(57)【要約】【課題】微量の糖脂質を定量するにあたり、ばらつきが少なく検出限界が低い定量法を提供する。また、定量と同時に、糖脂質の赤外スペクトルを得ることができ、クロマトグラムと対象物質の官能基に関する情報を同時に得ることができる定量法を提供する。【解決手段】弱アルカリを用いて試料中の不純物を除去し、高速液体クロマトグラフ赤外分光光度計を用いて測定することにより、従来法よりもばらつきが少なく、検出限界が低く、さらに、定量と同時に対象物質の赤外スペクトルが得られる方法を提供する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高速液体クロマトグラフ赤外分光光度法により、微量の糖脂質を定量する方法。
【請求項２】
試料中の不純物を弱アルカリ処理で除去してから定量することを特徴とする請求項１記載の糖脂質の定量法。
【請求項３】
糖脂質がセラミドや糖セラミドを含む中性糖脂質、ガングリオシド、スルファチド、スルホキノボシルジアシルグリセロール、セミノリピドを含む酸性糖脂質である、請求項１または２記載の糖脂質の定量法。
【請求項４】
糖脂質含量が１ｐｐｍから１００００ｐｐｍである試料を定量する請求項１、２または３記載の糖脂質の定量法。
【請求項５】
クロマトグラムと赤外スペクトルが同時に採取できることを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項に記載の糖脂質の定量法。
【請求項６】
高速液体クロマトグラフ赤外分光光度法の検出器がＬＣトランスフォーム（ラボコネクション社製）である請求項１から５までのいずれか１項に記載の糖脂質の定量法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、天然界に広範囲に存在する糖脂質の定量法に関する。さらに詳しくは、定量に際し、試料中の不純物を弱アルカリ処理で除去してから高速液体クロマトグラフ赤外分光光度法を用いることを特徴とする糖脂質の定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖脂質は、紫外吸収が微弱で糖脂質を溶解する溶媒が限られるため、定量がしにくい物質であった。従来、糖脂質をそのまま定量できないため、アルカリで糖と脂質成分を分解し、構成成分のうちスフィンゴイドのみを高速液体クロマトグラフで測定していた（木下幹朗：脂質生化学研究、３２巻、３３５頁、１９９０年）。また、定量には不適な方法ではあるが、薄層クロマトグラフによる分析（Ｇｅｎｓｈｉｒｏ　Ｋａｗａｉ、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｏｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｅｔｒｙ、１５巻、７７９頁、１９８６年）や高速液体クロマトグラフ光散乱検出法が用いた定量（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｌｅｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、５１巻、３４７頁、２００２年）が行われてきた。
【０００３】
しかし、上記のいずれの方法も、定量性や検出限界に問題があり、満足のいく方法ではなかった。
【０００４】
前記の文献（木下幹朗：脂質生化学研究、３２巻、３３５頁、１９９０年）では糖脂質を１規定の水酸化カリウムと１０％水酸化バリウムージオキサンで全量加水分解し、糖脂質の構成成分であるスフィンゴイドのみを分析している。この方法では、糖脂質のもう一つの構成成分である糖が分析できないので、結果、試料中の糖脂質を定量することができなかった。
【０００５】
また、文献（Ｇｅｎｓｈｉｒｏ　Ｋａｗａｉ、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｏｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｅｔｒｙ、１５巻、７７９頁、１９８６年）では、糖脂質を薄層クロマトグラフで分析した。しかし、薄層クロマトグラフによって、天然物中の糖脂質の組成把握することができたが、糖脂質を定量することができなかった。
【０００６】
