(57)【要約】【課題】血液凝固因子と抗血液凝固因子抗体とが共存する検体から酵素免疫測定法により当該抗血液凝固因子抗体を高感度で定量できる抗血液凝固因子抗体の定量方法を提供する。【解決手段】抗血液凝固因子抗体２を酵素免疫測定法により一次抗体５に結合させる処理前および処理後の少なくとも一方の時点で、検体に対し、血液凝固反応過程において当該血液凝固因子１を特異的に分解する酵素４を加えることにより、その後、前記特定の分解酵素４を失活させる処理を行う必要もなく、血液凝固因子１の立体障害を受けずに前記抗血液凝固因子抗体２を二次抗体７に結合させて定量する。【選択図】　　　図１
2004132816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固因子およびこれと特異的に抗原抗体反応する抗血液凝固因子抗体が共存する検体から酵素免疫測定法により前記抗血液凝固因子抗体を定量する方法であって、前記抗血液凝固因子抗体を前記酵素免疫測定法により一次抗体に結合させる処理前および処理後の少なくとも一方の時点で、前記検体に対し、血液凝固反応過程において当該血液凝固因子を特異的に分解する酵素を加えることにより前記検体中の血液凝固因子を特異的に分解し、その後、前記特定の分解酵素を失活させる処理を行わずに、前記抗血液凝固因子抗体を二次抗体に結合させて定量するようにしたことを特徴とする酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法。
【請求項２】
請求項１において、前記血液凝固因子を前記特定の分解酵素により分解する処理は、生体内温度の条件下で行うようにしたことを特徴とする酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２において、前記血液凝固因子が、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、血液凝固第Ｖ因子、および血液凝固第ＸＩＩＩ因子のいずれかである場合、特異的に分解処理するための前記分解酵素はトロンビンを使用することを特徴とする酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法。
【請求項４】
請求項３において、力価が２５Ｕの血液凝固因子に対して、力価が０．００１２５Ｕ以上のトロンビンを加えることを特徴とする酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法。
【請求項５】
請求項３または請求項４において、検体にトロンビンを加えて行う分解処理は、２０分以上反応させることを特徴とする酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法。
【請求項６】
血液凝固第ＶＩＩＩ因子および抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子抗体が共存する検体から酵素免疫測定法により前記抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子抗体を定量する方法であって、前記抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子抗体を前記酵素免疫測定法による一次抗体に結合させる処理前に、前記検体に、力価が２５Ｕの血液凝固第ＶＩＩＩ因子に対して力価が０．００１２５Ｕ以上のトロンビンを加えて２０分以上インキュベートすることにより当該血液凝固第ＶＩＩＩ因子を特異的に分解し、その後、前記トロンビンを失活させることなく、前記抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子抗体を一次抗体および二次抗体に結合させて定量するようにしたことを特徴とする酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法に関するものであり、特に、血液凝固因子と抗血液凝固因子抗体とが共存する条件下、例えば、イムノアフィニティクロマトグラフィーにおける血液凝固因子の溶出工程で抗血液凝固因子抗体が僅かに混入した溶出液、あるいは投与した血液凝固因子に対する自己抗体を産生した患者の血液等の検体中から、その抗血液凝固因子抗体を定量するのに好適な酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、血液凝固因子が不足することで血液が凝固しにくくなり出血性の疾患を生じてしまう病気が知られており、例えば、血友病は先天的に血液凝固第ＶＩＩＩ因子または血液凝固第ＩＸ因子が不足している病気であるし、血液凝固第Ｖ因子が欠乏している第Ｖ因子欠乏症や血液凝固第ＸＩＩＩ因子が欠乏している第ＸＩＩＩ因子欠乏症等も知られている。これらの疾患の治療には血液凝固因子を補充する必要があり、その症状に応じて新鮮凍結血漿や血液凝固因子濃縮製剤が投与される。先天性出血患者のうち我が国で最も多いのは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子が量的または質的に欠乏している血友病Ａ患者である。この血友病Ａ患者には、血液凝固第ＶＩＩＩ因子のみを分離精製した血液凝固第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤が開発され自己注射療法により投与されている。
