(57)【要約】【課題】体液より簡便な操作で高純度の単球を選択的に、かつ高い効率で採取する方法を提供すること。【解決手段】フィルターの表面積１ｍｍ２当たりの有核細胞総数として１０００〜１００００個の単核球浮遊液を、単球を捕捉し、リンパ球を通過するフィルターを充填してなるフィルター装置に流し、その後該フィルター装置に回収液を導入し、単球を回収することよりなる単球採取方法。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィルターの表面積１ｍｍ２当たりの有核細胞総数として１０００〜１００００個の単核球浮遊液を、単球を捕捉し、リンパ球を通過するフィルターを充填してなる装置に流し、その後該フィルター装置に回収液を導入し、単球を回収することを特徴とする単球の分離回収方法。
【請求項２】
単核球浮遊液が、血液を連続遠心分離法または比重遠心分離法により、顆粒球および赤血球を除去した単核球分画である請求項１記載の単球の分離回収方法。
【請求項３】
フィルター装置に単核球分画を流した後、該フィルター装置に洗浄液を流すことにより、リンパ球をフィルター装置外に流出させることを特徴とする請求項１または２記載の単球の分離回収方法。
【請求項４】
フィルターが不織布であり、その充填密度が０．０５〜０．５ｇ／ｃｍ３であり、平均繊維径が１．５μｍ以上１０μｍ未満の不織布である請求項１乃至３のいずれかに記載の単球分離回収方法。
【請求項５】
単球回収時のフィルター装置内温度を２℃〜１０℃とすることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の単球の分離回収方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の単球分離回収方法により得られた単球を高純度に含む単球組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、末梢血、臍帯血、骨髄等の細胞が浮遊する体液から単球を高純度に分離回収する方法及びこのようにして得られた単球を高純度に含む単球組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
単球／マクロファージは血液中あるいは組織中に含まれる有核細胞の一種であり、老朽化した自己細胞あるいは外来の細菌を食する作用を有する他、種々のサイトカインやプロテアーゼを産生する多機能細胞である。近年、これらの細胞を利用した細胞治療法が盛んに行われており、例えば、末梢血由来単球から分化誘導したマクロファージによる皮膚潰瘍や壊死／壊疽等の虚血性疾患に対する優れた治療効果が報告されている（例えば、非特許文献１等）。
【０００３】
また、単球を分化誘導することで得られる樹状細胞は、Ｔ細胞を抗原特異的に活性化する最も強力な抗原提示細胞であり、例えば、悪性腫瘍に対する治療効果が報告されている（例えば、非特許文献２）。これらの背景より、体内より単球／マクロファージを選択的あるいは特異的に分離・濃縮する技術が望まれるようになった。
【０００４】
近年、細胞分離技術が発達し、免疫学、細胞生物学、血液学、組織工学の分野で広範囲に用いられており、例えばモノクローナル標識抗体とフローサイトメーターを用いた細胞分離技術は、細胞特異的であり高純度な細胞集団を得ることができ、単球以外にも種々の細胞を分離できることが知られている。また、抗体結合フラスコ、磁気ビーズ、抗体ロゼット法は、フローサイトメーターのような高価な機器を用いずに比較的簡便な操作で高純度の目的細胞を分離できることができる。
【０００５】
例えば単球に特異的に抗原を認識する抗体を利用したポジティブセレクション、または単球以外の抗原を認識する抗体を利用したネガティブセレクションによって、単球を比較的高純度に分離することができる。しかし、これらの抗体は高価であり、また得られた細胞集団は抗体混入の可能性を回避することができないため、医療行為に用いるのは難しい。
【０００６】
エルトリエーション法は、傾斜を持つチャンバー内に細胞浮遊液を入れて遠心し、一方では緩衝液を遠心と逆方向に流すことで特定の細胞層を形成させる方法である。この方法は、高純度の単球を得る方法であるが、熟練の操作技術、また細胞分離に長時間を要し、実質的に無菌操作が難しいため、ルーチンの単球の採取に用いるのは難しい。
【０００７】
また近年では有核細胞、特に白血球を分離あるいは除去するフィルターが散見されるようになった。例えば特許文献１には、赤血球は通過するフィルターに造血幹細胞を捕捉させた後、最初の通液方向とは逆方向の液流を惹起させて造血幹細胞を回収する方法が開示されている。しかしながら、同公報は有核細胞を回収するフィルターであり、単球に対して選択性を有するものではない。また特許文献２には、単球および／又は単球由来のマクロファージ選択除去フィルター装置が開示されている。しかしながら、同公報は細胞浮遊液より単球および／又は単球由来のマクロファージを除去する装置であり、単球を選択的に回収する技術に関する記載は一切無い。また、特許文献３には、平均孔径２５〜６０μｍの多孔質フィルターが単球・顆粒球を選択的に捕捉・採取するのに適していることが開示されている。しかしながら、同公報は単球のみを選択的に採取するものではなく、また、実質的に回収した細胞集団には多量の顆粒球が混入することがわかった。
