(57)【要約】【課題】骨髄、末梢血、臍帯血などの単核球と除去を必要とする赤血球とを含む細胞集団から効率よく赤血球を除去し、単核球を回収する方法。【解決手段】細胞集団液をフィルターに導入し、単核球をフィルターで捕捉し、１．５〜２５ｗｔ％のアルブミンを含むリンス液でリンスし、単核球回収液を導入して単核球を採取する。リンス液には、前記濃度のアルブミンを含有する生理食塩液が用いられ、単核球回収液にはデキストラン生理食塩水溶液などが用いられる。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単核球と、少なくとも赤血球を含む除去対象細胞とを含む細胞集団を、少なくとも単核球を捕捉する単核球捕捉フィルターに導入し、次に１．５〜２５ｗｔ％のアルブミンを含むリンス液を該単核球捕捉フィルターに導入した後、単核球回収液を該単核球捕捉フィルターに導入して単核球を採取することを特徴とする単核球の採取方法。
【請求項２】
単核球が造血幹細胞を含む請求項１記載の単核球採取方法。
【請求項３】
１．５〜２５ｗｔ％のアルブミンを含む生理的溶液からなる、除去対象細胞を除去するために用いるリンス液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞集団から単核球を分離・回収する方法に関する。より、詳細には、細胞集団を単核球捕捉フィルターで捕捉し、単核球以外の細胞をリンス液により除去し、単核球を高率に回収する方法及びこの方法に用いられるリンス液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、全血輸血に代わって、全血から赤血球、血小板、白血球を選択的に取り出し、治療に必要な血球成分を輸血する成分輸血が行われるようになった。また最近では、白血病などの造血器腫瘍及び固形癌の化学療法における副作用である造血障害に対して、末梢血、骨髄、臍帯血の中の造血幹細胞を移植することが盛んに行われている。臍帯血幹細胞は、他の造血幹細胞移植、すなわち、骨髄移植あるいは末梢血幹細胞移植のようにドナーから採取されてすぐ患者に移植されることはまれであるので、採取時から使用時まで保存しておくことが必要である。臍帯血は凍結保存に際し、解凍後に溶血する赤血球による副作用を防止し、凍結保存時の体積を小さくする目的で、有核細胞を分離し、赤血球を除去すべきであるとされており、現在はほとんどの場合で分離保存が行われている（非特許文献１参照）。
【０００３】
血液から治療に必要な血球成分を分離する方法として、従来、比重液（例えばファルマシア社製Ｆｉｃｏｌｌ）を用いる比重遠心法が採用されているが、この方法は比重液に原料細胞を重層させる際に液面を乱してはならない等、非常に熟練を要する煩雑な操作である。特許文献１、特許文献２等には、この方法の操作の煩雑さを解決すべく多くの試みが開示されているが、比重液を用いるという点では同じであり、抜本的な解決には至っていない。また、ヒドロキシエチルスターチと混和して、赤血球の連銭形成により赤血球を沈降させ、白血球層を分離する方法があるが、この方法も作業が煩雑であり、分離性能も十分とは言えない。
【０００４】
これらに代わる簡便な方法としてフィルター法が検討されており、特許文献３には、血液中の回収必要細胞をフィルターに捕捉し、回収液をフィルターに通液することにより回収必要細胞を回収する方法が開示されている。この方法はきわめて単純、短時間の操作であるため有用性が高いが、フィルター内に除去対象細胞である赤血球が残存する為、凍結保存時の体積を小さくするには限界がある。
【０００５】
これらの問題を解決すべく、特許文献４では除去対象細胞を高率に除く方法として生理食塩液でリンスする方法について記載されている。しかしながら、本発明者らが検討したところ、処理する細胞集団液量が少ない場合には単核球の捕捉率および回収率は低下しないが、細胞集団液量が多い場合には単核球の捕捉率も回収率も低下することが分かった。
【０００６】
更に特許文献５には１％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）加ＰＢＳ溶液が、非特許文献２には０．５％ヒト血清アルブミン（以下ＨＳＡと略す）加生理食塩液が記載されている。しかしながら、これらの先行技術には、リンス液に用いる生理的溶液の一組成が記載されているに過ぎず、リンス液組成が細胞分離に与える影響については何も知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】
特開昭６１−８４５７７号公報
【特許文献２】
特開平２−１３４５６４号公報
【特許文献３】
特開平８−１０４６４３号公報