【０００３】
血液凝固第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤は、通常、クリオプレシピテートを原料としてイオン交換クロマトグラフィー、ウイルス除去膜やイムノアフィニティクロマトグラフィーによる精製処理を経て製造される。イムノアフィニティークロマトグラフィーは、抗原抗体反応を利用した精製法であり、特異性が高く夾雑物を効率良く除去できるため、タンパク質の高純度精製に広く利用されている。このイムノアフィニティクロマトグラフィーの主な工程を図９を参照しつつ説明する。まず、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１を精製するため、これと特異的に反応する抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子マウスモノクローナル抗体（２）（以下、「マウスＩｇＧ（２）」という）をゲル担体９に共有結合させ、カラム１０に充填しておく（図９（ａ））。
【０００４】
つづいて、そのカラム１０の中にクリオ溶解液１１を入れることにより、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１とマウスＩｇＧ（２）とが特異的に抗原抗体反応して結合する（図９（ｂ））。その後、洗浄液により不純物１２を除去するとともに（図９（ｃ））、溶出液を流してマウスＩｇＧ（２）と血液凝固第ＶＩＩＩ因子１との抗原抗体反応を弱め、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１を溶出させる（図９（ｄ））。このような工程を経て血液凝固第ＶＩＩＩ因子１を高純度に精製するようになっている。
【０００５】
しかしながら、前述したイムノアフィニティクロマトグラフィーにおいては、マウスＩｇＧ（２）が共有結合という化学結合の中でも最も強力な結合によってゲル担体９に固定されているにもかかわらず、図９（ｄ）に示すように、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１を溶出させる際に、前記マウスＩｇＧ（２）がゲル担体９から微量ながら剥離してしまい、その溶出液に混入してしまう場合がある。このようにマウスＩｇＧ（２）の混入量によっては血液凝固第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤の品質に影響を与えるおそれがあるため、混入量を正確に把握する必要がある。
【０００６】
そこで、マウスＩｇＧ（２）がどのくらい血液凝固第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤中に混入しているかを測定するために、例えば、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡともいう）が挙げられる。この酵素免疫測定法は、酵素で標識した二次抗体を用いて発色基質を発色させることにより抗原量あるいは抗体量を測定する方法であり、分光光度計で測定できて検出感度も優れているため好適と考えられる。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００１−２１５５９号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１とマウスＩｇＧ（２）とは抗原抗体の関係にあるため両者は免疫複合体を形成し、かつ、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１の分子量が大きいことも重なり、酵素免疫測定法においてマウスＩｇＧ（２）の一次抗体への結合や二次抗体が結合するのを阻害してしまい、十分な感度でマウスＩｇＧ（２）を定量できないという問題がある。
【０００９】
これを図１０を参照してもう少し具体的に説明すると、酵素免疫測定法では、まず、図１０（ａ）に示すように、プラスチック製のプレート６にマウスＩｇＧ（２）に対する抗体である抗マウスＩｇＧ（５）を結合させておき、そこにマウスＩｇＧ（２）と血液凝固第ＶＩＩＩ因子１とが共存する溶液を加える。すると、図１０（ｂ）に示すように、マウスＩｇＧ（２）が抗マウスＩｇＧ（５）と結合する。これをよく反応させた後に、酵素で標識してある二次抗体としての酵素標識抗マウスＩｇＧ（７）を加える。ここでは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）という酵素が標識されたＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（７）を加えると、このＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（７）がマウスＩｇＧ（２）に結合する（図１０（ｃ））。その後、それをよく洗浄し、基質を加えてＨＲＰにより発色させる（図１０（ｄ））。これにより、溶液中のマウスＩｇＧ（２）の濃度に応じた量の発色が現れ、定量分析できるようになっている。
【００１０】
