(57)【要約】【課題】膠原病もしくは自己免疫疾患に対する新たな治療薬および診断方法を提供する。【解決手段】本発明の治療薬は、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、特に好ましくはグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型ホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）又はその遺伝子を含有する膠原病もしくは自己免疫疾患用治療薬である。また、本発明の診断方法は、検体内のＧＰＩ−ＰＬＤの含有量またはその活性を測定することにより、膠原病もしくは自己免疫疾患の罹患の有無またはその発症可能性を判定する方法である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）又はその遺伝子を含有する膠原病もしくは自己免疫疾患用治療薬。
【請求項２】
上記ホスホリパーゼＤは、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型のホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）である請求項１記載の治療薬。
【請求項３】
上記ホスホリパーゼＤは、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された活性型のアミノ酸配列からなる請求項２記載の治療薬。
【請求項４】
静脈注射にて体内に投与される請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項５】
被験者から得た検体内のホスホリパーゼＤの含有量およびその活性の少なくとも一方を測定することにより、膠原病もしくは自己免疫疾患の罹患の有無またはその発症可能性を判定する方法。
【請求項６】
上記ホスホリパーゼＤは、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型のホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）である請求項５記載の判定方法。
【請求項７】
上記ホスホリパーゼＤ、又はその部分ペプチドに対する抗体を測定に用いる請求項５または６記載の判定方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の判定方法を利用した膠原病もしくは自己免疫疾患の罹患の有無またはその発症可能性の判定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂質分解酵素ホスホリパーゼＤを用いた膠原病もしくは自己免疫疾患用治療薬、並びにそれら疾患の診断方法（罹患の有無またはその発症可能性を判定する方法および判定キット）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自己免疫疾患は、自己の成分に対して異常な免疫反応を示す疾患であり、臓器特異性のない疾患と、臓器特異性のある疾患の２つに大別される。このうち臓器非特異的な疾患としては、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強（鞏）皮症、および混合結合組織病等が知られている。これら自己免疫疾患は膠原病とも呼ばれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このような自己免疫疾患、特に膠原病の原因は未だ不明であり、現在でも原因療法が確立されておらず、副腎皮質ステロイドを中心とする種々の治療法で病気の進行を抑えているのが現状である。
【０００４】
本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであって、その目的は、膠原病もしくは自己免疫疾患に対する新たな治療薬を提供することにある。さらに、本発明の他の目的は、膠原病もしくは自己免疫疾患に対する新たな診断方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、後述の実験結果等から、血漿に存在するグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型ホスホリパーゼＤ（血漿ＧＰＩ−ＰＬＤ）が、膠原病もしくは自己免疫疾患に対する新たな治療法および診断法として有効利用できる可能性を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、下記（１）〜（８）によりそれぞれ特定される膠原病もしくは自己免疫疾患用の治療薬、およびそれら疾患の診断方法に係る発明である。
