(57)【要約】【課題】肥満症を発症しているＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物の提供。【解決手段】肥満症を発症しているＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物を用いて肥満症の予防・治療・改善薬を効率良くスクリーニングすることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満症を発症しているＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
野生型動物に比べて体重または体脂肪が増加しているＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
非ヒト哺乳動物がマウスである請求項１または２記載の動物。
【請求項４】
ＰｒＲＰ遺伝子が配列番号：２で表わされる塩基配列を含有する遺伝子である請求項３記載の動物。
【請求項５】
請求項１または２記載の動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞を用いることを特徴とする肥満症の予防・治療・改善薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項１または２記載の動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞に試験化合物を投与し、体重または体脂肪の変化を測定することを特徴とする請求項５記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１または２記載の動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞を含有することを特徴とする肥満症の予防・治療・改善薬のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、肥満症等を発症しているＰｒＲＰノックアウト動物およびそれを用いる肥満症の予防・治療・改善薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　下垂体機能調節作用、中枢神経機能調節作用、膵臓機能調節作用を有するヒト、ウシおよびラット由来のリガンドポリペプチド（ＰｒＲＰ）並びにそれをコードするｃＤＮＡ、および該ＰｒＲＰに対するヒトおよびマウス由来のレセプタータンパク質（ＰｒＲＰ受容体）並びにそれをコードするｃＤＮＡが知られている（特許文献１）。
【０００３】
　マウス由来のＰｒＲＰ並びにそれをコードするゲノムＤＮＡ、およびＰｒＲＰノックアウト動物の製造法とそのためのターゲッティイングベクターが知られている（特許文献２）。
【０００４】
　ヒトおよびマウス由来ＰｒＲＰ受容体と高い相同性を有するラット由来オーファン受容体（ＵＨＲ−１）が知られている（非特許文献１）。
【０００５】
　ＰｒＲＰがプロラクチン分泌調節作用、胎盤機能調節作用を有することが知られている（特許文献３）。
【０００６】
　ＰｒＲＰがオキシトシン分泌調節作用を有することが知られている（特許文献４）。
【０００７】
　ＰｒＲＰに対するモノクローナル抗体（Ｐ２Ｌ−１Ｃａ、Ｐ２Ｌ−２Ｃａ、Ｐ２Ｌ−１Ｔａ）が知られている（特許文献５）。
【０００８】
　ＰｒＲＰが副腎皮質刺激ホルモン放出分泌調節作用を有し、肥満症に対して予防・治療効果があることが知られている（特許文献６）。
【０００９】
　ＰｒＲＰが摂食調節に関与していることが記載されている（非特許文献２）。
【００１０】
　ＰｒＲＰの投与により、摂食および体重増加が阻害されることが知られている（非特許文献３）。
【００１１】
　ＰｒＲＰとレプチンとの相互作用により、摂食および体重増加が阻害されることが知られている（非特許文献４）。
【特許文献１】ＷＯ９７／２４４３６号公報
【特許文献２】ＷＯ９８／４９２９５号公報
【特許文献３】ＷＯ９８／５８９６２号公報
【特許文献４】ＷＯ００／３８７０４号公報
【特許文献５】ＷＯ９９／６０１１２号公報
【特許文献６】ＷＯ００／３８７０４号公報
【非特許文献１】Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol.209, No.2, pp.606-613, 1995
【非特許文献２】Nature Neuroscience Vol.3, No.7, July 2000
【非特許文献３】Endcrinology February 2002, 143(2):360-367
【非特許文献４】Endcrinology February 2002, 143(2):368-374
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
　本発明は、肥満症の予防・治療・改善薬のスクリーニングに有用なＰｒＲＰノックアウト動物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
　本発明者らは、上記の課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全マウス（ＰｒＲＰノックアウトマウス）の作出に成功し、該ノックアウトマウスにおいて体重の増加や体脂肪の増加が見られることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１４】
　すなわち、本発明は、
（１）肥満症を発症しているＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物、
（２）野生型動物に比べて体重または体脂肪が増加しているＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物、
（３）非ヒト哺乳動物がマウスである上記（１）または（２）記載の動物、
（４）ＰｒＲＰ遺伝子が配列番号：２で表わされる塩基配列を含有する遺伝子である上記（３）記載の動物、
（５）上記（１）または（２）記載の動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞を用いることを特徴とする肥満症の予防・治療・改善薬のスクリーニング方法、
（６）上記（１）または（２）記載の動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞に試験化合物を投与し、体重または体脂肪の変化を測定することを特徴とする上記（５）記載のスクリーニング方法、および
（７）上記（１）または（２）記載の動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞を含有することを特徴とする肥満症の予防・治療・改善薬のスクリーニング用キットを提供する。
【００１５】
　さらに、本発明は、
（８）ＰｒＲＰ遺伝子が配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるマウスＰｒＲＰ、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるラットＰｒＲＰまたは配列番号：５で表わされるアミノ酸配列からなるウシＰｒＲＰをコードする遺伝子である上記（１）または（２）記載の動物、
（９）ＰｒＲＰ遺伝子が配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるマウスＰｒＲＰをコードする遺伝子である上記（１）または（２）記載の動物、および
（１０）ＰｒＲＰ遺伝子が不活性化された哺乳動物ＥＳ細胞を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
　本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物は、肥満症の予防・治療・改善薬のスクリーニングに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
　ＰｒＲＰ遺伝子が不活性化された哺乳動物ＥＳ細胞とは、哺乳動物ＥＳ細胞が有するＰｒＲＰ遺伝子に人為的に変異を加えることにより、遺伝子の発現能を抑制するか、もしくは該遺伝子がコードしているＰｒＲＰの活性を実質的に喪失させることにより、遺伝子が実質的にＰｒＲＰの発現能を有さない不活性化された（以下、本発明のノックアウト遺伝子と称することがある）哺乳動物のＥＳ細胞をいう。
【００１８】
　ＰｒＲＰはＷＯ９７／２４４３６号、ＷＯ９８／４９２９５号などに記載されている公知蛋白質であり、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるマウスＰｒＲＰ、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるラットＰｒＲＰ、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列からなるウシＰｒＲＰなどが用いられる。
【００１９】
　ＰｒＲＰ遺伝子としては、上記ＰｒＲＰをコードするゲノムＤＮＡなどが用いられるが、具体的には、（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるマウスＰｒＲＰをコードする、配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するマウスＰｒＲＰ遺伝子、（２）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるラットＰｒＲＰをコードする、配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するラットＰｒＲＰ遺伝子、（３）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列からなるウシＰｒＲＰをコードする、配列番号：６で表わされる塩基配列を含有するウシＰｒＲＰ遺伝子などが用いられ、なかでも配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるマウスＰｒＲＰをコードする、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるマウスＰｒＲＰ遺伝子が好ましく用いられる。
