(57)【要約】　　　（修正有）【課題】エレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）源において水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換を実施するためのシステムおよび方法を提供する。【解決手段】このシステムは、シース液が導入できるようになっているＥＳＩ源を備える液体クロマトグラフ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）を含む。得られるシステムは、シース液として、酸化デューテリウムなどの重水素化溶剤を用いるので、Ｈ／Ｄ交換実験をオンラインで実施することができる。これにより、交換可能な水素の数と位置を求め、薬剤代謝物の構造解明の助けとなる情報が直接提供される。【選択図】　　　図１
2004028993.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水素／重水素交換を実施するための方法であって、
エレクトロスプレー・イオン化源を有する液体クロマトグラフ−質量分析計の中に、個別の試料を導入することにおいて、その個別の試料が水素／重水素交換しうる化合物を含むことと、
エレクトロスプレー・イオン化源にシース液を供給することにおいて、該シース液がエレクトロスプレー・イオン化源内で該化合物と接触するとき、該化合物が水素／重水素交換をするように、該シース液が重水素化溶剤からなることとを含む方法。
【請求項２】
化合物が薬剤あるいは薬剤代謝物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
重水素化溶剤がＤ２Ｏを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
個別の試料が、水素／重水素交換をすると思われる少なくとも２種の化合物を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
水素／重水素交換による化合物のキャラクタリゼーションのための方法であって、
液体クロマトグラフのカラム中に個別の試料を導入することにおいて、その個別の試料が水素／重水素交換しうる少なくとも１種の化合物を含むこと、
該化合物を液体クロマトグラフから質量分析計のエレクトロスプレー・イオン化源内に溶出させること、および
エレクトロスプレー・イオン化源にシース液を供給することにおいて、該シース液がエレクトロスプレー・イオン化源で該化合物と接触するとき、該化合物が水素／重水素交換をするように、該シース液が重水素化溶剤からなることを含む方法。
【請求項６】
化合物を液体クロマトグラフから放射能検出器内に溶出させることをさらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１種の化合物が薬剤あるいは薬剤代謝物である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
重水素化溶剤がＤ２Ｏを含む請求項５に記載の方法。
【請求項９】
個別の試料が、水素／重水素交換をすると思われる少なくとも２種の化合物を含む請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、代謝物のキャラクタリゼーション・システムおよび方法、より詳細にはエレクトロスプレー・イオン化源をもつＬＣ−ＭＳあるいはＬＣ−ＭＳ／ＭＳに関し、これは薬剤代謝物の水素／重水素交換を検出するために使用される。
【０００２】
【従来の技術】
本出願は、２００２年３月１４日に出願の米国仮特許出願６０／３６４，３７３号の特典を請求し、あらゆる目的のために全体として参照により本明細書にこれを組み込む。
【０００３】
医薬品研究者は前臨床、臨床および商業化開発で成功する薬剤候補の数を増やすために、薬剤発見プロセスを精査し続けている。例えば、「Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　Ｄｒｕｇ　Ｒ＆Ｄ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（薬剤研究開発効率の改善）」、Ｍ．Ａ．Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，　Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ　２７５（Ｍａｒｃｈ　２６，２００１）を参照。コンビナトリアル・ケミストリにより医薬品合成化学者は、医薬品としての活性を求めて篩にかけることができる膨大な数の新しい化合的存在を生み出すことができるようになった。「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（コンビナトリアル・ケミストリ）」、Ａ．Ｃｚａｒｎｉｋ，　７０　Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．　３７８Ａ−３８６Ａ（１９９８）。しかし、医薬品産業は、コンビナトリアル法の利益を十分に得るためには、薬剤発見プロセスの他の分野を改善しなければならないということを認めている。
【０００４】
改善を要するこのような分野の１つが、薬剤発見プロセスで重要な役割をする薬剤代謝にある。「Ｒａｐｉｄ　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｐｒｏｃｅｓｓ（薬剤発見プロセスにおける薬剤代謝の迅速な評価）Ｍ．Ｂｅｒｔｒａｎｄｅｔ　ａｌ．，　１１　Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．　Ｓ６１−Ｓ７２（２０００）。開発の初期段階における薬剤代謝物の同定は、医薬品合成化学者が代謝のホット・スポット（ｈｏｔ　ｓｐｏｔ）のいくつかをブロックすることにより、より大きな半減期により明らかとなる、より代謝されにくい薬剤を生み出すことを助けることができる。したがって、薬剤代謝物の迅速な同定は薬剤開発にとってどうしても必要である。「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ　Ｐｒｅｓｓｕｒｅ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの薬剤代謝物のキャラクタリゼーションのための、液体クロマトグラフィ結合大気圧イオン化飛行時間型質量分析法の応用）」、Ｈ．Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　７２　Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．　３３４２−３３４８（２０００）；「Ｈｉｇｈｅｒ　Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ　ａｎｄ　ＦｕｔｕｒｅＴｒｅｎｄｓ（薬剤発見におけるより高速の代謝物同定処理：現在の能力と将来の方向）」、Ｋ．Ａ．Ｃｏｘ　ｅｔ　ａｌ．，　４　Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖ．　４５−５２（２００１）を参照。
【０００５】
水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換は、溶液中のタンパク質の構造、安定性、折り畳み動力学および分子間相互作用を研究するためのよく確立された技法である。「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　Ｕｓｅｓ　ｏｆ　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ（水素交換の機構と利用）」、Ｓ．Ｗ．Ｅｎｇｌａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　６　Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．　１８−２３（１９９６）。液相でのＨ／Ｄ交換の際、側鎖の、またアミド部分の不安定なプロトンは溶液から保護されておらず、一般に急速に交換する。これらの保護されていない水素の交換は、引用された研究に記載された実験条件のもとで、１秒あたり１０−１から１００回のオーダーで起こる。しかし、アミドあるいは側鎖の水素が溶液から保護されている場合（例えば、それらが構造的に安定な２次構造要素において水素結合しているとき）、交換速度がかなり低下している可能性がある。
