(57)【要約】【課題】トランスグルタミナーゼを高効率で生産し得る菌株、及び該菌株を用いたトランスグルタミナーゼの生産方法を提供する。【解決手段】ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターをストレプトマイセス・モバラエンシスに外来的に導入して形質転換体を得る。この形質転換体を培養してトランスグルタミナーゼを生産する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターが外来的に導入された形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシス。
【請求項２】
前記プロモーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのプロモーターである、請求項１に記載の形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシス。
【請求項３】
前記ターミネーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのターミネーターである、請求項１又は２に記載の形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシス。
【請求項４】
前記構造遺伝子が配列番号１の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシス。
【請求項５】
外来的に導入した配列番号２の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有するＤＮＡ断片を保有する、形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシス。
【請求項６】
ストレプトマイセス・モバラエンシスＳ−８１１２又はその変異株の形質転換体である、請求項１〜５のいずれかに記載の形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシス。
【請求項７】
ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターが外来的に導入された形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシスを、前記構造遺伝子を発現可能な条件で培養する工程、及び
産生されたトランスグルタミナーゼを回収する工程、
を含んでなるトランスグルタミナーゼの生産方法。
【請求項８】
前記プロモーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのプロモーターである、請求項７に記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
【請求項９】
前記ターミネーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのターミネーターである、請求項７又は８に記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
【請求項１０】
前記構造遺伝子が配列番号１の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する、請求項７〜９のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
【請求項１１】
前記形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシスが、外来的に導入された配列番号２の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有するＤＮＡ断片を保有する、請求項７〜９のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
【請求項１２】
前記形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシスが、ストレプトマイセス・モバラエンシスＳ−８１１２又はその変異株の形質転換体である、請求項７〜１１のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
【請求項１３】
ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターが外来的に導入された形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス。
【請求項１４】
前記プロモーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのプロモーターである、請求項１３に記載の形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス。
【請求項１５】
前記ターミネーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのターミネーターである、請求項１３又は１４に記載の形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス。
【請求項１６】
前記構造遺伝子が配列番号１の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する、請求項１３〜１５のいずれかに記載の形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス。
【請求項１７】
外来的に導入された配列番号２の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有するＤＮＡ断片を保有する、形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス。
【請求項１８】
ストレプトマイセス・リビダンス３１３１又はその変異株の形質転換体である、請求項１３〜１７のいずれかに記載の形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス。
【請求項１９】
ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターが外来的に導入された形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ）を、前記構造遺伝子を発現可能な条件で培養する工程、及び
産生されたトランスグルタミナーゼを回収する工程、
を含んでなるトランスグルタミナーゼの生産方法。
【請求項２０】
前記プロモーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのプロモーターである、請求項１９に記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
【請求項２１】
前記ターミネーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのターミネーターである、請求項１９又は２０に記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
【請求項２２】
前記構造遺伝子が配列番号１の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する、請求項１９〜２１のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
【請求項２３】
前記形質転換体ストレプトマイセス・リビダンスが、外来的に導入された配列番号２の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有するＤＮＡ断片を保有する、請求項１９〜２１のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
【請求項２４】
前記形質転換体ストレプトマイセス・リビダンスが、ストレプトマイセス・リビダンス３１３１又はその変異株の形質転換体である、請求項１９〜２３のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は放線菌由来のトランスグルタミナーゼを生産する菌株、及び該菌株を利用したトランスグルタミナーゼの生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トランスグルタミナーゼはペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒する酵素であり、特にタンパク質中のリジン残基のε−アミノ基とタンパク質分子内及び分子間にε−（γ−Ｇｌｎ）−Ｌｙｓ架橋結合を形成する。この性質を利用して当該酵素は食品分野、医薬分野等においてタンパク質の加工に広く用いられている。