（１）ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）又はその遺伝子を含有する膠原病もしくは自己免疫疾患用治療薬。
（２）上記（１）の治療薬であって、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）又はその遺伝子として、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型のホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）又はその遺伝子を含有する治療薬。
（３）上記（２）の治療薬であって、上記ＧＰＩ−ＰＬＤは、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された活性型のアミノ酸配列からなる治療薬。（４）上記（１）〜（３）のいずれかの治療薬であって、静脈注射にて体内に投与される治療薬。
（５）被験者から得た検体内のホスホリパーゼＤの含有量およびその活性の少なくとも一方を測定することにより、膠原病もしくは自己免疫疾患の罹患の有無またはその発症可能性を判定する方法。
（６）上記（５）の判定方法であって、測定対象のホスホリパーゼＤは、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型のホスホリパーゼＤ（ＧＰＩ−ＰＬＤ）である判定方法。
（７）上記（５）または（６）の判定方法であって、測定に、上記ホスホリパーゼＤ、又はその部分ペプチドに対する抗体を用いる判定方法。
（８）上記（５）〜（７）のいずれかの判定方法を利用した膠原病もしくは自己免疫疾患の罹患の有無またはその発症可能性の判定キット。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳述する。
【０００８】
（Ａ）本発明の治療薬について
ａ）ＧＰＩ−ＰＬＤの治療薬への利用
ＧＰＩ−ＰＬＤとは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）によって細胞膜表面上にアンカーされた蛋白質を基質とする脂質分解酵素であり、その酵素反応によりホスファチジン酸が生成される。ＧＰＩ−ＰＬＤは、血漿中にアポリポプロテインＡ１などと結合し、高密度リポプロテイン（ＨＤＬ）画分に存在するが、その生理的役割は従来明らかにされていなかった。
【０００９】
本発明者は、以下の理由から、上記ＧＰＩ−ＰＬＤが膠原病もしくは自己免疫疾患用の治療薬として有用であると判断した。
【００１０】
▲１▼　現在、アポトーシスの細胞内シグナル伝達に関する研究は過熱しているが、アポトーシスを起こした細胞の処理機構は殆ど明らかにされておらず、アポトーシスを引き起こした細胞が生体内でどのような分子メカニズムでスキャベンジャー（処理）されているのかが注目されている。正常の生体内においてアポトーシス細胞は速やかに吸収されており、炎症などを一切引き起こさない。この現象はアポトーシス細胞の処理機構はネクローシス（壊死）細胞の処理機構と全く異なる機構であることを示唆している。
【００１１】
▲２▼　最近のアポトーシスに関する研究から、自己免疫疾患発症因子の一つである抗核抗体の出現はアポトーシス細胞の核ＤＮＡ処理機構の異常に伴う核ＤＮＡ断片の免疫細胞への暴露が引き金になることが予測された。
【００１２】
▲３▼　本発明者は、脂質代謝酵素を研究する過程において、血漿に存在するグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型ホスホリパーゼＤ（血漿ＧＰＩ−ＰＬＤ）がアポトーシス細胞特異的に作用し、断片化したＤＮＡを細胞から遊離させる活性を持つことを見出した（後述の実施例参照）。
【００１３】
