(57)【要約】【課題】癌の浸潤の程度を測定する診断薬、癌の浸潤を防止する治療薬をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】Ａｒｆ６またはＰＡＧ２の抗体を用いて癌の浸潤の程度を診断することができる。Ａｒｆ６の活性阻害剤またはＰＡＧ２の活性化剤は癌の治療薬となりうる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｒｆ６の抗体を含む、癌の浸潤の程度を測定する診断薬。
【請求項２】
ＰＡＧ２の抗体を含む、癌の浸潤の程度を測定する診断薬。
【請求項３】
癌の浸潤を防止する治療薬のスクリーニング方法であって、候補化合物の存在下および不存在下にＡｒｆ６の活性を測定し、Ａｒｆ６の活性を阻害する化合物を癌の浸潤を防止する治療薬として選択する方法。
【請求項４】
Ａｒｆ６の抗体を有効成分として含む、癌の浸潤を防止する治療薬。
【請求項５】
癌の浸潤を防止する治療薬のスクリーニング方法であって、候補化合物の存在下および不存在下にＰＡＧ２の活性を測定し、ＰＡＧ２活性を高める化合物を癌の浸潤を防止する治療薬として選択する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌を診断、治療する為の癌細胞の運動や浸潤能を制御し抑制できることを示す分子機序に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
がんをより効率的に診断し、治療する為には、その発症の分子的機構の解明が欠かせない。近年のがんに関連する様々な基礎的研究の成果として、発がんの初期過程や正常を逸脱した増殖能や生存性の獲得機序に関して多くの知識が得られて来た。さらには、それらの知見に基づいた治療法も、例えば遺伝子治療等のように臨床的試験段階に達しているものや、実際に臨床治療薬として市販されるに到ったものもある。しかしながら、人類のがんに対する知識や、さらには、癌化する前の正常細胞の増殖制御の基本的仕組みそのものの理解がまだまだ不十分である。このことは、一例として、がんに対する初めての分子標的拮抗薬として開発され市販されたイレッサ（ゲフィチニブ）の臨床投与事例に端的に窺うことができる。イレッサは非小細胞肺癌に発現する増殖因子受容体であるＥＧＦ  受容体に対する拮抗剤であるが、開発段階でのデータに基づく安全性予測に反し、予期せぬ重篤な副作用を肺の正常上皮細胞に生じさせ、薬剤投与を受けた多くの患者が間質性肺炎・急性肺障害による死亡する事態となった。
また、悪性化したがんの大きな脅威の主な原因はその浸潤・転移性にあるが、細胞の浸潤や転移をもたらす分子機序に関しても、世界レベルにおいてもまだまだ研究の初期段階である。
Ａｒｆ６はＲａｓスーパーファミリーに属する低分子量Ｇ蛋白質である。主として、細胞形質膜成分のエンドソ−マルリサイクリングや細胞膜受容体のリサイクリングの制御に関与すると考えられている（Ｍｏｓｓ，  Ｊ．  ＆  Ｖａｕｇｈａｎ，  Ｍ．  （１９９８）  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＡＲＦ  ｏｒｂｉｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  ２１４３１−２１４３４；  Ｒｏｔｈ，  Ｍ．  Ｇ．  （２０００）  Ａｒｆ．  ｉｎ  ”ＧＴＰａｓｅｓ”，  ｅｄｓ．  Ｈａｌｌ，  Ａ．  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ），  ｐｐ１７６−１９７）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、上にも記したような未だ不完全であり、未知の部分が残っている癌細胞の特性に対して新しい知見を与え、さらに、その浸潤性を抑制できる手立てを示すことである。そのことにより、がんに対する今までに無い新しいより効果的な診断法や治療法を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は癌の大きな脅威である浸潤や転移をもたらす分子機序にｃｏｒｔａｃｔｉｎと共に、Ａｒｆ６とその負の制御因子であるＰＡＧ２が関与することを明らかにし、上記課題を解決したものである。
【０００５】
