(57)【要約】【課題】アフィニティー精製のための適切な位置にタグを付加したタンパク質を発現させることのできる発現ベクターを、またそれぞれに異なる位置にタグを付加した６種類のタグ付加タンパク質をそれぞれに発現する発現ベクターセットを、さらにこの発明は、前記のベクターセットを用いて目的タンパク質、またはタンパク質複合体を高純度で精製する方法を提供する。【解決手段】タグ（Ａ）およびタグ（Ｂ）を付加したタンパク質を発現するベクターであって、ベースベクター内にタンパク質コード配列のクローニング部位、タグ（Ａ）コード配列およびタグ（Ｂ）コード配列からなる発現カセットを備えており、Ｎ端からＣ端方向に、（１）　タンパク質−タグ（Ａ）−タグ（Ｂ）；（２）　タンパク質−タグ（Ｂ）−タグ（Ａ）；（３）　タグ（Ａ）−タンパク質−タグ（Ｂ）；（４）　タグ（Ｂ）−タンパク質−タグ（Ａ）；（５）　タグ（Ａ）−タグ（Ｂ）−タンパク質；または（６）　タグ（Ｂ）−タグ（Ａ）−タンパク質のいずれかのタグ付加タンパク質を発現することを可能とする。【選択図】　図１
2004121153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タグ（Ａ）およびタグ（Ｂ）を付加したタンパク質を発現するベクターであって、ベースベクター内に、タンパク質コード配列のクローニング部位、タグ（Ａ）コード配列およびタグ（Ｂ）コード配列からなる発現カセットを備えており、Ｎ端からＣ端方向に、
（１）　タンパク質−タグ（Ａ）−タグ（Ｂ）；
（２）　タンパク質−タグ（Ｂ）−タグ（Ａ）；
（３）　タグ（Ａ）−タンパク質−タグ（Ｂ）；
（４）　タグ（Ｂ）−タンパク質−タグ（Ａ）；
（５）　タグ（Ａ）−タグ（Ｂ）−タンパク質；または
（６）　タグ（Ｂ）−タグ（Ａ）−タンパク質
のいずれかのタグ付加タンパク質を発現することを可能とするタグ付加タンパク質発現ベクター。
【請求項２】
クローニング部位が、２種類以上の異なる制限酵素認識配列を含む請求項１の発現ベクター。
【請求項３】
制限酵素認識配列が、制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩをそれぞれ認識する配列である請求項２の発現ベクター。
【請求項４】
タグ（Ａ）が６×ヒスチジン−タグである請求項１の発現ベクター。
【請求項５】
タグ（Ｂ）がＦＬＡＧである請求項１の発現ベクター。
【請求項６】
ベースベクターが酵母用ベクターである請求項１の発現ベクター。
【請求項７】
ベースベクターが栄養要求性マーカー遺伝子を有する請求項１または６の発現ベクター。
【請求項８】
栄養要求性マーカー遺伝子がＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子またはＴＲＰ１遺伝子である請求項７の発現ベクター。
【請求項９】
クローニング部位が制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩをそれぞれ認識する配列を含み、タグ（Ａ）が６×ヒスチジン−タグであり、タグ（Ｂ）がＦＬＡＧである請求項１の発現ベクター。
【請求項１０】
配列番号１から６のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ断片を有する請求項９の発現ベクター。
【請求項１１】
配列番号１から６のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項１２】
請求項１の発現ベクター６種のセットであり、各発現ベクターは請求項１記載の（１）から（６）のそれぞれのタグ付加タンパク質を発現することを可能とする発現ベクターセット。
【請求項１３】
請求項１２の発現ベクターセット２組からなる１２種のベクターセットであり、各組の各発現ベクターは請求項１記載の（１）から（６）のそれぞれのタグ付加タンパク質を発現することを可能とするとともに、各組は、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子およびＴＲＰ１遺伝子からなる群より選択された異なる栄養要求性マーカー遺伝子を有する発現ベクターセット。
【請求項１４】
請求項１２の発現ベクターセット３組からなる１８種のベクターセットであり、各組の各発現ベクターは請求項１記載の（１）から（６）のそれぞれのタグ付加タンパク質を発現することを可能とするとともに、各組は、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子およびＴＲＰ１遺伝子からなる群より選択された異なる栄養要求性マーカー遺伝子を有する発現ベクターセット。
【請求項１５】
請求項１２の発現ベクターセットの各種ベクターにタンパク質コード配列をクローニングし、各ベクターをそれぞれ宿主細胞に形質導入し、細胞にタグ付加タンパク質を産生させ、タグ（Ａ）およびタグ（Ｂ）のリガンド分子を備えたカラムにタグ付加タンパク質溶液を通液してタンパク質を精製することを特徴とする高純度タンパク質の精製方法。
【請求項１６】
