(57)【要約】    【課題】  均一な磁性を有するとともに、粒径分布が狭く、かつ分散安定性に優れており、免疫測定用として有用な磁性体内包粒子とその製造方法、及びそれを用いた免疫測定用粒子を提供する。    【解決手段】  有機高分子物質と平均粒径１〜３０ｎｍの磁性体とからなる磁性体内包粒子であって、その内部に前記磁性体を分散状態で含有することを特徴とする磁性体内包粒子。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機高分子物質と平均粒径１〜３０ｎｍの磁性体とからなる磁性体内包粒子であって、その内部に前記磁性体を分散状態で含有することを特徴とする磁性体内包粒子。
【請求項２】
磁性体は、粒子を形成させる重合過程において粒子内部で金属イオンが酸化して形成されたものであることを特徴とする、請求項１記載の磁性体内包粒子。
【請求項３】
金属イオンは、鉄イオンであることを特徴とする、請求項２記載の磁性体内包粒子。
【請求項４】
有機高分子物質は、アクリル系モノマーからなる重合体を主構成成分とすることを特徴とする、請求項１、２又は３記載の磁性体内包粒子。
【請求項５】
アクリル系モノマーは、グリシジル基を有するモノマーであることを特徴とする、請求項４記載の磁性体内包粒子。
【請求項６】
アクリル系モノマーは、グリシジル基を有するモノマー及び下記一般式で表されるポリエチレングリコール（メタ）アクリレートであることを特徴とする、請求項４記載の磁性体内包粒子。
ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈ
（式中、ＲはＨ又はＣＨ３を表し、ｎは２〜２０の整数を表す。）
【請求項７】
平均粒径が０．０５〜１μｍであることを特徴とする、請求項１、２、３、４、５又は６記載の磁性体内包粒子。
【請求項８】
磁性体の含有量が０．１〜４０重量％であることを特徴とする、請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の磁性体内包粒子。
【請求項９】
水系溶媒中において疎水性モノマー及び／又は親水性モノマーを重合して粒子を形成する工程と、
前記粒子中に金属イオンを取り込みながら前記金属イオンを酸化して磁性体を形成する工程とからなり、
前記粒子を形成する工程と前記磁性体を形成する工程とを同時に進行させることを特徴とする磁性体内包粒子の製造方法。
【請求項１０】
疎水性モノマーは、グリシジル基を含有するアクリル系モノマーであることを特徴とする、請求項９記載の磁性体内包粒子の製造方法。
【請求項１１】
親水性モノマーは、下記一般式で表されるポリエチレングリコール（メタ）アクリレートであることを特徴とする、請求項９記載の磁性体内包粒子の製造方法。
ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈ
（式中、ＲはＨ又はＣＨ３を表し、ｎは２〜２０の整数を表す。）
【請求項１２】
粒子を形成する工程において、共重合モノマーとして反応性乳化剤を添加することを特徴とする、請求項９、１０又は１１記載の磁性体内包粒子の製造方法。
【請求項１３】
粒子を形成する工程において、重合開始剤を後添加することを特徴とする、請求項９、１０、１１又は１２記載の磁性体内包粒子の製造方法。
【請求項１４】
有機高分子物質と平均粒径１〜３０ｎｍの磁性体とからなり、その内部に前記磁性体を分散状態で含有する磁性体内包粒子に、抗原又は抗体が吸着又は結合していることを特徴とする免疫測定用粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、均一な磁性を有するとともに、粒径分布が狭く、かつ分散安定性に優れており、免疫測定用粒子として有用な磁性体を内包する高分子粒子とその製造方法、及びそれを用いた免疫測定用粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、磁性体内包粒子の作製法としては、（１）作製済みの高分子粒子に鉄イオンを含ませて磁性体内包粒子を作製する方法、（２）モノマーから粒子を重合する過程で作製済みの磁性体粒子を含ませる方法（特許文献１参照）、（３）別々に作製した高分子粒子と磁性体粒子とを複合化させる方法（特許文献２参照）が知られている。また、この他、（４）磁性体粒子を高分子等で被覆する方法（特許文献３参照）がある。
【０００３】
