(57)【要約】　　　（修正有）【課題】複数の遺伝子を単一のベクターに効果的に導入するための方法と、受容体ベクターと、２個の供与体ベクターＩＩとを有する複数遺伝子構築ベクターシステムとを提供する。【解決手段】本発明に開示された方法およびベクターシステムを使用して、前記受容体ベクターと一緒に前記２個の供与体ベクターを交互に組換えに使用することにより、組換えシステムに基づく複数サイクルのＤＮＡ組換えを繰り返し実行することができる。前記ベクターシステムおよび方法は、関心のある複数の遺伝子またはＤＮＡ断片を含み、該遺伝子を異なる細胞、組織および生物に導入し発現するためのいかなる遺伝子工学ベクターを構築するために利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　複数遺伝子組換えベクターコンストラクトを作成する方法であって、
（１）受容体ベクターと、少なくとも２個の供与体ベクターとを含む、複数遺伝子構築ベクターシステムと、
（２）前記受容体ベクターおよび異なる供与体ベクターの間でのＤＮＡ交換を通じて、前記受容体ベクターへの逐次的なＤＮＡ送達によって２または３回以上のラウンドの遺伝子構築を可能にするＤＮＡ組換えシステムとを含み、
　複数の供与体ベクターを異なるラウンドの組換えにおいて交替で使用して、前記受容体ベクターへの遺伝子またはＤＮＡ断片の逐次的な挿入を可能にする、複数遺伝子組換えベクターコンストラクトを作成する方法。
【請求項２】
　前記受容体ベクターは、
（１）ＤＮＡ組換えのためのＲＳ部位と、
（２）ホーミングエンドヌクレアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼの切断部位か、非可逆的な特異的組換え部位かである、前記ＲＳ部位の近傍に位置するＳ１部位と、
（３）前記供与体ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子と、
（４）大きなプラスミドを維持することができるレプリコンを含む複製のためのレプリコンとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
　供与体ベクターＩは、
（１）前記受容体ベクターのＲＳ部位と同一か、前記受容体ベクターのＲＳ部位と特異的な組換えを起こすことができる、ＤＮＡ組換えのためのＲＳ部位と、
（２）ホーミングエンドヌクレアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼの切断部位か、非可逆的な組換えのための部位かである、Ｓ１部位およびＳ２部位と、
（３）マルチクローニング部位ＭＣＳと、
（４）前記ＲＳ、Ｓ１、Ｓ２およびＭＣＳが相対的にＲＳ−Ｓ２−ＭＣＳ−Ｓ１の順序に並ぶ、前記供与体ベクターでの配置と、
（５）前記受容体ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
　供与体ベクターＩＩは、
（１）前記受容体ベクターのＲＳ部位と同一か、前記受容体ベクターのＲＳ部位と特異的組換えを起こすことができる、ＤＮＡ組換えのためのＲＳ部位と、
（２）ホーミングエンドヌクレアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼの切断部位か、非可逆的な組換えのための部位である、Ｓ１部位およびＳ２部位と、
（３）マルチクローニング部位ＭＣＳと、
（４）前記ＲＳ、Ｓ１、Ｓ２およびＭＣＳが相対的にＲＳ−Ｓ１−ＭＣＳ−Ｓ２の順序に並ぶ、前記供与体ベクターでの配置と、
（５）前記受容体ベクターの選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカー遺伝子とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
　受容体ベクターと供与体ベクターＩと供与体ベクターＩＩとを含む前記複数遺伝子構築ベクターシステムは、前記受容体ベクターとともに前記供与体ベクターＩと供与体ベクターＩＩとを交互に使用することによって２または３回以上のサイクルのＤＮＡ組換えを実行するために使用されて、複数遺伝子ベクターコンストラクトを構築する、請求項１に記載の方法であって、前記組換えの工程は、
（１）いずれかのＤＮＡ断片を含む、関心のある単一の標的遺伝子または標的遺伝子グループを、従来の分子クローニング技術により前記供与体ベクターＩまたは供与体ベクターＩＩのＭＣＳにクローニングして、前記標的遺伝子または標的遺伝子グループを前記Ｓ１部位およびＳ２部位の間に挿入させるステップと、
（２）（ｉ）前記プラスミドの選択マーカー遺伝子を用いた形質転換体の２重の選択により、標的遺伝子を含む前記供与体ベクターＩと、前記受容体ベクターとの生体内または試験管内でのプラスミド組換えを行うこと、（ｉｉ）Ｓ１部位を切断するエンドヌクレアーゼでの消化の後、必要な場合には前記Ｓ１切断部位に適合する２本鎖オリゴヌクレオチドリンカーに補助された、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる連結によって、前記２個のＳ１部位の間の前記供与体ベクターＩの骨格配列を組み込みプラスミドから除去すること、および（ｉｉｉ）Ｓ１が不可逆的な組換え部位の場合には、対応するリコンビナーゼで生体内または試験管内で組換え反応を実行して、前記２個のＳ１部位の間の供与体ベクターＩの骨格配列が除去され、挿入された遺伝子または遺伝子グループを含む前記受容体ベクターの末端が連結されて環状プラスミドを形成することによって、前記受容体ベクターに第１の標的遺伝子または遺伝子グループを組換えるための第１のサイクルのＤＮＡ組換えを実行するステップと、
（３）（ｉ）前記プラスミドの選択マーカー遺伝子を用いた形質転換体の２重の選択により、第２の遺伝子または遺伝子グループを含む前記供与体ベクターＩＩと、前記（２）のステップで得られた前記受容体ベクターとの生体内または試験管内でのプラスミド組換えを行うこと、（ｉｉ）Ｓ２部位を切断するエンドヌクレアーゼでの消化の後、必要な場合には前記Ｓ２切断部位に適合する２本鎖オリゴヌクレオチドリンカーに補助された、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる連結によって、前記２個のＳ２部位の間の前記供与体ベクターＩＩの骨格配列を組み込みプラスミドから除去すること、および（ｉｉｉ）Ｓ２が不可逆的な組換え部位の場合には、対応するリコンビナーゼで生体内または試験管内で組換え反応を実行して、前記２個のＳ２部位の間の供与体ベクターＩＩの骨格配列が除去され、挿入された遺伝子または遺伝子グループを含む前記受容体ベクターの末端が連結されて環状プラスミドを形成することによって、前記受容体ベクターに第２の標的遺伝子または遺伝子グループを組換えるための第２のサイクルのＤＮＡ組換えを実行するステップと、
（４）全ての標的遺伝子またはＤＮＡ断片が前記受容体ベクターに連結され、設計されたベクターコンストラクトが完成するまで、標的遺伝子または遺伝子グループを含む供与体ベクターＩおよびＩＩを交互に前記受容体ベクターと組み合わせて前記（２）および（３）のステップを繰り返すステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
　図１Ａに示された要素の全部または一部か、配列番号１の全部または一部かを含む、請求項１に記載の受容体ベクター。
【請求項７】
　図１Ｂに示された要素の全部または一部か、配列番号２のＤＮＡ配列の全部または一部かを含む、請求項１に記載の供与体ベクターＩ。
【請求項８】
　図１Ｃに示された要素の全部または一部か、配列番号３のＤＮＡ配列の全部または一部かを含む、請求項１に記載の供与体ベクターＩＩ。
【請求項９】
　関心のある複数の遺伝子またはＤＮＡ断片がベクターと組み合わされて所望のベクターコンストラクトを作成するか、あるいは、複数の遺伝子産物を得るためまたは複数の遺伝子に依存する特性を発現するために該ベクターコンストラクトに組み合わされた遺伝子が選択された被導入体に一緒に導入される、請求項１に記載の方法の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、バイオテクノロジーの分野、具体的には、複数の遺伝子の組換えＤＮＡを作成する方法及びベクターと、そのバイオテクノロジーでの応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
　遺伝学的な形質転換は、遺伝子工学の基本技術であり、生物の細胞内に遺伝子を導入するために用いられる。これまでに実施された実験および応用の大多数は、単数または複数の遺伝子の操作を伴う。しかし、多くの重要な形質および複雑な代謝経路は、多数の遺伝子の相互作用に依存する。したがって、ポリジーン性の形質および複数の形質を操作し、複数の遺伝子産物を産生させるために、生物の細胞に複数の遺伝子を導入する試みがなされてきた。しかし、複数遺伝子の遺伝学的形質転換は、現在の技術の限界により妨げられている。
【０００３】
