(57)【要約】【課題】血小板凝集阻害作用を有する新規な蛋白質を提供することが、本発明の課題である。【解決手段】本発明により、ブラジルサシガメ（Ｔｒｉａｔｏｍａ　ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）由来の新規な蛋白質であるＴｉ−３蛋白質、及び当該蛋白質をコードするＴｉ−３遺伝子が与えられた。Ｔｉ−３蛋白質は血小板凝集阻害活性を有するために、Ｔｉ−３蛋白質を有効成分として含有する医薬は、血小板凝集阻害剤として、心筋梗塞、肺梗塞、脳梗塞の治療及び予防に有効である。またＴｉ−３蛋白質は、医薬開発の場における血小板凝集阻害剤のリード化合物としてもまた、大きな可能性を有している。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラジルサシガメ由来の蛋白質であり、以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号（−１８）−１６４　で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ｂ）血小板凝集阻害活性を有し、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された蛋白質。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
ブラジルサシガメ由来の蛋白質であり、以下の（ｃ）または（ｄ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ｃ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−１６４　で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ｄ）血小板凝集阻害活性を有し、（ｃ）の一部が欠損、置換若しくは付加された蛋白質。
【請求項４】
ブラジルサシガメ由来の蛋白質をコードし、以下の（ｅ）または（ｆ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ｅ）配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−６９５　で示される塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ｆ）血小板凝集阻害活性を有する蛋白質をコードし、（ｅ）の一部が欠損、置換若しくは付加された遺伝子。
【請求項５】
請求項３記載の蛋白質を有効成分として含有する、血小板凝集阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、吸血昆虫であるブラジルサシガメ（Ｔｒｉａｔｏｍａ　ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の唾液腺に由来し、血小板凝集阻害活性を有するＴｉ−３蛋白質、及び当該Ｔｉ−３蛋白質をコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高齢化社会を迎え、成人病がますます重要な社会問題となってきた。成人病に起因する症状、特に血液関連の疾病、例えば高血圧症、肺高血圧症、心筋梗塞、脳梗塞、肺梗塞、クモ膜下出血後の血管攣縮などのように、血管が細くしかも硬くなることによって起こる疾病を治療したり、予防することは、高年齢層の社会では重要な課題である。これらの疾病は、血管弛緩拡張剤や血液凝固阻害剤、血小板凝集阻害剤によって治療したり予防することができる。その様な目的に使用が可能である抗凝固活性を有するペプチドとしては、ヒルの唾液腺由来のヒルジンがこれまでに知られていた。ヒルジンは吸血するムシの唾液腺から同定された抗凝固活性ペプチドであり、トロンビン阻害活性を有する。なお、本発明のＴｉ−３蛋白質、及び当該Ｔｉ−３蛋白質をコードする遺伝子は新規のものであるが、昆虫を主とする吸血動物の唾液中の生理活性物質に関する知見が、例えば非特許文献１と非特許文献２において総説としてまとめられている。
【０００３】
【非特許文献１】
リベイロ・ジェイ・エム（Ｒｉｂｅｉｒｏ　ＪＭ．），　アニュアル・レビュー・エントモロジー（Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｅｎｔｏｍｏｌ　），　１９８７年，　３２巻，　ｐ４６３−７８．　“Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｓａｌｉｖａ　ｉｎ　ｂｌｏｏｄ−ｆｅｅｄｉｎｇ　ｂｙ　ａｒｔｈｒｏｐｏｄｓ．”
【非特許文献２】
バサノバ・エイ・ブイ（Ｂａｓａｎｏｖａ　ＡＶ），　バスコバ・アイ・ピー（Ｂａｓｋｏｖａ　ＩＰ），　ザバロバ・エル・エル（Ｚａｖａｌｏｖａ　ＬＬ）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　２００２年，６７巻，　ｐ１４３−５０．　“Ｖａｓｃｕｌａｒ−ｐｌａｔｅｌｅｔ　ａｎｄ　ｐｌａｓｍａ　ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ　ｆｒｏｍ　ｂｌｏｏｄｓｕｃｋｉｎｇ　ａｎｉｍａｌｓ．”
