(57)【要約】【課題】過酸化水素選択透過膜と過酸化水素電極との間を常時連続通電して使用することによるセンサの検出性能が劣化することを防止し、長寿命のバイオセンサを提供することにある。【解決手段】エステル置換基を有する多糖類誘導体を主成分とする過酸化水素選択透過膜と過酸化水素電極を含む基体との間に膜を設け、過酸化水素選択透過膜を過酸化水素電極から離すことで、連続通電による過酸化水素選択透過膜への電圧印加の影響を防ぎ、連続通電使用に耐える長寿命のバイオセンサを実現する。【選択図】図１
2004028889.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
過酸化水素電極を含む基体、およびその上に形成されたエステル置換基を有する多糖類誘導体を主成分とする過酸化水素選択透過膜１を含むバイオセンサにおいて、前記過酸化水素選択透過膜１と基体との間に、膜２を設けて前記過酸化水素選択透過膜への電圧印加の影響を緩和したことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
過酸化水素選択透過膜１の上に、過酸化水素生成酵素が含まれる酵素膜を設けたことを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は多くの成分が混在する媒体から特定の成分を検出し測定するバイオセンサ、特に電流検出型電気化学的バイオセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
過酸化水素電極と酸化還元酵素とを組み合わせた酵素電極はもっとも多く採用されているバイオセンサのタイプの一つである。
電流測定型トランスデューサの一種である過酸化水素電極は、過酸化水素の他に、尿酸やアスコルビン酸などの還元性物質（以下、妨害成分という）に対しても応答し電流が発生する。したがって、これらの妨害成分が多く存在する生体関連試料を始めとする試料中の成分を測定する場合、酵素電極の測定精度を確保するために、妨害成分の影響を除去することが課題である。
【０００３】
上記課題を解決する最も有効な手段は電極表面又はその近辺に共存妨害物質を排除し過酸化水素を選択的に或いは優先的に透過させる選択透過膜を設けることである。
【０００４】
図１０にこのタイプのバイオセンサの基本構造を示す。その原理を簡単に説明すると、センサを被測定媒体に接触させると、標的成分、例えばグルコースが酵素膜８の中へ拡散し、酵素膜８に含まれる酵素、例えばグルコースオキシダーゼにより酸化され過酸化水素が生成される。生成された過酸化水素が過酸化水素選択透過膜７を通り越して基体６表面の過酸化水素電極５に達する。
【０００５】
基体６の過酸化水素電極５は、例えば作用極、対極及び参照極からなる３極構造をしており、図７に示すようなポテンシオスタット回路に接続され、予め参照極と作用極との間に一定の電圧（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ参照極に対して０．６Ｖ）が印加されており、作用極の表面に到達した過酸化水素が、反応式１）に示すような反応で酸化され電子情報に変換される。電子情報は一般的に過酸化水素が作用極表面に接する前（ベース電流）と接した後の電流値の比較で取り出される。したがって、正確な測定を行なうにはベース電流が安定していることが重要である。
Ｈ２Ｏ２　→　２Ｈ＋　＋　Ｏ２　＋　２ｅ−　　　　　　　　　反応式１）
【０００６】
一方、共存妨害成分がグルコースと同様に酵素膜８まで拡散するが、酵素膜８と過酸化水素電極５との間に設けられている選択透過膜７により排除され、電極５表面に到達できない。これにより出力電流が標的成分に由来するものであることを保証し、測定精度が確保される。
【０００７】
従来、過酸化水素選択透過膜として多くの材料が検討されているが、安定性と過酸化水素選択透過性ともに優れていることから、セルロース誘導体の一種である酢酸セルロースがもっとも多く検討され且つ実用化もされているが、酢酸セルロースからなる過酸化水素選択透過膜の製造方法として、予め膜を作成してから一定のサイズに加工して電極の表面に適用する方法、および膜材料の溶液などから電極の表面に直接適用してその場で製膜する方法に大別することができる。
【０００８】
