(57)【要約】【課題】　　　本発明は、Bacillus属細菌等の微生物のＤＮＡ取り込み能力と相同組換え能力を用いることにより複数のＤＮＡ断片が一定の順序と向きを保って連結集積していて、かつ微生物中で増幅可能なプラスミドＤＮＡを簡便に取得する方法、並びに該ＤＮＡを宿主微生物のゲノムＤＮＡに挿入する方法等を提供する。【解決手段】　宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡと挿入ＤＮＡを含む挿入ＤＮＡユニットを、互いにその順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有する複数の単位ＤＮＡとして調製し、該単位ＤＮＡを連結して、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ単位ＤＮＡを１つ以上重複して有するＤＮＡ断片を作製し、宿主を形質転換した後に宿主からプラスミドを抽出する。また、該挿入ＤＮＡユニットであって、さらに組み換えのための共通配列を有するものと該共通配列をゲノムＤＮＡに有する宿主において相同組み換えを誘導する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡと挿入ＤＮＡを含む挿入ＤＮＡユニットを、互いにその順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有する複数の単位ＤＮＡとして調製し、該単位ＤＮＡを連結して、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ単位ＤＮＡを１つ以上重複して有するＤＮＡ断片を作製することを特徴とする微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の作製方法。
【請求項２】
宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡが、さらに組み換えのための異なる２つの共通配列をその両末端に有するものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組み換えのための異なる２つの共通配列をその両末端に有するＤＮＡと挿入ＤＮＡを含む挿入ＤＮＡユニットを、互いにその順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有する複数の単位ＤＮＡとして調製し、該単位ＤＮＡを連結して、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ単位ＤＮＡを１つ以上重複して有するＤＮＡ断片を作製することを特徴とする微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の作製方法。
【請求項４】
単位ＤＮＡの連結が、塩およびポリエチレングリコールの存在下で各単位ＤＮＡを等モルずつ混合して行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片が、互いに重なり合う単位ＤＮＡを有する複数のＤＮＡ断片からなることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
挿入ＤＮＡが、１０Ｋｂ以上であることを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
宿主微生物が、自然形質転換能を有するものであることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
挿入ＤＮＡが、２つ以上の遺伝子を含むことを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
挿入ＤＮＡが、物質生産に必要な一連の遺伝子を含むことを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法により作製されたＤＮＡ断片。
【請求項１１】
請求項２に記載の方法により作製されたＤＮＡ断片。
【請求項１２】
請求項３に記載の方法により作製されたＤＮＡ断片。
【請求項１３】
請求項１０に記載のＤＮＡ断片を、宿主微生物のコンピテント細胞と共培養した後に、該微生物中のプラスミドＤＮＡを回収することを特徴とする複数の単位ＤＮＡが一定の順序と向きを保って連結された挿入ＤＮＡユニットを含むプラスミドＤＮＡの製造方法。　
【請求項１４】
請求項１１に記載のＤＮＡ断片を、宿主微生物のコンピテント細胞と共培養した後に、該微生物中のプラスミドＤＮＡを回収し、該プラスミドを、組み換えのための共通配列がゲノムＤＮＡ中に隣接して存在する宿主微生物のコンピテント細胞と共培養することを特徴とする複数の単位ＤＮＡが一定の順序と向きを保って連結された挿入ＤＮＡユニットをゲノムＤＮＡ中に含む微生物の製造方法。
【請求項１５】
請求項１１または１２に記載のＤＮＡ断片を、組み換えのための異なる２つの共通配列がゲノムＤＮＡ中に隣接して存在する宿主微生物のコンピテント細胞と共培養することを特徴とする複数の単位ＤＮＡが一定の順序と向きを保って連結された挿入ＤＮＡユニットをゲノムＤＮＡ中に含む微生物の製造方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法により製造された微生物。
【請求項１７】
微生物細胞内での目的物質生産に適したＤＮＡ断片、並びにそれをゲノムＤＮＡ中に含む微生物の選択および取得方法であって、以下の工程からなる方法；
(a)宿主微生物中で有効な複製開始点および／または異なる２つの組み換えのための共通配列をその両末端に有するＤＮＡと物質生産に必要な一連の遺伝子を含み、かつその遺伝子が異なる順番で連結している挿入ＤＮＡを含む挿入ＤＮＡユニットを、互いにその順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有する複数の単位ＤＮＡとして調製する工程、
(b)該単位ＤＮＡを連結して、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ単位ＤＮＡを１つ以上重複して有するＤＮＡ断片群を作製する工程、
(c)該ＤＮＡ断片群を用いて、請求項１２または１３に記載の方法により各挿入ユニットをゲノムＤＮＡ中に含む微生物群を製造する工程、
(d)各微生物細胞中で目的物質を生産させ、該目的物質量を解析する工程。
　
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、Bacillus属細菌等の微生物のＤＮＡ取り込み能力と相同組み換え能力を用いることにより複数のＤＮＡ断片が一定の順序と向きを保って連結集積していて、かつ微生物中で増幅可能なＤＮＡを簡便に取得する方法、並びに、該ＤＮＡをゲノムＤＮＡ中に含む微生物を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　生物の行うある物質生産等の一連の過程（バイオプロセス）においては、多数の遺伝子が関与しており、これらの遺伝子は、比較的まとまってゲノム中に存在していることもあるが、ゲノム中に分散していることが多い。近年のゲノムプロジェクトの成果により生物の持つ遺伝子の全貌が明らかにされつつあり、現在、これらのゲノム遺伝子情報を利用してあるバイオプロセスに必要かつ十分な遺伝子群を選び取ることで効率のよいバイオプロセスを再構成したり、あるいは様々な遺伝子の組み合わせで新規バイオプロセスの構築が必要とされている。遺伝子１つの平均的な長さがバクテリアにおいては、約１ｋｂ、動物においても１０から１００ｋｂの長さがあり、これらを複数組み合わせた場合の長さは、必然的に１０ｋｂ以上の巨大なＤＮＡとなる。このような巨大なＤＮＡの操作においては、該ＤＮＡを組み換え操作が可能な鎖長に分断する等した後、これをプラスミド上に１つずつ組み込んでいくような手法が取られていたが、この方法では、組み込みのたびに使用する制限酵素部位の制約が厳しくなり、限界がある。
【０００３】
　これらの問題を解決するために、固層法による長鎖ＤＮＡ連続連結法が、株式会社豊田中央研究所により考案されている（特許文献１、及び非特許文献１を参照）。大腸菌ベクターの一端をビーズ上に固定した後、このもう一端の方に非回文配列の付着末端を利用してDNA断片を指定した方向に連結した後、未反応物を取り除き更に次の断片を連結するという操作を繰り返すことで複数のＤＮＡ断片を望ましい順番と向きに連結した後、これをビーズから切り離し、得られた直鎖ＤＮＡを環状に連結した後、大腸菌に形質転換することにより、大腸菌プラスミド上に多数のＤＮＡ断片を望ましい向きと方向に集積するというものである。しかしながら、本方法は、先ずビーズに大腸菌ベクターを連結するための準備が必要である点、連結操作の各段階ごとに未反応物の除去が必要である点、そして、最後にＤＮＡをビーズから切り離し環状に連結する点で、煩雑で時間を要する操作が多い。特に環状に連結すること、即ち分子内ライゲーションは、ＤＮＡ濃度を薄くする必要があるが、ＤＮＡの長さが長くなるほど、理論上環状ＤＮＡの生成効率が下がることになる（非特許文献２参照。)ため、連結すべきDNA断片の合計の長さが長いほどこれらが連結されたＤＮＡの取得効率が低下することが問題であった。
【０００４】
　一方、枯草菌を用いてプラスミドＤＮＡを取得する方法が知られている。枯草菌はある生理状態において、能動的にＤＮＡを取り込む能力を持つ細胞（コンピテント細胞）が出現する。この取り込みの過程においては、まず、基質となる２本鎖ＤＮＡがコンピテント細胞上で切断される。この切断点より、２本鎖の内の片側のＤＮＡ鎖が分解され、残りのもう一方のＤＮＡ鎖が１本鎖ＤＮＡとして枯草菌の菌体内に取り込まれることが知られている。取り込まれた1本鎖ＤＮＡは、全く別個に取り込まれた相補鎖の1本鎖ＤＮＡと会合したりすることにより、環状の２本鎖ＤＮＡへと修復される（非特許文献３参照）。このようにプラスミドＤＮＡが切断されて取り込まれるために、大腸菌プラスミド形質転換系においては２本鎖の環状ＤＮＡを必要とするのとは異なり、枯草菌のコンピテントセルによるプラスミド形質転換における基質プラスミドの形状は、環状のＤＮＡである必要はなく、むしろ、取り込まれた後にプラスミドの修復に有利に働くような、同じＤＮＡが同一方向に多重に配列したような構造（コンカテマー構造）であることが必要であることがわかっていた。しかし、このような方法を用いて複数のＤＮＡ断片からなる挿入ＤＮＡが含まれるプラスミドは取得されていなかった。
【特許文献１】特開２００２−２６２８７０号公報
【非特許文献１】幸田ら、平成１３年度、日本生物工学会大会、講演要旨集、ｐ．２２３
【非特許文献２】Dugaiczyk, A., et al. J. Mol. Biol. 96, 171-184. (1975)
【非特許文献３】Canosi, U., et al. Mol. Gen. Genet., 181, 434-440. (1981)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　本発明は、Bacillus属細菌等の微生物のＤＮＡ取り込み能力と相同組換え能力を用いることにより複数のＤＮＡ断片が一定の順序と向きを保って連結集積していて、かつ微生物中で増幅可能なプラスミドＤＮＡを簡便に取得する方法、並びに、複数のＤＮＡ断片が一定の順序と向きを保って連結集積したＤＮＡ配列をゲノムＤＮＡ中に含む微生物を取得する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＤＮＡの制限酵素ＳｆｉＩの消化により発生する３塩基の突出末端が任意の配列に指定できることを利用して、集積すべき構成要素のＤＮＡ断片と枯草菌菌体内で有効な複製機構を有する線状プラスミドベクター断片の各末端を、各断片が１つのＤＮＡ集積単位中で一回ずつ順序良く連結できるような末端を生成するよにＳｆｉＩ切断部位を設計して調製し、これらのＳｆｉＩの断片を等モルとなるように濃度を合わせて混合した後、ポリエチレングリコールと塩存在下でライゲーション反応を行うことにより、このＤＮＡ連結単位が多重に繰り返した構造の直鎖の高分子ＤＮＡを生成させ、これを枯草菌コンピテント細胞に形質転換することで、枯草菌プラスミド中に望ましい順番と方向にＤＮＡを連結することに成功した。また、該プラスミド中の配列と共通の配列をゲノムＤＮＡ中に挿入した枯草菌コンピテント細胞と上記で取得したＤＮＡ連結単位が多重に繰り返した構造の直鎖の高分子ＤＮＡとを共培養することにより、枯草菌ゲノムＤＮＡ中に望ましい順番と方向にＤＮＡを連結することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
