(57)【要約】【課題】血管新生阻害活性を有する新規化合物、その製造方法、それを有効成分として含有する医薬組成物、特に血管新生阻害剤、抗腫瘍剤を提供すること。【解決手段】以下の式（Ｉ）で表される化合物、その光学活性体、それらの製薬上許容される塩、それらの水和物；該化合物の生産菌である糸状菌を培地に培養し、これを生成蓄積せしめ、採取することを特徴とする該化合物の製造方法；これを有効成分として含有する医薬組成物、特に血管新生阻害剤、抗腫瘍剤。（式Ｉ）【化１】2004262881.tif 000008
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）で表される化合物、その光学活性体、それらの製薬上許容される塩、またはそれらの水和物。
（式Ｉ）
【化１】
2004262881.tif 000006
【請求項２】
以下の式（ＩＩ）で表される請求項Ｉに記載の化合物ＲＫ−９５１１３、その光学活性体、それらの製薬上許容される塩、またはそれらの水和物。
（式ＩＩ）
【化２】
2004262881.tif 000007
【請求項３】
請求項１又は２記載の化合物の生産菌である糸状菌を培地に培養し、請求項１又は２記載の化合物を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１又は２記載の化合物の製造方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項５】
過度の血管新生がその発症原因の一つとして関与して発症する疾患の予防及び／又は治療のための請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
疾患が、悪性腫瘍、糖尿病、糖尿病血管合併症、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、心筋梗塞、潰瘍性大腸炎、乾癬症、及び血管新生性緑内障からなる群から選ばれる請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１又は２記載の化合物を有効成分として含有する血管新生阻害剤。
【請求項８】
請求項１又は２記載の化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血管新生阻害作用を有する新規化合物、その製造方法、及びこれを有効成分として含有する血管新生阻害剤、抗腫瘍剤などの医薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種の進行固形癌の増殖や転移において血管新生が重要な生理現象であることが明らかになりつつある。血管新生は、１）腫瘍細胞より分泌された血管新生因子による刺激、２）周皮細胞の離脱や基底膜などの細胞外マトリックスの分解・消化、３）血管内皮細胞の遊走と増殖、４）内皮細胞による管腔形成、基底膜の形成、周皮細胞による血管の成熟化、などのステップを経て完成する。腫瘍血管新生においては、こうしてできた新生血管は腫瘍に酸素・栄養などを供給して成長を促進するとともに、腫瘍細胞の他の部位への浸潤転移ルートの役割を果たす（例えば、非特許文献１及び２参照）。なかでも、血管内皮細胞に選択的に増殖抑制を示す新規化合物は、血管新生阻害剤、抗腫瘍剤、転移抑制剤、抗リウマチ様関節炎剤などとして期待できる。さらには、血管新生阻害剤は、糖尿病血管合併症のひとつである糖尿病性網膜症などの治療薬としての可能性もある。現在、糖尿病性網膜症に対する治療は対症療法的な側面が強く、治療が後手にまわりしばしば盲目となり、有効な予防薬・治療薬が望まれている。近年、いろいろな作用機構による血管新生阻害剤（抗体などのタンパク性化合物や低分子量化合物）が臨床試験段階にあるが、リード化合物となりうる新しい化合物は不断の希求と考えられる。
【０００３】
【非特許文献１】Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ３２Ａ，  ２５３４−２５３９  （１９９６）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，  １，  ２７−３１（１９９５）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、血管新生阻害活性を有する新規化合物を提供することである。
本発明の他の目的は、上記化合物の製造方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、上記化合物を有効成分として含有する医薬組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、上記化合物を有効成分として含有する血管新生阻害剤を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、上記化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、糸状菌に属するＲＫ９５−１１３株の醗酵液から単離した化合物から血管新生阻害活性、抗腫瘍活性を有する新規化合物を見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明は、以下に示す新規化合物、その製造方法、上記化合物を有効成分として含有する医薬組成物、特に血管新生阻害剤及び抗腫瘍剤を提供するものである。
