(57)【要約】【課題】センシング物質と試料中の特定物質との結合状態を測定する全反射減衰を利用したセンサーにおいて、結合した結合特定物質の回収量を増加させる。【解決手段】光ビーム２０を、試料液１５が供給された測定チップ１０の誘電体ブロック１１と薄膜層１２との界面１２ａに対して種々の入射角が得られるように入射させ、界面１２ａで全反射した光ビーム２０を光検出器２３により検出して、ウェル部１６内のセンシング物質１７と試料液１５中の特定物質との結合状態を測定する。ウェル部１６の底面の薄膜層１２に加え、側面にも薄膜層１４を設け、各薄膜層上にセンシング物質１７を固定する。底面の薄膜層１２のみが設けられている従来のセンサーに比べて、センシング物質１７が固定されている面積が大きく、多くの特定物質がセンシング物質１７と結合する。このため結合状態を測定後、脱離処理を施し結合特定物質を回収する際の回収量が増加する。【選択図】　　　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光ビームを発生させる光源と、
前記光ビームに対して透明な誘電体ブロックと、
該誘電体ブロックの一面に形成される第１の薄膜層と、
該第１の薄膜層の表面上に配されて、試料中の特定物質と結合するセンシング物質と、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られる角度で入射させる光学系と、
前記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、
該光検出手段の検出結果に基づいて全反射減衰の状態を測定する測定手段とを備えてなる全反射減衰を利用したセンサーにおいて、
前記誘電体ブロックの一面と異なる面に形成され、前記第１の薄膜層と略同一の化学特性を有する第２の薄膜層と、
該第２の薄膜層の表面上に配される前記センシング物質とをさらに備えたことを特徴とする全反射減衰を利用したセンサー。
【請求項２】
前記第１の薄膜層の表面上に前記試料を連続的に供給するとともに、この供給された試料を連続的に排出する試料給排手段を備えたことを特徴とする請求項１記載の全反射減衰を利用したセンサー。
【請求項３】
前記第１の薄膜層の上面に前記試料を保持するウェル部を形成する試料保持枠を備えたことを特徴とする請求項１記載の全反射減衰を利用したセンサー。
【請求項４】
前記第２の薄膜層が前記第１の薄膜層および前記誘電体ブロックから分離されていることを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の全反射減衰を利用したセンサー。
【請求項５】
誘電体ブロックと、該誘電体ブロックの上面に形成された第１の薄膜層と、該第１の薄膜層上に試料を保持するウェル部を形成する試料保持枠とを備え、前記全反射減衰を利用したセンサーに用いられる測定チップであって、
前記第１の薄膜層と略同一の化学特性を有する第２の薄膜層が、前記試料保持枠の内壁面に設けられていることを特徴とする測定チップ。
【請求項６】
前記試料保持枠の内壁面が、前記第１の薄膜層から離れるにつれて側外方に離れる形状に形成されていることを特徴とする請求項５記載の測定チップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、表面プラズモンの発生を利用して試料中の物質の特性を分析する表面プラズモンセンサー等の、全反射減衰を利用したセンサーおよび該全反射減衰を利用したセンサーに利用される測定チップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
金属中においては、自由電子が集団的に振動して、プラズマ波と呼ばれる粗密波が生じる。そして、金属表面に生じるこの粗密波を量子化したものは、表面プラズモンと呼ばれている。
【０００３】
従来より、この表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、試料中の物質の特性を分析する表面プラズモンセンサーが種々提案されている。そして、それらの中で特に良く知られているものとして、　Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号参照）。
【０００４】
上記の系を用いる表面プラズモンセンサーは基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、この光検出手段の検出結果に基づいて表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を測定する測定手段とを備えてなるものである。
【０００５】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【０００６】
上記構成の表面プラズモンセンサーにおいて、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角θＳＰで入射させると、該金属膜に接している試料中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と試料との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント波の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。
【０００７】
なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０００８】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角θＳＰより表面プラズモンの波数が分かると、試料の誘電率が求められる。すなわち表面プラズモンの波数をＫＳＰ、表面プラズモンの角周波数をω、ｃを真空中の光速、εｍとεｓをそれぞれ金属、試料の誘電率とすると、以下の関係がある。
【０００９】
【数１】
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試料の誘電率εｓが分かれば、所定の較正曲線等に基づいて試料中の特定物質の濃度が分かるので、結局、上記反射光強度が低下する入射角である全反射減衰角θＳＰを知ることにより、試料の誘電率つまりは屈折率に関連する特性を求めることができる。
【００１０】
なおこの種の表面プラズモンセンサーにおいては、上記全反射減衰角θＳＰを精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に並設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００１１】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の並設方向に関して微分して出力する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値、特に暗線部分に対応した微分値に基づいて試料の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００１２】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似のセンサーとして、例えば「分光研究」第４７巻　第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モードセンサーも知られている。この漏洩モードセンサーは基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、この光検出手段の検出結果に基づいて導波モードの励起状態、つまり全反射減衰の状態を測定する測定手段とを備えてなるものである。
【００１３】
上記構成の漏洩モードセンサーにおいて、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。この光強度の低下は、一般に光検出手段により暗線として検出される。そして導波光の波数は光導波層の上の試料の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、試料の屈折率や、それに関連する試料の特性を分析することができる。
【００１４】
上述した表面プラズモンセンサーや漏洩モードセンサーは、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモンセンサーの場合は金属膜であり、漏洩モードセンサーの場合はクラッド層および光導波層）上にセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の物質の溶液（試料液）を添加し、所定時間が経過する毎に前述の微分値を測定している。添加した物質が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記微分値を測定し、この微分値に変化が生じているか否か測定することにより、添加した物質とセンシング物質の結合が行われているか否か、すなわち添加した物質がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、化合物と蛋白質、遺伝子と蛋白質などが挙げられる。
【００１５】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、必ずしも全反射減衰角θＳＰの角度そのものを検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角θＳＰの角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。
【００１６】
また、本出願人は、特願２００１−９２６６６において、使い勝手のよいウェル形状の測定チップを用いて、上記全反射減衰の状態の測定を行うセンサーを提案している。ウェル形状の測定チップを用いることにより、例えば試料として液体試料を用いる場合であれば、測定チップ内に入る少量の液体試料を準備するのみで、測定を行うことができる。また測定チップを複数個保持可能なテーブルあるいはアレイ等を用いることにより、短時間で容易に多種の試料の測定を行うことができる。
【００１７】
一方、上記のような全反射減衰の状態の測定を行うセンサーとしては、センシング物質が固定された平板上の測定チップ上に流路機構を用いて、試料を連続的に供給して測定を行うセンサーが知られている。この形態のセンサーを用いれば、センシング物質と特定物質との結合状態を測定する際に、常に新しい試料が測定チップ上に供給されるため、試料中の被検体の濃度が変化せず、結合状態の測定を精度良く行うことができる。また、センシング物質と特定物質の結合状態を測定したのち、結合が行われている場合には、この結合体が固定されている測定チップ上に、特定物質が含まれていないバッファ液を流すことより、センシング物質と特定物質との解離状態を測定することができる。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
