(57)【要約】【課題】複数の測定項目の存在比を一回の測定において、簡便に知る方法および個々の濃度をも同時に測定しうる方法を提供する。【解決手段】イムノクロマト法に用いる標識粒子に２種類の色調の粒子を用いて、２種類の項目を同時に測定する方法を採用し、観察部位に現れる反応ラインの色調変化を観察することにより測定対象の２つの項目の存在比を検出する。さらに複数の反応ラインを設けることにより、その反応ラインの数を観察することにより測定対象の濃度と存在比を同時に測定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物と特異的に結合しうるリガンドを分析対象物のそれぞれに対応した標識物質で標識した標識リガンドを用いて、混在する２種の成分を同一の分析装置で分析する方法であって、該標識リガンドの相互作用により生じた信号を分析対象物の存在比に対応させることを特徴とする分析方法。
【請求項２】
標識物質が有色粒子であり、標識リガンドの相互作用により生じた信号が色調の変化である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分析対象物と特異的に結合しうるリガンドを標識した標識リガンドを用いるイムノクロマト法による混在する２種の成分を同一の分析装置で分析する方法であって、分析対象物の少なくとも一方の量をイムノクロマト法における反応量として算出しうる機能及び予め設定した２種の分析対象物の存在比を反映する機能を有した分析方法。
【請求項４】
分析方法がイムノクロマト法である請求項１および２に記載の方法。
【請求項５】
標識リガンドが有色粒子で標識されたリガンドである請求項３に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の方法を用いる検査薬及びキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は試料中の物質の分析方法に関するものであり、とりわけ臨床検査分野において利用される。
【０００２】
【従来の技術】生体試料中の成分を免疫学的に測定する方法は一般に行われている。標識リガンドを用いる酵素免疫測定法や有色粒子標識リガンドを用いるイムノクロマト法は汎用されている。通常の酵素免疫測定法では一つの測定対象物に対して一つの測定が行なわれる。一方、イムノクロマト法では、複数の測定対象物を一つの分析装置で個々のシグナルとして測定している（特開２０００−２９２４２７）方法が開示されている。一つの分析装置で複数の分析対象物を同時に測定しうる方法として、２種類の希土類金属キレート標識リガンドを用いる遅延蛍光免疫測定法による２項目同時測定法が実用化されている。これらの方法は、いずれもそれぞれの測定対象物に対して得られたシグナルをそれぞれ個別に測定している。
【０００３】臨床検査においては、測定対象物の個々の測定値が必要であることは当然であるが、なかには２項目の測定値の比が重要な項目もある。このような場合にはそれぞれの項目を個々に測定して、それぞれの測定値から比を算出している。そのような例として、ペプシノゲンＩ（ＰＧＩ）とペプシノゲンＩＩ（ＰＧＩＩ）の比や遊離の前立腺特異抗原（ｆ−ＰＳＡ）と総前立腺特異抗原（ｔ−ＰＳＡ）の比などがある。
【０００４】
【特許文献１】
特開２０００−２９２４２７号
【特許文献２】
特表平３−５００２４９号
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、複数の測定項目の存在比を一回の測定において、簡便に知る方法、さらには個々の濃度をも同時に測定しうる方法を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、公知の標識リガンドを用いる免疫化学手法を改良して、２種以上の測定項目を同時もしくは同一装置内で測定し、測定対象物のお互いの存在比を簡便に求める方法、さらには、存在比と測定対象物の量を同時に測定しうる方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
本発明は以下の構成よりなる。
１、分析対象物と特異的に結合しうるリガンドを分析対象物のそれぞれに対応した標識物質で標識した標識リガンドを用いて、混在する２種の成分を同一の分析装置で分析する方法であって、該標識リガンドの相互作用により生じた信号を分析対象物の存在比に対応させることを特徴とする分析方法。
２、標識物質が有色粒子であり、標識リガンドの相互作用により生じた信号が色調の変化である上記１に記載の方法。
３、分析対象物と特異的に結合しうるリガンドを標識した標識リガンドを用いるイムノクロマト法による、混在する２種の成分を同一の分析装置で分析する方法であって、分析対象物の少なくとも一方の量をイムノクロマト法における反応量として算出しうる機能及び予め設定した分析対象物の存在比を反映する機能を有した分析方法。