▲４▼　上記▲３▼の実験結果から、ＧＰＩ−ＰＬＤの作用によりアポトーシス細胞から断片化したＤＮＡが抜き取られ、隣接する貪食細胞（マクロファージ）等によって速やかにスキャベンジャーされている可能性が考えられた。
【００１４】
実際に、血漿中に存在するＧＰＩ−ＰＬＤは、生体内において高密度リポプロテイン（ＨＤＬ）画分と結合し、血漿中を回遊している。ＧＰＩ−ＰＬＤに結合するこのＨＤＬ　によって断片化ＤＮＡおよびＤＮＡ結合蛋白質が保護され、免疫細胞への暴露を阻害していることが推測される。そして、貪食細胞（マクロファージ）等の細胞膜表面上に発現するＨＤＬ受容体を介して断片化ＤＮＡ等が速やかに吸収されることが予測される。
【００１５】
▲５▼　以上のことから、ＧＰＩ−ＰＬＤの活性低下が膠原病や自己免疫疾患の直接の原因になっている可能性が考えられた。したがって、野生型または活性型のＧＰＩ−ＰＬＤあるいはその遺伝子は、膠原病もしくは自己免疫疾患の治療薬として有効であると判断された。
【００１６】
とりわけ、上記▲３▼の実験結果から、ＧＰＩ−ＰＬＤは、アポトーシスを起こした細胞から断片化ＤＮＡを速やかに遊離させる活性を持つことが示された。このため、ＧＰＩ−ＰＬＤを投与することによって、体内においてＨＤＬと結合した血漿ＧＰＩ−ＰＬＤがアポトーシス細胞内の断片化ＤＮＡ等を速やかに外部に取り出し、スキャベンジャー処理を促すものと考えられる。そして、これにより断片化ＤＮＡ等の免疫細胞への暴露による抗核抗体の生成を抑制することができるから、上記ＧＰＩ−ＰＬＤは、膠原病や自己免疫疾患の治療薬として、さらにはそれら疾患の予防薬として有効である（このように本発明の「治療薬」は、膠原病や自己免疫疾患の予防薬を含む意味である）。
【００１７】
血漿ＧＰＩ−ＰＬＤは、静脈注射等によって体内に導入しても毒性がないと推測されるので、この面からも治療薬として有用である。
【００１８】
ｂ）ＧＰＩ−ＰＬＤの精製方法
このようなＧＰＩ−ＰＬＤの精製方法としては、例えば、人の正常血清から親和性カラムにて血漿ＧＰＩ−ＰＬＤを精製し、濃縮することができる。
また、ＧＰＩ−ＰＬＤの野生型あるいは活性化型の組み換え遺伝子を作製し、人の細胞株などに安定的に発現させて、上清から親和性カラムにて精製することが容易であり、この場合、ＧＰＩ−ＰＬＤの大量生産が可能である。
【００１９】
配列番号１には、野生型ヒトＧＰＩ−ＰＬＤをコードする遺伝子の塩基配列（アクセッション番号：Ｐ８０１０８）が示され、配列番号２には、野生型ヒトＧＰＩ−ＰＬＤのアミノ酸配列（アクセッション番号：Ｌ１１７０２）が示される。配列番号１の塩基配列において、１〜２５２０番目のヌクレオチドがアミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域に相当する。これらの配列情報をもとにＧＰＩ−ＰＬＤの野生型あるいは活性化型の組み換え遺伝子を容易に作製することができる。
【００２０】
ｃ）治療薬の具体的形態と投与方法
上記ＧＰＩ−ＰＬＤあるいはその遺伝子の薬剤化については、従来公知の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、上記ＧＰＩ−ＰＬＤを静脈注射などによって投与する場合、ＧＰＩ−ＰＬＤを適当な溶液に溶かして薬液を製造すればよい。ＧＰＩ−ＰＬＤは、適当な外被タンパク質やリポソーム、ウィルス粒子などに内包させてもよい。また、このようなＧＰＩ−ＰＬＤ内包物の表面に適当な抗原を提示させることによって、目的細胞または目的組織に特異的にＧＰＩ−ＰＬＤを送り込むことが可能である。
【００２１】
薬剤の投与は、静脈注射による投与以外に、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げられる。また、患者の体外に取り出された血液等に薬剤を投与し、その後、患者の体内にその血液等を戻すような方法であってもよい。
【００２２】
上記ＧＰＩ−ＰＬＤの遺伝子を治療薬に用いる場合は、投与後、目的細胞においてＧＰＩ−ＰＬＤが発現されるように、当該遺伝子を発現ベクターに組み込むとよい。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、目的細胞中で発現可能なベクターであって人体に安全なものであればよい。さらに、こうしてＧＰＩ−ＰＬＤ遺伝子が組み込まれたベクターを、適当な外被タンパク質やリポソーム、ウィルス粒子などに内包させてもよい。これにより、上記と同様、目的細胞または目的組織に特異的にＧＰＩ−ＰＬＤ遺伝子を送り込み、ＧＰＩ−ＰＬＤを発現させることが可能である。