従来の表面プラズモンセンサー等の全反射減衰を用いたセンサーでは、センシング物質と特定物質の結合状態あるいは解離状態が主に測定対象とされていた。しかし、近年化合物、遺伝子あるいは蛋白質等のセンシング物質と、蛋白質などの特定物質の結合の測定を行う際に、結合状態または解離状態の解析に加え、センシング物質と、一旦結合した特定物質（以下結合特定物質と記載）との結合を脱離液などを用いて強制的に外し、脱離した結合特定物質の解析を行う手法が使用されようになっている。このような解析を行うセンシング物質と特定物質の組み合わせとしては、化合物と蛋白質、遺伝子と蛋白質、あるいは蛋白質と蛋白質等が知られている。
【００１９】
例えば蛋白質フィッシングと呼ばれる解析方法では、多種類の蛋白質を含む試料液をセンシング物質であるＤＮＡ等が固定された薄膜層上に供給し、結合反応が生じた場合には、結合した蛋白質（以下結合蛋白質と記載）を脱離液等を用いてて脱離させて回収し、その結合蛋白質を解析することにより、蛋白質の種類の特定および結合状態の解析等を行っている。
【００２０】
上記のように、結合特定物質の解析を精度よく行うためには、できる限り多くの量の結合特定物質を回収することが望ましい。しかしながら、従来の全反射減衰を用いたセンサーにおいては、ウェル形状の測定チップを用いて試料を溜めて測定を行う場合であれ、平板上の測定チップ上に流路機構を用いて試料を連続的に供給して測定を行う場合であれ、センシング物質と試料とが接触する面積が小さく、微少な量の特定物質がセンシング物質と結合するのみであるため、十分な量の結合特定物質を回収することが困難であるという問題があった。
【００２１】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、センシング物質と結合した結合特定物質の回収量を増加させることのできる全反射減衰を利用したセンサーを提供することを目的とするものである。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明の全反射減衰を利用したセンサーは、光ビームを発生させる光源と、
前記光ビームに対して透明な誘電体ブロックと、
該誘電体ブロックの一面に形成される第１の薄膜層と、
該第１の薄膜層の表面上に配されて、試料中の特定物質と結合するセンシング物質と、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記第１の薄膜層との界面で全反射条件が得られる角度で入射させる光学系と、
前記界面で全反射した光ビームの強度を検出する光検出手段と、
該光検出手段の検出結果に基づいて全反射減衰の状態を測定する測定手段とを備えてなる全反射減衰を利用したセンサーにおいて、
前記誘電体ブロックの一面と異なる面に形成され、前記第１の薄膜層と略同一の化学特性を有する第２の薄膜層と、
該第２の薄膜層の表面上に配される前記センシング物質とをさらに備えたことを特徴とするものである。
【００２３】
このようなセンサーとしては、金属膜を上記薄膜層として用いる前述の表面プラズモンセンサーや、誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成された光導波層とからなる層を上記薄膜層として用いる前述の漏洩モードセンサー等がある。
【００２４】
上記センサーは、前記第１の薄膜層の表面上に前記試料を連続的に供給するとともに、この供給された試料を連続的に排出する試料給排手段を備えたものであってもよい。
【００２５】
また、上記センサーは、前記第１の薄膜層の上面に前記試料を保持するウェル部を形成する試料保持枠を備えたものであってもよい。
【００２６】
上記第２の薄膜層は、前記第１の薄膜層および前記誘電体ブロックから分離されているものであってもよい。
【００２７】
本発明の測定チップは、誘電体ブロックと、該誘電体ブロックの上面に形成された第１の薄膜層と、該第１の薄膜層上に試料を保持するウェル部を形成する試料保持枠とを備え、前記全反射減衰を利用したセンサーに用いられる測定チップであって、
前記第１の薄膜層と略同一の化学特性を有する第２の薄膜層が、前記試料保持枠の内壁面に設けられていることを特徴とするものである。
【００２８】
上記測定チップは、前記試料保持枠の内壁面が、前記第１の薄膜層から離れるにつれて側外方に離れる形状に形成されているものであってもよい。
【００２９】
なお、本発明によるセンサーにおいて、光検出手段により前記界面で全反射した光ビームの強度を検出して、全反射減衰の状態を測定する方法としては種々の方法があり、例えば、光ビームを前記界面で全反射条件が得られる種々の入射角で入射させ、各入射角に対応した位置毎に前記界面で全反射した光ビームの強度を検出して、全反射減衰により発生した暗線の位置（角度）を検出することにより全反射減衰の状態を測定してもよいし、Ｄ．Ｖ．Ｎｏｏｒｔ，Ｋ．ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｃ．−Ｆ．Ｍａｎｄｅｎｉｕｓ，　Ｐｏｒｏｕｓ　Ｇｏｌｄ　ｉｎ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，　ＥＵＲＯＳＥＮＳＯＲＳ　ＸＩＩＩ，　１９９９，　ｐｐ．５８５−５８８　に記載されているように、複数の波長の光ビームを前記界面で全反射条件が得られる入射角で入射させ、各波長毎に前記界面で全反射した光ビームの強度を検出して、各波長毎の全反射減衰の程度を検出することにより全反射減衰の状態を測定してもよい。