【０００３】
古くからトランスグルタミナーゼは動物由来のものが知られていた。例えばモルモットの肝臓や哺乳動物の臓器、血液に広く分布していることが報告されており（Ｃｏｎｎｅｌｌａｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４６巻４号，１０９３−１０９８（１９７１）、Ｆｏｌｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　３８巻，１０９−１９１（１９７３）、Ｆｏｌｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｙｓｔｒｙ　３１巻，１−１３３（１９７７））、その酵素の特徴についても研究されている。一方、放線菌からは上記動物由来のトランスグルタミナーゼとは性質が異なる、カルシウム（Ｃａ２＋）非依存性のトランスグルタミナーゼが発見されている。具体的にはストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）［旧称：ストレプトベルチシリウム・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）］ＩＦＯ１３８１９（特開昭６４−２７２７１号公報）、ストレプトマイセス・グリセオカルネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｓ）［旧称：ストレプトベルチシリウム・グリセオカルネウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｍ）］ＩＦＯ１２７７６、ストレプトマイセス・シナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）［旧称：ストレプトベルチシリウム・シナモネウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）］ＩＦＯ１２８５２（特開２００１−１８６８８４号公報）等からトランスグルタミナーゼが単離、同定されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来トランスグルタミナーゼは自然界に存在する動物、菌類等から抽出、分離等を経て製造されていたため、供給量、供給費用等の点で改善すべき点が多くあった。一方、微生物由来のトランスグルタミナーゼについては遺伝子組換え操作を利用した生産方法の研究が精力的に行われている。しかしながら、遺伝子組換え操作を利用した最初の報告　（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，８２−８７（１９９４）、特開平５−１９９８８３号公報）によればその生産量は０．１ｍｇ／ｌ程度であって工業的生産レベルには程遠いものであった。また、最近の報告（特開２００１−１８６８８４号公報）によればある程度は生産レベルが向上しているものの、２週間の微生物培養によって４０〜５０ｍｇ／ｌ程度の生産性しか示さず、十分な生産性とは言い難い。
本発明は以上の背景に鑑みなされたものであって、トランスグルタミナーゼを高効率で生産し得る菌株、及び該菌株を用いたトランスグルタミナーゼの生産方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。即ち、放線菌由来のトランスグルタミナーゼを発現させる場合において、トランスグルタミナーゼ構造遺伝子、プロモーター、ベクター、及び宿主放線菌の組合せを検討した。その結果、トランスグルタミナーゼの生産性の極めて高い形質転換体を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は次の構成を提供する。
［１］　ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターが外来的に導入された形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシス。
［２］　前記プロモーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのプロモーターである、［１］に記載の形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシス。
［３］　前記ターミネーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのターミネーターである、［１］又は［２］に記載の形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシス。
［４］　前記構造遺伝子が配列番号１の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシス。
［５］　外来的に導入した配列番号２の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有するＤＮＡ断片を保有する、形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシス。
［６］　ストレプトマイセス・モバラエンシスＳ−８１１２又はその変異株の形質転換体である、［１］〜［５］のいずれかに記載の形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシス。
［７］　ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターが外来的に導入された形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシスを、前記構造遺伝子を発現可能な条件で培養する工程、及び
産生されたトランスグルタミナーゼを回収する工程、
を含んでなるトランスグルタミナーゼの生産方法。
［８］　前記プロモーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのプロモーターである、［７］に記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
［９］　前記ターミネーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのターミネーターである、［７］又は［８］に記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
［１０］　前記構造遺伝子が配列番号１の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する、［７］〜［９］のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
［１１］　前記形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシスが、外来的に導入された配列番号２の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有するＤＮＡ断片を保有する、［７］〜［９］のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
［１２］　前記形質転換体ストレプトマイセス・モバラエンシスが、ストレプトマイセス・モバラエンシスＳ−８１１２又はその変異株の形質転換体である、［７］〜［１１］のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
［１３］　ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターが外来的に導入された形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス。
［１４］　前記プロモーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのプロモーターである、［１３］に記載の形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス。
