液を添加して発色させた。２０分後、プレートリーダーを用いて波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、有意な発色が確認されたウェルの細胞を採取した。
【００２８】
６）ＭＡｂ産生ハイブリドーマのクローニング：抗体産生ハイブリドーマを限界希釈して複数のウェルに分注し、抗体産生能とともに増殖能を同時に有するハイブリドーマを選別した。このクローニング操作を合計３回行うことにより、１種類のハイブリドーマ・クローンが得られた。
【００２９】
７）抗エレウスロシドＥ  ＭＡｂの調製：前記ＭＡｂ抗体産生ハイブリドーマを１０μｇ／ｍｌインスリン、３５μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン及び２５μＭセレニウムを含有するｅ−ＲＤＦ無血清培地で３７℃、５％ＣＯ２の炭酸ガス培養器内で培養した。それらの培養上清をプロテインＧＦＦカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）にかけて抗エレウスロシドＥ  ＭＡｂを精製した。即ち、前記ハイブリドーマの培養上清を採取してトリス緩衝液でｐＨ７に調整した後にプロテインＧＦＦカラムに吸着させ、１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄した。そして、カラムに吸着されている抗体を１００ｍＭクエン酸緩衝液で溶出して抗体溶液を得た。得られた抗体溶液を水に対して４回透析し、最後に凍結乾燥することにより精製ＭＡｂ抗体を得た。
【００３０】
８）競合的ＥＬＩＳＡによるＭＡｂ抗体の検量線の作製：１μｇ／ｍｌのＥ−ＨＳＡ抱合体溶液を５０μｌずつウェルに添加し、１時間静置してウェルに吸着させた。非特異的結合を除去するために、５％のスキンミルクを含有するＰＢＳ溶液３００μｌを加え、１時間静置してブロッキングした。各種濃度のエレウスロシドＥ溶液５０μｌを１０容量％メタノール水溶液に溶解した後、さらに１μｇ／ｍｌの抗エレウスロシドＥ  ＭＡｂ溶液５０μｌを添加して１時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳを用いて３回ウェルを洗浄し、１０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体１００μｌを加え、１時間インキュベートして反応させた。その後、Ｔ−ＰＢＳでウェルを洗浄し、０．００３容量％過酸化水素及び０．３ｍｇ／ｍｌＡＢＴＳを含有するクエン酸緩衝液を添加して発色させた。１５分経過後、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作製した。結果を図４に示す。なお、図４の横軸にはエレウスロシドＥの濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。その結果、この検量線はエレウスロシドＥ濃度が０．０１〜１．３μｇ／ｍｌの範囲にある場合に特に有用であることが分かる。
【００３１】
９）交差反応性の調査：下記表１に示されるＥ関連化合物及びその類似化合物について、前記抗エレウスロシドＥ  ＭＡｂに対する交差反応性を調査した。前記類似化合物としては、図２に示されるガーリック酸（ｇａｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、シナピニック酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、バイカリン（ｂａｉｃａｌｉｎ）、オゴニン−７−Ｏ−グルクロニド（ｗｏｇｏｎｉｎ−７−Ｏ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）を用いた（ＧｌｃＡはグルクロン酸を示す）。即ち、まず、表１に示される化合物（試験用化合物）溶液（溶媒は１０容量％メタノール水溶液）の希釈系列（濃度が０ｎｇ／ｍｌであるものを含む）を用いて、前記８）の競合的ＥＬＩＳＡと同じ方法により発色させて検量線を作製した。次に、これらの検量線から濃度０ｎｇ／ｍｌの場合の吸光度に対して吸光度が５０％となる濃度（以下、Ｃ５０と記載する）を求め、以下に示す計算式に従って交差反応性（％）を求めた。結果を表１に示す。
【００３２】
【数１】
2004346051.tif 000007
【００３３】
【表１】
2004346051.tif 000008
表１の結果より、このＭＡｂ抗体は、前記類似化合物に対しては全く交差反応性を有しておらず、Ｅ関連化合物に特異的に反応するＭＡｂ抗体であることが示された。さらに、このＭＡｂ抗体は、エゾウコギに含まれる最も主要な有効成分であるエレウスロシドＥに対し特に高い親和性を有するものであることが明らかとなった。さらに、このＭＡｂ抗体は、エレウスロシドＢ及びメディオレシノールジグルコシドに対し１３〜１５％程度の弱い交差反応性が認められた。また、このＭＡｂ抗体は、ピノレシノールジグルコシドに対して、感度は極端に低いながらもその検出を行うことが可能であることも示された。
【００３４】
これらの化合物の構造を比較すると、上記化１〜化４に示される各Ｅ関連化合物の端部に存在するグルコシル基及び該グルコシル基に近接する対向する一対のメトキシ基が前記ＭＡｂ抗体によって認識されているものと推測される。さらに、前記グルコシル基及びメトキシ基の基端部に位置するベンゼン環も認識に関与しているものと推測される。加えて、前記一対のメトキシ基のうちの一方がない構造では、前記ＭＡｂ抗体の認識が極端に低下されることも推測される。
