(57)【要約】【課題】簡易な構成によって、各処理工程における塵埃や細菌等による汚染を低減するとともに、効率的に生体組織補填体を製造する。【解決手段】培地供給口５と培地排出口４とを備えた培養容器２の内部に、その培養容器２内のスペースを培地供給口５に接続する内側スペース７と培地排出口４に接続する外側スペース６とに区画する筒状の多孔体からなる生体組織補填材３を封入してなり、前記培地供給口５の口径が、前記培地排出口４の口径より大きく形成されている生体組織補填体の製造装置１を提供する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地供給口と培地排出口とを備えた培養容器の内部に、該培養容器内のスペースを前記培地供給口に接続する内側スペースと前記培地排出口に接続する外側スペースとに区画する筒状の多孔体からなる生体組織補填材を封入してなり、
前記培地供給口の口径が、前記培地排出口の口径より大きく形成されている生体組織補填体の製造装置。
【請求項２】
前記培地供給口および／または培地排出口が、熱溶着可能な材質からなる請求項１に記載の生体組織補填体の製造装置。
【請求項３】
前記生体組織補填材が筒状に形成されたセラミックス多孔体からなる請求項１または請求項２に記載の生体組織補填体の製造装置。
【請求項４】
前記生体組織補填材が、顆粒状のセラミックス多孔体により構成され、該セラミックス多孔体を筒状に保持するフィルタ部材を備えている請求項１または請求項２に記載の生体組織補填体の製造装置。
【請求項５】
前記フィルタ部材が、二重管状に配置された焼結体からなる請求項４に記載の生体組織補填体の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、生体組織補填体の製造装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体組織補填体を製造するには、患者から抽出された骨髄液等の体液から培養すべき細胞を抽出する抽出工程、培養すべき細胞に適した培地を調製する培地調製工程、抽出された細胞を適当な培養容器内に培地とともに投入して所定の培養条件下に配する一次培養工程、一次培養された細胞を生体組織補填材と混合してさらに培養する二次培養工程等、複数の工程が順次行われる。
【０００３】
従来、この種の細胞の培養装置として、培地を半径方向に流動させながら細胞を培養する、ラジアルフローを利用した培養装置が提案されている。（例えば、特許文献１、２参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特開平０９−０００２４０号公報
【特許文献２】
特開２０００−２７０８３８号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの培養装置では、培地の流れが半径方向の外から内方に向かって流れるように構成されている。すなわち、培養装置の内部に培地を滞留させて局所的な細胞の付着を防止する必要から、流通面積の広い半径方向外方から流通面積の小さい半径方向内方へと流れるように構成するのが一般的であった。このため、細胞を付着させる担体の層の半径方向内側には細胞が付着しにくいという問題があった。
【０００６】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な構成によって、各処理工程における塵埃や細菌等による汚染を低減することができるとともに、内部にも細胞が入りやすく、かつ、内側から外側への細胞密度の勾配を軸方向に均一にすることができ、効率的に生体組織補填体を製造することができる生体組織補填体の製造装置を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、培地供給口と培地排出口とを備えた培養容器の内部に、該培養容器内のスペースを前記培地供給口に接続する内側スペースと前記培地排出口に接続する外側スペースとに区画する筒状の多孔体からなる生体組織補填材を封入してなり、培地供給口の口径が、培地排出口の口径より大きく形成されている生体組織補填体の製造装置を提供する。
【０００８】
この発明によれば、間葉系幹細胞等の細胞を培養容器内の生体組織補填材に付着させた状態で、培地供給口および培地排出口をそれぞれ外部に配されている培地供給管および培地排出管にそれぞれ接続することにより、培地供給口から供給した培地を培地排出口から排出させることが可能となる。
【０００９】
この場合において、培地供給口に接続する内側スペースと培地排出口に接続する外側スペースとが筒状の多孔体からなる生体組織補填材により区画されているので、内側スペースに供給された培地は生体組織補填材を半径方向外方に向けて通過させられた後に外側スペースおよびこれに接続する培地排出口から培養容器の外部に排出されることになる。
