(57)【要約】【課題】本発明は、評価対象物の鎮痒効果の評価において、その鎮痒効果を簡便かつ感度良く客観的に評価できる方法を提供すること、ならびにその方法を利用して鎮痒効果を評価した組成物を提供すること。【解決手段】被験動物としてヘアレス動物を用いて、評価対象物を眼部に投与した後、掻痒惹起物質を投与した際にあらわれる該被験動物の掻破行動を観察することにより、評価対象物の鎮痒効果を評価することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験動物としてヘアレス動物を用いて、評価対象物を眼部に投与した後、掻痒惹起物質を眼部に投与した際にあらわれる該被験動物の掻破行動を観察することにより、評価対象物の鎮痒効果を評価することを特徴とする鎮痒効果の評価方法。
【請求項２】
掻痒惹起物質がヒスタミン、コンパウンド４８／８０、セロトニン、サブスタンスＰの群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
ヘアレス動物がヘアレスマウス、ヘアレスラット、ヘアレスモルモットから選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項４】
評価対象物が点眼薬、洗眼薬、コンタクトレンズ用剤、コンタクトレンズ装着液の群から選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の評価方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載した方法で鎮痒効果を評価したことを特徴とする評価対象物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、評価対象物の鎮痒効果をヘアレス動物の眼部を用いて評価する方法およびその評価方法を用いて鎮痒効果を評価した評価対象物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
痒みとは物理的な刺激や各種起痒物質による化学的な刺激等に対し、痒み受容体が反応することで発生する主観的な感覚のひとつである。
【０００３】
中でも眼のかゆみは、花粉、ハウスダストやアトピー症状のアレルギー疾患が原因で発生することが多く、時間を問わずこれら外的刺激を受けた際等に発症するため、非常に不快な症状であり、深刻な症状になると、時に不眠症の原因などにもなりうる。このような症状に対し、患者は無意識に痒い部分をかきむしったり、不潔な状態で患部に触れたりすることで、角結膜炎やその他眼感染症を併発し、時には重篤な眼疾患に発展してしまう可能性がある。
【０００４】
このため痒みそのものを緩和、予防あるいは治療するための物質や組成物を開発することが重要であり、最近では種々の点眼薬、洗眼薬等の眼科用剤が開発されている。
このような鎮痒効果のある物質の開発にあたっては、鎮痒効果の評価試験が物質ないし組成物の有効性を判断する上で必須となるが、その評価対象となる痒みそのものが主観的な症状であるため、鎮痒効果のある物質のスクリーニングを含め動物を用いてこのかゆみを客観的に評価する方法について種々検討が行われている。
【０００５】
動物の眼部に評価対象物を投与し、これに伴い現れる掻破行動を観察することにより痒みの評価を行っている例としては、卵白アルブミンと水酸化アルミニウムゲルの投与により能動感作を行いアレルギー性結膜炎を発症させたモルモットに、被験薬剤を投与し、被験薬剤の投与前後における掻破行動の回数から算出した抑制率を対照薬剤と比較することによる、抗アレルギー点眼剤の有効性の評価方法が開示されている（特許文献１、非特許文献１）。しかしながら、感作系を確立し、評価を行う試験系においては、感作系を確立するまでに数週間の時間が必要であるため、簡便性に欠けるという欠点がある。
【０００６】
一方で、モルモットに被験薬剤を点眼投与した後、ヒスタミンを点眼する受動感作に伴い誘発されるモルモットの引っ掻き行動の回数を計測することにより、新規化合物の鎮痒効果を評価する方法も開示されている（特許文献２）。これは感作系の確立が不要であるため簡便に行えるものの、引っ掻き行動の回数が少ないため反応性が悪く、種々多様の評価対象物の評価を行うという点においては問題があった。
【０００７】
