(57)【要約】    【課題】  常温もしくはそれ以上の過酷な条件においても長期間の保存安定性に優れ、高い血液凝固性能を長期間にわたって安定して発揮することのできる血液凝固促進剤、及び、この血液凝固促進剤が収容された血液検査用容器を提供する。    【解決手段】  ペプチド鎖において、アルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素、並びに、式（１）で表される安定化剤からなることを特徴とする血液凝固促進剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド鎖において、アルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素、並びに、式（１）で表される安定化剤からなることを特徴とする血液凝固促進剤。
【化１】
2004163423.tif 000004
（式中、Ｒ1，Ｒ2はＨ又はアルキル基を示し、ｎは２〜７の整数である）
【請求項２】
ｐＨ５．５〜７．５の水溶液であることを特徴とする請求項１記載の血液凝固促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の血液凝固促進剤が容器内に収容されてなることを特徴とする血液検査用容器。
【請求項４】
請求項１又は２記載の血液凝固促進剤が有底の管状容器内に収容され、乾燥されてなることを特徴とする血液検査用容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固促進剤及び血液検査用容器に関し、さらに詳しくは、血清生化学検査等の臨床検査において用いられる血液凝固促進剤、及び、この血液凝固促進剤が収容された血液検査用容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清生化学検査等の臨床検査において、血液からより短時間に血清を採取したい場合に、血液凝固促進剤として酵素が使用されている。血液凝固促進剤として使用される酵素は、ペプチド鎖において、アルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得るものであり、代表的な酵素として、トロンビンが挙げられる。
トロンビンは、シリカ等に代表される無機系の血液凝固促進剤よりも血液凝固活性が高く、急速に血液を凝固し、極めて短時間で血清を得ることができる。
【０００３】
しかしながら、トロンビンは不安定な酵素であり、安定に保存することは難しく、高い血液凝固性能を長期間にわたって安定して発揮させることは困難であった。トロンビンを安定に保存する方法としては、従来より凍結乾燥が用いられているが、長時間の安定性を得るために、アルミ包装やガラス容器等で保存し、常に適切な保存形態を維持する必要があった。特に、透湿性のある容器で保存する場合は、安定に保存することは困難であった。
【０００４】
また、トロンビンを水溶液中で安定に保存する方法として、例えば、安定化剤として糖及びアミノ酸を含むトロンビン水性液状組成物が開示されている（特許文献１参照）。しかしながら、この方法は、低温で短期間の保存には有効であるが、特に常温もしくはそれ以上の過酷な条件で長期間の保存安定性が要求される、血液凝固促進剤及び血液検査用容器に適用できるものではなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開昭６４−４０４３３号公報
【０００６】
さらに、トロンビンの乾燥製剤の安定化技術として、例えば、糖類、塩基性アミノ酸及び有機酸塩からなる乾燥製剤が開示されている（特許文献２参照）。
しかしながら、この乾燥製剤は、低温で短期間の保存には有効であるが、特に常温もしくはそれ以上の過酷な条件で長期間の保存安定性が要求される、血液凝固促進剤及び血液検査用容器に適用できるものではなかった。また、湿度の影響を受けやすいため、特に、透湿性のある容器で保存する場合は、安定性は十分ではなかった。
【０００７】
【特許文献２】特開平２−５３７３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来の問題点に鑑み、その目的は、常温もしくはそれ以上の過酷な条件においても長期間の保存安定性に優れ、高い血液凝固性能を長期間にわたって安定して発揮することのできる血液凝固促進剤、及び、この血液凝固促進剤が収容された血液検査用容器を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の血液凝固促進剤は、ペプチド鎖において、アルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素、並びに、式（１）で表される安定化剤からなることを特徴とする。
【００１０】
本発明の血液検査用容器は、上記血液凝固促進剤が容器内に収容されてなることを特徴とする。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の血液凝固促進剤は酵素及び安定化剤からなる。
上記酵素としては、ペプチド鎖において、アルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及びリジンと任意のアミノ酸残基との結合のうち、少なくともいずれか一方を加水分解し得るものが用いられる。
【００１２】
上記加水分解性を有する酵素としては、例えば、トリプシン、トロンビン、毒蛇トロンビン様酵素等のセリンプロテアーゼ；カテプシンＢ、フィシン等のチオールプロテアーゼ；キニナーゼＩ等の金属プロテアーゼなどが挙げられ、これらの中でもセリンプロテアーゼが好ましく、特にトロンビンが好適に用いられる。トロンビンの調製方法は、特に限定されず、例えば、動物（ヒト、ウシ等）の血漿から精製して得られたものを用いることができる。
