(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ジャガイモ塊茎におけるアミロース形成の抑制。【解決手段】アミロース型デンプンの形成を抑制するジャガイモの遺伝子工学的変性が記述される。ジャガイモゲノムにアンチセンス方向に挿入する３つの断片もまた記述される。さらに、前記アンチセンス断片を有するアンチセンス構築物、遺伝子及びベクターが記述される。さらにまた、顆粒結合デンプンシンターゼの形成をコ−ドする遺伝子のプロモーター及びそれ自身の遺伝子が記述される。また、前記アンチセンス断片を有する細胞、植物体、塊茎、微小塊茎および種子が記述される。最後に、遺伝子工学的な方法で変性されたジャガイモ由来の、天然のままの、あるいは誘導されたアミロペクチン型デンプン、及びジャガイモにおけるアミロース形成を抑制する方法が記述される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチセンス方向に挿入された、顆粒結合デンプンシンターゼの形成をコードするジャガイモ遺伝子（ＧＢＳＳ遺伝子）の断片を有する遺伝子構築体をジャガイモ組織のゲノムに導入することによるジャガイモの遺伝子工学的変性を特徴とし、該断片が、ＣａＭＶ３５Ｓ、パタチンＩ及びジャガイモＧＢＳＳプロモーターから選ばれるプロモーターと共に、配列番号１、配列番号２及び配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有する断片及び該断片から１以上の非隣接塩基対において逸れ及び断片配列番号１〜３と同様のアミロース形成抑制機能を有する断片の群から選ばれる、ジャガイモにおけるアミロースの形成を抑制する方法。
【請求項２】
該断片が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、又は該配列から１以上の非隣接塩基対において逸れ及び断片配列番号１と同様のアミロース形成抑制機能を有するヌクレオチド配列を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該プロモーターがジャガイモにおける顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）の遺伝子のプロモーターであり、該プロモーターは配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有する塊茎特異性ＧＢＳＳプロモーターであるか又は該ヌクレオチド配列から１以上の非隣接塩基対において該プロモーター機能に影響することなく逸れている請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ジャガイモの細胞壁及び/又はジャガイモ塊茎の果汁から該デンプンを分離することを特徴とし、該ジャガイモはアンチセンス方向に挿入された、顆粒結合デンプンシンターゼの形成をコードするジャガイモ遺伝子（ＧＢＳＳ遺伝子）の断片を包含する遺伝子構築体をジャガイモ組織のゲノムに導入することによってアミロース型デンプンの形成を抑制するように遺伝子工学的方法で変性されており、該断片は、ＣａＭＶ３５Ｓ、パタチンＩ及びジャガイモＧＢＳＳプロモーターから選ばれるプロモーターと共に、配列番号１、配列番号２及び配列番号３、及び該配列から１以上の非隣接塩基対において逸れ及び断片配列番号１〜３と同様のアミロース形成抑制機能を有する断片からなる群から選ばれる、アミロペクチン型デンプンを製造する方法。
【請求項５】
該断片が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するか、又は該配列から１以上の非隣接塩基対において逸れかつ断片配列番号１と同様のアミロース形成抑制機能を有する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アンチセンス方向に挿入された顆粒結合デンプンシンターゼの形成をコードするジャガイモ遺伝子（ＧＢＳＳ遺伝子）の断片を包含する遺伝子構築体をジャガイモ組織のゲノムに導入することによってアミロース型デンプンの形成を抑制するように遺伝子工学的方法で変性されたジャガイモから細胞壁及び/又はジャガイモ塊茎の果汁から該デンプンを分離することを特徴とし、該断片は、ＣａＭＶ３５Ｓ、パタチンＩ及びジャガイモＧＢＳＳプロモーターから選ばれるプロモーターと共に、配列番号１、配列番号２及び配列番号３、及び該断片から１以上の非隣接塩基対において逸れ及び断片配列番号１〜３と同様のアミロース形成抑制機能を有する断片からなる群から選ばれ、及び次いで該デンプンを化学的、物理的又は酵素的方法で誘導する、誘導アミロペクチン型デンプンを製造する方法。
【請求項７】
該断片が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するか、又は該配列から１以上の非隣接塩基対において逸れ及び断片配列番号１と同様のアミロース形成抑制機能を有する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号１、配列番号２及び配列番号３、及び該配列から１以上の非隣接塩基対において逸れた配列からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を有する、ジャガイモにおける顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）をコードする遺伝子の断片。
【請求項９】