［１５］　前記ターミネーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのターミネーターである、［１３］又は［１４］に記載の形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス。
［１６］　前記構造遺伝子が配列番号１の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する、［１３］〜［１５］のいずれかに記載の形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス。
［１７］　外来的に導入された配列番号２の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有するＤＮＡ断片を保有する、形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス。
［１８］　ストレプトマイセス・リビダンス３１３１又はその変異株の形質転換体である、［１３］〜［１７］のいずれかに記載の形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス。
［１９］　ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターが外来的に導入された形質転換体ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ）を、前記構造遺伝子を発現可能な条件で培養する工程、及び
産生されたトランスグルタミナーゼを回収する工程、
を含んでなるトランスグルタミナーゼの生産方法。
［２０］　前記プロモーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのプロモーターである、［１９］に記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
［２１］　前記ターミネーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのターミネーターである、［１９］又は［２０］に記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
［２２］　前記構造遺伝子が配列番号１の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する、［１９］〜［２１］のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
［２３］　前記形質転換体ストレプトマイセス・リビダンスが、外来的に導入された配列番号２の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有するＤＮＡ断片を保有する、［１９］〜［２１］のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
［２４］　前記形質転換体ストレプトマイセス・リビダンスが、ストレプトマイセス・リビダンス３１３１又はその変異株の形質転換体である、［１９］〜［２３］のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の構成を詳細に説明する。
本発明では、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターが外来的に導入された形質転換体である放線菌（ストレプトマイセス・モバラエンシス又はストレプトマイセス・リビダンス）が提供される。
ここでのトランスグルタミナーゼの構造遺伝子は、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来である限りその種類は特に限定されない。例えばストレプトマイセス・モバラエンシスＳ−８１１２が保有するトランスグルタミナーゼの構造遺伝子を用いることができる。構造遺伝子の具体例としては配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。尚、ストレプトマイセス・モバラエンシスＳ−８１１２は受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９８０で以下の国際機関に寄託されている。
国際寄託機関
名称：独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター
住所：〒３０５−８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号　中央第６
寄託日：平成１４年（２００２年）８月２０日
【０００７】
トランスグルタミナーゼの構造遺伝子は例えば次のようにして取得することができる。即ち、ストレプトマイセス・モバラエンシスの染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、このライブラリーをトランスグルタミナーゼの構造遺伝子に特異的なプローブを用いてスクリーニングする。そして、選択されたクローンから制限酵素処理によって挿入されたＤＮＡ断片を取得する。尚、ＰＣＲ法等を利用した公知の合成方法によってもトランスグルタミナーゼの構造遺伝子を調製することができる。
【０００８】
配列番号１に記載されるＤＮＡの一部が改変されたＤＮＡ（以下、「改変ＤＮＡ」ともいう）であっても、それがコードするタンパク質がトランスグルタミナーゼ活性を有する限り本発明における構造遺伝子として利用できる。尚、ここでのトランスグルタミナーゼ活性の程度はできるだけ高い方が好ましい。例えば、配列番号１の配列からなるＤＮＡがコードするタンパク質のトランスグルタミナーゼ活性と同等であることが好ましい。
【０００９】
改変ＤＮＡの具体例としては、配列番号１の配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。尚、ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアルデヒド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，　１５ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ，　ｐＨ　７．０）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％　ＳＤＳ、１０％　デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いて４２℃でインキュベーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを用いて６８℃で洗浄する条件である。更に好ましいストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，　１５ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ，　ｐＨ　７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる条件を例示することができる。
【００１０】
改変ＤＮＡの他の例として、配列番号１に示される塩基配列において１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、かつトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。塩基置換などの変異は複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは変異の対象となる塩基がコードするアミノ酸の種類や位置などによっても異なるが、２〜４０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個である。尚、このような改変には５’末端、３’末端、又はその他の部位への制限酵素切断配列の導入や、シグナルペプチドをコードする配列の付加などが含まれる。
【００１１】
以上のような改変ＤＮＡは、例えば部位特異的変異法を用いて、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように配列番号１の配列を有するＤＮＡを遺伝子工学的に改変することによって得られる。また、トランスグルタミナーゼ遺伝子を保有するストレプトマイセス・モバラエンシスを紫外線で処理し、その後改変されたトランスグルタミナーゼの構造遺伝子を単離することなど、公知の変異処理を利用した方法によっても取得することができる。
