(57)【要約】【課題】胃腸の健康を助け、かつ腸の病変を予防および／または治療するための新規なプロバイオティクス、および該プロバイオティクスを含有する医薬用または栄養食品用製剤を提供する。【解決手段】ビフィドバクテリウム　ロンガムＬＭＧ　Ｐ−２１５８６またはビフィドバクテリウム　ロンガムＬＭＧ　Ｐ−２１５８７の菌株から製造される生物学的に純粋な培養物、およびこれらの培養物をプロバイオティクスとして含有してなる、胃腸の健康を助け、かつ腸の病変を予防および／または治療するための医薬用または栄養食品用製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム　ロンガムＬＭＧ　Ｐ−２１５８６株から製造される生物学的に純粋な培養物。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム　ロンガムＬＭＧ　Ｐ−２１５８７株から製造される生物学的に純粋な培養物。
【請求項３】
請求項１または２記載の生物学的に純粋な培養物をプロバイオティクスとして含有してなることを特徴とする、胃腸の健康を助け、かつ腸の病変を予防および／または治療するための医薬用または栄養食品用製剤。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム　ロンガムＬＭＧ　Ｐ−２１５８６株の生物学的に純粋な培養物に由来する生菌体１×１０7〜１×１０11個の菌量を含有する医薬用または栄養食品用製剤。
【請求項５】
ビフィドバクテリウム　ロンガムＬＭＧ　Ｐ−２１５８７株の生物学的に純粋な培養物に由来する生菌体１×１０7〜１×１０11個の菌量を含有する医薬用または栄養食品用製剤。
【請求項６】
前記製剤がさらにプレバイオティクスをオリゴ糖の形で含有することを特徴とする請求項４または５記載の製剤。
【請求項７】
前記オリゴ糖が重合度２〜１０のフルクトオリゴ糖またはイヌリンであることを特徴とする請求項６記載の製剤。
【請求項８】
前記製剤がさらにビタミン類を含有することを特徴とする請求項４、５、６または７記載の製剤。
【請求項９】
前記ビタミン類がビタミンＥ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６およびＢ１２であることを特徴とする請求項８記載の製剤。
【請求項１０】
前記製剤がカプセル剤、錠剤、パケット剤、トローチ剤、液状懸濁剤、乾燥経口補助剤、液状経口補助剤、バイアル剤、ミルク、ヨーグルト、フレッシュチーズ、アイスクリーム、発酵穀物製品、粉末ミルク、小児用製品および家畜用製品から選択されることを特徴とする請求項４、５、６、７、８または９記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、胃腸の健康を助けるための、胃腸、とりわけ腸の病変をとくに予防および／または治療するための、非病原性微生物ビフィドバクテリウム　ロンガム（Bifidobacterium Longum）の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
　食品を保存するために、またヨーグルトやそのほかの乳製品などの食品をミルクから製造するために、発酵剤として使用されるさまざまな細菌が古くから知られている。これらの細菌は、「乳酸菌」という一般名で呼ばれており、ラクトコッカス（Lactococcus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ビフィドバクテリウム、ペディオコッカス（Pediococcus）などの多くの属からなる。
【０００３】
　最近、これらの細菌は、それを服用したとき、ヒトおよび動物に対して顕著な性質を示したため、大きな注目の的になっている。とくにラクトバチルスまたはビフィドバクテリウムの株（ときには一緒に組み合わせて投与される）は、特許文献１、２、３および４に引用されているように、腸粘膜に定着し、そしてほかの有害な微生物の定着を防止することにより、人々の健康を助けるのに効果を示した。
【０００４】
　これらの微生物はまた、「プロバイオティクス」とも呼ばれており、それらの有用な効果の基本的な要件は、それらが生存しかつ腸に定着することができるような数と生命力で腸粘膜に到達することができることである。したがって、それらの微生物が胃の低ｐＨに充分耐え得ることが必須である。
【０００５】
　プロバイオティクス製品の消費は、便秘や下痢などの腸の病変の場合、および抗生物質による治療期間後、とくに腸内細菌叢の衰えをもたらすような状況や、繊維に乏しい食事、環境状態またはストレスが腸内細菌叢の活力を低下させるような状況において、推奨される。
【０００６】
