(57)【要約】【課題】生理活性を有する新規な擬似糖鎖の創出を行うための糖鎖合成用プライマーを提供する。【解決手段】下記一般式（Ｉ）で表される擬似糖質。【化１】2004059536.tif 000086［式中、Ｌ１は窒素原子、イミノ基、酸素原子またはイオウ原子を示し、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎＣＨ３で示される基であり、この時ｎは、３〜２１の整数であり、Ｒ２は−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３から選択される基である。］；下記一般式（ＩＩ）で表される擬似糖質。【化２】2004059536.tif 000087［式中、Ｌ１及びＭ１は窒素原子、イミノ基、酸素原子またはイオウ原子を示し、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎＣＨ３で示される基であり、この時ｎは、３〜２１の整数であり、Ｒ２はそれぞれ独立に−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３から選択される基である。］【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される擬似糖質。
【化１】
2004059536.tif 000078
［式中、Ｌ１は窒素原子、イミノ基、酸素原子またはイオウ原子を示し、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎＣＨ３で示される基であり、この時ｎは、３〜２１の整数であり、Ｒ２は−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３から選択される基である。］
【請求項２】
前記一般式（Ｉ）で表される擬似糖質において、Ｌ１は酸素原子を示し、ｎは３〜１５の整数であることを特徴とする請求項１に記載の擬似糖質。
【請求項３】
下記一般式（Ｉａ）で表される擬似糖質。
【化２】
2004059536.tif 000079
［式中、Ｌ２は酸素原子を示し、ＸおよびＹは互いに異なり、各々、水素原子、またはＯＨ基を示し、Ｒ３は−（ＣＨ２）ｎＣＨ３で示される基であり、この時ｎは、３〜１５の整数であり、Ｒ２は−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３から選択される基である。］
【請求項４】
下記構造式（１）で表される擬似糖類、オクチル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド。
【化３】
2004059536.tif 000080
【請求項５】
下記構造式（２）で表される擬似糖類、ドデシル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド。
【化４】
2004059536.tif 000081
【請求項６】
下記構造式（３）で表される擬似糖類、ドデシル　２−アセトアミド−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド。
【化５】
2004059536.tif 000082
［式中、Ａｃはアセチル基を示す。］
【請求項７】
下記一般式（ＩＩ）で表される擬似糖質。
【化６】
2004059536.tif 000083
［式中、Ｌ１及びＭ１は窒素原子、イミノ基、酸素原子またはイオウ原子を示し、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎＣＨ３で示される基であり、この時ｎは、３〜２１の整数であり、Ｒ２はそれぞれ独立に−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３から選択される基である。］
【請求項８】
前記一般式（ＩＩ）で表される擬似糖質において、Ｌ１及びＭ１は酸素原子を示し、ｎは、３〜１５の整数であることを特徴とする請求項７に記載の擬似糖質。
【請求項９】
下記一般式（ＩＩａ）で表される擬似糖質。
【化７】
2004059536.tif 000084
［式中、Ｌ２及びＭ２は酸素原子を示し、ＸおよびＹは互いに異なり、各々、水素原子、またはＯＨ基を示し、Ｒ３は−（ＣＨ２）ｎＣＨ３で示される基であり、この時ｎは、３〜１５の整数であり、Ｒ２はそれぞれ独立に−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３から選択される基である。］
【請求項１０】
下記構造式（４）で表される擬似糖質、ドデシル　５ａ’−カルバ−β−Ｄ−ラクトシド。
【化８】
2004059536.tif 000085
【請求項１１】
請求項１に記載の式（Ｉ）または／および請求項７に記載の式（ＩＩ）で示される化合物を含む、糖鎖合成用プライマー。
【請求項１２】
請求項１１に記載の糖鎖合成用プライマーを糖付加能力を有する細胞に与え、細胞を培養し、培養物から糖鎖を分離採集することを特徴とする糖鎖の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の糖鎖合成用プライマーの、ウイルスまたは細菌毒素の中和剤、生体防御刺激剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗腫瘍転移剤、診断薬、細胞培養基材あるいは生体内薬物運搬体の製造のための使用。
【請求項１４】
請求項１または／および請求項７に記載の擬似糖質を有効成分として含有するグリコシダーゼ阻害剤またはグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤。
【請求項１５】
グルコシダーゼ阻害活性、ガラクトシダーゼ阻害活性、グルコセレブロシダーゼまたはガラクトセレブロシダーゼ阻害活性のうちの少なくともいずれかの活性を示す請求項１４に記載のグリコシダーゼ阻害剤。
【請求項１６】
請求項３に記載の式（Ｉａ）または／および請求項９に記載の式（ＩＩａ）で表される化合物を有効成分として含み、β−グルコシダーゼ阻害活性、β−ガラクトシダーゼ阻害活性、β−グルコセレブロシダーゼ阻害活性またはβ−ガラクトセレブロシダーゼ阻害活性のうちの少なくともいずれかの活性を示す、グリコシダーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖鎖生合成に使用しうる新規糖鎖合成用プライマーに関し、また新規なグリコシダーゼ阻害剤およびグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、細胞表面には種々の糖鎖が存在し、それらが多くの認識過程に関与していることが明らかになってきている。例えば、病原菌やウイルスの受容体として機能したり、リンパ球が炎症部位を認識する場合に重要な働きをしている糖鎖やガン細胞特異的に発現している糖鎖も報告されている。そのため、このような糖鎖を、病原菌の感染防止、病原菌が生産する毒素の中和、過剰な炎症反応の抑制、ガン転移の抑制などに応用する試みが多方面で検討されている（バイオサイエンスとインダストリー、６０巻、２３頁、２００２年）。
【０００３】
これら生体内糖鎖の機能研究、生理活性を有する新規糖鎖の開発研究のため、種々の糖鎖合成の方法が検討されている。糖鎖を得る方法としては、化学的に合成する方法、糖分解酵素による方法、糖転移酵素を用いる方法等がある。しかし、化学的に合成する方法では、任意の糖鎖を合成できるという利点もあるが、何段階もの工程が必要であり、収率が低いという欠点がある。分解酵素による方法では、酵素が比較的容易に入手でき、糖をブロックで転移することができるという利点があるものの、反応の選択性や収率に課題を残している。糖転移酵素を用いた方法では、目的とする構造の糖鎖を選択的に合成できるという利点があるが、酵素及びその基質として必要な糖ヌクレオチドが高価で、その入手が困難という欠点がある。
【０００４】
近年新たな糖鎖合成方法が提唱された。１９９７年Ｍｉｕｒａらは、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）がほとんど全てのスフィンゴ糖脂質の生合成中間体であること、ラクトースは糖脂質に特異的に存在することに注目し、ラクトース誘導体（ｎ−ドデシル　β−ラクトシド）を人為的に合成し、Ｂ１６メラノーマ細胞に添加した。その結果、この誘導体にシアル酸が付加し、Ｂ１６細胞が本来持つＧＭ３に相似した糖鎖構造を有する誘導体になり、且つ、細胞外に放出されることを発見した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．２４１巻、６９８頁、１９９７年）。また、中島らによって、ＰＣ１２細胞にラクトース誘導体を添加したところ、ガラクトースが付加し、Ｇｂ３と同様な糖鎖構造を有する誘導体となり、細胞外に放出されることを発見された（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２４巻、１４８頁、１９９８年）。これらの結果により、糖鎖プライマーの細胞内への導入を、糖鎖を合成する手段として利用する概念が生まれ、その後、糖鎖プライマーと細胞の組み合わせを変えることにより糖鎖ライブラリーを構築することを目的とし、「糖鎖のバイオコンビナトリアル合成」が提唱されるようになった。
【０００５】
この方法の利点は、細胞の生合成経路に従って糖鎖が伸長されるので、糖鎖プライマーを投与する細胞を任意に選択すれば手に入れたい糖鎖が自由に得られることである。また、化学合成法や酵素合成法で入手しにくい糖鎖も他の糖鎖を伸長させるのと同様に得ることができる。これまでの研究により、ラクトシド、ガラクトシド、グルコシド、Ｎ−アセチルグルコサミド、二糖型のＮ−アセチルラクトサミドについても様々な細胞で、その細胞に発現されている糖鎖生合成経路に従って糖鎖伸長されることが見出されており、「糖鎖ライブラリー」の構築が進んでいる。種々の細胞内の糖鎖合成を発現させうる糖鎖プライマーの新たな創出は、「糖鎖ライブラリー」の充実とともに、種々の生理活性を有する新規な糖鎖の創出が期待される。
また、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコセレブロシダーゼあるいはβ−ガラクトセレブロシダーゼ等のβ−グリコシダーゼに対する阻害剤は、抗ウイルス活性、神経機能改善作用、免疫アジュバント活性等を有すると期待されている（特開平８−４８６５８）。このような種々の生理活性を示す可能性の高い新規構造が望まれている。
【０００６】
本発明者等は、これまで、ヘキソース（六単糖）の環内酸素原子をメチレン基（−ＣＨ２−）で置き換えた擬似糖（カルバ糖、Ｃａｒｂａ　ｓｕｇａｒｓ）に着目し、糖加水分解酵素阻害、糖転移酵素阻害活性等を有する種々の生理活性物質を合成してきた。
【０００７】
カルバ糖を糖転移酵素の基質にし、糖鎖伸長させる試みも行われている。しかし、酵素法による糖鎖伸長は、前述のように、糖供与体として用いる任意の糖ヌクレオチドの合成は難しく、化学的に不安定で且つ高価であり、実用的方法ではなかった。また、カルバ糖を含むオリゴ糖鎖の化学合成も数多く行われているが、合成工程数が長く、収率が低いという欠点があり、これも実用的方法ではなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第一の目的は、「糖鎖ライブラリー」の充実とともに、種々の生理活性を有すると期待される新規な擬似糖鎖の創出を行うための糖鎖プライマーを提供することにある。また、種々の生理活性を示す可能性の高い新規構造が望まれており、この要望に合致する化合物を提供することが、本発明の第二の目的である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者等は、カルバ糖をプライマーとして用いて、「バイオコンビナトリアル合成」で糖鎖を伸長させることで、新たなカルバ糖を含むオリゴ糖を容易に得ることができるのではないかと考え鋭意研究を行なった。その結果、アルキル鎖をカルバ糖に結合させた化合物、あるいはアルキル鎖をカルバ糖を含むオリゴ糖鎖に結合させた化合物を糖鎖プライマーとしてある種の細胞に与えると、細胞がこれを取り込んで、カルバ糖またはオリゴ糖鎖の非還元末端に更に糖残基を付加（グリコシル化）し、付加生成物を細胞内に蓄積せずに細胞外に分泌すること、また、糖鎖プライマーを与える細胞の種類によって、付加される糖残基の種類が異なることを知見し、本発明を完成させた。
【００１０】
また、本発明を完成させる過程で、プライマーとして合成した、上記アルキル鎖をカルバ糖に結合させた化合物、あるいはアルキル鎖をカルバ糖を含むオリゴ糖鎖に結合させた化合物が、哺乳動物由来のβ−グリコシダーゼに対し、強い酵素阻害活性を有することを知見した。
【００１１】
本発明は上記のようにして完成された。本発明の要旨は、以下に記載のものであり、これにより上記課題を解決できる。
【００１２】
１）　下記一般式（Ｉ）で表される擬似糖質。
【００１３】
【化９】
2004059536.tif 000002
【００１４】
［式中、Ｌ１は窒素原子、イミノ基、酸素原子またはイオウ原子を示し、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎＣＨ３で示される基であり、この時ｎは、３〜２１の整数であり、Ｒ２は−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３から選択される基である。］
２）　前記一般式（Ｉ）で表される擬似糖質において、Ｌ１は酸素原子を示し、ｎは３〜１５の整数であることを特徴とする１）に記載の擬似糖質。
３）　下記一般式（Ｉａ）で表される擬似糖質。
【００１５】
【化１０】
2004059536.tif 000003
【００１６】
［式中、Ｌ２は酸素原子を示し、ＸおよびＹは互いに異なり、各々、水素原子、またはＯＨ基を示し、Ｒ３は−（ＣＨ２）ｎＣＨ３で示される基であり、この時ｎは、３〜１５の整数であり、Ｒ２は−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３から選択される基である。］
４）　下記構造式（１）で表される擬似糖類、オクチル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド。
【００１７】
【化１１】
2004059536.tif 000004
【００１８】
５）　下記構造式（２）で表される擬似糖類、ドデシル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド。
【００１９】
【化１２】
2004059536.tif 000005
【００２０】
６）　下記構造式（３）で表される擬似糖類、ドデシル　２−アセトアミド−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド。
【００２１】
【化１３】
2004059536.tif 000006
【００２２】
［式中、Ａｃはアセチル基を示す。］
７）　下記一般式（ＩＩ）で表される擬似糖質。
【００２３】
【化１４】
2004059536.tif 000007
【００２４】
