(57)【要約】　　　（修正有）【課題】神経の再生により、治療可能な疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、失明疾患などが例示される治療剤を提供する。【解決手段】チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする神経再生剤。チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類には、チオレドキシン活性を有するものであれば、オリゴペプチドからポリペプチド（タンパク質）まで広く含まれる。特にヒトチオレドキシン及び酵母チオレドキシンが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする神経再生剤。
【請求項２】
前記ポリペプチド類がヒトチオレドキシンである請求項１に記載の神経再生剤。
【請求項３】
神経が視神経及び／又は網膜である請求項１に記載の神経再生剤。
【請求項４】
チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする、神経再生に基づくアルツハイマー病、パーキンソン病及び老人性痴呆からなる群から選ばれる脳神経系疾患の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経再生剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経の生存及び分化は細胞の酸化還元条件により影響される。ＴＲＸ　はその活性部位配列；　−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−内にレドックス活性なジスルフィド／ジチオールを有する小さい　１２　ｋＤａの多機能タンパク質であり、タンパク質ジスルフィド還元系としてＮＡＤＰＨ及びチオレドキシンレダクターゼにも働く（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，　１９８５）。いくつかの報告は、ＴＲＸ−依存性レドックス制御がＡＰ−１、　ＮＦ−ｋＢ、ｐ５３、ＡＳＫ１及びｐ３８　ＭＡＰ　キナーゼにより介在されるシグナル伝達に密接に関与することを示した（Ｈｉｒｏｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７；　Ｓａｉｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９；　Ｕｅｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）．　ＴＲＸは広く分布し、種々のストレスにより誘導される（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７；　Ｍａｓｕｔａｎｉ，　１９９９）．　ＴＲＸ発現はまた　Ｋ５６２　赤白血病細胞の分化誘発剤であるへミン（Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，　２００１），　又は網膜色素上皮細胞のサイクリックＡＭＰアナログ（Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）により上昇する。ＴＲＸ　遺伝子の制御領域中には、いくつかのＳＰ−１結合モチーフ、抗酸化剤応答エレメント（ＡＲＥ）　及びサイクリックＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）がある。神経組織において、ＴＲＸは虚血後の星状膠細胞（Ｔｏｍｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３）　及び神経損傷後の運動ニューロン　（Ｍａｎｓｕｒ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）　において誘導される。ＴＲＸ　は酸化ストレスに対して細胞保護作用（Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔａｌ．，　１９９４）　及び神経保護活性（Ｈｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４）を有することが知られている。さらに、トランスジェニックマウスにおけるＴＲＸの過剰発現は病巣の虚血脳障害を軽減する（Ｔａｋａｇｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）．　ＴＲＸはまた中枢コリン作動性ニューロンの神経栄養因子として報告され、神経栄養活性を有するが（Ｅｎｄｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３），　その効果の分子的基礎は解明されていない。
【０００３】
神経成長因子（ＮＧＦ）及び脳由来神経栄養因子のようなニューロトロフィンファミリーの他のメンバーはニューロンに対し生存及び分化の促進を含む絶大な効果を有する（Ｌｏ，　１９９２）。ＮＧＦは、アルツハイマー病のような加齢に伴う神経変性疾患において可能性のある治療剤として報告された（Ｃｏｎｎｏｒ　ａｎｄ　Ｄｒａｇｕｎｏｗ，　１９９８）。これらのメカニズムの現在の理解は、褐色細胞腫細胞株ＰＣ１２についてのＮＧＦ作用の研究に大きく依存している（Ｇｒｅｅｎｅ　ａｎｄ　Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，　１９７６）。ＮＧＦにさらされると、ＰＣ１２細胞は交感神経ニューロン様細胞に分化する。シグナルは、ＮＧＦが細胞膜上のその高活性受容体であるＴｒｋＡに結合することにより開始され（Ｋａｐｌａｎ　ｅｔａｌ．，　１９９１）、ｒａｓ及びマイトージェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケード（Ｔｈｏｍａｓ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９２）により導入される。ＰＣ１２細胞のＮＧＦ処理はＮＧＦ作用に重要と考えられているｃ−ｆｏｓのような遺伝子の活性化をもたらす（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ，　１９８６）。ＮＧＦは、血清応答エレメント（Ｔｒｅｉｓｍａｎ，　１９８６）及びＣＲＥ（Ｇｉｎｔｙ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４；　Ａｈｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）を含むいくつかのエレメントによりｃ−ｆｏｓ遺伝子を活性化する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、神経系ないし神経細胞の再生を促進する技術に関する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＴＲＸが神経系ないし神経細胞の再生を促進し、視神経・網膜の再生による眼科領域での疾患の治療や、大脳皮質などの神経系ないし神経細胞の再生を促進し、神経細胞死に起因する各種疾患の治療に有用であることを見出した。
【０００６】
本発明は、以下の神経再生剤及び治療剤に関する
項１．　チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする神経再生剤。
項２．　前記ポリペプチド類がヒトチオレドキシンである請求項１に記載の神経再生剤。
項３．　神経が視神経及び／又は網膜である請求項１に記載の神経再生剤。
項４．　チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする、神経再生に基づくアルツハイマー病、パーキンソン病及び老人性痴呆からなる群から選ばれる脳神経系疾患の治療剤。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本明細書においては、チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類には、チオレドキシン活性を有するものであれば、オリゴペプチドからポリペプチド（タンパク質）まで広く含まれる。
【０００８】
チオレドキシン活性を有するファミリーは、活性中心に配列−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｙ−Ｃｙｓ−（Ｘ及びＹは同一又は異なって２０種類の天然アミノ酸のいずれかを示す。）を有しており、チオレドキシンスーパーファミリー（以下、「ＴＲＸファミリー」という）と呼ばれている。
【０００９】
ＴＲＸファミリーに属するポリペプチドとしては、活性中心に配列−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有するポリペプチド類を例示することができ、これらの中でも、活性中心に配列−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有するポリペプチド類が好ましい。
【００１０】
また、ＴＲＸファミリーに属するポリペプチドには、具体的には、ヒトを含む動物のチオレドキシン（ヒトを含む動物のＡＤＦ）、大腸菌などの細菌のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン等のチオレドキシン；ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチド（ヒトＡＤＦＰ）；ヒト，大腸菌等のグルタレドキシン等が含まれる。
【００１１】
ＴＲＸファミリーに属するポリペプチドとしては、チオレドキシンが好ましく、特にヒトチオレドキシン及び酵母チオレドキシンが好ましい。酵母チオレドキシンは、酵母から単離したものでもよいが、チオレドキシンを多く含む酵母の形態で使用することもできる。
【００１２】
これらＴＲＸファミリーに属するポリペプチド類は、本発明神経再生剤に、単独で、又は２種以上組み合わせて含有させることができる。
【００１３】
ＴＲＸファミリーに属するポリペプチドは、細菌（大腸菌）、酵母、植物及び動物、特にヒトを含む哺乳動物（ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、モルモット、ラット、マウス、ウサギなど）由来のいずれであってもよい。また、ＴＲＸファミリーに属するポリペプチドは、天然物を精製する方法、遺伝子組換え法により、酵母，大腸菌等から得られるものであってもよく、ＴＲＸ活性を有する限り、その１又は複数のアミノ酸を置換、付加、欠失等した誘導体であってもよい。
【００１４】
チオレドキシンを含む該ポリペプチド類は、酸化型であっても還元型であってもよいが、好ましくは還元型である。
【００１５】
再生される神経としては、大脳（皮質、髄質）、小脳、脳幹、視神経、内耳神経、運動神経、知覚神経、脊髄、交感神経、副交感神経などが挙げられ、これらの神経に分化し得る各種幹細胞にＴＲＸファミリーに属するポリペプチドを作用させることで、神経を再生し、神経の変性ないし神経細胞死に起因する各種神経系疾患を治療することができる。
【００１６】
神経に分化し得る各種幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞などが例示できる。
【００１７】
本発明者らは、神経幹細胞にＴＲＸが多く発現していることを見出しており、下記の実施例からも、ＴＲＸが幹細胞の増殖及び神経細胞への分化を促進することは明らかである。
【００１８】
神経の再生により治療可能な疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、失明疾患などが例示される。
【００１９】
本発明の神経再生剤は、例えば神経を再生可能な各種幹細胞に適用することにより、これら幹細胞の神経細胞への分化、結果として神経の再生を促進することができる。
【００２０】
神経系幹細胞の増殖及び神経細胞への分化を促進するためのＴＲＸファミリーに属するポリペプチドの有効量としては、成人１日あたり５０〜５００　ｍｇ程度であり、これを１日あたり１〜３回に分けて投与することができる。
【００２１】
投与経路としては、経口（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤など）及び非経口（注射剤、吸入剤、点鼻剤、坐剤など）のいずれでも投与することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明する。
実施例１
（１）細胞株及び培養
ＮＧＦ，　ポリエチレンイミン（ＰＥＩ），　ＰＤ９８０５９及びＮＡＣはＳｉｇｍａから購入した。ラット褐色細胞腫腫瘍細胞株ＰＣ１２は、５％　ＣＯ２　を含む湿気のある雰囲気中３７℃で、１０％熱不活性化ウマ血清及び５％熱不活性化胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）を有し、抗生物質（１００　ＩＵ／ｍｌのペニシリン及び１００　ｍｇ／ｍｌ　のストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ　１６４０　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，　ＮＹ）中で維持した。
・プラスミド：ｐＴｒｘＣＡＴ　プラスミドは公知の方法に従い構築した（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６）。ｔｈｅ　ｐＴｒｘＣＡＴ　ベクターからのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨ　Ｉ　インサートは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ　（＋）　（ｐＴＲＸｂｌｕｅ　ベクターにサブクローニングした。ｐＴＲＸ（−１１４８）−Ｌｕｃ、ｐＴＲＸ　（−１０６２）−Ｌｕｃ、ｐＴＲＸ　（−３５２）−Ｌｕｃ及びｐＴＲＸ　（−２６３）−Ｌｕｃ　ベクターはｐＴＲＸｂｌｕｅベクターのＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ　フラグメントをｐＧＬ３　ベイシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，　ＷＩ）のＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩ部位にライゲートすることにより構築した。ｐＴＲＸ（−２６３）−ＬｕｃベクターのＡｐａＩ　／ＰｖｕＩＩインサートは、切り出され、埋められ、自己ライゲートされてｐＴＲＸ　（−２１７）−Ｌｕｃベクターを得た。ｐＧＬ３−ｃ−ｆｏｓ　（−４０，　＋４２）　及びｐＧＬ３−ｃ−ｆｏｓ　（−９９，　＋４２）　ｌｕｃベクターは、Ｆｏｓ−４０　ｌｕｃのＭｌｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（Ｍａｓｕｔａｎｉ　ｅｔａｌ．，　１９９７）及びｔｈｅ　ｐＦＤＥ−ｌｕｃベクターをｐＧＬ３　ベイシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＭｌｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングすることにより構築した。ｐＦＤＥ−ｌｕｃは、ＦＤＥ−ＣＡＴ　（Ｔｒｏｕｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３）　のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＧＬ２ベイシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩにサブクローニングすることにより構築した。ｐＣＤＳＲ　ａ（ａｌｐｈａ）　−ＴＲＸ及び　ｐＣＤＳＲａ　−ＴＲＸ（Ｃ３２Ｓ／Ｃ３５Ｓ）ベクターは、既述の方法により構築した（Ｈｉｒｏｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）。Ｔｈｅ　ｐｃＤＮＡ３ＴＲＸ　（３２Ｓ／３５Ｓ）ベクターは、既述の方法により構築した（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）。ｐＣＤＳＲａ　−ＴＲＸ及びｐＣＤＳＲａ−ＴＲＸｍ　（Ｔａｇａｙａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８９；　Ｈｉｒｏｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）からのＢａｍＨＩインサートは、各々ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ　（ｐＢＳ−ｗｔＴＲＸ，　ｐＢＳ−ｄｍＴＲＸ）のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。ｐＢＩ−ＥＧＦＰ−ｗｔＴＲＸ及びｐＢＩ−ＥＧＦＰ−ｄｍＴＲＸ（３２Ｓ／３５Ｓ）は、各々ｐＢＳ−ｗｔＴＲＸ及びｐＢＳ−ｄｍＴＲＸ　ベクターのＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩフラグメントをｐＢＩ−ＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＰｖｕＩＩ／ＮｈｅＩ部位にライゲートすることにより構築した。すべての構築物は、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ＩＩ　ダイ・ターミネーター・サイクルシークエンシングキット（ｄｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｃｙｃｌｅｓ　ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた直接ヌクレオチドシークエンシングによりコントロールした。ｐＲＬ−ＴＫベクターは、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。ｐｃＤＮＡ３はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
