(57)【要約】【課題】臍帯細胞を用いた培養皮膚の作製において、十分な強度を有する培養皮膚を提供するために、厚い表皮層をもつ培養皮膚を製造し、その製造方法を確立すること。【解決手段】継代培養２代目までの臍帯上皮細胞、または安定な長期増殖性を獲得した臍帯上皮細胞の細胞系を厚く重層化した表皮層を形成することよって得られる、厚い表皮層をもつ培養皮膚およびその製造方法。好ましくは、細胞外マトリックスと、皮膚繊維芽細胞または／および臍帯筋繊維芽細胞からなる真皮層と、厚く重層化された臍帯上皮細胞を有する表皮層を含む培養皮膚である。【選択図】　図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
継代培養２代目までの臍帯上皮細胞が厚く重層化された表皮層を有する培養皮膚。
【請求項２】
安定な長期増殖性を獲得した臍帯上皮細胞の細胞系が厚く重層化された表皮層を有する培養皮膚。
【請求項３】
表皮層の厚さが約０．３〜１ｍｍ、臍帯上皮細胞の積層数が約７〜１０層である、請求項１または２記載の培養皮膚。
【請求項４】
前記細胞系が臍帯上皮細胞に安定な長期増殖性を獲得させるための遺伝子を導入することによって得られた細胞系である、請求項２記載の培養皮膚。
【請求項５】
臍帯上皮細胞に安定な長期増殖性を獲得させるための遺伝子が、ＳＶ４０のラージ　Ｔ抗原遺伝子である、請求項４記載の培養皮膚。
【請求項６】
細胞外マトリックスと、皮膚繊維芽細胞または／および臍帯筋繊維芽細胞からなる真皮層を有する、請求項１または２記載の培養皮膚。
【請求項７】
臍帯上皮細胞が、表皮細胞マーカーであるインボルクリンを発現した細胞である、請求項１または２記載の培養皮膚。
【請求項８】
臍帯上皮細胞が、表皮基底層細胞マーカーであるサイトケラチン１４を発現した細胞である、請求項１または２記載の培養皮膚。
【請求項９】
コラーゲンからなる細胞外マトリックスと、ヒト由来の皮膚繊維芽細胞または／および臍帯筋繊維芽細胞からなる真皮層の表面に、臍帯組織から分離・培養された継代２代目までの臍帯上皮細胞を播種し、培地下培養を行った後、上皮層のみを空気暴露培養を行うことによって、上皮層を厚く重層化させることを特徴とする、培養皮膚の製造方法。
【請求項１０】
コラーゲンからなる細胞外マトリックスと、ヒト由来の皮膚繊維芽細胞または／および臍帯筋繊維芽細胞からなる真皮層の表面に、臍帯組織から分離・培養された臍帯上皮細胞に、臍帯上皮細胞に安定な長期増殖性を獲得させるための遺伝子を導入し、長期間培養することによって安定な長期増殖性を獲得した臍帯上皮細胞系を分離し、得られた細胞系を播種し、培地下培養を行った後、上皮層のみを空気暴露培養を行うことによって、上皮層を厚く重層化させることを特徴とする、培養皮膚の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臍帯上皮細胞が厚く重層化された表皮層を有する培養皮膚に関する。具体的には、各種組織再構成のための皮膚移植及び細胞治療あるいは再生医療等に利用される、継代培養２代目までの臍帯上皮細胞、または安定な長期増殖性を獲得した臍帯上皮細胞の細胞系を含有する培養皮膚に関する。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚は生体と外部環境との間の界面として、生体内部の液体を保持し、水中では摩擦を減じたり、体温を一定に維持したり、生体内部を物理的な損傷から保護するという働きをもっている。
脊椎動物の皮膚は、真皮（ｄｅｒｍｉｓ）と呼ばれる中胚葉に由来する結合組織層と、その上に載置される外胚葉に由来する重層に並ぶ表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）とから構成されている。
培養皮膚とは、健常皮膚片（上皮片）から採取した上皮細胞ならびに繊維芽細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養して皮膚構造の一部を構築したものである。患者自身の健常皮膚片（上皮片）から採取した細胞を用いたものは自家培養皮膚、他人の皮膚（上皮片）から採取した細胞を用いたものは同種培養皮膚とよばれている。
培養皮膚は、重度熱傷、糖尿病性下肢潰瘍や静脈潰瘍の治療、形成外科手術後の瘢痕治療などに適用される。培養皮膚は、単に創傷面を被覆するだけでなく、創傷治癒に必要な成長因子などを分泌あるいは供給するという点でも有効である。
現在、ヒト機能性上皮細胞の供給源として、新生児及び成人陰茎部の包皮や口腔粘膜由来上皮細胞と皮膚由来の繊維芽細胞、コラーゲン、フィブリン、ヘパリン、シリコンなどのマトリックスを構成材料にした培養皮膚が報告されている（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、非特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】
特開昭６２−２４６３７１号公報
【特許文献２】
特開平４−３３２５６１号公報
【特許文献３】
特開２０００−１２５８５５号公報
【特許文献４】
特開２０００−１５７６２４号公報
【特許文献５】
特許第３１０５３０８号公報
【非特許文献１】
「日経バイオ年鑑２０００」日経ＢＰ社、１９９９年１１月３０日発行、Ｐ．１７６−１７９
