(57)【要約】【課題】簡易な構成によって、各処理工程における塵埃や細菌等による汚染を低減し、細胞の効率的な培養を可能とする。【解決手段】内部を滅菌処理され、その一部にガス透過膜６を備える容器本体２と、該容器本体２内部に連通し、先端を閉鎖された熱溶着可能な材質からなる少なくとも１本のチューブ３とを備える培養容器１を提供する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部を滅菌処理され、その一部にガス透過膜を備える容器本体と、該容器本体内部に連通し、先端を閉鎖された熱溶着可能な材質からなる少なくとも１本のチューブとを備える培養容器。
【請求項２】
前記容器本体が、扁平な形状を備え、
前記チューブが、前記容器本体の厚さ方向に沿う側面に備えられている請求項１に記載の培養容器。
【請求項３】
前記チューブが、前記容器本体の長手方向に対向する２側面に、それぞれ備えられている請求項２に記載の培養容器。
【請求項４】
内部を滅菌処理され、その一部にガス透過膜を備える扁平な容器本体内部に、所定の培地と細胞とを投入して培養する培養方法であって、
細胞培養時には、前記容器本体を略水平に配し、
培地交換時には、前記容器本体を略垂直に配して重力により培地を供給、排出する培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞を培養する培養容器および培養方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞を培養するには、患者から抽出された骨髄液等の体液から培養すべき細胞を抽出する抽出工程、培養すべき細胞に適した培地を調製する培地調製工程、抽出された細胞を適当な培養容器内に培地とともに投入して所定の培養条件下に配する一次培養工程、一次培養された細胞を生体組織補填材と混合してさらに培養する二次培養工程等、複数の工程が順次行われる。
【０００３】
従来、この種の細胞の培養は、全体を密封して内部の塵埃量を管理したクリーンベンチにおいて行うことが考えられている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特公平３−５７７４４号公報（第２頁第３欄等）
【０００５】
すなわち、クリーンベンチ内においては、例えば、天井側から床側に向かって流れる空気流が形成されており、各処理工程において塵埃等が生じた場合には、空気流によって塵埃等が床側に流され、床下に配置された集塵機によって回収されることになる。クリーンベンチ内にはロボットアームが配置されていて、各工程間において細胞を移動させることができるようになっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このように全ての処理工程を比較的大きなクリーンベンチ内で行う場合には、各工程が行われる空間が連続しているために、一の工程において発生する塵埃が、他の工程に配されている細胞に混入する可能性がある。したがって、複数の細胞を同時に培養する場合には、細胞間の混合が生じたり、添加する物質が汚染されたりしないように充分に気を付ける必要がある。
【０００７】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な構成によって、各処理工程における塵埃や細菌等による汚染を低減することができる培養容器および培養装置を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、内部を滅菌処理され、その一部にガス透過膜を備える容器本体と、該容器本体内部に連通し、先端を閉鎖された熱溶着可能な材質からなる少なくとも１本のチューブとを備える培養容器を提供する。
【０００９】
この発明によれば、容器本体の内部に培地と細胞とを封入して、所定の培養雰囲気内に配することにより、ガス透過膜を介して、必要濃度のガスが供給され、細胞の培養が促進される。この場合において、容器本体の内部は、ガスの透過を除き、外部からの物質の侵入がないので、無菌状態に保持され、感染等が防止されることになる。
【００１０】
また、容器本体に接続されたチューブに、空の他の容器や培地を封入した他の容器のチューブを熱溶着等することにより、内部を無菌状態に保持したまま培地を排出し、あるいは新たな培地を供給できる。したがって、密閉系において培地交換を行い、細胞を十分に増殖させることが可能となる。
【００１１】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の培養容器において、前記容器本体が、扁平な形状を備え、前記チューブが、前記容器本体の厚さ方向に沿う側面に備えられている培養容器を提供する。
この発明によれば、扁平形状の培養容器を略水平に配置して、比較的広い内表面を底面として、その底面において付着性の細胞を培養することが可能となる。この場合に、狭い培養室内においても上下方向に所定間隔をあけて配置すれば、複数の培養容器において、多数の検体について同時に効率的に細胞の培養を行うことが可能となる。また、チューブを容器本体の厚さ方向に沿う側面に備えることにより、容器本体を略水平に配置した培養状態においてもチューブを介して培地の入れ替え等を行うことが可能となる。
【００１２】
請求項３に係る発明は、請求項２に記載の培養容器において、前記チューブが、前記容器本体の長手方向に対向する２側面にそれぞれ備えられている培養容器を提供する。