また、文献（鹿島　稔、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｌｅｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、５１巻、３４７頁、２００２年）では、高速液体クロマトグラフ・光散乱検出器を用いた糖脂質の定量法が記載されている。この方法は、紫外可視検出器や赤外検出器のように物質の吸収スペクトルを測定して、標品の吸収スペクトルとの差から定量を行う方法と異なり、糖脂質を高速液体クロマトグラフで分離後、ネブライザーを用いて溶媒のみを蒸発させ、残った糖脂質粒子がレーザー光を散乱する強度を測定して糖脂質を定量している。原理的に、文献のＦｉｇ．６に示されたように、検量線（糖脂質量とレーザー散乱強度）が比例関係でなく、累乗関係になる。検量線が直線でないので、様々な濃度の標品を用意する必要があった。また、測定値のばらつきが大きく、文献のＴａｂｌｅ４に示されたように測定者によって６．３〜１０．４７％の標準偏差が認められた。さらに、文献のＴａｂｌｅ４に記載された３種の製品がどのような物か記載されていないので、確認試験ができなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高速液体クロマトグラフ赤外分光光度法により、微量の糖脂質を定量する方法であり、試料中の不純物を弱アルカリ処理で除去してから定量することにより、ばらつきが少なく検出限界が低い定量法を提供することにある。また、検出器として赤外分光光度計を用いることにより、定量と同時に、糖脂質の赤外スペクトルを得ることができ、クロマトグラムと対象物質の官能基に関する情報を同時に得ることができる定量法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の問題点に鑑み鋭意検討した結果、弱アルカリを用いて試料中の不純物を除去し、高速液体クロマトグラフ赤外分光光度計を用いて測定することにより、ばらつきを押さえた定量ができ、さらに、従来法よりも検出限界を低くできるとの知見を得て、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、次の［１］〜［６］である。
【０００９】
［１］　　高速液体クロマトグラフ赤外分光光度法により、微量の糖脂質を定量する方法。
【００１０】
［２］　　高速液体クロマトグラフ赤外分光光度法により、微量の糖脂質を定量する方法であって、試料中の不純物を弱アルカリ処理で除去してから定量することを特徴とする［１］　記載の糖脂質の定量法。
【００１１】
［３］　　糖脂質がセラミドや糖セラミドを含む中性糖脂質、ガングリオシド、スルファチド、スルホキノボシルジアシルグリセロール、セミノリピドを含む酸性糖脂質である、［１］または［２］記載の糖脂質の定量法。
【００１２】
［４］　　糖脂質含量が１ｐｐｍから１００００ｐｐｍである試料を定量する［１］、［２］または［３］記載の糖脂質の定量法。
【００１３】
［５］　　クロマトグラムと赤外スペクトルが同時に採取できることを特徴とする［１］から［４］のいずれか１項に記載の糖脂質の定量法。
【００１４】
［６］　　高速液体クロマトグラフ赤外分光光度法の検出器がＬＣトランスフォーム（ラボコネクション社製）である［１］から［５］のいずれか１項に記載の糖脂質の定量法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明に使用する高速液体クロマトグラフは、一般市販の装置を利用する。例えば、アジレント社製、シリーズ１１００型液体クロマトグラフ等を使用することができる。分離カラムとしては、やはり市販の製品を適宜利用できるが、糖脂質の分離に適した順相系で使用できるシリカゲル、アミノプロピル結合シリカゲル、シアノプロピル結合シリカゲルが充填剤として適している。
【００１６】
本発明に使用する赤外分光光度計は、高速液体クロマトグラフの検出器として特化されたものを使用する。すなわち、高速液体クロマトグラフのカラムから溶出した糖脂質を含有する液体のうち液体部分のみを除去し、糖脂質のみの赤外スペクトルを測定できる装置を用いる。
【００１７】
例えば、特開平５−１８０７６３号広報に記載の高速液体クロマトグラフ装置や特開平７−２００４６号広報記載の液体クロマトグラフ用赤外分光セルを用いた検出器が利用できる。市販の装置としてはラボコネクション社製、ＬＣトランスフォームシリーズ４０００が最も適している。
【００１８】