【０００８】
一方、単球を濃縮する最も一般的な方法としては、比重遠心分離法により単核球を分離した後、単球とリンパ球との基材への付着性の差を利用して、単球を選択的にプラスチックディッシュに付着させる方法が知られている。この方法は、実験室レベルの細胞数の処理に適し、また高価な機器や試薬を用いないが、非常に煩雑で長時間を要する操作であり、また大量の細胞数を一度に処理できないため、ルーチンの医療行為に用いるには難しい。
【０００９】
【特許文献１】
特開平８−１０４６４３号公報
【特許文献２】
特開平９−７５０７６号公報
【特許文献３】
特開昭５５−１３８４５８号公報
【非特許文献１】
ダビデ・ダノン（ＤＡＶＩＤ　ＤＡＮＯＮ）、「ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ　ＯＦ　ＨＵＭＡＮ　ＵＬＣＥＲＳ　ＢＹ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＭＡＣＲＯＰＨＡＧＥＳ　ＰＲＥＰＡＲＥＤ　ＦＲＯＭ　Ａ　ＢＬＯＯＤ　ＵＮＩＴ」、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ、（米国）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．、１９９７年、第３２巻、第６号、ｐ．６３３−６４１
【非特許文献２】
高橋、「免疫細胞療法（樹状細胞療法）」、医学のあゆみ、医歯薬出版、平成１２年１２月、第１９５巻、第１３号、ｐ．８４８−８４９
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記の問題点を解決し、体液より簡便な操作で高純度の単球を選択的に、かつ高い回収率で採取する方法及び単球組成物を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らが鋭意検討した結果、フィルターの表面積１ｍｍ２当たりの有核細胞総数として１０００〜１００００個の単核球浮遊液を、単球を捕捉し、リンパ球を通過するフィルターを充填してなるフィルター装置に流し、その後該フィルター装置に回収液を導入し、単球を回収することによって、驚くべきことに簡便な操作で高純度の単球分画を高い回収率で採取できることを見出し、本発明を得るに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、
・　フィルターの表面積１ｍｍ２当たりの有核細胞総数として１０００〜１００００個の単核球浮遊液を、単球を捕捉し、リンパ球を通過するフィルターを充填してなる装置に流し、その後該フィルター装置に回収液を導入し、単球を回収することを特徴とする単球の分離回収方法。
・　単核球浮遊液が、血液を連続遠心分離法または比重遠心分離法により、顆粒球および赤血球を除去した単核球分画である前記（１）の単球の分離回収方法。
・　フィルター装置に単核球分画を流した後、該フィルター装置に洗浄液を流すことにより、リンパ球をフィルター装置外に流出させることを特徴とする前記（１）または（２）記載の単球の分離回収方法。
【００１２】
・　フィルターが不織布であり、その充填密度が０．０５〜０．５ｇ／ｃｍ３であり、平均繊維径が１．５μｍ以上１０μｍ未満の不織布である前記（１）乃至（３）のいずれかに記載の単球の分離回収方法。
・　単球回収時のフィルター装置内温度を２℃〜１０℃とすることを特徴とする前記（１）乃至（４）のいずれかに記載の単球の分離回収方法。
・　前記（１）乃至（５）のいずれかに記載の単球採取方法により得られた単球を高純度に含有する単球組成物。
に関する。
本発明によれば、体液より簡便操作で高純度の単球を選択的に、かつ高い回収率で採取することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で言う単核球とは、細胞内に核を１つ保有する有核細胞を指し、いわゆる単球およびリンパ球を指す。また、単核球分画とは単核球、すなわち単球とリンパ球からなる細胞集団であり、実質的には微量の顆粒球を含むものも指す。
【００１４】
