(57)【要約】【課題】メチロフィラス属細菌への遺伝子導入に用いることができるプラスミドベクターを提供する。【解決手段】メチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡ断片と、同細菌細胞内で機能するマーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片とを含む環状ＤＮＡでメチロフィラス属細菌を形質転換し、形質転換体から前記マーカー遺伝子が発現する形質転換体を選択し、選択された形質転換体から環状ＤＮＡを単離することにより、メチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を単離する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡ断片と、同細菌細胞内で機能するマーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片とを含む環状ＤＮＡでメチロフィラス属細菌を形質転換し、形質転換体から前記マーカー遺伝子が発現する形質転換体を選択し、選択された形質転換体から環状ＤＮＡを単離することによって得ることができるメチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を含み、メチロフィラス属細菌で自律複製可能なプラスミドベクター。
【請求項２】
配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２からなる塩基配列又はその一部を有するメチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を含み、メチロフィラス属細菌で自律複製可能なプラスミドベクター。
【請求項３】
配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２からなる塩基配列又はその一部において、１若しくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を含む塩基配列を有するメチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を含み、メチロフィラス属細菌で自律複製可能なプラスミドベクター。
【請求項４】
配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２からなる塩基配列の一部が、配列番号１４に示す塩基配列である請求項２又は３に記載のプラスミドベクター。
【請求項５】
メチロフィラス属細菌で機能する薬剤耐性遺伝子を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載のプラスミドベクター。
【請求項６】
前記メチロフィラス属細菌がメチロフィラス・メチロトロファスである請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミドベクター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のプラスミドベクターを保持するメチロフィラス属細菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はメチロフィラス属細菌の遺伝子組換えに利用するプラスミドベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
メチロフィラス属細菌は、メタノールを主たる炭素源として生育することができる細菌であって、グラム陰性の桿菌である。同細菌は、胞子形成はなく、絶対好気性であり、そのメタノール資化経路はリブロースモノ燐酸経路により行われる。
【０００３】
メチロフィラス属細菌において利用され、目的遺伝子を組み込むプラスミドベクターとしては、不和合性グループのＩｎｃＱに属するＲＳＦ１０１０由来のもの、例えば、ｐＡＹＣ３０、及びｐＡＹＣ３６や、ＩｎｃＰに属するＲＰ４由来のもの、例えばｐＲＫ３１０などの広宿主域プラスミドベクターと呼ばれるものが用いられてきた（非特許文献１）。更に、最近ではボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）Ｓ８７から発見されたｐＢＢＲ１系のプラスミド、ｐＢＨＲ１などがある（非特許文献２）。
【０００４】
広宿主域プラスミドベクターの一つの問題点は、一般にプラスミドのサイズが大きいことである。例えば、ＲＳＦ１０１０は約８．６８ｋｂであり、ｐＲＫ３１０では約２０．４ｋｂである。一方、エシェリヒア・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）等で汎用的に利用されるプラスミドベクターは、例えばｐＳＴＶ２９では約３ｋｂ、ｐＵＣ１９では約２．７ｋｂと小型であり、遺伝子組換え技術において、これらのベクターは非常に扱いやすい。尚、ｐＢＢＲ１の大きさは約２．７ｋｂと小型であるが、このプラスミドの選択用に、薬剤耐性遺伝子、例えば、カナマイシン耐性遺伝子を搭載したベクターでは約４ｋｂ程度となる。また、本プラスミドは、メチロフィラス属細菌中で自律複製はするものの、メチロフィラス属細菌への導入頻度が低いという問題がある。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｍｅｔｈａｎｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈａｎｏｌ  ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ，  Ｅｄｔ  ｂｙ  Ｌ．  Ｃｏｌｉｎ  Ｍｕｒｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｔｒｅｓｓ  ，（１９９２）  ｐｐ１８５
【非特許文献２】
