(57)【要約】【課題】　蛍光トランスジーンを有し、その全身の骨格筋において蛍光タンパク質を発現する、新規なゴールデンゼブラフィッシュの提供。【解決手段】　（１）ゴールデンゼブラフィッシュのα−アクチン遺伝子プロモーター；（２）蛍光遺伝子；（３）アデノ関連ウイルスのインバーテッド末端リピート(ITR)；及び（４）pUCから得たベース部分を含む遺伝子断片の使用による、赤色の蛍光を放射する骨格筋を有するゴールデンゼブラフィッシュの新種を提供すること。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　（１）ゴールデンゼブラフィッシュのα−アクチン遺伝子プロモーター；（２）蛍光遺伝子；（３）アデノ関連ウイルスのインバーテッド末端リピート(ITR)；及び（４）pUCから得たベース部分を含む遺伝子断片。
【請求項２】
　以下のもの：
【化１】
2004129649.tif 000004
または
【化２】
2004129649.tif 000005
である請求項１に記載の断片。
【請求項３】
　（ａ）上流から下流に、ITR、CMVプロモーター、蛍光遺伝子、S40 polyA及びITRを含むプラスミドを構築する工程；
（ｂ）ゴールデンゼブラフィッシュのα−アクチン遺伝子プロモーター（全身の骨格筋アクチン遺伝子発現）でCMVプロモーターを置換し、新たなプラスミド構築物を生産する工程；
（ｃ）前記新たなプラスミド構築物を直線化する工程；
（ｄ）前記直線化されたプラスミド構築物を、ゴールデンゼブラフィッシュの受精卵内にマイクロインジェクションする工程；
（ｅ）蛍光で前記卵を選択する工程；及び
（ｆ）前記卵を培養し、全身性の蛍光を有するゴールデンゼブラフィッシュを生産する工程；
を含む全身性の蛍光を有するゴールデンゼブラフィッシュの生産方法。　
【請求項４】
　前記直線化プラスミドが、以下のもの：
【化３】
2004129649.tif 000006
または
【化４】
2004129649.tif 000007
である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
　前記蛍光遺伝子が、pDsRed2-1から得られる赤色蛍光遺伝子である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
　前記蛍光遺伝子が、pEGFP-1から得られる緑色蛍光遺伝子である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
　請求項３に記載の方法から生産される、全身性の蛍光を有するゴールデンゼブラフィッシュ。
【請求項８】
　全身性の赤色の蛍光を有する請求項７に記載のゴールデンゼブラフィッシュ。
【請求項９】
　全身性の緑色の蛍光を有する請求項７に記載のゴールデンゼブラフィッシュ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、新規なトランスジェニックゴールデンゼブラフィッシュ（ゴールデンゼブラダニオ）の生産方法に関する。本発明はまた、新規な遺伝子断片及び新規なトランスジェニックゴールデンゼブラフィッシュに関する。
【背景技術】
【０００２】
　観賞魚は漁業の一つの分野であり、グローバルなビジネスを有するエンターテイメント産業に属する。それ故、観賞魚の改変における組換えＤＮＡ及びトランスジェニック技術の使用は、良好な経済効果を作り出すであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
　残念なことに、従来のトランスジェニック技術は、モザイク状または微弱な蛍光の放射の発現を有するトランスジェニックフィッシュしか生産できていない。そのようなフィッシュは、特定の波長を有する蛍光顕微鏡での下でのみ見出される。非実用性と各種の困難性のため、従前の蛍光フィッシュの種類は消費者によりあまり受け入れられておらず、観賞魚に対する市場価値を有していない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
　本発明の目的は、所望のトランスジーンを有する稚魚の安定な供給を確立するために、Clontech社製のpDsRed2-1及びp-αEGFPITRのような市販で入手可能なプラスミド構築物に対して組換えＤＮＡ法を適用することである。
【０００５】
　本発明の別の目的は、（１）ゴールデンゼブラフィッシュのα−アクチン遺伝子プロモーター；（２）蛍光遺伝子；（３）アデノ関連ウイルスのインバーテッド末端リピート；及び（４）pUCから得たベース部分を含む遺伝子断片に関し、それは赤色の蛍光を放射する骨格筋を有するゴールデンゼブラフィッシュの新種を生ずる。