前者の例として、Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ社のグルコースアナライザーに用いられるバイオセンサが挙げられる。このバイオセンサは、予め作成した酢酸セルロース膜とポリカーボネート膜の間に酵素膜を挟むサンドイッチ膜をＯーリングなどで白金作用電極の表面に固定する手法を採っている（Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，　Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｖｏｌ．　１６７，　ｐ７１−８８，　１９９８）。
【０００９】
この方法では、一定の膜強度を得るために酢酸セルロース膜厚が厚いこと、および酢酸セルロース膜と電極との間の密着性が悪いことにより、情報の分散が発生し、その結果、検出感度および応答速度の低下をもたらすので、検出感度を維持するには面積の大きい電極を必要とする。また、この方式は製造の自動化が難しく安価に量産するには不適である。
【００１０】
後者の例として、特開平７−１５９３６６と特開平８−５０１１２で開示されたように、電極基体上にスピンコートなどの手法で酢酸セルロース膜を直接形成する方法が挙げられる。尚、これらのバイオセンサは酢酸セルロース膜と電極基体又は酵素膜との密着性および感度の安定性を確保するために、酵素膜の上部に保護膜を付けたりする工夫がされている。
【００１１】
選択透過膜と電極基体との密着性を確保する別の方法として、特開２０００−２６８３では、選択透過膜を作用電極の表面のみを被覆する形状に形成し、その上の酵素膜をシランカップリング剤を介して電極基板表面に接合し、酵素膜によって選択膜を物理的に押え込む方法が開示されている。また、特願２００２−０６２４０４では、反応性官能基の導入された多糖類誘導体からなる電極表面に直接選択透過膜を形成することにより、膜自身の基板付着性を向上させる方法が開示されている。
【００１２】
前者の課題を解決する形で考案された後者、特に特願２００２−０６２４０４のように過酸化水素選択透過膜自身に基板付着力を持たせたバイオセンサのメリットとして、薄膜化によるセンサ感度と応答性の向上、センサのコンパクト化、および量産に適し製造コストが安いことが挙げられる。
【００１３】
従来、特に生体成分を測定対象とするバイオセンサは、臨床検査や実験室用としての応用が多く、なんらかの形で訓練されている操作者が測定に当たるのが一般的である。実際の測定は、電源スイッチをオンにして、ポテンシオスタット回路を作動（電圧を印加）させ、ベース電流が安定するまでウォーミングアップしてからサンプルを供給して測定する。ここでポテンシオスタット回路が作動し作用極に電圧が印加されている状態を通電という。
【００１４】
電圧を印加しベース電流が安定するまでのウォーミングアップ時間は電極の材料や表面構造、および通電履歴などにより異なるが、通常、最低１０〜３０分間が必要である。測定が終わったら電源をオフにし、通電を解除するのが最も一般的な使用形態である。このような形態で使用される装置をラブ用装置という。
【００１５】
一方、高齢化に伴う医療費の高騰、および人々の健康意識の向上に伴い、在宅など非医療機関での自己健康チェックと管理がこれから重要になっていくと予想され、その一例はバイオセンサを利用したトイレ設置型尿検査装置を用いて健康チェック管理することである。
【００１６】
図８は洋式便器１４に取り付けられた尿検査装置の一例を示す外観図である。尿検査装置１０は計測本体１１と採尿ユニット１２とからなり、採尿ユニット１２が洋式便器１４のリムに装着される。採尿ユニット１２には採尿アーム１３があり、図示しないが、その先端部の形状は碗形をしており、採尿位置にて採尿口が略上方を向くように取付けられている。
【００１７】
使用者が放尿する前に、計測本体１１に設けたスタートボタン（図示せず）を押すと、採尿アーム１３が移動し、先端部が尿を受けることができる状態になる。次いで使用者が採尿口に向かって放尿し、一定量の尿が溜まったら自動的に計測する。
【００１８】
この種の装置は、センサや装置に関する知識が全く無い一般人の使用に耐えることは勿論、いつでも直ぐに測定開始できること、短時間で測定結果を出力することが大事である。というのは、使用者がトイレに入ってから、電圧を印加しベース電流が安定するまで１０分間以上も待ってから放尿を開始することや、放尿してから測定結果を得るまで長時間待つことは現実的ではないからである。いつでも直ぐに測定開始できるようにするために、センサは常時通電してある。このような形態で使用される装置を一般用装置という。
【００１９】
一般用装置に搭載されるバイオセンサは、ユーザーの負担や手間等を考慮すると、頻繁に交換せず、一度セットしてから長期間使用できることが望ましい。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
