(57)【要約】【課題】ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼに対する分解作用を示すことによって、ヘリコバクター・ピロリ菌の除菌に有効であり、かつ、薬剤耐性菌の出現を回避することができる抗体酵素及びその利用方法を提供する。【解決手段】ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼのモノクローナル抗体を作製し、そのモノクローナル抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の可変領域のアミノ酸配列、塩基配列を決定した。続いて、このアミノ酸配列について分子モデリングを行い、その３次元構造を推定し触媒三つ組残基構造を有しているか否かを確認した。そして、上記モノクローナル抗体の可変領域のうち、触媒三つ組残基構造を有するものを抗体酵素として取得し、ウレアーゼを分解することが確認された。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼの抗体またはその抗体断片であり、かつ、前記ウレアーゼの分解酵素として作用する抗体酵素。
【請求項２】
前記抗体酵素は、前記ウレアーゼの抗体の可変領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体酵素。
【請求項３】
前記抗体酵素は、触媒三つ組残基構造を有することを特徴とする請求項１または２に記載の抗体酵素。
【請求項４】
配列番号１に示すアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の抗体酵素。
【請求項５】
配列番号２に示すアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の抗体酵素。
【請求項６】
配列番号３に示すアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の抗体酵素。
【請求項７】
配列番号４に示すアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の抗体酵素。
【請求項８】
配列番号６に示すアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の抗体酵素。
【請求項９】
配列番号８に示すアミノ酸配列、又は、配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の抗体酵素。
【請求項１０】
請求項１ないし９の何れか１項に記載の抗体酵素を含んでなるヘリコバクター・ピロリ菌の感染患者に対する治療薬。
【請求項１１】
請求項１ないし９の何れか１項に記載の抗体酵素を含んでなるヘリコバクター・ピロリ菌の感染予防剤。
【請求項１２】
請求項１ないし９の何れか１項に記載の抗体酵素をコードする遺伝子。
【請求項１３】
配列番号５に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項１２に記載の遺伝子。
【請求項１４】
配列番号７に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項１２に記載の遺伝子。
【請求項１５】
配列番号９に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項１２に記載の遺伝子。
【請求項１６】
請求項１２ないし１５の何れか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１７】
前記遺伝子を植物に導入し、発現させることを特徴とする請求項１６に記載の形質転換体。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の形質転換体を含んでなるヘリコバクター・ピロリ菌の感染予防剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼに対する抗体酵素、それをコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらを利用したヘリコバクター・ピロリ菌の感染患者に対する治療薬・感染予防剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　Ｐｙｌｏｒｉ）菌は、細長いＳ字型のグラム陰性菌であり、組織学的に胃潰瘍発症者や消化性潰瘍発症者の胃の生体試料から高い頻度で検出される。このことから、ヘリコバクター・ピロリ菌は胃潰瘍・胃炎の原因菌であると考えられ、かつ最終的には胃癌の発生にも関わっていることが示唆される。このことは、ＷＨＯ（世界保健機関）からも報告されている。
【０００３】
このヘリコバクター・ピロリ菌（以下、ＨＰと称する）に感染している日本人の割合は、５０歳以上の成人では８０％にものぼると言われており、ＨＰ菌の除菌と迅速診断に関する研究開発が社会的に要請されている。ＨＰを除菌するために、これまでにいくつかの抗生物質が開発されているが、最近では３種の抗生物質を併用した形でＨＰ感染患者への投与が行われており、かなりの治癒効果が認められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、細菌やウィルスを除去するための抗菌剤や抗ウィルス剤として、抗生物質がその主役を担ってきた。ところが近年、抗生物質に対する薬剤耐性菌の出現スピードが非常に早くなってきている。抗生物質の開発に約１０年の期間を必要とするにもかかわらず、最近では抗生物質を投与後、早いものであれば数ヶ月で耐性菌が出現して抗生物質が効かなくなるというケースが報告されて問題となっている。
【０００５】
ヘリコバクター・ピロリ菌に関しても同様の問題が発生しており、抗生物質投与開始後間もないにもかかわらず、すでにＨＰに対する耐性菌の出現が報告されている。また、抗生物質による除菌後に胃潰瘍を再発するケースも見られることが明らかとなってきた。こうした背景から、ＨＰに対してこれまでとは違う新しい薬剤の開発が望まれている。
【０００６】
ところで、ヒトの胃内は胃酸の分泌によって酸性が強くなっているため、通常外部から侵入した細菌は生存することができないが、ヘリコバクター・ピロリ菌は、自身の細胞外膜に発現しているウレアーゼの作用によって、酸性の強い胃内でも生存することができる。そこで、ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼの活性を抑制すれば、当該菌は胃内で生存することが不可能になり、感染を防ぐことができる。
【０００７】
本発明はこの点に着目し、ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼに対する分解作用を示すことによって、ヘリコバクター・ピロリ菌の除菌に有効であり、かつ、薬剤耐性菌の出現を回避することができる抗体酵素を提供するものである。さらに本発明は、その抗体酵素をコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらを利用したヘリコバクター・ピロリ菌感染患者の治療薬・感染予防剤を提供するものでもある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、上記課題を解決するために、抗体でありながら酵素作用を有し、標的としたタンパク質を完全分解することのできる抗体酵素に着目し、ＨＰウレアーゼに対する抗体酵素を得るために鋭意検討した。その結果、ＨＰウレアーゼに対する抗体のうち、抗体酵素としての機能を発揮するものが存在することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
即ち、本発明に係る抗体酵素は、ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼを抗原とする抗体またはその抗体断片であり、かつ、上記ウレアーゼの分解酵素として作用するものである。ここで、上記「抗体断片」とは、ＨＰウレアーゼを抗原とする抗体を構成する各ペプチド鎖、さらにはこの各ペプチド鎖内の一部の領域のペプチド断片を意味する。
【００１０】
また、上記「抗体酵素」とは、抗体でありながら酵素作用を有するものであり、その中でも特に、その抗原タンパク質を標的として高い分解活性を示すものは「スーパー抗体酵素」と呼ばれる。上記「スーパー抗体酵素」は、標的としたタンパク質を完全分解することができ、しかも天然型酵素に近い活性を有する（参考文献：Ｓｕｐｅｒ　Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　［Ｉ］　：　Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｂｙ　ｉｔｓ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ．　Ｈｉｆｕｍｉ，　Ｅ．，　Ｏｋａｍｏｔｏ，　Ｙ．，　Ｕｄａ，　Ｔ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｅｎｇ．，　８８（３），　３２３−３２７　（１９９９））。本発明の抗体酵素は、ＨＰウレアーゼを抗原とする抗体であり、当該ＨＰウレアーゼを完全分解するため、「スーパー抗体酵素」に含まれる。
