(57)【要約】【課題】本発明の課題は、薬剤排出ポンプによる耐性化を回避できる化合物、あるいは薬剤排出ポンプを阻害することによって既存の抗菌薬を有効にする化合物をスクリーニングする方法を提供することである。【解決手段】式Ｉ：【化１】2004097031.tif 000009〔式中、Ｒは、炭素数２〜１４の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基である〕で表される化合物の存在下、被検物質とともに細菌を培養し、該細菌における排出ポンプをコードする遺伝子の発現を検出することにより、排出ポンプ阻害物質をスクリーニングする方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2004097031.tif 000006
〔式中、Ｒは、炭素数２〜１４の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基である〕
で表される化合物の存在下、被検物質とともに細菌を培養し、該細菌における排出ポンプをコードする遺伝子の発現を検出することにより、排出ポンプ阻害物質をスクリーニングする方法。
【請求項２】
細菌染色体中の排出ポンプをコードする遺伝子の一部又は全部を、相同組換えによってレポーター遺伝子と置き換え、式Ｉ：
【化２】
2004097031.tif 000007
〔式中、Ｒは上記と同義である〕
で表される化合物の存在下、被検物質とともに相同組換えのなされた細菌を培養し、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより、排出ポンプ阻害物質をスクリーニングする方法。
【請求項３】
細菌が緑膿菌である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法により同定された、排出ポンプ阻害物質。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法により同定された、排出ポンプ阻害剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法に使用するための、以下の要素を含むキット。
ａ）式Ｉ：
【化３】
2004097031.tif 000008
〔式中、Ｒは上記と同義である〕
で表される化合物、
ｂ）レポーター遺伝子を含むターゲティングベクター、
ｃ）レポーター遺伝子の発現を評価するための試薬
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬剤耐性を有する細菌の活性を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学療法、特に抗生物質の普及により、結核、赤痢などをはじめとする細菌感染症の激減は目を見張るものがあり、その公衆衛生への貢献ははかりしれない。しかしながら、抗生物質の使用の増加にともない、１９５０年代後半から、抗生物質の効かない、いわゆる薬剤耐性菌が出現しはじめ、近年急速に増加しつつある。最近では、特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ；ＭＲＳＡ）に代表される薬剤耐性菌が、院内感染菌として蔓延している。結核菌、赤痢菌、ブドウ球菌など重要な病原菌においては多くの種類の薬剤に耐性を示す、いわゆる多剤耐性菌が多い。これらの耐性菌で、その病原性が強い細菌が起炎菌である場合は、最も治療困難な難治性重症感染症となることが予想され、感染症の化学療法を遂行する上で大きな問題となっている。このような薬剤耐性菌増加の理由から、一般に抗生物質製剤のライフサイクルは短く、医薬品メーカーは莫大な費用をかけて、次々に新規抗生物質を市場に供給しなければならず、その損失は社会的にみて無視できない巨額に達する。
【０００３】
一方、近年、耐性菌の耐性機構の解析研究によって、細菌の薬剤排出機構として薬剤排出ポンプの存在が認知されてきた。古くは１９８０年にＬｅｖｙのグループによってテトラサイクリン系の抗菌薬を特異的に菌体外に排出するポンプが同定され（非特許文献１参照）、テトラサイクリン耐性の主たる要因として注目された。さらに最近の研究によって、大腸菌、緑膿菌、枯草菌、ブドウ球菌、肺炎球菌並びに淋菌における多剤排出型の薬剤排出ポンプの存在が報告された。なかでも、相同性を有する緑膿菌の薬剤排出ポンプとして現在までに４種の多剤排出型ポンプが報告されており、最近では、緑膿菌の全ゲノム配列が明らかになっており、その配列からさらに５〜６種類の新規多剤排出ポンプ、計１０種の存在が確認されている。そして、緑膿菌が本来的に示すところの薬剤低感受性の要因になっていると考えられてきている（非特許文献２〜５参照）。
【０００４】
例えば、緑膿菌の薬剤排出ポンプは、β−ラクタム、テトラサイクリン、クロラムフェニコール又はキノロン系等をはじめとした多種の薬剤を菌体外に排出し、緑膿菌の薬剤耐性に寄与している。この問題を克復するため、耐性化の要因である薬剤排出ポンプによる耐性化を回避できる化合物、あるいは薬剤排出ポンプの機能を阻害することによって既存の抗菌剤を有効にする化合物の開発が望まれていた。
【０００５】
しかし、このような薬剤排出ポンプがどのように作用して異物、薬物を菌体外に排出しているかは明らかでなかったため、上記のような化合物を見出すことは困難であった。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｌ．　ＭｃＭｕｒｒｙ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　７７，　３９７４，　１９８０
【非特許文献２】
Ｋ．　Ｐｏｏｌｅら，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７５，　７３６３，　１９９３
【非特許文献３】
Ｋ．　Ｐｏｏｌｅら，Ｍ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　２１，　７１３，　１９９６
【非特許文献４】
