(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ホルモンのような生体内ポリペプチドの生体内での安定化を図る方法を提供すること、及び、該方法を魚類に適用して、魚類の生体内生理機能の調節のために投与されるペプチドの安定化を図る方法を提供すること。【解決手段】胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるポリペプチド、その変異体、及び該ペプチドをコードする遺伝子を用いて、生体内ポリペプチドの生体内における安定化を図ることよりなる。本発明の方法は、魚類における性腺刺激ホルモンや成長ホルモン等の生体内導入に適用して、魚類の産卵誘発や産卵調節のような成熟調節、或いは魚類の成長調節における投入ポリペプチドの安定化を図る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなる、生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる、請求項１記載の生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチド。
【請求項４】
請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項５】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチド。
【請求項６】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与することを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
生体内ポリペプチドが、性腺刺激ホルモン又は成長ホルモンであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のＤＮＡ又はポリペプチド。
【請求項８】
生体内ポリペプチドのカルボキシ末端側に、請求項５又は６記載のポリペプチドを結合したことを特徴とする生体内安定化ポリペプチド。
【請求項９】
生体内ポリペプチドが、性腺刺激ホルモン又は成長ホルモンであることを特徴とする請求項８記載の生体内安定化ポリペプチド。
【請求項１０】
サブユニット構造を備えた生体内ポリペプチドの一方のサブユニットのカルボキシ末端側に、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域ペプチドを結合したことを特徴とする請求項８又は９記載の生体内安定化ポリペプチド。
【請求項１１】
魚類の生体内ポリペプチドのカルボキシ末端側に、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域ペプチドを結合したことを特徴とする請求項８〜１０のいずれか記載の生体内安定化ポリペプチド。
【請求項１２】
魚類の生体内ポリペプチドが、性腺刺激ホルモン又は成長ホルモンであることを特徴とする請求項１１記載の生体内安定化ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２記載の生体内安定化性腺刺激ホルモンを魚類に導入することを特徴とする魚類の成熟調節方法。
【請求項１４】
魚類の成熟調節が、魚類の産卵誘発或いは産卵調節であることを特徴とする請求項１３記載の魚類の成熟調節方法。
【請求項１５】
請求項１２記載の生体内安定化成長ホルモンを魚類に導入することを特徴とする魚類の成長調節方法。
【請求項１６】
生体内ポリペプチドをコードするＤＮＡの３´末端に、請求項１〜４のいずれか記載のＤＮＡを結合した遺伝子を、生体内で発現することを特徴とする生体内発現ポリペプチドの生体内安定化方法。
【請求項１７】
魚類で発現するポリペプチドをコードするＤＮＡの３´末端に、請求項１〜４のいずれか記載のＤＮＡを結合した遺伝子を、魚類生体内で発現することを特徴とする請求項１６記載の生体内発現ポリペプチドの生体内安定化方法。
【請求項１８】
魚類で発現する性腺刺激ホルモンのポリペプチドをコードするＤＮＡの３´末端に、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域ペプチドをコードするＤＮＡを結合した遺伝子を、魚類生体内で発現することを特徴とする魚類の成熟調節方法。
【請求項１９】
魚類の成熟調節が、魚類の産卵誘発或いは産卵調節であることを特徴とする請求項１８記載の魚類の成熟調節方法。
【請求項２０】
魚類で発現する成長ホルモンのポリペプチドをコードするＤＮＡの３´末端に、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域ペプチドをコードするＤＮＡを結合した遺伝子を、魚類生体内で発現することを特徴とする魚類の成長調節方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内ポリペプチドの生体内での安定化機能を付与するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び該ポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを利用した生体内安定化ポリペプチドによる生体内生理機能の調節、特に魚類の成熟調節及び成長調節のような生体内生理機能の調節への利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、ヒトをはじめとして、種々の分野の種々の動物において、生体内に存在するポリペプチドを、生体に投与して、生体の種々の生理機能の調節や、種々の薬理作用を利用した生体の防御などが行われている。
魚類においては、その養殖に際して、性腺刺激ホルモン（生殖腺刺激ホルモン）を用いて、該ポリペプチドを、生体に投与し、魚類の成熟を調節することが行われている。例えば、魚類の養殖における卵の人口孵化に際しては、ウナギやハマチのような通常、産卵を行わない魚に対しては、性腺刺激ホルモンを投与することで、産卵を誘発し、卵や精子を採る方法が行われている。また、マダイやヒラメのような産卵を行う魚に対しては、性腺刺激ホルモンを投入することで、産卵期等を調節し、養殖業者が望む時期に望む量・質の卵や精子を採る方法が行われている。
【０００３】
また、養殖している魚に、成長ホルモン（ポリペプチド）を投与して、魚の成長を促進させたり、魚に抵抗力を付与するポリペプチドを投与して、病気に対する耐性を高める方法も知られている。
このように、例えば、魚類の養殖に際しては、種々のポリペプチドの魚体内への投与が行われているが、その場合に、投与されたポリペプチドの生体内での安定性が問題になる。すなわち、魚類の場合には、上記のようにポリペプチドを投与するには、生け簀の中の魚を捕まえ、その魚に性腺刺激ホルモンを注射器で注射することにより行うのが普通である。この場合、魚に注入されたポリペプチドは、魚体内に注入された後、吸収→代謝→分布→排出の過程を経るが、この生体内の代謝の過程で分解が起こる。したがって、通常、魚体内に注射されたポリペプチドの濃度を一定レベル以上に保つためには、ポリペプチドが減衰する前の所定の期間で、連続的に行わなければならない。