従来の技術に基づくバイオセンサでは、従来の測定時のみ通電するラブ用装置においては安定性がよいが、常時連続通電が必要とされる一般用装置においては、妨害物質による出力が経時的に上昇し、センサ寿命が著しく低下することが本発明者によって明らかにされた。
【００２１】
図９には従来タイプの尿糖センサ（酵素としてグルコースオキシダーゼを使用）で、測定時のみ通電使用する場合及び連続通電して使用する場合における妨害物質による影響を示すグラフで、横軸は使用日数、縦軸の選択比は代表的な妨害成分の一つであるアスコルビン酸の出力を、同濃度のグルコースに対する出力で割った値をパーセンテージで示した値である。選択比が小さいほど、妨害成分による影響が小さく、従って測定精度が高い。
【００２２】
図９から分かるように、測定時のみ通電使用する場合、１０週間以上に渉って選択比がの上昇が全く見られないが、連続通電して使用すると、約２週間で選択比が上昇し始め、６週間で２０％を超えた。この選択比の経時的な上昇は、常時電圧を印加することによって選択透過膜に何らかの劣化が起こる結果と考えられ、選択比が２０％を超えた時をセンサの寿命と仮定すると、連続通電して使用する場合は、そうでない場合に比べて、寿命が著しく短いことが分かる。
【００２３】
かかる現状を鑑み本発明の目的は、常時連続通電して使用する場合においても、長寿命のバイオセンサを提供することにある。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明によるバイオセンサは、過酸化水素電極を含む基体、およびその上に形成されたエステル置換基を有する多糖類誘導体を主成分とする過酸化水素選択透過膜を含むバイオセンサにおいて、過酸化水素選択透過膜と基体との間に膜を設けて、過酸化水素選択透過膜への電圧印加の影響を緩和したことを特徴としている。
【００２５】
この様に選択透過膜と電極との間に膜を設け、選択透過膜を電極から離すことにより電圧印加による選択透過膜への影響が緩和されるをもって、連続通電して使用する場合での選択比上昇が抑制され、常時連続通電して使用する場合においても長寿命のセンサを提供できる。
【００２６】
過酸化水素選択透過膜の上に、過酸化水素生成酵素が含まれる酵素膜を設けることが好ましく、この様にすることで、酵素の基質となる各種の成分を少量のサンプルで精度よく測定できる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下図面などを用いて本発明を更に詳細に説明すると、図１に示す第１実施例のバイオセンサは、過酸化水素電極５を含む基体６の上に、膜２、過酸化水素選択透過膜（以下選択膜と略す）１、および酵素膜３が順に積層されている。
【００２８】
膜２は、選択膜１を基体６の電極５表面から遠ざけるスペーサーとして、連続通電による選択膜１へのダメージを抑制する役割を果たす。このような役割を果たす限り、膜２の材料、構造及び厚さなどは特に限定されないが、ここでは普遍的な好ましいガイダンスについて説明する。
【００２９】
まず、規定された寿命期間内で連続して通電する状態において、膜２成分の分解や溶出によって膜２が破壊または消失することがないよう、十分な安定性が必要である。次に、膜２の存在により過酸化水素の拡散損失が発生するが、センサ感度や応答性の低下への影響をできるだけ最小限に押さえることが望ましい。更に、膜２と電極との間、及び／又は膜２と選択膜１との間に、規定された寿命期間内で実使用に耐えうる十分な密着性または付着性が必要である。
【００３０】
連続通電している場合、作用極の表面近傍には常に電子欠乏状態になっていることから、膜２の材料として酸化されにくいもの、または酸化されても膜２としての安定性が損なわれないものが望ましい。また、反応式１）から分かるように、過酸化水素の酸化で水素イオンが発生することから、酸性（例えばｐＨ３）環境においても安定性のよい材料が望ましい。
【００３１】
膜２の具体的な有機材料として、セルロース、キトサンなどの多糖類およびその誘導体、アルブミンなどのタンパク、ポリアミノ酸、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミドや各種のポリカルボン酸などのビニル重合体、ポリウレターン、ポリカーボネート、ポリアニリン、ポリピロール、およびシリコーン樹脂やエポキシ樹脂、などの有機高分子、およびチオール化合物などの自己組織性低分子などが例として挙げられる。尚、有機高分子を用いると安定な膜２を形成しやすく、また選択膜１との付着性が得られやすく、好ましい。
【００３２】
