(57)【要約】【課題】遺伝子の相対的な位置情報の解析を行なう装置の提供。【解決手段】光プローブと、光検出手段と、データ収集手段と、光源が少なくとも２つ以上の選択可能な波長の励起光を発生できるとともに、さらに、動的光路変更手段を有し、励起光の光路の制御を行うことによって、同一試料に対して複数の蛍光イメージを取得することで、複数種の蛍光標識を識別して相対的な位置情報を解析できるようにした。【選択図】    図１
2004309378.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
先端に局在した光の場を発生可能な光プローブと、
前記光プローブに複数の選択可能な波長の励起光を発生する光源と、
前記光プローブを走査するための走査手段とを有する光プローブ顕微鏡。
【請求項２】
前記複数の波長の励起光で観察される蛍光イメージを比較演算する演算手段を有する請求項１記載の光プローブ顕微鏡。
【請求項３】
蛍光標識したＤＮＡプローブまたは蛍光標識したＰＮＡプローブを結合したＤＮＡに、先端に局在した光の場を発生可能な光プローブから複数の波長の励起光を照射し、複数の蛍光イメージを取得するＤＮＡ配列マッピング装置。
【請求項４】
蛍光染色あるいは標識試料を蛍光観察によって、蛍光像のイメージングを行う光プローブ顕微鏡装置において、
先端部分に局在した光の場を発生可能な光プローブと、
前記光プローブの先端と試料の間を近接した距離に制御するための光プローブ位置検出手段と、
微動手段および制御手段と、
前記光プローブが試料表面上を２次元的に走査するための走査手段と、
前記局在した光の場を発生するための光源と、
前記光プローブ先端に近接した前記試料表面からから放射される光を集光するための集光光学系と、
光検出手段と、
データ収集手段とを有し、
前記光源が少なくとも２つ以上の選択可能な波長の励起光を発生できるとともに、さらに、動的光路変更手段を有し、励起光の光路の制御を行うことによって、同一試料に対して複数の蛍光イメージを取得することで、複数種の蛍光標識を識別して相対的な位置情報を解析できるようにした光プローブ顕微鏡。
【請求項５】
前記光源が同時にすくなくとも２つの波長を発生するか、あるいは、すくなくとも２つの異なる波長を発生する光源の組み合わせであり、光プローブの２次元走査における各ライン走査中の往路と復路において、光プローブに導入される励起波長を動的光路変更手段によって切り替えることによって、ＯＬＥ＿ＬＩＮＫ１１回の２次元走査において、２つの蛍光イメージを同時に取得できることを特徴とする請求項４記載の光プローブ顕微鏡。ＯＬＥ＿ＬＩＮＫ１
【請求項６】
前記光源が同時にすくなくとも２つの波長を発生するか、あるいは、すくなくとも２つの異なる波長を発生する光源の組み合わせであり、光プローブの２次元走査におけるライン走査において、ライン走査毎に、交互に光プローブに導入される励起波長を動的光路変更手段によって切り替えることによって、１回の２次元走査において、２つの蛍光イメージを同時に取得できることを特徴とする請求項４記載の光プローブ顕微鏡。
【請求項７】
請求項５および請求項６記載の多波長同時観察光プローブ顕微鏡を組み合わせることによって、１回の２次元走査において、すくなくとも４つの蛍光イメージを同時に取得することを特徴とする請求項７記載の光プローブ顕微鏡。
【請求項８】
２つの励起光でそれぞれ観察された蛍光イメージを比較処理する演算手段を有し、標識の判別をおこなうことを特徴とする請求項４記載の光プローブ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の配列情報を解析するための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来技術として、遺伝子配列を解析する方法を例に取り説明すると、遺伝子解析では、ゲノムＤＮＡを制限酵素などによって断片化し、クローニングしたＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼなどの酵素により蛍光標識塩基を取り込ませたＤＮＡ鎖を作製し、電気泳動によって、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃそれぞれの塩基についての電気泳動パターンを求め塩基配列を解析する方法が広く用いられている。
【０００３】
また、最近では、数多くの既知の配列のオリゴヌクレオチドやｃＤＮＡなどを基板上に固定し、クローニングした試料ＤＮＡを反応させ、特異吸着の起きたことを検知することで、試料ＤＮＡ中に存在する塩基配列を推測するＤＮＡチップと呼ばれる方法も開発されている。
【０００４】
この他、ＤＮＡを解析する技術としては、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  法によって、試料ＤＮＡに対してプローブＤＮＡが、ハイブリダイズした状態を蛍光顕微鏡で観察することが、試みられている（例えば非特許文献１参照。）。
【０００５】
