(57)【要約】　　　（修正有）【課題】本発明は、細胞誘導タンパク質のファミリーのネトリンに対してレセプターとして機能する脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質に関する方法と組成物を提供する。本タンパク質は開示された脊椎動物ＵＮＣ−５コード核酸からの形質移入宿主細胞から組換え的に産生されてもヒト細胞から精製してもよい。本発明は開示された脊椎動物ｕｎｃ−５遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な特異的ハイブリダイゼーションプローブ及びプライマー、特異的抗体のような脊椎動物ＵＮＣ−５特異的結合薬剤、及び主題組成物を製造し、診断法、治療法及び生物製剤工業において使用する方法を提供する。【解決手段】ラットとヒト由来の天然ｕｎｃ５ｈ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列とその概念的翻訳物、及びラットとヒト由来の天然ｕｎｃ５ｈ−２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と概念的翻訳物は特定配列としてそれぞれ示される。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５、６、７又は８、あるいは脊椎動物ＵＮＣ−５特異的活性を有するそのフラグメントを含んでなる単離脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質。
【請求項２】
上記タンパク質が天然のネトリンタンパク質を特異的に結合する請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質をコードしている組換え核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を含んでなる細胞。
【請求項５】
単離脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質の調製方法において、請求項３に記載の核酸を宿主細胞又は細胞抽出物中に導入し、上記核酸が転写物として発現し、該転写物が上記タンパク質を含んでなる翻訳産物として発現される条件下で上記宿主細胞又は抽出物をインキュベートし、上記翻訳産物を単離する工程を含んでなる方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により調製された単離脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質。
【請求項７】
配列番号１、２、３、又は４、あるいは配列番号１、２、３、又は４の少なくとも２４の連続塩基を有し、天然の線虫ｕｎｃ−５ｃＤＮＡの存在下で対応する配列番号１、２、３、又は４の配列を有する核酸と特異的にハイブリダイズするのに充分なそのフラグメントを含んでなる単離脊椎動物ｕｎｃ−５核酸。
【請求項８】
脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質の結合標的への結合を変調する薬剤のスクリーニング方法において、
　請求項１に記載の単離タンパク質、上記タンパク質の結合標的、及び候補薬剤を含む混合物を、該薬剤の存在下で該タンパク質が参照親和性をもって上記結合標的に特異的に結合する条件下で、インキュベートし、
　上記結合標的に対する上記タンパク質の結合親和性を検出して薬剤偏向親和性を決定する工程を含んでなり、
　薬剤偏向親和性と参照親和性の間の差が、上記結合標的に対する上記タンパク質の結合を上記薬剤が変調することを示す方法。
【請求項９】
上記結合標的が天然のネトリンタンパク質である請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：マルク  テシエーラヴィニュ、イー．デビット  レオナルド、リンジーヒンク、マサユキ  マス、カズコ  ケイノ−マス
【０００２】
本件出願においてなされた研究はアメリカ国立衛生研究所の助成金により一部が支援されたものである。政府はこの出願に基づいて発行されるあらゆる特許に権利を有するものである。
この発明の分野は脊椎動物の細胞誘導を調節するタンパク質である。
【背景技術】
【０００３】
発達中の神経系において、遊走細胞と軸索は細胞外環境のキューによってその標的まで案内される。ネトリンは、異なったクラスの細胞と軸索に対する拡散性誘引物質及び忌避物質として機能し得る系統学的に保存された誘導キューのファミリーである1-10。脊椎動物、昆虫及び線形動物での最近の研究は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのＤＣＣサブファミリーメンバーをネトリン源に向けての遊走に関与しているレセプターとして関係づけた6,11-13。遊走をネトリン源から遠ざかるように方向付ける機構（おそらくは反発）は殆ど理解されていない。線虫（Caenorhabditis elegans）では（膜貫通タンパク質ＵＮＣ−５14をコードする）ｕｎｃ−５機能の喪失がこれらの遊走に欠陥を生じせしめ15,16、あるニューロン中でのｕｎｃ−５の異所性発現がその軸索を再びネトリン源から遠ざかるように方向付け得る17。しかし、ＵＮＣ−５とネトリンの間の関係は知られていなかった。本明細書において我々は、Ｉｇスーパーファミリーの新規なサブファミリーであり、ｍＲＮＡが様々なクラスの分化ニューロン中で明白な発現を示す線虫ＵＮＣ−５の脊椎動物相同体を開示し、これら脊椎動物のＵＮＣ−５相同体が脊椎動物のネトリン結合タンパク質であることを開示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の概要
