(57)【要約】【目的】新規なチロシナーゼ阻害剤、メラニン生成抑制剤及び美白剤を提供すること。【構成】フェノール化合物配糖体有効成分として含有する美白剤。前記フェノール化合物には、ヒドロキノン、ピロガロール、ベラトリルアルコール、没食子酸、カテコール、エラグ酸及びベンジルアルコールからなる群から選択される１種のフェノール化合物が含まれる。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　フェノール化合物のルチノース配糖体を有効成分として含有する美白剤。
【請求項２】
　前記フェノール化合物が、ヒドロキノン、ピロガロール、ベラトリルアルコール、没食子酸、カテコール、エラグ酸及びベンジルアルコールからなる群から選択される１種のフェノール化合物である請求項１に記載の美白剤。
【請求項３】
　前記フェノール化合物が、ヒドロキノンである請求項１に記載の美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、ＵＶ吸収能、抗酸化能、美白効果、チロシナーゼ阻害活性といった有用な機能を有するフェノール化合物の配糖体、より詳しくは、フェノール化合物のルチノース配糖体を製造する製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　フェノール化合物の配糖体は、少量ではあるが植物体に広く存在し、また優れた生理活性を有するにもかかわらず低毒性であることから、食品素材、食品添加物、医薬品、化粧品などの開発のターゲットとして注目されつつある。
【０００３】
　例えば、アルブチンは従来周知のフェノール化合物配糖体の一種である。その化学名は、ヒドロキノン　β−Ｄ−グルコピラノシドであり、ヒドロキノンをアグリコンとするグルコース配糖体である。アルブチンは美白効果、メラニン生成抑制および活性酸素抑制といった効果を有するため、化粧料として広く用いられている。また、カテコールやレゾルシノール等をアグリコンとする配糖体についても、皮膚色素沈着の予防および治療に有効であることが知られている。
【０００４】
　上記のような、優れた薬理効果を有するフェノール化合物の配糖体について更に詳しく検討すると、各配糖体のアグリコン、即ち、ヒドロキノン、カテコール、およびレゾルシノール自体も、夫々の配糖体に対応した優れた薬理効果を有している。しかし、これらのアグリコン自体の効果は夫々の配糖体に比較して小さい。そのため、高濃度での使用を余儀なくされるのみならず、長期に亘って使用すると皮膚に白斑を生じるなどの副作用を伴う。
【０００５】
　上記のような事実から、有用な薬理効果を有するフェノール化合物は、一般的に、これを配糖体にすることによって薬理効果を向上させ、且つ副作用を低減し得ることが期待される。更に、配糖体はそのアグリコン自体に比較して、一般的に水溶性が高いことが知られている。
【０００６】
　一方、例えば没食子酸の二量体であるエラグ酸は、抗酸化作用を始め、メラニン色素抑制作用等の優れた薬理効果を有しているが、酸化され易く不安定であり、また水に対する溶解性が極めて低いため、取り扱いが不便であるという問題がある。従って、このようなフェノール化合物については、これを配糖体にすることによって、その生理活性を損なうことなく、副作用および溶解性の問題を改善できることが期待される。
【０００７】
　しかしながら、フェノール化合物を配糖体に転化するための、効率的かつ簡便な方法が存在しないため、ある種のフェノール化合物では、有用な活性を有するにもかかわらず十分には利用が図られていないのが実状である。
【０００８】
　また、従来のフェノール配糖体における糖部分は、グルコース、リボース等の数種類に限定されており、アグリコンと糖との組合せは比較的限定されていた。従って、同じアグリコンであっても、異なった糖を結合させることができれば、有用な新規フェノール配糖体が得られることが期待される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
　本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、フェノール化合物から、そのルチノース配糖体を製造するための新規な方法を提供することを目的とするものである。
【００１０】
　また、本発明は、上記の方法で得られた新規なフェノール化合物のルチノース配糖体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
　本発明は、フェノール化合物の存在下において、ルチンに対し、ルチン分解酵素を作用させることを特徴とする、フェノール化合物のルチノース配糖体の製造方法、並びにこの方法によって得られる新規なフェノール化合物のルチノース配糖体である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