【特許文献４】
特開平１１−５６３５１号公報
【特許文献５】
特開平８−１０８０６９号公報
【非特許文献１】
編集：原田実根、薗田精昭、高上洋一、末梢血幹細胞移植−基礎から臨床まで、
発行：南江堂、発行年月日：１９９５年６月２５日、１７３頁
【非特許文献２】
Ｌ．ＤＡＬ　ＣＯＲＴＩＶＯ，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ　＆　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　９，　Ｍａｒｙ　　Ａｎｎ　Ｌｉｅｂｅｒｔ，２０００，Ｐ８８５　−８９０
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、１つのフィルターを用いて、単核球と少なくとも赤血球を含む除去対象細胞とを含む細胞集団から単核球を選択的に採取するに際して、赤血球を含む除去対象細胞を高率に除去し単核球を高率に回収することのできる単核球の採取方法を提供することにある。
さらに、本発明の他の課題は、除去対象細胞を高率に除去し、単核球の回収率を高めることのできるリンス液を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決すべくリンス液の組成という観点から鋭意検討した。その結果、リンス液にアルブミンを１．５〜２５％含有させることにより単核球の捕捉率を落とさずに赤血球を大幅に減らすことができ、その後の回収操作においても単核球の回収率を大きく向上させることができることを見出し、本発明を得るに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、次の（１）〜（３）の単核球の採取方法及びその方法に使用するリンス液に関する。
（１）単核球と、少なくとも赤血球を含む除去対象細胞とを含む細胞集団を、少なくとも単核球を捕捉する単核球捕捉フィルターに導入し、次に１．５〜２５ｗｔ％のアルブミンを含むリンス液を該単核球捕捉フィルターに導入した後、単核球回収液を単核球捕捉フィルターに導入して単核球を採取することよりなる単核球の採取方法。
（２）前記単核球が造血幹細胞を含む前記（１）記載の単核球採取方法。
（３）１．５〜２５ｗｔ％のアルブミンを含む生理的溶液からなる、除去対象細胞を除去するために用いるリンス液。
【００１１】
本発明によれば、１つのフィルターを用いて、少なくとも単核球および赤血球を含む細胞集団から単核球を選択的に採取するに際し、赤血球を含む除去対象細胞を高率に除去することができ、さらに単核球を高率に回収することができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明でいう単核球とは、円形に近い核を有する白血球のことであり、造血幹細胞、骨髄系幹細胞、リンパ球系幹細胞、単球マクロファージ前駆細胞、成熟した単球、リンパ球のことをいう。
【００１３】
本発明でいう細胞集団とは、分離回収を必要とする細胞と除去を必要とする細胞とを混在して含む細胞集団である。具体的には、分離回収を必要とする細胞とは、骨髄、末梢血、臍帯血等の造血幹細胞移植や免疫療法等に有用な細胞のことであり、より具体的には単核球のことをいう。また、除去を必要とする細胞とは、単核球と混在していると凍結解凍時の破壊細胞によるドナーへの副作用や単核球の低回収等の悪影響を及ぼす細胞のことであり、例えば、赤血球、血小板、顆粒球、ならびにこれらの混合物が挙げられる。
このように、本発明では、少なくとも単核球と除去対象細胞とを混在して含むものを細胞集団と称し、その例としては、骨髄、末梢血、臍帯血あるいはこれらを遠心分離等により粗分離したものが挙げられる。
【００１４】
本発明における単核球捕捉フィルターに細胞集団を導入する方法としては、落差による方法、シリンジで押し込む方法、バッグを押しつぶす方法、ローラーポンプを用いる方法等が挙げられる。
【００１５】
本発明で使用する細胞集団液は、細胞集団液量／（フィルター容積／濾材空隙率）が１．０〜４０．０の範囲内であることが好ましい。１．０以下であると細胞集団がフィルターを通過するのに十分な量でなく、回収必要細胞が十分に得られない。また、４０．０以上であると回収必要細胞がフィルターから漏洩する。
なお、ここ　でいう濾材空隙率は、下記の算出式で定義する。
2004121144.tif 000002
濾材を２種類以上使用する場合の濾材空隙率は、各濾材毎に（濾材の重量）（ｇ）／（濾材の比重）（ｇ／ｃｍ３）を計算し、その合計をフィルター内で全濾材の占める空間容積で除し、１　から引いた値とする。
【００１６】
