(57)【要約】【課題】血液試料中のＢＮＰの分解を防止または大幅に低減するという課題の解決策を提供する。【解決手段】アセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）、Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−アルギニナール）Ｐｈｅ（アンチパイン）、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＲＡＣＫ）、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）およびそれらの組合せで構成されるグループから選択される少なくとも１つの安定化成分。安定化成分は血液試料または血漿試料中に安定化作用を示す量導入され、該試料中の脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を安定化する。【選択図】　　　図１
2004029021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）、Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−アルギニナール）Ｐｈｅ（アンチパイン）、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＲＡＣＫ）、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）およびそれらの組合せで構成されるグループから選択される少なくとも１つの安定化成分を、血液試料または血漿試料中に安定化作用を示す量導入することから成る該試料中の脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を安定化する方法。
【請求項２】
ＢＮＰ安定化作用を有する１つまたはそれ以上の前記安定化成分の類縁体、変異体または誘導体からさらに成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの安定化成分が血液試料または血漿試料を採取する前に採取用容器の中にある請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの安定化成分が試料の採取時に血液試料または血漿試料中に導入される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの安定化成分が濃縮された状態または凍結乾燥された状態である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）、Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−アルギニナール）Ｐｈｅ（アンチパイン）、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＲＡＣＫ）、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）およびそれらの組合せで構成されるグループから選択される少なくとも１つの成分から成る、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を安定化する組成物。
【請求項７】
少なくとも１つの成分が濃縮された状態または凍結乾燥された状態である請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ＢＮＰと、アセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）、Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−アルギニナール）Ｐｈｅ（アンチパイン）、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＲＡＣＫ）、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）およびそれらの組合せで構成されるグループから選択される少なくとも１つの成分とから成る、安定化された脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を含む組成物。
【請求項９】
脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）と、アセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）、Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−アルギニナール）Ｐｈｅ（アンチパイン）、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＲＡＣＫ）、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）およびそれらの組合せで構成されるグループから選択される少なくとも１つのＢＮＰ安定化成分とから成る、ＢＮＰを含むかまたは含んでいる疑いのある試料を検査するためのコントロール物質。
【請求項１０】
アセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）、Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−アルギニナール）Ｐｈｅ（アンチパイン）、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＲＡＣＫ）、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）およびそれらの組合せで構成されるグループから選択される少なくとも１つの成分を内蔵する少なくとも１つのコンテナから成り、さらに
少なくとも１つの成分を分注するための滴下容器または類似のデバイスと、
少なくとも１つの成分を溶解するための緩衝液と、
合成ＢＮＰまたは外来のＢＮＰと、
取扱説明書とを含み得る血液由来の試料中の脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を安定化するキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）のタンパク質分解性の分解を低減し、それにより血漿や血清を初めとする血液由来の試料中でこのペプチドを安定化するための方法および組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）はうっ血性心不全（ＣＨＦ）の特異的かつ高感度な指標である。ＢＮＰは主として心室で合成され血流へと分泌される血管作動性の心臓性ペプチドホルモンである（非特許文献１，２）。このペプチドホルモンはナトリウム利尿および利尿を促進し、血管拡張剤として作用し、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系の血管収縮作用に拮抗する（非特許文献３）。
【０００３】
ＢＮＰの血漿中濃度は心臓機能の低下とともに上昇するので、血中のＢＮＰ濃度の測定は急性心筋梗塞または心不全の診断と予見とに有用である（非特許文献４−９）。心疾患および心不全は世界的に重要な健康問題であるため、ＢＮＰはさらに心臓病の検査をするかまたは心臓病の治療をするかの少なくともいずれかを選択するために患者を選別する際に使用する生化学マーカーとして提唱されている（非特許文献３）。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｈ．　Ｓｈｉｍｉｚｕ　ｅｔ　ａｌ．，　２００１，　Ｃｌｉｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ，　３０５：１８１−１８６
【非特許文献２】
Ｈ．　Ｓｈｉｍｉｚｕ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　Ｃｌｉｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ，　２８５：１６９−１７２
