(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ターゲット遺伝子に対して高い発現抑制作用を有し、他の遺伝子の発現に影響を与えないアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法及び該化合物を提供すること。【解決手段】下記の工程１）乃至７）を含むアンチセンス化合物の設計方法等の提供：１）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する工程；２）入力された塩基配列データとの相同性を求める工程；３）相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程：４）工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの添加及び無添加でインキュベートした細胞からそれぞれ全ＲＮＡ画分を抽出する工程；５）全ＲＮＡ画分の間における工程３）で出力された各遺伝子の発現量の差を解析する工程；６）各遺伝子の発現量の差にもとづいて工程１）で示されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を改変する工程；７）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程１）乃至７）を含むアンチセンス化合物の設計方法：
１）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する工程；
２）入力された塩基配列データと、塩基配列が解析された遺伝子の塩基配列データベースからの塩基配列データとの相同性を求める工程；
３）工程２）によって得られた相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程；
４）工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加してインキュベートした細胞及び該オリゴヌクレオチドを添加しないでインキュベートした細胞からそれぞれ全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
５）工程４）で得られた全ＲＮＡ画分の間における工程３）で出力された各遺伝子の発現量の差を解析する工程；
６）工程５）で得られた各遺伝子の発現量の差にもとづいて工程１）で示されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を改変する工程；
７）工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する工程。
【請求項２】
下記の工程１）乃至７）を含むアンチセンス化合物の設計方法：
１）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する工程；
２）入力された塩基配列データと、塩基配列が解析された遺伝子の塩基配列データベースからの塩基配列データとの相同性を求める工程；
３）工程２）によって得られた相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程：
４）工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを投与した動物及び該オリゴヌクレオチドを投与しなかった動物からそれぞれ全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
５）工程４）で得られた全ＲＮＡ画分の間における工程３）で出力された各遺伝子の発現量の差を解析する工程；
６）工程５）で得られた各遺伝子の発現量の差にもとづいて工程１）で示されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を改変する工程；
７）工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する工程。
【請求項３】
下記の工程１）乃至７)を含むアンチセンス化合物の設計方法：
１）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する工程；
２）入力された塩基配列データと、塩基配列が解析された遺伝子の塩基配列データベースからの塩基配列データとの相同性を求める工程；
３）工程２）によって得られた相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程；
４）工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加してインキュベートした細胞及び該オリゴヌクレオチドを添加しないでインキュベートした細胞からそれぞれ全ポリペプチド画分を抽出する工程；
５）工程４）で得られた全ポリペプチド画分の間における工程３）で出力された各遺伝子がコードするするポリペプチドの発現量の差を解析する工程；
６）工程５）で得られた各ポリペプチドの発現量の差にもとづいて工程１）で示されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を改変する工程；
７）工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する工程。
【請求項４】
下記の工程１）乃至７)を含むアンチセンス化合物の設計方法：
１）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する工程；
２）入力された塩基配列と、塩基配列が解析された遺伝子の塩基配列データベースからの塩基配列データとの相同性を求める工程；
３）工程２）によって得られた相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程；
４）工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを投与した動物及び該オリゴヌクレオチドを投与しなかった動物からそれぞれ全ポリペプチド画分を抽出する工程；
５）工程４）で得られた全ポリペプチド画分の間における工程３）で出力された各遺伝子がコードするポリペプチドの発現量の差を解析する工程；
６）工程５）で得られた各ポリペプチドの発現量の差にもとづいて工程１）で示されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を改変する工程；
７）工程６）得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する工程。
【請求項５】
塩基配列の改変が、i)オリゴヌクレオチドを構成する塩基の数を少なくすること、ii)オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列をターゲット遺伝子中の3’または5’側に移動する又はiii)オリゴヌクレオチドを構成する塩基の数を少なくし、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列をターゲット遺伝子中の3’または5’側に移動する、のi)〜iii)のいずれか一つに記載の方法によって行なわれることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
遺伝子の発現量がノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法によって測定されることを特徴とする、請求項1又は２に記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドの発現量がウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定されることを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項８】
細胞が培養細胞であることを特徴とする、請求項１、３及び５乃至７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
培養細胞が動物細胞であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
動物が哺乳類であることを特徴とする、請求項２、４及び５乃至７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
哺乳類がげっ歯類であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳類がマウス又はラットであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ターゲット遺伝子がＶＥＧＦ遺伝子であることを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
下記一般式（I）
HO−B1−B2−B3−B4−B5−B6−B7−B8−B9−B10−B11−B12−B13−B14−B15−B16−B17−B18−B19−B20−H　　（Ｉ）
（式中、B1乃至B3、B8及びB11は同一又は異なって式
【化１】
2004129650.tif 000026
で表される基（以下、「Cp」と表記する。）、式
【化２】
2004129650.tif 000027
で表される基（以下、「Cs」と表記する。）又は一般式Ce
【化３】
2004129650.tif 000028
（式中、lは1乃至5の整数を示す。）で表される基を示し、
B4、B5、B7、B9、B12、B14乃至B16は同一又は異なって式
【化４】
2004129650.tif 000029
で表される基（以下、「Ap」と表記する。）、式
【化５】
2004129650.tif 000030
で表される基（以下、「As」と表記する。）又は一般式Ae
【化６】
2004129650.tif 000031
（式中、ｍは1乃至5の整数を示す。）で表される基を示し、
B6、B10、B13及びB17は同一又は異なって式
【化７】
2004129650.tif 000032
で表される基（以下、「Gp」と表記する。）、式
【化８】
2004129650.tif 000033
で表される基（以下、「Gs」と表記する。）、式
【化９】
2004129650.tif 000034
で表される基（以下、「Gm」と表記する。）又は一般式Ge
【化１０】
2004129650.tif 000035
（式中、nは1乃至5の整数を示す。）で表される基を示し、
B18及びB19は同一又は異なって式
【化１１】
2004129650.tif 000036
で表される基（以下、「Tp」と表記する。）、式
【化１２】
2004129650.tif 000037
で表される基（以下、「Ts」と表記する。）又は一般式Te
【化１３】
2004129650.tif 000038
（式中、oは1乃至5の整数を示す。）で表される基を示し、
B20は式
【化１４】
2004129650.tif 000039
で表される基（以下、「Ｅ」と表記する。）
を有する化合物、及び／又は、その塩。
【請求項１５】
請求項１４において、B1乃至B3、B8及びB11は同一又は異なってCp又はCeであり、
B4、B5、B7、B9、B12、B14乃至B16は同一又は異なってAp又はAeであり、
B6、B10、B13及びB17が同一又は異なってGp、Gm又はGeであり、且つ、
B18及びB19が同一又は異なってTp又はTeである化合物、及び／又は、その塩。
【請求項１６】
請求項１４又は１５のいずれか１項において、B1乃至B3がCeである化合物、及び／又は、その塩。
【請求項１７】
請求項１６において、B4がAeである化合物、及び／又は、その塩。
【請求項１８】
請求項１７において、B5がAeである化合物、及び／又は、その塩。
【請求項１９】
請求項１８において、B6がGm又はGeである化合物、及び／又は、その塩。
【請求項２０】
請求項１９において、B7がAeである化合物、及び／又は、その塩。
【請求項２１】
請求項２０において、B8がCeである化合物、及び／又は、その塩。
【請求項２２】
請求項２１において、B19がTeである化合物、及び／又は、その塩。
【請求項２３】
請求項２２において、B18がTeである化合物、及び／又は、その塩。
【請求項２４】
請求項２３において、B17がGm又はGeである化合物、及び／又は、その塩。
【請求項２５】
請求項２４において、B16がAeである化合物、及び／又は、その塩。
【請求項２６】
請求項２５において、B15がAeである化合物、及び／又は、その塩。
【請求項２７】
請求項２６において、B14がAeである化合物、及び／又は、その塩。
【請求項２８】
請求項１４乃至２７のいずれか１項において、l、m、n及びoが同一又は異なって１又は２である化合物、及び／又は、その塩。
【請求項２９】
請求項２８において、l、m、n及びoが同一であって、１又は２である化合物、及び／又は、その塩。
【請求項３０】
請求項２９において、l、m、n及びoが２である化合物、及び／又は、その塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、特定の遺伝子の働きを抑制し、他の遺伝子の働きに影響を及ぼさないオリゴヌクレオチド化合物及び該化合物の設計方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列特異的にmRNAとワトソン−クリック型の塩基対を形成することで目的蛋白質の発現を抑制するというユニークなメカニズムで機能することから、既存の薬剤よりも、高い選択性と低い副作用が期待されている（例えば、非特許文献１参照。）。しかし、その一方で、似た相補配列をもつ他の遺伝子が存在した場合、そのmRNAにも結合し該遺伝子の発現を阻害する可能性がある。このような場合には予期しない副作用が生じる可能性もある。したがって、目的とする遺伝子の発現のみ抑え、他の遺伝子の発現に影響を及ぼさないアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることが重要である。
【０００３】
　アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによって、ターゲット遺伝子以外に発現が抑制された遺伝子を見出す方法としては、Stanford型マイクロアレイおよびAffymetrix型GenechipといったDNAチップ技術（以下、「DNAチップ」と称す）を用いる方法が知られている。この方法では、一度に多数の遺伝子を対象にその発現変動を観察することが可能であり、FisherらはMDR1遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドがMDR1以外の遺伝子においても発現を抑制することをDNAマイクロアレイにより見出している（例えば、非特許文献２参照。））。しかし、現在実用化されているDNAチップでは、検出感度が十分でないため、細胞内でごく少量しか発現していないmRNA量を検出することは極めて困難な場合がある（例えば、非特許文献３参照。）。また感度の問題から、再現性についての議論が常に付きまとうことが多い。また、マイクロアレイにおいては、相同性の高い複数の遺伝子が存在する場合、交差結合してしまうことから特異性が低下してしまうことが問題となる（例えば、非特許文献３参照。）。すなわち、DNAチップでは一度に数千・数万といった遺伝子発現の解析から抑制された遺伝子を絞り込むことが原理的には可能であるが、得られるデータの信頼性は必ずしも高くない場合が多い。
【０００４】
　したがって、信頼性の高い、ターゲット遺伝子に作用し他の遺伝子に作用しないアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法が求められていた。
【０００５】
　血管内皮細胞増殖因子VEGF（vascular endothelial growth factor）は、血管内皮細胞に特異的に働き、血管新生を促進する成長因子である。血管新生は、血管内皮細胞が成長因子や生理活性物質または機械的損傷などの刺激を受けて、増殖することによって行われ、発生、創傷治癒、炎症などにおいて重要な役割を果たしている。固形ガンでは、ガン組織が直径１〜２ｍｍを越えて増殖するためには、腫瘍にとって必要な酸素や栄養を供給するために、既存血管から新生血管が延びてガン組織まで到達することが必要であり（例えば、非特許文献４参照。）、また血管がガン組織に到達するとガン組織の増殖が爆発的に加速されることが知られ、さらに、癌細胞の転移はこの血管を通して行われる。VEGFは、腫瘍の血管新生において中心的な役割を果たすと考えられている。VEGFのガンでの関与については、１）多くのガン細胞はVEGFを分泌する（例えば、非特許文献５参照）ガン組織切片を抗VEGF抗体で染色するとガン組織およびその周辺の新生血管が強く染色される（例えば、非特許文献６及び７参照。）VEGFレセプターの一つが遺伝的に不活化されたマウスでは移植されたガンの増殖が抑制される（例えば、非特許文献８参照。）抗VEGF中和抗体が担ガンマウスに対して抗腫瘍活性を示す（例えば、非特許文献５及び９参照。）等が報告されている。以上の事実から、ガン細胞が分泌するVEGFが腫瘍血管新生において主要な役割を果していると考えられ、VEGFの血管新生活性を抑制する物質が癌の増殖や転移を抑制できるのではないかと期待されている。また、糖尿病患者の半数近くに合併症として眼疾患である糖尿病網膜症が認められる。糖尿病網膜症は、酸素不足により微小毛細血管の形成が促進され、やがてこれが破裂・出血して瘢痕組織を形成し、ついには網膜剥離・失明に至ると考えられている。従って、血管新生を抑制することで網膜症の重篤化が抑制できるのではないかと期待されている。Millerら（例えば、非特許文献１０参照。）はサルを用いた実験の結果から、増殖性の網膜症の進展にVEGFが極めて密接な関わりを持つことを報告している。そのため、VEGFの血管新生活性を抑制する物質が、糖尿病網膜症の予防あるいは治療のために有用であると考えられる。更に慢性関節リューマチ、乾癬、血管腫、強皮症、血管新生緑内障などの疾病においても病理的血管新生を伴い、それが主な症状の一つとなっている（例えば、非特許文献１１参照。）。従ってVEGFの働きを抑制する物質は前述の血管新生が関与している種々の疾患の治療に利用できる可能性がある。また、VEGFは、血管新生だけではなく、血管透過性亢進にも関与していることが知られている。VEGFによる血管透過性亢進は、癌性腹水貯留や虚血再灌流障害時の脳浮腫（例えば、非特許文献１２参照。）などの病的症状に関与していることが示唆されている。したがって、VEGFの働きを抑制する物質は、VEGFによる血管新生又は血管透過性亢進が関与している上記の疾患の治療に有用であると考えられる。
【０００６】
　ＶＥＧＦの働きを抑制する化合物として、下記の配列：
5'−cccaagacagcagaaagttcat−3'　（配列表の配列番号：１）
を有し、各塩基間がホスホロチオエートで結合しているアンチセンス分子（以下、「化合物Ａ」とする。）が知られている（例えば、非特許文献１３参照。）。化合物Ａは、ＶＥＧＦの配列（GenBank Accession 番号AF022375.1：配列表の配列番号２のヌクレオチド番号702〜723）の相補鎖に相当する。
【０００７】
　しかしながら、化合物ＡはVEGFの抑制活性が充分でなく、より強力なVEGFの抑制活性を有する化合物が期待されていた。また、更に強いVEGFの抑制活性を有し、しかも他の遺伝子の発現に影響を与えない化合物の設計方法が期待されていた。
【非特許文献１】R. Schlingensiepen and K.−H. Schinggensiepen著、edrs, R. Schlingensiepen, W. Brysch and K.−H. Schinggensiepen編、「Antisense− from technology to therapy」、Black Sciences Ltd.、 Berlin Chaper I、ｐ．３−２８
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）」、２００２年、第２７７巻、ｐ．２２９８０−２２９８４
【非特許文献３】松村正明、那波宏之著、「細胞工学別冊ゲノムサイエンスシリーズ１「DNAマイクロアレイと最新PCR法」」、秀潤社、ｐ．８−９
【非特許文献４】「ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Journal of National Cancer Institute）」、１９９０年、第８２巻、ｐ．４−６
【非特許文献５】「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）」、１９９３年、第１９４巻、ｐ.１２３４−１２４１
【非特許文献６】「ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディスン（Journal of Experimental Medicine）」、１９９１年、第１７４巻、ｐ.１２７５−１２７８
【非特許文献７】「キャンサー・リサーチ（Cancer Research）」、１９９３年、第５３巻、ｐ．４７２７−４７３５
【非特許文献８】「ネイチャー（Nature）」、１９９４年、第３６７巻、ｐ．５７６：
【非特許文献９】「ネイチャー（Nature）」、１９９３年、第３６２巻、ｐ．８４１：
【非特許文献１０】「アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（American Journal of Pathology）」、１９９４年、第１４５巻、ｐ．５７４−５８４
【非特許文献１１】「ジャーナル・オブ・メディスン（Journal of Medicine）」、１９８９年、第３２０巻、ｐ．１２１１：
【非特許文献１２】「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（The Journal of Clinical Investigation）」、１９９９年、第１０４巻、ｐ．１６１３−１６２０
【非特許文献１３】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）」、１９９５年、第２７０巻、ｐ．２８３１６−２８３２４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
