(57)【要約】【課題】生体内中のリン酸またはリン酸基を含む化合物の濃度を蛍光の測定により簡便に定量する方法を提供すること。【解決手段】一般式（Ｉ）Ｌｎ−Ｓ−Ｎ　　　（Ｉ）（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）で表される蛍光性物質とランタノド金属イオンとの錯体が発する蛍光を測定してリン酸またはリン酸基を含む化合物の濃度を測定する方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ　　　（Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）
で表される蛍光性物質とランタノイド金属イオンとの錯体が発する蛍光を測定してリン酸の濃度を測定する方法。
【請求項２】
一般式（Ｉ）
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ　　　（Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）
で表される蛍光性物質とランタノイド金属イオンとの錯体が発する蛍光を測定してリン酸基を含む化合物の濃度を測定する方法。
【請求項３】
一般式（Ｉ）
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ　　　（Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）
で表される蛍光性物質、ランタノイド金属イオンおよび試料を接触せしめ、該蛍光性物質とランタノイド金属イオンとの錯体が発する蛍光強度の減少量を測定して試料中のリン酸またはリン酸基を含む化合物の濃度を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内中のリン酸またはリン酸基を含む化合物の濃度を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リン酸エステルは天然に多く存在し、リン酸基は生体反応において重要な役割を担っている。糖類のリン酸エステルやヌクレオチドなどのリン酸結合は生体代謝過程で高エネルギーを生み出す。また、タンパク質の活性調節はリン酸化により行われているものが多い。従って、生体内におけるリン酸およびリン酸基を含む化合物の量を測定することは、生体内の状態を把握する上で非常に重要である。
【０００３】
生体内中の種々の物質を定量するための簡便な方法として、測定対象物質の濃度に依存した蛍光を利用する方法がある。カルシウムイオンや塩素イオンには、その存在により蛍光を発する種々の指示薬が知られており、これらの蛍光強度を測定することで生体内の濃度を簡便に定量することが可能である。しかしながら、リン酸およびリン酸基を含む化合物については、これまで良好な蛍光指示薬の存在が知られていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、生体内中のリン酸またはリン酸基を含む化合物の濃度を蛍光の測定により簡便に定量する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、特定のキレート構造を有する蛍光性物質を選択すると、試料中のリン酸またはリン酸基を含む化合物の濃度に依存して蛍光強度が変化することが判明した。この現象を利用することで、生体内のリン酸またはリン酸基を含む化合物の濃度を簡便に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）一般式（Ｉ）
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ　　　（Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）
で表される蛍光性物質とランタノイド金属イオンとの錯体が発する蛍光を測定してリン酸の濃度を測定する方法。
（２）一般式（Ｉ）
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ　　　（Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）
で表される蛍光性物質とランタノイド金属イオンとの錯体が発する蛍光を測定してリン酸基を含む化合物の濃度を測定する方法。
（３）一般式（Ｉ）
Ｌｎ−Ｓ−Ｎ　　　（Ｉ）
（式中、Ｌｎは４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Ｓはスペーサー分子を、Ｎはヌクレオチドをそれぞれ示す）
で表される蛍光性物質、ランタノイド金属イオンおよび試料を接触せしめ、該蛍光性物質とランタノイド金属イオンとの錯体が発する蛍光強度の減少量を測定して試料中のリン酸またはリン酸基を含む化合物の濃度を測定する方法。
【０００７】
本発明において「蛍光性物質」とは、金属イオンに配位して錯体となったときに錯体由来の蛍光を発することのできる化合物をいう。
【０００８】
