(57)【要約】【課題】微生物による含硫複素環式硫黄化合物の脱硫反応において、最終生成物による阻害作用や、含硫複素環式硫黄化合物の菌体膜透過における障害を解消し、脱硫率の向上を可能にすること。【解決手段】硫酸イオンの抑制を受けることなく恒常的に発現するプロモーター、およびＣ−Ｓ結合を選択的に切断する酵素をコードする脱硫遺伝子を、宿主微生物に機能しうる態様で導入した組換え微生物を２種類以上用いることを特徴とする、含硫複素環式化合物の脱硫方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸イオンの抑制を受けることなく恒常的に発現するプロモーター、およびＣ−Ｓ結合を選択的に切断する酵素をコードする脱硫遺伝子を、宿主微生物に機能しうる態様で導入した組換え微生物を２種類以上用いることを特徴とする、含硫複素環式化合物の脱硫方法。
【請求項２】
プロモーターが、ｋａｐ１プロモーター（配列番号１）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
脱硫遺伝子が、ロドコッカス属ＩＧＴＳ８株由来の脱硫遺伝子、ロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＡＤ１０９株由来の分解遺伝子、ペニバチルス属Ａ１１−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０２５）由来の脱硫遺伝子、および同Ａ１１−２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６）由来の脱硫遺伝子からなる群より選ばれるいずれか１の脱硫遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
脱硫遺伝子が、ロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子ｄｓｚ  ＡＢＣＤ（配列番号６）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
宿主微生物の少なくとも１種が、マイコバクテリウム属に属する微生物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
宿主微生物の少なくとも１種が、ロドコッカス属に属する微生物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
宿主微生物が、マイコバクテリウム属に属する微生物、およびロドコッカス属に属する微生物の２種類の微生物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
マイコバクテリウム属に属する微生物が、マイコバクテリウム属  ＮＣＩＭＢ１０４０３株またはそれと実質的に同等の菌学的性質を有する細菌である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ロドコッカス属に属する微生物が、ロドコッカス属ＭＣ１１０９株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５９４）またはそれと実質的に同等の菌学的性質を有する細菌である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
マイコバクテリウム属ＭＲ３４株（ＦＥＲＭ−Ｐ−１９２０５）、およびロドコッカス属ＭＣ０２０３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５９５）の２種類の組換え微生物を用いることを特徴とする、含硫複素環式化合物の脱硫方法。
【請求項１１】
マイコバクテリウム属ＭＲ３４株（ＦＥＲＭ−Ｐ−１９２０５）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を利用した含硫複素環式化合物の脱硫方法に関する。より詳しくは、複数の組換え微生物を用いることにより、脱硫率を向上させることを可能とした新規脱硫方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
石油等の化石燃料油中には多種類の硫黄化合物が含有されているが、硫黄は大気中に放出されると環境に重大な影響を与えるため、これらの脱硫が求められている。世界の種々の原油中に含まれる硫黄の濃度はそれぞれ異なるが、平均して１．１３％程度であり、代表的な含有硫黄化合物はメルカプタン類、スルフィド類、チオフェン類である。原油を蒸留分別した各留分中では、重い留分ほどベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン等のチオフェン類の比率が高い。
【０００３】
石油の脱硫方法としては、アルカリ洗浄、溶剤洗浄、吸着などの方法も知られているが、現在では水素化脱硫が主流である。水素化脱硫は、石油留分中の硫黄化合物を高温・高圧、金属触媒の存在下で水素と反応させ、硫黄を硫化水素として除去する、完成度の高い脱硫プロセスである。金属触媒としては、通常アルミナを担体としたコバルト、モリブデン、ニッケル、タングステンなどが使用される。
【０００４】
しかし、水素化脱硫法は化石燃料全体の硫黄濃度を低下させることはできても、難脱硫性の含硫複素環式化合物を十分に脱硫することができない。最近は、こうした難脱硫性化合物を効果的に除去し、軽油中の硫黄分を１ｐｐｍ以下に削減する超深度脱硫の研究が進められ、そのための触媒の改良や反応温度・圧力の向上が試みられている。
【０００５】
これに対し、微生物による酵素反応を利用して比較的穏和な条件下で脱硫を行う方法としてバイオ脱硫法がある（例えば、非特許文献１参照）。バイオ脱硫法では、酵素の高い基質特異性により、水素化脱硫では脱硫できなかった硫黄も比較的穏和な条件で除去することが可能である。例えば、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）  ＣＢ１（例えば、非特許文献２参照）、ロドコッカスロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＩＧＴＳ８  （ＡＴＣＣ５３９６８）  （例えば、非特許文献３参照）、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｋｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＫＡ２−５−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２７７）（例えば、非特許文献４参照）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．  ＳＹ−１  （例えば、非特許文献５参照）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  ｓｐ．  ＤＯ  （例えば、非特許文献６参照）や、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）  Ｋ３ｂ（例えば、非特許文献７参照）を用いた脱硫方法がこれまで報告されている。微生物脱硫法では、水素化脱硫法のように高い温度や圧力を必要とすることなく、ベンゾチオフェン類等を脱硫できる利点がある。
【０００６】
ところで、化石燃料中に存在する含硫複素環式化合物の９０％以上はジベンゾチオフェン類であり、その他の微量硫黄化合物は、ベンゾチオフェン類（ｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、ベンゾテトラナフチールチオフェン類（ｂｅｎｚｏｔｅｔｒａｎａｐｔｈｙｌｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、ベンゾナフチルチオフェン類  （ｂｅｎｚｏｎａｐｈｔｈｙｌｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）である。これらは、Ｃ−Ｃ結合を切断するような方法で脱硫しようとすると、化石燃料中にある他の芳香族炭化水素の分解によるエネルギー含有量の低下をまねくため、一般にＣ−Ｓ結合を特異的に切断する微生物を用いて脱硫されている。
【０００７】
しかしながら、従来の脱硫微生物では、脱硫に関連した脱硫酵素遺伝子が培養液中の無機硫黄化合物や含硫アミノ酸によって発現抑制を受けることが報告されている（例えば、非特許文献８参照）。これは、主に脱硫酵素遺伝子の発現を制御しているプロモーターが誘導型であることによる。すなわち、脱硫反応によって生成した硫黄が硫酸イオンとして培養液中に溶出し、培養液中の硫黄濃度が高くなるにつれて、脱硫遺伝子の発現が抑制され、脱硫効率が低下する。
【０００８】
さらに、軽油などの化石燃料中の含硫複素環式硫黄化合物は油相中に存在しているため、含硫複素環式硫黄化合物を微生物によって脱硫するためには、含硫複素環式硫黄化合物を微生物の細胞内へ取り込むことが必要である。しかしながら、微生物には菌体膜が存在するため、軽油などの化石燃料中の含硫複素環式硫黄化合物を脱硫するためには菌体膜を透過することが必要である。特にグラム陰性に属する微生物は菌体膜が細胞壁のみのグラム陽性に属する微生物に比較して、外膜と内膜の二膜を有しているため、グラム陽性に属する微生物より脱硫率が上がらないという現象が見られた。グラム陽性に属する微生物においても、高度にアルキル化された含硫複素環式硫黄化合物や含硫複素環式硫黄化合物の種類によって、菌体膜透過できないか、または透過性が低いため、含硫複素環式硫黄化合物の種類はアルキル化度によって、脱硫率が向上しないという問題があった。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  （１９９４），  ｐ３９−４５
【非特許文献２】
Ｉｓｂｉｓｔｅｒ，  Ｊ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｋｏｂｙｌｉｎｓｋｉ，Ｅ．Ａ．：Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏａｌ，  ｉｎ  Ｃｏａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  （１９８５），  Ｓｅｒ．９，  ｐ６２７
【非特許文献３】
Ｋｉｌｂａｎｅ，Ｊ．Ｊ．  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，  Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄ  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，  （１９９０），  ３，  ｐ６９−７０
【非特許文献４】
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．  Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｋ．，  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｏ．，  Ｈｉｒａｓａｗａ，Ｋ．，  Ｉｓｈｉｉ，Ｙ．，  Ｆｕｊｉｎｏ，Ｋ．，  Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｈ．  ａｎｄ  Ｍａｒｕｈａｓｈｉ，Ｋ．，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  （２００１），  ６５（２），  ｐ２８９−３０４，