本発明でいう単核球捕捉フィルターとは、単核球を実質的に捕捉し、除去対象細胞を実質的に通過させる及び／又はリンス液で洗い流されるフィルターのことであり、濾材を容器に充填したものが挙げられる。
本発明でいう除去対象細胞を実質的に通過させるとは、細胞集団中の除去対象細胞の６０％以上を通過させることをいう。
【００１７】
容器とは、成型容器で、容器内面に細胞捕捉面が存在するものであり、しかも成型性や滅菌性に優れ、細胞毒性が低いものが好ましい。例示すると、ポリエチレン、　ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属があげられる。成型性や滅菌性の点から、ポリエチレン、　ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネートが特に好ましい。
【００１８】
濾材としては、水不溶性であればいかなる材質でも使用可能であるが、成形性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、　ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属等が挙げられる。成形の容易さ、安定性の点から、素材はポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステルが特に好ましい。
【００１９】
濾材の形状としては、粒状、繊維塊、織布、不織布、平板、スポンジ状多孔質体等があげられ、何れを用いても構わないが、体積あたりの表面積が大きいという点で繊維塊、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好ましい。最も好ましくは不織布である。
なお、前記の濾材はこのままでも用いられるが、必要に応じて濾材表面に化学的な改質を加えても良い。例えば、アミノ酸、ペプチド、糖タンパク（抗体、接着分子等のバイオリガンドを含む）といったリガンドを表面に固定することで、特定の細胞に対して親和性を高めることができる。また、例えばヒドロキシエチルメタクリレートを主成分とする合成高分子等で濾材表面に血小板通過性を付与することもできる（特公平６−５１０６０号公報参照）。
【００２０】
本発明におけるリンス液は、フィルターに捕捉された単核球が剥離しにくく、一方で除去対象細胞を効率よく洗い流すものである。具体的には、生理的溶液であって、市販の生理食塩液、Ｄ−ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝液）やＨＢＳＳ（ハンクス液）等の緩衝液にアルブミンを特定濃度で溶解したものである。
【００２１】
アルブミンの濃度は１．５〜２５ｗｔ％であることが必要であり、より好ましくは１．５〜１５ｗｔ％、最も好ましくは１．５〜１０ｗｔ％である。単核球は濾材にアルブミンなどの血漿タンパク質を介してフィルターに捕捉されると推定されるが、リンス液のアルブミン濃度が１．５％未満だと単核球が捕捉されるのに十分なアルブミン濃度でなく、単核球がリンス液とともに洗い流され回収率が低下する。反対に、アルブミン濃度が２５％を超えると、アルブミンを溶解させるのが困難であり、しかも、アルブミンが溶液中で不安定となって析出しやすいので好ましくない。
また、アルブミンには、単核球を圧力や剪断応力による損傷などから保護する効果も期待できるため、この理由からもアルブミン溶液はリンス液として好適に使用できる。
【００２２】
本発明でいうアルブミンとは、動・植物の細胞、体液中に含まれる一群の可溶性タンパク質の総称であり、卵白中に含まれるオボアルブミン、乳中のラクトアルブミン、血清アルブミンなどが挙げられる。リンス液に用いるものとして好ましいのは、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、これらの遺伝子組み替え品、自己血漿などであるが、最も好ましくはＨＳＡである。アルブミンの性状としては、液状、粉末状があるがどちらでもよく、粉末状であれば生理食塩液やＰＢＳ（−）などの生理的溶液に溶解したものを原液として使用する。
【００２３】
本発明で使用するリンス液は、リンス液量／（フィルター容積／濾材空隙率）が０．３〜７．０の範囲内であることが好ましい。０．３以下ではフィルター内に残った除去対象細胞を十分に除ける量ではなく、また７．０以上では捕捉された回収必要細胞も除かれてしまう。
【００２４】
