(57)【要約】【課題】本発明は、うつ病治療薬及びその診断薬としてヒトベータ−フィブリノーゲン由来ペプチド断片及びその合成ペプチドを提供することである。【解決手段】一群５匹、７グループのマウスにペプチドＧを５ｍｇ／ｋｇの量で腹膜内に注射した。投与１０分後、各グループのマウスに、水で溶解した１００、１０および１μｇ／ｋｇのドーパミン１拮抗剤ＳＣＨ−２３３９０またはドーパミン２拮抗剤ｓｕｌｐｉｒｉｄｅ（シグマ社、セントルイスＭＯ、米国）あるいは１００μｌの生理食塩水（ＰＳ）を注射した。２回目の注射３０分後、マウスの「よじ登り行動」の継続時間を測定した。「よじ登り行動」に対する効果があったのはボランティアから採取した血清（５０−１００ｍＭ　ＮａＣｌで溶出し、分子量１０−３ｋＤａ）であった。しかし、ボランティアの血清から得られた他の分画や患者血清のいかなる分画にも効果が見られなかった。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
健常ヒト血清から５０−１００ｍＭ　ＮａＣｌ濃度で溶出され、分子量１０−３ｋＤａの精製したペプチド断片を含むうつ病治療薬並びに診断薬。
【請求項２】
アミノ酸配列がＧＶＮＤＮＥＥＧＦである合成ペプチドからなるうつ病治療薬並びに診断薬。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチドを含む誘導体。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のペプチドを発現する遺伝子を挿入した発現ベクター、ペプチド、タンパク質、酵素、ストレプトアビジンから成る群から選択される結合分子の結合体を含むうつ病治療薬並びに診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、うつ病治療薬及びその診断薬として有効な、向精神作用を有するヒトベーターフィブリーゲン由来ペプチド断片を含むうつ病治療薬並びに診断薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
うつ病患者は、年々増加しており、その数は米国では２０００万人、日本では２０万人といわれ、潜在患者を含めればこの何倍にも及ぶと考えられる。
うつ病は、抑うつ気分、悲壮感などの感情障害、思考抑止などの思考障害、意欲低下、睡眠障害、抑うつ状態の日内変動などを主症状とする情動性精神障害である。
原因は、脳の器質的障害による症候性うつ病、環境や心理的な要因による神経症性うつ病と原因不明の内因性うつ病に分類される。
その発症メカニズムは、セロトニンやノルアドレナリンといった神経伝達物質の脳内の働きが低下することによって起こるといわれている。
治療薬としては、三環系抗うつ薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）などが使用されている。
これまで、難治性うつ病の有効な治療薬はなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、うつ病治療薬及びその診断薬としてヒトベータ−フィブリノーゲン由来ペプチド断片及びその合成ペプチドを提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明のうつ病治療薬並びに診断薬は、健常ヒト血清から５０−１００ｍＭ　ＮａＣｌ濃度で溶出され、分子量１０−３ｋＤａの精製したペプチド断片を含むものである。
さらに、本発明のうつ病治療薬並びに診断薬は、アミノ酸配列がＧＶＮＤＮＥＥＧＦである合成ペプチドからなるものである。
本発明のうつ病治療薬並びに診断薬は、上記のペプチドを含む誘導体である。
本発明のうつ病治療薬並びに診断薬は、上記のペプチドを発現する遺伝子を挿入した発現ベクター、ペプチド、タンパク質、酵素、ストレプトアビジンから成る群から選択される結合分子の結合体を含むものである。
【０００５】
【実施例】
本発明を以下の実施例により詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【０００６】
動物：
体重２０−２５ｇの８週齢の雄のｄｄＹマウス（ＳＬＣ社、東京、日本）を使用した。
マウスは５群に分けて、プラスチックケージ（３３８×１４０×２２５ｍｍ）内で自由飲食にて飼育した。
