(57)【要約】【課題】筋細胞の再生治療法の提供。【解決手段】組換えアデノ随伴ウイルスベクターにＭｓｘ１  ｃＤＮＡを組み込んでなる組換えＤＮＡを有効成分とする筋疾患治療薬。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアデノ随伴ウイルスベクターにＭｓｘ１  ｃＤＮＡを組み込んでなる組換えＤＮＡを有効成分とする筋疾患治療薬。
【請求項２】
組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス５型ベクター又は同１型ベクターである請求項１記載の筋疾患治療薬。
【請求項３】
筋疾患が、筋損傷、筋ジストロフィー及び筋原性疾患から選ばれる疾患である請求項１又は２記載の筋疾患治療薬。
【請求項４】
骨格筋細胞に、組換えアデノ随伴ウイルスベクターにＭｓｘ１  ｃＤＮＡを組み込んでなる組換えＤＮＡを形質導入することを特徴とする脱分化単核細胞の製造法。
【請求項５】
骨格筋細胞に、組換えアデノ随伴ウイルスベクターにＭｓｘ１  ｃＤＮＡを組み込んでなる組換えＤＮＡを形質導入して脱分化単核細胞を得、次いでこれを分化転換誘導することを特徴とする分化転換細胞の製造法。
【請求項６】
分化転換細胞が、骨格筋細胞、脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞から選ばれる細胞である請求項５記載の分化転換細胞の製造法。
【請求項７】
組換えアデノ随伴ウイルスベクターにＭｓｘ１  ｃＤＮＡを組み込んでなる組換えＤＮＡの、筋疾患治療薬製造のための使用。
【請求項８】
筋疾患が筋損傷、筋ジストロフィー及び筋原性疾患から選ばれる疾患である請求項７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、筋ジストロフィー等の筋疾患に対する筋細胞再生治療及び骨格筋細胞から種々の細胞への分化転換方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
筋ジストロフィー症は、骨格筋に一次的な変性を来す進行性遺伝性疾患群であり、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、眼筋型筋ジストロフィーなどに分類される。身体各所の拘縮、変形が次第に進行して、運動障害、内分泌・代謝異常、知能障害などを生じる。筋ジストロフィー症患者の筋細胞は変性、壊死をおこす。筋ジストロフィー症に対する良好な治療手段はなく、治療法の開発が望まれている。
【０００３】
一方、最終分化をした細胞は不可逆的に細胞周期のＧ０期に停止しており，再び分裂することはないと、かつては考えられていた（非特許文献１）。しかしこの概念は、最終分化をしたマウス骨格筋細胞株Ｃ２の筋管細胞にＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原遺伝子を誘導発現させると、再び細胞周期にはいり細胞増殖をするという発見により覆された（非特許文献２及び３）。これらの脱分化細胞においては筋特異的遺伝子の発現は停止している（非特許文献４及び５）。Ｃ２筋管細胞にホメオボックス遺伝子Ｍｓｘ１を誘導発現させた場合にも、ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原の場合と同様に脱分化を引き起こし、多数の増殖する単核細胞を生ずることが示された（非特許文献６）。これらの脱分化細胞は筋管細胞に再び分化するだけでなく、脂肪細胞、骨細胞、あるいは軟骨細胞の指標となる蛋白質を発現している各細胞に分化転換しうる（非特許文献６）。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｂａｓｅｒｇａ，  Ｒ．，  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  （Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ，  １９８５）．
【非特許文献２】
Ｅｎｄｏ，  Ｔ．  ＆  Ｎａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ，  Ｂ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （ｅｄｓ．  Ｓｔｏｃｋｄａｌｅ，  Ｆ．  ＆  Ｋｅｄｅｓ，  Ｌ．）  ９５−１０４  （Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９）．
【非特許文献３】
Ｅｎｄｏ，  Ｔ．  ＆  Ｎａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ，  Ｂ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１１，  １０８１−１０９３  （１９９８）．