【０００４】
このような、ポリペプチドの魚体への連続投与の作業は、養殖業者にとって、作業にかかる時間とコストの増大の問題をひき起こすだけでなく、ポリペプチドを投与される魚体自体にとっても、例えば、ポリペプチド投与のために魚が弱って食欲を失ったり、魚の成長が阻害されたり、また魚が死亡したりするような、魚への負荷がかかり、大きな影響が及ぼされる。これらの問題を解決するために、養殖業者の間では、魚体内に投与したポリペプチドの延命化（生体内での半減期の延長効果）を図る方策が期待されている。
【０００５】
上記のように、例えば、魚類の養殖の分野では、性腺刺激ホルモンや成長ホルモンのようなポリペプチドを魚体内に投与することが行われており、そのような場合に、投与したポリペプチドの安定性の問題が提起されているが、一般に、生体内にポリペプチドを投与した場合には、その生体内におけるポリペプチドの分解の問題がある。そこで、投与したポリペプチドの本来の効果を有効に利用できるようにするためには、投与したポリペプチドの生体内での安定化を図ることが必要である。したがって、生体内に投与したポリペプチドの安定化は、ペプチドを生体機能の調整に用いる分野の一般的な課題でもある。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１０−３６２８５号公報
【特許文献２】
特開平１０−３６３９８号公報
【特許文献３】
特開平１０−３６３９９号公報
【特許文献４】
ＷＯ９８／２１２３８
【非特許文献１】
Ｍｏｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　６，　９５１−９５９，　１９９２
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ホルモンのような生体内ポリペプチドの生体内での安定化機能を付与するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び該ポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを利用した生体内安定化ポリペプチによる生体内生理機能の調節方法を提供すること、及び特別には、生体内でのポリペプチド安定化機能を付与するポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを利用した魚類の成熟調節及び成長調節のような生体内生理機能の調節を行う方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
通常、霊長類やウマは、（１）胎盤から分泌される胎盤性性腺刺激ホルモン（絨毛性ゴナドトロピン）（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ　ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ：ＣＧ）、（２）下垂体から分泌される濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ：ＦＳＨ）及び（３）黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ：ＬＨ）の３種の性腺刺激ホルモンを持つ。これらのホルモンのうち、ＣＧは、ＦＳＨ及びＬＨと比較してホルモンの半減期が長いことが知られている。本発明者は、この原因究明のため、ホルモンの構造に着目して研究したところ、ＣＧには、ＦＳＨ及びＬＨには存在しないカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）が付加していることが確認された。このカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）が、ホルモンの半減期の延長に関与するかどうか調べた結果、ＣＴＰを、ＦＳＨ及びＬＨに付加したものは、従来のＦＳＨ及びＬＨに比較して、ホルモンの半減期が著しく延長することが判った。また、ＦＳＨ及びＬＨの本来のホルモンの活性には変化はないことが判った。
【０００９】
本発明は、上記知見に基づいてなされたもので、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるポリペプチドを、ホルモンのような生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドとして用いて、生体内におけるポリペプチドの安定化を図ることよりなるものである。本発明は、また、生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチド及びＤＮＡの変異体、及び生体内ポリペプチドと生体内安定化機能を付与するポリペプチドとを結合した生体内安定化ポリペプチドからなる。
【００１０】
更に、本発明は、生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを、魚類における性腺刺激ホルモンや成長ホルモン等の生体内導入に適用して、魚類の産卵誘発や産卵調節のような成熟調節、或いは魚類の成長調節等を行う方法を含むものである。本発明の生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に、該ポリペプチドをコードする塩基配列は、配列表の配列番号１に、例示される。
【００１１】
すなわち本発明は、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなる、生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（請求項１）や、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる、請求項１記載の生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡ（請求項２）や、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ、すなわち、（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は（ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチド（請求項３）や、請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ（請求項４）からなる。
【００１２】
