(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚表皮と基底膜の接着を改善，強化し、肌のシワ，たるみ，肌理構造の改善作用を有する皮膚外用剤を提供することを課題とする。【解決手段】ラミニン産生促進剤と表皮インテグリン産生促進剤とを併用した場合に、シワ，たるみを改善し、肌理を整えることができる。【効果】特定の植物抽出液を化粧料に配合することによって、表皮のラミニン、インテグリン産生促進作用を有し、表皮と基底膜の接着を相乗的に改善することにより皮膚の肌理、シワ，たるみ，肌荒れ改善効果の期待できる化粧料の提供が可能となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト皮膚のラミニン産生促進物質を１種又は２種以上およびインテグリン産生促進物質を１種又は２種以上配合する皮膚外用剤。
【請求項２】
インテグリンがヒト表皮内インテグリンである請求項１記載の皮膚外用剤。
【請求項３】
ラミニン産生促進物質がヤナギハッカ属、ステビア属、アブラナ属、ゼニアオイ属、セイヨウネズ属、カラスウリ属、カギカズラ属に属する植物の抽出物及びグリシル−Ｌ−チロシンから選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求項１乃至請求項２記載の皮膚外用剤。
【請求項４】
ラミニン産生促進物質においてヤナギハッカ属に属する植物がヒソップ（Ｈｙｓｓｏｐｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ステビア属に属する植物がステビア（Ｓｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａ）、アブラナ属に属する植物がブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ．）、ゼニアオイ属に属する植物がゼニアオイ（Ｍａｌｖａｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ  Ｌ．），ハイアオイ（Ｍａｌｖａ  ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｅａ  Ｌ．）、セイヨウネズ属に属する植物がセイヨウネズ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ），  ペンシルシーダー（エンピツジャクシン，Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  Ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、カギカズラ属に属する植物がカギカズラ（Ｕｎｃａｒｉａｒｈｙｎｃｈｏｐｈｙｌｌａ（Ｍｉｑ．）Ｍｉｑ．）、カラスウリ属に属する植物がカラスウリ（トウカラスウリ，Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓｃｕｃｕｍｅｒｏｉｄｅｓ（Ｓｅｒ．）Ｍａｚｉｍ．），  キカラスウリ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ  ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ  Ｍａｚｉｍ．ｖａｒ．  ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｍｉｑ．）Ｋｉｔａｍ．）であることを特徴とする請求項１乃至請求項３記載の皮膚外用剤。
【請求項５】
インテグリン産生促進物質がヤナギハッカ属、ステビア属、アブラナ属、ゼニアオイ属に属する植物の抽出物であることを特徴とする請求項１乃至請求項４記載の皮膚外用剤。
【請求項６】
インテグリン産生促進物質において、ヤナギハッカ属に属する植物がヒソップ（Ｈｙｓｓｏｐｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ステビア属に属する植物がステビア（Ｓｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａ）、アブラナ属に属する植物がブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ．）、ゼニアオイ属に属する植物がゼニアオイ（Ｍａｌｖａｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ  Ｌ．），ハイアオイ（Ｍａｌｖａ  ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｅａ  Ｌ．）であることを特徴とする請求項１乃至請求項５記載の皮膚外用剤。
【請求項７】