　よく特徴付けされておりかつ健常人から取り出された細菌株を使用することにより、ヒトの細菌叢に天然に存在する微生物の適切なレベルを回復させることが、そのような投与の目標である。
【０００７】
　外来微生物の腸での定着活性は、それらの濃度および定着能力ならびにそれらが腸で見出す環境条件に依存する。なぜならば、その微生物は健康なヒトの腸から得られたものなので副作用がなく、多量の投与、高い定着能力および適切な環境条件により、腸内に多数定着することを通して、保護効果および治療効果が促進されるからである。とくに、強調されるべきことは、たとえばイヌリンやフルクトオリゴ糖などの栄養繊維の適切な存在が主として定着を助けるということである。なぜなら、それらの化合物はプロバイオティクスの基質であり、したがってそれらが定着の機会を増大するからである。前記オリゴ糖は、そのプロバイオティクスとの相乗作用のために、「プレバイオティクス」とも呼ばれている。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，４９４，６６４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２４１，９８３号明細書
【特許文献３】国際公開第００３３８５４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１１０４５３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
　本発明の目的は、胃腸の健康を助け、かつ腸の病変を予防および／または治療するための新規なプロバイオティクス、およびそれを含有する医薬用または栄養食品用製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
　本発明は、ビフィドバクテリウム　ロンガムＬＭＧ　Ｐ−２１５８６の生物学的に純粋な培養物に関する。
【００１１】
　また、本発明は、ビフィドバクテリウム　ロンガムＬＭＧ　Ｐ−２１５８７の生物学的に純粋な培養物に関する。
【００１２】
　さらに、本発明は、前記の生物学的に純粋な培養物をプロバイオティクスとして含有してなることを特徴とする、胃腸の健康を助け、かつ腸の病変を予防および／または治療するための医薬用または栄養食品用製剤に関する。
【００１３】
　さらにまた、本発明は、ビフィドバクテリウム　ロンガムＬＭＧ　Ｐ−２１５８６の生物学的に純粋な培養物に由来する生菌体１×１０7〜１×１０11個の菌量を含有する医薬用または栄養食品用製剤に関する。
【００１４】
　さらにまた、本発明は、ビフィドバクテリウム　ロンガムＬＭＧ　Ｐ−２１５８７の生物学的に純粋な培養物に由来する生菌体１×１０7〜１×１０11個の菌量を含有する医薬用または栄養食品用製剤に関する。
【００１５】
　前記医薬用または栄養食品用製剤は、さらにプレバイオティクスをオリゴ糖の形で含有するのが好ましく、オリゴ糖としては、重合度２〜１０のフルクトオリゴ糖またはイヌリンが好ましい。
【００１６】
　前記医薬用または栄養食品用製剤は、さらにビタミン類を含有するのが好ましい。ビタミン類としては、ビタミンＥ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６およびＢ１２が好ましい。
【００１７】
　さらに、前記製剤は、カプセル剤、錠剤、パケット剤、トローチ剤、液状懸濁剤、乾燥経口補助剤、液状経口補助剤、バイアル剤、ミルク、ヨーグルト、フレッシュチーズ、アイスクリーム、発酵穀物製品、粉末ミルク、小児用製品または家畜用製品であることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
　本発明は、ザ　ベルジャン　コーディネイテッド　コレクションズ　オブ　マイクロオーガニズムズ(the Belgian Coordinated Collections of Microorganisms)−ＢＣＣＭ　ＬＭＧ−コレクションに受託番号ＬＭＧ　Ｐ−２１５８６およびＬＭＧ　Ｐ−２１５８７として登録されているＷ１１およびＷ１１ａと命名したビフィドバクテリウム　ロンガム２菌株の生物学的に純粋な培養物；医薬用または栄養食品用製剤内でのプロバイオティクスとしてのそれらの用途；ならびに、胃腸の健康を助け、かつ腸の病変を予防および／または治療するために有用なそれらを含有する医薬用または栄養食品用製剤に関する。
【００１９】
　ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１およびＷ１１ａの２つの株は、健康なヒトの腸内菌叢から単離されたもので、これらの株は、腸内菌叢での定着能および腸内細胞への付着能（これらの能力により、胃腸管の健康を助け、またさまざまな起源の胃腸炎から変化した胃腸管の機能を回復させることができる非常に優れた生菌剤となり得る菌株の特徴が示される）を示したために同時に分離されたビフィドバクテリウム　ロンガムのそのほかの多くの株から選別された。前記ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１およびＷ１１ａの菌学的性質を以下に示す。
（１）スカドビとトロバレッティ（scardovi & Trovatelli）の方法（１９６５）による６−ホスホケトラーゼテスト（6-phosphoketolase test）：両株とも陽性
（２）糖の発酵性を、以下の培地：（ポリペプトン　１０ｇ、酵母エキス　１．５ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０　０．３ｍｌ、リン酸二カリウム　０．６６ｇ、酢酸ナトリウム　３Ｈ2Ｏ　１．５ｇ、クエン酸二アンモニウム　０．６６ｇ、硫酸マグネシウム　７Ｈ2Ｏ　０．０７ｇ、硫酸マンガン　４Ｈ2Ｏ　０．０１５ｇ、ブロモクレゾーム・パープル（purple bromocresol）　０．０５６ｇ、水　１０００ｍｌ）を添加したＡＰＩ５０ギャラリー（API 50 galleries）で調べた。その結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
2004097222.tif 000002
【００２１】
（３）クロシアッチ（Crociati）らの方法（１９９４）に従って、複合糖質の利用性を調べた。その結果を表２に示す。
【００２２】
【表２】
2004097222.tif 000003
【００２３】
　このプロフィールは、ビフィドバクテリウム　ロンガム種に典型的なものである。
【００２４】
（４）ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動法による、全タンパク質のプロフィールの結果を図１に示す。なお、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１はレーン３および４に、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａはレーン５および６に示す。
【００２５】
（５）エム　ベンチュラ（M. Ventura）らの方法（Appl. And Environ. Microb. (June 2001, pages 2760-2765)）に従って、種特異的プライマー（ＢＩＬＯＮ１／ＢＩＬＯＮ２、予想産物　８３１ｂｐ）と属特異的プライマー（ＰＯ／Ｌｍ３、予想産物　３８０ｂｐ）を組み合わせて用いたＰＣＲマルチプレックス（PCR multiplex）の結果を図２に示す。なお、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１はレーン３および４に、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａはレーン５および６に示す。
【００２６】
（６）ディー　ビンセント（D. Vincent）らの方法（Intern. Jour. of Microb. (43 1998; pages 185-193)）に従って、プライマー；ＯＰＡ０２、ＯＰＡ１８、ＯＰＬ０７、ＯＰＬ１６、ＯＰＭ０５をそれぞれ使用したＲＡＰＤプロフィール（RAPD profile）の結果を図３に示す。なお、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１はレーン２〜６に、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａはレーンレーン８〜１２に示す。
【００２７】
（７）ティー　マズキ（T. Mazuki）らの方法（Appl. And Environ. Microb. (October 1999, pages 4506-4512)）に従って、種特異的プライマーＢＩＬＯＮ１／ＢＩＬＯＮ２（予想産物　８３１ｂｐ）を用いたＰＣＲの結果を図４に示す。なお、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１はレーン３〜７に、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａはレーンレーン８〜１２に示す。
【００２８】
（８）エム　オリーブ（M. Olive）の方法（Journ. Of Clin. Microb. June 1999, pages 1661-1669)）に従って、Ｄｔプライマー（Dt primer）を用いたＲＥＰ　ＰＣＲプロフィール（REP PCR profile）の結果を図５に示す。なお、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１はレーン３および４に、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａはレーン６および７に示す。
