(57)【要約】【課題】各種骨代謝異常症において、関節変形の端緒となる骨破壊に対する治療又は予防に有用な新規医薬組成物、及び骨破壊に対する新規治療又は予防剤を提供することにある。【解決手段】ＯＣＩＦ、その類縁体及びその変異体からなる群から選択される１又は２以上の物質、もしくはＯＣＩＦ、その類縁体及びその変異体からなる群から選択される１又は２以上の物質と多糖又はその誘導体との複合体、およびマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）が産生する抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａのヒト化抗体を有効成分として含有する、骨代謝以上症における骨破壊の治療又は予防のための医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記［１］及び［２］を含有する医薬組成物；
［１］破骨細胞形成抑制因子（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ：以下、「ＯＣＩＦ」という）、その類縁体及びその変異体からなる群から選択される１又は２以上の物質（以下、「ＯＣＩＦ物質」という）；
［２］アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体。
【請求項２】
下記［１］及び［２］を含有する医薬組成物；
［１］ＯＣＩＦ物質、及び、多糖又はその誘導体（以下、「多糖物質」という）が、１：１乃至１：８の分子比で結合している、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体；
［２］アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体。
【請求項３】
多糖物質がデキストラン硫酸である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
デキストラン硫酸の平均分子量が１８００乃至６０００である、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体が、下記工程［Ａ］乃至［Ｃ］により製造されることを特徴とする、請求項２乃至４のいずれか一つに記載の医薬組成物；
［Ａ］ＯＣＩＦ物質及び多糖物質を混合する工程：
［Ｂ］ＯＣＩＦ物質及び多糖物質を保温する工程：
［Ｃ］遊離の多糖物質を除去する工程。
【請求項６】
請求項５に記載の工程［Ｂ］において、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質をアルカリ性条件下にて保温することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項７】
請求項５に記載の工程［Ｂ］において、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質をｐＨ１０乃至１１の条件下にて保温することを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項５に記載の工程［Ｃ］において、ゲル濾過により遊離の多糖物質を除去することを特徴とする、請求項５乃至７のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項９】
アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体がモノクローナル抗体ＣＨ１１又はそれらのヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体がマウス−マウスハイブリドーマＨＥＦ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）が産生する抗ヒトＦａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ又はそれらのヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
下記［１］及び［２］を有効成分として含有する骨代謝異常症予防又は治療剤；
［１］ＯＣＩＦ物質；
［２］アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体。
【請求項１２】
下記［１］及び［２］を有効成分として含有する骨代謝異常症予防又は治療剤；
［１］ＯＣＩＦ物質、及び、多糖物質が、１：１乃至１：８の分子比で結合している、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体；
［２］アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体。
【請求項１３】
多糖物質がデキストラン硫酸である、請求項１２に記載の骨代謝異常症予防又は治療剤。
【請求項１４】
デキストラン硫酸の平均分子量が１８００乃至６０００である、請求項１２又は１３に記載の骨代謝異常症予防又は治療剤。
【請求項１５】
ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体が、下記工程［Ａ］乃至［Ｃ］により製造されることを特徴とする、請求項１２乃至１４のいずれか一つに記載の骨代謝異常症予防又は治療剤；
［Ａ］ＯＣＩＦ物質及び多糖物質を混合する工程：
［Ｂ］ＯＣＩＦ物質及び多糖物質を保温する工程：
［Ｃ］遊離の多糖物質を除去する工程。
【請求項１６】
請求項１５に記載の工程［Ｂ］において、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質をアルカリ性条件下にて保温することを特徴とする、骨代謝異常症予防又は治療剤。
【請求項１７】
請求項１５に記載の工程［Ｂ］において、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質をｐＨ１０乃至１１の条件下にて保温することを特徴とする、請求項１６に記載の骨代謝異常症予防又は治療剤。
【請求項１８】
請求項１５に記載の工程［Ｃ］において、ゲル濾過により遊離の多糖物質を除去することを特徴とする、請求項１５乃至１７のいずれか一つに記載の骨代謝異常症予防又は治療剤。
【請求項１９】
アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体がモノクローナル抗体ＣＨ１１又はそれらのヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１１乃至１８のいずれか一つに記載の骨代謝異常症予防又は治療剤。
【請求項２０】
アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体がマウス−マウスハイブリドーマＨＥＦ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）が産生する抗ヒトＦａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ又はそれらのヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１１乃至１８のいずれか一つに記載の骨代謝異常症予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＯＣＩＦ物質及びアポトーシスを誘導する抗ヒトＦａｓ抗体を含有する医薬組成物に関する。また、本発明は、ＯＣＩＦ物質等及びアポトーシスを誘導する抗ヒトＦａｓ抗体を有効成分として含有する骨代謝異常症予防又は治療剤等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
単球・マクロファージ系の破骨細胞前駆細胞は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）と、骨芽細胞／間質細胞等が発現する破骨細胞分化因子（ＲＡＮＫＬ／ＯＤＦ）からの刺激によって活性化破骨細胞に分化、活性化することが知られている（非特許文献１参照）。ＯＣＩＦはＲＡＮＫＬに対する可溶性のデコイレセプターとして働き、破骨細胞前駆細胞が破骨細胞への分化及び成熟破骨細胞による骨吸収活性を阻害する内因性蛋白質として知られている（特許文献１参照）。ＯＣＩＦにより骨吸収の主役である破骨細胞自体の形成及び成熟破骨細胞による骨吸収活性を抑制することができれば、慢性関節リウマチにおける骨破壊を治療することができると期待される。
【０００３】
マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａの産生する抗Ｆａｓモノクローナル抗体及びそのヒト化抗体については、Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド系の異常によってアポトーシスが誘導されないため排除されないまま生き残っている自己反応性の免疫細胞を排除することにより、自己免疫疾患の一種である慢性関節リウマチの治療効果を有することが知られている（特許文献２、特許文献３又は特許文献４参照）。
【０００４】
【特許文献１】
ＷＯ９６／２６２１７号パンフレット
【特許文献２】
特開平１１−１７１９００号公報
【特許文献３】
特開２０００−１６６５７３号公報
【特許文献４】
特開２０００−１６６５７４号公報
【非特許文献１】
ヤスダら（Ｙａｓｕｄａ，　　Ｈ．　　ｅｔ　　ａｌ．）「ボーン（Ｂｏｎｅ）」１９９９年、２５巻、ｐ．１０９−１３３
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、各種骨代謝異常症において、関節変形の端緒となる骨破壊に対する治療又は予防に有用な新規医薬組成物、及び骨破壊に対する新規治療又は予防剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、ＯＣＩＦと抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体を併用することにより、ＯＣＩＦのもつ骨吸収抑制作用が増強されることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
（１）　下記［１］及び［２］を含有する医薬組成物；
［１］ＯＣＩＦ物質；
［２］アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体、
（２）　下記［１］及び［２］を含有する医薬組成物；
［１］ＯＣＩＦ物質、及び、多糖物質が、１：１乃至１：８の分子比で結合している、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体；
［２］アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体、
（３）　多糖物質がデキストラン硫酸である、（２）に記載の医薬組成物、
（４）　デキストラン硫酸の平均分子量が１８００乃至６０００である、（２）又は（３）に記載の医薬組成物、
（５）ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体が、下記工程［Ａ］乃至［Ｃ］により製造されることを特徴とする、（２）乃至（４）のいずれか一つに記載の医薬組成物；
［Ａ］ＯＣＩＦ物質及び多糖物質を混合する工程：
［Ｂ］ＯＣＩＦ物質及び多糖物質を保温する工程：
［Ｃ］遊離の多糖物質を除去する工程、
（６）　（５）に記載の工程［Ｂ］において、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質をアルカリ性条件下にて保温することを特徴とする、医薬組成物、
（７）　（５）に記載の工程［Ｂ］において、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質をｐＨ１０乃至１１の条件下にて保温することを特徴とする、（６）に記載の医薬組成物、