（１）の方法は鉄イオンを高分子粒子に吸収させるため、表面に磁性体が露出し、磁性体が酸化するという課題があった。（２）の方法は磁性体粒子が均一に粒子に取り込まれないという課題や粒径の制御が困難で、粒径分布の広い物となるという課題があった。（３）の方法は高分子粒子が凝集するため、粒径の小さな粒子には使用できないという課題があった。（４）の方法は、被覆が均一にできないため、浮遊性や分散性が悪く、また、磁性体粒子表面の一部が露出している場合があるという課題があった。
【０００４】
一方、従来から知られている微量免疫測定法としては、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ等が既に実用化されている。これらの方法は、それぞれアイソトープ、酵素、蛍光物質を標識として付加した抗原又は抗体を用い、これと特異的に反応する抗体又は抗原の有無を検出する方法である。
このような免疫測定法に際して、磁性体内包粒子は効率よくかつ簡便にＢ／Ｆ分離を行うために用いられている。また、Ｂ／Ｆ分離以外の使用（特許文献４参照）や、磁性体内包粒子自体を標識材料とする免疫測定法（特許文献５、特許文献６、特許文献７参照）が開示されている。
【０００５】
【特許文献１】特開平９−２０８７８８号公報
【特許文献２】特開平６−２３１９５７号公報
【特許文献３】特開平６−９２６４０号公報
【特許文献４】特開２０００−８８８５２号公報
【特許文献５】特開平６−１４８１８９号公報
【特許文献６】特開平７−２２５２３３号公報
【特許文献７】特表２００１−５２４６７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記現状に鑑み、均一な磁性を有するとともに、粒径分布が狭く、かつ分散安定性に優れており、免疫測定用として有用な磁性体内包粒子とその製造方法、及びそれを用いた免疫測定用粒子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、有機高分子物質と平均粒径１〜３０ｎｍの磁性体とからなる磁性体内包粒子であって、その内部に上記磁性体を分散状態で含有する磁性体内包粒子である。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明の磁性体内包粒子は、有機高分子物質と平均粒径１〜３０ｎｍの磁性体とからなるものである。
上記有機高分子物質は、高分子粒子のコアを形成するための疎水性モノマー、及び／又は、水中で安定に分散する高分子粒子を形成しつつ高分子粒子のシェルを形成するための親水性モノマーからなる重合体を主構成成分とするものである。
特に、有機高分子物質中の疎水性モノマーの量が少なくなると粒子重合中に後述する金属イオンを取り込み難くなり、また、親水性モノマーの量が少なくなると得られる磁性体内包粒子の分散安定性が低下するので、これらを併用するのが好ましく、その割合は、疎水性モノマーが５〜９７重量％、親水性モノマーが３〜９５重量％であるのが好ましく、この範囲で必要に応じて適宜調整するのがより好ましい。
【０００９】
＜疎水性モノマー＞
上記疎水性モノマーとしては、例えば、スチレン；α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、クロロメチルスチレンなどのスチレン誘導体；塩化ビニル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類；アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、エチレングリコール（メタ）アクリレート、トリフルオロエチル（メタ）アクリレート、ペンタフルオロプロピル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジルメタクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。これら単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用しても良い。
【００１０】
上記疎水性モノマーとしては、好ましくは、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、エチレングリコール（メタ）アクリレート、トリフルオロエチル（メタ）アクリレート、ペンタフルオロプロピル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジルメタクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル誘導体等のアクリル系モノマーが用いられる。
【００１１】
