(57)【要約】      （修正有）【課題】汚染土壌に存在する微生物相ついての変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法）によるデータの標準化および特徴付けのためのマーカーとなるポリヌクレオチドを提供すること。【解決手段】汚染土壌の浄化処理過程の特定の段階に検出される微生物相のマーカーポリヌクレオチドと該ヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列とからなるグループから選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドである。【選択図】  図８
2004242540.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１２で表されるヌクレオチド配列と、該ヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列とからなるグループから選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に含まれる、連続する少なくとも１５個のヌクレオチドの配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドは汚染土壌の浄化処理の処方の決定に用いる、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載のポリヌクレオチドを固定した、ＤＮＡマイクロアレイチップ。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドからなる第１のポリヌクレオチド鎖と、該第１のポリヌクレオチド鎖に相補的な第２のポリヌクレオチド鎖とからなる、２本鎖のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１３〜３６で表されるヌクレオチド配列と、該ヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列とからなるグループから選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
（１）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなる第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体からなる第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、
（２）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体からなる第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、
（３）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列の相補体から選択される１のヌクレオチド配列からなる第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体の３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、
（４）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体の３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドとからなるグループから選択される、１または２以上の２本鎖のポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号２５〜３６で表されるヌクレオチド配列から選択された１のヌクレオチド配列からなる第１のポリヌクレオチド鎖と、該第１のポリヌクレオチドの相補体からなる第２のポリヌクレオチド鎖とからなる、２本鎖のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドは汚染土壌の浄化処理の処方の決定に用いる、請求項５〜８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項５〜９に記載のポリヌクレオチドが挿入される、組換えベクター。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドはプラスミドベクターに挿入される、請求項１０に記載の組換えベクター。
【請求項１２】
微生物による汚染土壌の浄化処理の処方の決定方法であって、
浄化処理が施された複数の汚染土壌の浄化処理過程の少なくとも２の時点における、前記浄化処理が施された汚染土壌に存在する微生物相に関するデータ、汚染物質に関するデータ、前記浄化処理の処方に関するデータ、前記浄化処理の期間に関するデータを含むデータベースを作成すること、
浄化処理対象である対象汚染土壌に存在する微生物相に関するデータおよび汚染物質に関するデータを得ること、
前記対象汚染土壌に存在する微生物相に関するデータに近似する１または複数のデータを前記データベースから抽出すること、
前記抽出したデータに基づいて、前記対象汚染土壌に適用する浄化処理の処方を前記データベースから選択することを含み、
前記浄化処理が施された汚染土壌に存在する微生物相に関するデータおよび前記対象汚染土壌に存在する微生物相に関するデータは、
それぞれ前記浄化処理が施された汚染土壌および前記対象汚染土壌から抽出されるＤＮＡを鋳型とし、配列番号３７および３８のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅産物を得ること、
請求項９に記載のポリヌクレオチドおよび前記産物を変性剤濃度勾配ゲルに適用して電気泳動により分離すること、
電気泳動後のゲル中の前記ポリヌクレオチドおよび前記産物の分離パターンを記録すること、
前記分離パターンを前記ポリヌクレオチドの相対泳動度に基づいて較正して標準化したうえで比較することにより得る、
汚染土壌浄化処理の処方の決定方法。
【請求項１３】
微生物による汚染土壌の浄化処理方法であって、
請求項１２に記載の決定方法を用いて前記汚染土壌に対する汚染土壌浄化処理の処方を選択すること、
前記汚染土壌に前記処方による浄化処理を施すこと、
浄化処理中の少なくとも１の時点において、前記処方を継続するか、別の処方を採用するかまたは浄化処理を終了するかを決定すべく、請求項１２に記載の決定方法により汚染土壌浄化処理の処方を選択することを含む、汚染土壌の浄化方法。
【請求項１４】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号５で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号６で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号７で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号８で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号９で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号１０で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号１１で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、および配列番号１２で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物からなるグループから選択される１または２以上の微生物を含む、汚染土壌の浄化に用いられる添加材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、汚染土壌の浄化処理過程の特定の段階に検出される微生物相のマーカーポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドを利用する汚染土壌浄化処理の処方の決定方法とに関し、より具体的には、土壌に存在する微生物相に関する変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（以下「ＤＧＧＥ法」という。）によるデータの標準化および特徴付けに用いる微生物のリボソームＲＮＡ（以下「ｒＲＮＡ」という。）遺伝子由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
土壌の浄化処理技術として、汚染物質を分解することができる微生物（分解微生物）による浄化処理が注目されている。汚染土壌にもともと存在する分解微生物を活性化するバイオスティミュレーションにおいては汚染土壌に存在する分解微生物の性状把握が重要であり、外来の分解微生物を汚染土壌に添加するバイオオーギュメンテーションにおいては添加する外来の分解微生物の性状把握が重要である。
【０００３】
土壌に存在する分解微生物の性状把握には、従来、希釈法、平板培養法、メンブレンフィルター法などによる生細胞数を測定する方法が用いられてきた（杉山純多ら編、１９９９年、新版微生物学実験法、講談社サイエンティフィク、８２−８４ページ）。しかし、土壌に存在する微生物には培養困難なものが多いため、生細胞数を測定する方法では一部の微生物についてしか性状把握ができないうえ、培養期間として１月以上を要するという欠点があった。
【０００４】
微生物の培養を要しないで土壌に存在する分解微生物の性状把握をする技術として、キノンプロファイリング法がある（（社）日本下水道協会編、１９９７年、下水試験方法、上巻、７６３−７６７ページ；栗栖太ら、１９９９年、土木学会論文集、Ｎｏ６３６／ＶＩＩ−１３、２３−３３ページ）。しかし、キノンの分子種の多様性は微生物の生物種の多様性に比べると小さいため、特異的なキノンの分子種がない微生物については検出することはできない。
【０００５】
このため、近時、遺伝子工学的手法を利用して土壌に存在する分解微生物の性状把握をする技術が開発されている。かかる技術には、ＤＮＡマイクロアレイ法（例えば、Ｓｍａｌｌ、Ｊ．ら、２００１年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６７巻、４７０８−４７１６ページ；Ｗｕ、Ｌ．ら、２００１年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６７巻、５７８０−５７９０ページ；およびこれらに引用された論文）、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法（栗栖太ら、１９９９年、前出；非特許文献１；およびこれらに引用された文献）、Ｔ−ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、制限酵素切断断片末端の多様性）法（Ｌｉｕ、Ｗ．ら、１９９７年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６３巻、４５１６−４５２２ページ；および非特許文献１）、およびＤＧＧＥ（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｉｓｉｓ、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法がある（非特許文献２）。
【０００６】
ＤＧＧＥ法では、まず、分析対象の土壌から抽出したＤＮＡについて、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のような保存された配列相同性の高い領域における可変領域を挟む２つの不変領域の間をＰＣＲ法で増幅する。このとき、ＰＣＲに用いる一方のプライマーは、その末端にＧ−ＣクランプというＤＮＡ変性が起こりにくい配列を含むように設計しておく。そして、ＰＣＲ増幅産物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法により分離する。すると、変性剤の濃度勾配のあるゲルの中を移動するＰＣＲ増幅産物の個々のＤＮＡは、前記可変領域の塩基のＧＣ相対量に応じて、前記可変領域が変性を起こす変性剤の濃度の位置で停止してバンドを形成する。すなわち、変性剤の濃度が低いゲル部分の中のＤＮＡは、２本鎖状態のコンフォメーションをとるのでゲル中を移動することができる。移動とともにゲル中の変性剤の濃度が上昇して、前記ＤＮＡがＤＮＡ変性を起こす濃度の位置に達すると、前記Ｇ−Ｃクランプの部分は未変性で二重らせんのままだが、Ｇ−Ｃクランプ以外の部分は変性して二重らせんが解ける。すると、ＤＮＡは変性した２つの１本鎖部分とＧ−Ｃクランプの２本鎖部分とが３方向に伸びた状態のコンフォメーションをとるため、ＤＮＡは移動することができなくなり停止する。ＤＮＡの変性を起こす変性剤の濃度はＤＮＡの配列によって異なるため、微生物の種ごとにＰＣＲ増幅産物の変性剤濃度勾配ゲルでの移動度が異なる。したがって、電気泳動後のゲル中のＰＣＲ増幅産物の分離パターンの特定のバンドの移動度とそのバンドのＤＮＡ量とから、土壌中の微生物の構成を推定することができる。
【０００７】
ＤＧＧＥ法は、ＰＣＲプライマーに用いる領域の配列が保存されている微生物であれば、プライマーに挟まれた増幅産物の内部の配列に関係なく適用できる。例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡは、その全長配列または部分配列が１６，２７７種類以上がアライメントを取ったうえでデータベース化されており、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ、ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｈｔｍｌ／）を通じて利用可能となっている（Ｍａｉｄａｋ、Ｂ．Ｌ．ら、２００１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２９巻、１７３−１７４ページ）。そこで、前記データベースを参照して、全ての系統の微生物か、特定の系統に分類される微生物かという知りたい微生物の範囲に応じてプライマー配列を選択することにより、所望の範囲の微生物についての個別の種ごとの個体数（細胞数）を推定することができる。
【０００８】
分解微生物を含む全ての微生物の構成についてのデータが得られるＤＧＧＥ法は、土壌に含まれる汚染物質の種類および量とそれぞれの汚染物質を分解する活性とを反映するので、微生物を利用する浄化処理の処方を検討するうえで利用価値が高い。
【０００９】
ＤＧＧＥ法、Ｔ−ＲＦＬＰ法、キノンプロファイリング法および土壌から抽出したＤＮＡを用いるＤＮＡマイクロアレイ法は、分類学的な見地から微生物群集の構造を解析する方法（構造解析）である。これに対し、ＦＩＳＨ法、汚染物質を添加した培地を用いるＭＰＮ法および土壌から抽出したＲＮＡを用いるＤＮＡマイクロアレイ法は、浄化能力という微生物群集の機能を解析する方法（機能解析）である。ただし、前記構造の解析方法であっても、分解微生物の生物種または分類群に特異的なプライマーまたはプローブを用いる場合には、微生物群集の機能の解析方法として用いることができる。
【００１０】
これらの技術を用いて、分解微生物を利用する汚染土壌の浄化処理の過程における汚染土壌に存在する微生物の変動が調べられてきた（非特許文献２およびこれに引用された文献）。
【００１１】
【非特許文献１】
Ｉｗａｍｏｔｏ、Ｔ．およびＮａｓｕ、Ｍ．、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９２巻、１−８ページ
【非特許文献２】