　即ち、本発明によれば、
（１）宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡと挿入ＤＮＡを含む挿入ＤＮＡユニットを、互いにその順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有する複数の単位ＤＮＡとして調製し、該単位ＤＮＡを連結して、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ単位ＤＮＡを１つ以上重複して有するＤＮＡ断片を作製することを特徴とする微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の作製方法、
（２）宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡが、さらに組み換えのための異なる２つの共通配列をその両末端に有するものであることを特徴とする上記（１）に記載の方法、
（３）組み換えのための異なる２つの共通配列をその両末端に有するＤＮＡと挿入ＤＮＡを含む挿入ＤＮＡユニットを、互いにその順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有する複数の単位ＤＮＡとして調製し、該単位ＤＮＡを連結して、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ単位ＤＮＡを１つ以上重複して有するＤＮＡ断片を作製することを特徴とする微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片の作製方法、
（４）単位ＤＮＡの連結が、塩およびポリエチレングリコールの存在下で各単位ＤＮＡを等モルずつ混合して行われることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（５）微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片が、互いに重なり合う単位ＤＮＡを有する複数のＤＮＡ断片からなることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法、
（６）挿入ＤＮＡが、１０Ｋｂ以上であることを特徴とする上記（１）〜（５）の何れかに記載の方法、
（７）宿主微生物が、自然形質転換能を有するものであることを特徴とする上記（１）〜（６）の何れかに記載の方法、
（８）挿入ＤＮＡが、２つ以上の遺伝子を含むことを特徴とする上記（１）〜（７）の何れかに記載の方法、
（９）挿入ＤＮＡが、物質生産に必要な一連の遺伝子を含むことを特徴とする上記（１）〜（８）の何れかに記載の方法、
（１０）上記（１）に記載の方法により作製されたＤＮＡ断片、
（１１）上記（２）に記載の方法により作製されたＤＮＡ断片、
（１２）上記（３）に記載の方法により作製されたＤＮＡ断片、
（１３）上記（１０）に記載のＤＮＡ断片を、宿主微生物のコンピテント細胞と共培養した後に、該微生物中のプラスミドＤＮＡを回収することを特徴とする複数の単位ＤＮＡが一定の順序と向きを保って連結された挿入ＤＮＡユニットを含むプラスミドＤＮＡの製造方法、
（１４）上記（１１）に記載のＤＮＡ断片を、宿主微生物のコンピテント細胞と共培養した後に、該微生物中のプラスミドＤＮＡを回収し、該プラスミドを、組み換えのための共通配列がゲノムＤＮＡ中に隣接して存在する宿主微生物のコンピテント細胞と共培養することを特徴とする複数の単位ＤＮＡが一定の順序と向きを保って連結された挿入ＤＮＡユニットをゲノムＤＮＡ中に含む微生物の製造方法、
（１５）上記（１１）または（１２）に記載のＤＮＡ断片を、組み換えのための異なる２つの共通配列がゲノムＤＮＡ中に隣接して存在する宿主微生物のコンピテント細胞と共培養することを特徴とする複数の単位ＤＮＡが一定の順序と向きを保って連結された挿入ＤＮＡユニットをゲノムＤＮＡ中に含む微生物の製造方法、
（１６）上記（１４）または（１５）に記載の方法により製造された微生物、
（１７）微生物細胞内での目的物質生産に適したＤＮＡ断片、並びにそれをゲノムＤＮＡ中に含む微生物の選択および取得方法であって、以下の工程からなる方法；
(a)宿主微生物中で有効な複製開始点および／または異なる２つの組み換えのための共通配列をその両末端に有するＤＮＡと物質生産に必要な一連の遺伝子を含み、かつその遺伝子が異なる順番で連結している挿入ＤＮＡを含む挿入ＤＮＡユニットを、互いにその順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有する複数の単位ＤＮＡとして調製する工程、
(b)該単位ＤＮＡを連結して、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ単位ＤＮＡを１つ以上重複して有するＤＮＡ断片群を作製する工程、
(c)該ＤＮＡ断片群を用いて、請求項１２または１３に記載の方法により各挿入ユニットをゲノムＤＮＡ中に含む微生物群を製造する工程、
(d)各微生物細胞中で目的物質を生産させ、該目的物質量を解析する工程、
が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
　本発明によれば、土壌細バクテリアの一種である枯草菌等のコンピテント細胞形質転換法を用いて、複数のＤＮＡ断片を１度のライゲーション操作で連結することができる。つまり、従来法では困難であった巨大ＤＮＡの増幅可能なＤＮＡ断片への連結集積が極めて簡便に行えることが示された。
　集積するＤＮＡ断片は、末端の突出部分の塩基配列に制限があるが、それ以外の部分の塩基配列に組換えを誘発したり制御したりするような特殊な塩基配列を一切必要とせず、また、宿主ゲノムとの相同配列も一切必要としない。即ち本発明は、原核生物、真核生物を問わず広く一般のＤＮＡ集積に応用できるものと期待される。
【０００９】
　さらに、微生物形質転換用ＤＮＡ断片を作製する際、集積する各単位ＤＮＡのモル比が、１になるようにすることで最終的に取得されるプラスミドが効率的に得られることが本発明によって初めて明らかにされた。
　また、本発明の方法は、下記実施例２で示したように、単位ＤＮＡの長さの違い（最小０．３ｋｂ、最大３８ｋｂ）が大きくても全く問題なく集積が可能で、集積単位も５０ｋｂ以上が可能である。即ち、単位ＤＮＡの大きさを全く考慮することなく任意に連結できるものである。また、哺乳動物（マウス、ヒトを含む）や植物等を含む真核生物の遺伝子は、１０ｋｂを超える長いものが多いが、これらの遺伝子も単位ＤＮＡとして取り扱えることが示された。
【００１０】
　また、下記実施例２で用いたプリパスタチン合成遺伝子をコードしているｐｐｓは、約３ｋｂおきに１０個の繰り返しがある配列にもかかわらず、本発明の方法で作製された多重遺伝子集積プラスミドは、枯草菌内で安定に保持されかつ発現することも明らかになった。繰り返し配列は、哺乳動物（マウス、ヒトを含む）や植物等を含む真核生物において広く見られるが、本発明の方法は、繰り返し配列を有するＤＮＡ集積にも適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
　以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）微生物形質転換用ＤＮＡ断片の作製
　本発明の１つは、複数のＤＮＡ断片を任意の順番と方向に連結して集積したＤＮＡを調製する方法であって、具体的には、（１）宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡと挿入ＤＮＡを含む挿入ＤＮＡユニットを、互いにその順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有する複数の単位ＤＮＡとして調製し、（２）該単位ＤＮＡを連結して、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ単位ＤＮＡを１つ以上重複して有するＤＮＡ断片を作製した後に、（３）該ＤＮＡ断片と宿主微生物のコンピテント細胞と共培養して、該微生物からプラスミドＤＮＡを回収することにより複数のＤＮＡ断片を任意の順番と方向に連結して集積したＤＮＡを調製する方法である。
【００１２】
　本発明でいう挿入ＤＮＡとは、クローニングしようとするＤＮＡであり、その種類や大きさは特に限定されないが、１０ｋｂ以上が好ましい。ＤＮＡの種類は、原核生物、哺乳動物又は植物を含む真核生物の、ゲノムＤＮＡ断片、すでにクローニングされているＤＮＡ、ｃＤＮＡ断片のいずれでもよく特に制限されない。本発明の方法においては、プラスミド上に独立したＤＮＡ断片を連結することができるので、挿入ＤＮＡとしては、ゲノム上で独立して存在する遺伝子を２つ以上含むものを用いると特に効果的である。このような複数種の遺伝子として好ましくは、ある物質生産に必要な一連の遺伝子等が挙げられ、その具体例としては、プリパスタチンを構成するｄｅｇＱ、ｓｆｐ、ｐｐｓ遺伝子等が挙げられる。さらに、挿入ＤＮＡがこのような物質生産に必要な一連の遺伝子を含む場合で、その遺伝子の連結順序、および遺伝子間の距離や塩基配列などについて物質生産に適したものが知られている場合、それらに従って調製することが好ましい。
【００１３】
　また、宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡとは、作製されるＤＮＡ断片で形質転換される微生物中で、ＤＮＡの複製が行われるものであれば如何なるものであってもよい。本発明の宿主微生物としては、後述するように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌等が用いられるが、具体的な微生物と、該微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡとして、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）の場合はθ型の複製機構を有するもの（Janniere, L., et al. Gene 8753-61. (1990)）で、具体的にはｐＴＢ１９（Imanaka, T., et al. J. Gen. Microbiol. 130,1399-1408.(1984)）や、ｐＬＳ３２（Tanaka, T. and Ogura, M. FEBS Lett. 422, 243-246.(1998)）、ｐＡＭβ１（　Swinfield, T. J., et al. Gene 87,79-90.(1990)）等のプラスミドに含まれる複製開始点等の配列が挙げられる。また、作製されたプラスミドのコピー数が自在に調節できるものが好ましい。このようなＤＮＡのうちB. subtilis（枯草菌）の場合はθ型の複製機構を有するものは、ｐＧＥＴＳ１０９ベクター(日本農芸化学会誌75巻臨時増刊号p. 112)を直鎖化したもの等が用いられる。
【００１４】
　上記の挿入ＤＮＡおよび複製開始点を含む挿入ＤＮＡユニットには、これ以外にも、必要に応じて適当な塩基配列を含むことができる。例えば、本発明の方法によって、挿入ＤＮＡに含まれる遺伝子を発現するためのプラスミドを作製する場合には、プロモーターやオペレーター、アクチベーター、ターミネーターといった転写翻訳を制御する塩基配列を含んでもよい。枯草菌を宿主とした場合のプロモーターとして、具体的には、ＩＰＴＧ（isopropyl s-D-thiogalactopyranoside）で発現制御が可能なＰｓｐａｃ（Yansura, D. and Henner, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 439-443.(1984)）、あるいはＰｒプロモーター（Itaya, M. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63, 602-604.(1999)）等が挙げられる。
【００１５】