　現在生物に複数遺伝子を導入するために用いられる技術は、
（１）パーティクルガン法（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）その他の方法を用いて、異なる遺伝子を含む複数のプラスミドベクターを混合したものを共形質転換すること（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、非特許文献１、２）、
（２）１個または数個の遺伝子を各々が含むベクターで同一の被導入体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）生物に逐次的に再形質転換すること（ｒｅ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、非特許文献３）、あるいは、異なる外来遺伝子を遺伝するトランスジェニック生物の間での性的交雑を行って前記遺伝子を単一生物に組換えること（非特許文献４）、
（３）形質転換のための従来の分子クローニング技術を用いて、由来の異なる複数の遺伝子を同一のベクターに連結すること（非特許文献５、６）を含む。
【非特許文献１】Ｃｈｅｎ　Ｌ．、Ｍａｒｍｅｙ　Ｐ．、Ｔａｙｌｏｒ　Ｎ．Ｊ．ら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１０６０−１０６４．
【非特許文献２】Ｙｅ　Ｘ．、Ａｌ−Ｂａｂｉｌｉ　Ｓ．、Ｋｌｏｅｔｉ　Ａ．、Ｚｈａｎｇ　Ｊ．ら、（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７：３０３−３０５．
【非特許文献３】Ｌａｐｉｅｒｒｅ　Ｃ．、Ｐｏｌｌｅｔ　Ｂ．、Ｐｅｔｉｔ−Ｃｏｎｉｌ　Ｍ．ら、（１９９９）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１９：１５３−１６３．
【非特許文献４】Ｍａ　Ｊ．Ｋ．、Ｈｉａｔｔ　Ａ．、Ｈｅｉｎ　Ｍ．ら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：７１６−７１９．
【非特許文献５】ｖａｎ　Ｅｎｇｅｌｅｎ　Ｆ．Ａ．、Ｓｃｈｏｕｔｅｎ　Ａ．ら、（１９９４）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：１７０１−１０．
【非特許文献６】Ｄａｎｉｅｌｌ　Ｈ．、Ｄｈｉｎｇｒａ　Ａ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：１３６−１４１．
【０００４】
　前記（１）の技術は単純ではあるが、プラスミドの数の増加に伴って累進的に複数のプラスミドを共形質転換する効率は低下する。さらに、個別のプラスミドで共形質転換することはランダムな事象であり、挿入されるコピー数および外来遺伝子間の相対的な配置は制御することができない。それゆえ、一部の遺伝子はゲノムに挿入されるかもしれないが、他の一部の遺伝子は挿入されないかもしれない。
【０００５】
　前記（２）の技術については、形質転換のための選択可能なマーカーを前記トランスジェニック生物から除去しなければならないか、あるいは、形質転換の次のラウンドの前の新たな形質転換のラウンド毎に、異なる選択可能なマーカーを用いなければならない。さらに、複数のラウンドの形質転換またはトランスジェニック生物の間の交雑は、非常に時間がかかるので、この技術はほとんど利用されない。
【０００６】
　前記（３）の技術は最も広く利用され、信頼できるアプローチである。しかし、複数の遺伝子の単一ベクターへの導入が、例えば、４または５個以下の遺伝子に限定される現在の分子クローニング技術（非特許文献７）では、少数の遺伝子だけが単一のベクターにクローニングできる。この限定は３つの主要な面がある。（１）逐次的に複数の外来ＤＮＡ配列をベクターに組み合わせるときには、これに伴って組換えベクターのサイズが増大する。その結果、普通は制限エンドヌクレアーゼ切断部位である、ユニークなクローニング部位が減少し、最後には適当なクローニング部位が利用できなくなる。（２）前記組換えベクターのサイズが増大するときには、新しいＤＮＡ断片と前記ベクターとの間の連結の効率、特に平滑末端を有する断片についての効率が低下する。（例えば、ｐＵＣベクターおよびその誘導体のような）従来のプラスミドベクターのクローニング容量（ｃｌｏｎｉｎｇ　ｃａｐａｃｉｔｙ）は小さいので、これらのベクターを用いる複数の遺伝子のクローニングは困難である。例えば、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ、Ｐ１）、バイナリーバクテリア人工染色体（ＢＩＢＡＣ）および形質転換適格人工染色体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、ＴＡＣ）のような、Ｆ因子またはＰ１レプリコンに基づくいくつかのベクターのクローニング容量は他のベクターより大きいが（非特許文献８〜１１）、大きなクローニング容量を有するベクターは単一の大きなＤＮＡ断片をクローニングするのに適しているだけで、異なる出所からの複数のＤＮＡ断片をクローニングするのには適していない。
【非特許文献７】Ｈａｌｐｉｎ　Ｃ．、Ｂａｒａｋａｔｅ　Ａ．、Ａｓｋａｉｉ　Ｂ．Ｍ．ら、（２００１）．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４７：２９５−３１０．
【非特許文献８】Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ　Ｎ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、８７：１０３−１０７．
【非特許文献９】Ｓｈｉｚｕｙａ　Ｈ．、Ｂｉｒｒｅｎ　Ｂ．ら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、８９：８７９４−８７９７．
【非特許文献１０】Ｈａｌｍｉｌｔｏｎ　Ｃ．Ｍ．（１９９７）Ｇｅｎｅ、２００：１０７−１１６．
【非特許文献１１】Ｌｉｕ　Ｙ．Ｇ．、Ｓｈｉｒａｎｏ　Ｙ．、Ｆｕｋａｋｉ　Ｈ．ら、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９６：６５３５−６５４０．
【０００７】
　ＤＮＡ組換えは、組換え酵素（リコンビナーゼ）によって触媒されるＤＮＡ分子の交換として定義される。リコンビナーゼによって媒介されるＤＮＡ組換えは、ＤＮＡ鎖の切断、交換および再連結の一連の工程である。相同組換えおよび部位特異的組換えのシステムを含む、複数のＤＮＡ組換えシステムが発見されている。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、Ｒｌｐ／ＦＲＴ、Ｒ／Ｒｓ、ａｔｔＢ／ａｔｔＰおよびＧｉｎ／Ｇｉｘシステムのような組換えシステムは２個の特異的な組換え部位の間で組換えが起こることを可能にするので、遺伝子の組み込みまたは遺伝子の除去に利用することができる（非特許文献１２〜１５）。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼは、それぞれのプラスミドが（３４塩基対で構成される）ｌｏｘＰ組換え部位を有する２個のプラスミドの間の組換えを触媒して、単一の組換え（組み込み）プラスミドを作成する。逆組換えが前記組み込みプラスミドに一定方向に配置された２個のｌｏｘＰ部位の間で起こって、２個の別々のプラスミドを作成する。これらの組換えシステムは標的遺伝子の組換えにうまく利用されてきたが、現在の方法論では１または２ラウンドの組換えしかできず（非特許文献１６）、単一ベクターに複数の遺伝子を挿入するための複数ラウンドの遺伝子組換えのために利用可能な効果的な方法はない。
【非特許文献１２】Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ　Ｎ．およびＨａｍｉｌｔｏｎ　Ｄ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：４６７−４８６．
【非特許文献１３】Ｎａｓｈ　Ｈ．Ａ．（１９８１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、１５：１４３−１６７．
【非特許文献１４】Ｍｃｌｅｌｄ　Ｍ．、Ｃｒａｆｔ　Ｓ．およびＢｒｏａｃｈ　Ｊ．Ｒ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：３３５７−３３６７．
【非特許文献１５】Ｍｅｒｋｅｒ　Ｐ．、Ｍｕｓｋｈｅｌｉｓｈｖｉｌｉ　Ｇ．（１９９３）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ．、５８：５０５−５１３．
【非特許文献１６】ＭｃＣｏｒｍａｃ　Ａ．Ｃ．、Ｅｌｌｉｏｔｔ　Ｍ．Ｃ．およびＣｈｅｎ　Ｄ．Ｆ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２６１：２２６−２３５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
