(57)【要約】【課題】高精度の遺伝子解析ができるとともに、より高密度にポリヌクレオチドの微小スポットを配列でき、より多くの遺伝子解析を一度におこなうことができるポリヌクレオチドを固定化するための基体およびその製造方法とマイクロアレイを提供すること。【解決手段】少なくとも表面が炭素系材料からなる固定支持体１００を有する、ポリヌクレオチドを固定化するための基体１０において、固定支持体上１００に離散的に２次元配列させた化学修飾部３０１を設けた。また、化学修飾部３０１の２次元配列位置を示す位置決め用マーク５０１，５０２，５０３を端部に設けた。【選択図】    図８
2004309276.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表面が炭素系材料からなる固定支持体を有する、ポリヌクレオチドを固定化するための基体において、
前記固定支持体上に離散的に２次元配列させた化学修飾部を設けたことを特徴とするポリヌクレオチドを固定化するための基体。
【請求項２】
前記固定支持体は、炭素系材料からなる固定層と、前記固定層を支持する支持体とからなることを特徴とする請求項１記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体。
【請求項３】
前記支持体がシリコンからなることを特徴とする請求項２記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体。
【請求項４】
前記炭素系材料は、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイトの少なくともいずれか１つからなることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体。
【請求項５】
前記化学修飾部の２次元配列位置を示す位置決めマークを端部に設けたことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体。
【請求項６】
請求項１記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体を製造する方法において、
前記固定支持体の表面を化学修飾し、前記固定支持体表面の化学修飾部を選択的に除去することを特徴とするポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法。
【請求項７】
前記固定支持体表面の化学修飾部を選択的に除去するにあたって、化学修飾された前記固定支持体の表面をレーザ光により除去することを特徴とする請求項６記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法。
【請求項８】
請求項２記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体を製造する方法において、
前記固定層を離散的に２次元配列し、前記固定層の表面を化学修飾することを特徴とするポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法。
【請求項９】
前記固定層を離散的に２次元配列するにあたって、前記支持体上に作成した前記固定層をエッチングにより選択的に除去することを特徴とする請求項８記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法。
【請求項１０】
前記固定層を離散的に２次元配列するにあたって、前記支持体上に作成した前記固定層をレーザ加工により選択的に除去することを特徴とする請求項８記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体と、前記基体の化学修飾部上に２次元配列固定されたポリヌクレオチドとからなることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１２】
請求項５記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体と、前記基体の化学修飾部上に２次元配列固定されたポリヌクレオチドとからなるマイクロアレイの前記ポリヌクレオチドを解析するためのマイクロアレイの蛍光分析方法において、
前記位置決めマークを検出し、検出した位置決めマークの位置情報に基づき前記ポリヌクレオチドの２次元配列位置情報を演算し、
前記ポリヌクレオチドの２次元配列位置情報に基づき、検出用レーザ光の走査方向を補正して前記マイクロアレイに照射することを特徴とするマイクロアレイの蛍光分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現、変異、多型等の同時解析に非常に有用な、ポリヌクレオチドを固定化するための基体およびその製造方法、ならびにマイクロアレイおよびその蛍光分析方法に関する
【０００２】
【従来の技術】
