(57)【要約】      （修正有）【課題】植物において、硝酸態窒素により汚染された土壌で生育させた場合においても亜硝酸濃度を一定に維持する能力を増強させる手段を提供すること。【解決手段】植物体内で、非共生型ヘモグロビンを過剰発現させることを特徴とする、植物の活性窒素ストレス耐性能の増強方法、植物における活性窒素ストレスを低減させるための非共生型ヘモグロビンの使用、特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその機能的同等物をコードした核酸を保持する、トランスジェニック植物、並びに植物の生育環境における亜硝酸レベルを低減させるための該非共生型ヘモグロビン又は該トランスジェニック動物の使用。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体内で、非共生型ヘモグロビンを過剰発現させることを特徴とする、植物の活性窒素ストレス耐性能の増強方法。
【請求項２】
植物が、ナス科植物、イネ科植物及びアブラナ科植物からなる群より選ばれた植物である、請求項１記載の増強方法。
【請求項３】
非共生型ヘモグロビンが、
（ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号：１に対して、少なくとも１つのアミノ酸残基が、置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつパーオキシダーゼ様活性を有するポリペプチド、
である、請求項１又は２記載の増強方法。
【請求項４】
植物における活性窒素ストレスを低減させるための請求項１〜３いずれか１項に規定された非共生型ヘモグロビンの使用。
【請求項５】
（ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号：１に対して、少なくとも１つのアミノ酸残基が、置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつパーオキシダーゼ様活性を有するポリペプチド、
をコードした核酸を保持する、トランスジェニック植物。
【請求項６】
植物の生育環境における亜硝酸レベルを低減させるための請求項１〜３いずれか１項に規定された非共生型ヘモグロビン又は請求項５記載のトランスジェニック動物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の活性窒素ストレス耐性能の増強方法、植物における活性窒素ストレスを低減させるための非共生型ヘモグロビンの使用及びトランスジェニック植物に関する。さらに詳しくは、本発明は、硝酸態窒素により汚染された土壌で生育させた場合においても亜硝酸濃度を一定に維持する能力を増強させうる、植物の活性窒素ストレス耐性能の増強方法及び植物における活性窒素ストレスを低減させるための非共生型ヘモグロビンの使用、並びに、硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーションに有用なトランスジェニック植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、硝酸態窒素による土壌の汚染が問題となっている。例えば、硝酸を過剰に含む飲水、牧草等を経口摂取した家畜体内では、亜硝酸が生じ、該亜硝酸が、ヘモグロビンと反応することにより、酸素欠乏症（メトヘモグロビン血症）が引き起こされることが知られている（非特許文献１及び非特許文献２）。これは、ヘモグロビン中のヘム鉄が２価から３価に酸化されることに因ると考えられている。また、同様な現象は、ヒトでも報告されている。
【０００３】
土壌環境に大きな影響をうける植物において、硝酸塩は、窒素同化の出発物質であるが、硝酸塩から有機アミノ態窒素への変換プロセスにおいては、多量の還元力が必要とされる。そのため、かかる事実からは、土壌中における過剰な硝酸態窒素の存在は、植物に対するストレス因子となりうることが予想される。しかしながら、実際には、植物は、比較的高濃度の硝酸塩に対して耐性であるが、細胞内の亜硝酸レベルは非常に低い濃度（植物の実生の葉中における硝酸濃度から算出される濃度の約１０−４倍）で厳密に維持されている。また、植物への過剰な亜硝酸塩の投与は、生育阻害や葉の白化現象を引き起こすなど、植物に対して強いストレスとなる。
【０００４】
これらの事実から、動物及び植物を通じて、硝酸過剰障害は、亜硝酸の蓄積と生体に対する該亜硝酸の毒性にあると推定される。
【０００５】
従来、植物が細胞内の亜硝酸濃度を一定に維持する機構は、一義的に葉緑体に局在する亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ）活性によるものと考えられている（非特許文献３）。
【０００６】
