(57)【要約】【課題】二本鎖ＤＮＡ水溶液中に高濃度の塩またはアルコールを添加することなく、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導する方法、およびその利用方法等を提供する。【解決手段】二本鎖ＤＮＡと導電性高分子であるアルコキシポリチオフェン誘導体とを混合させる工程を有するＤＮＡらせん構造変化誘導方法によって、二本鎖ＤＮＡのらせん構造を、例えば、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へと変化させることができる。また、このＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、ＤＮＡスイッチングシステムへの応用や特定の塩基配列を検出する方法等への応用が可能である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導するためのＤＮＡらせん構造変化誘導方法において、
二本鎖ＤＮＡと導電性高分子とを混合させる工程を有していることを特徴とするＤＮＡらせん構造変化誘導方法。
【請求項２】
上記二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化とは、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造への変化、Ｚ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化、Ｂ型ＤＮＡ構造からＡ型ＤＮＡ構造への変化、およびＡ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化のうち、いずれかの変化であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法。
【請求項３】
上記導電性高分子は、ポリチオフェン誘導体であることを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法。
【請求項４】
上記二本鎖ＤＮＡは、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）配列、およびｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）配列のうち、いずれかの塩基配列を有していることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していることを特徴とするＤＮＡスイッチングシステム。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用することによって、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量する塩基配列検出方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用して、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量する塩基配列検出キットであって、導電性高分子を含んでいることを特徴とする塩基配列検出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導する方法、およびその利用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）は、ほとんどの生物体または細胞内小器官において、遺伝情報を担っている物質として知られている。ウイルスゲノムは、一本鎖ＤＮＡ、または一本鎖あるいは二本鎖ＲＮＡからなるものも存在するが、ほとんどの生物において、ＤＮＡは二本鎖として存在している。
【０００３】
二本鎖ＤＮＡでは、二つの鎖は反対向きに走り（逆平行）、互いの周りに二重らせん構造を形成している。このＤＮＡの二重らせん構造は、一方のＤＮＡ鎖の上のプリン塩基と他方のＤＮＡ鎖のピリミジン塩基とが、特異的に水素結合することによって形成されている。すなわち、ワトソン−クリック則に従って、アデニン（ｄＡ）とチミン（ｄＴ）とが対をなし、グアニン（ｄＧ）とシトシン（ｄＣ）とが対をなすことによって二本鎖ＤＮＡの二重らせん構造は形成されている。なお、「ｄ」は、デオキシの意である。
【０００４】
このような二本鎖ＤＮＡは、その塩基配列や、水溶液の条件等を変化させることによって、様々な構造多型を示すことが知られている。その中でも特に、図１３（ａ）に示すように、グアニンとシトシンとの繰り返し配列（例えば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列）を有する二本鎖ＤＮＡは、高塩雰囲気下では通常の右巻きらせん構造（Ｂ型ＤＮＡ構造）とは逆の左巻きらせん構造（Ｚ型ＤＮＡ構造）を示すことがＰａｕｌら（１９７２）によって報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
上記の方法の他にも、図１３（ｂ）に示すように、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導する方法としては、二本鎖ＤＮＡの水溶液中にエタノール等のアルコールの添加する方法、ポリアミンを添加する方法、および二本鎖ＤＮＡ水溶液を単純に加熱する方法等が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
しかし、このような二本鎖ＤＮＡのらせん構造の反転が、どのような生物学的意義で行われているのかについては、未だによくわかっておらず、活発な議論が専門家の間でなされているところである（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００７】
このように、二本鎖ＤＮＡのらせん構造反転の生物学的意義は不明であるが、ＤＮＡらせん構造反転（例えば、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造への変化、以下単にＢ−Ｚ転位と称する）という現象は、ナノバイオマテリアル等のスイッチングシステムへの応用が可能ではないかと考えられている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００８】
また、側鎖の第３位に四級アンモニウム基を有するアルコキシポリチオフェンが二本鎖ＤＮＡと静電的相互作用によって複合体（ポリイオンコンプレックス）を形成することが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。この複合体は、ポリチオフェン側鎖の四級アンモニウム基とＤＮＡのリン酸アニオンとが静電的相互作用によって形成されるものであり、これによって、ＤＮＡの検出を行っている。
【０００９】
【非特許文献１】
ウォルフラム  ゼンガー著、西村  善文訳、「核酸構造（下）」、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社発行、ｐ２６４−２６５、ｐ２７５−２７８
【００１０】
【非特許文献２】
箱島  敏雄著、「Ｚ−ＤＮＡの復権−左巻きＺ−ＤＮＡ結合蛋白質複合体の構造解析とその生物学的意義−」、蛋白質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．４５、Ｎｏ．４、（２０００）、ｐ５９５−５９９
【００１１】
【非特許文献３】
Ｃｈｅｎｇｄｅ  Ｍａｏ他著、「Ａ  ｎａｎｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂ−Ｚ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ」、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．  ３９７、１４  Ｊａｎｕａｒｙ  １９９９、ｐ１４４−１４６
【００１２】
【非特許文献４】
Ｈｏａｎｇ−Ａｎｈ  Ｈｏ他著、「Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｐｏｌｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２００２，  ４１，  ９，  ｐ１５４８−１５５１
