(57)【要約】【課題】改良されたＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対及びそれを用いる技術を提供すること。【解決手段】標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーが、（ｉ）標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分、（ｉｉ）ＦＲＥＴドナー成分又はＦＲＥＴアクセプター成分である蛍光成分及び（ｉｉｉ）該塩基配列成分と該蛍光成分とを連結するスペーサー成分であって、少なくとも１５原子の連結鎖を含有するスペーサー成分、を含有するものであり、少なくとも１５原子の該連結鎖の２原子が、負に荷電した置換基を保持するものである、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対；それを含む組成物若しくはキット；それを用いる試料中の核酸配列の定性的又は定量的検出方法；標的核酸と該プローブの対とのハイブリッドの融解プロファイルの決定方法；多数(multiple)のオリゴヌクレオチドの化学固相合成法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)又はＦＲＥＴアクセプター成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)であって、少なくとも１５原子の連結鎖を含有するスペーサー成分、
を含有するものであり、
ここで、少なくとも１５原子の該連結鎖の２原子が、負に荷電した置換基を保持するものである、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対。
【請求項２】
　標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であり、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結する第１のスペーサー成分(entity)、
を含有し、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第２のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴアクセプター成分である第２の蛍光成分、及び
−　該塩基配列成分と該蛍光成分とを連結する第２のスペーサー成分であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーのスペーサー成分とは異なるスペーサー成分、
を含有するものであり、
ここで、該第１のスペーサー成分の長さと該第２のスペーサー成分の長さとが、サイズで、少なくとも１５原子の連結鎖だけ異なるものである、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対。
【請求項３】
　標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分と該蛍光成分とを連結するスペーサー成分であって、標的ＤＮＡとハイブリダイズできないｎ１＝０〜１５ヌクレオチド残基を含有するスペーサー成分、
を含有し、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第２のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴアクセプター成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分と該蛍光成分とを連結するスペーサー成分であって、標的ＤＮＡとハイブリダイズできないｎ２＝０〜１５ヌクレオチド残基を含有するスペーサー成分、
を含有するものであり、
ここで、ｎ１の値と、ｎ２の値とは、１〜１０の自然数だけ異なるものである、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対。
【請求項４】
　少なくとも３つのオリゴヌクレオチドのセットであって、第１のオリゴヌクレオチド及び第2のオリゴヌクレオチドが、鋳型依存性核酸増幅反応用増幅プライマーの対として作用しうるものであり、さらに、該第１のオリゴヌクレオチド及び該第３のオリゴヌクレオチドが、ＦＲＥＴドナー成分とＦＲＥＴアクセプター成分とからなるＦＲＥＴ対の対応するメンバーの１つでそれぞれ標識されることを特徴とし、
該第１のオリゴヌクレオチド又は該第３のオリゴヌクレオチドが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)又はＦＲＥＴアクセプター成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分と該蛍光成分とを連結するスペーサー成分、 
を含有するものであり、
ここで、該スペーサー成分は、少なくとも１５原子の連結鎖を含有するものである、少なくとも３つのオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項５】
　核酸試料と、請求項１〜４いずれかに記載のハイブリダイゼーションプローブの対とを含有してなる組成物。
【請求項６】
　請求項１〜４いずれかに記載のハイブリダイゼーションプローブの対と、
核酸増幅プライマー、鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシドトリホスフェート及び鋳型依存性核酸増幅反応用緩衝液からなる群より選ばれた少なくとも１つの他のコンポーネントと
を含有してなるキット。
【請求項７】
　生物学的試料中に存在する核酸と、請求項１〜４いずれかに記載のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対とをハイブリダイズさせる、生物学的試料中の核酸配列の定性的又は定量的検出方法。
【請求項８】
　蛍光発光を温度の関数として決定することを特徴とする、標的核酸と請求項１〜４いずれかに記載のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対とからなるハイブリッドの融解プロファイルの決定方法。
【請求項９】
　ａ）色素標識ＣＰＧ−（Ｎ）ｎ
（ここで、Ｎが、Ｇとは異なる任意に選ばれたヌクレオチド残基であり、ｎ＝１〜１０であることを特徴とする）
の調製工程、
ｂ）工程ａ）で調製されたＣＰＧを用いる、第１の配列を有する第１のオリゴヌクレオチドの固相合成工程、及び
ｃ）工程ａ）で調製されたＣＰＧを用いる、第２の配列を有する少なくとも第２のオリゴヌクレオチドの固相合成工程、
を含む、多数(multiple)のオリゴヌクレオチドの化学固相合成法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、リアルタイムＰＣＲの分野に属する。より詳細には、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブの改良設計に関する。
【背景技術】
【０００２】
　カイネティック（kinetic）リアルタイムＰＣＲにおいて、ＰＣＲ産物の形成は、ＰＣＲの各サイクルにおいてモニタリングされる。増幅は、通常、増幅反応の間に蛍光シグナルを測定するための別の装置を有するサーモサイクラーにおいて測定される。この典型的な例は、ロシュ・ダイアグノスティックス社製、商品名：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（カタログ番号20110468）である。増幅産物は、例えば、標的核酸に結合している場合にのみ蛍光シグナルを発する蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブを用いるか、あるいは、場合によっては二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素を用いることにより検出される。解析対象全ての反応について、所定のシグナル閾値を決定し、この閾値に到達するために要するサイクル数Ｃｐを標的核酸について、並びに標準遺伝子又はハウスキーピング遺伝子のような参照核酸について、測定する。標的分子の絶対的又は相対的なコピー数を標的核酸及び参照核酸に関して得られたＣｐ値に基づいて決定することができる（非特許文献１）。
【０００３】
　増幅されたＤＮＡの検出には、以下のような種々の形式が存在する。
【０００４】
ａ）ＤＮＡ結合色素形式
　二本鎖増幅産物の量は、通常、解析対象試料中に元から存在する核酸の量を超えているため、適切な波長で励起されると二本鎖ＤＮＡに結合している場合にのみ増強された蛍光を発する二本鎖ＤＮＡ特異的色素を用いてよい。好ましくは、例えば、ＳＹＢＲグリーンＩなどのＰＣＲの効率に影響しない色素のみを用いる。
【０００５】
　当該技術分野で知られているその他の全ての形式には、その標的核酸への結合の際に蛍光を発するのみである蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブの設計が必要である。
【０００６】
ｂ）ＴａｑＭａｎプローブ
　一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを２つの成分(entity)で標識する。第１の成分(entity)を適切な波長で励起すると、蛍光共鳴エネルギー移動の原理にしたがって、吸収されたエネルギーが消光物質と呼ばれる第２の成分(entity)に移動される。ＰＣＲのアニーリング工程の際、ハイブリダイゼーションプローブは標的ＤＮＡに結合し、その後の伸長段階の際にＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により分解される。その結果、励起した蛍光成分(entity)及び消光物質は、相互に空間的に分離され、即ち、第１の成分(entity)の蛍光発光が測定されうる（特許文献１）。
【０００７】
ｃ）分子ビーコン
　また、これらのハイブリダイゼーションプローブは、第１の成分(entity)及び消光物質で標識され、該標識は、好ましくは、プローブの両端に位置する。プローブの二次構造の結果、両成分(entity)は、溶液中で空間的に近接する。標的核酸へのハイブリダイゼーションの後、両成分(entity)は、相互に分離され、これにより、適切な波長の光での励起の後、第１の成分(entity)の蛍光発光が測定されうる（特許文献２）。
【０００８】
ｄ）ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ
　ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ試験形式は、全ての種類の同質(homogenous)ハイブリダイゼーション試験に特に有用である（非特許文献２）。それは、同時に用いられ、かつ増幅された標的核酸の同じ鎖の隣接する部位に相補的である２つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを特徴とする。両方のプローブは、異なる蛍光成分(entity)で標識される。適切な波長の光で励起させた場合、第１の成分(entity)は、吸収したエネルギーを蛍光共鳴エネルギー移動の原則にしたがって第２の成分(entity)に移動させ、これにより、検出対象標的分子の隣接位置に両方のハイブリダイゼーションプローブが結合した場合に第２の成分(entity)の蛍光発光が測定できる。