しかしながら、硝酸から亜硝酸への還元は、細胞質で起こり、また、該亜硝酸からアンモニアヘの変換に要する還元力（６電子還元）は、環境ストレスの影響をうけやすい光合成の光化学反応に依存しているため、ＮｉＲ活性のみで、植物中における亜硝酸レベルの維持が行なわれるのかどうかは、不明であるのが現状である。
【０００７】
一方、哺乳類のヘモグロビンは、亜硝酸により機能障害をうけることが知られている（非特許文献４）。しかしながら、植物のヘモグロビンは、哺乳類のヘモグロビンと比べて、酸素を強固に結合し離しにくいという親和性等の諸性質における大きな相違点があり、また、植物のヘモグロビンと、亜硝酸との関連は不明である。
【０００８】
また、いくつかの植物では低酸素又は無酸素条件で非共生型ヘモグロビンの発現が誘導される事実に基づき、そのような生育条件における非共生型ヘモグロビンの生理機能の解析が行なわれている（非特許文献５、非特許文献６）。例えば、大麦の非共生型ヘモグロビン遺伝子をトウモロコシの培養細胞に導入した形質転換培養細胞において、該非共生型ヘモグロビンを過剰発現させること及び該非共生型ヘモグロビン遺伝子のアンチセンス鎖を導入した形質転換細胞において、該非共生型ヘモグロビン遺伝子の発現を抑制させることにより、低酸素下、トウモロコシ細胞におけるエネルギー状態が変化することが見出されている（前記非特許文献５）。また、シロイヌナズナにおいて、非共生型ヘモグロビンの１つであるＡＨＢ１を過剰発現させることにより、低酸素ストレスに対する生存率を増加し、早期生育が促進されることが見出されている（前記非特許文献６）。しかしながら、非共生型ヘモグロビンと亜硝酸等との直接の関連は不明であるのが現状である。
【０００９】
【非特許文献１】
グプタ（Ｇｕｐｔａ  ＳＫ），  Ｍｅｔｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎａｅｍｉａ  ｉｎ  ａｒｅａｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｒｉｎｋｉｎｇ  ｗａｔｅｒ，  Ｎａｔｌ．  Ｍｅｄ．  Ｊ．  Ｉｎｄｉａ．，  ２０００年発行，  １３，  第５８〜６１頁
【非特許文献２】
マックナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ＧＭ）  ら，  Ｄｉｅｔａｒｙ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｉｎ  ｍａｎ：  ｆｒｉｅｎｄ  ｏｒ  ｆｏｅ？  Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ．，  １９９９  年発行，  ８１，  第３４９  〜３５８  頁
【非特許文献３】
カワムラ（Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｙ．）  ら，  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｎ０３−  ，  Ｎ０２−  ａｎｄ  ＮＨ４  ＋  ｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｅａｖｅｓ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｐｌａｎｔｓ  ｂｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ３７，  １９９６年発行，  第８７８  〜８８０  頁
【非特許文献４】
グルツェラック（Ｇｒｚｅｌａｋ  Ａ）  ら，  ヘモグロビンは、該ヘモグロビン自体と他のタンパク質をニトロ化する（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｃａｎ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｉｔｓｅｌｆ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．），  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  ２００１年発行，  １５２８，  第９７〜１００  頁
【非特許文献５】
ソーワ（Ｓｏｗａ  ＡＷ）  ら、ヘモグロビンレベルの変動は、低酸素下、トウモロコシ細胞におけるエネルギー状態を変化させる（Ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  ｍａｉｚｅ  ｃｅｌｌｓ  ｕｎｄｅｒ  ｈｙｐｏｘｉａ．），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９８年発行，  ９５，  第１０３１７  〜１０３２１  頁
【非特許文献６】
