(57)【要約】　　　（修正有）【課題】化粧品基材、医薬品等に有用な、リン脂質、該リン脂質の誘導体の製造に有用な性質を発揮しうる改変型ホスホリパーゼＤ及び安定性を補強する方法を提供する。【解決手段】Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａ’−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（配列中、Ａ’は、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　）のアミノ酸配列、又は該配列とＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによるアラインメントでのスコアが少なくとも４８である場合の配列同一性が少なくとも７５％であり、かつＡ’に対応する残基が、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　であるアミノ酸配列を含有してなる改変型ホスホリパーゼＤ、並びにＡに対応する残基が、Ｇｌｙ又はＡｓｐであるアミノ酸配列を含有したホスホリパーゼＤをコードする核酸において、前記アミノ酸残基Ａ又は該アミノ酸残基Ａに対応する残基をコードする核酸を、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＳｅｒをコードする核酸に置換することを特徴とする、発現するホスホリパーゼの安定性を増強する方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記配列：
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａ’−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ
（配列中、Ａ’は、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　を示す）（配列番号：２）で表されるアミノ酸配列、又は
該配列番号：２とＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによるアラインメントでのスコアが少なくとも４８である場合の配列同一性が少なくとも７５％であり、かつＡ’に対応する残基が、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　であるアミノ酸配列を含有してなり、ただし、配列番号：４、１２、１３又は１５に示される配列を除くものである改変型ホスホリパーゼＤ。
【請求項２】
放線菌由来のホスホリパーゼＤの改変により得られる、請求項１記載の改変型ホスホリパーゼＤ。
【請求項３】
ストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼＤの改変により得られる、請求項１又は２記載の改変型ホスホリパーゼＤ。
【請求項４】
熱安定性：６０℃で１０分のインキュベーション後の残存活性が、少なくとも８０％であること
の性質を有する、請求項１〜３いずれか１項に記載の改変型ホスホリパーゼＤ。
【請求項５】
下記配列：
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ
（配列中、Ａ　は、Ｇｌｙ　又はＡｓｐ　を示す）　（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列、又は
該配列番号：１とＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによるアラインメントでのスコアが少なくとも４８である場合に配列同一性が少なくとも７５％であり、かつＡ　に対応する残基が、Ｇｌｙ　又はＡｓｐ　であるアミノ酸配列
を含有したホスホリパーゼＤをコードする核酸において、前記アミノ酸残基Ａ　又は該アミノ酸残基Ａ　に対応する残基をコードする核酸を、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　をコードする核酸に置換することを特徴とする、発現するホスホリパーゼの安定性を増強する方法。
【請求項６】
ホスホリパーゼＤが、放線菌に由来するものである、請求項５記載の発現するホスホリパーゼの安定性を増強する方法。
【請求項７】
ホスホリパーゼＤが、ストレプトマイセス属に由来するものである、請求項５又は６記載の発現するホスホリパーゼの安定性を増強する方法。
【請求項８】
請求項５〜７いずれか１項に記載の発現するホスホリパーゼの安定性を増強する方法により得られる、改変型ホスホリパーゼＤ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リン脂質の合成、リン脂質の各種誘導体の合成等に有用な安定化型ホスホリパーゼＤ、すなわち、改変型ホスホリパーゼＤ、及びホスホリパーゼＤに、リン脂質の合成、リン脂質の各種誘導体の合成等に用いるに適した性質、特に、安定性を増強する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ホスホリパーゼＤは、植物、微生物、哺乳動物細胞等に存在し、リン脂質をホスファチジン酸と塩基（例えば、コリン、エタノールアミン等）とに加水分解する酵素であり、エタノール等のアルコール存在下では、ホスファチジル基転移反応を触媒する酵素である。
【０００３】
前記ホスホリパーゼＤとしては、例えば、ストレプトマイセス・スピーシーズＡＡ５８６株由来のホスホリパーゼＤ−Ｐ（例えば、特許文献１及び特許文献２を参照のこと）、ストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼＤ（例えば、特許文献３を参照のこと）及びノカルジナプシス属由来のホスホリパーゼＤ（例えば、特許文献４を参照のこと）、ストレプトマイセス・クロモフスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ　）の培養液から抽出されたホスホリパーゼＤ（例えば、特許文献５を参照）等が知られている。さらに、キャベツ、ニンジン、ホウレンソウ、綿実等の植物体からの抽出、又はストレプトマイセス属、ミクロノスポラ属、ノカルディオプシス属、アクチノマデューラ属、ノカルディア属等の微生物を用いた発酵法により製造できることが知られている（例えば、特許文献６〜１２及び非特許文献１〜４を参照のこと）。
【０００４】
また、ホスホリパーゼＤは、血中リン脂質測定試薬への利用の他、リン脂質の加水分解やホスホリパーゼの可逆反応を利用する塩基交換反応による誘導体の製造に利用されている酵素であることが知られている（例えば、特許文献１３及び特許文献１４を参照のこと）。
【０００５】
しかしながら、これらのホスホリパーゼＤは、リン脂質の合成、リン脂質の各種誘導体の合成等に用いるには、熱や有機溶媒に不安定であるという欠点がある。
【０００６】
【特許文献１】
特開昭５８−１５２４８１号公報
【特許文献２】
特開平５−２５２９３５号公報
【特許文献３】
特公昭５２−３９９１８号公報
【特許文献４】
特公昭６３−６２１９５号公報
【特許文献５】
特開平３−１８７３８２号公報
【特許文献６】
特公昭５８−５２６３３号公報
【特許文献７】
特公平１−１２４７４号公報
【特許文献８】
特公平８−８８６６号公報
【特許文献９】
特開昭５８−６３３８８号公報
【特許文献１０】
特開昭５８−６７１８３号公報
【特許文献１１】
特開昭６０−１６４４８３号公報
【特許文献１２】
特開平４−１６６０８３号公報、
【特許文献１３】
特開昭６３−３６７９０号公報
【特許文献１４】
特開昭６１−２３６７９３号公報
【非特許文献１】
ヨシタカ　コクショウ（Ｙｏｓｈｉｔａｋａ　Ｋｏｋｕｓｈｏ）　ら著、アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９８７年発行、第５１巻、９号、２５１５−２５２４頁
【非特許文献２】
キクオ　シンボ　（Ｋｉｋｕｏ　Ｓｈｉｍｂｏ）　ら著、アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９０年発行、第５４巻、５号、１１８９−１１９３頁
【非特許文献３】
キクオ　シンボ（Ｋｉｋｕｏ　Ｓｈｉｍｂｏ）ら著、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９３年日発行、第５７巻、１１号、１９４６−１９４８頁
【非特許文献４】
ジアコモ　カレア（Ｇｉａｃｏｍｏ　Ｃａｒｒｅａ）ら著、バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ）、１９９５年発行、第１２５５巻、２７３−２７９頁
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、化粧品基材、医薬品等に有用な、リン脂質、該リン脂質の誘導体の製造に有用な性質、特に、有機溶媒に対する安定性や熱に対する安定性等を発揮しうる、安定化型ホスホリパーゼＤ、すなわち、改変型ホスホリパーゼＤを提供することを目的とする。また、本発明は、天然又は組換体の野生型ホスホリパーゼＤに、化粧品基材、医薬品等に有用な、リン脂質、該リン脂質の誘導体の製造に有用な性質、特に、有機溶媒に対する安定性や熱に対する安定性等を付与することができる、発現するホスホリパーゼの安定性を増強する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、
〔１〕　下記配列：
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａ’−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ
（配列中、Ａ’は、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　を示す）（配列番号：２）で表されるアミノ酸配列、又は