Ｔ．　Ｋｏｈｌｅｒら，Ｍ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　２３，　３４５，　１９９７
【非特許文献５】
Ｔ．　Ｍｉｎｅら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，　４３，　４１５，　１９９９
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、細菌の薬剤排出ポンプによる耐性化を回避できる化合物、あるいは薬剤排出ポンプを阻害することによって既存の抗菌薬を有効にする化合物をスクリーニングする方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類が細菌の排出ポンプの発現に関与していることを見出し、当該化合物の存在下で、細菌における排出ポンプ遺伝子の発現を検出することにより上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）　式Ｉ：
【化４】
2004097031.tif 000002
〔式中、Ｒは、炭素数２〜１４の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基である〕
で表される化合物の存在下、被検物質とともに細菌を培養し、該細菌における排出ポンプをコードする遺伝子の発現を検出することにより、排出ポンプ阻害物質をスクリーニングする方法。
（２）細菌染色体中の排出ポンプをコードする遺伝子の一部又は全部を、相同組換えによってレポーター遺伝子と置き換え、式Ｉ：
【化５】
2004097031.tif 000003
〔式中、Ｒは上記と同義である〕
で表される化合物の存在下、被検物質とともに相同組換えのなされた細菌を培養し、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより、排出ポンプ阻害物質をスクリーニングする方法。
（３）細菌が緑膿菌である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法により同定された、排出ポンプ阻害物質。
（５）（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法により同定された、排出ポンプ阻害剤。
（６）（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法に使用するための、以下の要素を含むキット。
ａ）式Ｉ：
【化６】
2004097031.tif 000004
〔式中、Ｒは上記と同義である〕
で表される化合物、
ｂ）レポーター遺伝子を含むターゲティングベクター、
ｃ）レポーター遺伝子の発現を評価するための試薬。
【００１０】
【発明の実施の形態】
アシル化ホモセリンラクトン類を含むオートインデューサーは、その濃度又は物性を変化させることにより、細胞内に存在するか又は膜に結合している調節タンパク質と結合し、その調節タンパク質により制御している一群の遺伝子の発現を制御する。オートインデューサーとは、生物内で産生され、細胞それ自身あるいは周辺の細胞に作用し、比較的低濃度で遺伝子の発現に影響を与える低分子の物質を意味する。
【００１１】
アシル化ホモセリンラクトン類が細菌の代謝に対して、制御活性を有する可能性が示唆されていたが、その具体的な作用については十分解明されていなかった。本発明者らは、アシル化ホモセリンラクトン類が細菌の排出ポンプの発現を促進する物質であり、当該化合物の排出ポンプ発現促進作用を阻害する物質が、薬剤耐性を有する細菌に対しても抗菌作用を有しうることを見出し、本発明のスクリーニング方法を完成させた。アシル化ホモセリンラクトン類が細菌の排出ポンプの発現に関与することは、以下に記載するような方法により実証された。
【００１２】
日和見感染菌である緑膿菌は、様々な抗生物質に耐性を示す多剤耐性菌の代表的株である。この主たる原因は、緑膿菌が発現する排出ポンプにあると考えられている。この原因となる排出ポンプをコードする遺伝子にレポーター遺伝子を導入し、そのレポーター遺伝子の活性を測定することで簡易的に排出ポンプの発現の状況をモニタリングした。相同組換えにより緑膿菌染色体上のｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭ遺伝子上にカテコール２，３ジオキシゲナーゼ遺伝子をコードするレポーター遺伝子（ｘｙｌＥ）を導入し、レポーター遺伝子導入株ＰＡＯ１−Ｘｙｌを構築した。その株を用いてアシル化ホモセリンラクトン類による排出ポンプの誘導効果を測定したところ、アシル化ホモセリンラクトン類の濃度を上昇させていくと、約２５μＭまでは濃度依存的に排出ポンプが誘導され、それ以降一定に保たれることを見出した。以上から、アシル化ホモセリンラクトン類が細菌の排出ポンプの発現を誘導していることが明らかとなった。
【００１３】
本明細書においては、式Ｉ：
【化７】
2004097031.tif 000005
で表される化合物をアシル化ホモセリンラクトン類と称する。
【００１４】
式Ｉにおける、Ｒは、炭素数２〜１４、好ましくは４〜１２の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基であり、置換基としては、ヒドロキシル基、オキソ基等が挙げられる。非置換の飽和脂肪族アシル基、並びに３位にオキソ基を有する飽和脂肪族アシル基が好ましい。
【００１５】
Ｒの具体例としては、特に限定されないが、例えば、アセチル基、プロピオニル基、３−オキソプロピオニル基、ブチリル基、３−オキソブチリル基、イソブチリル基、ヘプタノイル基、３−オキソヘプタノイル基、バレリル基、３−オキソバレリル基、イソバレリル基、３−オキソイソバレリル基、ノナノイル基、３−オキソノナノイル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、３−オキソヘキサノイル基、オクタノイル基、３−オキソオクタノイル基、ラウロイル基、３−オキソドデカノイル基、パルミトイル基、３−オキソパルミトイル基、ステアロイル基、３−オキソステアロイル基、ミリストイル基、３−オキソミリストイル基等が挙げられる。