また本発明は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチド（請求項５）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与することを特徴とするポリペプチド（請求項６）や、生体内ポリペプチドが、性腺刺激ホルモン又は成長ホルモンであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のＤＮＡ又はポリペプチド（請求項７）や、生体内ポリペプチドのカルボキシ末端側に、請求項５又は６記載のポリペプチドを結合したことを特徴とする生体内安定化ポリペプチド（請求項８）や、生体内ポリペプチドが、性腺刺激ホルモン又は成長ホルモンであることを特徴とする請求項８記載の生体内安定化ポリペプチド（請求項９）や、サブユニット構造を備えた生体内ポリペプチドの一方のサブユニットのカルボキシ末端側に、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域ペプチドを結合したことを特徴とする請求項８又は９記載の生体内安定化ポリペプチド（請求項１０）や、魚類の生体内ポリペプチドのカルボキシ末端側に、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域ペプチドを結合したことを特徴とする請求項８〜１０のいずれか記載の生体内安定化ポリペプチド（請求項１１）や、魚類の生体内ポリペプチドが、性腺刺激ホルモン又は成長ホルモンであることを特徴とする請求項１１記載の生体内安定化ポリペプチド（請求項１２）からなる。
【００１３】
さらに本発明は、請求項１２記載の生体内安定化性腺刺激ホルモンを魚類に導入することを特徴とする魚類の成熟調節方法（請求項１３）や、魚類の成熟調節が、魚類の産卵誘発或いは産卵調節であることを特徴とする請求項１３記載の魚類の成熟調節方法（請求項１４）や、請求項１２記載の生体内安定化成長ホルモンを魚類に導入することを特徴とする魚類の成長調節方法（請求項１５）や、生体内ポリペプチドをコードするＤＮＡの３´末端に、請求項１〜４のいずれか記載のＤＮＡを結合した遺伝子を、生体内で発現することを特徴とする生体内発現ポリペプチドの生体内安定化方法（請求項１６）や、魚類で発現するポリペプチドをコードするＤＮＡの３´末端に、請求項１〜４のいずれか記載のＤＮＡを結合した遺伝子を、魚類生体内で発現することを特徴とする請求項１６記載の生体内発現ポリペプチドの生体内安定化方法（請求項１７）や、魚類で発現する性腺刺激ホルモンのポリペプチドをコードするＤＮＡの３´末端に、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域ペプチドをコードするＤＮＡを結合した遺伝子を、魚類生体内で発現することを特徴とする魚類の成熟調節方法（請求項１８）や、魚類の成熟調節が、魚類の産卵誘発或いは産卵調節であることを特徴とする請求項１８記載の魚類の成熟調節方法（請求項１９）や、魚類で発現する成長ホルモンのポリペプチドをコードするＤＮＡの３´末端に、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域ペプチドをコードするＤＮＡを結合した遺伝子を、魚類生体内で発現することを特徴とする魚類の成長調節方法（請求項２０）からなる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるペプチドを、ホルモンのような生体内ポリペプチドのカルボキシ末端に結合して、該生体内ポリペプチドに生体内安定化機能を付与することよりなる。胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２で示され、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端３５アミノ酸残基からなる。また、本発明は、該胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるペプチドをコードするｃＤＮＡからなる。該ｃＤＮＡの塩基配列は、配列表の配列番号１で示され、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端３５アミノ酸残基をコードする１０５の塩基からなる。
【００１５】
更に、本発明は、上記胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるペプチドのペプチド変異体、及び該胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるペプチドをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ変異体を含む。ＤＮＡ変異体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡを挙げることができ、これらの胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるペプチドをコードするｃＤＮＡやその変異体は、そのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばヒトやウマの遺伝子ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーなどから公知の方法により調製することができ、また、そのＤＮＡ変異体は、公知の遺伝子操作の方法により、そのＤＮＡ配列を変更して、調製することができる。
【００１６】
また、本発明の対象となる生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号１に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡを挙げることができる。これらは例えば、ヒトやウマ由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、取得することができる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。
【００１７】
本発明の胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるペプチドのペプチド変異体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる生体内安定化機能を付与するポリペプチドを挙げることができる。かかるポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を用い、そのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の遺伝子工学的方法により調製することができる。
【００１８】