【００１３】
血液凝固促進剤における上記酵素の使用量は、少なくなると血液凝固に要する時間がかかりすぎ、多くなると凝固が速くなり過ぎて、不均一な凝固となったり、検査値に悪影響を及ぼす可能性がある。
使用量の目安としては、０．１〜１００ＩＵ（国際単位）が好ましく、例えば、酵素としてトロンビンを使用する場合、その使用量は、血液１ｍＬ（ミリリットル）当たり０．５〜５０ＩＵが好ましく、より好ましくは１〜２０ＩＵである。
【００１４】
上記安定化剤としては、式（１）で表されるものが用いられる。
【化２】
2004163423.tif 000002
式中、Ｒ1，Ｒ2はＨ又はアルキル基を示し、ｎは２〜７の整数である。
【００１５】
上記式（１）で表される安定化剤としては、例えば、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、５−アミノ吉草酸、６−アミノヘキサン酸、８−アミノカプリル酸、及びそれらの誘導体等が挙げられる。
【００１６】
上記酵素の安定化剤として、従来よりよく知られているグリシン、α−アラニン等のアミノ酸を使用しても、高温多湿の過酷な条件下では十分な安定化効果が得られず、長期間保存することができない。しかしながら、上記式（１）で表される安定化剤を用いることにより、上記酵素に対し、高温多湿の過酷な条件下でも十分な安定化効果を得ることができる。
【００１７】
血液凝固促進剤における上記安定化剤の使用量は、血液１ｍＬ当たり１×１０-5〜１００ｍｇが好ましく、より好ましくは１×１０-4〜１ｍｇである。
【００１８】
上記血液凝固促進剤には、後述する血液検査用容器内面に血餅が付着するのを防止するために、血餅剥離成分として、例えば、疎水性シリコーンオイル、親水性シリコーンオイル、水溶性高分子物質等が添加されてもよい。
【００１９】
さらに、上記血液凝固促進剤には、上記血餅剥離成分以外にも、抗線溶剤及び／又は抗プラスミン剤が添加されてもよい。
抗線溶剤及び抗プラスミン剤としては、例えば、アプロチニン、大豆トリプシンインヒビター、ｐ−アミノメチル安息香酸、アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
【００２０】
上記抗線溶剤及び／又は抗プラスミン剤の使用量としては、得られる血清を用いた臨床検査に影響を与えない程度の量で血液凝固促進剤中に含有されることが好ましい。例えば、アプロチニンは血液１ｍＬ当たり約１００〜６００ＫＩＵ（単位）の割合で、大豆トリプシンインヒビターは血液１ｍＬ当たり約５００〜４０００ＦＵ（単位）の割合で、そしてｐ−アミノメチル安息香酸、アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸はいずれも血液１ｍＬ当たり約１×１０-5〜１００ｍｇの割合となるように血液凝固促進剤中に含有されることが好ましい。
【００２１】
本発明の血液凝固促進剤は、上記加水分解性を有する酵素及び式（1)で表される安定化剤を含有する水溶液として用いてもよい。
【００２２】
上記血液凝固促進剤を水溶液として用いる際は、水溶液のｐＨを５．５〜７．５の範囲に保つことが好ましい。上記ｐＨ範囲に保つことにより、水溶液中の血液凝固促進剤の安定性が向上し、また、水溶液を乾燥した後においても血液凝固促進剤の安定性が向上し、酵素の失活を防止することができる。
【００２３】
また、上記血液凝固促進剤の水溶液のｐＨを５．５〜７．５の範囲に保つために、クエン酸−リン酸ニナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液が用いられてもよい。
【００２４】
本発明の血液検査用容器は、上記血液凝固促進剤が容器内に収容されてなる。
上記血液凝固促進剤を用いて血液を凝固させるためには、例えば、容器中に採取した血液に上記血液凝固促進剤を加えてもよいが、予め上記血液凝固促進剤が内部に収容された血液検査用容器とするのが好ましい。
【００２５】
上記血液凝固促進剤を容器に収容する方法は特に限定されないが、例えば、上記血液凝固促進剤を水溶液など溶液又は分散液とし、これらの液を容器内に滴下する方法、これらの液を管壁にスプレー等により塗布する方法などが挙げられ、さらに、特に容器が後述するような真空採血管などの有底の管状容器である場合には、溶液又は分散液として収容された血液凝固促進剤を乾燥するのが好ましい。
【００２６】
乾燥方法は特に限定されず、例えば、真空乾燥、加熱乾燥、温風乾燥、シリカゲルや除湿空気等による除湿乾燥などが挙げられる。このように血液凝固促進剤を乾燥して収容することで、血液凝固促進剤の保存安定性が向上する。
【００２７】
また、上記血液凝固促進剤は、例えば、乾燥粉末、顆粒等の予め乾燥した状態で容器内に収容されてもよい。さらに、例えば、不織布、織布、樹脂製シート、樹脂製ビーズ等の担体に、上記血液凝固促進剤が担持された状態で容器内に収容されてもよい。
【００２８】
上記容器は、合成樹脂製であってもガラス製であってもよく、材質は特に限定されない。
合成樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート等が挙げられ、特にポリエチレンテレフタレートが好適に用いられる。
上記容器の形状も特に限定されず、例えば、有底の管状容器が好適に用いられ、容器を密閉する栓体と組み合わせて使用されることが多い。
上記栓体としては、例えば、合成樹脂、エラストマー、ゴム等の材質からなるものが挙げられ、ゴムとしては、例えば、ブチルゴム、ハロゲン化ブチルゴム等が好適に用いられる。
【００２９】
上記血液検査用容器は、例えば、容器内を減圧として真空採血管として用いられてもよい。真空採血管として用いられる場合、容器は有底の管状容器が好適に用いられ、容器を密閉する栓体と組み合わせて使用される。