【００２０】
　本明細書中、ＥＳ細胞の材料とする哺乳動物としては、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。
【００２１】
　また、本明細書中、非ヒト動物としては、ＰｒＲＰ遺伝子を有するヒト以外の動物ならば、いかなる動物でもよいが、非ヒト哺乳動物が好ましい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。非ヒト哺乳動物のなかでも、病態動物モデル系の作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，クローズド系ＩＣＲ系統など（なかでも好ましくは、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統など、交雑系として、ＢＤＦ１系統またはクローズド系ＩＣＲ系統など））またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ系統，ＳＤ系統など）などが特に好ましい。
【００２２】
　ＰｒＲＰ遺伝子に人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該遺伝子配列の一部又は全部の削除、もしくは他遺伝子の挿入または置換があげられる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらすか、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウト遺伝子を作製することができる。
【００２３】
　ＰｒＲＰ遺伝子が不活性化された哺乳動物（好ましくは、非ヒト哺乳動物）ＥＳ細胞（以下、ＰｒＲＰ遺伝子不活性化ＥＳ細胞またはノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子またはゼオシン耐性遺伝子など、好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝子など）、あるいはレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ（大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、タウマリン遺伝子、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）遺伝子など、好ましくは、ｌａｃＺなど）等を挿入することによりＰｒＲＰ遺伝子のエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡベクター（以下、ターゲティングベクターと略記する）を作製する。レポーター遺伝子を挿入してエキソンの機能を破壊する場合、該レポーター遺伝子は、ＰｒＲＰプロモーターの制御下で発現するように挿入することが好ましい。
【００２４】
　上記「薬剤耐性遺伝子」とは、抗生物質などの薬剤耐性に関与する遺伝子を示し、導入される遺伝子が細胞において発現したか否かを選抜するマーカーとして利用される。
【００２５】
　また、上記「レポーター遺伝子」とは、遺伝子発現の指標になる遺伝子群のことを示し、通常、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が利用されることが多く、1)遺伝的背景がないもの、2)遺伝子発現を定量的に行える高感度の方法があるもの、3)形質転換細胞への影響が少ないもの、4)発現部位の局在性が示されるものなどが好ましく用いられる（植物細胞工学、第2巻、第721頁、1990）。また、上記の「薬剤耐性遺伝子」なども同じ目的で使用されるが、「レポーター遺伝子」は、単に導入される遺伝子が細胞において発現したかどうかだけではなく、どの組織でいつ発現したかを調べることができ、しかも定量的に発現量を正確に調べることができるものである。
【００２６】
　さらに、ターゲティングベクターを、例えば、相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞についてＰｒＲＰ遺伝子上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲティングベクター作製に使用したＰｒＲＰ遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【００２７】
　上記のターゲティングベクターとしては、例えば、ｐＧＴ−Ｎ２８（ＮＥＢ社）、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３など）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＢ５，ｐＣ１９４など）、酵母由来のプラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５など）、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスベクター、バキュロウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス群からのウイルス、またはエプスタイン・バー・ウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。
【００２８】
　また、相同組換え法等によりＰｒＲＰ遺伝子を不活性化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系統のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスやＤＢＡ／２系統との交雑種ＢＤＦ１系統マウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統とＤＢＡ／２系統とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１系統マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が操作上、取り扱いやすいという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスを遺伝的背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスと戻し交配することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６系統に戻すことが可能である点で有利に用い得る。
【００２９】
　また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚(受精後２．５日目頃の８細胞期胚が好ましい)を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
【００３０】
　また第二次セレクションは、Ｇ−バンディング法などを用いた核型分析等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えばマウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
【００３１】
　このようにして得られたＥＳ細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる再生能を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１〜０.５％トリプシン／０.１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合は、その培養細胞は放棄することが望まれる。
【００３２】
　ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin　プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られるＰｒＲＰ遺伝子発現不全細胞は、in vitroにおけるＰｒＲＰの細胞生物学的検討において有用である。
【００３３】
　また、ＥＳ細胞を保存する場合には、適当な凍結用培地（例えば、10％ＤＭＳＯ、10％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）などを用いて、約−８０℃以下で凍結保存する。
【００３４】
　本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物（以下、遺伝子発現不全非ヒト動物と称す場合がある）とは、例えば、前記のＰｒＲＰ遺伝子が不活性化された哺乳動物ＥＳ細胞由来の細胞を用いて遺伝子工学的に作出されたものであり、例えば、生殖細胞および体細胞に胚形成初期に不活性化ＰｒＲＰ遺伝子配列を導入された非ヒト動物である。
【００３５】
　該非ヒト動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００３６】
