(57)【要約】【課題】新規な糖尿病診断方法の提供。【解決手段】血中レチノイン酸濃度を指標とすることを特徴とする糖尿病の診断方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血中レチノイン酸濃度を指標とすることを特徴とする糖尿病の診断方法。
【請求項２】
該レチノイン酸がオールトランスレチノイン酸であることを特徴とする請求項１記載の糖尿病診断方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、ヒトの糖尿病の診断に有用な診断方法に関する。
【従来の技術】今日、世界中で少なくとも３０００万人の糖尿病患者がおり、現在、急速な人口の高齢化に伴い、その患者数は増加している。そして、今後、さらなる患者数増が確実視されている。この傾向は、日本においても例外ではなく、現在、約７００万人が糖尿病に罹患しており、その数は、数年後には、１０００万人に達するであろうと考えられている。
【０００２】
臨床的に現在行われている糖尿病および前糖尿病状態の診断方法は、空腹時の血糖値測定と７５ｇ経口糖負荷試験における糖負荷後１時間および／または２時間の血糖値測定によって行われるが、１回の診断について血液を複数回採取する必要があるため、被験者に苦痛を与えるものである。また、糖尿病の重症度の診断にはＨｂＡ１ｃ（グルコヘモグロビン）濃度が広く用いられている。ＨｂＡ１ｃはヘモグロビンが血中のグルコースと非酵素的に結合したもので、血中のグルコース濃度に依存して生成するため、検査時点以前の１−２か月間の血糖値を反映し、一時的な生理状態に左右されない。そのため糖尿病の重症度を正確に表し、血糖コントロールの良い指標となるため、糖尿病の治療において欠かせない指標となっている。
【０００３】
糖尿病の治療においては病期の判断が重要であるが、上記の方法を含む臨床的所見によって総合的に病期の判断がなされるものであり、十分な客観性を有しているとは言いがたく、新たな指標に基づく診断方法が望まれている。
糖尿病は代謝疾患の一種で、慢性高血糖を特徴とするが、そのほかにも糖代謝、脂質代謝、蛋白代謝等に特徴的な異常がある。
【０００４】
例えば、Ｉ型糖尿病においては、レチノールの血中濃度が健常人よりも低下する傾向が認められる（例えば、非特許文献１、２参照）。これに対してＩＩ型糖尿病においてはレチノールの血中濃度が健常人よりも上昇する傾向が認められることが知られている（例えば非特許文献３、４参照）。しかし、レチノールの血中濃度と糖尿病およびその合併症との関係は明らかではない。
【０００５】
近年、脂肪の分解に関与している細胞内小器官のひとつであるペルオキシゾームを、増殖作用を有する化合物によって活性化させる核内レセプターとしてｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＰＡＲ）が同定された。このＰＰＡＲはｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＲＸＲ）と二量体を形成して遺伝子の転写因子として作用することが知られている（例えば、非特許文献５参照）。ＰＰＡＲにはα、β、γの３種のサブタイプが知られているが、特にＰＰＡＲγは脂肪細胞の分化に重要な役割を果たしており、さらに糖尿病患者のインシュリン感受性を上昇させる作用を有していることが明らかとなっている。ＰＰＡＲγの生体内での生理的リガンドは未だ不明であるが、ＲＸＲについてはレチノールの代謝産物の一つである９−シス−レチノイン酸が生理的リガンドと考えられている。また、同じくレチノールの代謝産物の一つであるオールトランスレチノイン酸は脂肪細胞の分化を阻害する因子と考えられている（例えば、非特許文献６、７参照）。
【非特許文献１】Ｔｏｈｏｋｕ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９８６年，第１４９巻，ｐ．１３３−１４３。
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１９８９年，第５０巻，ｐ．３２９−３３１。
【非特許文献３】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  ｖｉｔａｍｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＝  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇｉｅ  ｅｔｄｅ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１９９１年，第６１巻，ｐ．３２８−３３３。
【非特許文献４】Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｄｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅｓ．  Ｎ．Ｓ．，１９９５年，第３１０巻，ｐ．１７７−１８２。
