(57)【要約】【課題】トロンボモジュリンを不活性化するペプチドを有効成分とするペプチドを有効成分とする炎症病態や血栓症などの予防剤や治療剤等を提供すること。【課題の解決手段】トロンボモジュリンの４０８番目のグルタミン酸から４２６番目のグルタミン酸に至る部分に対する相補性ペプチドを設計合成してトロンボモジュリンに反応して、トロンボモジュリンがトロンビンの活性を増強させる作用を抑制するペプチドを創生した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンボモジュリンに作用し、トロンボモジュリンの活性を阻害するペプチドであって、アミノ酸配列がアミノ酸１文字表記で表記するとＦＭＷＥＳＩＹＫＨＶＳＩＹＱＳＶＤＥＬである１９アミノ酸から成るペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列において、１若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、修飾、若しくは付加され、かつトロンボモジュリンの活性を阻害する作用を有する請求項１記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
アレルギー、血管炎、多臓器不全などを含む炎症病態の増悪因子のひとつとしても働くトロンボモジュリンの機能を制御する新規ペプチド、及び治療薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
補体タンパク質を加水分解する酵素、プロテアーゼのうち、ポリペプチド鎖のカルボキシ末端のアミノ酸残基を切断するものがカルボキシペプチターゼである。カルボキシペプチターゼは、その反応メカニズムによって金属型とセリン型の２つに分類される。それらの基質特異性から疎水性アミノ酸残基を切断するものと、塩基性アミノ酸残基であるリジンやアルギニンを切断するものとにも分けられる。血清中の塩基性アミノ酸残基であるリジンやアルギニンを切断するものとしては、ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｎ（ＣＰＮ）とｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｒ（ＣＰＲ）とが存在するが、ＣＰＲは前駆体のＰｒｏＣＰＲから血液凝固反応などに際し、トロンビンなどにより限定分解を受けてＣＰＲに活性化される。線溶反応はｆｉｂｒｉｎのカルボキシ末端リジン残基にｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎが結合し、さらにｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎとｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒの結合量が飛躍的に増大することにより、プラスミンが産生され、フィブリンを分解する。ＣＰＲはこのｆｉｂｒｉｎのカルボキシ末端リジン残基を切断することによりｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎとｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒの結合を阻害し、プラスミンによる線溶反応を制御する。従って、ＣＰＲの生成が過剰になると結果的にプラスミンの生成が抑えられ、血栓溶解が起こりにくくなる。
【０００３】
ｐｒｏＣＰＲはトリプシン、プラスミン、エラスターゼなどのプロテアーゼで活性化される。トロンビンにおいては、それ単独でも活性化されるが、この活性反応はトロンビンがトロンボモジュリンと結合して複合体を形成することにより著明に増強される。その反応は酵素反応効率の指標であるｋｃａｔ／Ｋｍでみると、トロンビン単独によるｐｒｏＣＰＲ活性化反応の約１２００倍といわれている。そこで、トロンボモジュリンを抑制すればＣＰＲの生成を抑えることができると考えられているが、モノクローナル抗体以外に特異的に抑制する薬剤は開発できていない。従って、トロンボモジュリンを制御する有用な薬剤の開発が待たれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、トロンボモジュリンがトロンビンの反応性を高める作用を阻害して、トロンビンの過剰な反応が関与する病態の治療剤を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記事実に鑑み、トロンボモジュリンにおけるトロンビンの結合部位のペプチド配列と考えられるＴＭの４０８番目のグルタミン酸（Ｅ）から４２６番目のグルタミン酸（Ｅ）に至る１９個のアミノ酸からなるペプチド部分を標的ペプチドとして、このペプチドに相補性値の高いペプチドを設計したものである。
【０００６】
本発明の特徴は、トロンボモジュリンの活性を阻害するペプチドであって、アミノ酸配列がアミノ酸１文字表記で表記するとＦＭＷＥＳＩＹＫＨＶＳＩＹＱＳＶＤＥＬである１９アミノ酸から成るペプチドである。
【０００７】
トロンボモジュリンの４０８番目のグルタミン酸（Ｅ）から４２６番目のグルタミン酸（Ｅ）に至る１９個のアミノ酸からなる部分が、トロンビンの結合部位のペプチド配列と考えられる。そこで、そのペプチド部分を標的ペプチドとして、相補性値の高いペプチドを設計し、アミノ酸１文字表記で表記するとＦＭＷＥＳＩＹＫＨＶＳＩＹＱＳＶＤＥＬである１９アミノ酸から成るペプチド（ＴＭ−３と命名）を得た。このペプチドはトロンボモジュリンがトロンビンの作用を高める機能を阻害する作用を持つ。
【０００８】