単核球捕捉フィルターに細胞集団を導入した後、除去対象細胞を前記のリンス液で洗い去る。その場合の濾材を流れるリンス液の線速としては、５ｃｍ／分以下であることが好ましい。線速が５ｃｍ／分より速いと単核球回収率が大きく低下する。これは単核球が濾材の孔の奥に入り込み、回収操作時孔の奥に入り込んだ単核球を十分に回収しにくく、回収率が低下すると推定される。単核球捕捉フィルターにリンス液を導入する方法としては特に限定はしないが、シリンジポンプ、ブラッドポンプ、ペリスタポンプ等の装置を用いて一定でかつ低速で流すのが好ましい。落差でも前記条件で流すことができるのであればそれでもよい。
【００２５】
本発明で用いる単核球回収液としては、単核球の損傷がなく、且つ高率に回収可能なものが好ましい。　好ましいものを例示すると、市販の生理食塩液、ＰＢＳ（−）（リン酸緩衝液）やＨＢＳＳ（ハンクス液）等の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０等の細胞培養用培地、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子溶液、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルスターチ、デキストラン、キチン誘導体、コラーゲン、フィブロネクチン、アルブミン、グロブリン等の天然高分子溶液、グルコース、サッカロース、マルトース、ソルビトール、グリセリン、ジメチルスルホキシド等の有機物溶液及びこれらの混合物が挙げられる。また、２価カチオンを除去して細胞剥離を容易にする目的でキレート剤が含有されていてもよい。
【００２６】
デキストランやヒドロキシエチルスターチ等の高分子溶液は凍害保護剤としても機能するため、そのまま或いはＤＭＳＯ等の凍害保護剤を更に添加することで凍結保存も可能である上、生理食塩液等に比し粘性を上げることができ、回収時の剪断応力を向上できるため、好結果を得ており、単核球回収液としてより好ましい。
【００２７】
本発明で用いる単核球回収液は、単核球回収液量／（フィルター容積／濾材空隙率）は０．７〜１５．０の範囲内であることが好ましい。０．７以下ではフィルターに捕捉された細胞を十分に回収できる量でなく、十分な回収率が得られない。また、１５．０以上では、それ以上単核球回収液量を増やしても回収必要細胞の回収率に変化は見られない。
【００２８】
本発明で行う回収方法としては、特に限定しないが、単核球回収液の流速は剪断応力を高め、単核球を高率で回収するためにできるだけ高速が好ましいが、内圧上昇による単核球捕捉フィルターとチューブ等の接続部のはずれや、単核球へのダメージを起こさない流速に制御することが好ましい。また、単核球回収液を単核球捕捉フィルターに導入する手段は、シリンジポンプ、ブラッドポンプ、ペリスタポンプ等の装置を用いるものや、簡便法としてシリンジを手で押す方法、液体を貯留したバッグを押しつぶして液流を惹起する方法、落差処理等が挙げられる。更に、単核球の回収率をより高めるために、フィルターに振動を加えるとか、ストップドフロー等を行ってもよい。又、特開平２００１−０６９９６６号公報に記載されている回収治具を使用すると、一定の流速で回収することができ、より好ましい。
本発明を実施する環境温度は、特に記載がない限り、５〜３７℃の範囲内で行なう。
【００２９】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を比較例と共に示すが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
１．単核球捕捉フィルターの作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦３０ｍｍ、横３０ｍｍ、高さ１２ｍｍ（有効濾過断面積９ｃｍ２、内容積１１ｃｍ３）で液体流出口と液体流入口を有するポリカーボネート製容器の入口側から、第１層目に平均繊維径２．３μｍ、目付６０ｇ／ｍ２のポリエステル不織布１８枚を、第２層目に平均繊維径１２μｍ、目付１００ｇ／ｍ２のポリエステル不織布１６枚を、上容器と下容器の周辺で挟み込むように充填して容器入口側空間と出口側空間に分離した。
なお、この単核球捕捉フィルター内に充填された不織布の濾材空隙率は０．９１で、充填密度は、第１層目が０．２２ｇ／ｃｍ３、　第２層目が０．２９ｇ／ｃｍ３であった。
【００３０】
また、該単核球捕捉フィルターに血小板通過性を付与する目的で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（モル比で９７：３）の１％エタノール溶液を該単核球捕捉フィルターの液体流入口から通液し、窒素ガスで余分なポリマー溶液をパージした後、６０℃で８時間以上真空乾燥機で乾燥させた。
【００３１】
２．細胞分離操作
