(57)【要約】【課題】１６ＳｒＲＮＡ　遺伝子に基づいたバチルス属細菌の系統的な位置を知ることができ、今後新しく単離された菌株の迅速な同定が可能となるバチルス属細菌に特異的なオリゴヌクレオチド、バチルス属細菌の菌種・菌群を検出・同定する方法を提供すること。【解決手段】検体中に存在するバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡ　遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように設計されたオリゴヌクレオチドであって、該ヌクレオチドが以下の配列群５’−ＡＴＧＴＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣ−３’・・・（ａ）５’−ＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣ−３’・・・（ｂ）５’−ＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡＡＧＡＣＣＣ−３’・・・（ｃ）の少なくとも１つであることを特徴とするオリゴヌクレオチド。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に存在するバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡ　遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、
そのヌクレオチド配列と相補的となるように設計されたオリゴヌクレオチドであって、
該ヌクレオチドが以下の配列群
５’−ＡＴＧＴＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣ−３’・・・（ａ）
５’−ＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣ−３’・・・（ｂ）
５’−ＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡＡＧＡＣＣＣ−３’・・・（ｃ）
の少なくとも１つであることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載された配列群のうち、少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）において用いるプライマー。
【請求項３】
請求項１に記載された配列群のうち、少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを、ＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）において用いるプローブ。
【請求項４】
請求項１に記載された配列群のうち、少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）におけるプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）として用いることを特徴とするバチルス属細菌の菌種・菌群を検出・同定する方法。
【請求項５】
請求項１に記載された配列群のうち、少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを、ＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）におけるプローブ（ｐｒｏｂｅ）として用いることを特徴とするバチルス属細菌の菌種・菌群を検出・同定する方法。
【請求項６】
バチルス属細菌より抽出されたＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲ法のスタンダードを作成し、請求項１に記載された配列群のうち、少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法におけるプライマーとして用い、ＰＣＲ産物の増幅を行い、初期鋳型量０．０１〜１０ｎｇと変化させ、ＰＣＲを行い、それぞれ各サイクルにおけるＰＣＲ産物のＵＶ強度から、各鋳型量における濃度マーカーと同量のＵＶ強度（＝１，０００）に達するサイクル数を求め、　算出されたサイクル数に対する初期鋳型量をプロットし、０．０１〜１０ｎｇの範囲で近似された関係式が次式Ｂで表されることを特徴とするバチルス属細菌の定量化方法。
式Ｂ　　（ｉｎｉｔｉａｌ　ＤＮＡ　ａｍｏｕｎｔ［ｎｇ］）＝９．００×１０６×０．５０（ｃｙｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ），ｒ２　＝０．９５８
（但し、ｉｎｉｔｉａｌ　ＤＮＡ　ａｍｏｕｎｔはＤＮＡ初期鋳型量、ｃｙｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ　は増幅回数、ｒ２は相関係数である。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はバチルス属細菌に特異的なオリゴヌクレオチド、プライマー、プローブ及びバチルス属細菌の定量化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バチルス属細菌は、アミラーゼ、カタラーゼ、プロテアーゼ活性などさまざまな酵素活性を有することが知られており、多種多様な有機物質を分解可能であるという生理的特徴を有する。更に他の細菌に比べ取り扱いが容易であり、生育可能な温度範囲が広く、また環境条件により菌体内に構造的変化を生じて胞子形成を行うという特徴も併せもっている。この胞子は熱、放射線、化学物質に強い特性がある。
【０００３】
バチルス属細菌は日本における食品製造（納豆などの発酵食品）に古く用いられ、また米国などでは天然の消臭剤としても利用されるなど、その利用範囲は極めて広い。
【０００４】
近年、バチルス属細菌は、下水処理分野においても注目されつつある有用微生物である。特に活性汚泥法に適用した場合により多くの有機物質の分解と処理施設の臭気の抑制効果が期待されている。
【０００５】
また、下水処理分野におけるバチルス属細菌の研究は目覚しいものがあり、シリカを主成分としてマグネシウムなどのミネラル溶液の添加によって、バチルス属細菌を人為的に増殖・優占化する手法の研究もなされている（非特許文献１）。
【０００６】
本発明者は更に研究を進め、上記ミネラル溶液を添加した活性汚泥中のバチルス属細菌の挙動を定量的ＰＣＲ法及びＦＩＳＨ法により検討し、本発明に至った。
【０００７】
【非特許文献１】
入江ら、「バチルス属細菌の増加／優占化による下水処理改善に関する研究」、防菌防黴誌、１９９９年、Ｖｏｌ．１７、４３１〜４４０頁
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、１６ＳｒＲＮＡ　遺伝子に基づいたバチルス属細菌の系統的な位置を知ることができ、今後新しく単離された菌株の迅速な同定が可能となるバチルス属細菌に特異的なオリゴヌクレオチド、バチルス属細菌の菌種・菌群を検出・同定する方法を提供することにある。
【０００９】
また本発明の課題は、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）における最適なプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を提供することにある。
【００１０】
更に本発明の課題は、ＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）における最適なプローブ（ｐｒｏｂｅ）を提供することにある。
【００１１】
更にまた本発明の課題は、バチルス属細菌がどの程度増殖／優占化が進んでいるかを迅速に把握でき、処理施設の運転管理が格段に容易になり、自動化、システム化が可能となるバチルス属細菌の定量化方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の課題は、以下の記載によって明らかとなる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の上記課題は、以下の各発明によって解決される。