該配列番号：２とＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによるアラインメントでのスコアが少なくとも４８である場合の配列同一性が少なくとも７５％であり、かつＡ’に対応する残基が、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　であるアミノ酸配列を含有してなり、ただし、配列番号：４、１２、１３又は１５に示される配列を除くものである改変型ホスホリパーゼＤ、
〔２〕　放線菌由来のホスホリパーゼＤの改変により得られる、前記〔１〕記載の改変型ホスホリパーゼＤ、
〔３〕　ストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼＤの改変により得られる、前記〔１〕又は〔２〕記載の改変型ホスホリパーゼＤ、
〔４〕　熱安定性：６０℃で１０分のインキュベーション後の残存活性が、少なくとも８０％であること
の性質を有する、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の改変型ホスホリパーゼＤ、
〔５〕　下記配列：
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ
（配列中、Ａ　は、Ｇｌｙ　又はＡｓｐ　を示す）　（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列、又は
該配列番号：１とＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによるアラインメントでのスコアが少なくとも４８である場合に配列同一性が少なくとも７５％であり、かつＡ　に対応する残基が、Ｇｌｙ　又はＡｓｐ　であるアミノ酸配列
を含有したホスホリパーゼＤをコードする核酸において、前記アミノ酸残基Ａ　又は該アミノ酸残基Ａ　に対応する残基をコードする核酸を、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　をコードする核酸に置換することを特徴とする、発現するホスホリパーゼの安定性を増強する方法、
〔６〕　ホスホリパーゼＤが、放線菌に由来するものである、前記〔５〕記載の発現するホスホリパーゼの安定性を増強する方法、
〔７〕　ホスホリパーゼＤが、ストレプトマイセス属に由来するものである、前記〔５〕又は〔６〕記載の発現するホスホリパーゼの安定性を増強する方法、並びに
〔８〕　前記〔５〕〜〔７〕いずれか１項に記載の発現するホスホリパーゼの安定性を増強する方法により得られる、改変型ホスホリパーゼＤ、
に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、熱安定性が低いストレプトマイセス　ハルステディ　　Ｋ１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈａｌｓｔｅｄｉｉ　Ｋ１）　株由来ホスホリパーゼＤ（Ｋ１ＰＬＤ）と、熱安定性が高いストレプトマイセス　セプタタス　　ＴＨ−２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｅｐｔａｔｕｓ　ＴＨ−２）株由来ホスホリパーゼＤ（ＴＨ−２ＰＬＤ）とから作製したキメラホスホリパーゼＤ（キメラＰＬＤ）において、ＴＨ−２ＰＬＤに由来するペプチド部分の含有量の大きさとは無関係に、低い熱安定性を呈するキメラＰＬＤが存在するという本発明者らの驚くべき知見に基づくものであり、かかる知見により、ホスホリパーゼＤにおける特定の領域に、ホスホリパーゼＤの安定性の向上に関与する残基が存在するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
【００１０】
かかる知見によれば、野生型ホスホリパーゼＤよりも安定性を増強させた安定化型ホスホリパーゼＤ、すなわち、改変型ホスホリパーゼＤが提供される。
【００１１】
本明細書において、「野生型ホスホリパーゼＤ」とは、生物において天然に生じる天然型ホスホリパーゼＤ及び該天然型ホスホリパーゼＤをコードする核酸を本来の起源とは異なる生物に導入して発現させることにより得られた組換ホスホリパーゼＤのいずれをも包含することを意図する。前記野生型ホスホリパーゼＤとしては、下記配列：
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ
（配列中、Ａ　は、Ｇｌｙ　又はＡｓｐ　を示す）　（配列番号：１）をモチーフとして含有したホスホリパーゼＤが挙げられる。
【００１２】
前記野生型ホスホリパーゼＤとしては、好ましくは、放線菌、より好ましくは、ストレプトマイセス属の菌、アクチノマデューラ属の菌、キタサトスポラ属の菌等に由来するホスホリパーゼＤが挙げられる。前記ストレプトマイセス属の菌としては、具体的にはストレプトマイセス・セプタタス、ストレプトマイセス・アンチバイオティカス等が挙げられる。
【００１３】
より具体的には、野生型ホスホリパーゼＤのアミノ酸配列としては、配列番号：６、１１又は１４に示された配列等が挙げられる。
【００１４】
本明細書において、「改変型ホスホリパーゼＤ」とは、天然には存在しない非天然型のアミノ酸配列を有する組換ホスホリパーゼＤを包含することを意図する。
【００１５】
また、本発明は、配列番号：１に示される配列を含有したホスホリパーゼＤにおいて、前記アミノ酸残基Ａ　を、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　に置換することにより、驚くべく安定性が増強するという本発明者らの知見に基づく。
【００１６】
本発明の改変型ホスホリパーゼＤとしては、下記配列：
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａ’−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ
（配列中、Ａ’は、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　を示す）（配列番号：２）で表されるアミノ酸配列を含有した改変型ホスホリパーゼＤである。
【００１７】
本発明の改変型ホスホリパーゼＤは、前記配列番号：２のアミノ酸配列を含有することに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の改変型ホスホリパーゼＤによれば、前記配列番号：１の配列を含有した野生型ホスホリパーゼＤに比べて、より高い安定性を呈するという優れた性質を発現する。そのため、本発明の改変型ホスホリパーゼＤによれば、化粧品基材、医薬品等に有用な、リン脂質、該リン脂質の誘導体の製造の際の反応条件下に、活性を安定して保持及び発現することができ、改変型ホスホリパーゼＤを繰返して使用できるという優れた効果を発揮する。また、本発明の改変型ホスホリパーゼＤによれば、酵素反応において最大活性を与える温度域が高温にまで広がり、高い温度で酵素反応を行なうことができるという優れた効果を発揮する。本発明の改変型ホスホリパーゼＤは、有機溶媒に対して安定であるため、例えば、担体に固定化し、水と水に不溶な有機溶媒の混合系において、ホスファチジルセリン等の機能性リン脂質を製造する際のホスホリパーゼＤの繰返し使用等が可能になるという優れた効果を発揮する
【００１８】
本発明の改変型ホスホリパーゼＤの具体例としては、ＴＨ−２ＰＬＤのアミノ酸配列（配列番号：６）中の１８８番目のグリシン残基（Ｇｌｙ）　が、バリン残基（Ｖａｌ）　、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）　、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）　又はセリン残基（Ｓｅｒ）　に置換された配列からなるホスホリパーゼＤ；配列番号：８（キメラＰＬＤ　Ｃ）、配列番号：１１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．　由来ＰＬＤ）　、配列番号：１４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ由来ＰＬＤ）　、又は配列番号：１６（キメラＰＬＤ　Ａ）中に存在する前記配列番号：１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：６の残基が、バリン残基（Ｖａｌ）　、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）　、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）　又はセリン残基（Ｓｅｒ）　に置換された配列からなるホスホリパーゼＤ；キメラＰＬＤ　Ｂ中に存在する前記配列番号：１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：６の残基が、バリン残基（Ｖａｌ）　、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）　、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）　又はセリン残基（Ｓｅｒ）　に置換された配列からなるホスホリパーゼＤ、後述の実施例における変異酵素Ｃ１、変異酵素Ｃ２、変異酵素Ｃ４等が挙げられる。なお、配列番号：４、１２、１３又は１５に示される配列からなるホスホリパーゼＤは、本発明の改変型ホスホリパーゼＤから除かれる。
【００１９】
ホスホリパーゼＤの活性は、（１）加水分解活性及び／又は（２）転移活性により評価されうる。
【００２０】
前記（１）加水分解活性は、例えば、