請求項１３または１４の発現ベクターセットの各種ベクターにタンパク質コード配列をクローニングし、各ベクターをそれぞれ異なる栄養要求性変異株細胞に形質導入し、細胞にタグ付加タンパク質を産生させ、タグ（Ａ）およびタグ（Ｂ）のリガンド分子を備えたカラムにタグ付加タンパク質溶液を通液してタンパク質を精製することを特徴とする高純度タンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、タグ付加タンパク質発現ベクターに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、タンパク質や複合タンパク質の高純度アフィニティー精製に有用な発現ベクターおよびそのセットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体の機能の大部分は、タンパク質によって担われている。生体内で、タンパク質は単独では存在することがほとんどないため、目的とするタンパク質の活性やその制御を理解するためには、目的のタンパク質が生体内でどのような他のタンパク質と相互作用、また会合をしているのか知る必要がある（たとえば、非特許文献１参照）。そのための簡便かつ効果的な手段として、現在最も汎用されているのが「アフィニティー精製」と呼ばれる方法である。この方法は、目的とするタンパク質に、「タグ」と呼ばれる特殊なペプチドを遺伝子工学的に付加し、このタグに親和性を有するリガンド分子を利用して、タグ付加した目的タンパク質およびこの目的タンパク質と会合している因子等のタンパク質複合体を取得する手法である。アフィニティー精製によって取得された因子等のタンパク質複合体がどのようなタンパク質であるか同定する手法も進歩している（たとえば、非特許文献２参照）。
【０００３】
近年、ポストゲノムプロジェクトの一つの方向として、ゲノム配列がコードする全てのタンパク質の機能解析を網羅的に行う「プロテオーム解析」が注目されている。その中でも最も有力なアプローチの一つが、全てのタンパク質に対して、そのタンパク質の会合体である「タンパク質複合体」を取得し、そこに含まれるタンパク質を同定する解析することである。特に、出芽酵母は真核生物のモデル生物として重要な位置を占めている上に、遺伝子操作が容易であることから、この解析に適したモデル生物である。
【０００４】
事実、出芽酵母を用いた大規模な「タンパク質複合体の取得とその構成タンパク質の同定」が２つのグループにより報告されている（非特許文献３および非特許文献４）。この報告の中で、２つのグループはそれぞれ１，７３９および７２５個の遺伝子に対してタンパク質複合体の取得を試みたが、実際に得られたタンパク質複合体は両グループとも５００個弱にとどまっている。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｃｅｌｌ　１９９８，　９２（２９１），　２９１−２９４
【非特許文献２】
Ｔｒｅｎｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１９９７（７），　１３９
【非特許文献３】
Ｎａｔｕｒｅ　２００２，　４１５，　１４１−１４７
【非特許文献４】
Ｎａｔｕｒｅ　２００２，　４１５，　１８０−１８３
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
アフィニティー精製において最も重要な要件の一つは、タンパク質に付加されたタグがリガンド分子にしっかりと認識され、両者が結合することである。しかしながら、酵母等の真核細胞で発現したタンパク質は折り畳まれでそれぞれ固有の立体構造をとるため、タグがタンパク質内部に埋没した状態となる危険性がある。このことは複数のタンパク質が結合したタンパク質複合体ではさらに顕著なものとなる。
【０００７】
上記の大規模プロテオーム解析（非特許文献３、４）において、タンパク質複合体を取得できなかった問題の一つに、用いたタグの種類と位置が個々のタンパク質の複合体取得に適していなかったことが考えられる。
【０００８】
従って、生体内のタンパク質について網羅的・包括的にタンパク質複合体を取得するには、それぞれのタンパク質に対してタグを付加するのに適切な位置を選択する必要がる。
【０００９】
また、適切なタグ付加位置の選択は、原核生物等を含めた様々な宿主において産生した単独タンパク質のアフィニティー精製においても重要な課題である。
【００１０】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、アフィニティー精製のための適切な位置にタグを付加したタンパク質を発現させることのできる発現ベクターを提供することを課題としている。
【００１１】
また、この出願の発明は、それぞれに異なる位置にタグを付加した６種類のタグ付加タンパク質をそれぞれに発現する発現ベクターセットを提供することを課題としている。
【００１２】
さらにこの出願の発明は、前記のベクターセットを用いて目的タンパク質、またはタンパク質複合体を高純度で精製する方法を提供することを課題としている。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明として、タグ（Ａ）およびタグ（Ｂ）を付加したタンパク質を発現するベクターであって、ベースベクター内に、タンパク質コード配列のクローニング部位、タグ（Ａ）コード配列およびタグ（Ｂ）コード配列からなる発現カセットを備えており、Ｎ端からＣ端方向に、
（１）　タンパク質−タグ（Ａ）−タグ（Ｂ）；