【０００４】
しかし、上記細胞の由来となる組織の上皮細胞は、細胞の分化度及び加齢度の進んだものであり、短い分裂寿命及び分化の可塑性が小さい。また、個体差による細胞集団の回収及び健常組織の不安定性や組織の大きさにばらつきがあるという問題や、手術時の余剰組織を提供することに対する倫理的な問題がある等、未解決要因が他数存在する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明においては、培養皮膚の作製に臍帯細胞を用いることによって上記の問題点を解決し、さらに十分な強度を有する培養皮膚を提供するために、厚い表皮層をもつ培養皮膚を製造し、その製造方法を確立することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々鋭意検討を行った結果、培養皮膚の作製において、継代培養２代目までの臍帯上皮細胞、または安定な長期増殖性を獲得した臍帯上皮細胞の細胞系を厚く重層化した表皮層を形成することよって、厚い表皮層をもつ培養皮膚を作製できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）継代培養２代目までの臍帯上皮細胞が厚く重層化された表皮層を有する培養皮膚、
（２）安定な長期増殖性を獲得した臍帯上皮細胞の細胞系が厚く重層化された表皮層を有する培養皮膚、
（３）表皮層の厚さが約０．３〜１ｍｍ、臍帯上皮細胞の積層数が約７〜１０層である、上記（１）または（２）記載の培養皮膚、
（４）前記細胞系が臍帯上皮細胞に安定な長期増殖性を獲得させるための遺伝子を導入することによって得られた細胞系である、上記（２）記載の培養皮膚、
（５）臍帯上皮細胞に安定な長期増殖性を獲得させるための遺伝子が、ＳＶ４０のラージ　Ｔ抗原遺伝子である、上記（４）記載の培養皮膚、
（６）細胞外マトリックスと、皮膚繊維芽細胞または／および臍帯筋繊維芽細胞からなる真皮層を有する、上記（１）または（２）記載の培養皮膚、
（７）臍帯上皮細胞が、表皮細胞マーカーであるインボルクリンを発現した細胞である、上記（１）または（２）記載の培養皮膚、
（８）臍帯上皮細胞が、表皮基底層細胞マーカーであるサイトケラチン１４を発現した細胞である、上記（１）または（２）記載の培養皮膚、
（９）コラーゲンからなる細胞外マトリックスと、ヒト由来の皮膚繊維芽細胞または／および臍帯筋繊維芽細胞からなる真皮層の表面に、臍帯組織から分離・培養された継代２代目までの臍帯上皮細胞を播種し、培地下培養を行った後、上皮層のみを空気暴露培養を行うことによって、上皮層を厚く重層化させることを特徴とする、培養皮膚の製造方法、および
（１０）コラーゲンからなる細胞外マトリックスと、ヒト由来の皮膚繊維芽細胞または／および臍帯筋繊維芽細胞からなる真皮層の表面に、臍帯組織から分離・培養された臍帯上皮細胞に、臍帯上皮細胞に安定な長期増殖性を獲得させるための遺伝子を導入し、長期間培養することによって安定な長期増殖性を獲得した臍帯上皮細胞系を分離し、得られた細胞系を播種し、培地下培養を行った後、上皮層のみを空気暴露培養を行うことによって、上皮層を厚く重層化させることを特徴とする、培養皮膚の製造方法
に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
臍帯細胞とは、潜在的自己再生活性および分化可塑性能力を保持する胎児性細胞の継続的供給源として、出産に伴い不要となるヒト胎児性付属器である臍帯の構成細胞であり、臍帯組織から分離される。
一般に、臍帯組織（出産前胎児組織）は臍帯上皮（最外層を含む）と臍帯筋繊維芽細胞を内包するワルトン膠質、２本の臍帯動脈と１本の臍帯静脈から構成され、体内では成長過程にあり、臍帯上皮は活発に成長しつつある体表皮膚上皮の一部であることから、成人皮膚と異なり老化が進んでいない再生上皮幹細胞を多く含む組織である。このことは高いテロメラーゼ活性及び長いテロメア長によって裏付けられている。このテロメラーゼ活性によって細胞の分裂寿命（加齢）が遅延され、長期生着する移植皮膚の作製が可能になる。
テロメアとは、真核生物の染色体末端に見られる独特の構造で、細胞分裂毎にテロメア長は短くなる。テロメラーゼとはテロメア繰り返し配列を合成する酵素で、テロメラーゼ活性のある細胞ではＤＮＡの複製毎におきるテロメア配列の短縮がテロメラーゼによって補われ、テロメア配列は安定化している。これまでの研究からテロメア長は細胞の老化度を測る細胞分裂時計と考えられている。
さらに細胞の老化遅延効果は細胞不死化遺伝子の導入によって極めて容易に実現することが出来、その効果は成人皮膚細胞に比べて著しく高いことも知られている（〜数百倍）。このことからも臍帯上皮細胞の潜在的分裂能力が極めて高いことが明らかである。
しかしながら、不死化遺伝子の導入は細胞の改変を伴うため、不死化臍帯上皮による培養皮膚シートの作製には、導入遺伝子を細胞から除去する操作を組み合わせることを制限しない。さらに、その実現は例えば既知のアデノ−ｃｒｅ−Ｌｏｘ系を用いて応用することを制限しない。
さらに臍帯の表層は胎児の表皮とつながっているため、臍帯の細胞は成人皮膚の細胞と同等かそれ以上の再生能力をもつ可能性が高い。さらに、胎児由来の細胞であるため、細胞の分裂寿命が長く、潜在的増殖能が高いという利点をもつ。
【０００９】
