(57)【要約】【課題】ロイコマラカイトグリーンを導入した水溶性高分子よりなるベクター及びベクター用高分子と、その製造方法及びこのベクター用高分子を用いた核酸含有複合体及びその製造方法を提供する。【解決手段】ロイコマラカイトグリーン化された水溶性高分子よりなるベクター及びベクター用高分子。好ましくは、ロイコマラカイトグリーン化ビニルモノマーとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとの共重合体よりなる。このベクター用高分子は、４−ビニル安息香酸と、４−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンとを反応させてロイコマラカイトグリーン基を有したビニルモノマーを製造し、このロイコマラカイトグリーン化ビニルモノマーとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとを共重合反応させて製造する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコマラカイトグリーン化された水溶性高分子よりなるベクター用高分子。
【請求項２】
請求項１において、ロイコマラカイトグリーン基を側鎖に有することを特徴とするベクター用高分子。
【請求項３】
請求項２において、ロイコマラカイトグリーン化ビニルモノマーとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとの共重合体よりなることを特徴とするベクター用高分子。
【請求項４】
請求項３において、ロイコマラカイトグリーン化ビニルモノマーとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとの合計に対するロイコマラカイトグリーン化ビニルモノマーの割合が０．０１〜４５モル％であることを特徴とするベクター用高分子。
【請求項５】
請求項３又は４において、分子量が３０００〜１００万であることを特徴とするベクター用高分子。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項のベクター用高分子よりなるベクター。
【請求項７】
４−ビニル安息香酸と、４−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンとを反応させてロイコマラカイトグリーン基を有したビニルモノマーを製造し、このロイコマラカイトグリーン化ビニルモノマーとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとを共重合反応させて請求項３に記載のベクター用高分子を製造することを特徴とするベクター用高分子の製造方法。
【請求項８】
請求項７において、ロイコマラカイトグリーン化ビニルモノマーとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとの合計に対するロイコマラカイトグリーン化ビニルモノマーの割合が０．０１〜４５モル％であることを特徴とするベクター用高分子の製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし５のいずれか１項のベクター用高分子と核酸との複合体よりなる核酸含有複合体。
【請求項１０】
請求項１ないし５のいずれか１項のベクター用高分子と核酸とを混合してベクター用高分子と核酸との複合体を形成する方法であって、ロイコマラカイトグリーン基をカチオン化させる工程を有することを特徴とする核酸含有複合体の形成方法。
【請求項１１】
請求項１０において、ベクター用高分子に紫外線を照射することによりロイコマラカイトグリーン基をカチオン化させることを特徴とする核酸含有複合体の形成方法。
【請求項１２】
請求項１１において、ベクター用高分子に紫外線を照射した後、ベクター用高分子と核酸とを混合することを特徴とする核酸含有複合体の形成方法。
【請求項１３】
請求項１０ないし１２のいずれか１項において、核酸がＤＮＡであることを特徴とする核酸含有複合体の形成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子導入技術に係るベクター、ベクター用高分子及びその製造方法と、このベクター用高分子を用いた核酸含有複合体及びその形成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