しかしながら、図１０（ｃ）に示すように、抗原抗体関係にある血液凝固第ＶＩＩＩ因子１とマウスＩｇＧ（２）とは免疫複合体を形成し、かつ、その血液凝固第ＶＩＩＩ因子１の分子量が３００ＫＤａと大きいため、マウスＩｇＧ（２）の抗マウスＩｇＧ（５）への結合や二次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（７）を加えたときに、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（７）とマウスＩｇＧ（２）との結合が、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１によって立体構造的に阻害されるものが生じ、結合できずに洗浄除去されてしまうという問題がある。
【００１１】
このような問題を解決する方法として、異なる抗原決定基（エピトープ）を持つ複数のモノクローナル抗体を一次抗体、二次抗体として使用することが考えられる。例えば、抗原と抗体の両方に反応するモノクローナル抗体を一次抗体、二次抗体とした場合、一次抗体により免疫複合体が捕捉され、さらに二次抗体も両者に対する抗体の混合物であるから、前記免疫複合体の立体構造により阻害されることなく酵素免疫測定法による検出が可能となる。
【００１２】
しかしながら、このような方法は、免疫複合体の検出を目的する場合であればよいが、本願発明の問題点のように免疫複合体を構成するいずれか一方のみを定量するためには、不十分であるし、特に、前述のような微量なマウスＩｇＧ（２）を定量するには適していない。また、他の解決方法として、免疫複合体の結合を解離させる条件下で酵素免疫測定法を実行することが考えられる。
【００１３】
しかし、免疫複合体の結合力を弱めるような条件下では、マウスＩｇＧ（２）と抗マウスＩｇＧ（５）との一次抗体間における結合力、場合によってはマウスＩｇＧ（２）とＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（７）との二次抗体間における結合も弱くなってしまうため、測定系全体としての感度が低下してしまう。
【００１４】
さらに、特開２００１−２１５５９号には、蛋白結合型糖化蛋白に蛋白分解酵素を加えて非特異的に抗原となる蛋白を分解し、蛋白糖化反応生成物を露出させ、その後、反応液を９５℃以上の沸騰水中に浸すことにより前記蛋白分解酵素を失活させることを特徴とする発明が記載されている。
【００１５】
しかし、このような方法においては、蛋白質変性剤の添加や加熱といった一般的な蛋白質変性方法であるため、被定量対象であるマウスＩｇＧ（２）も変性してしまうおそれがあり正確な定量ができない可能性がある。
【００１６】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、血液凝固因子と抗血液凝固因子抗体とが共存する検体について、酵素免疫測定法により抗血液凝固因子抗体を定量する場合に、この抗血液凝固因子抗体の一次抗体への結合や二次抗体の結合を阻害する血液凝固因子のみを特異的に分解し、前記抗血液凝固因子抗体の性状には影響を与えずに高感度で定量できる酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法を提供することを目的としている。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明の酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法の特徴は、血液凝固因子およびこれと特異的に抗原抗体反応する抗血液凝固因子抗体が共存する検体から酵素免疫測定法により前記抗血液凝固因子抗体を定量する方法であって、前記抗血液凝固因子抗体を前記酵素免疫測定法により一次抗体に結合させる処理前および処理後の少なくとも一方の時点で、前記検体に対し、血液凝固反応過程において当該血液凝固因子を特異的に分解する酵素を加えることにより前記検体中の血液凝固因子を特異的に分解し、その後、前記特定の分解酵素を失活させる処理を行わずに、前記抗血液凝固因子抗体を二次抗体に結合させて定量するようにした点にある。
【００１８】
そして、このような構成を採用したことにより、血液凝固反応過程において血液凝固因子を活性化させる等して特異的に分解する酵素は、その血液凝固因子のみを特異的に分解し、被測定対象である抗血液凝固因子抗体の性状には影響を与えないため、そのような分解処理を一次抗体結合の処理前および処理後のいずれか一方または両方の時点で行うことにより、抗血液凝固因子抗体と一次抗体、および二次抗体との結合が血液凝固因子によって阻害されるのを防止するという作用を奏する。
【００１９】
また、本発明は、検体中の血液凝固因子を特定の分解酵素により特異的に分解する処理は生体内温度の条件下で行うようにすることが好ましい。これにより、特定の分解酵素が生体内温度という、血液凝固反応において本来の機能を発揮する条件の下で血液凝固因子の分解処理が進行するため、血液凝固因子を効率的に分解するという作用を奏する。
【００２０】
