(57)【要約】【課題】第１、第２の光の光学的調整を容易かつ高精度にでき、超解像効果や期待する光学性能を確実に発現できる顕微鏡及びその光学調整方法を提供する。【解決手段】試料７４に含まれた分子を基底状態から第１電子励起状態に励起する第１の光源１１からの第１の光を二次元的に偏向する第１の偏向手段１４ａ，１４ｂと、上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起する第２の光源１２からの第２の光を二次元的に偏向する第２の偏向手段１７ａ，１７ｂと、偏向された第１、第２の光を同一光軸または互いに平行な光軸に合成する合成手段１６と、合成された第１、第２の光を同時に偏向する第３の偏向手段１９ａ，１９ｂとを有し、これら第１〜第３の偏向手段により第１、第２の光の光軸を調整して、集光光学系７２により一部重ね合わせて試料７４に照射することにより、その発光を検出するようにする。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するための第１の光源からの第１の光と、上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するための第２の光源からの第２の光とを、集光光学系により一部重ね合わせて照射して、上記試料からの発光を検出するようにした顕微鏡において、
上記第１の光源からの第１の光を二次元的に偏向する第１の偏向手段と、
上記第２の光源からの第２の光を二次元的に偏向する第２の偏向手段と、
上記第１の偏向手段により偏向された第１の光および上記第２の偏向手段により偏向された第２の光を、同一光軸上または互いに平行な光軸上を同一方向に進行するように合成する合成手段と、
上記合成手段で合成された第１の光および第２の光を同時に偏向する第３の偏向手段とを有することを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
上記第１の偏向手段は、互いに独立して偏向角を調整可能な少なくとも二つの角度調整ミラーまたはプリズムを有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
上記第２の偏向手段は、互いに独立して偏向角を調整可能な少なくとも二つの角度調整ミラーまたはプリズムを有することを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
上記第３の偏向手段は、互いに独立して偏向角を調整可能な少なくとも二つの角度調整ミラーまたはプリズムを有することを特徴とする請求項１，２または３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
上記第１の光源と上記第１の偏向手段との間の光路中および／または上記第２の光源と上記第２の偏向手段との間の光路中に位相変調素子を設けたことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項６】
上記第１の光源と上記合成手段との間の光路中に、上記第１の光の発散角を調整する第１の発散角調整手段を設けたことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項７】
上記第２の光源と上記合成手段との間の光路中に、上記第２の光の発散角を調整する第２の発散角調整手段を設けたことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項８】
上記合成手段で合成された第１の光および第２の光の光路中に、これら第１の光および第２の光の発散角を同時に調整する第３の発散角調整手段を設けたことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項９】
上記第１の発散角調整手段が、光学レンズまたは反射鏡からなることを特徴とする請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
上記第２の発散角調整手段が、光学レンズまたは反射鏡からなることを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡。
【請求項１１】
上記第３の発散角調整手段が、光学レンズまたは反射鏡からなることを特徴とする請求項８に記載の顕微鏡。
【請求項１２】
上記第１の発散角調整手段および上記第１の偏向手段の光学精度を、上記第１の光の波長に対して１／１０波長以下としたことを特徴とする請求項６または９に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
上記第２の発散角調整手段および上記第２の偏向手段の光学精度を、上記第２の光の波長に対して１／１０波長以下としたことを特徴とする請求項７または１０に記載の顕微鏡。
【請求項１４】
上記第１の光および／または上記第２の光のビーム径を調整するビーム径調整手段を設けたことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１５】
上記集光光学系の焦点面における上記第１の光および上記第２の光の集光状態を観察する観察手段を設けたことを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１６】