一方で、ヘアレス動物を用いた試験としては、ヘアレスマウスを用いた皮膚障害の客観的な評価方法ならびに皮膚保護用薬剤のスクリーニング方法が知られている（特許文献３）。また、実験的アレルギー性皮膚炎における痒みに関する研究（非特許文献２）として、ヘアレスマウスに長期間試験薬剤を反復塗布して感作／反応惹起することにより、即時性および遅延性の引っ掻き行動を観察する掻痒モデル作製の技術が発表されているが、これらの技術は皮膚への長期間の反復塗布が必要なものである上、皮膚と主として粘膜組織で構成される眼とは、組織的に薬物等の吸収挙動や反応性が全く異なるものであり、眼に対して被験物質を投与して鎮痒効果を評価する方法に関しては何ら開示されていない。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００２−２０１１２９号公報
【非特許文献１】
Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ　＆　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．７、Ｎｏ．２　２０００
【特許文献２】
特開２００１−１６３７８４号公報
【特許文献３】
特許第３２８０９３０号
【非特許文献２】
第１０１回薬理学会、２００２年発表要旨集
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、掻痒症状の緩和、予防及び治療に用いる物質あるいは組成物において、その鎮痒効果を簡便かつ感度良く客観的に評価できる方法を提供すること、ならびにその方法を利用して鎮痒効果を評価した物を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、簡便かつ感度良く客観的に評価対象物における鎮痒効果の評価方法を確立すべく、種々の検討を行った結果、ヘアレス動物を評価系に使用することにより、鎮痒効果が感度良く検出できることを見出した。
すなわち本発明は上記の知見に基づいてなされたものであり、本発明における評価対象物の鎮痒効果の評価方法は、請求項１記載の通り、被験動物としてヘアレス動物を用いて、該被験動物の眼部にあらかじめ評価すべき対象物を投与した後、掻痒惹起物質を投与した際にあらわれる該被験動物の掻破行動を観察することにより、評価対象物の鎮痒効果を評価することを特徴とする。
【００１１】
また、請求項２記載の評価方法は、掻痒惹起物質としてヒスタミン、コンパウンド４８／８０、セロトニン、サブスタンスＰの少なくとも１種から選択されることを特徴とする。
【００１２】
また、請求項３記載の評価方法は、被験動物として用いるヘアレス動物が、ヘアレスマウス、ヘアレスラット、ヘアレスモルモットから選択されることを特徴とする。また、本発明の眼科用組成物は、請求項４記載の通り、請求項１から３のいずれかに記載の評価方法を用いて鎮痒効果を評価したことを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の評価方法は、被験動物としてヘアレス動物を用いて、該被験動物の眼部にあらかじめ評価対象物を投与した後、掻痒惹起物質を投与した際にあらわれる該被験動物の掻破行動を観察することにより、評価対象物の鎮痒効果を評価することを特徴とするものである。
【００１４】
本発明の評価方法を用いた場合、能動感作に必要な長期間にわたる感作系の作成が不要であるため、簡便であり、また感度良く鎮痒効果の客観的評価を行うことが可能である。
【００１５】
被験動物としては、いわゆる遺伝的ヘアレス動物を用いることができる。好ましくは、ヘアレスマウス、ヘアレスラット、ヘアレスモルモット等の比較的扱いやすい小動物が挙げられ、より好ましくはヘアレスマウスである。また試験に用いる際の被験動物の週齢としては、通常４〜１５週齢のものが好ましい。
【００１６】
掻痒惹起物質としては、眼への投与によって掻痒関連行動を誘発できるものであれば特に制限はされないが、ヒスタミン、コンパウンド４８／８０、セロトニン等の肥満細胞脱顆粒促進物質や、、トリプシン、キマーゼ、パパイン、カリクレイン、ブラジキニン等のプロテアーゼおよびキニン類、プロスタグランジン、ロイコトリエンＢ４等のアラキドン酸代謝産物、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ニューロテンシン、セクレチン等の神経ペプチド、モルヒネ、エンドルフィン、エンケファリン等のオピオイドペプチドがあげられる。好ましくは、ヒスタミン、コンパウンド４８／８０、セロトニン、サブスタンスＰ、より好ましくはヒスタミン、コンパウンド４８／８０である。なお、ヒスタミンについては例えば塩酸塩などの塩の態様のものも含まれる。
【００１７】
