(57)【要約】【課題】金属酵素から、その活性の発現に必須である金属イオンを、簡便に高精度に除去する方法を開発し、酵素活性を制御できるシステムを提供する。【解決手段】適当な緩衝液中で、金属酵素溶液あるいは金属酵素の固定化物に電圧を印加して当該酵素から金属イオンを除去することにより、酵素活性を消失あるいは減少させる工程と、適切な金属イオンを付与することにより酵素活性を回復させる工程とを含む酵素活性の制御方法と、それを利用した金属の計測方法および金属の計測装置、またはモレキュラースイッチ。【選択図】　図１
2004097126.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属酵素において酵素活性の発現に必須な金属を前記金属酵素から電気化学的に脱離させ、前記酵素活性を消失または減少させる工程を有する
酵素活性の制御方法。
【請求項２】
前記酵素活性が消失または減少した前記金属酵素に、前記金属を付与して前記酵素活性を回復させる工程をさらに有する
請求項１記載の酵素活性の制御方法。
【請求項３】
金属酵素において酵素活性の発現に必須な金属を前記金属酵素から電気化学的に脱離させ、前記酵素活性を消失または減少させたときにオフとなり、
前記酵素活性が消失または減少した前記金属酵素に、前記金属を付与して前記酵素活性を回復させたときにオンとなる
モレキュラースイッチ。
【請求項４】
金属酵素において酵素活性の発現に必須な金属を前記金属酵素から電気化学的に脱離させ、前記酵素活性を消失または減少させる工程と、
前記酵素活性が消失または減少した前記金属酵素に試料を供給する工程と、
前記試料の供給により回復した酵素活性を指標として、前記試料中の前記金属の量を計測する工程とを有する
金属の計測方法。
【請求項５】
予め、前記酵素活性が消失または減少した前記金属酵素に前記金属を付与したときに回復する前記酵素活性を、前記金属の付与量が互いに異なる複数の条件で測定する工程と、
前記測定の結果に基づき検量線を作成する工程とを有し、
前記酵素活性を指標として前記金属の量を計測する工程は、前記検量線を参照する工程を含む
請求項４記載の金属の計測方法。
【請求項６】
前記金属酵素を担体に固定して用いる
請求項４記載の金属の計測方法。
【請求項７】
前記金属酵素はアルカリホスファターゼであり、前記金属は亜鉛またはコバルトの一方である
請求項４記載の金属の計測方法。
【請求項８】
金属酵素が固定された担体と、
該担体が充填されたカラムと、
該カラムに通液させる通液手段と、
前記カラムに定電流または定電位を印加し、前記金属酵素において酵素活性の発現に必須な金属を前記金属酵素から電気化学的に脱離させ、前記酵素活性を消失または減少させる印加手段と、
前記カラムに前記金属酵素の基質を供給する基質供給手段と、
前記カラムに試料を供給する試料供給手段と、
前記試料中に含まれる前記金属の量に応じて回復した前記金属酵素の前記酵素活性により、前記基質から生成した生成物を検出する検出手段とを有する
金属の計測装置。
【請求項９】
前記金属酵素はアルカリホスファターゼであり、前記金属は亜鉛またはコバルトの一方である
請求項８記載の金属の計測装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、金属酵素における酵素活性の制御方法と、制御された酵素活性を指標にしたモレキュラースイッチ、金属の計測方法および金属の計測装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、環境問題への関心が高まる中、その汚染要因の一つである重金属の計測法が注目されている。多くの金属は人体にとって必須であるため、摂取量が少なければ生体に影響を及ぼし、逆に過剰に摂取しすぎても害となったりする。
【０００３】
一般の金属の定量には、比色法や原子吸光分析法が使用されており、更に微量の試料に関しては、原子吸光分析や、高周波誘導結合プラズマ発光分析によって金属の定量が行われる。
【０００４】
一方、酵素タンパク質とその基質等との特異的な反応を利用して、基質等の化合物を検出できる電気化学センサーが開発されている（特許文献１参照）。また、例えばタンパク質等のポリマーを少なくとも２つの電極に連結したセンサーも提案されている（特許文献２参照）。
【０００５】
特許文献１記載のセンサーは、支持材にアンカー基を介してタンパク質を固定したものであり、固定されたタンパク質の活性を変化させる操作は行われない。特許文献２記載のセンサーについても、電極に結合されたタンパク質の活性を変化させる操作は行われない。