【非特許文献４】
Ｅｎｄｏ，  Ｔ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１２，  ３２１−３２９  （１９９２）．
【非特許文献５】
Ｅｎｄｏ，  Ｔ．  ＆  Ｇｏｔｏ，  Ｓ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１２，  ４２７−４３０  （１９９２）．
【非特許文献６】
Ｏｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｋｏｌｌｈｏｆｆ，  Ａ．  ＆  Ｋｅａｔｉｎｇ，  Ｍ．  Ｔ．，  Ｃｅｌｌ  １０３，  １０９９−１１０９  （２０００）．
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし最終分化筋管細胞の脱分化はこれまでのところ培養系でのみ示されているだけであり、生体内の骨格筋組織における成熟筋細胞（筋線維）が脱分化をして増殖するかどうかについては不明である。
また、非特許文献６では、Ｍｓｘ１を導入するベクターとしてテトラサイクリンによってサイトメガロウイルスプロモーター活性が抑制されるレトロウイルスベクターが使用されており、このベクターは増殖を停止した分化細胞には感染しないことから、直接生体内の骨格筋に投与しても発現させることはできない。
従って、本発明の目的は、生体に直接投与して発現させることが可能であり、筋ジストロフィー症等の筋疾患の治療に用いることのできる再生治療技術を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、骨格筋に、安全性の高いアデノ随伴ウイルスベクターを用いてＭｓｘ１遺伝子を導入すると、生体内において筋線維の脱分化と細胞増殖がおこり、多数の単核細胞が生ずることを見出した。さらに驚くべきことに、その後、Ｍｓｘ１の発現が消失すると、これらの脱分化によって生じた単核細胞は再び分化して筋線維を形成し、筋再生がおこることを見出し、アデノ随伴ウイルスベクターＭｓｘ１組換えＤＮＡが、筋疾患に対する再生治療薬として有用であることを見出した。
また、単離した脱分化単核細胞を、種々の成熟細胞への分化条件下に培養すると、その条件に応じた細胞に分化転換することも併せて見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルスベクターにＭｓｘ１  ｃＤＮＡを組み込んでなる組換えＤＮＡを有効成分とする筋疾患治療薬を提供するものである。
また、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルスベクターにＭｓｘ１  ｃＤＮＡを組み込んでなる組換えＤＮＡを、筋疾患患者に投与することを特徴とする筋疾患の治療法を提供するものである。
また本発明は、組換えアデノ随伴ウイルスベクターにＭｓｘ１  ｃＤＮＡを組み込んでなる組換えＤＮＡの、筋疾患治療薬製造のための使用を提供するものである。
【０００８】
さらに本発明は、骨格筋細胞に、組換えアデノ随伴ウイルスベクターにＭｓｘ１  ｃＤＮＡを組み込んでなる組換えＤＮＡを形質導入することを特徴とする脱分化単核細胞の製造法を提供するものである。
さらに本発明は、骨格筋細胞に、組換えアデノ随伴ウイルスベクターにＭｓｘ１  ｃＤＮＡを組み込んでなる組換えＤＮＡを形質導入して脱分化単核細胞を得、次いでこれを分化転換誘導することを特徴とする分化転換細胞の製造法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の筋疾患治療薬に用いる組換えＤＮＡは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに、Ｍｓｘ１  ｃＤＮＡを組み込んだものである。ここでＡＡＶは、Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属するヘルパー依存性ＤＮＡパルボウイルスであり、病原性がなくまた免疫反応が起こりにくいなど安全性が高く、生体内へ遺伝子を導入するためのベクターとして特に優れている。組換えＡＡＶベクターとしては、いくつか知られているが、骨格筋に形質導入するためにはアデノ随伴ウイルス５型ベタクー（ＡＡＶ５ベクター）（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７，  ３４２８−３４３２  （２０００））および同１型ベクター（ＡＡＶ１ベクター）が、遺伝子導入効率が高い（Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２，  ６１９−６２３  （２０００））ことから、特に好ましい。
