(57)【要約】【課題】細胞膜伸展刺激に対して活性化するカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質、それをコードする遺伝子、及びその利用を提供すること。【解決手段】カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質の遺伝子を新規にクローニングし、その発現によって１１７２個のアミノ酸からなる該機械受容チャネルタンパク質を取得した。本発明は更に、本発明の遺伝子（配列表の配列番号１）及びタンパク質（配列表の配列番号２）の変異体、本発明の機械受容チャネルタンパク質に特異的に結合する抗体、本発明の遺伝子をノックアウトした非ヒト動物、本発明の遺伝子を利用したカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルの機能又は発現に関連する疾病の診断方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質。
【請求項６】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、６７４番目のアラニンが該タンパク質の機械受容責任配列であり、該配列に相当する配列を有することを特徴とする請求項４又は５記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質。
【請求項７】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、６３４〜６９２番目の５９のアミノ酸配列からなるＳＴＲＥＸ配列をそのアミノ酸配列中に有することを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項９】
カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質に特異的に結合する抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項８記載の抗体。
【請求項１０】
カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質に特異的に結合する抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項８記載の抗体。
【請求項１１】
請求項４〜７のいずれか記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質を産生することができる発現系を含むＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項４〜７のいずれか記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質を発現することができる発現系を含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項４〜７のいずれか記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物。
【請求項１４】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、６７４番目のアラニンを他のアミノ酸に変換したアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入したことを特徴する請求項１３記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物。
【請求項１５】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、６３４〜６９２番目のＳＴＲＥＸ配列に相当する遺伝子配列を欠失したことを特徴する請求項１３記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物。
【請求項１６】
検体中のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードするＤＮＡ配列と配列表の配列番号１のＤＮＡ配列とを比較することを特徴とするカリウム透過性機械受容チャネルタンパク質の機能又は発現に関連する疾病の診断方法。
【請求項１７】
請求項４に記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパクをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部からなるカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルの機能又は発現に関連する疾病の診断用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
心・血管系組織は常に血液からのズリ応力、血圧による圧力や血管壁の伸展などといった機械的な刺激にさらされている。これらの刺激は心・血管系組織に様々な応答をひき起こすが、異常な機械刺激は心肥大・高血圧・動脈硬化などの病態の原因となる。これらの機械的刺激を細胞内情報に変換している機構の一つの候補として、機械受容（ｓｔｒｅｔｃｈ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ：ＳＡ）チャネルと呼ばれる細胞膜伸展で生じる膜張力により開閉が制御されるイオンチャネルがある。