基体上にＤＮＡ等のポリヌクレオチドの微小スポットが固定されたものをマイクロアレイと呼ぶが、図１０に示すように、従来のマイクロアレイ１は、あらかじめ調製しておいたＰＣＲ増幅したＤＮＡの微小スポット２００を基体１０の固定支持体１００表面に２次元配列し、固定化している（例えば、特許文献１参照）。また、固定支持体１００は、スライドガラスまたはシリコンなどの平面基板からなり、図１１に示すようにその表面にはＤＮＡが固定化できるようにＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ等の高分子層３００が塗布形成されている。
【０００３】
しかし、スライドガラスまたはシリコンなどの平面基板表面にＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ等の高分子層３００を塗布形成してＤＮＡを固定化する方法では、ＤＮＡの固定化状態が不安定であり、ハイブリッド形成過程や洗浄工程において、ＤＮＡが剥離するといった問題がある。そこで、ＤＮＡを安定に固定するために、図１２のようにダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイト等の炭素系材料からなる固定支持体１０１の表面を官能基で化学修飾しているものがある。（例えば、特許文献２参照）。図１２において、１０１は固定支持体、３０１は化学修飾部、２００はＤＮＡの微小スポットである。
【０００４】
以上のような高分子層を形成した基体や化学修飾された基体に、スポッティング装置を用いて、ＤＮＡの微小スポットを高密度で配列させる。スポッティング装置は、ペン先のような形状をしたスポットピンを持ち、吸引したＤＮＡを基体に接触してスポッティングする方式や、インクジェット式のスポットピンを持ち、基体に非接触でＤＮＡをスポッティングする方式がある。
【０００５】
一般的なマイクロアレイの大きさは２５ｍｍ×７６ｍｍであり、これにスポット径１００〜３００μｍ、スポットピッチ２００μｍ程度でスポッティング装置によりＤＮＡを配列している。
【０００６】
これら従来のマイクロアレイを用いて遺伝子解析する方法は以下のとおりである（例えば、特許文献３参照）。まず、既知の異なる多数のポリヌクレオチド、例えば標本ＤＮＡを２次元配列したマイクロアレイを作成する。つぎに、第１の蛍光色素で標識された健常者の細胞から取り出した検体ＤＮＡを前記マイクロアレイ上の標本ＤＮＡとハイブリタイズさせる。その後、所定の溶液で前記マイクロアレイを洗浄すると、マイクロアレイ上の標本ＤＮＡとハイブリタイズされなかった検体ＤＮＡは除去され、ハイブリタイズされた検体ＤＮＡだけが標本ＤＮＡの各微小スポット部に残る。蛍光分析装置を用いて、第１の蛍光色素を励起する波長の第１の励起レーザを走査しながらこのマイクロアレイ上の各微小スポットに照射する。すると検体ＤＮＡの残った部分のみ、第１の蛍光色素から蛍光を発する。この蛍光強度を検出し、標識信号を得る。
【０００７】
上記と同様の処理を、第２の蛍光色素で標識された遺伝子疾患を有する患者の細胞から取り出した検体ＤＮＡに関しても行い、第２の励起レーザの照射により発生した蛍光の検出結果を表す標識信号を得る。健常者の検体ＤＮＡから得られた標識信号と患者の検体ＤＮＡから得られた標識信号との比から、特異的な微小スポットを求めることにより、患者に特異なＤＮＡが何であるかを解析することができる。
【０００８】
図１３に従来の蛍光分析装置を示す。４０１は第１の励起レーザを出力する第１のレーザ光源、４０２は第２の励起レーザを出力する第２のレーザ光源である。この第１のレーザ光源４０１および第２のレーザ光源４０２から発せられた励起光は反射ミラー４０３、第１のダイクロイックミラー４０４、プリズム４０５を通過後、第１のスキャナミラ−４０６、および第２のスキャナミラー４０７で走査され、レンズ４０８を通過してマイクロアレイ１上のポリヌクレオチドの微小スポットを照射する。前記第１または第２の励起レーザの照射によりポリヌクレオチドの微小スポットから発生した蛍光を、レンズ４０８、第２のスキャナミラー４０７、第１のスキャナミラー４０６、プリズム４０５、フィルタ４０９、ピンホール４１０を通過させて、第２のダイクロイックミラー４１１で波長分離後、第１のフォトマルチメータ４１２または第２のフォトマルチメータ４１３に入射させ検出する構成になっている。
【０００９】
【特許文献１】
特表平１０−５０３８４１号公報
【００１０】
【特許文献２】
特開２００１−１３９５３２号公報
【００１１】
【特許文献３】
特開平２００１−０７４６５８号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のマイクロアレイおよびポリヌクレオチドを固定化するための基体では、各微小スポットの形状ばらつきや各微小スポット間距離のばらつきがあり、遺伝子解析プロセスの中で後工程となる測定・解析工程での不具合や測定精度が低くなるという問題があった。また、各微小スポットの形状ばらつきや各微小スポット間距離のばらつきによって、各微小スポットの大きさや、微小スポット間距離が制限され、マイクロアレイの高密度化が図れないといった問題点があった。