【００１１】
上記抗体酵素は、ＨＰウレアーゼの抗体としての性質を色濃く残した状態で、その抗原であるＨＰウレアーゼを分解するという性質を持っている。そのため、上記抗体酵素は特異性が高く、ヘリコバクター・ピロリ菌の生存に不可欠なウレアーゼのみを狙って分解することができる。
【００１２】
また、抗菌剤や抗ウィルス剤として抗生物質を用いた場合、細菌やウィルスが自身のタンパク質を変異させることで、抗生物質に対する耐性を獲得し、薬剤耐性菌（細胞）が出現してしまう。しかしながら、細菌やウィルスは自身の生存に必須となる部分は変異させることができない。上記抗体酵素はその必須部分であるウレアーゼを狙って攻撃し、その生理活性を完全に消失させることができるため、症状の回復はもちろん、薬剤耐性菌（細胞）の出現も回避することができる。
【００１３】
上記抗体酵素は、ＨＰウレアーゼの抗体の可変領域を含むことが好ましい。この「可変領域」とは、抗体を構成するＨ鎖及びＬ鎖のうち、Ｎ末端から約１１０残基のアミノ酸からなる部分のことである。この可変領域は、抗体の種類によって一次構造に多様性が見られ、抗体が酵素としての活性を有する場合にその活性中心が含まれている可能性が高い。それゆえ、上記抗体酵素が抗体の可変領域を含めば、酵素として高い活性を有することができる。
【００１４】
また、上記抗体酵素は触媒三つ組残基構造を有することが好ましい。なお、「触媒三つ組残基構造」とは、少なくともセリンを含む３つのアミノ酸残基が活性部位に含まれ活性中心を形成していると推定される構造のことを言う。この触媒三つ組残基構造を有するプロテアーゼは、活性部位にセリンが含まれることからセリンプロテアーゼと呼ばれる。従って、上記抗体酵素はセリンプロテアーゼの一種であると言うこともできる。この触媒三つ組残基と推定される構造を有していれば、プロテアーゼとして高い活性を有していると予測できる。
【００１５】
本発明に係る抗体酵素として、具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００１６】
上記配列番号１に示すアミノ酸配列は、ＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＨｐＵ−１８のＬ鎖の可変領域である。このＨｐＵ−１８のＬ鎖の可変領域は、後述の実施例にも示されるように、ＨＰウレアーゼの分解酵素として高い活性が認められた。
【００１７】
また、上記「１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加」とは、例えば、遺伝子工学的手法を用いて部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されるものであればよい。このように、遺伝子工学的手法を用いた場合、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる抗体酵素は、換言すれば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる抗体酵素の変異体である。
【００１８】
本発明に係る抗体酵素の他の例として、配列番号２、３、４、６、８の何れかに示すアミノ酸配列を含んでなるもの、さらに、配列番号２、３、４、６、８の何れかに示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００１９】
配列番号２に示すアミノ酸配列は、ＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＨｐＵ−９のＬ鎖の可変領域であり、配列番号３に示すアミノ酸配列はＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＨｐＵ−２のＨ鎖の可変領域である。また、配列番号４に示すアミノ酸配列は、ＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＨｐＵ−２０のＬ鎖の可変領域であり、配列番号６に示すアミノ酸配列は、上記ＨｐＵ−２０のＨ鎖の可変領域である。さらに、配列番号８に示すアミノ酸配列は、ＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＵＡ−１５のＬ鎖の可変領域である。これらのアミノ酸配列を有する抗体酵素についても、後述の実施例に示されるようにＨＰウレアーゼの分解酵素として高い活性が認められた。
【００２０】
上記抗体酵素は、ＨＰ菌の生存に必須であるＨＰウレアーゼを分解する作用があるため、ＨＰ菌の除菌に利用することができる。それゆえ、本発明に係るＨＰ菌の感染患者に対する治療薬は、上記抗体酵素を含んでなるものである。この治療薬は経口で服用したら、胃内に生存しているＨＰ菌を直接攻撃することが可能であるため、副作用が少ないとともに、即時的に効果を発揮することができる。
【００２１】
なお、上記抗体酵素は、治療薬として利用できるだけでなく、経口摂取が可能なことから食品などに含ませ、日常的に摂取しＨＰ菌の感染を予防することが可能である。従って、本発明には、上記抗体酵素を含んでなるＨＰ菌の感染予防剤も含まれる。
【００２２】
本発明には上記抗体酵素をコードする遺伝子も含まれ、この遺伝子を適当な宿主（例えば細菌、酵母）に導入すれば、本発明の抗体酵素をその宿主内で発現させることができる。
【００２３】
本発明に係る遺伝子として具体的には、配列番号５、７、９、１４、１５、１６の何れかに示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号５に示す塩基配列は、ＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＨｐＵ−２０の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列であり、配列番号７に示す塩基配列は、ＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＨｐＵ−２０の重鎖（Ｈ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。また、配列番号９に示す塩基配列は、ＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＵＡ−１５の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００２４】
また、配列番号１４に示す塩基配列は、ＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＨｐＵ−１８の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列のうちの一つである。配列番号１５に示す塩基配列は、ＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＨｐＵ−９の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列のうちの一つである。配列番号１６に示す塩基配列は、ＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＨｐＵ−２の重鎖（Ｈ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列のうちの一つである。
【００２５】
なお、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、上記本発明のペプチドをコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２６】
さらに本発明には、上記遺伝子が導入された形質転換体も含まれる。上記形質転換体は、自身の体内において上記抗体酵素を発現させることができる。従って、上記形質転換体の宿主として植物を用い、この植物に上記遺伝子を導入し、発現させれば、上記抗体酵素を含む形質転換体を得ることができる。この形質転換体は、ＨＰの感染を予防するという機能を備えた上記抗体酵素を含んでいるため、これを日常的に摂取すればＨＰの感染を抑制することができ、機能性食品として利用することができる。上記抗体酵素は加熱によってその構造が破壊されるため、上記遺伝子が導入される植物としては、生食に適した野菜であることが好ましい。このような野菜として、具体的にはトマト、キュウリ、ニンジンなどを挙げることができる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態について以下に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００２８】
（１−１）本発明に係る抗体酵素、および遺伝子について
