(57)【要約】【課題】簡便且つ安価な、単核球抽出液の製造方法、及び前記製造方法により調製した単核球抽出液を試料として用いる、単核球抗原分析方法を提供する。【解決手段】前記製造方法は、血液と赤血球溶解用溶液とを接触させることにより、血液中の赤血球を溶血させた後、遠心操作を行うことにより単核球分画を得る工程と、前記単核球分画と、膜可溶化用界面活性剤とを接触させることにより、単核球抽出液を得る工程とを含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液と赤血球溶解用溶液とを接触させることにより、血液中の赤血球を溶血させた後、遠心操作を行うことにより単核球分画を得る工程；及び
前記単核球分画と、膜可溶化用界面活性剤とを接触させることにより、単核球抽出液を得る工程
を含むことを特徴とする、単核球抽出液の製造方法。
【請求項２】
単核球分画を、生理食塩水又は緩衝液で洗浄した後、膜可溶化用界面活性剤との接触を実施する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の製造方法により調製した単核球抽出液を、被検試料として用いる、単核球抗原の分析方法。
【請求項４】
単核球抗原が単核球表面抗原である、請求項３に記載の分析方法。
【請求項５】
単核球表面抗原がＣＤ３抗原又はＣＤ１１ｂ抗原である、請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
単核球抗原がジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼである、請求項３に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、単核球抽出液の製造方法、及び前記製造方法を用いて調製した単核球抽出液を被検試料として用いる分析方法に関する。なお、本明細書における前記「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
【０００２】
【従来の技術】
現在、末梢血を初発材料とした単核球の分離法として、比重遠心用分離液［例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ファルマシア）又はモノポリ分離培地（Ｆｌｏｗ−ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］を用いる比重遠心分離法が広く用いられている（非特許文献１）。これらの方法に用いる比重遠心用分離液は比較的高価であり、多数の検体の処理にはコストを要する。
【０００３】
また、これらの分離液を使用する場合、末梢血を分離液上に重層する工程が存在する。その工程においては、末梢血と分離液との界面を乱さない操作が要求される。また、操作ミスなどにより、上層の末梢血と下層の分離液との界面を乱した場合、単核球が分離できなくなるなど、操作が煩雑で熟練を要する。また、これらの分離液を使用し、単核球の層を形成する場合には、通常、末梢血を５ｍＬ程度以上必要とする。
【０００４】
また、単核球からのタンパク質抽出には、超音波処理等、細胞に対して強い物理的衝撃を与え、細胞膜を破壊することにより、単核球中のタンパク質を抽出する方法が広く用いられている。これらの方法では、抽出中の発熱を防ぐため、抽出中は容器を氷冷する必要があり、操作は複雑である。
【０００５】
しかしながら、単核球抽出物を検査対象試料として用いる検査項目は多岐に及ぶ。また、検査対象抗原は、単核球表面抗原の場合、あるいは、単核球抗原の場合がある。実例として、例えば、単核球のＣＤ抗原を測定するサブセット検査は、感染症（例えば、ＨＩＶ又はＥＢウイルス等）の診断、あるいは、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リューマチ、シェーグレン症候群、又は多発性硬化症等）等の多岐に及ぶ診断に用いられている。また、末梢血単核球中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（以下、ＤＰＤと略称する）測定（非特許文献２）、並びに末梢血単核球のＣＤ３抗原測定及びＣＤ１１ｂ抗原測定も行われている。
【０００６】
【非特許文献１】
藤原大美ら，「免疫研究法ハンドブック」，中外医学社，１９９２年，ｐ．２４−２６
【非特許文献２】
ロナルド・エー・フレミング（Ｒｏｎａｌｄ  Ａ．Ｆｌｅｍｉｎｇ）ら，「キャンサー・リサーチ（ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ）」，（米国），１９９２年，第５２巻，ｐ．２８９９−２９０２
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来技術の前記の欠点を解消し、簡便且つ安価な、血液（例えば、末梢血）からの単核球抽出液の製造方法、すなわち、血液（例えば、末梢血）単核球中の単核球抗原（例えば、タンパク質）抽出法を提供することにある。また、前記製造方法により調製した単核球抽出液を試料として用いる、単核球抗原分析方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、血液と赤血球溶解用溶液とを接触させることにより、血液中の赤血球を溶血させた後、遠心操作を行うことにより単核球分画を得る工程（以下、単核球分離工程と称する）；及び
前記単核球分画と、膜可溶化用界面活性剤とを接触させることにより、単核球抽出液を得る工程（以下、界面活性剤処理工程と称する）
を含むことを特徴とする、単核球抽出液の製造方法により解決することができる。
