(57)【要約】　　　（修正有）【課題】筋分化制御因子知られるＩｄタンパク質をコードする遺伝子に関連するオリゴヌクレオチドを提供する。【解決手段】特定の塩基配列を有するヒトＩｄ遺伝子の塩基配列の、部分配列またはその変異配列から成る診断用プローブ、及び該ヒトＩｄ遺伝子配列の部分配列またはその変異配列に相補的な塩基配列から成るアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１又は配列番号２に記載の塩基配列の部分配列から成るオリゴヌクレオチドであって、診断用プローブとして使用できる長さの塩基数を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１又は配列番号２に記載の塩基配列の部分配列に相補的な塩基配列から成るアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、Ｉｄタンパク質の合成を阻害できる長さの塩基数を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒトＩｄ遺伝子に関し、さらに詳しくは、ヒトＩｄタンパク質をコードしている２種の遺伝子Ｉｄ−１Ｈ及びＩｄ−１Ｈ′（以下、両者を「ヒトＩｄ遺伝子」という）、該ヒトＩｄ遺伝子を組込んだ発現ベクター、該発現ベクターを導入した形質転換細胞、該形質転換細胞を培養して得られる組換えＩｄタンパク質、該ヒトＩｄ遺伝子の塩基配列の部分配列またはその変異配列から成る診断用プローブ、及び該ヒトＩｄ遺伝子配列の部分配列またはその変異配列に相補的な塩基配列から成るアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス治療に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
Ｉｄタンパク質は、マウス線維芽細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２において筋特異的遺伝子の活性を抑える筋分化制御因子として見出された〔Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６１，４９−５９ページ（１９９０年）〕。その後の研究により、Ｉｄタンパク質は、多くの増殖中の細胞に認められ、血清や成長因子を除去したり細胞が分化する際に減少することが明らかになった〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８８，１８１５−１８１９ページ（１９９１年）〕。以上の事実から、細胞中でのＩｄタンパク質の存在及びＩｄタンパク質をコードしているＩｄ遺伝子の発現は、細胞の増殖状態、分化・老化の状態を判断する指標のひとつであると位置づけられる。
【０００３】
マウスＩｄ遺伝子としては、現在３種類の遺伝子Ｉｄ−１、Ｉｄ−２、ＨＬＨ４６２が知られている。しかしながら、従来、ヒト細胞中に存在するＩｄ遺伝子としては、マウスＩｄ−２遺伝子に対応するヒトＩｄ−２遺伝子が知られているのみである〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８９，１５１２−１５１６ページ（１９９２年）〕。したがって、未知のヒトＩｄ遺伝子が何種類か存在すると考えられていた。今後、Ｉｄ遺伝子及びそれに関する知見をヒト及びヒト細胞についての基礎実験、診断、治療に適用することを考えた場合、未知のヒトＩｄ遺伝子の取得は早期に克服すべき課題であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規なヒトＩｄ遺伝子を提供することにある。また、本発明の目的は、該ヒトＩｄ遺伝子を組込んだ発現ベクター、該発現ベクターを導入した形質転換細胞、該形質転換細胞を培養して得られる組換えＩｄタンパク質、該ヒトＩｄ遺伝子の塩基配列の部分配列またはその変異配列から成る診断用プローブ、及び該ヒトＩｄ遺伝子配列の部分配列またはその変異配列に相補的な塩基配列から成るアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することにある。
【０００５】
本発明者等は、前記の課題を解決するために鋭意検討した結果、マウスＩｄ−１遺伝子に対応する新規ヒトＩｄ遺伝子としてＩｄ−１Ｈ及びＩｄ−１Ｈ′を単離することに成功した。この２種のヒトＩｄ遺伝子は、オールタネート・スプライシングにより、ゲノム上の同一の遺伝子座に由来する。単離したヒトＩｄ遺伝子を発現ベクターに組み込んで、該発現ベクターを大腸菌細胞に導入することにより、組換えＩｄタンパク質を大量に調製することに成功した。さらに、Ｉｄ−１Ｈ及びＩｄ−１Ｈ′遺伝子の発現が、細胞の増殖状態、特に細胞老化・永久増殖能獲得に対応して特異的に変動することを見出し、診断用プローブ等として利用可能であることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