本発明で言う単核球浮遊液とは、単核球分画を含む液体を指す。単核球を浮遊させる液体としては細胞に悪影響を及ぼさない液体であればいかなる液体も使用できるが、いくつか例示すると、血漿、血清、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）、ＨＢＳＳ（ハンクス液）などの緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０などの培地が挙げられる。これらの液体に、細胞保護、栄養補給、抗凝固性付与、凍結保存時の凍害防止等の目的で必要に応じ、血漿、血清、アルブミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレハロース、クエン酸化合物、ＥＤＴＡ、ヘパリン、ジメチルスルホキシド、デキストラン、ポリビニルピロリドン、グリセリン、キチン誘導体、ヒドロキシエチルデンプン、ゼラチン等を添加してもよい。
【００１５】
本発明で言う「捕捉」とは、フィルター装置に導入する単球の５０％以上がフィルターに捕捉される状態を指し、「通過」とは、フィルター装置に導入するリンパ球の５０％以上がフィルターより流出する状態を指す。
【００１６】
本発明で言う連続遠心分離法とは、末梢血より必要な血球成分または血漿成分を体外循環により選択的に採取し、残りをドナーに返却する方法であり、この方法より血小板、血漿、単核球等を得ることができる。特に本発明では、単核球分画を得る目的で用いる方法であり、実質的に顆粒球を排除する。
【００１７】
本発明で言う比重遠心分離法とは、比重液に末梢血や骨髄等の細胞浮遊液を積層させて遠心操作することによって赤血球と顆粒球を沈殿させる方法である。特に本発明では、単核球分画を得る目的で用いる方法であり、実質的に顆粒球を排除する。
【００１８】
本発明で言う「顆粒球および赤血球を除去」とは、血液を連続遠心分離法または比重遠心分離法することにより、顆粒球の５０％以上、赤血球の９０％以上が排除された状態を指す。また、ここで言う血液とは、末梢血、臍帯血、骨髄を指す。
【００１９】
本発明で言うフィルター装置とは、少なくとも入口と出口を有する容器にフィルターを充填したものを指す。また入口とは単核球分画の導入口であり、出口とはフィルターを通過した単核球、特にリンパ球の流出口であるが、入口および出口はフィルターの洗浄および単球の回収のために導入する流体の導入口、流出口の役割も果す。
【００２０】
フィルターの材質としては単球を捕捉できればいかなる材質も使用できるが、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属が挙げられる。また、これらのフィルターはこのままでも用いることができるが、細胞や血小板、赤血球等を選択的に捕捉する、あるいは通過させる等の必要に応じて表面改質を施したものでもよい。
【００２１】
より具体的に例示すると、血小板通過性を高めるにＷＯ８７／０５８１２号公報で提案されている非イオン性親水基と塩基性含窒素官能基を有するポリマーをコートする等が挙げられるがこれに限定されない。またアミノ酸、ペプチド、糖類、糖タンパク（抗体、接着分子等のバイオリガンドを含む）等のリガンドをフィルター上に固定して、単球を選択的に捕捉しても良い。リガンドをフィルター上に固定する方法は、例えば特開平２−２６１８３３号公報で提案されているハロアセトアミド法により固定する方法が挙げられる。但し単球に親和性を持つリガンドを選択する場合には、なるべくバイオリガンドは避け、また、細胞と接触することによる悪影響が少なく、更に回収時に容易に回収できる程度の親和性であることが好ましい。
【００２２】
フィルターの形状は、多孔質状、粒子状、中空糸状、粉末状等いずれの形状も取れるが、中でも、多孔質体、または粒状体であることが好ましい。多孔質体とは例えば、繊維塊、織布、不織布、スポンジ等の発泡体等を指すがこれに限定されない。単核球分画の導入とリンパ球の流出、および単球を回収するための流体を導入する等の諸操作を行う理由で、適切なフィルター形状が求められるが、単球を捕捉する理由より、上記形状の中でも表面積の大きい形状、すなわち多孔質体が好ましく、更に表面積の大きい不織布、スポンジ等の発泡体が好ましく、繊維径および充填密度により比較的簡便にフィルターの孔径を調節できる不織布が最適である。
【００２３】
単球を捕捉し、リンパ球を通過するフィルターを不織布の場合でより具体的に例示すると、平均繊維径が１．５μｍ以上１０μｍ未満、より好ましくは１．５μｍ以上８μｍ未満、更に好ましくは１．５μｍ以上６μｍ未満、かつフィルター装置に充填されるフィルターの充填密度が０．０５〜０．５ｇ／ｃｍ３である。平均繊維径が１．５μｍ未満では、充填密度を調節しても、実質的にリンパ球が通過しにくいために単球純度を上げることができず、また回収液が導入しにくい傾向になるため好ましくない。また、１０μｍを超えると、充填密度を調節しても単球が繊維に捕捉されず素通りする割合が高くなる。平均繊維径１．５μｍ未満１０μｍ以上のいずれの場合でも回収率の低下につながるおそれがあるので好ましくない。
【００２４】
