(57)【要約】【課題】コルディセピンの含有量を向上させる。【解決手段】冬虫夏草用倍地において、（Ａ）炭素源として米及び／又はとうもろこしを含有させる。さらに、（Ｂ）窒素源としてペプトン、イースト、モルト、ミルクからなる群から選ばれた少なくとも１種、（Ｃ）アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡからなる群から選ばれた少なくとも１種及び／又は（Ｄ）ビオチン、ビタミンＢ類からなる群から選ばれた少なくとも１種をそれぞれ含有させることが好ましい。ビタミンＢ類が、ビタミンＢ１及び／又はビタミンＢ１２であることが好ましい。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）炭素源として米及び／又はとうもろこしを含有する冬虫夏草用培地。
【請求項２】
前記冬虫夏草用培地が、（Ｂ）窒素源としてペプトン、イースト、モルト、ミルクからなる群から選ばれた少なくとも１種、（Ｃ）アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡからなる群から選ばれた少なくとも１種及び／又は（Ｄ）ビオチン、ビタミンＢ類からなる群から選ばれた少なくとも１種をそれぞれ含有する請求項１に記載の冬虫夏草用培地。
【請求項３】
前記ビタミンＢ類が、ビタミンＢ１及び／又はビタミンＢ１２である請求項２に記載の冬虫夏草用培地。
【請求項４】
前記（Ａ）成分の含有量が２〜１００重量％であり、前記（Ｂ）成分の含有量が１〜７重量％であり、前記（Ｃ）成分の含有量が０．１〜０．５重量％であり、かつ、前記（Ｄ）成分の含有量が微量である請求項２又は３に記載の冬虫夏草用培地。
【請求項５】
前記（Ａ）成分の含有量が３〜５重量％であり、前記（Ｂ）成分の含有量が４〜７重量％であり、前記（Ｃ）成分の含有量が０．３〜０．４重量％であり、かつ、前記（Ｄ）成分の含有量が微量である請求項２又は３に記載の冬虫夏草用培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた抗腫瘍効果、抗菌効果、免疫増強効果及び滋養強壮効果を有する薬用茸の一種である冬虫夏草用の培地に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
冬虫夏草は、薬用茸の一種で、昆虫などを宿主とし、菌糸が増殖して宿主を死に至らしめた後、該宿主の体内で菌糸が充満すると子実体を形成するコルディセプス（ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）属の茸の一種であり、冬季には宿主の体内にあり、夏季になると宿主の虫体から穿ち出る子嚢菌に属する茸である。
冬虫夏草は、自然状態では地中又は地上に菌糸又は胞子として存在する菌であり、寄生する昆虫の幼虫期、蛹期及び成虫期全般にわたって体内に侵入して発生する。
冬虫夏草は、優れた抗腫瘍効果、抗菌効果、免疫増強効果及び滋養強壮効果を有するものとして知られている。冬虫夏草の有効成分はコルディセピン（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ）であり、その含有量は、子実体の乾燥体において０．０２〜０．６重量％程度である。
【０００３】
近年、冬虫夏草の菌糸体を人工的に培養する方法としていくつか提案されており、例えば、冬虫夏草の虫体菌糸又は座胞子をセミなどの節足動物の昆虫類の成虫、蛹、幼虫などに定着させて固体培養する方法、米胚を利用した培養液の製造方法などが知られている。しかしながら、成虫、蛹、幼虫などに定着させる固体培養や、米胚を利用した液体培養などの従来の培養方法では、培養方法が複雑であった。また、その収量は、たとえば、さなぎ固体培養による培養生成産物中のコルディセピン含有量は約０．１〜０．５重量％、米胚液体培養の場合は約０．０４重量％といずれも高くなかった（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特開昭６３−２０９５７９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような実情に鑑みなされたものであり、その目的は、得られる培養生成物中のコルディセピンの含有量を向上させることができる冬虫夏草用培地を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）炭素源として米及び／又はとうもろこしを含有するものである。