本発明の培養皮膚とは、表皮層と真皮層からなる２層構造の培養皮膚であり、臍帯上皮細胞を表皮層の構成成分として含有する。
本発明における培養皮膚の表皮層は、真皮層の表面に、分離および培養された臍帯上皮細胞を培養重層化させた上皮シートが積層されたものである。表皮層の厚さは、通常約０．１〜１ｍｍ、好ましくは約０．３〜１ｍｍである。
本発明の臍帯上皮細胞とは、臍帯組織中、臍帯最外層を覆う１〜３層程度の上皮層中の円柱上皮細胞を分離した後、培養して増殖させた細胞である。
臍帯上皮細胞が厚く重層化された表皮層とは、臍帯上皮細胞が複数層に積層され表皮層として厚みを有したものである。表皮層を構成する臍帯上皮細胞の積層数は、通常約４〜１０層、好ましくは約７〜１０層である。
本発明において、継代培養２代目までの臍帯上皮細胞とは、臍帯組織から分離した臍帯上皮細胞を培養器で培養した継代培養１代目の細胞（継代を行っていない細胞）、または１回の継代を行った後の継代培養２代目の細胞である。継代とは、細胞を一定の培養器で培養しサブコンフルエントになった状態で、０．１％トリプシン−０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ水溶液等によって該細胞を培養器から回収し、細胞数をカウントした後、もとの培地の数倍〜十数倍程度の容量の培養器に播種しなおすことである。
【００１０】
本発明において、安定な長期増殖性とは、通常、継代数が約１０〜１００代（希釈率１：１０〜１００）、細胞集団としての分裂回数（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｄｏｕｂｌｉｎｇ　ｌｅｖｅｌ、以下ＰＤＬと略す）が約２０〜４００、増殖期間が約６ヶ月〜４年の長期増殖能を、特に培養条件（培地、温度、湿度、炭酸ガス濃度、光等）等を限定されることなく、安定して有することである。継代数が約２５〜１００代（希釈率１：２５〜１００）、ＰＤＬが約８０〜４００、増殖期間が約１〜４年の長期増殖能を有することがより好ましい。ただし、正常細胞が増殖を止め、純粋な細胞系が分離された時期を継代０代、ＰＤＬ　０とする。
安定な長期増殖性を獲得した臍帯上皮細胞の細胞系とは、分離・培養された臍帯上皮細胞のうち安定な長期増殖性を獲得した細胞集団である。
【００１１】
臍帯上皮細胞に安定な長期増殖性を獲得させるための遺伝子とは、その遺伝子を細胞の遺伝子に導入することによって、臍帯上皮細胞の性質を改変し、安定な長期増殖性を獲得することのできる遺伝子であれば特に限定されないが、一例として、ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子、ＨＰＶ（ヒトパピローマウィルス）１６のＥ６，Ｅ７遺伝子、ｈＴＥＲＴ等が挙げられる。また、導入される遺伝子は、実際に安定な長期増殖性を獲得させるための必要最小限の配列（以下、目的配列と略す）を含むものであれば特に制限されず、目的配列が由来する遺伝子の目的配列以外のＤＮＡ部分や、使用するベクターのＤＮＡなどであって、細胞の増殖に悪影響を与えないＤＮＡを含んでいてもよい。
【００１２】
ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子とは、シミアンウィルス４０（Ｓｉｍｉａｍ　ｖｉｒｕｓ　４０）の初期遺伝子群のひとつである。一般的には、癌遺伝子で細胞を増殖、不死化、癌化させて、細胞系（または細胞株）を樹立するために用いられるが、癌細胞の性質をすべて獲得するものではなく、正常細胞の形質をよく保持するとされる。実施例６では、該遺伝子が導入された臍帯上皮細胞は、長期間培養途中でテロメラーゼ活性が誘導されるが、テロメア長の維持能力は低く、正常細胞と同様に細胞分裂毎にテロメア長が短縮し続け、一部老化過程が進行することが示される。
【００１３】
本発明における真皮層は、好ましくは、分離および培養された皮膚繊維芽細胞または臍帯繊維芽細胞を構成成分として含有する培養皮膚真皮層である。真皮層の厚さは、通常約０．５〜３ｍｍであり、形状は滑らかなシート状であることが好ましい。
細胞外マトリックスとは、細胞を付着増殖させるための担体であり、例としては、コラーゲン不織布、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、コラーゲンシートなどが挙げられる。細胞外マトリックスとしては、これらのコラーゲン基材に代えて、他の生体吸収性基材（例えば、グリコサミノグリカン、グリコール酸、乳酸、キチン、ポリグラクチン、コンドロイチン硫酸、フィブリノーゲンなど）も使用可能である。
臍帯筋繊維芽細胞とは、臍帯内部のワルトン膠質中に含まれる筋繊維芽細胞を分離し、培養して増殖させたものである。
また、皮膚繊維芽細胞とは、皮膚真皮層中の繊維芽細胞を分離し、培養して増殖させたものである。
【００１４】
皮膚の表皮層は真皮層に接する基底膜から基底細胞層、有棘細胞層、顆粒細胞層、角化層と上に向かって細胞が分化して、その分化の進行が層構造となり（通常、約７〜１０層から成る）、外界に接する強固な組織を形成している。
表皮細胞マーカーとは、表皮細胞に含まれる物質である。インボルクリンは高度にクロスリンクした可溶性細胞質蛋白前駆体であり、表皮細胞において、有棘細胞層上部から顆粒細胞層にかけて強く発現している。