この発明によれば、容器本体内部の培地を交換する際に、容器本体に設けられたチューブが上下に配されるように容器本体を略垂直に立てることにより、下方のチューブからの培地の排出、および、上方のチューブからの新たな培地の供給を、重力により効率的に行うことが可能となる。
【００１３】
請求項４に係る発明は、内部を滅菌処理され、その一部にガス透過膜を備える扁平な容器本体内部に、所定の培地と細胞とを投入して培養する培養方法であって、細胞培養時には、前記容器本体を略水平に配し、培地交換時には、前記容器本体を略垂直に配して重力により培地を供給、排出する培養方法を提供する。
この発明によれば、扁平な容器本体を略水平に配することにより、細胞に適正な培養環境を与えるとともに、培養スペースを効率的に利用して、多数の検体を同時に同一条件下で培養することが可能となる。また、容器本体を略垂直に立てることにより、培地交換を重力により効率的に行うことが可能となる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明の一実施形態に係る培養容器および培養方法について、図面を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器１は、図１に示されるように、容器本体２と、該容器本体２内部に連通し先端を閉鎖された２本以上のチューブ３とを備えている。
【００１５】
容器本体２は、扁平な直方体の箱状に形成された枠体４と、該枠体４の窓部５に貼られたガス透過膜６とから、扁平な内部空間を画定している。枠体４の窓部５は、容器本体２の最も広い２つの面の略全体にわたって設けられている。したがって、窓部５に貼られるガス透過膜６は、相互に小さい間隔をあけて平行に配置され、培養容器１が略水平に配置されたときに、容器本体２の底面および天面を構成するようになっている。ガス透過膜６は、例えば、ポリスチレンにより構成されている。
【００１６】
前記チューブ３は、前記容器本体２の枠体４に一体的に形成されている。チューブ３および枠体４は、熱溶着可能な材質、例えば、塩化ビニルにより形成されている。
チューブ３は、その一端を容器本体２内部に開口し、その他端を閉塞されている。容器本体２およびチューブ３の内部には滅菌処理が施されている。
【００１７】
このように構成された本実施形態に係る培養容器１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器１を用いて骨髄細胞を培養するには、容器本体２内に所定の培地および骨髄細胞を注入して、所定の培養条件に維持する。
培地は、例えば、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）、抗生剤を所定の配合比率で混合したものである。なお、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。
また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
【００１８】
所定の培養条件は、例えば、所定の温度（例えば、３７±０．５℃）、湿度（例えば、１００％）およびＣＯ２濃度（例えば、５％）等である。具体的には上記温度、湿度およびＣＯ２濃度に管理された培養室（図示略）内に、培養容器１を収容することにより培養条件が達成される。
【００１９】
このとき、培養容器１は、略水平に配されることにより、ガス透過膜６が略水平に配される。したがって、培地中に浮遊していた骨髄細胞の内、付着性の間葉系幹細胞が、底面に配されているガス透過膜６の内面に付着して成長し始める。培養室内は、所定の温度、湿度およびガス濃度に維持されているので、培養に適した温度および湿度下において、ガス透過膜６を透過してくるガスの供給を受けて、間葉系幹細胞が、効率的に培養されることになる。
【００２０】
この場合において、本実施形態に係る培養容器１は、扁平な直方体状に形成されているので、略水平に配された状態が最も細胞の培養に適した状態であるとともに、例えば、図２に示されるように、上下方向に間隔をあけて複数段に配置することができる。このように複数配置しても、扁平な形状のために、培養室内の占有スペースはさほど必要なく、スペースを有効利用して、多数の検体を同一の培養条件下において同時に培養することができる。
【００２１】
また、このような培養容器１を用いた培養過程において、細胞は培地内から栄養分を吸収して成長するとともに、培地内に排出物を排出するので、培地を定期的に交換する必要がある。
本実施形態に係る培養容器１には、容器本体２に接続するチューブ３が設けられているので、このチューブ３を利用して培地交換を行うことができる。
【００２２】
すなわち、培養容器１内の培地を交換するには、同様のチューブ７を有する空の容器８を培養容器のチューブに無菌的に接続する（図３参照）。
チューブ３，７どうしを無菌的に接続するには、例えば、図４（ａ）に示すように、平行に配した２本のチューブ３，７を、これらのせん断方向に移動する発熱板９によって、同時に溶融させながら切断した後に、同図（ｂ）に示すように、チューブ３，７どうしが一致するようにずらし、その後、同図（ｃ）に示すように、発熱板９を除去することにより連結する。連結部分は連結時には閉鎖されているが、外力により管壁どうしを連結させたまま内部流路を連通させることができるようになっている。これにより、内部を無菌状態に保持したままチューブ３，７どうしおよびこれらに一体的に設けられている容器本体２と容器８どうしを連結することができる。以下、この方法を無菌的チューブ接続方法と言う。
