(57)【要約】【課題】　天然型のブタインターロイキン８（IL-8）を容易に大量に得る方法の提供。【解決手段】　本発明は、非刺激下においてブタIL-8を定常的に産生する細胞株、及び該細胞株を培養することを含む、ブタIL-8の製造方法を提供する。本発明は更に、IL-8産生機構の解明に役立ち得るIL-8高産生細胞及び低産生細胞、及び血清の不存在下においてもIL-8を産生し得る細胞株を提供する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　非刺激下においてブタインターロイキン８（IL-8）を産生する細胞株。
【請求項２】
　刺激が、LPS、分裂促進因子、レクチン、ウイルス、及びIL-8以外のサイトカインとの接触によって引き起こされるものである、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
　ブタ骨髄細胞由来である、請求項１または２に記載の細胞株。
【請求項４】
　受託番号がＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２５またはＦＥＲＭ　Ｐ−１９５２０である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項５】
　血清を実質的に含有しない培地中でIL-8を産生する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項６】
　受託番号がＦＥＲＭ　Ｐ−１９５２１である、請求項５に記載の細胞株。
【請求項７】
　請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞株を培養することを含む、ブタIL-8の製造方法。
【請求項８】
　ブタIL-8を含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞株の培養上清。
【請求項９】
　インターロイキン１β（IL-1β）、インターロイキン１０（IL-10）、インターロイキン１２（IL-12）、インターフェロンγ（IFN-γ）、及び腫瘍壊死因子α（TNF-α）を実質的に含有しない、請求項８に記載の培養上清。
【請求項１０】
　ブタ骨髄細胞を培地中で培養し、得られた線維芽細胞様の形態を示す細胞を更に培養することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞株の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、ブタインターロイキン８（IL-8）を産生する細胞株及びブタIL-8の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　サイトカインは、主としてリンパ球や単球から産生される、免疫及び疾患の治療において有用な種々のタンパク質性生理活性物質である。一般に、細胞からのサイトカインの産生は、リポ多糖（LPS）、分裂促進因子、レクチン、ウイルス、及び他のサイトカインによる刺激によって引き起こされることが知られている。
【０００３】
　サイトカインの一種であるインターロイキン８（IL-8）は、炎症時にマクロファージ等の種々の細胞から産生され、急性炎症反応における好中球の遊走・活性化に関わる因子である。従来、ブタを始めとする哺乳動物において、IL-8を産生させるためには、動物個体からマクロファージを採取し、LPS等の適当な刺激剤を用いてマクロファージを刺激することによってIL-8を産生させるか、あるいはIL-8遺伝子をバキュロウイルス等のベクターに組み込んで組換えIL-8を産生していた（例えば非特許文献１〜４参照）。
【０００４】
【非特許文献１】オカモト　Ｓ．（Okamoto S.）ら、「ザ　ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（The Journal of biological chemistry）」　（米国）　1994年　269巻　11号　p.8582-p.8589
【非特許文献２】ピアソン　リン　Ｇ．（Pearson Lin G.）ら、　「ザ　ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（The Journal of biological chemistry）」　（米国）　1994年　269巻　1号　p.77-p.85
【非特許文献３】レディー　Ｎ．Ｒ．（Reddy N.R.）ら、「ベテリナリー　イミュノロジー　アンド　イミュノパソロジー（Veterinary immunology and immunopathology）」　（オランダ）　2000年　74巻　1-2号　p.31-p.46
【非特許文献４】ヤスモト　Ｋ．（Yasumoto K.）ら、「ザ　ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（The Journal of biological chemistry）」　（米国）　1992年　267巻　31号　p.22506-p.22511
