(57)【要約】【課題】本発明は、生体の組織や細胞中に存在する微量の生体分子を質量分析法によって同定することによって、各種疾病等を迅速かつ簡便に診断するための方法を提供することを目的とする。質量分析法において、イオン化が困難とされていた生体分子のイオン化を促進するための方法を提供することを目的とする。【解決手段】生体分子に結合する能力のある反応基を有し、＋１から＋６の正の総電荷又は−６から−１の負の総電荷を有する蛍光標識化剤で生体分子を標識することを含む、生体分子の質量分析法を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子に結合する能力のある反応基を有し、＋１から＋６の正の総電荷又は−６から−１の負の総電荷を有する蛍光標識化剤で標識した生体分子の質量を分析することを含む、生体分子の質量分析法。
【請求項２】
蛍光標識化剤によって蛍光標識された生体分子をマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によってイオン化させることを含む、請求項１に記載の質量分析法。
【請求項３】
飛行時間型（ＴＯＦ）法又は四重極イオントラップ飛行時間型（ＱＩＴ−ＴＯＦ）法によってイオンを分離／検出することを含む、請求項２に記載の質量分析法。
【請求項４】
蛍光標識化剤が、シアニン、メロシアニン、シュードシアニン、イソシアニン、スチリル、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、アクリジン、インドール、ベンズオキサゾール、キノリン、イサト酸無水物、１，８−ナフタルイミド、２，３−ナフタルイミド、５−フェニル−４−ピリジル−２−オキサゾール、クマリン、ビマン（ｂｉｍａｎｅ）、６−Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミン、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−Ｓ−インダセン、エチジウムクロリド、プロピジウムジクロリド、フルオレセイン、レゾルフィン、ナイル・ブルーＡ（Ｎｉｌｅ  Ｂｌｕｅ）、ローダミン、ベンズイミダゾール、及びピリジンから選択される基幹構造を有する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の質量分析法。
【請求項５】
蛍光標識化剤が、シアニン、メロシアニン、及びスチリルから選択される基幹構造を有する、請求項４に記載の質量分析法。
【請求項６】
蛍光標識化剤が、以下の
シアニン
【化１】
2004317398.tif 000006
メロシアニン
【化２】
2004317398.tif 000007
スチリル
【化３】
2004317398.tif 000008
［ここで、
ｍは、０、１、２、３、及び４よりなる群から選択される整数であり；
Ｘ及びＹは、独立して、Ｏ、Ｓ、及びＣ（Ｒ８）ｐ（ここで、ｐは、１又は２であり、Ｒ８は、Ｈ又はＣ１−Ｃ４アルキルである）から選択され；
基Ｒ１ないしＲ９の少なくとも一つは、０ないし６個の正に帯電した窒素、リン若しくは硫黄原子、又は０ないし６個の負に帯電した酸素若しくは硫黄原子を含む反応基を含み；そして
点線は、それぞれ前記シアニン、メロシアニン、及びスチリル染料を形成するのに必要な炭素原子を表す］
から選択される、請求項５に記載の質量分析法。
【請求項７】
基Ｒ１ないしＲ９の少なくとも一つに含まれる、０ないし６個の正に帯電した窒素、リン若しくは硫黄原子、又は０ないし６個の負に帯電した酸素若しくは硫黄原子を含む反応基が、第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ピラゾン、スルフヒドリル、カルボキシル、ヒドロキシル、チオホスフェート、イミダゾール、並びにアルデヒド及びケトンが含まれるカルボニルから選択される、請求項６に記載の質量分析法。
【請求項８】
基Ｒ１ないしＲ９の、０ないし６個の正に帯電した窒素、リン若しくは硫黄原子、又は０ないし６個の負に帯電した酸素若しくは硫黄原子を含む反応基以外のものが、独立して、水素、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ−ないしジハロゲン置換ピリジン、モノ−ないしジハロゲン置換ジアジン、マレイミド、アジリジン、スルホニルハリド、酸ハリド、ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、アジド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、グリオキサル及びアルデヒドよりなる群から選択される、請求項６又は７に記載の質量分析法。
【請求項９】
基Ｒ１ないしＲ９の、０ないし６個の正に帯電した窒素、リン若しくは硫黄原子、又は０ないし６個の負に帯電した酸素若しくは硫黄原子を含む反応基を有する基が、−（ＣＨ２）５−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＮＨ２である、請求項６ないし８のいずれか１項に記載の質量分析法。
【請求項１０】
蛍光標識化剤が、化学式（Ｉ）：
【化４】
2004317398.tif 000009
［式中、
Ｘ及びＹは、Ｃ（ＣＨ３）２であり；
ｎは、１又は２の整数であり；
基Ｒ１は、−（ＣＨ２）５−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＮＨ２であり；
基Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｍＣＨ３（ここで、ｍは０から３までの整数）であり：及び
基Ｒ１０及びＲ１１は、Ｈである］
を有するシアニン誘導体である、請求項４ないし９のいずれか１項に記載の質量分析法。
【請求項１１】
生体分子が、糖、糖鎖、タンパク質、ペプチド、リン酸化ペプチド、核酸、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質から選択される、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物の組織又は細胞に微量に存在する生体分子の構造情報を質量分析法によって検出するための改善された方法に関する。具体的には、本発明は、生体分子に結合する能力のある反応基を有する蛍光標識化剤を使用することによる、質量分析法における生体分子の検出感度を増加させる方法であって、蛍光標識化剤が電荷を有することを特徴とする方法に関する。
【０００２】
本発明の方法は、好ましくは、電荷を有する蛍光標識化試薬とマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を組み合わせた技術を利用することにより行われる。
【０００３】
【従来の技術】
生体の高次調節機構において、生体分子の構造と機能との相関関係を調べることは非常に重要である。生体の組織や細胞に微量にしか発現しないような核酸やタンパク質を抽出し、それらの配列情報や三次元構造を迅速かつ簡便に同定することは、分子構造から分子機能を推定しようとするバイオインフォマティックスの分野、又は、発現したタンパク質を網羅的に解析していこうとするプロテオミクスの分野において重要な課題である。
