(57)【要約】  【課題】効率的にサンプリングできる埋め込みＱＣプローブデザインの方法とレイアウトスキームを提供する。  【解決手段】iｎ  ｓｉｔｕマイクロアレイ合成プロトコルで全アレイ面を横断する合計数Ｙのノズルグループを含むパルスジェット式液体付着装置を使用してコントロールプローブを生成するために核酸マイクロアレイのスポットの位置の集合を選択する方法で、プロトコルによる通過の各々で合計Ｚの噴射が行われる方法は、任意の所与の噴射においてノズルグループＹの全部より少なくサンプリングし、任意の所与の通過の噴射の合計ＺでノズルグループＹのすべてをサンプリングするようなスポットの位置のセットを識別する工程と、識別されたスポットの位置のセットを、コントロールプローブを生成すべきマイクロアレイのスポットの位置の集合として選択する工程とを有する。【選択図】図１Ｂ
2004309484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
iｎ  ｓｉｔｕマイクロアレイ合成プロトコルの間、１回または複数の通過で全アレイ面を横断する合計数Ｙのノズルグループを有するパルスジェット式液体付着装置を使用して、中にコントロールプローブを生成するために、ｉｎ  ｓｉｔｕで準備される核酸マイクロアレイのスポットの位置の集合を選択する方法で、前記プロトコルによる通過の各々は合計Ｚの噴射による方法であって、
（ａ）  任意の所与の噴射において前記ノズルグループＹの全部より少なくサンプリングし、任意の所与の通過の噴射の合計Ｚで前記ノズルグループＹのすべてをサンプリングするような、スポットの位置のセットを識別する工程と、
（ｂ）  前記識別されたスポットの位置のセットを、中にコントロールプローブを生成すべき前記マイクロアレイのスポットの位置の集合として選択する工程とを有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記スポットの位置の集合は、コラムの集合で構成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スポットの位置のセットは、規則的なパターンを構成することを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
合計数Ｙのノズルグループを有するパルスジェット式液体付着装置を使用するｉｎ  ｓｉｔｕマイクロアレイ合成プロトコルの間コントロールプローブを中に生成する、合計数Ｘのコラムを有するｉｎ  ｓｉｔｕで準備された核酸マイクロアレイのコラムの集合を選択する方法であって、
（ａ）（ｉ）Ｙとの間で素因数を共有せず、Ｙで乗算するとＸを超えない積を生成するパターン周期を識別する工程、または、（ｉｉ）Ｙとの間で単一の素因数２を共有し、Ｙで乗算するとＸを超えない積を生成するパターン周期を識別する工程のうちいずれかと、
（ｂ）前記パターン周期を使用して中にコントロールプローブを生成する前記マイクロアレイ内のコラムの集合を選択する工程とを有することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の方法に従って、中にコントロールプローブを生成する少なくとも第１のコラムの集合を選択するプログラムを記録して有することを特徴とするコンピュータ読み取り可能媒体。
【請求項６】
表面上の異なる位置に固定された２つ以上の異なる核酸の核酸アレイを生成する方法であって、
（ａ）中にコントロールプローブを生成するアレイの少なくとも１つのコラムの集合を、請求項４に記載の方法に従って選択する工程と、
（ｂ）前記少なくとも１つのコラムの集合の中にコントロールプローブを生成し、パルスジェット式液体付着装置を使用してｉｎ  ｓｉｔｕ合成で前記アレイを生成する工程とを有することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法に従って、核酸アレイを生成するようにプログラミングされることを特徴とする非接触型液体付着装置。
【請求項８】
約４から約３０のヌクレオチド残基から少なくとも第１のプローブドメインを各々が有する４つのコントロールプローブ核酸のセットであって、前記セットの各メンバーのプローブ核酸は、前記第１のプローブドメインの各残基部位において前記セットの他のメンバーとは異なる塩基を有することを特徴とする４つのコントロールプローブ核酸のセット。
【請求項９】
前記４つのコントロールプローブ核酸のセットは固体支持材の表面に固定されることを特徴とする請求項８に記載の４つのコントロールプローブ核酸のセット。
【請求項１０】
前記４つのコントロールプローブ核酸のセットはｉｎ  ｓｉｔｕで生成される核酸アレイのコラム内に存在することを特徴とする請求項９に記載の４つのコントロールプローブ核酸のセット。
【請求項１１】
表面上の異なる位置に固定された２つ以上の異なる核酸の核酸アレイを生成する方法であって、
（ａ）請求項８に記載の４つのコントロールプローブ核酸のセットのシーケンスを同定する工程と、
（ｂ）前記４つのコントロールプローブ核酸のセットを前記少なくとも１つのコラムの集合内に生成し、パルスジェット式液体付着装置を使用してｉｎ  ｓｉｔｕ合成で前記アレイを生成する工程とを有することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項６または請求項１１に記載の方法に従って生成されることを特徴とするアレイ。
【請求項１３】
サンプル内で核酸検体の存在を検出する方法であって、
（ａ）前記核酸検体と特異的に結合する核酸リガンドを有する請求項１２に記載の核酸アレイを、前記検体が前記アレイ上の前記核酸リガンドと結合するのに十分な条件下で、前記検体を含む可能性のあるサンプルと接触させる工程と、
（ｂ）前記サンプル内の前記検体の存在を検出するために、前記アレイの表面上の結合複合体の存在を検出する工程とを有することを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記方法は、前記アレイの読み取りの結果を第１の場所から第２の場所に送信するデータ送信工程をさらに有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法は、得られたアレイの読み取り値の送信された結果を受信する工程をさらに有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオポリマアレイに関し、特に、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成される核酸アレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
表面に結合した結合剤またはプローブと、溶液内のターゲット分子の間のアレイアッセイを使用して、その溶液内にある特定のバイオポリマ検体の存在を検出することができる。表面に結合したプローブは、溶液内のターゲット生体分子と結合できるオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその他の分子であってもよい。このような結合作用は、たとえばゲノミクス（ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ＳＮＰ検出、遺伝子発現差異解析、新規遺伝子の同定、遺伝子マッピング、指紋法など）、およびプロテオミクスの種々の異なる分野で使用される多くの方法と装置の基礎である。
【０００３】
１つの典型的なアレイアッセイ法は、ガラス基板などの基板上のアレイ内に固定されたバイオポリマプローブを含む。付着したプローブと結合するターゲット分子（「ターゲット」）を含む溶液を、溶液内のターゲットと基板上の相補的なプローブとの結合を促進し、基板の表面に結合する結合複合体を形成するのに十分な条件下で結合プローブと接触させる。ターゲット分子と基板上のプローブのスポット（またはフィーチャ）との結合パターンにより、パターン、すなわち、基板の表面上に検出される結合複合体パターンが生成される。この結合複合体の検出により、溶液内のターゲット生体分子に関する所望の情報が得られる。
【０００４】
結合複合体は、アレイをたとえば光学手段で読み取るかスキャンすることによって検出できるが、特定のアッセイについては適切であるように他の方法も使用できる。たとえば、レーザ光を使用してターゲットに付着した蛍光標識を励起させ、アレイ上で標識したターゲット分子がプローブ分子と結合したスポットのみにシグナルを生成させることができる。ついでこのパターンをデジタルにスキャンしコンピュータで解析する。このようなパターンを使用し、創薬ターゲットの同定、ＳＮＰマッピング、患者の治療に対する応答を追跡するサンプルのモニタリング、新しい治療法の効力の評価など生物学的アッセイのためのデータを生成することができる。
【０００５】
バイオポリマアレイは、あらかじめ得られたバイオポリマを付着させるか、またはｉｎ  ｓｉｔｕ合成方法のいずれかを使用して作成できる。付着方法は基本的には、バイオポリマが結合できるように適切に活性化された基板上の既定の位置にバイオポリマを付着させることを含む。異なるシーケンスのバイオポリマを基板上の異なる領域上に付着させて完成したアレイを生成することができる。あらかじめ得られたポリヌクレオチド、特に完全オリゴマまたはｃＤＮＡなどのＤＮＡの付着に関して当業界で知られている典型的な手順では、ピンの先端または開いたキャピラリなど１つまたは複数の液滴ディスペンサの中に少量のＤＮＡ溶液を入れ、ついでピンまたはキャピラリを基板表面に接触させる。このような手順は、後に示す特許文献１に説明されている。液体が表面に接触すると、一部の液体が移動する。ピンまたはキャピラリを洗浄してから、次のタイプのＤＮＡを取りアレイ上にスポットする。このプロセスを多くの異なるシーケンスについて繰り返すと、最終的に所望のアレイが形成される。別法としては、ＤＮＡをパルスジェットヘッドの形態の液滴ディスペンサに入れ、基板上に噴射することができる。このような技術は、特許文献２、３などに説明されている。
【０００６】
ｉｎ  ｓｉｔｕ合成方法は、ペプチドアレイ合成に関する特許文献４、また、特許文献３とこの文献に引用されているフォスフォアミダイトまたは他の化学反応を使用するポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）合成に関する文献などに記述された方法を含む。ｉｎ  ｓｉｔｕ核酸アレイ合成プロトコルと装置を説明した他の特許は、特許文献５、６、７、８、９、１０、１１などであり、これらの特許のすべてが参照により本明細書に組み込まれる。
【０００７】
このようなｉｎ  ｓｉｔｕ合成方法は基本的に、液滴を付着させる次のような一連の手順の反復と見ることができる。（ａ）保護されたモノマを基板上の既定の位置に入れ、適切に活性化された基板面（またはあらかじめ付着されている保護を取り除いたモノマのいずれか）と結合させる。（ｂ）付着したモノマの保護を除去し、続いて付着した保護されたモノマと反応できるようにする。（ｃ）別の保護されたモノマを付着させて結合させる。１つのサイクルの間に基板上の異なる領域に異なるモノマを付着させることができるので、完成したアレイの異なる領域は、完成したアレイ内で望ましい異なるバイオポリマシーケンスを持つことになる。酸化ステップおよび洗浄ステップなど、１つまたは複数の中間の別のステップが反復ごとに必要になる場合もある。
【０００８】
核酸アレイのｉｎ  ｓｉｔｕの準備に関しては、現在使用されているプロトコルの多くでは、適切なヌクレオチドフォスフォアミダイトとアクチベータを、たとえばガラスウェハ面など基板面の各アレイのスポット位置にパルスジェットで付着させることで３’末端から５’末端の方向で連続的な層を構成する。ついで基板をフローセルに写し、他のフォスフォアミダイトサイクルステップ（５’末端の水酸基の酸化と保護除去）を平行して行う。ついで基板を再び位置あわせして次の層を印刷する。
【０００９】
１つの例としてのｉｎ  ｓｉｔｕ核酸アレイ合成装置とこの装置の使用法を図１に示す。印刷プロセスを図１Ａと図１Ｂに図式的に示す。印刷ヘッドの詳細な図を図２に示す。図１Ａは、印刷ヘッドとウェハの間の関係を示す（この場合、６’’の四角形で１２の１’’×３’’スライドを生成する能力がある）。次に、ステージＸ方向を「コラム」と名づけ、ステージＸ方向に対して垂直な方向を「ロー」と名づける。印刷の間、インクジェットは固定位置にあり、ステッピングステージがウェハをヘッド上でＸ方向に動かす。ウェハがヘッド上を通過すると適切なフォスフォアミダイト（ｄＧ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡ。図２を参照のこと）を、各アレイスポットの中に印刷する。各化学成分を分注する２０のノズルがあるので（図２では１から２０と番号が付いている）、１度にアレイの２０コラムが印刷され、各コラムは各ウェルの中の特定のノズルにマッピングすることができる（図２）。したがって最終的なアレイの各コラムは、４メンバーのノズルグループと関連づけられる。ノズルグループは２０の周期性を有する。すなわち、１、２１、４１、６１の各コラムがすべて同じノズルグループによって書き込まれることになる。
【００１０】
