(57)【要約】      （修正有）【課題】  凝集アッセイをより高い速度及び精度で行うことができる自動化されたシステムを提供する。【解決手段】  凝集又はサイズ分離手段を有するアッセイを行うための装置であって、アッセイされる流体を受け入れるための第一セクション；及びアッセイされる流体を流体に対する動力、好適には遠心力の適用によって第一セクションから受け入れる第二セクションを含み、第二セクションは、支持体に対して固定化され且つ流体を混合して凝集した粒子を捕捉するために適合せしめられた要素を含んで成る。好適な実施態様において、アッセイされる流体は血液である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝集又はサイズ分離手段を有するアッセイを行うための装置であって：
アッセイされる流体を受け入れるために配置された第一セクション；及び
前記流体に対する動力の適用により当該流体を前記第一セクションから受け入れるために配置された第二セクションを含んで成り、ここで、当該第二セクションは、支持体に対して固定化され、そして前記流体を混合し且つ凝集した粒子を捕捉するために適合せしめられた要素を含んで成る、装置。
【請求項２】
前記第二セクションから流体を受け入れるために配置された第三セクションを更に含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記アッセイが更に凝集手段を必要とする、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記要素が柱状の形状である、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記柱の断面が円形であるかあるいは楕円形状である、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記柱の断面が、上流方向に向かい菱形もしくは三角の先端を伴い菱形形状かあるいは三角形状である、請求項４に記載の装置。
【請求項７】
前記各柱の直径が、当該柱の全長のある方向に沿って実質的に一定である、請求項４に記載の装置。
【請求項８】
前記柱が円錐である、請求項４に記載の装置。
【請求項９】
前記支持体が前記要素のためのハウジングを含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記装置が平面形状を有し、ここで、前記第一、第二及び第三セクションが当該装置中、流路として配置されている、請求項２に記載の装置。
【請求項１１】
前記装置がスライド又は回転できるディスクを含んで成る、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記第一セクションの、流体が流れる方向に対し平行する幅が第二セクションよりも広い、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記要素が一緒に、前記第一セクションから第三セクションに至る方向で、より近接して配置されている、請求項２に記載の装置。
【請求項１４】
前記第一セクションと第二セクションとの間に配置され且つ流体を混合するために適合せしめられた増強セクションを更に含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記第一セクションを第二セクションから分離し且つ流体の通過を動力が適用されることによってのみ可能にするよう適合せしめられている静止型バルブを更に含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記静止型バルブが、一組のバッフル又は表面張力によって流体を維持する狭い領域を含んで成る、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記第一セクションが底部表層を有するチャンバーを含んで成り、そして前記第二セクションが第一セクションの底部表層よりも高い底部表層を有する、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記静止型バルブが、第一セクションと第二セクションの間に配置され且つ第一と第二セクションの底部表層を連結する段差を含んで成る、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記第一セクションが更に、アッセイされる流体を収納するための第一亜セクション及び第二流体を収納するための第二亜セクションを含んで成る、請求項１に記載の装置。  
【請求項２０】
前記第一及び第二亜セクションは、アッセイされる流体と第二流体が動力の適用によって組み合わさることを可能にするために配置されたバッフルによって分離されている、請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
第一セクションと第二セクションの間に配置された増強領域を更に含んで成り、ここで、当該増強領域は、粒子の接近を促し凝集反応の強度の増強を生じさせるために流体が流れる流路（path）に広がる突起を含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項２２】
動力を適用する手段を更に含んで成り、ここで、当該動力は、１又は複数の電場、磁場、流体力学的な力、流体静力学的な力、重力、遠心力、光学的な力及び熱の力である、請求項１に記載の装置。
【請求項２３】
挿入体の形態である第一及び第二セクションを維持するためのキャリアーを更に含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項２４】
前記装置が中心軸を有するディスクの形態であり、そしてここで前記第一、第二及び第三セクションがそれぞれ、当該ディスク中、中心軸からある方向における流路として配置されている、請求項２に記載の装置。
【請求項２５】
前記装置が更に、複数の第一、第二及び第三セクション並びに当該複数の第一、第二及び第三セクションを維持するためのキャリアーを含んで成る、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記装置が更に、複数のキャリアーを含んで成り、ここで当該複数のキャリアーは中心軸の周囲に配置されている、請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