　挿入ＤＮＡユニットは、これを複数の単位ＤＮＡとして調製する。単位ＤＮＡとは、互いにその順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有しており、１つずつ連結したＤＮＡ断片が、１つの挿入ＤＮＡユニットとなるＤＮＡ断片を意味する。互いにその順序を保ったまま連結するとは、挿入ＤＮＡユニット上で隣り合う配列を有する単位ＤＮＡがその順序および向きを保って結合することをいい、また、繰り返し連結するとは、挿入ＤＮＡユニットの５’端の塩基配列を有する単位ＤＮＡの５’端と、挿入ＤＮＡの３’端の塩基配列を有する単位ＤＮＡの３’末端が結合することをいう。このような単位ＤＮＡとして、具体的には、例えば、断片の突出末端の塩基配列の相補性を利用して、お互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得るような末端を有するものが挙げられる。この突出末端の構造は特に制限はない。ただし、単位ＤＮＡの連結部位に制限酵素認識配列などが挿入されてもよい場合には、制限酵素認識配列であると、制限酵素による消化によって微生物形質転換用ＤＮＡ断片の構造を確認したり、単位ＤＮＡの作製の際に突出末端を制限酵素の消化により作製できるため好ましい。制限酵素認識配列としては、SfiIやBstXI等のように、複数種の配列を認識する酵素のものを用いると、単位ＤＮＡ断片の突出末端が各連結部位で異なるものにできるため、その連結する順序が保たれるし、制限酵素により作製された微生物形質転換用ＤＮＡの構造を確認する場合や、単位ＤＮＡの作製の際に、１種類の制限酵素による消化でよいため簡便である。
【００１６】
　単位ＤＮＡとしては、例えば、図１に単位ＤＮＡとして記載されている一連のＤＮＡ断片等が挙げられる。ＢｓＲ１ｓｔは矢印の方向にブラストサイジンＳ遺伝子の塩基配列を有し、ＣｍＲ２ｎｄは矢印の方向にクロラムフェニコール遺伝子の塩基配列を有し、ＥｍＲ３ｒｄは矢印の方向にエリスロマイシン遺伝子の塩基配列を有し、ＮｍＲ４ｔｈは、矢印の方向にテトラサイクリン遺伝子の塩基配列を有し、さらにＳｐＲ５ｔｈは、矢印の方向にスぺクチノマイシン遺伝子の塩基配列を有している。また、ｐＧＥＴＳ１０９ＳｆｉＩは、複製開始点を含むｒｅｐＡ遺伝子の塩基配列を有している。
【００１７】
　各単位ＤＮＡは、図１に記載されている順序、および塩基配列の方向を保ったまま繰り返し連結するように調製されている。具体的には、ＢｓＲ１ｓｔはの３’末端は、ＣｍＲ２ｎｄの５’末端と特異的に連結する突出末端となっており、その５’末端は、ｐＧＥＴＳ１０９Ｓｆｉｌの５’末端と特異的に結合する突出末端となっている。同様に、ＣｍＲ２ｎｄの３’末端とＥｍＲ３ｒｄの５’末端、ＥｍＲ３ｒｄの３’末端とＮｍＲ４ｔｈの５’末端、ＮｍＲ４ｔｈの３’末端とＳｐＲ５ｔｈの５’末端、およびＳｐＲ５ｔｈの３’末端とｐＧＥＴＳ１０９ＳｆｉＩの５’末端が特異的に結合する突出末端となっている。また、それぞれの突出末端は連結するとＳｆｉＩの認識配列となるように設計されている。
【００１８】
　単位ＤＮＡのＤＮＡ鎖長は特に制限されないが、好ましくは0.1〜100ｋｂのものが用いられる。また、挿入ＤＮＡユニットをどのように分断する配列からなるものであってもよい。ただし、制限酵素認識配列をその末端に配する場合には、好ましくは挿入ＤＮＡユニットに含まれる遺伝子の塩基配列を分断するものでない方がよい。
　単位ＤＮＡの作製方法としては、本発明の単位ＤＮＡを作製し得る方法であれば如何なるものであってもよいが、好ましくは、鋳型ＤＮＡ上の塩基配列に各突出末端を構成する制限酵素認識配列を付加したプライマーを用いたポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によりＤＮＡ断片を増幅し、得られたＤＮＡ断片を該制限酵素によって消化することによる方法が挙げられる。また、制限酵素の消化などによって取得された突出末端を有する単位ＤＮＡは、適当な方法を用いて精製することが好ましい。ここで、制限酵素として、ＳｆｉＩを用いる場合には、該制限酵素認識配列である５’−ｇｇｃｃｎｎｎｎｎｇｇｃｃ−３’ (ｎは、ａ、ｃ、ｇ、ｔのいずれか)のうち、各連結部位ごとに異なる配列、例えば５’−ｇｇｃｃａｔｇｔｇｇｇｃｃ−３’、５’−ｇｇｃｃａｇａｔｇｇｇｃｃ−３’、５’−ｇｇｃｃａａｇｔｇｇｇｃｃ−３’等を付加したプライマーによってＰＣＲを行う。
【００１９】
　かくして取得された単位ＤＮＡは、これをＤＮＡリガーゼなどを用いて連結（ライゲーション）することにより微生物形質転換用ＤＮＡ断片を作製することができる。連結方法は、特に制限はないが、単位ＤＮＡの鎖長が長い場合等は、ポリエチレングリコールと塩の存在下で各単位ＤＮＡを等モル混合して反応を行うことが好ましい。塩としてさらに好ましくは、１価のアルカリ金属の塩が挙げられる。また、１０％のポリエチレングリコール６０００と１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むライゲーション反応液で行うことがより好ましい。また、各単位ＤＮＡの反応液中の濃度には特に制限はないが、好ましくは、各々０．１ｆｍｏｌ／μｌ以上の濃度でかつ等モルになる濃度である。ライゲーションの反応温度、時間は特に制限はない。好ましくは、室温から３７℃で、５分から３０分である。
【００２０】
　かくして得られる微生物形質転換用ＤＮＡ断片は、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ単位ＤＮＡを１つ以上重複して有するものである。最も短い鎖長の具体例としては、図１の微生物組み換え用ＤＮＡ断片に記載されているＩからＩＩまでのＤＮＡ断片が挙げられる。また、このようなＤＮＡ断片として、互いに重なり合う単位ＤＮＡを有する複数のＤＮＡ断片からなるものも用いることができる。具体的には、図２に示すように、ｐＧＥＴＳ１０９ＳｆｉＩ−ＢｓＲ１ｓｔ−ＣｍＲ２ｎｄ−ＥｍＲ３ｒｄと連結している断片と、ＣｍＲ２ｎｄ−ＥｍＲ３ｒｄ−ＮｍＲ４ｔｈ−ＳｐＲ５ｔｈが連結している断片、およびＮｍＲ４ｔｈ−ＳｐＲ５ｔｈ−ｐＧＥＴＳ１０９ＳｆｉＩが連結している断片からなるものが挙げられる。これらの断片は、それぞれは、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ単位ＤＮＡを１つ以上重複して有するものではないが、それぞれが有する単位ＤＮＡが全体として、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ単位ＤＮＡを１つ以上重複して有するものである。
【００２１】
　上記の単位ＤＮＡの連結によって得られたＤＮＡ断片から、それらを選択して精製する必要は特にない。何故なら、後述する該ＤＮＡ断片による微生物の形質転換により上記の構造を有していないＤＮＡ断片は、微生物中でプラスミドにはなり得ないからである。
【００２２】
（２）微生物形質転換用ＤＮＡ断片を用いた挿入ユニットを含むプラスミドＤＮＡの製造方法
　該ＤＮＡ断片と宿主微生物のコンピテント細胞（以下、これを単に「コンピテント細胞」と称することがある）と共培養して、該微生物からプラスミドＤＮＡを回収することにより、挿入ＤＮＡおよび複製開始点を含む、即ち該微生物中で複製が可能なＤＮＡを取得することができる。
【００２３】
　宿主微生物としては、自然形質転換能を有するものであれば特に限定されない。このような微生物としては、ＤＮＡを取り込む際に一本鎖ＤＮＡに処理して取り込む自然形質転換能を有するもの等が挙げられる。具体的には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属細菌、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌等が挙げられる。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌としては、Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｂ．　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（巨大菌）、Ｂ．　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（中度好熱菌）等が挙げられる。このうち最も好ましい微生物としては、その自然形質転換能および組み換え能に優れた枯草菌が挙げられる。
【００２４】
　ただし、微生物ゲノム中に挿入ＤＮＡと相同の塩基配列が存在する場合は、該配列と相同組み換えしてしまう可能性が高いので、これを削除しておくことが好ましいが、挿入ＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組み込む場合には、挿入ＤＮＡユニットの末端の配列と相同性を有する配列が存在していても特に問題はない。
　微生物細胞をコンピテントとする方法は、それぞれの微生物に適した公知の方法を選択することができる。具体的には、例えば、枯草菌の場合には、Anagnostopoulos, C. and Spizizen, J.J. Bacteriol. 81,741-746.(1961)に記載の方法を用いることが好ましい。また、形質転換の方法もそれぞれの微生物に適した公知の方法を用いることができる。コンピテント細胞に与えるライゲーション産物の液量も特に制限はない。好ましくは、コンピテント細胞培養液量に対し、１／２０から等量であり、より好ましくは、半分量である。形質転換体からプラスミドを精製する方法としても公知の方法を用いることができる。
【００２５】
　かくして取得したプラスミドが、挿入ＤＮＡを有していることは、それ自体既知のサザンブロッティング法、ＰＣＲ法等によって確認することができる。また、挿入ＤＮＡがマーカーとなる遺伝子、例えば、薬剤耐性遺伝子等を含むように調製すれば、該薬剤によるスクリーニングによって確認することもできる。
【００２６】
（３）挿入ＤＮＡユニットをゲノムＤＮＡ中に有する微生物の製造方法
　本発明の第２は、上記で調製したＤＮＡを、宿主微生物のゲノムＤＮＡに挿入することにより、挿入ＤＮＡユニットをゲノムＤＮＡ中に有する微生物の製造方法、及び該微生物である。
【００２７】
　具体的な方法としては、（I）（１）に記載の挿入ＤＮＡユニットであって、その宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡが、さらに、異なる２つの組み換えのための共通配列をその両末端に有するもの（以下、これを「相同組み換え用ＤＮＡ断片」と称することがある）、または（２）に記載のの挿入ＤＮＡユニットを含むプラスミドＤＮＡであって、その挿入ＤＮＡユニット中の宿主微生物中で有効な複製開始点を含むＤＮＡが、さらに異なる２つの組み換えのための共通配列をその両末端に有するもの（以下、これを「相同組み換え用プラスミド」と称することがある）を、組み換えのための共通配列がゲノムＤＮＡ中に隣接して存在する微生物のコンピテント細胞と共培養して、相同組み換えを誘導し、複数のＤＮＡ断片を任意の順番と方向に連結して集積したＤＮＡをゲノムＤＮＡ中に有する微生物を製造する方法（以下、これを「間接法」と称することがある）、あるいは（II）組み換えのための異なる２つの共通配列をその両末端に有するＤＮＡと挿入ＤＮＡを含む挿入ＤＮＡユニットを、互いにその順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有する複数の単位ＤＮＡとして調製し、該単位ＤＮＡを連結して、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ単位ＤＮＡを１つ以上重複して有するＤＮＡ断片を作製することを特徴とする微生物細胞形質転換用ＤＮＡ断片（以下、これを「自己複製しない相同組み換え用ＤＮＡ断片」と称することがある）を作製し、（２）に記載の方法と同様に、組み換えのための共通配列がゲノムＤＮＡ中に隣接して存在する微生物のコンピテント細胞とを共培養して、相同組み換えを誘導し、複数のＤＮＡ断片を任意の順番と方向に連結して集積したＤＮＡをゲノムＤＮＡ中に有する微生物を製造する方法（以下、これを「直接法」と称することがある）が挙げられる。
【００２８】
