(57)【要約】【課題】例えば、難溶解性の薬物の腸管膜透過性の評価等にも適するための、簡便なｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬物の腸管膜透過性の評価方法等を提供すること。【解決手段】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬物の腸管膜透過性の評価方法であって、腸管由来の培養細胞同士が密着結合した異方性単層細胞を有する挿入部材を、その単層細胞の腸管腔側面を上部として、緩衝液を含む培養容器内に挿入する工程、透過率を試験するための被験物質、０．５〜２％（ｗ／ｗ）ＤＭＳＯ及び２〜１０ｍＭタウロコール酸を培養容器内の前記腸管腔側面に加えた後、前記培養容器をインキュベートする工程、前記挿入部材を取り除いた後、培養容器内の単層細胞の非腸管腔側面に透過された前記被験物質の量を測定する工程、及び前工程により測定された量等と対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記被験物質の腸管膜透過性を評価する工程を有することを特徴とする方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬物の腸管膜透過性の評価方法であって、
（１）腸管由来の培養細胞がコラーゲン細胞培養基質上で培養・分化誘導されてなる、細胞同士が密着結合した異方性を有する単層細胞を有する挿入部材を、その単層細胞の腸管腔側面を上部として、緩衝液を含む培養容器内に挿入する第一工程、
（２）透過率を試験するための被験物質、０．５％（ｖ／ｖ）より大でかつ２％（ｖ／ｖ）より小であるＤＭＳＯ及び２ｍＭより大でかつ１０ｍＭより小であるタウロコール酸を培養容器内の前記腸管腔側面に加えた後、前記培養容器をインキュベートする第二工程、
（３）前記挿入部材を一時的又は完全に取り除いた後、培養容器内の単層細胞の非腸管腔側面に透過された前記被験物質の量を測定する第三工程、及び
（４）第三工程により測定された量又はそれに相関関係を有する値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記被験物質の腸管膜透過性を評価する第四工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
腸管由来の培養細胞が、ヒト大腸癌由来のＣａｃｏ−２細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一工程における細胞同士が密着結合した異方性を有する単層細胞が、全４日間からなる２段階での培養・分化誘導により得られた単層細胞であって、前記２段階のうち、前段階が細胞を３日間培養する工程であり、後段階が細胞を１日間分化誘導させる工程である操作により培養・分化誘導されてなる単層細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
第一工程における細胞同士が密着結合した異方性を有する単層細胞が、腸管由来の培養細胞の細胞懸濁液をコラーゲン細胞培養基質上に播き込んだ後、当該細胞を炭酸ガス濃度が５％（ｖ／ｖ）〜２０％（ｖ／ｖ）である条件下にて３日間培養し、その後４ｍＭ〜２０ｍＭの酪酸の存在下１日間培養して当該細胞を分化誘導させることにより得られた単層細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
第一工程において、コラーゲン細胞培養基質が天然原繊維コラーゲン細胞培養基質であることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の方法により評価された腸管膜透過性に基づき被験物質の消化管での吸収性を推定することを特徴とするｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬物の消化管吸収性の予測方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬物の腸管膜透過性の評価方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
組織と等価なコラーゲン構築物の製法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。この方法では、半透過性膜を隔てて浸透圧勾配をつくる手段による、コラーゲン濃縮物の形成を必要とする。しかしながら、当該コラーゲン濃縮物上で３日間培養した細胞層は、消化管における吸収性を予測するための腸上皮細胞モデルが必要とする細胞同士の密着性を必ずしも十分に有しておらず、精度の高いｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬物の腸管膜透過性の評価方法を構築することができなかった。
【０００３】
【特許文献１】
米国特許第５，２５６，４１８号