【００１４】
（請求項１）検体中に存在するバチルス属細菌の１６ＳｒＲＮＡ　遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、
そのヌクレオチド配列と相補的となるように設計されたオリゴヌクレオチドであって、
該ヌクレオチドが以下の配列群
５’−ＡＴＧＴＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣ−３’・・・（ａ）
５’−ＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣ−３’・・・（ｂ）
５’−ＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡＡＧＡＣＣＣ−３’・・・（ｃ）
の少なくとも１つであることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【００１５】
（請求項２）請求項１に記載された配列群のうち、少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）において用いるプライマー。
【００１６】
（請求項３）請求項１に記載された配列群のうち、少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを、ＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）において用いるプローブ。
【００１７】
（請求項４）請求項１に記載された配列群のうち、少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）におけるプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）として用いることを特徴とするバチルス属細菌の菌種・菌群を検出・同定する方法。
【００１８】
（請求項５）請求項１に記載された配列群のうち、少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを、ＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）におけるプローブ（ｐｒｏｂｅ）として用いることを特徴とするバチルス属細菌の菌種・菌群を検出・同定する方法。
【００１９】
（請求項６）バチルス属細菌より抽出されたＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲ法のスタンダードを作成し、請求項１に記載された配列群のうち、少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法におけるプライマーとして用い、ＰＣＲ産物の増幅を行い、初期鋳型量０．０１〜１０ｎｇと変化させ、ＰＣＲを行い、それぞれ各サイクルにおけるＰＣＲ産物のＵＶ強度から、各鋳型量における濃度マーカーと同量のＵＶ強度（＝１，０００）に達するサイクル数を求め、　算出されたサイクル数に対する初期鋳型量をプロットし、０．０１〜１０ｎｇの範囲で近似された関係式が次式Ｂで表されることを特徴とするバチルス属細菌の定量化方法。
【００２０】
式Ｂ　　（ｉｎｉｔｉａｌ　ＤＮＡ　ａｍｏｕｎｔ［ｎｇ］）＝９．００×１０６×０．５０（ｃｙｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ），ｒ２　＝０．９５８
（但し、ｉｎｉｔｉａｌ　ＤＮＡ　ａｍｏｕｎｔはＤＮＡ初期鋳型量、ｃｙｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ　は増幅回数、ｒ２は相関係数（式の信頼性を示す統計学的な指標）である。）
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００２２】
（バチルス属細菌の系統解析）
本発明では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−７−１−１、Ａ４−７−１−２、Ａ４−２０−１２、ＩＣＳＣ−１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｕｎｉｃｕｌｕｓ株の５種類の検体菌株からＤＮＡを抽出し、１６Ｓ　ｒＤＮＡを増幅した後、系統解析を行い、図１に示す結果を得た。
【００２３】
ｒＲＮＡは、リボソームを構成するＲＮＡであり、細菌では、大きさによって
２３Ｓ、１６Ｓ、５ＳｒＲＮＡに分類され、それらをコードするのがｒＤＮＡである。
【００２４】
ｒＤＮＡはウィルスを除く全生物に存在し、タンパク質合成に関わる重要な分子であるため、進化速度が比較的遅く、種のレベルにおいて高い相同性を示すことが知られている。　また、分子進化中立説に基づいた塩基配列の置換率を用いることで生物の系統をより正確に、かつ、定量的に解析することが可能である。
【００２５】
現在、細菌の系統分類には、約１５００塩基の１６ＳｒＲＮＡ配列が用いられており、１００００以上の１６ＳｒＲＮＡ配列が決定され、日本ＤＮＡデータバンクやＧｅｎＢａｎｋなどの公的な遺伝子バンクに登録され利用されている。
【００２６】
細菌は、基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡの相同性が７０％以上の場合、同種であると定義されるが、ＤＮＡ−ＤＮＡの相同性と１６ＳｒＲＮＡ配列の相同性には、相関が見られない。したがって１６ＳｒＲＮＡ塩基配列を用いた菌種同定は注意が必要であるが、９７％以上の相同性があれば類縁関係があり、９９％以上であれば同種である可能性が高い。
【００２７】
系統解析の結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−７−１−１とＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−７−１−２との相同性が９５％以上のものをＧｒｏｕｐ１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−２０−１２とＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＩＣＳＣ−１との相同性が９５％以上のものをＧｒｏｕｐ２とした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｕｎｉｃｕｌｕｓ株については、２つのグループ及び他のＢａｃｉｌｌｕｓ　種と高い相同性を示さなかった。
【００２８】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−７−１−１とＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−７−１−２はＧｒｏｕｐ１の中でも、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して高い相同性を示した（相同性９９％）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−２０−１２とＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＩＣＳＣ−１はＧｒｏｕｐ２に属する細菌と高い相同性を示した（相同性９９％）。
【００２９】
本発明によると、生理学的、生化学的に不均質な種が多いＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌において、１６Ｓ　ｒＤＮＡに基づいた系統学的な位置を知ることができ、また近縁の細菌について得られている形態学的、生理学的知見から、今後新しく単離された菌株の迅速な同定が可能になる。
【００３０】
（オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブ）