　挿入ＤＮＡは上記（１）と同様のものを用いることができる。挿入ＤＮＡユニットとしては、間接法の場合には、挿入ＤＮＡ、宿主微生物中で有効な複製開始点、および宿主微生物のゲノムＤＮＡと相同組み換えを行うための異なる２つの共通配列（以下、これを「共通配列」と称することがある）をその両末端に含むＤＮＡを含むものが用いられる。この共通配列は、挿入ＤＮＡの両末端の配列を用いることもできる。さらに、これを宿主微生物のコンピテント細胞と共培養した時に、産生される該挿入ＤＮＡユニットを含むプラスミドＤＮＡが、そのコピー数が低くなるような構造を有するもの、あるいはそのコピー数を調節できる構造を有するものが好ましく用いられる。このような構造として具体的には、ラクトースやその誘導物質のIPTG　や、キシロース、アラビノース等の物質によりプロモーターを制御することで、複製に必要なたんぱく質の発現量に応じてコピー数が調節出来るプラスミドや、温度感受性の複製開始点や複製蛋白質を用いた温度によるコピー数の調節可能なプラスミド等が挙げられる。また、直接法においては、挿入ＤＮＡおよび共通配列を有するＤＮＡを含むものが用いられる。
【００２９】
　この共通配列は宿主微生物のゲノムＤＮＡへの挿入ＤＮＡの挿入に必要不可欠であり、挿入ＤＮＡを宿主微生物のゲノムＤＮＡに挿入するための足場（土台）となるべきものである。上記の共通配列を枯草菌等の宿主微生物のゲノムＤＮＡに予め隣接するように組み込んでおくか、宿主微生物のゲノムＤＮＡに存在する配列を共通配列として用いることもできる。この微生物細胞のゲノムＤＮＡに隣接して存在する共通配列の間が挿入ＤＮＡユニットの挿入部位となる。
【００３０】
　本発明の方法では、組み換えのための共通配列がゲノムＤＮＡ中に隣接して存在する宿主微生物のコンピテント細胞と相同組み換え用プラスミドまたは相同組み換え用ＤＮＡ断片を、共培養することにより相同組み換えを誘導し、挿入ＤＮＡユニットを宿主のゲノムＤＮＡ中に導入する。相同組み換えとは、１対の二本鎖ＤＮＡの相同的な塩基配列をもつ部分に起こる組み換えを言う。本明細書で言う「組み換えのための共通配列」とは、相同組み換えを生じさせることができる限り、挿入ＤＮＡユニット中の共通配列と、宿主微生物のゲノムＤＮＡ中の共通配列とが完全に同一である必要はなく、実質的に相同な配列（例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する配列であればよい。このような共通配列の長さは特に限定されないが、一般的には1ｋｂ以上が好ましく、例えば、５ｋｂから数１０ｋｂ程度が好ましく、１０ｋｂから２５ｋｂ程度がさらに好ましいが、挿入ＤＮＡユニットから１組の共通配列を除いた長さの５〜１５％程度が最適である。
【００３１】
　宿主微生物は、上記（２）に記載のものを用いることができる。宿主微生物と相同組み換え用プラスミドあるいは相同組み換え用ＤＮＡ断片の共培養による相同組み換えの詳細は、小倉光雄、バイオサイエンスとインダストリー、Vol.57, No.8, 532-535(1999)、板谷光泰、日本農芸化学会誌、Vol.67, No.4, 703-706 (1993)、並びに板谷光泰、日本農芸化学会誌、Vol.68, No.11, 1545-1550 (1994)などに記載されている方法を用いることができる。かくして製造される組み換え微生物も本発明の範囲に含まれる。
【００３２】
　本発明の方法において、挿入ＤＮＡは、物質生産に必要な一連の遺伝子を含むＤＮＡであることがあるが、この場合、挿入ＤＮＡとしてイントロンを含むゲノムＤＮＡを用いる場合で、宿主微生物として例えば枯草菌を使用する場合には、枯草菌内でイントロンを含むゲノムＤＮＡに含まれる遺伝子を発現できない、即ち目的物質が生産されない場合がある。このような場合は、スプライシングを誘起するタンパク質を該宿主微生物細胞に導入することにより、挿入ＤＮＡに含まれる遺伝子を発現させることができる。
【００３３】
（４）微生物細胞内での目的物質生産に適したＤＮＡ断片、並びにそれをゲノムＤＮＡ中に含む微生物の選択および取得方法
　本発明の方法の第３は、微生物細胞内での目的物質生産に適したＤＮＡ断片、並びにそれをゲノムＤＮＡ中に含む微生物の選択および取得方法であって、 (a)宿主微生物中で有効な複製開始点および／または異なる２つの組み換えのための共通配列をその両末端に有するＤＮＡと物質生産に必要な一連の遺伝子を含み、かつその遺伝子が異なる順番で連結している挿入ＤＮＡを含む挿入ＤＮＡユニットを、互いにその順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有する複数の単位ＤＮＡとして調製する工程、(b)該単位ＤＮＡを連結して、挿入ＤＮＡユニットを少なくとも１つ有し、かつ単位ＤＮＡを１つ以上重複して有するＤＮＡ断片群を作製する工程、(c)該ＤＮＡ断片群を用いて、請求項１２または１３に記載の方法により各挿入ユニットをゲノムＤＮＡ中に含む微生物群を製造する工程、(d)各微生物細胞中で目的物質を生産させ、該目的物質量を解析する工程からなる方法である。
【００３４】
　上記の(a)〜（c）の工程については、上記（１）〜（３）に詳細に説明した方法を用いることができる。
　製造された微生物細胞中で目的物質を生産させる方法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、例えば、宿主微生物が枯草菌の場合には、生産に関与する遺伝子を持つプラスミドによりコピー数を増加させた状態で生産する方法、あるいは、生産に関与する遺伝子のプロモーターを誘導物質や温度等の環境因子により誘導出来るように増殖に合わせた物質生産を行う方法等の方法が挙げられる。また、該微生物細胞中で生産される目的物質量の解析は、目的物質の種類や宿主微生物の種類に応じて適宜選択して行うことができる。具体的には、例えば、目的物質が抗菌物質で、これを枯草菌により生産させた場合、分泌された生産物を高速液体クロマトグラフィーや質量分析計、生物アッセイ等の方法を用いて生産物の量を測定する方法、あるいはプロテアーゼ等の菌体外分泌酵素の場合、その酵素の基質の反応速度を基質物質の吸光度の変化等により、生産量を測定したりする方法により、最も生産量が多かった微生物細胞を選択することによって、微生物細胞内での目的物質生産に適したＤＮＡ断片、並びにそれをゲノムＤＮＡ中に含む微生物を選択、取得することができる。
【実施例】
【００３５】
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、以下の実施例は本発明の一例を示すものに過ぎず、本発明の範囲は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
（材料）
　枯草菌１６８株とＲＭ１２５株（Uozumi, T., et al. Mol. Gen. Genet., 152, 65-69 (1977)）は、当研究室で受け継がれているものを使用した。中度高熱菌由来で枯草菌での複製が可能なプラスミドｐＴＢ５２２は、Ｉｍａｎａｋａ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３１，１７５３−１７６３（１９８５）に記載の方法に準じて取得されたものを用いた。ＩＰＴＧの添加によりクローニングした遺伝子の発現が調節可能なプラスミドｐＤＨ８８は、Ｈｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１８５，２２３−２２８（１９９０）に記載の方法に準じて取得されたものを用いた。大腸菌のプラスミドのｐＢＲ３２２は、宝酒造社から購入したものを使用した。テトラサイクリン耐性遺伝子のカセットを持つプラスミドｐＢＥＳＴ３０５は、Ｉｔａｙａ，Ｍ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，６８５−６８６（１９９２）に記載の方法に準じて取得されたものを用いた。クロラムフェニコール耐性遺伝子のカセットを持つプラスミドｐＢＥＳＴ４Ｄは、Ｉｔａｙａ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１０７，７９９−８０１（１９９０）に記載の方法に準じて取得されたものを用いた。ネオマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＢＥＳＴ５０１は、Ｉｔａｙａ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．,１７，４４１０（１９８９）に記載の方法に準じて取得されたものを用いた。Ｐｒプロモーター支配下のネオマイシン耐性遺伝子（Ｐｒ−ｎｅｏ）を持つプラスミドｐＢＥＳＴ５１５Ｃは、Ｉｔａｙａ，Ｍ，Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，６８５−６８６（１９９２）に記載の方法に準じて取得されたものを用いた。プラスミドｐＣＩＳＰ３１０ＢとｐＣＩＳＰ３１１Ｂは、Ｉｔａｙａ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２８，８６９−８７５（２０００）に記載の方法に準じて取得されたものを用いた。
【００３６】
　アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、ネオマイシンの抗生物質は、シグマ社から購入した。制限酵素ＳｆｉＩは、ＮＥＢ社から購入した。制限酵素ＮｏｔＩは、宝酒造から購入した。他の制限酵素とＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ、Ｔ４ DNA ligaseは、東洋紡社から購入した。大腸菌を用いたプラスミド作製に行ったDNA断片の平滑化とライゲーションには、宝酒造社のDNA Blunting KitとDNA Ligation Kitをそれぞれ用いた。PCRによる遺伝子増幅には、宝酒造社のTaKaRa Ex Taq　HSを用い、添付の説明書に従い行った。PCRの反応条件は、98℃、5分の後、以下の温度サイクルを30サイクル行った。98℃、20秒；60℃、30秒；72℃、増幅長さ1 kbあたり1分。PCR産物のクローニングには、Invtrogen社のTOPO XL PCR Cloning Kitを用いた。リゾチームは、生化学工業社製を用いた。LB培地の培地成分及び寒天は、ベクトン　ディッキントン社製のものを用いた。IPTG（isopropyl s-D-thiogalactopyranoside）は、シグマ社のものを使用した。他のすべての生化学試薬は、シグマ社およびナカライテスク社製のものを使用した。
【００３７】
　特記以外のプラスミドの構築は、大腸菌JA221株（CGSC#: 7091）を用いた。サザンハイブリダイゼーションは、Roche社のDIG DNA Labeling and Detection Kitを使用した。構築したプラスミドの抽出、検定、大量調製等の操作法は、標準プロトコール（Sambrook J, 他, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold  Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)）。コンピテント大腸菌JA221及びコンピテント枯草菌の形質転換は、既報の通り行った（Itaya, M. Mol. Gen. Genet., 241, 287-297(1993)）。
【００３８】
実施例１　５つの薬剤耐性遺伝子断片のプラスミド中への集積
（１）単位ＤＮＡの調製
　薬剤耐性遺伝子を含む、末端にSfiI認識配列を有する単位ＤＮＡの作製は、以下のように行った。ブラストサイジンS、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドpCISP310B（Itaya, M. et al. J. Biochem., 128, 869-875 (2000)）を鋳型として、プライマーBsR-Sfi1FとBsR-Sfi1R（配列番号８、９）を用いたPCRにより、ブラストサイジンS耐性遺伝子を増幅して、pCR-XL-TOPO（Invitrogen社）ベクターにクローニングし、プラスミドpCRBsR1stを構築した。また、同プラスミドを鋳型としたcat-SfiI2Fとcat-SfiI2R（配列番号１０、１１）を用いたPCRによりクロラムフェニコール遺伝子を増幅し、クロラムフェニコール耐性遺伝子をクローニングしたプラスミドpCRCmR2nd を構築した。さらに、spc-SfiI5Fとspc-SfiI5R（配列番号１６、１７）を用いたPCRによりスペクチノマイシン耐性遺伝子を増幅し、スペクチノマイシン耐性遺伝子をクローニングしたプラスミドpCRSpR5thを構築した。また、エリスロマイシン耐性遺伝子を有するpCISP311B（Itaya, M. et al. J. Biochem., 128, 869-875 (2000)）を鋳型として、erm-SfiI3Fとerm-SfiI3R（配列番号１２、１３）を用いたPCRからエリスロマイシン耐性遺伝子を増幅し、エリスロマイシン耐性遺伝子をクローニングしたプラスミドpCREmR3rdを構築した。さらに、ネオマイシン耐性遺伝子を持つpBEST501（Itaya, M. et al., Nucleic. Acid. Res., 17, 4410(1989)）プラスミドを鋳型としてneo-SfiI4Fとneo-SfiI4R（配列番号１４、１５）を用いたPCRによりネオマイシン耐性遺伝子を増幅し、ネオマイシン耐性遺伝子をクローニングしたプラスミドpCRNmR4thを得た。