［式中、Ｌ１及びＭ１は窒素原子、イミノ基、酸素原子またはイオウ原子を示し、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎＣＨ３で示される基であり、この時ｎは、３〜２１の整数であり、Ｒ２はそれぞれ独立に−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３から選択される基である。］
８）　前記一般式（ＩＩ）で表される擬似糖質において、Ｌ１及びＭ１は酸素原子を示し、ｎは、３〜１５の整数であることを特徴とする７）に記載の擬似糖質。９）　下記一般式（ＩＩａ）で表される擬似糖質。
【００２５】
【化１５】
2004059536.tif 000008
【００２６】
［式中、Ｌ２及びＭ２は酸素原子を示し、ＸおよびＹは互いに異なり、各々、水素原子、またはＯＨ基を示し、Ｒ３は−（ＣＨ２）ｎＣＨ３で示される基であり、この時ｎは、３〜１５の整数であり、Ｒ２はそれぞれ独立に−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３から選択される基である。］
１０）　下記構造式（４）で表される擬似糖質、ドデシル　５ａ’−カルバ−β−Ｄ−ラクトシド。
【００２７】
【化１６】
2004059536.tif 000009
【００２８】
１１）　１）に記載の式（Ｉ）または／および７）に記載の式（ＩＩ）で示される化合物を含む、糖鎖合成用プライマー。
１２）　１１）に記載の糖鎖合成用プライマーを糖付加能力を有する細胞に与え、細胞を培養し、培養物から糖鎖を分離採集することを特徴とする糖鎖の製造方法。
１３）　１１）に記載の糖鎖合成用プライマーの、ウイルスまたは細菌毒素の中和剤、生体防御刺激剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗腫瘍転移剤、診断薬、細胞培養基材あるいは生体内薬物運搬体の製造のための使用。
１４）　１）または／および７）に記載の擬似糖質を有効成分として含有するグリコシダーゼ阻害剤またはグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤。
１５）　グルコシダーゼ阻害活性、ガラクトシダーゼ阻害活性、グルコセレブロシダーゼまたはガラクトセレブロシダーゼ阻害活性のうちの少なくともいずれかの活性を示す１４）に記載のグリコシダーゼ阻害剤。
１６）　３）に記載の式（Ｉａ）または／および９）に記載の式（ＩＩａ）で表される化合物を有効成分として含み、β−グルコシダーゼ阻害活性、β−ガラクトシダーゼ阻害活性、β−グルコセレブロシダーゼ阻害活性またはβ−ガラクトセレブロシダーゼ阻害活性のうちの少なくともいずれかの活性を示す、グリコシダーゼ阻害剤。
【００２９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の糖鎖プライマーの製造法としては、特に制限はないが、好ましくは以下の方法により合成できる。
本発明の糖鎖プライマーのうち、一般式（Ｉ）あるいは一般式（Ｉａ）に示される単糖型のアルキルカルバグリコシドの合成原料であるグルコ型カルバ糖およびガラクト型カルバ糖は、発明者等が既に合成法を確立した方法（Ｓ．Ｏｇａｗａ　等：「Ｂｕｌｌ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｊｐｎ．」５３巻，１１２１頁（１９８０））により合成できる。すなわち、フランとアクリル酸のディールス−アルダー（Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ）反応により作られるエンド−付加体を（＋）−フェニルメチルアミン等を用いて光学分割した化合物（−）−エンド−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２−カルボン酸をヒドロキシラクトン化した後、水素化リチウムアルミニウム等の適当な還元剤での還元とアセチル化を行なって得られる１，４−アンヒドロ−５ａ−カルバ−α−Ｄ−グルコピラノース　トリアセテートをアセトリシスすることによって合成することができる。前述の（−）−エンド−付加体は更に一般式（ＩＩ）あるいは一般式（ＩＩａ）の二糖型のアルキルカルバラクトシドのカルバ糖部位の合成原料にも利用できる。１−β−グルコシド型アルキルカルバグリコシドは１，４−アンヒドロ−５ａ−カルバ−α−Ｄ−グルコピラノース　トリアセテートをアセトリシスし得られる一方のグルコ型カルバ糖（アセチル　２，３，４，５−Ｏ−テトラアセチル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド）のアセチル基を除去した後、１位の水酸基以外の水酸基を適当な保護化剤で保護し、１位の遊離水酸基にハロゲン化アルキルを作用させて合成することができる。また、１−β−Ｎ−アセチルグルコサミニド型アルキルカルバグリコシドは、まず、上記グルコ型カルバ糖を、小川等の方法（Ｓ．Ｏｇａｗａ等：「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．　Ｒｅｓ．」１９９巻，１７７頁（２０００））により、カルバＮ−アセチルグルコサミンに変換し、次いで、１位以外の水酸基を適当に保護した後、１位の遊離水酸基にハロゲン化アルキルを作用させて合成することができる。１−β−ガラクトシド型アルキルカルバグリコシドは、１，４−アンヒドロ−５ａ−カルバ−α−Ｄ−グルコピラノース　トリアセテートをアセトリシスし得られるもう一方のガラクト型カルバ糖（アセチル　２，３，４，５−Ｏ−テトラアセチル−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）のアセチル基を除去した後、２位、３位、４位および５位の水酸基を適当な保護化剤で保護し、次いで、１位に脱離基を導入後、１位の反転を行なってβ型カルバ糖を合成し、１位の遊離水酸基にハロゲン化アルキルを作用させて合成することができる。
【００３０】
一般式（ＩＩ）あるいは一般式（ＩＩａ）の二糖型のアルキルカルバラクトシドの合成は、上述の（−）−エンド−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２−カルボン酸を出発原料とし、小川等の方法（Ｓ．Ｏｇａｗａ　等：「Ｂｕｌｌ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｊｐｎ．」５９巻，２９５６頁（１９８６）およびＳ．Ｏｇａｗａ等：「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．　Ｒｅｓ．」２２９巻，１７３頁（１９９２））により合成できる３位、４位及び５位が適当な保護化剤で保護された１，２−アンヒドロ−５ａ−カルバ−マンノピラノースを、ペンタアセチルグルコースを出発原料に、Ｋｏｅｎｉｇｓ−Ｋｎｏｒｒ法（Ｒ．Ｄ．ガズリー著　山本和彦訳；糖質化学　共立出版（１９７７））およびＣｌａｓｓｏｎ等の方法：（Ｂ．Ｃｌａｓｓｏｎ等「Ｊ．　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．　Ｃｈｅｍ．」８巻，５４３頁（１９８９））により合成できる２位、３位および６位が適当な保護化剤で保護されたアルキル　β−Ｄ−グルコピラノシドとカップリングさせることにより合成できる。
【００３１】
以下、アルキルカルバグリコシドおよびアルキルカルバラクトシドの合成を詳細に説明する。
１．　アルキル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ１）の合成
【００３２】
【化１７】
2004059536.tif 000010
【００３３】
【化１８】
2004059536.tif 000011
【００３４】
アルキル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ１）の合成前駆体であるアセチル　２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式６）は前述したように小川等の方法（Ｓ．Ｏｇａｗａ　等：「Ｂｕｌｌ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｊｐｎ．」５３巻，１１２１頁（１９８０））により合成できる。このアセチル　２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラピラノシド（式６）を常法に従い脱アセチル化し、得られた５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラピラノースに、酸触媒存在下α，α−ジメトキシトルエン等の架橋剤（Ａ）を作用させて、４，６−Ｏ−保護Ａ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラピラノース（式ａ８）を得る。この化合物を適当な有機溶媒に溶解し、２，２−ジメトキシプロパン等の隣り合わせた水酸基の架橋剤（Ｂ）を酸触媒下作用させ、２，３−Ｏ−保護Ｂ−４，６−Ｏ−保護Ａ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラピラノース（式ａ１０）と１，２−Ｏ−保護Ｂ−４，６−Ｏ−保護Ａ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラピラノース（式ａ９）の混合物を得る。次に、これら化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、単離し得られた純粋な２，３−Ｏ−保護Ｂ−４，６−Ｏ−保護Ａ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラピラノース（式ａ１０）にオクチルクロリドなどの目的とする化合物に応じて適宜選択可能なアルキル化剤を作用させ、アルキル　２，３−Ｏ−保護Ｂ−４，６−Ｏ−保護Ａ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ１１）を合成する。その後、水酸基の保護基を常法により除去し、次いで常法に従って脱アセチル化し、アルキル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ１）を得ることができる。
【００３５】
２．　アルキル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（式ａ２）の合成
【００３６】
【化１９】
2004059536.tif 000012
【００３７】
【化２０】
2004059536.tif 000013
【００３８】
アルキル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（式ａ２）の合成前駆体であるアセチル　２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラピラノシド（式７）も前述した小川等の方法（Ｓ．Ｏｇａｗａ等：「Ｂｕｌｌ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｊｐｎ．」５３巻，１１２１頁（１９８０））により合成できる。このアセチル　２，３，４，５−Ｏ−テトラアセチル−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（式７）を常法に従い脱アセチル化し、得られた５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノースに、酸触媒存在下α，α−ジメトキシトルエン等の架橋剤（Ａ）を作用させて、４，６−Ｏ−保護Ａ−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース（式ａ１３）を得る。この化合物を適当な有機溶媒に溶解し、２，２−ジメトキシプロパン等の隣り合わせた水酸基の架橋剤（Ｂ）を酸触媒下作用させ、２，３−Ｏ−保護Ｂ−４，６−Ｏ−保護Ａ−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース（式ａ１５）と１，２−Ｏ−保護Ｂ−４，６−Ｏ−保護Ａ−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース（式ａ１４）の混合物を得る。次に、これら化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ単離・精製すると、純粋な２，３−Ｏ−保護Ｂ−４，６−Ｏ−保護Ａ−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノースアセテート（式ａ１５）を得ることができる。目的とする化合物はβ型であるので、１位の基を反転する必要がある。そこで得られた化合物の１位に脱離基を導入するため、メタンスルフォニルクロリド等の脱離基導入剤を作用させる。メタンスルフォニルクロリドを作用させた場合、２，３−Ｏ−保護Ｂ−４，６−Ｏ−保護Ａ−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース　メタンスルフォネート（式ａ１５’）を得ることができる。酢酸カリウム等の脱離剤を作用させて１位の基の反転を行なうことができるが、好ましくは２，３−Ｏ−保護Ｂ−４，６−Ｏ−保護Ａ−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース　メタンスルフォネートの保護Ａと保護Ｂを除去した後、２、３、４、６位の水酸基をクロロメチルメチルエーテル等の水酸基の保護基を作用させ、得られた２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メトキシメスリル−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノースメタンスルホネート（式ａ１６）について上記反転操作を行なうと収率良くβ体を得ることができる。得られた２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メトキシメスリル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノース（式ａ１７）に１−臭化ドデカンなどの目的とする化合物に応じて適宜選択可能なアルキル化剤を作用させると、アルキル　２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メトキシメスリル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（式ａ１８）を合成することができる。その後、水酸基の保護基を常法により除去し、アルキル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（式ａ２）を得ることができる。
【００３９】
３．　アルキル　２−アセトアミド−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（式ａ３）の合成
【００４０】
【化２１】
2004059536.tif 000014
【００４１】
【化２２】
