(57)【要約】【課題】高度不飽和脂肪酸生産能を有するラビリンチュラ属微生物の液体培養により、アラキドン酸、ＥＰＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡなどの高度不飽和脂肪酸を高収率で製造しうる工業化可能な方法を提供する。【解決手段】ラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄ）に属する高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を製造するに当たり、無機質及び有機質繊維の中から選ばれた少なくとも１種の繊維質物とレシチンとを含む液体培地中で培養する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄ）に属する高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を製造するに当たり、無機質及び有機質繊維の中から選ばれた少なくとも１種の繊維質物とレシチンとを含む液体培地中で培養することを特徴とする高度不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項２】
繊維質物５〜３０ｇ／リットル及びレシチン５〜４０ｇ／リットルを含む液体培地中で培養する請求項１記載の高度不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項３】
レシチンが大豆レシチンである請求項１又は２記載の高度不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法で用いるラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄ）に属する高度不飽和脂肪酸生産菌Ｌ２５株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９８６）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の液体培養により、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサテトラエン酸（ＤＴＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの高度不飽和脂肪酸を高収率で製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）類には、スラウストキトリウム科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）及びラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄ）の２つの科が存在し、そのうちラビリンチュラ科はラビリンチュラ属の１属からなる微生物である。これらはアラキドン酸、ＥＰＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡなどの高度不飽和脂肪酸を蓄積する微生物として知られている。
【０００３】
しかしながら、ラビリンチュラ科に属する微生物は、自然界からの単離が困難な上に、有効な培養方法がないため、これまでこの微生物を利用して長鎖高度不飽和脂肪酸を製造することは行われていなかったが、最近、それを簡単に単離する方法が開発された結果（特許文献１）、はじめて、この微生物の培養による長鎖高度不飽和脂肪酸の製造が可能になった（特許文献２）。
【０００４】
この方法は、グルコース、酵母エキス、ペプトンなどの栄養源と寒天とを含む天然海水又は人工海水に、炭素源として油脂又は脂肪酸を加えて調製した培地を用いて、ラビリンチュラ科に属する微生物を培養する方法であるが、固体培地のためタンク培養ができない上に、高度不飽和脂肪酸の生産量も低く、工業的方法としては、不適当であった。
【０００５】
【特許文献１】
特開２０００−６０５３９号公報（特許請求の範囲等）
【特許文献２】
特開２００１−２７５６５６号公報（特許請求の範囲等）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、高度不飽和脂肪酸生産能を有するラビリンチュラ属菌の液体培養により、アラキドン酸、ＥＰＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡなどの高度不飽和脂肪酸を高収率で製造しうる工業化可能な方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、先にラビリンチュラ科に属する微生物の液体培養により高度不飽和脂肪酸を高収率で製造する方法を開発するために鋭意研究を重ねた結果、先に栄養源及び海水を含む基本培地にレシチンを添加して得た栄養培地で高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を培養する方法を提案したが（特願２００１−１９０１３１号）、さらに研究を続け、基本培地にレシチンを添加するとともに、培養担体として繊維質物を用いることにより、その生産量が著しく向上すること及びこのような培養に適した新規な微生物が存在することを