また、膜２の無機材料としてシリコン酸化物、アルミニウム酸化物、チタン酸化物などの金属酸化物が例として挙げられる。尚、無機材料を膜２の主材料とすれば、膜２をスパッタリングや蒸着などの汎用プロセスで基体表面に直接成膜することが出来、望ましい。
【００３３】
つぎに、膜２の構造について説明すると、連続通電による選択膜１へのダメージは作用極表面に起こるので、膜２は作用極およびその近辺を覆うだけで十分であるが、特に絶縁基板上に形成している電極系（例えばプレーナー電極）の場合、製造上の都合などで、参照極や対極を含む他の部分を覆っても構わない。
【００３４】
更に、膜２の厚みについて説明すると、厚さが均一な構造を有することがセンサ性能のバラツキの低下につながるので、望ましい。既に述べた通り、膜２の存在が過酸化水素の拡散損失によるセンサ感度の低下をもたらすことから、その厚さはセンサ選択性能の劣化を押さえるために必要な最小限に押さえることが望ましい。勿論、ある程の度感度低下が許容できる場合、再現性や寿命を優先して膜厚を厚めに選定すれば良い。好ましい厚さとして、１００ｎｍ〜１０μｍの範囲が挙げられる。
【００３５】
また、膜２の密度に関しては、十分な安定性が保てるならば、低い方がよい。その理由として密度が低い方が過酸化水素の透過ロスが少ないこと、および膜２の中により多くの緩衝液が入って選択膜１の保護効果が高いことが上げられる。
【００３６】
即ち、酢酸セルロースを始めとするエステル含有多糖類誘導体選択膜１の連続通電測定による劣化の原因の一つとして、電圧印加による電子欠乏状態の持続、および過酸化水素を始めとする電極活成分の酸化に伴う水素イオンの発生よる作用極表面局部におけるｐＨの低下が考えられ、低いｐＨ環境においては、例えば酢酸セルロースが加水分解を受けアセチル置換基が離脱することが考えられる。酢酸セルロースの過酸化水素選択性能がアセチル置換基による部分が多いので、結果的にセンサの妨害成分に対する選択比が上昇するのである。
【００３７】
従って、センサの膜２を含む部分が、少なくともサンプルを測定しない待機時は緩衝液に浸す状態に保持されることが一般的であることや、膜の密度が低いほど、その中に緩衝液がより多く充満されるので、こうした局部領域のｐＨ低下を緩和する効果がより大きい。従って、膜２材料は疎水性のものよりも親水性の方が好ましい。さらに、膜２自身にアミノ基や、カルボキシル基やリン酸基などの弱電解性官能基を含むことがより一層望ましい。
【００３８】
次に選択膜１について説明すると、選択膜の主材料はエステル置換基を有する多糖類誘導体である。エステル置換基（−ＣＯＯＲ）は一般的に炭素数が１−３のアルキル基を有するもの、即ち、メチル基を有する酢酸エステル誘導体、プロピル基を有するプロピオン酸エステル誘導体、あるいはブチル基を有する酪酸エステル誘導体が望ましい。
【００３９】
また、多糖類としてセルロース、デキストラン、でん粉などが例としてあげられるが、材料の豊富さおよび入手のし易さからセルロースがより好ましく、具体的な材料として、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、および酢酪酸セルロースが好ましい例としてあげられる。中でも過酸化水素選択透過膜としての実績が多い酢酸セルロースがもっとも好ましい。
【００４０】
なお、これらの多糖類誘導体に上記エステル置換基のほかに、さらにアルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、またはエポキシ基などの反応性官能基を有する化学グループが含まれても良い。特に選択膜１と膜２或いは酵素膜３との付着性を向上させる必要がある場合、これらの官能基が共有結合によって膜同志を接着させる機能がある。
【００４１】
以上本発明によるバイオセンサの膜２および選択膜１について説明したが、次にセンサ構造全体の他の実施例について説明すると、過酸化水素電極５を含む基体６とエステル置換基を有する多糖類誘導体を主成分とする過酸化水素選択透過膜１との間に、膜２が位置する要件を満たせば良く、図２に示す様に酵素膜がない構造も実施可能である。
【００４２】
図２に示す酵素膜が省略された構造を持つセンサは、過酸化水素センサとしての応用が考えられ、また、過酸化水素生成酵素（例えば試薬または固定化酵素リアクターとしての形態で利用）との併用で図１のバイオセンサ構造と同様に各種の酵素基質を分析するバイオセンサとしても利用できる。
【００４３】
また、図３に示す様に、酵素膜３を外部試料から保護すること、または被測定成分の酵素膜３への到着を制限し、より高濃度の試料の測定に対応する目的で酵素膜３の上に更に保護膜４を形成する構造も考えられる。