請求項１５に記載の顕微鏡の光学調整方法であって、
上記集光光学系の焦点面に反射部材を設置して上記観察手段により上記焦点面を観察しながら、上記第１の偏向手段および上記第２の偏向手段により上記第１の光の光軸および上記第２の光の光軸を独立して調整すると共に、上記第３の偏向手段により上記第１の光の光軸および上記第２の光の光軸を同時に調整して、上記焦点面における上記第１の光および上記第２の光の位置合わせを行うことを特徴とする顕微鏡の光学調整方法。
【請求項１７】
上記反射部材としてスライドガラスを用いることを特徴とする請求項１６に記載の顕微鏡の光学調整方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の新しい光学顕微鏡およびその光学調整方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図４〜図７を参照して説明する。図４は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図４に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の第１の光により励起して、図５に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の第２の光により同様に励起して、図６に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図７に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図５の吸収過程や図７の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図５のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図６のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図６の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図４に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図８は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の第１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、更に波長λ２の第２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図８はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図８に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図９は、図８と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の第２の光を照射した空間領域Ａ１と第２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図９において、空間領域Ａ０では波長λ１の第１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の第２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図９の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。以下、波長λ１の第１の光をポンプ光とも呼び、波長λ２の第２の光をイレース光とも呼ぶ。
【００１７】
図１０は、通常のレーザ走査型蛍光顕微鏡を前提にした従来の超解像顕微鏡の概略構成を示すものである。この超解像顕微鏡は、主に、光源ユニット５０、スキャンユニット６０および顕微鏡ユニット７０の独立した三つのユニットから構成されている。
【００１８】
光源ユニット５０は、波長５３２ｎｍ（２倍高調波）のポンプ光を発生するＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ５１と、波長６４７ｎｍのイレース光を発生する連続発振型のＫｒレーザ５２と、イレース光を空間変調する位相板５３と、ポンプ光およびイレース光を同軸上に融合するビームコンバイナ５４とを有しており、ＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ５１からのポンプ光と、Ｋｒレーザ５２から発生されて位相板５３で空間変調されたイレース光とをビームコンバイナ５４で同軸上に合成してスキャンユニット６０に出射するようになっている。
【００１９】
ここで、位相板５３は、光軸対称位置を通過するイレース光の位相が反転するように光学薄膜を蒸着して構成され、例えば図１１に示すように、光軸の周りにイレース光の波長に対して１／４ずつ位相を異ならせた独立した四つの領域を有して構成される。したがって、この位相板５３を透過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺された中空状のイレース光が生成される。
【００２０】
