(57)【要約】【課題】転移性腫瘍等ヒトの遠隔腫瘍に対しても抗腫瘍効果を示すなど、癌に対する免疫療法が可能な抗腫瘍免疫反応を誘導できる腫瘍抗原のスクリーニング方法や、該スクリーニング方法により得られる腫瘍抗原や、それをコードする遺伝子等を提供すること。【解決手段】単純ヘルペスウイルス又は単純ヘルペスウイルスグリコプロテインを、腫瘍組織に直接投与して腫瘍特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を誘導し、かかる誘導された腫瘍特異的ＣＴＬｓと、腫瘍及び／又は精巣に由来するｃＤＮＡライブラリーとを用いたり、腫瘍特異的ＩｇＧを誘導し、かかる誘導された腫瘍特異的ＩｇＧを含む血清と、腫瘍及び／又は精巣に由来するｃＤＮＡライブラリーとを用いて、腫瘍抗原ペプチドをスクリーニングする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス又は単純ヘルペスウイルスグリコプロテインを、腫瘍組織に直接投与して腫瘍特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を誘導し、かかる誘導された腫瘍特異的ＣＴＬｓと、腫瘍及び／又は精巣に由来するｃＤＮＡライブラリーとを用いることを特徴とする腫瘍抗原のスクリーニング方法。
【請求項２】
単純ヘルペスウイルス又は単純ヘルペスウイルスグリコプロテインを、腫瘍組織に直接投与して腫瘍特異的ＩｇＧを誘導し、かかる誘導された腫瘍特異的ＩｇＧを含む血清と、腫瘍及び／又は精巣に由来するｃＤＮＡライブラリーとを用いることを特徴とする腫瘍抗原のスクリーニング方法。
【請求項３】
単純ヘルペスウイルスが、不活性化処理を施した単純ヘルペスウイルスであることを特徴とする請求項１又は２記載の腫瘍抗原のスクリーニング方法。
【請求項４】
単純ヘルペスウイルスグリコプロテインが、単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤであることを特徴とする請求項１又は２記載の腫瘍抗原のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の腫瘍抗原のスクリーニング方法により得られることを特徴とする腫瘍抗原。
【請求項６】
腫瘍抗原遺伝子Ｍ１Ｇ４１，Ｍ１Ｇ６０，Ｍ１Ｇ２，Ｍ１Ｇ３５，Ｍ１Ｇ１０３，ＭＩＧ１６９のいずれかがコードするタンパク質及び／又はペプチド、若しくはこれら腫瘍抗原遺伝子のヒトホモログがコードするＷｄ−ｒｅｐｅａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ−９，ｍｉｔｏｔｉｃ　ｋｉｎｅｓｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＰＡＧ６，Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ　１，Ｔｕｂｌｉｎ　ａｌｐｈａ　２　，ＳＭＣ４Ｌ１からなることを特徴とする請求項５記載の腫瘍抗原。
【請求項７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項８】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項９】
配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質及び／又はペプチド。
【請求項１０】
請求項５記載の腫瘍抗原をコードするＤＮＡ、又は該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質及び／又はペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のタンパク質及び／又はペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質及び／又はペプチド
【請求項１２】
配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質及び／又はペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項５〜９のいずれか記載の腫瘍抗原、又はタンパク質及び／若しくはペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１５】
請求項５〜９のいずれか記載の腫瘍抗原、又はタンパク質及び／若しくはペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
【請求項１６】
請求項５〜９のいずれか記載の腫瘍抗原、又はタンパク質及び／若しくはペプチドをコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損し又は前記遺伝子が過剰発現することを特徴とする非ヒト動物。
【請求項１７】
請求項５〜９のいずれか記載の腫瘍抗原、又はタンパク質及び／若しくはペプチドを有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【請求項１８】
請求項５〜９のいずれか記載の腫瘍抗原、又はタンパク質及び／若しくはペプチドによるインビトロ刺激により誘導された活性化Ｔ細胞。
【請求項１９】
請求項５〜９のいずれか記載の腫瘍抗原、又はタンパク質及び／若しくはペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部からなる癌の診断用プローブ。
【請求項２０】
請求項１９記載の癌の診断用プローブ及び／又は請求項１４記載の抗体を含有することを特徴とする癌の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）又はＨＳＶグリコプロテインを用いた腫瘍抗原のスクリーニング方法や該スクリーニング方法により得られる腫瘍抗原や、該腫瘍抗原の利用などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍特異的免疫誘導は、腫瘍再発を長期的に予防することができるが、このような免疫療法は、基本的に腫瘍特異的抗原の有無と、抗原を提示して腫瘍細胞を認識する細胞障害性免疫応答を誘導できるか否かに左右される。細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）は、共刺激分子と共に細胞表面に提示される細胞質タンパク質に由来するペプチドと複合するＭＨＣクラスＩ分子を認識する（非特許文献１参照）。腫瘍特異的抗原は、種々のヒト腫瘍から検出されている（非特許文献２，３参照）。癌ワクチンによる治療は、アジュバンド又はサイトカインと結合させて投与される不活性化させた腫瘍細胞、又はその溶解物の使用に焦点があてられてきた。最近、種々のサイトカイン、ＭＨＣ分子、共刺激分子又は腫瘍抗原を腫瘍細胞へ遺伝子導入することにより、免疫エフェクター細胞に対する腫瘍細胞の視覚感度（ｖｉｓｉｂｉｌｉｔｙ）が向上することが報告されている（非特許文献４参照）。ＨＳＶ等の腫瘍内への直接接種（インサイチュー癌ワクチン）により抗腫瘍免疫の誘導が可能になると、癌ワクチンを治療目的に使用する上での主要な問題点が克服される。すなわち、癌ワクチン作製のための患者の自家腫瘍細胞の採取、培養及び放射線照射などのインビトロ操作、或いは特異的腫瘍抗原の同定などの必要性が克服される。
【０００３】
ＨＳＶは２本鎖ＤＮＡウイルスで、核内で増殖するＤＮＡウイルスの中で最大長のゲノム（１５３ｋｂ）を有し、８４種のオープンリーディングフレームをコードする。ゲノムはＬ（ｌｏｎｇ）領域とＳ（ｓｈｏｒｔ）領域から構成され、各ユニーク配列をその両側に倒置反復配列が挟む形で存在する。ウイルスゲノムの全塩基配列が決定され、ほとんどのウイルス遺伝子の機能は解明されている。Ｍａｒｔｕｚａらは、γ３４．５遺伝子における欠失及びＩＣＰ６遺伝子へのｌａｃＺ遺伝子挿入により、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）の多重遺伝子の変異体である変異ヘルペスウイルスＧ２０７を開発した（非特許文献５参照）。Ｇ２０７は他のウイルスベクター類よりも治療上の観点において優れている。Ｇ２０７は分裂細胞において複製され、その結果感染細胞は溶解して死に至るが、非分裂細胞ではその増殖は顕著に弱まっている。無胸腺症マウスに樹立された腫瘍内にＧ２０７を接種すると腫瘍選択的複製によって腫瘍増殖が抑制され、マウスが延命された（非特許文献６参照）。また、免疫応答性マウスにおいてはＧ２０７を腫瘍内接種することにより腫瘍特異的免疫応答が誘導され、Ｇ２０７を接種しなかった腫瘍の増殖をも抑制する（非特許文献７参照）。この場合、Ｇ２０７がインサイチュー癌ワクチンとして機能している。現在まで、脳腫瘍を中心に変異ヘルペスウイルスＧ２０７を用いた遺伝子治療が行われ、米国で臨床応用も開始された（非特許文献８参照）。
【０００４】
また、ウイルスの不活性化方法として、加熱処理（非特許文献９参照）、紫外線照射（特許文献１参照）、γ線照射（特許文献２参照）、電子線照射（特許文献３，４参照）、加圧処理（特許文献５参照）、通電処理（特許文献６参照）などの物理的不活性化処理方法や、フェノール、ホルマリン、アルコールなどによる殺菌処理、アルカリ処理（特許文献７参照）、通常の酸素分子が電子的に励起されてエネルギー的に高い状態になった一重項酸素との接触（特許文献８参照）、ＤＮＡ分解酵素処理などの化学的不活性化処理方法や、これら物理的不活性化処理方法と化学的不活性化処理方法を併用する方法（特許文献９，１０参照）が知られている。
【０００５】