Ｍｕｙｚｅｒ、Ｇ．ら、１９９３年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５９巻、６９５−７００ページ
【００１２】
出願人は、先に、対象土壌について適用すべき浄化処理の処方を合理的に決定する方法および浄化処理方法についての特許出願を行った（特願２００２−１９１２７１）。前記特許出願に係る微生物による汚染土壌の浄化処理の処方の決定方法は、複数の汚染土壌の浄化処理過程の少なくとも２の時点における、前記汚染土壌に存在する微生物相に関するデータ、汚染物質に関するデータ、前記浄化処理の処方に関するデータ、前記浄化処理の期間に関するデータを含むデータベースを作成すること、浄化処理対象である対象汚染土壌に存在する微生物相に関するデータおよび汚染物質に関するデータを得ること、前記対象汚染土壌における微生物相のデータに近似するデータを前記データベースから抽出すること、前記抽出したデータに基づいて、前記対象汚染土壌に適用する浄化処理の処方を前記データベースから選択することを含む。
【００１３】
しかし、土壌に存在する微生物相に関するデータについて、検索対象のデータに近似するデータをデータベースから抽出するためには、微生物相に関するデータの全てを予め標準化する必要がある。例えば、ＤＧＧＥ法に用いるゲルの変性剤の濃度勾配は、厳密にはゲル毎に相異なる。そこで、共通のマーカーＤＮＡを全てのゲルに適用して電気泳動を行い、泳動後の分離パターンのデジタルデータをマーカーＤＮＡの相対泳動度に基づいて較正して標準化したうえでデータの抽出作業を行う必要がある。
【００１４】
さらに、ある土壌の汚染浄化の進行状態を特徴づけするためには、該土壌の微生物相に関するデータに汚染土壌の浄化の過程の各段階に特異的なバンドが含まれているかどうかを調べる必要がある。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、土壌に存在する微生物相に関するデータを標準化するため、及び前記土壌の汚染浄化の進行状態を特徴づけするために用いることのできる、ＤＧＧＥ法によるデータのマーカーとなるポリヌクレオチドを提供することにある。本発明の他の目的は、土壌に存在する微生物相に関するデータを得るためのＤＮＡマイクロアレイチップを提供することにある。また他の目的は、土壌に存在する微生物相に限定されることなく、さまざまな用途のためのＤＧＧＥ法によるデータをマーカーとなるポリヌクレオチドの相対移動度に基づいて標準化しまたは特徴付けることにより、変性剤の濃度勾配の異なるゲルを電気泳動して得られたＤＧＧＥ法のバンドの分離パターンを比較できる手段を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１〜１２で表されるヌクレオチド配列と、該配列番号１〜１２で表されるヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列とからなるグループから選択される、１または２以上のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドである。前記ポリヌクレオチドは汚染土壌の浄化処理の処方の決定に用いられる場合がある。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドは、さらに、配列番号１〜１２で表されるヌクレオチド配列と、配列番号１〜１２で表されるヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列とからなるグループから選択される、１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に含まれる、連続する少なくとも１５個のヌクレオチドの配列からなるポリヌクレオチドである。前記ポリヌクレオチドは汚染土壌の浄化処理の処方の決定に用いられる場合がある。本発明においては、オリゴヌクレオチド、すなわち、数個ないし数十個のヌクレオチドの配列からなるヌクレオチドの重合体は、ポリヌクレオチドに含まれる。
【００１８】
本発明のＤＮＡマイクロアレイチップは、さらに、配列番号１〜１２で表されるヌクレオチド配列と、配列番号１〜１２で表されるヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列とからなるグループから選択される、１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドおよび／または、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に含まれる、連続する少なくとも１５個のヌクレオチドの配列からなるポリヌクレオチドを固定した、ＤＮＡマイクロアレイチップである。
【００１９】
本発明のＤＮＡマイクロアレイチップは、さらに、配列番号１〜１２で表されるヌクレオチド配列と、配列番号１〜１２で表されるヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列とからなるグループから選択される、１または２以上のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに含まれる、連続する少なくとも１５個のヌクレオチドの配列からなるポリヌクレオチドを固定した、ＤＮＡマイクロアレイチップである。前記ポリヌクレオチドは汚染土壌の浄化処理の処方の決定に用いられる場合がある。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、さらに、配列番号１〜１２で表されるヌクレオチド配列と、配列番号１〜１２で表されるヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列とからなるグループから選択される１のヌクレオチド配列からなる第１のポリヌクレオチド鎖と、第１のポリヌクレオチド鎖に相補的な第２のポリヌクレオチド鎖とからなる、２本鎖のポリヌクレオチドである。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドは、さらに、配列番号１３〜３６で表されるヌクレオチド配列と、配列番号１３〜３６で表されるヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列とからなるグループから選択される、１または２以上のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドである。前記ポリヌクレオチドは汚染土壌の浄化処理の処方の決定に用いられる場合がある。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドは、（１）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなる第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体からなる第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、
（２）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体からなる第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、
（３）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列の相補体から選択される１のヌクレオチド配列からなる第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体の３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、
（４）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体の３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドとからなるグループから選択される、１または２以上の２本鎖のポリヌクレオチドである。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２５〜３６で表されるヌクレオチド配列から選択された１のヌクレオチド配列からなる第１のポリヌクレオチド鎖と、前記１のヌクレオチド配列の相補体からなる第２のポリヌクレオチド鎖とからなる、２本鎖のポリヌクレオチドである。前記ポリヌクレオチドは汚染土壌の浄化処理の処方の決定に用いられる場合がある。
【００２４】
本発明の組換えベクターは、（１）配列番号１〜１２で表されるヌクレオチド配列と、該ヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列とからなるグループから選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドと、（２）配列番号１３〜３６で表されるヌクレオチド配列と、該ヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列とからなるグループから選択される１または２以上のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドとからなるグループから選択されるポリヌクレオチドを挿入した、組換えベクターである。
【００２５】
本発明の組換えベクターは、また、（１）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなる第１のポリヌクレオチドと、該第１のポリヌクレオチドの相補体からなる第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、（２）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体からなる第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、（３）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列の相補体から選択される１のヌクレオチド配列からなる第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドの相補体の３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、（４）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第１のポリヌクレオチドと、該第１のポリヌクレオチドの相補体の３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドとからなるグループから選択される、１または２以上の２本鎖のポリヌクレオチドとからなるグループから選択されるポリヌクレオチドを挿入した、組換えベクターである。
【００２６】
本発明のベクターは、適当な宿主細胞の中で増殖可能な全ての複製可能なＤＮＡベクターを含む。本発明のベクターは、大腸菌で増殖することができるプラスミド、ファージまたはファージミドであることが好ましい。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は配列表に列挙されている。これらのうち、配列番号１〜１２で表されるヌクレオチド配列は、ＤＧＧＥ法のゲルから切り出したバンドのＤＮＡの塩基配列のうち、配列番号３７で表されるヌクレオチド配列と、配列番号３９で表されるヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列との間に挟まれるヌクレオチド配列である。（１）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなる第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体からなる第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、
（２）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体からなる第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、
（３）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列の相補体から選択される１のヌクレオチド配列からなる第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体の３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、
（４）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体の３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドとからなるグループから選択される、１または２以上の２本鎖のポリヌクレオチドは、本発明のＤＧＧＥ法のＰＣＲ反応産物である。とくに、上記（２）、（３）および（４）の２本鎖のポリヌクレオチドは、デオキシアデノシンの３’オーバーハング付加活性のある耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ反応産物である。配列番号２５〜３６で表されるヌクレオチド配列は、配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列の５’側にチミジンが付加され、かつ、３’側にデオキシアデノシンが付加されたヌクレオチド配列である。配列番号２５〜３６で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと、該１のヌクレオチド配列の相補体からなるポリヌクレオチドとからなる２本鎖ポリヌクレオチドは、デオキシアデノシンの３’オーバーハング付加活性のある耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応産物を３’チミジンオーバーハングのある組換えベクターにクローン化するときに組換えベクターに挿入されるポリヌクレオチドである。
【００２８】
本発明の微生物による汚染土壌の浄化処理の処方の決定方法は、
（Ａ）浄化処理が施された複数の汚染土壌の浄化処理過程の少なくとも２の時点における、前記汚染土壌に存在する微生物相に関するデータ、汚染物質に関するデータ、前記汚染土壌に施された浄化処理の処方に関するデータ、前記浄化処理の期間に関するデータを含むデータベースを作成すること、
（Ｂ）浄化処理対象である対象汚染土壌に存在する微生物相に関するデータおよび汚染物質に関するデータを得ること、
（Ｃ）前記対象汚染土壌に存在する微生物相に関するデータに近似する１または複数のデータを前記データベースから抽出すること、
（Ｄ）前記抽出したデータに基づいて、前記対象汚染土壌に適用する浄化処理の処方を前記データベースから選択することを含み、
前記浄化処理が施された汚染土壌に存在する微生物相に関するデータおよび前記対象汚染土壌に存在する微生物相に関するデータは、
（ａ）それぞれ前記浄化処理が施された汚染土壌および前記対象汚染土壌から抽出されるＤＮＡを鋳型とし、配列番号３７および３８のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅産物を得ること、
