(57)【要約】【課題】従来の抽出方法におけるような酵素消化過程に於ける適正作用ＰＨの調整、消化完了後の塩酸の除去およびプラセンタエキスとしてのＰＨの最終補正など、処理の繁雑さを解消するプラセンタエキスの製造方法を提供する。【解決手段】特定の耐熱性中性タン白質分解酵素を使用することにより、酵素消化過程における煩雑さ、すなわち、酵素消化過捏に於ける適正作用ＰＨの調整、消化完了後の塩酸の除去およびプラセンタエキスとしてのＰＨの最終補正などの処理の繁雑さを簡素化することが可能となり、また有効な消化ができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常分娩ヒトまたはブタ胎盤を、プロテアーゼーＳ、パパインＷ−４０、プロテアーゼーＮまたはプロテアーゼーＰより選ばれる耐熱性中性タン白質分解酵素を使用して酵素消化することを特徴とするプラセンタエキスの製造方法。
【請求項２】
プロテアーゼーＳ、パパインＷ−４０、プロテアーゼーＮまたはプロテアーゼーＰより選ばれる複数種のタン白質分解酵素を使用して酵素消化することを特徴とする請求項１に記載のプラセンタエキスの製造方法。
【請求項３】
酵素消化を撹拌下、温度２５〜６５℃で行うことを特徴とする請求項１に記載のプラセンタエキスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はプラセンタエキスの製造方法に関し、詳しくは、ヒトまたはブタの正常分娩胎盤の耐熱性中性タン白質分解酵素消化によるプラセンタエキスの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に哺乳動物の胎盤の生理機能は母体内での胎児の発育のための酸素の供給と栄養補給である。母体と胎児の循環系は栄養芽細胞層を介して完全に分離されている。過去１０数年間に神経成長因子や肝細胞成長因子などの栄養因子が医学領域で注目され、これらの既知栄養因子のほとんどが胎盤栄養芽細胞で作り出されていることがわかった。
【０００３】
プラセンタエキスは胎盤組織内に含まれているあらゆる成分が含まれるよう抽出されたもので、その生物活性は単一物質によるものでなく、各種の成分が多様に作用し、結合織増殖作用、抗老化作用、抗慢性潰瘍作用のほか、神経症状を主とする疾患、婦人科的疾患、皮フ科的疾患などに対する医療効果が既に人胎盤抽出エキスの注射薬などにより明らかとなっている。また、近年、これらの生物活性の中心となっているのは胎盤の栄養芽細胞が作り出す数々の栄養因子であることが明らかになりつつある。
【０００４】
プラセンタエキスの望ましい有効成分としては、ヌクレオチド・ヌクレオシド、
遊離のアルギニンおよびアルギニンを含むペプチド、ステロイドホルモンの中間代謝物・特にＣ−２１ステロイドおよびＣ−１９ステロイド、ムコ多糖（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸）、イノシトールおよびイノシトールリン脂質などが注目される。
【０００５】
我が国において、投与剤プラセンタエキスとしては、満期正常分娩の人胎盤の塩酸による加熱加水分解液、及びペプシン消化液と残渣の塩酸加水分解液とを配合した薬品名「ラエンネック」の２種類がある。いずれの製造法も１９５０〜１９６０年代に開発されたもので、「ラエンネック」は１９５８年、適応症「肝硬変症」で厚生省（貌厚生労働省）より製造承認を受け、１９８４年、適応症拡大により「慢性肝疾患における肝機能の改善」の薬効再評価が公示された。
【０００６】
プラセンタエキスは、具体的には、通常以下の手順で製造されている。
まず、ヒトまたはブタの正常分娩胎盤を２〜４℃で約４日間冷蔵し、洗浄、細挫してアセトンを加えてホモゲナイズし、脱脂、乾燥する。乾燥物を塩酸酸性（ｐＨ２．０）にし、ペプシンで一昼夜消化し、遠心分離して消化液を採取する。沈殿物は塩酸（５Ｎ）を加えて加熱し、加水分解する。加水分解液は活性炭で脱色し、濾過し、ペプシン消化液と混ぜ、陰イオン交換樹脂で塩酸を可及的に除去し、苛性ソーダーを用いてＰＨ６．１〜６．４に補正し、プラセンタエキスとする。