該断片が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するか、又は該配列から１以上の非隣接塩基対において逸れた請求項８に記載の断片。
【請求項１０】
a)　プロモーター、
　b)　プロモーターとの関係でアンチセンス方向に挿入された顆粒結合デンプンシンターゼをコードする遺伝子の断片であって、配列番号１、配列番号２及び配列番号３、及び該断片から１以上の非隣接塩基対において逸れ及び断片配列番号１〜３と同様のアミロース形成抑制機能を有する断片からなる群から選ばれる断片
を包含するジャガイモにおける顆粒結合デンプンシンターゼの遺伝子の発現を抑制するアンチセンス構築体。
【請求項１１】
該断片が配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するか又は該配列から１以上の非隣接塩基対において逸れ及び断片配列番号１と同様のアミロース形成抑制機能を有する請求項１０に記載のアンチセンス構築体。
【請求項１２】
該プロモーターが、配列番号４に記載のヌクレオチド配列又はそのプロモーター機能に影響することなく１以上の非隣接塩基対において逸れたヌクレオチド配列を包含する塊茎特異性ＧＢＳＳプロモーターである請求項１０又は１１に記載のアンチセンス構築体。
【請求項１３】
該プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びパタチンＩプロモーターから選ばれる請求項１０又は１１に記載のアンチセンス構築体。
【請求項１４】
該断片が配列番号１、配列番号２及び配列番号３、及び該断片から１以上の非隣接塩基対において逸れ及び断片配列番号１〜３と同様のアミロース形成抑制機能を有する断片からなる群から選ばれ、該断片がプロモーターに対してアンチセンス方向に挿入されている、ジャガイモにおける顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）をコードする遺伝子の断片を包含するベクター。
【請求項１５】
該断片が配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するか又は該配列から１以上の非隣接塩基対において逸れ及び断片配列番号１と同様のアミロース形成抑制機能を有する請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１０〜１３のいずれかに記載のアンチセンス構築体を包含するベクター。
【請求項１７】
ゲノムが請求項１０〜１３のいずれかに記載のアンチセンス構築体を包含するジャガイモ植物の細胞。
【請求項１８】
ゲノムが請求項１０〜１３のいずれかに記載のアンチセンス構築体を包含するジャガイモ植物。
【請求項１９】
ゲノムが請求項１０〜１３のいずれかに記載のアンチセンス構築体を包含するジャガイモ塊茎。
【請求項２０】
ゲノムが請求項１０〜１３のいずれかに記載のアンチセンス構築体を包含するジャガイモ植物の種子。
【請求項２１】
ゲノムが請求項１０〜１３のいずれかに記載のアンチセンス構築体を包含するジャガイモの微小塊茎。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　この発明は、ジャガイモ中に事実上アミロペクチン型デンプンのみを形成する結果となる、ジャガイモの遺伝子工学的変性（genetically engineered modification）に関する。この遺伝子工学的変性にはジャガイモへの遺伝子断片の挿入が含まれる。挿入される遺伝子断片には、アンチセンス方向に挿入された、顆粒結合デンプンシンターゼ（granule-bound starch synthase）の遺伝子のコ−ドおよび非コ−ド（すなわち、エクソンおよびイントロン）部の他に、リーダー配列、翻訳開始、翻訳終止およびトレーラー配列が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
　発明の背景　
　種々の形態のデンプンが、食品および紙産業において非常に重要である。また、将来的には、デンプンは、例えば包装材料として用いられる自然界で分解可能なポリマーを製造するための大きな潜在力であろう。とりわけトウモロコシおよびジャガイモに由来する天然のままのデンプンの誘導体形成（derivatisation）によって製造される多くの異なるデンプン製品が知られている。ジャガイモおよびトウモロコシの各々からのデンプンは、多くの市場域で競合している。
【０００３】
　ジャガイモの塊茎においては、デンプンは固体物質の最も大きな部分を占める。ジャガイモにおけるデンプンの約 1/4ないし 1/5はアミロースであり、デンプンの残りはアミロペクチンである。デンプンのこれら２成分は異なる適用分野を有しており、そのため、純粋アミロースまたは純粋アミロペクチンのいずれかを生成する可能性に最も関心が集まる。この２種のデンプン成分は通常のデンプンから生成することができる。これは多くの処理工程を必要とし、その結果として、高価で複雑なものである。
【０００４】
　今や、塊茎が主としていずれか一方の型のデンプンのみを生成するようにジャガイモを変性することが可能であることが、遺伝子工学によって立証された。その結果として、今日ジャガイモデンプンが通常使用されない領域において競合し得る品質のデンプンが得られる。遺伝子工学的方式で変性されたジャガイモからのデンプンは、いかなる化学的変性処理をも受けていないので、食品添加物として大きな潜在力を有している。
【０００５】
　デンプン合成　