また、フィルター装置内に充填されるフィルターは、０．０５〜０．５ｇ／ｃｍ３の嵩密度で充填される。０．０５ｇ／ｃｍ３未満では十分な大きさの細孔を安定して確保することが難しく、物理的に安定した強度を有するフィルター装置が実現しにくい。又、０．５ｇ／ｃｍ３を越える多孔質フィルターでは本発明の要件を満たす細孔を実現することは難しい。好ましい充填密度は０．１ｇ／ｃｍ３〜０．４ｇ／ｃｍ３、更に好ましくは０．１５ｇ／ｃｍ３〜０．３ｍ３である。容器の大きさは処理対象細胞浮遊液の量と処理速度等を考慮して適宜設定する。
【００２５】
また、微小凝集物を含む溶液をフィルターに導入する場合は、凝集塊を除去するために、平均繊維径１０μｍ〜５０μｍのプレフィルターを、単核球の導入口側、すなわち入口側に充填しても良い。プレフィルターを用いる場合、前記フィルターの平均繊維径よりも大きい平均繊維径のものを使うことが好ましい。
【００２６】
なお、本発明における平均繊維径とは、以下の手順に従って求められる値をいう。即ちフィルターを構成する、実質的に均一と認められるフィルター要素の一部をサンプリングし、走査電子顕微鏡などを用いて、写真に撮る。サンプリングに際しては、フィルター要素の有効濾過断面積部分を、１辺が０．５〜１ｃｍの正方形によって区分し、その中から３ケ所以上、好ましくは５ケ所以上をランダムサンプリングする。
【００２７】
ランダムサンプリングするには、例えば上記各区分に番地を指定した後、乱数表を使うなどの方法で、必要ケ所以上の区分を選べば良い。またサンプリングした各区分について、３ケ所以上好ましくは５ケ所以上を写真に撮る。このようにして得た写真について、写っている全ての繊維の直径を測定する。ここで直径とは、繊維軸に対して直角方向の繊維の幅をいう。測定した全ての繊維の直径の和を、繊維の数で割った値を平均繊維径とする。但し、複数の繊維が重なり合っており、他の繊維の陰になってその幅が測定できない場合、また複数の繊維が溶融するなどして、太い繊維になっている場合、更に著しく直径の異なる繊維が混在している場合、等の場合には、これらのデータは削除する。以上の方法により、１００本以上、好ましくは１０００本以上のデータにより平均繊維径を求める。
【００２８】
本発明で言う回収液とは、フィルターに捕捉された単球を回収するためにフィルター装置より導入される流体を指す。ここで言う単球とは実質的には単球を含む細胞集団を指す。回収液としては細胞に悪影響を及ぼさない流体であればいかなる流体も使用できるが、いくつか例示すると、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）、ＨＢＳＳ（ハンクス液）などの緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０などの培地が挙げられる。これらの液体に、細胞保護、栄養補給、抗凝固性付与、凍結保存時の凍害防止、粘度向上（回収率向上に有効な場合がある）等の目的で必要に応じ、血漿、血清、アルブミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレハロース、クエン酸化合物、ＥＤＴＡ、ヘパリン、ジメチルスルホキシド、デキストラン、ポリビニルピロリドン、グリセリン、キチン誘導体、ヒドロキシエチルデンプン、ゼラチン等を添加してもよい。
【００２９】
また、ここで言う流体とは、液体単体のみならず、空気、アルゴン、窒素など細胞に悪影響を及ぼさない気体を混合したものも含まれる。回収液の導入方向としては単核球分画の導入方向と同一方向あるいは逆方向が考えられるが、逆方向の方が高い回収率が得られる傾向にあるのでより好ましい。すなわち、回収液の導入手段は、フィルターの上流に設けても下流に設けてもよいが、回収率の点から下流に設ける方が好ましい。
【００３０】
また、フィルター装置内を２℃〜１０℃の低温条件下において回収液を導入すると、細胞がフィルターより剥離しやすい傾向があり、更にフィルターとの剥離によって生じる細胞へのダメージの軽減効果も期待できる点で好ましい。例えば、回収する前に低温条件下にするためには、冷蔵庫や氷浴にフィルター装置を入れておく、あるいは単球の回収操作の前に低温の液体を導入しても良く、それがフィルターを洗浄するために導入する流体でも良い。いずれの場合も、低温条件下および回収操作を行う際にはフィルター装置内に何らかの流体が含まれていると、細胞へのダメージの軽減と回収率を高める効果があり好ましい。但し、捕捉された細胞とフィルターとの接着は、時間とともに強固になるため、回収操作前に冷蔵庫や氷浴に入れてフィルター装置を低温化させる場合は、５〜４５分、より好ましくは５〜３０分以内が良い。
【００３１】
