(57)【要約】【課題】水処理設備の目詰まりの原因が微生物であるか否かを判定し、原因が微生物である場合はその種類を識別して、的確な目詰まり防止対策を講ずることができる水処理設備の目詰まり原因の判定方法を提供する。【解決手段】水処理設備の装置の付着物からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによりＤＮＡ鎖の特定部位を複製し、その複製数から装置に付着していた微生物数を推定することを特徴とする水処理設備の目詰まり原因の判定方法。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水処理設備の装置の付着物からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによりＤＮＡ鎖の特定部位を複製し、その複製数から装置に付着していた微生物数を推定することを特徴とする水処理設備の目詰まり原因の判定方法。
【請求項２】
ＤＮＡ鎖の特定部位の配列を求めて、微生物の種類を識別する請求項１記載の水処理設備の目詰まり原因の判定方法。
【請求項３】
ＤＮＡ鎖の特定部位が、１６Ｓ　ｒＤＮＡである請求項１又は請求項２記載の水処理設備の目詰まり原因の判定方法。
【請求項４】
水処理設備の装置が、膜分離装置である請求項１記載の水処理設備の目詰まり原因の判定方法。
【請求項５】
水処理設備の装置が、活性炭塔である請求項１記載の水処理設備の目詰まり原因の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水処理設備の目詰まり原因の判定方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、水処理設備の目詰まりの原因が微生物であるか否かを判定し、原因が微生物である場合はその種類を識別して、的確な目詰まり防止対策を講ずることができる水処理設備の目詰まり原因の判定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
浄水設備、超純水製造設備などの水処理設備においては、膜分離装置、活性炭塔などの目詰まりが発生する。目詰まりが発生すると、差圧の上昇、流束の低下などの支障を生ずるので、その原因を特定して適切な対策を講ずる必要がある。目詰まりの原因を大別すると、原水中に含まれる主として無機物からなる懸濁物質と、水処理設備の中で増殖した微生物があるが、そのいずれであるかを特定することは容易でない場合が多い。
例えば、水処理設備の装置の付着物について、糖とタンパク質の分析を行っても、これらの分析は感度が低く、糖又はタンパク質が検出されても、それが微生物に由来するものか、もともと原水に含まれていたものか、明確にできない場合が多い。付着物の量が多く、糖又はタンパク質が微生物に由来することが明らかになっても、微生物の種類や、微生物が増殖した原因までを特定することは困難である。電子顕微鏡で観察して微生物の種類を識別しようとしても、微生物の形が崩れている場合もある。培養法により、培地上に生育した微生物のコロニーを計数して微生物数を求めることが行われるが、超純水は極めて貧栄養の状態であるために、このような環境で生育する微生物の中には、培養法では計測できない微生物も多く存在する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、水処理設備の目詰まりの原因が微生物であるか否かを判定し、原因が微生物である場合はその種類を識別して、的確な目詰まり防止対策を講ずることができる水処理設備の目詰まり原因の判定方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、装置の付着物からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより１６Ｓ　ｒＤＮＡを複製することにより、１６Ｓ　ｒＤＮＡの複製数から装置に付着していた微生物数を推定することができ、さらに１６Ｓ　ｒＤＮＡの遺伝子配列を求めることにより、微生物の種類を識別し得ることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）水処理設備の装置の付着物からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによりＤＮＡ鎖の特定部位を複製し、その複製数から装置に付着していた微生物数を推定することを特徴とする水処理設備の目詰まり原因の判定方法、
（２）ＤＮＡ鎖の特定部位の配列を求めて、微生物の種類を識別する第１項記載の水処理設備の目詰まり原因の判定方法、
（３）ＤＮＡ鎖の特定部位が、１６Ｓ　ｒＤＮＡである第１項又は第２項記載の水処理設備の目詰まり原因の判定方法、
（４）水処理設備の装置が、膜分離装置である第１項記載の水処理設備の目詰まり原因の判定方法、及び、
（５）水処理設備の装置が、活性炭塔である第１項記載の水処理設備の目詰まり原因の判定方法
を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の水処理設備の目詰まり原因の判定方法においては、水処理設備の装置の付着物からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによりＤＮＡ鎖の特定部位を複製し、その複製数から装置に付着していた微生物数を推定する。さらに、ＤＮＡ鎖の特定部位の配列を求めて、微生物の種類を識別することができる。複製するＤＮＡ鎖の特定部位は、１６Ｓ　ｒＤＮＡであることが好ましい。本発明方法を適用する水処理設備の装置に特に制限はないが、精密ろ過膜、限外ろ過膜、逆浸透膜などを用いた膜分離装置や、活性炭塔などの目詰まり原因の判定に好適に適用することができる。
本発明方法において、目詰まりを起こしている装置の付着物からＤＮＡを抽出する方法に特に制限はなく、例えば、付着物中に含まれる細胞を、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤の存在下で、プロテイナーゼＫ（ＥＣ３．４．２１．１４）などを用いてタンパク質を加熱分解したのち、フェノールとクロロホルムを加えてペプチドを含有する有機相を除去し、塩存在下でエタノール又はイソプロパノールを加えてＤＮＡをフィルター上に沈殿させることができる。ＤＮＡの抽出は、市販のＤＮＡ抽出器を用いることにより、自動化することもできる。