・ウェスタンブロット分析
細胞を集めて氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、次いで可溶化溶液（１０　ｍＭ．Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ　７．４），　１５０　ｍＭ　ＮａＣＩ，　１％　ＮＰ−４０，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．１　ｍＭ　ＰＭＳＦ，　８　ｍｇ／ｍｌアプロチニン及び２ｍｇ／ｍｌロイペプチン）で氷上３０分間溶解させた。抽出物を遠心分離により清澄にした。細胞可溶化液を９５℃で５分間維持し、次いで１５％　ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。分離したタンパク質をポリビニリデンジフルオライド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏ．，　Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に移した。該膜をＴ−ＰＢＳ　（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）中１０％　（ｗ／ｖ）スキムミルクで終夜処理し、抗マウスＴＲＸ　ウサギポリクローナル抗体（Ｔａｋａｇｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８ｃ）と１時間インキュベートし、次いでペルオキシダーゼ複合化抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｎ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）と１時間インキュベートした。エピトープをＥＣＬウェスタンブロット検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｎ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）で可視化した。本発明者は、以前にこの抗マウス抗体がラットＴＲＸ　と交差反応することを報告した（Ｔａｋａｇｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８ｂ）。
・ノーザンブロット分析
全ＲＮＡを製造元の仕様書に従いＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて抽出した（Ｍａｒｕｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。全ＲＮＡ２０ｍｇ　を電気泳動にかけＭａｘｉｍｕｍ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ　Ｎｙｔｒａｎ　ｎｙｌｏｎ　（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｒｕｌ，　Ｋｎｅｅ，　ＮＨ　）にＴｕｒｂｏ−Ｂｌｏｔｔｅｒシステム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄＳｃｈｒｕｌ）を用いて移した。フィルターを、既述のように（Ｔａｋａｇｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８ｂ）ラットＴＲＸ　ｍＲＮＡと交差反応するマウスＴＲＸプローブとハイブリダイズさせた。
・トランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ
ＰＣ１２細胞をトランスフェクション前に３５−ｍｍ　ディッシュに７０％コンフルエンスで播種した。血清を含まない培地中の細胞をＢｏｕｓｓｉｆら（Ｂｏｕｓｓｉｆ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５）に記載されたようにＰＥＩ試薬を用いてトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクトした細胞を５０　ｎｇ／ｍｌ　のＮＧＦ　（Ｓｉｇｍａ）で処理した。　Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性により規格化したルシフェラーゼ遺伝子発現をアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）を用い、ルミノメーターで２４時間後に分析した。ルシフェラーゼの相対的フォールド活性化を計算した。同じ実験を３回行った。ＰＣ１２細胞を、ＴＲＸの活性部位が不活性化された二方向性発現ベクターｐＢＩ−ＥＧＦＰ，　ｐＢＩ−ＥＧＦＰ−ｗｔＴＲＸ又はｐＢＩ−ＥＧＦＰ−ｄｍＴＲＸでトランスフェクトした（Ｕｅｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）。トランスフェクション後、ＮＧＦを培地に加えた。２４時間後、細胞発現ＥＧＦＰをレーザー共焦点顕微鏡により調べた。
・免疫蛍光細胞染色
ＰＣ１２細胞をポリ−Ｌ−リシンでコートした培養スライド中７０％コンフルエンスで染色する前に播種した。次いで、細胞を１０％　ＦＣＳを含むＰＢＳ中３．７％パラホルムアルデヒドで２０分間室温で固定した。これを次にＰＢＳ中０．２％　（Ｗ／Ｖ）　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて１０分間膜透過性化し、５％　ウシ血清アルブミン及び１０％　ＦＣＳを含むＰＢＳで２０分間ブロッキングした。スライドを２ｍｇ／ｍｌのマウスＴＲＸ抗体（富士レビオより提供）で６０分間インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄した。次いでスライドを１ｍｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート標識二次抗体と６０分間インキュベートし、再度ＰＢＳで洗浄した。染色細胞をレーザー共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で調べた。
・結果
ＰＣ１２細胞中でのＮＧＦ誘発ＴＲＸ発現
本発明者は、ＮＧＦのＰＣ１２細胞中でのＴＲＸ発現についての効果を調べた。該タンパク質発現は、ＮＧＦによりＰＣ１２細胞中で増加した（図１Ａ）。ＴＲＸ　ｍＲＮＡもまたＮＧＦ処理の２時間後に増加した（図１Ｂ）。ＮＧＦ　処理による誘導メカニズムをさらに分析するために、本発明者は、ＴＲＸ　プロモータールシフェラーゼレポーターコンストラクト（ＴＲＸ−Ｌｕｃ）でＰＣ１２細胞をトランスフェクトした。ＮＧＦ　による処理は、ＴＲＸプロモーター活性を有意に増強した（図１Ｃ）。
ＴＲＸプロモーター中のＮＧＦ−応答領域の同定
ＮＧＦによるＴＲＸ遺伝子の活性化のメカニズムを理解するために、ＴＲＸプロモーター領域の各種欠失ミュータントを含むルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトを使用した。翻訳開始部位に対し−２６３位〜−２１７位の遺伝子領域はＮＧＦ応答に必要であった。この領域はコンセンサスＣＲＥに似ている配列を含み、活性化におけるＣＲＥの関与を示す（図２）。ＴＲＸ発現はＰＤ９８０５９又はＮＡＣにより抑制された。
【００２３】
ＥＲＫ阻害剤であるＰＤ９８０５９及びＮＡＣ　（Ｋａｍａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６）は　ＮＧＦによるＥＲＫ−ＣＲＥ介在活性化を抑制することが知られている。ＮＧＦで２日間処理すると神経突起伸長の出現を伴うＰＣ１２細胞のニューロン分化を誘発した。既報告のように、ＰＤ９８０５９　（５０ｍＭ）又はＮＡＣ　（２０　ｍＭ）は、ＰＣ１２　ｃｅｌｌｓにおける　ＮＧＦ−誘発形態変化を抑制した（図３Ａ）。次いで、本発明者はＰＤ９８０５９またはＮＡＣのＮＧＦ−介在ＴＲＸ遺伝子活性化についての効果を試験した。ＰＤ９８０５９　またはＮＡＣは、ＴＲＸ遺伝子のＮＧＦ−誘発活性化をブロックした（図３Ｂ）。ＰＤ９８０５９又はＮＡＣはまた、ＴＲＸタンパク質発現の減少を生じた（図３Ｃ）。
ＴＲＸ　のＮＧＦ−誘発核輸送は、ＰＤ９８０５９またはＮＡＣによりブロックされる。
【００２４】
ＥＲＫは、ＮＧＦ処理中に細胞質から核に輸送される（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２）．　ＴＲＸはまた、Ｈ２Ｏ２又はＵＶ照射にさらされたときにも細胞質から核に輸送される（Ｈｉｒｏｔａ　ｅｔａｌ．，　１９９７）。ＮＧＦ−誘発シグナリングにおけるＴＲＸの関与を分析するために、本発明者はＮＧＦ処理の際のＴＲＸの細胞下局在を研究した。ＮＧＦで１６時間処理した後、ＴＲＸは核に移動した。該移動はＰＤ９８０５９又はＮＡＣによりブロックされた（図４）。優性型ＴＲＸの過剰発現は、ＰＣ１２のＮＧＦ−誘発分化をブロックした。
【００２５】
本発明者は、次いでＴＲＸがＰＣ１２細胞のＮＧＦ−依存性分化に要求されるのかを調べた。本発明者は、ＰＣ１２細胞をｐＢＩ−ＥＧＦＰ，　ｐＢＩ−ＥＧＦＰ−ｗｔＴＲＸ又はｐＢＩ−ＥＧＦＰ−ｄｍＴＲＸ　（３２Ｓ／３５Ｓ）を用いて一時的にトランスフェクトし、そこでは、ＴＲＸのレドックス活性部位は不活性化された。ミュータントＴＲＸは転写因子のＴＲＸ依存性活性化を阻害した（Ｕｅｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）。トランスフェクション後、ＮＧＦが培地に添加された。ＮＧＦ処理の２４時間後、細胞をレーザー共焦点顕微鏡で調べた。ミュータントＴＲＸベクターでトランスフェクトされた細胞は分化の抑制を示し、一方野生型ＴＲＸベクターまたはコントロールベクターでトランスフェクトされた細胞はＮＧＦ−誘発分化を示した（図５）。
【００２６】
優性なネガティブミュータント型ＴＲＸの過剰発現は、ＮＧＦによるＣＲＥ介在ｃ−ｆｏｓ　誘発をブロックした。ＴＲＸは、ＤＮＡ結合（Ｈｉｒｏｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）　（Ｕｅｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）　又はコ−アクチベータ相互作用（Ｅｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）を促進することにより各種の転写因子を制御することが報告された。それゆえ、本発明者はＴＲＸがＣＲＥを介したＮＧＦ−介在活性化の調節に関与するかについて分析した。４時間の処理後、ＮＧＦはｐＧＬ３−ｃ−ｆｏｓ　（−９９，　＋４２）中でルシフェラーゼ活性の４０倍の増大を生じさせたが、ｐＧＬ３−ｃ−ｆｏｓ　（−４０，　＋４２）は増大しなかった（図６Ａ）。レポーター遺伝子であるｐＧＬ３−ｃ−ｆｏｓ　（−９９，＋４２）のＮＧＦに対する応答は，ＴＲＸの優性なネガティブミュータントのトランスフェクションにより著しく抑制された。トランス活性化はミュータントＴＲＸにより７５％抑制された（図６Ｂ）
・考察
本研究において、本発明者はＮＧＦがＰＣ１２細胞において、タンパク質及びｍＲＮＡレベルでＴＲＸ発現を誘導することを見出した。本発明者は、ルシフェラーゼアッセイによりＴＲＸ遺伝子の−２６３〜−２１７　ｂｐ　に位置するＮＧＦ応答領域を同定した。この領域は、ＣＲＥ　をコンセンサスする類似物を保有するＣＧＴＣＡ配列を含んでいた（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８６）。さらに、本発明者はＥＲＫ　阻害剤であるＰＤ９８０５９がＮＧＦ−誘発ＴＲＸ発現を抑制することを示した。ＮＧＦ−誘発ＣＲＥ活性化は細胞外シグナリング調節蛋白質キナーゼ（ＥＲＫ）　（Ｉｍｐｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）により介在される。これらの結果は、ＴＲＸ遺伝子がＥＲＫ及びＣＲＥカスケードを通してＮＧＦにより誘導されることを示す。さらなる研究が、ＮＧＦによるＴＲＸ遺伝子誘発メカニズムの分析について進行中である。
【００２７】
本発明者はまた、ＮＧＦがＰＭＡ　（Ｈｉｒｏｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７），　ＵＶ　（Ｕｅｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）及びへミン（Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，　２００１）と同様にＴＲＸの核移動を誘発することを実証した。本発明者は、ＥＲＫ阻害剤であるＰＤ９８０５９がＮＧＦのこの効果をブロックすることを示し、この結果はＥＲＫがＴＲＸのＮＧＦ−誘発核移動の調節に関与することを示唆する。該核移動のメカニズム及び生理学的重要性はさらに詳細に研究されるべきである。ＴＲＸのＮＧＦ−誘発発現及び核移動はＰＣ１２細胞のＮＧＦ−誘発分化に関連するようであり、なぜならＰＤ９８０５９及びＮＡＣは各々ＮＧＦ−誘発分化及びＴＲＸ発現だけでなく核移動を抑制するからである（図３及び４）。より重要なことには、優勢なネガティブミュータントＴＲＸの過剰発現は、分化をほぼ完全に阻害した（図５）。これらの結果は、ＴＲＸがＮＧＦにより誘発されるＰＣ１２の分化に必要であることを示す。
【００２８】
ｃ−ｆｏｓのような遺伝子はＮＧＦの作用に要求されると考えられた。ｃ−ｆｏｓ遺伝子の上流制御領域において、ＣＲＥは神経分化を誘発する各種の細胞外刺激に応答するｃ−ｆｏｓ転写の調節に決定的に重要である（Ａｈｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）　（Ｓｈｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８８）。本発明者は、ＴＲＸの優勢なネガティブミュータント型の過剰発現がＣＲＥを含むｐＧＬ３−ｃ−ｆｏｓ　（−９９，　＋４２）レポーター遺伝子のＮＧＦ−誘発活性化ブロックするが、ｐＧＬ３−ｃ−ｆｏｓ　（−４０，　＋４２）はブロックしないことを示した。これらの結果は、ＴＲＸがｃ−ｆｏｓ発現をもたらすＣＲＥを介したＮＧＦシグナリングに必要であることを実証する。ＴＲＸはＪｕｎ／Ｆｏｓ　（ＡＰ−１）を含むＤＮＡ−結合タンパク質の活性を調節し、核内還元分子であるレドックスファクター１（Ｒｅｆ−１）　と相互作用する（Ｈｉｒｏｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）。ＡＰ−１及びＲｅｆ−１は分化に関与することが報告された（Ｓｈｅｎｇ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，　１９９０）　（Ｃｈｉａｒｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）。最近、本発明者は、ＴＲＸ及びＲｅｆ−１が転写因子とコアクチベータ間の相互作用を調節すること（Ｅｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）、及びＣＲＥＢの活性化がＴＲＸにより調節されることを報告した（Ｈｉｒｏｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）。従って、ＴＲＸはＣＲＥＢのＤＮＡ又はコアクチベータとの相互作用を増大させ、ＮＧＦシグナリングを促進するかもしれない。さらなる研究は、ＮＧＦシグナリング経路におけるＴＲＸの関連メカニズムに必要である。
【００２９】
ＮＧＦは、軸索再生を促進することが示された（Ｈｏｌｌｏｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９０）。Ｅｎｄｏｈらはコリン作動性ニューロンについてのＴＲＸの神経栄養活性を報告した　（Ｅｎｄｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３）。本結果は、この知見を確認及び発展させ、ＴＲＸがニューロンの分化及び再生についてのＮＧＦの効果を増強する神経栄養性コファクターであることを示唆する
ＮＧＦはまた、ニューロン生存因子としても働く。ＮＧＦは軸索切断した中隔ニューロンの死を予防することが示された（Ｐａｌｌａｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８６）。ＮＧＦがなくなるとＰＣ１２細胞のアポトーシスを生じ、これはｐ３８　ＭＡＰＫ及びアポトーシスシグナリングキナーゼ１　（ＡＳＫ１）により媒介される　（Ｘｉａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５；　Ｋｕｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７；Ｋａｎａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）。ＴＲＸはＡＳＫ１及びｐ３８　ＭＡＰＫの内因性阻害剤として働くことが報告され（Ｓａｉｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８；　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）、ＮＧＦの消失はまたＰＣ　１２　細胞におけるＴＲＸ発現のダウンレギュレーションを生じる（Ｂａｉ，　ｅｔ　ａｌ．　ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ）。これらの結果は、ＮＧＦによるＴＲＸレベルの維持はニューロン死を予防する役割を果たすことを実証する。ＴＲＸの神経損傷に対する保護的役割が示された。ＴＲＸは虚血後の星状膠細胞で誘導される（Ｔｏｍｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）。トランスジェニックマウスにおけるＴＲＸの過剰発現は、病巣の脳虚血障害（Ｔａｋａｇｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）及び興奮毒性海馬損傷（Ｔａｋａｇｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）を軽減する。アルツハイマー病患者の脳におけるＴＲＸの減少した発現が報告されている（Ｌｏｖｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）。ＮＧＦ投与は、アルツハイマー病患者のコリン作動性ニューロンを維持するために提案された（Ｓｅｒｒａｎｏ　Ｓａｎｃｈｅｚ　ｅｔ　ａｌ．，　２００１）。これらの結果及び本発明の結果を総合すると、ＴＲＸの投与が神経変性疾患のような神経疾患におけるＮＧＦの効果を増強し得ることを示す。神経変性疾患に対するＴＲＸの治療的可能性を明らかにするためのさらなる研究が進行中である。