【０００３】
心筋では、これまでにパッチクランプ法で同定された数種類のＳＡチャネルが報告されている。Ｃｒａｅｕｉｕｓらは、トリ培養心室筋で１２０ｐＳの非選択性のカチオンチャネルを初めて報告した（Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｒｅｐ．　８，　４０７−４１４，　１９８８）。
その後の研究によるとトリ心室筋細胞には、ガドリニウムによりブロックされる２５ｐＳから２００ｐＳまでの５種類のＳＡチャネルが見つかっている（Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２６４，　Ｈ９６０−Ｈ９７２，　１９９３）。その中には、非選択性カチオンチャネルとカリウム選択性チャネルとがある。Ｈａｎｓｅｎらは、非選択性のＳＡチャネルが不整脈発生に絡んでいるのではないかという興味深い結果を報告している（Ｃｉｒｃ．　Ｒｅｓ．　６９，　８２０−８３１，　１９９１）。
【０００４】
イヌ左室摘出標本に圧負荷をかけ心室を伸展させると、不整脈を高頻度に発生させることができる。この不整脈はＳＡチャネルのブロッカーであるガドリニウムで抑制され、カルシウムチャネルブロッカーでは抑制されないことから、非選択性ＳＡチャネルの活性化による脱分極が伸展誘発の不整脈のトリガーになっているのではないかと推定している。
近年、ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌクランプ法によるＳＡチャネルの研究が相次いで発表された。Ｈａｇｉｗａｒａらは、ウサギ単離心房筋細胞を膨張させることにより発生する時間非依存的外向き整流クロライド電流を観察している（Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．）　４５６，　２８５−３０２，　１９９２）。また、Ｓａｓａｋｉらは、モルモット単離心室筋を用い非選択性カチオンチャネルを通ると推定される巨視的電流を観察している（Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　４２，　９５７−９７０，　１９９２）。しかし、いずれの報告でも、単一チャネルとの報告が不明瞭になっている。
【０００５】
上記のとおり、トリ胚心筋細胞は５種類の機械受容（ＳＡ）チャネルを発現することが報告されている。本発明者の過去の研究によると、５種類のチャネルのうち一つはラージコンダクタンス「ＢＫ」チャネルと類似の特性を持つことがわかった（Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２７６，　Ｈ１８２７−３８，　１９９９）。該チャネルはトリ心臓ｃＤＮＡからクローニングし、ＣＨＯ−Ｋ１細胞で一過性発現させることによって、ＳＴＲＥＸ配列を含み、機械感受性であることが判明した。ＳＴＲＥＸ（Ｓｔｒｅｓｓ　ａｘｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｅｘｓｏｎ）（Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２７６，　Ｈ１８２７−３８，　１９９９）、つまりＳｌｏ変異体での新規エクソンによって定義されるシステインリッチ（ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ）な５９アミノ酸は、ストレスホルモンにより発現を制御されるが、電位、細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）及びＰＫＡ感受性を調節することが報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２８０，　５３６２，　４４３−４４６，　１９９８、Ｎａｔｕｒｅ．　４１０，　６８３１，　９３６−９，　２００１、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２７６，　１１，　７７１７−２０，　２００１、Ｍｏｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　１３，　１０，　１７２８−３７，
１９９９、Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　５３７，　Ｐｔ１，　５７−６８，　２００１）。
【０００６】
以上のように、過去１０年間で、膜伸展によって活性化すると思われる（Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｊ．　５９，　７２２−７２８，　１９９１）機械受容（ＳＡ）チャネルと呼ばれる新しいタイプのイオンチャネルが同定され、報告されている。また様々な細胞タイプがＳＡチャネルを保有する（Ｊ．　Ｍｅｍｂｒ．　Ｂｉｏｌ．　１１３，　９３−１０７，　１９９０）。
心筋細胞では、いくつかのタイプのＫ＋チャネルが機械受容性であると報告されている（Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２６４　（Ｈｅａｒｔ　Ｃｉｒｃ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　３３），　Ｈ９６０−Ｈ９７２，　１９９３、Ｃｉｒｃ．　Ｒｅｓ．　４２，　９７３−９８３，　１９９３）。このタイプのチャネルは細胞が機械的に変形する時に、活性化すると考えられている。ＳＡチャネルのこの側面は心細胞において特に興味深いものである。なぜなら、心細胞は常に周期的伸展にさらされており、時には不整脈あるいは心肥大を引き起こす機械的負担（ｏｖｅｒｌｏａｄ）を受けているからである。