一方、ドイツのＰｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈ，Ｏｌｄらのグループにより、担癌患者の腫瘍細胞のｍＲＮＡから作製した蛋白質を患者の自己血清でスクリーニングするＳＥＲＥＸ法（非特許文献１０参照）が報告されており、その他、メラノーマ、腎癌、食道癌、大腸癌、肺癌等においてＩｇＧ抗体が認識する癌抗原を、上記ＳＥＲＥＸ法により単離した報告もなされている（非特許文献１１〜１６参照）。これらの抗原の中にはＣＤ８＋Ｔ細胞に認識されるものも報告されており（非特許文献１７参照）、ＳＥＲＥＸ法によりＣＤ８＋Ｔ細胞認識抗原が単離できる可能性が示されている。
【０００６】
【特許文献１】
特公昭４５−９５５６号公報
【特許文献２】
特開平２−９３６７号公報
【特許文献３】
特開平４−２００３５３号公報
【特許文献４】
特開平４−９２６７１号公報
【特許文献５】
特開平６−１４２１９７号公報
【特許文献６】
特開２０００−１７５６８２号公報
【特許文献７】
特開平９−１８７２７３号公報
【特許文献８】
特開平１１−１９９４９０号公報
【特許文献９】
特開平６−３２１９９４号公報
【特許文献１０】
特表平８−５０４４０７号公報
【非特許文献１】
Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　７，　４４５−４８０，　１９８９
【非特許文献２】
Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１２，　３３７−３６５，　１９９４
【非特許文献３】
Ａｄｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　５７，　２８１−３５１，　１９９４
【非特許文献４】
Ａｄｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　５８，　４１７−４５４，　１９９５
【非特許文献５】
Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　１　９３８，　１９９５
【非特許文献６】
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５５，　４７５２，　１９９５
【非特許文献７】
Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，　９，　２１７７−８５，　１９９９
【非特許文献８】
Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，　７，　８６７−８７４，　２０００
【非特許文献９】
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２２，　２３３−２３８，　１９８１
【非特許文献１０】
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９２，　１１８１０−１１８１３，　１９９５
“ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｂｙ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｌｏｎｉｎｇ”
【非特許文献１１】
Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　７２，　９６５−９７１，　１９９７
【非特許文献１２】
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５８，　１０３４−１０４１，　１９９８
【非特許文献１３】
Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　２９，　６５２−６５８，　１９９８
【非特許文献１４】
Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｏｎｃｏｌ．　１４，　７０３−７０８，　１９９９
【非特許文献１５】
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５６，　４７６６−４７７２，　１９９６
【非特許文献１６】
Ｈｕｍ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ　６，　３３−３９，　１９９７
【非特許文献１７】
Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１８７（２），　２６５−２７０，　１９９８
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
癌の転移は極めて治療困難な病態であり、現在まで有効な治療法はなく、限られた一部の化学療法剤に有効なものも報告されているが、その副作用が問題視されている。近年、ウイルスベクターを用いた遺伝子治療技術が飛躍的に発展したが、現在なお安全性の面では大きな問題を残している。本発明の課題は、転移性腫瘍等ヒトの遠隔腫瘍に対しても抗腫瘍効果を示すなど、癌に対する免疫療法が可能な抗腫瘍免疫反応を誘導できる腫瘍抗原のスクリーニング方法や、該スクリーニング方法により得られる腫瘍抗原や、それをコードする遺伝子等を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、ウイルスベクターによる癌治療の実用化においては、その使用上の安全性が基本的な前提条件であることに鑑み、野生型ＨＳＶに対して紫外線照射処理と熱処理を施し、完全に感染力が失われかつウイルスＤＮＡも破壊された不活化ＨＳＶを調製し、かかる不活化したＨＳＶをインサイチュー癌ワクチンとして腫瘍細胞株ＣＴ２６による悪性腫瘍組織に直接接種したところ腫瘍特異的免疫応答が誘導され悪性腫瘍が退縮し、また、直接接種しなかった遠隔悪性腫瘍に対してもその増殖を抑制することができることを見い出している（特願２００２−１３０２９４）。そこで、現在治療が困難とされているグリオーマ（悪性神経膠腫）を標的として、グリオーマ腫瘍組織にＨＳＶを直接投与することによりＣＴＬｓを誘導し、かかる誘導されたＣＴＬｓと、腫瘍由来のｃＤＮＡライブラリーとを用いて腫瘍抗原をスクリーニングし、新規の腫瘍抗原を見い出した。また、グリオーマ腫瘍組織にＨＳＶを直接投与した動物の血清と、精巣由来のｃＤＮＡライブラリーとを用いて腫瘍抗原をスクリーニングし、新たな腫瘍抗原を見い出した。本発明はかかる知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、単純ヘルペスウイルス又は単純ヘルペスウイルスグリコプロテインを、腫瘍組織に直接投与して腫瘍特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を誘導し、かかる誘導された腫瘍特異的ＣＴＬｓと、腫瘍及び／又は精巣に由来するｃＤＮＡライブラリーとを用いることを特徴とする腫瘍抗原のスクリーニング方法（請求項１）や、単純ヘルペスウイルス又は単純ヘルペスウイルスグリコプロテインを、腫瘍組織に直接投与して腫瘍特異的ＩｇＧを誘導し、かかる誘導された腫瘍特異的ＩｇＧを含む血清と、腫瘍及び／又は精巣に由来するｃＤＮＡライブラリーとを用いることを特徴とする腫瘍抗原のスクリーニング方法（請求項２）や、単純ヘルペスウイルスが、不活性化処理を施した単純ヘルペスウイルスであることを特徴とする請求項１又は２記載の腫瘍抗原のスクリーニング方法（請求項３）や、単純ヘルペスウイルスグリコプロテインが、単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤであることを特徴とする請求項１又は２記載の腫瘍抗原のスクリーニング方法（請求項４）に関する。
【００１０】
また本発明は、請求項１〜４のいずれか記載の腫瘍抗原のスクリーニング方法により得られることを特徴とする腫瘍抗原（請求項５）や、腫瘍抗原遺伝子Ｍ１Ｇ４１，Ｍ１Ｇ６０，Ｍ１Ｇ２，Ｍ１Ｇ３５，Ｍ１Ｇ１０３，ＭＩＧ１６９のいずれかがコードするタンパク質及び／又はペプチド、若しくはこれら腫瘍抗原遺伝子のヒトホモログがコードするＷｄ−ｒｅｐｅａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ−９，ｍｉｔｏｔｉｃ　ｋｉｎｅｓｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＰＡＧ６，Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ　１，Ｔｕｂｌｉｎ　ａｌｐｈａ　２　，ＳＭＣ４Ｌ１からなることを特徴とする請求項５記載の腫瘍抗原（請求項６）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項７）や、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（請求項８）や、配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質及び／又はペプチド（請求項９）や、請求項５記載の腫瘍抗原をコードするＤＮＡ、又は該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質及び／又はペプチドをコードするＤＮＡ（請求項１０）や、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、（ｃ）配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質及び／又はペプチドをコードするＤＮＡ（請求項１１）や、配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡ（請求項１２）や、請求項１２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質及び／又はペプチドをコードするＤＮＡ（請求項１３）に関する。
【００１１】