【０００７】
このプラセンタエキスはニンヒドリン試液で紫色、ビューレット反応で赤紫色〜青紫色に呈色する。有効成分の相対的含有量は窒素定量法（ケルダール法）で行い０．３０〜０．３５ｗ／ｖ％、強熱残分は１．０％以下である。
【０００８】
また、別の方法では、検疫された妊娠３ケ月の健常ブタの新鮮胎盤を熱処理や化学処理を行うことなく、低温下で凍結、浸漬をくり返して、細胞組織を破砕し、そのプロトプラズマを抽出し、除タン白、限外漏過して調製しプラセンタリキッドとする。このプラセンタリキッドは１００ｍｌあたりアルカリ性ホスフアターゼ含量が１．００キング・アームストロング単位である。（アルカリ性ホスフアターゼを含む溶液１００ｍｌあたり、酵素反応で１５分間に遊離するフェノールが１ｍｇのときアルカリ性ホスフアターゼの力価が１キングアームストロング単位（１ＫＡＵ）である。）
【０００９】
プラセンタリキッドはニンヒドリン試液で紫色、ビューレット反応で赤紫色〜青紫色に呈色する。有効成分の相対的含有量は窒素定量法（ケルダール法）で行い０．３０〜０．３５ｗ／ｖ％、強熱残分は１．０％以下である。
【００１０】
しかしながら、塩酸による加熱加水分解では、ヌクレチド・ヌクレオシドは核酸塩基にまで加水分解され、ムコ多糖の構成糖、イノシトールリン脂質などはほとんどが分解されてしまい、大量の黒褐色物質が産出されて栄養因子の減損をまねいている。また、着色物質の除去には活性炭による脱色が必要となり、甚だ煩雑である。
【００１１】
塩酸酸性（ｐＨ２．０）、３７℃でのペプシン消化では、栄養因子の大部分は分解されてしまう。しかし、いずれの製造法においても、塩酸を用いるため、陰イオン交換樹脂による塩酸の可及的除去、苛性ソーダー液によるＰＨの適正な中性化を必要とする。さらに、胎盤の中に比較的大量に含まれる過酸化脂質や胎盤臭の除去に活性炭を用いているが、不十分であり、有効な栄養因子の減損の役割が大きい。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
上述のような従来の抽出方法におけるような酵素消化過程に於ける適正作用ＰＨの調整、消化完了後の塩酸の除去およびプラセンタエキスとしてのＰＨの最終補正など、処理の繁雑さを解消するプラセンタエキスの製造方法が望まれていた。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特定の耐熱性中性タン白質分解酵素を使用することにより、酵素消化過程における煩雑さ、すなわち、酵素消化過捏に於ける適正作用ＰＨの調整、消化完了後の塩酸の除去およびプラセンタエキスとしてのＰＨの最終補正などの処理の繁雑さを簡素化することが可能となり、また有効な消化ができることを見出した。
【００１４】
本発明は、正常分娩ヒトまたはブタ胎盤を、プロテアーゼーＳ、パパインＷ−４０、プロテアーゼーＮまたはプロテアーゼーＰより選ばれる耐熱性中性タン白質分解酵素を使用して酵素消化することを特徴とするプラセンタエキスの製造方法であり、
また、この際、プロテアーゼーＳ、パパインＷ−４０、プロテアーゼーＮまたはプロテアーゼーＰより選ばれる複数種の耐熱性中性タン白質分解酵素を使用して酵素消化することを特徴とするプラセンタエキスの製造方法であり、
また、この酵素消化を撹拌下、温度２５〜６５℃で行うことを特徴とするプラセンタエキスの製造方法である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