【０００５】
【非特許文献３】
Ａ．　Ｇｏｇｉｎｅｔ−Ｇｅｏｒｇｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００，　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　Ｌａｂ．　Ｍｅｄ．，　３８（６）：５１９−５２３
【非特許文献４】
Ｅ．　Ｍｏｒｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｏｌｌ．　Ｃａｒｄｉｏｌ．，　８８：８２−９１
【０００６】
【非特許文献５】
Ｔ．　Ｔｓｕｔａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８９，　Ａｍ．　Ｈｅａｒｔ　Ｊ．，　１１７：５９９−６０６
【非特許文献６】
Ｍ．　Ｍｕｋｏｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９０，　Ｌａｎｃｅｔ，　３３５：８０１−８０２
【０００７】
【非特許文献７】
Ｔ．　Ａ．　ＭｃＤｏｎａｇｈ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８，　Ｌａｎｃｅｔ，　３５１：９−１３
【非特許文献８】
Ｔ．　Ｏｍｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，　９３：１９６３−１９６９
【０００８】
【非特許文献９】
Ｔ．　Ｔｓｕｔａｍｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，　９６：５０９−５１６
【非特許文献１０】
Ｄ．　Ｒ．　Ｍｕｒｄｏｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，血中ＢＮＰの安定性に関する検討間の相違：内在性ペプチドと外来ペプチドの比較（Ｄｉｓｐａｒｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＢＮＰ　ｉｎ　ｂｌｏｏｄ：　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ａｎｄ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ），Ｈｅａｒｔ，　８１：２１２−２１３
【０００９】
【非特許文献１１】
Ｔ．　Ｔｓｕｊｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４，　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．，　４０（４）：６７２−６７３
【非特許文献１２】
Ｂ．　Ｂｌｕｅｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　２００２　，バイヤー社ＡＤＶＩＡ　Ｃｅｎｔａｕｒ　ＡＣＳを用いたＣＨＦの診断と評価を補助するためのＢＮＰ自動検査法の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ＢＮＰ　ａｓ　ａｎ　ａｉｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＨＦ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｂａｙｅｒ　ＡＤＶＩＡ　Ｃｅｎｔａｕｒ　ＡＣＳ），Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　４８（Ｓ６）：Ａ８５，　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｃ３７
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
心疾患（例えば左心室の収縮不全）を有する患者を特定する診断マーカーとしてのＢＮＰの適用は、該ペプチドが血液試料中で安定性に乏しいため困難である（非特許文献１〜３，１０，１１）。内在性ＢＮＰおよび該ペプチドの合成物のいずれも、タンパク質分解により血漿および血清中で比較的急速に分解する傾向にある。加えて、ＢＮＰの急速な分解は全血から血漿を分離した後に起きる。このような分解は冷蔵条件下の保存中においてすら進行し、そのため新鮮な試料をすぐに凍結する場合でなければ新鮮な全血試料以外のものについてＢＮＰを正確に測定することは困難である。
【００１１】
血液試料中のＢＮＰを測定するための取り組みが当技術分野において報告されているが、完全に満足できるものはなく、ほとんどは効果がない。例えば、患者の血液試料中のＢＮＰを安定化する試みには特殊な組成でできた採取管（採血管）の使用（非特許文献２）；血液試料へのＥＤＴＡの添加（非特許文献１０）；血液試料へのアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）とベンザミジン（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）との組合せの添加（非特許文献１１）が含まれる。
【００１２】
血液試料中のＢＮＰの分解を防止するかまたは大幅に低減するという課題は、血液学の分野において依然として存続する課題であり、ＢＮＰを安定化するためのより良い方法と解決策とが必要とされている。本発明は、血液試料中のＢＮＰのタンパク質分解性の分解を低減または防止するためにＢＮＰを安定化するという現存する困難についての解決策を提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を解決するために、請求項１に記載の発明は、アセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）、Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−アルギニナール）Ｐｈｅ（アンチパイン）、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン、ジイソプロピルフルオロリン酸およびそれらの組合せで構成されるグループから選択される少なくとも１つの安定化成分を、血液試料または血漿試料中に安定化作用を示す量導入することから成る該試料中の脳性ナトリウム利尿ペプチドを安定化する方法を要旨とする。
【００１４】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、ＢＮＰ安定化作用を有する１つまたはそれ以上の前記安定化成分の類縁体、変異体または誘導体からさらに成ることを要旨とする。
【００１５】
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、少なくとも１つの安定化成分が血液試料または血漿試料を採取する前に採取用容器の中にあることを要旨とする。
【００１６】
請求項４に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、少なくとも１つの安定化成分が試料の採取時に血液試料または血漿試料中に導入されることを要旨とする。
【００１７】
請求項５に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、少なくとも１つの安定化成分が濃縮された状態または凍結乾燥された状態であることを要旨とする。
【００１８】
請求項６に記載の発明は、アセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）、Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−アルギニナール）Ｐｈｅ（アンチパイン）、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン、ジイソプロピルフルオロリン酸およびそれらの組合せで構成されるグループから選択される少なくとも１つの成分から成る、脳性ナトリウム利尿ペプチドを安定化する組成物を要旨とする。
【００１９】