電気泳動法による遺伝子解析およびＤＮＡチップによる遺伝子解析法における問題点としては、解析操作の複雑さが挙げられる。すなわち、この方法によると、ゲノムＤＮＡを断片化し、いくつもの工程を経てクローニングし、得られた膨大な数のクローンの塩基配列を解析するという作業を行う必要がある。さらに、解析から得られる塩基配列データは染色体上での位置情報を持たないため、目的塩基配列の位置を特定するには、それぞれの塩基配列を基に、様々なアルゴリズムによりクローンをつなぎ合わせていくという処理が必要であり、多くの時間と情報処理能力が要求されていた。これは、試料ＤＮＡの準備に手間がかかり、損傷ＤＮＡなどのクローニングのできないＤＮＡ試料の解析には適用できないという問題がある。また、解析が複雑になる点も問題としてあげられる。
【０００６】
これに対して、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法は、断片化していないＤＮＡ試料の配列情報を解析する方法として、工程も少なく、情報をつなぎ合わせる操作も不要で、きわめて有効な方法である。しかし、これまでの蛍光顕微鏡による観察法では、分解能がせいぜい５００ｎｍ程度であり、１．５ｋｂｐ程度の分解能でしか解析ができないという課題を有している。
【０００７】
遺伝子地図の構築は、遺伝子操作技術において、その対象となる遺伝子部位を特定するという点できわめて重要な部分を占める。したがって、迅速かつ、効率よく、高精度に遺伝子地図を構築する手法の開発が、強く望まれている。
【０００８】
このＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法の課題を解決する方法として、近接場光学顕微鏡用プローブやトンネル顕微鏡用プローブや光ピンセットを使用する方法が開示されている（例えば特許文献１参照。）。測定対象のＤＮＡ鎖に含まれる特定遺伝子配列の位置を求める方法において、測定対象ＤＮＡ鎖およびプローブ分子を用い、ＤＮＡ特異結合操作、固定・伸張操作、探針による検出操作からなる遺伝子解析方法  、および、ＤＮＡ固定操作、特異結合操作、伸張操作、探針による検出操作からなる遺伝子解析方法、および、ＤＮＡ固定・伸張操作、特異結合操作、探針による検出操作からなる遺伝子解析方法によって、分解能と精度の高い遺伝子配列の解析を実現することが可能である。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｈｏｌｍｅｓ−Ｄａｖｉｓ著「Ｔｒｅｎｄｓ  ｉ  ｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」３（１９９９）９１
【００１０】
【特許文献１】
特開２００１−１６５８４０号公報  （図９、００１９段落）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
このような遺伝子解析方法において、複数の標識の識別を可能にして、遺伝子の相対的な位置を明確に求めるための技術が必要とされており、生体膜における膜タンパクの解析などバイオ分野を中心とするその他の試料の解析においても複数の蛍光標識の同時解析を行うことが必要とされている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明では、このような蛍光標識試料の解析方法において、複数の標識の識別を可能にして、蛍光標識の相対的な位置を明確に求めるために、
先端部分に局在した光の場を発生可能な光プローブと、前記光プローブの先端と試料の間を近接した距離に制御するための光プローブ位置検出手段と、微動手段および制御手段と、前記光プローブが試料表面上を２次元的に走査するための走査手段と、前記局在した光の場を発生するための光源と、光プローブ先端に近接した試料表面からから放射される光を集光するための集光光学系と、光検出手段と、データ収集手段とを有し、
前記光源が少なくとも２つ以上の選択可能な波長の励起光を発生できるとともに、さらに、動的光路変更手段を有し、励起光の光路の制御を行うことによって、同一試料に対して複数の蛍光イメージを取得することで、複数種の蛍光標識を識別して相対的な位置情報を解析できるようにした多波長同時観察光プローブ顕微鏡を考案した。
【００１３】
さらに本発明では、先端に局在した光の場を発生可能な光プローブと、光プローブに複数の選択可能な波長の励起光を発生する光源と、光プローブを走査するための走査手段とを有する光プローブ顕微鏡とした。ここで複数の波長の励起光で観察される蛍光イメージを比較演算する演算手段を設けることができる。
【００１４】
本発明では、蛍光標識したＤＮＡプローブまたは蛍光標識したＰＮＡプローブを結合したＤＮＡに、先端に局在した光の場を発生可能な光プローブから複数の波長の励起光を照射し、複数の蛍光イメージを取得するＤＮＡ配列マッピング装置とした。
【００１５】
【発明の実施形態】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照し説明する。
【００１６】