　本発明による方法は、フェノール化合物の存在下において、ルチンに対してルチン分解酵素を作用させることにより、ルチンに含まれる糖部分、即ちルチノースを前記フェノール化合物へ転移させるものであり、下記の式で表される。
【化１】
2004010621.tif 000002
　　　　　　　（ここで、ＲＯＨはフェノール化合物である。）
【００１３】
　本発明におけるフェノール化合物は、上記の酵素反応においてルチノースの受容体として作用するものであれば特に限定されない。しかし、好ましいフェノール化合物としては、ヒドロキノン、ピロガロール、ベラトリルアルコール、没食子酸、カテコール、エラグ酸、ベンジルアルコール等が挙げられる。
【００１４】
　本発明で用いるルチンは、上記式に示されるように、アグリコンであるクエルセチンに、ルチノース（グルコースとラムノースとからなる二糖）がＯ-グリコシド結合した配糖体である。このルチンは、エンジュ（豆科）、蕎麦（タデ科）、ヘンルーダ（ミカン科）等の天然の植物に広く分布するフラボノール配糖体の一種であり、動脈硬化、高血圧の予防等に有用な生理活性物質として知られている。
【００１５】
　本発明におけるルチン分解酵素としては、ルチンを分解してルチノースを切り出し、これをフェノール化合物の酸素原子上に転移させ得るものであれば如何なるものでもよい。その例としては、エンジュ、蕎麦、ヘンルーダ等の植物に由来する酵素、或いはペニシリウム(Penicillium)属、アスペルギルス(Aspergillus)属の菌などの微生物に由来する酵素を挙げることができる。これらの酵素のうち、特に好ましいのはダッタン蕎麦の種実に含まれるルチン分解酵素である。何故なら、このルチン分解酵素は活性が高く、またダッタン蕎麦は現在も広く食用に供されているものであり、安全性の点で信頼性が高いからである。また、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)から得たルチン分解酵素は、広範囲のフェノール化合物に対して配糖化能を有する点で好ましい。
【００１６】
　本発明において、上記のルチン分解酵素は精製品であることが好ましいが、その活性の強さや含量によっては、必ずしも精製品である必要はない。即ち、これらの酵素を含有する植物や微生物の抽出液をそのまま用いたり、場合によっては植物体や微生物をそのまま用いてもよい。
【００１７】
　ダッタン蕎麦の種実に含まれるルチン分解酵素を例にとると、ダッタン蕎麦の種実、またはこの種実を挽いて調製した蕎麦粉にバッファーを加えて攪拌抽出をして抽出液を得、これを更に精製して得られた精製酵素を用いることが好ましい。しかし、ダッタン蕎麦に含まれる酵素は活性が高いので、抽出液をそのまま用いても十分に機能する。更に、ダッタン蕎麦の種実には、通常の蕎麦の種実に比較して非常に多量のルチンが含まれている。即ち、通常の蕎麦の種実では約１４ｍｇ％であるのに対して、ダッタン蕎麦の種実では約１３００ｍｇ％（ｍｇ％は、蕎麦種実１００ｇに含まれるルチンのｍｇ量を表す）である。従って、ダッタン蕎麦の種実またはその粉をそのまま用いても、十分に目的とするルチノースの転移反応を行うことができる。
【００１８】
　また、微生物に由来するルチン分解酵素を使用する際には、微生物そのものから酵素を抽出して使用してもよい。しかし、その微生物が菌体外に酵素を分泌する場合には、微生物を培養した培養液をそのまま粗酵素液として用いることができる。勿論、この培養液を更に抽出精製し、精製酵素にして用いることも可能である。
【００１９】
　植物や微生物からのルチン分解酵素の抽出は、通常、酵素の抽出に用いられる方法により行うことができる。例えば、酢酸バッファー中で攪拌して抽出すればよい。
【００２０】
　本発明の方法によれば、一段階の反応で、フェノール化合物をそのルチノース配糖体に変換することができる。従って、精製したルチン分解酵素は、そのままルチンに加えて反応させることもできるが、適当な担体に固定してバイオリアクターを構成すれば、連続的に目的の配糖体を製造することが可能となり、効率を飛躍的に向上させることができる。
【００２１】
　本発明によるルチノース配糖体の製造方法は、ルチン分解酵素が失活しない限り、如何なる条件下でも実施することができる。しかし、ｐＨ３〜９、温度８０℃以下で行うことが好ましく、ｐＨ５、温度４０℃で行うのが最も好ましい。
【実施例】
【００２２】
　＜実施例１＞
　（１）粗酵素液の調製
　ダッタン蕎麦粉５０ｇに２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５）を１．５リットル加え、１時間攪拌抽出した後、東洋濾紙製Ｎｏ．１濾紙で濾過することにより、粗酵素液１．４１リットルを得た。
【００２３】
　（２）配糖体の製造
　ルチン４ｇと、ヒドロキノン４００ｍｇと、上記で得た粗酵素液２０ｍｌとを混合し、４０℃で２４時間攪拌して反応させた。次いで、２０ｍｌの水を加えて１００００ｒｐｍで遠心分離し、濾過した。続いて、濾液を活性炭カラムにかけた後、１０％エタノールで洗浄することにより、ルチノースを除去した。更に、エタノール１００％で溶出させ、減圧留去した後、酢酸エチルを加えて洗浄してヒドロキノンを除去し、その後下記の条件でＨＰＬＣにかけて、２４．７ｍｇの精製物を得た。
