(57)【要約】【課題】精子数を簡便に測定することができる精子数測定方法および精子数測定用試薬を提供すること。【解決手段】本発明の精子数測定方法に使用する精子数測定用試薬は、乳酸塩と、酸化型ＮＡＤと、テトラゾリウム塩と、ジアホラーゼと、精液を添加したとき弱アルカリを示すｐＨ緩衝剤とを添加してなる混合物からなる。また、この発明の精子数測定方法は、この精子数測定用試薬に精液を添加するだけで発色する発色強度に基づいて精子数を測定することができる方法であって、従来法のように３種類の試薬を用時に混合する必要がない簡便な方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸塩と、酸化型ＮＡＤと、ジアホラーゼと、テトラゾリウム塩と、精液を添加したとき弱アルカリを示すｐＨ緩衝剤とから構成されていることを特徴とする精子数測定用試薬。
【請求項２】
請求項１に記載する精子数測定用試薬において、乳酸塩が乳酸脱水素酵素の基質となってピルビン酸を生成しうるものであることを特徴とする精子数測定用試薬。
【請求項３】
請求項１または２に記載する精子数測定用試薬において、乳酸塩が乳酸亜鉛または乳酸カルシウムであることを特徴とする精子数測定用試薬。
【請求項４】
請求項１に記載する精子数測定用試薬において、酸化型ＮＡＤがジアホラーゼ並びに乳酸脱水素酵素のいずれに対しても補酵素として作用しうることを特徴とする精子数測定用試薬。
【請求項５】
請求項１または４に記載する精子数測定用試薬において、酸化型ＮＡＤがβーＮＡＤであることを特徴とする精子数測定用試薬。
【請求項６】
請求項１に記載する精子数測定用試薬において、ジアホラーゼが、酸化型ＮＡＤが還元されて生成した還元型ＮＡＤに依存して、テトラゾリウム塩からホルマザンを生じる作用を有していることを特徴とする精子数測定用試薬。
【請求項７】
請求項１に記載する精子数測定用試薬において、テトラゾリウム塩が、ジアホラーゼの基質となって還元型ＮＡＤに依存して発色するものであることを特徴とする精子数測定用試薬。
【請求項８】
請求項１または７に記載する精子数測定用試薬において、テトラゾリウム塩が、ｐーヨードニトロテトラゾリウムバイオレットであることを特徴とする精子数測定用試薬。
【請求項９】
請求項１に記載する精子数測定用試薬において、ｐＨ緩衝剤は、中性から弱アルカリ性の緩衝剤であって、精液を添加したときのｐＨが、ｐＨ８以上、好ましくはｐＨ８．３以上になることを特徴とする精子数測定用試薬。
【請求項１０】
請求項１または９に記載する精子数測定用試薬において、ｐＨ緩衝剤は、トリスヒドロキシメチルアミノメタンと、クエン酸、リンゴ酸もしくはコハク酸との混合物であることを特徴とする精子数測定用試薬。
【請求項１１】
請求項１および１０のいずれか１項に記載する精子数測定用試薬において、乳酸塩が０．０５〜１ｇ、好ましくは０．１〜０．５ｇであり、酸化型ＮＡＤが０．１〜１０ｍｇ、好ましくは０．３〜３ｍｇであり、ジアホラーゼが０．１〜１００単位、好ましくは０．３〜６単位であり、テトラゾリウム塩が１〜１００ｍｇ、好ましくは５〜２０ｍｇであり、精液を加えた状態でｐＨを弱アルカリ性に保つための緩衝剤が中性から弱アルカリ性で緩衝作用を発揮することを特徴とする精子数測定用試薬。
【請求項１２】
請求項１および１１のいずれか１項に記載する精子数測定用試薬において、該精子数測定用試薬が固体状であることを特徴とする精子数測定用試薬。
【請求項１３】