【００４４】
酵素膜３を外部試料から保護する例として血液中の成分を分析するセンサへの応用が考えられる。即ち、血液中には酵素膜の表面への付着によりセンサを劣化させるタンパク質などの高分子が多数含まれるので、保護膜４を設けてこれらの成分の酵素膜３への到達を阻止することでセンサの測定精度や安定性を向上させることができる。
【００４５】
被測定成分の酵素膜３への到着を制限し、より高濃度の試料の測定に対応する例として、尿中成分の測定や工業分野における製造プロセスのオンラインモニタリングの際での、被検試料を希釈せずまたは数倍程度の希釈だけで広範囲の濃度測定に対応するバイオセンサが挙げられる。
【００４６】
次に、本発明によるバイオセンサの製造方法について説明すると、本発明によるバイオセンサは使用される過酸化水素電極を含む基体、選択される膜の材料、およびセンサ構造などにより、様々な製造方法が考えられるが、好ましくは膜材料から直接基体表面に膜を形成する方法であり、以下この方法について詳細に説明する。
【００４７】
まず、過酸化水素電極５を含む基体６を準備する。基体６の形は問わないが、好ましくは平らの絶縁基板上に作用電極を含む過酸化水素電極系を形成したもので、絶縁基板としてはガラス板、シリコンウェハー、セラミック板などを用いる。
【００４８】
絶縁基板上の過酸化水素電極系は作用電極が含まれば良いが、センサの製造コストおよびセンサを利用した測定システムの簡素化の視点から、過酸化水素電極５をパターン化して基板上に形成されたものが好ましく、その一例として図５に示す様にセラミック基板上にスクリーン印刷技術で３極系の基体６を作成する。
【００４９】
次に基体６への成膜に移るが、必要に応じて基体６表面の洗浄および活性化する目的で基体６を前処理する。洗浄に際しては水や酸を用いることができるが、特に酸による洗浄は汚れの除去と同時に、基体６表面の活性化が図れるので、好ましい。酸種の好ましい例としては硝酸、硫酸、塩酸などの強酸、または、リン酸、ぎ酸、コエン酸、酢酸などの弱酸が挙げられる。尚、酸洗浄後の基体６は水で洗浄する必要がある。
【００５０】
洗浄を完了した基体６は必要に応じて乾燥させる。乾燥条件は特に限定されないが、好ましい乾燥温度として２０〜８０℃、乾燥時間として５〜１２０分が挙げられる。なお、次の工程が水溶液を用いて表面処理する工程の場合、乾燥を省略することが出来る。
【００５１】
次に、必要に応じて基体６表面を活性化（反応性官能基の導入）して膜２と基体６との付着力を向上させるために、又は／及び基体６と混合層との親和性を向上させるために、基体６の表面処理を行う。表面処理方法としては汎用されている種々の方法、たとえばシラン化処理、プラズマ処理、電気化学的処理が利用できるが、好ましい例として、シラン化処理が挙げられる。
【００５２】
シラン化処理用のシラン化剤は基体６および選択膜１の材質と官能基の種類などの状況を勘案して適宜選択されてよいが、一般的好ましい例としてアミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、アルケン基、ハロゲン基、ビニル基などの官能基を含むものが望ましく、最も望ましくはアミノ基およびエポキシ基を含むシラン化剤である。
【００５３】
具体的なシラン化剤の例を挙げれば、アリルトリクロロシラン、アリルトリエトキシシラン、アリルトリメチルシラン、３ー（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３ーアミノプロピルトリメトキシシラン、３ーアミノプロピルトリエトキシシラン、クロロメチルジメチルクロロシラン、クロロメチルトリメチルシラン、３−クロロプロピルトリメトキシシラン、ジメトキシメチルクロロシラン、ジメチルアミノトリメチルシラン、メチルクロロシラン、エトキシジメチルビニルシラン、エチルジクロロシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジメトキシシラン、ヒドロキシメチルトリメチルシラン、３−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリルオキシプロピルメチルジメトキシシラン、メチルビニルジクロロシラン、トリクロロビニルシラン、トリエトキシビニルシラン、トリメトキシビニルシラン、およびトリメチルビニルシランからなる群から選択される物質が挙げられる。中でも、３ーアミノプロピルトリエトキシシランおよび３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランがそれぞれ基体表面にアミノ基またはエポキシ基を効率的に導入する安価のシラン化剤として最も好ましい。
