(57)【要約】【課題】プローブの設計が容易で、同一条件下で複数の塩基多型を精度よく検出できるプローブと、そのプローブを使った塩基多型検出方法を提供すること。【解決手段】検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも１つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から５’側または３’側に３核酸残基から１００核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも１つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成される塩基多型検出プローブ。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも１つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から５’側または３’側に３核酸残基から１００核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも１つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成される塩基多型検出プローブ。
【請求項２】
検出プローブ用オリゴヌクレオチドが３から９残基のオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の塩基多型検出プローブ。
【請求項３】
スペーサーがイノシンを含む、請求項１に記載の塩基多型検出プローブ。
【請求項４】
スペーサーがイノシンの重合体である、請求項１に記載の塩基多型検出プローブ。
【請求項５】
スペーサーが２から７残基のイノシンの重合体である、請求項４に記載の塩基多型検出プローブ。
【請求項６】
スペーサーが、少なくとも１種類以上の核酸誘導体およびその重合体を含む、請求項１に記載の塩基多型検出プローブ。
【請求項７】
スペーサーが２から７残基の核酸誘導体の重合体である、請求項６に記載の塩基多型検出プローブ。
【請求項８】
標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドが１５から１００残基のオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の塩基多型検出プローブ。
【請求項９】
配列番号３２から９１の何れかに記載の塩基配列を有する、請求項１に記載の塩基多型検出プローブ。
【請求項１０】
ＡＢＯ式血液型判定のために用いる、請求項９に記載の塩基多型検出プローブ。
【請求項１１】
検体核酸中の標的核酸の塩基多型を検出する方法であって、（ａ）検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも１つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から５’側または３’側に３核酸残基から１００核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも１つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成される塩基多型検出プローブを、検体核酸とハイブリダイズさせる工程；及び、
（ｂ）検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成の有無により塩基多型を検出する工程；
を含む、上記の方法。
【請求項１２】
検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成を、検出プローブ用オリゴヌクレオチドをプライマーとした核酸伸長反応により検出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸合成酵素にて核酸伸長反応を行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
核酸伸長反応時に標識ヌクレオチドを基質に加え、核酸伸張の有無を標識ヌクレオチドにて検出する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
核酸伸長反応時に発生するピロリン酸を検出して核酸伸長の有無を検出する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
核酸伸長反応にて生じた二本鎖核酸をインターカレーターを用いて検出する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成をＦＲＥＴ法にて検出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号３２から９１の何れかに記載の塩基配列を有する請求項１に記載の塩基多型検出プローブを用いる、ＡＢＯ式血液型判定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、塩基多型検出プローブとそれを用いた塩基多型検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒトゲノム解析が急速に進展し、その成果であるゲノム情報を医療の質的改善に結びつけようという試みが活発になってきている。一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ｓ）、ＳＮＰ（ｓ））のデータが整備されれば、薬効の個人差を識別し、患者毎に至適薬物と投与量を決定する、いわゆるオーダーメード医療が可能になると期待されている。このようなＳＮＰを利用したオーダーメード医療を実現するためには、迅速、正確、かつ安価なＳＮＰタイピング技術の開発が不可欠である。ここでいうＳＮＰタイピング技術とは、ゲノムの抽出・精製、核酸増幅、塩基配列の解析など検体の処理から検査結果のアウトプットに至るまでのすべての技術を意味する。一方、感染症の治療に際しては、感染ウィルスや感染起炎菌のゲノタイプ判定結果をもとに、治療法や薬剤を選択することが既に進められており、治療効果や医療費の軽減に寄与している。このようなヒトゲノム上の一塩基多型や、ウィルスや感染起炎菌のゲノタイプや変異を検出する方法が数多く報告されている。
【０００３】
日本特許第２８５３８６４号（特許文献１）には、塩基多型に相当するヌクレオチドを３’末端に導入したプライマーにて伸長反応を行い、その伸長産物の有無で変異ヌクレオチドを検出する方法が述べられている。３’末端が非相補的な配列のプライマーにおいても伸長産物が生じる場合には、試料ＤＮＡとプライマーとの結合性を減少させるためプライマー中に故意に１つ又はそれ以上のミスマッチを導入したプライマーから伸長させることにより、この非特異的伸長を避けることができると記載されている。
【０００４】
日本特許第２８５３８６４号に類似した方法として、欧州特許ＥＰ０３３２４３５号（特許文献２）が開示されている。この方法では、３’末端にＳＮＰサイトを導入したＤＮＡプローブをプライマーとして核酸伸張反応を行い、ＤＮＡプローブ中のＳＮＰの塩基がターゲットＤＮＡの塩基配列と相補的である場合は核酸伸張反応が起こり、ＳＮＰの塩基がターゲットＤＮＡと相補的でない場合には核酸伸張反応が起こらず、この核酸伸張産物の有無からＳＮＰサイトの塩基を決定する方法を示している。３’末端から１、２又は３塩基のところに人為的にミスマッチを導入した変異検出ＤＮＡプローブにて、プローブの３’末端のＳＮＰを検出すると、良好な結果が得られたことが記載されている。また、これを応用した方法も考案されている。例えば、ＰＣＲ反応時のプライマーの一方にこのプローブを使用すると、このプローブの塩基配列が検体の核酸配列と相補的である場合はＰＣＲによる増幅が起こり、相補的でない場合は増幅は起こらないことから、ＰＣＲ増幅産物の有無を判定することにより塩基多型を決定することができる。