前記冬虫夏草用培地が、（Ｂ）窒素源としてペプトン、イースト、モルト、ミルクからなる群から選ばれた少なくとも１種、（Ｃ）アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡからなる群から選ばれた少なくとも１種及び／又は（Ｄ）ビオチン、ビタミンＢ類からなる群から選ばれた少なくとも１種をそれぞれ含有することが好ましい。
前記ビタミンＢ類が、ビタミンＢ１及び／又はビタミンＢ１２であることが好ましい。
前記（Ａ）成分の含有量が２〜１００重量％であることが好ましく、特に好ましくは３〜５重量％である。前記（Ｂ）成分の含有量が１〜７重量％であることが好ましく、特に好ましくは４〜７重量％である。前記（Ｃ）成分の含有量が０．１〜０．５重量％であることが好ましく、特に好ましくは０．３〜０．４重量％である。前記（Ｄ）成分の含有量が微量であることが好ましい。
なお、本発明において重量％とは、水１００重量部に対して、成分ｘ重量部を含有することを意味する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）米及び／又はとうもろこしを炭素源として含有することを特徴とし、好ましくは、（Ｂ）ペプトン、イースト、モルト、ミルクからなる群から選ばれた少なくとも１種、（Ｃ）アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡからなる群から選ばれた少なくとも１種及び／又は（Ｄ）ビオチン、ビタミンＢ類を含有してなるものである。
【０００８】
本発明の培地で培養される冬虫夏草としては、コルディセピンを含有するものであれば特に限定されない。例えば、コルディセプス属に属するもので、コルディセプス・ミリタリス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）等の培養に好ましく用いられる。特にコルディセプス・ミリタリス（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５７、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５８）の培養に好ましく用いられる。
【０００９】
（Ａ）成分は、冬虫夏草用培地の炭素源として含有するものであり、米、とうもろこしのいずれか１種又は２種である。本発明においては、米、とうもろこしは、使用する培地の形態等にあわせて適宜粉砕して用いることが好ましい。例えば、液体培地の場合は、粒径２００〜３００μｍ程度とするが、これに限定されるものではない。米、とうもろこしは、安価で容易に入手できる材料であるので、低コストで培地を提供することができる。
（Ａ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は、好ましくは２〜１００重量％である。液体培地の場合は、好ましくは３〜５重量％である。（Ａ）成分の含有量が２重量％未満では、得られる培養生成物の培地の単位重量あたりの菌体重量が減少する傾向がある。
【００１０】
（Ｂ）成分は、冬虫夏草用培地の窒素源として含有するものであり、ペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれるいずれか１種又は２種以上である。イーストまたはモルトはその抽出物を使用してもよい。ミルクとしては、粉乳、脱脂粉乳が挙げられる。
（Ｂ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は、好ましくは１〜７重量％であり、特に好ましくは４〜７重量％である。（Ｂ）成分の含有量が１重量％未満、また、７重量％を超えた場合は、得られる培養生成物の培地の単位重量あたりの菌体重量が減少する傾向がある。
【００１１】
（Ｃ）成分は、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれるいずれか１種又は２種以上である。
アスパラギン、アスパラギン酸、グリシンは、アミノ酸の１種である。アスパラギンとしてはＬ体、Ｄ体どちらも使用できるが、Ｌ体が好ましい。アスパラギン酸においても、Ｌ体、Ｄ体どちらも使用できる。Ｌ−アスパラギン（和光純薬製のもの等）を用いた場合には、低コストに製造できるので工業的に好ましい。ＤＮＡとしては、例えば、魚等から抽出したＤＮＡが使用でき、鮭精液由来のＤＮＡ等が挙げられる。
