(57)【要約】【課題】ヒトを含む動物における、ストレスの結果として生じる免疫能、とりわけ腸管免疫系の機能低下を改善する作用を有するビフィズス菌製剤を提供する。【解決手段】Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌の菌体成分を経口摂取すると、ストレスにより誘発される腸管免疫の機能低下を改善し得るいう知見に基づく。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の菌の菌体成分を有効成分とする、ストレス抵抗性および／またはストレスにより誘発された免疫能の機能低下を改善するビフィズス菌製剤。
【請求項２】
腸管免疫の機能低下である請求項１記載のビフィズス菌製剤。
【請求項３】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の菌がＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ  ７０４１である請求項２記載のビフィズス菌製剤。
【請求項４】
菌体成分が菌体の超音波破砕物および／またはその分画物である請求項１記載のビフィズス菌製剤。
【請求項５】
分画物が細胞壁画分、細胞質膜画分、プロトプラスト、または水溶性画分である請求項４記載のビフィズス菌製剤。
【請求項６】
ストレス抵抗性および／またはストレスにより誘発された免疫能の機能低下を改善するビフィズス菌製剤を製造するための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の菌の菌体成分を有効成分の使用。
【請求項７】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の菌がＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ  ７０４１である請求項６記載の使用。
【請求項８】
菌体成分が菌体の超音波破砕物および／またはその分画物である請求項７記載の使用。
【請求項９】
分画物が細胞壁画分、細胞質膜画分、プロトプラスト、または水溶性画分である請求項８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストレスにより誘発された動物（ヒトを含む）の腸管免疫系の機能低下を改善するビフィズス菌製剤に関する。本発明のビフィズス菌製剤は、ストレス事象の前、ストレス事象中および／またはストレス事象後に、ビフィズス菌製剤を含む栄養製品を動物（ヒトを含む）に投与することを含む。本発明はまた、抗酸化剤系およびビフィズス菌製剤を含む栄養製品にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
元来、種々の外的有害因子（ストレッサー）に対する共通した一群の生体反応、すなわち一般適応症候群（ｇｅｎｅｒａｌ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ）として医学的生理学的に記載されたのがストレスまたはストレス反応とよばれるものである。しかし、今日においては社会的心理学的因子を含め広く外的要因による生体の変化を“ストレス”としてとらえることが一般的である。１９３０年代、ストレスの概念を提唱したＳｅｌｙｅのいう３症候のひとつに、胸腺・リンパ線の萎縮があげられていることからも明らかなように、心理的情動因子を含む“ストレス”は免疫系に量的質的変化をもたらす。
【０００３】
ストレスによる末梢血白血球数、リンパ球数、リンパ球分画の変動については、これまでの報告は必ずしも一定していない。古典的にはストレスにより末梢血顆粒球の増加に伴い総白血球数は増加するが、リンパ球数は減少すると報告されている（例えば非特許文献１）。しかし、運動負荷を物理的ストレスのモデルとした近年の報告では、運動負荷時には一過性の末梢血リンパ球（ＮＫ細胞数、Ｔ細胞数、Ｂ細胞数）数の増加がみられ、運動終了後にリンパ球数の減少がみられる（例えば非特許文献２）。Ｔ細胞サブセットの変化についても報告により異なり、ストレスによりＣＤ４／ＣＤ８比は低下するという報告が多いが、逆に増加するという報告もある。
【０００４】
一方、ストレスによる免疫系の機能的変化については、ＮＫ細胞活性、ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎやｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａなどのマイトジェン刺激によりリンパ球増殖反応、抗体産生能などは、種々のストレスによりいずれも抑制される。
【０００５】
ストレスが個体の免疫系に上記のような量的質的変化を与える機構については、“精神神経免疫学”あるいは“神経内分泌免疫学”とよばれる分野において解析が行われている。それによると、生体防御系としての免疫系は、神経系や内分泌系と相互に影響し合い、いわゆる「神経−内分泌−免疫系」のクロストークを通して恒常性維持に働くことが明らかになりつつある。しかしながら、全身系・末梢系免疫システムとは異なった誘導・制御機構をもつ腸管免疫系に対するストレスの作用についてはほとんど解析が行われていないのが現状である。すなわち、腸管免疫系は粘膜面へのＩｇＡ分泌が特徴的であり、感染防御において重要な役割を果たしているが、このＩｇＡ分泌に対する各種ストレスの影響はこれまで明らかにされてない。