【０００６】
Ｈ／Ｄ交換実験が核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法あるいは質量分析法（ＭＳ）のいずれかと組み合わされた方法もまたよく確立されている。「Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｏｌｄｉｎｇ　Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ：Ｎａｔｉｖｅ−Ｓｔａｔｅ　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ（タンパク質折り畳み中間体：天然状態での水素交換）」、Ｙ．Ｂａｉ，　２６９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９２−１９７（１９９５）；「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｏｌｄｉｎｇ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｂｙ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（質量分析法によるタンパク質折り畳み遷移個体数の検出）」、Ａ．Ｍｉｒａｎｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　２６２　Ｓｃｉｅｎｃｅ　８９６−８９９（１９９３）を参照。ＮＭＲ法は、Ｈ／Ｄ交換と組み合せられたとき、個々の残基あるいは各アミドの水素をモニターするのに理想的であるが、高濃度で溶解する、高純度のタンパク質あるいは代謝物に限定されている。このために、開発の発見段階では、化学的存在は限られた量でのみ入手可能であるから、薬剤および代謝物の構造的特徴が決められる可能性は大幅に低下する。
【０００７】
質量分析法を含む方法には、質量分析計の固有の感度および選択性に由来する利点がある。１９７０年代初期に、Ｈｕｎｔおよび共同研究者が、化学イオン化法（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＣＩ）の条件下では、ＣＨ３ＯＤあるいはＮＤ３を試薬ガスとして用いて、Ｈ／Ｄ交換を素早く行なうことができるということを示した。「Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ＩＩ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆＰｒｉｍａｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ，ａｎｄ　Ｔｅｒｔｉａｒｙ　Ａｍｉｎｅｓ（化学イオン化質量分析法　ＩＩ：第１級、２級、および３級アミンの区別）」、Ｄ．Ｆ．Ｈｕｎｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．　４５３９（１９７１）。後に、ＨｕｎｔとＳｅｔｈｉは、検体（ａｎａｌｙｔｅ）と試薬ガスの間のプロトン親和性の差が、化学イオン化質量分析法における交換度を決める主な因子であるということを示した。「Ｇａｓ−Ｐｈａｓｅ　Ｉｏｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ｉｓｏｔｏｐｅ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ＨｙｄｒｏｇｅｎＡｔｏｍｓ　ｉｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ　ｂｙ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（気相イオン／分子同位体交換反応：化学イオン化質量分析法による、特定の有機構造周囲環境にある水素原子を計数する方法）」、Ｄ．Ｆ．Ｈｕｎｔ　ａｎｄ　Ｓ．Ｋ．Ｓｅｔｈｉ，　１０２　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．　６９５３−６９６３（１９８０）。タンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）の衝突セルで実施された同位体交換の研究は、ＣＨ３ＯＤはフェノールおよびカルボン酸の特定の酸性水素を交換するが、アミノ水素を交換しないということを示すのに用いられた。「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｉｓｏｔｏｐｉｃ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｔａｎｄｅｍ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ（タンデム質量分析法における多官能性イオンの選択的同位体交換：方法、応用および機構）」、Ａ．Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅ　ｅｔ　ａｌ．，　２７　Ｏｒｇ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．　７７−８８（１９９２）。いくつかのプロトン化アミノ酸およびジペプチドの気相Ｈ／Ｄ交換速度論（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）もまた報告された。「Ｇａｓ−ｐｈａｓｅ　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ／Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　ａｓ　ａ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｔｈａｎｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（メタノールとプロトン化ペプチドの相互作用の分子プローブとしての、気相水素／重水素交換）」、Ｅ．Ｇａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，　５　Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．　６２３−６３１（１９９４）。
【０００８】
範囲と数は限られているが、Ｈ／Ｄ交換反応は、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、フリット−ＦＡＢ、およびサーモスプレー・イオン化法と組み合わせて構造研究に用いられてきた。「Ｄｅｕｔｅｒｉａｔｅｄ　Ｓｏｌｖｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｆａｓｔ　Ａｔｏｍ　Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（高速液体クロマトグラフィ−高速原子衝撃質量分析法における重水素化溶剤）」、Ｔ．ＭｃＬｅａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１５　Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．　１７７３−１７７５（１９９２）；「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｐｅｒｏｚｉｄｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｉｎ　Ｕｒｉｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｒａｔｓ，Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｄｏｇｓ，ａｎｄ　Ｍａｎ　ｂｙ　Ｆｒｉｔ−ＦＡＢ　ＬＣ／ＭＳ　ｕｓｉｎｇ　Ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ　Ｓｏｌｖｅｎｔｓ　ｔｏ　Ｇａｉｎ　Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（さらなる構造情報を得るための、重水素化溶剤を用いるフリット−ＦＡＢ　ＬＣ／ＭＳによるラット、イヌ、およびヒトの尿におけるａｍｐｅｒｏｚｉｄｅ代謝物の同定）」、Ｐ．