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、異方性（バリアー機能）を有する単層細胞を容易に形成させること、細胞同士が密着結合した単層細胞を容易に形成させること、さらに、難溶解性の薬物の腸管膜透過性の評価にも利用できることであって、そのための、簡便なｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬物の腸管膜透過性の評価方法等を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、ヒト大腸癌由来のＣａｃｏ−２細胞等の腸管由来の培養細胞がコラーゲン細胞培養基質上で培養・分化誘導されてなる単層細胞（特に、全４日間からなる２段階での培養・分化誘導により得られた単層細胞であって、前記２段階のうち、前段階が細胞を３日間培養する工程であり、後段階が細胞を１日間分化誘導させる工程である操作により培養・分化誘導されてなる単層細胞）を用いて、かつ、透過性試験において、特定な溶解補助剤を特定な濃度で組み合わせて使用すること（具体的には、バリアー機能に相当する細胞分化の指標としてＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの透過性（低透過性）及び電気抵抗性（Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ＴＥＥＲ）に基づき、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの腸管膜透過係数として約４ｎｍ／ｓｅｃ前後の値を維持しながら電気抵抗値が４００Ω・ｃｍ２以上となる組み合わせ条件を探索し、選択すること）により、異方性（バリアー機能）を有する単層細胞を容易しかも好ましくは短期間に形成させること、細胞同士が密着結合した単層細胞を容易しかも好ましくは短期間に形成させること、難溶解性の薬物の腸管膜透過性の評価にも適することを見出し、当該知見に基づく評価等を利用することにより、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
１．ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬物の腸管膜透過性の評価方法であって、
（１）腸管由来の培養細胞がコラーゲン細胞培養基質上で培養・分化誘導されてなる、細胞同士が密着結合した異方性を有する単層細胞を有する挿入部材を、その単層細胞の腸管腔側面を上部として、緩衝液を含む培養容器内に挿入する第一工程、
（２）透過率を試験するための被験物質、０．５％（ｖ／ｖ）より大でかつ２％（ｖ／ｖ）より小であるＤＭＳＯ及び２ｍＭより大でかつ１０ｍＭより小であるタウロコール酸を培養容器内の前記腸管腔側面に加えた後、前記培養容器をインキュベートする第二工程、
（３）前記挿入部材を一時的又は完全に取り除いた後、培養容器内の単層細胞の非腸管腔側面に透過された前記被験物質の量を測定する第三工程、及び
（４）第三工程により測定された量又はそれに相関関係を有する値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記被験物質の腸管膜透過性を評価する第四工程、
を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
２．腸管由来の培養細胞が、ヒト大腸癌由来のＣａｃｏ−２細胞であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．第一工程における細胞同士が密着結合した異方性を有する単層細胞が、全４日間からなる２段階での培養・分化誘導により得られた単層細胞であって、前記２段階のうち、前段階が細胞を３日間培養する工程であり、後段階が細胞を１日間分化誘導させる工程である操作により培養・分化誘導されてなる単層細胞であることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．第一工程における細胞同士が密着結合した異方性を有する単層細胞が、腸管由来の培養細胞の細胞懸濁液をコラーゲン細胞培養基質上に播き込んだ後、当該細胞を炭酸ガス濃度が５％（ｖ／ｖ）〜２０％（ｖ／ｖ）である条件下にて３日間培養し、その後４ｍＭ〜２０ｍＭの酪酸の存在下１日間培養して当該細胞を分化誘導させることにより得られた単層細胞であることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
５．第一工程において、コラーゲン細胞培養基質が天然原繊維コラーゲン細胞培養基質であることを特徴とする前項１、２、３又は４記載の方法；
６．前項１〜５のいずれか記載の方法により評価された腸管膜透過性に基づき被験物質の消化管での吸収性を推定することを特徴とするｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬物の消化管吸収性の予測方法；