2004059536.tif 000015
【００４２】
アルキル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ１）を合成する際の中間体である４，６−Ｏ−保護Ａ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式ａ８）を化合物（式ａ３）の合成原料とした。４，６−Ｏ−保護Ａ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式ａ８）を過ヨウ素酸酸化し得られるジアルデヒドを、塩基性条件下ニトロメタンを作用させると４，６−Ｏ−保護Ａ−２−デオキシ−２−ニトロ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式ａ１９）と４，６−Ｏ−保護Ａ−２−デオキシ−２−ニトロ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グロピラノース（式ａ２０）を得ることができる。これら混合物を適当な溶出溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行なうことにより、目的とする４，６−Ｏ−保護Ａ−２−デオキシ−２−ニトロ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式ａ１９）を分離し、この化合物のニトロ基をアミノ基に還元する還元剤、例えば、ラネーニッケルを触媒とする水素添加反応（パール還元）を行い、次いで常法によりアセチル化を行ない、４，６−Ｏ−保護Ａ−２−アセトアミド−３−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノースアセテート（式ａ２１）を得、さらに水酸基のみ常法にて脱アセチル化することにより、４，６−Ｏ−保護Ａ−２−アセトアミド−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式ａ２２）を合成することができる。次に、１位にドデシル基を導入するため、水酸基の活性化剤とともに、上記化合物に対し、ほぼ等モルのベンジルクロリド等の水酸基の保護剤（Ｄ）を作用させると、優先的に３位が保護された、４，６−Ｏ−保護Ａ−２−アセトアミド−３−Ｏ−保護Ｄ−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式ａ２４）を得ることができる。得られた化合物に１−臭化ドデカンなどの目的とする化合物に応じて適宜選択可能なアルキル化剤を作用させると、アルキル　４，６−Ｏ−保護Ａ−２−アセトアミド−３−Ｏ−保護Ｄ−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ２６）を得ることができ、その後、水酸基の保護基を常法により除去することによって、アルキル　２−アセトアミド−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ３）を得ることができる。
【００４３】
４．アルキル　（５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシド（ドデシル　５ａ’−カルバ−β−Ｄ−ラクトシド；式ａ４）の合成
【００４４】
【化２３】
2004059536.tif 000016
【００４５】
アルキル　５ａ’−カルバ−β−Ｄ−ラクトシドの合成は大別して４つの工程よりなる。第１の工程はアクセプターである２位、３位および６位の水酸基が適当な保護化剤で保護されたドデシル　β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ３１）の合成であり、第２の工程は、ドナーである３位、４位及び５位の水酸基が適当な保護化剤で保護された１，２−アンヒドロ−５ａ−カルバ−マンノピラノース（式ａ３８）の合成であり、第３の工程は、この２つの化合物をカップリングさせることであり、第４の工程は、目的とするアルキル　５ａ’−カルバ−β−Ｄ−ラクトシド（式ａ４）の合成である。
【００４６】
【化２４】
2004059536.tif 000017
【００４７】
第１の工程においては、グルコースのペンタアセテート（式２７）に適当な濃度の臭化水素−酢酸を作用させ、臭化グルコース　テトラアセテートを合成した後、１−ドデカノールなどの目的とする化合物に応じて適宜選択可能なアルコールを作用させると、アルキル　２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ２９）を合成できる。次いで、一旦アセチル基を除去した後、４位と６位の水酸基を適当な架橋剤で架橋保護（Ａ）し、２位と３位の水酸基を水酸基の保護化剤（Ｄ）で保護することにより、アルキル　２，３−ジ−Ｏ−保護Ｄ−４，６−Ｏ−架橋保護Ａ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ３０）を合成することができる。目的とする化合物は４位の水酸基にドナーを導入可能な化合物であるので、４位と６位を選択的に開裂させることができるトリエチルアミン−ボランと塩化アルミニウムを用いて４，６−Ｏ−架橋保護基を開裂することにより、目的とするアクセプターであるアルキル　２，３，６−トリ−Ｏ−保護Ｄ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ３１）を合成することができる。
【００４８】
【化２５】
2004059536.tif 000018
【００４９】
第２の工程においては、前述の（−）−エンド−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２−カルボン酸（式３２）に塩基性条件下臭素を作用させブロモラクトン化させ、次いで臭化水素−酢酸を作用させることによって、３，４−Ｏ−ジアセチル−２−ブロモ−５ａ−カルバβ−Ｄ−グルクロピラヌロン酸ブロミド（式３４）を合成し、得られた化合物を亜鉛等の脱臭素化剤を作用させ、次いで、この化合物のカルボン酸を適当な還元剤で還元し、常法によりアセチル化し、さらに脱アセチル化し、遊離水酸基をα，α−ジメトキシトルエンで架橋保護することによって、（１Ｒ，３Ｒ，６Ｒ，１０Ｓ）−１０−ヒドロキシ−３−フェニル−２，４−ジオキサビシクロ［４，４，０］デク−８−エン（式ａ３７）を合成することができる。この化合物にメタクロロ安息香酸を作用させ、次いで遊離水酸基を適当な水酸基の保護化剤（Ｄ）で保護することにより、目的とするドナーである３位、４位及び６位の水酸基が保護された１，２−アンヒドロ−３−Ｏ−保護Ｄ−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−マンノピラノース（式ａ３８）が合成できる。
【００５０】
【化２６】
2004059536.tif 000019
【００５１】
第３の工程においては、アルキル　２，３，６−トリ−Ｏ−保護−β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ３１）の遊離水酸基を水素化ナトリウム等の水酸基の活性化剤を作用させ、次いで、１，２−アンヒドロ−３−Ｏ−保護Ｄ−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−マンノピラノース（式ａ３８）を作用させることによって、アルキル　（３−Ｏ−保護Ｄ−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−保護−β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ３９）を合成することができる。
【００５２】
【化２７】
2004059536.tif 000020
【００５３】
第４の工程においては、上記カップリング体の遊離の水酸基を常法によりアセチル化し（式ａ４０）、カップリング体の２位を適当な酸化剤で酸化してカルボニル化し（式ａ４１）、次いで、１，８−ジアザビシクロ［４，５，０］ウンデカ−７−エンを作用させることによりカルバ糖部位の１位を異性化させ、α１→４をβ１→４に転化させる（式ａ４２）。次に、カルバ糖部位の２位のカルボニル基を適当な還元剤で還元し、遊離水酸基をアセチル化などにより保護することにより、主成分としてアルキル　（３−Ｏ−保護Ｄ−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−保護Ｄ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式ａ４３）を合成することができる。次いで、この化合物をカルバラクトース型にするため、脱ベンジリデン化と遊離水酸基への脱離基の導入を順次行ない（式ａ４５）、酢酸ナトリウムを作用させ、カルバ糖部位の４位の反転操作（式ａ４６）、及び保護基の除去を行なうことによって、目的とするカルバラクトース（式ａ４）を得ることができる。
【００５４】
なお、本発明の擬似糖質は、必要に応じて常法により適宜、誘導体、塩などの形態にして用いることができ、そのような形態も本発明の範囲に含まれる。
【００５５】
本発明の糖鎖合成用プライマーは、本発明の疑似糖質を含むことを特徴とする。本発明の糖鎖合成用プライマーは、疑似糖質単体を含むものでもよく、２種以上を含むものでもよく、また、適当な担体と組合わせてもよい。なお、本発明の糖鎖合成用プライマーの調製においては、本発明の疑似糖質を含むこと以外は、通常よく知られた手法を採用することができる。
本発明の糖鎖合成用プライマーを糖付加能力を有する細胞に与え、その細胞を培養し、培養物から糖鎖を分離採集することにより、各種の糖鎖を製造することができる。糖付加能力を有する細胞としては、本発明の糖鎖合成用プライマーに糖鎖付加をする能力を有するものであれば、どのような生物の細胞を用いてもよいが、通常、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ヒトなどの細胞を用いることができる。このような細胞として、例えばラットＰＣ１２細胞、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＨＬ−６０細胞などを挙げることができる。
【００５６】
上記の方法で得られた本発明の式１、式２、式３及び式４の化合物を糖鎖生合成用プライマーとして各種細胞の培地に添加して培養すると、細胞は式１、式２、式３及び式４の化合物を取り込み、ゴルジ体に於いて、式１、式２、式３及び式４の化合物の糖鎖部分にさらに糖を付加してグリコシル化し、その糖付加生成物を細胞内に蓄積せずに細胞外に分泌する。細胞により付加される糖は、細胞と加えるプライマーにより異なり、例えばＢ１６マウスメラノーマ細胞に式２あるいは式４の化合物を与えると、ノイラミン酸のアシル誘導体であるシアル酸が付加され、式１あるいは式３の化合物を与えると、ガラクトースが付加され更にはシアル酸が付加される。また、ラットＰＣ１２細胞に式２あるいは式４の化合物を与えると、ガラクトースが付加される。したがって、所望の糖を付加する細胞に、本発明の、式１、式２、式３及び式４の化合物を糖鎖プライマーとして与えることによって、所望の糖鎖を有する糖付加生成物を得、さらに必要に応じてこの工程を繰り返すことによって、多用な糖鎖を有する糖付加生成物を合成することが出来る。このようにして多用な糖鎖を有する糖鎖ライブラリーを構築することも可能である。また糖付加生成物は、細胞内に蓄積されずに細胞外に分泌されるので、培地から容易に回収することが出来る。したがって、本発明の式１、式２、式３及び式４の化合物を糖鎖生合成用プライマーとして使用することによって、従来の方法に比較して、工程が比較的簡単で、効率的に高収量で、所望の糖を所望の位置に含む糖鎖を合成することが出来る。なお、本発明の糖鎖の製造方法においては、本発明の糖鎖合成用プライマーを用いること以外は、通常よく知られた手法を採用することができる。すなわち、細胞の培養、培養物からの糖鎖の精製などは一般的な方法を採用することができる。
【００５７】
上記のようにして細胞から得られた、糖の付加されたグリコシル化生成物は、付加された糖鎖に応じて、各種の用途に使用することができる。本発明の糖鎖は単体で用いてもよく、２種以上を組み合わせてもよく、その際、適当な担体と組み合わせてもよい。たとえば用いた細胞が付加する糖鎖に特異的親和性を有するウイルスやタンパク質の中和に用いることが出来る。Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を用いた場合に得られるガラクトース付加生成物は、病原性大腸菌のＯ−１５７毒素やボツリヌス毒素を中和することが出来る。これら以外にも、付加する糖鎖に応じて、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞では、コレラ毒素、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞では破傷風毒素、ヒトＨＬ−６０細胞を用いた場合には抗炎症効果を有する糖付加生成物を得ることが出来る可能性がある。糖の付加されたグリコシル化生成物の可能性のある用途としては、上記のほか、生体防御系刺激剤製造のための用途、各種医薬品（抗炎症剤、抗菌剤、抗腫瘍転移剤、診断薬など）または細胞培養基材の製造のための用途、及び標的細胞ターゲッティング性を利用した生体内薬物運搬体の製造のための用途を挙げることが出来る。また上述のように多様な糖鎖を有する糖鎖ライブラリーを構築することも可能であるため、糖鎖の機能研究など広範囲の研究に使用することが出来る。なお、本発明のウイルスまたは細菌毒素の中和剤、生体防御刺激剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗腫瘍転移剤、診断薬、細胞培養基材あるいは生体内薬物運搬体などにおいては、本発明の糖鎖を含むこと以外は、通常よく知られた手法を採用することができる。すなわち、製剤方法、有効量・投与量の決定、投与方法などについては一般的な方法を採用することができる。
【００５８】
本発明のグリコシダーゼ阻害剤またはグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤は、有効成分として本発明の糖鎖合成用プライマーを１種または２種以上含み、グルコシダーゼ阻害活性、ガラクトシダーゼ阻害活性、グルコセレブロシダーゼまたはガラクトセレブロシダーゼ阻害活性のうちの少なくともいずれかの活性を示す。このような阻害剤は、抗ウイルス活性、神経機能改善作用、免疫アジュバント活性等を有すると期待されている。なお、本発明のグリコシダーゼ阻害剤またはグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤においては、本発明の糖鎖合成用プライマーを含むこと以外は、通常よく知られた手法を採用することができる。すなわち、製剤方法、有効量・投与量の決定、投与方法などについては一般的な方法を採用することができる。
【００５９】
【実施例】
以下、本発明の具体的実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】オクチル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式１）の合成