本発明は、脊椎動物のＵＮＣ−５タンパク質、関連する核酸、及び脊椎動物のＵＮＣ−５特異的活性を有するそのタンパク質ドメインに関する方法及び組成物を提供する。該タンパク質は対象脊椎動物のＵＮＣ−５コード核酸由来の形質移入宿主細胞から組換え的に産生されても脊椎動物細胞から精製されてもよい。本発明は、開示された脊椎動物ｕｎｃ−５遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な単離脊椎動物ｕｎｃ−５ハイブリダイゼーションプローブとプライマー、特異的抗体のような脊椎動物ＵＮＣ−５特異的結合薬剤、及び主題組成物を製造し、診断法（例えば、脊椎動物ｕｎｃ−５転写物に対する遺伝子ハイブリダイゼーションスクリーン）、治療法（例えば脊椎動物のｕｎｃ−５遺伝子発現を変調する遺伝子療法）及び生物薬剤工業（例えば免疫原、細胞誘導の変調試薬、薬理学的リード薬剤のために化学ライブラリをスクリーニングするための試薬等々）に使用する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の詳細な説明
ラットとヒト由来の天然ｕｎｃ５ｈ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号１及び２としてそれぞれ示され；概念的翻訳物は配列番号５及び６としてそれぞれ示される。ラットとヒト由来の天然ｕｎｃ５ｈ−２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号３及び４としてそれぞれ示され；概念的翻訳物は配列番号７及び８としてそれぞれ示される。本発明の脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質は配列番号１、２、３及び４の不完全翻訳物と配列番号５、６、７及び８の欠失変異体を含み、この翻訳物と欠失変異体は脊椎動物ＵＮＣ−５特異的アミノ酸配列とアッセイにより識別可能な脊椎動物ＵＮＣ−５特異的結合特異性又は機能を有する。このような活性な脊椎動物ＵＮＣ−５欠失変異体、脊椎動物ＵＮＣ−５ペプチド又はタンパク質ドメインは、配列番号５、６、７又は８の少なくとも約８、好ましくは少なくとも約１２、より好ましくは少なくとも２４の連続残基を含んでなる。例えば、以下に同定される脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質ドメインは、以下に記載されているように、とりわけ固相結合実験において同定され使用されるタンパク質結合ドメインを提供することが示される。
【０００６】
脊椎動物ＵＮＣ−５特異的活性又は機能は、簡便なインビトロ、細胞ベース、又はインビボ実験：例えばインビトロ結合実験、細胞培養アッセイ、動物（例えば遺伝子療法、遺伝子組換え等々）により決定することができる。結合実験は、結合標的との脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質の分子相互作用が評価されるあらゆるアッセイを包含する。結合標的は、ネトリンタンパク質、又は脊椎動物ＵＮＣ−５活性もしくはその局在化を直接変調する他の制御因子のような天然細胞外結合標的であっても；あるいは抗体のような特異的免疫タンパク質、又は以下に記載するようなスクリーニング検定において同定されるもののような脊椎動物ＵＮＣ−５特異的薬剤のような非天然結合標的であってもよい。
【０００７】
脊椎動物ＵＮＣ−５結合特異性は、結合平衡定数（通常少なくとも約１０7Ｍ-1、好ましくは少なくとも約１０8Ｍ-1、より好ましくは少なくとも約１０9Ｍ-1）により、脊椎動物ＵＮＣ−５発現細胞において負の変異体として機能し、異種性哺乳動物宿主（例えばげっ歯類又はウサギ）において脊椎動物ＵＮＣ−５特異的抗体を誘発する主題タンパク質の能力等々により、検定することができる。とにかく、主題脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質の脊椎動物ＵＮＣ−５結合特異性は必ず線虫ＵＮＣ−５を区別する。
【０００８】