本発明に係る抗体酵素について、ＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＨｐＵ−１８、ＨｐＵ−９、ＨｐＵ−２の抗体断片を例に挙げて説明する。このＨｐＵ−１８、ＨｐＵ−９、ＨｐＵ−２の抗体断片は、具体的には、それぞれＨｐＵ−１８抗体のＬ鎖の可変領域、ＨｐＵ−９抗体のＬ鎖の可変領域、ＨｐＵ−２抗体のＨ鎖の可変領域である。これら３つの抗体酵素は、ＨＰウレアーゼの複数のモノクローナル抗体の中から、その可変領域のアミノ酸配列を分子モデリングすることによってその立体構造を推定した結果、セリン、ヒスチジン（又はグルタミン酸）、アスパラギン酸からなる触媒三つ組残基を構成できるアミノ酸配列（抗体断片）として探し出されたものである。
【００２９】
上記ＨｐＵ−１８抗体のＬ鎖の可変領域（以下、ＨｐＵ−１８−Ｌと呼ぶ）、上記ＨｐＵ−９抗体のＬ鎖の可変領域（以下、ＨｐＵ−９−Ｌと呼ぶ）、及び上記ＨｐＵ−２抗体のＨ鎖の可変領域（以下、ＨｐＵ−２−Ｈと呼ぶ）は、ＨＰウレアーゼの分解酵素として作用する。これは、後述の実施例に示されるように、ＨＰウレアーゼの一部の領域に相当するペプチドを完全に分解するという結果からも明らかである。なお、分解された上記ペプチドは、ＨＰウレアーゼの酵素活性を発揮するために重要な領域の一つである。そのため、この領域を分解することによってＨＰウレアーゼの機能を完全に破壊し、それに伴ってＨＰ菌が酸性の強いヒト胃内で生存することを不可能にさせることができる。即ち、上記ペプチドを分解できる本発明の抗体酵素は、ＨＰ菌を効率よく除菌することができる。
【００３０】
続いて、上記ＨｐＵ−１８−Ｌの構造について以下に詳細に説明する。ＨｐＵ−１８−Ｌは、上述のようにＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体の一つＨｐＵ−１８のＬ鎖の可変領域であり、配列番号１に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。図１には、ＨｐＵ−１８−Ｌのアミノ酸配列、及びその下段にそれをコードする遺伝子の塩基配列の一例を示す。なお、この塩基配列は、本実施例においてクローニングしたＨｐＵ−１８抗体Ｌ鎖の遺伝子の塩基配列である。図１では、抗原分子（ＨＰウレアーゼ）と相補的な立体構造を形成し、抗体の相補性を決定する相補性決定部位を、ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、ＣＤＲ−３として二重下線を付して示している。
【００３１】
図２には、上記ＨｐＵ−１８−Ｌのアミノ酸配列を分子モデリングした結果、推定される立体構造を模式的に示す。図２に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列において第１番目のアスパラギン酸（図２ではカバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によってＤ１と示す）、第９８番目のヒスチジン（図２ではカバットの分類によってＨ９３と示す）、第９７番目のセリン（図２ではカバットの分類によってＳ９２と示す）又は第２８番目のセリン（図２ではカバットの分類によってＳ２７ａと示す）が触媒三つ組残基を構成していると推定される。またあるいは、配列番号１に示すアミノ酸配列において第３３番目のアスパラギン酸（図２ではカバットの分類によってＤ２８と示す）、第３１番目のヒスチジン（図２ではカバットの分類によってＨ２７ｄと示す）、第３２番目のセリン（図２ではカバットの分類によってＳ２７ｅと示す）が触媒三つ組残基を構成していると推定される。
【００３２】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＨｐＵ−１８−Ｌの変異体であって、ＨＰウレアーゼの分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＨｐＵ−１８抗体Ｌ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよく、ＨｐＵ−１８抗体Ｌ鎖全長であってもよい。
【００３３】
次に、上記ＨｐＵ−９−Ｌの構造について以下に詳細に説明する。ＨｐＵ−９−Ｌは、上述のようにＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体の一つであるＨｐＵ−９のＬ鎖の可変領域であり、配列番号２に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。図３には、ＨｐＵ−９−Ｌのアミノ酸配列、及びその下段にそれをコードする遺伝子の塩基配列の一例を示す。なお、この塩基配列は、本実施例においてクローニングしたＨｐＵ−９抗体Ｌ鎖の遺伝子の塩基配列である。図３では、相補性決定部位を、ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、ＣＤＲ−３として二重下線を付して示している。
【００３４】
図４には、上記ＨｐＵ−９−Ｌのアミノ酸配列を分子モデリングした結果、推定される立体構造を模式的に示す。図４に示すように、配列番号２に示すアミノ酸配列において第１番目のアスパラギン酸（図４ではカバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によってＤ１と示す）、第９８番目のヒスチジン（図４ではカバットの分類によってＨ９３と示す）、第２６番目のセリン（図４ではカバットの分類によってＳ２６と示す）又は第２８番目のセリン（図４ではカバットの分類によってＳ２７ａと示す）が触媒三つ組残基を構成していると推定される。
【００３５】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＨｐＵ−９−Ｌの変異体であって、ＨＰウレアーゼの分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号２に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＨｐＵ−９抗体Ｌ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよく、ＨｐＵ−９抗体Ｌ鎖全長であってもよい。
【００３６】
次に、上記ＨｐＵ−２−Ｈの構造について以下に詳細に説明する。ＨｐＵ−２−Ｈは、上述のようにＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体の一つであるＨｐＵ−２のＨ鎖の可変領域であり、配列番号３に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。図５には、ＨｐＵ−２−Ｈのアミノ酸配列、及びその下段にそれをコードする遺伝子の塩基配列の一例を示す。なお、この塩基配列は、本実施例においてクローニングしたＨｐＵ−２抗体Ｈ鎖の遺伝子の塩基配列である。図５では相補性決定部位を、ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、ＣＤＲ−３として下線を付して示している。
【００３７】
図６には、上記ＨｐＵ−２−Ｈのアミノ酸配列を分子モデリングした結果、推定される立体構造を模式的に示す。図６に示すように、配列番号３に示すアミノ酸配列において第９０番目のアスパラギン酸（図６ではカバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によってＤ８６と示す）、第８９番目のグルタミン酸（図６ではカバットの分類によってＥ８５と示す）、第８８番目のセリン（図６ではカバットの分類によってＳ８４と示す）又は第９１番目のセリン（図６ではカバットの分類によってＳ８７と示す）が触媒三つ組残基を構成していると推定される。
【００３８】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号３に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＨｐＵ−２−Ｈの変異体であって、ＨＰウレアーゼの分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号３に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＨｐＵ−２抗体Ｈ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよく、ＨｐＵ−２抗体Ｈ鎖全長であってもよい。
【００３９】
本発明に係る遺伝子は、上記抗体酵素をコードする遺伝子であり、例えば配列番号１４、１５、１６に示す塩基配列からなる遺伝子を挙げることができる。しかしながら、本発明に係る遺伝子はこれに限定されることなく、配列番号１、２、３に示すアミノ酸配列有する抗体酵素をコードする種々の遺伝子、さらには、その変異体をコードする遺伝子であってもよい。
【００４０】
（１−２）本発明の抗体酵素の他の例
続いて、本発明の抗体酵素の他の例として、ＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＨｐＵ−２０の抗体断片を例に挙げて説明する。このＨｐＵ−２０の抗体断片は、具体的には、ＨｐＵ−２０抗体のＬ鎖の可変領域、および、ＨｐＵ−２０抗体のＨ鎖の可変領域である。これら２つの抗体酵素も、上述のＨｐＵ−１８−Ｌなどと同様に、ＨＰウレアーゼの複数のモノクローナル抗体の中から、その可変領域のアミノ酸配列を分子モデリングすることによってその立体構造を推定した結果、セリン、ヒスチジン（又はグルタミン酸）、アスパラギン酸からなる触媒三つ組残基を構成できるアミノ酸配列（抗体断片）として探し出されたものである。