本発明方法においては、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、ＤＮＡ鎖の特定部位を複製する。ＤＮＡ鎖の特定部位の複製には、複製反応のプライマーとして増幅部両端の塩基配列を含む合成オリゴヌクレオチドを用い、ＤＮＡ二本鎖の解離、オリゴヌクレオチドとのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成を繰り返す。ＤＮＡ二本鎖の解離は、反応液を９５℃程度に加熱することにより行われるために、通常は相補鎖合成を始める前ごとに新たにＤＮＡポリメラーゼを補給する必要があるが、好熱性細菌より単離されたＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、この必要がなくなり、温度変化のみによる反応の繰り返しが可能となる。
例えば、ＳＹＢＲＴＭグリーン１存在下にポリメラーゼ連鎖反応により標的配列を増幅し、ポリメラーゼ連鎖反応には、標的核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼとプライマーを生物学的サンプルに添加するステップと、少なくとも変性温度と延長温度の間で生物学的サンプルを熱サイクルするステップを含むステップと、ＳＹＢＲＴＭグリーン１により吸収される波長の光で生物学的サンプルを励起して生物学的サンプルからの放射を検出するステップと、ＳＹＢＲＴＭグリーン１からの温度依存性蛍光をモニタするステップとにより、生物学的サンプルにおける標的核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅をリアルタイムでモニタすることができる。
【０００６】
本発明方法においては、ＰＣＲにより複製されたＤＮＡ鎖の特定部位の複製数から、装置に付着していた微生物数を推定する。ＰＣＲの条件を一定にし、複製するＤＮＡ鎖の部位を特定すると、装置に付着していた微生物数と特定部位の複製数の間にはほぼ一定した関係があり、この関係は蓄積されたデータに基づいて経験的に知ることができる。したがって、サンプリングした付着物の量とＤＮＡ鎖の特定部位の複製数から、装置の単位面積、単位体積、単位重量などに付着していた微生物数を推定することができる。また、装置の目詰まりが発生する付着微生物数も、蓄積されたデータに基づいて経験的に知ることができるので、水処理設備に目詰まりが起こったとき、微生物がその原因であるか否かを判定することができる。
目詰まり原因が微生物であるときは、さらに複製したＤＮＡ鎖の特定部位の配列から、微生物の種類を識別し、汚染源を調査して目詰まり防止対策を講ずることができる。汚染有機物が原因で水処理設備の装置に微生物が増殖していると考えられる場合は、原水及び各装置で採取したサンプルを培養し、増殖した微生物を調査し、どのポイントでの増殖微生物が装置に付着している微生物と対応しているかを調査し、原因を特定することができる。目詰まり原因が微生物でないときは、微生物以外の目詰まり原因、例えば、無機懸濁物質などに焦点をあてて原因を究明することができる。図１は、本発明方法を利用して水処理設備の目詰まりを防止するためのフローチャートである。
【０００７】
本発明方法において、複製するＤＮＡ鎖の特定部位に特に制限はないが、微生物間で配列が相違し、その配列に基づいて微生物を容易に識別し得る領域であることが好ましい。このような領域としては、例えば、１６Ｓ　ｒＤＮＡ、５Ｓ　ｒＤＮＡ、２３Ｓ　ｒＤＮＡ、ｇｙｒＢなどを挙げることができる。これらの中で、１６Ｓ　ｒＤＮＡは、微生物間でわずかに配列が相違し、配列に基づいた系統樹（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第６５巻、１０２〜１０９頁）が作成されており、微生物の種類を容易に識別することができるので、好適に利用することができる。
本発明方法によれば、微生物のＤＮＡを対象として微生物数を推定し、微生物の種類を識別するので、電子顕微鏡による観察のように微生物が本来の形を保持している必要がない。また、微生物の培養に頼らないために、コロニーを形成しにくい微生物も含めて、すべての微生物を漏れなく解析することができる。微生物に由来するＤＮＡの解析を行うことにより、微生物の流入源、微生物を増殖させている有機物源などの特定が可能となり、的確な目詰まり防止対策を講ずることができる。ＤＮＡによる微生物の定量は、感度が高く、わずかな微生物でも検出することができる。さらに、目詰まりの原因となる微生物のデータを蓄積することによって、検出された微生物の種類から、微生物増殖の原因を直接特定することも可能となる。超純水製造設備は、通常は貧栄養状態にあり、このような環境で増殖する微生物の種類は少ないので、増殖する微生物の識別は比較的容易である。
【０００８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１
中空糸型の精密ろ過膜の目詰まり原因を判定した。