また、本発明は、前記製造方法により調製した単核球抽出液を、被検試料として用いる、単核球抗原の分析方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の製造方法における単核球分離工程において初発材料として使用する血液は、単核球を分離可能な血液であって、分離処理を実施する前の血液である限り、特に限定されるものではなく、一般的には、例えば、末梢血又は骨髄液等が用いられているが、採血が容易な点で、末梢血が特に適している。なお、本明細書において「分離処理を実施する前の血液」とは、血液成分の分離又は除去操作を経ていない血液を意味し、例えば、採血直後の全血、あるいは、採決後、単に保存していただけの全血などを挙げることができる。
初発材料となる末梢血を得るためには、通常の採血法を用いることができる。採血管を用いる場合、抗凝固剤を含むものを用いることが好ましい。また抗凝固剤の種類としては、例えば、ヘパリンナトリウム、クエン酸ナトリウム、又はＥＤＴＡ等を用いることができる。
【００１０】
単核球分離工程では、単核球分離液として、一般的な赤血球溶解用溶液を用いることができる。前記赤血球溶解用溶液は、比重遠心分離法によって血液から分画した単核球画分から、残存赤血球を除去するために、通常、使用されており、例えば、塩化アンモニウム水溶液、又は塩化アンモニウム含有緩衝液（例えば、塩化アンモニウム含有トリス緩衝液、又は塩化アンモニウム含有リン酸緩衝液）等を用いることもできるし、あるいは、市販の赤血球溶解用溶液（Ｖｉｔａｌｙｓｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｋｉｔ；フナコシ社）を用いることもできる。
【００１１】
単核球分離工程において血液（特には末梢血）と単核球分離液（すなわち、赤血球溶解用溶液）とを接触させる際には、従来法である比重遠心分離法の場合と異なり、分離液上に注意深く重層する操作は必要とせず、例えば、反応容器に両者を単に添加し、混合することもできるし、あるいは、一方のみが入った容器に、残る一方を添加し、混合することもできる。
【００１２】
血液と赤血球溶解用溶液との接触による溶血反応は、緩衝液成分の浸透圧差に基づくものである。従って、血液と赤血球溶解用溶液との添加比率は、赤血球溶解用溶液中の緩衝液成分の溶血反応系における最終濃度により適宜決定することができる。一般的に使用されている市販の赤血球溶解用溶液（例えば、Ｖｉｔａｌｙｓｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｋｉｔ；フナコシ社）を用いる場合には、赤血球溶解用溶液中の緩衝液成分の溶血反応系における最終濃度は、８０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以上が好ましいので、血液１容に対し、赤血球溶解用溶液５容以上が好ましく、血液１容に対し、赤血球溶解用溶液１０容程度がより好ましい。
両者を添加及び混合した後、静置、あるいは、転倒混和することにより、溶血反応を生起することができる。より円滑な溶血反応を行うためには、反応容器中に血液と赤血球溶解用溶液とを添加した後、反応容器を緩やかに転倒混和することが好ましい。
【００１３】
血液と赤血球溶解用溶液とを添加し、混合した後、通常、１分以上の反応時間にて溶血反応を行うことができる。円滑な溶血反応を行うためには、反応時間は１０分以上が好ましい。溶血反応の完了は、例えば、目視により、反応前に濁度を呈していた反応溶液が透明に変化したことを指標として確認することができる。また、溶血反応時の温度は目的に応じて設定することができるが、０℃〜５０℃が好ましく、１５℃〜３０℃がより好ましい。
【００１４】
単核球分離工程における血液と赤血球溶解用溶液との接触に用いる反応容器としては、例えば、ガラス製チューブ又は合成樹脂製チューブ等を用いることができる。また、これらの容器の形状は、転倒混和を考慮し、密閉可能であることが好ましく、また、反応終了後、その他の容器に移すことなく直ちに遠心操作を行うことができる形状が好ましい。
【００１５】
血液と赤血球溶解用溶液との反応後の遠心操作は、通常、１５００Ｇ以下で行うことができ、３００Ｇ程度が好ましい。この遠心操作により生じた上清は、主に、血清成分と、赤血球の溶血により生じた画分であるので、これらを除去し、細胞ペレットのみを回収することにより、単核球分画を得ることができる。この遠心操作は、１回だけ実施することもできるし、あるいは、複数回行うこともできる。夾雑成分の効率良い除去のため、２回以上行うことが好ましい。
【００１６】
前記遠心操作により得られた単核球分画は、そのままの状態で、次の界面活性剤処理工程に用いることができるが、夾雑成分の効率良い除去のため、更に洗浄を行うことが好ましい。洗浄用緩衝液としては、一般に細胞の洗浄に広く用いられている生理食塩水又は緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略称する）若しくはトリス緩衝生理食塩水（以下、ＴＢＳと略称する）等を用いることができる。洗浄方法としては、例えば、単核球分画を洗浄用緩衝液に懸濁し、遠心操作を行い、上清画分を除去し、細胞ペレットを回収する方法等を用いることができる。
【００１７】
界面活性剤処理工程では、単核球分離工程で得られた単核球分画に対して、あるいは、単核球分離工程の後、所望により、更に洗浄操作を実施して得られた単核球分画に対して、膜可溶化用界面活性剤処理によりタンパク質抽出を行い、単核球抽出液を得ることができる。