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　しかしながら、従来の方法では、天然型のブタIL-8を大量に得ることはできなかった。更に、組換えブタIL-8では生産コストがかかり、精製工程も煩雑であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
　本発明者らは上記課題に鑑み種々検討した結果、意外なことに、特定の細胞を培養するだけで、ブタマクロファージ等が産生するブタIL-8を、刺激を与えることなく常時大量に採取できるようになることを見出した。IL-8は培養上清に分泌され、しかも培養上清中にIL-8以外のサイトカインはほとんど分泌されないことから、この上清を更に精製することなく使用することが可能であることが明らかとなった。
【０００７】
　すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１０）を提供する。
（１）　非刺激下においてブタインターロイキン８（IL-8）を産生する細胞株。
（２）　刺激が、LPS、分裂促進因子、レクチン、ウイルス、及びIL-8以外のサイトカインとの接触によって引き起こされるものである、上記（１）に記載の細胞株。
（３）　ブタ骨髄細胞由来である、上記（１）または（２）に記載の細胞株。
（４）　受託番号がＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２５またはＦＥＲＭ　Ｐ−１９５２０である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞株。
（５）　血清を実質的に含有しない培地中でIL-8を産生する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞株。
（６）　受託番号がＦＥＲＭ　Ｐ−１９５２１である、上記（５）に記載の細胞株。
（７）　上記（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞株を培養することを含む、ブタIL-8の製造方法。
（８）　ブタIL-8を含有する、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞株の培養上清。
（９）　インターロイキン１β（IL-1β）、インターロイキン１０（IL-10）、インターロイキン１２（IL-12）、インターフェロンγ（IFN-γ）、及び腫瘍壊死因子α（TNF-α）を実質的に含有しない、上記（８）に記載の培養上清。
（１０）　ブタ骨髄細胞を培地中で培養し、得られた線維芽細胞様の形態を示す細胞を更に培養することを含む、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞株の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
　本発明の細胞株は、刺激を与えることなく培養するだけで、培養液中に天然型のブタIL-8が常時採取できる。
　また、本発明によって得られたIL-8を常時大量に産生する細胞、及び場合によってその1/10程度の量しか産生しない細胞を用い、IL-8産生機構の解明に役立てることができる。
　更に、牛血清等の血清を含まない培地中でIL-8を多量に産生する細胞から、IL-8の精製が容易に、かつ低いコストでできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
　本発明は、非刺激下においてブタインターロイキン８（IL-8）を定常的に産生する細胞株を提供する。本明細書において、「非刺激下」とは、LPS、分裂促進因子、レクチン、ウイルス、及び他のサイトカイン等の、通常IL-8産生のために用いられる刺激剤の添加（接触）がないことをいう。尚、本発明の細胞株は非刺激下でIL-8を産生するが、このことは、上記LPS等で刺激した場合にIL-8産生量が変化しないことを意味するものではなく、刺激剤の添加によって産生量が更に上昇する細胞株も本発明の細胞株に含まれる。
【００１０】
　本発明の細胞株は、以下の方法により、ブタIL-8産生細胞として確立することができる。
　ブタ骨髄細胞を培養し、RPMI培地等の培地中で長期継代する。本発明において、ブタ骨髄細胞は入手可能なものであればいずれでも良い。その結果、円形の大型リンパ球様浮遊細胞と紡錘形の線維芽細胞様の形態を示す培養面付着細胞が得られる。この線維芽細胞様の形態を示す培養面付着細胞を長期継代することにより、本発明の細胞株を得ることができる。本発明において、継代による培養は、好ましくは３日以上７日以内で行う。このようにして得られた細胞株を、本発明者等はSL-24と命名した。
【００１１】
　本発明の細胞株はCD1b及び抗ブタ単球／マクロファージ抗体が陽性であり、形態的に水解酵素が認められることから、起源は単球系細胞であると思われる。しかし貪食能は認められない。
【００１２】
　上記のようにして得られた本発明の細胞株を、例えば５％ウシ胎児血清加RPMI培地で培養すると、培養液中に、ブタIL-8が多量に産生されることが明らかになった。SL-24細胞株においてブタサイトカイン定量キット（Bio-Source International Inc.）で測定した結果、６日間で９４ng/mlのブタIL-8を産生した。得られたIL-8はブタ白血球遊走能を有していた。