さらに、本発明では、血液凝固因子が、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、血液凝固第Ｖ因子、および血液凝固第ＸＩＩＩ因子のいずれかである場合、特異的に分解処理するための酵素はトロンビンを使用するようになっている。これにより、抗血液凝固因子抗体の定量を阻害する血液凝固第ＶＩＩＩ因子、血液凝固第Ｖ因子、および血液凝固第ＸＩＩＩ因子を確実に分解する。
【００２１】
また、本発明において、力価が２５Ｕの血液凝固因子に対して、力価が０．００１２５Ｕ以上のトロンビンを加えることが好ましい。これにより、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、血液凝固第Ｖ因子、および血液凝固第ＸＩＩＩ因子の各血液凝固因子を分解するのに適当なトロンビンの濃度および量が定まる。
【００２２】
さらに、本発明では、検体にトロンビンを加えて行う分解処理は、２０分以上反応させることが好ましい。これにより、トロンビンが、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、血液凝固第Ｖ因子、および血液凝固第ＸＩＩＩ因子の各血液凝固因子を十分に分解できる時間を確保できる。
【００２３】
また、本発明の特徴は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子および抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子抗体が共存する検体から酵素免疫測定法により前記抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子抗体を定量する方法であって、前記抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子抗体を前記酵素免疫測定法による一次抗体に結合させる処理前に、前記検体に、力価が２５Ｕの血液凝固第ＶＩＩＩ因子に対して力価が０．００１２５Ｕ以上のトロンビンを加えて２０分以上インキュベートすることにより当該血液凝固第ＶＩＩＩ因子を特異的に分解し、その後、前記トロンビンを失活させることなく、前記抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子抗体を一次抗体および二次抗体に結合させて定量するようにした点にある。
【００２４】
そして、このような構成を採用したことにより、血液凝固反応過程において血液凝固第ＶＩＩＩ因子を活性化させるトロンビンが、血液凝固第ＶＩＩＩ因子のみを特異的に分解し、被測定対象である抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子抗体の性状には影響を与えないため、そのような分解処理を一次抗体結合の処理前に行うことにより、抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子抗体と一次抗体、および二次抗体との結合が血液凝固第ＶＩＩＩ因子によって阻害されず正確な定量ができるという作用を奏する。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法の実施形態の一例を図面を用いて説明する。
【００２６】
本実施形態における抗血液凝固因子抗体の定量方法は、血液凝固因子およびこれと特異的に抗原抗体反応する抗血液凝固因子抗体が共存する検体の中から酵素免疫測定法を使用して前記抗血液凝固因子抗体を高感度に定量分析するものである。具体的には、酵素免疫測定法によって抗血液凝固因子抗体を一次抗体に結合させる処理前および処理後の少なくとも一方の時点で、当該血液凝固因子を特異的に分解する酵素、本実施形態では、血液凝固反応（カスケードとも言う）の各過程で当該血液凝固因子を活性化させる酵素を加えることにより当該血液凝固因子を特異的に分解し、その後、前記分解酵素を失活させる処理を行うことなく、前記抗血液凝固因子抗体を二次抗体に結合させて定量する。
【００２７】
特異的な分解酵素による血液凝固因子の分解処理は、立体構造障害を除去するために、少なくとも抗血液凝固因子抗体を二次抗体に結合させる前に行う必要があり、抗血液凝固因子抗体と一次抗体とが結合される処理前あるいは処理後が選択できるが、本実施形態では、一次抗体へ効率的に結合できるように一次抗体との結合前に行うことが好ましい。さらには、その一次抗体との結合前の分解処理に加えて、分解されずに残存している血液凝固因子を分解する目的で、一次抗体との結合後にも分解処理するのがより好ましい。
【００２８】
ここで、血液凝固因子製剤のうちでも最も代表的な血液凝固第ＶＩＩＩ因子製剤として精製される血液凝固第ＶＩＩＩ因子１を本実施形態の代表的な一例として図１から図４を参照しつつ説明する。
【００２９】
本実施形態で用いる検体は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤であり、その製造過程でイムノアフィニティクロマトグラフィーにより血液凝固第ＶＩＩＩ因子１をマウスＩｇＧ（２）に吸着させて不純物を洗浄除去することにより精製される。
【００３０】