【００１０】
Ｍｓｘ１は、ホメオボックス遺伝子、すなわち、真核生物のＤＮＡエキソン中に見出される互いに相同性の高い１８０塩基対からなる塩基配列をもつ遺伝子の一つであり、器官形成に関与しているといわれている遺伝子である。
【００１１】
本発明に用いる組換えＤＮＡは、宿主細胞でＭｓｘ１遺伝子が発現可能なようにＡＡＶベクターに組み込んであればよく、その組み込み手段に特に制限はないが、ＡＡＶベクターにＭｓｘ１  ｃＤＮＡの全長を発現可能なように組み込むのが好ましく、例えばＡＡＶベクターの逆転末端反復配列  （ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ）  間に挿入した特定のプロモーターとポリアデニル化シグナル配列の間にＭｓｘ１  ｃＤＮＡを組み込むのが好ましい。
【００１２】
このＡＡＶ−Ｍｓｘ１組換えＤＮＡは、生体の骨格筋組織に注射すると、当該組織内の骨格筋細胞に形質導入される。かくしてＡＡＶ−Ｍｓｘ１組換えＤＮＡが形質導入された骨格筋組織においては、筋線維が崩壊し、単核細胞が生じ、単核細胞は増殖する。これは、Ｍｓｘ１が骨格筋細胞内で発現し、骨格筋細胞を脱分化させたためである。その後、脱分化した単核細胞は、その組織内で筋細胞に分化再生し、再生した筋線維が増加する。
【００１３】
従って、ＡＡＶ−Ｍｓｘ１組換えＤＮＡを筋損傷および筋ジストロフィーや筋原性疾患（ミオパチー）などの遺伝子の突然変異により生ずる筋疾患等の患者に投与すれば、当該筋疾患部位で筋線維の再生が生じ、筋疾患の再生治療が可能である。
【００１４】
本発明の筋疾患治療薬の投与手段としては、筋疾患部位にＡＡＶ−Ｍｓｘ１組換えＤＮＡが到達すればよく、例えば筋内注射、局所埋め込み投与、静脈内注射等が挙げられるが、疾患部位への筋内注射によるのが好適である。
【００１５】
本発明の筋疾患治療薬をヒトを含む哺乳類、鳥類等に投与するには、ＡＡＶ−Ｍｓｘ１組換えＤＮＡに薬学的許容される担体を加えて、種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。当該担体としては、蒸留水、溶解補助剤、安定化剤、乳化剤、緩衝剤等が挙げられる。また、本発明の筋疾患治療薬にはＡＡＶ−Ｍｓｘ１組換えＤＮＡ以外に、筋疾患治療に有用な他の薬剤を配合してもよい。
【００１６】
本発明の筋疾患治療薬の投与量は、筋疾患の種類、症状等により変化するが、通常Ｍｓｘ１量として０．１μｇ〜１０ｍｇ／日程度が好ましい。
【００１７】
また、前述のようにＡＡＶ−Ｍｓｘ１組換えＤＮＡを骨格筋細胞に形質導入すると、骨格筋組織内において骨格筋細胞が脱分化し、単核細胞に変化する。従って、この骨格筋組織から単核細胞を単離すれば、効率良く単核細胞が得られる。本発明方法による単核細胞の生産効率は、従来のＳＶ４０ベクターを用いる方法等に比べて極めて高く、有利である。
【００１８】
単核細胞の単離手段は、例えば骨格筋組織にＡＡＶ−Ｍｓｘ１組換えＤＮＡを投与し、１０〜３０日後に骨格筋組織を摘出し、コラゲナーゼ中でインキュベートして細胞を解離させ、次いで遠心分離等の操作により行うのが好ましい。
【００１９】
また、脱分化単核細胞を得るためには、培養系において骨格筋細胞にＡＡＶ−Ｍｓｘ１組換えＤＮＡを形質導入して脱分化を生じさせてもよい。この培養系における形質導入は自体公知の手段、例えばトランスフェクションやマイクロインジェクションにより行えばよい。培養系からの脱分化単核細胞の採取は、トリプシンやコラゲナーゼ等の処理によればよい。なお、骨格筋細胞の培養は、例えば１０％馬血清と５％ニワトリ胚抽出物を含むＥａｇｌｅのＭＥＭ等の培地中、５％  ＣＯ２の条件下３７℃で、２日ごとに培地を交換して行うのが好ましい。
【００２０】
また、得られた単核細胞は、目的とする分化細胞への分化転換を誘導することができる。ここで転換し得る細胞は特に制限されず、骨格筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞等が挙げられる。ここで、分化転換誘導は、単核細胞を、それぞれの分化細胞への分化に適した培地で培養することにより行うことができる。これらの分化転換誘導用の培地は公知のものも用いることができる。例えば骨格筋細胞への分化転換誘導には、５％馬血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ  （ＤＭＥ）培地が用いられる。脂肪細胞への分化転換誘導には、ＭＤＩ−Ｉカクテル  （０．５  ｍＭ  １−メチル−３−イソブチルキサンチン、１  μＭ  デキサメタゾン、０．１  ｍＭ  インドメタシン、１０  μｇ／ｍｌインスリン）  ならびに１０  μｇ／ｍｌインスリンを含む増殖培地が用いられる。骨細胞への分化転換誘導には、０．１  μＭ  デキサメタゾン、１０  ｍＭ  β−グリセロホスフェート、５０  μＭ  アスコルビン酸  ２−リン酸を含む増殖培地が用いられる。また、これらの分化転換誘導のための培養は、例えば５％  ＣＯ２の条件下、３７℃で５〜２０日間行うのが好ましい。