実施例２（網膜視細胞についてのデータ）
動物
４週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅ　（ａｌｂｉｎｏ）　を日本ＳＬＣ　（静岡，日本），から入手し、実験前の２〜５日間本発明者のコロニールームで飼育した。日本ＳＬＣと本発明者の実験室における光強度は３００　ｌｕｘであり、実験室のケージ内の光強度は２０−４０　ｌｕｘであった。すべてのマウスを１２時間　（８：００　Ａ．Ｍ．から８：００　Ｐ．Ｍ．）　の明／暗サイクルにおいて、日本ＳＬＣ及び本発明者のコロニールームで維持した。
光照射
４週齢のマウスを実験前２４時間暗所に置いた。瞳孔を１％　塩酸シクロペントレート点眼剤（参天製薬）で拡張した。麻酔していないマウスを８，０００　ｌｕｘの発散する冷白色蛍光（松下電器産業）　に２時間反射インテリア（ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅ　ｉｎｔｅｒｉｏｒ）を備えたケージ中でさらした。すべての光照射は午前１０時に開始した。光照射中の温度は２５±１．５℃に維持した。照射中、両目が．同程度に照射を受けるように特別の配慮をした。
網膜組織切片の調製
ペントバルビタールによる腹腔内注射により深い麻酔を誘導後、マウスをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）　（ｐＨ，　７．４）を用いて左心室を灌流して　固定前に血液を洗い流した。次いで、ＰＢＳ中０．２５％グルタルアルデヒドを含む新たに調製した４％パラホルムアルデヒドで灌流した。次いで、目を取り除いた。すべての組織を既述のものと同じ固定剤で１２時間４℃でパラフィン中に埋入して固定し、視神経円板を含む全網膜を有する１μｍの矢状切片に切断した。７−０　絹縫合糸を目の側頭側のランドマークとしておいた。組織切片をスライドガラス上に集め、３０分間キシレン及び分量を変えた一連のアルコールで処理し、切片のパラフィンを除去した。
形態計測
視神経円板を含む網膜パラフィン切片（１　μｍ）をヘマトキシリン−エオジン（Ｈ−Ｅ）で染色し、各切片の４つの位置のデジタル化カラー画像をＰＤＭＣ　ｌｅ　デジタル画像システム（オリンパス）を用いて得た。２つの画像を視神経円板上部１００　〜８００　μｍの上部網膜から、及び２つを視神経円板下部１００　〜８００　μｍの下部網膜から得た。各画像のヘマトキシリン陽性の光受容体細胞核の数をカウントし、ワン−ウェイ（ｏｎｅ−ｗａｙ）　ＡＮＯＶＡ　、次いでＢｏｎｆｆｅｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ　ｐｏｓｔ　ｈｏｃテストにより比較した。
【００３０】
ＴｄＴ−介在ｄＵＴＰ　ニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）
ＴＵＮＥＬを、ｉｎ　ｓｉｔｕアポトーシス検出キット（宝酒造）を用い、１−μｍパラフィン切片上で行った。３’，３’−ジアミノベンゼン（Ｄａｋｏ，　Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，　ＣＡ）を発色剤として使用した。ＴＵＮＥＬ−陽性核の数を上記のヘマトキシリン陽性細胞カウントについて使用されたのと同様な方法によりカウントした。
抗体
ウサギ　抗マウスＴＲＸ　抗体（ポリクローナル）を既報のように調製した１９。
マウス及びヒトＴＲＸの免疫組織化学
マウスＴＲＸの免疫組織化学分析のために、本発明者はイムノペルオキシダーゼ法１９を使用した。簡潔に述べると、内因性ペルオキシダーゼ活性を０．６％　Ｈ２Ｏ２で不活性化した。一次抗体又はコントロール正常ウサギ血清を加え、４℃で終夜インキュベートした。ビオチン化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（Ｂｉｏｍｅｄａ，　ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，　ＣＡ）を二次抗体として使用した。アビジン−ビオチン増幅（Ｂｉｏｍｅｄａ）を行い、次いで基質である０．１％　３’，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ　（Ｄａｋｏ）でインキュベートした。
マウスＴＲＸのウェスタンブロット
網膜サンプル調製法及びウェスタンブロット法は、既報のように行った１５。簡潔に述べると、ペントバルビタールの腹腔内注射により深い麻酔に誘導後、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）　（ｐＨ，　７．４）を用いてマウスの左心室を灌流して　固定前に血液を洗い流し、次いで目を除去した。角膜及びレンズを目から取り除き、網膜の内層（網膜神経（ｎｅｕｒａｌ　ｒｅｔｉｎａ））を顕微鏡下にアイカップから分離した。氷冷ＰＢＳでの灌流後の目において、光受容体細胞層と網膜色素上皮細胞層の間の接着は弱くなり、それらは容易に分離された。網膜神経（ｎｅｕｒａｌ　ｒｅｔｉｎａ）除去後のアイカップは、網膜色素上皮細胞フラクションとして分析した。従って、このフラクションは脈絡膜及び強膜を含んでいた。等量の網膜タンパク質（５　μｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ／ｌａｎｅ）を１２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、次いで電気泳動的にポリビニリデンジフルオライド　（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，　Ｂｅｄｆｏｒｄ，　ＭＡ）に移した。ブロッキング後、膜を最初の抗体とインキュベートし、次いでペルオキシダーゼ連結第二抗体とインキュベートした。化学ルミネセンスをＥＣＬウェスタンブロット検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，　Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，　ＵＫ）で検出した。
組換えチオレドキシン（ｒＴＲＸ）　の硝子体内注入
５μｇのｒＴＲＸまたはミュータントｒＴＲＸ　（ＴＲＸＣ３２Ｓ／Ｃ３５Ｓ）２０又は３　μｌの０．９％ＮａＣｌを光照射の２時間前に硝子体内注入した。ｒＴＲＸを１０−μｌ　マイクロインジェクションシリンジを備えた３０−Ｇ　微細使い捨て針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，　Ｒｅｎｏ，　ＮＶ）を用いて右目の側頭縁から硝子体内注入した。
チロシンリン酸化タンパク質の検出
チロシンリン酸化タンパク質はＥＣＬ　チロシンリン酸化検出システム（ＲＰＮ　２２２０／１，　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて検出した。製造業者の推奨に従い、網膜神経（ｎｅｕｒａｌ　ｒｅｔｉｎａ）のタンパク質サンプルを調製し、１２％　ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０　μｇ　タンパク質／レーン）上で電気泳動し、次いで電気泳動的にＰＶＤＦ膜に移した。ブロッキング後、膜をペルオキシダーゼ連結抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ−２０，　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）　とインキュベートし、次いで化学ルミネセンスをＥＣＬウェスタンブロット検出キットで検出した。
酸化タンパク質の検出
酸化タンパク質は、酸化タンパク質検出キット（ＯｘｙＢｌｏｔ，　Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，　Ｐｕｒｃｈａｓｅ，　ＮＹ）を用いて既報のように検出した１７。ＯｘｙＢｌｏｔはカルボニル基の感受性免疫検出試薬を提供する。製造業者のプロトコールに従い、網膜神経の２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）−ヒドラゾン誘導体化タンパク質サンプルを調製し、１２％　ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（５　μｇ　タンパク質／レーン）で分離し、次いでＰＶＤＦ膜に移した。ブロッキング後、膜をタンパク質のＤＮＰ部分に特異的な一次抗体とインキュベートした。タンパク質バンドをマウスＴＲＸに関するウェスタンブロットと同じ方法で検出した。
ＤＮＡ　ラダー
ヌクレオソーム間ＤＮＡ切断をＱｕｉｃｋ　Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＭＢＬ，　名古屋，日本）を用いて検出した。製造業者のプロトコールに従い、網膜ＤＮＡを抽出し、１％　アガロースゲルにロードして電気泳動した。ゲルをエチジウムブロミドで染色し、ＤＮＡバンドを紫外線トランスルミネーターで可視化した。
統計的分析
全ての統計的分析は、ＳｔａｔＶｉｅｗ　ソフトウェア、　バージョン５．０　（ＳＡＳ，　Ｃａｒｙ，　ＮＣ）．を用いるマッキントッシュのパーソナルコンピュータ上で行った。
結果
網膜における内因性ＴＲＸの発現
網膜損傷の重篤度を決定するために、網膜切片中のトータル及びＴＵＮＥＬ−陽性　光受容体核（図７）を光照射の前、直後、光照射後１２，　２４，　４８及び９６時間でカウントした。光照射されていないマウスの光受容体細胞数と比較して（平均±　ＳＤ；　２４８．５　±　１１．４　細胞／　１００μｍ）、該数は光照射の２４時間後（１８２．０　±　１０．７，　Ｐ　＜０．０５）及びその後（１７８．３　±　１８．３　細胞／　１００μｍ，　Ｐ　＜　０．０１　及び　５０．０　±　９．８　細胞／　１００μｍ，　Ｐ　＜　０．０１　、各々４８時間及び９６時間）に有意に減少した。ＴＵＮＥＬ−陽性核は光照射の１２時間後に観察され（平均±ＳＤ；　８．７　±　２．２　％）、そして光照射の９６時間後まで維持された　（４４．２　±　６．９　％，　３４．５　±　２．４　％，　及び３８．０　±　１１．７％　各々２４，　４８，　及び９６　時間において）。．
ＴＲＸは様々な酸化ストレスに応答してアップレギュレーションされるので、本発明者は免疫組織化学（図８Ａ）及びウェスタンブロット（図８Ｂ、Ｃ）による光酸化ストレスに網膜が応答する間のＴＲＸ発現を分析した。光照射の直後、ＴＲＸの核標識が網膜後極の核内層及び核外層において観察された；　標識は虹彩直後の網膜周辺においては有意ではない。核内層中のＴＲＸ標識は光照射の２４時間後及びそれ以降に消失した。一方、核外層の標識は９６時間まで維持された。光照射の２４時間後、強力なＴＲＸ標識が後極の網膜色素上皮（ＲＰＥ）で観察され、それは光照射後９６時間まで維持された。標識は分析された時間経過を通じ、周辺網膜のＲＰＥにおいて有意ではなかった。ＴＲＸのウェスタンブロットの結果は、ＴＲＸのアップレギュレーションが網膜神経及びＲＰＥフラクションにおいて光照射の１２時間後及び２４時間後で示された（図８Ｂ及びＣ）。光照射の１２時間後及び２４時間後で、光照射前の網膜神経及びＲＰＥフラクションの両方においてクマッシーブルー染色されたゲル中の顕著なバンドの変化はなかった（データは示さない）。
ｒＴＲＸ注射マウスの網膜サンプルにおける酸化及びチロシンリン酸化されたタンパク質の検出
本発明者は、ｒＴＲＸ，　ビヒクル又はミュータントｒＴＲＸ　を硝子体内のキャビティに光照射前に注入したマウスの光照射後の酸化ストレスを評価するために、タンパク質の酸化及びチロシンリン酸化を分析した。
【００３１】
ビヒクル又はミュータントｒＴＲＸマウスにおいて、網膜神経中の酸化されたタンパク質量は光照射直後に増大した（図９Ａ）。ビヒクル又はミュータントｒＴＲＸ処理マウスと比較して、酸化されたタンパク質の量は、ｒＴＲＸ−処理マウスで減少した。光を照射しないマウス由来の網膜標本では、チロシンリン酸化された２本の強い強度のバンド及び３本の弱いバンドが検出された（図９Ｂ）。光照射の直後、強い強度の２つのバンドのうちの１つが増強され、弱い強度の追加の１つのバンドがビヒクル又はミュータントｒＴＲＸ処理マウスで検出された。ビヒクル又はミュータントｒＴＲＸ処理マウスと比較して、これらのバンドの増強はｒＴＲＸ−処理マウスでより顕著ではなかった。
光酸化ストレスに対するｒＴＲＸの細胞保護効果
本発明者は、次いで網膜損傷に対するｒＴＲＸ投与の効果を調べた。ｒＴＲＸ，　ビヒクルまたはミュータントｒＴＲＸのいずれかを硝子体内のキャビティに光照射前に注入し、生存する光受容体細胞核をこれらの目の間で比較（図１０Ａ，Ｂ）。光照射の９６時間後、光受容体細胞核の数は．　ビヒクル（Ｐ＜０．００１）またはミュータント　ｒＴＲＸ−処理の目（Ｐ＜０．００１）よりもｒＴＲＸ−処理の目で有意に高かった。ヌクレオソーム間のＤＮＡラダーはｒＴＲＸ−，　ビヒクル−またはミュータントｒＴＲＸ−処理の目由来の網膜サンプルで評価した。光照射の３６時間後、ＤＮＡラダーはビヒクル−及びミュータントｒＴＲＸ−処理マウス由来の網膜神経サンプルでは検出されたが、ｒＴＲＸ−処理マウス由来の網膜神経サンプルでは検出されなかった（データは示さない）。
【００３２】
光照射の９６時間後、ＤＮＡラダーはビヒクル及びミュータント　ｒＴＲＸ−処理マウス由来の網膜神経サンプルで検出された。これに対し、ｒＴＲＸ−処理マウス由来の網膜神経サンプルでは減少した（図１０Ｃ）。
考察
光照射は光受容体核の有意な損失の原因となる（図７）。ＴＵＮＥＬ−陽性光受容体細胞核（図７）及びＤＮＡラダー形成（図１０Ｃ）は光照射後の網膜で観察されるので、本発明者の現在のデータはアポトーシスが光受容体細胞の細胞死の主要な経路であり、このことは以前の文献１０と一致する。免疫組織化学法によると、ＴＲＸは網膜神経及びＲＰＥの両方において、光照射後にアップレギュレートされ、虹彩のごく近傍の網膜周辺（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｒｅｔｉｎａ）ではアップレギュレートされなかった（図８Ａ）。ウェスタンブロッティングにおいて、ＴＲＸは網膜神経及びＲＰＥフラクションの両方においてアップレギュレートされた（図８Ｂ及び８Ｃ）。これらを合わせると、本発明の結果はＴＲＸが光誘導性の内因性分子であり、ＴＲＸ　が光による網膜神経の再生において重要な役割を果たしていることを示す。タンパク質酸化はフリーラジカル産生により生じ、ｓｒｃファミリーキナーゼ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ及びマイトージェン活性化蛋白質キナーゼを含むチロシンキナーゼが酸化ストレスにより活性化される１２，２２，２３。本研究は、酸化及びチロシンリン酸化タンパク質の両方の光照射後の網膜神経における増強がｒＴＲＸ−処理マウスで減少するが，ミュータント　ｒＴＲＸ−処理マウスでは減少せず（図９Ａ，Ｂ），このことはｒＴＲＸの硝子体内投与が網膜における光酸化ストレスによる網膜神経の損傷を減少し、その保存された活性部位におけるシステイン残基が光酸化ストレスの減少に重要な役割を担うことを示唆する。
【００３３】
ビヒクル処理されたマウスと比較すると、光受容体細胞核及びＤＮＡラダー形成の減少は、ｒＴＲＸ−処理マウスにおいて有意に除外され、一方、その効果はミュータントＴＲＸ−処理マウスで消失した（図１０）。この結果は、ＴＲＸが網膜光障害において抗アポトーシス効果を有し、その保存活性部位におけるシステイン残基がこの細胞保護に重要な役割を担うことを示唆する。以前の研究は、外因性ｒＴＲＸの虚血／再灌流障害の肺１６、網膜１８及び血管内皮障害２４に対する細胞保護効果を示唆する。外因性ｒＴＲＸが網膜光受容体のダメージを改善するメカニズムは知られていない細胞外空間及び細胞膜における光酸化により誘導される活性酸素種はＴＲＸ依存性ペルオキシダーゼ２５又は一重項酸素又はヒドロキシラジカルに対するＴＲＸの直接消去作用２６により減少される可能性がある。他の可能性は外因性ＴＲＸが細胞膜に結合し、細胞内空間に取り込まれることである。
【００３４】
以前に、アスコルビン酸２７、ジメチルチオウレア２８，２９及びＷＲ−７７９１３８の様な抗酸化剤に対する細胞保護効果が示された。本発明の結果は、網膜光障害に対する抗酸化剤の役割をさらに強調するものである。さらに、チオレドキシンはレドックスレギュレーター、転写因子の調節機能及びストレスシグナリングキナーゼとしての作用を発揮し得１２，１３、これらの作用メカニズムは網膜光ストレスに対するチオレドキシンの細胞保護効果に重要であるかもしれない。
【００３５】
過剰な光はヒトの加齢に関係する黄斑変性及びおそらく網膜色素変性のいくつかの形態１，２の進行及び重篤度を増強し得る。眼科のプラクティスにおいて使用される顕微鏡の操作に由来する広いスペクトル光のハザードは光黄斑症の原因となり得る３，４。本発明は外因性ＴＲＸ投与により網膜光障害保護の可能性を実証した。さらに本発明は、内因性ＴＲＸの誘導が網膜光障害に対する増大した耐性と関連することを示唆する。本発明者は、プロスタグランジンＥ１３０，３１及びゲラニルゲラニルアセトン３２が細胞又は組織において効果的に内因性ＴＲＸを誘導することを示した。これらのＴＲＸ誘導剤を用いたＴＲＸ増強は、ヒトの光酸化ストレス関連網膜疾患の保護のための有用な治療的戦略になり得る