Ａｎｔｏｉｎｅ  Ｒ．  ＆  Ｌｏｃｈｔ  Ｃ．，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６，  ｐｐ１７８５−１７９９  （１９９２）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、メタノール資化性菌への遺伝子導入方法の選択肢を広げるために、従来知られている広宿主域プラスミドベクターに代わる、サイズが小さい新規なプラスミドベクターを提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体ＤＮＡの複製開始点（ｏｒｉＣｍ）のクローニングに成功し、この領域と、薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片とを連結させることにより、メチロフィラス・メチロトロファスで機能する新規なプラスミドベクターを作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００８】
（１）メチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡ断片と、同細菌細胞内で機能するマーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片とを含む環状ＤＮＡでメチロフィラス属細菌を形質転換し、形質転換体から前記マーカー遺伝子が発現する形質転換体を選択し、選択された形質転換体から環状ＤＮＡを単離することによって得ることができるメチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を含み、メチロフィラス属細菌で自律複製可能なプラスミドベクター。
（２）配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２からなる塩基配列又はその一部を有するメチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を含み、メチロフィラス属細菌で自律複製可能なプラスミドベクター。
（３）配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２からなる塩基配列又はその一部において、１若しくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を含む塩基配列を有するメチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を含み、メチロフィラス属細菌で自律複製可能なプラスミドベクター。
（４）配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２からなる塩基配列の一部が、配列番号１４に示す塩基配列である（２）又は（３）に記載のプラスミドベクター。
（５）メチロフィラス属細菌で機能する薬剤耐性遺伝子を含む（１）〜（４）のいずれかに記載のプラスミドベクター。
（６）前記メチロフィラス属細菌がメチロフィラス・メチロトロファスである（１）〜（５）のいずれかに記載のプラスミドベクター。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のプラスミドベクターを保持するメチロフィラス属細菌。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のプラスミドベクターは、メチロフィラス属細菌で自律複製可能なプラスミドベクターである。同プラスミドベクターは、メチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を含む。
【００１０】
前記自律複製配列は、メチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡの複製開始点（ｏｒｉＣｍ）を含むものであり、例えば、メチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡ断片と、同細菌細胞内で機能するマーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片とを含む環状ＤＮＡでメチロフィラス属細菌を形質転換し、形質転換体から前記マーカー遺伝子が発現する形質転換体を選択し、選択された形質転換体から環状ＤＮＡを単離することによって得ることができる。
【００１１】
前記自律複製配列の起源は、メチロフィラス属細菌であれば特に限定されないが、例えば、メチロフィラス・メチロトロファスが挙げられる。より具体的には、メチロフィラス・メチロトロファスの野生株ＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ  Ｎｏ．１０５１５）が挙げられる。同株は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、住所ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｓ．，  Ｔｏｒｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ  １３５，  Ａｂｂｅｙ  Ｒｏａｄ，  Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ９  ８ＤＧ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手可能である。そしてこの株の一般的な培養方法は、ＮＣＩＭＢのカタログに記載されているが、また実施例に記載したＳＥＩＩ培地でも生育させることができる。
【００１２】
上記のようにして、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株の染色体ＤＮＡから単離された、メチロフィラス属細菌で機能する自律複製配列を含むＤＮＡ断片の塩基配列の一例を、配列番号１１に示す。
【００１３】
本発明の自律複製配列は、後記実施例に示すように、メチロフィラス属細菌のショットガンクローニングによって取得することができる。