Ｏ．Ｅｄｌｕｎｄ，３０　Ｊ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．　１３８０−１３９２（１９９５）；「Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ａ　Ｔｈｅｒｍｏｓｐｒａｙ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（サーモスプレー質量分析計インターフェースを利用する水素−重水素交換の研究）」、Ｍ．Ｍ．Ｓｉｅｇｅｌ，６０　Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．　２０９０−２０９５（１９８８）；および「Ｔｈｅｒｍｏｓｐｒａｙ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ｉｎ　Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　Ｏｘｉｄｅ（酸化ジュウテリウム中のサーモスプレー液体クロマトグラフィ／質量分析法）」、Ｃ．Ｇ．Ｅｄｍｏｎｄｓ　ｅｔ　ａｌ．，　６０　Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．　２３１４−２３１７（１９８８）を参照。
【０００９】
エレクトロスプレー・イオン化法（ＥＳＩ）源をもつ質量分析計を含む、水素／重水素交換の研究は比較的新しい。ＫａｔｔａとＣｈａｉｔによる初期の研究は、ＥＳＩ質量スペクトルにおけるタンパク質の荷電状態分布は、ある程度、溶液中のタンパク質のプロトン化の度合いを反映しており、またそのために溶液中のタンパク質のコンホメーション変化を研究するために、ＥＳＩスペクトルを利用することができるということを示した。「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｐｒｏｂｅｄ　ｂｙ　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ−Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（水素交換エレクトロスプレー・イオン化質量分析法によりプローブされる、タンパク質のコンホメーション変化）」、Ｖ．Ｋａｔｔａ　ａｎｄ　Ｂ．Ｔ．Ｃｈａｉｔ，　５　Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．　２１４−２１７（１９９１）；Ｈｙｄｒｏｇｅｎ／Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ａ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｂｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（水素／重水素交換エレクトロスプレー・イオン化質量分析法：溶液中のタンパク質のコンホメーション変化をプローブする方法）」、Ｖ．Ｋａｔｔａ　ａｎｄ　Ｂ．Ｔ．Ｃｈａｉｔ，　１１５　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．　６３１７−６３２１（１９９３）。
【００１０】
この技法は後に、組換えタンパク質薬剤を含む品質管理研究、シャペロンタンパク質の折り畳み、リガンド−結合研究、および新規タンパク質のコンビナトリアル・ライブラリのスクリーニングに拡張された。「Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｒｕｇｓ：Ａ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｉｎｓｕｌｉｎ　ｂｙ　Ｈ／Ｄ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　ａｎｄ　Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（組換えタンパク質薬剤のモニタリング：Ｈ／Ｄ交換とエレクトロスプレー・イオン化質量分析法によるインシュリンの研究）」、Ｒ．Ｒａｍａｎａｔｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．　６９　Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．　５１４２−５１４５（１９９７）；「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧｒｏＥＬ−ｂｏｕｎｄ　α−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｍ　Ｐｒｏｂｅｄ　ｂｙ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（質量分析法によりプローブされた、ＧｒｏＥＬ結合α−ラクトアルブミンのコンホメーション）」、Ｃ．Ｖ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　３７２　Ｎａｔｕｒｅ　６４６−６５１（１９９４）；「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ　Ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ−Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（重水素交換−エレクトロスプレー・イオン化質量分析法により研究されたチトクロームｃのコンホメーション）」、Ｄ．Ｓ．Ｗａｇｎｅｒａｎｄ　Ｒ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｅｇｇ，　６６　Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．　７０６−７１０（１９９４）；および「Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　ｏｆ　ｄｅ　Ｎｏｖｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｂｙ　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　ａｎｄ　Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（水素−重水素交換およびエレクトロスプレー質量分析法による、新規（ｄｅ　ｎｏｖｏ）タンパク質コンビナトリアル・ライブラリのスクリーニング）」、Ｄ．Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ　ｅｔ　ａｌ．，　１２１　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．　９５０９−９５１３（１９９９）を参照。さらに、Ｈ／Ｄ交換法は多価プロトン化気相タンパク質のコンホメーションの違いを研究するためにも拡張された。「Ｐｒｏｂｉｎｇ　Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｍｕｌｔｉｐｌｙ　Ｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ　Ｇａｓ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｖｉａ　Ｈ／Ｄ　Ｉｓｏｔｏｐｉｃ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｗｉｔｈ　Ｄ２Ｏ（Ｄ２Ｏを用いるＨ／Ｄ同位体交換による、多価プロトン化気相タンパク質の、定性的なコンホメーションの違いのプロービング）」、Ｂ．Ｅ．Ｗｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　１１４　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．　５８９７−５８９８（１９９２）。
