(57)【要約】　　　（修正有）【課題】カプシクム属の植物について、接種のためのウイルスを必要とせず、迅速に、且つ高精度でトバモウイルス抵抗性を判別する。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むカプシクム属におけるトバモウイルス抵抗性識別マーカーを提供する。（ａ）特定の塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）上記の特定の塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなりトバモウイルス抵抗性識別マーカーとして機能するＤＮＡ【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むカプシクム属におけるトバモウイルス抵抗性識別マーカー。
（ａ）配列番号１又は２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２で表される塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなりトバモウイルス抵抗性識別マーカーとして機能するＤＮＡ
【請求項２】
識別対象のカプシクム属に属する植物に、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ
（ａ）配列番号１又は２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２で表される塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなりトバモウイルス抵抗性識別マーカーとして機能するＤＮＡ
が存在するか否かを検定することを特徴とするカプシクム属におけるトバモウイルス抵抗性識別方法。
【請求項３】
上記検定する工程は、上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡの一部又は全部を含む領域を増幅する工程と、その後、上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡの一部又は全部を含む領域を検出する工程とを有することを特徴とする請求項２記載のカプシクム属におけるトバモウイルス抵抗性識別方法。
【請求項４】
上記増幅する工程で用いる一対のプライマーを、上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡに基づいて設計することを特徴とする請求項３記載のカプシクム属におけるトバモウイルス抵抗性識別方法。
【請求項５】
上記一対のプライマーのうち一方は配列番号３で表される塩基配列からなり、他方は配列番号４で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項４記載のカプシクム属におけるトバモウイルス抵抗性識別方法。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを増幅するためのトバモウイルス抵抗性識別マーカー増幅用プライマー。
（ａ）配列番号１又は２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２で表される塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなりトバモウイルス抵抗性識別マーカーとして機能するＤＮＡ
【請求項７】
上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡの塩基配列に基づいて設計されたことを特徴とする請求項６記載のトバモウイルス抵抗性識別マーカー増幅用プライマー。
【請求項８】
配列番号３又は４で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項６記載のトバモウイルス抵抗性識別マーカー増幅用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピーマン等のカプシクム属に属する植物について、トバモウイルスに対する抵抗性の有無を識別できるトバモウイルス抵抗性識別マーカーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ピーマンおよびトウガラシを含むカプシクム属植物にはトバモウイルス属のトウガラシマイルドモットルウイルスに対して抵抗性と感受性を示す素材があることが知られている。抵抗性は、１つの優性遺伝子、すなわちＬ３抵抗性遺伝子により支配されていることが知られている（非特許文献１及び非特許文献２）。栽培場面においては、トバモウイルスに対する抵抗性を有することは有用であり、従来は抵抗性の有無をウイルスの接種により確認してきた（非特許文献３）。接種のためのウイルスが必要であることや検定のための時間がかかるため、より迅速で精度の高いウイルス抵抗性識別方法の開発が必要とされていた。