前記膜可溶化用界面活性剤処理では、例えば、単核球分画に対して膜可溶化用界面活性剤溶液を添加し、静置、あるいは、撹拌器（例えば、試験管ミキサー等）等を用いて撹拌することにより、タンパク質抽出を行うことができる。前記タンパク質抽出は、０〜５０℃で行うことが好ましい。また、処理時間は、１秒〜１時間が好ましい。
得られた抽出液をそのまま、単核球抽出液とすることもできるし、所望により、遠心操作を行い、夾雑物を除去した後の上清を、単核球抽出液とすることもできる。
【００１８】
本発明に用いる膜可溶化用界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、又は陽イオン性界面活性剤を挙げることができる。
前記非イオン性界面活性剤としては、例えば、
Ｎ，Ｎ−ビス  （３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）  コラミド［Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ  （３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）  ｃｈｏｌａｍｉｄｅ；商品名ＢＩＧＣＨＡＰ］、
Ｎ，Ｎ−ビス  （３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）  デオキシコラミド［Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ  （３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅ；商品名Ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ］、
ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （９）  Ｌａｕｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ；商品名ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−９ＥＸ］、
オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ；商品名ＭＥＧＡ−８）、
ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｎｏｎａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ；商品名ＭＥＧＡ−９）、
デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ；商品名ＭＥＧＡ−１０）、
ポリオキシエチレン  （８）オクチルフェニルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （８）  Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ；商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４］、
ポリオキシエチレン  （９）  オクチルフェニルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （９）  Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ；商品名ＮＰ−４０］、
ポリオキシエチレン  （１０）  オクチルフェニルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （１０）  Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ：商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００］、
ポリオキシエチレン  （２０）  ソルビタンモノラウレート［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２０）  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ；商品名Ｔｗｅｅｎ２０］、
ポリオキシエチレン  （２０）  ソルビタンモノパルミテート［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２０）
Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ；商品名Ｔｗｅｅｎ４０］、
ポリオキシエチレン  （２０）  ソルビタンモノステアレート［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２０）
Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ；商品名Ｔｗｅｅｎ６０］、
ポリオキシエチレン  （２０）  ソルビタンモノオレエート［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２０）  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ；商品名Ｔｗｅｅｎ８０］、
ポリオキシエチレン  （２０）  ソルビタントリオレエート［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２０）  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｔｒｉｏｌｅａｔｅ］、
