(57)【要約】【課題】コルディセピンの含有量を向上させる。【解決手段】冬虫夏草用培地は、（Ａ）炭素源としてグルコース、スクロース、糖蜜、マルトースから選ばれた少なくとも１種を１〜６重量％、（Ｂ）窒素源としてペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれた少なくとも１種を１〜７重量％、（Ｃ）アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれた少なくとも１種を０．１〜０．５重量％及び／又は（Ｄ）微量のビオチン及び／若しくはビタミンＢ類を含有してなる。ビタミンＢ類が、ビタミンＢ１及び／又はビタミンＢ１２であることが好ましい。（Ａ）成分の含有量が１〜３重量％であると共に、（Ｂ）成分の含有量が４〜７重量％であることが好ましい。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）炭素源としてグルコース、スクロース、糖蜜、マルトースから選ばれた少なくとも１種を１〜６重量％、（Ｂ）窒素源としてペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれた少なくとも１種を１〜７重量％、（Ｃ）アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれた少なくとも１種を０．１〜０．５重量％それぞれ含有してなる冬虫夏草用培地。
【請求項２】
前記冬虫夏草用培地が、さらに（Ｄ）微量のビオチン及び／又はビタミンＢ類を含有する請求項１に記載の冬虫夏草用培地。
【請求項３】
（Ａ）炭素源としてグルコース、スクロース、糖蜜、マルトースから選ばれた少なくとも１種を１〜６重量％、（Ｂ）窒素源としてペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれた少なくとも１種を１〜７重量％、（Ｄ）ビオチン及び／又はビタミンＢ類を微量それぞれ含有してなる冬虫夏草用培地。
【請求項４】
前記ビタミンＢ類が、ビタミンＢ１及び／又はビタミンＢ１２である請求項２又は３に記載の冬虫夏草用培地。
【請求項５】
前記（Ａ）成分の含有量が１〜３重量％であると共に、前記（Ｂ）成分の含有量が４〜７重量％である請求項１乃至４のいずれか１項に記載の冬虫夏草用培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた抗腫瘍効果、抗菌効果、免疫増強効果及び滋養強壮効果を有する薬用茸の一種である冬虫夏草用の培地に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
冬虫夏草は、薬用茸の一種で、昆虫などを宿主とし、菌糸が増殖して宿主を死に至らしめた後、該宿主の体内で菌糸が充満すると子実体を形成するコルディセプス（ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）属の茸の一種であり、冬季には宿主の体内にあり、夏季になると宿主の虫体から穿ち出る子嚢菌に属する茸である。
冬虫夏草は、自然状態では地中または地上に菌糸または胞子として存在する菌であり、寄生する昆虫の幼虫期、蛹期及び成虫期全般にわたって体内に侵入して発生する。
冬虫夏草は、優れた抗腫瘍効果、抗菌効果、免疫増強効果及び滋養強壮効果を有するものとして知られている。冬虫夏草の有効成分はコルディセピン（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ）であり、その含有量は、子実体の乾燥体において０．０２〜０．６重量％程度である。
【０００３】
近年、冬虫夏草の菌糸体を人工的に培養する方法としていくつか提案されており、例えば、冬虫夏草の虫体菌糸又は座胞子をセミなどの節足動物の昆虫類の成虫、蛹、幼虫などに定着させて固体培養する方法、米胚を利用した培養液の製造方法などが知られている。しかしながら、成虫、蛹、幼虫などに定着させる固体培養や、米胚を利用した液体培養などの従来の培養方法では、培養方法が複雑であった。また、その収量は、たとえば、さなぎ固体培養による培養生成産物中のコルディセピン含有量は約０．１〜０．５重量％、米胚液体培養の場合は約０．０４重量％といずれも高くなかった（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特開昭６３−２０９５７９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような実情に鑑みなされたものであり、その目的は、得られる培養生成物中のコルディセピンの含有量を向上させることができる冬虫夏草用培地を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）炭素源としてグルコース、スクロース、糖蜜、マルトースから選ばれた少なくとも１種を１〜６重量％、（Ｂ）窒素源としてペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれた少なくとも１種を１〜７重量％、（Ｃ）アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれた少なくとも１種を０．１〜０．５重量％それぞれ含有してなるものである。
前記冬虫夏草用培地が、さらに（Ｄ）微量のビオチン及び／又はビタミンＢ類を含有することが好ましい。