【００２１】
骨格筋細胞由来の単核細胞から得られた分化転換細胞は、再生治療用細胞として有用である。すなわち、現在、再生治療には胚幹細胞（ＥＳ細胞）や組織幹細胞（成体幹細胞）を用いることが有効であると考えられている。しかしＥＳ細胞を再生治療に用いることは法的に制限されており、また倫理的にも問題がある。一方、組織幹細胞を簡便な方法で多量に得ることは困難である。それに対し、体内で最も大きな体積を占める骨格筋に上述の方法でＭｓｘ１を発現させ、脱分化を誘導して、多数の脱分化細胞を回収することは容易である。従って、この脱分化細胞を用いた再生治療法は、胚幹細胞や組織幹細胞を用いる方法の欠点を解決するものである。
【００２２】
また、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のためには、患者自身から単離した脱分化細胞にジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）遺伝子を安定に発現させることが不可欠である。この目的のためには、例えばレトロウイルスベクターを用いて、ロッドドメインを欠いたミニジストロフィン（ｍｉｎｉｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）やマイクロジストロフィン（ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）ｃＤＮＡ（Ｈａｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８，  ２５３−２６１  （２００２）；Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｍ．  ２９３，  １２６５−１２７２  （２００２））を脱分化細胞に導入し、これらを安定に発現している細胞を増殖させればよい。このような細胞を患者に移植して、ミニジストロフィンやマイクロジストロフィンを発現している筋線維を再生させることにより、筋ジストロフィーが治療できる。
【００２３】
【実施例】
次に実施例を揚げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
【００２４】
Ａ．材料と方法
（１）  プラスミドの構築とＡＡＶ５ベクターの産生
Ｍｓｘ１の全コード領域を含むｃＤＮＡはマウスＣ２骨格筋筋芽細胞ｃＤＮＡプールから逆転写ポリメラーゼ連鎖反応  （ＲＴ−ＰＣＲ）  によりクローニングした。ここではＤＮＡデータベースアクセションナンバー  ＡＦ３０８５７２の配列に基づき合成した、センスプライマー  ５’−ＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＴＴＴＧ−３’（配列番号１）及びアンチセンスプライマー  ５’−ＣＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＣＣＴＡＡＧＴＣＡＧ−３’（配列番号２）を用いた。このｃＤＮＡはＭｙｃ−ｔａｇにフレームを合わせてつなぎ、ｐ１．１ｃプラスミドにサブクローニングした  （ｐ１．１ｃ／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１）。基のＡＡＶ５ベクタープラスミドｐＡＡＶ５／ＣＭＶ−ｌａｃＺはサイトメガロウイルス  （ＣＭＶ）  プロモーターにつないだｌａｃＺレポーター遺伝子とシミアンウイルス４０のポリアデニル化シグナル配列を逆転末端反復配列  （ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ）  の間に含んでいる。ｐＡＡＶ５／ＣＭＶ−Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１ベクタープラスミドはｐＡＡＶ５／ＣＭＶ−ｌａｃＺからｌａｃＺ遺伝子をＮｏｔＩで切断し、ｐ１．１ｃ／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１からのＭｙｃ−Ｍｓｘ１のＮｏｔＩ断片とつなぎ換えて構築した。ＡＡＶベクターは既述のようにヘルパーウイルスとしてのアデノウイルスを用いずに産生した  （Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５，  ９３８−９４５（１９９８））。
【００２５】
（２）  ＡＡＶ５ベクターの筋内投与