インテグリンがインテグリンα３β１である請求項１乃至請求項６記載の皮膚外用剤。
【請求項８】
ヒト皮膚のラミニンとインテグリンを共に産生促進する物質が、ヤナギハッカ属、ステビア属、アブラナ属、ゼニアオイ属に属する植物の抽出物であることを特徴とする請求項１乃至請求項７記載の皮膚外用剤。
【請求項９】
ヒト皮膚のラミニンとインテグリンを共に産生促進する物質において、ヤナギハッカ属に属する植物がヒソップ（Ｈｙｓｓｏｐｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ステビア属に属する植物がステビア（Ｓｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａ）、アブラナ属に属する植物がブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ．）、ゼニアオイ属に属する植物がゼニアオイ（Ｍａｌｖａｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ  Ｌ．），ハイアオイ（Ｍａｌｖａ  ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｅａ  Ｌ．）であることを特徴とする請求項１乃至請求項８記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、表皮のラミニン，インテグリン産生促進作用を有する皮膚外用剤に関し、さらに詳しくは、表皮と基底膜の接着を相乗的に改善，強化することにより皮膚の肌理，シワ，たるみ，肌荒れ改善効果の期待できる皮膚外用剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
老化によって起こる肌の変化はシワ，たるみの形成や肌理の消失が挙げられる。このようなシワ，たるみ，肌理消失は、皮膚真皮でのコラーゲン，エラスチンなどの細胞外マトリクスの変性により、弾力性が低下することが原因の一つと考えられており、老化した皮膚の改善を目的としてコラーゲン産生促進効果あるいはＩ，ＩＩＩ型コラーゲンの分解酵素であるコラゲナーゼの阻害効果を有する成分など様々な提案がなされてきた。実際、これまでに海藻抽出物等を含有する化粧料が知られている。
さらに近年では真皮コラーゲン等の細胞外マトリクスのみが皮膚弾力に機能するのではなく、真皮の線維芽細胞がこれら細胞外マトリクスと接着し結合することが皮膚構造保持に重要であることが明らかにされてきている。その接着機能を担うのが、線維芽細胞の細胞膜に発現しているインテグリンである。その構造はα鎖とβ鎖の２量体構造をとり、α鎖は更にα１からα６等が存在し、β鎖はβ１からβ４等の数種があり、その組み合わせにより様々な種が存在することが報告されている。真皮に存在するインテグリン種は主にコラーゲンＩに結合するα２β１であり、インテグリンα２β１を産生促進する成分が皮膚のシワ，たるみの改善に有用であることが示唆され提案されている。（例えば、特許文献１参照）
【０００３】さらに、近年老化した皮膚、特に紫外線照射部位において表皮と真皮の境界部に存在する基底膜の構造変化が明らかになってきた（例えば、非特許文献１参照）。また基底膜の主成分で基底細胞が産生するラミニン５に対する分解酵素であるゼラチナーゼが紫外線により産生が促進されること、ラミニンが欠損した皮膚では表皮水疱が形成され、表皮構造の顕著な構造変化が観察されることも明らかになっている。以上のことから、皮膚表皮基底膜が老化によって起こる皮膚のシワ，たるみあるいは肌理消失などの原因となる可能性が示唆された。このような背景から、実際皮膚のラミニン５の産生促進剤やラミニン分解酵素であるゼラチナーゼの活性阻害剤が提案されている（例えば、特許文献２乃至特許文献３参照）。真皮コラーゲンと同様に細胞外マトリクスであるラミニンのみが表皮構造形成に機能するのではない。表皮のケラチノサイトがその細胞膜に発現しているインテグリンを介しラミニンと接着することにより表皮構造形成に機能する。また、インテグリンはラミニンに接着し、その情報を細胞内に伝達することで、その後の細胞の増殖，伸展，分化，細胞内代謝系などケラチノサイトの生命現象に極めて重要な機能を有することが報告されている。この機能が表皮構造保持に機能すると考えられる。表皮のインテグリンは基底膜に存在するラミニン５，コラーゲンＩＶ等と接着するα３β１，α６β４，α６β１が知られている。その中でもβ１鎖はインテグリンの中でも最も接着機能に重要であると明らかにされている、最も研究されている種である。また、α３β１は細胞の情報伝達系，生命現象に極めて重要な役割を担っていることが予想されている。実際α３β１の遺伝子欠損マウスでは胎生致死になることが明らかにされている。このように、表皮のインテグリンは皮膚の表皮構造形成および保持に関与することから老化皮膚の変化に大きく関与することが示唆される。しかし、今までに表皮のインテグリンに着目した皮膚外用剤はなかった。さらに基底膜のラミニンおよび表皮のインテグリン共に着目した皮膚外用剤はなく、皮膚のシワ，たるみ，肌理消失をより効果的に改善することのできる皮膚外用剤が望まれていた。