上記疎水性モノマーとしては、より好ましくは、後述するように重合による粒子形成と磁性体形成とを同時進行するため、粒子重合中に高濃度に金属イオンを取り込む能力に優れたグリシジル基を有するアクリル系モノマーが用いられる。即ち、上記アクリル系モノマーの中でも、特にグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）は鉄イオン及びマグネタイトとの親和性が高いため特に好適に使用される。
【００１２】
上記疎水性モノマーとしては、架橋性単量体も使用できる。上記架橋性単量体としては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ジアリルフタレート及びその異性体、トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体等が挙げられる。これら架橋性単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用しても良い。
この中でも、エチレングリコールジ（メタ）アクリレートは鉄イオン及びマグネタイトとの親和性が高いため好適に使用される。
【００１３】
＜親水性モノマー＞
上記親水性モノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸などの重合性不飽和結合を有するカルボン酸；重合性不飽和結合を有するリン酸エステル；重合性不飽和結合を有するスルホン酸エステル；ジメチルアミノエチルメタクリレート４級塩、ジエチルアミノエチルメタクリレート４級塩などのアクリロイル基を有するアミンの塩；ビニルピリジン等のビニル基を有する含窒素化合物の塩などのカチオン基を有するビニル系単量体；２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、メチロールアクリルアミド、グリセロールメタクリレート（ＧＬＭ）などの非イオン性ビニル系単量体等が挙げられる。これら親水性モノマーは、単独で用いてもよく、２種以上を併用しても良い。この中でも、下記一般式で表されるポリエチレングリコール（メタ）アクリレートは、水中で粒子を安定に分散する能力が高く、磁性体の形成を妨げないので好適に使用される。
ＣＨ２＝ＣＲ−ＣＯＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈ
式中、ＲはＨ又はＣＨ３を表し、ｎは２〜２０の整数を表す。ｎの好ましい下限は２であり、好ましい上限は１０である。
【００１４】
上記磁性体は、粒子を形成させる重合過程において粒子内部で金属イオンが酸化して形成したものであるのが好ましい。
＜金属イオン＞
上記金属イオンは、磁性体を形成するものであれば特に限定されないが、好ましくは、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン等であり、より好ましくは、鉄イオンである。磁性体であるマグネタイトは塩化第２鉄を酸化剤等で酸化して得られる。
【００１５】
上記磁性体の平均粒径は１〜３０ｎｍである。１ｎｍ未満であると、磁性体の磁性応答特性が減少し、免疫測定に使用した際に測定感度が低下し、定性・定量分析が行い難くなる。また、３０ｎｍを超えると、磁性体内包粒子内での分散性が低下し、磁性が不均一になり、この場合も免疫測定に使用した際に定性・定量分析が行い難くなる。好ましい下限は２ｎｍであり、好ましい上限は２０ｎｍである。さらに、好ましい上限は１０ｎｍであり、このような微小な磁性体粒子を形成するのは通常困難であるが、後述する製造方法のように、粒子を形成する工程と金属イオンを粒子中に取り込みながら金属イオンを酸化して磁性体を形成する工程とを同時進行させることにより、微小な磁性体を形成することが可能となる。
【００１６】
本発明の磁性体内包粒子は、その内部に上記磁性体を分散状態で含有している。即ち、本発明の磁性体内包粒子においては、磁性体が粒子表面に露出することなく、粒子内部に分散した状態で存在している。
【００１７】
本発明の磁性体内包粒子の磁性体含有量は、その重合組成により０．１〜４０重量％の範囲で調整するのが好ましい。０．１重量％未満であると、磁性体内包粒子の磁性応答特性が減少し、免疫測定に使用した際に測定感度が低下し、定性・定量分析が行い難くなる。また、４０重量％を超えると、粒子の重合操作性が低下し、粒子重合中に金属イオンを取り込み難くなる。好ましい下限は１重量％であり、好ましい上限は３０重量％である。
【００１８】