【０００３】
【非特許文献１】
バーザル−ヘランズ（Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ）ら、「バイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」、１９９５年、２０９巻、２号、ｐ．４９８−５０５
【非特許文献２】
デ　ラ　クルーズ（ｄｅ　ｌａ　ｃｒｕｚ）ら、「モルキュラー　プラント−マイクローブインタラクションズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」、１９９７年、１０巻、１号、ｐ．１０７−１１３
【非特許文献３】
モウリー（Ｍｏｕｒｙ）等、「ゲノム（Ｇｅｎｏｍｅ）」、２０００年、４３巻、ｐ．１３７−１４２
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、カプシクム属の植物について、接種のためのウイルスを必要とせず、迅速に、且つ高精度でトバモウイルス抵抗性を判別することができるカプシクム属のトバモウイルス抵抗性識別マーカーを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、トバモウイルスに抵抗性を示すカプシクム属の植物に特異的に存在するＤＮＡを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むカプシクム属におけるトバモウイルス抵抗性識別マーカー。
（ａ）配列番号１又は２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２で表される塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなりトバモウイルス抵抗性識別マーカーとして機能するＤＮＡ
【０００７】
（２）識別対象のカプシクム属に属する植物に、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ
（ａ）配列番号１又は２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２で表される塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなりトバモウイルス抵抗性識別マーカーとして機能するＤＮＡ
が存在するか否かを検定することを特徴とするカプシクム属におけるトバモウイルス抵抗性識別方法。
【０００８】
（３）上記検定する工程は、上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡの一部又は全部を含む領域を増幅する工程と、その後、上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡの一部又は全部を含む領域を検出する工程とを有することを特徴とする（２）記載のカプシクム属におけるトバモウイルス抵抗性識別方法。
【０００９】
（４）上記増幅する工程で用いる一対のプライマーを、上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡに基づいて設計することを特徴とする（３）記載のカプシクム属におけるトバモウイルス抵抗性識別方法。
【００１０】
（５）上記一対のプライマーのうち一方は配列番号３で表される塩基配列からなり、他方は配列番号４で表される塩基配列からなることを特徴とする（４）記載のカプシクム属におけるトバモウイルス抵抗性識別方法。
【００１１】
（６）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを増幅するためのトバモウイルス抵抗性識別マーカー増幅用プライマー。
（ａ）配列番号１又は２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２で表される塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなりトバモウイルス抵抗性識別マーカーとして機能するＤＮＡ
【００１２】
（７）上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡの塩基配列に基づいて設計されたことを特徴とする（６）記載のトバモウイルス抵抗性識別マーカー増幅用プライマー。
【００１３】
（８）配列番号３又は４で表される塩基配列からなることを特徴とする（６）記載のトバモウイルス抵抗性識別マーカー増幅用プライマー。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るカプシクム属におけるトバモウイルス抵抗性識別マーカーは、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むものである。