実施例２に関するＲｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
１．　　　　　Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋｓ　ＫＪ，　Ｋｌｅｉｎ　Ｒ，　Ｋｌｅｉｎ　ＢＥ．　Ｓｕｎｌｉｇｈｔ　ａｎｄ　ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｍａｃｕｌａｒ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．　Ｔｈｅ　Ｂｅａｖｅｒ　Ｄａｍ　Ｅｙｅ　Ｓｔｕｄｙ．　Ａｒｃｈ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．　１９９３；１１１（４）：５１４−５１８．
２．　　　　　Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ　ＡＶ，　Ｈｏｏｄ　ＤＣ，　Ｈｕａｎｇ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｉｓｅａｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｆｒｏｍ　ｍｕｔａｎｔ　ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ　ａｌｌｅｌｅ　ｔｏ　ｒｏｄ　ａｎｄ　ｃｏｎｅ　ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｎ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　１９９８；９５（１２）：７１０３−７１０８．
３．　　　　　Ｂｙｒｎｅｓ　ＧＡ，　Ｃｈａｎｇ　Ｂ，　Ｌｏｏｓｅ　Ｉ，　Ｍｉｌｌｅｒ　ＳＡ，　Ｂｅｎｓｏｎ　ＷＥ．　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐｈｏｔｉｃ　ｍａｃｕｌｏｐａｔｈｙ　ａｆｔｅｒ　ｃａｔａｒａｃｔ　ｓｕｒｇｅｒｙ．　Ａｍ　Ｊ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．　１９９５；１１９（２）：２３１−２３２．
４．　　　　　Ｍｉｎｃｋｌｅｒ　Ｄ．　Ｒｅｔｉｎａｌ　ｌｉｇｈｔ　ｄａｍａｇｅ　ａｎｄ　ｅｙｅ　ｓｕｒｇｅｒｙ．　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．　１９９５；１０２（１２）：１７４１−２．
５．　　　　　Ｗｉｅｇａｎｄ　ＲＤ，　Ｇｉｕｓｔｏ　ＮＭ，　Ｒａｐｐ　ＬＭ，　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＲＥ．　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｒｏｄ　ｏｕｔｅｒ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｔｒｅｔｉｎａ．　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．　１９８３；２４（１０）：１４３３−１４３５．
６．　　　　　Ｐｅｎｎ　ＪＳ，　Ｎａａｓｈ　ＭＩ，　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＲＥ．　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｌｉｇｈｔ　ｈｉｓｔｏｒｙ　ｏｎ　ｒｅｔｉｎａｌ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ　ａｎｄ　ｌｉｇｈｔ　ｄａｍａｇｅ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ．　Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．　１９８７；４４（６）：７７９−７８８．
７．　　　　　Ｏｒｇａｎｉｓｃｉａｋ　ＤＴ，　Ｗａｎｇ　ＨＭ，　Ｘｉｅ　Ａ，　Ｒｅｅｖｅｓ　ＤＳ，　Ｄｏｎｏｓｏ　ＬＡ．　Ｉｎｔｅｎｓｅ−ｌｉｇｈｔ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｒａｔ　ｒｏｄ　ｏｕｔｅｒ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｌｉｐｉｄｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ｐｒｏｇ　Ｃｌｉｎ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｓ．　１９８９；３１４：４９３−５１２．
８．　　　　　Ｒｅｍｅ　ＣＥ，　Ｂｒａｓｃｈｌｅｒ　ＵＦ，　Ｒｏｂｅｒｔｓ　Ｊ，　Ｄｉｌｌｏｎ　Ｊ．　Ｌｉｇｈｔ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｒｅｔｉｎａ：　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａ　ｒａｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔ　（ＷＲ−７７９１３）　ｏｎ　ａｃｕｔｅ　ｒｏｄ　ｏｕｔｅｒ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｄｉｓｋ　ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ．　Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．　１９９１；５４（１）：１３７−１４２．
９．　　　　　Ｄｅ　Ｌａ　Ｐａｚ　ＭＡ，　Ｚｈａｎｇ　Ｊ，　Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ　Ｉ．　Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｔｉｎａ：　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｇｅ　ｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｍａｃｕｌａ　ａｎｄ　ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ．　Ｃｕｒｒ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．　１９９６；１５（３）：２７３−２７８．
１０．　　　　Ｈａｆｅｚｉ　Ｆ，　Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ　ＪＰ，　Ｍａｒｔｉ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　ａｂｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｃ−ｆｏｓ　ｐｒｅｖｅｎｔｓ　ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　ｏｆ　ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｉｎ　ｒｅｔｉｎａｌ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ．　Ｎａｔ　Ｍｅｄ．　１９９７；３（３）：３４６−３４９．
１１．　　　　Ｈｏｌｍｇｒｅｎ　Ａ．　Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ．　Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９８５；５４：２３７−２７１．
１２．　　　　Ｓａｉｔｏｈ　Ｍ，　Ｎｉｓｈｉｔｏｈ　Ｈ，　Ｆｕｊｉｉ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｉｓ　ａ　ｄｉｒｅｃｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｓｉｇｎａｌ−　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ　（ＡＳＫ）　１．　Ｅｍｂｏ　Ｊ．
１９９８；１７（９）：２５９６−２６０６．
１３．　　　　Ｈｉｒｏｔａ　Ｋ，　Ｍｕｒａｔａ　Ｍ，　Ｓａｃｈｉ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｒｏｌｅｓ　ｏｆ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｉｎ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍ　ａｎｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｕｓ．　Ａ　ｔｗｏ−ｓｔｅｐ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｒｅｄｏｘ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＮＦ−　ｋａｐｐａＢ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　１９９９；２７４（３９）：２７８９１−２７８９７．
１４．　　　　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｈ，　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｋ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ．　Ｒｅｄｏｘ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．　Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１９９７；１５：３５１−３６９．
１５．　　　　Ｏｈｉｒａ　Ａ，　Ｈｏｎｄａ　Ｏ，　Ｇａｕｎｔｔ　ＣＤ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｄｕｌｔ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆａｃｔｏｒ／ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｒｅｔｉｎａ．　Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ．　１９９４；７０（２）：２７９−２８５．
１６．　　　　Ｏｋｕｂｏ　Ｋ，　Ｋｏｓａｋａ　Ｓ，　Ｉｓｏｗａ　Ｎ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔ　ｌｕｎｇ．　Ｊ　Ｔｈｏｒａｃ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｓｕｒｇ．　１９９７；１１３（１）：１−９．
１７．　　　　Ｔａｋａｇｉ　Ｙ，　Ｍｉｔｓｕｉ　Ａ，　Ｎｉｓｈｉｙａｍａ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ　ｆｏｃａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｂｒａｉｎ　ｄａｍａｇｅ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　１９９９；９６（７）：４１３１−４１３６．
１８．　　　　Ｓｈｉｂｕｋｉ　Ｈ，　Ｋａｔａｉ　Ｎ，　Ｋｕｒｏｉｗａ　Ｓ，　Ｋｕｒｏｋａｗａ　Ｔ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ，　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ　Ｎ．　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｄｕｌｔ　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｎ　ｒｅｔｉｎａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ．　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ．　１９９８；３９（８）：１４７０−１４７７．
１９．　　　　Ｔａｋａｇｉ　Ｙ，　Ｇｏｎ　Ｙ，　Ｔｏｄａｋａ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｉｓ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｉｎ　ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ　ｐｌａｑｕｅｓ　ａｎｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｎｅｏｉｎｔｉｍａ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔ　ａｒｔｅｒｉｅｓ．　Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ．　１９９８；７８（８）：９５７−９６６．
２０．　　　　Ｈｉｒｏｔａ　Ｋ，　Ｍａｔｓｕｉ　Ｍ，　Ｉｗａｔａ　Ｓ，　Ｎｉｓｈｉｙａｍａ　Ａ，　Ｍｏｒｉ　Ｋ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ．　ＡＰ−１　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ａ　ｄｉｒｅｃｔ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ａｎｄ　Ｒｅｆ−１．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　１９９７；９４（８）：３６３３−３６３８．
２１．　　　　Ｏｌｉｖｅｒ　ＣＮ，　Ｓｔａｒｋｅ−Ｒｅｅｄ　ＰＥ，　Ｓｔａｄｔｍａｎ　ＥＲ，　Ｌｉｕ　ＧＪ，　Ｃａｒｎｅｙ　ＪＭ，　Ｆｌｏｙｄ　ＲＡ．　Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｄａｍａｇｅ　ｔｏ　ｂｒａｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，　ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，　ａｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｒｅｅ　ｒａｄｉｃａｌｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ−　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎｊｕｒｙ　ｔｏ　ｇｅｒｂｉｌ　ｂｒａｉｎ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　１９９０；８７（１３）：５１４４−５１４７．
２２．　　　　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｋ，　Ｈｏｒｉ　Ｔ，　Ｓａｔｏ　Ｎ，　Ｓｕｇｉｅ　Ｋ，　Ｋａｗａｋａｍｉ　Ｔ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ．　Ｒｅｄｏｘ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｒｃ　ｆａｍｉｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｐ５６ｌｃｋ　ｉｎ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．　１９９３；８（１１）：３１３３−３１３９．
２３．　　　　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｋ，　Ｈｏｒｉ　Ｔ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ．　Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｐ５６ｌｃｋ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ　３−ｋｉｎａｓｅ　ｉｎ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ　ｏｘｉｄａｔｉｏｎ：　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｂｅｒｒａｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．　Ｍｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１９９６；３３（１０）：８５５−８６５．
