(57)【要約】【課題】  cysK遺伝子と外来蛋白質をコードする遺伝子を含むバクテリアを培養することを特徴とするセリン豊富な蛋白質の製造方法を提供する。【解決手段】  cysK遺伝子を含むベクターと、外来蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターとにより形質転換されたバクテリア、またはcysK遺伝子と外来蛋白質をコードする遺伝子とを含む組換えベクターにより形質転換されたバクテリアを培養し、これより外来蛋白質を収得する段階を含む。【選択図】        図４ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
cysK遺伝子と外来蛋白質をコードする遺伝子とを含むバクテリアを培養することを特徴とする外来蛋白質の製造方法。 
【請求項２】
前記バクテリアは、cysK遺伝子と外来蛋白質をコードする遺伝子とを同時に含むベクターにより形質転換されたことを特徴とする請求項１記載の方法。 
【請求項３】
前記バクテリアは、cysK遺伝子を含むベクターと、外来蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターとにより形質転換されたことを特徴とする請求項１記載の方法。 
【請求項４】
cysK遺伝子は大腸菌由来であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 
【請求項５】
外来蛋白質はセリン豊富な蛋白質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
セリン豊富な蛋白質はレプチンまたはIL-12p40(インターロイキン12β鎖)であることを特徴とする請求項５記載の方法。 
【請求項７】
cysK遺伝子と外来蛋白質をコードする遺伝子とを同時に含むことを特徴とする組換えベクター。
【請求項８】
請求項７の組換えベクターにより形質転換されたことを特徴とするバクテリア。 
【請求項９】
cysK遺伝子を含むベクターと、外来蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターとにより形質転換されたことを特徴とするバクテリア。 
【請求項１０】
cysK遺伝子またはcysK遺伝子を含む組換えベクターを、形質転換された微生物を利用した外来蛋白質の製造工程に使用する方法。 
【請求項１１】
外来蛋白質はセリン豊富な蛋白質であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、システイン合成酵素遺伝子(cysK)と外来蛋白質をコードする遺伝子とを含むバクテリアを培養することを特徴とするセリン豊富な蛋白質の生産方法に係り、さらに詳しくは、セリン豊富な外来蛋白質の遺伝子とシステイン合成酵素遺伝子とを含むバクテリアを培養し、これからセリン豊富な外来蛋白質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌は、外来蛋白質の合成及び生産のために最も幅広く使用される菌株であって、組換え技術を利用したインターフェロン、インターロイキン２、コロニー刺激因子、成長ホルモン、インシュリン様成長因子、人体由来血清アルブミンのような蛋白質の製造に活用されている。 また、大腸菌内における外来蛋白質の效率よい生産のために、外来蛋白質を発現するためのプラスミドベクター、適切な培養条件、製造された外来蛋白質の分解抑制条件などが必要とされ、これを満足させる多様な発現システムが開発されている（非特許文献１）。 
【０００３】
しかし、外来蛋白質の製造収率を向上させるためには、現在利用される方法を用いる場合には、発現誘導後に長い時間が所要されるため、外来蛋白質の製造収率が高くないから、これを解消するための努力が続いているが、何の成果も得られていない。
【０００４】
よって、大腸菌で外来蛋白質を高収率で製造し得る方法の開発の必要性が絶えず叫ばれている。
【非特許文献１】Weickert et al., Curr. Opin. Biotechnol., 7:494-9,1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の主な目的は、cysK遺伝子と外来蛋白質をコードする遺伝子とを含むバクテリアを培養することを特徴とする外来蛋白質の製造方法を提供することにある。
【０００６】