（ａ）配列番号１又は２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２で表される塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなりトバモウイルス抵抗性識別マーカーとして機能するＤＮＡ
【００１５】
ここで「トバモウイルス抵抗性識別マーカー」とは、トバモウイルス属のウイルスに対して抵抗性を示すカプシクム属の植物に特異的に見いだされるＤＮＡであって、トバモウイルス抵抗性の有無の識別に使用することができるＤＮＡをいう。トバモウイルス属に属するウイルスとしては、例えば、トウガラシマイルドモットルウイルス（ＰＭＭｏＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）、パプリカマイルドモットルウイルス　（ＰａＭＭＶ）を挙げることができる。
【００１６】
また、トバモウイルス抵抗性識別マーカーを見いだすことのできるカプシクム属に属する植物としては、Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ｃｈｉｎｅｎｓｅ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ｂａｃｃａｔｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ及びＣａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｎｕｕｍ等を挙げることができる。なお、トバモウイルス抵抗性識別マーカーを見いだすことのできるＣａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｎｕｕｍに属する野菜としては、ピーマン、トウガラシ及びパプリカ等を例示できる。
【００１７】
１．　トバモウイルス抵抗性識別マーカーの検索
トバモウイルス抵抗性識別マーカーの検索は、生物個体間の遺伝的多型を検出する方法、例えば、ＨＥＧＳ／ＡＦＬＰ法［Ｋａｗａｓａｋｉ　ａｎｄ　Ｍｕｒａｋａｍｉ　Ｊ．　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｓ．１１３：　４９７−５０６（２０００），　Ｋａｗａｓａｋｉ　ら　ＭＧＧ　２６６：１５７−１６６（２００１）　］等によって行うことができる。すなわち、まず、トバモウイルス抵抗性ピーマン及びウイルス感受性ピーマンより常法、例えばＣＴＡＢ法［Ｍｕｒｒａｙら：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　８：４３２１−４３２５（１９８０）］等によりそれぞれＤＮＡを抽出する。この際、抽出に使用する植物組織に限定はないが、好ましくは葉を用いる。さらに、これらの葉は、ＤＮＡ抽出を効率よく行うことができるように粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素により凍結し、乳鉢内で粉砕することができる。なお、トバモウイルス抵抗性ピーマン及びウイルス感受性ピーマンを用いる方法に限定されず、カプシクム属に属する植物であれば如何なる植物を用いてもよい。
【００１８】
次に、抽出したＤＮＡを制限酵素（例えばＭｓｅ　Ｉ，　ＥｃｏＲ　Ｉ）で消化し、アダプターをＤＮＡリガーゼを用いて結合させる。これを鋳型として、いわゆる前選択プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；　ＰＣＲ）を行う。次に、この増幅断片を鋳型にして、いわゆる選択プライマーを組み合わせてＰＣＲを行う。ここでＰＣＲの反応条件は、特に限定はしないが、好ましくは９２〜９６℃で１〜２分間（二本鎖ＤＮＡの解離）、３７〜４２℃で１〜２分間（プライマーのアニーリング）、７０〜７４℃で１〜２分間（相補鎖の合成）で順次反応させ、好ましくはこれを３０〜４０サイクル行う。ＰＣＲは、特に限定されないが、ヒートブロック式のプログラム温度制御装置（例えば、ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　（宝酒造社製））を用いて行うことができる。
【００１９】
ＨＥＧＳ／ＡＦＬＰ法のＰＣＲの後、その増幅断片を検出する。検出方法としては、ゲル電気泳動（例えば、アガロース電気泳動、ポリアクリルアミド電気泳動等）及びそれに続くゲル染色（例えば、エチジウムブロミド染色や銀染色等）による方法があげられるが、これに限定されない。例えば、ポリアクリルアミド電気泳動の後、銀染色でゲルを染色すると、増幅断片を示すバーコード様のバンドパターンが得られる。従って、このバンドパターンを、トバモウイルス抵抗性ピーマン由来のＤＮＡを用いた場合と、トバモウイルス感受性ピーマン由来のＤＮＡを用いた場合とで比較することで、トバモウイルス抵抗性ピーマンに特異的に見出されるＰＣＲ増幅産物を検出することができる。