【０００９】
　標的配列にアニーリングする場合、ハイブリダイゼーションプローブは、head−to−tailの配置で相互に極めて近接して位置しなければならない。通常、第１のプローブの標識された３’末端と第２のプローブの標識された５’末端との間の空隙は、可能な限り小さく、即ち、１〜５塩基である。これにより、典型的には、ＦＲＥＴドナー化合物とＦＲＥＴアクセプター化合物とが、１０〜１００オングストロームに近接する。
【００１０】
　ＦＲＥＴアクセプター成分(entity)の蛍光の増加をモニターする代わりに、ハイブリダイゼーション事象の定量的測定として、ＦＲＥＴドナー成分(entity)の蛍光の減少をモニターすることも可能である。
【００１１】
　特に、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ形式は、増幅された標的ＤＮＡを検出するために、リアルタイムＰＣＲにおいて用いられるであろう。リアルタイムＰＣＲの技術において公知の全ての検出形式のうち、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ形式は、極めて高感度で厳密で信頼性があることがわかっている（特許文献３、特許文献４、特許文献５）。それでもなお、適切なＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ配列の設計は、検出対象標的核酸配列の特殊な性質により制限される場合がある。
【００１２】
　２つのＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの使用の代替として、蛍光標識プライマー及び１つのみの標識オリゴヌクレオチドプローブを用いることも可能である（非特許文献３）。この点に関し、プライマーをＦＲＥＴドナー又はＦＲＥＴアクセプター化合物のどちらで標識するかは自由に選択してよい。
【００１３】
　ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲのほかに、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブは、融解曲線解析にも用いられる。このような試験において、標的核酸は、まず適切な増幅プライマーを用いた典型的なＰＣＲで増幅される。ハイブリダイゼーションプローブは、増幅反応中にすでに存在していてもよいし、後に添加してもよい。ＰＣＲの終了後、試料の温度を恒常的に上昇させると、標的ＤＮＡにハイブリダイゼーションプローブが結合していれば、蛍光が検出される。融点においてハイブリダイゼーションプローブは、その標的から遊離し、蛍光シグナルがバックグラウンド値まで即座に低下する。この低下を蛍光減少の最大値が観察される第１微分値が求められるような適切な蛍光対温度−時間プロットでモニターする。
【００１４】
　しかしながら、カイネティック（kinetic）リアルタイムＰＣＲ並びに融解曲線解析に関しては、同じ対の蛍光色素で標識されているが異なるハイブリダイゼーションプローブでは、絶対シグナル強度の多大な相違が観察される。さらに、この現象は、使用する蛍光色素の対とは無関係である。
【００１５】
　種々の系において以前に開示されているＧ残基の消光効果又は脱消光効果による可能性があるとも考えられるが、観察される効果の理由は不明である（特許文献６、非特許文献４）。
【００１６】
　多くの場合において、消光効果を起こすG残基は、通常、対応する蛍光化合物の空間的近接部に位置する（特許文献７）。更にまた、この効果に基づいて、場合によっては、試験法を設定することが可能であり、非ハイブリダイズの標識プローブの蛍光発光は、内部残基により消光され、プローブが相補標的配列にハイブリダイズすると即座に起こる脱消光効果によりハイブリダイゼーションがモニタリングできる（特許文献８）。
【００１７】
　しかしながら、他の場合は、特定の対のＦＲＥＴ色素で標識したハイブリダイゼーションプローブで観察される比較的低いシグナル強度の理由は全く理解されていない。さらに、この観察された効果は、１つの反応容器内で１以上の標的配列を増幅し、２種以上の多数(multiple)のハイブリダイゼーションプローブ又はＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対を用いて定量的に解析することを特徴とする多重試験の設計に関して、大いに不都合である。したがって、当該技術分野においては、絶対的蛍光シグナルが増強されるＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの改良設計が望まれている。
【特許文献１】米国特許第5,538,848号明細書
【特許文献２】米国特許第5,118,801号明細書
【特許文献３】国際公開第97/46707号パンフレット
【特許文献４】国際公開第97/46712号パンフレット
【特許文献５】国際公開第97/46714号パンフレット
【特許文献６】国際公開第01/36668号パンフレット
【特許文献７】欧州特許第１０４６７１７号明細書（EP1046717）
【特許文献８】国際公開第01/73118号パンフレット
【非特許文献１】ロシュ・ダイアグノスティックス社製、商品名：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒのオペレーターマニュアル（カタログ番号20110468）
【非特許文献２】Matthews, J. A.及びKricka, L. J., Anal. Biochem 169, pp1−25（1988）
【非特許文献３】Bernard, P.S.ら, Anal. Biochem., 255, pp101−107（1998）
【非特許文献４】Seidel, C.A.M.ら, J. Phys. Chem., 100, pp5541−5553（1996）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
　本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動を増加させること、絶対的蛍光シグナルを増加させること、試料中の核酸配列を定性的又は定量的に検出すること等の少なくとも１つを可能にする、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対を提供することを目的とする。また、本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動を増加させること、絶対的蛍光シグナルを増加させること、試料中の核酸配列を定性的又は定量的に検出すること等の少なくとも１つを可能にする、少なくとも３つのオリゴヌクレオチドのセットを提供することを目的とする。さらに、蛍光共鳴エネルギー移動を増加させること、絶対的蛍光シグナルを増加させること、試料中の核酸配列を定性的又は定量的に検出すること等の少なくとも１つを可能にする組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動を増加させること、絶対的蛍光シグナルを増加させること、試料中の核酸配列を定性的又は定量的に検出すること等の少なくとも１つを可能にするキットを提供することを目的とする。本発明は、試料中の核酸配列を定性的又は定量的に検出することができる、生物学的試料中の核酸配列の定性的又は定量的検出方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、一塩基多型などの小さい変異を検出することができる、標的核酸と前記ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対とからなるハイブリッドの融解プロファイルの決定方法を提供することを目的とする。また、本発明は、前記ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブなどを効率よく合成することができる、化学固相合成法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
　前記欠点は、本発明によるハイブリダイゼーションプローブの対の設計により解消される。すなわち、本発明は、１つのメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　蛍光成分(entity)、及び、
−　該プローブの対の標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションの際にＦＲＥＴ対を生じさせる２種の蛍光化合物の距離が、塩基配列成分(entity)と蛍光成分(entity)との間にスペーサー成分(entity)を有さないＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対と比較して増加するように該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)を連結するスペーサー成分(entity)、
を含有する、ハイブリダイゼーションプローブの対に関する。
【００２０】
　第１の局面において、本発明は、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)又はＦＲＥＴアクセプター成分(entity)のいずれかである蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)であって、少なくとも１５原子の鎖を含有し、ここで、少なくとも１５原子の該連結鎖の２原子は負に荷電した置換基を含有するものであるスペーサー成分(entity)、
を含有するものである、ＦＲＥＴハイブリダイｚ−エションプローブの対に関する。
【００２１】
　１つの特定の実施態様において、スペーサー成分(entity)は、鎖の長さが、１〜１０個、好ましくは、２〜７個、最も好ましくは、３〜５個のＡ、Ｔ又はＣヌクレオチド残基であることを特徴とする、ヌクレオチド残基の鎖より構成される。プローブをその標的ＤＮＡに結合させる場合は、スペーサーとなるヌクレオチドは、標的ＤＮＡにハイブリダイズできない。
【００２２】
　本発明のスペーサーがＦＲＥＴドナー成分(entity)を有するＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対のメンバーの内部に存在する場合、有利であることがわかっている。
【００２３】
　第２の局面において、本発明は、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)、
を含有し、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第２のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴアクセプター成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)を連結するスペーサー成分(entity)であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーのスペーサー成分(entity)とは異なるスペーサー成分(entity)、
を含有するものであり、