（ｂ）（１）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなる第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体からなる第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、（２）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体からなる第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、（３）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列の相補体から選択される１のヌクレオチド配列からなる第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体の３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドと、（４）配列番号１３〜２４で表されるヌクレオチド配列から選択される１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第１のポリヌクレオチドと、前記１のヌクレオチド配列の相補体の３’側にデオキシアデノシンがさらに付加された第２のポリヌクレオチドとからなる、２本鎖のポリヌクレオチドとからなるグループから選択される、１または２以上の２本鎖のポリヌクレオチドおよび前記産物を変性剤濃度勾配ゲルに適用して電気泳動により分離すること、
（ｃ）電気泳動後のゲル中の前記ポリヌクレオチドおよび前記産物の分離パターンを記録すること、
（ｄ）前記分離パターンを前記ポリヌクレオチドの相対泳動度に基づいて較正して標準化したうえで比較することにより得る。
【００２９】
本発明の微生物による汚染土壌の浄化処理方法は、前記汚染土壌浄化処理の処方の決定方法を用いて前記汚染土壌に対する汚染土壌浄化処理の処方を選択すること、前記汚染土壌に前記処方による浄化処理を施すこと、浄化処理中の少なくとも１の時点において、前記処方を継続するか、別の処方を採用するかまたは浄化処理を終了するかを決定すべく、前記汚染土壌浄化処理の処方の決定方法により汚染土壌浄化処理の処方を選択することを含む。
【００３０】
本発明の汚染土壌の浄化に用いられる添加材は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号５で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号６で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号７で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号８で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号９で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号１０で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、配列番号１１で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物、および配列番号１２で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物からなるグループから選択される１または２以上の微生物を含む。
【００３１】
本発明における「微生物」は、単細胞生物および多細胞生物を含む真核生物と、古細菌および細菌を含む原核生物とを含み、これらが単独で生活するか、あるいは他の真核生物または原核生物に寄生するかを問わない。
【００３２】
土壌の「微生物相」とは、その土壌に存在する微生物の構成、すなわちその土壌に存在する全ての微生物の種類およびそれぞれの種類の微生物の細胞数についての情報をいう。換言すれば、ある土壌の優占種の数およびそれぞれの優占種の優占の程度についての情報である。
【００３３】
前記土壌に存在する微生物相に関するデータは、例えば、ＤＧＧＥ法、Ｔ−ＲＦＬＰ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＦＩＳＨ法、キノンプロファイリング法およびＭＰＮ法を含む、これらに限られない全ての方法により得ることができる。また、これらの方法を組み合わせることによっても得ることができる。さらに、前記構造解析と前記機能解析とを併用することによっても得ることができる。
【００３４】
「汚染物質」とは、微生物によって分解されあるいは微生物相を変動させる、人体および環境に有害な全ての物質をいう。例えば、原油と、Ａ重油およびＣ重油を含む重油のような原油から精製される全ての液体および固体の石油製品（以下「油」という。）が該当する。
【００３５】
「汚染物質に関するデータ」とは、汚染物質の種類と量とについてのデータをいう。「汚染土壌」とは、前記汚染物質を含む土壌をいう。また、「非汚染土壌」とは、前記汚染土壌に隣接し、前記汚染土壌と土質が実質的に同じで、前記汚染物質を含まない土壌をいう。
【００３６】
「汚染土壌の浄化処理の処方」とは、バイオスティミュレーションにあっては、土壌に酸素を供給すること、さまざまな種類および量の栄養塩を土壌に添加すること、水分保持のために散水したり粘土質の土壌や滅菌した堆肥を混合すること、通気性を高めるために砂質土を混合すること、土壌のｐＨを一定に保つこと等を含むがこれらに限られない、汚染土壌にもともと存在する分解微生物を活性化するための全ての手段をいい、バイオオーギュメンテーションにあっては、予め同じ汚染物質を添加して該汚染物質を分解する微生物が増殖するように馴養した模擬汚染土壌を添加すること、堆肥、活性汚泥など分解微生物を大量に含む物質を添加すること、培養下で増殖させた前記汚染物質を分解する微生物を添加すること、本発明の汚染土壌の浄化に用いられる添加材を添加すること等を含むがこれらに限られない、外来の分解微生物を汚染土壌に添加する全ての手段をいう。
【００３７】
前記土壌に存在する微生物相に関するＤＧＧＥ法によるデータは、複数の土壌から抽出されるＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応で増幅した複数の産物を得て、該産物を変性剤濃度勾配ゲルに適用して電気泳動によりバンドを分離し、電気泳動後のゲル中の前記産物の分離パターンを記録し、前記分離パターンを比較することにより得られる。
【００３８】
前記ポリメラーゼ連鎖反応には、異なる種または系統に分類される微生物のゲノムの間で配列相同性が高い領域、すなわち生物進化の過程で保存された配列を有する領域において、異なる種の微生物で配列が共通な不変領域が種特異的な配列多様性を有する可変領域を挟むＤＮＡを増幅できるようなプライマーを用いる。
【００３９】
プライマーは、異なる種の微生物で配列が共通な不変領域が種特異的な配列多様性を有する可変領域を挟むように配置されていることを条件として、ゲノム上のいかなる領域の配列からでも設計することができる。好ましい領域の一つは１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子である。１６Ｓ  ｒＲＮＡには合計９箇所の可変領域があるが、これらのいずれかを挟むようにプライマーを設計してもよい。より好ましくはＶ３という可変領域を挟むようなプライマーである。順方向プライマーである配列番号３７のヌクレオチド配列のうちＧ−Ｃクランプを除く３’末端から１７塩基のヌクレオチド配列と、逆方向プライマーである配列番号３８のヌクレオチド配列の逆配列である配列３９のヌクレオチド配列とは、それぞれ、前記Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔのデータベースを検索すると、１万以上の種の１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列に含まれることがわかっている。したがって、配列番号３７および３８が最も好ましいプライマーである。
【００４０】
「汚染土壌の浄化のための添加材」とは、バイオレメディエーションによる汚染土壌の浄化処理のために浄化対象の汚染土壌に添加するいかなる物質をもいい、予め浄化対象の汚染物質を添加して培養を重ねた分解菌馴養土を含むが、これに限られない。
【００４１】
【発明の効果】
本発明に係るポリヌクレオチドは、複数の汚染土壌の浄化処理例における土壌に存在する微生物のｒＲＮＡ遺伝子の部分配列を含む。本発明に係るポリヌクレオチドは、変性剤の濃度勾配が異なるゲルであっても同じ濃度の位置にバンドを形成する。したがって、本発明に係るポリヌクレオチドは、相対移動度のマーカーとしてバンドの分離パターンを標準化することにより、変性剤の濃度勾配が異なるゲルでのＤＧＧＥ法によるデータの比較を可能にする。本発明に係るポリヌクレオチドは、土壌に存在する微生物相のデータに限らず、すべての用途のＤＧＧＥ法によるデータの標準化のためのマーカーとして有用である。また、本発明に係るポリヌクレオチドは、浄化処理の特定の段階の土壌に存在する微生物相についてのＤＧＧＥ法によるデータに出現するバンドに由来する。したがって、本発明に係るポリヌクレオチドは、被検材料の土壌に存在する微生物相についてのＤＧＧＥ法によるデータの特徴付けを容易にすることができる。さらに、本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るポリヌクレオチド自体を鋳型とするか、あるいは本発明に係るポリヌクレオチドを挿入した組換えベクターを鋳型とすることにより、いつでも必要に応じて大量に調製することができる。
【００４２】
本発明に係るポリヌクレオチドの少なくとも１本のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド配列か、あるいは該ヌクレオチド配列の逆配列は、５’および３’末端に、それぞれ配列番号３７および３９で表されるヌクレオチド配列を含む。したがって、本発明に係るポリヌクレオチドを鋳型として配列番号３７および３８で表されるヌクレオチド配列からなるプライマーと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを用いるＰＣＲ反応を行うことにより、本発明に係るポリヌクレオチドを大量に調製することができる。配列番号３９で表されるヌクレオチド配列は配列番号３８で表されるヌクレオチド配列の相補体だからである。また、本発明に係るポリヌクレオチドは組換えベクターに挿入されている場合がある。この場合には、前記組換えベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体のクローンを単離することができる。また形質転換体を増殖させることにより、前記組換えベクターを大量に調製することもできる。したがって、本発明に係るポリヌクレオチドは、必要に応じて大量調製できるため、量的な制約を受けない。
【００４３】
本発明に係るポリヌクレオチドは、土壌に存在する微生物に含まれるＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションを行うためのプローブとして、ＦＩＳＨ法による土壌に存在する微生物の同定に用いることができる。また、本発明に係るポリヌクレオチドは、Ｔ−ＲＦＬＰ法のようなＰＣＲ法による核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。
【００４４】
本発明に係るＤＮＡマイクロアレイチップは、分析対象の土壌に存在する微生物相のデータを得るために用いることができる。
【００４５】
本発明に係る方法において作成するデータベースは、浄化処理例である複数の汚染土壌の浄化処理の各々の過程について、少なくとも２の時点における、前記浄化処理の期間に関するデータと、前記浄化処理の両時点における微生物相および汚染物質に関するデータとを含むことから、各浄化処理の過程における両時点間の浄化進行の程度を知ることができる。
【００４６】
前記データベース中におけるデータ（浄化処理例のデータ）のうち汚染土壌に存在する微生物相に関するデータ（浄化処理例の微生物相データ）には、汚染物質の濃度によって増殖、生存等に影響を受ける微生物と、汚染物質を分解する微生物とについての情報が含まれる。前者の微生物は汚染物質の濃度を反映し、後者の微生物は土壌の浄化能力を反映する。
【００４７】
本発明の微生物による汚染土壌の浄化処理の処方の決定方法は以下の手順で行う。
【００４８】
まず、予め浄化処理例の土壌の微生物相のＤＧＧＥ法によるデータを得る。ここで、浄化処理例の土壌に由来するＤＮＡを配列番号３７および３８で表される配列を有するプライマーでＰＣＲ反応させて得られた反応産物をＤＧＧＥ法のゲルで電気泳動する際に、本発明のポリヌクレオチドをゲルの少なくとも１のレーンに適用する。ＤＧＧＥ法による電気泳動後のゲルを染色して得られたバンドの分離パターンをデジタル画像として記録する。このデジタル画像を、本発明のポリヌクレオチドの相対泳動度に基づいて較正する（以下「標準化処理」という。）。標準化処理後の浄化処理例の微生物相のＤＧＧＥ法によるデータをデータベースに格納する。浄化処理対象の土壌に存在する微生物相のデータ（浄化処理対象の微生物相データ）についても、同様に、本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１のレーンに適用したゲルを電気泳動し、染色して得られたバンドの分離パターンをデジタル画像として記録し、標準化処理を行う。これにより、例えばＤＧＧＥ法における泳動ゲル毎の変性剤の濃度勾配の相違のような、微生物相のデータを収集する過程での実験条件の相違の影響を排除することができる。
【００４９】
浄化処理対象の標準化された微生物相データと近似する、１または複数の浄化処理例の標準化された微生物相のデータを、前記データベースから抽出する。浄化処理対象の標準化された微生物相データと浄化処理例の標準化された微生物相データとが近似することは、浄化処理対象の土壌と汚染土壌との間で、土壌に存在する汚染物質の濃度および微生物の浄化能力が近似することを意味する。
【００５０】
抽出の作業には、対象の標準化された微生物相データと浄化処理例の標準化された微生物相データとの近似の程度に応じて、前記データベースに格納された複数の浄化処理例のデータを１列に並べる作業と、前記近似の程度に応じて、データベースに格納された土壌の浄化処理例のデータをクラスタに分類する作業とを含む。
【００５１】
抽出により、各浄化処理例について適用された処方に関する前記データベース中のデータをクラスタ分類して表示することができる。
【００５２】
その結果、前記クラスタ分類のパターンに基づいて、浄化対象の汚染土壌に適用するのにふさわしい処方であるかどうかを判断し、浄化対象の汚染土壌に適用する処方の候補を合理的に選択することができる。
【００５３】
本発明の浄化方法にあっては、対象の微生物相のデータと近似する微生物相のデータを、データベースに格納された土壌に存在する微生物相のデータから抽出し、抽出された土壌についての処方、汚染物質および浄化処理期間のデータに基づいて浄化対象の土壌に適用する処方を決定する。そのため、浄化対象土壌の浄化処理の過程の開始の時点においては、いかなる処方を適用するか、あるいは前記対象土壌は分解微生物を利用する浄化処理に適するか否かについて、合理的に判断することができる。さらに、前記対象の土壌の浄化処理の過程の途中の時点で、処方を変更するか、あるいは浄化処理を終了するかについて合理的に判断することができる。
【００５４】
【発明の実施の形態】
本発明に係るポリヌクレオチドは、土壌に存在する微生物相に関するデータを得るためのＤＧＧＥ法の電気泳動後のゲルから切り出されたＤＮＡのバンドに由来する。そこで、まず、ＤＧＧＥ法のためのサンプルの調製について説明する。
【００５５】
土壌のサンプルは、土壌を均一に撹拌した後の採取物からなる。あるいは、土壌の数カ所をランダムに選んで採取したサンプルの混合物からなる。
【００５６】