ポリオキシエチレン  （２３）  ラウリルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２３）  Ｌａｕｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ；商品名Ｂｒｉｊ３５］、
ポリオキシエチレン  （２０）  セチルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２０）  Ｃｅｔｈｙｌ  Ｅｔｈｅｒ；商品名Ｂｒｉｊ５８）］、
ｎ−ドデシル−ベータ−Ｄ−マルトピラノシド（ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−ベータ−Ｄ−ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、
ｎ−ヘプチル−ベータ−Ｄ−チオグルコピラノシド（ｎ−Ｈｅｐｔｙｌ−ベータ−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、
ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（ｎ−Ｏｃｔｙｌ−ベータ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、
ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−チオグルコピラノシド（ｎ−Ｏｃｔｙｌ−ベータ−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、
ｎ−ノニル−ベータ−Ｄ−チオマルトシド（ｎ−Ｎｏｎｙｌ−ベータ−Ｄ−ｔｈｉｏｍａｌｔｏｓｉｄｅ）、
ジギトニン（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）、又は
サポニン（Ｓａｐｏｎｉｎ）
等を用いることができる。
【００１９】
両性界面活性剤としては、例えば、
３−［（３−コラミドプロピル）  ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート［３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ；商品名ＣＨＡＰＳ］、
又は
３−［（３−コラミドプロピル）  ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート［３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ；商品名ＣＨＡＰＳＯ］
等を用いることができる。
【００２０】
陰イオン性界面活性剤としては、例えば、
ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、
ドデシル硫酸リチウム（Ｌｉｔｈｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、
３，５−ジヨードサリチル酸リチウム（Ｌｉｔｈｉｕｍ  ３，５−Ｄｉｉｏｄｏｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）、
ドデシル硫酸トリス［Ｔｒｉｓ  （ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）  ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ；Ｔｒｉｓ  ＤＳ］、
コール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｏｌａｔｅ）、
デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、
Ｎ−ラウロイルサルコシン（Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ）、又は
Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｎ−Ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）
等を用いることができる。
【００２１】
陽イオン性界面活性剤としては、例えば、
セチルジメチルエチルアンモニウムブロマイド（Ｃｅｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）、
セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｃｅｔｈｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）、
セチルトリメチルアンモニウムクロライド（Ｃｅｔｈｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、又は
グアニジンチオシアネート（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）
等を用いることができる。
【００２２】
これらの界面活性剤は、目的に応じて、単独で、あるいは、組み合わせて用いることができる。また、界面活性剤濃度は、目的に応じて、例えば、測定対象物の抽出効率、安定性、及び測定法に干渉しない濃度を設定することができ、例えば、０．０１％〜５０％に設定することができる。また、密閉可能な容器を用いた場合、抽出中に抽出液の飛沫が発生せず、より安全性の高い抽出を行うことができる。