本発明の他の目的は、外来蛋白質の遺伝子を含む組換えベクターと、システイン合成酵素遺伝子(cysK)を含む組換えベクターとにより同時に形質転換された組換えバクテリア及び、cysK遺伝子と外来蛋白質をコードする遺伝子とを同時に含む組換えベクターにより形質転換されたバクテリアを提供することである。 
【０００７】
本発明のまた他の目的は、cysK遺伝子またはcysK遺伝子を含む組換えベクターにより、形質転換された微生物を利用した外来蛋白質の製造工程に使用する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、大腸菌で外来蛋白質を高収率で製造し得る方法を開発するために鋭意研究努力を重ねた結果、大腸菌でセリン豊富な外来蛋白質を製造する場合、セリン豊富な外来蛋白質を暗号化する遺伝子と大腸菌由来システイン合成酵素遺伝子(cysK)とを同時に発現させることにより、セリン豊富な外来蛋白質の製造収率を向上させられることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、上記目的を達成するために、本発明は、cysK遺伝子と外来蛋白質をコードする遺伝子とを含むバクテリアを培養することを特徴とする外来蛋白質の製造方法を提供する。
【００１０】
本発明において、前記バクテリアは、cysK遺伝子と外来蛋白質をコードする遺伝子とを同時に含むベクターにより形質転換されるか、cysK遺伝子を含むベクターと、外来蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターとにより形質転換されること特徴とする。
【００１１】
また、本発明は、cysK遺伝子と外来蛋白質をコードする遺伝子とを含む組換えベクター及び、前記ベクターにより形質転換されたバクテリアを提供する。
【００１２】
また、本発明は、cysK遺伝子を含むベクターと、外来蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターとにより形質転換されたバクテリアを提供する。
【００１３】
また、本発明は、cysK遺伝子またはcysK遺伝子を含む組換えベクターにより、形質転換された微生物を利用した外来蛋白質の製造工程に使用する方法を提供する。
【００１４】
本発明において、cysK遺伝子は大腸菌由来であることを特徴とし、外来蛋白質はセリン豊富な蛋白質であることを特徴とすることができる。
【００１５】
また、前記セリン豊富な蛋白質はレプチンまたはIL-12p40(インターロイキン12β鎖)であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。 
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を具体的に説明する。 
【００１７】
先ず、本発明で使用した用語を次のように定義した。 本発明で「特定アミノ酸豊富な蛋白質」とは、大腸菌内の平均アミノ酸組成(Koonin et al., in Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology(eds. Neidhardt，F.C. et al.) American Society for Microbiology，Washington，DC, 1432-57,1996)に比べて特定アミノ酸が多い蛋白質のことである。本発明において「セリン豊富な蛋白質」とは、アミノ酸組成でのセリンの含量が10％以上で多い順序で第１または第２の組成比を示す蛋白質のことである。 
【００１８】
今までの公知によれば、レプチンのようなセリン豊富な蛋白質を大腸菌で遺伝子組換え方法で製造する場合には、形質転換大腸菌の高濃度培養、レプチンの発現誘導、レプチンの発現、形質転換大腸菌の収得、収得した大腸菌からレプチンの抽出などの段階を経てレプチンが製造される。 この時、レプチンの発現誘導以後から最大レプチン蛋白質量に至るまでには約8時間以上かかる。それは、大腸菌を高濃度で培養すればセリン系アミノ酸の合成代謝が抑制されるからであることを２次元電気泳動法により確認した(図１)。 
【００１９】
本発明者らは、前記レプチンのようなセリン豊富な蛋白質の製造収率を向上させるために、セリン系アミノ酸の合成を促進させるシステイン合成酵素を暗号化する遺伝子を、セリン豊富な蛋白質の遺伝子と同時に発現させる場合、同じ量のセリン豊富な蛋白質の遺伝子のみを発現させる時よりも、セリン豊富な蛋白質の生産時間を短縮できることを確認し、結果的に製造収率を向上させられることが分かった。
【００２０】