（１）ペンタアセチル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式６）およびペンタアセチル　５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース（式７）の合成
【００６０】
【化２８】
2004059536.tif 000021
【００６１】
小川等の方法　（Ｓ．Ｏｇａｗａ　等：「Ｂｕｌｌ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｊｐｎ．」５３巻，１１２１頁（１９８０））　に従って合成した、式（５）で表される（１Ｓ）−２−エキソ−３−エンド−ジアセトキシ−５−エンド−アセトキシメチル−７−オキサ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタン（４２ｇ、０．１５ｍｏｌ）を酢酸（１２６ｍｌ）、無水酢酸（６６ｍｌ）および濃硫酸（７．２ｍｌ）の混液に溶解し、密栓状態で８０℃、２０時間加熱処理を行なったところ、上記２化合物（式６、式７）が生成した。反応液を氷水に注ぎ込み過剰の無水酢酸を分解後、炭酸水素ナトリウムで中和した。中和後、酢酸エチルで上記２化合物（式６、式７）を抽出した。酢酸エチル相を、水、食塩水で洗浄後、分取し減圧濃縮した。こうして得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　６０、５００ｇ、アセトン／ヘキサン＝１／８）にて精製、分離し、化合物　（式６）をシロップとして２４．０ｇ（収率４２％）、化合物　（式７）を結晶として２４．５ｇ（収率４２．５％）得た。
【００６２】
化合物　（式６）の物性は以下のとおりである。
分子式：Ｃ１７Ｈ２４Ｏ１０
比旋光度：　［α］Ｄ２７　＋１７°（ｃ　１．８、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000022
【００６３】
また、化合物（式７）の物性は以下のとおりである。
分子式：Ｃ１７Ｈ２４Ｏ１０
比旋光度：　［α］Ｄ２７　＋４３°（ｃ　１．１、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000023
【００６４】
（２）４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式８）の合成
【００６５】
【化２９】
2004059536.tif 000024
【００６６】
上記実施例１（１）で得た化合物（式６、９．６８ｇ、２８ｍｍｏｌ）をメタノール（７０ｍｌ）に溶解し、１Ｍのソディウムメトキシドメタノール溶液（１５ｍｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応液をアンバーライトＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ＋）で中和し、減圧濃縮した。こうして得られた残渣をジメチルフォルムアミド（５０ｍｌ）に溶解し、α，α−ジメトキシトルエン（５．５ｍｌ、３７ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルフォン酸・一水和物（０．８５ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で３時間攪拌した。反応溶液をトリエチルアミンで中和後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　３００ｇ、メタノール／クロロホルム＝１／１５）にて精製し、４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式８）を結晶として４．５ｇ（収率５９％）得た。
【００６７】
化合物（式８）の物性は以下のとおりである。
分子式：Ｃ１１Ｈ１８Ｏ５
比旋光度：　［α］Ｄ２０　−４３°（ｃ　１．２、ＭｅＯＨ）
融点：　１６７−１６８℃
2004059536.tif 000025
【００６８】
（３）４，６−Ｏ−ベンジリデン−１，２−Ｏ−イソプロピリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式９）および４，６−Ｏ−ベンジリデン−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式１０）の合成
【００６９】
【化３０】
2004059536.tif 000026
【００７０】
上記実施例１（２）で得た化合物（式８、６３ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をジメチルフォルムアミド（１．９ｍｌ）に溶解し、２，２−ジメトキシプロパン（０．２９ｍｌ、２．２ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルフォン酸・一水和物（９ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で１時間攪拌した。反応溶液をトリエチルアミンで中和後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　５ｇ、アセトン／ヘキサン＝１／５）にて精製し、４，６−Ｏ−ベンジリデン−１，２−Ｏ−イソプロピリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式９）をシロップとして３８ｍｇ（収率５２％）、４，６−Ｏ−ベンジリデン−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式１０）を結晶として４８ｍｇ（収率４８％）得た。
【００７１】
化合物（式９）の物性は以下のとおりである。
分子式：Ｃ１７Ｈ２２Ｏ５
比旋光度：　［α］Ｄ２０　−２１°（ｃ　１．７、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000027
【００７２】
また、化合物（式１０）の物性は以下のとおりである。
分子式：Ｃ１７Ｈ２２Ｏ５
比旋光度：　［α］Ｄ２０　−２０°（ｃ　１．２、ＭｅＯＨ）
融点：　１５０−１５１℃
2004059536.tif 000028
【００７３】
（４）オクチル　４，６−Ｏ−ベンジリデン−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式１１）およびオクチル　２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式１２）およびオクチル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式１）の合成
【００７４】
【化３１】
2004059536.tif 000029
【００７５】
無水ジメチルフォルムアミド（７ｍｌ）に、ヘキサンで洗浄したソディウムハイドライド（ＮａＨ、１０６ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ）および上記実施例１（３）で得た化合物（式１０、４０４ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）のジメチルフォルムアミド（１２ｍｌ）溶液をアルゴン気流雰囲気下で加え、０℃で３０分間攪拌した。その溶液に臭化ｎ−オクタン（０．４５７ｍｌ、２．６３ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間攪拌した。反応溶液を食塩水で洗浄後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　５ｇ、アセトン／ヘキサン＝１／１５）にて精製し、オクチル　４，６−Ｏ−ベンジリデン−１，２−Ｏ−イソプロピリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式１１）を結晶として４３９ｍｇ（収率７９．５％）得た。
【００７６】
この化合物（式１１、３８７ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を８０％酢酸水（１０ｍｌ）に溶かし、５０℃で１時間攪拌することにより、オクチル　２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式１２）を含む反応溶液を得た。純粋な化合物（式１２）を得るため、反応溶液を濃縮乾固し、無水酢酸で常法により、遊離水酸基のアセチル化を行ない、そのアセチル化物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　２０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／４）にて精製し、化合物（式１２）をシロップとして４２４ｍｇ（収率９８％）得た。
【００７７】
次に化合物（式１２、３８７ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）をメタノール（２ｍｌ）に溶解し、１Ｍナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．８ｍｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。ついでこの反応溶液をアンバーライトＩＲ１２０Ｂ（Ｈ＋）で中和し、濃縮乾固した。その残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　１５ｇ、メタノール／クロロホルム＝１／２０）にて精製し、オクチル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式１）を結晶として２１５ｍｇ（収率８８％）得た。
【００７８】
化合物（式１１）の物性は以下のとおりである。
分子式：Ｃ２５Ｈ３８Ｏ５
比旋光度：　［α］Ｄ２０　−２７°（ｃ　１．５、ＣＨＣｌ３）
融点：　５７−５８℃
2004059536.tif 000030
【００７９】
また、化合物（式１２）の物性は以下のとおりである。
分子式：Ｃ２３Ｈ３８Ｏ９
比旋光度：　［α］Ｄ２０　＋０．２°（ｃ　２．５、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000031
【００８０】
また、化合物（式１）の物性は以下のとおりである。
分子式：Ｃ１５Ｈ３０Ｏ５
比旋光度：　［α］Ｄ１９　−１４°（ｃ　０．９、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３＝１／１）
2004059536.tif 000032
【００８１】
【実施例２】ドデシル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（式２）の合成
（１）４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース（式１３）および３−Ｏ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−１，２−Ｏ−イソプロピリデン−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース（式１４）および４，６−Ｏ−ベンジリデン−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース　アセテート（式１５）の合成
【００８２】
【化３２】
2004059536.tif 000033
【００８３】
実施例１（１）で合成した化合物（式７、１２．７ｇ、３２．８ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍｌ）に溶解し、１Ｍのソディウムメトキシドメタノール溶液（１０ｍｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応液をアンバーライトＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ＋）で中和し、減圧濃縮した。こうして得られた残渣をジメチルフォルムアミド（５０ｍｌ）に溶解し、α，α−ジメトキシトルエン（６．８ｍｌ、４６ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルフォン酸・一水和物（１．１ｇ、６．４ｍｍｏｌ）を加え、減圧下、５０℃で３時間攪拌した。反応溶液をトリエチルアミンで中和後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　４００ｇ、メタノール／クロロホルム＝１／２０）にて精製し、４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース（式１３）を結晶として４．９５ｇ（収率５６．７％）得た。
【００８４】
次に、上記化合物（式１３、２４２ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）をジメチルフォルムアミド（４．８ｍｌ）に溶解し、２，２−ジメトキシプロパン（０．４５ｍｌ、４．７ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルフォン酸・一水和物（３１ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を加え、０℃で３０分間攪拌した。反応溶液をトリエチルアミンで中和後、減圧濃縮した。得られた残渣を常法により無水酢酸でアセチル化し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　５ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／１０次いで１／１５）にて精製したところ、３−Ｏ−アセチル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−１，２−Ｏ−イソプロピリデン−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース（式１４）をシロップとして１１１ｍｇ（収率３８％）、４，６−Ｏ−ベンジリデン−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース　アセテート（式１５）を結晶として１７３ｍｇ（収率５９％）得た。
【００８５】
化合物（式１３）の物性は以下のとおりである。
分子式：Ｃ１４Ｈ１８Ｏ５
比旋光度：　［α］Ｄ２０　；＋４６．５°（ｃ　１．０、ＭｅＯＨ）
融点：１５５．５−１５７℃
2004059536.tif 000034
【００８６】
また、化合物（式１４）の物性は以下のとおりである。
分子式：Ｃ１９Ｈ２４Ｏ６
比旋光度：　［α］Ｄ２２　；＋１３１°（ｃ　１．１、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000035
【００８７】
また、化合物（式１５）の物性は以下のとおりである。
分子式：Ｃ１９Ｈ２４Ｏ６
比旋光度：　［α］Ｄ２２　；＋４４°（ｃ　１．１、ＣＨＣｌ３）