（２）　タンパク質−タグ（Ｂ）−タグ（Ａ）；
（３）　タグ（Ａ）−タンパク質−タグ（Ｂ）；
（４）　タグ（Ｂ）−タンパク質−タグ（Ａ）；
（５）　タグ（Ａ）−タグ（Ｂ）−タンパク質；または
（６）　タグ（Ｂ）−タグ（Ａ）−タンパク質
のいずれかのタグ付加タンパク質を発現することを可能とするタグ付加タンパク質発現ベクターを提供する。
【００１４】
この第１発明の発現ベクターにおける好ましい態様の一つは、クローニング部位が２種類以上の異なる制限酵素認識配列を含むことであり、さらに好ましいのは、制限酵素認識配列は制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩをそれぞれ認識する配列である。
【００１５】
別の好ましい態様においては、タグ（Ａ）が６×ヒスチジン−タグであり、タグ（Ｂ）がＦＬＡＧである。
【００１６】
またさらに別の態様において、ベースベクターは酵母用ベクターである。
【００１７】
さらにまた別の好ましい態様において、ベースベクターは栄養要求性マーカー遺伝子を有し、好ましくは、この栄養要求性マーカー遺伝子はＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子またはＴＲＰ１遺伝子である。
【００１８】
第１発明の発現ベクターの特に好ましい態様は、クローニング部位が制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩをそれぞれ認識する配列を含み、タグ（Ａ）が６×ヒスチジン−タグであり、タグ（Ｂ）がＦＬＡＧである発現ベクターである。そして、このようなベクターは、好ましくは配列番号１から６のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ断片を有する。
【００１９】
この出願は、第２の発明として、配列番号１から６のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ断片を提供する。
【００２０】
この出願は、第３の発明として、前記第１発明の発現ベクター６種のセットであり、各発現ベクターは前記第１発明において記載した（１）から（６）のそれぞれのタグ付加タンパク質を発現することを可能とする発現ベクターセットを提供する。
【００２１】
この出願は、第４の発明として、前記第３発明の発現ベクターセット２組からなる１２種のベクターセットであり、各組の各発現ベクターは前記第１発明において記載した（１）から（６）のそれぞれのタグ付加タンパク質を発現することを可能とするとともに、各組は、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子およびＴＲＰ１遺伝子からなる群より選択された異なる栄養要求性マーカー遺伝子を有する発現ベクターセットを提供する。
【００２２】
この出願は、第５の発明として、前記第３発明の発現ベクターセット３組からなる１８種のベクターセットであり、各組の各発現ベクターは前記第１発明において記載した（１）から（６）のそれぞれのタグ付加タンパク質を発現することを可能とするとともに、各組は、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子およびＴＲＰ１遺伝子からなる群より選択された異なる栄養要求性マーカー遺伝子を有する発現ベクターセットを提供する。
【００２３】
この出願はさらに、第６の発明として、前記第３発明の発現ベクターセットの各種ベクターにタンパク質コード配列をクローニングし、各ベクターをそれぞれ宿主細胞に形質導入し、細胞にタグ付加タンパク質を産生させ、タグ（Ａ）およびタグ（Ｂ）のリガンド分子を備えたカラムにタグ付加タンパク質溶液を通液してタンパク質を精製することを特徴とする高純度タンパク質の精製方法を提供する。
【００２４】
またこの出願は、第７の発明として、前記第４発明または第５発明の発現ベクターセットの各種ベクターにタンパク質コード配列をクローニングし、各ベクターをそれぞれ異なる栄養要求性変異株細胞に形質導入し、細胞にタグ付加タンパク質を産生させ、タグ（Ａ）およびタグ（Ｂ）のリガンド分子を備えたカラムにタグ付加タンパク質溶液を通液してタンパク質を精製することを特徴とする高純度タンパク質の精製方法を提供する。
【００２５】
なお、この発明において「タンパク質」および「ペプチド」とは、細胞から単離精製されたもの、遺伝子工学的に製造されたもの、合成されたもの、またはそれらと構造的に類似の生物活性等価物であって、ペプチド結合として知られるアミド型の連結により連なっているアミノ酸のポリマーを意味するのに使用する。具体的には、生物細胞（特に真核細胞）において発現する機能既知または機能未知のタンパク質であり、アミノ酸配列構造が既知であるものが好ましく、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列が既知であるものがさらに好ましい。タンパク質は、例えば公知のタンパク質ライブラリーから選択して用いることができ、あるいはｃＤＮＡライブラリー（既存ライブラリー、または任意細胞のトータルＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリー）の各ｃＤＮＡクローンから遺伝子工学的に作製したタンパク質を用いることができる。「真核細胞」は、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞等であり、特にヒトを含めた哺乳動物細胞である。