次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を具体的に説明するためのもので、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例により限定されないことは、当該分野で通常の知識を有するものには明らかなことである。
【実施例１】
【００２１】
２次元電気泳動法を利用したレプチン生産菌株の生理的変化分析
公知の方法に基づいて、組換え大腸菌BL21(DE3)(pEDOb5)の人体由来レプチン生産前と後の細胞内蛋白質変化量を２次元電気泳動法を利用して比較した(Hochstrasser et al., Anal. Biochem., 173:424-5, 1998; Han et al., J. Bacteriol., 183:301-8,2001):すなわち、大腸菌BL21(DE3)(pEDOb5)を初期培養以後、レプチンの発現を誘導して高濃度で培養しながら、発現誘導以前の培養液と発現誘導以後の培養液とをそれぞれ分取した後、各培養物を4℃にて6000rpmで5分間遠心分離して沈殿物を収得し、500 μlの低塩緩衝液(KCl 3mM、KH2PO4 1.5mM、NaCL 68mM、NaH2PO4 9mM)で洗浄した。次いで、200 μlのＴＥ緩衝液(Tris-HCl 10mM、EDTA 1mM)に懸濁し、超音波破砕機で細胞を破壊した後、4℃にて12,000rpmで10分間遠心分離し、上澄液を取って真空乾燥させた後、-20℃に保管して試料を用意した。
【００２２】
前記用意した各試料200μgをIEF変性溶液{尿素(urea)9M 、CHAPS 0.5％(w/v)、DTT 10mM、Bio-lyte pH3-10 0.2％(w/v)、ブロムフェノールブルー 0.001％(w/v)}340μlに溶解し、17cmストリップ(ReadyStripTM IPG Strips pH3-10、Bio−Rad Laboratories Inc., USA)に入れた後、20℃にて12時間水和させ、等電点電気泳動を行った。 その後、ストリップを平衡緩衝液I{尿素6M、SDS 2％(w/v)、Tris-HCl(pH8.8) 0.375M、 グリセロール20％(v/v)、DTT 130mM}に約15分間振盪しながら浸漬した後、また平衡緩衝液II{尿素6M、SDS 2％(w/v)、Tris-HCl(pH8.8) 0.375M、グリセロール20％(v/v)、ヨードアセトアミド135mM、ブロムフェノールブル3.5M}に約15分間振盪しながら浸漬し、ストリップをSDSゲルに乗せて分子量による分離を行った。
【００２３】
２次元ゲルは銀染色キット(silver staining kit，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)で染色し、スキャナ(GS710 Calibrated Imaging Densitometer，Bio−Rad Laboratories Inc., USA)でスキャンし、MelanieII(Bio−Rad Laboratories Inc., USA)ソフトウェアで蛋白質を定量した。また、蛋白質の同定は、２次元ゲル上で目的の蛋白質を選別して摘出し、洗浄し、真空乾燥した後、トリプシンを入れて37℃にて8時間以上反応させた。次いで、 MALDI-TOF MS(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight mass spectrometer) (VoyagerTM Biospectrometry，Perseptive Biosystems Inc., USA)を用いてトリプシンによって切断されたペプチドの分子量を測定した。レプチン蛋白質発現以前とレプチン蛋白質が最大に発現される瞬間の細胞内蛋白質変化量を比較した。
【００２４】
その結果から、レプチン蛋白質発現後ほぼ全てのアミノ酸合成が抑制されていることが分かった。 特に、アミノ酸合成経路の中でセリン系に係わる蛋白質(cysK, GlyA)がレプチンの過剰生産によって非常に減少し、GlyAは2.5倍、cysKは2.3倍減少した(図１)。 この点から、セリン系アミノ酸合成経路がレプチンの過剰生産によって非常に阻害されることが明らかになり、セリン豊富な蛋白質であるレプチンを生産する菌株における減少したセリン系アミノ酸合成関連代謝を促進させるために、この経路において核心酵素であるCysK蛋白質を暗号化するcysK遺伝子を導入しようとした。