正常成体  （６−９週齢）  ＩＣＲマウス  （日本エスエルシー）  とＣ５７ＢＬ／１０  Ｓｎ  （日本エスエルシー）  又はＣ５７ＢＬ／１０  ＳｃＮ  （実験中央動物研究所）  マウスをエーテルで麻酔した。これらのマウスの前脛骨筋に５０  μＬの１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  （ｐＨ  ７．４）  又はリン酸バッファー塩溶液  （ＰＢＳ）  中のＡＡＶ５／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１又はＡＡＶ５／ｌａｃＺ  （１．５×１０１０〜１０１１ウイルスゲノム）  を２７ゲージ針を装着したインスリンシリンジで注射した。
【００２６】
（３）  凍結切片作製と免疫蛍光染色
前脛骨筋を単離し液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結した。凍結切片  （厚さ５  μｍ）  はＬｅｉｃａ  凍結ミクロトームＣＭ１８００で作製し、０．１  Ｍ  Ｎａ−ＰＯ４  バッファー  （ｐＨ  ７．４）  中の４％  パラホルムアルデヒドで１５分間あるいはメタノールで２分間固定した。用いた一次抗体は抗Ｍｙｃモノクローナル抗体  （ｍＡｂ）  Ｍｙｃ１−９Ｅ１０  （Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５，  ３６１０−３６１６  （１９８５）；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、抗ＭｙＨＣ  ｍＡｂ  Ａ４．１０２５  （Ｗｅｂｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ５２，  ５０３−５１３  （１９８８），  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）、及び抗ジストロフィンｍＡｂ  ＭＡＮＤＲＡ１  （Ｓｉｇｍａ）  である。凍結切片は次に、二次抗体のフルオレセイン  イソチオシアネート  （ＦＩＴＣ）  標識ヤギ抗マウスＩｇＧ  （アフィニティー精製品，Ｃａｐｐｅｌ）  と反応させた。核は１  μｇ／ｍｌ  ビスベンズイミド  Ｈ３３２５８  （Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８）  で対比染色した。標本は位相差と蛍光検鏡装置を装着したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡又はＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００倒立顕微鏡で観察した。
【００２７】
（４）  増殖細胞の同定
ｉｎ  ｖｉｖｏで増殖している細胞を同定するために、ＡＡＶ５／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１を前脛骨筋に注射して７日後に０．３−０．６  ｍｌ  の１０  μｍ  ５−ブロモ  −２’−デオキシロリジン  （ＢｒｄＵ）、  １  μＭ  ５−フルオロ  −２’−デオキシウリジン  （ＦｄＵ）  を静脈内注射した。ＢｒｄＵ／ＦｄＵを注射して２時間後に前脛骨筋を摘出し凍結切片を作製した。標本は抗ＢｒｄＵ  ｍＡｂ  ＢＭＣ９３１８  （Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）  でメーカーの解説書に従い染色した。
【００２８】
（５）  単核細胞の単離
脱分化した単核細胞は，Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，  Ｄｅｖ．  Ｄｙｎａｍ．  ２０８，  ５０５−５１５  （１９９７）  の方法を改良した方法により、ＡＡＶ５／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１を注射して１０日後に前脛骨筋から単離した。要約すると、摘出した前脛骨筋をはさみで細切し、タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）平衡塩溶液中の１％  コラゲナーゼＡ  （Ｒｏｃｈｅ）  中で３７℃、１時間インキュベートした。解離した細胞を１０％  馬血清  （ＨＳ）  を含むＥａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地  （ＭＥＭ）  １．５  ｍｌに懸濁した。これらの細胞を、１５  ｍｌコニカル遠心管中でＭＥＭに７０、５０、３５％  の濃度のＰｅｒｃｏｌｌをそれぞれ３．５  ｍｌずつ含む段階勾配の上に重層し、水平ローターで１，２５０×ｇ  で２０℃、２０分間遠心した。密度マーカービーズ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）  で測定して１．０４５−１．０５５  ｇ／ｍｌの密度にある細胞を回収した。単離した細胞はコラーゲンでコートした培養皿上で１０％  ＨＳと５％  ニワトリ胚抽出物  （ＣＥＥ）  を含むＭＥＭ（増殖培地）中で培養した。培地は２日ごとに交換した。