かくして、本発明によれば、後記の配列表中、配列番号１の塩基配列で表されるヒトＩｄ遺伝子（Ｉｄ−１Ｈ）、配列番号２の塩基配列で表されるヒトＩｄ遺伝子（Ｉｄ−１Ｈ′）、及びこれらの変異体が提供される。また、本発明によれば、上記のヒトＩｄ遺伝子またはその変異体を組込んだ新規な発現ベクター、及び該発現ベクターを導入した新規な形質転換細胞が提供される。さらに、本発明によれば、上記の形質転換細胞を培養して得られる組換えＩｄタンパク質が提供される。
【０００７】
前記ヒトＩｄ遺伝子の塩基配列の部分配列またはその変異配列を化学合成することにより、診断用プローブが得られる。また、前記のヒトＩｄ遺伝子の塩基配列の部分配列またはその変異配列に相補的な塩基配列から成るアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成すれば、アンチセンス治療等に利用できる。以下、本発明について詳述する。
【０００８】
（１）ヒトＩｄ遺伝子の単離
本発明のヒトＩｄ遺伝子（Ｉｄ−１Ｈ及びＩｄ−１Ｈ′）は、ヒト線維芽細胞ＴＩＧ−１から得られたｃＤＮＡである。このｃＤＮＡは、次のようにして調製することができる先ず、公知のマウスＩｄ遺伝子３種（Ｉｄ−１、Ｉｄ−２、ＨＬＨ４６２）のＤＮＡ配列において共通性が高く、タンパク質が機能を発揮する上で不可欠であると考えられる塩基配列に相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドを合成する。次いで、合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして、ヒト線維芽細胞ＴＩＧ−１のｃＤＮＡライブラリーより、該プローブに相補的なｃＤＮＡを持つクローンをハイブリダイゼーション法によりスクリーニングし、ヒトＩｄ遺伝子を単離する。
【０００９】
プローブとして使用した２種の合成オリゴヌクレオチド（ＨＬＨ−１及びＨＬＨ−２）の塩基配列を図１及び図２に示す。これらの２種類の塩基配列は、前記３種のマウスＩｄ遺伝子がコードするアミノ酸配列中、３種間でアミノ酸配列がほぼ完全に共通している領域（α−ヘリックス部分２箇所に相当）２箇所に対応する塩基配列（各３８ｍｅｒ）である。アミノ酸配列をもとにオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて合成しているため、各合成オリゴヌクレオチドは、縮重により、図１または図２に示すように、塩基配列の異なる部分を有するものの混合物として得られる。
【００１０】
得られた２種のヒトＩｄ遺伝子は、ジデオキシ法またはマクサム−ギルバート法により全塩基配列を決定し、次いで、ヒトＩｄ遺伝子発現に必要な部分を決定する。このようにして決定した塩基配列を後記の配列表に、配列番号１（Ｉｄ−１Ｈ）及び配列番号２（Ｉｄ−１Ｈ′）として示す。本発明に係るヒトＩｄ遺伝子には、これらの２種の遺伝子Ｉｄ−１Ｈ及びＩｄ−１Ｈ′と、これらの変異体が含まれる。
【００１１】
（２）ヒトＩｄ遺伝子を組込んだ発現ベクター、該発現ベクターを導入した形質転換細胞、及びヒトＩｄタンパク質の生産
上記の単離したヒトＩｄ遺伝子（ｃＤＮＡ）を常法によりベクターに組込む。ベクターとしては、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落したものであってもよい。大量のヒトＩｄタンパク質を生産するために、ベクターとしては、例えばｐＥＴ３ベクターを用いることが好ましい。ベクターＤＮＡに前記ｃＤＮＡを組込む方法は、例えば、制限酵素によるＤＮＡの処理とリガーゼによる再結合など、既知のいずれの方法も適用し得る。
【００１２】
こうして得られたヒトＩｄ遺伝子を組込んだプラスミドベクターを常法により寄主微生物に導入し、形質転換細胞（形質転換株）を得る。導入する寄主微生物としては、エシェリキア・コリＫ１２株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＫ１２株）によって代表されるエシェリキア族に属する微生物（大腸菌）を用いるのが好ましい。また、ヒトＩｄタンパク質を生産するためにｐＥＴ３ベクターを発現ベクターとして用いる場合は、導入する大腸菌としてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｌｙｓ　Ｓを用いると、精製の過程で大腸菌由来の挟雑物の残留が少なく、手間を省くことができるため、特に好ましい。
【００１３】
形質転換細胞は、例えばｐＵＣ１１８プラスミドに、ヒトＩｄ遺伝子（ｃＤＮＡ：Ｉｄ−１ＨまたはＩｄ−１Ｈ′）を組込んで得られるプラスミドベクターを、エシェリキア・コリＫ１２株に導入して形質転換反応により得られる新規微生物であり、ｃＤＮＡとしてＩｄ−１Ｈを用いて得たＥ．ｃｏｌｉ　ｐＩｄ−１Ｈ（微工研菌寄第１３２７０号）と、Ｉｄ−１Ｈ′を用いて得たＥ．ｃｏｌｉ　ｐＩｄ−１Ｈ′（微工研菌寄第１３２７１号）と呼称される２種のものがある。
【００１４】
同様にして、例えばｐＥＴ３ベクターのような発現ベクターに、ヒトＩｄ遺伝子（ｃＤＮＡ：Ｉｄ−１ＨまたはＩｄ−１Ｈ′）を組込んで得られる発現ベクターを、大腸菌例えばＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＳに導入して形質転換細胞を得ることができ、これを培養することにより、培養物から組換えＩｄタンパク質を得ることができる。