　本発明者は、VEGFの働きを抑制する物質について検討した結果、化合物（I）
HO−Ce2−Ce2−Ce2−Ae2−Ae2−Gm−Ae2−Ce2−As−Gs−Cs−As−Gs−Ae2−Ae2−Ae2−Gm−Te2−Te2−Ce2−Ae2−Te2t−H（化合物Ｉ：配列表の配列番号：３の塩基配列を有する化合物）
が強力なVEGFの抑制活性を有し、VEGFによる血管新生又は血管透過性亢進が関与している疾患の治療に有用であることを見出した。
【０００９】
　本発明者はさらに、ターゲット遺伝子に対する高い発現抑制作用を有し、しかも、他の遺伝子の発現に影響を与えないアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計方法を見出し、この方法によって設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なＶＥＧＦの発現抑制活性を有し、しかも、他の遺伝子に対する発現抑制効果が元のアンチセンスオリゴヌクレオチドに比べて低下していることを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、
（１）下記の工程１）乃至７）を含むアンチセンス化合物の設計方法：
１）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する工程；
２）入力された塩基配列データと、塩基配列が解析された遺伝子の塩基配列データベースからの塩基配列データとの相同性を求める工程；
３）工程２）によって得られた相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程；
４）工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加してインキュベートした細胞及び該オリゴヌクレオチドを添加しないでインキュベートした細胞からそれぞれ全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
５）工程４）で得られた全ＲＮＡ画分の間における工程３）で出力された各遺伝子の発現量の差を解析する工程；
６）工程５）で得られた各遺伝子の発現量の差にもとづいて工程１）で示されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を改変する工程；
７）工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する工程、
（２）下記の工程１）乃至７）を含むアンチセンス化合物の設計方法：
１）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する工程；
２）入力された塩基配列データと、塩基配列が解析された遺伝子の塩基配列データベースからの塩基配列データとの相同性を求める工程；
３）工程２）によって得られた相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程；
４）工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを投与した動物及び該オリゴヌクレオチドを投与しなかった動物からそれぞれ全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
５）工程４）で得られた全ＲＮＡ画分の間における工程３）で出力された各遺伝子の発現量の差を解析する工程；
６）工程５）で得られた各遺伝子の発現量の差にもとづいて工程１）で示されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を改変する工程；
７）工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する工程、
（３）下記の工程１）乃至７)を含むアンチセンス化合物の設計方法：
１）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する工程；
２）入力された塩基配列データと、塩基配列が解析された遺伝子の塩基配列データベースからの塩基配列データとの相同性を求める工程；
３）工程２）によって得られた相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程；
４）工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加してインキュベートした細胞及び該オリゴヌクレオチドを添加しないでインキュベートした細胞からそれぞれ全ポリペプチド画分を抽出する工程；
５）工程４）で得られた全ポリペプチド画分の間における工程３）で出力された各遺伝子がコードするするポリペプチドの発現量の差を解析する工程；
６）工程５）で得られた各ポリペプチドの発現量の差にもとづいて工程１）で示されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を改変する工程；
７）工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する工程、
（４）下記の工程１）乃至７)を含むアンチセンス化合物の設計方法：
１）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する工程；
２）入力された塩基配列と、塩基配列が解析された遺伝子の塩基配列データベースからの塩基配列データとの相同性を求める工程；
３）工程２）によって得られた相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程；
４）工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを投与した動物及び該オリゴヌクレオチドを投与しなかった動物からそれぞれ全ポリペプチド画分を抽出する工程；
５）工程４）で得られた全ポリペプチド画分の間における工程３）で出力された各遺伝子がコードするポリペプチドの発現量の差を解析する工程；
６）工程５）で得られた各ポリペプチドの発現量の差にもとづいて工程１）で示されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を改変する工程；
７）工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する工程、
（５）塩基配列の改変が、i)オリゴヌクレオチドを構成する塩基の数を少なくすること、ii)オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列をターゲット遺伝子中の3’または5’側に移す又はiii)オリゴヌクレオチドを構成する塩基の数を少なくし、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列をターゲット遺伝子中の3’または5’側に移す、のi)〜iii)のいずれか一つに記載の方法によって行なわれることを特徴とする、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の方法、
（６）遺伝子の発現量がノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法によって測定されることを特徴とする、（1）又は（２）に記載の方法、
（７）ポリペプチドの発現量がウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定されることを特徴とする、（３）又は（４）に記載の方法、
（８）細胞が培養細胞であることを特徴とする、（１）、（３）及び（５）乃至（７）のいずれか一つに記載の方法。
（９）培養細胞が動物細胞であることを特徴とする（８）に記載の方法、
（１０）動物が哺乳類であることを特徴とする、（２）、（４）及び（５）乃至（７）のいずれか一つに記載の方法、
（１１）哺乳類がげっ歯類であることを特徴とする、（１０）に記載の方法、
（１２）哺乳類がマウス又はラットであることを特徴とする、（１１）に記載の方法、
（１３）ターゲット遺伝子がＶＥＧＦ遺伝子であることを特徴とする、（１）乃至（１２）のいずれか一つに記載の方法、
（１４）
下記一般式（I）
HO−B1−B2−B3−B4−B5−B6−B7−B8−B9−B10−B11−B12−B13−B14−B15−B16−B17−B18−B19−B20−H　　（Ｉ）
（式中、B1乃至B3、B8及びB11は同一又は異なって式
【００１１】
【化１】
2004129650.tif 000002
で表される基（以下、「Cp」と表記する。）、式
【００１２】
【化２】
2004129650.tif 000003
で表される基（以下、「Cs」と表記する。）又は一般式Ce
【００１３】
【化３】
2004129650.tif 000004
（式中、lは1乃至5の整数を示す。）で表される基を示し、
B4、B5、B7、B9、B12、B14乃至B16は同一又は異なって式
【００１４】
【化４】
2004129650.tif 000005
で表される基（以下、「Ap」と表記する。）、式
【００１５】
【化５】
2004129650.tif 000006
で表される基（以下、「As」と表記する。）又は一般式Ae
【００１６】
【化６】
2004129650.tif 000007
（式中、ｍは1乃至5の整数を示す。）で表される基を示し、
B6、B10、B13及びB17は同一又は異なって式
【００１７】
【化７】
2004129650.tif 000008
で表される基（以下、「Gp」と表記する。）、式
【００１８】
【化８】
2004129650.tif 000009
で表される基（以下、「Gs」と表記する。）、式
【００１９】
【化９】
2004129650.tif 000010
で表される基（以下、「Gm」と表記する。）又は一般式
【００２０】
【化１０】
2004129650.tif 000011
（式中、nは1乃至5の整数を示す。）で表される基を示し、
B18及びB19は同一又は異なって式
【００２１】
【化１１】
2004129650.tif 000012
で表される基（以下、「Tp」と表記する。）、式
【００２２】
【化１２】
2004129650.tif 000013
で表される基（以下、「Ts」と表記する。）又は一般式
【００２３】
【化１３】
2004129650.tif 000014
（式中、oは1乃至5の整数を示す。）で表される基を示し、
B20は式
【００２４】
【化１４】
2004129650.tif 000015
で表される基（以下、「Ｅ」と表記する。）
を有する化合物、及び／又は、その塩、
（１５）（１４）において、B1乃至B3、B8及びB11は同一又は異なってCp又はCeであり、
B4、B5、B7、B9、B12、B14乃至B16は同一又は異なってAp又はAeであり、
B6、B10、B13及びB17が同一又は異なってGp、Gm又はGeであり、且つ、
B18及びB19が同一又は異なってTp又はTeである化合物、及び／又は、その塩、
（１６）（１４）又は（１５）のいずれかにおいて、B1乃至B3がCeである化合物、及び／又はその塩、
（１７）（１６）において、B4がAeである化合物、及び／又は、その塩、
（１８）（１７）において、B5がAeである化合物、及び／又は、その塩、
（１９）（１８）において、B6がGm又はGeである化合物、及び／又は、その塩、
（２０）（１９）において、B7がAeである化合物、及び／又は、その塩、
（２１）（２０）において、B8がCeである化合物、及び／又は、その塩、
（２２）（２１）において、B19がTeである化合物、及び／又は、その塩、
（２３）（２２）において、B18がTeである化合物、及び／又は、その塩、
（２４）（２３）において、B17がGm又はGeである化合物、及び／又は、その塩、
（２５）（２４）において、B16がAeである化合物、及び／又は、その塩、
（２６）（２５）において、B15がAeである化合物、及び／又は、その塩、
（２７）（２６）において、B14がAeである化合物、及び／又は、その塩、
（２８）（１４）乃至（２７）のいずれか１つにおいて、l、m、n及びoが同一又は異なって１又は２である化合物、及び／又は、その塩、
（２９）（２８）において、l、m、n及びoが同一であって、１又は２である化合物、及び／又は、その塩、
（３０）（２９）において、l、m、n及びoが２である化合物、及び／又は、その塩、
からなる
【発明の効果】
【００２５】
　本発明により、ターゲット遺伝子の発現量を抑え、他の遺伝子の発現に対する影響が少ないアンチセンス化合物の設計が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
　本発明の化合物のうち、最も好適な化合物は、以下の化合物群１から選択される化合物、及び／又はその塩である。
化合物群１
HO−Ce2−Ce2−Ce2−Ae2−Ae2−Ge2−Ae2−Ce2−Ap−Gp−Cp−Ap−Gp−Ae2−Ae2−Ae2−Ge2−Te2−Te2−E−H、
HO−Ce2−Ce2−Ce2−Ae2−Ae2−Gm−Ae2−Ce2−Ap−Gp−Cp−Ap−Gp−Ae2−Ae2−Ae2−Gm−Te2−Te2−E−H、
HO−Ce1−Ce1−Ce1−Ae1−Ae1−Ge1−Ae1−Ce1−Ap−Gp−Cp−Ap−Gp−Ae1−Ae1−Ae1−Ge1−Te1−Te1−E−H、及び、
HO−Ce1−Ce1−Ce1−Ae1−Ae1−Gm−Ae1−Ce1−Ap−Gp−Cp−Ap−Gp−Ae1−Ae1−Ae1−Gm−Te1−Te1−E−H。
　なお、上記及び本明細書中においてAe1、Ge1、Ce1、Te1、Ae2、Ge2、Ce2、Te2及びTe2tは下記に示す化学構造を有する基を表す。
【００２７】
【化１５】
2004129650.tif 000016
　「その塩」とは、本発明の化合物は、塩にすることができるので、その塩をいい、そのような塩としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩のようなアリ−ルスルホン酸塩、酢酸塩、りんご酸塩、フマ−ル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
【００２８】
　なお、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物及びその塩は、水和物としても存在することができ、本発明は、それらの水和物をも包含する。
【００２９】
　又、本発明の別の形態は、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物、及び／又は、その塩を含有する医薬組成物であり、好ましくは、VEGFによる血管新生又は血管透過性亢進が関与している疾患の治療及び予防に用いる医薬組成物であり、更に好ましくは、ガン、糖尿病網膜症、慢性関節リューマチ、乾癬、血管腫、強皮症、血管新生緑内障、癌性腹水貯留又は虚血再灌流障害時の脳浮腫の治療及び予防に用いる医薬組成物である。
【００３０】
　なお、本発明における、アンチセンス化合物とはある特定の遺伝子の発現を抑制するために設計されたオリゴヌクレオチドのことをいい、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのことをいう。本発明におけるターゲット遺伝子とは、アンチセンス化合物を設計する際に、アンチセンス化合物による遺伝子発現抑制対象として選択された遺伝子である。本発明におけるアンチセンス効果とはアンチセンス化合物の投与又は添加によってターゲット遺伝子の発現が抑制される効果のことをいう。本発明におけるマッチ率とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドが相補する塩基配列と完全な塩基対（アデニンとチミン、グアニンとシトシン）を形成する割合を示す数値であり、以下の式で表すことができる。（マッチ率＝（アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド数−ミスマッチヌクレオチド数）／（アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド数）×１００）なお、本発明においては特に定義しない限り、オリゴヌクレオチドには天然型のヌクレオチドがリン酸エステル結合しているもののほか、ＤＮＡ合成機、例えばパーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２などを用いて文献（Nucleic Acids Research, 12, 4539(1984)）記載の方法に準じて合成・修飾されたものも含む。本発明においてオリゴヌクレオチドの塩基配列が相補性を有するとは対応する部分において一方のオリゴヌクレオチドの相補鎖の塩基配列と他のオリゴヌクレオチドの塩基配列が完全に一致する場合のほか、一部に一致しない配列があっても、インキュベート条件で塩基対を形成するものも含む。
【００３１】
　ホスホロアミダイド法に用いられるホスホロアミダイト試薬は、天然型のヌクレオシド及び2'−O−メチルグアノシン（Gm）については市販の試薬を用いることができる。非天然型のホスホロアミダイトは特開２０００−２９７０９７の実施例５（5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−4−N−ベンゾイルシチジン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、実施例９（5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−5−メチルウリジン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、実施例１４(5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−6−N−ベンゾイルアデノシン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、の化合物または、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−メチル−2−N−イソブチリルフェノキシアセチルグアノシン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト（ファルマシア社製）を用いることができる。その他のヌクレオシドについてはl、m、n、o及びpが１であるヌクレオシドについてWO99/14226、l、m、n、o及びpが２乃至5であるヌクレオシドについてWO 00/47599記載の方法にしたがって得ることができる。
【００３２】
　又、所望により、チオエート化する場合は、硫黄のほかテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ、アプライドバイオシステムズ社）、Beaucage試薬（Glen Research社）等の３価の亜リン酸に反応してチオエートを形成する試薬を用い、文献（Tetarhedron Letters, 32, 3005(1991)、J. Am. Chem. Soc., 112, 1253(1990)）記載の方法に準じてチオエート誘導体を得ることが出来る。また、文献（S. M. Freier et al, Nucleic Acids Res., 25, 4429 (1997)）記載の修飾オリゴヌクレオチドも同文献に引用されている方法によって合成することができる。
　１．ターゲット遺伝子の決定
　アンチセンス化合物はターゲット遺伝子のｍＲＮＡとワトソン−クリック型塩基対を形成することによって目的蛋白質の発現を抑制する。本発明のアンチセンス化合物の設計方法は任意の遺伝子に対して適用可能である。まず初めにターゲット遺伝子を決定し、ターゲット遺伝子に対するアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドを選択する。アンチセンス化合物は既にターゲット遺伝子に対する発現抑制効果を有することが知られているオリゴヌクレオチドでもよいし、また、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的な配列と完全に一致した塩基配列ではなく、一部の塩基配列が異なっていても、アンチセンス効果を有するものであればよい。また、標的とする遺伝子を決定し、該遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を有するように独自に設計したオリゴヌクレオチドであれば、あらかじめアンチセンス効果が確認されていないオリゴヌクレオチドでもよい。当該オリゴヌクレオチドは通常、１０〜５０ヌクレオチド、好適には１５〜２５ヌクレオチドからなる。
【００３３】
　本工程で用いるアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列は、ターゲット遺伝子の塩基配列に基づいて、周知の方法、例えば、ランダムな短鎖DNA断片とターゲット遺伝子のRNAを混ぜ、RNase　H（RNアーゼH）で消化し、切断部位をアンチセンス配列とする方法（Lloyd,B.H. et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29, 3664−3673. Ho,S.P. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 1901−1907. Matveeva,O. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 5010−5016.）、ランダムな短鎖DNA断片とターゲット遺伝子のRNAを混ぜ、結合したものをゲルシフトにより分離し、結合部位を決定する方法（Bruce,T.W. and Lima,W.F. (1997) Biochemistry, 36, 5004−5019., Bruce,T.W. and Lima,W.F. US patent, 6,022,691.）、 アンチセンス配列を有する20量体程度のオリゴヌクレオチドをガラスプレートなどに固定化したアレイを作成し、ラジオアイソトープ等で標識したターゲット遺伝子のRNAを用いてハイブリダイゼイションを行い、RNAが結合する配列を決定する方法（Sohail,M. et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29, 2041−2051）等を用いても決定することができる。また、アンチセンス配列を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列は、コンピュータープログラムを用いて決定することもできる（Scherr,M.(2000)Nucleic Acids Res. 28, 2455−2461., Patzel et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27, 4328−4334）。