スキャンユニット６０は、ハーフミラー６１、ガルバノミラー６２および６３、投影レンズ６４、ピンホール６５、ノッチフィルタ６６および６７、光電子増倍管６８を有している。このスキャンユニット６０では、光源ユニット５０からのポンプ光およびイレース光を、ハーフミラー６１を透過させた後、ガルバノミラー６２および６３により二次元方向に偏向させて顕微鏡ユニット７０に出射させると共に、顕微鏡ユニット７０で検出される蛍光を、ガルバノミラー６３および６２を経てハーフミラー６１で反射させた後、投影レンズ６４、ピンホール６５、ノッチフィルタ６６および６７を経て光電子増倍管６８で受光するようになっている。
【００２１】
ここで、ピンホール６５は、共焦点位置に配置されており、空間フィルタとして機能する。これは、顕微鏡ユニット７０にセットされる試料以外から発する、例えば光学系からの蛍光や散乱光をカットして測定のＳ／Ｎを高める作用をなすのと同時に、試料内の特定の深さ部分から発光した蛍光のみを選別するオプティカルセクショニングの機能をもつ。また、ノッチフィルタ６６および６７は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去する役目をする。
【００２２】
顕微鏡ユニット７０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、ハーフミラー７１、対物レンズ７２および接眼レンズ７３を有しており、スキャンユニット６０からのポンプ光およびイレース光を、ハーフミラー７１で反射させた後、集光光学系を構成する対物レンズ７２により試料７４に集光させ、これにより試料７４から発する蛍光を、対物レンズ７２を経てハーフミラー７１で反射させてスキャンユニット６０に出射させると共に、ハーフミラー７１を透過した蛍光を観察手段を構成する接眼レンズ７３に導いて蛍光像を目視観察できるようになっている。
【００２３】
この超解像顕微鏡によると、試料７４の集光点上において、イレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光が抑制されるので、ポンプ光（波長λ１）の広がりより狭い領域（Δ＜０．６１・λ１／ＮＡ、ＮＡは対物レンズ７２の開口数）に存在する蛍光ラベラー分子のみが観察され、結果的に超解像性が発現することになる。したがって、ポンプ光およびイレース光をスキャンユニット６０で走査しながら蛍光信号を測定すれば、超解像の２次元蛍光像を得ることができる。
【００２４】
【特許文献１】
特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】
特開２００１−１００１０２号公報
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来提案されている超解像顕微鏡にあっては、実用上、以下に説明するような問題がある。すなわち、超解像顕微鏡では、ポンプ光の中心部とイレース光の中心部とを確実に位置合わせして、集光したポンプ光の辺縁部の蛍光を消去することが最大のキーテクノロジーであり、ポンプ光およびイレース光の集光位置がずれると、ポンプ光の中央部の蛍光も消去されて、結果として全体の蛍光強度が低下するだけで、空間分解能は向上せず、Ｓ／Ｎだけが悪くなることになる。
【００２６】
ところが、超解像顕微鏡では、ポンプ光およびイレース光を回折限界に絞り込んだサイズが数１００ｎｍとなるため、その位置合わせ精度は少なくとも１００ｎｍのオーダを上回ることになる。このため、図１０に示したように、単に、ＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ５１から出射されるポンプ光と、Ｋｒレーザ５２から位相板５３を経て出射されるイレース光とを、ビームコンバイナ５４に直接入射させて高精度に位置合わせするのは極めて困難である。
【００２７】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、第１の光および第２の光の光学的調整を容易かつ高精度に行うことができ、超解像効果や期待する光学性能を確実に発現できる顕微鏡およびその光学調整方法を提供することにある。
【００２８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する請求項１に係る発明は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するための第１の光源からの第１の光と、上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するための第２の光源からの第２の光とを、集光光学系により一部重ね合わせて照射して、上記試料からの発光を検出するようにした顕微鏡において、
上記第１の光源からの第１の光を二次元的に偏向する第１の偏向手段と、
上記第２の光源からの第２の光を二次元的に偏向する第２の偏向手段と、
上記第１の偏向手段により偏向された第１の光および上記第２の偏向手段により偏向された第２の光を、同一光軸上または互いに平行な光軸上を同一方向に進行するように合成する合成手段と、
上記合成手段で合成された第１の光および第２の光を同時に偏向する第３の偏向手段とを有することを特徴とするものである。