【００１０】
ここで、培地供給口の口径が培地排出口の口径より大きく形成されているので、培地供給口から供給された培地は、培養容器内部に一旦充填された後に培地排出口から排出されることになる。したがって、培地は、偏った部位において生体組織補填材を通過することなく、全周にわたってムラなく通過させられることになる。
【００１１】
その結果、培地を循環させることにより、生体組織補填材に付着した細胞に必要な栄養分等を供給しながら、生体組織補填材を足場として成長させることができ、効率的に生体組織補填体が製造されることになる。また、生体組織補填体が製造された後には、培地供給口および培地排出口を培地供給管および培地排出管から切断して封鎖し、生体組織補填体を培養容器内に密封状態に保持することが可能となる。
【００１２】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の生体組織補填体の製造装置において、前記培地供給口および／または培地排出口が熱溶着可能な材質により構成されている製造装置を提供する。
この発明によれば、培地供給口および培地排出口と、外部に配されている培地供給管および培地排出管との接続を熱溶着により無菌的に行うことが可能となり、接続作業を簡易にすることができる。
【００１３】
請求項３に係る発明は、請求項１または請求項２に記載の生体組織補填体の製造装置において、前記生体組織補填材が筒状に形成されたセラミックス多孔体からなる製造装置を提供する。
この発明によれば、生体組織補填材のみにより培養容器内部のスペースを区画することができる。したがって、簡易な構成により生体組織補填体を製造することが可能となる。
【００１４】
請求項４に係る発明は、請求項１または請求項２に記載の生体組織補填体の製造装置において、前記生体組織補填材が、顆粒状のセラミックス多孔体により構成され、そのセラミックス多孔体を筒状に保持するフィルタ部材を備えている製造装置を提供する。
この発明によれば、培地供給口から培養容器内の内側スペースに供給された培地は、フィルタ部材を通して、該フィルタ部材により筒状に保持されている顆粒状のセラミックス多孔体内を通過させられる。その後、再度フィルタ部材を通過して外側スペースに入り、培地排出口から外部に排出されることになる。したがって、顆粒状の生体組織補填材を足場にして細胞を成長させた生体組織補填体を製造することができる。
【００１５】
請求項５に係る発明は、請求項４に記載の生体組織補填体の製造装置において、前記フィルタ部材が、二重管状に配置された焼結体からなる製造装置を提供する。
この発明によれば、二重管状に配置された焼結体の間に顆粒状の生体組織補填材を配置することにより、該生体組織補填材が筒状に保持されるので、該生体組織補填材の各部位において均一に培地を流通させて効率的に生体組織補填体を製造することが可能となる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造装置について、図１から図４を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る製造装置１は、生体組織としての骨の欠損部に補填するための骨補填体を製造する製造装置である。
【００１７】
本実施形態に係る骨補填体の製造装置１は、図１および図２に示されるように、両端を閉塞された円筒状の培養容器２とその内部に封入された骨補填材３とから構成されている。培養容器２は、熱溶着可能な材質、例えば、塩化ビニルにより構成されており、その一端面２ａの中央および他端面２ｂの中央にそれぞれ培地排出口４および培地供給口５が一体的に設けられている。初期状態において培地排出口４および培地供給口５は先端を閉鎖されており、培養容器２内部は完全に滅菌されている。培地供給口５の口径は、培地排出口４の口径よりも大きく形成されている。
【００１８】
前記骨補填材３は、培養容器２の内径寸法よりも充分に小さい外径寸法と、培養容器２内部の高さ寸法と同等の高さ寸法とを有する円筒ブロック状に形成されている。材質は、例えば、βリン酸三カルシウム多孔体である。この骨補填材３は、培養容器２の内面に形成された位置決め突起２ｃによって培養容器２内部に位置決め状態に固定されている。そして、このようにして固定された骨補填材３は、その外周面と培養容器２の内周面との間に円管状の外側スペース６と、培養容器２中央の内側スペース７とを画定することができるようになっている。
【００１９】
前記培地排出口４には、前記外側スペース６に連通する複数の連通孔４ａが設けられている。