前記装置が更に、前記装置が中心軸の周囲を回転するための駆動部を含んで成る、請求項２４に記載の装置。
【請求項２８】
前記装置が更に、前記装置が中心軸の周囲を回転するための駆動部を含んで成る、請求項２６に記載の装置。
【請求項２９】
アッセイされる流体の凝集を検出するための検出器を更に含んで成る、請求項１に記載の装置。
【請求項３０】
前記検出器が光学検出器である、請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
凝集又はサイズ分離手段を有するアッセイを行うための装置であって：
中心軸を有する光ディスク；
アッセイされる流体を受け入れるために配置された第一セクション、ここで、当該第一セクションは、アッセイされる流体を提供する流体エントリーポートを含む；
前記流体に対する動力の適用により前記第一セクションから流体を受け入れるために配置された第二セクション、ここで当該第二セクションは、支持体に対して固定化されそして前記流体を混合し且つ凝集した粒子を捕捉するために適合せしめられた要素を含んで成る；
前記第二セクションから流体を受け入れるために配置された第三セクション、ここで、当該第一、第二及び第三セクションはそれぞれ、前記ディスク中、中心軸から任意の方向における流路として配置されている；
前記装置が前記中心軸の周囲を回転するための動力；並びに
光学検出器、
を含んで成る装置。
【請求項３２】
分離されるかあるいは凝集せしめられる粒子を有する流体をアッセイするための方法であって：
（a）アッセイされる流体を請求項１に記載の装置の第一セクション中に提供し；
（b）前記流体に対して動力を適用し、当該流体を前記第一セクションから第二セクションへと移動せしめ、ここで、当該第二セクションは、支持体に対して固定化され、そして流体を混合し且つ当該流体中の粒子を捕捉するために適合せしめられた要素を含んで成り；並びに
（c）前記流体の特性を測定する、
ことを含んで成る方法。
【請求項３３】
血液をアッセイするための方法であって：
（a）血液を請求項１に記載の装置の第一セクションへと供給するかあるいは入れ；
（b）試薬を提供し；
（c）前記試薬と血液とを組み合わせ；
（d）前記組み合わさった試薬と血液に対して動力を適用し第一セクションから第二セクションへと移動せしめ、ここで、当該第二セクションは、支持体に対して固定化され、そして当該血液と試薬とを混合し且つ凝集した血球を、もしあれば、捕捉するために適合せしめられた要素を含んで成り；そして
（e）前記血液の凝集の程度を、もしあれば、測定する、
ことを含んで成る方法。
【請求項３４】
前記動力が遠心力である、請求項３３に記載の血液をアッセイする方法。
【請求項３５】
前記装置が回転できるディスクである、請求項３４に記載の血液をアッセイする方法。
【請求項３６】
前記試薬がヒト又は動物源に由来する１又は複数の抗体である、請求項３３に記載の血液をアッセイする方法。
【請求項３７】
前記アッセイが、ABO血液型判定、Rhタイピング、抗原表現型決定、ABO血清型判定、抗体の検出及び同定、交差試験及び滴定である、請求項３３に記載の血液をアッセイする方法。
【請求項３８】
血液を凝集せしめるための方法であって：
（a）第一チャンバー中へと血液を提供するかあるいは入れ；
（b）試薬を提供し；
（c）前記試薬と血液とを組み合わせ；
（d）前記組み合わさった試薬と血液に対して動力を適用し、前記第一セクションから第二チャンバー中へと移動せしめることを含んで成り、ここで、当該第二チャンバーは、支持体に対して固定化され、そして当該血液と試薬とを混合し且つ凝集した血球を捕捉するために適合せしめられた要素を含んで成る方法。
【請求項３９】
コンピュータと連動するコンピュータプログラムによって行われている、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３１に記載の方法を行うために設定された、コンピュータが読み込むことができるプログラムコードを有するコンピュータが使用可能な媒体を含んで成る製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は凝集アッセイの分野に関連し、そして詳細には凝集又はサイズ分離手段を有するアッセイを行うために有用な装置、及び凝集体、詳細には赤血球を分離するために有用な装置に関連する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血液型血清学には、輸血又は患者に関連する器官を移植する前に、血液供与者と患者受容者との間での血球適合性の特定が必要になる。血球細胞の適合性は、患者の血清中に含まれている抗体と供与者由来の血液細胞上に存在する抗原との間での免疫反応がないことによって決定されている。あらゆる個体の赤血球の表層上で多くの異なる血液型抗原が発見されている。血液型判定は、一般に、赤血球を、どのような抗原が存在しそして不在であるかの特定をするために試験する方法である。これは一般に既知の特異性の抗体を使用することによって達成されている。
【０００３】
患者の血清又は血しょう中の抗体を検出するために、既知の抗原を有する血液球を含有する試薬が血清試料と混合されている。反応物は、赤血球の抗原に対するそれらの抗体が存在する場合に赤血球の凝集を生じさせる十分な時間に渡りインキュベートされる。次いで、前記混合物は遠心され、そしてもし凝集した血球が存在するならば、かかる凝集体は反応容器の底部にて明らかに見て分かり、従って、赤血球上の既知の抗原に対して向けられる抗体の試料中での存在を示す。もし赤血球上の既知の抗原に対して向けられる抗体が試料中に存在していなければ、凝集は生じず、このことは、遠心後に凝集した赤血球が無いことによって示される。
【０００４】