このように、細胞膜伸展刺激に対して活性化する機械受容チャネルに対しては、多くの研究と報告がなされているが、その機構の遺伝子レベル、及びその発現するタンパク質レベルでの研究は、まだ進展していない。
【０００７】
【非特許文献１】
Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２７６，（Ｈｅａｒｔ　Ｃｉｒｃ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　４５）Ｈ１８２７−Ｈ１８３８，　１９９９
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、細胞膜伸展刺激に対して活性化するカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質、それをコードする遺伝子、及びその利用を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
心筋には、複数の機械受容チャネルが存在することが報告されている。本発明者は、カリウム透過性機械受容チャネルの構造と機械刺激依存性との関連の解析を進める中で、新たにトリ胚心臓から、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質の遺伝子をクローニングし、そのタンパク質の発現に成功し、本発明を完成した。すなわち、本発明者は、心筋細胞膜上に存在する機械受容チャネルのうち、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質の遺伝子を新規にクローニングし、その発現によって１１７２個のアミノ酸からなる該機械受容チャネルタンパク質を取得した。該機械受容チャネルタンパク質は、５９個のシステインリッチＳＴＲＥＸ（Ｓｔｒｅｓｓ　ａｘｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｅｘｓｏｎ）配列を有する。
【００１０】
更に、該チャネルの機械刺激感受性機能の発現を確認すると共に、該チャネルの機械刺激感受性に重要なアミノ酸配列（責任配列）も確認し、それが１１７２個のアミノ酸の６７４番目のアラニンであることも確認した。本発明の遺伝子のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１に示され、その遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示される。本発明は、更に、本発明の遺伝子（配列表の配列番号１）及びタンパク質（配列表の配列番号２）の変異体、本発明の機械受容チャネルタンパク質に特異的に結合する抗体、本発明の遺伝子をノックアウトした非ヒト動物、本発明の遺伝子を利用したカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルの機能又は発現に関連する疾病の診断方法を提供する。
【００１１】
すなわち本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡ（請求項１）や、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ、すなわち、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質（請求項２）や、請求項１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項３）からなる。
【００１２】
また本発明は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質（請求項４）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質（請求項５）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、６７４番目のアラニンが該タンパク質の機械受容責任配列であり、該配列に相当する配列を有することを特徴とする請求項４又は５記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質（請求項６）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、６３４〜６９２番目の５９のアミノ酸配列からなるＳＴＲＥＸ配列をそのアミノ酸配列中に有することを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質（請求項７）や、請求項４〜７のいずれか記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質に特異的に結合する抗体（請求項８）や、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質に特異的に結合する抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項８記載の抗体（請求項９）や、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質に特異的に結合する抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項８記載の抗体（請求項１０）からなる。