この単核球捕捉フィルターに、ＣＰＤ（クエン酸・リン酸・デキストロース）加ヒト臍帯血７０〜２００ｍｌを液体流入口から落差により通液して単核球を捕捉した後、同じく液体流入口からフィルター内に残存する赤血球、血小板をＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を１．５％含有する生理食塩液１０ｍｌを落差で通液してリンスした。濾過した血液及びフィルター内を通ったリンス液はドレインボトルに回収した。その後、市販の１０％デキストラン生理食塩水溶液（小林製薬「デキストラン４０注」）にＨＳＡを３％になるように添加した液体１８ｍｌ＋エアー１９ｍｌを液体流出口から通液し、液体流入口から単核球を回収した。
【００３２】
３．分析
本細胞分離操作での細胞数のカウントは多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定し、単核球捕捉率、単核球回収率、赤血球除去率を算出した。尚、捕捉率、回収率、除去率は以下の式で算出した。
捕捉率（％）＝１００−１００×（ドレイン液中細胞数　／元細胞数）
回収率（％）＝１００×（単核球回収液中細胞数／元細胞数）
除去率（％）＝１００−１００×（単核球回収液中細胞数／元細胞数）
【００３３】
また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ造血機能アッセイとして公知のメチルセルロース培地（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ　ＧＦ４４３４Ｖ）を用いるコロニーアッセイを原料血液、回収後細胞液について行い、コロニー形成細胞回収率を以下の式で算出した。
コロニー形成細胞回収率（％）＝細胞分離操作後の白血球回収率×〔（回収後細胞液のコロニー数／播種細胞数）／（原料血液のコロニー数／播種細胞数）〕
【００３４】
４．結果
表１に示す。
【００３５】
【実施例２】
１．細胞分離フィルターの作製
実施例１と同様の方法で作製した。
２．細胞分離操作
ＣＰＤ加ヒト臍帯血７０〜２００ｍｌを実施例１と同様の方法で細胞分離操作を行い、リンス液として５％ＨＳＡ加生理食塩液１０ｍｌを流した。
３．分析
実施例１と同様の方法で行った。
４．結果
表１に示す。
【００３６】
【実施例３】
１．細胞分離フィルターの作製
実施例１と同様の方法で作製した。
２．細胞分離操作
ＣＰＤ加ヒト臍帯血７０〜２００ｍｌを実施例１と同様の方法で細胞分離操作を行い、リンス液として２５％ＨＳＡ液１０ｍｌを流した。
３．分析
実施例１と同様の方法で行った。
４．結果
表１に示す。
【００３７】
【比較例１】
１．細胞分離フィルターの作製
実施例１と同様の方法で作製した。
２．細胞分離操作
ＣＰＤ加ヒト臍帯血７０〜２００ｍｌを実施例１と同様の方法で細胞分離操作を行い、リンス液として生理食塩液１０ｍｌを流した。
３．分析
実施例１と同様の方法で行った。
４．結果
表１に示す。
【００３８】
【比較例２】
１．細胞分離フィルターの作製
実施例１と同様の方法で作製した。
２．細胞分離操作
ＣＰＤ加ヒト臍帯血７０〜２００ｍｌを実施例１と同様の方法で細胞分離操作を行い、リンス液として０．５％ＨＳＡ加生理食塩液１０ｍｌを流した。
３．分析
実施例１と同様の方法で行った。
４．結果
表１に示す。
【００３９】
【比較例３】
１．細胞分離フィルターの作製
実施例１と同様のフィルターを作製した。
２．細胞分離操作
細胞分離フィルターに、ＣＰＤ加ヒト臍帯血７０〜２００ｍｌを液体流入口から落差により通液して単核球を捕捉した後、フィルターにリンス液を通液させず、市販の１０％デキストラン生理食塩水溶液（小林製薬「デキストラン４０注」）にＨＳＡを３％になるように添加した液体１８ｍｌ＋エアー１９ｍｌを液体流出口から通液し、液体流入口から単核球を回収した。
３．分析
実施例１と同様の方法で行った。
４．結果
表１に示す
【００４０】
【表１】
2004121144.tif 000003
【００４１】
実施例１〜３では、アルブミンを含まないリンス液を用いる比較例１、アルブミン濃度の低い比較例２に比べ単核球捕捉率および回収率、コロニー形成細胞回収率はリンスをしない比較例３と比べても同等の高い値を維持していた。
また、実施例１〜３の赤血球除去率はリンスを行う比較例１、２と同等であり、リンスを行わない比較例３に比べて有意に高い結果となった。
このように、リンス液にアルブミンを加えた場合、細胞集団液量が多くても単核球を高率に回収でき、赤血球を高率に除去することができた。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の単核球の採取方法およびリンス液により、簡便な操作で細胞集団から除去対象細胞を高率に除去するだけでなく、単核球を高率に回収できる。