(57)【要約】【課題】ＳＭＧ−１と結合する新規のポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドを提供し、更には、ｍＲＮＡサーベイランス機構を人為的に制御する物質のスクリーニング系を提供する。【解決手段】前記ポリペプチドは、ＳＭＧ−１と結合する活性、ＳＭＧ−１によりリン酸化される活性、及びこれらの活性を通じてＳＭＧ−１の働きを制御する活性を有する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧＢＰ１活性を示すポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧＢＰ１活性を示すポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する抗体又はその断片。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現が部分的に又は完全に抑制されたノックアウト非ヒト動物又は細胞。
【請求項７】
（１）請求項１に記載のポリペプチドと、ＳＭＧ−１と、試験物質とを、前記試験物質が存在しなければ前記ポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮可能な条件下で、接触させる工程、及び
（２）前記ポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮されたか否かを分析する工程を含む、前記ポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
（１）請求項１に記載のポリペプチド及びＳＭＧ−１を産生可能な細胞と、試験物質とを、前記試験物質が存在しなければ前記細胞が前記ポリペプチドを産生可能な条件下で、接触させる工程、及び
（２）前記ポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮されたか否かを分析する工程を含む、請求項１に記載の前記ポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のスクリーニング方法で得られた、請求項１に記載のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質を有効成分として含有する、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊の抑制剤。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載のスクリーニング方法で得られた、請求項１に記載のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質を有効成分として含有する、ナンセンス変異により早期翻訳終止コドンを生じることが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤。
【請求項１１】
請求項７又は８に記載のスクリーニング方法で得られた、請求項１に記載のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質を有効成分として含有する、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊の促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＳＭＧ−１結合タンパク質及びその活性を制御する物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の変異による表現型の異常の１／４程度は、遺伝子の塩基配列の置換、組換え、及び／又は欠失などの変異により、結果的にタンパク質のコード領域にナンセンスコドンが出現してしまう形の異常であると言われている。このような遺伝子は、途中で終わった異常なタンパク質をコードするが、通常、そのような異常なタンパク質をコードするｍＲＮＡは検出されない。これは、異常な位置にナンセンスコドンを有するｍＲＮＡを識別し、排除する機構を細胞が備えていることに起因する。この機構は、ナンセンスコドンに起因するｍＲＮＡ分解機構（あるいはｍＲＮＡサーベイランス機構）と呼ばれ、ヒトの遺伝性疾患の症状にも大きく反映していると同時に、免疫担当細胞の成熟に伴って生ずる異常なｍＲＮＡを排除する生理的な役割を有することも示唆されている。しかし、その分子機構に関しては、脊椎動物では未だにほとんど不明である。
【０００３】
本発明者及びその共同研究者は、ヒトＳＭＧ−１（ｈＳＭＧ−１）というプロテインキナーゼ分子がヒトＵＰＦ１をリン酸化することが、ｍＲＮＡサーベイランスの過程に必須であることを明らかにし、既に発表している［山下暁朗ら，「ジーンズ・アンド・デベロップメント（ＧＥＮＥＳ　＆　ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ）」，（米国），２００１年，第１５巻，ｐ．２２１５−２２２８（非特許文献１）］。しかしながら、ヒトＳＭＧ−１を含むサーベイランス複合体については未だにほとんど不明である。
【０００４】
なお、今回、本発明者が見出した新規のポリペプチドをコードするヒトｃＤＮＡの塩基配列が、Ｋａｗａｂａｔａ，Ａ．，　Ｈｉｋｉｊｉ，Ｔ．，　Ｋｏｂａｔａｋｅ，Ｎ．，　Ｉｎａｇａｋｉ，Ｈ．，　Ｉｋｅｍａ，Ｙ．，Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｓ．，　Ｏｋｉｔａｎｉ，Ｒ．，　Ｏｔａ，Ｔ．，　Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，　Ｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，　Ｎｉｓｈｉ，Ｔ．，Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｔ．，　Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，　Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，　Ｉｓｏｇａｉ，Ｔ．　ａｎｄ　Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．　”ＮＥＤＯ　ｈｕｍａｎ　ｃＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｐｒｏｊｅｃｔ．”　　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃＤＮＡ．．．［ｇｉ：１０４３９８１５］．　Ｄａｔａｓｈｅｅｔ．　［ｏｎｌｉｎｅ］．　Ｅｎｔｒｅｚ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｄａｔａｂａｓｅ，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｅｎｔｒｅｚ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：　ＡＫ０２６８５８．　［ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ　ｏｎ　２００２−０９−０２］．　Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎｅｔ：　＜ＵＲＬ：　　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝１０４３９８１５＆ｄｏｐｔ＝ＧｅｎＢａｎｋ＞（非特許文献２）に報告されている。しかし、この文献には、このｃＤＮＡを発現してポリペプチドを取得したことも、前記ポリペプチドの機能についても、全く開示がない。
【０００５】
また、本発明者が見出した新規ポリペプチドと近似の分子量を有するタンパク質ｐ１４０が、本発明者により、大西ら，「新規ＰＩ３Ｋ関連巨大プロテインキナーゼの構造と機能の解析」，「１９９９年度第２２回日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集」，１９９９年，ｐ．２３５（非特許文献３）に開示されている。しかしながら、前記文献は、細胞周期の進行又はチェックポイント制御に重要な機能を示すヒトフォスファチジルイノシトールキナーゼ（ＰＩＫ）−関連タンパク質キナーゼ（ＰＩＫＫ）について開示するものであり、ｍＲＮＡサーベイランス機構に関する開示もそれを示唆する記載も全くない。
【０００６】
【非特許文献１】
山下暁朗ら，「ジーンズ・アンド・デベロップメント（ＧＥＮＥＳ　＆　ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ）」，（米国），２００１年，第１５巻，ｐ．２２１５−２２２８
【非特許文献２】
Ｋａｗａｂａｔａ，Ａ．，　Ｈｉｋｉｊｉ，Ｔ．，　Ｋｏｂａｔａｋｅ，Ｎ．，　Ｉｎａｇａｋｉ，Ｈ．，　Ｉｋｅｍａ，Ｙ．，Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｓ．，　Ｏｋｉｔａｎｉ，Ｒ．，　Ｏｔａ，Ｔ．，　Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，　Ｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，　Ｎｉｓｈｉ，Ｔ．，Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｔ．，Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，　Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，　Ｉｓｏｇａｉ，Ｔ．　ａｎｄ　Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．　”ＮＥＤＯ　ｈｕｍａｎ　ｃＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｐｒｏｊｅｃｔ．”　　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃＤＮＡ．．．［ｇｉ：１０４３９８１５］．　Ｄａｔａｓｈｅｅｔ．　［ｏｎｌｉｎｅ］．　Ｅｎｔｒｅｚ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｄａｔａｂａｓｅ，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｅｎｔｒｅｚ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ：　ＡＫ０２６８５８．　［ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ　ｏｎ　２００２−０９−０２］．　Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎｅｔ：　＜ＵＲＬ：　　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝１０４３９８１５＆ｄｏｐｔ＝ＧｅｎＢａｎｋ＞