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記のヒルジンは合成が困難であり、副作用を有するという欠点を有していた。そのために大量に得て安全な医薬として用いるには、これらの問題を解決する必要がある。そこで、合成が容易であり、かつ副作用を有さない抗血小板凝集活性を有する蛋白質を採取することが求められていた。その様な蛋白質は、抗血栓剤のリード化合物として有用であり、創薬の分野において高い有用性を有するものと考えられる。
【０００５】
そこで本発明の目的は、吸血昆虫であるブラジルサシガメ（Ｔｒｉａｔｏｍａ　ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の唾液腺から単離され、血小板凝集阻害活性を有する蛋白質を提供することにある。そして、更にはバキュロウイルスの系を用いてその様な蛋白質の大量供給を可能にすることである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記の課題を解決するために、本出願において以下の発明を提供するものである。本発明は、配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号（−１８）−１６４　で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ブラジルサシガメ由来のＴｉ−３蛋白質である。血小板凝集阻害活性を有し、その一部が欠損、置換若しくは付加された蛋白質もまた、本発明の範囲内である。
【０００７】
更に本発明は、配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−１６４で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ブラジルサシガメ由来のＴｉ−３蛋白質である。血小板凝集阻害活性を有し、その一部が欠損、置換若しくは付加された蛋白質もまた、本発明の範囲内である。
【０００８】
更に本発明は、配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−６９５　で示される塩基配列からなることを特徴とする、ブラジルサシガメ由来のＴｉ−３遺伝子である。血小板凝集阻害活性を有し、その一部が欠損、置換若しくは付加されたポリペプチドをコードする遺伝子もまた、本発明の範囲内である。
【０００９】
更に本発明は、上記の蛋白質を有効成分として含有する血小板凝集阻害剤である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
吸血性昆虫やダニの類の唾液腺には動物の血液や血管に対して特異な活性をもつ物質が含まれている。本発明者らは、唾液腺から抗凝血作用を持つ活性物質を同定し、単離・精製し、それらの有効成分の性状を解析することにより、また、遺伝子ｃＤＮＡのクローニングを行うことにより、バキュロウイルス発現系によって血管弛緩機能を持つ蛋白質を多量に製造できることを明らかにして本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明者らは吸血昆虫であるブラジルサシガメ（Ｔｒｉａｔｏｍａ　ｉｎｆｅｓｔａｎｓ：Ｔｉ　）に注目し、ブラジルサシガメ由来の抗血小板凝集活性を有する蛋白質を採取することを試みた。ブラジルサシガメ約４０匹から唾液腺を摘出し、全ＲＮＡ　を抽出し、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ　としてリバーストランスクリプターゼによりｄｓＤＮＡ　を合成し、トランスファーベクターに組み込んで唾液腺ｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｔｉ唾液腺ｃＤＮＡライブラリーからランダムにコロニーをピックアップして、塩基配列の解析を行った。５５０　個の配列を決め、重複を除いて分泌シグナルを持つもの４４個のｃＤＮＡを得て、全塩基配列を決めた。得られたＴｉ−３遺伝子の塩基配列およびその遺伝子がコードするＴｉ−３蛋白質のアミノ酸配列を図１に示す。
【００１２】
そのうちの１６個について、バキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ　）　を用いた蛋白質発現系で発現させるためのトランスファーベクターコンストラクトを作製し、ウイルスにトランスフェクトし、多核体を作らない、即ち挿入蛋白質を発現しているウイルスクローンを分離した。蛋白質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、ＨＰＬＣによるゲル濾過・イオン交換クロマトグラフィーにより精製することにより、本発明のＴｉ−３蛋白質を採取した。そして上記の方法により採取した本発明の蛋白質が、血小板凝集に及ぼす作用を検討した。
【００１３】
目的とする物質をヒトの洗浄血小板に加え、コラーゲンで血小板凝集を惹起し、１０分後の透光度を測定することにより血小板凝集阻害作用の検討を行った。その結果、Ｔｉ−３蛋白質は血小板のコラーゲン凝集を濃度依存的に抑制した。よって本発明のＴｉ−３蛋白質は血小板凝集を阻害する作用を有し、血小板凝集阻害剤として有効であることが示された。そのために、Ｔｉ−３蛋白質は、心筋梗塞、肺梗塞、脳梗塞等の治療薬や予防薬に有効であると思われる。
【００１４】