また、本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）炭素源としてグルコース、スクロース、糖蜜、マルトースから選ばれた少なくとも１種を１〜６重量％、（Ｂ）窒素源としてペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれた少なくとも１種を１〜７重量％、（Ｄ）ビオチン及び／又はビタミンＢ類を微量それぞれ含有してなるものである。
前記ビタミンＢ類が、ビタミンＢ１及び／又はビタミンＢ１２であることが好ましい。
前記（Ａ）成分の含有量が１〜３重量％であると共に、前記（Ｂ）成分の含有量が４〜７重量％であることが好ましい。
なお、本発明において重量％とは、水１００重量部に対して、成分ｘ重量部を含有することを意味する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）グルコース、スクロース、糖蜜、マルトースから選ばれた少なくとも１種、（Ｂ）ペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれた少なくとも１種、（Ｃ）アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれた少なくとも１種及び／又は（Ｄ）ビオチン、ビタミンＢ類を含有してなるものである。
【０００８】
本発明の培地で培養される冬虫夏草としては、コルディセピンを含有するものであれば特に限定されない。例えば、コルディセプス属に属するもので、コルディセプス・ミリタリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）等の培養に好ましく用いられる。特にコルディセプス・ミリタリス（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５７、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５８）の培養に好ましく用いられる。
【０００９】
（Ａ）成分は、冬虫夏草用培地の炭素源として含有するものであり、グルコース、スクロース、糖蜜、マルトースのいずれか１種又は２種以上である。
（Ａ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は１〜６重量％であり、好ましくは１〜３重量％である。（Ａ）成分の含有量が１重量％未満、または、６重量％を超えた場合は、得られる培養生成物の培地の単位重量あたりの菌体重量が減少する傾向がある。
【００１０】
（Ｂ）成分は、冬虫夏草用培地の窒素源として含有するものであり、ペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれるいずれか１種または２種以上である。イーストまたはモルトはその抽出物を使用してもよい。ミルクとしては、粉乳、脱脂粉乳等が挙げられる。
（Ｂ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は１〜７重量％であり、好ましくは４〜７重量％である。（Ｂ）成分の含有量が１重量％未満、また、７重量％を超えた場合は、得られる培養生成物の培地の単位重量あたりの菌体重量が減少する傾向がある。
【００１１】
（Ｃ）成分は、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれるいずれか１種または２種以上である。
アスパラギン、アスパラギン酸、グリシンは、アミノ酸の１種である。アスパラギンとしてはＬ体、Ｄ体どちらも使用できるが、Ｌ体が好ましい。アスパラギン酸においても、Ｌ体、Ｄ体どちらも使用できる。Ｌ−アスパラギン（和光純薬製のもの等）を用いた場合には、低コストに製造できるので工業的に好ましい。ＤＮＡとしては、例えば、魚等から抽出したＤＮＡが使用でき、鮭精液由来のＤＮＡ等が挙げられる。
（Ｃ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は０．１〜０．５重量％である。（Ｃ）成分の含有量が０．１重量％未満の場合は、コルディセピン含有量の増加効果が少ないので好ましくない。また、（Ｃ）成分の含有量が０．５重量％を超えた場合は、菌体の成長およびコルディセピン含有量の増加効果の極限を超えるため好ましくない。
【００１２】
（Ｄ）成分は、ビタミンとして冬虫夏草用培地に含有させるものであり、ビオチン、ビタミンＢ類のいずれか１種または２種以上である。
ビオチンはビタミンの一種である。
ビタミンＢ類は、ビタミンＢであれば特に限定されず、好ましくは、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２等であり、これらは単独のものでも、または二種以上の混合物であってもよい。
（Ｄ）成分の含有量は、特に限定されないが、微量であることがよく、例えば冬虫夏草用培地１００ｍｌに対して２〜１０μｇ程度である。（Ｄ）成分の含有量が２μｇ未満の場合は、得られる培養生成物中のコルディセピン含有量の増加効果が少ないので好ましくない。また、（Ｄ）成分の含有量が１０μｇを大きく超えた場合は、菌体の成長およびコルディセピン含有量の増加効果の極限を超えるので好ましくない。
【００１３】
冬虫夏草用培地のｐＨは、２〜９であることがことが好ましく、特に好ましくは、５〜７である。ｐＨの調製は、調製が行えるならばどのようにしてもよく、例えば、塩酸や水酸化ナトリウムを使用する調製方法が挙げられる。
【００１４】
本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）〜（Ｄ）成分以外はほとんど水であるが、この水としては、特に限定されず、水道水、井戸水、蒸留水等が挙げられる。