【００１３】
　上記のようにして得られた本発明の細胞株は、そのまま使用してIL-8の製造を行うことも可能であるが、数種類の細胞が混在する可能性もあることから、当分野で通常行われている手法によってクローニングを行うことで、安定してIL-8を産生し得る細胞を得ることができる。本発明者等は、上記SL-24細胞を0.1％トリプシン−0.05％EDTAで単離浮遊させ、浮遊液を２倍段階希釈して96穴プラスチックマイクロプレートで培養し、単離した細胞が増殖して１個のコロニーを形成したウェルから細胞を0.1％トリプシン−0.05％EDTAを用いて回収し、２種類のクローン細胞を得た。
【００１４】
　得られた細胞の一方は線維芽細胞の形態を有する長形の細胞であり、他方は多角で短形の細胞であり、形態で明らかに区別することができた。前者をLC（Long form Colony）、後者をSC（Short form Colony）と命名した。
【００１５】
　LC細胞及びSC細胞は、同じSL-24細胞由来であるにも関わらず、サイトカイン産生能が明らかに異なっていた。すなわち、LC細胞はLPS等の刺激がない状態の７日間の培養で非常に多量のIL-8（約70ng/ml）を産生したが、SC細胞はLC細胞と比較して細胞数は約２／３であるにも関わらず、１／１０程度の量のIL-8（約７ng/ml）を産生したに過ぎなかった。
【００１６】
　IL-8を多量に産生し得る本発明の細胞株は、LPS等による刺激を行うことなくIL-8を安定して産生するので、IL-8を製造する上で非常に有用である。また、従来マクロファージ等の細胞からLPS等の刺激によってIL-8が産生・放出されていたのに対し、こうした刺激なしにIL-8を産生する細胞が得られたことで、IL-8産生のメカニズムの解明に役立てることができる。更に、起源が同じであるにも関わらず、IL-8高産生細胞とIL-8低産生細胞が得られたことで、これらの双方を比較検討することで、IL-8産生のメカニズムの解明に更に役立てることができる。
【００１７】
　本発明の細胞株は、無血清培地中で培養して順化した細胞を樹立することができる。無血清培地としては、当分野で通常用いられているものであればいずれでも良く、特に限定するものではないが、例えばVP-SFM培地（GIBCO）等を好適に使用することができる。本発明者等は、得られた順化細胞株においても非刺激下におけるIL-8産生機能が保持されていることを確認し、これをNS-LC細胞と命名した。NS-LC細胞はLC細胞と匹敵するIL-8産生量を示し、血清のない状態で多量のIL-8を産生できる。
【００１８】
　上記のようにして得られる本発明の細胞株は、７日間の培養により、総計で少なくとも5ng/ml、好ましくは10ng/ml以上、より好ましくは40ng/ml以上、更に好ましくは60ng/ml以上のIL-8を産生する。この際、培地中には、培養開始時点からの経過日数によって増減すること等から特に限定するものではないが、１ｍｌの培地当たり約１０５〜約１０６個の細胞が存在する。
【００１９】
　本発明はまた、上記細胞株を培養することを含む、ブタIL-8の製造方法を提供する。
　本発明の細胞株は、７日間の培養において、培養上清中に少なくとも5ng/mlのIL-8を産生するため、本発明の細胞株を単に培養することにより、従来のように刺激を与えることなくブタインターロイキン８を容易に得ることができる。本発明の細胞株の製造及び維持のために用いる培地としては、当分野において哺乳動物細胞の培養等に通常用いられている培地であればいずれでも良く、特に限定されるものではないが、好ましくは血清含有RPMI培地が挙げられる。しかしながら、上記したように、本発明の細胞株を無血清培地中における培養に適するように順化した場合には、無血清培地中で培養を行う。培養温度等の他の条件も通常用いられているものであれば良く、特に限定されない。培養時間は、目的とするIL-8の量に応じて適宜選択することができるが、好ましくは５日〜７日程度である。尚、長期間培養する場合には、当分野で通常行われているように、培地の交換や継代等の操作を行うことが必要である。
【００２０】
　本発明の細胞株は、ブタIL-8を細胞外に分泌するため、培養液中にIL-8が蓄積する。従って、IL-8は培養上清から回収することができる。培養上清中にIL-8以外のサイトカインが存在する場合には、その作用も現れることから、使用前に上清を精製することが必要である。従って、この培養上清を、必要に応じ、当分野で通常行われる各種クロマトグラフィー等の手段を用いて精製することができる。しかしながら、培養上清中にIL-8以外のサイトカイン、具体的にはインターロイキン１β（IL-1β）、インターロイキン１０（IL-10）、インターロイキン１２（IL-12）、インターフェロンγ（IFN-γ）、及び腫瘍壊死因子α（TNF-α）を実質的に含有しないことが判明したことから、培養上清をそのままIL-8溶液として用いることも可能である。尚、細胞中にはレトロウイルス等の混入もないことが確認されており、副作用等のおそれもない。