豊富な１６Ｓ　ｒＲＮＡ塩基配列を比較することで、ある特定の菌種・菌群に特異的な配列が得られる。その配列をＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に用いるプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）やＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）のプローブ（ｐｒｏｂｅ）として用いることで、そのターゲットとなる菌種・菌群を迅速で正確に、培養することなく、検出・同定が可能となり、また、それらは培養不可能もしくは培養困難な細菌でさえも検出可能にし、様々な環境の微生物群集構造が調査可能となる。
【００３１】
本発明では、上記検体菌株のみならず、全てのＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌について有効であると思われる遺伝子レベルでの解析を検討した。具体的には数ある分子生物学的手法の内で、定量的ＰＣＲ法及びＦＩＳＨ法を用いた。これらの手法においては、オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブが必要不可欠である。
【００３２】
（定量的ＰＣＲ法におけるプライマーの設計）
はじめに全１６ＳｒＤＮＡについて検討を行い、次いでＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌にのみ特異的である領域を検討した。主に１６Ｓ　ｒＤＮＡ配列における発現領域（Ｖ領域；Ｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎｓ、Ｖ１〜Ｖ１０まで存在）に注目し、中でも細菌属に特異的な配列が多く存在するといわれているＶ２、細菌種に特異的な配列が多く存在するといわれているＶ３という２つの領域（３３９−５３９、Ｅ．ｃｏｌｉｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）をターゲットとして特異的領域を検討した。その結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌に特異的であると推測された幾つかの領域が得られた。得られた領域をもとに、これら領域を増幅可能なプライマーを検討した。その結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌に特異的であるプライマーを３つ設計することができた。
【００３３】
即ち、オリゴヌクレオチドが以下のシークエンス（５′ｔｏ　３′）を有する３つのプライマーである。
【００３４】
５’−ＡＴＧＴＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣ−３’・・・（ａ）
５’−ＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣ−３’・・・（ｂ）
５’−ＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡＡＧＡＣＣＣ−３’・・・（ｃ）
【００３５】
設計されたプライマーの評価として、検体菌株を用いてＰＣＲを行った。その結果、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のプライマーは全ての細菌種ＤＮＡにおいて目的とする遺伝子（約５００ｂｐ）の増幅が確認された。
【００３６】
（ＦＩＳＨ法におけるプローブの設計）
次に、本発明では、ＦＩＳＨ法によるＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の観察を行い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌に特異的なプローブを設計した。
【００３７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌に特異的なプローブとして、
５’−ＡＴＧＴＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣ−３’・・・（ａ）
５’−ＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣ−３’・・・（ｂ）
５’−ＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡＡＧＡＣＣＣ−３’・・・（ｃ）
の配列のオリゴヌクレオチドプローブを設計できた。
【００３８】
上記オリゴヌクレオチドプローブを順に上から、Ｂｔ１６Ｓ１Ｐ、Ｂｔ１６Ｓ２Ｐ、Ｂｔ１６ＳＲＰと表す。前記のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌に特異的な３つのプローブの内で、最も感度が良いと思われたのはＢｔ１６Ｓ２Ｐであった。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌に特異的なプローブＢｔ１６Ｓ２Ｐは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−７−１−１株のみにハイブリダイズし、他の菌株についてはほとんどハイブリダイズしないことが確認された。
【００３９】
（定量的ＰＣＲ法によるＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌量の解析・バチルス属細菌の定量化方法）ＰＣＲとは、ｄｅｎａｔｕｒｅ−ａｎｎｅａｌｉｎｇ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎこの反応を繰り返すことにより、目的領域を含むＤＮＡ断片を指数関数的に増幅可能な手法である。しかしながら、ＰＣＲは無制限にＤＮＡの増幅を行うのではなく、ある程度増幅した段階で反応が停止する。１サイクルの反応で目的とするＤＮＡ断片を、理論的には２倍に増加可能であり、初期鋳型量をＩとすると、ｎサイクル後の反応生成物量ｙは式１となる。
【００４０】
（式１）　　　ｙ＝Ｉ×２ｎ
【００４１】
しかしながら、各サイクル毎の増幅は、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング効率やＤＮＡ鎖の伸長反応の効率が１００％ではなく、したがって式（２）
のようになる。
【００４２】
（式２）　　　ｙ＝Ｉ×Ｅｎ（１≦Ｅ≦２）
【００４３】
定量的ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ）法とは、指数関数的増加期に反応生成物量を解析し、初期鋳型量を算出する方法である。
【００４４】
しかしながら、実際の解析場面では、初期鋳型量が未知であることがほとんどであるため、適切なＰＣＲサイクル数をあらかじめ設定することは原理的に不可能であり、また任意の一点のみの解析では初期鋳型量を算出することは困難である。したがって、既知のＤＮＡ濃度を変化させてＰＣＲを行い、各サイクル数における反応生成物量を解析し、そのカイネテイクスから定量性のあるＰＣＲサイクル数範囲を決定した上で、未知のサンプル中における目的遭伝子の存在量を概算することができる。
【００４５】
本発明では、汚泥サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の存在量を、定量性のある他の分子生物学的手法による検討を試み、具体的には定量的ＰＣＲ法によるＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌量の解析を行った。即ち、１６ＳｒＤＮＡ解析、クローニング解析により、汚泥サンプル中に存在するＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の種類は特定できた。そしてこれら細菌種がどの程度存在するかを調査するために、分子生物学的手法の１つ、定量的ＰＣＲ法によるＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の定量化を試みた。
【００４６】