【００１３】
また、従来のマイクロアレイおよびポリヌクレオチドを固定化するための基体では、その固定支持体の外形公差が０．３ｍｍほどある。したがって、固定支持体に対する化学修飾部の２次元配列位置が、基体毎に図１４（ｂ）のようにオフセットしたり、図１４（ｃ）のように傾いたりする。さらに、この化学修飾部に固定化したポリヌクレオチドの微小スポットの２次元配列も、マイクロアレイ毎にオフセットしたり、傾いたりする。そのため、マイクロアレイを蛍光分析装置で測定する際、励起レーザが微小スポットの配列位置からずれて走査することがあり、マイクロアレイごとに測定結果のばらつきが生じるという問題があった。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、ポリヌクレオチドの微小スポット形状を均一にするとともに微小スポットを均一配列させることにより、高精度の遺伝子解析ができるとともに、より高密度にポリヌクレオチドの微小スポットを配列でき、より多くの遺伝子解析を一度におこなうことができるポリヌクレオチドを固定化するための基体およびその製造方法とマイクロアレイを提供することにある。
【００１５】
また、本発明の別の目的は、マイクロアレイの蛍光分析において励起光をポリヌクレオチドの微小スポットに正確に走査・照射でき、蛍光分析による測定精度が低下しないようにすることができるポリヌクレオチドを固定化するための基体およびその製造方法、ならびにマイクロアレイおよびその蛍光分析方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記問題を解決するため、請求項１記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体は、少なくとも表面が炭素系材料からなる固定支持体を有する、ポリヌクレオチドを固定化するための基体において、前記固定支持体上に離散的に２次元配列させた化学修飾部を設けたことを特徴とするものである。
【００１７】
このような構成にすることで、化学修飾部以外の場所にポリヌクレオチドは固定されないので、ポリヌクレオチドは２次元配列された化学修飾部上にのみ固定化され、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配置を均等にすることができる。
【００１８】
また、請求項２記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体は、前記固定支持体が、炭素系材料からなる固定層と、前記固定層を支持する支持体とからなることを特徴とするものである。
【００１９】
このような構成にすることで、ポリヌクレオチドを固定化しない部分の固定層を除去し、残った固定層上に化学修飾することにより、離散的に２次元配列させた化学修飾部を設けることができる。
【００２０】
また、請求項３記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体は、前記支持体がシリコンからなることを特徴とするものである。
【００２１】
また、請求項４記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体は、前記炭素系材料が、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイトの少なくともいずれか１つからなることを特徴とするものである。
【００２２】
請求項３及び４のような構成とすることで、シリコンは疎水性を有し、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイトは親水性を有するので、前記基体上にスポッティングされたＤＮＡは、シリコンを避けて、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボンまたはグラファイト上の化学修飾部に効率よく集中することができる。
【００２３】
また、請求項５記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体は、前記化学修飾部の２次元配列位置を示す位置決めマークを端部に設けたことを特徴とするものである。
【００２４】
このような構成にすることで、位置決めマークを蛍光分析装置であらかじめ検出することにより、化学修飾部およびポリヌクレオチドの微小スポットの２次元配列位置を特定でき、蛍光分析装置の励起光をポリヌクレオチドの微小スポットに正確に走査・照射できる。また、固定支持体の表面はダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイト等の炭素系材料からなっているため、位置決めマークはレーザによって容易に設けることができる。
【００２５】