本発明でいう洗浄液とは、単球以外の細胞をフィルター外に流出させるためにフィルター装置に導入される流体を指し、捕捉されたリンパ球を洗い流し、フィルターに捕捉されている全細胞中における単球の含有率を上げる役割を果す。また、赤血球、血小板を含む単核球分画をフィルターに導入する場合は、フィルターの洗浄は、赤血球、血小板を洗い流す効果もある。洗浄液としては細胞に悪影響を及ぼさない流体であればいかなる流体も使用できるが、いくつか例示すると、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）、ＨＢＳＳ（ハンクス液）などの緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０などの培地が挙げられる。これらの液体に、細胞保護、栄養補給、抗凝固性付与等の目的で必要に応じ、血漿、血清、アルブミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレハロース、クエン酸化合物、ＥＤＴＡ、ヘパリン等を添加してもよい。また、ここで言う流体とは、液体単体のみならず、空気、アルゴン、窒素など細胞に悪影響を及ぼさない気体を混合したものも含まれる。流体の導入方向としては単核球分画の通液方向と同一方向あるいは逆方向が考えられるが、同一方向の方が、単球まで洗い流される可能性が低いため、回収率の点でより好ましい。
すなわち、フィルターを洗浄するために導入する流体の導入手段は、フィルターの上流に設けても下流に設けてもよいが、回収率の点から上流に設ける方が好ましい。
【００３２】
以下に本発明を実施する方法の具体例を記載するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
まず、少なくとも入口と出口を有する容器の入口側に凝集塊除去用のプレフィルター、出口側に単球分離用のフィルターを充填したものをフィルター装置とする。必要に応じて、出口側および入口側に回路を設けても良い。
連続遠心分離法または比重遠心分離法により得られた単核球分画を、入口側よりフィルター装置に流す。その方法としては、落差による方法、シリンジで押し込む方法、バッグを押しつぶす方法、ローラーポンプやシリンジポンプを用いる方法等が挙げられる。落差がより簡便な方法であるが、流量を制御したい場合はローラーポンプやシリンジポンプ等を用いると良い。
【００３３】
フィルター装置に導入する単核球浮遊液は、フィルターの表面積１ｍｍ２当たりの細胞球総数として１０００〜１００００個、好ましくは１２００〜９０００個、より好ましくは１６００〜８０００個とする。フィルターの表面積１ｍｍ２当たりの有核細胞総数が１０００個未満であると、リンパ球の通過する割合が低く、回収される単球の純度が低くなるので適さない。また、フィルターの表面積１ｍｍ２当たりの有核細胞総数が１００００個より多いと、リンパ球だけでなく単球もフィルターより流出する割合が高くなり、単球純度は上がるものの、単球の回収率が低くなる傾向があり適さない。ここで言うフィルター表面積は、単球を捕捉し、リンパ球を通過するフィルターの表面積を指し、凝集塊除去のためのプレフィルターの表面積は含まれない。
【００３４】
フィルターの表面積は、平均繊維径、フィルター材質の比重、フィルターの総重量より求めることができ、以下の式で算出される。
2004129550.tif 000002
【００３５】
また、単球とリンパ球をより効率的に分離するためには、単核球を適切な流速でフィルター装置に流す必要があるが、その範囲は線速０．１ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２以上５．０ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２未満、より好ましくは線速０．２ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２以上２．０ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２未満である。ここで言う線速とは、流速を細胞分離フィルターの有効濾過断面積で除したものである。線速が０．１ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２未満では、細胞を処理するのに時間がかかり過ぎるため好ましくない。また、線速が５．０ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２を超えると、単球とリンパ球の分離能が低下する傾向があるため好ましくない。
【００３６】
次に洗浄液を流してリンパ球を流出させる。その方法としては、落差による方法、シリンジで押し込む方法、バッグを押しつぶす方法、ローラーポンプやシリンジポンプを用いる方法等が挙げられる。落差がより簡便な方法であるが、流量を制御したい場合はローラーポンプやシリンジポンプ等を用いると良い。
【００３７】