【００４１】
上記ＨｐＵ−２０抗体のＬ鎖の可変領域（以下、ＨｐＵ−２０−Ｌと呼ぶ）、上記ＨｐＵ−２０抗体のＨ鎖の可変領域（以下、ＨｐＵ−２０−Ｈと呼ぶ）は、ＨＰウレアーゼの分解酵素として作用する。これは、後述の実施例に示されるように、ＨＰウレアーゼのβサブユニットを分解するという結果からも明らかである。なお、分解された上記ペプチドは、ＨＰウレアーゼの酵素活性を発揮するために重要な領域の一つである。そのため、この領域を分解することによってＨＰウレアーゼの機能を完全に破壊し、それに伴ってＨＰ菌が酸性の強いヒト胃内で生存することを不可能にさせることができる。即ち、上記ペプチドを分解できる本発明の抗体酵素は、ＨＰ菌を効率よく除菌することができる。
【００４２】
続いて、上記ＨｐＵ−２０−Ｌの構造について以下に詳細に説明する。ＨｐＵ−２０−Ｌは、上述のようにＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体の一つＨｐＵ−２０のＬ鎖の可変領域であり、配列番号４に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。図１１には、ＨｐＵ−２０−Ｌのアミノ酸配列、及びその下段にそれをコードする遺伝子の塩基配列の一例を示す。なお、この塩基配列は、本実施例においてクローニングしたＨｐＵ−２０抗体Ｌ鎖の遺伝子の塩基配列である。図１１では、抗原分子（ＨＰウレアーゼ）と相補的な立体構造を形成し、抗体の相補性を決定する相補性決定部位を、ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、ＣＤＲ−３として下線を付して示している。
【００４３】
図９には、上記ＨｐＵ−２０−Ｌのアミノ酸配列を分子モデリングした結果、推定される立体構造を模式的に示す。図９に示すように、配列番号４に示すアミノ酸配列において第１番目のアスパラギン酸（図９ではカバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によってＤ１と示す）、第９８番目のヒスチジン（図９ではカバットの分類によってＨ９３と示す）、第９７番目のセリン（図９ではカバットの分類によってＳ９２と示す）又は第２８番目のセリン（図９ではカバットの分類によってＳ２７ａと示す）が触媒三つ組残基を構成していると推定される。なお、ＨｐＵ−２０−Ｌのｇｅｒｍｌｉｎｅは、ｃｒ１である。
【００４４】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号４に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＨｐＵ−２０−Ｌの変異体であって、ＨＰウレアーゼの分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号４に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＨｐＵ−２０抗体Ｌ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよく、ＨｐＵ−２０抗体Ｌ鎖全長であってもよい。
【００４５】
次に、上記ＨｐＵ−２０−Ｈの構造について以下に詳細に説明する。ＨｐＵ−２０−Ｈは、上述のようにＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体の一つであるＨｐＵ−２０のＨ鎖の可変領域であり、配列番号６に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。図１２には、ＨｐＵ−２０−Ｈのアミノ酸配列、及びその下段にそれをコードする遺伝子の塩基配列の一例を示す。なお、この塩基配列は、本実施例においてクローニングしたＨｐＵ−２０抗体Ｈ鎖の遺伝子の塩基配列である。図１２では、相補性決定部位を、ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、ＣＤＲ−３として下線を付して示している。
【００４６】
図１０には、上記ＨｐＵ−２０−Ｈのアミノ酸配列を分子モデリングした結果、推定される立体構造を模式的に示す。図１０に示すように、配列番号６に示すアミノ酸配列において第９０番目のアスパラギン酸（図１０ではカバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によってＤ８６と示す）、第８９番目のグルタミン酸（図１０ではカバットの分類によってＥ８５と示す）、第８８番目のセリン（図１０ではカバットの分類によってＳ８４と示す）が触媒三つ組残基を構成していると推定される。
【００４７】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号６に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＨｐＵ−２０−Ｈの変異体であって、ＨＰウレアーゼの分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号６に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＨｐＵ−２０抗体Ｈ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよく、ＨｐＵ−２０抗体Ｈ鎖全長であってもよい。
【００４８】
本発明に係る遺伝子は、上記抗体酵素をコードする遺伝子であり、例えば配列番号５、７に示す塩基配列からなる遺伝子を挙げることができる。この配列番号５に示す塩基配列からなる遺伝子は、ＨｐＵ−２０のＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列の一つであり、配列番号７に示す塩基配列からなる遺伝子は、ＨｐＵ−２０のＨ鎖の可変領域をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列の一つである。しかしながら、本発明に係る遺伝子はこれに限定されることなく、配列番号４、６に示すアミノ酸配列有する抗体酵素をコードする種々の遺伝子、さらには、その変異体をコードする遺伝子であってもよい。
【００４９】
（１−３）本発明の抗体酵素のさらに他の例
続いて、本発明の抗体酵素のさらに他の例として、ＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体ＵＡ−１５の抗体断片を例に挙げて説明する。このＵＡ−１５の抗体断片とは、具体的には、ＵＡ−１５抗体のＬ鎖の可変領域である。この抗体酵素も、上述のＨｐＵ−１８−Ｌなどと同様に、ＨＰウレアーゼの複数のモノクローナル抗体の中から、その可変領域のアミノ酸配列を分子モデリングすることによってその立体構造を推定した結果、セリン、ヒスチジン、アスパラギン酸からなる触媒三つ組残基を構成できるアミノ酸配列（抗体断片）として探し出されたものである。
【００５０】
上記ＵＡ−１５抗体のＬ鎖の可変領域（以下、ＵＡ−１５−Ｌと呼ぶ）は、ＨＰウレアーゼの分解酵素として作用する。そして、ＨＰウレアーゼを分解することによってＨＰウレアーゼの機能を完全に破壊し、それに伴ってＨＰ菌が酸性の強いヒト胃内で生存することを不可能にさせることができる。即ち、上記ペプチドを分解できる本発明の抗体酵素は、ＨＰ菌を効率よく除菌することができる。
【００５１】
続いて、上記ＵＡ−１５−Ｌの構造について以下に詳細に説明する。ＵＡ−１５−Ｌは、上述のようにＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体の一つＵＡ−１５のＬ鎖の可変領域であり、配列番号８に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００５２】
図１８には、軽鎖と重鎖からなるＵＡ−１５の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行った結果、推定された立体構造を模式的に示す。図１８においては、軽鎖をＬで示し、重鎖をＨで示している。図１８に示すように、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するＵＡ−１５Ｌ鎖において、第１番目のアスパラギン酸（図１８では、カバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によって、Ａｓｐ１と記す）、第２８番目のセリン（図１８では、カバットの分類によって、Ｓｅｒ２７ａと記す）、第９４番目のヒスチジン（図１８では、カバットの分類によって、Ｈｉｓ９０と記す）が、触媒三つ組残基を構成していると推測される。
【００５３】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号８に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＵＡ−１５−Ｌの変異体であって、ＨＰウレアーゼの分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号８に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＵＡ−１５抗体Ｌ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよく、ＵＡ−１５抗体Ｌ鎖全長であってもよい。