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ，２０００年，第４０５巻，ｐ．４２１−４２４。
【非特許文献６】Ｄｉｆｆｅｒｅｔｉａｔｉｏｎ，１９８２年，第２３巻，ｐ．１６４−１６９。
【非特許文献７】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７年，第１７巻，ｐ．１５５２−１５６１。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、糖尿病の診断に有用な新規の因子を見出すことであり、これを用いた臨床的に有用な糖尿病診断方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、血中レチノイン酸濃度を指標とすることを特徴とする糖尿病の診断方法である。
【０００９】
さらに、該レチノイン酸がオールトランスレチノイン酸であることを特徴とする糖尿病診断方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】レチノールの活性代謝物であるレチノン酸は生体内で重要な役割にもかかわらず、血中レチノン酸濃度と糖尿病の関係についてはなんらの検討もなされてこなかった。本発明者らは血中レチノイン酸濃度と糖尿病の病態に一定の関係が見られることを突き止め、血中レチノイン酸濃度の測定することを特徴とする糖尿病の診断方法を完成した。すなわち、糖尿病患者の血中のレチノイン酸濃度を測定することにより、糖尿病の進行の程度および重症度が予測でき、治療方法の選択に有用な情報を得ることができる。
糖尿病の進行の程度とＨｂＡ１ｃ濃度との相関関係はよく知られている。レチノイン酸濃度とＨｂＡ１ｃ濃度が相関することから、レチノイン酸濃度が糖尿病の進行の程度と相関することが明らかとなった。こうしてレチノイン酸濃度の測定による糖尿病の進行程度を診断する新規で有用な本発明の診断方法が完成された。
血中のレチノイン酸濃度の測定方法としては、当業者にとってはいろいろな方法が考えられる。高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、または、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法が簡便、高感度、かつ高精度であり好ましい。ガスクロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）による測定も測定サンプルの誘導体化が不可欠ではあるが、高感度かつ高精度である。また、抗原抗体反応を用いる蛍光分析も実用的である。
【００１１】
ＨＰＬＣによる血中レチノイン酸濃度の測定に際しては、測定対象となる血液を適当な方法によって前処理してから測定を行うことも可能である。前処理を行うことによって、より高感度かつ、より高精度な測定が可能となり好ましい。前処理においては、遠心分離、有機溶剤等による除蛋白、有機溶剤による抽出、酸または塩基による振分け、アミノプロピルカラムの利用等の既知の方法を任意に組み合わせることができる。
【００１２】
ＨＰＬＣに用いるカラム担体としては順相系、逆相系いずれでも用いることができるが、ＯＤＳカラム等の逆相系の方が分離が良好であり好ましい。
【００１３】
ＨＰＬＣにおける検出方法としては、既知の検出方法のいずれでもよいが、紫外線の吸収、または蛍光測定による方法が簡便かつ高感度であり好ましい。また、レチノイン酸を誘導体化することで、吸収強度、吸収波長、および蛍光強度等を変化させることで選択性および感度を向上させることもできる。
【００１４】
以下に本発明における血中レチノイン酸濃度の測定による糖尿病の診断方法について具体例により詳細に説明するが、本発明は具体例に限定されるものではない。
【００１５】
【実施例】
（１）血清の調製
積水化学インセパック（凝固促進剤（トロンビン）、血清分離剤入り）に血液約１０ｍｌを採取し、室温で１時間程度放置後４℃で３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し血清をポリプロピレンチューブに移した。そのうち１ｍｌを用いて以下に述べる抽出方法によって直ちに抽出、または−２０℃で数日保存後抽出した。
【００１６】
（２）抽出操作