　したがって、関心のある複数の遺伝子を単一のベクターに挿入するための効果的な方法が、応用的または学術的な目的のために必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
　本発明は、複数の遺伝子またはＤＮＡ断片を単一の遺伝子工学ベクターに構築する（ａｓｓｅｍｂｌｙ）効果的な方法と、かかる目的に利用されるベクターシステムとを提供する。本発明は、（ｉ）受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）ベクターと、少なくとも２個の供与体（ｄｏｎｏｒ）ベクターとを含む複数遺伝子構築ベクターシステムと、（ｉｉ）前記受容体ベクターと、異なる供与体ベクターとの間でのＤＮＡの交換（ｓｗａｐｐｉｎｇ）を通じての該受容体ベクターへの逐次的なＤＮＡの送達によって、複数ラウンドの遺伝子構築を可能にするＤＮＡ組換えシステムを含む方法と、（ｉｉｉ）切断頻度が稀なエンドヌクレアーゼの切断部位と、組換えの各ラウンドで組み込みプラスミド中間体から前記供与体ベクターの骨格断片を除去するための前記受容体ベクターおよび供与体ベクターの不可逆的な組換え部位とを含む、特別に設計されたＤＮＡ配列とを含むが、これらに限定されない。
【００１０】
　本発明による方法は、細胞、組織および生物を含むがこれらに限定されない被導入体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）への複数の遺伝子の導入または発現を含むがこれらに限定されない、遺伝子工学および遺伝子の機能の研究における複数の遺伝子の操作を可能にする。多数の遺伝子およびＤＮＡ断片を含む単一の組換えプラスミドベクターを合成する方法と、連結された遺伝子およびＤＮＡ断片をその後イネのゲノムに導入することの可能性および効果を実証するために、本発明の実施例が示される。
【００１１】
　複数ラウンドの遺伝子組換えによって単一ベクターに複数の遺伝子を連結するための新規な技術を創作するために、本発明では、ＤＮＡ組換えシステムと、ホーミングエンドヌクレアーゼ切断部位と、前記ＴＡＣベクターその他のベクター要素とを含む、現在は他の目的に利用されている個々の構成要素が、新規なベクターシステムに作り上げられる。本発明は、既存の複数遺伝子ベクターコンストラクトの合成方法で経験された技術的限界を克服する。本発明は、用いた組換え用のリコンビナーゼの標的部位の性質によって限定されない。１の実施態様では、前記リコンビナーゼ標的部位は、ｌｏｘ、ＦＲＴ、Ｒｓ、ａｔｔ、Ｇｉｘまたはこれらの突然変異体の部位からなるグループから選択されることがある。本発明は、用いられる頻度が稀な切断部位または不可逆性の組換え部位の性質によっては限定されない。１の実施態様では、前記部位は、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ（ＶＤＥ）またはＰＩ−ＰｓｐＩのホーミングエンドヌクレアーゼ部位または不可逆的な特異的組換え部位からなるグループから選択される場合がある。
【００１２】
　本発明の有益な点および有利な点は、添付する図面を適宜参照してさらに説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
　理論的には、別々の供与体および受容体ベクターで遺伝する遺伝子は、組換えシステムを用いる複数ラウンドの共組み込み（ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）事象によって、無限に組み込みベクターに連結できる。前記供与体ベクターおよび受容体ベクターは、組換え部位と、複製開始点配列と、細菌選択マーカーとを含む骨格配列を、それぞれ含む。しかし、前記供与体ベクターの骨格配列は、第１ラウンドの組換えの後、次のラウンドのベクター組換えの前に、前記組み込みベクターから除去されなければならない。この骨格の除去は、（ｉ）二重の複製開始点が細菌の中での前記組み込みベクターの不安定性の原因となり、直接反復する組換え部位が逆組換えの原因となることのためと、（ｉｉ）前記供与体ベクター上の前記マーカー遺伝子が前記組み込みベクターから削除されない場合には、組換えの次のラウンドごとに新しい選択マーカー遺伝子が必要になることのために必要となる。
【００１４】
　したがって、２個の重要な技術的問題が、複数回の遺伝子組換えのために解決されなければならない。具体的には、（ｉ）前記ベクターの中で適当に配置された切断部位が各ラウンドの遺伝子組換えにおける前記骨格の除去のために利用可能でなければならず、（ｉｉ）前記供与体の骨格を除去するための切断部位は、前記受容体ベクターの骨格および増えていく挿入された遺伝子の内部のいずれかの部位に存在してはいけない。しかし、前記切断部位が各組換えのラウンドの後で破壊されない場合には、同種類の部位はその後のラウンドの組換えで利用することができない。組換えられた遺伝子の数が増えると、適当な切断部位の入手可能性は下がる。
【００１５】
　ゲノム中の認識部位の頻度が低い遺伝子工学用のエンドヌクレアーゼは、通常「切断部位が稀な」エンドヌクレアーゼとよばれる。これらのうち、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ（ＶＤＥ）およびＰＩ−ＰｓｐＩのようなホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、非常に切断頻度が稀な酵素である。ホーミングエンドヌクレアーゼの認識配列は以下の特徴を有する。（ｉ）認識配列の塩基の数が制限エンドヌクレアーゼの認識配列よりはるかに長い。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩはそれぞれ１８塩基対および３９塩基対を認識するので、天然のＤＮＡ配列のこれらの酵素による理論的な切断頻度は非常に低い。（ｉｉ）認識配列が非対称性である（非特許文献１７）。逆方向の２個の切断部位がホーミングエンドヌクレアーゼで消化され、その後２個の末端が連結されると、連結された部位はもはや前記エンドヌクレアーゼの完全な認識配列を含まない。
【非特許文献１７】Ｂｅｌｆｏｒｔ　Ｍ．およびＲｏｂｅｒｔｓ　Ｒ．Ｊ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、２５：３３７９−３３８８．
【００１６】
　たいていの組換えシステムの一部の組換え反応は可逆性である。しかし、一部の可逆性の部位特異的な組換えシステムは、ラムダインテグラーゼによって媒介されるａｔｔＢ／ａｔｔＰシステムの反応のように、不可逆的な組換えを起こすように改変される場合がある（非特許文献１８）。不可逆的な組換えは、２個の組換え部位の間の不可逆的なＤＮＡ断片を除去するために用いられることがあり、前記２個の末端は同時に連結されることがある。
【非特許文献１８】Ａｌｂｅｒｔ　Ｈ．、Ｄａｌｅ　Ｅ．Ｃ．、Ｌｅｅ　Ｅ．およびＯＷ　Ｄ．Ｗ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．，７：６４９−６５９．
【００１７】
　上記の問題に対処するため、本発明は、単一ベクターに複数の遺伝子を効果的に構築するための方法および複数遺伝子構築ベクターシステムを提供する。前記ベクターシステムは、受容体ベクターと少なくとも２個の供与体ベクターとからなる。前記方法は、前記受容体ベクターおよび異なる供与体ベクターの間でのＤＮＡ交換を通じての前記受容体ベクターへの逐次的なＤＮＡ送達によって、複数ラウンドの遺伝子組換えを可能にするＤＮＡ組換えシステムを含む。複数の供与体ベクターは、前記受容体ベクターへの遺伝子またはＤＮＡ断片の逐次的な挿入を可能にするために、異なるラウンドの組換えに順繰りに使用される。
【００１８】
　プラスミド組換えのラウンドの間、切断頻度が稀なエンドヌクレアーゼの切断部位または不可逆的な組換え部位を含む、前記受容体ベクターおよび供与体ベクター上の特別に設計されたＤＮＡ配列が、各ラウンドの組換えにおける組み込みプラスミド中間体から前記供与体ベクターの骨格断片を除去することを可能にする。この方法は、前記供与体ベクターにサブクローニングされた全ての標的遺伝子またはＤＮＡ断片が前記受容体ベクターに送達されるまで、連続的に遺伝子組換えを繰り返すことを可能にする。
【００１９】
　前記方法の好ましい実施態様では、本発明で説明されたベクターは、不要な供与体ベクターの骨格断片を除去するための２種類のホーミングエンドヌクレアーゼの切断部位を有するので、組み合わされた遺伝子または前記受容体ベクターの切断は避けられる。同様の効果は、他の切断頻度が稀なエンドヌクレアーゼの認識部位または不可逆的な組換え部位を利用して達成されることがある。前記２個の供与体ベクターを交互に使用することによって、たった２種類のエンドヌクレアーゼ切断部位または不可逆的な組換え部位が、複数ラウンドの遺伝子組換えに十分である。
【００２０】
　本発明による受容体ベクターは、送達されるべき外来遺伝子またはＤＮＡ断片の被導入体であって、以下の特徴を有する。