【００１６】
式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類の具体例としては、特に限定されないが、例えば、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−ヒドロキシブチリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソオクタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−デカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（７−システトラデカノイル）−ホモセリンラクトン又はＮ−（３−ヒドロキシ−７−システトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン等を挙げることができ、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンを用いるのが好ましい。
【００１７】
本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は、例えば、脂肪族カルボン酸又はそのエステルと環状アミノ酸との間にアミド結合を形成させることによって合成することができる。また、アシル化ホモセリンラクトン類は、例えば、Ｃｈｈａｂｒａ，　Ｓ．　Ｒ．，　Ｐ．　Ｓｔｅａｄ，　Ｎ．　Ｊ．　Ｂａｉｎｔｏｎ，　Ｇ．　Ｐ．　Ｃ．　Ｓａｌｍｏｎｄ，　Ｇ．　Ｓ．　Ａ．　Ｂ．　Ｓｔｅｗａｒｔ，　Ｐ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，　ａｎｄ　Ｂ．　Ｗ．　Ｂｙｃｒｏｆｔ，　Ｊ．　Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，　４６，　４４１−４５４，　１９９３、Ｚｈａｎｇ，　Ｌ．，　Ｐ．　Ｊ．　Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．　Ｋｅｒｒ，　ａｎｄ　Ｍ．　Ｅ．　Ｔａｔｅ，　Ｎａｔｕｒｅ，　３６２，　４４６−４４８，　１９９３、Ｓｃｈａｅｆｅｒ　Ａ．Ｌ．，　Ｂ．　Ｌ．　Ｈａｎｚｅｌｋａ，　Ａ．　Ｅｂｅｒｈａｒｄ，　ａｎｄ　Ｅ．　Ｐ．　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７８，　２８９７−２９０１，　１９９６、Ｇａｏ，　Ｊ．−Ｇ．　ａｎｄ　Ｅ．　Ａ．　Ｍｅｉｇｈｅｎ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７５，　３８５６−３８６２，　１９９３などに記載された方法によって合成できる。
【００１８】
また、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は微生物によって生合成されるため、微生物を培養した培養物から当技術分野において通常用いられる方法によって分離精製することもできる。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法を適用できる細菌としては、排出ポンプを有するものであれば特に限定されないが、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、エルジニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）属、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレノトロホモナス（Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ブルコホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、フランキセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属等に属するグラム陽性菌及びグラム陰性菌を含む広範囲の各種細菌が挙げられる。
【００２０】
具体的には、緑膿菌、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・アルカリジェネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、ストレノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ブルコホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）、アエロモナス・ヒドロフィリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、シトロバクター・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ゾンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｏｎｎｅｉ）、エンテロバクター・クロアケエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アエロジェネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ　ｍｏｒｇａｎｉｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロビデンシア・レットゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、プロビデンシア・スツアルティイ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　