（Ｉ）測定対象のタンパク質１００ｎｇ相当量の水溶液０．１ｍｌを、反応液〔組成：２ｍＭ　ホスファチジルパラニトロフェノール、１００ｍＭ　酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．６２５％　ＴｒｉｔｏｎＴＭＸ　　１００）　０．９ｍｌに添加し、３７℃で、インキュベートしながら、１分間あたりの３６０ｎｍでの吸光度変化量を求めるステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた吸光度変化量から、ｐＨ５．５におけるパラニトロフェノールのミリモル分子吸光係数６．８に基づき、１分間あたりのパラニトロフェノールの生成量を算出するステップ
を行なうことにより評価されうる。なお、ホスホリパーゼＤの加水分解活性の１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのパラニトロフェノールを遊離させる酵素活性として定義される。
【００２１】
前記（２）転移活性は、例えば、
（ｉ）測定対象のタンパク質２００ｎｇ相当量の水溶液０．０５ｍｌを反応用エマルジョン〔１１．４２ｍＭ　パラニトロフェノールと、７．５ｍＭ　酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と、５７．１４ｗ／　ｗ％　ベンゼンと、２．８６ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミンとを含む混合液を、１５分間、超音波にて分散させ、エマルジョン化し、３７℃で５分間加熱させたもの〕　０．３５ｍｌに添加し、得られた混合物を３７℃、１０分間インキュベートするステップ、
（ｉｉ）前記ステップ（ｉ）で得られた産物に、１Ｎ　塩酸　０．１ｍｌを添加し反応を停止するステップ、
（ｉｉｉ）　前記ステップ（ｉｉ）で得られた混合物に、１Ｎ　水酸化ナトリウム溶液　０．１５ｍｌとクロロホルム／メタノール（３／１）溶液０．４ｍｌとを添加し、ついで、得られた混合物を４℃で１０分間遠心するステップ、及び
（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）　で得られた水相０．０２ｍｌと０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．１８ｍｌとを混合し、得られた混合物について、４０５ｎｍの吸光度を測定するステップ、
を行なうことにより評価されうる。なお、ホスホリパーゼＤの転移活性の１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのパラニトロフェノールを遊離させる酵素活性として定義される。
【００２２】
本発明の改変型ホスホリパーゼＤは、高い安定性を呈する。前記安定性としては、具体的には、例えば、熱安定性：６０℃で１０分のインキュベーション後の残存活性が、少なくとも８０％であること
等が挙げられる。なお、ここで、前記残存活性とは、６０℃で１０分のインキュベーションをしなかった場合のホスホリパーゼＤの加水分解活性を１００として、６０℃で１０分のインキュベーション後の加水分解活性から算出される値をいう。
【００２３】
なお、本発明の改変型ホスホリパーゼＤにおいては、前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列は、ホスホリパーゼＤにおける前記安定性を妨げない配列、好ましくは、ホスホリパーゼＤの疎水性度を増加させ、かつパッキングの密度を増加させる性質を妨げない配列であり、かつ前記アミノ酸残Ａ’に対応する残基、具体的には、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　を保持するものであれば、前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは、８５％以上、より好ましくは、８７％以上の配列同一性を有する配列であってもよい。ここで、前記配列同一性は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによるアラインメントのスコアが少なくとも４８、好ましくは５２以上であり、かつホスホリパーゼＤの活性の発現を妨げない配列であればよく、かかるアライメントにより、１若しくは数個のギャップを有する配列であってもよい。すなわち、本発明の改変型ホスホリパーゼＤには、配列番号：２とＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによるアラインメントでのスコアが少なくとも４８である場合に配列同一性が少なくとも７５％であり、かつＡ’に対応する残基が、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　であるアミノ酸配列を含有した改変型ホスホリパーゼＤ（ただし、配列番号：４、１２、１３又は１５に示される配列からなるホスホリパーゼＤを除く）も包含される。
【００２４】
本発明の改変型ホスホリパーゼＤは、下記配列：
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ
（配列中、Ａ　は、Ｇｌｙ　又はＡｓｐ　を示す）　（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列を含有したホスホリパーゼＤをコードする核酸において、前記アミノ酸残基Ａ　又は該アミノ酸残基Ａ　に対応する残基をコードする核酸を、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　をコードする核酸に置換することにより得ることができる。
【００２５】
前記配列番号：１に示される配列を含有したホスホリパーゼＤとしては、放線菌由来ホスホリパーゼＤ、具体的には、ストレプトマイセス属由来ホスホリパーゼＤ、より具体的には、ストレプトマイセス・スピーシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）由来ホスホリパーゼＤ（配列番号：１１、ＤＤＢＪアクセッション番号：Ｅ０５５１４）、ストレプトマイセス・アンチバイオティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｖｉｏｔｉｃｕｓ）　由来ホスホリパーゼＤ（配列番号：１４）、ストレプトマイセス・セプタタスＴＨ−２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｅｐｔａｔｕｓ　ＴＨ−２）由来ホスホリパーゼＤ（配列番号：６、ＤＤＢＪアクセッション番号：ＡＢ０５８７８３）等が挙げられる。
【００２６】
なお、本発明においては、前記配列番号：１に示されるアミノ酸配列は、該アミノ酸配列を含有するポリペプチドが、ホスホリパーゼＤの活性を発現するものであり、かつ前記アミノ酸残基Ａ　に対応する残基、具体的には、Ｇｌｙ　又はＡｓｐ　を保持するものであれば、前記配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは、８５％以上、より好ましくは、８７％以上の配列同一性を有する配列であってもよい。ここで、前記配列同一性は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによるアラインメントのスコアが少なくとも４８、好ましくは５２以上であればよく、かかるアライメントにより、１若しくは数個のギャップを有する配列であってもよい。
【００２７】
したがって、本発明の改変型ホスホリパーゼＤとしては、好ましくは、放線菌、より好ましくは、ストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼＤの改変により得られるもの等が挙げられる。
【００２８】
本発明の改変型ホスホリパーゼＤは、例えば、
（ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、又は
該配列番号：１とＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによるアラインメントでのスコアが少なくとも４８である場合に配列同一性が少なくとも７５％であり、かつＡ　に対応する残基が、Ｇｌｙ　又はＡｓｐ　であるアミノ酸配列
を含有したホスホリパーゼＤをコードする核酸において、前記アミノ酸残基Ａ　をコードする核酸又は該アミノ酸残基Ａ　に対応する残基をコードする核酸を、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　をコードする核酸に置換して、核酸構築物を得る工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸構築物を宿主に導入し、形質転換体を得る工程、及び
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた形質転換体を培養して、核酸構築物の発現産物としてホスホリパーゼＤを得る工程、
により得られうる。
【００２９】
前記工程（ａ）において、前記アミノ酸残基Ａ　をコードする核酸又は該アミノ酸残基Ａ　に対応する残基をコードする核酸の、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　をコードする核酸への置換は、例えば、ギャップド・デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ　）法、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法、ＰＣＲによる変異導入法等の慣用の部位特異的変異導入方法等により行なわれうる。また、アミノ酸残基Ａ　又は該アミノ酸Ａ　に対応する残基をコードする核酸を、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　をコードする核酸に置換する場合、ホスホリパーゼＤを発現させるための宿主のコドン使用頻度に合わせ、使用する核酸をデザインすることができる。
【００３０】