本発明において「誘導体」とは、基本構造に官能基等の化合物を置換もしくは付加せしめるよう合成されたものを意味する。より具体的には４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニル〔４，４’−ｂｉｓ（１”，　１”，　１”，　２”，　２”，　３”，　３”−ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｏ−４”，　６”−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｎ−６”−ｙｌ）−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏ−ο−ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ；以下ＢＨＨＣＴとも略す〕の誘導体としては、４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）テルフェニルや４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ｐ−テルフェニル等が挙げられる。
【０００９】
本発明において「スペーサー分子」とは、一般式（Ｉ）で表される蛍光性物質においてＬｎ、すなわち、４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，　２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体、およびＮ、すなわちヌクレオチドの両者に結合可能であり、当該結合によりそれらをつなぐことができる二価の基であれば特に限定されない。好適なスペーサー分子として、炭素と炭素の間に７以下のアミド結合を有していてもよい炭素数５以上２５以下の二価の脂肪族炭化水素基が挙げられる。さらに具体的には、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−（ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ）２−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）５−ＮＨ−等が挙げられる。
【００１０】
本発明の蛍光性物質を構成するヌクレオチドとしては、種々のデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ）、種々のリボヌクレオチド（ｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＴＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ）およびそれらの誘導体が挙げられる。ここで、誘導体とは、基本構造に官能基等の化合物を置換もしくは付加せしめるよう合成されたものを意味し、具体的にはｄＩＴＰ、ＩＴＰ、７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ等が挙げられる。
【００１１】
本発明で使用可能なランタノイド金属イオンとしては、ユウロピウム、サマリウム、テルビウム、ジスプロシウム等が挙げられる。一般的には塩化物の形で使用されるが、測定に支障のない範囲で他の塩類の形態として使用することができる。本発明においてはこれらのランタノイド金属イオンを単独で、もしくは複数種混合して使用することができる。
【００１２】
本発明の蛍光性物質とランタノイド金属イオンとの錯体が発する蛍光を測定する方法としては、生体から抽出した試料を試験管中にて蛍光性物質およびランタノイド金属イオンと混合し、蛍光光度計にて溶液の蛍光を測定する方法が利用できる。また、生体中に蛍光性物質とランタノイド金属イオンとを直接取り込ませ、共焦点蛍光顕微鏡等を用いて蛍光を測定する方法も利用できる。
【００１３】
本発明の測定方法において、使用する蛍光性物質とランタノイド金属イオンとの比（ランタノイド金属イオン／蛍光性物質）は、通常１／１０〜５０００、好ましくは１／４〜５００、より好ましくは１／２〜５０である。蛍光性物質が多すぎると測定可能範囲が狭くなるので好ましくなく、また少なすぎると測定感度が低くなるので好ましくない。また、蛍光性物質の使用量は、通常１０−８〜１０−３Ｍ、好ましくは１０−７〜１０−４Ｍ、より好ましくは１０−６〜１０−５Ｍであり、ランタノイド金属イオンの使用量は、通常１０−９〜１０−２Ｍ、好ましくは１０−８〜１０−３Ｍ、より好ましくは１０−７〜１０−４Ｍである。
【００１４】
測定にあたっては、まず検量線作成のためリン酸またはリン酸基を含む化合物の既知濃度の系列試料を作製する。蛍光性物質とランタノイド金属イオンとを混合した測定用試液に、検量線作成用試料をそれぞれ混合し、蛍光光度計などによりそれぞれの蛍光強度を測定する。得られた蛍光強度を試料中のリン酸またはリン酸基を含む化合物の濃度に対してプロットし、検量線を作成する。次に、測定用試料を測定用試薬と混合し、蛍光強度を測定する。得られた蛍光強度から検量線をもとにして試料中のリン酸またはリン酸基を含む化合物の濃度を求める。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例にて具体的且つ詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