尚、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異にはストレプトマイセス・モバラエンシスの個体差に基づく場合等、天然に生じる変異も含まれる。
【００１２】
例えば、天然に存在するストレプトマイセス・モバラエンシスがこのような改変ＤＮＡを有する場合には、当該菌株からゲノム（染色体）ＤＮＡを抽出し、これを適当な制限酵素で処理した後に、配列番号１のＤＮＡ又はその一部をプローブとしたスクリーニングにおいてストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを選択、単離することによって改変ＤＮＡを得ることができる。
【００１３】
プロモーターは上記の構造遺伝子に作用するものが採用される。好ましくは、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのプロモーターを採用する。更に好ましくは、使用される構造遺伝子と由来が同一のプロモーターを採用する。例えば、上記のようにしてストレプトマイセス・モバラエンシスからトランスグルタミナーゼの構造遺伝子を取得する際に、当該構造遺伝子に加えてそのプロモーター領域も含むＤＮＡ断片を取得し、このＤＮＡ断片を本発明における構造遺伝子及びプロモーターとして用いることができる。
【００１４】
ターミネーターについても上記の構造遺伝子に作用するものが採用される。好ましくは、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのプロモーターを採用する。更に好ましくは、使用される構造遺伝子と由来が同一のターミネーターを利用する。例えば、上記のようにしてストレプトマイセス・モバラエンシスのトランスグルタミナーゼの構造遺伝子を取得する際に、当該構造遺伝子に加えてそのターミネーター領域も含むＤＮＡ断片を取得し、このＤＮＡ断片を本発明における構造遺伝子及びプロモーターとして用いることができる。
【００１５】
ここでプロモーター、構造遺伝子、及びターミネーターの全てが同一のストレプトマイセス・モバラエンシスに由来することが特に好ましい。このような態様の例としては、配列番号２の配列を有するＤＮＡ断片を含む宿主ストレプトマイセス・モバラエンシスを用いる場合を挙げることができる。このようなＤＮＡ断片は、例えば上記のようにしてストレプトマイセス・モバラエンシスからトランスグルタミナーゼの構造遺伝子を取得する際に、当該構造遺伝子に加えてそのプロモーター及びターミネーター領域も含むようにして調製することができる。
ここで、配列番号２の配列からなるＤＮＡの一部が改変されたＤＮＡ（改変ＤＮＡ）であっても、それがコードするタンパク質がトランスグルタミナーゼ活性を有する限り同様に利用することができる。尚、ここでのトランスグルタミナーゼ活性の程度はできるだけ高い方が好ましい。例えば、配列番号２の配列からなるＤＮＡがコードするタンパク質のトランスグルタミナーゼ活性と同等であることが好ましい。
【００１６】
上記の配列番号１のＤＮＡの場合と同様に、ここでの改変ＤＮＡの具体例としては配列番号２の配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号２に示される塩基配列において１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、かつトランスグルタミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。その他、改変の許容される範囲、改変ＤＮＡの調製方法などについても配列番号１のＤＮＡの場合と同様である。
【００１７】
上記の構造遺伝子、プロモーター、ターミネーターが外来的に導入された形質転換体である放線菌（ストレプトマイセス・モバラエンシス又はストレプトマイセス・リビダンス）は、当該構造遺伝子等を含有した発現ベクターで宿主放線菌（ストレプトマイセス・モバラエンシス又はストレプトマイセス・リビダンス）を形質転換することによって作製される。
形質転換に供されるストレプトマイセス・モバラエンシスとしては、例えばストレプトマイセス・モバラエンシスＳ−８１１２（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９８０）又はその変異株を用いることができる。他方、ストレプトマイセス・リビダンスとしては、例えばストレプトマイセス・リビダンス３１３１（ＡＴＣＣ　３５２８７）又はその変異株を用いることができる。変異株の作製には例えば紫外線照射等の公知の方法を用いることができる。
【００１８】
発現ベクターの構築には放線菌の形質転換に使用可能な市販のベクターなど、公知のベクターを利用することができる。例えば、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどの大腸菌を宿主とするプラスミドと、ストレプトマイセス・リビダンス３１３１が保有するプラスミドｐＩＪ７０２などの放線菌を宿主とするプラスミドとを組み合わせて発現ベクターを構築することができる。発現プラスミドの具体例を以下に示す。まず、ｐＵＣ１９とｐＩＪ７０２を用いて大腸菌の複製開始点及び放線菌の複製開始点を併せ持つシャトルベクターを構築する。一方で、ストレプトマイセス・モバラエンシスからトランスグルタミナーゼのプロモーター、構造遺伝子、及びターミネーターを含むＤＮＡ断片を単離し、ｐＵＣ１９の適当な制限酵素サイトに挿入する。次に、このプラスミドにｐＩＪ７０２及び上記のシャトルベクターを用いてｔｓｒ（チオストレプトン耐性）遺伝子を挿入し、大腸菌の複製開始点、Ａｍｐｒ（アンピシリン耐性）遺伝子、放線菌の複製開始点、及びｔｓｒ（チオストレプトン耐性）遺伝子、並びにトランスグルタミナーゼのプロモーター、構造遺伝子、及びターミネーターを含む発現ベクターを得る。
ベクターを構築する際の制限酵素処理、ＤＮＡ断片の挿入等は常法により行うことができる。
尚、このようなストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに当該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターを含む発現ベクターは、ストレプトマイセス・リビダンス及びストレプトマイセス・モバラエンシス以外のストレプトマイセス属に属する微生物の形質転換にも利用できる。
【００１９】
以上のようにして構築した発現ベクターを用いた放線菌（ストレプトマイセス・モバラエンシス又はストレプトマイセス・リビダンス）の形質転換は、プロトプラスト化した宿主放線菌に発現ベクターを導入する方法で行うことができる。このような形質転換を、宿主である放線菌が生育可能な条件下で行うことが好ましい。本発明者らが検討したところでは、このような方法によれば形質転換効率が顕著に上昇した。その他の条件、操作方法などは常法（例えばＴｕｒｎｅｒら方法（Ｇｅｎｅ，　３６，　３２１−３３１（１９８５））において採用されるものを適宜選択して用いることができる。ここでの「宿主である放線菌が生育可能な条件」とは、放線菌の生育に必要とされる栄養素が反応液中に含有された条件をいい、具体的には例えば肉エキス、イーストエキス、及び／又はペプトン（ポリペプトン、トリプトンペプトン、カゼインペプトンなどを含む）が反応液中に含有された条件をいう。より高い形質転換効率を得るために、宿主のプロトプラスト化工程、及びプロトプラスト化した宿主へのベクターの導入工程の両者をこのような条件下で行うことがさらに好ましい。
形質転換体の選択は発現ベクターに予め組み込んだｔｓｒ遺伝子などの選択マーカーを利用して行うことができる。
【００２０】
選択された形質転換体、即ちストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、プロモーター、及びターミネーターが外来的に導入された宿主放線菌（ストレプトマイセス・モバラエンシス又はストレプトマイセス・リビダンス）を、トランスグルタミナーゼの構造遺伝子を発現可能な条件で培養することによりトランスグルタミナーゼを産生させることができる。形質転換体の培養用の培地は炭素源、窒素源、及び必要に応じて無機塩化物（無機イオン）を含むものを用いることができる。形質転換体の生育を促進するために、ビタミン、アミノ酸などを添加した培地を用いることもできる。炭素原としては例えばグルコース、デンプン、デキストリン等を採用でき、窒素原としては例えばポリペプトン、イーストエキス、肉エキス等を採用でき、無機塩化物としてはリン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等を採用できる。