【００３０】
またＰ．Ｉ．Ｎｉｋｉｔｉｎ，Ａ．Ｎ．Ｇｒｉｇｏｒｅｎｋｏ，Ａ．Ａ．Ｂｅｌｏｇｌａｚｏｖ，Ｍ．Ｖ．Ｖａｌｅｉｋｏ，Ａ．Ｉ．Ｓａｖｃｈｕｋ，Ｏ．Ａ．Ｓａｖｃｈｕｋ，　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏ−Ａｒｒａｙ　Ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ，　ＥＵＲＯＳＥＮＳＯＲＳ　ＸＩＩＩ，　１９９９，　ｐｐ．２３５−２３８　に記載されているように、光ビームを前記界面で全反射条件が得られる入射角で入射させるとともに、この光ビームの一部を、この光ビームが前記界面に入射する前に分割し、この分割した光ビームを、前記界面で全反射した光ビームと干渉させて、その干渉後の光ビームの強度を検出することにより全反射減衰の状態を測定してもよい。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の全反射減衰を利用したセンサーは、誘電体ブロックの一面に形成された第１の薄膜層の表面上に配されて、試料中の特定物質と結合するセンシング物質に加え、誘電体ブロックの一面と異なる面に形成され、第１の薄膜層と略同一の化学特性を有する第２の薄膜層の表面上に配されるセンシング物質を備えているため、第１の薄膜層の表面上に配されるセンシング物質に試料を供給すると共に、第２の薄膜層の表面上に配されるセンシング物質にも試料を供給することにより、第１の薄膜層の表面上に配されるセンシング物質および第２の薄膜層の表面上に配されるセンシング物質の両方が、それぞれ試料中の特定物質と結合するため、従来の全反射減衰を利用したセンサーに比べて、多くの結合特定物質が生成され、これらの結合特定物質を回収することにより、結合特定物質の回収量を増加させることができる。
【００３２】
上記センサーが、前記第１の薄膜層の表面上に前記試料を連続的に供給するとともに、この供給された試料を連続的に排出する試料給排手段を備えたものであれば、センシング物質と試料中の特定物質との結合状態を測定する際に、常に新しい試料がセンシング物質上に供給されるため、試料中の特定物質の濃度が変化せず、結合状態の測定を精度良く行うことができる。
【００３３】
また、上記センサーが、前記第１の薄膜層の上面に前記試料を保持するウェル部を形成する試料保持枠を備えたものであれば、例えば試料として液体試料を用いる際に、試料保持枠内に入る少量の液体試料を準備するのみで、結合状態の測定を行うことができる。
【００３４】
上記第２の薄膜層が、前記第１の薄膜層および前記誘電体ブロックから分離されているものであれば、測定精度を向上するために、例えば温度調整や湿度調整等を行う際に、第１の薄膜層および誘電体ブロックのみに調整を施すことが可能であり、小型の調整手段を用いることができる。
【００３５】
本発明の測定チップは、誘電体ブロックと、該誘電体ブロックの上面に形成された第１の薄膜層と、該第１の薄膜層上に試料を保持するウェル部を形成する試料保持枠とを備え、前記全反射減衰を利用したセンサーに用いられる測定チップであって、前記第１の薄膜層と略同一の化学特性を有する第２の薄膜層が、前記試料保持枠の内壁面に設けられているものであれば、測定チップのウェル部の底面（第１の薄膜層）および内壁面（第２の薄膜層）の全面にセンシング物質が固定可能であり、この測定チップに試料を供給すれば、底面および内壁面のセンシング物質に特定物質が結合する。このため、センシング物質がウェル部の底面のみに固定されている場合に比べて、結合蛋白質の回収量が増加する。
【００３６】
さらに、試料保持枠の内壁面に、第２の薄膜層が形成されていない場合には、センシング物質も固定されることがない。このため、センシング物質と試料の結合状態を測定する際に、試料保持枠の内壁面において、試料保持枠を形成する透明樹脂等と、試料中の特定物質とが結合してしまう場合がある。このようにして形成された結合特定物質は、本来の解析対象であるセンシング物質と係合する結合特定物質とは異なる場合があり、これらの透明樹脂等と結合した結合特定物質が、センシング物質と結合した結合特定物質に混入して回収された場合には、結合特定物質の解析の信頼性が低下する可能性がある。
【００３７】
また、本来センシング物質と結合する特定物質が、測定チップの内壁の透明樹脂等と多量に結合してしまい、センシング物質との結合量が減少し、結合状態の測定に支障が生じることもある。
【００３８】
本発明の測定チップを用いれば、試料が接触する面にはセンシング物質が固定されているため、本来の解析対象である結合特定物質以外の結合特定物質が形成されるおそれや、多量の特定物質が測定チップの内壁面と結合してしまい、結合状態の測定に支障が生じるおそれがなく、結合状態の測定の信頼度および結合特定物質の解析結果の信頼度が向上する。
【００３９】
また、上記測定チップの試料保持枠の内壁面が、前記第１の薄膜層から離れるにつれて側外方に離れる形状に形成されている場合には、第１の薄膜層および第２の薄膜層の厚みを均一化する効果を得ることもできる。すなわち、金属膜等からなるこの薄膜層は一般に蒸着によって形成されるので、その場合に試料保持枠を上述のような形状としておけば、蒸着に際して蒸着材料が試料保持枠に遮られて薄膜層の厚みが不均一になることを防止可能である。
【００４０】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。図１は、本発明の第１の実施形態による表面プラズモンセンサーの側面形状を示すものである。
