(57)【要約】【課題】ナフタレン水酸化物をテトラゾ化ｏ−ジアニシジンと反応・呈色させ、ナフタレン水酸化物を定量する方法を提供することを目的とする。【解決手段】１−ナフトール又は２−ナフトールなどのナフタレン水酸化物を、酢酸エチル、メタノール及び／又はエタノールなどの水溶性有機溶媒、及び水からなる混合溶液中でテトラゾ化ｏ−ジアニシジンと反応させ、生成した色素を測定し、既知濃度のナフタレン水酸化物から作成した検量線を用いて、未知濃度のナフタレン水酸化物を定量する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナフタレン水酸化物を、酢酸エチル、水溶性有機溶媒、及び水からなる混合溶液中でテトラゾ化ｏ−ジアニシジンと反応させ、生成した色素を測定することを特徴とする、ナフタレン水酸化物の定量方法。
【請求項２】
ナフタレン水酸化物が、１−ナフトール又は２−ナフトールであることを特徴とする、請求項１に記載のナフタレン水酸化物の定量方法。
【請求項３】
水溶性有機溶媒が、メタノール及び／又はエタノールであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のナフタレン水酸化物の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ナフタレン水酸化物を酢酸エチル、水溶性有機溶媒、及び水からなる混合溶液中でジアゾ色素類と反応させて発色させたのち、既知濃度のナフタレン水酸化物との比色により定量する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
溶液中のナフタレン水酸化物を定量する方法には、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーなどによる機器分析のほかに、ジアゾ色素類を利用した比色定量法などが知られている。ジアゾ色素類を利用した比色定量方法には、ナフタレン水酸化物とテトラゾ化ｏ−ジアニシジンとの反応の結果から生成する赤みを帯びた紫色ないし紫色の色素を、既知濃度試料から生成する色素量と比較して定量する方法がある。この呈色反応はナフタレンとでは起こらないことから、細菌などによるナフタレンの水酸化反応で生じたナフタレン水酸化物の簡易測定に用いられている。すなわち固形のナフタレンあるいは、例えばジメチルホルムアミドのような溶媒を用いたナフタレン溶液を菌の懸濁液に添加してインキュベートしたのち、それにテトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩の水溶液を加えて発色させる方法である。その発色後に発色の安定化剤として酢酸を加えたのちに吸光度を測定する方法もある（例えば非特許文献１参照）。
【０００３】
しかし、菌の懸濁液を用いる系では菌由来の物質又は培養液由来の物質がテトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩と反応することから、ごく低濃度のナフタレン水酸化物を定量することは困難であった。また、細菌を用いずに精製された酵素を用いてナフタレン水酸化物を調製した場合でも、たとえば反応に補酵素（たとえばβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）やβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）やそれぞれに対応した還元型の分子であるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ）を必要とする酵素では、反応液に添加された補酵素とテトラゾ化ｏ−ジアニシジンとが反応してしまうために、それらを分離除去してからでなければナフタレン水酸化物を定量することは困難であった。そのため多くの場合は有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で反応液からナフタレン水酸化物を抽出して、それをガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーを用いて定量していた。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｃａｎａｄａ  Ｋ．Ａ．ら：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４（２）３４４−４９、２００２。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