【０００５】
しかしながら、これら日本特許第２８５３８６４号と欧州特許ＥＰ０３３２４３５号に使用されているプライマーを使った一塩基変異の検出では、プライマーの３’末端付近の配列が標的核酸の配列と完全に一致しなくても非特異的な核酸伸長反応がしばしば起こることが確認されている。また、ＰＣＲにおけるプライマーとテンプレートＤＮＡのアニーリング温度は、使用するプライマーの塩基配列に依存するため、複数の塩基多型の検出を同一のＰＣＲ条件下で行うことが困難である。つまり、プライマーとテンプレートＤＮＡのアニーリング温度や変性温度のプライマー配列への依存度が低く、かつ、塩基多型検出の精度の高い塩基多型の検出法が求められている。
【０００６】
【特許文献１】
日本特許第２８５３８６４号
【０００７】
【特許文献２】
欧州特許ＥＰ０３３２４３５号
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、プローブの設計が容易で、同一条件下で複数の塩基多型を精度よく検出できるプローブと、そのプローブを使った塩基多型検出方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく種々検討した結果、塩基多型を検出するプローブの設計と、そのプローブを使った塩基多型検出法の開発に成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１０】
（１）　検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも１つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から５’側または３’側に３核酸残基から１００核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも１つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成される塩基多型検出プローブ。
【００１１】
（２）　検出プローブ用オリゴヌクレオチドが３から９残基のオリゴヌクレオチドである、（１）に記載の塩基多型検出プローブ。
（３）　スペーサーがイノシンを含む、（１）に記載の塩基多型検出プローブ。
（４）　スペーサーがイノシンの重合体である、（１）に記載の塩基多型検出プローブ。
（５）　スペーサーが２から７残基のイノシンの重合体である、（４）に記載の塩基多型検出プローブ。
【００１２】
（６）　スペーサーが、少なくとも１種類以上の核酸誘導体およびその重合体を含む、（１）に記載の塩基多型検出プローブ。
（７）　スペーサーが２から７残基の核酸誘導体の重合体である、（６）に記載の塩基多型検出プローブ。
（８）　標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドが１５から１００残基のオリゴヌクレオチドである、（１）に記載の塩基多型検出プローブ。
（９）　配列番号３２から９１の何れかに記載の塩基配列を有する、（１）に記載の塩基多型検出プローブ。
（１０）　ＡＢＯ式血液型判定のために用いる、（９）に記載の塩基多型検出プローブ。
【００１３】
（１１）　検体核酸中の標的核酸の塩基多型を検出する方法であって、（ａ）検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも１つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から５’側または３’側に３核酸残基から１００核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも１つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成される塩基多型検出プローブを、検体核酸とハイブリダイズさせる工程；及び、
（ｂ）検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成の有無により塩基多型を検出する工程；
を含む、上記の方法。
【００１４】
（１２）　検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成を、検出プローブ用オリゴヌクレオチドをプライマーとした核酸伸長反応により検出する、（１１）に記載の方法。
（１３）　核酸合成酵素にて核酸伸長反応を行う、（１２）に記載の方法。
（１４）　核酸伸長反応時に標識ヌクレオチドを基質に加え、核酸伸張の有無を標識ヌクレオチドにて検出する、（１２）に記載の方法。
【００１５】
（１５）　核酸伸長反応時に発生するピロリン酸を検出して核酸伸長の有無を検出する、（１２）に記載の方法。
（１６）　核酸伸長反応にて生じた二本鎖核酸をインターカレーターを用いて検出する、（１２）に記載の方法。
（１７）　検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成をＦＲＥＴ法にて検出する、（１１）に記載の方法。
（１８）　配列番号３２から９１の何れかに記載の塩基配列を有する請求項１に記載の塩基多型検出プローブを用いる、ＡＢＯ式血液型判定方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）塩基多型検出プローブ
本発明の塩基多型検出プローブは、検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも１つの検出プローブ用オリゴヌクレオチド、検体核酸中の標的とする塩基多型から５’側または３’側に３核酸残基から１００核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも１つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、並びに上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間に存在するスペーサーから構成されるものである。
【００１７】
本発明において、核酸とは、プリン塩基またはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とし、このリン酸各ヌクレオチド間で糖の３’と５’位炭素の間にジエステル結合をつくって結ばれ重合した長い鎖状のポリヌクレオチドのことを指す。Ｄ−リボースを糖成分とするものをリボ核酸（ＲＮＡ）、Ｄ−２−デオキシリボースを糖成分とするものをデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）という。
【００１８】
本発明において塩基多型とは、核酸配列上に存在する核酸配列の変異や一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ｓ）、ＳＮＰ（ｓ））を意味し、ヌクレオチドの置換や欠失や挿入がある。核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても良く、ＤＮＡを鋳型として転写されたＲＮＡや、ＲＮＡを鋳型として逆転写されたＤＮＡであってもよい。
【００１９】