本発明の磁性体内包粒子の平均粒径は、その重合条件により０．０５〜１μｍの範囲で調整するのが好ましい。０．０５μｍ未満や１μｍを超えると、磁性体内包粒子の粒子形状の制御及び重合操作がしづらくなり、また、０．０５μｍ未満では免疫測定法に適用した際に測定感度が低下し、定性・定量分析が行い難くなり、１μｍを超えると免疫測定法に適用した際に、分散液において凝集により経時で粒子が沈降し易くなり、この場合も定性・定量分析が行い難くなる。好ましい下限は０．０７μｍであり、好ましい上限は０．８μｍである。
【００１９】
本発明の磁性体内包粒子は、水系溶媒中において疎水性モノマー及び／又は親水性モノマーを重合して粒子を形成する工程と、上記粒子中に金属イオンを取り込みながら上記金属イオンを酸化して磁性体を形成する工程とからなり、上記粒子を形成する工程と上記磁性体を形成する工程とを同時に進行させる方法により製造される。このような製造方法もまた、本発明の１つである。
【００２０】
水系溶媒中において疎水性モノマー及び／又は親水性モノマーを重合して粒子を形成する工程においては、重合開始剤を添加するのが好ましい。
＜重合開始剤＞
上記重合開始剤としては特に限定されず、例えば、水溶性の有機アゾ化合物、無機過酸化物、有機過酸化物等が挙げられる。
上記重合開始剤の好適な例としては、過硫酸カリウム（ＫＰＳ；重合温度７０℃）、アゾビスアミジノプロパン塩酸塩（Ｖ−５０；重合温度７０℃）、２，２−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジハイドロクロライド（ＶＡ−０４４；重合温度６０℃）等が挙げられる。このうち、過酸化物系重合開始剤であるＫＰＳは、重合開始とともに２価の鉄イオンの酸化に寄与することを期待して、モノマーと鉄イオンによる、重合とマグネタイト生成との同時進行を想定している。また、Ｖ−５０及びＶＡ−０４４は酸化力が弱く、２価の鉄イオンの緩やかな酸化反応に関与する重合開始剤となる。
上記重合開始剤は、Ｆｅ２＋の酸化による消費やＦｅ３＋によってラジカル活性を失う場合があるため、重合による粒子成長を促す目的で、粒子成長過程に後添加することが有効である。この場合、新たな２次粒子は形成されず、粒子表面がポリマーで被覆される。
【００２１】
＜ｐＨ調整剤＞
本発明において、重合と同時に磁性体を形成するにあたっては、重合系内のｐＨを塩基性に調整することが重要となる。例えば、重合開始剤としてＫＰＳを用いた系では、メリットとして水中での分散安定性がよく、粒径分布の狭い単分散粒子が得られるが、デメリットとして酸化力の制御ができず、重合系内が酸性になるために、得られる磁性体内包粒子が磁石への引き寄せられ方の弱い粒子になることがある。一方、重合開始剤として酸化力を持たないＶＡ−０４４を用いた系でのメリットは、重合系内のｐＨがほぼ中性であることである。
重合系内のｐＨを弱塩基性に保つには、ｐＨ調整剤として一般的な塩基を使用することができる。好適にはＮＨ４ＯＨがｐＨ調整剤として使用される。
上記ｐＨ調整剤は、必要に応じて数回添加することができる。
【００２２】
＜重合方法＞
本発明の磁性体内包粒子は、懸濁重合、分散重合、乳化重合、ソープフリー乳化重合等の粒子重合法が使用できるが、得られる磁性体内包粒子のＣｖ値は５％以下であることが好ましいので、粒径分布の制御に優れたソープフリー乳化重合により好適に製造される。
以下、ソープフリー乳化重合による磁性体内包粒子の製造方法を例示するが、この方法に限定されるものではない。
【００２３】
代表的な重合組成は、以下のとおりである。
親水性モノマー／疎水性モノマー／反応性乳化剤からなるモノマー組成物：３ｇ
Ｈ２Ｏ：１００ｇ
四つ口フラスコに上記モノマー組成物及び水を秤量する。それぞれの口には攪拌棒、還流冷却管を取り付ける。次に、重合開始剤としてＫＰＳとＶ−５０を用いる系では７０℃の、ＶＡ−０４４を用いる系では５０℃〜６０℃の恒温槽に入れ、攪拌しながら系内を窒素置換する。その後、水に溶かした重合開始剤を注射筒で系内に注入する。この時点を重合開始とし、所定時間後に注射筒を用いて磁性源となるＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏの水溶液を注入する。ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏは重合開始剤の１／３〜４倍モルを水５ｇに溶かしたものを使用する。即ち、重合開始剤により上述のモノマーの重合を開始するとともに２価の鉄イオンの酸化（マグネタイト化）を行うことにより磁性体内包粒子を製造する。
重合は開始から２時間〜２４時間行うことが好ましい。適度な酸化力を得るために、重合途中にＮＨ４ＯＨを加えてもよく、更に、重合による粒子の成長を促すために、重合途中に重合開始剤を加えてもよい。この様にして磁性体を内包した高分子粒子である磁性体内包粒子を得ることができる。