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄ）に属する高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を製造するに当たり、無機質及び有機質繊維の中から選ばれた少なくとも１種の繊維質物とレシチンとを含む液体培地中で培養することを特徴とする高度不飽和脂肪酸の製造方法、及びこの方法において用いるのに好適な新らしい菌株であるラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄ）に属する高度不飽和脂肪酸生産菌Ｌ２５株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９８６）を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明方法で用いる高度不飽和脂肪酸生産能を有するラビリンチュラ科に属する微生物としては、例えば石垣島で採取されたオヒルギの落葉から分離されたラビリンチュラ・エスピーＳ３−２（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ　ｓｐ．Ｓ３−２株、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７０９０）、ラビリンチュラ・ゾーステラエ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ　ｚｏｓｔｅｒａｅ、ＡＴＣＣ７６１２０）、ラビリンチュラ・Ｌ４株、Ｌ２２株、Ｌ２５株、Ｌ２９株などがある。
【００１０】
次に、本発明方法においては、基本培地として、例えばグルコースのような糖類、ペプトン、無機塩及び酵母エキスのような栄養源０．１〜１０ｇ／リットルとを含む海水を滅菌したものが用いられる。この際の海水濃度としては、通常の海水濃度の２５〜１２５％、特に５０〜９０％の範囲に調整されたものを用いるのが好ましい。
そして、本発明方法においては、窒素源として上記のペプトンと酵母エキスを用い、窒素源濃度を１．５〜６．０ｇ／リットルの範囲に調整して用いるのが好ましい。
【００１１】
ここで、無機塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＮＯ３、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、（ＮＨ４）２ＳＯ４などが用いられるが、海水中に含まれる成分については、特に添加する必要はない。
【００１２】
本発明方法においては、上記の基本培地に、必須成分としてレシチン及び繊維質物を含有させたものを用いる。ここで用いるレシチンは、ホスファチジルコリンを主成分とする脂質抽出物である。このホスファチジルコリンは、動物、酵母、カビ類に広く存在するリン脂質で、哺乳動物の膜リン脂質中、５０％近くを占めている。このものは、一般式
【化１】
2004121019.tif 000002
（式中のＲ及びＲ′は脂肪酸残基である）
で表わされる化学構造を有し、その多くはＲが飽和脂肪酸残基、Ｒ′が不飽和脂肪酸残基である。
【００１３】
本発明方法で用いるレシチンについては、特に制限はなく、植物由来、動物由来のいずれのものも用いることができるが、安価に入手できるという点で大豆レシチンや卵黄レシチン、特に大豆レシチンが好ましい。このレシチンは、基本培地１リットル当たり、通常５〜４０ｇ、好ましくは５〜２５ｇの範囲で添加された場合、培地中の目的物含量が高くなるが、所望ならばさらに高い濃度で用いることができ、このようにすれば全脂質中の高度不飽和脂肪酸の含有率をより高くすることができる。
【００１４】
本発明方法において用いる繊維質物は、無機質繊維、有機質繊維のいずれでも、また天然繊維、合成繊維のいずれでもよいが、特に好適なのは綿のような天然有機物繊維や炭素繊維のような無機質繊維である。この繊維質物は単独で用いてもよいし、また２種以上組み合わせて用いてもよい。この繊維質物の使用量は、基本培地１リットル当たり、通常５〜３０ｇ、好ましくは１０〜２０ｇの範囲内で選ばれる。この範囲内で繊維が添加された場合には、高度不飽和脂肪酸の生産性を高めることができ、また、効率よく培養菌体を回収することが可能となる。
【００１５】
本発明方法で用いられる高度不飽和脂肪酸生産菌のうちＬ２５株は、文献未載の新規な菌であり、特許微生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９８６として寄託されている。
【００１６】
この新規な菌株は、ラビリンチュラ属の特徴である紡錘形状を有し、海中に広く存在する海生菌の１種である。そして、以下に示す菌学的性質から、容易に公知の微生物と区別される。
Ｉ．形態学的性質
（１）細胞の大きさは、約１０μｍで紡錘形である。
（２）ネットワークを形成し、その中で滑走運動している。
ＩＩ．培養的性質
（１）糖質寒天培地では培地表面のみに拡がる。
（２）糖質液体培養では、ほとんど生育しない。
（３）有機又は無機の窒素源を利用して増殖する。
（４）至適ｐＨは５〜９、至適温度は１８〜２５℃である。
【００１７】