　デンプンの合成およびそれらの調節は、現在、基礎研究のレベルおよび産業利用の両面で、非常な興味をもって研究されている。ショ糖のデンプンへの変換における特定の酵素の助力については多くが知られているにもかかわらず、デンプンの生合成はいまだ明らかにされていない。しかしながら、とりわけトウモロコシの研究を行なうことにより、合成経路の一部およびこれらの反応に関与する酵素を明らかにすることが可能になっている。デンプン顆粒を生成するための最も重要なデンプン合成酵素は、デンプンシンターゼおよび分枝酵素である。トウモロコシにおいては、現時点では、３形態のデンプンシンターゼが示され、研究されている。３種のうち２種は説明可能であるが、１種は説明不可能な形でデンプン顆粒に関与している。分枝酵素もまた、おそらく３種の異なる遺伝子によってコ−ドされる３種の形態からなる（Mac Donald & Preiss, 1985; Preiss, 1988）。
【０００６】
　トウモロコシにおけるワクシー遺伝子　
　デンプン成分アミロースの合成は、増殖細胞中のデンプン顆粒に関連するデンプンシンターゼα-1.4-D-グルカン-4-α-グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.4.1.21）の作用により本質的に起こる。この顆粒結合酵素をコ−ドする遺伝子は、酵素が“ＧＢＳＳ”（granule-bound
starch synthase）と呼ばれるのに対して、“ワクシー（waxy）”（＝ＷＸ+）と呼ばれる。
【０００７】
　トウモロコシにおけるワクシー遺伝子位置は、遺伝学的および生化学的のいずれにおいても完全に特徴付けられている。第９染色体上のワクシー遺伝子は、内胚乳、花粉および胚嚢中のアミロースの生成を制御する。ＷＸ+ 対立遺伝子を有する正常トウモロコシにおける内胚乳中に形成されるデンプンは、25％のアミロースと75％のアミロペクチンとからなる。内胚乳がＷＸ+
遺伝子に位置する変異を含み、そのため機能するＧＢＳＳが合成されないトウモロコシの変異体が見出されている。このため、この変異トウモロコシからの内胚乳は、デンプン成分としてアミロペクチンのみを有する。したがって、このいわゆるワクシー変異体は、ＧＢＳＳもアミロースをも含まない（Echt
& Schwartz, 1981）。
【０００８】
　ＧＢＳＳタンパク質は、細胞核中でＷＸ+ 遺伝子によってコ−ドされるが、アミロプラストに移送されて活性化する。このため、プレタンパク質は２種の成分、すなわちアミロプラスト膜を横切ってタンパク質を移送する
7ｋｂの移行ペプチド（transit peptide）と、58ｋｂの真のタンパク質とからなる。トウモロコシにおけるＷＸ+ 遺伝子のコ−ド領域は
3.7ｋｂの長さであり、14のエクソンおよび13のイントロンを含む。プロモーター領域における多くの調節シグナルが知られており、２種の異なるポリアデニル化配列が記述されている（Klosgen
ら、1986； Schwartz-Sommerら、1984；
Shure ら、1983）。
【０００９】
　ジャガイモにおけるアミロース酵素　
　ジャガイモにおいては、主要な顆粒結合タンパク質を構成する60ｋＤのタンパク質が同定されている。このジャガイモ酵素に対する抗体がトウモロコシからのＧＢＳＳと交差反応することから、これが顆粒結合シンターゼであることが推測される（Vos-Scheperkeuterら、1986）。しかしながら、ジャガイモＧＢＳＳの遺伝子は、現時点では、位置および構造のいずれに関しても、トウモロコシにおけるワクシー遺伝子と同定度にまでは特徴付けられていない。
【００１０】
　トウモロコシのみならず、大麦、米およびモロコシ属の植物について、自然界に発生するワクシー変異体が記述されている。ジャガイモにおいては天然変異体は見出されてはいないが、モノハプロイド（ｎ＝12）植物からの葉のＸ線放射により変異体が作製されている（Visserら、1987）。この変異体の塊茎から単離されたデンプンは、ＧＢＳＳタンパク質およびアミロースのいずれも有していない。この変異体は、単純劣性遺伝子により決定され、ａｍｆと呼ばれる。これは、ＧＢＳＳタンパク質およびアミロースを欠くことから他の植物種のワクシー変異体になぞらえることができる。しかしながら、この変異体の染色体数が天然の数（ｎ＝48）の４倍であるため、染色体数の安定性が弱く、これはジャガイモ植物体に対して否定的な効果を及ぼし得る（Jacobsenら、1990）。
【００１１】
　アミロース生成の阻害　
　アミロースの形成を触媒する顆粒結合デンプンシンターゼ、ＧＢＳＳ、の阻害により、アミロースの合成を激烈に減少させることができる。この阻害は、主としてアミロペクチンであるデンプンに帰結する。　
【００１２】
　酵素形成の阻害は、数通りの方法、例えば、　
-酵素の構成をコ−ドする遺伝子配列の変性に帰結する変異原処理　
-酵素をコ−ドする遺伝子配列へのトランスポゾンの組み込み　
-酵素をコ−ドする遺伝子が発現しないような遺伝工学的変性、例えば、アンチセンス遺伝子阻害　
により達成することができる。
【００１３】
　図１は、正常な遺伝子発現の特定の抑制を示し、ここでは相補的アンチセンスヌクレオチドが標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる。したがって、アンチセンスヌクオチドは、イン・ビボで“逆”遺伝子配列から転写されるアンチセンスＲＮＡである（Izant, 1989）。
【００１４】
