(57)【要約】【課題】本発明は、ビール有害菌ペクチネータス（Pectinatus）属菌の検出、そのための遺伝子配列およびこれを用いる該菌の検出方法に関する。【解決手段】検体中に存在するペクチネータス（Pectinatus）属菌に属するペクチネータス・セルビシフィラス（P.cerevisiiphillus）菌を選択的に検出するため、ペクチネータス属菌の16SリボソームRNA遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的である特定の配列から選ばれる配列からなるか、または対応する相補的である配列であることを特徴とするオリゴヌクレオチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に存在するペクチネータス（Pectinatus）属菌に属するペクチネータス・セルビシフィラス（P.cerevisiiphillus）菌を選択的に検出するため、ペクチネータス属菌の16SリボソームRNA遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的である以下の配列１〜４から選ばれる配列からなるか、または対応する相補的である配列であることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
　5'-CAGGCGGATGACTAAGCG-3'　　１
　5'-TGGGATTCGAACTGGTCA-3'　　２
　5'-CTCAAGATGACCAGTTCG-3'　　３
　5'-AATATGCATCTCTGCATACG-3'　４
【請求項２】
検体中に存在するペクチネータス（Pectinatus）属菌に属するペクチネータス・フリシンゲンシス（P.frisingensis) 菌を選択的に検出するため、ペクチネータス属菌の16SリボソームRNA遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的である以下の配列５〜８から選ばれる配列からなるか、または対応する相補的である配列であることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
　5'-CAGGCGGAACATTAAGCG-3'　　５
　5'-ATGGGGTCCGAACTGAGG-3'　　６
　5'-CTCAAGAACCTCAGTTCG-3'　　７
　5'-AATATCCATCTCTGGATACG-3'　８
【請求項３】
検体中に存在するペクチネータス（Pectinatus）sp. DSM20764菌を選択的に検出するため、ペクチネータス属菌の16SリボソームRNA遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的である以下の配列９〜10から選ばれる配列からなるか、または対応する相補的である配列であることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
5'-TGGGGTCCGAACTGAATG-3'　　９
5'-GCATCCATCTCTGAATGCG-3'　 10
【請求項４】
請求項１、２または３に記載されたオリゴヌクレオチドのうち、少なくとも連続した10塩基以上を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１、２または３に記載されたオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプライマーとして機能させる、標的のヌクレオチド配列を増幅させる方法。
【請求項６】
請求項１、２または３に記載されたオリゴヌクレオチドの配列群のうち、少なくとも１つをＤＮＡ検出用のプローブとして機能させる方法。
【請求項７】
請求項１、２または３に記載されたオリゴヌクレオチドの配列群のうち、少なくとも１つが標識物により修飾されたオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビール有害菌ペクチネータス（Pectinatus）属菌の検出に関する。さらに詳しくは、ビール有害菌であるペクチネータス・セルビシフィラス（P.cerevisiiphillus）菌、ペクチネータス・フリシンゲンシス（P. frisingensis）菌、ペクチネータス
sp. DSM20764 菌をそれぞれ検出するための遺伝子配列およびこれを用いる該菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ビール製造における微生物検査では、菌種を同定するには、増殖培養、分離培養を経て、菌を単離しなければならず、少なくとも７日は要する。その後、単離した菌を増殖させ、形態観察、グラム染色性、カタラーゼ試験、糖資化性などの多くの性状試験を行うことにより同定を行っている。これらの多岐にわたる検査は煩雑であり、時間も費用もかかる。また、これら一般に行われている同定試験のほかに、単離した菌からDNAを抽出し、それを膜上あるいは他の支持体上に固定し、標準菌のDNAをプローブとしてハイブリダイゼイション試験を行うことにより菌種を同定する方法がある。しかし、この方法も数日を要し、さらに十分な検出感度および選択性を得るのが難しい。