【００２１】
形質転換体を培養する際の培養温度は例えば１５℃〜３７℃の範囲であり、好ましくは２５℃〜３５℃の範囲である。また、培地のｐＨは例えば５．０〜８．０、好ましくは６．０〜７．５に調整される。
【００２２】
形質転換体を所望時間培養した後の培養液又は菌体よりトランスグルタミナーゼを回収することができる。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理して不溶物を除去した後、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを組み合わせて分離、精製を行うことによりトランスグルタミナーゼを取得することができる。他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことによりトランスグルタミナーゼを取得することができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
【００２３】
【実施例】
本実施例では、特に記載しない限り制限酵素およびその他の遺伝子操作用酵素として宝酒造株式会社または東洋紡績株式会社の製品を用いた。尚、酵素の反応条件等は添付の取り扱い説明書に従った。
【００２４】
［実施例１］　放線菌用ベクターｐＩＪ７０２の取得
プラスミドｐＩＪ７０２を保有するストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）３１３１（ＡＴＣＣ　３５２８７）を以下の培地条件で３０℃、２日間培養した。
ＹＥＭＥ培地　＋　０．５％グリシン　＋　５０μｇ／ｍｌチオストレプトン
イースト・エキス　　３ｇ
ペプトン　　　　　　　　　　５ｇ
マルト・エキス　　　　３ｇ
塩化マグネシウム　　１ｇ
グルコース　　　　　　　　１０ｇ
サッカロース　　　　　　３４０ｇ
グリシン　　　　　　　　　　５ｇ
５０ｍｇ／ｍｌ　チオストレプトン溶液（シグマ：ジメチルスルホキシド溶液）１ｍｌ／　Ｌ　（ｐＨ７．０）
【００２５】
培養後の培地２００ｍｌを遠心分離（１２，０００ｇ、４℃、１０分間）し、得られた菌体を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２５％　Ｓｕｃｒｏｓｅ（以下、「ＴＥ−Ｓｕｃｒｏｓｅ」という）１０ｍｌに懸濁した。次に３０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（シグマアルドリッチジャパン社製）を含むＴＥ−Ｓｕｃｒｏｓｅ　２ｍｌ及び０．２５ｍＭ　ＥＤＴＡ　４ｍｌを加え、これを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後２０％　ＳＤＳ　２ｍｌを加え、さらに５Ｍ　ＮａＣｌ　５ｍｌを加えて穏やかに攪拌した後、０℃で１晩インキュベートした。
【００２６】
次に遠心分離（１００，０００ｇ、４℃、４０分間）により得られた上清に３０％　ポリエチレングリコール６０００を終濃度１０％になるように加え、０℃で４．５時間インキュベートした。その後、遠心分離（９００ｇ、４℃、５分間）し、沈殿を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ　に溶解した。そして塩化セシウム１６．８ｇ及び１０ｍｇ／ｍｌの濃度にエチジウムブロマイドを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ（以下、「ＴＥ」という）に溶かして調整した溶液１．２ｍｌを加え、遠心分離（１，３００ｇ、室温、１５分間）により残さを取り除いた後、再び遠心分離（２３０，０００ｇ、２０℃、１２時間）を行った。遠心後、紫外線照射下でプラスミドＤＮＡ層を得た。次にＴＥで飽和したブタノールによる抽出を行ってエチジウムブロマイドを除いた。この抽出を３回繰り返して行った。得られたプラスミドＤＮＡ溶液はＴＥを透析外液として４℃で１晩の透析に供した。その後、ＴＥ飽和フェノールで１回、クロロホルム・イソアミルアルコールで２回抽出処理を行った。次に、１／１０容量の３Ｍ　酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）溶液と２倍容量のエタノールを加え、−８０℃に３０分間静置した。その後、遠心分離（１２，０００ｇ、４℃、１５分間）により沈殿を回収し、沈殿を７０％　エタノールで洗浄し、乾燥させた。これをＴＥ　２００μｌに溶かした。以上の操作によって最終的に得られたＤＮＡ量は約１０μｇであった。
【００２７】
［実施例２］　ｐＩＪ７０２を保有するストレプトマイセス・リビダンス３１３１（ＡＴＣＣ　３５２８７）からのチオストレプトン感受性株の取得
ｐＩＪ７０２を保有するストレプトマイセス・リビダンス３１３１（ＡＴＣＣ　３５２８７）をＹＥＭＥ培地で３０℃、７日間培養した。次に、培養液をＹＥＭＥ培地で１０５〜１０９倍に希釈し、それぞれの希釈液を１００μｌずつＹＥＭＥ寒天培地（ＹＥＭＥに１．５％寒天を加えたプレート寒天培地）５枚にまき、３０℃で１週間培養した。培養後ＲｅｐｌｉＰｌａｔｅＴＭ　Ｃｏｌｏｎｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｐａｄ（宝酒造株式会社製）を用い、２００μｇ／ｍｌ　チオストレプトンを含むＹＥＭＥ培地にレプリカし、３０℃で１週間培養した。そしてプラスミドｐＩＪ７０２を脱落してチオストレプトン感受性となった株を選択し、これをストレプトマイセス・リビダンス３１３１−ＴＳとした。これを後の形質転換の宿主として用いた。
【００２８】
［実施例３］　シャトルベクターｐＳＶ１の取得
シャトルベクターｐＳＶ１を図１に示す方法で構築した。まず、大腸菌用ベクターｐＵＣ１９（宝酒造株式会社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ断片と、放線菌用ベクターｐＩＪ７０２をＢｃｌＩ（宝酒造株式会社製）で消化して得られるｔｓｒを含むＤＮＡ断片を用意し、これらをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を用いて連結することによりｐＵＣＴＳＲを作製した。次にｐＵＣＴＳＲをＫｐｎＩ、ＣｌａＩ（宝酒造株式会社製）で消化して得られるＤＮＡ断片（長断片）と、ｐＩＪ７０２をＫｐｎＩ、ＣｌａＩ（宝酒造株式会社製）で消化して得られるＤＮＡ断片（短断片）を用意し、これらをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を用いて連結した後、大腸菌ＤＨ５株（東洋紡株式会社）に形質転換した。こうして得られた形質転換体が持つｐＵＣ１９断片とｐＩＪ７０２断片が連結したプラスミドをシャトルベクターｐＳＶ１とし、後の操作に用いた。
【００２９】
［実施例４］　トランスグルタミナーゼ分泌発現プラスミドｐＵＪ５１ＢＤの作製
トランスグルタミナーゼ遺伝子を保有する分泌発現プラスミドｐＵＪ５１ＢＤを図２に示す方法で構築した。まず、ストレプトマイセス　モバラエンシスＳ−８１１２（受託番号ＦＩＲＭ　Ｐ−１８９８０）から単離されたトランスグルタミナーゼ（以下、「ＢＴＧ」ともいう）遺伝子ＢａｍＨＩ断片を含むファージＤＮＡ（λＢＴＧ、特開平５−１９９８８３号公報）から約６．６ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を切り出してｐＵＣ１９のＢａｍＨＩサイトに挿入したプラスミドｐＢＴＧ−ＢＢを作製した。ｐＢＴＧ−ＢＢから３’の不要な領域をＫｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用　Ｄｅｌｉｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を用いて欠失させ、約３．９ｋｂのＢＴＧ遺伝子を含むプラスミドｐＵ５１Ｂを作製した。次にｐＵ５１ＢのＰｓｔＩサイトに放線菌用ベクターｐＩＪ７０２のＰｓｔＩ消化ＤＮＡ断片を挿入したプラスミドｐＵＪ５１Ｂを作製した。ｐＵＪ５１ＢからＸｂａＩ−ＣｌａＩ断片を切り出し、実施例３で得た大腸菌−放線菌シャトルベクターｐＳＶ１のＸｂａＩ−ＣｌａＩ断片と置換することでｐＩＪ７０２由来のｍｅｌ（チロシナーゼ）遺伝子を除去したＢＴＧ分泌発現プラスミドｐＵＪ５１ＢＤを構築した。
【００３０】
［実施例５］　プロモーター領域の塩基配列解析