【００５４】
シラン化処理の方法と手順として、まずシラン化剤を溶媒で適宜調整して一定濃度に希釈したシラン化溶液を作成する。次に基体６表面をシラン化溶液に一定時間接触させてから洗浄し、或いは洗浄せずに乾燥する。別の方法として、スピンコーターなどの成膜装置で基体表面にシラン化溶液を塗布してから乾燥する方法を用いても良い。尚、シラン化溶液と接触してから洗浄せずに乾燥する方法、或いは成膜装置でシラン化溶液を塗布する方法を採用すると、基体６表面にシラン化剤の薄膜が形成されることになる。
【００５５】
続いて膜２の成膜工程に移る。成膜法は選定される材料および予定構造などを勘案して周知の膜形成法から選定して適宜決定すれば良いが、好ましい成膜方法の例として、膜２材料を溶媒で一定濃度に調整した原液（溶液）を基体６表面に層状に展開し、その後溶媒を蒸発させ、基体６表面に膜２を形成する方法が挙げられる。この方法は特に有機高分子を材料とする膜２を成膜するのに好適である。
【００５６】
原液の調整に用いられる溶媒は膜２材料の性質や膜２を形成する方法などを勘案して適宜決定すれば良く、また、原液の濃度は膜２の材料、溶液粘度、目標膜厚、塗布方法など、種々の条件を勘案して決定すれば良く、特に限定されないが、一般的に他の条件が同じであれば、膜厚は原液濃度と正の相関関係にあるので、原液濃度は膜厚を調整する重要なファクターとして位置付ければよい。
【００５７】
一例を挙げると、過酸化水素電極５を含む基体６表面にスピン回転コート法で直接膜２を成膜する場合、原液の濃度が２〜１０（ｗ／ｖ）％の範囲が望ましい。この例において、膜厚が原液の濃度と粘度との両方に正の相関関係にあり、原液濃度が高まると、溶液粘度も急激に上がることから、原液の濃度を少し変化させることで膜２の膜厚を大きく調整することが可能である。
【００５８】
キトサンやアルブミンなどの水溶性材料で膜２を成膜する場合は、膜原液にグルタルアルデヒドなどの架橋剤を添加しても良く、この場合、架橋剤添加のタイミングは膜２を形成する直前か、一定時間（例えば５分間）前が好ましい。
【００５９】
膜原液を基体６表面に層状に展開して膜２を成膜する方法の好ましい例として、基体６が静止した状態での滴下塗布、流延塗布、及びスピンコーターなどの成膜装置による回転塗布する方法、基体６を膜原液と接触させた後で基体６を引き上げる方法等があり、特に過酸化水素電極５を含む基体６表面が平らな基板の場合、スピン回転による方法は高精度の膜厚制御が可能で、均質の膜を製造するのに適している。また、別の成膜方法として速度を一定に制御できる引き上げ装置によるディッピング塗布方法を用いれば、基体表面が平らではない場合でもかなり均一な厚みの膜２を成膜でき好ましい。
【００６０】
膜２原液の調整に使用された溶媒の揮発性が高い場合、原液塗布作業の完了と同時に膜２が完成されることになるが、溶媒に揮発性の低いものが含まれる場合は、原液塗布完了後、乾燥工程に移す。乾燥は基本的には特に雰囲気を制御することなく、室温でもよいが、場合によっては加熱や減圧などの措置を講じてもよい。一般的な乾燥時間として、数分間から数時間の範囲が挙げられる。
【００６１】
また、キトサンやアルブミンなどの水溶性分子を架橋して水不溶性の膜２にする場合、原液に架橋剤を入れずに成膜し、膜が乾燥してから架橋を行なう方法を用いることができる。例えば、架橋剤がグルタルアルデヒドの場合、乾燥した膜の上にグルタルアルデヒド溶液を塗布したり、又は膜を含む基体をグルタルアルデヒド溶液に一定時間浸したり、或いはグルタルアルデヒド溶液とともに密閉環境下で、グルタルアルデヒドガス雰囲気中で架橋する等の方法が用いられる。
【００６２】
また、上記の成膜方法の他に、スパッタリングや真空蒸着、ＣＶＤなどの薄膜作成方法があるが、これらの方法は特にシリコン酸化物などの無機材料で膜２を成膜する場合に好適である。
【００６３】
次に選択膜１の成膜工程に移る。選択膜１は膜２と同様な成膜方法が適用出来、アセチル基を含むセルロース誘導体に適用する溶媒の好ましい例として、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、メチルエチルケトン、メチルセロソルブ、メチルセロソルブアセテート、乳酸エチル、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−ペンタノン（ジアセトンアルコール）、塩化エチレン、メタノール、エタノール、ホルムアルデヒド、及び水などが挙げられる。これらの溶媒は単独として、又は複数種類を混合して用いることができる。