【０００６】
一方、プロバイオティクスとして期待される腸内細菌由来成分は腸管免疫調節作用（例えば非特許文献３）がある。
【０００７】
ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍやＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓなどのグラム陽性菌の中には、リンパ球の増殖活性を高めたり、ＩｇＡ産生を亢進させるはたらきのあるものが存在し、プロバイオティクスの免疫調節作用が期待されている。ペプチドグリカンなどのグラム陽性菌の菌体壁成分には抗腫瘍効果やアジュバント活性などが報告されているが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの菌体由来成分のうち水溶性高分子多糖成分にも高い免疫賦活作用があることが報告されている。この活性成分はグルコースとガラクトースを主成分とする高分子多糖を含み、その構成糖の結合型は、−４Ｇａｌｐ−（または−５Ｇａｌｆ１−）、−６Ｇｌｃｐ１−が多く、Ｇａｌｆ１−、−６Ｇａｌｆ１−といったガラクトフラノシドも含んでいる。さらにβ−グルコシド結合をとる構造と活性との相関も示唆されている。
【０００８】
上記のマイトジェン活性の高いＢ．  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ  ７０４１由来菌体成分のマウスへの６日間の経口投与によって、腸管免疫系の誘導部位であるパイエル板のＣＤ４陽性細胞はインターロイキン−６（ＩＬ−６）やインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）などのサイトカインの産生量が亢進し、腸管粘膜に外分泌される総ＩｇＡ量は増加することが明らかになっている。このことから、菌体成分によって粘膜免疫系への感作が起こると、ＩＬ−６によってＩｇＡ形質細胞への最終分化の誘導が促進され、さらに上皮細胞（ＩＥＣ）側ではＩＦＮ−γによってポリＩｇレセプター（ｐＩｇＲ）の誘導促進がおこり、結果として管腔側へのＳＩｇＡの分泌が促進されていることが示唆される。
【０００９】
さらに、プロバイオティクスとして期待される菌体によって腸管内で産生される代謝産物（短鎖脂肪酸など）が腸管上皮細胞間リンパ球（ＩＥＣ）などに作用している可能性も考えられ、ＳＩｇＡ産生に影響を与えていることが推察される。
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｓ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２２１：  １３０１−１３０３，  １９８３；  Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｓ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８５：  ９２９７−９３０１，  １９８８
【非特許文献２】Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｇｏｅｔｚ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ．  １５：  ３８２−３８７，  １９９４
【非特許文献３】細野  朗：ＦＯＯＤ  Ｓｔｙｌｅ  ２１  ２００２．９（Ｖｏｌ．  ６  Ｎｏ．  ９）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトを含む動物における、ストレスの結果として生じる免疫能、とりわけ腸管免疫系の機能低下を改善する作用を有するビフィズス菌製剤を提供する。また、本発明は、ヒトを含む動物に対するストレス抵抗性を付与する作用を有するビフィズス菌製剤を提供する。ストレスは、身体的な過度の運動、精神的な極度の疲労、疾患状態を含む。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌の菌体成分を経口摂取すると、ストレスにより誘発される腸管免疫の機能低下を改善し得るいう知見に基づいてなされたものである。
【００１３】
すなわち、本発明は
（１）  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の菌の菌体成分を有効成分とする、ストレス抵抗性および／またはストレスにより誘発された免疫能の機能低下を改善するビフィズス菌製剤、
（２）  腸管免疫の機能低下である（１）のビフィズス菌製剤、
（３）  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の菌がＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ  ７０４１である（２）のビフィズス菌製剤、
（４）  菌体成分が菌体の超音波破砕物および／またはその分画物である（１）のビフィズス菌製剤、
（５）  分画物が細胞壁画分、細胞質膜画分、プロトプラスト、または水溶性画分である（４）のビフィズス菌製剤、