【０００３】
　より迅速な菌検出法として、最近では、生物ルミネッセンスを利用したATP発光法により生菌の検出を行う方法があるが（非特許文献１参照）、菌種を問わずに検出するため、同定には全く利用できない。また、ビールに有害な一部の乳酸菌、例えば、Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei,
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus coryniformis等については、乳酸菌に特異的な抗体を使用することによって、比較的早期の同定が可能となっている（特許文献１、特許文献２参照）。しかし、この方法を適用するためには、菌を単離するまでの操作が必要なために、その分日数を要し、さらに十分な検出感度および選択性を得るのが難しい。
【０００４】
　そこで、さらに迅速な検出法が検討され、最近では、検体となる乳酸菌のDNAを抽出し、このDNAに相補的なオリゴヌクレオチドをプライマーとして機能させたPCR法を用いた乳酸菌を検出する方法がある（特許文献３、特許文献４、非特許文献２参照）。
【０００５】
　一方、近年、偏性嫌気性菌であるペクチネータス属菌が、製品ビールに対して悪影響を与える菌であることが確認されている。この菌の検出に対して、ペクチネータス属菌を検出するための選択分離培地の検討（非特許文献３参照）、主要抗原決定基のイムノブロット分析による同定（非特許文献４参照)、蛍光免疫法を利用した検出（非特許文献５参照）が試みられているが、検出感度や検出時間等の面から満足できる方法はまだ確立されていない。
【特許文献１】特開平6-46811号公報
【特許文献２】特開平6-311894号公報
【特許文献３】特開平5-15400号公報
【特許文献４】特開平6-141899号公報
【非特許文献１】J. Am. Soc. Brew. Chem.: 52(1) 19-23, 1994
【非特許文献２】J. Am. Soc. Brew. Chem.: 52(3) 95-99, 1994
【非特許文献３】J. Am. Soc. Brew. Chem.:52(3) 115-119, 1994
【非特許文献４】FEMS. MICROBIOL . LETT.: 67(3) 307-311, 1990
【非特許文献５】J. Am. Soc. Brew. Chem.: 51(4) 158-163, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明では、ペクチネータス属菌をより迅速に感度良く検出し、同時に同定できる方法を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ペクチネータス属菌の16Sリボソーム遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作成し、これらをプライマーとして機能させて遺伝子増幅に用い、各該菌を選択的に検出することを特徴とする方法を提供するものである。
【０００８】
　そして、ペクチネータス・セルビシフィラス菌を特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは以下の配列１〜４、
　5'-CAGGCGGATGACTAAGCG-3'　　１
　5'-TGGGATTCGAACTGGTCA-3'　　２
　5'-CTCAAGATGACCAGTTCG-3'　　３
　5'-AATATGCATCTCTGCATACG-3'　４
から選ばれる配列からなるか、または対応する相補的配列、即ち、
１の配列に対しては、5'-CGCTTAGTCATCCGCCTG-3'
２の配列に対しては、5'-TGACCAGTTCGAATCCCA-3'
３の配列に対しては、5'-CGAACTGGTCATCTTGAG-3'
４の配列に対しては、5'-CGTATGCAGAGATGCATATT-3'
であることを特徴とする。
【０００９】
　また、ペクチネータス・フリシンゲンシス菌を特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは以下の配列５〜８、
　5'-CAGGCGGAACATTAAGCG-3'　　５
　5'-ATGGGGTCCGAACTGAGG-3'　　６
　5'-CTCAAGAACCTCAGTTCG-3'　　７
　5'-AATATCCATCTCTGGATACG-3'　８
から選ばれる配列からなるか、または対応する相補的配列、即ち、
５の配列に対しては、5'-CGCTTAATGTTCCGCCTG-3'
６の配列に対しては、5'-CCTCAGTTCGGACCCCAT-3'
７の配列に対しては、5'-CGAACTGAGGTTCTTGAG-3'
８の配列に対しては、5'-CGTATCCAGAGATGGATATT-3'
であることを特徴とする。