【００３５】
また、この製造方法では、前記エレウスロシドＥ以外にも、その他のＥ関連化合物を抗原（抱合体）に用いた場合でも、各化合物に特異的に結合するであろう抗体が得られることが、この交差反応性の調査から明確に裏付けられた。さらに、前記抗体は、抗原（抱合体）として用いられた化合物以外のＥ関連化合物に対しても、ある程度の交差反応性が見られるものと推測され得る。
【００３６】
１０）各種エゾウコギ中のエレウスロシドＥ含有量の定量：下記表２に示されるエゾウコギの乾燥粉末５ｍｇにメタノール０．５ｍｌを添加し、メタノール中に溶解された成分を抽出した。この抽出操作を合計５回行い、全ての抽出液を合わせて遠心分離を行い、不溶解物を沈澱させた。上清を１０容量％メタノール水溶液を用いて適切な濃度に希釈し、前記ＭＡｂ抗体を用いて、前記８）の競合的ＥＬＩＳＡと同じ方法により発色させて波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、８）で作製した検量線を利用して各エゾウコギ中のエレウスロシドＥ含有量（重量％）を決定した。一方、通常行われている逆相ＨＰＬＣにより、同じ試料についてエレウスロシドＥ含有量及びエレウスロシドＢ含有量を測定した。結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
2004346051.tif 000009
その結果、競合的ＥＬＩＳＡで定量したエレウスロシドＥ含有量の測定結果と、逆相ＨＰＬＣで定量したエレウスロシドＥ含有量の測定結果とは非常に良好な一致を見たことから、競合的ＥＬＩＳＡによるエレウスロシドＥ含有量の定量が実用的なものであることが確認された。さらに、データは示さないが、競合的ＥＬＩＳＡによる定量は酵素反応による増幅作用を有していることから、逆相ＨＰＬＣ等の従来の定量方法よりも１０００倍程度高感度であり、極めて微量に含有されるＥ関連化合物の検出及び定量に適したものであると言える。従って、前記ＭＡｂ抗体を用いた競合的ＥＬＩＳＡによるＥ関連化合物の定量方法は、作業が極めて迅速かつ簡便であることから、Ｅ関連化合物を含有する製品の品質検査に際して著しく実用的であるうえ、高感度かつ再現性が良好であって信頼性が高い方法であることが確認された。
【００３８】
なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・  エレウスロシドＢ、メディオレシノールジグルコシド又はピノレシノールジグルコシドを用いて抱合体を作製した後、該抱合体を抗原として抗体を作製してもよい。このように構成した場合、上記エレウスロシドＥと抗原性担体とからなる抱合体を抗原として作製された抗体の場合と同様に、抱合体を構成するＥ関連化合物に対し特に高い特異性を持った抗体を容易に製造することができる。
【００３９】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・  エレウスロシドＥ、エレウスロシドＢ、メディオレシノールジグルコシド及びピノレシノールジグルコシドから選ばれる少なくとも１種に結合することを特徴とする抗体。このように構成した場合、エレウスロシド関連化合物の検出を容易に行うことができる。
【００４０】
・  前記抗原性担体はアミノ基を備えていることを特徴とする請求項２に記載の抗体の製造方法。前記抗原性担体は蛋白質であることを特徴とする請求項２に記載の抗体の製造方法。
【００４１】
・  エレウスロシド関連化合物を定量する方法であって、担体と共有結合したエレウスロシド関連化合物を吸着させたウェルにエレウスロシド関連化合物溶液を添加し、さらに請求項１に記載の抗体を加えてインキュベートした後にウェルを洗浄し、標識化免疫定量法を用いてエレウスロシド関連化合物溶液中のエレウスロシド関連化合物濃度を定量することを特徴とするエレウスロシド関連化合物の定量方法。このように構成した場合、エレウスロシド関連化合物の定量を容易かつ高精度に行うことができる。
【００４２】
・  請求項１に記載の抗体を産生することを特徴とするモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ。このように構成した場合、エレウスロシド関連化合物の検出を容易に行うことができるモノクローナル抗体を極めて容易に製造することができる。
【００４３】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１に記載の発明の抗体によれば、エレウスロシド関連化合物の検出を容易に行うことができる。請求項２に記載の発明の抗体の製造方法によれば、エレウスロシド関連化合物の検出を容易に行うことができる抗体を容易に製造することができる。請求項３に記載の発明のエレウスロシド関連化合物の定量方法によれば、エレウスロシド関連化合物の定量を容易かつ高精度に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】エレウスロシドＥとＢＳＡとの結合反応を模式的に示す反応式。
【図２】実施例の類似化合物の構造を示す図。
【図３】実施例の抗原のハプテン数を調査したマススペクトログラフ。
【図４】実施例のＭＡｂ抗体の検量線を示す片対数グラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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