【００１１】
しかし、ＥＳＩ／ＭＳとして報告されているこれらの方法は、薬剤発見プロセスでは通常、迅速で高感度の、代謝物のオンライン同定方法が必要とされるために、医薬品産業で用いるのには適していない。この欠点を改善する最近の試み限られた成功を収めた。例えば、研究者等はＮＤ３をネブライザあるいはカーテン・ガスとして用い、ＥＳＩで形成されたイオンの構造解明のために、Ｈ／Ｄ交換を実行できる可能性を示した。「Ｇａｓ　Ｐｈａｓｅ　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ／Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ａｓ　ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ（構造解明の実用的手段としての、エレクトロスプレー・イオン化質量分析法における気相水素／重水素交換）」、Ｍ．Ｅ．Ｈｅｍｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　５Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．　４３４−４４２（１９９４）。しかし、この研究は精製試料の質量分析計への注入に限られた。さらに、タンデム質量分析法による情報を得るために、この方法が有用であることは示されなかった。他の研究にも同様の欠点があった。例えば、「ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ　ａｓ　ａ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒａ　ｉｎ　ＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＭｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（エレクトロスプレー・マイクロカラム液体クロマトグラフィ−質量分析法における質量スペクトルの改良のための試薬としての酸化デューテリウム）」、Ｋ．Ｅ．Ｋａｒｌｓｓｏｎ，　６４７　Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．　３１−３８（１９９３）を参照。
【００１２】
最近、研究者達は、オンラインＨ／Ｄ交換実験により薬剤代謝物の同定が容易になるように、ＬＣ移動相として酸化デューテリウムを用いた。「Ｕｓｅ　ｏｆＯｎ−Ｌｉｎｅ　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ／Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　Ｅｘｃｈａｎｇｅｔｏ　Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（代謝物同定を容易にするためのオンライン水素／重水素交換の利用）」、Ｄ．Ｑ．Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，　１５　Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．　１８３２−１８３９（２００１）；および「Ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　Ｕｓｉｎｇ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｔａｎｄｅｍ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析法を用いる薬剤代謝の研究における、水素／重水素交換法の有用性）」、Ｎ．Ｏｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１８　Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．　３２５−３３４（１９９８）を参照。しかし、この技法では、Ｄ２Ｏ中で全ての試料を調製すること、ならびに重水素化バッファおよび移動相を用いることが必要とされたので、迅速な代謝物の同定に、この技法は実用的ではなかった。今日まで、薬剤代謝物のキャラクタリゼーションのための、ＥＳＩに基づくオンラインＨ／Ｄ交換あるいは類似の実用的な方法は依然として知られていない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、高圧液体クロマトグラフィ−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）あるいはＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて水素／重水素交換を検出して、検体、例えば薬剤代謝物のキャラクタリゼーションをオンラインでおこなう方法を提供する。本発明はそれを薬剤の発見のために特に有用にしている数々の利点を提供する。例えば、完全にオンラインでこの技法を実施することができる−従来の技法と異なり、特許請求された方法は、重水素化された溶剤を含む、時間がかかり労力を要する試料の調製を必要としない。そうではなく、ｉｎ　ｖｉｖｏあるいはｉｎ　ｖｉｔｒｏでの研究による個別の試料が、ＬＣ−ＭＳあるいはＬＣ−ＭＳ／ＭＳのＨＰＬＣ部分に導入され、結果として質量スペクトルが得られ、これを水素／重水素交換が起こったかどうかを決めるために用いることができる。さらに、特許請求された方法は重水素化された移動相をもつＨＰＬＣを用いる必要がない。これは重水素化溶剤の使用をできるだけ少なくする助けとなる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
こうして、本発明の一態様においては、水素／重水素交換を実施する方法が提供される。この方法には、個別の試料を、エレクトロスプレー・イオン化源をもつ液体クロマトグラフ−質量分析計に導入することが含まれる。個別の試料は水素／重水素交換をするであろう化合物（すなわち、この化合物は交換可能な水素をもつ）を含む。この方法にはまた、エレクトロスプレー・イオン化源にシース液（ｓｈｅａｔｈ　ｌｉｑｕｉｄ）を供給することも含まれる。このシース液は、シース液がエレクトロスプレー・イオン化源で化合物と接触するとき、この化合物が水素／重水素交換をするように、重水素化溶剤を含む。
【００１５】
本発明の別の態様においては、水素／重水素交換により化合物のキャラクタリゼーションをおこなう方法が提供される。この方法には、個別の試料を液体クロマトグラフのカラムに導入することが含まれ、個別の試料は水素／重水素交換をするであろう少なくとも１種の化合物を含む。この方法にはまた、前記化合物を液体クロマトグラフから、質量分析計のエレクトロスプレー・イオン化源に溶出させること、およびエレクトロスプレー・イオン化源にシース液を供給することが含まれる。このシース液は、シース液がエレクトロスプレー・イオン化源で化合物と接触するとき、この化合物が水素／重水素交換をするように、重水素化溶剤を含む。
【００１６】
本発明の様々な特徴、利点および他の使用法が、以下の説明および図を参照することによりより明らかとなるであろう。
【００１７】
【発明の実施の形態】
図１は、水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換を用いて、薬剤代謝物のキャラクタリゼーションを迅速におこなうためのオンライン・システム１０の概略図である。図１に示されるように、システム１０は、高圧液体クロマトグラフ１２（ＨＰＬＣ）、質量分析計１４（ＭＳ）、および任意選択でフロー・スルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）放射能検出器１６を含む。与えられた試料の成分（すなわち、代謝物）を分離する、システム１０のＨＰＬＣ１２の部分は、入口２０および出口２２をもつ分離カラム１８を含む。入口２０および出口２２はそれぞれ、１台または複数のポンプ２４（例えば、往復動ピストンポンプ、シリンジ・ポンプ、定圧ポンプなど）、および任意選択の検体検出器２６と、第１の導管２８および第２の導管３０を通じて連通している。ＨＰＬＣ１２は、ガード・カラム３２を含み、これは分離カラム１８の入口２０に隣接している。ガード・カラム３２は、分離カラム１８を詰まらせるかもしれない、試料中の何らかの粒子を濾過して除くか、あるいは代謝物の分離の障害となりうる、試料中の何らかの化合物を除去する。