本発明者は、第一に、Ａｒｆ６が細胞運動や癌細胞における浸潤足形成に深く関わっていることを明らかにした。Ａｒｆ６（配列番号１）は低分子量Ｇ蛋白質であるＡｒｆファミリーメンバーの一つであり、その活性は、ＧＥＦ（ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）とＧＡＰ（ＧＴＰａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）により、それぞれ正と負に制御される。Ａｒｆファミリーメンバーに対するＧＡＰはヒトゲノムに複数個存在することが知られている（Ｓａｂｅ，  Ｈ．  （２００３）  Ｐａｘｉｌｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＡｒｆＧＡＰｓ  −ｔｈｅｉｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ．    ｉｎ  ”Ｔｈｅ  Ａｒｆ  Ｂｏｏｋ”，  ｅｄｓ．  Ｋａｈｎ，  Ｒ．  （Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）．  （ｉｎ  ｐｒｅｓｓ））。浸潤運動へのＡｒｆ６の関与の発見に関連して、Ａｒｆ６の活性を阻害すると、実際に浸潤運動を阻害できることを明らかにした。
続いて本発明者は第二に、ＰＡＧ２と命名した蛋白質（配列番号２）がＡｒｆ６に対するＧＡＰであり、その過剰発現によって細胞運動活性を負に制御できることを明らかにした。
さらに第三に、ヒトゲノムに存在するＡｒｆＧＡＰ蛋白質を網羅的に検討した結果、ＰＡＧ２のみがｃｏｒｔａｃｔｉｎ（Ｗｅｅｄ，  Ｓ．  Ａ．  ＆  Ｐａｒｓｏｎｓ，  Ｊ．  Ｔ．  （２００１）  Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ：  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｔｏ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ａｃｔｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．    Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０，  ６４１８−６４３４）と呼ばれる癌細胞における浸潤足形成に必須とされている蛋白質と結合すること、従って、ＰＡＧ２が癌細胞における浸潤足形成制御に特異的、かつ必須の役割を果たすことを明らかにした。
【０００６】
癌は様々な要因によって発症し、また原発組織も様々である。従って、それぞれの癌細胞の性格をより詳しく知ることは癌治療の方針を決定する上で非常に重要なことである。今回Ａｒｆ６が癌細胞の浸潤運動に必須の因子であること、また数あるＡｒｆＧＡＰの中で、浸潤運動に関与しているＡｒｆ分子に対する活性制御因子がＰＡＧ２であることが見出された。
【０００７】
従って本発明はＡｒｆ６の抗体を含む癌の浸潤の程度を測定する診断薬を要旨とする。
本発明は、またＰＡＧ２の抗体を含む癌の浸潤の程度を測定する診断薬を要旨とする。
診断の対象となる癌は、乳癌を含むあらゆる臓器の上皮組織由来癌である。
該抗体を用いて患者の癌組織を免疫染色（参考文献：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  染色法のすべて、医歯薬出版株式会社、１９９０年）をすることによりそれらの癌の性格付けをより詳しく行うことができる。例えばＡｒｆ６の抗体による癌組織の免疫染色が陽性であれば転移性の高い癌であるといえるし、陰性であれば転移の可能性は比較的低いといえる。またＰＡＧ２の抗体による癌組織の免疫染色が陽性であれば転移性の高い癌であるといえるし、陰性であれば分化程度が低く転移の可能性は比較的低いといえる。
抗体を作成する方法はよく知られている。本発明のタンパク質を使用して抗体を誘導する。ウサギ、ラット、およびマウスといったような動物を、例えば１００μｇのタンパク質およびフロイントアジュバンドを含むエマルジョンの腹腔内注射および／または皮内注射により免疫する。例えば固体表面に吸着させたタンパク質を使用するＥＬＩＳＡ検定により抗体を検出することができる。高い力価を得るためにブースター注射が例えば約２週間の間隔で数回必要である。抗体は上述の方法によるポリクローナル抗体のほかモノクローナル抗体（Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｄ．  （１９８８），  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏ  ）も用いることができる。
【０００８】
本発明は、癌の浸潤を防止する治療薬のスクリーニング方法であって、
候補化合物の存在下および不存在下にＡｒｆ６の活性を測定し、Ａｒｆ６の活性を阻害する化合物を癌の浸潤を防止する治療薬として選択する方法にも関する。