　ＰｒＲＰ遺伝子をノックアウトさせるには、前記のターゲティングベクターを非ヒト動物ＥＳ細胞または非ヒト動物卵細胞に公知の方法（例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、凝集法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法など）によって導入し（好ましい導入法としては、ＥＳ細胞に導入する場合にはエレクトロポレーション法、卵細胞に導入する場合にはマイクロインジェクション法などがあげられる）、ターゲティングベクターの不活性化されたＰｒＲＰ遺伝子配列を相同組換えにより、非ヒト動物ＥＳ細胞または非ヒト動物卵細胞の染色体上のＰｒＲＰ遺伝子と入れ換えることにより行うことができる。
【００３７】
　ＰｒＲＰ遺伝子がノックアウトされた細胞は、ＰｒＲＰ遺伝子上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲティングベクターに使用したマウス由来のＰｒＲＰ遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。
【００３８】
　非ヒト動物ＥＳ細胞を用いた場合は、相同組換えにより、ＰｒＲＰ遺伝子が不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を胚形成の初期の適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト動物胚または胚盤胞に注入し（注入法）、またはＰｒＲＰ遺伝子が不活性化されたＥＳ細胞塊を２個の８細胞期胚ではさみ込む（集合キメラ法）ことにより作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト動物の子宮に移植する。
【００３９】
　作出された動物は正常なＰｒＲＰ遺伝子座をもつ細胞と人為的に変異したＰｒＲＰ遺伝子座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
【００４０】
　該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異したＰｒＲＰ遺伝子座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えたＰｒＲＰ遺伝子座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、ＰｒＲＰヘテロ発現不全個体であり、ＰｒＲＰヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔からＰｒＲＰホモ発現不全個体を得ることができる。
【００４１】
　卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法で遺伝子溶液を注入することによりターゲティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト動物を比較することにより、相同組換えによりＰｒＲＰ遺伝子座に変異のあるものを選択することにより得られる。
【００４２】
　ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知の方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
【００４３】
　このようにしてＰｒＲＰ遺伝子がノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該遺伝子がノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
【００４４】
　さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従って行うことができる。即ち、該不活化遺伝子配列の保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化遺伝子配列を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得することができる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化遺伝子配列を有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代することができる。このようにして得られた該不活化遺伝子配列を有する動物の子孫も本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物に含まれる。
【００４５】
　本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物（特に、ＰｒＲＰホモ欠損非ヒト動物、好ましくはＰｒＲＰホモ欠損マウス）は、
（１）野生型動物に比べて、体重、体脂肪、脂肪組織重量（例、腎周囲白色脂肪組織、後腹膜白色脂肪組織、腸間膜白色脂肪組織、生殖器周囲白色脂肪組織、鼠蹊部皮下白色脂肪組織、肩甲骨間褐色脂肪組織）などが増加している、
（２）肥満症を発症している、
などの表現型を示す。
【００４６】
　野生型動物に比べて、体重、体脂肪、脂肪組織重量が増加しているとは、例えば、野生型動物に比べて、体重、体脂肪、脂肪組織重量が約５％以上、好ましくは約１０％以上、さらに好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、特に好ましくは約５０％以上増加していることをいう。
【００４７】
　このようにＰｒＲＰ遺伝子が不活性化された哺乳動物ＥＳ細胞は、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物を作出する上で、非常に有用である。また、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物、該動物に対する薬剤誘発あるいはストレス負荷によって生じる病態モデル動物、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物と他の病態モデル動物との交配によって生じるより良い病態モデル動物、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物と他の病態モデル動物との交配によって生じる病態モデル動物に対する薬剤誘発あるいはストレス負荷によって生じる病態モデル動物およびＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物と他の病態モデル動物を用いた骨髄移植動物、もしくはそれらの組織またはそれらに由来する細胞は、ＰｒＲＰの欠損に起因する疾病、例えば、ＰｒＲＰにより誘導され得る種々の生物活性の欠失に基づく、ＰｒＲＰの生物活性の不活性化に起因する疾病（例えば、肥満症など）のより良いモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。ここで、他の病態モデル動物としては、例えば、血液細胞側のみの遺伝子発現の欠損あるいは上昇に限局させた骨髄移植を用いたモデルマウス（Linton, M. F., et al., Science 267: 1034-1037 (1995)）、高脂血症もしくは動脈硬化症モデルとしてＷＨＨＬウサギ（低比重リポ蛋白レセプター（LDLR）に変異を有する；Watanabe Y.、アテロースクレローシス（Atherosclerosis）、第36巻、第261頁、1980年）、ＳＨＬＭ（apoE欠損変異を有する自然発症マウス；Matsushima Y.ら、マンマリアン・ゲノム（Mamm. Genome）、第10巻、第352頁、1999年）、LDLRノックアウトマウス（Ishibashi S.ら、ジャーナル・オヴ・クリニカル・インヴェスティゲーション（J. Clin. Invest.）、第92巻、第883頁、1993年）、apoEノックアウトマウス（Piedrahita J.A.ら、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第89巻、第4471頁、1992年）、ヒトapoB導入マウス（Callow M.J.ら、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第91巻、第2130頁、1994年）等が、虚血性心疾患モデルとしてCD55 CD59ダブルトランスジェニックマウス（Cowan P.J.ら、Xenotransplantation、第5巻、第184-90頁、1998年）等が、皮膚炎モデルとしてinterleukin 1トランスジェニックマウス（Groves R.W. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第92巻、11874頁、1995年）等が、免疫不全モデルとしてCD19ノックアウトマウス（Spielman J.ら、Immunity、第3巻、39頁、1995年）等が、低血糖モデルとしてSPC2ノックアウトマウス（Furuta M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第94巻、6646頁、1997年）等が、脂肪肝モデルとしてob/obマウス（Herberg L.及びColeman D.L.、メタボリズム（Metabolism）、第26巻、第59頁、1977年）、KKマウス（Nakamura M.及びYamada K.、ダイアベトロジア（Diabetologia）、第3巻、第212頁、1967頁）、FLSマウス（Soga M.ら、ラボラトリー・オヴ・アニマル・サイエンス（Lab. Anim. Sci.）、第49巻、第269頁、1999年）、糖尿病モデルとしてNODマウス（Makino S.ら、エクスペリメンタル・アニマル（Exp. Anim.）