本発明方法を好適に実施するには、例えば基本培地として、グルコース、ポリペプトン、酵母エキスを適量含む１００％人工海水を用い、蒸気滅菌後、所要量の繊維及びレシチンを加える。レシチンを加える際、その分散を促進するためにＴｗｅｅｎ８０のような界面活性剤を培地中に添加しておくのが好ましい。また、これまでのラビリンチュラ属菌の保存及び培養に際しては、細菌や酵母を共存させる必要があったが、本発明方法においては、これまでの固体培養法とは異なり、バクテリアや酵母による混合培養を必要としない。そのため、保存された種菌を接種する際、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地中に添加することにより、ラビリンチュラ属株の単独生育が可能となり、大量の高度不飽和脂肪酸を高純度で生産することができる。
【００１８】
次いで、得られた培地にラビリンチュラ属菌を接種し、２〜１４日間、好ましくは７〜１０日間静置培養する。この際の至適温度は２０〜３０℃、至適ｐＨは７〜９の範囲である。従って、培養条件としては、ｐＨ７〜９、温度２０〜３０℃、海水濃度２５〜１２５％の範囲で選ぶのが好ましい。ここで、海水濃度とは、塩化ナトリウム濃度３質量％を基準とし、それに対する相対的濃度で表わしたものである。
【００１９】
このようにして得られた培養物から、常法に従い、非水溶性有機溶剤で抽出処理し、抽出液から有機溶剤を蒸発除去することにより、所望の高度不飽和脂肪酸、例えばアラキドン酸、ＥＰＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡなどの高度不飽和脂肪酸を含むトリアシルグリセロール混合物として回収することができる。そして、そのトリアシルグリセロール混合物を加水分解し、クロマトグラフィー処理により各高度不飽和脂肪酸を分離、回収することができる。また、培養菌体は、繊維を搾るだけで効率よく回収することができ、さらに、搾り終えた繊維は再利用することができる。
【００２０】
【実施例】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
【００２１】
なお、各例における基本培地としては、ポリペプトン１ｇ／リットル、酵母エキス０．５ｇ／リットル、Ｔｗｅｅｎ８０　１．２５ｇ／リットルを含む１００％人工海水を用い、滅菌後、これに大豆レシチン３０ｇ／リットル、ストレプトマイシン及びペニシリンの抗生物質を５０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、さらに繊維を０．２ｇ／１０ミリリットルの割合で加えた。菌株としては主にラビリンチュラＬ２５株を用いた。培養は２５℃の温度で、緩く振とう培養しながら２週間行った。
そして、脂肪酸組成分析及び脂肪酸定量分析は、培養物の一部を採取し、ガスクロマトグラフィーにより、その中に含まれる全脂肪酸量及び高度不飽和脂肪酸を測定することにより行った。なお、各実施例の結果については、単位培地容量当たりの高度不飽和脂肪酸生産量を含有量（ｇ／リットル）で表し、全脂肪酸量に対する高度不飽和脂肪酸の割合を含有率（質量％）で表した。
【００２２】
本実施例におけるラビリンチュラ株は、バクテリアと複合培養の状態で保存されているものを使ったため、バクテリアの増殖を抑制するために基本培地に抗生物質を加えたが、単独培養の状態で保存されているものを植菌株として用いるときは、抗生物質は加える必要はない。
【００２３】
実施例１
大豆レシチン１０ｇ／リットルを含む基本培地に活性炭繊維を加えた栄養培地に、各ラビリンチュラＳ３−２、Ｌ４、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５株を植菌し、２週間培養を行った。培養後、ガスクロマトグラフィーにより、高度不飽和脂肪酸の単位培地容量当たりの含有量及び全脂肪酸に対する割合を求めた結果を下記の表１に示す。
【００２４】
【表１】
2004121019.tif 000003
【００２５】
この表１から分かるように、多少の差は見られるものの、前記栄養培地の条件下では、ほとんどの菌株において、よい生育が見られた。高度不飽和脂肪酸含有量の最も高い菌株はラビリンチュラＳ３−２株であり（０．７８ｇ／リットル）、含有率が最も高い菌株はラビリンチュラＬ２５株であった（１６．０質量％）。
【００２６】
実施例２
繊維の種類を下記の表２に示すように変えて調製した各栄養培地に、ラビリンチュラＬ２５株を植菌し、２週間培養を行った。培養後、ガスクロマトグラフィーにより、高度不飽和脂肪酸の単位培地容量当たりの含有量及び全脂肪酸に対する割合を求めた結果を下記の表２に示す。
【００２７】
【表２】
2004121019.tif 000004
【００２８】
この表２から分かるように、基本培地に繊維を加えなかったコントロールに比べ、天然植物繊維や化学合成繊維を加えた全ての場合において、いずれも高い高度不飽和脂肪酸生産量及び含有率を示した。
【００２９】
実施例３
基本培地に添加する繊維として活性炭繊維を用い、０〜０．２０ｇ／１０ミリリットルの範囲で繊維量を変えて調製した各基本培地に、ラビリンチュラＬ２５株を植菌し、２週間培養を行った。培養後、ガスクロマトグラフィーにより、高度不飽和脂肪酸の単位培地容量当たりの含有量及び全脂肪酸に対する割合を求めた結果を下記の表３に示す。
【００３０】
【表３】
2004121019.tif 000005
【００３１】
この表３から分かるように、培養液１０ミリリットルに対し、０．０５ｇ以上繊維を添加した場合に、良好な高度不飽和脂肪酸生産量が得られた。また、本実施例の基本培地条件下では、繊維量０．１〜０．２ｇ／１０ミリリットルの範囲内が最適であることが分かった。