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述のＢ−Ｚ転位のような二本鎖ＤＮＡらせん構造の反転現象は、一般的には高塩濃度雰囲気下、またはある一定の濃度下によってはじめて誘導されることから、実用的なスイッチングシステムへの応用が困難であるとともに、可逆的なスイッチングシステムの構築が困難であるという問題があった。
【００１４】
したがって、二本鎖ＤＮＡ水溶液中の塩濃度を高めることなく、またはアルコールを添加することなく、二本鎖ＤＮＡにおけるＢ−Ｚ転位を誘導する方法の開発が強く求められていた。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、二本鎖ＤＮＡ水溶液中に高濃度の塩またはアルコールを添加することなく、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導する方法、およびその利用方法等を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、高濃度の塩またはアルコールの添加による二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化誘導に代わる手法として、導電性高分子と二本鎖ＤＮＡとの相互作用を利用したスイッチングシステムを構築し、これを詳細に解析したところ、ＤＮＡ−導電性高分子複合体間における電荷移動等によって、二本鎖ＤＮＡにおけるＢ−Ｚ転位が誘導されることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、上記の課題を解決するために、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導するためのＤＮＡらせん構造変化誘導方法において、二本鎖ＤＮＡと導電性高分子とを混合させる工程を有していることを特徴としている。
【００１８】
上記の方法によれば、詳細は不明であるが、二本鎖ＤＮＡと導電性高分子とが複合体を形成すると考えられるため、二本鎖ＤＮＡと導電性高分子との間で電荷移動が発生すると考えられる。これによって、高濃度の塩やアルコールを添加することなく、二本鎖ＤＮＡのらせん構造を簡便、かつ効率的に変化させることができる。
【００１９】
なお、「二本鎖ＤＮＡと導電性高分子とを混合させる工程」とは、二本鎖ＤＮＡと導電性高分子との複合体を形成させ、二本鎖ＤＮＡと導電性高分子との間に電荷移動を発生させる工程をいう。
【００２０】
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、上記の課題を解決するために、上記二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化とは、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造への変化、Ｚ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化、Ｂ型ＤＮＡ構造からＡ型ＤＮＡ構造への変化、およびＡ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化のうち、いずれかの変化であることを特徴としている。
【００２１】
上記の方法によれば、二本鎖ＤＮＡのらせん構造を、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へと、またはＺ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造へと、あるいはＢ型ＤＮＡ構造からＡ型ＤＮＡ構造へと、またはＡ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造へと大きく変化させることができる（それぞれ、Ｂ−Ｚ転位、Ｚ−Ｂ転位、Ｂ−Ａ転位、Ａ−Ｂ転位と称する）。
【００２２】
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、上記の課題を解決するために、上記導電性高分子は、ポリチオフェン誘導体であることを特徴としている。
【００２３】
上記の方法によれば、二本鎖ＤＮＡとポリチオフェン誘導体とが静電的相互作用によって複合体を形成すると考えられる。このため、二本鎖ＤＮＡとポリチオフェン誘導体との間での電荷移動を発生すると考えられる。このため、効率的に二本鎖ＤＮＡのらせん構造を変化させることができる。
【００２４】
なお、「ポリチオフェン誘導体」とは、炭素原子（Ｃ）と硫黄原子（Ｓ）とを分子中に含む複素環式化合物であればよく、特に限定されるものではない。例えば、ＣとＳとを分子中に含む五員環または六員環構造であって、共役二重結合またはこれに近い結合様式を有するアルコキシポリチオフェン誘導体等が挙げられる。なかでも特に、ヘテロ原子を含む中性のアルコキシポリチオフェン誘導体であることが好ましい。
【００２５】
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、上記の課題を解決するために、上記二本鎖ＤＮＡは、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）配列、およびｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）配列のうち、いずれかの塩基配列を有していることを特徴としている。
【００２６】
二本鎖ＤＮＡの塩基配列中に、上記の塩基配列を有していれば、確実、かつ効率的に二本鎖ＤＮＡのらせん構造を変化させることができる。
【００２７】
また、本発明にかかるＤＮＡスイッチングシステムは、上記の課題を解決するために、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していることを特徴としている。
【００２８】
上記の構成によれば、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化という現象を、ＤＮＡスイッチとして利用することができる。これによって、本発明にかかるＤＮＡスイッチングシステムは、例えば、極微細な構造体であるナノマテリアル、特にナノマテリアル中に生体物質の特徴を利用したナノバイオマテリアルのスイッチングシステムとして利用することができる。
【００２９】
また、本発明にかかる塩基配列検出方法は、上記の課題を解決するために、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用することによって、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量することを特徴としている。
【００３０】
また、本発明にかかる塩基配列検出キットは、上記の課題を解決するために、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用して、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量する塩基配列検出キットであって、導電性高分子を含んでいることを特徴としている。
【００３１】
上記の構成によれば、二本鎖ＤＮＡ中に含まれる特定の塩基配列を選択的に検出または定量することが可能である。すなわち、調査対象である二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造の変化の有無、および／または、らせん構造の変化の程度等を指標として、その二本鎖ＤＮＡ中に含まれる特定の塩基配列を選択的に検出・定量することができる。さらに、二本鎖ＤＮＡ中のどの位置に、当該特定の塩基配列がどの程度の鎖長で存在しているのかといった情報も取得することが可能となる。なお、らせん構造の変化の有無や変化の程度を調べるための方法としては、例えば、ＣＤスペクトルまたはＵＶスペクトルを測定する等の従来公知の方法を利用できる。
【００３２】
また、この「特定の塩基配列」としては、例えば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）配列、またはｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）配列等が挙げられる。
【００３３】
【発明の実施の形態】