【００１３】
さらに本発明は、請求項４〜７のいずれか記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質を産生することができる発現系を含むＤＮＡ（請求項１１）や、請求項４〜７のいずれか記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質を発現することができる発現系を含む宿主細胞（請求項１２）や、請求項４〜７のいずれか記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や（請求項１３）、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、６７４番目のアラニンを他のアミノ酸に変換したアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入したことを特徴する請求項１３記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物（請求項１４）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、６３４〜６９２番目のＳＴＲＥＸ配列に相当する遺伝子配列を欠失したことを特徴する請求項１３記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物（請求項１５）や、検体中のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードするＤＮＡ配列と配列表の配列番号１のＤＮＡ配列とを比較することを特徴とするカリウム透過性機械受容チャネルタンパク質の機能又は発現に関連する疾病の診断方法（請求項１６）や、請求項４に記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパクをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部からなるカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルの機能又は発現に関連する疾病の診断用プローブ（請求項１７）からなる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードする遺伝子からなる。該遺伝子は、配列表の配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡからなる。本発明の遺伝子を取得するには、例えば、本発明の機械受容チャネルタンパク質の遺伝子情報により、トリ胚心臓由来のｃＤＮＡライブラリーから公知の方法で取得することができる。
【００１５】
また、本発明は、次の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質、からなる変異遺伝子を含む。
該変異遺伝子を取得するには、本発明の配列表の遺伝子配列情報により、適宜公知の遺伝子工学の手法により変異させて、取得することができる。
【００１６】
更には、本発明は遺伝子ライブラリーから取得したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードするＤＮＡ、すなわち、インタクトな遺伝子の変異体を含む。該遺伝子を取得するには、例えば、配列番号１に示される塩基配列からＤＮＡプローブを作製し、該ＤＮＡプローブを用いて、ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ機械受容チャネル機能を有するものを選択して、取得することができる。該ＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。
【００１７】
本発明のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質の機能を有する変異体タンパク質を具体的に挙げることができる。これらのタンパク質は、それをコードする本発明の遺伝子を用いて遺伝子工学的に、或いは本発明のＤＮＡ配列情報に基づき、その配列を組換えて公知の方法により調製することができる。本発明で取得した配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、６３４〜６９２番目の５９のシステインリッチのアミノ酸配列からなるＳＴＲＥＸ配列をそのアミノ酸配列中に有し、そして配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、６７４番目がアラニンからなる該タンパク質の機械受容責任配列を有する。
【００１８】
本発明は、本発明のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。該本発明の抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質に結合する抗体は、例えば、該タンパク質の発現、変異又は欠失に起因する疾病の診断や該タンパク質の分子機構を解明する上で有用である。