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、ヒト皮膚表皮のラミニン，インテグリン産生を促進することで、表皮と基底膜の接着を相乗的に改善，強化し、肌のシワ，たるみ，肌理構造の改善作用を有する皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−２６３７１８号
【特許文献２】特開２０００−２５６３０８号
【特許文献３】特開２０００−２５６１２２号
【非特許文献１】Ｌａｖｋｅｒ，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｌ．  １９７９，７３，  ５９−６６
【０００５】
【問題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、前記問題点を解決するために鋭意検討した結果、表皮のラミニンおよびインテグリンに着目した。ラミニン分解酵素であるゼラチナーゼ阻害作用およびラミニン産生促進作用を有する物質、さらにインテグリン産生促進効果を有する物質を新たに見出し、これらラミニン産生促進剤とインテグリン産生促進剤とを併用した場合に、シワ，たるみを改善する作用及び肌理を整える作用に優れ、顕著な効果を発揮することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、ラミニン産生促進剤及びインテグリン産生促進剤を含有する皮膚外用剤を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明におけるインテグリン産生促進剤としては、インテグリンの産生量を促進するものであり、基底膜に存在するラミニン５，コラーゲンＩＶ等の細胞外マトリクスと接着する表皮細胞のインテグリン種はα３β１，α６β４，α６β１が主に知られていることから、α３鎖，α６鎖，β１鎖，β４鎖の発現を促進するものが好ましく、そのうちα３鎖と接着機能に極めて重要であるβ１鎖の発現を促進するものがより望ましい。
【０００７】
本発明に使用されるラミニン産生促進物質としての植物抽出物、インテグリン産生促進物質としての植物抽出物に用いられる植物は特に限定されない。ヤナギハッカ属の植物には、ヒソップ（Ｈｙｓｓｏｐｕｓｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）等が挙げられる。
【０００８】
ステビア属の植物には、ステビア（Ｓｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａ）等が挙げられる。
【０００９】
アブラナ属の植物には、ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ．）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｌ．ｖａｒ−ｎｉｐｐｏ−ｏｌｅｏｆｅｒａ（Ｍａｋｉｏ）  Ｋｉｔａｍ）、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｌ  ｖａｒ．ｇｌａｂｒａＫｉｔａｍ．）、カラミナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ  （Ｌ．）  Ｃｒｅｒｎ．ｖａｒ．ｊｕｎｃｅａ）、タカナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ  （Ｌ．）
Ｃｒｅｒｎ．ｖａｒ．ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ  ｓｉｎｓｋａｙａ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ．ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ  Ｌ）、ハボタン（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ．  ｖａｒ．ａｃｅｐｈａｌａ  ＤＣ．）等が挙げられる。
【００１０】