そして、血液凝固第ＶＩＩＩ因子を特異的に分解する酵素であるトロンビンを用いて、本実施形態の定量方法は、図１に示すように、主として、酵素免疫測定法による定量前に検体に前記トロンビン４を加えて血液凝固第ＶＩＩＩ因子１を分解させる第１トロンビン処理（処理Ｓ１）と、このトロンビン処理後の前記検体を抗マウスＩｇＧ（５）が結合されたプレート６に入れてマウスＩｇＧ（２）と抗マウスＩｇＧ（５）とを結合させる一次抗体処理（処理Ｓ２）と、この一次抗体処理後に再びトロンビン４を加えて残存する血液凝固第ＶＩＩＩ因子１を分解させる第２トロンビン処理（処理Ｓ３）と、このトロンビン処理後の前記検体に酵素で標識されたＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（７）を加えてマウスＩｇＧ（２）と結合させる二次抗体処理（処理Ｓ４）とが順次行われる。
【００３１】
これらの各処理について、図２および図３の模式図を参照しつつより詳細に説明する。
【００３２】
第１トロンビン処理では、２５Ｕの血液凝固第ＶＩＩＩ因子１に対して０．００１２５Ｕ以上のトロンビン４が加えられる。例えば、５０Ｕ／ｍｌの血液凝固第ＶＩＩＩ因子１を０．５ｍｌ含む検体であれば、０．０５Ｕ／ｍｌのトロンビン４を０．０２５ｍｌ以上加える必要がある。
【００３３】
また、反応させる温度条件は、トロンビン４が生体内で血液凝固第ＶＩＩＩ因子を活性化させるように作用する酵素であるため、生体内温度が好ましく約３７℃がよい。時間条件は１０〜３０分程度であり、２０分以上が好ましく、３０分以上であれば、より確実に血液凝固第ＶＩＩＩ因子１を分解させられるためより好ましい。この反応は温度調整に適しているヒートブロック上やウォーターバスにより行われる。
【００３４】
このような第１トロンビン処理により、トロンビン４は血液凝固第ＶＩＩＩ因子１の活性化酵素であることから、図２に示すように、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１を特異的に分解する。
【００３５】
つぎに、図３（ａ）〜（ｃ）に示すように、一次抗体処理では、抗マウスＩｇＧ（５）がコーティングされた９６穴プレート６に、トロンビン処理した検体を入れて室温で２時間程度インキュベートする。このとき、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１は細かく分解されているため、マウスＩｇＧ（２）が抗マウスＩｇＧ（５）に結合し易くなっている。インキュベートとした後、洗浄液でよく洗浄する。
【００３６】
つづいて、第２トロンビン処理では、洗浄後のプレート６に、再びトロンビン４を入れて残存する血液凝固第ＶＩＩＩ因子１を分解する。これにより、次の二次抗体処理におけるＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（７）の結合を確実かつ容易にする。第２トロンビン処理では、第１トロンビン処理のときよりも濃度が濃くて多めの量のトロンビン４を加える。
【００３７】
つぎに、二次抗体処理では、第２トロンビン処理後に洗浄液で洗浄し、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（７）を加えて室温で２時間程度インキュベートする。これにより、図３（ｄ）に示すように、前記ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（７）が血液凝固第ＶＩＩＩ因子１に阻害されることなくマウスＩｇＧ（２）と結合される。そして、洗浄液で洗浄した後、基質を加えてＨＲＰによりその基質を発色させて吸光度等を測定する。
【００３８】
なお、前述した二次抗体処理におけるＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（７）に代えて、図４に示すように、ビオチン化抗マウスＩｇＧ（７ａ）を第２トロンビン処理後の検体に加えて二次抗体処理を行い、さらにアビジン化ＨＲＰ８を加えるようにしてもよい。アビジン化ＨＲＰ８は１つのビオチンに対して４つが結合するため、発色度が高くなりマウスＩｇＧ（２）が低濃度であっても高感度で検出できる。
【００３９】
つぎに、前述した本実施形態におけるトロンビン処理の効果を確認するために、以下のような実験を行って吸光度等を測定した。
【００４０】
【実施例】
まず、第１トロンビン処理として、力価が１００Ｕ／ｍｌである血液凝固第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤５００μｌに対し、０．５Ｕ／ｍｌのヒトトロンビン４（三菱ウェルファーマ社製）を２５μｌずつ加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００４１】
つづいて、ヤギ抗マウスＩｇＧ（５）をコーティングした９６穴プレート６に、トロンビン処理した検体を１００μｌずつ入れ、室温で２時間インキュベートして一次抗体処理を行った。
【００４２】
つぎに、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で５回洗浄した後、残存する血液凝固第ＶＩＩＩ因子１の分解を目的として、５Ｕ／ｍｌのトロンビン４を１００μｌずつ加え、３７℃で３０分間インキュベートすることにより第２トロンビン処理を行った。
【００４３】