融点：１０６−１０７℃
2004059536.tif 000036
【００８８】
（２）２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メトキシメスリル−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース　メタンスルフォネート（式１６）、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メトキシメスリル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノース（式１７）、ドデシル　２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メトキシメスリル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（式１８）、ドデシル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（式２）の合成
【００８９】
【化３３】
2004059536.tif 000037
【００９０】
実施例２（１）で合成した化合物（式１５、１２ｍｇ、３３μｍｏｌ）を１Ｍナトリウムメトキシドのメタノール溶液に加え、室温で１時間攪拌した。この反応溶液をアンバーライトＩＲ１２０Ｂ（Ｈ＋）で中和し、減圧濃縮した。得られた残渣ピリジン（１．０ｍｌ）に溶解し、メタンスルフォニルクロリド（７．７μｌ、０．１μｍｏｌ）を加え、室温で２２時間攪拌した。この反応溶液に少量のメタノールを添加後、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチル（１５ｍｌ）に溶解後、食塩水で洗浄し、酢酸エチル層を減圧濃縮した。得られた残渣を８０％酢酸水（１ｍｌ）に溶解し、６０℃で１時間攪拌した。この反応溶液を減圧濃縮した。次に、この残渣をジクロルメタン（１．０ｍｌ）に溶解し、クロロメチルメチルエーテル（２８μｌ、０．２７μｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３２μｌ、０．２７μｍｏｌ）を加え、４０℃で１２時間攪拌した。生成した２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メトキシメスリル−５ａ−カルバ−α−Ｄ−ガラクトピラノース　メタンスルフォネート（式１６）をクロロホルム（１５ｍｌ）で抽出し、クロロホルム溶液を水で洗浄した。クロロホルム溶液を減圧濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　０．５ｇ、アセトン／ヘキサン＝１／３）にて精製したところ、化合物（式１６）をシロップとして９．７ｍｇ（収率６７％）得た。さらに、この一連の操作に順じて、化合物（式１５、１．３９ｇ、３．９９ｍｍｏｌ）から化合物（式１６）をシロップとして０．８９４ｇを合成した。
【００９１】
次に、化合物（式１６、７９５ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）に酢酸カリウム（３．６ｇ、３７ｍｍｏｌ）とジメチルフォルムアミド（１６ｍｌ）を加え、１００℃で２日間攪拌した。この反応溶液を酢酸エチル（１５０ｍｌ）で希釈し、食塩水で洗浄後、酢酸エチル層を分取し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　４０ｇ、アセトン／ヘキサン＝１／１０）にて精製したところ、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メトキシメスリル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノース　アセテートをシロップとして５６２ｍｇｍｇ得た。ついで、この化合物（５３３ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）に１Ｍナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．５３ｍｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。この反応物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　４０ｇ、アセトン／ヘキサン＝１／４）にて精製したところ、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メトキシメスリル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノース（式１７）をシロップとして４２０ｍｇ（収率８８％）得た。
【００９２】
次に、無水ジメチルフォルムアミド（７ｍｌ）に、ヘキサンで洗浄したソディウムハイドライド（ＮａＨ、５８ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）および化合物（式１７、１７１ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）のジメチルフォルムアミド（５．０ｍｌ）溶液をアルゴン気流雰囲気下で加え、０℃で３０分間攪拌した。その溶液に１−臭化ドデカン（０．３５ｍｌ、１．４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２７時間攪拌した。反応溶液に少量のメタノールを添加後、酢酸エチル（６０ｍｌ）で希釈し、食塩水で洗浄後、酢酸エチル層を分取し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　１５ｇ、酢酸エチル／トルエン＝１／８）にて精製したところ、ドデシル　２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メトキシメスリル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（式１８）をシロップとして１９８ｍｇ（収率７９％）得た。
【００９３】
次に、この化合物（式１８、１８６ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）に４Ｍ塩酸（５．５ｍｌ）を加え、６０℃で３時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮後、無水酢酸を用いて常法により遊離水酸基をアセチル化し、得られたアセチル化物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　１２ｇ、アセトン／ヘキサン＝１／１０）にて精製したところ、ドデシル　２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドをシロップとして１３２ｍｇ得た。このアセチル化物（９４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）に１Ｍのナトリウムメトキシドのメタノール溶液とメタノール／クロロホルム混液（１／２）を加え、室温で２時間攪拌した。この反応溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　５ｇ、メタノール／クロロホルム＝１／２０）にて精製したところ、ドデシル　５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（式２）をシロップとして５８ｍｇ（収率９２％）得た。
【００９４】
化合物（式１６）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ１６Ｈ３２Ｏ１１Ｓ
比旋光度：　［α］Ｄ２２　；＋１１°（ｃ　２．７、ＣＨＣｌ３）
融点：１０６−１０７℃
2004059536.tif 000038
【００９５】
また、化合物（式１７）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ１５Ｈ３０Ｏ９
比旋光度：　［α］Ｄ２２　；−５１°（ｃ　１．１、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000039
【００９６】
また、化合物（式１８）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ２７Ｈ５４Ｏ９
比旋光度：　［α］Ｄ２２　；−２０°（ｃ　１．１、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000040
【００９７】
また、化合物（式２）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ１９Ｈ３８Ｏ５
比旋光度：　［α］Ｄ２２　；−２２°（ｃ　０．６、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３＝１／１）
融点：７８−７９℃
2004059536.tif 000041
【００９８】
【実施例３】ドデシル　２−アセトアミド−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式３）の合成
（１）４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−２−ニトロ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式１９）および４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−２−ニトロ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グロピラノース（式２０）の合成
【００９９】
【化３４】
2004059536.tif 000042
【０１００】
実施例１（２）で合成した化合物（式８、２．４９ｇ、９．３ｍｍｏｌ）を水（１００ｍｌ）に溶解し、炭酸水素ナトリウム（１．４９ｇ、１７ｍｍｏｌ）と過ヨウ素酸ナトリウム（６．９７ｇ、３２．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間攪拌した。生成した沈殿物を濾過除去し、濾液を減圧濃縮した。残渣をメタノール（７５ｍｌ）に溶解し、ニトロメタン（１．６６ｍｌ、３１ｍｍｏｌ）と１Ｍのナトリウムメトキシドのメタノール溶液（６．６ｍｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応溶液をアンバーライトＩＲ１２０Ｂ（Ｈ＋）で中和後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　１８０ｇ、メタノール／クロロホルム＝１／４０）にて精製したところ、４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−２−ニトロ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式１９）を結晶として１．５５ｇ（収率５６％）、４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−２−ニトロ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グロピラノース（式２０）をシロップとして０．４９ｇ（収率１８％）得た。
【０１０１】
化合物（式１９）の物性は以下の通りである。
2004059536.tif 000043
また、化合物（式２０）の物性は以下の通りである。
2004059536.tif 000044
【０１０２】
（２）４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−アセトアミド−３−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース　アセテート（式２１）および４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−アセトアミド−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式２２）の合成
【０１０３】
【化３５】
2004059536.tif 000045
【０１０４】
無水酢酸（２．１ｍｌ、２２．０ｍｍｏｌ）を含むメタノール（５０ｍｌ）溶液に、実施例３（１）で合成した化合物（式１９、１．４７ｇ、４．９８ｍｍｏｌ）を溶解し、ラネイ−ニッケル　Ｔ−４存在下、パール・シェーカータイプ（Ｐａｒｒ　ｓｈａｋｅｒ−ｔｙｐｅ）装置中において、室温条件で水添操作を行った（初期水素圧　約２５０ＫＰａ）。反応終了後、触媒を除去し、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　１３０ｇ、アセトン／ヘキサン＝１／２）にて精製したところ、４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−アセトアミド−３−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース　アセテート（式２１）を結晶として１．３ｇ（収率６７％）得た。
【０１０５】
こうして得られた化合物（式２１、１．１６ｇ、２．９６ｍｍｏｌ）をメタノール（２３ｍｌ）に溶解し、１Ｍのナトリウムメトキシドのメタノール溶液（２．３ｍｌ）で処理することによって、４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−アセトアミド−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式２２）を結晶として０．９１ｇ（収率　定量的）得た。
【０１０６】
化合物（式２１）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ２０Ｈ２５ＮＯ７
比旋光度：　［α］Ｄ２７　；−３３°（ｃ　１．０、ＣＨＣｌ３）
融点：２３２−２３３℃
2004059536.tif 000046
【０１０７】
また、化合物（式２２）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ１６Ｈ２１ＮＯ５
比旋光度：　［α］Ｄ２０　；＋６５°（ｃ　１．２、ＭｅＯＨ）
融点：２１５−２２６℃
2004059536.tif 000047
【０１０８】
（３）ベンジル　４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−アセトアミド−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式２３）および４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−アセトアミド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式２４）およびベンジル　４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−アセトアミド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式２５）の合成