【００２９】
（６）  脱分化細胞の再分化と分化転換
単離した細胞は増殖培地中で増殖を続け、５日目までに分散したコロニーを形成した。これらの細胞を筋管細胞への再分化のために５％  ＨＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地に移した。筋管細胞への分化を検出するために、細胞はｍＡｂ  Ａ４．１０２５で染色した。脂肪細胞への分化を誘導するために、細胞をＭＤＩ−Ｉカクテル  （０．５  ｍＭ  １−メチル−３−イソブチルキサンチン、  １  μＭ  デキサメタゾン、０．１  ｍＭ  インドメタシン、１０  μｇ／ｍｌインスリン）  を含む増殖培地に、そしてその後  １０  μｇ／ｍｌインスリンを含む増殖培地に移した  （Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，  １４３−１４７  （１９９９））。この処理はＭＤＩ−Ｉカクテルを２日そしてインスリンを１日というサイクルを３回繰り返した（合計９日）。４％  パラホルムアルデヒドで固定した後に、細胞は０．３％  Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏで染色した。骨細胞への分化を誘導するために、細胞を０．１  μＭ  デキサメタゾン、１０  ｍＭ  β−グリセロホスフェート、５０  μＭ  アスコルビン酸  ２−リン酸を含む増殖培地  （Ｊａｉｓｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６４，  ２９５−３１２  （１９９７））  中で１６日間培養した。アルカリ性ホスファターゼ活性を検出するために、細胞を２  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５  ｍＭ  ＥＧＴＡを含むＰＢＳ中の４％  パラホルムアルデヒドで固定した。これらの細胞はまずＸ−Ｐｈｏｓ／ＮＢＴ検出バッファー  （０．１  Ｍ  ＮａＣｌ，  ５０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ９．５）  中におき、そして引き続き０．１  ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ  −４−  クロロ  −３−インドリルホスフェート  （ＢＣＩＰ）  と１  ｍｇ／ｍｌ  ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）  を含むＸ−Ｐｈｏｓ／ＮＢＴ検出バッファー中で１時間以上反応させた。
【００３０】
Ｂ．結果
実施例１
（１）  ＡＡＶ５／Ｍｙｓ−Ｍｓｘ１を注射した前脛骨筋における単核細胞の出現と筋線維の崩壊組換えＡＡＶ５ベクター（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７，  ３４２８−３４３２  （２０００））にＭｙｃ−ｔａｇを付加したマウスＭｓｘ１ＤＮＡを組み込み  （ＡＡＶ５／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１）、これを６−９週齢のＩＣＲマウスの前脛骨筋に注射した。ＡＡＶ５／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１を前脛骨筋に注射して０日  （Ａ，  Ｂ）、３日  （Ｃ，  Ｄ）、７日  （Ｅ，  Ｆ）、及び１４日  （Ｇ，  Ｈ）  目の横断面を図１に、縦断面を図２に示す。図１及び２中、Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧは、Ｈ３３２５８による核染色と重ね合わせた位相差像である。図１及び２中、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨは、抗Ｍｙｃ  ｍＡｂ染色で検出した外来のＭｓｘ１の発現を示す。
【００３１】