２４．　　　　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｈ，　Ｍａｔｓｕｄａ　Ｍ，　Ｆｕｒｕｋｅ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａｄｕｌｔ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆａｃｔｏｒ／ｈｕｍａｎ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｆ−２　ｃｅｌｌ　ｉｎｊｕｒｙ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ　ｏｒ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ　［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｅｒｒａｔｕｍ　ａｐｐｅａｒｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｌｅｔｔ　１９９４　Ｏｃｔ；４２（３）：２１３］．　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｌｅｔｔ．　１９９４；４２（１−２）：７５−８０．
２５．　　　　Ｃｈａｅ　ＨＺ，　Ｃｈｕｎｇ　ＳＪ，　Ｒｈｅｅ　ＳＧ．　Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｙｅａｓｔ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　１９９４；２６９（４４）：２７６７０−２７６７８．
２６．　　　　　Ｄａｓ　ＫＣ，　Ｄａｓ　ＣＫ．　Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ，　ａ　ｓｉｎｇｌｅｔ　ｏｘｙｇｅｎｑｕｅｎｃｈｅｒ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｒｅｄｉｃａｌ　ｓｃａｖｅｎｇｅｒ：　ｒｅｄｏｘ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；　２７７（２）：　４４３−４４７．
２７．　　　　　Ｏｒｇａｎｉｓｃｉａｋ　ＤＴ，　Ｗａｎｇ　ＨＭ，　Ｌｉ　ＺＹ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｓｃｏｒｂａｔｅ　ｉｎ　ｒｅｔｉｎａｌ　ｌｉｇｈｔ　ｄａｍａｇｅ　ｏｆ　ｒａｔｓ．　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ　１９８５；２６（１１）：　１５８０−１５８８．
２８．　　　　　Ｌａｍ　Ｓ，　Ｔｓｏ　ＭＯ，　Ｇｕｒｎｅ　ＤＨ．　Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｔｉｎａｌ　ｐｈｏｔｉｃ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ａｌｂｉｎｏ　ｒａｔｓ　ｂｙ　ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｕｒｅａ．　Ａｒｃｈ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　１９９０；　１０８（１２）：　１７５１−１７５７．
２９．　　　　　Ｏｒｇａｎｉｓｃｉａｋ　ＤＴ，　Ｄａｒｒｏｗ　ＲＭ，　Ｊｉａｎｇ　ＹＩ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｕｒｅａ　ａｇａｉｎｓｔ　ｒｅｔｉｎａｌ　ｌｉｇｈｔ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎ　ｒａｔｓ．　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ　１９９２；　３３（５）：　１５９９−１６０９．
３０．　　　　Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｍ，　Ｏｈｉｒａ　Ａ，　Ｈｏｎｄａ　Ｏ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｕｌｔ　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｒａｔ　ｒｅｔｉｎａ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ＯＰ−１２０６　ａｌｐｈａ−ＣＤ，　ａ　ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ１　ａｎａｌｏｇｕｅ．　Ｊ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．　１９９７；４５（１）：６３−７０．
３１．　　　　Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｍ，　Ｓａｔｏ　Ｎ，　Ｔａｊｉｍａ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｔｉｎａｌ　ｐｉｇｍｅｎｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐａｔｈｗａｙ；　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ１．　Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．　１９９７；６５（５）：６４５−６５２．
３２．　　　　Ｈｉｒｏｔａ　Ｋ，　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｈ，　Ａｒａｉ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌａｃｅｔｏｎｅ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ａｎｄ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ　ｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．　２０００；２７５（３）：８２５−８３０．
実施例３
ＰＣ１２細胞を１０％ウシ血清（ＨＳ）及び５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中でインキュベートした。細胞を５％ＣＯ２下の湿潤雰囲気で３７℃でインキュベートした。０，０．３，１ｍＭ　ＭＰＰ＋（１−メチル−４−フェニルピリジニウムイオン）とともに３時間インキュベーション後、ＰＣ１２細胞を回収し、細胞ライゼートを調製した。ＴＲＸ発現をＰＣ１２細胞中ウェスタンブロットにより検出した。簡潔に述べると、細胞ライゼートは９５℃で５分間維持し、次に１２％ドデシル硫酸アクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動し（５μｇ／レーン）、次にトランスファーメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，　Ｂｅｄｆｏｒｄ，　ＭＡ）に移した。０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中５％スキムミルクでブロッキング後、該メンブランを１時間、ラットＴＲＸと交叉反応する抗マウスＴＲＸ抗体（Ｙ．Ｔａｋａｇｉ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ　Ｆｌｏｗ　Ｍｅｔａｂ．　１８（１９９８）　ｐｐ．２０６−２１４）とインキュベートした。次いで、該メンブランをペルオキシダーゼ−複合化抗ウサギイムノグロブリン抗体とインキュベートした。結合したペルオキシダーゼを製造業者の仕様書に従い化学発光（ＥＣＬＴＭ（ＲＰＮ２１０６，　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）ウェスタンブロット検出キット）で促進した。各サンプルにおけるＴＲＸ量をコンピュータ化されたデンシトメータ、ＮＩＨイメージを用いて各バンドの密度を分析することにより評価した。ＭＰＰ＋処理条件下、ＴＲＸ発現はＰＣ１２細胞で減少した（図１１）。類似の実験を３回行った。
【００３６】
次に、本発明者は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイによりＰＣ１２細胞の生存度に関するＭＰＰ＋の効果を詳細に検討した。損傷細胞から放出されたＬＤＨは細胞培養物のアリコートで測定された。残存する細胞性ＬＤＨをＰＢＳ中０．２％Ｔｗｅｅｎ２０で細胞を溶解することにより得た。細胞培養物又は細胞ライゼートの５０μｌサンプル中のＬＤＨは、製造業者の方法に従いＬＤＨアッセイキット（ｋｙｏｋｕｔｏ，　Ｔｏｋｙｏ）を用いて測定した。細胞溶解パーセントを（培地中のＬＤＨ／ウェル当たりの総ＬＤＨ）のＬＤＨ比として測定した。ここで、総ＬＤＨは培地＋細胞ライゼートのＬＤＨを指す。ＭＰＰ＋とともに培養すると、細胞生存度は用量依存的に減少した（図１２）。類似の実験を３回繰り返した。
【００３７】
ＴＲＸの過剰発現がＭＰＰ＋誘発損傷からのＰＣ１２細胞を保護するかどうかを測定するために、ＰＣ１２細胞（１×１０７／ｍｌ）１０％ＨＳ及び５％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地で終夜培養した。細胞を組織ディッシュから機械的に脱着させ、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、次いで細胞を１０μｇのｐＢＩ−ＥＧＦＰ−ｗｔＴＲＸと混合した。ｐＢＩ−ＥＧＦＰ−ｗｔＴＲＸは、ｐＢＩ−ＥＧＦＰコントロールベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にＴＲＸ　ｃＤＮＡ断片（Ｙ．Ｔａｇａｙａ　ｅｔ　ａｌ．　ＥＭＢＯ　Ｊ．　８　（１９８９），　ｐｐ．７５７−７６４）を連結することにより構築した。その後、細胞を５分間氷上でインキュベートし、適当な単回電気パルスにさらした。一時的なＴＲＸ過剰発現及び組換えヒトＴＲＸの投与は、ＰＣ１２細胞がＭＰＰ＋と２４時間インキュベートしたときのＭＰＰ＋誘発損傷を抑制した（図１３Ａ、Ｂ）。
【００３８】
上記の結果は、ＴＲＸが神経細胞の保護効果を有し、それによりＭＰＰ＋の損傷誘発作用を抑制したことを示す。
実施例４
チオレドキシントランスジェニック（ｔｒｘ−ｔｇ）マウスは、β−アクチンプロモーターの制御下にヒトＴＲＸトランスジーンを保有し、脳を含む全身でヒトＴＲＸを発現するＣ５７ＢＬ／６マウス（野生型）である（Ｔａｋａｇｉ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９６（１９９９）　４１３１−４１３６）。本発明者は、ヒトＴＲＸがｔｒｘ−ｔｇの網膜全体で発現されていることを確認した（図１４Ａ、Ｂ）。網膜サンプルの調製法、免疫組織化学、及びウェスタンブロッティングは、既述のように行った（ＴａｋａｇｉＹ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９６（１９９９）　４１３１−４１３６；　Ｏｈｉｒａ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｂ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　７０　（１９９４）　２７９−２８５）。従って、本発明者は、ｔｒｘ−ｔｇマウスが強い光で誘発される網膜損傷により抵抗性であるかについて評価した。本研究の全ての方法は、Ｕｓｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌｓ　ｉｎ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ　ａｎｄ　Ｖｉｓｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈに関するＡＲＶＯステートメントに従った。
【００３９】
第１に、本発明者は、抗マウスＴＲＸ抗体を用いたウェスタンブロッティングによりｔｒｘ−ｔｇ及び野生型マウスの網膜への光曝露の前後における内因性マウスＴＲＸを分析した（Ｔａｋａｇｉ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９６（１９９９）　４１３１−４１３６；　Ｏｈｉｒａ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｂ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　７０　（１９９４）　２７９−２８５）。光曝露前、３−４週齢の雄マウスを暗所で４８時間順応させ、その瞳孔を０．５％トロピカミド及び０．５％塩酸フェニレフリン点眼剤（参天製薬）を用いて拡張させた。麻酔していないマウスを、２時間反射型インテリアを備えたケージ中で８０００　ｌｕｘの拡散性の昼白色蛍光線（松下電器産業）に曝した（Ｗｅｎｚｅｌ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　２０　（２０００）　８１−８８）。照明中、眼が同レベルの光を受けるように注意した。光曝露前、ｔｒｘ−ｔｇマウスの網膜における内因性マウスＴＲＸの発現を野生型マウスのものと比較できた。光曝露の全２４時間後、内因性マウスＴＲＸの２倍のアップレギュレーションがｔｒｘ−ｔｇ及び野生型マウスの両方において観察され、そこでは両方のマウスにおいて顕著な相違はなかった（データは示さない）。ｔｒｘ−ｔｇマウスの各組織におけるヒトＴＲＸタンパク質の量は内因性マウスＴＲＸタンパク質より３−６倍大きいことが報告されている（Ｔａｋａｇｉ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９６（１９９９）　４１３１−４１３６）。さらに、β−アクチンプロモーターの活性は内因性マウスＴＲＸプロモーターの活性と比較して十分高いと考えられる。結果として、網膜における全ＴＲＸタンパク質の量は、光曝露の前後において野生型マウスよりもｔｒｘ−ｔｇマウスにおいて相当多いと考えられる。
【００４０】
次に、本発明者は、ｔｒｘ−ｔｇ及び野生型マウスの光曝露後の酸化ストレスを評価するためにタンパク質の酸化及びチロシンリン酸化を分析した。酸化されたタンパク質は、既述のように（Ｔａｋａｇｉ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９６（１９９９）　４１３１−４１３６）酸化タンパク質検出キット（ＯｘｙＢｌｏｔ，　Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，　Ｐｕｒｃｈａｓｅ，　ＮＹ）を用いて検出した。該キットはカルボニル基の敏感な免疫検出のための試薬を提供する。製造業者のプロトコールに従い、２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）ヒドラゾン誘導体化網膜タンパク質サンプルを調製し、１２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０μｇタンパク質／レーン）で分離し、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に移した。ブロッキング後、膜をタンパク質のＤＮＰ部分に特異的な１次抗体とインキュベートした。次いで、タンパク質バンドをヒトＴＲＸと同じウェスタンブロッティング法により検出した。チロシンリン酸化タンパク質をＥＣＬチロシンリン酸化検出システム（ＲＰＮ　２２２０／ｌ，　ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。製造業者の推奨に従い、網膜タンパク質サンプルを調製し、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（１０μｇタンパク質／レーン）で電気泳動し、次に電気泳動的にＰＶＤＦ膜に移した。ブロッキング後、膜をペルオキシダーゼ連結抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ−２０，　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とインキュベートし、化学発光をＥＣＬウェスタンブロット検出キットで検出した。野生型マウスにおいて、網膜神経における酸化蛋白量は光曝露前と比較して光曝露直後に増大した（図１５Ａ、レーン２）。野生型マウスと比較して、酸化蛋白量はｔｒｘ−ｔｇマウスで減少した（図１５Ａ、レーン４）。野生型マウスの網膜標本において、チロシンリン酸化タンパク質の３つの強いバンド（矢印）が光曝露前に検出された（図１５Ｂ、レーン１）。光曝露直後、これらのバンドは増強され、少なくとも２つの追加のバンド（矢頭）が検出された（図１５Ｂ、レーン２）。野生型マウスと比較して、これらのバンドの増大はｔｒｘ−ｔｇマウスではあまり顕著ではなかった（図１５Ｂ、レーン４）。タンパク質酸化はフリーラジカル産生の結果であり（Ｏｌｉｖｅｒ　Ｃ．Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８７（１９９０）　５１４４−５１４７）、ｓｒｃファミリーキナーゼ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ及びマイトジェン活性化蛋白質キナーゼを含むチロシンキナーゼが酸化ストレスにより活性化される（Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　３３（１９９６）　８５５−８６５；　Ｓａｉｔｏｈ，Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．，　１７（１９９８）　２５９６−２６０６）。従って、この結果は、ＴＲＸの過剰発現が網膜における光酸化ストレスを減少させることを示す。
【００４１】