【００１８】
図１に示されるＨＰＬＣ１２はまた、任意選択でオートサンプラー３４を含み、これは、試料ループ（示されていない）により、カラム１８、３２およびポンプ２４と連通している。オートサンプラー３４は通常、例えば１枚または複数の標準マルチウェル・プレートに、あるいは別々のバイアルに収容された複数の試料を含む。オートサンプラーは典型的には、１本あるいは複数のコンピュータ制御シリンジあるいは類似の注入装置を含み、これらは、３−Ｄロボット・アームなどの移行運動機構上に装着されている。このように、異なる試料を試料ループに、またそれ故ガード３２および分離１８カラムに周期的に注入するように、オートサンプラー３４をプログラムすることができる。他の実施形態では、手動注入バルブおよび試料ループが利用でき、これは、第１導管２８により、分離カラム入口２０と連通している。
【００１９】
システム１０の運転中、ポンプ２４は分離カラム１８にキャリア溶剤（すなわち、移動相）を連続的に供給し、移動相は試料をオートサンプラー３４（あるいは他の試料注入装置）からガード３２および分離１８カラムへ、またそれらを通して移送する。各代謝物は移動相および固定相（すなわち、カラム・パッキング）と異なる相互作用をするので、個々の代謝物は異なる時間で分離カラム出口２２から出る。移動相は分離された代謝物を、カラム出口２２から、第２の導管３０を通し、そして検体検出器２６へと移送し、この検出器は、移動相の特性変化を検出することにより（例えば、紫外あるいは可視光吸収、屈折率変化など）、代謝物あるいは薬剤物質の通過を感知する。検体を分離する困難さに応じて、移動相の組成を運転中一定にするか（すなわち、一定組成溶離）、あるいは経時的に変えること（すなわち、勾配溶離あるいは混合モード溶離）ができる。さらに、ＨＰＬＣ１２は、代謝物の極性、大きさ、および固定相上に固定されている化合物への特殊なアフィニティの違いを含む多くの異なる原理に基づいて代謝物を分離する、移動および固定相の組合せを用いることができる。
【００２０】
図１に示される実施形態において、移動相および個々の代謝物（溶出物）は、検体検出器２６を出て、溶出物をフロー・スプリッタ・バルブあるいは第１のＴ字管３８へ導く第３の導管３６を通る。第１のＴ字管３８は溶出物を第４の導管４０および第５の導管４２に向け、これらはそれぞれ溶出物を、質量分析計１４とフロー・スルー放射能検出器１６に導く。第１のＴ字管３８により、第４の導管４０と第５の導管４２を通る流量の比を変えることができ、これらは移動相の流量と同様、システム１０の運転中通常は一定に保たれる。移動相の流量は、大きさ（内径）ならびにガード３２および分離１８カラムの性質（カラム・パッキング）、代謝物の分離し易さなどを含む多くの要因に依存し、約１０−１ｍＬ／ｍｉｎから約１０１ｍＬ／ｍｉｎの範囲とすることができる。さらに、質量分析計１４と放射能検出器１６への流量の比は、約０．１から約０．９の範囲とすることができる。したがって、移動相流量が約１ｍＬ／ｍｉｎであると言われる場合、様々な運転において、ＭＳ１４に入る溶出物の流量は、約０．１ｍＬ／ｍｉｎから約０．９ｍＬ／ｍｉｎの範囲内であってよいが、ＭＳ１４に入る流量は、通常は、約０．２ｍＬ／ｍｉｎと約０．３ｍＬ／ｍｉｎの間の範囲にあるであろう。
【００２１】
図１に示される質量分析計１４は、標準のエレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）源４４を含み、これは通常の質量分析計４６（例えば、１連または複数の４重極、イオン・トラップなど、および検出器）に連結している。図１には示されていないが、質量分析計１４はまたコンピュータ化されたデータ取得および処理システムを含み、これを、質量スペクトルを生成させる以外にも、ＨＰＬＣ検体検出器２６および放射能検出器１６からのデータを記録するのに用いることもできる。別の実施形態においては、ＨＰＬＣ検体検出器２６および放射能検出器１６からのデータを取得および処理するための別のシステムを利用してもよい。
【００２２】
ＥＳＩ源のデザインは販売者によりいくらか異なることがあるが、それらは通常、一対の同軸円柱チューブを含み、これらはそれぞれ異なる電位に保たれている。イオンを生成させるために、ＥＳＩ源が、検体および溶剤からなる液体を、中心チューブあるいはキャピラリ（ノズル）を通して方向づける。液体はノズルの先端から出てくるとき、同軸チューブの間に存在する電位のために、荷電した液滴に分割される。液滴がノズルの先端から離れる方向に飛行するにつれ、それらは溶剤の蒸発により大きさが小さくなり、このために各液滴の表面の電荷密度が増加する。増加する電荷密度により、液滴は最終的により小さい液滴へと分割され、それぞれの液滴は元の液滴より少ない電荷をもつ。このプロセスが繰り返され、終には個々の検体イオンが生成する。エレクトロスプレー・イオン化プロセスの達成結果を改善するために、多くのＥＳＩ源では、同軸円柱チューブの間の環状部分にシース液を導入できるようになっており、その後この液体はノズルの先端の下流で、検体および溶剤と接触する。
【００２３】
こうして、システム１０の運転中、第４の導管４０でＨＰＬＣ流出物をＥＳＩ源４４のノズルに送りながら、ポンプ４８で、１種または複数の重水素化溶剤からなるシース液を連続的にＥＳＩ源４４に供給する。重水素化溶剤およびＨＰＬＣ１２からのＨＰＬＣ溶出物は、ノズルの先端の下流で１秒の何分の１の間（例えば、１０−１ｓの間）だけ互いに接触することができるが、驚くべきことに、代謝物と重水素化溶剤はかなりの水素／重水素交換をする。実施例に示されるように、代謝物（および薬剤）について得られた質量スペクトルに、この交換を認めることができ、それでこれを代謝物のキャラクタリゼーションに用いることができる。シース液ポンプ４８は、ＨＰＬＣポンプ２４と同じ、あるいは異なるタイプのものであってもよく、ＥＳＩ源４４に入る、シース液とＨＰＬＣ溶出物の流量の比は、ほぼ１あるいはそれ以上である。ＨＰＬＣ移動相からの溶剤とシース液は、第６の導管５０を通してＭＳ１４を出て、適当な廃棄物あるいは再利用物として集められる。
【００２４】
シース液は、質量分析計に適合し、十分に水素／重水素交換が起こると思われる何らかの重水素化溶剤を含むことができる。このような重水素化溶剤には、限定はしないが、Ｄ２Ｏ、ＣＤ３ＯＤなどを含めることができる。酸化デューテリウムは特に有用であると思われる。シース液は、代謝物のキャラクタリゼーションの際、ＨＰＬＣ溶出物の性質を少し変えるさらなる成分を含んでいてもよいが、通常それは、水素／重水素交換交換が最もよく起こるようにするために、重水素化溶剤のみを含む。
【００２５】
前記のように、第５の導管４２は、ＨＰＬＣ溶出物の一部分を任意選択の放射能検出器１６に送る。何らかの適当な放射能検出器を用いることができるが、図１に示される実施形態では、シンチレーション計数管が用いられている。こうして、システム１０は第２のＴ字管５２を含み、これにより液体シンチレーション剤あるいはカクテルの添加が可能となる。放射能の減衰が起こるとき、シンチレーション剤が光を発生し、この光がシンチレーション計数管により検出される。シンチレーション・カクテルは、第１のＴ字管３８の下流で添加されるので、第５の導管４２はインライン逆止弁５４を含み、これは第３の導管３６および第４の導管４０への逆流を防ぐ。使用済みのＨＰＬＣ流出物およびシンチレーション剤は、第７の導管５６を通って放射能検出器１６を出ていく。放射能検出器に入る、シンチレーション剤とＨＰＬＣ溶出物の流量の比は、とりわけ、用いられるシンチレーション・カクテルの種類およびＨＰＬＣ溶出物の性質に依存するであろう。一般に、その比は約２から約４の範囲であり、典型的には、比は３である。
【００２６】
【実施例】
本明細書に記載されたシステム１０および方法の有用性を例示するために、以下の実施例では、マトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）インヒビターとして知られるＰＤ　０２００１２６の代謝物における水素／重水素交換を調べる。