【００３９】
　また、枯草菌において有効な複製開始点を有し、かつコピー数調節可能な大腸菌-枯草菌間シャトルプラスミドのpGETSであって、SfiI認識配列を有するpGETS109SfiIの構築は、以下の様に行った。プラスミドpTB522（Imanaka, T., et al., J. Gen. Microbiol., 131, 1753-1763(1985)）を制限酵素EcoRIとMluIで消化した後、DNA Blunting Kit（TAKARA社製）を用いてこのサイトを平滑化した。また、プラスミドpDH88（Henner, D. H., Methods Enzymol., 185, 223-228(1990)）を制限酵素HindIIIとBglIIで切断し脱リン酸化した後、DNA Blunting Kit（TAKARA社製）を用いてこのサイトを平滑化した。両断片を連結して、pDHrepAFを構築した。ターミネーターをクローニングするために、プライマーrrnBterm2F  とrrnBtermR （配列番号１、２）により大腸菌JA221（CGSC#: 7091）のゲノムDNAをテンプレートとしてPCRを行い、増幅した断片をプラスミドpCR XL TOPO（Invitrogen社製）中にクローニングし、プラスミドpCRrrnBTerm2を構築した。pDHrepAFをEcoRIで切断し脱リン酸化したものに、pCRrrnBTerm2をEcoRIとMunIで消化して得られた断片を連結して、プラスミドpDHrepAT1を構築した。pBR322（TAKARA社製）を制限酵素PvuIIで切断し脱リン酸化した後、pDHrepAT1をEcoRIとBamHIで切断し末端を平滑化した断片を連結して、プラスミドpBRDHrepAT1Fを構築した。pBRDHrepAT1FをSmaIで切断し脱リン酸化した後、pBEST305（Itaya, M. Biosci. Biotech. Biochem., 56,685-686. (1992)）をEcoRIとPstIで消化し末端を平滑化して得られたテトラサイクリン耐性遺伝子のカセットを連結して、プラスミドpGETS109を構築した。プラスミドpGETS109のHindIII　サイトに、VSfiKpn-1FとVSfiKpn-1R（配列番号３、４）をアニールして作製したリンカーを挿入して、プラスミドpGETS109SfiIを作製した。
【００４０】
　それぞれのプラスミドをSfiIにより消化し、低融点アガロース中で電気泳動してバンドを切り出すことにより薬剤耐性遺伝子を有する単位ＤＮＡ、BsR1st、CmR2nd、EmR3rd、NmR4th、SpR5thと、pGETS109SfiIを精製し、これらの一部を電気泳動することにより濃度を調べた。これらのSfiI断片の末端の配列は図１の単位ＤＮＡに示すとおりである。
【００４１】
（２）単位ＤＮＡの連結（ライゲーション）
　上記（１）で調製されたBsR1st、CmR2nd、EmR3rd、NmR4th、SpR5thと、pGETS109SfiIの各単位ＤＮＡは、ライゲーション時の体積22 μlにおけるの最終濃度が0.25 fmol/μlずつ、即ちモル比が1となるように適当量をとり、合計が10μlになるよにTEバッファーを添加した後、２×Linear ligationバッファー（132 mM Tris-HCl(pH 7.6)、13.2 mM MgCl2、20 mM Dithiothreithol、0.2 mM ATP、300 mM NaCl、20 %(w/v) polyethylen glycol）11 μlを混合し、そこにT4 DNA Ligase (4 weiss unit/μl：NEB社製)を 1 μl添加して、37℃、30分間恒温することでライゲーションした。このときライゲーション産物は、図１に示すように単位ＤＮＡが多重に繰り返した高分子直鎖状DNAとなっている。このサンプルを（i）とする。
【００４２】
　また、各断片のモル比が1から逸脱した場合における形質転換効率に与える影響を調べるために、上記(i)に対して、(ii）単位ＤＮＡのうち、CmR2ndを全く添加しなかったもの、（iii）CmR2ndを他の単位ＤＮＡに比べて8倍濃度（最終濃度2 fmol/μl）添加したもの、（iv）単位ＤＮＡpGETS109SfiIを他の単位ＤＮＡに比べて8倍濃度（最終濃度2 fmol/μl）添加したものもそれぞれ調整し、上記（i）と同様にライゲーションを行った。
【００４３】
（３）枯草菌の形質転換
　上記（２）で取得したライゲーション産物の7 μlを、枯草菌RM125株（Uozumi, T., et al., Mol. Gen. Genet., 152, 65-69(1977)）のコンピテント細胞培養液(Itaya, M., et al.,Mol. Gen. Genet., 241, 287-297(1993) )50 μlにそれぞれ添加して37℃、30分間恒温した。その後、各単位ＤＮＡに含まれる薬剤耐性遺伝子を発現させるために、LB培地200 μlを添加してから37℃、1時間培養、10μg/mlのテトラサイクリン(Sigma社製)を含むLB寒天培地に広げて、37℃で終夜培養した。得られたテトラサイクリン耐性コロニーは、（i）のライゲーション産物からは246個で、（ii）からは12個、（iii）からは129個、（iv）からは59個得られた。これらの株の大多数について単位ＤＮＡに含まれる耐性遺伝子が耐性を示す5つの薬剤（ブラストサイジンS、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン）に対する耐性の有無を、各薬剤を含むプレートに爪楊枝でレプリカすることにより調べたところ、全ての薬剤に対する耐性を示したコロニーの割合が、（i）74％、（ii）0%、（iii）77％、（iv）59％となった。
【００４４】
　上記の(i)のライゲーション産物から得られた形質転換体のうち、任意に選んだ12株のコロニーを、10 μg/ml のテトラサイクリン（SIGMA社製）とプラスミドコピー数を増加させるための1 mMのIPTG（isopropyl s-D-thiogalactopyranoside：SIGMA社製）を添加した2 mlのLB培地に植菌し、37℃で終夜培養した後、少量スケールでのプラスミド精製を行った。得られたプラスミドをSfiIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、臭化エチジウムにより染色した結果を図３に示す。その結果、上記（１）で作製した単位ＤＮＡであるBsR1st、CmR2nd、EmR3rd、NmR4th、SpR5thと、pGETS109SfiIの存在が確認されたプラスミドを持つ株が12株中8株あり、その正しいプラスミドの有無は、上述の各薬剤プレートによる耐性の結果と完全に一致していた。これらのことから、ライゲーションを行う際には、各単位ＤＮＡを等モルずつ混合して行うとライゲーション効率が高いことがわかった。
【００４５】
　また、より詳細にこのプラスミドの構造を調べるために、上記で各単位ＤＮＡが含まれることを確認したプラスミドのうちの1つについて、大腸菌JA221 （CGSC#: 7091）に形質転換した後、大量にプラスミドを調整して、各種制限酵素の切断パターンを詳細に検討した結果、BsR1st、CmR2nd、EmR3rd、NmR4th、SpR5thの各断片が、この順番にプラスミドpGETS109SfiI中に集積していることを確認した。
【００４６】
実施例２　抗カビ物質プリパスタチンの生産に関与する３つの遺伝子degQ、sfp、ppsの枯草菌プラスミド中への集積
（１）プリパスタチン産生のための遺伝子
　枯草菌の生産するリポペプチド性抗菌物質プリパスタチンの生産には現在までにdegQ(0.3 kb)、sfp(1 kb)、pps(38 kb)の３つの遺伝子が必要であることが明らかになっている（Tsuge, K., et al. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 2183-2192.(1999)）。本実施例で宿主として用いる枯草菌168株（Uozumi, T., et al., Mol. Gen. Genet., 152, 65-69(1977)）は、これが有する変異型degQ遺伝子（degQ0遺伝子）と変位型sfp遺伝子（sfp0遺伝子）は、野生型のdegQ遺伝子とsfp遺伝子と比較してどちらも1塩基の変異により機能不全型になっているため、プリパスタチンを生産しない（Tsuge, K., et al. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 2183-2192.(1999)）。従って本実施例においては、活性型の同遺伝子を該宿主にプラスミドとして導入し、該宿主にプリパスタチンを産生させることを試みた。
【００４７】
（２）枯草菌168株ゲノムからの変異型degQ sfp、pps遺伝子の除去
　活性型のdegQ、sfp、pps遺伝子を含むの3つのＤＮＡ断片を枯草菌プラスミド中に集積するにあたり、宿主となる枯草菌にこれらの遺伝子が残存していると、ゲノムとプラスミド間の相同組換え等により、ゲノムとプラスミドの不安定性を引き起こす可能性があるため、上記遺伝子集積を行うのに先立ち、まず、枯草菌168株ゲノム中に存在する変異型degQ、sfp、pps遺伝子ＤＮＡの完全な除去を行った。
【００４８】
　枯草菌168株ゲノムから変異型degQ遺伝子ＤＮＡを除去するために、プライマーdegQ2F-BglとdegQ2R-Bgl（配列番号１８、１９）により、プラスミドpCRdegQ（後述の（３）（ｉｉ）で作製）を鋳型としてdegQ遺伝子ＤＮＡの両末端からそれぞれ逆の方向にPCRを行い、得られた断片をBglIIで消化し自己閉環することにより、pCRΔdegQを構築した。このプラスミドは、元のプラスミドpCRdegQに比較して 0.3 kbのdegQ遺伝子ＤＮＡが除去されていて変わりにBglIIサイトが存在する。pCRΔdegQにクローニングされているdegQ遺伝子の両末端にあった領域を EcoRIにより切り出し、これをpBR322（TAKARA社製）のEcoRIサイトにクローニングして、pBRΔdegQFを作製した。このプラスミドのdegQの両末端にあった領域中のBglIIサイトを切断した後に、脱リン酸化処理と平滑末端処理を行なったものに、プラスミドpBEST515C（Itaya, M. Biosci. Biotech. Biochem., 56,685-686. (1992)）のEcoRI消化により得られたPr-neo断片を平滑末端化したものを挿入することにより、プラスミドpBRΔdegQF::Pr-neo30Fを構築した。このプラスミドをPstIで切断して直鎖状にした後、枯草菌168株（Uozumi, T., et al. Mol. Gen. Genet., 152, 65-69
(1977)）にItaya, M. Mol. Gen. Genet., 241, 287-297(1993)に記載の方法に準じて形質転換してネオマイシン耐性で選択することにより、degQ遺伝子ＤＮＡを完全に欠失し、その領域にネオマイシン耐性遺伝子であるPr-neoを持つ枯草菌BEST8635株を構築した。
【００４９】