表皮基底層細胞マーカーとは、表皮基底層細胞に含まれる物質である。サイトケラチンは中間径フィラメントのひとつで、細胞特異的に発現し、分化のよいマーカーとされる。表皮細胞においては、基底細胞層で、サイトケラチン１４（もしくはサイトケラチン５）が、分化細胞（有棘、顆粒細胞）層で、サイトケラチン１０（もしくはサイトケラチン１）が発現する。
【００１５】
本発明の培養皮膚には、さらに、血管内皮細胞、神経細胞、造血幹細胞、血管誘導因子、上皮細胞分化因子、上皮細胞増殖因子、繊維芽細胞増殖因子を含有させてもよい。
【００１６】
本発明の培養皮膚の製造において、表皮層は、真皮層の表面に臍帯上皮細胞を４〜１０層に重層化することによって作製される。臍帯上皮細胞の重層化は、真皮層の表面に、分離されたままの臍帯上皮細胞または一度培養した臍帯上皮細胞を播種して培養し、臍帯上皮細胞が増殖することによって達成される。このような重層化は、通常、上皮細胞分化因子の添加、表皮層の空気暴露の条件にて培養を続けることによって達成される。
一方、真皮層の作製は、皮膚繊維芽細胞または／および臍帯筋繊維芽細胞を担体、好ましくはコラーゲンなどの細胞外マトリックスなどと共に用いて作製することが好ましい。細胞外マトリックス用いる培養皮膚真皮層の製造法としては、細胞外マトリックス内または細胞外マトリックス上に、繊維芽細胞を播種して生着させ、１〜４週間培養して作製する方法や、ゲル状の担体の場合、溶液の状態で繊維芽細胞と混合した後ゲル化させ、１〜４週間培養して、ゲル内に繊維芽細胞を内包した真皮層を作製する方法が挙げられる。
【００１７】
本発明の臍帯上皮細胞を分離する方法は、下記工程を含む。
▲１▼臍帯付属組織を蛋白質分解酵素に浸漬し、臍帯付属組織の結合を緩める工程、
▲２▼臍帯付属組織を物理的に剥離させる工程、及び
▲３▼臍帯付属組織を蛋白質分解酵素により細胞レベルまで分離する工程。
本発明の臍帯上皮細胞は、臍帯組織を蛋白質分解酵素などで処理することにより、上皮組織片を分離した後、さらに、トリプシン−ＥＤＴＡなどの溶液で細胞レベルにまで分離するように処理することが好ましい。蛋白質分解酵素としては、フィブロネクチン、コラーゲンタイプＩ、ＩＶ分解する酵素であるディスパーゼ、トリプシンおよびコラゲナーゼなどが例示される。臍帯組織（上皮片）を物理的に剥離させる段階では、メス、ピンセット、ブラシなどの器具を用いる。
【００１８】
本発明の臍帯上皮細胞を培養する方法において、使用する培地としては、特に制限はないが、臍帯上皮細胞以外の上皮細胞または繊維芽細胞のための培地を含む培地が使用できる。このような培地としては、動物細胞用培地、例えば、ＭＣＤＢ１５３（Ｓｉｇｍａ）、ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ），Ｄｅｆｉｎｅｄ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ），ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２（クラボウ），ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ），ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２（クラボウ），ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ），ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）　Ｍｅｄｉｕｍ１０６Ｓ（クラボウ）などが挙げられる。特にＭＣＤＢ１５３培地（含サプリメント）とＤＭＥＭ培地（ＦＢＳを０〜１０％含有）を４対１（容量比）で混合した培地（ＭＣＤＢ１５３−１／４）を作製して用いることが好ましい。
また、臍帯上皮細胞の培養容器としては、培養皿、培養フラスコ、メンブレン、カバーガラス上などが例示される、通常、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、ＴＣ処理ポリカーボネート、混合セルロースエステル、親水処理ＰＴＦＥ（ＩＷＡＫＩ，ＮＵＮＣ，ＣＯＲＮＩＮＧ，ＦＡＬＣＯＮ）製であり、その表面が細胞外接着物で被覆した容器であることが好ましい。前記細胞外接着物としては、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、プロテオグリカン、テネイシンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される。上皮細胞はその下の結合組織と基底膜を介して接しているため、特にその基底膜成分のコラーゲンタイプＩ、ＩＶで被覆された培養容器を用いることが好ましい。
臍帯上皮細胞の培養条件としては、約３７℃、１００％湿度、５％炭酸ガスの存在下であることが好ましいが、これらの条件に制限されるものではない。
【００１９】
また、本発明において、安定な長期増殖性を獲得した細胞系を分離するとは、生体組織から取り出して培養した細胞が安定な長期増殖性を獲得した細胞集団となることをいう。細胞系を分離するための具体的な手法としては、例えば、臍帯上皮細胞に安定な長期増殖性を獲得させるための遺伝子を導入した後、長期間培養することによって、安定な長期増殖性を獲得していない細胞系は死滅し、安定な長期増殖性を獲得した細胞系が分離される方法が挙げられる。この場合、長期間培養とは、通常、継代数が約１０〜１００代（希釈率１：１０〜１００）、ＰＤＬが約２０〜４００、増殖期間が約６ヶ月〜４年の長期間培養である。