本発明の自律複製配列は、メチロフィラス属細菌における自律複製能が維持される限り、配列番号１１に示す塩基配列の一部であってもよい。このような部分配列は、例えば以下のようにして、特定又は取得することができる。まず、配列番号１１に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片を用意する。このＤＮＡ断片の末端の一方又は両方を、エキソヌクレアーゼで段階的に切り縮め、メチロフィラス属細菌細胞内で機能するマーカー遺伝子と連結して、環状の組換えＤＮＡを作製する。これらの組換えＤＮＡでメチロフィラス属細菌を形質転換し、マーカー遺伝子が発現する形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、構造を解析する。
【００１４】
また、配列番号１１の塩基配列の一部を有するＤＮＡ断片は、配列番号１１に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１１の塩基配列に基づいて作製した所望のプライマーを用いたＰＣＲによっても、調製することができる。
【００１５】
配列番号１１の一部を有する自律複製配列としては、配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２からなる塩基配列、及び、配列番号１４に示す塩基配列（配列番号１１の塩基番号１５３５〜１８５５）が挙げられる。以下、配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２からなる塩基配列を「ＯｒｉＣｍ」、配列番号１４に示す塩基配列を「ＯｒｉＣｍＳ」と記載することがある。これらの塩基配列を有するＤＮＡ断片は、例えば、メチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び８、又は配列番号９及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）によって各々取得することができる。また、前記塩基配列を有するＤＮＡ断片は、同塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとするハイブリダイゼーションによって、メチロフィラス属細菌のゲノムライブラリーから単離することもできる。
【００１６】
本発明の自律複製配列は、メチロフィラス属細菌における自律複製能が維持される限り、ＯｒｉＣｍ、又はＯｒｉＣｍＳを、前記と同様にしてさらに短縮したものであってもよい。ＯｒｉＣｍ、又はＯｒｉＣｍＳを含むプラスミドＤＮＡの適当な位置に制限酵素部位を持たせておき、ＯｒｉＣｍ、又はＯｒｉＣｍＳの外側でプラスミドＤＮＡを切断すると、エキソヌクレアーゼによる反応と、再環状化を容易に行うことができる。
【００１７】
また、本発明のプラスミドベクターが持つ自律複製配列は、メチロフィラス属細菌における自律複製能が損なわれない限り、ＯｒｉＣｍ又はその一部において、１若しくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を含む塩基配列を有していてもよい。前記「数個」とは、自律複製配列の位置やヌクレオチドの種類によっても異なるが、具体的には、ＯｒｉＣｍのうち、ＯｒｉＣｍＳ以外の部分においては２〜１１００個、好ましくは、２〜８００個、より好ましくは２〜３００個である。また、ＯｒｉＣｍＳにおいては、２〜２０個、好ましくは、２〜１０個、より好ましくは２〜４個である。
【００１８】
また、上記のような、ＯｒｉＣｍ又はその一部と実質的に同一の塩基配列を有する自律複製配列として具体的には、ＯｒｉＣｍ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列が挙げられる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。ＯｒｉＣｍの一部が３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００１９】
上記のような、ＯｒｉＣｍ又はその一部と実質的に同一の塩基配列を有する自律複製配列は、例えば、部位特異的変異法によって、特定の部位のヌクレオチドにおいて置換、欠失、又は挿入を含むようにＯｒｉＣｍ又はその一部を改変することによって取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ＯｒｉＣｍ又はその一部を含むＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および同ＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００２０】
上記のような変異を有するＤＮＡが自律複製能を有するか否かは、メチロフィラス属細菌細胞内で機能するマーカー遺伝子と連結して、環状の組換えＤＮＡを作製し、得られた組換えＤＮＡでメチロフィラス属細菌を形質転換し、形質転換体でマーカー遺伝子の発現を検出することによって、調べることができる。
【００２１】
また、上記のようなヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入には、メチロフィラス属細菌の菌株による違いなどの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【００２２】
本発明のプラスミドベクターは、自律複製配列の他に、マーカー遺伝子を含むことが好ましい。マーカー遺伝子としては、薬剤耐性を宿主に付与できる遺伝子が好ましい。このような薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
【００２３】
本発明のプラスミドベクター中には、外部からのＤＮＡ断片を搭載しやすいように、一または複数の制限酵素切断認識部位を組み入れておくことが望ましい。そのような部位としては、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩなどが挙げられる。制限酵素切断認識部位は、マルチクローニング部位であってもよい。