ハント（Ｈｕｎｔ  ＰＷ）ら、ヘモグロビン１レベルの増加は、シロイヌナズナにおける低酸素ストレスに対する生存率を増加させ、早期生育を促進する（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  １  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｅａｒｌｙ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ２００３年発行，  ９９，  第１７１９７  〜１７２０２  頁
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物において、硝酸態窒素により汚染された土壌で生育させた場合においても亜硝酸濃度を一定に維持する能力を増強させること、硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーションのための手段を提供すること等を可能にする、植物の活性窒素ストレス耐性能の増強方法、及び植物における活性窒素ストレスを低減させるための非共生型ヘモグロビンの使用を提供することを目的とする。また、本発明は、硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーションに有用なトランスジェニック植物を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕  植物体内で、非共生型ヘモグロビンを過剰発現させることを特徴とする、植物の活性窒素ストレス耐性能の増強方法、
〔２〕  植物が、ナス科植物、イネ科植物及びアブラナ科植物からなる群より選ばれた植物である、前記〔１〕記載の増強方法、
〔３〕  非共生型ヘモグロビンが、
（ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号：１に対して、少なくとも１つのアミノ酸残基が、置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつパーオキシダーゼ様活性を有するポリペプチド、
である、前記〔１〕又は〔２〕記載の増強方法、
〔４〕  植物における活性窒素ストレスを低減させるための前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に規定された非共生型ヘモグロビンの使用、並びに
〔５〕  （ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号：１に対して、少なくとも１つのアミノ酸残基が、置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつパーオキシダーゼ様活性を有するポリペプチド、
をコードした核酸を保持する、トランスジェニック植物、
〔６〕  植物の生育環境における亜硝酸レベルを低減させるための前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に規定された非共生型ヘモグロビン又は前記〔５〕記載のトランスジェニック動物の使用、
に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物、具体的には、シロイヌナズナに存在する３種類のヘモグロビンのうち、ＡＨＢ１が、パーオキシダーゼ様活性を有し、かかるＡＨＢ１のパーオキシダーゼ様活性により、亜硝酸レベルを低減させうるという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
【００１３】
かかる本発明者らの知見によれば、植物体内で、非共生型ヘモグロビンを過剰発現させることを特徴とする、植物の活性窒素ストレス耐性能の増強方法が提供される。
【００１４】
本発明の植物の活性窒素ストレス耐性能の増強方法においては、非共生型ヘモグロビン、特に、シロイヌナズナ起源の非共生型ヘモグロビンＡＨＢ１又は該ＡＨＢ１の機能的同等物を用いることに１つの大きな特徴がある。本発明の増強方法においては、前記非共生型ヘモグロビンを用いるため、植物体内で、下記▲１▼〜▲４▼の一連の反応：
▲１▼  パーオキシダーゼと類似の反応により過酸化水素（Ｈ２  Ｏ２  ）を水まで還元する際に、下記式１：
【００１５】
【化１】
2004242631.tif 000002
【００１６】
に示されるように、電子供与体として亜硝酸（ＮＯ２  −  ）が利用され、
▲２▼  前記亜硝酸は、酸化されることにより二酸化窒素（ＮＯ２  ）となり、
▲３▼  生じた二酸化窒素により、下記式２：
【００１７】
【化２】
2004242631.tif 000003
【００１８】
に示されるように、前記非共生型ヘモグロビン自体のチロシン残基がニトロ化され、
▲４▼  下記式３：
【００１９】
【化３】
2004242631.tif 000004