【００５４】
本発明に係る遺伝子は、上記抗体酵素をコードする遺伝子であり、例えば配列番号９に示す塩基配列からなる遺伝子を挙げることができる。この配列番号９に示す塩基配列からなる遺伝子は、ＵＡ−１５のＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列の一つである。しかしながら、本発明に係る遺伝子はこれに限定されることなく、配列番号８に示すアミノ酸配列を有する抗体酵素をコードする種々の遺伝子、さらには、その変異体をコードする遺伝子であってもよい。
【００５５】
なお、ＵＡ−１５の重鎖の可変領域は、配列番号１０に示すアミノ酸配列を一次構造として有しているが、このＵＡ−１５の重鎖には、触媒三つ組残基と推測される構造は存在しないため、抗体酵素としての活性を有しない。また、このＵＡ−１５の重鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号１１として併せて記載する。
【００５６】
（２）本発明に係る抗体酵素の取得方法について
本発明に係る抗体酵素が、ＨｐＵ−１８Ｌ鎖やＨｐＵ−２Ｈ鎖、あるいは、ＨｐＵ−２０のＬ鎖およびＨ鎖や、ＵＡ−１５Ｌ鎖などのようにＨＰウレアーゼの抗体のＨ鎖やＬ鎖の全長である場合には、従来公知の抗体取得方法を利用して、該当するＨＰウレアーゼのモノクローナル抗体を取得しＨ鎖とＬ鎖とに分離すればよい。また、本発明に係る抗体酵素が、ＨＰウレアーゼの抗体断片である場合には、先ず該当するモノクローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体断片が得られるように切断すればよい。
【００５７】
また、上述のＨｐＵ−１８−Ｌ、ＨｐＵ−９−Ｌ、ＨｐＵ−２−Ｈ、ＨｐＵ−２０−Ｌ、ＨｐＵ−２０−Ｈ、ＵＡ−１５−Ｌなどのようにそのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子配列が明らかとなっている抗体酵素については、遺伝子組み換え技術などを用いて取得することができる。この場合、上記抗体酵素をコードする遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されたペプチドを精製するという方法などを採用することができる。なお、大量発現させることができる適当なプロモーターとともに上記抗体酵素をコードする遺伝子を組み込めば、目的とする抗体酵素を効率よく取得できる可能性がある。
【００５８】
上記抗体酵素のアミノ酸配列が明らかでない場合には、後述の実施例に示すように、先ずモノクローナル抗体産生細胞からｍＲＮＡを取得し、当該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成しその遺伝子配列を読み取る。その後、その遺伝子配列からアミノ酸配列を推定し、分子モデリングによって３次元構造を予測して触媒三つ組残基様構造が含まれているか否かを確認すればよい。そして、上記触媒三つ組残基様構造が含まれている抗体断片を抗体酵素として取得することができる。
【００５９】
なお、ＨｐＵ−１８−Ｌ、ＨｐＵ−９−Ｌ、ＨｐＵ−２−Ｈ、ＨｐＵ−２０−Ｌ、ＨｐＵ−２０−Ｈ、及びＵＡ−１５−Ｌの変異体のうち、そのＣ末端に各抗体のＬ鎖あるいはＨ鎖の残りのアミノ酸配列が任意の数だけ付加されている場合には、例えば、後述の実施例における実験７において３’側のプライマーを適宜変更すればよい。
【００６０】
また、本発明に係る抗体酵素をコードする遺伝子については、その塩基配列が明らかとなっているものの場合には、そのｃＤＮＡ（あるいはゲノムＤＮＡ）を取得した後、それを鋳型として適当なプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって該当する領域を増幅させることで取得することができる。また、部位特異的突然変異誘発法を利用して、変異が導入された遺伝子が得られれば、それを導入した形質転換体においては、配列番号１、２、３、４、６、８に示すアミノ酸からなる抗体酵素の変異体が翻訳産物として得られる。
【００６１】
（３）本発明の抗体酵素、及びそれをコードする遺伝子の利用方法について
上述のようにして得られた抗体酵素は、抗体としての性質を残した状態で抗原であるＨＰウレアーゼを分解することができる。そのため、ＨＰウレアーゼに対して特異的に作用するＨＰ菌の除菌剤として使用することができる。また、上記抗体酵素は、ＨＰ菌の生存に不可欠なウレアーゼを破壊するため、従来除菌剤として使用されてきた抗生物質とは異なり、ＨＰ菌に対する薬剤耐性を与えないと考えられる。さらに、上記抗体酵素は、薬として開発できるだけでなく、経口摂取が可能なことから、例えば健康飲料に混ぜる、あるいはヨーグルト、バターなどの乳製品に混ぜるなどとったＨＰ菌感染予防のための健康食品の開発にも利用できる可能性がある。
【００６２】
また、本発明に係るＨＰ菌感染患者に対する治療薬は、上述のような性質を持った抗体酵素を含んでいるため、従来治療薬として使用されていた抗生物質と比較して優れた面を有する。即ち、上記治療薬はＨＰウレアーゼに対する特異性が高いので、副作用を軽減させることができる。また、従来の治療薬は、薬を服用後、腸で吸収されてから身体全体に回り、各細胞に分け隔てなく入っていくが、本発明の治療薬は、経口で服用したら胃内に送られ、胃内に生存しているＨＰ菌を直接攻撃することが可能である。従って、副作用が少ないのは勿論であるが、即時的に効果を発揮することができると考えられる。さらに、上記治療薬に含まれる抗体酵素は、ＨＰウレアーゼを分解した後、いずれ他のプロテアーゼに分解されるため、副作用がより少ないことが期待できる。
【００６３】
さらに、本発明の抗体酵素は、それをコードする遺伝子を適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することに利用できる。即ち、本発明に係る形質転換体は、上記抗体酵素をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、遺伝子が対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。この形質転換体は、自身の体内で上記抗体酵素を発現させることができる。
【００６４】
また、上記「形質転換体」とは、形質転換植物を含む意味であり、上記遺伝子を植物に発現可能に導入すれば形質転換植物となる。形質転換体、形質転換植物の範疇には、生物個体；根、茎、葉、生殖器官（花器官および種子を含む）などの各種器官；各種組織；細胞；などが含まれ、さらにはプロトプラスト、誘導カルス、再生個体およびその子孫なども含まれるものとする。このような形質転換植物はＨＰ菌感染患者に対する治療薬、あるいはＨＰ菌の感染予防剤などとして利用することができる。なお、上記形質転換植物を作製する場合に、宿主植物として例えばトマト、キュウリ、ニンジンなどを用いれば、上記抗体酵素を含む高機能植物が得られる可能性があり、それを日常的に摂取すればＨＰ菌の感染を抑制することができる。上記高機能植物は、ＨＰ菌感染予防用の機能性食品としての商品化が期待できる。
【００６５】
なお、本実施の形態において説明した図１、図３、図５、図１１、図１２に示す各抗体酵素のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号は、カバットの分類による番号であるため、それに該当する各配列番号に示すアミノ酸の番号とは異なっている。
【００６６】
【実施例】
本発明の実施例について、実験１ないし実験１５として以下に説明する。
【００６７】
〔実験１〕（ＨＰウレアーゼの精製）
ＨＰ菌は、７％ＦＢＳ含有ブルセラ液体培地で非好気性下、３７℃で培養を行った。培養したＨＰ菌体を遠心分離することによって回収し、０．１５ＭＮａＣｌで洗浄した後、菌体を蒸留水に懸濁し、激しく攪拌することによって菌体成分を抽出した。そして、遠心・透析後の可溶成分を蒸留水抽出物（ＤＷＥｘｔｒａｃｔ）とした。これをＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　　Ｆａｓｔ　　Ｆｌｏｗを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、次いでＳｕｐｅｒｏｓｅ６を用いたゲル濾過を行い、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。さらにこれをゲル濾過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＨＰウレアーゼの精製純度が高純度であることを確認した。
【００６８】
〔実験２〕（抗体産生細胞の作製）
実験１で精製した高純度ＨＰウレアーゼを抗原として脾細胞をＮＳ−１ミエローマとポリエチレングリコールとで融合し、ＨＡＴ選択の後、スクリーニング、クローニングを行って、ＨｐＵ−２、ＨｐＵ−９、ＨｐＵ−１８という３種の抗ＨＰウレアーゼマウスモノクローナル抗体産生細胞を作製した。