【０００６】
電気化学的手法を用いたことにより、金属酵素から金属イオンが脱離した報告として、金属酵素の一種であるアルカリホスファターゼを含む溶液について等電点電気泳動を行った結果、酵素活性が消失し、付与することにより回復したという事例がある（非特許文献１参照）。
【０００７】
この等電点電気泳動はタンパク質の精製において、通常用いられる手法のひとつであり、その結果、酵素活性に影響が生じたことを報告するものであり、当該酵素活性を意図して消失、また回復させて使おうとしたものではない。
【０００８】
電気化学的に酵素活性を制御する先行技術として、酵素反応系において、酸化反応で生じた補酵素ＮＡＤＨ（還元形ＮＡＤ）を電気化学的方法によりＮＡＤ＋（ニコチンアミドジヌクレオチド）に再生し、酸化反応を促進させる報告がある（非特許文献２参照）。
【０００９】
また、これと類似の、酵素の基質を電気化学的に再生させ、酵素活性を制御する方法は数多く報告されている。しかし、基質ではなく、酵素自身を構成する一要素を電気的に脱離させることにより、活性を制御した報告はなされていない。
【００１０】
金属酵素は、活性を発現するために、当該酵素に特有の金属を保持していなければならないことが広く知られている。その金属をキレート剤を用いて除去すると、酵素活性は消失するが、消失した酵素活性は金属イオンの付与により回復する。
【００１１】
このような金属の除去と付与により酵素活性を制御し、この酵素活性を指標として当該金属を計測する方法が報告されている（非特許文献３参照）。この場合、活性を制御するための金属の脱離はキレート剤を用いて行っている。
【００１２】
【特許文献１】
特開平８−２３３７７３号公報
【特許文献２】
特表平１０−５０７５２１号公報
【非特許文献１】
Ａ．　Ｌａｔｎｅｒ，　Ｍ．　Ｅ．　Ｐａｒｓｏｎｓ，　Ａ．　Ｗ．　Ｓｋｉｌｌｅｎ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ，　１１８，　２９９　（１９７０）
【非特許文献２】
Ｏ．　Ｍｉｙａｗａｋｉ　ａｎｄ　Ｔ．　Ｙａｎｏ，　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ．　Ｔｅｃｈｎｏｌ．，　１４，　４７４　（１９９２）
【非特許文献３】
Ｉ．　Ｓａｔｏｈ，　“Ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ　ｏｆ　ｈｅａｖｙ　ｍｅｔａｌ　ｉｏｎｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｗｉｔｈ　ａｐｏｅｎｚｙｍｅｓ”，　Ｉｎ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　ｅｄｓ．，　Ｂ．　Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ　ａｎｄ　Ｌ．　Ｂ▲ｕ▼ｌｏｗ，　１５Ｂ，　Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，　ＣＴ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．　ＪＡＩ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，　１９９６，　ｐｐ．　４６１−４７１．
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
従来の方法は、金属酵素中の金属を除去するため、キレート剤や変性剤の添加といった、薬剤の作用を用いていた。しかしながら、キレート剤等の薬剤の添加により金属酵素から金属を完全に除去するには、所定の濃度の薬剤を含有する溶液を調製する必要がある。
【００１４】
また、薬剤の添加により失活した金属酵素の活性を回復させるには、キレート剤等が含まれない溶液に置換してから金属酵素に金属を付与する必要があり、溶液の調製や置換の時間を要するだけでなく、操作が煩雑となる。また、薬剤を含有する溶液の調製量が多い場合や、溶液中の薬剤が高濃度である場合には、薬剤が環境に負荷をかける問題もある。
【００１５】
必要に応じて特定の酵素反応が起こり、不要なときは酵素が不活性化するような酵素はモレキュラースイッチとして利用できる。特に、そのような用途に用いる酵素では酵素活性を可逆的に変化させる必要がある。
【００１６】