【００２４】
上記反応性乳化剤は共重合モノマーであり、必要に応じて添加してもよい。
＜反応性乳化剤＞
上記反応乳化剤としては、例えば、下記一般式で表される反応性乳化剤類が挙げられ、これら反応性乳化剤は、単独で用いてもよく、２種以上を併用しても良い。
【００２５】
【化１】
2004163421.tif 000002
【００２６】
得られた磁性体内包粒子は、残存モノマー、重合開始剤、未反応の鉄イオン等を取り除くために遠心分離・再分散を蒸留水で繰り返し行うことで精製する。遠心分離を行った後、上澄みをデカンテーションにより捨て、蒸留水を加え、ガラス棒により再分散を行う。精製後、ガラス製バイアルに移し、ふた・パラフィルムで密閉・保存する。
【００２７】
本発明の磁性体内包粒子は免疫測定用に非常に適しており、磁性体内包粒子に抗原又は抗体を吸着又は結合させることにより免疫測定用粒子を得ることができる。このような免疫測定用粒子もまた、本発明の１つである。
本発明の磁性体内包粒子に抗体又は抗原を吸着又は結合させる方法としては特に限定されず、例えば、物理吸着法やカルボジイミドを用いた化学結合法等公知の方法を使用することができる。
【００２８】
本発明の磁性体内包粒子又は本発明の免疫測定用粒子は、免疫測定法に好適に用いることができる。
上記免疫測定法としては、例えば、磁性体内包粒子を坦体として用いたラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ等公知の方法が挙げられ、サンドイッチ法や競合法により、目的とする抗原又は抗体を測定することができる。また、上記方法の標識物質であるアイソトープ、酵素等の代わりに、磁性体内包粒子を標識として用いることができる。
【００２９】
本発明の磁性体内包粒子は、磁性体を均一に分散含有する粒径分布の狭い粒子であるので、本発明の磁性体内包粒子を用いることにより磁性体を標識とする免疫測定法において感度よく精密に測定することができる。即ち、測定しようとする抗原又は抗体と特異的に反応する抗体又は抗原を磁性体内包粒子に結合させた免疫測定用粒子を用い、この免疫測定用粒子と測定しようとする抗原又は抗体とを反応させた後、反応した免疫測定用粒子における磁性体内包粒子の磁性量を測定することにより、測定しようとする抗原又は抗体を定性的かつ定量的に測定することができる。
【発明の効果】
【００３０】
請求項１に記載の発明の磁性体内包粒子は、内部に平均粒径１〜３０ｎｍの磁性体を含有しているので、磁性体の磁性応答特性に優れているとともに、磁性体内包粒子内での磁性体の分散性にも優れており、即ち、磁性体内包粒子は、磁性が均一で、かつ、磁性応答特性に優れたものであり、さらに、粒径分布も狭く粒径が均一なものである。故に、測定感度等が要求される免疫測定用として好適に使用できるものであり、免疫測定法において免疫反応に寄与した磁性体内包粒子の磁性を測定することにより、優れた測定感度で、定性的のみならず定量的に免疫測定を行うことができる。また、表面が有機高分子物質から形成されているので、抗原又は抗体を確実に結合させることができる。
請求項２に記載の発明の磁性体内包粒子及び請求項３に記載の発明の磁性体内包粒子は、磁性体が粒子内部で金属イオン、好ましくは鉄イオンが酸化して形成されたものであるので、磁性体内包粒子内に確実かつ均一に磁性体が取り込まれており、免疫測定法に要求される測定感度を確実に発現することができる。
請求項４に記載の発明の磁性体内包粒子は、磁性体内包粒子を構成する有機高分子物質がアクリル系モノマーであるので、重合による粒子形成が確実に行われるとともに、重合による粒子形成と磁性体形成とを確実に同時進行させることができる。故に、磁性体内包粒子は、磁性が均一であり、かつ、粒径分布も狭く、免疫測定法においてより優れた測定感度を発現することができる。
請求項５に記載の発明の磁性体内包粒子は、磁性体内包粒子を構成する有機高分子物質がグリシジル基を有するアクリル系モノマーであるので、磁性体を形成するのに好適な鉄イオン及びマグネタイトとの親和性に優れており、故に、磁性体内包粒子は磁性体がより均一に分散されたものとなり、免疫測定法に要求される測定感度がより優れたものとなる。
請求項６に記載の発明の磁性体内包粒子は、磁性体内包粒子を構成する有機高分子物質が特定の疎水性アクリル系モノマーと親水性アクリル系モノマーとの組合せであるので、粒子重合中に金属イオンを均一に取り込み易いだけでなく、磁性体内包粒子の分散安定性にも優れており、故に、分散液において凝集により経時で粒子が沈降することがなく、かつ、超音波処理等の余分な工程を必要とせず、免疫測定法などにおいて優れた測定感度を発現することができる。