一層最近、凝集反応が容器の一部で行われ、そして凝集した赤血球の分離は、凝集した細胞を試薬／試料混合物中の他の要素から分離するマトリクスを使用することで同容器の他の部分で行われているシステムが開発されている。１つのかかるシステムは、米国特許第５，６５０，０６８号及び５，５５２，０６４号（どちらも件の出願の所有者によって共有されている）中に開示及び記載されている。これら特許のそれぞれの内容は本明細書中に参照によって組み込まれている。かかる凝集反応及び分離容器（前記出願において開示され、発明においても有用である）は、Ortho−Clinical Diagnostics Inc.、Rartin、New JerseyによってBIOVUE（登録商標）の下で市販されている。かかる反応容器は、上方チャンバー及び下方チャンバーを有するカラムの形態であり、ここで当該上方チャンバーは下方チャンバーよりも直径が大きい。前記下方チャンバーは、凝集した細胞を凝集しなかった細胞から分離するためのマトリクスを含む。前記下方チャンバーの直径は、試薬及び試料がピペットを使用し典型的に上方チャンバーに対して加えられた場合に当該試薬及び試料が上方チャンバー中に残り、そして更なる力が適用されない限りは下方チャンバーへと入り込むことが無いよう十分に狭い。
【０００５】
Coombs試験として公知の間接抗グロブリン試験は、赤血球の表層上の特定抗原に対するIgG抗体が患者の血清中にあるかどうかを特定するために使用されている。Coombs試験では、抗体を赤血球の表層上の抗原に対して結合せしめるために、血清は試薬赤血球の存在下でインキュベートされる。これらのIgG抗体は往々にして殆ど、それら自身では、赤血球を凝集しないかあるいは常用の技術により視覚的に検出するには不十分な程度でのみそれらを凝集せしめる。ヒトIgGに対して向けられた第２抗体の添加は、可視凝集を促すために通常欠かすことができない。
【０００６】
所定の抗原が赤血球の表層上に存在しているかどうかを特定するために使用される血液試験の赤血球タイピングにおいて、分析される赤血球は上方チャンバーに対して加えられ、しかる後に、遠心力の適用によって、それらは特定の赤血球抗原に対する抗体及び分離マトリクスが入っている下方チャンバーの方へと移動せしめられる。もし、赤血球がそれらの表層上に１又は複数の抗原を有するならば、下方チャンバーにおいて特定の抗体と結合し、凝集体が形成されて当該マトリクスにより分離されるであるだろう。
【０００７】
他の種類の血液アッセイ、例えば、患者の血清中で赤血球抗原に対し直接凝集する抗体がアッセイされるリバースタイピングにおいては、患者の血清及び表層上の抗原は既知である試薬赤血球が上方チャンバーに対して加えられて、液体媒体及び分離マトリクスが入っているが抗体は入っていない下方チャンバー中へと反応物を移動せしめるために遠心力が適用される。このアッセイでは、患者の血清中で直接凝集する抗体の存在が、前記マトリクスによって分離される凝集体が生産されるであるだろう。
【０００８】
他の種類の血液アッセイでは、赤血球抗原に対し既知の特異性を有する試薬抗体が患者の赤血球と一緒に上方チャンバー中に配置されるであるだろう。もし前記試薬抗体が直接凝集する抗体であるならば、予備インキュベーションを伴わずに、遠心力が適用されて、内容物が、水溶液中に分離マトリクスが入っている下方チャンバー中へと入る力が加えられるであるだろう。次いで、凝集体が前記マトリクスによって分離されるだろう。代わりの方法は、患者の赤血球が上方チャンバー中へと配置され、そして既知の特異性を有するIgG試薬抗体が加えられ、しかる後にインキュベーションをし、当該抗体を赤血球表層上の予定抗原に対して結合せしめる。インキュベーション後、反応物を、分離マトリクス及び上方チャンバー中で赤血球をインキュベートするのに使用するIgG試薬抗体に対して特異的な抗IgG抗体が入っている下方チャンバー中へと移動せしめるために遠心力が適用される。もし、試薬抗体が患者の細胞の表層上に存在しているならば、下方チャンバー中の抗IgG抗体が、前記マトリクスによって分離されるであるだろう凝集体の生産を促す。
【０００９】
試料及び試薬が、赤血球タイピング試験の場合の直接凝集、Coombs試験の場合は抗体−抗原反応、のいずれかを可能にする十分な時間に渡りインキュベートされた後、反応容器は、反応物がカラムの下方部へと押し出されそして分離マトリクス上に至るよう遠心される。前記遠心の結果、凝集しなかった物質は分離マトリクスを通過し、他方、凝集した細胞は分離マトリクスの先端上に残るかるいあるいは凝集の程度に応じてマトリクス内に分配される。より強い凝集反応は分離マトリクスのより上方部分に残る細胞をもたらし、その一方でより弱い凝集反応は当該マトリクスの先端から様々な距離での凝集体の分布をもたらす。
【００１０】
インキュベーション段階中、カラムの上方部分における試料及び試薬の保持力は、カラムのより下方部分の上部（ここでは、直径が上方部分に対して減少している）の余裕部分（top margin）に渡る表面張力によりもたらされている。このカラムを使用してアッセイを行う際のポテンシャル表層の欠陥の２つの潜在的ソースが確認されている。第一に、もし試薬及び試料が過度の力により直接、反応チャンバーの中心に分注されるならば、インキュベーション段階中、反応物は下方チャンバー中のゲルマトリクスの先端に対して直接配置され、そして上方チャンバー中には残らない。従って、反応物は凝集が終了する前に分離カラム中へと入り始めるであるだろう。第二番目に、分離マトリクスを含む希釈物又は溶液が上方チャンバーに入りうる可能性がある。このことは、例えば、容器の輸送及び取り扱い中の跳ね上げ及び他の撹乱により生じうる。分離マトリクスを含む溶液もしくは希釈物が、試験の結果に直接の影響を及ぼす抗体もしくは他の試薬をも含むいくつかの場合、かかる跳ね上げは、他のカラムに由来する所定の試薬によりカラムの交差汚染をもたらしうる。このようなことは、使用者がピペットを反応チャンバー中へと挿入し、チップが跳ねた試薬で汚染され、そしてそれがピペットにより他の容器へと移されうる場合に生じる。このことは凝集アッセイの間違い結果につながる。
【００１１】
赤血球判定を決定するための上記の伝統的な方法（赤血球の膜タンパク質の多型差に関する試験）は、赤血球（全血かあるいは生理懸濁流体液中の細胞の懸濁のいずれか）とヒトもしくは動物の抗体もしくはレクチンを含有する流体とを混合することによって行われている。先に論じたように、陽性反応の終点は、赤血球膜構造に対して特異的な抗体の存在下での赤血球のクランピングによる凝集を検出することである。そのような凝集をしない赤血球は、試験した膜構造、又は血液型が、特異性を欠いているかあるいは陰性であると考えられる。かかる試験はスライドガラス又は試験管、最も常用には１０×７５mmもしくは１２×７５mmの試験管において内で行われている。赤血球の並置、従って反応の速度を加速せしめるために、試験が試験管で行われる場合には、遠心され、その結果当該管を穏和に振とうすることによって沈降した赤血球が懸濁せしめられる。伝統的に、凝集が流体媒体内で確認された場合、この結果の解釈は主観的でありそして非常に熟練且つ熟知した技師を必要とする手段であると考えられる。