【非特許文献５】
Ｏｈｍｏｒｉ，  Ｔ．，  Ｍｏｎｎａ，Ｌ．，Ｓａｉｋｉ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｋｏｄａｍａ，Ｔ．  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  （１９９２），  ５８，  ｐ９１１−９１５，
【非特許文献６】
ｖａｎ  Ａｆｆｅｒｄｅｎ，  Ｍ．，Ｓｃｈａｃｈｔ，  Ｓ．，  Ｋｌｅｉｎ，  Ｊ．ａｎｄＴｒｕｐｅｒ，Ｈ．Ｇ．，Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  （１９９０），  １５３，  ｐ３２４−３２８
【非特許文献７】
Ｄａｈｌｂｅｒｇ，  Ｍ．Ｄ．（１９９２）  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｏａｌ，  Ｍａｙ４−７，  ＣｌｅａｒｗａｔｅｒＢｅａｃｈ，ＦＬ，ｐｐ．１−１０．Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｐｏｗｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ＰａｌｏＡｌｔｏ，  ＣＡ．
【非特許文献８】
Ｍａｍｉｅ  Ｚ．Ｌ．，  Ｓｚｕｉｒｅｓ  Ｃ．Ｈ．，  Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ  Ｄ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｃｈｉｌｓ  Ｊ．Ｄ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  （１９９６），  １７８，  ｐ６４０９−６４１８
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、微生物による含硫複素環式硫黄化合物の脱硫反応において、最終生成物による阻害作用や含硫複素環式硫黄化合物の菌体膜透過における障害を解消し、脱硫率の向上を可能にすることにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｋｏｃｃｕｓ）属に属する微生物とマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物に、硫黄による抑制を受けることなく、恒常的かつ高発現に機能するｋａｐ１プロモーターと、これに機能しうる態様で連結させた脱硫遺伝子を導入して組換え微生物を作製した。そして、この２種類の組換え微生物を、順次または同時に用いることにより、菌体膜透過性が低く脱硫困難な種々の含硫複素環式硫黄化合物を効果的に脱硫できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１）  硫酸イオンの抑制を受けることなく恒常的に発現するプロモーター、およびＣ−Ｓ結合を選択的に切断する酵素をコードする脱硫遺伝子を、宿主微生物に機能しうる態様で導入した組換え微生物を２種類以上用いることを特徴とする、含硫複素環式化合物の脱硫方法。
（２）  プロモーターが、ｋａｐ１プロモーター（配列番号１）である、上記（１）記載の方法。
（３）  脱硫遺伝子が、ロドコッカス属ＩＧＴＳ８株由来の脱硫遺伝子、ロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＡＤ１０９株由来の分解遺伝子、ペニバチルス属Ａ１１−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０２５）由来の脱硫遺伝子、および同Ａ１１−２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６）由来の脱硫遺伝子からなる群より選ばれるいずれか１の脱硫遺伝子である、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）  脱硫遺伝子が、ロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子ｄｓｚ  ＡＢＣＤ（配列番号６）である、上記（３）に記載の方法。
（５）  宿主微生物の少なくとも１種が、マイコバクテリウム属に属する微生物である、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）  宿主微生物の少なくとも１種が、ロドコッカス属に属する微生物である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）  宿主微生物が、マイコバクテリウム属に属する微生物、およびロドコッカス属に属する微生物の２種類の微生物である、上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８）  マイコバクテリウム属に属する微生物が、マイコバクテリウム属  ＮＣＩＭＢ１０４０３株またはそれと実質的に同等の菌学的性質を有する細菌である、上記（５）〜（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）  ロドコッカス属に属する微生物が、ロドコッカス属ＭＣ１１０９株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５９４）またはそれと実質的に同等の菌学的性質を有する細菌である、上記（６）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）  マイコバクテリウム属ＭＲ３４株（ＦＥＲＭ−Ｐ−１９２０５）、およびロドコッカス属ＭＣ０２０３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５９５）の２種類の組換え微生物を用いることを特徴とする、含硫複素環式化合物の脱硫方法。
（１１）  マイコバクテリウム属ＭＲ３４株（ＦＥＲＭ−Ｐ−１９２０５）。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
本発明は、２種類の微生物、特にロドコッカス属およびマイコバクテリウム属に属する微生物に、硫酸イオンの抑制を受けることなく恒常的に発現するプロモーターおよびＣ−Ｓ結合を選択的に切断する脱硫遺伝子を機能しうる態様で導入した組換え微生物を、順次または同時に用いることにより、化石燃料油である軽油などの含硫複素環式化合物を脱硫する方法を提供する。
【００１５】
１．宿主微生物
本発明で用いられる組換え微生物の宿主となる微生物は、ＫＡＰ１プロモーターが機能しうる微生物であれば、特に限定されない。例えば、ロドコッカス属等のノカルディオフォーム型細菌に分類される微生物、マイコバクテリウム属、ゴルドニア属に属する微生物を用いることができる。なお、ノカルディオフォーム型細菌とは、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌが採用する細菌の分類体系における３３のセクションのうちの１つで、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）等が含まれる。この分類体系では、従来の階層的分類とは異なり、細菌をその特性−例えば、細胞形態、酵素に対する反応、グラム染色性、エネルギー代謝等により分類している。したがって、同一セクション内では共通のプロモーターが機能しうることが期待される。
【００１６】
本発明においては、２種類の異なる宿主微生物が用いられる。これらの微生物は、化石燃料中に存在する含硫複素環式化合物の菌体膜透過性が異なることが好ましい。特に、菌体膜透過にかかわる特性について、補完性がある２つの微生物であることが望ましい。例えば、一方の微生物が高アルキル化した含硫複素環式化合物に対して特に高い菌体膜透過性を有する微生物であれば、他方の微生物は、低アルキル化した含硫複素環式化合物に対して特に高い菌体膜透過性を有する微生物であることが望ましい。そのような２種類の宿主微生物としては、例えばマイコバクテリウム属に属する微生物とロドコッカス属に属する微生物を挙げることができる。
【００１７】
前記マイコバクテリウム属に属する微生物としては、マイコバクテリウム属  ＮＣＩＭＢ１０４０３株およびこれと実質的に同等の菌学的性質を有する菌株を挙げることができる。マイコバクテリウム属  ＮＣＩＭＢ１０４０３株は、特に高アルキル化した含硫複素環式化合物に対して、高い菌体膜透過性を有する。ここで、「実質的に同等の菌学的性質を有する菌株」とは、ＮＣＩＭＢ１０４０３株を起源とし、該菌株と同様の菌体膜透過性能力を有しているが、その起源である菌株とは他の１つ以上の性質において異なっている菌株を意味し、例えば、ＮＣＩＭＢ１０４０３株の変異株や形質転換体を挙げることができる。
【００１８】
前記ＮＣＩＭＢ１０４０３株は、ＮＣＩＭＢ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ；  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｕｒｕｇａ−ｇ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｐ／ｎｃｉｍｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）より入手できる。表１に、ＮＣＩＭＢ１０４０３株に関する情報を記載する。
【００１９】
【表１】
2004242511.tif 000002
【００２０】
また、前記ロドコッカス属に属する微生物としては、ロドコッカス・エリスロポリスＫＡ２−５−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２７７：特開平１１−９２９３参照）やロドコッカス・エリスロポリスＭＣ０２０３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５９５）、およびこれらと実質的に同等の菌学的性質を有する菌株を挙げることができる。ロドコッカス・エリスロポリスＫＡ２−５−１株やＭＣ０２０３株は、特に低アルキル化した含硫複素環式化合物に対して、高い菌体膜透過性を有する。ここで、「実質的に同等の菌学的性質を有する菌株」とは、ＫＡ２−５−１株やＭＣ０２０３株を起源とし、該菌株と同様の菌体膜透過性能力を有しているが、その起源である菌株とは他の１つ以上の性質において異なっている菌株を意味し、例えば、ＫＡ２−５−１株やＭＣ０２０３株の変異株や形質転換体を挙げることができる。
【００２１】
２．プロモーター
本発明で用いられるプロモーターは、硫酸イオンによる抑制を受けることなく、恒常的に発現するプロモーターであれば、特に限定されない。そのようなプロモーターとしては、例えば、ｋａｐ１プロモーターを挙げることができる。
【００２２】