　次に、sfp遺伝子ＤＮＡを欠損させるためにsfp遺伝子の５’上流側のＤＮＡを、プライマーsfp2F-Bamとsfp2R-Bam（配列番号２０、２１）、そして３’下流側のＤＮＡをプライマーsfp3F-Bamとsfp3R-Bam（配列番号２２、２３）を用いてPCRにより増幅してｐCR-XL-TOPOベクター（Invirogen社製）にクローニングした。sfp遺伝子の５’上流側のＤＮＡ断片が含まれるプラスミドをpCRupsfpとし、３’下流側のＤＮＡをクローニングしたプラスミドをpCRdownsfpとした。pCRdownsfpをBamHIで切断し、得られたsfp遺伝子の３’下流領域を含むＤＮＡ断片をpCISP310B（Itaya, M. et al. J. Biochem., 128, 869-875 (2000)）のBamHIサイトに挿入したプラスミドpC[downsfp/]を構築した。次にこのプラスミドのEcoRIサイトにプラスミドpCRupsfpをEcpRIで切断して得られたsfp遺伝子の５’上流領を含む断片を挿入して、プラスミドpC[downsfp/upsfp]を構築した。このプラスミドを上記と同様にしてBEST8635株に形質転換してBEST8646株を得た。
【００５０】
　この株のゲノムＤＮＡ中には、sfp遺伝子はなくなり、代わりにcIリプレッサー遺伝子とスペクチノマイシン耐性遺伝子のカセットが挿入されており、導入されたcIリプレッサー遺伝子により、Prプロモーターの発現が抑制され、この株ではネオマイシン感受性株となっているが、cIリプレッサー遺伝子が消失すると、ネオマイシン耐性へと変わる（特開2001-321170号公報）。
【００５１】
　次に、BEST8646株のゲノムＤＮＡから上記cIリプレッサー遺伝子とスペクチノマイシン耐性遺伝子のカセットを消去するために、sfp遺伝子５’上流と３’下流領域のＤＮＡを連結したＤＮＡ断片を構築した。まず、pCRupsfpをPstIで切断しその後EcoT22Iの部分消化により約1 kbのPstI-EcoT22Iのsfp遺伝子５’上流断片を得て、これをpCRdownsfpのPstIサイトに導入してpCRdownsfp/upsfpを得た。このプラスミドを枯草菌BEST8646株に形質転換してsfp 遺伝子５’上流と下流領域の2重交差により組み換わりcIリプレッサー遺伝子とスペクチノマイシン耐性遺伝子のカセットが消去したBEST8647株を得た。
【００５２】
　さらに、pps遺伝子ＤＮＡを消去するために、pps遺伝子の５’上流の領域をプライマーppsA2F-BamとppsA2R-Bam（配列番号２４、２５）により、また３’下流の領域をプライマーppsE2F-BamとppsE2R-Bam（配列番号２６、２７）により枯草菌168株のゲノムDNAを鋳型としたPCRにより得て、これらPCR産物をそれぞれpCR-XL-TOPOベクター（Invitrogen社）にクローニングしたプラスミドpCRupppsAとpCRdownppsEを構築した。pCRdownppsEのNotI-PstI間にオリゴDNAのRVICeuPstFとRVICeuPstR（配列番号２８、２９）をアニールして作製したアダプターを挿入して、pCRdownppsE-ICeuIを作製し、このプラスミドをMluIとPstIの消化により得られたpps遺伝子の３’下流領域のＤＮＡ断片を、pCRupppsAをEcoT22Iで部分消化した後、MluIで切断して得られた断片に連結して、プラスミドpCRupppsA/downppsE-ICeuIを構築した。
【００５３】
　このプラスミドをさらにEcoT22Iの部分消化の後、PstIで得られた断片を自己閉環することにより、プラスミドpCRupppsA/downppsE-ICeuI-lastを構築した。このプラスミドをEcoRVサイトにpCISP303#6のPvuIIサイトで直鎖化したものを挿入して、pCRupppsA/downppsE-ICeuI-last/CISPR3を構築した。このプラスミドを上記の枯草菌BEST8647株に上記と同様に導入して、スペクチノマイシン耐性株を取得することで、pps遺伝子が完全に欠失し、代わりにプラスミドpCISP303#6（Itaya, M., et al., J. Biochem., 128, 869-875 (2000)）がこの部分に挿入された枯草菌BEST8652株を構築した。この株にpCRupppsA/downppsE-ICeuI-lastを上記と同様に形質転換し、ネオマイシン耐性株を取得することにより、pps遺伝子が完全に欠失した枯草菌BEST8666株を作製した。この株は、元の168株と比較して、ゲノムＤＮＡ上のdegQ、sfp、pps遺伝子を完全に欠損した株で、即ち、以下のように表現できる。trpC2 ΔdegQ::Pr-neo Δsfp Δpps。
【００５４】
（３）野生型degQ 、sfp、pps遺伝子の取得および突出末端付加（ｉ）野生型degQ 、sfp遺伝子の取得
　まず、野生型のdegQ遺伝子ＤＮＡを得る目的で、変異型のdegQ0遺伝子を含む1.6 kbのＤＮＡ断片をプライマーdegQFとdegQR（配列番号３０、３１）により枯草菌168株ゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅し、pCR-XL-TOPOベクター（Invitrogen社製）にクローニングし、プラスミドpCRdegQ0を構築した。
【００５５】
　このプラスミドを鋳型としてあらかじめT4 Polynucleotide kinaseによりリン酸化した点突然変異導入プライマーdegQFmutとdegQRmut（配列番号３２、３３）を用いてＰＣＲを行った。このプライマーは枯草菌168株が有する変異型degQR遺伝子の点突然変異を野生型に変換する塩基配列を有する。このPCR産物を自己閉環することにより野生型のdegQ遺伝子ＤＮＡをもつプラスミドpCRdegQを構築した。さらに、このプラスミドを鋳型としてプライマーdegQF-BamHIとdegQR-BamHI（配列番号３４、３５）を用いてPCRにより0.3 kbのdegQ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し、これをpCR-TL-TOPOベクター（Invitrogen社）にクローニングしてプラスミドpCRdegQBamHI11を構築した。
【００５６】
　次に、機能型のsfp遺伝子ＤＮＡの取得を上述のdegQ遺伝子を含むＤＮＡ断片の取得方法とほぼ同様の手順で行った。まず、変異型sfp遺伝子を含む1.6 kbの領域をプライマーsfpFとsfpR（配列番号３６、３７）によりより枯草菌168株ゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅し、pCR-XL-TOPOベクター（Invitrogen社）にクローニングしたプラスミドpCRsfp0を構築した。あらかじめT4 Polynucleotide kinaseによりリン酸化した変異型sfpR遺伝子を野生型に変換する配列を有する点突然変異導入プライマーsfpF3とsfpR1（配列番号３８、３９）を用いて、上記pCRsfp0を鋳型としてPCRプラスミド全長を増幅し、このPCR産物を自己閉環することにより野生型のsfp遺伝子ＤＮＡをもつプラスミドpCRsfpを構築した。このプラスミドを鋳型としてプライマーsfpF-BamHIとsfpR-BamHI（配列番号４０、４１）を用いてPCRにより1 kbのsfp遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し、これをpCR-TL-TOPOベクターにクローニングしてプラスミドpCRsfpBamHI33を構築した。
【００５７】
（ｉｉ）degQとsfp遺伝子にSfiIサイトを付加し単位ＤＮＡの作製
　プラスミドpBR322のHindIIIサイトにリンカーHindIII-NotI（配列番号５）を導入してプラスミドpBR322NotIを構築した。配列番号４２、４３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの1st-Fと1st-R、及び配列番号４４、４５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド2nd-Fと2nd-Rをそれぞれアニールして、SfiIサイトを２つ持つアダプター1st、2ndを作製し、これらをそれぞれ上記pBR322NotIに組み込んだプラスミドpBR-1st、pBR-2ndを構築した。これらのプラスミドには、２つのSfiIサイトの間（6 bp）にBglIIサイトが存在する。そのBglIIサイトに、上記（３）（i）で作製したプラスミドpCRdegQBamHI11のBamHI消化から得られたdegQを含む断片を導入して、pBR-1stからはpBR-degQ1stFとその逆向きのpBR-degQ1stRを、また、pBR-2ndからはpBR-degQ2ndFとその逆向きのpBR-degQ2ndRをそれぞれ構築した。同様に、pBR-1stあるいはpBR-2ndのBglIIサイトに、上記（３）（i）で作製したプラスミドpCRsfpBamHI33のBamHI消化から得られたsfpを含む断片を導入して、pBR-1stからはpBR-sfp1stFとその逆向きのpBR-sfp1stRを、また、pBR-2ndからはpBR-sfp2ndFとその逆向きのpBR-sfp2ndRをそれぞれ構築した。
【００５８】
（ｉｉｉ）pps遺伝子の取得およびSfiIサイトを付加した単位ＤＮＡの作製
　pps遺伝子ＤＮＡ断片の取得は、組換え転移の手法（特開2002-017350号公報、Tsuge, K. and Itaya, M. J. Bacteriol. 183,5453-5458. (2001)）により以下のように行ったが、この際全体をSfiIの断片として得られるように調製した。まず、pps遺伝子ＤＮＡ断片の両末端の約1 kbの断片を、プライマーppsAF-SfiIとppsAR-NotI（配列番号４６、４７）、プライマーppsEF-NotIとppsER-SfiI（配列番号４８、４９）を用いて枯草菌168株ゲノムＤＮＡを鋳型としたPCRにより得て、それぞれpCR-XL-TOPO（Invitrogen社）にクローニングしてプラスミドpCRppsAとpCRppsEを得た。
【００５９】
　実施例１（１）で作製したpGETS109のHindIIIサイトを切断してHindIII-NotIリンカー（配列番号５）を挿入したプラスミドpGETS109NotIを作製した。このプラスミドのNotIサイトに、V-3rd-FとV-3rd-R（配列番号６、７）をアニールして作製したリンカーを挿入して、プラスミドpGETS109V-3rdFを作製した。また、実施例１（１）で作製したpBRDHrepAT1FをSmaIで切断し脱リン酸化した後、pBEST4D（Itaya, M., et al. J. Biochem., 107,799-801.(1990)）をSalIで消化し末端を平滑化して得られたクロラムフェニコール耐性遺伝子のカセットを連結して、プラスミドpGETS113を構築した。
【００６０】
　pCRppsEをHindIIIで消化してこの断片を上記プラスミドpGETS113のHindIIIサイトにクローニングしてpGETS113ppsEを作製し、このプラスミドのNotIサイトに、pCRppsAをNotIで消化して得られた断片をクローニングして、pGETS113ppsAEを構築した。プラスミドpGETS113ppsAEに組み込んだ２つの末端の境界はNotIサイトになっているが、これをNotIで切断して枯草菌168株に形質転換し、組換え転移の手法により枯草菌168株ゲノム中の38 kbのpps領域をプラスミド中に転移することを以下のように行った。
【００６１】
　塩化セシウム密度勾配法により大量調製したpGETS113 ppsAE　の1 μgを、10Uの制限酵素NotIで37℃、1時間反応させて線状プラスミドとしたものを100 μlの枯草菌168株のコンピテント細胞を含む培地に1.5 mlチューブ内でよく混合し、37℃, 30分間保温した。これに300 μlのLB培地を加えよく混合した後さらに、37℃, 1時間保温した。この培養液の全量をクロラムフェニコール（最終濃度5 μg/ml）を含む1.5 %寒天濃度のLBプレートに塗布し、37 ℃で終夜培養することによりクロラムフェニコール耐性の形質転換体を選択した。このコロニーを、クロラムフェニコール（最終濃度5 μg/ml）を含むLB液体培地100 ml に植菌し、37℃で終夜培養（17時間））した。この培養液にIPTG（isopropyl s-D-thiogalactopyranoside：SIGMA社製）を終濃度1 mMになるように添加して、さらに37℃で6時間培養した。培養終了後集菌し、リゾチームで溶菌後、サルコシルにより可溶化した後、臭化エチジウム-塩化セシウム密度勾配超遠心法によりプラスミドを含む画分を収集した。これを再度臭化エチジウム-塩化セシウム密度勾配超遠心法により精製し、プラスミドpGETS113ppsABCDEを得た。このプラスミドは、38 kbのppsABCDE（以下ppsと略す）がSfiI断片として切り出せるようになっている。