【０００４】
高次調節機構を制御する生体分子としは、上述の核酸やタンパク質の他に、複合糖質、例えば、糖鎖、糖質等の重要性が認識されつつある。生体内におけるタンパク質のおおよそ５０％以上のタンパク質には糖鎖が結合した形で存在しており、糖鎖が糖タンパク質の構造及び機能を制御する役割を果たしていると言われている。さらに、糖鎖を認識する分子と糖タンパク質の相互作用が様々な生命現象に深く関わっていることもわかってきた。ところが、糖タンパク質においては、１種類のタンパク質であっても、タンパク質に結合する糖鎖構造は一様ではないため、そのタンパク質にどのような糖鎖が結合し、糖鎖がどのように機能しているのか知ることは、こうした糖鎖の不均一性により非常に困難である。
【０００５】
最近、タンパク質の分野においては、ハイスループットによる構造解析法が確立しつつあり、糖鎖の分野においても同様に構造解析法が確立しつつある。糖鎖構造解析研究のための手法としては、例えば、糖鎖の遊離法、クロマトグラフィー法、電気泳動法、化学分解法、ＮＭＲ法、質量分析、酵素消化法、相互作用解析法等が代表されるが、このうち、質量分析法の近年の進歩が目覚しい。しかしながら、質量分析による糖鎖の構造解析には、糖鎖が、タンパク質やペプチドとは異なり、イオン化しにくく、さらには、糖鎖の質量分析から得られる構造情報としては、糖鎖の分子量、及び糖配列、例えば、ヘキソースやＮ−アセチルヘキソサミンの違いを知ることができるのみであり、糖鎖を構成する分子量が同じである糖残基の種類を同定することはできず、したがって、複雑に枝分かれした糖鎖構造全体を決定することや結合位置を同定することは困難である。そこで、糖鎖の構造解析には、イオン化効率の悪さを補うために多量の試料が必要とされること、そして、糖鎖構造全体を決定するためには、質量分析以外の手法を用いることは必須であった。従って、糖鎖をハイスループットで解析するためには、質量分析においては、測定すべき糖鎖量を１ｐｍｏｌより少なくする必要がある。
【０００６】
近年、糖鎖の構造解析においては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ：  Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）と飛行時間型（ＴＯＦ：  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）法を組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析が主流となりつつある。ＭＡＬＤＩで生体分子を測定する場合には、レーザーエネルギーを吸収し、分子をイオン化するのを補助するマトリックスが必要となる。これまで、糖鎖をイオン化させるために使用されるマトリックスとしては、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、アラビノオキサゾン、β−カルボリン等が知られている。
【０００７】
さらに、糖鎖は、ＵＶ吸収がなく、蛍光を発しないために、たとえ、上記の質量分析法によって測定したとしても、検出することは困難である。また、糖鎖を標識する場合、未反応の標識試薬を除去する工程が必要であり、こうした工程等による糖鎖試料の喪失を極力減らすために、精製工程等はない方が好ましい。
【０００８】
従来、糖鎖を蛍光標識する試薬として、２−アミノピリジン（ＰＡ）が知られている。ＰＡを用いて糖鎖を蛍光標識する場合は、ヒドラジン又は酵素による糖鎖の遊離、及び標識化後のＰＡ化糖鎖の精製という煩雑な工程を必要とする。なお、ＰＡは電荷を持たず、ＰＡ化糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる検出では十分な感度が得られない。
【０００９】
本発明者らは、糖鎖構造解析用として、ＵＶ吸収を有し、糖鎖と結合する能力を有する標識試薬、４−（ビオチンアミド）フェニルアセチルヒドラジド（ＢＰＨ）を開発した（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。しかしながら、この標識試薬で標識化された糖鎖を用いて質量分析を行う場合においても、１度の質量分析には少なくとも１０ｐｍｏｌを必要とした。
【００１０】
また、特願平１０−５１７２９５は、生物学的研究用に開発したシアニン色素（特願２０００−５０４２０２）を用いて炭水化物を標識し、二次元電気泳動で解析する方法を開示している。
【００１１】
【特許文献１】特願２０００−５０４２０２
【００１２】
【特許文献２】特願平１０−５１７２９５
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６８，２５７３−２５７９（１９９６）
【００１４】
【非特許文献２】Ｎａｖｅｎ，Ｔ．Ｊ．Ｐ．ａｎｄ  Ｈａｒｖｅｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１０，８２９−８３４（１９９６）
【００１５】
【非特許文献３】Ｎｏｎａｍｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．，３２，２８７−２９６（１９９７）
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
生体の組織や細胞に存在する微量の核酸、タンパク質、糖鎖等の生体分子を質量分析法によって、迅速かつ簡便に、しかも極力少ない試料で分析することができれば、生体分子の異常に伴う各種疾病等のハイスループットな高感度検出が可能となる。
【００１７】
したがって、本発明の目的は、生体分子に結合する能力のある反応基を有し、電荷を有する蛍光標識化剤を使用することによって、質量分析法における生体分子の検出感度を増加させる方法を提供することである。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、電荷を有する蛍光標識化剤によって標識した生体分子は、質量分析によって容易にイオン化され、したがって、生体分子を高感度で検出できることを見出し、本発明の方法を完成させた。
【００１９】
具体的は、本発明の方法は、生体分子に結合する能力のある反応基を有し、電荷を有する蛍光標識化剤で標識した生体分子の質量を分析することを含む、生体分子の質量分析法を提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明は、電荷を有する蛍光標識化剤を用いて生体分子を標識し、生体分子を高感度で測定することを目的とする。一般的に、生体分子の測定には、クロマトグラフィー法、電気泳動法、化学分解法、ＮＭＲ法、質量分析法、酵素消化法、相互作用解析法等が例示されるが、本発明の方法において使用される蛍光標識化剤を用いる限り、これらの方法に限定されない。