【００２０】
及び下記式４：
【化４】
2004242631.tif 000005
【００２１】
に示されるように、ニトロ化に関与しない二酸化窒素が、二量体化を経て水と反応し、硝酸と亜硝酸とを生じると考えられる一連の反応が増強されるという優れた効果を奏する。
【００２２】
また、本発明の増強方法によれば、植物体内での前記▲１▼〜▲４▼の一連の反応が増強されることにより、植物が生育する環境中における亜硝酸濃度を低下させることができるという優れた効果を発揮する。
【００２３】
前記ＡＨＢ１のアミノ酸配列は、配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＢ８２７６９）に示され、該ＡＨＢ１をコードする核酸の塩基配列は、配列番号：２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ９４９９８）に示される。
【００２４】
本発明の増強方法には、非共生型ヘモグロビンとして、（ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることができる。また、本発明においては、前記ＡＨＢ１と実質的に同等なパーオキシダーゼ様活性を有するものであれば、機能的同等物、すなわち、他種起源の非共生型ヘモグロビン、改変型非共生型ヘモグロビンＡＨＢ１等を用いてもよい。
【００２５】
前記「機能的同等物」としては、
（ｂ）配列番号：１に対して、少なくとも１つのアミノ酸残基が、置換、欠失、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつパーオキシダーゼ様活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号：１に示される配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつパーオキシダーゼ様活性を有するポリペプチド、
等が挙げられる。
【００２６】
前記（ｂ）において、置換、欠失、付加若しくは挿入の変異の数は、かかる変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが、パーオキシダーゼ様活性を有すればよく、少なくとも１つ、すなわち、１個若しくは数個であればよい。
【００２７】
前記（ｂ）のポリペプチドは、天然に存在する非局在型ヘモグロビンであってもよく、ＡＨＢ１を人為的に改変することにより得られたポリペプチドであってもよい。人為的な改変は、慣用の部位特異的変異法等により実施されうる。
【００２８】
なお、前記パーオキシダーゼ様活性は、測定対象のタンパク質について、例えば、反応液〔組成：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、０．０１１ｍＭ  測定対象のタンパク質、０．１ｍＭ  ＮａＮＯ２  、０．１ｍＭ  Ｈ２  Ｏ２  〕中、２５℃で１０分又は３０分間インキュベーションし、９５℃で２分間熱変性させ、変性タンパク質を遠心分離で除去し、上清をキャピラリー電気泳動に供し、サンプル中の硝酸濃度と亜硝酸濃度とを測定することにより評価されうる。なお、コントロールとして、前記反応液において、測定対象のタンパク質、亜硝酸又は過酸化水素のいずれかを含まない組成のもので反応を行なうか、あるいはＡＨＢ１とは構造及び機能上無関係のタンパク質を用いて評価すればよい。
【００２９】
前記（ｃ）において、前記配列同一性は、２つの分子における比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を配列同一性の算出に適したアルゴリズムに基づき比較することにより決定されうる。ここで、比較対象のアミノ酸配列は、２つの配列の最適なアラインメントのための参考配列（例えば、コンセンサス配列等）と比べて、付加又は欠失（例えば、ギャップ等）を有していてもよい。最適なアラインメント及び配列同一性の算出のためのアルゴリズムとしては、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）  らの局所ホモロジーアルゴリズム［Ａｄｄ．  ＡＰＬ．  Ｍａｔｈ．，  ２，  ４８２  （１９８１）］、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）  らのホモロジーアラインメントアルゴリズム［Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８，  ４４３（１９７０）］、パールソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）  らの相同性検索法［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５，  ２４４４  （１９８８）］  が挙げられ、より具体的には、ギャップペナルテイ法、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｇｏｏｄ−Ｋａｎｅｈｉｓａ  アルゴリズム、ＢＬＡＳＴ  アルゴリズム、ＦＡＳＴＡ  アルゴリズム等が挙げられる。