テトラゾ化ｏ−ジアニシジン塩は水溶性であることから有機溶媒には溶けにくい性質をもつため、ナフタレン水酸化物の呈色試薬として用いる場合には水溶液として用いることが好ましい。一方でテトラゾ化ｏ−ジアニシジン塩の水溶液を酢酸エチルと混合すると酢酸エチル相と水相とに分離してしまうためナフタレン水酸化物の比色定量には適当ではない。本発明は上記問題を解決し、ナフタレン水酸化物をテトラゾ化ｏ−ジアニシジンと反応・呈色させ、ナフタレン水酸化物を定量する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはテトラゾ化ｏ−ジアニシジンとナフタレン水酸化物とを、酢酸エチルと水溶性有機溶媒と水との混合溶液中で反応させることにより、反応液が酢酸エチル相と水相とに分離することなく反応することを見出し、酢酸エチル中のナフタレン水酸化物を比色法により定量する方法を完成するに至った。
【０００７】
即ち本発明は、ナフタレン水酸化物を、酢酸エチル、水溶性有機溶媒、及び水からなる混合溶液中でテトラゾ化ｏ−ジアニシジンと反応させ、生成した色素を測定することを特徴とする、ナフタレン水酸化物の定量方法である。以下、本発明を更に詳細に説明する。
【０００８】
本発明はナフタレン水酸化物とテトラゾ化ｏ−ジアニシジンとのジアゾカップリング反応を、酢酸エチル、水溶性有機溶媒、及び水からなる混合溶液中で行い、反応の結果生じた色素を、例えば吸光度で測定して、既知濃度のナフタレン水酸化物溶液から作成した検量線を用いて未知濃度のナフタレン水酸化物を比色定量する方法である。
【０００９】
ナフタレン水酸化物としては、例えば１−ナフトールや２−ナフトール等があげられるが、それ以外にも複数個の水酸基で置換されたものや水酸基以外に置換基をもつ１−ナフトール誘導体や２−ナフトール誘導体であってもかまわない。ただしそのナフタレン水酸化物が、酢酸エチルで抽出可能であること、かつ、テトラゾ化ｏ−ジアニシジンとの反応部位を有しており、酢酸エチル、水溶性有機溶媒、及び水からなる混合溶液中で反応して呈色すること、かつ、テトラゾ化ｏ−ジアニシジンとの反応の結果生成した色素が、その量を測定可能なある一定の時間は可溶性の状態であることが必要である。
【００１０】
水溶性有機溶媒は、ナフタレン水酸化物やテトラゾ化ｏ−ジアニシジンとは反応せず、ナフタレン水酸化物とテトラゾ化ｏ−ジアニシジンとの反応を妨害せず、かつ酢酸エチルに可溶性であることが必要である。たとえば水溶性有機溶媒をメタノール、エタノールから少なくとも１種類を選んで用いればよい。
【００１１】
水溶性有機溶媒は、ナフタレン水酸化物を含んだ酢酸エチル溶液とテトラゾ化ｏ−ジアニシジンの水溶液の混合後に加えても良いが、好ましくは同時にすべてを混合するか、もしくは水溶性有機溶媒をナフタレン水酸化物を含んだ酢酸エチル溶液に予め加えてからテトラゾ化ｏ−ジアニシジンの水溶液を混合するか、もしくは水溶性有機溶媒をテトラゾ化ｏ−ジアニシジンの水溶液に予め加えてからナフタレン水酸化物を含んだ酢酸エチル溶液を混合するか、もしくはナフタレン水酸化物を含んだ酢酸エチル溶液とテトラゾ化ｏ−ジアニシジンの水溶液の両者にそれぞれ予め水溶性有機溶媒を加えてからそれらを混合することが望ましい。
【００１２】
水溶性有機溶媒の濃度は、水溶性有機溶媒、酢酸エチル、及び水の３者が混合されたのちに、酢酸エチルと水とが２相に分離しないような濃度で、かつ、ナフタレン水酸化物やテトラゾ化ｏ−ジアニシジンやそれら両者の反応で生じた色素化合物が可溶である濃度であればよい。たとえばナフタレン水酸化物を含んだ酢酸エチル溶液に、テトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩のメタノール水溶液を混合して呈色反応を行う場合において、前者と後者の体積比が１／４であるときは、体積比でメタノール／水の比が６／４〜４／１になるようにして調製したメタノール水溶液でテトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩のメタノール水溶液を調製すればよい。
【００１３】
テトラゾ化ｏ−ジアニシジンの水溶液は調製後、徐々に変色する場合があるので用時調製が好ましく、より好ましくは反応直前まで氷冷しておくとよい。有機溶媒の水溶液でテトラゾ化ｏ−ジアニシジンの溶液を調製するときには有機溶媒と水の混合時に発熱することがあるので、適宜冷却してからテトラゾ化ｏ−ジアニシジンを溶解することが好ましい。テトラゾ化ｏ−ジアニシジンの濃度は、ナフタレン水酸化物を含んだ酢酸エチル溶液と水溶性有機溶媒と水とを混合した反応系で不溶化しない濃度でなければならない。また予め有機溶媒の水溶液でテトラゾ化ｏ−ジアニシジンの溶液を調製するのであればその溶液中でも不溶化しない濃度でなければならない。そのような適切な濃度を予め調べておけばよい。たとえば０．２ｍＭ以下の１−ナフトールを含んだ酢酸エチル溶液に、テトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩のメタノール水溶液を混合して呈色反応を行う場合において、前者と後者の体積比が１／４であり、かつ、体積比でメタノール／水の比が７／３になるようにして調製したメタノール水溶液でテトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩のメタノール水溶液を調製する場合では、テトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩は２〜５ｍＭにすればよく、より好ましくは４ｍＭである。