（１）ＤＮＡ組換えのためのＲＳ部位を有し、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ、Ｒｓ、ａｔｔＢ、ａｔｔＰまたはＧｉｘである場合があるが、これらに限定されない。（２）前記ＲＳ部位の近傍に位置するＳ１部位を有し、これはホーミングエンドヌクレアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼの切断部位または不可逆的な組換え部位である。（３）選択マーカー遺伝子を有し、これは抗生物質耐性遺伝子である場合があるが、これに限定されない。（４）複製のためのレプリコンは大きなプラスミドを維持することができ、これは、バクテリオファージＰ１のレプリコン、Ｆ因子のレプリコン、ＲｉレプリコンまたはｐＶＳ１レプリコンである場合があるが、これらに限定されない。
【００２１】
　本発明による供与体ベクターは、遺伝子組換えを通じて関心のある遺伝子を前記受容体ベクターに導入するための中間ベクターである。前記２個の供与体ベクターは、供与体ベクターＩおよび供与体ベクターＩＩであって、以下の特徴を有する。（１）前記受容体ベクターのＲＳ部位と同一か、あるいは、前記受容体ベクターのＲＳ部位と組換え体を形成することができる、ＤＮＡ組換えのためのＲＳ部位を有する。（２）Ｓ１部位と、これとは別のＳ２部位とを有し、これらは、ホーミングエンドヌクレアーゼまたは切断頻度が稀な制限エンドヌクレアーゼの切断部位か、不可逆的な組換え部位かである。（３）ＲＳ部位、Ｓ１部位、Ｓ２部位およびマルチクローニング部位（ＭＣＳ）が、供与体ベクターＩでは相対的にＲＳ−Ｓ２−ＭＣＳ−Ｓ１の順序で配置され、供与体ベクターＩＩでは相対的にＲＳ−Ｓ１−ＭＣＳ−Ｓ２の順序で配置される。（４）前記供与体ベクターＩおよび供与体ベクターＩＩのそれぞれが選択マーカー遺伝子を有し、これは前記受容体ベクターの選択マーカー遺伝子とは異なるものであって、抗生物質耐性遺伝子である場合があるがこれに限定されず、前記供与体ベクターでは同じでも異なってもかまわない。
【００２２】
　上記のホーミングエンドヌクレアーゼ部位は、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ（ＶＤＥ）またはＰＩ−ＰｓｐＩである場合があるが、これらに限定されない。
【００２３】
　上記の不可逆的な特異的組換え部位は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、改変されたａｔｔＢ、改変されたａｔｔＰ、改変されたｌｏｘＰ、改変されたＦＲＴ、改変されたＲｓまたは改変されたＧｉｘである場合があるが、これらに限定されない。
【００２４】
　図１を参照して、本発明による複数遺伝子構築ベクターシステムは３つのベクター（Ａ、ＢおよびＣ）を含む。ベクターＡはｐＹＬＴＡＣ７４７という名前の受容体ベクターで、ベクターＢはｐＹＬＶＳという名前の供与体ベクターＩで、ベクターＣはｐＹＳＶという名前の供与体ベクターＩＩである。前記３つのベクター（Ａ、ＢおよびＣ）において、ＲＳ部位はｌｏｘＰで表され、Ｓ１部位はＩ−ＳｃｅＩで表され、Ｓ２部位はＰＩ−ＳｃｅＩで表され、ＭＣＳは外来遺伝子をクローニングするための２３個のユニークな制限エンドヌクレアーゼ切断部位からなるマルチクローニング部位である。前記供与体ベクター（Ｂ、Ｃ）では、ＬａｃＺはクローニングのための選択マーカーとしてのガラクトシダーゼ遺伝子であり、Ｃｍはクロラムフェニコール耐性選択マーカー遺伝子である。前記受容体ベクター（Ａ）では、Ｋａｎはカナマイシン耐性選択マーカー遺伝子である。ＲＢおよびＬＢは、それぞれ、転移ＤＮＡ領域（Ｔ−ＤＮＡ）の右側および左側の縁である。受容体ベクター（Ａ）のＰ１プラスミドレプリコンはバクテリオファージＰ１に由来し、大腸菌の中で前記プラスミドを複製させる。受容体ベクター（Ａ）のＲｉレプリコンはアグロバクテリウム・リゾゲネス菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）のＲｉプラスミドに由来し、前記プラスミドをアグロバクテリウム・リゾゲネス菌およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の中で複製させる。供与体ベクター（Ｂ、Ｃ）におけるＯｒｉはｐＵＣプラスミドの複製開始点である。
【００２５】
　本発明による複数の遺伝子を構築する方法は、（１）標的遺伝子またはＤＮＡ断片を別々の供与体ベクターにクローニングするステップと、（２）供与体ベクターＩと前記受容体ベクターとのプラスミド組換えを行うステップと、（３）供与体ベクターＩＩと前記受容体ベクターとのプラスミド組換えを行うステップと、（４）全ての所望の標的遺伝子およびＤＮＡ断片が前記受容体ベクターに導入されるまで前記（２）および（３）のステップを繰り返すステップとを含む。
【００２６】
　標的遺伝子またはＤＮＡ断片は別々の供与体ベクターのＭＣＳに従来のクローニング技術によってクローニングされて、前記遺伝子が前記受容体ベクターに組み合わされる順序でＳ１およびＳ２部位の間に挿入される。技術的に可能である場合には、２または３個以上の遺伝子が供与体ベクターに遺伝子グループとしてクローニングされてもかまわない。詳細な説明において使用される「遺伝子」という単語は、機能的な遺伝子か、ＤＮＡ断片かのいずれかを表す。
【００２７】
　図２Ａを参照して、第１の遺伝子または遺伝子グループを含む供与体ベクターＩのプラスミド（ｐＹＬＶＳ−遺伝子１）と、受容体ベクタープラスミドｐＹＬＴＡＣ７４７とは、生体内でプラスミド組換えを触媒するＣｒｅリコンビナーゼを発現する大腸菌宿主に共に導入される。それから、形質転換体はカナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む選択培地で選択される。組み込まれたプラスミドおよび別々のプラスミドからなるプラスミドは精製され、それから、Ｃｒｅ遺伝子を有しない大腸菌宿主に再度導入され、形質転換体がカナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む選択培地で選択される。プラスミドの組換えは、試験管内で精製されたＣｒｅリコンビナーゼを用いて実行されることもある。前記２個のＩ−ＳｃｅＩ部位で挟まれたｐＹＬＶＳの骨格断片は、エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩでの消化によって除去される。一緒に組み込まれたプラスミド上の前記２個の非対称なＩ−ＳｃｅＩ部位は反対向きに配置されるため、突出する３’末端は互いに相補的ではなく、連結部位を形成するＴ４ＤＮＡリガーゼによるプラスミドの環状化は、適合する２本鎖オリゴヌクレオチドリンカーＳを必要とする。得られたプラスミド上の連結部位は、これ以降の遺伝子構築のサイクルの間、前記酵素によって認識されることはない。得られた遺伝子１を含むプラスミドは大腸菌に導入される。形質転換体がカナマイシンを含む選択培地で選択され、それから、クロラムフェニコール感受性について試験される。選択されたクローンは、ｐＹＬＶＳ骨格断片を含まないが遺伝子１が挿入された新たなプラスミドで、ｐＹＬＴＡＣ７４７−遺伝子１と名付けられる。ｐＹＬＴＡＣ７４７−遺伝子１の上では、前記ホーミングエンドヌクレアーゼ切断部位は、ｐＹＬＶＳ由来のＰＩ−ＳｃｅＩ部位に置換されている。
【００２８】
　図２Ｂを参照して、第２の遺伝子または遺伝子グループを含む供与体ベクターＩＩプラスミド（ｐＹＬＳＶ−遺伝子２）と、受容体ベクタープラスミドｐＹＬＴＡＣ７４７−遺伝子１とが、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する大腸菌宿主に共に導入される。形質転換体がカナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む選択培地で選択される。前記プラスミドは精製され、Ｃｒｅ遺伝子を有しない大腸菌宿主に再度導入されて、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む選択培地で選択される。プラスミド組換えは、精製されたＣｒｅリコンビナーゼを用いて試験管内で実行されてもかなわない。前記２個のＰＩ−ＳｃｅＩ部位で挟まれたｐＹＬＳＶの骨格断片がエンドヌクレアーゼＰＩ−ＳｃｅＩでの消化によって除去される。共に組み込まれたプラスミドの上の前記２個の非対称なＰＩ−ＳｃｅＩ部位は反対向きに配置されているため、突出する３’末端は互いに相補的ではなく、連結部位を形成する連結によるプラスミドの環状化は、適合する２本鎖リンカーＶを必要とする。Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる連結の後、得られたプラスミド上の連結部位は、これ以降の遺伝子構築のサイクルの間、前記酵素によって認識されない。遺伝子１および遺伝子２を含む得られたプラスミドは大腸菌の中に導入される。形質転換体はカナマイシンを含む選択培地で選択され、それから、クロラムフェニコール感受性についてクロラムフェニコールで試験される。選択されたクローンはｐＹＬＳＶ骨格断片を含まないが遺伝子２を含む新たなプラスミドで、ｐＹＬＴＡＣ７４７−遺伝子１−遺伝子２と名付けられる。この新たなプラスミドのホーミングエンドヌクレアーゼの切断部位はＩ−ＳｃｅＩになるが、これは、もとのベクターｐＹＬＴＡＣ７４７にあったものと同じである。