【００１０】
さらに、ペクチネータス sp. DSM20764 菌の16SリボソームRNA遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的であるオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが以下の配列９〜10、
5'-TGGGGTCCGAACTGAATG-3'　　 ９　　　　　　　　　　　　　　　
5'-GCATCCATCTCTGAATGCG-3'　  10
から選ばれる配列からなるか、または対応する相補的配列、即ち、
９の配列に対しては、5'-CATTCAGTTCGGACCCCA-3'
10の配列に対しては、5'-CGCATTCAGAGATGGATGC-3' 
であることを特徴とする。
【００１１】
　また本発明は、ペクチネータス（Pectinatus）sp. DSM20764菌の16SリボソームRNAをコードするＤＮＡである。そして、前記塩基配列の全部は下記の配列番号：１に示される。なお、ペクチネータス（Pectinatus）sp. DSM20764菌はドイツの菌株保存機関である
DSM-Deutche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH から入手可能な菌である。
【００１２】
遺伝子増幅に関する技術はすでに公知であり、Saikiらが開発したPolymerase Chain Reaction法（以下、PCR法と略す；Science
230, 1350, 1985) を基に行うことができる。この方法は、特定の遺伝子配列を増幅させる反応で、迅速・高感度で高い特異性を持ち、かつ簡便であることから、遺伝学的研究のみならず、近年は、医療分野における病原菌の迅速判定や、食品分野における有害菌の迅速検出にも応用が試みられてきている。PCR法を行うことにより、検体中に僅かな量しか標的配列が存在していなくても、２つのプライマーが挟む標的ヌクレオチド配列は何百万倍にも増幅され、検出が可能までに大量にそのコピーが産生される。また、PCR法を行うには、検体中に存在する菌から核酸成分を遊離させる必要があるが、PCRは標的配列が数分子以上存在すれば増幅反応が進むので、溶菌酵素や界面活性剤を用いた簡便な前処理をするだけで十分に試験に供することができる。そのため、従来の細菌検出法に比べ、利用価値が非常に高い。
【００１３】
これらのことを利用すべく、本発明では、ペクチネータス・セルビシフィラス菌、ペクチネータス・フリシンゲンシス菌およびペクチネータス
sp. DSM20764 菌の16Sリボソーム遺伝子と特異的にハイブリダイズするように作成したオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行い、認識されるべき配列の検出を行うことにより、検体中にペクチネータス・セルビシフィラス菌、ペクチネータス・フリシンゲンシス菌あるいはペクチネータス属
DSM20764 菌が存在するか否かを迅速、高感度に判定する方法を開発した。検体は、ビール及びビール製造途中の半製品、または、下水などの嫌気的環境下から採取されたサンプルでもよい。また、プライマーに用いるオリゴヌクレオチドは化学合成されたものでも天然のものでも、いずれの使用でも可能である。
【００１４】
２つのプライマーが規定する、ペクチネータス・セルビシフィラス菌の16Sリボソーム遺伝子のヌクレオチド配列上の標的配列の塩基長は、プライマー１と３を組み合わせた場合は約70塩基対、プライマー２と４を組み合わせた場合は約390塩基対、プライマー１と４を組み合わせた場合は約440塩基対である。これらのプライマーの組み合わせは、いずれでもペクチネータス・セルビシフィラス菌に特異的であるため、この菌種の検出を行えるが、２組以上を平行して使用することにより、より確実な同定が行える。
【００１５】
２つのプライマーが規定する、ペクチネータス・フリシンゲンシス菌の16Sリボソーム遺伝子のヌクレオチド配列上の標的配列の塩基長は、プライマー５と７を組み合わせた場合は約70塩基対、プライマー６と８を組み合わせた場合は約390塩基対、プライマー５と８を組み合わせた場合は約440塩基対である。これらのプライマーの組み合わせは、いづれでもペクチネータス・フリシンゲンシス菌に特異的であるため、この菌種の検出を行えるが、２組以上を平行して使用することにより、より確実な同定が行える。
【００１６】
９および10の２つのプライマーが規定する、ペクチネータス
sp. DSM20764 菌の16SリボソームRNA遺伝子のヌクレオチド配列上の標的配列の塩基長は、約390塩基対である。このプライマーの組み合わせは、ペクチネータス
sp. DSM20764 菌に特異的であるため、この菌種の検出を行うことができる。
【００１７】