その後、洗浄液で５回洗浄した後、１／６０，０００に希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ（７ａ）（生化学工業株式会社製）を１００μｌ加え、室温で２時間インキュベートした。そして、洗浄液で５回洗浄した後、１／１，０００に希釈したアビジン化ＨＲＰ（ＧＩＢＣＯ社製）を１００μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。最後に、洗浄液で５回洗浄後、３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を１００μｌ、１０分後に１Ｎ硫酸を５０μｌずつ加え、４５０ｎｍで吸光度を測定した。マウスＩｇＧ（２）の定量は、まず濃度既知のマウスＩｇＧ（２）について同様の操作を行い、各濃度に対する吸光度を求めてスタンダード直線を作成し、このスタンダード直線の吸光度からマウスＩｇＧ（２）の濃度を求めるようにした。なお、これらの操作は自動ＥＬＩＳＡ装置（Ｂｅｈｒｉｎｇ　ＥＬＩＳＡ　ＰｒｏｃｅｓｓｅｒＩＩＩ）を使用して行った。
【００４４】
以上のような本実施形態における処理を行った後に、トロンビン４の効果を確認するために、トロンビン処理を経た検体と未処理の検体、および検体を加えないマウスＩｇＧ（２）のみを含むスタンダード溶液についてマウスＩｇＧ（２）の濃度に対する吸光度をそれぞれ測定した。また、トロンビン４が血液凝固第ＶＩＩＩ因子１およびマウスＩｇＧ（２）に与える影響を調べるためにポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｄｏｄｅｃｙｌ　Ｓｕｌｆａｔｅ−Ｐｏｌｙ−Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）により性状を確認した。
【００４５】
「トロンビン処理効果の確認」
マウスＩｇＧ濃度に対する吸光度を測定する場合、試料は、まず、比較基準となるスタンダード溶液として、マウスＩｇＧ（２）の濃度が０〜０．５ｎｇ／ｍｌとなるように希釈溶液により希釈した。また、トロンビン処理する検体およびトロンビン処理しない検体としては、血液凝固第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤にマウスＩｇＧ（２）を添加し、そのマウスＩｇＧ（２）の濃度が０〜０．５ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。このとき、血液凝固第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤に混入しているマウスＩｇＧ（２）の量は濃度の計算に含めない。
【００４６】
マウスＩｇＧ（２）の各濃度のスタンダード溶液およびトロンビン処理、未処理の検体に対して４５０ｎｍの波長の光を当てて吸光度を測定した結果を図５および図６に示す。図６は、図５の各数値をグラフに表したものである。ただし、これらの図では１／１０，０００のビオチン化抗マウスＩｇＧ（７ａ）を使用して発色させている。吸光度Ａとは、ｌｏｇ１０（Ｉ０／Ｉ）のことであり、Ｉ０は入射光の強さであり、Ｉは透過光の光の強さである。これらの結果によれば、トロンビン処理をしていない検体は、スタンダード直線に比べると０．０５ｎｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ濃度以上において、吸光度が低くなっており、添加したマウスＩｇＧ濃度以下の吸光度を示した。これは、従来の問題点で指摘したように、マウスＩｇＧ（２）と血液凝固第ＶＩＩＩ因子１とが免疫複合体を形成するために、マウスＩｇＧ（２）と一次抗体である抗マウスＩｇＧ（５）との結合や二次抗体であるビオチン化抗マウスＩｇＧ（７ａ）との結合が阻害されてしまった結果である。
【００４７】
一方、トロンビン処理を行った検体の吸光度は、スタンダード直線と同様の傾きをもつことからマウスＩｇＧ（２）を正確に定量できていることがわかる。
【００４８】
「トロンビンによる血液凝固第ＶＩＩＩ因子１およびマウスＩｇＧ（２）への影響」つぎに、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１およびマウスＩｇＧ（２）にトロンビン４が与える影響を調べるためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルは、ＳＤＳサンプル緩衝液とタンパク質溶液とを１：１で混合後、１００℃で２分間加熱して作製した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、泳動用ゲルと濃縮用ゲルからなるゲルと泳動緩衝液とを使用し、泳動は１０ｍＡの定電流により行った。泳動用ゲルは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１の場合、８．５％アクリルアミドを含むゲルを使用し、マウスＩｇＧ（２）の場合、１０％アクリルアミドを含むゲルを使用した。
【００４９】