【非特許文献３】
大西ら，「新規ＰＩ３Ｋ関連巨大プロテインキナーゼの構造と機能の解析」，「１９９９年度第２２回日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集」，１９９９年，ｐ．２３５
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、ｍＲＮＡサーベイランス機構を解明することにより、ｍＲＮＡサーベイランス機構を人為的に制御可能な方法を開発することを目的として、鋭意探求したところ、ｈＳＭＧ−１と強固に結合した新規タンパク質を同定し、全構造を決定した。この分子は、細胞内でｈＳＭＧ−１に強固に結合しており、キナーゼ活性の制御や細胞内の局在化、更にはサーベイランス複合体の活性制御に大きく関わっていることが予測される。従って、ｍＲＮＡサーベイランス機構を人為的に制御する際の分子標的候補の一つであることを本発明者は見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。
従って、本発明の課題は、ＳＭＧ−１と結合する新規のポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドを提供し、更には、ｍＲＮＡサーベイランス機構を人為的に制御する物質のスクリーニング系を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧＢＰ１活性を示すポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧＢＰ１活性を示すポリペプチドに関する。
また、本発明は、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチドに結合する抗体又はその断片に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が部分的に又は完全に抑制されたノックアウト非ヒト動物又は細胞に関する。
【０００９】
また、本発明は、（１）前記ポリペプチドと、ＳＭＧ−１と、試験物質とを、前記試験物質が存在しなければ前記ポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮可能な条件下で、接触させる工程、及び
（２）前記ポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮されたか否かを分析する工程を含む、前記ポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質のスクリーニング方法に関する。
また、本発明は、前記スクリーニング方法で得られた、前記ポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質を有効成分として含有する、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊の抑制剤に関する。
また、本発明は、前記スクリーニング方法で得られた、前記ポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質を有効成分として含有する、ナンセンス変異により早期翻訳終止コドンを生じることが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤に関する。
また、本発明は、前記スクリーニング方法で得られた、前記ポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質を有効成分として含有する、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊の促進剤に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
［１］本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧＢＰ１活性を示すポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧＢＰ１活性を示すポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；並びに
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧＢＰ１活性を示すポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）
が含まれる。
【００１２】
本発明のポリペプチドである「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、ＳＭＧ−１（特にはヒトＳＭＧ−１）と結合して複合体を形成することのできる、９９１個のアミノ酸残基からなる新規タンパク質である。本発明者は、このポリペプチドがＳＭＧ−１結合活性を有することから、「ＳＭＧＢＰ１」（ＳＭＧ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１）と命名した。
本明細書において、「ＳＭＧＢＰ１活性」とは、ＳＭＧ−１（特にはヒトＳＭＧ−１）と結合する活性、ＳＭＧ−１によりリン酸化される活性、及び／又はこれらの活性を通じてＳＭＧ−１の働きを制御する活性を意味する。また、本明細書において、「ＳＭＧＢＰ１活性を示す」とは、これらの活性の少なくとも１つを示すことを意味する。
なお、ＳＭＧ−１は、ｍＲＮＡサーベイランスの過程に必須なフォスファチジルイノシトールキナーゼ（ＰＩＫ）−関連タンパク質キナーゼ（ＰＩＫＫ）であり、自己リン酸化能を有すると同時に、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍＲＮＡ　ｄｅｃａｙ；ＮＭＤ）の必須因子であるＵＰＦ１／ＳＭＧ−２［Ｓｕｎ，Ｘら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８年，９５，ｐ．１０００９−１００１４；及びＢｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ａ．ら，Ｒｎａ，２０００年，６，ｐ．１２２６−１２３５］をリン酸化する活性を有するタンパク質であり、ＳＭＧ−１の活性がＮＭＤを正に制御している［山下暁朗ら，「ジーンズ・アンド・デベロップメント（ＧＥＮＥＳ　＆　ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ）」，（米国），２００１年，第１５巻，ｐ．２２１５−２２２８］。
【００１３】
本明細書において、試験対象であるポリペプチドが「ＳＭＧＢＰ１活性を示す」か否かを判定する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、試験ポリペプチドとＳＭＧ−１（例えば、ヒトＳＭＧ−１）とを接触させ、試験ポリペプチドとＳＭＧ−１との複合体が形成されるか否かを分析することにより、判定することができる。
【００１４】
前記判定方法において、試験ポリペプチドとＳＭＧ−１とを接触させる方法としては、例えば、試験ポリペプチド及びＳＭＧ−１を、それぞれ別々に遺伝子工学的に調製し、それらを接触させる方法、あるいは、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＳＭＧ−１を産生可能な細胞に導入し、細胞内で試験ポリペプチド及びＳＭＧ−１を産生させ、接触させる方法などを挙げることができる。
【００１５】
また、前記判定方法において、試験ポリペプチドとＳＭＧ−１との複合体を分析する方法としては、例えば、
ＳＭＧ−１又は試験ポリペプチドのいずれか一方に対する抗体（例えば、抗ＳＭＧ−１抗体）を用いて免疫沈降を行なった後、残るもう一方のポリペプチドに対する抗体（例えば、抗試験ポリペプチド抗体）を用いるウエスタンブロットにより、後者のポリペプチドの存在の有無を確認する方法［例えば、後述の実施例４（２）に記載の方法］；
ＳＭＧ−１又は試験ポリペプチドのいずれか一方に対する抗体（例えば、抗ＳＭＧ−１抗体）を用いて免疫沈降を行なった後、電気泳動し、適当な検出法（例えば、銀染色）により、残るもう一方のポリペプチド（例えば、試験ポリペプチド）の存在の有無を確認する方法［例えば、実施例３（１）に記載の方法］；
抗ＳＭＧ−１抗体を用いて免疫沈降を行なった後、ＳＭＧ−１によるリン酸化が可能な条件下でリン酸化を実施し、リン酸化された試験ポリペプチドの存在の有無を確認する方法［例えば、実施例１（２）〜（４）に記載の方法］；又は
クロマトグラフィーを実施した後、試験ポリペプチド及びＳＭＧ−１が同一分画に存在するか否かを確認する方法［例えば、実施例２（２）及び（３）に記載の方法］
などを挙げることができる。
【００１６】
本発明のポリペプチドである「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧＢＰ１活性を示すポリペプチド」としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、ＳＭＧＢＰ１活性を示す融合ポリペプチドを挙げることができる。
本発明のポリペプチドで用いることのできるマーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
【００１７】
本発明の機能的等価改変体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧＢＰ１活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、その起源もヒトに限定されない。
【００１８】
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、ヒトＳＭＧＢＰ１）のヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、サル、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来の機能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、ヒト由来の変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体）をコードするポリヌクレオチドを元にして、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを元にして、遺伝子工学的に人為的に改変したポリヌクレオチドを用いて製造したポリペプチドなどが含まれる。