ゼニアオイ属の植物には、ゼニアオイ（Ｍａｌｖａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ  Ｌ．）、ハイアオイ（Ｍａｌｖａ  ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｅａ  Ｌ．）、ジャコウアオイ（Ｍａｌｖａ  ｍｏｓｃｈａｔａ  Ｌ．）、フユアオイ（Ｍａｌｖａ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ  Ｌ．ｖａｒ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ）、オカノリ（Ｍａｌｖａ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ  Ｌ．ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ（Ｌ．）Ｍａｋｉｎｏ（Ｍ．ｃｒｉｓｐａＬ．）等が挙げられる。
【００１１】
セイヨウネズ属の植物には、セイヨウネズ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ），  ペンシルシーダー（エンピツジャクシン，Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  Ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）等が挙げられる。
【００１２】
カラスウリ属の植物には、カラスウリ（トウカラスウリ，Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ  ｃｕｃｕｍｅｒｏｉｄｅｓ（Ｓｅｒ．）Ｍａｚｉｍ．），  キカラスウリ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓｋｉｒｉｌｏｗｉｉ  Ｍａｚｉｍ．ｖａｒ．  ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｍｉｑ．）Ｋｉｔａｍ．）等が挙げられる。
【００１３】カギカズラ属の植物には、カギカズラ（Ｕｎｃａｒｉａ  ｒｈｙｎｃｈｏｐｈｙｌｌａ（Ｍｉｑ．）Ｍｉｑ．）等が挙げられる。
【００１４】本発明に使用される植物の抽出部位は、特に限定されない。花弁、葉、茎、根、種子、果実等或いは、全草を生のまま或いは乾燥したものを用いて抽出することも出来る。
【００１５】本発明で使用される抽出物は各種溶媒にて抽出することが可能である。水のみを用いる場合のほかに、水と混和する極性溶媒を単独で用いることもできる。極性溶媒としてエタノール、プロピレングリコール、エチエングリコール、１，３−ブチレングリコールなどを用いることが可能であるが極性溶媒であれば、その限りではない。更に、エタノール、プロピレングリコール、エチレングリコール、１，３−ブチレングリコールの１種又は２種以上の混合溶媒を用いることができる。
【００１６】抽出時間・抽出温度は、特に限定されない。例えば、水による抽出であれば、通常６０℃下において、３〜４時間抽出を行い、エタノールなどの低沸点溶媒を使用する場合は還流器付きの抽出装置を使用する。抽出した溶液は、冷却後、ろ過をすることによって抽出液を得ることができる。更に、活性炭やその他樹脂などを用いて脱臭・脱色などを行うこともできる。必要に応じて加熱等の方法により溶媒をなくし、抽出物（乾燥物）としても利用が可能である。
【００１７】
本発明に使用されるグリシル−Ｌ−チロシンの製造方法は、特に限定されない。合成品でも、抽出・精製物であっても良い。市販品であれば、“グリシル−Ｌ−チロシン（協和発酵社製）”を用いることが出来る。
【００１８】
本発明にかかる配合量は、特に限定されない。原則的には、有効量存在すれば良いことになるが、ラミニン産生物質、インテグリン産生物質ともに、組成物中乾燥重量で０．００００１〜１００重量％が利用でき、好ましくは、０．０００１〜０．５重量％、なかでも０．００１〜０．０５重量％が最適である。特に、用時調製の外用剤などは、この本願発明にかかるラミニン産生物質とインテグリン産生物質とで１００重量％となるように配合することも可能である。
【００１９】また、本発明にかかる皮膚外用剤の適用範囲は、特に限定されない。つまり、この発明の有効成分が有する作用効果に応じて各作用効果を利用できる全ての皮膚外用剤に適用できる。
【００２０】
たとえば、本発明にかかる有効成分を各種の外用製剤類（動物用に使用する製剤も含む）全般において利用でき、具体的にはアンプル、粉末、顆粒、固形、液体、ゲル又は気泡状の１）医薬品、２）医薬部外品、３）局所用又は全身用の皮膚用化粧料（例えば、クリーム、乳液、化粧水、パック剤、洗顔料などの各種基礎化粧料など）、４）衛星用品などが挙げられる。
【００２１】以下、本発明による試験実施例を示すとともに、本発明の素材を利用した皮膚外用剤の処方例での利用例を示すが、ここに記載された実施例に限定されるものではない。
【００２２】試料溶液の調製
調製例１（水抽出物）
各種植物乾燥物（全草）を、１００ｇとり、１０００ｍＬの精製水を加え、６０℃下において３時間抽出を行った。冷却後、ろ過を行い、ろ液を得た。ろ液を減圧下濃縮し、十分乾燥させ、水抽出物を１０ｇを得た。