本発明の生体内安定化機能を付与するポリペプチドを用いて生体内ポリペプチドの安定化を図るには、例えば、性腺刺激ホルモンや成長ホルモンのような生体内ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３´末端に、本発明の生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を結合し、該遺伝子を公知の真核生物を用いた遺伝子の発現系を用いて発現させて、生体内ポリペプチドのカルボキシ末端に本発明の生体内安定化機能を付与するポリペプチドを結合したポリペプチドを取得する。該生体内安定化機能を付与するポリペプチドを結合したポリペプチドの形で、ポリペプチドを生体内へ投与することにより、生体内ポリペプチドの生体内における安定化を図ることができる。
【００１９】
また、本発明の生体内安定化機能を付与するポリペプチドを用いて生体内ポリペプチドの安定化を図る方法としては、生体内ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３´末端に、本発明の生体内安定化機能を付与するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を結合し、該遺伝子を生体内に導入し、発現させて、安定化したポリペプチドとして利用することができる。
【００２０】
本発明の生体内安定化機能を付与したポリペプチドをコードする遺伝子を生体内へ導入するには、公知の動物生体組織や細胞内への遺伝子を導入する方法を使用することができる。例えば、ガラス針を動物細胞又は組織細胞にさして該細胞内導入物質を注入するマイクロインジェクション法（発生工学実験マニュアル、講談社）や、電気パルスを印加することによって細胞膜に穴を開け、遺伝子を動物生体組織や細胞内に導入するエレクトロポーレーション法のような方法を用いることができる（ＥＭＢＯ　Ｊ．　１，　８４１−８４５　，１９８２、Ｇｅｎｅ　９６，　２３−２８，　１９９０）。これらの生体内ポリペプチドをコードする遺伝子を生体内へ導入する方法において、通常は、その操作が直接的であり、かつ簡便であることから、通常マイクロインジェクション法が便利に利用することができる。
【００２１】
更に、本発明は、生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを、魚類における性腺刺激ホルモンや成長ホルモン等の生体内導入に適用して、魚類の産卵誘発や産卵調節のような成熟調節、或いは魚類の成長調節等を行う方法を含む。本発明の生体内ポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドを用いて、魚類の産卵誘発や産卵調節のような成熟調節、或いは魚類の成長調節等を行うには、例えば性腺刺激ホルモンや成長ホルモン等のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの３´末端に、配列表の配列番号１に示されるＤＮＡ配列を結合した遺伝子を、魚類の受精卵へ注入することにより、生体内へ該遺伝子を導入して行うことができる。
【００２２】
また、上記のような生体内ポリペプチドとポリペプチドの生体内安定化機能を付与するポリペプチドを結合したポリペプチドをコードする遺伝子を、別途、遺伝子発現系を用いて発現させ、該結合ポリペプチドを取得して、それを魚類の生体内へ導入して、魚類の産卵誘発や産卵調節のような成熟調節や、或いは魚類の成長調節等を行うことができる。従来、魚類の養殖に際しては、種々のポリペプチドを魚体内へ投与することが行われており、その場合に、投与されたポリペプチドの生体内での安定性が問題になっていたが、本発明の方法を用いることにより、ポリペプチドの生体内での安定化を図ることが可能となり、養殖業者にとって、魚体へのポリペプチドの繰り返し投与を行う必要がなくなるため、作業にかかる時間とコストの増大の問題を解消する。それと共に、ポリペプチドの生体内での効果の持続を図ることが可能となり、かつ魚体自体にとっても、その投与に対する魚への負荷の軽減を図ることが可能となる。
【００２３】
本発明の方法が適用される生体内ポリペプチドとしては、特に限定されないが、上記のように、αサブユニットとβサブユニットを備えた生体内ポリペプチドである性腺刺激ホルモンや成長ホルモンのような、生体内へ投与されるホルモンが挙げられる。
従来、魚類の産卵誘発や産卵調節のような成熟調節に際して魚の生体内へ投与されていた濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）や、黄体形成ホルモン（ＬＨ）は、生体内に投与した場合に、比較的短いホルモンの半減期しか得られなかったが、本発明の安定化機能を付与するペプチドを用いることによって、その半減期を著しく延長することが可能となる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［材料と方法］
（１本鎖ＧｔＨ発現コンストラクト・ｐＢ−ＳＣＦ、ｐＢ−ＳＣＬ＋の構築）
タンパク質をコードする領域として、小林ら（Ｇｅｎ　Ｃｏｍｐ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　１０５，　３７２−３７８，　１９９７）及び吉浦ら（Ｇｅｎ　Ｃｏｍｐ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　１０５，　３，　３７９−３８９，　１９９７）によってクローン化されたキンギョ（ｇｏｌｄｆｉｓｈ）性腺刺激ホルモン（ＧｔＨ）α鎖（以下、「α１」という。）のｃＤＮＡ配列（配列表の配列番号３）、及び、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）β鎖（以下、「Ｆβ」という。）（配列表の配列番号５）、若しくは、黄体形成ホルモン（ＬＨ）β鎖（以下、「Ｌβ」という。）（配列表の配列番号７）の、いずれか１種類のβ鎖のｃＤＮＡ配列を用いた。
ここで、キンギョＧｔＨα鎖は、小林ら（Ｇｅｎ　Ｃｏｍｐ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　１０５，　３７２−３７８，　１９９７）により、脳下垂体からα１とα２の２種類のｃＤＮＡ配列がクローン化されているが、α１が常に優位に発現していることから、本発明においてはα１を用いることとした。
【００２５】