また、検査用血清や血漿を効率的に採取するために、血液検査用容器には血清分離剤や血漿分離剤などが収容されてもよい。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の血液凝固促進剤は、上述の通りの構成であり、高温多湿のような過酷な条件においても保存安定性が優れ、高い血液凝固性能を長期間にわたって安定して発揮することができるので、血液検査用容器に好適に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）
トロンビン（持田製薬社製）２５万単位及び３−アミノプロピオン酸１０ｍモル（０．８９ｇ）を１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに、水溶液の１重量％に相当する親水性シリコーンオイル及び１重量％に相当する水溶性高分子物質を添加した。得られた血液凝固促進剤の水溶液のｐＨは５．９であった。
この血液凝固促進剤の水溶液を、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）製の有底の管状容器（内径１０ｍｍ×長さ１００ｍｍ）の内部に２０μＬスプレーし、真空乾燥機で１２時間乾燥した後、ゴム製の栓体で減圧密封して血液検査用容器（真空採血管）を得た。
【００３３】
（実施例２）
トロンビン（持田製薬社製）２５万単位及び３−アミノプロピオン酸２０ｍモル（１．７８ｇ）を１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに、水溶液の１重量％に相当する親水性シリコーンオイル及び１重量％に相当する水溶性高分子物質を添加した。得られた血液凝固促進剤の水溶液のｐＨは６．１であった。
この血液凝固促進剤の水溶液から、実施例１と同様にして血液検査用容器（真空採血管）を得た。
【００３４】
（実施例３）
トロンビン（持田製薬社製）２５万単位、３−アミノプロピオン酸１０ｍモル（０．８９ｇ）及びアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸１ｇを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに、水溶液の１重量％に相当する親水性シリコーンオイル及び１重量％に相当する水溶性高分子物質を添加した。得られた血液凝固促進剤の水溶液のｐＨは６．４であった。
この血液凝固促進剤の水溶液から、実施例１と同様にして血液検査用容器（真空採血管）を得た。
【００３５】
（実施例４）
トロンビン（持田製薬社製）２５万単位及び４−アミノ酪酸１０ｍモル（１．０３ｇ）を１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに、水溶液の１重量％に相当する親水性シリコーンオイル及び１重量％に相当する水溶性高分子物質を添加した。得られた血液凝固促進剤の水溶液のｐＨは６．４であった。
この血液凝固促進剤の水溶液から、実施例１と同様にして血液検査用容器（真空採血管）を得た。
【００３６】
（実施例５）
トロンビン（持田製薬社製）２５万単位及び５−アミノ吉草酸１０ｍモル（１．１７ｇ）を１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに、水溶液の１重量％に相当する親水性シリコーンオイル及び１重量％に相当する水溶性高分子物質を添加した。得られた血液凝固促進剤の水溶液のｐＨは６．１であった。
この血液凝固促進剤の水溶液から、実施例１と同様にして血液検査用容器（真空採血管）を得た。
【００３７】
（実施例６）
トロンビン（持田製薬社製）２５万単位及び６−アミノヘキサン酸１０ｍモル（１．３１ｇ）を１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに、水溶液の１重量％に相当する親水性シリコーンオイル及び１重量％に相当する水溶性高分子物質を添加した。得られた血液凝固促進剤の水溶液のｐＨは６．８であった。
この血液凝固促進剤の水溶液から、実施例１と同様にして血液検査用容器（真空採血管）を得た。
【００３８】
（実施例７）
トロンビン（持田製薬社製）２５万単位及び８−アミノカプリル酸１０ｍモル（１．５９ｇ）を１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに、水溶液の１重量％に相当する親水性シリコーンオイル及び１重量％に相当する水溶性高分子物質を添加した。得られた血液凝固促進剤の水溶液のｐＨは６．９であった。
この血液凝固促進剤の水溶液から、実施例１と同様にして血液検査用容器（真空採血管）を得た。
【００３９】
（比較例１〜１６）
トロンビン（持田製薬社製）２５万単位及び表１に示した安定化剤１０ｍモルを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに、水溶液の１重量％に相当する親水性シリコーンオイル及び１重量％に相当する水溶性高分子物質を添加した。得られた血液凝固促進剤の水溶液のｐＨは表１に示した通りであった。
この血液凝固促進剤の水溶液から、実施例１と同様にして血液検査用容器（真空採血管）を得た。
【００４０】
上記実施例及び比較例で得られた血液検査用容器を、３５℃、７５％ＲＨの恒温恒湿槽で保存し、保存２週間後及び保存１ケ月後のトロンビン力価（保存前に対する残存率）を測定して、安定性の評価を行った。測定したトロンビン力価残存率を表１に示した。
また、上記の保存１ケ月後の血液検査用容器について、健常人より血液５ｍＬを真空採血し転倒混和を行い、５分間放置した後遠心分離を行った。このときの血清中のフィブリン発生の有無、血清収率について観察した。結果を表１に示した。
【００４１】
【表１】
2004163423.tif 000003