(57)【要約】【課題】メンブレン転写物に対して高密度に複数のプローブを反応させうるようにする。【解決手段】複数のレーンに沿ってタンパク質試料が展開して固相化されているメンブレン転写物１０に試薬ａ，ｂ，ｃ，ｄ，…を分注するが、試薬ａ，ｂ，ｃ，ｄ，…を各スポット群１２に対して互いに干渉しないように距離を離した異なる直線に沿って分注する。次に、試料タンパク質とプローブの試薬ａ，ｂ，ｃ，ｄ，…が反応したものを発色させて光学的に検出できるようにするために、発色試薬や蛍光試薬などの検出試薬を二次反応試薬として、試薬ａ，ｂ，ｃ，ｄ，…が分注された直線上に重ねて分注していく。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メンブレン上に展開して固相化された各スポットに対して、スポット内の対象物質を検出するための複数種の試薬を互いに干渉しないように領域を異ならせて分注し、対象物質の存在又は対象物質と相互作用する物質を高密度に検出する免疫ブロット法。
【請求項２】
前記各検出用試薬を、微量分注装置を用いてメンブレン上の異なる線上へ直線状に連続滴下する請求項１に記載の免疫ブロット法。
【請求項３】
前記各検出用試薬の分注は、メンブレン上のスポットの存在する領域のみに行なう請求項１又は２に記載の免疫ブロット法。
【請求項４】
前記試薬は対象物質と特異的に反応するプローブを含む一次試薬と、プローブと反応した後の対象物質を発色させる二次試薬とを含んでおり、まず一次試薬を分注し、その後一次試薬を分注した領域上に二次試薬を分注する請求項１から３のいずれかに記載の免疫ブロット法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床、診断、生化学、分子生物学などの分野において、メンブレン上に展開して固相化された物質を検出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
メンブレン上に展開して固相化された物質を検出する方法として、免疫ブロット法がある。免疫ブロット法は一般にはウェスタンブロット法とも呼ばれ、タンパク質試料等を電気泳動により展開し、その後メンブレンに固相化した後に、対象物質に対する特異抗体をプローブとして反応させてその存在を検出する方法である。
【０００３】
この方法に対する変法として、未知のタンパク質試料を展開したメンブレンに対し、対象分子を探索すること、又は対象分子とその特異抗体を反応させて対象分子と相互作用を示す分子を探索することも行われている。
【０００４】
これらの方法を実現するために、通常、試料を展開したメンブレン全体に１種類のプローブを含む試薬を添加して反応させている。そのため、複数種の特異プローブを平行して用いるためには、同一試料のメンブレン転写物を複数枚用意するか、一枚の転写物を短冊状に切り分けるか、短冊状に複数に区分されたチャンバーにメンブレンを挟むなどして、各プローブに対しそれぞれ別個の反応容器を準備する必要がある。
【０００５】
一方、試薬を分注する方法として、ピエゾ素子により試薬を微量分注することでメンブレン上の微小区画で抗原・抗体反応等を行なわせる系が提案されている（非特許文献１参照。）。その提案の方法では、ピエゾ素子により試薬を吐出し、メンブレン上の所望の位置に「点」状に試薬を分注する。
【０００６】
【非特許文献１】
ＷＯ９８／４７００６号公開公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、同一試料に対し複数のプローブを平行に用いる場合には、各プローブに対しそれぞれ別個の反応槽を用意する必要があった。そのため、これらに使用するメンブレン転写物を作成するためには、同一サンプルを複数レーン（或いは幅広のレーンで）泳動するなど、多量のサンプルを消費せざるを得なかった。しかし、例えば診断目的等で多人数の血清をプローブとして用いる場合などは、固相化サンプルの消費量や物理的な処理検体数から考慮して実現は非常に困難である。
【０００８】
また、多くの場合、これらの操作は手作業によるものであり、作業効率は極めて低いものであった。
そこで本発明では、メンブレン転写物に対して高密度に複数のプローブを反応させうるようにすることを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明では微量分注方法を利用してメンブレン上の各スポットに対して複数種類の試薬を分注するようにする。