【００１４】
ナフタレン水酸化物とテトラゾ化ｏ−ジアニシジンとの反応の結果生じた色素化合物の比色に用いる吸収波長は４６０ｎｍから５８０ｎｍまでの範囲で、ナフタレン水酸化物を含まない対照試料を反応させたときの吸光度と水酸化物を含む試料を反応させたときの吸光度との値の差が大きくなる波長を設定すればよく、好ましくは５１０ｎｍから５７０ｎｍ、より好ましくは、１−ナフトールとテトラゾ化ｏ−ジアニシジンとの反応物では５２０ｎｍから５４０ｎｍであり、２−ナフトールとテトラゾ化ｏ−ジアニシジンとの反応物では５５０ｎｍから５７０ｎｍである。
【００１５】
反応温度と反応時間は、既知濃度のナフタレン水酸化物を用いて予め実験を行い、ナフタレン水酸化物の検量域ともども適切なものを設定すればよい。たとえば前述の４ｍＭテトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩（氷冷）を用いて、１−ナフトールの検量線を作成する場合には、室温で１時間反応をおこなったのちに、波長５２８ｎｍの吸光度を測定して、濃度と吸光度との関係を調べて比例関係にある濃度域を検量線として用いればよく、未知試料は同条件で呈色反応を行い吸光度から検量線を用いて定量すればよい。
【００１６】
【実施例】
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
０ｍＭから０．５ｍＭの１−ナフトールを含んだ酢酸エチル溶液８００μｌに予め氷冷した４ｍＭテトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩のメタノール溶液（メタノール：Ｈ２Ｏ＝４：１）を２００μｌ加えて室温で、６０分間から１８０分間反応させて５２８ｎｍの吸光度変化を測定して検量線を作成した。結果を図１に示す。図中、●は反応時間が６０分間、△は反応時間が９０分間、×は反応時間が１８０分間反応させたあとの波長５２８ｎｍの吸光度の測定結果を示す。図からも明らかなように、反応時間６０分から９０分において、１−ナフトールの濃度０ｍＭ〜０．２ｍＭの範囲で、その濃度と吸光度の関係を示すグラフの直線性がよく、１−ナフトールの定量に利用できることが分かる。
【００１８】
実施例２
２５ｍＭ  ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）―ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）に、無添加、５ｍＭ  ＮＡＤＨ添加、５ｍＭ  β−ＮＡＤ添加、又は０．５ｍＭナフタレン添加した溶液を調製した（ただしナフタレンを含む溶液は５％体積のジメチルホルムアミドを含む）。それぞれの溶液８００μｌについて、０ｍＭから０．５ｍＭの１−ナフトールを含んだ酢酸エチル溶液８００μｌと塩化ナトリウム０．４ｇを加えた。それを室温で２時間振とうして水−酢酸エチルの２液による分離抽出をおこなったのち、遠心分離して有機相を得た。その有機相の６４０μｌに予め氷冷した４ｍＭテトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩のメタノール溶液（メタノール：Ｈ２Ｏ＝４：１）を１６０μｌ加えて、室温で６０分間反応させたのち５２８ｎｍの吸光度変化を測定して検量線を作成した。
【００１９】
結果を図２に示す。図中、●は無添加の溶液、三角はＮＡＤＨが混在した溶液、□はβ−ＮＡＤが混在した溶液、×はナフタレンが混在した溶液の、それぞれから調製した酢酸エチル相に含まれる１−ナフトールを、テトラゾ化ｏ−ジアニシジンと反応させたあとの波長５２８ｎｍの吸光度の測定結果を示す。図からも明らかなように、無添加、５ｍＭ  ＮＡＤＨ添加、５ｍＭ  β−ＮＡＤ添加、又は０．５ｍＭナフタレン添加した溶液のいずれも、１−ナフトール濃度と吸光度の関係を示すグラフの直線性がよく、１−ナフトールの定量に利用できることが分かる。したがって１−ナフトールを含んだ試料に生物由来のＮＡＤＨやβ−ＮＡＤが混入していても、予め、水−酢酸エチルの２液による分離抽出を実施してから得られる酢酸エチル中に含まれる１−ナフトールを定量すればよいことが分かる。
【００２０】
実施例３