【００４１】
図１に示す通りこの表面プラズモンセンサーは、使い切りの測定チップ１０と、測定用の光ビーム（レーザビーム）２０を発生させる半導体レーザ等のレーザ光源２１と、入射光学系である集光レンズ２２と、光検出器２３と、上記レーザ光源２１の駆動を制御するとともに、上記光検出器２３の出力信号Ｓを受けて後述の処理を行なう信号処理部２４と、表示部２５とを有している。
【００４２】
測定チップ１０は、概略四角錐形状とされた誘電体ブロック１１と、この誘電体ブロック１１の上面に形成された、例えば金、銀、銅、アルミニウム等からなる第１の薄膜層としての薄膜層１２と、この薄膜層１２の上に側方が閉じられた空間を画成する筒状部材からなる試料保持枠１３と、この試料保持枠１３の内壁面に形成された第２の薄膜層としての薄膜層１４とを有している。試料液保持枠１３の部分は、その内面が薄膜層１２から上方に離れるにつれて側外方に離れるテーパ形状とされている。この試料液保持枠１３内のテーパ形状の空間は、試料液１５を貯えるウェル部１６として機能している。
【００４３】
測定チップ１０は、誘電体ブロック１１と試料液保持枠１３とを、例えば透明樹脂等から一体整形し、蒸着により薄膜層１２および薄膜層１４を形成したものである。なお本例では、薄膜層１２および薄膜層１４の上にＤＮＡからなるセンシング物質１７が固定され、試料液１５の中には種々の蛋白質が含まれている。
【００４４】
集光レンズ２２は、光ビーム２０を集光して収束光状態で誘電体ブロック１１に通し、誘電体ブロック１１と薄膜層１２との界面１２ａに対して種々の入射角が得られるように入射させる。この入射角の範囲は、上記界面１２ａにおいて光ビーム２０の全反射条件が得られ、かつ、表面プラズモン共鳴が生じ得る角度範囲を含む範囲とされる。
【００４５】
なお光ビーム２０は、界面１２ａに対してｐ偏光で入射する。そのようにするためには、予めレーザ光源２１をその偏光方向が所定方向となるように配設すればよい。その他、波長板や偏光板で光ビーム２０の偏光の向きを制御してもよい。
【００４６】
光検出器２３は、多数の受光素子が１列に配されてなるラインセンサーであり、受光素子の並び方向が図１中の矢印Ｘ方向となるように配されている。信号処理部２４は、上記光検出器２３の出力信号Ｓを受ける測定手段２６を有している。
【００４７】
以下、上記構成の表面プラズモンセンサーによる試料分析について説明する。まず、測定ユニット１０に、試料液１５が供給される。信号処理部２４からの指令でレーザ光源２１が駆動され、そこから発せられた光ビーム２０が前述のように収束する状態で、誘電体ブロック１１と薄膜層１２との界面１２ａに入射する。この界面１２ａで全反射した光ビーム２０は、光検出器２３によって検出される。
【００４８】
光ビーム２０は、上述の通り収束光状態で誘電体ブロック１１に入射するので、上記界面１２ａに対して種々の入射角θで入射する成分を含むことになる。なおこの入射角θは、全反射角以上の角度とされる。そこで、光ビーム２０は界面１２ａで全反射し、この反射した光ビーム２０には、種々の反射角で反射する成分が含まれることになる。
【００４９】
このように光ビーム２０が全反射するとき、界面１２ａから薄膜層１２側にエバネッセント波がしみ出す。そして、光ビーム２０が界面１２ａに対してある特定の入射角θＳＰで入射した場合は、このエバネッセント波が薄膜層１２の表面に励起する表面プラズモンと共鳴するので、この光については反射光強度Ｉが鋭く低下する。なお図３には、この全反射減衰現象が生じた際の入射角θと反射光強度Ｉとの関係を概略的に示してある。
【００５０】
そこで、測定手段２６において、全反射減衰の状態として、光検出器２３が出力する出力信号Ｓから各受光素子毎の検出光量を調べ、暗線を検出した受光素子の位置に基づいて上記入射角（全反射減衰角）θＳＰを求める。
【００５１】
本実施形態では薄膜層１２上に、試料液１５の中の特定物質である蛋白質と結合するセンシング物質１７が固定され、蛋白質との結合状態に応じてセンシング物質１７の屈折率が変化するので、上記全反射減衰角θＳＰを測定し続けることにより、この結合状態の変化の様子を調べることができる。
【００５２】
すなわち、時間経過とともに、全反射減衰角θＳＰの角度が変化する場合には、試料液１５中の蛋白質がセンシング物質１７と結合していると判定することができ、全反射減衰角θＳＰの角度に変化が生じない場合には、試料液１５中には、センシング物質と結合する蛋白質は存在していないと判定することができる。測定手段２６は、以上の原理に基づいて上記結合の有無を判定し、その判定結果が表示部２５に表示される。
【００５３】
所定時間経過後に、全反射減衰角θＳＰの角度に変化が生じ、結合が生じているとの判定結果が表示された場合には、測定チップ１０を測定位置から取り外し、試料液１５を捨て、センシング物質１７と結合蛋白質の結合を外す脱離処理を施して、結合蛋白質を回収する。その後この結合蛋白質を解析し、その種類および結合状態等を調べる。
【００５４】
すなわち、本実施形態におけるセンサーでは、測定チップ１０のウェル部１６の底面および内壁面の全面に薄膜層が形成され、この薄膜層の上にセンシング物質１７が固定されているため、従来のウェル部１６の底面のみに薄膜層が形成され、その上にセンシング物質が固定されているセンサーに比べ、センシング物質が固定されている面積が広くなる。このセンシング物質１７に蛋白質が結合しているため、従来のセンサーより多くの蛋白質がセンシング物質１７と結合するので、この結合蛋白質を回収する際には、結合蛋白質の回収量が増加する。