注射後３日目までには複数の単核細胞が前脛骨筋にみられるようになった  （図１、２）。Ｍｓｘ１の発現を抗Ｍｙｃモノクローナル抗体  （ｍＡｂ）  Ｍｙｃ１−９Ｅ１０  （Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５，  ３６１０−３６１６  （１９８５））  を用いて検出したところ（図１及び２のＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）、生じた多くの単核細胞や筋線維の核にはＭｓｘ１が高いレベルで発現していた。単核細胞の数は徐々に増加してゆき、ＡＡＶ５／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１注射後約１４日目までには筋線維は著しく崩壊していた。コントロールとしてＡＡＶ５／ｌａｃＺを注射した場合には、限定された範囲にわずかの単核細胞がみられるのみであった。従ってＡＡＶ５／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１の注射によって単核細胞が生じたのは、おもにＭｓｘ１の形質導入によるものであり、注射による損傷やそれによって起こる衛星細胞の増殖によるものではない。さらに、ＡＡＶ５カプシドをもつベクターは分化筋細胞にはきわめて効率よく形質導入するが、未分化筋細胞への形質導入効率は非常に低い  （Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７５，  ７６６２−７６７１  （２００１））  ことから、ＡＡＶ５／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１の導入によって生じた単核細胞は筋線維に由来していると考えられる。Ｍｓｘ１を導入した筋線維が著しく崩壊していた  （図１、２）  こともこのことを裏付けている。
【００３２】
（２）  次に、生じた単核細胞が増殖しているかどうかをみるために、ＡＡＶ５／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１注射後７日目に５−ブロモ−２’−デオキシウリジン  （ＢｒｄＵ）  を静脈内注射した。ＢｒｄＵを２時間取り込ませた骨格筋の横断面（Ａ、Ｂ）と縦断面（Ｃ、Ｄ）を図３に示す。抗ＢｒｄＵ  ｍＡｂを用いた染色により、多数の単核細胞がＢｒｄＵを取り込んだことが示された  （図３）。従ってこれらの単核細胞は細胞周期を回って増殖していた。筋線維はサルコメアを構成するミオシン重鎖  （ＭｙＨＣ）  を含む筋特異的遺伝子を発現していたが、単核細胞はもはやＭｙＨＣを発現していなかった  （図３）。これらの結果は、単核細胞が筋線維から単なる断片化ではなく増殖による脱分化によって生じたことを示している。また、増殖している単核細胞においてＭｓｘ１の発現が徐々に減少する  （図１、２）  のは、ＡＡＶベクターが細胞内では染色体に組み込まれずにエピソームとして存在するために、おそらく発現が希釈されるためである。
【００３３】
（３）  また、Ｍｓｘ１を導入・発現させて２日後（Ａ、Ｂ）と１４日後の骨格筋の横断面を図４に示す。また、Ｍｓｘ１発現後１４日（Ａ）、２１日（Ｂ）、２８日（Ｃ）の骨格筋の横断面を図５に示す。１４日目までには、直径の小さな筋細胞は残存している崩壊筋線維よりも高いレベルでＭｙＨＣを発現していた  （図４Ｃ、Ｄ）。これらの小さな筋細胞は中心核をもっていたので、再生により形成されたものである。再生筋線維はしだいに体積を増していった。一方、単核細胞の数は減少していった  （図５）。再生筋線維ではＭｓｘ１の発現はみられなかった。２８日目には再生筋線維は依然として中心核をもっていたが、もとの体積にまで回復していた。一方、単核細胞はわずかに残っているのみであった  （図５Ｃ）。従って脱分化細胞はＭｓｘ１の発現が消失した後に再び分化して筋再生にかかわったと考えられる。
【００３４】
実施例２
（１）  ＡＡＶ５／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１注射後１０日目に、脱分化した単核細胞をＰｅｒｃｏｌｌを用いた密度勾配遠心により分画して、密度が１．０４５−１．０５５  ｇ／ｍｌの細胞を回収した。単離した細胞の培養１日目（１ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）及び１日目（５ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）における、Ｍｓｘ１の発現（Ｂ、Ｆ）及びＰａｘ７の発現（Ｄ、Ｈ）を図６に示す。こうして単離した細胞の一部は、単離して１日目には依然としてＭｓｘ１を発現していた  （図  ６Ａ、Ｂ）。しかしその発現は５日目までにはほとんど検出できなくなっていた  （図  ６Ｅ、Ｆ）。これはおそらく細胞増殖によって発現量が希釈されたことによると考えられる。一方、幹細胞から衛星細胞への決定にかかわっていると考えられるＰａｘ７  （Ｓｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  １０２，  ７７７−７８６  （２０００））  は１日目から５日目までずっと発現していた  （図  ６Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）。