【０００６】
１．以下の式（Ｉ）で表される化合物、その光学活性体、それらの製薬上許容される塩、またはそれらの水和物。
（式Ｉ）
【化３】
2004262881.tif 000002
２．以下の式（ＩＩ）で表される上記Ｉに記載の化合物ＲＫ−９５１１３、その光学活性体、それらの製薬上許容される塩、またはそれらの水和物。
（式ＩＩ）
【化４】
2004262881.tif 000003
３．上記１又は２記載の化合物の生産菌である糸状菌を培地に培養し、上記１又は２記載の化合物を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記１又は２記載の化合物の製造方法。
４．上記１又は２記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
５．過度の血管新生がその発症原因の一つとして関与して発症する疾患の予防及び／又は治療のための上記４記載の医薬組成物。
６．疾患が、悪性腫瘍、糖尿病、糖尿病血管合併症、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、心筋梗塞、潰瘍性大腸炎、乾癬症、及び血管新生性緑内障からなる群から選ばれる上記５記載の医薬組成物。
７．上記１又は２記載の化合物を有効成分として含有する血管新生阻害剤。
８．上記１又は２記載の化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【０００７】
さらに別の観点からは、本発明は、過度の血管新生が疾病の要因と考えられる悪性腫瘍、糖尿病性網膜症などの治療方法であって、上記化合物の治療有効量を、ヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法、血管新生や血管内皮細胞の増殖の調節方法、悪性腫瘍の転移の調節方法などであって、上記化合物の有効量を細胞に接触させる工程を含む方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
式（Ｉ）で表される化合物は不斉炭素を有しており、不斉炭素に基づく光学異性体またはジアステレオマーなどの立体異性体が存在するが、本発明の範囲には純粋な形態の立体異性体のほか、任意の立体異性体の混合物またはラセミ体などが包含される。また、本発明化合物は複数のオレフィン性二重結合を有しており、それぞれの二重結合に基づく幾何異性体が存在する場合があるが、純粋な形態の幾何異性体のほか、任意の幾何異性体の混合物も本発明の範囲に包含される。「本発明化合物」という場合には、製薬上許容される塩、またはその水和物又は溶媒和している化合物も包含される。
式（Ｉ）で表される化合物のうち、好ましい化合物は式（ＩＩ）で表される化合物である。この化合物を本明細書において「ＲＫ−９５１１３」と呼ぶ場合がある。
【０００９】
本発明化合物の製造方法としては、微生物の醗酵生産物から分離採取する方法（抽出法）、およびそれらを出発原料として化学合成（合成法）する方法が挙げられる。抽出法においては、本発明化合物（Ｉ）を産生しうる微生物を通常の醗酵生産に用いる培地組成、培地条件で培養して培地中に化合物（Ｉ）を生成蓄積せしめ、これを分離採取する方法により化合物（Ｉ）を単離する。
本発明化合物（Ｉ）を生産しうる微生物としては糸状菌ＲＫ９５−１１３株が挙げられる。なお、該微生物は、平成２００３年２月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６）に受託番号ＦＥＲＭＰ−１９２３３として寄託されている。
【００１０】
本発明化合物（Ｉ）の生産培地としては、炭素源、窒素源および無機塩を適当に含有するものであれば合成培地または天然培地のいずれも好適に用いることができる。必要に応じて、ビタミン類またはその他栄養物質を適宜加えてもよい。
炭素源としては例えば、グルコース、マルトース、フラクトース、シュークロース、デンプン等の糖類、グリセロール、マンニトール等のアルコール類、グリシン、アラニン、アスパラギン等のアミノ酸類、大豆油、オリーブ油等の油脂類等の一般的な炭素源より、微生物の資化性を考慮して１種または２種以上を適宜選択して用いればよい。窒素源としては、大豆粉、コーンスチープリカー、ビーフエキス、ペプトン、酵母エキス、アミノ酸混合物、魚粉等の有機含窒素化合物またはアンモニウム塩、硝酸塩等の無機窒素化合物が挙げられ、微生物の資化性を考慮して１種または２種以上を適宜選択して用いればよい。無機塩としては、例えば炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバルト、各種リン酸塩を必要に応じて添加すればよい。また、消泡剤、例えば植物脂、ポリプロピレンアルコール等は必要に応じて添加することができる。
【００１１】
培養温度は微生物が生育し本発明化合物（Ｉ）を生産する範囲で適宜変更できるが、好ましくは１０−３２℃であり、さらに好ましくは２０−２８℃である。初発ｐＨは６−８付近が望ましく、培養時間は通常４日〜数週間程度であるが、本発明化合物（Ｉ）の生産量が採取可能な量に達したとき、好ましくは最高に達したときに培養を終了すればよい。培養法は、固相培養、通気攪拌培養等の通常用いられる方法であればいずれも好適に用いうる。