（６）  ストレス抵抗性および／またはストレスにより誘発された免疫能の機能低下を改善するビフィズス菌製剤を製造するための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の菌の菌体成分を有効成分の使用、
（７）  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の菌がＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ  ７０４１である（６）の使用、
（８）  菌体成分が菌体の超音波破砕物および／またはその分画物である（７）の使用、
（９）  分画物が細胞壁画分、細胞質膜画分、プロトプラスト、または水溶性画分である（８）の使用、
からなる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（以下「ビフィズス菌」ともいう）内の菌種については、Ｒｅｕｔｅｒ、Ｍｉｔｓｕｏｋａ、Ｓｃａｒｄｏｖｉらによって研究が行われ、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌの第８版では１１菌種に分類された。その後、ＤＮＡホモロジーを用いた遺伝子型による分類がＳｃａｒｄｏｖｉにより導入され、ＤＮＡホモロジーを基準に多くの新菌種が認められた。Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８６年）では２４菌種に分類され、さらに現在、表１に示したように、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として２６菌種が認められている（光岡知足編集．  １９９２．  腸内フローラの分類と生態：  ｐ．  ５５−７２  ．  学会出版センター）。
【００１５】
【表１】
2004262773.tif 000002
【００１６】
また、Ｂ．  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓは、マンニトールとソルビトールの資化性により４つのｂｉｏｖａｒ  ａ、ｂ、ｃ、およびｄに分けられた。一方、Ｂ．  ｃａｔｅｎｕｌａｔｉｍ、Ｂ．  ａｎｇｕｌａｔｕｍ、Ｂ．  ｄｅｎｔｉｕｍ、およびＢ．  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍはＳｃａｒｄｏｖｉらによりヒト糞便、膣および口腔、下水や子牛から分離される新菌種として報告された。これらの４菌種は表２に示すようにＤＮＡの相同性においてＢ．  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓとは明らかに異なった菌種であるが、糖分解性状は類似していることがしられている（光岡知足編集．  １９９２．  腸内フローラの分類と生態：  ｐ．  ５５−７２  ．  学会出版センター）。
【００１７】
【表２】
2004262773.tif 000003
【００１８】
本発明においては、候補となるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の菌種は表１および表２に示す菌種（生菌および死菌）すべてを含む。ビフィズス菌の培養方法は公知である〔光岡知足著、“腸内菌の世界”（叢文社、１９８０）〕。また、ビフィズス菌培養物、精製ビフィズス菌体、凍結乾燥菌体、あるいは市販のビフィズス菌製剤等も含む。ビフィズス菌製剤については、１×１０１０個／ｇ以上を訴求した商品も多くみられるようになっている。
【００１９】
本発明は、上記菌体の破砕物、細胞壁画分、プロトプラスト、細胞質膜画分、または水溶性画分であって、各種ストレス負荷したとき、腸管粘膜系におけるＩｇＡ抗体および総ＩｇＡ産生低下、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるリンパ球に対するマイトジェン作用低下、あるいはサイトカイン産生低下を抑制する作用を有するものすべてを含む。
【００２０】
ビフィズス菌の可溶性の細胞質画分とそれ以外の膜画分を含む菌体不溶性画分は、菌体を超音波処理の後、超遠心分離により簡便に分けることができる。細胞壁画分、プロトプラスト、細胞質膜画分、または水溶性画分の調製は公知〔例えば、松沢  洋，  李泳春，  “微生物実験法（新生化学実験講座）”，  （社）日本生化学会編，  （株）東京化学同人，  ｐ．  １７９；特許３１７４６１１号；特開平９−２４１１７９公開公報〕であり、本発明はこれらの公知技術を含む。
【００２１】
ビフィズス菌は、ヒトや各種動物の消化管や糞便、ヒトの膣や口腔、ミツバチの消化管、下水などに分布し、ヒトと動物種間や乳児と成人の間には“すみわけ”が認められる。現在、ヒト由来ビフィズス菌として１０菌種が報告されているが、わが国においては、ヒトから分離されるビフィズス菌種として報告されているのはＢ．  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂ．  ｂｒｅｖｅ、Ｂ．  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂ．  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓの５菌種であり、その他の菌種については報告されていない（光岡知足編集．  １９９２．  腸内フローラの分類と生態：  ｐ．  ５５−７２  ．  学会出版センター）。