【００１２】
抗体と赤血球の流体混合物が混合され、そして当該混合物は、凝集した細胞を凝集しなかった細胞から分離を可能にする多孔性マトリクスにより篩分ける前に、ある時間に渡りインキュベートされる方法が最近記載された。一般に、凝集しているかあるいはクランピングしているこれらの細胞は、小孔により篩い分けられることはないだろうし且つ多孔性物質の表層上で捕捉されるであるだろう。その一方で、凝集しなかった細胞は多孔性物質によりろ過されるであるだろう。このような試験の方法は、凝集した細胞を凝集しなかった細胞から見分けるために最小限の特別なトレーニングを必要とし、そして自動装置によって容易に読み込むことができる。前記篩分け物質は、例えば、小球状ゲル又はガラスビーズ、グラスウールもしくはグラスファイバーなどの様々な粒子によって作製されて良く、Sephacryl（登録商標）（Amersham Pharmacia Biotech AB）又はガラスビーズが最も一般的である。かかる物質及び方法の記載は、La Pierre らの米国特許第５，４６０，９４０号及び５，４９１，０６７号に記載されており、その両方は全体を参照として組み込まれている。
【００１３】
本明細書中で先に論じたように、前記篩分け物質は、凝集した赤血球を凝集しなかったものから分離することを目的としている。一般原理は、篩い分け効果であり、多孔性物質（ガラス、Sephycryl（登録商標）又は他のアッセイの化学に対して適切な物質）の球間を重力もしくは遠心力下で無効空間（spatial−void）もしくは通路を通じ運動するように赤血球懸濁が投与される。これらの通路のサイズは、固体球状粒子のサイズによって決定されている。実際には、平均ビーズサイズが５０ミクロン、従って２５〜７５ミクロンの粒子サイズ幅を有するSephycryl（登録商標）が球間での適切なサイズの通路を形成することが示されている。このサイズの通過経路は凝集していないヒト赤血球を捕捉することはできないが、血液型判定の血清学的性能基準のために重要である、凝集した様々なサイズの細胞を捕捉することができる。平均直径サイズ７０〜８０ミクロンのガラスビーズを用いた場合に類似する結果が確認されている。従って、形成された通路は、方向及び充填密度に依存して幅が６〜１５ミクロンのオーダーであるように決定されている。
【００１４】
凝集検出の原理を使用する最も一般的な２つの血液型判定法の共通点は、篩分け機構であり、例えば、Sephycryl（登録商標）又はガラスビーズは、試験容器から独立した物であり、かかる容器は往々にして管／ミクロチューブ又はカラム／ミクロカラムを意味する。これら篩い分け因子は、試験容器内に挿入される製剤溶液内の固体粒子として混合されているかあるいは、液体製剤が添加される前又は後のいずれかに当該容器内に配置されている。適切な通過サイズを確実化にするために、形の堅さを維持する必要性は重要な検討材料である。
【００１５】
Virtanen（米国特許第６，０３０，５８１号）は、血液検体試験を行うための光ディスク形態を開示している。アッセイの性質に依存して、開示されたディスクは、流体保存手段、流体移動手段の多くの要素、例えば、１又は複数のキャピラリー管、バルブ、バッテリー、分析装置、カラム、フィルター、電場の源、ワイヤー又は他の電気伝導性手段、例えば、金属表層堆積物（metalic surface deposit）などを含む。
【００１６】
WO９７／２１０９０は、オンボード情報学を伴うミクロフルイディスクシステム中で流体移動を駆動するために求心力を使用する装置を開示する。
【特許文献１】米国特許第５，６５０，０６８号
【特許文献２】米国特許第５，５５２，０６４号
【特許文献３】米国特許第５，４６０，９４０号
【特許文献４】米国特許第５，４９１，０６７号
【特許文献５】米国特許第６，０３０，５８１号
【特許文献６】国際特許出願WO ９７／２１０９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
発明の概要
本発明の目的は、上記の公知技術の不利な点を解消することである。本発明の他の目的は、管及びチャンバー凝集試験の実施に関連する上記の潜在的欠陥を回避することである。本発明の他の目的は、凝集によってアッセイを行うための、詳細には血液血液型タイピングをするための改良された方法及び装置を提供することである。凝集アッセイをより高い速度及び精度で行うことができるシステム、詳細には自動化されたシステムを提供することが本発明の更なる目的である。
【００１８】
本発明の前記及び更なる目的は、凝集又はサイズ分離手段を有するアッセイを行うための装置を提供する本発明の１つの観点によって達成されている。その装置には：アッセイされる流体を受け入れるために配置された第一セクション；及び前記流体に対する動力の適用により第一セクションから流体を受け入れるために配置された第二セクションが含まれ、当該第二セクションは、支持体に対して固定化され、そして前記流体を混合し且つ凝集した粒子を捕捉するために適合せしめられた要素を含む。好適な実施態様において、前記要素は柱状として成形されている。他の好適な実施態様では、第三セクションが第二セクションの後に供されており、そして装置はディスク、好適には中心軸を有する光ディスクの形態であり、ここで、前記第一、第二及び第三セクションはそれぞれ、前記ディスク中、当該中心軸からある方向における流路として配置されている。
【００１９】
本発明の他の観点は、凝集又はサイズ分離手段を有するアッセイを行うための装置を提供する。前記装置は以下のものを伴う。それは；中心軸を有する光ディスク；アッセイされる流体を受け入れるために配置された第一セクション、当該第一セクションはアッセイされる流体を供するための流体エントリーポートを伴う；前記流体に対する動力の適用により第一セクションから当該流体を受け入れるために配置された第二セクション、当該第二セクションは、支持体に対して固定化されそして流体を混合し且つ凝集した粒子を捕捉するために適用された要素を含む；前記第二セクションから流体を受け入れるために配置された第三セクション、ここで、前記第一、第二及び第三セクションはそれぞれ、前記ディスク中、当該中心軸からある方向における流路として配置されている；当該装置を中心軸の周りで回転させるための駆動力；そして光検出器を含む。