このようにして検出されたトバモウイルス抵抗性ピーマンに特異的に見出されるＰＣＲ増幅産物を、カプシクム属のウイルス抵抗性識別マーカーとすることができる。
【００２０】
２．　トバモウイルス抵抗性識別マーカーの塩基配列決定
上記１において得られたカプシクム属のトバモウイルス抵抗性識別マーカーの塩基配列は、当該技術分野で周知の塩基配列決定法により決定することができる。すなわち、例えば、上記１におけるＰＣＲ増幅産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動後のゲルからウイルス抵抗性識別マーカーとしたバンドを抽出し、塩基配列決定用プラスミド（例えば、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ　（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製））に連結する。次いで、連結物を大腸菌に形質転換後、コロニーＰＣＲ法によって、ウイルス抵抗性識別マーカーの挿入されたプラスミドを含有する大腸菌をスクリーニングする。得られた大腸菌からプラスミドを調製し、ジデオキシ法等の公知の手法によって挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。トバモウイルス抵抗性識別マーカーとして取得されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１に、その相補鎖配列を配列番号２に示す。配列番号１及び２で表される塩基配列からなるＤＮＡは、トバモウイルス抵抗性植物中で互いに２本鎖を形成し、共にカプシクム属のトバモウイルス抵抗性識別マーカーとして有用である。
【００２１】
なお、トバモウイルス抵抗性識別マーカーは、配列番号１又は２に示される塩基配列からなるものに限定されず、カプシクム属のトバモウイルス抵抗性を識別できる機能を有するものであれば、配列番号１又は２に示す塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなるものであっても良い。ここで、「１以上の塩基」とは、例えば、１〜５０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個の塩基を意味する。
【００２２】
言い換えると、トバモウイルス抵抗性識別マーカーは、配列番号１又は２に示される塩基配列からなるＤＮＡにおける多型物も含む意味である。ここで、「多型物」とは、より詳細には、同じトバモウイルス抵抗性のカプシクム属個体間において、１もしくは数個のレベルで対応する塩基配列間に差異の生じたＤＮＡ多型物を意味する。
【００２３】
なお、トバモウイルス抵抗性識別マーカーは、上記１の方法により調製すことができるが、その他にも、決定された塩基配列に基づいてプライマーを設計・合成し、このプライマーを用いてトバモウイルス抵抗性個体から抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより調製することもできる。
【００２４】
３．カプシクム属のトバモウイルス抵抗性識別方法
上記１及び２で説明したトバモウイルス抵抗性識別マーカーを用いることによって、カプシクム属に属する被検植物に関するトバモウイルス抵抗性を識別することができる。具体的には、トバモウイルス抵抗性識別マーカーの有無の解析はＰＣＲ法等により行うことができる。トバモウイルス抵抗性識別マーカーの有無の解析は、当該トバモウイルス抵抗性識別マーカーにハイブリダイズできるプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションにより行うこともできる。
【００２５】
例えば、ピーマンについて、ＰＣＲ法による抵抗性識別マーカーの解析に基づいたトバモウイルス抵抗性識別は、以下のようにして行うことができる。まず、トバモウイルス抵抗性識別マーカーの一部を含むウイルス抵抗性識別マーカー増幅用プライマーを設計・合成する。ここで「トバモウイルス抵抗性識別マーカーの一部」とは、上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡに特異的にプライマーとして機能するヌクレオチド鎖をいう。ここで「プライマーとして機能する」とは、ＰＣＲの相補鎖合成反応においてＤＮＡポリメラーゼに３’末端ＯＨ基を提供し、当該酵素によるヌクレオチド鎖合成反応を開始させるように機能することをいう。プライマーの合成は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られる公知の方法を用いることができるが、より簡便には、ＤＮＡシンセサイザー（例えばＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて行うことができる。
【００２６】