飼育室は、湿度５０−６０％、室温２１−２５℃に保たれており、７：００から１９：００まで点灯した。
実験の２４時間前にマウス強制水泳試験［　Ｍａｓｕｄａ　Ｙ．　他，　Ｅｘｐ．　Ａｎｉｍ．，　５０，　３３１−３３５，　２００１　］で記述された方法で、マウスに６分間の強制水泳を行った。
【０００７】
抗うつ効果の測定法：
行動の抗うつ様作用を測定する装置と実験過程は、以前に［Ｐｏｒｓｏｌｔ　Ｒ．Ｄ．他，　Ａｒｃｈ．　Ｉｎｔ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．Ｔｈｅｒ．，　２２９，　３２７−３３６，１９７７　］で発表された。
手短に言うと、マウスを１０ｃｍの高さまで２５℃の水をはったシリンダー（直径１０
ｃｍ、高さ２０ｃｍ）に入れてから６分間そのままにした。
次の３分間で装置の壁をよじ登るまでの時間を、抗うつ効果のインデックスとして測定した。
この「よじ登り行動」の測定は、１５：００から１７：００までの時間帯に実行された。
【０００８】
ヒト血清の準備：
情動的にも精神的にも異常の見られない７人の健康なボランティア（４人の女性と３人の男性、年齢２４−４３歳）から採血して合計血清１０ｍｌを得た。
一方、中等度のうつ病のみを持つ、精神病の症状のない７人の患者（ＤＳＭ−ＩＶと診断された、３人の女性と４人の男性、年齢２３−５２歳）から、医療行為の前に告知に基づく同意の下に合計１０ｍｌの血清を採取した。
これらの患者には、他の病気はなかった。
【０００９】
これらの血清は、［　Ｍａｓｕｄａ　Ｙ．他，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，　２１，　４５４−４６１，　２００２，　Ｍａｓｕｄａ　Ｙ．他，Ｔｏｈｏｋｕ．Ｊ．Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．，　１９２，　２８３−２８９，　２０００　］に記載されたように、脂質を除去した後、２８本に分注した。
手短に言うと、血清１０ｍｌに２５ｍｌのメタノールと１２．５ｍｌのクロロホルムを加えた後、この溶液を２分間振盪し、室温（ＲＴ）で１０分間放置した。
次に、溶液にクロロホルム１２．５ｍｌを追加して、３０秒間再び振盪した。
最後に、溶液に１２．５ｍｌの水を加えて、３０秒間振盪した。
そして、溶液を室温にて５分間１５０ｇで遠心した。
【００１０】
次に、前記溶液からペプチドを含む上層のメタノール−水層を集め、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００　ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｕｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いて分離した。
ペプチド分画は、１０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３　ｐＨ　８．３の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロース（ワットマン社、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、英国）にかけた。
そして、ＮａＣｌを５０、１００、１５０、２００、２５０、３００ｍＭの順に濃度を上げて溶出した。
各溶出分画は、フィルターを用いた限外ろ過法（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ：グレース社、東京、日本）によって分子量３０　ｋＤａ以上，　３０−１０　ｋＤａ，　１０−３　ｋＤａ　そして　３　ｋＤａ以下に分画した。
【００１１】
各分画の「よじ登り行動」に対する効果：
上記の方法で得られた各分画をタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように生理食塩水（ＰＳ）で調整した。
そして、それぞれを一群５匹のマウスに分画２００μｌづつ腹膜内に注射した。
注射４０分後、先に記述したような方法で「よじ登り行動」に対する効果を測定した。
【００１２】
効果のあるペプチドの分析：