、第29巻、第1頁、1980年）、BBラット（Crisa L.ら、ダイアビーティス・メタボリズム・レヴュー（Diabetes Metab. Rev.）、第8巻、第4頁、1992年）、ob/obマウス、db/dbマウス（Hummel L.ら、サイエンス（Science）、第153巻、第1127頁、1966年）、KKマウス、GKラット（Goto Y.ら、トウホク・ジャーナル・オヴ・エクスペリメンタル・メディシン（Tohoku J. Exp. Med.）、第119巻、第85頁、1976年）、Zucker fattyラット（Zucker L.M.ら、アニュアル・オヴ・ニューヨーク・アカデミー・オヴ・サイエンス（Ann. NY Acad. Sci.）、第131巻、第447頁、1965年）、OLETFラット（Kawano K.ら、ダイアビーティス（Diabetes）、第41巻、第1422頁、1992年）等が、肥満モデルとしてob/obマウス、db/dbマウス、KKマウス、Zucker fattyラット、OLETFラット等が、アルツハイマー病モデルとして変異アミロイド前駆体蛋白質遺伝子導入マウス等が、貧血性低酸素症モデルとしてbeta SAD (beta S-Antilles-D Punjab)トランスジェニックマウス（Trudel M.ら、EMBO J、第10巻、3157頁、1991年）等が、性腺障害モデルとしてSteroidogenic factor 1ノックアウトマウス（Zhao L.ら、Development、第128巻、147頁、2001年）等が、肝臓癌モデルとしてp53ノックアウトマウス（Kemp C.J. Molecular Carcinogenesis, 第12巻、132頁、1995年）等が、乳癌モデルとしてc-neuトランスジェニックマウス（Rao G.N.ら、Breast Cancer Res Treat, 第48巻、265頁、1998年）等が、子宮内膜炎モデルとしてperforin Fas-ligandダブルノックアウトマウス（Spielman J.ら、J Immunol. , 第161巻、7063頁、1998年）等が知られている。
【００４８】
　骨髄移植マウスは遺伝子機能の変化が限局されることで、より適した病態モデル動物となる可能性を秘めている。例えば、上記されたＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物から得られた病態モデル動物をドナー動物として、その骨髄を採取し、あらかじめ放射線照射で骨髄を破壊した他のレシピエント動物に移植したマウス、あるいは、他の病態モデル動物をドナー動物として、その骨髄を採取し、あらかじめ放射線照射で骨髄を破壊したＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物から得られた病態モデル動物をレシピエント動物として移植した骨髄移植マウスなども含まれる。
【００４９】
　このように、本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物、該動物に対する薬剤誘発あるいはストレス負荷によって生じる病態モデル動物、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物と他の病態モデル動物との交配によって生じる病態モデル動物、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物と他の病態モデル動物との交配によって生じる病態モデル動物に対する薬剤誘発あるいはストレス負荷によって生じる病態モデル動物、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物から得られた病態モデル動物と他の病態モデル動物を用いて骨髄移植して得られた病態モデル動物、もしくはそれらの組織またはそれらに由来する細胞を、該疾病の予防・治療・改善薬のスクリーニングに用いることができる。また、上記組織やそれに由来する細胞の応用例としては、肝臓や腎臓などのホモジネートを用いて特定の活性を測定する、あるいは、腹腔マクロファージを用いて特定産物の活性や産生量を測定することでスクリーニングに用いることができる。
[本発明のスクリーニング方法Ａ]
　本発明は、本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物もしくはその組織またはそれらに由来する細胞を用いることを特徴とする肥満症の予防・治療・改善薬のスクリーニング方法を提供する。
【００５０】
　本発明のスクリーニング方法において用いられるＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物、該動物の薬剤誘発あるいはストレス負荷によって生じる病態モデル動物、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物と他の病態モデル動物との交配によって生じる病態モデル動物、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物と他の病態モデル動物との交配によって生じる病態モデル動物に対する薬剤誘発あるいはストレス負荷によって生じる病態モデル動物、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物から得られた病態モデル動物と他の病態モデル動物を用いて骨髄移植して得られた病態モデル動物、もしくはそれらの組織またはそれらに由来する細胞としては、前記と同様のものが挙げられる。
【００５１】
　試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００５２】
　試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００５３】
　具体的には、本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物、該動物の薬剤誘発あるいはストレス負荷によって生じる病態モデル動物、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物と他の病態モデル動物との交配によって生じる病態モデル動物、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物と他の病態モデル動物との交配によって生じる病態モデル動物に対する薬剤誘発あるいはストレス負荷によって生じる病態モデル動物およびＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物から得られた病態モデル動物と他の病態モデル動物を用いて骨髄移植して得られた病態モデル動物（以下、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物等と称する場合がある）、もしくはそれらの組織またはそれらに由来する細胞を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物、もしくはそれらの組織またはそれらに由来する細胞と比較し、該動物の体重の変化、体脂肪の変化、脂肪組織重量、血糖値の変化、各器官や臓器の重量変化などを指標として試験化合物の肥満症の予防・治療・改善効果を試験することができる。
【００５４】
　試験動物（ＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物等）を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００５５】
　例えば、肥満症の予防・治療・改善薬をスクリーニングする場合、本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物等に高脂肪負荷処置を行い、高脂肪負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の血中の中性脂肪（トリグリセライド）値、血中コレステロール値および体重変化などを経時的に測定することによりスクリーニングすることができる。また、本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物等にＳＴＺあるいはアロキサンなどの薬剤投与を行い、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の血糖値および体重変化などを経時的に測定することによりスクリーニングすることができる。
【００５６】
　例えば、該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の体重、体脂肪、脂肪組織重量が野生型動物レベルにまで減少した場合、例えば約５％以上、好ましくは約１０％以上、さらに好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、特に好ましくは約５０％以上減少した場合、該試験化合物を肥満症に対して治療・予防効果を有する物質として選択することができる。
【００５７】
　本発明のスクリーニング方法を用いて得られる予防・治療・改善薬は、上記した試験化合物から選ばれた化合物またはその塩であり、肥満症の予防・治療・改善効果を有するので、肥満症に対する安全で低毒性な治療・予防薬などの医薬として有用である。また、該化合物またはその塩から誘導される化合物またはその塩も同様に用いることができる。
【００５８】
　該スクリーニング方法で得られた化合物の塩としては、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などの薬学的に許容し得る塩などがあげられる。
【００５９】
　無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、並びにアルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