【００１２】
培養液から本発明化合物（Ｉ）を分離・単離するには、一般に微生物代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適宜利用して行うことができる。例えば、各種イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲル濾過クロマトグラフィー、または活性炭、アルミナ、シリカゲル等の吸着剤によるクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー、あるいは結晶化、減圧濃縮、又は凍結乾燥等の手段を単独でまたは適宜組み合わせて、あるいは反復して用いることが可能である。
【００１３】
本発明化合物は、後述する実験例に記載の通り、優れた血管新生抑制作用、抗腫瘍活性を示す。従って、本発明化合物は過度の血管新生がその発症原因の一つとして関与して発症する各種疾患などに有効である。例えば、悪性腫瘍、糖尿病、糖尿病血管合併症、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、心筋梗塞、潰瘍性大腸炎、乾癬症、及び血管新生性緑内障などの予防剤、治療剤、および抗腫瘍剤として使用することができる。
本発明化合物を、上記の疾患の治療あるいは予防を目的としてヒトに投与する場合は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤等として経口的に、または注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等として非経口的に投与することができる。また、本発明化合物の有効量を、その剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤等の医薬用添加剤を必要に応じて混合し、医薬製剤とすることができる。注射剤の場合には、適当な担体とともに滅菌処理を行って製剤とする。
【００１４】
本発明の医薬組成物の投与量は、疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、または体重によっても異なり、最終的には医師の判断に委ねられるが、成人に経口で投与する場合、通常、０．１−１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、１−２０ｍｇ／ｋｇ／日、非経口で投与する場合、通常、０．０１−１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．１−２ｍｇ／ｋｇ／日を投与する。これを１回あるいは数回に分割して投与すればよい。
【００１５】
また、本発明化合物を試薬として使用する場合には、有機溶剤又は含水有機溶剤に溶解して用いることができる。使用可能な有機溶剤としては、例えばメタノールやジメチルスルホキシド等を挙げることができる。剤型としては、例えば、粉末などの固形剤、又は有機溶剤若しくは含水有機溶剤に溶解した液体剤などを挙げることができる。通常、上記の化合物を試薬として用いて血管内皮細胞の増殖抑制作用を発揮させるための効果的な使用量は、０．００００１〜１  μｇ／ｍｌであるが、適切な使用量は培養細胞系の種類や使用目的により異なり、適宜選択可能である。また、必要により上記範囲外の量を用いることができる。
以下に実施例及び実験例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。「％」は他に明記しない限り質量％である。
【００１６】
【実施例】
実施例１
グルコース  ２．０％、可溶性デンプン  １．０％、ビーフ抽出液  ０．３％、乾燥酵母  ２．５％、食塩０．０５％、リン酸第２カリウム  ０．００５％、コーンスティープリカー  ０．３％、炭酸カルシウム  ０．０５％、硫酸マグネシウム  ０．０５％からなる組成の培地（ｐＨ  ７．２）に、糸状菌ＲＫ９５−１１３株を接種して２８℃で７２時間振盪培養を行った。この培養液１４０  ｍｌを同組成の培地１５リットルに接種し、２８℃で９６時間振盪培養を行った。
上記培養液を遠心分離器で菌体と上清に分離し、上清をｐＨ３．０に調整し、１５リットルの酢酸エチルで抽出した。抽出後、すべての酢酸エチルを合わせて減圧濃縮し、褐色のシロップ６．５  ｇを得た。このシロップをクロロホルム１０  ｍｌに溶解し、クロロホルムで充填したシリカゲルカラム（直径４  ｃｍ、長さ６０  ｃｍ）に浸潤させた。最初に、クロロホルム５００ｍｌで溶出した後、割合配合（容積比）を順次変えたクロロホルム−メタノール溶液（１００：０，  １００：１，  ５０：１，  ２０：１，  １０：１，  ５：１，  １：１）各５００  ｍｌずつで溶出した。
【００１７】
本発明化合物ＲＫ−９５１１３は、クロロホルム−メタノール溶液（１００：１）の画分に溶出した。この分画を減圧濃縮することにより、１．４８  ｇの褐色シロップを得た。次に、この褐色シロップ１．４８  ｇをアセトニトリル：水（９：１）溶液に溶解し、数回に分けて逆相ＯＤＳカラム（直径２  ｃｍ、長さ  ２５  ｃｍ、ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ、センシュー科学社製）を用いて、高速液体クロマトグラフィーによる分取（アセトニトリル：水＝２：８→アセトニトリル：水＝１０：０；直線的グラジエント（４０分）、流速９．０  ｍｌ／分）を行い活性画分（６．９  ｍｇ）を得た。さらに、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）による精製を行い、最終的に純粋な無色アモルファス状ＲＫ−９５１１３（２．２  ｍｇ）を得た。