【００６４】
選択膜１の成膜が終了したら、次に酵素膜３の成膜工程に移る。酵素膜３は予め酵素膜３を作成してから選択膜１の表面に装着する方法、その場で直接酵素膜３を選択膜１の表面に成膜する方法が考えられるが、好ましくは後者の方法である。
【００６５】
具体的な酵素膜３の成膜方法として上述した膜２の成膜方法とほほ同様な方法が適用できるが、センサ寿命を確保するために一定量以上の酵素量を作用極の表面に担持させる必要がある場合には、他の膜材料に比べて高価である酵素を節約するために、酵素原液を作用極の表面にドロップして乾燥される方法が好ましい。この方法によれば、酵素膜３が作用極及びその近辺部分のみ一定の厚さをもって被覆するので、酵素のロスが無く、酵素使用量を最小限に押さえ安価に製造することができる。
【００６６】
以上、基体６表面上に、膜２、選択膜１及び酵素膜３を順次成膜するバイオセンサの製造方法について説明したが、更に図３に示す様に酵素膜３表面に保護膜４を必要とする場合、後工程で続けて保護膜４を成膜すれば良い。また、酵素膜３と選択膜１との付着性が弱い場合、選択膜１の上に接着層９を形成してから酵素膜３を形成してもよい。尚、膜２を製造する前の基体６洗浄や表面処理の一部または全部を省略することができるのは言うまでもない。
【００６７】
【実施例】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。
【００６８】
ステップ▲１▼：基体表面の洗浄
ガラス容器に５０ｍｌの１Ｎの硝酸を加え、続いて過酸化水素電極５を設けたセラミック製の基体６（図５参照）を完全に液に沈めるように入れて、手で数回ゆっくり振蕩してから室温で３０分間放置した。続いて、基体６を取り出して大量の脱イオン水で洗浄した。
【００６９】
ステップ▲２▼：基体表面のシラン化処理
別のガラス容器に４９．５ｍｌの脱イオン水および０．５ｍｌの３−アミノプロピルトリエトキシシラン（アミノシラン）を加えて混合し、１％のアミノシラン溶液を調整した。続いて、ステップ▲１▼で硝酸で洗浄処理された基体６を調整済みのアミノシラン溶液に浸すように入れて、手で数回ゆっくり振蕩してから室温で３０分間放置した。続いて、基体６を取り出して大量の脱イオン水で洗浄した。
【００７０】
ステップ▲３▼：酵素膜原液の調整
グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４、シグマアルドリッチ製）２２９０ユニットを、０．７ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝溶液（１００ｍＭ、ｐＨ６．０）で溶解し酵素溶液とした。また、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を２５ｍｇ秤量し、１．０ｍｌの脱イオン水で溶解してＢＳＡ溶液を調整した。続いて調整されたＢＳＡ溶液０．２ｍｌを取り、前記酵素溶液に加えて、均一に混ぜた。混ぜた後の混合液に２．０（ｖ／ｖ）％のグルタルアルデヒド水溶液を０．１ｍｌ加えて攪拌した。こうして酵素膜の原液を調整した。
【００７１】
（実施例１）
ステップ▲２▼でアミノシラン化処理された基体６を、予め調整した２（ｗ／ｖ）％のＢＳＡ溶液（０．２（ｖ／ｖ）％のグルタルアルデヒドを含む、溶媒水）にディッピングしてから、４０ｃｍ／ｍｉｎの速度で引き上げてＢＳＡを主成分とする膜２を基体表面に成膜した。室温で約５分間乾燥させた後、膜２を成膜した基体６をスピンコーターにセットし、置換度２．３の５（ｗ／ｖ）％アルデヒド官能基を含む酢酸セルロース溶液（溶媒ジアセトンアルコール）を原液として、アルデヒド化酢酸セルロースを主成分とする選択膜１を成膜した。続いて、３％のキトサン溶液（酢酸０．７５％を含む、溶媒水８０部ジアセトンアルコール２０部）を、作用電極を覆うように滴下し、スピンコートでキトサンを主成分とする接着層９を形成した。最後に、ステップ▲３▼で調整された酵素膜の原液１０μｌを、ピペットで作用電極の上にドロップし、３５℃の雰囲気中で３０分間乾燥して酵素膜３を成膜した。こうしてＢＳＡを主成分とする膜２を有する第１実施例のバイオセンサを製造した。
【００７２】
（実施例２）
ステップ▲１▼で酸洗浄された基体６をスピンコーターにセットして、調整した３％のキトサン（酢酸０．７５％を含む、溶媒：水）溶液を原液としてキトサンを主成分とする膜２を基体６表面に成膜した。次に予め調整した置換度２．４の７（ｗ／ｖ）％酢酸セルロース溶液（溶媒アセトン）を原液として、酢酸セルロースを主成分とする選択膜１を成膜した。最後にステップ▲３▼で調整された酵素膜の原液を用いて、同様にスピンコート法で酵素膜３を成膜した。