【００２１】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
（１）質量分析法
本発明は、生体分子に結合する能力のある反応基を有し、＋１から＋６の正の総電荷又は−６から−１の負の総電荷を有する蛍光標識化剤で標識した生体分子の質量を分析することを含む、生体分子の質量分析法である。
【００２２】
「質量分析法」とは、試料導入部、イオン化部、質量分離部及び検出部を含む気相イオン分光計を用いて、主に試料の質量を測定する分析方法である。具体的には、試料をイオン化部（又は装置）でイオン化し、得られたイオン化分子を質量分離部で質量／電荷（ｍ／ｚ）に従って分離し、検出部で検出する方法である。本願明細書において「質量分析計」というときは、試料、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖等の生体分子を上記「質量分析法」よって測定することを可能にした装置をいう。質量分析計は、ターボ分子ポンプ又は油拡散ポンプによって高真空に維持され、イオン化部から発生又は飛行したイオン化分子は、高真空のため、他の気体分子との相互作用により散乱又は断片化されることなくイオン検出部に到達する。検出部に到達したイオンは、増幅された後、電気信号に変換され、スペクトルとしてデータ処理される。尚、「測定」には、分離、検出、増幅、定量、および半定量のいずれもが包含される。
【００２３】
生体分子のイオン化法は、特に限定されるものではないが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、レーザー脱離（ＬＤ）法、高速原子衝撃（ＦＡＢ）法、液体二次イオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）法、液体イオン化（ＬＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法が例示される。このうち、ＬＤ法はマトリックスを使用しないため、生体分子自身が照射されるレーザー光を吸収し、イオン化され得ることが必要となる。一方、ＭＡＬＤＩ法では、照射されるレーザー光の波長に則して使用可能なマトリックスを選択する必要がある。したがって、マトリックスがレーザー光を吸収しさえすれば、生体分子自身がレーザー光を吸収する必要がないため、多種類の生体分子をイオン化することができる。
【００２４】
本発明によれば、生体分子の質量分析法に使用されるイオン化法は、好ましくは、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法、ＡＰＣＩ法であり、より好ましくは、ＭＡＬＤＩ法である。
【００２５】
生体分子のイオン化に使用されるマトリックスは、イオン化に使用されるレーザーの種類によって異なり、以下の化合物が例示される。レーザーとして、Ｎｄ−ＹＡＧ第４高周波２６６ｎｍを使用する場合は、ニコチン酸、２−ピラジンカルボン酸等が挙げられる。パルス窒素レーザー３３７ｎｍやＮｄ−ＹＡＧ第３高周波３５５ｎｍを使用する場合には、シナピン酸（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）（ＳＡ）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（αＣＨＣＡ）、フェルラ酸（ＦＡ）、３−ヒドロキシピコリン酸（ＨＰＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、５−メトキシサリチル酸、ジアミノナフタレン、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸、ジスラノール、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）等が挙げられる。また、ＣＯ２  ２．９４μｍを使用する場合には、コハク酸、５−（トリフルオロメチル）ウラシル、グリセリン等が挙げられる。
【００２６】
タンパク質、ペプチド、糖ペプチドを分析する場合には、マトリックスとして、ニコチン酸、シナピン酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、５−メトキシサリチル酸、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（α−ＣＨＣＡ）、ジアミノナフタレン、コハク酸、５−（トリフルオロメチル）ウラシル等が好ましい。２，５−ジヒドロキシ安息香酸は、紫外光エネルギーを吸収し、プロトンドナーであり、さらには、極性物質と均一に混和しやすい性質を有しているため、特に好ましい。
【００２７】
糖、糖鎖、糖脂質等を分析する場合には、ノルハルマン、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、α−ＣＨＣＡ（又は「ＣＣＡ」とも言う）、アラビノオキサゾン、ＴＨＡＰ等が好ましい。より好ましくは、ノルハルマン、ＤＨＢ、アラビノオキサゾンである。さらにより好ましくは、ノルハルマン、ＤＨＢである。
【００２８】
使用可能なレーザーは、パルス窒素レーザー３３７ｎｍが好ましく、生体分子を急速に加熱するために、生体分子を分解させることなくイオン化することが可能である。このようなパルスイオン化は、熱イオン化の一種であり、分子量が１００ｋＤａを超える熱的不安定なタンパク質であっても分解させることなく、脱離イオン化が可能である。
【００２９】
ＭＡＬＤＩ法を用いて生体分子をイオン化する場合には、一般的に、生体分子とマトリックス（溶液）をモル比で１×１０−２〜５×１０−４：１に混合した後、混合溶液を乾燥させ結晶状態にする。結晶にパルスレーザーを照射することにより、［Ｍ］＋、［Ｍ＋Ｈ］＋、［Ｍ＋Ｎａ］＋、［Ｍ＋Ｋ］＋等の生体分子由来のイオン種、及びマトリックス由来のイオン種が脱離する。本発明によれば、［Ｍ］＋のイオン種のみが脱離することが好ましい。通常、イオン化により３種類のイオンが形成されてしまうが、本発明の好ましい蛍光標識化剤を使用すれば、［Ｍ］＋という１種類のみのイオン種として脱離させるために、感度ならびにスペクトルの複雑さが改善される、という利点が得られる。より具体的には、後述する実施例１の記載に基づいて、試料の調製及び測定を行うことができる。
【００３０】
「質量分析部」とは、上記したイオン化部においてイオン化された生体分子のイオンを電磁気的相互作用を利用して、生体分子特有の質量／電荷（ｍ／ｚ）に従って分離する部分（又は装置）をいう。質量分析部には、飛行時間型（ＴＯＦ）、四重極イオントラップ飛行時間型（ＱＩＴ−ＴＯＦ）、四重極型、イオントラップ型、磁場型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型（ＦＴ−ＩＣＲ）が例示されるが、これらに限定されない。本発明に従えば、好ましくは、ＴＯＦ、ＱＩＴ−ＴＯＦ、ＦＴ−ＩＣＲである。より好ましくは、ＴＯＦである。
【００３１】