前記骨補填材３は、多数の連続気孔を備えており、外側スペース６と内側スペース７との間における培地の流通を可能にしている。
前記外側スペース６には、培養容器２に設けられた培地排出口４の連通孔４ａが接続されている。一方、前記内側スペース７には、培地供給口５が接続されている。
【００２０】
このように構成された本実施形態に係る製造装置１により骨補填体を製造するには、例えば、所定の細胞数にまで一次培養された間葉系幹細胞を封入状態に保持する熱溶着可能な管状部材８（図３参照）と前記培地供給口５とを無菌的チューブ接続方法により接続し、管状部材８内部の間葉系幹細胞を培養容器２内に圧力あるいは重力等により投入する。
【００２１】
無菌的チューブ接続方法とは、例えば、図３（ａ）に示すように、平行に配した管状部材８と培地供給口５とを、これらのせん断方向に移動する発熱板９によって、同時に溶融させながら切断した後に、同図（ｂ）に示すように、管状部材８と培地供給口５とが一致するようにずらし、その後、同図（ｃ）に示すように、発熱板９を除去することにより連結する手法をいう。連結部分は連結時には閉鎖されているが、外力により管壁どうしを連結させたまま内部流路を連通させることができるようになっている。すなわち、内部を無菌状態に保持したまま管状部材８と培地供給口５とを連結することができる。
【００２２】
このようにして間葉系幹細胞を培養容器２内に投入した後には、再度、無菌的チューブ接続方法により、培地供給口５と管状部材８とを切り離した後に、図４に示すように、培地供給管１０と培地供給口５とを無菌的に連結する。また、培地排出口４と培地排出管１１も無菌的チューブ接続方法により連結する。
【００２３】
前記培地供給管１０には、ポンプ１２を介して培地容器１３が接続されており、ポンプ１２の作動によって連続的に新たな培地を供給することができるようになっている。
培地としては、例えば、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）、抗生剤を所定の配合比率で混合したものである。また、成長因子、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を混合することにしてもよい。また、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤を混合することにしてもよい。
なお、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。
また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
【００２４】
また、培地排出管１１には、廃棄培地容器１４が接続されており、培地排出口４から排出された培地を貯留することができるようになっている。培地容器１３、ポンプ１２および培地供給管１０、並びに、培地排出管１１および廃棄培地容器１４内部も完全に滅菌処理されている。
【００２５】
この状態でポンプ１２を作動させることにより、培地容器１３内に貯留されている培地が、培地供給管１０および製造装置１の下面側に配置されている培地供給口５を介して培養容器２内の内側スペース７に供給される。培養容器２内に供給された培地は、内側スペース７内を満たすように貯留されていくとともに、円筒状の骨補填材３の内周面から半径方向外方に向けて浸透し、骨補填材３の全外周面からその周囲に円筒状に形成された外側スペース６に放出されて貯留されていく。外側スペース６には培地排出口４の連通孔４ａが接続されているので、培地は、連通孔４ａから培地排出口４および培地排出管１１を介して廃棄培地容器１４に排出されることになる。
【００２６】
この場合において、既に培養容器２内に投入されている間葉系幹細胞も供給された培地とともに、骨補填材３の内周面の各部位から骨補填材３の半径方向外方に浸透していき、そこで、骨補填材３を足場として、かつ、供給された培地から栄養分を受けて、増殖あるいは分化して骨形成作用を生じさせる。
【００２７】
このように、本実施形態に係る骨補填体の製造装置１によれば、熱溶着可能な培地供給口５と培地排出口４とを備えているので、内部を無菌状態に保持したまま、搬送し、培地供給・排出系に接続し、培養骨の製造後は、培地供給・排出系から無菌的に切り離して、培養骨を搬送することができる。
また、培地を流しながら細胞を培養することができるので、効率的に培養骨を製造することができる。
【００２８】
なお、この実施形態においては、生体組織として骨を例に挙げ、骨髄液から抽出して培養した間葉系幹細胞を培養する場合について説明したが、骨髄液のみならず末梢血や臍帯血から抽出することにしてもよい。また、間葉系幹細胞に限定されるものではなく、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の体細胞の培養にも使用できる。