前記核酸構築物の作製には、使用する宿主に応じて、慣用のベクターを用いうる。前記ベクターとしては、例えば、宿主が、大腸菌の場合、ｐＵＣ１８及びその誘導体、ｐＢＲ３２２及びその誘導体、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ及びその誘導体、ｐＧＥＭ（登録商標）及びその誘導体等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１等のファージベクターが挙げられ、宿主が、酵母の場合、ｐＹＡＣ誘導体等が挙げられる。前記核酸構築物は、誘導可能なプロモーター、選択用マーカー遺伝子、ターミネーター等の因子を含有してもよい。また、前記核酸構築物は、発現対象のポリペプチドの単離精製が容易になるように、発現対象のポリペプチドがＨｉｓ　タグ、ＧＳＴ　融合タンパク質として発現されうる配列を含有してもよい。
【００３１】
前記工程（ｂ）において、宿主への核酸構築物の導入は、慣用の形質転換法、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等が挙げられる。
【００３２】
前記宿主としては、大腸菌、酵母、枯草菌、緑濃菌、サルモネラ菌、Ｌ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ｓｆ９細胞等が挙げられる。前記大腸菌としては、具体的には、ＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株等が挙げられる。
【００３３】
前記工程（ｃ）において、形質転換体の培養は、使用した宿主、ベクター等に応じて、適宜条件を設定できる。
【００３４】
また、前記工程（ｃ）において、核酸構築物の発現産物であるホスホリパーゼＤは、形質転換体の培養物から、一般的な生化学的方法によって単離精製されうる。
【００３５】
本発明の改変型ホスホリパーゼＤの製造の具体例としては、例えば、後述の実施例に記載の方法等が挙げられるが、本発明は、かかる例示に限定されるものではない。
【００３６】
本発明によれば、前記配列番号：１に示されるアミノ酸配列、又は
該配列番号：１とＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによるアラインメントでのスコアが少なくとも４８である場合に配列同一性が少なくとも７５％であり、かつＡ　に対応する残基が、Ｇｌｙ　又はＡｓｐ　であるアミノ酸配列
を含有したホスホリパーゼＤについて、安定性を増強させることが可能になる。したがって、本発明には、発現するホスホリパーゼの安定性を増強する方法も含まれる。
【００３７】
本発明の発現するホスホリパーゼの安定性を増強する方法は、下記配列：
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ
（配列中、Ａ　は、Ｇｌｙ　又はＡｓｐ　を示す）　（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列、又は
該配列番号：１とＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによるアラインメントでのスコアが少なくとも４８である場合に配列同一性が少なくとも７５％であり、かつＡ　に対応する残基が、Ｇｌｙ　又はＡｓｐ　であるアミノ酸配列
を含有したホスホリパーゼＤをコードする核酸において、前記アミノ酸残基Ａ　又は該アミノ酸残基Ａ　に対応する残基をコードする核酸を、Ｖａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　又はＳｅｒ　をコードする核酸に置換することに１つの大きな特徴がある。したがって、前記アミノ酸配列を含有したホスホリパーゼＤの安定性、例えば、熱安定性をより増強することができるという優れた効果を発揮する。
【００３８】
本発明の安定性の増強方法は、前記改変型ホスホリパーゼＤの製造における工程（ａ）〜（ｃ）と同様の工程を行なうことにより実施されうる。
【００３９】
かかる安定性の増強方法により得られたホスホリパーゼＤは、有機溶媒に対して安定であるため、例えば、担体に固定化し、水と水に不要な有機溶媒の混合系でのホスファチジルセリン等の機能性リン脂質製造でのホスホリパーゼＤの繰り返し使用への応用が可能になるという優れた効果を発揮する。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
【００４１】
製造例１　キメラホスホリパーゼＤ（キメラＰＬＤ）の作製
キメラＰＬＤの作製のための融合対象のホスホリパーゼＤをコードする核酸として、熱安定性が低いストレプトマイセス　ハルステディ　　Ｋ１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈａｌｓｔｅｄｉｉ　Ｋ１）　株由来ホスホリパーゼＤ（以下、Ｋ１ＰＬＤという）をコードする核酸（ＤＤＢＪアクセッション番号：ＡＢ０６２１３６）と、熱安定性が高いストレプトマイセス　セプタタス　　ＴＨ−２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｅｐｔａｔｕｓ　ＴＨ−２）株由来ホスホリパーゼＤ（以下、ＴＨ−２ＰＬＤ）をコードする核酸（ＤＤＢＪ　アクセッション番号：ＡＢ０５８７３）　とを用いた。なお、前記Ｋ１ＰＬＤのアミノ酸配列を配列番号：４に示し、Ｋ１ＰＬＤをコードする核酸の塩基配列を配列番号：３に示す。また、前記ＴＨ−２ＰＬＤのアミノ酸配列を配列番号：６に示し、ＴＨ−２ＰＬＤをコードする核酸の塩基配列を配列番号：５に示す。
【００４２】
前記Ｋ１ＰＬＤをコードする核酸と、ＴＨ−２ＰＬＤをコードする核酸とを用い、Ｎ末端側にＫ１ＰＬＤ由来のポリペプチドが配置され、かつＣ末端側にＴＨ−２ＰＬＤ由来のポリペプチドが配置されたキメラＰＬＤ群（以下、Ｋ１／ＴＨ−２と総称する）を作製した。
【００４３】
キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２の作製のために、前記Ｋ１ＰＬＤをコードする核酸と、ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ　）の制御下に発現するネズミチフス菌由来フラジェリン遺伝子であるｆｌｊＢ遺伝子と、ＴＨ−２ＰＬＤをコードする核酸と、インフレームで発現するｌａｃＺとを、この順にｐＡＣＹＣ１８４上にタンデムに配置し、これらの核酸の間にストレプトマイシン及びスペクチノマイシン耐性遺伝子を挿入して、Ｋ１／ＴＨ−２融合遺伝子調製用ベクターを構築した。なお、ＴＨ−２ＰＬＤのＣ末端側のＨＫＤモチーフのアスパラギン酸以降の領域が、宿主細胞に対して毒性を呈するため、かかるＨＫＤモチーフのアスパラギン酸以降の領域に対応する部分を除去して得られた核酸（配列番号：５の塩基番号：１５１〜１４７９を用いた。
【００４４】
エレクトロポレーション法により、得られた融合遺伝子調製用ベクターを、ストレプトマイシン耐性であり、かつ一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子にｓｓｂ−３変異を有する大腸菌ＭＫ１０１９株に導入し、得られた形質転換体を、グルコース最小培地〔組成：グルコース（２　ｇ／　Ｌ）、フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（０．５　ｇ／　Ｌ）、５−ブロモ−４　−クロロ−３−ガラクトピラノシドを含むｍｉｎｉｍａｌ　Ａ　培地（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ著、Ａ　Ｓｈｏｒｔ　Ｃｏｕｒｓｅ　ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ａｎｄ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｆｏｒ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎ．Ｙ．　に記載）　〕に播種し、青色を呈するｐａｐｉｌｌａｅを選別し、シングルコロニーを得た。
【００４５】
得られたシングルコロニーより、慣用の方法により、それぞれキメラＰＬＤを得た。
【００４６】
試験例１　ホスホリパーゼＤの活性測定
（１）ホスホリパーゼＤの加水分解活性の測定
測定対象のタンパク質１００ｎｇ相当量の水溶液０．１ｍｌを、反応液〔組成：２ｍＭ　ホスファチジルパラニトロフェノール、１００ｍＭ　酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．６２５％　ＴｒｉｔｏｎＴＭＸ１００〕０．９ｍｌに添加し、３７℃で、インキュベートしながら、１分間当たりの３６０ｎｍでの吸光度変化量を求め、得られた吸光度変化量から、ｐＨ５．５におけるパラニトロフェノールのミリモル分子吸光係数６．８に基づき、１分間当たりのパラニトロフェノールの生成量を算出した。なお、ホスホリパーゼＤの加水分解活性の１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのパラニトロフェノールを遊離させる酵素活性として定義した。
【００４７】
（２）ホスホリパーゼＤの転移活性の測定
各種濃度のパラニトロフェノールの希釈系列について、４０５ｎｍの吸光度を測定し、検量線を作成した。
【００４８】
