(57)【要約】【課題】細胞や組織を培養するために有用な細胞付着剤を提供する。【解決手段】アイヌワカメ（Ａｌａｒｉａ  ｐｒａｅｌｏｎｇａ  Ｋｊｅｌｌｍａｎ）又はガッカラコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｃｏｒｉａｃｅａ  Ｍｉｙａｂｅ）に由来するラミナランを有効成分とする細胞付着剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラミナランを有効成分とする細胞付着促進剤。
【請求項２】
ラミナランが、アイヌワカメに由来する、請求項１に記載の細胞付着促進剤。
【請求項３】
ラミナランが、ガッカラコンブに由来する、請求項１に記載の細胞付着促進剤。
【請求項４】
細胞が、ヒト皮膚線維芽細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞付着促進剤。
【請求項５】
細胞が、ヒト骨芽細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞付着促進剤。
【請求項６】
細胞が、ヒト歯肉維芽細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞付着促進剤。
【請求項７】
ラミナランを有効成分とする細胞増殖促進剤。
【請求項８】
ラミナランが、アイヌワカメに由来する、請求項７に記載の細胞増殖促進剤。
【請求項９】
ラミナランが、ガッカラコンブに由来する、請求項７に記載の細胞増殖促進剤。
【請求項１０】
細胞が、ヒト骨芽細胞である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の細胞増殖促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラミナランを有効成分とする細胞付着剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
北海道東部では、アイヌワカメ、スジメ、カレキグサ、ヒバマタ等の海藻が天然に生育し、大量に採取可能であるが、食用に適さないこと等から、資源としては活用されていなかった。そのうえ、昆布等の食用海藻繁茂の妨げとなるため、その多くは駆除、廃棄処分されている。
【０００３】
褐藻中には、フコイダン、アルギン酸及びラミナランのような有用成分が含まれていることが知られている。ラミナランは、褐藻中に存在する貯蔵多糖であり、β１−３結合を主としβ１−６結合を含むことがあるグルカンであり、冷水に不溶なものと可溶なものとの２種類が知られている。前者は、枝分かれが少なく、後者は、枝分かれが多い。
【０００４】
ラミナラン及びその誘導体は、ウイルス抑制作用、免疫調整作用、腸内微生物（善玉菌）の活性化、抗アレルギー作用等の生理活性を有していることが近年見出されており、健康食品等への用途が検討されている。また、線維芽細胞や表皮角化細胞に対する細胞増殖促進作用も知られている（特許文献１）。
【０００５】
そこで、本発明者らは、皮膚の保護や処置、又は骨等の再生における有用性を検討するために、ラミナランの細胞の付着促進作用を測定したところ、驚くべきことに、海藻に由来するラミナランが、従来用いられてきたウシ胎児血清を凌ぐ細胞付着促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
【特許文献１】
特表平１０−５００１２６号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
細胞や組織を培養するために有用な細胞付着剤を提供する。
具体的には、ラミナランを有効成分とする細胞付着剤を提供する。また、ラミナランは、アイヌワカメ（Ａｌａｒｉａ  ｐｒａｅｌｏｎｇａ  Ｋｊｅｌｌｍａｎ）又はガッカラコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｃｏｒｉａｃｅａ    Ｍｉｙａｂｅ）に由来するラミナランが好ましい。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明で用いる海藻としては、褐藻類の海藻が好ましく、特にアイヌワカメ又はガッカラコンブが好ましい。これらの海藻は、そのままでも用いられるが、水洗し汚れを除き、乾燥した後、スライス状に裁断したもの又は粉砕した乾燥粉末として用いるのが好ましい。
【０００９】
上記海藻からラミナランを含む多糖類を抽出する方法は特に限定されないが、一般的には水系の溶媒を用いて抽出される。中でも、熱水による抽出、酸性の水による抽出が好ましく用いられる。抽出後、ろ過あるいは遠心分離などにより海藻残さを除去することが好ましい。
【００１０】
上記抽出物から目的とするラミナランを精製する方法は特に限定されないが、透析法、限外ろ過法、イオン交換樹脂法が好ましく用いられる。特に好ましくはイオン交換樹脂法である。イオン交換樹脂による精製は、該樹脂をカラムに充填しても、バッチ方式で行ってもよいが、カラムに充填する方法が好ましく用いられる。
【００１１】
本発明の細胞付着剤は、従来用いられてきたウシ胎児血清の代替物として培養液に添加することができる。培養液への添加量は、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｍｌである。また、本発明の細胞付着剤は、損傷を受けた部位へ投与して、組織修復を促進するために用いることができる。また、本発明の細胞付着剤は、経口投与によって皮膚や骨の代謝、修復又は再生を促進するために用いることができる。好ましい細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト骨芽細胞又はヒト歯肉線維芽細胞である。さらに、本発明の細胞付着剤は、再生医療分野における細胞の足場に添加し、組織の構築を促進するために用いることができる。
【００１２】
【実施例】
アイヌワカメからのラミナランの粗抽出