【００２０】
本発明の他の観点は、分離されるかあるいは凝集せしめられる粒子を有する流体をアッセイするための方法を供する。前記方法は：アッセイされる流体を先に記載した装置の第一セクション中へと供給し；前記流体を第一セクションからを第二セクション中へと移動せしめるために当該流体に対して動力を適用し、ここで当該第二セクションは、支持体に対して固定化されそして流体を混合し且つ流体中の粒子を捕捉するために適用された要素を含み；そして流体の特性を測定すること、を含む。好適な実施態様において、アッセイされる流体は血液である。本発明の他の観点は、血液を凝集せしめるための方法を供し、それは：血液を第一チャンバーへと提供するかあるいは入れ；試薬を提供し；当該試薬と血液とを結合せしめ；結合した試薬と血液を第一セクションから第二セクション中へと移動せしめるために動力を適用することを含む。前記第二チャンバーは、支持体に対して固定化され、そして血液と試薬とを混合し且つ凝集した血液細胞を捕捉するために適合せしめられた要素を含む。
【００２１】
本発明の他の観点は、上記方法を行うために設定されたコンピュータが読み込むことができるプログラムコードを有するコンピュータ使用に適した媒体を含む製造物を提供する。
【００２２】
本発明の更なる目的、特徴及び利点は、好適な実施態様の詳細な事項から当業者に明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
好適な実施態様の詳細な説明
背景の節で記載されているように、公知のカラム凝集技術（CAT）プラットフォームは、ビーズ（BioVue（登録商標）など）又はゲル（DiaMed（登録商標）／MTS（登録商標））を、様々なサイズの凝集体を分離するための装置として使用する。各凝集レベル／強度（即ち、０、＋１、＋２、＋３及び＋４）により遠心下でカラム下方へ様々な距離で移動する。次いで、凝集バンドは、血液銀行の技術者によって視覚的にかあるいはAutoVue（登録商標）などの装置によって自動的に、検出されて段階分けされる。本発明は、本発明を記載する例示の実施態様として、ヒト赤血球の血液タイピングをするためにカラム凝集技術（CAT）を使用する。しかし、この開示中で記載された本発明は、ヒトの赤血球に限定されることはなく、むしろ、例えば溶液中のラテックス粒子を測定するアッセイ測定の場合に凝集又はサイズ分離が必要な任意の微粒子検体に対して適用されて良い。
【００２４】
本明細書中で使用されている場合、「血液」とは全血又は全血の任意の成分、例えば、赤血球、血しょう、血清などを幅広く含む。
【００２５】
本発明の装置は、アッセイされる流体を受け入れるための第一セクション、及び当該アッセイされる流体を当該流体に対する動力の適用によって第一セクションから受け入れる第二セクションを含む。前記第一セクションは任意の構造、例えば、タイピングされる血清又は血しょう及び対応する試薬などの流体を受け入れて保持できるチャンバーなどであって良い。好適な実施態様において、前記装置はディスク、例えば、コンパクトディスクなどの光ディスク（CD−ROM）構造において形成されていてこれら３つ全てのセクションはディスク中で流路として形成されている。しかし、他の構造、例えば、ガラススライド又はプラスチックスライド、あるいはこれらの技術の変形も使用できうる。好適な実施態様において、第一セクションは、２つのセクションにわけられており、それは例えば、試料受け入れセクションと反応物受け入れセクションである。動力を適用する迄、流体が混入するのを避けるために２つのセクションの間にはバッフル又はプレートが入れられていて良い。動力の適用により、流体は、バッフル又はプレートを超えて且つ周辺へと追いやられ互いに密接に接触する。代わりに、第一セクションは単一のチャンバーのみを有しても良い。この場合、流体が第一セクションに対して、例えば、当該第一セクションのカバーの開口部を通じて加えられた場合、混合は、当該流体を撹拌すること及び混ぜあわせることよって生じるであるだろう。
【００２６】
前記装置の第二セクションは、第一セクションに類似していて良い。この第二セクションは表面張力を利用するサイズにされていて良い。即ち、前記第二セクション（又は当該第二セクションに対する入り口）は、流体が、求心力のような動力の適用を伴わずに重力又は毛管作用によって単独で侵入することがないようなサイズにされていて良い。
【００２７】
第二セクションにおける重要な特徴は、要素が支持体に対して固定化されていることである。前記要素は、CAT装置において慣用的に使用されているビーズ又はゲルに代わりうる。ビーズ生成の製造上の問題である、サイズ決定及び仕上げ及び製造上の欠陥は、本発明では、ビーズ、ビーズ様粒子又はゲルを使用しないので非常に減少している、又は好適には除かれている。CATカセットにビーズ又はゲルのいずれかを充填する問題も取り除かれており、そして泡の生成を引き起こす輸送環境の問題も除去されているかあるいは非常に減少している。
【００２８】
要素の形体及び凝集した粒子の、例えば凝集した赤血球を分離する働きができる要素間の距離のみが要求される。例えば形態は、支持体表層又は基材に対して結合し且つそれから起立する円柱であって良い。この要素は、列をなして構成編成されて良く、流体が柱の並びを通り抜けて流れる場合に、列をなし近接する柱間を赤血球及び凝集体が直線的通過で流れないようにするため、当該柱の位置は、オフセットされている。柱間の距離は、巨大な凝集体のみを捕捉するためにある領域においては更に離れていて良く、そしてこの距離は、例えば、様々なサイズの凝集体を選択的に分離するために下流に向かって次第に減少して良い。要素のために適した他の形状としては、三角形状、菱形形状、又は円錐形状の柱が挙げられうる。
【００２９】