【００１９】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体は、当業者であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列における第１６番目〜第２９８８番目の塩基からなる配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）に従って実施することが可能である。
【００２０】
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、ポリペプチドコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドがＳＭＧＢＰ１活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
【００２１】
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドがＳＭＧＢＰ１活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
【００２２】
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＳＭＧＢＰ１活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｎｇｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）により得られた値を意味する。
【００２３】
［２］本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列番号１で表される塩基配列における第１６番目〜第２９８８番目の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチド、あるいは、配列番号１で表される塩基配列における第１６番目〜第２９８８番目の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
【００２５】
前記（１）のＰＣＲを用いた方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。抽出した前記ｍＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
【００２６】
より詳細には、まず、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織から、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、あるいは、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
【００２７】
続いて、抽出したｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡを更に分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。
次に、精製されたｍＲＮＡを、例えば、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的とするｃＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
【００２８】
前記（２）の常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，９，２２５１−２２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ　Ｙｏｏ法（Ｙｏｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げることができる。
【００２９】
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、又はＪＭ１０９株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシン等に対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、又はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
【００３０】
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（ｉ）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる形質転換株スクリーニング法、（ｉｉ）ＰＣＲにより作製したプローブを用いる形質転換株スクリーニング法、（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転換株スクリーニング法、又は（ｉｖ）セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーション系を用いる形質転換株スクリーニング法を採用することができる。
【００３１】
前記（ｉ）の合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（３２Ｐ又は３３Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルター又はポリアミドフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
【００３２】
前記（ｉｉ）のＰＣＲにより作製したプローブを用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、３２Ｐ又は３３Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
【００３３】
前記（ｉｉｉ）の本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、形質転換株の培養上清、細胞内、又は細胞表面にポリペプチドを産生させ、本発明のポリペプチドに対する抗体及び前記抗体に対する２次抗体を用いて、所望のポリペプチド産生株を検出し、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
【００３４】
前記（ｉｖ）のセレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーション系を用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロースフィルター等にブロットし、本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞から別途調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結合したｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収されたｍＲＮＡを適当なポリペプチド翻訳系、例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞へ注入したり、あるいは、ウサギ網状赤血球ライゼート又は小麦胚芽等の無細胞系を用いて、ポリペプチドに翻訳させる。本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて検出して、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
【００３５】
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
【００３６】
前記（３）の化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ　１０００Ｍ　ＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。
【００３７】
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
【００３８】
［３］本発明の発現ベクター及び形質転換体
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生物又は原核生物の宿主細胞をトランスフェクションすることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
【００３９】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞又は導入対象細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。本発明の発現ベクターには、本発明の組換えポリペプチドを製造するための発現ベクターと、遺伝子治療により体内で本発明のポリペプチドを産生させるための発現ベクターとが含まれる。
【００４０】
また、本発明の形質転換体も、本発明の前記発現ベクター又はポリヌクレオチドでトランスフェクションされ、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であることもできるし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であることもできる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。
【００４１】
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、又はヒト由来細胞である２９３Ｔ細胞（ＤｕＢｒｉｄｇｅ，Ｒ．Ｂ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，３７９−３８７，１９８７）等を挙げることができる。
【００４２】
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有しているものも使用することができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
【００４３】
宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとしてＳＶ４０複製起点を有しているものを使用すれば、細胞内で自律増殖が可能である。更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