等を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬物の腸管膜透過性の評価方法等に関するものであり、本発明方法により、生物学的利用率の決定要因の一つとなる腸管膜透過性（消化管での吸収性）を薬物動態初期評価として、高速に実施可能（ＨＴＳ化）とするため、薬物のスクリーニング研究等に最適である。
【０００８】
本発明における第一工程は、ヒト大腸癌由来のＣａｃｏ−２細胞等の腸管由来の培養細胞がコラーゲン細胞培養基質上で培養・分化誘導されてなる、細胞同士が密着結合した異方性を有する単層細胞を有する挿入部材を、その腸管腔側面を上部として、緩衝液を含む培養容器内に挿入する工程である。
本発明方法において用いられる腸管由来の培養細胞は、異方性（バリアー機能）を有する単層細胞を形成でき、しかも細胞同士が密着結合した単層細胞を形成できるようなものであればよい。このような培養細胞は、例えば、ヒト由来のｐｒｉｍａｒｙ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｔｕｍｏｒから通常の移植培養技術及び１５％  ＦＢＳ含有イーグル最小培地等を用いて分離してもよいが、例えば、ヒト大腸癌由来のＣａｃｏ−２細胞（例えば、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  （Ｂｅｔｈｅｓｄａ）  ５８：２０９−２１４，  １９７７  や  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  （Ｂｅｔｈｅｓｄａ）  ５９：２２１−２２６，  １９７７等に記載される、ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｔｕｍｏｒから分離されたヒト細胞株である。）の場合には、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  、１０８０１  Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９，  ＵＳＡ）等の細胞株保存機関からも有償で入手することが可能である。培地、培養方法、保存方法等の情報は、例えば、ＡＴＣＣ発行のＰｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｈｅｅｔ  ｆｏｒ  ＨＴＢ−３７やウェブサイト（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）等により公開されている。
本発明方法において用いられるコラーゲン細胞培養基質は、例えば、特許第２８１５１３５号公報にある実施例１に記載される「天然源繊維コラーゲン細胞培養基質の調製」等に従って調製すればよい。また、市販のコラーゲン細胞培養基質（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を利用することも可能である。
【０００９】
本発明方法において用いられる挿入部材（以下、本挿入部材と記すこともある。）は、細胞同士が密着結合した異方性を有する単層細胞を有している。ここで「細胞同士が密着結合した異方性を有する単層細胞」は、ヒト大腸癌由来のＣａｃｏ−２細胞等の腸管由来の培養細胞をコラーゲン細胞培養基質上で、例えば、全４日間からなる２段階での培養・分化誘導により調製することができる。さらに好ましくは、例えば、前記２段階のうち、前段階が細胞を３日間培養する工程であり、後段階が細胞を１日間分化誘導させる工程である操作によって培養・分化誘導することにより調製することがよい。
【００１０】
以下、挿入部材の調製について詳細に説明する。
挿入部材自体及び培養容器としては、例えば、ファルコンＴＭＨＴＳマルチウェルＴＭインサートシステム（商品名）（日本ベクトン・ディッキンソン社製）を利用することもできる。さらにまた、当該挿入部材自体に予めコラーゲンコーティングされている形態の市販品（日本ベクトン・ディッキンソン社製）を利用することもできる。
まず腸管由来の培養細胞の培養は、哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば、適当な炭素源、窒素源及びビタミン等の微量栄養物を適宜含む生育培地（好ましくは、上皮細胞の増殖及び分化に適切なあらゆる細胞培養培地であって、具体的には、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ、Ｍ−１９９、ＲＰＭＩ、さらにこれらの培地に、血清（ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）又はウシ血清）、血清含有添加物（ＮＵ−ＳＥＲＵＭ）、血清不含有添加物（ＭＩＴＯ＋）等が適宜添加された培地）中で炭酸ガスの存在下で培養を行う。