本発明は、塩強度依存的あるいはアルコール強度依存的にのみ、らせん構造の変化や構造多型を示すと考えられていた塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡと、アルコキシポリチオフェン誘導体とを混合させることによって、該二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造を簡便かつ効率的に変化させることのできる手段を提供するとともに、この手段の利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法について説明し、次いでこれらＤＮＡらせん構造変化誘導方法の利用方法等について説明することとする。
【００３４】
本発明のＤＮＡらせん構造変化誘導方法、およびその利用方法に関する実施の一形態について図１〜１３に基づいて説明すれば以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３５】
（１）本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法
本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導するためのＤＮＡらせん構造変化誘導方法であって、二本鎖ＤＮＡと導電性高分子とを混合させる工程を有していればよく、その他の工程や条件については特に限定されるものではない。
【００３６】
本発明に用いられる「二本鎖ＤＮＡ」は、例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびオリゴＤＮＡ等であればよい。また、二本鎖ＤＮＡの鎖長は特に限定されるものではない。
【００３７】
また、「二本鎖ＤＮＡのらせん構造」には、例えば、図１３（ｂ）に示すように、Ｂ型ＤＮＡ構造、Ｚ型ＤＮＡ構造、Ａ型ＤＮＡ構造、Ｃ型ＤＮＡ構造等が挙げられる。
【００３８】
また、「二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化」としては、図１３（ｂ）に示すように、上記Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造、Ａ型ＤＮＡ構造、またはＣ型ＤＮＡ構造への変化、あるいは逆の、Ｚ型ＤＮＡ構造、Ａ型ＤＮＡ構造、またはＣ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化等が挙げられるが、特に、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造への変化、またはその逆のＺ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化であることが好ましい。また、Ｂ型ＤＮＡ構造からＡ型ＤＮＡ構造への変化、またはその逆のＡ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化であることが好ましい。
【００３９】
上記二本鎖ＤＮＡは、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）配列、およびｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）配列のうち、いずれかの塩基配列を有していることが好ましい。これは、後述する実施例に示すように、上記の塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡは、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法によって、効率的にらせん構造の変化を誘導することができるためである。なお、「ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列」とは、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）配列の２以上の繰り返し配列をいい、単なる（ｄＧ−ｄＣ）・（ｄＧ−ｄＣ）配列を含む。「ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）配列」とは、アデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）配列の２以上の繰り返し配列をいい、単なる（ｄＡ−ｄＴ）・（ｄＡ−ｄＴ）配列を含む。また、「ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）配列」とは、アデニン（Ａ）−シトシン（Ｃ）配列の繰り返し配列と、グアニン（Ｇ）−チミン（Ｔ）配列の繰り返し配列との組み合わせ配列をいうが、単なる（ｄＡ−ｄＴ）・（ｄＧ−ｄＴ）配列をも含む。
【００４０】
また、「導電性高分子」としては、例えば、静電的相互作用によって二本鎖ＤＮＡと複合体を形成でき、二本鎖ＤＮＡとの間で電荷移動を行うことができる物質であればよく、特に限定されるものではない。また、「電荷移動を行う」とは、例えば、導電性高分子から二本鎖ＤＮＡに対して電子が供給される場合でも、逆に、二本鎖ＤＮＡから導電性高分子に対して電子が供給される場合のどちらであってもよい。
【００４１】
上記導電性高分子としては、例えば、下記化学式（１）に挙げられるようなアルコキシポリチオフェン誘導体（ポリアルコキシチオフェン誘導体）が挙げられる。
【００４２】
【化１】
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【００４３】
上記化学式（１）中のＲ１、Ｒ２は、少なくとも一方の基が炭素数１〜３０のアルコキシル基であればよく、他方の基は水素原子、炭素数１〜３０のアルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基から選ばれる基であればよい。なお、これらの基は、水に溶解または分散しやすいように、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、およびアンモニウム基等から選ばれる置換基を有していることが好ましい。また、ｎは１以上の正の整数であればよく、特に限定されるものではない。なお、分子量としては、特に１０００〜数千万の範囲であることが好ましい。
【００４４】
例えば、下記化学式（２）、および化学式（３）に示す構造を有するアルコキシポリチオフェン誘導体、および後述する実施例に示す、下記化学式（４）に示す構造を有するＰＥＤＯＴ（Ｐｏｌｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉｏｘｙ  ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ：Ｐｏｌｙ  （３，４−ｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ））等は、水溶液に溶解または分散するものである。
【００４５】
【化２】
2004242574.tif 000004
【００４６】
【化３】
2004242574.tif 000005
【００４７】
【化４】
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【００４８】
なお、上記アルコキシポリチオフェン誘導体として、五員環構造の複素環式化合物を例に挙げて説明しているが、これに限定されるものではなく、例えば、六員環構造を有するの複素環式化合物であるアルコキシポリチオフェン誘導体であってもよい。
【００４９】
また、通常二本鎖ＤＮＡは水溶液に溶解するため、本発明における二本鎖ＤＮＡと導電性高分子とを混合する工程も、原則として水溶液中で行われる。しかし、何らかの処理により、二本鎖ＤＮＡおよび導電性高分子が水溶液以外の極性または非極性の有機溶媒に溶解可能となる場合、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、極性または非極性の有機溶媒中でも行うことができる。さらに、固体フィルム、またはキャストフィルム中でも行うことができる。
【００５０】