【００２９】
　上記の第２および第３のステップは、全ての標的遺伝子が受容体ベクターに送達されるまで、遺伝子組換えのための新たな標的遺伝子を含む供与体ベクターＩおよびＩＩで交互に繰り返される。
【００３０】
　Ｉ−ＳｃｅＩ認識配列および切断箇所（矢印）は以下のとおりである。
【００３１】
【化１】
2004121248.tif 000002
【００３２】
　２個の逆向きのＩ−ＳｃｅＩ切断末端と、オリゴヌクレオチドリンカーＳ（小文字で表示される）とは、組み合わされて以下のような連結部位を形成する。
【００３３】
【化２】
2004121248.tif 000003
５’−ＴＡＧＧＧＡＴＡＡｎｎｎ…ｎｎｎｔｔａｔＣＣＣＴＡ−３’
３’−ＡＴＣＣＣｔａｔｔｎｎｎ…ｎｎｎＡＡＴＡＧＧＧＡＴ−５’
【００３４】
　前記リンカーのコア配列（ｎ）は８または９個以上であることが好ましく、前記リンカーのコア配列（ｎ）はいかなる塩基であってもかまわないが、完全なＩ−ＳｃｅＩまたはＰＩ−ＳｃｅＩ認識部位を形成するものであってはならない。本発明の実施例（図５および６）では、制限酵素部位ＮｏｔＩがリンカーＳに含まれるように設計される。
【００３５】
【化３】
2004121248.tif 000004
【００３６】
　ＰＩ−ＳｃｅＩ認識配列および切断箇所（矢印）は以下のとおりである。
【００３７】
【化４】
2004121248.tif 000005
【００３８】
　２個の逆向きのＰＩ−ＳｃｅＩ切断末端と、オリゴヌクレオチドリンカーＶ（小文字で表示される）とは、組み合わされて以下のような連結部位を形成する。
【００３９】
【化５】
2004121248.tif 000006
【００４０】
　前記リンカーのコア配列（ｎ）の塩基数は８または９個以上が好ましく、前記リンカーのコア配列（ｎ）はいかなる塩基であってもかまわないが、完全なＰＩ−ＳｃｅＩまたはＩ−ＳｃｅＩ認識部位を形成するものであってはならない。本発明の実施例（図５および６）では、制限酵素部位ＮｏｔＩがリンカーＳに含まれるように設計される。
【００４１】
【化６】
2004121248.tif 000007
【００４２】
　したがって、本発明による組換えベクターコンストラクトを作成する方法は、受容体ベクターおよび供与体ベクターを提供すること、前記受容体ベクターおよび供与体ベクターをＤＮＡ組換えを起こすことができる細胞の中に導入すること、前記細胞を薬剤選択にかけること、組換えベクターを得ること、該組換えベクターをエンドヌクレアーゼ消化および薬剤選択に供すること、および組換え受容体ベクターを得ることを含む。
【００４３】
　提供される前記受容体ベクターは、ＤＮＡ組換え配列と呼ばれるＤＮＡ組換えのための配列と、選択マーカー遺伝子と、第１のエンドヌクレアーゼ切断部位とを含む。第１のエンドヌクレアーゼ切断部位は、前記ＤＮＡ組換えのための配列の近傍にあり、前記受容体ベクターの中で１カ所しか存在しない。前記選択マーカー遺伝子は第１のエンドヌクレアーゼ切断部位の近傍にある。
【００４４】
　提供される前記供与体ベクターは、ＤＮＡ組換え配列と、前記受容体ベクターの中に送達されるべき関心のある標的配列と、第１のエンドヌクレアーゼ切断部位と、第２のエンドヌクレアーゼ切断部位とを含む。第１のエンドヌクレアーゼ切断部位と第２のエンドヌクレアーゼ切断部位とはそれぞれ前記供与体ベクターの中に１カ所ずつしか存在しない。前記ＤＮＡ組換え配列は、前記受容体ベクターの対応する配列との組換えを起こすことができる。前記ＤＮＡ組換え配列は、第２のエンドヌクレアーゼ切断部位の近傍にある。前記関心のある標的配列は第２のエンドヌクレアーゼ切断部位と第１のエンドヌクレアーゼ切断部位との近傍にある。前記選択マーカー遺伝子は第１のエンドヌクレアーゼ切断部位の近傍にあり、前記受容体ベクターの選択マーカー遺伝子とは異なる。
【００４５】
　前記受容体ベクターおよび供与体ベクターは細胞の中に導入され、前記受容体ベクターと、前記標的配列を含む前記供与体ベクターとの間のプラスミド組換えを可能にする。前記細胞は、前記受容体ベクターと供与体ベクターとの２個の異なる選択マーカー遺伝子のそれぞれに関する薬剤選択に供される。組換えベクターが前記薬剤選択で生き残った細胞から得られる。前記組換えベクターは、第１のエンドヌクレアーゼによるエンドヌクレアーゼ消化に供され、その後、環状の組換えプラスミドを形成するための自己連結に供される。前記組換えプラスミドは、前記受容体ベクターの選択マーカー遺伝子での薬剤選択に供される。前記薬剤選択で生き残った組換え受容体ベクターが得られる。前記組換え受容体ベクターは、前記供与体ベクター由来の関心のある前記標的配列と、第２のエンドヌクレアーゼ切断部位と、前記受容体ベクターの選択マーカー遺伝子と、前記ＤＮＡ組換え配列とを含む。
【００４６】
　複数遺伝子の組換えベクターコンストラクトを作成する方法は、関心のある標的配列を含む追加の供与体ベクターを提供するステップと、前記組換え受容体ベクターと、前記追加の供与体ベクターとを細胞に導入してＤＮＡ組換えを可能にするステップと、前記細胞を薬剤選択に供するステップと、組換えベクターを得るステップと、該組換えベクターをエンドヌクレアーゼ消化、自己連結および薬剤選択に供するステップと、新たな組換え受容体ベクターを得るステップとを１または２回以上繰り返すことをさらに含むことが好ましい。
【００４７】
　提供される前記追加の供与体ベクターは、ＤＮＡ組換え配列と、前記受容体ベクターの中に送達されるべき関心のある標的配列と、選択マーカー遺伝子と、第１のエンドヌクレアーゼ切断部位と、第２のエンドヌクレアーゼ切断部位とを含む。第１のエンドヌクレアーゼ切断部位と第２のエンドヌクレアーゼ切断部位とは、それぞれ前記供与体ベクター上に１カ所ずつしか存在しない。前記ＤＮＡ組換え配列は、前記受容体ベクターの対応する配列との組換えを起こすことができる。前記ＤＮＡ組換え配列は第１のエンドヌクレアーゼ切断部位の近傍にある。関心のある前記標的配列は、第１のエンドヌクレアーゼ切断部位と第２のエンドヌクレアーゼ切断部位の近傍にある。前記選択マーカー遺伝子は、第２のエンドヌクレアーゼ切断部位の近傍にあり、前記受容体ベクターの選択マーカー遺伝子とは異なる。
【００４８】
　前記組換え受容体ベクターおよび追加の供与体ベクターは細胞に導入されて、前記受容体ベクターと、前記標的配列を含む前記供与体ベクターとの間のプラスミド組換えが起こることを可能にする。前記細胞は、前記組換え受容体ベクターと追加の供与体ベクターとの２個の異なる選択マーカー遺伝子のそれぞれに関する薬剤選択に供される。組換えベクターは前記薬剤選択で生き残った細胞から得られる。前記組換えベクターは、前記組換え受容体ベクターのエンドヌクレアーゼ切断部位と同じ部位を切断するエンドヌクレアーゼの消化に供され、その後、環状組換えプラスミドを形成するための自己連結に供される。前記薬剤選択で生き残る組換え受容体ベクターが得られる。前記組換え受容体ベクターは、前記追加の供与体ベクターの関心のある標的配列を含む。
【００４９】
　前記受容体ベクターは、配列番号１のＤＮＡ配列の全部または一部を含む場合がある。第１の供与体ベクターは、配列番号２のＤＮＡ配列の全部または一部を含む場合がある。第２の供与体ベクターは、配列番号３のＤＮＡ配列の全部または一部を含む場合がある。
【００５０】
　他の可能な改変および変更は、本発明の特許請求の範囲とその精神から逸脱することなく実行することができる。かかる改変は、供与体ベクターの数または組換えおよび消化のための特異的部位の数および／または配置に関する場合があるが、これらに限定されない。例えば、３または４個以上の供与体ベクターが、前記受容体ベクターと組換えるために順次使用されることがある。３個の供与体ベクターを使用する場合には、前記受容体ベクターと供与体ベクターとに存在する部位およびそれらの配置の順序は以下のように設計されることがある。
受容体ベクター：ＲＳ−Ｓ１
供与体ベクターＩ：ＲＳ−Ｓ２−ＭＣＳ−Ｓ１
供与体ベクターＩＩ：ＲＳ−Ｓ３−ＭＣＳ−Ｓ２
供与体ベクターＩＩＩ：ＲＳ−Ｓ１−ＭＣＳ−Ｓ３
【００５１】
　ここで、ＲＳは組換え部位である。Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、ホーミングエンドヌクレアーゼまたは切断頻度が稀なエンドヌクレアーゼのための切断部位か、あるいは、不可逆的組換え部位である。複数遺伝子の構築サイクルの間、各供与体ベクターは、供与体ベクターＩ、供与体ベクターＩＩ、供与体ベクターＩＩＩ、供与体ベクターＩ、供与体ベクターＩＩ等の順番で使用される。
【００５２】