　アンチセンス技術を用いることにより、植物における種々の遺伝子機能が阻害されている。カルコン（chalcone）シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ（polygalacturonase）およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricin
acetyltransferase）のアンチセンス構築物が、植物種ペチュニア、トマトおよびタバコにおいて、対応する酵素を阻害するために用いられている。
【００１５】
　ジャガイモにおけるアミロースの阻害　
　ジャガイモにおいては、従来、顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳタンパク質）を阻害するために、ＧＢＳＳをコ−ドする遺伝子（以後、この遺伝子を“ＧＢＳＳ遺伝子”と称する）に対応するアンチセンス構築物を用いて実験が行なわれている。Hergersberger （1988）はある方法を記述しており、それによりトウモロコシのＷＸ+ 遺伝子のｃＤＮＡクローンによってジャガイモのＧＢＳＳ遺伝子のｃＤＮＡクローンが単離されている。ｃＤＮＡクローン全体に基づくアンチセンス構築物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium
tumefaciens）によりジャガイモのリーフ・ディスク（leaf discs）に移送される。再生されたジャガイモの芽からイン・ビトロで誘導された微小塊茎においては、アミロース含有量の変化し、かつ弱い減少が観察され、図に示されている。ＧＢＳＳ遺伝子の完全な特徴付けは提示されていない。
【００１６】
　ジャガイモ中のＧＢＳＳタンパク質の遺伝子はさらに特徴付けられており、そこではゲノムＷＸ+ クローンが制限分析により調べられている。しかしながら、このクローンのＤＮＡ配列は決定されていない（Visserら、1989）。
【００１７】
　ジャガイモ中のＧＢＳＳ遺伝子に対応するアンチセンス構築物を用いるさらなる実験が報告されている。ＣａＭＶ35Ｓプロモーターに加えてｃＤＮＡクローンに基づくアンチセンス構築物が、アグロバクテリウム・リゾゲンス（Agrobacterium
rhizogens）により形質転換されている。情報によると、この形質転換はジャガイモ中のアミロース含量をより低下させる結果となったが、評価はなされていない（Flavell、1990）。
【００１８】
　ジャガイモの遺伝子工学的変性に現時点で用いられる方法は、事実上アミロースを含有しない型のデンプンを有するジャガイモに帰結してはいない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
　したがって、この発明の目的は、ジャガイモ塊茎におけるアミロース形成の事実上完全な抑制を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
　この発明によると、ジャガイモにおけるＧＢＳＳ遺伝子の機能および、それ故に、アミロース生成が、全く新規のアンチセンス構築物により阻害される。この発明によるアンチセンス断片の形成に対しては、ＧＢＳＳおよび、その結果として、アミロース生成の可能な限り有効な阻害を達成するために、ゲノムＧＢＳＳ遺伝子が基礎として用いられる。この発明によるアンチセンス構築物は、アンチセンス方向に、リーダー配列、翻訳開始、翻訳終止およびトレーラー配列の他にプロモーターを含む領域の配列に対応するＧＢＳＳ遺伝子のコ−ドおよび非コ−ド両部分を有する。組織特異的な発現のために（すなわち、アミロース生成はジャガイモ塊茎のみで阻害されるべきである）、ジャガイモ塊茎において特異的に活性なプロモーターが用いられる。その結果、他の方法では否定的な副作用を受けるであろう植物体の他の部分のデンプン組成は影響を受けない。
【００２１】
　したがって、この発明は、配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載されるヌクレオチド配列の１つを本質的に有する断片を含む。しかしながら、この配列は、この断片の機能に影響を及ぼすことなく、１以上の非隣接塩基対において、記載された配列から逸れ (deviate)てもよい。
【００２２】
　また、この発明は、この発明による顆粒結合デンプンシンターゼをコ−ドする遺伝子に属する 987ｂｐを含む、ジャガイモ塊茎特異的プロモーターをも包含する。このプロモーターも対応する遺伝子も従来特徴付けられてはいない。 987ｂｐのプロモーター配列は配列番号４に記載されており、遺伝子配列は配列番号５に記載されている。また、プロモーターおよび遺伝子配列は、それらの機能に影響を及ぼすことなく、１以上の非隣接塩基対において、記載された配列から逸れてもよい。
【００２３】
　また、この発明は、この発明によるアンチセンス断片およびアンチセンス構築物を含むベクターをも包含する。
【００２４】
　他の面においては、この発明は、アンチセンス方向に挿入されたこの発明による断片を含むゲノムを有する細胞、植物、塊茎、微小塊茎および種子を包含する。
【００２５】
　さらなる面においては、この発明は、天然のままの、および誘導体が形成された（derivatised）アミロペクチン型デンプンを包含する。
【００２６】
　最後に、この発明は、ジャガイモにおけるアミロース形成を抑制し、それによりジャガイモ中に主としてアミロペクチン型デンプンを形成させる方法を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