【００２３】
調製例２（エチルアルコール抽出物）
各種植物乾燥物（全草）を１０ｇとり、ソックスレー抽出器を用いてエチルアルコールにて５時間抽出を行った。冷却後、ろ過を行い、ろ液を得た。ろ液を減圧下濃縮し、十分乾燥させ、エチルアルコール抽出物を０．９ｇ得た。
【００２４】
調製例３（エチルアルコール・水混液抽出物）
前記水抽出物における抽出法において水の代わりに５０％エチルアルコール５０％水混液を使用した。抽出物は可能な限り溶媒を除去、濃縮した後、十分乾燥させ、５０％エチルアルコール抽出物を９．８ｇ得た。
【００２５】
前記植物抽出物を５０％エチルアルコールに１．０％濃度になるように溶解後、０．２μｍメンブレンフィルターにてろ過滅菌し、各植物抽出液とした。
【００２６】ゼラチナーゼ阻害作用の評価
各種植物抽出液のゼラチナーゼ阻害作用の評価をＩＶ型コラーゲナーゼ活性測定法（ヤガイ）を用いて評価を行った。蛍光標識基質であるＦＩＴＣ−ＩＶコラーゲン液の入ったマイクロチューブに各試料およびマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−９酵素液を添加し混合する。室温２０ｍｉｎ放置後、４２℃３時間反応させる。氷冷５分間にて反応停止し、氷冷した蛍光測定調整液を添加し、３０分間氷冷する。マイクロチューブを４℃で遠心分離し、上清を蛍光測定用ｗｅｌｌに移し室温１０分間放置する。酵素反応により解離したＦＩＴＣを蛍光マイクロプレートレーダーを用い蛍光５２０ｎｍ，
励起光４９５ｎｍで測定した。コントロールとして試料の溶媒、陽性対照にＥＤＴＡ・２Ｎａを用いた。ブランクとして酵素添加直後に１分間煮沸処理したものを用いた。オオバナサルスベリ、レタスは陰性対象である。コントロールを１００％としたときのゼラチナーゼ活性率（％）を算出した。尚、表中の濃度は最終濃度である。
【００２７】
【数１】
2004262861.tif 000002
【００２８】
【表１】ゼラチナーゼ活性率（％）
2004262861.tif 000003
【００２９】
表１に示した結果のように、ヒソップ、ステビア、ブロッコリー、ゼニアオイ、ハイアオイ、セイヨウネズ、ペンシルシーダー、カギカズラ、カラスウリ、キカラスウリ抽出物及びグリシル−Ｌ−チロシンにおいて高いゼラチナーゼ阻害効果が認められた。
【００３０】ラミニン産生促進の評価
ケラチノサイトＨａＣａＴ細胞が産生するラミニン量をＥＬＩＳＡ法（ＱｕｉｎｔｉＭａｔｒｉｘＨｕｍａｎ  ＬＡＭＩＮＩＮ  ＥＬＩＳＡ  ＣＨＥＭＩＣＯＮ）にて測定した。ケラチノサイトＨａＣａＴを１０ｃｍシャーレに１０％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地にて培養し２４時間後、２％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地に培地交換し、各試料を最終濃度０．０１％、０．００５％となるように添加した。さらに４８時間培養後に細胞をＰＢＳ（−）にて洗浄後、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒで細胞を剥離し回収した。細胞をソニックにて破壊し遠心分離後（８０００ｒｐｍ１０分間）、上清を静かに採取し細胞抽出液とした。細胞抽出液を一次抗体であるラビット抗ヒトラミニン抗体と共にチューブで混合し室温１０分間放置する。混合液をヒトラミニンがコートされた９６ＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温１時間放置する。酵素標識二次抗体としてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰＣｏｎｊｕｇａｔを添加し室温３０分間反応させる。さらに酵素基質としてＴＭＢ／Ｅ基質を添加し室温１０分反応後、反応停止液としてＳｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、マイクロプレートリーダー４７５ｎｍで測定した。コントロールとして試料の溶媒、陽性対象としてＴＧＦβ  ０．５μｇ／ｍｌ、陰性対象にオオバナサルスベリ、レタスを用いた。ＥＬＩＳＡ試験では、ブランクとしてＢｕｆｆｅｒを用いた。ラミニン標準品を用い、検量線を作成し、結果を吸光度値よりラミニン量を求め、コントロールを１００％としたときのラミニン産生促進率（％）を算出した。結果は表２に示した。
【００３１】
【数２】
2004262861.tif 000004
【００３２】
【表２】
2004262861.tif 000005
【００３３】
表１に示した結果のように、ヒソップ、ステビア、ブロッコリー、ゼニアオイ、ハイアオイ、セイヨウネズ、ペンシルシーダー、カギカズラ、カラスウリ、キカラスウリ抽出物及びグリシル−Ｌ−チロシンにおいて、ラミニン量の増加が見られ、ラミニン産生効果が認められた。