ＢＴＧの構造遺伝子の配列（配列番号１）から塩基配列解析用の合成プライマーＢＢ−２３［インヴィトロジェン（株）］５’−ＡＣＡＣＣＧＣＡＣＴＣＡＴＡＧＴＧＧＣＧ−３’（配列番号３）を合成した。プロモーター領域の３’側からプライマーＢＢ−２３を用いて、５’側からＭ１３−ＲＶ（宝酒造株式会社製）を用いてプラスミドｐＢＴＧ−ＢＢの塩基配列を解析した。得られた塩基配列解析の結果から更に合成プライマーＢＢ−１９　５’−ＴＣＣＧＴＧＣＧＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＧ−３’（配列番号４）、ＳＰ６−２０　５’−ＧＡＣＧＧＣＣＴＣＣＧＡＡＴＡＡＣ−３’（配列番号５）を合成し、これらを用いたプライマーウォーキングによりプロモーター領域約７００ｂｐの全塩基配列を決定した（図３）。同様に、合成プライマーＳＰ６−３２　５’−ＡＴＧＴＣＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＡＣ−３’（配列番号６）とＳＰ６−３６　５’−ＣＡＣＣＡＣＧＡＡＡＧＴＣＧＣＴＡＣ−３’（配列番号７）を用いたプライマーウォーキングにより約５００ｂｐのターミネータ領域の塩基配列を決定した。その結果、プロモーター領域、構造遺伝子、及びターミネータ領域からなる塩基配列（配列番号２）が同定された（図４、図５）。尚、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ反応はＢｉｇＤｙｅＴＭ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｋｉｔ（アプライド・バイオシステムズ）を用い、解析はＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０シークエンサー（アプライド・バイオシステムズ）を使用した。
【００３１】
［実施例６］　ストレプトマイセス・リビダンス３１３１−ＴＳ　プロトプラストの調製
実施例２で取得したストレプトマイセス・リビダンス３１３１−ＴＳをＹＥＭＥ培地（０．５％グリシン）で３０℃、２日間培養した。培養後の培地２００ｍｌを遠心分離（１，３００ｇ、室温、１０分間）し、得られた菌体を０．３５Ｍサッカロース溶液７２ｍｌに懸濁した。次に、この懸濁液を遠心分離（１，３００ｇ、室温、１０分間）し、菌体を１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（シグマアルドリッチジャパン社）を含むＰ緩衝液６０ｍｌに再懸濁し、これを３０℃、２．５時間インキュベートした。インキュベート後の懸濁液を脱脂綿でろ過して残さを取り除いた。次に得られたろ液を遠心分離（１，３００ｇ、室温、１０分間）し、沈渣をＰ緩衝液２５ｍｌで洗浄した。この洗浄を２回繰り返した後、沈殿をＰ緩衝液１ｍｌに懸濁し、これをプロトプラスト懸濁液とした。
Ｐ緩衝液
ＴＥＳ［Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ　ａｃｉｄ］　　５．７３ｇ
サッカロース　　　　　　　１０３ｇ
塩化マグネシウム　　　　　２．０３ｇ
硫酸カリウム　　　　　　　０．５ｇ
塩化カルシウム　　　　　　３．６８ｇ
Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　　２ｍｌ／Ｌ　（ｐＨ７．４）
尚、１％リン酸一カリウム溶液を別に調製し、これを使用直前に１００ｍｌＰ緩衝液当たり１ｍｌ加えた。
Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
塩化亜鉛　　　　　　　　　４０ｍｇ
塩化第二鉄　　　　　　　　２００ｍｇ
塩化第二銅　　　　　　　　１０ｍｇ
塩化マンガン　　　　　　　１０ｍｇ
四硼酸ナトリウム　　　　　１０ｍｇ
モリブデン酸アンモニウム　１０ｍｇ／Ｌ
【００３２】
［実施例７］　ストレプトマイセス・リビダンス３１３１−ＴＳ　の形質転換
以下の各溶液を混合し、全量１４０μｌとした。
ＢＴＧ分泌発現プラスミドｐＵＪ５１ＤのＤＮＡ溶液　　　　　　　　　２０μｌ
ストレプトマイセス・リビダンス　３１３１−ＴＳ　プロトプラスト　１００μｌ
０．３５Ｍ　サッカロース溶液　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μｌ
次に、２０％ポリエチレングリコール１０００を含むＰ緩衝液を１．５ｍｌ加えピペッティングにより穏やかに混合し室温で２分間静置した。この混合液を遠心分離（１，７００ｇ、室温、１０分間）し、沈殿を集めた。沈殿として得られたプロトプラストをＰ緩衝液で２回繰り返し洗浄した。ペレットを１ｍｌのＰ緩衝液に再懸濁した後に、２００μｌずつＲ−２培地に塗布した。
一方、以下に示したＲ−２／Ａ及びＲ−２／Ｂを別調製した。
Ｒ−２／Ａ
硫酸カリウム　　　　　　０．５ｇ
塩化マグネシウム　　　　２０．２ｇ
塩化カルシウム　　　　　５．９ｇ
グルコース　　　　　　　２０．０ｇ
プロリン　　　　　　　　６．０ｇ
カザミノ酸　　　　　　　０．２ｇ
Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　４．０ｍｌ
寒天　　　　　　　　　　４４．０ｇ／Ｌ
【００３３】
Ｒ−２／Ｂ
ＴＥＳ　　　　　　　　　１１．５ｇ
イースト・エキス　　１０．０ｇ
サッカロース　　　　　２０３ｇ／Ｌ（ｐＨ７．４）
プレート培地作製時にＲ−２／Ａ、Ｒ−２／Ｂを混合し、更に１％　ＫＨ２ＰＯ４を最終容量２００ｍｌあたり１ｍｌの割合で混合した。これらを３０℃で１８時間インキュベートした。その後、２００μｇ／ｍｌチオストレプトン及び４００μｇ／ｍｌチロシンを含むＰ緩衝液１ｍｌを加え、プレートの表面を覆った。更に７日間プレートを３０℃でインキュベートしチオストレプトン耐性を獲得した形質転換体（ＡＢＬ−１）を得た。
【００３４】
［実施例８］　ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）のプロトプラストの調製
前培養としてストレプトマイセス・モバラエンシスＳ−８１１２をＹＥＭＥ培地＋１％　グルコース＋２５ｍＭ　塩化マグネシウム（ｐＨ７．０）で２７℃、３日間培養した。次に、ＹＥＭＥ培地＋１％　グルコース＋４ｍＭ　塩化マグネシウム＋１％　グリシン（ｐＨ７．０）に前培養後の培養液を０．５％接種した後、２７℃で３日間培養した。培養後の培地を遠心分離（３，０００ｇ、４℃、１０分間）し、得られた菌体の湿重量を測定した。湿菌体０．６ｇに対し１０ｍｌの０．３Ｍサッカロース溶液で洗浄操作後、再び遠心分離（３，０００ｇ、４℃、１０分間）し、菌体を０．４ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（日本ロッシュ株式会社製）と０．１ｍｇ／ｍｌのアクロモペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）を含むＢＳ−Ｌ緩衝液４ｍｌに懸濁して３０℃、３０分間穏やかに攪拌した。次に氷中でＢＳ−Ｐ緩衝液５ｍｌを加え、ＢＳ−Ｐ緩衝液３ｍｌで洗浄しながら脱脂綿を用いてろ過した。得られた懸濁液を遠心分離（１，５００ｇ、４℃、５分間）し、ＢＳ−Ｐ緩衝液１０ｍｌで再懸濁後、再び遠心分離（１，５００ｇ、４℃、５分間）した。得られた沈殿をＢＳ−Ｐ緩衝液０．５ｍｌで再懸濁した溶液をプロトプラスト懸濁液として後述の形質転換に使用した。
【００３５】
ＢＳ−Ｌ緩衝液
１０％肉エキス　　　　　１０ｍｌ
イーストエキス　　　　　１ｇ
ペプトン　　　　　　　　２ｇ
グルコース　　　　　　　１０ｇ
サッカロース　　　　１７１．１５ｇ
塩化カルシウム　　　　０．２７７ｇ
塩化マグネシウム　　　０．５０８ｇ／Ｌ（ｐＨ７．０）
【００３６】
ＢＳ−Ｐ緩衝液
１０％肉エキス　　　　　１０ｍｌ
イーストエキス　　　　　１ｇ
ペプトン　　　　　　　　２ｇ
グルコース　　　　　　　１０ｇ
サッカロース　　　　１７１．１５ｇ
塩化カルシウム　　　　２．７７ｇ
塩化マグネシウム　　　２．０３ｇ／Ｌ（ｐＨ７．０）
【００３７】
［実施例９］　ストレプトマイセス・モバラエンシスの形質転換
実施例８で得られたプロトプラスト懸濁液（プロトプラスト濃度１ｘ１０９／ｍｌ）を１００μｌと実施例４で得られたＢＴＧ分泌発現プラスミドｐＵＪ５１Ｄ　１μｇを含む２Ｍ　サッカロース溶液１０μｌを混合した後、直ちに氷中に１０秒間静置し、続いて２５％ポリエチレングリコール１０００（シグマアルドリッチジャパン社製）を含むＰ緩衝液０．５ｍｌを加えた後、直ちに氷中に１分間静置し、続いてＢＳ−Ｐ緩衝液を２ｍｌ加えた後、直ちに遠心分離（１，５００ｇ、４℃、１０分間）した。得られた沈殿をＢＳ−Ｐ緩衝液０．５ｍｌで懸濁し、０．１ｍｌずつＳＢＳ寒天培地に分注し、ＳＢＳ軟寒天培地３ｍｌを用いて攪拌しながら重層した。ふたを開けて正確に２時間乾燥した後、２７℃で正確に２４時間培養した。更に２００μｇ／ｍｌ　チオストレプトンを含むＳＢＳ軟寒天培地３ｍｌを重層して２７℃で培養した。以上の操作の結果得られた形質転換体をＡＢＭ−１とした。