前記土壌のサンプルからのＤＮＡの抽出は、新鮮な土壌のサンプルまたは−２０°Ｃで凍結保存されたサンプルから行う。ＤＮＡ抽出には、例えばＱｂｉｏｇｅｎｅ社（米国カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）のＦａｓｔＤＮＡ（登録商標）ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌを使用して精製することができる。このようにして精製されたＤＮＡは−２０°Ｃで凍結保存する。
【００５７】
ＤＮＡを取り扱う作業およびその他の遺伝子工学の作業は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら編、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第３版、２００１年、米国ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ刊）を参照して行うことができる。
【００５８】
つぎに、ＰＣＲ法による、前記土壌から抽出されたＤＮＡの増幅を行う。
【００５９】
前記ＰＣＲ法は、石井らの総説（石井浩介ら、２０００年、Ｍｉｃｒｏｂｅｓａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ、１５巻、５９−７３ページ）を参照して行うことができる。例えば、配列番号３７および３８のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを用いて前記土壌サンプルから抽出されたＤＮＡを鋳型として増幅することができる。配列番号３７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドは、微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ３領域を増幅するためのフォワードプライマーあるいは順方向プライマーであって、前記Ｇ−Ｃクランプを含む。配列番号３８のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドは、微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ３領域を増幅するためのリバースプライマーあるいは逆方向プライマーである。好ましい耐熱性ＤＮＡポリメラーゼには、例えば、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ）が含まれる。
【００６０】
増幅後の反応液のＤＮＡはフィルターに吸着させて精製する。例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（米国、マサチューセッツ州、Ｂｅｄｆｏｒｄ）のＡｍｉｃｏｎＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−ＰＣＲ遠心フィルターデバイスを使用することができる。
【００６１】
次に、変性剤濃度勾配ゲルでの電気泳動を行う。
【００６２】
変性剤濃度勾配ゲルでの電気泳動は、前記石井らの総説を参照して行うことができる。例えば、ゲルの調製のために、未重合の８％アクリルアミド（アクリルアミド：ビス＝３７．５：１）および０．５ｘＴＡＥ（４０ｍＭ  トリス酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に変性剤を５０〜６０％含む高変性剤ゲル溶液と、８％アクリルアミドおよび１ｘＴＡＥに変性剤を２０〜３０％含む低変性剤ゲル溶液とを用意する。ここで変性剤は、４０％  ホルムアミドと、７Ｍ  尿素との混合液を１００％とする。高変性剤ゲル溶液および低変性剤ゲル溶液に重合開始剤である過硫酸アンモニウムおよびＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）をそれぞれ最終濃度０．０４％および０．１％になるように添加し、速やかに濃度勾配作成装置に注ぐ。濃度勾配作成装置は、低濃度変性剤を含むゲル溶液用の容器と高濃度変性剤を含むゲル溶液用の容器とを含む。前記２つの容器は連通管で接続されていて、混合された溶液は、チューブを介して２枚のゲル板間の溶液受け入れ空間に静かに注入される。前記溶液受け入れ空間は、高さ１６ｃｍ、幅１ｍｍの寸法を有する。ゲルが重合した後、ゲルを電気泳動装置に固定し、陽極および陰極の電極槽に０．５ｘＴＡＥ（前記１ｘＴＡＥを２分の１に希釈したもの）をバッファーとして注ぎ込む。前記精製されたＰＣＲ産物は、１つのウェルあたり１８０〜３００ｎｇ使用する。少なくとも１のレーンに本発明のポリヌクレオチドを適用して、相対泳動度のマーカーとする。泳動条件は４０Ｖで１６時間である。
【００６３】
変性剤濃度勾配ゲルでの電気泳動の結果は次のようにして記録する。電気泳動後の変性剤濃度勾配ゲルを、臭化エチジウムのようなＤＮＡと結合する蛍光色素で染色し、紫外線で励起された蛍光をモノクロＣＣＤカメラのような撮像素子で撮影した後、ＢＭＰ形式、ＪＰＥＧ形式などのデジタル画像として記録する。
【００６４】
デジタル画像として記録された変性剤濃度勾配ゲル電気泳動のバンドの分離パターンは、必要に応じて、相対移動度に基づいて標準化処理またはノーマライゼーションを行う。標準化処理は、電気泳動の際に少なくとも１のレーンに適用された本発明のポリヌクレオチドの相対移動度を基準にして他のレーンのバンドの分離パターンを較正することにより行われる。標準化処理の作業は、任意の手法を用いて行うことができる。例えば、アマシャムバイオサイエンス社のＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒなどの市販のソフトウェアを用いて行うことができる。
【００６５】
変性剤濃度勾配ゲルの特定のバンドからのＤＮＡの回収は以下のとおり行う。
【００６６】
前記撮影の終了後、トランスイルミネーターの上にゲルを置く。そして、紫外線照明下で、前記ゲルから使い捨て式メスまたはパスツールピペットのような切断手段を用いて単一のバンドの部分のゲル片を切り出す。該ゲル片を切り出すときには、バンド毎に新品の切断手段を用いて、ＤＮＡの混入を防ぐ。
【００６７】
切り出されたゲル片を１．５ｍｌプラスチックチューブのような容器に入れる。ゲル片を純水またはバッファーで洗浄して、ゲル片に含まれる変性剤を除去する。新たな純水またはバッファーをゲル片の入ったチューブに加えて静置する。この純水またはＴＥバッファーに抽出されたＤＮＡを鋳型とし、配列番号３７および３８で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ反応を行う。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ反応産物のＤＮＡの３’末端に１個のデオキシアデノシンを付加する（デオキシアデノシンがオーバーハングされる）活性を有することが好ましい。１個のチミジンが３’末端に付加されたベクターを用いることにより、ＰＣＲ反応産物のＤＮＡにオーバーハングされたデオキシアデノシンは、ベクターＤＮＡにオーバーハングされたチミジンと対合することができるが、ＰＣＲ反応産物同士あるいはベクターＤＮＡ同士では対合することはできない。そこで、ＰＣＲ反応産物のＤＮＡとベクターとの連結を効率的に行うことが可能となるとともに、複数のＰＣＲ反応産物のＤＮＡがベクターに挿入されることを防止できる。
【００６８】
前記ＰＣＲ反応産物はフィルターに吸着させて精製する。精製したＤＮＡと、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州、マジソン）のような適当なプラスミドベクターとをＴ４ＤＮＡリガーゼのような酵素により連結する反応を行う。上記のとおり、好ましいベクターは、切断部位のそれぞれの３’末端に１個のチミジンが付加された状態で用意される。
【００６９】
前記連結する反応の産物でＪＭ１０９株のような適当な大腸菌のコンピテント細胞に形質転換を起こさせる。好ましいベクターと大腸菌の菌株との組み合わせは、ベクターに何らかの外来ＤＮＡが挿入されているかどうかを迅速に判定することができるものである。例えば、β−ガラクトシダーゼのα相補性を利用して、形質転換細胞をＸ−ｇａｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を添加した寒天培地の上で培養し、形成されたコロニーの色によって判定することができる。
【００７０】
前記形質転換された細胞をＸ−ｇａｌを添加した寒天培地の上で培養して、コロニーを形成させる。ＰＣＲ反応産物のＤＮＡが挿入されたベクターを形質転換した大腸菌は、Ｘ−ｇａｌを添加した寒天培地の上で白色のコロニーを形成するのに対し、ベクターだけが形質転換された大腸菌は、Ｘ−ｇａｌを添加した寒天培地の上で青色のコロニーを形成する。白色のコロニーを選ぶことにより、ベクターに何らかの外来ＤＮＡが挿入された形質転換細胞のコロニーを選択する。選択するコロニーの数は、ＤＧＧＥ法のゲルから切り出したバンドあたり１０〜２０個である。
【００７１】
それぞれのコロニーの大腸菌に形質転換された組換え体の解析は以下のとおりに行う。
【００７２】
まず、それぞれの組換え体の挿入ＤＮＡの調製を行う。これは、組換え体プラスミドを調製することにより行うこともできる。代替策として、ＰＣＲ法を用いて行うこともできる。すなわち、前記白色コロニーから抽出したＤＮＡを鋳型とし、用いたベクターの挿入部位を挟む近傍のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、それぞれのプラスミドクローンに挿入されたＤＮＡをＰＣＲ反応で増幅する。前記ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒをベクターとして用いるときには、好ましいプライマーは、配列番号４０および４１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれＴ７プライマーおよびＳＰ６プライマーと一般に呼ばれている）である。前記プライマーに対応するヌクレオチド配列がベクターの開裂部位を挟むように配置されているので、開裂部位に挿入されたＤＮＡの配列の如何に関係なく挿入されたＤＮＡを増幅することができるからである。
【００７３】
上記のとおり調製された挿入ＤＮＡの解析は、以下のとおり行う。まず前記増幅された挿入ＤＮＡの長さをアガロースゲル電気泳動法により確認する。その結果、予想される長さであると認められた挿入ＤＮＡを含むクローンについては、さらに、Ｒｓａ  Ｉ、Ｍｓｐ  ＩまたはＳａｕ３Ａ  Ｉのような切断部位の出現頻度の比較的高いとされる制限酵素を用いて、精製された前記挿入ＤＮＡを消化し、各クローンに挿入されたＤＮＡの切断パターンをアガロースゲル電気泳動法によって調べる。前記切断パターンに基づいて、ＤＧＧＥ法のゲルから切り出したバンドごとの形質転換コロニーの分類を行う。
【００７４】
つぎに、前記挿入ＤＮＡがＤＧＧＥ法のゲルにおいて、切り出したバンドと同じ相対泳動度を示すことを確認する。まず、上記のとおり分類されたバンドごとの形質転換コロニーのうち、同じ切断パターンの挿入ＤＮＡを含む組換え体のコロニーの数が多い１または２以上のコロニーを選択する。前記コロニーに由来するプラスミドＤＮＡか、該プラスミドＤＮＡを鋳型として配列番号４０および４１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応により得たＤＮＡかを鋳型とし、配列番号３７および３８で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行って得たＤＮＡを変性剤濃度勾配ゲルに適用して電気泳動を行う。このようにして、ＤＧＧＥ法のゲルから切り出したバンドと同じ相対泳動度を示す挿入ＤＮＡを含むプラスミドのクローンを同定する。
【００７５】
それぞれのバンドと同じ相対泳動度を示す挿入ＤＮＡの塩基配列は、本発明の技術分野の通常の技量を有する者に周知のいかなる方法で決定してもよい。例えば、前記挿入ＤＮＡを含むプラスミドを精製し、配列番号４０または４１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとするサイクルシーケンシング反応を行う。前記反応は、例えば、アプライドバイオシステムズ社製のＢＩＧ  Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーター・サイクルシーケンシングキットを用いて行うことができる。塩基配列の決定は、例えば、アプライドバイオシステムズ社製ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０ジェネティックアナライザーを用いて行うことができる。
【００７６】
上記のとおり決定された塩基配列のうち、配列番号３７で表されるヌクレオチド配列と、配列番号３９で表されるヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列との間に挟まれるヌクレオチド配列か、配列番号３８で表されるヌクレオチド配列と、配列番号３７で表されるヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列との間に挟まれるヌクレオチド配列かをクエリーとして、相同性のあるヌクレオチド配列を検索する作業を行う。
【００７７】
あるクエリーのヌクレオチド配列に対して相同性のあるヌクレオチド配列を検索するための２つの代表的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムである。。ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムは、ＮＣＢＩの匿名ＦＴＰサーバー（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）の／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓ／で入手可能である。説明書に記載され、前記アルゴリズムとともに配布された、デフォルトのパラメーター値に設定したＢＬＡＳＴＮアルゴリズムのバージョン２．０．４（１９９８年２月２４日）、バージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）またはバージョン２．０．１１（２０００年１月２０日）を、本発明によるポリヌクレオチド変異体の決定に用いるのが好ましい。ＢＬＡＳＴＮを含むＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズムの使用法は、ＮＣＢＩのウェッブサイトのＵＲＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｎｅｗｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌ）と、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．らの「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ（ギャップ入りのＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース検索プログラム）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻、３３８９−３４０２頁、１９９７年という刊行物とに記載されている。
【００７８】
ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、インターネット上のｆｔｐサイトｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｆａｓｔａ／で入手可能である。説明書に記載され、プログラムとともに配布されたデフォルトのパラメーター値に設定されたＦＡＳＴＡアルゴリズムの、バージョン２．０ｕ４（１９９６年２月）またはバージョン３．２ｔ０９（１９９９年１２月７日）を、本発明による変異体の決定に用いることが好ましい。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの使用法は、Ｐｅａｒｓｏｎ、ＷＲおよびＬｉｐｍａｎ、ＤＪ、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｏｏｌｓｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ（生物学的な配列の解析のための改良されたツール）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、２４４４−２４４８頁、１９８８年と、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＦＡＳＴＰ  ａｎｄ  ＦＡＳＴＡ（ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡを用いる迅速で敏感な配列比較）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３巻、６３−９８頁、１９９０年とに説明されている。
【００７９】
これらのアルゴリズムは、例えば、ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ）で利用することができる。
【００８０】
本発明に係る汚染土壌の浄化処理の処方を決定する方法においては、その決定に当たり、まず、複数の浄化処理例についてのデータベースを作成する。該データベースには、各処理例における汚染土壌の浄化処理の過程について、少なくとも２の時点における、各例の汚染土壌に存在する微生物相に関するデータ、汚染物質に関するデータ、前記浄化処理の処方に関するデータおよび前記浄化処理の期間に関するデータを含む。
【００８１】
これらのデータは各浄化処理例ごとに関連付けて、前記データベースに格納される。したがって、前記データベースに格納された微生物相データを検出することにより、これに対応する汚染物質に関するデータ、前記浄化処理の処方に関するデータ、前記浄化処理の期間に関するデータを関連させて抽出することができる。
【００８２】
前記データベースにおける浄化処理例の微生物相データおよび汚染物質に関するデータは、各汚染土壌から浄化処理過程の少なくとも２の時点におけるサンプルを採取する。前記２の時点の間隔は、例えば、１週間、２週間または１ヶ月のように任意に定めることができる。
【００８３】
前記土壌のサンプルは、土壌を均一に撹拌した後の採取物からなる。あるいは、土壌の数カ所をランダムに選んで採取したサンプルの混合物からなる。汚染物質に関するデータを得るための測定は即時に行う。また、微生物相のデータは、ＦＩＳＨ法、キノンプロファイリング法、ＭＰＮ法、ＤＧＧＥ法、Ｔ−ＲＦＬＰ法、およびＤＮＡマイクロアレイ法を用いて得ることができる。ただし、ＦＩＳＨ法、キノンプロファイリング法およびＭＰＮ法による土壌に存在する微生物相のデータを得るための測定は即時におこなうが、ＤＧＧＥ法、Ｔ−ＲＦＬＰ法およびＤＮＡマイクロアレイ法による測定は、前記土壌のサンプルを−２０°Ｃで凍結保存しておき、後日行ってもよい。
【００８４】
前記データベースに含まれる浄化処理例の汚染物質に関するデータは、該汚染物質の種類と量とを含む。
【００８５】
微生物で分解することができる汚染物質には、油の他に、ＴＣＥ（トリクロロエチレン）およびＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）などの有機ハロゲン化合物、２，４，６−ＴＮＴ（トリニトロトルエン）が含まれる（前記Ｉｗａｍｏｔｏ、Ｔ．およびＮａｓｕ、Ｍ．、２００１年およびこれに引用された文献を参照）。微生物で浄化することができる汚染物質には、前記微生物で分解できる汚染物質の他、還元により毒性を低減できる６価クロム、硫化により不溶性の塩にすることができる鉛およびカドミウムのような金属を含む。
【００８６】
汚染物質に関するデータは任意の方法で得ることができる。例えば、汚染物質が油の場合、汚染物質の種類、すなわち油分組成は、イヤトロスキャンを用いたＴＬＣ−ＦＩＤ法により分析する。また、汚染物質の量、すなわち油分濃度は、溶媒抽出−ＩＲ法によるＴＰＨの測定と、ソックスレー抽出重量法によるｎ−Ｈｅｘ（ヘキサン）抽出物質量の測定とにより決定する。
【００８７】
汚染土壌に存在する微生物相に関する、例えば、ＤＧＧＥ法によるデータは、上記のとおり、前記汚染土壌に存在する微生物のＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型として、配列番号３７および３８で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ反応により前記土壌から抽出されたＤＮＡの増幅を行い、得られたＤＮＡと、本発明のポリヌクレオチドとを変性剤濃度勾配ゲルに適用して電気泳動を行って、バンドの分離パターンをデジタル画像として記録し、本発明のポリヌクレオチドの相対泳動度に基づいて標準化処理を施すことにより、得られる。
【００８８】
前記ゲルのデジタル画像の標準化と、各レーンの分離パターンの画像データの切り出しおよびデータベースへの格納の作業は、任意の手法を用いて行うことができる。例えば、アマシャムバイオサイエンス社のＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ、ＰＤＩ社（米国ニューヨーク州）のＤｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ（登録商標）、Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ社（米国バージニア州）のＧｅｎｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などの市販のソフトウェアを用いて行うことができる。
【００８９】
前記データベースの作成後、浄化処理対象である対象汚染土壌に存在する微生物相に関するＤＧＧＥ法によるデータおよび汚染物質に関するデータを得る。この浄化処理対象である対象汚染土壌に存在する微生物相に関するＤＧＧＥ法によるデータについても、前記汚染土壌に存在する微生物相に関するＤＧＧＥ法によるデータと同様に、該浄化処理対象である対象汚染土壌から、土壌サンプルを採取し、土壌からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡのＰＣＲ法による増幅産物と本発明のポリヌクレオチドとを変性剤濃度勾配ゲルに適用して電気泳動を行い、バンドの分離パターンのデジタル画像を記録し、標準化処理を施して得る。
【００９０】
その後、浄化処理対象の汚染土壌の微生物相データに近似する１または複数のデータを前記データベースから抽出する。その作業は以下のとおり行う。
【００９１】
対象汚染土壌の微生物相のデータと前記データベースに格納されている複数の浄化処理例の微生物相のデータとを相互に比較して、前記対象汚染土壌の微生物相データ（検索対象のデータ）と近似する前記浄化処理例の微生物相データを前記データベースから抽出する。この作業には、階層クラスタ分析の手法を用いる。この手法を用いると、検索対象のデータとの近似の程度を定量化できるとともに、前記データベースに格納されているデータをグループまたはクラスタに分類して、検索対象のデータの近縁関係を系統樹としてデンドログラムで表示することができる。
【００９２】
階層クラスタ分析の手法には、ＵＰＧＭＡ（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｐａｉｒ−ｇｒｏｕｐｉｎｇ）法および近隣結合（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＪ）法のような距離行列法が含まれる（Ｓａｉｔｏｕ  Ｎ．、１９９６年、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ．編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６巻、４２７−４４９ページ、米国フロリダ州、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ刊）。
【００９３】
ＵＰＧＭＡ法は、一般的には、対象とするデータ間の全ての距離を求めた後、最小の距離を示すデータのペアを見つけ、このクラスターを形成したペアと他のデータ間の距離を算術平均により求め、その後、そのペアをあたかも一つのデータであるかのように扱って、同じことを繰り返し、得られたクラスターから系統樹を作成していくアプローチである。
【００９４】
近隣結合法は、一つのｎｏｄｅ（節）だけでつながった２つのＯＴＵ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  Ｕｎｉｔ、グラフ理論におけるｅｄｇｅに相当する）を表現する「近隣」という概念を用いた、段階的探索を行う距離行列法である。最初に星状の系統樹を仮定し、全ての枝の長さの和が最小になるように近隣を見つけていくアプローチである。
【００９５】
ＵＰＧＭＡ法および近隣結合法は系統樹を段階的に探索する方法であるが、他に系統樹を網羅的に探索する方法もある。階層クラスタ分析のさまざまな手法については、石村貞夫（「グラフ統計の話」、１９９５年、東京図書刊）およびＲｉｃｈａｒｄ  Ａ．ら（「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１９９６年、英国Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ刊）に記載されている。
【００９６】
微生物相に関してＤＧＧＥ法により得られたデータについて階層クラスタ分析の手法で比較をすることは前記ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒをはじめとする市販ソフトウェアを用いて行うこともできる。前記の比較をするインターネット上で入手可能なフリーウェアおよびシェアウェアが多数ある。例えばＥＢＩ（欧州バイオインフォマティクス研究所）の“Ｔｈｅ  ＢｉｏＣａｔａｌｏｇ”のサイト（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｒｂａ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｂｉｏｃａｔａｌｏｇ／Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．ｈｔｍｌ）から入手できる。
【００９７】
前記汚染土壌に存在する微生物相に関してＤＧＧＥ法により得られたデータを含むデータベースを作成し、浄化対象土壌に存在する微生物相に関してＤＧＧＥ法により得られたデータと近似するデータを抽出する作業は、市販ソフトウェアを組み合わせて手作業で行うこともできるが、上記フリーウェアまたはシェアウェアを組み込んだ専用ソフトウェアを用いることにより、ハイスループット化を図ることができる。
【００９８】
その後、抽出したデータに基づいて、浄化対象の汚染土壌に適用する浄化処理の処方を前記データベースから選択して決定する。これは、以下のとおり行う。
【００９９】
すなわち、浄化対象の微生物相データと浄化処理例の微生物相データとの近似の程度に基づいて、データベースから浄化処理の処方を抽出する。前記近似の程度を、前記階層クラスタ分析の手法を用いて決定すると、浄化処理対象となる土壌について適用すべき処方を、対象の微生物相データと浄化処理例の微生物相データとの近似の程度に応じて定量化し分類して、その結果を系統樹として視覚的に理解しやすいように表示することができる。例えば、抽出された処方は、縦軸を汚染物質の濃度、横軸を処理期間の日数または週の数として、予め設定した近似の程度以上にデータが近似するそれぞれの汚染土壌の処理過程を、色および線の種類の異なる折れ線で表すことができる。前記色および線の種類で、近似の程度と分類とを区別するとともに、それぞれの汚染土壌の処理過程で適用された処方を系統樹で表示することができる。
【０１００】
前記データベースに格納された浄化処理に関するデータが十分に多いときには、前記系統樹のパターンに応じて、浄化対象の土壌について適用すべき浄化処理の処方の内容と該処方の適用がどの程度にふさわしいかの判断を自動化して、処方の選択をさらに合理的にすることができる。
【０１０１】
例えば、浄化対象の微生物相データと近似する複数の浄化処理例の微生物相データ相互間の近似の程度が比較的低い場合には、近似の程度を比較して、該近似の程度の最も高い浄化処理例について適用された処方を、浄化対象土壌に適用すべき処方として選択する。
【０１０２】
逆に、前記近似の程度が比較的高い場合には、単に前記近似の程度を比較して処方に優先順位をつけるのではなく、浄化対象の微生物相データと同程度に近似する複数の浄化処理例の微生物相データについて適用された処方同士を比較して、最も短い期間に最も速く汚染物質が減少した浄化処理例について適用された処方を、浄化対象土壌に適用すべき処方として選択する。
【０１０３】
前記データベースは、さらに、浄化処理を行った個々の土壌のケースごとに、非汚染土壌、すなわち、浄化処理を行った土壌に隣接し、該土壌と土質が実質的に同じで、汚染物質を含まない土壌の微生物相に関する前記ＤＧＧＥ法によって得られた分離パターンのデータと、汚染物質の種類およびその濃度のデータとを含むものとすることができる。
【０１０４】
任意の時点における汚染物質の種類およびその濃度が、前記非汚染土壌における汚染物質の種類およびその濃度と実質的に同じ場合、またはその土壌について法令等で定められた汚染物質の種類およびその濃度の基準を満たす場合には、浄化処理を終了する。
【０１０５】
本発明の汚染土壌の浄化処理方法をそのフローチャートである図１を用いて説明する。
【０１０６】
まず、浄化処理開始前に、浄化処理対象の汚染土壌のサンプルを採取し、前記対象の汚染土壌に存在する微生物相のデータを得る。つぎに、前記対象の微生物相データと近似する前記データベースに格納された浄化処理例の微生物相データとの比較を行い、近似の程度に基づいて、浄化対象土壌に適用すべき処方を決定する。前記データベースに格納された浄化処理例の微生物相データとの近似の程度が低い場合には、分解微生物を用いる汚染土壌の浄化処理そのものに適合しない可能性があるので、生物的な処理を中止して、他の浄化処理法を採用することを検討する。
【０１０７】
浄化処理中には、適当な時間間隔を置いて浄化処理対象の土壌サンプルを採取し、前記対象の汚染土壌に存在する微生物相のデータを得る。つぎに、前記対象の微生物相データと近似する前記データベースに格納された浄化処理例の微生物相データとの比較を行い、近似の程度に基づいて、浄化対象土壌に適用すべき処方を決定する。すなわち、浄化の進行に応じて、これまでと同じ処方を適用することが決定されるときは、該処方を継続する。また、これまでとは異なる処方を適用することが決定されるときは、処方を変更する。あるいは、適用すべき処方に基づいて浄化処理を終了する。
【０１０８】
浄化処理を終了する場合には、全ての作業を終了する他、汚染物質の濃度は低下したが、浄化処理対象の土壌の用途との関係で、例えば、土壌に存在する微生物相が非汚染土壌の微生物相と同一でないと土壌の利用ができない場合には、土壌に存在する微生物相についてのデータを継続的に監視する。この場合には、土壌サンプルを定期的に採取して土壌に存在する微生物相データを得る。次に、前記対象の微生物相データと近似する前記データベースに格納された浄化処理例の微生物相データとの比較を行い、近似の程度に基づいて、浄化対象土壌に適用すべき処方を決定する。そして、土壌の微生物相が土地利用に適するものとなるまでこれを繰り返す。
【０１０９】
【実施例】
１．模擬汚染土壌浄化実験（第１の実験）