はじめに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−７−１−１株より抽出されたＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲ法のスタンダードを作成した。ＰＣＲに使用したプライマーセットは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌に特異的なＢｔ１６Ｓ１、Ｂｔ１６Ｓ２、Ｂｔ１６ＳＲを使用した。
【００４７】
ＮＩＨ　Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いた解析により、各サイクル数におけるＰＣＲ産物の増幅が示された。図２には、解析例として初期鋳型量１ｎｇにおける各サイクル数のＰＣＲ産物の増幅が示されている。
【００４８】
初期鋳型量１ｎｇにおいて、ＰＣＲ産物のＵＶ強度約１００〜１５００の範囲で近似することができ、得られた近似式は次式Ａである。
【００４９】
式Ａ　　（ＵＶ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）＝０．０１３２×１．６４（ｃｙｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ），ｒ２　＝０．９６７
（但し、ｉｎｉｔｉａｌ　ＤＮＡ　ａｍｏｕｎｔはＤＮＡ初期鋳型量、ｃｙｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ　は増幅回数、ｒ２は相関係数（式の信頼性を示す統計学的な指標）である。）
【００５０】
同様に、初期鋳型量０．０１〜１０ｎｇと変化させ、ＰＣＲを行い、それぞれ各サイクルにおけるＰＣＲ産物のＵＶ強度から、各初期鋳型量における近似範囲及び近似式を得た。それぞれの結果を用いて、各鋳型量における濃度マーカーと同量のＵＶ強度（＝１，０００）に達するサイクル数を近似式より算出した。その結果は表１に示してある。
【００５１】
【表１】
2004097133.tif 000002
【００５２】
算出されたサイクル数に対する初期鋳型量をプロットし、０．０１〜１０ｎｇの範囲で近似された関係式として次式Ｂを得た。その結果を図３に示した。
【００５３】
式Ｂ　　（ｉｎｉｔｉａｌ　ＤＮＡ　ａｍｏｕｎｔ［ｎｇ］）＝９．００×１０６×０．５０（ｃｙｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ），ｒ２　＝０．９５８
【００５４】
（但し、ｉｎｉｔｉａｌ　ＤＮＡ　ａｍｏｕｎｔはＤＮＡ初期鋳型量、ｃｙｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ　は増幅回数、ｒ２は相関係数（式の信頼性を示す統計学的な指標）である。）
【００５５】
以上のことから、式ＢはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌を定量化するスタンダードとして用いられ、各活性汚泥中のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の存在量を算出した。
【００５６】
スタンダードを作成した後、実際に２０００年に採取された活性汚泥由来のＤＮＡ
１０　ｎｇを初期鋳型量としてＰＣＲを行った。
【００５７】
この活性汚泥由来のＤＮＡは、いわゆる混合系で、細菌、古細菌といった原核生物は勿論のこと、真核生物由来の遺伝子も含まれたものである。
【００５８】
ＰＣＲに使用したプライマーは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌に特異的であるため、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＤＮＡのみ増幅される。その際、増幅されたＤＮＡ量と初期鋳型量の関係から、活性汚泥中のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の存在量を定量化することができる。
【００５９】
スタンダード作成と同様に、濃度マーカーと同量のＵＶ強度（＝１，０００）に達するサイクル数を近似式より算出した。この結果を表２に示した。
【００６０】
【表２】
2004097133.tif 000003
【００６１】
従って、本発明によると、得られたサイクル数と式Ｂから、各活性汚泥１０ｎｇ中のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のＤＮＡ量を概算でき（表３）、また概算したＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＤＮＡ量と抽出された全ＤＮＡ量から、最終的に各活性汚泥１ｇ中におけるＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来ＤＮＡ量を算出できる（表３）。
【００６２】
【表３】
2004097133.tif 000004
【００６３】
さらに濃縮槽→曝気槽（１〜４槽）→沈殿槽→再び濃縮槽といった小規模な下水処理〔連続操作〕が行われている場合にも、各槽ごとのＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の量を遺伝子レベルで定量化できれば、処理管理を誤ることがなく、またＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の優占化の進行の度合いもわかるので、処理の安定性にも貢献できる。
【００６４】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例によって限定されるものではない。
【００６５】
参考例（系統解析）
（１）使用した菌株
検体として本実験で使用した菌株は、シリカを主成分としてマグネシウムなどのミネラル溶液を添加した活性汚泥により処理する処理実験プラント（培養系）より単離した。この単離した菌株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ．（バチルス・サブチリス）Ａ４−７−１−１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ．Ａ４−７−１−２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ．Ａ４−２０−１２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ．ＩＣＳＣ−１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｆｕｎｉｃｕｌｕｓ株の５種である。
【００６６】
（２）培養
下記液体培地を三角フラスコに各１００ｍｌずつ分注後、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５ｍｉｎ）を行った。ここに各菌株を植菌し、３７℃で３―４日間培養した。培養の結果、各菌株は、弱いクックドミート分解性を示し、嫌気的成育性を示した。
【００６７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ培地組成：培地としてニュートリエントブロス（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ）８ｇ／ｌ、グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）８ｇ／ｌ、乾燥酵母エキス（Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）０．５ｇ／ｌおよび食塩５ｇ／ｌに寒天（Ａｇａｒ）１５ｇ／ｌを加えたものからなる寒天培地。