（８）　（５）に記載の工程［Ｃ］において、ゲル濾過により遊離の多糖物質を除去することを特徴とする、（５）乃至（７）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（９）　アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体がモノクローナル抗体ＣＨ１１又はそれらのヒト化抗体であることを特徴とする、（１）乃至（８）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（１０）　アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体がマウス−マウスハイブリドーマＨＥＦ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）が産生する抗ヒトＦａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ又はそれらのヒト化抗体であることを特徴とする、（１）乃至（８）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（１１）　下記［１］及び［２］を有効成分として含有する骨代謝異常症予防又は治療剤；
［１］ＯＣＩＦ物質；
［２］アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体、
（１２）　下記［１］及び［２］を有効成分として含有する骨代謝異常症予防又は治療剤；
［１］ＯＣＩＦ物質、及び、多糖物質が、１：１乃至１：８の分子比で結合している、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体；
［２］アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体、
（１３）　多糖物質がデキストラン硫酸である、（１２）に記載の骨代謝異常症予防又は治療剤、
（１４）　デキストラン硫酸の平均分子量が１８００乃至６０００である、（１２又は１３に記載の骨代謝異常症予防又は治療剤、
（１５）　ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体が、下記工程［Ａ］乃至［Ｃ］により製造されることを特徴とする、（１２）乃至（１４）のいずれか一つに記載の骨代謝異常症予防又は治療剤；
［Ａ］ＯＣＩＦ物質及び多糖物質を混合する工程：
［Ｂ］ＯＣＩＦ物質及び多糖物質を保温する工程：
［Ｃ］遊離の多糖物質を除去する工程、
（１６）　（１５）に記載の工程［Ｂ］において、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質をアルカリ性条件下にて保温することを特徴とする、骨代謝異常症予防又は治療剤、
（１７）　（１５）に記載の工程［Ｂ］において、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質をｐＨ１０乃至１１の条件下にて保温することを特徴とする、（１６）に記載の骨代謝異常症予防又は治療剤、
（１８）　（１５）に記載の工程［Ｃ］において、ゲル濾過により遊離の多糖物質を除去することを特徴とする、（１５）乃至（１７）のいずれか一つに記載の骨代謝異常症予防又は治療剤、
（１９）　アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体がモノクローナル抗体ＣＨ１１又はそれらのヒト化抗体であることを特徴とする、（１１）乃至（１８）のいずれか一つに記載の骨代謝異常症予防又は治療剤、
（２０）　アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体がマウス−マウスハイブリドーマＨＥＦ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）が産生する抗ヒトＦａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ又はそれらのヒト化抗体であることを特徴とする、（１１）乃至（１８）のいずれか一つに記載の骨代謝異常症予防又は治療剤、
（２１）　下記［１］及び［２］に記載の物質のそれぞれの薬理的な有効量を投与することを含む骨代謝異常症の予防又は治療方法；
［１］ＯＣＩＦ物質；
［２］アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体、
（２２）　下記［１］及び［２］に記載の物質のそれぞれの薬理的な有効量を投与することを含む骨代謝異常症の予防又は治療方法；
［１］ＯＣＩＦ物質、及び、多糖物質が、１：１乃至１：８の分子比で結合している、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体；
［２］アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体、
（２３）　多糖物質がデキストラン硫酸である、（２２）に記載の予防又は治療方法、
（２４）　デキストラン硫酸の平均分子量が１８００乃至６０００である、（２２）又は（２３）に記載の予防又は治療方法、
（２５）　ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体が、下記工程［Ａ］乃至［Ｃ］により製造されることを特徴とする、（２２）乃至（２４）のいずれか一つに記載の予防又は治療方法；
［Ａ］ＯＣＩＦ物質及び多糖物質を混合する工程：
［Ｂ］ＯＣＩＦ物質及び多糖物質を保温する工程：
［Ｃ］遊離の多糖物質を除去する工程、
（２６）　（２５）に記載の工程［Ｂ］において、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質をアルカリ性条件下にて保温することを特徴とする、予防又は治療方法、
（２７）　（２５）に記載の工程［Ｂ］において、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質をｐＨ１０乃至１１の条件下にて保温することを特徴とする、（２６）に記載の予防又は治療方法、
（２８）　（２５）に記載の工程［Ｃ］において、ゲル濾過により遊離の多糖物質を除去することを特徴とする、（２５）乃至（２７）のいずれか一つに記載の予防又は治療方法、
（２９）　アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体がモノクローナル抗体ＣＨ１１又はそれらのヒト化抗体であることを特徴とする、（２１）乃至（２８）のいずれか一つに記載の骨代謝異常症予防又は治療剤、
（３０）　アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体がマウス−マウスハイブリドーマＨＥＦ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）が産生する抗ヒトＦａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ又はそれらのヒト化抗体であることを特徴とする、（２１）乃至（２８）のいずれか一つに記載の予防又は治療方法、
（３１）　医薬組成物を製造するための下記［１］及び［２］の使用；
［１］ＯＣＩＦ物質；
［２］アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体、
（３２）　医薬組成物を製造するための下記［１］及び［２］の使用；
［１］ＯＣＩＦ物質、及び、多糖物質が、１：１乃至１：８の分子比で結合している、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体；
［２］アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体、
（３３）　多糖物質がデキストラン硫酸である、請求項３２に記載の使用、
（３４）　デキストラン硫酸の平均分子量が１８００乃至６０００である、（３２）又は（３３）に記載の使用、
（３５）　ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体が、下記工程［Ａ］乃至［Ｃ］により製造されることを特徴とする、（３２）乃至（３４）のいずれか一つに記載の使用；
［Ａ］ＯＣＩＦ物質及び多糖物質を混合する工程：
［Ｂ］ＯＣＩＦ物質及び多糖物質を保温する工程：
［Ｃ］遊離の多糖物質を除去する工程、
（３６）　請求項３５に記載の工程［Ｂ］において、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質をアルカリ性条件下にて保温することを特徴とする、（３５）に記載の使用、
（３７）　（３５）に記載の工程［Ｂ］において、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質をｐＨ１０乃至１１の条件下にて保温することを特徴とする、（３６）に記載の使用、
（３８）　（３５）に記載の工程［Ｃ］において、ゲル濾過により遊離の多糖物質を除去することを特徴とする、（３５）乃至（３７）のいずれか一つに記載の使用、
（３９）　アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体がモノクローナル抗体ＣＨ１１又はそれらのヒト化抗体であることを特徴とする、（３１）乃至（３８）のいずれか一つに記載の使用、
（４０）　アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体がマウス−マウスハイブリドーマＨＥＦ７Ａ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８）が産生する抗ヒトＦａｓ抗体ＨＦＥ７Ａ又はそれらのヒト化抗体であることを特徴とする、（３１）乃至（３８）のいずれか一つに記載の使用、
（４１）　医薬組成物が骨代謝異常症の予防又は治療のための組成物である、（３１）乃至（４０）に記載の使用、
を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の医薬組成物は、ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体に加え、アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体を含有する。本発明においては、そのような医薬組成物を骨代謝異常症の予防又は治療に適用することを、ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体並びにアポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体の「併用」と呼ぶ。
【０００８】
同様に、本発明の骨代謝異常症予防又は治療剤は、ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体に加え、アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体を含有する。本発明においては、そのような骨代謝異常症予防又は治療剤を骨代謝異常症の予防又は治療に適用することも、ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体並びにアポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体の「併用」と呼ぶ。
【０００９】
さらに、本発明は、薬理的に有効な量のＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体と、薬理的に有効な量のアポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体を投与することを含む骨代謝異常症の予防又は治療方法を含むものとする。本発明においては、そのような骨代謝異常症の予防又は治療方法も、ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体並びにアポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体の「併用」と呼ぶ。
【００１０】
また、本発明の医薬組成物又は本発明の骨代謝異常症予防又は治療剤を製造するための、ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体、並びに、アポトーシス誘導活性を有する抗ヒトＦａｓ抗体の使用も本発明に含まれる。
【００１１】
本発明において、骨代謝異常症とは、実質的な骨量の減少を特徴とするあらゆる疾患であり、それを治療するかあるいは予防するためには骨吸収又は骨吸収速度を抑制する必要がある疾患を意味する。