測定対象のタンパク質２００ｎｇ相当量の水溶液０．０５ｍｌを反応用エマルジョン〔１１．４２ｍＭ　パラニトロフェノールと、７．５ｍＭ　酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と、５７．１４ｗ／　ｗ％ベンゼンと、２．８６ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンとを含む混合液を１５分間超音波にて分散させ、エマルジョン化し、３７℃で５分間加熱させたもの）０．３５ｍｌに添加し、得られた混合物を３７℃、１０分間インキュベートした。得られた産物に、１Ｎ　塩酸０．１ｍｌを添加し反応を停止した。得られた混合物に、１　Ｎ　水酸化ナトリウム溶液０．１５ｍｌとクロロホルム／メタノール（３／１）溶液０．４ｍｌとを添加した後、得られた混合物を４℃で１０分間遠心した。得られた水相０．０２ｍｌと０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．１８ｍｌとを混合し、得られた混合物について、４０５ｎｍの吸光度を測定した。得られた測定値より、前記検量線に基づき、転移反応によるパラニトロフェノール生成量を算出した。なお、ホスホリパーゼＤの転移活性の１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのパラニトロフェノールを遊離させる酵素活性として定義した。
【００４９】
比較例１　キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２の活性測定
前記製造例１で得られたキメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２について、前記試験例１の（１）及び（２）のように、ホスホリパーゼＤの加水分解活性の測定及び転移活性を測定した。
【００５０】
その結果、キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２について、ホスホリパーゼＤの加水分解活性及び転移活性は検出されなかった。
【００５１】
実施例１　活性を呈するキメラＰＬＤの作製
前記試験例１の結果より、ホスホリパーゼＤ活性を検出することができなかったため、キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２のＣ末端側に、Ｋ１のＣ末端側６７アミノ酸（配列番号：４のアミノ酸番号：４３８〜５０４）を有するキメラＰＬＤ群（以下、Ｋ１／ＴＨ−２／Ｋ１と総称する）の作製を試みた。
【００５２】
前記製造例１で得られた各菌株から、慣用の方法によりプラスミドを単離し、該プラスミドのそれぞれから、キメラＰＬＤをコードする断片を得た。
【００５３】
ついで、得られた各断片中、Ｋ１／ＴＨ−２のＣ末端に対応する位置の直後に、Ｋ１ＰＬＤのＣ末端６７アミノ酸をコードする核酸（配列番号：３の塩基番号：１５２３〜１７２１）をそれぞれ連結し、得られた産物を、発現ベクターｐＥＴＫｍＳ２　〔名古屋大学の岩崎雄吾先生より供与されたもの、ナオト　ミシマ（Ｎａｏｔｏ　Ｍｉｓｈｉｍａ）　ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ．，　１３（１９９７）　８６４−８６８　に記載〕に挿入し、キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２／Ｋ１の発現用ベクターを得た。
【００５４】
得られた発現ベクターを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ホスホリパーゼＤの加水分解活性を指標として、Ｋ１／ＴＨ−２／Ｋ１を発現する菌株を得た。
【００５５】
ついで、得られた各菌株より、慣用の方法により、それぞれキメラＰＬＤを得た。
【００５６】
キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２／Ｋ１について、前記試験例１の活性測定法と同様に、ホスホリパーゼＤの加水分解活性を測定した。
【００５７】
また、ホスホリパーゼＤの活性を呈するキメラＰＬＤを産生する菌株から、慣用の方法により、プラスミドを単離した。ついで、前記プラスミドを用いて、スークエンスを行ない、キメラＰＬＤの組換ポイントの位置を決定した。
【００５８】
その結果、図１に示されるキメラＰＬＤ　Ａ〜Ｆが、ホスホリパーゼＤ活性を呈することがわかり、キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２のＣ末端側に、Ｋ１のＣ末端側６７アミノ酸に配置することにより、ホスホリパーゼＤの活性を発現させることがはじめて可能になることがわかった。
【００５９】
実施例２　キメラＰＬＤ群Ｋ１／ＴＨ−２／Ｋ１の性質検討
図１に示されるキメラＰＬＤ　Ａ〜Ｆのそれぞれについて、熱安定性を調べた。
【００６０】
Ｋ１ＰＬＤ、ＴＨ−２ＰＬＤ、キメラＰＬＤ　Ａ〜Ｆ　各０．００５Ｕ相当量水溶液０．０２ｍｌを６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後のＫ１ＰＬＤ、ＴＨ−２ＰＬＤ、キメラＰＬＤ　Ａ〜Ｆについて、前記試験例１と同様に、加水分解活性を測定した。なお、対照として、６０℃で１０分間のインキュベーションをしないＫ１ＰＬＤ、ＴＨ−２ＰＬＤ、キメラＰＬＤ　Ａ〜Ｆ　各０．００５Ｕ相当量水溶液０．０２ｍｌを用い、前記と同様に加水分解活性を測定した。その結果を図２に示す。図２中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。
【００６１】
その結果、図２に示すように、キメラＰＬＤ　Ａ〜Ｆは、熱安定性が高いＴＨ−２ＰＬＤに由来するペプチドの含有量に非依存的に耐熱性を示すことがわかった。特に、キメラＰＬＤ　Ｃは、熱安定性が高いＴＨ−２ＰＬＤに由来する２６５アミノ酸からなるペプチド部分を有するにもかかわらず、予想外にも、６０℃で１０分間のインキュベーションにより、著しく残存活性が少なく、熱安定性が低いことがわかった。
【００６２】
実施例３　キメラＰＬＤ　Ｃの熱安定性に関与するアミノ酸残基の検討
前記実施例２の結果に基づき、Ｋ１ＰＬＤ及びＴＨ−２ＰＬＤについて、高い配列類似性を有するストレプトマイセス・スピーシーズ　ＰＭＦ株由来のＰＬＤの３次元構造データとの比較により、イオンペアを形成することができ、かつ熱安定性に関与することが予想されるアミノ酸残基の候補を抽出した。ここで、候補の抽出の際には、アルギニン残基とイオンペアを形成する可能性のある半径３Å内のアミノ酸残基であることを条件とした。ストレプトマイセス・スピーシーズ　ＰＭＦ株由来のＰＬＤのアミノ酸配列を参照して、抽出されたアミノ酸残基の位置を、キメラＰＬＤ　Ａ〜Ｆにおける組換ポイントとともに図３に示す。
【００６３】
その結果、図３に示されるように、キメラＰＬＤ　Ｃは、キメラＰＬＤ　Ｃの１８８位と１９３位とからなるイオンペアの上流に、Ｋ１ＰＬＤ由来ペプチドとＴＨ−２ＰＬＤ由来ペプチドとの組換ポイントがあった。
【００６４】
そこで、かかる１８８位周辺のアミノ酸残基が存在するαヘリックスにおいて、キメラＰＬＤ　Ｃ〔アミノ酸配列を配列番号：８に示し、塩基配列を配列番号：７に示す〕と、該キメラＰＬＤ　Ｃについで熱安定性が低いキメラＰＬＤ　Ｄ〔アミノ酸配列を配列番号：１０に示し、塩基配列を配列番号：９に示す〕との間で異なる４残基について、耐熱性への関与を検討した。
【００６５】
キメラＰＬＤ　Ｃについて、図４に示す変異酵素Ｃ１〜Ｃ４を作製した。
【００６６】
具体的には、変異酵素Ｃ１に関して、キメラＰＬＤ　Ｃをコードする核酸を制限酵素ＡａｔＩＩで消化し、得られた約４５０ｂｐの断片（配列番号：７の塩基番号：５９８〜１０４５）を、キメラＰＬＤ　Ｄの相当部分（配列番号：９の塩基番号：５９８〜１０４５）と置換した核酸構築物を作製し、実施例２と同様にして変異酵素Ｃ１を得た。
【００６７】
変異酵素Ｃ２に関して、プライマーＡ〔ＣＣＡＴＧＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＣＣＣＡＣＡＣＣＧＣＡ（配列番号：１９）〕とプライマーＣ２〔ＧＴＣＧＡＣＧＴＣＣＧＡＣＡＣＣＧＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＣＧＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＣＣ（配列番号：２０）〕とを用い、キメラＰＬＤ　Ｃをコードする核酸を鋳型とし、ＧＣ−ＲＩＣＨ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍキット（ロッシュ社製）を用いてＰＣＲを行なった。
【００６８】
なお、前記プライマーＡは、キメラＰＬＤ　Ｃの塩基配列（配列番号：７）の塩基番号：１の塩基の５’末端側に、ＮｃｏＩ認識部位を付加したプライマーであり、前記プライマーＣ２は、キメラＰＬＤ　Ｃの塩基配列（配列番号：７）の塩基番号：５４７〜６０６において、塩基番号：５５６のＧをＡに、塩基番号：５７４のＧをＣに変異させることによって、配列番号：８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１８６番目のＧｌｙをＳｅｒに、１９２番目のＶａｌをＬｅｕに変異させるプライマーである。
【００６９】
ＰＣＲ条件は、プライマー濃度を１μＭ、アニーリング温度を５０℃、伸長時間を３０秒とした以外は、前記キットに添付のプロトコールにしたがった。
【００７０】
ＰＣＲで得られた約６００ｂｐの増幅産物を、ＴＡクローニングキット（プロメガ社製）のｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ　Ｅａｓｙに挿入し、塩基配列を確認した。その後、前記増幅産物とキメラＰＬＤ　Ｃ遺伝子の制限酵素ＮｃｏＩ及びＳａｌＩで切り出される部分とを置換することにより、キメラＰＬＤ　Ｃ２をコードする核酸構築物を得た。前記核酸構築物を用い、実施例２と同様にして変異酵素Ｃ２を得た。
【００７１】
変異酵素Ｃ３に関し、前記プライマーＡと、プライマーＣ３〔ＧＴＣＧＡＣＧＴＣＣＧＡＣＡＣＣＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＡＡＣＧＴＡＧＴＣＧＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＣＣ　（配列番号：２１）〕とを用い、キメラＰＬＤ　Ｃをコードする核酸を鋳型とし、ＧＣ−ＲＩＣＨ　ＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍキット（ロッシュ社製）を用いてＰＣＲを行なった。