（Ｃ）成分の冬虫夏草用培地中の含有量は好ましくは０．１〜０．５重量％であり、特に好ましくは、０．３〜０．４重量％である。（Ｃ）成分の含有量が０．１重量％未満の場合は、得られる培養生成物の培地の単位重量あたりの菌体重量が減少する傾向があり、かつコルディセピン含有量の増加効果が少ないので好ましくない。また、（Ｃ）成分の含有量が０．５重量％を超えた場合は、菌体の成長及びコルディセピン含有量の増加効果の極限を超えるため好ましくない。
【００１２】
（Ｄ）成分は、ビタミンとして冬虫夏草用培地に含有させるものであり、ビオチン、ビタミンＢ類のいずれか１種又は２種以上である。
ビオチンはビタミンの一種である。
ビタミンＢ類は、ビタミンＢであれば特に限定されず、好ましくは、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２等であり、これらは単独のものでも、又は二種以上の混合物であってもよい。
（Ｄ）成分の含有量は、特に限定されないが、微量であることがよく、例えば冬虫夏草用培地１００ｍｌに対して２〜１０μｇ程度である。（Ｄ）成分の含有量が２μｇ未満の場合は、得られる培養生成物中のコルディセピン含有量の増加効果が少ないので好ましくない。また、（Ｄ）成分の含有量が１０μｇを大きく超えた場合は、菌体の成長およびコルディセピン含有量の増加効果の極限を超えるので好ましくない。
【００１３】
冬虫夏草用培地のｐＨは、２〜９であることがことが好ましく、特に好ましくは、５〜７である。ｐＨの調製は、調製が行えるならばどのようにしてもよく、例えば、塩酸や水酸化ナトリウムを使用する調製方法が挙げられる。
【００１４】
本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）〜（Ｄ）成分以外はほとんど水であるが、この水としては、特に限定されず、水道水、井戸水、蒸留水等が挙げられる。
このように、本発明の冬虫夏草用培地は、（Ａ）成分、（Ｂ）成分、（Ｃ）成分及び／又は（Ｄ）成分を含有してなることにより、得られる培養生成物中のコルディセピンの含有量を向上させることができる。さらに、（Ａ）〜（Ｄ）成分、水以外にも、コルディセピンの含有量を向上させるために他の成分を含有させてもよい。
他の成分としては、例えば（Ａ）成分以外の炭素源としては糖蜜、（Ｂ）成分以外の窒素源としてはおから、それ以外には例えばマグネシウム、カルシウム等のミネラルが挙げられる。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例及び参考例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれになんら限定されるものではない。
【００１６】
〔実施例１〕
炭素源として米４ｇ、窒素源としてペプトン３．８ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン  ２μｇ、蒸留水１００ｍｌからなり、ｐＨ６．８の液体培地を作成した。
〔実施例２〕
炭素源としてとうもろこし５ｇ、窒素源としてペプトン３．６ｇをそれぞれ用いたこと以外は実施例１と同様にして液体培地を作成した。
〔実施例３〕
炭素源として米２ｇ及びとうもろこし２．５ｇ、窒素源としてペプトン３．７ｇをそれぞれ用いたこと以外は実施例１と同様にして液体培地を作成した。
〔実施例４〕
窒素源としてイースト３．８ｇを用いたこと以外は実施例１と同様にして液体培地を作成した。
〔実施例５〕
窒素源としてモルト３．８ｇを用いたこと以外は実施例１と同様にして液体培地を作成した。
〔実施例６〕
炭素源として米４３ｇ、窒素源としてペプトン４ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇを蒸留水１００ｍｌに混合し、固体培地を作成した。
〔実施例７〕
炭素源として米６０ｇ、窒素源としてペプトン４ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇを蒸留水１００ｍｌに混合し、固体培地を作成した。
〔実施例８〕
炭素源としてとうもろこし８３ｇ、窒素源としてペプトン４ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇを蒸留水１００ｍｌに混合し、固体培地を作成した。
なお、実施例中、米としては、糖質が７５．５重量％、たんぱく質が６．８重量％含まれる精白米の粒径約２００〜３００μｍの粉末を用いた。とうもろこしとしては、糖質が６８．６重量％、たんぱく質が８．６重量％含まれる粒径約２００〜３００μｍの粉末を用いた。
【００１７】