測定対象としての精液が添加されたときのｐＨがｐＨ８以上であり、精液中の乳酸脱水素酵素の量によって、乳酸塩を基質としてピルヒ゛ン酸を生成させ、この反応にともなって乳酸脱水素酵素に比例して酸化型ＮＡＤから還元型ＮＡＤを生じさせ、生じた還元型ＮＡＤを利用して、還元型ＮＡＤに依存してテトラゾリウム塩からジアホラーゼによって発色色素を生じさせることによって精子数を測定することを特徴とする精子数測定方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載する精子数測定方法において、該ｐＨ８．３以上であることを特徴とする精子数測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、精子数を測定するための精子数測定用試薬および精子数測定方法に関するものであり、更に詳細には、特に男性機能を測定するのに有用な精子数測定用試薬法と精子数測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、環境ホルモンの影響で精子数の減少が報告されている。２０年前に比べて精子数が半減しているとされている。しかしながら、この精子数を測定する適当な方法がなかった。
【０００３】
したがって、本発明者等は、精子に含まれ、その精子数と比例するとされる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ−Ｃ４）に注目して、これを測定することによって精子数を測定する精子数測定器具を始めて開発し、パワーチェッカー「ホタル」として発売してきた。しかしながら、このパワーチェッカー「ホタル」は、精液分取器と、３種類の試薬とからなり、用時にこれらの試薬を混合して測定しなければならなかった。しかも、その器具には、その取り扱い方が非常に面倒であるという欠点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らは、従来方法の欠点を解消して、用時に混合することなく精子数を簡単に測定することが出来る試薬と方法を鋭意研究した結果、精嚢由来で精液中に存在しかつ精子数と比例するとされる乳酸脱水素酵素に注目して、この乳酸脱水素酵素を測定することによって、用時に混合することなく、１種類の混合試薬からなる精子数測定用試薬を用いれば、この精子数測定用試薬に精液を混ぜるだけで非常に簡便に精子数を測定することができる精子数測定方法とを見出して、本発明を完成した。
従って、本発明は、複数の成分を混合した精子数測定用試薬と、この精子数測定用試薬に精液を混ぜることによって精子数を簡便に測定することが出来る精子数測定方法とを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決する手段】
上記目的を達成するために、本発明は、別の態様として、精液中の乳酸脱水素酵素の量を測定することによって精子数を簡便に測定することが出来る１種類の試薬からなる精子数測定用試薬を提供する。
本発明に係る精子数測定用試薬は、乳酸塩と、酸化型ＮＡＤと、ジアホラーゼと、テトラゾリウム塩と、ｐＨ緩衝剤とから構成されている。本発明の試薬は、これらの構成成分を１つの試薬として混合されたものである。
本発明に係る精子数測定用試薬の１つの好ましい態様としては、その精子数測定用試薬が全て固体からなることが好ましい。
また、本発明に係る精子数測定用試薬は、この試薬に精液が添加されたときのｐＨが、ｐＨ８以上、好ましくはｐＨ８．３以上であるのがよい。
【０００６】
本発明は、別の態様として、精液中の乳酸脱水素酵素の量を測定することによって精子数を簡便に測定することが出来る精子数測定方法を提供する。
本発明に係る精子数測定方法は、精嚢由来で精液中に存在し精子数と比例するとされる乳酸脱水素酵素の測定によって行なうものである。つまり、この方法は、精液中の乳酸脱水素酵素の量を、乳酸塩を基質としてピルビン酸を生成させ、酸化型ＮＡＤから還元型ＮＡＤを生じさせることによって測定することからなつている。こうして生じた還元型ＮＡＤを利用して、還元型ＮＡＤに依存してテトラゾリウム塩からジアホラーゼによってホルマザンを生じることによって、結果として乳酸脱水素酵素に比例して、つまり精子数に比例して強く発色することによって、精子数を測定することから構成されている。