【００２３】
膜可溶化用界面活性剤処理に用いる溶液には、分析対象抗原の保護剤としてタンパク質分解酵素阻害剤を添加することもできる。本発明において用いることのできるタンパク質分解酵素阻害剤は、例えば、大豆トリプシンインヒビター（ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＳＢＴＩ）、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＮＴＢ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ｐ−クロロメルクリ安息香酸（ＰＣＭＢ）、ｐ−ヒドロキシメルクリ安息香酸（ＰＨＭＢ）、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、Ｎ−トシル−Ｌ−リシルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニルメチルケトン（ＴＰＣＫ）、ロイコペプチン（ｌｅｕｋｏｐｅｐｔｉｎ）、又はペプスタチン（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）等を挙げることができる。
これらのタンパク質分解酵素阻害剤は、目的に応じて、単独で、あるいは、組み合わせて用いることができる。また、タンパク質分解酵素阻害剤濃度は、目的に応じて、例えば、０．０１μｍｏｌ／Ｌ以上に設定することができるが、これに限定されるものではなく、目的に応じた濃度を設定することができる。
【００２４】
本発明の製造方法で得られた単核球抽出液は、単核球抗原分析用試料として用いることができる。すなわち、本発明の製造方法は、単核球抗原分析用試料の製造方法でもある。本発明の単核球抗原分析方法では、本発明の製造方法により得られた抽出液を被検試料として用いること以外は、分析対象の各単核球抗原に応じた公知の分析方法により、前記分析対象物を分析することができる。この場合、目的に応じて、単核球抽出液を直接分析することもできるし、あるいは、適切な緩衝液を用いて希釈し、分析することもできる。
【００２５】
本発明の分析方法で分析可能な単核球抗原には、単核球表面抗原及び単核球中抗原とが含まれ、例えば、タンパク質、核酸、脂質、又は糖類等を挙げることができる。前記タンパク質としては、例えば、単核球表面抗原であるＣＤ３抗原若しくはＣＤ１１ｂ抗原、又は単核球中抗原であるＤＰＤ等を挙げることができる。
例えば、単核球表面抗原であるＣＤ抗原測定を行うことにより、例えば、感染症（例えば、ヒト免疫不全ウイルス又はＥＢウイルス等）の診断、あるいは、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リューマチ、シェーグレン症候群、又は多発性硬化症等）等の多岐に及ぶ診断に用いることができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《末梢血単核球抽出液の調製》
本実施例では、後述の実施例２に記載の末梢血単核球のＣＤ３抗原測定、実施例３に記載のＣＤ１１ｂ抗原測定、及び実施例４に記載の末梢血単核球中のＤＰＤ測定に用いる試料として、末梢血単核球抽出液を調製した。
【００２７】
（１）本発明方法による、末梢血からの単核球の分離
初発材料として、ヘパリン入り採血管を用いて末梢血を採血した。また、単核球分離液として、０．８３％塩化アンモニウム水溶液及び０．１７ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６５）を９容：１容の割合で混合した緩衝液を用いた。まず、単核球分離液９ｍＬに対し、先に採血した末梢血１ｍＬを添加した。その後、両者を混合し、室温にて１５分間反応させた。反応終了後、３００Ｇ及び２５℃にて５分間遠心し、遠心上清を除去し、細胞ペレットを得た。更に、細胞ペレットに対し、単核球分離液９ｍＬを添加し、緩やかにペレットをほぐした後、室温、１５分間反応させた。反応終了後、３００Ｇ及び２５℃にて５分間遠心し、遠心上清を除去した。得られた細胞ペレットを単核球とした。
【００２８】
（２）従来法（モノポリ分離培地を使用）による、末梢血からの単核球の分離
対照実験として、モノポリ分離培地（Ｆｌｏｗ−ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて末梢血から単核球を調製した。すなわち、初発材料として、ヘパリン入り採血管を用いて末梢血を採血し、単核球分離液として、モノポリ分離培地（Ｆｌｏｗ−ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。まず、単核球分離液１０ｍＬに対し、先に採血した末梢血１０ｍＬを重層し、１５００Ｇ及び２５℃にて２０分間遠心後、単核球を分離した。
【００２９】
（３）単核球の洗浄
実施例１（１）又は実施例１（２）で得られた各単核球に対し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）９ｍＬを添加し、緩やかに細胞をほぐした後、３００Ｇ及び２５℃にて５分間遠心し、遠心上清を除去した。再度残った細胞ペレットに対し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）９ｍＬを添加し、緩やかに細胞ペレットをほぐした後、３００Ｇ及び２５℃にて５分間遠心し、遠心上清を除去し、得られた細胞ペレットを洗浄済み単核球とした。
【００３０】
（４）単核球抽出液の調製