なお、かかる配列同一性は、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において、一般に利用可能なＢＬＡＳＴ等を用いて算出されうる。なお、本明細書においては、配列同一性は、前記ＢＬＡＳＴにおいて、期待値１０、ワードサイズ３、ギャップコスト〔Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１〕によりアラインメントされ得られた値をいう。
【００３０】
本発明の増強方法を適用しうる植物としては、ナス科植物、イネ科植物、アブラナ科植物等が挙げられる。
【００３１】
本発明の増強方法は、具体的には、植物に、前記非共生型ヘモグロビンをコードする核酸を導入し、該非共生型ヘモグロビンを過剰発現させることにより行なわれる。
【００３２】
植物への核酸の導入は、例えば、前記非共生型ヘモグロビンをコードする核酸を、生物的導入法、直接的導入法等により行なわれうる。
【００３３】
前記生物的導入法としては、例えば、慣用のアグロバクテリウムを用いる方法等が挙げられる。かかるアグロバクテリウムを用いる方法においては、Ｔｉプラスミド等の慣用のベクターに前記非共生型ヘモグロビンをコードする核酸を連結し、得られた組換えベクターが用いられうる。前記ベクターは、マーカーとなる遺伝子、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等、前記非共生型ヘモグロビンの発現制御可能なプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、イネアクチン遺伝子プロモーター、トウモロコシユビキチン遺伝子プロモーター等、前記非共生型ヘモグロビンの発現を調節しうるエレメント、例えば、アグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター等を含有していてもよい。
【００３４】
前記直接的導入法としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガンを用いたボンバードメント法等が挙げられる。かかる直接的導入法においては、前記非共生型ヘモグロビンをコードする核酸又は該核酸を含有した発現可能な構築物が用いられうる。また、前記直接的導入法においては、前記非共生型ヘモグロビンをコードする核酸又は該核酸を含有した発現可能な構築物を、植物のプロトプラスト、ディスク状の葉切片（リーフディスク）等に導入する。
【００３５】
前記非共生型ヘモグロビンをコードする核酸を植物に導入することにより、植物の活性窒素ストレス耐性能の増強されたトランスジェニック植物が得られる。かかるトランスジェニック植物も本発明に含まれる。
【００３６】
前記トランスジェニック植物における活性窒素ストレス耐性能は、例えば、種々の強度の亜硝酸ストレス下での培養、化学窒素肥料（硝酸塩又はアンモニウム塩）  過剰施肥下での生育の評価をバイオマス増加量（根や茎葉の生長量）・クロロフィル含有量（ともに個体レベル）や光合成活性（細胞レベル）を指標とすること、二酸化窒素などの窒素酸化物を含む大気中での生育等により評価されうる。
【００３７】
また、本発明には、植物における活性窒素ストレスを低減させるための前記非共生型ヘモグロビンの使用も含まれる。
【００３８】
前記増強方法及び前記非共生型ヘモグロビンの使用によれば、植物生育環境における亜硝酸濃度の低減等、硝酸態窒素による土壌汚染の低減への応用が期待される。
【００３９】
また、本発明によれば、植物の生育環境における亜硝酸レベルを低減させるための前記非共生型ヘモグロビン又は前記トランスジェニック動物の使用も提供される。
【００４０】
【実施例】
本発明を下記実施例等により具体的に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【００４１】
実施例１
シロイヌナズナに見出される３種類の非共生型ヘモグロビンＡＨＢ１、ＡＨＢ２及びＧＬＢ３のそれぞれについて、組換えタンパク質を調製した。種々の生物学的活性を調べたところ、非共生型ヘモグロビンＡＨＢ１は、驚くべく、ペルオキシダーゼ様活性を有することが見出された。以下に、非共生型ヘモグロビンＡＨＢ１の結果を示す。