請求項７に記載の発明は、請求項６に記載の組成物において、少なくとも１つの成分が濃縮された状態または凍結乾燥された状態であることを要旨とする。
請求項８に記載の発明は、ＢＮＰと、アセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）、Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−アルギニナール）Ｐｈｅ（アンチパイン）、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン、ジイソプロピルフルオロリン酸およびそれらの組合せで構成されるグループから選択される少なくとも１つの成分とから成る、安定化された脳性ナトリウム利尿ペプチドを含む組成物を要旨とする。
【００２０】
請求項９に記載の発明は、脳性ナトリウム利尿ペプチドと、アセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）、Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−アルギニナール）Ｐｈｅ（アンチパイン）、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン、ジイソプロピルフルオロリン酸およびそれらの組合せで構成されるグループから選択される少なくとも１つのＢＮＰ安定化成分とから成る、ＢＮＰを含むかまたは含んでいる疑いのある試料を検査するためのコントロール物質を要旨とする。
【００２１】
請求項１０に記載の発明は、アセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）、Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−アルギニナール）Ｐｈｅ（アンチパイン）、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン、ジイソプロピルフルオロリン酸およびそれらの組合せで構成されるグループから選択される少なくとも１つの成分を内蔵する少なくとも１つのコンテナから成り、さらに少なくとも１つの成分を分注するための滴下容器または類似のデバイスと、少なくとも１つの成分を溶解するための緩衝液と、合成ＢＮＰまたは外来のＢＮＰと、取扱説明書とを含み得る、血液由来の試料中の脳性ナトリウム利尿ペプチドを安定化するキットを要旨とする。
【００２２】
１つの態様では、本発明は、体液の試料、特に血漿や血清を始めとする血液由来の試料、好ましくは血漿試料中のＢＮＰを安定化する方法を提供する。本発明によれば、ＢＮＰの安定化により試料中の内在性プロテアーゼによるＢＮＰの分解が低減される。本発明の方法は、外から添加されたＢＮＰもしくは内在性のＢＮＰを含む血液試料、またはＢＮＰを含んだ血液試料を入れる容器もしくはコンテナに、安定化する成分（以下、安定化成分とする）を添加することを含む。安定化成分は、ＢＮＰのタンパク分解性の分解を低減し、分解から保護し、または分解を防止する１つまたはそれ以上のプロテアーゼ阻害剤の化合物から成る。阻害剤の化合物には、アセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）、Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−アルギニナール）Ｐｈｅ（アンチパイン）、およびＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）のほかにＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＲＡＣＫ）およびジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）が含まれる。本発明によれば、化合物を単独で使用することも組み合わせて使用することも可能である。組合せは、２つ、３つまたはそれ以上の安定化成分を混合物として含みうる。加えて、阻害剤４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）またはＡＥＢＳＦに構造的に関連する化合物を単独でまたは前述の阻害剤と組み合わせて使用可能である。好ましいＢＮＰ阻害剤の組合せの非限定的な例には、ロイペプチンとＰＰＡＣＫ；アンチパインとＰＰＡＣＫ；ロイペプチンとＰＰＲＡＣＫ；アンチパインとＰＰＲＡＣＫ；ロイペプチン、アンチパインおよびＰＰＡＣＫ；ロイペプチン、アンチパイン、ＰＰＲＡＣＫおよびＤＦＰ；が含まれる。実際の適用に特に好ましい阻害剤は、ＰＰＡＣＫまたはＰＰＲＡＣＫである。本明細書に記載のＢＮＰ阻害剤は、従来使用されていた化合物に比べて改善されたＢＮＰの安定性を提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、安定化する阻害剤化合物を単独または組み合わせて含む、安定化されたＢＮＰ組成物を提供する。より詳細には、組成物は、ＰＰＡＣＫのみ；アンチパインのみ；ロイペプチンのみ；ロイペプチンとＰＰＡＣＫの組合せ；アンチパインとＰＰＡＣＫの組合せ；ロイペプチンとアンチパインの組合せ；ロイペプチン、アンチパインおよびＰＰＡＣＫの組合せ；ロイペプチン、アンチパイン、ＰＰＡＣＫおよびＤＦＰの組合せ、またはそれらの類縁体、変異体もしくは誘導体、またはそれらに構造上および機能上の少なくともいずれかの関連がある阻害剤から選択された成分を含みうる。例えばＰＰＡＣＫを使用するときは、ＰＰＲＡＣＫも単独または上記の組合せで使用可能であることは完全に理解されるであろう。安定化成分の組合せにはロイペプチンおよびＰＰＡＣＫ（またはＰＰＲＡＣＫ）が含まれることが好ましい。本明細書に記載の安定化成分は、試料中の内在性ＢＮＰを安定化するため、および試料中にスパイクされうる外来のＢＮＰを安定化するための少なくともいずれかの目的で血液試料に添加（すなわちスパイク）可能である。本明細書に記載の方法と組成物とは、血漿試料や血清試料などの血液試料におけるＢＮＰの安定性の著しい向上を提供する（例えば実施例５）。
【００２４】
別の態様では、本発明は、採取される血液試料（好ましくは血漿試料）に、採取の前、採取時、または採取直後でかつ実験用もしくは臨床用の道具立て（ｓｅｔｔｉｎｇ）で検査する前または保存前に、上記の阻害剤成分およびそれらの組合せを直接添加することによりＢＮＰを含む血液試料を安定化する手順を提供する。これらの成分は、新鮮な試料だけでなく融解した試料、特に血液、血漿もしくは血清の融解したばかりの試料についてもＢＮＰの阻害剤の添加物として役立つ。新鮮な血漿または融解した血漿中のＢＮＰを安定化するためには、ＰＰＡＣＫを水溶性組成物の状態で使用することが好ましい。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、例えばアンチパイン、ロイペプチン、ＰＰＡＣＫ、ＰＰＲＡＣＫおよびＤＦＰから選択される阻害剤成分を１つまたは組み合わせて（例えばカクテル（　混合物）　として）含む、全血を採取する際に使用する真空管（例えばバキュテイナ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ、登録商標））のような採血用のコンテナまたは容器を提供する。血液試料、特にＢＮＰを含む血液試料は、１つまたはそれ以上の記載の阻害剤をその中に有する採血用容器または採血用コンテナに採取される。この態様では、ロイペプチンおよびＰＰＡＣＫのような予め添加された阻害剤成分が、該コンテナまたは容器に採取された血液試料または血漿試料が中に入るとすぐに試料中のＢＮＰを安定化するようにそこに存在している。
【００２６】