【００３２】
実施例４
レシチンの濃度を下記の表４に示すように変え、かつ繊維として活性炭繊維を用いて調製した基本培地に、ラビリンチュラＬ２５株を植菌し、２週間培養を行った。培養後、ガスクロマトグラフィーにより、高度不飽和脂肪酸の単位培地容量当たりの含有量及び全脂肪酸に対する割合を求めた結果を下記の表４に示す。
【００３３】
【表４】
2004121019.tif 000006
【００３４】
この表４から分かるように、レシチン濃度を上げていくと、高度不飽和脂肪酸含有量は高くなるが、４．００質量％を超えるとむしろ減少し、４．００質量％付近が最適であった。また含有率においてはレシチン濃度１．３３質量％から４．００質量％で高い値が得られた。これらの結果から、レシチン濃度は１〜４質量％の範囲内が培養する上で最適であることが分かった。
【００３５】
実施例５
抗生物質としてペニシリン及びストレプトマイシンを添加した基本培地とともに、これらを添加しない比較培地を調製した。繊維としてそれぞれ活性炭繊維を用いて調製した基本培地及び比較培地に、それぞれラビリンチュラＬ２５株を植菌し、２週間培養を行った。培養後、ガスクロマトグラフィーにより、高度不飽和脂肪酸の単位培地容量当たりの含有量及び全脂肪酸に対する割合を求めた結果を下記の表５に示す。
【００３６】
【表５】
2004121019.tif 000007
【００３７】
この表５から分かるように、ストレプトマイシン及びペニシリン等の抗生物質を加えても高い高度不飽和脂肪酸生産性が得られた。このことは、バクテリアを混合培養しない条件下でもラビリンチュラ属菌を培養することができることを示している。
【００３８】
実施例６
繊維として綿及び活性炭繊維を用いて調製した各栄養培地にラビリンチュラＬ２５株を植菌し、２週間培養を行った。なお、下記の表６に示すように、大豆レシチンの代わりにグルコース、大豆油それぞれを加えた培地を用意し、比較実験を行った。培養後、ガスクロマトグラフィーにより、高度不飽和脂肪酸の単位培地容量当たりの含有量及び全脂肪酸に対する割合を求めた結果を下記の表６に示す。
【００３９】
【表６】
2004121019.tif 000008
【００４０】
繊維として用いた綿及び活性炭繊維は、いずれの添加物でも両者同じ傾向が見られた。また、この表６から分かるように、グルコースでは全くラビリンチュラＬ２５株は生育せず、大豆油でもほとんど生育が認められなかった。これに対し、大豆レシチンでは高い高度不飽和脂肪酸生産が得られた。
【００４１】
実施例７
基本培地のポリペプトン（Ｐ）と酵母エキス（Ｙ）をＰ：Ｙ＝２：１の割合とし、かかる窒素源濃度を１．５〜２４ｇ／リットルの範囲内で変えて調製した各基本培地にラビリンチュラＬ２５株を植菌し、２週間培養を行った。培養後、ガスクロマトグラフィーにより、高度不飽和脂肪酸の単位培地容量当たりの含有量及び全脂肪酸に対する割合を求めた結果を下記の表７に示す。
【００４２】
【表７】
2004121019.tif 000009
【００４３】
この表７から分かるように、窒素源を全く添加しない場合はほとんど高度不飽和脂肪酸生産量は得られないが、１．５〜３．０ｇ／リットルの濃度範囲で加えることにより、高い高度不飽和脂肪酸生産量が得られた。しかし、この範囲を超えてさらに窒素源濃度を高くすると、高度不飽和脂肪酸生産量は減少を示した。
【００４４】
実施例８
繊維として綿及び活性炭繊維を用いて調製した栄養培地にラビリンチュラＬ２５株を植菌し、２週間培養を行った。その後、繊維を搾って除き、培養液を回収し、その繊維を新しい同じ培地に入れ同様に培養し、１週間培養を行った。さらにその後、再び繊維を搾り培養液を回収し、その繊維を新しい同じ培地に入れ同様に培養した。このように、３回培養液を取り替えて培養実験を繰り返した。繰り返し回収した各培養液から、ガスクロマトグラフィーにより高度不飽和脂肪酸の単位培地容量当たりの含有量をそれぞれ求めた結果を図１に示す。
【００４５】
図１から、繊維の種類によらずに繊維を繰り返して培地に使用することができることが分かる。また、綿及び活性炭繊維の双方において、繰り返し使用することによって、１週間あたりに得られる高度不飽和脂肪酸生産量は高くなった。
【００４６】
また、レシチン類は、植物油の抽出に際して副産物として生産され、その利用法が模索されていることから、高度不飽和脂肪酸の生産方法における原料として新たな用途が見出されたことになり、レシチンの有効利用という見地からも、産業上、大きな意味を有する。
【００４７】
【発明の効果】
本発明によれば、植物油の抽出の際に副生される大豆レシチンのようなレシチンを添加した基本培地に、さらには液体培養の担体として任意繊維を用いることで、ラビリンチュラ属に属する微生物を液体培養により大量に培養することができ、効率よく高度不飽和脂肪酸を製造することができる。また、繊維は再利用が可能であり、経済的にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】繊維を１週間毎に新しい培地に再利用したときの、各週における高度不飽和脂肪酸の生産量を示すグラフである。
【図１】
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