核酸マイクロアレイは、品質管理（ＱＣ）の専門家に独特な課題を提示している。マイクロアレイは何千から何万もの定量的な測定を並行的に行う。しかし、これらの測定に関する絶対標準サンプルは数個しか存在せず、まったく存在しない場合もあり、現在でもこのような標準を真剣に開発しようとする組織はない。今日までマイクロアレイ製造業者はこの問題に関して２つの方法で対処してきた。
【００１１】
１  代表ＱＣ
製造キャンペーンは、所定のパーセントのアレイを、ＱＣ目的だけに特に使用する固定されたデザインにすることを含む。代表ＱＣアレイでは、指定されたサンプルに対して、指定されたプロトコルを使用してハイブリダイゼーションを行い、続いて所定の既定の定量的な標準に一致するデータを生成しなければならない。
２  埋め込みＱＣ
各アレイはデザインに関係なく、アレイのランドスケープをサンプリングするプローブの特定のサブセットを含む（すなわちＱＣプローブが各デザインの中に「埋め込まれている」）。これらのプローブは、指定されたサンプルにハイブリダイゼーションを行った後、指定されたプロトコルを使用して所定の定量的標準に一致するデータを生成しなければならない。さらに、顧客が使用している間にデータ品質の測定基準を提供するために、これらのプローブをターゲットとしたＱＣサンプル（複数可）を、顧客サンプル内に含めることもできる。
【００１２】
代表ＱＣは、カスタムアレイデザイン（すなわち、製造キャンペーンは、種々の比較的特徴のないデザインのアレイを含んでいてもよい）で使用してもよく、または、カタログアレイデザイン（すなわち、製造キャンペーンは１つだけのよく特徴の知られたデザインのアレイを含む）で使用してもよい。代表ＱＣデザインは、カスタムアレイデザインまたはカタログアレイデザインからは独立しているので、カスタムアレイデザインまたはカタログアレイデザインの生産工程の品質を評価するために使用でき、また、最適な条件下で独立してハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００１３】
しかし埋め込みＱＣは、カタログアレイでもっともよく機能する（カスタムアレイデザインに埋め込みグリッドも含めることが求められない限り）。埋め込みＱＣでは任意のアレイをＱＣ目的のためにサンプリングできるため、埋め込みＱＣを使用する利点は効率が高くロバストであるということである。また、埋め込みＱＣデータを使用時点で収集することもでき、販売前のサンプルから収集することもできる。一方、代表ＱＣは常に、エンドユーザに販売する前に行う。したがって、埋め込みＱＣでは、製品をエンドユーザに販売してから（出荷、保管、取り扱いなど）劣化が発生しても検出できるため、製品の品質をより表すという結果になる。しかし、代表ＱＣと比較した場合の欠点は、ＱＣ目的のために使用できるアレイ上のスポットは固定された割り当てに限定されるということである。したがって、埋め込みＱＣの設計者は細心の注意を払わなければならず、可能であれば、固定された数のプローブに対して多数の埋め込みＱＣタスクを割り当てなければならない。
【００１４】
ＱＣの重要な機能は、比較的均一に各ノズルグループの性能をサンプリングすることである。この目的を達成する１つの方法は、「グリッド線コントロールプローブ」の使用を含む。グリッド線コントロールプローブは、１セットのコントロール２５ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブをアレイ面に直接合成するか、２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドテザーの上（すなわち５’末端）に合成するか、または、３５ｍｅｒオリゴヌクレオチドテザーの上（すなわち５’末端）に合成することによって構成される。これらのプローブを溶液中の共通に相補的な標識をした２５ｍｅｒターゲットに暴露すると、６０ｍｅｒのｉｎ  ｓｉｔｕオリゴヌクレオチドマイクロアレイ上ですべてのオリゴヌクレオチド合成の層をサンプリングする。プローブが重なっているために、重なっているプローブがその層において異なる塩基を使用している場合、層１から２０、２６から３５、４６から６０は１度だけサンプリングされ、層２１から２５、３６から４５は２度サンプリングされることになる。
【００１５】
このようなグリッド線プローブは代表ＱＣアレイ製造プロトコルで広範に使用されている。しかし、これらのプローブは２つの欠点を有する。
【００１６】
１  アレイの印刷に関与するすべてのインクジェットノズルをサンプリングするために、このグリッド線プローブを代表ＱＣアレイ上の連続的なローにレイアウトする。アレイ面の良好なサンプリングを得るためには、多くのこのようなローをレイアウトする。この結果、グリッド線プローブが使用可能なアレイスポットのうち６０％以上を占めることになってしまう。
【００１７】
２  グリッド線プローブが共有する単一の２５ｍｅｒコントロールプローブシーケンスは、層ごとに１から２の塩基しかサンプリングしない（重なっていない領域では１塩基、その層で重なり、その層で異なる塩基を使用する２プローブで１つの層をサンプリングする場合は２塩基）。サンプリングされない塩基の印刷が失敗しても、この失敗はグリッド線プローブでは見えない。
【特許文献１】米国特許第５，８０７，５２２号
【特許文献２】ＷＯ９５／２５１１６号
【特許文献３】ＷＯ９８／４１５３１号
【特許文献４】米国特許第５，４４９，７５４号
【特許文献５】米国特許第６，４５１，９９８号
【特許文献６】米国特許第６，４４６，６８２号
【特許文献７】米国特許第６，４４０，６６９号
【特許文献８】米国特許第６，４２０，１８０号
【特許文献９】米国特許第６，３７２，４８３号
【特許文献１０】米国特許第６，３２３，０４３号
【特許文献１１】米国特許第６，２４２，２６６号
【特許文献１２】米国特許第５，９４８，９０２号
【特許文献１３】米国特許第６，２３２，０７２号
【特許文献１４】米国特許第６，１８０，３５１号
【特許文献１５】米国特許第６，１７１，７９７号
【特許文献１６】米国特許第５，０９１，６５２号
【特許文献１７】米国特許第５，２６０，５７８号
【特許文献１８】米国特許第５，２９６，７００号
【特許文献１９】米国特許第５，３２４，６３３号
【特許文献２０】米国特許第５，５８５，６３９号
【特許文献２１】米国特許第５，７６０，９５１号
【特許文献２２】米国特許第５，７６３，８７０号
【特許文献２３】米国特許第６，０８４，９９１号
【特許文献２４】米国特許第６，２２２，６６４号
【特許文献２５】米国特許第６，２８４，４６５号
【特許文献２６】米国特許第６，３７１，３７０号
【特許文献２７】米国特許第６，３２０，１９６号
【特許文献２８】米国特許第６，３５５，９３４号
【特許文献２９】米国特許第６，２２１，５８３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
ｉｎ  ｓｉｔｕ核酸アレイ合成プロトコルでは、ｉｎ  ｓｉｔｕ核酸アレイ印刷プロセスのいくつかの側面における作業生成物を非常に効率的にサンプリングできる埋め込みＱＣプローブデザインの方法とレイアウトスキームを開発する関心がある。特に関心となるのは、比較的少数のプローブを使用して、いくつかの知られたアレイ製造エラーモードを効率的に検出できる方法の開発である。本発明はこのニーズを満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
ｉｎ  ｓｉｔｕ核酸アレイ合成プロトコルを使用して核酸アレイを生成する方法および装置を提供する。本発明の一部の実施形態の特徴は、特定の効率的なコントロールプローブスポット／コラム選択プロトコルにしたがって選択された、アレイの、たとえばコラムなどのスポットの集合の中でコントロールプローブを生成することである。本発明の一部の他の実施形態の特徴は、「全塩基全層」プローブセットを、アレイの少なくとも１つのコラム内に生成することである。また、本発明の方法で使用するように構成された装置、および、本発明の方法と装置を使用して作成されたアレイ、このようなアレイを使用する方法も提供する。
【００２０】
［定義］
特段の記載のない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者であれば一般的に理解している意味と同じ意味を有する。しかし、明確と参照のために、一部の要素を次に定義する。
【００２１】
「バイオポリマ」は、１つまたは複数のタイプの反復する単位のポリマである。バイオポリマは典型的には生体内にあり、特に、多糖類（炭水化物など）、ペプチド（この用語を使用する場合、ポリペプチドとタンパク質を含む）、ポリヌクレオチドおよびこれらのアナログを含み、アナログは、アミノ酸アナログまたはアミノ酸以外のグループ、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド以外のグループから構成されるかまたはこれらを含む化合物などである。バイオポリマは、従来のバックボーンを自然ではないまたは合成バックボーンに置き換えたポリヌクレオチド、および、従来の塩基のうち１つまたは複数をワトソンクリックタイプの水素結合相互作用に関与することのできる基（自然または合成）と置き換えた核酸（または合成されたアナログまたは自然のアナログ）を含む。ポリヌクレオチドは、単一または多数の鎖状の構成を含み、鎖のうち１つまたは複数は、他と完全に並んでいてもよくまた並んでいなくてもよい。「ヌクレオチド」は核酸のサブユニットを指し、リン酸基、五炭糖、窒素含有塩基、および、ポリマ形態では（ポリヌクレオチドとして）、２つの自然に存在するポリヌクレオチドと同様に、シーケンス特異的に自然のポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションできるサブユニットの官能基アナログ（合成または自然）を含む。バイオポリマは、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、および他のポリヌクレオチドを含み、その源は問わない。これについては、米国特許第５，９４８，９０２号とこの特許に引用された参考文献に説明されている（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれている）。「オリゴヌクレオチド」は一般に、１０から１００ヌクレオチド長のヌクレオチド多量体を指し、「ポリヌクレオチド」は、任意の数のヌクレオチドを有するヌクレオチド多量体を含む。「バイオモノマ」は、単一のユニットを指し、同じバイオモノマまたは他のバイオモノマと結合して、バイオポリマを形成することができる（たとえば、２つの結合基を有する単一のアミノ酸またはヌクレオチド。結合基のうち１つまたは両方が、除去可能な保護基を有していてもよい）。
【００２２】
「アレイ」は、任意の１次元、２次元、または実質的に２次元（３次元と同様）の、アドレス可能な領域の構成を含み、この領域は領域と関連づけられた特定の化学成分（複数可、たとえば、ポリヌクレオチドシーケンスまたはオリゴヌクレオチドシーケンスなどのバイオポリマ（核酸）、ポリペプチド（たとえばタンパク質）、炭水化物、脂質など）を有する。もっとも広い意味では、好ましいアレイは、ポリマ結合試薬のアレイであり、ポリマ結合試薬は、ポリペプチド、タンパク質、核酸、多糖類、このようなバイオポリマ結合剤の合成模倣物のいずれであってもよい。本発明の関心となる多くの実施形態では、アレイは核酸アレイであり、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、これらの合成模倣物などを含む。アレイが核酸アレイである場合、核酸は核酸の鎖に沿った任意の部位でアレイに共有結合していてもよいが、一般には、末端のうち１つ（たとえば３’末端または５’末端）で結合する。アレイは、たとえばタンパク質またはタンパク質のフラグメントなど、ポリペプチドのアレイである場合もある。
【００２３】
任意の所与の基板は、基板の表面に付着した１、２、４、または４以上のアレイを担持することができる。使用法に応じて、アレイのうち任意のアレイまたは全部のアレイが互いに同じであってもよくまたは異なっていてもよく、各アレイは多数のスポットを含むことができる。典型的なアレイは１０以上、１００以上、１０００以上、１万以上、または１０万以上のスポットを、２０ｃｍ２未満の面積、または１０ｃｍ２未満の面積の中に含むことができる。たとえば、スポットは、１０μｍから１．０ｃｍの範囲の幅（すなわち丸いスポットの場合直径）を有していてもよい。他の実施形態では、各スポットは１．０μｍから１．０ｍｍ、通常は５．０μｍから５００μｍ、より一般には１０μｍから２００μｍの範囲の幅を有していてもよい。円形でないスポットも、前述の幅（直径）の範囲の円形のスポットと等価な範囲の面積を有していてもよい。これらのスポットのうち少なくとも一部または全部が、異なる組成である（たとえば、各スポットの組成のうち任意の反復を除くと、残りのスポットは全スポットの数の少なくとも５％、１０％、または２０％を占めてもよい）。典型的には、ポリヌクレオチド（またはそのスポットが構成されたタイプのバイオポリマまたは化学成分）を担持しないスポット間の領域が存在する（しかしこれは必ずしも必要というわけではない）。このようなスポット間の領域は典型的には、アレイを試薬の液滴付着を含むプロセスで形成する場合に存在するが、たとえば、光による合成製造プロセスを使用する場合には存在しなくてもよい。しかし、スポット間領域が存在するときは、種々の大きさと構成であってよいことを理解されたい。