より具体的な培養方法としては、例えば、１０％〜２０％  ＦＢＳ含有イーグル最小培地又はその改変培地（好ましくは、１０％〜２０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ、ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏｓ．３０−２００３，  ３０−２０２０等に記載されるような培地、１％  Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ及び１％  ＮＥＡＡが添加されたイーグル最小培地、ＭＩＴＯ＋血清延長剤（ＴＭＳｅｒｕｍＥｘｔｅｎｄｅｒ）が添加されたＤＭＥＭ等）等の生育培地を含むフラスコ内に少量の培養細胞の細胞懸濁液を加えた後、これを、例えば、濃度５％（ｖ／ｖ）〜２０％（ｖ／ｖ）の炭酸ガスの存在下に３７℃で培養を行う。培養期間中、通常週に１〜２回、生育培地を新鮮な培地と交換すればよい。
このように培養されて８０〜９０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔな状態に達した培養細胞を、コラーゲン細胞培養基質上に、例えば、１つの基質上に約１０５〜１０６細胞の細胞密度になるように播種し、例えば、１０％〜２０％  ＦＢＳ含有イーグル最小培地又はその改変培地（好ましくは、１０％〜２０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ、ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏｓ．３０−２００３，  ３０−２０２０等に記載されるような培地等）等の基本播種培地を用いて濃度５％（ｖ／ｖ）〜２０％（ｖ／ｖ）の炭酸ガスの存在下に３７℃で培養を行う。好ましくは３日間培養することがよい。
【００１１】
次に、腸管由来の培養細胞の分化誘導は、哺乳動物細胞の分化誘導に使用される通常の方法によって行うことができるが、例えば、酪酸等の適当な分化誘導剤を含む培地（即ち、分化誘導培地）中で炭酸ガスの存在下に培養を行う。培養方法としては、前述の培養方法と同様な方法を用いればよい。具体的には、ヒト大腸癌由来のＣａｃｏ−２細胞の場合には、例えば、ヒト大腸癌由来のＣａｃｏ−２細胞の細胞懸濁液をコラーゲン細胞培養基質（好ましくは、天然原繊維コラーゲン細胞培養基質）上に播き込んだ後、当該細胞を炭酸ガス濃度が５％（ｖ／ｖ）〜２０％（ｖ／ｖ）である条件下にて基本播種培地を用いて３日間培養した後に、４ｍＭ〜２０ｍＭの酪酸の存在下（好ましくは、４ｍＭ〜２０ｍＭの酪酸が添加された基本播種培地、即ち、分化誘導培地、等を用いて）１日間培養して当該細胞を分化誘導させることがよい。このようにして本挿入部材を調製することができる。
【００１２】
次に、本挿入部材を、当該挿入部材が有する単層細胞の腸管腔側面を上部として、緩衝液を含む培養容器内に挿入する。
単層細胞の腸管腔側面は、単層細胞の非腸管腔側面とは対面関係にあり、コラーゲン基質に接着していない面であることから容易に識別可能である。
本挿入部材を挿入する培養容器内には、予め緩衝液を加えておくことがよい。ここで用いられる緩衝液とは、後述の透過試験系内において用いられるものであって、当該透過試験系内において適するようなものであればよいが、好ましくは、リン酸緩衝液、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ（シグマ社製）、  Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いればよい。尚、ｐＨとしては、例えば、約６〜７．５程度、好ましくは７．４のｐＨ非勾配や、腸管腔側面の側では６及び非腸管腔側面の側では７．４等のｐＨ勾配等をあげることができる。
【００１３】
本発明における第二工程は、透過率を試験するための被験物質、０．５％（ｖ／ｖ）より大でかつ２％（ｖ／ｖ）  より小であるＤＭＳＯ及び２ｍＭより大でかつ１０ｍＭより小であるタウロコール酸を培養容器内の前記腸管腔側面に加えた後、前記培養容器を一定時間インキュベートする工程である。
当該工程は透過試験系内に相当し、特定な溶解補助剤を特定な濃度で組み合わせて使用することが本発明の一つの重要な技術的事項である。当該条件は、過度の試験を伴う試行錯誤の結果（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗが主にｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒルートで単層膜を透過すると考えられる物質であることに着目し、当該物質の腸管膜透過係数が約４ｎｍ／ｓｅｃ前後の値であり、さらに電気抵抗値が４００Ω・ｃｍ２以上を維持することで、十分な異方性（バリアー機能）を有し、かつ、細胞同士が十分に密着結合した単層細胞を形成しており、さらに難溶解性の薬物の腸管膜透過性の評価にも適すると判断した。）として、バリアー機能に相当する細胞分化の指標としてＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの透過性（低透過性）及び電気抵抗性に基づき、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの腸管膜透過係数として約４ｎｍ／ｓｅｃ前後の値を維持しながら電気抵抗値が４００Ω・ｃｍ２以上となる組み合わせ条件を探索し、選択することにより、新たに見出されたものである。