目詰まりを起こしている中空糸型の精密ろ過膜のサンプル０．１ｍｇをナイフで細かく切断して容量２ｍＬのチューブに入れた。このチューブに直径０．１ｍｍのジルコニア／シリカビーズ１ｍＬと抽出緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸［ｐＨ８．０］，１００ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ四ナトリウム塩［ｐＨ８．０］，１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム［ｐＨ８．０］，１．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）１ｍＬを加え、細胞破砕機［ＢＩＯＳＰＥＣ−ＣＳＣ社、Ｂｅａｄ　Ｂｅａｔｅｒ］で２分間処理した。次に、凍結融解を３回繰り返したのち、プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加え、３７℃にて３０分間保温した。この液に、１０重量％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液２５０μＬを加え、６５℃で２時間保温し、再び上記の細胞破砕機による処理を繰り返した。次いで、８，０００ｘｇにて室温で１０分間遠心分離し、上清を採取した。上清は、クロロホルムにより抽出し、等量のイソプロパノールを添加したのち、室温で６０分間静置し、８０００ｘｇにて室温で２０分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿は、７０重量％エタノール水溶液で洗浄し、乾燥させたのち、滅菌蒸留水５０μＬに溶解した。
この抽出ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ反応を行い１６Ｓ　ｒＤＮＡのコピー数を調べた。ＰＣＲ検出には、検出器［ロッシュ・ダイアグノスティック社、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ］を用いた。測定方法は、ＳＹＢＲＴＲグリーン法とした。また、測定には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　ＤＮＡ　Ｍａｓｔｅｒ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　キット［ロッシュ・ダイアグノスティック社」を用いた。その際、プラーマーペアは、Ｂａｃｔ０００９（５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣ　Ｃ／Ａ　ＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）、Ｂａｃｔ１４９２（５’−ＡＣＧＧ　Ｃ／Ｔ　ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＧＧＡＣＴＴ−３’）を用いた。アニーリングの温度は５５℃とし、塩化マグネシウムの濃度は３ｍｍｏｌ／Ｌとした。
膜面積１ｃｍ２当たりの１６Ｓ　ｒＤＮＡのコピー数は、９．６×１０７であった。１細菌当たりの平均的な１６Ｓ　ｒＤＮＡコピー数は約４であり、膜の目詰まりによる流束の低下は細菌１．０×１０７個／ｃｍ２から起こることが分かっているので、目詰まりは、微生物が原因であると判定された。
そこで、増幅された１６Ｓ　ｒＤＮＡをプラスミドにクローンニングし、１６Ｓ　ｒＤＮＡクローンを得た。その結果、存在する微生物の優占種は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａに近い細菌であることが分かった。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａは、フェノールやトルエンなどの芳香族化合物を分解する細菌として知られているために、そのような物質の流入の可能性を調査したところ、再利用している回収水の中にフェノールを含有するものがあることが分かり、この回収水を処理プロセスから外した。その結果、精密ろ過膜の目詰まりの問題は解決された。
【０００９】
実施例２
中空糸型の限外ろ過膜の目詰まり原因を判定した。
目詰まりを起こしている中空糸型の限外ろ過膜のサンプル０．１ｍｇをナイフで細かく切断して容量２ｍＬのチューブに入れ、実施例１と同様にして、ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより１６Ｓ　ｒＤＮＡを複製した。
膜面積１ｃｍ２当たりの１６Ｓ　ｒＤＮＡのコピー数は１．６×１０３であり、この膜の目詰まり原因は、微生物ではないと判定された。そこで、無機物の溶出物を調査したところ、配管からの無機物の溶出が限外ろ過膜の目詰まりの原因であることが分かった。
実施例３
活性炭塔の目詰まり原因を判定した。
目詰まりを起こしている活性炭塔の活性炭１ｃｍ３を超音波処理し、剥離された菌体を０．２２μｍのフィルターで集菌した。このフィルターを容量２ｍＬのチューブに入れ、実施例１と同様にして、ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより１６Ｓ　ｒＤＮＡを複製した。
活性炭１ｃｍ３当たりの１６Ｓ　ｒＤＮＡのコピー数は、７．６×１０１０であった。１細菌当たりの平均的な１６Ｓ　ｒＤＮＡコピー数は約４なので、付着細菌数は、活性炭１ｃｍ３当たり１．９×１０１０個と推定される。このように大量の微生物が活性炭に付着していたことから、活性炭の目詰まり原因は微生物であると判定された。
そこで、増幅された１６Ｓ　ｒＤＮＡをプラスミドにクローニングし、１６Ｓ　ｒＤＮＡクローンを得た。その結果、存在微生物の優占種は、Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈに近い細菌であることが分かった。Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈは、メタンやメタノールを分解する細菌として知られているために、そのような物質の流入を調査したところ、再利用している回収水には、不定期にメタノールの流入があることが分かり、この流入水を処理プロセスから外した。その結果、活性炭塔の目詰まりの問題は解決された。
【００１０】
【発明の効果】
本発明方法によれば、従来は困難であった水処理設備の膜分離装置や活性炭塔などの目詰まり原因を特定することができるので、的確な目詰まり防止対策を講じて対処することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明方法を利用して水処理設備の目詰まりを防止するためのフローチャートである。
【図１】
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