【０１０９】
【化３６】
2004059536.tif 000048
【０１１０】
実施例３（２）で得られた化合物（式２２、３２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をジメチルフォルムアミド（１．０ｍｌ）に溶解し、ナトリウムハイドライド（１１ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を加え、０℃で３０分攪拌した。ついで、臭化ベンジル（１８．２μｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を加え０℃で１時間攪拌した。反応終了後少量のメタノールを添加し過剰量の臭化ベンジルを分解した。その後、反応溶液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　５ｇ、アセトン／トルエン＝１／２）にて精製したところ、ベンジル　４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−アセトアミド−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式２３）を結晶として２ｍｇ（収率３％）、４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−アセトアミド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式２４）を結晶として２２ｍｇ（収率４１％）、ベンジル　４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−アセトアミド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式２５）を結晶として２１ｍｇ（収率３２％）、未反応の４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−アセトアミド−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノース（式２２）を結晶として１０ｍｇ得た。
【０１１１】
化合物（式２３）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ２３Ｈ２７ＮＯ５
比旋光度：　［α］Ｄ２５　；−５０°（ｃ　０．８、ＣＤＣｌ３）
融点：２００−２０１℃
2004059536.tif 000049
【０１１２】
また、化合物（式２４）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ２３Ｈ２７ＮＯ５
比旋光度：　［α］Ｄ２２　；＋３０°（ｃ　０．８、ＣＤＣｌ３）
融点：２１７−２１８℃
2004059536.tif 000050
【０１１３】
また、化合物（式２５）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ３０Ｈ３３ＮＯ５
比旋光度：　［α］Ｄ２２　；―１５°（ｃ　２．４、ＣＤＣｌ３）
融点：２１０．５−２１２℃
2004059536.tif 000051
【０１１４】
（４）ドデシル　４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−アセトアミド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式２６）およびドデシル　２−アセトアミド−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式３）の合成
【０１１５】
【化３７】
2004059536.tif 000052
【０１１６】
実施例３（３）に順じて合成した化合物（式２４、３６．０ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）にジメチルフォルムアミド（１．０ｍｌ）中で、ナトリウムハイドライド存在下、１−臭化ドデカンを作用させ、ドデシル化操作を行なった。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　４ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／３）にて精製したところ、ドデシル　４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−アセトアミド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式２６）が結晶として３５ｍｇ（収率６８％）得られた。
【０１１７】
上記操作に順じて合成した化合物（式２６、２１７ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を、１Ｍ塩酸０．２ｍｌを含むエタノール／酢酸エチル（１／１）混液に溶解し、１０％パラジウム／炭素の触媒量存在下、常圧で水素ガスを作用させ、水素添加を行なった。その後、触媒を除去し、減圧濃縮した。得られた残渣を常法により、遊離水酸基をアセチル化し、そのアセチル化物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　１５ｇ、アセトン／ヘキサン＝１／３）にて精製したところ、ドデシル　２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシドが無色シロップとして１８７ｍｇ（収率９５％）得られた。このアセチル化物（１６２ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）をメタノール／ジクロルメタン（１／２）混液に溶解し、１Ｍのナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．４ｍｌ）をさせ脱アセチル化を行なった。脱アセチル化物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　６ｇ、メタノール／クロロホルム＝１／２０−１／１０濃度勾配溶出）にて精製したところ、ドデシル２−アセトアミド−２−デオキシ−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシド（式３）が結晶として１２０ｍｇ（収率９９％）得られた。
【０１１８】
化合物（式２６）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ３５Ｈ５１ＮＯ５
比旋光度：　［α］Ｄ２２　；−５°（ｃ　１．０、ＣＤＣｌ３）
融点：９７−９８℃
2004059536.tif 000053
【０１１９】
また、化合物（式３）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ２１Ｈ４４ＮＯ５
比旋光度：　［α］Ｄ２５　；−９°（ｃ　１．２、ＭｅＯＨ／ＣＤＣｌ３＝１／１）
融点：７２−７３℃
2004059536.tif 000054
【０１２０】
【実施例４】ドデシル　５ａ’−カルバ−β−Ｄ−ラクトシド（式４）の合成
（１）ドデシル　２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式２９）の合成
【０１２１】
【化３８】
2004059536.tif 000055
【０１２２】
Ｄ−グルコースのペンタアセテート（式２７）を出発原料にし、常法（Ｋｏｅｎｉｇｓ−Ｋｎｏｒｒ法）を用いドデシル　２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式２９）を合成した。すなわち、グルコースペンタアセテート（式２７）に１５％臭化水素−酢酸を作用させ、臭化グルコーステトラアセテート（式２８）を合成し、精製することなく、１−ドデカノール、過塩素酸銀、炭酸銀を用いてグリコシル化を行ない、β−グリコシド（式２９）を合成した。この時のβ−グリコシド（式２９）の収率は５１％であった。
【０１２３】
化合物（式２９）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ２６Ｈ４４Ｏ１０
比旋光度：　［α］Ｄ２０　―１４°（ｃ　１．１、ＣＨＣｌ３）
融点：　５３−５４．５℃
2004059536.tif 000056
【０１２４】
（２）ドデシル　２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド（式３０）およびドデシル　２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式３１）の合成
【０１２５】
【化３９】
2004059536.tif 000057
【０１２６】
実施例４（１）で合成した化合物（式２９、１１．０ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を常法によりナトリウムメトキシドを用いて脱アセチル化を行なった。得られた脱アセチル体をジメチルフォルムアミド（１００ｍｌ）に溶解し、α，α−ジメトキシトルエン（４．７ｍｌ、３２ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルフォン酸一水和物（０．７３ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を加え、減圧下、５０℃で４時間３０分攪拌した。この反応液をトリエチルアミンで中和後、減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　３００ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／２）にて精製したところ、４，６−ベンジリデン誘導体がシロップとして得られた。ナトリウムハイドライドを添加したジメチルフォルムアミド中で、臭化ベンジルを作用させて、遊離水酸基のベンジル化を行った。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　５００ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／３０）にて精製したところ、ドデシル　２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド（式３０）が結晶として１０．１ｇ（収率７７％）得られた。
【０１２７】
次に、上記で得られた化合物（式３０、３．９９ｇ、６．４７ｍｍｏｌ）とモレキュラー・シーブス４Ａ（１６ｇ）のテトラヒドロフラン（２４０ｍｌ）懸濁液に、ボラン−トリエチルアミン（２．９２ｇ、３８．８ｍｍｏｌ）と塩化アルミニウム（５．１８ｇ、３８．８ｍｍｏ）を０℃で加え、ついで室温で２１時間攪拌した。反応物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　３００ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／８）にて精製したところ、ドデシル　２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式３１）が結晶として３．８１ｇ（収率９５％）得られた。
【０１２８】
化合物（式３０）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ３９Ｈ５２Ｏ６
比旋光度：　［α］Ｄ２１　―２３°（ｃ　１．４、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000058
【０１２９】
また、化合物（式３１）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ３９Ｈ５４Ｏ６
比旋光度：　［α］Ｄ２２　―１２°（ｃ　１．３、ＣＨＣｌ３）
融点：　４２−４３℃
2004059536.tif 000059
【０１３０】
（３）１，２−Ｏ−アンヒドロ−３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−マンノピラノース（式３８）の合成
【０１３１】
【化４０】
2004059536.tif 000060
【０１３２】
１，２−Ｏ−アンヒドロ−３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−マンノピラノース（式３８）は本発明者らが行なった方法に順じて合成した（Ｏｇａｗａ，　Ｓ．，Ｔｏｎｅｇａｗａ，　Ｔ．，　Ｎｉｓｈｉ，　Ｋ．，　Ｙｏｋｏｙａｍａ，　Ｊ．　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２２９，　１７３−１８２，　１９９２）。
【０１３３】
方法を以下に概略する。
フランとアクリル酸のＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応によって得られたｅｎｄｏ−付加体を（＋）−フェニルメチルアミンを用いて光学分割した化合物（式３２）を出発原料とし、脱アミン化、ブロモラクトン化により、化合物（式３３）を２工程で得た（収率７９％）。この化合物（式３３）を封管中２０％臭化水素−酢酸を作用させて化合物（式３４）とし、続いて亜鉛による脱臭素反応を行ない、化合物（式３５）を２工程で得た（収率３８％）。化合物（式３５）を水素化リチウムアルミニウムによる還元、アセチル化を行い、カルバグルカールトータルアセテート（式３６）を２工程で得た。ついで、脱アセチル化、ベンジリデン化を行ない、化合物（式３７）を２工程で得た（収率８５％）。化合物（式３７）をメタクロロ安息香酸を用いてエポキシ化を行ない、続いてベンジル化を行ない１，２−Ｏ−アンヒドロ−３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−マンノピラノース（式３８）を得た（収率８３％、２工程）。
【０１３４】
（４）ドデシル　（３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式３９）の合成
【０１３５】
【化４１】
2004059536.tif 000061
【０１３６】
化合物（式３１、６．５５ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）のジメチルフォルムアミド（５０ｍｌ）溶液に、アルゴン気流下ヘキサンと１５−クラウン−５　エーテル（１５−ｃｒｏｗｎ−５　ｅｔｈｅｒ、６．３１ｍｌ、３１．８ｍｍｏｌ）で洗浄したナトリウムハイドライド（１．２７ｇ、３１．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌した。この反応溶液に、化合物（式３８、７．１６ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）のジメチルフォルムアミド（５０ｍｌ）溶液を加え、７０℃で５日間攪拌した。その反応液に少量のメタノール（１ｍｌ）を加え、酢酸エチル（１．２Ｌ）で希釈し、酢酸エチル溶液を水で洗浄後、減圧濃縮した。こうして得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　５００ｇ、アセトン／トルエン＝１／４０）にて精製したところ、（３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−α−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式３９）がシロップとして８．５３ｇ（収率９６％）得られた。