【００１４】
本発明方法の第二工程における透過試験系内において、透過率を試験するための被験物質の添加濃度としては、例えば、１μＭ以上で、好ましくは１０μＭ〜１００μＭである。
被験物質を培養容器内の単層細胞の腸管腔側面に加えた後、前記培養容器をインキュベートする時間として、例えば、１５分間以上を、好ましくは３０分間以上２時間以内をあげることができる。当該透過試験系における保温温度としては、ヒトの体温に相当する温度範囲、例えば、３７℃前後、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃を、より好ましくは３６．８℃〜３７．２℃をあげることができる。また当該透過試験系におけるｐＨとしては、例えば、６〜７．５があげられる。
【００１５】
さらに、本発明方法の感度を高めるためには、例えば、第二工程における透過試験系内に、蛋白質等を添加してもよい。例えば、牛血清アルブミンの場合には、その添加濃度は、例えば、０．５％（ｖ／ｖ）以上で、好ましくは１％（ｖ／ｖ）〜４％（ｖ／ｖ）である。また、被験物質の溶解性を高めるために、上記の透過試験系内にタウロコール酸以外の他の溶解補助剤を添加してもよい。但し、それらの添加は、本発明の効果を消失させることがない範囲に限定されることは言うまでもない。
【００１６】
本発明における第三工程は、前記挿入部材を一時的又は完全に取り除いた後、培養容器内の非腸管腔側面に透過された前記被験物質の量（以下、本透過量と記すこともある。）又はそれに相関関係を有する値を測定する工程である。ここで「挿入部材を一時的に取り除いた後」とは、経時的にサンプリングを行う場合を意味しており、また「挿入部材を完全に取り除いた後、」とは、最終サンプリングを行う場合や経時的にサンプリングを行う必要がない場合等を意味している。
本透過量は、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、又はクロマト的な分離を要しない蛍光プレートリーダー（蛍光分光光度計）を用いる蛍光分光吸収分析等を利用して、培養容器内の非腸管腔側面に透過された被験物質の量を定量分析すればよい。検出方法としては、例えば、前記被験物質のＵＶ吸光度を測定する方法や、前記被験物質の蛍光強度を測定する方法、予めラジオアイソトープで標識した前記被験物質を用いて放射活性を測定する方法等が挙げられる。尚、当該定量分析の際に第二工程後のインキュベート液から蛋白質を除去しておく必要がある場合には、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２８０，  ２１１−２２１等に記載される方法によりインキュベート液から蛋白質を除去すればよい。
さらにまた本透過量から、被験物質の量に相関関係を有する値として、例えば、下記の式で算出される腸管膜透過係数（Ｐａｐｐ）を求めてもよい。
【００１７】
【数１】
腸管膜透過係数（Ｐａｐｐ，ｎｍ／ｓｅｃ）＝本透過量（μｍｏｌ）×１０７／時間（ｓｅｃ）／膜面積（ｃｍ２）／培養容器内の腸管腔側面に加えた被験物質の濃度μｍｏｌ／ｃｍ３）
【００１８】
また場合によっては、第二工程後に、培養容器内の腸管腔側面に残された被験物質の減少量を分析することにより、本透過量を算出することもできる。
【００１９】
因みに、被験物質がＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗである場合には、緩衝液等が有していない蛍光を発する性質が当該物質に存在するため、蛍光プレートリーダー（励起波長：４３０ｎｍ、蛍光波長：５３５ｎｍ）を用いて当該物質の量を容易に測定することができる。
【００２０】
本発明における第四工程は、第三工程により測定された量又はそれに相関関係を有する値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記被験物質の腸管膜透過性を評価する工程である。
第三工程により測定された量又はそれに相関関係を有する値と、対照（即ち、基準物質、ネガティブコントロール等における測定された量又はそれに相関関係を有する値）とを比較するには、いかなる方法であってもよいが、例えば、コンピュータを利用して自動化するような場合には、各種の薬物における腸管膜透過係数の値を予め蓄積されたデータベースにアクセスすることにより、対照との比較を行い、これにより得られる差異に基づき、前記被験物質の腸管膜透過性を評価すればよい。このようにして被験物質が有する腸管膜透過性の評価（本発明方法）を行うことができる。