洗浄液によりリンパ球を流すためには、適切な流速でフィルター装置に流す必要があり、その範囲は線速０．１ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２以上１０．０ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２未満、より好ましくは線速０．２ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２以上３．０ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２未満である。線速が０．１ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２未満では、フィルターを洗浄するのに時間がかかり過ぎ、またフィルターより流出するリンパ球が少ないため好ましくない。また、線速が１０．０ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２を超えると、リンパ球と同時に単球も流出する割合が高くなる傾向にあり、回収率が低くなる点で好ましくない。
【００３８】
最後に回収液を流して単球を回収する。その方法としては、落差による方法、シリンジで押し込む方法、バッグを押しつぶす方法、ローラーポンプやシリンジポンプを用いる方法等が挙げられる。落差がより簡便な方法であるが、より好ましくは流速を制御可能な、回収液を強力に押し出すバネ式装置あるいは圧力式装置により回収すると、より高い回収率が得られる点で好ましい。
【００３９】
回収液の流速は、せん断応力を高め、単球を高率で回収するためにより高流速が好ましいが、内圧上昇による細胞分離フィルターと回路の接続部のはずれや、細胞へのダメージを起こさない流速に制御することが好ましく、その範囲は線速５０ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２以上１５００ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２未満、より好ましくは線速１００ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２以上１０００ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２未満である。線速５０ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２未満では、せん断応力が低く、細胞が十分に回収できないため好ましくない。また、線速１５００ｍｌ／ｍｉｎ／ｃｍ２以上では、内圧上昇により細胞へのダメージが起こる割合が高くなるため好ましくない。
【００４０】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
１．細胞分離フィルター作成
高さ２３ｍｍ×直径６．８ｍｍφの円筒型ポリエチレンカラムの入口側から順番に平均繊維径３３μｍ（目付約５０ｇ／ｍ２）、１２μｍ（目付約３０ｇ／ｍ２）、２．７μｍ（目付約９０ｇ／ｍ２）のポリエステル不織布をそれぞれ１２枚、１３枚、３枚ずつ充填し、細胞分離器とした。なお、高さ３ｍｍ×内径５ｍｍφ（外径７ｍｍφ）の中空状のシリコン製チューブを不織布上下で押さえ、不織布が動かないように固定した。有効濾過断面積３６．３ｍｍ２、２．７μｍ不織布の充填密度は約０．２５ｇ／ｃｍ２であった。また、この細胞分離器に血小板通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（ヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートのモル比＝９７：３）の１％エタノール溶液を該フィルターの入口側から通液した後、窒素ガスを通して乾燥させた。
【００４１】
２．細胞分離操作
ＡＣＤ溶液を用いてヒト末梢血から連続遠心分離法（ＣＯＢＥ　ＳＰＥＣＴＲＡ、ＣＯＢＥ−Ｌａｂ．Ｉｎｃ社製）により単核球分画を得た。単核球分画（６．８×１０７個／ｍｌ、単球純度２４．４％）を０．５ｍｌ分取し、生理食塩水で４ｍｌに希釈し０．１ｍｌ／ｍｉｎの流速で細胞分離フィルターに流した後、０．５ｍｌ／ｍｉｎでＰＢＳ（−）６ｍｌで洗浄し、４℃の冷蔵庫で細胞分離フィルターごと１５分冷やした後、細胞分離フィルター出口より１０％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字社製「デキストラン４０注」）２ｍｌ、次いで空気５ｍｌを導入して細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約７０分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積１ｍｍ２当たりの有核細胞総数は、３２３０個であり、単球回収率４８％、単球純度３９．８％であった。なお、単球回収率および単球純度は、自動血球計数装置（ミクロセルカウンター、シスメックス社製）によって測定した有核細胞の比率から算出した。
【００４２】
【比較例１】
実施例１同様の細胞分離フィルターを作成した。