ｋａｐ１プロモーターは、本発明らが、脱硫細菌  ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＫＡ２−５−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６２７７）から単離したプロモーター（特願２００１−３４８３８４号）で、ロドコッカス属、マイコバクテリウム属、ゴルドニア属等の微生物において、硫酸イオンの影響を受けることなく、恒常的かつ高活性で発現する。したがって、このプロモーター下流に連結された脱硫遺伝子は恒常的に発現し、連続的脱硫反応を可能にする。
【００２３】
ｋａｐ１プロモーターの塩基配列を配列番号１に示すが、この配列に限定されず、配列番号１に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、ｋａｐ１と同等のプロモーター活性を有する限り、ｋａｐ１プロモーターに含まれる。なお、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６５℃、０．５×ＳＳＣ、より好ましくは、５５℃、０．１×ＳＳＣのような条件をいう。
【００２４】
３．脱硫遺伝子
本発明で用いられる脱硫遺伝子は、含硫複素環式化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断する酵素をコードする遺伝子であれば、特に限定されない。そのような酵素は、アルキル化ジベンゾチオフェン類を脱硫して、相当するヒドロキシビフェニール体を生成することができる。
【００２５】
前記遺伝子としては、例えば、ロドコッカス属ＩＧＴＳ８株由来の脱硫遺伝子（Ｃ．Ｓ．Ｐｉｄｄｉｎｔｏｎ，  Ｂ．Ｒ．Ｋｏｖａｃｅｖｉｃｈ  ａｎｄ  Ｌ．Ｒａｍｂｏｓｅｋ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６１，４６８−４７５（１９９５））、ロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子（Ｋ．Ｈｉｒａｓａｗａ，  Ｙ．Ｉｓｈｉｉ，  Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｋ．Ｋｏｉｚｕｍｉ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｍａｒｕｈａｓｈｉ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６５（２），  ２３９−２４６，２００１）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＡＤ１０９株由来の分解遺伝子（ＷＯ  ９８／４５４４６）、ペニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属Ａ１１−１ｌ株およびＡ１１−２株由来の脱硫遺伝子（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０２５，  ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６）を挙げることができる。
【００２６】
特に望ましくは、ロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子ｄｓｚ  ＡＢＣＤ（Ｋ．Ｈｉｒａｓａｗａ，  Ｙ．Ｉｓｈｉｉ，  Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｋ．Ｋｏｉｚｕｍｉ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｍａｒｕｈａｓｈｉ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６５（２），  ２３９−２４６，２００１；配列番号６）が用いられる。このＤｓｚＡＢＣＤは難脱硫性のアルキル化ベンゾチオフェンを２−ヒドロキシベンゾチオフェン（２−ＨＢＰ）に分解することができる。
【００２７】
４．組換え微生物の構築
４．１  発現ベクターの作製
本発明で用いられる組換え微生物は、前述の宿主微生物に、硫酸イオンによる抑制を受けることなく、恒常的に発現するプロモーター（例えば、ｋａｐ１プロモーター）およびＣ−Ｓ結合を選択的に切断する酵素をコードする脱硫遺伝子を機能しうる態様で導入することにより、作製される。
【００２８】
微生物への上記遺伝子の挿入は、該プロモーターおよび脱硫酵素遺伝子を含む発現ベクターを用いて行うことができる。用いられるベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、ファージ、ウィルス、ＹＡＣ等を使用することができるが、特にトランスポゾンまたはトランスポソームを用いることが好ましい。
【００２９】
該発現ベクターは、プロモーターと脱硫遺伝子、あるいはさらに適当なターミネーター配列を、機能しうる態様で含む。ここで、「機能しうる態様」とは、脱硫遺伝子がプロモーターの支配下で適切に発現しうる態様をいう。したがって、脱硫遺伝子はプロモーターの下流に位置することになる。
【００３０】
前記発現ベクターには、上述の必須の配列のほか、その目的と効果を損なわない範囲で、他の遺伝子や配列を含むことができる。該遺伝子や配列としては、例えばプラスミドベクターの複製に関与する遺伝子や組換え体の選抜に使用するマーカー遺伝子、相同性組換えベクターにおける置換用の塩基配列およびトランスポゾンベクターの反復ＤＮＡ配列等が挙げられる。
【００３１】
本発明の好ましい態様として、トランスポゾンを用いた発現ベクターを以下のようにして作製することができる。トランスポゾンを用いた方法は、染色体へのＤＮＡ挿入の強力なツールとして既に当技術分野では公知であり、例えばｐＭＯＤ１（エア・ブラウン社）等を用いた方法等が知られている。
【００３２】
トランスポゾンは転移性遺伝因子とも呼ばれ、宿主生物の染色体内において新たな位置へ移動する独特な能力（転移能力）を有している。そのため、染色体相同組換え法とは大きく異なり、該因子と標的部位との間に相同性のあるＤＮＡ領域を必要としない。またトランスポゾンはその構造上、ＤＮＡの両末端の塩基配列のみがトランスポゾンとしての基本機能、すなわち転移に必要であり、この両末端の塩基配列に挟まれた領域に種々の機能性因子、例えば抗生物質耐性遺伝子のようなマーカー遺伝子、制限酵素切断部位等の任意のＤＮＡ配列を組み込むことが出来る。
【００３３】
トランスポゾンには、選抜をより容易にするために、適当なマーカー遺伝子をレポーター遺伝子とともに挿入することが好ましい。該マーカー遺伝子としては、例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
【００３４】
トランスポゾンの染色体への挿入は、公知の形質転換、形質導入、接合伝達（ｃｏｎｊｕｇａｌ  ｍａｔｉｎｇ）または電気穿孔法等により行うことができる。トランスポゾンの挿入組換え体は、例えば上述のトランスポゾン上のマーカー遺伝子により選抜することができる。
【００３５】
本発明では、ｐＭＯＤ１のように大腸菌内で複製可能なプラスミドに内包されたトランスポゾン内に、硫酸イオンの抑制を受けることなく恒常的に発現するプロモーター（例えば、配列番号１で示される塩基配列からなるｋａｐ１プロモーター）、その下流に脱硫遺伝子（例えば、ｄｓｚＡＢＣＤ遺伝子）および抗生物質耐性因子等の組換え体選抜のためのマーカー遺伝子を組み込む。次に、適当な制限酵素でトランスポゾン部分を切断し、アガロースゲル電気泳動等により単離する。単離したトランスポゾンＤＮＡ断片をトランスポゼースと反応させることにより、宿主内で脱硫酵素遺伝子を発現させる発現ベクターとして使用可能なトランスポソームが調製できる。
【００３６】
４．２  微生物の形質転換
微生物の形質転換は、例えば前記発現ベクターを公知の方法によって宿主微生物に導入することによって達成される。導入法は特に限定されず、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等、利用可能な任意の方法を用いればよい。前述のトランスポゾンであれば、公知の形質転換、形質導入、接合伝達（ｃｏｎｊｕｇａｌ  ｍａｔｉｎｇ）または電気穿孔法等により行うことができる。
【００３７】
４．３  組換え微生物：マイコバクテリウム属  ＭＲ３４株、およびロドコッカス・エリスロポリス  ＭＣ０２０３株
上記の方法によって得られる組換え微生物の好ましい例として、マイコバクテリウム属ＭＲ３４株、およびロドコッカス属ではＭＣ０２０３株を挙げることができる。
【００３８】
ＭＲ３４株はマイコバクテリウム属ＮＣＩＭＢ１０４０３株に、ｋａｐ１プロモーターとロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子ｄｓｚＡＢＣＤ（Ｋ．Ｈｉｒａｓａｗａ，  Ｙ．Ｉｓｈｉｉ，  Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｋ．Ｋｏｉｚｕｍｉ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｍａｒｕｈａｓｈｉ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６５（２），  ２３９−２４６，２００１）、および組換え体の選抜のための生理的マーカーであるゲンタマイシン耐性因子を、前述したトランスポソームを用いて組み込んだ、組換え微生物である。このＭＲ３４株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１    中央第６）に、２００３年２月７日付けでＦＥＲＭ  Ｐ−１９２０５として寄託されている。
【００３９】
水素化脱硫後の化石燃料中に多く含有している４，６位にアルキル側鎖を有するジベンゾチオフェン類から生成するヒドロキシ体はメチル化されやすく、難脱硫性の高アルキル化含硫複素環式化合物となる。ＭＲ３４株は、これまで微生物では特に難脱硫といわれている４，６−ジプロピルジベンゾチオフェンや１０−メチルベンゾナフトチオフェンでさえも、容易に脱硫することができる。
【００４０】
一方、ＭＣ０２０３株はロドコッカス・エリスロポリスＭＣ１１０９株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５９４）に、ｋａｐ１プロモーターとロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子ｄｓｚＡＢＣＤ、および組換え体の選抜のための生理的マーカーであるゲンタマイシン耐性因子を、前述したトランスポソームを用いて組み込んだ、組換え微生物である。このロドコッカス・エリスロポリスＭＣ０２０３株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１    中央第６）に、２００１年１１月１２日付けで  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５９５として寄託されている。ＭＣ０２０３は、特有の膜組成をもち、難脱硫性のアルキルジベンゾチオフェン類を容易に脱硫することができる（特願２００１−３４８３８５号参照）。
【００４１】
以上のようにＭＲ３４株は、特に高アルキル化含硫複素環式化合物の菌体膜透過性が高く、ＭＣ０２０３株は化石燃料中に存在する含硫複素環式化合物に存在する低アルキル化化含硫複素環式化合物の菌体膜透過性が高く、いずれも難脱硫性といわれている含硫複素環式化合物のアルキル化体を効率よく脱硫することができる。
【００４２】
５．  組換え微生物を用いた脱硫方法