本発明の方法において、その好ましい態様として、本発明に係る精子数測定用試薬を測定対象の精液に添加したときのｐＨは、ｐＨ８以上、好ましくはｐＨ８．３以上にするのがよい。更に、乳酸を基質としてピルビン酸を生成させ、酸化型ＮＡＤから還元型ＮＡＤを生じさせる反応は、この条件下で行うのがよい。
【０００７】
【発明の実施の態様】
本発明に係る精子数測定方法は、本発明に係る精子数測定用試薬を精液に添加して、乳酸塩を基質としてピルビン酸を生成させることによって、乳酸脱水素酵素に比例して、酸化型ＮＡＤが還元型ＮＡＤに還元される。このようにして生じた還元型ＮＡＤを利用してかつ還元型ＮＡＤに依存して、テトラゾリウム塩がジアホラーゼによってホルマザンを生成する。その結果として、乳酸脱水素酵素に比例して、つまり、精子数に比例して発色することになる。この発色強度を測定することによって、乳酸脱水素酵素の量、つまり、精子数を測定することができる。
また、本発明の方法においては、本発明の精子数測定用試薬は、精液を添加したときのｐＨが、ｐＨ８以上、好ましくはｐＨ８．３以上になるのがよい。その上、この条件下で、本発明の測定方法を実施するのがよい。
更に、本発明においては、発色強度と、乳酸脱水素酵素の量、つまり、精子数との関連を示す標準比較図によって精子数を測定するようにすることができる。
【０００８】
本発明に係る精子数測定用試薬は、乳酸塩と、酸化型ＮＡＤと、ジアホラーゼと、テトラゾリウム塩と、精液を添加したとき弱アルカリを示すｐＨ緩衝剤とから構成されている。この試薬は、これらの構成成分を１つの試薬として混合されたものがよい。
【０００９】
本発明に係る精子数測定用試薬を構成する成分の１つである乳酸塩としては、例えば、乳酸亜鉛、乳酸カルシウムなどが挙げられるが、本発明において乳酸脱水素酵素の基質となりうるものであればいずれでもよい。かかる塩に限定されるものではなく、いずれの塩も使用することが出来る。また、本発明においては、精子数測定用試薬は全体として固体であるのが好ましいが、場合によっては、液体である乳酸自体も使用することが出来る。
本発明の精子数測定用試薬には、乳酸塩は、一般には、０．０５ｇ〜１ｇ、好ましくは０．１ｇ〜０．５ｇの割合で含まれるのがよい。
【００１０】
本発明の精子数測定用試薬において別の１つの成分として使用される酸化型ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレヲチド）としては、βーＮＡＤが好ましいが、ジアホラーゼ並びに乳酸脱水素酵素のいずれに対しても補酵素として作用しうるものであれば純度、由来等は問わず、いずれでも使用することが出来る。この発明においては、酸化型ＮＡＤは、乳酸塩を基質として生成したピルビン酸によって、乳酸脱水素酵素に比例して、還元型ＮＡＤに還元されることになる。本発明の精子数測定用試薬に含まれる酸化型ＮＡＤ量は、一般には、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは０．３ｍｇ〜３ｍｇであるのがよい。
【００１１】
本発明の精子数測定用試薬に更に含まれているジアホラーゼは、酸化型ＮＡＤが還元されて生成した還元型ＮＡＤに依存して、テトラゾリウム塩からホルマザンを生じる作用を有しているものである。本発明において使用されるジアホラーゼは、上記作用を満たすものであれば、その由来は問わずいずれも使用することができる。
本発明の精子数測定用試薬には、ジアホラーゼは、０．１〜１００単位、好ましくは０．３〜６単位の割合で含まれているのがよい。
【００１２】
また、本発明の精子数測定用試薬に使用されるテトラゾリウム塩は、ｐーヨードニトロテトラゾリウムバイオレットが好ましいが、ジアホラーゼの基質となって還元型ＮＡＤに依存して発色物質を生じるものであればいずれの化合物であってもよい。