【００２４】
各アレイは１００ｃｍ２未満、または５０ｃｍ２未満、１０ｃｍ２未満、１ｃｍ２未満の面積をカバーしていてもよい。多くの実施形態では、１つまたは複数のアレイを担持する基板は一般に四角形の固体の形状を有し（他の形状も可能である）、長さは４ｍｍを超えて１ｍ未満、通常は４ｍｍを超えて６００ｍｍ未満、さらに一般的には４００ｍｍ未満であり、幅は４ｍｍを超えて１ｍ未満、通常は５００ｍｍ未満、さらに一般的には４００ｍｍ未満であり、厚さは０．０１ｍｍを超えて５．０ｍｍ未満、通常は０．１ｍｍを超えて２ｍｍ未満、さらに一般的には０．２ｍｍを超えて１ｍｍ未満である。蛍光を検出して読み取るアレイの場合、基板は励起光を照射すると弱い蛍光を放射する材料で作成することができる。この場合さらに、基板は比較的透過的で、焦点を絞ったレーザ光が領域を移動する時間が遅くても、入射レーザ光の吸収とこの結果起きる温度上昇を低減するようにしてもよい。たとえば、基板１０は、照射光の全統合スペクトルに渡って測定するか、または別法としては５３２ｎｍまたは６３３ｎｍで測定したときに、前面に入射する照射光の少なくとも２０％または５０％（または少なくとも７０％、９０％、９５％）を透過してもよい。
【００２５】
アレイは、ｉｎ  ｓｉｔｕ製造の場合は、ポリヌクレオチド前駆体ユニット（モノマなど）またはあらかじめ得られたポリヌクレオチドをパルスジェットから液滴付着させて製造することができる。このような方法は以前に引用した、米国特許第６，２４２，２６６号、第６，２３２，０７２号、第６，１８０，３５１号、第６，１７１，７９７号、第６，３２３，０４３号、Ｃａｒｅｎらが１９９９年４月３０日に提出した米国出願番号第０９／３０２，８９８号と、これらに引用された参照文献に記載されている。これらの参考文献は参照により本明細書に組み込まれている。上述のように、他の液滴付着方法を製造に使用することもできる。また、当業界で知られているように、液滴付着方法ではなく光を使用した製造法も使用できる。特に光を使用した合成プロトコルでアレイを作成するときには、スポット間領域はなくてもよい。
【００２６】
アレイは、アレイ上の特定の既定の位置（すなわち「アドレス」）においてある領域（すなわち、アレイの「スポット」）が、特定のターゲットまたはターゲットのクラスを検出するように、異なる化学成分（たとえば異なるポリヌクレオチドシーケンス）の多数の領域を有するときに「アドレス可能」である（そのスポットについてターゲットではないものをたまたま検出する場合もある）。アレイのスポットは典型的には、介在する空隙で分離されるが、これは必ずしも必要ではない。アレイの場合、「ターゲット」は、種々の領域で基板に結合しているプローブ（「ターゲットプローブ」）によって検出される移動相（典型的には液体）の化学成分と呼ばれる。しかし、「ターゲット」または「ターゲットプローブ」はいずれも、もう一方で評価される化合物であってもよい（すなわち、ターゲットもターゲットプローブも、他と結合することによって評価する未知のポリヌクレオチドの混合物であってよい）。「スキャン領域」は、上記の目的のアレイスポットを検出する連続的な（好ましくは四角形の）領域を指す。スキャン領域は、照射してその結果放射される蛍光を検出し記録する面積の合計の部分である。本発明の目的のために、スキャン領域は、関心となる第１のスポットから最後のスポットの間で、レンズの各通過でスキャンされるスライドの全領域を含むが、関心となるスポットのない介在領域も存在する。「アレイレイアウト」は、基板上のスポットの配置、１つまたは複数のスポットの大きさ、所与の位置における化学成分の指示など、そのスポットの１つまたは複数の特徴を指す。ポリヌクレオチドに関しては、「ハイブリダイゼーション」と「結合」という用語は、相互交換可能である。
【００２７】
本明細書で使用される「基板」という用語は、たとえばアレイなどのマーカ分子またはプローブが上に付着できる面を指す。バイオチップではガラススライドがもっとも一般的な基板であるが、石英ガラス、シリコン、プラスチック、その他の材料も適切である。
【００２８】
本明細書で使用される「柔軟」という用語は、たとえば、底面またはカバーが破損せずに曲げたり、折りたたんだりなどの操作ができる構造を指す。たとえば、カバーが破損せずに底面からはがすことができる場合、そのカバーは柔軟である。
【００２９】
基板または基板ウェブに関する「柔軟性」は、基板が半径１．２５ｃｍ未満のローラの周りを１８０度曲げられることを指す。基板は破損や（たとえば割れる）塑性変形を受けずに少なくとも１００回、どちらの方向でも繰り返して曲げたり伸ばしたりできる。この曲げは、材料の弾性限界内でなくてはならない。柔軟性に関する上述のテストは２０℃の温度で行う。
【００３０】
「ウェブ」は、幅より大きな長さを有する基板材料の長い連続的な一片を指す。たとえば、ウェブの長さと幅の比は少なくとも５／１、１０／１、５０／１、１００／１、２００／１、または５００／１、または少なくとも１０００／１である。
【００３１】
基板は柔軟（柔軟なウェブなど）であってもよい。基板が柔軟な場合、基板の長さは種々であってよく、少なくとも１ｍ、少なくとも２ｍ、または少なくとも５ｍ（または少なくとも１０ｍ）などの長さである。
【００３２】
本明細書で使用される「剛性」という用語は、たとえば、底面またはカバーが容易に曲げられず曲げると破損してしまう構造、すなわち柔軟ではない構造を指す。
【００３３】
本明細書では「厳しいハイブリダイゼーション条件」という用語は、相補的な結合メンバー、すなわちプローブと、サンプル内の相補的なターゲットの間でアレイ面上に二本鎖を生成することに一致する条件を指すために使用する。二本鎖の例としては、ＤＮＡプローブなどの核酸プローブと、たとえば、サンプル内に存在する、このＤＮＡプローブに対応するｍＲＮＡ検体などサンプル内に存在する対応する核酸ターゲットの二本鎖などがある。厳しいハイブリダイゼーション条件の例は、６０℃以上の温度で、３×ＳＳＣ（４５０ｍＭの塩化ナトリウム／４５ｍＭクエン酸ナトリウム）におけるハイブリダイゼーションである。別の厳しいハイブリダイゼーション条件の例は、３０％のホルムアミド、１Ｍの塩化ナトリウム、０．５％のサルコシンナトリウム、５０ｍＭのＭＥＳを含むｐＨ６．５の溶液内で４２℃で培養することである。厳しいハイブリダイゼーション条件は、少なくとも上記の代表的な条件と同程度に厳しいハイブリダイゼーション条件であり、上記の特定の厳しい条件の少なくとも８０％、典型的には少なくとも約９０％厳しい場合に、その条件を厳しいとみなす。他の厳しいハイブリダイゼーション条件も当業界で知られており、場合に応じて使用することができる。
【００３４】
「遠隔の場所」という用語は、アレイが存在しハイブリダイゼーションを行う場所とは別の場所を意味する。たとえば、遠隔の場所は、同じ町の中の別の場所（たとえば、オフィス、研究所など）、異なる町の別の場所、異なる州の別の場所、異なる国の別の場所であってよい。したがって、ある項目が別の項目から「遠隔である」と示される場合、この意味は、この２つの項目が少なくとも異なる部屋または異なる建物にあり、少なくとも１マイル、１０マイル、１００マイル離れている場合もあるということである。情報の「通信」は、情報を電気信号として表すデータを適切な通信チャネル上（たとえば私設ネットワークまたは公共ネットワーク）で送信することを指す。ある項目の「転送」は、その項目を１つの場所から次の場所に移す任意の手段を指し、物理的にその項目を移動することであってもよいし、（可能な場合には）他の方法で移動することであってもよく、少なくともデータの場合は、データを担持する媒体を物理的に移動するかそのデータを通信することを含む。アレイ「パッケージ」は、アレイとそのアレイが付着した基板だけであってもよいが、パッケージは他の特徴（たとえばチャンバを伴う筐体など）を含んでいてもよい。「チャンバ」は閉じた容積を指す（チャンバは１つまたは複数のポートを介してアクセス可能であってもよい）。また、本出願を通して、「上」、「上側」、「下側」などの用語は、相対的な意味で使用されることを理解されたい。
【００３５】
「コンピュータベースのシステム」は、本発明の情報を解析するために使用するハードウェア手段、ソフトウェア手段、データ記憶手段を指す。本発明のコンピュータベースシステムの最小のハードウェアは、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、データ記憶手段を備える。当業者であれば、任意の現在入手可能なコンピュータベースのシステムが、本発明での使用に適切であることが容易に理解されるであろう。データ記憶手段は、上記の本発明の情報の記録を含む任意の製造物、またはこのような製造物にアクセスできるメモリアクセス手段を含んでいてもよい。
【００３６】
コンピュータ読み取り可能媒体上にデータ、プログラミング、その他の情報を「記録」することは、当業界で知られた方法を使用して情報を記憶するプロセスを指す。任意の便利なデータ記憶構造を、記憶された情報にアクセスするために使用する手段に基づいて選択することができる。たとえばワードプロセッサのテキストファイル、データベースフォーマットなど、種々のデータプロセッサプログラムとフォーマットを記憶のために使用することができる。
【００３７】
「プロセッサ」は、必要な機能を実行する任意のハードウェアおよび／またはソフトウェアの組み合わせを指す。たとえば、本明細書の任意のプロセッサは、電子コントローラ、メインフレーム、サーバ、パーソナルコンピュータ（デスクトップまたはポータブル）形態で入手可能なプログラマブルデジタルマイクロプロセッサであってよい。プロセッサがプログラマブルな場合、適切なプログラミングを遠隔の場所からプロセッサに通信することもできるし、または、あらかじめコンピュータプログラム製品に保存しておくこともできる（たとえば、ポータブルまたは固定のコンピュータ読み取り可能記憶媒体など。これは磁気デバイスベース、光学デバイスベース、ソリッドステートデバイスベースのいずれであってもよい）。たとえば、磁気媒体または光ディスクがプログラミングを担持し、対応するステーションで各プロセッサと通信する適切なリーダで読み取ることができる。
【００３８】
即ち、本発明は、iｎ  ｓｉｔｕマイクロアレイ合成プロトコルの間、１回または複数の通過で全アレイ面を横断する合計数Ｙのノズルグループを有するパルスジェット式液体付着装置を使用して、中にコントロールプローブを生成するために、ｉｎ  ｓｉｔｕで準備される核酸マイクロアレイのスポットの位置の集合を選択する方法で、前記プロトコルによる通過の各々は合計Ｚの噴射(swarth;スワース)による方法であって、（ａ）任意の所与の噴射において前記ノズルグループＹの全部より少なくサンプリングし、任意の所与の通過の噴射の合計Ｚで前記ノズルグループＹのすべてをサンプリングするような、スポットの位置のセットを識別する工程と、（ｂ）前記識別されたスポットの位置のセットを、中にコントロールプローブを生成すべき前記マイクロアレイのスポットの位置の集合として選択する工程とを有することを特徴とする方法を提供する。
【００３９】
好ましくは、前記スポットの位置の集合は、コラムの集合で構成される。
【００４０】
好ましくは、前記スポットの位置のセットは、規則的なパターンを構成する。
【００４１】
更に本発明は、合計数Ｙのノズルグループを有するパルスジェット式液体付着装置を使用するｉｎ  ｓｉｔｕマイクロアレイ合成プロトコルの間コントロールプローブを中に生成する、合計数Ｘのコラムを有するｉｎ  ｓｉｔｕで準備された核酸マイクロアレイのコラムの集合を選択する方法であって、（ａ）（ｉ）Ｙとの間で素因数を共有せず、Ｙで乗算するとＸを超えない積を生成するパターン周期を識別する工程、または、（ｉｉ）Ｙとの間で単一の素因数２を共有し、Ｙで乗算するとＸを超えない積を生成するパターン周期を識別する工程のうちいずれかと、（ｂ）前記パターン周期を使用して中にコントロールプローブを生成する前記マイクロアレイ内のコラムの集合を選択する工程とを有することを特徴とする方法を提供する。
【００４２】
更に、本発明は、上述の方法に従って、中にコントロールプローブを生成する少なくとも第１のコラムの集合を選択するプログラムを記録して有することを特徴とするコンピュータ読み取り可能媒体を提供する。
【００４３】
更に、本発明は、表面上の異なる位置に固定された２つ以上の異なる核酸の核酸アレイを生成する方法であって、（ａ）中にコントロールプローブを生成するアレイの少なくとも１つのコラムの集合を、請求項４に記載の方法に従って選択する工程と、（ｂ）前記少なくとも１つのコラムの集合の中にコントロールプローブを生成し、パルスジェット式液体付着装置を使用してｉｎ  ｓｉｔｕ合成で前記アレイを生成する工程とを有することを特徴とする方法を提供する
【００４４】
更に、本発明は、上述の方法に従って、核酸アレイを生成するようにプログラミングされることを特徴とする非接触型液体付着装置を提供する。
【００４５】
更に、本発明は、約４から約３０のヌクレオチド残基から少なくとも第１のプローブドメインを各々が有する４つのコントロールプローブ核酸のセットであって、前記セットの各メンバーのプローブ核酸は、前記第１のプローブドメインの各残基部位において前記セットの他のメンバーとは異なる塩基を有することを特徴とする４つのコントロールプローブ核酸のセットを提供する
【００４６】
好ましくは、前記４つのコントロールプローブ核酸のセットは固体支持材の表面に固定される。