本発明方法において、測定された量又はそれに相関関係を有する値と、対照とを比較する場合には、異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が溶媒やバックグランドとなる試験系溶液等のネガティブコントロールとすることで、他方の被験物質が有する腸管膜透過性を評価してもよいし、また前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質（例えば、基準物質）が有する腸管膜透過性を基準としながら他方の被験物質が有する腸管膜透過性を評価してもよい。もちろん両者で評価してもよい。
後者の場合には、測定（被験物質）値が対照（基準物質）値よりも高い値であれば、該被験物質は該基準物質よりも腸管膜透過性が高いと評価する。一方、測定（被験物質）値が対照（基準物質）値よりも低い値であれば、該被験物質は該基準物質よりも腸管膜透過性が低いと評価する。
【００２１】
さらに、本発明方法により評価された腸管膜透過性に基づき、被験物質の消化管での吸収性を推定することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける薬物の消化管吸収性を予測すればよい。
例えば、対照としてネガティブコントロールを用いた場合には、被験物質の消化管吸収性を評価するための指標となる腸管膜透過係数が、統計学的に有意な値を示す物質を、消化管吸収性を有する物質として予測する。一方、対照として腸管膜透過係数が低い物質（基準物質）を用いた場合には、測定（被験物質）値が対照（基準物質）値と同等若しくはそれよりも低い値を示す物質を低い消化管吸収性を有する物質として予測する。また、例えば、対照として腸管膜透過係数が高い物質（基準物質）を用いた場合には、測定（被験物質）値が対照（基準物質）値と同等若しくはそれよりも高い値を示す物質を高い消化管吸収性を有する物質として予測する。
【００２２】
【実施例】
以下に、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
実施例１  （第一工程：腸管由来の培養細胞がコラーゲン細胞培養基質上で培養・分化誘導されてなる、細胞同士が密着結合した異方性を有する単層細胞の調製等）
（１−１）腸管由来の培養細胞の調製
腸管由来の培養細胞として、ＡＴＣＣより購入したヒト大腸癌由来のＣａｃｏ−２細胞を使用した。
まず、細胞培養液（以下、ＣＭ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）と記すこともある。）は、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｍｉｘｔｕｒｅ（具体的には、１００００  Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ、１００００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ、２５μｇ／ｍｌ  ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ  ｉｎ  ０．８５％  ｓａｌｉｎｅ）、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、非必須アミノ酸及びＦＢＳを、それぞれ終濃度として５％、１％、１％及び１０％となるように、ＤＭＥＭに添加することにより調製された。
ＣＭを含むフラスコ内に少量の上記の培養細胞の細胞懸濁液を加えた後、これを、濃度５％（ｖ／ｖ）の炭酸ガスの存在下に３７℃で培養を行った。培養期間中、通常週に１〜２回、生育培地を新鮮な培地と交換した。このようにして細胞が８０〜９０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔな状態に達するまで培養された。
（１−２）コラーゲン細胞培養基質の調製
コラーゲン細胞培養基質として、日本ベクトン・ディッキンソン社製より購入した天然源繊維コラーゲン細胞培養基質を使用した。これは、挿入部材自体に予め天然源繊維コラーゲンコーティングがなされている形態のものであった。
（１−３）単層細胞の調製
前記（１−２）のコラーゲン細胞培養基質を、脱気のために、ＣＭを用いて予めプレインキュベート（条件：３７℃、０．５時間）した。このコラーゲン細胞培養基質上に、前記（１−１）により得られた、８０〜９０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔな状態に達した培養細胞を、１つの基質上に２×１０５細胞の細胞密度になるように播種し、ＣＭを用いて濃度５％（ｖ／ｖ）の炭酸ガスの存在下に３７℃で３日間培養を行った。次に、５ｍＭの酪酸及びＳｅｒｕｍ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒが添加されたＤＭＥＭ（Ｅｎｔｅｒｏ−ＳＴＩＭＴＭ、ベクトンディッキンソンから購入）を用いて１日間培養することにより、当該細胞を分化誘導させた。このようにして、腸管由来の培養細胞がコラーゲン細胞培養基質上で培養・分化誘導されてなる、細胞同士が密着結合した異方性を有する単層細胞を調製した。