【化１】
2004028993.tif 000003
式Ｉにおいて、「＊」は放射能標識の位置を表す。マトリックス・メタロプロテアーゼは、コラーゲンなどの細胞外マトリックス成分の分解を担う一群の亜鉛含有酵素である。ＭＭＰの役割は完全には理解されていないが、それらは、炎症を含む広範な血管疾患、平滑筋細胞の遊走、および血管レジオン（ｌｅｇｉｏｎ）の病因に関与していた。例えば、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ａ　Ｓｅｒｉｅｓ　ｏｆ　Ｐｏｔｅｎｔ，Ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ　Ａｖａｉｌａｂｌｅ　ＢｉｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅＭａｔｒｉｘ　Ｍｅｔａｌｌｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（一連の、強力で系統的に入手可能なビフェニルスルホンアミド・マトリックス・メタロプロテイナーゼ・インヒビターの構造−活性の関係および薬物動態論的解析）」、Ｐ．Ｍ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　４３　Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．　１５６−１６６（２０００）を参照。
【００２７】
後で記載されるように、ＰＤ　０２００１２６およびその代謝物の質量スペクトルが、ＥＳＩ源とイオン・トラップ質量分析計をもつ、ＬＣ−ＭＳあるいはＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて得られた。各実施例では、Ｈ２ＯあるいはＤ２Ｏがシース液として用いられ、得られた質量スペクトルは代謝物の同定の助けとなるように比較された。しかし、開示されたオンライン・システム１０および方法の有用性は、ＰＤ　０２００１２６、他のＭＭＰインヒビター、あるいはそれらの代謝物のキャラクタリゼーションに限定されないということは明らかである。そうではなく、水素／重水素交換が起こりうる、如何なる薬剤あるいは薬剤代謝物の迅速なキャラクタリゼーションにも、開示されたシステムおよび方法を広く利用することができる。
【００２８】
実験
ＰＤ　０２００１２６
放射能標識化マトリックス・メタロプロテアーゼ・インヒビター、２−（４’−ブロモ−ビフェニル−４−スルホニルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−メチル−ブチルアミド（［１４Ｃ］ＰＤ　０２００１２６）および提案された代謝物Ｍ８（ＰＤ　０４０８２０８）、Ｍ９（ＰＤ　０１６９４６９）およびＭ１０（ＰＤ　０３０７４４２）が、Ｐｆｉｚｅｒ　Ｇｌｏｂａｌ　Ｒｅｓｅａｃｈ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ（Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、ミシガン州）で、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ等の文献に記載された手順に従って合成され、ＮＭＲ、ＬＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより確認された。
【００２９】
ｉｎ　ｖｉｖｏでの研究
血漿試料を得るために、３００ｍｇ／ｋｇのＰＤ　０２００１２６を経口投与した後の様々な時点で、ウサギの血液を収集した。１容積の血漿に対して３容積のアセトニトリルを添加することにより、血漿を沈澱させ、次に遠心した。得られた上清をデカンテーションで取り出し、乾燥し、次に、ＨＰＬＣに注入する前に移動相溶剤（後に記載）で再び溶液にした。１００μＬのアリコートを各実験（運転）で注入した。
【００３０】
ｉｎ　Ｖｉｔｒｏでの研究
提案された代謝物Ｍ２（ＰＤ　０２００１２６−グルクロニド）が、［１４Ｃ］ＰＤ　０２００１２６とイヌ肝細胞との１８０分間のインキュベーションの後、生成した。
【００３１】
試薬
ＨＰＬＣグレードの溶剤をＭａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ　Ｂａｋｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｐａｒｉｓ、ケンタッキー州）から購入した。水を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｍｉｌｌｉ−Ｑｐｌｕｓ水精製システム（Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）を用いて精製した。Ｕｌｔｉｍａ　Ｆｌｏ　Ｍシンチレーション・カクテルをＰａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ．（Ｍｅｒｉｄａｎ、コネチカット州）から購入した。ＰＤ０２００１２６の２．０ｎｇ／μＬの保存溶液をメタノールで調製し、分析のために２００ｎｇの各検体標準を注入した。
【００３２】
装置と条件
ポンプ、オートインジェクタ、およびＵＶ検出器を含む、Ａｇｉｌｅｎｔ　１１００　ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、デラウェア州）を、代謝物を分離するために用いた。代謝物の分離を、Ｍｅｔａｓｉｌ　ＡＱガード・カラム（Ｍｅｔａｃｈｅｍ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、カルフォルニア州）および１５０ｍｍｘ４．６ｍｍのＭｅｔａＣｈｅｍ　Ｐｏｌａｒｉｓ　Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣカラム（Ｍｅｔａｃｈｅｍ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。移動相は、酢酸でｐＨ４に調節した２０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（溶剤Ａ）およびアセトニトリル（溶剤Ｂ）を含み、各運転中ずっと一定の流量（１ｍＬ／ｍｉｎ）に保たれた。代謝物の勾配溶離を、０、４０、５０、６０、および７５分で、溶剤Ａ／Ｂの比をそれぞれ９５／５、５０／５０、２５／７５、５／９５、および９５／５とする、プログラムされた、段階的な変化を用いて実施した。
【００３３】
ＵＶ検出器（２８０ｎｍ）通過後、ＨＰＬＣ流出物を分割し、２０％〜３０％の流れを、質量分析計に備わるＥＳＩ源を通して質量分析計に導入し、他方７０％〜８０％を放射能検出器（β−ＲＡＭ、ＩＮ／ＵＳ、Ｔａｍｐａ、フロリダ州）に向けた。ＭＳシグナルと共に、ＵＶ検出器からのアナログ出力を、質量分析計に備わるデータ・システム（Ｘｃａｌｉｂｕｒ　Ｖ１．２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）にリアル・タイムで記録した。別のソフトウァ・プログラム（Ｗｉｎ−Ｆｌｏｗ　Ｖ１．５、ＩＮ／ＵＳ、Ｔａｍｐａ、フロリダ州）を、β−ＲＡＭを制御し、β−ＲＡＭのアナログ出力を収集するために用いた。代謝物および変化していない薬剤についての、半定量的情報を得るためにβ−ＲＡＭのデータを積分した。放射能検出器とＭＳの間の応答の遅れは、０．２ｍｉｎ〜０．４ｍｉｎであり、ＭＳの応答が先に記録された。
【００３４】