【００１５】
（３）診断用プローブ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド
Ｉｄタンパク質は、筋特異的遺伝子の活性を抑える筋分化制御因子としての性質だけでなく、増殖の盛んな細胞において広くその存在が認められ、血清や成長因子を除去したり、細胞分化を誘導したりして増殖停止状態になると、その量が減少する。
【００１６】
さらに、本発明者等によって、ヒトＩｄタンパク質が細胞老化・永久増殖能獲得に対応して特異的に変動することが新たに見出された。したがって、細胞中のＩｄ遺伝子の発現量及びゲノム中のＩｄ遺伝子座の突然変異の有無などを知ることで、組織・細胞における増殖状態、分化・老化の状態を判断する情報が得られると考えられ、ヒトＩｄ遺伝子配列の一部またはその変異配列から成る診断用プローブとしての用途が考えられる。
【００１７】
また、Ｉｄタンパク質は、核内に存在する転写制御因子であり、そのメカニズムから考えて、細胞増殖に関する数多くの遺伝子の発現を調節している可能性がある。その場合、Ｉｄ遺伝子の発現を制御することにより、細胞増殖に関する広範囲の遺伝子の発現に影響を及ぼしうると考えられ、アンチセンス技術等によりＩｄタンパク質の合成を効果的に阻害する手段を見出すことができれば、癌や早老症といった、増殖異常が重要な意味を持つ疾病に対して治療手段を提供することができる。例えば、培養細胞実験では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、Ｉｄ遺伝子の発現を阻止することにより、細胞増殖を負に制御することができる。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明についてさらに具体的に説明する。
【００１９】
［実施例１］
（１）プローブとして用いる塩基配列の選定と化学合成
ヒト細胞中に存在するヒトＩｄ遺伝子を単離するために、マウスＩｄ遺伝子３種（Ｉｄ−１、Ｉｄ−２、ＨＬＨ４６２）のコードするアミノ酸配列を検討し、３種の間でアミノ酸配列がほぼ完全に共通している領域（α−ヘリックス部分２箇所に相当する）２箇所を見出した。そのアミノ酸配列に対応する塩基配列２種類（各３８ｍｅｒ）を決定した（　図１及び図２参照）。以上のようにして決定した塩基配列を持つオリゴヌクレオチド２種（ＨＬＨ−１、ＨＬＨ−２）をアプライド・バイオシステム社のオリゴヌクレオチドシンセサイザー（３８０Ｂ）を用いて合成した。
【００２０】
（２）ヒトｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト正常繊維芽細胞ＴＩＧ−１を用いて、ｃＤＮＡライブラリーの作製を行った。ｃＤＮＡライブラリー作製にはＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇの方法を用い、１×１０６のコロニーからなるｃＤＮＡライブラリーを得た。
【００２１】
（３）ヒトＩｄ遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
上記の方法で調製したヒトｃＤＮＡライブラリーを（１）で合成した２種の３８ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの混合物をプローブとしてスクリーニングした。オリゴヌクレオチドの５′末端を［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでラベルし、ナイロンフィルターに固定したヒトｃＤＮＡと６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。反応液としては、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、５×ＳＳＣ、及び０．５％ＳＤＳという組成の混合液を用いた。ハイブリダイゼーション後、▲１▼２×ＳＳＣ洗浄液により、室温で１０分間２回洗浄し、次いで、▲２▼２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳの組成の洗浄液を用いて、６５℃で１０分間２回洗浄し、さらに、▲３▼０．１×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳの組成の洗浄液を用いて、室温で５分間２回洗浄した。乾燥後、Ｘ線フィルム（コダックＸＡＲ−５）を使用して−８０℃に７日間露光した。１０６個のコロニーをアッセイしたところ、１０個の陽性クローンを得た。
【００２２】
（４）ヒトＩｄ遺伝子塩基配列の決定