【００７３】
（比較例）
ステップ▲２▼でアミノシラン化処理された基体６を、スピンコーターにセットし、置換度２．３の５（ｗ／ｖ）％アルデヒド官能基を含む酢酸セルロース溶液（溶媒ジアセトンアルコール）を原液として、アルデヒド化酢酸セルロースを主成分とする選択膜１を基体６表面に成膜した。続いて、３％のキトサン溶液（酢酸０．７５％を含む、溶媒水８０部ジアセトンアルコール２０部）を原液としてスピンコートでキトサンを主成分とする接着層を成膜した。最後に、ステップ▲３▼で調整された酵素膜の原液１０μｌを、ピペットで作用電極の上にドロップし、３５℃の雰囲気中で３０分間乾燥して酵素膜３を成膜した。こうして、膜２を有しないバイオセンサを製造した。なお、選択膜１、接着層、および酵素膜３を含めた製造法は実施例１と全く同じ条件であった。
【００７４】
製造した実施例１、実施例２及び比較例の各バイオセンサをフローセルに装着し、図６に示すフローインジェクション分析装置で、アスコルビン酸（ＡＳＡ、１００ｍＭ）、およびグルコース（ＧＬＣ、１０ｍＭ）の溶液に対する応答のピーク電流を測定した。測定条件を以下に示す。
キャリア液：３３ｍＭのリン酸二水素カリウムとリン酸一水素ナトリウム、５０ｍＭの塩化カリウムを含むｐＨ６．８の緩衝溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
サンプル注入量：１０μｌ
チューブ：サンプラーのサンプルインジェクターからセンサまでのチューブ長が１２０ｃｍ、内径が０．８ｍｍφ
得られた結果を、単位濃度当たりの出力（感度）および選択比にまとめて表１に示す。
【００７５】
続いてセンサを図８に示すトイレ設置型尿検査装置に準じる評価装置で連続通電測定による耐久測定評価を行なった。この装置は尿糖検査装置と同様な測定シーケンスを有するが、採尿器の代わりに各種のサンプル溶液を入れたボトムに採尿チューブを差し込んでサンプリングを行なう。測定は原則として週３日行い、一日当りの測定はＨＰＯ（２ｍＭ）、ＡＳＡ（１００ｍＭ）、およびＧＬＣ（１１．１ｍＭ）の各３〜５回で計９〜１５回の連続測定であり、所要時間は６０〜１２０分であった。尚、測定していないときはセンサセルに緩衝液を充填し、液が流れていない状態で保持していた。結果を図４に示す。
【００７６】
表１　実施例及び比較例の各センサの初期性能
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【００７７】
表１から、実施例１、実施例２および比較例の各センサの感度、及び選択比などの初期性能には大差が無いことが分かる。
【００７８】
一方、図４から、実施例１、実施例２の各センサは、約半年間の連続通電測定にいて選択比を５％以下に維持しているのに対して、比較例のセンサは、１ヶ月で選択比が１０％を超え、２ヶ月で７０％を超えた。仮に選択比２０％をセンサ性能の閾値とすると、本発明構造によるセンサは少なくとも６ヶ月以上の連続通電使用寿命も有するのに対して、従来構造のセンサは１ヶ月強の寿命しか有しておらず、本発明によるセンサの使用寿命の長さが際立っている。尚、実験期間中において、実施例１、実施例２および比較例いずれのセンサにおいて、酵素活性の低下によるセンサ感度の低下が見られなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるバイオセンサの構造図である。
【図２】本発明による他例のバイオセンサの構造図である。
【図３】本発明による他例のバイオセンサの構造図である。
【図４】連続通電における妨害物質選択比の経時変化を示す図である。
【図５】過酸化水素電極をセラミック基板上に作成した基体を示す図である。
【図６】フローインジェクション分析装置を示す図である。
【図７】ポテンシオスタット回路システムの例を示す図である。
【図８】トイレ設置型尿検査装置の外観図である。
【図９】従来のバイオセンサにおける妨害物質選択比の経時変化を示す図である。
【図１０】従来のバイオセンサの構造図である。
【符号の説明】
１…選択透過膜
２…膜
３…酵素膜
４…保護膜
５…過酸化水素電極
６…基体
７…選択透過膜
８…酵素膜
９…接着層
１０…トイレ設置型尿検査装置
１１…計測ユニット
１２…リム取付式採尿ユニット
１３…採尿アーム
１４…洋式便器
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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