【００４２】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｅｃｏｔｙｐｅ  Ｃ２４）実生より、慣用の方法により、全ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡ（約２μｇ）を鋳型とし、プライマー（１μ１）として、オリゴｄＴを用い、逆転写酵素（東洋紡社製、商品名：ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ、終濃度５Ｕ／μｌ）を用いた逆転写反応により、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。なお、逆転写反応は、４２℃で４５分間のインキュベーションにより行なった。
【００４３】
ついで、得られた一本鎖ｃＤＮＡ（約０．０１μｇ）を鋳型とし、ＡＨＢ１遺伝子のコード領域を特異的に増幅する下記プライマー：
ＡＨＢ１  Ｆ（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）  ５’−ｔｔｃａｔａｔｇｇａｇａｇｔｇａａｇｇａａａｇａｔｔｇｔｇｔｔｃ−３’（配列番号：３）と、
ＡＨＢ１  Ｒ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）  ５’−ｔｔｇｇａｔｃｃｔｔａｇｔｔｇｇａａａｇａｔｔｃａｔｔｔｃａｇｃｔｔ−３’（配列番号：４）
とからなるプライマー対を用い、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製、商品名：ＬＡ−Ｔａｑ、終濃度０．０５Ｕ／μｌ）を用いて、ＰＣＲを行なった。なお、ＰＣＲにおけるサーマルプロファイルは、９５℃１８０秒の反応後、９５℃６０秒と６０℃６０秒と７２℃６０秒とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行なう条件とした。その結果、０．５ｋｂの増幅産物が得られた。
【００４４】
得られた増幅産物を、ベクター（商品名：ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター、プロメガ社製）を用いてクローン化した。得られた組換えプラスミドを用いて、前記増幅産物の塩基配列を確認したところ、該増幅産物の塩基配列は、ＡＨＢ１の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ９４９９８）と一致ししていることがわかった。
【００４５】
ついで、得られたＡＨＢ１遺伝子を含む断片を、大腸菌タンパク質発現ベクター商品名：ｐＥＴ１６ｂ〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕に組み込んだ。ついで、得られた組換えプラスミドにより大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ）ｐＬｙｓＳを形質転換し、ＡＨＢ１の組換えタンパク質を、アミノ末端にヒスチジンタグ配列を有するタンパク質として、大量発現させた。ここで、タンパク質発現の誘導は、形質転換体をＬＢ液体培地〔組成：０．０１重量％  トリプトン、０．００５重量％  酵母エキス、０．００５重量％  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）〕で３７℃で振とう培養し、培養物の濁度がＯＤ６００  で１．５に到達した時点で、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を、終濃度０．４ｍＭになるように添加し、さらに３７℃で１２時間振とう培養することにより行なった。
【００４６】
培養後、得られた培養物から、常法に従い、Ｎｉ２＋親和性カラムクロマトグラフィーを用いて、ヒスチジン標識タンパク質としてＡＨＢ１タンパク質を精製した。１５％（ｗ／ｖ）  ポリアクリルアミドゲル／ドデシル硫酸ナトリウム電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、各精製段階で得られた画分の精製度を調べた結果を図１に示す。図中、レーンは、分子量マーカーを示し、レーン１は、粗抽出液、レーン２は、Ｎｉ２＋親和性カラムクロマトグラフィー画分を示す。また、レーン１及びレーン２は、それぞれ２μｇ相当量のタンパク質を泳動した結果である。
【００４７】
その結果、Ｎｉ２＋親和性カラムクロマトグラフィーで得られた精製タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、実質的に均一のタンパク質であることがわかった。
【００４８】
ついで、得られたＡＨＢ１タンパク質について、島津製作所社製、商品名：ＢｉｏＳｐｅｃ１６００を用いて、４５０〜６５０ｎｍの吸収スペクトルを測定した。結果を図２の左パネルに示す。また、得られたＡＨＢ１タンパク質を５ｍＭフェリシアン化カリウムで、２５℃で２０分間処理し、得られた産物について、前記と同様に、４５０〜６５０ｎｍの吸収スペクトルを測定した。結果を図２の右パネルに示す。
【００４９】