すなわち、本発明の免疫ブロット法は、メンブレン上に展開して固相化された各スポットに対して、スポット内の物質を検出するための複数種の試薬を互いに干渉しないように領域を異ならせて分注し、対象物質の存在又は対象物質と相互作用する物質を高密度に検出する方法である。
【００１０】
これにより、メンブレン転写物を短冊状に切り分けたり、特殊な容器で分室化することなく微量区画化が可能であり、かつ高密度で複数試料を分注するため大量検体処理が容易になる。メンブレン転写物の消費を大きく節減し、かつ微量分注装置を用いることにより一連の作業の大幅な省力化を図ることができる。
【００１１】
また、上に紹介した提案のピエゾ素子による分注方法では、メンブレン上の「点」に対して試薬を分注しているが、本発明の好ましい形態では、そのような微量分注方法をメンブレン上での「線」状の分注に利用することにより、一定領域の一次元展開メンブレン転写物に対し、複数種類のプローブをそれぞれの直線状微小区画に連続滴下することにより高密度に反応させるようにする。
【００１２】
これにより、スポットが一次元に展開されたサンプル転写メンブレンに対し、抗体等の複数プローブをそれぞれの線上に分注し、好ましくはさらにそれに続き検出試薬等をそれらの線上に分注することにより、高密度な検出を実現することができる。
【００１３】
微量分注方式に用いる液体分注装置の第１の例は、上に紹介したピエゾ素子による分注方式のものである。そのような液体分注装置では、先端の吐出部につながる空間に充填された試薬を、ピエゾ素子を備えた駆動部により押圧することによりその吐出部から液滴を吐出する。その場合、制御信号のパラメータは、ピエゾ素子への印加電圧の大きさ、印加電圧の立上がり時間、印加時間、印加電圧の立下がり時間のうちの少なくとも１つを含んだものとすることができる。
【００１４】
これに類似の液体分注装置として、インクジェット方式の液体吐出装置で用いられている液体吐出素子を備えたものも用いることができる。
【００１５】
微量分注方式に用いる液体分注装置の他の例として、シリンジポンプによる分注方式の装置も用いることができる。その場合、制御信号のパラメータは、シリンジポンプのプランジャのストローク、速さ、加速のうちの少なくとも１つを含んだものとすることができる。
【００１６】
メンブレンに固相化される試料は、例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミドゲル電気泳動やその他のクロマトグラフィーによって一次元方向に分離されて展開したタンパク質、ペプチド、糖、脂質、核酸等の分子又はそれらの混合物である。．
【００１７】
メンブレンへの試料の固相化は、ゲルその他の泳動媒体に試料を展開させた後世、メンブレンに転写することにより行なうことができる。
このように固相化に使用されるメンブレンの材質としては、ＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ニトロセルロース、ナイロン（登録商標）又はその派生物等を挙げることができる。
【００１８】
メンブレン上に展開して固相化されたスポット内の物質を検出するために、対象分子に結合するプローブとなる物質としては、対象分子が抗原である場合には抗体を使用する。一般的には、対象分子と特異的に反応する生体物質を使用することができる。また、幾つかの抗体や生体物質を組み合わせて使用することもできる。
試薬の分注は、メンブレン上のスポットの存在する領域のみに行なうようにするのが好ましい。それにより、試薬の無駄を省くことができる。
【００１９】
対象物質を光学的に検出できるようにするためには、分注する試薬として対象物質と特異的に反応するプローブを含む一次試薬と、プローブと反応した後の対象物質を発色させる二次試薬とを含んでいることが好ましい。その場合、まず一次試薬を分注し、その後一次試薬を分注した領域上に二次試薬を分注する。そのような二次試薬としては、発色試薬や蛍光試薬を用いることができる。
【００２０】
また、対象分子にプローブを反応させた後、それを適当な手段により検出する方法として、発色試薬や蛍光試薬を分注することのほかに、金属イオンを反応させたり、又はこれらの方法を組み合わせることができる。そのような方法としては、金コロイド標識抗体を用いる方法や、金属イオンに親和性をもつタンパク質等をＮｉ２＋キレート酵素などを用いて蛍光反応に導入する方法がある。