【００２６】
「コード配列」とは、タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチドの配列（ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列）である。
【００２７】
「タグ」とは、タンパク質に連結させてその精製や検出のための目印として利用することのできるペプチドであり、特異的に結合するリガンド分子が利用可能なものを意味する。
【００２８】
この発明において使用するその他の用語や概念については、発明の実施形態や実施例の記載において説明する。また、この発明を実施するために使用する様々な遺伝子操作技術等は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９８９）等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能なものである。
【００２９】
以下、前記の各発明の実施形態を詳しく説明する。
【００３０】
【発明の実施の形態】
第１発明は、タグ（Ａ）およびタグ（Ｂ）を付加したタンパク質を発現するベクターであって、ベースベクター内に、タンパク質コード配列のクローニング部位、タグ（Ａ）コード配列およびタグ（Ｂ）コード配列からなる発現カセットを備えている。そしてこの発現ベクターは、発現カセットのクローニング部位、２種類のタグコード配列の位置によって、以下のいずれかのタグ付加タンパク質を発現することができるようになっている。
（１）　Ｎ−タンパク質−タグ（Ａ）−タグ（Ｂ）−Ｃ
（２）　Ｎ−タンパク質−タグ（Ｂ）−タグ（Ａ）−Ｃ
（３）　Ｎ−タグ（Ａ）−タンパク質−タグ（Ｂ）−Ｃ
（４）　Ｎ−タグ（Ｂ）−タンパク質−タグ（Ａ）−Ｃ
（５）　Ｎ−タグ（Ａ）−タグ（Ｂ）−タンパク質−Ｃ
（６）　Ｎ−タグ（Ｂ）−タグ（Ａ）−タンパク質−Ｃ
この発現ベクターは、任意の「ベースベクター」に６種類の「発現カセット」のいずれかを挿入結合することによって作製することができる。従って、「発現カセット」はベースベクターの任意のクローニング部位に対応した制限酵素配列を両端に有することが好ましい。またこの制限酵素配列は、発現カセットの方向を一致させるために、異なる配列であることが好ましい。
【００３１】
「ベースベクター」は、適当な宿主細胞で外来タンパク質を発現させるための既存のベクターＤＮＡを一部改変して使用することができる。
【００３２】
例えば宿主細胞として大腸菌などの微生物を対象とする場合は、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター等を有するｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ等を使用することができる。また真核細胞用ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有するｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２などを使用することができる。またシャトルベクターｐＡＵＲ系等を使用することもできる。
【００３３】
「発現カセット」は、前記のとおり「タンパク質コード配列のクローニング部位」、「タグ（Ａ）コード配列」および「タグ（Ｂ）コード配列」を６通りの組み合わせで含有するヌクレオチド配列である。それぞれの配列は連続的に結合していてもよく、あるいは幾つかのヌクレオチドを介して隣接していてもよい。
【００３４】
発現カセットの「タンパク質コード配列のクローニング部位」は、具体的には制限酵素認識配列であり、好ましくは２種以上の異なる制限酵素認識配列、さらに好ましくは３〜６種の異なる制限酵素認識配列である（以下、複数の制限酵素認識配列からなるクローニング部位を「マルチクローニングサイトまたはＭＣＳ」と記載することがある）。これらの制限酵素認識配列は、ベースベクターに存在しない制限酵素認識配列を選択する。また、ベースベクターに存在するクローニング部位の幾つかを削除してもよい。この発明においては、発現カセットのＭＣＳとして、制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩをそれぞれ認識する配列を提供する。
【００３５】
発現カセットの「タグ（Ａ）コード配列」および「タグ（Ｂ）コード配列」は、それぞれに異なるタグをコードするヌクレオチド配列であり、例えば、６×ヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、β−ガラクトシターゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等をコードする配列から任意に選択することができる。特に、Ｈｉｓ（タグ（Ａ））およびＦＬＡＧ（タグ（Ｂ））をそれぞれコードする配列が、他のタグ配列よりも長さが短いため、タグを付加するタンパク質への影響を最小限度にとどめることができるうえに、過去のタンパク質複合体の精製実績も優れている点で好ましい。
【００３６】