本発明の弱アルカリ分解は、試料中に不純物として存在する、トリグリセリド、りん脂質等のエステル結合を分解し、極性を高めて、分離除去することを目的とする。具体的には、サンプルをメタノール性水酸化カリウム溶液に懸濁して反応後にクロロホルムと水を加えて分配により糖脂質と不純物を分離する。
【００１９】
本発明の定量法の対象となる糖脂質は、セラミドや糖セラミドを含む中性糖脂質、ガングリオシド、スルファチド、スルホキノボシルジアシルグリセロール、セミノリピドを含む酸性糖脂質である。糖脂質の起源は、植物由来、動物由来または合成品のいずれかまたは混合物である。
【００２０】
次に、定量法について詳述する。
まず、本発明の対象となる糖脂質を原料から抽出する。抽出には、有機溶剤として、ヘキサン、アセトン、エタノールのいずれかまたは混合物を使用する。糖脂質が溶けにくい場合には、クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン化溶剤やメタノールを使用することができる。得られた糖脂質を含む抽出液をロータリーエバポレーター等で乾燥し粗抽出物とする。
【００２１】
粗抽出物に弱アルカリ、たとえば含水メタノール性水酸化カリウムを加え、穏和な条件たとえば室温で加水分解を行う。アルカリとしては、水酸化カリウムの他に、水酸化ナトリウム等を単独または混合して使用することができる。加水分解の条件は、不純物の分子中に存在するアシル基が完全に加水分解されることを目安として決定する。
【００２２】
加水分解後にクロロホルムと水を加え（クロロホルム水洗浄）、分液ロートに移して、下層（クロロホルム層）を採取する。クロロホルム水洗浄を必要に応じて繰り返す。採取したクロロホルム層を集め、ロータリーエバポレータ等で蒸発乾固し供試サンプルとする。
【００２３】
供試サンプルの所定量を溶離液に溶解し、高速液体クロマトグラフ赤外分光光度計に注入する。同様に所定の濃度の標品について定量を行い検量線を作成する。供試サンプルの分析から得られた値を検量線に代入し、原料に含まれていた糖脂質含量を算出する。高速液体クロマトグラフの分離条件は、測定したい糖脂質に適したものとする。例えば、ガングリオシドを定量する場合には、カラムとしてシリカゲル、溶離液はノルマルプロパノール７５容量部、２８％アンモニア５容量部、水２５容量部の混合液を用いる。溶離液の組成について、赤外検出器の構造上不揮発成分を含まないものが好ましい。測定値のばらつきを押さえるために、アイソクラティック溶出が好ましいが、必要に応じて、グラジエント溶出を行うことができる。
【実施例】
【００２４】
実施例１
マイタケ廃菌床２ｋｇにクロロホルム５Ｌ、メタノール２．５Ｌを加え、室温で１昼夜プロペラ攪拌機で混合した。混合物を吸引濾過し、ろ液５．５Ｌを採取した。ろ液をロータリーエバポレータで乾固し、粗抽出物１５ｇを得た。粗抽出物０．４ｇを０．４規定のメタノール性水酸化カリウム溶液５０ｍＬに混合し、４０℃で１時間加水分解を行った。加水分解後クロロホルム５０ｍＬ、水５０ｍＬを加え、混合後１昼夜静置して下層を採取した。採取した下層をロータリーエバポレーターで乾固し、クロロホルム１ｍＬに得られた全量を溶解し供試サンプルとした。
供試サンプルを高速液体クロマトグラフ赤外分光光度計で分析した。高速液体クロマトグラフとしては、アジレント社製シリーズ１１００、赤外分光光度計としてＬＣ―トランスフォーム（ラボコネクション社製）を用いた。分離条件は、カラムとしてデベロシルＣＮ３　φ２ｍｍ×１５０ｍｍ（野村化学株式会社）、溶離液はヘキサン９８容量部、エタノール２容量部の混合液を直線的に２０分間でヘキサン５０容量部、エタノール５０容量部に置き換えるグラジエント溶出とし、流速０．２ｍＬ／分とした。ＬＣトランスフォームのディスク上の不揮発成分は、ＦＴ−ＩＲ（マグナＩＲ７５０：サーモニコレー社製）で分析した。検量線は、標品として羊由来ガングリオシドＧＭ１（フナコシ製）を用いて作成した。
【００２５】
結果、マイタケ廃菌床にガングリオシドＧＭ１が１５０ｐｐｍ含まれていることが分かった。５回測定したときの標準偏差は１５０ｐｐｍ±０．０２％であった。また、同じ分析を３箇所の機関で行った際の変動係数は０．９％であった。
【００２６】
【実施例２】