別の態様では、本発明はＢＮＰ測定のための安定な血漿コントロールを提供する。本発明のこの態様によれば、一定量の外来のＢＮＰ、例えば組換え技術で生産されたＢＮＰまたはＢＮＰ−３２のような合成ＢＮＰ（非特許文献１０）を、１つまたはそれ以上の本発明の阻害剤成分（例えばロイペプチン、アンチパイン、ＰＰＡＣＫ、ＰＰＲＡＣＫ、ＤＦＰまたはそれらの組合せ）が添加されたヒト血液由来の媒体（ｍａｔｒｉｘ）、例えば血漿媒体にスパイクすることにより、コントロールを作製可能である。本発明のこの特徴により、そのようなコントロールの調製および値設定の際の内在性プロテアーゼによるスパイクされたＢＮＰの急速な分解を原因とする、血漿媒体コントロール調製における従来の困難が克服される。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、阻害剤成分アンチパイン、ロイペプチン、ＰＰＡＣＫ、ＰＰＲＡＣＫ、および／またはＤＦＰのうち少なくとも１つ又はそれらの組合せのカクテルを、血漿試料および血清試料などのＢＮＰを含む血液試料に導入することを含む。本発明は、ＢＮＰと阻害剤成分とから成る安定な組成物を提供する。好ましい例として、ロイペプチンとＰＰＡＣＫとの組合せが外来のＢＮＰ例えば合成ＢＮＰの添加前に血液由来の媒体に含まれることにより、例えばヒトまたは動物の血漿媒体中で安定な市販のＢＮＰコントロールのための、安定なコントロール物質が用意される。
【００２８】
本発明のさらなる態様、特徴および利点は本発明の実施の形態を読むことで理解されるであろう。
【００２９】
【発明の実施の形態】
本発明は、血液試料、特に血漿試料および血清試料における心臓性ペプチドホルモンＢＮＰの分解を阻害または低減する１つまたはそれ以上のプロテアーゼ阻害剤の成分を含む方法と組成物とに関する。試料の採取、保存および検査の際のＢＮＰの分解は、不当に低い検査結果もしくは陰性の検査結果を招き、臨床上または医学的に検査された患者の試料を誤って分類する原因となる。本発明に従い、本明細書に記載の１つまたはそれ以上の新規に特定されたＢＮＰ安定化成分を血液、特に血漿に添加することにより、ＢＮＰの分解が著しく低減または阻害され、より正確かつ信頼性の高い試料についての判断が可能となる。本発明のＢＮＰ安定化成分を含む方法と組成物とは、心不全および心疾患の少なくともいずれかについて検査を受けている（または該疾患の疑いのある）患者の診断および管理のための所定の検査において、より正確なＢＮＰ濃度の測定をもたらす。
【００３０】
本発明により、単独または組み合わせた状態で（例えば２つ以上の成分のカクテルとして）ＢＮＰ安定化の優れた性質を有することが見出された成分には、プロテアーゼ阻害剤であるアセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）；Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−アルギニナール）Ｐｈｅ（アンチパイン）（ミズーリ州セントルイスに所在のシグマアルドリッチ社、カリフォルニア州サンディエゴに所在のカルビオケム社）；およびＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）、（カリフォルニア州サンカーロスに所在のバケムペニンシュララボラトリーズ（Ｂａｃｈｅｍ−Ｐｅｎｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｓ））だけでなくＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＲＡＣＫ）、（カリフォルニア州サンディエゴに所在のカルビオケム社）およびジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、（カリフォルニア州サンディエゴに所在のカルビオケム社）が含まれる。さらに、阻害剤４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）またはＡＥＢＳＦに構造的に関連する化合物を単独もしくは前記の阻害剤と組み合わせて使用可能である。これらの安定化成分またはこれらの成分から成る組成物は、血液試料中の内在性ＢＮＰだけでなく血液試料中に外から添加された（例えばスパイクされた）ＢＮＰを安定化するために使用可能である。
【００３１】
本発明によれば、１つまたはそれ以上の上記の阻害剤はＢＮＰを安定化し、血液（血漿）試料中のプロテアーゼによるＢＮＰの分解を低減または防止する。ＰＰＡＣＫは、単独およびアンチパイン、ロイペプチン、もしくは両方と組み合わせてＢＮＰの安定性を大幅に改善することが特に新規に見出された。動物（哺乳動物）、好ましくはヒトの血漿試料に直接添加したとき、阻害剤は、好ましくはロイペプチンとＰＰＡＣＫまたはアンチパインとＰＰＡＣＫの組合せで、凍結と融解を繰り返した後でも室温および４℃において試料中のＢＮＰを安定化した（実施例１）。
【００３２】
上記阻害剤の安定化の能力は、タンパク質分解に対して特に感受性の高い領域、例えば完全なＢＮＰ−３２の残基−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−から成る環状部位の領域を備えたＢＮＰの構造の評価に基づいて決定される。従って本発明の阻害剤、例えば限定するものではないがＢＮＰを構成するＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ残基に構造上の類似性を有するＰＰＡＣＫとＰＰＲＡＣＫとは、ＢＮＰの安定化に特に適している。理論上結合することが望めなくとも、ＢＮＰに対する構造上の類似性を有することは阻害剤にむしろより良いＢＮＰを安定化する作用をもたらす。加えて、本明細書にさらに記載のコントロール物質と安定化された組成物（以下、被安定化組成物とする）とにおいては、ＢＮＰの本来のアルギニン（Ａｒｇ）残基と関連部分とを分解から保護するために、例えばＢＮＰ−３２の分解に関与する天然のアミノ酸残基をタンパク質分解に対するＢＮＰの耐性を高める分子で置き換えることにより、ＢＮＰを修飾することが可能である。非限定的な例として、より安定なＢＮＰは天然のＬ−Ａｒｇの代わりにＤ−Ａｒｇを含みうる。さらに、より効果の高いＢＮＰを安定化する化合物もこの論理的根拠を用いて設計可能である。
【００３３】
本発明には、ＢＮＰを安定化するべく単独もしくは組み合わせて使用するために、ＰＰＡＣＫの類縁体、変異体、または誘導体（例えば化学的な類縁体、変異体、または誘導体）だけでなく、ロイペプチン、アンチパインおよびＰＰＡＣＫに、構造上および／または機能上関連する阻害剤も含まれる。ロイペプチン、アンチパインおよびＰＰＡＣＫの正常型（すなわち変異体でも誘導体でもないもの）とそのような類縁体、変異体などとの組合せも考えられる。本発明で使用するのに適したＰＰＡＣＫ関連化合物の非限定的な例は、ＰＰＲＡＣＫ（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン）、（カリフォルニア州サンディエゴに所在のカルビオケム社）である。
【００３４】
本発明の特定の関連実施形態において、阻害剤ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）（カリフォルニア州サンディエゴに所在のカルビオケム社）およびＰＰＲＡＣＫは、アンチパイン、ロイペプチンおよびＰＰＡＣＫと同じくらい効果的にＢＮＰを安定化することが示されている（実施例５、表１１を参照）。従って本発明は、本明細書に記載の組成物および方法において単独またはアンチパイン、ロイペプチンおよびＰＰＡＣＫのうち１つまたはそれ以上と組み合わせて使用されるＤＦＰおよびＰＰＲＡＣＫのうち少なくともいずれかを含む。
【００３５】
本発明には、（ｉ　）検査前の操作時に試料のＢＮＰが分解するのを防止するため記載のＢＮＰ分解阻害剤を血液または血漿試料の採取の過程で添加すること、（ｉｉ）検査の準備の間および検査の間にＢＮＰが分解するのを防止するため採取後に血液または血漿試料に阻害剤を添加すること、（ｉｉｉ　）内在性または合成ＢＮＰのいずれかを用いて、コントロールや医学的判断用のプール（ストック）などを調製するために血漿または血清を含まない基剤に阻害剤を添加すること、を含む多数の実際の適用が内包される。これらの適用については本明細書中でさらに説明する。
【００３６】
本発明の１つの実施形態では、安定化成分ロイペプチン、アンチパイン、ＰＰＡＣＫ、ＰＰＲＡＣＫおよび／またはＤＦＰのうち１つまたはそれ以上をヒトまたは動物の血液試料中のＢＮＰを安定化するために該試料に導入する方法が提供される。試料は血漿試料であることが好ましい。試料はヒト血漿試料であることがさらに好ましい。ヒト以外の動物（哺乳動物）、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの血液試料中のＢＮＰの安定化も、例えば獣医学上の適用に向けて想定される。