さらに本発明は、請求項５〜９のいずれか記載の腫瘍抗原、又はタンパク質及び／若しくはペプチドに特異的に結合する抗体（請求項１４）や、請求項５〜９のいずれか記載の腫瘍抗原、又はタンパク質及び／若しくはペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項１５）や、請求項５〜９のいずれか記載の腫瘍抗原、又はタンパク質及び／若しくはペプチドをコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損し又は前記遺伝子が過剰発現することを特徴とする非ヒト動物（請求項１６）や、請求項５〜９のいずれか記載の腫瘍抗原、又はタンパク質及び／若しくはペプチドを有効成分として含有する抗腫瘍剤（請求項１７）や、請求項５〜９のいずれか記載の腫瘍抗原、又はタンパク質及び／若しくはペプチドによるインビトロ刺激により誘導された活性化Ｔ細胞（請求項１８）や、請求項５〜９のいずれか記載の腫瘍抗原、又はタンパク質及び／若しくはペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部からなる癌の診断用プローブ（請求項１９）や、請求項１９記載の癌の診断用プローブ及び／又は請求項１４記載の抗体を含有することを特徴とする癌の診断薬（請求項２０）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の腫瘍抗原のスクリーニング方法としては、ＨＳＶ又はＨＳＶグリコプロテインを、腫瘍組織に直接投与してＣＴＬｓを誘導し、かかる誘導されたＣＴＬｓと、腫瘍及び／又は精巣に由来するｃＤＮＡライブラリーとを用いる方法、或は、ＨＳＶ又はＨＳＶグリコプロテインを、腫瘍組織に直接投与して腫瘍特異的ＩｇＧを誘導し、かかる誘導された腫瘍特異的ＩｇＧを含む血清と、腫瘍及び／又は精巣に由来するｃＤＮＡライブラリーとを用いる方法であれば特に制限されるものではない。
【００１３】
上記ＨＳＶとしては、野生型のＨＳＶ、不活性化処理されたＨＳＶ等を用いることができ、不活性化処理としては、公知のウイルス不活性化処理、例えば、加熱処理、紫外線照射、γ線照射、電子線照射、加圧処理、通電処理などの物理的不活性化処理方法や、フェノール、ホルマリン、アルコールなどの殺菌処理、アルカリ処理、ＤＮＡ分解酵素処理などの化学的不活性化処理方法や、界面活性剤の存在下での加熱処理など、これら物理的不活性化処理方法と化学的不活性化処理方法を併用する方法を挙げることができる。これらウイルスの不活性化処理の中でも、紫外線処理等のウイルスＤＮＡを破壊する処理と、熱処理等の感染力を喪失させるタンパク質の変性処理とを併用した不活性化処理が、癌ワクチンの安全性の面からして特に好ましい。かかる紫外線処理としては、生物の遺伝子に損傷を誘発する効果がある波長１９０〜３００ｎｍ遠紫外線、中でもＤＮＡ及びＲＮＡの塩基に吸収され、吸収された光量子エネルギーにより形成された、チミン−チミン、チミン−シトシン、シトシン−シトシン、ウラシル−ウラシル等の二量体により、細胞分裂の際の複製を停止させる２５４ｎｍの紫外線を用い、１〜１０Ｊ／ｍ２、好ましくは４Ｊ／ｍ２、５〜６０分間、好ましくは３０分間の照射処理を好適に例示することができ、また、熱処理としては、４５〜８０℃で５〜１０時間の加熱処理、好ましくは５６℃、３０分間の加熱処理を好適に例示することができる。
【００１４】
ＨＳＶとして、具体的には、ＫＯＳ株，Ｇ２０７株等のＨＳＶ−１及び１６９株等の単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）の野生株、不活性化処理株、遺伝子操作により変異処理を受けた変異株を挙げることができる。また、ＨＳＶグリコプロテインとしては、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の野生株の他、遺伝子操作により変異処理を受けた変異株、不活性化処理株に由来するｇＤ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＤ），ｇＢ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂ），ｇＣ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ）等のＨＳＶグリコプロテインを挙げることができるが、これらのなかでもｇＤを好適に例示することができる。これらＨＳＶグリコプロテインは、大腸菌等の細菌や酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞などを宿主細胞として用い、リコンビナント蛋白として好適に作製することができる。
【００１５】
本発明の腫瘍抗原としては、上記の本発明のスクリーニング方法により得られる腫瘍抗原であれば特に制限されないが、具体的には、表１に掲げるＭ１Ｇ４１，Ｍ１Ｇ６０，Ｍ１Ｇ２，Ｍ１Ｇ３５，Ｍ１Ｇ１０３，Ｍ１Ｇ１６９等のマウス腫瘍抗原遺伝子がコードするタンパク質又はペプチドや、Ｈｓ．２２５６７４；Ｗｄ−ｒｅｐｅａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ−９、Ｈｓ．２７０８４５；ｍｉｔｏｔｉｃ　ｋｉｎｅｓｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｈｓ．１５８２１３；ＳＰＡＧ６、Ｈｓ．２９０９；Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ　１、Ｈｓ．３４９６９５；Ｔｕｂｕｌｉｎ　ａｌｐｈａ　２、Ｈｓ．５０７５８；Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｏｆ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　４−ｌｉｋｅ　１（ＳＭＣ４Ｌ１）等の上記マウス腫瘍抗原遺伝子のヒトホモログがコードするヒトタンパク質又はペプチドを挙げることができる。また、本発明の腫瘍抗原として、配列表の配列番号２や配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチドも具体的に例示することができる。なお、本発明の腫瘍抗原の由来はヒトに限定されるものではない。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
本発明の対象となる腫瘍抗原としては、上記配列番号２や配列番号４に示されるタンパク質又はペプチドや、配列番号２や配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質又はペプチドを例示することができ、ここで免疫誘導活性とは、抗体産生、細胞性免疫、免疫寛容等の免疫反応を誘導する活性をいい、かかる免疫誘導活性の中でも、末梢血のＣＴＬｓ前駆細胞の頻度を上昇させるＴ細胞誘導活性を有するものが特に好ましい。なお、本発明のタンパク質及びペプチドの由来はヒトに限定されるものではない。
【００１８】
本発明の対象となるＤＮＡとしては、表１に示されるＭ１Ｇ４１，Ｍ１Ｇ６０，Ｍ１Ｇ２，Ｍ１Ｇ３５，Ｍ１Ｇ１０３，ＭＩＧ１６９等の腫瘍抗原遺伝子や該腫瘍抗原遺伝子のヒトホモログ、及びこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡ、並びに配列番号２や配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡ、配列番号２や配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡ、配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡ、或は該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡであれば特に制限されるものではない。かかる本発明の腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡの調製方法としては特に制限されるものではないが、例えば、腫瘍細胞株から得られたｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法により増幅したｃＤＮＡをλファージベクターに導入して大腸菌に感染させることによって作製した腫瘍細胞ｃＤＮＡライブラリーを、癌患者血清を用いてスクリーニングし、癌患者血清のみに反応し、健常人血清とは反応せず、癌を含む癌細胞に発現する抗原をスクリーニングすることにより得ることができる。
【００１９】
また、配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種腫瘍や由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、同効な目的とする免疫誘導活性を有するタンパク質及び／又はペプチドをコードするＤＮＡを得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２０】
本発明の腫瘍抗原は、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグと結合して用いることもでき、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した腫瘍抗原等の精製や、Ｔ細胞誘導活性を有するタンパク質の検出や、腫瘍抗原等に対する抗体の定量、癌の診断用マーカーなどとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２１】
本発明の腫瘍抗原に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明の腫瘍抗原又はその一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、グリオーマ等の診断、ミサイル療法等の治療ばかりでなく、グリオーマ等の悪性腫瘍の発症機構を明らかにする上で有用である。
【００２２】