【００３４】
　例えばターゲット遺伝子をＶＥＧＦとした場合、下記の塩基配列をオリゴヌクレオチドの塩基配列として入力することができる。
5'− cccaagacagcagaaagttcat −3'(配列表の配列番号：１)
　２．遺伝子発現量の測定
　添加したオリゴヌクレオチドが実際に遺伝子発現抑制効果を有するか否かはターゲット遺伝子の発現量を測定することで確認することができる。ターゲット遺伝子の発現量は周知の方法で測定することができる。また、ターゲット遺伝子に対応するポリペプチドの発現量を測定することによっても添加したオリゴヌクレオチドがターゲット遺伝子の発現抑制効果を有するか否かを確認できる。以下、遺伝子の発現量を測定する方法とポリペプチドの発現量を測定する方法に分けて、オリゴヌクレオチドの遺伝子発現抑制効果を測定する方法を説明する。
【００３５】
　Ａ．遺伝子の発現量を測定する方法
　遺伝子の発現量を測定する方法として以下の方法を説明するが、遺伝子の発現量を測定することができる限りにおいてこれらの方法に限定されない。
【００３６】
　なお、全ＲＮＡを抽出するに際しては、オリゴヌクレオチドを含まない培地で洗浄した細胞をＲＮＡ抽出用の溶媒（例えばフェノール等、リボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの）で直接溶解するのが好ましい。または、該組織の細胞を破壊しないように、スクレーパーで慎重に掻きとるか、もしくはトリプシン等の蛋白質分解酵素を用いて穏やかに組織から細胞を抽出するなどの方法により、細胞を回収した後、速やかにＲＮＡ抽出工程に移行する。
【００３７】
　ＲＮＡの抽出方法としては、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156−159）などを採用しうるが、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。また、市販のＲＮＡ抽出用試薬（例えば、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン（株）製）、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ギブコ・ビーアールエル社製）またはＲＮＡ−Ｂｅｅ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｉｎｃ製））等を試薬に添付のプロトコールに従って用いることもできる。このようにして得られた全ＲＮＡが含まれている試料を全ＲＮＡ画分という。
【００３８】
　得られた全ＲＮＡは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いることが好ましい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つことが知られているので、この特徴を利用して例えばビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブにｍＲＮＡを吸着させ、さらにストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子に、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用してｍＲＮＡを捕捉し洗浄操作の後、ｍＲＮＡを溶出することにより、ｍＲＮＡを精製することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出して精製する方法も採用し得る。さらにショ糖密度勾配遠心法などにより、ｍＲＮＡをさらに分画することもできる。
【００３９】
　なお、培養細胞から全ＲＮＡを抽出する工程を経ずに、ｍＲＮＡのみを精製することもできる。例えば市販のｍＲＮＡ抽出用のキット（Quick Prep Micro mRNA Purification Kit；アマシャム　ファルマシア　バイオテク（株）社製）を用いれば培養細胞から直接ｍＲＮＡを精製することができる。
【００４０】
　（１）核酸ハイブリダイゼーションを利用する方法
ｉ）　ＲＮＡの固相化
　核酸ハイブリダイゼーションを利用して、オリゴヌクレオチドを添加して培養した培養細胞またはオリゴヌクレオチドを投与した哺乳動物個体より得た全ＲＮＡ試料中でのターゲット遺伝子の発現量を特異的に見るためには、ノーザンブロット法、ドットブロット法やスロットブロット法を利用することができる。ＲＮＡを転写したり、ブロッティングするメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、ハイボンド−Ｃピュア（アマシャム・ファルマシア社製）等）、ポジティブチャージ・ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−Ｎ＋（アマシャム・ファルマシア社製）等）または親水性ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−Ｎ／ＮＸ（アマシャム・ファルマシア社製）等）等が用いられる。
【００４１】
　ノーザンブロット用のアガロースゲル電気泳動法としては、アガロースホルムアミドゲル電気泳動法、試料をグリオキサールとジメチルスルホキシドで処理し、変性させた後、リン酸緩衝液で作製したアガロースゲルで泳動させる方法およびアガロースゲルメチル水銀電気泳動法（以上Maniatis, T. et al. (1982) in “Molecular Cloning A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, NY.）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４２】
　電気泳動後のゲルからメンブレンにＲＮＡを移す、いわゆるブロッティング方法としては、キャピラリートランスファー法（Maniatis, T. et al. (1982) in “Molecular Cloning A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, NY.）、バキューム法、電気泳動法（Maniatis, T. et al. (1989) in “Molecular Cloning A Laboratory Manual、２nd ed” Cold Spring Harbor Laboratory, NY.）等を挙げることができる。ドットブロット法やスロットブロット法のための器材も市販されている（例えば、バイオドット（バイオラッド社製）等）。
【００４３】
　ブロッティング終了後、メンブレンに移し取られたＲＮＡをメンブレンに固定する操作を行う（この操作はメンブレンの材質によって異なり、製品によっては固定操作不要の場合もある）。
【００４４】
　ｉｉ）　プローブの標識と検出
　核酸ハイブリダイゼーションによる検出を行うにあたり、上記のようにして固相化させたＲＮＡ試料中の、特定のｍＲＮＡを検出するためのプローブの標識方法と検出方法について以下に述べる：
　ａ）放射性同位元素標識
　ＤＮＡ断片またはそれを保持するベクター等を材料乃至鋳型として、ニックトランスレーション法（例えば、ニックトランスレーションキット（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）、ランダムプライム法（例えば、マルチプライムＤＮＡラベリングシステム（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）、末端標識法（例えば、メガラベル（宝酒造（株）社製）、３’−末端ラベリングキット（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）で標識ＤＮＡプローブを調製するか、あるいは鋳型となるＤＮＡをサブクローニングしたベクター中のＳＰ６プロモーターやＴ７プロモーターを利用したイン・ビトロ転写法により標識ＲＮＡプローブを調製する。これらプローブの検出はＸ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーにより行うことができ、さらにＸ線フィルムの場合はデンシトメトリー（例えば、ＧＳ−７００イメージイングデンシトメーター（バイオラッド社製）を使用）を、イメージングプレートの場合はＢＡＳ２０００ＩＩ（富士フィルム製）システムをそれぞれ用いた定量も可能である。
【００４５】
　ｂ）酵素標識
　ＤＮＡあるいはＲＮＡ断片を直接酵素標識する。標識に用いられる酵素は例えば、アルカリフォスファターゼ（AlkPhos Direct system for chemiluminescence（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horseradish Peroxidase）（ＥＣＬダイレクト・ヌクレイック・アシッド・ラベリング・アンド・ディテクション・システム（アマシャム・ファルマシア社製）等を使用）を挙げることができる。プローブの検出は、標識した酵素の触媒反応が検出可能になるような基質、例えば該触媒反応により発色物質を生成したり、発光するような基質を含む酵素反応緩衝液にメンブレンを浸すことにより行う。発色基質を用いた場合は目視により検出することができ、発光基質を用いた場合は放射性同位元素標識の場合と同様にＸ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーやインスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。さらに、発光基質を用いた場合は、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘ（バイオラッド社製）システムを利用した定量も可能である。
【００４６】
　ｃ）その他分子による標識
　フルオレセイン標識：　ＤＮＡ断片にニックトランスレーション法、ランダムプライム法、または３’末端標識法（アマシャム・ファルマシア社より市販されているＥＣＬ　３’−オリゴラベリングシステムなど）で標識する。あるいはＳＰ６、Ｔ７プロモーターによるイン・ビトロ転写によりＲＮＡに標識する；
　ビオチン標識：　ＤＮＡの５’末端を標識（アマシャム・ファルマシア社より市販されているオリゴヌクレオチド・ビオチン・ラベリングキットなど使用）したり、ＤＮＡ断片にニックトランスレーション法、ランダムプライム法などで標識する；
　ジゴキシゲニン修飾ｄＵＴＰ標識：　ＤＮＡ断片にニックトランスレーション法、ランダムプライム法などで標識する。
【００４７】
　これら標識分子の検出は、いずれの場合も、標識された分子に特異的に結合する分子を放射性同位元素や酵素で標識したものをプローブに結合させる操作を含む。特異的に結合する分子とは、例えばフルオレセインやジゴキシゲニンの場合は抗フルオレセイン抗体や抗ジゴキシゲニン抗体であり、ビオチンの場合はアビジンまたはストレプトアビジンである。これらをプローブに結合させた以降は、その標識された放射性同位元素や酵素により上記ａ）またはｂ）の記載と同様の方法にしたがって検出を行うことができる。
【００４８】
　ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションと検出
　ハイブリダイゼーションは、本発明が属する技術分野において周知の方法で行われ得る。本発明におけるハイブリダイゼーション溶液または洗浄液の組成と、ハイブリダイゼーション温度または洗浄温度の関係については、例えば文献（バイオ実験イラストレイテッド４、ｐ１４８、秀潤社刊）の記載に従うことができるが、好ましい条件は以下の通りである：
　ハイブリダイゼーション溶液：　ExpressHyb Hybridization Solution（クローンテック社製）；
　プローブの終濃度（放射標識プローブの場合）：　１乃至２×１０６ｃｐｍ／ｍｌ（好ましくは、２×１０６ｃｐｍ／ｍｌ）；
　ハイブリダイゼーション温度および時間：　６８℃、１乃至２４時間。
【００４９】
　メンブレンの洗浄条件：
　ａ）　０．１乃至５×ＳＳＣ（最も好ましくは２×ＳＳＣ）、０．０５乃至０．１％　ＳＤＳ（最も好ましくは０．０５％）ドデシル硫酸ナトリウム（以下「ＳＤＳ」という）中、室温乃至４２℃（最も好ましくは室温）で２０乃至６０分間（最も好ましくは２０分間）振盪する操作を、洗浄液を交換して２乃至６回（最も好適には３回）行う；
　ｂ）　上記ａ）の後、０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中、５０乃至６５℃で、２０乃至６０分間振盪する操作を、洗浄液を交換して２乃至６回行う。または、０．２乃至０．５×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中、６２乃至６５℃で、２０乃至６０分間振盪する操作を、洗浄液を交換して２乃至６回行う。最も好適には、０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中、５０℃で、２０分間振盪する操作を、洗浄液を交換して３回行う。
【００５０】
　洗浄終了後、上記７）に記載したように、プローブの標識法に合わせた検出・定量を行う。また、β−アクチン遺伝子の細胞あたりの発現量は安定していることが知られているので、各試料間のＲＮＡ量の差等に起因するばらつきを補正する目的で、各試料におけるβ−アクチン遺伝子の発現量を同時に測定しておき、このβ−アクチン発現量を基準とした、検出対象遺伝子（オリゴヌクレオチド）発現量の相対値を、被験物質を添加した細胞群と添加しなかった細胞群との間で比較することにより、より精密な評価を行うことができる。
【００５１】
　その結果、ターゲット遺伝子の発現量を低下させる化合物は、アンチセンス効果を有するといえ、ターゲット遺伝子に対するアンチセンス化合物となるオリゴヌクレオチドとすることができる。
【００５２】
　（２）ＲＴ−ＰＣＲ
　本発明における、核酸の検出を行うもう一つの態様は、まずｍＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素反応を行ってから、ＰＣＲを実施して特異的にＤＮＡ断片を増幅する、いわゆるＲＴ−ＰＣＲを行う方法である。この方法において、目的の塩基配列を特異的に増幅するためには、目的のｍＲＮＡの特定の部分配列に相補的なアンチセンスプライマーと、該アンチセンスプライマーから逆転写酵素により生成されるｃＤＮＡの配列中の特定の部分配列に相補的なセンスプライマーが用いられる。ＲＴ−ＰＣＲは市販のキット（例えば、RNA　PCRキット　AMV　ver２.１（宝酒造）やReady to Go RT−PCR Beads（アマシャム　ファルマシア　バイオテク）等）を用いて、キットに添付のマニュアルに従って行なうことができるが、以下の方法でもできる。
【００５３】
　逆転写酵素反応およびＰＣＲの両方に用いられるアンチセンスプライマーは、実質的にターゲット遺伝子の塩基配列のアンチセンス配列中の、連続した１５ヌクレオチド乃至４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド乃至３５ヌクレオチド、更に好ましくは２１ヌクレオチド乃至３０ヌクレオチドの塩基配列からなる。
【００５４】
　一方、ＰＣＲにおいて用いられるセンスプライマーの配列は、本発明のオリゴヌクレオチドのターゲット遺伝子の塩基配列において、上記アンチセンスプライマーの相補鎖にあたる配列中の最も５’末端側の位置よりもさらに５’末端側領域に存在する配列中の連続した１５乃至４０ヌクレオチド、好ましくは１８乃至３５ヌクレオチド、更に好ましくは２１乃至３０ヌクレオチドの任意の部分配列からなる。ただし、センスプライマーとアンチセンスプライマーに互いに相補的な配列が存在すると、プライマー同士がアニーリングすることにより非特異的な配列が増幅され、特異的な遺伝子検出の妨げとなるおそれがあるので、そのような組み合わせを避けたプライマーの設計を行うことが好ましい。
【００５５】
　これらアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーには、いずれも上記で規定したそれら塩基配列の５’末端に、オリゴヌクレオチドのターゲット遺伝子の塩基配列とは無関係の塩基配列がリンカーとして付加されていてもよい。ただし、特異的な遺伝子検出の妨げとならないよう、該リンカーは反応中に反応液内の核酸と非特異的アニーリングを起こさないようなものであることが好ましい。
【００５６】
　ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は以下に記載する通りである。なお、ＲＴ−ＰＣＲによる検出のための試料は、通常ポリ（Ａ）＋ＲＮＡにまで精製されている必要は必ずしもない。
【００５７】
　ｉ）逆転写酵素反応
　反応液組成の例（全量２０μｌ）：
　全ＲＮＡ　適宜；
　塩化マグネシウム　２．５乃至５ｍＭ（好ましくは５ｍＭ）；
　１×ＲＮＡ　ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−塩酸（２５℃におけるｐＨ８．３乃至９．０（好ましくは８．３））、５０ｍＭ　塩化カリウム）；
　ｄＮＴＰｓ　０．５乃至１ｍＭ（好ましくは１ｍＭ）；
　アンチセンスプライマー　１μＭ　（アンチセンスプライマーの代用として、市販のランダムプライマーやオリゴ（ｄＴ）プライマー（１２−２０ヌクレオチド）を２．５μＭ添加することもできる）；
　逆転写酵素　０．２５乃至１単位／μｌ（好ましくは０．２５単位／μｌ）；
　滅菌水で２０μｌに調整する。
【００５８】
　反応温度条件：
　３０℃で１０分間保温（ランダムプライマー使用時のみ）した後、４２乃至６０℃（好ましくは４２℃）で１５乃至３０分間（好ましくは３０分間）保温し、さらに９９℃で５分間加熱して酵素を失活させてから、４乃至５℃（好ましくは５℃）で５分間冷却する。
【００５９】
　ｉｉ）ＰＣＲ
　反応液組成の例：
　塩化マグネシウム　２乃至２．５ｍＭ（好ましくは２．５ｍＭ）；
　１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−塩酸（２５℃におけるｐＨ８．３乃至９．０（好ましくは８．３））、５０ｍＭ　塩化カリウム；
　ｄＮＴＰｓ　０．２乃至０．２５ｍＭ（好ましくは０．２５ｍＭ）；
　アンチセンスプライマーおよびセンスプライマー　０．２乃至０．５μＭ（好ましくは０．２μＭ）；
　Ｔａｑポリメラーゼ　１乃至２．５単位（好ましくは２．５単位）；
　滅菌水を加えて全量を８０μｌに調整し、その全量を、逆転写反応を終了した反応液全量に加えてからＰＣＲを開始する。
【００６０】
　反応温度条件：　まず９４℃で２分間加熱した後、９０乃至９５℃（好ましくは９４℃）で３０秒間、４０乃至６０℃（好ましくは、プライマーの特性から算出される解離温度（Ｔｍ）からそれより２０度低い温度までの範囲内で３０秒間、７０乃至７５℃（好ましくは７２℃）で１．５分間の温度サイクルを２８乃至５０サイクル（好ましくは２８サイクル）繰り返してから、４℃に冷却する。
【００６１】
　ＰＣＲ終了後、反応液を電気泳動し、目的の大きさのバンドが増幅されているか否かを検出する。定量的検出を行うためには、予め段階希釈したｃＤＮＡクローンを標準の鋳型ＤＮＡとして同条件でＰＣＲを実施し、定量的検出が可能な温度サイクル数を定めておくか、または、例えば５サイクル毎に一部反応液をサンプリングしてそれぞれ電気泳動を行う。また例えばＰＣＲ反応時に放射標識ｄＣＴＰを用いることにより、バンド中に取り込まれた放射能の量を指標に定量を行うこともできる。遺伝子定量の信頼性を高めた方法として、上記ＲＴ−ＰＣＲ法を改良した競合ＲＴ−ＰＣＲ法（Souaze et al., BioTechniques 21, 280−285 (1996)）や、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法（Heid et al., Genom. Res. 6, 986−994 (1996)）なども利用可能である。
【００６２】
　オリゴヌクレオチド存在下で培養した細胞由来の試料と、オリゴヌクレオチド非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、ターゲット遺伝子の発現量を低下させたオリゴヌクレオチドはターゲット遺伝子の発現を抑制する物質であり、ターゲット遺伝子に対するアンチセンス化合物となる得、ターゲット遺伝子の発現を抑えることでターゲット遺伝子の発現量の増大等が原因で引き起こされる疾患の治療薬となり得る。
【００６３】
　（３）固相化試料を用いた解析方法
　ｉ）固相化試料
　固相化試料としては、例えば以下のものが挙げられる。
ａ）遺伝子チップ：
　データベース上のＥＳＴ（expressed sequence tag）配列またはｍＲＮＡ配列をもとに合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドが固相化された遺伝子チップを用いることができる。このような遺伝子チップとしてはアフィメトリックス社製の遺伝子チップ（Lipshutz, R. J. et al. (1999) Nature genet. 21, suppliment、20−24）を用いることができるが、これに限定されず、公知の方法に基づき作製してもよい。遺伝子チップ上に固相化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの基となるＥＳＴ配列またはｍＲＮＡ配列は、解析対象の動物あるいは動物細胞と、同種の動物由来のものであることが最も好ましい。マウスやマウス由来培養細胞を用いるときはマウス由来のものが望ましく、ヒト検体やヒト培養細胞を用いるときはヒト由来のものが望ましい。ＫＫマウス由来のｍＲＮＡを解析する場合はマウス由来のものが最も好ましく、例えば、アフィメトリックス社製マウス１９Ｋセット（Murine 19K set： 19KA, 19KB,19KC）やマウス１１Ｋセット（Murine 11K set： 11KA, 11kB）を用いることができる。ヒト白色脂肪細胞由来のｍＲＮＡを解析する場合には、ヒト由来のものが好ましく、例えば、アフィメトリックス社製ヒトＵ９５セットまたはＵ１３３セットを用いることができる。しかしながら、それらに限定されず、例えば近縁種の動物由来のものも使用可能である。近縁種としては、例えば哺乳類同士を挙げることができ、ヒトとマウス、ヒトとサル等の組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００６４】