【００２９】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、上記第１の偏向手段は、互いに独立して偏向角を調整可能な少なくとも二つの角度調整ミラーまたはプリズムを有することを特徴とするものである。
【００３０】
請求項３に係る発明は、請求項１または２に記載の顕微鏡において、上記第２の偏向手段は、互いに独立して偏向角を調整可能な少なくとも二つの角度調整ミラーまたはプリズムを有することを特徴とするものである。
【００３１】
請求項４に係る発明は、請求項１，２または３に記載の顕微鏡において、上記第３の偏向手段は、互いに独立して偏向角を調整可能な少なくとも二つの角度調整ミラーまたはプリズムを有することを特徴とするものである。
【００３２】
請求項５に係る発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡において、上記第１の光源と上記第１の偏向手段との間の光路中および／または上記第２の光源と上記第２の偏向手段との間の光路中に位相変調素子を設けたことを特徴とするものである。
【００３３】
請求項６に係る発明は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡において、上記第１の光源と上記合成手段との間の光路中に、上記第１の光の発散角を調整する第１の発散角調整手段を設けたことを特徴とするものである。
【００３４】
請求項７に係る発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の顕微鏡において、上記第２の光源と上記合成手段との間の光路中に、上記第２の光の発散角を調整する第２の発散角調整手段を設けたことを特徴とするものである。
【００３５】
請求項８に係る発明は、請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡において、上記合成手段で合成された第１の光および第２の光の光路中に、これら第１の光および第２の光の発散角を同時に調整する第３の発散角調整手段を設けたことを特徴とするものである。
【００３６】
請求項９に係る発明は、請求項６に記載の顕微鏡において、上記第１の発散角調整手段が、光学レンズまたは反射鏡からなることを特徴とするものである。
【００３７】
請求項１０に係る発明は、請求項７に記載の顕微鏡において、上記第２の発散角調整手段が、光学レンズまたは反射鏡からなることを特徴とするものである。
【００３８】
請求項１１に係る発明は、請求項８に記載の顕微鏡において、上記第３の発散角調整手段が、光学レンズまたは反射鏡からなることを特徴とするものである。
【００３９】
請求項１２に係る発明は、請求項６または９に記載の顕微鏡において、上記第１の発散角調整手段および上記第１の偏向手段の光学精度を、上記第１の光の波長に対して１／１０波長以下としたことを特徴とするものである。
【００４０】
請求項１３に係る発明は、請求項７または１０に記載の顕微鏡において、上記第２の発散角調整手段および上記第２の偏向手段の光学精度を、上記第２の光の波長に対して１／１０波長以下としたことを特徴とするものである。
【００４１】
請求項１４に係る発明は、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の顕微鏡において、上記第１の光および／または上記第２の光のビーム径を調整するビーム径調整手段を設けたことを特徴とするものである。
【００４２】
請求項１５に係る発明は、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の顕微鏡において、上記集光光学系の焦点面における上記第１の光および上記第２の光の集光状態を観察する観察手段を設けたことを特徴とするものである。
【００４３】
請求項１６に係る発明は、請求項１５に記載の顕微鏡の光学調整方法であって、
上記集光光学系の焦点面に反射部材を設置して上記観察手段により上記焦点面を観察しながら、上記第１の偏向手段および上記第２の偏向手段により上記第１の光の光軸および上記第２の光の光軸を独立して調整すると共に、上記第３の偏向手段により上記第１の光の光軸および上記第２の光の光軸を同時に調整して、上記焦点面における上記第１の光および上記第２の光の位置合わせを行うことを特徴とするものである。
【００４４】
請求項１７に係る発明は、請求項１６に記載の顕微鏡の光学調整方法において、上記反射部材としてスライドガラスを用いることを特徴とするものである。
【００４５】
本発明は、波長の異なる第１の光および第２の光を同時に照射する光走査型顕微鏡に適用可能であり、第１の偏向手段および第２の偏向手段により第１の光および第２の光の偏向方向を独立して調整することで、合成手段において第１の光および第２の光を同一光軸上または互いに平行な光軸上を同一方向に進行するように合成することが可能となり、また合成された第１の光および第２の光の偏向方向を第３の偏向手段により同時に調整することで、焦点面における第１の光および第２の光の位置合わせを容易かつ高精度で行うことが可能となり、その結果、超解像顕微鏡においては超解像効果を確実に発現することが可能となる。
【００４６】