【００４４】
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
【００４５】
更に、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のポリペプチドを安定に産生するトランスフェクションされた細胞を得ることができる。
【００４６】
遺伝子治療のベクターとしては、一般的に使用されているベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、又はセンダイウイルス等）を用いることができる。
【００４７】
本発明の形質転換体は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞内に本発明のポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
【００４８】
本発明の形質転換体を培養することにより、前記細胞の細胞内に生産される本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精製することができる。具体的には、本発明のポリペプチドを含む細胞抽出液を、例えば、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、本発明のポリペプチドを精製することができる。
【００４９】
本発明のポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることにより、本発明のポリペプチドの発現の確認、又は精製等が容易になる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列と本発明のポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。
【００５０】
［４］本発明のスクリーニング方法
本発明のポリペプチドを用いると、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御（例えば、抑制又は促進）する物質をスクリーニングすることができる。本発明のポリペプチドであるヒトＳＭＧＢＰ１は、ｍＲＮＡサーベイランスの過程に必須なヒトＳＭＧ−１と生体内で強固に結合しており、キナーゼ活性の制御や細胞内の局在化、更にはサーベイランス複合体の活性制御に大きく関わっていることが予測される。従って、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質は、例えば、ＳＭＧ−１活性の制御を介して、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍＲＮＡ　ｄｅｃａｙ；ＮＭＤ）を制御することが可能であるはずであるので、ＮＭＤが関連する種々の疾病の治療及び／又は予防剤の候補物質として有用であり、本発明のポリペプチドそれ自体を、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質、あるいは、ＮＭＤが関連する種々の疾病の治療及び／又は予防剤のスクリーニングツールとして使用することができる。
なお、ＮＭＤとは、遺伝子の本来の翻訳領域の途中のコドンが終止コドンに変異したナンセンス変異ｍＲＮＡを認識して、特異的に分解する機構である。
【００５１】
ＮＭＤが関連する種々の疾病としては、例えば、排除されるべき、ＰＴＣを含むｍＲＮＡが排除されないことが原因で生じる病態、あるいは、ナンセンス変異により早期翻訳終止コドン（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｃｏｄｏｎ：ＰＴＣ）を生じることが原因で生じる病態を挙げることができる。
ナンセンス変異によりＰＴＣを生じることが原因で生じる病態としては、特に限定されるものではないが、例えば、遺伝性疾患（例えば、デセンヌ型筋ジストロフィー症）、あるいは、体細胞変異によって生じる癌などを挙げることができる。重要な点は、ゲノムの変異によって生じる全ての疾患の中で、「ナンセンス変異によりＰＴＣを生じる」というメカニズムに応じてこれが当てはまるという点である。
【００５２】
ゲノムの変異により生ずる疾患の１／４は、特定遺伝子の途中に終止コドンが生じてしまうことに起因すると言われている。その結果、前記遺伝子が本来コードする全長ポリペプチドからなるタンパク質が発現されないばかりでなく、ＮＭＤ機構の存在により、前記遺伝子が本来コードする全長ポリペプチドのＮ末端側部分断片からなるタンパク質断片も、ほとんど発現されないことが、その原因とされている。しかし、遺伝子の途中に終止コドンが存在したとしても、遺伝子の種類又は終止コドンの位置によっては、タンパク質断片の状態でも、全長ポリペプチドと同程度の、あるいは、最小限必要な活性を有する場合も少なくない。この場合、ＮＭＤ機構を抑制することができれば、有効な活性を有するタンパク質断片の発現が可能となるため、特定遺伝子の途中に終止コドンが存在するために生じる病態、すなわち、特定遺伝子のナンセンス変異による病態の少なくとも一部を解消することができることが理論的に予測されている。しかし、従来、ＮＭＤのみを特異的に抑制する手法は、全く知られていない。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法により選択された、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質の内、ＳＭＧＢＰ１活性の制御を介してＳＭＧ−１活性を抑制することのできる物質は、ＮＭＤを特異的に抑制することが期待でき、従って、特定遺伝子のナンセンス変異によるあらゆる病態について、少なくとも一部について遺伝子変異を解消することができるという全く新しいタイプの治療及び／又は予防剤の有効成分として有用である。
あるいは、本発明のスクリーニング方法により選択された、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質の内、ＳＭＧＢＰ１活性の制御を介してＳＭＧ−１活性を促進することのできる物質は、ＮＭＤを促進することができるので、ＮＭＤの促進剤の有効成分として、あるいは、排除されるべき、ＰＴＣを含むｍＲＮＡが排除されないことが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤の有効成分として有用である。
【００５４】
本発明のスクリーニング方法にかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）又は通常の合成技術によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
【００５５】
本発明のスクリーニング方法は、
（１）本発明のポリペプチドと、ＳＭＧ−１（例えば、ヒトＳＭＧ−１）と、試験物質とを、前記試験物質が存在しなければ前記ポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮可能な条件下で、接触させる工程（以下、接触工程と称する）と、
（２）前記ポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮されたか否かを分析する工程（以下、分析工程と称する）と
を含む。
【００５６】
前記接触工程において、本発明のポリペプチドとＳＭＧ−１と試験物質とを接触させる方法は、試験物質が存在しなければ本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮可能な条件下（すなわち、本発明のポリペプチドがＳＭＧ−１と結合可能な条件下）で、両者を接触させることができる限り、特に限定されるものではない。このような接触方法としては、例えば、試験ポリペプチド及びＳＭＧ−１を、それぞれ別々に遺伝子工学的に調製し、試験ポリペプチドとＳＭＧ−１と試験物質とを接触させる方法、あるいは、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＳＭＧ−１を産生可能な細胞に導入し、試験物質存在下にて、細胞内で試験ポリペプチド及びＳＭＧ−１を産生させ、試験ポリペプチドとＳＭＧ−１と試験物質とを接触させる方法などを挙げることができる。
【００５７】
前記分析工程では、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮されたか否かを分析する。より具体的には、例えば、本発明のポリペプチドとＳＭＧ−１との複合体が形成されたか否かを分析する。
分析工程において、本発明のポリペプチドとＳＭＧ−１との複合体が形成されていないと判定された場合には、試験物質は、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を抑制する物質であると判断することができる。
【００５８】
分析工程において、本発明のポリペプチドとＳＭＧ−１との複合体を分析する方法としては、例えば、
ＳＭＧ−１又は本発明のポリペプチドのいずれか一方に対する抗体（例えば、抗ＳＭＧ−１抗体）を用いて免疫沈降を行なった後、残るもう一方のポリペプチドに対する抗体（例えば、本発明のポリペプチドに対する抗体）を用いるウエスタンブロットにより、後者のポリペプチドの存在の有無を確認する方法［以下、免疫沈降及びウエスタンブロット併用法と称する；例えば、後述の実施例４（２）に記載の方法］；
ＳＭＧ−１又は本発明のポリペプチドのいずれか一方に対する抗体（例えば、抗ＳＭＧ−１抗体）を用いて免疫沈降を行なった後、電気泳動し、適当な検出法（例えば、銀染色）により、残るもう一方のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチド）の存在の有無を確認する方法［以下、免疫沈降及び銀染色併用法と称する；例えば、実施例３（１）に記載の方法］；
抗ＳＭＧ−１抗体を用いて免疫沈降を行なった後、ＳＭＧ−１によるリン酸化が可能な条件下でリン酸化を実施し、リン酸化された本発明のポリペプチドの存在の有無を確認する方法［以下、免疫沈降及びリン酸化反応併用法と称する；例えば、実施例１（２）〜（４）に記載の方法］；又は
クロマトグラフィーを実施した後、本発明のポリペプチド及びＳＭＧ−１が同一分画に存在するか否かを確認する方法［以下、分画法と称する；例えば、実施例２（２）及び（３）に記載の方法］
などを使用することができる。
【００５９】