【００１２】
本発明の医薬組成物を用いて治療又は予防される骨代謝異常症には、一次性骨粗鬆症（老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症及び特発性若年性骨粗鬆症）、内分泌骨粗鬆症（甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群及び末端肥大症）、性機能低下に伴う骨粗鬆症（下垂体機能低下症、Ｋｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ症候群及びＴｕｒｎｅｒ症候群）、遺伝性及び先天性形態の骨粗鬆症（骨形成不全、ホモシスチン尿症、メンケス症及びライリー−デイ症候群）、重力負荷軽減又は四肢の固定や不動化による骨減少症、パジェット病、骨髄炎、骨喪失による感染性病巣、固形腫瘍（乳癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌等）に起因する高カルシウム血症、血液学的悪性疾患（多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病）、特発性高カルシウム血症、甲状腺機能亢進症又は腎臓機能不全に伴う高カルシウム血症、ステロイド投与に起因する骨減少症、他の薬物（メトトレキセート及びシクロスポリンＡ等の免疫抑制剤、ヘパリン及び抗てんかん薬）投与に起因する骨減少症、腎臓機能不全に伴う骨減少症、外科手術、消化器疾患（小腸障害、大腸障害、慢性肝炎、胃切除、原発性胆汁性肝硬変及び肝硬変）に伴う骨減少症、慢性関節リウマチ等の各種リウマチによる骨減少症、慢性関節リウマチ等の各種リウマチによる骨破壊及び関節破壊、ムチランス型リウマチ、変形性関節症、歯周骨喪失、癌の骨転移（骨溶解性転移）、外傷性負傷、ゴシェ病、鎌状赤血球貧血、全身性紅性狼創若しくは非外傷性負傷に伴う骨壊死又は骨細胞死、腎性骨異栄養症等の骨異栄養症、低アルカリフォスファターゼ血症、糖尿病に伴う骨減少症、栄養障害又は摂食障害に伴う骨減少症、その他の骨減少症等が包含される。また、本発明における骨代謝異常症は、前記固形腫瘍、癌の骨転移（骨溶解性転移）又は血液学的悪性疾患による悪液質をも包含する（特開２０００−１７８２００号公報参照）。
【００１３】
本発明において、「骨吸収」とは主に破骨細胞により骨が吸収される現象を表わし、細胞又は分子レベルの現象を指す場合に用いるのに対し、「骨破壊」とは骨代謝異常症の患者の骨において骨吸収によって骨量又は骨密度が減少する現象を表わし、個体レベルの現象を指す場合に用いる。
【００１４】
本発明のＯＣＩＦ、その類縁体又はその変異体は、ＷＯ９６／２６２１７号公報又はＷＯ９７／２３６１４号公報に記載された方法により、動物の組織、動物の体液若しくは動物細胞の培養液等からタンパク質として抽出精製された天然型として、又はＯＣＩＦ、その類縁体若しくはその変異体をコードするポリヌクレオチドを組み込んだベクターで形質転換された動物細胞や大腸菌等の宿主細胞が生産する遺伝子組換え型として、得ることができる。
【００１５】
本発明のＯＣＩＦ、その類縁体及びその変異体の起源は特に限定されないが、好適にはヒト、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物又はニワトリ、ガチョウ、シチメンチョウ等の鳥類由来であり、より好適にはヒトＯＣＩＦである。
【００１６】
また、本発明のＯＣＩＦ及びその類縁体は、一本鎖のポリペプチドとして生産されるが、非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は約６００００又は約１２００００であり（ＷＯ９６／２６２１７号公報参照）、好適には分子量約１２００００の２量体である。
【００１７】
本発明において、ＯＣＩＦ類縁体とは、ヒトＯＣＩＦｃＤＮＡをプローブとするハイブリダイゼーション法により、動物細胞、体液又は組織由来のｃＤＮＡライブラリーより得ることができるポリヌクレオチドにコードされたタンパク質であり、そのようなＯＣＩＦ類縁体としてＯＣＩＦ２、ＯＣＩＦ３、ＯＣＩＦ４、ＯＣＩＦ５（いずれも、ＷＯ９６／２６２１７号公報参照）、ヒト以外の動物由来のＯＣＩＦ等を例示することができる。そのようなＯＣＩＦ類縁体は、ヒトＯＣＩＦｃＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション法によりＯＣＩＦ類縁体をコードするｃＤＮＡを得、発現ベクターへ挿入し、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、発現させることにより、得ることができる（ＷＯ９６／２６２１７号公報参照）。
【００１８】
本発明において、ＯＣＩＦ変異体とは、ヒトＯＣＩＦと１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入され且つＯＣＩＦ活性を有するタンパク質を意味する。そのようなＯＣＩＦ変異体は、ＯＣＩＦ又はその類縁体をコードするヌクレオチドに、ＰＣＲ法、遺伝子組換え法、又は、制限酵素等のエキソ型ヌクレアーゼ若しくはエンド型ヌクレア−ゼを用いた切断法により、１又は２以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加及び／又は挿入を行い、次いで得られたヌクレオチド変異体を挿入した発現ベクターで動物細胞又は大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、該宿主細胞の発現するタンパク質画分から常法に従って精製することにより、得ることができる。
【００１９】
また、ヒトＯＣＩＦのアミノ酸配列のカルボキシル末端から相当部分を欠失させた、短鎖型ＯＣＩＦにもＯＣＩＦ本来の生物活性を保持している分子が知られている（ＷＯ９６／２６２１７号公報及びＷＯ９７／２３６１４号公報参照）。本発明のＯＣＩＦ変異体には、ＯＣＩＦ活性を有する短鎖型ＯＣＩＦも包含される。そのような短鎖型ＯＣＩＦのアミノ末端には、必要に応じて、メチオニンが付加され得る。
【００２０】
さらに、ＯＣＩＦは免疫グロブリンのＦｃドメイン等との融合タンパク質としても活性を保持している例が知られており（ＷＯ９７／２３６１４号公報参照）、本発明のＯＣＩＦ変異体にはそのようなＯＣＩＦの融合タンパク質も包含される（ＷＯ９７／２３６１４号公報参照）。
【００２１】
また、ＯＣＩＦは水溶性ポリマー等の化学修飾を受けるとその活性に改善が見られることが知られており、本発明のＯＣＩＦ変異体はそのような化学修飾ＯＣＩＦをも包含する。化学修飾ＯＣＩＦとしては、ポリエチレングリコールが結合したＯＣＩＦを例示することができる（ＷＯ９７／２３６１４号公報参照）。
【００２２】
このような本発明のＯＣＩＦ変異体としては、ＯＣＩＦ−Ｃ１９Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２０Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２１Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２２Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２３Ｓ、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ１、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ２、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ３、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ４、ＯＣＩＦ−ＤＤＤ１、ＯＣＩＦ−ＤＤＤ２、ＯＣＩＦ−ＣＬ、ＯＣＩＦ−ＣＣ、ＯＣＩＦ−ＣＤＤ２、ＯＣＩＦ−ＣＤＤ１、ＯＣＩＦ−ＣＣＲ４、ＯＣＩＦ−ＣＣＲ３、ＯＣＩＦ−ＣＢｓｔ、ＯＣＩＦ−ＣＳｐｈ、ＯＣＩＦ−ＣＢｓｐ、ＯＣＩＦ−ＣＰｓｔ（以上、ＷＯ９６／２６２１７号公報参照）、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−１８５］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−１８０］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ１９５、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ２０２、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ２７７、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ３１９、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ４００、ｍｕＯＰＧ［２２−１８５］、ｍｕＯＰＧ［２２−１９４］、ｍｕＯＰＧ［２２−２００］、ｍｕＯＰＧ［２２−２１２］、ｍｕＯＰＧ［２２−２９３］、ｍｕＯＰＧ［２２−３５５］、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［２２−２０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ　Ｐ２６Ａ、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］−ＦｃＹ２８Ｆ、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］、ｈｕＯＰＧ［２７−４０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［２９−４０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［３２−４０１］−Ｆｃ、ＭｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］、ＭｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］５ｋＰＥＧ、ＭｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］２０ｋ　ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　５ｋ　ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　２０ｋ　ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　３１ｋ　ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　５７ｋ　ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　１２ｋ　ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　２０ｋ　分岐ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　８ｋ　ＰＥＧ　ダイマー、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　