本発明にかかる脱硫方法は、少なくとも２種類の前記組換え微生物を含硫複素環式化合物を含む培養液中に添加し、該微生物の生育条件下で連続的に実施することができる。具体的には、本発明の脱硫方法は以下のようにして行われる。
【００４３】
５．１  菌体の培養（菌体生産）
まず前記組換え微生物を、脱硫方法に供する菌体生産ために培養する。培養は、微生物の通常の培養法にしたがって行えばよい。培養の形態は固体培養でも液体培養でもよいが、液体培養が好ましい。培地の栄養源としては通常用いられているものが広く用いられる。炭素源としては利用可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、コハク酸、クエン酸、酢酸等が使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物等の有機栄養物質が使用される。硫黄源としては利用可能な無機硫黄化合物であればよく、たとえば硫酸塩等が使用される。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン類等が必要に応じて用いられる。
【００４４】
好適な培地としては、天然栄養培地：例えばＬＢ培地や２ＹＴ培地、あるいは無機塩類を主体とする合成培地：例えば、特開平１１−１８１４４６号「脱硫活性微生物の製造方法」に記載の組成である基本培地等を用いることができる。特にロドコッカス属に属する微生物およびマイコバクテリウム属に属する微生物は、それぞれ後述のＮＫＩＩ（表２）、ＮＫＩＩＩ培地（表３）を用いることが好ましい。培養は、微生物が生育可能である温度、ｐＨなど、使用する微生物にとって最適な培養条件で行う。一般的には、まず新鮮な培地に種菌を適当量、例えば１〜２容量％接種する。培地としては、前項で記載した培地を用いることができるが、種菌としては、対数増殖期初期から定常期までのいずれかの状態の菌を用いればよく、好ましくは対数増殖期後期のものを用いる。種菌の量は必要に応じて増減することができる。その後、ｐＨ６〜９、約３０にて１〜２日間往復または回転振盪培養する。
【００４５】
５．２  含硫複素環式化合物
本発明において脱硫対象となる含硫複素環式化合物は、特に限定されず、例えば、石油等の化石燃料油中に含まれる含硫複素環式化合物類を広く対象とすることができる。特にｋａｐ１プロモーターの挿入により、本発明の組換え微生物は外部環境にかかわらず脱硫酵素遺伝子を高いレベルで発現させる。
【００４６】
したがって、挿入する脱硫酵素を選ぶことで、難脱硫性のベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン、ベンゾテトラヒドロナフトチオフェン、およびベンゾナフトチオフェン類、ならびにアルキル化ベンゾチオフェン類、アルキル化ジベンゾチオフェン類、アルキル化ベンゾテトラヒドロナフトチオフェン類、およびベンゾナフトチオフェン類等を好適に脱硫することができる。かかるアルキル化ベンゾチオフェンとしては２−メチルジベンゾチオフェン、３−メチルベンゾチオフェン、５−メチルベンゾチオフェン、５−メチルベンゾチオフェン、２−エチルチオフェン等が例示される。アルキル化ジベンゾチオフェンとしては、４−メチルジベンゾチオフェン、４−エチルジベンゾチオフェン、４−プロピルジベンゾチオフェン、４−ブチルジベンゾチオフェン、４−ペンチルジベンゾチオフェン、４−ヘキシルジベンゾチオフェン、４，６−ジメチルベンゾチオフェン、４，６−ジエチルジベンゾチオフェン、４，６−ジプロピルジベンゾチオフェン、３，４，６−トリメチルジベンゾチオフェン、３−プロピル，４，８−ジメチルジベンゾチオフェン等が例示される。またアルキル化べンゾナフトチオフェンとしては、１０−メチルベンゾナフトチオフェンが例示される。
【００４７】
これらの含硫複素環式化合物を溶解するために使用可能な有機溶媒としては、ｎ−テトラデカンの他、Ｃ８〜Ｃ２０のｎ−パラフィンやケロシン、軽油、重油などが挙げられる。また、必要に応じて反応液上方の気相を酸素で置換封入してもよい。
【００４８】
５．３  脱硫反応
含硫複素環式化合物の分解は、例えば、上記組み換え微生物を上記培地中で培養した後、得られた培養物から遠心分離などの集菌操作によって得られた休止菌体を含硫複素環式化合物と接触させて行うことによって行う。このような休止菌体による脱硫は、例えば以下のようにして行われる。
【００４９】
まず、休止菌体を調製する。新鮮な培地に種菌を適当量、例えば１〜２容量％接種する。培地としては、上記の培地を用いることができる。種菌としては、対数増殖期初期から定常期までのいずれかの状態の菌を用いればよく、好ましくは対数増殖期後期のものを用いる。種菌の量は必要に応じて増減することができる。その後、ｐＨ６〜９、約３０℃にて１〜２日間往復又は回転振盪培養する。
【００５０】
次いで、菌体を分離集菌し、洗浄することにより休止菌体が得られる。集菌は、培養菌体が対数増殖期初期から定常期までのいずれの状態にある時に行ってもよいが、対数増殖期中期から後期の状態にある時に行うのが好ましい。また、集菌は、遠心分離の他、濾過、沈降分離等のいかなる方法で行ってもよい。菌体の洗浄には、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等のいかなる緩衝液を使用してもよく、また、水を用いて菌体を洗浄することもできる。あるいはまた、菌体の洗浄を省くこともできる。
【００５１】
休止菌体による脱硫は、休止菌体を適当な緩衝液に懸濁して調製した菌懸濁液に軽油または基質である含硫複素環式化合物を油相に添加して反応させることにより行う。緩衝液としては種々の緩衝液を使用できる。緩衝液のｐＨは特に限定されないが、ｐＨ６〜７が好適である。また、緩衝液の代わりに、水や培地等を使用することもできる。菌体懸濁液の濃度は、ＯＤ６６０  が１〜１００の間が好適であり、必要に応じて増減できる。菌懸濁液量に対する油量の油水比は０．０１〜１００の間で行うことが可能であり、必要に応じて使用することができる。好ましくは１〜１０の油水比が用いられる。反応温度は３０〜４２℃で行うことができるが、その他の適当な温度でもよく、好ましくは３５〜４０℃が好適である。反応時間は１〜２時間が好適であるが、必要に応じて増減できる
なお、２種類またはそれ以上の反応用菌体は脱硫対象である軽油等の含硫複素環式化合物に同時に加えてもよいし、順次加えてもよい。ここで、順次加えるとは、１つの反応用菌体を加えて脱硫反応を行った後、油層のみを分離し、次いで別な反応用菌体を加えて脱硫反応をさせること、あるいはこの工程を繰り返すことを意味する。
【００５２】
脱硫率の測定は、高速液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー／質量スペクトル、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー／質量スペクトル分析などを使用して行うことができる。また、必要に応じて他の分析方法を併せて利用してもよい。
【００５３】
５．４  本発明の脱硫方法の利点
本発明の脱硫方法は、導入したプロモーターと脱硫酵素遺伝子により、脱硫遺伝子が恒常的に発現し、反応生成物である硫酸イオンによるフィードバック阻害を受けることなく、かつ宿主菌の菌体膜における化石燃料中に存在する含硫複素環式化合物に対する菌体膜透過性に対する基質特異性があり、単一の属に属する微生物を用いた場合に比較して、高い脱硫率で脱硫させることが可能になる。
【００５４】
また、微生物を用いた含硫複素環式化合物に対する脱硫方法において、含硫複素環式化合物が菌体膜透過性が低いかまたはないために脱硫率および脱硫速度を低下させており、異なった属に属する微生物、特にマイコバクテリウム属およびロドコッカス属に属する微生物を用いることにより、菌体膜透過性における障害を解消し、高い脱硫率を可能にすることができる。
【００５５】
さらに、そのような組換え微生物のうち、特に含硫複素環式化合物の菌体膜透過性にかかわる特性がそれぞれ異なる、すなわち脱硫特性が異なる２種類またはそれ以上の組換え微生物を選んで、順次または同時に用いることにより、単独での脱硫効果からは予測できないほど高い脱硫率が達成できる。
【００５６】
以上のとおり、本発明の脱硫方法は、外部環境に関わらず脱硫酵素を高活性に発現させ、含硫複素環式化合物に対する菌体膜透過性に対する障害を解消する。さらに、該方法は化石燃料中に含有される難脱硫性の含硫複素環式化合物をも高効率で脱硫しうる。すなわち、本発明の脱硫方法は、化石燃料中に含有される含硫複素環式化合物の工業的レベルでの脱硫方法として利用価値が高い。
【００５７】
【実施例】
以下、本発明を参考例および実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。
【００５８】
〔参考例１〕プロモーター検索用トランスポゾンの作製
ロドコッカス・エリスロポリスＫＡ２−５−１株よりプロモーター配列を検索するためのトランスポゾンを以下のようにして作製した。
（１）  トランスポゾンＤＮＡ断片の作製
トランスポゾンを含むプラスミドであるｐＭＯＤ１（エア・ブラウン社）からトランスポゾンＤＮＡ断片を調製した。まずｐＭＯＤ１をテンプレートとして、以下のプライマーによりＰＣＲ反応を行った。プライマーは、ｐＭＯＤ１に含まれるトランスポゾン中の制限酵素切断部位  ＰｖｕＩＩをＳｔｕＩに置換し、かつ３’側にＨｐａＩの制限酵素認識部位が導入されるようにデザインされている。
プライマー：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５−ＣＣＴＡＧＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣＡＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧ−３（配列番号２）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５−ＣＴＴＡＡＧＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣＧＴＴＡＡＣＣＣＴＧＡＡＧＣ−３（配列番号３）
次に、反応液の一部を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１３０ｂｐの遺伝子増幅断片（目的とするトランスポゾンＤＮＡ断片）が得られたことを確認した。
【００５９】
（２）  ｐＭＯＤＳｔの作製
大腸菌由来のベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）  （ストラタジーン社）を制限酵素ＳａｃＩおよびＫｐｎＩと３７℃、１時間反応させ、プラスミドＤＮＡを切断した。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えてよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離し、上層を採取した。採取した上層に、これと等容量の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液および２．５容のエタノールを加え、析出した沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ：ｐＨ８．０］に溶解した。回収した溶液に０．１容のＢｌｕｎｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．１容のＫＯＤＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を加え、７２℃、５分反応させてＤＮＡ制限酵素切断面を平滑化した。