ここで、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の該第１のメンバーの該スペーサー成分(entity)の長さと該第２のメンバーの該スペーサー成分(entity)の長さとが、サイズで、少なくとも１５原子の鎖だけ異なるものである、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対に関する。
【００２４】
　スペーサー成分(entity)がヌクレオチド残基から構成される場合は、本発明のこの局面は、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)であって、標的ＤＮＡにハイブリダイズできないｎ１＝０〜１５個のヌクレオチド残基数を有するスペーサー成分(entity)、
を含有し、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第２のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴアクセプター成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)であり、標的ＤＮＡにハイブリダイズできないｎ２＝０〜１５個のヌクレオチド残基数を有するスペーサー成分(entity)、
を含有するものであり、
ここで、ｎ１の値と、ｎ２の値とは、１〜１０の自然数、好ましくは、２〜７の自然数、最も好ましくは、３〜５の自然数、異なるものである、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であると定義されるであろう。
【００２５】
　第３の局面において、本発明は、少なくとも３個のオリゴヌクレオチドのセットであり、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが鋳型依存性核酸増幅反応のための増幅プライマー対として働くことができることを特徴とし、さらに、該第１のオリゴヌクレオチドと該第３のオリゴヌクレオチドとが、ＦＲＥＴドナー成分(entity)とＦＲＥＴアクセプター成分(entity)とからなるＦＲＥＴ対の対応するメンバーの１つで各々標識されていることを特徴とし、ここで、該第１のオリゴヌクレオチド又は該第3のオリゴヌクレオチドのいずれかは、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)又はＦＲＥＴアクセプター成分(entity)のいずれかである蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)、
を含有するものであり、
ここで、該スペーサー成分(entity)が、少なくとも１５原子の連結鎖を含有することを特徴とする。少なくとも３個のオリゴヌクレオチドのセットに関する
【００２６】
　別の局面において、本発明は、核酸試料と上記したハイブリダイゼーション対とを含有する組成物に関する。
【００２７】
　さらに、本発明は、上記したハイブリダイゼーションプローブの対又はオリゴヌクレオチドのセットを含有するキットをも提供する。好ましくは、該キットは、核酸増幅プライマー、鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシドトリホスフェート及び鋳型依存性核酸増幅反応用の緩衝液からなる群から選択される少なくとも１つの他の成分(entity)を含んでよい。
【００２８】
　本発明のハイブリダイゼーションプローブの対は、生物学的試料における核酸配列の定性的又は定量的な検出のためのいずれかの同質(homogenous)又は異質(heterogeneous)の方法のために用いてもよい。特に、本発明のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブは、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の配列に実質的に相補的な標的核酸配列を含有する該試料中に存在する該核酸の部分が、核酸増幅反応、特に、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅される方法のために用いられてもよい。特定の実施態様においては、ＦＲＥＴドナー成分(entity)の蛍光発光又はＦＲＥＴアクセプター成分(entity)の発光をリアルタイムでモニターする。
【００２９】
　更に別の局面において、本発明は、温度の関数として蛍光発光を測定することを特徴とする、標的核酸と上記したＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対とからなるハイブリッドの融解プロファイルの測定のための改良方法を提供する。
【００３０】
　また、さらなる別の局面において、本発明は、
ａ）色素標識ＣＰＧ―（Ｎ）ｎの調製、ここで、Ｎは、Ｇとは異なる任意に選択されたヌクレオチド残基でありｎ＝１〜１０である、
ｂ）工程a）で調製されたＣＰＧを用いた第１の配列を有する第１のオリゴヌクレオチドの固相合成、
ｃ）工程a）で調製されたＣＰＧを用いた第２の配列を有する少なくとも第２のオリゴヌクレオチドの固相合成、
を含む、多数のオリゴヌクレオチドの化学固相合成法に関する。
【００３１】
　すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕　標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)又はＦＲＥＴアクセプター成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)であって、少なくとも１５原子の連結鎖を含有するスペーサー成分(entity)、
を含有するものであり、
ここで、少なくとも１５原子の該連結鎖の２原子が、負に荷電した置換基を保持するものである、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対、
〔２〕　該スペーサー成分(entity)が、標的ＤＮＡにハイブリダイズしうる１〜１０個、好ましくは、２〜７個、最も好ましくは、３〜５個のＡ、Ｔ又はＣのヌクレオチド残基である、前記〔１〕記載のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対、
〔３〕　標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であり、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結する第１のスペーサー成分(entity)、
を含有し、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第２のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴアクセプター成分(entity)である第２の蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結する第２のスペーサー成分(entity)であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーのスペーサー成分(entity)とは異なるスペーサー成分(entity)、
を含有するものであり、
ここで、該第１のスペーサー成分(entity)の長さと該第２のスペーサー成分(entity)の長さとが、サイズで、少なくとも１５原子の連結鎖だけ異なるものである、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対、
〔４〕　標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)であって、標的ＤＮＡとハイブリダイズできないｎ１＝０〜１５ヌクレオチド残基を含有するスペーサー成分(entity)、
を含有し、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第２のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴアクセプター成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)であって、該スペーサー成分(entity)が、標的ＤＮＡとハイブリダイズできないｎ２＝０〜１５ヌクレオチド残基を含有するスペーサー部分、
を含有するものであり、
ここで、ｎ１の値と、ｎ２の値とは、１〜１０の自然数により異なるものである、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対、
〔５〕　第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、鋳型依存性核酸増幅反応用増幅プライマーの対として作用しうるものであり、さらに該第１のオリゴヌクレオチド及び該第３のオリゴヌクレオチドが、ＦＲＥＴドナー成分(entity)とＦＲＥＴアクセプター成分(entity)とからなるＦＲＥＴ対の対応するメンバーの１つでそれぞれ標識されることを特徴とし、
該第１のオリゴヌクレオチド又は該第３のオリゴヌクレオチドが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)又はＦＲＥＴアクセプター成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)、 
を含有するものであり、
ここで、該スペーサー成分(entity)は、少なくとも１５原子の連結鎖を含有するものである、少なくとも３オリゴヌクレオチドのセット、
〔６〕　核酸試料と、前記〔１〕〜〔５〕いずれかに記載のハイブリダイゼーションプローブの対とを含有してなる組成物、
〔７〕　前記〔１〕〜〔５〕いずれかに記載のハイブリダイゼーションプローブの対と、
核酸増幅プライマー、鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシドトリホスフェート及び鋳型依存性核酸増幅反応用緩衝液からなる群より選ばれた少なくとも１つの他のコンポーネントと
を含有してなるキット、
〔８〕　生物学的試料中に存在する核酸と、前記〔１〕〜〔５〕いずれかに記載のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対とをハイブリダイズさせる、生物学的試料中の核酸配列の定性的又は定量的検出方法、
〔９〕　該試料中に存在し、かつ該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の配列に実質的に相補的な標的核酸配列を含有する該核酸の一部を、核酸増幅反応、特に、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させる、前記〔８〕記載の方法、
〔１０〕　ＦＲＥＴドナー成分(entity)又はＦＲＥＴアクセプターのいずれかの蛍光発光をリアルタイムにモニターする、前記〔９〕記載の方法、
〔１１〕　蛍光発光を温度の関数として決定することを特徴とする、標的核酸と前記〔１〕〜〔５〕いずれかに記載のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対とからなるハイブリッドの融解プロファイルの決定方法、並びに
〔１２〕　ａ）色素標識ＣＰＧ−（Ｎ）ｎ
（ここで、Ｎが、Ｇとは異なる任意に選ばれたヌクレオチド残基であり、ｎ＝１〜１０であることを特徴とする）
の調製工程、