８５％メタノールに生アイヌワカメを加え、３時間沸騰させ、脱脂、脱色を行った。着色した液を新しい８５％メタノールと交換し、同様の操作を３回繰り返した。液を除去後、脱色したアイヌワカメにアセトンを加え、室温で１時間静置した。液を除去後、アイヌワカメを風乾した。この乾燥アイヌワカメ２２３ｇを市販ミキサーで細かく粉砕し、０．０９Ｎ希塩酸に加え、室温で一晩静置した。海藻残さをガーゼとろ紙でこし取り、粘調なラミナラン粗抽出物液を得た。残さを再度０．０９Ｎ希塩酸で抽出し、先に抽出したラミナラン粗抽出物液と合わせた。ラミナラン粗抽出物液を、水酸化ナトリウム水溶液で中和し、分画分子量１０００のセルロースアセテート透析膜を用いて脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥した。得られたラミナラン粗抽出物の乾燥重量は７９６ｍｇであった。
【００１３】
アイヌワカメからのラミナランの精製
ラミナラン粗抽出物の凍結乾燥品５２９ｍｇをミリＱ水に溶解し、アニオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。精製条件を以下に示す。
カラムサイズ：内径２６ｍｍ、長さ３００ｍｍ
カラム充填剤：ＥＣＴＥＯＬＡ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅアニオン交換樹脂
溶媒：ミリＱ水
流速：１．０ｍｌ／分
温度：２３℃
不純物多糖であるアルギン酸やフコイダンは酸性多糖なので、アニオン交換樹脂に吸着する。一方、中性糖のラミナランはアニオン交換樹脂に吸着しないため、そのまま溶出する。最初の２００ｍｌにラミナランは全て溶出した。この溶出液をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥した。
【００１４】
得られた精製ラミナランの分析
得られた精製ラミナランの乾燥重量は２２５ｍｇであり、上記精製方法による精製ラミナランの収率はラミナラン粗抽出物に対して４２．５％であった。精製ラミナランの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルはシグマ社のラミナランと同一であった。不純物のピークは見られなかった。
【００１５】
細胞付着アッセイ（ＭＴＳアッセイ）
医学における皮膚の処置及び骨の再生へのラミナランの適用を検討すべく、ＭＴＳアッセイを行った。
【００１６】
培養細胞として、ヒト皮膚線維芽細胞（細胞株ＳＹ４ＴＫ）、ヒト骨芽細胞（細胞株ｈｏｓｔ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、ヒト歯肉線維芽細胞（ボランティア（男子２０歳）から得た歯肉弁を初代培養した。培養条件：１０％ＦＢＳ（ギブコ）含有、ダルベッコ改変イーグルＭＥＭ（ＤＭＥＭ；日水製薬）にて継代培養し、５〜９代の細胞を実験に供した。）を用いた。
【００１７】
培地の調製
１）陽性対照：  １０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ
２）陰性対照：  ０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ
３）市販ラミナラン：  陰性対照に市販ラミナランを１ｍｇ／ｍｌで添加
４）アイヌワカメ：  陰性対照にアイヌワカメ由来精製ラミナランを１ｍｇ／ｍｌで添加
５）ＦＢＳ不含：  ＦＢＳ不含ＤＭＥＭ
【００１８】
細菌用プレート（Ｎｕｎｃ社製；９６ウェル）に１００μｌの試験培地を添加して、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＰＢＳでウェルをリンスし、ＢＳＡ培地で１時間ブロッキングした後、さらにＰＢＳでリンスした。対数増殖期の細胞懸濁液（１×１０４個／ｍｌ、１００μｌ）をウェルに加え、２．５時間インキュベートした。培地とともに未付着の細胞を除き、ＤＭＥＭ（フェノールレッド不含）１００μｌを加え、さらに、ＭＴＳ溶液（２ｍｇ／ｍｌＭＴＳ：０．９２ｍｇ／ｍｌＰＭＳ＝２０：１）を２５μｌ加えた。プレートを２２５分間インキュベートして、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【００１９】
ヒト皮膚線維芽細胞及びヒト骨芽細胞の付着活性は、アイヌワカメ由来のラミナランが最も高かった。陽性対照として用いた１０％ＦＢＳ及び比較例として用いたラミナリア由来ラミナランに比べて有意に高い吸光度を示した。ヒト歯肉線維芽細胞の付着活性は、陽性対照として用いた１０％ＦＢＳが最も高かったものの、アイヌワカメ由来のラミナランは、比較例として用いたラミナリア由来ラミナランに比べて有意に高い吸光度を示した（図１〜３）。
【００２０】
上記と同様な方法によって、下記の試料について細胞付着活性を測定した。
４）アイヌワカメ：  陰性対照にアイヌワカメ由来精製ラミナランを１０ｍｇ／ｍｌで添加
１）ＦＢＳ不含：  ＦＢＳ不含ＤＭＥＭ
２）陰性対照：  １．０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ
３）陽性対照：  １０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ
４）ガッカラコンブ由来ラミナラン（純度７０．７％、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）
５）ガッカラコンブ由来海藻エキス：水溶性多糖含有物（純度３３．５％、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）
６）アイヌワカメ由来ラミナラン（純度６０．２％、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）
７）アイヌワカメ由来海藻エキス：水溶性多糖含有物（純度２９．４％、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）
【００２１】