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法、すなわち、本発明における二本鎖ＤＮＡと導電性高分子とを混合する工程の条件は、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、二本鎖ＤＮＡと導電性高分子とが静電的相互作用によって複合体を形成し、二本鎖ＤＮＡと導電性高分子と間で電荷移動が発生するような緩衝液等が含まれていればよい。また、その他の反応条件、例えば、二本鎖ＤＮＡの濃度、導電性高分子（例えば、アルコキシポリチオフェン誘導体）の濃度、混合時の反応温度や反応時間、ｐＨ、塩の濃度（使用するバッファーの種類）等については適宜設定可能であり、特に限定されるものではない。なお、二本鎖ＤＮＡと導電性高分子とを混合させる工程では、導電性高分子中のカチオンが安定化されないことが好ましく、例えば、酸性領域のｐＨであることが好ましいが、特に限定されるものではない。この他にも、例えば、ＰＥＤＯＴを安定に分散させるためにＰＳＳを加えているように（後述する実施例参照）、導電性高分子がｐＨ中性領域でも安定になるように添加剤を用いること、またはｐＨ中性領域でも安定な導電性高分子を用いることによっても、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法を実施することが可能であり、本発明にかかる二本鎖ＤＮＡと導電性高分子とを混合させる工程のｐＨが酸性領域である場合に限られるわけではない。
【００５１】
以上のように、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法を用いることによって、塩強度依存的あるいはアルコール強度依存的に構造変化や構造多型を示す塩基配列（例えば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列等）を有する二本鎖ＤＮＡであっても、塩濃度やアルコール濃度を高めることなく、二本鎖ＤＮＡのらせん構造を簡便かつ効率的に変化させることができる。すなわち、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法を用いることによって、例えば、図１（ａ）に示すように、二本鎖ＤＮＡのらせん構造を、Ｂ−Ｚ転位、Ｚ−Ｂ転位のように変化させることができる。また、その他にも、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法を用いることによって、例えば、二本鎖ＤＮＡのらせん構造をＢ−Ａ転位またはＡ−Ｂ転位のように変化させることもできる。
【００５２】
したがって、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、以下のように利用することができる。
【００５３】
（２）本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法の利用方法
（２−１）ＤＮＡスイッチングシステム
本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、ＤＮＡスイッチングシステムとして利用することができる。
【００５４】
すなわち、本発明にかかるＤＮＡスイッチングシステムは、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。
【００５５】
上記の構成によれば、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化という現象を、そのままＤＮＡスイッチとして利用することができる。このＤＮＡスイッチとしては、例えば、Ｂ型ＤＮＡ構造をスイッチオフ状態とした場合に、図１（ａ）に示すように、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造にＤＮＡのらせん構造が変化した場合にスイッチオン状態に切り替わるＤＮＡスイッチ等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００５６】
また、本発明にかかるＤＮＡスイッチングシステムは、図１（ａ）に示すように、可逆的なＤＮＡスイッチとして利用することも可能である。すなわち、従来のように塩濃度を高めることによってＢ−Ｚ転位を発生させる場合は可逆的なスイッチングが困難であるが、本発明のように導電性高分子を用いてＤＮＡのらせん構造の変化を誘導する場合は、電場等の外部刺激によって導電性高分子の荷電状態をコントロールすることができるため、ＤＮＡらせん構造を可逆的に変化させることが可能であり、その結果として可逆的なスイッチングが可能となる。
【００５７】
このようなＤＮＡスイッチは、二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造の変化（例えば、Ｂ−Ｚ転位、Ｚ−Ｂ転位、Ｂ−Ａ転位、またはＡ−Ｂ転位等）といった、大きな構造変化をスイッチングシステムとして利用するものである。このため、スイッチのオン−オフを確実に切り換えることが可能である。さらに、上記ＤＮＡスイッチは、非常に微細なスイッチであるため、例えば、本発明にかかるＤＮＡスイッチングシステムは、極微細な構造体であるナノマテリアル、特にナノマテリアル中に生体物質の特徴を利用したナノバイオマテリアルのスイッチングシステムとして利用することができる。
【００５８】
（２−２）塩基配列検出方法および塩基配列検出キット
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、塩基配列検出方法および塩基配列検出キットとして利用することもできる。
【００５９】
すなわち、本発明にかかる塩基配列検出方法は、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していればよく、その他の工程、条件等は特に限定されるものではない。
【００６０】
また、本発明に係る塩基配列検出キットも、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。
【００６１】
すなわち、本発明にかかる塩基配列検出方法または塩基配列検出キットは、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用することによって、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化の有無、および／または、らせん構造の変化の程度等を調べ、その二本鎖ＤＮＡ中に含まれる特定の塩基配列を選択的に検出・定量する方法またはキットであればよい。
【００６２】
具体的には、本発明にかかる塩基配列検出方法または塩基配列検出キットを利用することによって、調査対象となる二本鎖ＤＮＡ中に、特定の塩基配列、例えば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）配列、またはｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）配列が含まれているか否かを選択的に検知、判断することができる。
【００６３】
これは、後述の実施例に示すように、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）配列、およびｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）配列は、上記導電性高分子と混合することによって、ＤＮＡのらせん構造を変化させる特性を有しているためである。
【００６４】
したがって、例えば、調査対象となる二本鎖ＤＮＡと上記導電性高分子とを混合させ、当該二本鎖ＤＮＡのらせん構造がＢ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造に変化する場合は、上記ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列、またはｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）配列が含まれていると判断できる。逆に、当該二本鎖ＤＮＡのらせん構造が変化しない場合は、上記ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列、またはｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）配列が含まれていないと判断できる。また、例えば、調査対象となる二本鎖ＤＮＡと上記導電性高分子とを混合させ、当該二本鎖ＤＮＡのらせん構造がＢ型ＤＮＡ構造からＡ型ＤＮＡ構造に変化する場合は、上記ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）配列が含まれていると判断できる。逆に、当該二本鎖ＤＮＡのらせん構造が変化しない場合は、上記ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）配列が含まれていないと判断できる。これは、後述の実施例に示すように、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法によれば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列、またはｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）配列は、Ｂ−Ｚ転位またはＺ−Ｂ転位を、そしてｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）配列は、Ｂ−Ａ転位またはＡ−Ｂ転位を起すと推測されるためである。