Ｈ２ＯあるいはＤ２Ｏのいずれかであるシース液を、ＰＥ　Ｓｅｒｉｅｓ　２００ポンプ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、コネチカット州）により、０．２ｍＬ／ｍｉｎあるいは０．４ｍＬ／ｍｉｎの一定流量で送った。ＬＣ−ＭＳ（スキャン範囲１００〜１１００Ｄａ）およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験を、ＥＳＩ源を備えるイオン・トラップ質量分析計（ＬＣＱ−Ｄｅｃａ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｎｎｉｇａｎ、Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）を用いて実施した。それぞれの運転の際には、スプレー電圧を４５００Ｖ、キャピラリ温度を３００℃、シース・ガス（Ｎ２）流量をフル・スケールの８０％、また補助ガス（Ｎ２）流量をフル・スケールの２０％として、ＥＳＩを負イオン化モードで操作した。イオン・トラップ質量分析計を用いて実施された全てのＬＣ−ＭＳ／ＭＳの運転では、ヘリウムを４０ｐｓｉｇの一定圧力に保ち、ダンピング（ｄａｍｐｉｎｇ）ガスならびに衝突ガスとして用いた。すべてのＬＣ−ＭＳｎ実験で、前駆体の単離ウィンドウを１ａｍｕに設定し、活性化振幅（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）（％）、活性化Ｑおよび活性化時間（ｍｓ）をそれぞれ、３５、０．２５、および３０に設定した。通常、１０〜１５スキャンのシグナル平均をとって最終のＭＳあるいはＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。
【００３５】
全ての研究された薬剤候補および代謝物の構造、ならびに各化学的存在に付随する交換可能な水素の数が表１に列挙されている。これら代謝物の構造の解明が、水素／重水素交換を用いる、また用いないフル・スキャンのＬＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより達成された。
【表１】
2004028993.tif 000004
【００３６】
実施例１．　ＬＣ−ＭＳを用いる、ＰＤ　０２００１２６の構造の解明
図２Ａは、オフラインＨ／Ｄ交換、重水素化移動相を用いるＨＰＬＣ分離、およびＤ２Ｏシース液を用いるＥＳＩを利用した、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示し、図２Ｂは、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を利用した、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示し、図２Ｃは、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を利用した、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示す。用いられたＬＣ−ＭＳの条件（１ｍＬ／ｍｉｎのＨＰＬＣ移動相流量、０．２ｍＬ／ｍｉｎのＥＳＩシース液流量）のもとで、ＰＤ　０２００１２６は３８．６分で溶出し、７９Ｂｒおよび８１Ｂｒを含む脱プロトン化分子（［Ｍ−Ｈ］−）はそれぞれ、ｍ／ｚが４２５および４２７で検出された（図２Ｃ）。Ｄ２Ｏをシース液として用いたとき（０．２ｍＬ／ｍｉｎ）、最も高強度の同位体エンベロープは、ｍ／ｚが４２７および４２９に、２Ｄａだけシフトすることが認められた（図２Ｂ）。質量スペクトルで強度が最大の、ｍ／ｚが４２７のピークは、交換可能なプロトン（すなわち、Ｏ、ＮおよびＳなどのヘテロ原子上の水素）の最大数が置換され、イオン化に伴いデューテリウムが除去されることに関連づけられた。ｍ／ｚが４２７および４２９のイオンは、観察された同位体クラスター・イオンの間では高強度であるが、ｍ／ｚが４２６および４２８のイオンが検出されたことは、完全には交換が進んでいないということを示している。
【００３７】
Ｈ／Ｄ交換の後、ｍ／ｚが４２５のイオンは存在しないか、あるいは無視しうる量しか存在しないということは（図２Ｂ）、ＰＤ　０２００１２６は、３個の活性水素のうち、少なくとも２個が置換されるまで交換を受けているということを示唆している。キャピラリ電気泳動−質量分析法を含むＨ／Ｄ交換の研究で解明されるように、交換速度あるいは逆交換のいずれかに、不完全な交換を関連づけることができる。「Ｈｙｄｒｏｇｅｎ／Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｕｓｉｎｇ　ａ　Ｃｏａｘｉａｌ　Ｓｈｅａｔｈ−Ｆｌｏｗ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｆｏｒ　Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ／Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（キャピラリ電気泳動／質量分析法で同軸シース・フロー・インターフェースを用いる水素／重水素交換）」、Ｍ．Ｅ．Ｐａｌｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　１４　Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．　８０８−８１７（２０００）を参照。別の言い方をすると、交換可能な水素が同じように活性でなければ、最も活性な水素のみが交換を受け、こうしてプロセスの速度を限られたものにする。他方、逆交換もまた、溶剤中のＨ２Ｏの存在あるいは不適切な量のＤ２Ｏのために、不完全な交換に寄与しうる。
【００３８】
不完全なＨ／Ｄ交換に関連するこれら２つの要因を追求し、それらが構造の解明にどう影響しうるかを評価するために、本発明者等は、シース液によるＨ／Ｄ交換プロセスについて、系統的な評価をおこなった。最初に、シース液の流量がＨ／Ｄ交換に及ぼす影響が評価された。シース液の流量を０．２から０．４ｍＬ／ｍｉｎに増やして、ＥＳＩ源の重水素の理論的原子％を６２％（＝０．２／（０．１２５＋０．２）ｘ１００、ここで０．１２５は４０分頃にこの源に入る緩衝水溶液の見積もられた流れであり、０．２はＤ２Ｏシース液の流量である）から７２％（＝０．４／（０．１２５＋０．４））に増加させた。「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　ｂｙ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｆｏｒ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｂｙ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（質量分析法による測定のための、交換による重水素の導入）」、Ｊ．Ａ．ＭｃＣｌｏｓｅｋｙ，　１９３　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　３２９−３３８（Ｊ．Ａ．ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ　ｅｄ．，　１９９０）を参照。しかし、ＥＳＩ源の重水素の原子％を増やしても、同位体クラスター・パターンに顕著な変化は起こらず、少なくともある最低基準値を越えれば、シース液として送られるＤ２Ｏの量は、Ｈ／Ｄ交換の達成度には実質的に影響がないということを示唆している。
【００３９】
実験で組み込まれたＤの％を確認し、理論値６２％〜７６％と比較し、また交換可能な水素の数を計算するために、ＭｃＣｌｏｓｅｋｙおよび共同研究者により記載された段階的な方法を用いた。すでに引用されたＭｃＣｌｏｓｋｅｙによる文献、および「Ｆａｓｔ　Ａｔｏｍ　Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ（水素−重水素交換の後の高速原子衝撃質量分析法）」、Ｓ．Ｖｅｒｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　５８　Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．　２８９８−２９０２（１９８６）を参照。交換前に得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトル（図２Ｃ）は、ｍ／ｚが４２５、４２６、４２７、４２８および４２９のピークがそれぞれ、３９．３、８．２、４１．１、８．５および２．９％の相対強度をもつということを示した。ＥＳＩ源での交換の後では、ｍ／ｚが４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０および４３１の同位体クラスター・イオンがそれぞれ、１．１、１０．７、３３．３、１４．６、３２．８、５．９および１．６％の相対強度で検出された。ＭｃＣｌｏｓｋｅｙおよび共同研究者により記載された方法を用いた計算により、ＰＤ　０２００１２６では２個が交換され、実験的に求められたＤの組込み％は５０％より小さいということが示された。この計算は複数同位体元素の存在のために複雑であるが、結果は、ＤＳＩ源でのＨ／Ｄ交換は速度により制限されているようであるということを示した。