【００４７】
好ましくは、前記４つのコントロールプローブ核酸のセットはｉｎ  ｓｉｔｕで生成される核酸アレイのコラム内に存在する。
【００４８】
更に、本は発明は、表面上の異なる位置に固定された２つ以上の異なる核酸の核酸アレイを生成する方法であって、（ａ）請求項８に記載の４つのコントロールプローブ核酸のセットのシーケンスを同定する工程と、（ｂ）前記４つのコントロールプローブ核酸のセットを前記少なくとも１つのコラムの集合内に生成し、パルスジェット式液体付着装置を使用してｉｎ  ｓｉｔｕ合成で前記アレイを生成する工程とを有することを特徴とする方法を提供する。
【００４９】
更に、本発明は、上述の方法に従って生成されることを特徴とするアレイを提供する。
【００５０】
更に、本発明は、サンプル内で核酸検体の存在を検出する方法であって、（ａ）前記核酸検体と特異的に結合する核酸リガンドを有する請求項１２に記載の核酸アレイを、前記検体が前記アレイ上の前記核酸リガンドと結合するのに十分な条件下で、前記検体を含む可能性のあるサンプルと接触させる工程と、（ｂ）前記サンプル内の前記検体の存在を検出するために、前記アレイの表面上の結合複合体の存在を検出する工程とを有することを特徴とする方法を提供する。
【００５１】
好ましくは、前記方法は、前記アレイの読み取りの結果を第１の場所から第２の場所に送信するデータ送信工程をさらに有する。
【００５２】
好ましくは、前記方法は、得られたアレイの読み取り値の送信された結果を受信する工程をさらに有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
以下に添付の図面等を参照して、本発明の最良と考えられる好適実施形態について詳細に説明する。
【００５４】
ｉｎ  ｓｉｔｕ核酸アレイ合成プロトコルを使用して核酸アレイを生成する方法と装置を提供する。本発明の一部の実施形態の特徴は、コントロールプローブを、特定の効率的なコントロールプローブスポット／コラム選択プロトコルにしたがって選択されたアレイのコラムなど、アレイのスポットの集合の中で生成することである。本発明の他の一部の実施形態の特徴は、アレイのコラムのうち少なくとも１つのコラムの中に「全塩基全層」プローブセットを生成することである。また、本発明の方法で使用するように構成された装置、本方法と装置を使用して生成されたアレイ、およびこのアレイを使用する方法も提供する。
【００５５】
しかし、本発明を詳細に説明する前に、本発明は本明細書に説明された特定の変形例に限定されず、変更できることを理解されたい。本発明の真の精神および範囲から離れることなく、本明細書に説明される本発明に種々の変更を行うことや、等価物に置き換えることができる。さらに、特定の状況、材料、材料の組成、プロセス、プロセスの作業（複数可）またはステップ（複数可）を、本発明の目的（複数可）、精神、範囲に適合させるように多くの修正を行うこともできる。このようなすべての修正例も本明細書の請求項の範囲内であることが目的である。本明細書に説明した方法では、説明したイベントを論理的に可能な任意の順序で実行することもできるし、説明した順序で実行することもできる。さらに、値の範囲を提供する場合、この範囲の上限と下限の間にあるすべての中間の値、また範囲の中の他の値も本発明内に包含されることを理解されたい。また、本明細書に記述された本発明の変形例の、任意のオプションの特徴も、本明細書に説明した特徴のうち１つまたは複数から独立するかまたは組み合わせて請求することを意図している。
【００５６】
引用された例は、本出願の出願日以前の開示のものを基に提供している。本発明が以前の発明によって予見されるものではないことを理解されたい。
【００５７】
単一の項目への言及は、多数の同じ項目が存在する可能性を含む。より具体的には、本明細書及び特許請求の範囲に示される各要素の単数形は、特段の記載のない限り、複数の対象物を含む。さらに、請求項は任意のオプションの要素を排除するように書かれていることに注意されたい。したがって、この記述は、請求項の要素の言及、または「否定的な」限定の使用との関連で「単一」、「唯一」などの排除的な用語を使用する前提としての機能を果たしている。
【００５８】
上記の発明の概要と背景技術と定義における説明より詳細に本発明を説明するにあたり、本発明の効率的なコントロールプローブコラム選択プロトコルの代表的な実施例をまず詳細に説明し、ついで、本発明の「全塩基全層」コントロールプローブセットを概観する。また、上記の本発明を特徴とするアレイの代表的な用途について説明する。
【００５９】
［コントロールプローブスポット／コラムの効率的な選択］
上述のように、本発明は、アレイのｉｎ  ｓｉｔｕ合成の間にコントロールプローブを入れる核酸アレイ内のスポットの集合を選出する方法を提供する。ここでは埋め込みコントロールプローブ（埋め込みＱＣアレイ）を有するアレイを生成する。言い換えれば、本発明は、核酸マイクロアレイ内でコントロールプローブを中に生成するスポット（またたとえば２次元アレイまたは３次元アレイ内のコラムなどスポットの集合）を決定または識別する方法を提供する。言い換えれば、本発明は、核酸マイクロアレイのコントロールプローブ、特に埋め込みコントロールプローブを中に生成するスポットの集合を選択する方法を提供する。
【００６０】
本発明の方法の特徴は、まずアレイを作成するときに使用するパルスジェットヘッドデバイスのノズルグループＹを全部サンプリングする１セットのスポットの位置を識別することである。このため、識別されるスポットのセットは、ｉｎ  ｓｉｔｕ合成装置のパルスジェットヘッドの各ノズルグループから生成されるプローブを含むセットである。さらに、選択されるかまたは識別されたスポットは、生成されるアレイのすべての領域内に位置する。すなわち、コントロールプローブを含まないアレイの領域がないようにアレイの全表面に渡って位置する。スポットが占めるアレイの合計面積の２５％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％などとなるアレイの任意の領域が、コントロールプローブのスポットを含む場合、スポットはアレイの全領域内に位置すると見なす。一部の実施形態では、このステップで識別されるスポットは、アレイのスポットの合計数の約６０％未満を構成し、たとえばアレイのスポットの合計数の約５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、選択されるスポットのセットは、所与の通過の所与の噴射ではノズルグループの全部より少ないノズルグループをサンプリングし、所与の通過の合計の噴射ではノズルグループを全部サンプリングするスポットのセットである。図１Ｂに示すように、試薬付着印刷プロトコルは、生成されるプローブの長さに応じたいくつかの通過で実行されると考えられ、各通過はいくつかの噴射を含むと考えられる。たとえば、２５ｍｅｒプローブを印刷するためのプロトコルは、２５の異なる通過で構成してもよい。アレイの大きさに依存して、各所与の通過はたとえば１０の噴射から構成してもよい。この例としてのシナリオでは、コントロールプローブのスポットとして使用するために選択されるスポットのセットは、所与の噴射ではノズルグループ全部より少ないノズルグループをサンプリングする。たとえばサンプリングのパーセントは９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満またはそれ未満である（パーセンテージで）。しかし、各通過を構成する噴射Ｚの合計数（たとえばこの実施形態では１０）では、各ノズルグループは少なくとも１回サンプリングされる。任意の所与の噴射では、サンプリングされるノズルグループの合計数の一部は、１回または複数回サンプリングしてもよい。たとえば最高で５回または５回以上で、２回、３回、４回、または４回以上を含む。典型的には、スポットの同じセットを、各通過におけるコントロールプローブのスポット位置として使用する。
【００６２】
上記のようにスポットのセットを識別した後、ついで、識別されたスポットの位置のセットを、コントロールプローブを中に生成するマイクロアレイのスポットの位置の集合として選択する。
【００６３】
上述のように、一部の実施形態では、スポットの位置の集合は、スポットの位置のコラムの集合であり、これについては次の実施形態で詳細に説明する。一部の実施形態では、選択されたスポットの位置のセットは、反復する周期のパターンが選択されるように、規則的なパターンを構成する。これについては後述する。さらに別の実施形態では、スポットの位置のセットはランダムパターンを構成し、パターンは任意の定義された周期性を有しない。
【００６４】
コントロールプローブスポット選択プロセスの一部の実施形態の特徴は、このプロセスが「コントロールプローブコラム」選択プロセスであるということであり、本発明のこれらの実施形態の特徴は、核酸プローブが合成されるアレイ表面の効果的なサンプリングを提供するということである。従って、本発明のこれらの実施形態の方法は、「効率的なコントロールプローブコラム」選択プロセスと呼ぶこともできる。
【００６５】
これらの実施形態では、本発明は、アレイのｉｎ  ｓｉｔｕ合成の間にコントロールプローブを入れる核酸アレイ内のコラムを選択する方法を提供する。ここでは、埋め込みコントロールプローブ（埋め込みＱＣアレイ）を有するアレイが生成される。言い換えれば、本発明は、核酸マイクロアレイ内でコントロールプローブを中に生成するコラムを決定または識別する方法を提供する。言い換えれば、本発明はコントロールプローブ、具体的には埋め込みコントロールプローブを中に生成する、核酸マイクロアレイのコラムの集合を選択する方法を提供する。本発明の「コントロールプローブコラム」選択プロセスの特徴は、このプロセスが核酸プローブを合成するアレイの表面の効率的なサンプリングを提供するということである。このため、本発明の方法は、「効率的なコントロールプローブコラム」選択プロセスと呼ぶこともできる。
【００６６】
本発明のコントロールプローブコラム選択プロトコルは、パルスジェット式ｉｎ  ｓｉｔｕ核酸アレイ合成プロトコルと装置で使用するように設計されている。代表的なパルスジェット式ｉｎ  ｓｉｔｕ核酸アレイ合成プロトコルと装置を説明する特許は、米国特許第６，４５１，９９８号、６，４４６，６８２号、６，４４０，６６９号、６，４２０，１８０号、６，３７２，４８３号、６，３２３，０４３号、６，２４２，２６６号を含み、これらの特許の開示は参照により本明細書に組み込まれているが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
このようなプロトコルでは、複数のノズルグループを伴う印刷ヘッドを含む装置が典型的に使用される。このような装置の多くでは、ノズルグループの数は典型的には約５から約５１２の範囲であり、通常は約１０から約２５６、たとえば２０など約５から約５０の範囲である。
【００６８】
本方法を実施する際には最初に、使用するｉｎ  ｓｉｔｕ核酸アレイ合成装置内のノズルグループの合計数（今後Ｙと呼ぶ）を決定する。ついで、アレイ上で生成するコラムの合計数（今後Ｘと呼ぶ）を決定する。多くの実施形態では、生成されるコラムの合計数は約４５から約５００、約５０から約５００、約９０から約２７５の範囲内である。
【００６９】
ＹとＸを決定すると、次にコントロールプローブを中に生成するパターン周期を識別する。より具体的には、コントロールプローブを中に印刷するコラムの周期性を識別または決定する。言い換えれば、所与のローの中で、コントロールプローブを含むコラムの間に、コントロールプローブを含まないコラムをいくつ生成するかを識別する。
【００７０】
本方法で識別するパターン周期（今後Ｚと呼ぶ場合もある）は次のいずれかである。（ｉ）Ｙとの間で素因数を共有せず、Ｙで乗算すると、Ｘを超えない積を生成するか、または、（ｉｉ）Ｙとの間で単一の素因数２を共有し、Ｙで乗算するとＸを超えない積を生成する。
【００７１】
したがって、一部の実施形態では、識別されるかまたは選択された周期パターンＺ（すなわち、コラムの所与のローの中のコントロールプローブコラムの周期性）は、Ｙとの間で素因数を共有せずＹで乗算するとＸを超えない積を生成する整数である。これらの実施形態では、パターンが所与のローで周期的であるので、コントロールプローブを中に生成するコラムの全体のパターンは、そのパターンを開始したノズルグループに戻る前に印刷ヘッドのすべてのノズルグループが１回サンプリングされるパターンである。
【００７２】
次に、本方法によるコントロールプローブコラム選択プロトコルの代表的な例を、印刷ヘッド内に２０のノズルグループを有する装置について提供する。図３は、７コラムの周期で２１５コラム×１０５ローのマイクロアレイの１つのローをサンプリングした結果を示す。表の上の数はノズルグループの一覧を示し、表の中の数はサンプリングされたアレイ上のコラムを示す。サンプリングパターンは、２０コラムごとに回り込んでいる（２０のノズルグループがあるため）。図３から、パターンがコラム１３４に達するまでに（７×２０＝１４０以下（１４０を含む）の最大のアレイコラム数）、各ノズルグループが一度はサンプリングされていることが明らかであろう。コラム１４１において（７×２０＝１４０以上（１４０を含む）最小のコラム数）、サンプリングパターンは繰り返しを始める。上記の第１の具体的なプロトコルでは（すなわち、所与のロー上の周期パターン。ＺはＹとの間で素因数を共有せず、Ｚ×ＹはＸより小さい）、３コラムと９コラムの間の間隔（上記の例としての７コラム周期または間隔の他に）も役に立つ。これは３が素数であるが２０の因数ではなく、９＝３２は２０＝５×２２との間で素因数を共有しないためである。しかし、８（＝２３）は役に立たない。これは、２０との間で２つの２の因数を共有するためである。また１１も役に立たない。１１は素因数であり２０の因数ではないが、１１×２０＝２２０＞２１５であるためである（すなわち、このパターンではすべてのノズルグループをサンプリングする前に、アレイ上のコラムがなくなってしまう）。