ヒトまたはブタの正常分娩により娩出される胎盤を使用する。胎盤は、通常、変性、アポトーシス、懐死などの退行性変化を伴っており、血液を含む離漿および黒褐色血餅を水道水で洗浄しながら充分に除去する。好ましくは、羊膜を可及的に切除し、胎盤（臍帯を含む）を４〜５等分にカットし、水洗し、ポリエチレンの袋に入れて（乾操を防ぐため）、−１０〜−２０℃に凍結保存する。凍結期間１ケ月以内には製造工程に入る。
【００１６】
製造に際しては、解凍して、好ましくは、脱塩水で洗浄し、胎盤重量の（等量／２倍量）の脱塩水を加えながら、ミンチにかけて切り刻み、好ましくは１２０℃程度で、１５分間程度高圧滅菌してタン白質や細胞外マトリックスの高分子化合物の高次構造を破壊（褐色に変色し、ホモジナイズおよび酵素消化が容易になる）する。生の臍帯や羊膜、隔膜などはホモジナイズされ難い。
【００１７】
ホモジナイザーで粥状にし、タン白質分解酵素を加える。耐熱性中性タン白質分解酵素は、プロテアーゼーＳ、パパインＷ−４０、プロテアーゼーＮまたはプロテアーゼーＰより選ばれる。これらは、いずれもタン白分解酵素であり、いずれも中性領域で作用し、また耐熱性に優れる。パパインＷ−４０はパパイア果汁の乳汁から抽出されたものである。プロテアーゼーＳ、パパインＷ−４０、プロテアーゼーＮまたはプロテアーゼーＰは、いずれも天野エンザイム株式会社より市販されている。この添加量は胎盤の重量の０．０５〜０．１５％程度が好ましい。また、酵素消化は、プロテアーゼーＳ、パパインＷ−４０、プロテアーゼーＮまたはプロテアーゼーＰより選ばれる耐熱性中性タン白質分解酵素を複数種使用すると重複消化が可能となるので好ましい。
【００１８】
また、酵素消化を撹拌下、好ましくは温度２５〜６５℃で行うと、雑菌の混入・増殖を積極的に抑制することが出来るので好ましい。特に、この際、撹拌機付き・恒温ヒーター付きの酵素反応タンクを使用すると雑菌の混入・増殖を積極的に抑制することが出来るので好ましい。タン白質分解酵素を加え、好ましくは攪拌機・恒温ヒーター付酵素反応タンクにて好ましくは、１０〜２４時間、消化し液状化する。消化液のＰＨは８．０〜５．０で無調整で行う。
【００１９】
酵素消化に於ける温度条件は各酵素特性より好ましくは次を基本として設定する。
・高温耐熱性・中性タン白質分解酵素：プロテアーゼ−Ｓは、５５℃〜６５℃
・高温耐熱性・中性タン白質分解酵素：パパイン−Ｗ４０は、４５℃〜５０℃
・中温耐熱性・中性タン白質分解酵素：プロテアーゼ−Ｎは、３０℃〜５５℃
・低温・中性タン白質分解酵素：プロテアーゼーＰは２５℃〜４５℃
（但し、いずれの酵素も天野エンザイム株式会社製）
【００２０】
酵素消化の開始時には、防腐剤を加えることも好ましい。防腐剤としては、ヘキサノール／エタノール混合物（好ましくは１対１）が好ましく挙げられ、その添加量は、好ましくはホモジネイト容積の１〜０．１％の割合に加える。
【００２１】
酵素消化の進行と共に過酸化脂質や胎盤臭の成分はヘキサノールと共に垢状に液面に浮上する。浮上する垢状物質をヘキサノール層と一緒に布製の網で潰し取る。更に、好ましくは、へキサノール／エタノール混合液を加え、攪拌し、しばらく放置して同じ操作をもう一度、繰り返す。消化後、布製の網で濃過して羊膜、胎盤隔膜、血管などの未消化の破片を濾し取る。
【００２２】
濾液に防腐剤を加えて、高圧滅菌し、放冷し、濃縮した後、凍結乾燥（好ましくは水分３％以下）し、無菌状態で粉砕し、ハードカプセルに詰め、プラセンタエキス粉末製品とする。
【００２３】
また、酵素消化終了後の消化液にＬ−アルギニン、ニンニクエキスなどの栄養素を配合し、高圧滅菌（例えば１２０℃、１５分間）してもよい。
【００２４】
【実施例】
本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明する。
実施例１
（原料処理工程）
正常分娩ヒトまたはブタより娩出した胎盤を生のまま凍結し、７日〜１０日間静置した凍結胎盤および勝帯２，０００ｇは水道水で洗浄、解凍経過中に３〜５ｃｍにカットし、付着している血液、血餅などは棄て、直ちにホモゲナイザーで粥状にした。