また、本発明に用いられる掻痒惹起物質は投与の簡便性より、溶液として投与することが好ましい。また投与する掻痒惹起物質の量は、掻痒惹起物質の種類によって異なるため、特に規定されるものではないが、１眼あたり０．０５〜１．５ｍｇが好ましく、０．２５〜０．５ｍｇがより好ましい。なお、１眼あたりの投与量が５〜１０μｌの場合、好ましくは１〜３０ｗ／ｖ％の溶液を、より好ましくは５〜１０ｗ／ｖ％の溶液を用いることができ、例えば、ヒスタミンの場合、好ましくは１〜３０％（例えば投与量が片眼５μＬの場合、０．０５ｍｇ／ｓｉｔｅ〜１．５ｍｇ／ｓｉｔｅ）、より好ましくは５〜１０％（例えば投与量が片眼５μＬの場合、０．２５ｍｇ／ｓｉｔｅ〜０．５ｍｇ／ｓｉｔｅ）程度とモルモットに一般的に用いられる掻痒惹起物質の量の半量以下でモルモットに対し、掻痒を惹起することが可能である。
通常、掻痒惹起物質は投与の後、しばらく眼に滞留するため、この投与という行為そのものが被験動物の行動や評価対象物の反応性に影響を及ぼすことがあるが、本発明では掻痒惹起物質のこのように投与量が少ないため、掻痒惹起物質が評価対象物の反応性に及ぼす影響も最小限となり、評価対象物の評価が感度良く行える。
【００１８】
また、本発明において評価対象物の投与から掻痒惹起物質の投与までの時間については、特に規定されるものではないが、通常、評価対象物の投与から１〜６０分後に掻痒惹起物質の投与を行うことが好ましい。
【００１９】
本発明において観察される被験動物の掻破行動とは、主として掻痒惹起物質によって誘発された痒みによって、掻痒惹起物質の適用部位に対し、被験動物が自発的に後肢により示すいわゆる引っ掻き行動である。
【００２０】
また、本発明を用いた鎮痒効果の評価は、被験動物によって示される掻破行動の有無を観察できればよく、さらに掻破行動の回数等を計測することが好ましい。その計測は直接目視で行ってもよいが、無人環境下においてビデオカメラ等により記録ならびに観察計測を行うことが好ましい。
【００２１】
また、掻破回数の計測時間については、掻痒惹起物質の種類や量によって、掻破行動を開始する時間やその行動が持続する時間が異なるため、再現性のある評価が担保できるよう設定されていれば、特に規定されるものではないが、通常、掻痒惹起物質の投与直後から被験動物に現れる掻破行動についてその回数が計測可能で、計測時間は５〜９０分間、好ましくは２０〜６０分間である。
【００２２】
また、本発明における鎮痒効果の評価方法は、新規物質における鎮痒効果のスクリーニング評価から、単一あるいは複数の鎮痒成分を含有する組成物の鎮痒効果の評価に適用でき、特に抗ヒスタミン成分を含む組成物の鎮痒効果の評価に適している。
【００２３】
また、本発明を用いて鎮痒効果を評価する物は、それぞれの用途に応じて、通常眼に適用される剤型として評価を行うことが好ましい。また組成物は、例えば液剤の場合、眼科用液（点眼薬、洗眼薬、眼内灌流液、コンタクトレンズ装着液なども含む）、コンタクトレンズ用剤など、半固形剤の場合、眼軟膏剤などに製剤化されて適用されるが、特に好適な製剤形態は液剤で、具体的には、点眼剤、洗眼剤、コンタクトレンズ用剤、コンタクトレンズ装着液等として適用されるのが好ましい。
【００２４】
また、本発明を用いて鎮痒効果の評価を行う対象物には、医薬品、医薬部外品、コンタクトレンズ用剤など用途等に応じて、医薬品、医薬部外品、コンタクトレンズ用剤等に通常使用される成分を適宜配合してもよい。配合できる成分としては、例えばｐＨ調整剤、防腐・抗菌・殺菌剤、界面活性剤、安定化剤、等張化剤、キレート剤、酵素成分、香料、清涼化剤、抗酸化剤などが挙げられる。
【００２５】
【試験例および実施例】
本発明を以下の試験例と実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明は以下の記載に基づいて何ら限定して解釈されるものではない。
【００２６】
試験例１（ヘアレスマウスを用いたヒスタミンの用量反応試験）
実験方法：
被験動物として６週齢の雄性ヘアレスマウス（ＨＯＳ：ＨＲ−１）２０匹を１群５匹ずつとして４群に分け、以下の試験を行った。なお、対照として５週齢のＨａｒｔｌｅｙ系雄性モルモット２０匹を１群５匹ずつとして４群に分けて使用した。
各被験動物は購入後、飼育室で１週間の馴化飼育後、試験に用いた。
まず各試験群の各被験動物に対し、試験薬剤として生理食塩水を片眼５μｌずつ、両眼の眼瞼結膜嚢に点眼投与した。
次に、表１に示す投与量となるようにヒスタミン２塩酸塩（ＩＣＮバイオメディカル社製）を生理食塩水に溶解した掻痒惹起薬剤をそれぞれ作製し、試験薬剤の投与から３０分後に、被験動物に片眼５μｌずつ、両眼の眼瞼結膜嚢に点眼投与した。掻痒惹起薬剤の投与直後から３０分間にわたり、被験動物が後肢によって眼部を引っ掻く回数を計測した。なお、引っ掻き行動は掻痒惹起薬剤を投与後に被験動物が後肢で投与部位を引っ掻きはじめてから後肢を離すまでの一連の行動を引っ掻き回数１回として計測し、各被験動物ごとに計測した引っ掻き回数を各個体の引っ掻き回数とした。