例えば、タンパク質の断片化に利用されるサーモリシン等の各種の金属酵素では、配位している金属の有無によって活性が制御されることが知られている。そのような金属酵素から金属を可逆的に除去し、酵素活性を制御したい場合、添加量によってはタンパク質が不可逆的に変性する変性剤の使用は好ましくない。
【００１７】
また、前述したように、試料中の微量の金属を分析する方法としては、原子吸光分析や高周波誘導結合プラズマ発光分析が挙げられるが、これらの方法は大型で高価な機器や、機器の高額な維持費を必要とする。したがって、目的とする金属を従来よりも簡便、迅速かつ安価に計測できる方法が望まれている。
【００１８】
本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、したがって本発明は、簡便で安価、かつ安全性に優れた方法で酵素活性を精度よく制御できる酵素活性の制御方法と、それを利用したモレキュラースイッチを提供することを目的とする。
また、本発明は、酵素反応を利用して簡便、迅速かつ安価に金属を検出できる金属の計測方法と計測装置を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するため、本発明の酵素活性の制御方法は、金属酵素において酵素活性の発現に必須な金属を前記金属酵素から電気化学的に脱離させ、前記酵素活性を消失または減少させる工程を有することを特徴とする。本発明の酵素活性の制御方法は、好適には、前記酵素活性が消失または減少した前記金属酵素に、前記金属を付与して前記酵素活性を回復させる工程をさらに有する。
【００２０】
上記の目的を達成するため、本発明のモレキュラースイッチは、金属酵素において酵素活性の発現に必須な金属を前記金属酵素から電気化学的に脱離させ、前記酵素活性を消失または減少させたときにオフとなり、前記酵素活性が消失または減少した前記金属酵素に、前記金属を付与して前記酵素活性を回復させたときにオンとなることを特徴とする。
これにより、簡便で安価、かつ安全性に優れた方法で酵素活性を精度よく制御することが可能となり、モレキュラースイッチとして利用できる。
【００２１】
上記の目的を達成するため、本発明の金属の計測方法は、金属酵素において酵素活性の発現に必須な金属を前記金属酵素から電気化学的に脱離させ、前記酵素活性を消失または減少させる工程と、前記酵素活性が消失または減少した前記金属酵素に試料を供給する工程と、前記試料の供給により回復した酵素活性を指標として、前記試料中の前記金属の量を計測する工程とを有することを特徴とする。
【００２２】
また、上記の目的を達成するため、本発明の金属の計測装置は、金属酵素が固定された担体と、該担体が充填されたカラムと、該カラムに通液させる通液手段と、前記カラムに定電流または定電位を印加し、前記金属酵素において酵素活性の発現に必須な金属を前記金属酵素から電気化学的に脱離させ、前記酵素活性を消失または減少させる印加手段と、前記カラムに前記金属酵素の基質を供給する基質供給手段と、前記カラムに試料を供給する試料供給手段と、前記試料中に含まれる前記金属の量に応じて回復した前記金属酵素の前記酵素活性により、前記基質から生成した生成物を検出する検出手段とを有することを特徴とする。
これにより、酵素反応およびその制御を利用して簡便、迅速かつ安価に金属を検出することが可能となる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の酵素活性の制御方法、モレキュラースイッチ、金属の計測方法および金属の計測装置の実施の形態について、図面を参照して説明する。
【００２４】
本発明で酵素活性が制御され、金属の計測に利用できる金属酵素には、亜鉛を補因子とするアルカリホスファターゼや、サーモリシン、カルボキシペプチダーゼ等が含まれる。また、本発明を適用できる金属酵素には、亜鉛のみならず銅を補因子とするアスコルビン酸オキシダーゼや、ガラクトースオキシダーゼ、ラッカーゼ等、あるいはコバルト等を補因子とする酵素も含まれる。
【００２５】
また、アミラーゼのようにカルシウムを補因子とする酵素であっても、カルシウムの替わりに金属が結合したときにも活性を示すことが知られている酵素については、上記の金属酵素と同様に本発明を適用できる。金属酵素の補因子には様々な種類の金属があるが、本発明を用いれば、これらの金属酵素から補因子を除去することができる。
【００２６】
本発明は従来使われてきたキレート剤、変性剤のような化学処理剤に代えて金属酵素を含む系を電場内におくことで、金属を除去しづらい金属酵素からより容易に金属を除去できる。特に、タンパク質は一般に高次構造をとっており、金属が酵素内部にあるようなものについては、化学処理よりも有効に金属を除去できる場合がある。