【００２３】
ｄ）ＧＰＩ−ＰＬＤ以外のホスホリパーゼＤの治療薬への利用
前述のように、ＧＰＩ−ＰＬＤは野生型であってもよいし、活性化型に改変したものであってもよい。また、バクテリアＰＬＤも、野生型ＧＰＩ−ＰＬＤと同様、アポトーシス細胞特異的に作用し、断片化したＤＮＡを細胞から遊離させる活性を持つことが示された。このため、バクテリアＰＬＤ等のホスホリパーゼＤも治療薬として利用できる可能性がある。このようなホスホリパーゼＤの有効性については、例えば膠原病の実験モデル動物にてその効果を確認することができる。
【００２４】
（Ｂ）本発明の診断方法（判定方法および判定キット）について
前述のように、ＧＰＩ−ＰＬＤの活性低下が膠原病や自己免疫疾患の直接の原因になっていると考えられるため、被験者から得た検体（血液や患部組織など）内のＧＰＩ−ＰＬＤの含有量またはその活性を測定することにより、膠原病もしくは自己免疫疾患の罹患の有無またはその発症可能性を判定することが可能である。ＧＰＩ−ＰＬＤの含有量やその活性の測定方法は特に限定されるものではなく、例えば、ＧＰＩ−ＰＬＤ（配列番号２にアミノ酸配列が示される）、又はその部分ペプチドに対する抗体を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等によってその含有量を測定することができる。
【００２５】
また、ＧＰＩ−ＰＬＤの活性を測定する方法としては、細胞にＧＰＩアンカー型のアルカリホスファターゼを発現させておいて可溶化剤存在下にＧＰＩ−ＰＬＤを添加し、細胞膜表面から解離したアルカリホスファターゼの活性を測定することによりＧＰＩ−ＰＬＤの活性を測定する方法が例示される。
【００２６】
本発明の判定キットとしては、ＧＰＩ−ＰＬＤの含有量またはその活性を測定するための材料を含むものであればよく、上記抗体や測定に必要な酵素、試薬などを含むものが例示される。
【００２７】
【実施例】
血漿ＧＰＩ−ＰＬＤ　がアポトーシス細胞に対して特異的に作用し、断片化したＤＮＡを細胞から遊離させる活性を有するか、以下の実験により調べた。
【００２８】
本実験において、アポトーシスを起こすものとして使用した細胞は、ＤＴ４０細胞　（ｃｈｉｋｅｎ　ｐｒｅ−Ｂ細胞）１×１０６　ｃｅｌｌｓであり、アポトーシスを生じさせるための刺激剤としての抗原は、Ｍ４　（ａｎｔｉ　ｃｈｉｃｋ　ＩｇＭ　Ａｂ）４　μｇ／ｍｌを用いた。
【００２９】
ＧＰＩ−ＰＬＤの存在、および非存在下でそれぞれＤＴ４０細胞に対して、上記抗原により刺激してアポトーシスを生じさせた。続いて、２４時間後、上記各ＤＴ４０細胞の固形分画および上清分画から、ＤＮＡをそれぞれ抽出した。各抽出法を、以下の各フローチャートにそれぞれ示す。
【００３０】
まず、固形分画（ｐｐｔ）からのＤＮＡ抽出法を示す。
１）　　１×１０６以上の細胞をＰＢＳ（−）で一回洗浄、少量のＰＢＳ（−）に浮遊させ、１．５ｍｌチューブに移し、微量遠心機で２，５００ｒｐｍ、５分間遠心する。
２）　　上清を除去、細胞ペレットをチューブの底を叩いて浮遊させてから、細胞融解バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）１００μｍ加え、細胞融解させてＤＮＡ断片を抽出する。
３）　　上記抽出液を、４℃にて、１０分間、静置した後、１６，０００ｒｐｍ、２０分間遠心する。
４）　　上清（ＤＮＡを含む）を、１．５ｍｌチューブに取る。
５）　　ＲＮＡａｓｅ　Ａ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を４μｌ加え、３７℃に１時間静置する。
６）　　２μｌのプロテナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）　Ｋ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃に１時間静置する。