４、分析方法がイムノクロマト法である前記１及び２に記載の方法。
５、標識リガンドが有色粒子で標識されたリガンドである前記３に記載の方法。
６、上記１〜５に記載の方法を用いる検査薬及びキット。
【０００８】本発明の実施態様の例を挙げて本発明を詳細に説明する。イムノクロマト法を応用して、目視的に信号を確認できる金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子等の粒子状物質に抗原もしくは抗体を標識した標識リガンドを用いる方法を例示する。測定対象とする物質ＡとＢを測定する場合、物質Ａに対する抗体またはそのフラグメントを例えば青色粒子で標識し、一方物質Ｂに対する抗体またはそのフラグメントについては例えば黄色粒子で標識する。その標識リガンドを混合して、試料と反応させ、イムノクロマト法で測定する。反応物捕獲部位でそれぞれの測定対象物を捕獲し、反応ラインを観察することによって物質の存否を判定する。上記の標識粒子の例では、反応ラインの色調が青であれば物質Ａが大半であり、逆に黄色であれば物質Ｂが大半であることを示し、ＡとＢがほぼ同量であれば緑の反応ラインが出現する。このように、物質ＡとＢの存在比によって、出現する反応ラインの色調が変化することを利用して、その色調を観察することにより存在比を求めることができる。
【０００９】本発明の別の実施態様例として、物質ＡとＢの存在比および物質Ａ又はＢの少なくともどちらか一方の量を測定する方法が例示される。物質Ａに対する抗体又はそのフラグメント及び物質Ｂに対する抗体又はそのフラグメントを着色ラッテクスのような標識物で標識した標識リガンドを用いる。なお、この場合、標識物は同一物質であっても良いし、別の物質であっても良い。両方の物質に対する標識リガンドを反応させ、反応物捕獲部位でそれぞれの測定対象物を捕獲し、反応ラインを観察することによって物質の存否を判定する。この際、反応物捕獲部位は測定対象物の濃度あるいは量に応じて反応ラインの長さ、太さあるいは数の変化として対応し得るようにする。例えば物質ＡとＢの存在比が３：１であれば、ＡとＢのラインの長さ、太さあるいは数が３：１に対応し得るようにしておく。
また物質Ａの量を測定しうるように反応ラインの長さ、太さあるいは数によってその量も算出しうるように設計しておく。
【００１０】本発明は例えばペプシノゲンＩとＩＩ（ＰＧＩ、ＰＧＩＩ）の存在比およびその量又は濃度の測定、遊離の前立腺特異抗原又は前立腺特異抗原複合体と総前立腺特異抗原の存在比及びそれらの量又は濃度の測定に適用される。本発明はこれらの測定項目に限られることなく、少なくとも物質の存在比を測定することに意義を有する項目の測定に適用しうる。
【００１１】臨床的に意義のあるＰＧＩとＰＧＩＩの存在比（ＰＧＩ／ＰＧＩＩ）が３：１で表１に示したように緑色になるように設計しておけば、緑色よりも青色が強くなればＰＧＩ／ＰＧＩＩ＞３であると判定でき、黄緑色になればＰＧＩ／ＰＧＩＩ＜３であると判定できる。ＰＧＩとＰＧＩＩの比は萎縮性胃炎、胃癌のスクリーニング検査として有用であり、現在ＰＧＩ／ＰＧＩＩが３以下である場合には胃癌の可能性があると意義付けられている。従って、本発明により精密測定をすることなく、簡便短時間に臨床判断が容易にできる。
【００１２】本発明のもう一つの実施態様においては、ＰＧＩの濃度（量）とＰＧＩ／ＰＧＩＩ比の同時測定が可能である、例えば観察部位での発色が３つ目の部位までくればＰＧＩの濃度が７０ｎｇ／ｍｌ以上であるように設定しておき、一方ＰＧＩＩの方はＰＧＩの３分の１の感度に設定しておくと、臨床検体を測定したとき、ＰＧＩの発色を観察するだけで、ＰＧＩが７０ｎｇ／ｍｌ以上か以下かを判定できる。そして同時にＰＧＩＩの部位を観察することによって、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが３以上であるかどうかを判定できる。すなわち、ＰＧＩとＰＧＩＩの発色部位の数が同数であればＰＧＩ／ＰＧＩＩが３であり、ＰＧＩの数がＰＧＩＩよりも多ければ存在比が３以上であることがわかる。逆にＰＧＩＩの方が多ければＰＧＩ／ＰＧＩＩの比率は３以下であると判定できる（図３及び図４〜図４−６）。
【００１３】
【実施例】本発明の実施例を以下に示す。
【実施例１】ペプシノゲンＩ（ＰＧＩ）に対するモノクローナル抗体（クローンＮｏ．７Ｇ３、日本医学臨床検査研究所製）を青色着色ラテックス（粒径０．３５μｍ）に感作させ、標識抗ＰＧＩ抗体を調製した。調製した標識抗ＰＧＩ抗体はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした後、ＢＳＡ含有リン酸緩衝液中に分散させた。ペプシノゲンＩＩ（ＰＧＩＩ）に対するモノクローナル抗体（クローンＮｏ．２Ｄ５、日本医学臨床検査研究所製）も黄色着色ラテックス（粒径０．３５μｍ）に感作させ、同様に標識抗ＰＧＩＩ抗体を調製した。両標識抗体を等量混合したものを標識抗体保持パッドに浸漬して、標識抗体保持パッドを調製した。