各群の被験動物の引っ掻き回数について、各群５匹の引っ掻き回数の平均値と標準誤差を表１に示した。
【００２７】
【表１】
2004132794.tif 000002
【００２８】
試験結果：
表１から明らかなように、被験動物としてヘアレスマウスを用いた試験群では、対照群であるモルモットを用いた群より眼部における引っ掻き行動の回数が多く、かつ低用量の掻痒惹起物質で引っ掻き行動の十分な誘発が可能であった。
【００２９】
試験例２（マレイン酸クロルフェニラミンによる眼の痒みの抑制試験）
実験方法：
被験動物として６週齢の雄性ヘアレスマウス（ＨＯＳ：ＨＲ−１）１５匹を１群５匹ずつとして３群に分け、以下の試験を行った。なお、対照として５週齢のＨａｒｔｌｅｙ系雄性モルモット１５匹を１群５匹ずつとして３群に分けて使用した。
各被験動物は購入後、飼育室で１週間の馴化飼育後、試験に用いた。
また、表２に示す投与量となるようにマレイン酸クロルフェニラミン（福寿製薬株式会社製）を生理食塩水に溶解したものを２種類作製したもの、および生理食塩液を試験薬剤とし、これらを各被験動物に対し、片眼５μｌずつ、両眼の眼瞼結膜嚢に点眼投与した。
試験薬剤の投与から３０分経過した後、次に掻痒惹起薬剤として片眼の投与量が０．５ｍｇとなるように調製したヒスタミン塩酸塩の生理食塩溶液を同様に両眼に点眼し、掻痒惹起薬剤の投与直後から３０分間にわたり、被験動物が後肢によって眼部を引っ掻く回数を計測した。
なお、引っ掻き行動は掻痒惹起薬剤を投与後に被験動物が後肢で投与部位を引っ掻きはじめてから後肢を離すまでの一連の行動を引っ掻き回数１回として計測し、各被験動物ごとに計測した引っ掻き回数を各個体の引っ掻き回数とした。掻痒抑制率は以下の式から算出した。
ヘアレスマウスにおける掻痒抑制率（％）＝｛１−（実施例５または６における引っ掻き回数の平均値　／　実施例７における引っ掻き回数の平均値）｝×１００
モルモットにおける掻痒抑制率（％）＝｛１−（比較例５または６における引っ掻き回数の平均値　／　比較例７における引っ掻き回数の平均値）｝×１００
【００３０】
各群の被験動物の引っ掻き回数について、各群５匹の引っ掻き回数の平均値と標準誤差、掻痒抑制率を表２に示した。
【表２】
2004132794.tif 000003
【００３１】
試験結果：
表２から明らかなように、被験動物としてヘアレスマウスを用いた試験群では、マレイン酸クロルフェニラミンの濃度が高濃度になると引っ掻き回数が減少しており、逆に低濃度になると引っ掻き回数が増加するという濃度依存性が認められ、マレイン酸クロルフェニラミンに鎮痒効果があることが低濃度のマレイン酸クロルフェニラミンでも確認できた。一方で対照群であるモルモットを用いた系では、マレイン酸クロルフェニラミンの鎮痒効果は確認できなかった。
【００３２】
試験例３（点眼剤、洗眼剤による眼の痒みの抑制試験）
実験方法：
被験動物として６週齢の雄性ヘアレスマウス（ＨＯＳ：ＨＲ−１）３０匹を１群５匹ずつとして６群に分け、以下の試験を行った。各被験動物は購入後、飼育室で１週間の馴化飼育後、試験に用いた。
また、表３に示した組成の試験薬剤（実施例１１、１２は洗眼剤、実施例１０、１３〜１５は点眼剤）を各試験群の被験動物に対し片眼５μｌずつ、両眼の眼瞼結膜嚢に点眼投与した。
試験薬剤の投与から３０分経過した後、次に掻痒惹起薬剤として片眼の投与量が０．５ｍｇとなるように調製したヒスタミン塩酸塩の生理食塩溶液を同様に両眼に点眼し、掻痒惹起薬剤の投与直後から３０分間にわたり、被験動物が後肢によって眼部を引っ掻く回数を計測した。なお、引っ掻き行動は掻痒惹起薬剤を投与後に被験動物が後肢で投与部位を引っ掻きはじめてから後肢を離すまでの一連の行動を引っ掻き回数１回として計測し、各被験動物ごとに計測した引っ掻き回数を各個体の引っ掻き回数とした。
各群の被験動物の引っ掻き回数について、各群５匹の引っ掻き回数の平均値と標準誤差を表３に示した。
【表３】
2004132794.tif 000004
【００３３】
試験結果：
表３から明らかなように、鎮痒成分であるマレイン酸クロルフェニラミンの各試験薬剤における濃度と被験動物の引っ掻き回数について、濃度依存性が認められた。
試験薬剤中のマレイン酸クロルフェニラミンの濃度が０．００３％以上であれば、被験動物の掻破行動の抑制が観察でき、本発明による鎮痒効果の評価方法は、鎮痒成分が低濃度である評価対象物に対しても有効に適用できることが認められた。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によれば、評価対象物の鎮痒効果を評価するにあたり、簡便かつ感度良く客観的評価が行える。