このように、本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）成分、（Ｂ）成分、（Ｃ）成分及び／又は（Ｄ）成分を含有してなることにより、得られる培養生成物中のコルディセピンの含有量を向上させることができる。さらに、（Ａ）〜（Ｄ）成分、水以外にも、コルディセピンの含有量を向上させるために他の成分を含有させてもよい。
他の成分としては、例えば（Ｂ）成分以外の窒素源としてはおから、それ以外には例えばマグネシウム、カルシウム等のミネラルが挙げられる。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例及び参考例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれになんら限定されるものではない。
下記実施例及び参考例の各培地を本培養培地として用い、以下のようにして得られる生成物の菌体重量および総コルディセピン量を求めた。
【００１６】
（使用菌株）
菌株としては、コルディセプス・ミリタリス（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５７）を、保存菌株用培地（スラント培地：ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン  ２μｇ、寒天３ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）で保存したものを用いた。この菌株を、種菌培養として下記前々培養および前培養した後、後述の各実施例及び各参考例の培地を用いて本培養した。
【００１７】
（前々培養）
平板寒天培地（ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン２μｇ、寒天３ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）をシャーレに２０ｍｌ充填した。このシャーレ培地に、前記保存した菌株を約１５ｍｍ＊１５ｍｍ切り出して接種し、これを２１℃下２週間培養した。
【００１８】
（前培養）
液体培地（ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン２μｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに分注し、１２１℃下２０分間滅菌処理した。処理後、液温度が室温まで下がったとき、この液体培地に、前々培養したシャーレ培地から切り出した約１ｃｍ角のコロニ−三つを接種した。これを回転振盪機を用いて８０ｒｐｍで、２１℃下１０日間培養し、分生子の発生を顕微鏡で確認後、本培養に使用した。
【００１９】
（本培養）
下記実施例及び参考例の各培地１００ｍｌをそれぞれ５００ｍｌ三角フラスコに分注し、１２１℃下２０分間滅菌処理した。なお、各例毎に（１種につき）それぞれ３つ同じ実験を行った。処理後、それぞれ液温度が室温まで下がったとき、この液体培地に、前培養した培地から採取した約１ｍｌを接種し、静置して本培養を行った。
【００２０】
（培養生成物中の総コルディセピン量の測定）
本培養後、各培養液１００ｍｌをろ紙（５Ｂ：アドバンテック東洋社製）を用いてろ過した。得られた菌体を５日間凍結乾燥した後、精密天秤で測定しその重量（以下、菌体重量とする）を測定した。
また、ろ過した培養液を凍結乾燥し、その重量（以下、培養液乾燥重量とする）を測定した。
【００２１】
凍結乾燥した菌体１ｇを水（蒸留水）を用いて１０分間超音波（サンフレックス、ＤＧ−１、５０Ｗ、４３ＫＨｚ）処理した。この処理液をろ紙（５Ｂ：アドバンテック東洋社製）を用いてろ過してコルディセピン含有量分析用試料とした。
この試料を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ（ＬＣ−１０：株式会社島津製作所製））を用いて分析し、コルディセピンの含有量を測定した（以下、菌体コルディセピン含有量とする）。
【００２２】
ＨＰＬＣの条件は、カラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（ＯＤＳ）  ２５０Ｌ＊４．６φｍｍ（ジーエルサイエンス株式会社製）を用い、移動相は５０ｍＭリン酸カリウム：アセトニトリル（Ｖ／Ｖ＝９５：５）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出波長２６０ｎｍで行った。
前記ろ過培養液の凍結乾燥物についても、同様にしてコルディセピン含有量を測定した（以下、培養液コルディセピン含有量とする）。
【００２３】
これらの値から、次式に基づいて総コルディセピン量を求めた。
（総コルディセピン量）＝（菌体コルディセピン量＊菌体重量）／（菌体重量＋培養液乾燥重量）＋（培養液コルディセピン量＊培養液乾燥重量）／（菌体重量＋培養液乾燥重量）
上記の測定は、前述のように培地１種につき三連で実験して得られた培養物のそれぞれについて行い、３つの値の平均値をその培地における値とした。
【００２４】
〔実施例１〜４〕
下記表１に示した実施例１〜４の各種炭素源３ｇ、窒素源としてペプトン１ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン  ２μｇ、蒸留水１００ｍｌからなり、ｐＨ６．８の液体培地をそれぞれ作成した。これら作成した培地を前記の本培養の培地として用いて、それぞれ菌体重量および総コルディセピン量を求めた。その結果を表１に示した。なお、本培養は、２１℃下暗所にて５０日間行った。