【００２４】
また、本発明のプラスミドベクターは、さらに、他の細菌、例えばエシェリヒア・コリで機能する自律複製配列を含むシャトルベクターであっても適わない。このようなシャトルベクターは、例えば、本発明のメチロフィラス属細菌の自律複製配列を含むＤＮＡ断片と、エシェリヒア・コリのプラスミドベクター又はその一部とを連結することによって構築することができる。エシェリヒア・コリのプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＨＳＧ３９６、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＴＳＶ２９、ｐＳＣ１０１、ｐＭＷ２１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳなどが挙げられる。
【００２５】
上記のようなシャトルベクターとして、後記実施例に示すｐＯｒｉＣｍＳ−２が挙げられる。同プラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子と、クローニング部位としてＸｂａＩ部位を有している。
【００２６】
本発明のＤＮＡのクローニングに用いるゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００１）に記載されている。
【００２７】
本発明のプラスミドベクターは、メチロフィラス属細菌に所望の遺伝子を導入するのに用いることができる。すなわち、本発明のプラスミドベクターに目的遺伝子を挿入し、得られた組換えプラスミドでメチロフィラス属細菌を形質転換する。前記遺伝子としては、メチロフィラス属細菌内で発現し得る遺伝子であれば特に制限はないが、炭水化物、脂質、タンパク質、ビタミン、色素、アミノ酸、核酸等の有用物質生成に関わる酵素遺伝子、生体内代謝調節に関与する遺伝子、これらの遺伝子を人為的に改良した遺伝子等が挙げられる。
【００２８】
例えば、Ｌ−リジンの生合成に重要なジヒドロジピコリン酸合成酵素の変異型酵素遺伝子をメチロフィラス・メチロトロファスに導入することにより、Ｌ−リジン生産能が付与される（ＷＯ  ００／６１７２３参照）。従って、例えば、エシェリヒア・コリのジヒドロジピコリン酸合成酵素の変異体であって、Ｌ−リジンによる酵素活性への阻害が低減した酵素をコードするｄａｐＡ２４遺伝子を、本発明のプラスミドベクターに搭載することも可能である。具体的には、変異型酵素をコードする遺伝子ｄａｐＡ２４が搭載されたプラスミドｐＲＳ−ｄａｐＡ２４（ＷＯ  ００／６１７２３参照）を制限酵素ＸｂａＩで切断し、ｄａｐＡ２４遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得する。次に、下記実施例で示すプラスミドベクターｐＯｒｉＣｍＳ−２を同じく制限酵素ＸｂａＩで切断し、この部位にｄａｐＡ２４遺伝子を含むＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼにより連結することにより、本プラスミドベクターにｄａｐＡ２４遺伝子を搭載できる。これをメチロフィラス・メチロトロファス株に導入することよって、この株にＬ−リジン生産能を付与又は増強することが可能である。
【００２９】
また、本発明のプラスミドベクターは、メチルフィラス属細菌の染色体上の遺伝子と外来遺伝子との遺伝子置換、又は染色体上の遺伝子の破壊にも用いることができる。
【００３０】
メチロフィラス属細菌に、本発明のプラスミドベクター又はその誘導体を導入して形質転換する方法としては、エレクトロポレーションが挙げられる（Ｃ．Ｇ．Ｇｌｉｅｓｃｈｅ，  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ４３，  ｐｐ１９７−２０１  （１９９７））。また、このプラスミドに接合伝達に必要なＤＮＡ領域（ｍｏｂ領域など）を通常の方法により組み入れることにより、接合伝達によるプラスミド導入も可能となる。
【００３１】
通常、メチロフィラス属細菌の形質転換株は、導入したプラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子の発現による、薬剤耐性をマーカーとして選抜する。例えば、カナマイシン耐性の遺伝子が搭載されたベクターをエレクトロポレーションにより導入した場合は、その菌株を含む溶液をカナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）を含むＳＥＩＩ寒天培地（実施例１参照）上に塗布し、３７℃にて２〜４日間培養することで、目的のプラスミドベクターを保持した形質転換体を得ることができる。
【００３２】
上記方法により形質転換して得られるメチロフィラス属細菌は、通気攪拌もしくは振とう等の好気的条件下で、２０〜４３℃、好ましくは３４〜３８℃の温度でｐＨを５〜８に制御して培養し、導入した遺伝子を発現させることができる。使用される培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養源を含有する通常の培地である。
【００３３】
主要炭素源は、メタノールであるが、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、でんぷん加水分解物などの糖類、グリセロール、ソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸、ピルビン酸等の有機酸類を併用して用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素源、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。これらの他に、有機微量栄養源として、ビタミンＢ１、または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい場合もある。培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは０．０１〜５容量％、より好ましくは、０．１〜２容量％である。また培養期間は通常２〜９０時間とすることができ、好適には２４〜４８時間である。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を更に具体的に説明する。