また、本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明の腫瘍抗原若しくはエピトープを含むその断片、又は該腫瘍抗原を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６，　４９５−４９７，　１９７５）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４，　７２，　１９８３）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ，　７７−９６，　Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，　１９８５）など任意の方法を用いることができる。
【００２３】
上記一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４９４６７７８号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本発明の腫瘍抗原を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーで本発明のポリペプチドを精製することもできる。本発明の腫瘍抗原やその抗原エピトープを含むペプチドに対する抗体は、グリオーマ等の診断や治療に使用できる可能性がある。そして、これら抗体が特異的に結合する組換えタンパク質又はペプチドも、本発明の腫瘍抗原に包含される。
【００２４】
本発明はまた、上記本発明の腫瘍抗原を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子の宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら（ＢＡＳＩＣ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，　１９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，　２ｎｄ　Ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎ．Ｙ．，　１９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング　（ｓｃｒａｐｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
【００２５】
また、発現系としては、上記本発明の腫瘍抗原を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２６】
本発明において、上記本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、本発明の腫瘍抗原を発現する機能を失った非ヒト動物をいい、また、本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子の機能が染色体上で過剰発現する非ヒト動物とは、野生型非ヒト動物に比べてかかる本発明の腫瘍抗原を大量に産生する非ヒト動物をいう。そして、本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、本発明の腫瘍抗原欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を併用することが比較実験等を実施する上で好ましい。かかる本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、本発明腫瘍抗原のノックアウトマウスやトランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００２８】
例えば、本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損したマウス、すなわち本発明の腫瘍抗原のノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされた本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子を、ウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンの本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３’末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲッティングベクターを作製する。
【００２９】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明の腫瘍抗原のノックアウトマウスを作製することができる。また、ノックアウトマウスにおいて本発明の腫瘍抗原が生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスでの発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００３０】
本発明の腫瘍抗原のトランスジェニックマウスは、本発明の腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡにチキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりかかるトランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入した本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００３１】
また、上記本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子若しくはＤＮＡ、本発明の腫瘍抗原、本発明の腫瘍抗原とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質、本発明の腫瘍抗原に対する抗体、本発明の腫瘍抗原を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞等は、グリオーマ、膵癌、食道癌、大腸癌、乳癌等の悪性腫瘍の治療や診断に有用であり、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４抗原陽性Ｔ細胞、ＣＤ８抗原陽性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞等の全てのＴ細胞を含む）の誘導等免疫応答のメカニズムの解明にも使用することができる。
【００３２】
本発明の腫瘍抗原又はこれに対する抗体を有効成分として含有する組成物は抗腫瘍剤として有用である。例えば、本発明の腫瘍抗原を経口、静脈注射等により投与すると、インビボにおけるＣＴＬｓ等のＴ細胞の誘導活性が増大することによる抗腫瘍効果が期待できる。また上記抗体はミサイル療法に用いることができる。本発明はまた、本発明の腫瘍抗原とのインビトロ刺激により誘導された活性化Ｔ細胞に関する。例えば、末梢血リンパ球や腫瘍浸潤リンパ球にＩＬ−２とともに本発明の腫瘍抗原で刺激すると腫瘍反応性活性化Ｔ細胞が誘導され、この活性化されたＴ細胞は養子免疫療法に有効に用いることができる。
【００３３】
さらに本発明は、本発明の腫瘍抗原をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部からなる癌の診断用プローブや、この癌の診断用プローブや本発明の腫瘍抗原に特異的に結合する抗体を含有するグリオーマ、食道癌、大腸癌、乳癌等の悪性腫瘍の診断薬に関する。上記診断用プローブとしては、本発明の腫瘍抗原をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃＲＮＡ）のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものが好ましく、例えば、検体から得られた遺伝子と、本発明の腫瘍抗原をコードするＤＮＡ配列とを比較することにより、グリオーマ等の疾病の診断が可能となる。かかる検出に用いられる検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるゲノムＤＮＡや、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではなく、かかる検体を使用する場合、ＰＣＲ等により増幅したものを用いてもよい。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例においては、グリオーマ（悪性神経膠腫）細胞株として、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの頭蓋内に化学発ガン物質であるｍｅｔｈｙｌｃｈｏｌａｎｔｈｒｅｎｅを投与して誘発させた、ＮＩＨのＡｋｂａｓａｋ　Ａ　らによって樹立されたＧＬ２６１株（Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，　Ｄｅｃ；　７５（６）：　９２２−９，　１９９１）を用い、ＨＳＶとしては、ＨＳＶ−１のＧ２０７株を用いた。ＨＳＶの増殖には、アフリカミドリザル腎細胞株Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ社製）を用いた。Ｖｅｒｏ細胞は、１０％　非働化牛胎児血清（ＩＦＣＳ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて培養し、ウイルス増殖時は１％　ＩＦＣＳ添加ＤＭＥＭを用いて培養した。ウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞よりウイルスバッファー（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）中で凍結融解を繰り返し、超音波破砕後にバッファー上清より回収した。