その結果、図２の左パネルに示されるように、５００〜６００ｎｍ間における可視スペクトルにおいて、５４０ｎｍ及び５７６ｎｍで吸収極大を示すことから、得られたＡＨＢ１タンパク質は、酸素分子が配位した２価鉄（Ｆｅ２＋）ヘムを有するオキシヘモグロビン（ｏｘｙＨＢ）であることがわかった。また、図２の右パネルに示されるように、５ｍＭ  フェリシアン化カリウムによる処理により、ヘム中のＦｅ２＋は、容易に酸化され、酸素分子を結合しない３価鉄（Ｆｅ３＋）ヘムを有するメトヘモグロビン（ｍｅｔＨＢ）に変換されることがわかった。これらの結果は、ヘモグロビンに共通してみられる物理化学的分子特性である。
【００５０】
実施例２
（１）    抗ニトロチロシン抗体を用いたイムノブロッティング
実施例１で得られたＡＨＢ１のｏｘｙＨＢ及びｍｅｔＨＢについて、反応液〔組成：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、０．０１１ｍＭ  ＡＨＢ１  （ｏｘｙＨＢ又はｍｅｔＨＢ）、１ｍＭ  ＮａＮＯ２  、１ｍＭ  Ｈ２  Ｏ２  〕  ４０μｌ中、亜硝酸存在下で過酸化水素と２５℃で３０分反応させた。ここで、前記ＡＨＢ１タンパク質のモル濃度は、分子量を１９，２７４Ｄａとして算出した値である。なお、前記反応液の組成において、ＮａＮＯ２  又はＨ２  Ｏ２  を含まない反応液、又はＡＨＢ１の代わりに、同濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた反応液をコントロールとして用いた。
【００５１】
反応終了後、常法に従い、反応産物２０μｌを、１５％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜（ミリポア社製、商品名：ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＴＭ−Ｐ）にブロッティングした。ブロッティング後のＰＶＤＦ膜と、抗ニトロチロシン抗体〔アップステート・バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）  社製〕と、市販キット〔パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社製、商品名：Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ〕とを用い、前記Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓに添付の説明書に記載の条件に従って、イムノブロッティングを行なった。結果を図３に示す。
【００５２】
その結果、図３に示すように、ＡＨＢ１は、ｏｘｙＨＢ及びｍｅｔＨＢのどちらの型のヘモグロビンでも、過酸化水素存在下で、亜硝酸と反応し、ニトロ化物を生じることがわかった。さらに、抗ニトロチロシン抗体とＡＨＢ１との結合が検出されたことから、ＡＨＢ１中に存在する３つのチロシン残基のいずれか、あるいは全てがニトロ化されていることが推定された。また、ＢＳＡを用いたコントロール実験の結果、抗ニトロチロシン抗体とＢＳＡとの結合が検出されなかったことから、このニトロ化は、ＡＨＢ１に特異的であると考えられる。
【００５３】
かかる結果により、非共生型ヘモグロビンＡＨＢ１は、チロシン残基が特異的にニトロ化され、それにより、亜硝酸を酸化後に安定なニトロ化合物として捕捉することが示唆される。また、非共生型ヘモグロビンＡＨＢ１は、植物において有毒な亜硝酸の細胞内レベルを一定濃度以下に保つための亜硝酸スキャベンジャー（消去剤）  として機能しているという仮説がたてられる。したがって、植物における遺伝子操作によるヘモグロビンの過剰発現は、過剰硝酸障害の直接的原因と推定される有毒な亜硝酸の蓄積を防ぎ、活性窒素ストレスに対する耐性の増強に応用できる可能性がある。
【００５４】
（２）  ＡＨＢ１のニトロ化反応における硝酸の生成
実施例１で得られたＡＨＢ１を用い、該ＡＨＢ１のニトロ化反応時における硝酸の生成を調べた。
【００５５】
ニトロ化反応においては、反応液〔組成：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、０．０１１ｍＭ  ＡＨＢ１（ｏｘｙＨＢ）、０．１ｍＭ  ＮａＮＯ２  、０．１ｍＭ  Ｈ２  Ｏ２  〕  ２００μｌを用い、２５℃で行なった。
【００５６】
反応開始後０分、１０分、２０分及び３０分の各時点で、４５μｌ  反応産物をサンプリングした。サンプリング直後、サンプルを９５℃で２分間熱変性させ、変性タンパク質を遠心分離で除去し、上清１０μｌをキャピラリー電気泳動に供し、サンプル中の硝酸濃度と亜硝酸濃度とを測定した。表１にＡＨＢ１のニトロ化に際して生じた硝酸イオンを定量した結果を示し、図４にＡＨＢ１のニトロ化反応中における亜硝酸及び硝酸の濃度変化を示す。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