以下の操作においてはサンプルを遮光条件下にて取り扱った。血清１ｍｌをアルゴンガス置換した１０ｍｌのネジキャップ付褐色試験管にとり、エタノール２ｍｌを加えボルテックス後、室温で１８００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。上清をあらかじめ１００ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．５）２ｍｌを入れアルゴンガス置換した１０ｍｌのスリ付試験管に移した。そこにｎ−ヘキサン／酢酸エチル（９／１）５ｍｌを加え、激しく振り混ぜた後室温で１８００ｒｐｍ、３分間遠心分離し、試験管をドライアイスを入れたアセトンに漬け水層を凍らせた。有機層をｎ−ヘキサン／酢酸エチル（９／１）２ｍｌでコンディショニングしたアミノプロピルカラム（ＩＳＯＬＵＴＥ  ＮＨ２、５００ｍｇ／３ｍｌ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＫ）にのせ、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（９／１）２ｍｌ、クロロホルム／２−プロパノール（２／１）２ｍｌで２回、ジエチルエーテル１ｍｌで順次洗浄した後、３％酢酸を含むジエチルエーテル２ｍｌでレチノイン酸を溶出させた。この画分をアルゴンガス気流下で濃縮、乾燥した。ここにエタノール５０μｌを加えて溶解し、ＨＰＬＣにて分析した。
【００１７】
（３）ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析は島津製作所製ＬＣ−１０ＡＳポンプに紫外線検出器（島津製作所、ＳＰＤ−１０Ａ）とインテグレータ（島津製作所、ＣＲ−８Ａ）を接続して行った。カラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ  ４Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（２５０ｘ４．６ｍｍ、５μｍ、ナカライテスク製）を室温にて用いた。
【００１８】
移動相としては、溶媒Ａ：アセトニトリル／メタノール／２％酢酸（６０／１６／２４、ｖ／ｖ／ｖ）および溶媒Ｂ：アセトニトリルを用い、グラジエント組成（溶媒Ｂの含有量）、０％（０−８分）、０−６０％（８−１４分）、６０−７０％（１４−１６分）、７０％（１６−３８分）にて、流速０．６ｍｌ／分にて溶出した。検出は３４５ｎｍにて行った。
【００１９】
（４）レチノイン酸の定量
検量線はレチノイン酸標品を血清に添加、回収して作成した。分散係数は１０％以下で良好な直線性（Ｒ２＞０．９９９）が得られた。レチノイン酸の抽出効率は８０％と推定され、定量限界（ＬＯＱ）および検出限界（ＬＯＤ）はそれぞれ、オールトランスレチノイン酸の場合：０．２７ｎｇ／ｍｌ、０．０８ｎｇ／ｍｌ、１３−シスレチノイン酸の場合：０．４４ｎｇ／ｍｌ、０．１３ｎｇ／ｍｌ、９−シスレチノイン酸の場合：０．２２ｎｇ／ｍｌ、０．０７ｎｇ／ｍｌと推定された。
【００２０】
（５）生化学的検査
血糖値：採血直後に小型血糖測定機（電極：グルテストセンサー）により測定した。
【００２１】
ＨｂＡ１ｃ、ＴＣ（総コレステロール）、ＨＤＬＣ（ＨＤＬコレステロール）、ＴＧ（トリグリセリド）、ＦＦＡ（遊離脂肪酸）の定量についてはＳＲＬ，Ｉｎｃ．に依頼した。
【００２２】
【測定例１】
健常者４名について血中レチノイン酸濃度の日内変動を３時間おきに４回測定した結果を表１に、健常者６名について血中レチノイン酸濃度の日間変動を３週間にわたって４回測定した結果を表２に示した。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
【表２】
2004163379.tif 000003
【００２５】
【測定例２】
健常者１８名、ＩＩ型糖尿病患者１３名についての血中レチノイン酸濃度の測定結果を表３、表４に示した。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
【表４】
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【００２８】
【発明の効果】表１および表２より、変動係数を比較するとレチノイン酸の血中濃度の日内および日間変動は、血中グルコース、総コレステロールおよびＨＤＬコレステロールの血中濃度と同程度に安定している。一方、トリグリセリドと遊離脂肪酸の濃度変動はレチノイン酸の濃度変動よりも大きい。すなわち、レチノイン酸の血中濃度変動は、日内および日間ともに低く抑えられており、疾病診断の指標として有用である。
【００２９】
さらに、表３より、ＩＩ型糖尿病患者の血中レチノイン酸濃度は、健常者よりも低い傾向がある。しかし、これはＩＩ型糖尿病患者群と健常者群の年齢構成の差異によることを否定できない。他の脂肪類の指標には年齢構成による差異は認められない。
【００３０】
表４より、糖尿病の指標として用いられているＨｂＡ１ｃ濃度とレチノイン酸の血中濃度には相関が認められる。すなわち、一般にＨｂＡ１ｃ濃度は糖尿病の進行程度および重症度と関係があるとされていることから、レチノイン酸濃度が糖尿病の進行程度および重症度と関連することがわかる。ここでＨｂＡ１ｃ濃度は総コレステロールと相関が認められるが年齢とは相関が認められない。
【００３１】
また、レチノイン酸の血中濃度と他の血中脂肪指標とは特に相関が認められない。
以上の結果より、血中レチノイン酸濃度は、これまでに知られていない新たな糖尿病診断の指標として有用であることが明らかとなった。