【００２０】
本発明において、遺伝子の導入は、一般に遺伝子導入法に用いられる方法により行うことができ、例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気穿孔法、ウィルスを用いた方法などが挙げられる。リポフェクション法とは、ＤＮＡが結合したリポソームを用い細胞融合を利用して、細胞にＤＮＡを導入する方法である。
これらの遺伝子導入法において、通常、導入されるＤＮＡは種々公知のベクター中に組込まれる。遺伝子を導入するためのベクターとしては、特に限定されず、ウィルスベクターおよび非ウィルスベクターの両者が含まれる。ウィルスベクターとしては、例えば、レトロウィルスやアデノウィルス等の感染力を有する遺伝子配列に、臍帯上皮細胞に安定な長期増殖性を獲得させるための遺伝子を含む配列が連結されたものが挙げられる。非ウィルスベクターとしては、例えば、種々公知のプラスミドに、臍帯上皮細胞に安定な長期増殖性を獲得させるための遺伝子を含む配列が連結されたものが挙げられる。プラスミドとしては、ｐＢＲ３２２を好適に用いることが出来る。
一例として、臍帯上皮細胞に安定な長期増殖性を獲得させるための遺伝子を含む配列が連結されたベクターを、リポソーム中に内包させ、リポフェクション法を用いて細胞のＤＮＡに遺伝子を導入する方法が挙げられる。
【００２１】
臍帯筋繊維芽細胞を分離する方法としては、臍帯組織から移植片培養法を用いて臍帯繊維芽細胞を分離する方法が用いられる。移植片培養法とは、生体から取り出した組織の小片を培養する方法で、組織片から遊出・増殖してくる細胞を得ることができる。臍帯筋繊維芽細胞は、臍帯上皮細胞を分離した後の臍帯組織から臍帯内の血管を除いた後、組織片培養法を用いて分離し、培養することが好ましい。
具体的には、例えば、臍帯組織をメスなどで約１〜５ｍｍ角の小組織に細断した後、ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳを１０％含有）を含む培養容器に５〜１０日間静置し、組織周辺から遊走及び分裂増殖する臍帯筋繊維芽細胞をトリプシン−ＥＤＴＡなどの溶液を用いて分離し、ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳを１０％含有）でさらに５〜３０日間培養する方法がある。
【００２２】
臍帯組織から分離した臍帯筋繊維芽細胞の培養方法において、使用する培地としては、特に制限はないが、例えば、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ），ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ），　Ｍｅｄｉｕｍ１０６Ｓ（クラボウ）が例示され、特に、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ含有）を用いることが好ましい。
本発明における臍帯筋繊維芽細胞の培養容器としては、培養皿、培養フラスコ、カバーガラス上などが例示される。本発明における臍帯筋繊維芽細胞の培養条件としては、約３７℃、１００％湿度、５％炭酸ガスの存在下であることが好ましいが、これらの条件に制限されない。
【００２３】
皮膚繊維芽細胞を分離する方法としては、皮膚真皮層から移植片培養法を用いて皮膚繊維芽細胞を分離する方法が用いられる。皮膚繊維芽細胞は、ディスパーゼを用いて表皮層を分離した後の皮膚真皮層から組織片培養法を用いて分離し、培養することが好ましい。
具体的には、例えば、ヒト皮膚真皮層をメスなどで約１〜５ｍｍ角の小組織に細断した後、ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳを１０％含有）を含む培養容器に５〜１０日間静置し、組織周辺から遊走及び分裂増殖するヒト皮膚繊維芽細胞をトリプシン−ＥＤＴＡなどの溶液を用いて分離し、ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳを１０％含有）でさらに５〜３０日間培養する方法がある。
【００２４】
皮膚繊維芽細胞の培養方法において、使用する培地としては、特に制限はないが、例えば、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ），ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ），　Ｍｅｄｉｕｍ１０６Ｓ（クラボウ）が例示され、特に、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ含有）を用いることが好ましい。
皮膚繊維芽細胞の培養容器としては、培養皿、培養フラスコ、カバーガラス上などが例示される。
皮膚繊維芽細胞の培養条件としては、約３７℃、１００％湿度、５％炭酸ガスの存在下であることが好ましいが、これらの条件に制限されない。
【００２５】