従って、この発明の発現ベクターにおいて特に好ましい発現カセットは、ＭＣＳが制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩをそれぞれ認識する配列、タグ（Ａ）がＨｉｓ、タグ（Ｂ）がＦＬＡＧである。また、この出願の第２発明は、このような発現カセットの具体的実体として、配列番号１から６のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ断片を提供する。
【００３７】
なお、発現カセットはベースベクターのプロモーター調節下に位置する。プロモーターはベースベクターの種類や宿主細胞の種類、タンパク質の種類や発現条件等に応じて任意に選択することができる。例えば実施例に示した酵母細胞等を宿主とする場合には、ガラクトース誘導プロモーターを使用することによって、培地成分中の糖の種類によってタンパク質の発現を調節することができる。
【００３８】
また、ベースベクターによる形質転換細胞を選択するための手段として、ベースベクターは「選択マーカー」を有している。この選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、またテトラサイクリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を用いることができる。さらにこの発明では、選択マーカーとして「栄養要求性マーカー遺伝子」を使用することもできる。例えば、ＬＥＵ２遺伝子を機能喪失している栄養要求性変異株（例えば、酵母ＭＳＹ７４８株など）はロイシンを含まない培地では生育できないが、ＬＥＵ２遺伝子を含むベクターによって形質転換した変異株はロイシン欠失培地においても生育することができ、形質転換細胞を選択することができる。しかも、このようなマーカー遺伝子を使用することによって、遺伝子型の異なる様々な栄養要求性変異株を宿主としてタンパク質を発現させることができ、それによって、様々なタンパク質複合体を精製することができる。栄養要求性マーカー遺伝子としては、前記のＬＥＵ２遺伝子のほか、ウラシル要求性変異株の選択に使用することのできるＵＲＡ３遺伝子、トリプトファン要求性変異株の選択に使用可能なＴＲＰ１等を使用することができる。
【００３９】
第３発明は、前記第１発明の発現ベクター６種のセットである。このベクターセットの各ベクターは、同一種ベースベクターの同一クローニング部位に、前記６種の発現カセットのいずれかが挿入結合されており、前記第１発明において記載した（１）から（６）のそれぞれのタグ付加タンパク質を発現することができる。ベースベクターの種類やその構成、発現カセットの構成等は前記第１発明の各態様に準ずることができる。
【００４０】
第４発明は、前記第３発明の発現ベクターセット２組からなる１２種のベクターセットである。各組の各発現ベクターは、栄養要求性マーカー遺伝子として、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子またはＴＲＰ１遺伝子のいずれかを有しており、ウラシル、ロイシンまたはトリプトファン要求性変異株を宿主とした場合の形質転換細胞の選択と、それら変異株におけるタンパク質またはタンパク質複合体の精製に使用することができる。
【００４１】
第５発明は、前記第３発明の発現ベクターセット３組からなる１８種のベクターセットである。各組の各発現ベクターは、栄養要求性マーカー遺伝子として、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子またはＴＲＰ１遺伝子のいずれかを有しており、ウラシル、ロイシンまたはトリプトファン要求性変異株を宿主とした場合の形質転換細胞の選択と、それら変異株におけるタンパク質またはタンパク質複合体の精製に使用することができる。
【００４２】
この出願の第６発明は、前記第３発明の発現ベクターセットの各種ベクターにタンパク質コード配列をクローニングし、各ベクターをそれぞれ宿主細胞に形質導入し、細胞にタグ付加タンパク質を産生させ、タグ（Ａ）およびタグ（Ｂ）のリガンド分子を備えたカラムにタグ付加タンパク質溶液を通液してタンパク質を精製することを特徴とする高純度タンパク質の精製方法である。
【００４３】
タンパク質コード配列は、例えばそのタンパク質をコードするｃＤＮＡの前後を、発現カセット内のクローニング部位と同一の制限酵素で切断し、このＤＮＡ断片を予め同一酵素で切断した発現ベクターに公知の方法でライゲーションすることによって発現ベクターにクローニングする。このようにして得た組換え発現ベクターは、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって宿主細胞に形質導入する。そして、形質転換細胞を培養し、あるいはプロモーターの種類に応じて発現誘導を行った後、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過等によって培養物から目的タンパク質を粗精製する。そして最終的に、タグ（Ａ）およびタグ（Ｂ）のリガンド分子を備えたカラムを用いたアフィニティー精製によってタグ付加タンパク質を高純度で精製する。
【００４４】
「リガンド分子」はタグの種類に応じて公知のものを使用することができる。例えば６×Ｈｉｓタグを用いた場合にはニッケル分子を、ＦＬＡＧの場合には抗Ｆｌａｇ　Ｍ２