分析工程において前記免疫沈降及びウエスタンブロット併用法を用いる場合には、ＳＭＧ−１又は本発明のポリペプチドのいずれか一方に対する抗体（例えば、抗ＳＭＧ−１抗体）を用いて免疫沈降を行なった後、残るもう一方のポリペプチドに対する抗体（例えば、本発明のポリペプチドに対する抗体）を用いてウエスタンブロットを実施する。ウエスタンブロットの結果、後者のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチド）が検出されれば、本発明のポリペプチドとＳＭＧ−１との複合体が形成された（すなわち、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮された）と判定することができる。一方、後者のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチド）が検出されなければ、本発明のポリペプチドとＳＭＧ−１との複合体が形成されていない（すなわち、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮されていない）と判定することができ、更に、試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を抑制する物質であると判断することができる。同様にして、試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を促進する物質であることも判断することができる。
【００６０】
分析工程において前記免疫沈降及び銀染色併用法を用いる場合には、ＳＭＧ−１又は本発明のポリペプチドのいずれか一方に対する抗体（例えば、抗ＳＭＧ−１抗体）を用いて免疫沈降を行なった後、電気泳動し、適当な検出法（例えば、銀染色）により、残るもう一方のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチド）の存在の有無を確認する。後者のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチド）が検出されれば、本発明のポリペプチドとＳＭＧ−１との複合体が形成された（すなわち、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮された）と判定することができる。一方、後者のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチド）が検出されなければ、本発明のポリペプチドとＳＭＧ−１との複合体が形成されていない（すなわち、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮されていない）と判定することができ、更に、試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を抑制する物質であると判断することができる。同様にして、試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を促進する物質であることも判断することができる。
【００６１】
分析工程において前記免疫沈降及びリン酸化反応併用法を用いる場合には、抗ＳＭＧ−１抗体を用いて免疫沈降を行なった後、ＳＭＧ−１によるリン酸化が可能な条件下でリン酸化を実施し、リン酸化された本発明のポリペプチドの存在の有無を確認する。本発明のポリペプチドが検出されれば、本発明のポリペプチドとＳＭＧ−１との複合体が形成された（すなわち、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮された）と判定することができる。一方、本発明のポリペプチドが検出されなければ、本発明のポリペプチドとＳＭＧ−１との複合体が形成されていない（すなわち、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮されていない）と判定することができ、更に、試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を抑制する物質であると判断することができる。同様にして、試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を促進する物質であることも判断することができる。
【００６２】
分析工程において前記分画法を用いる場合には、クロマトグラフィーを実施した後、本発明のポリペプチド及びＳＭＧ−１が同一分画に存在するか否かを確認する。本発明のポリペプチド及びＳＭＧ−１が同一分画に存在すれば、本発明のポリペプチドとＳＭＧ−１との複合体が形成された（すなわち、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮された）と判定することができる。一方、本発明のポリペプチド及びＳＭＧ−１が同一分画に存在しなければ、本発明のポリペプチドとＳＭＧ−１との複合体が形成されていない（すなわち、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性が発揮されていない）と判定することができ、更に、試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を抑制する物質であると判断することができる。同様にして、試験物質が、本発明のポリペプチドのＳＭＧＢＰ１活性を促進する物質であることも判断することができる。
【００６３】
［５］本発明の医薬組成物
本発明のスクリーニング方法により選択することのできるＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質の内、ＳＭＧＢＰ１活性の制御を介してＳＭＧ−１活性を抑制する物質は、ＮＭＤを抑制することが可能であり、ナンセンス変異によりＰＴＣを生じることが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤の候補物質として有用である。このようなＳＭＧＢＰ１活性制御物質は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ＮＭＤを抑制することが必要な対象［例えば、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）］、あるいは、ナンセンス変異によりＰＴＣを生じることが原因で生じる病態の治療及び／又は予防が必要な対象に、有効量で投与することができる。
【００６４】
一方、本発明のスクリーニング方法により選択することのできるＳＭＧＢＰ１活性を制御する物質の内、ＳＭＧＢＰ１活性の制御を介してＳＭＧ−１活性を促進する物質は、ＮＭＤを促進することが可能であり、排除されるべき、ＰＴＣを含むｍＲＮＡが排除されないことが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤の候補物質として有用である。このようなＳＭＧＢＰ１活性制御物質は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ＮＭＤを促進することが必要な対象［例えば、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）］、あるいは、排除されるべき、ＰＴＣを含むｍＲＮＡが排除されないことが原因で生じる病態の治療及び／又は予防が必要な対象に、有効量で投与することができる。
【００６５】
本発明の医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００６６】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の医薬組成物は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬組成物をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００６７】
本発明の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で、有効成分を含有することができる。
本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
【００６８】
［６］本発明の抗体
本発明のポリペプチドに反応する抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、各種動物に、本発明のポリペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；又はＤｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
【００６９】
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又は卵から製造することができる。このように製造された血清又は卵から、常法のポリペプチド単離精製法によりポリクローナル抗体を分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
【００７０】
モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により、当業者が容易に製造することが可能である。
すなわち、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
【００７１】
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリーコールを利用することができる。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択することができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイブリドーマは、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。
【００７２】
このように製造されたモノクローナル抗体は、培養上清又は腹水から常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
また、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、前記モノクローナル抗体をコードする遺伝子の全部又は一部を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、又は動物細胞）に導入して生産させることもできる。
【００７３】
以上のように分離精製された抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）について、常法により、ポリペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得ることができる。
【００７４】