β−アクチンは生物の細胞骨格を構成する主要なタンパク質で、その遺伝子は種を通じてよく保存されているうえ、いずれの種においてもその発現量が極めて高いことが知られており、そのメダカβ−アクチン遺伝子プロモーター／エンハンサー（以下、「β−アクチンＰ／Ｅ配列」という。）はメダカにおいて外来遺伝子の発現を組織非特異的に強く促すことが示されている（Ｍｏｌ　Ｍａｒ　Ｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　３，　１９２−１９９，　１９９８、Ｍｏｌ　Ｍａｒ　Ｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　７，　１７３−１８０，　１９９８）ことから、本発明においては、遺伝子発現を制御する領域として、メダカβ−アクチンＰ／Ｅ配列（Ｍｏｌ　Ｍａｒ　Ｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　３，　１９２−１９９，　１９９８）を用いることとした。また、ｍＲＮＡを安定化させる目的で、発現コンストラクトにはＧｔＨ−ｃＤＮＡ配列の下流に、ウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡ付加シグナル（ＢＧＨ　ｐｏｌｙＡ配列）を組み込んだ。
【００２６】
１本鎖ＧｔＨ発現コンストラクトは、ＰＣＲ法により作製した。すなわち、タンパク質をコードする領域として、キンギョβ及びα各鎖ｃＤＮＡを融合し、更に、Ｍｉｎら（Ｊ　Ｒｅｐｒｏｄ　Ｄｅｖ　４０，　３０１−３０５，　１９９４）によってクローン化されているウマ黄体形成ホルモン／絨毛性ゴナドトロピン（ｅＬＨ／ＣＧ、ウマではＬＨβ鎖遺伝子とＣＧβ遺伝子が同一であるため、「ＬＨ／ＣＧ」と表記する。）ｃＤＮＡ（配列表の配列番号９）由来のＣ末端ペプチド領域（ｅＣＴＰ；５’−　ｔｃｃｔｃｔｔｃｃｔｃｔａａｇｇａｔｃｃｃｃｃａｔｃｃｃａａｃｃｔｃｔｃａｃａｔｃｃａｃａｔｃｃａｃｃｃｃａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｃａｇａｃｇｔｔｃｃｔｃｔｃａｔｃｃｃｃｔｃｃｃａａｔａａａｇａｃｔｔｃｔ　−３’：配列表の配列番号１）、アミノ酸３５残基分（配列表の配列番号２）をコードしている。以下、「ＣＴＰ」と表記する。）のｃＤＮＡ配列を挿入した１本鎖ＦＳＨ−ｃＤＮＡ（以下、「ＳＣＦ」と表記する。）（配列表の配列番号１１）及び１本鎖ＬＨ−ｃＤＮＡ（以下、「ＳＣＬ＋」と表記する。）（配列表の配列番号１３）を用いた（図１）。そして、遺伝子発現を制御する領域としてのメダカβ−アクチンＰ／Ｅ配列及びＢＧＨ　ｐｏｌｙＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋に組み込んだもの（以下、「ｐＢ−ＳＣＦ」、及び、「ｐＢ−ＳＣＬ＋」と表記する。）を用いた（図２及び図３）。
【００２７】
ここで、α鎖、β鎖ｃＤＮＡのタンパク質コード領域を一致させて融合することにより、α鎖サブユニットとβ鎖サブユニットの会合効率を上昇させることができるため、遺伝子導入細胞内において組換えＧｔＨ分子が効率的に正確な立体構造をとり、生理活性を有するＧｔＨが生産される。α鎖とβ鎖の連結部分には、ＣＴＰのｃＤＮＡを挿入した。従来、ＣＴＰのｃＤＮＡ配列は、α鎖及びβ鎖の立体構造及びｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける生物活性を変化させることなく連結できる配列として、１本鎖ＧｔＨ生産の際一般的に用いられてきた。したがって、本発明の実施例においても、ＬＨ／ＣＧ由来のＣＴＰ−ｃＤＮＡ配列をα鎖とβ鎖の連結配列として利用した。
【００２８】
上記ｐＢ−ＳＣＦを構築するため、クローニングベクター・ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋又はｐＧＥＭ　Ｔ−ＥａｓｙにクローニングされているキンギョＧｔＨ各サブユニット（α鎖サブユニット：α１、及びβ鎖サブユニット：Ｆβ）及びｐＵＣ１１９にクローニングされているＣＴＰのｃＤＮＡ配列をＰＣＲ法によって増幅し（得られたＰＣＲ増幅産物；Ｆβは４４０ｂｐ、α１は６７０ｂｐ、ｅＣＴＰは１３０ｂｐ）、ＳＣＦ断片を作製した。
ＧｔＨサブユニット及びＣＴＰを増幅するため、Ｆβ鎖を増幅するプライマーとしてＰ−１及びＰ−２を、ＣＴＰを増幅するプライマーとしてＰ−３及びＰ−４を、α１鎖を増幅するプライマーとしてＰ−５及びＰ−６をそれぞれ設計し、ＰＣＲの反応に用いた（表１及び図４）。その際、Ｐ−２は５´側にＣＴＰのＤＮＡ配列を、Ｐ−３は５´側にＦβ鎖のＤＮＡ配列を、Ｐ−４は５´側にα１鎖のＤＮＡ配列を、Ｐ−５は５´側にＣＴＰの配列をそれぞれ含むように設計した（図４）。
【００２９】
【表１】
2004121180.tif 000002
【００３０】
まず、Ｐ−１とＰ−２、Ｐ−３とＰ−４、Ｐ−５とＰ−６を用いてＰＣＲを行い、それぞれＦβ鎖、ＣＴＰ及びα１鎖を増幅した（図４：反応１、反応２、反応３）。ＰＣＲはＧｔＨα１、Ｆβ、ＣＴＰそれぞれのｃＤＮＡが組み込まれたｐＧＥＭ　Ｔ−Ｅａｓｙ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋（約０．５ｎｇ）、又はｐＵＣ１１９を鋳型として、１μＬの１０×ＬＡ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ、１μＭの各サブユニットに特異的なプライマー、４００μＭ　ｄＮＴＰ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２．５ｕｎｉｔのＬＡ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む１０μＬの反応混合液中で行った。ＰＣＲの反応サイクルは一連の反応（９４℃で３０秒間熱変性させ、６０℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長反応させる）を３０回繰り返して行った。
【００３１】
次に、Ｐ−１とＰ−４を用いたＰＣＲによりＤＮＡ断片ＦβとＣＴＰを融合し、Ｆβ−ＣＴＰ（５７０ｂｐ）を作製した（図４：反応４）。ＰＣＲの反応条件としては、反応１で得たＦβ鎖断片０．５μＬと、反応２で得たＣＴＰ０．０５μＬを鋳型として、ＬＡ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む上述と同様の反応混合液中で行った。ＰＣＲの反応サイクルは一連の反応（９４℃で３０秒間熱変性させ、６０℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で４０秒間伸長反応させる）を３０回繰り返して行った。更に、Ｐ−１とＰ−６を用いたＰＣＲによりＤＮＡ断片Ｆβ−ＣＴＰとα１鎖を融合し、１本鎖Ｆβ−ＣＴＰ−α１（ＳＣＦ；１２４０ｂｐ）を作製した（図４：反応５）。ＰＣＲの反応条件としては、Ｆβ−ＣＴＰ断片０．５μＬとα１断片０．５μＬを鋳型として、ＬＡ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む上述の反応混合液中で行った。ＰＣＲの反応サイクルは一連の反応（９４℃で３０秒間熱変性させ、６５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で６０秒間伸長反応させる）を３０回繰り返して行った。ＰＣＲによる増幅産物は制限酵素Ｓａｌ　Ｉで消化し、ベクターの構築に用いた。