ジスルフィド架橋（以上、ＷＯ９７／２３６１４号公報参照）等を例示することができ、好適には、ＯＣＩＦ−Ｃ１９Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２０Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２１Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２２Ｓ、ＯＣＩＦ−Ｃ２３Ｓ、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ１、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ２、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ３、ＯＣＩＦ−ＤＣＲ４、ＯＣＩＦ−ＤＤＤ１、ＯＣＩＦ−ＤＤＤ２、ＯＣＩＦ−ＣＬ、ＯＣＩＦ−ＣＣ、ＯＣＩＦ−ＣＤＤ２、ＯＣＩＦ−ＣＤＤ１、ＯＣＩＦ−ＣＣＲ４、ＯＣＩＦ−ＣＣＲ３、ＯＣＩＦ−ＣＢｓｔ、ＯＣＩＦ−ＣＳｐｈ、ＯＣＩＦ−ＣＢｓｐ、ＯＣＩＦ−ＣＰｓｔ、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−１９４］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−１８５］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−１８０］−Ｆｃ、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ１９５、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ２０２、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ３１９、ｍｕＯＰＧ［２２−４０１］Ｃ４００、ｕＯＰＧ［２２−１９４］、ｍｕＯＰＧ［２２−２００］、ｍｕＯＰＧ［２２−２１２］、ｍｕＯＰＧ［２２−２９３］、ｍｕＯＰＧ［２２−３５５］、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［２２−２０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ　Ｐ２６Ａ、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］−Ｆｃ　Ｙ２８Ｆ、ｈｕＯＰＧ［２２−４０１］、ｈｕＯＰＧ［２７−４０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［２９−４０１］−Ｆｃ、ｈｕＯＰＧ［３２−４０１］−Ｆｃ、ＭｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］５ｋ　ＰＥＧ、ＭｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］２０ｋ　ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　５ｋ　ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　２０ｋ　ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　３１ｋ　ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　５７ｋ　ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　１２ｋ　ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　２０ｋ分岐ＰＥＧ、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　８ｋ　ＰＥＧ　ダイマー、ＨｕＯＰＧ　ｍｅｔ［２２−１９４］Ｐ２５Ａ　ジスルフィド架橋である。
【００２３】
以上のような本発明のＯＣＩＦ類縁体及びＯＣＩＦ変異体のうち好適なものは、ＯＣＩＦと同等以上又はＯＣＩＦに準ずる生理活性を有する。
【００２４】
本発明のＯＣＩＦ、その類縁体及びその変異体には、糖鎖が付加していてもよい。糖鎖が付加したＯＣＩＦ、その類縁体又はその変異体としては、動物細胞が生産する組換え型ＯＣＩＦ、動物組織等から単離された天然型のＯＣＩＦ等を例示することができる。糖鎖が付加したＯＣＩＦ、その類縁体及びその変異体の生産に適した動物細胞としては、チャイニーズ・ハムスター・オヴァリー（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ：以下、「ＣＨＯ」という。）細胞等の哺乳動物細胞を例示することができる。ちなみに、糖鎖が付加していない、遺伝子組換え型のＯＣＩＦ、その類縁体及びその変異体の生産に適した細胞としては、大腸菌等の原核細胞等を例示することができる。
【００２５】
本発明において、多糖又はその誘導体とは、単糖がグリコシド結合することにより生じる重合体（グルカン）又はその誘導体であり、好適には構成単糖が２種類以上からなるヘテロ多糖（ヘテログリカン）又はその誘導体である。具体的には、天然型の多糖又はその誘導体としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン酸、ヘパラン酸、ケラタン酸、カラギーナン、ペクチン、ヘパリン等を例示することができ、合成型の多糖又はその誘導体としては、デキストラン硫酸等を例示することができ、好適にはデキストラン硫酸である。
【００２６】
本発明において、デキストラン硫酸とはデキストラン硫酸又はその塩であり、好適にはデキストラン硫酸ナトリウムである。デキストラン硫酸ナトリウムとしては、デキストラン硫酸ナトリウムイオウ５（名糖産業（株）製）、デキストラン硫酸ナトリウム５０００、デキストラン硫酸１００００（ともに、和光純薬（株）製）等を例示することができる。
【００２７】
デキストラン硫酸の分子量は次のようにして算出される；
１）デキストランの分子量の測定
デキストランの極限粘度（極限粘度の測定法は、第十三改正、日本薬局方　解説書、廣川書店刊（１９９８）、デキストラン４０の項参照）より、下記の佐藤の式により算出することができる（第十三改正、日本薬局方　解説書、廣川書店刊（１９９８）、デキストラン４０の項参照）。
極限粘度＝９．００×１０−４×分子量０．５０
２）イオウ含量の測定
日本薬局方（第十四改正、じほう刊（２００１）、デキストラン硫酸イオウ５の項参照）記載の方法によりデキストラン硫酸上のイオウ含量を重量％として測定した。
【００２８】
デキストランの構成単位であるグルコースの分子量は本来１８０であるが、デキストラン分子中ではグルコースどうしがα−１，６結合しているため、デキストラン分子中のグルコースの実質的な分子量は１８０から水１分子分の分子量を差し引いた値、すなわち１６２である。
【００２９】
デキストラン硫酸においては、上述のようなデキストラン分子中のグルコースの有する水素１原子がＳＯ３Ｎａ（１グラム当量１０３）に置換されるているので、イオウの置換度（以下、単に「置換度」という。）は下記式により表される。
イオウ含量（重量％）＝｛３２×置換度÷（１６２＋１０２×置換度）｝×１００
３）デキストラン硫酸の分子量の算出
上述の通りデキストランの構成単位であるグルコースの実質的な分子量は１６２であるので、下記式によりデキストラン硫酸の分子量を算出することができる。
分子量＝デキストランの分子量×（１６２＋１０２×置換度）÷１６２
デキストラン硫酸は一定の分子量分布を有していることが知られており、本発明においては、デキストラン硫酸の平均分子量をもってその分子量に代える。
【００３０】
本発明において好適に使用されるデキストラン硫酸ナトリウムイオウ５（名糖産業（株）製）の、上記２）に従って算出されたイオウ置換度（平均値±標準偏差）は０．３２±０．０１（ｎ＝７）であり、上記１）乃至３に従って算出された分子量（平均値±標準偏差）は１９５０±７０（ｎ＝７）である。同じく好適なデキストラン硫酸であるデキストラン硫酸ナトリウム５０００（和光純薬（株）製）は分子量５０００である。
【００３１】
本発明において使用される多糖又はその誘導体の平均分子量は、特に限定されるものではないが、好適な多糖又はその誘導体である、デキストラン硫酸の平均分子量は通常１５００乃至１２０００の範囲であり、より好適には１８００乃至６０００である。
【００３２】
本発明の多糖又はその誘導体は、そのまま使用してもよいが、精製、分画したものを使用してもよい。
【００３３】
本発明の提供する、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体における両者の分子比は、ＯＣＩＦ物質：多糖物質＝１：１乃至１：１０であり、好適には１：１乃至１：８であり、より好適には１：１乃至１：６であり、より一層好適には１：１乃至１：４である。
【００３４】
上述の通り、ＯＣＩＦは２量体を形成することが知られており（ＷＯ９６／２６２１７号公報参照）、ＯＣＩＦ物質は、ホモ又はヘテロ２量体や、単量体３つ以上からなるホモ又はヘテロ多量体であり得るが、本発明における当該分子比は、ＯＣＩＦ物質単量体（モノマー）１分子当たりの多糖物質の分子数として計算される。
【００３５】
本発明のＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体は、両者を水溶液中にて保温すること等により得ることができる。両者を水溶液中で保温する場合、ＯＣＩＦ物質の水溶液中の濃度範囲は、上限が１０乃至５０ｍｇ／ｍｌ、下限が０．１乃至５ｍｇ／ｍｌであり、好適な範囲は１乃至２０ｍｇ／ｍｌ、より好適な範囲は５乃至１０ｍｇ／ｍｌである。多糖物質の該水溶液中の濃度範囲は、上限が２００ｍｇ／ｍｌ乃至１０００ｍｇ／ｍｌ、下限が０．１乃至１００ｍｇ／ｍｌであり、好適な範囲は１０乃至５００ｍｇ／ｍｌ、より好適な範囲は１００乃至２００ｍｇ／ｍｌである。該水溶液のｐＨは、上限がｐＨ１１乃至１２、下限がｐＨ６乃至１０であり、好適な範囲はｐＨ１０乃至１１である。該水溶液を保温する温度は、上限が３７乃至５０℃、下限が０乃至４℃であり、好適な範囲は４乃至３７℃であり、より好適な範囲は４乃至１０℃である。
【００３６】
本発明のＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体は、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質が、共有結合、イオン結合、配位結合等の化学的結合、又は、疎水性的相互作用、水素結合、静電的相互作用、親和性結合等の非化学的結合により互いに結合したものである。
【００３７】
該複合体は、遊離の多糖物質を含有していない。
【００３８】
遊離の多糖物質を除去する方法としては、通常、精製、単離及び分画の操作に適用される手段であれば特に限定されるものではないが、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過（分子ふるい）クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ−、結晶化、塩析、限外濾過等を挙げることができ、好適にはゲル濾過クロマトグラフィー（以下、単に「ゲル濾過」という。）、限外濾過等を挙げることができる。
【００３９】
また、本発明のＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体は、等電点の測定、糖含量の測定、抗体による定量等により、原料であるＯＣＩＦ物質と区別することができる。
【００４０】
等電点は等電点電気泳動により常法に従って測定することができる。ＯＣＩＦは塩基性タンパク質でありその等電点はｐＨ９付近に観測されるが、デキストラン硫酸の如き多糖又はその誘導体が結合すると等電点が低下するので、ＯＣＩＦ物質とそれら及び多糖物質の複合体とを区別することが可能である。
【００４１】
糖含量はフェノール硫酸法による中性糖の定量法を用いて好適に測定することができる。多糖物質が結合したＯＣＩＦ物質の糖含量は元のＯＣＩＦ物質に比して増加するので、ＯＣＩＦ物質とそれら及び多糖物質の複合体とを区別することが可能である。
【００４２】
本発明の多糖物質と特異的に結合する抗体を用い、ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体中に含有される多糖物質を定量することにより、両者を区別することができる。
【００４３】
ＯＣＩＦ物質は、抗ＯＣＩＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法等を用いて測定することができる。該ＥＬＩＳＡに適した抗ＯＣＩＦモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマＯＩ−１９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６４２０）の生産する抗体、ハイブリドーマＯＩ−４（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６４１９）の生産する抗体、ハイブリドーマＯＩ−２６（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６４２１）の生産する抗体等を例示することができる（ＷＯ９９／１５６９１号公報参照）。ハイブリドーマＯＩ−１９又はＯＩ−４の生産する抗体はＯＣＩＦ単量体（モノマー）及び２量体（ホモダイマー）と結合し、ハイブリドーマＯＩ−２６の生産する抗体はＯＣＩＦ２量体（ホモダイマー）と特異的に結合する。このような抗体を用いて常法に従ってＥＬＩＳＡ測定を行うことができる（ＷＯ９９／１５６９１号公報参照）。