【００６８】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｆｕｎｉｃｕｌｕｓ　培地組成：培地として、ソルブルスターチ（Ｓｏｌｕｂｌｅ　ｓｔａｒｃｈ）５ｇ／ｌ、ニュートリエントブロス（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ）４ｇ／ｌ、グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）８ｇ／ｌ、乾燥酵母エキス（Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）１ｇ／ｌに寒天（Ａｇａｒ）１３ｇ／ｌを加えたものからなる寒天培地。
【００６９】
（３）ＤＮＡサンプルの抽出
上記の培養液から以下の方法で、ＤＮＡサンプルを抽出した。
【００７０】
〔試薬〕
Ａ：ＴＥ　　ｂｕｆｆｅｒ
１０ｍＭ　　Ｔｔｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
Ｂ：１０％ＳＤＳ（当日調製）
Ｃ：２０ｍｇ／ｍｌ　　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ
ｄｄＨ２Ｏで調製した後、−２０℃で保存
Ｄ：Ｌｙｓｏｚｙｍｅ
Ｅ：５Ｍ　　ＮａＣｌ
Ｆ：ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ
２７０ｍＭ　　ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　　ｂｒｏｍｉｄｅ）
７０　ｍＭ　　ＮａＣｌ
Ｇ：ＣＩＡ（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）
Ｈ：ＰＣＩ
（中性フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）
Ｉ：３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ　５．２）
Ｊ：７０％　エタノール
【００７１】
〔操作〕
各菌株について、集菌（８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、その中から１．０ｇをそれぞれ分取した。遠心操作（８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）により試薬Ａで３回洗浄した。試薬Ａ６ｍｌに懸濁させ、ｆｒｅｅｓｅ−ａｎｄ−ｔｈａｗを５回繰り返した。試薬Ｄ　１０ｍｇを添加し、ボルテックスを使用せずに攪拌した。試薬Ｂ　７５０μｌ、試薬Ｃ　７５μｌを添加し攪拌した。３７℃で２時間インキュベートし、試薬Ｅ　２．７ｍｌ、試薬Ｆ　２．２ｍｌを添加、攪拌した後、６５℃で２０分間インキュベートした。常温で等量の試薬Ｇを添加し、穏やかに１時間攪拌した。８，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄を新しい遠心管に移した。等量の試薬Ｈを添加、攪拌後、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄を新しい遠心管に移した。等量のイソプロピルアルコール、１／１０量の試薬Ｉを添加しよく攪拌し、室温で１０分間放置した。１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、上澄を除いた。試薬Ｊ３ｍｌで洗浄し、１２，０００ｒｐｍで２分間遠心し上澄を捨てた。デシケーターにてペレットを乾燥させた後、試薬Ａ　１．５ｍｌに溶解した。
【００７２】
（４）アガロースゲル電気泳動による抽出ＤＮＡの確認
〔試薬〕
Ａ：０．７％　　ａｇａｒｏｓｅ
Ｂ：５０×ＴＡＥ　ｂｕｆｆｅｒ
Ｃ：ＥｔＢｒ溶液（０．５μｇ／ｍｌ）
Ｄ：ＤＮＡローディングバッファー（ＸＣ：キシレンシアノール）
Ｅ：λＥｃｏＴ１４Ｉマーカー（０．１μｇ／１００μｌ）
【００７３】
〔操作〕
試薬Ａ　０．３５ｇ、試薬Ｂ　ｌｍｌを加えＭｉ１１ｉＱで５０ｍｌにメスアップした。ゲルを十分に溶かした後、試薬Ｃ２．５μｌを加えよく混ぜた。水平ゲルトレイにコームをセットし、溶解したアガロースゲルを流し込み、室温で固化させた。上記で抽出したＤＮＡサンプル１μｌ、試薬Ｄ　２μｌ、ｄｄＨ２０　９μｌ加え、電気泳動用サンプルを調製した。アガロースゲルのウェルに試薬Ｅ　１０μｌ、電気泳動用サンプル１２μｌをアプライし、１００Ｖで３０分間泳動した。泳動後、ゲルをＵＶトランスイルミネーターの上にのせ、ＦＡＳ−ＩＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ）で画像解析を行った。
【００７４】
（５）ＲＮＡの処理
〔試薬〕
Ａ：１０ｍｇ／ｍｌ　　Ｒｎａｓｅ　Ａ溶液
【００７５】
〔操作〕
１．上記（４）の操作で得られたＤＮＡ溶液に１／１００量の試薬Ａを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。
２．等量のＰＣＩを加えて、５〜１０分間穏やかに攪拌した。
３．１３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、水層を新しいエッペンドルフチューブに分取した。液−液中間層に変性タンパクの層が確認されなくなるまで上記２．３．の操作を繰り返した。
４．１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と等量のイソプロピルアルコールを添加し、よく攪拌した後、室温で２分間放置した。
５．１３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みをマイクロピペッターで取り除いた。
６．７０％エタノール（４℃で保存）を１ｍｌ加え、エッペンドルフチューブ内を洗浄するようによく攪拌した。
７．１３，０００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みをマイクロピペッターで取り除いた。
８．得られたペレットを凍結遠心乾燥機で乾燥させた。
９．上記３．で回収された溶液と等量のＴＥ　ｂｕｆｆｅｒを加えて一晩放置し、溶解させた。
【００７６】
（６）ＰＥＧ沈殿
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、Ｈ−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＨの構造をもつ高分子エーテルアルコールで、重合度ｎによって様々な分子量のものが存在する。ＰＥＧはＤＮＡの水和水を奪うことで、ＤＮＡ分子の凝集を促進して沈殿させる（コロイド粒子の塩析）ものと考えられる。このとき、ＲＮＡはＤＮＡに比べ、リボースの２位の水酸基の分だけ親水性が高い。そのため、凝集が起こりにくく沈殿しないのでＲＮＡの除去が可能となる。
【００７７】
〔試薬〕
Ａ：ＰＥＧ溶液
１．６Ｍ　ＮａＣｌ
１３％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００；平均分子量７，０００〜９，０００）
【００７８】
〔操作〕
１．上記（５）でＲＮａｓｅ処理を行ったＤＮＡサンプルに等量の試薬Ａを添加し、よく攪拌した。
２．氷中にいれ、４℃で一晩放置した。
３．１３，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心し、ペレットにした。
４．上澄みをマイクロピペッターで取り除いた。
５．７０％エタノール１ｍｌを加え、エッペンドルフチューブ内を洗浄するように穏やかに攪拌した。
６．１３，０００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みをマイクロピペッターで取り除いた。
７．得られたペレットを凍結遠心乾燥機で乾燥させた。
８．１．で使用した溶液と等量のＴＥ　ｂｕｆｆｅｒを加え、一晩放置し、溶解させた。
【００７９】
（７）ＤＮＡ濃度の測定
核酸溶液（ここではＤＮＡ）の濃度測定を行う場合、測定すべきサンプル量が極少量であることから、サンプルを適当な濃度になるよう希釈したものを試料溶液として測定する。通常核酸溶液は、分光光度計により２６０ｎｍという短波長で測定されるが、その際、溶液中のタンパク質の混入も無視できないため、同時に２８０ｎｍでの吸光度も測定する必要がある。
【００８０】
測定されたＯ．Ｄ．２６０（ｑとする）、Ｏ．Ｄ．２８０（ｐとする）を用いて、［１］式により溶液中のタンパク質、フェノールの混入を確認できる。