【００６０】
　有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。
【００６１】
　無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
【００６２】
　有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
【００６３】
　塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
【００６４】
　本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を上述の治療・予防薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができ、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を薬学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００６５】
　錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントゴム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００６６】
　注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
【００６７】
　このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
【００６８】
　該化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症患者においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症患者においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
［本発明のスクリーニング方法Ｂ］
　本発明は、本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の遺伝子に対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００６９】
　上記スクリーニング方法において、本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物としては、前記した本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物の中でも、ＰｒＲＰ遺伝子がレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子がＰｒＲＰ遺伝子に対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
【００７０】
　試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
【００７１】
　レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
【００７２】
　ＰｒＲＰ遺伝子をレポーター遺伝子で置換された本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物では、レポーター遺伝子がＰｒＲＰ遺伝子に対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
【００７３】
　例えば、ＰｒＲＰ遺伝子領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、ＰｒＲＰ遺伝子の発現する組織で、ＰｒＲＰの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便にＰｒＲＰの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、ＰｒＲＰ遺伝子欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
【００７４】
　例えば、該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、レポータータンパク質の発現が約５％以上、好ましくは約１０％以上、さらに好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、特に好ましくは約５０％以上増加した場合、該試験化合物をＰｒＲＰ遺伝子に対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩として選択でき、試験動物に試験化合物を投与した場合、レポータータンパク質の発現が約５％以上、好ましくは約１０％以上、さらに好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、特に好ましくは約５０％以上減少した場合、該試験化合物をＰｒＲＰ遺伝子に対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩として選択できる。
【００７５】
　上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた物質であり、ＰｒＲＰ遺伝子に対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩である。
【００７６】
　該スクリーニング方法で得られた化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００７７】
　ＰｒＲＰ遺伝子に対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、ＰｒＲＰの発現を促進し、ＰｒＲＰの機能を促進することができるので、例えば、肥満症の予防・治療・改善剤などの医薬として使用することができる。
【００７８】
　一方、ＰｒＲＰ遺伝子に対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、ＰｒＲＰの発現を阻害し、ＰｒＲＰの機能を阻害することができるので、例えば、拒食症の予防・治療・改善剤などの医薬として使用することができる。
【００７９】
　さらに、上記スクリーニングで得られた化合物またはその塩から誘導される化合物またはその塩も同様に用いることができる。
【００８０】
　該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したスクリーニング方法Ａで得られた化合物またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
【００８１】
　このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【００８２】
　該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、肥満症の治療目的でＰｒＲＰ遺伝子に対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肥満症の治療目的でＰｒＲＰ遺伝子に対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該物質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８３】
　このように、本発明のＰｒＲＰ遺伝子発現不全非ヒト動物は、ＰｒＲＰ遺伝子に対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、ＰｒＲＰ遺伝子発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療・改善薬の開発に大きく貢献することができる。
【００８４】
　また、ＰｒＲＰ遺伝子のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポータ遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、ＰｒＲＰそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【００８５】
　本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００８６】
　ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
　ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
　　Ａ　　　　　　：アデニン
　　Ｔ　　　　　　：チミン
　　Ｇ　　　　　　：グアニン
　　Ｃ　　　　　　：シトシン
Ｉ            ：イノシン
Ｒ            ：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）
Ｙ            ：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）
Ｍ            ：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）