ｓｔｕａｒｔｉｉ）、アシネトバクター・カルコアセティクス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アシネトバクター・ヘモリティクス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エルジニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｐｅｓｔｉｓ）、偽結核エルジニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エルジニア・インターメディア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・ヘモリティクス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラヘモリティクス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、デュクレー菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｕｃｒｅｙｉ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ・ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター・フィータス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ）、ボレリア・バーグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリテイクス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ガードネレラ・バジナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ディスタソニス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）３４５２Ａ同族群、バクテロイデス・ブルガトゥス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｖｕｌｇａｔｕｓ）、バクテロイデス・オバルス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｏｖａｌｕｓ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・エガーチイ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ）、バクテロイデス・スプランクニクス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）、ミコバクテリウム・イントラセルレア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｕｌｃｅｒａｎｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・インターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、スタフィロコッカス・ハイイクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｙｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・シムランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｍｕｌａｎｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカス・サッカロリティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エルウィニア・カルトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）等を挙げることができる。
【００２１】
本発明は、シュードモナス属、特に緑膿菌、ブルコホルデリア属、特にＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ、エルウィニア属、特にＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、エシェリキア属、特に大腸菌、リゾビウム属、特にＲｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、ビブリオ属、特にＶｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｉの排出ポンプを阻害する物質のスクリーニングにおいて好適に使用できる。さらに、緑膿菌に対する排出ポンプ阻害物質をスクリーニングする場合は、ＰＡＯ１株、Ｎ１３５株、ｎａｌＢ株、ｎｆｘＢ株、ｎｆｘＣ株等の株を使用するのが好ましい。
また、遺伝子組換えにより、排出ポンプ遺伝子を導入した細菌を使用してもよい。
【００２２】
本発明において「排出ポンプ」とは、細胞の細胞質又は周辺細胞質から基質分子をエネルギー依存様式で輸出するタンパク質集合を意味する。したがって、排出ポンプは、典型的に、細胞の細胞膜中に位置している。グラム陰性細菌において、排出ポンプは周辺腔の範囲にわたることができ、外膜の範囲にわたる排出ポンプの部分も存在しうる。
【００２３】
緑膿菌に存在する排出ポンプには、緑膿菌ＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプ又は緑膿菌株Ｋ３８５によって過発現される排出ポンプ又は緑膿菌株ＰＡＯ４０９８Ｅによって過発現される排出ポンプの一部分であるポリペプチドと少なくとも３０％のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチドが含まれる。
【００２４】
ＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプは、緑膿菌野生株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＰＡＯ１）で構成的に発現しているＲＮＤファミリーの膜タンパク質である。ＭｅｘＡは、内膜にアンカリングしているペリフェラルタンパク質であり、ＭｅｘＢは、内膜を１２回貫通した内膜タンパク質であり、ＯｐｒＭは外膜に存在するチャンネルタンパク質である。これら３つのサブユニットでＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプは構成されている。この排出ポンプの基質として、現在までに各種の抗生物質、例えば、βラクタム剤、キノロン剤、クロラムフェニコールなど、有機溶媒、オートインデューサーの１つである３ｏｘｏＣ−１２ＨＳＬが知られており、また、この排出ポンプは、抗生物質や有機溶媒に対する耐性、さらには緑膿菌の二次代謝産物（毒素、プロテアーゼ、色素など）の産生に深く関わっていることも知られている。ＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプ、及びその塩基配列については、Ｐｏｏｌｅ，　Ｋ．ら、　Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１０（３），　５２９−５４４，　１９９３及びＰｏｏｌｅ，　Ｋ．ら、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７５（２２），　７３６３−７３７２，　１９９３等に記載されている。
【００２５】
その他の排出ポンプとしては、ＲＮＤファミリー、ＭＦＳファミリー、ＳＭＲファミリー、ＡＢＣファミリー、ＭＡＴＥファミリーに属するタンパク質が挙げられる。具体的には、ＲＮＤファミリーに属するものとしては、緑膿菌のＭｅｘＥ−ＭｅｘＦ−ＯｐｒＮ排出ポンプ（Ｋｏｈｌｅｒ，　Ｔ．ら、Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２３，　３４５−３５４，　１９９７）、ＭｅｘＸ−ＭｅｘＹ排出ポンプ（Ｍｉｎｅ．　Ｔ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．　４３，　４１５−４１７，　１９９９）、ＭｅｘＣ−ＭｅｘＤ−ＯｐｒＪ排出ポンプ（Ｐｏｏｌｅ，　Ｋ．ら、Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２１　（４），　７１３−７２４，　１９９６）、ＭＦＳファミリーに属するものとしては、大腸菌のＭｄｆＡ排出ポンプ（Ｅｄｇａｒ　Ｒ．ら、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．　１７９，　２２７４−２２８０，　１９９７）、ＭＡＴＥファミリーに属するものとしては、大腸菌のＹｄｈＥ（Ｍｏｒｉｔａ　Ｙ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．　Ａｇｅｎｔｓ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．　４２，　１７７８−１７８２，　１９９８）、ＡＢＣファミリーに属するものとしては、大腸菌のＨｌｙＢＤ（Ｄｉｎｈ　Ｔ．ら、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７６，　３８２５−３８３１，　１９９４）を挙げることができる。
【００２６】
本発明において、「排出ポンプ阻害物質」とは、排出ポンプの発現を阻害する物質、好ましくは、アシル化ホモセリンラクトン類が排出ポンプの発現を促す機構を阻害する物質を意味する。緑膿菌においては、Ｎ−ドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトンはＬａｓＲタンパク質と、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンはＲｈＩＲと結合して、下流の遺伝子群の調節を行っていると考えられる。そして、ＲｈＩＲとアシル化ホモセリンラクトン類の複合体が排出ポンプを発現させると考えられる。この複合体は、直接に排出ポンプの転写を促進する、排出ポンプ調節遺伝子の発現量を変化させて排出ポンプ遺伝子の発現を促す、又は排出ポンプの調節遺伝子の質的変化を促すことによって排出ポンプ遺伝子の発現を促すものと考えられる。本発明の排出ポンプ阻害物質は、例えば、アシル化ホモセリンラクトン類を分解することによって、アシル化ホモセリンラクトン類とその調節タンパク質との結合を阻害することによって、又はアシル化ホモセリンラクトン類とその調節タンパク質との複合体が認識するタンパク質との結合を阻害することによって、排出ポンプの発現を阻害すると考えられる。本発明においては、抗菌剤を含む幅広い基質範囲を有する排出ポンプの発現を阻害する物質が好ましい。
【００２７】
本発明によってスクリーニングする被検物質が含まれうる試料としては、特に限定されないが、動物（カビ、放射菌等の微生物を含む）及び植物の抽出物、並びに人工合成物が挙げられる。
【００２８】
本発明において、細菌における排出ポンプをコードする遺伝子の発現を検出する方法としては、式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類の存在下、被検物質とともに細菌を培養した時に、被検物質の存在によって、当該排出ポンプ遺伝子の発現が変化するかどうかを検出することができるものであれば特に限定されず、当技術分野の当業者であれば適宜選択することができる。そのような方法としては、特に限定されないが、例えば、遺伝子ターゲティング（相同組換えを利用したレポーター遺伝子の導入）、排出ポンプの基質である各種抗生物質に対する感受性の変化のモニタリング、排出ポンプによって排出される蛍光物質又は染色物質の排出に伴う供試菌の色調変化及びＲＴ−ＰＣＲによる排出ポンプ遺伝子の転写量の測定等が挙げられる。
【００２９】
本発明の一実施形態では、遺伝子ターゲティングを使用して排出ポンプの発現を検出する。すなわち、この実施形態では、まず、排出ポンプをコードする遺伝子の全部又は一部を相同組換えを用いてレポーター遺伝子と置き換えることによってレポーター遺伝子を細菌染色体中に導入する。次に、式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類の存在下、被検物質とともに相同組換えのなされた細菌を培養し、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより、排出ポンプ阻害物質をスクリーニングする。