本発明に係る脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質は単離されるか純粋である：「単離」タンパク質は、天然の状態では付随している物質の少なくとも幾らかを伴っておらず、この量は、与えられた試料中の全タンパク質の好ましくは少なくとも約０．５％，より好ましくは少なくとも約５％を構成し、純粋なタンパク質は与えられた試料中の全タンパク質の少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９９％を構成する。脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質とタンパク質ドメインは合成されても、組換え技術により産生されても、あるいは哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞から精製されてもよい。非常に広範な分子及び生化学的方法が主題組成物の生化学合成、分子発現及び精製に利用できる。例えば、Molecular Cloning,ALaboratory Manual（分子クローニング、実験室マニュアル）(Sambrookら、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）、Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学における現在のプロトコール）(Ausubelら編、Greene Publ. Assoc.,Wiley-Interscience,NY)あるいは当該分野でその他知られているものを参照されたい。
【０００９】
本発明は、天然及び非天然脊椎動物ＵＮＣ−５特異的結合薬剤、かかる薬剤を同定し調製する方法、及び診断法、治療法及び製薬開発におけるその用途を提供する。例えば、脊椎動物ＵＮＣ−５特異的薬剤は様々な診断及び治療用途に有用である。脊椎動物ＵＮＣ−５特異的結合薬剤には、脊椎動物ＵＮＣ−５特異的リガンド、例えばネトリン、及び特異的抗体もしくはＴ細胞抗原レセプターのような体細胞性組換えプロテインレセプター（例えばHarlowとLane（１９８８）Antibodies,A Laboratory Manual(抗体、実験室マニュアル)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）及び例えば一重、二重及び三重ハイブリッドスクリーンのようなアッセイで同定されるその他の天然結合薬剤、以下に記載するような化学ライブラリのスクリーンで同定される非天然結合薬剤等々が包含される。診断用途では、結合薬剤は、例えば蛍光、放射能、化学発光、あるいは他の容易に検出可能な分子でしばしば標識され、結合薬剤に直接抱合され、又は結合薬剤に特異的なプローブに抱合される。特に興味がある薬剤は脊椎動物ＵＮＣ−５機能、例えば脊椎動物ＵＮＣ−５依存性細胞誘導を変調する；例えば単離細胞、全組織、あるいは個体を脊椎動物ＵＮＣ−５結合薬剤で処理して脊椎動物ＵＮＣ−５依存性細胞誘導又は機能を活性化、阻害、又は変更する。
【００１０】
本発明は、翻訳可能転写物、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、診断用核酸等々としての用途；ｕｎｃ−５遺伝子及び遺伝子転写物の存在の検出及び更なるｕｎｃ−５相同体又はＵＮＣ−５構造類似体をコードする核酸の検出あるいは増幅における用途を含む広範囲の用途が見出されるＵＮＣ−５関連核酸を提供する。主題核酸は合成／非天然配列のものか及び／又は単離される、すなわち、天然の状態で付随している物質の少なくとも幾らかを伴わず、この量は、与えられた画分中に存在する全核酸の好ましくは少なくとも約０．５％，より好ましくは少なくとも約５％を構成し、通常は、天然染色体上で結合しているもの以外のヌクレオチド（群）に結合した天然配列又は非天然配列を含んでなることを意味する組換え体である。配列番号１、２、３又は４のヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含んでなる核酸は、そのような配列又はフラグメントを、天然染色体上で結合しているもの以外の配列が直ぐ隣に位置している末端か、天然染色体上で結合しているもの以外の配列が直ぐに隣に位置しているか末端にある１０ｋｂ、好ましくは２ｋｂよりも小さい負のフランキング領域が隣に位置している末端に含んでいる。核酸は通常はＲＮＡもしくはＤＮＡであるが、他の塩基又はヌクレオチド類似体を含んでなる核酸を使用して安定性を修正する等々もしばしば好適である。
【００１１】
開示した脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質のアミノ酸配列は、選択発現系に対して最適化された脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質コード核酸を逆翻訳するために使用されるか（Hollerら（1993）Gene 136,323-328;Martinら（1995）Gene 154,150-166）、天然の脊椎動物ＵＮＣ−５コード核酸配列の単離に使用される変性オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブ（「ＧＣＧ」ソフトウェア、ジェネティクス・コンピュータ・グループ・インク、マディソンＷＩ）を産生するために使用され、脊椎動物ＵＮＣ−５発現核酸は、脊椎動物ＵＮＣ−５発現ベクターに使用され、例えば発現及びスクリーニング用の組換え宿主細胞、例えば脊椎動物ＵＮＣ−５変調化転写に関与する疾患に対する候補薬の効能等の機能性研究のための遺伝子組換え動物に導入される。