ＤＮＡを細胞中に運搬するための非ウイルス系ベクターとして、例えば、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（登録商標）として商品化された、カチオン性脂質であるジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウム（Ｆｅｌｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８４，　７４１３−７４１７，　１９８７）がある。これに引き続いて更に多くのカチオン性脂質が合成され、幾つかは、実験室用のトランスフェクション試薬として市販されている。例えば、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）（登録商標））、ＤＯＳＰＡ（リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標））、ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＡＰ（登録商標））である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なベクター用合成高分子材料を提供することを目的とする。また、本発明は、このベクター用高分子を用いた核酸含有複合体の形成方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明のベクター及びベクター用高分子は、ロイコマラカイトグリーン化された水溶性高分子よりなるものである。
【０００６】
本発明の核酸含有複合体及びその形成方法では、かかる本発明のベクター用高分子と核酸とを混合して該複合体を形成する。この形成方法は、ロイコマラカイトグリーン基をカチオン化させる工程を有する。このロイコマラカイトグリーン基は側鎖として導入されていることが好ましい。
【０００７】
このロイコマラカイトグリーン基は、例えば紫外線の照射等によりカチオン化するので、ポリアニオンである核酸と静電的に複合体を形成する。このカチオン化したロイコマラカイトグリーン基は、可逆的にノニオン化して核酸を解離させる。
【０００８】
この核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドとくにＤＮＡが好適であるが、リボ核タンパク質であってもよい。
【０００９】
本発明のベクター用高分子は、ロイコマラカイトグリーン化ビニルモノマーとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとの共重合体よりなることが好適である。このベクター用高分子を製造するには、４−ビニル安息香酸と、４−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンとを反応させてロイコマラカイトグリーン基を有したビニルモノマーを製造し、このロイコマラカイトグリーン化ビニルモノマーとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとを共重合反応させる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるロイコマラカイトグリーン（以下、ＬＭＧと記載することがある。）は次の化学構造式のものである。
【００１１】
【化１】
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【００１２】
ＬＭＧ基は、水溶性高分子の側鎖に導入されることが好ましい。水溶性高分子としてはビニルジメチルアクリルアミドコポリマーが好適である。
【００１３】
ＬＭＧ基を有するビニルジメチルアクリルアミドコポリマーは、４−ビニル安息香酸と４−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンからＬＭＧ化ビニルモノマーを合成し、これとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとをラジカル共重合反応させることにより合成することができる。具体的には、オキサリルクロライドに４−ビニル安息香酸を反応させ塩化４−ビニルベンゾイルを得，これをメタノールと反応させてメチルエステルへ誘導する．このメチルエステルと４−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンとをモル比で１：０．０１〜１：５０で混合し、さらにｎ−ブチルリチウムを加えて反応させた後，塩酸で中和することでＬＭＧ化ビニルモノマーを合成することができる．このＬＭＧ化ビニルモノマーをＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとベンゼン中で０．０１〜４５モル％で混合し、ＡＩＢＩＮなどを開始剤として共重合させ，エーテルで再沈殿させることでＬＭＧ基を側鎖に有したビニルジメチルアクリルアミドコポリマーを合成することができる。