Ｋ            ：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｓ            ：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｗ            ：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）
Ｂ            ：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｄ            ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｖ            ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｎ            ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）
　　　　　　　　　　もしくはチミン（Ｔ）または不明もしくは他の塩基
　ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
　ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
　ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
　ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
　ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
　ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
　ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
　ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
　ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
　ＢＨＡ　　　　　：ベンズヒドリルアミン
　ｐＭＢＨＡ　　　：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
　Ｔｏｓ　　　　　：ｐ−トルエンスルフォニル
　Ｂｚｌ　　　　　：ベンジル
　Ｂｏｍ　　　　　：ベンジルオキシメチル
　Ｂｏｃ　　　　　：ｔ−ブチルオキシカルボニル
　ＤＣＭ　　　　　：ジクロロメタン
　ＨＯＢｔ　　　　：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
　ＤＣＣ　　　　　：Ｎ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
　ＴＦＡ　　　　　：トリフルオロ酢酸
　ＤＩＥＡ　　　　：ジイソプロピルエチルアミン
　Ｇｌｙ          ：グリシン
　ＡｌａまたはＡ　：アラニン
　ＶａｌまたはＶ  ：バリン
　ＬｅｕまたはＬ　：ロイシン
　ＩｌｅまたはＩ  ：イソロイシン
　ＳｅｒまたはＳ  ：セリン
　ＴｈｒまたはＴ  ：スレオニン
　ＣｙｓまたはＣ  ：システイン
　ＭｅｔまたはＭ  ：メチオニン
　ＧｌｕまたはＥ  ：グルタミン酸
　ＡｓｐまたはＤ  ：アスパラギン酸
　ＬｙｓまたはＫ  ：リジン
　ＡｒｇまたはＲ  ：アルギニン
　ＨｉｓまたはＨ  ：ヒスチジン
　ＰｈｅまたはＦ  ：フェニルアラニン
　ＴｙｒまたはＹ  ：チロシン
　ＴｒｐまたはＷ  ：トリプトファン
　ＰｒｏまたはＰ  ：プロリン
　ＡｓｎまたはＮ  ：アスパラギン
　ＧｌｎまたはＱ  ：グルタミン
　ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
　Ｆａｍ　　　　　：６−カルボキシ−フルオレセイン
　Ｔａｍｒａ　　　：６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン
　本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
　マウス由来ＰｒＲＰのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
　配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するマウス由来ＰｒＲＰをコードするゲノムＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
　ラット由来ＰｒＲＰのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
　配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するラット由来ＰｒＲＰをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
　ウシ由来ＰｒＲＰのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
　配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するウシ由来ＰｒＲＰをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
　実施例１で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
　実施例１で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
　実施例６で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
　実施例６で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
　実施例６で使用したプライマーの塩基配列を示す。
【００８７】
　後述の実施例１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐｍＧＢ３は、平成９年３月５日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（旧：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８５２として、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に平成９年２月１９日から寄託番号ＩＦＯ　１６０５９として寄託されている。
【００８８】
　後述の実施例２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐｍＧＦＥ１は、平成１０年３月１８日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（旧：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２９８として寄託されている。
【００８９】
　以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載されている方法に従った。
【実施例１】
【００９０】
　マウス・ゲノムＤＮＡからのProlactin  releasing　peptide（PrRP）コード領域を含むＤＮＡの取得及び配列決定
　以下の２種のプライマーを合成した。
ｒＦＢＧ：　５’-AGATTGGCATCATCCAGGAAGACGGAGCAT−３’（配列番号：７）
ｒＲＳＡ：　５’-GTCGACTCAGCAGCACTGTCTTCTCGAGCTG−３’（配列番号：８）
　この２種のプライマーを用いてマウス・ゲノムＤＮＡ（Ｍｏｕｓｅ　ＢＡＬＢ／ｃ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ）０．５ｎｇを鋳型としてＰＣＲ法による増幅を行った。
【００９１】
　反応液の組成は、合成ＤＮＡプライマー各２００ｎＭ、鋳型ＤＮＡ０．５ｎｇ、０．２５ｍＭｄＮＴＰｓ　ＥｘＴａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　０．５μｌおよび酵素に付属のバッファーで、総反応溶液は５０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（パーキンエルマー社）を用い、９５℃・３０秒、６７℃・６０秒を３０ｃｙｃｌｅ繰り返した。増幅産物の確認は１．２％アガロースゲル電気泳動およびエキジウムブロマイド染色によって行い、生じた約１ｋｂのバンドを回収後、ＴＡクローニングキット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてサブクローニングした。そのライゲーションミクスチャーをＥ．ｃｏｌｉ．ＪＭ１０９に形質転換し、挿入断片をもつクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地中で選択し、白色を呈するクローンを分離し、形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐｍＧＢ３を得た。このクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、自動プラスミド抽出装置を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの一部を用いてＡＢＩ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、得られた塩基配列の情報はＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用いて行った。