【００１２】
本発明はまた、配列番号１、２、３又は４に含まれる脊椎動物ＵＮＣ−５ｃＤＮＡ特異的配列を有し、それに対して特異的ハイブリダイゼーションを行う（すなわち、線虫ｕｎｃ−５ｃＤＮＡの存在下で対応の配列番号１、２、３又は４に特異的にハイブリダイズする）のに充分な核酸ハイブリダイゼーションプローブ及び複製／増幅プライマーを提供する。かかるプライマーもしくはプローブは、少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも３６、更に最も好ましくは少なくとも９６の塩基長である。特異的ハイブリダイゼーションを証明するには一般に厳密な条件、例えば４２℃の温度で５ｘＳＳＰＥ（０．１８ＭのＮａＣｌ、０．０１ＭのＮａＰＯ4、ｐＨ７．７、０．００１ＭのＥＤＴＡ）中に３０％のホルムアミドを含むバッファー中でハイブリダイズし４２℃において０．２ｘＳＳＰＥでの洗浄を行ったとき結合したまま残る条件、好ましくは例えば４２℃の温度で５ｘＳＳＰＥ中に５０％のホルムアミドを含むバッファー中でハイブリダイズし４２℃において０．２ｘＳＳＰＥでの洗浄を行ったとき結合したまま残る条件を必要とする。脊椎動物ＵＮＣ−５ｃＤＮＡはまた例えばＢＬＡＳＴＸ（Atschulら(1990)Basic Local Alignment Search Tool,J Mol Biol215,403-410）のような整合化アルゴリズムを使用して他のタンパク質から区別することもできる。
【００１３】
脊椎動物ｕｎｃ−５ハイブリダイゼーションプローブは、臨床及び研究室試料中の野生型及び変異体脊椎動物ｕｎｃ−５対立遺伝子を同定するために使用される。変異体対立遺伝子は、高処理臨床診断に対する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブを産生するために使用される。例えば、治療用脊椎動物ＵＮＣ−５核酸は活性な脊椎動物ＵＮＣ−５の細胞発現もしくは細胞内濃度又は利用能を変調するために使用される。脊椎動物ＵＮＣ−５阻害核酸は典型的には開示された天然脊椎動物ＵＮＣ−５コード配列の相補を含んでなるアンチセンス、一本鎖配列である。与えられた脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質の発現のアンチセンス変調には遺伝子調節配列に作用可能に連結したアンチセンス核酸を使用してもよい。遺伝子の転写が内因性脊椎動物ＵＮＣ−５コードｍＲＮＡに結合可能なアンチセンス転写物を生じるように配向されたプロモータ配列を持つ脊椎動物ＵＮＣ−５配列を含んでなるベクターを細胞に形質移入する。アンチセンス核酸の転写は構成的又は誘発性であり、ベクターは安定した染色体外イメンテナンス又は組込みをもたらし得る。別法としては、与えられた脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質をコードするゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡに結合する一本鎖アンチセンス核酸を、標的タンパク質の発現が大幅に減少する濃度で、宿主中の又は宿主から一時的に単離された標的細胞に投与してもよい。脊椎動物ＵＮＣ−５発現の増強は、対応遺伝子産物の機能性発現を増大させる脊椎動物ＵＮＣ−５核酸を標的細胞型中に導入することにより行われる。このような核酸は脊椎動物ＵＮＣ−５発現ベクター、内因性対立遺伝子の機能性発現を上方制御するベクター、又は変異体対立遺伝子の標的修正のための置換ベクターであってもよい。生きた細胞中に核酸を導入する技術は当該分野において知られており、レトロウィルスベースの形質移入、ウィルスコートタンパク質−リポソーム性形質移入等々が含まれる。
【００１４】
本発明は脊椎動物ＵＮＣ−５変調性細胞機能のレベルで活性な薬剤に対する薬剤、化合物又はリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。一般に、これらのスクリーニング法は天然の脊椎動物ＵＮＣ−５結合標的との脊椎動物ＵＮＣ−５相互作用を変調する化合物に対するアッセイを含む。標識インビトロタンパク−タンパク結合アッセイ、イムノアッセイ、細胞ベースアッセイ、動物ベースアッセイ等々を含む結合薬剤に対する広範なアッセイが提供される。好ましい方法は、リード化合物に対しての化学ライブラリの自動でコスト性能の良い高処理スクリーニング受け入れられる。このようなライブラリは数多くの化学クラスの候補薬剤を包含するが、典型的には有機化合物；好ましくは小さい有機化合物であり、合成もしくは天然化合物のライブラリを含む広範なソースから得られる。同定された薬剤は動物及びヒト治験のために製薬工業で使用さえる；例えば薬剤は誘導体化し、インビトロ及びインビボアッセイで再スクリーニングして製薬開発のための活性を最適化し毒性を最小化する。
【００１５】