【００８１】
ｑ／（ｒ−ｑ）＝１．８〜２．０　　　　　　　　　　　……［１］
（１．８≧の場合、タンパク、フェノールの混入）
【００８２】
また、試料とした核酸の性状により吸光係数が異なるため、試料中の核酸性状に適した吸光係数を考慮する必要がある。２本鎖ＤＮＡの場合、その吸光係数は０．０５であり、その際の核酸濃度単位は、μｇ／μｌである。
【００８３】
以上のことから、核酸濃度は、［２］式によって得られる。
【００８４】
核酸濃度［μｇ／μｌ］＝得られたＯ．Ｄ．２６０×希釈倍率×０．０５　‥…［２］
【００８５】
〔操作〕
１．核酸測定用石英セル（容量：４００μｌ）及びＴＥ　ｂｕｆｆｅｒを用いて、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ　２０００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）により、波長２６０ｎｍの校正を行った。２．直ちに波長２８０ｎｍに変え、その際の吸光度を確認した。
３．　ＲＮａｓｅ処理、ＰＥＧ沈殿によりＲＮＡを除去したＤＮＡ溶液を、ＴＥｂｕｆｆｅｒを用いて１０、５０、１００、２００倍希釈したものを試料溶液とした。
４．各希釈試料溶液についてのＯ．Ｄ．２６０を測定した。
５．直ちに波長２８０ｎｍに変え、Ｏ．Ｄ．２８０を測定した。
６．測定されたＯ．Ｄ．２６０（ｑとする）、Ｏ．Ｄ．２８０（ｐとする）比から、溶液中のタンパク質、フェノールの混入を確認した。
７．上記の式を用いて、各試料溶液中の核酸濃度を算出した。
【００８６】
（８）　１６ＳｒＤＮＡの増幅
２本鎖のゲノムＤＮＡを鋳型とし、１６ＳｒＤＮＡ領域をオリゴヌクレオチドプラ
イマーとよばれる短いＤＮＡ断片で挟むように各相補鎖にハイブリッド結合さ
せる。そして、基質である４種類のデオキシリボヌクレオチド３リン酸存在下、ＤＮＡポリメラーゼを作用させると、プライマーの３′末端に鋳型塩基配列にしたがってヌクレオチドが付加され、ＤＮＡ鎖が伸長する。
【００８７】
ＰＣＲ（ｐｏｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）の原理は、この反応により生じた新たな２本鎖ＤＮＡを加熱して相補鎖に分離し（ｄｅｎａｔｕｒｅ）、過剰に存在するプライマーを急激な温度低下により、再び該当位置にハイブリッド結合させ（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、ＤＮＡポリメラーゼ反応で新たなＤＮＡ鎖を合成する（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ことにある。
【００８８】
つまり、ＰＣＲにより、ｄｅｎａｔｕｒｅ→ａｎｎｅａｌｉｎｇ→ｅｘｔｅｎｓｉｏｎという３つのの反応を繰り返すことにより、目的とする１６ＳｒＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片を指数関数的に増幅することが可能となる。
【００８９】
〔試薬〕
Ａ：バクテリアｆｏｒｗａｒｄプライマー２７Ｆ（表４参照）
Ｂ：ユニバーサルｒｅｖｅｒｓｅプライマー１５２５Ｒ（表４参照）
試薬Ａ、Ｂは、４μＭとなるように希釈し（−２０℃で保存）、使用。
Ｃ：ＰＣＲ　Ｂｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ　ＰＣＲ　Ｂｅａｄｓ）
【００９０】
【表４】
2004097133.tif 000005
【００９１】
〔操作〕
試薬Ａ、Ｂ、Ｃ及びｄｄＨ２Ｏを用いて、全容２５μｌの反応系を調製し、ＰＣＲを行った。反応条件は、図４に示した。反応終了後、核酸精製用スピンカラムを用いて、反応生成物の精製を行った。精製されたＤＮＡを用いて先ほどと同様に電気泳動を行い、目的とする遺伝子の増幅を確認した。
【００９２】
（９）シークエンシング
オートシークエンサーＡＢＩ　３１０（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びオートシークエンサーＡＢＩ　３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、塩基配列を決定した。
【００９３】
〔試薬〕
Ａ：Ｂｉｇ　Ｄｙｅ
Ｂ：シークエンシングプライマー（前記表４）
Ｃ：７０％エタノール
Ｄ：ＴＳＲ（Ｔｅｒｍｏｎａｔｅ）
Ｅ：ブルーデキストラン
Ｆ：脱イオンホルムアミド
試薬Ｄは、ＡＢＩ　３１０で、試薬Ｅ、ＦはＡＢＩ　３７７でそれぞれ使用
【００９４】
〔操作〕
試薬Ａ４μｌ、試薬Ｂ０．４μｌ、ＰＣＲ産物４μｌ及びｄｄＨ２Ｏ　１．６μｌを用いて全容１０μｌの反応系を調製し、シークエンシング反応を行った。余分な塩、色素などを除去するために、シークエンシング反応産物をスピンカラムにより、精製した。凍結遠心乾燥機を用いて、シークエンシング反応産物を乾燥させた。
【００９５】
以下の操作は、使用したシークエンサーにより異なるため、それぞれ記述した。
【００９６】
（オートシークエンサーＡＢＩ　３１０の場合）
試薬Ｄ　１２μｌを添加し、Ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒで１時間振とうした。９５℃で２分間熱変性した。オートシークエンサーＡＢＩ　３１０で塩基配列を決定した。
【００９７】
（オートシークエンサーＡＢＩ　３７７の場合）
シークエンシング用ゲル板を作製した。試薬Ｅと試薬Ｆを１：５の割合で混合し、そこから４μｌ分取し、添加した。Ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒで１時間振とうした。９０℃で２分間熱変性した。オートシークエンサーＡＢＩ　３７７で塩基配列を決定した。
【００９８】
（１０）ホモロジー解析
各配列は、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　Ｄａｔａｂａｓｅ　ＰｒｏｊｅｃｔのＣＨＩＭＥＲＡ　ＣＨＥＣＫを行った後、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴにより多重アライメントを行い、その結果から類縁種の１６ＳｒＤＮＡ配列を選択した。
【００９９】
そして、進化的系統樹及び各配列のホモロジーをＣｌａｓｔａｌ　Ｗ１．６．１、Ｔｒｅｅ　Ｖｉｅｗを用いて算出し、供試菌株の系統解析を行った。
【０１００】
供試菌株の系統解析の結果から、本実験の試料である新規の活性汚泥中に存在するＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌は、２つのグループに属する細菌種であることが確認され
た。
【０１０１】
系統解析の結果は、図１に示されており、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−７−１−１とＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−７−１−２との相同性が９５％以上のものをＧｒｏｕｐ１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−２０−１２とＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＩＣＳＣ−１との相同性が９５％以上のものをＧｒｏｕｐ２とした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｕｎｉｃｕｌｕｓ株については、２つのグループ及び他のＢａｃｉｌｌｕｓ　種と高い相同性を示さなかった。
【０１０２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−７−１−１とＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−７−１−２はＧｒｏｕｐ１の中でも、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して高い相同性を示した（相同性９９％）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−２０−１２とＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＩＣＳＣ−１はＧｒｏｕｐ２に属する細菌と高い相同性を示した（相同性９９％）。