その結果、表１及び図４に示されるように、ニトロ化反応の進行により反応組成中の亜硝酸濃度が低下するとともに、反応組成中には含まれないはずの硝酸が生じていることが明らかとなった。また、亜硝酸濃度が一定レベルに達した後、減少しなかった。このことから、ＡＨＢ１のペルオキシダーゼ様活性による触媒効率が低いこと及び／又は又はＡＨＢ１は、自己ニトロ化により失活することが推定される。
【００５９】
実施例３
ＡＨＢ１を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物の作成を試みた。
【００６０】
実施例１において、ＰＣＲで得られたＡＨＢ１のコード領域を含む断片を、バイナリーベクターであるＴｉプラスミドｐＩＧ１２１−Ｈｍに組み込んだ。得られた組換えプラスミド内において、ＡＨＢ１  ｃＤＮＡの転写は、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターと、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）  のノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータにより調節されている。かかる組換えプラスミドを、凍結融解法にてアグロバクテリウム・トゥメファシエンス  ＥＨＡ１０１株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＥＨＡ１０１）  に導入し、リーフディスク法を用いて、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｘａｎｔｈｉ）の野生株及び亜硝酸還元酵素活性を著しく欠くクローン２７１のそれぞれを形質転換した。
【００６１】
クローン２７１由来のトランスジェニックタバコ植物によれば、亜硝酸還元酵素活性を著しく欠くことから亜硝酸感受性の表現型を持つため、非共生型ヘモグロビンが亜硝酸の消去に機能していることの確認に用いることができる。
【００６２】
得られた形質転換株から、任意に、粗ＤＮＡを抽出して、ＰＣＲにより、ＡＨＢ１  ｃＤＮＡの核ゲノムへの組込みを確認することにより、トランスジェニックタバコ植物を評価する。また、得られたトランスジェニックタバコ植物について、種々の強度の亜硝酸ストレス下での培養、化学窒素肥料（硝酸塩又はアンモニウム塩）  過剰施肥下での生育の評価をバイオマス増加量（根や茎葉の生長量）・クロロフィル含有量（ともに個体レベル）や光合成活性（細胞レベル）を指標とすること、二酸化窒素などの窒素酸化物を含む大気中での生育等により、亜硝酸ストレス耐性能を評価する。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の植物の活性窒素ストレス耐性能の増強方法、及び植物における活性窒素ストレスを低減させるための非共生型ヘモグロビンの使用によれば、植物において、硝酸態窒素により汚染された土壌で生育させた場合においても亜硝酸濃度を一定に維持する能力を増強させること、硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーションのための手段を提供すること等を可能になるという優れた効果を奏する。また、本発明のトランスジェニック動物は、硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーションへの応用に用いることができるという優れた性質を有する。
【００６４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＡＨＢ１タンパク質について、各精製段階で得られた画分の精製度を調べた結果を図１に示す。図中、レーンは、分子量マーカーを示し、レーン１は、粗抽出液、レーン２は、Ｎｉ２＋親和性カラムクロマトグラフィー画分を示す。また、レーン１及びレーン２は、それぞれ２μｇ相当量のタンパク質を泳動した結果である。
【図２】図２は、ＡＨＢ１タンパク質の４５０〜６５０ｎｍの吸収スペクトルを示す。図中、左パネルは、Ｎｉ２＋親和性カラムクロマトグラフィーで得られたＡＨＢ１タンパク質の結果を示し、右パネルは、５ｍＭ  フェリシアン化カリウムで、２５℃で２０分間処理されたＡＨＢ１タンパク質の結果を示す。
【図３】図３は、抗ニトロチロシン抗体によるＡＨＢ１のニトロ化を検出した結果を示す図である。
【図４】図４は、ＡＨＢ１のニトロ化反応中における亜硝酸及び硝酸の濃度変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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