【０１３７】
化合物（式３９）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ６０Ｈ７６Ｏ１０
比旋光度：　［α］Ｄ２３　―１０°（ｃ　１．８、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000062
【０１３８】
（５）ドデシル　（３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−α−Ｄ−アラビノ−ヘクス−２−ウロピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式４１）の合成
【０１３９】
【化４２】
2004059536.tif 000063
【０１４０】
実施例４（４）で合成した化合物（式３９）の２’水酸基を常法によりアセチル化し、そのアセチル化物（式４０、７．３９ｇ、７７．２ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（１２０ｍｌ）に溶解後、無水酢酸（２２ｍｌ、０．２３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１１時間攪拌した。反応溶液にメタノール（１０ｍｌ）を加え、酢酸エチル（１．２Ｌ）で希釈し、その酢酸エチル溶液を水で洗浄後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　５００ｇ、酢酸エチル／トルエン＝１／５）にて精製したところ、ドデシル　（３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−α−Ｄ−アラビノ−ヘクス−２−ウロピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式４１）がシロップとして７．２ｇ（収率９８％）得られた。
【０１４１】
この化合物の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ６０Ｈ７４Ｏ１０
比旋光度：　［α］Ｄ２２　―８°（ｃ　１．１、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000064
【０１４２】
（６）ドデシル　（３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−アラビノ−ヘクス−２−ウロピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式４２）の合成
【０１４３】
【化４３】
2004059536.tif 000065
【０１４４】
実施例４（５）で得られた化合物（式４１、６．９８ｇ、７．３１ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１４０ｍｌ）に１，８−ジアザビシクロ［４，５，０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ、２．２ｍｌ、１４．６ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で１時間攪拌した。この反応溶液を酢酸エチル（１．２Ｌ）で希釈し、この酢酸エチル溶液を水で洗浄後減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　５００ｇ、酢酸エチル／トルエン＝１／４０）にて精製したところ、ドデシル　（３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−アラビノ−ヘクス−２−ウロピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式４２）が４．６６ｇ（収率６７％）得られた。
【０１４５】
化合物（式４２）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ６０Ｈ７４Ｏ１０
比旋光度：　［α］Ｄ２２　―８°（ｃ　０．５、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000066
【０１４６】
（７）ドデシル　（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式４３）およびドデシル　（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式４４）の合成
【０１４７】
【化４４】
2004059536.tif 000067
【０１４８】
実施例４（６）で得られた化合物（式４２、３０４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（６．０ｍｌ）溶液に１Ｍのボラン−テトラヒドロフラン複合体（１．２７ｍｌ、１．２７ｍｍｏｌ）をアルゴン気流下添加し、１６時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチル（６０ｍｌ）で希釈し、この酢酸エチル溶液を水で洗浄後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　３０ｇ、アセトン／ヘキサン＝１／１０）にて精製したところ、ドデシル　（３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式４３）が約２２０ｍｇ、ドデシル　（３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−５ａ−カルバ−β−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式４４）が２７ｍｇ得られた。前者を更に精製するために、常法により水酸基のアセチル化を行ない、得られたアセチル化物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　１８ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／１０）にて精製したところ、化合物（式４３）がシロップとして１３６ｍｇ（収率５２％）得られた。後者のβ−Ｄ−マンノピラノシル化合物も同様にアセチル化し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　１８ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／７）にて精製したところ、化合物（式４４）がシロップとして１６ｍｇ（収率９％）得られた。
【０１４９】
化合物（式４３）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ６２Ｈ７８Ｏ１１
比旋光度：　［α］Ｄ２２　＋９°（ｃ　０．９、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000068
【０１５０】
また、化合物（式４４）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ６２Ｈ７８Ｏ１１
比旋光度：　［α］Ｄ２３　―１．４°（ｃ　０．７、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000069
【０１５１】
（８）ドデシル　（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−４，６―ジ―Ｏ−メタンスルフォニル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式４５）およびドデシル　（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式４６）およびドデシル　（５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシド（ドデシル５ａ’−カルバ−β−Ｄ−ラクトシド）（式４）の合成
【０１５２】
【化４５】
2004059536.tif 000070
【０１５３】
実施例４（７）にしたがって合成した化合物（式４３、１．４２ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）を８０％酢酸水に加え、７０℃で１０時間加温した。その後、反応溶液を減圧濃縮し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山１００ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／２）にて精製したところ、粗ドデシル（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−マンノピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシドが８０５ｍｇ得られた。この全量をピリジン（１６ｍｌ）に溶解し、メタンスルホニルクロリド（０．４１ｍｌ、５．３ｍｍｏｌ）を加え、１４時間反応させた。その後、反応液にメタノール（０．１ｍｌ）加え、減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルに溶解し、その酢酸エチル溶液を、１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水で順次洗浄後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　６０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／５）にて精製したところ、ドデシル　（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−４，６―ジ―Ｏ−メタンスルフォニル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式４５）がシロップとして８８８ｍｇ（収率５９％）得られた。
【０１５４】
次に、８０％ジメチルフォルムアミド水（１５ｍｌ）に化合物（式４５、７２３ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）とナトリウムメトキシド（２．３８ｇ、２９ｍｍｏｌ）を加え、１２０℃で３日間攪拌した。この反応液を酢酸エチル（１５０ｍｌ）で希釈し、酢酸エチル溶液を水で洗浄後、減圧濃縮した。得られた残渣を常法によりアセチル化し、得られたアセチル化物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　６０ｇ、アセトン／ヘキサン＝１／１０）にて精製したところ、ドデシル　（２，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式４６）がシロップとして６５３ｍｇ（収率９１％）得られた。
【０１５５】
次に、化合物（式４６、５５１ｍｇ、０．５３３ｍｍｏｌ）を１Ｍ塩酸（０．５ｍｌ）を含むエタノール（１６ｍｌ）に溶解し、１０％パラジウム／炭素の触媒量存在下、室温で７時間加水素分解を行なった（水素圧は大気圧）。反応生成物を常法によりアセチル化し、得られたアセチル化物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　６０ｇ、アセトン／ヘキサン＝１／２）にて精製したところ、ドデシル　（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドがシロップとして４０７ｍｇ（収率９２％）得られた。この化合物（３３６ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を常法により脱アセチル化した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（片山　２０ｇ、メタノール／クロロホルム＝１／５）にて精製したところ、ドデシル　（５ａ−カルバ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシド（式４；ドデシル　５ａ’−カルバ−β−Ｄ−ラクトシドと同意）が結晶として２０４ｍｇ（収率９６％）得られた。
【０１５６】
化合物（式４５）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ５７Ｈ７８Ｏ１５Ｓ２
比旋光度：　［α］Ｄ２３　＋１０°（ｃ　１．２、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000071
【０１５７】
また、化合物（式４６）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ５９Ｈ７８Ｏ１３
比旋光度：　［α］Ｄ１９　＋１７°（ｃ　１．２、ＣＨＣｌ３）
2004059536.tif 000072
【０１５８】
また、化合物（式４）の化合物（式４５）の物性は以下の通りである。
分子式：Ｃ２５Ｈ４８Ｏ１０
比旋光度：　［α］Ｄ１９　−２１°（ｃ　１．０、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３＝１／１）
2004059536.tif 000073
【０１５９】
【試験例１】
特に断らない限り以下で用いる有機溶媒は、ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕ社製のスペクトル用特性試薬を、水はＭｉｌｌｉＱ水（以下ＭＱ）を用いた。
プライマー処理
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（理研細胞銀行）を１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ　　ＢＲＬ）含有ＤＭＥＭ（ＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ　　Ｉｎｃ．）（ペニシリンＧカリウム１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン０．１ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３　３．７ｇ／Ｌ添加）中で培養し、培地交換は隔日で行い、コンフルエントになったら、継代した。