【００６５】
さらに、調査対象である二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造の変化の程度を指標とすることにより、当該二本鎖ＤＮＡ中に特定配列が、どの位置に、どの程度（鎖長、塩基数等）含まれるかを選択的に検出（特定）・定量することも可能である。
【００６６】
すなわち、上記導電性高分子と特定の塩基配列とを混合した場合、特定の塩基配列がどのような挙動を示すのか、例えば、特定の塩基配列のらせん構造がどの程度変化するのか等の特徴的な情報を予め調べておくことにより、調査対象となる二本鎖ＤＮＡ中に、当該特定配列がどの位置に、どの程度の鎖長の塩基配列として存在するのか調べることが可能となる。なお、特定の塩基配列と上記導電性高分子とを混合した際に生じる、特定の塩基配列（ＤＮＡ）／導電性高分子複合体の示す挙動を調べるための方法としては、例えば、後述する実施例に示すように、特定の塩基配列（ＤＮＡ）／導電性高分子複合体についての円二色信号（ＣＤスペクトル）、または紫外・可視吸収スペクトル（ＵＶ−ｖｉｓスペクトル）を測定する方法等の従来公知の方法が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００６７】
具体的には、例えば、後述する実施例に示すように、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列と、上記導電性高分子であるＰＥＤＯＴとを混合することによって生じるＤＮＡのらせん構造の変化は、ＵＶスペクトル測定における２９０ｎｍのピークを指標に鋭敏に検出することができるという点で特徴的である。一方、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）配列と、上記導電性高分子であるＰＥＤＯＴとを混合することによって生じるＤＮＡのらせん構造の変化は、ＵＶスペクトル測定における２９０ｎｍのピークを検出できないという点で特徴を有する。
【００６８】
ここで、例えば、二本鎖ＤＮＡ中に含まれる（ｄＧ−ｄＣ）配列の量、すなわち（ｄＧ−ｄＣ）塩基配列の含有量は、二本鎖ＤＮＡにおける一塩基多型（ＳＮＰｓ）の発生の主要因の一つと考えられている。この理由の一部として、ＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化されたシトシン（ｄＣ）が脱アミノ化を受けてチミン（ｄＴ）に変異する傾向があることが挙げられている。これにより、ＣｐＧジヌクレオチドの変異速度は、他のジヌクレオチドに比べて約１０倍程度高くなっている。
【００６９】
そのため、本発明にかかる塩基配列検出方法、および塩基配列検出キットにより、例えば、二本鎖ＤＮＡ中における（ｄＧ−ｄＣ）塩基配列の含有量を定量的に検出することによって、遺伝子疾患の簡便な検出方法等を開発できる可能性がある。
【００７０】
さらに、図１３（ｂ）に示すような、Ｂ型ＤＮＡ構造やＺ型ＤＮＡ構造をはじめとした構造多型等についての二本鎖ＤＮＡのコンフォメーション情報を得ることができる。
【００７１】
上記二本鎖ＤＮＡのコンフォメーションの一つである、Ｚ型ＤＮＡ構造（左巻きらせんＤＮＡ構造）は、全身性紅斑性狼瘡等の自己免疫疾患に関与していると考えられている。したがって、本発明にかかる塩基配列検出方法、および塩基配列検出キットによって、Ｚ型ＤＮＡ構造になり得る塩基配列を簡便に検出することにより、これらの疾患の早期検出デバイス、早期発見方法、治療方法、および治療剤等の開発に寄与することができる可能性がある。
【００７２】
また、従来、ＤＮＡ中の特定の塩基配列を検出する方法としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０００，  ７２，  ｐ３７１７−３７２４）、ＲＩ法、ＰＣＲによる増幅後ＤＮＡシークエンサーによる解読する方法、制限酵素による選択的切断と電気泳動法（野島  博著、「遺伝子工学の基礎」、東京化学同人）、およびマススペクトロメトリー法（質量分析法）（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００１，  ７３，  ｐ２１２６−２１３１）等が知られていたが、これらの方法は、いずれも操作等が煩雑、難解であったり、複雑な機器等を利用する必要があったりと、簡便な方法とはいい難いかった。
【００７３】
しかし、本発明にかかる塩基配列検出方法、および塩基配列検出キットは、上述したように、調査対象の二本鎖ＤＮＡと上記導電性高分子とを混合させ、ＣＤスペクトル、またはＵＶスペクトル等を測定して、ＤＮＡらせん構造の変化の有無、および／または変化の程度等を調べるのみで特定の塩基配列を検出・定量することができる。したがって、本発明にかかる塩基配列検出方法、および塩基配列検出キットは、従来のＤＮＡ中の特定の塩基配列検出方法と比較して、より簡便、かつ容易に、二本鎖ＤＮＡ中に含まれる特定の塩基配列を検出・定量することができるといえる。
【００７４】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７５】
【実施例】
まず、本実施例に用いた二本鎖ＤＮＡ、導電性高分子、および簡単な実験方法について図３を用いて説明する。
【００７６】
図３に示すように、本実施例では、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）、（ｄＧ−ｄＣ）８−（ｄＧ−ｄＣ）８、（ｄＡ−ｄＴ）８−（ｄＡ−ｄＴ）８、（ｄＧ−ｄＣ）３−（ｄＧ−ｄＣ）３、（ｄＡ−ｄＴ）３−（ｄＡ−ｄＴ）３を用いた。また、導電性高分子として、安定剤としてＰＳＳ（Ｐｏｌｙ（ｓｔｙｒｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ））を含んでいるＰＥＤＯＴ（以下、単にＰＥＤＯＴ／ＰＳＳと称する）を用いた。具体的には、市販の２．８ｗｔ％  ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを用いた。なお、本実施例で用いたＰＥＤＯＴ／ＰＳＳ、および二本鎖ＤＮＡはＳＩＧＭＡ社より購入し、精製は行わずそのまま用いた。ＤＮＡは、特に示さない場合は、Ａ２６０＝１．０になるようにｍｉｌｌｉＱで調整して、ＤＮＡ水溶液として実験に用いた。なお、ＰＥＤＯＴの構造式は、上記化学式（４）および図２に示す。また、ＰＳＳの構造式は、下記化学式（５）に示す。
【００７７】
【化５】
2004242574.tif 000007
【００７８】
また、各実験で行ったＣＤスペクトルは、温度：２５℃、開始波長：５００ｎｍ、終了波長：２００ｎｍ、感度：５０−１００ｍｄｅｇ、データ間隔：０．５ｎｍ、積算回数：５、バンド幅：２．０ｎｍ、レスポンス：１．０ｓｅｃ、走査速度：５０ｎｍ／ｍｉｎの条件で測定した。
【００７９】
また、ＵＶスペクトル（ＵＶ−ｖｉｓスペクトル）は、温度：２５℃、レスポンス：Ｆａｓｔ、バンド幅：５．０ｎｍ、走査速度：２００ｎｍ／ｍｉｎ、開始波長：５００ｎｍ、終了波長：２００ｎｍ、データ間隔：１．０ｎｍ、繰り返し：１の条件で測定した。
【００８０】
以下具体的な実験結果について説明する。
【００８１】
（１）高塩濃度に伴うＤＮＡのらせん構造の変化の確認
まず、高塩濃度に伴う二本鎖ＤＮＡのＢ−Ｚ転位を確認した。具体的には、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）水溶液中に、それぞれ塩化ナトリウムを５Ｍになるように加えた後、ＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定を行った。その結果をそれぞれ図４、図５に示す。なお、コントロールとして、上記ＤＮＡのみの水溶液についてのＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定を行い、その結果も併せて図示する。
【００８２】