本発明の培養皮膚は、潜在的分裂能力が高く、比較的抗原性が低く、継続的な供給を受けられる胎児由来臍帯組織の細胞により主に構成されており、糖尿病性下腿潰瘍、重度熱傷などへの治療に適用され、各種組織再構成のための皮膚移植及び細胞治療あるいは再生医療等に利用される。
【００２６】
【実施例】
次に、本発明を実施例を用いて詳細に説明する。
％は特記ない限り重量％を示す。
（実施例１）　臍帯上皮細胞の分離および培養
出産後に摘出されたヒト由来の臍帯（長さ３０〜６０ｃｍ、直径９〜１５ｍｍ）をＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’　ｂａｌａｎｃｅｄ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）またはＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｄ　Ｓａｌｉｎｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて、３回よく洗浄し、付着血液などを除いた。臍帯の両端部分をそれぞれ糸で縛り、下記組成を有する培地（ＭＣＤＢ１５３−１／４培地）で蛋白質分解酵素「ｄｉｓｐａｓｅ（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ製）」を２０％になるように希釈した溶液中に、上記臍帯の両端部分（各２ｃｍ）のみは、該溶液に浸漬しないよう糸で吊り下げて浸漬し、４℃にて２５〜５０時間静置した。
培地：ＭＣＤＢ１５３−１／４培地
（ＭＣＤＢ１５３培地とＤＭＥＭ（含０〜１０％ＦＢＳ）培地を４：１で混合した培地）
ＭＣＤＢ１５３培地（ＳＩＧＭＡ）への添加物は下記の通りである。
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【００２７】
浸漬した臍帯を取り出し、上記ＭＣＤＢ１５３−１／４培地中にて、メス、ピンセットおよびブラシを用いて臍帯上皮片を剥離し、その上皮片の懸濁液を遠心分離して上皮片のみを回収した。次に０．１％トリプシン−０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液に約１０分間浸漬し、メッシュ（オープニング７０μｍ）を通して臍帯上皮細胞を単離し、遠心して臍帯上皮細胞（約１０６個）を回収した。
回収した臍帯上皮細胞を上記ＭＣＤＢ１５３−１／４培地に懸濁し、培養器（コラーゲンタイプＩＶで被覆された培養皿）に播種して、該培養器をインキュベータ内に置き、５％ＣＯ２の存在下に３７℃で培養した。
培養器内で臍帯上皮細胞は、培養器上に約８０％生着し、２日目から増殖を始めた。
【００２８】
（実施例２）　臍帯筋繊維芽細胞の分離および培養
実施例１において臍帯上皮細胞を分離した後、残された臍帯組織からメス、およびピンセットを用いて臍帯組織中の血管を取り除いた。血管を除いた後の臍帯組織をメス、ピンセットを用いて、約５ｍｍ角の細片に切断した。細片を培養皿内に静置し、一面が培地で浸かる程度、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳを含む）を加えた。
約１週間後、組織細片の周辺に臍帯筋繊維芽細胞が生え出してくる様子が観察された後、ＤＥＭＥ培地（含１０％ＦＣＳ）約５ｍＬを臍帯組織が十分浸る程度、加えた。
その後、十分臍帯筋繊維芽細胞が増殖してから、臍帯組織を取り除き、０．１％トリプシン−０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液によって臍帯筋繊維芽細胞（約１０６個）を回収した。次にＤＭＥＭ培地（含１０％ＦＣＳ）に懸濁し、新しい培養皿に播種して、インキュベータ内にて５％ＣＯ２の存在下に３７℃にて培養した。
培養器内で臍帯筋繊維芽細胞は、培養器上にほぼ全て生着し、２日目から増殖を始めた。
【００２９】
（実施例３）　分離培養した臍帯上皮細胞の増殖
実施例１と同様に分離した臍帯上皮細胞を下記３種類の培地（Ａ，Ｂ，Ｃ）を用いて培養した。
ＭＣＤＢ１５３−１／４（０％ｃｘ−ＦＣＳ，２％ＦＣＳ）培地−−−−−−−−−−−（Ａ）
ＭＣＤＢ１５３−１／４（０％ｃｘ−ＦＣＳ，０％ＦＣＳ）培地−−−−−−−−−−−（Ｂ）
ＭＣＤＢ１５３（０％ｃｘ−ＦＣＳ，２％ＦＣＳ）培地−−−−−−−−−−−−−−−（Ｃ）
臍帯上皮細胞の継代は、該細胞がサブコンフルエントになった状態で０．１％トリプシン−０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ水溶液によって該細胞を回収し、細胞数をカウントした後、もとの３倍量の培養器に播種しなおした。
その細胞増殖曲線を図１に示す。
グラフ中、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は上記培地の種類を示し、横軸は継代後の培養日数を示す。
【００３０】
（実施例４）　分離培養した臍帯上皮細胞の分化誘導
酵素抗体（免疫ペルオキシターゼ）法を用いて、臍帯上皮細胞に対するインボルクリン、サイトケラチン１４の免疫染色を行った。一次抗体は、以下のものを用いた。
ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩ−ＩＮＶＯＬＵＣＲＩＮ　ＣＬＯＮＥ　ＳＹ５（ＳＩＧＭＡ）