【００１９】
本発明のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質は、本発明の遺伝子を、該タンパク質を産生することができる発現系、該発現系を含む宿主細胞を用いて発現させ、取得することができる。該発現系及び宿主細胞細胞としては、遺伝子工学の分野で用いられている公知の発現系及び宿主細胞を用いることができる。また、該遺伝子を用いた本発明タンパク質の製造に際して用いられる遺伝子の導入方法及び生成したタンパク質の精製方法としては、いずれもこの分野で公知の方法を用いることができる。
【００２０】
本発明は、遺伝子を変異させて、細胞におけるカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質の発現を変異させ、該カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネル機能が欠損した非ヒト動物の作製を含む。該非ヒト動物の作製は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、６７４番目のアラニンを他のアミノ酸に変換したアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入することにより、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードする遺伝子機能を欠損させ、行うことができる。また、動物遺伝子の、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、６３４〜６９２番目のＳＴＲＥＸ配列に相当する部分を欠失させ、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネル機能の欠失したした非ヒト動物を作製することができる。本発明における非ヒト動物としては、トリ、ウサギ、マウス、ラット等の非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本発明のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネル機能が欠損した非ヒト動物の作製に際して、遺伝子を導入する方法としては、ターゲティングベクターの構築等公知の適宜の方法を用いることができる。
【００２１】
本発明は、検体中のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードするＤＮＡ配列と配列表の配列番号１のＤＮＡ配列とを比較することによって、カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質の機能又は発現に関連する疾病を診断する方法を含む。また、請求項４に記載のカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部をプローブとして用いて、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルの機能又は発現に関連する疾病の診断を行うことができる。これらのプローブは、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルの機能又は発現に関連する疾病の診断用のキットとして製品化することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（細胞培養）
受精１２日目トリ培養心筋細胞をコラゲナーゼ処理にて分散し、３５ｍｍ培養ディッシュに３０分おき、接着した繊維芽細胞を残し、未接着の浮遊心筋細胞を回収して、抗生剤及び１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中で培養した。
【００２３】
実施例２（クローニング）
トリ胚心臓ｃＤＮＡライブラリのＢＫチャネルに対して縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーを用いてチャネルをクローニングした。クローニング方法は、次のように行った。ヒト脳由来ＢＫチャネルのＳ７からＳ９までを縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）配列プライマーとして設計し、ＰＣＲによる増幅を行った。単一バンドは、ＢＫチャネルと相同性のあるペプチド配列をコードしていた。ＰＣＲ産物をプローブとして、１０〜２０日目のトリ胚心臓由来のｃＤＮＡライブラリーを用いたプラークハイブリダイゼーションを行い、ｃＤＮＡライブラリーより単一クローンを同定した。なお、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーは、センスプライマーとして、５’−　ｇａｇｃｔｃａａｇｃｔｇｇｇｔｔｔｃａｔａｇｃｔ　−３’（配列表の配列番号３、アミノ酸配列ＥＬＫＬＧＦＩＡ：配列番号４に対応）、及び、アンチセンスプライマーとして、５’−　ｃａｔｃａｃｔａａａｔｔｔｃｔｔａａｔｃｃａａｔ　−３’（配列番号５、アミノ酸配列ＩＧＬＲＮＬＶＭ：配列番号６に対応）を用いた。
【００２４】