【０００６】
　本発明のさらに別の目的は、蛍光トランスジーンを有し、その全身の骨格筋において蛍光タンパク質を発現する、新規なゴールデンゼブラフィッシュを生産する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
　従来技術の欠点を避けるため、本発明は、完全で厳しいデザインを有し、概念的なブレークスルーを使用する。つまり、ゴールデンゼブラフィッシュのα-アクチン遺伝子プロモーターを、pDsRedITRのようなものに導入し、新規なプラスミド構築物p-αDsRedITRを得る。次いで、p-αDsRedITRを、ゴールデンゼブラフィッシュの受精卵（第一分裂前）の細胞質にマイクロインジェクションする。これらの卵を使用して、全身の骨格筋で魚体全体で発現されている蛍光トランスジーンを有する子孫についてスクリーニングする。蛍光トランスジーンを有する子孫を、さらなる繁殖のために使用する。
【０００８】
　本発明の方法は、他の利用可能な方法に対して以下の改良点を提供できる：
１．主な材料構築物は、プラスミド構築物p-αEGFPITR及びpDsRedITRのようなものであり、これらは安定的で経済的なソースを有する。
２．新規なＤＮＡ断片は、ゴールデンゼブラフィッシュに全身の骨格筋の蛍光を保証する。
３．受精卵内への新規なＤＮＡ断片のマイクロインジェクションは、より高い割合で、よる優れた品質で、ゴールデンゼブラフィッシュの全身の骨格筋の蛍光を可能にする。
４．ヘテロ接合体のトランスジーンは、次世代に安定に受け継がれる。これは、経済的で自然な再生産方法を可能にする。
５．新規なミューテートされたゴールデンゼブラフィッシュの種類では、全身の骨格筋が、肉眼で容易に観察される蛍光を放射する。より短い波長の光源の下では、魚体の赤色の蛍光が強調されて、その特別な特徴と美しさをもたらす。これは、観賞魚に対して付加価値を与える。
【０００９】
　本発明で使用される蛍光遺伝子は、Clontech社のpDsRed2-1から得ることが可能なDsRedのような赤色蛍光遺伝子であることができ、またはAmersham Bioscience社から購入できるGFPのような緑色蛍光遺伝子であることができる。
【００１０】
　前記記載のように、本発明は、以下の工程を含む全身性の蛍光を有するゴールデンゼブラフィッシュの生産方法を提供する：
（ａ）上流から下流に、ITR、CMVプロモーター、蛍光遺伝子、S40 polyA及びITRを含むプラスミドを構築する工程；
（ｂ）ゴールデンゼブラフィッシュのα−アクチン遺伝子プロモーター（全身の骨格筋アクチン遺伝子発現）でCMVプロモーターを置換し、新たなプラスミド構築物を生産する工程；
（ｃ）前記新たなプラスミド構築物を直線化する工程；
（ｄ）前記直線化されたプラスミド構築物を、ゴールデンゼブラフィッシュの受精卵内にマイクロインジェクションする工程；
（ｅ）蛍光で前記卵を選択する工程；及び
（ｆ）前記卵を培養し、全身性の蛍光を有するゴールデンゼブラフィッシュを生産する工程。
【００１１】
　直線化されたプラスミドは、以下のものから選択されることが好ましい：
【化１】
2004129649.tif 000002
または
【化２】
2004129649.tif 000003
【００１２】
　本発明の方法で使用される好ましい蛍光遺伝子は、pDsRed2-1から得られる赤色蛍光遺伝子、またはpEGFP-1から得られる緑色蛍光遺伝子である。
【００１３】
　本発明はまた、本発明の方法から生産された全身性の蛍光を有するゴールデンゼブラフィッシュを提供する。好ましいゴールデンゼブラフィッシュは、全身性の赤色または緑色の蛍光を有する。
【実施例】
【００１４】
　以下の実施例は非制限的であり、本発明の各種の態様及び特徴を説明するためのみ存在する。
【００１５】
赤色の蛍光を有するゴールデンゼブラフィッシュの生産方法
１．市販で入手可能なプラスミド構築物、pDsRed2-1及びp-αEGFPITRを、基本材料として選択した。プラスミド構築物pDsRed2-1は、Clontech社から購入できた。プラスミド構築物p-αEGFPITRは、"Uniform GFP-expression in transgenic medaka (Oryzias latipes) at the F0 generation," Chi-Yuan Chou等, Transgenic Research 10: 303-315, 2001のような関連文献の記載に従って生産された。