【００６９】
〔実験３〕（Ｈ鎖及びＬ鎖の調製）
各抗体産生細胞より得られた各精製抗体（ＨｐＵ−２、ＨｐＵ−９、ＨｐＵ−１８）に対して限外濾過を繰り返すことによって、低分子のプロテアーゼインヒビターを除去した。これに続いて、０．２Ｍβ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌによる還元反応（１５℃、３ｈｒ）と、０．３Ｍｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅによるアルキル化反応（１５℃、１５ｍｉｎ）とを行い、Ｈ鎖とＬ鎖とに分離した。これを限外濾過濃縮後、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ３００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｗａｔｅｒｓ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いてＨＰＬＣ精製した。移動相には６Ｍｇｕａｎｉｄｉｎｅ溶液（ｐＨ６．５）を使用し、流速は０．１５ｍｌ／ｍｉｎとした。
【００７０】
分取したＨ鎖及びＬ鎖の溶液は、６Ｍｇｕａｎｉｄｉｎｅ溶液で希釈調製後、ＰＢＳに対して透析してｒｅｆｏｌｄｉｎｇした後に、実験条件に合わせてバッファー交換した。
【００７１】
〔実験４〕（抗体産生細胞の培養）
実験２で作製した３つの抗ヘリコバクター・ピロリモノクローナル抗体（ＨｐＵ−２、ＨｐＵ−９、ＨｐＵ−１８）を産生する細胞を凍結ストックより起こした。そして、各抗体産生細胞を２０％の牛胎児血清を含んだＩＭＤＭ培地で培養した。温度３７℃、二酸化炭素濃度５．５％の条件下、継代を繰り返しながら細胞数が５×１０７個になるまで培養を続けた。細胞は遠心によって回収された。
【００７２】
〔実験５〕（ＨｐＵ抗体産生細胞からｍＲＮＡの抽出）
ＰｈａｒｍａｃｉａのｑｕｉｃｋＰｒｅｐＴＭｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔのプロトコールに準じて実験を行った。回収した各抗体産生細胞にＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒを加えてホモジナイズ後、遠心分離を行った。上澄みをＯｌｉｇｏ（ｄＴ）−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　　Ｓｐｕｎ　　Ｃｏｌｕｍｎに添加し十分に混合した。軽く遠心しゲルを沈殿させ溶液を除去した。洗浄操作を３回繰り返し、最後にＥｌｕｔｉｏｎ　　Ｂｕｆｆｅｒを添加し溶出してきた溶液を回収した。溶出液は２６０ｎｍの吸光度を測定することでｍＲＮＡの定量を行った後、エタノール沈殿を行い−８０℃で保存した。
【００７３】
〔実験６〕（ｍＲＮＡからｃＤＮＡの合成）
ＡＭＷ　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　　Ｋｉｔ（ＬＩＦＥ　ＳＣＩＥＮＣＥ，ＩＮＣ．）のプロトコールに準じて実験を行った。各抗体産生細胞より抽出した各ｍＲＮＡを遠心分離によって回収し、Ｒｎａｓｅ−ｆｒｅｅの水に溶解した。これにｐｄ（Ｔ）１２−１８Ｐｒｉｍｅｒを加えて７０℃で１０分処理した。その後ジチオトレイトールとＲｎａｓｅ　　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＡＭＷ　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｓｃｒｉｐｔａｓｅを加え混合後４１℃で６０分間反応させた。これによって、各抗体産生細胞のｍＲＮＡからそれぞれのｃＤＮＡが合成された。
【００７４】
〔実験７〕（ＰＣＲによる抗体遺伝子の増幅）
合成したｃＤＮＡを鋳型としてＭｏｕｓｅ　　Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅ　　Ｋｉｔ（ＮＯＶＥＧＥＮ）に含まれている抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域の５’側と３’側とに相補的に結合するプライマーと、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ、ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）とを混合し、十分に攪拌した。９５℃１０分間インキュベート後９４℃１分、５０℃１分、７２℃２分の反応を４０回繰り返した。アガロースゲル電気泳動で増幅産物を確認した。
【００７５】
ＨｐＵ−２については、その結果を図８に示すように、予測した位置（ＨｐＵ−２Ｈ鎖では約５００ｂｐ、ＨｐＵ−２Ｌ鎖では約４５０ｂｐ）にＤＮＡの強いバンドを確認することができた。なお、図８において、レーン１はマーカー、レーン２はＨ鎖、レーン３はＬ鎖を電気泳動させたものである。また、図示はしないが、ＨｐＵ−９Ｈ鎖では約５００ｂｐ、ＨｐＵ−９Ｌ鎖では約４５０ｂｐ、ＨｐＵ−１８Ｈ鎖では約５００ｂｐ、ＨｐＵ−１８では約４５０ｂｐのところに、ＤＮＡの強いバンドを確認することができた。それぞれのＤＮＡ断片を切り出して精製を行った。
【００７６】
〔実験８〕（精製したそれぞれのＤＮＡ断片のクローニング）
精製した断片とｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＴ４　ＤＮＡ　　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてライゲーション反応を行った。室温で１時間インキュベート後コンピテント細胞ＪＭ１０９と混合し氷上で２０分放置した。その後、４２℃４５秒、氷上２分して培地を加え、３７℃で１時間培養を行った。ＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌを塗り広げた寒天プレートに培養した菌液を広げ、３７℃で一昼夜インキュベートした。形成された白いコロニーを任意に選び出し、３７℃で一昼夜、液体培養した。アルカリ−ＳＤＳ法によって菌体からプラスミドを精製し、目的の断片が挿入されているかを確認した。
【００７７】
〔実験９〕（クローニングしたＨｐＵ抗体の塩基配列及びアミノ酸配列の決定）
Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　　ＩＩ　　ｄｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｃｙｃｌｅ　　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　　ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のプロトコールに準じて実験を行った。精製したプラスミドにプライマーとｄＮＴＰ、各ｄｄＮＴＰ、サイクルシークエンス用耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを混合し、軽く攪拌した。９５℃、１０分インキュベート後９４℃１分、６０℃１分、７２℃２分の反応を４０回繰り返した。反応終了後エタノール沈殿し、最終的にＤＮＡはｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎに溶解し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い塩基配列を読み取った。ＨｐＵ−１８（Ｌ鎖）、ＨｐＵ−９（Ｌ鎖）、ＨｐＵ−２（Ｈ鎖）の可変領域について、塩基配列の読み取り結果及びその塩基配列からアミノ酸配列に変換した結果をそれぞれ図１、図３、図５に示す。何れの配列も上段がアミノ酸配列、下段が塩基配列である。なお、図示はしないがＨｐＵ−１８（Ｈ鎖）、ＨｐＵ−９（Ｈ鎖）、ＨｐＵ−２（Ｌ鎖）の可変領域についても、その塩基配列及びアミノ酸配列を決定した。
【００７８】
〔実験１０〕（決定したアミノ酸配列から３次元構造の予測）
抗体可変領域立体構造予測プログラムＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社）にＨｐＵ−２、ＨｐＵ−９、ＨｐＵ−１８のＨ鎖およびＬ鎖のアミノ酸配列を入力し立体構造を構築した。次いでＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）（ＭＳＩ社）でエネルギーの最小化を行い、ＨｐＵ−２、ＨｐＵ−９、ＨｐＵ−１８それぞれの可変領域の立体構造とした。
【００７９】
その結果、３次元構造の分子モデリングによって推定されるＨｐＵ−１８（Ｌ鎖）の可変領域の立体構造を図２に、ＨｐＵ−９（Ｌ鎖）の可変領域の立体構造を図４に、ＨｐＵ−２（Ｈ鎖）の可変領域の立体構造を図６に模式的に示す。上記３つの抗体断片については、触媒三つ組残基様構造が認められた。一方、図示はしないがＨｐＵ−１８（Ｈ鎖）、ＨｐＵ−９（Ｈ鎖）、ＨｐＵ−２（Ｌ鎖）には、触媒三つ組残基様構造は認められなかった。
【００８０】
〔実験１１〕（ＨｐＵ抗体による酵素活性試験）