また、請求項６記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法は、請求項１記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体を製造する方法において、前記固定支持体の表面を化学修飾し、前記固定支持体表面の化学修飾部を選択的に除去することを特徴とするものである。
【００２６】
このように化学修飾部を広範囲に形成した後、不要部を選択除去することにより、容易かつ微細に２次元配列された化学修飾部を形成することができ、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配置を均等にできる。
【００２７】
また、請求項７記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法は、前記固定支持体表面の化学修飾部を選択的に除去するにあたって、化学修飾された前記固定支持体の表面をレーザ光により除去することを特徴とするものである。
【００２８】
このようにレーザ光を用いるため、容易に前記固定支持体表面の化学修飾部を選択的に除去することができ、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配列数が異なる他種のマイクロアレイを作製することができる。また、固定支持体はダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイト等の炭素系材料からなっているため、レーザによって容易に選択除去できる。
【００２９】
また、請求項８記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法は、請求項２記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体を製造する方法において、前記固定層を離散的に２次元配列し、前記固定層の表面を化学修飾することを特徴とするものである。
【００３０】
このようにするため、ポリヌクレオチドを固定化しない部分の固定層を除去し、残った固定層上を化学修飾することにより、離散的に２次元配列させた化学修飾部を持つポリヌクレオチドを固定化するための基体を製造できる。
【００３１】
また、請求項９記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法は、前記固定層を離散的に２次元配列するにあたって、前記支持体上に作成した前記固定層をエッチングにより選択的に除去することを特徴とするものである。
【００３２】
このようにエッチングを用いることで、エッチングの際に用いるマスクにしたがって固定層を微細に２次元配列することができる。
【００３３】
また、請求項１０記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法は、前記固定層を離散的に２次元配列するにあたって、前記支持体上に作成した前記固定層をレーザ加工により選択的に除去することを特徴とするものである。
【００３４】
このようにレーザ加工を用いることで、マスクを用いずに固定層を微細に２次元配列することができるので、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配列数が異なる他種のマイクロアレイを容易に作成することができる。また、固定層はダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイト等の炭素系材料からなっているため、レーザによって容易に選択除去できる。
【００３５】
また、請求項１１記載のマイクロアレイは、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体と、前記基体の化学修飾部上に２次元配列固定されたポリヌクレオチドとからなることを特徴とするものである。
【００３６】
このような構成にすることで、ポリヌクレオチドは２次元配列された化学修飾部上にのみ固定化され、化学修飾部以外の場所にポリヌクレオチドは固定されないので、基体上のポリヌクレオチド微小スポットは微細かつ配置が均一になる。また、化学修飾部すなわちポリヌクレオチドの微小スポットの２次元配列位置を示す位置決めマークを設けた基体からなるマイクロアレイでは、その位置決めマークを蛍光分析装置であらかじめ検出することにより、蛍光分析装置の励起光をポリヌクレオチドの微小スポットに正確に走査・照射できる。
【００３７】
請求項１２記載のマイクロアレイの蛍光分析方法は、請求項５記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体と、前記基体の化学修飾部上に２次元配列固定されたポリヌクレオチドとからなるマイクロアレイの前記ポリヌクレオチドを解析するためのマイクロアレイの蛍光分析方法において、固定支持体の端部に設けた前記位置決めマークを検出し、前記ポリヌクレオチドの２次元配列位置情報を演算し、前記ポリヌクレオチドの２次元配列位置情報に基づき、検出用レーザ光の走査方向を補正して前記マイクロアレイに照射することを特徴とするものである。