インビトロ結合アッセイでは、他のペプチド又はポリペプチド、例えば検出もしくは固着用のタグ等との融合産物の一部であってもよい脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質を含む成分の混合物を使用する。アッセイ混合物は例えばネトリンのような天然の細胞外脊椎動物ＵＮＣ−５結合標的を含む。天然の結合標的を使用してもよいが、その部分がアッセイにおいて簡便に測定可能な主題脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質に対して結合親和性及び結合活性をもたらす限り、その部分（例えばペプチド）を使用することがしばしば好ましい。アッセイ混合物はまた候補薬理剤及び典型的には塩、バッファー、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等々のような様々なその他の試薬を含有する。混合物成分は、要求された結合をもたらす任意の順序で添加することができ、最適な結合を容易にする任意の温度でインキュベーションを実施してもよい。ついで、混合物は、候補の薬理剤が存在しなかったら脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質が細胞結合標的、参考結合親和性を持つ部分又は類似体に特異的に結合するような条件下でインキュベートされる。インキュベート期間は同様に最適結合となるように選択されるが、迅速な高処理スクリーニングを容易にするように最小化される。
【００１６】
インキュベート後、脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質と一又は複数の結合標的の間の薬剤偏向結合が検出される。しばしば分離工程が未結合成分から結合成分を分離するために最初に使用される。分離は、沈降（例えばＴＣＡ沈降、免疫沈降等々）、固定化（例えば固体基質上）等々により実施してもよく、続いて、例えば膜ろ過、ゲルクロマトグラフィー（例えばゲルろ過、アフィニティー等々）による洗浄が続く。成分の一つは通常標識を含むか標識に結合される。標識は、放射能、発光、光学もしくは電子密度等々のような直接的検出をもたらすものでも、あるいはエピトープタグ、酵素等々のような間接的検出をもたらすものでもよい。標識と他のアッセイ成分、例えば光学又は電子密度、放射性放射線、非放射性エネルギー移動等々の性質に応じて、様々な方法を使用して標識を検出することができ、あるいは抗体抱合体等々で間接的に検出される。薬剤の存在下での結合アフィニティーと比較して薬剤の非存在下における標的に対する脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質の結合アフィニティーの差は、薬剤が脊椎動物ＵＮＣ−５結合標的に対する脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質の結合を変調することを示している。同様に、以下に記載される細胞ベース転写アッセイにおいても、薬剤の存在及び不存在下における脊椎動物ＵＮＣ−５転写誘導の差は、薬剤が脊椎動物ＵＮＣ−５誘発転写を変調することを示している。本明細書において使用される差は、統計的に有意であり、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％の差を表す。
【００１７】
次の実験部分と実施例は例証のために提供するもので限定をなすものではない。
【００１８】
実験
ＵＮＣ５Ｈ−１（配列番号１）とＵＮＣ５Ｈ−２（配列番号３）と命名したＵＮＣ−５の２つのラット相同体をコードするｃＤＮＡを、Ｅ１８ラット脳ｃＤＮＡライブラリから単離した（方法の項を参照されたい）。予想タンパク質（配列番号５及び７）はその全長にわたってＵＮＣ−５と配列類似性を示すが、ＵＮＣ−５に対してよりも（２８％同一性）互いにより類似している（５２％同一性）。ＵＮＣ−５同様14、双方が、その細胞外ドメインに２つの予想Ｉｇ様ドメイン及び２つの予想トロンボスポジン型−１反復、予想膜貫通領域、及び大きい細胞内ドメインを保有する。ＵＮＣ５Ｈタンパク質はまたそれぞれ奇妙なことにＵＮＣ−５14に欠けるシグナル配列を有している。細胞膜におけるＵＮＣ５Ｈタンパク質の予想トポロジーは形質移入細胞中に発現されたタンパク質の組換え版及び細胞外及び細胞内ドメインに対して向けられた抗体を用いて実証された（方法の項を参照されたい）。２つのＵＮＣ５Ｈタンパク質の細胞質ドメインは明白なシグナル伝達モチーフを含んでいないが、粘着接合部に局在化し接合部の形成に関係するタンパク質であるゾナ・オクルーデンス−１（ＺＯ−１）に対する相同小領域を有している18,19。ＺＯ−１はＰＤＺドメインを含み18,19、構造はタンパク質クラスター形成を意味するが20、ＵＮＣ−５相同体との相同領域はＺＯ−１のカルボキシ末端のユニーク配列に対応する。ＺＯ−１と線虫ＵＮＣ−５の相同性は明白ではないが（またコンピュータＢＬＡＳＴサーチにより検出されていない）、４つ全ての配列を整合すると明白である。
【００１９】