【００３７】
本発明のＢＮＰ安定化成分には、血液試料または血漿試料中のＢＮＰを安定化する（すなわちＢＮＰの分解を低減または防止する）ために単独または組み合わせて使用されるプロテアーゼ阻害剤ロイペプチン、アンチパイン、ＰＰＡＣＫ、ＰＰＲＡＣＫ、および／またはＤＦＰを含む。各阻害剤成分は長期にわたり血漿試料中のＢＮＰを安定化する効果を示すが、例えばロイペプチンとＰＰＡＣＫとの組合せ、またはアンチパインとＰＰＡＣＫとの組合せ、またはアンチパイン、ロイペプチンおよびＰＰＡＣＫの組合せのような阻害剤成分の組合せは、室温および４℃で長期にわたり、また凍結した試料を融解する際にも、著しいＢＮＰ安定化作用をもたらす（例えば実施例１〜３，７を参照のこと）。従って、本発明の方法および組成物は、例えば診療所、臨床検査室、病棟および医師の研究室のような医療において日常直面する条件下で、ＢＮＰを含む血液試料を正確に分析し信頼性の高いＢＮＰ値を得ることを可能にする。加えて、本発明は、より効果的で容易な採血とＢＮＰ分析のための診療所または研究室への血液試料の運搬とを可能にする有利な方法と組成物とを提供する。
【００３８】
血液および血漿試料中で安定化成分として使用するため、本明細書に記載のプロテアーゼ阻害剤は試料中にＢＮＰを安定化する量だけ存在する。例えば、限定するものではないが、アセチルロイシルロイシルアルギナール（ロイペプチン）は試料中に約０．５μｇ／ｍｌ〜約５５μｇ／ｍｌ、好ましくは約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約４５μｇ／ｍｌ〜約５５μｇ／ｍｌ存在し；Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）またはＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＰＰＲＡＣＫ）は試料中に約０．３５μｇ／ｍｌ〜約３８μｇ／ｍｌ、好ましくは約３．５μｇ／ｍｌ〜約３５μｇ／ｍｌ、より好ましくは約３２μｇ／ｍｌ〜約３８μｇ／ｍｌ存在し；アンチパインは試料中に約０．５μｇ／ｍｌ〜約５５μｇ／ｍｌ、好ましくは約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約４５μｇ／ｍｌ〜約５５μｇ／ｍｌ存在する。ＤＦＰは好ましくは約２μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１８μｇ／ｍｌ（１００μＭ）存在する。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、血漿媒体、好ましくはヒトの血漿媒体中に単独または組み合わせて本明細書に記載のＢＮＰ安定化成分を含む被安定化組成物を含む。臨床上および医学的に利用するコントロールとしての使用に好適な被安定化組成物には、試料すなわち血漿媒体中のＢＮＰのタンパク質分解性の分解を低減または防止するロイペプチン、アンチパインおよび／またはＰＰＡＣＫのうち１つまたはそれ以上が含まれる。加えて、被安定化組成物には、ＤＦＰおよび／またはＰＰＲＡＣＫが単独で、互いに組み合わせて、または本発明の他の阻害剤と組み合わせて含まれうる。安定化成分の組合せが用いられる場合、被安定化組成物には、これらの安定化成分のカクテルを提供するために、例えば非限定的な例としてロイペプチンとＰＰＡＣＫとの組合せ；ロイペプチンとアンチパインとの組合せ；アンチパインとＰＰＡＣＫとの組合せ；アンチパイン、ロイペプチンおよびＰＰＡＣＫの組合せ；ロイペプチンとＰＰＲＡＣＫとの組合せ；アンチパインとＰＰＲＡＣＫとの組合せ；アンチパイン、ロイペプチンおよびＰＰＲＡＣＫの組合せ；ＤＦＰとＰＰＡＣＫとの組合せ；ＤＦＰとＰＰＲＡＣＫとの組合せ；ＤＦＰとアンチパインとの組合せ；ＤＦＰとロイペプチンとの組合せ；ＤＦＰ、アンチパイン、ロイペプチンおよびＰＰＡＣＫの組合せ；ＤＦＰ、アンチパイン、ロイペプチンおよびＰＰＲＡＣＫの組合せ；ＤＦＰ、アンチパイン、ロイペプチン、ＰＰＡＣＫおよびＰＰＲＡＣＫの組合せなどが含まれうる。
【００４０】
安定化成分は、単独もしくは共に調合もしくは混合され、望ましければ凍結乾燥され、または使用前に水溶液もしくは緩衝液に溶解され、調製したばかりの実験試料に添加物として導入されうる。代替例では、アンチパイン、ロイペプチン、ＰＰＡＣＫ、ＰＰＲＡＣＫまたはＤＦＰのうち１つまたはそれ以上から成る安定化成分は水溶液として直接提供され、ＢＮＰを安定化するのに有効な量のその水溶液を最初のＢＮＰ測定の前に必要なだけまたは望ましいだけ血漿もしくは血液試料に添加可能である。限定するものではないが、本発明の阻害剤は遠心分離を用いた回収による全血からの血漿の分離後約５〜３０分またはそれより短い間に添加されることが好ましく、試料は凍結して保存されるのが好ましい。試料のタイプとして血清が使用される場合は、凝血の過程でＢＮＰが破壊されるので阻害剤を全血採取の前に採血管に添加する。
【００４１】
安定化成分は、血液または血漿をあまり大幅には薄めることなく、例えばプロテアーゼ阻害剤の高濃度の調製物をわずか数滴ばかり血液試料または血漿試料に添加可能なように、高濃度の状態で提供されうる。従って、安定化成分は滴下用のバイアルまたはコンテナ（例えば滴下容器もしくは類似のデバイスを受承するのに好適なコンテナ）の中に、または試料中に該成分を分注するのが簡単なように注射器の中に供されうる。成分は、試料に添加されるべく高濃度の剤形の、例えばロイペプチンとＰＰＡＣＫとの組合せまたはアンチパインとＰＰＡＣＫとの組合せなどの組合せであることが好ましい。加えて、本発明のプロテアーゼ阻害剤の組成物を内蔵する滴下用のバイアルまたはコンテナは、血液または血漿試料中のＢＮＰを検出する検査の実施用キットに含まれうる。血漿は患者の試料中の１検体として実際にＢＮＰを分析測定する前に様々な時間間隔で日常的に分離されるので、安定なＢＮＰを提供するそのような態様は特に市販用の用途について有利である。
【００４２】
指針としては、高濃度の阻害剤は、非限定的な例として凍結状態で約５−１０ｍｇ／ｍｌ；または約５−１０ｍｇ／ｍｌに直接簡単に希釈できるように非限定的な例として乾燥粉末で約５−１０ｍｇ／バイアルの濃度で提供されうる。５−１０ｍｇ／ｍｌの溶液は一般にＢＮＰを含む試料に例えば９９−１９９容量に対して１容量の比でさらに添加するための１００倍−２００倍のストック用の物質に相当する。
【００４３】
別の実施形態では、医学的判断用のプールのようなコントロール物質には、分析しようとする試料（例えばヒトの血漿試料）と同じ血液由来の媒体（例えば血漿）中に作製された物質が含まれる。そのようなコントロール物質は、患者の治療および治療結果に関する臨床上の判断を下す基準としての役割を果たすので、正確でなければならず、かつ安定した成分を含んでいなければならない。具体的には、コントロールはＢＮＰのような包含される物質の設定値または設定レベルを有し、その設定値または設定レベルは切点すなわち患者に関する医学的な判断や決定を下すのに使用される値、例えば患者の試料中に存在するＢＮＰの量またはレベルに相当する。特定の切点に基づいた特定の範囲の安定化されたＢＮＰの設定レベルを有するコントロールは、種々の用途、例えば心臓発作、梗塞、さらなる心疾患などのリスクについて患者の試料をスクリーニングすること；心臓病患者の治療をモニタリングすること；および心臓病の患者を心疾患の程度または重篤度について段階分けすること；の少なくともいずれかについて用意可能である。
【００４４】