【００３５】
実施例１［ＣＴＬｓによって認識される腫瘍抗原ペプチドのスクリーニング］
実施例１−１（グリオーマ反応性ＣＴＬｓの調製）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両側皮下に片側あたり１×１０６個のＧＬ２６１を移植し、腫瘍生着後（移植後７〜１０日）に右側腫瘍内に直接１×１０７ｐｆｕのＨＳＶ−１のＧ２０７株を３日ごとに計５回の投与を行った。最終投与から７日後（ＨＳＶ投与開始から１９日目）に脾臓を摘出した。プレート１穴あたり、２００μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（協和醗酵工業社製）で処理をした３×１０５個のＧＬ２６１株に、２×１０６個の脾細胞を加えて、３７℃で１時間の共培養を行った。なお、培養液は１０％　ＦＣＳ、５０μＭの２−メルカプトエタノール及び２．５％　Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）を含むＲＰＭＩ培地を用いた。２週間ごとにマイトマイシンＣ処理をしたＧＬ２６１株により刺激を繰り返し、刺激後４日目まで毎日培養液を半量ずつ交換した。４日目にＴ細胞をよくピペッティングしながら回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心してペレットを２ｍｌに懸濁した後、リンホセパール（ＩＢＬ社製）２ｍｌに重層し、４００×ｇで３０分間遠心した後、中間層を回収した。さらに、１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地１０ｍｌで洗浄し、細胞数が１穴あたり１×１０６個以上になるように再度２４穴のプレートにプレーティングして増殖させることにより、ＧＬ２６１反応性ＣＴＬｓ（ＧＣＬ−１）を調製した。
【００３６】
実施例１−２（Ｈ−２ｂ拘束性の検討）
マウス主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）であるＨ−２ｂを発現する腫瘍株［ＧＬ２６１（ポジティブコントロール）、Ｂ１６（悪性黒色腫）、ＭＣ３８（大腸癌）、ＭＣＡ２０７（肉腫）］、Ｈ−２ｄを発現する腫瘍株［Ａ２０（リンパ腫）、ＣＴ２６（大腸癌）、ＹＡＣ−１（リンパ腫）］及びネガティブコントロールとしてマウスＣ５７ＢＬ／６系ＳＰＣ（脾細胞）を、上記調製したＧＣＬ−１の存在下、若しくは非存在下で培養した後、放出されるインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）をＥＬＩＳＡ法（ＩＮＦ−γ測定用ＥＬＩＳＡ抗体は全てＥＮＤＯＧＥＮ社製）により測定した結果、ＧＣＬ−１はＧＬ２６１にのみ特異的に反応してＩＮＦ−γを放出することが明らかになった（図１）。また、その放出はＨ−２Ｄｂをブロックする抗Ｈ−２Ｄｂ抗体により抑制されることから、ＧＣＬ−１はＨ−２ｂ拘束性にＧＬ２６１を認識することが示された（図２）。
【００３７】
実施例１−３（腫瘍抗原の同定用ｃＤＮＡライブラリーの作製）
培養ＧＬ２６１細胞をグアニジンイソシアネート（ＧＴＣ）溶液７ｍｌに溶解して、２２Ｇの注射針をつけた１０ｍｌシリンジで懸濁し、グアニジン−塩化セシウム超遠心（３５０００ｒｐｍ、１８時間、１８℃）を行った後、ペレットをＴＥＳ　１８０μｌで洗浄後、ＴＥＳ　３６０μｌで溶解し、フェノール・クロロホルム処理（１２０００ｒｐｍ、５分、室温）、エタノール処理（１２０００ｒｐｍ、２０分、４℃）し、７０％　エタノールで洗浄後、Ｌｏｗ　ＴＥ　１００μｌで溶解して全ＲＮＡの抽出を行った（７０８．５μｇ／１００μｌ）。
ＲＮＡの精製は、以下のように行った。前記の抽出した全ＲＮＡ　１００μｌに４００μｌの１．２５倍濃縮ＴＮＥＳ　ｂｕｆｆｅｒと１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ　を添加し、３７℃で１時間反応後、フェノール・クロロホルム処理（５００μｌ、６０℃、１５分；３分ごとにボルテックス）、エタノール処理（１２０００ｒｐｍ、１５分）し、７０％　エタノールで洗浄後、６００μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏに溶解し、オリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０　ｓｕｐｅｒ；第一化学薬品社製）　１５０μｌを加え、よくピペッティングした（７０℃、１０分）。次いで、５ＭのＮａＣｌ　３７μｌを加えてよくピペッティングし（３７℃、１０分）、１３２００ｒｐｍで５分間遠心し、５００μｌのＷａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。１３２００ｒｐｍで５分間遠心し、１００μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏに溶解後、６５℃で５分間保持し、１３２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をＮｅｗ　ｔｕｂｅへ移す操作を２回繰り返し、吸光度を測定し、得られたｍＲＮＡを５μｇ／ｔｕｂｅに分注した。
【００３８】
ｃＤＮＡの合成は、以下のように行った。ｍＲＮＡ試料　５μｇをエタノール処理後、１２０００ｒｐｍで２５分間遠心し、７０％　エタノールで洗浄後、６μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏに溶解した。次いで、Ｎｏｔ　Ｉ　プライマー　２μｌを加え、７０℃で１０分間反応させ、氷冷後、５×Ｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｂｕｆｆｅｒ　４μｌ、０．１ＭのＤＴＴ　２μｌ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ　１μｌを加えて３７℃で２分間反応させ、５μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　を加えて３７℃で１分間反応させ、プラスミドライブラリー第１ｓｔｒａｎｄを調製した。（なお、ライブラリー作製試薬は、Ｓｕｐｅｒ　Ｓｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ：ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製を用いた。）このプラスミドライブラリー第１ｓｔｒａｎｄを鋳型とし、ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ　９１μｌ、５×２ｎｄ　ｓｔｒａｎｄ　ｂｕｆｆｅｒ　４μｌ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ　３μｌ、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来ＤＮＡリガーゼ　１μｌ、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来ＤＮＡポリメラーゼＩ　４μｌ、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来ＤＮＡ　ＲＮａｓｅ　１μｌを加え、軽くボルテックスし、１６℃で２時間反応後、Ｔ４ポリメラーゼ　２μｌを加え、１６℃で５分間反応させ、０．５ＭのＥＤＴＡ　１０μｌを加えた後、フェノール・クロロホルム処理し、上清１５０μｌに７．５ＭのＮＨ４ＯＡｃ　７５μｌを加え、エタノール　５００μｌを添加して１３２００ｒｐｍで２０分間遠心し、７０％　エタノールで洗浄しプラスミドライブラリー第２ｓｔｒａｎｄを調製した。
【００３９】
ｃＤＮＡの断端処理と、長いサイズのｃＤＮＡインサートの精製は、以下のように行った。合成した二本鎖ｃＤＮＡに、ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ　２５μｌ、５×Ｔ４ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒ　１０μｌ、Ｓａｌ　Ｉ　ａｄａｐｔｏｒ　１０μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ　５μｌを加え、１６℃で一晩、アダプタをライゲーションした。フェノール・クロロホルム処理した上清４５μｌに７．５ＭのＮＨ４ＯＡｃ　２５μｌ、エタノール　１５０μｌを加え１３２００ｒｐｍで２０分間遠心し、７０％　エタノールで洗浄し、ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ　４１μｌ、ＲＥＡＣＴ３　ｂｕｆｆｅｒ　５μｌ、ＮｏｔＩ　４μｌを加え、３７℃で２０時間反応させた後、フェノール・クロロホルム処理した上清５０μｌに７．５ＭのＮＨ４ＯＡｃ　２５μｌ、エタノール　１５０μｌを加え１３２００ｒｐｍで２０分間遠心し、７０％　エタノールで洗浄し、ＴＥＮ　１００μｌに溶解して、サイズフラクションに供した。ＴＥＮ　０．８ｍｌ×４をカラムにローディングた後に試料１００μｌをカラムにローディングして画分１を回収し、同様にＴＥＮ　１００μｌをカラムにローディングして画分２を回収した。さらに、ＴＥＮ　１００μｌをカラムにローディングし、１滴ずつ回収することにより、画分３〜１５を同様に回収した。１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）１μｌに試料１μｌを加え、各画分のＤＮＡ濃度を測定した結果、高濃度のＤＮＡを含む画分８〜１３（計１５０μｌ）を回収し、７．５ＭのＮＨ４ＯＡｃ　７５μｌ、エタノール　５００μｌを加え１３２００ｒｐｍで２０分間遠心し、７０％　エタノールで洗浄し、ＴＥＮ　３０μｌに溶解した。
【００４０】