前記要素は、支持体に対して固定化されている。前記支持体は、第二セクションのチャンバー壁であって良いかあるいは、第二セクション中へと使用前のある時点で挿入される予め形成された挿入体であって良い。要素は、射出成形などによって、ワンピースで支持体へと形成できうる。支持体から要素を機械加工又はエッチングするなどの代替方法も挙げられうる。適切な方法を使用することによって、凝集体を特定のパターンに分離するために適切なサイズの要素及び流路を形成することが可能である。例えば、凝集した赤血球の場合、要素は、互いに１０ミクロン未満の距離で平面表層基材に広がっていて良い。赤血球が凝集している好適な実施態様において、要素は４０〜８０ミクロンの直径を有し且つ当該要素間の距離は７〜１５ミクロンである。本発明の更なる利点は、凝集反応が増強されているかあるいは増幅されており、従って弱い陽性の検出が一層信頼可能になる。その理由は、反応セクション及び分離セクションが一層完全に反応せしめることを可能にし、従って弱い陽性の反応を増強／増幅するからである。
【００３０】
好適な実施態様において、バルブは第一帯と第二帯の間に位置している。前記バルブの好適な機能は、流体を第一セクションから次のセクションへと移すこと及び移動中の混合を促すことである。前記バルブの他の有効な機能は、流体を第一セクション中に予め所望された条件が到達する迄、例えば所定の力の適用迄、保持することである。好適には、前記バルブは静止型バルブである。前記静止型バルブは、この機能を達成するのに十分な任意の構造でありうる。例えば、好適な実施態様において、前記静止型バルブは一連の段差又は隆起である。
【００３１】
好適な実施態様において、増強セクション又は帯は、第一セクションと第二セクションの間に位置している。これは、凝集の過程で、赤血球などの粒子を含む流体の更なる混合を供する帯である。これは、流体の乱流を増やし且つ凝集反応などの反応の強度を増強せしめるために粒子の接近の増加を生じる。前記増強セクションは、当該セクションにより流体の流れを干渉する突起又は他の構造を含んで良い。例えば、増強セクションはバッフルを含んで良い。
【００３２】
好適な実施態様において、本発明は、第二セクションから流体及び又は凝集体を受け入れるために当該第二セクションの下流に位置する第三セクションをも含む。
【００３３】
他の好適な実施態様において、本発明は、前記装置のセクションを入れるためのハウジングをも含みうる。いくつかの実施態様において、前記ハウジングがそれ自体で前記セクションのためのチャンバーを形成する。即ち、前記ハウジング及びチャンバーはワンピース構造体である。他の実施態様において、セクションチャンバーは、ハウジングから分離できる構造、例えば、図１２a及び１２bに例示したような挿入体であって良い。好適な実施態様において、前記ハウジングは、中心軸を有するディスク、もし光検出が使用されているならば、好適には光ディスク、例えば、下に更に詳細に説明したようなCD−ROM装置であって良い。他の実施態様において、前記ハウジングはスライドできる。
【００３４】
本発明の他の観点において、前記装置は１又は複数の、好適には複数の、第一、第二及び第三セクション、並びに複数のセクションを維持するためのキャリアーを含む。前記キャリアーは、複数のセクションを、流体を第一セクションから第二セクションへと移動せしめる動力が適用できる限り、任意の好適な方法で配置されて良い。配置は横並び、又は好適には、図４に示されているように中心軸の周囲に配置できうる。好適な実施態様において、前記キャリアーは、横並び配置で前記セクションを維持し、そして複数のキャリアーが図３に示されているように中心軸の周囲に配置されている。前記セクション及び／又はキャリアーが中心軸の周囲に配置されている場合、前記動力は、１又は複数のキャリアーを回転せしめることによって生じた求心力によって都合良く提供されうる。好適な実施態様において、キャリアーは、米国特許第６０３０５８１号（その全体は参照として組み込まれている）に記載されているような公知のCD形態にある。
【００３５】
凝集の存在及び／又は凝集の程度の検出は、当業者に公知の検出スキームを使用することで行われて良い。例えば、検出は、AutoVue（登録商標）装置など公知の装置上で使用されている現在の検出システムに類似しているだろう。他の検出方法において、凝集複合体はg−力（又は適用されている他の動力）、凝集体のサイズ、及び分離領域の孔又は開口部のサイズに依存する速度で分離領域を移動する。前記装置を遠心中に複数回画像化することによって、この速度が決定されて良く、それは当該画像を加工すること及び凝集体を出発点及び分離領域の長さに対し位置決定することによる。加えて、最後の位置も決定される。
【００３６】
もし、光画像化が使用されているならば、それは「出発」システム、又はスキャンニングシステムのいずれかによって行われうる。違いは、結像光学系の構造と画像を集めるために画像ピクセルを前処理することにある。ピクセル解像度及び試料速度は、必要最小の写像性と画像輪郭決定を一致せしめるために決定されている。
【００３７】
他の検出方法も使用されて良い。例えば、凝集複合体が鉄粒子、蛍光化合物、色素生産性化合物（即ち、OPD又はTMB）又は放射性追跡子などのマーカーを含むようにアッセイは構成されて良い。次いで、検出は、磁気検出、容量測定、光密度測定、光画像化、分光測光、又は放射線測定などの方法により行われうる。本発明の構造及び設計はこれら代替法を可能にする。
【００３８】
ある好適な検出方法において、前記装置は、光を遮らない（optically clear）物質及びある程度の色を有する粒子からなるディスクであり、従って光学手段の有無で、結果を視覚的に読み込むことができる。この好適な方法において、検出はディスクがもはや動いていなくなった後に生じるだろう。このディスクは、動きを供する装置、例えばローター上にある間に読み込まれて良いかあるいは、取り出されて照明を背にして読み返されて良い。
【００３９】
他の実施態様において、自動読み込み、例えば、先に記載した光画像化が使用されて良い。自動読み込みにより、結果はディスクがローター上にある間に決定されて良い。１つの実施態様において、光学検出装置が前記ディスクの上又は下のいずれかに位置しており、それの、ディスクの対応する領域（即ち、第二及び第三セクション）のビューは、ビューされる領域の全長を走るスリットの全体に渡る。ビュー領域は、ディスクの逆側から照射されている。検出器は、スリット全長を通じて光又は色の透過性の程度を同時に識別する。次いで、この読み込みは、光学系が、前記スリットのある領域から他の領域に至る光透過又は光の干渉を比較できるような方法で小像現に分割される。次いで、光分析のサメーションが論理プログラムによって生じ、陽性の結果と陰性結果が識別される。自動読み込みの利点とは、ディスクが動いている間に結果を分析することが可能なことである。従って、スリットは、動力、例えば遠心力の全体的な適用によりビューされて良い。このことは、遠心時間及び／又は遠心速度が調節されている間にスリット領域における特定の位置での凝集／非凝集塊の位置と流速とを比較することによって、任意の試験で行われる複数の計算を可能にする。このことは、確定される最終結果を生み出し、従って全ての静止読み込みを廃止する。代わりに、運動結果と静止結果が最終結果のために組み合わされても良い。