【００１８】
以下にＲＫ−９５１１３の物理化学的性質を示す。
ＲＫ−９５１１３のＮＭＲデータを表１に示す（溶媒：重アセトン−ｄ６、δｐｐｍ、内部標準：  ＴＭＳ、１３Ｃ：１２５  ＭＨｚ、１Ｈ：５００  ＭＨｚ）。
性状：無色アモルファス状
比旋光度：−４０．０  （ｃ＝０．０３５，  ２３度，  エタノール）
分子式：Ｃ２４Ｈ３４Ｏ５
高分解能質量分析  （ＨＲ−ＥＩＭＳ）  ：
実験値  （ｍ／ｚ）：４０２．２３９３
理論値  （ｍ／ｚ）：４０２．２４０７
ＵＶ  λｍａｘ  ｎｍ  （メタノール）  （ε）：３００（４７８３０）
赤外吸収スペクトルν（ｃｍ−１）：２９２０，  １７００，  １６１０，  １２６５，  １２２５，  １１２５，  １００５
Ｒｆ値（シリカゲル６０  Ｆ２５４、メルク社製）：０．６３  （展開溶媒；  クロロホルム：メタノール＝５０：１）
呈色反応（陽性）：１０％硫酸（熱処理）
溶解性：メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドに易溶。ｎ−ヘキサン、水に不溶。
【００１９】
【化５】
2004262881.tif 000004
【００２０】
【表１】
2004262881.tif 000005
【００２１】
以下の方法に従って本発明化合物の活性を測定した。
試験例１  ＲＫ−９５１１３による正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓの増殖抑制効果
ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２  （クラボウ社）培地を用いて培養維持された正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓを９６穴プラスチックディッシュに１．５ｘ１０３の細胞数でまいた。細胞が接着後、一連の希釈したＲＫ−９５１１３を添加し（０．０１−１０  ｎｇ／ｍｌの濃度域）、４日後の細胞生存率を生細胞測定試薬ＷＳＴ−８ＴＭ試薬（２−２（メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩）（ナカライテスク社）を用いて検定した。細胞生存率は、以下の式で算出した。
細胞生存率＝１００×（サンプル存在下の吸光度−ブランクの吸光度）／（薬剤非存在下の吸光度−ブランクの吸光度）
ＲＫ−９５１１３は、０．１ｎｇ／ｍｌの濃度でＨＵＶＥＣ細胞の増殖を５０％阻害した。
【００２２】
試験例２  ＲＫ−９５１１３によるヒト正常肺繊維芽細胞ＷＩ−３８の増殖に与える影響
ＤＭＥＭ培地（１０％  ウシ胎児血清）を用いて培養維持された正常ヒト肺繊維芽細胞ＷＩ−３８を９６穴プラスチックディッシュに３ｘ１０３の細胞数でまいた。細胞が接着後、一連の希釈したＲＫ−９５１１３を添加し（０．０１−１０  ｎｇ／ｍｌの濃度域）、４日後の細胞生存率を生細胞測定試薬ＷＳＴ−８ＴＭ試薬（２−２（メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，  モノナトリウム塩）（ナカライテスク社）を用いて検定した。細胞生存率は、以下の式で算出した。
細胞生存率＝１００×（サンプル存在下の吸光度−ブランクの吸光度）／（薬剤非存在下の吸光度−ブランクの吸光度）
ＲＫ−９５１１３のＷＩ−３８細胞の増殖を５０％阻害する濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ以上であった。
【００２３】
製剤例１：注射・点滴剤
ＲＫ−９５１１３  １０  ｍｇを含有するように、粉末ブドウ糖５  ｇを加えてバイアルに無菌的に分配して密封し、窒素、ヘリウムなどの不活性ガスを封入して冷暗所に保存した。使用前にエタノールに溶解し、０．８５％生理的食塩水１００  ｍｌを添加して静脈内注射剤とし、一日あたり１０〜１００  ｍｌを症状に応じて静脈内注射または点滴で投与する。
【００２４】
製剤例２：顆粒剤
ＲＫ−９５１１３  １  ｇ、乳糖９８  ｇ、およびヒドロキシプロピルセルロース１  ｇをそれぞれ取り、よく混和した後、定法にしたがって粒状に成形し、それをよく乾燥して、瓶やヒートシール包装などに適した顆粒剤を製造した。一日あたり１００〜１０００  ｍｇを症状に応じて経口投与できる。
【００２５】
【発明の効果】
本発明の化合物は、血管内皮細胞の増殖を選択的に阻害することにより血管新生阻害活性、抗腫瘍活性、転移抑制活性を発揮することから、血管新生阻害剤、抗腫瘍剤、転移抑制剤、抗リウマチ様関節炎剤などとして有用であり、さらに具体的には、過度の血管新生がその発症原因の一つとして関与して発症する疾患、例えば、悪性腫瘍、糖尿病、糖尿病血管合併症、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、心筋梗塞、潰瘍性大腸炎、乾癬症、及び血管新生性緑内障などの治療及び／又は予防剤として有用である。