発現プラスミドとｃＤＮＡインサートとのライゲーション及び形質転換は次のように行い、最終的なｃＤＮＡライブラリーを構築した。ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ　１２．５μｌ又は１０μｌ、５×Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒ　４μｌ、真核細胞発現プラスミドベクター　ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６　１μｌ、インサート２．５μｌ又は５μｌを加え、４℃で一晩ライゲーションを行った。次いで、ｔＲＮＡ　５μｌ、７．５ＭのＮＨ４ＯＡｃ　１２．５μｌ、エタノール　７０μｌを加え１３２００ｒｐｍで２０分間遠心し、７０％　エタノール　０．５ｍｌで洗浄し、Ｈ２Ｏ　５μｌに溶解し、ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｍｉｘｔｕｒｅとした。大腸菌ＤＨ１０Ｂ　５０μｌにｌｉｇａｔｉｏｎ　ｍｉｘｔｕｒｅ　１μｌを加え、氷冷５分間の後、エレクトロポレーション（２．５ｋＶ）し、ＳＯＣ　１ｍｌを加えて３７℃で１時間、２００ｒｐｍで振盪した。１０μｌをアンピシリン含有ＬＢプレート（培地１リットル中ｂａｃｔｏ　ｔｒｙｐｔｏｎ　１０ｇ、ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　５ｇ、ＮａＣｌ　１０ｇ、アンピシリン　１００ｍｇを含む。）上にプレーティングした。作製したｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡ数は、３×１０５個（モル比がベクター：インサート＝１：１）及び４×１０５個（ベクター：インサート＝１：２）であった。
【００４１】
実施例１−４（ＣＴＬｓによるグリオーマ抗原遺伝子のスクリーニング）
１穴あたり１５０μｌのアンピシリン含有ＬＢ培地の入った９６穴プレートに、１穴あたり１００個になるようにｃＤＮＡライブラリーを調整後、３７℃、１８０ｒｐｍで一晩培養し、培養した大腸菌　３μｌを１穴あたり２５０μｌのＴＹＧＰＮ培地（培地１リットル中ｂａｃｔｏ　ｔｒｙｐｔｏｎ　２０ｇ、ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　１０ｇ、１００％　グリセロール　８ｍｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４　５ｇ、ＫＮＯ３　１ｇを含む。）の入った９６穴プレートに加えて３７℃で２４時間培養して増幅し、常法によりプラスミドＤＮＡの抽出を行った。さらに、約１００ｎｇのｃＤＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）を用いて９６穴プレート上でリポフェクション法により１×１０４個のＭＨＣクラスＩのＫｂとＤｂを発現する２９３ＫｂＤｂ細胞に導入の後、１０％の非働化ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中にて３７℃で一晩インキュベートした。９６穴プレートから培地を取り除いた後、ＧＣＬ−１を１×１０４個／２００μｌ加え、３７℃で２４時間インキュベートした。培養上清を回収し、ＧＣＬ−１から放出されたインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）量をＥＬＩＳＡ法により測定した。３×１０４個のｃＤＮＡクローンを１次スクリーニングした結果、１穴のみＩＮＦ−γの放出が検出された。さらに、その穴の大腸菌をプレーティングして５００個のコロニーを単離し、上記と同様に２次スクリーニングを行った結果、２穴からＩＮＦ−γが検出された。これらの穴からグリオーマ抗原をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを単離した。
【００４２】
実施例１−５（単離抗原遺伝子の塩基配列の決定及び相同性検索）
上記で得られたプラスミド中のｃＤＮＡインサートの塩基配列を決定し（配列番号１；ＧＬ２６１抗原遺伝子（ＧＡＲＣ−１））、データベース（ＵｎｉＧｅｎｅ；米国国立生体工学情報センター）により検索した結果、マウスＵｎｉＧｅｎｅのＭｍ．１２８６４　ＲＩＫＥＮ　ｃＤＮＡ　１１９０００２Ｌ１６遺伝子に一致した（図３）が、ヒトのＨｓ．６１１８　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１５　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　１２のホモログであり（図４）、ミトコンドリアのリボソームタンパクであることが示唆された。また、ＧＡＲＣ−１には数カ所の遺伝子変異が存在し、またアミノ酸レベルでは８１番目のアスパラギン酸からアスパラギンへ置換する変異が認められた（図５）。
【００４３】
実施例１−６（遺伝子発現の解析）
上記で同定された遺伝子ＧＡＲＣ−１の各正常組織細胞、グリオーマ組織、グリオーマ細胞株における遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法にて解析した。使用したｃＤＮＡは胎児脳、脳、心臓、肺、胃、小腸、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、胎盤、骨格筋、大腸、線維芽細胞の正常細胞１４種と、ＧＢ１３、ＧＢ１７、ＧＢ１６、ＧＢ４のグリオーマ組織４種と、ＧＩ−１、Ｕ２５１、Ｕ８７ＭＧ、Ａ１７２（グリオーマ細胞）を用いた。また、ＰＣＲは以下の条件で行った。センスプライマーとして（５’−　ＡＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡ　−３’；配列番号２３）、アンチセンスプライマーとして（５’−　ＡＧＴＧＡＣＡＡＡＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＣＴ　−３’；配列番号２４）を用い、熱変性９４℃で１分間、アニーリング５８℃で１分間、伸長反応７２℃で１分間の条件で３０サイクルのＰＣＲを行った。これらの得られた産物を２％アガロースで電気泳動を行って、ＥｔＢｒで染色した後、２５４ｎｍの紫外線照射によりバンドを検出した。その結果、ＧＡＲＣ−１は正常組織では精巣で弱い発現が認められた。一方、グリオーマ組織において正常組織と比較し高い発現が認められた（図６）。
【００４４】
実施例１−７（グリオーマ抗原ＧＡＲＣ−１のＴ細胞に認識されるエピトープ部位の決定）
上記ｃＤＮＡ（ＧＡＲＣ−１；配列番号１）、若しくは登録されているＭｍ．１２８６４遺伝子を鋳型とし、センスプライマーとしてＴ７プライマー（５’−　ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ　−３’；配列番号５）、及び、図５に示される種々のアンチセンスプライマー［７８３Ａ−プライマー：　５’−　ＡＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＡ　−３’；配列番号６、４９０Ａ−プライマー：　５’−　ＧＴＧＡＣＡＡＡＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＣＴ　−３’；配列番号７、ＧＡＲＣ−１遺伝子由来の２７３Ａ−プライマー：　５’−　ＣＣＣＡＴＡＧＣＧＴＡＣＡＧＣＴＴＧＴＴ　−３’；配列番号８、Ｍｍ．１２８６４遺伝子に由来する２７３Ａ−プライマーに対応する２７３ｗプライマー：５’−　ＣＣＣＡＴＡＧＣＧＴＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣ　−３’；配列番号９］を用い、３’末端を順次欠失させた断片をＰＣＲにより増幅してＧＬ２６１抗原ｃＤＮＡ配列に由来する３種類の欠失・変異ｃＤＮＡクローン［１番目から７８３番目までの塩基配列（７８３ｍ；１８４アミノ酸残基）、１番目から４９０番目までの塩基配列（４９０ｍ；１５９アミノ酸残基）及び１番目から２７３番目までの塩基配列（２７３ｍ；８６アミノ酸残基）］、及びＭｍ．１２８６４遺伝子に由来する欠失・正常型ｃＤＮＡクローン（２７３ｗ；８６アミノ酸残基）を作製した（図７）。
【００４５】
上記それぞれのｃＤＮＡインサートをｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に組込んで（図７）、ＭＨＣクラスＩのＫｂとＤｂを発現する細胞である２９３ＫｂＤｂ細胞に導入した後、ＧＣＬ−１と共培養して放出されたＩＮＦ−γを測定することにより、ＧＡＲＣ−１抗原のＴ細胞の認識部位について解析を行った。その結果、最も短いクローンである上記２７３ｍ（８６アミノ酸残基）までＧＣＬ−１は反応してＩＮＦ−γの放出が認められたが、変異をもたない上記２７３ｗ（８６アミノ酸残基）では明らかなＩＮＦ−γの放出量の低下が認められた（図８）。
【００４６】
（ＧＡＲＣ−１が認識するＨ−２Ｄｂ拘束性のペプチドの検索）
さらに、エピトープとなるペプチドを決定するため、Ｗｅｂ上の検索サイト（ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　＆　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）のＨＬＡ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ　ｐｒｏｇｒａｍ（　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ　ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ　ｂｉｎｄ／））を用いて、ＧＡＲＣ−１が認識するＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｄｂ）に結合するペプチドを検索した結果、Ｍｍ．１２８６４遺伝子から予想される配列には高いアフィニティーを示すペプチドは認められなかった。一方、ＧＡＲＣ−１遺伝子から予想される配列のアミノ酸変異部分を含む９残基（ＡＡＬＬＮＫＬＹＡ；配列番号４）のペプチドが高いアフィニティーを示した。そこで、高いアフィニティーが予想される変異ペプチドと、コントロールとして同部位の変異のないペプチド（ＡＡＬＬＤＫＬＹＡ）を合成し、高速液体クロマトグラフィーによる精製及び質量分析器による確認を行った後、それぞれ種々の濃度のペプチドを２９３ＫｂＤｂ細胞にパルスし、ＧＣＬ−１と接触させ、放出されるＩＮＦ−γ量を測定した。その結果、変異ペプチドは、コントロールペプチドＡＡＬＬＤＫＬＹＡと比較して、低濃度でもＧＣＬ−１を強く刺激することが明らかになった（図９）。したがって、ＧＣＬ−１は、ＧＡＲＣ−１遺伝子がコードするアミノ酸に由来するＨ−２Ｄｂに結合する変異ペプチド（ＡＡＬＬＮＫＬＹＡ；配列番号４）を特異的に認識していることが明らかになった。