【００２１】
【発明の実施の形態】
図１は本発明を実施するために試薬を分注する液体分注装置の一例を制御系とともに概略的に表したものである。その試薬が一次試薬と二次試薬を使用する場合には、いずれの試薬に対してもこの液体分注装置を用いることができる。
【００２２】
１は液体吐出素子としてピエゾ素子を備えた液体分注装置である。３はその液体分注装置１から吐出された試薬の液滴であり、液体分注装置１の下部に保持されたメンブレン５に分注される。
【００２３】
メンブレン５はＸ−Ｙステージ９上に載置され、液体分注装置１から試薬を液滴として吐出しながらメンブレン５を試料が展開しているレーンの方向（Ｘ方向とする）に沿ってＸ−Ｙステージ９により移動させることにより、試薬をメンブレン５上で１直線に沿って分注することができる。Ｘ−Ｙステージ９をＹ方向に所定量させ、同様にしてＸ方向に移動させながら液体分注装置１から試薬を吐出していくことにより、異なった直線上での分注を繰り返していくことができる。
【００２４】
液体分注装置１の先端にある吐出口部分の画像を取り込んで分注状態をモニタするために撮像装置としてＣＣＤカメラ４が配置されている。ＣＣＤカメラ４は吐出口部分の状態とともに、吐出される液滴３も同時に撮像することができる。撮像装置としてはＣＣＤカメラに限らず、他のカメラを用いてもよい。
【００２５】
ＣＣＤカメラ４は液体分注装置１の先端の吐出口部分を水平方向から撮像する。水平から傾斜をもって斜め上方向から撮像してもよいが、吐出口部分の状態をより正確にモニタするためには、水平方向から撮像するのが好ましい。
【００２６】
液体分注装置１の吐出口部分の画像をより正確に取り込むために、この実施例では透過光で撮像できるように、ＣＣＤカメラ４の光軸上には、液体分注装置１の吐出口部分を挟んでＣＣＤカメラ４と反対側に光源２が配置されている。光源２としては時間的に連続した光を発光するものでもよいが、この実施例としてはストロボを使用する。ストロボの場合、液滴３が液体分注装置１から吐出されるタイミングと同期して発光するように設定することができ、その場合にはカメラ４を連続して作動させている場合でも、ストロボ２が発光した場合にのみ鮮明な画像が取り込まれる。その鮮明な画像は、順次吐出される液滴３の画像が同じタイミングで取り込まれたものであるため、あたかも静止画像のような情報が得られる。そのため液滴３の状態をモニタし、液滴３の大きさを調整するのに好都合である。
【００２７】
光源２として時間的に連続した光を発光するものを使用した場合には、ＣＣＤカメラ４が取り込んだ液滴３の画像で同じ場所を通過する画像を採用することにより、順次吐出される液滴３の画像があたかも静止画像であるかのような情報が得られる。
【００２８】
６は分注制御ユニットで、液体分注装置１のピエゾ素子に電圧を印加することにより吐出動作を行なわせる。また、ストロボ２の発光するタイミングは、分注制御ユニット６から液体分注装置１のピエゾ素子へ印加される電圧のタイミングを基にして、その電圧印加のタイミングに同期させて液体分注装置１からの液滴吐出の一定時間後に発光するように制御される。
【００２９】
８は圧力制御機構であり、液体分注装置１の吐出液を収容する分注液容器２０に充填されたサンプルや試薬などの吐出液が所定の圧力を保つように調節するものである。
【００３０】
７は制御コンピュータであり、分注制御ユニット６を制御して分注動作を制御するものであり、ＣＣＤカメラ４が撮像した画像を基にして所定の大きさの液滴３が吐出されるように制御する。制御コンピュータはまた、分注制御ユニット６による分注動作とＸ−Ｙステージ９の移動が同期するように、Ｘ−Ｙステージ９の駆動も制御する。
【００３１】
分注制御ユニット６がピエゾ素子の駆動を制御するパラメータは、ピエゾ素子への印加電圧の大きさ、印加電圧立上がり時間、印加時間、印加電圧立下がり時間の全て、又はそのうちの少なくとも１つである。
【００３２】
図２（Ａ）に、一次元展開タンパク質サンプル（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）をメンブレンに転写したメンブレン転写物１０に対し、プローブとなる抗体などの複数の試薬ａ，ｂ，ｃ，ｄ，…をそれぞれ異なる直線上に微量分注する実施例を示す。