【００７３】
コントロールコラムパターン周期Ｚを識別したら、ついで識別されたパターン周期Ｚを使用して、マイクロアレイ内でコントロールプローブを中に生成する、複数のコラムの集合を選択する。具体的には、パターン周期を使用して、ｉｎ  ｓｉｔｕ核酸アレイ合成の間にコントロールプローブを中に生成するマイクロアレイ内のコラムを決定する。たとえば、上記のようにパターン周期７を選択する場合、このパターン周期を使用して、コントロールプローブを中に印刷するアレイ内のコラム（集合的にコラムパターンと呼ぶ）を決定する。たとえば、第１のコラムから開始して、そのコラム内のノズルグループ１からコントロールプローブを印刷し、ついで７コラム通過してコラム８に行き、コラム８で第２のノズルグループ、たとえばノズルグループ８からコントロールプローブを印刷する。以下同様である。
【００７４】
所定の実施形態では、コントロールプローブコラムのパターンは、所与のアレイの中の第１のコラムから開始する。この構成または実施形態の代表的な例を図３の表に示す。しかし図３に示されたパターンは、すべてのノズルグループを等しくサンプリングしているわけではない（グループ５から７、１１から１４、１８から２０は１度しかサンプリングされていないが、残りは２度サンプリングされている）。このパターンのいくつかのローがアレイ全体に分布している場合、この結果得られるサンプルは二峰性である。ＮのローはノズルグループによってＮのサンプルまたは２Ｎのサンプルを生成する。一部の実施形態では、このような結果は統計的観点から望ましくない。
【００７５】
したがって、一部の実施形態では、コントロールプローブを印刷する最初のコラムは、ノズルグループごとに実質的に同じ数の反復するコラム内にコントロールプローブが印刷されるという結果になるように選択する。ノズルグループごとに実質的に同じ数の反復コラムという表現は、任意の２つのノズルグループに対して選択されたコラムの合計数に変動があっても、約４以上、または約３以上、２以上、１以上は変化しないことを意味し、一部の実施形態ではまったく変化しないことを意味する。このような望ましい結果は、本明細書では「ディザリング」と呼ぶ。ディザリングは、ノズルグループをサンプリングする順序を周期的に置換する効果を有する。この置換により、２度サンプリングされるノズルグループが変わる。場合によっては、ディザリングを使用して、ノズルグループごとにほぼ同じ数の反復で全アレイ面と全ノズルグループを効率的にサンプリングする全体のパターンを生成することができる。一部の代表的な実施形態では、コントロールプローブを生成する開始コラムまたは最初のコラムは１＋Ｎであり、Ｎは１からＺの範囲の整数である。
【００７６】
上記のように、一部の実施形態では、選択されたパターン周期Ｚは、Ｙとの間で単一の因数２を共有し、Ｙで乗算するとＸを超えない積を生成する数である。言い換えれば、Ｚは、所与のローで周期的であり、Ｙとの間で単一の因数２を共有し、Ｚ×ＹがＸを超えないパターン周期である。このようなコントロールプローブコラムパターンの選択方法は、コントロールプローブを中に印刷するコラムの第１の集合を選択し、ついで、コントロールプローブを中に印刷するコラムの第２の集合を選択し、第２のコラムの集合の最初のコラムは第１のコラムの集合の最初のコラムに隣接しているという特徴を有する方法では特に望ましい。たとえば、コントロールプローブコラムの２つの集合を共に使用するように識別する場合、第１のコントロールパターンの第１のコラムはＮであり、第２のコントロールプローブコラムパターンの第１のコラムはＮ＋１である。２つのパターンの組み合わせにより、所与の印刷ヘッドのすべてのノズルグループを効率的にサンプリングする。
【００７７】
本発明による代表的なコントロールプローブコラムパターン選択プロトコルまたは方法を、次の実験のセクションで詳細に説明する。
【００７８】
上記のプロトコルまたは方法により、アレイ基板の全表面に渡って装置の印刷ヘッドのノズルグループを効率的にサンプリングするコントロールプローブコラムパターンを選択することができる。
【００７９】
一度パターンを識別すると、ｉｎ  ｓｉｔｕプロトコルを使用して核酸アレイを合成する。ここで、コントロールプローブは識別されたパターンのコントロールプローブコラム内に生成される。所与のコントロールプローブコラムでコントロールプローブであるスポットの数は、テストプローブとは反対に変わりうるが、典型的には約１％から約１０％であり、代表的な範囲は約１％から約５％、約１％から約３％を含む。
【００８０】
任意の便利なコントロールプローブを、パターンの中で識別されたコントロールプローブスポット／コラム内で生成することができる。本発明の関心となる一部の実施形態では、次に詳細に説明する本発明の「全塩基全層」コントロールプローブが、識別されたコントロールプローブコラム内で生成される。
【００８１】
上記の方法の少なくとも一部の実施形態を実行するためのプログラミングも提供する。たとえば、ＸとＹの値を入力してコントロールプローブコラムパターンを決定することができるアルゴリズムを提供する。本発明によるプログラミングは、たとえば、コンピュータが読み取るかアクセスできる任意の媒体など、コンピュータ読み取り可能媒体上に記録してもよく、読み取りまたはアクセスは直接であってもよいし間接であってもよい。このような媒体は、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭとＤＶＤなどの光記憶媒体、ＲＡＭとＲＯＭなどの電気記憶媒体、磁気／光記憶媒体などこれらのカテゴリのハイブリッドを含むが、これらに限定されるものではない。当業者であれば、現在知られている任意のコンピュータ読み取り可能媒体を使用して上記の方法を実行するための本発明のプログラミング／アルゴリズムの記録を含む製造物を作成できることが理解されるであろう。
【００８２】
一部の実施形態では、本システムはさらに、ユーザインタフェースを提供するという特徴を有する。このユーザインタフェースは、ユーザに、たとえばＸとＹ、ディザリングパラメータ、パターン周期選択アルゴリズムなど、多数の異なる入力を含む１つまたは複数の異なる入力の間で選択するオプションを提供する。
【００８３】
また、本発明は、本方法によって識別されたコントロールプローブコラムパターン内にコントロールプローブを印刷するように装置に命令するプログラミングを含む、ｉｎ  ｓｉｔｕパルスジェット核酸アレイ印刷装置を提供する。種々の知られたｉｎ  ｓｉｔｕパルスジェットアレイ製造装置または今後開発される装置を上記のように構成することができる。代表的なパルスジェット装置は、米国特許第６，４５１，９９８号、第６，４４６，６８２号、第６，４４０，６６９号、第６，４２０，１８０号、第６，３７２，４８３号、第６，３２３，０４３号、第６，２４２，２６６号に説明された装置を含むが、これらに限定されない。上記の特許の開示は参照により本明細書に組み込まれている。
【００８４】
また、このような装置を使用して核酸アレイを生成する方法も提供する。この方法は、本発明によってコントロールプローブコラムのパターンを識別するステップと、ついで、ｉｎ  ｓｉｔｕプロトコルを使用してアレイを生成するステップとを含む。ここでコントロールプロトコルは、識別されたパターンのコントロールプローブコラム内に生成される。任意のｉｎ  ｓｉｔｕパルスジェットアレイ製造プロトコルまたは方法を上記のように構成することができ、代表的なｉｎ  ｓｉｔｕパルスジェットプロトコルは、米国特許第６，４５１，９９８号、第６，４４６，６８２号、第６，４４０，６６９号、第６，４２０，１８０号、第６，３７２，４８３号、第６，３２３，０４３号、第６，２４２，２６６号に説明されたプロトコルを含むが、これらに限定されない。上記の特許の開示は参照により本明細書に組み込まれている。
【００８５】
上記の方法で生成されたアレイは、たとえば、上述の方法と公式によって識別されたコントロールプローブコラムパターンのコラムなど、スポットの集合内に印刷されたコントロールプローブを有するという特徴を持つ。識別されたコントロールプローブスポットとコラムの中に生成される実際のコントロールプローブは、任意の便利なコントロールプローブであってよく、その中にはポジティブコントロールプローブとネガティブコントロールプローブの両方が含まれる。当業界では種々のこのようなコントロールプローブが知られている。本発明の一部の実施形態で特に、次に詳細に説明する「全塩基全層」コントロールプローブの集合が関心となる。このようなアレイは、次に詳細に説明するように種々の応用に使用することができる。
【００８６】
上記のコントロールプローブスポット／コラム識別方法と、この方法を実行するようにプログラミングされた装置を使用して、たとえば核酸アレイを生成する際に、柔軟な基板と剛性の基板を含む種々の異なる任意の基板の表面上に核酸を付着させることができる。好ましい材料は、付着される材料に物理的な支持を提供し、付着プロセスの条件と、付着プロセスに続いて特定のアレイを使用する際に行われる処理または処理の条件に耐える。アレイ基板は簡単な構成から複雑な構成まで種々の任意の構成をとることができる。したがって、基板は一般的にはたとえば、矩形または正方形のディスクなどのスライドまたはプレートの構成など、平面の形状を有していてもよい。多くの実施形態では、基板は一般に矩形の固体として形成され、長さは約４ｍｍから２００ｍｍの範囲であり通常は約４ｍｍから１５０ｍｍでより一般的には約４ｍｍから１２５ｍｍの範囲であり、幅は約４ｍｍから２００ｍｍの範囲であり通常は約４ｍｍから約１２０ｍｍであるがより一般的には約４ｍｍから約８０ｍｍの範囲であり、厚さは約０．０１ｍｍから約５ｍｍであり通常は約０．１ｍｍから約２ｍｍであるがより一般的には約０．２ｍｍから約１ｍｍの範囲である。しかし、とくに製造後により少ないアレイ数１２を担持するより小さな基板に切断する時には、より大きな基板またはより小さな基板も使用できる。他の構成および等価な面積を有する基板も選択できる。アレイの構成は製造、処理、使用法を考慮して選択することができる。
【００８７】
基板は種々の材料のうち任意の材料から製造することができる。たとえば、研究と研究に関連する用途に使用するための結合対のアレイを生成することが望ましい場合など、一部の実施形態では、基板を製造する元の材料は、理想的には、ハイブリダイゼーションの間の非特異的な結合は低レベルであるべきである。多くの状況では、可視光および／またはＵＶ光に対して透過的な材料を使用することが好ましい。本発明の関心となる柔軟な基板の材料としては、ナイロン（修飾されたナイロンと修飾されないナイロン）、ニトロセルロース、ポリプロピレンなどを含む。この実施形態ではナイロンメンブランおよびナイロンメンブランの誘導体が特に有用である。剛性の基板としては、本発明の関心となる特定の材料は、ガラス、石英シリカ、シリコン、プラスチック（たとえばポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびこれらの混合物など）、金属（たとえば金、プラチナなど）が含まれる。ポリヌクレオチド組成または他の化学成分が付着する基板の表面は、滑らかであるかまたは実質的に平面であってもよいし、または、へこみまたは突起などの不規則性を有していてもよい。表面は、表面の性質を望ましいように修飾する役割を果たす１つまたは複数の異なる化合物の層で修飾してもよい。本発明の関心となるこのような修飾層には、金属、金属酸化物、ポリマ、生体小分子などの無機物層および有機物層が含まれる。本発明の関心となるポリマ層としては、ペプチド、タンパク質、ポリ核酸、またはこれらの模倣物（たとえばペプチド核酸など）、多糖類、リン脂質、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンアミン、ポリアリーレンサルファイド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテートなどの層が含まれる。ここでポリマは、ヘテロポリマでもあってもよくホモポリマであってもよく、別の官能基部分が付着していてもよいし、付着していなくてもよい（たとえば共役した官能基）。
【００８８】
［全塩基全層コントロールプローブ］
上述のように、本発明はまた、本明細書で「全塩基全層」コントロールプローブと呼ぶプローブの集合も提供する。この集合は、所与のコントロールプローブ内ですべての層または位置において所与のノズルグループのすべてのノズルメンバーが付着させた塩基の残基を集合的に含む核酸プローブの集合である。言い換えれば、本発明は各層で所与のノズルグループの各ノズルが付着させた塩基または残基を集合的に含む異なるシーケンスの複数の異なるプローブから構成されたコントロールプローブの「全塩基全層」集合を提供する。したがって、本発明の「全塩基全層」コントロールプローブの集合は、所与のノズルグループに関して、そのグループの各ノズルが各層のコントロールプローブ内でサンプリングされるか表されるようにする。