前記実施例１〜８の培地を本培養培地として用い、以下のようにして、得られる生成物の菌体重量及び総コルディセピン量を求めた。
【００１８】
（使用菌株）
菌株としては、コルディセプス・ミリタリス（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６５７）を保存菌株用培地（スラント培地：ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン  ２μｇ、寒天３ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）で保存したものを用いた。この菌株を、種菌培養として下記前々培養及び前培養した後、各実施例及び各参考例の培地を用いて本培養した。
【００１９】
（前々培養）
平板寒天培地（ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン２μｇ、寒天３ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）をシャーレに２０ｍｌ充填した。このシャーレ培地に、前記保存した菌株を約１５ｍｍ＊１５ｍｍ切り出して接種し、これを２１℃下２週間培養した。
【００２０】
（前培養）
液体培地（ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１ｇ、ビオチン２μｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに分注し、１２１℃下２０分間滅菌処理した。処理後、液温度が室温まで下がったとき、この液体培地に、前々培養したシャーレ培地から切り出した約１ｃｍ角のコロニ−三つを接種した。これを回転振盪機を用いて８０ｒｐｍで、２１℃下１０日間暗所で培養し、分生子を顕微鏡で確認後、本培養に使用した。
【００２１】
（本培養）
前記実施例１〜８の各培地をそれぞれ５００ｍｌ三角フラスコに入れ、１２１℃下２０分間滅菌処理した。なお、各実施例毎に（１種につき）それぞれ３つ同じ実験を行った。処理後、それぞれ培地温度が室温まで下がったとき、これら培地に、前培養した培地から採取した約１ｍｌを接種した。
実施例１〜５の液体培地を用いた場合は、２３℃下６０日間暗所で静置して本培養した。
実施例６および７の固体培地を用いた場合は、２５℃下１４日間暗所にて培養した後、明所（通常の室内光）にて同温度で９０日間本培養した。
実施例８の固体培地を用いた場合は、１６℃下２８日間暗所にて培養した後、明所（通常の室内光）で２５℃下３９日間本培養した。
【００２２】
（液体培地における培養生成物中の総コルディセピン量の測定）
本培養後、各培養液１００ｍｌをろ紙（５Ｂ：アドバンテック東洋社製）を用いてろ過した。得られた菌体を５日間凍結乾燥した後、精密天秤で測定しその重量（以下、菌体重量とする）を測定した。
また、ろ過した培養液を凍結乾燥し、その重量（以下、培養液乾燥重量とする）を測定した。
【００２３】
凍結乾燥した菌体１ｇを水（蒸留水）を用いて１０分間超音波（サンフレックス、ＤＧ−１、５０Ｗ、４３ＫＨｚ）処理した。この処理液をろ紙（５Ｂ：アドバンテック東洋社製）を用いてろ過してコルディセピン含有量分析用試料とした。
この試料を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ（ＬＣ−１０：株式会社島津製作所製））を用いて分析し、コルディセピンの含有量を測定した（以下、菌体コルディセピン含有量とする）。
【００２４】
ＨＰＬＣの条件は、カラムにＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（ＯＤＳ）  ２５０Ｌ＊４．６φｍｍ（ジーエルサイエンス株式会社製）を用い、移動相は５０ｍＭリン酸カリウム：アセトニトリル（Ｖ／Ｖ＝９５：５）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出波長２６０ｎｍで行った。
前記ろ過培養液の凍結乾燥物についても、同様にしてコルディセピン含有量を測定した（以下、培養液コルディセピン含有量とする）。
【００２５】
これらの値から、次式に基づいて総コルディセピン量を求めた。
（総コルディセピン量）＝（菌体コルディセピン量＊菌体重量）／（菌体重量＋培養液乾燥重量）＋（培養液コルディセピン量＊培養液乾燥重量）／（菌体重量＋培養液乾燥重量）
上記の測定は、前述のように培地１種につき三連で実験して得られた培養物のそれぞれについて行い、３つの値の平均値をその培地における値とした。これらの結果を下記表１に示した。