ｂ）工程ａ）で調製されたＣＰＧを用いる、第１の配列を有する第１のオリゴヌクレオチドの固相合成工程、及び
ｃ）工程ａ）で調製されたＣＰＧを用いる、第２の配列を有する少なくとも第２のオリゴヌクレオチドの固相合成工程、
を含む、多数のオリゴヌクレオチドの化学固相合成法、
に関する。
【発明の効果】
【００３２】
　本発明のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対によれば、蛍光共鳴エネルギー移動を増加させ、絶対的蛍光シグナルを増加させ、検出対象標的核酸配列の特殊な性質により制限されずに、試料中の核酸配列を定性的又は定量的に検出できるという優れた効果を奏する。また、本発明の少なくとも３つのオリゴヌクレオチドのセットによれば、蛍光共鳴エネルギー移動を増加させ、絶対的蛍光シグナルを増加させ、検出対象標的核酸配列の特殊な性質により制限されずに、試料中の核酸配列を定性的又は定量的に検出できるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の組成物によれば、蛍光共鳴エネルギー移動を増加させ、絶対的蛍光シグナルを増加させ、検出対象標的核酸配列の特殊な性質により制限されずに、試料中の核酸配列を定性的又は定量的に検出できるという優れた効果を奏する。また、本発明のキットによれば、蛍光共鳴エネルギー移動を増加させ、絶対的蛍光シグナルを増加させ、検出対象標的核酸配列の特殊な性質により制限されずに、試料中の核酸配列を定性的又は定量的に検出できるという優れた効果を奏する。また、本発明は、生物学的試料中の核酸配列の定性的又は定量的検出方法によれば、検出対象標的核酸配列の特殊な性質により制限されずに、試料中の核酸配列を定性的又は定量的に、効率よく検出することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明は、融解プロファイルの決定方法によれば、一塩基多型などの小さい変異を効率よく検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の化学固相合成法によれば、前記ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブなどを効率よく合成することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
　本発明は、本発明者等がこれまで調べたあらゆる状況においてＦＲＥＴドナー化合物及びＦＲＥＴアクセプター化合物の限定的な空間的分離が驚くべく増強された蛍光共鳴エネルギー移動プロセスをもたらすという驚くべき観察結果に基づいている。
【００３４】
　当該技術分野で公知のように、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ試験形式は、同時に用いられ、かつ増幅された標的核酸の同じ鎖の隣接する部位に相補的である2個の一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを特徴とする。両方のプローブは、異なる蛍光成分(entity)で標識される。適切な波長の光で励起すると、第１の成分(entity)は、吸収したエネルギーを、蛍光共鳴エネルギー移動の原則にしたがって第２の成分(entity)に移動させ、これにより、検出対象標的分子の隣接位置に両方のハイブリダイゼーションプローブが結合した場合に第２の成分(entity)の蛍光発光が測定できる。
【００３５】
　この点に関し、本発明は、該ハイブリダイゼーションプローブの対の１つのメンバーの蛍光標識が、特定のスペーサー部分(moiety)によりオリゴヌクレオチド鎖に連結されるＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対に関する。その結果、標的ＤＮＡに両方のプローブが結合すると、ＦＲＥＴ対を発生させる2種の蛍光化合物の距離が従来のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブと比較して増加する。しかしながら、驚くべきことに、本発明者等は、これまで調べた全ての場合において、これにより増強された蛍光シグナリングがもたらされることを発見した。
【００３６】
　本発明によれば、蛍光共鳴エネルギー移動及びこのように蛍光シグナリングを増加させる望ましい効果は、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であって、該ハイブリダイゼーションプローブの対の１つのメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　蛍光成分(entity)、及び、
−　該プローブの対の標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションの際にＦＲＥＴ対を生じさせる2つの蛍光化合物の距離が、塩基配列成分(entity)と蛍光成分(entity)との間にスペーサー成分(entity)を有さないＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対と比較して増加するように該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)を連結するスペーサー成分(entity)、
を含有するものである、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対により達成される。
【００３７】
　本発明の観点において、「実質的に相補的な」という用語は、標準的なアニーリング条件下、各配列が特異的に相互にハイブリダイズすることを意味するものとする。標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)の長さは、１０〜４０ヌクレオチド残基で変わってもよい。好ましくは、標的核酸のＡＴ含量によるが、該長さは、１５〜３０ヌクレオチド残基である。８５％より多くのハイブリッド構成残基間の完全なワトソンクリック塩基対が、少なくとも、必要である。さらに、１０個の構成的ヌクレオチド残基のセグメントに渡る完全な相補性が要求される。
【００３８】
　本発明の観点において、「隣接してハイブリダイズする」の語は、２つのハイブリダイゼーションプローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、標的核酸配列に関して２つのプローブの間に０〜１０個、好ましくは、１〜２個の相補ヌクレオチド残基の範囲にわたり、小さなギャップが存在するか、それが全く存在しないことを意味する。
【００３９】
　第１の局面において、新規な本発明は、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であって、該ハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーは、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)又はＦＲＥＴアクセプター成分(entity)のいずれかである蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)を連結するスペーサー成分(entity)であり、少なくとも１５原子の連結鎖を含有するスペーサー成分(entity)、
を含有するものであり、
ここで、少なくとも１５原子の該連結鎖の２原子は、負に荷電した置換基を含有しているものである、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対に関する。
【００４０】
　この本発明の第１の局面に関して、明確化するために、所望の改良ＦＲＥＴシグナリングを得るためには、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の一方のメンバーのみが少なくとも１５原子の鎖を有するスペーサー成分(entity)を保持し、他方のメンバーは当該技術分野で知られるいずれかの従来の方法により蛍光化合物で直接標識されることを強調する。
【００４１】
　更に明確化するために、本発明の観点において、「スペーサー成分(entity)」という用語はメソメリズム効果に関与しない蛍光発色団と、一方では5’又は3’末端ヌクレオチド残基のいずれかのリボース成分(entity)の部分ではない全ての要素との間にある全ての要素を含むことが強調される。
【００４２】
　上記において説明した通り、本発明のハイブリダイゼーションプローブの対の一方のメンバーに存在するスペーサー成分(entity)は少なくとも１５原子の連結鎖を有する。しかしなお、改良ＦＲＥＴシグナリングの所望の効果を得るためには、鎖は１００原子を超えるものであってはならない。好ましくは、連結原子の鎖は20〜60、もっとも好ましくは３０〜４５原子である。これは、スペーサーにより連結される塩基配列成分(entity)と蛍光成分(entity)との間の距離が約２０〜１５０オングストローム、好ましくは、２５〜９０オングストローム、最も好ましくは、４０〜７０オングストロームとなる。
【００４３】
　その結果、ドナー成分(entity)とＦＲＥＴアクセプター成分(entity)との間の距離も、ＦＲＥＴプローブが標的配列に連結すると増加することに注目する必要がある。さらに、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブは意外にも増強された蛍光シグナリングをもたらす。距離の増加は、本発明のスペーサー成分(entity)の長さに関して上記したオングストローム値に相当する。
【００４４】
　改良ＦＲＥＴプロセスの所望の効果を得るためには、スペーサー成分(entity)が少なくとも部分的に負荷電であることが必須である。この効果は少なくとも１５原子の該連結鎖の原子少なくとも２個が負に荷電した置換基を保持している場合に得られる。好ましくは、この効果は、スペーサーとなる連結鎖に少なくとも２つのホスフェート基を導入することにより得られる。あるいは、スペーサー成分(entity)は、遊離のヒドロキシ又は酸性の基、例えば、カルボキシ基を有する少なくとも２個の側鎖を含んでよい。
【００４５】
　好ましい実施態様においては、スペーサー成分(entity)は標的ＤＮＡにハイブリダイズできないヌクレオチド残基の鎖からなる。これに関し、ヌクレオチド残基の数が１〜１０、好ましくは２〜７、最も好ましくは３〜５である場合に、２個の蛍光部分は、なお相互に十分合理的に近接している。
【００４６】
　したがって、本発明のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対のオリゴヌクレオチドの１つは、標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)に対して3’又は5’に、スペーサー成分(entity)として機能する１〜１０個、好ましくは２〜７個、最も好ましくは３〜５個の付加的なヌクレオチド残基が存在するように設計されている。標的ＤＮＡにハイブリダイズしない末端残基の３’又は５’末端は当該技術分野で知られた標準的な操作法にしたがってＦＲＥＴ成分(entity)の１つで標識される。
【００４７】
　好ましくは、該付加的非ハイブリダイズ残基は、Ａ、Ｔ又ＧはC残基である。さらに好ましくは、７０％より多くの該付加的残基が、Ａ、Ｃ又はＴ残基である。最も好ましくは、該付加的な残基は、ホモＡ、ホモＴ又はホモＣの一続き(string)である。