【００１４】
このＬＭＧ化された、即ちＬＭＧ基含有ビニルジメチルアクリルアミドコポリマーにあっては、ＬＭＧ基の導入量、即ち、ＬＭＧ化ビニルモノマーとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとの合計に対するＬＭＧ化ビニルモノマーのモル比は０．０１〜４５モル％程度が好適である。この導入量が０．０１モル％よりも少ないと、核酸の複合量が少なくなり、４５モル％よりも多いと、ＬＭＧ基の紫外線照射によるカチオン化に長時間を要するようになる。
【００１５】
このＬＭＧ化ビニルジメチルアクリルアミドコポリマーの分子量は３０００〜１００万程度が好適である。このＬＭＧ化ビニルジメチルアクリルアミドコポリマーは、水溶性である。
【００１６】
このＬＭＧ化ビニルジメチルアクリルアミドコポリマーのＬＭＧ基は紫外線の照射によりイオン解離してカチオン化するため、ポリアニオンである核酸と複合化しうる。このＬＭＧ化ビニルジメチルアクリルアミドコポリマーは、このようにカチオン化した後、室温下で徐々にノニオンに戻るフォトクロミック特性を有する。
【００１７】
ＬＭＧ化ビニルジメチルアクリルアミドコポリマーよりなるベクター用高分子と核酸とを複合させるには、このベクター用高分子の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の水溶液に対し波長３００〜４００μｍの紫外線を照射した後、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。紫外線の照射量はエネルギー束密度０．１〜１０．０ｍＷ／ｃｍ２の光を０．１〜１０分照射する程度が好ましい。ＬＭＧ化ビニルジメチルアクリルアミドコポリマーに対しては核酸を過剰量添加し、核酸をＬＭＧ基に対し飽和状に複合させるのが好ましい。
【００１８】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００１９】
また、ＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス、Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００２０】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００２１】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００２２】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められる細胞に加え、細胞外の異物を細胞内へと取り込む性質（食作用）を有する細胞、すなわち後述のマクロファージに代表される食細胞が好ましい。当該核酸の機能発現が求められる細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等の食細胞および白血球、線維芽細胞やある種の上皮細胞（消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞等）はその食作用により効率よく核酸含有複合体をその内部に取り込むことができ（食細胞への核酸含有複合体のターゲッティング）、且つその標的指向性により核酸を所望の部位に送達させる（食細胞の標的細胞へのターゲッティング）のに都合が良い。これにより、心臓、筋肉、血管、血液、骨髄、リンパ組織、結合組織、肝臓、骨、滑膜、神経、皮膚、炎症組織、癌組織等のあらゆる臓器・組織を遺伝子導入の対象とすることが可能となる。
【００２３】
核酸と上記ベクターとを含有する核酸含有複合体を含んでなる食細胞は実験目的の使用の他に、医薬としても好適に使用することができる。すなわち、核酸含有複合体を含んでなる食細胞をインビトロで調製した後、得られた食細胞を生体に投与することにより、食細胞の病変部位への集積性という特性を利用して、標的部位で所望の核酸からの遺伝子情報を発現させることができる。
【００２４】