請求項７に記載の発明の磁性体内包粒子は、平均粒径が０．０５〜１μｍであるので、重合操作がし易く、即ち、上記のような磁性体内包粒子が確実に得られる。
請求項８に記載の発明の磁性体内包粒子は、磁性体の含有量が０．１〜４０重量％であるので、優れた磁性応答特性を均一かつ確実に発現することができ、免疫測定法により好適に適用することができる。また、重合操作もし易く、上記のような磁性体内包粒子が確実に得られる。
請求項９〜１３に記載の発明の製造方法は、粒子を形成する工程を磁性体を形成する工程とを同時進行させているので、上記の磁性体内包粒子を容易かつ確実に得ることができる。
請求項１４に記載の発明の免疫測定用粒子は、担体である磁性体内包粒子が内部に平均粒径１〜３０ｎｍの磁性体を含有しているので、磁性が均一で、かつ、磁性応答特性に優れたものであり、さらに、粒径分布も狭く粒径が均一なものである。また、表面が有機高分子物質で形成されているので、抗原又は抗体が確実に結合されている。故に、測定感度等が要求される免疫測定法に好適に使用できるものであり、免疫測定法において免疫反応に寄与した免疫測定用粒子における磁性体内包粒子の磁性を測定することにより、優れた測定感度で、定性的のみならず定量的に免疫測定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１〜７）
２００ｍｌの四つ口フラスコに表１に示す各種モノマー及び水９０ｇを秤量した。それぞれの口には攪拌シールと攪拌棒、還流冷却管、セラムラバーを取り付けた。系を７０℃の恒温槽に入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら系内を３０分間窒素置換した。その後、水に溶かした重合開始剤であるＫＰＳ  ０．０６ｇを１０ｇの水に溶解し注射筒で系内に注入した。この時点を重合開始とし、２分後に注射筒を用いて所定量のＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ水溶液を注入した。重合は重合開始から２０時間行った。適度な酸化力を得るために、重合途中にＮＨ4ＯＨ  ０．１６５ｇを加えた。
作製した粒子は、遠心分離・再分散を蒸留水で４回繰り返し行うことで精製した。この際、遠心分離は２０℃、１３５００ｒｐｍで行った。遠心分離を行った後、上澄みをデカンテーションにより捨て、蒸留水を加え、ガラス棒により再分散を行って磁性体内包粒子を得た。
【００３３】
【表１】
2004163421.tif 000003
【００３４】
表中の記載は以下のとおりである。
ＧＭＡ：グリシジルメタクリレート
ＥＧＤＭ：エチレングリコールジメタクリレート
ＡＡｍ：アクリルアミド
ＰＥ−９０：ポリエチレングリコールメタクリレート（ｎ＝２）
ＰＥ−３５０：ポリエチレングリコールメタクリレート（ｎ＝８）
ＮＥ−２０：
【００３５】
【化２】
2004163421.tif 000004
【００３６】
（式中、ＸはＨを表す。）
【００３７】
ＳＥ−２０：
【００３８】
【化３】
2004163421.tif 000005
【００３９】
（式中、ＸはＳＯ４ＮＨ４を表す。）
【００４０】
得られた磁性体内包粒子分散液について、目視で粒子の分散状態を観察した。また、精製した磁性体内包粒子を水で希釈し、金属メッシュで支持したコロジオン膜上に沈着固定して、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により、粒子の形態を観察した。
【００４１】
実施例１は、一部凝集塊が認められ、時間が経つにつれて粒子が沈降する分散安定性のやや低いものであったため、超音波処理により再分散した。一方、親水性モノマーとしてポリエチレングリコールメタクリレートを用いた実施例２〜５、及び、反応性乳化剤を用いた実施例６、７は、いずれも凝集塊が認められず、分散安定性の高い粒子が得られた。特に、反応性乳化剤を用いた実施例６、７は、粒子サイズが小さく、分散安定性が優れていることが認められた。また、実施例１〜７の粒子は、いずれも粒子内部に磁性体を含み、粒子表面がきれいな輪郭であることが観察された。図１に実施例２の磁性体内包粒子のＴＥＭ写真（平均粒径；磁性体内包粒子０．２１μｍ、磁性体５ｎｍ）を示した。
【００４２】