　以下、添付の図面を参照してこの発明をより詳細に説明する。添付の図面において、
【００２８】
　図１はアンチセンス遺伝子阻害の原理を説明し、　
【００２９】
　図２はジャガイモＧＢＳＳ遺伝子の制限分析の結果を示し、　
【００３０】
　図３は２種の新規バイナリーベクター pHo3 およびpHo4 を示し、　
【００３１】
　図４はアンチセンス構築物 pHoxwA、pHoxwB およびpHoxwDを示し、　
【００３２】
　図５はアンチセンス構築物 pHoxwF およびpHoxwG を示し、および　
【００３３】
　図６はアンチセンス構築物 pHoxwK およびpHoxwL を示す。
【００３４】
　さらに、この発明による異なるＤＮＡ断片の配列が、配列番号１、２、３、４および５に示されている。１以上の非隣接塩基対におけるこれらの配列からの逸脱が存在してもよい。
【００３５】
　材料　
　この発明を実施するにあたり、以下の材料を用いた。　
菌株： E.coli　DH5alfa および DH5alfaF'IQ（BRL）。　
E.coli JM105（Pharmacia）。Ａ．ツメファシエンス（Clontech）。
ベクター： M13mp18およびmp19 （Pharmacia）。pBI101および pBI121 （Clontech）。pBI240.7（M.W.Bevan）。pUC プラスミド（Pharmacia）。
酵素：制限酵素および EcoRIリンカー（BRL）。
【００３６】
UNIONTM ＤＮＡライゲーション・キット（Clontech）。シークエナーゼTM（SequenaseTM）ＤＮＡシークエンシング・キット（USB）。Ｔ4-ＤＮＡリガーゼ（Pharmacia）。　
上述の材料は、製造者によって定められた仕様に従って用いる。
【００３７】
　ゲノム・ライブラリー　
　EMBL3 中のゲノム・ライブラリーは、ジャガイモBintje の葉を出発物質として用いて、出願人のために Clontech によって作製されている。
【００３８】
　ＧＢＳＳ遺伝子の同定および単離　
　Clontechからのプロトコルに従い、遺伝子の5' および3'両末端のｃＤＮＡクローン（このｃＤＮＡクローンは、M.Hergersberger, Max Plank Institute in　Cologne より入手した）によって、ゲノム・ライブラリーがジャガイモＧＢＳＳ遺伝子についてスクリーニングされている。
【００３９】
　ジャガイモＧＢＳＳ遺伝子、ｗｘ311 の完全長クローンが、ゲノム・ライブラリーから同定され、単離されている。ＧＢＳＳ遺伝子の開始点が、断片ｗ（3.95ｋｂ）と呼ばれるEcoRI断片で決定されている。また、ＧＢＳＳ遺伝子の終止点も、断片ｘ（5.0ｋｂ）と呼ばれる EcoRI断片で決定されている。断片ｍ（3.9ｋｂ）と呼ばれるBgIII-SpeI 断片も単離され、これは断片ｗおよび断片ｘからの配列を共有している。断片ｗ、ｍおよびｘはｐＵＣ13（Viera, 1982；Yanisch-Peronら、1985）にサブクローニングされ、それぞれｐＳｗ、ｐＳｍおよびｐＳｘと呼ばれる（図２）。
【００４０】
　ジャガイモにおけるＧＢＳＳ遺伝子の特徴付け　
　ジャガイモにおけるＧＢＳＳ遺伝子が、制限分析およびｃＤＮＡプローブによって特徴付けられている。ここでは、ＧＢＳＳ遺伝子の 5' および 3' 末端がより正確に決定されている（図２）。Sangerら、1977によるＧＢＳＳ遺伝子の配列決定が、ｐＵＣ19と同様に
M13mp18および mp19 中のｐＳｗおよびｐＳｘからのサブクローンに対して、 5' 末端付近から開始して行なわれている（配列番号 5参照）。
【００４１】
　プロモーター領域が、BglII-NsiI断片（配列番号4参照）で決定されている。転写および翻訳開始点が、重複 BglII-HindIII 断片で決定されている。ターミネーター領域が、SpeI-HindIII断片で順に決定されている。
【００４２】
　ジャガイモにおけるＧＢＳＳ遺伝子に対するアンチセンス構築物　
　この発明によるＧＢＳＳ遺伝子断片（配列番号 1、
2および 3、並びに図２参照）が、以下の方法で決定されている。ｐＳｗを NsiI および HindIIIで制限することにより断片Ｉ（配列番号 1）が得られ、ｐＵＣ19にサブクローニングされたこの断片を
19NH35 と称する。19NH35を HpaI-SstIでさらに制限することにより、この発明によるＧＢＳＳ遺伝子の 342ｂｐを有する断片が得られる。この断片は、リーダー配列、翻訳開始およびコ−ド領域の最初の
125ｂｐを含む。
【００４３】
　ｐＳｍを HpaI および NsiI で制限することにより断片ＩＩ（配列番号
2）が得られ、pJRD184 （Heusterspreuteら、1987）にサブクローニングされたこの断片を pJRDmitt と称する。pJRDmittを
HpaI-SstIでさらに制限することにより、この発明によるＧＢＳＳ遺伝子の2549ｂｐを有する断片が得られる。この断片は、遺伝子の中間からのエクソンおよびイントロンを含む。
【００４４】
　ｐＳｘを SstI および SpeI で制限することにより断片ＩＩＩ（配列番号
3）が得られ、pBluescript （Meltonら、1984）にサブクローニングされたこの断片を pBlue3'と称する。pBlue3' を
BamHI-SstI でさらに制限することにより、この発明によるＧＢＳＳ遺伝子の 492ｂｐを有する断片が得られる。この断片は、最後のイントロンおよびエクソン、翻訳終止およびトレーラー配列の