　ｂ）マウスまたはヒト、全ＲＮＡあるいは特定の組織から得た全ＲＮＡより作製されたｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物が固相化された、アレイまたはメンブレンフィルター：
　上記ｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物は、マウスまたはヒトのＥＳＴデータベース等の配列情報を基に作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたものである。アレイやフィルターは市販のもの（例えば、インテリジーン：宝酒造社製等）を使用してもよいし、上記ｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物を市販のスポッター（例えば、ＧＭＳ４１７アレイヤー：宝酒造社製等）を用いて固相化することにより作製してもよい。
【００６５】
　ｉｉ）プローブの作製と解析
　標識プローブは、特定のｍＲＮＡクローンではなく、発現している全てのｍＲＮＡを標識したものを用いる。プローブ作製のための出発材料としては精製していないｍＲＮＡを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ（Ａ）+ＲＮＡを用いることが望ましい。以下に、各種固相化試料を用いた場合の、標識プローブの調製方法と検出、解析方法について説明する。
【００６６】
　ａ）アフィメトリックス社製遺伝子チップ：
　アフィメトリクス社製遺伝子チップに添付されたプロトコール（アフィメトリックス社発現解析技術マニュアル）に従ってビオチン標識したｃＲＮＡプローブを作製する。次いでアフィメトリックス社製遺伝子チップに添付のプロトコール（発現解析技術マニュアル）に従って、アフィメトリックス社製の解析装置（ＧｅｎｅＣｈｉｐ　Ｆｌｕｉｄｉｃｓ　Ｓｔａｔｉｏｎ　４００）を用いてハイブリダイゼーションおよび解析を行ない、アビジンによる発光を検出、解析を行なう。
【００６７】
　ｂ）アレイ：
　逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、ｃＤＮＡの検出ができるようにｃＤＮＡを標識しておくことが必要であり、蛍光色素で標識する場合には、蛍光色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５など）で標識されたｄ−ＵＴＰなどを加えておくことによりｃＤＮＡを蛍光標識する。このとき、オリゴヌクレオチド添加細胞由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡと対照細胞由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡをそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時には両者を混合して用いることができる。アレイとして例えば、宝酒造（株）社の市販アレイを用いる場合、同社のプロトコールに従いハイブリダイゼーションおよび洗浄を行って、蛍光シグナル検出機（例えばＧＭＳ４１８アレイスキャナー（宝酒造（株）社製）等）で蛍光シグナルを検出後、解析を行う。ただし、使用するアレイとしては市販のものに限定されず、自家製のもの、特別に作製したのもでもよい。
【００６８】
　ｃ）メンブレンフィルター：
　逆転写酵素でポリ（Ａ）+ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、ｄ−ＣＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行ない、例えば、市販のフィルター製マイクロアレーである、アトラスシステム（クローンテック社製）を用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄を行なった後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クローンテック社製等）を用いて検出、解析を行なう。
【００６９】
　前記ａ）乃至ｃ）のいずれに記載の方法も、同一ロットの固相化試料にターゲット遺伝子由来のプローブをハイブリダイズさせる。このとき、使用するプローブ以外のハイブリダイゼーション以外の条件は同じとする。蛍光標識プローブを用いる場合には、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば一つの固相化試料に両プローブの混合物を一度にハイブリダイズさせて蛍光強度を読み取ることができる（Brown, P. O. et al. (1999) Nature genet, 21, supplement, 33−37）。
【００７０】
　（４）その他の方法
　オリゴヌクレオチドのターゲット遺伝子の発現量に対する影響を測定する他の方法としては、以下に記載するものを挙げることができる。
【００７１】
　ｉ）リボヌクレアーゼ保護アッセイ（RNase protection assay）：　ＲＮＡ試料中の、上記１）乃至５）のいずれか一つに記載の塩基配列を有するｍＲＮＡ（ただし配列中のtはuに読み替える）のみに標識プローブをハイブリダイズさせ、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成させておいてから、試料にリボヌクレアーゼを添加してインキュベーションすると、プローブがハイブリダイズしたｍＲＮＡは二本鎖を形成していることによってリボヌクレアーゼによる消化を免れ、それ以外のＲＮＡは消化されるので、該二本鎖オリゴヌクレオチドのみが残る（検出されるｍＲＮＡよりプローブが短ければ、プローブの鎖長に相当する二本鎖オリゴヌクレオチドが残る。）。この二本鎖オリゴヌクレオチドを定量することにより、目的の遺伝子の発現量を測定する。具体的には、例えば以下に記載する方法に従う。
【００７２】
　二本鎖を形成せずに余った標識プローブを二本鎖オリゴヌクレオチドと確実に分離して定量を容易にするために、余った標識プローブはリボヌクレアーゼに消化されることが好ましいが、リボヌクレアーゼとして一本鎖ＤＮＡも消化できるようなものを使用すれば、標識プローブはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。標識プローブの調製方法は上記「（１）核酸ハイブリダイゼーションを利用する方法」の項中、「ｉｉ）　プローブの標識と検出」の項に記載の方法に準じて行なうことができるが、リボヌクレアーゼアッセイにおいて用いられるプローブの長さは５０乃至５００ヌクレオチド程度が好ましい。また、二本鎖ＤＮＡを直接標識して熱変性したのみのプローブ等、相補鎖が混在するようなプローブは本法には好適ではない。
【００７３】
　ＲＮＡプローブは、例えば下記の方法に従って調製される。まず鋳型ＤＮＡをバクテリオファージのプロモーター（Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３プロモーター等）を有するプラスミドベクター（例えばｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ社製）など）に挿入する。次にこの組換えプラスミドベクターを、制限酵素で、挿入断片のすぐ下流で一ヶ所だけ切断されるように消化する。得られた直鎖ＤＮＡを鋳型として、放射能標識されたリボヌクレオチド存在下で、インビトロ転写反応を行う。この反応には、ベクター中のプロモーターに合わせてＴ７、ＳＰ６またはＴ３ポリメラーゼ等の酵素を用いる。以上の操作は例えばリボプローブシステム−Ｔ７、同−ＳＰ６または同−Ｔ３（いずれもプロメガ社製）を用いて行うことができる。
【００７４】
　オリゴヌクレオチドを添加して培養した細胞より抽出された全ＲＮＡはさらに精製してｍＲＮＡとして使用することが望ましい。調製された全ＲＮＡ試料１０乃至２０μｇ相当分と、５×１０５ｃｐｍ相当の過剰量の標識プローブとを用いてリボヌクレアーゼ保護アッセイを行う。この操作は市販のキット（HybSpeed RPA Kit、アンビオン社製）を用いて行うことができる。得られたリボヌクレアーゼ消化後の試料を、８Ｍ　尿素を含む４乃至１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムでオートラジオグラフィーを行う。以上の操作により、リボヌクレアーゼ消化を免れた二本鎖オリゴヌクレオチドのバンドを検出することができ、またその定量は上記「（１）核酸ハイブリダイゼーションを利用する方法」の項中、「ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションと検出」の項に記載の方法に従って実施することができる。さらに、ノーザンブロット解析の場合と同様、各試料間のＲＮＡ量の差等に起因するばらつきを補正する目的で、β−アクチン遺伝子の発現量を同時に測定しておけば、より精密な評価を行うことができる。
【００７５】
　このようにして、オリゴヌクレオチドを添加して培養した細胞由来の試料と、オリゴヌクレオチド非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、ターゲット遺伝子の発現量を低下させたオリゴヌクレオチドは、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス化合物となり、ターゲット遺伝子の発現量の増大で引き起こされる疾患の治療薬となり得る。
【００７６】
　ｉｉ）ランオン・アッセイ（Run−on assay、Greenberg, M. E. and Ziff, E. B.
B. (1984) Nature 311, 433−438,およびGroudine, M. et al. (1981) Mol. Cell Biol. 1, 281−288参照）：　本方法は、細胞から核を単離して目的の遺伝子の転写活性を測定する方法であり、これまでに述べたような細胞内のｍＲＮＡを検出する方法ではないが、本発明においては「遺伝子の発現量を検出する方法」に包含される。単離された細胞核を用いて、試験管内で転写反応を行わせると、核を単離する前に既に転写が開始されｍＲＮＡ鎖が生成されている途中のものが伸長していく反応のみが進行する。この反応時に放射標識したリボヌクレオチドを添加して、伸長していくｍＲＮＡを標識しておき、その中に含まれる、非標識プローブにハイブリダイズするｍＲＮＡを検出することにより、核を単離した時点における目的の遺伝子の転写活性を測定することができる。被験物質の影響が最も顕著に現れる時間のデータを判定に用いるため、培養細胞に被験物質を添加してから核を単離するまでの時間について、例えば添加３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後および２４時間後の細胞から核を単離してそれぞれアッセイを行うなどの方法をとることができる。なお具体的操作方法は、プローブを上記（１）の記載に準じて標識しないものを調製する他は、上記参照文献の記載に準ずる。このようにして、オリゴヌクレオチド存在下で培養した細胞由来の試料と、オリゴヌクレオチド非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、ターゲット遺伝子の転写活性を低下させたオリゴヌクレオチドは、ターゲット遺伝子の発現量を低下させ、ターゲット遺伝子の発現量の増加によって引き起こされる疾患の治療または予防剤となり得る。
Ｂ．ポリペプチドの発現量を測定する方法
　オリゴヌクレオチドの遺伝子発現抑制効果を測定する方法として、抗体を利用した方法について説明する。まず、試料中のポリペプチドを９６穴プレートや３８４穴プレート等のマルチウエルプレートのウエル内底面やメンブレン等に固相化しておいてから、オリゴヌクレオチドのターゲット遺伝子産物を特異的に認識する抗体を用いた検出が行われる。このうち、９６穴プレートや３８４穴プレート等のマルチウエルプレートを用いるのは一般に固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）や放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）と呼ばれる方法である。一方、メンブレンに固相化する方法としては、試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動を経てメンブレンにポリペプチドを転写する方法（ウエスタンブロット法）か、または直接メンブレンに試料またはその希釈液を染み込ませる、いわゆるドットブロット法やスロットブロット法が挙げられる。
【００７７】
　（１）試料の調製
　試料としては、ヒト全血、血清、肝臓または培養細胞が好ましい。該全血、肝臓または脂肪組織抽出液は、必要に応じて高速遠心を行うことにより、不溶性の物質を除去した後、以下のようにＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
【００７８】
　ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料としては、例えば回収した血清、肝臓や培養細胞抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば血清、肝臓や培養細胞抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ社製等）と混合する。ドット／スロットブロットの場合は、例えば回収した血清、肝臓や培養細胞抽出液そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させる。
【００７９】
　（２）試料の固相化
　上記のようにして得られた試料中のポリペプチドを特異的に検出するためには、試料を免疫沈降法、リガンドの結合を利用した方法等によって、沈殿させ、固相化せずに検出することもできるし、そのまま検出する該試料を固相化することもできる。ポリペプチドを固相化する場合において、ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法に用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等が挙げられる。
【００８０】
　電気泳動後のゲルからメンブレンにポリペプチドを移す、いわゆるブロッティング方法としては、ウエット式ブロッティング法（CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume 2 ed by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober）、セミドライ式ブロッティング法（上記CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume 2 参照）等を挙げることができる。ドットブロット法やスロットブロット法のための器材も市販されている（例えば、バイオ・ドット（バイオラッド）等）。
【００８１】
　一方、ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法で検出・定量を行うためには、専用の９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）や３８４穴プレートに試料またはその希釈液（例えば０．０５％　アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃乃至室温で一晩、または３７℃で１乃至３時間静置することにより、ウエル内底面にポリペプチドを吸着させて固相化する。
【００８２】
　（３）抗体
　用いられる抗体は、オリゴヌクレオチドのターゲット遺伝子産物またはその一部を特異的に認識するものである。このような抗体としては、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドのターゲット遺伝子産物のポリペプチドのいずれにも結合するが、他のいかなるマウスまたはヒト由来の蛋白質とも結合しないような抗体を挙げることができる。
【００８３】
　前記抗体は、常法を用いて（例えば、新生化学実験講座１、蛋白質１、p.389−397、1992）、抗原となる蛋白質、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Kohler and Milstein, Nature 256, 495−497, 1975、Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody p.365−367, 1980, Prenum Press, N.Y.）に従って、オリゴヌクレオチドのターゲット遺伝子産物の蛋白質に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【００８４】
　抗体を作製するための抗原としては、オリゴヌクレオチドのターゲット遺伝子産物のポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
【００８５】
　前記抗原ポリペプチドはオリゴヌクレオチドのターゲット遺伝子によってコードされているポリペプチドをin vitroにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、オリゴヌクレオチドのターゲット遺伝子産物であるポリペプチドを発現可能なベクターにターゲット遺伝子を組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによって該ターゲット遺伝子を発現させることにより、該標的ポリペプチドを得ることが出来る。
【００８６】
　ポリペプチドのIn vitro合成としては、例えばロシュ・ダイアグノスティックス（株）社製のラピッドトランスレーションシステム（RTS）が挙げられるが、これに限定されない。ＲＴＳを用いる場合を例に挙げると、目的の遺伝子をＴ７プロモーターにより制御される発現ベクターにクローニングし、これをin vitroの反応系に添加すると、最初に鋳型ＤＮＡよりＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡが転写され、その後大腸菌溶解液中のリボソーム等により翻訳が行われ、目的のポリペプチドが反応液中に合成される(Biochemica, 1, 20−23 (2001), Biochemica, 2, 28−29 (2001)。
【００８７】
　原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【００８８】
　例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用できる。
【００８９】
　プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（trp）プロモーター、ラクトース（lac）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（tac）プロモーター、リポプロテイン（lpp）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Tu（tufB）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも目的のポリペプチドの産生に使用することができる。
【００９０】
　枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87−93）などが用いられるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００９１】
　真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175−182、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126−4220）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００９２】
　脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐＣＲ３．１（Invitrogen社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854−864）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００９３】
　宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295−1308)、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456−457）、および電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841−845）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook, J. et al. (1989) ： “Molecular Cloning A Laboratory Manual“ Cold Spring Harbor Laboratory, NY）やｐＳＶ２ｎｅｏ（Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327−341）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００９４】
　昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やTrichoplusia niの卵細胞由来High Five細胞（Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog. I： 391−396）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリン蛋白質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Kidd, I. M. and V.C. Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and Biotechnology 42, 137−159)。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Zhe−mei Wang, et al. (1998) Biol. Chem., 379, 167−174)。
【００９５】
　真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Saccharomyces cerevisiaeや石油酵母Pichia pastorisが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen, J. L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018−3025）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1−5）などを好ましく利用できる。また、分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Andrew, L. Niles,et al. (1998) Biotechnol.Appl. Biochem. 28, 125−131)。
【００９６】
　上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。
【００９７】
　上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常のタンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明のポリペプチドを大量に製造できる。
【００９８】
　上記のようにして得られる抗体は、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法などの各種免疫学的測定法や免疫組織染色などに用いることができる。
【００９９】
　（４）検出
　上記（３）記載の方法で得られる抗体は、それを直接標識するか、または該抗体を一次抗体とし、該抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。
【０１００】
　標識の種類として好ましいものは酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）を使用する方法のための、予め標識された抗体（またはストレプトアビジン）は種々のものが市販されている。ＲＩＡの場合はＩ１２５等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
【０１０１】
　これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原であるポリペプチドの量が測定される。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、それら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
【０１０２】
　発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては目視で検出できる。ＥＬＩＳＡ法においては、好ましくは市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウエルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定することにより定量する。また好ましくは上記（３）において抗体作製のために使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行って、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することが可能である。
【０１０３】
　一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においてはＸ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができ、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。また、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
【０１０４】
　（５）測定操作
　ｉ）ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットの場合
　まず、抗体の非特異的吸着を阻止するため、予めメンブレンをそのような非特異的吸着を阻害する物質（スキムミルク、カゼイン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時間浸しておく操作（ブロッキング）を行う。ブロッキング溶液の組成は、例えば５％　スキムミルク、０．０５乃至０．１％　ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が用いられる。スキムミルクの代わりに、ブロックエース（大日本製薬）、１乃至１０％のウシ血清アルブミン、０．５乃至３％のゼラチンまたは１％のポリビニルピロリドン等を用いてもよい。ブロッキングの時間は、４℃で１６乃至２４時間、または室温で１乃至３時間である。
【０１０５】
　次に、メンブレンを０．０５乃至０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記（３）記載の方法で作製された抗体をブロッキング溶液で適宜希釈した溶液中に一定時間浸して、抗体をメンブレン上の抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のウエスタンブロッティング実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で２時間行う。抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使用する場合はブロッキング溶液で２０００乃至２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で４５分乃至１時間浸し、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずメンブレンを洗浄液中で１５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【０１０６】
　ｉｉ）ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ
　まず、上記（２）の方法で試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、ウエスタンブロットの場合と同様、予めブロッキングを行っておく。ブロッキングの条件については、ウエスタンブロットの項に記載した通りである。
【０１０７】
　次に、ウェル内を０．０５乃至０．１％　ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記（３）記載の方法で作製された抗体を洗浄液で適宜希釈した溶液を分注して一定時間インキュベーションし、抗体を抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記（３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のＥＬＩＳＡ実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間程度行う。抗体反応操作終了後、ウェル内を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００乃至２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のウェルに二次抗体溶液を分注して室温で１乃至３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【０１０８】
　また本発明において、いわゆるサンドイッチ法のＥＬＩＳＡは例えば以下に記載する方法により実施することができる。まず、ターゲット遺伝子によってコードされているポリペプチドのアミノ酸配列のいずれか一つにおいて、親水性に富む領域を２箇所選んで、それぞれの領域中のアミノ酸６残基以上からなる部分ペプチドを合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を上記（４）記載のように標識しておく。標識しなかった方の抗体は、上記（２）記載の方法に準じて９６穴または３８４穴のＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル内に入れて常温で１時間インキュベーションする。ウェル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分注してインキュベーションする。再びウェル内を洗浄後、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【０１０９】
　（６）リガンド
抗体の他に、ターゲット遺伝子によってコードされているポリペプチドに特異的に結合する基質、補酵素、調節因子等のリガンドを用いることによっても標的蛋白質を定量することができる。
【０１１０】
　３．アンチセンス化合物の設計方法
　本発明におけるアンチセンス化合物は、以下のＡ乃至Ｄのいずれかに記載の方法によって設計することができる。
【０１１１】
　Ａ．下記の工程１）乃至７）を含む方法：
１）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する工程；
２）入力された塩基配列データと、塩基配列が解析された遺伝子の塩基配列データベースからの塩基配列データとの相同性を求める工程；
３）工程２）によって得られた相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程；
４）工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加してインキュベートした細胞及び該オリゴヌクレオチドを添加しないでインキュベートした細胞からそれぞれ全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
５）工程４）で得られた全ＲＮＡ画分の間における工程３）で出力された各遺伝子の発現量の差を解析する工程；
６）工程５）で得られた各遺伝子の発現量の差にもとづいて工程１）で示された塩基配列を改変する工程；
７）工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する工程。
【０１１２】
　Ｂ．下記の工程１）乃至７）を含む方法：
１）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する工程；
２）入力された塩基配列データと、塩基配列が解析された遺伝子の塩基配列データベースからの塩基配列データとの相同性を求める工程；
３）工程２）によって得られた相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程；
４）工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを投与した動物及び該オリゴヌクレオチドを投与しなかった動物からそれぞれ全ＲＮＡ画分を抽出する工程；
５）工程４）で得られた全ＲＮＡ画分の間における工程３）で出力された各遺伝子の発現量の差を解析する工程；
６）工程５）で得られた各遺伝子の発現量の差にもとづいて工程１）で示された塩基配列を改変する工程；
７）工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する工程。
【０１１３】
　Ｃ．下記の工程１）乃至７)を含む方法：
１）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する工程；
２）入力された塩基配列データと、塩基配列が解析された遺伝子の塩基配列データベースからの塩基配列データとの相同性を求める工程；
３）工程２）によって得られた相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程；
４）工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加してインキュベートした細胞及び該オリゴヌクレオチドを添加しないでインキュベートした動物細胞からそれぞれ全ポリペプチド画分を抽出する工程；
５）工程４）で得られた全ポリペプチド画分の間における工程３）で出力された各遺伝子に対応するポリペプチドの発現量の差を解析する工程；
６）工程５）で得られた各ポリペプチドの発現量の差にもとづいて工程１）で示された塩基配列を改変する工程；
７）工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する工程。
【０１１４】
　Ｄ．下記の工程１）乃至７)を含む方法：
１）ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する工程；
２）入力された塩基配列データと、塩基配列が解析された遺伝子の塩基配列データベースからの塩基配列データとの相同性を求める工程；
３）工程２）によって得られた相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程；
４）工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを投与した動物及び該オリゴヌクレオチドを投与しなかった動物からそれぞれ全ポリペプチド画分を抽出する工程；
５）工程４）で得られた全ポリペプチド画分の間における工程３）で出力された各遺伝子に対応するポリペプチドの発現量の差を解析する工程；
６）工程５）で得られた各ポリペプチドの発現量の差にもとづいて工程１）で示された塩基配列を改変する工程；
７）工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する工程。
【０１１５】
　以下、各工程を詳しく説明する。
（１）工程１）について
工程１）は上記「１.ターゲット遺伝子の決定」の項で決定されたターゲット遺伝子に対するアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの相補鎖の塩基配列を入力する入力手段からなる。アンチセンス化合物はターゲット遺伝子のｍＲＮＡとワトソンクリック型の塩基対を形成することでターゲット遺伝子のコードする蛋白質の発現を抑制する。したがって、オリゴヌクレオチドは塩基配列データベース上の遺伝子配列データの相補鎖と相同性が高い場合に当該遺伝子の発現を抑制する可能性がある。コンピュータープログラムによっては、アンチセンス化合物の塩基配列を入力してもアンチセンス化合物の塩基配列の相補鎖の相同性検索を行なわないものもあり、このような場合はオリゴヌクレオチドの塩基配列データを入力する代わりにオリゴヌクレオチドの相補鎖の塩基配列データを入力すればよい。
【０１１６】
　ここで入力された塩基配列が以下の工程の検索キーのキーデータとなる。
【０１１７】
　（２）工程２）について
工程２）における塩基配列データベースとしては公知及び／または未知の遺伝子の塩基配列情報が収録されているデータベースであれば良く、公開されているあるいは未公開の、遺伝子の塩基配列情報のデータベースを用いることができる。公開されている、遺伝子の塩基配列情報のデータベースとしては日本の国立遺伝学研究所、米国のNCBI（National Center for Biotechnology）のGenBank、欧州におけるEBI（European Bioinfromatics Institite；旧EMBL）の遺伝子データベース等があり、これらのデータベースのデータはコンピューターのメモリーやハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭや磁気テープ等の外部記憶媒体、更にはインターネットを通じて利用可能である。塩基配列データベースに登録されている遺伝子の塩基配列データが、以下に記載するターゲットデータとなる。
【０１１８】
　工程１）で入力されたオリゴヌクレオチドの塩基配列データと塩基配列データベースに登録されている遺伝子の塩基配列データとの相同性を求めるには通常用いられている相同性検索プログラムを用いることができる。このような相同性検索プログラムとしては工程１）で入力されたオリゴヌクレオチドの塩基配列と塩基配列データベース中の遺伝子の塩基配列に一致する配列や類似の配列が存在するかどうかを検索できるプログラムであれば良く、そのようなプログラムとしては例えばＦＡＳＴＡ（W.R. Pearson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85：2444(1988)）、ＢＬＡＳＴ（S.F. Altschul, Nucleic Acids Res., 25：3389(1997)）及びＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ（J.D. Thompson, Nucleic Acids Res., 22：4673(1994)）等を挙げることができる。これらの相同性検索プログラムはユーザーのコンピューターに組み込んで実行することもできるし、インターネット等のネットワークを介してデータベース提供組織のコンピュータ上に登録されているプログラムを実行することもできる。
【０１１９】
　なお、相同性検索プログラムを実行する場合、プログラム中に検索パラメーターがある場合、このパラメーターを適宜設定することで所望の相同性を有する遺伝子を検出することができる。
【０１２０】
　例えば、塩基配列データベース中の遺伝子配列に対して、Blast検索を行ない、Ｅ値（Expectation value）10以下の遺伝子群、若しくは、CLUSTALWによるアライメントを行ない、スコア80以上の遺伝子群を抽出する。
【０１２１】
　あるいは、塩基配列データベース中の遺伝子配列に対して、Blast検索を行ない、Ｅ値（Expectation value）1000以下の遺伝子群、若しくは、CLUSTALWによるアライメントを行ない、スコア70以上の遺伝子群に対して、アンチセンス化合物とのΔＧ（自由エネルギー変化）を計算し、ΔＧの小さい順（エネルギー的にアンチセンス化合物と安定な２本鎖を形成すると予想される順）に順位付けした遺伝子を得ることができる。
【０１２２】
　（３）工程３）について
工程３）は工程２）によって得られた相同性が高い遺伝子のデータを出力する工程である。工程２)によって求められた相同性の高い順に任意の数の遺伝子を出力することができる。データの出力の形式は相同性検索プログラムによるが、入力されたオリゴヌクレオチドの相補鎖の塩基配列と相同性を有する塩基配列を有する遺伝子を特定できるような形式であればよく、例えば、データベース上で各遺伝子に付与されているアクセッション（Accession）番号を出力したり、遺伝子の名称を出力するものでもよい。また、遺伝子配列データを同時に出力し、アンチセンス化合物と相同性を有する塩基配列の領域を示す形式でもよい。
【０１２３】
　（４）工程１）乃至３）について
　工程１）乃至３）についてのハードウエア構成を図１を用いて説明する。図１は相同性遺伝子検索システムの基本構成を示す図である。図１において１０１はワークステーションまたはパーソナルコンピューター（以下、ワークステーションにはパーソナルコンピューターも含める）、１０２は外部記憶装置、１０３はワークステーションをネットワークと接続するためのモデムあるいはルーター等の装置、１０４はネットワーク、１０５は塩基配列データベースである。このシステムでは、ワークステーション１０１が、マンマシンインターフェースとなる部分であり、研究者のいるサイトに設置され、ローカルな塩基配列データベースの検索（相同性検索）の処理を実行する。
【０１２４】
　ここでのワークステーション１０１には、塩基配列データベースとしての外部記憶装置１０２が接続され、外部記憶装置１０２により遺伝子情報の配列データが蓄積されているＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭまたはハードディスクなどの記憶媒体から、遺伝子配列データのターゲットデータを得て検索キーのキーデータに対する相同性の評価と、ターゲットデータの中から候補として抽出する遺伝子配列の相同性検索を行なう。また、ワークステーション１０１は、モデムまたはルーター等の装置を介して公共の塩基配列データベース１０５に接続されており、塩基配列データベースの情報を得て、それをターゲットデータとして、ローカルな塩基配列データベースでのデータ検索の処理と同様に、検索キーのキーデータに対する遺伝子情報の配列データの相同性検索を行なう。なお、図１においては破線の上部分でシステムが完結しているが、ワークステーション１０１に直接検索キーのキーデータを入力するのではなく、１０１をサーバーとして破線の下に示す１０６のクライアント端末から検索キーのキーデータを入力し、相同性検索を１０１で行なわせ、１０６に出力させることもできる。
【０１２５】
　遺伝子配列の配列データは、キーボードから直接に、またはフレキシブル・ディスクなどの記録媒体あるいはネットワークを介してワークステーション１０１に入力される。この配列データを検索キーのキーデータとして、塩基配列データベースの検索処理（相同性検索）を実施する。相同性検索は前述の相同性検索プログラムを用いることによって行なうことができる。
【０１２６】