　本発明による複数の遺伝子を構築する方法は複数の用途がある。本発明は、好ましくは、さまざまな形質転換方法に適する複数遺伝子形質転換ベクターを構築するために使用されて、複数の遺伝子産物の産生または複数の遺伝子の相互作用に基づく性質の発現を目的として、植物、動物、昆虫、酵母および微生物を含むがこれらに限定されない、さまざまな被導入体生物に複数の遺伝子を一緒に導入することができる。本発明によって作成されたコンストラクトで複数の遺伝子を導入する形質転換方法は、アグロバクテリウム菌を介する形質転換方法、パーティクルガン法、顕微注入法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、花粉管経路形質転換法（ｐｏｌｌｅｎ−ｔｕｂｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）またはウイルスを介する遺伝子形質転換法を含むがこれらに限定されない。例えば、実施例として本発明において説明された受容体ベクターｐＹＬＴＡＣ７４７は、アグロバクテリウム菌を介する形質転換に必要なバイナリー形質転換ベクターの全ての要素、すなわち、Ｔ−ＤＮＡ領域の左右の縁と、細菌の抗生物質選択マーカー（カナマイシン耐性遺伝子）と、大腸菌およびアグロバクテリウム菌で機能するＰ１プラスミドレプリコンおよびＲｉプラスミドレプリコンとを含む。本発明の方法によってｐＹＬＴＡＣ７４７に植物選択マーカー遺伝子その他の標的遺伝子を挿入した後、このベクターコンストラクトは、アグロバクテリウム菌を介する形質転換その他の形質転換法により植物の形質転換に使用することができる。本発明による方法を利用して、さまざまなタイプのベクターを複数の遺伝子またはＤＮＡ断片の構築に適する受容体ベクターおよび供与体ベクターとして容易に改変して、特別な目的のためのさまざまなタイプの遺伝子工学ベクター、特に、例えば、バクテリア人工染色体、酵母人工染色体、哺乳類人工染色体または植物人工染色体のような複数の要素を含む、サイズが大きいかまたは複雑なベクターを構築することができる。
【００５３】
　本発明は以下の利点がある。本発明の方法は、融通がきき、多目的に利用することができる。異なる由来の複数の遺伝子またはＤＮＡ断片を単一のベクターに効果的に組み合わせることができ、該ベクターの中での標的遺伝子の配置および方向を自由に設計することができ、信頼できる段階的な工程によって容易に達成することができる。本発明は、複数遺伝子ベクターコンストラクトを作成する既存のクローニング方法の技術的限界を克服する。
【００５４】
　遺伝子組換えのために１つの受容体ベクターとともに２個の供与体ベクターを使用することによって、複数サイクルの遺伝子組換えを繰り返すことができる。この戦略により、たった２個の頻度が稀なエンドヌクレアーゼ切断部位または不可逆的な特異的組換え部位が、複数ラウンドの遺伝子組換えにとって必要なステップである、前記供与体ベクターの不要な骨格断片を除去するのに十分である。
【００５５】
　Ｐ１プラスミドのレプリコンおよびＲｉレプリコンのような大きなプラスミドを維持する能力があるレプリコンを使用して、本発明の供与体ベクターは多数の外来遺伝子を受け入れて安定に維持することができる。
【００５６】
　本明細書に引用された文書または刊行物の全ては、引用のためにここに取り込まれる。
【００５７】
　本発明は、複数遺伝子構築ベクターシステムの作成と、イネに複数遺伝子を導入するという前記システムの応用とを示す以下の実施例を参照して、具体的な詳細にわたってさらに説明される。しかし、本発明の特許請求の範囲はこれらの実施例によっては限定されない。
【実施例１】
【００５８】
　この実施例は、受容体ベクターｐＹＬＴＡＣ７４７の構築を示す。
【００５９】
　図３を参照して、プライマーＰ１は以下の配列を有し、その下線部はＸｂａＩ制限部位である。
【００６０】
【化７】
2004121248.tif 000008
【００６１】
　プライマーＰ２は以下の配列を有し、その下線部はＢａｍＨＩ制限部位であり、斜線部はＴ−ＤＮＡの左側の縁ＬＢである。
【００６２】
【化８】
2004121248.tif 000009
【００６３】
　ＭＣＳ〜ｌｏｘＰ〜Ｉ−ＳｃｅＩ断片（配列番号１）の配列は以下のとおりである。
【００６４】
【化９】
2004121248.tif 000010
【００６５】
　下線部のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）配列は、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＦｓｅＩおよびＮｏｔＩからなる。斜線部の配列はｌｏｘＰ部位である。小文字の配列はＩ−ＳｃｅＩ部位である。
【００６６】
　ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位を含むＰ１およびＰ２プライマーは、形質転換適格人工染色体ベクターｐＹＬＴＡＣ７配列（非特許文献１１）に従って合成された。ベクターの枠断片（１５６９０塩基対）がＰＣＲで増幅され、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化され、合成２本鎖ＤＮＡ断片ＭＣＳ〜ｌｏｘＰ〜Ｉ−ＳｃｅＩ（配列番号１）と連結されて、ｐＹＬＴＡＣ７４７という名前の受容体ベクタープラスミドが作成された。
【実施例２】
【００６７】
　この実施例は供与体ベクターの構築を示す。
【００６８】
　図４を参照して、ｐＣＡＭＢＩＡ１２００およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫはプラスミドベクターである。Ｏｒｉはプラスミドの複製開始点である。Ｃｍはクロラムフェニコール耐性遺伝子である。Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子である。選択マーカーとしてのＬａｃＺはガラクトシダーゼ遺伝子である。
【００６９】
　プライマー３〜６はそれぞれ以下の配列である。
【００７０】
【化１０】
2004121248.tif 000011
【００７１】
　供与体ベクターＩプラスミドｐＹＬＶＳのｌｏｘＰ〜ＰＩ−ＳｃｅＩ〜ＭＣＳ〜Ｉ−ＳｃｅＩ領域（配列番号２）は以下の配列である。
【００７２】
【化１１】
2004121248.tif 000012
【００７３】
　供与体ベクターＩＩプラスミドｐＹＬＳＶのｌｏｘＰ〜Ｉ−ＳｃｅＩ〜ＭＣＳ〜ＰＩ−ＳｃｅＩ配列（配列番号３）は以下のとおりである。
【００７４】
【化１２】
2004121248.tif 000013
【００７５】
　上記の配列において、斜線部の配列はｌｏｘＰ部位である。下線部の配列はＰＩ−ＳｃｅＩ部位である。小文字の配列はＩ−ＳｃｅＩ部位である。ＰＩ−ＳｃｅＩ部位とＩ−ＳｃｅＩ部位との間の配列は、２３個のユニークな制限酵素部位からなるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）である。
【００７６】
　プライマーＰ３およびＰ４は、クロラムフェニコール耐性遺伝子の配列に基づいて合成された。クロラムフェニコール耐性遺伝子Ｃｍ（８２６塩基対）は、ＰＣＲによりプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１２００から増幅された。プライマーＰ５およびＰ６は、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ配列に基づいて合成され、１６６０塩基対の断片（Ｏｒｉ〜ＭＣＳ〜ＬａｃＺ）がＰＣＲにより、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫから増幅された。上記の２個の断片は連結され、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に導入されて、中間ベクタープラスミドｐＹＬを得た。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫから由来するプラスミドｐＹＬの本来のＭＣＳは制限エンドヌクレアーゼＢｓｓＨＩＩでの消化によって除去され、合成２本鎖ＤＮＡ断片ｌｏｘＰ〜ＰＩ−ＳｃｅＩ〜ＭＣＳ〜Ｉ−ＳｃｅＩ（配列番号２）が連結により前記プラスミドに挿入されて、新しいプラスミドを形成した。このプラスミドは供与体ベクターＩで、ｐＹＬＶＳと名付けられた。２個の制限酵素部位ＢｇｌＩＩが、一方はｌｏｘＰとＰＩ−ＳｃｅＩとの間に配置され、他方はＩ−ＳｃｅＩとＬａｃＺとの間に配置されるように、前記ベクター上に設計された。それゆえ、別の供与体ベクター（供与体ベクターＩＩ）は、ＢｇｌＩＩで消化して、Ｉ−ＳｃｅＩ〜ＭＣＳ〜ＰＩ−ＳｃｅＩ部位を含むＢｇｌＩＩ断片を反対向きに前記ベクターに挿入することにより、ｐＹＬＳＶから作成された。供与体ベクターＩＩにおいて、部位の相対的な配置はｌｏｘＰ〜Ｉ−ＳｃｅＩ〜ＭＣＳ〜ＰＩ−ＳｃｅＩ（配列番号３）に変更され、このベクターはｐＹＬＳＶと名付けられた。
【実施例３】
【００７７】
　本実施例は、植物の形質転換のための複数の遺伝子を含むベクターコンストラクトの構築を示す。
【００７８】