【００２５】
（原料調整工程（１））
この粥状胎盤を高圧滅菌器で殺菌（１２０℃、１０〜１５分間）し、放冷（室温）し、遊離した液体部分に植物性、耐熱性タン白質分解酵素パパインＷ−４０（２．０グラム）を溶かし、再度ホモゲナイザーで均一化し、２，０００ｇの調整原料（１）を得た。
【００２６】
（酵素消化工程・調整工程・原料（２））
調整原料（１）を攪拌機・恒温ヒーター付酵素反応タンクに注入し、１０Ｎ苛性ソーダーにて水素イオン濃度ＰＨ７．０に調整し、ヘキサノール０．１ｍ１を加え、５０℃〜５５℃の恒温条件で２０時間、調整原料（１）の酵素消化を行った。消化液には防腐剤（パラべン）２ｇを加え、高圧滅菌器で殺菌（１２０℃、１０〜１５分間）し、放冷（室温）の後、濾布にて濾過し、一部の沈殿物を除き、１，９００ｇの調整原料（２）を得た。
【００２７】
（凍結乾燥工程）
調整原料（２）を濃縮エキス分１５％まで濃縮し、凍結乾燥（水分３％以下）し、無菌状態で粉砕し、ハードカプセルに詰めプラセンタエキス製品を得た。
実施例１により得たプラセンタエキスの製造実験成績は表１の如くである。
【００２８】
【表１】
2004097033.tif 000002
【００２９】
上記とパパイン−Ｗ４０を、プロテアーゼ−Ｓ、プロテアーゼ−Ｎ、プロテアーゼ−Ｐに変えた以外は同様にし、以下の成分調整工程によりプラセンタエキスを製造した。
【００３０】
（成分調整工程）
調整原料（２）は常温にて０．４５〜０．２０μｍセルロースアセテイトメンブランフィルターで濾過し、バラペン０．２％含有無菌水で成分量を調整し、１，８７４ｇ〜１，９０６ｇ（約１，８７４ｍｌ〜１，９０６ｍｌ）のプラセンタエキス液状製品を得た。
表２は、実施例１で得られたプラセンタエキス製品試験成績である。
【００３１】
【表２】
2004097033.tif 000003
【００３２】
プロテアーゼーＮにより製造したプラセンタエキス液状製品の性質は次の如くであった。
2004097033.tif 000004
【００３３】
また、凍結乾燥により製造したプラセンタエキス粉末の製品試験成績は次の如くである。
2004097033.tif 000005
【００３４】
実施例２
実施例１より、プロテアーゼ−Ｎ使用による収量ならびに窒素含量が良好であることがわかったので、製造量をスケールアップした状態で再テストした。
（原料処理工程）
正常分娩ヒトまたはブタより娩出した胎盤を生のまま凍結し、７日間静置した凍結胎盤および臍帯１０，０００ｇは水道水で洗浄、解凍経過中に３〜５ｃｍにカットし付着している血液、血餅などは棄て、直ちにホモゲナイザーで粥状にし、３℃、５日間冷蔵庫に保存した。
【００３５】
（原料調整工程・調整原料（１））
粥状胎盤は高圧滅菌器で殺菌（１２０℃、１０〜１５分間）し、放冷（室温）し、遊離した液体部分に中性タン白質分解酵素プロテアーゼーＮ　２．５ｇを溶解し、元に戻し、再度ホモゲナイザーで均一化し、１０，０００ｇの調整原料（１）を得た。
【００３６】
（酵素消化工程・調整原料（２））
調整原料（１）は、攪拌機・恒温ヒーター付き酵素反応タンクに注入し、１０Ｎ苛性ソーダーにて水素イオン濃度ｐＨ７．０に調整、へキサノール０．５ｍｌを加え、５５℃の恒温条件で２０時間、調整原料（１）の酵素消化を行った。
消化液には防腐剤（パラペン）１０ｇを加え、高圧滅菌器で殺菌（１２０℃、１０〜１５分間）し、放冷（室温）の後、ヤシガラ炭１００ｇを加え、遠心分離器により不溶沈殿物を除き同時に脱色し、９，５００ｇの調整原料（２）を得た。
【００３７】
（成分調整工程）
調整原料（２）は常温にて、０．４５μｍセルロースアセテイトメンブランフィルターで濾過し、さらに０．２０μｍセルロ←スアセテイトメンブランフィルターで濾過し、バラペン０．２％含有無菌水で成分量を調整し、９，５００ｇ（約９，５００ｍｌ）のプラセンタエキス液状製品を得た。