本発明のこの実施形態では、血液媒体中にＢＮＰを含むそのようなコントロール物質を生産する際に長期間および／または凍結と融解の後にＢＮＰの分解を防止するか大幅に低減するため、安定化成分例えばロイペプチン、アンチパイン、ＰＰＡＣＫ、ＰＰＲＡＣＫ、ＤＦＰおよびそれらの組合せが効果的である。コントロール物質を調製するために１つまたはそれ以上の本発明のＢＮＰを安定化する阻害剤を使用することにより、大量の材料（例えば血漿）を用いて多数の（例えば数千のオーダーの）コントロール試料を作製することが可能となる。加えてこれらのコントロール物質は、これらのコントロール物質中のＢＮＰのような成分のレベルが長期間安定であるため、保存可能で長期間安定でありうる。さらに、スパイクされたり外から添加されたＢＮＰのようなＢＮＰの値が初期設定値やコントロールの切点から大きくは変わらないので、再測定値は保存されたコントロール物質において事実上一定で確実に同じ状態である。本実施形態によれば、患者の血液試料のＢＮＰの分析と定量とに使用するコントロール物質を調製するため、阻害剤を単独または組み合わせて、血液由来の（例えば血漿）媒体に外来ＢＮＰ（例えば合成ＢＮＰ）を添加する前、または添加の際に加えることが可能である。
【００４５】
別の実施形態では、本発明は、全血を採取するときに使用する採血管またはバキュテイナ管の中に存在する安定化成分、すなわち阻害剤ロイペプチン、アンチパイン、ＰＰＡＣＫ、ＰＰＲＡＣＫ、ＤＦＰまたはそれらの組合せのうち１つまたはそれ以上からなる組成物を提供する。血液採取の前に安定化成分が添加されているので、試料中に存在するいずれのＢＮＰも採取時に安定化される。本発明の安定化する組成物は、記載のプロテアーゼ阻害剤、例えばロイペプチン、アンチパイン、ＰＰＡＣＫ、ＰＰＲＡＣＫおよび／またはＤＦＰを単独もしくは組み合わせて、少量の高濃度の水溶液の状態、または血液試料の添加で溶解するかもしくは血液試料の採取直前に少量の水溶液で溶かされる凍結乾燥の状態で採血管内に備えうる。採取された試料が薄まるのを避けるために、試料の容量の１％を超えない容量の高濃度の阻害剤溶液を使用することが好ましい。例えば、約６０μｌを超えない量の高濃度の阻害剤または阻害剤の混合物を一般的な６ｍｌの採血管に添加すべきである。
【００４６】
特定の実施形態では、ロイペプチンとＰＰＡＣＫとの組合せを血液由来の媒体、例えばヒト血漿に添加した後で、コントロール物質、医学的判断用のプールなどを調製するために外来の合成ＢＮＰを添加する。コントロールおよび医学的判断用のプールは、安定化成分と内在性ＢＮＰとの組合せを用いて調製することも可能である。
【００４７】
該実施形態の別例では、本発明は、採取される血液試料（好ましくは血漿試料）に、採取の前、採取時、または採取直後でかつ実験用もしくは臨床用の道具立てで検査する前に、阻害剤成分およびそれらの組合せを直接添加することによりＢＮＰを含む血液試料を安定化する手順を提供する。これらの成分は、新鮮な試料だけでなく融解した試料、特に血液、血漿もしくは血清の融解したばかりの試料についてもＢＮＰの阻害剤の添加物として役立つ。新鮮な血漿または融解した血漿中のＢＮＰを安定化するためには、ロイペプチンとＰＰＡＣＫとの組合せまたはロイペプチンとＰＰＲＡＣＫとの組合せを水溶性組成物の状態で使用することが好ましい。
【００４８】
一部の試料では、ＢＮＰが非常に急速に分解するようなＢＮＰに対する異なる攻撃性が見出されている。これは、ある試料では他の試料に対してより活性の高い、またはより強力なプロテアーゼが存在する結果、ある一連の試料において著しく急速にＢＮＰが分解することによる。例えば表１に示すように、ある患者の試料は強力なタンパク質分解性のＢＮＰ分解を示した（すなわち４℃での保存後２４時間以内に５０％未満となった）。しかし本発明のプロテアーゼを添加すると、そのようなタンパク質分解は大幅に抑制された。
【００４９】
【表１】
2004029021.tif 000003
【００５０】
従って、試料への阻害剤の添加は採取後可能な限り速やかに（例えば数分以内、好ましくは約５分以内またはそれより短い間に）実施することが好ましい。本発明の阻害剤の利用により、室温（〜２０℃）で約４４時間保存されたヒト血漿において外来のＢＮＰの回収率は良好である（例えば〜９０％）。さらに、表２は、阻害剤としてロイペプチン（５０μｇ／ｍｌ）およびＰＰＡＣＫ（３５μｇ／ｍｌ）を添加した場合としない場合の、ヒト血漿試料（インタージェン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）社）にスパイクされた合成ＢＮＰ（２０００ｐｇ／ｍｌ）の用量の回収率を示す。
【００５１】
【表２】
2004029021.tif 000004
しかしながら、ＢＮＰの分解速度がより速い試料については保存可能時間がかなり短い可能性がある。よって、試料（およびＢＮＰ）の保存は、阻害剤存在下であってもＢＮＰが０℃より高い温度にさらされるのが最小限となる時間であることが好ましい。
【００５２】
別の態様では、本発明はＢＮＰ測定のための安定な血漿コントロールを提供する。本発明のこの態様によれば、一定量の外来のＢＮＰ、例えば組換え技術で生産されたＢＮＰまたはＢＮＰ−３２のような合成ＢＮＰ（非特許文献１０）を、１つまたはそれ以上の本発明の阻害剤成分すなわちロイペプチン、アンチパインおよびＰＰＡＣＫもしくはそれらの組合せが添加されたヒト血液由来の媒体、例えば血漿媒体にスパイクすることにより、コントロールを作製可能である。本発明のこの特徴により、そのようなコントロールの調製および値設定の際の内在性プロテアーゼによるスパイクされたＢＮＰの急速な分解を原因とする、血漿媒体コントロールの調製における従来の困難が克服される。血漿媒体の試料中に１つまたはそれ以上の安定化する、かつ阻害剤の成分、例えばロイペプチンとＰＰＡＣＫ（またはＰＰＲＡＣＫ）があると、該試料は例えば４℃で少なくとも１７時間の間活性を失うことなく明らかな安定性を有する。
【００５３】
例えば、表３は、本発明に従いロイペプチン（５０μｇ／ｍｌ）とＰＰＡＣＫ（３５μｇ／ｍｌ）の両方を含む正常なヒトの血漿に添加した合成ＢＮＰ−３２の安定性の実績を示す。
【表３】
2004029021.tif 000005
【００５４】
表４は、室温（ＲＴ、２２℃）における、表３で上記に説明したのと同じ阻害剤の組合せを含む血漿試料中のＢＮＰ−３２の安定性が、４℃における安定性に比べてわずかに低いだけであったことを示す。
【表４】
2004029021.tif 000006
【００５５】
（実施例）
当業者に本発明を例証し本方法を説明するべく、以下の実施例で本発明の特定の態様について説明する。実施例は単に本発明とその種々の態様を理解し実践するために有用な特定の方法論を提供するにすぎないので、実施例が本発明を限定するものと解釈するべきではない。
【００５６】
（実施例１）
本明細書に記載のＢＮＰを安定化する阻害剤化合物の効果を単独および組合せの両方について調べるため、試料中の合成ＢＮＰ−３２を検出する免疫測定法を用いて実験を実施した。
【００５７】
本実施例に記載の実験では血漿中の合成ＢＮＰ−３２の安定性を調べた。実験を実施するために、プロテアーゼ阻害剤を正常なヒト血漿に添加（「スパイク」）し、次いで既知量のＢＮＰを添加した。阻害剤を添加されていない正常ヒト血漿をコントロールとして使用した。阻害剤を含む血漿試料と含まない血漿試料とに存在するＢＮＰに起因するシグナルを、スパイク直後および４℃で試料を保存した後に測定した。
【００５８】
試料中のＢＮＰ濃度を数値化するための分析シグナルを発生させるため、２種類のＢＮＰ特異的なモノクローナル抗体（日本国大阪市に所在の塩野義製薬株式会社；ＥＰ５４２２５５Ａ１／Ｂ１；ＪＰ３２９７３９２）を使用した。第１の抗体をアクリジニウム・エステル（ＡＥ）で標識し、第２の抗体をビオチンで標識した。この２種類の抗体は血漿試料中に存在するＢＮＰ分子に結合して複合体を形成し、形成された複合体をストレプトアビジンでコーティングされた常磁性粒子（ＰＭＰ）で捕捉した。磁場によってＰＭＰを分離し、非特異的に結合した物質を除去すべく洗浄した。ＰＭＰ上に保持されたＢＮＰ−ＡＥ複合体をアルカリ溶液で処理し、捕捉されたＢＮＰの量に比例する化学発光シグナルを発生させた；該シグナルは相対的な光の単位「ＲＬＵ」として測定される。検査は自動化学発光システムＡＤＶＩＡ：Ｃｅｎｔａｕｒ（登録商標）（ニューヨーク州タリータウンに所在のバイヤー社）で、すでに記載のＢＮＰ検出試薬を用いて実施した（例えば非特許文献１２）。実験結果を表５に示す。
【００５９】