より詳細には、ＰＣＲ法によるトバモウイルス抵抗性識別マーカーの解析には、トバモウイルス抵抗性識別マーカーの一部又は全部の領域を増幅し得るような５’側プライマーと３’側プライマーとからなる一対のトバモウイルス抵抗性識別マーカー増幅用プライマーが必要である。例えば、ウイルス抵抗性識別マーカー増幅用プライマーの５’側プライマーとしては５’−ＣＣＡＡＴＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号３）を、３’側プライマーとして５’−ＡＴＴＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＧＡＣ−３’（配列番号４）が挙げられるが、当業者であれば配列番号１又は２の配列に基づいて、他の適切な配列を容易に設計・合成することができ、これらのプライマーに限定されない。これらのプライマーは、５’側プライマーと３’側プライマーとを適当に組み合わせて、ウイルス抵抗性識別マーカー領域を増幅するプライマーペアとして使用することができるが、その適当な組合せは、当業者であれば適宜選択することができる。すなわち、５’側プライマーが、３’側プライマーより上流（５’から３’への向きにおいて）に存在するようにプライマーペアを選択することが必須の条件となるが、プライマーの組合せは任意である。
【００２７】
配列番号３，４のプライマーを用いてカプシクム属に属する植物について、トバモウイルス抵抗性の有無の識別を行うことができる。例えば、ピーマンについては、トバモウイルス抵抗性のピーマン素材とトバモウイルス感受性のピーマン素材との交配の組合せにより得られるＦ１個体の交配の確認や、Ｆ２個体群の中からトバモウイルス抵抗性個体を識別することができる。
【００２８】
具体的手順を例示すると以下のようになる。すなわち、まず、ピーマン幼植物の組織から常法に従ってＤＮＡを抽出する。ＤＮＡ抽出に用いる植物体の組織は特に限定されないが、好ましくは葉を用いる。さらに、これらの葉は、核酸抽出の効率を良く行うことができるように粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素を用いて粉砕することができる。ＤＮＡの抽出は公知の方法を用いて行うことができるが、好ましくはＣＴＡＢ法［Ｍｕｒｒａｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　８，　４３２１−４３２５　（１９８０）］により抽出することができる。
【００２９】
次いで、抽出したＤＮＡを鋳型とし、上述した一対のウイルス抵抗性識別マーカー領域増幅用のプライマーを用いてＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片を増幅させる。ＰＣＲの温度条件は、当業者であれば経験に基づいて適切に決定することができ、特に限定はしないが、好ましくは９２〜９６℃で１０〜３０秒間（二本鎖ＤＮＡの解離）、５５〜６５℃で１０〜３０秒間（プライマーのアニーリング）、７０〜７４℃で１０〜３０秒間（相補鎖の合成）順次反応させ、好ましくはこれを３０〜４０サイクル行う。ＰＣＲは、ヒートブロック式のプログラム温度制御装置（例えば、ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　（宝酒造社製））を用いて行うことができる。
【００３０】
最後に、以上のようにして得られる反応混合物から、増幅された核酸を検出する。検出の方法については、当技術分野で通常用いられる方法を用いることができるが、好ましくは上述したアガロースゲル電気泳動およびそれに続くエチジウムブロミドによるゲル染色を行う方法を用いることができる。これにより、トバモウイルス属に対して抵抗性を示す被検体ピーマンにのみＰＣＲ増幅断片が検出されるが、トバモウイルス属に対して感受性を示す被検体ピーマンには検出されない。したがって、ＰＣＲ増幅断片が検出されれば、被検体ピーマン中にはトバモウイルス抵抗性識別マーカーが存在し、当該被検体ピーマンはトバモウイルスに対して抵抗性であると評価できる。
【００３１】
なお、上述したトバモウイルス抵抗性識別方法は、識別対象がピーマンに限定されず、カプシクム属に属する植物であれば如何なる植物をも識別対象とすることができる。カプシクム属に属する植物としては、Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ｃｈｉｎｅｎｓｅ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ｂａｃｃａｔｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ及びＣａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｎｕｕｍ等を挙げることができる。なお、トバモウイルス抵抗性識別マーカーを見いだすことのできるＣａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｎｕｕｍに属する野菜としては、ピーマン以外には、トウガラシ及びパプリカ等を例示できる。