そして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、セミドライ式のブロッティング装置を使用してゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。転写は１．５ｍＡ／ｃｍ２の定電流で行い、ニトロセルロース膜を３％牛血清アルブミンでブロッキングした後、一次抗体として抗ヒト第ＶＩＩＩ因子マウスモノクローナル抗体、二次抗体としてビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧと反応させた。そして、アビジン化アルカリフォスファターゼ（Ｈａｒｌａｎ社製）と反応させた後に、発色基質を加えて血液凝固第ＶＩＩＩ因子１を検出した。マウスＩｇＧ（２）の検出は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１の検出で使用した二次抗体であるビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧを一次抗体として使用し、その後の工程は血液凝固第ＶＩＩＩ因子１と同様の手順により行った。
【００５０】
図７には、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１をトロンビン処理したときの経時変化を示す。この図７に示すように、トロンビン４を投入した後の経過時間が０分のとき、つまりトロンビン未処理のときの血液凝固第ＶＩＩＩ因子１は、重鎖が分子量２００ＫＤａ以上のバンドとして検出され、軽鎖は分子量８０ＫＤａの２本鎖として検出されている。その後、トロンビン処理後の時間が経過するのに伴って重鎖および軽鎖がそれぞれ分解され、２０分経過すると分子の多くが４５ＫＤａ以下の短いバンドとして検出され、３０分後には大部分が４５ＫＤａのバンドとして検出されるに至り、断片化された。なお、図示していないが、３０分以上時間が経過してもそれ以上分子が分解されることはなかった。
【００５１】
一方、トロンビン処理によるマウスＩｇＧ（２）への影響を調べた。図８には、非還元のマウスＩｇＧと、還元したマウスＩｇＧについて、それぞれトロンビン処理およびトロンビン処理しないものを用意し、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量を検出した。なお、還元処理は、マウスＩｇＧの軽鎖と重鎖のジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を切断する処理である。
【００５２】
そこで、図８に示すように、レーン１およびレーン２は、いずれも非還元のマウスＩｇＧ（２）であって、レーン１はトロンビン処理したマウスＩｇＧ（２）であり、レーン２はトロンビン未処理のマウスＩｇＧ（２）である。いずれのサンプルも全分子の分子量が１５０ＫＤａであり、トロンビン処理による分解等の影響を受けていないことがわかる。
【００５３】
同様に、レーン３およびレーン４は、いずれも還元したマウスＩｇＧ（２）であって、レーン３はトロンビン処理したマウスＩｇＧ（２）であり、レーン４はトロンビン未処理のマウスＩｇＧ（２）である。いずれも５０ＫＤａの重鎖と、２５ＫＤａの軽鎖が出現しており、相違しない。
【００５４】
このような結果により、マウスＩｇＧ（２）の二次構造に変化はなく、トロンビン４によりマウスＩｇＧ（２）が分解されないことが確認された。
【００５５】
つぎに、本実施形態の定量方法における検出限界を以下の式１に従って算出した。
吸光度の検出限界＝μＢ＋（３．３×σＢ）・・・式１
μＢ＝ブランクまたは披験物質から得られる応答の平均値
σＢ＝ブランク応答の標準偏差
バリデーションデータ収集のために行った試験回数２０回でのブランク値の平均は０．０７５、標準偏差は０．０１７である。これら数値を上記式に代入すると、
吸光度の検出限界＝０．０７５＋（３．３×０．０１７）＝０．１３１
【００５６】
したがって、本実施形態の定量方法では、吸光度が０．１３１以上の検体について測定可能である。今回収集したデータによると０．０５ｎｇ／ｍｌ以上のマウスＩｇＧ濃度であれば、０．１３１以上の吸光度を示している。これによりトロンビン処理を行う酵素免疫測定法の定量限界は０．０５ｎｇ／ｍｌであった。
【００５７】
以上より、前述した本実施形態によれば、血液凝固因子と抗血液凝固因子抗体とが共存する検体について、酵素免疫測定法により抗血液凝固因子抗体を定量する場合に、二次抗体との結合を阻害する血液凝固因子のみを特異的に分解することにより、前記抗血液凝固因子抗体の性状には影響を与えずに高感度で定量することができる。
【００５８】
イムノアフィニティクロマトグラフィーを利用したタンパク質精製を行った際には、ゲル担体から抗体が剥離し、目的タンパク質に対する不純物となる場合がある。その抗体濃度を測定する場合には、抗原となる目的タンパク質が存在するため、酵素免疫測定法等のサンドイッチ方式の測定法では、目的タンパク質が大きなものであれば、二次抗体の結合を阻害し、測定感度が低下する。このような場合には、本実施形態のように目的タンパク質のみを分解する酵素により検体を処理すれば、感度の向上が図れる。
【００５９】
なお、本発明の本実施形態の各構成は前述したものに限るものではなく、適宜変更することができる。
【００６０】