【００３８】
ＳＢＳ寒天培地（ｐＨ７．０）
肉エキス　　　　　　　１０ｇ
イーストエキス　　　　７．５ｇ
トリプトンペプトン　　　１ｇ
グルコース　　　　　　　１０ｇ
サッカロース　　　　３０８．０７ｇ
寒天　　　　　　　　　　２５ｇ／Ｌ（ｐＨ７．０）
ＳＢＳ軟寒天培地（ｐＨ７．０）
肉エキス　　　　　　　　　１０ｇ
イーストエキス　　　　　　７．５ｇ
トリプトンペプトン　　　　　１ｇ
グルコース　　　　　　　　　１０ｇ
サッカロース　　　　　　３０８．０７ｇ
シープラークアガロース　　　２５ｇ／Ｌ（ｐＨ７．０）
【００３９】
［実施例１０］　ＢＴＧ遺伝子を組み込んだ形質転換体の培養
実施例７で得られた形質転換体ＡＢＬ−１、及び実施例９で得られた形質転換体ＡＢＭ−１をそれぞれ以下の培地条件で３０℃、７日間培養した。
ポリペプトン　　　　　　　　　２０ｇ
可溶性デンプン　　　　　　　　２０ｇ
イーストエキス　　　　　　　　２ｇ
リン酸二カリウム　　　　　　　２ｇ
硫酸マグネシウム　　　　　　　１ｇ
アデカノールＬＧ１２６　　　　　　０．５ｇ
５０ｍｇ／ｍｌ　チオストレプトン溶液　０．５ｍｌ／Ｌ（ｐＨ７．０）
上記条件下で培養した後の培地を遠心分離（１２，０００ｇ、４℃、１０分間）し、得られた上清を以下のＥＬＩＳＡ法に供した。
【００４０】
［実施例１１］　ＢＴＧ生産量の定量（ＥＬＩＳＡ法）
ストレプトマイセス・モバラエンシスＳ−８１１２の培養上清からＢｌｕｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより得た精製ＢＴＧを抗原としてウサギを免疫することにより作製された抗ＢＴＧ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によって、実施例１０で得られた培養上清中のＢＴＧ量を定量した。
まず、９６穴マイクロプレートの各ウェルにＰＢＳ緩衝液で希釈した抗ＢＴＧ抗体溶液を１００μｌずつ分注し、３７℃、１時間インキュベートして抗体をプレートに固定化した。抗体溶液を除いた後、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むブロックエース（大日本製薬株式会社製）の１０倍希釈液（以下、「洗浄液」という）２００μｌを用いて各ウェルを洗浄した。洗浄操作は続けて３回行った。次にブロックエース４倍希釈液２００μｌを各ウェルに分注し、３７℃、１時間インキュベートしてブロッキングを行った。ブロックエース４倍希釈液を除去した後、各ウェルを洗浄液で３回洗浄した。次に測定サンプルである培養上清（ＡＢＬ−１又はＡＢＭ−１の培養上清）をブロックエースの１０倍希釈液で適宜希釈し、希釈液を各ウェルに５０μｌずつ分注し、３７℃、１時間インキュベートした。尚、スタンダードとしては、精製ＢＴＧをブロックエースの１０倍希釈液でそれぞれ異なる濃度に調製したものを用意し、測定サンプルと同様にブロッキング処理後のウェルに添加した。
各ウェルからサンプル溶液を除去した後、各ウェルを洗浄液で３回洗浄した。次に抗ＢＴＧ抗体　Ｆａｂ’断片にホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）を架橋させたＦａｂ’−ＨＲＰを含むブロックエース１０倍希釈液１００μｌを各ウェルに分注し、３７℃、１時間インキュベートした。その後、Ｆａｂ’−ＨＲＰ溶液を除いた後、各ウェルを洗浄液で３回洗浄した。次に０．０４％オルトフェニレンジアミン（ｏ−ＰＤＡ）、０．４２％過酸化水素液を含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）を各ウェルに１５０μｌずつ分注し、３７℃でインキュベートすることによりｏ−ＰＤＡと過酸化水素をＨＲＰで反応させて発色させた。反応開始から正確に２０分後に、反応の停止液として３Ｍ硫酸溶液を各ウェルに５０μｌずつ分注した後、各ウェルの波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。そして、スタンダードの吸光度から求めた標準曲線を用いて各培養上清ＡＢＬ−１又はＡＢＭ−１）中のＢＴＧ量を求めた。各培養上清あたりのＢＴＧ量を図６の表に示す。この表に示されるようにＡＢＬ−１では０．７ｇ／Ｌ、ＡＢＭ−１では０．５ｇ／ＬものＢＴＧが生産された。既報の生産性（４０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌ）と比較すれば、ＡＢＬ−１では１０倍以上、ＡＢＭ−１では約１０倍の生産性が得られたこととなり、極めて高い効率でＢＴＧの生産を行えることが確認された。
【００４１】
ＰＢＳ緩衝液
塩化ナトリウム　　　　８．０ｇ
リン酸二ナトリウム　　１．１ｇ
塩化カリウム　　　　　０．２ｇ
リン酸一カリウム　　　０．２ｇ／Ｌ（ｐＨ７．４）
【００４２】
［実施例１２］　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
形質転換体ＡＢＬ−１及び形質転換体ＡＢＭ−１の培養上清をそれぞれ電気泳動用２ｘＳＤＳ緩衝液と１：１の割合で混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとした。尚、対照（コントロール）として、ストレプトマイセス・リビダンス３１３１−ＴＳの培養上清、精製ＢＴＧをバッファで希釈したもの、ストレプトマイセス・モバラエンシスＳ−８１１２の培養上清を用意した。各サンプルを１２．５％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにはファルマシア・バイオテクのファストシステムを用い、染色は銀染色とした。染色後のゲルの写真を図７に示す。図７においてレーン１、２、３、４、及び５はそれぞれストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．　ｌｉｖｉｄａｎｓ）３１３１−ＴＳ培養上清、ＡＢＬ−１の培養上清、精製ＢＴＧ、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓ．　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）Ｓ−８１１２の培養上清、及びＡＢＭ−１の培養上清をアプライしたレーンである。また、レーンＭは分子量マーカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をアプライしたレーンである。
図４に示されるように、ＡＢＬ−１（レーン２）及びＡＢＭ−１（レーン５）では精製ＢＴＧ（レーン３）とほぼ同じ位置にはっきりとしたバンドが観察され、ＢＴＧが高濃度で含有されていることが判る。一方、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．　ｌｉｖｉｄａｎｓ）３１３１−ＴＳの培養上清（レーン１）及びストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓ．　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）Ｓ−８１１２の培養上清（レーン４）では精製ＢＴＧと認められるバンドは観察されない。このことから、ＡＢＬ−１及びＡＢＭ−１では特異的にＢＴＧの産生が行われていることが判る。
２ｘＳＤＳ緩衝液
トリス塩酸塩　　　　　　　２．４２ｇ
ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　０．７４４ｇ
ＳＤＳ　　　　　　　　　　　　　５０ｇ
β−メルカプトエタノール　　　１００ｍｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）
【００４３】
本発明は、上記発明の実施の形態の説明に何ら限定されるものではなく、特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００４４】
【発明の効果】
本発明によりトランスグルタミナーゼの生産性が極めて高い放線菌が提供される。当該放線菌を用いることによりトランスグルタミナーゼの効率的な生産を行うことができる。
【００４５】
以下、次の事項を開示する。
（１）　ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターを含有するベクターで宿主ストレプトマイセス・モバラエンシスを形質転換する工程、
前記構造遺伝子を発現可能な条件で形質転換体を培養する工程、及び