　相同性検索を行なうワークステーションは上述の相同性検索を行なうことができる構成であれば良く、中央演算装置、メモリ、外部記憶装置、外部出力装置、等を有するＷＩＮＤＯＷＳオペレーティングシステム（マイクロソフト社商標）や、ＬｉｎｕｘシステムあるいはＭａｃｉｎｔｏｓｈ（アップル社商標）オペレーションシステム等のオペレーティングプログラムが稼動する構成のコンピュータであれば、パーソナルコンピューターに上述の相同性検索プログラムを組み込むことで相同性検索は可能となる。また、ワークステーションに相同性検索プログラムを組み込まずに、ネットワークを介して外部のコンピュータ上で相同性検索を行ない、検索結果を入手することも可能である。
【０１２７】
　相同性検索の結果はコンピュータのディスプレー、プリンター等任意の出力手段に出力することができる。
【０１２８】
　なお、このような遺伝子の相同性検索を行ない、相同性遺伝子のデータを入手するためには自分で上記ワークステーション等のシステムを組み立てるほかに、市販の遺伝子解析システムを利用することもでき、このようなシステムとしては例えば、TimeLogic社（米国）製のDecypherシステムを挙げることができる。
【０１２９】
　例えば、上記Decypherシステムを用いた場合、コンピュータにオリゴヌクレオチドの塩基配列を入力し、塩基配列データベースを選択し、相同性検索プログラムを選択し、検索パラメーターを設定して検索を行なうと、検索条件に合致した相同性遺伝子を出力することができる。また、ネットワークを介した公共の相同性検索サービスを利用して相同性遺伝子のデータを入手することができる。例えば、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)にて、GenBankのデータベースにおけるBLAST検索を行い、検索結果を入手することも可能である。
【０１３０】
　（５）工程４）について
　工程１）に示される塩基配列を有する化合物は、ＤＮＡ合成機、例えばパーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２などを用いて文献（Nucleic Acids Research, 12, 4539(1984)）記載の方法に準じて合成することが出来る。
【０１３１】
　その際に用いられるホスホロアミダイト試薬は、天然型のヌクレオシド及び2'−O−メチルグアノシン（Gm）については市販の試薬を用いることができる。非天然型のホスホロアミダイトは特開２０００−２９７０９７の実施例５（5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−4−N−ベンゾイルシチジン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、実施例９（5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−5−メチルウリジン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、実施例１４(5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−6−N−ベンゾイルアデノシン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、の化合物または、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−メチル−2−N−イソブチリルフェノキシアセチルグアノシン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト（ファルマシア社製）を用いることができる。その他のヌクレオシドについてはl、m、n、o及びpが１であるヌクレオシドについてWO99/14226、l、m、n、o及びpが２乃至5であるヌクレオシドについてWO 00/47599記載の方法にしたがって得ることができる。
【０１３２】
　又、所望により、チオエート化する場合は、硫黄のほかテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ、アプライドバイオシステムズ社）、Beaucage試薬（Glen Research社）等の３価の亜リン酸に反応してチオエートを形成する試薬を用い、文献（Tetarhedron Letters, 32, 3005(1991)、J. Am. Chem. Soc., 112, 1253(1990)）記載の方法に準じてチオエート誘導体を得ることが出来る。また、文献（S. M. Freier et al, Nucleic Acids Res., 25, 4429 (1997)）記載の修飾オリゴヌクレオチドも同文献に引用されている方法によって合成することができる。
【０１３３】
　本工程で用いられる細胞は標的とする遺伝子が発現している細胞であれば良く、例えば、例えば、c−rafに対する発現抑制効果を見るためにはA549細胞(ATCC number CCL−185)（Brett P. Monia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1996) 93, 15481−15484）を、rasに対する発現抑制効果を見るためには、T24細胞(ATCC number HTB−4)、MRC−5細胞(ATCC number CCL−171)、J82細胞(ATCC number HTB−1) (Guan Chen et al., J. Biol. Chem., (1996) 271, 28259−28265)を使うことができる。
【０１３４】
　ＶＥＧＦに対する発現抑制効果を調べるためには通常の状態ではＶＥＧＦが発現している細胞を用いることができ、このような細胞としては例えばヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞（アメリカン・タイプカルチャー・コレクション；ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５）を挙げることができる。これらの細胞は当業者が通常用いる培養方法によって培養することができる。また、本発明においては、培養細胞の代わりに動物個体を用いることもでき、ターゲット遺伝子が発現している限りにおいて、哺乳類、例えばラット、マウス等を任意に選択することができる。培養細胞にオリゴヌクレオチドを添加する場合にはＥＰＥＩ（Gene−tools社）、リポフェクチン（インビトロジェン社）といった細胞内導入(トランスフェクション)用試薬とともに添加する。
【０１３５】
　i)　ｍＲＮＡの発現量を測定する方法
　上記Ａ．の工程４）では、細胞として培養細胞を用いる場合は細胞株を一定条件で培養した後に工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＥＰＥＩやリポフェクチンといった細胞内導入(トランスフェクション)用試薬とともに添加して一定時間インキュベートし、その後細胞から全ＲＮＡ画分を抽出する。全ＲＮＡ画分の抽出及びｍＲＮＡの精製は上記、「２．遺伝子発現量の測定」の項の「Ａ．遺伝子の発現量を測定する方法」の項に記載した方法に準じて行なうことができる。
【０１３６】
　対照として用いるオリゴヌクレオチドを添加しないで培養した細胞由来の全ＲＮＡ画分またはｍＲＮＡも上記と同様に抽出、精製できる。
【０１３７】
　一方、動物を用いる場合には食餌、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射等、適当な方法で投与することができる。投与後の動物個体からは屠殺、採血後に他の組織が混入しないように注意しながら適当な組織、血液等を取り出し、全ＲＮＡ画分をＲＮＡ抽出用の溶媒（例えばフェノール等、リボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの）で直接溶解するのが好ましい。または、該組織の細胞を破壊しないように、スクレーパーで慎重に掻きとるか、もしくはトリプシン等の蛋白質分解酵素を用いて穏やかに組織から細胞を抽出するなどの方法により、細胞を回収した後、速やかにＲＮＡ抽出工程に移行する。全ＲＮＡ画分の抽出及び精製は、上記と同じ方法によって行なうことができる。
【０１３８】
　ii)ポリペプチドの発現量を測定する方法
上記Ｂ.の工程４）では、上記i)と同様の方法によって細胞株を一定条件で培養した後に工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを添加して一定時間インキュベートし、その後細胞から全ポリペプチドを抽出する。動物を用いる場合も工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを投与して一定時間後、i)と同様に適当な組織、血液等を取り出す。ポリペプチド画分の調製は上記「２．遺伝子発現量の測定」の項中、「Ｂ．ポリペプチドの発現量を測定する方法」の項中「（１）試料の調製」に記載の方法に準じて行なうことができる。
【０１３９】
　（６）工程５）について
　工程５）における遺伝子発現量の差の解析は遺伝子の発現量を解析することができる限りにおいて公知の手法を用いて行なうことができるが、ＲＴ−ＰＣＲ法、競合ＲＴ−ＰＣＲ法及びＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法が好適である。
ＲＴ−ＰＣＲ法は、上記、「２．遺伝子発現量の測定」の項中「Ａ．遺伝子の発現量を測定する方法」の「（２）ＲＴ−ＰＣＲ」の項に記載した方法によって行なうことができる。遺伝子定量の信頼性を高めた方法として、上記ＲＴ−ＰＣＲ法を改良した競合ＲＴ−ＰＣＲ法（Souaze et al., BioTechniques 21, 280−285 (1996)）や、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法（Heid et al., Genom. Res. 6, 986−994 (1996)）なども利用可能である。
【０１４０】
　工程５）でオリゴヌクレオチドを添加して培養した細胞由来の試料と該オリゴヌクレオチドを添加しないで培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、該オリゴヌクレオチドの添加によって各遺伝子の発現量が減少した場合、該オリゴヌクレオチドは当該遺伝子の発現を抑制したと判断することができる。同様に工程５）でオリゴヌクレオチドを投与した動物由来の試料と該オリゴヌクレオチドを投与しなかった動物由来の試料との間で検出結果を比較し、該オリゴヌクレオチドの添加によって各遺伝子の発現量が減少した場合、該オリゴヌクレオチドは当該遺伝子の発現を抑制したと判断することができる。
【０１４１】
　なお、上記「２．遺伝子発現量の測定」の項で説明した方法によって工程３）で出力された遺伝子及びターゲット遺伝子の発現量を測定し、発現量の差を解析することもできる。また、複数の測定方法を組み合わせることも可能である。
【０１４２】
　また、遺伝子の発現量はｍＲＮＡの翻訳産物のポリペプチドの発現量を測定することによっても行なうことができる。ポリペプチドの発現量の測定は、上記「２．遺伝子発現量の測定」の項中、「Ｂ．ポリペプチドの発現量を測定する方法」の項に記載されている方法によって行なうことができる。
【０１４３】
　（７）工程６）について
　工程５）においてオリゴヌクレオチドの添加の有無によってターゲット遺伝子以外の相同性遺伝子の発現量の差が顕著に認められる場合、副作用等の発生が懸念される。したがって、発現量の差が認められる場合は工程１）で示された塩基配列の改変を行なう。ここで、「オリゴヌクレオチドの添加の有無によってターゲット遺伝子以外の相同性遺伝子の発現量の差が顕著に認められる場合」とは、オリゴヌクレオチドの添加によって発現量が顕著に低下する場合をいい、発現量が５０％以上低下するような場合は発現量が顕著に低下したといえる。ただし、本発明においては、遺伝子の発現量の低下が５０％未満でも、発現量の低下が認められる限りにおいて、工程１）で示された塩基配列の改変を行なうことができる。
【０１４４】
　塩基配列の改変は、以下のi)乃至iii)のいずれかの方法で行なうことができる。
【０１４５】
　i)オリゴヌクレオチドを構成する塩基の数を短くする。この方法により、ターゲット遺伝子とより厳密な配列特異性を持たせる。すなわち、オリゴヌクレオチドを構成する塩基の数を短くすれば、ターゲット遺伝子以外の遺伝子と親和性を有する配列が除かれることになり、ターゲット遺伝子以外の遺伝子に対する親和性を軽減することができる。オリゴヌクレオチドを構成する塩基の数を少なくする場合には塩基配列の５’側から又は３’側からあるいは５’側から及び３’側からの両方の側からヌクレオチドを１〜５少なくすることができる。本方法の概念図を図２に示す。例えば、図２ではターゲット遺伝子に対するアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドの長さを５ヌクレオチド短くするとターゲット遺伝子に対するマッチ率は１００％のままで、非ターゲット遺伝子に対するマッチ率が75％から67％に低下し、ターゲット遺伝子以外の相同性遺伝子の発現の抑制効果を低減することができる様子が示してある。塩基配列を短くし配列特異性が高くなる代わりに、ターゲット遺伝子との親和性が著しく低下する場合には、非天然型のヌクレオシドをオリゴヌクレオチド中に新たに導入し親和性を向上させてもよい。
【０１４６】
　ii)オリゴヌクレオチドの塩基配列をターゲット遺伝子中の３’側あるいは５’側に移動する。具体的には、ターゲット遺伝子に対するアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドとして選択した塩基配列を塩基配列の長さは変えずにターゲット遺伝子の３’側に１〜１０塩基、好ましくは１〜５塩基移動した塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドや５’側に１〜１０塩基、好ましくは１〜５塩基移動した塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを設計する。
【０１４７】
　オリゴヌクレオチドの塩基配列を５’側に移動する場合には、ターゲット遺伝子の５’側からヌクレオチド番号（Ｘ）番目から（Ｘ＋Ｙ）番目までの塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに対してはターゲット遺伝子の５’側から、（Ｘ−１）番目から（Ｘ−１＋Ｙ）番目まで乃至（Ｘ−１０）番から（Ｘ−１０＋Ｙ）番目、好ましくは、（Ｘ−１）番目から（Ｘ−１＋Ｙ）番目乃至（Ｘ−５）番目から（Ｘ−５＋Ｙ）番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを設計する（ここで、Ｘは整数であり、Ｙは１０〜５０、好適には１5〜２５の整数である。以下、同じ。）。
【０１４８】
　オリゴヌクレオチドの塩基配列を３’側に移動する場合には、ターゲット遺伝子の５’側から（Ｘ）番目から（Ｘ＋Ｙ）番目までの塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス化合物に対してはターゲット遺伝子の５’側から、（Ｘ＋１）番目から（Ｘ＋１＋Ｙ）番目まで乃至（Ｘ＋１０）番から（Ｘ＋１０＋Ｙ）番目、好ましくは、（Ｘ＋１）番目から（Ｘ＋１＋Ｙ）番目乃至（Ｘ＋５）番目から（Ｘ＋５＋Ｙ）番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを設計する。
【０１４９】
　このように５’側あるいは３’側に塩基配列を移動したオリゴヌクレオチドはターゲット遺伝子のｍＲＮＡに対する親和性を保ったまま、ターゲット遺伝子以外の遺伝子に対する親和性を減少させることができる。
【０１５０】
　なお、５’側あるいは３’側に塩基配列の位置を移動することによって工程３）の相同性検索によって検索された遺伝子以外の遺伝子と相同性を示すことになる場合もあるので、他の遺伝子との相同性検索を改めて行ない、配列を移動する方向および移動する数を選択することもできる。本方法の概念図を図３に示す。図３ではターゲット遺伝子に対するアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドを５’側に4塩基移動するとターゲット遺伝子に対するマッチ率は１００％で変わらないのに対し、非ターゲット遺伝子に対するマッチ率は75％から55％に減少し、非ターゲット遺伝子に対する発現抑制効果が低減される様子が示してある。
iii)オリゴヌクレオチドを構成する塩基の数を短くなるすることでターゲット遺伝子とより厳密な（マッチ率の高い）配列特異性を持たせる。そして、このようにして設計したオリゴヌクレオチドについてさらに、オリゴヌクレオチドの塩基配列をターゲット遺伝子中の３’側あるいは５’側に移動する。具体的には、ターゲット遺伝子に対するアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドとして選択した塩基配列を塩基配列の長さを短くし、ターゲット遺伝子の３’側に１乃至１０塩基、好ましくは１〜５塩基移動した塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドや５’側に１乃至１０塩基好ましくは１乃至５塩基移動した塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを設計する。オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは１乃至１０塩基、好ましくは１乃至５塩基短くすることができる。
【０１５１】
　上記、i)乃至iii)のいずれかの方法によってオリゴヌクレオチドの塩基配列を改変する。
【０１５２】
　（８）工程７）について
工程７）では、工程６）の塩基配列の改変工程によって得られた、塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する。
【０１５３】
　すなわち工程１）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの代わりに、工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて工程４）及び工程５）を行ない、工程３）で出力された遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する。
【０１５４】
　また、工程７）では必要に応じて、工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、i)工程１）乃至６）を繰り返し、又は、ii)工程４）乃至６）を繰り返しターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択することができる。i)又はii)の場合は、以下のような工程になる。
i)工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて工程１）乃至６）を繰り返し、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する。
又は、
ii)工程６）で得られた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて工程４）乃至６）を繰り返し、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する。
【０１５５】
　ここでi)の場合には、工程１）が（ｎ＋１）回目の場合にはｎ回目の工程６）で設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を工程１）で入力するという方法で工程１）乃至工程６）を繰り返し、工程３）で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチドを選択する（ここで「ｎ」は１以上の整数を表す。）。
【０１５６】
　また、ii)の場合は工程４）では、工程４）が（ｎ＋１）回目のときは、工程１）で示されるオリゴヌクレオチドの塩基配列の代わりにｎ回目の工程６）で設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を用いる。
【０１５７】
　工程６）が（ｎ＋１）回目（ここで「ｎ」は１以上の整数を表す。）のときは、工程６)では、工程１）で示される塩基配列の代わりにｎ回目の工程６）で設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を用いる。
【０１５８】
　本工程７）において、「工程３」で出力された各遺伝子の発現量に影響のないオリゴヌクレオチド」とは、例えば、工程５）において遺伝子の発現量が５０以上低下していた遺伝子の発現量の低下割合が５０％未満に減少する場合をいう。ただし、遺伝子によっては、遺伝子の発現量の低下割合が減少していればよい場合もあり、そのような場合は遺伝子の発現量の低下割合が減少していれば、改変前の遺伝子の発現量の低下割合は５０％以上でなくてもよいし、改変後の遺伝子の発現量の低下割合が５０％未満でなくてもよい。
【０１５９】
　このように、工程１)乃至工程７）によって、ターゲット遺伝子に対してアンチセンス効果を有し、他の遺伝子の発現量に影響のない化合物が選択される。
【０１６０】
　本発明のオリゴヌクレオチドの設計方法によって例えば、化合物（I）のオリゴヌクレオチドの塩基配列を用いて工程１）乃至工程７）行なうと、一般式（I）を有する化合物が選択される。
【０１６１】
　本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、VEGFの抑制活性を示しかつ、化合物(I)よりも他の遺伝子の発現量の抑制活性が少ない。又、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物、及び／又は、その塩は、吸収、体内分布、血中半減期などの体内動態に優れ、腎臓、肝臓等の臓器に対する毒性も低い。従って、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物、及び／又はその塩は、例えば医薬として有用であり、特に種々の血管新生又は血管透過性亢進が関与している疾患を治療若しくは予防する医薬として有用である。
【０１６２】
　本発明の化合物を、上記疾患の予防薬又は治療薬として使用する場合には、前記一般式(Ｉ)を有する化合物、又は、その塩若しくはエステルを、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、又は、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。