【００５５】
また、ウェル部１６を備えた測定チップ１０を用いて測定を行っているため、ウェル部１６に入る少量の試料液１５を準備するのみで、結合状態の測定を行うことができる。
【００５６】
さらに、例えば試料保持枠１３の内壁面に、薄膜層１４が形成されていない場合には、センシング物質１７も固定されることがない。このため、試料保持枠１３の内壁面において、試料保持枠１３を形成する透明樹脂と試料液１５中の蛋白質が結合してしまう場合がある。このようにして形成された結合蛋白質は、本来の解析対象であるセンシング物質１７と係合した結合蛋白質とは異なる場合があり、これらの透明樹脂と結合した蛋白質が、センシング物質１７と結合した結合蛋白質に混入して回収された場合には、結合蛋白質の解析の信頼性が低下する可能性がある。本実施の形態においては、試料液１５が接触する面には全てセンシング物質１７が固定されているため、本来の解析対象である結合蛋白質以外の結合蛋白質が形成されるおそれがなく、結合蛋白質の解析結果の信頼度が一層向上する。
【００５７】
また、試料保持枠１３の内壁面に、センシング物質１７が固定されていない場合には、本来センシング物質１７と結合する結合蛋白質が、内壁面の透明樹脂等と多量に結合してしまい、センシング物質１７との結合量が減少してしまい、結合状態の測定に支障が生じることがあるが、測定チップ１０を用いれば、試料液１５が接触する面には全てセンシング物質１７が固定されているため、多量の結合蛋白質が測定チップ１０の内壁面と結合してしまい、結合状態の測定に支障が生じることがなく、結合状態の測定の信頼度が向上する。
【００５８】
次に、図３および図４を参照して本発明の第２の実施の形態である表面プラズモンセンサーについて説明する。図３は表面プラズモンセンサーの側面形状を示すものであり、図４は、この表面プラズモンセンサーに用いられる流路ユニットの上面図および側断面図である。なお、図３においては、図１中の要素と同等の要素には同番号を付してあり、それらについての説明は特に必要の無い限り省略する。
【００５９】
図２に示す通りこの表面プラズモンセンサーは、測定チップ３０と、測定用の光ビーム（レーザビーム）２０を発生させるレーザ光源２１と、集光レンズ２２と、光検出器２３と、信号処理部２４と、表示部２５と、流路ユニット５０とを有している。
【００６０】
測定チップ３０は、略四角錐形状とされた透明樹脂等からなる誘電体ブロック３１と、この誘電体ブロック３１の上面に形成された、例えば金、銀、銅、アルミニウム等からなる第１の薄膜層としての薄膜層３２とを有している。薄膜層３２の上には、ＤＮＡからなるセンシング物質３３が固定されている。
【００６１】
測定チップ３０の上面には、薄膜層３２上に流路を形成するための流路ユニット５０が取り付けられている。この流路ユニット５０は、概略四角形状に形成されている流路ホルダ５１に、試料液１５を供給するための供給路５２および試料液１５を排出するための排出路５３が取り付けられ、測定チップ３０に簡単に着脱することができる。流路ホルダ５１には、供給路５２の出口と排出路５３の入口が開口され、また流路ホルダ５１の下面の金属膜１２の表面と接する領域に、この供給路５２の出口と排出路５３の入口を囲むシール部５４が設けられている。このため、この流路ユニット５０を測定チップ３０に取り付けた場合には、薄膜層３２およびシール部５４によりシールされた測定流路５５が形成される。図４に流路ユニット５０の上面図および側断面図を示す。なお、シール部５４は、流路ホルダ５１の上部部分と一体形成されたものであってもよいし、上部部分とは異なる素材により形成され、後付されたものであってもよく、例えばＯリング等を流路ホルダ５１の下部部分に取り付けたものであってもよい。
【００６２】
流路ユニット５０の供給路５２には、ポンプ５６が接続され、該ポンプ５６には試料液溜部５７および脱離液溜部５８が接続されている。試料液溜部５７には予め複数種類の蛋白質を含む試料液１５が準備され、脱離液溜部５８には、センシング物質と結合蛋白質の結合を外す、脱離液５９が準備されている。ポンプ５６は、測定時には、試料液１５を供給路５２に供給し、また結合蛋白の回収時には脱離液５９を供給路５２へ供給する。流路ユニット５０、ポンプ５６および液溜部５７が、発明の試料給排手段として機能する。
【００６３】
排出路５３には、結合蛋白質生成部６０が接続され、結合蛋白質生成部６０には、排出口６１および結合蛋白質回収部６２が接続されている。測定時には、試料液１５は結合蛋白質生成部６０を経て、排出口６１から排出される。また結合蛋白の回収時には、排出口６１が閉鎖され、脱離液５９は、結合蛋白質生成部６０を経て、結合蛋白質回収部６２へ送液される。
【００６４】
結合蛋白質生成部６０には、誘電体ブロック３１を形成する透明樹脂と同等の同盟樹脂から形成される基板６３と、該基板６３上に形成される第２の薄膜層としての薄膜層６４と、該薄膜層６４に固定されるセンシング物質６５とが設けられている。なお、薄膜層６４は、薄膜層３２と同一の素材から同様に形成されたものであり、またセンシング物質６５も、センシング物質３３と同一の素材から同様に固定されたものである。結合蛋白質回収部６２は、測定流路５５内および結合蛋白質生成部６０内でセンシング物質から脱離された結合蛋白質を脱離液５９から回収するものである。なお、図３において点線で囲まれている領域は、温調エリア６９であり、図示省略した温調手段により常に所定温度に保たれている。
【００６５】