飛行時間型質量分析（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＴＯＦＭＳ）法は、イオン化部から生じたイオン化分子を真空の分析管を通過する間に飛行時間の差によりそれぞれ分離し、質量の小さいものから順次検出器に到達したイオン化分子を検出することを原理とする。さらに、飛行時間型質量分析計には、リニアー型とリフレクター型がある。リニアー型では、発生したイオンが、検出器に到達するまで無電界のため直線飛行する。しかしながら、リニアー型では、飛行途中で中性粒子になったものやメタステーブルイオンも検出できるため高感度ではあるが、イオン発生時の初期エネルギーの分布がそのまま飛行時間に反映されるため分解能が低くなる。一方、リフレクター型では、イオン源から発生したイオンをデフレクターにて偏向させ、さらにリフレクターにてイオン源方向に引き戻すように電圧を加える。このイオン反射電界を付加することにより、イオン発生時のエネルギー分布により同一イオンの飛行時間が分散していた状態が打ち消され収束されるため、リフレクター型は質量分解能が高いことを特徴とする。しかし、リフレクター型では、折り返す前までのメタステーブルイオンは、未分解の安定イオンとの飛行時間が異なり、また、中性粒子は折り返さないため、特に短寿命のイオンの検出感度が低くくなる。寿命の短い高質量イオンについては、リニアー型が適している。リフレクター型では、イオン化部で生じたイオン群から飛行時間によりプレカーサーイオンを選択し、リフレクターの前でＰｏｓｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｄｅｃａｙ（ＰＳＤ）により生じたプロダクトイオンを検出することにより、ＭＳ／ＭＳが可能である。また、飛行時間型質量分析では、より高いエネルギーを微量の生体分子に照射することによって生ずる断片化したイオン化分子の解析から生体分析の組成情報等が得られるＩｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｄｅｃａｙ（ＩＳＤ）解析が可能である。
【００３２】
本発明の方法を用いたＰＳＤ解析、及び微量試料の測定に適したＩＳＤ解析については、それぞれ、後述する実施例４及び５に詳述される。
本発明の方法は、上述した各種イオン化部と質量分析部とのいずれの組み合わせによっても実施することが可能であるが、ＭＡＬＤＩ法と飛行時間型（ＴＯＦ）分析法を組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計において実施することが好ましい。
【００３３】
本発明において使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計としては、ＥｔｔａｎＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  Ｐｒｏ  （アマシャムバイオサイエンス社製）、  Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＶ（ブルーカー社製）等が例示される。
【００３４】
四重極イオントラップ飛行時間型質量分析（Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  Ｉｏｎ  Ｔｒａｐ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＱＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ）法は、ＴＯＦの前に組み込んだ四重極イオントラップにおいて、構成する２組の電極間に適当な大きさ及び周波数の高周波信号を加えることによって電極群の中心に収束したイオン化分子に対して、高周波信号の大きさと周波数を変化させることによって特定のｍ／ｚを有するイオン化分子を飛行させることを特徴とする。従って、この四重極イオントラップ中で、Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＣＩＤ）を利用したＭＳｎが可能であり、前記ＰＳＤに比べてより多くのフラグメントシグナルが得られるため、生体分子の構造解析に重要な手法となる。
【００３５】
本発明において使用可能なＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ質量分析計としては、ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ（島津製作所社製）が例示される。
しかしながら、上記のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計又はＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ質量分析計を使用し、上述したマトリックスのいずれかを使用したとしても、イオン化が困難である糖鎖、リン酸化ペプチド、糖ペプチド、糖タンパク質等を測定する場合には、マススペクトルの解析において十分な感度が得られないことが多い。そこで、イオン化が困難である生体分子を分離／検出するためには、後述する電荷を有する蛍光標識化剤を用いて、予め生体分子を標識化（又は誘導化）することにより、イオン化効率を上昇させることができる。
【００３６】
（２）蛍光標識化剤
本発明の方法に使用する蛍光標識化剤は、生体分子に結合する能力のある反応基を有し、電荷を有することを特徴とする。特に、本発明の方法に使用する蛍光標識化剤は、生体分子に結合する能力のある反応基を有し、＋１から＋６の正の総電荷、又は−６から−１の負の総電荷を有することを特徴とする。
【００３７】
具体的には、本発明の方法に使用する蛍光標識化剤は、基幹構造に、生体分子と結合する能力のある反応基がリンカー分子を介して又は介さずに結合し、蛍光標識化剤全体として正又は負に荷電している。
【００３８】
本発明の方法で使用される蛍光標識化剤の基幹構造としては、シアニン、メロシアニン、シュードシアニン、イソシアニン、スチリル、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、アクリジン、インドール、ベンズオキサゾール、キノリン、イサト酸無水物、１，８−ナフタルイミド、２，３−ナフタルイミド、５−フェニル−４−ピリジル−２−オキサゾール、クマリン、ビマン（ｂｉｍａｎｅ）、６−Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミン、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−Ｓ−インダセン、エチジウムクロリド、プロピジウムジクロリド、フルオレセイン、レゾルフィン、ナイル・ブルーＡ（Ｎｉｌｅ  Ｂｌｕｅ）、ローダミン（例えば、ジヒドロテトラメチルローダミン、ジヒドロ−Ｘ−ローダミン、テキサスレッド（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標））、ベンズイミダゾール、及びピリジン染料類が例示される。蛍光標識化剤の基幹構造としては、好ましくは、シアニン、メロシアニン、スチリルを有する。より好ましくは、シアニンを有する。尚、当業者であれば、慣用技術を用いてこれら基幹構造を有する化合物から誘導体を調製することができる。