【０１６３】
　これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【０１６４】
　本発明の化合物を患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Mannino et al.,Biotechniques,1988,6,682；Blume and Cevc,Biochem.et Biophys.Acta,1990,1029,91；Lappalainen et al.,Antiviral Res.,1994,23,119；Chonn and Cullis,Current Op.Biotech.,1995,6,698 ）。
【０１６５】
　0.2−0.4 μｍのサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Fraley et al.,Trends Biochem.Sci.,1981,6,77 ）。リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種又はそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４−１８ の炭素原子、特に１６ −１８ の炭素原子を含有し、飽和している（１４ −１８ の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
【０１６６】
　リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的又は能動的のいずれかであってもよい。受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスの蛋白質コート（Morishita et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),1993,90,8474 ）、モノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）、糖、糖脂質又は蛋白質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、又は天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げる事ができる。標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子又はその適切なオリゴペプチドフラグメント、又は（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、又はその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ ；Ｆ （ａｂ'）2 ）、であり得る。２種又はそれ以上の生物活性剤（例えば、一般式（I）で示される化合物又はその塩とその他の薬剤）は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。内容物の細胞内安定性及び／又は標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
【０１６７】
　その使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１mg（好適には、３０mg）、上限２０００mg（好適には、１５００mg）を、静脈内投与の場合には、１回当り下限０．５mg（好適には、５mg）、上限５００mg（好適には、２５０mg）を成人に対して、１日当り１乃至６回症状にに応じて投与することが望ましい。
【０１６８】
　以下、実施例、参考例及び製剤例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが本発明はこれらの実施例に制限されない。
【実施例】
【０１６９】
　（実施例１）
　HO−Ce2−Ce2−Ce2−Ae2−Ae2−Gm−Ae2−Ce2−As−Gs−Cs−As−Gs−Ae2−Ae2−Ae2−Gm−Te2−Te2−Ce2−Ae2−Te2t−Hの合成
ＶＥＧＦ遺伝子に対するアンチセンス効果を有するオリゴヌクレオチドとしてＶＥＧＦ配列（GenBank Accetion番号AF022375.1、配列表の配列番号：２）のヌクレオチド番号702〜723の相補鎖の塩基配列からなるアンチセンス化合物を合成した。
【０１７０】
　核酸合成機（パーキンエルマー社製 ABI model392 DNA/RNA synthesizer）を用い、1.0μmolスケールで行った。各合成サイクルにおける溶媒、試薬、ホスホロアミダイトの濃度は天然オリゴヌクレオチド合成の場合と同じであり、溶媒、試薬、天然型ヌクレオシドのホスホロアミダイトはPE Biosystems社製のものを用いた。非天然型のホスホロアミダイトは特開２０００−２９７０９７の実施例５（5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−4−N−ベンゾイルシチジン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、実施例９（5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−5−メチルウリジン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、実施例１４(5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−6−N−ベンゾイルアデノシン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、の化合物または、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−メチル−2−N−イソブチリルフェノキシアセチルグアノシン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト（ファルマシア社製）を用いた。また硫化反応はGlen Research社のsulfurizing reagentを1g / 100mlの濃度で用いた。参考例１の化合物（1.0μmol）を固相担体として用い、ＤＭＴｒ基をトリクロロ酢酸によって脱保護し、その5'−水酸基に天然型ホスホロアミダイトユニット及び非天然型ホスホロアミダイトユニットを用いて縮合反応を繰り返し行ない、表記の化合物を合成した。
合成サイクルは以下の通りである。
【０１７１】
　合成サイクル
1) detritylation トリクロロ酢酸/ジクロロメタン；85sec
2) coupling ホスホロアミダイト(25eq)、テトラゾール/アセトニトリル； 10乃至20min
3) capping 1−メチルイミダゾール/テトラヒドロフラン、無水酢酸/ピリジン/テトラヒドロフラン；15sec
4) sulfurization 硫化反応試薬；5min（×2）(As, GS, CS, TSを縮合させる合成サイクル時)
　または、oxidation ヨウ素/水/ピリジン/テトラヒドロフラン；15sec （Ap, Gp, Cp, Tp, Ae2, Ge2, Ce2, Te2, Gmを縮合させる合成サイクル時）
固相担体として、修飾されたコントロールポアグラス（CPG）（特開平７−８７９８２の実施例１２ｂに記載）１μmol分を用い、DNA合成機を用いて表記化合物を得た。
【０１７２】
　目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を5'−DMTｒ基をつけたまま合成した後、濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。溶媒を減圧下留去し、残った残渣を逆相ＨＰＬＣ（島津製作所製LC−10VP；カラム（GLサイエンス Inertsil Prep−ODS(20×250mm)）；0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH7；32.5%→60%CH3CN(30min, linear gradient)；40℃；10ml/min；254nm）にて精製し、9.0分に溶出する分画を集めた。溶媒を減圧下留去した後、８０％酢酸水を加え30分放置しDMTr基を除去した。溶媒を留去した後、H2O 約５ｍｌを加え、水層を酢酸エチル約５ｍｌで３回洗浄し、水溶媒留去後目的化合物を得た。
【０１７３】
　本化合物はイオン交換HPLC(カラム（Tosoh TSKgel DEAE−2SW(4.6×250mm)）； A液：20% CH3CN, B液：67mM リン酸バッファー(pH6.8), 1.5M NaCl； gradient：B液20→80% (20min, linear gradient)； 60℃；1ml/min)で分析すると13.8分に溶出された。（144 A260 units）（λmax(H2O) = 260nm）
　本化合物の塩基配列は、以下の通りである。
【０１７４】
5'− cccaagacagcagaaagttcat −3'　（配列表の配列番号：３）
本化合物を化合物ａと命名した。
【０１７５】
　（実施例２）ミスマッチ化合物の合成
化合物ａの塩基配列に対して８つのミスマッチ配列を有する以下の化合物を合成した。
HO−Ce2−Ce2−Ae2−Ae2−Ce2−Gm−Te2−Ce2−As−Gs−As−Cs−Gs−Ae2−Ae2−Ce2−Gm−Ae2−Te2−Ae2−Ae2−Te2t−H
化合物の合成および精製は実施例１に記載の方法に従って行なった。
【０１７６】
　目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を5'−DMTｒ基まで外した状態で合成した後、濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。溶媒を減圧下留去し、残った残渣を逆相ＨＰＬＣ（島津製作所製LC−10VP；カラム（GLサイエンス Inertsil Prep−ODS(20×250mm)）；0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH7； 11%→25%CH3CN(30min, linear gradient)；40℃；10ml/min；254nm）にて精製し、14.1分に溶出する分画を集めた。本化合物はイオン交換HPLC(カラム（Tosoh TSKgel DEAE−2SW(4.6×250mm)）； A液：20% CH3CN, B液：67mM リン酸バッファー(pH6.8), 1.5M NaCl； gradient：B液20→80% (20min, linear gradient)； 60℃；1ml/min)で分析すると14.0分に溶出された。（39 A260 units）（λmax(H2O) = 259nm）
　本化合物の塩基配列は、以下の通りである。
【０１７７】
5'−ccaacgtcagacgaacgataat−3'　（配列表の配列番号：４）
本化合物を化合物ｂと命名した。
【０１７８】
　（実施例３）相同性検索
化合物ａの塩基配列（配列表の配列番号：３）と類似した相補的配列を有する遺伝子のmRNAを見出すために、化合物ａ塩基配列データをコンピューターに入力し、TimeLogic社（米国）製のDecypherシステムを用いてGenBankヒト遺伝子データベース（ｈｓ・ｆｎａ）を対象にしてBLASTプログラムを用いた相同性（ホモロジー）検索を行った（パラメータ条件 Expectation ： 10 ； Extension threshold ： 11 ； Word size ： 11 ； Nucleic Match ： 1 ； Nucleic Mismatch ： −1 or -3 ； Gapped Alignments ： On ； Gap Oopen Penalty ： 5 ； Gap ExtensionPenalty ： 2 ； Reporting Threshold ： 1 ； Show GI numbers ： On）。その結果、化合物ａの塩基配列の相補鎖と類似した塩基配列を内在し、化合物ａと結合しうる13の候補遺伝子を見出した(表１)。なお、以下の表中ではトランスクリプション　バリアント（transcript variant）についても記載しているが、遺伝子の数としては、トランスクリプション　バリアントが複数でも１つの遺伝子として解析した。
【０１７９】
　（表１）
2004129650.tif 000017
　なお、表１の中でデータベース上で機能不明な推定蛋白質（hypothetical protein）及びゲノム配列を除いたExpectation Scoreが4.9以上の１０遺伝子(表２)を解析した。
【０１８０】
　（表２）
2004129650.tif 000018
　また、ClustalWを用いて、Genebankヒト遺伝子データベースから類似配列を含む遺伝子を検索し（パラメータ条件はKtuple size：2、Window size：4、Pairwise gap penalty：5、Gap opening penalty：15、Gap extension penalty：6.66、Weight matrix：IUB、Gap separation distance：8、End gaps：OFF、Transition weight：0.5、Top diagonals：5、Score： PERCENTAGEで行なった。）、スコア77以上の100遺伝子(表３)を抽出した。
【０１８１】
　（表３）
2004129650.tif 000019
2004129650.tif 000020
　なお、抽出した約100遺伝子のうち、データベース上で機能不明な推定蛋白質（hypothetical protein）とゲノム配列を除外したスコア88以上の10遺伝子、及び、スコア77以上の遺伝子群のうち９つの連続した塩基配列が完全に相補である２遺伝子、の合計１２遺伝子を選択した（表４）。
【０１８２】
　（表４）
2004129650.tif 000021
　（実施例４）化合物ａのVEGF遺伝子以外の遺伝子の発現の変動解析
BLAST検索により出力された１０遺伝子（表２）および、ClustalW検索により出力された遺伝子のうち14遺伝子（表４）についてヒト肺癌細胞株A549細胞における遺伝子発現をRT−PCRにより調べた。
【０１８３】
　その結果、BLAST検索によって出力された１０遺伝子のうち、6遺伝子(表５)について発現が確認できた。また、ClustalW検索により出力された１４遺伝子のうち、７遺伝子について発現が確認できた(表６)。これら合計13遺伝子に関して、未処理細胞群、化合物ａ添加群、化合物ｂ添加群間でのmRNAの発現変動をRT−PCR法により解析した。
【０１８４】
　（表５）
2004129650.tif 000022
　（表６）
2004129650.tif 000023
　ヒト肺癌細胞株A549細胞(ATCC number：CCL−185)を、コラーゲンタイプＩがコートされた１２穴プレート（IWAKI製）上に、0.6×105個 / ウェル / 1ml RPMI1640(GIBCO BRL)（10% Fetal Bovine Serum(Hyclone社)含有）の密度でプレーティングし、一晩37℃、5%CO2下で培養した。各オリゴヌクレオチド−EPEIコンプレックスの調製は、各種オリゴヌクレオチド水溶液(50μM) 20μLおよびEPEI(Gene Tool社製、200μM) 2μLを水178μLに加えすぐに１０秒間ボルテックスし２０分間室温で静置することで要時行なった。検体を添加する直前に各ウェルの細胞培養液を新しい培地（RPMI1640）0.8mlに交換し、そこに要時調製したオリゴヌクレオチド−EPEIコンプレックス200μLを添加した。４時間37℃、5%CO2でインキュベート後、培地をオリゴヌクレオチドを含まないRPMI1640（10% Fetal Bovine Serum含有）1mlと交換し、さらに２０時間インキュベートした。つぎに各ウェルの細胞をtrypsin − EDTA(0.05% Trypsin, 0.53mM EDTA・4Na)（GIBCO BRL）400 μLを用いてプレートから剥がしRPMI1640（10% Fetal Bovine Serum含有）1mlを加えた後、1.5mlエッペンドルフチューブに遠心回収した後、PBS (−) buffer（日水製薬（株））で２回洗浄した。回収した細胞からのtotal mRNAの抽出は、Quick Prep Micro mRNA Purification Kit（アマシャム　ファルマシア　バイオテク（株））を用いてマニュアルどおりに行い、total mRNAを含む水溶液を200μL得た。このうち10μLを用いて Ready−To−Go RT−PCR Beads（アマシャム　ファルマシア　バイオテク（株））を用いて、マニュアルに従いoligo dT(12−18)をプライマーに用いた逆転写反応を行い、total cDNA solution 50μLを得た。これをテンプレートとして、同様にβ−actinのmRNAの増幅を行なった。ハウスキーピング遺伝子であるβ−actinのｍRNA量を内部標準として用いることで、各サンプル中のβ−actin mRNA量が等しくなるように補正した量のテンプレートcDNAを用い、VEGFおよびその他13遺伝子のｍRNAの定量的なPCRによる増幅を行なった。PCR反応の条件を以下に示す。
VEGF (VEGF165 ： AF022375.1, VEGF121 ： E15157.1)
　　primer 1 ： 5'−tgcattggagccttgccttg−3'　（配列表の配列番号：５）
　　primer 2 ： 5'−ctcaccgcctcggcttgt−3'　（配列表の配列番号：６）
　　期待される増幅断片（遺伝子データベース中での塩基配列番号：以下同じ 　724 - 1278 555bp (VEGF165), 1061−1483, 445bp (VEGF121)
phospholipase C, beta4 (PLCβ4) (NM_000933.1) 
　　primer 3 ： 5'− aatgcccacgagcagcaaac −3'　（配列表の配列番号：７）
　　primer 4 ： 5'− ccatctcggcttccaatttcacc −3'　（配列表の配列番号：８）
　　期待される増幅断片 ： 2937 - 3273 (337bp)
polymerase iota (POLI) (NM_007195.1) 
　　primer 5 ： 5'− ctgccaaatgtcttgaagcactgg −3'　（配列表の配列番号：９）
　　primer 6 ： 5'− tagggcactgacgactctcacg −3'　（配列表の配列番号：１０）
　　期待される増幅断片 ： 801 - 1154 (354bp)
TATA box binding protein (TBP)−associated factor, RNA polymerase II, C1 (TAF2C1) (NM_003185.1) 
　　primer 7 ： 5'− catctggcaagcagtctacagag −3'　(配列表の配列番号：１１)
　　primer 8 ： 5'− gcacaaggtaaggttgaggtgaag −3'　（配列表の配列番号：１２）
　　期待される増幅断片 ： 1817 - 1957 (141bp)
transducin (beta)−like 1 (TBL1) (NM_005647.1) 
　　primer 9 ： 5'− tttccttttcattcagcccctgccc −3'　（配列表の配列番号：１３）
　　primer 10 ： 5'− ccgtagaatcaaacgaagcacttgcc −3'　（配列表の配列番号：１４）
　　期待される増幅断片 ： 1745 - 2105 (361bp)
cell division cycle 25B (CDC25B) (NM_021872.1, 021873.1, 402187.1) 
　　primer 11 ： 5'− tcacgatgagatcgagaacctcc −3'　（配列表の配列番号：１５）
　　primer 12 ： 5'− cccacgctcagatgagaattcac −3'　（配列表の配列番号：１６）
　　期待される増幅断片 ： 1416 - 1767 (352bp)
signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) (NM_007315.1)
　　primer 13 ： 5'− atctccaacgtcagccagctcc −3'　（配列表の配列番号：１７）
　　primer 14 ： 5'− tgatgaagcccatgatgcaccc −3'　（配列表の配列番号：１８）
　　期待される増幅断片 ： 1568 - 1943 (376bp)
Rab escort protein 1 (NM_000390.1) 
　　primer 15 ： 5'− tgacagtgccagcagaggaac −3'　（配列表の配列番号：１９）
　　primer 16 ： 5'− gggccagagcagacataaacg −3'　（配列表の配列番号：２０）
　　期待される増幅断片 ： 1454 - 1763 (310bp)
tubby super−family protein (TUSP) (NM_020245.2)
　　primer 17 ： 5'− ctctgccatgttacacggtcttc −3'　（配列表の配列番号：２１）
　　primer 18 ： 5'− tcttagaaccctacccctcccc −3'　（配列表の配列番号：２２）
　　期待される増幅断片 ： 10124 - 10497 (374bp)
deoxyguanosine kinase (DGUOK) (NM_001929.1)
　　primer 19 ： 5'− cgaaaacttacccagaatggcacg −3'　（配列表の配列番号：２３）
　　primer 20 ： 5'− cccacaggagaaaagaatgccag −3'　（配列表の配列番号：２４）
　　期待される増幅断片 ： 136 - 495 (360bp)
nuclear receptor subfamily 2, group C, member 1 (NR2C1) (NM_003297.1)
　　primer 21 ： 5'− cctgatctgtctgcacaacacc −3'　（配列表の配列番号：２５）
　　primer 22 ： 5'− tgaagcggcacagttggaag −3'　(配列表の配列番号：２６)