278ｂｐを含む。
【００４５】
　断片Ｉを有するアンチセンス構築物（図４）：アンチセンス構築物 pHoxwA のために、19NH35からの HpaI-SstI断片が、SmaI-SstI で開裂したバイナリー・ベクター pBI121
（Jefferson ら、1987）にアンチセンス方向に挿入されている。次いで、このアンチセンス断片の転写を、CaMV 35Sプロモーターにより開始し、NOSターミネーター（NOS＝ノパリン・シンターゼ（nopaline synthase））によって終了させる。
【００４６】
　アンチセンス構築物 pHoxwB のために、19NH35からのHpaI-SstI断片が、SmaI-SstI で開裂させたバイナリー・ベクタ− pHo4 （図３）にアンチセンス方向に挿入されている。ジャガイモにおいて塊茎特異的なパタチンＩ（patatin　I）プロモーターを、M.Bevan、Institute of Plant Science Research より入手したベクター pBI240.7 から得る。次いで、アンチセンス断片の転写を、パテチンＩプロモーターにより開始し、NOSターミネーターによって終了させる。
【００４７】
　アンチセンス構築物 pHoxwD のために、19NH35からのHpaI-SstI断片が、SmaI-SstI で開裂させたバイナリー・ベクター pHo3 （図３）にアンチセンス方向に挿入されている。pHo3は、pBI101を基に構築された新規のバイナリーベクターである。今や特徴付けがなされたこの発明によるジャガイモＧＢＳＳ遺伝子のこの発明によるプロモーター（配列番号4を参照）（ＧＢＳＳプロモーター）を有するこのベクターは、SmaIおよびSstIで制限開裂され、19NH35からの HpaI-SstI断片がアンチセンス方向に挿入されている。次いで、このアンチセンス断片の転写をそれ自身のＧＢＳＳプロモーターによって開始し、NOS
ターミネーターにより終了させる。これは、パタチンＩプロモーターのようなＧＢＳＳプロモーターが塊茎特異的であるため、アンチセンス断片がジャガイモ塊茎のみにおいて転写されることを意味する。
【００４８】
　断片ＩＩを有するアンチセンス構築物（図５）：アンチセンス構築物 pHoxwF のために、pJRDmittからのHpaI-SstI 断片が、SmaI-SstI で開裂されたバイナリー・ベクター
pHo4 にアンチセンス方向に挿入されている。次いで、このアンチセンス断片の転写を、パテチンＩプロモーターで開始し、NOS ターミネーターで終了させる。
【００４９】
　アンチセンス構築物 pHoxwG のために、pJRDmittからのHpaI-SstI断片が、SmaI-SstI で開裂されたバイナリ・ベクター pHo3 にアンチセンス方向に挿入されている。次いで、このアンチセンス断片の転写を、それ自身のＧＢＳＳプロモーターによって開始し、NOSターミネーターにより終了させる。
【００５０】
　断片ＩＩＩを有するアンチセンス構築物（図６）：アンチセンス構築物 pHoxwK のために、pBlue3' からの BamHI-SstI 断片が、BamHI-SstIで開裂されたバイナリー・ベクター
pHo4 にアンチセンス方向に挿入されている。次いで、このアンチセンス断片の転写を、パタチンＩプロモーターで開始し、NOS ターミネーターで終了させる。
【００５１】
　アンチセンス構築物 pHoxwL のために、pBlue3'からのBamHI-SstI断片が、BamHI-SstIで開裂されたバイナリー・ベクター pHo3 にアンチセンス方向に挿入されている。次いで、このアンチセンス断片の転写をそれ自身のＧＢＳＳプロモーターで開始し、NOSターミネーターで終了させる。
【００５２】
　形成されたアンチセンス構築物（図４、５、６）は、“凍結溶解”法（Hoekema ら、1983； An ら、1988）を用いる直接形質転換により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株 LBA4404に形質転換されている。
【００５３】
　形質転換　
　アンチセンス構築物は、適切には“凍結溶解”法（Anら、1988）により細菌に移入される。組換え細菌のジャガイモ組織への移入は、ジャガイモ組織にある種の損傷を与えた後、適切な培地中でジャガイモ組織を組換え細菌と共にインキュベートすることにより起こる。インキュベーションの間に、細菌からのＴ-ＤＮＡが宿主植物のＤＮＡに入り込む。インキュベーションの後細菌を殺し、カルス誘導のためにジャガイモ組織を固体培地に移し、カルスを成長させるためにインキュベートする。さらに適切な培地に通した後に芽が形成され、これはジャガイモ組織から切り離される。
【００５４】
　アンチセンス構築物の発現を試験するための検査およびそれらのジャガイモゲノムへの移入を、例えば、サザーンおよびノーザン・ハイブリダイゼーション（Maniatisら（1982））により行なう。移入されているアンチセンス構築物のコピー数を、サザーン・ハイブリダイゼーションにより決定する。
【００５５】
　タンパク質レベルでの発現の試験は、イン・ビトロで形質転換された芽に誘導される微小塊茎に対して行なわれる。これにより、試験をできる限り迅速に行なうことが可能となる。
【００５６】
　ＧＢＳＳタンパク質の特徴付け　