【００８９】
所与の「全塩基全層」コントロールプローブの集合は、コントロールプローブの集合がコントロールとして機能する所与のアレイ内のテストプローブの長さと、所与のセットを構成する特定のコントロールプローブの性質に依存して、単一のコントロールプローブのセットから構成してもよくまたは複数の異なるコントロールプローブのセットから構成してもよい。したがって一部の実施形態では、本発明による「全塩基全層」コントロールプローブの集合は、単一のコントロールプローブのセットから構成してもよい。別の実施形態では、本発明による「全塩基全層」コントロールプローブの集合は、複数の異なるコントロールプローブのセットから構成してもよく、ここで複数とは少なくとも２を意味し、多くの実施形態では、セットの数は４より少なく、たとえば、２または３など４より少ない。
【００９０】
上記のように、コントロールプローブの所与の集合がコントロールプローブのセットを１つだけ含むかまたは複数含むかは、少なくとも部分的には、コントロールセットを構成するコントロールプローブの性質とテストプローブの長さとに依存する。アレイのテストプローブがコントロールプローブと同じ長さである場合、一部の実施形態では、コントロールプローブの集合の中には単一のコントロールプローブのセットだけが存在する。たとえば、テストプローブがすべて２５ｍｅｒである場合、単一の２５ｍｅｒのコントロールプローブのセットが、このようなアレイ上で使用するためのコントロールプローブの集合を構成してもよい。テストプローブがコントロールプローブより長い別の実施形態では、所与のコントロールプローブの集合を、２つ以上のコントロールプローブのセットから構成し、テストプローブの完全な長さまたはすべての層をコントロールプローブの中で表すことができる。たとえば、表面結合プローブ（すなわちテストプローブ）が〜３０塩基より長い（すなわち３０ｍｅｒより長い）実施形態では、ターゲットシーケンスと相補的なプローブのハイブリダイゼーション効率と、このプローブと一塩基ミスマッチまたは欠落との間の差は、他のケミカルノイズの源に匹敵するレベルまで低減することができる（もっとも顕著なノイズは、プローブからシグナルを生成するために使用されるハイブリダイゼーションアッセイのケミカルノイズである）。したがって、多くの実施形態では、テストターゲットの長さを〜３０塩基未満に維持し、アッセイの分解能を維持するほうが望ましい。このような実施形態では、２つ以上のコントロールプローブのセットを有することが望ましい。たとえば、テストプローブが６０ｍｅｒである場合、４つの２５ｍｅｒ長のコントロールプローブの３つのセットまたはバージョンで（１セットはテストプローブの１から２５の層（残基）、１セットはテストプローブの２１から４５の層（残基）、もう１セットはテストプローブの３６から６０の層（残基）。合計で１２プローブの３つのセットがコントロールプローブの集合を構成する）、テストプローブのすべての層ですべての塩基をサンプリングすることができる。最小数のコントロールプローブを使用することが望ましい別の実施形態では、６０ｍｅｒプローブの末端近くの間違った塩基または失われた塩基は、プローブの中央に近い間違った塩基または失われた塩基ほどハイブリダイゼーションを破壊するものではないこと、および、アレイ面にもっとも近い５塩基は、全体のハイブリダイゼーション効率にほとんど寄与しないことに注意すれば、より少ない数を使用することができる。このような実施形態では、コントロールプローブのセットの数は２に低減することができる（集合内に８つのコントロールプローブ）（１セットの４つのコントロールプローブは層６から３０をサンプリングし、１セットの４つのコントロールプローブは層３１から５５をサンプリングする）。また、コントロールプローブのセットの数は、３０ｍｅｒプローブとターゲットを使用することによって４つのプローブの２つのセットに低減することができる（分解能は多少失われる）。さらに別の実施形態では、たとえば、２つの異なるドメインの複合プローブに対して、２種類に区別して標識したコントロールターゲットのセットなど、区別して標識したコントロールターゲットの対応する数のセットと共に使用する、２つ以上の異なるプローブドメインを有する複合プローブを使用する。ここで複合プローブは、テストプローブが３０塩基以上の長さであっても、テストプローブと等しい長さである。このような複合プローブとこの使用法を次により詳細に説明する。
【００９１】
各コントロールプローブのセットは、約４から約３０のヌクレオチド残基から少なくとも第１のプローブドメインを各々が有する、異なるシーケンスの４つの異なるコントロールプローブ核酸から構成される。ここでこのセットの各プローブ核酸のメンバーは、第１のプローブドメインの各残基部位において、そのセットの他のメンバーとは異なる塩基を有する。たとえば、所与のプローブドメインの部位または残基１において、このセットのコントロールプローブ１はＡを有し、コントロールプローブ２はＧを有し、コントロールプローブ３はＣを有し、コントロールプローブ４はＴを有していてもよい。例としての４つの６ｍｅｒコントロールプローブのセットは次のとおりである。
【００９２】
５’−ＡＴＧＣＴＣ−表面
５’−ＣＡＣＴＧＡ−表面
５’−ＴＧＡＧＣＴ−表面
５’−ＧＣＴＡＡＧ−表面
【００９３】
上式で、セットの各プローブは、６残基長の単一のプローブドメインを有する。
【００９４】
上記のように、所与のコントロールプローブのセットのコントロールプローブは、約４から約３０の塩基長の少なくとも１つのプローブドメインを含み、長さは典型的には約５から３０であり、たとえば約１０から約３０、約１５から約２５などである。一部の実施形態では、所与のセットを構成するコントロールプローブは、単一のプローブドメインを含む。さらに別の実施形態では、コントロールプローブは、複数の２つ以上のプローブドメインを含み、このような実施形態の異なるプローブドメインの数（この場合プローブは複合コントロールプローブと呼ばれる）は、２から約１０の範囲であってもよく、２から５、２から４、２から３などの範囲であってもよい。上述のように、最少数のコントロールプローブから構成されたコントロールプローブの集合を使用して、たとえば４５ｍｅｒ、６０ｍｅｒ、７５ｍｅｒ、９０ｍｅｒなど、３０ｍｅｒより長いテストプローブのすべての層のすべての塩基をサンプリングしたい場合には、複合プローブが関心となる。たとえば、所与のアレイ上のテストプローブが６０ｍｅｒの場合、各々が６０塩基長で、４つの可能なプローブドメインのうち２つで構成された単一のコントロールプローブのセットから構成されたコントロールプローブの集合を有してもよい。たとえば、各部位に異なる塩基を使用した、長さが３０以下の４つのシーケンス（すなわちプローブドメイン）を考える。これらのシーケンスをＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄと示す。
【００９５】
５’−Ａ−Ｂ−表面
５’−Ｂ−Ａ−表面
５’−Ｃ−Ｄ−表面
５’−Ｄ−Ｃ−表面
【００９６】
上記の複合プローブは各層の各塩基をサンプリングする。２つの異なるプローブドメインの複合コントロールプローブの上記の集合は、６０ｍｅｒのテストプローブのすべての層のすべての塩基をサンプリングすることができる（ここでＡとＢに対する相補的なターゲットは、独立して測定可能な異なる化学成分で標識する（ＣとＤについても同様である）。これについては後述する）。
【００９７】
コントロールプローブの集合を使用するに際しては、対応する４つの標識したコントロールターゲット核酸のセットを、集合内のコントロールプローブの各プローブドメインのアレイを使用する間に使用する（ハイブリダイゼーションアッセイにおけるアレイの実際の使用は次に詳細に説明する）。対応という言葉は、コントロールターゲット核酸のセットが、厳しい条件下でそのセットのコントロールプローブのメンバーとハイブリダイゼーションするターゲット核酸を含むという意味であり、コントロールターゲット核酸のセットは、コントロールプローブのセットの各メンバーに対してターゲット核酸を含む。多くの実施形態では、ターゲット核酸は設計したコントロールプローブのセットに対して完全に相補的である。すなわち、コントロールプローブとコントロールターゲットのセットの組み合わせの中の各コントロールプローブとコントロールターゲットの対は、完全に相補的であり、ハイブリダイゼーションして二重の分子を形成し、ミスマッチの塩基対はないということを意味する。
【００９８】
所与の集合のコントロールプローブが各々、単一のプローブドメインしか含まない場合、アレイを使用する時にそのコントロールプローブで使用するすべてのコントロールターゲット核酸は、単一の検出可能な標識で標識することができる。本発明で使用できる標識の方法のうち１つの方法は、ヌクレオチドのうち１つまたは複数を、３２Ｓ、３２Ｐ、３Ｈなどの放射性標識で標識する同位体標識である。別の標識手段は、たとえばＣＴＰなどの蛍光タグをつけたヌクレオチドがコントロールターゲット核酸の中に存在する蛍光標識である。本発明で使用することのできる蛍光標識の特定の例は次の例を含む。イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、２−〔エチルアミノ〕−３−（エチルイミノ）−２−７−ジメチル−３Ｈ−キサンチン−９−ｙｌ〕安息香酸エチルエステルモノハイドロクロライド（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｒ６Ｇ）（これは、約５００ｎｍから５６０ｎｍの範囲の波長の応答放射を放出する）、１，１，３，３，３’，３’−ヘキサメチルインドジカルボキサニン  イオダイド（Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ）（ＨＩＤＣ）（約６００ｎｍから６６０ｎｍの範囲の波長の応答放射を放出する）、６−カルボキシフルオレセイン（一般にＦＡＭとＦの略語で知られる）、６−カルボキシ−２’，  ４’，  ７’，  ４，  ７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，  ５’−ジクロロ−２’，  ７’−ジメソキシフルオロセイン（ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）  （ＪＯＥまたはＪ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡまたはＴ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸまたはＲ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５またはＧ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ６またはＧ６）、ローダミン１１０などのフルオレセイン色素およびローダミン色素などのキサンチン系色素。たとえばＣｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７などのシアニン色素。たとえばウンベリフェロンなどのクマリン。たとえばヘキスト３３２５８などのベンジミド（ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）色素。たとえばテキサスレッドなどのフェナントリジン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｅ）色素。エチジウム色素。アクリジン色素。カルバゾール色素。フェノキサジン色素。ポルフィリン色素。Ｃｙ３（約５４０ｎｍから５８０ｎｍの範囲の波長の応答放射を放出する）、Ｃｙ５（約６４０ｎｍから６８０ｎｍの範囲の波長の応答放射を放出する）などのシアニン色素などのポリメチン色素。ＢＯＤＩＰＹ色素。キノリン色素。しかしこれらに限定されるものではない。本発明の関心となる特定の蛍光標識としては、ピレン、クマリン、ジエチルアミノクマリン、ＦＡＭ、フルオレセイン  クロロトリアジニル（Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌ）、フルオレセイン、Ｒ１１０、エオシン、ＪＯＥ、Ｒ６Ｇ、ＨＩＤＣ、テトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ、リサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、ＲＯＸ、ナフトフルオレセイン（Ｎａｐｔｈｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが含まれる。
【００９９】
複合プローブを使用する場合、ターゲットプローブの各異なるプローブドメインのコントロールターゲットのセットを使用する。ここで各セットは区別して標識する（すなわち、互いに区別できるように異なるタイプの標識で標識する）。たとえば、プローブドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄを有する上記の４つの代表的な複合プローブのセットでは、ターゲットの組み合わせ（ｇ−ａ、ｒ−ｂ、ｇ−ｃ、ｒ−ｄ）が区別可能なシグナルを生成するように、２つの区別可能な標識（ｇおよびｒで示す）を、対応するターゲット、ａ、ｂ、ｃ、ｄに使用する。ここでｇは緑、ｒは赤である。各複合プローブの２つの可能なターゲットが異なる標識を有する、任意のシーケンスと標識の組み合わせにより、区別可能なシグナルが生成される。