その結果、トリ胚心臓ｃＤＮＡライブラリーより、約１０８プラークがスクリーニングされた。１個の陽性プラークには、４ｋｂｐのインサートｃＤＮＡが含まれており、Ｅｃｏ　ＲＩで消化したＤＮＡ断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に組込んでサブクローニングを行うことにより、トリｓｌｏに類似のクローンを得、ＳＡＫｃａチャネルとした（配列番号１）。また、そのアミノ酸配列を配列番号２に示した。配列上における主な違いは、クローニングしたチャネルは、サイトＩでのＳＴＲＥＸ配列（ＳＡＫｃａチャネルｃＤＮＡ配列の１９００〜２０７６番目：配列番号７）を含んでいたことである（図１Ａ）。ＣＨＯ−Ｋ１細胞において発現させ、抗ＢＫ抗体及び抗ＳＴＲＥＸ抗体によって１４０ｋＤａでの単一バンドを検出した（図１Ｂ）。なお、抗ＳＴＲＥＸ抗体として、ＳＡＫｃａチャネルＳＴＲＥＸ部位ペプチド配列（ＳＡＫｃａチャネルアミノ酸配列の６３４〜６９２番目：配列番号８）中のペプチド配列（ＳＡＫｃａチャネルアミノ酸配列の６６０〜６８５番目：ＭＳＧＳＶＨＳＮＭＤＴＬＥＲＡＦＰＬＳＳＶＳＶＮＤＣ：配列番号９）の合成を行った後、ウサギに免疫し、アフィニティーカラム（Ｂｉｏｇａｔｅ，　Ｉｎｃ．，　Ｇｉｆｕ，　Ｊａｐａｎ）を用いてアフィニティー精製を行うことにより得られたものを用いた。
【００２５】
実施例３（パッチクランプ法による電気生理学的解析）
パッチクランプ法は、Ａｘｏｐａｔｃｈ　２００Ａ　ａｍｐｌｉｆｉｅｒ（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、インサイドアウト及びセルアタッチにて行った。電流は、５ｋＨｚ下でｌｏｗ−ｐａｓｓフィルター処理をし、１０ｋＨｚ下でサンプリングを行った。また、２０〜２２℃下で記録を行った。データ処理及び解析は、Ｄｉｇｉｄａｔａ及びＡｘｏｃｌａｍｐ　ｖｅｒ．　８．を用いて行った。ピペットの抵抗は、０．５〜１Ｍ　ｏｈｍであった。単一チャネル用の内部ピペット溶液の組成は、１４５ｍＭ　ＫＣｌ、５ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）であり、外液の組成は、１４５ｍＭ　ＫＣｌ、５ｍＭ　ＮａＣｌ、１１８μＭ　ＣａＣｌ２、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）である。この条件下で、［Ｃａ２＋］ｉを０付近にし、Ｃａ２＋透過性ＳＡチャネルを介した［Ｃａ２＋］ｉの上昇をわずかなものにした。ＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ−Ｋ１細胞に、ｐＴａｒｇｅｔベクター及びｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）に組込んだＳＡＫｃａプラスミド１μｇを、Ｅｆｆｅｃｔｉｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてトランスフェクションを行った。ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）が発現している細胞をパッチクランプ実験用として選択した。
【００２６】
（データ解析）
データ解析は前述のソフトウェアを用いて行った（Ｗｒｉｇｈｔ，　Ｋｌｉｎｅ　＆　Ｎｏｗａｋ，　１９９１）。チャネル開口の許容限界値を単一チャネル電流（ｕｎｉｔ　ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｎｎｅｌ　ｃｕｒｒｅｎｔ）の５０％に設置した。平均開口時間はイベントリストから構築した開口時間ヒストグラムから算出した。バースト（Ｂｕｒｓｔ）解析は閉口時間の長短の区別が明確な記録についてのみ行った。バーストの定義はＣｏｌｑｕｈｏｕｎ及びＳａｋｍａｎｎ（Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．　３６９，　５０１−５５７，　１９８５）による。開口、閉口及びバースト（Ｂｕｒｓｔ）時間のデータは最尤法で合わせた。大半の実験は単一ＭａｘｉＫチャネル１つを含むパッチ上で行った。いくつかのチャネルを含むパッチは、開口率（Ｐｏ）及び平均開口時間解析時のみに用いた。Ｅｘｃｅｌ統計パッケージをｔ検定用に用いた。ボルツマン関数構造フィッティング（Ｂｏｌｔｓｍａｎｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ　ｆｉｔｔｉｎｇ）をＯｒｉｇｉｎ（ＭｉｃｒｏＣａｌ社製，　Ａｎｄｏｖｅｒ，　ＭＡ）で行った。データは平均値±ＳＥＭで表示し、Ｐ＜０．０５の場合に有意差と見なした。
【００２７】
その結果、パッチピペット内の負の圧力によって単一チャネル活性（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｎｎｅｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）が活性化することが明らかになった（図１Ｃ及び１Ｄ）。パッチピペット内の負の圧力を−４０ｍｍＨｇとした時、チャネル活性が上昇し、いくつかのレベルでの開口が観察された（図１　Ｃ、中央）。膜吸引をやめると、チャネル活性は減少した（図１Ｃ、下）。
【００２８】