ＵＮＣ−５相同体が神経細胞遊走もしくは軸索誘導に関与したレセプター候補であるかどうかを決定するために、我々はラット胎仔でのインサイツハイブリダイゼーションにおいてＲＮＡによりＵｎｃ５ｈ−１及びＵｎｃ５ｈ−２の発現部位を最初に調べた。Ｕｎｃ５ｈ−１転写物は腹側脊髄の神経管の初期段階で検出される。胎仔１１日（Ｅ１１）では、運動ニューロンがその領域で分化し始めると21、正中線床板領域（midline floor plate region）を除く腹側脊髄全体にわたって転写物が存在するが、心室領域と側縁において最も強い。Ｅ１２では、運動柱において明白な発現が観測されるが、更に背側に延びており、心室領域は除外されている。これにより背側の発現は、Ｅ１３による発現が明らかに運動ニューロンを含む腹側脊髄の分裂終了細胞に限局されているので、一過性であるようである。Ｕｎｃ５ｈ−２転写物は、蓋板領域にそれが見出されるＥ１４までは、脊髄には有意なレベルでは検出されない。しかし、Ｕｎｃ５ｈ−２は、脊髄の隣の発達中の感覚神経節において、Ｅ１２では低レベルで、Ｅ１４になると高レベルで検出される。しかして、これら二種の遺伝子の発現が、分化ニューロンに軸索形成(axonogenesis)が生じている領域において認められ、このプロセスにおける可能な役割と一致する。
【００２０】
これらの遺伝子の発現はまた神経系の高い軸レベル並びに非神経構造において認められる。Ｅ１３では、Ｕｎｃ５ｈ−１は後脳及び中脳の基板（腹側神経管）、発達中の視床下部及び視床、及び淡蒼球において発現される。この段階でのＵｎｃ５ｈ−２発現は、発達中の眼杯、鼻孔、肢芽の頂堤、泌尿生殖器結節の背側に、及び中脳と尾側間脳の限られた領域に検出される。Ｅ１６では、Ｕｎｃ５ｈ−１ｍＲＮＡはまた嗅内皮質において高レベルで、皮質全体にわたってより低レベルで検出される。Ｕｎｃ５ｈ−２はまたこの段階で皮質中に低レベルで、肥大性軟骨細胞中に高レベルで検出される。この二腫の相同体の発現は出生後も持続し、出生１０日後（Ｐ１０）に、皮質全体にわたって低レベルで双方が発現し、中隔野に区別されるパターンで双方が発現し、発達中の視床下部と嗅内皮質中に高レベルのＵｎｃ５ｈ−１発現が続く。加えて、双方の遺伝子の出生後の発現の顕著な部位が小脳においてである。双方の遺伝子が内部顆粒細胞層に発現され、Ｕｎｃ５ｈ−２がまた外胚層の内部側に発現され、ここで顆粒細胞前駆物質が内部顆粒細胞における最終目的地への遊走に先立ち分化する22,23。しかして、この領域におけるＵｎｃ５ｈ−２の発現は発達中の小脳における顕著な細胞遊走事象に付随している。
【００２１】
二種のＵＮＣ５Ｈタンパク質の発現パターンは細胞又は軸索遊走における潜在的な役割を示唆していたが、ネトリンに対する応答の媒介に関係付けるより直接的な証拠を得るために、我々はネトリン−１がこれらのタンパク質を発現する細胞を結合するかどうかを試験した。ＵＮＣ５Ｈ−１かＵＮＣ５Ｈ−２の何れかを発現する形質移入サル腎臓ＣＯＳ−１細胞又はヒト胚性腎臓２９３細胞は、ネトリンレセプターＤＣＣ及びネオジェニン（neogenin）を発現する形質移入細胞に対してまた認められるように、バックグラウンドを超えるネトリン−１タンパク質の有意な結合を示したが、Ｉｇスーパーファミリーの二種の他のメンバーであるＴＡＧ−１又はＬ１を発現する形質移入細胞には認められない13。これらの実験において、結合は、細胞へのネトリン−１の特異的結合を排除するが13、ＵＮＣ５相同体への結合を明らかに妨げない可溶性ヘパリンの存在下でなされた。ＵＮＣ５Ｈ−２の場合には、外因的に添加されたヘパリンは相互作用には必要とされないことを証明するために、我々はヒト免疫グロブリン分子の定常領域（Ｆｃ）にＵＮＣ５Ｈ−２の細胞外ドメインが融合してなる可溶性タンパク質を産生した。このＵＮＣ５Ｈ−２−Ｆｃ融合タンパク質は、添加されるヘパリンの不在下でネトリン−１（その幾らかは細胞の表面に結合して残る3,10）を発現する形質移入２９３細胞に結合したが、非形質移入細胞とＵＮＣ５Ｈ−２自体を発現する細胞、ＤＣＣ、又はネオジェニンの何れに対する結合も示さなかった。ＵＮＣ５Ｈ−２−Ｆｃ融合体はまた床板細胞により生成される接着性細胞外基質タンパク質であるＦ−スポンジン24、又は感覚神経節にＵｎｃ５ｈ−２が発現される段階での感覚軸索に対する化学忌避物質25であるセマホリンIIIを発現する形質移入細胞は結合しなかった。ネトリン−１同様、これらのタンパク質は分泌されるが細胞表面と可溶性画分の間に分配される24、26。しかして、ネトリン−１とＵＮＣ５Ｈ−２の間の相互作用は特異的であるとみられ、ヘパリンを必要としないし、細胞表面に非特異的に結合するタンパク質と普遍的相互作用を示しもしない。
【００２２】
ネトリン−１に対するＵＮＣ−５相同体の親和性を、ヒトＩｇＧの定常部分にネトリン−１のアミノ末端２／３部分を融合したネトリン(ＶＩｏＶ)-Ｆｃを使用する平衡結合実験において推定した13。このネトリン−１誘導体は生物活性であるが、ネトリン−１とは異なり、高濃度で凝集せず、全長ネトリン−１のものに匹敵するＫｄでＤＣＣを結合する13。三種のＵＮＣ５相同体の各々に対するネトリン(ＶＩｏＶ)-Ｆｃの特異的結合は飽和を示し、結合曲線をヒルの式にフィットさせＵＮＣ５Ｈ１とＵＮＣ５Ｈ２に対してそれぞれ１９±０．８ｎＭと３．４±１．０ｎＭのＫｄ値であった。これらの値はＤＣＣ−ネトリン(ＶＩｏＶ)-Ｆｃ)相互作用に対するＫｄ（〜５ｎＭ）に匹敵し、ネトリン−１の軸索成長促進効果の有効量と一致している2,13。