ＡＣＤ溶液を用いてヒト末梢血から連続遠心分離法（ＣＯＢＥ　ＳＰＥＣＴＲＡ、ＣＯＢＥ−Ｌａｂ．Ｉｎｃ社製）により単核球分画を得た。単核球分画（６．８×１０７個／ｍｌ、単球純度２４．４％）を２．５ｍｌ分取し、生理食塩水で４ｍｌに希釈し実施例１と同様の操作で細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約７０分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積１ｍｍ当たりの有核細胞総数は、１６１５０個であり、単球回収率１５％、単球純度４４．５％であった。
【００４３】
【実施例２】
実施例１同様の細胞分離フィルターを作成した。
ＡＣＤ溶液を用いてヒト末梢血から連続遠心分離法（ＣＯＢＥ　ＳＰＥＣＴＲＡ、ＣＯＢＥ−Ｌａｂ．Ｉｎｃ社製）により単核球分画を得た。単核球分画（６．８×１０７個／ｍｌ、単球純度２４．４％）を１．５ｍｌ分取し、生理食塩水で４ｍｌに希釈し実施例１と同様の操作で細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約７０分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積１ｍｍ２当たりの有核細胞総数は、９６９０個であり、単球回収率３８％、単球純度４１．１％であった。
【００４４】
【比較例２】
実施例１同様の細胞分離フィルターを作成した。
ＡＣＤ溶液を用いてヒト末梢血から連続遠心分離法（ＣＯＢＥ　ＳＰＥＣＴＲＡ、ＣＯＢＥ−Ｌａｂ．Ｉｎｃ社製）により単核球分画を得た。単核球分画（６．８×１０７個／ｍｌ、単球純度２４．４％）を０．１ｍｌ分取し、生理食塩水で４ｍｌに希釈し実施例１と同様の操作で細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約７０分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積１ｍｍ２当たりの有核細胞総数は、６４６個であり、単球回収率２４％、単球純度２６．７％であった。
【００４５】
【実施例３】
実施例１同様の細胞分離フィルターを作成した。
ヒト末梢血（ＡＣＤ溶液：ヒト末梢血＝１：８）を採血した。この時点で単球純度７．２％であった。比重遠心分離法（ファルマシア社製「フィコール」、比重１．０７７ｇ／ｍｌ）により単核球分画を採取し、１×１０７個／ｍｌになるように１０％血漿加ＰＢＳ（−）へ浮遊させた。この時点で単球の純度は１８．４％であった。０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速で単核球分画８ｍｌを細胞分離フィルターの入口より流した後、０．５ｍｌ／ｍｉｎでＰＢＳ（−）６ｍｌを流し、４℃の冷蔵庫で細胞分離フィルターごと１５分冷やした後、細胞分離フィルター出口より１０％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字社製「デキストラン４０注」）２ｍｌ、次いで空気５ｍｌを導入して細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約７０分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積１ｍｍ２当たりの有核細胞総数は、７６００個であり、単球回収率４７％、単球純度３４．６％であった。
【００４６】
【比較例３】
実施例１同様の細胞分離フィルターを作成した。
ヒト末梢血（ＡＣＤ溶液：ヒト末梢血＝１：８）を採血した。この時点で単球純度７．２％であった。比重遠心分離法（ファルマシア社製「フィコール」、比重１．０７７ｇ／ｍｌ）により単核球分画を採取し、１×１０６個／ｍｌになるように１０％血漿加ＰＢＳ（−）へ浮遊させた。この時点で単球の純度は１８．４％であった。単核球分画７．５ｍｌを実施例３と同様の操作で細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約７０分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積１ｍｍ２当たりの有核細胞総数は、７１２個であり、単球回収率１５％、単球純度１８．６％であった。
【００４７】
【実施例４】
１．細胞分離フィルター作成
平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布（目付約１００ｇ／ｍ２）１６枚と平均繊維径２．３μｍのポリエステル不織布（目付約６０ｇ／ｍ２）１８枚を重ね、押し切りカッターで３５ｍｍ角に切断し細胞分離フィルター材とした。この細胞分離フィルター材を容器外寸（縦×横×厚み）４１×４１×１８ｍｍで液体流出口と液体流入口を対角線上に持つポリカーボネート製容器の出口側に平均繊維径２．３μｍのポリエステル不織布がくるように充填して細胞分離フィルターとした。なお、有効濾過断面積１２．２５ｃｍ２、２．３μｍ不織布の充填密度は約０．２２ｇ／ｃｍ２であった。また、この細胞分離器に血小板通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（ヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートのモル比＝９７：３）の１％エタノール溶液を該フィルターの入口側から通液した後、窒素ガスを通して乾燥させた。