ｓｌｏはＢＫチャネルをコードすることが明らかな唯一の遺伝子であり、選択的スプライシングは電位依存やＣａ２＋感受性などの現在のＢＫ機能の多様性のメカニズムとなっている。ＢＫチャネルのいくつかが機械感受性であることを示す様々な論文があるが、どの論文においても分子レベルでの配列とＢＫチャネルの機械感受性との関係についは説明していなかった。そのうえ、ＢＫチャネルが機械受容性であると主張する論文においても、メカニズムの大部分はＣａ２＋透過性ＳＡチャネルが膜伸展によって活性化し、ＳＡチャネルを介して上昇した［Ｃａ２＋］ｉがＢＫチャネルを活性化するというものである（Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２５７，　Ｆ３４７−Ｆ４５２，　１９８９、Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｓｃａｎｄ．　１７０，　２，　９９−１０９，　２０００、Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｒｅｎａｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２８０，　７８６−９３，　２００１）。ＳＡＫｃａと他トリＢＫとの主な違いがＳＴＲＥＸ配列であることから、ＳＴＲＥＸ配列の機能を解析することは当然である。ＳＴＲＥＸ変異体の存在はトリ蝸牛で報告されていたが、電気生理学などの機能解析的実験はされていなかった（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｎ　１９，　１０６１−１０７５，　１９９７）。例えば、ＳＲＫＲ変異体などの別のトリｓｌｏ変異体の特徴と、Ｃａ感受性については解析されているが、機械感受性については明らかにされていなかった（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｎ　１９，　１０６１−１０７５，　１９９７）。
【００２９】
実施例４（ＳＡＫｃａ変異体）
ＳＡＫｃａと他トリＢＫとの主な違いがＳＴＲＥＸ配列であることから、ＳＴＲＥＸ配列の機能を解析することは当然である。ＳＴＲＥＸ変異体の存在はトリ蝸牛で報告されていたが、電気生理学などの実験はされていなかった（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｎ　１９，　１０６１−１０７５，　１９９７）。例えば、ＳＲＫＲ変異体などの別のトリｓｌｏ変異体の特徴と、Ｃａ感受性については解析されているが、機械感受性については明らかにされていなかった（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｎ　１９，　１０６１−１０７５，　１９９７）。従って、本発明者らはＳＴＲＥＸ配列が機械感受性の要因となりうると仮定し、次に本発明者らはＳＡＫｃａからＳＴＲＥＸ配列を欠損させて変異体を作製し（ＳＡＫｃａ−ＤＥＬ：図２Ａ）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞へ一過性発現させた。ＳＡＫｃａ−ＤＥＬ単一チャネル電流をオンセルパッチで測定したところ、チャネル活性はテスト範囲内においてパッチ膜変形に対応して増加せず、ＳＴＲＥＸ配列が機械感受性において重要であることが示唆された（図２Ｂ及びＣ）。
【００３０】
実施例５（様々な動物種におけるＳＴＲＥＸ配列と機械感受性）
様々な動物種のＳＴＲＥＸの性質をさらに検討するために、本発明者らはＣＨＯ−Ｋ１細胞においてマウスおよびラットのｓｌｏ−ＳＴＲＥＸ変異体（マウスｓｌｏはＤｒ．　Ｇｅｎｅｔｚｋｙより供与。ウサギｓｌｏ−１及び−２は、Ｄｒ．　Ｓｈａｏ　Ｘｉｏｎｇ及びＤｒ．　Ｇｕｇｇｉｎｏより供与。ラットｓｌｏ及びラットｓｌｏ−ＳＴＲＥＸは、ラット脳ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得した。）を発現させた。その結果、これらの種の変異体が機械感受性ではないことを確認した（図３）。したがって、本発明者らは機械感受性において、トリＳＴＲＥＸ配列が極めて重要であると考えられた。図３Ａは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に一過性発現した様々なＳＴＲＥＸ変異体の機械感受性を示す。ＳＡＫｃａチャネルのみが機械感受性を示しているのに対し、マウス、ラット及びウサギのＳＴＲＥＸ配列は全く機械感受性を示さなかった。これらの理由として、ＢＫチャネルの機械感受性はトリと他種間との配列の違いに起因すると考えられた。さらに、上記種の配列を比較したところ、Ｃｈａｕ−Ｆａｓｓｍａｎが予測したようにアラニンをスレオニンに置換するとかなりの範囲にわたって二次構造が変化することから、本発明者らはＬＥＲＡ配列（ＳＡＫｃａのアミノ酸残基６７１〜６７４番目：配列表１０）が重要であることを明らかにした（図３Ｂ）。さらに、本発明者らは、ＳＡＫｃａＡ６７４Ｔ変異体（６７４番目のアラニンをスレオニンに置換）を作製し、ＣＨＯ細胞で発現した。図３Ｄに示したように、該変異体は、テスト範囲内では機械感受性を示さなかった。
【００３１】
実施例６（ヒトにおけるＳＴＲＥＸ配列）