【００６２】
（４）野生型degQ、sfp、pps遺伝子を含む単位ＤＮＡの調製
　上記（３）で作製した単位ＤＮＡとなる、ある特定の3塩基の３’末端突出をもつDNA断片は、すべてSfiIの消化により得られるように設計されている。プラスミドpGETS113ppsABCDEをSfiIで消化した後、低融点アガロースゲル中で電気泳動を行い、目的の断片をゲル中より切り出して精製することにより、38 kbのpps断片を得た。また、ベクターのpGETS109V-3rdFもSfiIで消化した後ベクター部分を精製した。上記（３）（iii）で作製した各単位ＤＮＡを含むプラスミドの、pBR-degQ1stF、pBR-degQ2ndF、pBR-sfp1stF、pBR-sfp1stR、pBR-sfp2ndF、そしてpBR-sfp2ndRについても同様にSfiIにより消化した後、アガロースゲル電気泳動によりベクターと分離し、断片degQ1stF、degQ2ndF、sfp1stF、sfp1stR、sfp2ndF、そしてsfp2ndRを得た。これらの断片の末端は図４に示すとおりである。これらの断片は、精製後に一部を電気泳動することにより濃度を測定した後、2.5 fmol/μlとなるようにTEバッファーにより調整した。
【００６３】
（５）degQ、sfp、pps遺伝子を含む単位ＤＮＡの構築
　単位ＤＮＡ中の連結の順番の違いや方向の違いにより、形質転換された枯草菌中のプリパスタチンの産生への影響を解析するために、4つのプラスミド（a）pGETS-pps-degQ1stF-sfp2ndF、（b）pGETS-pps-degQ1stF-sfp2ndR、（c）pGETS-pps-sfp1stF-degQ2ndF、（d）pGETS-pps-sfp1stR-degQ2ndF（図４）を以下の手順により作製した。（a）は、2.5 fmol/μl の上記（４）で取得したdegQ1stF、sfp2ndF、pps、pGETS109V-3rdFの各SfiI断片を0.5 μlずつと、２×Linear ligationバッファー（132 mM Tris-HCl(pH 7.6)、13.2 mM MgCl2、20 mM Dithiothreithol、0.2 mM ATP、300 mM NaCl、20 %(w/v) polyethylen glycol）2.5 μlを混合し、そこにT4 DNA Ligase (4 weiss unit/μl：NEB社製)を 0.5 μl添加して、37℃、30分間恒温することでライゲーションした。残りのプラスミド作製においては、（a）に加えたdegQ1stFとsfp2ndFのSfiI断片を、（b）ではdegQ1stFとsfp2ndRに、（c）ではsfp1stFとdegQ2ndFに、（d）ではsfp1stRとdegQ2ndFに、それぞれ変更して（a）と同様にライゲーションした。これらのライゲーション産物を、枯草菌BEST8666株のコンピテント細胞培養液50 μlにそれぞれ添加して37℃、30分間恒温した。その後薬剤耐性遺伝子を発現させるために、LB培地200 μlを添加してから37℃、1時間培養、10 μg/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天培地に広げて、37℃で終夜培養した。
【００６４】
（６）構築した単位ＤＮＡの構造確認
　それぞれのライゲーション産物から得られたテトラサイクリン耐性株数は、15〜47であった。それぞれから6株を任意に選択して、10 μg/ml のテトラサイクリン（SIGMA社製）とプラスミドコピー数を増加させるための1 mMのIPTG（isopropyl s-D-thiogalactopyranoside：SIGMA社製）を添加した2 mlのLB培地に植菌し、37℃で終夜培養した後、少量スケールでのプラスミド精製を行った。得られたプラスミドをSfiIで消化後、パルスフィールドゲル電気泳動を行い、臭化エチジウムにより染色した結果を図５に示す。また、臭化エチジウム染色ではその存在の確認が困難なdegQとsfp断片については、degQあるいはsfpの各プローブを用いたサザンハイブリダイゼーションにより確認した（図５：PFGEのsfpプローブ、PFGEのdegQプローブ）。その結果、各6サンプル中３つ以上のサンプルが正しい大きさのpps、degQ、sfpそしてpGETS109V-3rdを持っていた（図５のレーン上に○がついているクローン）。
【００６５】
（７）ライブラリープラスミドの遺伝子発現の確認
　これらの作製された（a）〜（d）のプラスミド中の遺伝子が機能するかを確認するために、（a）〜（d）のプラスミドを持つ株を1株ずつ選択し、10 μg/ml のテトラサイクリン（SIGMA社製）と1 mMのIPTG（SIGMA社製）を添加したNo.3培地（水1Ｌに対し、Bacto Tryptone（ベクトン　ディッキンソン社製）10 g、グルコース　10 g、リン酸二水素カリウム　1 g、硫酸マグネシウム・7水和物　0.5 gを溶解し、水酸化ナトリウムでpH 6.8に調整したもの）に植菌し、30℃で、５日振とう培養後、培養液の酸性沈殿のメタノール抽出物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。図６に示すように、枯草菌BEST8666株は、pps、degQ、sfpの一切を持たないためプリパスタチンを生産しないが、この株中で上記のプラスミドを構築した株では、調べた全ての株でプリパスタチンの生産が認められ、遺伝子集積が正しく行われていることを確認した。
【００６６】
実施例３　抗カビ物質プリパスタチンの生産に関与する３つの遺伝子degQ、sfp、ppsのプラスミドによる遺伝子集積を経由した枯草菌ゲノムＤＮＡへの挿入
（１）degQ、sfp、pps遺伝子の単位DNAの作製
　本実施例で使用した単位DNAのsfp1stF、sfp1stR、sfp2ndF、sfp2ndF、pps及び、ベクターのpGETS109V-3rdは、実施例２（４）で調製したものと同一である。pGETS109V-3rdは、ｐGETS109の派生プラスミドで、枯草菌細胞内の平均的なコピー数が1コピー程度だが、プラスミド複製たんぱく質をコードする遺伝子repAの発現量をIsopropyl 1-thio-β-galactoside (IPTG)により制御できるように設計されており、培地中にIPTGを添加するとRepAたんぱく質の発現量に応じてプラスミドのコピー数が増大し、1mM のIPTG添加時に10コピー程度に増幅されるという特徴がある。プラスミドDNAの構造確認を行うときは、IPTGを添加して培養するが、プラスミド保持株からプラスミドを脱落させる際には、IPTGを入れずかつ薬剤選択圧をかけない状態で10世代程度培養することで容易にプラスミド脱落株を取得できる。degQ遺伝子の単位DNAについては、実施例２のものと異なり以下のとおり新たに作製した。
【００６７】
　プライマーdegQ2BamHFとdegQR-BamHI（配列番号５０、３５）を用いてPCRにより0.6 kbのdegQ遺伝子を含むDNA断片（以下degQ’とする）を増幅し、これをpCR-XL-TOPOベクター（Invitrogen社）にクローニングしてプラスミドpCRdegQ’BamHIを得た。以下、実施例２（３）iiのdegQの単位DNA取得と同様の方法によりpCRdegQ’BamHIのBamHI消化物より得られたdegQ’を含む断片をpBR-1stとpBR-2ndのBglIIサイトにクローニングし、pCR-1stからpBR-degQ’1stFを、pCR-2ndからpBR-degQ’2ndFをそれぞれ構築した。実施例２（３）iiiの方法によりそれぞれプラスミドを調製した後、実施例２（４）と同様の方法により上述のプラスミドをSfiIにより消化した後、アガロースゲル電気泳動によりベクターと分離し、断片degQ’1stFとdegQ’2ndFを得た。これらの断片は、精製後に一部を電気泳動することにより濃度を測定した後、2.5 fmol/mlとなるようにTEバッファーにより調製した。
【００６８】
（２）挿入DNAユニットを受容する宿主微生物株の調製
　実施例２（３）により調製したBEST8666株は、DdegQ::Pr-neo、Dsfp、Dppsとなっている。本菌に集積ユニットを相同配列間の組換えにより導入するための共通配列（pBR322）と組換えを検出するためのマーカー遺伝子のユニットを導入するために、実施例２（２）で調製したpCRupppsA/downppsE-ICeuI-lastのEcoRVサイトに配列番号５１と５２をアニールして調製したI-PpoIアダプターを挿入して、挿入方向の違いによりpCRupppsA/downppsE-ICeuI-last-IPpoIFとpCRupppsA/downppsE-ICeuI-last-IPpoIRの２つのプラスミドを構築した。同様に実施例２（２）で使用したpCISP303#6のPvuIIサイトに配列番号５１と５２をアニールして調製したI-PpoIアダプターを挿入してpCISP303#6-IPpoIRを構築した。pCRupppsA/downppsE-ICeuI-last-IPpoIRのI-PpoIサイトにpCISP303#6-IPpoIRをI-PpoIサイトで直鎖化したものを導入して、pCR[upppsA/downppsE-ICeuI-last-IPpoI]B-3を構築し、これを枯草菌BEST8666株のDppの上流と下流領域の相同性を利用して挿入することによりDpps::pBR322::(cI spc)となったBEST8824株を構築した。同様に、pCRupppsA/downppsE-ICeuI-last-IPpoIFのI-PpoIサイトにpCISP303#6-IPpoIRをI-PpoIサイトで直鎖化したものを導入して、pCR[upppsA/downppsE-ICeuI-last-IPpoI]A28-3を構築し、これを枯草菌BEST8666株のDppsに挿入することによりDpps::pBR322::(cI spc)となったBEST8827株を構築した。即ち、BEST8824株とBEST8827株のpBR322::(cI spc)が、I-PpoIサイトによりカセット化されており、両株では、カセットの向きが異なる。これらのプラスミドの構造を図７に示した。図中縦縞の四角は組み換えのための共通配列を示す。
【００６９】
（３）挿入DNAユニットの調製
　単位DNA中の連結の違いやゲノム中における方向の違いにより、形質転換された枯草菌中のプリパスタチンの産生への影響を解析するために、BEST8824株とBEST8827株の2種類の株を遺伝子集積ユニットの宿主菌として使用して、実施例２（５）の方法により多重遺伝子集積における遺伝子断片の順番の違いや方向の違いを反映したライブラリーの構築として、4つのプラスミド（a）pGETS-pps-degQ’1stF-sfp2ndF、（b）pGETS-pps-degQ’1stF-sfp2ndR、（c）pGETS-pps-sfp1stF-degQ’2ndF、（ｄ）pGETS-pps-sfp1stR-degQ’2ndF（図７）を以下の手順により調製した。（a）は、2.5 fmol/ml の（１）で取得したdegQ’1stF、及び実施例２（４）で取得したsfp2ndF、pps、pGETS109V-3rdFの各SfiI断片を0.5 mlずつと、２×Linear ligationバッファー（132 mM Tris-HCl(pH 7.6), 13.2 mM MgCl2, 20 mM Dithiothreithol, 0.2 mM ATP, 300 mM NaCl, 20 %(w/v) polyethylen glycol）2.5 mlを混合し、そこにT4 DNA Ligase (4 weiss unit/ml)を 0.5 ml添加して、37℃、30分間恒温することでライゲーションした。残りのプラスミド調製においては、（a）に加えたdegQ’1stFとsfp2ndFのSfiI断片を、（b）ではdegQ’1stFとsfp2ndRに、（c）ではsfp1stFとdegQ’2ndFに、（d）ではsfp1stRとdegQ’2ndFに、それぞれ変更して（a）と同様にライゲーションした。これらのライゲーション産物を、枯草菌BEST8824株とBEST8827株のコンピテント細胞培養液50 mlにそれぞれ添加して37℃、30分間恒温した。その後薬剤耐性遺伝子を発現させるために、LB培地200 mlを添加してから37℃、1時間培養、10 mg/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天培地に広げて、37℃で終夜培養した。