【００２４】
　　　　　カラム；Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２　Ｐ−５０　４．６×２５０ｍｍ
　　　　　　　　　（昭和電工株式会社製）
　　　　　検出器；ＲＩ検出器、ＵＶ検出器
　　　　　溶離液；アセトニトリル：水＝７５：２５
　　　　　流速　；１．０ｍｌ／ｍｉｎ
　上記で得られた精製物をＨＰＬＣ分析した結果を、図１および図２に示す。図１はＵＶ検出器による結果であり、図２はＲＩ検出器による結果である。
【００２５】
　また、上記で得た精製物のＵＶ吸収スペクトルを図３に、またヒドロキノンのＵＶ吸収スペクトルを図４に示す。
【００２６】
　更に、上記で得た精製物の13Ｃ−ＮＭＲ分析を行ったところ、図５に示す結果が得られた。
【００２７】
　これらの結果から、上記の反応によって得られた生成物は、下記の式で表されるヒドロキノンのルチノース配糖体（ヒドロキノンルチノシド：以下、ＨＱＲと称する）であることが分かった。
【化２】
2004010621.tif 000003
【００２８】
　＜実施例２＞
　　ダッタン蕎麦の代わりにエンジュを用い、それ以外は全て実施例と同様に行った。その結果、６．５ｍｇの精製ＨＱＲが得られた。
【００２９】
　＜実施例３：　ＨＱＲの酸分解＞
　　実施例１、２で得た精製物（ＨＱＲ）１ｍｇを、２Ｎ塩酸溶液１．２ｍｌ中に溶解し、ブロックヒータで１００℃に加熱して、２時間分解反応を行った。その後、エタノールを添加しながら減圧留去した。得られた分解物について、実施例１で行ったのと同様のＨＰＬＣ分析を行なった。その結果を、図６（ＵＶ検出器）および図７（ＲＩ検出器）に示す。
【００３０】
　この結果も、実施例１、２で得た精製物がＨＱＲであることを支持している。
【００３１】
　＜実施例４＞
　　上記で得られた精製ＨＱＲのチロシナーゼ阻害活性を調べるために、下記の試験溶液を調製した。
【００３２】
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　試験溶液　　　　対照溶液
　　０．０５％Ｌ−チロシン溶液　　　　　　１．０　ｍｌ　　１．０　ｍｌ
　　ＨＱＲ溶液（５ｍＭ）　　　　　　　　　１．０　ｍｌ
　　５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．８）　　　０．９　ｍｌ　　０．９　ｍｌ
　　チロシナーゼ溶液（５００ｍＵ／ｍｌ）　０．１　ｍｌ　　０．１　ｍｌ
なお、チロシナーゼとしては、マッシュルーム起源のチロシナーゼ（和光純薬株式会社製）を用いた。
【００３３】
　上記の試験液および対照溶液を２５℃でインキュベートし、３０分毎に４７０ｎｍでの吸光度を測定した。その結果を図８に示す。
【００３４】
　図８の結果から、ＨＱＲはチロシナーゼの活性を阻害し、チロシンの分解を抑制することが分かった。
【００３５】
　＜実施例５＞
　　ＩＦ０から分譲を受けたアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)を、２％ルチンを含む液体培地中で、３０℃で８日間の培養を行い、その培養液を回収した。
【００３６】
　この培養液をそのままルチン分解酵素として用い、実施例１に類似した方法で、ルチンとヒドロキノンとの反応を行った。即ち、ルチン、ヒドロキノンおよび上記の培養濾液を混合し、３０℃で２日間反応させた。遠心分離および吸引濾過により、未反応のルチンおよび生成したケルセチン等を沈殿として除去した。そのときの上清を回収し、これに酢酸エチルを加え、未反応のヒドロキノンを上層として除去した。一方、下層を活性炭クロマトグラフィーに供試、その３０％１−プロパノールによる溶出画分を回収した。
【００３７】
　こうして得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、図５に示したものと同じであった。このＮＭＲデータから、生成物は実施例１と同じくＨＱＲであることが分かった。また、1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（データは省略）から、そのアノマー構造はβであることが分かった。
【００３８】
　また、ヒドロキノンの代わりに、ピロガロール、ベラトリルアルコール、没食子酸を用い、上記と同様の反応および精製を行った。その結果、ヒドロキノン以外のこれらフェノール化合物についても、同様にルチノース配糖体の生成が認められた。
【００３９】
　＜実施例６：　ＨＱＲの抗酸化能＞
　　上記の実施例で得たヒドロキノンルチノシド（ＨＱＲ）の抗酸化性を調べるために、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／電気化学検出器（ＥＣＤ）による還元性の測定を行った。電気化学検出器は、電極間に一定の電位を印加して、そこを通る試料による電流の変化を測定するものである。電極間に印加する電位を正の電位とすれば、この条件で検出される物質は、還元力、即ち抗酸化能を有しているということができる。