上記（３）で得られたクローンから、互いに重複しない３クローン（クローンＮｏ．１〜３）をｐＵＣ１１８プラスミドにリクローニングした。その後、その３クローンの塩基配列を、Ｓｅｑｕｅｎａｒｅ　Ｖｅｔ．２（ＵＳＢ社製）を用いて、ジデオキシ法により決定した。その結果、クローンＮｏ．３は、既報のヒトＩｄ−２遺伝子と同じものであったが、クローンＮｏ．１及びＮｏ．２は、新規遺伝子であった。クローンＮｏ．１の配列は、マウスＩｄ（Ｉｄ−１）遺伝子の配列と８５％ホモロジーがあることからＩｄ−１Ｈ（Ｈはｈｕｍａｎ）と呼称する。クローンＮｏ．２は、クローンＮｏ．１と同一の遺伝子座からオールタネート・スプライシングにより生じた産物と推定されることから、Ｉｄ−ＩＨ′と呼称する。決定したＩｄ−１ＨとＩｄ−１Ｈ′遺伝子の塩基配列を後記の配列表に示した。
【００２３】
［実施例２］
新規微生物の作成
Ｉｄ−１Ｈについては、ｃＤＮＡライブラリーに由来するＩｄ−１Ｈ遺伝子を含むｐＣＤ２プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断してＩｄ−１ＨｃＤＮＡを取り出し、ｐＣＵ１１８プラスミドのＢａｍＨＩサイトに組込んだ。Ｉｄ−１Ｈ′については、ｃＤＮＡライブラリーに由来するＩｄ−１Ｈ′遺伝子を含むｐＣＤ２プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで切断してＩｄ−１Ｈ′ｃＤＮＡを取り出し、ｐＵＣ１１８プラスミドのＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩサイトに組込んだ。かくして、２種の新規微生物を得た。１つは、Ｉｄ−１Ｈを用いて得たＥ．ｃｏｌｉ　ｐＩｄ−１Ｈ（微工研菌寄第１３２７０号）であり、他の１つは、Ｉｄ−１Ｈ′を用いて得たＥ．ｃｏｌｉ　ｐＩｄ−１Ｈ′（微工研菌寄第１３２７１号）である。同様に発現ベクターｐＥＴ３に２種のヒトＩｄ遺伝子を組込んで得られる発現ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＳに導入して形質転換細胞を得た。
【００２４】
［実施例３］
細胞中のＩｄ遺伝子産物量の増殖状況に応じた変動
Ｉｄ−１ＨとＩｄ−１Ｈ′遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）量の増殖状態に応じた変動を、ノーザンブロットハイブリダイゼーション法で調べた（　図３〜図６参照）。図３及び図４に示すように、Ｉｄ−１Ｈ（図３）とＩｄ−１Ｈ′（図４）のｍＲＮＡ量は、若年期の細胞では増殖開始後の時間経過に対して特有の変動パターンを示す。これに対して、図５及び図６に示すように、Ｉｄ−１Ｈ（図５）とＩｄ−１Ｈ′（図６）のｍＲＮＡ量は、老化した細胞では細胞が増殖刺激に応答しなくなるのに対応して、Ｉｄ−１ＨとＩｄ−１Ｈ′のｍＲＮＡ量はほとんど零のままである。これらの実験結果は、Ｉｄ−１ＨとＩｄ−１Ｈ′遺伝子が増殖制御及び老化過程において、一定の働きを担っていることを示唆している。したがって、ヒトＩｄ遺伝子（Ｉｄ−１Ｈ及びＩｄ−１Ｈ′）の塩基配列の部分配列またはその変異配列は、診断用プローブとして有用である。また、該ヒトＩｄ遺伝子の塩基配列の部分配列またはその変異配列に相補的な塩基配列から成るアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成すれば、アンチセンス治療に有用である。
【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、新規なヒトＩｄ遺伝子、該ヒトＩｄ遺伝子を組込んだ発現ベクター、該発現ベクターを導入した形質転換細胞等が提供される。本発明のヒトＩｄ遺伝子は、遺伝子工学の分野、ヒト細胞についての基礎実験、診断、治療等に有用である。例えば、該ヒトＩｄ遺伝子の塩基配列の部分配列またはその変異配列から成る診断用プローブ、あるいは該ヒトＩｄ遺伝子の塩基配列の部分配列またはその変異配列に相補的な塩基配列から成るアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたアンチセンス治療などへの応用が期待できる。
【００２６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトｃＤＮＡライブラリーより２種のヒトＩｄ遺伝子　（Ｉｄ−１Ｈ及びＩｄ−１Ｈ′）をハイブリダイゼーション法によりスクリーニングする際にプローブとして用いたオリゴヌクレオチド配列。
【図２】ヒトｃＤＮＡライブラリーより２種のヒトＩｄ遺伝子　（Ｉｄ−１Ｈ及びＩｄ−１Ｈ′）をハイブリダイゼーション法によりスクリーニングする際にプローブとして用いたオリゴヌクレオチド配列。
【図３】若年期の細胞中のＩｄ−１Ｈ遺伝子産物量の増殖状態に応じた変動を示すグラフ。
【図４】若年期の細胞中のＩｄ−１Ｈ′遺伝子産物量の増殖状態に応じた変動を示すグラフ。
【図５】老年期の細胞中のＩｄ−１Ｈ遺伝子産物量の増殖状態に応じた変動を示すグラフ。
【図６】老年期の細胞中のＩｄ−１Ｈ′遺伝子産物量の増殖状態に応じた変動を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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