　　期待される増幅断片 ： 315 - 665 (351bp)
E74−like factor 2 (ELF2) (NM_006874.1)
　　primer 23 ： 5'− tccaacaacagcgacctctcc −3'　（配列表の配列番号：２７）
　　primer 24 ： 5'− tgccactgcttccgatttaacc −3'　（配列表の配列番号：２８）
　　期待される増幅断片 ： 1213 - 1564 (352bp)
v−raf−1 murine leukemia viral oncogene homolog 1 (RAF1) (NM_002880.1)
　　primer 25 ： 5'− ccacttttctgctccctttctcc −3'　（配列表の配列番号：２９）
　　primer 26 ： 5'− actgcctgctaccttacttcctc −3'　（配列表の配列番号：３０）
　　期待される増幅断片 ： 2131 - 2433 (303bp)
glucose regulated protein, 58kD (GRP58) (NM_005313.1)
　　primer 27 ： 5'− ttttatgccccttggtgtggtc −3'　（配列表の配列番号：３１）
　　primer 28 ： 5'− tcctcctgtgccttcttcttcttc −3'　（配列表の配列番号：３２）
　　期待される増幅断片 ： 1201 - 1511 (311bp)
　酵素： Takara Taq premix (宝酒造)
反応条件： 95℃ (15 sec), 55℃ (30 sec), 72℃ (30 sec)
サイクル数：VEGF： 30回、PLC β4 ： 27回、POLI： 30回、TAF2C1： 30回、TBL1： 27回、CDC25B： 25回、STAT1： 21回、Rab escort protein 1 ： 28回、TUSP ： 28回、DGUOK ： 28回、NR2C1 ： 26回、ELF2 ： 28回、RAF1 ： 28回、GRP58 ： 26回
　得られた各PCR産物は、10%アクリルアミドゲル電気泳動（１x TBE溶液（0.89Mトリス、ホウ酸、EDTA溶液 (pH8.3、宝酒造製)240V、30分）を行ない、分子量マーカーとして100bp DNA Ladder (宝酒造)を用い、SYBR Green I (FMC社)を用いてPCR産物を蛍光染色し、蛍光イメージアナライザー（モレキュラーイメージャーFX（Bio−Rad社））にてPCR産物を可視化し、産物量を定量した。可視化し、そのイメージの白黒を反転した結果を図４に示す。化合物ｂ添加では見られなかったVEGFの発現抑制が、化合物ａ添加によって観察された。また、発現を調べた13遺伝子のうち、3遺伝子（CDC25B, STAT1, NR2C1）において、化合物ｂを添加した場合に比べて化合物ａを添加した場合に顕著な発現抑制が観察された。
【０１８５】
　（実施例５）オリゴヌクレオチドの設計（１）
１．　実施例４の結果に基づいて、オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さを短くするという方針の下に以下のような化合物の設計を行なった。本化合物は配列表の配列番号２のヌクレオチド番号705〜723の塩基配列の相補鎖に相当する。
HO−Ce2−Ce2−Ce2−Ae2−Ae2−Gm−Ae2−Ce2−Ap−Gp−Cp−Ap−Gp−Ae2−Ae2−Ae2−Gm−Te2−Te2−E−Hの合成
実施例１と同様の方法に従って、DNA合成機を用いて表記化合物を得た。
【０１８６】
　目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を5'−DMTｒ基をつけたまま合成した後、濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。溶媒を減圧下留去し、残った残渣を逆相ＨＰＬＣ（ギルソン社model 305；カラム（アプライドバイオシステムズジャパン Poros R3 (4.6×100mm)）を用いて、流液条件（A液：0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA)(pH 7)、B液：100%アセトニトリル溶液、C液：２％トリフルオロ酢酸水溶液、0min→5min（A液95%→90%, B液5%→10%, C液0%）、5min→10min（A液95%, B液5%, C液0%）、10min→15min（A液100%→0%, B液0%, C液0%→100%）、15min→19min（A液0%→100%, B液0%, C液100%→0%）、19min→24min（A液100%→68%, B液0%→32%, C液0%）；40℃；10ml/min；検出254nm）にて精製し、22分から26分の間に検出されるピーク分画を集め、5'−DMTｒ基の除去された粗精製物を得た。溶媒を減圧下留去した後、残った残渣を逆相ＨＰＬＣ（島津製作所製LC−10VP；カラム（Merck chromolith RP−18e(4.6×100mm)）；0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH7； 6%→15%CH3CN(15min, linear gradient)；60℃；2ml/min）にて再精製し、9.0−10.0分に溶出する分画を集めた。本化合物は逆相HPLC(島津製作所製LC−10VP；カラム（Merck chromolith RP−18e(4.6×100mm)）；0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH7； 6%→15%CH3CN(10min, linear gradient)；60℃；2ml/min)で分析すると7.90分に溶出された。（151nmol）（λmax(H2O) = 257nm）
　本化合物の塩基配列は、以下の通りである。
【０１８７】
5'− cccaagacagcagaaagtt −3'　（配列表の配列番号：３３）
本化合物を化合物ｃと命名した。
【０１８８】
　２．　実施例４の結果に基づいて、オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さを短くするという方針の下に以下のような化合物の設計を行なった。本化合物は配列表の配列番号２のヌクレオチド番号702〜720の塩基配列の相補鎖に相当する。
HO−Ae2−Ae2−Gm−Ae2−Ce2−As−Gs−Cs−As−Gs−Ae2−Ae2−Ae2−Gm−Te2−Te2−Ce2−Ae2−Te2−E−H
　化合物の合成および精製は１．と同様の方法によって行なった。本化合物は逆相HPLC(島津製作所製LC−10VP；カラム（Merck chromolith RP−18e(4.6×100mm)）；0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH7； 6%→15%CH3CN(10min, linear gradient)；60℃；2ml/min)で分析すると8.70分に溶出された。（176 nmol）（λmax(H2O) = 258nm）
　本化合物の塩基配列は、以下の通りである。
【０１８９】
5'− aagacagcagaaagttcat −3'　（配列表の配列番号：３４）
本化合物を化合物ｄと命名した。
【０１９０】
　３．実施例４の結果に基づいて、オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さを短くするという方針の下に以下のような化合物の設計を行なった。本化合物は配列表の配列番号２のヌクレオチド番号702〜718の塩基配列の相補鎖に相当する。
HO−Ce2−Ce2−Ce2−Ae2−Ae2−Gm−Ae2−Ce2−Ap−Gp−Cp−Ap−Gp−Ae2−Ae2−Ae2−Gm−E−H
　化合物の合成および精製は１．と同様の方法によって行なった。
で分析すると7.29分に溶出された。（146 nmol）（λmax(H2O) = 256nm）
本化合物の塩基配列は、以下の通りである。
5'− cccaagacagcagaaag −3'　（配列表の配列番号：３５）
本化合物を化合物ｅと命名した。
【０１９１】
　４．　実施例４の結果に基づいて、オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さを短くするという方針の下に以下のような化合物の設計を行なった。本化合物は配列表の配列番号２のヌクレオチド番号705〜720の塩基配列の相補鎖に相当する。
HO− Ae2−Ae2−Gm−Ae2−Ce2−Ap−Gp−Cp−Ap−Gp−Ae2−Ae2−Ae2−Gm−Te2−Te2−E−H
　化合物の合成および精製は１．と同様の方法によって行なった。
本化合物の塩基配列は、以下の通りである。本化合物は逆相HPLC(島津製作所製LC−10VP；カラム（Merck chromolith RP−18e(4.6×100mm)）；0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH7； 6%→15%CH3CN(10min, linear gradient)；60℃；2ml/min)で分析すると8.57分に溶出された。（135 nmol）（λmax(H2O) = 257nm）
5'− aagacagcagaaagtt −3'　（配列表の配列番号：３６）
本化合物を化合物fと命名した。
【０１９２】
　（実施例６）遺伝子発現抑制効果の測定
　化合物ａ、化合物ｃ、化合物ｄ、化合物ｅ及び化合物ｆの遺伝子発現抑制効果を調べた。
【０１９３】
　VEGFおよび実施例３で発現変動が見られたCDC25B, STAT1, NR2C1の計４遺伝子について、未処理細胞群、化合物ａ、化合物ｃ、化合物ｄ、化合物ｅ及び化合物ｆ添加群でのmRNAの発現量をRT−PCR法で解析した。
【０１９４】
　実施例４と同様の方法でA549細胞に化合物ａ、化合物ｃ、化合物ｄ、化合物ｅ及び化合物ｆをそれぞれ添加し、24時間後にmRNAを抽出した。各cDNAの量はβ−actin mRNAを定量することで補正した。実施例４と同じ条件で同じプライマーを用いてRT−PCRを行い、ＶＥＧＦ、ＮＲ２Ｃ１、ＳＴＡＴ１及びＣＤＣ２５Ｂ遺伝子の発現量を測定した（図５）。
【０１９５】
　ＶＥＧＦ遺伝子の発現の抑制活性は化合物ａ、化合物ｃ及び化合物ｄに認められ、発現抑制活性の強さは化合物ａが最も強く、化合物ｃでは化合物ａの約半分の発現抑制活性を示した。発現抑制活性の強さはmRNAと相補的な化合物の配列数に応じていた。
【０１９６】
　NR2C1遺伝子の発現抑制活性は化合物ａ及び化合物ｄ添加群で認められ、いずれもＮＲ２Ｃ１の発現量を２０％以下に低下させた。化合物ｄは、化合物ａと比べて、NR2C1 mRNAと相補的でない5’側を短くした配列なので、発現抑制活性に影響を与えなかったと考えられた。化合物ｃ、化合物ｅ及び化合物ｆではNR2C1 mRNAと相補的な3’側配列が3mer以上短くなっているため、mRNAとの親和性が低下し、抑制活性をほとんど示さなくすることができた。
【０１９７】
　STAT1遺伝子の発現抑制活性は、化合物ａ及び化合物ｄで同程度認められた。化合物ｄは化合物ａのSTAT1 mRNAと相補的でない5’側を短くしたに過ぎなかったので、化合物ａと同程度の抑制活性を示したと考えられた。化合物ｃ、化合物ｅ及び化合物ｆでは、STAT1 mRNAと相補的な3’側配列が化合物ａに比べ2mer以上短くなっているため、mRNAとの親和性が低下し、化合物ａ及び化合物ｄに比べ低い発現抑制活性になっていると考えられた。
【０１９８】
　CDC25B遺伝子の発現抑制活性は化合物ａにおいてのみ認められた。化合物ｃ、化合物ｄ、化合物ｅ及び化合物ｆではＣＤＣ２５Ｂ遺伝子の3’, 5’側どちらにおいても相補的な配列を1mer以上失うことに成ったことがその理由であると考えられた。
【０１９９】
　以上の結果より、化合物ｃ、化合物ｄ、化合物ｅ及び化合物ｆの中で、化合物ｃが、VEGFに対する発現抑制活性を有し、かつ非ターゲット遺伝子であるNR2C1, STAT1, CDC25Bに対する抑制活性をほとんど持たない性質をもつアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが分かった。
【０２００】
　（実施例７）オリゴヌクレオチドの設計（２）
　１．アンチセンス化合物の再設計
　オリゴヌクレオチドの塩基配列をターゲット遺伝子中の３’側に３mer移動した以下のような化合物の設計を行なった。本化合物は配列表の配列番号２のヌクレオチド番号705〜726の塩基配列の相補鎖に相当する。
HO−Gm−Ce2−Ae2−Ce2−Ce2−Ce2−Ae2−Ae2−Gm−Ae2−Ce2−As−Gs−Cs−As−Gs−Ae2−Ae2−Ae2−Gm−Te2−Te2−E−H
　化合物の合成及び精製は実施例５の１．と同様の方法によって行なう。
本化合物は以下の塩基配列からなる。
5’−gcacccaagacagcagaaagtt−3’（配列表の配列番号：３７）
本化合物を化合物ｇと命名した。
【０２０１】
　２．相同性検索
　化合物ｇの塩基配列と類似した相補的配列を有するｍＲＮＡを見出すために実施例３に記載の方法に基づいてGenBankヒト遺伝子データベースを対象にしてＢＬＡＳＴプログラムを用いた相同性検索を行なった。パラメータ条件は実施例３と同じにした。その結果相同性の高い遺伝子としてHomo sapiens hypothetical protein FLJ13993 (FLJ13993), mRNA. (Genbank accession No. NM_024695)
Homo sapiens solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, GABA), member 13 (SLC6A13), mRNA. (Genbank accession No. NM_016615)
を得ることができた。また、実施例3に記載の条件でClustalW解析を行ない、３遺伝子を見出した（表７）。
【０２０２】
　（表７）
2004129650.tif 000024
　化合物ｇを添加した細胞において上記遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲで測定することで化合物ｇのこれらの遺伝子の発現量に及ぼす影響を測定することができる。
【０２０３】
　上記オリゴヌクレオチドを用いて、変動が見られた3遺伝子（STAT1, NR2C1, CDC25B）および上記５遺伝子における発現変動をＲＴ−ＰＣＲで測定する。
【０２０４】
　（参考例１）CPG担体結合化合物の合成
【０２０５】
【化１６】
2004129650.tif 000025
　特開２０００−２９７０９７の実施例８の化合物2’−O,4’−C−エチレン−5’−O−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（５８０ｍｇ、０．９８８ｍｍｏｌ）を窒素気流下、無水ピリジン（１０ｍｌ）に溶かし、コハク酸無水物（１７８ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）、4−ジメチルアミノピリジン（２１７ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下留去し、残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し（ジクロロメタン：メタノール＝２５：２）、無色アモルファス状化合物（５８０ｍｇ、０．８４４mmol、収率８５％）を得た。このうち５１５ｍｇを無水ジメチルホルムアミド（６ｍｌ）に溶かし、ペンタクロロフェノール（３３０ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２３１ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。析出物をろ過後、ろ液を減圧下濃縮し、ベンゼンを加え析出物を再度ろ過した。ろ液を減圧下濃縮し、無水ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）を加え、そこにトリエチルアミン（２８０μｌ、２．０ｍｍｏｌ）、ロングチェーンアルキルアミノグラス（５００Å、粒子サイズ：１２０/２００メッシュ）（ＣＰＧ Ｉｎｃ製）（６ｇ）を加え、６０℃、８時間、さらに室温で７２時間放置した。ＣＰＧをろ過し、さらにジクロロメタンで洗浄した後、ＣＰＧにアプライドバイオシステムズ社ＤＮＡ合成機ＡＢＩ３９２用キャッピング試薬２種（無水酢酸/ピリジン/テトラヒドロフラン）（１‐メチルイミダゾール/テトラヒドロフラン）をそれぞれ２０ｍｌ加え、１０分放置した。ＣＰＧをろ過し、ピリジン、ジクロロメタンの順に洗浄し、減圧乾燥し、目的物（約６ｇ、ジメトキシトリチル基の導入量＝62μｍｏｌ/ｇ）を得た。
【０２０６】
　（製剤例）
　（製剤例１）ソフトカプセル剤
消化性油状物、例えば、大豆油、綿実油又はオリーブ油中に入れた、実施例１の化合物の混合物を調製し、正置換ポンプでゼラチン中に注入して、100 mgの活性成分を含有するソフトカプセルを得、洗浄後、乾燥する。
【０２０７】
　（製剤例２）錠剤
　常法に従って、100 mgの実施例２の化合物、0.2 mgのコロイド性二酸化珪素、5 mgのステアリン酸マグネシウム、275 mgの微結晶性セルロース、11 mg のデンプン及び98.8 mg のラクトースを用いて製造する。
【０２０８】
　尚、所望により、剤皮を塗布する。
【０２０９】
　（製剤例３）懸濁剤
　5 ml中に、100 mgの実施例１の化合物、100 mgのナトリウムカルボキシ基メチルセルロ−ス、5 mgの安息香酸ナトリウム、1.0 g のソルビトール溶液 (日本薬局方) 及び0.025 mlのバニリンを含有するように製造する。
【０２１０】
　（製剤例４）注射剤
　1.5 重量% の実施例２の化合物を、10容量% のプロピレングリコール中で撹拌し、次いで、注射用水で一定容量にした後、滅菌して製造した。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】相同性検索コンピュータシステム図
【図２】ターゲット遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計概念図i)
【図３】ターゲット遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計概念図ii)
【図４】化合物ａ及びｂの遺伝子発現抑制効果図
【図５】化合物ａ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆの遺伝子発現抑制効果の図
【配列表フリーテキスト】
【０２１２】
配列番号１：　VEGF165に対するアンチセンス化合物の塩基配列
配列番号３：　化合物ａ
配列番号４：　化合物ｂ
配列番号５：　ＶＥＧＦ１６５用PCRセンスプライマー
配列番号６：　ＶＥＧＦ１６５用PCRアンチセンスプライマー
配列番号７：　phospholipase C, beta4用PCRセンスプライマー
配列番号８：　phospholipase C, beta4用PCRアンチセンスプライマー
配列番号９：　polymerase iota用PCRセンスプライマー 
配列番号１０：　polymerase iota用PCRアンチセンスプライマー
配列番号１１：　TATA box binding protein (TBP)−associated factor, RNA polymerase II, C1用PCRセンスプライマー
配列番号１２：　TATA box binding protein (TBP)−associated factor, RNA polymerase II, C1用PCRアンチセンスプライマー
配列番号１３：　transducin (beta)−like 1用PCRセンスプライマー
配列番号１４：　transducin (beta)−like 1用PCRアンチセンスプライマー
配列番号１５：　cell division cycle 25B用PCRセンスプライマー
配列番号１６：　cell division cycle 25B用PCRアンチセンスプライマー
配列番号１７：　signal transducer and activator of transcription 1用PCRセンスプライマー
配列番号１８：　signal transducer and activator of transcription 1用PCRアンチセンスプライマー
配列番号１９：　Rab escort protein 1用PCRセンスプライマー
配列番号２０：　Rab escort protein 1用PCRアンチセンスプライマー
配列番号２１：　tubby super−family protein用PCRセンスプライマー
配列番号２２：　tubby super−family protein用PCRアンチセンスプライマーｂ
配列番号２３：　deoxyguanosine kinase用PCRセンスプライマー
配列番号２４：　deoxyguanosine kinase用PCRアンチセンスプライマー
配列番号２５：　nuclear receptor subfamily 2, group C, member 1用PCRセンスプライマー
配列番号２６：　nuclear receptor subfamily 2, group C, member 1用PCRアンチセンスプライマー
配列番号２７：　E74−like factor 2用PCRセンスプライマー
配列番号２８：　E74−like factor 2用PCRアンチセンスプライマー
配列番号２９：　v−raf−1 murine leukemia viral oncogene homolog 1用PCRセンスプライマー
配列番号３０：　v−raf−1 murine leukemia viral oncogene homolog 1用PCRアンチセンスプライマー
配列番号３１：　glucose regulated protein, 58kD用PCRセンスプライマー
配列番号３２：　glucose regulated protein, 58kD用PCRアンチセンスプライマー
配列番号３３：　化合物ｃ
配列番号３４：　化合物ｄ
配列番号３５：　化合物ｅ
配列番号３６：　化合物ｆ
配列番号３７：　化合物ｇ
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2004129650000001.app