Ｋｅｒａｔｉｎ　１４，ｃｌｏｎｅ　ＲＣＫ１０７（ＳＡＮＢＩＯ）
それぞれの抗体を用いた免疫染色像を図２および図３に示す。
図２（（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）は倍率４０倍、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）は倍率２００倍の像）において、表皮細胞マーカーであるインボルクリンに対する抗インボルクリン抗体を用いた臍帯組織断面の免疫染色像で、重層化した上皮層にはインボルクリンの発現が認められ（（Ａ）〜（Ｄ））、単層の上皮層にはインボルクリンの発現が認められなかった（（Ｅ）、（Ｆ））。このことから重層化した上皮領域は、表皮層を含む培養皮膚の材料として適していることが示唆される。
図３において、上皮基底層細胞マーカーであるサイトケラチン１４に対する抗サイトケラチン１４抗体を用いた、培養下の臍帯上皮細胞の免疫染色像で、サイトケラチン１４の発現が確認された。このことから、臍帯組織から分離後、培養下での臍帯上皮細胞においても、表皮層を含む培養皮膚の材料として適したものであることが分かる。
（Ａ）が分離培養した臍帯上皮細胞（ＵＣＥＣ）の抗サイトケラチン１４抗体免疫染色像で、（Ｃ）が臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の抗サイトケラチン１４抗体免疫染色像、（Ｂ）がＵＣＥＣのＩｇＧ免疫染色像、（Ｄ）がＨＵＶＥＣのＩｇＧ免疫染色像である（（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）はネガティブコントロール）。
【００３１】
（実施例５）　遺伝子導入による安定な長期増殖性を獲得した臍帯上皮細胞系の分離
実施例１と同様にして分離した臍帯上皮細胞に対して、の初代培養２〜５日目の細胞増殖の活発な時期に、リポフェクション法を用いて、ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子を導入し、臍帯上皮細胞系の分離を行なった。
実際には、初代培養臍帯上皮細胞を培養器（コラーゲンタイプＩＶで被覆された直径３５ｍｍ培養皿）に５０〜８０％飽和密度に調整しておいた。次にリポソーム（ＦｕｇｅｎｅＴＭ６　　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ）５μｌとＭＣＤＢ１５３培地（ＳＩＧＭＡ）９５μｌを混合して１５分室温に静置し、この混合液を１μｇのｐＳＶ４０ｏｒｉ−　（ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子を含む配列をプラスミドベクターｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ制限酵素切断部位に連結したプラスミド。）へ添加し１５分室温に静置した。ｐＳＶ４０ｏｒｉ−の模式図を図７に示す。図中Ｔは、ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子配列を示し、２箇所のＢａｍＨＩ制限酵素切断部位の左側部分がｐＢＲ３２２由来のＤＮＡで、右側部分がＳＶ４０由来のＤＮＡである。
このＤＮＡ溶液１００μｌをあらかじめ臍帯上皮細胞を培養した培養器（培地量２ｍｌ）に添加した。その１日後に新鮮なＭＣＤＢ１５３−１／４培地に交換した。
３〜５日後に１：３希釈で継代を行い、１日おきに培地を交換して培養を続けた。培養・継代を続けると遺伝子導入を受けなかった細胞は徐々に増殖を止め分化・死滅したが、ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子が正常に導入された細胞は活発に増殖を続けた。
遺伝子導入後、継代数が５０代、ＰＤＬが１９０、増殖期間が約１５ヶ月以上の長期増殖能を確認できた。ただし、正常細胞が増殖を止め、純粋な細胞系が分離された時期を継代０代、ＰＤＬ　０とした。
【００３２】
（実施例６）　細胞系を分離した臍帯上皮細胞の潜在的分裂能力（テロメア長とテロメラーゼ活性）の測定
高感度で能率的なＰＣＲ法を用いたテロメラーゼ活性検出法であるＴＲＡＰ（Ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ　Ｒｅｐｅａｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）　法を用いて、実施例５で細胞系をを分離した臍帯上皮細胞のテロメラーゼ活性を測定した。
その結果を図４に示す。
ＳＶ４０のラージ　Ｔ抗原遺伝子の導入により細胞系を分離した臍帯上皮細胞について、継代５〜５０代（ＰＤＬ：６〜１９０）のテロメラーゼ活性を測定したところ、継代２５代、ＰＤＬ８２以降で、強いテロメラーゼ活性が検出された。
また、特定の遺伝子またはＤＮＡ断片をフィルター上に検出する方法であるサザンブロット法を用いて細胞系を分離した臍帯上皮細胞のテロメア長を測定した。
その結果を図５に示す。
ＳＶ４０のＬａｒｇｅ　Ｔ抗原遺伝子の導入によって細胞系を分離した臍帯上皮細胞について、継代５〜５０代（ＰＤＬ：６〜１９０）のテロメア長を測定したところ、ＴＲＡＰ法で強いテロメラーゼ活性が検出された継代２５代、ＰＤＬ８２以降でも、テロメア長が減少し続けていた。ただし、正常細胞が増殖を止め、純粋な細胞系が分離された時期を継代０代、ＰＤＬ０とした。