【００４０】
動力は、流体を装置中に移動せしめることができる全ての力であって良く、そして、電場、磁場、流体力学的な力、流体静力学的な力、重力、遠心力、光学的な力及び熱による力などが挙げられる。好適には、前記力は遠心力である。
【００４１】
本発明の装置は、複数の試料の凝集を特定するためのシステム中で使用されて良い。例えば、前記システムは、前記装置及び複数のキャリアー、例えばCDを含む。キャリアー輸送は、当該キャリアーに試料及び／又は試薬を詰めることも伴う。試料及び試薬を分注及び位置決めするステーションも試料及び試薬と共に装置に搭載することができうる。前記システムは更に、インキュベーター、流体に対して動力を適用するための遠心器、検出器及び読み込み装置をも含んで良い。関連コントロールコンポーネント、例えば、コントローラー、コンピュータ端末及びデータ入力ドライバも含まれて良い。
【００４２】
本発明は、流体、例えば血液をアッセイするための方法をも供する。概して、分離又は凝集せしめられる赤血球又はラテックス粒子などの粒子を有する全ての流体が本発明によりアッセイされて良い。本発明のある実施態様において、流体は上記装置の第一セクション中へと供給されるかあるいは単に第一チャンバー中へと入れられる。もし必要ならば、試薬、例えば、抗体も供給されて良い。次いで、流体を上記チャンバーの第一セクションから第二セクションへと移動せしめるために動力が当該流体に対して適用されるかあるいは、単に第二チャンバーに対して適用される。前記第二チャンバーは、流体を混合して流体中の粒子を捕捉するために当該第二チャンバーのある部分に対して固定化された要素を有する。前記動力は、好適に、第二セクション又はチャンバーを上記のように回転せしめ、遠心力の適用をもたらすことによって適用されている。第二セクション又は第二チャンバーを含む装置は、好適には光を透過する回転ディスクである。流体が第二セクション又は第二チャンバー全体を移動した後、もしあれば、流体中に存在する粒子の分離が生じ、そして流体の特性、例えば、血液凝集の場合は分離の程度、の測定が行われて良い。この測定は、特定のアッセイが行われるために任意に必要でありうる。
【００４３】
血液に対して行われうる多くのアッセイとしては、ABO血液型判定、Rhタイピング、抗原表現型決定、ABO血清型判定、抗体の検出及び同定、交差試験及び滴定が挙げられる。
【００４４】
好適な実施態様において、上記方法は、コンピュータと連動するコンピュータプログラムによって実行されて良く、それは当該方法を行うために設定されたコンピュータが読み込むことができるプログラムコードを有するコンピュータが使用できる媒体を含む。
【００４５】
概して、本発明は、上記の方法を使用することで単に流体を凝集又は分離するために使用されても良いが、分離された流体に対して最終測定を必ず行う必要はない。
【００４６】
参照は、図中に示されている好適な実施態様の詳細な説明を作製するためであるだろう。図１に示されている実施態様は、検体と試薬との最初の相互作用のためのチャンバー（１）を含む。インキュベーション時間の最後に、この装置は、遠心により回転し、従って、前記試薬及び検体を含む液体、例えば血しょうが、分離及び検出領域から出た液体を必要になるまで維持する働きをする静止型バルブ（２）を超えて通過する。前記静止型バルブは、反応チャンバー（１）中の溶液を、例えば、表面張力、又は物理的緩衝作用によって収容する。装置の遠心が静止機構を超え且つ検体及び試薬を増強セクション（３）及び分離セクションに侵入せしめる。前記増強セクション（３）が粒子の接近を促す働きをし、凝集反応の強度を増強せしめる。前記分離セクション（４）は、凝集複合体がサイズごとに分離されるよう所定の開口部サイズを有する固定化されたバリア又は要素からなる。前記開口部のサイズはアッセイの目的、及び凝集複合体の予測されたサイズ及び分布に応じて、変わるかあるいは一定でありうる。前記バリアの形は、円柱、円錐、菱形又は長方形、及び凝集体をサイズによって分離する任意の形状であって良い。
【００４７】
先に記載したように、図１に示されている実施態様における検出は、事実上、その性質が公知の装置において使用されている検出に類似している。反応チャンバー及びカラムが一体化されており、そして液量及び凝集バンドの位置は、検出ソフトウェアと連携した光学システムにより特定されている。前記装置は、視覚的な調査及び検出も可能なものである。図２は期待される形の例示である。
【００４８】
詳細には、図２において、液量はメニスカス（６）の位置によって検出され、そして凝集領域は（７）によって表示されている。液量検出は、十分な試薬と検体試料を確実に加えるためには必須である。凝集複合体の強度及びサイズは、遠心後の分離領域（４）の全長に沿ったその位置によって決定されている。
【００４９】
図２は、他の方法をも示す。凝集複合体（７）は、g−力、凝集体のサイズ及び分離領域の孔又は開口部のサイズに依存した速度で分離領域を通過する。遠心中、装置を複数回画像化せしめることによって、この速度が特定されて良い。それは画像の加工並びに出発点及び分離領域の全長に対しての凝集複合体の位置を決定することによる。加えて、最終的な位置も決定される。
【００５０】
光画像化は、「出発」システム、又は先に記載のスキャンニングシステムのいずれかによって行われて良い。
【００５１】
図３は、キャリアー上での装置の実施態様を示す。この場合、前記キャリアーが、６つの装置の１組を支える。図４は、アッセイを行うための装置を取り付ける第二の方法を示す。この場合、CD形態が使用されている。
【００５２】
図６に示されている実施態様は、図３に示されている実施態様の変形型である。図３において、スライドの末端の装置は、中心線に対しある角度をなすg力により分離領域の側方へと移動する凝集体を有しうる。図６に示す実施態様は、g力を分離領域の軸に沿って配向せしめることを可能にする変更である。