　すなわち本発明はまた、ブタIL-8を含有する、上記細胞株の培養上清を提供する。
【００２１】
　上記したように、本発明の培養上清は、インターロイキン１β（IL-1β）、インターロイキン１０（IL-10）、インターロイキン１２（IL-12）、インターフェロンγ（IFN-γ）、及び腫瘍壊死因子α（TNF-α）を実質的に含有しない。ここで、インターロイキン１β等を「実質的に含有しない」とは、ELISA、RT-PCR等の通常用いられる検出手段によってはほとんど、あるいは全く検出されないことをいう。尚、本発明の培養上清からはIL-1α及びIL-6が検出されたが、微量であり、培養上清をそのままIL-8溶液として用いたとしても問題はほとんどないと考えられる。
【００２２】
　更に、無血清培地中での培養に順化した細胞株の培養上清を用いれば、血清を実質的に含有しないため、IL-8の精製をする際に容易に行うことができる他、培養上清をそのまま用いたとしても望ましくない免疫応答が起こることもない。本明細書において「血清を実質的に含有しない」とは、ウシ血清等の培養のための血清が添加されていないこと、及び血清が添加されていない培地中で培養された細胞の培養上清のことをいう。しかしながら、「血清を実質的に含有しない」とは、本発明の細胞株の製造及び維持のための初期の培養に用いた培地由来の血清が微量に残存している場合を除外するものではない。
【００２３】
　本発明は更に、ブタ骨髄細胞を培地中で培養し、得られた線維芽細胞様の形態を示す細胞を更に培養することを含む、本発明の細胞株の製造方法を提供する。本発明の方法は更に、安定してIL-8を産生する細胞を得るためのクローニング工程、及び無血清培地中での培養に順化させる工程を含むことができる。
【００２４】
　尚、本発明者等が見出した細胞株SL-24は、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に２００２年９月１８日付けで受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２５として寄託されている。また、細胞株SL-24からクローニングによって得られたブタ細胞株SC(SL-24)、LC(SL-24)、NS-LC(SL-24)はそれぞれ上記の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに２００３年９月１０日付けで受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９５１９、ＦＥＲＭ　Ｐ−１９５２０、及びＦＥＲＭ　Ｐ−１９５２１としてそれぞれ寄託されている。
【００２５】
　以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
　細胞株の作製
　白血病（診断病名：悪性リンパ腫）を併発したブタの骨髄（大腿骨から分離）を無菌的に取り出し、低浸透圧のトリス緩衝液を加え、赤血球を溶血させた。赤血球を溶血させた骨髄細胞を３％ウシ胎児血清を含むRPMI培地（日水製薬株式会社：05918）で３回洗浄した。
【００２７】
　洗浄した細胞を１０％ウシ胎児血清を含むRPMI培地に浮遊し、５％ＣＯ２供給下の炭酸ガスふ卵機内で３７℃で培養した。
【００２８】
　培養液に浮遊し、増殖しているリンパ球形の細胞を取り除き、培養シャーレもしくは培養ボトルの壁面に付着し増殖している細胞のみにし、培養液交換（培養５〜７日後）を約６ヶ月間続けた。付着細胞の培養を続け、永久的に培養可能な細胞株を得た（図１）。この細胞株をSL-24細胞と命名した。
【実施例２】
【００２９】
　SL-24細胞によるIL-8の産生
　SL-24細胞を培養した培養液を８日間毎日採取し、細胞数及びIL-8産生量を測定した（図２）。ブタサイトカイン定量キット（Bio-Source International Inc.）で測定した結果、図２から明らかなように、６日間で９４ng/mlのブタIL-8を産生した。
【００３０】
　次いで、培養上清を用いてブタ白血球遊走試験を行った。ブタ白血球遊走試験は３ヶ月齢のドュロック及びラージホワイトの２種類のブタを用い、フィコールにより白血球を単離し、サンプルを入れた２４穴プラスチックプレートに透過膜を通過し遊走してくる白血球の数を算定した。また白血球の核分葉の度合いも観察した。その結果、ブタサイトカイン定量キットにより測定したIL-8の産生量にほぼ一致して、ブタ白血球遊走能が上昇した（図３）。このことより、SL-24細胞が産生するIL-8は生物活性を有しており、天然のIL-8と同様のものと判断された。
【実施例３】
【００３１】
　培養上清含有サイトカイン組成
　SL-24細胞の培養上清について、他のサイトカインの含有量を測定した。IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10及びTNF-αについては、ブタサイトカイン定量キット（Bio-Source International Inc.）で測定した。IL-1α、IL-6及びIL-12は報告されているように、RT-PCR法またはNested-PCR法で検出を行った。その結果、IL-8が多量に検出された他は、IL-1α及びIL-6がわずかに検出され、その他のサイトカインは検出されなかった。結果を表１に示す。