更には、本発明のポリペプチドに反応する抗体を、クラクソンらの方法又はゼベデらの方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８，１９９１；又はＺｅｂｅｄｅｅ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３１７５−３１７９，１９９２）により、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ）Ｆｖ又はＦａｂとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−８５９，１９９４）に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能である。
【００７５】
［７］本発明のノックアウト非ヒト動物及び細胞
本発明のノックアウト非ヒト動物は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現が部分的に又は完全に抑制されている限り、特に限定されるものではなく、それ自体公知の方法により、作製することができる。
【００７６】
例えば、本発明のポリヌクレオチドを含有してなる組換えベクターを用い、目的とする非ヒト動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、又はニワトリ等の胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）において、染色体上の本発明のタンパク質をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）；又はＣｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等］により不活化するか、あるいは、任意の配列と置換した変異クローンを作製する［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３５０，６３１５，２４３（１９９１）］。胚性幹細胞の変異クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）への注入キメラ法又は集合キメラ法等の手法により、胚性幹細胞クローンと正常細胞とからなるキメラ個体を調製することができる。このキメラ個体と正常個体との掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上に存在する本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に任意の変異を有する個体を得ることができ、更に、その個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入ったホモ個体の中から、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現が部分的に又は完全に抑制された個体としてノックアウト非ヒト動物を得ることができる。
【００７７】
更に、前記ノックアウト非ヒト動物から、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現が部分的に又は完全に抑制された、本発明の細胞を得ることができる。
あるいは、所望の細胞（例えば、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞、又はヒト由来細胞である２９３Ｔ細胞）に対して、例えば、ＲＮＡ干渉法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８，２００２）により、細胞内在性のＳＭＧＢＰ−１の発現を抑制することができ、これらの細胞も本発明の範囲に含まれる。
【００７８】
また、染色体上の本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の任意の位置へ変異を導入することにより、ノックアウト非ヒト動物を作製することも可能である。例えば、染色体上の本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳領域中へ、塩基を置換、欠失、及び／又は挿入等させて変異を導入することにより、その遺伝子産物の活性を改変させることも可能である。
また、その発現制御領域への同様な変異を導入することにより、例えば、発現の程度、時期、及び／又は組織特異性等を改変させることも可能である。更に、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、及び／又は発現量等を制御することも可能である。このような例として、脳のある特定の領域で発現されるプロモーターを利用して、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例［Ｃｅｌｌ，８７，７，１３１７（１９９６）］や、Ｃｒｅを発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，５３３５（１９９７）］が知られている。
【００７９】
従って、染色体上の本発明のポリペプチドをコードする遺伝子についても、このように任意の時期や組織で発現を制御することができ、また、任意の挿入、欠失、及び／又は置換をその翻訳領域や発現制御領域に有するノックアウト非ヒト動物を作製することができる。ノックアウト非ヒト動物は、任意の時期、任意の程度、及び／又は任意の部位で、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の症状を誘導することができる。このように、本発明のノックアウト非ヒト動物は、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。
【００８０】
更には、本発明のノックアウト非ヒト動物は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子とは異なる遺伝子に起因する疾患のモデル動物を樹立するのに用いることもできる。例えば、本発明のノックアウト非ヒト動物の１つであるＳＭＧＢＰ１ノックアウトマウスと、種々の系統の（見かけ上の）正常マウスとを掛け合わせる。後者の正常マウスが、ＰＴＣを有する変異遺伝子を含む場合、前記掛け合わせにより得られたマウス（例えば、相同染色体の双方にＳＭＧＢＰ１変異が入ったホモ個体、あるいは、相同染色体の一方にＳＭＧＢＰ１変異が入ったヘテロ個体）では、ＮＭＤ活性が影響を受けることが予想され、例えば、ＮＭＤが抑制された場合には、前記変異遺伝子に由来するｍＲＮＡが増加する。その結果、或る変異遺伝子については、隠れていた症状が表面化し、何らかの疾患が生じることがあり、新たな疾患モデルマウスを樹立することができる。
【００８１】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ヒトＳＭＧ−１（ｈＳＭＧ−１）の酵素活性依存的にリン酸化されるｈＳＭＧ−１結合タンパク質の発見》
（１）細胞の培養及び回収と細胞抽出液の調製
ヒトＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）を常法に従って培養し、１０７細胞まで増やした。培養皿上の細胞を、氷冷したリン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で洗浄した後、セルスクレイパーで掻き取り、遠心操作により細胞を集めた。ＰＢＳを除いた後、プロテアーゼ阻害剤［１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、及び１０μｇ／ｍＬロイペプチン］を添加したＦ−リシス液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２５ｍｏｌ／Ｌスクロース、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−β−メルカプトエタノール、１．２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＧＴＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌフッ化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌピロリン酸ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、及び０．５％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０］３ｍＬを加えよく攪拌し、更に、超音波処理により細胞を完全に破砕した。１５分間の遠心操作（１５０００回転）により上清を回収し、細胞抽出液とした。
【００８２】
（２）免疫沈降
本実施例では、抗ｈＳＭＧ−１血清として、抗血清Ｃ［山下暁朗ら，「ジーンズ・アンド・デベロップメント（ＧＥＮＥＳ　＆　ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ）」，（米国），２００１年，第１５巻，ｐ．２２１５−２２２８］を使用した。抗血清Ｃは、ｈＳＭＧ−１のＣ末側断片［ｈＳＭＧ−１のアミノ酸配列（３６５７アミノ酸）における第３０７６番目〜第３５４２番目のアミノ酸残基からなる配列に相当］をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＳＴ）との融合タンパク質（分子量＝約７０ｋＤａ）として大腸菌で発現させ、それを免疫源として得られた抗血清である。
【００８３】
予め抗ｈＳＭＧ−１血清（抗血清Ｃ）１０μＬ又はその免疫前血清（ｐｒｅ）１０μＬを結合させておいたプロテインＡセファロース粒子（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ社）２５μＬに、それぞれ、実施例１（１）で得られた細胞抽出液（遠心上清）１ｍＬを加え、４℃で２時間攪拌した。遠心操作により上清を除き、新たに洗浄液Ａ（Ｆ−リシス液に０．２５ｍｏｌ／Ｌ塩化リチウムを加えたもの）を加えて穏やかに攪拌した直後、更に遠心操作で上清を除いた。この操作をこの後６回繰り返し、非特異的吸着物を除去した。
【００８４】
（３）リン酸化反応
最後に回収されたプロテインＡセファロース粒子を、１×キナーゼ反応液［１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−β−グリセロリン酸、及び１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール（ＤＴＴ）］で一度洗浄操作を行なった。２×キナーゼ反応液に２価金属イオン（２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２若しくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｎＣｌ２又はその両方）及び／又は１μｍｏｌ／Ｌウォートマンニン［フォスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）関連タンパク質キナーゼの阻害剤］を加えた緩衝液２５μＬを加えて軽く攪拌し、氷上で２０分ほど静置した。更に反応開始液（５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及び１０μｍｏｌ／Ｌ−ＡＴＰ）２５ｍｌを加えて軽く攪拌し、３０℃で１５分間反応させた。２×ＳＤＳサンプルバッファー［２００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１２％β−メルカプトエタノール、２０％グリセロール、及び０．０２％ブロモフェノールブルー］５０μＬを加えて反応を停止させ、１００℃で４分間保温してタンパク質を変性させた。この遠心上清を以下の解析試料として使用した。