表５では、コントロール標準試料（Ｓ１−Ｓ７）は使用時までリン酸緩衝液中に凍結した。これらの標準試料は、生理的緩衝液に合成ＢＮＰをスパイクすることにより重量を基準にして調製した。表５の１列目は被検試料を示す：標準Ｓ１−Ｓ７；インタージェン社（マサチューセッツ州ミルフォード）より市販されている、健康なヒト供血者から採取されＦＤＡ認定の方法でＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＨＩＶについて陰性であることが検査された正常なＥＤＴＡ血漿から成る、インタージェンヒト血漿プール（ＩＨＰＰ）；阻害剤ＡＥＢＳＦ（すなわち［　４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド］　）；阻害剤アンチパイン；阻害剤ベンザミジン；阻害剤ＰＰＡＣＫ；および健康なヒト供血者由来のプールされた正常なＥＤＴＡ血漿で、かつＦＤＡ認定の方法でＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＨＩＶについて陰性であることが検査されたＫＣＢＢ（カンザスシティー血液バンク）の血漿プール。
【００６０】
表５の２列目はＢＮＰの濃度［ＢＮＰ］（存在すれば）を示す。表５の３−８列は、血漿試料中のＢＮＰの安定性プロファイルを示し、ＢＮＰについて試料を測定した回数を示す。「ＲＬＵ」は相対的な光の単位または検査において数値化された光子の計数を示す。表５の９列目は回収されたシグナルの比率を示す。
【００６１】
【表５】
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2004029021.tif 000008
【００６２】
表５は、インタージェン社の血漿とＫＣＢＢの血漿の２つの血漿試料を比較するデータを示す。ＢＮＰ濃度の評価を容易にするため、非常に高用量の合成ＢＮＰを血漿試料にスパイクした。ＢＮＰを含むが阻害剤を含まない血漿をネガティブコントロールとした。阻害剤を含まないＫＣＢＢの血漿試料中のＢＮＰは保存７２時間後にほとんど検出不可能であったが、阻害剤を含んだ同じ血漿ではＢＮＰ濃度の緩やかな減少、すなわち保存１週間後に初期値の約９２％に減少するにとどまった。個々の阻害剤の有効性はＩＨＰＰについてだけ調べた。ＰＰＡＣＫが調べた阻害剤の中で最も有効と思われ、少なくとも３週間の間外来ＢＮＰを十分に保護した（すなわち約９５．９％のＢＮＰが回収された）。アンチパインも良好な保護能力を示した（保存３日後に約９０％を回収）。この一連の実験では、アンチパインの効力はＰＰＡＣＫよりも長く持続した。アンチパインの効力は４週間にわたり観察されたがＰＰＡＣＫの効力はほとんどなかった。しかし、当業者には認識されるであろうが、阻害剤が一部の血液試料中で不安定であることは珍しいことではない。従って、概ね良好な阻害剤（例えばＰＰＡＣＫ）の阻害活性は一部の血漿試料中では時間がたつと劣化する可能性があるが、全ての試料について劣化するわけではない。
【００６３】
血液試料の違いの動的特性に伴う上記の知見からわかるように、アンチパインとＰＰＡＣＫとの組合せが本発明において非常に好適であり、場合によっては１種類の阻害剤の代わりに必要とされることもある。しかし実用上はＰＰＡＣＫまたはアンチパインのいずれか単独でも許容可能なＢＮＰの安定性が提供されるであろう。アンチパインは一般にロイペプチンに類似の活性スペクトルを示すので、その後の検査にロイペプチンを含めた（表７、実施例２を参照のこと）。
【００６４】
表６は、ＰＰＡＣＫ単独で、ＢＮＰの分解を低減または阻害するために許容可能な程度に試料中のＢＮＰを十分安定化したことを表すデータを示す。従って、本発明によれば、混合物中にＰＰＡＣＫを含んだ複数の阻害剤の組合せの阻害活性により、ＢＮＰを安定化するための阻害活性の長期持続が可能となる。
【００６５】
【表６】
2004029021.tif 000009
【００６６】
（実施例２）
本実施例は、血漿中の合成ＢＮＰ−３２の長期の安定性に対する、阻害剤の成分ＰＰＡＣＫ、ロイペプチンおよびアンチパインの単独または組合せでの効果を評価するために実施された追加の検査のデータを示す。血漿試料に合成ＢＮＰ−３２をスパイクし、４℃で様々な期間（すなわち０日、２４時間および約９０時間）保存してから検査した。ある時点におけるＢＮＰの存在を検出し数値化する検査法は、実施例１に記載した方法と同じとした。ＥＤＴＡ（血液に対し約１．８ｇ／ｌ、すなわち６ｍｌの採血管あたり約１０．８ｍｇに相当するＫ２ＥＤＴＡまたはＫ３ＥＤＴＡ）を含んだインタージェン社のヒト血漿試料（ＩＨＰ、マサチューセッツ州ミルフォードに所在のインタージェン社のＩｎｔｅｒｇｅｎ番号０１Ｄ１７０７）を使用した。標準試料については実施例１に記載した。本実施例の実験結果を表７に示す。
【００６７】
【表７】
2004029021.tif 000010
【００６８】
表７の結果からわかるように、安定化成分ロイペプチン、アンチパイン、またはＰＰＡＣＫ（５０μｇ／ｍｌ）を単独もしくは共に含むことにより、血漿試料を様々な期間４℃に冷蔵保存した後に該試料を検査したときのＢＮＰの安定性が著しく改善された。詳細には、表７の最後の列が安定性検査の間のＢＮＰ濃度の全体的な変化を示す。負の数値、例えばアンチパインの場合の−１４．３％は、ＢＮＰの減少が初期のＢＮＰ量の１４．３％であったことを示す。実験結果は試料中のＢＮＰを安定化するためにＰＰＡＣＫを単独で使用することを支持しているが、本発明によればＢＮＰの安定性は本明細書に記載のように１つまたはそれ以上の阻害剤を組み合わせることにより、特に表７に示すように長期の安定性について向上可能である。
【００６９】
（実施例３）
本実施例で実施した実験では、血漿試料中の内在性ＢＮＰの安定性を評価した（すなわちＮＹＨＡ（ニューヨーク心臓協会）分類ＩＩＩ　のヒトＣＨＦ血漿を使用）。内在性ＢＮＰを含む血漿試料はＰｒｏＭｅｄＤｘ社（マサチューセッツ州ノートン）より入手し凍結保存した。検査当日、使用前に試料を融解した。融解した試料は融解後約１時間以内に使用した。阻害剤を試料を融解した直後に添加した。結果を表８に示す。
【００７０】
表８において、２列目は検査開始日（０日）に融解して検査した血漿中に存在するＢＮＰの量を示す。表８の３列目は、４℃で約４時間保存した後に検査した、その０日の血漿試料中に存在するＢＮＰの量を示す。表８の４列目は、４℃で約２４時間保存した後に検査した、同じ０日の血漿試料中に存在するＢＮＰの量を示す。検査は上記の実施例に記載したように実施した。
【００７１】
【表８】
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【００７２】
上記の実施例の結果から、本発明のＢＮＰ安定化成分／阻害剤成分の存在下で血漿試料の安定性が向上することが確認される。
【００７３】
（実施例４）
ヒト血漿に対して動物の血清およびヒト血清におけるＢＮＰの安定化を評価するために実験を実施した。表９，１０は、３つの異なる媒体、すなわちウシ胎児血清（カリフォルニア州ランチョドミンガス（Ｒａｎｃｈｏ　Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ）に所在のバイオセルラボ（Ｂｉｏｃｅｌｌ　Ｌａｂｓ））、正常ヒト血清（バイオセルラボ）、正常ヒト血漿（インタージェン）におけるＰＰＡＣＫおよびロイペプチンのＢＮＰ安定化剤としての有効性を示す。実験結果は、ヒト血清および動物の血清のいずれもＢＮＰ分解に関して血漿よりもはるかに攻撃的な挙動を示し、検査した阻害剤の最も高い濃度においてすらペプチドの分解が急速であることを示す。それにもかかわらず、全ての条件においてＰＰＡＣＫおよびロイペプチンの添加によりＢＮＰの分解が著しく阻害されることが見出された。
【００７４】
【表９】
2004029021.tif 000012
【００７５】
【表１０】
2004029021.tif 000013
【００７６】
（実施例５）