実験結果を図４及び５に示した。ラミナランは海藻エキスより高い付着応答を示し、陽性対象をしのぐ活性が得られた。ラミナランには、ヒト骨芽細胞の付着促進効果があり、その活性は、フコダインやアルギン酸などの水溶性多糖より高いことが示唆された。
【００２２】
次に、各試料に対する細胞増殖活性試験を行った。細胞増殖は、細胞の分化過程において、付着の次に起こると考えられる段階である。ここでは、ラミナランの細胞増殖能力の検討、さらには高純度ラミナランと海藻エキス（水溶性多糖含有物質：低濃度のラミナラン）との細胞増殖活性の比較を目的とした。
【００２３】
細菌用プレート（Ｎｕｎｃ社製；９６ウェル）の各ウェルに対数増殖期の細胞懸濁液（１×１０４個／ｍｌ、１００μｌ）加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。培地をＦＢＳ不含ＤＭＥＭに交換し（１００μｌ／ｍｌ）、さらに２４時間培養した。培地を１００μｌ／ウェルの試料培地に交換し、所定時間（２４、４８及び７２時間）培養した。培地とともに未付着の細胞を除き、各ウェルに、ＤＭＥＭ（フェノールレッド不含）１００μｌを加え、さらに、ＭＴＳ溶液（２ｍｇ／ｍｌＭＴＳ：０．９２ｍｇ／ｍｌＰＭＳ＝２０：１）を２５μｌ加えた。プレートを７５分間インキュベートして、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【００２４】
実験結果を図６及び７に示した。ラミナランは海藻エキスより高い増殖応答を示し、陽性対象とほぼ同様の活性が得られた。ラミナランには、ヒト骨芽細胞の増殖促進効果があり、その活性は、フコダインやアルギン酸などの水溶性多糖より高いことが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト皮膚線維芽細胞の付着活性。各サンプルを含むＤＭＥＭでコートした細菌用プレート上で２．５時間インキュベーションし、次にＭＴＳアッセイによって付着細胞を測定した。Ａｌａｒｉａ  ｐｒａｅｌｏｎｇａ；０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ及びアイヌワカメ（Ａｌａｒｉａ  ｐｒａｅｌｏｎｇａ）由来の１ｍｇ／ｍｌラミナランでコートした、市販のラミナリア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ）；０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ及び市販のラミナリア由来の１ｍｇ／ｍｌラミナランでコートした、０．５％ＦＢＳ又はＢＳＡ；陰性コントロールとしての０．５％ウシ胎児血清又は１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ；陽性コントロールとしての１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ。
【図２】ヒト骨芽細胞の付着活性。各サンプルを含むＤＭＥＭでコートした細菌用プレート上で２．５時間インキュベーションし、次にＭＴＳアッセイによって付着細胞を測定した。Ａｌａｒｉａ  ｐｒａｅｌｏｎｇａ；０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ及びアイヌワカメ（Ａｌａｒｉａ  ｐｒａｅｌｏｎｇａ）由来の１ｍｇ／ｍｌラミナランでコートした、市販のラミナリア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ）；０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ及び市販のラミナリア由来の１ｍｇ／ｍｌラミナランでコートした、０．５％ＦＢＳ又はＢＳＡ；陰性コントロールとしての０．５％ウシ胎児血清又は１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ；陽性コントロールとしての１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ。
【図３】ヒト歯肉線維芽細胞の付着活性。各サンプルを含むＤＭＥＭでコートした細菌用プレート上で２．５時間インキュベーションし、次にＭＴＳアッセイによって付着細胞を測定した。Ａｌａｒｉａ  ｐｒａｅｌｏｎｇａ；０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ及びアイヌワカメ（Ａｌａｒｉａ  ｐｒａｅｌｏｎｇａ）由来の１ｍｇ／ｍｌラミナランでコートした、市販のラミナリア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ）；０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ及び市販のラミナリア由来の１ｍｇ／ｍｌラミナランでコートした、０．５％ＦＢＳ又はＢＳＡ；陰性コントロールとしての０．５％ウシ胎児血清又は１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ；陽性コントロールとしての１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ。
【図４】ガッカラコンブ由来海藻エキス及びガッカラコンブ由来ラミナランのヒト骨芽細胞の付着活性への効果を示す。
【図５】アイヌワカメ由来海藻エキス及びアイヌワカメ由来ラミナランによるヒト骨芽細胞の付着活性への効果を示す。
【図６】ガッカラコンブ由来海藻エキス及びガッカラコンブ由来ラミナランによるヒト骨芽細胞の増殖活性への効果を示す。
【図７】アイヌワカメ由来海藻エキス及びアイヌワカメ由来ラミナランによるヒト骨芽細胞の増殖活性への効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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