　PCR反応に用いるDNAポリメラーゼは、90℃以上の温度に耐熱性があればよい。PCR反応における温度条件は、２本鎖DNAを１本鎖にする熱変性反応で90〜98℃、プライマーを鋳型DNAにハイブリダイスさせるアニーリング反応で37〜65℃、DNAポリメラーゼを作用させる鎖長反応で50〜75℃で行い、これを１サイクルとしたものを数十サイクル行わせることにより、標的配列を増幅させることができる。PCR反応後、反応物を電気泳動により分離し、臭化エチジウム等で核酸染色を行い、増幅されたヌクレオチド配列の塩基長が、上述の標的配列の塩基長と等しければ、検体中にペクチネータス・セルビシフィラス菌、ペクチネータス・フリシンゲンシス菌、またはペクチネータス
sp. DSM20764 菌が存在したと判定できる。増幅されたヌクレオチド配列の検出には、クロマトグラフィーも有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明を実施例により説明する。
（１）ペクチネータス・セルビシフィラス菌の検出方法
検体の調製
ペクチネータス属に属する菌は、表１に示した３種１０株を使用した。また、ペクチネータス・セルビシフィラス用ブライマーの特異性を確かめるために、ビール微生物検査においてペクチネータス菌以外に検査対象となり得る細菌および酵母、さらに一般に研究室でよく用いられる大腸菌を用いた。これらを適当な増殖用培地にて培養を行った後、菌体を遠心操作により回収した。その後、菌体からのDNA抽出は、新生化学実験講座２
核酸I 分離精製
p20〜21（日本生化学会編、東京化学同人）に従って行い、各々１mlのDNA溶液を得た。
【００１９】
【表１】
2004121259.tif 000002
【００２０】
プライマーの合成
ペクチネータス・セルビシフィラス菌の16SリボソームRNA遺伝子の塩基配列（KARL HEINZ SCHLEIFER, and HELGA SEIDEL-RUFER et
al, Int. J. Syst. Bacteriol. 40(1):19-27, 1990）から、下記１〜４の配列群を選び、それらと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。
　5'-CAGGCGGATGACTAAGCG-3'　　１
　5'-TGGGATTCGAACTGGTCA-3'　　２
　5'-CTCAAGATGACCAGTTCG-3'　　３
　5'-AATATGCATCTCTGCATACG-3'　４
【００２１】
ＰＣＲ
滅菌した0.5mlチューブに、前記検体液1μl、滅菌水78.5μl、10×反応用バッファー（東洋紡社製
10×TAP）10μl、25mM塩化マグネシウム水溶液6μl、20mM dNTPs 1μl、100μMのプライマー１及び３（または２及び４、または１及び４）各1μl、5U／μl Taq DNA polymerase（東洋紡社製 TAP-101）0.5μlを加え、計100μlの反応液を調整した。これを、以下の温度条件：
　熱変性；94℃
1分
　アニーリング；54℃
1分
　鎖長反応；74℃
1分
を１サイクルとし、これを30サイクル繰り返してPCRを行った。また、サイクル反応開始前に、98℃
1分、サイクル反応終了後に74℃
3分の熱処理を行った。なお、温度制御装置は、ASTEC社製プログラムテンプコントロールシステムPC-800を使用した。
【００２２】
検出
PCRを終了した反応液10μlを用い、3.5% (w/v) アガロースゲルにて、100V定電圧で30分間、電気泳動を行った。反応液の他に、分子量マーカーとしてφX174／HincIIも同時に泳動した。泳動終了後、臭化エチジウム溶液（約0.5μg／ml）中で15分間染色した後、紫外線照射下でゲルを観察し、写真撮影を行った。ゲルの観察または撮影した写真より、増幅産物の塩基長を、分子量マーカーとの相対移動度から求めた。
【００２３】
結果
表１中の菌番号２及び５の検体の、PCR反応後の電気泳動結果を、図１に示した。
　また、試験をした全ての菌について、検出バンドの結果を表２にまとめた。
【００２４】
【表２】
2004121259.tif 000003
表中、数字は検出バンドの塩基長（キロ塩基対）を示し、（−）はバンドが検出されなかったことを示す。
【００２５】
これらの結果より、前記１〜４の配列の各オリゴヌクレオチドを表２に示した組合せで、PCR反応のプライマーとして使用した場合、いずれの組合せも、ペクチネータス・セルビシフィラス菌にのみにバンドが検出され、しかも検出されたバンドは全て標的配列と等しい塩基数であった。このことより、本発明の各オリゴヌクレオチドが、ペクチネータス・セルビシフィラス菌の16SリボソームRNA遺伝子の標的とする配列を正しく認識していることが示された。かつ、同属のペクチネータス・フリシンゲンシス菌をはじめ、他の菌種には一切バンドが検出されないことから、本発明は、ペクチネータス・セルビシフィラス菌を種特異的に検出できることを示し、ペクチネータス・セルビシフィラス菌を検出すると同時に、同定も行うことができるものであることが示された。
【００２６】
（２）ペクチネータス・フリシンゲンシス菌の検出方法
検体の調製