【００３５】
【実施例１】メチロフィラス・メチロトロファスのｏｒｉＣ（ｏｒｉＣｍ）を含むプラスミドの作製
メチロフィラス・メチロトロファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）ＡＳ１（ＮＣＩＭＢ  Ｎｏ．１０５１５）をＳＥＩＩ培地（  （ＮＨ４）２ＳＯ４  ５ｇ／Ｌ，  Ｋ２ＨＰＯ４  １．９ｇ／Ｌ，  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  １．５６ｇ／Ｌ，  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇ／Ｌ，  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ７２ｍｇ／Ｌ，  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ５  μｇ／Ｌ，  ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ２５  μｇ／Ｌ，  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２３  μｇ／Ｌ，  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ９．７ｍｇ／Ｌ，  メタノール  ０．５％（ｖ／ｖ））、３７℃で一晩培養し、Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆ．Ｋｉｔ（ＣａｔＮｏ．８５１７１）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。これをＳａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）で部分分解した。この反応溶液を、０．７％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供して、ＤＮＡサイズとして２〜３ｋｂｐ（キロ塩基対）の大きさのＤＮＡ断片領域をゲルから回収し精製した。ＤＮＡ断片の精製には、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製  ＣｏｎｃｅｒｔＴＭ  Ｒａｐｉｄ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを利用し、添付のマニュアルに従って実施した。
【００３６】
一方、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）は制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アルカリフォスファターゼ処理（宝酒造社製、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）を使用）を行い、上述で作製したＳａｕ３ＡＩで部分分解後の染色体ＤＮＡと連結した（宝酒造社製、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を使用）。このライゲーション溶液で市販のコンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ寒天培地（ポリペプトン１０ｇ／Ｌ，酵母エキス  ５ｇ／Ｌｌ，  ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ，  寒天  １５ｇ／Ｌ，  カナマイシン  ５０μｇ／ｍｌ含む）で選択することで、約４５００個の形質転換体を取得した。
【００３７】
次に、これらの形質転換体をまとめてＬＢ液体培地（カナマイシン  ５０μｇ／ｍｌ含む）で培養し、この培養液からプラスミドＤＮＡを常法（アルカリ法）で抽出し、このプラスミドＤＮＡでメチロフィラス・メチロトロファスをエレクトロポレーション法により形質転換した。エレクトロポレーションは、ＢｉｏＲａｄ社製ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒを使用し、１．８ｋＶ／ｃｍで行った。
【００３８】
形質転換体をＳＥＩＩ寒天培地（寒天  １．５％、カナマイシン  ２０μｇ／ｍｌ含む）で３７℃、約４８時間培養後、約２００個のカナマイシン耐性コロニーが出現した。この中から無作為に６０個のコロニーを選択し、それらをまとめてＳＥＩＩ液体培地で、上記と同様に培養後、この培養液から常法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００３９】
このＤＮＡ溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換し、ＬＢ寒天培地（カナマイシン  ５０μｇ／ｍｌ）上でカナマイシン耐性を示すコロニーを多数取得した。この耐性株から無作為に１０株選択し、各々からプラスミドＤＮＡを抽出し、電気泳動によりその大きさを確認したところ、各々のプラスミドＤＮＡはほぼ同一の大きさであり、ｐＨＳＧ２９８に挿入されたＤＮＡ断片の大きさは、約２．７ｋｂと推定できた。次に制限酵素でこれらプラスミドを分解し、その分解パターンの比較を行ったところ、取得した１０株が保持していたプラスミドは全て同一構造のものであることが判明した。なお、ここで取得したプラスミドはｐＯｒｉＣｍＬと命名した。
【００４０】
【実施例２】ｏｒｉＣｍ領域の限定と小型ｏｒｉＣｍプラスミドの作製