次いで、調製された単層細胞を有する挿入部材を、その単層細胞の腸管腔側面を上部として、下記の組成（表１参照）からなる緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌを含む培養容器内に挿入した。尚、ｐＨは、使用直前にＨＣｌ又はＮａＯＨで適宜調整された。
【００２４】
【表１】
2004242612.tif 000002
【００２５】
実施例２  （第二工程：透過試験系の構築及び実施）
実施例１で調製された、挿入部材が挿入された培養容器内の腸管腔側面の緩衝液を一旦除去した後に、前記緩衝液（ｐＨ６．０に調整されたもの）０．５ｍｌを培養容器内の腸管腔側面に加えた。透過試験系内の平衡化のために、その状態で培養容器を２０分間、３７℃でプレインキュベートした。
次いで、培養容器内の腸管腔側面の緩衝液及び非腸管腔側面の緩衝液を一旦除去した後に、透過率を試験するための被験物質であるＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ（１００μＭ）、１％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ、及び、５ｍＭのタウロコール酸が予め添加された前記緩衝液（ｐＨ６．０に調整されたもの）０．３ｍｌを培養容器内の腸管腔側面に加え、また、前記緩衝液（ｐＨ７．４に調整されたもの）１ｍｌを培養容器内の非腸管腔側面に加えた。
その状態で培養容器を９０分間、３７℃で振盪（４０ｓｗｉｎｇ／ｍｉｎ）しながらインキュベートした。
【００２６】
実施例３  （第三工程及び第四工程：透過試験系の実施（本透過量の測定）及び被験物質の腸管膜透過性の評価、並びに、消化管吸収性の推定）
実施例２でインキュベートされた培養容器から挿入部材を取り除いた後、培養容器内の非腸管腔側面から試料液をサンプリング（１００μｌ／ウェル）し蛍光プレートリーダー（励起波長：４３０ｎｍ、蛍光波長：５３５ｎｍ）を用いて当該試料液の蛍光吸収度を測定した。次いで、測定された蛍光吸収度に基づき算出された透過量から、下記の式で算出される腸管膜透過係数（Ｐａｐｐ）を求めた。尚、膜面積（挿入部材の有効面積）は０．３ｃｍ２であった。
【００２７】
【数２】
腸管膜透過係数（Ｐａｐｐ，ｎｍ／ｓｅｃ）＝本透過量（μｍｏｌ）×１０７／時間（ｓｅｃ）／膜面積（ｃｍ２）／培養容器内の腸管腔側面に加えた被験物質の濃度μｍｏｌ／ｃｍ３）
【００２８】
その結果、タウロコール酸とＤＭＳＯとの共添加の試験区において、タウロコール酸５ｍＭとＤＭＳＯ１％（ｖ／ｖ）との組み合わせでは電気抵抗値が下がることは無く、被験物質（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ）の腸管膜透過係数が約５ｎｍ／ｓｅｃ前後の値を維持した。さらに、当該組み合わせの試験区を用いて、文献的にヒトの消化管での吸収性（吸収率）が既知な薬物を使用し、その吸収性（吸収率）と当該実施例で示された透過性との間に良好な相関関係が認められた。
【００２９】
参考例１  （Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの透過性及び電気抵抗性に基づく組み合わせ条件の探索・選択）
透過性試験において、特定な溶解補助剤を特定な濃度で組み合わせて使用すること、具体的には、バリアー機能に相当する細胞分化の指標としてＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの透過性（低透過性）及び電気抵抗性に基づき、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの腸管膜透過係数として約４ｎｍ／ｓｅｃ前後の値を維持しながら電気抵抗値が４００Ω・ｃｍ２以上となる組み合わせ条件を探索し、選択することにより、難溶解性の薬物の腸管膜透過性の評価にも適することを見出すための試験方法を下記に示す。
（１−１）腸管由来の培養細胞の調製
腸管由来の培養細胞として、ＡＴＣＣより購入したヒト大腸癌由来のＣａｃｏ−２細胞を使用した。
まず、細胞培養液（以下、ＣＭ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）と記すこともある。）は、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｍｉｘｔｕｒｅ（具体的には、１００００  Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ、１００００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ、２５μｇ／ｍｌ  ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ  ｉｎ  ０．８５％  ｓａｌｉｎｅ）、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、非必須アミノ酸及びＦＢＳを、それぞれ終濃度として５％、１％、１％及び１０％となるように、ＤＭＥＭに添加することにより調製された。