【０１００】
複合プローブを使用する場合、たとえばＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄなどのプローブドメインのシーケンスと、たとえばａ、ｂ、ｃ、ｄなどの、ターゲットセットの相補的なターゲットは、典型的には、各部位において異なるという性質の他に、いくつかの特別な性質を有する。
【０１０１】
１  ターゲットシーケンスａ、ｂ、ｃ、ｄは、相補的なプローブだけと特異的にハイブリダイゼーションしなければならない。アレイ上の他のコントロールプローブまたは実験（すなわちテスト）プローブとクロスハイブリダイゼーションを起こしてはいけない。
２  複合プローブは認識可能な二次構造を有していてはならない。
３  ターゲットも認識可能な二次構造を有していてはならない。
４  ４つのプローブ／ターゲットの二本鎖の融解温度は、ほぼ等しくなければならない。
【０１０２】
複合プローブを使用する場合、各複合プローブドメイン（したがって相補的なターゲット）について上記のパラメータを満足させる適切なシーケンスを同定する任意の便利なプロトコルを使用することができる。一般に、プローブドメインの長さがＬである場合、シーケンスＡには４Ｌの可能性があり、（所与のＡに対して）シーケンスＢには３Ｌの可能性があり、（所与のＡとＢに対して）シーケンスＣには２Ｌの可能性があり、（所与のＡ、Ｂ、Ｃに対して）シーケンスＤには１つの可能性しかない。たとえばＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの種々の複合プローブドメインのシーケンスを同定する２つの代表的な方法は次のとおりである。
【０１０３】
１  モンテカルロ法  ランダムにシーケンスを生成し、所望の性質に関してスクリーニングする。
２  シーケンシャル方法  すべての必要な単一シーケンスの性質を有する単一のシーケンスＡを生成する。ついでシーケンスＡをシーケンスＢ、Ｃ、Ｄを生成するためのシードとして使用する。生成方法は一般にＡの望ましい性質を保つが、ターゲットが、プローブ群の中で複数の他のメンバーと効率的にハイブリダイゼーションするプローブ群は生成しない。
【０１０４】
一部の実施形態では、シーケンシャル法はモンテカルロ法より少ない処理ステップしか必要としないので、シーケンシャル法が望ましい。シーケンシャル法については、次の実験セクションでさらに説明する。
【０１０５】
上記の「全塩基全層」プローブの集合は、埋め込みＱＣプローブとして任意の核酸アレイに使用することができる。この場合、コントロールプローブの集合は特に、上記の方法に従って選択されたコントロールプローブコラムパターンを有するアレイなど、ｉｎ  ｓｉｔｕで生成された核酸アレイと共に使用するのに適している。上記の「全塩基全層」コントロールプローブ集合を含むアレイとこのアレイの使用法、および、このアレイが使用できる代表的な用途を次のセクションで詳細に説明する。
【０１０６】
［アレイ］
本発明では、上記の方法を使用して生成された新規な核酸アレイを提供する。本発明のアレイは、基板表面の異なる知られた位置に、たとえば共有結合または非共有結合で固定されたモノマシーケンスによって異なる、少なくとも２つの異なる核酸を含む。アレイの各異なる核酸シーケンスは典型的には、たとえば、基板表面上のスポットとして、基板表面上のポリマの多数のコピーの組み合わせとして存在する。アレイ上に存在する異なる核酸シーケンスの数、したがって、スポットまたは同様な構造（すなわちアレイのスポット）の数は種々であってよいが、一般には少なくとも２であり、通常は少なくとも５でありより一般には少なくとも１０である。この場合、アレイの上の異なるスポットの数は、アレイが目的とする使用法に応じて、５０、１００、５００、１０００、１万、または１万以上などの多数であってもよい。アレイ表面上に存在する異なる核酸のスポットは一般にはパターンとして存在し、パターンは、たとえば基板面全体の四角のグリッドなどスポットの構成されたローとコラムの形状であってもよいし、たとえば、同心円または半円形の一連のスポットなど基板表面全体の一連の曲線の形状であってもよい。アレイ表面上に存在するスポットの密度も種々であってよいが、一般的には少なくとも約１０スポット／ｃｍ２であり、通常は少なくとも約１００スポット／ｃｍ２である。密度は１０６または１０６以上の高密度でもよいが、一般的には約１０５スポット／ｃｍ２を超えない。本発明の核酸アレイでは、核酸は核酸鎖の任意の部位でアレイに共有結合してもよいが、一般には、たとえば、３’末端または５’末端など、末端のうち１つにおいて結合する。
【０１０７】
本発明のアレイの特徴は、これらが次のうち少なくとも１つを含むことである。（１）アレイ内のコントロールプローブコラムのパターンが、上記の方法で使用された上記の規則またはパラメータを満足させるように、上記の方法に従って選択されたコントロールプローブコラムのパターン。および、（２）上記の「全塩基全層」コントロールプローブの集合。したがって、一部の実施形態では、本発明のアレイは、アレイ内のコントロールプローブコラムのパターンが上記の条件を満足させるように、上記の方法に従って選択されたコントロールプローブコラムのパターンを有するという特徴がある。一部の別の実施形態では、本発明のアレイは上述の「全塩基全層」コントロールプローブの集合を含むという特徴がある。さらに別の一部の実施形態では、本発明のアレイは、次の両方を有するという特徴がある（１）アレイ内のコントロールプローブコラムのパターンが上記の方法で使用される上記の規則またはパラメータを満足させるように、上記の方法に従って選択されたコントロールプローブコラムのパターン、および、（２）上記の「全塩基全層」コントロールプローブの集合。
【０１０８】
［アレイの実用性］
本発明のアレイには種々の用途があり、このような用途は一般には、所与のサンプル内の特定の検体の存在を、定量的ではないにしても少なくとも定性的に検出する検体の検出という用途である。このようなアッセイを実行するプロトコルは当業界ではよく知られているので、本明細書で詳しく説明する必要はない。一般に、目的の検体を含むと考えられるサンプルを、その検体が、本発明の方法によって生成されたアレイ上に存在するそれぞれの結合対のメンバーと結合するのに十分な条件下で、アレイと接触させる。したがって目的の検体がサンプル内に存在する場合、その検体は相補的な結合のメンバーの部位でアレイに結合し、複合体がアレイ面に形成される。ついでこのアレイ表面に存在する結合複合体を、たとえば検体上に存在する同位体標識または蛍光標識のシグナル生成システムの使用を介して検出する。ついでサンプル内の検体の存在を、基板表面上の結合複合体の検出から推定する。
【０１０９】
本発明の関心となる特定の検体検出の用途としては、本発明の核酸アレイを使用するハイブリダイゼーションアッセイが含まれる。これらのアッセイでは、ターゲット核酸のサンプルをまず準備する。準備には、ターゲット核酸をシグナル生成システムのメンバーなどの標識で標識することを含んでいてもよい。アレイが上記の「全塩基全層」コントロールプローブを含む場合、典型的には標識したコントロールターゲットの集合がサンプル内に含まれ、集合は、上記のようにすべてを同じ標識で標識したコントロールターゲットで構成してもよいし、または異なる標識で区別して標識した２つ以上のセットで構成してもよい。サンプルの準備に続いて、サンプルを、ハイブリダイゼーション条件の下でアレイと接触させ、これによってアレイ面に付着しているプローブシーケンスと相補的であるターゲット核酸との間で複合体を形成する。ついでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する。本発明のアレイを使用して実行できる本発明の関心となる特定のハイブリダイゼーションアッセイは、遺伝子発見アッセイ、遺伝子発現差異解析アッセイ、核酸シーケンシングアッセイなどを含む。種々の用途でアレイを使用した方法を説明する特許および特許出願は、第５，１４３，８５４号、第５，２８８，６４４号、第５，３２４，６３３号、第５，４３２，０４９号、第５，４７０，７１０号、第５，４９２，８０６号、第５，５０３，９８０号、第５，５１０，２７０号、第５，５２５，４６４号、第５，５４７，８３９号、第５，５８０，７３２号、第５，６６１，０２８号、第５，８００，９９２号を含む。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれている。
【０１１０】
一部の実施形態では、本発明の方法は、上記の検出ステップおよび抽出ステップのうち少なくとも１つのステップからのデータを、遠隔の場所に送信するステップを含む。「遠隔の場所」という用語は、アレイが存在しハイブリダイゼーションを行う場所以外の場所を意味する。たとえば、遠隔の場所は、同じ町の中の別の場所（オフィス、研究室など）、異なる町の異なる場所、異なる州の異なる場所、異なる国の異なる場所などであってよい。したがって、１つの項目（アイテム）が別の項目から「離れている」と示される場合、これらの２つの項目が少なくとも異なる建物の中にあり、少なくとも１マイル、１０マイル、または少なくとも１００マイル離れていることを意味する。情報の「通信」は、この情報を表すデータを電気信号として適切な通信チャネル（たとえば私設通信網または公共通信網）上で送信することを意味する。項目の「転送」は、その項目を物理的に輸送するか（可能な場合は）他の方法で動かすことによって、その項目を１つの場所から別の場所に移すことを意味し、少なくともデータの場合は、物理的にそのデータを担持する媒体を輸送するかそのデータを通信することを含む。データは遠隔の場所に送信してさらに評価および／または使用することができる。データの送信には、たとえばファクシミリ、モデム、インターネットなど、任意の便利な通信手段を使用することができる。
【０１１１】
したがって、本発明の方法によって作成されたアレイを使用する際には、典型的にはアレイをサンプル（たとえばタンパク質を含んだサンプルなど蛍光標識した検体）に暴露し、ついでアレイを読み取る。アレイに照射し、アレイの各スポットにおいて生じた蛍光の位置と強度を読み取り、アレイの表面上の結合複合体を検出することによってアレイを読み取ることができる。たとえば、カリフォルニア州パロアルトのアジレントテクノロジー社から市販されている、アジレントマイクロアレイスキャナ装置と同様なスキャナをこの目的のために使用することができる。他の適切な装置と方法は、米国特許第５，０９１，６５２号、第５，２６０，５７８号、第５，２９６，７００号、第５，３２４，６３３号、第５，５８５，６３９号、第５，７６０，９５１号、第５，７６３，８７０号、第６，０８４，９９１号、第６，２２２，６６４号、第６，２８４，４６５号、第６，３７１，３７０号、第６，３２０，１９６号、第６，３５５，９３４号に説明されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれている。しかしアレイは、前述の方法または装置とは異なる、任意の方法または装置で読み取ることができ、他の読み取り方法としては、他の光学的な技術（たとえば、化学発光標識または電子発光標識の検出など）、または、電気的な技術（各スポットに電極を与え、そのスポットにおけるハイブリダイゼーションを検出する。この方法は米国特許第６，２２１，５８３号などに開示されている）が挙げられる。測定から得られた結果は生の結果であってもよいし（各スポットについて１つまたは複数のカラーチャネルの蛍光強度の測定値など）、または、あるスポットに関する測定値が既定の閾値以下であった場合それを拒絶するおよび／またはアレイから読み取られたパターンに基づいて結論（たとえば特定のターゲットシーケンスがそのサンプル内に存在していたか存在していなかったかなど）を形成するなどで得られるような処理された結果であってもよい。場合によっては測定値の結果（処理されている場合もあれば処理されていない場合もある）を遠隔の場所に転送し（たとえば通信などにより）、遠隔の場所で受信してさらに使用することもできる（さらに処理するなど）。
【０１１２】
［キット］
検体検出アッセイで使用するキットも提供される。このキットは少なくとも上述の本発明のアレイを含む。アレイが上述の「全塩基全層」コントロールプローブを含む場合、キットはさらに、アレイ上のコントロールプローブの集合内のコントロールプローブのプローブドメインに対応するターゲットから構成されるコントロールターゲット核酸の標識された集合を含んでいてもよく、コントロールターゲット核酸の集合は、全部が同じ標識で標識されたターゲットで構成されていてもよく、または、区別して標識したターゲット核酸の２つ以上のセットから構成されていてもよい。キットはさらに、サンプル準備試薬、バッファ、標識など検体検出アッセイを実行するために必要な１つまたは複数のほかの構成要素を含んでいてもよい。したがって、キットは、バイアルまたはボトルなどの１つまたは複数の容器を含んでいてもよく、各容器はアッセイのための別々の構成要素、核酸ハイブリダイゼーションアッセイなどのアレイアッセイを実行するための試薬などを含んでいてもよい。またキットは、検体を変性させるための変性試薬、ハイブリダイゼーションバッファなどのバッファ、洗浄用溶剤、酵素基質、標識したターゲット核酸サンプルなど標識したターゲットサンプルを生成するための試薬、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロール、アレイベースのアッセイを行うためにアレイアッセイ装置を使用する方法に関する文書による指示などを含んでいてもよい。このようなキットはまた典型的には、アレイベースのアッセイを実行するために使用する命令を含んでいてもよい。