【００３２】
　　　ブタSL-24細胞におけるサイトカイン産生
【表１】
2004129660.tif 000002
＊ELISAによるサイトカイン検出（ng/ml）
＊＊RT-PCRによるサイトカイン検出
＊＊＊Nested-PCRによるサイトカイン検出
【実施例４】
【００３３】
　IL-8産生細胞のクローニング
　SL-24細胞を0.1％トリプシン−0.05％EDTAで単離浮遊させ、浮遊液を２倍段階希釈して96穴プラスチックマイクロプレートで培養した。単離した細胞が増殖して１個のコロニーを形成したウェルから細胞を0.1％トリプシン−0.05％EDTAを用いて回収し、２種類のクローン細胞を得た。
【００３４】
　得られた細胞の一方は線維芽細胞の形態を有する長形の細胞であり、他方は多角で短形の細胞であり、形態で明らかに区別することができた。前者をLC（Long form Colony）細胞、後者をSC（Short form Colony）細胞と命名した（図４）。ほとんどのコロニーはSC細胞であり、LC細胞のコロニーは１ウェルのみしか得ることができなかった。
【実施例５】
【００３５】
　クローンによるIL-8産生の検出
　実施例４で得られたLC細胞及びSC細胞について、培養液中のサイトカイン産生量をブタサイトカイン定量キット（Bio-Source International Inc.）を用いて測定した。
【００３６】
　図５の結果から明らかなように、LC細胞はLPS等の刺激がない状態で非常に多量のIL-8（約70ng/ml）を産生したが、SC細胞はLC細胞と比較して細胞数は約２／３であるにも関わらず、１／１０程度の量のIL-8（約７ng/ml）を産生したに過ぎなかった。
【実施例６】
【００３７】
　無血清培地中でIL-8を産生する細胞株の樹立
　実施例５で得られたLC細胞を５％ウシ胎児血清を含むRPMI培地で培養し、シートを形成したLC細胞の培地を無血清培地VP-SFM（GIBCO）に交換し、２〜３日培養した。その後、細胞をトリプシンで消化し、VP-SFM培地で１回洗浄した後、２倍（１本から２本）に増やして培養した。細胞の様子を観察しながら、培養２日後に培地を新しいVP-SFM培地と交換し、２〜３日培養した後にトリプシンで消化し、上記と同様に培養した。この継代を５〜６代繰り返すと、LC細胞由来の細胞が増殖し、培養３〜４日で３倍から４倍の割合で継代可能となった。得られた細胞株において非刺激下におけるIL-8産生機能が保持されていることを確認し、これをNS-LC細胞と命名した。
【００３８】
　図６に無血清培地VP-SFM中で培養したNS-LC細胞、及び血清含有培地RPMI中で培養したLC細胞及びSC細胞のIL-8産生量及び培養細胞数を示す。この結果から明らかなように、NS-LC細胞はLC細胞と匹敵するIL-8産生量を示し、血清のない状態で多量のIL-8を産生できる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
　IL-8は、マクロファージ由来の白血球遊走因子であり、炎症部位への白血球の動員において重要な役割を果たしている。ブタにおいては、急性の炎症の場合には炎症を起こしたブタ自身が産生する内因性IL-8等の作用によって治癒するが、慢性の疾患においては内因性のIL-8の産生は低下していることが考えられる。このような個体に対して、IL-8を外部から投与することにより、症状の軽減及び治癒が可能である。従って、本発明によって得られるブタIL-8を、こうした慢性疾患に罹患しているブタに投与することで、疾患を治療することが可能となる。
【００４０】
　一方、子ブタの肺炎では、子ブタ自身が産生するIL-8が症状を重くしていることが報告されている。本発明の細胞株を用いてIL-8産生のメカニズムを解明することで、IL-8産生の制御が可能となり、こうした疾患の治療につなげることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】SL-24細胞培養３日目にギムザ染色を行った結果の写真を示す。倍率は４００倍である。
【図２】ブタサイトカイン定量キット（Bio-Source International co.）により測定したSL-24細胞のIL-8産生量を棒グラフで示す。折れ線グラフは細胞数を示す。
【図３】ブタ白血球遊走試験の結果を示す。Ｄ：ドュロック、Ｗ：ラージホワイト
【図４】SL-24細胞よりクローニングした紡錘形のLC細胞（ａ）及びSC細胞（ｂ）をギムザ染色した写真を示す。倍率は４００倍である。
【図５】ブタサイトカイン定量キットにより測定したLC細胞及びSC細胞のIL-8産生量（ａ）及び培養細胞数（ｂ）を折れ線グラフで示す。
【図６】ブタサイトカイン定量キットにより測定したLC細胞、SC細胞及びNS-LC細胞のIL-8産生量（ａ）及び培養細胞数（ｂ）を折れ線グラフで示す。
【図１】
2004129660.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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