Ａｒｆ６の活性の測定は以下のようにして行う。細胞あるいは組織から抽出物に対して、活性化型Ａｒｆ６であるＧＴＰに結合したＡｒｆ６に特異的に結合することが知られているタンパク質であるメタロチオネイン２をＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）に融合させたものをプローブとしたプルダウンアッセイを行い、プローブに結合し、回収されたＡｒｆ６の量を抗体を用いたブロット法により定量する（参考文献：Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  Ｊ．，Ｋ．，  ａｎｄ  Ｄ’Ｓｏｕｚａ−Ｓｃｈｏｒｅｙ  Ｃ  （２００２），  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＲＦ６  ＧＴＰａｓｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｆｕｒｒｏｗ  ｉｎｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：２７２１０−２７２１６）。
Ａｒｆ６の抗体はＡｒｆ６の活性を阻害するので癌の浸潤を防止する治療薬である。
【０００９】
本発明は癌の浸潤を防止する治療薬のスクリーニング方法であって、
候補化合物の存在下および不存在下にＰＡＧ２の活性を測定し、ＰＡＧ２活性を高める化合物を癌の浸潤を防止する治療薬として選択する方法にも関する。
ＰＡＧ２の活性は以下のように測定する。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの測定：  ３２Ｐでα位を標識したＧＴＰを結合させたＡｒｆ６とＰＡＧ２を３０ｏＣで１０−３０分間反応させ、反応後のＧＴＰとＧＤＰの量比を薄層クロマトグラフにて展開し測定する。反応液に、検定したい化合物を添加し、ＧＡＰ活性に対する効果を調べる。反応液は以下の文献に記載されているＰＡＰの活性測定で用いられたものに準ずる。  （Ａｎｄｒｅｅｖ，  Ｊ．，  Ｓｉｍｏｎ，  Ｊ．，  Ｓａｂａｔｉｎｉ，  Ｄ．  Ｄ．，  Ｋａｍ，  Ｊ．，  Ｐｌｏｗｍａｎ，  Ｇ．，  Ｒａｎｄａｚｚｏ，  Ｐ．  Ａ．，  Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，  Ｊ．  （１９９９）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９，  ２３３８−２３５０．）
ｉｎ  ｖｉｖｏでの測定：  Ａｒｆ６  ｃＤＮＡとＰＡＧ２ｃＤＮＡをＣＯＳ７細胞に遺伝子導入し、２４時間後に細胞抽出液を調製し、抽出液に存在する全Ａｒｆ６に対するＧＴＰ−Ａｒｆ６の量を、先に述べたＧＳＴ−ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ２を用いた方法により測定する。  その際、細胞に検定したい化合物や蛋白質を導入しておき、その効果を検討する。
【００１０】
また遺伝子治療としてＡｒｆ６やＰＡＧ２のそれぞれの遺伝子構造に基くｓｉＲＮＡ法を用いて癌細胞に発現するＡｒｆ６やＰＡＧ２を特異的にノックダウンすることも可能である。
【００１１】
【実施例】
実施例１
ＣＯＳ７細胞にＡｒｆ６の活性変異体（Ａｒｆ６ＤＡ；図１パネルＡ）やＰＡＧ２  （ＷＴ）とそのＧＡＰ活性消失変異体（ＣＡ）（図１パネルＢ）を遺伝子導入により強制発現させた。細胞のコラーゲン（Ｃｏｌ）とファイブロネクチン（ＦＮ）に対する運動性をＢｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒを用いて測定した。３時間の測定において、コントロール  （ｍｏｃｋ  ＆  ＣＡ）では全体の約１０％の細胞が移動したが、Ａｒｆ６の活性変異体やＰＡＧ２発現細胞では、移動した細胞の数は約半分に抑えられた（図１）。
【００１２】
実施例２
ＣＯＳ７細胞にＰＡＧ２と共にＡｒｆ１（パネルＡ）もしくはＡｒｆ６（パネルＢ）を強制発現させ、それぞれのＡｒｆにより生じる表現型を抑制するか調べた。図２に示すように、ＰＡＧ２はＡｒｆ６による表現型を効率良く抑制したが、Ａｒｆ１による表現型に対して抑制効果は示さなかった。図１と同様、ＰＡＧ２のＧＡＰ活性消失変異体（ＣＡ）もコントロールとして用いた。ＰＡＧ２はＡｒｆ６に対するＧＡＰであることがわかる。
【００１３】
実施例３