また、第１の光の発散角を調整する第１の発散角調整手段、第２の光の発散角を調整する第２の発散角調整手段、第１の光および第２の光の発散角を同時に調整する第３の発散角調整手段を適宜付加したり、第１の光および／または第２の光のビーム径を調整するビーム径調整手段を適宜付加したりすることで、より確実に第１の光および第２の光を同一焦点面に最小サイズで集光することが可能となる。
【００４７】
さらに、第１の光源と第１の偏向手段との間の光路中および／または第２の光源と第２の偏向手段との間の光路中に位相変調素子を設けることで、第１の光および／または第２の光を確実に空間変調した後に、それらの光軸調整を行うことが可能となり、光軸調整によって第１の光および／または第２の光の変調条件が影響されることもなくなる。また、第１の発散角調整手段および第１の偏向手段の光学精度（波面収差）を第１の光の波長に対して１／１０波長以下としたり、第２の発散角調整手段および第２の偏向手段の光学精度（波面収差）を第２の光の波長に対して１／１０波長以下としたりすることで、変調された位相分布の乱れを抑制でき、顕微鏡機能の劣化を防止することが可能となる。
【００４８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００４９】
図１は、本発明の一実施の形態における顕微鏡の概略構成を示すもので、蛍光抑制効果を用いた超解像顕微鏡に適用した場合の構成を示している。この超解像顕微鏡は、図１０に示した超解像顕微鏡と同様に、主として、光源ユニット１０、スキャンユニット３０および顕微鏡ユニット４０の独立した三つのユニットから構成されているが、スキャンユニット３０および顕微鏡ユニット４０については、図１０に示したスキャンユニット６０および顕微鏡ユニット７０と同様の構成であるので、同一構成要素には同一参照番号を付してその説明を省略し、光源ユニット１０について詳細に説明する。以下、ローダミン６Ｇで染色された生体試料を観察する場合を例にとって説明する。
【００５０】
ローダミン６Ｇは、波長５３０ｎｍ近傍に基底状態（Ｓ０）から第１電子励起状態（Ｓ１）に励起される吸収帯があり、また、波長６００ｎｍ〜６５０ｎｍの帯域に第１電子励起状態（Ｓ１）から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態（Ｓ２）に励起される二重共鳴吸収帯域が存在することが確認されている（例えば、Ｅ．Ｓａｈａｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｔｒｅｖｅｓ：ＩＥＥＥ，Ｊ．Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ．，ＱＥ−１３，６９２（１９７７）参照）。
【００５１】
そこで、本実施の形態では、第１の光源としてＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ１１を用い、このＮｄ：ＹＡＧレーザ１１から出力される２倍高調波の波長５３２ｎｍのレーザ光をポンプ光（第１の光）として用いる。また、第２の光源は連続発振型のＫｒレーザ１２を用い、このＫｒレーザ１２から出力される波長６４７ｎｍのレーザ光をイレース光（第２の光）として用い、このイレース光を、図１１に示した位相板と同様の構成からなる位相板１３を透過させることにより空間変調して中空ビームに整形する。
【００５２】
ところで、超解像顕微鏡では、顕微鏡ユニット４０の試料焦点面で、ポンプ光とイレース光とが完全に同光軸で、集光点が一致することが不可欠である。そのためには、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ１１からのポンプ光およびＫｒレーザ１２からのイレース光のそれぞれの発散角を調整して、完全に平行光とすることが要求される。また、ポンプ光とイレース光とを最小サイズで集光するためには、それらのビーム径と顕微鏡ユニット４０の集光光学系を構成する対物レンズ７２の口径とを一致させることも要求される。
【００５３】
このため、本実施の形態では、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ１１からのポンプ光を、第１の偏向手段としての例えば二枚の角度調整ミラー１４ａ，１４ｂにより二次元的に偏向して光軸を調整すると共に、第１の発散角調整手段としての例えば発散角調整レンズ１５により完全な平行光に調整して、合成手段を構成するビームコンバイナ１６に入射させる。
【００５４】
同様に、Ｋｒレーザ１２からのイレース光についても、第２の偏向手段としての例えば二枚の角度調整ミラー１７ａ，１７ｂにより二次元的に偏向して光軸を調整すると共に、第２の発散角調整手段としての例えば発散角調整レンズ１８により完全な平行光に調整して、ビームコンバイナ１６に入射させる。これにより、ビームコンバイナ１６においてポンプ光とイレース光とを同軸上に合成する。
【００５５】
また、ビームコンバイナ１６で同軸上に合成されて出射されるポンプ光およびイレース光は、第３の偏向手段としての例えば二枚の角度調整ミラー１９ａ，１９ｂにより二次元的に同時に偏向して、スキャンユニット３０に対する光軸を調整すると共に、ビーム径調整手段としての例えばアイリス２０によりポンプ光およびイレース光のビーム径を、顕微鏡ユニット４０の対物レンズ７２の口径と一致するように調整してスキャンユニット３０に出射する。さらに、必要に応じて、ビームコンバイナ１６の出射側にも、第３の発散角調整手段としての例えば発散角調整レンズ２１を設け、これによりポンプ光およびイレース光を、同時に平行光に調整し直す。