イムノクロマト用のニトロセルロースメンブラン上にペプシノゲンＩ（ＰＧＩ）に対するモノクローナル抗体（クローンＮｏ．２Ｆ５、日本医学臨床検査研究所製．）とペプシノゲンＩＩ（ＰＧＩＩ）に対するモノクローナル抗体（．　クローンＮｏ．１０Ｅ１１、日本医学臨床検査研究所製）の等量混合物を、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ社製のドッティングマシンを用いて反応物捕獲ラインを作成した。
これらの部材を組み合わせて図１に示すようなイムノクロマト法の装置を調製した。
【００１４】
【実施例２】精製したＰＧＩ抗原とＰＧＩＩ抗原をそれぞれ混合した試料を実施例１で調製した装置で分析した。その結果を表１に示した。またそのときの反応模式図を図２に示した。ＰＧＩとＰＧＩＩの存在比によって、反応ラインの色調が変化して観察され、予め色調と存在比の関係を求めておくことにより測定試料中の物質の存在比を求めることが可能であることがわかった。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
【実施例３】ＰＧＩＩに対するモノクローナル抗体（クローンＮｏ．２Ｄ５、日本医学臨床検査研究所製）を実施例１で用いたＰＧＩ抗体を標識したものと同じ青色ラテックスで標識した。ＰＧＩ標識抗体とＰＧＩＩ標識抗体をそれぞれ別々に標識粒子保持パッドに保持させたものを用いて、図３に示すような複数の観察部位を有するイムノクロマト装置を調製した。本装置では、ＰＧＩ観察部位での発色が左から３つ目の部位までくればその濃度が７０ｎｇ／ｍｌ以上であるように設定しており、一方ＰＧＩＩの方はＰＧＩの約３分の１の感度に設定した。本装置を用いて以下に示す検体を測定した。その結果を表２に示した。
検体１；ＰＧＩ＝７５ｎｇ／ｍｌ，　ＰＧＩＩ＝２０ｎｇ／ｍｌ
検体２；ＰＧＩ＝７５ｎｇ／ｍｌ，　ＰＧＩＩ＝３５ｎｇ／ｍｌ
検体３；ＰＧＩ＝５５ｎｇ／ｍｌ，　ＰＧＩＩ＝２０ｎｇ／ｍｌ
【００１７】
【表２】
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【００１８】以上の結果、本発明の装置を用いてＰＧＩの濃度とＰＧＩとＰＧＩＩの存在比の両方が同時に測定できることがわかり、臨床応用に有用であることが判った。
【００１９】
【発明の効果】
本発明により、試料中に存在している複数の測定項目の存在比を一回の測定において、簡便に測定し、かつ同時に個々の濃度をも測定しうる方法が提供できる。
【００２０】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ測定用イムノクロマト法の構築図である。
【図２】反応結果を着色パターンで表した図である。
【図３】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ及びＰＧＩの量を同時測定するイムノクロマト装置の一例の図ある。
【図４】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ≒３、ＰＧＩ＜７０ｎｇ／ｍＬでの反応パターンを示した図である。
【図４−２】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ≒３、ＰＧＩ≧７０ｎｇ／ｍＬでの反応パターンを示した図である。
【図４−３】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ＞３、ＰＧＩ＜７０ｎｇ／ｍＬでの反応パターンを示した図である。
【図４−４】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ＞３、ＰＧＩ≧７０ｎｇ／ｍＬでの反応パターンを示した図である。
【図４−５】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ＜３、ＰＧＩ＜７０ｎｇ／ｍＬでの反応パターンを示した図である。
【図４−６】ＰＧＩ／ＰＧＩＩ＜３、ＰＧＩ≧７０ｎｇ／ｍＬでの反応パターンを示した図である。
【符号の説明】
１、試料添加パッド
２、標識パッド（抗ＰＧＩ抗体標識着色粒子及び抗ＰＧＩＩ抗体標識着色粒子保持部）
３、展開メンブラン
４、捕獲部位（抗ＰＧＩ抗体及び抗ＰＧＩＩ抗体固定部）
５、吸収パッド
６、ＰＧＩ単独の青色発色
７、ＰＧＩ／ＰＧＩＩ＝３／１の緑色発色
８、ＰＧＩＩ単独の黄色発色
９、ＰＧＩ測定部
１０、ＰＧＩＩ測定部
１１、観察部位
１２、ライン状の反応部位
１３、円状の反応部位
１４、帯状の反応部位
１５、ＰＧＩ＝７０ｎｇ／ｍＬのライン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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