【００３０】
以下に遺伝子ターゲティングを用いた本発明のスクリーニング方法の一態様について説明する。
【００３１】
レポーター遺伝子は、相同組換えにより排出ポンプ遺伝子のプロモーターの下流に導入する。相同組換えによる遺伝子ターゲティングにおいて用いられるターゲティングベクターは、内在性染色体ＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列の上流の染色体ＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列、及び該標的ＤＮＡ配列の下流の染色体ＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列を各々の末端に有し、当該２つの相同なＤＮＡ配列の間にレポーター遺伝子、マーカー遺伝子などの外来性遺伝子を含む基本構造を有する。外来遺伝子と内在性染色体ＤＮＡとの間で相同組換えを起こさせるためには、レポーター遺伝子の２つの相同領域は各々少なくとも約０．５Ｋｂの塩基長が必要とされる。従って、ターゲティングベクターにおける相同領域の作成は、概ね下記（１）〜（５）のような操作工程で行われる。
【００３２】
（１）標的ＤＮＡ配列の一部の塩基配列を基に該配列を含むＤＮＡにハイブリダイズする少なくとも約２００ｂｐ以上の塩基長を有するプローブを作製し、該プローブを放射性標識し、プラークハイブリダイゼーション用の標識プローブを調製する。
（２）該放射性標識プローブ及び市販又は必要に応じて調製した染色体ＤＮＡのλファージライブラリーを用いてプラークハイブリダイゼーションを行い、該標的ＤＮＡ配列を含む長鎖染色体ＤＮＡがクローニングされている陽性λファージプラークを同定、取得する（Ｃｒｕｎｓｔｅｉｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７２，　３９６１，　１９７５）。
（３）該陽性クローンを複数の適当な制限酵素の組み合わせで消化して得られる染色体ＤＮＡ断片を電気泳動に供して各々の染色体ＤＮＡ断片の遺伝子の大きさを解析する。
（４）下記工程（５）で調製する２つの染色体ＤＮＡ断片を調製するための必要な遺伝子情報を得るために、該解析結果を基に該長鎖染色体ＤＮＡの制限酵素地図を作成する。
（５）該標的ＤＮＡ配列の上流及び下流に位置する各々少なくとも約０．５Ｋｂの遺伝子長を有する染色体ＤＮＡ断片が得られるように、該制限酵素地図を基に、該長鎖染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断する。ここで得られた２つの染色体ＤＮＡ断片を、相同組換え用ターゲティングＤＮＡの両端に各々配置する相同ＤＮＡ配列として用いる。
【００３３】
あるいは、相同領域は、標的ＤＮＡ配列内における上流領域及び下流領域の配列でもよい。この場合、まず、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに標的ＤＮＡ配列を挿入する。続いて、標的ＤＮＡ配列内に存在する適当な制限酵素部位で標的ＤＮＡ配列を切断して、当該部位にレポーター遺伝子等の外来遺伝子を挿入することにより、ターゲティングベクターを作成することもできる。
【００３４】
また、ＰＣＲ法を用いることでも相同領域を取得することができる。標的ＤＮＡ配列の一部の塩基配列をもとにプライマーを設計し、テンプレートとして標的ＤＮＡを含む溶液を用いてＰＣＲを行い、目的相同領域を特異的に増幅させ、それを適当なベクターにクローニングすることで相同組換えに必要な相同領域を取得することが可能である。
【００３５】
ターゲティングベクターは、レポーター遺伝子及び上記の相同ＤＮＡ配列の他に、レポーター遺伝子が相同組換えにより導入された細菌株を選択するための要素、例えば、マーカー遺伝子及び致死遺伝子等を含むように設計する。ターゲティングベクターを接合伝達により導入する場合は、さらに、プラスミド伝播に必要な領域、例えば、ＭＯＢ領域を含むのが好ましい。
【００３６】
ベクターにレポーター遺伝子及び上記の相同ＤＮＡ配列等を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３７】
ターゲティングベクターを作成するために用いることができる染色体導入型ベクターとしては、宿主生物中の染色体に組み込み可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、酵母人工染色体ＤＮＡ（ＹＡＣ：ｙｅａｓｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）などが挙げられる。ターゲティングベクターを接合伝達により導入する場合は、接合伝達用ベクター、例えば、ｐＮＯＴ１９を使用するのが好ましい。
【００３８】
レポーター遺伝子としては、特に限定されないが、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、ヒスチジン遺伝子（ｈｉｓ３）、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子、カテコール２，３ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｘｙｌＥ）、緑色蛍光タンパク質遺伝子、青色蛍光タンパク質遺伝子などが用いられる。本発明では、カテコール２，３ジオキシゲナーゼ遺伝子を用いるのが好ましい。
【００３９】
マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
致死遺伝子としては、ｓａｃＢ−ｓａｃＲ遺伝子が挙げられる。
【００４０】
細菌へのベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えば、カルシウムイオン法、エレクトロポレーション法、接合伝達法などが挙げられる。接合伝達に用いる伝達用宿主は、目的の細菌に接合するものであれば特に限定されないが、大腸菌を用いるのが好ましく、大腸菌Ｓ１７−１を用いるのが特に好ましい。