強力な光は視細胞のＤＮＡ損傷を引き起こす（Ｏｒｇａｎｉｓｃｉａｋ　Ｄ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，　７０　（１９９９）　２６１−２６８）。光誘発ＤＮＡ損傷に対する過剰発現されたＴＲＸの細胞保護効果を評価するために、本発明者は、８−ヒドロキシ−２−デオキシグアノシンについての定量的免疫組織化学（８ＯｈｄＧ指数）を用いた。パラフィン処理網膜サンプルの調製法、アルカリホスファターゼ法を用いた８ＯｈｄＧのための免疫組織化学及び８ＯｈｄＧ免疫染色の定量法は、既知である（Ｏｈｉｒａ　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｂ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　７０（１９９４）　２７９−２８５；　Ｔｏｙｏｋｕｎｉ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｂ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　７６（１９９７）　３６５−３７４）。抗８ＯｈｄＧモノクローナル抗体をＮＯＦ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。８ＯｈｄＧ指数を計算するために、各マウスの２つの位置（上部及び下部網膜、視神経円板から約１００μｍ）でのデジタル化されたカラー画像をデジタルイメージングシステム（ＰＤＭＣ　ｌｅ，　オリンパス）を用いてＰＩＣＴファイルとして得、マッキントッシュパーソナルコンピュータ上のＮａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ｉｍａｇｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１．６１ソフトウェアを用いて分析した。光曝露前マウス系統間での視細胞の核（外顆粒層）における８ＯｈｄＧ指数の有意な差異はなかった（図１６Ｂ、−２ｈ）。光曝露の１２時間後及び２４時間後、８ＯｈｄＧ指数はｔｒｘ−ｔｇマウスよりも野生型マウスで有意に高かった（各々、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０１）（図１６Ｂ、１２ｈ及び２４ｈ）。野生型マウスにおいて、強い染色が光曝露２４時間後で維持された（図１６Ａ、左パネル）。一方、ｔｒｘ−ｔｇマウスの外顆粒層の染色は光曝露２４時間後に減少した（図１６Ａ、右パネル）。主要なＤＮＡ塩基改変産物である８ＯｈｄＧはヒドロキシラジカル、一重項酸素、または光動力作用のいずれかにより誘導され、酸化的ストレス誘発ＤＮＡ損傷の確立したマーカーである（Ｔｏｙｏｋｕｎｉ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｂ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　７６（１９９７）　３６５−３７４）。従って、この結果は、過剰発現したＴＲＸが光酸化ストレスにより生じる視細胞のＤＮＡ損傷を防止することを示す。
【００４２】
網膜電図記録法（ＥＲＧ）は、視細胞により生じる作用電位（ａ−波）及びＭｕｌｌｅｒグリア細胞と相互作用する内顆粒層の二次ニューロンにより生じる作用電位（ｂ−波）の記録である。従って、ａ−およびｂ−波の振幅はこれらの最初の２つの網膜ニューロンの機能的状態を反映する。網膜機能に関する過剰発現したＴＲＸでの効果をテストするために、本発明者は、両方のマウス系統間でａ−波及びｂ−波を比較した。フラッシュＥＲＧはＰＥ−３０００（Ｔｏｍｅｙ，　Ｎａｇｏｙａ）を用いて記録した。金のコンタクトレンズ電極（直径３ｍｍ、１．５−ｍｍベースカーブ、京都コンタクトレンズ）を左目上に置き、同一の参照電極を口内に、外側電極を左脚パッド上に置いた。光曝露前、ａ−波およびｂ−波の振幅はこれらの系統間で異ならなかった（図１７，−２ｈ）。光曝露後、ａ−波およびｂ−波の振幅は、６時間（各々、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０５）及び１２時間（各々、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０５）で、野生型マウスと比較してｔｒｘ−ｔｇマウスで有意に高かった（図１７，６ｈ及び１２ｈ）。従って、この結果は、過剰発現したＴＲＸが光損傷を受けた網膜神経を再生することを示す。
参考文献
Ａｈｎ　Ｓ，　Ｏｌｉｖｅ　Ｍ，　Ａｇｇａｒｗａｌ　Ｓ，　Ｋｒｙｌｏｖ　Ｄ，　Ｇｉｎｔｙ　ＤＤ，　Ｖｉｎｓｏｎ　Ｃ　（１９９８）　Ａ　ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ＣＲＥＢ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｔｈａｔ　ｉｔ　ｉｓ　ａ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｏｆ　ｓｔｉｍｕｌｕｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃ−ｆｏｓ．　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１８：９６７−９７７．
Ｂｏｕｓｓｉｆ　Ｏ，　Ｌｅｚｏｕａｌｃ’ｈ　Ｆ，　Ｚａｎｔａ　ＭＡ，　Ｍｅｒｇｎｙ　ＭＤ，　Ｓｃｈｅｒｍａｎ　Ｄ，　Ｄｅｍｅｎｅｉｘ　Ｂ，　Ｂｅｈｒ　ＪＰ　（１９９５）　Ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎｔｏ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ：　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　９２：７２９７−７３０１．
Ｃｈｅｎ　ＲＨ，　Ｓａｒｎｅｃｋｉ　Ｃ，　Ｂｌｅｎｉｓ　Ｊ　（１９９２）　Ｎｕｃｌｅａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆ　ｅｒｋ−　ａｎｄ　ｒｓｋ−ｅｎｃｏｄｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ．　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１２：９１５−９２７．
Ｃｈｉａｒｉｎｉ　ＬＢ，　Ｆｒｅｉｔａｓ　ＦＧ，　Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ　Ｈ，　Ｌｉｎｄｅｎ　Ｒ　（２０００）　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒｅｄｏｘ　ｆａｃｔｏｒ　／　ＡＰ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｒｅｆ−１　ｉｓ　ａｎ　ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｒｅｔｉｎａ．　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ　７：２７２−２８１．
Ｃｏｎｎｏｒ　Ｂ，　Ｄｒａｇｕｎｏｗ　Ｍ　（１９９８）　Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　Ｒｅｖ　２７：１−３９．
Ｅｍａ　Ｍ，　Ｈｉｒｏｔａ　Ｋ，　Ｍｉｍｕｒａ　Ｊ，　Ａｂｅ　Ｈ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ，　Ｓｏｇａｗａ　Ｋ，　Ｐｏｅｌｌｉｎｇｅｒ　Ｌ，　Ｆｕｊｉｉ−Ｋｕｒｉｙａｍａ　Ｙ　（１９９９）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｂｙ　ＨＬＦ　ａｎｄ　ＨＩＦ１ａｌｐｈａ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｈｙｐｏｘｉａ：　ｔｈｅｉｒ　ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｄｏｘ　ｓｉｇｎａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＣＢＰ／ｐ３００．　ＥＭＢＯ　Ｊ　１８：１９０５−１９１４．
Ｅｎｄｏｈ　Ｍ，　Ｋｕｎｉｓｈｉｔａ　Ｔ，　Ｔａｂｉｒａ　Ｔ　（１９９３）　Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｆｒｏｍ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ａｓ　ａ　ｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　１９２：７６０−７６５．
Ｇｉｎｔｙ　ＤＤ，　Ｂｏｎｎｉ　Ａ，　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ　ＭＥ　（１９９４）　Ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｅｓ　ａ　Ｒａｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｔｈａｔ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ　ｃ−ｆｏｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｖｉａｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＲＥＢ．　Ｃｅｌｌ　７７：７１３−７２５．
Ｇｒｅｅｎｅ　ＬＡ，　Ｔｉｓｃｈｌｅｒ　ＡＳ　（１９７６）　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｎｏｒａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ　ｃｌｏｎａｌ　ｌｉｎｅ　ｏｆ　ｒａｔ　ａｄｒｅｎａｌ　ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｗｈｉｃｈ　ｒｅｓｐｏｎｄ　ｔｏ　ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　７３：２４２４−２４２８．
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　Ｓ，　Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ　Ｋ，　Ｇｏｎ　Ｙ，　Ｆｕｒｕｉｃｈｉ　Ｓ，　Ｍａｒｕｏｋａ　Ｓ，　Ｔａｋｅｓｈｉｔａ　Ｉ，　Ｈｉｒｏｔａ　Ｋ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ，　Ｈｏｒｉｅ　Ｔ　（１９９９）　Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｐ３８　ＭＡＰ　ｋｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＩＬ−６　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　２５８：４４３−４４７．
Ｈｉｒｏｔａ　Ｋ，　Ｍａｔｓｕｉ　Ｍ，　Ｉｗａｔａ　Ｓ，　Ｎｉｓｈｉｙａｍａ　Ａ，　Ｍｏｒｉ　Ｋ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９７）　ＡＰ−１　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ａ　ｄｉｒｅｃｔ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ａｎｄ　Ｒｅｆ−１．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　９４：３６３３−３６３８．
Ｈｉｒｏｔａ　Ｋ，　Ｍａｔｓｕｉ　Ｍ，　Ｍｕｒａｔａ　Ｍ，　Ｔａｋａｓｈｉｍａ　Ｙ，　Ｃｈｅｎｇ　ＦＳ，　Ｉｔｏｈ　Ｔ，　Ｆｕｋｕｄａ　Ｋ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（２０００）　Ｎｕｃｌｅｏｒｅｄｏｘｉｎ，　ｇｌｕｔａｒｅｄｏｘｉｎ，　ａｎｄ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ＮＦ−ｋａｐｐａＢ，　ＡＰ−１，　ａｎｄ　ＣＲＥＢ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＨＥＫ２９３　ｃｅｌｌｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　２７４：１７７−１８２．
Ｈｏｌｌｏｗｅｌｌ　ＪＰ，　Ｖｉｌｌａｄｉｅｇｏ　Ａ，　Ｒｉｃｈ　ＫＭ　（１９９０）　Ｓｃｉａｔｉｃ　ｎｅｒｖｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｃｒｏｓｓ　ｇａｐｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｓｉｌｉｃｏｎｅ　ｃｈａｍｂｅｒｓ：　ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＮＧＦ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ
ａｘｏｎａｌ　ｂｒａｎｃｈｉｎｇ．　Ｅｘｐ　Ｎｅｕｒｏｌ　１１０：４５−５１．
Ｈｏｌｍｇｒｅｎ　Ａ　（１９８５）　Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ．　Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　５４：２３７−２７１．　Ｈｏｒｉ　Ｋ，　Ｋａｔａｙａｍａ　Ｍ，　Ｓａｔｏ　Ｎ，　Ｉｓｈｉｉ　Ｋ，　Ｗａｇａ　Ｓ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９４）　Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｇｌｉａｌｃｅｌｌｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｄｕｌｔ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆａｃｔｏｒ／ｈｕｍａｎ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　（ＡＤＦ／ＴＲＸ）．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　６５２：３０４−３１０．
Ｉｍｐｅｙ　Ｓ，　Ｏｂｒｉｅｔａｎ　Ｋ，　Ｗｏｎｇ　ＳＴ，　Ｐｏｓｅｒ　Ｓ，　Ｙａｎｏ　Ｓ，　Ｗａｙｍａｎ　Ｇ，　Ｄｅｌｏｕｌｍｅ　ＪＣ，　Ｃｈａｎ　Ｇ，　Ｓｔｏｒｍ　ＤＲ　（１９９８）　Ｃｒｏｓｓ　ｔａｌｋ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＥＲＫ　ａｎｄ　ＰＫＡ　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　Ｃａ２＋　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＲＥＢ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＥＲＫ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ．　Ｎｅｕｒｏｎ　２１：８６９−８８３．
Ｋａｍａｔａ　Ｈ，　Ｔａｎａｋａ　Ｃ，　Ｙａｇｉｓａｗａ　Ｈ，　Ｍａｔｓｕｄａ　Ｓ，　Ｇｏｔｏｈ　Ｙ，　Ｎｉｓｈｉｄａ　Ｅ，　Ｈｉｒａｔａ　Ｈ　（１９９６）　Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＣ１２　ｃｅｌｌｓ．　Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｕｎｃｏｕｐｌｅｓ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｒａｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｃａｓｃａｄｅ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７１：３３０１８−３３０２５．
Ｋａｎａｍｏｔｏ　Ｔ，　Ｍｏｔａ　Ｍ，　Ｔａｋｅｄａ　Ｋ，　Ｒｕｂｉｎ　ＬＬ，　Ｍｉｙａｚｏｎｏ　Ｋ，　Ｉｃｈｉｊｏ　Ｈ，　Ｂａｚｅｎｅｔ　ＣＥ（２０００）　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃ−Ｊｕｎ　Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｋｉｎａｓｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ　ｎｅｕｒｏｎｓ．　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　２０：１９６−２０４．
Ｋａｎｅ　ＤＪ，　Ｓａｒａｆｉａｎ　ＴＡ，　Ａｎｔｏｎ　Ｒ，　Ｈａｈｎ　Ｈ，　Ｇｒａｌｌａ　ＥＢ，　Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ　ＪＳ，　Ｏｒｄ　Ｔ，　Ｂｒｅｄｅｓｅｎ　ＤＥ　（１９９３）　Ｂｃｌ−２　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｒａｌ　ｄｅａｔｈ：　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６２：１２７４−１２７７．．Ｋａｐｌａｎ　ＤＲ，　Ｍａｒｔｉｎ−Ｚａｎｃａ　Ｄ，　Ｐａｒａｄａ　ＬＦ　（１９９１）　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒｋ　ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＮＧＦ．　Ｎａｔｕｒｅ　３５０：１５８−１６０．