　図５を参照して、異なる数の遺伝子を含む複数のベクターコンストラクトが制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩで消化され、ゲル電気泳動に供された。図５の下の数字は以下の複数遺伝子構築の工程の間にベクターｐＹＬＴＡＣ７４７に送達された標的遺伝子および機能的なＤＮＡ断片の数を示す。レーン７〜１０における５．２ｋｂのバンドと、レーン９〜１０における１．２ｋｂのバンドと、レーン１０における３．０ｋｂのバンドとは、２本の断片のバンドが重複して移動している（ＮｏｔＩ断片のサイズについては図６を参照せよ）。レーンＭはラムダＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ分子量マーカーである。
【００７９】
　組換えに用いられた遺伝子および機能的なＤＮＡ断片は、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ）、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）、マツユキソウレクチン遺伝子（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ　ｎｉｖａｌｉｓ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＧＮＡ）、ジャガイモプロテイナーゼインヒビターＩＩ（ＰｉｎＩＩ）、イネ酸性キチナーゼ（ＲＡＣ２２）、イネ塩基性キチナーゼ（ＲＣＨ１０）、イネ白葉枯病耐性遺伝子（Ｘａ２１）およびベータ−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である。これらの遺伝子は、もとは個別にプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋またはｐＵＣ１８にクローニングされていた。
【００８０】
　第１の遺伝子ＨＰＴは、従来のクローニング方法によってｐＹＬＴＡＣ７４７のＮｏｔＩ部位に直接クローニングされた。作成されたベクターｐＹＬＴＡＣ７４７−ＨＰＴは図５のレーン２に示される。
【００８１】
　ＭＡＲ配列（１．２ｋｂ）は供与体ベクターＩプラスミドｐＹＬＶＳにサブクローニングされて、ｐＹＬＶＳ−ＭＡＲが作成された。ｐＹＬＶＳ−ＭＡＲとｐＹＬＴＡＣ７４７−ＨＰＴとは、Ｃｒｅ遺伝子を含み、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する大腸菌ＮＳ３５２９株を共形質転換するのに使用されて、組換えられたプラスミドを形成した。前記組換えられたプラスミドは、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むＬＢ培地上で選択され、精製されて、Ｃｒｅ遺伝子を欠いた大腸菌ＤＨ１０Ｂに再度導入された。組み込まれたプラスミドは、ｐＹＬＶＳ骨格を切り離すためにＩ−ＳｃｅＩ消化に供された。消化されたプラスミドは、環状プラスミドを形成するために、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで（ＮｏｔＩ部位を含む）オリゴヌクレオチドリンカーＳと連結された。クロラムフェニコール感受性について試験した後、ｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲと名付けられた新しいプラスミドが得られた（図５レーン３）。
【００８２】
　ＧＮＡ遺伝子（５．２ｋｂ）は供与体ベクターＩＩｐＹＬＳＶにサブクローニングされて、ｐＹＬＳＶ−ＧＮＡが作成された。ｐＹＬＳＶ−ＧＮＡとｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲとが、組換えられたプラスミドを形成するためにＮＳ３５２９株に共形質転換された。前記組換えられたプラスミドは、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むＬＢ培地上で選択され、精製されて、ＤＨ１０Ｂに再度導入された。組み込まれたプラスミドは、精製され、ｐＹＬＳＶ骨格を切り離すために、ＰＩ−ＳｃｅＩ消化に供された。消化されたプラスミドは、環状プラスミドを形成するために、Ｔ４リガーゼで（ＮｏｔＩを含む）オリゴヌクレオチドリンカーＶと連結された。クロラムフェニコール感受性について試験した後、ｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲ−ＧＮＡと名付けられた新しいプラスミドが得られた（図５レーン４）。
【００８３】
　ＰｉｎＩＩ遺伝子（３．０ｋｂ）は、ｐＹＬＶＳにサブクローニングされて、ｐＹＬＶＳ−ＰｉｎＩＩが作成された。ｐＹＬＶＳ−ＰｉｎＩＩとｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲ−ＧＮＡとは、組換えられたプラスミドを形成するためにＮＳ３５２９株に共形質転換された。組換えられたプラスミドは、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むＬＢ培地上で選択され、精製されて、ＤＨ１０Ｂに再度導入された。組み込まれたプラスミドは、ｐＹＬＶＳ骨格を切り離すためにＩ−ＳｃｅＩ消化に供され、環状プラスミドを形成するためにＴ４ＤＮＡリガーゼでリンカーＳと連結された。クロラムフェニコール感受性について試験された後、ｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲ−ＧＮＡ−ＰｉｎＩＩと名付けられた新しいプラスミドが得られた（図５レーン５）。
【００８４】
　もともと同一のプラスミドベクターにクローニングされたイネのＰＡＣ２２／ＲＣＨ１０遺伝子（６．４ｋｂ）は、ｐＹＬＳＶにサブクローニングされて、ｐＹＬＳＶ−ＲＡＣ２２／ＲＣＨ１０が作成された。ｐＹＬＳＶ−ＲＡＣ２２／ＲＣＨ１０と、ｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲ−ＧＮＡ−ＰｉｎＩＩとは、ＮＳ３５２９株に共形質転換され、組換えプラスミドが形成された。組換えられたプラスミドは、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むＬＢ培地上で選択され、精製されて、ＤＨ１０Ｂに再度導入された。組み込まれたプラスミドは、精製され、ｐＹＬＳＶ骨格を切り離すためにＰＩ−ＳｃｅＩ消化に供された。消化されたプラスミドは、環状プラスミドを形成するために、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでオリゴヌクレオチドリンカーＶと連結された。クロラムフェニコール感受性について試験した後、ｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲ−ＧＮＡ−ＰｉｎＩＩ−ＴＡＣ２２／ＲＣＨ１０と名付けられた新しいプラスミドが得られた（図５、レーン６）。
【００８５】
　Ｘａ２１遺伝子（９．７ｋｂ）は、ｐＹＬＶＳにサブクローニングしてｐＹＬＶＳ−Ｘａ２１が作成された。ｐＹＬＶＳ−Ｘａ２１と、ｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲ−ＧＮＡ−ＰｉｎＩＩ−ＴＡＣ２２／ＲＣＨ１０とが、ＮＳ３５２９株に共形質転換するのに使用され、組換えられたプラスミドが形成された。前記組換えられたプラスミドはカナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むＬＢ培地上で選択され、精製されて、ＤＨ１０Ｂに再度導入された。組み込まれたプラスミドは精製され、ｐＹＬＳＶ骨格を切り離すためにＩ−ＳｃｅＩ消化に供された。消化されたプラスミドは、環状プラスミドを形成するために、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでオリゴヌクレオチドリンカーＳと連結された。クロラムフェニコール感受性について試験した後、ｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲ−ＧＮＡ−ＰｉｎＩＩ−ＴＡＣ２２／ＲＣＨ１０−Ｘａ２１と名付けられた新しいプラスミドが得られた（図５、レーン７、Ｘａ２１遺伝子は２個のＮｏｔＩ部位を内部に有することに注意せよ）。
【００８６】
　Ｂａｒ遺伝子（１．８ｋｂ）は、ｐＹＬＳＶにサブクローニングされ、ｐＹＬＳＶ−Ｂａｒが作成された。ｐＹＬＳＶ−Ｂａｒと、ｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲ−ＧＮＡ−ＰｉｎＩＩ−ＴＡＣ２２／ＲＣＨ１０−Ｘａ２１とは、ＮＳ３５２９株に共形質転換するために使用され、組換えられたプラスミドが形成された。前記組換えられたプラスミドは、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むＬＢ培地上で選択され、精製されて、ＤＨ１０Ｂに再度導入された。組み込まれたプラスミドは、精製され、ｐＹＬＳＶ骨格を切り離すためにＰＩ−ＳｃｅＩ消化に供された。消化されたプラスミドは、環状プラスミドを形成するためにＴ４ＤＮＡリガーゼでオリゴヌクレオチドリンカーＶと連結された。クロラムフェニコール感受性について試験した後、ｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲ−ＧＮＡ−ＰｉｎＩＩ−ＴＡＣ２２／ＲＣＨ１０−Ｘａ２１−Ｂａｒと名付けられた新しいプラスミドが得られた（図５、レーン８）。