検体核酸中の標的とする塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも１つの検出プローブ用オリゴヌクレオチドは、標的とする塩基多型部位に特異的なオリゴヌクレオチドである。即ち、塩基多型の野生型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出プローブ用オリゴヌクレオチドは、野生型の核酸配列と二本鎖を形成するが、変異型の核酸配列とは二本鎖を形成しない、または、形成しても安定性が低い。同様に、塩基多型の変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出プローブ用オリゴヌクレオチドは、変異型の核酸配列と二本鎖を形成するが、野生型の核酸配列とは二本鎖を形成しない、または、形成しても安定性が低い。これにより、塩基多型の野生型又は変異型の核酸配列と相補的な核酸配列を有する少なくとも１つの検出プローブ用オリゴヌクレオチドを有する本発明の塩基多型検出プローブを検体核酸とハイブリダイズさせ、検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成の有無により塩基多型を検出することができる。
【００２０】
検体核酸中の標的とする塩基多型から５’側または３’側に３核酸残基から１００核酸残基の領域のいずれかにハイブリダイズする少なくとも１つの標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドは、本発明の塩基多型検出プローブを検体核酸に結合させるためのものである。検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖を形成させる条件下で、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドが標的核酸と二本鎖を形成することができれば、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの長さは特に限定されない。標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドとして、通常の合成オリゴヌクレオチド以外に、例えばヌクレオチドをアミド結合にて重合させたＰＮＡと呼ばれるオリゴヌクレオチド等核酸と二本鎖を形成するものであれば利用可能である。
【００２１】
本発明の塩基多型検出プローブにおいては、上記検出プローブ用オリゴヌクレオチドと上記標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドの間にスペーサーが存在する。
【００２２】
本発明の塩基多型検出プローブにおいて、検出プローブ用オリゴヌクレオチド、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、及びスペーサーの方向は特に限定されず、５’末端から３’末端の方向に、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、スペーサー及び検出プローブ用オリゴヌクレオチドの順に配置されていてもよいし、５’末端から３’末端の方向に、検出プローブ用オリゴヌクレオチド、スペーサー及び標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドが配置されていてもよい。検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成を、検出プローブ用オリゴヌクレオチドをプライマーとした核酸伸長反応により検出する場合には、５’末端から３’末端の方向に、標的結合プローブ用オリゴヌクレオチド、スペーサー及び検出プローブ用オリゴヌクレオチドの順に配置されていることが好ましい。
【００２３】
本発明においてスペーサーは、検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的結合プローブ用オリゴヌクレオチドを連結させることができるものであれば特に限定されないが、イノシンを用いるスペーサーが特に好ましい。スペーサーの性質として、標的核酸と二本鎖を形成しない、または、形成しても通常の塩基対の結合より結合力が弱くて検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖形成を不安定化させるものが好ましい。また、分子の大きさや二本鎖核酸の立体構造（二重らせん構造）を考えた場合、核酸や核酸誘導体の重合体、Ｄ−リボースやＤ−２−リボースの重合体が好ましいことは容易に類推される。これら核酸や核酸誘導体は、既存の自動ＤＮＡ合成機にて、通常のＤＮＡ合成と同じ方法で合成が可能であることも優れた点である。
【００２４】
イノシンとは、塩基部分にプリン誘導体であるヒポキサンチンを含むヌクレオチドの一つである。Ｍａｒｔｉｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３（２４），８９２７−８９３８，１９８５）によると、イノシンとの塩基対の安定性はＣ、Ａ、ＴまたはＧの順で、イノシンは核酸中ではおよそグアニンのアナログとして働くが、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｌｉｃｋの塩基対グアニンとシトシン、アデニンとチミンよりも安定性が低いことが示されている。このイノシンの性質を利用して、複数種類のアレルを有する核酸配列を増幅する際のｒｅｄｕｎｄａｎｃｙを下げるプライマーとしてイノシンを含むオリゴヌクレオチドが使用されている（Ｊ．　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　３４，１２，２９９０−２９９６，１９９６）。
【００２５】
本発明の塩基多型検出プローブは、溶液の状態でもよく、基板、担体、多孔質体に固定化あるいは吸着された状態でもよい。固定化や吸着の方法は特に限定されるものではなく、例えば以下のような方法が挙げられる。アミノ修飾したオリゴヌクレオチドと基板上に導入したカルボキシル基を水溶性カルボジイミドによって活性化し、アミド結合させる方法（Ｊ．Ｏｒｇ．，２６２５２５，１９６１）や、ビオチン修飾したオリゴヌクレオチドの場合にはアビジンを表面にコートした基板や担体にビオチン−アビジン結合させる方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１，２２９１，１９７２）、アミノ修飾したオリゴヌクレオチドをトレシル基を導入したシリカゲルに固定化する方法、シールされたガラス上にＤＮＡ合成試薬を接触させる合成方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，１３６８，１９９４）等がある。
【００２６】
上記した本発明の塩基多型検出プローブは、通常のＤＮＡ合成機を用いて常法により合成することができる。
【００２７】
（２）塩基多型検出方法
本発明においては、上記（１）で説明した本発明の塩基多型検出プローブを検体核酸とハイブリダイズさせ、検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成の有無により塩基多型を検出することにより、検体核酸中の標的核酸の塩基多型を検出することができる。
【００２８】
本発明において、検体核酸とは試料中の核酸を意味する。ここで言う試料とは、ＤＮＡやＲＮＡを含むもので、その由来は、血液、尿、髄液、喀痰、体液、細胞浮遊液、細胞培養液、工場廃液などの細胞または核酸が含まれるものならどのようなものであってもよい。また、それらの試料に何らかの処理をほどこした処理液であっても良い。処理の方法としては、例えば、喀痰のような粘性の高い試料を喀痰処理剤により溶解するなどの方法が挙げられる。また、試料中の核酸は溶液の状態でも、多孔質フィルターや基板等に固定化された状態でもよい。ここで示す細胞とは、ヒト細胞、哺乳類細胞、酵母などの真核性単細胞生物、真菌、細菌、ウィルスなどを意味する。