アフィニティーレシン等を使用することができる。
【００４５】
この第６発明の方法は、以上のとおり、タグ（Ａ）およびタグ（Ｂ）をそれぞれ異なる位置に付加した６種類の融合タンパク質をアフィニティー精製する。これによって、タグ（Ａ）および／またはタグ（Ｂ）が発現タンパク質またはタンパク質複合体の立体構造に応じて最も適正な位置（すなわち、最もリガンド分子と結合しやすい位置）に付加したタンパク質を高純度で精製することができる。そして、このようなタンパク質の高純度精製によって、タンパク質と複合体を形成したタンパク質群をも取得し、特定することが可能となる。
【００４６】
第７発明は、前記第４発明または第５発明の発現ベクターセットの各種ベクターにタンパク質コード配列をクローニングし、各ベクターをそれぞれ異なる栄養要求性変異株細胞に形質導入し、細胞にタグ付加タンパク質を産生させ、タグ（Ａ）およびタグ（Ｂ）のリガンド分子を備えたカラムにタグ付加タンパク質溶液を通液してタンパク質を精製することを特徴とする高純度タンパク質の精製方法である。この方法では、前記第６発明の方法に加え、栄養要求性の異なる３種類の細胞株での発現タンパク質を精製することができるため、特に遺伝子型の異なる宿主細胞での発現タンパク質複合体の精製が可能となる。
【００４７】
以下、実施例を示してこの出願の各発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００４８】
【実施例】
実施例１：ｐＭＨベクターの構築
ベースベクターの材料として、ＧＡＬ１プロモータおよびＣＭＫ１ターミネータを含むｐＲＳ３１６（Ｓｈｉｋｏｒｓｋｉ　Ｒ．Ｓ．　ａｎｄ　Ｈｉｅｔｅｒ　Ｐ．　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１９８９，　１２２：　１９−２７）由来で、ＵＲＡ３遺伝子を有するプラスミドＹｃｐＵＧ５７８Ｔを使用した。発現カセットは以下の６種類を作製した。
（１）　ＭＣＳ−Ｈｉｓ−ＦＬＡＧ（１−４，　６，　１０，　１１，　１５，　１８）
（２）　ＭＣＳ−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ（１，　３−５，　１０，　１３，　１６，　１７）
（３）　Ｈｉｓ−ＭＣＳ−ＦＬＡＧ（１，　２，　４，　６，　８，　１２，　１６，　１８）
（４）　ＦＬＡＧ−ＭＣＳ−Ｈｉｓ（１，　３−５，　１４，　１５，　１７）
（５）　Ｈｉｓ−ＦＬＡＧ−ＭＣＳ（１−３，　７，　８，　１１，　１４，　１９）
（６）　ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ−ＭＣＳ（１−３，　７，　９，　１２，　１３，　１９）
なお、前記（１）から（６）の具体的塩基配列は配列番号１〜６に示したとおりである。また前記（１）から（６）のそれぞれの括弧内の数字は、これらを作製するために使用した５’リン酸化ＤＮＡ断片を示した表１の番号に対応する。なお、表１の各塩基配列は全て配列番号１〜６に含まれている。
【００４９】
【表１】
2004121153.tif 000003
【００５０】
これらのＤＮＡ断片群を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いてそれぞれ配列番号１から６となるようにライゲーションして発現カセットを構築し、アガロースゲル（４％Ｎｕｓｉｖｅ　ＧＴＧアガロース；ＦＭＣ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社）による電気泳動法によって分離し、１００塩基対前後の部分のバンドを切り出し、精製した。次いで、プラスミドＹｃｐＵＧ５７８ＴＮのＥｃｏＲＩサイトおよびＢａｍＨＩサイト間に挿入した。ＹｃｐＵＧ５７８ＴＮは、表１に示したＤＮＡ断片＃２０を用いてＹｃｐＵＧ５７８Ｔにサイトミューテーションを起こし、制限酵素サイトのＮｄｅＩをＳｎａＢＩに変換したものである。これによって得られた６種類の発現ベクターと挿入された発現カセットとの関係は以下のとおりである。
【００５１】
ｐＭＨ０１１：ＭＣＳ−Ｈｉｓ−ＦＬＡＧ
ｐＭＨ０１２：ＭＣＳ−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ
ｐＭＨ０１３：Ｈｉｓ−ＭＣＳ−ＦＬＡＧ
ｐＭＨ０１４：ＦＬＡＧ−ＭＣＳ−Ｈｉｓ
ｐＭＨ０１５：Ｈｉｓ−ＦＬＡＧ−ＭＣＳ
ｐＭＨ０１６：ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ−ＭＣＳ
なお、これら発現ベクターセットの塩基配列は直接シークエンス法によって確認した。図１は、発現ベクターの構成と、各発現カセットの塩基配列である。
【００５２】
また、栄養要求性マーカー遺伝子としてＬＥＵ２遺伝子およびＴＲＰ１遺伝子をそれぞれ有するベクターセットも構築した。すなわち、ＬＥＵ２遺伝子を含むｐＲＳ３１５およびｐＲＳ３１４（Ｓｈｉｋｏｒｓｋｉ　Ｒ．Ｓ．　ａｎｄ　Ｈｉｅｔｅｒ　Ｐ．　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１９８９，　１２２：　１９−２７）をベースベクターとして、その制限サイトＰｖｕＩＩに前記発現カセット（１）から（６）を挿入した。ＬＥＵ２遺伝子とともに発現カセット（１）から（６）を含むものをそれぞれｐＭＨ０２１〜ｐＭＨ０２６とし、ＴＲＰ１遺伝子を含むものをそれぞれｐＭＨ０３１〜ｐＭＨ０３６とした。