【００２９】
また、骨補填材３として、βリン酸三カルシウム多孔体を例に挙げて説明したが、これに代えて、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。
【００３０】
また、培養容器２、培地供給口５および培地排出口４を塩化ビニルにより製造することとしたが、これに代えて、熱溶着可能な材質であれば、他の任意の材料により構成してもよい。また、培養容器２を構成する材料と培地供給口５、培地排出口４を構成する材料とを異ならせてもよい。
【００３１】
また、図５および図６に示されるように、骨補填材を構成することにしてもよい。すなわち、この変形例では、二重円管状に形成されたフィルタ部材１５，１６の間に、顆粒状のセラミックス多孔体からなる骨補填材１７が保持されている。これにより、骨補填材１７は、培養容器２内のスペースを外側スペース６と内側スペース７とに区画する円筒状に形成されている。
【００３２】
フィルタ部材１５，１６は、例えば金属製の焼結体により構成されている。焼結体は、顆粒状のセラミックス多孔体からなる骨補填材１７の通過を阻止し、細胞および培地の流通を可能とする程度の大きさの貫通穴（図示略）を有している。このように構成された骨補填体の製造装置においても、二重円管状のフィルタ部材１５，１６およびその間に保持されている骨補填材１７に培地を透過させながら骨補填材１７に捕獲した間葉系幹細胞を、骨補填材１７を足場として成長させることができる。
【００３３】
なお、上記フィルタ部材１５，１６としては金属製の焼結体に代えて、他の材質からなるメッシュ部材を採用してもよい。また、骨補填材１７の外周および内周に二重管状のフィルタ部材１５，１６間に電位差を加えることにより、骨補填材１７内部への細胞の浸透を促進することにしてもよい。
また、二重管状のフィルタ部材１５，１６に代えて、コイル状のフィルタ部材（図示略）を配置することにしてもよい。
【００３４】
また、上記実施形態においては骨補填材３，１７の形状を円筒状に形成することとしたが、これに代えて、外面を直方体状に形成し、中央に穴を形成することにしてもよい。また、外面を錐状に形成することにしてもよい。さらに、複数に区分された骨補填材のブロックを組み合わせて、全体として筒状に形成されるようにしてもよい。
【００３５】
また、上記実施形態においては、培地供給口５を培養容器２の下面に配し、培地排出口４を培養容器２の上面に配して、培地が、下から上に流通する例を示したが、これに代えて、上から下に流通させることにしてもよい。この場合には、ポンプ１２を不要とすることができ、装置の構成を簡略化することができる。また、上記培養容器２を横向きに設置して、培地が横方向に流れるように構成してもよい。
【００３６】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明によれば、生体組織補填材の搬送、生体組織補填材を足場とする細胞の培養、培養後に製造された生体組織補填体の搬送の全てを、無菌状態に保持したまま行うことができるという効果を奏する。また、培地を流通させながら細胞を培養することができるので、効率的に生体組織補填体を製造することができる。この場合において、培地供給口の口径を培地排出口の口径より大きく形成しているので、培地は、筒状の生体組織補填材を全周にわたって均等に透過させられ、均質な生体組織補填体を製造することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造装置を示す縦断面図である。
【図２】図１の製造装置を示す横断面図である。
【図３】図１の製造装置の培地供給口および培地排出口を外部の培地供給管および培地排出管に接続する際に用いられる無菌的チューブ接続方法を説明する図である。
【図４】図１の製造装置を用いた生体組織補填体の製造方法を説明する模式図である。
【図５】図１の製造装置の変形例を示す縦断面図である。
【図６】図５の製造装置を示す横断面図である。
【符号の説明】
１　製造装置
２　培養容器
３　骨補填材（生体組織補填材）
４　培地排出口
４ａ　連通孔（培地排出口）
５　培地供給口
６　外側スペース
７　内側スペース
１５，１６　フィルタ部材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2004121167.tif 000007
【図６】
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