【００３２】
【実施例】
以下に、本発明を実施例を示して具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３３】
［実施例１］　　トバモウイルス抵抗性識別マーカーの探索
（１）ピーマン葉からのＤＮＡの抽出
ピーマンの葉５ｇからＣＴＡＢ法を用いてＤＮＡを抽出した。抽出に用いたピーマンは、みはたＫＯＳ（感受性ピーマン：Ｌ３抵抗性遺伝子をもたない）、みはたＮＤＮ（抵抗性ピーマン：Ｌ３抵抗性遺伝子をホモにもつ）、みはた１号（Ｌ３抵抗性遺伝子をヘテロにもつ）の自殖後代の感受性個体１２個体、抵抗性個体１２個体を用いた。
【００３４】
（２）ＨＥＧＳ／ＡＦＬＰ法によるウイルス抵抗性識別マーカーの探索
上記（１）で抽出したＤＮＡを鋳型としてＨＥＧＳ／ＡＦＬＰ法を行った。すなわち、まず、上記（１）で抽出したＤＮＡに制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩとＭｓｅ　Ｉを加え、３７℃で４時間制限酵素処理を行った。次に、制限酵素処理断片にＥｃｏ　ＲＩアダプターとＭｓｅ　Ｉアダプターを加えて室温で４時間ＤＮＡライゲースによるライゲーション反応を行った後、Ｅｃｏ　ＲＩ、Ｍｓｅ　Ｉ　アダプターの部分塩基配列とそれに隣接する制限酵素の切断面の塩基配列とで構成される　Ｅｃｏ　ＲＩ、Ｍｓｅ　Ｉ　前選択プライマーを用いたＰＣＲ（反応条件：９４℃で１分間の後に、９４℃で３０秒間、５６℃で１分間及び７２℃で１分間からなるサイクルを２０サイクル行う）により増幅させた。
【００３５】
その後、Ｅｃｏ　ＲＩ、Ｍｓｅ　Ｉ　前選択プライマーの３’　末端側にさらに任意の　３　塩基を付加した塩基配列をＥｃｏ　ＲＩ　選択プライマー（６４　種類）、Ｍｓｅ　Ｉ　選択プライマー（６４種類）とし、合計　４０９６（６４　ｘ　６４）通りの選択　ＰＣＲ　（反応条件：９４℃で３０秒間、６８℃で１分間及び７２℃で１分間からなるサイクルを１６サイクル行う。ただし会合時の温度（６８℃）は、１サイクル毎に０．７℃づつ下げていく）を行った後に、さらにＰＣＲ（反応条件：９４℃で１分間の後に、９４℃で３０秒間、５６℃で１分間及び７２℃で１分間からなるサイクルを２６サイクル行う）を行った。なお、温度設定にはヒートブロック式のプログラム制御装置ＰＣＲ　Ｔｈｅｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（宝酒造製）を用いた。次に反応液８μｌをポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルを銀染色して増幅断片を検出した。その結果、Ｌ３抵抗性遺伝子を持つ個体由来のＤＮＡにおいて特異的に検出されるトバモウイルス抵抗性識別マーカーを同定した。
【００３６】
［実施例２］　　トバモウイルス抵抗性識別マーカーの塩基配列決定
（１）トバモウイルス抵抗性識別マーカーのクローニング
実施例１において同定されたトバモウイルス抵抗性識別マーカーを、２０倍に希釈したＴＢＥバッファーで満たした透析チューブに入れて、３０分間５００Ｖの電圧をかけてポリアクリルアミドゲルから溶出させた。その後電極を逆転して３０秒間５００Ｖの電圧をかけた。透析チューブ内のバッファーを回収した。回収したトバモウイルス抵抗性識別マーカーを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、大腸菌に形質転換した。
【００３７】
（２）ウイルス抵抗性識別マーカーの塩基配列決定
次に、トバモウイルス抵抗性識別マーカーを有するクローンを培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　を用いて組換えプラスミドを抽出した。抽出した組換えプラスミドを鋳型としてＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔｓ（ＰＥバイオシステムズジャパン社）により、トバモウイルス抵抗性識別マーカーの塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１および２に示した。
【００３８】
［実施例３］　　ＰＣＲ法によるピーマンのウイルス抵抗性識別
得られたウイルス抵抗性識別マーカーの存在を指標として、ピーマンについてトバモウイルス抵抗性識別をＰＣＲ法を用いて行った。まず、実施例２において決定された塩基配列に基づいて、ウイルス抵抗性識別マーカー増幅用プライマーを設計及び合成した。５’側プライマーとして５’−ＣＣＡＡＴＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号３）を、３’側プライマーとして５’−ＡＴＴＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＧＡＣ−３’（配列番号４）を合成した。
【００３９】