【０１０３】
実施例１（プライマーの設計及び評価）
参考例で解析された２つのグループを中心にＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌を検出する幾つかの特異的プライマーを設計する。
【０１０４】
ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）より、類縁種及びアウトグループの１６ＳｒＤＮＡ配列を選択した。得られた配列をＤＮＡＳＩＳ、Ｓｅｑ　ｐｕｐ及びＣｌｕｓｔａｌ　Ｗ１．６．１により、多重アライメントを行った。アライメントを行った配列を目視し、目的菌株において異なる塩基配列を示す領域を幾つか選択した。選択する際、プライマーの長さ及びＴｍ値に注意し、２０ｍｅｒ程度の領域を選択した。また、ＯＬＩＧＯ　４．０−Ｓを用いて、１６ＳｒＤＮＡ配列から最適プライマー領域を検索した。
【０１０５】
その際、Ｔｍ値、ヘアピン構造の有無に注意し、選択した。選択した領域を用いて、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴにより多重アライメントを行い、目的とするＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌のみが得られることを確認した。
【０１０６】
最終的に、ＤＮＡＳＩＳ、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴによる多重アライメント結果、アライメント配列の目視及びＯＬＩＧＯ４．０−Ｓによる最適プライマー領域の検索結果の総合的な評価により、本発明で使用するプライマーを設計した。
【０１０７】
プライマーの評価
〔試薬〕
Ａ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌ｆｏｒｗａｒｄプライマーＢｔ１６Ｓ１
Ｂ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌ｆｏｒｗａｒｄプライマーＢｔ１６Ｓ２
Ｃ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌ｒｅｖｅｒｓｅプライマーＢｔ１６ＳＲ
Ｄ：バクテリアｆｏｒｗａｒｄプライマー２７Ｆ
Ｅ：バクテリアｒｅｖｅｒｓｅプライマーＥｕ１１００Ｒ
Ａ〜Ｅについては、表４に示した。
【０１０８】
〔操作〕
前で抽出、精製したＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＤＮＡ及び試薬Ａ〜Ｅを用いて、以下の組合わせでＰＣＲを行った。
Ｓｅｔ　ｌ：試薬Ｂ―試薬Ｅ
Ｓｅｔ　２：試薬Ａ―試薬Ｃ
Ｓｅｔ　３：試薬Ｃ―試薬Ｄ
【０１０９】
反応条件については、図４に示した。反応終了後、電気泳動を行った。次いでＵＶトランスイルミネーターＦＡＳＩＩＩにより、画像解析を行った。
【０１１０】
各プライマーセットにおける増幅産物を比較し、各プライマーセットの評価を行った。上記プライマーセットの評価を行った後、上記と同様にＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．ＫＨＴ−２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＲＨＴ−４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株よりＤＮＡを抽出、精製し、各プライマーセットによりＰＣＲを行った。反応終了後、電気泳動を行った。ＵＶトランスイルミネーターＦＡＳＩＩＩにより、画像解析を行った。
【０１１１】
その結果、上記上記プライマーセットＳｅｔ　ｌ、２、３のプライマーは全ての細菌種ＤＮＡにおいて目的とする遺伝子（約５００ｂｐ）の増幅が確認された（図５参照）。
【０１１２】
実施例２（ＦＩＳＨ法による微生物相の解析）
蛍光　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリッド形成法〔ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＦＩＳＨ〕は、本来染色体の遺伝子座位を決定するために開発された手法で、蛍光色素などで標識した一本鎖プローブＤＮＡを特定遺伝子の相補性部位でハイブリダイズさせ、その部位を顕微鏡下で検出するものである。
【０１１３】
近年では、染色体遺伝子マッピングのみならず、細菌などの組織中のＤＮＡやＲＮＡの局在性の分析にも広く用いられている。（図６参照）
【０１１４】
（１）供試菌株のＷｈｏｌｅ　ｃｅｌｌ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
標準株として、前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−７−１−１を使用した。比較菌株として、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ　ＤＰＨ−１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９を使用した。
【０１１５】
（２）　供試菌株の固定
〔試薬〕
Ａ：１×ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）
３×ＰＢＳを１×ＰＢＳとなるようにｄｄＨ２Ｏ（滅菌済み）で調製
３×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）
３９０ｍＭ　ＮａＣｌ
３０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４
Ｂ：４％パラホルムアルデヒド固定液
【０１１６】
あらかじめ調製しておいた２０％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（１ケ月保存可、４℃）を、試薬Ａを用いて調製した。２０％ホルムアルデヒドは、ドラフト内で粉末であるパラホルムアルデヒドにｄｄＨ２０を加え、１０ＭＮａＣｌを数滴加えながら５０〜６０℃で溶解した。
Ｃ：エタノール（氷冷したもの）
【０１１７】
〔操作〕
１．１．５−ｍｌ容のエッペンドルフチューブに各供試菌株の新鮮な培養液３００μｌを分取した。
２．各エッペンドルフチューブに対して、３倍量の試薬Ｂを添加し、４℃で一晩放置し、固定化した。
３．放置後、卓上遠心機を用いて、８，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上澄をマイクロピペットで取り除いた。
４．固定した細胞に試薬Ａ５００μｌを加えて再懸濁し、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、マイクロピペットで上澄を取り除いた。
５．試薬Ａ１０μｌ添加し、細胞壁浸透性の改善のため、ｆｒｅｅｚｅ−ａｎｄ−ｔｈａｗサイクルを５回繰り返した。
６．等量のエタノール（氷冷済み）を添加し、ボルテックスミキサーを用いてよく攪拌した。
７．これを細胞固定化溶液とし、使用するまで−２０℃で保存した。
【０１１８】
（３）ハイブリダイゼーション用スライドグラスの調製
〔試薬〕
Ａ：スライドコーティング水溶液
０．１％ゼラチン
０．０１％硫酸カリウムクロム（ＩＩＩ）
１０％硫酸カリウムクロム水溶液（要冷蔵）を作製し、使用時に試薬Ａ調製
【０１１９】
〔操作〕
１．８穴（¢８ｍｍ）のハイブリダイゼーション用スライドグラスを洗浄液に１時間浸し（アルカリ処理）、スライドグラス表面の洗浄を行った後、ｄｄＨ２Ｏですすぎ、風乾した。
２．恒温槽により、あらかじめ７０℃にしておいたスライドグラスコーティング水溶液に１のスライドグラスを浸し、ゼラチンコーティングを行った。
３．垂直に立てかけ、風乾した。
【０１２０】