【００２２】
そこで、ストレスにより誘発される免疫抑制を改善する適用対象がヒトの場合は、候補となるビフィズス菌はヒトに常在する上記１０菌種、すなわち、Ｂ．  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂ．  ｂｒｅｖｅ、Ｂ．  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂ．  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂ．  ａｎｇｕｌａｔｕｍ、Ｂ．  ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｂ．  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｂ．  ｄｅｎｔｉｕｍおよびＢ．  ｇａｌｌｉｃｕｍがあげられる。また、対象が家畜の牛を想定する場合は、表１の牛由来のビフィズス菌、すなわち、Ｂ．  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂ．  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂ．  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｂ．  ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｂ．  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ、Ｂ．  ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍおよびＢ．  ｂｏｕｍが候補としてあげられる。対象が鶏の場合は同様の考えで  Ｂ．  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ、Ｂ．  ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂ．  ｐｕｌｌｏｒｕｍおよびＢ．  ｇａｌｌｉｃｕｍが候補としてあげられる。さらに今後自然界から分離されるビフィズス菌も候補となる。
【００２３】
微生物保存機関のビフィズス菌株としては、Ｂ．  ｌｏｎｇｕｍ  ＡＴＣＣ１５７０７Ｔ株（Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ）、Ｂ．  ｂｒｅｖｅＡＴＣＣ１５７００Ｔ株（Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｏｆ  ｉｎｆａｎｔ）、Ｂ．  ｉｎｆａｎｔｉｓＡＴＣＣ１５６９７Ｔ株（Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｏｆ  ｉｎｆａｎｔ）、Ｂ．  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓＡＴＣＣ１５７０３Ｔ株（Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ）、およびＢ．  ｃａｔｅｎｕｌａｔｉｍＡＴＣＣ２７６７７株（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔ．  ２４：
６−２０，  １９７４）等を例示することができる。
【００２４】
近年、ビフィズス菌のなかでも、さらに菌種により、あるいは菌株により作用がすこしずつ異なることが明らかにされてきており、最近の利用傾向は特徴の異なる数種の菌を組み合わせて、より機能性を高めた商品や、腸内ビフィズス菌の増殖因子となるオリゴ糖などと組合わせた商品が多くみられるようになっている。そこで、本発明はこのような組み合わせを含む。
【００２５】
本発明のビフィズス菌破砕物、細胞壁画分、プロトプラスト、細胞質膜画分、または水溶性画分を含む製剤は、ストレスにより免疫機能の低下したヒトを含む動物に免疫機能改善を目的として投与することができる。また、ストレスにより免疫機能の低下したヒトに対して、保健機能食品として利用することができる。また、ストレスにより免疫機能の低下した動物に対して、免疫機能改善を目的として、その有効量を飼料に添加することができる。
【００２６】
ビフィズス菌製剤には、免疫機能に有利な効果を発揮する抗酸化剤、例えば、ビタミンＡ、セレン、ビタミンＣあるいはβ−カロチンなどを添加することができる。
ストレスにより免疫機能の低下したヒトが、免疫機能改善、あるいは免疫機能低下の改善を目的して、ビフィズス菌製剤を摂取する場合の有効量は、経験的に１日あたり生菌数が１０９以上で整腸効果が認められているので、この数字は一つの目安となると考えられる（Ｏｇａｔａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ，  １６（２）：  ５３−５８，  １９９７  ）が、免疫機能改善の有効量は公知の免疫学的パラメーター（例えば、白血球機能の活性化）から決定可能である。