【００２３】
細胞遊走と軸索誘導におけるこれら脊椎動物ＵＮＣ５Ｈの関与を証明するには、その機能をインビボで撹乱させることが必要である。さて、しかしながら、我々の結果は、遊走を被り軸索を伸展しているある集団の細胞によりこれら相同体が発現されるので、そのような関与と少なくとも一致している。例えば、Ｕｎｃ５ｈ１は脊髄運動ニューロンにより発現され、その軸索は床板細胞によりインビトロで忌避され27、インビトロでのその成長はネトリン−１により抑えることができる。これはまた滑車運動ニューロンの領域にも発現され、これはネトリン−１により忌避することができる4。双方のＵｎｃ５ｈ遺伝子はまた発達中の小脳にも発現され、この小脳は広範な細胞遊走の部位である。
【００２４】
ここに記載したＵＮＣ−５相同体のインビボ機能を測定する必要はあるが、脊椎動物ＵＮＣ５Ｈタンパク質がネトリン−１を結合するという我々の証拠は、Ｉｇスーパーファミリーのこの新規なサブファミリーのメンバーがネトリンレセプターであるという考えに対する直接の裏づけをもたらす。この考えは、ｕｎｃ−５はネトリンＵＮＣ−６の機能を必要とする背側遊走に対して自律的に必要とされる細胞であり14、通常は縦方向又は腹側方向に突出するニューロンにおけるｕｎｃ−５の異所性発現がその軸索を背側に向けて進め得る17、という発見に基づいて線虫ＵＮＣ−５に対して最初に提案された。ＵＮＣ−５はＵＮＣ−６レセプターであるという可能性と一致していたが、これらの結果はまた別のＵＮＣ−６レセプターの機能の修飾におけるＵＮＣ−５の役割にも一致している。修飾因子機能の可能性は、腹側遊走に関与する推定ＵＮＣ−６レセプターである11、ＤＣＣ相同ＵＮＣ−４０が、背側に突出する軸索により発現され、その突出に必要とされ11,15,16、ＵＮＣ−５は誘引性ネトリンレセプター（ＵＮＣ−４０）を忌避性ネトリンレセプターに切換えることにより機能するかもしれないことを示唆している証拠により更に強いものになった。しかしながら、我々の結果は、ＵＮＣ−５がまたネトリンレセプターとして直接機能することを示唆している。ＵＮＣ−４０とＵＮＣ−５がレセプター複合体を形成可能であるがＵＮＣ−５がＵＮＣ−６ネトリンのシグナル伝達にもまた単独で機能可能であるモデルは、ｕｎｃ−４０機能の喪失が、ｕｎｃ−５機能喪失又はｕｎｃ−６機能喪失の何れかよりも背側遊走に対するあまり厳しくない表現型となるという知見の説明を提供する15,16。
【００２５】
細菌の研究では、線形動物、ハエ及び脊椎動物の神経系の正中線のネトリン源に向けての軸策の案内におけるネトリンタンパク質の機能が顕著に系統的に保存されていることが証明され１，７，８，９、これらの案内事象の根底にある軸索応答を媒介するＩｇスーパーファミリーのＤＣＣサブファミリーのメンバーの保存された役割が証明された11,12,13。ＵＮＣ−５の脊椎動物相同体の同定と、これらがネトリン結合タンパク質であるという証拠は、ネトリンが忌避応答を誘発するシグナル伝達機構もまた保存されていることを示唆している。
【００２６】
ラットＵＮＣ−５相同体の単離及びインサイツハイブリダイゼーション。ヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースを調査して、ＵＮＣ−５のカルボキシ末端タンパク質に遠い類似性を有する小さな配列（ジェンバンク受託番号Ｒ１１８８０）が明らかになった。胎児ヒト脳ｃＤＮＡライブラリ（ストラータジーン）からポリメラーゼ連鎖反応により増幅された対応するｃＤＮＡフラグメントを使用してライブラリをスクリーニングし、ＵＮＣ５Ｈ１のヒト相同体のコード領域の最初の４４０ｎｔを除く全てを含んでなる３．８ｋＢのｃＤＮＡクローンが単離される。このｃＤＮＡからの非オーバラッププローブを使用して、Ｅ１８ラット脳ライブラリ（S.Nakanishiの提供物）をスクリーニングして、７つの部分的及び一つの全長ＵＮＣ５Ｈ１ｃＤＮＡと一つの全長ＵＮＣ５Ｈ２ｃＤＮＡを単離した。Ｅ１３ラット背側及び腹側脊髄ライブラリの更なるスクリーニングにより第２の全長ＵＮＣ５Ｈ２ｃＤＮＡ並びに殆ど全長ＵＮＣ５Ｈ１ｃＤＮＡを単離した。配列決定を、ライカー（Ｌ４０００）自動シーケンサー並びに33Ｐサイクルシーケンシングにより実施した。ジェンバンク受託番号はｒＵＮＣ５Ｈ１及びｒＵＮＣ５Ｈ２に対してそれぞれＵ８７３０５及びＵ８７３０６である。ＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションは記載されているようにして実施した13。
【００２７】