【００４０】
　５ｍＭのＨＱＲを高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＹＭＣ社製のＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＮＨ2　２５０×４．６ｍｍ　Ｉ．Ｄ．、溶離液：４０ｍＭ酢酸アンモニウム、１７．５ｍＭ酢酸／８０％メタノール、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ）に２０μｌ注入し、溶出してくる試料を電気化学検出器（資生堂社製アンペロメトリック式電気化学検出器、印加電圧＋８００ｍＶ）により検出した。
【００４１】
　比較のために、抗酸化活性を有するとされているアルブチンおよびコウジ酸の同濃度溶液を同様の方法で測定した。
【００４２】
　この方法によって測定した各物質の電流変化値（ピーク高さから算出）は、以下の通りであった。
【００４３】
　　　　　　　　　　　　　　試料　　　　　　　　　電流変化値
　　　　　実施例　　　　　５ｍＭ　ＨＱＲ　　　　　１０４０ｎＡ
　　　　　比較例１　　　　５ｍＭ　アルブチン　　　１１５０ｎＡ
　　　　　比較例２　　　　５ｍＭ　コウジ酸　　　　３００ｎＡ
【００４４】
　上記の結果から、ＨＱＲはアルブチンと略同等、コウジ酸よりも３〜４倍強い還元力を有することが分かり、ＨＱＲが抗酸化能を有していることが示された。
【００４５】
　　［発明の効果］
　以上詳述したように、本発明によれば、フェノール化合物から、簡便かつ効率的に、そのルチノース配糖体を製造することができる。また、本発明により得られるフェノール化合物のルチノース配糖体は、糖部分が二糖のルチノースであるため、新規化合物である。また、本発明の方法により得られる配糖体は、チロシナーゼ阻害活性、美白効果、メラニン生成抑制、活性酸素抑制といった有用な薬理作用を有し、かつ副作用や難溶性といった欠点も少ないものが多い。従って、本発明は斯かる有用な化合物を提供するものとして、社会に裨益するところ大なるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】実施例１で得られた精製物（ＨＱＲ）のＨＰＬＣ分析（ＵＶ検出器）の結果を示す図である。
【図２】実施例１で得られた精製物（ＨＱＲ）のＨＰＬＣ分析（ＲＩ検出器）の結果を示す図である。
【図３】実施例１で得た精製物（ＨＱＲ）のＵＶ吸収スペクトルを示す図である。
【図４】ヒドロキノンのＵＶ吸収スペクトルを示す図である。
【図５】実施例１で得られた精製物（ＨＱＲ）の１３ＣＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図６】実施例３で得たＨＱＲの分解生成物のＨＰＬＣ分析（ＵＶ検出器）の結果を示す図である。
【図７】実施例３で得たＨＱＲの分解生成物のＨＰＬＣ分析（ＲＩ検出器）の結果を示す図である。
【図８】ＨＱＲのチロシナーゼ阻害活性を示す図である。
【図１】
2004010621.tif 000004
【図２】
2004010621.tif 000005
【図３】
2004010621.tif 000006
【図４】
2004010621.tif 000007
【図５】
2004010621.tif 000008
【図６】
2004010621.tif 000009
【図７】
2004010621.tif 000010
【図８】
2004010621.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成15年10月24日(2003.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
　本発明は、フェノール化合物のルチノース配糖体を有効成分として含有する美白剤に関する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
　本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、新規な美白剤を提供することを目的とするものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
　本発明は、フェノール化合物のルチノース配糖体を有効成分として含有する美白剤である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
　本発明の美白剤が有効成分として含有するフェノール化合物のルチノース配糖体は、フェノール化合物の存在下において、ルチンに対してルチン分解酵素を作用させることにより、ルチンに含まれる糖部分、即ちルチノースを前記フェノール化合物へ転移させることにより製造され得るものであり、この転移反応は、下記の式で表される。