【００７２】
なお、前記プライマーＣ３は、キメラＰＬＤ　Ｃの塩基配列（配列番号：７）の塩基番号：５４７〜６０６において、５５６番目のＧをＡに、５８３番目のＴをＡに変異させることによって、配列番号：８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：１８６番目のＧｌｙをＳｅｒに、１９５番目のＳｅｒ　をＴｈｒ　に変異させる、さらに、塩基番号：５７６のＣをＴに変異させることにより、アミノ酸残基（Ｖａｌ　）を変化させることなく、この部位にあるＳａｌＩ部位を消滅させるプライマーである。
【００７３】
ＰＣＲ条件は、プライマー濃度を１μＭ、アニーリング温度を５０℃、伸長時間を３０秒とした以外は、前記キットに添付のプロトコールにしたがった。
【００７４】
ＰＣＲで得られた約６００ｂｐの増幅産物を、ＴＡクローニングキット（プロメガ社製）のｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ　Ｅａｓｙに挿入し、塩基配列を確認した。その後、前記増幅産物とキメラＰＬＤ　Ｃ遺伝子の制限酵素ＮｃｏＩ及びＳａｌＩで切り出される部分とを置換することにより、キメラＰＬＤ　Ｃ３をコードする核酸構築物を得た。前記核酸構築物を用い、実施例２と同様にして変異酵素Ｃ３を得た。
【００７５】
変異酵素Ｃ４に関し、前記プライマーＡと、プライマーＣ４〔ＧＴＣＧＡＣＧＴＣＣＧＡＣＡＣＣＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＣＧＴＣ　（配列番号：２２）〕とを用い、キメラＰＬＤＣをコードする核酸を鋳型とし、ＧＣ−ＲＩＣＨ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍキット（ロッシュ社製）を用いてＰＣＲを行なった。
【００７６】
なお、前記プライマーＣ４は、キメラＰＬＤ　Ｃの塩基配列（配列番号：７）の塩基番号：５６５〜６０６において、塩基番号：５７４のＧをＣに、塩基番号：５８３のＴをＡに変異させることによって、配列番号：８に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：１９２のＶａｌ　をＬｅｕ　に、アミノ酸番号：１９５のＳｅｒ　をＴｈｒ　に変異させるプライマーである。
【００７７】
ＰＣＲ条件は、プライマー濃度を１μＭ、アニーリング温度を５０℃、伸長時間を３０秒とした以外は、前記キットに添付のプロトコールにしたがった。
【００７８】
ＰＣＲで得られた約６００ｂｐの増幅産物を、ＴＡクローニングキット（プロメガ社製）のｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ　Ｅａｓｙに挿入し、塩基配列を確認した。その後、前記増幅産物と、キメラＰＬＤ　Ｃ遺伝子の制限酵素ＮｃｏＩ及びＳａｌＩで切り出される部分とを置換することにより、キメラＰＬＤ　Ｃ４をコードする核酸構築物を得た。前記核酸構築物を用い、実施例２と同様にして変異酵素Ｃ４を得た。
【００７９】
ついで、キメラＰＬＤ　Ｃ及び前記変異酵素Ｃ１〜Ｃ４　各０．００５Ｕ相当量水溶液０．０２ｍｌを６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後のキメラＰＬＤ　Ｃ及び変異酵素Ｃ１〜Ｃ４について、前記試験例１と同様に、加水分解活性を測定した。なお、対照として、６０℃で１０分間のインキュベーションをしないキメラＰＬＤ　Ｃ及び変異酵素Ｃ１〜Ｃ４　各０．００５Ｕ相当量水溶液０．０２ｍｌを用い、前記と同様に加水分解活性を測定した。その結果を図５に示す。図５中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。
【００８０】
図５に示されるように、６０℃での耐熱性が劣るものは、１８８位に対応する残基が、ＴＨ−２と同じグリシンである変異酵素であり、６０℃での耐熱性が著しく向上したものは、いずれもＫ１と同じセリンである変異酵素であることがわかった。
【００８１】
実施例４　ＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素の作製
１８８位に対応するセリン残基と耐熱性との関係をさらに検討するために、比較的安定なＴＨ−２ＰＬＤについて、変異酵素を作製し、熱安定性を評価した。
【００８２】
ＴＨ−２ＰＬＤにおいては、前記セリン残基に対応する位置は、配列番号：６に示されるアミノ酸配列中、１８８位のグリシン（Ｇ）に相当する。そこで、１８８位のＧを他の１９アミノ酸のそれぞれに置換した１９種の変異酵素を作製した。
【００８３】
具体的には、まず、プライマーＴ１〔ＡＧＣＧＣＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＣＧＡ　　（配列番号：２３）とプライマーＴ２〔ＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＧＡＧＧＣＣ　（配列番号：２４）〕とを用い、ＴＨ−２ＰＬＤをコードした核酸を鋳型として、ＧＣ−ＲＩＣＨ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍキット（ロッシュ社製）を用いてＰＣＲを行なった。
【００８４】
なお、前記プライマーＴ１は、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列（配列番号：５）の塩基番号：１１３２〜１１５１に相当する配列からなるプライマーである。また、前記プライマーＴ２は、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列（配列番号：５）の塩基番号：１６６３〜１６６７の下流にＣＧＧＡＴＣＣ　を付加した配列からなり、得られた増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＴＫｍＳ２のＢａｍＨＩ認識部位に挿入することにより、Ｈｉｓタグがインフレームで挿入されるようにデザインしたプライマーである。
【００８５】
ＰＣＲ条件は、プライマー濃度を１μＭ、アニーリング温度を５０℃、伸長時間を３０秒とした以外は、前記キットに添付のプロトコールにしたがった。
【００８６】
ＰＣＲで得られた約５４０ｂｐの増幅産物を、ＴＡクローニングキット（プロメガ社製）のｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ　Ｅａｓｙにクローニングし、塩基配列を確認した。その後、前記増幅産物を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切り出した。得られた断片と、ｐＥＴＫｍＳ２上のＴＨ−２ＰＬＤをコードする核酸中の制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切り出される部分とを置換することにより、ＴＨ−２ＰＬＤのＣ末端にＨｉｓタグが付加されたポリペプチドをコードする核酸を保持した発現ベクターを得た。前記発現ベクターを用い、実施例２と同様にしてＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤを得た。
【００８７】
また、プライマーＴ３〔ＴＣＧＧＡＣＧＴＣＧＡＴＣＴＣＧＣＧＣＴ　　（配列番号：２５）〕とプライマーＴ４〔ＧＴＣＧＴＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡ　（配列番号：２６）〕とを用い、ＴＨ−２ＰＬＤをコードした核酸を鋳型として、ＧＣ−ＲＩＣＨ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍキット（ロッシュ社製）を用いてＰＣＲを行なった。
【００８８】
なお、前記プライマーＴ３は、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列（配列番号：５）の塩基番号：７５１〜７７０において、塩基番号：７６２のＣをＴに置換することにより、アミノ酸残基（Ａｓｐ　）を変化させることなく、制限酵素ＳａｌＩ認識部位（配列番号：５の塩基番号：７５７）を消滅させるプライマーである。また、前記プライマーＴ４は、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列の塩基番号：１１９８から１２１８に対応するプライマーである。
【００８９】
ＰＣＲ条件は、プライマー濃度を１μＭ、アニーリング温度を５０℃、伸長時間を３０秒とした以外は、前記キットに添付のプロトコールにしたがった。
【００９０】
ＰＣＲで得られた約４７０ｂｐの増幅産物を、ＴＡクローニングキット（プロメガ社製）のｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ　Ｅａｓｙにクローニングし、塩基配列を確認した。その後、前記増幅産物を制限酵素ＡａｔＩＩで切り出し、得られた断片と、ｐＥＴＫｍＳ２上のＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ遺伝子の制限酵素ＡａｔＩＩで切り出される部分とを置換することにより、ＴＨ−２ＰＬＤのＣ末端にＨｉｓタグが付加されたポリペプチドをコードした核酸であり、かつ制限酵素ＳａｌＩ部位（７５７番目）を消滅させた核酸を保持した発現ベクターを得た。
【００９１】
さらに、プライマーＴ５〔ＧＡＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＣＧＧＣＴＧ（配列番号：２７）とプライマーＴ６〔ＧＴＧＴＣＧＡＣＧＴＡＧＴＣＧＴＣＣＴＴＣＣＡＮＮＮＧＴＴＧＡＴ　（配列番号：２８）〕とを用い、ＴＨ−２ＰＬＤをコードした核酸を鋳型として、ＧＣ−ＲＩＣＨ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍキット（ロッシュ社製）を用いてＰＣＲを行なった。