【００４４】
ＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体の、ヒト又は動物体内における血中滞留性は、ヒト又は動物に投与して一定時間が経過した後、血液を採取し、血液中又は血清中における、該複合体の濃度を、抗ＯＣＩＦモノクローナル抗体を用いた上述の如きＥＬＩＳＡ法等を用いて測定し、算出することが可能である（ＷＯ９９／１５６９１号公報参照）。
【００４５】
本発明において、抗ヒトＦａｓ抗体は、抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体又はそのヒト化抗体であることが望ましい。
【００４６】
抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体又はそのヒト化抗体は、例えば特開平１１−１７１９００号公報、特開２０００−１６６５７３号公報、特開２０００−１６６５７４号公報、特開２００１−３４２１４８号又は特開２００１−３４２１４９号公報記載の方法によって得ることができる。中でも、特開平２００１−３４２１４８号公報の実施例中で開示されているヒト化抗体が、本発明の医薬組成物の有効成分として好ましい。なお、本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体を作製するにあたっての基礎となる抗体として好適な抗Ｆａｓモノクローナル抗体の産生細胞であるマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａは工業技術院生命工学工業研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター、住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号　中央第６）に平成９年（１９９７年）２月１９日付けで国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８が付されている。また、ＨＥＦ７Ａの産生する抗Ｆａｓモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを動物細胞で発現させる組換えＤＮＡベクターで形質転換された大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＭＥ−Ｈ及びＥ．ｃｏｌｉ　ｐＭＥ−Ｌは、それぞれ平成９年（１９９７年）３月１２日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター、住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号　中央第６）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８６８及びＦＥＲＭ　ＢＰ−５８６７が付されている。また、ＨＥＦ７Ａの産生する抗Ｆａｓモノクローナル抗体をヒト化した抗Ｆａｓ抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ３種の形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＭＭ６　ＳＡＮＫ　７３６９７株、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＨＭ１７　ＳＡＮＫ　７３５９７株及びＥ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＨＨ７　ＳＡＮＫ　７３４９７株、並びに、ヒト化した抗Ｆａｓ抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｇＨＳＬ７Ａ６２　ＳＡＮＫ７３３９７株は、平成９年（１９９７年）８月２２日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター、住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号　中央第６）に国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７１、ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７２及びＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７３、並びにＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７４が付されている。さらに、ＨＥＦ７Ａの産生する抗Ｆａｓモノクローナル抗体をヒト化した抗Ｆａｓ抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ２種の形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＨＭ２　ＳＡＮＫ　７０１９８株及びＥ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＨＨ５　ＳＡＮＫ　７０３９８株、並びに、ヒト化した抗Ｆａｓ抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｇＨＰＤＨＶ３　ＳＡＮＫ　７０２９８株は、平成１０年（１９９８年）２月２６日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター、住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号　中央第６）に国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７２及びＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７４、並びにＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７３が付されている。
【００４７】
また、本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体を作製するにあたっての基礎となる抗体として好適な別の抗Ｆａｓモノクローナル抗体としてＣＨ１１を挙げることができる。ＣＨ１１産生ハイブリドーマは米原ら（Ｙｏｎｅｈａｒａ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１６９，１７４７参照）により、ヒト二倍体繊維芽細胞ＦＳ−７で免疫して得られたマウスのリンパ球とマウスミエローマ細胞とを細胞融合して得られたものである。なお、ハイブリドーマ由来のＣＨ１１自体は（株）医学生物学研究所より市販されている。ＣＨ１１の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを動物細胞で発現させる組換えＤＮＡベクターで形質転換された大腸菌株Ｅ．　ｃｏｌｉ　ｐＣＲ３−Ｈ１２３及びＥ．　ｃｏｌｉ　ｐＣＲ３−Ｌ１０３は平成８年（１９９６年）２月２８日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター、住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号　中央第６）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４２７及びＦＥＲＭ　ＢＰ−５４２８が付されている。ＣＨ１１をヒト化する過程については特開２０００−１５４１４９号公報に記載されている。ＣＨ１１のヒト化抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ、４種の形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨκＫＹ２−５８株、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨκＫＦ２−１９株、Ｅ．ｃｏｌｉｐＨκＲＹ２−１０株及びＥ．ｃｏｌｉ　ｐＨκＲＦ２−５２株、並びに、ＣＨ１１のヒト化抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ、２種の形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨμＨ５−１株及びＥ．ｃｏｌｉ　ｐＨμＭ１−１株は、平成９年（１９９７年）３月１１日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター、住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号　中央第６）に国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８６１、ＢＰ−５８６０、ＢＰ−５８５９及びＢＰ−５８６２、並びに、ＢＰ−５８６３及びＦＥＲＭ　ＢＰ−５８６４が付されている。
【００４８】
従って、該寄託菌株からプラスミドを単離するか、若しくは該寄託菌株からの抽出物を鋳型としてＰＣＲを行うなどの方法により、ハイブリドーマの産生する抗ヒトＦａｓ抗体又はそのヒト化抗体のタンパク質のサブユニットをコードするＤＮＡを取得することができる。
【００４９】
また、抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体のヒト抗体である、ヒト抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体も本発明の抗ヒトＦａｓ抗体に含まれる。本発明において、「ヒト抗体」とは、免疫グロブリンを構成するＨ鎖の可変領域及びＨ鎖の定常領域並びにＬ鎖の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全ての領域がヒト免疫グロブリンをコードする遺伝子に由来する免疫グロブリンを意味する。そのようなヒト抗体の製造方法としては、ヒト免疫グロブリン遺伝子をヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物をヒト抗原で免疫感作することにより、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として取得する方法（ＷＯ９４／２５５８５号公報、特表平６−５００２３３号公報等参照）等を例示することができるが、その方法に限定されるものではない。このようなヒト抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体の作成法の一つの具体例を以下に挙げる。抗原としては、ヒトＦａｓの細胞外領域を含む蛋白質、又は、ヒトＦａｓの細胞外領域に特異的なアミノ酸配列からなるペプチドを用いることが出来る。ヒトＦａｓの一次構造は公知である（Ｉｔｏｈ，　Ｎ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９１）　Ｃｅｌｌ　６６，　ｐ．２３３−２４３）ので、当業者に周知の方法により本発明の抗原を作製することができる。本発明の抗原として好ましいものの例としてヒトＦａｓの細胞外領域とマウスインターロイキン３受容体の細胞外領域との融合蛋白質を挙げることができ、該蛋白質の作製方法は、特開平１１−１７１９００号公報（対応欧州特許出願公開第９０９８１６号公報、対応米国特許出願第０９／４０８，６４６号明細書）の実施例１に記載されている。ヒト末梢血あるいは脾臓から採取したヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏでＩＬ−４存在下、抗原で感作し、感作したヒトリンパ球をマウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ６Ｈ６／Ｂ５（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１８２３）と細胞融合させることにより目的の抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングする。得られた抗体産生ハイブリドーマが生産する抗体は、ヒト抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体である。これらの抗体の中からヒトＦａｓ発現細胞に対してアポトーシスを誘導する活性を有する抗体を選別する。しかしながら、このようにヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで感作する方法では、一般的に抗原に対して高親和性の抗体を得るのは困難である。従って、抗原に高親和性のヒトモノクローナル抗体を得るには、上記のようにして得られた低親和性のヒト抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体を高親和化する必要がある。それには、上記のようにして得られ、アポトーシス誘導活性を有するものの低親和性であるヒト抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体のＣＤＲ領域（特にＣＤＲ−３）にランダム変異を導入し、これをファージで発現させて抗原として用いた蛋白質又はペプチドを固相化したプレートを用いてファージディスプレー法により、抗原として用いた蛋白質又はペプチドに強力に結合するファージを選択し、そのファージを大腸菌で増やし、その塩基配列から高親和性を有するＣＤＲのアミノ酸配列を決定すればよい。このようにして得られたヒト抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体をコードする遺伝子を一般的に使用されている哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んで、発現させることによりヒト抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体が得られる。これらの中から、ヒトＦａｓ発現細胞に対しアポトーシスを誘導する活性を有し、かつ高親和性である目的のヒト抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体を選別することができる。ヒト末梢血リンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養する代わりに、Ｓｅｖｅｒｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに移植し、このＳＣＩＤマウスを上記の抗原を用いて感作することによってもヒト抗体を得ることができる（Ｍｏｓｉｅｒ　Ｄ．　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｎａｔｕｒｅ　３３５，　ｐ２５６−２５９，　　１９８８；　Ｄｕｃｈｏｓａｌ　Ｍ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｎａｔｕｒｅ　３５５，　ｐ２５８−２６２，　　１９９２）。
【００５０】
また、抗ヒトＦａｓ抗体の断片であっても、ヒトＦａｓ発現細胞に対するアポトーシス誘導活性を有する限り本発明の併用に用いることができる。本発明において、「抗体の断片」とは、本発明における抗体の一部を意味し、好適には本発明のモノクローナル抗体の一部を意味する。抗体の断片には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ等が含まれる。「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ’」とは、免疫グロブリン又はモノクローナル抗体を、ペプシンやパパイン等のタンパク質分解酵素又はペプチド分解酵素で処理することにより、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後が切断されて生じる抗体断片を意味する。
【００５１】
慢性関節リウマチの骨破壊に対する治療又は予防剤の試験は、以下に記載する方法により実施することができる。
【００５２】
まず、免疫不全症を呈する実験動物に、象牙片とヒト慢性関節リウマチ患者由来の患部滑膜組織とを、該象牙片と該滑膜組織とが互いに接触するように移植する。ここで用いられる免疫不全動物としては、ＣＢ−１７／Ｉｃｒ　Ｃｒｊ−ｓｃｉｄ、ＢＡＬＢ／ｃＡ−ｓｃｉｄ、ＢＡＬＢ／ｃＡ−ｂｇ，ｓｃｉｄ等、ＳＣＩＤマウスの亜系の先天性免疫不全マウスが好適に用いられ、中でもＣＢ−１７／Ｉｃｒ　Ｃｒｊ−ｓｃｉｄマウスがより好適であるが、これに限定されない。また、象牙片は、用いられる動物に移植可能であって、且つ顕微鏡下での吸収窩の観察のために適した形状及び大きさであればよいが、吸収窩の観察のためには少なくとも一つの平面を有していればよい。例えばＣＢ−１７／Ｉｃｒ　Ｃｒｊ−ｓｃｉｄマウスに移植する場合は、厚さが１００μｍ〜２５０μｍであって、直径４〜８ｍｍの円又は縦、横の長さがそれぞれ４〜８ｍｍの長方形の平面を有する薄板状であることが好ましい。
【００５３】
次に、上記のようにして象牙片と滑膜組織を移植した動物に、慢性関節リウマチにおける骨破壊の治療又は予防剤としての効果を試験しようとする物質を、試験する化合物の特性に応じて、経口、静注、皮下注、筋注、移植部位若しくはその近傍に埋め込むなどの経路により投与する。試験物質の投与量、投与頻度、投与回数等の条件は適宜設定する。また、比較対照のために、上記のようにして象牙片と滑膜細胞を移植した別の個体に、対照薬又は試験物質の溶解に用いたものと同じ溶媒を投与するか、又は何も投与しないでおく。
【００５４】
このように処置した動物を一定期間飼育した後、動物から象牙片を摘出し、洗浄後、染色し、顕微鏡下で観察して象牙片表面に形成された吸収窩の数を測定する。試験物質を投与しないか又は対照薬を投与した対照群と、試験物質を投与した群との間で吸収窩の数を比較し、吸収窩の形成を抑制した試験物質を、慢性関節リウマチにおける骨破壊の治療又は予防剤の候補物質として選択する。
【００５５】
本発明の提供するＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体並びに抗ヒトＦａｓ抗体を含有する医薬組成物は、ヒト又はヒト以外の動物に対し、経口又は非経口により安全に投与され得る。医薬組成物としての投与形態は、疾患の種類、疾患の程度、症状、年齢、性別、体重等に応じて適宜選択することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤は経口投与され、注射剤は単独で若しくはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与されるか又は単独で筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与され、貼付剤は経皮投与され、点鼻剤は経鼻投与され、粘膜適用剤は経粘膜投与若しくは口腔内投与され、坐剤は直腸内投与される。これらの製剤は、常法に従い、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、着色剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤、ゲル化剤、界面活性剤、コーティング剤等、医薬の製剤分野において通常使用し得る公知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００５６】
錠剤の形態に成形するには、担体として当該分野で公知のものを広く使用できる。そのような担体としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等を挙げることができる。また、錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。
【００５７】
丸剤の形態に成形するには、担体として当該分野で公知のものを広く使用できる。そのような担体としては、例えば、ブドウ糖、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン寒天等の崩壊剤等を挙げることができる。
【００５８】
坐剤の形態に成形するには、担体として当該分野で公知のものを広く使用できる。そのような担体としては、例えば、ポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセリド等を挙げることができる。
【００５９】
注射剤として調製される場合には、液剤及び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であることが好ましい。これら液剤、乳剤及び懸濁剤の形態に成形するには、希釈剤として当該分野で公知のものを広く使用でき、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。なお、この場合、血液との等張性を保つのに十分な量の食塩、ブドウ糖、グリセリン等を医薬組成物中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、可溶化剤等を添加してもよい。注射剤は凍結乾燥品であってもよい。
【００６０】
また、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、他の医薬等を含有せしめてもよい。
【００６１】
これらの医薬組成物中に含まれるＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体の量は、特に限定されるものではないが、通常０．１乃至７０重量％であり、好適には１乃至３０重量％である。
【００６２】
本発明の提供するＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体をＦａｓ特異的結合分子と併用する際の、ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体の投与量は、症状、年齢、投与形態、剤形等に依存するが、通常成人に対して１日当たり、投与量の上限が１乃至５０ｍｇ／ｋｇ、下限が０．１乃至１ｍｇ／ｋｇであり、好適な範囲は０．０１乃至１ｍｇ／ｋｇであり、より好適な範囲は０．１乃至１ｍｇ／ｋｇである。
【００６３】
また、ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体と抗ヒトＦａｓ抗体を併用する際の、抗ヒトＦａｓ抗体の体重当たりの投与量は、該分子の種類、併用するＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体の種類及び投与量、症状、年齢、投与形態、剤形等に依存するが、通常成人に対して１日当たり、投与量の上限が１乃至１０ｍｇ／ｋｇ、下限が０．０１乃至０．１ｍｇ／ｋｇであり、好適な範囲は０．１乃至１ｍｇ／ｋｇであり、より好適な範囲は０．１乃至１ｍｇ／ｋｇである。ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体を、本発明において最適な抗ヒトＦａｓ抗体である、マウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａの産生する抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体のヒト化抗体と併用する際の、該ヒト化抗体の体重当たりの投与量は、通常成人に対して１日当たり、投与量の上限が５乃至５０ｍｇ／ｋｇ、下限が０．１乃至１ｍｇ／ｋｇであり、好適な範囲は１乃至５ｍｇ／ｋｇである。これらの投与量でマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａの産生する抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体のヒト化抗体を単独で投与することも可能である。
【００６４】
ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体並びに抗ヒトＦａｓ抗体を併用するに際し、抗ヒトＦａｓ抗体を投与する時期は、ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体を投与する前、同時及び後のいずれであってもよい。その投与方法はＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体の投与方法に準ずるが、それらに限定されるものではない。
【００６５】
また、ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体並びに抗ヒトＦａｓ抗体の併用に供される医薬組成物は、ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体を投与する時期、抗ヒトＦａｓ抗体を投与する時期、両者の投与方法等によらず、本発明の医薬組成物に包含される。従って、本発明において併用に供される医薬組成物は、配合剤、併用剤等、当該分野において複数の異なる成分を同一の個体に投与するために使用され得る従来公知のあらゆる形態をとり得る。
【００６６】
さらに、ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体並びに抗ヒトＦａｓ抗体の併用に供される骨代謝異常症予防又は治療剤は、ＯＣＩＦ物質、又はＯＣＩＦ物質及び多糖物質の複合体を投与する時期、Ｆａｓ特異的結合分子を投与する時期、両者の投与方法等によらず、本発明の骨代謝異常症予防又は治療剤に包含される。従って、本発明において併用に供される骨代謝異常症予防又は治療剤は、配合剤、併用剤等、二つ以上の異なった物質を同一の個体に投与するために使用され得る、当該分野において従来公知のあらゆる形態をとることができる。
【００６７】
本発明の提供する医薬組成物の投与回数は、該医薬組成物に含有される成分の種類、投与形態、剤形等に依存するが、数日に１回、１日１回、又は１日数回である。本発明の提供する骨代謝異常症予防又は治療剤の投与回数は、該骨代謝異常症予防又は治療剤に含有される有効成分の種類、投与形態、剤形等に依存するが、数日に１回、１日１回、又は１日数回である。
【００６８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［製造例１．ＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸の複合体の調製（Ｉ）］
ＷＯ９６／２６２１７号公報記載の方法に従って得られた、分子量約１２００００の遺伝子組換え型ヒトＯＣＩＦ（２量体）を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）へ、２、５、６．５、１０、１２．５、２０又は５０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解せしめた。この水溶液に、デキストラン硫酸ナトリウムイオウ５（名糖産業（株）製：以下、「ＤＳ５」という。）を、終濃度４０、１００、１３０、１５０、２００、４００，５１０又は１０００ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ１０．５又は１１に調製した。得られた水溶液を４、７又は３７℃にて１、３、６、１８、２４、４８、７２、１４４又は２８８時間保温した。
【００６９】
保温後の水溶液４ｍｌを、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）で予め平衡化したゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（カラム内径１６ｍｍ×長さ６０ｃｍ：排除限界分子量１３０万：Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）へ添加し、該緩衝液により流速２ｍｌ／ｍｉｎで溶出させた。紫外分光光度計を用いてλ２８０ｎｍの吸収をモニターし、保持時間約２８乃至３６分の溶出液を分取した。ＯＣＩＦ２量体と結合していない遊離のＤＳ５は保持時間約５０乃至７０分に溶出された。上記ゲル濾過は室温にて行った。
【００７０】
得られたＯＣＩＦ及びＤＳ５の複合体を含有する画分を−６０℃にて凍結保存した。
【００７１】
なお、本製造例に記載された各処方の反応条件を下記の表１にまとめた。
【００７２】
【表１】
2004059582.tif 000002
［製造例２．ＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸の複合体の調製（ＩＩ）］
製造例１記載のヒトＯＣＩＦ（２量体）を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）へ、５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解せしめた。この水溶液に、分子量５０００のデキストラン硫酸ナトリウム（和光純薬（株）製：以下、「ＤＳ５０００」という。）を、終濃度１５０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ１０．５に調製した。得られた水溶液を４℃にて２４時間保温した。
【００７３】
保温後の水溶液４ｍｌを、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）で予め平衡化したゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（カラム内径１６ｍｍ×長さ６０ｃｍ：排除限界分子量１３０万：Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）へ添加し、該緩衝液により流速２ｍｌ／ｍｉｎで溶出させた。紫外分光高度計を用いてλ２８０ｎｍの吸収をモニターし、保持時間約２８乃至３６分の溶出液を分取した。ＯＣＩＦと結合していない遊離のＤＳ５０００は保持時間約４０乃至６５分に溶出された。上記ゲル濾過は室温にて行った。
【００７４】
得られたＯＣＩＦ及びＤＳ５０００の複合体を含有する画分を−６０℃にて凍結保存した。
【００７５】
なお、本製造例に記載された処方の反応条件を下記の表２にまとめた。
【００７６】
【表２】
2004059582.tif 000003
なお、以下の実施例においては、調製された医薬組成物を「処方」と呼ぶ。
［製造例３．等電点の測定］
製造例１記載の遺伝子組換え型ヒトＯＣＩＦ（２量体）及び実施例１記載で得られたＯＣＩＦ及びＤＳ５の複合体（処方２２）を、等電点電気泳動ゲルＩＥＦＰＡＧＥ　ｍｉｎｉ（ｐＨ範囲３乃至１０：岩城硝子（株）製）に添加し、該装置の説明書の記載に従って所定の電圧を印加した。電気泳動終了後、ゲルをクマシーブルー染色した。
【００７７】
その結果、ＯＣＩＦの等電点は約ｐＩ９であり、一方ＯＣＩＦ及びＤＳ５の複合体（処方２２）の等電点は約ｐＩ６．５であった。
［製造例４．ＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸の複合体におけるＯＣＩＦ並びにデキストラン硫酸の定量と両者の分子比の算出］
１）パーオキシダーゼで標識した抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−４原液の調製
当該抗体の酵素標識は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｋｉｔ（ピアース社製）を用い、該キットのプロトコルＩＩに従って行った。
【００７８】
精製された抗ヒトＯＣＩＦ抗体（ＷＯ９９／１５６９１号公報参照）ＯＩ−４を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈したもの１ｍｌに、上記キットに添付されたＮ−スクシニミジル−Ｓ−アセチルチオ酢酸を、ジメチルフォルムアミドにて使用直前に１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したもの４μｌを添加し、室温にて３０分間保温した。ここに、予め５ｍｇのヒドロキルアミン塩酸塩を上記キットに添付されたＭａｌｅｉｍｉｄｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ１００μｌへ使用直前に溶解した溶液２０μｌを添加した後、室温にて２時間保温した。当該反応液を、予め３０ｍｌのＭａｌｅｉｍｉｄｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒで平衡化した、上記キットに添付されたポリアクリルアミド脱塩カラム（容積１０ｍｌ）へ付し、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒで溶出し、０．５ｍｌずつ分取した。当該抗体を含む７乃至１０番目の画分を合併した。ここに、上記キットに添付されたＥＺ−Ｌｉｎｋ　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　５ｍｇを５００μｌの蒸留水に溶解したもの１００μｌを添加し、室温にて１時間保温した後、等容のグリセロールを添加し、−２０℃にて保存した。
【００７９】
最終的に得られた溶液を、パーオキシダーゼで標識した抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−４（以下、「ＰＯＤ−ＯＩ−４」という。）の原液とした。
２）ＯＣＩＦの定量
製造例１又は２に記載の各処方におけるＯＣＩＦ量を、抗ＯＣＩＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００８０】
９６穴マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ：ＮＵＮＣ社製）上の各ウェルに、抗ヒトＯＣＩＦモノクローナル抗体ＯＩ−２６（ＷＯ９９／１５６９１号公報参照）を０．１ＭＮａＨＣＯ３溶液へ５μｇ／ｍｌとなるように溶解せしめたもの１００μｌを分注し、シールして４℃にて１晩静置した。
【００８１】
０．１％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μｌで、各ウェルを３回洗浄した。
【００８２】
希釈緩衝液（組成：０．２ＭＴｒｉｓ−塩酸、４０％Ｂｌｏｃｋ　Ａｃｅ（雪印乳業（株）製）、０．１％ポリソルベート２０：ｐＨ７．４）２０μｌを各ウェルヘ添加し、室温にて２０分間保温した・
被検試料を希釈緩衝液を用いて適宜希釈した。検量線作成のための標準溶液には既知濃度のＯＣＩＦを含有する希釈緩衝液を、対照には希釈緩衝液を、それぞれ用いた。各被検試料５０μｌを各ウェルへ分注した。
【００８３】
各ウェルに、１）で得られたＰＯＤ−ＯＩ−４の原液を［０．１ＭＴｒｉｓ−塩酸、４０％Ｂｌｏｃｋ　Ａｃｅ（雪印乳業（株）製）、０．１％ポリソルベート２０（ｐＨ７．４）］で１５００倍希釈したもの５０μｌを添加し、室温にて２時間静置した。
【００８４】
反応後、０．１％ポリソルベート２０を含有するｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（以下、「ＰＢＳ」という。：ｐＨ７．４）２５０μｌで、各ウェルを４回洗浄した。
【００８５】
０．１Ｍクエン酸と０．２Ｍリン酸水素２ナトリウムを混合し、基質溶解液とした（ｐＨ４．５）。
【００８６】
ＯＰＤ錠（和光純薬（株）製）１３ｍｇに基質溶解液３２．５ｍｌ及び過酸化水素水６．５μｌを加えて溶解することにより得られた基質液１００μｌを各ウェルへ添加し、アルミホイルで遮光し室温にて１５分間静置した。
【００８７】
硫酸５０ｍｌに精製水２５０ｍｌを混合することにより得られた反応停止液５０μｌを各ウェルへ添加した。
【００８８】
攪拌振とう器（タイターミキサーＭＢ−１：Ｊａｐａｎ　Ｔｒｉｋａ社製）を用いて穏やかに攪拌した後、マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ　ＦＬＵＯＲ：ＴＥＣＡＮ社製）を用いて波長λ４９０ｎｍにおける試料溶液の吸光度を測定した。
【００８９】
標準溶液を用いて作成した検量線より、被検試料中のＯＣＩＦ濃度を算出した。
３）デキストラン硫酸の定量
製造例１及び２に記載の各処方におけるデキストラン硫酸量を、フェノール硫酸法により中性糖として測定した。
【００９０】
１０乃至６０μｇ／ｍｌ範囲の既知濃度のＤＳ５（名糖産業（株）製）又はＤＳ５０００（和光純薬（株）製）を希釈溶液（組成：０．０１Ｍクエン酸、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％ポリソルベート８０水溶液：ｐＨ６．０）に溶解し標準溶液とした。標準溶液、試料溶液及び希釈溶液各０．２ｍｌを試験管へ分注した。