【００３２】
ｐＢ−ＳＣＬ＋を構築するため、キンギョＧｔＨ各サブユニット（α鎖サブユニット：α１、及びβ鎖サブユニット：Ｌβ）及びＣＴＰのｃＤＮＡ配列をＰＣＲ法によって増幅し（得られたＰＣＲ増幅産物；Ｌβは４４０ｂｐ、α１は６７０ｂｐ、ｅＣＴＰは１３０ｂｐ）、ＳＣＬ＋断片を作製した。
ＧｔＨサブユニット及びＣＴＰを増幅するため、ＬＨβ鎖を増幅するプライマーとしてＰ−１´及びＰ−２´を、ＣＴＰを増幅するプライマーとしてＰ−３´をそれぞれ設計した（表１及び図４）。その際、Ｐ−２´は５´側にＣＴＰのＤＮＡ配列を、Ｐ−３´は５´側にＬβ鎖のＤＮＡ配列を含むように設計した（図４）。
なお、ＣＴＰの３´側プライマーであるＰ−４、α１鎖を増幅するＰ−５及びＰ−６はＳＣＦ作製の際に用いたプライマーと同一のものを用いた（表１）。以上のプライマーを用いてＳＣＦ作製の際と同様の条件でＰＣＲ反応を行い、ベクター構築を行った（図４）。
【００３３】
β−アクチンＰ／Ｅ配列（約３８００ｂｐ）については、まずβ−アクチンＰ／Ｅ配列に特異的なプライマー（表１）を用いてＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片を増幅すると同時にその両端に制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩ（ＴａＫａＲａ社製）の認識配列を付加した。ＰＣＲ反応はｐＯＢＡを鋳型として１０×Ｅｘ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　１μＬ、１μＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１．２５ｕｎｉｔのＥｘ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）を含む５０μＬの混合液中で行った。
ＰＣＲの反応サイクルは一連の反応（９３℃で４５秒間熱変性させ、６０℃で６０秒間アニーリングし、７２℃で５分間伸長反応させる）を３０回繰り返して行った。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は電気泳動で展開後、回収してＥｃｏ　ＲＩで消化した。
ＢＧＨ　ｐｏｌｙＡ（２８０ｂｐ）は、Ｒｃ／ＲＳＶベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）から制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ（ＴａＫａＲａ社製）で切り離し、ベクター構築に用いた。
【００３４】
それぞれのＤＮＡ配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋ベクターの制限酵素クローニングサイト、即ちメダカβアクチンＰ／Ｅ遺伝子配列をＥｃｏ　ＲＩサイトへ、１本鎖ＧｔＨ−ｃＤＮＡ（ＳＣＦ又はＳＣＬ＋）配列をＳａｌ　Ｉサイトへ、ＢＧＨ　ｐｏｌｙＡをＸｈｏ　Ｉサイトへ、それぞれライゲーション反応によって組み込み、２種類の発現コンストラクト・ｐＢ−ＳＣＦ及びｐＢ−ＳＣＬ＋を構築した（図５）。
また、ｐＢ−ＳＣＬ＋についてはＣＴＰの効果を確認するためにｐＢ−ＳＣＬ＋からＣＴＰ配列を除去したｐＢ−ＳＣＬ−も同時に構築した。これらの発現コンストラクトはマイクロインジェクションに用いるためＴＥバッファーに溶解し、５０μｇ／ｍＬの濃度に調整した。
【００３５】
（マイクロインジェクション法による外来遺伝子の導入）
マイクロインジェクションには、東京水産大学大泉実験実習場で飼育され成熟した３才又は４才のニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　ｍｙｋｉｓｓ）雌から卵を採取し、１才のニジマス雄から搾出した精子を用いて媒精した。その後、卵膜硬化抑制のため１ｍＭ還元型グルタチオン溶液（ｐＨ８．０）中にて１０℃で培養したものを用いた（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｓｕｉｓａｎ　Ｇａｋｋａｉｓｈｉ　５５，　３６９，　１９８９）。マイクロインジェクションは受精後１時間から４時間の間にマイクロマニピュレーター（ナリシゲ化学社製）を用いて行った。ニジマス受精卵を等張液（ＮａＣｌ　９．０４ｇ、ＫＣｌ　０．２４ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　０．３４ｇ／Ｌ）中に微針で固定し、ＤＮＡ溶液２ｎＬをマイクロピペットによって受精卵の胚盤へ注入した（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｓｕｉｓａｎ　Ｇａｋｋａｉｓｈｉ　５７，　８１９−８２４，　１９９１）。これらの作業は、室温をニジマス飼育水の温度である１０℃に保った状態で行った。
【００３６】
（遺伝子導入ニジマス初期胚を用いたウエスタン・ブロット解析）
ｐＢ−ＳＣＬ＋を導入した後、４日経過したニジマス胚（ｐＢ−ＳＣＬ＋導入ニジマス初期胚）とキンギョ脳下垂体から全タンパク質を抽出しウエスタン・ブロット法による解析を行った。ｐＢ−ＳＣＬ＋導入ニジマス初期胚の胚盤を剥がし１０個の胚をプールしてｐＢ−ＳＣＬ＋導入区として３サンプルをサンプルバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール）中でホモジナイズし、タンパク質を抽出した。一方、キンギョ雌１尾（ＢＷ　８１．５ｇ、ＧＳＩ　１１．７％）から脳下垂体を摘出し、上記ニジマス初期胚の際と同様の方法によりタンパク質の抽出を行った。
【００３７】
ｐＢ−ＳＣＬ＋導入ニジマス初期胚及びキンギョ脳下垂体から抽出したタンパク質のうち、それぞれ１個分及び１００分の１個分を９７℃で５分間熱処理を施した後、アクリルアミド濃度１５％のゲルを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分子量の差で展開した後、アクリルアミドゲル中のタンパク質をミニバッファートランスファー装置（ＢＩＯＣＲＡＦＴ社製）を用いてＨｙｂｏｎｄ　ＥＣＬ　ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）へ転写した。メンブレンフィルターは、小林らによって作製された抗キンギョ合成α１ペプチド抗体又は抗キンギョＬＨβ鎖抗体とともに室温で１．５時間インキュベートした。
【００３８】
その後、メンブレンフィルターをＰＢＳ−Ｔ（８０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）とともに１時間室温でインキュベートし、この抗体の結合をＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）によって検出した。ゲルからメンブレンへのタンパク質の転写、メンブレンの抗体とのインキュベーション、ＰＢＳ−Ｔでの洗浄、タンパク質の検出は、ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔｓに添付のプロトコールに従って行った。