【実施例２】
【００２５】
cysK遺伝子を導入した組換えプラスミドの作製
CysK蛋白質を発現するための組換えプラスミドpAC104cysKを次のように作製した:先ず、大腸菌BL21(DE3)染色体を鋳型として、プライマー１： 5'-gcgaattcatgagtaagatttttgaagataa-3'(配列番号１)とプライマー２： 5'-gcgaattctatatactgttgcaattctttctc-3'(配列番号２)とを用いてポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction:PCR)を行った。 この時、第１変性は95℃にて5分間１回行って、この後第２変性は95℃にて50秒間、アニーリングは55℃にて1分間、延長は72℃にて1分30秒間行って、これを30回繰り返し、以後72℃にて5分間最後の延長を1回行った。 
【００２６】
得られたcysK遺伝子を制限酵素EcoRIで切断し、gntT104プローモーター(Peekhaus and Conway、J. Bacteriol., 180:17 77-85, 1998)を有するプラスミドp10499A(Park et al., FEMS Microbiol. Lett., 214:217-22, 2002)の同一の制限酵素切断部位に挿入してプラスミドp104cysKを収得した。次いで、前記収得したプラスミドを制限酵素EcoRV及びScaIで切断し、制限酵素EcoRVで切断されたプラスミドpACYC184にクローニングし、これを大腸菌XL1-blueの中に形質転換して、組換えプラスミドpAC104cysKを作製した(図２)。
【実施例３】
【００２７】
IL-12p40遺伝子を導入した組換えプラスミドの作製
IL-12p40(インターロイキン12β鎖)蛋白質を発現させるために下記のように組換えプラスミドpEDIL-12p40を作製した。すなわち、人体由来インターロイキンβ鎖遺伝子を含むプラスミドpUC18/p40を鋳型として、プライマー３： 5'-ggctagcattaatgatatgggaactgaagaaagat-3'(配列番号３)とプライマー４： 5'-gccggatccttattaactgcagggcacaga-3' (配列番号４)とを用いて重合酵素連鎖反応を、実施例２と同一の方法で行ってIL-12p40遺伝子を収得し、収得した遺伝子を制限酵素AdeI及びBamHIで切断し、レプチン発現ベクター(Jeong and Lee，Appl. Environ. Microbiol., 65:3027-32, 1999)に存在する制限酵素ＮｄｅI及びBamHIIの位置に挿入して、プラスミドpEDIL-12p40を作製した(図３)。 
【実施例４】
【００２８】
cysK同時発現システムによる人体由来レプチンの生産
前記実施例２で作製された組換えプラスミドpAC104cysKと、従来のレプチン発現プラスミドpEDOb5(Jeong and Lee，Appl. Environ. Microbiol. 65, 3027-32, 1999)とで同時に大腸菌BL21(DE3)を形質転換して大腸菌BL21(DE3)(pEDOb5)(pAC104cysK)を作製し、これを培養してレプチンを製造した。この時、対照群としては、従来のレプチン発現プラスミドpEDOb5のみにより形質転換された大腸菌BL21(DE3)(pEDOb5)を同一の条件で培養し、これよりレプチンを生産した。 
【００２９】
前記形質転換された各大腸菌を、10g/lの葡萄糖を添加した10mlのＲ／２培地｛KH2PO4 6.75g/l、(NH4)2HPO4 2g/l、クエン酸0.85g/l、微量金属溶液（HCl 5M、FeSO47×H2O 10g/l、CaCl2 2g/l、ZnSO4×7H2O 2.2g/l、MnSO4×5H2O 0.54g/l、CuSO4×5H2O 1g/l、(NH4)Mo7O24×4H20 0.1g/l、Na2B4O7×10H2O 0.02g/l）5ml/l、MgSO4×7H2O 0.7g/l｝に接種し、37℃にて8時間培養した後、これを再び10g/lの葡萄糖を含む200mlのＲ／２培地に移して37℃にて一晩培養した。次いで、Ｒ／２培地で培養した組換え大腸菌200mlを、10g/lの葡萄糖を含む1.8LのＲ／２培地に接種し、37℃、pH6.88を維持しながら、葡萄糖700g/lとMgSO4×7H2O 20g/lとを含む供給基質溶液を供給しながら培養した。 この時、基質供給はpH変化に応じて供給されるが、培地内pHが6.88以上の場合、供給基質溶液は10ml/minの速度で、醗酵機内の葡萄糖濃度が0.7g/lとなるように自動調整されて供給された。 培地内溶存酸素量(DO)は40％を維持するように、空気及び純粋酸素が自動調整されて供給された。培養された培養物を分光光度計で600nm波長で測定した光学密度(OD)が30であるとき、1mMのIPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)を添加してレプチンの発現を誘導した。 全ての培養には、プラスミドの安定した維持のために100mg/lのアンピシリンと30mg/lのクロラムフェニコールとを採用した。 