本発明の精子数測定用試薬に含有されるテトラゾリウム塩の量は、１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜２０ｍｇであるのがよい。
【００１３】
本発明に係る精子数測定用試薬は、精液を添加したときのｐＨを、ｐＨ８以上、好ましくはｐＨ８．３以上になるように調整するのがよく、そのために、前もってｐＨ緩衝剤が添加されているのがよい。したがって、ｐＨ緩衝剤としては、中性から弱アルカリ性の緩衝剤であるのがよく、例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタンとクエン酸との混合物が好ましいが、精液を加えた状態で、中性から弱アルカリ性で緩衝作用を発揮するものであればいずれの試薬でもよい。また、特に水溶性の固体であって、リンゴ酸、コハク酸等などの固形有機酸を使用することもできる。
本発明において好ましいｐＨ緩衝剤の１つである、例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタン／クエン酸の混合液の場合には、それぞれの使用量は、トリスヒドロキシアミノメタンが０．０５〜１ｇ、好ましくは０．１から０．３ｇであって、クエン酸量は、精液が添加されて水溶液となったときｐＨが８〜８．５の弱アルカリ性を示すように添加するのがよい。
【００１４】
こうして得られた本発明に係る精子数測定用試薬は、一般的に固型状なので、保存形態もしくは商品の形態としては、例えば、粉末、顆粒、錠剤、スティック、ゼリー状等のいずれの形態でもよい。特に、ゼリー状の場合には、コンドームの頭部に塗布したり、貼り付けたりすることもできる。また、粉末、顆粒、錠剤、スティック等の形態の場合にも、コンドーム中に添加することによって使用することができる。
【００１５】
本発明に係る精子数測定用試薬は、精液に接触されることによって、精液中に精子が十分に存在すれば、つまり、約１億個／ｍｌ程度の正常数の精子が存在していれば、約１０から１５分後にはバイオレットに発色する。一方、精子数が１０００万個／ｍｌ以下と通常の１／１０以下では殆ど発色しない。つまり、発色の強度は、精子数に一般的に直線的に比例するので、これによって精子数の概数を測定することができることになる。
【００１６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実験例
本発明に係る精子数測定用試薬を、下記成分を混合して調製した。なお、下記に示す量は、２０回分の量である。
乳酸亜鉛を２ｇと、酸化型ＮＡＤとしてβーＮＡＤを１０ｍｇと、ジアホラーゼを１２単位と、テトラゾリウム塩としてｐーヨードニトロテトラゾリウムバイオレットを２４ｍｇと、弱アルカリ緩衝剤としてトリスヒドロキシメチルアミノメタン／クエン酸の混合物を、トリスヒドロキシアミノメタンを４ｇ、クエン酸を２ｇほど磨り潰して混合した。この混合物を２０個に分けた。
この混合物１個を、平均的な精子濃度（精子約１億個／ｍｌ）に該当する４０００シグマ単位／ｍｌの乳酸脱水素酵素に添加したところ、１５分後にきれいなバイオレットに発色した。
【００１７】
実施例１
実験例で使用した混合物１回分の量に、健常者の精液（精子約１億個／ｍｌ）を添加したところ、１５分後にきれいなバイオレットに発色した。
【００１８】
実施例２
実験例で使用した混合物１回分の量に、極端に精子数が少ない精液（精子数約１００万／ｍｌ）を添加したところ、３０分経過してもほとんど発色は認められなかった。
【００１９】
【発明の効果】
従来の精子数測定方法では、３種類の試薬を用時に混合することが必要であって、取り扱いに不便であった。本発明に係る精子数測定方法ならびに精子数測定用試薬は、複数の成分を１種類に混合している上に、用時に混合することなしに、精液を接触させるまたは添加するだけで、精子数の概数を測定することができる極めて簡便な精子数測定方法ならびに精子数測定用試薬である。