【００３９】
基幹構造が電荷を有しない場合には、慣用技術を用いて、基幹構造に電荷を有する誘導体を調製することができ、あるいは電荷を有する原子若しくは分子（若しくは基）を例えばリンカー分子として結合させてもよい。具体的には、例えば、基幹構造又はリンカー分子に電荷を有する原子、例えば、窒素、酸素、硫黄、リン、又はこれらの原子の１つ若しくはそれ以上を含む分子（若しくは基）を導入することによって、蛍光標識化剤の総電荷を調節することができる。
【００４０】
蛍光標識化剤は、生体分子に結合する能力のある反応基を有し、該蛍光標識化剤で標識した生体分子の質量を分析することができれば、蛍光標識化剤の総電荷は限定されない。
【００４１】
蛍光標識化剤の正の総電荷は、好ましくは＋１ないし＋６、より好ましくは＋１ないし＋３、さらにより好ましくは＋１ないし＋２、最も好ましくは＋１である。
【００４２】
蛍光標識化剤の負の総電荷は、好ましくは−６ないし−１、より好ましくは−３ないし−１、さらにより好ましくは−２ないし−１、最も好ましくは−１である。
【００４３】
本明細書において、「生体分子に結合する能力のある反応基」とは、蛍光標識化剤を所期の生体分子に結合させることのできる基である。反応基は、生体分子との結合性を損なわなずに、生体分子の構造及び機能に影響を与えない範囲において、蛍光標識化中の基幹構造に直接結合してもよく、又はリンカー分子を介して基幹構造に結合してもよい。前記反応基は、１個又はそれ以上、１種類又はいくつかの組み合わせによって、基幹構造又はリンカー分子に結合してもよい。
【００４４】
本発明の方法に使用する蛍光標識化剤は、生体分子に結合する能力のある反応基を有し、全体として＋１から＋６の正の総電荷、又は−６から−１の負の総電荷を有することを特徴とする。蛍光標識化剤の基幹構造が電荷を有する場合には、反応基又は反応基＋リンカー分子部分は、電荷を有しない、即ち、０でもよい。例えば、蛍光標識化剤の基幹構造がシアニン又はスチリルの場合、基幹構造中の窒素が＋１に帯電している。よって、これに結合する反応基又は反応基＋リンカー分子部分は電荷が０でもよい。これに対し、基幹構造がメロシアニンの場合、基幹構造中の窒素は帯電していない。よって、これに結合する反応基又は反応基＋リンカー分子部分は、＋１から＋６の正の電荷、又は−６から−１の負の電荷を有する。
【００４５】
反応基が基幹構造に直接結合する場合は、基幹構造上の反応基の結合位置は限定されない。好ましくは、基幹構造を構成する炭素、窒素、酸素、硫黄、リンである。より好ましくは、窒素、炭素、酸素である。最も好ましくは、窒素である。
【００４６】
反応基がリンカー分子に結合する場合は、反応基の結合位置は限定されない。好ましくは、反応基の結合位置は、少なくとも１個の反応基がリンカー分子の末端に結合する。
【００４７】
反応基の好ましい態様は、第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ピラゾロン、スルフヒドリル、カルボキシル、ヒドロキシル、チオホスフェート、イミダゾール、アルデヒド、ケトン、イソシアネート、ヒドラジドが例示される。好ましくは、反応基は、ヒドラジド、アミン、ヒドロキシルアミンである。より好ましくは、ヒドラジド、ヒドロキシルアミンである。最も好ましくは、ヒドラジドである。
【００４８】
リンカー分子は、基幹構造と反応基とを連結するための分子をいう。リンカー分子は、電荷を有しない基幹構造、例えば、ナフタレン等を使用する場合には、電荷を有する原子又は分子（若しくは基）を導入するすることによって、リンカー分子に電荷を持たせることができる。また、リンカー分子は、蛍光標識化剤の担持する電荷、又は生体分子のイオン化によって生じる電荷を保持することができ、蛍光を消長しない分子であることが好ましい。
【００４９】
リンカー分子の好ましい態様は、炭素、窒素、酸素、硫黄、及びリンから選択される１−６０個の鎖原子を含むことができ、例えば、
（ａ）  −（ＣＨ２）ｘ−；
（ｂ）  −（（ＣＨ２）ｐ−ＣＯ−）ｙ−
（ｃ）  −（（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ）ｙ−；
（ｄ）  −（（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｑ）ｙ−；又は
（ｅ）  −（（ＣＨ２）ｐ−Ａｒ−（ＣＨ２）ｑ）ｙ−
［式中、
ｘは、１−３０、好ましくは、１−１０であり；
ｐは、１−１０、好ましくは、１−５であり；
ｑは、０−１０、好ましくは、０−５であり；
ｙは、１−１０、好ましくは、１−５であり；及び
Ａｒは、アリールである］
である。
【００５０】
好ましくは、−（（ＣＨ２）ｐ−ＣＯ−）ｙ−（ここで、ｐは１−５であり、ｙは１−５である）である。
より好ましくは、−（ＣＨ２）５−Ｃ（＝Ｏ）−である。
【００５１】
本発明の質量分析法に使用する蛍光標識化剤の好ましい一態様は、以下のシアニン
【００５２】
【化５】
2004317398.tif 000002
【００５３】
メロシアニン
【００５４】
【化６】
2004317398.tif 000003
【００５５】
スチリル
【００５６】
【化７】
2004317398.tif 000004
【００５７】
［ここで、
ｍは、０、１、２、３、及び４よりなる群から選択される整数であり；
Ｘ及びＹは、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ８）ｐ（ここで、ｐは、１又は２であり、Ｒ８は、Ｈ又はＣ１−Ｃ４アルキルである）から選択され；
基Ｒ１ないしＲ９の少なくとも一つは、０ないし６個の正に帯電した窒素、リン、若しくは硫黄原子、又は０ないし６個の負に帯電した酸素、若しくは硫黄原子を含む反応基を含み；そして
点線は、それぞれ前記シアニン、メロシアニン、及びスチリル染料を形成するのに必要な炭素原子を表す］
から選択される。
【００５８】
あるいは、上記化合物中の窒素を含む環は、点線を構成する炭素原子と、窒素及びＸ又はＹが一緒になって、飽和又は不飽和の、五員環又は六員環を形成してもよい。
【００５９】
好ましくは、前記基Ｒ１ないしＲ９の少なくとも一つに含まれる、０ないし６個の正に帯電した窒素、リン若しくは硫黄原子、又は０ないし６個の負に帯電した酸素、若しくは硫黄原子を含む反応基が、第一級アミン、第二級アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ピラゾン、スルフヒドリル、カルボキシル、ヒドロキシル、チオホスフェート、イミダゾール、並びにアルデヒド及びケトンが含まれるカルボニルから選択される。
【００６０】
基Ｒ１ないしＲ９に含まれる０ないし６個の正に帯電した窒素、リン、若しくは硫黄原子、又は０ないし６個の負に帯電した酸素若しくは硫黄原子を含む反応基は、基Ｒ１ないしＲ９中の好ましくは１ないし２箇所、より好ましくは１箇所に存在する。
【００６１】