　ＧＢＳＳタンパク質の活性に関するＧＢＳＳ遺伝子の機能に対するアンチセンス構築物の効果を、微小塊茎からデンプンを抽出し、それをＧＢＳＳタンパク質の存在に関して分析することにより調べる。ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動（Hovenkamp-Hermelink ら、1987）において、ＧＢＳＳ遺伝子が機能する場合には、ＧＢＳＳタンパク質は60ｋＤに明瞭なバンドを形成する。ＧＢＳＳ遺伝子が発現しない場合、すなわち、アンチセンスＧＢＳＳ遺伝子が十分に発現する場合には、それによりＧＢＳＳタンパク質の形成が阻害され、ゲル上には60ｋＤのバンドは現われない。
【００５７】
　デンプンの特徴付け　
　微小塊茎におけるデンプンの組成は、通常のジャガイモ塊茎の組成と同一である。このため、アミロース生成に対するアンチセンス構築物の効果を微小塊茎で調べる。アミロペクチンに対するアミロースの割合は、（例えば、Hovenkamp-Hermelink ら、1988による）分光分析法によって決定することができる。
【００５８】
　アミロペクチン・ポテトからのアミロペクチンの抽出　
　アミロペクチンは、公知の方法により、いわゆるアミロペクチン・ポテト（アミロース形成がこの発明によるアンチセンス構築物の挿入によって抑制されているジャガイモ）から抽出する。
【００５９】
　アミロペクチンの誘導体形成　
　アミロペクチンの最終用途により、誘導体形成（derivatisation）によってその物理的および化学的な質を変性させることができる。ここで、誘導体形成は、化学的、物理的および酵素的処理並びにそれらの組み合わせを意味する（変性ジャガイモ）。
【００６０】
　化学的誘導体形成、すなわち、アミロペクチンの化学的修飾は、異なる方法、例えば、酸化、酸加水分解、デキストリン化、異なる形態のエーテル化（例えば、カチオン化、ヒドロキシプロピル化、およびヒドロキシエチル化）、異なる形態のエステル化（例えば、酢酸ビニルにより、無水酢酸により、または一リン酸化、二リン酸化およびオクチルスクシン化により）、およびそれらの組み合わせにより行なうことができる。
【００６１】
　アミロペクチンの物理的変性は、例えば、シリンダー乾燥または押出しにより行なうことができる。　
【００６２】
　酵素的誘導体形成においては、現存の酵素系によって、アミロペクチンの分解（粘性の減少）および化学的修飾が行なわれる。　
【００６３】
　誘導体形成は、所望の最終生成物により、異なる温度で行なわれる。使用される通常の温度範囲は 20-45℃であるが、 180℃までの温度が可能である。
【００６４】
　この発明を、下記実施例においてより詳細に記述する。　
【００６５】
　例１　
この発明によるアンチセンス構築物が挿入されている微小塊茎の作製　
【００６６】
　アンチセンス構築物（図４、５および６参照）を、“凍結溶解”法（Anら、1988）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス LBA 4404 に移入する。ジャガイモ組織への移入は、Rocha-Sosaら（1989）からの変形プロトコルに従って行なう。
【００６７】
　イン・ビトロで培養したジャガイモ植物体からのリーフ・ディスクを、暗所で、 3％ショ糖および 0.5％ＭＥＳを有する液体ＭＳ培地（Murashige & Skoog; 1962）において、培地10ｍＬ当り組換えアグロバクテリウムの懸濁液
100μＬと一緒に 2日間インキュベートする。これら 2日間の後、細菌を殺す。カルス誘導のためにリーフ・ディスクを固体培地に移し、カルスの成長に応じて 4-6週間インキュベートする。この固体培地は以下のような組成を有する：　
　　　ＭＳ＋ 3％　　　　　　ショ糖　
　　　 2ｍｇ／Ｌ　　　ゼアチン・リボシド　
　　　 0.02 ｍｇ／Ｌ　“ＮＡＡ”　
　　　 0.02 ｍｇ／Ｌ　“ＧＡ3 ”　
　　　 500ｍｇ／Ｌ　　“クラフォラン（Claforan）”　
　　　 50 ｍｇ／Ｌ　　カナマイシン　
　　　 0.25 ％　　　　“ゲラン（Gellan）”　
【００６８】
　続いて、リーフ・ディスクをホルモンの異なる組成を有し、　
　　ＭＳ＋ 3％　　　　ショ糖　
　　　 5ｍｇ／Ｌ　　“ＮＡＡ”　
　　　 0.1ｍｇ／Ｌ　“ＢＡＰ”　
　　　 500ｍｇ／Ｌ　“クラフォラン”　
　　　 50 ｍｇ／Ｌ　カナマイシン　
　　　 0.25 ％　　　“ゲラン”　
を含む培地に移す。
【００６９】
　リーフ・ディスクを約 4週間この培地に保存し、4週間後に“クラフォラン”濃度が 250ｍｇ／Ｌに減じられている培地に移す。必要であれば、その後、リーフ・ディスクを 4または 5週間毎に新鮮な培地に移す。芽が形成された後、これらをリーフ・ディスクから切り離し、同様の培地に移す。
【００７０】
　アンチセンス構築物がリーフ・ディスクに移入されている状態は、まず、再生された芽からのリーフ抽出物を、グルクロニダーゼ活性を Jeffersonら（1987）によって記述された基質により分析することによって検査する。この活性は、視認評価によって示される。
【００７１】
　アンチセンス構築物の発現およびそれらのジャガイモゲノムへの移入のさらなる試験は、Maniatisら（1981）によるサザーンおよびノーザン・ハイブリダイゼーションによって行なわれる。移入されているアンチセンス構築物のコピー数は、サザーン・ハイブリダイゼーションによって決定する。
【００７２】
　アンチセンス構築物がジャガイモゲノムに移入され、かつ発現していることが立証された場合には、タンパク質レベルでの発現の試験を開始する。この試験は、形質転換された芽を基にしてイン・ビトロで誘導された微小塊茎に対して行なう。これにより、ジャガイモ塊茎を有する完全なジャガイモ植物体の成長を待つ必要性が避けられる。