【００２７】
本発明のビフィズス菌製剤の形態は、例えば、塊状、液状、シロップ状、粉末状とすることができ、これらの形態に応じて、種々の添加剤、例えば増量剤、甘味剤、他の糖質、ビタミン類、香料、着色剤等を含有させることがでる。形態は液状または粉末の食品形態や、粉剤、散剤、液剤、懸濁剤、錠剤、発泡剤等の医薬品形態等である。
【００２８】
次に、実施例により本発明を説明する。
【実施例】
［実施例１］  ビフィズス菌の菌体破砕物の調製
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ  ７０４１〔日本ビフィズス菌センター〕を３７℃、４８  時間嫌気培養した。
培養後菌体を遠心（６，０００×ｇ、５℃、１０分間  ）して回収し、超純水で３回洗浄（６，０００×ｇ、５℃、１０分間  ）した後、凍結乾燥して−２０℃で保存した。凍結乾燥菌体は超純水で４  ｍｇ／ｍＬに懸濁した後、氷冷却下超音波処理（大岳製作所製、１５分間  ）し、さらに８００×ｇ、５℃、５分間の遠心によって未処理の細胞や超音波処理によって生じた金属くずを除去した。これを凍結乾燥し、細胞破砕物（ＢＰ）を得た（ＢＰはアッセイまで−２０℃で保存  ）。
【００２９】
［実施例２］  各種ストレス負荷の腸管免疫に及ぼす影響
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを６週齢で購入（日本クレア）し、３日間順化飼育した後、１群  ８匹として４群に分けた。次に運動ストレス群のみ４〜８日目までの５日間、流水遊泳運動のトレーニング（水温３２℃、７  Ｌ／ｍｉｎの流水中にて５分間×３セット  ）を行い、さらに２日間おいて１１〜１５日目の５日間は以下の条件で各群にそれぞれのストレスを負荷した。実験期間中（１５日間）は、それぞれのマウスにはマウス用固型飼料ＭＦ（オリエンタル酵母）および水を自由摂取させた。
ストレス条件は、運動ストレスとして水温３２℃、７Ｌ／ｍｉｎの流水遊泳運動負荷（１日あたり１０  ｍｉｎ×３セット）群、拘束ストレス（小さい穴を多数開けた５０  ｍＬ容ポリプロピレン製チューブ中にマウスを固定）負荷群（１日３時間）、さらに、水侵拘束ストレス（小さい穴を多数開けた５０  ｍＬ容ポリプロピレン製チューブ中にマウスを固定し、これを水深１  ｃｍ、約３２℃の水をたくわえたケージ内に静置  ）負荷群（１日３時間）負荷、および非ストレス負荷群とした。
ストレスを負荷する前（１０日目）、ストレス負荷期間（１１、１２、１３、１４および１５日目）の５日間、眼窩静脈叢から採血し、血漿中のコルチコステロン量をＲＩＡ法により測定した。
ストレス負荷終了後（１５日目）、マウスからパイエル板細胞を採取し、各種サイトカイン刺激による培養条件での培養上清中の総ＩｇＡ量をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡ法の概略は以下のとおりである。
ヤギ抗マウスＩｇＡ抗体（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ）を９６ウェルマイクロプレート（ＭａｘＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）に添加し、４℃で一晩固相化した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキング後、１  ％  ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液（サンプルバッファー）で適当な倍率に希釈した測定サンプルを各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベーションした。サンプルバッファーで１，０００倍に希釈したビオチン化抗マウスＩｇＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベーションした。１  ％  ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で１，０００倍に希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体（Ｚｙｍｅｄ）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベーションした。そして０．１  ％フェニルリン酸二ナトリウム含ジエタノールアミン緩衝液を各ウェルに添加し、３７℃でインキュベーション後、４０５  ｎｍにて吸光値を測定した（ＢｉｏＲａｄ）。腸内容物中の総ＩｇＡ量についても同様の方法で測定した。
血中コルチコステロン量は、運動ストレス、拘束ストレス、および水侵拘束ストレス負荷群において、いずれも非ストレス群（対照群）に比べて高いレベルを維持したが、ストレスの種類による大きな差異は認められなかった（図１）。