【００２７】
化学的処理によれば、キレート剤の立体構造や大きさが問題となり、タンパク質内部に埋まっている金属部分にキレート剤が接近できなかったり、キレート剤が接近しても金属錯体を形成するのが困難だったりする可能性がある。
【００２８】
それに対し、電気化学的方法によれば、単に電場を印加するのみであり、キレート剤等よりも明らかに小さい金属イオンを、タンパク質の金属結合部位から立体的障害を起こさずに引き抜くことが可能である。
【００２９】
本発明における酵素の状態は、溶解してあっても、懸濁された状態であっても、固形の支持体に担持させた状態であってもよく、本発明を適用することができる。いずれの場合においても、金属から脱離した金属イオンは半透膜、フィルターまたはカラム等を用いることによって、酵素から分離させることができる。
【００３０】
溶解した酵素や固定化した酵素に加える電流や電圧は酵素が不可逆的に変性しない範囲内で有効であり、タンパク質電気泳動用や、電気化学計測用の定電流・定電圧装置で容易に行うことができる。印加する電場は電流にしておよそ１００μＡ
〜１０　Ａであり、電圧にして１　ｍＶ　〜１０００　Ｖ位である。
【００３１】
但し、この電流または電圧は実質的に酵素に印加される値ではなく、系全体に印加される。溶液の組成や気泡等の影響により、系全体の抵抗は増加する。印加する電流または電圧は、金属酵素の金属結合部位の微細環境や、溶液の導電率等を考慮して決定する。
【００３２】
本発明では、種々の固定化方法による酵素に適用可能である。酵素を担体に固定化する方法としては、グルタルアルデヒド等を利用する架橋法、ヒドロキシアパタイト等を利用する物理的吸着法、イオン交換樹脂等を利用するイオン結合法、ジアゾニウム塩等を利用する共有結合法、アルギン酸や膜等を利用した包括法等、一般的に固定化法として知られている方法ならばいずれも利用できる。
【００３３】
本発明にかかる酵素の固定化担体には、微細孔性ガラス粒子を用いることができる。この粒子の大きさは１００　μｍ　〜数ｍｍ位で有効であり、孔の大きさは約１０　ｎｍ　〜２００　ｎｍである。
【００３４】
また、担体にはガラス以外にも、酵素の固定化に用いることのできる白金や金等で作製した電極、寒天、逆ミセル等を利用できる。白金や金等を用いる場合、白金黒や金黒を用いたり、白金表面を化学修飾して化学結合で酵素を固定化したりすることが可能である。
【００３５】
本発明では、金属酵素から金属イオンを除去した系に、再び金属イオン含有液を添加することによって酵素活性を回復させることが可能である。金属酵素の活性を回復させる金属は原則として、その金属酵素が本来、補因子とする金属であるが、はじめに含まれていた金属に限定されない。
【００３６】
具体的には、アルカリホスファターゼについては本来の補因子である亜鉛の代わりにコバルトを添加しても酵素活性の回復が可能であり、アミラーゼではカルシウムやストロンチウム等の添加により活性の回復が可能である。
【００３７】
本発明では、金属酵素からの金属の除去と、金属が除去された金属酵素への金属の付与により、酵素活性を制御できる。酵素活性の制御は、金属の付与の有無、あるいは付与する金属の濃度の調節によって行う。逆に、活性を有した状態から電気化学的手法によって活性を消失させることもできる。この制御によって、本発明をモレキュラースイッチとして用いることができる。
【００３８】
モレキュラースイッチとは、一分子でスイッチの役割を担うことを指し、本発明での分子は、酵素を指す。酵素活性を有した状態をスイッチがオンの状態、活性がない時をオフの状態とする。当該金属酵素に電位を印加して金属が脱離すると、活性がなくなったオフの状態となる。オフの状態の金属酵素に適量の金属を添加することによって活性が回復し、オンの状態にできる。
【００３９】
本発明により、活性中心に亜鉛を持つプロテアーゼである、サーモリシンの固定化物を上記のモレキュラースイッチとして利用することができる。サーモリシンは、タンパク質の配列をプロテインシークエンサーにより決定する際、しばしば用いられる酵素である。本酵素はタンパク質を断片化するために用いられるが、本発明を適用して当該酵素の活性をオン・オフすることにより、タンパク質の断片化を行ったり行わなかったりすることが可能である。
【００４０】
本発明によれば、活性中心に亜鉛を持つアルカリホスファターゼの固定化物を、上記のようなモレキュラースイッチとして利用することもできる。亜鉛の除去により活性が消失したアルカリホスファターゼは、亜鉛の添加によって酵素活性が回復し、回復する酵素活性は亜鉛の存在量に依存する。