以下、上記構成の表面プラズモンセンサーによる試料分析について説明する。測定に先立ち、流路ユニット５０のシール部５４が測定チップ３０の薄膜層３２に密着するように、流路ユニット５０を測定チップ３０に取り付ける。ポンプ５６を作動させ、液溜部５７に準備されている試料液１５を流路ユニット５０の供給路５２を介して測定流路５５へ供給する。測定を行っている間は、ポンプ５６を作動させ続けるため、試料液１５は測定流路５５に連続的に供給される。測定流路５５はシール部５４によりシールされているため、測定流路５５に供給された試料液１５は順次排出路５３、結合蛋白質生成部６０および排出口６１を通って排出される。
【００６６】
測定流路５５内に、試料液１５が供給された後、測定を開始する。光ビーム２０が収束する状態で、誘電体ブロック１１と薄膜層３２との界面３２ａに入射する。この界面１２ａで全反射した光ビーム２０は、光検出器２３によって検出される。以後の測定方法は、第１の実施の形態と同様であるため、その詳細な説明は省略する。
【００６７】
測定開始後、時間経過とともに、全反射減衰角θＳＰの角度が変化する場合には、試料液１５中の蛋白質がセンシング物質３３と結合していると見なすことができ、全反射減衰角θＳＰの角度に変化が生じない場合には、試料液１５中には、センシング物質３３と結合する蛋白質は存在していないと見なすことができる。なお、試料液１５は継続的に供給されるめ、試料液１５中の特定の蛋白質がセンシング物質３３と結合している場合には、結合蛋白質生成部６０においても同じ蛋白質がセンシング物質６５と結合し、結合蛋白質が生成されている。
【００６８】
所定時間経過後に、全反射減衰角θＳＰの角度に変化が生じている場合には、ポンプ５６により、試料液１５の供給を停止し、代わりに脱離液５９の供給を開始する。同時に、排出口６１を閉鎖し、排出された脱離液５９を結合蛋白質回収部６２へ送液する。
【００６９】
測定流路５５内および結合蛋白質生成部６０内でセンシング物質から脱離された結合蛋白質は、脱離液５９とともに、結合蛋白質回収部６２へ送られて、結合蛋白質回収部６２で回収される。その後この結合蛋白質を解析し、その種類および結合状態等を調べる。
【００７０】
すなわち、本実施の形態では、測定チップ３０の薄膜層３２に加え、結合蛋白質生成部６０の薄膜層６４にもセンシング物質が固定され、これらのセンシング物質に蛋白質が結合しているため、センシング物質が測定チップ３０の薄膜層３２のみに固定されている場合に比べて、結合蛋白質の回収量が増加する。
【００７１】
また、本センサーは、流路ユニット５０を測定チップ３０へ取り付け、試料液１５をセンシング物質３３上へ給排しているため、常に新しい試料液１５がセンシング物質３３上に供給されるため、試料液１５中の蛋白質の濃度が変化せず、結合状態の測定を精度良く行うことができる。
【００７２】
さらに、本実施の形態においては、薄膜層６４が設けられている結合蛋白質生成部６０が、測定チップ３０から分離されて配置されているため、薄膜層６４を温調エリア６９の外に設けることができ、温調エリア６９の大型化を防止することができる。
【００７３】
次に、図５を参照して本発明の第３の実施形態について説明する。なお、図５においては、図１中の要素と同等の要素には同番号を付してあり、それらについての説明は特に必要の無い限り省略する。
【００７４】
この第３の実施の形態の全反射減衰を利用したセンサーは、先に説明した漏洩モードセンサーであり、測定チップ９０を用いるように構成されている。この測定チップ９０の誘電体ブロック１１の上面および試料保持枠１３の内壁面にはクラッド層９１が形成され、さらにその上には光導波層９２が形成されている。また光導波層９２の表面上にはセンシング物質１７が固定されている。
【００７５】
誘電体ブロック１１は、例えば合成樹脂やＢＫ７等の光学ガラスを用いて形成されている。一方クラッド層９１は、誘電体ブロック１１よりも低屈折率の誘電体や、金等の金属を用いて薄膜状に形成されている。また光導波層９２は、クラッド層９１よりも高屈折率の誘電体、例えばＰＭＭＡを用いてこれも薄膜状に形成されている。クラッド層９１の膜厚は、例えば金薄膜から形成する場合で３６．５ｎｍ、光導波層９２の膜厚は、例えばＰＭＭＡから形成する場合で７００ｎｍ程度とされる。
【００７６】
上記構成の漏洩モードセンサーにおいて、レーザ光源２１から出射した光ビーム２０を誘電体ブロック１１を通してクラッド層９１に対して全反射角以上の入射角で入射させると、該光ビーム２０が誘電体ブロック１１とクラッド層９１との界面９１ａで全反射するが、クラッド層９１を透過して光導波層９２に特定入射角で入射した特定波数の光は、該光導波層９２を導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層９２に取り込まれるので、上記界面９１ａで全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。
【００７７】
光導波層９２における導波光の波数は、該光導波層９２の上のセンシング物質１７の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、センシング物質１７の屈折率を測定することができ、試料液１５中の蛋白質とセンシング物質１７との結合状態を知ることができる。
【００７８】
本実施形態でも、測定チップ９０のウェル部１６の底面および内壁面の全面にセンシング物質１７が固定され、これらのセンシング物質１７に蛋白質が結合するため、センシング物質１７がウェル部１６の底面のみに固定されている場合に比べて、結合蛋白質の回収量が増加する。