【００２６】
（固体培地における培養生成物中の総コルディセピン量の測定）
固体培地を用いた培養では、菌体と培地とを分離するのが困難なため、本培養後培養生成物を培地ごと２週間天日干しで乾燥させ、この乾燥物中のコルディセピン量を測定した。この乾燥物１ｇを蒸留水を用いて上述の液体培養の場合と同様に超音波処理し、ろ過してコルディセピン量測定用試料とし、ＨＰＬＣにて分析した。したがって、固体培地を用いた培養によって得られた総コルディセピン量は、この乾燥物単位重量あたりのコルディセピン重量として求めた値である。上記の測定は、前述のように培地１種につき三連で実験して得られた培養物のそれぞれについて行い、３つの値の平均値をその培地における値とした。これらの結果を下記表１に示した。
【００２７】
【表１】
2004242507.tif 000002
【００２８】
表１に示した結果から、本発明の炭素源として米、とうもろこし、窒素源としてペプトン、イースト、モルトを用いた実施例１〜８の場合、いずれも得られた培養生成物中のコルディセピン量が従来と比較して顕著に増加した。
【００２９】
〔参考例１〕
窒素源の種類を変えた場合の培養生成物の菌体重量及び総コルディセピン含有量を検討した。
参考例１は、炭素源としてグルコース３ｇを用い、窒素源として、ペプトン、イースト、モルト、脱脂粉乳の４種類をそれぞれ１ｇを用いた４種の場合について調べた。なお、炭素源及び窒素源を除く他の成分は実施例１と同様のものを用いて、液体培地を作成した。これら４種類の培地をそれぞれ前記実施例とほぼ同様に本培養培地として用いて、２１℃下、暗所で３０日間静置して本培養を行い、前記実施例と同様にして総コルディセピン含有量を測定した。その結果を下記表２に示した。
【００３０】
【表２】
2004242507.tif 000003
【００３１】
表２に示した結果から、総コルディセピン量はペプトンを用いた場合がもっとも顕著に増大し、また、イースト、モルト、脱脂粉乳においても十分な増加が認められた。
【００３２】
〔参考例２〕
アミノ酸の種類を変えた場合及びＤＮＡを添加した場合の培養生成物の菌体重量及び総コルディセピン含有量を検討した。
参考例２は、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン、ＤＬ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン、シスチン、ヒスタミン、トリプトファン、フェニルアラニン、アルギニン、リジン、ＤＮＡ（鮭由来）のいずれかをそれぞれ０．５ｇ、蒸留水１００ｍｌを用いてｐＨ６．８の液体培地を作成し、２１℃３０日間暗所にて本培養を行い、総コルディセピン量を前記と同様にして求めた。なお、アミノ酸もＤＮＡも加えない培地をコントロールとした。各培地を使用した場合の評価は、コントロールにおける総コルディセピン量の値を１として比を求めることで行った。その結果を表３に示した。
【００３３】
【表３】
2004242507.tif 000004
【００３４】
表３に示した結果から、総コルディセピン量はＤＮＡ、ＤＬ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン、ＤＬ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン酸及びグリシンを添加した場合が顕著に多く、特にＤＮＡが最も多かった。
【００３５】
〔参考例３〕
ビタミン類の種類を変えた場合の培養生成物の菌体重量及び総コルディセピン含有量を検討した。
参考例３は、グルコース３ｇ、ペプトン１ｇ、ビタミン類２μｇを蒸留水１００ｍｌに添加して作成したｐＨ６．８の液体培地と、ビタミン類無添加のコントロール培地の４種の培地を用いて、２１℃下暗所で３０日間本培養を行い、前記と同様にして総コルディセピン量を求めた。各培地を使用した場合の評価は、コントロールにおける総コルディセピン量の値を１として比を求めることで行った。その結果を表４に示した。
【００３６】
【表４】
2004242507.tif 000005
【００３７】
表４に示した結果から、総コルディセピン量は、コントロールと比較して、いずれのビタミン類を添加した場合も顕著に増加した。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の培地を使用して冬虫夏草を培養することにより、得られる培養生成物中のコルディセピンの含有量を、従来の培地を使用した場合よりも顕著に向上させることができる。