ＨｐＵ−２抗体のＨ鎖、ＨｐＵ−９及びＨｐＵ−１８抗体のＨ鎖またはＬ鎖とＨＰウレアーゼの部分ペプチドであるＨＰＵ２ＥＰＩ（アミノ酸配列：１８３ＳＶＥＬＤＩＧＧＮＲＲＩＦＧＮＡＬＶＤ２０４（配列番号１２））とを１５ｍＭリン酸バッファー（ＰＢ：ｐＨ６．５）中で反応させた。なお、上記ＨＰＵ２ＥＰＩは、２３８アミノ酸からなるＨＰウレアーゼタンパク質のαユニット一次構造中の第１８３番目から２０４番目の領域に相当するペプチドである。この操作はクリーンベンチ内で行った。精製済みのペプチド粉末を１５ｍＭＰＢ（ｐＨ６．５）で溶解し、ウルトラフリーＭＣ（ミリポア製、０．２２μｍ）で濾過滅菌した。また、ＨｐＵ−２、ＨｐＵ−９、ＨｐＵ−１８抗体Ｈ鎖またはＬ鎖溶液は、反応液中の濃度がそれぞれＨ鎖は、０．４μＭ（２０μｇ／ｍｌ）、Ｌ鎖は０．８μＭ（２０μｇ／ｍｌ）、ペプチドは８０μＭ（１８４．４μｇ／ｍｌ）になるように混合した。反応温度は２５℃、反応容器は乾熱滅菌済みの小試験管で行った。反応液をＨＰＬＣで分析し、ペプチドの経時変化を追跡した。この時の分析条件は、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、波長２１４ｎｍ、移動相０．１％ＴＦＡ・１３％アセトニトリル・超純水である。反応液の分取はクリーンベンチ内で行い、サンプルをウルトラフリーＣ３（ミリポア製、０．５μｍ）に取り、１０，０００ｒ．ｐ．ｍ、約１ｍｉｎ遠心し、濾過してからＨＰＬＣにインジェクトした。また、コントロールとして、Ｈ鎖のみ、Ｌ鎖のみ、およびペプチドのみのものを１５ｍＭＰＢ（ｐＨ６．５）で調製した。
【００８１】
その結果を図７に示す。図７のグラフにおいて、横軸は反応時間（時間）、縦軸は基質であるペプチド（ＨＰＵ２ＥＰＬ）の濃度（μＭ）である。また、▲１▼はＨｐＵ−２（Ｈ）と上記ペプチドとを混合した場合、▲２▼はＨｐＵ−９（Ｈ）と上記ペプチドとを混合した場合、▲３▼はＨｐＵ−１８（Ｈ）と上記ペプチドとを混合した場合、▲５▼はＨｐＵ−９（Ｌ）と上記ペプチドとを混合した場合、▲６▼はＨｐＵ−１８（Ｌ）と上記ペプチドとを混合した場合、▲７▼は上記ペプチドのみの場合である。図７に示すように、ＨｐＵ−１８（Ｌ）では上記ペプチドと混合した結果、反応開始から約２０時間で上記ペプチドの濃度はゼロになり、ほぼ完全に分解された。ＨｐＵ−９（Ｌ）では、上記ペプチドは約９０時間で完全に分解された。ＨｐＵ−２（Ｈ）では反応初期に上記ペプチドの濃度がほとんど変化しない誘導期が現れ、それに続く活性期を経て、約１６０時間で上記ペプチドは完全に分解された。
【００８２】
なお、この実験１１において上記ペプチドに対する酵素活性が認められたもの（ＨｐＵ−２（Ｈ）、ＨｐＵ−９（Ｌ）、ＨｐＵ−１８（Ｌ））については、実験１０の３次元構造分子モデリングにおいて触媒三つ組残基を持っていると推定された。一方、本実験１１において酵素活性が認められなかったもの（ＨｐＵ−１８（Ｈ）、ＨｐＵ−９（Ｌ））については、実験１０において触媒三つ組残基を構成できないと推定された。このことより、触媒三つ組残基を有する抗体には、抗体酵素としての活性が認められることが示唆される。
【００８３】
〔実験１２〕（ＨｐＵ−２０抗体、ＵＡ−１５抗体のＨ鎖およびＬ鎖の調製）実験１および実験２と同様にして、ＨｐＵ−２０、ＵＡ−１５という２種の抗ＨＰウレアーゼマウスモノクローナル抗体産生細胞を作製した。そして、実験３と同様の方法で、ＨｐＵ−２０、ＵＡ−１５のＨ鎖およびＬ鎖が調製された。
【００８４】
〔実験１３〕（ＨｐＵ−２０抗体、ＵＡ−１５抗体の配列決定および分子モデリング）
実験４〜８と同様の方法で、ＨｐＵ−２０のＬ鎖およびＨ鎖、ＵＡ−１５のＬ鎖およびＨ鎖のｃＤＮＡがそれぞれクローニングされた。そして、実験９と同様の方法で、ＨｐＵ−２０のＬ鎖およびＨ鎖、ＵＡ−１５のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域のｃＤＮＡについて、塩基配列が決定され、その塩基配列からアミノ酸配列も決定された。さらにその後、実験１０と同様の方法で、ＨｐＵ−２０のＬ鎖およびＨ鎖、ＵＡ−１５のＬ鎖およびＨ鎖について、３次元構造の分子モデリングによって立体構造が推定された。
【００８５】
その結果、推定されたＨｐＵ−２０（Ｌ鎖）の可変領域の立体構造を図９に、ＨｐＵ−２０（Ｈ鎖）の可変領域の立体構造を図１０に、ＵＡ−１５（Ｈ鎖およびＬ鎖）の可変領域の立体構造を図１８に模式的に示す。これらの立体構造予測から、ＨｐＵ−２０のＬ鎖およびＨ鎖、ＵＡ−１５のＬ鎖については、触媒三つ組残基様構造が認められた。一方、ＵＡ−１５（Ｈ鎖）には、触媒三つ組残基様構造は認められなかった。
【００８６】
〔実験１４−１〕（ＨｐＵ−２０Ｌ鎖およびＨ鎖を用いた酵素活性試験１）
ＨｐＵ−２０−ＬおよびＨｐＵ−２０−ＨのＴＰ４１−１ペプチド（配列番号１３）に対する酵素活性試験を実施した。この分解反応は、以下のような材料、条件、手順で実施された。
【００８７】
（材料）
▲１▼：ＨｐＵ−２０　ｍＡｂ（ｉｎ１５ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ６．５、精製・透析終了後、濾過滅菌されたもの。）
▲２▼：ＨｐＵ−２０抗体
▲２▼−１：Ｌｏｔ．１［ＨｐＵ−２０−Ｌ］（　ｉｎ１５ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ６．５、濃度９４．４μｇ／ｍｌ）
▲２▼−２：Ｌｏｔ．１［ＨｐＵ−２０−Ｈ］（　ｉｎ１５ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ６．５、濃度７０．８μｇ／ｍｌ）
▲２▼−３：Ｌｏｔ．２［ＨｐＵ−２０−Ｌ］（　ｉｎ１５ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ６．５、濃度９６．７μｇ／ｍｌ）
▲２▼−４：Ｌｏｔ．２［ＨｐＵ−２０−Ｈ］（　ｉｎ１５ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ６．５、濃度１０３．３μｇ／ｍｌ）
▲３▼：精製された　ＴＰ４１−１　ペプチド
（反応液）
▲１▼：ＨｐＵ−２０−Ｌ：０．８μＭ（２０μｇ／ｍｌ）
▲２▼：ＨｐＵ−２０−Ｈ：０．４μＭ（２０μｇ／ｍｌ）
▲３▼：ＨｐＵ−２０　ｍＡｂ：０．８μＭ（１２０μｇ／ｍｌ）
▲４▼：ＴＰ４１−１　ペプチド：１２０μＭ（２８４μｇ／ｍｌ）
（反応条件）
反応温度：２５℃
小試験管、マイクロチップ、１５ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ６．５）：滅菌処理
実験操作：クリーンベンチ内
（方法）
（１）：ＴＰ４１−１を１５ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ６．５で１．７ｍｇ／ｍｌに調製し、濾過滅菌する。
（２）：次に、（１）の１．７ｍｇＴＰ４１−１を１５ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ６．５で５６８μｇ／ｍｌに調製する。
（３）：２０抗体のＨ、Ｌ鎖を１５ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ６．５でそれぞれ４０μｇ／ｍｌに調製する。
（４）：（２）と（３）を１：１の割合で混合する。
（５）：ＨＰＬＣでペプチドの経時変化を追跡する。
【００８８】
この実験の結果については、Ｌｏｔ．１を図１３に、Ｌｏｔ．２を図１４に示す。図１３、図１４のグラフでは、横軸に反応時間（時間）を、縦軸に基質であるＴＰ４１ペプチドの濃度（μＭ）を示す。
【００８９】
図１３、１４のグラフに示すように、調製したＬｏｔ．１およびＬｏｔ．２において、若干の反応性の違いはあるものの、ともに再現性よくＴＰ４１ペプチドを完全に分解した。これらの結果から、ＨｐＵ−２０−ＬおよびＨｐＵ−２０−Ｈは、ＴＰ４１−１ペプチドの分解反応において酵素活性を有することが確認された。
【００９０】
〔実験１４−２〕（ＨｐＵ−２０Ｌ鎖およびＨ鎖を用いた酵素活性試験２）
続いて、活性化したＨｐＵ−２０Ｌ鎖およびＨ鎖を用いて、タンパク質分解実験を以下のような材料、反応液の組成・種類、反応条件、方法で実施した。
【００９１】
（材料）
▲１▼：活性化した（一度ＴＰ４１ペプチドを完全に分解した）Ｌｏｔ．２［ＨｐＵ−２０−Ｌ］（ｉｎ１５ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ６．５、０２．１０．１５分離、　０２．１０．１６精製、０２．１０．２１　ＰＢＳ透析終了、０２．１０．２１〜２２　ＰＢにｂｕｆｆｅｒ交換。４．２ヶ月保存、濃度９６．７μｇ／ｍｌ）
▲２▼：ＨＰ菌ウレアーゼ（Ｍ．Ｗ＝５２２６００）０２．０７．０１精製、濃度１．８４ｍｇ／ｍｌ
▲３▼：ＢＳＡ　ＳＩＧＵＭＡ　Ａ−６００３　Ｌｏｔ５１Ｋ７６００
▲４▼：ＨＳＡ　ＷＡＫＯ　０１９−１０５０３　ＬｏｔＫＳＨ６８８６
（反応液組成）
▲１▼：ＨｐＵ−２０−Ｌ：０．４μＭ（２０μｇ／ｍｌ）
▲２▼：ＨＰ菌ウレアーゼ：５２ｎＭ（２８μｇ／ｍｌ）
▲３▼：ＢＳＡ：０．４μＭ（２８μｇ／ｍｌ）
▲４▼：ＨＳＡ：０．４μＭ（２８μｇ／ｍｌ）
（反応条件）
反応温度：２５℃
小試験管、マイクロチップ、１５ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ６．５）：滅菌処理