【００３３】
（実施例７）　継代２代目までの臍帯上皮細胞を重層化した培養皮膚の作製
ヒト皮膚繊維芽細胞の培養容器に０．１％トリプシン−０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液で細胞を分散させ回収した。その一部を取り、１．５×１０６／８ｍＬの濃度になるように真皮培地（含７．５％牛血清）に懸濁し、氷冷した。
以下の溶液を混合して、氷冷しながらよく懸濁した。
コラーゲン溶液　　　８ｍＬ
中和培地　　　　　１６ｍＬ
牛血清　　　　　　　２ｍＬ
繊維芽細胞懸濁液　　４ｍＬ
この混合液をカルチャートレイ内のティッシュチャンバー内側に４ｍＬずつ分注し、ティッシュチャンバー外側に真皮培地を１２ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２　で約１０日間インキュベートして培養真皮を作製した。
臍帯上皮細胞の培養容器に、実施例１で分離・培養した継代２代目までの臍帯上皮細胞を０．１％トリプシン−０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ水溶液で分散させ回収した。その一部を取り、培養真皮中央部に２．２×１０５播種し、表皮培地にて約４日培養した。次に真皮部のみをＡｉｒ／Ｌｉｑｕｉｄ培養培地に浸し、上皮部を空気暴露して約１０日培養することにより、臍帯上皮細胞を厚く重層化させて、培養皮膚を作製した。
得られた培養皮膚の組織断面Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色像を図６に示す。
（Ａ）、（Ｃ）がコントロールとして、ヒト表皮細胞を用いて作製した培養皮膚で、（Ｂ）、（Ｄ）が臍帯上皮細胞を用いて作製した培養皮膚の組織断面ＨＥ染色像である（（Ａ）、（Ｂ）；倍率４０倍、（Ｃ）、（Ｄ）；倍率２００倍の像）。（Ｂ）、（Ｄ）では、表皮細胞のような角質化した上皮層（（Ａ）、（Ｃ））は見られなかったが、上皮層が非常に厚く重層化を起こしている様子が観察された。
【００３４】
（実施例８）　遺伝子を導入した臍帯上皮細胞を重層化した培養皮膚の作製
ヒト皮膚繊維芽細胞の培養容器に０．１％トリプシン−０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液で細胞を分散させ回収した。その一部を取り、１．５×１０６／８ｍＬの濃度になるように真皮培地（含７．５％牛血清）に懸濁し、氷冷した。
以下の溶液を混合して、氷冷しながらよく懸濁した。
コラーゲン溶液　　　８ｍＬ
中和培地　　　　　１６ｍＬ
牛血清　　　　　　　２ｍＬ
繊維芽細胞懸濁液　　４ｍＬ
この混合液をカルチャートレイ内のティッシュチャンバー内側に４ｍＬずつ分注し、ティッシュチャンバー外側に真皮培地を１２ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２　で約１０日間インキュベートして培養真皮を作製した。
臍帯上皮細胞の培養容器に、実施例５で得られた臍帯上皮細胞の細胞系を０．１％トリプシン−０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ水溶液で分散させ回収した。その一部を取り、培養真皮中央部に２．２×１０５播種し、表皮培地にて約４日培養した。次に真皮部のみをＡｉｒ／Ｌｉｑｕｉｄ培養培地に浸し、上皮部を空気暴露して約１０日培養することにより、臍帯上皮細胞を厚く重層化させて、培養皮膚を作製した。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の培養皮膚は、厚い表皮層を有するため、培養皮膚として十分な強度を有する実用的な製品を提供することができる。
また、本発明の培養皮膚の作製においては、臍帯細胞を材料として用いるため、出産後、母体並びに胎児から自然分離後、通常、廃棄されるべき臍帯の構成細胞を再利用することができ、社会的倫理的側面及び法的規制からの制約も少ない。さらに、材料とする臍帯細胞は正常分娩による胎児由来組織であるため、供給される細胞が手術時に摘出される余剰組織のように疾病の伴う恐れのあるものではなく、明白な随伴病変を持たない正常な胎児性ヒト細胞の継続的かつ安定な供給が得られるという著しい利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】臍帯上皮細胞の細胞増殖曲線である。
【図２】臍帯上皮組織断面の抗インボルクリン抗体による免疫染色像である。
【図３】臍帯上皮細胞の抗サイトケラチン１４抗体による免疫染色像である。
【図４】細胞系を分離した臍帯上皮細胞のテロメラーゼ活性を示す電気泳動像である。
【図５】細胞系を分離した臍帯上皮細胞のテロメア長の継代変化を示すグラフである。
【図６】臍帯上皮細胞を用いた培養皮膚の組織断面ＨＥ染色像である。
【図７】ｐＳＶ４０ｏｒｉ−の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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