【００６０】
（１）で調製したｐＭＯＤ１  ＤＮＡ反応液（トランスポゾンＤＮＡ断片含む）とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）ＤＮＡ断片を含む液を等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を２倍量加え、よく攪拌した後、１６℃、６０分間インキュベートした。大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ  塩化ナトリウム，  ０．００２５Ｍ  塩化カリウム、０．０１Ｍ  硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ  塩化マグネシウム、０．０２Ｍ  グルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とうした。得られた大腸菌よりプラスミドを抽出し、その塩基配列を３１０型ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンズエルマー社）を用いて解析し、（１）で作製したトランスポゾンＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを選別した。このプラスミドは、ｐＭＯＤＳｔと命名した。
【００６１】
（３）  ｐＴｎＫＳｔの作製
トランスポゾンの抗生物質耐性マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を利用するためにｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクター（ＡＴＣＣ  ８７０９７  Ｊｕｓｔｉｎ  Ａ．Ｃ．Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｊｏｈｎ  Ａ．ｃ．Ａｒｃｈｅｒ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｈｐ  ｏｐｅｒｏｎ  ”Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ７４：１７５−１８８，１９９８）より前記マーカー遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を調製した。すなわち、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢをテンプレートとして、以下のプライマーによりＰＣＲ反応を行った。
プライマー：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５−ＣＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＣＡＣＴＣＡＧＧＧＣＧＣ−３（配列番号４）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５−ＣＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣ−３（配列番号５）
反応液の一部を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１．２Ｋｂの遺伝子増幅断片が得られたことを確認した。
【００６２】
ｐＭＯＤｓｔを制限酵素ＨｐａＩで３７℃、１時間反応させ、プラスミドＤＮＡを切断した。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離を行い、上層を採取した。採取した上層にその０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ：ｐＨ８．０］に溶解した。上記のｐＫ１８ｍｏｂＳａｃＢ  ＤＮＡ  反応物とｐＭＯＤｓｔ  ＤＮＡ断片を含む液を等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を２容加え、よく攪拌した後、１６℃、６０分間インキュベートした。
【００６３】
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ  塩化ナトリウム，  ０．００２５Ｍ  塩化カリウム、０．０１Ｍ  硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ  塩化マグネシウム、０．０２Ｍグルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とうした。次にカナマイシン硫酸塩２００ｐｐｍを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、バクトアガー１．５％］に塗沫した。カナマイシン耐性を示した大腸菌よりプラスミドを抽出し、これらのプラスミドの塩基配列を３１０型ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンズエルマー社）を用いて解析し、目的の改変がなされたプラスミドを選別した。このプラスミドをｐＴｎＫＳｔと命名した。
【００６４】
（４）  レポーター遺伝子（ｒｓＧＦＰ）の挿入
プロモーター配列の挿入を視覚的に確認できるよう、ｐＱＢＩ６３（宝酒造社）由来のｒｓＧＦＰ（ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子をレポーター遺伝子として挿入した。まず、ｐＱＢＩ６３を制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで３７℃、１時間反応させて切断後、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ、約８００ｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて回収し、ｒｓＧＦＰを調製した。このｒｓＧＦＰ  ＤＮＡ断片溶液を同様にＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＴｎＫＳｔ  ＤＮＡ溶液と等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を２容加え、よく攪拌した後、１６℃、６０分間インキュベートした。
【００６５】
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ  塩化ナトリウム，  ０．００２５Ｍ  塩化カリウム、０．０１Ｍ  硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ  塩化マグネシウム、０．０２Ｍグルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とうした。次にカナマイシン硫酸塩２００ｐｐｍを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、バクトアガー１．５％］に前記反応液を塗沫した。得られた大腸菌よりプラスミドを抽出し、これらのプラスミドの塩基配列を３１０型ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンズエルマー社）を用いて解析し、ｒｓＧＦＰが挿入されたプラスミドを選別した。このプラスミドをｐＴｎＫｇｆｐと命名した。
【００６６】
このようにして作製したｐＴｎＫｇｆｐを制限酵素ＳｔｕＩで３７℃、１時間反応させて切断後、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけて、約２．２ＫｂのＤＮＡ断片をＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて回収した。回収したＤＮＡ溶液と等容量のトランスポゾーム溶液を加え、さらに２容の１００％グリセロールを加えてよく混ぜた後、室温にて２０分インキュベートした。調製したプロモーター検索用トランスポゾンをＴｎＫｇｆｐと命名した。
【００６７】
〔参考例２〕ロドコッカス・エリスロポリスＫＡ２−５−１株からのプロモーターの単離
（１）  トランスポゾンＴｎＫｇｆｐによるレポーター遺伝子の導入
５００ｍｌ容三角フラスコに入った滅菌済みのＬＢ培地１００ｍｌにロドコッカス・エリスロポリスＫＡ２−５−１株を植菌し、３０℃で２４時間培養した。得られた培養液を４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿を滅菌水にて２回洗浄後、測定波長６６０ｎｍでの濁度が４０になるように１０％グリセロール水溶液に懸濁した。
【００６８】
前記懸濁液８０μｌに参考例１で調製したＴｎＫｇｆｐ溶液１μｌを添加し、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド社）を用いて２５μＦ、４００Ω、１．５ｋＶ／ｃｍの条件で処理した。処理液にＳＯＣ培地  ０．４２ｍｌを添加し、３０℃、３時間培養を行った。得られた培養液をカナマイシン硫酸塩１００ｍｇ／ｌ、硫酸アンモニウム０．１ｍＭおよび寒天末１５  ｇ／ｌを含む基本培地（Ａ−ＫｍＡＳＡ培地）に塗末し、３０℃、４８時間培養した。基本培地は、特開平  １１−１８１４４６号「脱硫活性微生物の製造方法」に記載の組成を用いた。Ａ−ＫｍＡＳＡ培地においてコロニーを形成した菌を３０２ｎｍの紫外線照射下で観察し、ｒｓＧＦＰ特有の蛍光緑色を呈したコロニーを選抜した。
【００６９】
選抜したコロニーを硫酸アンモニウム０．１ｍＭおよびカナマイシン１００ｍｇ／ｌを含む基本培地２ｍｌに、１白菌耳量を植菌し、３０℃で７２時間培養した。培養液を４℃、１７０００ｇで５分間遠心分離し、沈殿した菌体を採取した。採取した菌体よりＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用いて染色体ＤＮＡを分離精製した。  精製した染色体ＤＮＡの全量を制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間反応させ、染色体ＤＮＡを切断した。切断した染色体ＤＮＡは、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて精製した。
【００７０】
（２）  プロモーターのクローニングおよび塩基配列の決定
一方、大腸菌由来のベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）  （ストラタジーン社）を制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１時間反応させ、プラスミドＤＮＡを切断した。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えてよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離し、上層を採取した。採取した上層に０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ：ｐＨ８．０］に溶解した。