（４）ゼラチンコーティングスライドグラスへの細胞固定
〔試薬〕
Ａ：５０％エタノール
Ｂ：８０％エタノール
Ｃ：９８％エタノール
試薬Ａ〜Ｃは、５０−ｍｌ容の遠心管に作製し、使用時まで４℃で保存
【０１２１】
〔操作〕
１．Ｉで調製した細胞固定化溶液３μｌをゼラチンコーティング・スライドグラスのウェルに添加し、風乾した。
２．風乾した後、試薬Ａ→試薬Ｂ→試薬Ｃの順に各々３分間浸し、固定化細胞を脱水固定した。
３．再び風乾した。
【０１２２】
（５）Ｗｈｏｌｅ　ｃｅｌｌ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
〔試薬〕
Ａ：ハイブリダイゼーション緩衝液
２×ハイブリダイゼーション緩衝液（ｐＨ７．２）
１．８ＮａＣｌ
４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
１％ＳＤＳ
Ｘ％ホルムアルデヒド
試薬Ａについては、上記の組成であらかじめ調製しておいたものを用いて、各最終濃度が１×ハイブリダイゼーション緩衝液、０．１％ＳＤＳ％ホルムアルデヒド（Ｘ：例．バクテリアプローブＥＵＢ３３８の場合５％、アーキアプローブＡＲＣ９１５の場合３５％）となるように調製し、ハイブリダイゼーション緩衝液とした。
Ｂ：ハイブリダイゼーションプローブ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌に特異的なプローブＢｔ１６Ｓ１Ｐ、Ｂｔ１６Ｓ２Ｐ、Ｂｔ１６ＳＲＰ（表５参照）
ユニバーサルプローブＵＮＩ−１３９２（表５参照）
それぞれ５０ｎｇ／μｌに調製したものを使用
Ｃ：（グリセロール／ＰＢＳ＝１／１）＋０．１％バラフェニレンジアミン
【０１２３】
【表５】
2004097133.tif 000006
【０１２４】
〔操作〕
１．試薬Ａを浸した密閉容器を、恒温槽を用いてあらかじめ４５℃に設定し、これを恒温チャンバーとした。
２．細胞を固定したスライドグラスのウェルに、試薬Ｂ　ｌ．０μｌを含む９．０μｌの試薬Ａを滴下し、１の恒温チャンバーにすばやく挿入し、４５℃で２時間ハイブリダイズを行った。なお、操作２以降はすべて遮光して行った。
３．ハイブリダイズが終了した後、恒温チャンバーからスライドグラスを取りだし、あらかじめ４８℃で温めておいた試薬Ａを用いて、直ちにスライドからプローブを洗い流し、ハイブリダイゼーションを停止させた。
４．試薬Ａ　５０ｍｌｇａ入った遠心管にスライドグラスを浸し、４８℃で２０分間インキュべートした。
５．その後、ｄｄＨ２０でスライドグラスを洗浄し、余分な塩を取り除いた。
６．スライドグラスを風乾した。
７．試薬Ｃをスライドグラスのウェルに滴下し、カバーグラスをかぶせた後、共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＣＬＳＭ：ｃｏｎｆｏｃａｌ　　ｌａｓｅｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）により、各細胞を観察した。
【０１２５】
（６）検体を用いたハイブリダイゼーションの検討
〔試薬〕前記（５）と同様
【０１２６】
〔操作〕
１．ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアルデヒド濃度を変化させ、ハイブリダイゼーションを行った。
２．試薬Ｃをスライドグラスのウェルに滴下し、カバーグラスをかぶせた後、共焦点レーザースキャン顕微鏡）により、各細胞を観察した。
３．得られた画像を用いて、各ホルムアルデヒド濃度におけるハイブリダイゼーションを評価した。
【０１２７】
（７）ハイブリダイゼーションプローブの検討
前記（６）と並行して、グラム陰性細菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０９株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌と同様Ｌｏｗ　Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｕ　ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓＤＰＨ−１株及びＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行い、プローブの検討を行った。
【０１２８】
〔試薬〕前記（５）、（６）と同様
【０１２９】
〔操作〕
１．上記菌株を用いて細胞固定化溶液を調製し、ゼラチンコーティングースライドグラスのウェルに細胞を脱水固定した。固定化溶液の調製、細胞の固定方法については、ＩＶと同様である。
２．ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアルデヒド濃度を変化させ、ハイブリダイゼーションを行った。
３．試薬Ｃをスライドグラスのウェルに滴下し、カバーグラスをかぶせた後、共焦点レーザースキャン顕微鏡により、各細胞を観察した。
４．得られた画像を用いて、各ホルムアルデヒド濃度におけるハイブリダイゼーションを評価した。
【図面の簡単な説明】
【図１】検体菌株の系統解析図（バチルス属の１６ＳｒＤＮＡ系統解析結果。各枝につけられた番号は、ｂｏｏｔｓｔｒａｐ法による値を示している。）
【図２】初期鋳型量１ｎｇにおいて、ＰＣＲ産物のＵＶ強度約１００〜１５００の範囲で近似式が得られる過程を示す図（Ａは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．から得られた１ｎｇのＤＮＡサンプルをＢｔ１６Ｓ１とＢｔ１６ＳＲにより増幅した際の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部のＰＣＲ増幅を示す５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドのアガロースゲルである。ＢとＣは、ＮＩＨｉｍａｇｅソフトウエアのプログラムにより測定し説明されたＵＶ強度の各プロットを示す。Ｄにおいて、ＵＶ強度（◆）のプロットに基づいて決定される回帰直線が（ＵＶ強度）＝０．０１３２×１．６４（サイクル数），ｒ２＝０．９６７を満たすものであると計算できる。尚、ＭはＵＶ強度１０００の時の濃度マーカーを示している。）
【図３】増幅回数と初期鋳型量の関係を示す図（表１に基づいてＵＶ強度が１０００となるサイクル数をＤＮＡ初期鋳型量のｌｏｇ値に対してプロットしたものである。サイクルの回数は表１の回帰直線に基づいて計算されたものである。この図の直線は線形回帰である次式を満たす：（ＤＮＡ初期鋳型量）＝９．００×１０６×０．５０（サイクル数）、ｒ２＝０．９５８。）
【図４】反応条件を示す図（ＰＣＲの▲１▼ｄｅｎａｔｕｒｅ▲２▼ａｎｎｅａｌｉｎｇ▲３▼ｅｘｔｅｎｓｉｏｎである。Ｘ：５５℃（１６ＳｒＤＮＡ）、６９．５℃（Ｂｔ１６Ｓ１、Ｂｔ１６Ｓ２とＢｔ１６ＳＲ）、Ｙ：１分間（ＰＣＲ定量分析）、２分間（１６ＳｒＤＮＡ）、Ｚ：２９サイクル（ＰＣＲ定量分析）、３５サイクル（１６ＳｒＤＮＡ））
【図５】プライマーセットＳｅｔ　ｌ、２、３のプライマーが目的とする遺伝子（約５００ｂｐ）の増幅の確認している図（バチルス属の特定プライマー（ａ：ｓｅｔ１，Ｂｓ１６Ｓ２−Ｅｕ１１００Ｒ、ｂ：ｓｅｔ２，Ｂｓ１６Ｓ１−Ｂｓ１６ＳＲ、ｃ：ｓｅｔ３，２７Ｆ−Ｂｓ１６ＳＲ）で増幅された１６ＳｒＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動。▲１▼▲７▼；サイズマーカー、▲２▼▲３▼▲４▼▲５▼▲６▼；ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ４−７−１−１、Ａ４−７−１−２、Ａ４−２０−１２，ＩＣＳＣ−１とｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｕｎｉｃｕｌｕｓ）
【図６】ハイブリダイゼーション反応を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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