【００２９】
（９）製造工程中にラクトバチルスの汚染がなかったかを調べるために、エス　ドーベルネット（S. Dubernet）らの方法（FEMS Microb.; Lett. 214 (2002) pages 271-275）に従って、ラクトバチルスに対する属特異的ＰＣＲを行なった（プライマー　Ｒ１６−Ｉ／ＬｂＬＭＡ　１、予想産物２５０ｂｐ）。その結果を図６に示す。なお、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１はレーン９および１０に、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａはレーン５および６に示す。
【００３０】
（１０）プラスミドの有無を調べるために、サンブルック、フリティッシュ、マニアティス（Sambrook, Fritsch, Maniatis）の方法（Molecular Cloning a Laboratory Manual, vol.1 page 23-31）に従って、プラスミドのプロフィール（Plasmidial profile）を調べた。その結果を図７に示す。なお、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１はレーン４および５に、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａはレーン２および３に示す。この結果より、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１およびＷ１１ａは何のプラスミドも有しないことが明らかである。
【００３１】
　本発明の細菌培養物は、まず実験室で製造され、ついで工業的規模で製造されており、また、主たる成分として、トリプシン性カゼインペプトン、大豆ペプトン、酵母エキスおよびグルコースを含み、さらにカリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩および亜鉛塩を添加したＴＰＹと呼ばれる適当な培養培地において、３７℃で２０時間増殖させた純粋な株からなる。
【００３２】
　２つのプロバイオティクス、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１およびＷ１１ａの細菌培養物の工業的生産のための接種時に使用される母培養物(mother cultures)を取得するまで、純粋な株の菌数を増大させることを目的として、前記初代培養物から継代培養物を調製した。
【００３３】
　前記細菌培養物の工業的製造プロセスは、つぎの工程を備える：
１．５．５〜７．５の間に調整されたｐＨでの発酵；
２．遠心分離による、培養ブロス（culture broth）からの細菌バイオマスの分離；
３．凍結および凍結乾燥の工程のあいだ細胞の活性を保護するための、プロテイド、炭化水素および無機塩から選ばれる適切な凍結保護物質の添加と、またできる限り、酵素分解および酸性ｐＨ条件に対する菌株の耐性を増大させる範囲でのタンパク質性沈殿物（カゼインのすい臓のペプトン、カゼインの加水分解物、ダイズのすい臓のペプトンおよび酵母エキスの混合物）の添加ののちの、細菌バイオマスの凍結乾燥；
４．凍結乾燥された培養物の粉砕と顆粒化。
【００３４】
　このように製造された製品は、たとえば、Ison A.P. and Matthew G.B., Applied Microbial Physiology a practical approach, Rhodes P.M. and Stanbury P.F. Editors-IRL Press Oxford, 103-130, 1997に報告されているような、当業者に知られている微生物学的な菌数計測方法にしたがって分析したとき、最終製品１グラム当たり、平均約１×１０10〜約１×１０12個のビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１またはＷ１１ａの生菌体を含有する。
【００３５】
　細菌培養物は、マウスの腸の定着試験において、ビフィドバクテリウム　ロンガムＬＭＧ　Ｐ−２１５８６またはＬＭＧ　Ｐ−２１５８７の菌量の計測数が、マウスの糞１グラム当たり１×１０6個より多い生菌数を示す陽性であることが検査された。
【００３６】