【００４８】
２．細胞分離操作
ＡＣＤ溶液を用いてヒト末梢血から連続遠心分離法（ＣＯＢＥ　ＳＰＥＣＴＲＡ、ＣＯＢＥ−Ｌａｂ．Ｉｎｃ社製）により単核球分画を得た。単核球分画（６．８×１０７個／ｍｌ、単球純度２４．４％）を５０ｍｌ分取し、５ｍｌ／ｍｉｎの流速で細胞分離フィルターに流した後、１０ｍｌ／ｍｉｎでＰＢＳ（−）５０ｍｌで洗浄し、４℃の冷蔵庫で細胞分離フィルターごと１５分冷やした後、細胞分離フィルター出口より１０％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字社製「デキストラン４０注」）１０ｍｌ、次いで空気２５ｍｌを導入して細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約４０分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積１ｍｍ２当たりの有核細胞総数は、２５９６個であり、単球回収率５３％、単球純度４１．３％であった。
【００４９】
【比較例４】
実施例４同様の細胞分離フィルターを作成した。
ＡＣＤ溶液を用いてヒト末梢血から連続遠心分離法（ＣＯＢＥ　ＳＰＥＣＴＲＡ、ＣＯＢＥ−Ｌａｂ．Ｉｎｃ社製）により単核球分画を得た。単核球分画（６．８×１０７個／ｍｌ、単球純度２４．４％）を５ｍｌ分取し、実施例４と同様の操作で細胞を回収した。単核球分画をフィルターに流してから、単球を回収するまでに要した時間は、約３０分であった。本細胞分離操作でのフィルターの表面積１ｍｍ２当たりの有核細胞総数は、２６０個であり、単球回収率４９％、単球純度２５．１％であった。
【００５０】
【比較例５】
ＡＣＤ溶液１ｍｌを含んだチューブにヒト末梢血８ｍｌを採血した。この時点で単球純度は６．３％であった。比重遠心分離法（ファルマシア社製「フィコール」、比重１．０７７ｇ／ｍｌ）により単核球分画を採取し、５×１０６個／ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）へ浮遊させた。この時点で単球の純度は１７．９％であった。付着細胞培養用ディッシュに単核球分画を播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で２時間培養した。培地の上清を取り除き、温ＰＢＳ（−）で２回リンスして浮遊細胞を取り除いた後、再度ＰＢＳ（−）を少量加え、ラバーポリスマンを用いて、付着している細胞をディッシュより引き剥がした。この間の操作は、ＣＯ２インキュベーターへディッシュを入れる以外は全てクリーンベンチ内で行った。単核球分画をディッシュに播種してから、単球を回収するまでに要した時間は、約１９０分であった。本細胞分離操作での単球回収率３１％、単球純度２７．８％であった。
【００５１】
これらの実施例１〜４及び比較例１〜５の細胞分離操作で得られた有核細胞総数／フィルター表面積、単球回収率、単球純度及び単球回収に要した時間を表に示した。
【表１】
2004129550.tif 000003
【００５２】
また、これらの実施例１〜４及び比較例１〜４の有核細胞総数／フィルター表面積に対する単球回収率及び単球純度をプロットし、図１に示した。この図からみて、単球回収率及び単球純度が高くなるのは、フィルター表面積１ｍｍ２当たり有核細胞総数１０００〜１００００個の範囲であり、この範囲より小さい場合は単球純度が低下（場合によっては単球回収率も低下する）し、この範囲より大きい場合は単球回収率が著しく低下した。
【００５３】
【発明の効果】
本発明によれば、高純度、かつ高収率の単球分画を採取することができる。本発明によれば、フィルターを用いることにより大量の細胞を一度に処理でき、またフィルターを回路に組み込むことにより、密閉系で単球分画を採取できるため、実験室レベルの実験医療のみならず、ルーチンの医療行為への発展に大いに貢献することができる。
また、連続遠心分離法で採取した単核球分画は、凍結しておくと小分けに使用することができる。ドナーが不足している等の際は、連続遠心分離法で採取した単核球分画を、適宜に解凍し、本発明の方法により簡便操作で単球を得て、医療行為に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１〜４、および比較例１〜４の結果を表すグラフである。
【図１】
2004129550.tif 000004