実施例２：酵母における組換えタンパク質の発現
酵母細胞ＭＨＹ５８１（遺伝子型：ＭＡＴａ　／ＭＡＴα／Δｅｓａ１：：ＨＩＳ３／ＥＳＡ１）は、Ｗ３０３（Ｔｈｏｍａｓ　Ｂ．Ｊ．　ａｎｄ　Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　Ｒ．，　Ｃｅｌｌ，　１９８９，　５６：　６１９−６３０）におけるＥＳＡ１遺伝子の複製に関する完全長オープンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦと略記）をＨＩＳ３遺伝子に置換したものである。ＥＳＡ１のＯＲＦをｐＭＨベクター群に挿入するため、表１に示したＤＮＡ断片＃２１および＃２２Ａを用いたサイトミューテーションによって、ＥＳＡ１の開始コドンまたは終止コドンにそれぞれＮｄｅＩまたはＳａｌＩ制限サイトを設けた。
【００５３】
ＥＳＡ１　ＯＲＦ内のＮｄｅＩ制限サイトは、表１のＤＮＡ断片＃２０によってミューテーションを行った。取得したＥＳＡ１の完全長ＯＲＦを含むクローンのＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片を、ｐＭＨ０２１からｐＭＨ０２６のそれぞれに挿入し、それら用いて酵母株ＭＨＹ２８１を形質転換し、ＭＨＹ５０１からＭＨＹ５０６をそれぞれ構築した。得られた形質転換酵母株の胞子形成と、４分子に分離後のＭＡＴａ、ＬＥＵ＋、Ｈｉｓ＋株（それぞれＭＨＹ５０１ａからＭＨＹ５０６ａとして、遺伝子型：ＭＡＴａΔｅｓａ１：：ＨＩＳ３［ｐＭＨ−ＥＳＡ１］）を選択した。また、ＥＳＡ１のＯＲＦそのものは含まない条件下でのモック精製のため、ｐＭＨ５２４ベクターをＷ３０３−１ａ（Ｔｈｏｍａｓ　Ｂ．Ｊ．　ａｎｄ　Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　Ｒ．，　Ｃｅｌｌ，　１９８９，　５６：　６１９−６３０）に形質導入し、タグ無しのＥＳＡ１を有する酵母細胞ＭＨＹ５００ａを作成した。
実施例３：発現ベクター間の比較
炭素源として２％ガラクトースを含み、またロイシン不含で構成された合成培地で、酵母細胞（ＭＨＹ５００ａからＭＨＹ５０５ａ）をＯＤ６００値が約１．５から２．０になるまで培養した。全細胞抽出液は定法によって調製した。この抽出液をＳｕｐｅｒｏｓｅ−６　ｇｅｌ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で分画し、分子量１ＭＤａを超える分画物をＰｒｏｂｏｕｎｄレシン（Ｎｉ−アフィニティー；Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社）または抗Ｆｌａｇ　Ｍ２アフィニティーレシン（Ｓｉｇｍａ社）のいずれかに通し、結合させた。
【００５４】
上記レシンを抽出緩衝溶液で洗浄後、レシンに結合した分画物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるサンプル溶液とレシンを混合させることによって抽出し、その後煮沸した。
【００５５】
図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果である。レーン１は全細胞抽出液のみ、レーン２および３は全細胞抽出液をＦＬＡＧアフィニティーレシンに通した結果であり、レーン４および５は全細胞抽出液をヒスチジンタグアフィニティーレシンに通した結果である。なお、レーン２および４は各レシンを洗浄した際に得られた結合しなかった分画物を、レーン３および５は結合した分画物をサンプルにしたものである。この図２から明らかなように、ＥＳＡ１複合体の大量調整および精製には、ｐＭＨ０２４−ＥＳＡ１を選択することが１番適している。その一方で、ｐＭＨ０２６−ＥＳＡ１は、ＥＳＡ１遺伝子が欠如することによって生じる細胞の致死性を回復することができなかった。
【００５６】
以上の結果から、当初の狙い通りタグを付加する位置依存的に、精製によって得られるタンパク質複合体の量が異なることが証明された。さらには、この発明の発現ベクターセットを用いることによって、タンパク質複合体の精製にもっとも効率的なタグの位置を容易に選択することが可能となった。
実施例４：組換えタンパク質の精製
図３は下記のタンパク質精製のフローチャートである。タグ無しのＥＳＡ１を有する酵母細胞ＭＨＹ５００ａを用いたモック精製との比較によってＭＨＹ５０４ａからＥＳＡ１複合体を精製した。全細胞抽出液は、ＢｉｏＮｅｂ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ　システム（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ社）を使用して酵母細胞を破砕した点を除き、実施例３の全細胞抽出液と同じものを調製した。硫酸アンモニウム沈殿を行った後、抽出液をＨｉＰｒｅｐ　２６／６０　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００　ｇｅｌ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通して分画した。分子量１　ＭＤａを超えた分画物を判定し、それらをまずＰｒｏｂｏｎｄレシンによって精製し、次に抗Ｆｌａｇ　Ｍ２アフィニティーレシンによって精製し、さらに１００　ｍＭのＮａＣｌおよび０．２ｍｇ／ｍＬのＦｌａｇペプチドを含んだｂｕｆｆｅｒ　Ｂ（Ｅｂｅｒｈａｒｔｅｒ　Ａ．　ｅｔ．ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　１９９８，　１５：　３１５−３２１）によって抽出した。