【００４７】
実施例２［ＩｇＧによって認識される腫瘍抗原のスクリーニング］
実施例２−１（インサイチュー癌ワクチン）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス両側皮下に片側あたり１×１０６個のＧＬ２６１を移植し、腫瘍生着後（移植後７〜１０日）、右側腫瘍内に直接１×１０７ｐｆｕのＨＳＶを３日毎に計５回投与（図１０右の横軸に▲で表示）した。ＨＳＶを用いたインサイチュー癌ワクチン投与による腫瘍抑制効果を確認するために、腫瘍体積（ｍｍ３）を経時的に測定（ｎ＝５）した。その結果、対照群（Ｍｏｃｋ）と比較してＨＳＶ投与群では、接種腫瘍（右側腫瘍：Ｒｔ）のみならず、遠隔腫瘍（左側腫瘍：Ｌｔ）の増殖も有意に抑制されることが明らかになった（図１０）。また、最終投与から７日後（ＨＳＶ投与開始から１９日目）に血清の採取を行った。
【００４８】
実施例２−２（ＳＥＲＥＸ法によるグリオーマ抗原のスクリーニング）
ＧＬ２６１接種マウスから採取した血清２００μｌを５％　スキムミルク含有ＴＢＳＴ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０）で１００倍希釈した。また、１プレートあたり２×１０４個の陰性ファージを、１プレートあたり大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）５００μｌに感染させプレーティングし、２０ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を吸収させたメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−ｃ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を、プレート上にのせて３７℃で４時間培養した後、発現したタンパク質をメンブレンに移し、５％のスキムミルクを含むＴＢＳＴで一晩ブロッキングを行った。次に、１００倍希釈した上記血清２５ｍｌあたり、１０枚のメンブレンを室温で３時間浸した後、血清を回収した。また、１００倍希釈した血清を３匹分混合し、最終希釈倍率を３００倍とした。
【００４９】
（１次スクリーニング）
１プレートあたり１×１０４個のマウス精巣ｃＤＮＡファージライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を大腸菌（ＸＬ−ｂｌｕｅ）５００μｌに感染させ、ＮＺＹアガープレート５０枚にプレーティングし、４２℃で４〜６時間インキュベートした後、２０ｍＭのＩＰＴＧを吸収させたメンブレンをアガー上にのせ、発現したタンパク質をメンブレンに転写させた。次に、メンブレンを５％のスキムミルクを含むＴＢＳＴで一晩ブロッキングし、メンブレンを３００倍希釈した血清に室温下で１時間浸した後、ＴＢＳＴで５分間×３回、メンブレンの洗浄を行った。さらに、メンブレンを４０００倍に希釈した２次抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体；ＩＣＮ）液１００ｍｌに室温で１時間浸し、ＴＢＳＴで５分間×３回、及びＴＢＳ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）で５分間×２回の洗浄を行った後、Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒでリンスを２回行い、発色剤［Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　３０ｍｌ、ＮＢＴ（Ｎｉｔｒｏ　ｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）１３５μｌ及びＢＣＩＰ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ）１０５μｌ］で発色させることにより、５×１０５クローンから２９４個の陽性クローンを検出した。最後に、陽性クローンを回収し、各々ＳＭ　ｂｕｆｆｅｒ（０．５８％　ＮａＣｌ、０．２％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％ゼラチン；ｐＨ７．５）５００μｌに懸濁した。
【００５０】
（２次スクリーニング）
１次スクリーニングの陽性ファージを１プレートあたり２００μｌの大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）に感染させ、ＮＹＺアガープレートにプレーティングし、４２℃で４〜６時間インキュベートした後、２０ｍＭのＩＰＴＧを吸収させたメンブレンをアガー上にのせ、合成したタンパク質をメンブレンに転写させた。次に、メンブレンを５％のスキムミルクを含むＴＢＳＴで一晩ブロッキングし、３００倍に希釈した血清に室温で３時間浸けた後、ＴＢＳＴで５分間×３回の洗浄を行った。さらに、メンブレンを４０００倍に希釈した２次抗体（ＩＣＮ）液１００ｍｌに室温で１時間浸し、ＴＢＳＴで５分間×３回、及びＴＢＳで５分間×２回の洗浄を行った後、Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒでリンスを２回行って発色剤で発色させることにより、血清ＩｇＧが反応する陽性クローンを検出して最終的に２６個のクローンを単離し、各々ＳＭ　ｂｕｆｆｅｒ２００μｌに懸濁した。
【００５１】
実施例２−３（単離されたグリオーマ抗原遺伝子の塩基配列の決定及び相同性検索）
上記得られた２６個のファージクローンからＰＣＲ法によりインサートＤＮＡを増幅し、以後の解析に用いた。ＤＮＡポリメラーゼとしてＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ）を用い、センスプライマーとしてＴ３（５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’；配列番号１０）、アンチセンスプライマーとしてＴ７（５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；配列番号５）を用いた。なお、ＰＣＲ反応の条件は、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて９４℃、１分間の熱変性の後、５５℃で２分間のアニ−ル及び７２℃で２分間の伸長反応を３０サイクル繰り返して行った。得られたＰＣＲ産物を、Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＡＢＩ）及びＡＢＩ３１００オートシークエンサーを用いてＤＮＡのシークエンスを行った後、データベース（ＢＬＡＳＴ：Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）による検索を行い、遺伝子を同定した（表１）。
【００５２】
これら２６種類の遺伝子のうち２０種類は米国国立生体工学情報センターのＵｎｉＧｅｎｅによって統合整理されており、さらに血清反応の強いもの、データベース上で組織発現が限られているもの、以前に腫瘍抗原として同定されたもの、の計３項目に分けて分類した（表２）。その結果、血清反応の強い遺伝子として、Ｍ１Ｇ４１（Ｈｓ．２２５６７４；Ｗｄ−ｒｅｐｅａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ−９）、Ｍ１Ｇ６０（Ｈｓ．２７０８４５；ｍｉｔｏｔｉｃ　ｋｉｎｅｓｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｍ１Ｇ１１７、Ｍ１Ｇ１６９（Ｈｓ．５０７５８；ＳＭＣ４Ｌ１）、データベース上で組織発現が限られている遺伝子として、Ｍ１Ｇ２（Ｈｓ．１５８２１３；ＳＰＡＧ６）、Ｍ１Ｇ３５（Ｈｓ．２９０９；Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ　１）、Ｍ１Ｇ１０３（Ｈｓ．３４９６９５；Ｔｕｂｕｌｉｎ
ａｌｐｈａ　２）を挙げることができる。
【００５３】
【表２】
2004097199.tif 000003
【００５４】
実施例２−４（ＲＴ−ＰＣＲ法による単離されたグリオーマ抗原のｍＲＮＡ発現の解析）
上記で同定された遺伝子のうち、血清反応の強いもの、データベース上で組織発現が限られているものに関してはヒト遺伝子との相同性を検索し、かかるヒト遺伝子について各正常組織細胞、腫瘍細胞株、腫瘍組織由来ｃＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行った。使用したｃＤＮＡは、脳、心臓、肺、胃、小腸、結腸、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、胎盤、骨格筋の正常組織１２種と、ＧＢ１３、ＧＢ１７、ＧＢ１６、ＧＢ４のグリオーマ組織４種と、Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、ＧＩ−１、Ｕ２５１（グリオーマ細胞）、ＳＫ−ＭＥＬ２３、６２４ＭＥＬ（悪性黒色腫）、ＲＣＣ７、Ｓａｉｔｏ（腎癌）、ＬＵ９９、ＥＢＣ１（肺癌）、ＴＥ１０（食道癌）、ＰＫ５９（膵癌）、ＫＵ７（膀胱癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、ＨＬ６０、ＭＯＬＴ４（リンパ腫）の腫瘍培養細胞を用いた。