例えば、本実施形態では、血液凝固因子の代表的な一例として血液凝固第ＶＩＩＩ因子１を実施例として示したが、他の血液凝固因子、例えば、血液凝固第Ｖ因子や血液凝固第ＸＩＩＩ因子についても、分子量がそれぞれ大きいため、各抗体である抗血液凝固第Ｖ因子モノクローナル抗体や抗血液凝固第ＸＩＩＩ因子モノクローナル抗体を共存下で定量する場合に、それらの血液凝固反応過程において活性させる酵素であるトロンビン４により特異的な分解処理を加えることで、より正確な定量分析をすることが可能である。同様に、血友病Ｂ患者のための濃縮製剤である血液凝固第ＩＸ因子濃縮製剤についても、混入した抗血液凝固第ＩＸ因子モノクローナル抗体を定量する場合に、血液凝固反応過程における血液凝固第ＩＸ因子の活性化酵素である血液凝固第ＸＩ因子を加えて特異的に分解処理することにより、より正確な定量分析が可能と考えられる。
【００６１】
また、各血液凝固因子の抗体としてマウスＩｇＧ（２）を使用しているが、これに限る必要はなく、ポリクローナル抗体にも応用することが可能である。
【００６２】
さらに、本実施形態では、イムノアフィニティクロマトグラフィーによって精製された血液凝固濃縮製剤を例に挙げているが、これに限られるものではなく、たとえば、血液凝固第ＶＩＩＩ因子１に対する自己抗体を産生した疾患に対してその抗体を定量する場合、あるいは抗原抗体の関係に限らず、親和性を有する２つのものが共存する条件下でいずれか一方の定量を行う場合にも利用できる。
【００６３】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、血液凝固因子と抗血液凝固因子抗体とが共存する検体について、酵素免疫測定法により抗血液凝固因子抗体を定量する場合に、この抗血液凝固因子抗体の一次抗体への結合や二次抗体の結合を阻害する血液凝固因子のみを特異的に分解し、前記抗血液凝固因子抗体の性状には影響を与えずに高感度で定量することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法の主な工程を示すフローチャート図である。
【図２】本実施形態における第１トロンビン処理したときの検体の状況を示す模式図である。
【図３】本実施形態におけるＨＲＰ標識二次抗体を用いた酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法を示す模式図であって、（ａ）はプレートに抗マウスＩｇＧを結合させた状態を示す図、（ｂ）はトロンビン処理後の検体を投入した状態を示す図、（ｃ）は一次抗体結合処理を行い、洗浄後を示す図、（ｄ）は二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを結合させた状態を示す図である。
【図４】本実施形態におけるビオチン化二次抗体を用いた酵素免疫測定法による抗血液凝固因子抗体の定量方法を示す模式図であって、（ａ）はプレートに抗マウスＩｇＧを結合させた状態を示す図、（ｂ）はトロンビン処理後の検体を投入した状態を示す図、（ｃ）は一次抗体結合処理を行い、洗浄後を示す図、（ｄ）は二次抗体としてビオチン化抗マウスＩｇＧを結合させた状態を示す図、（ｅ）はビオチンにアビジン化ＨＲＰを結合させた状態を示す図である。
【図５】本実施形態においてマウスＩｇＧの各濃度に対する吸光度の結果を示す表である。
【図６】図５の各数値をグラフ化した図である。
【図７】トロンビン処理による血液凝固第ＶＩＩＩ因子の経時変化を示す図であって、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にブロッティングした結果を示す図である。
【図８】トロンビン処理によるマウスＩｇＧへの影響を示す図であって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にブロッティングした結果を示す図である。
【図９】血液凝固第ＶＩＩＩ因子の精製過程におけるイムノアフィニティクロマトグラフィーの工程を示す図であり、（ａ）はクリオ溶解液をカラムに投入する状態を示す図、（ｂ）はクリオ溶解液をカラム内に通過させて血液凝固第ＶＩＩＩ因子をマウスＩｇＧに吸着させた状態を示す図、（ｃ）は洗浄液を流して不純物を除去する状態を示す図、（ｄ）は血液凝固第ＶＩＩＩ因子を溶出する状態を示す図である。
【図１０】従来の酵素免疫測定法による抗血液凝固第ＶＩＩＩ因子マウスモノクローナル抗体の定量方法を示す模式図であって、（ａ）はプレートに抗マウスＩｇＧを結合させた状態を示す図、（ｂ）はプレートに溶出液を投入してマウスＩｇＧと抗マウスＩｇＧとの一次抗体結合させた状態を示す図、（ｃ）は二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを投入した状態を示す図、（ｄ）はマウスＩｇＧにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを結合させた状態を示す図である。
【符号の説明】
１　血液凝固第ＶＩＩＩ因子
２　マウスＩｇＧ
４　トロンビン
５　抗マウスＩｇＧ
６　プレート
７　ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ
７ａ　ビオチン化抗マウスＩｇＧ
８　アビジン化ＨＲＰ
９　ゲル担体
１０　カラム
１１　クリオ溶解液
１２　不純物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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