図４（ａ）に示すように、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）水溶液にＮａＣｌ  ５Ｍを加えた場合（図中、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）／ＮａＣｌ  ５Ｍで示す）のＣＤスペクトルは、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）のみの水溶液のＣＤスペクトルと異なる波形を示すことがわかった。また同様に、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）水溶液にＮａＣｌ  ５Ｍを加えた場合（図中、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）／ＮａＣｌ  ５Ｍで示す）のＣＤスペクトルは、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）のみの水溶液のＣＤスペクトルと異なる波形を示すことがわかった。これは、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）、およびｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）水溶液中の塩濃度を５Ｍという高塩濃度に変化させた場合、これらの二本鎖ＤＮＡのらせん構造が変化したことを示している。
【００８３】
また、図４（ｂ）に示すように、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）水溶液にＮａＣｌ５Ｍを加えた場合（図中、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）／ＮａＣｌ  ５Ｍで示す）のＣＤスペクトルは、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）のみの水溶液のＣＤスペクトルと異なる波形を示すことがわかった。これも同様に、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）水溶液中の塩濃度を５Ｍという高塩濃度に変化させた場合、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）のらせん構造が変化したことを示している。この変化は、おそらくＢ−Ａ転位ではないかと推測される。
【００８４】
また、図５（ａ）に示すように、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）／ＮａＣｌ  ５Ｍ水溶液のＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）のみの水溶液のＵＶ−ｖｉｓスペクトルに比べて、約２９０ｎｍ付近にピークを有する。これは、フーグスティン型のスタッキング（図８参照）によるものであり、ＤＮＡのらせん構造の反転（Ｂ−Ｚ転位）がおこったときに出現するものである。
【００８５】
また、図５（ｂ）に示すように、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）水溶液のＵＶ−ｖｉｓスペクトルとｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）／ＮａＣｌ  ５Ｍ水溶液のＵＶ−ｖｉｓスペクトルとは、異なる波形を示している。
【００８６】
以上のことから、高塩強度に伴って、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）の塩基配列は、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へと変化することが確認できた。また、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）配列は、Ｂ型ＤＮＡ構造からＡ型ＤＮＡ構造へと変化すると推測された。
【００８７】
（２）ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳの添加によるＤＮＡのらせん構造変化の確認
次に、ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳと、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）、またはｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）とを混合することによって、これらの二本鎖ＤＮＡのらせん構造が変化するか否かを調べた。
【００８８】
具体的には、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）水溶液のそれぞれに、市販のポリチオフェンであるＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを０．０３ｗｔ％になるように添加・混合した後に、それぞれの水溶液についてＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定を行った。なお、コントロールとして、上記ＤＮＡのみの水溶液、およびＰＥＤＯＴ／ＰＳＳのみの水溶液についてもＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定を行った。これらの結果を併せて図６、図７に示す。
【００８９】
まず、図７（ａ）に示すように、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）水溶液にＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを添加・混合した場合（図中、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）／ＰＥＤＯＴで示す）のＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、図５（ａ）と同様に、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）のみの水溶液についてのＵＶ−ｖｉｓスペクトルに比べて、約２９０ｎｍ付近にピークを有することがわかった。すなわち、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）水溶液にＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを添加・混合した場合は、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）のらせん構造が変化していると考えられた。すなわち、この変化はＢ−Ｚ転位と考えられた。
【００９０】
また、図６（ａ）に示すように、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）水溶液にＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを添加・混合した場合（それぞれ図中、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）／ＰＥＤＯＴ、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）／ＰＥＤＯＴで示す）のＣＤスペクトルが、図４（ａ）に示す５ＭのＮａＣｌを添加した場合のｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）水溶液、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）水溶液についてのＣＤスペクトルと波形がわずかに異なっていることがわかった。これは、おそらく、ＤＮＡ水溶液にＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを加えた場合には、らせん構造が完全にはＺ型ＤＮＡ構造に転移せず、わずかにＡ型ＤＮＡ構造もしくはＢ型ＤＮＡ構造が混合しているためではないかと考えられた。
【００９１】