以下の実施例において、ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰとはＢＨＨＣＴが、炭素と窒素の合計の原子数が１１のスペーサー分子を介してｄＵＴＰと結合している蛍光性物質を意味し、特開２００１−２４７８５７号公報に従って合成した。
また、ＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰとはＢＨＨＣＴが、炭素と窒素の合計の原子数が４のスペーサー分子を介してｄＵＴＰと結合している蛍光性物質を意味し、以下に示す方法により合成した。
【００１６】
（１）ＢＨＨＣＴの合成
特開平９−２４１２３３号公報に従いＢＨＨＣＴを合成した。ｏ−テルフェニル２．６３ｇからＢＨＨＣＴ６．５ｇを得た。
【００１７】
（２）Ｈｇ−ｄＵＴＰの合成
ｄＵＴＰ−ナトリウム塩３００ｍｇを０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．０）６０ｍｌに溶解した。酢酸水銀８５１．９ｍｇを加え、５０〜５５℃で４時間攪拌した。反応液を冷却した後、塩化リチウム２０３．９８ｍｇを加え、生成した塩化水銀を除くために反応液を酢酸エチルで洗浄し、５倍量のエタノールを加え−２０℃で結晶を析出させた。この結晶を減圧濾過し、室温で減圧乾燥してＨｇ−ｄＵＴＰの白色結晶４０２．９ｍｇを得た。
【００１８】
（３）アリルアミン−ｄＵＴＰの合成
０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ＝５．０）で２０ｍＭに調製したＨｇ−ｄＵＴＰ１８．５ｍｌに水２．７ｍｌ中のテトラクロロパラジウム（ＩＩ）酸カリウム１２１．１７ｍｇを加え、次いで２Ｍアリルアミン水溶液（ｐＨ＝７．０）２．２２ｍｌを加え室温で２４時間攪拌した。この反応液を濾過して黒色固形のパラジウムを除去し、濾液をそのままカラムクロマト（ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−２５；酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ＝８．５）の０．１−０．６Ｍグラジエント）にかけ、精製した。精製されている画分を合わせて５倍量のエタノールを加え、−２０℃で結晶を析出させた。この結晶を減圧濾過し、室温で減圧乾燥してアリルアミン−ｄＵＴＰの白色結晶５９．９ｍｇを得た。
【００１９】
（４）ＮＨＳ−ＢＨＨＣＴの合成
ＴＨＦ５０ｍｌ中にＢＨＨＣＴ１．７ｇおよびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）０．２１ｇを溶解した。この溶液にＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）０．３８ｇを添加し、次いでトリエチルアミン０．２ｇを滴下し、室温で１時間攪拌した。この反応液を処理し、シリカゲルカラムにかけ精製し、ＮＨＳ−ＢＨＨＣＴの黄色粘性液体０．５ｇを得た。
【００２０】
（５）ＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰの合成
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ＝８．５）２０ｍｌ中にアリルアミン−ｄＵＴＰ６０ｍｇを溶解した。この溶液にＤＭＦ２ｍｌに溶解したＮＨＳ−ＢＨＨＣＴ１０１ｍｇを滴下し、室温で４時間攪拌した。この反応液に５倍量のエタノールを加え、−２０℃で２４時間放置し結晶を析出させた。この結晶を減圧濾過し、室温で減圧乾燥してＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰの薄黄色結晶４６ｍｇを得た。また、減圧濾過後の濾液を濃縮し、エタノールを加え、２次晶１７９．３ｍｇを得た。
【００２１】
実施例１
（１）測定用試液の調製
リン酸濃度測定用試液として、２種類の試液（Ａ・Ｂ）を調製した。
Ａ：　４μＭ　ＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰ、０．１ｍＭ　ＥｕＣｌ３、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍｇ／ｍｌ　Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００
Ｂ：　４μＭ　ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ、０．０１ｍＭ　ＥｕＣｌ３、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍｇ／ｍｌ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００
【００２２】
（２）検量線作成用試料の調製