【００８５】
（４）リン酸化タンパク質の解析
高分子量から低分子量にわたるリン酸化タンパク質を分離能よく解析するため、解析試料をゲル濃度６％又は１２．５％の２種のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で展開した後、ゲルを乾燥し、常法に従ってオートラジオグラフィーにてリン酸化バンドを可視化した。
【００８６】
結果を図１に示す。図１において、記号「３２Ｐ」は、３２Ｐを用いたオートラジオグラフィーによる結果であることを示す。記号「＋」及び「−」は、それぞれ、ウォートマンニンの存在下及び不在下でリン酸化反応を実施したことを示す。記号「ＩＰ」は免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を意味し、記号「Ｃ３」及び「ｐｒｅ」は、それぞれ、免疫沈降において、抗血清Ｃ及びその免疫前血清を用いたことを示す。泳動パターンの右端に示す各分子量（例えば、「２０５ｋＤａ」）及び各矢印は、分子量マーカーとして用いた各種タンパク質の分子量及びその泳動位置を示す。泳動パターンの左端に示す記号「ｐｐ４３０」、「ｐｐ４００」、「ｐｐ１３０」、及び「ｐｐ７０」は、それぞれ、その数字が示す分子量を有するタンパク質が、リン酸化されていることを示す。
【００８７】
図１に示すように４００ｋＤａ及び４３０ｋＤａの位置にリン酸化バンドが検出された。これらのバンドはｈＳＭＧ−１の自己リン酸化によるものであることが、以下の事実から支持される。すなわち、この２つのリン酸化バンドの位置は、ウエスタンブロット法で検出されるｈＳＭＧ−１の分子量と一致した。また、これらのバンドは、免疫前血清を用いた免疫沈降物では検出されなかった。また、ｈＳＭＧ−１もその一員であるＰＩ３−キナーゼ関連タンパク質キナーゼの阻害剤であるウォートマンニン存在下では、そのリン酸化バンドが顕著に減弱した。更に、ＰＩ３−キナーゼ関連タンパク質キナーゼはその活性（自己リン酸化活性も含む）に対して２価金属イオンとしてＭｇよりＭｎを要求する傾向があるが、本免疫沈降実験でもＭｎを加えた場合により強い４３０ｋＤａタンパク質及び４００ｋＤａタンパク質のリン酸化が見られた。
【００８８】
ここで、ｈＳＭＧ−１の自己リン酸化の強弱に完全に対応する形で、１３０ｋＤａのタンパク質（ｐ１３０）及び７０ｋＤａのタンパク質（ｐ７０）の２種のタンパク質がリン酸化タンパク質として検出された。これらは、ｈＳＭＧ−１のキナーゼ活性でリン酸化される結合タンパク質の可能性がある。
この可能性を支持するために、抗血清Ｃの代わりに、別の抗ｈＳＭＧ−１血清である抗血清Ｌを用いて、前記の免疫沈降及びリン酸化反応を実施した。なお、抗血清Ｌは、ｈＳＭＧ−１のＮ末側断片［ｈＳＭＧ−１のアミノ酸配列（３６５７アミノ酸）における第８６４番目〜第１０５９番目のアミノ酸残基からなる配列に相当］をＧＳＴとの融合タンパク質（分子量＝約５０ｋＤａ）として大腸菌で発現させ、それを免疫源として得られた抗血清である。
【００８９】
結果を図２に示す。図２において、記号「３２Ｐ」は、３２Ｐを用いたオートラジオグラフィーによる結果であることを示し、記号「ＷＢ：Ｃ３」は、抗血清Ｃを用いたウエスタンブロットの結果であることを示す。記号「Ｃ−ｐｒｅ」、「Ｃ」、「Ｌ−ｐｒｅ」、及び「Ｌ」は、それぞれ、免疫沈降において、抗血清Ｃの免疫前血清、抗血清Ｃ、抗血清Ｌの免疫前血清、及び抗血清Ｌを用いたことを示す。
抗血清Ｃを用いた場合だけでなく、ｈＳＭＧ−１の異なる部位を抗原とする抗血清Ｌ抗体を用いた場合にも、１３０ｋＤａ及び７０ｋＤａの２種のタンパク質がリン酸化タンパク質として検出されたことから、前記の可能性が更に強まった。この結果は、抗血清Ｃで非特異的に免疫沈降されるタンパク質が偶然ｈＳＭＧ−１でリン酸化されるのではないことを示している。
【００９０】
【実施例２】
《ＨｅＬａ細胞抽出液の液体カラムクロマトグラフィーでの分離とｈＳＭＧ−１免疫複合体におけるリン酸化反応》
（１）細胞抽出液の調製
以下の操作はすべて４℃以下にて行なった。
３×１０９細胞のＨｅＬａ細胞を常法で培養し、実施例１（１）と同様の方法で細胞をＰＢＳ中に回収した。遠心操作により上清を除いた後の細胞に、０．２５％トリトンＸ−１００及びプロテアーゼ阻害剤（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、及び１０μｇ／ｍＬロイペプチン）を添加した緩衝液ＴＧ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴ、１ｍｍｏｌ／Ｌオルトバナジン酸ナトリウム、及び１０％グリセロール］３５ｍＬを加え、静かに攪拌した。この細胞懸濁液をポッター（Ｐｏｔｔｅｒ）型ホモジナイザーに移し、ポリテトラフルオロエチレン製のペッスル（ｐｅｓｔｌｅ）を５０ストロークさせることで細胞を破砕し、タンパク質を抽出した。超遠心操作（１０００００×ｇ，６０分間）により細胞抽出液を得た。細胞抽出液を膜フィルター（０．２２μｍ　ｐｏｒｅｓｉｚｅ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で濾過して解析用試料とした。
【００９１】
（２）液体カラムクロマトグラフィー
まず陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐＱ（５ｍＬ樹脂体積；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を４本連結し、液体カラムクロマグラフィーシステムＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に接続し、緩衝液Ａ（緩衝液ＴＧに０．１％トリトンＸ−１００を添加したもの）で平衡化した。実施例２（１）で調製した解析用試料をカラムに添加して、緩衝液Ａで充分に洗浄した後、緩衝液Ａ中で緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを添加したもの）の割合を８５分間で０〜６０％に直線的に上昇させていくことで、タンパク質を樹脂から溶離させた。なお、流速は１．５ｍＬ／分とした。ＦＰＬＣシステム付属の自動分画分取装置（フラクションコレクター）を用いて、２分間／分画（約３ｍＬ）の割合で溶出物を連続的に分取した。また、タンパク質の溶出の程度を２８０ｎｍの吸光度でモニターした。
【００９２】
結果を図３に示す。図３において、曲線ａは、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）、すなわち、タンパク質の相対濃度を示し、直線ｂは、塩化ナトリウムの濃度勾配を示す。記号「ｆｒ．」は分画を意味し、「ｆｒ．」の直後に続く各数字、及び曲線ａに沿って並ぶ手書きの各数字は、それぞれ、分画番号である。
【００９３】
（３）各分画からのｈＳＭＧ−１の免疫沈降とリン酸化反応
各分画（１０μＬ相当量）を、抗ｈＳＭＧ−１抗体Ｃ又は抗ｈＳＭＧ−１抗体Ｐを用いてウエスタンブロット解析した。
結果を図４に示す。記号「ＷＢ：Ｐ」及び「ＷＢ：Ｃ」は、それぞれ、抗血清Ｐ及び抗血清Ｃを用いたウエスタンブロットの結果であることを示す。
分画２５〜分画２８にｈＳＭＧ−１が濃縮して溶出することが判明した。
【００９４】
各分画６００μＬを用いて、実施例１（２）及び実施例１（３）と同様の方法で免疫沈降及びリン酸化反応を行なった。但し、免疫沈降に用いる抗体（抗血清Ｃ）は１μＬ／分画とし、リン酸化反応に用いる２×キナーゼ反応液には、２価金属イオンとして１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｎＣｌ２を添加し、ウォートマンニンは添加しなかった。更に、２×キナーゼ反応液には、外部基質としてＧＳＴ−ｐ５３（１−５８）タンパク質２μｇを加えた。なお、ＧＳＴ−ｐ５３（１−５８）タンパク質は、ｐ５３タンパク質（アミノ酸残基数＝３９３）の第１番目〜第５８番目のアミノ酸からなる部分断片と、ＧＳＴとの融合タンパク質であり、ｐ５３タンパク質における第１５番目のセリン残基（Ｓｅｒ１５）及び第３７番目のセリン残基（Ｓｅｒ３７）は、ｈＳＭＧ−１のリン酸化共通モチーフと一致する配列中にあり、ｈＳＭＧ−１によりリン酸化されることが知られている［山下暁朗ら，「ジーンズ・アンド・デベロップメント（ＧＥＮＥＳ　＆　ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ）」，（米国），２００１年，第１５巻，ｐ．２２１５−２２２８］。
【００９５】
リン酸化反応後、反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーによって解析した。結果を図５に示す。カラムで分画しても、ｈＳＭＧ−１の自己リン酸化能及び外部基質リン酸化能と、ｐ１３０及びｐ７０とを分離することができないことから、ｈＳＭＧ−１は、常に、ｐ１３０及びｐ７０と挙動を共にしていることが強く示唆される。
【００９６】
次に、分画２０〜分画３１を用いて、実施例１（２）及び実施例１（３）と同様の方法で免疫沈降及びリン酸化反応を行なった。但し、リン酸化反応に用いる２×キナーゼ反応液には、外部基質としてＧＳＴ−ｐ５３（１−５８）タンパク質２μｇを加え、反応開始液のＡＴＰの濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、放射性ＡＴＰは加えなかった。また、反応時間は１時間とした。
ＧＳＴ−ｐ５３（１−５８）タンパク質のリン酸化状態を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ｐ５３タンパク質におけるリン酸化Ｓｅｒ１５に対する抗体（抗Ｐ−Ｓｅｒ１５抗体；Ｓｈｉｅｈ，Ｓ．Ｙ．ら，Ｃｅｌｌ，９１，３２５−３３４，１９９７）又はｐ５３タンパク質におけるリン酸化Ｓｅｒ３７に対する抗体（抗Ｐ−Ｓｅｒ３７抗体；Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｍ．ら，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１５，７０６０−７０６９，１９９６）によるウエスタン法とで解析した。