【００４１】
染色体にレポーター遺伝子が導入された細菌株は、導入したターゲティングベクターに含まれるマーカー遺伝子及び致死遺伝子を利用して、選択することができる。
【００４２】
上記のようにして得られたレポーター遺伝子導入株を、当該細菌に好適な条件で培養する。培養した菌体を新たな培地に植菌し、３７℃にて数時間培養後、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類を２０μＭ以上、好ましくは５０〜１０００μＭの濃度になるように培養液に添加する。排出ポンプは、アシル化ホモセリンラクトン類２０μＭ以上で十分誘導されるからである。その際、１種あるいは数種の被検物質を含んでいる試料溶液を同時に添加する。その後さらに２〜１０時間、好ましくは３〜５時間培養し、集菌した後、導入したレポーター遺伝子の発現を、導入したレポーター遺伝子に適した方法で検出する。
【００４３】
試料溶液に排出ポンプ阻害物質、すなわちアシル化ホモセリンラクトン類の排出ポンプ発現促進作用を阻害する物質が含まれる場合、試料溶液を添加しないときと比べ、レポーター遺伝子の発現は減少する。一方、試料溶液に排出ポンプ阻害物質が含まれない場合は、試料溶液を添加しないときと比べ、レポーター遺伝子の発現には変化がないことになる。レポーター遺伝子の発現は排出ポンプ遺伝子の発現を意味するので、試料溶液にアシル化ホモセリンラクトン類に対する阻害物質が含まれる場合は、排出ポンプの発現が抑制され、含まれない場合は排出ポンプの発現には変化がないことになる。アシル化ホモセリンラクトン類の排出ポンプ発現促進作用を阻害し、細菌における排出ポンプの発現を阻害する物質が存在すると、菌体内に存在する各種薬剤を排出することができないので、当該物質は、薬剤耐性を獲得した細菌に対しても抗菌作用を有することになる。上記のような方法により排出ポンプ阻害物質のスクリーニング及びその阻害効果を評価することができる。
【００４４】
本発明はまた、上記のようなスクリーニング方法によって同定された排出ポンプ阻害物質に関する。このような物質としては、特に限定されず、天然物及び合成物の双方が含まる。本発明の排出ポンプ阻害物質は、単独で、又は従来の抗菌剤とともに使用することによって、抗菌剤として使用できる。本発明の排出ポンプ阻害物質は、公知の抗菌剤とともに用いた場合に、排出ポンプの発現によって薬剤耐性を獲得した細菌に対しても、抗菌剤の作用を増強できる点において有利である。本発明の排出ポンプ阻害物質とともに用いることができる公知の抗菌剤としては、特に限定されないが、例えば、ペニシリン（ペナム）系抗生物質、セファロスポリン（セフェム）系抗生物質、オキサセフェム系抗生物質、ペネム系抗生物質、カルバペネム系抗生物質、モノバクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、クロラムフェニコール系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、グリコペプチド系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、リンコマイシン系抗生物質、サルファ剤、パラアミノサリチル酸製剤、イソニコチン酸ヒドラジド製剤及びキノロン系合成抗菌剤などを挙げることができる。
【００４５】
本発明はまた、上記のようなスクリーニング方法に用いるためのキットに関する。該キットは、式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類、レポーター遺伝子を含むターゲティングベクター、レポーター遺伝子の発現を評価するための試薬を含む。レポーター遺伝子の発現を評価するための試薬としては、カテコール２，３ジオキシゲナーゼの活性を評価するためのカテコールなどが挙げられる。該キットはまた、ｐＨ７．５の１０×リン酸カリウム溶液（５００ｍＭリン酸カリウム溶液）及びコントロール用のｘｙｌＥ遺伝子を含む大腸菌等を含んでいてもよい。
【００４６】
【実施例】
実施例１．アシル化ホモセリンラクトン類による排出ポンプ発現促進
緑膿菌の排出ポンプであるＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプをコードする遺伝子ｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭオペロン内にレポーター遺伝子であるｘｙｌＥ遺伝子を導入した株ＰＡＯ１−Ｘｙｌを、ＬＢ培地（１％　トリプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ）中、３７℃にて一晩培養した。その培養液２０μｌを新たなＬＢ培地４ｍｌに植菌し、３時間培養した。続いて、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンを最終濃度が０、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２００μＭの濃度になるように培養液に添加した。その後、さらに３時間培養した後に集菌した。得られた菌体をｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸カリウム溶液に懸濁し、超音波により菌体を破砕し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心することで未破壊菌体及び菌体残渣を除き、粗酵素溶液を調製する。この粗酵素溶液を適宜５０ｍＭリン酸カリウム溶液で希釈し、９９０μｌに対し１０μｌの１００ｍＭカテコール溶液を添加し、カテコールの分解に伴う３７５ｎｍの吸光の増加を測定することでカテコール２，３ジオキシゲナーゼ活性を測定した。その結果、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンの濃度が２５μＭになるまでは、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンの濃度に依存してｘｙｌＥ遺伝子産物であるカテコール２，３ジオキシゲナーゼの活性が上昇し、それ以上の濃度では、一定の高い活性値のままであった。結果を図１に示す。