【００４１】
固定化したアルカリホスファターゼは、例えば、動物細胞あるいは植物細胞のプロトプラスト内から細胞（またはプロトプラスト）外への亜鉛イオンの移動または漏出の検知に利用できる。これは、細胞融合の成否の確認に適用できる。
【００４２】
細胞融合において、予め細胞内に取り込ませておいた亜鉛イオンが、細胞の破壊により漏出すると、アルカリホスファターゼの固定化物に取り込まれ、スイッチがオンの状態となる。スイッチがオンの状態のアルカリホスファターゼに、基質であるｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＮＰＰ）を添加すると、酵素反応によりｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌが生成する。
【００４３】
ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌの生成に伴い、波長４０５ｎｍにおける吸光度が増大するため、この吸光度を指標として生成物を検出できる。このような生成物の検出を通して、亜鉛の細胞外への移動を容易に認めることができる。つまり、標識化剤としての亜鉛イオンの検知により、細胞融合の成否が確認できる。
【００４４】
本発明にかかる酵素活性を指標とすることにより、金属濃度を計測することが可能となる。金属濃度の計測に適用可能な酵素は、前述したアルカリホスファターゼ、サーモリシン、カルボキシペプチダーゼ等であり、これらに限定されない。測定対象となる金属は、前述したように、当該金属酵素の活性を発現するものであるなら、何れのものでも適用可能である。
【００４５】
金属の計測を行う際には、目的金属を選択できるイオノフォア膜等と組み合わせることによって、より選択的な計測が可能となる。また、酵素を選ぶことによって同一金属の検出であっても、その感度及び精度を変化させることが可能となる。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明を具体的な事例によって詳細に説明するが、本発明の実施例はこれに限定されない。
（１）　金属酵素の固定化方法
金属酵素としては、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ；　ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ｍｏｎｏｅｓｔｅｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ，　ＥＣ　３．１．３．１，　エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来；旭化成株式会社製）を用いた。
【００４７】
固定化担体には微細孔性ガラス（Ｃ．Ｐ．Ｇ．；孔径２４．２　ｎｍ、粒子径１２０−２００メッシュ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ社製）を３　ｇ　秤量し、ｐＨ　３．４５　に調整した１０　％　γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（γ−ＡＰＴＥＳ）を加えて７５　℃で３時間反応させることにより、ガラスのアルキルアミノ化を行った。その１．０　ｇに１０　ｍＭ　リン酸塩緩衝液（ｐＨ　７．０）により調製した２．５　％　グルタルアルデヒド溶液を加えてアルデヒド化した後、乾燥させ、上記緩衝液にて１０　ｍｇ／ｍｌ　に調製したアルカリホスファターゼ溶液を加えて固定化を行った。この固定化物を還元剤（ＮａＢＨ４）で処理した。
【００４８】
固定化後還元された酵素は微小カラムに充填し、カラムを恒温に保つためのウォータージャケット内にセットした。以下、これを固定化酵素カラムユニットと呼ぶこととする。図１は固定化酵素カラムユニットと、それに定電流・定電位を印加する装置を示す構成図である。
【００４９】
図１に示すように、タイゴンチューブ１によって白金管２とテフロンチューブ３（「テフロン」はデュポン社の登録商標）またはフレア付きテフロンチューブ３ａが連結されている。フレア付きテフロンチューブ３ａはネジ４とワッシャー５によってウォータージャケットのキャップ６に埋め込まれる。ウォータージャケット７は、フィルター８に挟まれた固定化酵素粒子充填層９を被覆している。固定化酵素粒子充填層９は、酵素が固定化されたガラス粒子を充填した層である。ウォータージャケットのキャップ６はパッキン１０を用いて密封される。
【００５０】