　本発明はさらに、厳密には主たる目的に由来するのであるが、胃腸の健康を助け、かつ腸の病変（たとえば、下痢、さまざまな起源の胃腸炎、便秘、過敏性腸、憩室疾患および慢性炎症性腸疾患）を予防および／または治療するために有効な医薬用または栄養食品用製剤におけるプロバイオティクスとしての、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１またはＷ１１ａ株から得られる生物学的に純粋な培養物の用途に関する。
【００３７】
　ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１またはＷ１１ａを含有する細菌培養物の、胃腸の健康を助けるという有効性は、それら細菌培養物を含有する医薬用または栄養食品用製剤に、たとえばフルクトオリゴ糖またはイヌリンなどの非消化性オリゴ糖の形態の栄養性繊維を添加することによって、増大させることができる。前記栄養性繊維は、腸の最初の管では吸着されずまた加水分解もされず、病原性バクテリアにとって不利なビフィドバクテリウム　ロンガムＬＭＧ　Ｐ−２１５８６およびＬＭＧ　Ｐ−２１５８７株の活性を強化し、代謝を促進する。本発明を実施するのに好ましいオリゴ糖は、一般式ＧＦｎ（ｎ≦４）で表されるフルクトース分子（Ｆ）の鎖に結合されたグルコース分子（Ｇ）の基本単位からなり、重合度すなわち単糖単位数２〜２０のフルクトオリゴ糖の混合物である。本発明の２種のプロバイオティクスと結合するプレバイオティクスとして用いられるフルクトオリゴ糖は、２〜１０、好ましくは３〜６の重合度を有する。
【００３８】
　本発明の製剤は、たとえばアスパルテーム、マンニトールまたはソルビトールなどの甘味料、香料および着色料などのさまざまな賦形剤とともに、腸管の病変期間中大きく低下しているビタミン成分を再貯蓄させることにより健康をさらに助ける範囲で、ビタミン類、好ましくはビタミンＥ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６およびＢ１２を含むことができる。
【００３９】
　本発明のそのほかの態様は、受託番号ＬＭＧ　Ｐ−２１５８６またはＬＭＧ　Ｐ−２１５８７でそれぞれ登録されているビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１およびＷ１１ａの細菌培養物を、任意に、プレバイオティクス（好ましくはフルクトオリゴ糖またはイヌリンなど）および／またはビタミン（好ましくはビタミンＥ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６およびＢ１２など）とともに、含有する医薬用または栄養食品用製剤である。
【００４０】
　好ましくは、医薬用製剤は、安定に使用できる期限の最終日にビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１またはＷ１１ａの生菌体１×１０7〜１×１０11個の菌量を含有するカプセル剤、錠剤、パケット剤(packets)、トローチ剤、液状懸濁剤、乾燥経口補助剤(dry oral supplements)、液状経口補助剤(liquid oral supplements)、バイアル剤（vials）などの形態で、、経口投与可能な組成物からなる。
【００４１】
　前記医薬用製剤の１日当たりの投与量は、１ｋｇ体重当たり、生菌体６×１０8〜１×１０9個である。
【００４２】
　前記医薬用製剤はまた、フルクトオリゴ糖またはイヌリンなどのプレバイオティクス、および／またはビタミン、好ましくはビタミンＥ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６およびＢ１２を含有することができる。フルクトオリゴ糖の含有量は、１回投与当たり、好ましくは０．５〜５ｇ、より好ましくは１〜３ｇである。イヌリンの含有量は、１回投与当たり、好ましくは０．５〜５ｇ、より好ましくは１〜３ｇである。
【００４３】
　ビフィドバクテリウム　ロンガム１×１０7〜１×１０11の生菌体からなるプロバイオティクスの量は、ミルク、ヨーグルト、リコタ(ricotta)、ストラチーノ(stracchino)およびモッツァレラ(mozzarella)（イタリアチーズの種類）などのフレッシュチーズ、アイスクリーム、発酵乳製品、発酵穀物製品、粉末ミルク、小児用製品および家畜用製品などのさまざまな種類の栄養食品の製造にも適用され得る。
【００４４】
　菌体計測検査試験により、本発明のビフィドバクテリウム　ロンガム両菌株は耐性を有しており、そのため、医薬用または栄養食品用製剤の製造の技術的工程中にも、またその通常の保存期間中にも、著しい死滅を受けないことが示された。事実、これらの細菌製剤について安定性試験を行なったところ、製造後２年以上のあいだその販売を継続できるほどに、両菌株は室温で極めて良好な耐性を示した。