【００７９】
次に図６を参照して本発明の第４の実施の形態について説明する。本実施の形態の表面プラズモンセンサーは、上記第１の実施の形態の表面プラズモンセンサーと比べ測定方法を変更したものである。図６は、本実施の形態の表面プラズモンセンサーの側面形状を示すものであり、本表面プラズモンセンサーの測定位置には、レーザ光源１２０　とＣＣＤ１２１　が配設されており、レーザ光源１２０　とＣＣＤ１２１　との間には、コリメータレンズ１２２　、干渉光学系１２３　、集光レンズ１２４　およびアパーチャー１２５　が配設されている。
【００８０】
上記干渉光学系１２３　は、偏光フィルタ１３１　、ハーフミラー１３２　、ハーフミラー１３３　およびミラー１３４　により構成されている。さらに、ＣＣＤ１２１　は測定手段１３５　に接続されており、測定手段１３５　は表示部６２に接続されている。
【００８１】
以下、本実施の形態の表面プラズモンセンサーにおける測定動作について説明する。レーザ光源１２０　が駆動されて光ビーム１４０　が発散光の状態で出射される。この光ビーム１４０はコリメータレンズ１２２　により平行光化されて偏光フィルタ１３１に入射する。偏光フィルタ１３１　を透過して界面１２ａに対してｐ偏光で入射するようにされた光ビーム１４０　は、ハーフミラー１３２　により一部がレファレンス光ビーム１４０Ｒとして分割され、ハーフミラー１３２　を透過した残りの光ビーム１４０Ｓは界面１２ａに入射する。界面１２ａで全反射した光ビーム１４０Ｓおよびミラー１３４　で反射したレファレンス光ビーム１４０Ｒはハーフミラー１３３　に入射して合成される。合成された光ビーム１４０’は集光レンズ１２４　により集光され、アパーチャー１２５　を通過してＣＣＤ１２１　によって検出される。このとき、ＣＣＤ１２１　で検出される光ビーム１４０’は、光ビーム１４０Ｓとレファレンス光ビーム１４０Ｒとの干渉の状態に応じて干渉縞を発生させる。
【００８２】
ここで、試料液１５中の蛋白質が薄膜層１２の表面に固定されているセンシング物質１７と結合するか否かを、試料液１５を測定チップ１０へ供給後、継続的に測定を行い、ＣＣＤ１２１　により検出される干渉縞の変化を検出することにより、判定することができる。
【００８３】
すなわち、上記試料液１５中の蛋白質とセンシング物質１７との結合状態に応じてセンシング物質１７の屈折率が変化するため、界面１２ａで全反射した光ビーム１４０Ｓおよびレファレンス光ビーム１４０Ｒがハーフミラー１３３　により合成される際に、干渉の状態が変化するため、上記干渉縞の変化に応じて結合反応の有無を検出することができる。測定手段１３５　は、以上の原理に基づいて上記反応の有無を検出し、その結果が表示部２５に表示される。
【００８４】
本実施形態でも、測定チップ１０のウェル部１６の底面および内壁面の全面にセンシング物質１７が固定され、これらのセンシング物質１７に蛋白質が結合するため、センシング物質１７がウェル部１６の底面のみに固定されている場合に比べて、結合蛋白質の回収量が増加する。
【００８５】
なお、上記各実施の形態においては、誘電体ブロックが薄膜層とともに、使い切りされる測定チップを構成しているが、誘電体ブロックがチップ化されずに、表面プラズモンセンサー本体に組み込まれる場合であっても、同様の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態による表面プラズモンセンサーの側面図
【図２】上記表面プラズモンセンサーにおける光ビーム入射角と反射光強度との関係の説明図
【図３】本発明の第２の実施の形態による表面プラズモンセンサーの側面図
【図４】上記表面プラズモンセンサーにおける流路ユニットの上面図および側断面図
【図５】本発明の第３の実施の形態による漏洩モードセンサーの側面図
【図６】本発明の第４の実施の形態による表面プラズモンセンサーの側面図
【符号の説明】
１０，３０，９０　　測定チップ
１１，３１　　　誘電体ブロック
１２，１４，３２，６４　　　薄膜層
１２ａ　　　　誘電体ブロックと薄膜層との界面
１３　　　　　試料保持枠
１５　　　　　試料液
１６　　　　　ウェル部
１７，３３　　　　センシング物質
２０　　　　　光ビーム
２１　　　　　光源
２２　　　　　集光レンズ
２３　　　　　光検出器
２４　　　　　信号処理部
２６　　　　　測定手段
５０　　　　　流路ユニット
５１　　　　　流路ホルダー
５２　　　　　供給路
５３　　　　　排出路
６０　　　　　結合蛋白質生成部
６２　　　　　結合蛋白質回収部
６９　　　　　温調エリア
９１　　　　　クラッド層
９１ａ　　　　誘電体ブロックとクラッド層との界面
９２　　　　　光導波層
１２０　　　　　レーザ光源
１２１　　　　ＣＣＤ
１２２　　　　コリメータレンズ
１２３　　　　干渉光学系
１２４　　　　集光レンズ
１２５　　　　アパーチャー
１３４　　　　ミラー
１３５　　　　測定手段
１４０　　　　光ビーム
【図１】
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【図２】
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【図３】
2004028832.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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