ウォータージャケット７には恒温水出口１１と恒温水入り口１２を介して恒温が循環し、これによって固定化酵素粒子充填層９内が恒温に保たれる。ウォータージャケットのキャップ１３は固定化酵素用カラム１４の上流側のキャップであり、下流側と同様にパッキン１０を用いて密封される。また、キャップ１３は固定化酵素用カラム１４の下流側と同様に、ネジ４およびワッシャー５を用いてテフロンチューブ３、フレア付きテフロンチューブ３ａ等に接続されている。
【００５１】
固定化酵素用カラム１４内の固定化酵素粒子充填層９にはキャリヤー入り口１５からキャリヤーが供給され、キャリヤーはキャリヤー出口１６から排出される。定電流・定電位印加装置１７は固定化酵素用カラム１４内の上流側と下流側にそれぞれ設けられた白金管２に接続される。これにより、固定化酵素に定電流または定電位が印加される。
【００５２】
（２）ＦＩＡ　（Ｆｌｏｗ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）システム
図２は本実施例のＦＩＡシステムの構成図である。図２に示すように、ＦＩＡシステムはタンク内のキャリヤーＣ、送液用ポンプＰ、脈流を防ぐためのダンパーＤａ、試料注入用ループ付ロータリーバルブ（金属注入用バルブＭＶおよび基質注入用バルブＳＶ）、固定化酵素カラムユニットＩＥ、定電流・定電位印加装置ＰＧ、検出計Ｄ（紫外・可視分光検出器）、記録計Ｒより構成されている。
【００５３】
キャリヤーＣには１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）を用い、キャリヤーＣの送液（１．０　ｍｌ／ｍｉｎ）にはプランジャーポンプＰを用いた。ＦＩＡシステムは２つのループ付ロータリーバルブを経由しており、これらのロータリーバルブは酵素の補因子（金属）注入用バルブＭＶと酵素基質注入用バルブＳＶである。
【００５４】
これらのバルブから注入された試料は、キャリヤーＣと共に固定化酵素カラムユニットＩＥに達する。固定化酵素カラムユニットＩＥはウォータージャケット（図１参照）によって３０℃に保たれており、試料は固定化酵素カラムユニットＩＥで触媒作用を受ける。
【００５５】
カラムユニットＩＥ内を通過したキャリヤーＣは、紫外・可視分光検出器Ｄ内に設置されたフローセルに導入される。紫外・可視分光検出器Ｄにより特定波長（４０５　ｎｍ）における吸光度変化が連続的にモニタリングされ、記録計Ｒに記録される。
【００５６】
（３）試薬の調製
酵素活性の測定用キャリヤーは、１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に、ＮａＣｌおよびクエン酸がそれぞれ１．０　Ｍ，　０．１　μＭになるように溶解されており、かつｐＨ　が８．０に調整されたものを用いた。補因子の電気的除去用キャリヤーには、０．１　Ｍのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ　４．５）を用いた。また、酵素の基質には２．０　ｍＭ　ＰＮＰＰ　（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，　シグマ社製）を用いた。調製の際は、キャリヤーを用いて希釈した。比較用のキレート剤には、１００　ｍＭ　ＰＤＣ　（２，６−ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）を用いた。また、補因子の検量線作成には、亜鉛標準液（原子吸光分析用）を種々の濃度に希釈して用いた。
【００５７】
（４）アルカリホスファターゼカラムの活性測定
（２）に記載したＦＩＡシステムを用いて、アルカリホスファターゼが固定化されたカラムの活性を測定した。酵素活性の測定用キャリヤーを用い、流速１．０　ｍｌ／ｍｉｎでキャリヤーが流れていることを確認した後、基質注入用バルブより２．０　ｍＭＰＮＰＰを１００　μｌ注入した。この基質の触媒反応に伴う吸光度変化を計測した。この操作を１０回行い、再現性を求めた。１０回の吸光度の平均値は１．６５であり、相対標準偏差は０．１０　％　であった。このことから、本計測システムは非常に再現性が高いことが示された。
【００５８】
また、種々の濃度の基質を注入した際の吸光度変化も同様にして測定した。種々の濃度（０．０６２５，　０．１２５，　０．２５，　０．５，　１．０，　２．０ｍＭ）の基質を注入した結果、基質の濃度が高くなるに従い、吸光度は大きくなった。基質濃度が０．５　ｍＭまでは、濃度と吸光度に比例関係が得られ、定量的に反応していることが示された。
【００５９】
（実施例１）