【００４５】
　以下に、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１株の細菌培養物の製造法
　工業的発酵における播種時に使用されるビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１株の「初代培養物」は、ザ　ベルジャン　コーディネイテッド　コレクションズ　オブ　マイクロオーガニズムズ−ＢＣＣＭ　ＬＭＧ−コレクション−ラボラトリウム　フォール　ミクロバイオロジー(Laboratorium voor Microbiologie)、ユニバジテイト　ゲント(Universiteit Gent)に寄託されているもの（該寄託機関に発送され受理された菌株で、純度と生存が確認され、受託番号ＬＭＧ　Ｐ−２１５８６として登録された菌株）と厳密に同じものである。
【００４７】
　「初代培養物」を得るために、前記菌株をつぎの組成（１リットル当たり）を有するＴＰＹと呼ばれる培養培地中で増殖させた。
【００４８】
−カゼインのトリプシン性ペプトン　　　　　　　　　１０ｇ
−大豆ペプトン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ
−酵母エキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ
−グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｇ
−無水Ｋ2ＨＰＯ4　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ
−ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ
−ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　０．２５ｇ
−ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　０．１５ｇ
−ツイーン８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍｌ
−システイン塩酸塩　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ
−蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　全量が１０００ｍｌとなるよう添加
【００４９】
　増殖は、３７℃で２０時間実施し、ついで培養物にプロテイド、炭化水素および無機塩から選ばれる適当な凍結保護物質を添加して、バイアルに分配し、凍結して液体窒素中−１９６℃で保存した。
【００５０】
　前記菌株の菌体数を増大する目的で、「初代培養物」から出発して、３％の接種率でもって、３つの継代培養物を調製した。
【００５１】
　約３００リットル容量の「中間培養物」の反応器に接種するために、「母培養物」と呼ばれる、約１０リットルの最後の継代培養物を使用した。
【００５２】
　ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１の生物学的に純粋な培養物の工業的生産のその後のプロセスは、つぎの工程からなる：
１．６．５〜７．０の間に調整されたｐＨでの発酵；
２．遠心分離による培養ブロスからの細菌バイオマスの分離；
３．その後の凍結および凍結乾燥の工程のあいだ菌体の活性を保護することを目的として、プロテイド、炭化水素および無機塩から選ばれる凍結保護物質の溶液を用いる、またできる限り、酵素分解および酸性ｐＨ条件に対する菌の耐性を賦与することを目的として、タンパク性沈殿物を含有させることによる、細菌バイオマスの保護；
４．凍結乾燥；
５．凍結乾燥された培養物の粉砕と顆粒化；
６．凍結乾燥された培養物の混合(blending);
７．包装。
【００５３】
　得られた製品は、１ｇ当たり、約８〜１０×１０10個の生菌体を含有する。
【実施例２】
【００５４】
ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａ株の細菌培養物の製造法
　ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａ株の生物学的に純粋な細菌培養物を、ザ　ベルジャン　コーディネイテッド　コレクションズ　オブ　マイクロオーガニズムズ−ＢＣＣＭ　ＬＭＧ−コレクション−ラボラトリウム　フォール　ミクロバイオロジー、ユニバジテイト　ゲントに寄託されているもの（該寄託機関で純度と生存が確認され、受託番号ＬＭＧ　Ｐ−２１５８７として登録された菌株）と厳密に一致するビフィドバクテリウム　ロンガム株の「初代培養物」から出発して、実施例１に記載の方法にしたがって調製した。