【００５５】
また、ＰＣＲは以下の反応条件で行った。Ｗｄ−ｒｅｐｅａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ−９には、センスプライマーとして（５’−ＧＧＴＴＡＣＡＡＧＴＣＣＣＡＴＡＣＴＣＣ−３’；配列番号１１）、アンチセンスプライマーとして（５’−ＴＣＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＣＣＣＴＴ−３’；配列番号１２）を、ｍｉｔｏｔｉｃ　ｋｉｎｅｓｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　には、センスプライマーとして（５’−ＧＡＴＴＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＡＡＣ−３’；配列番号１３）、アンチセンスプライマーとして（５’−ＴＣＧＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＡＧＡＣＧＡＡ−３’；配列番号１４）を、ＳＰＡＧ６には、センスプライマーとして（５’−ＴＡＣＣＣＣＧＡＧＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＧ−３’；配列番号１５）、アンチセンスプライマーとして（５’−ＣＣＴＴＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＡＡＣＧＴＧ−３’；配列番号１６）を、Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ　１　には、センスプライマーとして（５’−ＡＴＴＣＡＧＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＴＣＣＴ−３’；配列番号１７）、アンチセンスプライマーとして（５’−ＴＴＧＡＣＡＧＧＣＧＧＣＡＴＴＧＴＴＣＣ−３’；配列番号１８）を、Ｔｕｂｕｌｉｎ　ａｌｐｈａ　２　には、センスプライマーとして（５’−ＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＣＡＴＴＣＴＧＡＣＴ−３’；配列番号１９）、アンチセンスプライマーとして（５’−ＣＣＣＣＴＣＡＧＴＡＴＴＣＴＴＣＡＣＣＴ−３’；配列番号２０）、ＳＭＣ４Ｌ１には、センスプライマーとして（５’−ＣＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＴＣＣＣＣＴＴＴ−３’；配列番号２１）、アンチセンスプライマーとして（５’−ＣＡＧＧＣＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＴＴＧＧＴ−３’；配列番号２２）をそれぞれ用いて、熱変性９４℃で３０秒間、アニーリング６２℃で３０秒間、伸長反応７２℃で１分間の条件で３０サイクル（Ｍ１Ｇ３５及びＭ１Ｇ１０３は３５サイクル）のＰＣＲを行った。
【００５６】
これらのＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を１．５％　アガロースゲルで電気泳動を行ってＥｔＢｒで染色した後、２５４ｎｍの紫外線照射によりバンドを検出した（図１１〜１６）。その結果、Ｗｄ−ｒｅｐｅａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ−９　は、正常組織では脳での弱い発現と精巣での発現が認められた一方、脳腫瘍の細胞株や脳腫瘍組織、その他様々な腫瘍細胞株で高い発現が認められた（図１１）。ｍｉｔｏｔｉｃ　ｋｉｎｅｓｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　は、正常組織では精巣のみで、脳腫瘍を含む様々な腫瘍細胞株及び脳腫瘍組織において高い発現が認められた（図１２）。ＳＰＡＧ６は、正常組織において、脳、肺で弱い発現があり、精巣で高い発現を示した。腫瘍組織ではほとんど発現は認められなかった（図１３）。Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ　１　は、正常組織では肺、精巣における強い発現が認められた。また、脳を含む様々な組織で弱い発現が認められた一方、脳腫瘍細胞株、メラノーマ細胞では高い発現が認められた（図１４）。Ｔｕｂｕｌｉｎ　ａｌｐｈａ　２　は、正常組織では脳、肺、胃、肝臓で弱い発現があり、心臓、精巣、胎盤で強い発現が認められ、さらに脳腫瘍細胞株、脳腫瘍組織での高い発現が認められた（図１５）。ＳＭＣ４Ｌ１は、正常組織では精巣における強い発現と、脳、胃、小腸、大腸における弱い発現が認められ、とりわけ脳腫瘍を含む脳腫瘍細胞株において高い発現が認められた（図１６）。
【００５７】
【発明の効果】
本発明によると、転移性腫瘍等ヒトの遠隔腫瘍に対しても抗腫瘍効果を示すなど、癌に対する免疫療法が可能な抗腫瘍免疫反応を誘導できる腫瘍抗原のスクリーニング方法や、該スクリーニング方法により得られる腫瘍抗原及び抗原ペプチドや、それをコードする遺伝子等を提供することができる。
【００５８】
【配列表】
2004097199.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】樹立されたＣＴＬがＧＬ２６１に特異的に反応してＩＮＦ−γを放出することを示す図である。
【図２】樹立されたＣＴＬがＧＬ２６１に特異的に反応してＩＮＦ−γを放出し、その放出はＨ−２Ｄｂをブロックする抗体により抑制されることを示す図である。
【図３】単離した遺伝子がマウスＵｎｉＧｅｎｅにおいてＭｍ．１２８６４　ＲＩＫＥＮ　ｃＤＮＡ　１１９０００２Ｌ１６遺伝子であることを示す図である。
【図４】単離した遺伝子がヒトＵｎｉＧｅｎｅにおいてＨｓ．６１１８　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１５　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　１２のホモログであることを示す図である。
【図５】単離した遺伝子には、ＵｎｉＧｅｎｅに登録されている遺伝子と数カ所の変異が存在し、またアミノ酸レベルでは８１番目のアスパラギン酸からアスパラギンへ置換する変異が認められたことを示す図である。
【図６】遺伝子ＧＡＲＣ−１の正常組織細胞、グリオーマ組織、グリオーマ細胞株における遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。
【図７】単離した遺伝子の３’末端から欠失変異（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｍｕｔａｎｔ）クローン及び５’末端から２７３ｂｐの部分で変異をもたないクローンの作製を示す図である。
【図８】単離した遺伝子の３’末端からの欠失変異クローン及び２７３ｂｐの部分で変異をもたないクローンを作製し、ＥＬＩＳＡ法を用いてＩＦＬ−γの放出量を測定することによりエピトープ部分の絞り込みを行った結果を示す図である。
【図９】ＧＬ２６１反応性ＣＴＬが認識するＨ−２Ｄｂ拘束性のペプチドが、ＡＡＬＬＮＫＬＹＡであることを示す図である。
【図１０】左：ＨＳＶのＧＬ２６１腫瘍内接種により、ｍｏｃｋ接種の対照群と比較して、遠隔腫瘍（左側腫瘍：Ｌｔ）の増殖が有意に抑制されることを示す図である。（縦軸：腫瘍体積、横軸：ワクチン治療開始後の日数）右：ＨＳＶのＧＬ２６１腫瘍内接種により、ｍｏｃｋ接種の対照群と比較して、接種腫瘍（右側腫瘍：Ｒｔ）の増殖が有意に抑制されることを示す図である。（縦軸：腫瘍体積、横軸：ワクチン治療開始後の日数、▲：ＨＳＶ接種日）
【図１１】ヒト遺伝子Ｈｓ．２２５６７４；　Ｗｄ−ｒｅｐｅａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ−９　の正常組織、腫瘍細胞株及び腫瘍組織における発現分布をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。
【図１２】ヒト遺伝子Ｈｓ．２７０８４５；　ｍｉｔｏｔｉｃ　ｋｉｎｅｓｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　の正常組織、腫瘍細胞株及び腫瘍組織における発現分布をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。
【図１３】ヒト遺伝子Ｈｓ．１５８２１３；ＳＰＡＧ６の正常組織、腫瘍細胞株及び腫瘍組織における発現分布をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。
【図１４】ヒト遺伝子Ｈｓ．２９０９；　Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ　１　の正常組織、腫瘍細胞株及び腫瘍組織における発現分布をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。
【図１５】ヒト遺伝子Ｈｓ．３４９６９５；　Ｔｕｂｌｉｎ　ａｌｐｈａ　２　の正常組織、腫瘍細胞株及び腫瘍組織における発現分布をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。
【図１６】ヒト遺伝子Ｈｓ．５０７５８；　ＳＭＣ４Ｌ１　の正常組織、腫瘍細胞株及び腫瘍組織における発現分布をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2004097199.tif 000032
【図１６】
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