第１の実験では、人為的に作成した汚染土壌での浄化処理の過程において、土壌に存在する微生物相のデータ、汚染物質のデータその他を収集した。まず、砂質シルト系の畑地土壌にＡ重油またはＣ重油を１０，０００ｍｇ／ｋｇずつ添加して５ヶ月間馴養を行った。馴養後の残存油分量を表１に示す。これに新たにＡ重油またはＣ重油を添加して、油分濃度を約８，０００ｍｇ／ｋｇとした後、室温（１０〜２０°Ｃ）の屋内でのそれぞれの土壌の浄化の過程を追跡した。適用した浄化処方を表１に示す。
【０１１０】
【表１】
2004242540.tif 000003
【０１１１】
表１において、１００ｍｇ−Ｐ／ｋｇとは、Ｐすなわちリンを土壌１ｋｇあたり１００ｍｇ添加することをいい、実際には、土壌１ｋｇあたり、０．２８１ｇのＫ２ＨＰＯ４と、０．２１９ｇのＫＨ２ＰＯ４とを添加する。５００ｍｇ−Ｎ／ｋｇとは、Ｎすなわち窒素を土壌１ｋｇあたり５００ｍｇ添加することをいい、土壌１ｋｇあたり１．４３ｇのＮＨ４ＮＯ３を添加する。
【０１１２】
第１の実験における汚染物質のデータを図２に示す。油分濃度の分析は、ソックスレー抽出重量によるｎ−Ｈｅｘ（ヘキサン）抽出物質量の測定と、溶媒抽出−ＩＲ法によるＴＰＨの測定とで行った。また、油分の組成分析は、イヤトロスキャンを用いたＴＬＣ−ＦＩＤ法により行った。図２の線グラフはｎ−Ｈｅｘ抽出物質量、棒グラフはＴＰＨである。Ａ重油は飽和分、芳香族分などの比較的微生物による分解が容易な成分が多かったため、４ヶ月の浄化処理期間で約９５％の除去が確認された。Ｃ重油のほうは、レジン分、アスファルテン分などの難分解性成分を多く含むため、Ａ重油に比べると浄化は進まなかったが、７〜８割の除去が確認された。
【０１１３】
第１の実験におけるそれぞれの土壌に存在する微生物相について土壌サンプルから抽出したＤＮＡを鋳型として、配列番号３７および３８の配列を有するプライマーと、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（登録商標）（宝酒造）および付属のバッファーとを用いて前記土壌サンプルから抽出されたＤＮＡを増幅することができる。反応条件は、９５°Ｃで３０秒、５５°Ｃで３０秒、７２°Ｃで１５秒のサイクルを２８回繰り返し、その後４°Ｃで保存する。得られた増幅産物をＤＧＧＥ法により分離したゲルの泳動パターンを図３に示す。レーン１、２、３および４は、それぞれ、Ａ重油・実験開始時、Ａ重油・実験終了時、Ｃ重油・実験開始時およびＣ重油・実験終了時の土壌サンプル由来の増幅産物の分離パターンである。
【０１１４】
これらの分離パターンの比較から、Ａ重油を含む土壌における優占種とＣ重油を含む土壌における優占種とに違いがあることがわかった。これらの土壌はもともと同じものであったことから、汚染物質の種類によって微生物相が大きく変化することが確認された。また、Ａ重油を含む土壌では、実験開始時の土壌に比べて実験終了時の土壌の優占種が少ないのは、分解微生物が優占化したためであると考えられる。
【０１１５】
２．実際の油で汚染された土壌の浄化実験（第２の実験）
第２の実験は、高濃度の潤滑油（約９０，０００ｍｇ／ｋｇ）で実際に汚染された粘性土壌を用いた。この土壌は難透気性のため、通気性・通水性の向上を目的として現場内の同一油で汚染された砂質土を洗浄処理した砂を混合した。また、別途Ａ重油を添加して培養を重ねた分解菌馴養土も添加した。実験条件を表２に示す。ケース１および２は５ヶ月間、ケース３および４は４ヶ月間、３０°Ｃで処理を行った。撹拌と散水は週１回行った。
【０１１６】
【表２】
2004242540.tif 000004
【０１１７】
図４に第２の実験における油分濃度の経時的変化を示す。ケース１は粘性土壌に洗浄した砂質土を約３０％混合し通気性を高めたものであり、粘性土壌のみのケース３と比較すると初期濃度は低いが、明らかに経時的な油分の分解除去が認められる。またケース２はケース１に馴養土を約３％添加し、通気性向上に加え分解菌の投入も同時に行った。その結果、ケース１以上に油分濃度の分解が促進された。一方、粘性土壌に馴養土のみを約３％添加したケース４においては、通気性の向上がないため油分の分解も進んでいない。
【０１１８】
第２の実験におけるそれぞれの土壌に存在する微生物相について、土壌サンプルから抽出したＤＮＡを配列番号３７および３８の配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。得られた増幅産物をＤＧＧＥ法により分離したゲルの泳動パターンを図５に示す。それぞれのレーンの上の数字は、それぞれのレーンの土壌サンプルを採取するまでの各ケースの実験条件での処理時間を週単位で表している。図７は、第２の実験におけるケース１〜４の表記の期間の処理後に採取された土壌サンプルと、粘性土および馴養土のそれぞれの土壌サンプルとに由来する増幅産物を適用したゲルから切り出したバンドの位置および名称を示す。図７を参照してレーンごとのバンドの分離パターンを比較すると、馴養土を除く全てのサンプルで検出されるバンド（Ｃａｓｅ  １（１３））がある。また、馴養土のレーン（５２）と、馴養土を添加した実験条件であるケース２および４（Ｃａｓｅ  ２（１７）およびＣａｓｅ  ４（４０））とに共通して検出されるバンドがある。さらに、ケース１の処理開始から８、１３および２１週間後に採取した土壌のサンプルではバンド（Ｃａｓｅ  １（１０））が検出されるが、この時期は、油分の経時的変化における芳香族分の減少時期と一致している。
【０１１９】
３．変性剤濃度勾配ゲルで分離されたバンドからのＤＮＡの回収
図６は、第１の実験におけるそれぞれの土壌サンプル由来の増幅産物を適用したゲル（図３と同じ）から切り出したバンドの位置および名称を示す。各レーンの上の数字は、実験開始から土壌サンプルの採取までの時間を週単位で表す。上記のとおり、図７は、第２の実験におけるケース１〜４の表記の期間の処理後に採取された土壌サンプルと、粘性土および馴養土のそれぞれの土壌サンプルとに由来する増幅産物を適用したゲルから切り出したバンドの位置および名称を示す。
【０１２０】
図６および１０に示したバンドから抽出されたＤＮＡを鋳型とし、配列番号３７および３８で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ）によりＰＣＲ反応を行った。反応条件は、９５°Ｃで３０秒、５５°Ｃで３０秒、７２°Ｃで１５秒のサイクルを２８回繰り返すことであった。その後反応産物は一時的に４°Ｃで保存され、長期的には−２０°Ｃで保存された。。ＰＣＲ反応産物を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（米国、マサチューセッツ州、Ｂｅｄｆｏｒｄ）のＡｍｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−ＰＣＲ遠心フィルターデバイスで処理して、ＤＮＡを精製した。
【０１２１】
切り出されたＤＧＧＥ法のゲルのバンド由来の精製ＤＮＡは、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒと連結された。反応に用いたＴ４ＤＮＡリガーゼおよびバッファーは、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州、マジソン）に付属のものを用い、反応条件はマニュアルに従った。ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒの全塩基配列を配列番号４２に示す。ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒは、制限酵素ＥｃｏＲＶにより配列番号４２の配列の第５１番目のチミジンと第５２番目のデオキシアデノシンとの間で平滑末端を生じるように切断され、切断部位のそれぞれの３’末端に１個のチミヂンが付加された状態で用意されていた。
【０１２２】
ＰＣＲ反応に用いた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ）は、増幅産物のＤＮＡの３’末端にデオキシアデノシンを付加する。そこで、ＰＣＲ反応産物の５’末端は、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒの第５１番目のチミジンの次に、上記のとおりベクターに付加された、チミジンの３’末端と連結されている。また、ＰＣＲ反応産物の３’末端には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによりデオキシアデノシンが付加されており、該デオキシアデノシンの３’末端は、前記ベクターの第５２番目のデオキシアデノシンの５’末端と連結されている。
【０１２３】
それぞれのバンドのＤＮＡを挿入したベクターは、熱ショック法により大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテント細胞に形質転換された。形質転換されたＪＭ１０９細胞は、アンピシリン（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＸ−ｇａｌ（２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に播かれた。白色のコロニーをそれぞれのバンドについて１０〜２０個ずつ単離した。単離されたコロニーの菌体懸濁液を用いて、配列番号４０および４１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ）によりＰＣＲ反応を行って、それぞれの形質転換体のクローンに含まれるプラスミドに挿入された配列のＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応条件は、９５°Ｃで５分間のプレヒーティングの後、９５°Ｃで３０秒、５５°Ｃで３０秒、７５°Ｃで１分のサイクルを２５回繰り返すことであった。その後反応産物は一時的に４°Ｃで保存され、長期的には−２０°Ｃで保存された。。
【０１２４】
前記挿入された配列のＤＮＡは、以下のとおり解析された。まず、上記のとおり配列番号４０および４１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動法により分析し、全長が約４００ｂｐのものを選んだ。つぎに、増幅されたＤＮＡを制限酵素Ｒｓａ  Ｉ、Ｍｓｐ  ＩおよびＳａｕ３Ａ  Ｉで消化した後、アガロースゲル電気泳動法により切断断片の分離パターンを比較した。切断断片の分離パターンの同一性に基づいて、形質転換体クローンをクラスタに分類した。
【０１２５】
つぎに、得られたクローンのＤＮＡが変性剤濃度勾配ゲルでの電気泳動で切り出したバンドと同じ相対泳動度を示すことを確認した。切り出したバンドのそれぞれについて、同一クラスタに属するクローン数の多い順に少なくとも２つのクラスタに属する形質転換体クローンに含まれるプラスミドを鋳型とし、配列番号３７および３８で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ）によりＰＣＲ反応を行って、それぞれの形質転換体のクローンに含まれるＤＧＧＥ法のプライマーに挟まれる配列のＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応条件は、９５°Ｃで３０秒、５５°Ｃで３０秒、７２°Ｃで１５秒のサイクルを２８回繰り返すことであった。その後反応産物は一時的に４°Ｃで保存され、長期的には−２０°Ｃで保存された。。ＰＣＲ反応産物を変性剤濃度勾配ゲルに適用し、電気泳動後、ゲルを染色してバンドの分離パターンを、対応する土壌サンプルのＤＧＧＥ法によるＰＣＲ反応産物のバンドと比較して、一致することを確認した。
【０１２６】
さらに、増幅されたＤＮＡの塩基配列を決定した。シーケンシング反応は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−ＰＣＲ遠心フィルターデバイスで精製したＤＮＡを鋳型とし、配列番号４１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｓｐ６プライマー）をプライマーとして、アプライドバイオシステムズ社製のＢＩＧ  Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーター・サイクルシーケンシングキットを用いて行った。サイクルシーケンシング反応の条件は、９６°Ｃで１分間のプレヒーティングの後、９６°Ｃで１０秒、５５°Ｃで５秒、６０°Ｃで４分のサイクルを２５回繰り返した。その後反応産物は、一時的に４°Ｃで保存され、長期的には−２０°Ｃで保存された。塩基配列の決定は、アプライドバイオシステムズ社製ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０ジェネティックアナライザーを用いて行った。
【０１２７】
表３に、本願明細書に添付する配列表に記載の配列番号と、該配列番号のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの名称との対応関係を示す。表３において、複数のポリヌクレオチドが１つの配列番号に対応するのは、塩基配列が同一であることを意味する。
【０１２８】
表３
2004242540.tif 000005
【０１２９】
図８は、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と既知のヌクレオチド配列との類縁関係を示すデンドログラムである。本発明のポリヌクレオチドをクエリーとしてＤＤＢＪのサイトでデフォルトの設定でＢＬＡＳＴ検索を行い、相同性の高い既知のヌクレオチド配列を見つけた。本発明のポリヌクレオチドと、前記相同性の高い既知のヌクレオチド配列との類縁関係は、ＣＬＡＳＴＡＬ  Ｗを用いてデンドログラムとして表示した。
【０１３０】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＤＧＧＥ法のゲルのバンドは、第１の実験においては、Ａ重油で汚染された土壌の浄化処理開始時（Ａ−０ｕ６）および４ヶ月間処理後（Ａ−４ｕ６）のいずれにも検出された。そこで、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、Ａ重油で汚染された土壌のマーカーとなる可能性がある。また、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は、Ａ重油で汚染された土壌の浄化に関連すると考えられる。さらに、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物を含む、汚染土壌の浄化のための添加材は、油、とくにＡ重油で汚染された土壌の浄化に有用であると考えられる。
【０１３１】
配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、第１の実験のＡ重油で汚染された土壌では４ヶ月間処理後（Ａ−４ｏ１４）で検出された。第２の実験では、馴養土（５２−２）において検出された。また、第２の実験のケース２の処理条件においては、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは処理開始時（１７−５）で検出され、処理の進行に伴い検出量が増大した。配列番号２で表されるヌクレオチド配列と同じ相対移動度のバンドは、第２の実験においては、ケース２の条件での処理開始から２〜１３週間後と、ケース３の４〜１３週間後と、ケース４の処理開始時および処理開始後２〜１６週間後とで検出された。（ただし、ケース４の処理開始時のサンプルから切り出されたバンド（４０−４）から回収されたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号９）は、配列番号２のヌクレオチド配列と同一ではなかった。）ここで、第２の実験における馴養土はＡ重油を添加して培養を重ねた分解菌馴養土であった。したがって、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、Ａ重油で汚染された土壌の浄化の進行のマーカーとなる可能性がある。また、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は、Ａ重油で汚染された土壌の浄化に関連すると考えられる。さらに、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物を含む、汚染土壌の浄化のための添加材は、油、とくにＡ重油で汚染された土壌の浄化に有用であると考えられる。