実施例５は数種の異なる阻害剤の比較評価を示す。表１１では血栓溶解性に関与するセリンプロテアーゼの阻害剤を比較する。阻害剤は一般的な活性を示す濃度で使用した。ＰＰＡＣＫ以外の阻害剤は全てカルビオケム社（カリフォルニア州サンディエゴ）より入手した。アプロチニンおよびベンザミジンのような阻害剤は周知であり、本明細書に記載の新規な阻害剤化合物と比較する目的で使用した。ＡＥＢＳＦ（［４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド］）はフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）関連の阻害剤である。データから、ＢＮＰの安定化においてアプロチニンの有効性が低く、ＡＥＢＳＦとベンザミジンの有効性が中程度であることが示される。しかしながら、本明細書で新たに提示されるように、ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロリン酸）およびＰＰＲＡＣＫ（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン）はＢＮＰの安定化についてアンチパイン、ロイペプチンおよびＰＰＡＣＫと同程度に作用することが見出された。
【００７７】
【表１１】
2004029021.tif 000014
【００７８】
（実施例６）
本実施例で示す実験では、異なるロットのヒト血漿におけるＰＰＡＣＫ（表１２）およびアンチパインならびにロイペプチン（表１３）の濃度依存性の測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）の結果を示す。合成ＢＮＰをスパイクした正常ヒト血漿（インタージェン）の試料中でＰＰＡＣＫ、アンチパインまたはロイペプチンの濃度を振ってデータを採取した。ＰＰＡＣＫについては３種の正常ヒト血漿試料（Ａ，Ｂ，Ｃ）を使用した。ＰＰＡＣＫの濃度依存性測定の結果は、約３．９μｇ／ｍｌおよびそれより高濃度のＰＰＡＣＫを含む血漿中に保存したＢＮＰの回収率が約９０％またはそれより高いことを示す（表１２）。アンチパインおよびロイペプチンの濃度依存性測定の結果は、これらの阻害剤が約５０μｇ／ｍｌで血漿中のＢＮＰの安定性を十分保護することを示す。
【００７９】
【表１２】
2004029021.tif 000015
【００８０】
【表１３】
2004029021.tif 000016
【００８１】
（実施例７）
実施例７は、内在性ＢＮＰの安定性に対するＰＰＡＣＫの効果を測定するための種々の実験の結果を示す。冷蔵保存時間を変えた様々な患者の試料の安定性を測定するため、５人の患者の試料を０，１，８，２４，４８，１４４時間冷蔵保存した。阻害剤ＰＰＡＣＫがＢＮＰの分解を低減する能力を評価するため、関連する一組の試料にＰＰＡＣＫを終濃度３５μｇ／ｍＬとなるように添加した。表１４に示すように、ＰＰＡＣＫは０時間ですら著しく分解を抑制した。結果は、０時間（第１回測定）の測定値に対する回収率として算出した。
【００８２】
【表１４】
2004029021.tif 000017
【００８３】
表１４の結果から、２４時間の時点でＰＰＡＣＫを添加した試料のＢＮＰの平均的な損失がわずか６．２％であったのに対して阻害剤を含まない試料では平均的な損失は２８％であった。４８時間までに、ＰＰＡＣＫを含まない試料のＢＮＰの平均的な損失が４０％に達した一方、ＰＰＡＣＫを含む試料では初期のＢＮＰ測定値に対して１００％の回収率を示した。０時間における試料中のＢＮＰの初期値は、ＰＰＡＣＫの添加した場合に平均で３１％高かった。これらの知見から、血漿の遠心分離直後にプロテアーゼ阻害剤を添加することにより、患者の試料を安定化させるとともにＢＮＰ分解を伴わず試料の冷蔵保存期間を長くする有益な方法が提供されることが示される。さらに、ＰＰＡＣＫが４℃で６日間保存した後でもＢＮＰ分解を防止可能であることがデータから示される。
【００８４】
表１５は上記において分析した患者の試料（表１４）についての追加データであり、ＰＰＡＣＫが室温で６時間保存した後でもＢＮＰ分解を防止可能であることを示す。表１４，１５に示す各時点において、ＰＰＡＣＫを含まない場合は、免疫学的反応性を有するＢＮＰは事実上残っていない。表１４と同じように、結果は第１回測定（０時間）の測定値に対する回収率として算出した。表中、１は患者番号１の試料、１ｐはプロテアーゼ阻害剤ＰＰＡＣＫを添加した患者番号１の試料、等を表す。
【００８５】
【表１５】
2004029021.tif 000018
【００８６】
（実施例８）
この解析では、種々の希釈媒体におけるＢＮＰの安定性を比較するために、２つのレベルの合成ＢＮＰを市販の血清または血漿を基にした様々な希釈媒体にスパイクした。全ての希釈媒体は元々ＢＮＰを含有していなかった。使用した希釈媒体は次のものである：希釈媒体１はフィルター濾過されたウマ血清；希釈媒体２は加熱により不活性化されたヤギ血清；希釈媒体３は活性炭でフィブリンを除去されたヒト血漿；希釈媒体４はフィブリンを除去されたヒト血漿（アーバイン社）；希釈媒体５はフィブリンを除去されたヒト血漿（Ｓｅｒａｃｏｎ　ＩＩ、登録商標）；希釈媒体６は本来のヒト血清；希釈媒体７は脱脂された、除去された血漿（Ｓｅｒａｃｏｎ　ＩＩ）。
【００８７】
ＢＮＰを希釈媒体に添加して約４５分後に安定性検査を実施した。結果を表１６に示す。表１６において「低量スパイク」とはＢＮＰの添加を濃度約３００ｐｇ／ｍｌとしたことを示し、「高量スパイク」とはＢＮＰの添加を濃度約３０００ｐｇ／ｍｌとしたことを示す。本明細書に示したようなＰＰＡＣＫの安定化作用にもかかわらず、ＢＮＰの回収率は特に希釈媒体７において低下した。これらの結果から、プロテアーゼ阻害剤を含む場合と含まない場合のＢＮＰの分解に対する患者の試料の活性が異なることは明らかである。
【００８８】
【表１６】
2004029021.tif 000019
【００８９】
表１７は、ＢＮＰ陽性の血漿（すなわち内在性ＢＮＰを含む血漿）を正常な血漿で希釈するとＢＮＰの分解速度が変わることを示す。この速度は希釈媒体として使用した血漿と、それより度合いは低いが被検血漿とに特異的である。表１７では、血漿Ａ，Ｂ，Ｃはマサチューセッツ州ボストンに所在のブリガム・アンド・ウィメンズホスピタル（Ｂｒｉｇｈａｍ　ａｎｄ　Ｗｏｍｅｎ’ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の循環器部門より入手した試料を表す。正常血漿プール１はニューヨーク州タリィタウンに所在のバイヤー社の実験室において社内の提供者の血漿から調製した；血漿プール２は本明細書にすでに記載したのと同じＫＣＢＢの血漿プールである；血漿プール３および４はインタージェン社より入手した。
【００９０】
【表１７】
2004029021.tif 000020
【００９１】
本明細書で参照または引用したすべての特許、特許出願、公開された特許協力条約に基づく国際出願および米国出願、論文、書籍、参考資料、取扱説明書、抄録の内容は、本発明が関連する先行技術をより十分に説明するため引用により本願に組み込まれる。
本発明の範囲および精神から逸脱することなく上記の主題を様々に変更することが可能であるので、上記の発明の詳細な説明に含まれるかまたは請求項に規定される全ての主題が本発明の説明および例証として解釈されるべきである。上記の教示に照らせば本発明の多数の修正形態および変更形態が可能である。
【００９２】
【発明の効果】
以上、本発明によれば、血液試料中のＢＮＰの分解を防止または大幅に低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】長期間４℃で保管した患者の試料中の天然（内在性）ＢＮＰの分解の低減に関する阻害剤の効果を示す図。これらの検討では、ＰＰＡＣＫを濃度３５μｇ／ｍｌで使用し、ロイペプチンを濃度５０μｇ／ｍｌで使用した。阻害剤を含む試料では、４℃で約２５時間の保存において阻害剤を含まない試料に比べて著しく多いＢＮＰが存在していた。
【図２】ヒト血漿プール（米国マサチューセッツ州ミルフォードに所在のインタージェン社）にスパイクした外来の合成ＢＮＰ（１０，０００ｐｇ／ｍｌ）の分解の低減に関する阻害剤の効果を示す図。ヒト血漿中のＢＮＰは、阻害剤の非存在下のＢＮＰをスパイクされた血漿に比べ、阻害剤存在下ではほぼ３０日間安定化された。これらの検討では、以下の阻害剤の組合せを使用した：ＡＥＢＳＦ（すなわち［　４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド］　）（２００μｇ／ｍｌ）、アンチパイン（１００μｇ／ｍｌ）、ベンザミジン（１４ｍＭ）および　ＰＰＡＣＫ（３５μｇ／ｍｌ）。
【図１】
2004029021.tif 000021
【図２】
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