【００２５】
【表１】
2004242506.tif 000002
【００２６】
表１に示した結果から、本発明の炭素源としてグルコース、スクロース、マルトース、糖蜜を用いた実施例１〜４の場合、いずれも得られた培養生成物中のコルディセピン量が従来と比較して顕著に増加した。
【００２７】
〔実施例５〜１０〕
下記表２に示した実施例５〜１０の６つの含有量の炭素源としてグルコース、窒素源としてペプトン１ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン  ２μｇ、蒸留水１００ｍｌからなり、ｐＨ６．８の液体培地をそれぞれ作成した。これら作成した培地を前記の本培養の培地として用いて、それぞれ菌体重量および総コルディセピン量を求めた。その結果を表２に示した。なお、本培養は、２１℃下暗所にて５０日間行った。
【００２８】
【表２】
2004242506.tif 000003
【００２９】
表２に示した結果から、本発明のグルコースの含有量が１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇの実施例５〜８の場合、いずれも得られた培養物中のコルディセピン量が従来と比較して顕著に増加した。
【００３０】
〔実施例１１〜１４〕
下記表３に示した実施例１１〜１４の各種窒素源１ｇ、炭素源としてグルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン  ２μｇ、蒸留水１００ｍｌからなり、ｐＨ６．８の液体培地をそれぞれ作成した。これら作成した培地を前記の本培養の培地として用いて、それぞれ菌体重量および総コルディセピン量を求めた。その結果を表３に示した。なお、本培養は、２１℃下暗所にて３０日間行った。
【００３１】
【表３】
2004242506.tif 000004
【００３２】
表３に示した結果から、本発明の窒素源としてペプトン、イースト、モルト、脱脂粉乳を用いた実施例１１〜１４の場合、いずれも得られた培養生成物中のコルディセピン量が従来と比較して顕著に増加した。
【００３３】
〔実施例１５〜１９〕
炭素源としてグルコース３ｇ、窒素源として下記表４に示した実施例１５〜１９のそれぞれの含有量のペプトン、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン  ２μｇ、蒸留水１００ｍｌからなり、ｐＨ６．８の液体培地をそれぞれ作成した。これら作成した培地を前記の本培養の培地として用いて、それぞれ菌体重量および総コルディセピン量を求めた。その結果を表４に示した。なお、本培養は、２１℃下暗所にて３０日間行った。
【００３４】
【表４】
2004242506.tif 000005
【００３５】
表４に示した結果から、本発明のペプトンの含有量が３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇとした実施例１５〜１９の場合、いずれも得られた培養物中のコルディセピン量が従来と比較して顕著に増加した。
【００３６】
〔参考例１〜１４〕
下記表５に示した参考例１〜１３の各種アミノ酸又はＤＮＡ（鮭由来）０．１ｇ及び参考例１４のアミノ酸又はＤＮＡ無添加、グルコース３ｇ、蒸留水１００ｍｌを用いて培地を作成した。これら作成した培地を前記の本培養の培地として用いて、それぞれ菌体重量および総コルディセピン量を求めた。各培地を使用した場合の評価は、アミノ酸又はＤＮＡ無添加のコントロール（参考例１４）における総コルディセピン量を１として比を求めることにより行った。その結果を表５に示した。なお、本培養は、２１℃下暗所にて３０日間行った。
【００３７】
【表５】
2004242506.tif 000006
【００３８】
表５に示した結果から、総コルディセピン量はＤＮＡ、ＤＬ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン、ＤＬ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン酸及びグリシンを添加した場合が顕著に多く、特にＤＮＡが最も多かった。
【００３９】
〔実施例２０〜２２、参考例１５〕
下記表６に示した実施例２０〜２２の各種ビタミン類２μｇ及び参考例１５のビタミン類無添加、炭素源としてグルコース３ｇ、窒素源としてペプトン１ｇ、蒸留水１００ｍｌからなり、ｐＨ６．８の液体培地をそれぞれ作成した。これら作成した培地を前記の本培養の培地として用いて、それぞれ菌体重量および総コルディセピン量を求めた。各培地を使用した場合の評価は、ビタミン類無添加のコントロール（参考例１５）における総コルディセピン量を１として比を求めることにより行った。その結果を表６に示した。なお、本培養は、２１℃下暗所にて３０日間行った。
【００４０】
【表６】
2004242506.tif 000007
【００４１】
表６に示した結果から、本発明のビタミン類としてビタミンＢ１２、ビタミンＢ１、ビオチンを用いた実施例２０〜２２の場合、いずれも得られた培養生成物中のコルディセピン量が増大した。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の培地を使用して冬虫夏草を培養することにより、得られる培養生成物中のコルディセピンの含有量を、従来の培地を使用した場合よりも顕著に向上させることができる。