試験に用いた各プライマーは１００ｍＭになるようにＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に溶解し、これをプライマーストック溶液とした。溶液の滅菌はフィルターろ過により行った。
細胞へのプライマー投与は、Ｂ１６細胞を１０６細胞／１００ｍｍφｄｉｓｈになるように播種し１５〜１８時間培養して細胞を接着させた後、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（トランスフェリン５０μｇ／Ｌ、インスリン５ｍｇ／Ｌ、二酸化セレン３０ｎＭ含有）で２回洗浄し、５０μＭの糖鎖プライマーを含有したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に加えることによって行った。
プライマーを投与した細胞を４８時間培養した後、氷上で反応をとめた。培地上清を回収した後、ＰＢＳ（−）で洗浄しながらセルスクレイパーで細胞を剥離した。この細胞懸濁液を遠心管に集め、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この上清を培地画分として回収した。沈殿した細胞はＰＢＳ（−）５００μｌに懸濁し、再び１０００ｒｐｍで５分間遠心分離をして沈殿を細胞画分、上清を培地画分として回収した。
【０１６０】
培地成分からの糖脂質成分の抽出
培地画分はＳｅｐ−Ｐａｋ　Ｃ−１８（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて糖脂質の抽出を行った。Ｓｅｐ−Ｐａｋ　Ｃ−１８にメタノール１０ｍｌを通してカラムを活性化し、ＭＱ１０ｍｌでカラムを平衡化させた。次に培地画分を２度通して糖脂質成分を吸着させ、ＭＱ１０ｍｌを通してカラムを洗浄した。続いてメタノール４ｍｌ、クロロホルム／メタノール＝２／１（ｖ／ｖ）を５ｍｌ通して糖脂質成分をカラムから溶出し、回収した溶液は遠心エバポレーターで濃縮した。
続いて、細胞画分をクロロホルム／メタノール＝２／１（ｖ／ｖ）を１ｍｌ加えて３０分間超音波照射した後、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。上清は分取し、窒素気流下で溶媒を蒸発させた。残渣にはクロロホルム／イソプロパノール／水＝７／１１／２（ｖ／ｖ／ｖ）１ｍｌを加えて３０分間超音波照射した後、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。上清は分取し先の抽出液と混合して、窒素気流下で溶媒を蒸発させた。
【０１６１】
培地画分及び細胞画分中の糖資質の分離同定
細胞画分、培地画分より抽出した糖脂質はＨＰＴＬＣプレート（層厚０．２ｎｍ、サイズ１０×２０ｃｍ、Ｓｉｌｉｃａ　Ｇｅｌ　６０　Ｍｅｒｃｋ）に展開することで分析した。培地画分は試料をクロロホルム／メタノール＝２／１（ｖ／ｖ）に溶解し、回収量の１／１０量をＨＰＴＬＣプレートにスポットし、クロロホルム／メタノール／０．２％ＣａＣｌ２水＝５／４／１（ｖ／ｖ／ｖ）の展開溶媒で展開した。細胞画分は、試料をクロロホルム／メタノール＝２／１（ｖ／ｖ）に溶解し、タンパク質量が５０μｇになるようにＨＰＴＬＣプレートにスポットし、クロロホルム／メタノール／０．２％ＣａＣｌ２水＝２／１（ｖ／ｖ）の展開溶媒で展開した。なお、タンパク量の測定はＢＩＯ−ＲＡＤ社のＤＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙを用い、測定方法は該キットの説明書に従い行った。展開したＨＰＴＬＣプレートは溶媒を乾燥させた後、プレートをレゾシノール−塩酸試薬（１０ｍｌの水にレゾシノール２００ｍｇを溶解し、塩酸８０ｍｌと０．１Ｍ硫酸銅０．２５ｍｌを加え、水を加えて１００ｍｌとした溶液）で染色し、シアル酸を持つ糖脂質を検出した。９５℃で、２０分間加熱し発色させた後、デンシトメーター（ＣＳ９０００、島津製作所）で測定波長５８０ｎｍで定量した。その後、オルシノール−硫酸試薬（濃硫酸１１．４ｍｌにオルシノールを２ｇ溶解させ、水で１００ｍｌとした溶液）で中性糖脂質を検出した。１００℃で５分間加熱し発色させた後、デンシトメーター（ＣＳ９０００、島津製作所）で測定波長５８０ｎｍで定量した。
【０１６２】
ＨＰＴＬＣプレートで糖脂質を分離した後、プリムリン試薬を十分に噴霧し、３６５ｎｍのＵＶ照射により糖脂質を視覚化し、印をつけた。このプレートをブロッティング用液（２−プロパノール／メタノール／０．２％ＣａＣｌ２水＝４０／７／２０（ｖ／ｖ／ｖ））に２０秒浸した後、ｇｌａｓｓ　ｆｉｂｅｒ　ｆｉｌｔｅｒ　（ＡＣ−５９７２　　ＡＴＴＯ）の上にシリカゲル面を上にしておき、その上にＰＶＤＦ膜（クリアブロットＰ膜、ＡＥ−６６０５、ＡＴＴＯ）、ＰＴＦＥ膜（ＡＣ−５９７３　ＡＴＴＯ）、ｇｌａｓｓ　ｆｉｂｅｒ　ｆｉｌｔｅｒの順にのせてＴＬＣサーマルブロッター（ＡＣ−５９７０　ＡＴＴＯ）　（１８０℃、３０秒）で糖脂質をＰＶＤＦ膜にブロッティングした。ブロッティング溶液を乾かし、水洗した後、目的部分を切り取った。切り取ったＰＶＤＦ膜から、メタノール１ｍｌ、クロロホルム／メタノール＝２／１（ｖ／ｖ）１ｍｌで順に抽出し、溶媒をあわせて蒸発させて糖脂質を単離した。
【０１６３】
単離した糖脂質をクロロホルム／メタノール＝１／１（ｖ／ｖ）２０μｌに溶解し、そのうち１μｌを０．６４Ｍ　　ＤＨＢ（２．５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）の１０％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）２μｌに加えて良く撹拌した。このうち１μｌをサンプルプレート上に展開し、風乾させた。この糖脂質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳで質量分析した。
マススペクトルは、Ｖｏｙａｇｅｒ　ＤＥＴＭ　ＢｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＴＭ　Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　を用いて測定した。
【０１６４】
化合物（式１）をプライマーとする細胞内糖鎖伸長試験結果
【０１６５】
【化４６】
2004059536.tif 000074
【０１６６】
本発明の化合物（式１）のプライマーの存在下でＢ１６マウスメラノーマ細胞の培養を行った培地画分をＨＰＴＬＣにより分析したところ、本発明化合物のプライマーはＢ１６マウスメラノーマ細胞によりガラクトースでグリコシル化（生成物１ａ）され、さらにシアル酸でグリコシル化（生成物１ｂ）されることが認められた。一方、プライマーの存在下で培養を行った細胞画分を分析したところ、細胞画分にはガラクトースでグリコシル化されたプライマー及びさらにシアル酸でグリコシル化されたプライマーは検出されず、ガラクトースでグリコシル化されたプライマー及びさらにシアル酸でグリコシル化されたプライマーは、細胞内に蓄積されずに、培地中に分泌されることが示された。
図１に示すように、単離した生成物１ａ及び生成物１ｂの質量分析によっても、生成物１ａの予想化合物　（式１−１、計算値　４５３．２７　［Ｍ＋Ｈ］＋）及び生成物１ｂの予想化合物（式１−２、計算値　７４２．３５　［Ｍ−Ｈ］−）のそれぞれの理論分子量とほぼ同じ位置（４５３．５８及び７４２．６５）に分子イオンピークが現れた。
【０１６７】
化合物（式２）をプライマーとする細胞内糖鎖伸長試験結果
【０１６８】
【化４７】
2004059536.tif 000075
【０１６９】
本発明の化合物（式２）のプライマーの存在下でＢ１６マウスメラノーマ細胞の培養を行った培地画分をＨＰＴＬＣにより分析したところ、本発明化合物のプライマーはＢ１６マウスメラノーマ細胞によりシアル酸でグリコシル化（生成物２ａ）されることが認められた。一方、プライマーの存在下で培養を行った細胞画分を分析したところ、細胞画分にはシアル酸でグリコシル化されたプライマーは検出されず、シアル酸でグリコシル化されたプライマーは、細胞内に蓄積されずに、培地中に分泌されることが示された。
図２に示すように、単離した生成物３の質量分析によっても、生成物２ａの予想化合物（式２−１、計算値　６３６．３６　［Ｍ−Ｈ］−）の理論分子量とほぼ同じ位置（６３６．６２）に分子イオンピークが現れた。
【０１７０】
化合物（式３）をプライマーとする細胞内糖鎖伸長試験結果
【０１７１】
【化４８】
2004059536.tif 000076
【０１７２】
本発明の化合物（式３）のプライマーの存在下でＢ１６マウスメラノーマ細胞の培養を行った培地画分をＨＰＴＬＣにより分析したところ、本発明化合物のプライマーはＢ１６マウスメラノーマ細胞によりガラクトースでグリコシル化（生成物３ａ）され、さらに１個（生成物３ｂ）及び２個のシアル酸でグリコシル化（生成物３ｃ）されることが認められた。一方、プライマーの存在下で培養を行った細胞画分を分析したところ、細胞画分にはガラクトースでグリコシル化されたプライマー及びさらに１個及び２個のシアル酸でグリコシル化されたプライマーは検出されず、ガラクトースでグリコシル化されたプライマー及びさらに１個及び２個のシアル酸でグリコシル化されたプライマーは、細胞内に蓄積されずに、培地中に分泌されることが示された。
図３に示すように、単離した生成物３ａ、３ｂ及び生成物３ｃの質量分析によっても、生成物３ａの予想化合物（式３−１、計算値　５５０．３６　［Ｍ＋Ｈ］＋）、及び、生成物３ｂの予想化合物（式３−２、計算値　８６３．４４　［Ｍ＋Ｎａ］＋、８８５．４２　［Ｍ−Ｈ＋２Ｎａ］＋）、及び、生成物３ｃの予想化合物（式３−３、計算値　１１９８．４９　［Ｍ−２Ｈ＋３Ｎａ］＋）のそれぞれの理論分子量とほぼ同じ位置（生成物３ａ；５５０．９９、生成物３ｂ；８６３．４７及び８８５．４２、生成物３ｃ；１１９９．６７）に分子イオンピークが現れた。
【０１７３】
分析結果４　化合物（式４）をプライマーとする細胞内糖鎖伸長試験
【０１７４】
【化４９】
2004059536.tif 000077
【０１７５】
本発明の化合物（式４）のプライマーの存在下でＢ１６マウスメラノーマ細胞の培養を行った培地画分をＨＰＴＬＣにより分析したところ、本発明化合物のプライマーはＢ１６マウスメラノーマ細胞によりシアル酸でグリコシル化（生成物４ａ）されることが認められた。一方、プライマーの存在下で培養を行った細胞画分を分析したところ、細胞画分にはシアル酸でグリコシル化された化合物（生成物４ａ）は少量検出されたので、シアル酸でグリコシル化された化合物（生成物４ａ）は、ほとんどが細胞外へ放出されるが、一部は細胞内にとどまっていることが示された。
図４に示すように、単離した生成物４ａの質量分析によっても、予想生成物であるシアル酸でグリコシル化された化合物（式４−１、計算値　７９８．４１　［Ｍ−Ｈ］−）の理論分子量とほぼ同じ位置（７９８．１６）に分子イオンピークが現れた。
また、シアル酸の結合様式が、糖脂質ＧＭ３（ラクトシルセラミドにシアル酸がα−２−３結合している）と同一であるか調査するため、α−２−３−Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅでシアル酸でグリコシル化された化合物（生成物４ａ）を処理した。その結果、分解によりシアル酸とプライマー（式４）がそれぞれ検出され、シアル酸の結合様式が、糖脂質ＧＭ３と同一であることが確認された。
【０１７６】
【試験例２】
酵素阻害活性検定
本発明の４化合物（式１、式２、式３及び式４）の存在下で、酵素による基質の分解反応を行い、その分解程度より本発明の式１、式２、式３及び式４で示される、それぞれの化合物の酵素阻害活性を調査した。
酵素反応液（４ｍＭ　ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−α−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ）、１０ｍＭ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ７．０）　、２μＵ　β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ｂｏｖｉｎｅ　ｌｉｖｅｒ　ＳＩＧＭＡ））、本発明の式１、式２、式３及び式４の化合物それぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ）を調製し、９６穴マイクロタイタープレート１穴当り５０μｌの容量で、３７℃で６０分間反応させた。反応後、反応停止液（０．２Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３）　１５０μｌを加え反応を停止し、測定波長４１０ｎｍでの吸光度を測定し、対照区と比較して阻害活性を評価した。
特に強い阻害活性が見られたものについては、上記酵素反応液中の、本発明の化合物の濃度を１０倍段階希釈して、同条件で反応を行い、５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を決定した。
【０１７７】
測定結果
阻害活性の測定の結果、本発明の式１、式２、式３及び式４で示される化合物は、すべてβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅに対する阻害活性を示した。その阻害程度は、本発明の式１、式２、式３及び式４の化合物それぞれ、対照区と比較して、６５％阻害、８７％阻害、８４％阻害、５３％阻害であった。
特に強い阻害活性の見られた式２及び式３の化合物については、ＩＣ５０値の決定を行った。その結果、それぞれのＩＣ５０値は、６．４μＭ　、５２ｍＭであった。
【０１７８】
【発明の効果】
本発明により、種々の生理活性を有すると期待される新規な擬似糖鎖の創出を行うための新規糖鎖合成用プライマーが提供される。また、種々の生理活性を示す可能性の高い新規構造が提供される。
【０１７９】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は化合物（式１）のプライマーの存在下でＢ１６マウスメラノーマ細胞によりガラクトースでグリコシル化されることが認められた生成物１ａ、及び生成物１ａがシアル酸でグリコシル化されることが認められた生成物１ｂの質量スペクトルを示す。
【図２】図２は化合物（式２）のプライマーの存在下でＢ１６マウスメラノーマ細胞によりシアル酸でグリコシル化されることが認められた生成物２ａの質量スペクトルを示す。
【図３】図３は化合物（式３）のプライマーの存在下でＢ１６マウスメラノーマ細胞によりガラクトースでグリコシル化されることが認められた生成物３ａ、及び生成物３ａがシアル酸でグリコシル化されることが認められた生成物３ｂ、及び生成物３ｂが更にシアル酸でグリコシル化されることが認められた生成物３ｃの質量スペクトルを示す。
【図４】図４は化合物（式４）のプライマーの存在下でＢ１６マウスメラノーマ細胞によりシアル酸でグリコシル化されることが認められた生成物４ａの質量スペクトルを示す。
【図１】
2004059536.tif 000088
【図２】
2004059536.tif 000089
【図３】
2004059536.tif 000090
【図４】
2004059536.tif 000091