一方、被検ピーマンの葉５ｇより、ＣＴＡＢ法によりＤＮＡを抽出した。「みはたＫＯＳ」（感受性ピーマン：Ｌ３抵抗性遺伝子をもたない）と「みはたＮＤＮ」（抵抗性ピーマン：Ｌ３抵抗性遺伝子をホモにもつ）とのＦ１である「みはた１号」の自殖後代集団（抵抗性個体１６個体、感受性個体１６個体）、また感受性の素材「みはたＫＯＳ」、「昌介」、「園研昌介」、抵抗性の素材「みはたＮＤＮ」、Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ｃｈｉｎｅｎｓｅ　ＰＩ　１５９２３６，　ＰＩ　１５２２２５，　ＰＩ　３１５００８よりＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型として、５’側プライマーと３’側プライマーを用いたＰＣＲを行った。このＰＣＲでは、ＤＮＡ溶液１　μｌ（２０　ｎｇ／μｌ）、１０ｘＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　２　μｌ、ｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ　１．６　μｌ（各２．５　ｍＭ）、ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　０．１μｌ（５Ｕ／μｌ）、滅菌蒸留水１４．３　μｌ、５’側プライマー０．５　μｌ　（１０　μＭ）および３’側プライマー０．５　μｌ　（１０　μＭ）を混合して反応を行った。なお、５’側プライマーは配列番号３の塩基配列であり、３’側プライマーは配列番号４の塩基配列である。ＰＣＲ条件は、９４℃で４分間の反応後、９４℃で１０秒間、６０℃で１０秒間及び７２℃で１０秒間からなるサイクルを３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で７分間反応させる条件とした。なお、温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度制御装置ＰＣＲ　Ｔｈｅｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（宝酒造製）を用いた。
【００４０】
次に、ＰＣＲ反応液１０μｌを１％アガロースゲル電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、紫外線光下で観察して増幅断片を検出した。結果を図１及び図２に示した。図１は「みはた１号」の自殖後代を用いた場合であり、上段はトバモウイルスに対して感受性を示すＦ２集団１６個体を供試した結果を示し、下段はトバモウイルスに対して抵抗性を示すＦ２集団１６個体を供試した結果を示す。図１に下段に付した矢印はＰＣＲ増幅産物を指し示している。図２は抵抗性が既知の各種ピーマン品種を解析した結果である。図２中「ＫＯＳ」はＣ．　ａｎｎｕｕｍ「みはたＫＯＳ」のＤＮＡを用いたときの結果を示し、「ＮＤＮ」はＣ．　ａｎｎｕｕｍ「みはたＮＤＮ」のＤＮＡを用いたときの結果を示し、「Ｚ」はＣ．　ｃｈｉｎｅｎｓｅ　ＰＩ　３１５００８のＤＮＡを用いたときの結果を示し、「Ｙ」はＣ．　ｃｈｉｎｅｎｓｅ　ＰＩ　１５９２３６のＤＮＡを用いたときの結果を示し、「Ｘ」はＣ．　ｃｈｉｎｅｎｓｅ　ＰＩ　１５２２２５のＤＮＡを用いたときの結果を示し、「ＥＳＳ」はＣ．　ａｎｎｕｕｍ「園研昌介」のＤＮＡを用いたときの結果を示し、「Ｅ１」はＣ．　ａｎｎｕｕｍ　　「昌介」のＤＮＡを用いたときの結果を示す。
【００４１】
図１及び図２から明らかなように、トバモウイルス抵抗性の試料にのみ目的の増幅断片が検出された。以上のことから、ＰＣＲ法による本発明のウイルス抵抗性識別マーカーの解析に基づいて、ピーマンのウイルス抵抗性識別を行うことができることが判明した。
【００４２】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、カプシクム属に属する植物に関してトバモウイルス属に対する抵抗性の有無を迅速に、且つ、優れた精度で識別することができる。
【００４３】
【配列表】
2004097107.tif 000002
2004097107.tif 000003
2004097107.tif 000004
【００４４】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３及び４は合成ＤＮＡである。
【図面の簡単な説明】
【図１】「みはた１号」の自殖後代から抽出したＤＮＡを用いてトバモウイルス抵抗性識別マーカーを検出するためのＰＣＲを行った結果を示す電気泳動写真であり、上段はトバモウイルスに対して感受性を示すＦ２集団１６個体を供試した結果を示し、下段はトバモウイルスに対して抵抗性を示すＦ２集団１６個体を供試した結果を示す。
【図２】抵抗性が既知の各種ピーマン品種から抽出したＤＮＡを用いてトバモウイルス抵抗性識別マーカーを検出するためのＰＣＲを行った結果を示す電気泳動写真である。
【図１】
2004097107.tif 000005
【図２】
2004097107.tif 000006