【００２９】
検体核酸は、反応液中の核酸の他に、基板、担体、又は多孔質体（例えば、多孔質からなるフィルター）に固定化あるいは吸着された核酸などその形態は問わない。固定化や吸着の方法は特に限定されるものではなく、例えば以下のような方法が挙げられる。アミノ修飾したオリゴヌクレオチドと基板上に導入したカルボキシル基を水溶性カルボジイミドによって活性化し、アミド結合させる方法（Ｊ．Ｏｒｇ．，２６２５２５，１９６１）や、ビオチン修飾したオリゴヌクレオチドの場合にはアビジンを表面にコートした基板や担体にビオチン−アビジン結合させる方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１，２２９１，１９７２）、アミノ修飾したオリゴヌクレオチドをトレシル基を導入したシリカゲルに固定化する方法、シールされたガラス上にＤＮＡ合成試薬を接触させる合成方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，１３６８，１９９４）等がある。
【００３０】
本発明において多孔質体からなるフィルターとは、一方の面から他方の面に連通する多数の微細な孔を有し、核酸を選択的に分離除去できる平均孔径を有する通気性のフィルターを意味する。多孔質体からなるフィルターの孔の形状やその連通状態、フィルターの厚さ、材質、形状、寸法等は特に問わず、多孔質体からなるフィルターはフィルム、シート、膜、板塊状、繊維状、粒状等の任意の形態であることができる。多孔質体からなるフィルターは有機材料および無機材料のいずれからなっていてもよく、また天然材料、合成材料または半合成材料からなっていてもよい。多孔質体からなるフィルターの例としては天然、合成、半合成、再生の有機または無機繊維からなる多孔質体；　有機または無機発泡体（例えばスポンジ、フォームなど）；孔成分の溶出、焼結、延伸、穿孔などにより孔形成された有機、無機多孔質体；有機または無機の微粒子や細片を充填または結合した多孔質体などを挙げることができる。例えば、繊維からなる多孔質体フィルターの場合は、繊維は有機または無機の短繊維、スライバー、長繊維のいずれからなっていてもよく、しかもフィルターの形態は、単なる繊維の塊でもよく、また不織布または織布よりなる繊維布層の１層または複数層でもよい。
【００３１】
検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成は、検出プローブ用オリゴヌクレオチドをプライマーとした核酸伸長反応により検出することができ、この核酸伸長反応は、核酸合成酵素にて行うことができる。
【００３２】
核酸伸長反応とは、ＤＮＡの伸長反応の場合、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃで表記される４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質として、鋳型核酸の配列に従い、ＤＮＡ合成酵素にて触媒されるＤＮＡ鎖の重合反応を意味する。基質としては、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の他に、Ｃｙ３やＣｙ５等の蛍光化合物で標識されたヌクレオチドやＤｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ＤＩＧ）−１１−ｄＵＴＰやビオチンを付加した標識ヌクレオチドでもよい。核酸合成酵素としてはＤＮＡ合成酵素を使用することができ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性のＴａｑポリメラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。またその由来も、バクテリア由来、ウィルス由来、脊椎動物由来、無脊椎動物由来、植物由来などいずれでもよい。鋳型核酸がＲＮＡからなる場合は、逆転写酵素にて触媒される。またその由来も、バクテリア由来、ウィルス由来、脊椎動物由来、無脊椎動物由来、植物由来などいずれでもよい。
【００３３】
ピロリン酸は、ｄＮＴＰを基質としたＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ伸長反応の際に生じる副生成物である。ＬＡＭＰ法では、このピロリン酸と反応溶液中のマグネシウムイオンから生じる沈殿を検出し、核酸増幅の指標としている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２８９，１５０−１５４，２００１）。また、塩基配列決定法の一つである、いわゆるパイロシークエンス法においてもこのピロリン酸を検出している。本発明においても、これらの方法を用いて、ピロリン酸を指標として伸長反応の可否を判定することが出来る。
【００３４】
核酸伸長の可否を検出する方法としてさまざまな方法があり、以下に例を示す。例えばＰＣＲ法が有用である。本プローブをＰＣＲに用いるプライマーとしてＰＣＲを行えば、検出プローブ用オリゴヌクレオチドの塩基配列と標的核酸の塩基配列が完全に相補的な時に両者が二本鎖を形成し、この検出プローブ用オリゴヌクレオチドの３’末端から核酸の伸長反応が起こり、核酸の増幅が起こる。一方、検出プローブ用オリゴヌクレオチドの塩基配列と標的核酸の塩基配列が相補的でない場合は、両者は二本鎖を形成しない、または、形成しても不安定であり、核酸伸長反応が起こらない、または、伸長反応が起こっても増幅効率が低下する。この差を、アガロースゲル電気泳動にて検出したり、エチジウムブロマイドやＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ等のいわゆる核酸のインターカレーターを使って検出することが可能である。また、増幅産物の核酸配列と相補的な配列を持つ標識核酸をプローブとして、ハイブリダイズにて増幅産物を検出することができる。標識核酸プローブとして、放射標識やＤＩＧ標識、蛍光標識プローブ等があり、Ｔａｑｍａｎプローブも有用である。Ｔａｑｍａｎプローブとは、蛍光ドナーとアクセプターの働きを有する２種のＤｙｅにてオリゴヌクレオチドの両端を標識したもので、標的核酸配列にハイブリダイズした際には蛍光を発し、ＤＮＡ合成酵素によりプローブが分解された際には蛍光がクエンチされる性質を有するプローブである。
【００３５】
また、伸長・増幅した核酸の荷電を検出することで、核酸伸長反応を検出することも可能である。また、核酸伸長反応液中にＣｙ３−ｄＵＴＰやＣｙ５−ｄＵＴＰなどの蛍光標識されたヌクレオチドやＤＩＧ標識ヌクレオチドを核酸伸長反応液中に添加して核酸伸長反応を行い、伸長核酸中の蛍光標識ヌクレオチドやＤＩＧ標識ヌクレオチドを検出することで、核酸伸長反応の可否を検定できる。標識ヌクレオチドとして、先に示したＣｙ３−ｄＵＴＰやＣｙ５−ｄＵＴＰ等の蛍光標識ヌクレオチド、ＤＩＧ標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド等の標識ヌクレオチドなどがある。
【００３６】
さらに本発明では、検出プローブ用オリゴヌクレオチドと標的核酸との二本鎖核酸の形成をＦＲＥＴ法にて検出することもできる。ＦＲＥＴ法とは、Ｆｌｕｏｅｒｅｓｃｅｎｔ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ法のことで、２種のＤｙｅがおよそ１０から７５オングストロームの近接した距離に存在する場合に、そのドナー側のＤｙｅから生じた蛍光にて励起されたアクセプター側のＤｙｅの蛍光強度を測定する方法である。例えば、塩基多型検出プローブ中の検出プローブ用オリゴヌクレオチドの３’末端を一方のＤｙｅにて標識し、この塩基多型検出プローブがハイブリダイズする標的核酸の近傍にハイブリダイズする５’末端をもう一方のＤｙｅにて標識したオリゴヌクレオチドを用意し、この２者を標的核酸とハイブリダイズさせる。検出プローブ用オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズした時は、アクセプターから生じる蛍光強度が強まることから、検出プローブ中の塩基多型を判別することができる。