産生されたトランスグルタミナーゼを回収する工程、
を含んでなるトランスグルタミナーゼの生産方法。
（２）　前記形質転換する工程が、前記宿主ストレプトマイセス・モバラエンシスが生育可能な条件で行われる（１）に記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
（３）　前記ベクターがプラスミドｐＩＪ７０２を改変したプラスミドからなる、（１）又は（２）に記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
（４）　前記プロモーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのプロモーターである、（１）〜（３）のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
（５）　前記ターミネーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのターミネーターである、（１）〜（４）のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
（６）　前記宿主ストレプトマイセス・モバラエンシスが、ストレプトマイセス・モバラエンシスＳ−８１１２又はその変異株である、（１）〜（５）のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
（７）　前記構造遺伝子が配列番号１の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する、（１）〜（６）のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
（８）　前記形質転換体が、外来的に導入された配列番号２の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有するＤＮＡ断片を保有する、（１）〜（６）のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
【００４６】
（１１）　ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターを含有するベクターで宿主ストレプトマイセス・リビダンスを形質転換する工程、
前記構造遺伝子を発現可能な条件で形質転換体を培養する工程、及び
産生されたトランスグルタミナーゼを回収する工程、
を含んでなるトランスグルタミナーゼの生産方法。
（１２）　前記形質転換する工程が、前記宿主ストレプトマイセス・リビダンスが生育可能な条件で行われる、（１１）に記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
（１３）　前記ベクターがプラスミドｐＩＪ７０２を改変したプラスミドからなる、（１１）又は（１２）に記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
（１４）　前記プロモーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのプロモーターである、（１１）〜（１３）のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
（１５）　前記ターミネーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのターミネーターである、（１１）〜（１４）のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
（１６）　前記宿主ストレプトマイセス・リビダンスが、ストレプトマイセス・リビダンス３１３１又はその変異株である、（１１）〜（１５）のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
（１７）　前記構造遺伝子が配列番号１の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する、（１１）〜（１６）のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
（１８）　前記形質転換体が、外来的に導入された配列番号２の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有するＤＮＡ断片を保有する、（１１）〜（１６）のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼの生産方法。
【００４７】
（２１）　ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターを含む発現ベクター。
（２２）　前記プロモーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのプロモーターである、（２１）に記載の発現ベクター。
（２３）　前記ターミネーターが、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来トランスグルタミナーゼのターミネーターである、（２１）又は（２２）に記載の発現ベクター。
（２４）　前記構造遺伝子が配列番号１の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する、（２１）〜（２３）のいずれかに記載の発現ベクター。
（２５）　配列番号２の配列、又は該配列の一部が改変された配列であってトランスグルタミナーゼをコードする配列を有する発現ベクター。
（２６）　（２１）〜（２５）のいずれかの発現ベクターで形質転換された、ストレプトマイセス属に属する微生物。
【００４８】
（３１）　宿主放線菌をそれが生育可能な条件下でプロトプラスト化する工程、
前記宿主放線菌が生育可能な条件下で、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）由来トランスグルタミナーゼの構造遺伝子、並びに該構造遺伝子に作用するプロモーター及びターミネーターを含む発現ベクターを宿主放線菌に導入する工程、を含む放線菌の形質転換方法。
（３２）前記宿主放線菌がストレプトマイセス・リビダンス又はストレプトマイセス・モバラエンシスである、ことを特徴とする（３１）に記載の形質転換方法。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例におけるシャトルベクターｐＳＶ１の構築方法を示す図である。
【図２】図２はトランスグルタミナーゼ遺伝子を保有する分泌発現プラスミドｐＵＪ５１ＢＤの構築方法を示す図である。
【図３】図３は実施例において決定されたトランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を示した図である。
【図４】図４は、トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）遺伝子のプロモーター領域及び構造遺伝子の一部の塩基配列を示した図である。
【図５】図５は、トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）遺伝子の構造遺伝子の一部及びターミネータ領域の塩基配列を示した図である。
【図６】図６は形質転換体ＡＢＬ−１及びＡＢＭ−１の培養上清中におけるＢＴＧ量を測定した結果をまとめた表である。
【図７】図７は形質転換体ＡＢＬ−１及びＡＢＭ−１の培養上清を電気泳導した結果（銀染色後のゲル）を示す図である。レーン１、２、３、４、及び５はそれぞれストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．　ｌｉｖｉｄａｎｓ）３１３１−ＴＳの培養上清、ＡＢＬ−１の培養上清、精製ＢＴＧ、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓ．　ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）Ｓ−８１１２の培養上清、及びＡＢＭ−１の培養上清をアプライしたレーンである。レーンＭは分子量マーカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をアプライしたレーンである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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