【００３０】
レプチンの発現誘導後、1時間ごとに培養液を分取し、それぞれの分取された培養物を光学密度(OD)5となるように一定に希釈し、4℃にて6000rpmで5分間遠心分離して沈殿物を収得し、前記沈殿物をTE緩衝液(Tris-HCl 10mM、EDTA 1mM) 200μlに懸濁した後、公知の方法によって、12％SDS-PAGEを行った(図４a、図４ｂ)。 図４aは対照群の培養に際し、培養時間による細胞濃度、細胞乾燥重量及び外来蛋白質量の変化を示すグラフであり、図４ｂは組換え大腸菌BL21(DE3)(pEDOb5)(pAC104cysK)の培養に際し、培養時間による細胞濃度、細胞乾燥重量及び外来蛋白質量の変化を示すグラフであって、(■)は細胞の光学密度を、(○)は細胞乾燥重量を、(▲)は製造されたレプチンの量をそれぞれ示す。 図４ａに示すように、単独に発現させた場合には、発現誘導以後8時間が経過した時点においてレプチンの発現量が最大値に逹し、これより製造収率が0.475 g/l×hに達した。一方、図４ｂに示すように、同時に発現させた場合には、蛋白質柔道後2時間ぶりに最大値に逹し、これより製造収率が1.56g/l×hに達した。 
【００３１】
結論的に、cysK遺伝子同時発現によってセリン豊富な蛋白質を生産する本発明は、公知の方法に比べてレプチンの生産性を3.4倍位増加させられることが明らかになった。 
【実施例５】
【００３２】
cysK同時発現システムによるセリン豊富な蛋白質の生産
公知によれば、大腸菌内の蛋白質の平均アミノ酸組成は、 ロイシンが10.5％、アラニンが9.6％で第１、第２の組成比を示し、セリンは平均5.6％を示す(図５ａ、図５ｂ、図５ｃ、図５ｄ)。 図５ａ乃至図５ｄは今まで公知された蛋白質のアミノ酸組成比を示すグラフであって、図５ａは大腸菌蛋白質らのアミノ酸組成比、図５ｂはレプチンのアミノ酸組成比、図５ｃはG-CSFのアミノ酸組成比、図５ｄはIL-12p40のアミノ酸組成比をそれぞれ示す。
【００３３】
図５ｂに示すように、レプチンは典型的なセリン豊富な蛋白質であって、蛋白質内のセリン組成比が11.6％で極めて多くのセリンアミノ酸を含む。 図５ｃに示すように、他の蛋白質であるhG-CSF(human granulocyte−colony stimulating factor)では、セリンの組成比が8.2％で少し多い方であるが、やはりこれよりも大腸菌内の蛋白質のアミノ酸組成と類似して、ロイシンが19％、アラニンが12％で第１、第２の組成比を示す。 図５ｄに示すように、また他のセリン豊富な蛋白質と知られたIL-12p40ではセリンの組成比が11.1％に達する。 
【００３４】
本発明者らは前記実施例４の結果の全てのセリン豊富な蛋白質の生産への適用可否を確認するために、hG-CSFと、他のセリン豊富な蛋白質であるIL-12p40とを対象として同じ方法を適用し、蛋白質を生産した(Jeong and Lee、Protein Expr. Purif., 23:311-8, 2001)。 
【００３５】
hG-CSFの場合は、cysK遺伝子を同時に発現させなくても短時間(3時間)に最大蛋白質生産量に逹するので、実施例４の結果と類似の結果を確認することができなかった。ところが、IL-12p40の場合は、cysK遺伝子を同時発現させることで、レプチンと類似の生産性増加效果を得ることができた(図６ａ、図６ｂ)。
【００３６】