【００３７】
本発明の方法により検体核酸中の標的核酸の塩基多型を検出する場合、検体核酸の一本鎖核酸への変性は必須でないが、一般的には変性を行う方が好ましい場合が多い。変性させる方法としては、例えば熱変性法やアルカリ変性法がある。熱変性として、９５℃に２分間、または６５℃にて１０分間熱変性させる方法、アルカリ変性としては、核酸を０．５Ｎ　ＮａＯＨを含む変性溶液中におく方法が挙げられる。一般的にプローブを標的核酸にハイブリダイズさせて二重鎖を形成させる場合には、上記の検体核酸の変性が必要である。ＰＣＲにおいてもプライマーを検体核酸とハイブリダイズさせるために熱変性のステップが通常は必要である。しかし、Ｂｓｔ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｌａｒｇｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）のような鎖置換型のＤＮＡ合成酵素の場合、変性がなくてもプライマー検体核酸にハイブリダイズしＤＮＡの伸長反応が起こることが知られている。
【００３８】
（３）本発明の具体的態様
本発明にて、さまざまなデザインの塩基多型検出プローブをプライマーとしてＰＣＲを行い、電気泳動、または、インターカレーターの一つＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎやハイブリダイゼーションプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法にて、標的核酸の増幅の有無を検出した。その結果、塩基多型検出プローブのスペーサーとしてイノシンデオキシリボヌクレオチドを使用した場合、その重合数は２残基から７残基がよく、２残基から６残基がより好ましく、３残基から５残基がさらに好ましく、また、塩基多型検出プローブの検出プローブ用オリゴヌクレオチドのヌクレオチド残基数は、３残基から９残基がよく、３残基から７残基がより好ましく、３残基から５残基がさらに好ましいことを見出した。また、検出プローブ用オリゴヌクレオチド中の塩基多型の挿入位置は、検出プローブ用オリゴヌクレオチドを５残基とした場合、いずれでも変異の検出が可能であるが、３’端より２残基目から５残基目が好ましく、より好ましくは３残基目から５残基目がより好ましく、３残基目がさらに好ましいことを見出した。これら塩基多型検出プローブと、日本国特許第２８５３８６４号や欧州特許ＥＰ０３３２４３５号に記載されているプライマーとを比較検討した結果、より効率よく塩基多型の検出ができることを見出し、本発明に至った。
【００３９】
また本発明者は、この塩基多型検出プローブをＡＢＯ式血液型判定に実践した。ヒトの血液型は、赤血球上に付加される２種の糖鎖によって判別される。Ａ型は、Ｈｕｍａｎ　ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ　Ａ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０２０４６９）にて、赤血球上にＮ−アセチルグルコサミンを含む糖鎖が合成される。一方、Ｂ型のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ遺伝子上にはアミノ酸置換を引き起こす複数箇所のＳＮＰｓが存在してアミノ酸配列の異なるタンパクが翻訳され、Ｎ−アセチルグルコサミンではなくガラクトースを含む糖鎖が赤血球表面に合成される。また、Ｏ型は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ遺伝子上のＳＮＰｓにより途中でストップコドンが現れ、Ｏ型の赤血球表面にＮ−アセチルグルコサミンやガラクトースからなる糖鎖の合成が不可能となる。本発明者はこれらＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ遺伝子上のＳＮＰｓを検出する塩基多型検出プローブを設計した。ＡＢＯ血液型判定に用いるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ遺伝子上のＳＮＰｓとこれを検出するための塩基多型検出プローブの配列番号を表１に記載した。
【００４０】
【表１】
2004129544.tif 000002
【００４１】
ＳＮＰｓを検出する際には、遺伝子がコードされている正鎖と、この正鎖に対して相補的な負鎖の配列のいずれか一方が判ればよく、従って、表１に示した正鎖と負鎖の配列を有する塩基多型検出プローブが利用できる。塩基多型検出プローブをＰＣＲプライマーの一方とした場合、この塩基多型検出プローブに対して相補鎖の配列のオリゴヌクレオチドをもう一方のプライマーとして設計し、ＰＣＲを行うことが出来る。この相補鎖のプライマーの配列は、両アレルに共通な配列であって、例えば塩基多型検出プローブから３’側に数十〜数百塩基の位置に、例えば１０〜８０塩基のヌクレオチドであればよい。
【００４２】
本発明者は、表１に示した塩基多型検出プローブを使ったＰＣＲにて、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ遺伝子上のＳＮＰｓの塩基配列の検出に成功し、ＡＢＯ式血液型判定方法を完成するに至った。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００４３】
【実施例】
実施例１：イノシンスペーサーの長さ
化学的に合成した配列番号１又は２に記載のオリゴヌクレオチドあるいは配列番号３〜１０の塩基多型検出プローブを５’プライマーとし、配列番号１１に記載のオリゴヌクレオチドを３’プライマーとし、Ｌａｍｂｄａ　ＤＮＡ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）をテンプレートとしてＰＣＲを行った。これらの配列は、Ｌａｍｂｄａ　ＤＮＡ配列において、ＧＣ含量やＰＣＲ産物のサイズを考慮して設計した。ＰＣＲはＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を使用した。３ｎｇのＬａｍｂｄａＤＮＡを入れたＰＣＲ用チューブに、５’プライマーと３’プライマーが、それぞれ最終濃度０．４μＭとなるように添加し、２μｌのＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍの反応バッファーと、最終濃度が１．５ｍＭとなるようＭｇＣｌ２を添加し、０．３μｌのＨｉＦｉ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加し、最終容量を２０μｌとした。これらＰＣＲ反応液をＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）で、９５℃で３分反応させた後、９５℃で３０秒、６０℃で１分及び７２℃で３分のサイクルを３０回行い、そして最後に７２℃で５分間反応させた。ＰＣＲ反応終了後、５μｌの反応液を１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、ＰＣＲ産物の有無を確認した。この結果を図１に示す。ＬＡＭ５Ｉ５ｗとＬＡＭ５Ｉ５ｍ３にて、ＰＣＲ産物量の差が顕著であり、一塩基の置換が検出されていることが示された。
【００４４】