核酸含有複合体を食細胞に取り込ませる過程当該過程は、上述の如く、食細胞が本来有する食作用により、核酸含有複合体を取り込むことによって達成される。当該過程は、予めインビトロで当該核酸含有複合体と食細胞を混合することによって、あるいは、当該核酸含有複合体を生体に投与し、生体内での食細胞への取り込みを利用することによって実施することもできる。インビトロでの核酸含有複合体と食細胞との混合比は、食細胞が当該核酸含有複合体を取り込むことができれば特に限定されず、通常、核酸含有複合体を過剰に加えることで達成される。生体への核酸含有複合体の投与、あるいはインビトロで調製した食細胞の生体への投与は、後述の本発明の核酸含有複合体ならびに医薬の投与方法に準じて行なうことができる。特に本発明の食細胞（核酸含有複合体を取り込んだもの）を生体に投与する場合には、食細胞の働きを維持したまま処置する必要があり、具体的には骨髄移植あるいは免疫療法に準じた手法がとられ得る。より具体的には投与方法の代表例として以下のようなものがある。（ａ）病変部またはその近傍組織内に投与する。（ｂ）体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔）内に投与する。（ｃ）病変部を支配する血管内、リンパ組織内に投与する。（ｄ）病変部から離れた血管または皮膚・脂肪・骨格筋組織内に投与する。いずれの場合にも食細胞が有する遊走能により投与部よりも病変部への効果がより期待できる。
【００２５】
食細胞内で核酸を発現誘導する過程当該過程は、通常当分野で行われる手法を用いて行われる。すなわち、食細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で核酸を含めることにより行なう。
【００２６】
食細胞を標的部位に到達せしめる過程当該過程は、食細胞の遊走能によって行なわれることが容易であり、且つ安全である。標的部位によって食細胞を適宜選択することが好ましい。例えば癌組織や炎症組織へのターゲッティングを所望する場合にはマクロファージ、類上皮細胞、多核巨細胞が、血液には単球が、骨髄やリンパ組織には樹状細胞が、結合組織には組織球が、肝臓にはクッパー細胞が、骨には破骨細胞が、滑膜には滑膜Ａ細胞が、神経には小膠細胞が、皮膚にはランゲルハンス細胞が好適に用いられる。また、各種臓器表面に当該食細胞を投与することにより、その臓器の深部へと核酸（当該食細胞に担持されている）を運ぶこともできる。
【００２７】
本発明の核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができるが、目的とする特定部位での核酸の持続的且つ局所的な放出のためには非経口的な投与が特に好ましい。当該複合体に更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することにより、本発明の核酸含有複合体を有効成分とする医薬を調製することができる。これら担体は公知のものが使用できる。さらに徐放効果を調節する各種添加剤を含めることもできる。
【００２８】
本発明の核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００２９】
本発明の核酸含有複合体は、目的に応じて種々の形状の製剤化が可能である。例えば、粒状、円・角柱状、シート状、ディスク状、ペースト状等の固形、半固形製剤、あるいは懸濁剤や乳剤等の注射剤が挙げられる。好ましくは目的とする特定部位での徐放効果に優れ、また局所投与に好適な固形製剤である。例えばシート状に製した本発明の核酸含有複合体は、局所血管の内壁に固定するのに適している。より具体的には動脈形成術用のステントに当該シート状の核酸含有複合体を巻きつけ、カテーテルにより任意の血管枝に当該ステントを挿入し、局所血管内でバルーンを膨らませることにより血管内壁に核酸含有複合体を固定する方法が挙げられる。当該方法は、固定部位の血管壁そのものへの遺伝子導入、さらに固定部位末梢領域に対する選択的遺伝子治療（癌に対する遺伝子治療、例えば抗血管新生療法、あるいは循環障害に対する遺伝子治療、例えば血管新生療法等）が可能となる。
【００３０】
注射剤は、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、静脈内、リンパ管内、リンパ節内、動脈内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内、等に投与され得、好ましくは筋肉内に投与される。病変組織内に直接投与することも可能である。
【００３１】
固形、半固形製剤の場合は、核酸の放出を期待する部位に該製剤を直接埋め込む方法、ペースト状製剤を注射器にて注入する方法、粒子状製剤を懸濁注射により注入する方法、経皮経管的にカテーテルを挿入し、これを介してステントに付着させた複合体を血管内に留置する方法、複合体の微粒子をカテーテルにより注入し核酸の放出を期待する部位に局在させる方法等が挙げられる。
【００３２】