【００９２】
　決定した塩基配列を解析した結果、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐｍＧＢ３の保持するプラスミドｐｍＧＢ３に挿入されたＤＮＡ断片はマウス型ＰｒＲＰをコードすることが分かった。
【実施例２】
【００９３】
　マウス・ゲノムＤＮＡからのＰｒＲＰ全翻沢領域のＤＮＡの取得及び配列決定
　実施例１で得られたプラスミドｐｍＧＢ３の挿入されたＤＮＡ断片を調整し、この断片をプローブとしてマウスＥＳ細胞（ＲＷ−４（１２９／ＳvＪ））のＢＡＣライブラリーよりｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ＢＡＣ　４９２１）を行った。得られたＢＡＣクローンより、目的とするリガンドペプチドコード領域を含むＤＮＡ断片をｐＵＣ１８　ＶｅｃｔｏｒのＥｃｏＲＩ　部位にサブクローニングし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐｍＧＦＥ１を得て、その配列を決定した（配列番号：２）。
【実施例３】
【００９４】
　ノックアウトマウス作製のためのターゲティングベクターの構築
　ターゲティングベクターの構築には、実施例２で得られたｐｍＧＦＥ１とｐＧＴ−Ｎ２８（ＮＥＢ社）を用いて行った。ｐＧＴ−Ｎ２８のＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にｐｍＧＦＥ１のＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位のＶｓｐＩ部位を含む断片を導入し（マウスＰｒＲＰ遺伝子の５’上流域）、次に、ＸｈｏＩ部位とＮｏｔＩ部位の間にｐｍＧＦＥ１のＨｐａＩ部位とＳａＩＩ部位の断片を（マウスＰｒＲＰ遺伝子の３’下流域）それぞれｌｉｎｋｅｒ　ｌｉｇａｔｉｏｎによりＸｈｏＩ、ＮｏｔＩに改変した後導入することによりｐｍＧＦＥＮ２８を得た。
【実施例４】
【００９５】
　ＥＳ細胞の相同組換え体の取得
　ＥＳ細胞の相同組換え体の取得に関しては　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　社より購入したＥＳ細胞（ＲＷ−４）とその添付マニュアルにしたがって行った。より具体的には実施例３で得られたｐｍＧＦＥＮ２８をＶｓｐＩ及びＮｏｔＩで消化して生ずる約１３ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で回収した後、ＲＷ−４細胞にバイオラッド社のジーンパルサーを用いてエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を行い組換え体を得た。つまりサザン解析で５’側プローブにて１２Ｋｂｐと５．５Ｋｂｐ、３’側プローブにて７．５Ｋｂｐ、５．５Ｋｂｐのバンドが検出できる。その結果クローン、５６ＦＦ、８１ＦＦのクローンが求める相同組換え体と考えられた。
【実施例５】
【００９６】
　ノックアウトマウスの作製
　相同組み換え細胞株Ｎｏ．５６ＦＦをＣ５７ＢＬ／６Ｎ　Ｃｒｊ系統（日本チャールス・リバー社製）マウス胚盤胞へのインジェクションを常法により行った。インジェクションされた胚盤胞は別途精管結紮マウスと交配することによって得られた偽妊娠マウス卵管に移植することによって妊娠させ、Ｎｏ．５６ＦＦ株由来のキメラマウスが産仔として生まれた。雄キメラマウスはＣ５７ＢＬ／６Ｎ　Ｃｒｊ系統雌マウスと交配し、産仔での生殖系列移行およびヘテロマウスの取得を行った。次に、サザンハイブリダイゼーションを行って、遺伝子欠損の確認を行った。さらに確認されたヘテロマウスを交配させることによりホモ欠損マウスの取得を確認した。
【実施例６】
【００９７】
　ＲＴ−ＰＣＲによるＰｒＲＰｍＲＮＡのＫＯマウスにおける組織分布の検討
　鋳型となるｃＤＮＡには、マウス視床下部、延髄由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）から以下の方法で合成したものを使用した。ＲＮＡ１μｇからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従って４２℃で反応を行い、反応終了後にエタノール沈殿して１００μｌに溶解した。ＲＴ−ＰＣＲはＳｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｐｒｉｓｍ　７７００（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、増幅と検出のためのプライマーとして５’−GCTAGGCTTAGTCCTCCCAGGA−３’（配列番号：９），　５’−ATCCCACGACCCGTGTAGCA−３’（配列番号：１０）　およびＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）−CATGGAGACCCGCACCCCTGACATCAA−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：１１）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１２．５μｌに、それぞれ１００μＭのプライマー溶液を０．０５μｌ、５μＭのＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅを０．５μｌ、および上記で調製したｃＤＮＡ溶液を０．５μｌ加え、蒸留水で総反応液量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。得られたマウス視床下部、延髄におけるＰｒＲＰのｍＲＮＡ発現量はpolyA  RNA１ｎｇあたりのコピー数として算出した（図１）。
【実施例７】
【００９８】
　視床下部および延髄におけるＰｒＲＰの発現量
　ＰｒＲＰノックアウトマウスおよび野生型マウスを頚静脈より放血後、視床下部および延髄を摘出した。これら臓器を５ｍｌの蒸留水中にて１０分間煮沸後氷中で冷却し、酢酸およびペプスタチン（ペプチド研究所）を添加して最終濃度をそれぞれ１Ｍおよび１０μｇ／ｍｌとした。ホモジナイザーにて視床下部および延髄を破砕後、溶液中のタンパク濃度をＰｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社）にて測定した。視床下部および延髄破砕溶液は、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、その上清を、４％酢酸含有８６％エタノール４ｍｌ、メタノール４ｍｌ、蒸留水４ｍｌ、４％酢酸４ｍｌを順次ながして活性化したＳｅｐ−ｐａｃｋ　Ｐｌｕｓ　Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に添加した。添加後、１０ｍｌの蒸留水で洗浄後、４％酢酸含有８６％エタノール４ｍｌで溶出し、３７℃の窒素ガス気流下で濃縮する。濃縮画分を０．２５ｍｌのバファーＣ〔１％　ＢＳＡ、０．４Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５％　２ｍＭ　ＥＤＴＡ・Ｎａ〔Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ，　ｄｏｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，　ｄｉｈｙｄｒａｔｅ，ＤＯＪＩＮＤＯ社〕を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０〕中で再構成し、サンドイッチ−ＥＩＡ法により定量した。サンドイッチ−ＥＩＡは、ＰｒＲＰを認識するモノクローナル抗体Ｐ２Ｌ−１Ｃａを１０μｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置後、ウェルの余剰の結合部位をＰＢＳで４倍希釈したブロックエース（大日本製薬）４００μｌを加え不活化したプレートに、バッファーＣで希釈したＰｒＲＰおよび臓器抽出物１００μｌを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、ＨＲＰ標識化Ｐ２Ｌ−１Ｔａ（バッファーＣで２０，０００倍希釈）１００μｌを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム（ＫＩＲＫＥＧＡＡＲＤ＆ＰＥＲＲＹ　ＬＡＢ，ＩＮＣ、フナコシ薬品取り扱い）１００μｌを加え室温で１０分間反応させることにより測定した。反応を１Ｍリン酸１００μｌを加え停止させたのち、４５０ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＢＩＯＣＨＲＯＭＡＴＩＣ、大日本製薬社製）で測定した。
【００９９】
　野生型マウスおよびＰｒＲＰノックアウトマウス各８個体の視床下部および延髄のＰｒＲＰ含量を図２および図３に示す。視床下部のＰｒＲＰ含量（図２）は、雄のＫＯ群；０．６５±０．２２ｆｍｏｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｗｉｌｄ群；３１．４±３．３４ｆｍｏｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、雌のｗｉｌｄ群；ＫＯ群；０．６１±０．１７ｆｍｏｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、３４．９４±３．４５ｆｍｏｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、延髄のＰｒＲＰ含量（図３）は、雄のＫＯ群；２．９２±０．２２ｆｍｏｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｗｉｌｄ群；１５．６２±１．４５ｆｍｏｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、雌のＫＯ群；２．５０±０．３８ｆｍｏｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ｗｉｌｄ群；１９，０１±２．３９ｆｍｏｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであり、雌雄とも視床下部および延髄においてＫＯ群でＰｒＲＰ含量の著しい低下が認められた。