実施例２：検出プローブ用オリゴヌクレオチドの長さ
検出プローブ用オリゴヌクレオチド上の核酸残基数の異なる塩基多型検出プローブ設計し、ＰＣＲを行った。変異挿入個所は検出プローブ用オリゴヌクレオチド中の中央とした。化学的に合成した配列番号５、６、１３〜１８記載の塩基多型検出プローブ、配列番号１２のオリゴヌクレオチドのいずれかを５’プライマーとし、配列番号１１記載のオリゴヌクレオチドを３’プライマーとして、Ｌａｍｂｄａ　ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。実験の詳細は実施例１に従った。ＰＣＲ反応終了後、５μｌの反応液を１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、ＰＣＲ反応物の有無を確認した。この結果を図２に示す。塩基多型検出プローブ中の検出プローブの長さ５または３ｍｅｒのときに、ＰＣＲ産物量の差が顕著であることが示された。
【００４５】
実施例３：検出プローブ用オリゴヌクレオチド中の変異導入位置
検出プローブ用オリゴヌクレオチドの変異導入個所をかえた塩基多型検出プローブを設計し、ＰＣＲを行った。化学的に合成した配列番号５、６、１９〜２２記載の塩基多型検出プローブ、配列番号１２のオリゴヌクレオチドのいずれかを５’側プライマー、配列番号１１記載のオリゴヌクレオチドを３’側プライマーとし、Ｌａｍｂｄａ　ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。実験の詳細は実施例１に従った。ＰＣＲ反応終了後、５μｌの反応液を１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、ＰＣＲ産物の有無を確認した。この結果を図３に示す。塩基多型検出プローブ中の検出プローブ用オリゴヌクレオチドが５ｍｅｒの時、３’端から３番目に変異個所を導入すると最もＰＣＲ産物量の差が顕著であることが示された。
【００４６】
実施例４：ＨＬＡタイピング
ヒト培養細胞ＨＬ−６０とＵ−９３７のＨＬＡ−Ａ遺伝子のタイピングをＳＲＬ社に依頼した結果、それぞれＨＬＡ−Ａ＊０１０１とＨＬＡ−Ａ＊１１０１であることが判明した。ウェブサイト　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｔｈｏｎｙｎｏｌａｎ．ｃｏｍ／からＨＬＡ遺伝子の配列比較表”　ｗｗｗ．ａｎｔｈｏｎｙｎｏｌａｎ．ｃｏｍ／からＨＬＡ遺伝子の配列比較表ＨＬＡＤＢ−１．１２．０−ＯＣＴ　２００１をダウンロードし、ファイル中のＡ＊０１０１とＡ＊１１０１の２つの遺伝子配列を比較し、適当な一塩基置換としてＨＬＡ＊０１０１のｃＤＮＡ配列２７２位のアレルがＨＬＡ−Ａ＊０１０１がＡ，ＨＬＡ−Ａ−１１０１がＧであることを見出し、この領域に塩基多型検出プローブを設定し、以下ＰＣＲのプライマーとして使用した。まず、５ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを入れたＰＣＲ用チューブに、５’プライマーとして、配列番号２３のＨＬＡ−Ａ＊０１０１を検出する塩基多型検出プローブ、または、配列番号２４のＨＬＡ−Ａ＊１１０１を検出する塩基多型検出プローブのいずれかと、３’プライマーとして配列番号２５のオリゴヌクレオチドが、それぞれ最終濃度０．４μＭとなるように添加し、２μｌのＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍの反応バッファーと、適当な濃度のＭｇＣｌ２を添加し、０．３μｌのＨｉＦｉ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加し、最終容量を２０μｌとした。これらＰＣＲ反応液をＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）で９５℃　３分、１ｃｙｃｌｅ；９５℃　３０秒、６０℃　１分、７２℃　３分、　３０ｃｙｃｌｅｓ；７２℃　５分間反応させた。ＰＣＲ反応終了後、５μｌの反応液を１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、ＰＣＲ産物の有無を確認した。この結果を図４に示す。ＰＣＲ産物の有無と各細胞のＨＬＡタイプが一致していることが示された。
【００４７】
実施例５：Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲによるＨＬＡタイピング
Ｒｏｃｈｅ社製のＲｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲマシーンＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒにて、塩基多型検出プローブを使ったＰＣＲ反応を行った。培養細胞から調製した５ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを入れたＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ専用キャピラリーチューブに、５’プライマーとして配列番号２６、２７の塩基多型検出プローブのいずれかと、３’プライマーとして配列番号２５のオリゴヌクレオチドを、それぞれ最終濃度０．５μＭとなるように添加した。次に、３’端をＦＩＴＣにて標識した配列番号９２のプローブと、５’端をＬＣ−Ｒｅｄ６４０にて標識し、かつ、３’をリン酸化した配列番号９３のプローブとを、それぞれ最終濃度が０．２μＭと０．４μＭになるように添加した。これにＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｂｅ（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）の反応液２μｌと適量のＭｇＣｌ２を添加して、全量を２０μｌとした。これをＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒで、９５℃で２０秒、１ｃｙｃｌｅ；９５℃で１０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２０秒を１００ｃｙｃｌｅｓ；４０℃で３００秒、反応させた。ＰＣＲ増幅反応中の蛍光強度の測定は、アニーリングのエンドポイントにて各サイクル１回測定した。その結果を図５に示す。ＨＬ−６０細胞、Ｕ−９３７細胞共に、ゲノム配列とプローブ配列が一致する際にＰＣＲの増幅の立ち上がりに要するＰＣＲのサイクル数を見分けることで、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１かＨＬＡ−Ａ＊１１０１かのタイピングが可能であることが示された。
【００４８】
実施例６：培養細胞のＡＢＯ式血液型検出