【００４８】
　上記したものと相互排除的でない他の好ましい実施態様において、少なくとも１５原子の連結鎖を含有するスペーサー成分(entity)により本発明の配列に連結しているＦＲＥＴドナー成分(entity)である。さらに、本発明のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブのためにＦＲＥＴドナー成分(entity)としてフルオレセインを用いると特に有利であることがわかっている。
【００４９】
　第２の局面において、本発明は、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)、
を含有し、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第２のメンバーが、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴアクセプター成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーのスペーサー成分(entity)とは異なるスペーサー成分(entity)、
を含有するものであり、
ここで、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の該第１のメンバーの該スペーサー成分(entity)の長さと該第２のメンバーの該スペーサー成分(entity)の長さとは、サイズで、少なくとも１５原子の鎖だけ異なるものであるＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対に関する。
【００５０】
　好ましくは、これらの１５個の異なる原子の少なくとも２個が、負に荷電した置換基を有する。最も好ましくは、これらの少なくとも２原子がホスフェート基である。さらに、本発明の第１の局面について開示した大きさに関する好ましいスペーサーの特徴は上記２個のスペーサー成分(entity)の間の差異についてもあてはまる。
【００５１】
　ヌクレオチド残基の鎖を適切なスペーサー成分(entity)として使用すべき場合は、本発明は、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対であって、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第１のメンバーは、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)であって、標的ＤＮＡにハイブリダイズできないｎ１＝０〜１５個のヌクレオチド残基を有するスペーサー成分(entity)、
を含有し、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の第２のメンバーは、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴアクセプター成分(entity)である蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)を連結するスペーサー成分(entity)であり、標的ＤＮＡにハイブリダイズできないｎ２＝０〜１５個のヌクレオチド残基を有するスペーサー成分(entity)
を含有するものであり、
ここで、ｎ１の値とｎ２の値とは、１〜１０の自然数、好ましくは２〜７の自然数、最も好ましくは３〜５の自然数で異なるものである、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対に関する。
【００５２】
　また、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の２つのメンバーの該スペーサー成分(entity)が、相互にヌクレオチド塩基対形成相互作用のような非共有結合相互作用を呈することができる場合、この特定の実施態様の範囲内である。いいかえれば、第１のハイブリダイゼーションプローブの付加的な残基の一部と第２のハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド残基とが塩基対形成相互作用を形成し、これにより標的核酸にハイブリダイズした際に部分的なステム構造を形成するように、両方のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブは標的核酸にハイブリダイズしない付加的なヌクレオチド残基を異なる数量保有している。
【００５３】
　好ましくは、これらの塩基対形成相互作用は、Ａ／Ｔ塩基対形成相互作用である。さらに、塩基対形成相互作用を起こすヌクレオチドにより形成されるステム構造は、任意に、ミスマッチを含有する場合、本発明の範囲にある。
【００５４】
　さらに、本発明は、ＰＣＲ増幅産物の検出に有用なプライマー/プローブ形式にも適用される。この形式においては、１つのプライマーは、ＦＲＥＴプロセスに関与する１つの蛍光化合物で内部標識される。
【００５５】
　したがって、本発明の種々の局面の全ての観点において、「ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対」の語は、１対のオリゴヌクレオチドを含有するものとして定義され、該オリゴヌクレオチドの一方が第３のオリゴヌクレオチドと共にポリメラーゼ増幅反応（ＰＣＲ）のためのプライマーとして働くことができることを特徴とする。この場合、ＦＲＥＴシグナルは、増幅反応の際又はその後に、蛍光成分(entity)を保持した第２のオリゴヌクレオチドがＰＣＲにより生成したアンプリコンにハイブリダイズする際に生じる。
【００５６】
　結果として、本発明は、少なくとも３個のオリゴヌクレオチドのセットであって、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが鋳型依存性核酸増幅反応のための増幅プライマー対として働くことができることを特徴とし、さらに、該第１のオリゴヌクレオチド及び該第３のオリゴヌクレオチドは、ＦＲＥＴドナー成分(entity)とＦＲＥＴアクセプター成分(entity)とからなるＦＲＥＴ対の相当するメンバーの１つで各々標識されていることを特徴とし、ここで、該第１のオリゴヌクレオチド又は該第３のオリゴヌクレオチドのいずれかは、
−　標的核酸の配列に実質的に相補的な塩基配列成分(entity)、
−　ＦＲＥＴドナー成分(entity)又はＦＲＥＴアクセプター成分(entity)のいずれかである蛍光成分(entity)、及び
−　該塩基配列成分(entity)と該蛍光成分(entity)を連結するスペーサー成分(entity)、
を含有するものであり、
ここで、該スペーサー成分(entity)は、少なくとも１５原子の連結鎖を含有し、好ましくは、１〜１０ヌクレオチド残基の鎖、最も好ましくは３〜５ヌクレオチド残基の鎖からなることを特徴とする、少なくとも３個のオリゴヌクレオチドのセットに関する。
【００５７】
　標識されたプライマーの使用には当該技術分野で公知の自動法で行なわれるであろう従来の５’又は３’標識とは異なる内部標識を必要とするため、好ましくは、本発明のスペーサー成分(entity)を有するものが第３のオリゴヌクレオチドである。最も好ましくは、該第３のオリゴヌクレオチドは、ＦＲＥＴドナー化合物で標識される。
【００５８】
　また好ましくは、少なくとも１５原子の該連結鎖の少なくとも２原子は負に荷電した置換基を保持する。最も好ましくは、これらの少なくとも２個の原子はホスフェート基に相当する。さらに、本発明の第１の局面において開示されたサイズに関する好ましいスペーサーの局面もあてはまる。
【００５９】
　上記した本発明のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対又は本発明のオリゴヌクレオチドのセットを使用する場合は、本発明のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対のＦＲＥＴアクセプター成分(entity)からの蛍光発光の強度は、その標的配列にハイブリダイズすると、同じ標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの比較の対のＦＲＥＴアクセプター成分(entity)の蛍光発光の強度と比較して、該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ比較の対が該ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ比較の対のメンバーの何れも該ヌクレオチド配列と該蛍光成分(entity)とを連結するスペーサー成分(entity)を含有しないことを除き、該ハイブリダイゼーションプローブの対と同一であれば、検出可能に増加する。
【００６０】
　この点に関し、「検出可能に増加する」という語は、上記した２種のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対が従来のリアルタイムＰＣＲ試験、例えば、商品名：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置（Roche Applied Sciences社製）においてモニタリングできることを意味する。しかしながら、好ましくは検出可能な差は２０％より大きい。
【００６１】
　蛍光シグナルの増加の程度は、標的核酸配列及び用いられるＦＲＥＴ色素の対に大きく依存する。特定の場合においては、蛍光シグナルの増加は、２００％を超えうる。蛍光シグナルの増加は、従来のハイブリダイゼーション試験で観察されるのみではない。実施例で示すとおり、リアルタイムＰＣＲ定量及び融解曲線解析においても検出可能である。
【００６２】
　別の局面において、本発明は、核酸試料及び請求項１〜６に記載のハイブリダイゼーションプローブの対を含有した組成物に関する。解析に先立ち、かかる組成物と解析対象試料とを混合することにより検出される標的核酸をさらに含む組成物を形成する。
【００６３】
　さらなる局面において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドの対及び上記した組成物を使用する種々の方法及び用途に関する。
【００６４】
　例えば、本発明のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対は、生物学的試料中に存在する核酸と該本発明のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対とをハイブリダイズさせる、生物学的試料中の核酸配列の定性的又は定量的検出に用いてよい。
【００６５】
　１つの実施態様において、このような方法は、典型的なハイブリダイゼーション試験であってよい。ハイブリダイゼーションは、溶液中で行なってよく、あるいは、標的核酸又はＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対の一方のメンバーをあらかじめ固相支持体上に固定化させておいてもよい。固体支持体そのものは、例えば、ハイブリダイゼーション膜、磁気ガラスビーズ、核酸固定化用のマイクロアレイ又は当該技術分野で公知のいずれかの他の材料であることができる。
【００６６】