実施例１（３）で調製した洗浄済み単核球を、密閉可能なチューブに入れ、４％ＣＨＡＰＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００μＬを添加し、試験管ミキサーを用いて３０秒間撹拌した。撹拌終了後、氷浴中にて３０分間静置し、その後、２００００Ｇ及び４℃にて３０分間遠心し、遠心上清を回収し、これを単核球抽出液とした。
【００３１】
【実施例２】
《末梢血単核球のＣＤ３抗原測定》
（１）検体希釈液及び標準液の調製
実施例１にて調製した単核球抽出液を４％ＣＨＡＰＳを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて適当な倍率に希釈し、検体希釈液を調製した。また、ＣＤ３抗原陽性細胞抽出物を４％ＣＨＡＰＳを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて適当な倍率に希釈し、標準液を調製した。
【００３２】
（２）ＣＤ３抗原測定用ＥＬＩＳＡプレートの調製
５０ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ  ９．０）を用いて調製した抗ＣＤ３ウサギＩｇＧ（ＤＡＫＯ）溶液（５００倍希釈）を、９６穴マイクロタイタープレート（ＤＮＡ−ＢＩＮＤ；Ｃｏｓｔａｒ）のウェルに５０μＬ／ウェルずつ分注し、４℃にて１晩静置した。その後、ウェル中の溶液を抜き取り、次いで１％スキムミルク、３％蔗糖、及び０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．６）を２００μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃にて２時間静置し、ブロッキング操作を行うことにより、ＣＤ３抗原測定用ＥＬＩＳＡプレートを調製した。
【００３３】
（３）ＣＤ３抗原測定用ビオチン標識抗体溶液及びアビジン酵素溶液の調製
ビオチン標識抗ＣＤ３抗体（ビオチン標識ＵＣＨＴ−１抗体；イムノテック）を、５％スキムミルク及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて１００倍に希釈し、ＣＤ３抗原測定用ビオチン標識抗体溶液を調製した。
また、西洋ワサビペルオキシダーゼ−アビジン（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ａｖｉｄｉｎ  Ｄ；ベクター）を、５％スキムミルク及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて１００００倍に希釈し、アビジン酵素溶液を調製した。
更に、先に調製したＣＤ３抗原測定用ＥＬＩＳＡプレートと組み合わせることにより、ＣＤ３抗原測定用ＥＬＩＳＡ試薬を調製した。
【００３４】
（４）単核球抽出液中ＣＤ３抗原のＥＬＩＳＡ法による測定
測定に先立ち、先に調製した検体希釈液又は標準液５０μＬとＣＤ３抗原測定用ビオチン標識抗体溶液５０μＬとを混合し、２５℃にて１時間静置反応した。次いで、先に調製したＣＤ３抗原測定用ＥＬＩＳＡプレートのウェルに、前記混合液（ＣＤ３抗原測定用ビオチン標識抗体溶液と混合反応した検体希釈液又は標準液）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、３７℃にて１時間静置した。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて、３００μＬ／ウェルの量で５回洗浄した。次いで、先に調製したアビジン酵素溶液を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温にて３０分間静置した。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて、３００μＬ／ウェルの量で４回洗浄した。次いで、市販のペルオキシダーゼ用基質試薬（ＢＭ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｇｅｎｔ；ベーリンガーマンハイム）を１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温にて１０分間静置した。反応終了後、発光検出器（ルミノス９０００Ｄ；ダイアヤトロン）にて０．５秒間の発光量を測定した。なお、検体希釈液中のＣＤ３抗原濃度は、標準液の測定値から算出した。
【００３５】
結果を図１に示す。なお、ＣＤ３抗原濃度は、標準液中に含まれるＣＤ３抗原陽性細胞抽出物の２８０ｎｍの吸光度にて示した。
図１に示すように、本発明方法により得られた末梢血単核球ののＣＤ３抗原量と、従来法であるモノポリ分離培地を使用して得られた末梢血単核球ののＣＤ３抗原量とは、近似した測定結果が得られた。
【００３６】
【実施例３】
《末梢血単核球のＣＤ１１ｂ抗原測定》
（１）検体希釈液及び標準液の調製
ＣＤ３抗原陽性細胞抽出物の代わりに、ＣＤ１１ｂ抗原陽性細胞抽出物を用いること以外は、実施例２（１）の操作を繰り返すことにより、検体希釈液及び標準液を調製した。
【００３７】
（２）ＣＤ１１ｂ抗原測定用ＥＬＩＳＡプレートの調製
５０ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ  ９．０）を用いて調製した抗ＣＤ１１ｂ抗体（クローン４４：Ｈａｒｌａｎ）溶液（２μｇ／ｍＬ）を、９６穴マイクロタイタープレート（ＤＮＡ−ＢＩＮＤ；Ｃｏｓｔａｒ）のウェルに５０μＬ／ウェルずつ分注し、４℃にて１晩静置した。その後、ウェル中の溶液を抜き取り、次いで１％スキムミルク、３％蔗糖、及び０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．６）を２００μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃にて２時間静置し、ブロッキング操作を行うことにより、ＣＤ１１ｂ抗原測定用ＥＬＩＳＡプレートを調製した。