実施例１に記載したプラスミドｐＯｒｉＣｍＬの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢ社製）により解析を行った。結果を配列番号１１に示す。塩基配列決定に用いたプライマーの配列を、配列番号１〜６に記載した。
【００４１】
その結果、この挿入ＤＮＡ断片には、いくつかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在することがわかった。それらのうち２つを、配列番号１１に示してある。第１のＯＲＦは、ｄｎａＡ様遺伝子の後半領域に、第２のＯＲＦはｄｎａＮ様遺伝子の前半領域に、各々類似している（図１）。また、配列表には示されていないが、配列番号１１の塩基配列において、５’末端から、４０１番目の塩基までにも、ＯＲＦが存在している。
【００４２】
次に、最初に単離した上記の約２．７ｋｂ長のＤＮＡ領域にある、ｄｎａＡ様遺伝子からｄｎａＮ様遺伝子までの約１．４４ｋｂ長のＤＮＡ領域のみで、自律複製活性があるか否かの検討を行った。
【００４３】
まず、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号７、８に記載したプライマー（５’末端側にＳａｌＩサイトを連結）を用いたＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片（配列番号１１の塩基番号１１６９〜２６１２）の増幅を行った。増幅反応は、宝酒造社製Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、＜変性工程＞９８℃で１０秒間、＜アニーリング工程＞６０℃で３０秒間、＜ＤＮＡ鎖の伸長反応工程＞７２℃で９０秒間、の反応を２５サイクル実施した。ここで増幅された１４４２ｂｐのＤＮＡ断片をＳａｌＩ（宝酒造）で分解し、同じくＳａｌＩ（宝酒造）分解後、脱リン酸化処理を行ったベクターｐＨＳＧ２９８と連結した（宝酒造社製、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を使用）。そしてベクターに搭載されているｌａｃプロモーターに対して各方向に挿入された２種類のプラスミドを取得した。これらのプラスミドでメチロフィラス・メチロトロファスを形質転換したところ、両タイプのプラスミドからカナマイシン耐性を示す株を取得出来、このＤＮＡ領域に自律複製活性が存在していることが判明した。これら両プラスミドを、各々ｐＯｒｉＣｍ−１（ｄｎａＡ様遺伝子の方向が、ベクターのｌａｃプロモーターと同じ向きのプラスミド）、ｐＯｒｉＣｍ−２（ｄｎａＡ様遺伝子の方向が、ベクターのｌａｃプロモーターと逆向きのもの）と命名した。
【００４４】
更に、自律複製活性を有する領域を特定するために、ｄｎａＡ様遺伝子とｄｎａＮ様遺伝子の間のＤＮＡ領域における自律複製活性の有無を調べることとした。まず、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号９、１０に記載したプライマー（５’末端側にＳａｌＩサイトを連結）を用いたＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片（ＤｎａＡ様タンパク質のＣ末側１０アミノ酸残基とＤｎａＮ様タンパク質のＮ末側１０アミノ酸残基を含む領域をコードするＤＮＡとその両者間のＤＮＡ部分：配列番号１１の塩基番号１５３５〜１８５５）の増幅を行った。増幅反応は、宝酒造社製Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、＜変性工程＞９８℃で１０秒間、＜アニーリング工程＞６０℃で３０秒間、＜ＤＮＡ鎖伸長工程＞７２℃で１分間の一連反応を２５サイクル実施した。
【００４５】
ここで増幅された３２１ｂｐのＤＮＡ断片をＳａｌＩ（宝酒造）で分解し、同じくＳａｌＩ（宝酒造）分解後、脱リン酸化処理を行ったベクターｐＨＳＧ２９８と連結した（宝酒造社製、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を使用）。その結果、ベクターに搭載されているｌａｃプロモーターに対してｄｎａＡ様遺伝子の向きが逆向きに挿入されたプラスミドのみが、多数取得された。
【００４６】
これらのプラスミドでメチロフィラス・メチロトロファスを形質転換したところ、カナマイシン耐性を示す株を多数取得出来、このＤＮＡ領域に自律複製活性が存在しており、また形質転換頻度も高いことが判明した。なお、導入プラスミドとして、ｐＢＨＲ１（ｐＢＢＲ１からの誘導体）を用い、同様な条件にて形質転換したところ、形質転換体の出現頻度は、上で取得されたプラスミドの場合と比べ、数十分の一であった。上記のようにして得られたプラスミドをｐＯｒｉＣｍＳ−２（ｄｎａＡ様遺伝子の向きが、ｌａｃプロモーターと逆向きになっている）と命名した。こうして特定された自律複製能のあるＤＮＡ断片（３２１ｂｐ領域）の塩基配列を、配列番号１４に示した。
【００４７】
なお、前記ｐＯｒｉＣｍＳ−２を保持するメチロフィラス・メチロトロファス株を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＳＥＩＩ液体培地で、３７℃、２４時間培養後、その菌体から、上記と同様に常法によりプラスミドを調製し、０．７％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した後、エチジュームブロマイド染色したところ、明瞭なプラスミドＤＮＡのバンドが観察され、メチロフィラス・メチロトロファス内で、複数のコピー数を維持するプラスミドとして機能することがわかった。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、メチロフィラス属細菌においてプラスミドとして機能する新規なベクターが提供される。同ベクターは、メチロフィラス属細菌の育種等に有用である。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の自律複製配列の構造を示す図。
【図１】
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