【００３４】インテグリン産生促進の評価
ケラチノサイト表面に発現するインテグリン量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定した。ケラチノサイトＨａＣａＴを１０ｃｍシャーレに１０％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地にて培養し２４時間後、２％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地に培地交換し、各試料を最終濃度０．０１〜０．０２％となるように添加した。コントロールとして試料の溶媒、陽性対象としてＴＧＦβ  ０．５μｇ／ｍｌを使用した。さらに４８時間培養後に細胞をＰＢＳ（−）にて洗浄後、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒで細胞を剥離し回収した。細胞をソニックにて破壊し遠心分離後、上清を採取し細胞抽出液とした。一次抗体としてＢｕｆｆｅｒにて１００倍希釈した抗ヒトインテグリンβ１抗体（マウスモノクローナル抗体，ＴａｋａｒａＦＮＲ５）がコート（４℃一晩）された９６ＥＬＩＳＡプレートに細胞抽出液を添加（室温１時間）し、酵素標識二次抗体としてＨＲＰ標識抗ヒトインテグリンβ１抗体（マウスモノクローナル抗体，ＴａｋａｒａＦＮＲ１０）を１００倍希釈し添加（室温１時間）しサンドイッチ複合体を形成させる。酵素基質としてＯＰＤ液を添加し反応（室温１５分）後、反応停止液として１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４添加し、マイクロプレートリーダー４７５ｎｍで測定した。本試験ではコントロールとして試料の溶媒、陽性対象としてＴＧＦβ  ０．５μｇ／ｍｌを用いた。ＥＬＩＳＡ試験では、ブランクとしてＢｕｆｆｅｒを用いた。結果を吸光度値よりブランクを差し引きコントロールを１００％としたときのインテグリン産生促進率（％）を算出して表３に示した。
【００３５】
【数３】
2004262861.tif 000006
【００３６】
【表３】
2004262861.tif 000007
【００３７】
表３より、ヒソップ、ステビア、ブロッコリー、ゼニアオイの作用により、インテグリンβ１量の増加が見られ、インテグリンβ１産生促進が認められた。
【００３８】化粧料の使用による皮膚シワ，肌理改善効果の測定
さらに、本発明にかかる軟膏を用いて、実際に使用した場合の効果について検討を行った。顔のシワおよび肌理消失を訴える女性１４０名に３ヶ月間連続で一日２回（朝・夕）全顔に塗布してもらい連用試験を行った。被験者を無作為に２０名ずつの群に分け表４の処方の軟膏を塗布してもらい、皮膚の改善度を評価した。評価方法は開始時と塗布３ヶ月後に皮膚のレプリカを採取し、最も大きなシワの長さおよび肌理状態を観察し、シワ改善度と肌理改善度を評価した。さらに使用後の実感度を被験者に４段階評価してもらった。結果を表４に示す。また、使用期間中に肌の異常を訴えた被験者はいなかった。
【００３９】判定基準
（レプリカのシワ判定基準）
５：開始時と比較してシワの長さ５０％減少
４：開始時と比較してシワの長さ３０％減少
３：開始時と比較してシワの長さ１０％減少
２：開始時と比較してシワの長さ同じ
１：開始時と比較してシワの長さ増加
（レプリカの肌理判定基準）
５：開始時と比較して顕著に均一性上昇
４：開始時と比較して均一性上昇
３：開始時と比較してやや均一性上昇
２：開始時と比較して均一性同じ
１：開始時と比較して均一性減少
（被験者のシワ度判定基準）
顕著に有効：シワがなくなった
有効：開始時と比較してシワが短くなり浅くなった
やや有効：開始時と比較してやや短くなり、浅くなった
無効：開始時と比較して同じ
【００４０】
【表４】
2004262861.tif 000008
【００４１】
表４の結果から、ラミニン産生効果しかないグリシル−Ｌ−チロシンのみでも、シワ改善効果・肌理改善効果が見られるが、ラミニン産生成分及びインテグリン産生成分を組み合わせることにより、飛躍的に高いシワ改善、肌理改善効果がみられることがわかる。中でも、ラミニン産生効果とインテグリン産生効果を併せ持つ成分は、単独配合でも、ラミニン産生成分及びインテグリン産生成分を組み合わせて配合した場合と同程度の効果が見られる。被験者の実感効果も高く、本発明の有効成分により、シワ、肌理が改善されたことがわかる。
【００４２】化粧料の使用によるたるみ改善効果の測定