検量線作成用試料として、濃度の異なる４種類（０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ）のリン酸水溶液を調製した。
【００２３】
（３）蛍光測定および検量線の作成
試液５０μｌに検量線作成用試料を５０μｌ添加混合した。この混合液の蛍光強度を遮光保存３０分間経過後に、蛍光光度計（大日本製薬　フルオロスキャンＩＩ）で、励起波長３１５ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍの条件にて測定した。Ａ・Ｂそれぞれについて、蛍光強度をリン酸濃度に対してプロットし、検量線を作成した（図１）。
【００２４】
（４）試料中のリン酸濃度の測定
試液Ａ・Ｂそれぞれ５０μｌに濃度既知（１．０×１０−４Ｍ）の同じリン酸含有溶液を５０μｌずつ添加混合した。このそれぞれの混合液の蛍光強度を遮光保存３０分間経過後に、蛍光光度計（大日本製薬　フルオロスキャンＩＩ）で、励起波長３１５ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍの条件にて測定した。試液Ａによる蛍光強度は９２、試液Ｂによる蛍光強度は２６６であった。それぞれの検量線から試料中のリン酸濃度はともに１．０×１０−４Ｍと求められ、既知濃度に一致した。
【００２５】
実施例２
（１）測定用試液の調製
リン酸基を含む化合物の濃度測定用試液として、次の試液を調製した。
８μＭ　ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ、０．０１ｍＭ　ＥｕＣｌ３、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍｇ／ｍｌ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００
【００２６】
（２）検量線作成用試料の調製
検量線作成用試料として、２４濃度水準のｄＵＴＰ溶液、８濃度水準の一本鎖オリゴＤＮＡ（２７ｍｅｒ）溶液、８濃度水準の二本鎖ＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した。
【００２７】
（３）蛍光測定および検量線の作成
試液５０μｌに検量線作成用試料を５０μｌ添加混合した。この混合液の蛍光強度を遮光保存３０分間経過後に、蛍光光度計（大日本製薬　フルオロスキャンＩＩ）で、励起波長３１５ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍの条件にて測定した。それぞれについて、蛍光強度をリン酸基を含む化合物の濃度に対してプロットし、検量線を作成した（図２）。
【００２８】
（４）試料中のリン酸基を含む化合物濃度の測定
それぞれ濃度既知のｄＵＴＰ含有溶液（５．０×１０−５Ｍ）、一本鎖オリゴＤＮＡ（２７ｍｅｒ）含有溶液（６．０×１０−７Ｍ）、二本鎖ＤＮＡ含有溶液（１．２×１０−３ｍｇ／ｍｌ）の５０μｌを別々にそれぞれ試液５０μｌに添加混合した。このそれぞれの混合液の蛍光強度を遮光保存３０分間経過後に、蛍光光度計（大日本製薬　フルオロスキャンＩＩ）で、励起波長３１５ｎｍ、蛍光波長６１２ｎｍの条件にて測定した。ｄＵＴＰ含有溶液の蛍光強度は１０５６、一本鎖オリゴＤＮＡ（２７ｍｅｒ）含有溶液の蛍光強度は６２７、二本鎖ＤＮＡ含有溶液の蛍光強度は４５１であった。それぞれの検量線から試料中の濃度はｄＵＴＰ含有溶液が５．０×１０−５Ｍ、一本鎖オリゴＤＮＡ（２７ｍｅｒ）含有溶液が６．０×１０−７Ｍ、二本鎖ＤＮＡ含有溶液が１．２×１０−３ｍｇ／ｍｌとそれぞれ求められ、既知濃度に一致した。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の方法を利用することにより、生体内中のリン酸およびリン酸基を含む化合物の濃度の測定が簡便になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡおよびＢは本発明の方法により、リン酸濃度測定用の検量線を作成したものである。Ａは試液（終濃度の２倍濃度液）として、４μＭ　ＢＨＨＣＴ−４−ｄＵＴＰ、０．１ｍＭ　ＥｕＣｌ３、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍｇ／ｍｌ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を用いた場合、Ｂは試液として、４μＭ　ＢＨＨＣＴ−１１−ｄＵＴＰ、０．０１ｍＭ　ＥｕＣｌ３、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍｇ／ｍｌ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を用いた場合である。
【図２】Ａ〜Ｃは本発明の方法により、リン酸基を含む化合物の濃度測定用の検量線を作成したものである。ＡはｄＵＴＰ濃度を測定する場合の検量線、Ｂは一本鎖オリゴＤＮＡ濃度を測定する場合の検量線、Ｃは二本鎖ＤＮＡ濃度を測定する場合の検量線である。
【図１】
2004132795.tif 000002
【図２】
2004132795.tif 000003