【００３８】
これにより、蛍光分析装置の励起光をポリヌクレオチドの微小スポットに正確に走査・照射でき、蛍光分析によるマイクロアレイごとの測定結果のばらつきを抑えることができる。
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的実施例を図に基づいて説明する。
【００４０】
（第１実施例）
図１は本発明のＤＮＡ等のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。図２はポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。図において、１０はＤＮＡ等のポリヌクレオチドを固定するための基体、１０１はダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、またはグラファイトからなる固定支持体、３０１は化学修飾部である。化学修飾部３０１は図２のように微小エリアに分かれ、各微小エリアは離散的に２次元配列されている。本実施例では固定支持体１０１として、３ｍｍ角、厚さ０．３ｍｍのＣＶＤダイヤモンドを用いた。
【００４１】
本実施例の基体１０の製造方法としては、図３に示すように、まず固定支持体１０１の表面全体に化学修飾を施した（ステップ１）。ついで、化学修飾部３０１が図２のように離散的に配列するように、化学修飾部３０１を選択的に除去した（ステップ２）。ステップ１の化学修飾は、特許文献１を参考に、塩素ガス中でＣＶＤダイヤモンドの固定支持体１０１に紫外線照射して表面を塩素化し、ついでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、酸クロリドを用いてクロロフォルム中で乾留してカルゴキシル化した。この表面が化学修飾された固定支持体１０１を、カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した１，４−ジオキサン溶液中に浸漬させ、末端カルボキシル基を脱水縮合した。反応終了後、さらに、１，４−ジオキサン溶液で洗浄後乾燥し、固定支持体１０１表面を化学修飾した。つぎに、ステップ２の化学修飾部３０１の選択除去では、レーザを用いた。用いたレーザは波長２６６ｎｍのＹＡＧ４倍波レーザであり、固定支持体１０１表面でφ２００μｍになるようにレンズ系で集光した。このレーザ光を２つのガルバノスキャナーを用いて３５０μｍの等間隔でＸ−Ｙ方向に走査した。波長２６６ｎｍのレーザ光に対して、固定支持体１０１として用いたダイヤモンドの炭素原子間の共有結合が切れ、固定支持体１０１表面のレーザ照射部はケミカル加工される。したがって、レーザ照射により、照射部の固体支持体１０１表面が数μｍ消失してしまうと共に、化学修飾部３０１も除去することができた。
【００４２】
作製した基体１０の各化学修飾部３０１の大きさは１５０μｍ角、各化学修飾部間の距離は２００μｍであった。あらかじめ調製しておいたＰＣＲ増幅したＤＮＡをスポッティング装置によって、作製した基体１０の各化学修飾部３０１上にスポッティング固定し、マイクロアレイを作製した。その後、相補的な配列をもつ蛍光標識プローブとハイブリタイゼーションさせ、蛍光分析装置で分析をおこなった。従来のマイクロアレイに比べ、ＤＮＡの各微小スポットが、規則正しく所定の位置に配列しているために、サンプル毎の解析結果のばらつきが大幅に減少した。
【００４３】
（第２実施例）
図４は第２実施例のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。図５は第２実施例のポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。図において、１０２は固定層、１０３は支持体、３０１は化学修飾部である。本実施例において、固定支持体は、固定層１０２とこれを支持する支持体１０３とから構成されている。固定層１０２は図５のように微小エリアに分かれ、各微小エリアは離散的に２次元配列されている。化学修飾部３０１は、この２次元配列された固定層１０２の上に設けられている。
【００４４】
本実施例の基体１０の製造方法としては、図６に示すように、まず支持体１０３の表面全体に固定層１０２を形成した（ステップ１）。ついで、固定層１０２が図５のように離散的に配列するように、固定層１０２を選択的に除去した（ステップ２）。さらに、固定層１０２上に化学修飾を施した（ステップ３）。ステップ１では、２５ｍｍ×７６ｍｍ、厚さ１ｍｍのガラスまたはシリコン製の支持体１０３上に、メタンガス（ＣＨ４）を原料にプラズマＣＶＤを用いて厚さ０．２μｍのダイヤモンドライクカーボンを形成した。ステップ２では、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）法を用いて加工をおこなった。使用したマスク形状に応じて、１２５μｍピッチで２次元配列されたφ５０μｍの固定層１０２の微小エリアが１０万個形成できた。ステップ３では、第１実施例のステップ１と同等の化学修飾処理をおこなった。