　別の好ましい実施態様においては、該試料中の検出対象の核酸は、核酸増幅反応、特にポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。より詳細には、ハイブリダイゼーション操作の前又はハイブリダイゼーション操作の間に、試料中に存在する該核酸の一部を核酸増幅反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供する。条件として、標的核酸は、ハイブリダイゼーションプローブに用いられる配列と実質的に相補的であるか、相同である配列を含有する。いいかえれば、用いられるハイブリダイゼーションプローブは増幅される標的核酸の部分に特異的にハイブリダイズする必要がある。
【００６７】
　特定の実施態様においては、ＦＲＥＴドナー成分(entity)の蛍光発光又はＦＲＥＴアクセプター成分(entity)の発光を増幅反応自体の間、リアルタイムでモニターする。したがって、本発明のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対が、サーモサイクルの間の標的核酸の増幅の進行をモニターするために用いられている場合、更に本発明の範囲内である。当該技術分野で知られるとおり、リアルタイムモニターにより速度論的データが得られ、定量的解析が容易になる。すなわち、本発明は、また、増幅反応そのものの間に、ＦＲＥＴアクセプター成分(entity)の蛍光発光の増加をモニターするか、又は、ＦＲＥＴドナー成分(entity)の蛍光発光の減少をモニターすることによる、標的核酸の増幅のモニター方法に関する。
【００６８】
　別の局面において、本発明は、蛍光発光を温度の関数(function)として測定することを特徴とする、標的核酸と上記ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対とからなるハイブリッドの融解プロファイルの測定方法を提供する。この局面において、本発明は、標的核酸とハイブリダイゼーションプローブの間の複合体の解離をモニターすることにより、一塩基多型などの小さい配列の変異の検出を可能にする、融解曲線解析のための上記したＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの使用に関する。
【００６９】
　より詳細には、本発明は、まず、標的核酸と２つのハイブリダイゼーションプローブとの間の三重ハイブリッド複合体を形成させることを特徴とする、標的核酸と本発明のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対とからなるハイブリッドの融解プロファイルの測定方法に関する。その後、温度を上昇させ、リアルタイムで蛍光をモニターすることにより三重複合体の熱解離を測定する。いいかえれば、本発明は、蛍光発光を温度の関数として測定することを特徴とする、標的核酸と上記ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対とからなるハイブリッドの融解プロファイルの測定方法にも関する。
【００７０】
　さらなる局面において、本発明は、上記したハイブリダイゼーションプローブの対を含有したキットをも提供する。好ましくは、核酸増幅プライマー、鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシドトリホスフェート及び鋳型依存性核酸増幅反応用の緩衝液からなる群から選択された少なくとも１つの他のコンポーネントを含有してもよい。
【００７１】
　最後の局面において、本発明は、本発明のハイブリダイゼーションプローブの対を含有するキットに関する。このようなキットは、上記した本発明のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対を含有してもよい。さらに、核酸増幅反応のプライマー対として機能することができるオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【００７２】
　また、本発明のキットは、核酸増幅ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシドトリホスフェート又は対応する類縁体、鋳型依存性核酸増幅反応、例えば、ＰＣＲなどに用いられてもよい適切な緩衝液などの付加的なコンポーネントを含んでもよい。さらに、キットは、相対的又は絶対的な核酸定量実験の定量解析のためのコンピュータープログラムを保持したコンパクトディスクなどのソフトウェアツールをさらに含有してもよい。
【００７３】
　一般的に、標的核酸とオリゴヌクレオチドの対とのハイブリダイゼーションの際、蛍光共鳴エネルギー移動がある程度起こり、そこでは両方のＦＲＥＴ成分(entity)が、合理的な空間的近接位置にあり、これによりＦＲＥＴドナー励起後、ＦＲＥＴアクセプターからの蛍光発光がモニターできるものであれば、原則として、蛍光部分に連結したスペーサーを保持するヌクレオチド残基は、内部残基、５’末端残基又は３’末端残基のいずれかであってよい。
【００７４】
　これに関し、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブとして機能するオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知の方法により、いずれかの位置において、所望の蛍光成分(entity)で標識されていてよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド塩基又はホスフェート部分で、内部に標識されてもよい。
【００７５】
　しかしながら、好ましくは、そしてスペーサー部分の有無とは無関係に、第１のＦＲＥＴ成分(entity)を保持する１つのオリゴヌクレオチドをその3’末端残基の3−ヒドロキシ基において標識し、第２のＦＲＥＴ成分(entity)を保持する第２のオリゴヌクレオチドをその5’末端残基の5’ホスフェート基において標識して、これにより、両方のオリゴヌクレオチドと標的核酸とがハイブリダイズすると、両方のＦＲＥＴ成分(entity)の蛍光標識は、該末端残基が標的核酸中の隣接する残基と塩基対形成性であるか、あるいは１、２若しくは最大で１０個のさらなる残基により分離されているのみである残基と少なくとも塩基対形成性であるという事実のために、相互に合理的な近接位置にくる。
【００７６】
　一方のオリゴヌクレオチドが５’末端で標識され、第２のオリゴヌクレオチドが3’末端で標識されている場合、どのオリゴヌクレオチドがＦＲＥＴドナー部分を保持し、どのオリゴヌクレオチドがＦＲＥＴアクセプター部分を保持するかは、任意に選択してよい。しかしながら、上記した通り、改良蛍光シグナリングのためにはスペーサー成分(entity)を保持しているオリゴヌクレオチドをＦＲＥＴドナー部分で標識することが有利であることがわかっている。
【００７７】
　通常、５’蛍光標識は、蛍光化合物を保持する適切なホスホロアミデートを用いてオリゴヌクレオチド合成の終了時に導入されてもよい。あるいは、オリゴヌクレオチド合成の後、反応性のアミノ基を保持しているオリゴヌクレオチドをＮＨＳエステルとして活性化されている蛍光化合物で標識してよい。オリゴヌクレオチドの３’標識のためには、蛍光化合物を有する３官能性のスペーサー成分(entity)を含有する市販の管理された微細孔ガラス粒子を化学オリゴヌクレオチド合成の開始のための固体支持体として使用する。
【００７８】
　一般的に、本発明のハイブリダイゼーションプローブの設計は、相互に蛍光エネルギー移動が起こり得る蛍光化合物の如何なる組み合わせにも適用される。例示できるものとしては、フルオレセイン／Ｃｙ５（Amersham社製）、フルオレセイン／ＬＣ−Ｒｅｄ−６４０（Roche Applied Science社製）、フルオレセイン／ＬＣ−Ｒｅｄ−７０５（Roche Applied Science社製）及びフルオレセイン／ＪＡ２８６（EP747447）であるが、これらに限定されない。
【００７９】
　また、ＦＲＥＴアクセプター成分(entity)は、蛍光化合物とは異なる消光物質部分であり、結果的に、ＦＲＥＴドナー部分からの蛍光の減少がモニターされる場合、本発明の範囲内である。この点に関して、用いられる消光化合物の例は、ダブシル〔Kreuzer, K.A.ら, Clin. Chem., 47, 486−490（2001）〕又はいわゆる、ブラックホールクエンチャー（国際公開第01/86001号パンフレット）である。
【００８０】
　多くの場合において、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブは、典型的な一本鎖ＤＮＡ分子である。それでもなお、何らかの修飾が可能である。例えば、一本鎖ＤＮＡは、7−デアザプリン、ジアミノプリン又はＣ−ヌクレオチドなどの非天然の塩基を含んでいてもよい。一本鎖ＤＮＡは、２−Ｏ−メチル、ホスホチオエート又は類似のものなどの修飾された糖リン酸骨格を有してもよい。
【００８１】
　よりさらなる局面において、本発明は、スペーサー成分(entity)が対応する標的ＤＮＡにハイブリダイズしない付加的なオリゴヌクレオチド残基の鎖に相当することを特徴とする、実施態様に関する本発明のオリゴヌクレオチドの効率的な合成のための新しい方法に関する。
【００８２】
　多数の異なる標的配列に本発明を適用する場合、同じ５’又は３’末端を共通して有するのみである多数の異なるＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを提供する必要がある。共通の３’末端の場合は、蛍光標識された管理された微細孔ガラス粒子（ＣＰＧ）を用いた固相オリゴヌクレオチド合成を行なうことにより当該技術分野で公知の保護基により保護された末端ヒドロキシ基を保持する中間体ＣＰＧ−（Ｎ）ｎを得てよい。
【００８３】
　このような試薬は、その後、共通の３’末端を有する多数の所望の種々のオリゴヌクレオチドを固相合成するための固相原料として用いられうる。好ましくは、このような標識試薬は、n＝１〜１０の大きさを有する１種類のみのヌクレオチド残基、すなわち、ホモＡ、ホモＴ又はホモＣから構成される。最も好ましくは、このような標識試薬は、ホモＴから構成される。最も好ましいサイズは３〜５である。
【００８４】
　したがって、本発明は、
ａ）色素標識ＣＰＧ−（Ｎ）ｎ
（Ｎが、Ｇとは異なる任意に選択されるヌクレオチド残基でありn＝１〜１０であることを特徴とする）
の調製、
ｂ）工程ａ）で調製されたＣＰＧを用いた第１の配列を有する第１のヌクレオチドの固相合成、
ｃ）工程ａ）で調製されたＣＰＧを用いた第２の配列を有する少なくとも第２のオリゴヌクレオチドの固相合成、
を含む、多数のオリゴヌクレオチドの化学固相合成法にも関する。
【００８５】
　前記方法は、対応するＦＲＥＴドナープローブ用の標識試薬を調製するために、フルオレセイン標識ＣＰＧを用いる場合に特に有利であることがわかっている。
【００８６】
　下記実施例、参考文献、配列表及び図面は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は、添付した請求項に示されている。本発明の精神から逸脱することなく、示された操作法において変更を行なうことができるものと理解される。
【実施例１】
【００８７】
ＰＣＲプライマー及びプローブの調製