結果を図６に示す。図６において、記号「ＷＢ：α−Ｐ−Ｓｅｒ１５」及び「ＷＢ：α−Ｐ−Ｓｅｒ３７」は、それぞれ、抗Ｐ−Ｓｅｒ１５抗体及び抗Ｐ−Ｓｅｒ３７抗体を用いたウエスタンブロットの結果であることを示す。記号「Ｐ−Ｓｅｒ１５−ｐ５３」及び「Ｐ−Ｓｅｒ３７−ｐ５３」は、それぞれ、Ｓｅｒ１５及びＳｅｒ３７がリン酸化されたＧＳＴ−ｐ５３（１−５８）タンパク質を意味する。
【００９７】
【実施例３】
《抗体カラムによるｈＳＭＧ−１複合体の精製と解析》
（１）免疫沈降
実施例１（１）と同様の方法でＨｅＬａ細胞抽出液を準備した。細胞抽出液に３ｍＬの体積のプロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を加え、４℃において３０分間攪拌処理した。遠心操作により上清を得た。正常ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）２５μｇを、あるいは、常法により抗血清Ｎから精製した抗ｈＳＭＧ−１ＩｇＧ（Ｎ抗体）２５μｇを予め結合させておいたプロテインＡセファロース１００μＬに、前記の遠心上清を半量ずつ加え、４℃で２時間攪拌した。なお、抗血清Ｎは、ｈＳＭＧ−１のＮ末断片［ｈＳＭＧ−１のアミノ酸配列（３６５７アミノ酸）における第１番目〜第１０６番目のアミノ酸残基からなる配列に相当］をＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌で発現させ、それを免疫源として得られた抗血清である。
遠心操作により上清を除き、新たにＦ−リシス液を加えて更に攪拌した直後、更に遠心操作で上清を除いた。この操作をこの後６回繰り返し、最後に回収されたプロテインＡセファロース粒子に、２×ＳＤＳ−サンプルバッファー１００μＬを加えて１００℃で４分間煮沸した。遠心操作で得た上清を解析用試料とした。
【００９８】
この解析用試料の１／２０量を常法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥし、銀染色を行なった。結果を図７に示す。１３０ｋＤａ付近に、正常ウサギＩｇＧによる免疫沈降物中には見られないバンドが、抗ｈＳＭＧ−１ＩｇＧ抗体による免疫沈降物中に含まれることを発見した。この際、４３０ｋＤａ付近には、免疫沈降されたｈＳＭＧ−１と思われるバンドが検出された。
【００９９】
（２）質量分析
解析用試料の１／４量をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、常法に従ってポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（イモビロンＣ；ミリポア社）に転写した。転写後の膜にクマージブリリアントブルー（ＣＢＢ）液を加えた後、素早く水につけ、洗浄した後、乾燥し、膜状に転写され、染色されたタンパク質を観察した。４３０ｋＤａと思われるバンドと、１３０ｋＤａのリン酸化タンパク質と思われるバンドが確認された。
染色された１３０ｋＤａのタンパク質（ｐ１３０）を膜からナイフで切り出し、公知の方法（例えば、岩松明彦、実験医学、Ｖｏｌ．１７、Ｎｏ．８、１９９９年、第１３５１頁〜第１３５５頁のクローズアップ実験法「質量分析計を用いたプロテオーム解析」など）に従って、膜状でタンパク質をタンパク質分解酵素Ｌｙｓ−Ｃ（リジルエンドペプチダーゼ）で完全消化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マトリックスアシステッドレーザー励起イオン化法−飛行時間型質量分析計）を用いて消化断片の質量分析を行なった。
【０１００】
その結果、表１に示す８種類のＬｙｓ−Ｃ消化断片（ＡＰ１〜ＡＰ８）の質量を決定することに成功した。公知のタンパク質一次構造データベースを検索し、８つの質量のうち、６つのタンパク質断片（ＡＰ１、ＡＰ２、ＡＰ３、ＡＰ４、ＡＰ５、及びＡＰ８）が、公知のデータベースに登録されているｃＤＮＡクローンＡＫ０２６８５８．１の翻訳産物から予想されるＬｙｓ−Ｃ消化断片と一致した。図８に、ＡＫ０２６８５８．１翻訳産物の一次構造（配列番号２で表されるアミノ酸配列）と、ＡＰ１、ＡＰ２、ＡＰ３、ＡＰ４、ＡＰ５、及びＡＰ８に対応する各配列の位置を示す。このことから、ｐ１３０がＡＫ０２６８５８．１の翻訳産物であり、ｈＳＭＧ−１結合タンパク質であることが推測された。ＡＫ０２６８５８．１翻訳産物には、既知の機能モチーフに相同性を示す部分はなかった。その一方で、ＡＫ０２６８５８．１翻訳産物に相同性が高いタンパク質をコードすると考えられる遺伝子がショウジョウバエ（ＣＧ６７２９；相同性＝４１％）及び線虫（Ｋ０４Ｂ１２．３；相同性＝４１％）にも存在しており、このタンパク質は、進化的に保存されたタンパク質であると考えられた。なお、前記相同性の数値は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｎｇｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）による。
【０１０１】
2004097029.tif 000002
【０１０２】
【実施例４】
《抗ｐ１３０抗体の調製及び発現タンパク質の解析》
（１）抗体の調製
ＡＫ０２６８５８．１ＤＮＡは、東京大学医科学研究所の菅野教授らによる全長ｃＤＮＡ塩基配列決定プロジェクトにより既に同定されていたものであり、本実施例で用いた前記ＤＮＡを含むプラスミド（ｐＭＥ１８Ｓに挿入してある）は、同教授より分与された。ＡＫ０２６８５８．１翻訳産物が実際にｈＳＭＧ−１結合タンパク質であることを確認するため、その特異抗体を開発した。
ＡＫ０２６８５８．１を含むプラスミドを制限酵素ＳｍａＩ及びＭｓｃＩで消化し、４４６塩基対のＤＮＡ断片（配列番号２で表されるアミノ酸配列における第５６３番目〜第７１０番目のアミノ酸からなる配列に対応）を取得した。このＤＮＡ断片を大腸菌発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のＳｍａＩ部位に挿入した後、大腸菌ＤＨ５株に導入した。組み換えプラスミドを有する大腸菌株を培養し、常法により、ｐ１３０タンパク質断片をＧＳＴとの融合タンパク質として精製した。精製した融合タンパク質を抗原とし、常法によりウサギ（Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ種）を免疫し、抗血清を得た。更に、抗原タンパク質を用いる常法（アフィニティー精製法）により、抗血清から特異抗体（抗ＡＫ０２６８５８．１翻訳産物抗体）を分取した。
【０１０３】
（２）ｐ１３０のＨｅＬａ細胞における発現と免疫沈降法によるｈＳＭＧ−１結合性の確認
ＨｅＬａ細胞抽出液を実施例１（１）と同様の方法により調製し、実施例３（１）と同様の方法により、正常ウサギ血清、あるいは、抗ｈＳＭＧ−１抗血清（抗血清Ｎ、抗血清Ｌ、又は抗血清Ｃ）を用いて免疫沈降した。細胞抽出液及び免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した後、常法に従って、実施例４（１）で調製した抗ＡＫ０２６８５８．１翻訳産物抗体を用いるウエスタンブロット法で解析した。
【０１０４】
結果を図９に示す。図９において、記号「ＩＰ」は免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を意味し、記号「Ｎ」、「Ｌ」、及び「Ｃ」は、それぞれ、免疫沈降において、抗血清Ｎ、抗血清Ｌ、及び抗血清Ｃを用いたことを示す。また、記号「ＷＢ」は、ウエスタンブロットの結果であることを示す。
まず、細胞抽出液に１３０ｋＤａの分子量を有するタンパク質が特異的に検出されることから、この抗体がＡＫ０２６８５８．１翻訳産物を認識することができることが判明した。また、同じ分子量を有するタンパク質が、抗血清Ｎ、抗血清Ｌ、又は抗血清Ｃのいずれで免疫沈降した場合にでも検出された。一方、正常ウサギ血清で免疫沈降した場合には、そのようなタンパク質は検出されないことから、最終的にＡＫ０２６８５８．１翻訳産物はｈＳＭＧ−１の特異的結合タンパク質であることが判明した。その分子量からｈＳＭＧ−１免疫沈降物中でリン酸化される１３０ｋＤａタンパク質であることが強く示唆される。
【０１０５】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドによれば、ナンセンス変異によりＰＴＣを生じることが原因で生じる病態の治療及び／又は予防剤の簡便なスクリーニング系を提供することができる。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、及び抗体は、本発明のポリペプチドを製造するのに有用である。
【０１０６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】抗ｈＳＭＧ−１血清（抗血清Ｃ）を用いて得られたヒトＨｅＬａ細胞抽出液の免疫沈降物について、リン酸化反応を実施した結果をオートラジオグラフィーにより示す、図面に代わる写真である。
【図２】２種類のｈＳＭＧ−１血清（抗血清Ｃ又は抗血清Ｌ）を用いて得られたヒトＨｅＬａ細胞抽出液の免疫沈降物について、リン酸化反応を実施した結果をオートラジオグラフィーにより示す、図面に代わる写真である。
【図３】ヒトＨｅＬａ細胞抽出液の陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐＱによるクロマトグラフである。
【図４】図３に示す各分画におけるヒトＳＭＧ−１の分布を示すために実施したウエスタンブロット法の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図５】図３に示す各分画のｈＳＭＧ−１血清による各免疫沈降物について、リン酸化反応を実施した結果をオートラジオグラフィーにより示す、図面に代わる写真である。
【図６】図３に示す分画２０〜３１のｈＳＭＧ−１血清による各免疫沈降物について、リン酸化反応を実施した結果をウエスタンブロットにより示す、図面に代わる写真である。
【図７】ヒトＨｅＬａ細胞抽出液の抗ｈＳＭＧ−１ＩｇＧ（Ｎ抗体）による免疫沈降物について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、銀染色した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図８】ＡＫ０２６８５８．１翻訳産物の一次構造と、ＡＰ１、ＡＰ２、ＡＰ３、ＡＰ４、ＡＰ５、及びＡＰ８に対応する各配列の位置を示す説明図である。
【図９】ヒトＨｅＬａ細胞抽出液の抗ｈＳＭＧ−１抗血清（抗血清Ｎ、抗血清Ｌ、又は抗血清Ｃ）による免疫沈降物について、抗ＡＫ０２６８５８．１翻訳産物抗体を用いるウエスタンブロットの結果を示す、図面に代わる写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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