実験操作：クリーンベンチ内
（方法）
（１）ＨＳＡ、ＢＳＡを１５ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ６．５で２．２ｍｇ／ｍｌに調製し、濾過滅菌する。
（２）次に、（１）の１．７ｍｇ／ｍｌ　ＴＰ４１−１を１５ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ６．５で５５μｇ／ｍｌに調製する。
（３）１．８４ｍｇ／ｍｌ　ＨＰ菌ウレアーゼを１５ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ６．５で５５μｇ／ｍｌに調製する。
（４）活性化したＨｐＵ−２０−Ｌと（２）、（３）を１：１の割合で混合する。
（５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで抗体及び、各タンパクの変化を追跡する
（反応液の種類）
▲１▼：０．４μＭ　ＨｐＵ−２０−Ｌ＋０．４μＭ　ＢＳＡ：３２０μｌ
▲２▼：０．４μＭ　ＨｐＵ−２０−Ｌ＋０．４μＭ　ＨＳＡ：３２０μｌ
▲３▼：０．４μＭ　ＨｐＵ−２０−Ｌ＋５２ｎＭ　ＨＰ菌ウレアーゼ：３２０μｌ
▲４▼：０．４μＭ　ＨｐＵ−２０−Ｌのみ：３２０μｌ
▲５▼：０．４μＭ　ＢＳＡのみ：３２０μｌ
▲６▼：０．４μＭ　ＨＳＡのみ：３２０μｌ
▲７▼：５２ｎＭ　ＨＰウレアーゼのみ：３２０μｌ
本実験の結果を図１５〜図１７に示す。図１５〜図１７は、反応開始１時間後の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。なお、各レーンにおける試料については、Ｍはマーカーであり、▲１▼〜▲７▼は、上記の各反応液である。
【００９２】
図１５〜図１７に示す結果から、約１時間の反応でＨｐＵ−２０−ＬはＢＳＡを全く分解しないことがわかる。ＨＳＡに対しては２８．５ｋＤａに薄いバンドが見られるがコントロールのＨＳＡはほとんど変化しておらず非常に弱い分解しか起こしていないことがわかる。これに対し、ＨＰ菌ウレアーゼに対しては、約１時間の反応で、５０ｋＤａに強いバンドが、２６ｋＤａに弱いバンドが観察された、また、βサブユニットのバンドはコントロールに比べ、２６．７％減少していた。αサブユニットのバンドについては反応前後でほとんど変化していなかった。この結果から、ＨｐＵ−２０−Ｌは、ＨＰ菌ウレアーゼのβサブユニットを特異的に分解することが明らかとなった。
【００９３】
〔実験１５〕（ＵＡ−１５Ｌ鎖およびＨ鎖を用いた酵素活性試験）
ＵＡ−１５−ＬおよびＵＡ−１５−Ｈを用いて、ＴＰ４１−１ペプチド（配列番号１３）に対する酵素活性試験を実施した。この分解反応は、以下のような反応液を用いて、以下のような反応条件で実施された。
【００９４】
（反応液）
▲１▼：Ｌｏｔ．１［ＵＡ−１５−Ｌ］：０．８μＭ（２０μｇ／ｍｌ）
▲２▼：Ｌｏｔ．１［ＵＡ−１５−Ｈ］：０．４μＭ（２０μｇ／ｍｌ）
▲３▼：Ｌｏｔ．２［ＵＡ−１５−Ｌ］：０．８μＭ（２０μｇ／ｍｌ）
▲４▼：Ｌｏｔ．２［ＨｐＵ−２０−Ｈ］：０．４μＭ（２０μｇ／ｍｌ）
▲５▼：ＴＰ４１−１ペプチド：１２０μＭ（２８４μｇ／ｍｌ）
（反応条件）
反応温度：２５℃
小試験管、マイクロチップ、１５ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ６．５）：滅菌処理
実験操作：クリーンベンチ内
この実験の結果については、Ｌｏｔ．１を図１９に、Ｌｏｔ．２を図２０に示す。図１９、図２０のグラフでは、横軸に反応時間（時間）を、縦軸に基質であるＴＰ４１ペプチドの濃度（μＭ）を示す。図１９および図２０に示すグラフからも分かるように、ＵＡ−２０のＬ鎖についてはＴＰ４１−１ペプチドを分解する酵素活性が確認されたがＵＡ−２０のＨ鎖については、酵素活性は確認されなかった。
【００９５】
続いて、反応液にＬｏｔ．２におけるＵＡ−１５−Ｌの反応液に、ペプチド基質（ＴＰ４１−１）を再添加して、１５℃、２５℃、３７℃の各温度でペプチドの分解実験を実施した。
【００９６】
結果を図２１に示す。この結果から、反応温度が２５℃の場合が、ＵＡ−１５−Ｌの酵素活性が最も高いことが明らかとなった。
【００９７】
さらに、上記の反応条件で、反応液にＬｏｔ．１［ＵＡ−１５−Ｌ］を用いて、一度ＴＰ４１−１ペプチドを完全に分解した後、この溶液にＴＰ４１−１ペプチドを、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、３０μＭ、６５μＭ、８０μＭの各濃度で添加して、ＵＡ−１５−Ｌによる速度論的解析を行った。その結果を図２２および表１に示す。
【００９８】
【表１】
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【００９９】
【発明の効果】
以上のように、本発明の抗体酵素によれば、ＨＰ菌のウレアーゼを特異的に分解することができ、ＨＰ菌を効率よく除菌することができる。上記抗体酵素は、従来の除菌剤とは異なりＨＰ菌に薬剤耐性を与えないと考えられるため、ＨＰ菌感染患者の治療薬として有効に利用することができる。さらに、上記抗体酵素は経口で摂取してＨＰ菌の除菌効果を発揮するため、ＨＰ菌の感染予防剤として利用することもできる。
【０１００】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｐＵ−１８Ｌ鎖の可変領域のアミノ酸配列、及びそれをコードする遺伝子の塩基配列を示す模式図である。
【図２】ＨｐＵ−１８Ｌ鎖の可変領域の立体構造を示す模式図である。
【図３】ＨｐＵ−９Ｌ鎖の可変領域のアミノ酸配列、及びそれをコードする遺伝子の塩基配列を示す模式図である。
【図４】ＨｐＵ−９Ｌ鎖の可変領域の立体構造を示す模式図である。
【図５】ＨｐＵ−２Ｈ鎖の可変領域のアミノ酸配列、及びそれをコードする遺伝子の塩基配列を示す模式図である。
【図６】ＨｐＵ−２Ｈ鎖の可変領域の立体構造を示す模式図である。
【図７】本実施例におけるＨｐＵ抗体による酵素活性試験を行った結果を示すグラフである。
【図８】本実施例においてＰＣＲで増幅したＨｐＵ−２抗体断片遺伝子を含む増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行った結果を示す模式図である。
【図９】ＨｐＵ−２０Ｌ鎖の可変領域の立体構造を示す模式図である。
【図１０】ＨｐＵ−２０Ｈ鎖の可変領域の立体構造を示す模式図である。
【図１１】ＨｐＵ−２０Ｌ鎖の可変領域のアミノ酸配列、及びそれをコードする遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図１２】ＨｐＵ−２０Ｈ鎖の可変領域のアミノ酸配列、及びそれをコードする遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図１３】ＨｐＵ−２０−ＬおよびＨｐＵ−２０−Ｈを用いてＴＰ４１−１ペプチド（図中では、ＴＰと記す）の分解実験を行った結果（Ｌｏｔ．１）を示す図である。
【図１４】ＨｐＵ−２０−ＬおよびＨｐＵ−２０−Ｈを用いてＴＰ４１−１ペプチド（図中では、ＴＰと記す）の分解実験を行った結果（Ｌｏｔ．２）を示す図である。
【図１５】ＨｐＵ−２０Ｌ鎖を用いたタンパク質分解実験において、反応開始１時間後の試料についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図１６】ＨｐＵ−２０Ｌ鎖を用いたタンパク質分解実験において、反応開始１時間後の試料についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図１７】ＨｐＵ−２０Ｌ鎖を用いたタンパク質分解実験において、反応開始１時間後の試料についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図１８】軽鎖と重鎖からなるＵＡ−１５の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行った結果、推定された立体構造を示す図である。なお、本図では、軽鎖上にのみ触媒三つ組残基様構造が現れていることを示している。
【図１９】ＵＡ−１５−Ｌ（図中では、Ｌと示す）およびＵＡ−１５−Ｈ（図中では、Ｈと示す）を用いてＴＰ４１−１ペプチドの分解実験を行った結果（Ｌｏｔ．１）を示す図である。
【図２０】ＵＡ−１５−Ｌ（図中では、Ｌと示す）およびＵＡ−１５−Ｈ（図中では、Ｈと示す）を用いてＴＰ４１−１ペプチドの分解実験を行った結果（Ｌｏｔ．２）を示す図である。
【図２１】ＵＡ−１５−Ｌ（図中では、Ｌと示す）を用いて、１５℃、２５℃、３７℃の各温度でＴＰ４１−１ペプチド（図中では、ＴＰと記す）の分解実験を行った結果を示す図である。なお、この分解実験は、図１９に結果を示す実験を行った後に、ＴＰ４１−１ペプチドを再度加え、反応温度の違いを見たものである。
【図２２】ＵＡ−１５−Ｌを用いたＴＰ４１−１ペプチド分解反応の速度論的解析の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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