２．DsRed断片を、プラスミドpDsRED2-1から切り出した。次いでCMVプロモーター及び二つのアデノ関連ウイルスのインバーテッド末端リピート(ITR)を図２に記載されたようにDsRed断片に結合し、プラスミド構築物p-DsRedITRを生産した。プラスミド構築物p-DsRedITRは、より高い度合いの発現安定性を達成した。
３．新規なプラスミド構築物：p-αDsRedITRの形成
　図１に示されたように、ゴールデンゼブラフィッシュのα−アクチン遺伝子プロモーターを、制限酵素NcoI及びSalIでの切断によってプラスミド構築物p-αEGFPITRから得た。NcoIを最初に使用して前記プラスミド構築物を切断し、末端を埋め、引き続きSalIでの後の切断により３．６８ｋｂの断片を得た。
　図２に示されたように、制限酵素BamHI及びSalIでの切断により、プラスミド構築物pDsRedITRからCMVプロモーターを切り出した。BamHIを最初に使用して前記プラスミド構築物を切断し、末端を埋め、引き続きSalIでの後の切断によって４．２ｋｂの断片を得た。次いで、ゴールデンゼブラフィッシュのα−アクチンプロモーター（全身の骨格筋のアクチン遺伝子発現）を、CMVプロモーターが切り出された位置で、前記プラスミド構築物pDsRedITRにライゲートした。生成したプラスミド構築物は、二つの１４５ｂｐのアデノ関連ウイルスのインバーテッド末端リピート(ITR)を有した。一方のITRは、SV40 polyAの３’末端に位置した。他方は、α−アクチン遺伝子プロモーターの５’末端に位置した。
　図３に示されたように、８．０ｋｂの全長を有する生成したプラスミド構築物p-αDsRedITRが作製された。プラスミド構築物p-αDsRedITRは、（１）ゴールデンゼブラフィッシュα−アクチン遺伝子プロモーター（全身性遺伝子発現）；（２）サンゴ赤色蛍光タンパク質；（３）アデノ関連ウイルスインバーテッド末端リピート；及び（４）pUCプラスミド構築ベースを含んだ。
　プラスミド構築物p-αDsRedITRを、大腸菌5.に導入し、無性生殖により大量に生産させた。
４．プラスミド構築物の直線化：
　図４に示されたように、p-αDsRedITRから得た適量のＤＮＡを、比例的な量のNotI制限酵素で切断し、少量の切断産物をアガロースゲル電気泳動により分析してその直線性を確認し、所望の断片長は実際に８ｋｂである。次いで、切断されたＤＮＡ産物を、等量のフェノール：クロロホルム（１：１）の溶液により抽出し、エタノールで沈降し、風乾し、１０μｇ／ｍｌの密度でＰＢＳに溶解し、それを細胞質のマイクロインジェクションのため使用した。
５．細胞質のマイクロインジェクション
ａ．受精卵の回収：マイクロインジェクションの前夜の午後１１時で、インキュベーターが暗期に突入する前に、魚体を囲んだ領域から回収し、別のネットにより分離した。翌朝明期が始まった後に、魚卵を１５−２０分ごとに回収した。各マイクロインジェクション期間で、３０−４０の卵を注入した：各実験の間で２５０−３００の卵を注入した。
ｂ．マイクロインジェクション：直線化したＤＮＡを定量し、希釈フェノールレッドを含む５×ＰＢＳで所望の濃度に溶解した。ＤＮＡをゼブラフィッシュマイクロインジェクター(Drummond)のマイクロキャピラリーにより拾い出し、そこではマイクロキャピラリーの注射針の幅は約１０μｍであった。マイクロ針が細胞の細胞質に侵入すると、注入されるＤＮＡは約２，３ｎｌであると見積もられた。
ｃ．受精卵の培養：受精卵を滅菌溶液でリンスし、温度が２８．５℃に規定されたインキュベーターで培養した。２４時間後に胚が形成されると蛍光が観察できた。
６．蛍光顕微鏡観察：
　注入された胚を、水を含む皿に配置した。赤色蛍光の分布と強度を、蛍光顕微鏡(Leica MZ-12; Fluorescence System: 光源Ｈｇ１００Ｗ；主要放射波長５５８ｎｍ、主要吸収波長５８３ｎｍ、フィルターセットＲＦＰ−Ｐｌｕｓ；写真システムＭＰＳ６０)の下で観察できた。
７．トランスジーンの遺伝系列伝播
　図８に示されるように、p-αDsRedITR断片でのマイクロインジェクションの胚から由来し、赤色蛍光タンパク質の全身の骨格筋発現を有するミューテートされた新規なゴールデンゼブラフィッシュ（Ｆ０）を野生型と交配させ、均一な蛍光を示すＦ１子孫を得た。次いで蛍光発現を有するＦ１を再び野生型と交配させ、全て赤色の蛍光発現を示し、蛍光の発現を有さない魚体から容易に識別可能なＦ２世代を得た。トランスジェニックゴールデンゼブラフィッシュと野生型の間の差異は、青色光の下でより良く識別できた。本発明のＤＮＡ断片は、他の蛍光遺伝子を有するように改変でき、かくして各種の蛍光を有する魚体を生産可能であった。
【００１６】
　他の蛍光トランスジーンを、赤色蛍光を有するゴールデンゼブラフィッシュの卵に導入し、各種の体色を有する魚体を作製しても良い。
【００１７】