【００７１】
上記の染色体ＤＮＡ  反応物とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）ＤＮＡ断片を含む液を等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡社製）  を２容加え、よく攪拌した後、１６℃、６０分間インキュベートした。
【００７２】
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ  塩化ナトリウム，  ０．００２５Ｍ  塩化カリウム、０．０１Ｍ  硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ  塩化マグネシウム、０．０２Ｍグルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とうした。得られた培養液０．１ｍｌをカナマイシン２５ｍｇ／ｌ、寒天１５ｇ／１を含むＬＢ培地に塗布し、３７℃、１昼夜培養した。得られた大腸菌よりプラスミドを抽出し、これらのプラスミドの塩基配列を３１０型ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンズエルマー社）を用いて決定した。得られた塩基配列データは、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ／ＡＴＳＱ  ｖ３．０  およびＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ  ｖ８．０を用いて解析した。解析の結果得られた約３５０ｂｐの大腸菌プロモーターと相同性の高いＤＮＡ配列をＫＡＰ１と命名し、ＫＡＰ１を含むプラスミドをｐＫＡＰ１と命名した。
【００７３】
ｐＫＡＰ１のＤＮＡ溶液にＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを添加し、３７℃、１時間インキュベートした。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えてよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離し、上層を採取した。採取した上層に０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡ：ｐＨ８．０］に溶解し、ＫＡＰ１  ＤＮＡ断片溶液とした。
【００７４】
〔参考例３〕  組換えトランスポゾンＴｎＫＡＰＤＳの作製
（１）  ｐＳＫＡＢＣの作製
ロドコッカス・エリスロポリス  ＫＡ２−５−１株のｄｓｚＡＢＣＤ  遺伝子を含む組換えプラスミドｐＲＫＰＰＢＢ（  Ｋａｚｕａｋｉ  Ｈｉｒａｓａｗａ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６５（２）  ２３９−２４６  （２００１））溶液にＤｒａＩ  及び  ＸｂａＩ溶液を添加し、３７℃、１時間インキュベートした。得られた反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動を用いてＤＮＡを分離し、約５．０  ｋｂのＤＮＡ断片をＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ：ｐＨ８．０］に溶解し、ｄｓｚＡＢＣＤ  を含むＤＮＡ断片とした。回収した溶液に０．１容のＢｌｕｎｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．１容のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を加え、７２℃、５分間反応させてＤＮＡ制限酵素切断面を平滑化した。
【００７５】
一方、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社）を含む溶液にＳｍａＩ及びＥｃｏＲＶ溶液を添加し、３７℃、１時間インキュベートした。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えてよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離し、上層を採取した。採取した上層に、その０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ：ｐＨ８．０］に溶解し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）／ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶ断片とした。
【００７６】
上記のｄｓｚＡＢＣＤ  を含むＤＮＡ断片とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）／ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶ断片を含む溶液を等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を２容加え、よく攪拌した後、１６℃、１時間インキュベートした。
【００７７】
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ  塩化ナトリウム，  ０．００２５Ｍ  塩化カリウム、０．０１Ｍ  硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ  塩化マグネシウム、０．０２Ｍグルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間振とうした。得られた大腸菌よりプラスミドを抽出し、これらのプラスミドの塩基配列を３１０型ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社製）を用いて目的のＤＮＡが挿入されたプラスミドを選別した。このプラスミドをｐＳＫＡＢＣと命名した。
【００７８】
（２）  ｄｓｚＡＢＣＤ  を含むＤＮＡ断片の作製
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社）にｄｓｚＡＢＣＤ  遺伝子を含む組換えプラスミドｐＳＫＡＢＣ  溶液を加え、Ｘｂａ  Ｉ  及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ溶液を添加して３７℃、１時間インキュベートし、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）のＸｂａＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩサイトにｄｓｚＡＢＣＤ  遺伝子群を組み込んだ。反応液は０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ、約５．０ｋｂのＤＮＡ断片をＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ：ｐＨ８．０］に溶解して、ｄｓｚＡＢＣＤ  を含むＤＮＡ断片とした。
【００７９】
（３）  ＴｎＫｓｔ／ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片の作製
一方、トランスポゾンベクターｐＴｎＫｓｔを含むＤＮＡ溶液にＥｃｏＲＩ及び、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ溶液を添加し、３７℃、１時間インキュベートした。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えてよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離し、上層を採取した。採取した上層に０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ：ｐＨ８．０］に溶解し、ＴｎＫｓｔ／ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片とした。
【００８０】
（４）  組換えトランスポゾンＴｎＫＡＰＤＳの作製
上記のようにして得られたｄｓｚＡＢＣＤを含むＤＮＡ断片溶液、ｐＲＨＫ１／ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩのＤＮＡ断片溶液、及び実施例２で得られたＫＡＰ１  ＤＮＡ断片溶液を各等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  （東洋紡社）を３容加え、よく攪拌した後、１６℃、３０分間インキュベートした。
【００８１】
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ  塩化ナトリウム，  ０．００２５Ｍ  塩化カリウム、０．０１Ｍ  硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ  塩化マグネシウム、０．０２Ｍ  グルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とう培養した。得られた培養液０．１ｍｌをカナマイシン２５ｍｇ／ｌ、寒天１５ｇ／１を含むＬＢ培地に塗布し、３７℃、１昼夜培養した。得られた培養コロニーをカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地１．５ｍｌに植菌し、ＧＦＸ  ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア）を用いて調製したプラスミドＤＮＡを、５０μｌ  ＴＥ緩衝液に溶解し、ｐＴｎＫＡＰＤＳ遺伝子溶液とした。このようにして作製したｐＴｎＫＡＰＤＳ遺伝子溶液を制限酵素ＳｔｕＩで３７℃、１時間反応後、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ、約６ＫｂのＤＮＡ断片をＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて回収した。回収したＤＮＡ溶液に等容量のトランスポゾーム溶液を加え、さらに２容の１００％グリセロールを加えてよく混ぜた後、室温にて２０分インキュベートした。調製した組換えトランスポゾンをＴｎＫＡＰＤＳと命名した。
【００８２】
〔実施例４〕ＴｎＫＡＰＤＳによるロドコッカス・エリスロポリスＭＣ１１０９株の形質転換−ＭＣ０２０３株の作製
（１）  ロドコッカス・エリスロポリスＭＣ１１０９株の取得及び同定
５００ｍｌ容三角フラスコに土壌１ｇを入れ、汚染が観察されない新鮮軽油５０ｍｌと等容量のＬＢ培地を添加して３０℃で１０日間インキュベートした。得られた軽油添加培養液の１ｍｌを種菌として、５００ｍｌ容三角フラスコに、新鮮軽油５０ｍｌと等容量のＬＢ培地を添加し、これに前記種菌１ｍｌを植菌し、３０℃で１０日間インキュベートした。同様の継代培養を３回繰り返した。継体培養後の培養液をＬＢ寒天平板に塗布して単一コロニーを分離し、ＭＣ１１０９株と命名した。表２に示した項目についてＭＣ１１０９株の同定を行い、ロドコッカス・エリスロポリスと同定した。なお、表２から明らかなよう、ＭＣ１１０９株にはオキシダーゼ活性がなく、脱硫能力を有しない。