【００３８】
（３）ＣＤ１１ｂ抗原測定用ビオチン標識抗体溶液及びアビジン酵素溶液の調製
０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ  ８．４）を用いて調製した抗ＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｅａｒ−１）溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１．５ｍＬに対し、ジメチルスルホキシドを用いて調製したコハク酸イミド修飾ビオチン（ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ；ＰＩＥＲＣＥ）溶液（２ｍｇ／ｍＬ）３０μＬを添加し、撹拌した。その後、氷上にて２時間静置反応し、反応終了後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して４℃にて１晩透析し、ＣＤ１１ｂ抗原測定用ビオチン標識抗体を得た。このように調製したＣＤ１１ｂ抗原測定用ビオチン標識抗体を、５％スキムミルク及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて３．６μｇ／ｍＬに希釈し、ＣＤ１１ｂ抗原測定用ビオチン標識抗体溶液を調製した。
また、実施例２（３）の操作を繰り返すことにより、アビジン酵素溶液を調製した。
更に、先に調製したＣＤ１１ｂ抗原測定用ＥＬＩＳＡプレートと組み合わせることにより、ＣＤ１１ｂ抗原測定用ＥＬＩＳＡ試薬を調製した。
【００３９】
（４）単核球抽出液中ＣＤ１１ｂ抗原のＥＬＩＳＡ法による測定
実施例３（１）で調製した検体希釈液及び標準液、実施例３（２）で調製したＣＤ１１ｂ抗原測定用ＥＬＩＳＡプレート、並びに実施例３（３）で調製したＣＤ１１ｂ抗原測定用ビオチン標識抗体溶液及びアビジン酵素溶液を用いること以外は、実施例２（４）の操作を繰り返すことにより、単核球抽出液中ＣＤ１１ｂ抗原の測定を実施した。
【００４０】
結果を図２に示す。なお、ＣＤ１１ｂ抗原濃度は、標準液中に含まれるＣＤ１１ｂ抗原陽性細胞抽出物の２８０ｎｍの吸光度にて示した。
図２に示すように、本発明方法により得られた末梢血単核球のＣＤ１１ｂ抗原量と、従来法であるモノポリ分離培地を使用して得られた末梢血単核球のＣＤ１１ｂ抗原量とは、近似した測定結果が得られた。
【００４１】
【実施例４】
《末梢血単核球中のＤＰＤ測定》
（１）末梢血単核球中ＤＰＤのＥＬＩＳＡ法による測定
（１−１）検体希釈液及び標準液の調製
実施例１にて調製した単核球抽出液を、２％ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略称する）及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて適当な倍率に希釈し、検体希釈液を調製した。
また、ＭＩＡ  Ｐａｃａ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１４２０）抽出物を、２％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて適当な倍率に希釈し、標準液を調製した。
【００４２】
（１−２）ＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡプレートの調製
抗ＤＰＤウサギＩｇＧを定法によりペプシン消化し、抗ＤＰＤウサギＦ（ａｂ’）２を調製した。５０ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ  ９．６）を用いて調製した１０μｇ／ｍＬ抗ＤＰＤウサギＦ（ａｂ’）２溶液を、９６穴マイクロタイタープレート（ＭＳ８６９６Ｆ；住友ベークライト）の各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注し、４℃にて１晩静置した。その後、ウェル中の溶液を抜き取り、次いで、１％ＢＳＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を２５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃にて１時間静置し、ブロッキング操作を行うことにより、ＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡプレートを調製した。
【００４３】
（１−３）ＤＰＤ測定用酵素標識抗体の調製
抗ＤＰＤウサギＩｇＧを定法によりペプシン消化し、抗ＤＰＤウサギＦ（ａｂ’）２を調製した。これとは別に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略称する）を化学修飾し、ＢＳＡと結合させることにより、ＨＲＰ−ＢＳＡ複合体を調製した。その後、抗ＤＰＤウサギＦ（ａｂ’）２を用いて定法にて抗ＤＰＤウサギＦａｂ‘断片を調製し、同時にＨＲＰ−ＢＳＡ複合体の化学修飾物を調製し、両者を結合することにより、ＤＰＤ測定用酵素標識抗体を調製した。更に、先に調製したＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡプレートと組み合わせることにより、ＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡ試薬を調製した。