【実施例３】
【００５５】
インビボでの定着試験
　試験は、１群２匹のマウスからなる４群で実施した。各マウスに、１．６×１０9ＣＦＵ／６０μｌに等しい濃度でビフィドバクテリウム　ロンガムＬＭＧ　Ｐ−２１５８６を含有するグルコース溶液を２回投与した。２回目の投与は最初の投与の１６時間後であった。
【００５６】
　これらマウスの糞中に存在するビフィドバクテリウム　ロンガムの量を計算することにより、マウスの腸への定着に対する該菌株の能力を検査した。最初の試料採取は、投与開始前に実施し、その後の試料採取は、２回目の投与から２時間後、４時間後、８時間後、２４時間後および４８時間後にそれぞれ実施した。糞中に見出されたビフィドバクテリウム　ロンガム株の量は約１０6ＣＦＵ／ｇであり、定着が起きたことを示した。とくに、該ビフィドバクテリウム　ロンガムは、糞中に見られたビフィドバクテリアの株全てに関して、菌叢の主たる成分となっていることが分かった。
【実施例４】
【００５７】
フルクトオリゴ糖およびビタミンと組み合せたバッグ製剤
　ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１の生菌体約２×１０10個に相当する生物学的に純粋な細菌培養物２５０ｍｇ、フルクトオリゴ糖２５００ｍｇおよびビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６およびＢ１２を含有し、水またはミルクに溶解されるための３ｇの重さのバッグ製剤を例として報告する。
【００５８】
　とくに、フルクトオリゴ糖としては、一般式ＧＦｎ（ｎ≦４）で表される、１つのグルコース分子に結合された複数個のフルクトース分子の鎖により形成されており、重合度２〜１０のフルクトオリゴ糖の混合物からなるＡｃｔｉｌｉｇｈｔ（登録商標）９５０Ｐと呼ばれる市販の製品を使用した。
【００５９】
　バッグ剤の詳細な処方はつぎの通りである。
【００６０】
【表３】
2004097222.tif 000004
【００６１】
製造方法
　ビタミン類をＡｃｔｉｌｉｇｈｔ（登録商標）９５０Ｐのアリコートと混合する第１工程を実施し、ついで網の目が０．５ｍｍの篩にかける。この第１の混合物をＡｃｔｉｌｉｇｈｔ（登録商標）９５０Ｐの第２のアリコートに添加し、第２の混合工程を実施する。最後に、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１の細菌培養物、Ａｃｔｉｌｉｇｈｔ（登録商標）９５０Ｐの残りのアリコートおよびそのほかの成分を混合物に添加して、さらに撹拌し、ついで０．８ｍｍの篩にかける。
【００６２】
　製品は、３ｇのアルミニウム製バッグに分配する。バッグ製剤製造の技術的工程は、菌株の生存に関していかなる損傷も生じさせない。
【００６３】
安定性試験
　半減期を決めるために、製剤調製直後（０時間）、および２２℃で１、２および３ヵ月保存後にそれぞれ、菌量を測定することにより、前記バッグに関する安定性試験を実施した。１、２および３ヵ月後のデータの分析から、これらの期間では死亡率は非常に低く、各量に対する生菌体の数は、２年後で、前記バッグ処方において５×１０9個以上であることが分かった。この結果より、該調製が本発明の所望する範囲に充分適当であることが分かった。
【実施例５】
【００６４】
ビタミン類を配合した軟ゲルカプセル処方
　下記処方の軟ゲルカプセルを調製した。
【００６５】
【表４】
2004097222.tif 000005
【００６６】
　すなわち、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１の細菌培養物、ビタミン類、大豆レシチン、ならびに脂肪酸モノおよびジグリセリドの大豆油中の均質懸濁液を調製し、食用ゼラチン、グリセロール、二酸化チタンおよび黄酸化鉄からなる７．５オーバルサイズ(oval size)のカプセルに該懸濁液を分配し、ついで約２１℃の温度および約２０％の湿度の気流で乾燥させることにより、軟ゲルカプセル剤を調製した。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動法による、全タンパク質のプロフィールの結果を示す。左から、レーン１はマーカー、レーン２はＬ．ファーメンタム（L. Fermentum）（ＡＴＣＣ　１４８６９）、レーン３および４はビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１、レーン５および６はビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａを示す。