【００８３】
このロドコッカス・エリスロポリスＭＣ１１０９株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１    中央第６）に、２００１年１１月１２日付けでＦＥＲＭ  Ｐ−１８５９４  として寄託されている。
【００８４】
（２）ＴｎＫＡＰＤＳ  による形質転換
５００ｍｌ容三角フラスコに入った滅菌済みのＬＢ培地１００ｍｌにロドコッカス  エリスロポリスＭＣ１１０９株を植菌し、３０℃で２４時間培養した。得られた培養液を４℃、１０，０００ｒｐｍ、１０分遠心分離し、沈殿を滅菌水にて２回洗浄し、測定波長６６０ｎｍでの濁度が４０になるように１０％グリセロール水溶液に懸濁した。
【００８５】
該懸濁液８０μｌにＴｎＫＡＰＤＳ  トランスポゾン溶液１μｌを添加し、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド社）を用いて２５μＦ、４００Ω、１．５ｋＶ／ｃｍの条件で処理した。処理液にＳＯＣ培地０．４２ｍｌを添加し、３０℃、３時間培養した。得られた培養液を４℃、１０，０００ｇで遠心分離し、溶液部分を廃棄して等容量のＮＫＩＩ培地（表２）に再懸濁した。
【００８６】
【表２】
2004242511.tif 000003
【００８７】
得られた菌懸濁液を１００ｍｌ容三角フラスコに入ったＮＫＩＩ培地１０ｍｌに等容量の４，６−ジエチルジベンゾチオフェン３００ｍｇ／ｌを含むテトラデカンを添加し、３０℃で７２時間培養した。培養液をジベンゾチオフェン２５ｍｇ／ｌと寒天１５ｇ／ｌを含むジベンゾチオフェン寒天ＮＫＩＩ培地に塗布し、単一コロニーとして取得し、ＴｎＫＡＰＤＳ  の形質転換株ロドコッカス・エリスロポリスＭＣ０２０３株と命名した。
【００８８】
このロドコッカス・エリスロポリスＭＣ０２０３株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１    中央第６）に、２００１年１１月１２日付けで  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５９５  として寄託した。
【００８９】
〔参考例５〕  組換えトランスポゾンＴｎＧＫＡＰＤＳ  の作製
（１）  ｐＴｎＧＳｔの作製
トランスポゾンの抗生物質耐性マーカーとしてゲンタマイシン耐性遺伝子を利用するためにｐＪＱ２００（入手先ＡＴＣＣ７７４８２）より前記マーカー遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩにより調製した。反応液の一部を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１．４Ｋｂの遺伝子増幅断片が得られたことを確認した。
【００９０】
ＰＭＯＤｓｔ（参考例１）を制限酵素ＨｐａＩで３７℃、１時間反応させ、プラスミドＤＮＡを切断した。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離を行い、上層を採取した。採取した上層にその０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ：ｐＨ８．０］に溶解した。上記のｐＪＱ２００のＤＮＡ  断片とｐＭＯＤｓｔ  ＤＮＡ断片を含む液を等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を２容加え、よく攪拌した後、１６℃、６０分間インキュベートした。
【００９１】
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ  塩化ナトリウム，  ０．００２５Ｍ  塩化カリウム、０．０１Ｍ  硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ  塩化マグネシウム、０．０２Ｍグルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とうした。次にゲンタマイシン硫酸塩２００ｐｐｍを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、バクトアガー１．５％］に塗沫した。ゲンタマイシン耐性を示した大腸菌よりプラスミドを抽出し、これらのプラスミドの塩基配列を３１０型ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンズエルマー社）を用いて解析し、目的の改変がなされたプラスミドを選別した。このプラスミドをｐＴｎＧＳｔと命名した。
【００９２】
また、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ  塩化ナトリウム，  ０．００２５Ｍ  塩化カリウム、０．０１Ｍ  硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ  塩化マグネシウム、０．０２Ｍ  グルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とう培養した。得られた培養液０．１ｍｌをカナマイシン２５ｍｇ／ｌ、寒天１５ｇ／１を含むＬＢ培地に塗布し、３７℃、１昼夜培養した。得られた培養コロニーをカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地１．５ｍｌに植菌し、ＧＦＸ  ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア）を用いて調製したプラスミドＤＮＡを、５０μｌ  ＴＥ緩衝液に溶解し、ｐＴｎＫＡＰＤＳ遺伝子溶液とした。このようにして作製したｐＴｎＫＡＰＤＳ遺伝子溶液を制限酵素ＳｔｕＩで３７℃、１時間反応後、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ、約６ＫｂのＤＮＡ断片をＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて回収した。回収したＤＮＡ溶液に等容量のトランスポゾーム溶液を加え、さらに２容の１００％グリセロールを加えてよく混ぜた後、室温にて２０分インキュベートした。調製した組換えトランスポゾンをＴｎＫＡＰＤＳと命名した。
【００９３】
（２）  ＴｎＧｓｔ／ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片およびＴｎＫｓｔ／ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片の作製
一方、トランスポゾンベクターｐＴｎＧｓｔを含むＤＮＡ溶液にＥｃｏＲＩおよび、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ溶液を添加し、３７℃、１時間インキュベートした。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えてよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離し、上層を採取した。採取した上層に０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ：ｐＨ８．０］に溶解し、ＴｎＧｓｔ／ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片とし、トランスポゾンベクターｐＴｎＫｓｔを含むＤＮＡ溶液にＥｃｏＲＩ及び、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ溶液を添加し、３７℃、１時間インキュベートした。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えてよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離し、上層を採取した。採取した上層に０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡ  ：ｐＨ８．０］に溶解し、ＴｎＫｓｔ／ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片とした。
【００９４】
（３）  組換えトランスポゾンＴｎＧＫＡＰＤＳの作製
上記のようにして得られたＴｎＧｓｔ／ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩのＤＮＡ断片溶液または、ＴｎＫｓｔ／ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片溶液、ｄｓｚＡＢＣＤ  ＤＮＡ断片溶液（参考例３参照）、およびｋａｐ１ＤＮＡ断片溶液（参考例１および２参照）を各等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  （東洋紡社）を３容加え、よく攪拌した後、１６℃、３０分間インキュベートした。
【００９５】
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ  塩化ナトリウム，  ０．００２５Ｍ  塩化カリウム、０．０１Ｍ  硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ  塩化マグネシウム、０．０２Ｍ  グルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とう培養した。得られた培養液０．１ｍｌをゲンタマイシン２５ｍｇ／ｌ、寒天１５ｇ／１を含むＬＢ培地に塗布し、３７℃、１昼夜培養した。得られた培養コロニーをゲンタマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地１．５ｍｌに植菌し、ＧＦＸ  ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア）を用いて調製したプラスミドＤＮＡを、５０μｌ  ＴＥ緩衝液に溶解し、ｐＴｎＧＫＡＰＤＳ遺伝子溶液およびとした。このようにして作製したｐＴｎＧＫＡＰＤＳ遺伝子溶液を制限酵素ＳｔｕＩで３７℃、１時間反応後、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ、約６ＫｂのＤＮＡ断片をＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて回収した。回収したＤＮＡ溶液に等容量のトランスポゾーム溶液を加え、さらに２容の１００％グリセロールを加えてよく混ぜた後、室温にて２０分インキュベートした。調製した組換えトランスポゾンをＴｎＧＫＡＰＤＳと命名した。また、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ  塩化ナトリウム，  ０．００２５Ｍ  塩化カリウム、０．０１Ｍ  硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ  塩化マグネシウム、０．０２Ｍ  グルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とう培養した。得られた培養液０．１ｍｌをカナマイシン２５ｍｇ／ｌ、寒天１５ｇ／１を含むＬＢ培地に塗布し、３７℃、１昼夜培養した。得られた培養コロニーをカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地１．５ｍｌに植菌し、ＧＦＸ  ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア）を用いて調製したプラスミドＤＮＡを、５０μｌ  ＴＥ緩衝液に溶解し、ｐＴｎＫＡＰＤＳ遺伝子溶液とした。このようにして作製したｐＴｎＫＡＰＤＳ遺伝子溶液を制限酵素ＳｔｕＩで３７℃、１時間反応後、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ、約６ＫｂのＤＮＡ断片をＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて回収した。回収したＤＮＡ溶液に等容量のトランスポゾーム溶液を加え、さらに２容の１００％グリセロールを加えてよく混ぜた後、室温にて２０分インキュベートした。調製した組換えトランスポゾンをＴｎＫＡＰＤＳと命名した。