【００９１】
該試験管へ５０ｍｇ／ｍｌフェノール水溶液０．２ｍｌを分注し、速やかに攪拌した。
【００９２】
６０℃の水浴中で２０秒間保温した後、濃硫酸１．０ｍｌを添加して速やかに攪拌した。
【００９３】
室温にて１０分間静置した後再度攪拌し、室温にて２０分間静置した。
【００９４】
分光光度計（ＵＶ−２４０：島津製作所（株）製）を用い、波長λ４９０ｎｍにおける各ウェルの吸光度をそれぞれ測定した。
【００９５】
ヒトＯＣＩＦはそれ自体に糖鎖が結合している。そこで、上記測定で得られたＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸の複合体中の中性糖含量の値から、同様に測定した原料のＯＣＩＦの中性糖含量の値を差し引くことにより、ＯＣＩＦに結合したデキストラン硫酸の量を算出した。
４）ＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸の複合体におけるＯＣＩＦ並びにデキストラン硫酸の分子比の算出
上記３）で得られた各処方におけるデキストラン硫酸含有量を上記２）で得られた各処方におけるＯＣＩＦの含有量で除算することにより、ＯＣＩＦ１ｍｇに結合しているデキストラン硫酸の量を算出した。
【００９６】
次いで、ヒトＯＣＩＦ単量体を分子量６００００、ＤＳ５を分子量１９５０、ＤＳ５０００を分子量５０００、ＤＳ１００００を分子量１００００として、各処方におけるＯＣＩＦ単量体とデキストラン硫酸の分子比を、ＯＣＩＦ単量体１分子当たりのデキストラン硫酸の分子数として算出した。
【００９７】
結果を下記表３に示す。
【００９８】
【表３】
2004059582.tif 000004
［実施例１．ＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸の複合体並びに抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体のヒト化抗体の示す骨吸収抑制効果］
慢性関節リウマチにおける骨破壊に対するＯＣＩＦ及び多糖物質の複合体と抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体のヒト化抗体との単独又は併用効果を、ヒト慢性関節リウマチ患者滑膜組織中を用い、以下に記載する方法に従って検討した。なお、ＯＣＩＦ及び多糖物質としては製造例１の処方２２に記載のＯＣＩＦ及びデキストラン硫酸ナトリウムイオウ５複合体（以下、「ＯＣＩＦ−ＤＳ５」という）を用いた。また、特開平１１−１７１９００号公報（対応欧州特許出願公開第９０９８１６号明細書、対応米国特許出願第０９／４０８，６４６号明細書）又は特開２００１−３４２１４８号公報記載の方法に従って、ヒト化ＨＦＥ７Ａ軽鎖（特開平１１−１７１９００号公報（対応欧州特許出願公開第９０９８１６号明細書、対応米国特許出願第０９／４０８，６４６）記載の配列表の配列番号１０７、又は、特開２００１−３４２１４８号公報記載の配列表の配列番号１０７）、ヒトＨＦＥ７Ａ重鎖（特開平１１−１７１９００号公報（対応欧州特許出願公開第９０９８１６号明細書、対応米国特許出願第０９／４０８，６４６号明細書）記載の配列番号１１７、又は、特開２００１−３４２１４８号公報記載の配列番号１１７）を生産する哺乳動物細胞を組換えＤＮＡ技術を用いて作製し、これを用いてヒト化ＨＦＥ７Ａ（以下、「ｈ−ＨＦＥ７Ａ」という）を生産し、精製した。なお、上記のヒト化した抗Ｆａｓ抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＨＨ５　ＳＡＮＫ　７０３９８株、およびヒト化した抗Ｆａｓ抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｇＨＰＤＨＶ３　ＳＡＮＫ　７０２９８株は、平成１０年（１９９８年）２月２６日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター、住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号　中央第６）に国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７４、およびＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７３が付されている。
【００９９】
ＣＢ−１７／Ｉｃｒ　Ｃｒｊ−ｓｃｉｄ（ＳＣＩＤマウス）（５週齢の雄、日本チャールスリバー（株）より購入）を馴化後、使用した。ＳＣＩＤマウスをエーテルで麻酔し、背部皮下に滅菌ハサミで少し傷つけた後、ヒト慢性関節リウマチ患者患部より採取した滑膜組織（約０．５ｇ）に象牙切片をくるむようにして移植した。移植後手術用縫合糸にて切開背部皮膚を縫合した。象牙切片はクレハ分析センターより厚さ１５０μｍ、直径６ｍｍの円状のものを購入し、７０％エタノール液中で超音波洗浄（ＳＯＮＩＦＩＥＲ　４５０、ＢＲＡＮＳＯＮ社、１０分３回）を行い滅菌したものを使用した。実験時には生理食塩水中に浸し洗浄した後、使用した。
【０１００】
滑膜組織と象牙を移植したマウスに、ＯＣＩＦ−ＤＳ５　１０ｍｇ／ｋｇ、ｈ−ＨＦＥ７Ａ　１０ｍｇ／ｋｇ、ＯＣＩＦ−ＤＳ５　１０ｍｇ／ｋｇとｈ−ＨＦＥ７Ａ　１０ｍｇ／ｋｇ併用、若しくはヒトＩｇＧ　１０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ週１回、計３回投与した。移植後３週目にエーテル麻酔下でＳＣＩＤマウスを心臓採血により致死させ、その後、移植滑膜組織、象牙切片をハサミ及びピンセットでマウスの組織が入らないように留意し、摘出した。摘出した象牙切片を９６穴プレート中で蒸留水を加え、ハンドモーター（原吉）で５秒間、２回両面を洗浄後、生理食塩水（大塚）に浸した。その後Ａｃｉｄ　Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（ＳＩＧＭＡ）中で１３分間染色し、再び蒸留水中にてハンドモーターで５秒間、２回両面を洗浄した。滑膜細胞中の破骨細胞による象牙切片上の吸収窩の形成を顕微鏡にて観察した。
【０１０１】
結果を図１に示した。ヒトＩｇＧを投与した対照群では象牙一枚当たり８８．０個の吸収窩が形成されていたのに対し、ＯＣＩＦ−ＤＳ５を投与した群では象牙一枚当たり１１．０個、ｈ−ＨＦＥ７Ａを投与した群では象牙一枚当たり１８．５個であった。また、ＯＣＩＦ−ＤＳ５とｈ−ＨＦＥ７Ａを併用して投与した群では象牙一枚当たり０個であり、ＯＣＩＦ−ＤＳ５とｈ−ＨＦＥ７Ａの併用により骨破壊を相乗的に抑制することが明らかとなった。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明により、骨代謝異常症に対する治療または予防のための有用な医薬組成物が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＯＣＩＦ−ＤＳ５、ｈ−ＨＦＥ７Ａまたはこれらの併用による吸収窩形成抑制効果を表す図。
【図１】
2004059582.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成15年6月11日(2003.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体又はそのヒト化抗体は、例えば特開平１１−１７１９００号公報、特開２０００−１６６５７３号公報、特開２０００−１６６５７４号公報、特開２００１−３４２１４８号又は特開２００１−３４２１４９号公報記載の方法によって得ることができる。中でも、特開平２００１−３４２１４８号公報の実施例中で開示されているヒト化抗体が、本発明の医薬組成物の有効成分として好ましい。なお、本発明のヒト化抗Ｆａｓ抗体を作製するにあたっての基礎となる抗体として好適な抗Ｆａｓモノクローナル抗体の産生細胞であるマウス−マウスハイブリドーマＨＦＥ７Ａは工業技術院生命工学工業研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター、住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号　中央第６）に平成９年（１９９７年）２月２０日付けで国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８２８が付されている。また、ＨＥＦ７Ａの産生する抗Ｆａｓモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを動物細胞で発現させる組換えＤＮＡベクターで形質転換された大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＭＥ−Ｈ及びＥ．ｃｏｌｉ　ｐＭＥ−Ｌは、それぞれ平成９年（１９９７年）３月１２日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター、住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号　中央第６）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５８６８及びＦＥＲＭ　ＢＰ−５８６７が付されている。また、ＨＥＦ７Ａの産生する抗Ｆａｓモノクローナル抗体をヒト化した抗Ｆａｓ抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ３種の形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＭＭ６　ＳＡＮＫ　７３６９７株、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＨＭ１７　ＳＡＮＫ　７３５９７株及びＥ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＧＨＨ７　ＳＡＮＫ　７３４９７株、並びに、ヒト化した抗Ｆａｓ抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｇＨＳＬ７Ａ６２　ＳＡＮＫ７３３９７株は、平成９年（１９９７年）８月２２日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター、住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号　中央第６）に国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７１、ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７２及びＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７３、並びにＦＥＲＭ　ＢＰ−６０７４が付されている。さらに、ＨＥＦ７Ａの産生する抗Ｆａｓモノクローナル抗体をヒト化した抗Ｆａｓ抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ２種の形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＨＭ２　ＳＡＮＫ　７０１９８株及びＥ．ｃｏｌｉ　ｐＨＳＨＨ５　ＳＡＮＫ　７０３９８株、並びに、ヒト化した抗Ｆａｓ抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを組み込んだ形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｇＨＰＤＨＶ３　ＳＡＮＫ　７０２９８株は、平成１０年（１９９８年）２月２６日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター、住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号　中央第６）に国際寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７２及びＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７４、並びにＦＥＲＭ　ＢＰ−６２７３が付されている。