抗体、発現作成物及び免疫組織化学。ウサギポリクローナル抗血清が、ＵＮＣ５Ｈ−１において殆ど完全に保存されている（一アミノ酸置換）ＵＮＣ５Ｈ−２の細胞外ドメインの配列（ＹＬＲＫＮＦＥＱＥＰＬＡＫＥ、配列番号７、残基１４８−１６１）に対応するペプチド、及びＵＮＣ５Ｈ−１（ＧＥＰＳＰＤＳＷＳＬＲＬＫＫＱ、配列番号５、残基５８０−５９４）及びＵＮＣ５Ｈ−２（ＥＡＲＱＱＤＤＧＤＬＮＳＬＡＳＡ、配列番号７、残基９０９−９２４）の細胞質ドメインの独特な配列に対応するペプチドに対して産生した。抗血清を各ペプチドでアフィニティー精製した（クオリティ・コントロールド・バイオケミカルズ）。様々な作成物に対するｃＤＮＡをＣＯＳ細胞発現ベクターｐＭＴ２１と２９３−ＥＢＮＡ細胞発現ベクターｐＣＥＰ４（インビトロジェン）内にサブクローン化し、リポフェクタミンを使用してそれらの細胞に一過性に形質移入した。細胞外ペプチドに対する抗血清が細胞透過化なしに形質移入細胞に発現された両方のＵＮＣ５Ｈタンパク質を検出することができる一方、細胞質ドメインペプチドに対して向けられた抗血清は細胞透過後にその各タンパク質を検出した。ネトリン−１タンパク質が、Ｃ末端ｍｙｃ−エピトープタグに対して産生されたモノクローナル抗体（９Ｅ１０）29を組換えネトリン−１を検出するために使用し、ヘパリンを１μｇ／ｍｌで使用したこと以外は記載されているようにして13、生産され、精製され、使用され、結合アッセイで可視化された。ＵＮＣ５Ｈ−２−Ｆｃ融合を安定に発現する２９３−ＥＢＮＡ株化細胞が誘導され記載されているようにして維持された10,13。融合タンパク質をタンパクＡアガロースのアフィニティークロマトグラフィーにより７日間馴らした無血清培地から精製した。ネトリン−１を発現する２９３株化細胞は記載されているようなものであった13。この株化細胞に対するＵＮＣ５Ｈ−２−Ｆｃ融合体の結合を、ヒトＦｃに対して産生されたＣｙ３−抱合二次抗体（ジャクソン・イムノリサーチ）を使用して可視化した。
【００２８】
文献
2004121244.tif 000002
2004121244.tif 000003
【実施例】
【００２９】
１．  高収量脊椎動物ＵＮＣ−５−ネトリン結合アッセイに対するプロトコール
Ａ．  試薬：
−ニュートラライトアビジン：ＰＢＳ中に２０μｇ／ｍｌ。
−阻害バッファー：ＰＢＳ中に５％のＢＳＡ、０．５％のトウィーン２０；室温で１時間。
−アッセイバッファー：１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１％のグリセロール、０．５％のＮＴ−４０、５０ｍＭのｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル。
−33Ｐ脊椎動物ＵＮＣ−５タンパク質の１０ｘストック：２００，０００−２５０，０００ｃｐｍの標識脊椎動物ＵＮＣ−５１（ベックマンカウンター）が補填された１０-8−１０-6Ｍの「非放射性」脊椎動物ＵＮＣ−５。スクリーニングの間に４℃のマイクロ冷蔵庫に配置。
−プロテアーゼ阻害剤カクテル（１０００Ｘ）：１０ｍｌのＰＢＳ中に１０ｍｇのトリプシン阻害剤（ＢＭＢ＃１０９８９４）、１０ｍｇのアプロチニン（ＢＭＢ＃２３６６２４）、２５ｍｇのベンズアミジン（シグマ＃Ｂ−６５０６）、２５ｍｇのロイペプチン（ＢＭＢ＃１０１７１２８）、１０ｍｇのＡＰＭＳＦ（ＢＭＢ＃９１７５７５）、及び２ｍＭのＮａＶｏ3（シグマ＃Ｓ−６５０８）。
−ネトリン−１：ＰＢＳ中の１０-7−１０-5Ｍのビオチン化ネトリン−１
【００３０】
Ｂ．  アッセイプレートの調製：
−４℃で一晩かけてウェル当り１２０μｌの保存Ｎ−アビジンでコーティング。
−２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。
−１５０μｌの阻害バッファーで阻害。
−２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。
【００３１】
Ｃ．  アッセイ：
−４０μｌのアッセイバッファー／ウェルを添加。
−１０μｌの化合物又は抽出物を添加。
−１０μｌの33Ｐ−ＵＮＣ−５（２０−２５，０００ｃｐｍ／０．１−１０ｐｍｏｌ／ウェル＝１０-9−１０-7Ｍ最終濃度）を添加。
−２５℃で１５分間振とう。
−２５℃で更に４５分間インキュベート。
−４０μｌＭのビオチン化ネトリン−１（アッセイバッファー中に０．１−１０ｐｍｏｌ／４０ｕｌ）を添加。
−室温で１時間インキュベート
−２００μＭのＰＢＳで４回洗浄することにより反応を停止。
　    −１５０μＭのシンチレーションカクテルを添加。
−トップカウントをカウント
【００３２】
Ｄ．  （各プレート上にある）全アッセイ用の対照：
ａ．非特異的結合
ｂ．８０％阻害で可溶性（非ビオチン化ネトリン−１）。
【００３３】
本明細書において引用した刊行物と特許出願の全てを、あたかもそれぞれ個々の刊行物又は特許出願が出典明示により特に個々に取り込まれることが示されているように、出典明示によりここに取り込む。前記の発明を理解を容易にするために例証と実施例によりある程度詳細に記載したが、この発明の教示に照らせば、添付の請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しないで、ある変更と修正を行ってもよいことは当業者であれば容易に分かるであろう。
【配列表】
2004121244000001.app