予め氷冷した４ｍＭテトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩のメタノール溶液（メタノール：Ｈ２Ｏ＝７：３）を１６０μｌ、０ｍＭから０．２ｍＭの２−ナフトールを含んだ酢酸エチル溶液６４０μｌに加えて室温で、６０分間反応させて波長５２８ｎｍと５５０ｎｍの吸光度変化を測定して検量線を作成した。結果を図３に示す。図中、三角は波長５２８ｎｍの吸光度（Ａ５２８）、四角は波長５５０ｎｍの吸光度（Ａ５５０）の測定結果を示す。図からも明らかなように、波長５２８ｎｍと５５０ｎｍのいずれでも０ｍＭ〜０．１ｍＭの範囲で、２−ナフトール濃度と吸光度の関係を示すグラフの直線性がよく、２−ナフトールの定量に利用できることが分かる。
【００２１】
実施例４
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４（ＤＳＭ１１７３７）をＹｅａｇｅｒ  Ｃ．Ｍ．ら：Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９、６５（２）、６３２−６３９に記載のｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅｄｉｕｍに１０ｍＭ乳酸を加えた培地２０ｍｌを加えたバッフル付三角フラスコで温度３０℃で２０時間振とう培養した。なお、培養開始から１６時間後と１８時間後にそれぞれ２００ｍＭフェノール水溶液２００μｌを加えた。得られた培養液の菌密度はＯＤ６００値が２．９９であった。
【００２２】
これを遠心分離して菌を回収したのち、２０ｍＭ乳酸を含んだ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）でリンスした。すなわち菌を２０ｍＭ乳酸を含んだ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁したのち再び遠心分離して菌を集めた。この操作を２度おこなったのち、同緩衝液でＯＤ６００値が１になるように菌懸濁液を調製した。
【００２３】
その菌懸濁液１ｍｌを栓付ガラス試験管（８ｍｌ容）にとり１０ｍＭ  ナフタレン溶液１０μｌを加えたのち、密栓して往復振とう（毎分１６０往復）しながら、３０℃で６０分間インキュベートしてナフタレンの酸化反応をおこなった。
【００２４】
酢酸エチル１ｍｌを加えて反応停止後、塩化ナトリウム０．５ｇを加えて室温で毎分２８０往復、２時間振とうした。なお反応０分間の試料はナフタレン添加前に酢酸エチルを加えた。
【００２５】
ついでその振とう後の液を遠心分離して有機相（酢酸エチルの画分）を採取した。得られた有機相の６４０μｌに、メタノール：Ｈ２Ｏ＝７：３の溶媒で調製した４ｍＭテトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩溶液１６０μｌ（氷冷）を加えて、室温で１時間反応させた。１−ナフトールとテトラゾ化ｏ−ジアニシジンの反応で生じた色素は波長５２８ｎｍの吸光度で測定し、既知濃度の１−ナフトールで作成した検量線から１−ナフトールの濃度を定量した。比色分析の結果は３２μＭであった。
【００２６】
また１−ナフトールをＯＤＳ−１２０Ｔカラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ、東ソー株式会社製の逆相カラム）を用いてＨＰＬＣにより定量した。操作は、カラム温度を５０℃として、溶離液には試料ロードから５分間はメタノール／水＝６／４の溶液、次の５分間でメタノール／水＝６／４から９５／５の溶液への直線濃度勾配、次の４分間はメタノール／水＝９５／５の溶液で、流速０．８ｍｌ／分で実施した。検出には波長２７０ｎｍの吸光度を用いた。
ＨＰＬＣでの分析の結果、２−ナフトール（保持時間７．２分）は検出されなかった。試料中に検出された１−ナフトール（保持時間７．７分）の濃度はＨＰＬＣでは３１μＭであった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明で提供されるナフタレン水酸化物の定量方法は、従来の比色定量方法ではできなかった酢酸エチルに可溶化されたナフタレン水酸化物が比色法により測定可能になった。それにより、ナフタレン水酸化物の水溶液に混在するとテトラゾ化ｏ−ジアニシジンと反応しやすい生体成分であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドやその類縁物質等を、予め水−酢酸エチルの２相系で水相に除去したのちにナフタレン水酸化物を比色法により測定することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で行った１−ナフトールの濃度と吸光度との関係を示す図である。
【図２】実施例２で行った１−ナフトールの濃度と吸光度との関係を示す図である。
【図３】実施例３で行った２−ナフトール濃度と吸光度との関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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