５０−１００ｍＭ　ＮａＣｌ濃度で溶出され、分子量１０−３ｋＤａに分画されたボランティアと患者から採取した血清分画は、ＨＰＬＣ法を用いて分析した。
また、これら分画の高いピークは、タンパク質シーケンサ（パーキン−エルマー社、東京、日本）にて分析された。
【００１３】
アミノ酸残基９個からなる２本のペプチド、ＧＶＮＤＮＥＥＧＦ（ペプチドＧ）とＡＶＮＩＧＥＦＬＶ（ペプチドＨ）、を合成した。
【００１４】
これらペプチドとヒトのフィブリノペプチドＢ（ＱＧＶＮＤＮＥＥＧＦＦＳＡＲ、Ｂａｃｈｅｍ社、Ｂｕｂｅｎｄｏｌｆ、スイス）を水で溶解した。
【００１５】
一群５匹のマウスにぺプチドＧ、ペプチドＨ、フィブリノペプチドＢをそれぞれ５，１，０．２ｍｇ／ｋｇの濃度で腹膜内に注射した。
対照として１００μｌの生理食塩水（ＰＳ）を腹膜内に注射した。
投与４０分後、マウスの「よじ登り行動」に対する効果を測定した。
【００１６】
ペプチドによって誘導される効果の神経メカニズム：
以前に［Ｍａｓｕｄａ　Ｙ．他，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　２１，　４５４−４６１，　２０００］で記述された方法で神経学的な検査を行った。
手短に言うと、一群５匹、７グループのマウスにペプチドＧを５ｍｇ／ｋｇの量で腹膜内に注射した。
投与１０分後、各グループのマウスに、水で溶解した１００、１０および１μｇ／ｋｇのドーパミン１拮抗剤ＳＣＨ−２３３９０またはドーパミン２拮抗剤ｓｕｌｐｉｒｉｄｅ（シグマ社、セントルイスＭＯ、米国）あるいは１００μｌの生理食塩水（ＰＳ）を注射した。
２回目の注射３０分後、マウスの「よじ登り行動」の継続時間を測定した。
【００１７】
統計的分析：
グループ間の有意差判定にクルスカルーウォリス・ランク・テストを用いた。
有意差が存在した場合（Ｐ＜０．０１）には、マン・ホイットニーＵ−テストを用いた。
【００１８】
結果：
「よじ登り行動」に対する効果があったのはボランティアから採取した血清（５０−１００ｍＭ　ＮａＣｌで溶出し、分子量１０−３ｋＤａ）であった。
しかし、ボランティアの血清から得られた他の分画や患者血清のいかなる分画にも効果が見られなかった。
【００１９】
「よじ登り行動」に対する時間：
有効なボランティア血清分画：６６．２±２．２秒
他のボランティア血清分画：０
すべての患者血清分画：０
（５匹のマウスの平均±ＳＥ）。
【００２０】
効果が見られた高いピークの分画のアミノ酸配列は、ＧＶＮＤＮＥＥＧＦからなるぺプチドであった。
これと対応する患者血清に由来するピークの分画は、ＡＶＮＩＧＥＦＬＶからなるペプチドであった。
【００２１】
データベース検索システムＤＢＧＥＴを使用したＧｅｎｏｎｅ　Ｎｅｔは、アミノ酸配列解析から前者の配列がヒトベータ−フィブリノーゲン断片であると同定できた。
しかし、後者の配列は確認できなかった。
【００２２】
合成ペプチドＧ（ＧＶＮＤＮＥＥＧＦ）は、用量依存的（クルスカルーウォリス・ランク・テスト；ｋ＝３、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝５、ｎ＝１５、Ｈ＝１２．５、Ｐ＜０．００９）に「よじ登り行動」に対する持続時間を増加した。（表１）
【表１】
2004059531.tif 000002
【００２３】
一方、合成ペプチドＨ（ＡＶＮＩＧＥＦＬＶ）やフィブリノペプチドＢ（ＱＧＶＮＤＮＥＥＧＦＦＳＡＲ）は５ｍｇ／ｋｇの用量でも何らの効果も示さなかった（表１）。
【００２４】
合成ペプチドＧの行動効果は、用量依存的（クルスカルーウォリス・ランク・テスト；ｋ＝３、ｎ１＝ｎ２＝ｎ３＝５、ｎ＝１５、Ｈ＝１２．５、Ｐ＜０．００９）にドーパミン１拮抗剤ＳＣＨ−２３３９０によって抑制されたが、ドーパミン２拮抗剤ｓｕｌｐｉｒｉｄｅでは抑制されなかった（表２）。
【表２】
2004059531.tif 000003
【００２５】
【発明の効果】
健常ヒト血清から精製したペプチド断片は、マウス強制水泳試験による無動時間を短縮させ、新規なうつ病治療薬及びその診断薬として医療に新しい貢献が出来る。
有効なペプチドのアミノ酸配列はＧＶＮＤＮＥＥＧＦで、これはヒトベータ−フィブリノーゲン由来ペプチド断片であることが判明した。
本ペプチド及びその誘導体は、うつ病の治療薬及び診断薬として有効である。