【００９２】
なお、前記プライマーＴ５は、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列（配列番号：５）の塩基番号：３３７〜３６０に対応する配列からなるプライマーである。また、前記プライマーＴ６は、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列（配列番号：５）の塩基番号：７０６〜７３７に対応するプライマーであり、ＴＨ−２ＰＬＤの塩基配列（配列番号：５）の塩基番号：７１２〜７１４の塩基配列を置換することにより、ＴＨ−２ＰＬＤの１８８位のアミノ酸残基を置換することができるようにデザインされたプライマーである。
【００９３】
ＰＣＲ条件は、プライマー濃度を１μＭ、アニーリング温度を５０℃、伸長時間を３０秒とした以外は、前記キットに添付のプロトコールにしたがった。
【００９４】
ＰＣＲで得られた約４００ｂｐの増幅産物を、ＴＡクローニングキット（プロメガ社製）のｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ　Ｅａｓｙにクローニングし、塩基配列を確認した。その後、前記増幅産物を制限酵素ＳａｌＩで切り出し、得られた断片と、ｐＥＴＫｍＳ２上のＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤをコードする核酸中の制限酵素ＳａｌＩで切り出される部分とを置換することにより、ＴＨ−２ＰＬＤのＣ末端にＨｉｓタグが付加され、ＴＨ−２ＰＬＤの１８８位のＧｌｙ　を他のアミノ酸に置換したＨｉｓタグ付ＰＬＤの発現ベクターを得た。前記発現ベクターを用い、実施例２と同様にして、Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤを発現させた。
【００９５】
ついで、得られたＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ　各０．００５Ｕ相当量水溶液０．０２ｍｌを６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後のＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤについて、前記試験例１と同様に、加水分解活性を測定した。なお、対照として、６０℃で１０分間のインキュベーションをしないＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ　各０．００５Ｕ相当量水溶液０．０２ｍｌを用い、前記と同様に、加水分解活性を測定した。その結果を図６に示す。図６中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。
【００９６】
その結果、１８８位のＧが、Ｃ（システイン）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｋ（リジン）、Ｌ（ロイシン）、Ｍ（メチオニン）、Ｎ（アスパラギン）及びＲ（アルギニン）のそれぞれに置換された７種の変異酵素は、ホスホリパーゼＤ活性を示さなかった。
【００９７】
図６に示されるように、ＴＨ−２ＰＬＤでは、残存活性が１０％以下であるのに対し、１８８位のＧが、比較的疎水性の高い、Ｖ（バリン）、Ｆ（フェニルアラニン）及びＷ（トリプトファン）のそれぞれに置換された変異酵素（Ｇ１８８Ｖ、Ｇ１８８Ｆ及びＧ１８８Ｗ）では、残存活性が５０％を超えることがわかった。
【００９８】
実施例５　ＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素の安定性の検討
（１）耐熱性の検討
実施例４で得られたＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤを発現する菌株並びに１８８番目のアミノ酸がＶａｌ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　、又はＳｅｒ　であるＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ〔Ｇ１８８Ｖ、Ｇ１８８Ｆ、Ｇ１８８Ｗ又はＧ１８８Ｓ〕を発現する菌株について、その培養上清を７０％　飽和硫酸アンモニウムで濃縮し、得られた沈殿物を、１／１５Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。得られた産物を、ニッケルアフィニティカラム（商品名：ＴＡＬＯＮ　Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎｓ、クロンテック社製）に供して、Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤのそれぞれを得た。ついで、得られたＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ（２．４μｇ相当量）のそれぞれについて、１０％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド電気泳動）により、純度を確認した。その結果を図７に示す。
【００９９】
ついで、得られたＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤのそれぞれを用いて、至適温度を評価した。Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ（１．０μｇ相当量）のそれぞれを、試験例１の活性測定法と同様に、３５℃、４５℃、５５℃、６５℃、７５℃及び８５℃のそれぞれにおけるホスホリパーゼＤの加水分解活性を測定した。その結果を図８のパネルＡに示す。図８のパネルＡ中、最大活性を１００として算出した相対活性を示す。
【０１００】
また、Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ（１．０μｇ相当量）のそれぞれについて、試験例１の活性測定法と同様に、３７℃及び６５℃のそれぞれにおける活性を測定し、比活性を算出した。その結果を図８のパネルＢに示す。
【０１０１】
図８のパネルＡに示されるように、Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤのいずれも、６５℃付近で最大活性を示すことがわかる。なかでも、Ｇ１８８Ｖ、Ｇ１８８Ｆは、７５℃でもほぼ最大活性と同じ活性を示し、もとのＴＨ−２ＰＬＤよりも、高い活性を示す温度範囲が拡大していることがわかる。
【０１０２】
また、図８のパネルＢに示されるように、３７℃における比活性は、Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤのいずれも３５−４０Ｕ／ｍｇであり、至適温度の６５℃では、いずれも６０Ｕ／ｍｇ前後の値を示したので、これらの置換は、触媒能には影響を与えないことがわかる。
【０１０３】
ついで、Ｈｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ（０．１ｍｇ／ｍｌ）のそれぞれについて、１５℃、５５℃、６５℃、６８℃、７５℃のそれぞれで１０分間インキュベートした後の残存活性を測定した。示された温度及びインキュベート時間で、予めＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤをインキュベートすることを除き、試験例１と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図９のパネルＡに示す。図９のパネルＡ中、インキュベーションをしない場合の加水分解活性を１００として算出した残存活性を示す。
【０１０４】
また、６８℃で、５分間、１０分間、１５分間インキュベートした場合の残存活性の継時変化を測定した。示された温度及びインキュベート時間で、予めＨｉｓタグ付変異ＴＨ−２ＰＬＤ及びＨｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤをインキュベートすることを除き、試験例１と同様に、加水分解活性を測定した。結果を図９のパネルＢに示す。図９のパネルＢ中、インキュベーションしない場合の加水分解を１００として算出した残存活性を示す。
【０１０５】
図９のパネルＡに示されるように、ＴＨ−２ＰＬＤ及びＧ１８８Ｓでは、６５℃で１０分間のインキュベーションにより、残存活性が２０％以下となるのに対し、Ｇ１８８Ｖ、Ｇ１８８Ｆ及びＧ１８８Ｗでは、ほぼ１００％活性を保持していることがわかる。
【０１０６】
また、図９のパネルＢに示されるように、６８℃での残存活性の継時変化を比較した結果から、Ｇ１８８Ｖ、Ｇ１８８Ｆ及びＧ１８８Ｗの中でも、特に、Ｇ１８８Ｆが最も耐熱性に優れていることがわかる。
【０１０７】
（２）有機溶媒に対する安定性の検討
０．３Ｕ　Ｈｉｓタグ付変異ＰＬＤ（Ｇ１８８Ｆ）を用い、酵素の安定性を評価した。
【０１０８】
対照として、０．３Ｕ　天然ＴＨ−２ＰＬＤ（精製標品）及び０．３Ｕ　Ｈｉｓタグ付ＴＨ−２ＰＬＤ（以下、組換対照という）を用いた（表１中、▲１▼及び▲２▼）。
【０１０９】
反応液組成を、表１に示す。なお、有機層と水層とを、それぞれ別容器で調製した。反応容器（１０ｍｌ容スクリューキャップ付ガラスビン）に有機層２．５ｍｌと水層１．０ｍｌとを入れた状態で、４０℃で３分間静置してプレインキュベーションを行ない、撹拌を開始した時点を反応開始０時間目とした。撹拌は、スターラーにより、二層が混ざり合い界面が見えなくなる程度の撹拌を行なった。
【０１１０】
【表１】
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【０１１１】
反応液の有機層中のホスファチジルセリン（以下、ＰＳという）の含有率が、４０％以上に達した時点で有機層のみを別容器に回収した。ついで、残部の水層が入った反応容器に、新しい基質を含有した有機層（表１）を追加した。この際、前記有機層を追加した反応系に、塩化カルシウム６ｍｇをさらに添加した。