Ｈｕｍａｎ　ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ　Ａ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）ｍＲＮＡ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃｄｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０２０４６９）の２１１位から３１０位までのＤＮＡの部分配列をウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にてホモロジー検索を行い、Ｈｕｍａｎ　ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ　Ａ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）遺伝子のゲノム部分配列を含むＧｅｎｏｍｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｆｒｏｍ　Ｈｕｍａｎ　９ｑ３４，ｃｏｍｐｌｅｔｅｓｅｑｕｅｎｃｅ　［Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ］（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＣ０００３９７）を得た。ＮＭ＿０２０４６９とＡＣ０００３９７の配列をもとに化学的に合成した配列番号２８と２９、３０と３１とを使用して、ヒト培養細胞ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ社）、Ｕ−９３７（ＡＴＣＣ社）、ＡＳＭ（大日本製薬）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ社）から調製したゲノムＤＮＡのＨｕｍａｎ　ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ　Ａ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）ゲノムの部分配列の増幅をＰＣＲにて行い、ＤＮＡシークエンスにてこの部分配列を決定した。Ｈｕｍａｎ　ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ　Ａ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）ｍＲＮＡ、ｃｏｍｐｌｅｔｅｃｄｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０２０４６９）の２６１位と８０３位の配列を調べ、ＡＢＯ式血液型の判定を行った。この結果を表２に示す。２６１位のヌクレオチドがＧの場合、Ａ型またはＢ型の血液型を示し、Ｇが欠失の場合、Ｏ型の血液型を示す。また、８０３位のヌクレオチドがＧならＡまたはＯ型の血液型を示し、ＣならＢ型の血液型を示す。
【００４９】
【表２】
2004129544.tif 000003
【００５０】
一方、Ｈｕｍａｎ　ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ　Ａ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）遺伝子配列上で、ＡＢＯを規定する変異位置に塩基多型検出プローブを設定し、以下ＰＣＲのプライマーとして使用した。２６１位の変異検出は以下の様に行った。上記細胞から調製した５ｎｇのゲノムＤＮＡを含むＰＣＲ用チューブに、配列番号２８記載のオリゴヌクレオチドを５’プライマー、配列番号４２、４３記載の塩基多型検出プローブのいずれかを３’プライマーとし、それぞれ最終濃度が０．４μＭとなるように添加し、２μｌのＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍの反応バッファーと、適当な濃度のＭｇＣｌ２と０．３μｌのＨｉＦｉ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとを添加し、最終容量を２０μｌとした。これらＰＣＲ反応液をＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）で９５℃で３分、１ｃｙｃｌｅ；９５℃で３０秒、６６℃で３０秒、７２℃で２分、４０ｃｙｃｌｅｓ；７２℃で５分間反応させた。ＰＣＲ反応終了後、５μｌの反応液を２％アガロースゲルにて電気泳動を行い、ＰＣＲ産物の有無を確認した。この電気泳動の結果を図６に示す。８０３位の変異検出には、配列番号８４、８５記載の塩基多型検出プローブを５’プライマーとし、配列番号３０記載のオリゴヌクレオチドを３’プライマーとして、２６１位の変異検出と同様の方法にて行った。その電気泳動の結果を図７に示す。図６及び図７から判定したＡＢＯ血液型を表３に示す。表２と表３の結果が一致し、塩基多型検出プローブにてＡＢＯ遺伝子の判定が可能であることが示された。
【００５１】
【表３】
2004129544.tif 000004
【００５２】
【発明の効果】
本発明の塩基多型検出プローブは、容易にデザインすることが可能であり、また、従来のＤＮＡ合成機にて合成可能である。本発明にそってＰＣＲ法にて塩基多型を検出する際には、これを同一条件下で行うことが可能であり、精度良く塩基多型を検出することが可能である。
【００５３】
【配列表】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
2004129544.tif 000013
【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８４】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【００９６】
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【００９７】
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【００９８】
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【００９９】
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【０１００】
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【０１０１】
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【０１０２】
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【０１０３】
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【０１０４】
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【０１０５】
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【０１０６】
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【０１０７】
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【０１０８】
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【０１０９】
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【０１１０】
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【０１１１】
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【０１１２】
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【０１１３】
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【０１１４】
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【０１１５】
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【０１１６】