【０１３２】
配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、第１の実験のＣ重油で汚染された土壌サンプルで最も優占的なバンド（Ｃ０−１５、Ｃ０−２０およびＣ４−２０）であった。そこで、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、Ｃ重油で汚染された土壌のマーカーとなる可能性がある。また、配列番号３で表されるヌクレオチド配列と相同性の高いＡＢ０３５０３４は、油汚染ビーチより採取されている。そこで、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は、油、とくにＣ重油で汚染された土壌の浄化に関連すると考えられる。さらに、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物を含む、汚染土壌の浄化のための添加材は、油、とくにＣ重油で汚染された土壌の浄化に有用であると考えられる。
【０１３３】
配列番号４で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、第１の実験でのＡ重油で汚染された土壌の浄化処理開始時（Ａ−０ｏ６）には検出されたが、４ヶ月の浄化処理後には検出されなかった。したがって、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を含むバンドは、Ａ重油で汚染された土壌の浄化の初期段階のマーカーとなる可能性がある。また、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は、Ａ重油で汚染された土壌の浄化の初期段階に関与すると考えられる。また、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物を含む、汚染土壌の浄化のための添加材は、油、とくにＡ重油で汚染された土壌の浄化に有用であると考えられる。
【０１３４】
配列番号５で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、第２の実験におけるケース１の条件での浄化処理開始から２週間後（７−８）に検出された。ケース１は第２の実験での潤滑油で汚染された土壌の浄化が最も効率的に進行する条件である。そこで、配列番号５で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは潤滑油で汚染された土壌の浄化が効率的に進行する状態のマーカーとなる可能性がある。また、配列番号５で表されるポリヌクレオチドを有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は、潤滑油で汚染された土壌の効率的な浄化に関与すると考えられる。さらに、配列番号５で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物を含む、汚染土壌の浄化のための添加材は、油、とくに潤滑油で汚染された土壌の浄化に有用であると考えられる。
【０１３５】
配列番号６で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、第２の実験におけるケース１の条件での浄化処理開始から８週間後（１０−１５）に検出された。このバンドと同じ相対移動度のバンドは、ケース１の条件での浄化処理開始から１３および２１週間後と、ケース２の条件での浄化処理開始から８〜２１週間後と、ケース４の条件での浄化処理開始から４〜１６週間後にも検出されている。（ただし、ケース４から切り出されたバンドから回収されたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（４３−３）とは同一ではなかった。）これらの時期は、油分の経時的変化における芳香族分の減少時期と一致している。そこで、配列番号６で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、潤滑油で汚染された土壌の浄化の後期段階または油分の経時的変化における芳香族分の減少時期のマーカーとなる可能性がある。また、配列番号６で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は、油で汚染された土壌の浄化、とくに芳香族分のような難分解成分の分解に深く関与すると考えられる。さらに、配列番号６で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物を含む、汚染土壌の浄化のための添加材は、油で汚染された土壌の浄化、とくに芳香族分のような難分解成分の分解に有用であると考えられる。
【０１３６】
配列番号７で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、第２の実験のケース１の浄化処理開始から２１週間後（１３−１６）に検出された。このバンドと同じ相対移動度のバンドは、馴養土を除くすべてのケースに共通して検出された。いずれのケースでも、処理開始時よりも処理開始から２週間以後のほうで強く検出された。そこで、配列番号７で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、油、とくに潤滑油で汚染された土壌の浄化の進行中のマーカーとなる可能性がある。配列番号７で表されるヌクレオチド配列と９９％の相同性があるＡＢ０３５０３４は、油汚染ビーチより採取されている。そこで、配列番号７で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は、油で汚染された土壌の浄化に深く関与すると考えられる。さらに、配列番号７で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物を含む、汚染土壌の浄化のための添加材は、油で汚染された土壌の浄化に有用であると考えられる。
【０１３７】
配列番号８で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、第２の実験のケース３の浄化処理開始から２週間後（３０−１５）に検出された。このバンドと同じ相対移動度のバンドは、同じケース３の浄化処理開始から４および８週間後にも検出された。配列番号８で表されるヌクレオチド配列と９８％の相同性があるＡＦ２４７７７４は、ディーゼル油汚染サイト中のベンゾピレン分解コンソーシア構成菌である。そこで、配列番号８で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、油で汚染された土壌の浄化の進行中のマーカーとなる可能性がある。また、配列番号８で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は、油で汚染された土壌の浄化に深く関与すると考えられる。さらに、配列番号８で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物を含む、汚染土壌の浄化のための添加材は、油、とくに潤滑油またはディーゼル油で汚染された土壌の浄化に有用であると考えられる。
【０１３８】
配列番号９で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、第２の実験のケース４の浄化処理開始時（４０−４）に検出された。このバンドと同じ相対移動度のバンドは、同じケース４の浄化処理開始から２〜１６週間後にも検出された。また、ケース２の浄化処理開始時および処理開始から２〜２１週間後と、馴養土のサンプルにも検出された。（ただし、ケース２（１７−５）および馴養土のバンド（５２−２）から回収されたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号２）は、配列番号９と同一ではなかった。）そこで、配列番号９で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、油で汚染された土壌の浄化の進行中のマーカーとなる可能性がある。また、配列番号９で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は、油、とくに潤滑油で汚染された土壌の浄化に深く関与すると考えられる。さらに、配列番号９で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物を含む、汚染土壌の浄化のための添加材は、油、とくに潤滑油で汚染された土壌の浄化に有用であると考えられる。
【０１３９】
配列番号１０で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、第２の実験のケース４の処理開始から８週間後（４２−１１）に検出された。このバンドと同じ相対移動度のバンドは、同じケース４の処理開始から１３週間後と、ケース３の処理開始から８〜２１週間後にも検出された。ケース３および４は、砂質土が混入されないためケース１および２と比較すると、通気性がより悪く、油分の分解の進行も遅い条件である。そこで、配列番号１０で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、土の通気性との関連で油分の分解が遅い状態のマーカーとなる可能性がある。また、配列番号１０で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は、油で汚染された通気性の悪い土壌の浄化に関与すると考えられる。さらに、配列番号１０で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物を含む、汚染土壌の浄化のための添加材は、油で汚染された通気性の悪い土壌の浄化に有用であると考えられる。
【０１４０】
配列番号１１で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、第２の実験におけるケース４の条件での浄化処理開始から８週間後（４３−３）に検出された。このバンドと同じ相対移動度のバンドは、ケース１の条件での浄化処理開始から８〜２１週間後と、ケース２の条件での浄化処理開始から８〜２１週間後と、ケース４の条件での浄化処理開始から４、１３および１６週間後にも検出されている。（ただし、ケース１から切り出されたバンド（１０−１５）から回収されたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号６）と同一ではなかった。）これらの時期は、油分の経時的変化における芳香族分の減少時期と一致している。そこで、配列番号１１で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、潤滑油で汚染された土壌の浄化の後期段階または油分の経時的変化における芳香族分の減少時期のマーカーとなる可能性がある。また、配列番号１１で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は、油で汚染された土壌の浄化、とくに芳香族分のような難分解成分の分解に深く関与すると考えられる。さらに、配列番号１１で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物を含む、汚染土壌の浄化のための添加材は、油で汚染された土壌の浄化、とくに芳香族分のような難分解成分の分解に有用であると考えられる。
【０１４１】
配列番号１２で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、馴養土で検出された。しかし、このバンドと同じ相対移動度のバンドは、馴養土を添加したケース２および４においては検出されなかった。そこで、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、Ａ重油で汚染された土壌の汚染浄化のマーカーとなる可能性がある。また、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は、Ａ重油で汚染された土壌の浄化に関与すると考えられる。さらに、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物を含む、汚染土壌の浄化のための添加材は、Ａ重油で汚染された土壌の浄化に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る汚染土壌の浄化処理方法のフローチャート。
【図２】第１の実験における汚染物質の変化を示すグラフ。
【図３】第１の実験のそれぞれの土壌のＤＧＧＥ法によるゲル電気泳動パターン。
【図４】第２の実験における汚染物質の変化を示すグラフ。
【図５】第２の実験のそれぞれの土壌のＤＧＧＥ法によるゲル電気泳動パターン。
【図６】図３のゲルから切り出したバンドの位置とこれから回収されたポリヌクレオチドの名称。
【図７】第２の実験の土壌サンプルのＤＧＧＥ法のゲルから切り出したバンドの位置と、これから回収されたポリヌクレオチドの名称。
【図８】本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と既知のヌクレオチド配列との類縁関係を示すデンドログラム。
【配列表フリーテキスト】
配列１：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−０ｕ６およびＡ−４ｕ６
配列２：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−４ｏ１４、１７−５および５２−２
配列３：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＣ０−１５、Ｃ０−２０およびＣ４−２０
配列４：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−０ｏ６
配列５：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン７−８
配列６：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン１０−１５
配列７：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン１３−１６
配列８：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン３０−１５
配列９：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４０−４
配列１０：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４２−１１
配列１１：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４３−３
配列１２：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン５１−１０
配列１３：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−０ｕ６およびＡ−４ｕ６
配列１４：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−４ｏ１４、１７−５および５２−２