【００２３】
これにより、空の容器８と培養容器１の容器本体２とが無菌状態を保持したままチューブ３，７を介して連結されるので、密閉系において、培養容器１の容器本体２から接続されたチューブ３，７を介して空の容器８内に培地を排出することができる。
【００２４】
次に、排出された培地を収容した容器８と容器本体２との間のチューブ３を無菌的に切断する。チューブ３を無菌的に切断するには、図５に示す方法によって、切断することができる。すなわち、図５（ａ）に示すように、チューブ３のせん断方向に移動する発熱板９によって、同図（ｂ）に示すように、チューブ３を溶融させながら切断した後に、同図（ｃ）に示すように、発熱板９を除去することにより、チューブ３が、その端部を閉鎖された状態で切断される。以下、この方法を無菌的チューブ切断方法と言う。
【００２５】
この後に、新たな培地が封入された培地容器１０を無菌的チューブ接続により、培養容器１に接続し、該培地容器１０からチューブ３，１１を介して培養容器１の容器本体２内へ新たな培地を供給する。これにより、培地容器１０と培養容器１の容器本体２とが無菌状態を保持したままチューブ３，１１を介して連結されるので、密閉系において、培地容器１０から培養容器１の容器本体２へ、チューブ３，１１を介して新たな培地を供給することができる。そして、これにより、培養容器１内の培地が交換されることになる。
【００２６】
なお、培養容器１内の培地の交換は、図１，図２に示した細胞培養状態のままで、培養容器１の側面に配されるチューブ３に無菌的チューブ接続および無菌的チューブ切断を施して、空の容器８を吸引し、あるいは、培地容器１０を外部から加圧する等して、培養容器１の容器本体２内への培地の供給および排出を行うことにしてもよい。これに代えて、図３に示すように、一方のチューブ３に培地容器１０を無菌的チューブ接続し、他方のチューブ３に空の容器８を無菌的チューブ接続し、培地容器１０、培養容器１および空の容器８を、この順に上から下に配置することにより、重力により培養容器１内の廃棄培地を空の容器８内に排出し、培地容器１０内の新たな培地を培養容器１内へ供給することにしてもよい。これにより、動力を用いることなく、簡易に培地交換を行うことができる。
【００２７】
そして、このようにして細胞の培養期間中に、上記培養容器１内の培地交換を複数回にわたって行うことにより、ガス透過膜６上に間葉系幹細胞が充分に成長した後に、間葉系幹細胞を回収する。間葉系幹細胞の回収は、例えば、トリプシンのような蛋白質分解酵素を封入した容器（図示略）を、培養容器１のチューブ３に無菌的チューブ接続して、培養容器１の容器本体２内に供給する。これにより、間葉系幹細胞がガス透過膜６上から非侵襲的に剥離される。
この後に、培養容器１を遠心分離機にかけることにより、容器本体２内に封入されている培地から間葉系幹細胞を分離して回収することが可能となる。
【００２８】
このように、本実施形態に係る培養容器１および培養方法によれば、内部を滅菌状態に保持したまま、密閉系において細胞を培養することが可能となる。また、培養室内の限られたスペースを効率的に利用して、多数の検体を同時に同一培養条件下において培養することができるという効果がある。
【００２９】
なお、本実施形態に係る培養容器１は、間葉系幹細胞を培養する場合について説明したが、これに代えて、培地内に、例えば、βリン酸三カルシウム多孔体からなる骨補填材（図示略）を封入しておき、該骨補填材を足場として間葉系幹細胞を分化させることにより骨補填体を製造する場合に使用されてもよい。
骨補填材は、顆粒状でもブロック状でもよい。また、これに代えて、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。
【００３０】
この場合に、容器本体２の内部には、成長因子Ｃとして、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を混合することにしてもよい。また、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤を混合することにしてもよい。
【００３１】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明によれば、簡易な構成により、スペースを有効利用して、多数の検体を同一条件下において同時に培養することができるとともに、必要な培地等を密閉系において、供給・排出することができる。したがって、検体相互間の細菌等の感染を防止し、効率的に健全な培養細胞あるいは生体組織補填体を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施形態に係る培養容器を示す斜視図である。
【図２】図１の培養容器を複数配列した状態を示す斜視図である。
【図３】図１の培養容器における培地交換方法の一例を示す説明図である。
【図４】無菌的チューブ接続を説明する説明図である。
【図５】無菌的チューブ切断を説明する説明図である。
【符号の説明】
１　培養容器
２　容器本体
３　チューブ
６　ガス透過膜
【図１】
2004129568.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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