Ｔｉ−３蛋白質は、配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号（−１８）−１６４　で示されるアミノ酸配列により特定される。本願明細書において、配列番号１に示す蛋白質の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号１に示すアミノ酸配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と配列番号１に示すアミノ酸配列とは、９５％以上、好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、血小板凝集を阻害するＴｉ−３蛋白質としての機能を有する限り、本発明の範囲内である。なお、配列表の配列番号１において、−１８　から−１の部分はシグナルペプチドであり、プロセシングを受けた結果、成熟蛋白質はアミノ酸番号１−１６４　で示される１６４　個のアミノ酸からなっている。
【００１５】
また、Ｔｉ−３遺伝子は上記のＴｉ−３蛋白質をコードしており、配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−６９５　で示される塩基配列からなることを特徴とする。なお、塩基配列中の塩基番号２１−５６６に相当する部分が読み枠であり、上記の蛋白質をコードしている。遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡ　の特定の部位に、当該ＤＮＡ　の基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含むものである。
【００１６】
即ち、配列表の配列番号２に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号２に示す塩基配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号２に示す塩基配列とは、９５％以上、好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、血小板凝集を阻害するＴｉ−３蛋白質としての機能を有する蛋白質をコードする限り、本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号２に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
【００１７】
本発明におけるＴｉ−３蛋白質は、Ｔｉ−３蛋白質のｃＤＮＡを組みこんだバキュロウイルス発現系で多量に製造することができる。それらの一例を次に挙げる。カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　）の核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ　）を用い、カイコの培養細胞ＢｍＮ４又はカイコの幼虫を用いて発現させることができ、それぞれ培養液又はカイコ体液からクロマトグラフィーにより単離できる。また、Ｔｉ−３蛋白質のｃＤＮＡをオートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ　）に組込み、ヨトウムシ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　）のＳｆ９　細胞、あるいはイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　）のＴｎ５　細胞で発現させ、培養上清から同様にクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００１８】
また本発明におけるＴｉ−３蛋白質は、Ｔｉ−３蛋白質のｃＤＮＡを組みこんだ大腸菌による発現系を用いることによっても多量に製造することができる。その様な目的のために、Ｔｉ−３蛋白質のｃＤＮＡを増幅し、ｐＭＡＬ−ｃ２ｇ等のプラスミドに組み込んだマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）融合蛋白質発現ベクターを作製することができる。そして、その発現ベクターにより大腸菌を形質転換し、ＩＰＴＧを含む培地中で培養することにより、大腸菌においてＭＢＰ　融合Ｔｉ−３蛋白質の発現を誘導することができる。この様な目的のために使用可能な大腸菌株としては、例えばＢＬ２１株等を挙げることができる。そして、大腸菌体内において誘導されたＭＢＰ融合Ｔｉ−３蛋白質を、大腸菌を破砕することにより回収することができる。その様にして回収されたＭＢＰ　融合Ｔｉ−３蛋白質を、アミロースレジンを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、精製することができる。
【００１９】
本発明のＴｉ−３蛋白質は、吸血性昆虫の唾液腺より血小板凝集阻害作用を持つ活性物質を同定し、単離・精製し、その遺伝子ｃＤＮＡのクローニングを行うことにより、バキュロウイルス発現系により血小板凝集阻害作用を持つ蛋白質を多量に製造できるものである。また、蛋白質の血小板凝集阻害作用に起因する活性部位を究明し、構造解析が進めば、分子設計手法で活性物質を一般の化学合成手法で製造することも可能である。
【００２０】
また、本発明のＴｉ−３蛋白質は血小板凝集阻害作用を有する医薬のリード化合物としても高い有用性を有すると思われる。即ちＴｉ−３蛋白質に種々の改変を行うことにより、より血小板凝集阻害作用の高い物質を得ることができる可能性がある。本発明のＴｉ−３蛋白質は、その様な検討の基礎となる生理活性物質を与えるものであり、更なる新規な抗血小板凝集物質を得るためのリード化合物としても大きな有用性を有するものである。