【００５３】
前記装置をキャリアー中、垂直な位置で搭載することによって、g力が常に当該キャリアーの軸と並列する。このようにして、凝集体は移動しないかあるいはチャンバーの側方に定着する。
【００５４】
図７に示されている実施態様は、図５中に示された基本的反応チャンバー設計に対する変形を示す。反応チャンバーは（１）で表示されている。二次反応チャンバー（９）は、分離カラムのための更なる試薬、又は予備加湿剤のために使用されて良い。検体及び試薬は入口（１１）及び（１２）を通じて加えられる。段差（１０）は図３に示された（２）の丸がついた種類である。スラローム又は増強セクション（３）、分離セクション（４）、及び分離チャンバー末端（５）は図３と同じである。丸みがついた段差（１０）及びスラローム又は増強セクション（３）は、流体が分離領域を通り移動する場合に、混合効率を高める働きをする。反応チャンバーフラップ（バッフル）（８）は、回転運動により流体の（１）から（９）への通過が生じる迄はg−力により流体を分離しておく。
【００５５】
図８は、バランシングウェル（１３）の追加を伴うコンパクトディスク（「CD」）、例えばCD−ROM形態を示す。これらのウェルは、全ての試料ウェルが使用されてはいない事象においてディスクの使用を可能にする。前記CD−ROM形態は、前記装置の表層上に刷り込まれた、又は刻まれた、又は型打ちされた、又はエッチングされたバーコード（１４）により試料、ウェル及びディスクの確実な同定を可能にする。加えて、凝集体に分離領域（４）を移動させるため、g−力を使用することが、リアルタイムでの反応のスキャンニングを可能にする（図９）。
【００５６】
図９には、本発明の装置及びキャリアーの他の実施態様の透視図が示されてる。図９に示されている実施態様において、反応チャンバーは、流体と試薬を分けるためにバッフル（８）により分割されている。そしてまた、流体及び試薬をロードするためのCD−ROMの上部の開口部（１５）も示されている。
【００５７】
図１０には、本発明の装置及びキャリアーの他の実施態様の透視図が示されてる。この実施態様は、反応チャンバー中にバッフルが示されていないこと以外は、図９に示されている実施態様に類似している。そしてまた、図１０に示されている実施態様において、この装置は、使用時にCDキャリアー中に挿入されるフタをされた挿入体の形態である。
【００５８】
図１１は、本発明の装置を含むシステムを示す。図１１に示す実施態様において、装置はCDキャリアー中にある。CDはCDスタック（２１）に搭載されている。CDローダー（２２）は前記CDを試料分注位置（２５）へと移動せしめ、ここで試料分注アーム（２６）が試料（２３）及び試薬（２４）を前記装置へとロードする。次いで、CDは「CDチェンジャー」（２７）にロードされ、それは、この実施態様において、インキュベーター、遠心器及び検出器を含む。図１１に示されている実施態様において、前記システムは、予め試薬を注入され提供されて良い。代わりに、前記試薬は、前記システムに対してアッセイが行われる時に加えられて良い。試薬の添加を分けて行うことの利点としては、コストをより下げること、棚寿命の延長、及び輸送中の取り扱いに対する注意を減らすことなどが挙げられる。
【００５９】
図１２a及び図１２bは、それぞれ、本発明の好適な実施態様の上面及び側断面図である。ここで前記装置（即ち、第一、第二及び第三セクション）は、光ディスクの場合にはキャリアー（３２）へと、個別に挿入できる着脱可能な挿入体（３１）である。
【００６０】
検体が血清又は血しょうであり、そして試薬が赤血球凝集体である好適な方法において、相対遠心力（rcf）は、懸濁中の赤血球を第一セクションから要素を含む第二セクションを通じ第三セクションへと移動せしめるのに十分であるだろう。遠心の速度は、赤血球の破壊又は損傷を避けるために制限されている。好適な実施態様において、可変速度モーターを伴う遠心器、例えば、Clay Adamsにより作製されたSero−fugeIIが使用されて良い。例えば、回転は１５〜３０秒に渡り、９００〜１０００g及び３０〜４５秒に渡り、５００〜６００g、そして最終的な回転は４５〜６０秒に渡り、９００〜１０００gであるだろう。他の実施態様において、例えば１００gで１０分に渡るようなより遅い定常回転が使用されて良い。
【００６１】
本発明の化合物、組成物及び方法に対する様々な変更及び変形がなされて良いことは当業者に明らかである。従って、このことは、かかる変更及び変形が付随の請求項の範囲内にあり且つそれらに等しいならば、本発明が網羅していることを意味する。
【００６２】
先に引用した刊行物の開示は、ある程度それぞれが独立しているかのように、参照によりそれらの全体を参照によって本明細書中に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の１つの観点の装置の上部断面図である。
【図２】本発明の他の観点の装置の上部断面図である。
【図３】本発明の他の観点の装置の、キャリアーを含む上部断面図である。
【図４】本発明の他の観点の装置の、キャリアーを含む上部断面図である。
【図５ａ】本発明の他の観点の装置の、部分、透視、側断面図である。
【図５ｂ】図５aに示す実施態様の分離要素を示す、装置の部分的な、上部断面図である。
【図６】本発明の他の観点の装置の、キャリアーを含む上部断面図である。
【図７】本発明の他の観点の装置の、キャリアーを含む透視上部断面図である。
【図８】本発明の他の観点の装置の、キャリアーを含む透視上部断面図である。
【図９】本発明の他の実施態様の装置の、キャリアーを含む透視図である。
【図１０】本発明の他の実施態様の装置の、キャリアーを含む透視図である。
【図１１】本発明の装置を含むシステムである。
【図１２ａ】本発明の装置の、キャリアーを含む透視上面図である。ここで前記装置は挿入体として設計されている。
【図１２ｂ】図１２aの装置の側断面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2004317489.tif 000013
【図１２ａ】
2004317489.tif 000014
【図１２ｂ】
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【外国語明細書】
2004317489000001.pdf