好ましくは、基Ｒ１及び／又はＲ２に反応基を有する。
より好ましくは、前記基Ｒ１ないしＲ９の少なくとも一つに含まれる、０ないし６個の正に帯電した窒素、リン若しくは硫黄原子、又は０ないし６個の負に帯電した酸素若しくは硫黄原子を含む反応基が、−（ＣＨ２）５−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＮＨ２である。
【００６２】
蛍光標識化剤のより好ましい一態様は、前記基Ｒ１ないしＲ９の、０ないし６個の正に帯電した窒素、リン若しくは硫黄原子、又は０ないし６個の負に帯電した酸素若しくは硫黄原子を含む反応基以外のものは、特に限定されない。
【００６３】
好ましくは、基Ｒ１ないしＲ９の、０ないし６個の正に帯電した窒素、リン、若しくは硫黄原子、又は０ないし６個の負に帯電した酸素若しくは硫黄原子を含む反応基以外のものは、独立して、水素、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ−ないしジハロゲン置換ピリジン、モノ−ないしジハロゲン置換ジアジン、マレイミド、アジリジン、スルホニルハリド、酸ハリド、ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、アジド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、グリオキサル及びアルデヒドよりなる群から選択される。
【００６４】
蛍光標識化剤のさらにより好ましい一態様は、化学式（Ｉ）
【００６５】
【化８】
2004317398.tif 000005
【００６６】
［式中、
Ｘ及びＹは、Ｃ（ＣＨ３）２であり；
ｎは、１又は２の整数であり；
Ｒ１は、−（ＣＨ２）５−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＮＨ２であり：
Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｍＣＨ３（ここで、ｍは０から３までの整数）であり；および
Ｒ１０及びＲ１１は、Ｈである］
を有するシアニン誘導体である。
【００６７】
好ましくは、前記シアニン誘導体は、ｎが１であり、ｍが１である。本明細書においては、これにより定義されるシアニン誘導体を「Ｃｙ３−ヒドラジド」と称することがある。
【００６８】
好ましくは、前記シアニン誘導体は、ｎが２であり、ｍが０である。本明細書においては、これにより定義されるシアニン誘導体を「Ｃｙ５−ヒドラジド」と称することがある。
【００６９】
好ましくは、Ｎ−ヒドラジノカルボニルアルキル−シュードシアニンである。より好ましくは、１−エチル−１’−（４−ヒドラジノカルボニルブチル）−２，２’−シアニンである。
【００７０】
本発明の質量分析に使用可能な蛍光標識化剤は、特願２００２−５０４２０２に開示されたシアニン色素を使用することができ、該シアニン色素を製造する場合においては、本明細書に援用することができる。
【００７１】
（３）生体分子の蛍光標識化と質量分析
（ａ）生体分子
本発明の方法によって測定可能である限り、生体分子の起源、製法等は限定されない。即ち、本願明細書において「生体分子」というときは、天然産物、化学合成物の何れでもよい。具体的には、生体分子は、生物学的材料由来であり得て、器官、組織、細胞からの抽出物、例えば、糖、糖鎖、タンパク質、ペプチド、リン酸化ペプチド、核酸、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質等である。生体分子は、上述した蛍光標識化剤の反応基と相互作用し、該蛍光標識化剤が結合し得る官能基を有することが好ましい。好ましくは、生体分子の官能基は、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、アミノ基、スルフヒドリル基である。より好ましくは、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基である。最も好ましくは、カルボニル基である。
【００７２】
本発明の方法によれば、質量分析が可能な生体分子は、イオン化が困難である生体分子、例えば、糖鎖、リン酸化ペプチド、糖ペプチドである。好ましくは、糖鎖である。
【００７３】
「糖鎖」には、単糖類、オリゴ糖類や生体中に含有される多糖類の他、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合糖質から誘導された糖鎖等が含まれる。単糖類には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、キシロース、グルクロン酸、イズロン酸が含まれる。オリゴ糖は、１種類又はそれより多くの単糖が２ないし１０数個連結したものであり、ラクトース、スクロース、キトトリオース、ＮＡ２、ＮＧＡ３が例示される。多糖とは、オリゴ糖を構成する単糖の数がオリゴ糖よりも多いものをいう。ここで、上記のオリゴ糖、多糖を構成する単糖（糖残基）同士は、α又はβグリコシド結合によって連結する。「α」及び「β」は糖環１位のグリコシド結合のアノマーを示し、５位ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ３との位置関係がトランスのものを「α」、シスのものを「β」で示す。構成する糖残基のうち、アノマー炭素が他の糖残基と結合していない糖残基を還元末端といい、アノマー炭素のみで他の糖残基と結合している糖残基を非還元末端という。オリゴ糖中の還元末端は、１つであり、非還元末端は、オリゴ等の分岐によって１ないし複数個存在する。ここで、オリゴ糖の蛍光標識は、還元末端のアノマー炭素の水酸基と蛍光標識化剤の反応基を反応させることによって、オリゴ糖中の特定の位置に蛍光標識化剤を結合させることができる。
【００７４】
（ｂ）蛍光標識化
前記蛍光標識化剤を用いれば、生体分子のいずれをも蛍光標識することができ、蛍光標識化は、慣用技術を用いて行うことができる。
【００７５】
具体的には、生体分子がタンパク質、ペプチド等のようにアミノ酸から構成されるものであれば、アミノ酸側鎖の水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基等に、慣用技術を用いて、蛍光標識化剤を結合させることができる。
【００７６】
複合糖質を蛍光標識する場合には、糖鎖の還元末端の遊離した水酸基を利用することができる。単糖、オリゴ糖、多糖の場合は、還元末端が遊離の状態であるため、前処理をしなくてよい。これ以外の複合糖質の場合は、ヒドラジン分解−Ｎ−アセチル化、アルカリ処理、トリフルオロアセトリシス、オゾノリシス等の化学的手法、グリコペプチダーゼ、エンドグリコシダーゼ、グリコセラミダーゼ等の酵素による処理等の公知の方法によって前処理を行い、還元末端を遊離させればよい。より具体的には、後述する実施例１に記載したように、糖鎖と蛍光標識化剤を混合し、加熱することによって、糖鎖を蛍光標識することができる。本発明によれば、蛍光標識した糖鎖は、精製することなく質量分析を行うことができる。
【００７７】
（ｃ）質量分析