また、図６（ｂ）、図７（ｂ）に示すように、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）水溶液にＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを添加・混合した場合（図中、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）／ＰＥＤＯＴで示す）のＣＤスペクトルおよびＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）水溶液のみのＣＤスペクトルおよびＵＶ−ｖｉｓスペクトルと異なる波形をしていることがわかった。これらのことから、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）も、ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳと混合することによって、らせん構造の変化が起こっていると考えられる。
【００９２】
特に、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）は、図４（ｂ）、図６（ｂ）に示すように、微小の塩濃度の変化やＰＥＤＯＴ／ＰＳＳの影響でらせん構造が転移するため、複雑なＣＤスペクトルをとっていると考えられる。
【００９３】
また、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）についても、以前の研究から塩濃度の増加によってＢ−Ｚ転位が発生することが報告されている。しかし、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）のＢ−Ｚ転位は起こりにくいことが知られている。そのため、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）のＵＶスペクトルに比べ、２９０ｎｍ付近のピークが小さいと考えられる。
【００９４】
以上の結果より、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＴ）と、ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳとを混合させることによって、これらの二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造がＢ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へと変化することが明らかとなった。また、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）とＰＥＤＯＴ／ＰＳＳとを混合させることによって、二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造がＢ型ＤＮＡ構造からＡ型ＤＮＡ構造へと変化すると推測された。
【００９５】
（３）ＤＮＡ鎖長依存性
次いで、（ｄＧ−ｄＣ）８−（ｄＧ−ｄＣ）８、（ｄＧ−ｄＣ）３−（ｄＧ−ｄＣ）３、およびＰｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）を用いて、ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳのＤＮＡらせん構造変化誘導効果についてのＤＮＡ鎖長依存性を調べた。
【００９６】
具体的には、（ｄＧ−ｄＣ）８−（ｄＧ−ｄＣ）８、（ｄＧ−ｄＣ）３−（ｄＧ−ｄＣ）３、およびＰｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）水溶液のそれぞれに、ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを０．０６ｗｔ％になるように添加・混合した後に、それぞれの水溶液についてＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定を行った。なお、コントロールとして、上記ＤＮＡのみの水溶液、およびＰＥＤＯＴ／ＰＳＳのみの水溶液についてもＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定を行い、その結果も併せて図９に示す。
【００９７】
図９（ａ）に示すように、（ｄＧ−ｄＣ）８−（ｄＧ−ｄＣ）８、（ｄＧ−ｄＣ）３−（ｄＧ−ｄＣ）３、およびＰｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）水溶液にＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを添加・混合した場合（図中、それぞれ（ｄＧ−ｄＣ）８−（ｄＧ−ｄＣ）８／ＰＥＤＯＴ、（ｄＧ−ｄＣ）３−（ｄＧ−ｄＣ）３／ＰＥＤＯＴ、Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）／ＰＥＤＯＴで示す）のＣＤスペクトルは、そのＤＮＡ鎖長に関わらず、ほぼ同様の波形であった。また、ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳと混合させたＤＮＡ水溶液のＣＤスペクトルの波形は、ＤＮＡ水溶液のみのＣＤスペクトルの波形と、そのＤＮＡ鎖長に関わらず、異なっていることがわかった。
【００９８】
また、図９（ｂ）に示すように、（ｄＧ−ｄＣ）８−（ｄＧ−ｄＣ）８、（ｄＧ−ｄＣ）３−（ｄＧ−ｄＣ）３、およびＰｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）水溶液にＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを添加・混合した場合（図中、それぞれ（ｄＧ−ｄＣ）８−（ｄＧ−ｄＣ）８／ＰＥＤＯＴ、（ｄＧ−ｄＣ）３−（ｄＧ−ｄＣ）３／ＰＥＤＯＴ、Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）／ＰＥＤＯＴで示す）のＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、そのＤＮＡ鎖長に関わらず、ほぼ同様の波形であった。また、ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳと混合させたＤＮＡ水溶液のＵＶ−ｖｉｓスペクトルの波形も、ＤＮＡ水溶液のみのＵＶ−ｖｉｓスペクトルの波形と、そのＤＮＡ鎖長に関わらず、異なっていることがわかった。なお、（ｄＡ−ｄＣ）・（ｄＧ−ｄＴ）配列についても同様の実験を行ったところ、（ｄＧ−ｄＣ）・（ｄＧ−ｄＣ）配列の場合と同様の結果が得られた（結果は不図示）。さらに、（ｄＡ−ｄＴ）８−（ｄＡ−ｄＴ）８、（ｄＡ−ｄＴ）３−（ｄＡ−ｄＴ）３、ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）・ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）についても同様の実験を行ったところ、ＵＶ−ｖｉｓスペクトル、ＣＤスペクトルは変化しないことがわかった（結果は不図示）。
【００９９】
以上のことから、ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳと混合した（ｄＧ−ｄＣ）・（ｄＧ−ｄＣ）配列、および（ｄＡ−ｄＣ）・（ｄＧ−ｄＴ）配列は、そのＤＮＡ鎖長に関わらず、いずれもらせん構造のＢ−Ｚ転位を起すことがわかった。一方、（ｄＡ−ｄＴ）・（ｄＡ−ｄＴ）配列は、構造変化しないか、もしくはＢ−Ａ転位を起すのではないかと推測された。
【０１００】
（４）ＤＮＡらせん構造変化についてのＰＥＤＯＴの濃度依存性
続いて、Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）を用いて、ＤＮＡのらせん構造の変化についてのＰＥＤＯＴの濃度依存性を調べた。
【０１０１】
具体的には、Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）水溶液に、ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳをそれぞれ０．００３ｗｔ％、０．０３ｗｔ％、０．０６ｗｔ％になるように添加・混合した後に、それぞれの水溶液についてＣＤスペクトルの測定を行った。なお、コントロールとして、上記ＤＮＡのみの水溶液についてもＣＤスペクトルの測定を行い、それらの結果を併せて図１０に示す。
【０１０２】