【実施例８】
【０１００】
　ＰｒＲＰノックアウトマウスの体重変化の比較検討における実験方法
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ　ＣｒｊとＪｃｌ：ＩＣＲ（日本クレア社製）の２系統にそれぞれコンジェニック（８世代の戻し交配のあと、ＰｒＲＰヘテロ欠損どうしの交配で得られた第２世代）されたＰｒＲＰホモ欠損マウスおよび野生型マウスを用いた。動物は明期が７：００〜１９：００、温度が２３±２℃、湿度が５５±１０％に自動調節された動物室で、床敷材のペパークリーン（日本エスエルシ−社製）を入れたＴＰＸケージ（１３０×１５０×２１０ｍｍ）に個別収容し、飼料と飲み水を自由摂取させた。なお、ケージは原則として週に一度交換した。
【０１０１】
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ　Ｃｒｊにコンジェニック化されたＰｒＲＰホモ欠損マウスと野生型マウス（雄性，６週齢）を用いた。ホモ欠損マウスおよび野生型マウスの体重はほぼ均一になるように普通食（固形ＣＥ−２：３．４２ｋｃａｌ／ｇ，日本クレア製）給餌と高脂肪食（ｈｉｇｈ　ｆａｔ：４．６５ｋｃａｌ／ｇ−無塩バター：１９％，コーンオイル：２％，カゼイン：１８％，コーンスターチ：５０．９％，その他として無機質，ビタミン，セルロースなど１０．１％）給餌に群分けして１３週齢まで自由摂取させ、餌の違いによる体重の変化を比較検討した。普通食での結果を図４に、高脂肪食での結果を図５に示す。
【０１０２】
　Ｊｃｌ：ＩＣＲにコンジェニック化されたＰｒＲＰホモ欠損マウスおよび野生型マウスは雄性の４週齢を用いた。ホモ欠損マウスおよび野生型マウスの離乳集団より無作為に各１０例を選出し、普通食（固形ＣＥ−２，日本クレア製）を自由摂取させ、１８週齢までの体重の変化を比較検討した（図６）。
【実施例９】
【０１０３】
　通常食あるいは高脂肪食を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｎ　Ｃｒｊ系ＰｒＲＰホモ欠損マウスの体重増加に伴う体脂肪の変化
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ　Ｃｒｊの系統にコンジェニック化（Ｎ８−Ｆ４）されたＰｒＲＰホモ欠損マウスおよび同野生型マウスを用いた。動物は６週齢から通常食（３．４２ｋｃａｌ／ｇ、日本クレアＣＥ−２）または高脂肪食（４．６５ｋｃａｌ／ｇ、コーンオイル２％と無塩バター１９％を含有）を自由摂取させ、１５週齢時にＤＥＸＡ（ｄｕａｌ−ｅｎｅｒｇｙ　Ｘ−ｒａｙ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）（Ｈｏｌｏｇｉｃ　ＱＤＲ−４５００Ａ）により体脂肪量を測定した。
【０１０４】
　次に体脂肪量測定１週間後の１６週齢時に解剖を行い、各種白色脂肪組織（腎周囲、後腹膜、腸間膜、生殖器周囲、鼠蹊部皮下）および肩甲骨間褐色脂肪組織の重量測定を行った。各群の例数は８例とした。
【０１０５】
　通常食給餌下における１５週齢時の平均体重（ｍｅａｎ±ＳＥ）は、野生型マウスの２４．６±０．６ｇに比較してホモ欠損マウスは２７．２±０．９ｇであり、軽度ながら有意（ｐ＜０．０５）な増加が認められた。その時のＤＥＸＡ法による平均体脂肪率（ｍｅａｎ±ＳＥ）は野生型マウスの１４．０±２．５％に対してホモ欠損マウスは１９．５±１．７％と有意ではないが高値傾向を示した。
【０１０６】
　一方、高脂肪食給餌下における平均体重は野生型マウスの２９．８±１．０ｇに対してホモ欠損マウスは３７．６±１．０ｇであり、また体脂肪率も野生型マウスの３４．６±３．５％に比べホモ欠損マウスでは４７．０±１．１％と、共に有意（Ｐ＜０．０１）な増加を示した。
【０１０７】
　体脂肪量測定１週間後の１６週齢時に解剖し、採取した各種脂肪組織重量の平均値（ｍｅａｎ±ＳＥ）を図７に示した。
【０１０８】
　通常食給餌下の解剖時の平均体重は野生型マウスの２４．７±０．６ｇに対し、ホモ欠損マウスは２８．３±１．０ｇであり、有意（ｐ＜０．０１）に高かった。採取した腎周囲、後腹膜、腸間膜、生殖器周囲、そして鼠蹊部皮下の各白色脂肪組織は野生型マウスに比べホモ欠損マウスでは絶対値および相対値ともに有意（ｐ＜０．０５〜０．０１）に大きかった。褐色脂肪組織重量には野生型マウスとホモ欠損マウス間に差はなかった。
【０１０９】
　一方、高脂肪食給餌下においても通常食給餌同様、野生型マウスに比べホモ欠損マウスは体重をはじめ脂肪組織重量において、絶対値ではすべてに有意（ｐ＜０．０５〜０．０１）な高値が認められた。相対値は腸間膜、生殖器周囲、鼠蹊部皮下の脂肪組織に有意（ｐ＜０．０５〜０．０１）な高値が認められ、腎周囲、後腹膜の脂肪組織では高値傾向にあった。
【０１１０】
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ　Ｃｒｊ系ＰｒＲＰホモ欠損マウスでは、Ｊｃｌ：ＩＣＲ系にコンジェニック化された場合と同様、通常食給餌下においても体重の増加が認められたが、その程度は高脂肪食給餌によりさらに増大し、体脂肪の増加を伴っている事実が確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】マウス視床下部（Hypothalamus）および延髄（Medulla）におけるマウスＰｒＲＰの発現分布図を示す。横軸のＫＯはマウスＰｒＲＰノックアウトマウスを、Ｗｉｌｄは野生型マウスを、Ｍａｌｅはオスを、Ｆｅｍａｌｅはメスを示す。縦軸はコピー数を示す。
【図２】野生型マウスおよびＰｒＲＰノックアウトマウス各８個体の視床下部のＰｒＲＰ含量を示す。ｈｏｍｏはＰｒＲＰノックアウトマウスを、ｗｉｌｄは野生型マウスを示す。縦軸のｉｒ−ＰｒＲＰ（ｆｍｏｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）はＰｒＲＰ含量を示す。ｍａｌｅはオスを、ｆｅｍａｌｅはメスを示す。
【図３】野生型マウスおよびＰｒＲＰノックアウトマウス各８個体の骨髄のＰｒＲＰ含量を示す。ｈｏｍｏはＰｒＲＰノックアウトマウスを、ｗｉｌｄは野生型マウスを示す。縦軸のｉｒ−ＰｒＲＰ（ｆｍｏｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）はＰｒＲＰ含量を示す。ｍａｌｅはオスを、ｆｅｍａｌｅはメスを示す。
【図４】Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ　Ｃｒｊ系統マウスにコンジェニック化されたＰｒＲＰホモ欠損マウスの普通食による成長曲線を示す。横軸のＡｇｅ（ｗｅｅｋｓ）は週齢を、縦軸のＢｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ（ｇ）は体重を示す。●は野生型マウスを、○はＰｒＲＰホモ欠損マウスを示す。＊はｐ＜０．０５ ｖｓ 野生型マウス（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）を示す。
【図５】Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ　Ｃｒｊ系統マウスにコンジェニック化されたＰｒＲＰホモ欠損マウスの高脂肪食による成長曲線を示す。横軸のＡｇｅ（ｗｅｅｋｓ）は週齢を、縦軸のＢｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ（ｇ）は体重を示す。●は野生型マウスを、○はＰｒＲＰホモ欠損マウスを示す。Ｍｅａｎ±ＳＥ（ｎ＝８）。＊＊はｐ＜０．０１ ｖｓ 野生型マウス（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）を示す。
【図６】Ｊｃｌ：ＩＣＲ系統マウスにコンジェニック化されたＰｒＲＰホモ欠損マウスの普通食による成長曲線を示す。横軸のＡｇｅ（ｗｅｅｋｓ）は週齢を、縦軸のＢｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ（ｇ）は体重を示す。●は野生型マウスを、○はＰｒＲＰホモ欠損マウスを示す。＊はｐ＜０．０５ ｖｓ 野生型マウス（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）を示す。＊＊はｐ＜０．０１ ｖｓ 野生型マウス（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）を示す。
【図７】通常食または高脂肪食を給餌したＰｒＲＰホモ欠損マウス（Ｈｏｍｏ）および野生型マウス（Ｗｉｌｄ）の各種脂肪組織重量を示す。ＢＷは体重（Ｂｏｄｙ　Ｗｅｉｇｈｔ）を示す。Ｍｅａｎ±ＳＥ（ｎ＝８）。＊はｐ＜０．０５ ｖｓ 野生型マウス（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）を示す。＊＊はｐ＜０．０１ ｖｓ 野生型マウス（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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