腸内容物中の総ＩｇＡ量は、運動ストレス負荷群において、非ストレス群（対照群）に対して有意（＊＜０．０５、一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ’ｓ  ｔｅｓｔ  ）に低下した。拘束ストレスおよび水侵拘束ストレス負荷群においては、非ストレス群に対して低値を示す傾向がみられた（図２）。
パイエル板細胞のＩｇＡ産生量は、運動ストレス、拘束ストレス群が非ストレス群に対して顕著に低下する傾向が認められた（図３）。
以上の結果から、マウスに運動ストレスあるいは拘束ストレスを負荷すると、血中コルチコステロンレベルが上昇し、腸管免疫系における総ＩｇＡ分泌が抑制されることが明らかとなった。
【００３０】
［実施例３］  ストレス負荷による腸管免疫機能低下に対するビフィズス菌体破砕物の効果
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを６週齢で購入（日本クレア）し、３日間順化飼育した後、１群  ８匹として、拘束ストレス負荷＋ＢＰ投与、２）拘束ストレス負荷＋ＢＰ非投与、３）拘束ストレス非負荷＋ＢＰ投与、および４）拘束ストレス非負荷＋ＢＰ非投与の４群に分けた。
実施例１で調製したＢＰを１０  ｍｇ／日、９日間あらかじめ経口投与したマウスに対し、さらにＢＰの経口投与とともに拘束ストレス（１日５時間）を連続５日間負荷した（この場合、ＢＰを１４日間投与し、投与期間中の最後の５日間にストレスを負荷した）。
実験終了後、実施例２と同様に、腸内容物中総ＩｇＡ量、およびパイエル板細胞の培養上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。測定法は実施例２と同様に行い、このときの捕捉用抗体はラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体、検出用抗体をビオチン標識ラット抗マウス用ＩＦＮ−γ抗体（いずれもＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いた。
腸内容物中の総ＩｇＡ量は、拘束ストレス負荷群において、ＢＰ投与群がＢＰ非投与群に対して高値を示す傾向が認められた（図４）。また、拘束ストレス負荷群におけるＢＰ非投与群の総ＩｇＡ量は、非ストレス負荷群におけるＢＰ投与群およびＢＰ非投与群の総ＩｇＡ量とほぼ同じレベルであった。
【００３１】
一方、パイエル板細胞のＩＦＮ−γ産生量は、拘束ストレス負荷群および非拘束ストレス負荷群に対してＢＰを投与することにより、顕著に亢進した。
以上の結果から、ＢＰの経口投与は、ストレス負荷による腸管粘膜におけるＩｇＡ産生の低下を抑制することが明らかとなった。これは、ＢＰ投与によってＩＦＮ−γ産生応答が亢進し、分泌型ＩｇＡ産生が高まりことによるものと考えられる。
すなわち、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ  ７０４１の菌体破砕物の経口摂取は、ストレスによる腸管免疫の低下を改善することが明らかとなった。
このことは、プロバイオティクスとして期待されるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌体成分が、ストレスによる腸管免疫系の機能低下を改善化できることを示すものである。
【００３２】
【発明の効果】
本発明により、ストレスの結果として生じる腸管免疫系の機能低下を改善するのに有用なビフィズス菌製剤が提供された。該製剤は保健機能食品として有用である。ストレスは、身体的な過度の運動、精神的な極度の疲労、疾患状態を含む。
本発明により、ヒトを含む動物における、ストレスの結果として生じる免疫能、とりわけ腸管免疫系の機能低下を改善する作用を有するビフィズス菌製剤が提供された。また、ヒトを含む動物に対するストレス抵抗性を付与する作用を有するビフィズス菌製剤が提供された。ストレスは、身体的な過度の運動、精神的な極度の疲労、疾患状態を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＢＡＬＢ／ｃマウスへの運動ストレス、拘束ストレス、水侵拘束ストレスおよび非ストレス負荷期間中の血中コルチコステロンの測定結果を示す。
ここで、運動ストレス：●、拘束ストレス：■、水侵拘束ストレス▲：非ストレス：×である。
【図２】ＢＡＬＢ／ｃマウスへの同上ストレスを５日間負荷後の腸内容物中の総ＩｇＡの測定結果を示す。
【図３】ＢＡＬＢ／ｃマウスへの同上ストレスを５日間負荷後のパイエル板細胞をＣｏｎ  ＡあるいはＢＰ存在下で培養し、その培養上清中のＩｇＡを測定した結果を示す。
【図４】Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ  ７０４１菌体破砕物（ＢＰ）を１０  ｍｇ／日、５日間経口投与したマウスに対し、拘束ストレス（１日５時間）を連続５日間負荷した後、
腸内容物中総ＩｇＡ量を測定した結果を示す。
【図５】同上におけるパイエル板細胞をＣｏｎ  ＡあるいはＢＰ存在下で培養し、その培養上清中のＩｇＡを測定した結果を示す。
【図１】
2004262773.tif 000004
【図２】
2004262773.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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