また、ｐＢ−ＳＣＦ導入ニジマス初期胚についても、上記ｐＢ−ＳＣＬ＋導入ニジマス初期胚と同様の手法でタンパク質を抽出し、ウエスタン・ブロット法による解析を行った。
【００３９】
（キンギョ生殖腺を用いた生物検定）
ｐＢ−ＳＣＦ導入ニジマス初期胚から剥離した胚盤２５粒を回収し、培養培地中でホモジナイズしたものをサンプルとし、それぞれ２サンプルずつ用意した。その後、キンギョ雌２尾（平均ＢＷ　２４．６ｇ、平均ＧＳＩ　０．７４％）から卵巣を摘出した。摘出した卵巣は培養培地中で小片に切り分け、１区あたり約３０ｍｇを用いた。培養培地としては、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｌ、ペニシリン６０ｍｇ／ｌ、ＨＥＰＥＳ　２．５ｇ／ｌを加え、２Ｎ　ＮａＯＨでｐＨ７．６に調整したＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌ−１５　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌ−１５培地；ＧＩＢＣＯ社製）０．５ｍｌにニジマス初期胚２５粒分のホモジネートを加えたものを用いた。
【００４０】
実験区としては、培地にニジマス初期胚を加えず、Ｌ−１５培地のみで精巣を培養した「培地のみ」、遺伝子を導入しなかったニジマス胚を加えた「野生型」、ｐＢ−ＳＣＦ導入ニジマス胚を加えた「ＳＣＦ」及びニジマス初期胚を加えず、ｈＣＧ（三共株式会社製）５ＩＵを添加した「ｈＣＧ」の４区を設け、それぞれ２連の実験で行った。キンギョ卵巣片の培養は２０℃で２０時間行った。卵巣片を培養後、Ｌ−１５培地０．５ｍｌを回収し、エストラジオール（Ｅ２）量の測定を行った。Ｅ２は卵胞顆粒膜細胞から分泌されるホルモンであり、体内でテストステロンから合成され、卵子形成を促進する雌性ステロイドホルモンである。したがって本研究ではＥ２量を測定することにより、卵胞機能を正確に把握する。つまりニジマス初期胚内において産生された組換えタンパク質がｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＧｔＨとしての活性の有無を判定した。
【００４１】
Ｅ２量の測定は、Ａｉｄａら（Ｊｐｎ．　Ｓｏｃ．　Ｓｃｉ．　Ｆｉｓｈ．　５０，　５６５−５７１，　１９８４）による放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；以下、「ＲＩＡ法」という。）を用いて行った。まず、回収した培地４００μＬからジエチルエーテルによって３回のステロイドホルモン抽出を行い、４０℃の恒温槽中においてジエチルエーテル画分を乾固させた。そこに２００μｌの０．１％Ｇｅｌ−ＰＢＳ溶液（Ｇｅｌａｔｉｎ−１０ｍＭ　ＰＢＳ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ　ＮａＣｌ）を加えて攪拌し、ステロイドホルモンを再溶解した。次に［３Ｈ］テストステロン（アマシャムバイオサイエンス社製）１００μｌ（約１００００ｃｐｍ）、及び抗エストラジオール抗体（ＣＯＳＭＯ　ＢＩＯ社製）２００μｌを加え、抗原抗体反応を進行させるため４℃で１２時間放置した。
【００４２】
続いて、デキストランチャーコール溶液（デキストラン（Ｓｉｇｍａ社製）５ｇ／ｌ　ＰＢＳ、チャーコール（Ｎｏｒｉｔ“Ｐｌｕｓ”社製）０．５ｇ／ｌ　ＰＢＳ）を２５０μｌ加えた後、３０００ｒｐｍで２０分間、冷却遠心を行い、抗体と結合したステロイドホルモン（ｂｏｕｎｄ）と結合していないステロイドホルモン（ｆｒｅｅ）を分離した。さらに、ｂｏｕｎｄのみを含む上清にシンチレーター（オムニフロー；Ｐａｃｋａｒｄ社製）３ｍＬを加え、攪拌後１２時間放置した。最後に、液体シンチレーションカウンター（ｌｉｑｕｉｄ　ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｚｅｒ　１６００ＴＲ；Ｐａｃｋａｒｄ社製）を用いて５分間放射活性を測定した。測定した値と濃度既知のスタンダード（６０〜３８４０ｐｇ／ｍＬ）より得られた標準曲線からＬ−１５培地中に分泌されたＥ２量をキンギョ卵巣１ｍｇ当たりの量に換算後、算出した。
【００４３】
ｐＢ−ＳＣＬ＋導入ニジマス初期胚から剥離した胚盤２５粒を回収し、培養培地中でホモジナイズしたものをサンプルとし、それぞれ２サンプルずつ用意した。その後、キンギョ雄２尾（平均ＢＷ　１６．０ｇ、平均ＧＳＩ　１．１％）から精巣を摘出し、摘出した精巣を培養培地中で小片に切り分け、１区あたり約３０ｍｇを用いた。また、培養培地はｐＢ−ＳＣＦ導入ニジマス初期胚を用いた研究と同様のものを使用した。実験区はｐＢ−ＳＣＬ＋導入ニジマス胚を加えたものを「ＳＣＬ＋」とし、その他３区はｐＢ−ＳＣＦ導入ニジマス初期胚を用いた研究と同様に設け４区とし、２連の実験を行った。キンギョの精巣片の培養はキンギョ卵巣片の培養と同様の手法で行った。
【００４４】
精巣片を培養後、Ｌ−１５培地０．５ｍＬを回収し、テストステロン（Ｔ）量の測定を行った。Ｔは精子形成を促進する雄性ステロイドホルモンである１１−ケトテストステロンの前駆ホルモンで、ＧｔＨの作用によって精巣内で多量に産生されることが知られている（長浜　１９９１　　生殖：配偶子形成の制御機構．“魚類生理学”　板沢　靖男・羽生　功　編．ｐｐ．２４３−２８６．恒星社厚生閣，東京．　ｐ２０）。したがって、本研究ではＴ量を測定することにより、ニジマス初期胚内において産生された組換えタンパク質がｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＧｔＨとしての活性の有無を判定した。
測定方法は、ｐＢ−ＳＣＦ導入ニジマス初期胚を用いた場合と同様の手法であるＲＩＡ法を採用した。測定後、測定値と濃度既知のスタンダード（６０〜３８４０ｐｇ／ｍｌ）より得られた標準曲線からＬ−１５培地中に分泌されたＴ量をキンギョ精巣１ｍｇ当たりの量に換算後、算出した。
【００４５】
（キンギョ個体を用いた生物検定）
ｐＢ−ＳＣＬ＋及びＣＴＰを含まないｐＢ−ＳＣＬ−導入ニジマス胚を淡水魚用リンゲル液（０．７５％　ＮａＣｌ、０．０２％　ＣａＣｌ２、０．２％　ＫＣｌ）中でホモジナイズし、体重１ｇ当たり２０粒の胚盤に相当する量を雄キンギョ（平均体重５．０ｇ）の腹腔内に注射した。注射後キンギョは水温２０℃の循環濾過水槽（６０Ｌ）に収容した。注射後６時間目、１２時間目及び２４時間目に尾柄部から約５０μＬの血液を採取した。採取した血液を４℃、３０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離後、上清を用いて血中テストステロン量を測定した。テストステロン量の測定には前述のＲＩＡ法を用いた。なお、これらの測定は３個体のキンギョを用いて行った。