【００５６】
上述した調整作業は、顕微鏡ユニット４０の焦点面に反射部材としての例えばスライドガラスを配置し、このスライドガラスで反射されるポンプ光およびイレース光を、観察手段を構成する接眼レンズ７３を通して観察しながら行う。
【００５７】
さらに詳しくは、先ず、位相板１３をイレース光の光路から外した状態で、接眼レンズ７３を通して焦点面を観察しながら、上述したようにしてポンプ光とイレース光との光軸を調整する。次に、イレース光の光路に位相板１３を挿入してイレース光を中空状に空間変調し、その状態で、イレース光が焦点面において期待通りの中空状になっているか否かを、同様に接眼レンズ７３を通して確認する。ここで、イレース光が完全な中空状になっていない場合には、接眼レンズ７３を通して焦点面におけるイレース光のスポット形状を観察しながら、位相板１３の中心とイレース光の光軸とが完全に一致するように、位相板１３の挿入位置を微調整する。
【００５８】
以上の調整により、顕微鏡ユニット４０の焦点面において、イレース光の中空部中央とポンプ光の強度中心とを一致させて超解像効果を発現できる調整条件を確立し、顕微鏡システム全体の光学調整を終了する。
【００５９】
その後は、顕微鏡ユニット４０の焦点面に色素発光体を含む試料７４を設置し、スキャンユニット３０のガルバノミラー６２，６３によりポンプ光およびイレース光を二次元走査しながら、試料７４からの蛍光を光電子増倍管６８で受光すれば、コンピュータ上で二次元蛍光画像を得ることができる。また、接眼レンズ７３を含む観察光学系に散乱光を取り除くための適当なフィルタを挿入すれば、試料面における蛍光抑制効果も直接目視することができる。
【００６０】
ところで、図１に示す構成において、位相板１３にイレース光を入射させると、理論的にはイレース光は理想的な中空状に整形されるが、例えば光源ユニット１０内のイレース光の光路に配置されている光学素子の加工精度が不十分であったりすると、光軸調整によってイレース光の波面が乱れて集光点で崩れた形状に変形し、結果として超解像性が発現せず、Ｓ／Ｎが低下するだけになると言う弊害が生じる。
【００６１】
これを防止するには、例えば、Ｋｒレーザ１２と第２の偏向手段を構成する角度調整ミラー１７ａとの間に、例えば位相板からなる位相変調素子を配置して、イレース光を確実に空間変調する。このようにすれば、光軸調整によってイレース光の変調条件に影響を与えることがなくなる。
【００６２】
ポンプ光についても同様で、光軸調整によってポンプ光の波面が乱れて集光点で崩れた形状に変形する場合には、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ１１と第１の偏向手段を構成する角度調整ミラー１４ａとの間に、例えば位相板からなる位相変調素子を配置して、ポンプ光を確実に空間変調すれば、光軸調整によってポンプ光の変調条件に影響を与えることがなくなる。
【００６３】
また、本発明者による実験検討によると、光学素子の加工精度が、波長λに対してｒ．ｍ．ｓの評価でλ／１０以下の波面収差を発生させる程度であれば、集光点において比較的良好な形状のスポットが得られることが確かめられた。図２（ａ）および（ｂ）はその実験結果を示すもので、図２（ａ）は一枚の集光レンズが発生する波面収差がλ／１０のときのスポット形状と強度分布とを示しており、図２（ｂ）は同じくλ／４のときのスポット形状と強度分布とを示している。
【００６４】
図３は、上記の実験に用いた評価システムの構成を示すものである。この評価システムは、Ｈｅ−Ｎｅレーザ８１からの波長λ（６３２ｎｍ）のレーザ光を、空間フィルタ８２で均一波面に変換した後、λ／２０の光学精度を有するコリメータレンズ８３で平行光に変換して液晶型光書き込み光空間変調器８４に入射させ、ここで空間変調されて反射される反射光を、交換可能な結像レンズ８５により結像して、そのスポット像をＣＣＤカメラ８６で撮影するようにしたものである。なお、液晶型光書き込み光空間変調器８４は、波面収差がλ／１０以下となるように予め波面補正しておくと共に、この液晶型光書き込み光空間変調器８４には、図１１に示した位相板に対応する屈折率分布を光書き込みしておく。
【００６５】
図２（ａ）は、上記の評価システムにおいて、結像レンズ８５として波面収差がλ／１０のものを用いた場合のＣＣＤカメラ８６による結像スポットの撮影画像を示しており、図２（ｂ）は、結像レンズ８５として波面収差がλ／４のものを用いた場合のＣＣＤカメラ８６による結像スポットの撮影画像を示している。
【００６６】
図２（ａ）および（ｂ）から明らかなように、図２（ａ）に示す波面収差がλ／１０の場合には、スポット形状が良好なリング形状を成しており、上下左右の強度もバランスがとれている。これに対して、図２（ｂ）に示す波面収差がλ／４の場合には、スポット形状が上下左右で強度バランスが崩れた形状に歪んでおり、中央部分にも強度成分が残存している。なお、ポンプ光についても同様で、発生する波面収差がλ／１０以下のときは、スポット形状は良好な円形となるが、λ／４の波面収差が発生すると、スポット形状は良好な円形とならず、歪んだものとなってしまう。
【００６７】