固定化酵素カラムからアルカリホスファターゼの補因子である亜鉛（ＩＩ）イオンを、以下のような電気化学的方法によって除去した。
まず、活性測定用のキャリヤーで通液し、酵素活性を確認した後、補因子の電気化学的除去用キャリヤー（ｐＨ　４．５）に切り替え、１０分間通液した後、図２に示すシステムによって、通液を行いながら固定化酵素カラムユニットの上下に設置した白金管に電流を印加した。印加電流は定電流装置により２．０　ｍＡとし、印加時間は１時間とした。
【００６０】
その後、再度酵素活性用キャリヤーに戻し、２．０　ｍＭ　ＰＮＰＰを注入して酵素活性を計測した。その結果、図３に示すように、電流印加前に１．６４９の吸光度ΔＡを有していた活性が、印加後には０．０１７まで低下した。この値は、固定化酵素カラムを通さず、基質のみを注入した場合とほぼ同様の値であったことから、電流印加により酵素活性を消失させ、活性を制御できることが示された。
【００６１】
電流印加の時間は、１ミリ秒から１時間の範囲で行ったが、５分間でも１時間の場合と同様の結果を得ることが出来た。また、数秒間の印加においても、有意な酵素活性の低下が確認された。
【００６２】
アルカリホスファターゼカラムに電流を印加した際に酵素から除去され、カラム外に流出した亜鉛イオンを、ＩＣＰ−ＡＥＳ（高周波誘導結合プラズマ発光分析）により定量した。電流の印加は、上記の酵素活性の測定（図３に結果を示す測定）を行った場合と同様の条件で行い、電流印加時間を５分間とした。
【００６３】
本実施形態のカラムで酵素から亜鉛を除去し、亜鉛をカラム外に流出させるには５分間で十分であるが、電流印加前後に余裕をもたせ、電流を印加した５分間と電流印加の前後各１分間にカラムから流出した溶液を採取した。
【００６４】
採取した溶液について、シークエンシャル型プラズマ発光分析装置（ＩＣＰＳ−７０００，　島津製作所）を用いて亜鉛を定量した。亜鉛の定量では、亜鉛の吸光波長である２１３．８５６　ｎｍの発光強度を検量線法により比較した。
【００６５】
上記の実施例１で亜鉛を計測した結果を図４に示す。ここで、推定されたアルカリホスファターゼカラム中の亜鉛含有量は３．５８７　μｇであった。また、アルカリホスファターゼカラム中の理論亜鉛含有量は、３．６６　μｇと実験で得られた値とほぼ同程度であった。ここで、アルカリホスファターゼカラム中の理論亜鉛含有量は、担体に固定化された酵素量と、カラムへの担体の充填量と、アルカリホスファターゼの亜鉛含有量を用いて算出した。以上のことから、電流を印加することにより、亜鉛をアルカリホスファターゼから脱離させ得ることが示された。
【００６６】
（比較例１）
図５は、上記の実施例１において、補因子除去用キャリヤーを１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に変更した場合に得られた結果である。比較例１では、ｐＨ　８．０のキャリヤーにおいて電流を印加した後、そのまま同じキャリヤーを通液しながら酵素活性を測定した。図３と図５を比較すると明らかなように、比較例１では酵素活性に全く変化が現れず、補因子である亜鉛が取り除けていないことが示された。
【００６７】
実施例１で用いた補因子除去用キャリヤーのｐＨ　４．５は、アルカリホスファターゼの等電点であり、比較例１で用いた補因子除去用キャリヤーのｐＨ　８．０は、アルカリホスファターゼの至適ｐＨである。以上から、本発明の方法において補因子の除去に用いるキャリヤーは、当該酵素の等電点であるｐＨに調整することが好ましいと言える。
【００６８】
（実施例２）
実施例１と同様の手順に従い、アルカリホスファターゼ中の亜鉛を電気的に脱離させ、酵素活性を測定した。その後、図２に示した金属注入用バルブより、種々の濃度の亜鉛溶液を注入して酵素活性の測定を行った。
【００６９】
１．０　ｎＭから１．０　ｍＭの亜鉛溶液を注入して検量線を作成したところ、図６に示すような結果を得た。すなわち、固定化されたアルカリホスファターゼから電気化学的に亜鉛を脱離した後、適当な亜鉛溶液を添加することにより、目的の酵素活性を発現させることが出来た。
【００７０】
以上のように、本実施例のシステムによれば、アルカリホスファターゼ活性を制御できることが示された。また、亜鉛濃度と酵素活性との関係を示す検量線を作成した後、未知試料を注入して酵素活性を測定し、検量線と比較すれば、未知試料中の亜鉛濃度を定量できることが示された。すなわち、本実施例の装置はバイオセンシングシステムとして使用できる。
【００７１】
（実施例３）