【００４７】
実施例２　排出ポンプ阻害物質のスクリーニング
実施例１によりＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプの発現がＮ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンにより誘導されることが明らかになった。そこで、この排出ポンプの発現を指標に阻害剤の検索を行うこと、又は阻害剤の評価を行うことが可能になる。
【００４８】
レポーター遺伝子導入株の作成
ＭｅｘＡ−ＭｅｘＢ−ＯｐｒＭ排出ポンプの発現を検出するため、緑膿菌の染色体ｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭ遺伝子内にカテコール２，３ジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子を導入した。
【００４９】
すなわち、大腸菌用ベクターｐＮＯＴ１９に、緑膿菌ＰＡＯ１株の染色体由来のｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭ排出ポンプ遺伝子をクローニングした。このベクターのｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭ上にカナマイシン耐性遺伝子を含むレポーター遺伝子カセットｘｙｌＥを導入し、ｐＭｅｘ：：Ｘｙｌ−ＭＯＢベクターを構築した。このｐＭｅｘ：：Ｘｙｌ−ＭＯＢベクターを大腸菌の接合伝達用株である大腸菌Ｓ１７−１に導入し、大腸菌Ｓ１７−１（ｐＭｅｘ：：Ｘｙｌ−ＭＯＢ）を作成した。
【００５０】
次に、緑膿菌ＰＡＯ１株と大腸菌Ｓ１７−１（ｐＭｅｘ：：Ｘｙｌ−ＭＯＢ）をＬＢ培地において３７℃にて一晩培養し、前者１ｍｌと後者０．５ｍｌを混合し、５０００ｒｐｍで２分間遠心して集菌し、その後上清を捨て、新しい０．１ｍｌのＬＢ培地に細胞を懸濁した。その後、その懸濁液をＬＢ寒天培地上に置いたニトロセルロース膜の上に静置し、再度３７℃で３時間培養後、下記の組成を有するＶＢＭＭ液体培地１ｍｌで膜上の細胞を回収し、１００〜１５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン若しくはスルベニシリンを含むＶＢＭＭ寒天培地に塗布した後に、３７℃で３日間培養した。
【００５１】
ＶＢＭＭ培地の組成（１Ｌあたり）
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　０．２ｇ
クエン酸３ナトリウム・２Ｈ２Ｏ　　　　２ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　　１０ｇ
ＮａＮＨ４ＨＰＯ４・４Ｈ２Ｏ　　　　　　　３．５ｇ
【００５２】
寒天培地上に生育してきたコロニーをＬＢ培地で３７℃にて一晩培養し、１０％のスクロースを含むＬＢ寒天培地に塗布し、生育してきたコロニーをＰＡＯ１−Ｘｙｌ候補株とし、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法を用いて、染色体のｍｅｘＡ−ｍｅｘＢ−ｏｐｒＭ排出ポンプ遺伝子内にｘｙｌＥ遺伝子が導入されていることを確認し、これをレポーター遺伝子導入株（ＰＡＯ１−Ｘｙｌ株）として選択した。
【００５３】
レポーター遺伝子導入株の培養
上記にようにして得られたレポーター遺伝子導入株（ＰＡＯ１−Ｘｙｌ株）をＬＢ培地（１％　トリプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｌ）で３７℃にて１５時間培養し、培養後の菌体を１／２００量の新たなＬＢ培地に植菌し、３時間培養する。その後Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンを約５０μＭの濃度になるように培養液に添加する。その際、１種あるいは複数の物質を含んでいる試料溶液Ａを同時に添加する。さらに、３時間培養した後集菌する。
【００５４】
カテコール２，３ジオキシゲナーゼの活性の測定
上記のように培養した菌体をｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸カリウム溶液に懸濁し、超音波により菌体を破砕し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心することで未破壊菌体及び菌体残渣を除き、粗酵素溶液を調製する。この粗酵素溶液を適宜５０ｍＭリン酸カリウム溶液で希釈し、９９０μｌに対し１０μｌの１００ｍＭカテコール溶液を添加し、カテコールの分解に伴う３７５ｎｍの吸光の増加を測定することでカテコール２，３ジオキシゲナーゼ活性を測定する。
【００５５】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法によって、細菌の排出ポンプの発現を阻害する物質をスクリーニングすることができる。また、同定された排出ポンプ阻害物質を従来の抗菌薬と同時に使えば、抗菌薬の効果を数倍〜数十倍高められるため、薬剤耐性を有する細菌に対する抗菌剤の効果を高めることができると同時に、抗菌剤による副作用を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるレポーター遺伝子導入株（ＰＡＯ１−Ｘｙｌ株）とＮ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンとを培養したときの、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンの濃度とカテコール２，３ジオキシゲナーゼ活性の関係を表すグラフである。
【図２】実施例２におけるターゲティングベクター（ｐＭｅｘ：：Ｘｙｌ−ＭＯＢ）の作成方法を表す図である。
【図１】
2004097031.tif 000010
【図２】
2004097031.tif 000011