【００４４】
（１−４）単核球抽出液中ＤＰＤのＥＬＩＳＡ法による測定
先に調製したＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡプレートのウェルに、検体希釈液又は標準液を１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温にて１時間静置した。反応終了後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む生理食塩水３００μＬ／ウェルにて３回洗浄した。次いで、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び２０％正常ヤギ血清を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて調製したＤＰＤ測定用酵素標識抗体溶液（５μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温にて１時間静置した。反応終了後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む生理食塩水３００μＬ／ウェルにて３回洗浄した。次いで、０．２６％オルトフェニレンジアミン二塩酸塩（以下、ＯＰＤと略称する）及び０．００６％過酸化水素を含む０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温にて３０分間静置した。反応終了後、０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液を１００μＬ／ウェルずつ分注し、得られた４９０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。なお、検体希釈液中のＤＰＤ濃度は、標準液の測定値から算出した。
【００４５】
（２）単核球抽出液中ＤＰＤのタンパク濃度測定
先に調製した単核球抽出液を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて適当な倍率に希釈し、検体希釈液を調製した。また、ＢＳＡを、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて適当な倍率に希釈することにより、標準液を調製した。
【００４６】
９６穴マイクロタイタープレート（ＭＳ８６９６Ｆ；住友ベークライト）のウェルに、市販のタンパク質アッセイ試薬（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ；ＰＩＥＲＥＣＥ社）を２００μＬ／ウェルずつ分注した。次いで、検体希釈液又は標準液を１０μＬ／ウェルずつ分注し、室温にて３０分間静置した。反応終了後、得られた６３０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。なお、検体希釈液中のＤＰＤ濃度は、標準液の測定値から算出した。
【００４７】
上記測定の結果、本発明方法により得られた単核球中ＤＰＤ量は、２回測定したところ、９２．１０ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ及び６４．０４ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、その平均値は、７８．０７ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。また、従来法であるモノポリ分離培地を使用して得られた単核球中ＤＰＤ量は、８１．１６ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。なお、表示の単位は、単位タンパク質当たりの比活性値である。
本発明方法により得られた単核球中ＤＰＤ量と、従来法であるモノポリ分離培地を使用して得られた単核球中ＤＰＤ量とは、近似した測定結果が得られた。
【００４８】
【発明の効果】
本発明の製造方法によれば、従来、単核球の分離に用いられてきた高価な比重遠心用分離溶液を用いる必要がないため、安価であり、しかも、熟練を有する複雑な操作も必要がなく、簡便である。また、細胞に対して超音波処理等の強い物理的衝撃を与えることがないため、抽出中の発熱を抑えることができる。しかも、密閉可能な容器を用いた操作が可能であるため、安全性の点でも有利である。
更に本発明の製造方法は、血液（特に末梢血）単核球抗原分析方法、特には、末梢血単核球のＣＤ３抗原測定法、ＣＤ１１ｂ抗原測定法、及び末梢血単核球中のＤＰＤ測定法に有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明方法又は従来法（モノポリ分離培地）を用いて調製した各単核球抽出液中のＣＤ３抗原量を、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示すグラフである。
【図２】本発明方法又は従来法（モノポリ分離培地）を用いて調製した各単核球抽出液中のＣＤ１１ｂ抗原量を、ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示すグラフである。
【図１】
2004317154.tif 000002
【図２】
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