【０１１３】
本発明のコントロールプローブコラム選択プロトコルと共に使用するキットも提供される。このようなキットは好ましくは、少なくとも、上記のプログラミングと命令を含むコンピュータ読み取り可能媒体を含む。命令はインストールまたは設定の指示を含んでいてもよい。命令は本発明を使用するための指示を含んでいてもよい。
【０１１４】
ソフトウェアと指示をキットとして提供することは多くの目的の役に立つ。この組み合わせをパッケージ化し、既存の製造装置をアップグレードする手段として購入できるようにしてもよい。別法としてはこの組み合わせを、アレイを製造するための新しい装置と共に提供し、この装置にこのソフトウェアをあらかじめロードすることもできる。この場合、命令は参照マニュアル（またはその一部）としての役割を果たし、コンピュータ読み取り可能媒体はあらかじめロードされたユーティティのバックアップコピーとしての役割を果たす。
【０１１５】
上記のキットの命令は一般に適切な記録媒体上に記録する。たとえば、命令はたとえば紙またはプラスチックなどの印刷物に印刷することもできる。したがって、命令はキットの中にパッケージされた挿入物、キットの容器またはキットの構成要素のラベルの中に入れてもよい（すなわちパッケージまたは中のパッケージに関連づける）。他の実施形態では、命令は、たとえばプログラムが存在する媒体と同じ媒体を含む、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなどの適切なコンピュータ読み取り可能媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。
【０１１６】
さらに別の実施形態では、命令自体はキット内に存在せず、命令をたとえばインターネットなどを介して遠隔の源から得る手段を提供する。この実施形態の例は、命令を見ることができるかおよび／または命令をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。逆に、ウェブアドレスを提供するなどにより遠隔の源から本発明のプログラミングを得るための手段を提供してもよい。さらに、キットは命令とソフトウェアをインターネットまたはワールドワイドウェブなどの遠隔の源から得るかまたはダウンロードするキットであってよい。アクセスセキュリティまたは識別プロトコルの一部の形態を使用し、本発明を使用する権利のある人だけにアクセスを制限してもよい。命令に関しては、命令および／またはプログラミングを得る手段は一般に、適切な記録媒体上に記録する。
【０１１７】
限定するためではなく説明のために次の実施例を示す。
【実施例】
【０１１８】
［実験］
Ｉ  効率的なサンプリングパターンの例
ローＲを占め、コラムＣで開始し、コラム間隔Ｚを使用する１ロー周期のサンプリングパターンをＲ−Ｃ−Ｚと示す。たとえば、ロー１を占め、コラム４で開始し、コラム間隔７を使用するパターンは、１−４−７と示す。ついで、〔１−７−７、２９−５−７、５７−３−７、８４−１−７〕で表される４ローの組み合わせで、表１に示された２１５コラム×１０５ローのアレイのノズルグループをサンプリングする。
【０１１９】
【表１】
2004309484.tif 000003
【０１２０】
このパターンではすべてのノズルグループが最低で５回、最高で７回サンプリングされる。さらに、このパターンでは全アレイ面がサンプリングされるので、全プローブ合成効率における長期的な勾配を検出できる。
【０１２１】
ＩＩ  全塩基全層プローブの構築
複合プローブ設計シーケンシャル法を使用して、次の例で６０ｍｅｒアレイの層６から５５の中のすべての塩基をサンプリングする４つのシーケンスを構成する。
【０１２２】
第１のプローブとして、既存の２５ｍｅｒＱＣプローブＰｒｏ２５Ｇをとる（配列表配列番号１参照）。
【０１２３】
Ｐｒｏ２５Ｇのシーケンスは、最小の自己構造と適切に均一な塩基組成を有するように設計されたものである（経験的な公式はＡ５Ｃ６Ｇ６Ｔ８：４８％ＧＣである）。したがって、均一な塩基組成によりほとんど同等な二本鎖融解温度で、導出可能なシーケンスの最大数が得られるため、これは優れた「シード」候補である。次のプローブの生成を開始するためには、Ｇ（１３）から開始して循環的にＰｒｏ２５Ｇの順序を変え、ターゲットの重複を最小限にする（配列表配列番号２参照。シーケンスＢＸを示す）。
【０１２４】
配列表配列番号１及び２をともに参照すれば、Ｐｒｏ２５ＧとシーケンスＢＸとは、５’末端から、１５、１６、１７番目、２０、２１、２２番目、及び２４番目の塩基は所与の層で同一であり、他の塩基は相違することが理解される。課題は、塩基組成（および二本鎖の溶解温度）に与える混乱を最小にしながら、塩基の同一性を除去することである。これは、シーケンスＢＸにおいて塩基を交換することで行うことができる。シーケンスＢＸ内のＴ（１５）をＧ（２０）、Ｃ（１６）をＴ（２１）、Ａ（１７）をＴ（２５）、Ａ（２１）をＣ（２４）とそれぞれ交換することにより、シーケンスＥＱＣＰ１を得る（配列表配列番号３参照。シーケンスＥＱＣＰ１を示す。）。
【０１２５】
第３のプローブを生成するには、Ａ（１７）から開始してＰｒｏ２５Ｇを循環的に順序を変え逆にする（配列表配列番号４参照。シーケンスＣＸを示す。）。
【０１２６】
配列番号１、３及び４によれば、５’末端から３番目、８番目、１２番目、１４番目、１６番目、２０番目、及び２３番目でＥＱＣＰ１とＣＸの塩基が同一であり、１番目、９番目、及び１７番目でＰｒｏ２５ＧとＣＸとの塩基が同一であることが理解される。ここでも可能であれば塩基の交換によって塩基の同一性を除去する。Ａ（１）をＴ（３）、Ｇ（８）をＡ（９）、Ｃ（１２）をＡ（１７）、Ａ（１４）をＴ（１６）、Ｃ（１９）をＧ（２３）とそれぞれ交換すると、次の配列が得られる（配列表配列番号５参照。シーケンスＣＹを示す。）。
【０１２７】
これにより、訂正されない塩基の同一性はシーケンスＣＹのＴ（２０）における同一性のみとなる。この同一性は交換では解決できないので、変更して解決しなければならない。新しいシーケンスでもＰｒｏ２５Ｇと同じＧＣ内容量を維持するためには、Ｔ（２０）をＡに変えると配列番号１４及び１５に示すような配列が得られる（配列番号６及び７参照。それぞれＥＱＣＰ２、ＥＱＣＰ３を示す。）。
【０１２８】
ＥＱＣＰ２が最終的に決定されると、ＥＱＣＰ３も完全に決定されるので、シーケンスＥＱＣＰ２もＥＱＣＰ３も完全に書き出されていることに注意されたい。
【０１２９】
候補のシーケンスはほとんど同等の二本鎖溶解温度、低い自己構造、低い複合プローブ自己構造、低いクロスハイブリダイゼーションの可能性という要件を満たしているのだろうか。候補のプローブに対して相補的である４つのターゲットのシーケンス、予想される二本鎖溶解温度と自己構造を次の表２に示す。
【０１３０】
【表２】
2004309484.tif 000004
【０１３１】
ここで、ターゲット濃度は１０ｐＭとする。表２から、予想される二本鎖溶解温度は６℃の範囲であることが明らかである。この範囲は適切に狭く、また、溶解温度は予想される６０℃というハイブリダイゼーション温度よりも高い。すべてのターゲットの自己構造自由エネルギは６０℃では正であるので、低い構造を有することが示される。（尚、表２の値を導出する手法については、次に示すウェブサイトを参照：  http://bioweb.pasteur.fr/seganal/interfaces/mfold-simple.http）
【０１３２】
複合プローブの熱力学的な性質を表３に詳細に示す。Ｔ５テザーを各プローブの３’末端に付加し、６０ｍｅｒマイクロアレイプローブの第１の５塩基に間違いがあっても実質的に観察可能な結果を有しないという事実を反映していることに注意されたい。
【０１３３】
【表３】
2004309484.tif 000005
【０１３４】
表３は、４つの複合プローブシーケンスのうち２つが、６０℃のハイブリダイゼーション温度で構造化されていない可能性が高いが（自由エネルギが正）、２つは、なんらかの構造を有する可能性がある（自由エネルギが負）ことを示す。しかし、予想される構造を詳細に検討すると、プローブ内の６０塩基のうち３つから４つだけが関係することが示される。この発見は、ほとんどのプローブがターゲットに使用可能なことを意味する。ハイブリダイゼーションの律速ステップは、３から４塩基長の最初の二本鎖の形成であり、また、すべての４ターゲットを伴う二本鎖形成は熱力学的に非常に起こりやすいので、この少量の二次構造はターゲット結合を阻害するものではない。
【０１３５】
各プローブと、ターゲットセットの中の３つの非相補的なメンバーの間のクロスハイブリダイゼーションは、使用される構成方法で阻害されている。ＥＱＣＰ１を構成するために使用されるＰｒｏ２５Ｇの循環的な置換により、ＥＱＣＴ１とＰｒｏ２５Ｇ（またはＥＱＣＰ１とＴａｒ２５Ｃ）の間の最大の重複が２５塩基中の１３塩基に限定される。ＥＱＣＰ２とＥＱＣＰ３を構成するために使用する方法は、クロスハイブリダイゼーションの可能性をさらに壊す。この結果、クロスハイブリダイゼーションの可能性は低いと予想される。
【０１３６】
シーケンスのホモロジ検索アプリケーションであるＢＬＡＳＴを使用して、イースト菌の各遺伝子に対して設計されたこれらのターゲットとプローブの間のクロスハイブリダイゼーションの可能性を評価した。この結果を表４にまとめる。
【０１３７】
【表４】
2004309484.tif 000006
【０１３８】
表４から、任意のターゲットと、任意のイーストＯＲＦの任意の領域の間に観察される重複のうちもっとも長い重複は２０／２５塩基であり、これは通常は十分にミスマッチであってクロスハイブリダイゼーションを防ぐことが明らかであろう。より重要なことは、観察されたマッチのうちどれもが、実際にはアレイ上のプローブと重複していないことである。ＧｅｎＢａｎｋのヒト遺伝子に対して同様なＢＬＡＳＴ検索を行った結果、検索のために設定した最小の厳しさに一致するＢＬＡＳＴのマッチはなかった。
【０１３９】
最後に、このプローブセット構成の方法は、さらに長いシーケンスにも一般化でき（６０ｍｅｒアレイのより多くの層または全部の層）または２標識以上の標識へも一般化することができることに注意されたい（標識数を増やすと効率も上がる。Ｍの標識は各プローブがＭのターゲットに結合できることを意味するためである）。
【０１４０】
上記の説明から、上記の本発明によってマイクロアレイの全領域の効率的なサンプリングが提供されることが明らかであろう。サンプリングは、パルスジェット印刷プロセスの詳細を考慮する。サンプリングパターンは、ポジティブコントロールプローブ、ネガティブコントロールプローブ、実験プローブなど、任意のプローブタイプに使用することができる。本開示に説明したポジティブコントロールプローブとネガティブコントロールプローブのパターンを使用して、ハイブリダイゼーション効率の勾配とバックグラウンドシグナル結合の勾配をそれぞれ補正できる。この方法により、２５ヌクレオチドより明らかに長いプローブを有するマイクロアレイのほとんどの層またはすべての層から合成効率情報を集めるシーケンスが得られる。本発明の方法は、測定の質を犠牲にすることなく、最小のプローブのセットを使用して上記を達成し、実験者が使用するアレイのスポットを節約できる。したがって、本発明は当業界に多大な貢献を行うことができる。
【０１４１】
本明細書に引用されたすべての刊行物と特許出願は、各刊行物と特許出願が具体的に個別に参照により組み込まれるように、本明細書に参照により組み込まれる。どの刊行物の引用も、本出願の提出前に開示されているため引用したものであり、本発明が関連技術によって予想されるものではないことを理解されたい。
【０１４２】
上述の発明を明確に理解するために、例示的に詳細に説明し、実施例を示したが、当業者であれば本発明の教示に照らして、付随する請求項により理解される発明の範囲から離れることなく、本発明に所定の変更と修正を加えることができることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１Ａ】代表的なパルスジェットｉｎ  ｓｉｔｕ核酸アレイ製造装置およびこの装置の印刷ヘッド要素の概念図である。
【図１Ｂ】代表的なパルスジェットｉｎ  ｓｉｔｕ核酸アレイ製造装置およびこの装置の印刷ヘッド要素の概念図である。
【図２】代表的なパルスジェットｉｎ  ｓｉｔｕ核酸アレイ製造装置およびこの装置の印刷ヘッド要素の概念図である。
【図３】本発明による核酸マイクロアレイのコントロールプローブコラムの代表的な集合を示す表である。
【図１Ａ】
2004309484.tif 000007
【図１Ｂ】
2004309484.tif 000008
【図２】
2004309484.tif 000009
【図３】
2004309484.tif 000010
【配列表】
2004309484000001.app