【００４５】
図７は、本実施例で作製した基体１０にＤＮＡをスポッティングして固定して得られたマイクロアレイ１の断面図である。図において、２００はＤＮＡの微小スポットである。このマイクロアレイ１に対して相補的な配列をもつ蛍光標識プローブとハイブリタイゼーションさせ、蛍光分析装置で分析をおこなった。その結果、高密度で実装した１０万個のＤＮＡについて、解析することができた。数千個程度の解析しかできなかった従来のマイクロアレイに比べて、大幅に高密度化が達成できた。
【００４６】
（第３実施例）
第３実施例のポリヌクレオチドを固定化するための基体は、第２実施例の図６のステップ２において、レーザを用いて加工をおこなって作製したものである。用いたレーザは波長２６６ｎｍのＹＡＧ４倍波レーザであり、固定層１０２表面でφ７５μｍになるようにレンズ系で集光した。このレーザ光を２つのガルバノスキャナーを用いて１２５μｍの等間隔でＸ−Ｙ方向に走査した。その結果、１２５μｍピッチで２次元配列されたφ５０μｍの固定層１０２の微小エリアが１０万個形成できた。ステップ３では、第２実施例のステップ３と同等の化学修飾処理をおこなった。
【００４７】
第２実施例と同様に、本実施例の基体にＤＮＡをスポッティングし、相補的な配列をもつ蛍光標識プローブとハイブリタイゼーションさせ、蛍光分析装置で分析をおこなった。その結果、第２実施例と同様に、高密度で実装した１０万個のＤＮＡについて、解析することができた。数千個程度の解析しかできなかった従来のマイクロアレイに比べて、第２実施例と同様に大幅に高密度化が達成できた。
【００４８】
（第４実施例）
図８は第４実施例のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。同図に示すように、本実施例の基体には、その端部に化学修飾部３０１の２次元配列位置を示す位置決めマーク５０１〜５０３を設けている。位置決めマーク５０１は化学修飾部３０１の２次元配列のＸ軸方向の開始点、位置決めマーク５０２はＸ軸方向の終了点、位置決めマーク５０３はＹ軸方向の開始点を示している。そのほかの構成は、第２，第３実施例の基体と同様であり、本実施例の基体も、ガラスまたはシリコン製の支持体１０３と、支持体１０３上に離散的に２次元配列されたダイヤモンドライクカーボンからなる固定層２０２と、固定層２０２上に設けられた化学修飾部３０１とを備えている。
【００４９】
この基体の製造装置は、２次元方向に走査可能な加工用レーザを備えている。加工用レーザとしては、ＹＡＧレーザやＹＡＧレーザの高調波（ＳＨＧ，ＴＨＧ，ＦＨＧ）レーザなどが利用できる。また、半導体レーザを用いることも可能である。２次元方向に走査する手段として、２軸ステージや、２つのスキャナミラーや、ステージとスキャナミラーの組み合わせなどを用いることができる。
【００５０】
基体の製造方法としては、まず支持体１０３表面全体に固定層１０２を形成した（ステップ１）。ついで、固定層１０２が図５のように離散的に配列するように、加工用レーザによって固定層１０２を選択的に除去した（ステップ２）。つづいて、固定層１０２の２次元配列のＸ軸方向の開始点を示す位置決めマーク５０１、Ｘ軸方向の終了点を示す位置決めマーク５０２、およびＹ軸方向の開始点示す位置決めマーク５０３を加工用レーザによってマークした（ステップ３）。さらに、固定層１０２上に化学修飾を施した（ステップ４）。
【００５１】
ステップ１では、２５ｍｍ×７６ｍｍ、厚さ１ｍｍのガラスまたはシリコン製の支持体１０３上に、メタンガス（ＣＨ４）を原料にプラズマＣＶＤを用いて厚さ０．２μｍのダイヤモンドライクカーボンを形成した。
【００５２】
ステップ２で用いたレーザは波長２６６ｎｍのＹＡＧ４倍波レーザであり、固定層１０２表面でφ７５μｍになるようにレンズ系で集光した。このレーザ光を２つのガルバノスキャナーを用いて１２５μｍの等間隔でＸ−Ｙ方向に走査した。その結果、１２５μｍピッチで２次元配列された５０μｍ角の固定層１０２の微小エリアが１０万個形成できた。
【００５３】
ステップ３では、ステップ２の状態から支持体１０３の位置を動かさず、加工用レーザの走査位置指令だけをコントロールしてマークした。その際、位置決めマークの線幅が細くなるように、レーザの集光径が固定層１０２表面でφ１０μｍになるように集光後、マークした。ステップ２とステップ３の順序は逆であってもかまわない。
【００５４】
ステップ４では、ステップ３の支持体を取り出し、特許文献１を参考に、化学修飾をおこなった。
【００５５】
作製した基体に、あらかじめ調製しておいた標本ＤＮＡをスポッティング装置によって固定し、１０万個のＤＮＡ微小スポットを持つマイクロアレイを作製した。その後、蛍光標識した検体ＤＮＡとハイブリタイゼーションさせ、蛍光分析装置で分析をおこなった。