図６ａはIL-12p40を生産する組換え大腸菌BL21(DE3)(pEDIL-12p40)の培養に際し、培養時間による細胞濃度、細胞乾燥重量及び外来蛋白質量の変化を示すグラフであり、図６ｂはIL-12p40を生産し、cysK遺伝子を同時発現させる組換え大腸菌BL21(DE3)(pEDIL-12p40)(pAC104cysK)の培養に際し、培養時間による細胞濃度、細胞乾燥重量及び外来蛋白質量の変化を示すグラフであって、(■)は細胞の光学密度、(○)は細胞乾燥重量、(▲)は製造されたインターロイキン12β鎖の量をそれぞれ示す。図６ａに示すように、実施例３で作製されたpEDIL-12p40を用いることを除いて、実施例４の方法でIL-12p40を生産した場合は、発現誘導７時間が経過した時点でIL-12p40の発現量が最大値に逹して最大収率が0.090g/l×hであることが確認された。一方、図６ｂに示すように、実施例２で作製されたpAC104cysKと、実施例３で作製されたpEDIL-12p40とを用いることを除いては、実施例４の方法でIL-12p40を生産した場合、発現誘導２時間が経過した時点で最大収率(0.349 g/l×h)でIL-12p40を製造した。 
【００３７】
結論的に、cysK遺伝子同時発現によってセリン豊富な蛋白質を生産する本発明から、公知の方法に比べてIL-12p40の生産性を3.9倍程度増加させることができることが分かった。 
【００３８】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に説明したが、かかる具体的な記述は、当該分野で通常の知識を有する者には単に好適な実施形態に過ぎないもので、これにより本発明の範囲が限定されないのは明らかなことである。例えば、システイン合成酵素を過多発現させられる方法として、cysK遺伝子を外来蛋白質発現ベクター内に導入するか、或いは宿主細胞の染色体に融合する方法もある。これら方法によれば、cysK遺伝子の発現量さえ十分であれば同一の效果が得られ、これは当該分野で通常の知識を有する者には明らかなことである。よって、本発明の実質的な範囲は添付した各請求項と、それらの等価物とによって定義されると理解されるべきであろう。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上説明したように、本発明は、cysK遺伝子と外来蛋白質をコードする遺伝子とを含むバクテリアを培養することを特徴とする外来蛋白質の製造方法を提供する效果がある。より具体的には、セリン豊富な外来蛋白質の遺伝子を含む発現ベクターと、システイン合成酵素遺伝子(cysK)を含む発現ベクターとにより形質転換されたバクテリア、またはcysK遺伝子とセリン豊富な外来蛋白質をコードする遺伝子とを同時に含む組換えベクターにより形質転換されたバクテリアを培養し、これより外来する外来蛋白質を製造する方法を提供する。 
【００４０】
本発明によれば、組換え大腸菌を利用したセリン豊富な外来蛋白質の生産に際し、最大蛋白質生産量に至る時間を大幅に短縮させることができるので、せリン豊富な外来蛋白質の製造収率の向上に幅広く活用することができる。 
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】組換え大腸菌を利用したレプチンの発現誘導以前と以後の細胞内のGlyAとCysK蛋白質の発現程度を示すグラフである。
【図２】プラスミドpAC104cysKの遺伝子を示す図である。
【図３】プラスミドpEDIL-12p40の遺伝子を示す図である。
【図４ａ】レプチンを生産する組換え大腸菌BL21(DE3)(pEDOb5)の培養に際し、培養時間による細胞濃度、細胞乾燥重量及び外来蛋白質量の変化を示すグラフである。
【図４ｂ】レプチンを生産し、cysK遺伝子を同時発現させる組換え大腸菌BL21(DE3)(pEDOb5)(pAC104cysK)の培養に際し、培養時間による細胞濃度、細胞乾燥重量及び外来蛋白質量の変化を示すグラフである。
【図５ａ】大腸菌蛋白質らのアミノ酸組成比を示すグラフである。
【図５ｂ】レプチンのアミノ酸組成比を示すグラフである。
【図５ｃ】G-CSFのアミノ酸組成比を示すグラフである。
【図５ｄ】IL-12p40のアミノ酸組成比を示すグラフである。
【図６ａ】IL-12p40を生産する組換え大腸菌BL21(DE3)(pEDIL-12p40)の培養に際し、培養時間による細胞濃度、細胞乾燥重量及び外来蛋白質量の変化を示すグラフである。
【図６ｂ】IL-12p40を生産し、cysK遺伝子を同時発現させる組換え大腸菌BL21(DE3)(pEDIL-12p40)(pAC104cysK)の培養に際し、培養時間による細胞濃度、細胞乾燥重量及び外来蛋白質量の変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【配列表】
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