　本発明のゴールデンゼブラフィッシュは、各種のライフサイエンスにおける医薬及び研究、例えば細胞融合、クローニング、核トランスファー、細胞運動性、細胞標的化、及び胚発生の研究に広く適用できる。
【００１８】
　本発明は、当業者がそれを作製し使用できるように十分詳細に記載され例示されている一方で、各種の改変、変形、及び改良が、本発明の精神と範囲から離れることなく存在するはずである。
【００１９】
　本発明は、そこに本質的なものと並んで、言及された目的を実行し、言及された目標と利点を得ることができるように十分に適合されることは当業者に予測されるであろう。胚、動物、及びそれらを生産する工程と方法は、好ましい実施態様を表す例示的なものであり、本発明の範囲を制限するものとは企図されない。そこでの改変及び他の使用が当業者に想起されるであろう。これらの改変は本発明の精神の範囲内に包含され、特許請求の範囲によって規定されている。
【００２０】
　各種の置換及び改変が、本発明の範囲及び精神から離れることなく、ここに開示された本発明になされ得ることは当業者に明らかであろう。
【００２１】
　ここに説明的に記載された本発明は、ここに特には開示されていないいずれかのエレメント（類）及び制限（類）の不存在下で適切に実施できるであろう。使用されている用語及び表現は、記載の目的で使用され制限的ではなく、そのような用語及び表現の使用において、示され記載された特徴またはその一部のいずれの同等物をも排除することを企図するものではないが、特許請求の範囲に係る発明の範囲内で各種の改変が可能であることが認識される。それ故、本発明は、好ましい実施態様及び任意の特徴によって特定的に開示されているが、ここに開示された概念の変形及びバリエーションは当業者により依存し、そのような変形及びバリエーションは、添付された特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内に存在するものと考慮されることが理解されるべきである。
【００２２】
　他の実施態様は、特許請求の範囲内に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、プラスミド構築物p-αEGFPITRをその制限部位と共に説明する図である。
【図２】図２は、プラスミド構築物pDsRedITRをその制限部位と共に説明する図である。
【図３】図３は、プラスミド構築物p-αDsRedITRをその挿入遺伝子断片と制限部位と共に説明する図である。
【図４】図４は、ＤＮＡ断片p-αDsRedITRと制限部位の直線状の模式図である。
【図５】図５は、ＤＮＡ断片p-αEGFPITRと制限部位の直線状の模式図である。
【図６】図６は、３日後の本発明のＤＮＡで成功してトランスフェクトされたゴールデンゼブラフィッシュの胚（Ｆ１世代）の、赤色の蛍光の発現を表す写真図である。写真は１／４秒で露光される。
【図７】図７は、３日後の本発明のＤＮＡで成功してトランスフェクトされたゴールデンゼブラフィッシュの胚（Ｆ１世代）の、緑色の蛍光の発現を表す写真図である。写真は２秒で露光される。
【図８】図８は、各種の世代（Ｆ０、Ｆ１及びＦ２）での新規なゴールデンゼブラフィッシュ（p-αDsRedITRトランスジーンを有する）の遺伝／発現比を説明する図である。
【図１】
2004129649.tif 000008
【図２】
2004129649.tif 000009
【図３】
2004129649.tif 000010
【図４】
2004129649.tif 000011
【図５】
2004129649.tif 000012
【図６】
2004129649.tif 000013
【図７】
2004129649.tif 000014
【図８】
2004129649.tif 000015
【外国語明細書】
2004129649.tif 000016
2004129649.tif 000017
2004129649.tif 000018
2004129649.tif 000019
2004129649.tif 000020
2004129649.tif 000021
2004129649.tif 000022
2004129649.tif 000023
2004129649.tif 000024
2004129649.tif 000025
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2004129649.tif 000027
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2004129649.tif 000029
2004129649.tif 000030