【００５６】
蛍光分析の方法としては、図９に示すように、まず励起用レーザを基体の端部に走査・照射して、その反射光の変化をフォトマルチメータで検出することにより、位置決めマークの位置を特定した（ステップ１）。ついで、位置決めマークの位置をもとに、ポリヌクレオチドの微小スポットの２次元配列位置座標を演算した（ステップ２）。その後、微小スポットの２次元配列位置座標をもとに、励起用レーザ光の走査方向を補正してマイクロアレイに照射した（ステップ３）。
【００５７】
従来の位置決めマークを設けていないマイクロアレイと、本発明の位置決めマークを設けたマイクロアレイとを比較するため、それぞれ同一検体ＤＮＡについて２０枚のマイクロアレイを用いて蛍光分析をおこなった。その結果、本発明の位置決めマークを設けたマイクロアレイでは、測定のばらつきが１／５に抑えられた。
【００５８】
なお、上記各実施例では、サンプルとしてＤＮＡを使用したが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡの他のポリヌクレオチドを使用しても同様の効果が得られた。
【００５９】
また、本実施例においては、レーザにより位置決めマークを施したが、同時にバーコードや２次元コードのような識別コードを基体端部に形成することも可能である。
【００６０】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の請求項１記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体によれば、ポリヌクレオチドを固定化したい部分のみ化学修飾することによって、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配置を均等にすることができる。そのため、精度よく遺伝子解析できる。
【００６１】
また、請求項２記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体によれば、ポリヌクレオチドを固定化しない部分の固定層を除去することにより、離散的に２次元配列させた化学修飾部を設けることができる。したがって、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配置を均等にすることができ、精度よく遺伝子解析できる。また、基体上に高密度にポリヌクレオチドを固定化することができる。
【００６２】
また、請求項３及び４ポリヌクレオチドを固定化するための基体によれば、シリコンは疎水性を有し、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイトは親水性を有するので、前記基体上にスポッティングされたＤＮＡを、シリコンを避けて、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボンまたはグラファイト上の化学修飾部に効率よく集中させることができる。
【００６３】
また、請求項５記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体によれば、蛍光分析装置の励起レーザを微小スポットの配列位置に正確に走査・照射することができるので、マイクロアレイごとの外形寸にばらつきがあっても、測定のばらつきを抑えることができる。
【００６４】
また、請求項６記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法によれば、ポリヌクレオチドを固定化したい部分のみ化学修飾部とすることができ、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配置を均等にできる。
【００６５】
また、請求項７記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法によれば、レーザを用いるため、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配列数が異なるマイクロアレイを作製する際に、容易に固定支持体表面の化学修飾部を選択的に除去することができる。
【００６６】
また、請求項８記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法によれば、固定層のある部分のみ化学修飾されるので、離散的に２次元配列された化学修飾部を設けることができる。
【００６７】
また、請求項９記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法によれば、エッチングを用いるため、エッチングの際に用いるマスクの寸法精度にしたがって固定層を微細に２次元配列することができる。
【００６８】
また、請求項１０記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法によれば、レーザ加工を用いるため、固定層を微細に２次元配列することができる。