動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、使用される高分子、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００３３】
本発明の核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Ｇａｕｃｈｅｒ病等）等が挙げられる。
【００３４】
【実施例】
＜メチル４−ビニルベンゾエートの合成＞
オキサリルクロライド２１．４ｇ（和光純薬製）に４−ビニル安息香酸５．０ｇを氷冷下で攪拌しながら加え、室温で攪拌を続けた。８時間後、反応溶液をアスピレーターで２時間、さらにポンプで一晩減圧し、未反応のオキサリルクロライドを除去した。残留物にクロロホルムを加えて不溶物を濾別し、濾液をエバポレーターで濃縮した。残留物を真空乾燥することにより塩化４‐ビニルベンゾイルを得た。得られた塩化４‐ビニルベンゾイルは精製せずに次に反応に用いた。塩化４‐ビニルベンゾイルの粗生成物に氷冷下で脱水メタノール　（５０　ｍｌ）を加えて一晩攪拌した後、反応溶液を濃縮して、真空乾燥しメチル４−ビニルベンゾエートを得た。収量５．０６　ｇ、収率９３　％、１Ｈ−ＮＭＲ　（３００ＭＨｚ　，ＣＤＣｌ３）：δ３．９１　（ｓ，　３Ｈ，ＣＯＯＣＨ３），　５．３８（ｄ，　１Ｈ，　Ｊ＝１０．２Ｈｚ，　ｔｒａｎｓ−Ｈ　ｏｆ　ＰｈＣＨ＝ＣＨ２），　５．８６　（ｄ，１Ｈ，　Ｊ＝１７．４Ｈｚ，　ｃｉｓ−Ｈ　ｏｆ　ＰｈＣＨ＝ＣＨ２），　６．７５（ｑ，１Ｈ，　Ｊ＝１０．８　Ｈｚ，　ＰｈＣＨ＝Ｃ），　７．４６（ｄ，　２Ｈ，　Ｊ＝８．７Ｈｚ，　ｏ−Ｈ　ｏｆ　ＰｈＣ＝Ｃ），７．９９　（ｄ，　２Ｈ，　Ｊ＝８．１Ｈｚ，　ｍ−Ｈ　ｏｆ　ＰｈＣ＝Ｃ）である。
【００３５】
＜ジフェニル（４−ビニルフェニル）メタンロイコヒドロキシドの合成＞
４−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（１２．３３　ｇ，６１．７　ｍｍｏｌ，Ｍｗ．　２００．０８）のＴＨＦ（テトラヒドロフラン）溶液（１１５ｍｌ）をアルゴン気流下においてドライアイス／メタノールバス中で‐７８℃に冷却した。冷却下でその溶液にｎ−ブチルリチウムのヘキサン溶液（１．６　ｍｏｌ％，４８　ｍｌ，　７７．０　ｍｍｏｌ）とメチル４−ビニルベンゾエート（５．０　ｇ，３０．８　ｍｍｏｌ，Ｍｗ．１６２．１８）を含むＴＨＦ溶液（６７　ｍｌ）を加え、反応溶液を攪拌下で室温までゆっくり戻した。さらに室温で一時間攪拌後、反応溶液をエバポレーターで濃縮し、得られた残留物に水（１５０ｍｌ）を加え、１Ｎ　ＨＣｌで中和した。溶液をジクロロメタン（３５０ｍｌ）で抽出（３回）し、抽出液に硫酸マグネシウムを加えて一晩乾燥した。濾過後、エバポレーターで濾液を濃縮し、得られた濃緑色のオイルに１Ｎ　ＮａＯＨを少量加えたメタノールを加え、生成した淡緑色の固体を濾取した後、真空乾燥し、ジフェニル（４−ビニルフェニル）メタンロイコヒドロキシド（ＤＶＬ）を得た。収量４．７９　ｇ、収率４２　％、１Ｈ−ＮＭＲ（３００　Ｈｚ，　ＣＤＣｌ３）：δ２．９４　（ｓ，６Ｈ，Ｎ（ＣＨ３）２），　５．２１（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ，ｔｒａｎｓ−Ｈ　ｏｆ　ＰｈＣＨ＝ＣＨ２），５．７２（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ，ｃｉｓ−ＨｏｆＰｈＣＨ＝ＣＨ２），６．６５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，４Ｈ，ｍ−ＨｏｆＮＰｈ），６．７４（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ，ＰｈＣＨ＝Ｃ），７．１２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，４Ｈ，ｏ−Ｈ　ｏｆＮＰｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ，ｏ−Ｈ　ｏｆ　ＰｈＣ＝Ｃ）７．３４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ，ｍ−Ｈ　ｏｆ　ＰｈＣ＝Ｃ）である。
【００３６】
＜ＤＶＬとＤＭＡＡｍの共重合体の合成＞