【００７３】
　ジャガイモの芽のステム（stem）片を節で切り離して変更ＭＳ培地上に置く。それらは、暗所において、19℃でインキュベートすることにより、2-3週間後に微小塊茎を形成する（Bourque ら、1987）。
【００７４】
　培地は下記のような組成を有する：　
　　　ＭＳ＋ 6％　　ショ糖　
　　　 2.5％　カイネチン　
　　　 2.5％　“ゲラン”　
【００７５】
　ＧＢＳＳタンパク質の活性に関するＧＢＳＳ遺伝子の機能に対するアンチセンス構築物の効果をポリアクリルアミドゲル電気泳動（Hovenkamp-Hermelink ら、1987）により分析する。微小塊茎からデンプンを抽出し、ＧＢＳＳタンパク質の存在について分析する。ポリアクリルアミドゲルにおいて、ＧＢＳＳ遺伝子が機能する場合には、ＧＢＳＳタンパク質は60ｋＤに明瞭なバンドを形成する。ＧＢＳＳ遺伝子が発現しない場合、すなわち、アンチセンスＧＢＳＳ遺伝子が十分発現してＧＢＳＳタンパク質の形成を阻害する場合には、ゲル上に60ｋＤバンドを認めることはできない。
【００７６】
　デンプンの組成、すなわち、アミロペクチンに対するアミロースの割合を、Hovenkamp-Hermelink ら（1988）に従って分光分析法により測定する。この方法では、各デンプン成分の含量は標準曲線に基づいて決定する。
【００７７】
　例２　
アミロペクチン・ポテトからのアミロペクチンの抽出　
【００７８】
　主なデンプン成分がアミロペクチンであり（以下、アミロペクチン・ポテトと称する）、この発明による遺伝子工学的方法で変性されたジャガイモをすりおろし、それによりデンプンを細胞壁から解放する。
【００７９】
　細胞壁（繊維）は遠心スクリーン（centrisiler）で果汁およびデンプンから分離する。果汁は２工程、すなわち最初にハイドロサイクロン（hydrocyclone）、続いて特別に設計されたバンド型真空フィルターでデンプンから分離する。
【００８０】
　次いで、ハイドロサイクロン中で最終精製を行ない、果汁および線維の残留物を分離する。　
【００８１】
　生成物を、最初の真空フィルター上での予備乾燥、続く熱気流中での最終乾燥の２工程により乾燥させる。
【００８２】
　例３　
アミロペクチンの化学的誘導体形成　
【００８３】
　アミロペクチンを、水中で、濃度 20-50％のスラッジにする。ｐＨを10.0-12.0に調整し、最終生成物の置換度が0.004-0.2となるような量の４級アンモニウム化合物を添加する。反応温度は 20-45℃に設定する。反応が完了したときに、ｐＨを
4-8に調整し、そのうえで生成物を洗浄して乾燥させる。この方法においては、カチオン性デンプン誘導体　2-ヒドロキシ-3-トリメチルアンモニウムプロピルエーテルが得られる。
【００８４】
　例４　
アミロペクチンの化学的誘導体形成　
【００８５】
　アミロペクチンを、水中で、水分含量が10-25重量％のスラッジにする。ｐＨを 10.0-12.0に調整し、最終生成物の置換度が 0.004-0.2となるような量の４級アンモニウム化合物を添加する。反応温度は20-45℃に設定する。反応が完了したときに、ｐＨを 4-8に調整する。最終生成物は、2-ヒドロキシ-3-トリメチルアンモニウムプロピルエーテルである。
【００８６】
　例５　
アミロペクチンの化学的誘導体形成　
【００８７】
　　アミロペクチンを、水中で、濃度 20-50重量％のスラッジにする。ｐＨを5.0-12.0 に調整し、最終生成物が所望の粘性を得るように次亜塩素酸ナトリウムを添加する。反応温度は 20-45℃に設定する。反応が完了したときに、ｐＨを
4-8に調整し、そのうえで最終生成物を洗浄して乾燥させる。この方法においては、酸化デンプンが得られる。
【００８８】
　例６　
アミロペクチンの物理的な誘導体形成　
【００８９】
　アミロペクチンを、水中で、 20-50重量％の濃度のスラッジとし、そのうえでこのスラッジを加熱したシリンダー上に塗布する。スラッジはシリンダー上で乾燥してフィルムとなる。
【００９０】
　例７　
アミロペクチンの化学的および物理的な誘導体形成　
【００９１】
　化学修飾するために、アミロペクチンを例３ないし５のいずれかに記載の方法によって処理し、次いで物理的な誘導体形成のために、例６に従ってさらに処理する。
【参考文献】
【００９２】
2004097219.tif 000002
2004097219.tif 000003
2004097219.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】アンチセンス遺伝子阻害の原理を説明する。
【図２】ジャガイモＧＢＳＳ遺伝子の制限分析の結果を示す。
【図３】２種の新規バイナリーベクター pHo3 およびpHo4 を示す。
【図４】アンチセンス構築物 pHoxwA、pHoxwB およびpHoxwDを示す。
【図５】アンチセンス構築物 pHoxwF およびpHoxwG を示す。
【図６】アンチセンス構築物 pHoxwK およびpHoxwL を示す。
【図１】
2004097219.tif 000005
【図２】
2004097219.tif 000006
【図３】
2004097219.tif 000007
【図４】
2004097219.tif 000008
【図５】
2004097219.tif 000009
【図６】
2004097219.tif 000010
【配列表】
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