作製した磁性体内包粒子（実施例１〜７）は、磁石へ引き寄せられることの確認として１．５ｍｌのマイクロチューブに少量取り、蒸留水で適当に希釈して磁石つきマイクロチューブ立て（ＤＹＮＡＬ社製、ＭＰＣ（登録商標）＿Ｍ）にチューブを立てて、分散している粒子が磁石に引き寄せられることを目視により確認した。特に、親水性モノマーとしてポリエチレングリコールメタクリレートを用いた実施例２〜５は、他の実施例に比べ磁力が大きいことがうかがえた。各実施例における磁性体内包粒子の磁性体の平均粒径を表２に示した。
【００４３】
【表２】
2004163421.tif 000006
【００４４】
（実施例８）
２００ｍｌの四つ口フラスコに下記に示す各種モノマー及び水を秤量した。
ＡＡｍ／ＧＭＡ／ＥＧＤＭ／Ｈ2Ｏ＝０．１５／２．８３５／０．０１５／９０（ｇ）
それぞれの口には攪拌シールと攪拌棒、還流冷却管、セラムラバーを取り付けた。系を７０℃の恒温槽に入れ、２００ｒｐｍで攪拌しながら系内を３０分間窒素置換した。その後、水に溶かした重合開始剤であるＫＰＳ  ０．０６ｇを１０ｇの水に溶解し注射筒で系内に注入した。この時を重合開始とし、所定時間後に注射筒を用いてＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ水溶液（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．１６５ｇを水５ｇに溶解）を注入した。重合開始１分後に適度な酸化力を得るためＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ＝０．１６５／５（ｇ）を加え、２時間重合を行った。
【００４５】
作製した粒子は、遠心分離・再分散を蒸留水で４回繰り返し行うことで精製した。この際、遠心分離は２０℃、１３５００ｒｐｍで行った。遠心分離を行った後、上澄みをデカンテーションにより捨て、蒸留水を加え、ガラス棒により再分散を行って磁性体内包粒子を得た。
【００４６】
（実施例９）
重合開始後、所定時間に下記物質を添加したこと、重合時間が３時間であること以外は実施例８と同様に磁性体内包粒子を得た。
重合開始３０分後  ＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ＝０．１６５／５（ｇ）
重合開始６０分後  ＫＰＳ／Ｈ２Ｏ＝０．１６５／５（ｇ）
【００４７】
（実施例１０）
重合開始後、所定時間に下記物質を添加したこと、重合時間が３時間であること以外は実施例８と同様に磁性体内包粒子を得た。
重合開始６０分後  ＫＰＳ／Ｈ２Ｏ＝０．１６５／５（ｇ）、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ＝０．０８８／５（ｇ）
重合開始１２０分後  ＧＭＡ＝０．５（ｇ）、ＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ＝０．１６５／５（ｇ）
【００４８】
（実施例１１）
重合開始後、所定時間に下記物質を添加したこと、重合時間が４時間であること以外は実施例８と同様に磁性体内包粒子を得た。
重合開始１分後  ＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ＝０．１６５／５（ｇ）
重合開始１２０分後  ＫＰＳ／Ｈ２Ｏ＝０．１６５／５（ｇ）
【００４９】
得られた磁性体内包粒子（実施例８〜１１）に対し、ＴＥＭによる粒子の形態観察を行なった。
実施例９、１０は、いずれも、実施例８よりも多くの磁性体を含み、粒径が増大していることが認められた。また、実施例１１では、内部に実施例９、１０と同程度の磁性体を含み、粒子表面がきれいな輪郭であることが観察された。これまでの実験より、粒子成長の速い段階でＮＨ4ＯＨを加えることは、成長を阻害する要因になっていることが推測された。一方、重合開始剤の後添加は、重合率がほぼ１００％になり、また、２次粒子が形成されず粒子表面がポリマーで覆われていることが観察され、有効な手段であることが確認された。各実施例における磁性体内包粒子の磁性体の平均粒径を表３に示した。
【００５０】
【表３】
2004163421.tif 000007
【００５１】
さらに、実施例２で得られた磁性体内包粒子から免疫測定用粒子を作製し、免疫測定を行った。
（免疫測定用粒子の作製）