図１は、本発明の多波長同時観察光プローブ顕微鏡の構成図を示したものである。図１において、先端部分に局在した光の場を有するプローブ１１と、そのプローブ１１の先端と試料の間を近接した距離に制御するためのプローブ位置検出手段１２、微動手段１３および制御手段１４と、前記プローブを試料表面上で２次元的に走査する走査手段１５と、前記局在した光の場を発生するための光源１６と、プローブ１１先端に近接した試料２０表面から放射される光を集光するための光学系１７と、光検出器１８と、を有している。  本発明では、走査手段１５の信号に対して、動的光路変更手段２０とデータ収集手段１９で励起光の光路の切り替えとデータ収集の切り替えを行うことによって、同一試料に対して複数の蛍光イメージを取得することができる。これによって、例えば、蛍光標識したＤＮＡプローブあるいはＰＮＡプローブを結合させた検査対象ＤＮＡを高分解能な蛍光観察によって、分子レベルでそのＤＮＡプローブあるいはＰＮＡプローブの結合位置を検出し、特定ＤＮＡ配列のマッピングを行う際に、一回の２次元走査を行うことで、同一試料に対して複数の蛍光イメージを取得することで、複数種の蛍光標識を識別して相対的な位置情報の解析が行えるようにしたものである。
【００１７】
前記光源が同時にすくなくとも２つの波長を発生するか、あるいは、すくなくとも２つの異なる波長を発生する光源の組み合わせであり、動的光路変更手段によって、いずれかの波長を選択できるようになっている。図２（ａ）は、光源と動的光路変更手段の部分の模式図であり、２つの波長を発生する光源の例を示している。光源１６１からの光は、動的光路変更手段２０１の中の可動フィルター３１，３２によって選択できる。図２（ｂ）は、光源と動的光路変更手段の部分の模式図のうちの２つの光源から１つの波長を選択する例を示している。光源１６２，１６３からの光は、動的光路変更手段２０２の中の可動ミラー３３によって、切り替えることができ、波長を選択することができる。
【００１８】
なお、フィルターやミラーを用いる切り替え方式のほかに、音響光学素子を用いて光路切り替えを行うこともできる。
【００１９】
このような動的光路変更手段を用いることで、光プローブの２次元走査における各ライン走査中の往路と復路において、光プローブに導入される励起波長をＯＬＥ＿ＬＩＮＫ２動的光路変更手段ＯＬＥ＿ＬＩＮＫ２によって切り替えることによって、１回の２次元走査において、２つの蛍光イメージを同時に取得できる。図３は、２次元走査における励起光の切り替えの状態の説明図であり、往路３０１において第１の励起光による蛍光の取得をおこない、復路３０２において第２の励起光による蛍光の取得を行うことができる。
【００２０】
一方、前記光源が同時にすくなくとも２つの波長を発生するか、あるいは、すくなくとも２つの異なる波長を発生する光源の組み合わせであり、光プローブの２次元走査におけるライン走査において、ライン走査毎に、交互に光プローブに導入される励起波長を動的光路変更手段によって切り替えることによって、１回の２次元走査において、２つの蛍光イメージを同時に取得することもできる。図４は、２次元走査における励起光の切り替えの状態の説明図であり、奇数回目の走査４０１において第１の励起光による蛍光の取得をおこない、偶数回目の走査４０２において第２の励起光による蛍光の取得を行うことができる。
【００２１】
また、図３、図４で説明したデータの取得方式を組み合わせることによって、１回の２次元走査において、すくなくとも４つの蛍光イメージを同時に取得することができる。また、蛍光用のフィルターの切り替え手段を設け、同時に切り替えることもできる。
【００２２】
一方、本発明の多波長同時観察光プローブ顕微鏡において、標識色素の判別を行うために、２つの励起光でそれぞれ観察された蛍光イメージを比較処理する演算手段を設けることもできる。
【００２３】
【発明の効果】
複数種の蛍光標識を識別して相対的な位置情報の解析を可能にすることによって、例えば、遺伝子操作技術において有用となる、迅速かつ、効率よく、高精度に遺伝子地図を構築する手法として、測定対象のＤＮＡ鎖に含まれる特定遺伝子配列の位置を求める方法において、測定対象ＤＮＡ鎖およびプローブ分子を用い、ＤＮＡ特異結合操作、固定・伸張操作、探針による検出操作からなる遺伝子解析方法をさらに発展させ、複数の標識の識別を可能にして、遺伝子の相対的な位置を明確に求めるための装置を提供できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の多波長同時観察光プローブ顕微鏡の構成を示す図。
【図２】本発明の多波長同時観察光プローブ顕微鏡における光源と動的光路変更手段の部分の模式図。
【図３】２次元走査における励起光の切替状態の説明図
【図４】２次元走査における励起光の切替状態の説明図
【符号の説明】
１１  プローブ
１２  位置検出手段、
１３  微動手段
１４  制御手段
１５  走査手段
１６  光源
１７  集光光学系
１８  光検出器
１９  データ収集手段
２０  試料
２１  動的光路変更手段
２２  画像演算処理手段
３１，３２  可動フィルター
３３  可動ミラー
１６１  光源
１６２，１６３  光源
２０１  動的光路変更手段
２０２  動的光路変更手段
３０１  往路
３０２  復路
４０１  奇数回目の走査
４０２  偶数回目の走査
【図１】
2004309378.tif 000003
【図２】
2004309378.tif 000004
【図３】
2004309378.tif 000005
【図４】
2004309378.tif 000006