７）　　１０μｌの３Ｍの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）水溶液と、２５０μｌのエタノールを加え、−２０℃にて、一晩静置する。
８）　　その後、１６，０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、続いて、上清を除去した後、ＴＥバッファー２０μｍに融解して、固形分画からのＤＮＡ抽出液とする。
【００３１】
次に、上清分画（ｓｕｐ）からのＤＮＡ抽出法を示す。
１）　　培養上清より１００μｌとり、等量の中性フェノールを加え、混合する。
２）　　上記混合液を、１０，０００ｒｐｍにて、５分間遠心する。
３）　　上記上清の水層（ＤＮＡを含む）を新たな１．５ｍｌチューブに取る。
４）　　上記チューブに１００μｌの中性フェノールを加える。
５）　　上記の２）〜３）の操作を再び行う。
６）　　１００μｌのクロロフォルムを加え、混合する。
７）　　上記の２）〜３）の操作を再び行う。
８）　　１０μｌの３Ｍの酢酸ナトリウム水溶液と２５０μｌのエタノールを加えて混合し、−２０℃にて、一晩静置する。
９）　　その後、１６，０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清除去後、ＴＥバッファー２０μｌに融解して、上清分画からのＤＮＡ抽出液とする。
【００３２】
次に、上記のＧＰＩ−ＰＬＤの存在、および非存在下での固形分画、上清分画からの各抽出液について、以下のアガロースゲル電気泳動により、ＤＮＡの有無をそれぞれ測定した。
１）　　２％程度のアガロースゲルを作製する。
２）　　ＤＮＡ試料は、（上記各ＤＮＡ抽出液＋ＴＥバッファー）５：ゲルローディングバッファー（６Ｘ）１となるように混合して調製する。
３）　　上記の混合サンプル及びＤＮＡ分子量マーカーをウェルに入れる。
４）　　５０ＶくらいでＢＰＢがゲルの約２／３の位置にくるくらいまで、泳動する。
５）　　１μｇ／ｍｌ程度の濃度のエチジウムブロマイド溶液にゲルを浸漬し、上記ゲルに対して、上記エチジウムブロマイド溶液を、ゆっくり２０分程度浸透させる。
６）　　上記ゲルに対して、ＵＶトランスイルミネーターでＤＮＡの蛍光を検出し、写真撮影を行う。
【００３３】
以上の実験結果を図１に示す。つまり図１は、ＧＰＩ−ＰＬＤの非存在下（レーン１〜３）又は存在下（レーン４・５）において、抗ニワトリＩｇＭ抗体（Ｍ４）を用いて刺激（レーン２〜５）した結果であり、図中レーン１は、ネガティブコントロールである。
【００３４】
同図に示すように、ＧＰＩ−ＰＬＤの非存在下では、アポトーシスを生じたＤＴ４０細胞における、固形分画（レーン２）および上清分画（レーン３）の双方からＤＮＡが検出された。一方、ＧＰＩ−ＰＬＤの存在下では、アポトーシスを生じたＤＴ４０細胞における、上清分画（レーン５）のみからＤＮＡが検出された。また、上清分画（レーン５）からのＤＮＡ検出量は、非存在下での、固形分画（レーン２）および上清分画（レーン３）の合計に相当すると判断された。
【００３５】
以上のように、ＧＰＩ−ＰＬＤがアポトーシス細胞に対して特異的に作用し、断片化したＤＮＡを細胞から速やかに遊離させる活性を持つことが示された。こうしたＧＰＩ−ＰＬＤの作用を利用して、アポトーシス細胞内の断片化ＤＮＡ等を速やかに外部に取り出し、近傍の貪食細胞などに取り込ませることによって、膠原病や自己免疫疾患に対しての有効な治療法になると判断される。
【００３６】
【発明の効果】
本発明は、以上のように、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、特にＧＰＩ−ＰＬＤの活性を利用した膠原病や自己免疫疾患の新たな治療法および診断法を提供するものであり、これにより、膠原病や自己免疫疾患に対するより根源的な治療と的確な診断の実現が期待できる。また、ＧＰＩ−ＰＬＤ等は毒性がなく、大量生産が可能である。
【００３７】
【配列表】
2004059550.tif 000002
2004059550.tif 000003
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るＧＰＩ−ＰＬＤが、アポトーシス細胞に対して特異的に作用し、断片化したＤＮＡを細胞から遊離させる活性を持つことを示す電気泳動図である。
【図１】
2004059550.tif 000017