実施例２により得たプラセンタエキスの製品試験成績は表３の如くである。
【００３８】
【表３】
2004097033.tif 000006
【００３９】
またプラセンタエキスの性状は実施例１のプロテアーゼ−Ｎにより製造したプラセンタエキスの性状の範囲内であった。
【００４０】
実施例３
（２種類の酵素で重複消化法での製造例）
（原料処理工程）
正常分娩ヒトまたはブタより娩出した胎盤を生のまま凍結し、７日間静置した凍結胎盤および臍帯２，０００ｇは水道水で洗浄、解凍経過中に３〜５ｃｍにカットし、付着している血液、血餅などは棄て、直ちにホモゲナイザーで粥状にし、３℃、５日間冷蔵庫に保存した。
【００４１】
（原料調整工程・調整原料（１））
粥状胎鮭は高圧滅菌器で殺菌（１２０℃、１０〜１５分間）後、放冷し、遊離した液体部分に中性タン白質分解酵素はプロテアーゼーＳ、パパインーＷ４０、プロテアーゼーＮ、プロテアーゼーＰのいずれの場合も、０．５ｇを溶解し、元に戻し、再度ホモゲナイザーで均一化し、２，０００ｇの調整原料（１）を得た。
【００４２】
（酵素消化工程Ａ・調整原料（２））
調整原料（１）は、攪拌機・恒温ヒーター付き酵素反応タンクに注入し、１０Ｎ苛性ソーダーにて水素イオン濃度ｐＨ７．０に調整、へキサノール０．１ｍｌを加え、２５〜６５℃恒温朱件で１０時間、調整原料（１）の酵素消化を行って、調整原料（２）を得た。
【００４３】
（酵素消化工程Ｂ・調整原料（３））
酵素消化した調整原料（２）に、中性タン白質分解酵素を表４に記載した組み合わせで各酵素０．５ｇを一部の調整原料（２）に溶解し、元に戻し、十分攪拌の後、重複酵素消化を行った。
【００４４】
【表４】
2004097033.tif 000007
【００４５】
重複酵素消化は攪拌機・恒温ヒーター付き酵素反応タンクの適正反応温度を設定し、追加１０時間、調整原料（２）の酵素消化を行った。
消化終了液には防腐剤（バラペン）２．０ｇを加え、高圧滅菌器で殺菌（１２０℃、１．０〜１５分間）し、放冷（室温）の後、ヤシガラ炭（２０ｇ）を加え、遠心分離器により不溶沈殿物を除き同時に脱色し、２，０００ｇの調整原料（３）を得た。
【００４６】
（成分調整工程）
調整原料（３）は常温にて、ポアサイズ０．４５μｍセルロースアセテイトメンブランフィルターで濾過し、さらにポアサイズ０．２０μｍセルロースアセテイトメンブランフィルターで濾過し、パラペン０．２％含有無菌水で成分量を調整し、約１，８２０ｇ〜１，９００ｇ（約１，８２０ｍｌ〜１，９００ｍｌ）のプラセンタエキス液状製品を得た。
【００４７】
実施例３により得たプラセンタエキスの製造実験成績は表５の如くである。
但し、酵素組合せＮｏは表４による。
【００４８】
【表５】
2004097033.tif 000008
【００４９】
【発明の効果】
本発明によるプラセンタエキスは満期正常分娩のヒトまたはブタ胎盤を中性タン白質分解酵素による消化で液状化し加熱滅菌して調整したものであるので、酵素消化を受けたタン白質や加水分解された栄養成分と栄養芽細胞が作り出した栄養因子を１００％抽出したエキスである。
【００５０】
本発明の製造方法は、酵素消化過程に於けるＰＨ調節等の作業の繁雑さを簡素化できる。また、攪拌・恒温ヒーター付き酵素反応タンクの使用により、耐熱性中性タン白質分解酵素による消化が容易にできるのみならず、任意の反応条件の中性タン白質分解酵素の選択、複数の中性タン白質分解酵素による重複消化が可能となり、この事により雑菌の混入・増殖を積極的に抑制することができる。したがって、高収量の有効成分の抽出が低コストで行うことができる。
【００５１】
また、本発明によるプラセンタエキス粉末は医薬品として投与することが出来るだけでなく、種々の形態，例えば栄養補助食品（飲料も含む）の形で与えることも可能である。