ＣＭを含むフラスコ内に少量の上記の培養細胞の細胞懸濁液を加えた後、これを、濃度５％（ｖ／ｖ）の炭酸ガスの存在下に３７℃で培養を行った。培養期間中、通常週に１〜２回、生育培地を新鮮な培地と交換した。このようにして細胞が８０〜９０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔな状態に達するまで培養された。
（１−２）単層細胞の調製
挿入部材のメンブレンフィルターを脱気のために、ＣＭを用いて予めプレインキュベート（条件：３７℃、０．５時間）した。このメンブレンフィルター上に、前記（１−１）により得られた、８０〜９０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔな状態に達した培養細胞を、１つの基質上に２．１×１０４細胞の細胞密度になるように播種し、ＣＭを用いて濃度５％（ｖ／ｖ）の炭酸ガスの存在下に３７℃で１９〜２５日間培養を行った。その間の細胞培養液の交換は、培養開始３日目とそれ以降１日おきに行った。このようにして、腸管由来の培養細胞がコラーゲン細胞培養基質上で培養されてなる、異方性を有する単層細胞を調製した。
次いで、調製された単層細胞を有する挿入部材を、その単層細胞の腸管腔側面を上部として、前述の組成（表１参照）からなる緩衝液（ｐＨ７．４）を含む培養容器内に挿入した。
（１−３）透過試験系の構築及び実施
上記（１−２）で調製された、挿入部材が挿入された培養容器内の腸管腔側面の緩衝液を一旦除去した後に、前記緩衝液（ｐＨ６．０に調整されたもの）０．５ｍｌを培養容器内の腸管腔側面に加えた。透過試験系内の平衡化のために、その状態で培養容器を２０分間、３７℃でプレインキュベートした。
次いで、培養容器内の腸管腔側面の緩衝液及び非腸管腔側面の緩衝液を一旦除去した後に、透過率を試験するための被験物質であるＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ（１００μＭ）、各種濃度（０、１、２、５％（ｖ／ｖ））のＤＭＳＯ、及び、各種濃度（０、５、１０、１５、２０ｍＭ）のタウロコール酸が予め添加された前記緩衝液（ｐＨ６．０に調整されたもの）０．３ｍｌを培養容器内の腸管腔側面に加え、また、前記緩衝液（ｐＨ７．４に調整されたもの）１ｍｌを培養容器内の非腸管腔側面に加えた。
その状態で培養容器を９０分間、３７℃で振盪（４０ｓｗｉｎｇ／ｍｉｎ）しながらインキュベートした。
（１−４）透過試験系の実施（本透過量の測定）
上記（１−３）でインキュベートされた培養容器から挿入部材を取り除いた後、培養容器内の非腸管腔側面から試料液をサンプリング（１００μｌ／ウェル）し、蛍光プレートリーダー（励起波長：４３０ｎｍ、蛍光波長：５３５ｎｍ）を用いて当該試料液の蛍光吸収度を測定した。次いで、測定された蛍光吸収度に基づき算出された透過量から、前述の式（数１参照）で算出される腸管膜透過係数（Ｐａｐｐ）を求めた。尚、膜面積（挿入部材の有効面積）は０．３ｃｍ２であった。
【００３０】
その結果、タウロコール酸の添加量が５ｍＭである場合のみ、被験物質（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ）の腸管膜透過係数が約４ｎｍ／ｓｅｃ前後の値を維持しながら電気抵抗値が４００Ω・ｃｍ２以上であった。一方、ＤＭＳＯの添加量が１％（ｖ／ｖ）である場合のみ、被験物質（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ）の腸管膜透過係数が約５ｎｍ／ｓｅｃ前後の値を維持しながら電気抵抗値が４００Ω・ｃｍ２以上であった。
また、タウロコール酸とＤＭＳＯとの共添加の試験区においては、タウロコール酸１０ｍＭとＤＭＳＯ１％（ｖ／ｖ）との組み合わせでは電気抵抗値が下がることがあったが、タウロコール酸５ｍＭとＤＭＳＯ１％（ｖ／ｖ）との組み合わせでは電気抵抗値が下がることは無く、被験物質（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ）の腸管膜透過係数が約５ｎｍ／ｓｅｃ前後の値を維持した。さらに、当該組み合わせの試験区を用いて、文献的にヒトの消化管での吸収性（吸収率）が既知な薬物を使用し、その吸収性（吸収率）と当該実施例で示された透過性との間に良好な相関関係が認められた。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により、簡便なｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬物の腸管膜透過性の評価方法等が提供可能となった。