【００４６】
［実験結果］
（ニジマス初期胚におけるキンギョ１本鎖ＬＨの発現）
キンギョ１本鎖ＧｔＨ遺伝子発現コンストラクト・ｐＢ−ＳＣＬ＋導入初期胚より抽出したタンパク質をサンプルとし、ウエスタン・ブロット法によって抗キンギョ合成α１鎖又は抗組換えＬβ鎖抗体と反応するタンパク質を検出した。その結果、キンギョ脳下垂体のα１鎖及びＬβ鎖と同様の抗原性を示す分子量約３６ｋＤａのタンパク質が検出された。この分子量は本発現コンストラクトから産生されるタンパク質に糖鎖が付加した場合の予想分子量と一致したことから、ニジマス初期胚内においてキンギョ１本鎖ＬＨが産生されたことを示している（図６）。
【００４７】
（遺伝子導入ニジマス初期胚で生産した組換えタンパク質の生物活性）
ｐＢ−ＳＣＦ導入ニジマス初期胚ホモジネートを添加した培養液中でキンギョ卵巣を培養し、キンギョ卵巣が培養液中に産生したＥ２量をＲＩＡ法により測定した。その結果、「ｈＣＧ」区、及び「ＳＣＦ」区においてＥ２量の増加が見られた（図７）。また、「ＳＣＦ」区のエストラジオール量の平均値は、「培養のみ」区、及び「野生型」区の約４倍の１．４ｐｇ／ｍｇ卵巣片であった。
ｐＢ−ＳＣＬ＋導入ニジマス初期胚ホモジネートを添加した培養液中でキンギョ精巣を培養し、キンギョ精巣が培養液中に産生したＴ量をＲＩＡ法により測定した。その結果、「ｈＣＧ」区、及び「ＳＣＬ＋」区においてＴ量の増加が見られた（図８）。また、「ＳＣＬ＋」区のテストステロン量の平均値は、「培養のみ」区、及び「野生型」区の約５倍の４．６ｐｇ／ｍｇ精巣片であった。
【００４８】
（キンギョ個体内で生産した組換えタンパク質の生物活性）
キンギョ個体内にｐＢ−ＳＣＬ＋及びｐＢ−ＳＣＬ−導入ニジマス初期胚ホモジネートを注射し、注射後１２時間目の各区における血中Ｔ量の結果を図９に示した。「ＳＣＬ＋」区及び「ＳＣＬ−」区とも有意に血中Ｔ量の上昇を促したものの、「ＳＣＬ＋」区では「ＳＣＬ−」区の約３倍ほど血中Ｔ量が高かった。
【００４９】
（キンギョ個体内で生産した組換えタンパク質の経時変化）
キンギョ個体内にｐＢ−ＳＣＬ＋及びｐＢ−ＳＣＬ−導入ニジマス初期胚ホモジネートを注射した場合の、注射後の血中テストステロン量の経時変化を図１０に示す。
注射後６時間目には、両区とも同程度の血中テストステロン量を示した。注射後１２時間目には、両区とも血中テストステロン量の減少が見られたが、減少量は「ＳＣＬ−」区が「ＳＣＬ＋」区より３倍程度大きかった。さらに注射後２４時間目にも注射後１２時間目と同様の減少量の差が顕著に見られた。このことから、ｐＢ−ＳＣＬ＋がキンギョ個体内において長期間安定的に効力を発揮したと考えられる。
【００５０】
［評価］
本発明においては、１本鎖ＧｔＨ−ｃＤＮＡ作製の際、α鎖とβ鎖の間に、Ｍｉｎら（Ｊ　Ｒｅｐｒｏｄ　Ｄｅｖ　４０，　３０１−３０５，　１９９４）によってクローン化されたＬＨ／ＣＧβ鎖由来のＣＴＰ配列を挿入した。Ｇａｌｅｔら（Ｊ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　１６７，　１１７−１２４，　２０００）によってＬＨ／ＣＧβ鎖のＣＴＰ配列の有無で、組換えＬＨ／ＣＧのｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける生物活性に変化はないことが示されているが、ｈＣＧのＣＴＰ配列を用いた研究から、ＣＴＰ配列がｉｎ　ｖｉｖｏにおいてＧｔＨ分子の半減期を延長する役割を持つことが示唆されている（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９，　４３０４−４３０８，　１９９２）。これは、ＬＨ、ＦＳＨやＣＧは、分子量の約３割が付加されている糖鎖によるものであることから、これらのホルモンを比較した場合、生体内でのホルモンの寿命が長いＣＧのカルボキシ末端ポリペプチド（ＣＴＰ）に特異的に結合している糖鎖によるものと推測される。
【００５１】
従って、このようなＣＴＰ配列を付加した（付加型）ＬＨやＦＳＨを用いて魚類の催熟を行った場合、親魚体内に投与した付加型ＬＨ及び付加型ＦＳＨは、これら性腺刺激ホルモン（ＧｔＨ）が長期間体内に留まることとなり、その催熟効率が上昇する。上記のことから、本発明による発現系で産生された１本鎖ＬＨに含まれるｅＬＨ／ＣＧβ鎖由来のＣＴＰ配列も組換えＧｔＨ分子への半減期延長効果を有することが示される。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により、胎盤性性腺刺激ホルモンのカルボキシ末端領域からなるポリペプチド、その変異体、或いは該ポリペプチドをコードする遺伝子を用いて、ホルモンのような生体内ポリペプチドの生体内安定化を図ることにより、広く、生体に投与されるポリペプチド薬剤の生体内での安定化を図り、その効果を飛躍的に増大することを可能とする。また、特に、本発明の生体内安定化機能を付与するポリペプチド及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡを、魚類における性腺刺激ホルモンや成長ホルモン等のようなペプチドの、魚の生体内導入に適用することにより、魚類の産卵誘発や産卵調節のような成熟調節、或いは魚類の成長調節等を効果的に行うことを可能とし、近年多くの種類の栽培漁業が行われている魚類の養殖技術に、その技術の効率化と確実性とをもたらすことができる。したがって、本発明の技術は、実用化技術としてこの分野の技術に大きな進歩をもたらすものである。
【００５３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例における、一本鎖ＳＣＦ−ｃＤＮＡ及びＳＣＬ＋−ｃＤＮＡの構造を示す図である。
【図２】本発明の実施例における、一本鎖ＳＣＦ−ｃＤＮＡを含む発現コンストラクトを示す図である。
【図３】本発明の実施例における、一本鎖ＳＣＬ＋−ｃＤＮＡを含む発現コンストラクトを示す図である。
【図４】本発明の実施例における、一本鎖ＳＣＦ−ｃＤＮＡ及びＳＣＬ＋−ｃＤＮＡの作製について示す図である。
【図５】本発明の実施例における、一本鎖ＳＣＦ−ｃＤＮＡ及びＳＣＬ＋−ｃＤＮＡを含む発現コンストラクトの構造を示す図である。
【図６】本発明の実施例における、ｐＢ−ＳＣＬ＋導入ニジマス初期胚を用いたウエスタン・ブロット解析を示す図である。
【図７】本発明の実施例において、ＳＣＦの生物活性について示す図である。
【図８】本発明の実施例において、ＳＣＬ＋の生物活性について示す図である。
【図９】本発明の実施例において、ＳＣＬ−及びＳＣＬ＋のｉｎ　ｖｉｖｏ生物活性について示す図である。
【図１０】本発明の実施例において、ＳＣＬ＋及びＳＣＬ−の血中Ｔ量経時変化について示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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