ヒトＢＫチャネルにおけるＳＴＲＥＸ配列の存在を調べるために、ヒトゲノムにおけるＳＡＫｃａでのＳＴＲＥＸ配列を、検索サイト（ＢＬＡＳＴ：ｅＥｎｓｅｍｂｌｅ社製、Ｈｕｍａｎ　ＢＬＡＳＴＶｉｅｗ）を用いてホモロジー検索を行った。その結果、ＫＣＮＭＡ１において同様の配列、ヒトｓｌｏホモログ（ＡＣ０２４９４９．５．１２８８０２．１７７５４０）を同定した。ヒトＳＴＲＥＸ配列はＳＡＫｃａ、特にＬＥＲＡ配列と極めて相同性が高く（図４Ａ）、機械感受性の要因であるとするのは難しいが、ＳＴＲＥＸ配列を持つヒトＢＫチャネルが膜伸展によって活性化しうると考えられた。本発明者らはヒト心臓組織（ｈｕｍａｎ　ＨｅａｒｔＭａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）からＳＴＲＥＸ変異体を含む３種類のＢＫ変異体を同定した（図４Ｂ）。ＳＴＲＥＸを持つＫＣＮＭＡ１をＣＨＯ−Ｋ１細胞で一過性発現させたところ、ＳＴＲＥＸを持つヒトＢＫだけが機械感受性であったのに対し、ＳＴＲＥＸを持たないＢＫ及び他変異体には機械感受性は認められなかった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明では、心筋細胞膜上に存在する機械受容チャネルのうち、カルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルタンパク質の遺伝子を新規にクローニングし、その発現によって１１７２個のアミノ酸からなる該機械受容チャネルタンパク質を取得し、提供した。本発明は、更に、本発明の遺伝子（配列表の配列番号１）及びタンパク質（配列表の配列番号２）の変異体、本発明の機械受容チャネルタンパク質に特異的に結合する抗体、本発明の遺伝子をノックアウトした非ヒト動物、本発明の遺伝子を利用したカルシウム依存性カリウム透過性機械受容チャネルの機能又は発現に関連する疾病の診断方法を提供する。
心筋における機械感受性チャネルは不整脈発生機序に密接に関与しているとされ、本発明による該遺伝子、機械受容チャネルタンパク質、更には抗体、非ヒト動物、及び診断方法の提供は、臨床に直結する不整脈・心不全・高血圧の予防・診断更には治療薬開発に高い貢献が期待できる。
【００３３】
【配列表】
2004097060.tif 000002
2004097060.tif 000003
2004097060.tif 000004
2004097060.tif 000005
2004097060.tif 000006
2004097060.tif 000007
2004097060.tif 000008
2004097060.tif 000009
2004097060.tif 000010
2004097060.tif 000011
2004097060.tif 000012
2004097060.tif 000013
2004097060.tif 000014
2004097060.tif 000015
2004097060.tif 000016
2004097060.tif 000017
2004097060.tif 000018
2004097060.tif 000019
2004097060.tif 000020
2004097060.tif 000021
2004097060.tif 000022
2004097060.tif 000023
2004097060.tif 000024
2004097060.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＡＫｃａのアミノ酸配列及び発現解析を示す図である。なお、Ａは、トリ心臓由来のＳＡＫｃａチャネルの推定アミノ酸配列で、枠内はＳＴＲＥＸ配列を示す。Ｂは、抗ＢＫ抗体（上段）、及び抗ＳＴＲＥＸ　Ａｂ抗体（下段）を用いてウエスタンブロット法により解析した、ＳＡＫｃａの発現解析を示した図で、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にＳＡＫｃを一過性発現させたもの（右側）、及びベクターを導入したもの（左側：対照）を示す。Ｃは、伸展反応時に対するＳＡＫｃａの選択的単一チャネル電流を示し、Ｄは、１０ｍＶ下における、膜張力（ｍｍＨｇ）と開口率との関係を示す図である。
【図２】機械受容（ｓｔｒｅｔｃｈ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ）に重要なＳＴＲＥＸ配列の性質を示した図である。Ａは、ＳＡＫｃａ及びＳＴＲＥＸ欠損変異ＳＡＫｃａの模式図である。Ｂは、膜吸引反応におけるＳＡＫｃａ−ＤＥＬ変異（欠損変異ＳＡＫｃａ）の選択的単一チャネル電圧（Ｏｎ　ｃｅｌｌパッチ：Ｖｍ＝５０ｍＶ）を示し、Ｃは、ＳＡＫｃａ（●）、及び欠損変異ＳＡＫｃａ（ＳＡＫｃａ−ＤＥＬ変異）（○）の膜張力（ｍｍＨｇ）と開口率との関係（１０ｍＶ、ｎ＝６）を示した図である。
【図３】伸展感受性に対するＳＴＲＥＸ重要配列の性質を示した図である。Ａは、様々な種におけるＳＴＲＥＸ配列及び伸展感受性を示し、Ｂは、トリ、マウス、ラット、及びウサギＳＴＲＥＸのアミノ酸配列を比較したことを示す。Ｃは、ＳＡＫｃａＡ６７４Ｔ（●）の膜張力（ｍｍＨｇ）と開口率との関係（１０ｍＶ、ｎ＝６）を示した図である。
【図４】ＫＣＮＭＡ１（ヒトｓｌｏ）及びそのＳＴＲＥＸ変異体の性質を示した図である。Ａは、ヒト及びトリ心筋ＳＴＲＥＸのアミノ酸配列の比較した結果である。なお、下線部は相同性配列を示す。Ｂは、ヒト心筋より単離したＲＮＡを鋳型とし、プライマーセット１及び２を用いたＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した結果、すなわち、ヒト心筋において、ＳＴＲＥＸが存在することを示す図である。
【図１】
2004097060.tif 000026
【図２】
2004097060.tif 000027
【図３】
2004097060.tif 000028
【図４】
2004097060.tif 000029