実施例２で得られた磁性体内包粒子３０ｍｇにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）６ｍｌを加え、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行った。得られた沈渣に、抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液を１ｍｌ加え、室温にて２０時間撹拌混和した。その後、未反応の抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を除去するために１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行い、さらに、得られた沈渣をリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）６ｍｌに懸濁させ、再度１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行った。その後、得られた沈渣を、牛血清アルブミンを１重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液６ｍｌに懸濁させ、室温で１時間撹拌してブロッキング処理を行い、抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体が磁性体内包粒子に結合された免疫測定用粒子を得た。
次に、得られた免疫測定用粒子を冷蔵保存するため、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行い、得られた沈渣を、牛血清アルブミンの濃度が１重量％になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）に溶解し、さらに、アジ化ナトリウムを０．０１重量％の濃度になるように溶解した溶液６ｍｌに懸濁させ、すぐに冷蔵保存した。
【００５２】
（試験片の作製）
ニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ、日本ミリポア社製）を幅３０ｃｍ×長さ６ｃｍに裁断し、その長さ方向上端より３ｃｍの部位（反応部位）に、上記免疫測定用粒子で用いたものとは異なる反応エピトープを有する抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を２．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにトリス塩酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．４）に溶解した溶液を幅０．７ｍｍの直線状に塗布した。その後、３７℃で２時間乾燥した後、牛血清アルブミン（和光純薬社製）を１重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液に１時間浸漬し、ブロッキング処理を行った。さらにその後、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムを０．１重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液にて洗浄後、シリカゲルデシケーター内で室温下にて乾燥し、抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体固定化膜を得た。
得られた抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体固定化膜を幅５ｍｍに裁断し、長さ方向上端に幅５ｍｍ×長さ２ｃｍの吸水用ろ紙（日本ミリポア社製）を重ね、透明なテープで固定して試験片とした。
【００５３】
（免疫測定の実施）
リン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）に上記免疫測定用粒子を０．１重量％の濃度になるように溶解し、さらに牛血清アルブミンを１重量％の濃度になるように溶解し、さらにアジ化ナトリウムを０．０１重量％の濃度になるように溶解した溶液を作製し、該溶液２０μｌを９６ウェルマイクロプレート（ナルジェヌンクインターナショナル社製）の各ウェルに添加した。
次に、ＨＢｓ抗原標準品（５０ＩＵ／ｍｌ）を所定の濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）で希釈し、各々１００μｌをウェルに添加混合後、試験片をウェル内に入れ、立位するように立てた。
３０分後、試験片を取り出した所、反応部位においてＨＢｓ抗原濃度に応じた磁性が確認され、磁性を標識とする免疫測定法に有用であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】実施例２の磁性体内包粒子（平均粒径；磁性体内包粒子０．２１μｍ、磁性体５ｎｍ）のＴＥＭ写真である。
【図１】
2004163421.tif 000008