図１０（ａ）に示すように、０．０３ｗｔ％、０．０６ｗｔ％になるようにＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを添加・混合したＤＮＡ水溶液のＣＤスペクトル（図中、それぞれＰＥＤＯＴ０．０３ｗｔ％＋ＤＮＡ、ＰＥＤＯＴ０．０６ｗｔ％＋ＤＮＡと示す）は、ほぼ同様の波形を示しており、ＤＮＡのらせん構造の反転が起こっていることがわかった。一方、０．００３ｗｔ％となるようにＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを添加・混合したＤＮＡ水溶液のＣＤスペクトル（図中、ＰＥＤＯＴ０．００３ｗｔ％＋ＤＮＡと示す）は、０．０３ｗｔ％、０．０６ｗｔ％となるようにＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを添加・混合した場合と若干異なる波形であることがわかった。これは、完全ではないが、ＤＮＡらせん構造の反転が一部起こっているためと考えられる。
【０１０３】
したがって、図１０（ｂ）に示すように、ＤＮＡのらせん構造は、ＰＥＤＯＴの濃度に依存して変化（Ｂ−Ｚ転位）することがわかった。
【０１０４】
（５）ＤＮＡのらせん構造の変化に対するＰＳＳの影響
本実施例にて用いているＰＥＤＯＴには安定剤としてＰＳＳが含まれている。このため、ポリアニオンであるＰＳＳがＤＮＡのらせん構造のＢ−Ｚ転位にどのような影響を及ぼすのか調べる必要があった。そこで、Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）を用いて、ＤＮＡのらせん構造の変化に対するＰＳＳの影響を調べた。
【０１０５】
具体的には、Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・Ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）水溶液に、ＰＳＳを０．０００３ｗｔ％になるように添加・混合した後に、それぞれの水溶液についてＣＤスペクトルの測定を行った。なお、コントロールとして、上記ＤＮＡのみの水溶液、およびＰＳＳのみの水溶液についてもＣＤスペクトルの測定を行い、それらの結果を併せて図１１に示す。
【０１０６】
図１１（ａ）に示すように、ＰＳＳとＤＮＡとの混合水溶液のＣＤスペクトルの波形と、ＤＮＡのみの水溶液のＣＤスペクトルの波形とは、ほぼ同様の形状となった。このことから、図１１（ｂ）に示すように、ＰＳＳを添加・混合しても、ＤＮＡのらせん構造は、Ｂ型ＤＮＡ構造のままであると考えられる。したがって、ＤＮＡのらせん構造の変化（Ｂ−Ｚ転位）は、ＰＳＳの影響を受けていないことがわかった。
【０１０７】
（６）ＤＮＡのらせん構造の変化に対するｐＨの影響
続いて、ＤＮＡのらせん構造の変化に対するｐＨの影響を調べた。具体的には、ｐＨ７に調整したリン酸バッファーを含む（ｄＧ−ｄＣ）８−（ｄＧ−ｄＣ）８水溶液に、ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳを添加・混合した後、この水溶液についてＣＤスペクトルを測定した。なお、コントロールとして、ＤＮＡのみの水溶液のＣＤスペクトルも併せて測定し、図１２に示す。
【０１０８】
図１２（ａ）に示すように、ｐＨ７のリン酸バッファー存在下で、（ｄＧ−ｄＣ）８−（ｄＧ−ｄＣ）８とＰＥＤＯＴとを混合させても、ＣＤスペクトルの波形の変化は認められなかった。このことから、ｐＨ７のリン酸バッファー存在下では、図１２（ｂ）に示すように、ＰＥＤＯＴとＤＮＡとを混合させても、ＤＮＡのらせん構造はＢ型ＤＮＡ構造のままであると考えられる。これは、ポリチオフェンであるＰＥＤＯＴのカルボカチオンがリン酸バッファー（バッファー中のリン酸アニオン）によって安定化されているため、ＤＮＡ／ＰＥＤＯＴ複合体の間で電荷移動が起こらなかったためと考えられる。
【０１０９】
なお、本実施例で用いているＰＥＤＯＴ／ＰＳＳは、水にやや溶け難い性質がある。そのため、溶けきれていないＰＥＤＯＴ／ＰＰＳが、ＤＮＡのらせん構造の変化に対してどのような影響を与えるのかを調べた。具体的には、ＰＥＤＯＴ／ＰＰＳ  ２．８ｗｔ％の溶液を０．２μｍのフィルターに通し、ｍｉｌｌｉＱで４７倍に希釈し、それをＤＮＡと１：１で相互作用させた後に、ＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定を行った。その結果、溶けきれていないＰＥＤＯＴ／ＰＰＳは、ＤＮＡのらせん構造の変化に対して、全く影響を与えていないことがわかった（結果は不図示）。
【０１１０】
以上のことから、二本鎖ＤＮＡとＰＥＤＯＴとを混合させることによって、二本鎖ＤＮＡのらせん構造をＢ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造、またはＢ型ＤＮＡ構造からＡ型ＤＮＡ構造へと変化させることができることが明らかとなった。なお、例えば、外部電場を変化させ、導電性高分子（本実施例ではＰＥＤＯＴ）の荷電状態を変化させることで、これらのＤＮＡらせん構造をさらに反転させることができると考えられる。すなわち、外部電場を変化等させることによって、例えば、Ｂ−Ｚ転位を起したＤＮＡにＺ−Ｂ転位を起させたり、Ｂ−Ａ転位を起したＤＮＡにＡ−Ｂ転位を起させたりすることができると考えられる。
【０１１１】
【発明の効果】
以上のように、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法によれば、塩濃度やアルコール濃度を高めることなく、ＤＮＡのらせん構造を効率的に変化させることができるという効果を奏する。
【０１１２】
それゆえ、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、ＤＮＡスイッチングシステム、塩基配列検出方法、および塩基配列検出キット等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】二本鎖ＤＮＡのらせん構造がＢ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へ、またＺ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造へ変化する現象を模式的に示した図である。
【図２】本実施の形態にて用いた導電性高分子であるＰＥＤＯＴの構造式を示す図である。
【図３】本実施の形態における実験にて用いた材料および実験方法を簡単に説明する図である。
【図４】（ａ）（ｂ）は、高濃度の塩を添加した場合におけるＤＮＡ構造変化をＣＤスペクトル測定にて調べた結果を示す図である。
【図５】（ａ）（ｂ）は、高濃度の塩を添加した場合におけるＤＮＡ構造変化をＵＶ−ｖｉｓスペクトル測定にて調べた結果を示す図である。
【図６】（ａ）（ｂ）は、ＰＥＤＯＴを添加した場合におけるＤＮＡ構造変化をＣＤスペクトル測定にて調べた結果を示す図である。
【図７】（ａ）（ｂ）は、ＰＥＤＯＴを添加した場合におけるＤＮＡ構造変化をＵＶ−ｖｉｓスペクトル測定にて調べた結果を示す図である。
【図８】二本鎖ＤＮＡ中における塩基のフーグスティン型のスタッキングを示す図である。
【図９】（ａ）（ｂ）は、ＰＥＤＯＴのＤＮＡらせん構造変化誘導効果についてのＤＮＡ鎖長依存性をＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトル測定にて調べた結果を示す図である。
【図１０】（ａ）は、ＰＥＤＯＴの濃度変化に伴うＤＮＡの構造変化をＣＤスペクトル測定にて調べた結果を示す図であり、（ｂ）は、ＰＥＤＯＴによってＤＮＡの構造が変化することを模式的に示す図である。
【図１１】（ａ）は、ＤＮＡのらせん構造の変化に対するＰＳＳの影響をＣＤスペクトル測定にて調べた結果を示す図であり、（ｂ）は、ＰＳＳの影響によってＤＮＡの構造が変化しないことを模式的に示す図である。
【図１２】（ａ）は、ＤＮＡのらせん構造の変化に対するＰＥＤＯＴの作用についてのｐＨ（リン酸バッファー）の影響をＣＤスペクトル測定にて調べた結果を示す図であり、（ｂ）は、ｐＨ（リン酸バッファー）の影響によってＰＥＤＯＴのＤＮＡの構造を変化させる機能が抑えられることを模式的に示す図である。
【図１３】（ａ）は、従来の高塩濃度によるＤＮＡらせん構造の変化を模式的に示す図であり、（ｂ）は、従来のＤＮＡらせん構造の変化を誘導する方法について簡単に説明する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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