【００８７】
　先に得られたｐＹＬＶＳ−ＭＡＲと、ｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲ−ＧＮＡ−ＰｉｎＩＩ−ＴＡＣ２２／ＲＣＨ１０−Ｘａ２１−Ｂａｒとは、大腸菌ＮＳ３５２９株に共形質転換するのに用いられ、組換えられたプラスミドが形成された。プラスミドは、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むＬＢ培地上で選択され、精製されて、ＤＨ１０Ｂに再度導入された。前記プラスミドは、精製され、ｐＹＬＶＳ骨格を切り離すためにＩ−ＳｃｅＩ消化に供された。消化されたプラスミドは、環状プラスミドを形成するためにＴ４ＤＮＡリガーゼでオリゴヌクレオチドリンカーＳと連結された。クロラムフェニコール感受性について試験した後、ｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲ−ＧＮＡ−ＰｉｎＩＩ−ＴＡＣ２２／ＲＣＨ１０−Ｘａ２１−Ｂａｒ−ＭＡＲと名付けられた新しいプラスミドが得られた（図５、レーン９）。
【００８８】
　ＬＢとＲＢとに挟まれたＧＵＳ遺伝子（ＬＢ／ＧＵＳ／ＲＢ、３．０ｋｂ）はｐＹＬＳＶにサブクローニングされて、ｐＹＬＳＶ−ＬＢ／ＧＵＳ／ＲＢが作成された。ｐＹＬＳＶ−ＬＢ／ＧＵＳ／ＲＢと、ｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲ−ＧＮＡ−ＰｉｎＩＩ−ＴＡＣ２２／ＲＣＨ１０−Ｘａ２１−Ｂａｒ−ＭＡＲとはＮＳ３５２９を共形質転換するために用いられ、組換えられたプラスミドが形成された。前記組換えられたプラスミドは、カナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むＬＢ培地上で選択され、精製されて、ＤＨ１０Ｂに再度導入された。組み込まれたプラスミドは、精製され、ｐＹＬＶＳ骨格を切り離すためにＰＩ−ＳｃｅＩ消化に供され、環状プラスミドを形成するためにＴ４ＤＮＡリガーゼでリンカーＶと連結された。クロラムフェニコールの感受性について試験した後、ｐＹＬＴＡＣ７４７ＨＰＴ−ＭＡＲ−ＧＮＡ−ＰｉｎＩＩ−ＴＡＣ２２／ＲＣＨ１０−Ｘａ２１−Ｂａｒ−ＭＡＲ−ＬＢ／ＧＵＳ／ＲＢと名付けられた新しいベクターが得られた（図５、レーン１０）。
【００８９】
　最終的なコンストラクトは、１０個の外来遺伝子および機能的ＤＮＡ配列を含み、ｐＹＬＴＡＣ７４７−１０Ｇと再度名付けられた。ＲＢとＬＢとの間の遺伝子の構造は図６に示されている。かっこ内の数字は、前記ベクターに挿入された遺伝子またはＤＮＡ配列の順序である。Ｎは、リンカーＳおよびリンカーＶから由来したか、あるいは、前記ベクターおよびＸａ２１遺伝子の中に存在していたＮｏｔＩ部位を表す。ＮｏｔＩ部位の間に記載された数字は、断片の長さ（ｋｂ）を示す。本実施例は、本発明の方法が異なる由来の複数の遺伝子およびＤＮＡ配列を単一のベクターに構築するうえで効果的であることを実証する。
【実施例４】
【００９０】
　本実施例は、複数の遺伝子を一緒にイネのゲノムに導入するうえで前記複数遺伝子形質転換ベクターが効果的であることを示す。
【００９１】
　プラスミドｐＹＬＴＡＣ７４７−１０Ｇは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌ＥＨＡ１０５株に導入され、アグロバクテリウム菌クローンＥＨＡ１０５［ｐＹＬＴＡＣ７４７−１０Ｇ］が得られた。ＥＨＡ１０５［ｐＹＬＴＡＣ７４７−１０Ｇ］はイネのカルス組織を形質転換するのに用いられた。ｐＹＬＴＡＣ７４７−１０Ｇは、ハイグロマイシンおよび／または除草剤Ｂａｓｔａで形質転換体を選択するのに使用可能なＨＰＴおよびＢａｒ遺伝子を含む。イネの胚は、カルスを誘導するために２５°Ｃ暗所で培地に接種された。誘導されたカルスはサブカルチャー用培地に移された。ＥＨＡ１０５［ｐＹＬＴＡＣ７４７−１０Ｇ］細胞は２８°Ｃ２４時間ＹＭ寒天培地上で培養され、その後、ＯＤ５５０が０．５〜１．０になるまで２８°Ｃで１００μモル／Ｌのアセトシインゴン（ａｃｅｔｏｓｙｉｎｇｏｎｅ）を含むＭＢ液体培地４０ｍｌ中で培養された。前記カルスは、ＥＨＡ１０５［ｐＹＬＴＡＣ７４７−１０Ｇ］を２０分間接種され、ＭＢ寒天培地に移されて、２５°Ｃ７２時間暗所で培養された。前記カルスは、選択培地のための５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含む培地に４週間移された。選択の後、前記カルスは再生培地に移されて植物体が再生された。５０個を上回る形質転換されたイネの植物個体が得られた。
【実施例５】
【００９２】
　本実施例は、分子ハイブリダイゼーション法による形質転換イネ植物からの外来遺伝子の検出である。
【００９３】
　ゲノムＤＮＡは、Ｔ０トランスジェニックイネ植物から単離され、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで消化されて、アガロースゲル上で泳動された。ハイブリダイゼーション用膜にブロッティングした後、外来遺伝子の断片をプローブとして、イネのゲノムに組み込まれた外来遺伝子が検出された。図７に示すとおり、大抵のトランスジェニック植物においては、同一のＴ−ＤＮＡ領域に存在する全ての外来遺伝子は一緒にイネのゲノムに導入された。レーンＭは、ラムダＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ分子量マーカーである。これらの結果は、本発明に従って構築された複数遺伝子ベクターが複数の遺伝子を植物ゲノムに効果的に導入することができることを証明する。
【００９４】
　本発明は好ましい実施態様との関係で説明されたが、添付する特許請求の範囲およびその精神から逸脱することなしに、多くの他の可能な改変および変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１Ａ】本発明の複数遺伝子構築ベクターシステムを構成する、ｐＹＬＴＡＣ７４７と名付けられた供与体ベクターを示す概略図。
【図１Ｂ】本発明の複数遺伝子構築ベクターシステムを構成する、ｐＹＬＶＳと名付けられた供与体ベクターを示す概略図。
【図１Ｃ】本発明の複数遺伝子構築ベクターシステムを構成する、ｐＹＬＳＶと名付けられた供与体ベクターを示す概略図。
【図２Ａ】第１の遺伝子（遺伝子１）組換えのための遺伝子構築工程の第１サイクル、あるいは、奇数番目の遺伝子組換えのための遺伝子構築工程の奇数番目のサイクルを示す概略図。
【図２Ｂ】第２の遺伝子（遺伝子２）組換えのための遺伝子構築工程の第２サイクル、あるいは、偶数番目の遺伝子組換えのための遺伝子構築工程の偶数番目のサイクルを示す概略図。
【図３】受容体ベクターｐＹＬＴＡＣ７４７の構築を示す概略図。
【図４】供与体ベクターｐＹＬＶＳおよびｐＹＬＳＶの構築を示す概略図。
【図５】受容体ベクターｐＹＬＴＡＣ７４７に異なる数の遺伝子が含まれる複数遺伝子コンストラクトの制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩによる消化産物の電気泳動パターン。
【図６】１０個の遺伝子またはＤＮＡ断片が挿入された複数遺伝子コンストラクトｐＹＬＴＡＣ７４７−１０Ｇの概略図。
【図７】複数遺伝子コンストラクトｐＹＬＴＡＣ７４７−１０Ｇで形質転換されたトランスジェニックイネ植物における複数の遺伝子のサザンブロットハイブリダイゼーション法による検出結果を示す図。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列表の配列番号１：ＭＣＳ〜ｌｏｘＰ〜Ｉ−ＳｃｅＩの合成された断片。
配列表の配列番号２：ｌｏｘＰ〜ＰＩ−ＳｃｅＩ〜ＭＣＳ〜Ｉ−ＳｃｅＩの合成された断片。
配列表の配列番号３：ｌｏｘＰ〜Ｉ−ＳｃｅＩ〜ＭＣＳ〜ＰＩ−ＳｃｅＩの合成された断片。
【図１Ａ】
2004121248.tif 000014
【図１Ｂ】
2004121248.tif 000015
【図１Ｃ】
2004121248.tif 000016
【図２Ａ】
2004121248.tif 000017
【図２Ｂ】
2004121248.tif 000018
【図３】
2004121248.tif 000019
【図４】
2004121248.tif 000020
【図５】
2004121248.tif 000021
【図６】
2004121248.tif 000022
【図７】
2004121248.tif 000023
【配列表】
2004121248000001.app