さらに、本発明にかかる軟膏を用いて、実際に使用した場合の効果について検討を行った。顔のたるみを訴える３０代から４０代の女性１４０名に１ヶ月間連続で一日２回（朝・夕）塗布してもらい連用試験を行った。被験者を無作為に２０名ずつの群に分け、表５の処方の軟膏を塗布してもらい、皮膚の改善度を評価した。評価方法は開始時と塗布１ヶ月後に半顔ずつの改善効果を比較し評価した。評価方法は開始時と塗布１ヶ月後に皮膚のハリ，弾力改善度をＣｕｔｏｍａｔｅｒＳＥＭ４７４（Ｃｕｒａｇｅ  ａｎｄ  Ｋｈａｚａｋａ）を用い評価した。Ｃｕｔｏｍａｔｅｒにて皮膚の弾力回復率を測定し、塗布後の弾力回復率から開始時の弾力回復率を差し引き評価した。さらに、使用後の実感度を被験者に頬，目元部位のたるみ改善度，および頬のハリ改善度に関して４段階評価してもらった。結果を表５に示す。また、使用期間中に肌の異常を訴えた被験者はいなかった。
【００４３】皮膚弾力性
Ｃｕｔｏｍａｔｅｒの陰圧吸引により伸びた皮膚の高さを伸展長（ｍｍ）とし、陰圧開放後に吸引前の状態に戻らず盛り上がったままの皮膚の高さを非退縮長（ｍｍ）とする。
【００４４】
【数４】
2004262861.tif 000009
【００４５】判定基準
（弾力回復率判定基準）
５：弾力回復率３０％以上
４：弾力回復率２０〜３０％以上
３：弾力回復率１０〜２０％
２：弾力回復率０〜１０％
１：弾力回復率０％以下
（被験者のたるみ度判定基準）
顕著に有効：たるみがなくなった
有効：開始時と比較してたるみが減った
やや有効：開始時と比較してややたるみが減った
無効：開始時と比較して同じ
【００４６】
【表５】
2004262861.tif 000010
【００４７】
表５の結果から、ラミニン産生効果しかないグリシル−Ｌ−チロシンのみでも、たるみ改善効果が見られるが、ラミニン産生成分及びインテグリン産生成分を組み合わせることにより、飛躍的に高いたるみ改善効果がみられることがわかる。中でも、ラミニン産生効果とインテグリン産生効果を併せ持つ成分は、単独配合でも、ラミニン産生成分及びインテグリン産生成分を組み合わせて配合した場合と同程度の効果が見られる。被験者の実感効果も高く、本発明の有効成分により、たるみが改善されたことがわかる。
【００４８】処方例１
（１）軟膏      （重量％）
ａ）ヒソップ抽出物…０．０１
ｂ）ステビア抽出物…０．０１
ｃ）酸化防止剤…適量
ｄ）ワセリン…残部
製法ａ）〜ｄ）までを加え、４０℃に加温し、十分に混合する。
【００４９】処方例２
（２）クリーム状外用剤（重量％）
ａ）ミツロウ  …２．０
ｂ）ステアリルアルコール…５．０
ｃ）ステアリン酸…８．０
ｄ）スクワラン…１０．０
ｅ）自己乳化型グリセリルモノステアレート…３．０
ｆ）ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）…１．０
ｇ）  ブロッコリー抽出物…０．００５
ｈ）ゼニアオイ抽出物…０．０１
ｉ）１，３−ブチレングリコール…５．０
ｊ）水酸化カリウム…０．３
ｋ）防腐剤・酸化防止剤…適量
ｌ）精製水…残部
製法ａ）〜ｆ）、ｋ）を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。ｉ）、ｊ）、ｌ）を混合し８０℃に保ち水相とする。油相に水相を加え乳化する。乳化後、攪拌しながら冷却し６０℃になったらｇ）〜ｈ）を加え４０℃になったら取りだしクリーム状外用剤を得る。
【００５０】処方例３
（３）乳液状外用剤（重量％）
ａ）ミツロウ…０．５
ｂ）ワセリン…２．０
ｃ）スクワラン…８．０
ｄ）ソルビタンセスキオレエート…０．８
ｅ）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）…１．２
ｆ）セイヨウネズ抽出物…０．０３
ｇ）ハイアオイ抽出物…０．０１
ｈ）１，３−ブチレングリコール…７．０
ｉ）カルボキシビニルポリマー…０．２
ｊ）水酸化カリウム…０．１
ｋ）精製水…残部
ｌ）防腐剤・酸化防止剤…適量
ｍ）エタノール…７．０
製法ａ）〜ｅ）までを加熱溶解し、８０℃に保つ。ｈ）〜ｌ）までを加熱溶解し、
８０℃に保ち、ａ）〜ｅ）に加えて乳化し６０℃でｆ）、ｇ）を加え、５０℃まで撹拌しながら冷却する。５０℃でｍ）を添加し、４０℃まで冷却し、乳液状外用剤を得る。
【００５１】処方例４
（４）化粧水（重量％）
ａ）グリシル−Ｌ−チロシン…０．００１
ｂ）ステビア抽出物…０．０００１
ｃ）グリセリン…５．０
ｄ）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．）…１．０
ｅ）エタノール…６．０
ｆ）香料…適量
ｇ）防腐剤・酸化防止剤…適量
ｈ）精製水…残部
製法ａ）〜ｈ）までを随時加え混合し、均一に溶解する。
【００５２】
【発明の効果】本発明の植物抽出物にシワ，たるみ，肌理構造改善効果を見出した。本発明の植物抽出液を化粧料に配合することによって、表皮のラミニン，インテグリン産生促進作用を有し、表皮と基底膜の接着を相乗的に改善することにより皮膚の肌理，シワ，たるみ，肌荒れ改善効果の期待できる化粧料の提供が可能となった。