配列１５：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＣ０−１５、Ｃ０−２０およびＣ４−２０
配列１６：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−０ｏ６
配列１７：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン７−８
配列１８：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン１０−１５
配列１９：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン１３−１６
配列２０：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン３０−１５
配列２１：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４０−４
配列２２：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４２−１１
配列２３：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４３−３
配列２４：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン５１−１０
配列２５：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５’―Ｔおよび３’―Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−０ｕ６およびＡ−４ｕ６
配列２６：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５’―Ｔおよび３’―Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−４ｏ１４、１７−５および５２−２
配列２７：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５’―Ｔおよび３’―Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＣ０−１５、Ｃ０−２０およびＣ４−２０
配列２８：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５’―Ｔおよび３’―Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−０ｏ６
配列２９：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５’―Ｔおよび３’―Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン７−８
配列３０：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５’―Ｔおよび３’―Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン１０−１５
配列３１：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５’―Ｔおよび３’―Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン１３−１６
配列３２：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５’―Ｔおよび３’―Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン３０−１５
配列３３：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５’―Ｔおよび３’―Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４０−４
配列３４：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５’―Ｔおよび３’―Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４２−１１
配列３５：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５’―Ｔおよび３’―Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４３−３
配列３６：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５’―Ｔおよび３’―Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン５１−１０
配列３７：微生物ｒＲＮＡ遺伝子のＤＧＧＥ―ＰＣＲ法のための４０ヌクレオチドのＧ−Ｃクランプを有する順方向プライマー
配列３８：微生物ｒＲＮＡ遺伝子のＤＧＧＥ―ＰＣＲ法のための逆方向プライマー
配列３９：微生物ｒＲＮＡ遺伝子のＤＧＧＥ―ＰＣＲ法のための逆方向プライマー（配列番号３８）の相補体
配列４０：プラスミド挿入ＤＮＡのシーケンシング用のＴ７プライマー
配列４１：プラスミド挿入ＤＮＡのシーケンシング用のＳｐ６プライマー
配列４２：ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（登録商標）プラスミドベクター
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月18日(2004.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
配列番号１２で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、馴養土で検出された。しかし、このバンドと同じ相対移動度のバンドは、馴養土を添加したケース２および４においては検出されなかった。そこで、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列を有するバンドは、Ａ重油で汚染された土壌の汚染浄化のマーカーとなる可能性がある。また、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は、Ａ重油で汚染された土壌の浄化に関与すると考えられる。さらに、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列を有するｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物を含む、汚染土壌の浄化のための添加材は、Ａ重油で汚染された土壌の浄化に有用であると考えられる。
【配列表フリーテキスト】
配列１：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−０ｕ６およびＡ−４ｕ６
配列２：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−４ｏ１４、１７−５および５２−２
配列３：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＣ０−１５、Ｃ０−２０およびＣ４−２０
配列４：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−０ｏ６
配列５：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン７−８
配列６：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン１０−１５
配列７：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン１３−１６
配列８：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン３０−１５
配列９：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４０−４
配列１０：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４２−１１
配列１１：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４３−３
配列１２：未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン５１−１０
配列１３：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−０ｕ６およびＡ−４ｕ６
配列１４：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−４ｏ１４、１７−５および５２−２
配列１５：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＣ０−１５、Ｃ０−２０およびＣ４−２０
配列１６：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−０ｏ６
配列１７：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン７−８
配列１８：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン１０−１５
配列１９：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン１３−１６
配列２０：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン３０−１５
配列２１：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４０−４
配列２２：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４２−１１
配列２３：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４３−３
配列２４：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列を付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン５１−１０
配列２５：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５'−Ｔおよび３'−Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−０ｕ６およびＡ−４ｕ６
配列２６：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５'−Ｔおよび３'−Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−４ｏ１４、１７−５および５２−２
配列２７：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５'−Ｔおよび３'−Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＣ０−１５、Ｃ０−２０およびＣ４−２０
配列２８：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５'−Ｔおよび３'−Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローンＡ−０ｏ６
配列２９：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５'−Ｔおよび３'−Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン７−８
配列３０：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５'−Ｔおよび３'−Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン１０−１５
配列３１：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５'−Ｔおよび３'−Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン１３−１６
配列３２：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５'−Ｔおよび３'−Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン３０−１５
配列３３：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５'−Ｔおよび３'−Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４０−４
配列３４：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５'−Ｔおよび３'−Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４２−１１
配列３５：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５'−Ｔおよび３'−Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン４３−３
配列３６：ＤＧＧＥ−ＰＣＲ法用のプライマー配列と、５'−Ｔおよび３'−Ａのオーバーハングとを付加した未培養の微生物ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列  クローン５１−１０
配列３７：微生物ｒＲＮＡ遺伝子のＤＧＧＥ−ＰＣＲ法のための４０ヌクレオチドのＧ−Ｃクランプを有する順方向プライマー
配列３８：微生物ｒＲＮＡ遺伝子のＤＧＧＥ−ＰＣＲ法のための逆方向プライマー
配列３９：微生物ｒＲＮＡ遺伝子のＤＧＧＥ−ＰＣＲ法のための逆方向プライマー（配列番号３８）の相補体
配列４０：プラスミド挿入ＤＮＡのシーケンシング用のＴ７プライマー
配列４１：プラスミド挿入ＤＮＡのシーケンシング用のＳｐ６プライマー
配列４２：ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（登録商標）プラスミドベクター
【配列表】
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【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る汚染土壌の浄化処理方法のフローチャート。
【図２】第１の実験における汚染物質の変化を示すグラフ。
【図３】第１の実験のそれぞれの土壌のＤＧＧＥ法によるゲル電気泳動パターン。
【図４】第２の実験における汚染物質の変化を示すグラフ。
【図５】第２の実験のそれぞれの土壌のＤＧＧＥ法によるゲル電気泳動パターン。
【図６】図３のゲルから切り出したバンドの位置とこれから回収されたポリヌクレオチドの名称。
【図７】第２の実験の土壌サンプルのＤＧＧＥ法のゲルから切り出したバンドの位置と、これから回収されたポリヌクレオチドの名称。
【図８】本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と既知のヌクレオチド配列との類縁関係を示すデンドログラム。