真空凍結乾燥したぶなしめじ子実体１ｋｇにクロロホルム２．５Ｌ、メタノール１Ｌを加え、６０℃で１昼夜リフラックス抽出した。抽出後の混合物を吸引濾過し、ろ液２．２Ｌを採取した。ろ液をロータリーエバポレータで乾固し、粗抽出物５ｇを得た。粗抽出物０．４ｇを０．４規定のメタノール性水酸化ナトリウム溶液１００ｍＬに混合し、３０℃で２時間加水分解を行った。加水分解後クロロホルム１００ｍＬ、水１００ｍＬを加え、混合後１昼夜静置して下層を採取した。採取した下層をロータリーエバポレーターで乾固し、クロロホルム１ｍＬに得られた全量を溶解し供試サンプルとした。
【００２７】
供試サンプルを高速液体クロマトグラフ赤外分光光度計で分析した。高速液体クロマトグラフとしては、日本分光株式会社製９８０シリーズ、赤外分光光度計としてＬＣ―トランスフォーム（ラボコネクション社製）を用いた。分離条件は、カラムとしてハイパーシル６０　φ２ｍｍ×１５０ｍｍ（ヒューレットパッカード社）、溶離液はクロロホルム６５容量部、メタノール１５容量部、水２重量部の混合液、流速０．２ｍＬ／分とした。ＬＣトランスフォームのディスク上の不揮発成分は、ＦＴ−ＩＲ（マグナＩＲ７５０：サーモニコレー社製）で分析した。検量線は、標品として牛脳由来セレブロシド（フナコシ製）を用いて作成した。
【００２８】
結果、ぶなしめじ子実体（乾燥物）にセレブロシドが４２００ｐｐｍ含まれ、標準偏差は±０．０５％であることが分かった。また、同じ分析を３箇所の機関で行った際の変動係数は０．７％であった。
【００２９】
【実施例３】
実施例２において、高速液体クロマトグラフ赤外分光光度計に、実施例２で標品として使用したセレブロシドを１、０．１、０．０１マイクログラム注入してそれぞれ５回定量した際の標準偏差を求めた結果、それぞれの標準偏差は０．０４、０．０８、０．１１％であった。
【００３０】
比較例１
実施例１と同じ方法で調製した供試サンプルを文献（Ｇｅｎｓｈｉｒｏ　Ｋａｗａｉ、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｏｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｅｔｒｙ、１５巻、７７９頁、１９８６年）記載の方法で、すなわち薄層クロマトグラフで分析した。展開後のプレートを２波長クロマトスキャナー（島津製作所）で分析したが、５回測定した際の標準偏差が１３２ｐｐｍ±３４％となり、測定値が本実験の定量法に比べて低い上に、ばらつきが大きいことが分かった。
【００３１】
比較例２
文献（鹿島　稔、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｌｅｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、５１巻、３４７頁、２００２年）中に記載された既往の分析法によって、５箇所の異なる機関でセレブロシドを分析した際の変動係数は６．３から１０．４７％であった。
【００３２】
比較例３
文献（鹿島　稔、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｌｅｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、５１巻、３４７頁、２００２年）中に記載された方法で、実施例２で標品として使用したセレブロシドを１、０．１、０．０１マイクログラム注入してそれぞれ５回定量した際の標準偏差を求めた結果、それぞれの標準偏差は０．２、５．３、１４．３％であった。
【００３３】
実施例１と比較例１の結果から従来の薄層クロマトグラフを用いた定量法と比較して、本発明の定量法が、ばらつきの面で格段に優れた方法であることが分かる。また、実施例２と比較例２の結果から、本発明の定量法を種々の機関で実施したときの変動係数が、従来の方法よりも優れていることが分かる。さらに、検出限界を把握するために行った実施例３と比較例３の結果から、本発明の定量法の検出限界が、従来法に比べて有意に低いことが分かる。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の糖脂質の定量法は、被験サンプル中の不純物を弱アルカリ分解精製により除去し、高速液体クロマトグラフ赤外分光光度計により定量を行う。弱アルカリ分解精製により、妨害ピークを生じる不純物が除去されおり、紫外吸収がない糖脂質の定量に適した赤外分光光度計を検出器として用いるので、従来の方法に比べてばらつきの少なく検出限界が低い定量を行うことができる。