【０１１２】
なお、比較対照として、表１の▲４▼に示す反応液を用い、有機層の追加の際に、０．１Ｕずつ追加し、評価した。
【０１１３】
反応液の有機層中におけるＰＳの含有率は、反応液の有機層を、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）〔展開液：１−プロパノール：酢酸メチル：クロロホルム：メタノール：０．２５重量％　ＫＣｌ＝５：５：５：２：１．８〕で展開し、シリカゲルＴＬＣプレートに、濃硫酸とエタノールとの混合液（１：１）を噴霧して発色させ、発色の度合いをデンシトメーター（島津製作所社製、商品名：ＤＵＡＬ　ＷＡＶＥＬＥＮＧＴＨ　ＦＬＹＩＮＧ　ＳＰＯＴ　ＳＣＡＮＮＩＮＧ　ＤＥＮＳＩＴＯＭＥＴＥＲ　；測定条件：５５０　ｎｍ）で測定することに評価した。なお、反応液の有機層中におけるＰＳの含有率が、４０％に達するまでに要する時間を表２に示す。
【０１１４】
【表２】
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【０１１５】
表２に示すように、▲１▼の天然ＴＨ−２ＰＬＤ及び▲２▼の組換対照と比較して、▲３▼のＨｉｓタグ付変異ＰＬＤ（Ｇ１８８Ｆ）によれば、有機層の追加による基質交換２回目、３回目、４回目の反応を行なった場合、より短い時間でＰＳの含有率が、４０％以上になることがわかる。また、▲３▼のＨｉｓタグ付変異ＰＬＤ（Ｇ１８８Ｆ）と▲４▼の場合とを比較して、反応時間に差が見られず、コリンの蓄積を始めとする反応液中組成の変化によることが示唆されるため、基質交換回数を重ねるごとに起こる反応速度の低下は、酵素の失活による影響が少ないものであることがわかる。
【０１１６】
すなわち、Ｈｉｓタグ付変異ＰＬＤ（Ｇ１８８Ｆ）によれば、反応に際して、１回ずつ酵素を追加していくことなく、数回そのまま反応を行なうことができるという優れた効果を得ることができる。
【０１１７】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、コンセンサスモチーフ配列を示し、配列中、６位のＸａａは、Ｇｌｙ又はＡｓｐを示す。
【０１１８】
配列番号：２は、コンセンサスモチーフ配列を示し、配列中、６位のＸａａは、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＳｅｒを示す。
【０１１９】
配列番号：７は、キメラＰＬＤ　Ｃの配列である。
【０１２０】
配列番号：８は、キメラＰＬＤ　Ｃの配列である。
【０１２１】
配列番号：９は、キメラＰＬＤ　Ｄの配列である。
【０１２２】
配列番号：１０は、キメラＰＬＤ　Ｄの配列である。
【０１２３】
配列番号：１６は、キメラＰＬＤ　Ａの配列である。
【０１２４】
配列番号：１７は、キメラＰＬＤ　Ｅの配列である。
【０１２５】
配列番号：１８は、キメラＰＬＤ　Ｆの配列である。
【０１２６】
配列番号：１９は、プライマーの配列である。
【０１２７】
配列番号：２０は、プライマーの配列である。
【０１２８】
配列番号：２１は、プライマーの配列である。
【０１２９】
配列番号：２２は、プライマーの配列である。
【０１３０】
配列番号：２３は、プライマーの配列である。
【０１３１】
配列番号：２４は、プライマーの配列である。
【０１３２】
配列番号：２５は、プライマーの配列である。
【０１３３】
配列番号：２６は、プライマーの配列である。
【０１３４】
配列番号：２７は、プライマーの配列である。
【０１３５】
配列番号：２８は、プライマーの配列である。
【０１３６】
【発明の効果】
本発明の改変型ホスホリパーゼＤによれば、化粧品基材、医薬品等に有用な、リン脂質、該リン脂質の誘導体の製造の際の反応条件下に、活性を安定して保持及び発現することができ、改変型ホスホリパーゼＤを繰返して使用できるという優れた効果を奏する。また、本発明の発現するホスホリパーゼの安定性を増強する方法によれば、前記アミノ酸配列を含有したホスホリパーゼＤの安定性、例えば、熱安定性をより増強することができるという優れた効果を奏する。
【０１３７】
【配列表】
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【０１３８】
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【０１３９】
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【０１４０】
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【０１４１】
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【０１４２】
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【０１４３】
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【０１４４】
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【０１４５】
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【０１４６】
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【０１４７】
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【０１４８】
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【０１４９】
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【０１５０】
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【０１５１】
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【０１５２】
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【０１５３】
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【０１５４】
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【０１５５】
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【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【０１６０】
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【０１６１】
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【０１６２】
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【０１６３】
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【０１６４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ストレプトマイセス　ハルステディ　　Ｋ１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈａｌｓｔｅｄｉｉ　Ｋ１）　株由来ホスホリパーゼＤ（Ｋ１ＰＬＤ）、ストレプトマイセス　セプタタスＴＨ−２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｅｐｔａｔｕｓ　ＴＨ−２）株由来ホスホリパーゼＤ（ＴＨ−２ＰＬＤ）及び該Ｋ１ＰＬＤとＴＨ−２ＰＬＤとから作製したキメラホスホリパーゼＤ（キメラＰＬＤ）のそれぞれの１次構造を示す概略図である。図１中、「ａａ」は、アミノ酸残基を示す。
【図２】図２は、６０℃１０分間インキュベートした場合のＫ１ＰＬＤ、ＴＨ−２ＰＬＤ及びキメラＰＬＤの熱安定性を示す図である。
【図３】図３は、ストレプトマイセス　スピーシーズ　ＰＭＦ株由来のホスホリパーゼＤのアミノ酸配列を参照して、イオンペアを形成する可能性のあるアミノ酸残基の位置及びキメラＰＬＤ　Ａ〜Ｆにおける組換ポイントを示す図である。
【図４】図４は、キメラＰＬＤ　Ｃの変異酵素Ｃ１〜Ｃ４における変異部位の構造を示す図である。
【図５】図５は、６０℃１０分間インキュベートした場合のキメラＰＬＤ　Ｃ及び変異酵素Ｃ１〜Ｃ４の熱安定性を示す図である。
【図６】図６は、６０℃１０分間インキュベートした場合のＴＨ−２ＰＬＤ変異酵素の熱安定性を示す図である。
【図７】図７は、ＴＨ−２ＰＬＤの変異酵素の精製標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析パターンを示す図である。
【図８】図８は、ＴＨ−２ＰＬＤ変異酵素の至適温度条件を調べた結果を示す図である。パネルＡは、至適温度を調べた結果を示し、パネルＢは、３７℃及び６５℃のそれぞれにおける比活性を調べた結果を示す。
【図９】図９は、ＴＨ−２ＰＬＤ及びその変異酵素（０．１ｍｇ／ｍｌ）の熱安定性を示す図である。パネルＡは、１５℃、５５℃、６５℃、６８℃、７５℃のそれぞれで１０分間インキュベートした後の残存活性を示し、パネルＢは、６８℃で、５分間、１０分間、１５分間インキュベートした場合の残存活性の継時変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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