本発明によれば、一般的にイオン化が困難であるとされる生体分子、例えば、糖鎖、リン酸化ペプチド、糖ペプチド等の質量分析を行うことができる。生体分子を質量分析によって測定する場合、当該技術分野において周知なように、生体分子は少なくとも１０ｐｍｏｌ必要である。本発明の方法によれば、これらの生体分子の質量分析を行う場合、生体分子の必要量は、１ｐｍｏｌ以下、好ましくは、０．１ｐｍｏｌ以下、より好ましくは、０．０１ｐｍｏｌ以下、さらに好ましくは、１ｆｍｏｌ以下、最も好ましくは、０．２５ｆｍｏｌ以下である。したがって、本発明によれば、生体分子の質量分析の感度増加は、蛍光標識化剤を使用しない従来の手法に比にして、１０倍、好ましくは、１００倍、より好ましくは、１０００倍、さらに好ましくは、１００００倍、最も好ましくは、４００００倍である。理論に縛られるわけではないが、本発明の質量分析法の感度増加は、生体分子を一定の蛍光標識剤で標識することにより、イオン化率が向上することに因ると考えられる。
【００７８】
具体的には、実施例２に示すように、糖鎖をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで解析すると、糖鎖が１ｆｍｏｌあればマススペクトルを得ることができる。蛍光標識化剤を使用しない従来の方法では、糖鎖の質量分析には１０ｐｍｏｌ必要とされていたので、本発明の方法によれば、糖鎖の質量分析の感度増加は１００００倍である。
【００７９】
本発明の方法によれば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いた生体分子の解析は、質量情報を得ることに限定されず、ＰＳＤ（Ｐｏｓｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｄｅｃａｙ）解析、ＩＳＤ（Ｉｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｄｅｃａｙ）解析、タンデムマス解析等によって、生体分子の組成情報、配列情報、構造情報等を得ることができる。
【００８０】
本明細書において、「ＰＳＤ解析」とは、ＴＯＦ質量分析計内を飛行中に断片化した励起分子イオンを検出することによって、生体分子の組成情報が詳細に得られる手法をいう。「断片」とは、当該技術分野において周知なように、生体分子を構成する分子間の結合、例えば、ペプチド結合、グリコシド結合等が、レーザーのエネルギーによって切断され得られた、生体分子の各構成成分、又は構成成分の２個若しくはそれより多くが結合したままの分子単位をいう。ＰＳＤ解析によって、未知試料又は構成成分が不明な生体分子の組成情報等を得ることができる。具体的に、実施例４には、Ｃｙ５標識化ラクト−ネオ−フコペンタオース糖鎖のＰＳＤ解析によって、該糖鎖を構成する糖残基の種類及び糖鎖の一次構造情報が得られることを示している。
【００８１】
本明細書において、「ＩＳＤ解析」とは、ＴＯＦ質量分析において、生体分子をより高いエネルギーのレーザーを照射し、レーザー照射と同時に生体分子が断片化し、発生した励起分子イオンを検出することによって、ＰＳＤ解析と比べて、より少量の試料から生体分子の組成情報等が得られる手法をいう。具体的に、実施例５には、ＰＳＤ解析で使用した糖鎖の１／１０量で、該糖鎖を構成する糖残基の種類及び糖鎖の一次構造情報が得られることを示している。
【００８２】
本発明の方法によれば、生体分子を上述した蛍光標識化剤で標識した後は、未反応の標識化剤を除去する工程を必要とせず、質量分析計に試料を導入し、測定することができる。一方、未反応の蛍光標識化剤を除去し、精製した蛍光標識化した生体分子を用いる場合は、慣用の精製技術、例えば、クロマトグラフィー等によって精製することができる。具体的には、実施例６に示すように、蛍光標識した糖鎖は、ＺｉｐＴｉｐ  Ｃ１８カラム担体（ミリポア社製）に捕獲され、水で容易に分離精製することが可能である。
【００８３】
本発明の方法によれば、蛍光標識化剤の蛍光波長及び／又は分子量の異なる２種又はそれより多くの蛍光標識化剤を用いて、質量分析による生体分子のディファレンシャル分析又はイメージングを行うことができる。
【００８４】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００８５】
実施例１  糖鎖の蛍光標識化
アセトニトリル中の２５ｍＭ  キトトリオースの１μｌ及び５０ｍＭ  Ｃｙ３−ヒドラジドの２μｌを小バイアルに３０％アセトニトリルの１７μｌに添加した。混合物をヒートブロック上で９０℃１時間加熱した。室温に冷却後、混合物を適宜希釈し、精製せずにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で解析した。
【００８６】
実施例２  検出限界の検討
Ｃｙ３−ヒドラジドで標識したキトトリオース糖鎖を用いて、測定試料の最小量を求める検討を行った（図１参照）。Ｃｙ３標識した糖鎖が、１ｐｍｏｌ、２００、４０、１０、４、２、及び１ｆｍｏｌになるように希釈し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのレフレクトロンモードで測定した。使用した装置はＲｅｆｌｅｘ  ＩＶ（ブルーカー社）であり、マトリックスはノルハルマンである。調製した最小量の１ｆｍｏｌでは、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比は３以上であった（図１最上段）。したがって、標識化糖鎖が１ｆｍｏｌよりもさらに少ない量であっても測定が可能であると考えられる。また、リニアーモードによれば、さらに少ない量で測定することができると考えられる。これより、従来、糖鎖を質量分析し、良好なマススペクトルを検出できるために最低限１０ｐｍｏｌ必要であったことを考慮すると、本発明の方法によって、質量分析による検出感度は、１００００倍増加したといえる。
【００８７】
実施例３  検出感度の増加
オボアルブミン由来のＮ−グリカンをＣｙ３−ヒドラジン又はＧｉｒａｒｄ’ｓ  Ｔで標識し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行った（図２）。図２ａは、対照例として、Ｎ−グリカン（１０ｐｍｏｌ）を標識化せずに、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）をマトリックスとし、Ｅｔｔａｎ  ＭＡＬＤＩ  Ｐｒｏ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて測定した。マススペクトルは全く検出できなかった。これに対して、Ｎ−グリカンをＣｙ３−ヒドラジンで標識し、α−ＣＨＣＡ（ＣＣＡ）をマトリックスとして質量分析を行った場合には、オボアルブミン特有のマススペクトルが得られた（図２ｂ）。
【００８８】