ペクチネータス属に属する菌は、前記と同様に表１に示した３種１０株を使用した。また、ペクチネータス・フリシンゲンシス菌用プライマーの特異性を確かめるために、ビール微生物検査においてペクチネータス菌以外に検査対象となり得る細菌および酵母、さらに一般に研究室でよく用いられる大腸菌を用いた。これらを適当な増殖用培地にて培養を行った後、菌体を遠心操作により回収した。その後、菌体からのDNA抽出は、新生化学実験講座２
核酸I 分離精製
p20〜21（日本生化学会編、東京化学同人）に従って行い、各々１mlのDNA溶液を得た。
【００２７】
プライマーの合成
ペクチネータス・フリシンゲンシス菌の16SリボソームRNA遺伝子の塩基配列（KARL HEINZ SCHLEIFER, and HELGA SEIDEL-RUFER et
al, Int. J. Syst. Bacteriol. 40(1): 19-27, 1990 ）から、下記５〜８の配列群を選び、それらと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。
　5'-CAGGCGGAACATTAAGCG-3'　　５
　5'-ATGGGGTCCGAACTGAGG-3'　　６
　5'-CTCAAGAACCTCAGTTCG-3'　　７
　5'-AATATCCATCTCTGGATACG-3'　８
【００２８】
ＰＣＲ
滅菌した0.5mlチューブに、前記検体液1μl、滅菌水78.5μl、10×反応用バッファー（東洋紡社製
10×TAP）10μl、25mM塩化マグネシウム水溶液6μl、20mM dNTPs 1μl、100μMのプライマー５及び７（または６及び８、または５及び８）各1μl、5U／μl Taq DNA polymerase（東洋紡社製 TAP-101）0.5μlを加え、計100μlの反応液を調整した。これを、以下の温度条件：
　熱変性；94℃
1分
　アニーリング；54℃
1分
　鎖長反応；74℃
1分
を１サイクルとし、これを30サイクル繰り返してPCRを行った。また、サイクル反応開始前に、98℃
1分、サイクル反応終了後に74℃
3分の熱処理を行った。なお、温度制御装置は、ASTEC社製プログラムテンプコントロールシステムPC-800を使用した。
【００２９】
検出
PCRを終了した反応液10μlを用い、3.5% (w/v) アガロースゲルにて、100V定電圧で30分間、電気泳動を行った。反応液の他に、分子量マーカーとしてφX174／HincIIも同時に泳動した。泳動終了後、臭化エチジウム溶液（約0.5μg／ml）中で15分間染色した後、紫外線照射下でゲルを観察し、写真撮影を行った。ゲルの観察または撮影した写真より、増幅産物の塩基長を、分子量マーカーとの相対移動度から求めた。
【００３０】
結果
表１中の菌番号２及び５の検体の、PCR反応後の電気泳動結果を、図２に示した。
また、試験をした全ての菌について、検出バンドの結果を表３にまとめた。
【００３１】
【表３】
2004121259.tif 000004
表中、数字は検出バンドの塩基長（キロ塩基対）を示し、（−）はバンドが検出されなかったことを示す。
【００３２】
これらの結果より、前記５〜８の配列の各オリゴヌクレオチドを表３に示した組合せで、PCR反応のプライマーとして使用した場合、いずれの組合せも、ペクチネータス・フリシンゲンシス菌にのみにバンドが検出され、しかも検出されたバンドは全て標的配列と等しい塩基数であった。このことより、本発明の各オリゴヌクレオチドが、ペクチネータス・フリシンゲンシス菌の16SリボソームRNA遺伝子の標的とする配列を正しく認識していることが示された。かつ、同属のペクチネータス・セルビシフィラス菌をはじめ、他の菌種には一切バンドが検出されないことから、本発明は、ペクチネータス・フリシンゲンシス菌を種特異的に検出できることを示し、ペクチネータス・フリシンゲンシス菌を検出すると同時に、同定も行うことができるものであることが示された。
【００３３】
（３）ペクチネータス
sp. DSM20764 菌の検出方法
検体の調製
ペクチネータス属に属する菌は、Pectinatus cerevisiiphilus (DSM20467) 、Pectinatus
frisingensis (DSM6306) 、Pectinatus sp. DSM20764 を使用した。また、Pectinatus sp. DSM20764 用プライマーの特異性を確かめるために、表４に示す他の偏性嫌気性菌を使用した。これらを適当な増殖用培地にて培養を行った後、菌体を遠心操作により回収した。その後、菌体からのDNA抽出は、新生化学実験講座２
核酸Ｉ 分離精製p20〜21（日本生化学会編、東京化学同人）に従って行い、DNA溶液を得た。
【００３４】
【表４】
2004121259.tif 000005
【００３５】
ペクチネータス
sp. DSM20764 菌の16SリボソームRNA遺伝子の塩基配列の決定
前記のように調製したペクチネータス
sp. DSM20764 菌のDNA溶液を鋳型に用い、Modern
Microbiological Methods 'Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics'