本発明の別の特徴は、アミノ酸配列において、１若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換、修飾、若しくは付加され、かつトロンボモジュリンの機能を阻害する作用を有する請求項１記載のペプチドである。本発明ペプチドを化学修飾したり、アミノ酸を置換するなどによって、より活性が高く安定なペプチドを売ることができる。さらに、本発明ペプチドを直接薬剤として用いることも可能であるが、本発明ペプチドをプロトタイプとして高次構造を解析して、それにより得られる知見にもとづいて、類似構造を有する化学合成薬剤の開発などに用いることもできる。
【０００９】
【本発明の実施の様態】
以下、本発明を具体的に説明する。本発明で使用するアミノ酸と一文字表記は以下に示すものである。すなわち、天然には、２０種類のアミノ酸が存在し、この２０種類のアミノ酸は、アルキル基の構造によって、親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸および中間型アミノ酸に分けることができる。親水性アミノ酸は、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アスパラジン（Ａｓん；Ｎ）、アスパラジン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、タイロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）である。疎水性アミノ酸としては、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、及びメチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）が含まれる。中間型のアミノ酸としては、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｓ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、及びスレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）である。
【００１０】
トロンボモジュリンの４０８番目のグルタミン酸（Ｅ）から４２６番目のグルタミン酸（Ｅ）に至る１９個のアミノ酸からなる部分が、トロンビンの結合部位のペプチド配列と考えられるので、その部分を標的ペプチドとして、相補性値の高いペプチドを設計し、１９アミノ酸から成るアミノ酸１文字表記で表記するとＦＭＷＥＳＩＹＫＨＶＳＩＹＱＳＶＤＥＬであるペプチド（ＴＭ−３と命名）を得た。
【００１１】
このようにして得られたペプチドは、注射薬、経口投与用の錠剤、粉末剤、噴霧吸入剤、塗布用軟膏剤等の形態でヒトに投与することができる。この場合、上記ペプチドの他に、防腐剤、安定化剤等を含んでもよい。上記ペプチドは、他の生物製剤で使用される適当な賦形剤、吸着防止剤等とともに処理して、それぞれの投与形態として投与することができる。例えば、所望量の上記ペプチドと防腐剤、安定化剤、賦形剤、吸着防止剤等を適宜混合して、一定量ずつアンプルに充填・封入し、治療用注射剤とすることができる。あるいは、所望量の上記ペプチドを抗原性のないタンパク成分と水溶液の状態で混合し、一定量ずつバイアルに分注して凍結乾燥し、凍結乾燥製剤としてもよい。このような製剤の製造は、通常のペプチド製剤を製造する工程と同様に行うことができる。
【００１２】
【実施例１】
ＴＭ−３をヒト血漿に添加し、トロンビンとトロンボモジュリンを加えることによりｐｒｏＣＰＲがＣＰＲに活性化される反応におけるＴＭ−３の作用を、生成されるＣＰＲ活性を指標として解析した。
【００１３】
トロンビンとトロンボモジュリンの濃度比は、ヒト血漿中のｐｒｏＣＰＲ活性化はその比率が１：４のときが最も効率がよいという以前の報告に準じて決定した。ヒト血漿にトロンボモジュリンを添加し、各濃度に振り分けたＴＭ−３を入れて、室温で１０分間反応させた。その後、トロンビンと塩化カルシウムを混ぜ、ｂｕｆｆｅｒで総量の調整をし、室温で１０分間反応させた。その後、トロンビンの特異的阻害剤であるＰＰＡＣＫを入れて反応を停止させた。
【００１４】
総量５０μｌ中の最終濃度は、１０％血漿，４６ｎＭトロンボモジュリン、１１．５ｎＭトロンビン、１０ｍＭ塩化カルシウム、１６μＭ  ＰＰＡＣＫとした。
【００１５】
カルボキシペプチダーゼ活性（ＣＰ活性）の測定は、これらの各試料を１０μｌとって、ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅを５μｌ添加し、３７度Ｃで４５分間反応させた後、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒを１００μｌ加えて氷上に置き、３％塩化シアヌル含有の１．４ジオキサンを７５μｌ入れて発色させた。
【００１６】
これらを５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清１００μｌを９６穴のマイクロプレートに移し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００１７】
ＣＰＮは血漿中では、活性型で存在するため、ＣＰ活性値からＣＰＮ活性値を引いた値がＣＰＲ活性値となる。
【００１８】
トロンビン・トロンボモジュリン複合体で活性したＣＰＲ値を１００％とすると、トロンビン単独で活性させた場合、活性率は２．３％に下がる。トロンビン・トロンボモジュリン複合体でのＣＰＲ活性において、ＴＭＴ−３を添加すると、その濃度依存的に活性率は下がり、１６μＭのときの活性率は２．８％で、トロンビン単独の活性化率と同じくらいになり、ＴＭによるｐｒｏＣＰＲ活性化増強効果はほぼ完全に抑えられた。