したがって、本実施の形態では、好ましくは、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ１１からビームコンバイナ１６に至るポンプ光の光路に配置される光学素子の光学精度、すなわち図１においては第１の偏向手段を構成する角度調整ミラー１４ａ，１４ｂおよび第１の発散角調整手段を構成する角度調整レンズ１５のそれぞれの光学精度を、ポンプ光の波長（５３２ｎｍ）に対して１／１０波長以下とする。同様に、Ｋｒレーザ１２からビームコンバイナ１６に至るイレース光の光路に配置される光学素子の光学精度、すなわち図１においては第２の偏向手段を構成する角度調整ミラー１７ａ，１７ｂおよび第２の発散角調整手段を構成する角度調整レンズ１８のそれぞれの光学精度を、イレース光の波長（６４７ｎｍ）に対して１／１０波長以下とする。このようにすれば、ポンプ光およびイレース光の位相分布の乱れを抑制でき、顕微鏡機能の劣化を防止することができる。
【００６８】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記実施の形態では、アイリス２０を用いてビーム径調整手段を構成したが、複数枚のレンズからなる可変焦点の光学系を用いてビーム径調整手段を構成することもできる。また、本発明は、第１の光および第２の光を同一光軸上に合成する場合に限らず、互いに平行な光軸上を同一方向に進行するように合成する場合にも有効に適用することができる。この場合、第１の光および第２の光のビーム径を調整する場合には、それぞれ独立して調整すればよい。
【００６９】
また、第１〜第３の各偏向手段は、角度調整ミラーに限らず、プリズムや回折格子を用いて構成したり、あるいはそれらを適宜組み合わせて構成したりすることもできる。さらに、第１〜第３の各発散角調整手段は、発散角調整レンズに限らず、凹面鏡等の反射鏡や可変焦点の光学系を用いて構成することもできる。
【００７０】
また、本発明は、蛍光抑制効果を利用する超解像顕微鏡に限らず、特許文献１に開示されているような二重共鳴吸収過程で誘起される過渡吸収を検出する二波長の光を利用する顕微鏡等、二波長の光を空間的に重ね合わせて使用する走査型光学顕微鏡に広く適用することができる。
【００７１】
【発明の効果】
本発明によれば、波長の異なる第１の光および第２の光を一部重ね合わせて試料に照射する顕微鏡において、第１の光を二次元的に偏向する第１の偏向手段、第２の光を二次元的に偏向する第２の偏向手段、第１の光および第２の光を同時に偏向する第３の偏向手段を設けたので、第１の光および第２の光の光学的調整を容易かつ高精度に行うことができ、超解像効果や期待する光学性能を確実に発現することができる。
【００７２】
また、本発明による顕微鏡の光学調整方法によれば、集光光学系の焦点面に反射部材を設置して顕微鏡の観察手段により焦点面を観察しながら、第１の偏向手段による第１の光の光軸調整および第２の偏向手段による第２の光の光軸調整を独立して行うと共に、第３の偏向手段により第１の光および第２の光の光軸調整を同時に行うようにしたので、焦点面における第１の光および第２の光の位置合わせを容易かつ高精度に行うことができ、超解像効果や期待する光学性能を確実に発現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態における顕微鏡の概略構成図である。
【図２】光学素子の波面収差による影響を説明するための図である。
【図３】波面収差を評価するシステムの一例の構成を示す図である。
【図４】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図５】図４の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図６】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図７】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図８】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図９】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１０】従来の超解像顕微鏡の一例の構成を示す図である。
【図１１】図１０に示す位相板の構成を示す斜視図である。
【符号の説明】
１０  光源ユニット
１１  Ｎｄ：ＹＡＧレーザ（第１の光源）
１２  Ｋｒレーザ（第２の光源）
１３  位相板
１４ａ，１４ｂ  角度調整ミラー（第１の偏向手段）
１５  発散角調整レンズ（第１の発散角調整手段）
１６  ビームコンバイナ（合成手段）
１７ａ，１７ｂ  角度調整ミラー（第２の偏向手段）
１８  発散角調整レンズ（第２の発散角調整手段）
１９ａ，１９ｂ  角度調整ミラー（第３の偏向手段）
２０  アイリス（ビーム径調整手段）
２１  発散角調整レンズ（第３の発散角調整手段）
３０  スキャンユニット
４０  顕微鏡ユニット
７２  対物レンズ（集光光学系）
７３  接眼レンズ（観察手段）
７４  試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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