【００６９】
また、請求項１１記載のマイクロアレイによれば、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配置を均等にすることができ、またポリヌクレオチドの微小スポットも小さくすることができるので、多くの遺伝子についての解析を一度に行える高密度のマイクロアレイにすることができる。さらに、化学修飾部すなわちポリヌクレオチドの微小スポットの２次元配列位置を示す位置決めマークを設けた基体からなるマイクロアレイでは、その位置決めマークを蛍光分析装置であらかじめ検出することにより、蛍光分析装置の励起光をポリヌクレオチドの微小スポットに正確に走査・照射できる。
【００７０】
また、請求項１２記載のマイクロアレイの蛍光分析方法によれば、蛍光分析装置の励起レーザが微小スポットの配列位置上を正確に走査・照射するので、マイクロアレイごとの外形寸にばらつきがあっても、測定のばらつきを抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。
【図２】本発明の第１実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。
【図３】本発明の第１実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法を示す模式図である。
【図４】本発明の第２実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。
【図５】本発明の第２実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。
【図６】本発明の第２実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法を示す模式図である。
【図７】本発明の第２実施例を示すマイクロアレイの断面図である。
【図８】本発明の第４実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。
【図９】本発明のマイクロアレイの蛍光分析方法を示す模式図である。
【図１０】従来のポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。
【図１１】従来のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。
【図１２】従来のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。
【図１３】従来の蛍光分析装置の模式図である
【図１４】従来のマイクロアレイの問題点を示す模式図である。
【符号の説明】
１  マイクロアレイ
１０  ポリヌクレオチドを固定化するための基体
１００  スライドガラスまたはシリコンからなる固定支持体
１０１  ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、またはグラファイトからなる固定支持体
１０２  ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、またはグラファイトからなる固定層
１０３  ガラスまたはシリコン製の支持体
２００  ＤＮＡの微小スポット
３００  Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ等の高分子層
３０１  化学修飾部
４０１  第１の励起レーザを出力する第１のレーザ光源
４０２  第２の励起レーザを出力する第２のレーザ光源
４０３  反射ミラー
４０４  第１のダイクロイックミラー
４０５  プリズム
４０６  第１のスキャナミラ−
４０７  第２のスキャナミラー
４０８  レンズ
４０９  フィルタ
４１０  ピンホール
４１１  第２のダイクロイックミラー
４１２  第１のフォトマルチメータ
４１３  第２のフォトマルチメータ
５０１〜５０３  位置決めマーク
【図１】
2004309276.tif 000003
【図２】
2004309276.tif 000004
【図３】
2004309276.tif 000005
【図４】
2004309276.tif 000006
【図５】
2004309276.tif 000007
【図６】
2004309276.tif 000008
【図７】
2004309276.tif 000009
【図８】
2004309276.tif 000010
【図９】
2004309276.tif 000011
【図１０】
2004309276.tif 000012
【図１１】
2004309276.tif 000013
【図１２】
2004309276.tif 000014
【図１３】
2004309276.tif 000015
【図１４】
2004309276.tif 000016