図３ａは、Ｇｉｒａｒｄ’ｓ  Ｔで標識したＮ−グリカン（３０ｐｍｏｌ）をＤＨＢをマトリックスとしてＲｅｆｌｅｘ  ＩＶを用いて測定した結果である。図３ｂは、Ｃｙ３−ヒドラジドで標識したＮ−グリカン（４００ｆｍｏｌ）をＤＨＢをマトリックスとしてＲｅｆｌｅｘ  ＩＶを用いて測定した結果である。両者を比較すると、Ｇｉｒａｒｄ’ｓ  Ｔで標識したＮ−グリカンの質量分析では、マススペクトルが得られるが、Ｓ／Ｎ比が悪い（図３ａ）。これに対して、Ｃｙ−３ヒドラジド標識したＮ−グリカンの場合は、使用量がおよそ１／１００であるにもかかわらず、Ｓ／Ｎ比が高いマススペクトルが得られた（図３ｂ）。さらに、ノルハルマンをマトリックスとして使用した場合には、２００ｆｍｏｌの使用量で、より良好なマススペクトルが得られた（図３ｃ）。
【００８９】
以上より、Ｃｙ３−ヒドラジドを用いて糖鎖を標識することによって、Ｓ／Ｎ比を高くし、検出感度を増加させることができた。
実施例４  質量分析におけるＰＳＤ解析
Ｃｙ５−ヒドラジドで標識したラクト−ネオ−フコペンタオース（２０ｐｍｏｌ）を用いてＰＳＤ解析を行った（図４参照）。この糖鎖の一次構造は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃである。ＣＣＡをマトリックスとし、Ｅｔｔａｎ  ＭＡＬＤＩ  Ｐｒｏで測定した。糖鎖は、レーザー照射により、非還元末端から切断され断片化する。糖鎖の還元末端の糖残基を蛍光標識するため、標識された還元末端の糖残基を有する断片のみが、マススペクトルとして検出される。図中の低分子側から、Ｃｙ５−ヒドラジド（４８１．７４２  ｍ／ｚ）、標識された糖残基（６５８．５  ｍ／ｚ）がマススペクトルとして検出され、順次、糖残基が１つずつ付加していくマススペクトルが得られる。各スペクトル間は、構成する糖残基に相当し、例えば、Ｈｅｘ（ヘキソース）は、ラクト−ネオ−フコペンタオースの還元末端側から２番目のガラクトース（Ｇａｌ）に対応している。また、ｄＨｅｘ（デオキシヘキソース）は、非還元末端に位置したフコースに対応している。したがって、本発明の方法は、ＰＳＤ解析に適しており、糖鎖を構成する糖残基の種類、及び一次配列を決定するの上で有効な方法であるといえる。
【００９０】
実施例５  質量分析におけるＩＳＤ解析
Ｃｙ５−ヒドラジドで標識したラクト−ネオ−フコペンタオース（２ｐｍｏｌ）を用いてＩＳＤ解析を行った（図５）。ＣＣＡをマトリックスとし、Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＶで測定した。図中のＨｅｘＮＡｃ（Ｎ−アセチルヘキソサミン）は、糖鎖の還元末端側から３番目のＮ−アセチルグルコサミンに対応し、４番目のＨｅｘ（ヘキソース）は、ガラクトース（Ｇａｌ）に対応する。したがって、本発明の方法は、ＩＳＤ解析にも適しており、実施例４に記載したＰＳＤ検出に比べて、試料の使用量が少なくて済み、ＰＳＤ解析と同様に糖鎖を構造する糖残基の種類、及び一次配列を決定する上で有効な方法であるといえる。
【００９１】
実施例６  標識糖鎖の精製
標識化後に残存する蛍光標識化剤の除去について検討した結果を図６に示す。上述した実施例では、標識化糖鎖を精製することなく質量分析計に共しているが、未反応の蛍光標識化剤を除去し精製した標識化糖鎖を使用する場合においても、本発明の方法が有効である。即ち、実施例１に記載の蛍光標識化方法によって標識した糖鎖（１５１４  ｍ／ｚ）の反応溶液をＺｉｐＴｉｐ  Ｃ１８カラムに流すと、反応物はカラムに捕獲され、蛍光標識化糖鎖は、５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）では溶出されず（図６上段）、水に対して溶出された（図６下段）。したがって、本実施例に従えば、未反応の蛍光標識化剤を除去し、標識化糖鎖を容易に精製することができる。
【００９２】
【発明の効果】
本発明により、質量分析による生体分子の分離及び／又は検出の感度を増加させることができた。したがって、微量な生体分子を検出することによる、各種疾患の迅速及び簡便な診断等が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、キトトリオースをＣｙ３−ヒドラジドで標識化後、標識化糖鎖の１ｐｍｏｌ、２００、４０、１０、４、２、及び１ｆｍｏｌについてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行った結果を示す。Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＶを用い、ノルハルマンをマトリックスとして使用し、レフレクトロンモードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行った。
【図２】図２は、オボアルブミン由来のＮ−グリカンを蛍光標識し、蛍光標識化剤及びマトリックスの違いによる検出感度の増加における効果を検討した結果である。パネルａ：Ｎ−グリカン（１０ｐｍｏｌ）を標識化せずに、ＤＨＢをマトリックスとし、Ｅｔｔａｎ  ＭＡＬＤＩ  Ｐｒｏを用いて測定した。パネルｂ：Ｎ−グリカン（１０ｐｍｏｌ）をＣｙ３−ヒドラジンで標識し、ＣＣＡをマトリックスとして質量分析を行った。
【図３】図３は、オボアルブミン由来のＮ−グリカンを蛍光標識し、蛍光標識化剤及びマトリックスの違いによる検出感度の増加における効果を検討した結果である。パネルａ：Ｇｉｒａｒｄ’ｓ  Ｔで標識したＮ−グリカン（３０ｐｍｏｌ）をＤＨＢをマトリックスとしてＲｅｆｌｅｘ  ＩＶを用いて測定した。パネルｂ：Ｃｙ３−ヒドラジドで標識したＮ−グリカン（４００ｆｍｏｌ）をＤＨＢをマトリックスとしてＲｅｆｌｅｘ  ＩＶを用いて測定した。パネルｃ：Ｃｙ３−ヒドラジドで標識したＮ−グリカン（２００ｆｍｏｌ）をノルハルマンをマトリックスとしてＲｅｆｌｅｘ  ＩＶを用いて測定した。
【図４】図４は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いたＣｙ−５標識したラクト−ネオ−フコペンタオース（２０ｐｍｏｌ）のＰＳＤ解析の結果を示す。マトリックスをＣＣＡとし、Ｅｔｔａｎ  ＭＡＬＤＩ  Ｐｒｏを使用した。
【図５】図５は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いたＣｙ−５標識したラクト−ネオ−フコペンタオース（２ｐｍｏｌ）のＩＳＤ解析の結果を示す。マトリックスをＣＣＡとし、Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＶを使用した。
【図６】図６は、標識化後に残存する蛍光標識化剤の除去について検討した結果である。Ｃｙ標識した糖鎖（ｍ／ｚ  １５１４）の反応溶液をＺｉｐＴｉｐ  Ｃ１８カラムに流し、反応物をカラムに捕獲される。その後、蛍光標識化糖鎖は、５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）では溶出されず（図６上段）、水に対して溶出された（図６下段）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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