Ｋｉｍ　ＹＣ，　Ｍａｓｕｔａｎｉ　Ｈ，　Ｙａｍａｇｕｃｈｉ　Ｙ，　Ｉｔｏｈ　Ｋ，　Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｍ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（２００１）　Ｈｅｍｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｇｅｎｅ　ｂｙ　Ｎｒｆ２．　Ａ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｂｙ　ａ　ｓｗｉｔｃｈ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７６：１８３９９−１８４０６．
Ｋｕｍｍｅｒ　ＪＬ，　Ｒａｏ　ＰＫ，　Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ　ＫＡ　（１９９７）　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｗｉｔｈｄｒａｗａｌｏｆ　ｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｓ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｐ３８　ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ．
Ｊ　Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ　２７２：２０４９０−２０４９４．
Ｌｏ　ＤＣ　（１９９２）　Ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ．　Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　２：３３６−３４０．
Ｌｏｖｅｌｌ　ＭＡ，　Ｘｉｅ　Ｃ，　Ｇａｂｂｉｔａ　ＳＰ，　Ｍａｒｋｅｓｂｅｒｙ　ＷＲ　（２０００）　Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎａｎｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｂｒａｉｎ．　Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ　２８：４１８−４２７．
Ｍａｎｓｕｒ　Ｋ，　Ｉｗａｈａｓｈｉ　Ｙ，　Ｋｉｒｙｕ−Ｓｅｏ　Ｓ，　Ｓｕ　Ｑ，　Ｎａｍｉｋａｗａ　Ｋ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ，　Ｋｉｙａｍａ　Ｈ　（１９９８）　Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｍｏｔｏｒ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ａｆｔｅｒ　ｎｅｒｖｅ　ｉｎｊｕｒｙ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　Ｍｏｌ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　６２：８６−９１．
Ｍａｒｕｙａｍａ　Ｔ，　Ｋｉｔａｏｋａ　Ｙ，　Ｓａｃｈｉ　Ｙ，　Ｎａｋａｎｏｉｎ　Ｋ，　Ｈｉｒｏｔａ　Ｋ，　Ｓｈｉｏｚａｗａ　Ｔ，　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ　Ｙ，　Ｆｕｊｉｉ　Ｓ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９７）　Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｅｎｓｔｒｕａｌ　ｃｙｃｌｅ．　Ｍｏｌ　Ｈｕｍ　Ｒｅｐｒｏｄ　３：９８９−９９３．
Ｍａｓｕｔａｎｉ　Ｈ，　Ｍａｇｎａｇｈｉ−Ｊａｕｌｉｎ　Ｌ，　Ａｉｔ−Ｓｉ−Ａｌｉ　Ｓ，　Ｇｒｏｉｓｍａｎ　Ｒ，　Ｒｏｂｉｎ　Ｐ，　Ｈａｒｅｌ−Ｂｅｌｌａｎ　Ａ．（１９９７）　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃ−ｆｏｓ　ＳＲＥ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ＳＡＰ−１ａ．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１５：１６６１−１６６９．
Ｍａｓｕｔａｎｉ　Ｈ，　Ｕｅｎｏ　Ｍ，　Ｕｅｄａ　Ｓ　ａｎｄ　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９９）　ｉｎ　Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｎｄ　ｒｅｄｏｘ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　（Ｓｅｎ，　Ｃ．Ｋ．，　Ｓｉｅｓ，　Ｈ．，　Ｂａｅｕｅｒｌｅ，　Ｐ．Ａ．，ｅｄｓ），　ｐｐ．２９７−３１１，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ
Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ　Ｊ　（１９８６）　Ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒａｐｉｄｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｃ−ｆｏｓ　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ＰＣ１２　Ｒａｔ　ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　８３：４７８９−４７９３．
Ｍｏｎｔｍｉｎｙ　ＭＲ，　Ｓｅｖａｒｉｎｏ　ＫＡ，　Ｗａｇｎｅｒ　ＪＡ，　Ｍａｎｄｅｌ　Ｇ，　Ｇｏｏｄｍａｎ　ＲＨ　（１９８６）　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｙｃｌｉｃ−ＡＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ　ｇｅｎｅ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　８３：６６８２−６６８６．
Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｈ，　Ｍａｔｓｕｄａ　Ｍ，　Ｆｕｒｕｋｅ　Ｋ，　Ｋｉｔａｏｋａ　Ｙ，　Ｉｗａｔａ　Ｓ，　Ｔｏｄａ　Ｋ，　Ｉｎａｍｏｔｏ　Ｔ，　Ｙａｍａｏｋａ　Ｙ，　Ｏｚａｗａ　Ｋ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９４）　Ａｄｕｌｔ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆａｃｔｏｒ／ｈｕｍａｎ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｆ−２　ｃｅｌｌ　ｉｎｊｕｒｙ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ　ｏｒ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｌｅｔｔ　４２：７５−８０．
Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｈ，　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｋ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９７）　Ｒｅｄｏｘ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．　Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５：３５１−３６９．
Ｎｉｓｈｉｙａｍａ　Ａ，　Ｍａｔｓｕｉ　Ｍ，　Ｉｗａｔａ　Ｓ，　Ｈｉｒｏｔａ　Ｋ，　Ｍａｓｕｔａｎｉ　Ｈ，　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｈ，　ＴａｋａｇｉＹ，　Ｓｏｎｏ　Ｈ，　Ｇｏｎ　Ｙ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９９）　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ−２／　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｄ（３）　ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１　ａｓ　ａ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７４：２１６４５−２１６５０．
Ｐａｌｌａｇｅ　Ｖ，　Ｔｏｎｉｏｌｏ　Ｇ，　Ｗｉｌｌ　Ｂ，　Ｈｅｆｔｉ　Ｆ　（１９８６）　Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｎｅｕｒａｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ　ｏｎ　ｂｅｈａｖｉｏｒ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈ　ｍｅｄｉａｌ　ｓｅｐｔａｌ　ｌｅｓｉｏｎｓ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　３８６：１９７−２０８．
Ｓａｉｔｏｈ　Ｍ，　Ｎｉｓｈｉｔｏｈ　Ｈ，　Ｆｕｊｉｉ　Ｍ，　Ｔａｋｅｄａ　Ｋ，　Ｔｏｂｉｕｍｅ　Ｋ，　Ｓａｗａｄａ　Ｙ，　Ｋａｗａｂａｔａ　Ｍ，　Ｍｉｙａｚｏｎｏ　Ｋ，　Ｉｃｈｉｊｏ　Ｈ　（１９９８）　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｉｓ　ａ　ｄｉｒｅｃｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ　（ＡＳＫ）　１．　ＥＭＢＯ　Ｊ　１７：２５９６−２６０６．
Ｓｅｒｒａｎｏ　Ｓａｎｃｈｅｚ　Ｔ，　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ａｇｒａｍｏｎｔｅ　Ｍｄ　Ｍ，　Ｌｏｒｉｇａｄｏｓ　Ｐｅｄｒｅ　Ｌ，　Ｄｉａｚ　Ａｒｍｅｓｔｏ　Ｉ，　Ｇｏｎｚａｌｅｚ　Ｆｒａｇｕｅｌａ　ＭＥ，　Ｄｏｒｔａ−Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ　ＡＪ　（２００１）　Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ　ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ．　Ｒｅｖ　Ｎｅｕｒｏｌ　３２：８２５−８２８．
Ｓｈｅｎｇ　Ｍ，　Ｄｏｕｇａｎ　ＳＴ，　ＭｃＦａｄｄｅｎ　Ｇ，　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ　ＭＥ　（１９８８）　Ｃａｌｃｉｕｍ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｏｆ　ｃ−ｆｏｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｒｅｑｕｉｒｅ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｕｐｓｔｒｅａｍ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　８：２７８７−２７９６．
Ｓｈｅｎｇ　Ｍ，　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ　ＭＥ　（１９９０）　Ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃ−ｆｏｓ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ．　Ｎｅｕｒｏｎ　４：４７７−４８５．
Ｔａｇａｙａ　Ｙ，　Ｍａｅｄａ　Ｙ，　Ｍｉｔｓｕｉ　Ａ，　Ｋｏｎｄｏ　Ｎ，　Ｍａｔｓｕｉ　Ｈ，　Ｈａｍｕｒｏ　Ｊ，　Ｂｒｏｗｎ　Ｎ，　Ａｒａｉ　Ｋ，　Ｙｏｋｏｔａ　Ｔ，　Ｗａｋａｓｕｇｉ　Ｈ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ．　（１９８９）　ＡＴＬ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　（ＡＤＦ），　ａｎ　ＩＬ−２　ｒｅｃｅｐｔｏｒ／Ｔａｃ　ｉｎｄｕｃｅｒ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｔｏ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ；　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｄｉｔｈｉｏｌ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＩＬ−２　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．　ＥＭＢＯ　Ｊ　８：７５７−７６４．
Ｔａｋａｇｉ　Ｙ，　Ｈｏｒｉｋａｗａ　Ｆ，　Ｎｏｚａｋｉ　Ｋ，　Ｓｕｇｉｎｏ　Ｔ，　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　Ｎ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９８ａ）　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｄｏｘ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ，　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｆｏｃａｌ　ｂｒａｉｎ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｌｅｔｔ　２５１：２５−２８．．Ｔａｋａｇｉ　Ｙ，　Ｔｏｋｉｍｅ　Ｔ，　Ｎｏｚａｋｉ　Ｋ，　Ｇｏｎ　Ｙ，　Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ｈ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９８ｂ）　Ｒｅｄｏｘ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｄａｍａｇｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｂｒａｉｎ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ａｆｔｅｒ　ｍｉｄｄｌｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ａｒｔｅｒｙ　ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ：　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ．　Ｊ　Ｃｅｒｅｂ　Ｂｌｏｏｄ　Ｆｌｏｗ　Ｍｅｔａｂ　１８：２０６−２１４．
Ｔａｋａｇｉ　Ｙ，　Ｇｏｎ　Ｙ，　Ｔｏｄａｋａ　Ｔ，　Ｎｏｚａｋｉ　Ｋ，　Ｎｉｓｈｉｙａｍａ　Ａ，　Ｓｏｎｏ　Ｈ，　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　Ｎ，　Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ｈ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９８ｃ）　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｉｓ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｉｎ　ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ　ｐｌａｑｕｅｓ　ａｎｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｎｅｏｉｎｔｉｍａ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔ　ａｒｔｅｒｉｅｓ．　Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ　７８：９５７−９６６．
Ｔａｋａｇｉ　Ｙ，　Ｍｉｔｓｕｉ　Ａ，　Ｎｉｓｈｉｙａｍａ　Ａ，　Ｎｏｚａｋｉ　Ｋ，　Ｓｏｎｏ　Ｈ，　Ｇｏｎ　Ｙ，　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　Ｎ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９９）　Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ　ｆｏｃａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｂｒａｉｎ　ｄａｍａｇｅ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　９６：４１３１−４１３６