典型例を示す。ジフェニル（４−ビニルフェニル）メタンロイコヒドロキシド（０．１４５　ｇ，０．３９　ｍｍｏｌ，ＭＷ．３７２．５）とＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）　（３．８６　ｇ，３９．０　ｍｍｏｌ，ＭＷ．９９．１）を含むベンゼン溶液に２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ，０．０３３　ｇ，　ＭＷ．１６４．２，［モノマー］／［ＡＩＢＮ］＝２００）を加えた。そのベンゼン溶液を凍結、脱気、解凍操作を３回繰り返した後、脱気封管し、恒温振とう器を用いて６０℃で振とうした。１７時間後、反応溶液をエーテル（１　Ｌ）に攪拌しながら滴下した後、３０分間放置し、析出物を沈殿させた。溶液から上澄み液をデカンテーションにより除去した。沈殿物に再びエーテル（５００ｍｌ）を加えて１時間攪拌した後、３０分間放置し、デカンテーションを繰り返した。沈殿物にヘキサン（５００ｍｌ）を加えて１時間攪拌し、得られた白色固体のマラカイトグリーン（ＬＭＧ）化水溶性高分子を濾取後真空乾燥した。収量　２．４７　ｇ、収率６１．８％、１Ｈ−ＮＭＲ（３００　Ｈｚ，　ＣＤＣｌ３）：δ２．７８−２．９０付近（ＰｈＮ（ＣＨ３）２，ＣＯＮ（ＣＨ３）２），６．６０−６．６５付近（ｍ−Ｈ　ｏｆ　ＮＰｈ），７．２０−７．２５付近（ｏ−Ｈ　ｏｆ　ＮＰｈ）である。
【００３７】
＜実験Ｎｏ．１＞
このＬＭＧ化高分子（５　ｍｇ，ＤＶＬの導入率５．２３％）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５００　μｌ，ｐＨ７．４）から８３．８μｌ　を分取し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５９１６　μｌ）で希釈した。その希釈溶液（１０８０μｌ）を１０ｍｍ長のセル内で紫外線（東芝製色カラーフィルターＵＶ−Ｄ３３Ｓを通した波長３３０ｎｍを中心とする３００〜４００ｎｍの範囲の紫外線）を照射エネルギー束密度１ｍＷ／ｃｍ２で照射し、５秒間隔で紫外可視スペクトルを測定した結果が図１である。図１より照射によって、ＬＭＧ化高分子に由来する６３０ｎｍ付近の吸収が増加し、カチオン化が進行することが分かる。次にこのセルを暗所へ放置し６３０ｎｍでの吸光度を経時的に測定すると、約４０分でカチオンの中性化が示唆された。ここで再度の照射を行って吸光度の変化を経時的に測定した結果が図２である。図２より、光照射によるカチオン化と暗所での中性化が繰返し可逆的に起こることが分かる。
【００３８】
＜実験Ｎｏ．２＞
このＬＭＧ化高分子に紫外線を照射し、カチオン化した後にｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッフアー（ｐＨ＝７．４）＋１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液を混合すると、蛍光を有する粒子の形成が観測された。図３は共焦点レーザー顕微鏡による蛍光像である。形成された粒子を動的光散乱法により粒径分布を測定した結果が図４である。５０〜３５０ｎｍの範囲の粒子が形成されていることが分かり、キュウムラント平均粒子径は１４１．２ｎｍでほぼ均質であることが分かる。
【００３９】
なお、このＬＭＧ化高分子は、紫外線未照射の中性体で水溶液中でｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドと混合しても変化はなかった。
【００４０】
＜実験Ｎｏ．３＞
実験Ｎｏ．２で作成したＬＭＧ化高分子とｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ遺伝子の複合体を、暗所において３７℃でインキュベートを行った結果、約３時間後で平均粒子径は、約１／２の８０ｎｍまで減少し、それ以降はほぼプラトーに達した（図５参照）。複合体化された遺伝子が放出されたことによって粒子径が減少したことが示唆される。以上により、光刺激によってカチオン化されたベクターへｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ遺伝子が一旦複合体を形成し、３７℃下で徐々にリリースされることが確認された。
【００４１】
【発明の効果】
以上の通り、本発明によると、ロイコマラカイトグリーンを導入した水溶性高分子よりなるベクター及びベクター用高分子と、その製造方法及びこのベクター用高分子を用いた核酸含有複合体及びその製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実験結果を示す図である。
【図２】実験結果を示す図である。
【図３】実験結果を示す図である。
【図４】実験結果を示す図である。
【図５】実験結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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