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【０１１７】
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【０１１８】
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【０１１９】
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【０１２０】
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【０１２１】
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【０１２２】
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【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【０１３４】
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【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【０１３８】
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【０１３９】
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【０１４０】
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【０１４１】
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【０１４２】
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【０１４３】
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【０１４４】
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【０１４５】
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【０１４６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、スペーサー長の異なる塩基多型検出プローブでのＰＣＲの結果を示す。　プライマーは、使用した５’プライマーを示す。
Ｌａｎｅ１　１００ｂｐラダー（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）；Ｌａｎｅ２　ＬＡＭ０Ｉ５ｗ（配列番号１）；Ｌａｎｅ３　ＬＡＭ０Ｉ５ｍ３（配列番号２）；Ｌａｎｅ４　ＬＡＭ３Ｉ５ｗ（配列番号３）；Ｌａｎｅ５　ＬＡＭ３Ｉ５ｍ３（配列番号４）；Ｌａｎｅ６　ＬＡＭ５Ｉ５ｗ（配列番号５）；Ｌａｎｅ７　ＬＡＭ５Ｉ５ｍ３（配列番号６）；Ｌａｎｅ８　ＬＡＭ７Ｉ５ｗ（配列番号７）；Ｌａｎｅ９　ＬＡＭ７Ｉ５ｍ３（配列番号８）；Ｌａｎｅ１０　ＬＡＭ９Ｉ５ｗ（配列番号９）；Ｌａｎｅ１１　ＬＡＭ９Ｉ５ｍ３（配列番号１０）
【図２】図２は、核酸残基数の異なる多型検出プローブでのＰＣＲの結果を示す。プライマーは、使用した５’プライマーを示す。
Ｌａｎｅ１　１００ｂｐラダー（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）；Ｌａｎｅ２　ＬＡＭ１（配列番号１２）；Ｌａｎｅ３　ＬＡＭ５Ｉ７ｗ（配列番号１３）；Ｌａｎｅ４　ＬＡＭ５Ｉ７ｍ４（配列番号１４）；Ｌａｎｅ５　ＬＡＭ５Ｉ５ｗ（配列番号５）；Ｌａｎｅ６　ＬＡＭ５Ｉ５ｍ３（配列番号６）；Ｌａｎｅ７　ＬＡＭ５Ｉ３ｗ（配列番号１５）；Ｌａｎｅ８　ＬＡＭ５Ｉ３ｍ２（配列番号１６）；Ｌａｎｅ９　ＬＡＭ５Ｉ１ｗ（配列番号１７）；Ｌａｎｅ１０　ＬＡＭ５Ｉ１ｍ１（配列番号１８）；Ｌａｎｅ１１　１００ｂｐラダー（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）；
【図３】図３は、検出プローブ用オリゴヌクレオチド中の変異位置が異なる塩基多型検出プローブでのＰＣＲの結果を示す。プライマーは、使用した５’プライマーを示す。
Ｌａｎｅ１　１００ｂｐラダー（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）；Ｌａｎｅ２　ＬＡＭ１（配列番号１２）；Ｌａｎｅ３　ＬＡＭ５Ｉ５ｗ（配列番号５）；Ｌａｎｅ４ＬＡＭ５Ｉ５ｍ１（配列番号１９）；Ｌａｎｅ５　ＬＡＭ５Ｉ５ｍ２（配列番号２０）；Ｌａｎｅ６　ＬＡＭ５Ｉ５ｍ３（配列番号６）；Ｌａｎｅ７　ＬＡＭ５Ｉ５ｍ４（配列番号２１）；Ｌａｎｅ８　ＬＡＭ５Ｉ５ｍ５（配列番号２２）
【図４】図４は、塩基多型検出プローブを使ったＰＣＲによる培養細胞のＨＬＡタイピングの結果を示す。プライマーは、使用した５’プライマーを示す。
Ｌａｎｅ１　１００ｂｐラダー（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）；Ｌａｎｅ２、４，６，８、５’プライマー：ＨＬＡｅｘ２−１−３Ｉ５ａ３（配列番号２３）；Ｌａｎｅ３、５、７、９　ＨＬＡｅｘ２−１−３Ｉ５ｇ３（配列番号２４）。
【図５】図５は、ＲｅｌａｔｉｍｅＰＣＲによる多型検出の結果を示す。ＨＬＡ−Ａ＊０１０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１に特異的な塩基多型検出プローブをプライマーとしたＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ。５’プライマーを塩基多型検出プローブＨＬＡｅｘ２−１−５Ｉ５ａ３（配列番号２６）、または、ＨＬＡｅｘ２−１−５Ｉ５ｇ３（配列番号２７）のいずれか、３’プライマーには、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１に共通のプライマー（配列番号２５）を用いた。横軸にサイクル数、縦軸に蛍光強度を示した。
【図６】図６は、塩基多型検出プローブを使ったＰＣＲの結果を示す。Ｈｕｍａｎ　ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ　Ａ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）の２６１位のアレルを検出する塩基多型検出プローブを用いたＰＣＲの産物の電気泳動。５’プライマーとしてＡＢＯ１１（配列番号２８）、３’プライマーとして塩基多型検出プローブＡＢＯ８（配列番号４２）、または、塩基多型検出プローブＡＢＯ１０（配列番号４３）を用いた。
【図７】図７は、塩基多型検出プローブを使ったＰＣＲの結果を示す。Ｈｕｍａｎ　ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ　Ａ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）の８０３位のアレルを検出する塩基多型検出プローブを用いたＰＣＲの産物の電気泳動。５’プライマーとして塩基多型検出プローブＡＢＯ２０（配列番号８４）、または、塩基多型検出プローブＡＢＯ２２（配列番号８５）、３’プライマーとしてＡＢＯ１３（配列番号３０）を用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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