【図２】種特異的プライマー（ＢＩＬＯＮ１／ＢＩＬＯＮ２、予想産物　８３１ｂｐ）と属特異的プライマー（ＰＯ／Ｌｍ３、予想産物　３８０ｂｐ）を組み合わせて用いたＰＣＲマルチプレックスの結果を示す。左から、レーン１および８はＰＣＲマーカー、レーン２はネガティブ試料、レーン３および４はビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１、レーン５および６はビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａ、レーン１１および１２はビフィドバクテリウム　ロンガム（ＡＴＣＣ　１５７０７）、レーン７、９、１０および１３はそれぞれ、Ｌ．アシドフィルス（L. acidophilus）（ＡＴＣＣ　４３５６）、Ｌ．パラカゼイ（L. paracasei）（ＡＴＣＣ　３３４）、Ｂ．ブレーべ（B. breve）（ＡＴＣＣ　１５７００）およびＳ．サーモフィルス（S. thermophilus）ＭＯ２を示す。
【図３】プライマー；ＯＰＡ０２、ＯＰＡ１８、ＯＰＬ０７、ＯＰＬ１６、ＯＰＭ０５を使用したＲＡＰＤプロフィールの結果を示す。左から、レーン１および７はＰＣＲマーカー、レーン２〜６は、それぞれ、ＯＰＡ０２、ＯＰＡ１８、ＯＰＬ０７、ＯＰＬ１６、ＯＰＭ０５を使用した際のビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１を示す。レーン８〜１２はそれぞれ、ＯＰＡ０２、ＯＰＡ１８、ＯＰＬ０７、ＯＰＬ１６、ＯＰＭ０５を使用した際のビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａを示す。
【図４】種特異的プライマーＢＩＬＯＮ１／ＢＩＬＯＮ２（予想産物　８３１ｂｐ）を用いたＰＣＲの結果を示す。左から、レーン１および１５はＰＣＲマーカー、レーン２はネガティブ試料、レーン３〜７は、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１（選択寒天培地から再単離されたコロニー）、レーン８〜１２はビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａ（選択寒天培地から再単離されたコロニー）、レーン１３および１４はビフィドバクテリウム　ロンガム（ＡＴＣＣ　１５７０７）を示す。
【図５】Ｄｔプライマーを用いたＲＥＰ　ＰＣＲプロフィールの結果を示す。左から、レーン１はマーカー、レーン２はネガティブ試料、レーン３および４は、ビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１、レーン６および７はビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａ、レーン８および９はビフィドバクテリウム　ロンガム（ＡＴＣＣ　１５７０８）、レーン１０および１１はビフィドバクテリウム　ロンガム（ＡＴＣＣ　１５７０７）、レーン１２および１３はＢ．ブレーべ（ＡＴＣＣ　１５７００）、レーン１４はＬ．アシドフィルス（ＡＴＣＣ　４３５６）を示す。
【図６】プライマー　Ｒ１６−Ｉ／ＬｂＬＭＡを用いた、ラクトバチルスに対する属特異的ＰＣＲの結果を示す。左から、レーン１はＰＣＲマーカー、レーン２はネガティブ試料、レーン３および４はＬ．アシドフィルス（ＡＴＣＣ　４３５６）、レーン５および６はビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａ、レーン７および８はＬ．ファーメンタム（ＡＴＣＣ　１４８６９）、レーン９および１０はビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１、レーン１１および１２はＬ．プランタラム（L. plantrum）（ＡＴＣＣ　１９８８）、レーン１３および１４はビフィドバクテリウム　ロンガム（ＡＴＣＣ　１５７０７）、レーン１５および１６はＬ．パラカゼイ（ＡＴＣＣ　２５３０２）を示す。
【図７】プラスミドのプロフィールの結果を示す。左から、レーン１はスーパーコイルであるＤＮＡマーカー、レーン２および３はビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１ａ、レーン４および５はビフィドバクテリウム　ロンガムＷ１１を示す。
【図１】
2004097222.tif 000006
【図２】
2004097222.tif 000007
【図３】
2004097222.tif 000008
【図４】
2004097222.tif 000009
【図５】
2004097222.tif 000010
【図６】
2004097222.tif 000011
【図７】
2004097222.tif 000012