【００２１】
【実施例】
次に本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２２】
（遺伝子の採取方法）
ブラジルサシガメ（Ｔｒｉａｔｏｍａ　ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）胸部より唾液腺を摘出した。これより、Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐ　ｍＲＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、唾液腺ｍＲＮＡを抽出・精製した。次にこのｍＲＮＡをテンプレートに用い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で唾液腺ｃＤＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーからランダムにクローン（総数５５０クローン）を拾い上げ、ＱｉＡＰｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ社製）にてプラスミド抽出・精製した。このプラスミドに組み込まれているｃＤＮＡの塩基配列をＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて解読した。解読されたｃＤＮＡの塩基配列は、Ｇｅｎｅｔｙｘ　ｖｅｒ　８．５　（Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）を用いて解析した。その結果、同一の塩基配列を有する４個のｃＤＮＡクローンが見出され、これをＴｉ−３と命名した。
【００２３】
（組換え蛋白質の大量発現と精製）
ＰＣＲ法にて増幅したＴｉ−３　ｃＤＮＡ全長を、プラスミドｐＡｃＹＭ１のＢａｍＨＩの制限酵素サイトに組み込んだトランスファーベクターを作製し、Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。このプラスミドベクターとＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ　Ｌｉｎｅａｒｌｉｚｅｄ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ　（Ｐｈａｅｍｉｎｇｅｎ社製）を用いて昆虫培養細胞Ｓｆ−９に導入し、組換えバキュロウイルスを作製した。この組換えウイルスを別の昆虫培養細胞Ｔｎ−５に感染させ、組換えＴｉ−３を大量発現させた。培養液中に分泌された組換えＴｉ−３蛋白質は、ＭＯＮＯ　Ｓ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーおよびＴＳＫ２０００ＳＷ　（東ソー社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによる二段階の精製を行うことで純化し、以下の実験に供した。
【００２４】
（血小板凝集）
血小板凝集はヒト洗浄血小板を用いて比濁法によって測定した。すなわち、ヒト洗浄血小板（６．０×１０５／ｍｌ）５０　ｍｌに対し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ　７．４），　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌに溶解した精製Ｔｉ−３を４０　ｍｌ加え、３７℃でインキュベートした。１０分後、２０　ｍｇ／ｍｌのコラーゲン（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ社製）を１０　ｍｌ加え、さらに１０分間インキュベートし、溶液の６００　ｎｍでの透光度をＭｉｃｒｏ　Ｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ　ＭＰＲ−Ａ４ｉ　（東ソー社製）を用いて測定した。
【００２５】
Ｔｉ−３が血小板のコラーゲン凝集に対して及ぼす影響を図２に示す。図２より、Ｔｉ−３は濃度依存的に血小板凝集を抑制した。すなわち、ブラジルサシガメ唾液腺由来蛋白質Ｔｉ−３は血小板のコラーゲン凝集を阻害する蛋白質であることが明らかとなった。
【００２６】
【発明の効果】
本発明により、ブラジルサシガメ由来の新規な蛋白質であるＴｉ−３蛋白質、及び当該蛋白質をコードするＴｉ−３遺伝子が与えられた。Ｔｉ−３蛋白質は血小板凝集阻害活性を有するために、Ｔｉ−３蛋白質を有効成分として含有する医薬は、血小板凝集阻害剤として、心筋梗塞、肺梗塞、脳梗塞の治療及び予防に有効である。またＴｉ−３蛋白質は、医薬開発の場における血小板凝集阻害剤のリード化合物としてもまた、大きな可能性を有している。
【００２７】
【配列表】
2004121091.tif 000002
2004121091.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｔｉ−３蛋白質及びそれをコードする遺伝子の配列を示す図である。
【図２】図２は、Ｔｉ−３蛋白質が血小板のコラーゲン凝集に対して及ぼす影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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