"16S/23S rRNA Sequencing" p115〜175（J.Wiley & Sons Ltd., New York)に記載の多くの細菌に共通なユニバーサルプライマーの5'側にM13プライマー配列を配置したプライマーを用いて、PCRを行った。
【００３６】
PCR終了後の増幅DNA断片を、アガロースゲル電気泳動により分離して切り出し、商品名SUPRECTM−01（宝酒造社製）を用いてゲルから溶出させ、エタノール沈殿により回収した。このようにして得られたDNA断片を鋳型とし、シーケンス反応を行った。シーケンシングプライマーは商品名
IRD41 Infared Dye Labeled M13
Forwardプライマー（日清紡製造、アロカ（株）販売）を、反応液はSequiTherm（登録商標）Long-Read（登録商標）Cycle Sequencing Kit-LC（EPICENTRE
TECHNOLOGIES社製）を使用した。塩基配列決定は、4000L Long ReadIR（登録商標）DNA Sequencing System（LI-COR社製）を用いた。
得られたペクチネータス
sp. DSM20764 菌の16SリボソームRNA遺伝子配列を配列番号：１に示す。
【００３７】
プライマーの合成
配列番号：１のペクチネータス
sp. DSM20764 菌の16SリボソームRNA遺伝子配列上の630番目から647番目までの配列と同じ配列、及び1004番目から1022番目までの配列に相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。
プライマーを用いたペクチネータス
sp. DSM20764 菌の検出及び同定
検体の調製で得た各菌のDNA溶液を、合成したプライマーを用いてPCRを行った。PCRは以下の温度条件：
　熱変性；94℃　30秒
　アニーリング；55℃　30秒
　鎖長反応；72℃　30秒
を１サイクルとし、これを35サイクル繰り返して行った。PCR終了後、反応液をアガロースゲルにて、100V定電圧で30分間電気泳動に供した。反応液の他に、分子量マーカーとしてφX174/HincIIも同時に泳動した。泳動終了後、約0.5μg/mlの臭化エチジウム溶液中で20分間染色した後、紫外線照射下でゲルを観察し、写真撮影を行った。ゲルの観察または撮影した写真より、増幅産物の塩基長を分子量マーカーとの相対移動度から求めた。
その結果、図３に示されるように、ペクチネータス
sp. DSM20764 菌にのみ約390bpsのバンドが検出された。
【００３８】
この結果より、前記オリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして用いた場合、ペクチネータス
sp. DSM20764 菌にのみ目的長のバンドが検出された。このことより、本発明の各オリゴヌクレオチドが、ペクチネータス
sp. DSM20764 菌の16SリボソームRNA遺伝子上の標的とする塩基配列を正しく認識していることが示された。かつ、同族のPectinatus cerevisiiphilus及びPectinatus
frisingensisを始め、近縁な偏性嫌気性菌にも目的長のバンドは一切検出されなかったことから、本発明は、ペクチネータス
sp. DSM20764 菌を種特異的に検出できることを示し、該菌を検出できると同時に同定も行うことが出来るものであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
従来法ではペクチネータス属菌の菌種を同定するまでに最短でも約10日が必要であったが、本発明を用いることにより、必ずしも前培養を必要とすることなく、また、分離培養も必要とせずに、1〜3日以内で、迅速かつ明確に、検体中にペクチネータス・セルビシフィラス菌、ペクチネータス・フリシンゲンシス菌、またはペクチネータス
sp. DSM20764 菌を検出し、同時に同定することが可能となる。しかも、PCR法は、検体の前処理も含めて操作が簡便で、使用する薬品、器具、装置も安価であることから、作業者の熟練を要せず、低コストで信頼性の高い検査が可能となる。さらに、最近はPCR周辺機器が大きく進歩してきており、それらを本発明に利用すると、ペクチネータス菌検査の全自動化も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】第１図はプライマー１〜４の組み合わせにおいて、表１中の菌番号２および５の検体の、PCR反応後の電気泳動結果を示す図。
【図２】第２図はプライマー５〜８の組み合わせにおいて、表１中の菌番号２および５の検体の、PCR反応後の電気泳動結果を示す図。
【図３】第３図はプライマー９および10の組み合わせにおいて、表４中の菌番号１〜９の検体の、PCR反応後の電気泳動結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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