【００７０】
（４）構築した挿入DNAユニットの宿主ゲノムＤＮＡへの挿入
　それぞれのライゲーション産物から得られたテトラサイクリン耐性株数は、13〜519コロニーであった。それぞれから６株を任意に選択して、２本の10 mg/mlのテトラサイクリン入りの2 mlのLB培地に植菌し、一方にプラスミドのコピー数を増加させるための1 mMのIPTGを添加して、37℃で終夜培養した後、IPTGを入れて培養した培養液より少量スケールのプラスミド精製を行った。精製したプラスミドを制限消化せずにそのまま電気泳動することにより、大きさを指標としてプラスミド中に正しく単位DNAを集積しているクローンをそれぞれ一株選択し、この株の培養液のうちIPTGを添加せずに培養したものを、LB培地により100倍あるいは10000倍希釈し、3 mg/mlのネオマイシンを含むプレートに100 mlを塗沫し、30℃で一晩培養した。Dppsの領域に挿入されている組換えの共通配列（pBR322配列）と集積プラスミドのベクター部分に存在しているpBR322配列間で組換えを起こしたことにより２つの共通配列間に挟まれているcIリプレッサー遺伝子が、集積ユニットと置換されることにより、ネオマイシン耐性となった株を得た。この構造を図８に示す。図中、Nmは、 ネオマイシンを、Spはスペクチノマイシンを、Tcはテトラサイクリンを、Rは耐性を、Sは感受性を意味する。
【００７１】
　ネオマシン耐性株の出現頻度は、プラスミド保持株の104〜106株に１株の頻度であった。そのうちのそれぞれ25株を10 mg/mlのテトラサイクリンを含むプレートと、3 mg/mlのネオマイシンを含むプレートと、50 mg/mlのスペクチノマイシンを含むプレートにレプリカし、プラスミド中の集積ユニットが、共通配列の相同領域を利用してゲノムに導入されることで、cIリプレッサー遺伝子とスペクチノマイシン耐性遺伝子が消失し、かつ、プラスミドが残存しない場合に示す表現型である、ネオマイシン耐性、テトラサイクリン感受性、ネオマイシン感受性株を１〜25株得た。これら株を培養後、アガロースゲルブロック中でゲノムDNAを調製し、制限酵素I-PpoIで消化後パルスフィールドゲル電気泳動により分析した結果、元の宿主に集積ユニットが挿入されたことにより発生する、約4４kbのバンドを検出した（図９）。さらに、ゲノムDNAをテンプレートとしたPCRとサザンハイブリダイゼーションにより、3つの遺伝子のdegQ、sfp、ppsが指定した順番に連結していることを確認し、BEST8824株ゲノムに（a）〜（d）の集積ユニットを持つ４株をBUSY8120、8121、8345、8124株、BEST8827株ゲノムに（a）〜（d）の集積ユニットを持つ４株をBUSY8127、8128、8352、8243株と命名した。
【００７２】
（５）ライブラリーの遺伝子発現レベルの比較
　実施例３（４）で調製されたBEST8824株ゲノムに（a）〜（d）の集積ユニットを持つ４株と、BEST8827株ゲノムに（a）〜（d）の集積ユニットを持つ４株との合計８株のライブラリーについて、LB培地で37℃、一晩前培養した後、ACS培地（培地1l当たり、スクロース 100 g、クエン酸 11.7 g、硫酸ナトリウム 4 g、酵母エキス 5 g、リン酸水素二アンモニウム 4.2 g、塩化カリウム 0.76 g、塩化マグネシウム・6水和物 0.42 g、塩化亜鉛 0.0104 g、塩化第二鉄・6水和物 0.0245 g、塩化マンガン・4水和物 0.0181 gを溶解し、アンモニア水でpH 6.9に調整後、オートクレーブする）に植菌し、30℃で、5日間振とう培養後、培養液の酸性沈殿のメタノール抽出物を高速液体クロマトグラフィーにより各株のプリパスタチンの生産量を計測し、すべての株よりプリパスタチンの産生が確認された。各プリパスタチン生産量は、BUSY8243株（56 mg/ml）、BUSY8127株（55 mg/ml）、BUSY8128株（54 mg/ml）、BUSY8352株（53 mg/ml）、BUSY8345株（45 mg/ml）、BUSY8124株（43 mg/ml）、BUSY8120株（41 mg/ml）、BUSY8121株（36 mg/ml）の順となり、集積ユニット中の3遺伝子の順序や、ゲノム中での向きにより生産性が異なっていた。
【００７３】
実施例４　抗カビ物質プリパスタチンの生産に関与する３つの遺伝子degQ、sfp、ppsの集積ユニットの枯草菌ゲノムへの直接挿入
　実施例３に示した方法は、一度挿入ユニットが正しいかをプラスミドの状態おいて確認後ゲノムに挿入しているが、本実施例では、ライゲーション後の挿入ユニットを宿主菌に形質転換後直接挿入ＤＮＡユニットがゲノムに挿入されたものを選択した。
（１）単位DNAの準備
　実施例３と同様のものを使用した。
（２）挿入DNAユニットを受容する宿主株
　実施例３で調製したBEST8824株とBEST8827株を使用した。
（３）挿入DNAユニットの調製と宿主ゲノムへの組み込み
　集積ユニットのpps-degQ’1stF-sfp2ndF（実施例３の（a）に相当）を以下の手順により調製した。2.5 fmol/ml の（１）で取得したdegQ’1stF、及び実施例２（４）で取得したsfp2ndF、pps、pGETS109V-3rdFの各SfiI断片を0.5 mlずつと、２×Linear ligationバッファー（132 mM Tris-HCl(pH 7.6), 13.2 mM MgCl2, 20 mM Dithiothreithol, 0.2 mM ATP, 300 mM NaCl, 20 %(w/v) polyethylen glycol）2.5 mlを混合し、そこにT4 DNA Ligase (4 weiss unit/ml)を 0.5 ml添加して、37℃、30分間恒温することでライゲーションした。ライゲーション産物を、枯草菌BEST8824株とBEST8827株のコンピテント細胞培養液50 mlにそれぞれ添加して37℃、30分間恒温した。その後薬剤耐性遺伝子を発現させるために、LB培地200 mlを添加してから37℃、1時間培養後、3 mg/mlのネオマイシンを含むLB寒天培地に広げて、37℃で終夜培養した。BEST8824株からは、95株、BEST8827株からは、181株のネオマイシン耐性株が得られた。すべての株を10 mg/mlのテトラサイクリンを含むプレートと、3 mg/mlのネオマイシンを含むプレートと、50 mg/mlのスペクチノマイシンを含むプレートにレプリカし、挿入DNA中の集積ユニットが、共通配列の相同領域を利用してゲノムに導入されることで、cIリプレッサー遺伝子とスペクチノマイシン耐性遺伝子が消失し、かつ、ベクターpGETS109V-3rdFが残存しない場合に示す表現型である、ネオマイシン耐性、テトラサイクリン感受性、ネオマイシン感受性株をそれぞれ24株と58株を得た（図１０）。一般的に、これらの候補株の中にはcIリプレッサー遺伝子とスペクチノマイシン耐性遺伝子が自然に欠失した変異体が含まれるので、得られたネオマイシン耐性、テトラサイクリン感受性、ネオマイシン感受性株にpps遺伝子があるかどうかを、プライマーppsE-FとppsE-R（配列番号５３と５４）を用いたコロニーPCRによりスクリーニングし、BEST8824株の形質転換体から1株、BEST8827株の形質転換体から８株の陽性株を得た。これらの株からそれぞれ1株（それぞれBEST8830株とBEST8831株）を任意に選択し、ゲノムDNAをゲル中で調製した後、制限酵素I-PpoIで切断し、パルスフィールドゲル電気泳動により分析した結果、両株から約4４ kbの集積ユニットが確認された（図１１）。
【００７４】
（４）挿入ユニットの遺伝子発現の確認
　ゲノム中に集積した遺伝子が機能するかを確認するために、BEST8830株とBEST8831株を実施例３（５）と同様の方法により、LB培地で37℃、一晩前培養した後、ACS培地に植菌し、30℃で、5日間振とう培養後、培養液の酸性沈殿のメタノール抽出物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、量株ともプリパスタチンの生産が確認され、各単位DNAが機能していることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
　本発明によれば、土壌細バクテリアの一種である枯草菌等のコンピテント細胞形質転換法を用いて、複数のDNA断片を１度のライゲーション操作で連結したプラスミドを取得することができる。つまり、従来法では困難であった巨大DNAの増幅可能なＤＮＡ断片への連結集積が極めて簡便に行えることが示された。
　また、本発明の方法は、実施例２で示したように、単位DNAの長さの違い（最小0.3 kb 最大38kb）が大きくても全く問題なく集積が可能で、集積単位も50kb以上が可能であるため、単位DNAの大きさを全く考慮することなく任意に連結できるものである。哺乳動物（マウス、ヒトを含む）や植物等を含む真核生物の遺伝子は、10 kbを超える長いものが多いが、これらの遺伝子も単位DNAとして取り扱うことができる。
【００７６】
　また、実施例2で用いたプリパスタチン合成遺伝子をコードしているppsは、約3 kbおきに10個の繰り返しがある配列にもかかわらず、本発明の方法で作製された多重遺伝子集積プラスミドは、枯草菌内で安定に保持されかつ発現することも明らかになった。このような繰り返し配列は、哺乳動物（マウス、ヒトを含む）や植物等を含む真核生物において広く見られるが、本発明の方法は、繰り返し配列を有するDNA集積にも適用できる。
【００７７】
　即ち、本発明の方法あるいはそのゲノムＤＮＡに挿入ＤＮＡが挿入された微生物細胞により従来その遺伝子のサイズが大きいために、宿主細胞に組み込むことのできなかった有用物質等を人工的に効率良く産生させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】５種類の単位ＤＮＡと、それらからなる微生物形質転換用ＤＮＡ断片の構成、及び該ＤＮＡ断片により形質転換した微生物から取得されるプラスミドＤＮＡの構造を示す図である。
【図２】互いに重なり合う単位ＤＮＡを有する複数のＤＮＡ断片からなる微生物形質転換用ＤＮＡ断片の構成、及び該ＤＮＡ断片により形質転換した微生物から取得されるプラスミドＤＮＡの構造を示す図である。
【図３】形質転換体の持つプラスミドの分析結果を示すアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図４】プリパスタチンの生産に関与する３つの遺伝子のdegQ、sfp、ppsの各断片の末端の塩基塩基配列とこれらにより構築されるライブラリーの構造を示す図である。
【図５】形質転換体６株ずつから得られたプラスミドを制限酵素SfiIで切断した後にアガロースゲル電気泳動した結果を示す写真、およびdegQ、sfpをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。
【図６】ライブラリーの各プラスミドをもつ枯草菌のプリパスタチンの生産性を高速液体クロマトグラフィーで分析した結果を示すグラフである。
【図７】４種類の挿入DNAの構造とそれを組み込んだ宿主微生物のゲノム構造を示す図と得られたライブラリーのプリパスタチンの生産性の結果を示す図である。
【図８】３種類の単位DNAからなる挿入DNAのプラスミドを持つ微生物株のゲノム中に挿入ユニットを組み込む手順を示す図である。
【図９】挿入DNAユニットが宿主微生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたことを示す図である。
【図１０】挿入ユニットが多重に繰り返した高分子直鎖状DNAを、プラスミド構造を経由せずに微生物ゲノムに組み込むための手順を示す図である。２重交叉の組換え場所が、離れた挿入ユニット間の場合、冗長な領域間で2回目の組み換えが起きる。
【図１１】挿入DNAユニットが宿主微生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたことを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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