【００３３】
メンブレン転写物１０には複数のレーンに沿ってタンパク質試料が展開して固相化されている。図２（Ｂ）に１つのレーンの一部を拡大して示すように、プローブの試薬ａ，ｂ，ｃ，ｄ，…を各スポット１２に対して互いに干渉しないように距離を離した異なる直線に沿って分注する。（Ａ），（Ｂ）における直線は、それらの直線に沿って試薬を分注することを示している。
【００３４】
試薬の分注は、図示された直線に沿って行なうが、スポット１２の存在する領域のみに行ない、スポット１２のない領域には分注しないように分注制御ユニット６による分注動作を制御することもできる。
【００３５】
図１の液体分注装置を用いてこのような分注を行なうために、まず試薬ａについて各レーンに１本ずつ分注を行なう。次に試薬をｂに交換して、試薬ａを分注した直線から互いに干渉しないだけの距離を離した位置の直線上に試薬ｂを分注する。同様にして、試薬ｃ，ｄ，…についても同様に分注していく。
【００３６】
次に、試料タンパク質とプローブが反応したものを発色させて光学的に検出できるようにするために、発色試薬や蛍光試薬などの検出試薬を二次反応試薬として分注する。このときは、試薬ａ，ｂ，ｃ，ｄ，…が分注された直線上に重ねて分注していく。検出試薬は試薬ａ，ｂ，ｃ，ｄ，…について共通であることも、それぞれに特有のものを使用することもある。そのような二次反応試薬を分注することにより、図２（Ｃ）に黒く示した発色部１４のように、プローブと反応した部分が発色し、それを光学顕微鏡により検出することができるようになる。
【００３７】
なお、試薬ａ，ｂ，ｃ，ｄ，…を分注する前に、必要に応じて、タンパク質泳動レーンを染色試薬等を用いてその泳動像を可視化して後の分注位置を知る指標としてもよい。そのような方法として、メンブレン全体をクマシーブリリアンブルーなどの色素やタンパク質・糖結合性蛍光試薬、金コロイド溶液によって処理してタンパク質等を染め出す方法などがある。
【００３８】
実施例では液体分注装置としてピエゾ素子を用いたものを使用している。ピエゾ素子による試薬分注ではメンブレン上に直径１００μｍ程度の大きさに試薬を滴下することが可能であるので、多数のプローブにより高密度な検出を行なうことができる。しかし、吐出素子はピエゾ素子に限らず、インクジェット方式のものやシリンジ方式のものを使用してもよい。
【００３９】
【発明の効果】
本発明は、メンブレン上に展開して固相化された各スポットに対して、スポット内の対象物質を検出するための複数種の試薬を互いに干渉しないように領域を異ならせて分注するようにしたので、サンプル泳動像の上に同時に複数のプローブにより各々が独立した微小反応区画を作製することができる。
また、プローブはサンプル泳動レーン上のみに添加するように制御すれば、従来法のように泳動レーンから外れた空白部分にまでプローブが及ぶことがなく、余分な試薬を消費することが避けられ、かつ高い効率での反応の実現が期待できる。
また微量分注装置を用いることから、珍断等の多種検体を処理する場合において、複数反応系の自動処理が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を実施するために試薬を分注する液体分注装置の一例を制御系とともに概略的に示すブロック図である。
【図２】一実施例の動作を示す図で、（Ａ）はメンブレン転写物に複数の試薬ａ，ｂ，ｃ，ｄ，…を分注した状態を示す概略平面図、（Ｂ）は（Ａ）の１つのレーンの一部を拡大して示す概略平面図、（Ｃ）はさらに二次反応試薬を分注した後の状態を示す概略平面図である。
【符号の説明】
１      ピエゾチップによる分注機構
２      ストロボ
３      液滴
５      ターゲット
４      ＣＣＤカメラ
６      分注制御ユニット
７      制御コンピュータ
８      圧力制御機構
９      Ｘ−Ｙステージ
１０      メンブレン転写物
１２      スポット
１４      発色部
【図１】
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【図２】
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