Ｔａｋａｇｉ　Ｙ，　Ｈａｔｔｏｒｉ　Ｉ，　Ｎｏｚａｋｉ　Ｋ，　Ｍｉｔｓｕｉ　Ａ，　Ｉｓｈｉｋａｗａ　Ｍ，　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　Ｎ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（２０００）　Ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｓ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ．　Ｊ　Ｃｅｒｅｂ　Ｂｌｏｏｄ　Ｆｌｏｗ　Ｍｅｔａｂ　２０：８２９−８３３．
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｙ，　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ−Ｕｅｄａ　Ｙ，　Ｍｏｒｉ　Ｋ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９６）　Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｄｕｌｔ　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　（ＡＤＦ）／ｈｕｍａｎ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　（Ｔｒｘ）　ｇｅｎｅ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２４：２７４６−２７５２．
Ｔｈｏｍａｓ　ＳＭ，　ＤｅＭａｒｃｏ　Ｍ，　Ｄ’Ａｒｃａｎｇｅｌｏ　Ｇ，　Ｈａｌｅｇｏｕａ　Ｓ，　Ｂｒｕｇｇｅ　ＪＳ　（１９９２）　Ｒａｓ　ｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｆｏｒ　ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−　ａｎｄ　ｐｈｏｒｂｏｌ　ｅｓｔｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＡＰ　ｋｉｎａｓｅｓ．　Ｃｅｌｌ　６８：１０３１−１０４０．．Ｔｏｍｉｍｏｔｏ　Ｈ，　Ａｋｉｇｕｃｈｉ　Ｉ，　Ｗａｋｉｔａ　Ｈ，　Ｋｉｍｕｒａ　Ｊ，　Ｈｏｒｉ　Ｋ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９３）　Ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＡＴＬ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆａｃｔｏｒ，　ａ　ｈｕｍａｎ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ，　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｒｂｉｌ　ｂｒａｉｎ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｇｌｏｂａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　６２５：１−８．
Ｔｒｅｉｓｍａｎ　Ｒ　（１９８６）　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅ　ｔｈａｔ　ｍｅｄｉａｔｅｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃ−ｆｏｓ　ｇｅｎｅ　ｔｏ　ｓｅｒｕｍ　ｆａｃｔｏｒｓ．　Ｃｅｌｌ　４６：５６７−５７４．
Ｔｒｏｕｃｈｅ　Ｄ，　Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖ　Ｍ，　Ｌｅｎｏｒｍａｎｄ　ＪＬ，　Ｒｏｂｉｎ　Ｐ，　Ｌｅｉｂｏｖｉｔｃｈ　ＳＡ，　Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ　Ｐ，　Ｈａｒｅｌ−Ｂｅｌｌａｎ　Ａ　（１９９３）　Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃ−ｆｏｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｂｙ　ＭｙｏＤ　ｏｎ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．　Ｎａｔｕｒｅ　３６３：７９−８２．
Ｕｅｎｏ　Ｍ，　Ｍａｓｕｔａｎｉ　Ｈ，　Ａｒａｉ　ＲＪ，　Ｙａｍａｕｃｈｉ　Ａ，　Ｈｉｒｏｔａ　Ｋ，　Ｓａｋａｉ　Ｔ，　Ｉｎａｍｏｔｏ　Ｔ，　Ｙａｍａｏｋａ　Ｙ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ，　Ｎｉｋａｉｄｏ　Ｔ　（１９９９）　Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｒｅｄｏｘ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｐ２１　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７４：３５８０９−３５８１５．
Ｘｉａ　Ｚ，　Ｄｉｃｋｅｎｓ　Ｍ，　Ｒａｉｎｇｅａｕｄ　Ｊ，　Ｄａｖｉｓ　ＲＪ，　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ　ＭＥ　（１９９５）　Ｏｐｐｏｓｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＥＲＫ　ａｎｄ　ＪＮＫ−ｐ３８　ＭＡＰ　ｋｉｎａｓｅｓ　ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：１３２６−１３３１．
Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｍ，　Ｓａｔｏ　Ｎ，　Ｔａｊｉｍａ　Ｈ，　Ｆｕｒｕｋｅ　Ｋ，　Ｏｈｉｒａ　Ａ，　Ｈｏｎｄａ　Ｙ，　Ｙｏｄｏｉ　Ｊ　（１９９７）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｔｉｎａｌ　ｐｉｇｍｅｎｔ．　Ｅｘｐ　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ　６５：６４５−６５２．
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＮＧＦ誘発ＴＲＸ発現。
図１Ａは、ＮＧＦにより生じるＴＲＸタンパク質の増加を示す。ＮＧＦ　（５０　ｎｇ／ｍｌ）　で２４時間及び４８時間処理されたＰＣ１２細胞を収穫し、ウェスタンブロッティングにかけて検出した。
【図１Ｂ】ＮＧＦ誘発ＴＲＸ発現。
図１Ｂは、ＮＧＦにより誘発されたＴＲＸ　ｍＲＮＡの増大した発現を示す。ＮＧＦ処理されたＰＣ１２細胞は、示された各時間で収穫され、次いでノーザンブロッティングにより分析した。
【図１Ｃ】ＮＧＦ誘発ＴＲＸ発現。
図１Ｃは、ＮＧＦによるＴＲＸ遺伝子の活性化である。ＰＣ１２細胞はｐＴＲＸ−Ｌｕｃ　ベクターｐＴＲＸ　（−１１４８）とｐＲＬ−ＴＫでトランスフェクトされ、次いでＮＧＦの存在下又は非存在下に処理された。
【図２】ＴＲＸプロモータ中でＮＧＦに応答する領域の同定
ＰＣ１２細胞は、左パネルに示されるようにｐＴＲＸ−ＬｕｃベクターとｐＲＬ−ＴＫでトランスフェクトされ、示された値は未処理細胞に対するＮＧＦ（５０　ｎｇ／ｍｌ）−処理細胞のルシフェラーゼ活性の比を示す。この結果は、３つの独立した実験の代表例である。
【図３Ａ】
ＰＤ９８０５９またはＮＡＣによるＴＲＸ発現の抑制。
図３Ａは、ＰＤ９８０５９またはＮＡＣによるＰＣ１２の分化の遮断を示す。ＰＣ１２細胞はＮＧＦ　（５０　ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で２日間培養し、次いでＰＤ９８０５９　（５０　ｍＭ）またはＮＡＣ　（２０　ｍＭ）の存在下にＮＧＦ　（５０　ｎｇ／ｍｌ）と培養した。
【図３Ｂ】
ＰＤ９８０５９またはＮＡＣによるＴＲＸ発現の抑制。
図３Ｂは、ＰＤ９８０５９またはＮＡＣの添加によるＮＧＦ−誘発トランス活性化の阻害である。ＰＣ１２細胞はｐＴＲＸ　（−２６３）−ＬｕｃベクターとｐＲＬ−ＴＫでトランスフェクトされ、次いでＮＧＦ（５０　ｎｇ／ｍｌ）及びＰＤ９８０５９（５０　ｍＭ）またはＮＡＣ　（２０　ｍＭ）で処理された。示された値は、ＮＧＦ　５０　（ｎｇ／ｍｌ）及びＰＤ９８０５９またはＮＡＣで処理された細胞の未処理細胞に対するルシフェラーゼ活性の比である。該結果は、３つの独立した実験の代表例である。
【図３Ｃ】
ＰＤ９８０５９またはＮＡＣによるＴＲＸ発現の抑制。
図３Ｃは、ＰＤ９８０５９またはＮＡＣによるＴＲＸタンパク質発現の抑制を示す。　ＰＣ１２細胞は図３Ａと同様に処理され、タンパク質サンプルは分画され、抗−ＴＲＸ抗体でスクリーニングされた。
【図４】ＮＧＦ−誘発ＴＲＸ核移動の抑制
図４（Ａ）は、ＮＧＦなしで培養したＰＣ１２細胞を示し、図４（Ｂ）はＮＧＦで処理したＰＣ１２細胞を示し、図４（Ｃ）及び図４（Ｄ）は、ＮＧＦ及びＰＤ９８０５９（図４Ｃ）またはＮＡＣ　（図４Ｄ）で処理されたＰＣ１２細胞を示す。
これらの細胞は、抗−ＴＲＸ　ｍＡｂで染色された。
【図５】ミュータントＴＲＸ過剰発現によるＮＧＦ誘発分化の阻害。
ＰＣ１２細胞はｐＢＩ−ＥＧＦＰ，　ｐＢＩ−ＥＧＦＰ−ｗｔＴＲＸまたはｐＢＩ−ＥＧＦＰ−ｄｍＴＲＸ　（３２Ｓ／３５Ｓ）ベクターでトランスフェクトされ、次いでＮＧＦ　５０　（ｎｇ／ｍｌ）で処理された。２４時間後、これらの細胞をレーザー共焦点顕微鏡で調べた。
【図６Ａ】
優性ネガティブミュータント型のＴＲＸによるＣＲＥ−介在ｃ−ｆｏｓ誘発の抑制。
図６Ａは、ＮＧＦがＣＲＥを通してｃ−ｆｏｓを誘導することを示す。ＰＣ１２細胞は、ｐＲＬ−ＴＫ　とともに上部パネルで示されたようにｐＧＬ３−ｃ−ｆｏｓ　（−４０，　＋４２）またはｐＧＬ３−ｃ−ｆｏｓ　（−９９，　＋４２）でトランスフェクトされ、次いでＮＧＦで４時間処理された。示された値は未処理細胞に対するＮＧＦ処理細胞のルシフェラーゼ活性の比である。
【図６Ｂ】
優性ネガティブミュータント型のＴＲＸによるＣＲＥ−介在ｃ−ｆｏｓ誘発の抑制。
図６Ｂは、ＮＧＦによるｃ−ｆｏｓの活性化のミュータント型ＴＲＸによる抑制を示す。ＰＣ１２細胞は、上部パネルに示されるように、ｐＲＬ−ＴＫとともに、ｐＧＬ３−ｃ−ｆｏｓ　（−９９，　＋４２）及びｐｃＤＮＡ３　（１ｇ）またはｐｃＤＮＡ３−ＴＲＸ　（３２Ｓ／３５Ｓ）　（１ｇ）ベクターで共トランスフェクトされた。トランスフェクトされたＰＣ１２細胞はＮＧＦで４時間処理された。示された値は、未処理細胞に対するＮＧＦ処理細胞のルシフェラーゼ活性の比である。
【図７】光照射された網膜のＨ−Ｅ及びＴＵＮＥＬ染色。網膜標本における代表的なＨ−Ｅ及びＴＵＮＥＬ染色が示される。光受容体細胞核の有意な減少が２４時間後及びその後に観察された。ＴＵＮＥＬ−陽性細胞は１２時間後及びその後に観察された（矢印）。ＩＮＬは核内層であり、ＯＮＬは核外層である。
【図８】網膜サンプルのＴＲＸ発現についての免疫組織化学及びウェスタンブロット。ＴＲＸについての代表的免疫組織化学が（Ａ）に示される。ＴＲＸの核標識は光照射直後に核内層　（ＩＮＬ）　で観察されるが（短い矢）　，２４時間後或いはその後に消失した。核外層（ＯＮＬ）の核標識は、光照射直後に観察され（長い矢）９６時間後まで維持された。免疫標識は光照射直後（０時間）では毛様体近傍の周辺網膜（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｒｅｔｉｎａ）　では顕著ではない。ＴＲＸ標識は２４時間後或いはその後にＲＰＥで観察されるが（矢印）、網膜周辺では顕著ではない（白い矢印、１２時間後及び２４時間後）。網膜神経及びＲＰＥフラクションにおけるＴＲＸについての代表的なウェスタンブロット（Ｂ），　及びバンド強度の半定量的分析（Ｃ）が示される。光照射の１２時間後及び２４時間後のバンド強度は光照射されていないマウスのそれと比較した誘導倍率により表される。
【図９】ビヒクル，　ｒＴＲＸ　（５　μｇ）またはミュータント　ｒＴＲＸ　（５　μｇ）で硝子体内前処理された目からの網膜サンプルの酸化された（Ａ）及びチロシン−リン酸化された（Ｂ）タンパク質の検出．　（Ａ）網膜神経においてる酸化されたタンパク質についての代表的ウェスタンブロットが示される。光照射前（第１レーン）及びビヒクル，　ｒＴＲＸ及びミュータントｒＴＲＸ処理された目（各々第２レーン、第３レーン及び第４レーン）である。（Ｂ）　網膜神経においてチロシンリン酸化タンパク質についての代表的なウェスタンブロットが示される。光照射前（第１レーン）及びビヒクル，　ｒＴＲＸ及びミュータントｒＴＲＸ処理された目（各々第２レーン、第３レーン及び第４レーン）である。強い強度の２つのバンド及び弱い強度の３つのバンド（矢印）が光照射前に検出された。光照射直後、強い強度を有する２つのバンドの１つ（上部矢印）が増強され、弱い強度を有する１つの追加的バンド（下部矢印）がビヒクル又はミュータントｒＴＲＸ−処理マウスで検出された。
【図１０】組換えＴＲＸの細胞保護効果。ビヒクル、ｒＴＲＸ　（５　μｇ）またはミュータント　ｒＴＲＸ　（５　μｇ）で硝子体内前処理された目からの網膜サンプルの代表的Ｈ−Ｅ染色（Ａ）及び光受容体核の数（Ｂ）が示される。光照射の９６時間後　ｒＴＲＸ　処理された目の光受容体核の数（平均±ＳＥ，　１０１．３±５．１　細胞／　１００μｍ；　ｎ＝６）はビヒクル−　（６３．３　±　２．７　細胞／１００μｍ；　ｎ＝６）及びミュータント　ｒＴＲＸ−処理された（５１．４　±　３．３　細胞／１００μｍ；　ｎ＝４）　目におけるよりも有意に大きい。Ｐ値はワン−ウェイＡＮＯＶＡ　及びその後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ　／Ｄｕｎｎ　ｐｏｓｔ　ｈｏｃテストにより計算した。網膜サンプルにおける代表的なＤＮＡラダー検出が（Ｃ）に示される。ＤＮＡラダー形成の分析は、ビヒクル、ｒＴＲＸまたはミュータント　ｒＴＲＸ処理された目での光曝露９６時間後で検出した。ＯＮＬは核外層であり；　ｎ．ｓ．，は統計的に有意差はないことである。
【図１１】ＭＰＰ＋は、ＰＣ１２細胞中でのＴＲＸを減少する。３５ｍｍディッシュで終夜プレ培養されたＰＣ１２細胞（２×１０５／ｍｌ）は、０，０．３及び１ｍＭ　ＭＰＰ＋を含む培地中で３時間培養し、次いで細胞ライゼートを集めた。ＴＲＸはウェスタンブロッティングにより１２ｋＤａのバンドとして認識される。
【図１２】ＭＰＰ＋は、ＰＣ１２細胞の生存度を減少する。ＰＣ１２細胞（２×１０４／ｍｌ）は、０，０．３及び１ｍＭ　ＭＰＰ＋とともに２４時間培養された。細胞溶解パーセントはＬＤＨ放出アッセイにより測定した。
【図１３】ＴＲＸ過剰発現及び組換えＴＲＸの投与はＭＰＰ＋誘発損傷を抑制する。ＴＲＸ過剰発現の２４時間後、１ｍＭ　ＭＰＰ＋を培地中に加え２４時間インキュベートした。細胞溶解パーセントはＬＤＨ放出アッセイにより測定した。ＴＲＸ過剰発現ＰＣ１２細胞はＬＤＨ放出アッセイにより測定されるようにＭＰＰ＋誘発損傷に抵抗性であった（図１３Ａ）。さらに、１００μｇ／ｍｌのｒＴＲＸの投与はまた、ＰＣ１２細胞がＭＰＰ＋と２４時間インキュベートされたとき０．３及び１ｍＭ　ＭＰＰ＋誘発損傷を抑制した。２つのアスタリスク（＊）は統計的に有意であることを示す（＊＊Ｐ＜０．００１）
【図１４】代表的免疫組織化学（Ａ）；及び、野生型及びｔｒｘ−ｔｇマウスの眼の網膜サンプルにおけるヒトＴＲＸ発現についてのウェスタンブロット（Ｂ）。ＧＬＣはガングリオン細胞層；ＩＮＬは内顆粒層；ＯＮＬは外顆粒層；及びＲＰＥは網膜色素上皮層であり、スケールバーは１００μｍである。
【図１５】野生型及びｔｒｘ−ｔｇマウスの網膜神経における酸化された（Ａ）及びチロシンリン酸化された（Ｂ）タンパク質の代表的ウェスタンブロット。野生型及びｔｒｘ−ｔｇマウスの光曝露前（−２ｈ）（各々レーン１及び３）、並びに野生型及びｔｒｘ−ｔｇマウスの光曝露直後（０ｈ）（各々レーン２及び４）。
【図１６】視細胞顆粒層中の８ＯｈｄＧの定量的免疫組織化学分析。
（Ａ）野生型マウス（左パネル）及びｔｒｘ−ｔｇマウス（右パネル）の光曝露２４時間後の標本における８ＯｈｄＧの代表的免疫組織化学分析を示す。ＯＮＬは外顆粒層；スケールバーは２０μｍである。
（Ｂ）８ＯｈｄＧ指数が要約される。各カラムは平均±ＳＥとして表される（各群でｎ＝５）。Ｐ値はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ−ｔｅｓｔにより計算した。
【図１７】ＥＲＧ。平均ａ−及びｂ−波振幅が要約される。各カラムは平均±ＳＥとして表される（各群でｎ＝５）。Ｐ値はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ−ｔｅｓｔにより計算した。
【図１Ａ】
2004010574.tif 000002
【図１Ｂ】
2004010574.tif 000003
【図１Ｃ】
2004010574.tif 000004
【図２】
2004010574.tif 000005
【図３Ａ】
2004010574.tif 000006
【図３Ｂ】
2004010574.tif 000007
【図３Ｃ】
2004010574.tif 000008
【図４】
2004010574.tif 000009
【図５】
2004010574.tif 000010
【図６Ａ】
2004010574.tif 000011
【図６Ｂ】
2004010574.tif 000012
【図７】
2004010574.tif 000013
【図８】
2004010574.tif 000014
【図９】
2004010574.tif 000015
【図１０】
2004010574.tif 000016
【図１１】
2004010574.tif 000017
【図１２】
2004010574.tif 000018
【図１３】
2004010574.tif 000019
【図１４】
2004010574.tif 000020
【図１５】
2004010574.tif 000021
【図１６】
2004010574.tif 000022
【図１７】
2004010574.tif 000023