金属酵素として実施例１、２と同様にアルカリホスファターゼを用い、補因子である亜鉛をアルカリホスファターゼから電気化学的に除去した後、様々な二価金属溶液を添加して酵素活性を測定した。
【００７２】
具体的には、アルカリホスファターゼから電気化学的に亜鉛を脱離させた後、二価のコバルト、カルシウム、銅、マグネシウム、ニッケル、マンガン、鉛、鉄、カドミウム溶液をいずれも１．０　ｍＭの濃度で別々に注入して、酵素活性を測定した。金属イオンはそれぞれキャリヤーにより目的濃度になるように希釈した。
【００７３】
図７に示すように、亜鉛およびコバルトにおいて有意な活性の回復が観察された。亜鉛については、図３を参照するとわかるように、金属酵素から亜鉛を除去する前とほぼ同じレベルに酵素活性が回復する。マグネシウムとマンガンにおいても活性の回復が見られたが、その回復は僅かであった。コバルト溶液の濃度を亜鉛同様より詳細にして測定することにより、亜鉛のみならず、コバルトの計測にも適用可能であることが示唆された。
【００７４】
上記の本発明の実施形態の酵素活性の制御方法およびモレキュラースイッチによれば、金属酵素中の補因子を電気化学的に脱離させることにより、当該金属酵素の活性を制御することが可能となる。また、環境に負荷をかけるキレート剤等を用いる必要がなく、安全性が高い。補因子の脱離および付与は可逆的に行うことが可能であり、様々な分野での応用が期待される。
【００７５】
また、上記の本発明の実施形態の金属の計測方法および金属の計測装置によれば、本発明の制御方法により制御された酵素活性を指標として、溶液中の金属濃度を測定することが可能となる。現在の分析方法では、微量の金属の定量に大掛かりな測定装置が必要とされており、本発明の方法または装置を適用すれば、そのような装置自体あるいは装置の維持・使用に要するコスト等を削減できる。
【００７６】
本発明の酵素活性の制御方法、モレキュラースイッチ、金属の計測方法および金属の計測装置の実施形態は、上記の説明に限定されない。例えば、図２のシステムでは金属注入用バルブＭＶが基質注入用バルブＳＶの上流側に配置されているが、これらを入れ替えて基質注入用バルブＳＶを上流側に配置してもよい。また、ウォータージャケット内を循環させる液体の温度は、固定化させる酵素の至適温度等に応じて適宜変更することができる。その他、本発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の変更が可能である。
【００７７】
【発明の効果】
本発明の酵素活性の制御方法およびモレキュラースイッチによれば、簡便で安価、かつ安全性に優れた方法で酵素活性を精度よく制御することが可能となる。また、本発明の金属の計測方法および金属の計測装置によれば、酵素反応を利用して簡便、迅速かつ安価に金属を検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の実施形態に係る固定化酵素カラムユニットと、それに電流を印加する装置を示す構成図である。
【図２】図２は本発明の実施形態に係る固定化酵素カラムユニットをフローシステムに導入したブロック図である。
【図３】図３は本発明の実施例１に係り、電流印加前後の固定化酵素カラムの活性を評価した図である。
【図４】図４は本発明の実施例１に係る固定化酵素カラムから脱離した亜鉛量をＩＣＰ−ＡＥＭにより測定した結果を示す図である。
【図５】図５は比較例１に係り、電流印加前後の固定化酵素カラムの活性を評価した図である。
【図６】図６は本発明の実施例２に係り、種々の濃度の亜鉛溶液を添加した際の固定化酵素カラムの活性を示す図である。
【図７】図７は本発明の実施例３に係り、種々の金属溶液を添加した際の固定化酵素カラムの活性を示す図である。
【符号の説明】
１…タイゴンチューブ、２…白金管、３…テフロンチューブ、３ａ…フレア付きテフロンチューブ、４…ネジ、５…ワッシャー、６…ウォータージャケットのキャップ、７…ウォータージャケット、８…フィルター、９…固定化酵素粒子充填層、１０…パッキン、１１…恒温水出口、１２…恒温水入り口、１３…ウォータージャケットのキャップ、１４…固定化酵素用カラム、１５…キャリヤー入り口、１６…キャリヤー出口、１７…定電流・定電位印加装置、Ｃ…キャリヤー、Ｐ…通液ポンプ、Ｄａ…ダンパー、ＭＶ…金属注入用バルブ、ＳＶ…基質注入用バルブ、ＩＥ…固定化酵素カラム、ＰＧ…定電流・定電位印加装置、Ｒ…記録計、Ｄ…検出計、Ｗ…排出液。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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