【００９６】
〔参考例６〕マイコバクテリウム  ｓｐ．  ＮＣＩＭＢ１０４０３株のＴｎＧＫＡＰＤＳによる形質転換−ＭＲ３４株の作製
（１）  マイコバクテリウム  ｓｐ．  ＮＣＩＭＢ１０４０３株のＴｎＧＫＡＰＤＳによる形質転換
５００ｍｌ容三角フラスコに入った滅菌済みのＬＢ培地１００ｍｌにマイコバクテリウム属ＮＣＩＭＢ１０４０３株（ＮＣＩＭＢ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ  ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｕｒｕｇａ−ｇ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｐ／ｎｃｉｍｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ”  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｕｒｕｇａ−ｇ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｐ／ｎｃｉｍｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）より入手）を植菌し、３０℃で２４時間培養した。得られた培養液を４℃、１０，０００ｒｐｍ、１０分遠心分離し、沈殿を滅菌水にて２回洗浄し、測定波長６６０ｎｍでの濁度が４０になるように１０％グリセロール水溶液に懸濁した。
【００９７】
該懸濁液８０μｌにＴｎＧＫＡＰＤＳ  トランスポゾン溶液１μｌを添加し、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド社）を用いて２５μＦ、４００Ω、１．５ｋＶ／ｃｍの条件で処理した。処理液にＳＯＣ培地０．４２ｍｌを添加し、３０℃、３時間培養した。得られた培養液を４℃、１０，０００ｇで遠心分離し、溶液部分を廃棄して等容量のＮＫＩＩＩ培地（表３）に再懸濁した。
【００９８】
【表３】
2004242511.tif 000004
【００９９】
得られた菌懸濁液を、１００ｍｌ容三角フラスコに入った培地（ＮＫＩＩＩ培地から硫黄源のみを除いた培地１０ｍｌに同容の４，６−ジエチルジベンゾチオフェン３００ｍｇ／ｌを含むテトラデカンを添加したもの）に添加し、３０℃で７２時間培養した。培養液をジベンゾチオフェン２５ｍｇ／ｌと寒天１５ｇ／ｌを含むジベンゾチオフェン寒天ＮＫＩＩＩ培地に塗布し、単一コロニーとして取得した。このＮＣＩＭＢ１０４０３株のＴｎＧＫＡＰＤＳ  による形質転換株をマイコバクテリウムＭＲ３４株と命名した。
【０１００】
このマイコバクテリウムＭＲ３４株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１    中央第６）に、２００３年２月７日付けで  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２０５として寄託した。
【０１０１】
〔実施例１〕マイコバクテリウムＭＲ３４株およびロドコッカスＭＣ２０３株による軽油の脱硫試験
（１）試験方法
ＮＫＩＩ培地（表２）およびＮＫＩＩＩ培地（表３）２ｍｌに、それぞれロドコッカスＭＣ０２０３株およびマイコバクテリウムＭＲ３４株１白菌耳量をそれぞれ、植菌し、３０℃で２４時間培養した培養液１ｍｌを上記と同じ組成の培地１００ｍｌに移植し、さらに３０℃で４８時間培養した。得られた培養液を４℃、１０，０００ｒｐｍで  ５分間遠心分離後、得られた沈殿をｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸緩衝液で２回洗浄し、１００ｐｐｍ  ＭｇＣｌ２および１０ｇ／Ｌグルコースを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）  に懸濁して反応用菌体とした。この反応用菌体の測定波長６６０ｎｍでの濁度（ＯＤ６６０）は６０であった。
【０１０２】
脱硫活性反応は、ロドコッカスＭＣ０２０３株菌およびマイコバクテリウムＭＲ３４株の反応用菌体がそれぞれ８ｍｌ入った１００ｍｌの三角フラスコに、３種類の軽油（Ｂ−ＬＧＯ：硫黄濃度４０６  ｍｇ／ｌ、Ｆ−ＬＧＯ：硫黄濃度  １２２  ｍｇ／ｌ、Ｃ−ＬＧＯ：硫黄濃度１８  ｍｇ／ｌ）を４分の１容量（２ｍｌ）加え、３７℃、１５０ｓｐｍで往復振とうして実施した。それぞれの菌株の菌体濃度はＯＤ６６０は３０であった。
【０１０３】
また、ロドコッカスＭＣ０２０３株菌の反応用菌体８ｍｌを用いて同様に脱硫反応を行った後、脱硫後の油層のみを分離し、続けてマイコバクテリウムＭＲ３４株の反応用菌体８ｍｌを加えて同様に脱硫反応を行った。さらに、比較試験として、１種類の菌株の反応用菌体のみ８ｍｌを用いて、同様の方法で脱硫活性試験を行った。
【０１０４】
（２）  脱硫反応の測定
脱硫率の測定は軽油中の残存硫黄濃度はパイロ蛍光法硫黄分析機（７０００Ｓ    Ａｎｔｅｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｔｅｘａｓ，  ＵＳＡ）を用いて測定し、残存する硫黄化合物は、ＧＣ−ＡＥＤにより測定した。
ＧＣ−ＡＥＤの測定は下記の条件で行った。
【０１０５】
〔ＧＣ−ＡＥＤ  測定条件〕
装置：ＨＰ  ５８９Ａ  ガスクロマトグラフィー、  ＨＰ  ５９２１Ａ  検出器
（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ  ＵＳＡ）
カラム：ＨＰ−１  （２５  ｍｘ０．３２ｍｍｉ．ｄ．）
インジェクター、キャビティ温度：２５０  ℃
カラム温度：６０℃〜２５０  ℃、５  ℃／ｍｉｎ
【０１０６】
（３）  結果
結果を表４および図１に示した。
【表４】
2004242511.tif 000005
【０１０７】
表４に示されるように、２種類の組換え脱硫菌を用いた場合、それぞれ１種類の菌株を単独で用いた場合に比較して、３種類の軽油のいずれについても残存硫黄濃度は低く、高い脱硫率が達成された。すなわち、２種類の組換え脱硫菌を用いることにより、それぞれ１種類の脱硫菌では、菌体濃度、撹拌条件等の種々の脱硫反応条件を改良しても到達できない高い脱硫率を得ることが可能になった。なお、２種類の脱硫菌を順次用いた場合でも、これらを同時に用いた場合と同様の結果が得られた。なお、表４にはＭＣ０２０３株を先に用いた結果を示したが、ＭＲ３４株を先に用いた場合でも同様の結果がえられる。
【０１０８】
〔実施例２〕ＭＲ３４株とＭＣ０２０３株によるアルキル化ジベンゾチオフェン類に対する脱硫活性特性試験
（１）試験方法
マイコバクテリウムＭＲ３４株およびロドコッカス・エリスロポリスＭＣ０２０３  株をそれぞれ実施例１と同様の方法で培養した。得られた培養液を４℃、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、沈殿をｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸緩衝液で２回洗浄し、１００ｐｐｍＭｇＣｌ２および１０ｇ／Ｌグルコースを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）  に懸濁して反応用菌体を作製した。この菌体溶液ＯＤ６６０は３０であった。
【０１０９】
脱硫活性反応は、上記反応用菌体が５ｍｌ入った１００ｍｌの三角フラスコに、ジベンゾチオフェン、４，６−ジエチルジベンゾチオフェン、４，６−ジプロピルじベンゾチオフェンまたは２，４，６，８−テトラエチルジベンゾチオフェンをそれぞれ１．４ｍＭ濃度でｎ−ヘキサデカンに溶解したものを等容量（５ｍｌ）加え、３７℃、１５０ｓｐｍで往復振とうして、反応させた。反応時間は基質によって、脱硫の難易度が異なるので、それぞれの脱硫率が５０％を越えない時間実施した。
【０１１０】
（２）  脱硫活性測定
脱硫活性測定は、以下の条件で高速液体クロマトグラフィーにより、ヘキサデカン中のアルキル化ジベンゾチオフェン量を測定することにより行い、菌体量は乾燥菌体重量（ｇ）を測定して、比活性値として示した。結果を表５に示す。
2004242511.tif 000006
【０１１１】
【表５】
2004242511.tif 000007
【０１１２】
（３）  結果
表５から明らかなように、ＭＲ３４株とＭＣ０２０３株はジベンゾチオフェンの側鎖の数または長さによって、異なる脱硫比活性を示した。すなわち、ＭＣ０２０３株は側鎖のないジベンゾチオフェンに対して高い脱硫比活性を示したが、アルキル側鎖の長さが長いほど、またその数が多いほど、脱硫比活性が低いことが確認された。一方、ＭＲ３４株はアルキル側鎖が長く、またその数が多いジベンゾチオフェンに対しても、高い脱硫比活性を示すことが確認された。
【０１１３】
この結果は、含硫複素環式化合物の膜透過に関する特性は各菌株によって様々で、油中の含硫複素環式化合物の脱硫活性が菌体膜透過性に大きく影響を受けることを示している。つまり、脱硫活性を上げるためには含硫複素環式化合物に対して高い菌体膜透過性を有する組換え微生物を作製し、これを用いることが望ましいが、１種類の菌株で多くの含硫複素環式化合物をすべて効率よく脱硫することは困難であると考えられた。
【０１１４】
【発明の効果】
本発明によれば、化石燃料中に含有されるジベンゾチオフェン類、ベンゾチオフェン類、ベンゾテトラナフチールチオフェン類、ベンゾナフチルチオフェン類などの含硫複素環式化合物を含む化石燃料油の脱硫率を上げることができる。
【０１１５】
【配列表】
2004242511.tif 000008
2004242511.tif 000009
2004242511.tif 000010
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【０１１６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：ｄｓｚＡＢＣＤ
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、脱硫活性試験結果（ＧＣ−ＡＥＤクロマトグラム）を示すグラフである。各グラフは、（ａ）脱硫前のＢ−ＬＧＯ、（ｂ）２種類の菌株（ＭＲ３４とＭＣ２０３０）による脱硫反応、（ｃ）ＭＣ２０３０株のみによる脱硫反応、（ｄ）ＭＲ３４株のみによる脱硫反応の結果を示す。
【図１】
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