ＰＡＧ２に存在するプロリンリッチ配列に対する結合蛋白質を、まず、酵母を用いたｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法にて検索した。その結果、ｃｏｒｔａｃｔｉｎが候補に挙げられた。図４では、ＰＡＧ２とｃｏｒｔａｃｔｉｎとの細胞内における結合を確認している。パネルＡとＢでは、ＰＡＧ２とｃｏｒｔａｃｔｉｎが細胞内で結合していることを、ＰＡＧ２とｃｏｒｔａｃｔｉｎをＣＯＳ７細胞に共発現させ共沈澱法により確認した。ＡとＢとでは、共沈澱を行う際の、主になる分子を互いに変え、どちらの場合も同じ結果であることを示している。パネルＣでは、ＰＡＧ２に対するｃｏｒｔａｃｔｉｎの結合部位がＳＨ３領域であることを同じく共沈澱法により確認している。Ａ−Ｃにおいて、ＰＡＧ２とｃｏｒｔａｃｔｉｎとの結合特異性を示す為、ＰＡＧ２と同じくＡＭＡＰ  サブファミリーに属するＡｒｆＧＡＰであるＰＡＧ３をコントロールに用いている。図４に示されるようにＰＡＧ３はｃｏｒｔａｃｔｉｎには有意な結合性を示さない。ｃｏｒｔａｃｔｉｎは細胞内でのＰＡＧ２への特異的結合蛋白質である。
【００１４】
実施例４
ＰＡＧ２には１６種のそれぞれ異なるプロリンリッチ配列が存在する。一般に、ＳＨ３領域とプロリンリッチ配列とは１対１の結合をし、そのことにより蛋白質間の結合を介在する。Ｓｐｏｔ法にてＰＡＧ２に存在するそれぞれのプロリンリッチ配列を化学合成し（パネルＡ、＃１−＃１６）、ｃｏｒｔａｃｔｉｎ  ＳＨ３領域との結合性を生化学的に検討した。Ｂにその結果を示し、ＣにはＢの結果を測定し数値化したグラフを示す。ペプチド＃１７はコントロールに用いたｄｙｎａｍｉｎ２のプロリンリッチ配列である。図から分かるように、ＰＡＧ２プロリンリッチ配列の内、＃４と＃７が他よりも有意な結合性を示した（図５）。
【００１５】
実施例５
実施例４でＰＡＧ２プロリンリッチ配列の中で、＃４と＃７とがｃｏｒｔａｃｔｉｎ  ＳＨ３領域への結合配列として候補に挙がった。ここでは、そのどちらが実際に細胞内での結合に関与しているのか決定した。＃４プロリンリッチ配列を欠くＰＡＧ２スプライスバリアント（パネルＡ，  ＰＡＧ２ｂ）は自然界に存在する為、それを単離しｃｏｒｔａｃｔｉｎとの結合性を検討した。実験は、図４と同様、両蛋白質をＣＯＳ７細胞に共発現させ、共沈澱法により調べた。図６のＢに示すように、ＰＡＧ２ｂはｃｏｒｔａｃｔｉｎとの共沈澱を示さなかった。＃７プロリンリッチ配列の関与の有無は、このペプチドに変異を導入したもの（パネルＡ，  ＰＡＧ２ａ＊とＰＡＧ２ｂ＊）を用いて調べた。その結果、＃７プロリンリッチ配列はｃｏｒｔａｃｔｉｎとの細胞内での結合には関与していないことが示された（図６）。
【００１６】
実施例６
ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をコラーゲンの上に培養し浸潤仮足におけるｃｏｒｔａｃｔｉｎとＰＡＧ２との共局在を示している（図７の上段）。図７の下段には、コントロールとしてＰＡＧ３の局在を示しているが、ＰＡＧ３は浸潤仮足に存在しない。
【００１７】
悪性がんの大きな脅威の主な原因はその浸潤・転移性にある。細胞の浸潤や転移をもたらす分子機序に関しても、世界レベルにおいてもまだまだ研究の初期段階であったが、今回の発明によって、浸潤性を制御する分子機構に関する知見が大きく飛躍し、また、浸潤を抑制できる手立てを示したことにより、今後、より有効な治療法の開発や診断薬の開発を促すことができる。本発明の内容であるＡｒｆ６とＰＡＧ２の機能知見に基づくと、それらに対する抗体や、活性化物質や阻害物質のデザインや作成は、新しいがんの診断や治療法、治療薬の開発に有用である。
【００１８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ａｒｆ６の活性変異体やＰＡＧ２の強制発現による癌化細胞（ＣＯＳ７）の運動性（ｈａｐｔｏｔａｃｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）の抑制を示す。
【図２】ＰＡＧ２は細胞内でＡｒｆ６に対して特異的ＧＡＰとして働くことを示す実験結果である。
【図３】ヒトＡｒｆＧＡＰの一次構造の相同性に基づくヒトゲノムに存在するＡｒｆＧＡＰ蛋白質の系統樹である。作成にはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗを使用した。ヒトＡｒｆＧＡＰの中で、ＰＡＧ２とＰＡＧ３から構成されるＡＭＡＰ  サブファミリーのみがプロリンリッチ配列を有する。
【図４】ｃｏｒｔａｃｔｉｎは細胞内でのＰＡＧ２に対する特異的結合蛋白質の一つであることを示す実験結果である
【図５】ＰＡＧ２のプロリンリッチ配列の中でｃｏｒｔａｃｔｉｎ  ＳＨ３領域への結合配列の生化学的同定を示す。
【図６】ＰＡＧ２の＃４プロリンリッチ配列が細胞内でのｃｏｒｔａｃｔｉｎ  との結合に必須なインターフェースであることを示す実験結果である。
【図７】ＰＡＧ２とｃｏｒｔａｃｔｉｎはヒト乳癌細胞の浸潤仮足に共局在することを示す免疫染色像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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