【００３５】
（２）  単離した脱分化細胞を、筋細胞の分化条件下に５日おいたときのＭｙＨＣの発現（Ａ）及び筋原線維形成の様子（Ｂ）；脂肪細胞の分化条件下に９日おいたときの脂肪粒の形成の様子（Ｃ）；並びに骨細胞の分化条件下に１６日おいたときのアルカリホスファターゼ発現の様子（Ｄ）を図７に示す。これらの単離細胞を５％馬血清を含む筋細胞分化培地で培養すると、５日目までに最終分化をして多核の筋管細胞を形成した。これらの筋管細胞にはサルコメアを構成するＭｙＨＣが発現し、横紋構造をもつ筋原線維が発達していた  （図  ７Ａ、Ｂ）。一方、脱分化細胞を脂肪細胞の分化培地で９日間培養したところ、脂肪細胞に特徴的な形態を示しＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏで染色される多数の脂肪粒をもつ細胞に変換した  （図  ７Ｃ）。また脱分化細胞を骨細胞の分化条件下で１６日間培養したところ、骨細胞の指標であるアルカリホスファターゼを発現している細胞塊が多数形成された  （図  ７Ｄ）。これらの結果は，Ｃ２筋管細胞からの脱分化細胞で示されたように  （Ｏｄｅｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  １０３，  １０９９−１１０９（２０００））、筋線維からの脱分化細胞も多能性をもち、脂肪細胞と骨細胞に分化転換したことを示している。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の組換えベクターを用いれば、筋損傷および筋ジストロフィーや筋原性疾患（ミオパチー）などの遺伝子の突然変異により生ずる筋疾患の再生治療が可能となる。
【００３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＡＶ５／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１を導入・発現させたマウス骨格筋の横断面を示す図である。Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧは、それぞれ０日、３日、７日及び１４日目における核染色（Ｈ３３２５８使用）と重ね合わせた位相差像を示す。Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨは、それぞれ０日、３日、７日及び１４日目におけるＭｓｘ１発現（抗Ｍｙｃ  ｍＡｂによる染色）を示す。
【図２】ＡＡＶ５／Ｍｙｃ−Ｍｓｘ１を導入・発現させたマウス骨格筋の縦断面を示す図である。Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧは、それぞれ０日、３日、７日及び１４日目における核染色（Ｈ３３２５８使用）と重ね合わせた位相差像を示す。Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨは、それぞれ０日、３日、７日及び１４日目におけるＭｓｘ１発現（抗Ｍｙｃ  ｍＡｂによる染色）を示す。
【図３】Ｍｓｘ１を導入・発現させて７日後にＢｒｄＵを注入し、２時間取り込ませた骨格筋の横断面（Ａ、Ｂ）と縦断面（Ｃ、Ｄ）を示す図である。Ａ及びＣは位相差像であり、Ｂ及びＤはＤＮＡ合成の様子を抗ＢｒｄＵ  ｍＡｂで染色した像を示す。
【図４】Ｍｓｘ１を導入・発現させて３日後（Ａ、Ｂ）と１４日後（Ｃ、Ｄ）の骨格筋の横断面を示す図である。Ａ及びＣは位相差像であり、Ｂ及びＤはＭｙＨＣ発現（抗ＭｙＨＣ  ｍＡｂによる染色）及び核染色像を示す。
【図５】Ｍｓｘ１を発現後１４日（Ａ）、２１日（Ｂ）及び２８日（Ｃ）目の骨格筋の横断面を示す図である。位相差像と核染色とを重ね合わせた図である。
【図６】単離した単核細胞の培養１日目（Ａ〜Ｄ）及び５日目（Ｅ〜Ｈ）における位相差像（Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧ）、Ｍｓｘ１の発現（Ｂ、Ｆ）及びＰａｘ７の発現（Ｄ、Ｈ）を示す図である。
【図７】単離した単核細胞を筋細胞の分化条件下に５日おいた後の細胞の位相差像（Ａ）及びＭｙＨＣと核染色像（Ｂ）；脂肪細胞の分化条件下に９日おいた後のＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色像（Ｃ）；及び骨細胞の分化条件下に１６日おいた後のアルカリホスファターゼの発現（Ｄ）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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