　市販の標準ホスホアミダイト（DMTr ibu G, DMTr bzA；DMTr bz C及びDMTr T）と対応するＣＰＧ支持体とを用いて、商品名：ＡＢＩ３９４合成装置で、１μｍｏｌスケールでプライマーを合成した。標準的な合成に用いる薬品は、Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社より入手した。固体支持体からのオリゴヌクレオチドの除去と、脱保護とを、５５℃で８時間３３％ＮＨ3を用いて行なった。合成はトリチル様式として行なわれた。精製は、ＲＰ１８オリゴＲ３　４．６×５０ｍｍカラム（Perseptive Biosystems社製）上で、緩衝液Ａ：水中、０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．０／ＭｅＣＮ　９５:５、緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮを用い、グラジェントは、３分間２０％Ｂ、１２分間１２〜４０％Ｂとし、流速１ｍｌ／分、検出２６０ｎｍで行なった。その後、濃縮したオリゴヌクレオチド溶液を室温で８０％酢酸で５分間処理し、５’ＤＭＴｒ保護基を除去した。その後、オリゴヌクレオチドをＲＰ１８カラムで脱塩し、商品名:ＳｐｅｅｄＶａｃ中で凍結乾燥させた。
【００８８】
　５’標識オリゴヌクレオチド（ＪＡ２８６／ＬＣＲｅｄ６４０）の合成を、１μｍｏｌ範囲で行なった。市販の標準ホスホアミダイト（DMTr ibu G, DMTr bzA；DMTr bz C及びDMTr T）及び標準的合成のための薬品は、Glen Research社より入手した。５’アミノ基を、市販の５’アミノ修飾剤（Glen Research、カタログ番号10−1916−90）を用いて導入した。固体支持体として３’ホスフェートＣＰＧ（Glen Research社製、20−2900−01）を用いた。固体支持体からのオリゴヌクレオチドの除去と、脱保護とは、５５℃で８時間３３％ＮＨ3で行なわれた。溶液を真空下に蒸発させた。残存物を６００μｌの２重蒸留水に溶解し、マイクロ遠沈管に移し、酢酸ナトリウム緩衝液（３Ｍ、ｐＨ８．５）６０μｌを添加した。氷冷エタノール1.8mlを添加し、混合物を3時間−１５℃で保存した。溶液を１５分間１００００×ｇで遠心分離した。上澄みを傾瀉した。ペレットを氷冷エタノール２００μｌで洗浄した。遠心分離の後、上澄みを傾瀉した。ペレットをホウ酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）４００μｌに溶解させ、標準的な操作法にしたがって標識した。
【００８９】
　ＮＨＳ−活性化ＬＣ−Ｒｅｄ−６４０と、ＪＡ２８６とを用いた。ＮＨＳ−ＬＣ−Ｒｅｄ−６４０は、Roche applied Science社より入手した（カタログ番号2015161）。ＮＨＳ活性化ＪＡ２８６は、EP0747447の実施例１にしたがって合成した。ＮＨＳ活性化Ｃｙ５を、Amersham社より入手（カタログ番号DEITER？）し、ＬＣＲｅｄ７０５（Roche Applied Science、カタログ番号2157594）は、ホスホアミデートの形態でオリゴヌクレオチド合成中に取り込まれた。
【００９０】
　ＤＭＦ中の色素ＮＨＳエステル１ｍｇの溶液を添加し、１５時間反応させた。標識オリゴヌクレオチドをＯｌｉｇｏ　Ｒ３　４．６×５０ｍｍカラムを用いた逆相クロマトグラフィーにより精製した。クロマトグラフィーは、緩衝液Ａ：０．１Ｍの水中酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．０、緩衝液Ｂ：水中、０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム／ＭｅＣＮ　１:１を用い、流速１ｍｌ／分、検出２６０ｎｍで行なった。グラジェントは、２分間０％Ｂ、４５分間で１００％Ｂとした。生成物が溶出し始めた時点で、グラジェントを停止させ、２０〜２５％Ｂで非標識オリゴヌクレオチドが溶出され、６０〜６５％Ｂで所望の標識オリゴヌクレオチドが溶出され、１００％Ｂで色素が溶出された。標識オリゴヌクレオチドのピークの画分を採取し、真空遠心分離により溶媒を除去した。残存物を２重蒸留水に溶解し、次に、再度、真空遠心分離により蒸発させた。この操作を３回反復した。ペレットを水に溶解し、凍結乾燥した。
【００９１】
　３’フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドは市販の商品名：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ＣＰＧ（Roche Applied Science社製、カタログ番号3138178）の添付物にしたがって合成し、精製した。この特定のＣＰＧは、合成対象ヌクレオチドにＣ１２リンカーを与える（EP1186613）。
【実施例２】
【００９２】
フルオレセイン／ＪＡ２８６標識ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いたＶ因子　ＤＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ
　Ｖ因子　ＤＮＡ断片の増幅のために、２０μｌ　リアルタイムＰＣＲ混合物を以下のように設定した：
１０6コピーのＶ因子遺伝子を含むプラスミド
（ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ＿０１４３３５)
３ｍＭ　ＭｇＣｌ2
配列番号：：１及び２のプライマー　各５００ｎＭ
それぞれ、配列番号：：３及び４、３及び６、３及び８、４及び５、４及び７のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ　各２００ｎＭ
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　ＤＮＡ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｈｙｂ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｋｉｔ(Roche Applied Science社製, カタログ番号2158825)のＰＣＲコンポーネント
【００９３】
　プライマー及びプローブとして、
配列番号:１
フォワードプライマー:
5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A
配列番号:２
リバースプライマー：
5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA
配列番号:３
ＦＲＥＴドナープローブ
5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC−フルオレセイン
配列番号:４
ＦＲＥＴアダプタープローブ：
5' JA286−AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT
配列番号:５
ＦＲＥＴドナープローブ
5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TCA AAA A−フルオレセイン
配列番号:６
ＦＲＥＴアクセプタープローブ
5' JA286−TTT TTA GGG ATC TGC TCT TAC AGA TTA GAA GTA GTC CTA TT
配列番号:７
ＦＲＥＴドナープローブ
5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TCA AA−フルオレセイン
配列番号:８
ＦＲＥＴアクセプタープローブ
5' JA286−TTT AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT
を用いた。
【００９４】
　配列番号：３、５及び７のプローブを、実施例１にしたがい、フルオレセインで３’末端標識した。配列番号：４、６及び８のプローブは、実施例１のＦＲＥＴアクセプターとしてＪＡ２８６で５’末端標識した。
【００９５】
　配列番号：３のＦＲＥＴドナープローブと、陰性対照として配列番号：４のＦＲＥＴアクセプタープローブとを組み合わせて用いた。更に、本発明の５又は３Ａヌクレオチド残基スペーサーを含有する配列番号：５又は配列番号：７のドナープローブを、配列番号：4のＦＲＥＴアクセプタープローブと組み合わせた。あるいは、配列番号：3のＦＲＥＴドナープローブを、本発明の５又は３Ｔヌクレオチド残基を含有する配列番号：６のＦＲＥＴアクセプタープローブと組み合わせて用いた。
【００９６】
　増幅は、以下に示すサーモサイクルプロトコルにしたがって、商品名：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置（Roche Applied Science社製）で行なった。
【００９７】
【表１】
2004121252.tif 000002
【００９８】
　リアルタイムのモニタリングはＪＡ２８６発光（７１０ｎｍ）に特異的な検出チャネルにおける蛍光シグナルを測定し、そして、初期蛍光バックグラウンド強度の正規化のために算術的バックグラウンド補正を行ないながら４５サイクルにわたり二次微分閾値法を用いて行なった。
【００９９】
　結果を図１に示す。図からわかるように、フルオレセイン標識ＦＲＥＴドナープローブの場合、３又は５Ａ残基のいずれかからなるスペーサー、あるいは、ＪＡ２８６標識ＦＲＥＴアクセプタープローブの場合は、３又は５Ｔ残基からなるスペーサーを用いることにより改良増幅が得られた。効果はステム構造がＦＲＥＴドナープローブ又はＦＲＥＴアクセプタープローブの何れの部分であるかとは無関係に観察されたが、より強い蛍光シグナルは、ＦＲＥＴドナープローブが本発明にしたがって設計された場合に得られた。
【０１００】
　ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対への１つのステム構造のみの導入はＦＲＥＴドナー部分とＦＲＥＴアクセプター部分との間の距離の増加に鑑みて不都合であると考えられたため、観察された結果は特に意外であった。
【実施例３】
【０１０１】
本発明のスペーサー1個を有するフルオレセイン／ＪＡ２８６で標識された本発明のハイブリダイゼーションプローブを用いたＶ因子ＤＮＡの融解曲線解析
　実施例２にしたがい、反応の後、試料を以下の温度遷移プロトコルを用い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Roche Applied Science社製）のマニュアルの指示にしたがって融解曲線解析に供した。
【０１０２】
【表２】
2004121252.tif 000003
【０１０３】
　蛍光のモニターは、７１０ｎｍにおいてＪＡ２８６のチャネルで得られた絶対シグナル値を測定することにより行なった。
【０１０４】
　結果を図２に示す。図からわかるように、ＦＲＥＴドナープローブ又は代替的に、ＦＲＥＴアクセプタープローブのいずれかが、本発明の３又は５ヌクレオチド残基を有することを特徴とする、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの使用は、両方の場合において、何れのスペーサーも有さないＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対と比較して増強されたピークをももたらした。
【実施例４】
【０１０５】
異なるＦＲＥＴアクセプター色素を有する本発明のＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いたＧ６ＰＤＨ　ＤＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ
　異なる標的ＤＮＡとしてＧ６ＰＤＨを検出し、種々のＦＲＥＴアクセプター色素の有用性を比較し、濃度４ｍＭのＭｇＣｌ2を用いるという変更を行なった外は実施例2に記載したとおり実験を行なった。
【０１０６】
　すなわち、プライマー及びプローブは、
配列番号：９
フォワードプライマー
5' GGG TGC ATC GGG TGA CCT G
配列番号：１０
リバースプライマー
5' AGC CAC TGT GAG GCG GGA
配列番号：１１
ＦＲＥＴドナープローブ
5' GGT GTT TTC GGG CAG AAG GCC ATC C− フルオレセイン
配列番号：12
ＦＲＥＴアクセプタープローブ: 
5' JA286−AAC AGC CAC CAG ATG GTG GGG TAG ATC TT
5' LCRed640− AAC AGC CAC CAG ATG GTG GGG TAG ATC TT
5'−Cy5− AAC AGC CAC CAG ATG GTG GGG TAG ATC TT
5'−LCRed705− AAC AGC CAC CAG ATG GTG GGG TAG ATC TT
配列番号：13
ＦＲＥＴドナープローブ:
5‘−GGT GTT TTC GGG CAG AAG GCC ATC CAA AAA
である。
【０１０７】
　配列番号：１１及び１３のプローブを実施例１にしたがい、フルオレセインで３’末端標識した。配列番号：１２のプローブは実施例1のＦＲＥＴアクセプターとしてＪＡ２８６、ＬＣＲｅｄ６４０、Ｃｙ５又はＬＣＲｅｄ７０５で５’末端標識した。配列番号：１１及び１３のＦＲＥＴドナープローブは、各々異なるアクセプター色素で標識された配列番号：１２のＦＲＥＴアクセプタープローブ全４種と組み合わせて用いた。
【０１０８】
　増幅は、以下に示すサーモサイクルプロトコルにしたがってライトサイクラー機（Roche Applied Science社製）で行なった。
【０１０９】
【表３】
2004121252.tif 000004
【０１１０】
　結果を図３ａ−ｄに示す。図からわかるように、ＦＲＥＴドナープローブが本発明のステム構造を有する全てのＦＲＥＴ対で、そのようなステム構造を有さない同じ蛍光色素を有するＦＲＥＴ対と比較して改良増幅シグナルが得られた。
【０１１１】
　本発明は、検出対象標的ＤＮＡとは無関係に、そしてより重要な点は実際に使用するＦＲＥＴアクセプター色素とは無関係に適用されることが結論できる。
【実施例５】
【０１１２】
本発明の種々のスペーサーで標識されたＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いたＦ因子　ＤＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ
　本発明の種々のヌクレオチド残基を有するＦＲＥＴドナープローブを試験するという変更を行なった以外は実施例２に記載したとおり実験を行なった。
【０１１３】
　用いたプローブ又はプライマーは、
配列番号：１
フォワードプライマー：
5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A
配列番号：２
リバースプライマー
5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA
配列番号：３
FRETドナープローブ
5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC−フルオレセイン
配列番号：４
FRETアクセプタープローブ
5' JA286−AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT
5' LCRed705−AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT
配列番号：５
FRETドナープローブ
5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TCA AAA A−フルオレセイン
配列番号：14
FRETドナープローブ
5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TCT TTT T−フルオレセイン
である。
【０１１４】
　配列番号：３、５のプローブ（５Ａスペーサーを含む）及び配列番号：１４のプローブ（５Ｔスペーサーを含む）を、実施例１にしたがい、フルオレセインで３’末端標識した。配列番号：４のプローブは、実施例１のＦＲＥＴアクセプターとしてＪＡ２８６又はＬＣＲｅｄ７０５のいずれかで５’末端標識した。３個の異なるＦＲＥＴドナープローブのそれぞれを、配列番号：４の２つの異なるＦＲＥＴアクセプターと組み合わせて用いた。
【０１１５】
　結果を、図４ａ及び図４ｂに示す。図からわかるように、スペーサーとして異なるヌクレオチドステム残基を有する異なるＦＲＥＴドナーハイブリダイゼーションプローブの使用は、いつも、いかなるスペーサー部分(moiety)をももたないＦＲＥＴドナーハイブリダイゼーションプローブの使用に比べ、改良された蛍光シグナリングをもたらす。観察された効果は、検出された標的配列には依存しなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
　本発明によれば、１つの反応容器内で１以上の標的配列を増幅し、２種以上の多数(multiple)のハイブリダイゼーションプローブ又はＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの対を用いて、定性的又は定量的に解析する、多重試験の設計が可能になる。また、本発明によれば、検出対象標的核酸配列の特殊な性質により制限されずに、試料中の核酸配列を定性的又は定量的に、効率よく検出することができる解析を行うことができる。さらに、本発明は、リアルタイムＰＣＲに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１は、本発明のスペーサー１個を有するＶ因子アンプリコンを検出するためのフルオレセイン／ＪＡ２８６ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例２に開示されたリアルタイムＰＣＲ実験の蛍光対サイクル数のプロットを示す図である。図中、−は、スペーサーを有さないＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ、5Aは、5A残基スペーサーを有するＦＲＥＴドナープローブ、3Aは、3A残基スペーサーを有するＦＲＥＴドナープローブ、5Tは、5T残基スペーサーを有するＦＲＥＴアクセプタープローブ、3Tは、3T残基スペーサーを有するＦＲＥＴアクセプタープローブを示す。
【０１１８】
【図２】図２は、本発明のスペーサー１個を有するフルオレセイン/JA286ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例３に記載の実験の融解曲線解析を示す蛍光対温度のプロットの一次微分である。図中、−は、スペーサーを有さないＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ、5Aは、5A残基スペーサーを有するＦＲＥＴドナープローブ、3Aは、3A残基スペーサーを有するＦＲＥＴドナープローブ、5Tは、5T残基スペーサーを有するＦＲＥＴアクセプタープローブ、3Tは、3T残基スペーサーを有するＦＲＥＴアクセプタープローブを示す。
【０１１９】
【図３】図３は、Ｇ６ＰＤＨアンプリコンを検出するためのＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの種々の対を用いた実施例４に記載したリアルタイムＰＣＲ実験の蛍光対サイクル数のプロットを示す図である。実験は直接（”ｎｅｇ”）又は本発明の5A残基スペーサー（”５Ａ”）のいずれかによりオリゴヌクレオチドに連結したＦＲＥＴドナーとしてのフルオレセインとＦＲＥＴ対とを比較している。図３ａは、フルオレセイン／ＪＡ２８６とフルオレセイン−５Ａ／Ａ２８６との比較（-/+）、図３ｂは、フルオレセイン／ＬＣＲｅｄ６４０とフルオレセイン−５Ａ／ＬＣＲｅｄ６４０との比較（-/+）、図３ｃは、フルオレセイン／Ｃｙ５とフルオレセイン−５Ａ／Ｃｙ５との比較（-/+）、図３ｄは、フルオレセイン／ＬＣＲｅｄ７０５とフルオレセイン−５Ａ／ＬＣＲｅｄ７０５との比較(-/+)を示す。
【０１２０】
【図４】図４は、本発明の種々のスペーサーを有するＶ因子を検出するためのフルオレセイン／ＪＡ２８６ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ又はフルオレセイン／ＬＣＲｅｄ７０５ハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例５に記載したリアルタイムＰＣＲ実験の蛍光対サイクル数のプロットを示す図である。図４ａは、フルオレセイン／ＪＡ２８６ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いた結果であり、図中、Ｆ／ＪＡ２８６は、ＦＲＥＴ対フルオレセイン／ＪＡ２８６スペーサー無し、Ｆ−５Ａ／ＪＡ２８６は、ＦＲＥＴ対フルオレセイン／ＪＡ２８６〔フルオレセインドナープローブは５Ａスペーサーを保持〕、Ｆ−５Ｔ／ＪＡ２８６は、ＦＲＥＴ対フルオレセイン／ＪＡ２８６〔フルオレセインドナープローブは５Ｔスペーサーを保持〕を示す。図４ｂは、フルオレセイン／ＬＣＲｅｄ７０５ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを用いた結果であり、図中、Ｆ／ＬＣＲｅｄ７０５は、ＦＲＥＴ対フルオレセイン／ＬＣＲｅｄ７０５スペーサー無し、Ｆ−５Ａ／ＬＣＲｅｄ７０５は、ＦＲＥＴ対フルオレセイン／ＬＣＲｅｄ７０５〔フルオレセインドナープローブは５Ａスペーサーを保持〕、Ｆ−５Ｔ／ＬＣＲｅｄ７０５は、ＦＲＥＴ対フルオレセイン／ＬＣＲｅｄ７０５〔フルオレセインドナープローブは５Ｔスペーサーを保持〕を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１２１】
　配列番号：１は、プライマーの配列である。
【０１２２】
　配列番号：２は、プライマーの配列である。
【０１２３】
　配列番号：３は、プライマーの配列である。
【０１２４】
　配列番号：４は、プライマーの配列である。
【０１２５】
　配列番号：５は、プライマーの配列である。
【０１２６】
　配列番号：６は、プライマーの配列である。
【０１２７】
　配列番号：７は、プライマーの配列である。
【０１２８】
　配列番号：８は、プライマーの配列である。
【０１２９】
　配列番号：９は、プライマーの配列である。
【０１３０】
　配列番号：１０は、プライマーの配列である。
【０１３１】
　配列番号：１１は、プライマーの配列である。
【０１３２】
　配列番号：１２は、プライマーの配列である。
【０１３３】
　配列番号：１３は、プライマーの配列である。
【０１３４】
　配列番号：１４は、プライマーの配列である。
【図１】
2004121252.tif 000005
【図２】
2004121252.tif 000006
【図３】
2004121252.tif 000007
【図４】
2004121252.tif 000008
【配列表】
2004121252000001.app