【００５７】
この精製では、ＦＬＡＧタグによるアフィニティー精製は、対Ｈｉｓレシンに非特異的に結合する酵母タンパク質を除去し、またその逆にＨｉｓタグによるアフィニティー精製は、対ＦＬＡＧレシンに非特異的に結合するタンパク質を除去する。
【００５８】
図４（Ａ）は、タグ付加ＥＳＡ１を有する株（レーン１：ＭＨＹ５０４ａ）またはタグ無しＥＳＡ１を有する株（レーン２：ＭＨＹ５００ａ）から得られた全細胞抽出液を、抗Ｆｌａｇ　Ｍ２アフィニティーレシンを用いて精製した分画物を銀染色法によって確認した結果である。この図４（Ａ）に示したように、ＥＳＡ１タンパク質とともに幾つかのタンパク質（Ｔｒａ１Ｐ、ＥＰ１１ｐ、Ａｒｐ４ｐ、Ａｃｔ１ｐ）が精製された。
実施例５：タンパク質構成成分の特定
精製タンパク質群のバンドをタンパク質質量フィンガープリンティング法によって特定し、その結果を図４（Ａ）の右側に示した。Ｖｏｙａｇｅｒ　ＤＥ−ＳＴＲ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）ＭＡＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳシステムによってトリプシン化した断片のペプチドの質量を測定後、プログラムＰｒｏＦｏｕｎｄ（ＰｒｏｔｅｏＭｅｔｒｉｃｓ社）を使用して、データベースのＮＣＢＩ　ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａｂａｓｅから対応するタンパク質を特定した。またＷｅｂｅｒらによる方法（Ｗｅｂｅｒ．　Ｖ　ｅｔ．ａｌ，　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｅｌｌ，　１９９５，　６：１２６３−１２７０）に従い、抗Ａｒｐ４抗体を用いて免疫染色を行った。免疫染色の結果を図４（Ｂ）に示した。
実施例６：ヒストンアセチル化酵素解析（ＨＡＴ解析）
精製タンパク質複合体の構成タンパク質に対するＨＡＴ解析は、ＹａｍａｍｏｔｏとＨｏｒｉｋｏｓｈｉの方法（Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｔ　ａｎｄ　Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ　Ｍ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　１９９７，　２７２：３０５９５−３０５９８）およびＳｕｚｕｋｉらの方法（Ｓｕｚｕｋｉ　Ｔ．　ｅｔ．ａｌ．，　Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ，　２０００，　５：２９−４１）に基づいて行った。
【００５９】
結果は図４（Ｃ）に示したとおりであり、ＥＳＡ１とともに精製されたタンパク質はヌクレオソーム内のヒストンをアセチル化した。これらのタンパク質は、酵母ＮｕＡ４サブユニット（Ａｌｌａｒｄ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１９９９，　１８：５１０８−５１１９；　Ｇａｌａｒｎｅａｕ　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ，　２０００，　５：９２７−９３７）およびヒトＴＩＰ６０複合体サブユニットの酵母カウンターパート（Ｉｋｕｒａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ，　２０００，　１０２：４６３−４７３）と同一であることから、この発明の方法によって、機能的複合体を精製可能であることが確認された。
【００６０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、タンパク質またはタンパク質複合体の高純度アフィニティー精製に最も適した位置にタグを付加したタンパク質を発現させるためのベクターおよびベクターセットが提供される。これらの発明は、プロテオーム解析等の効率と精度に大きく貢献する。
【００６１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の発現ベクターの一例を示した構成図と、その発現カセット６種の塩基配列である。
【図２】実施例３の結果である。
【図３】実施例４の操作手順である。
【図４】実施例４、５および６の結果である。（Ａ）は銀染色法、（Ｂ）はウエスタンブロッティング法（免疫染色法）、（Ｃ）ＨＡＴ解析法の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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