【００４０】
交換速度および逆交換の影響をさらに評価するために、２００μＬのＰＤ　０２００１２６標準と８００μＬのＤ２Ｏとの２４時間のインキュベーションをおこない、Ｄ２Ｏシース液と共に重水素化移動相を用い、ＬＣ−ＭＳ実験を繰り返した。同位体クラスター・パターン（図２Ａ）では、ｍ／ｚが４２６のイオンが少なくなっており、Ｈ／Ｄ交換がＥＳＩ源でのみ起こった前の実験に比べて、交換がより完全に近い所まで進んでいるということを示している。さらに、この実験により、ＥＳＩ源でのシース液によるＨ／Ｄ交換は速度により制限されているようであり、オフラインでの溶剤交換より非効率であるということが確認された。しかし、以前に記載されたオンライン型Ｈ／Ｄ交換法に比べて、代謝物の交換可能な水素に関する情報が容易に得られるようにすることができる。「Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｏｎ−Ｌｉｎｅ　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ／Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｔｏ　Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（代謝物の同定を容易にするための、オンライン水素／重水素交換の利用）」、Ｄ．Ｑ．Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，　１５　Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．　１８３２−１８３９（２００１）；および「Ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　Ｕｓｉｎｇ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｔａｎｄｅｍ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析法を用いる、薬剤代謝物の研究における、水素／重水素交換法の有用性）」、Ｎ．Ｏｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１８　Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．　３２５−３３４（１９９８）と比較。
【００４１】
実施例２．　７９Ｂｒを含む分子の単離を伴うＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いる、ＰＤ　０２００１２６の構造の解明
図３Ａは、オフラインＨ／Ｄ交換、重水素化移動相を用いるＨＰＬＣ分離、およびＤ２Ｏシース液を用いるＥＳＩを用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（７９Ｂｒを含む脱プロトン化分子のＭＳによる単離）により得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示し、図３Ｂは、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（７９Ｂｒを含む脱プロトン化分子のＭＳによる単離）により得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示し、図３Ｃは、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（７９Ｂｒを含む脱プロトン化分子のＭＳによる単離）により得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示す。最初の実験は、酢酸でｐＨ４に調節された、２０ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液（溶剤Ａ）およびアセトニトリル（溶剤Ｂ）からなる移動相（１ｍＬ／ｍｉｎ）ならびにＨ２ＯあるいはＤ２Ｏからなるシース液（０．２ｍＬ／ｍｉｎ）を用いて実施された。この１組の実験では、Ｈ／Ｄ交換はＥＳＩ源でのみ可能であった。図３Ｃと図３Ｂで、シース液としてそれぞれＨ２ＯとＤ２Ｏを用いて得られた、生成イオン（ｐｒｏｄｕｃｔ−ｉｏｎ）スペクトルが比較される。
【００４２】
別の１組の実験が、酢酸でｐＨ４に調節された、２０ｍＭの酢酸アンモニウムＤ２Ｏ溶液（溶剤Ａ）およびアセトニトリル（溶剤Ｂ）からなる移動相（１ｍＬ／ｍｉｎ）を用い、またシース液（０．２ｍＬ／ｍｉｎ）としてＤ２Ｏを用いて実施された。この１組の実験では、ガードおよび分離カラムに注入される前にＨ／Ｄ交換が起こりえて、また移動相としてＤ２Ｏを用いることにより、Ｄの組み込み％が増加した（図３Ａ）。図３Ｂおよび図３Ｃの比較により、ＥＳＩ源ではＨ／Ｄ交換が完全には進んでいなかったということが示される。オフラインでのＨ／Ｄ交換の後に得られたＭＳ／ＭＳスペクトルで、ｍ／ｚが２４９、２９７、３１２および３８２のフラグメント・イオンが存在しないということは（図３Ａ）、Ｈ／Ｄ交換が完全に進み、また用いられた実験条件のもとで、利用できるＤの％は、交換がＥＳＩ源でのみ起こった場合に利用できる、６２％〜７６％の重水素より大きかったということを示している。さらに、逆交換は、オフライン溶剤交換法では限られているか、あるいは起こらなかった。しかし、オフライン法は、代謝物を早期に同定するために、迅速な情報が求められている場合、多大な労力を要し実用的でない。
【００４３】
ｍ／ｚが２４９、２９７、３１２および３８２のフラグメント・イオンの存在は、ＭＳ／ＭＳで単離された、ｍ／ｚが４２７の前駆体イオンのいくつかが、８１Ｂｒ−ＰＤ　０２００１２６からのものであることを示しており、ｍ／ｚが２４７、２９５、３１１および３８０の高強度イオンの存在は、ＭＳ／ＭＳで選択された、ｍ／ｚが４２７のイオンのほとんどが、３個の重水素置換を受けた７９Ｂｒ−ＰＤ　０２００１２６（イオン化のために１個の交換可能なプロトンが除去されるので、正味の増加は２）からのものであるということを示している。ｍ／ｚが３１０（図３Ｃ）のフラグメント・イオンが、ｍ／ｚが３１１（図３Ｂおよび図３Ａ）にシフトすることは、ブロモ−ビフェニル−スルホンアミド部分のアミド窒素がそのまま残っているということを示している。
【００４４】
実施例３．　８１Ｂｒを含む分子の単離を伴うＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いる、ＰＤ　０２００１２６の構造の解明
図４Ａは、オフラインＨ／Ｄ交換、重水素化移動相を用いるＨＰＬＣ分離、およびＤ２Ｏシース液を用いるＥＳＩを用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（８１Ｂｒを含む脱プロトン化分子のＭＳによる単離）により得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示し、図４Ｂは、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（８１Ｂｒを含む脱プロトン化分子のＭＳによる単離）により得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示し、図４Ｃは、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（８１Ｂｒを含む脱プロトン化分子のＭＳによる単離）により得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示す。これらのデータは、フラグメント化の帰属をさらに確認するために、またＥＳＩ源で起こる交換に伴う、Ｈ／Ｄ交換のより低い効率が生成イオンの説明に困難を引き起こすかどうかを調べるために得られた。
【００４５】
これらの実験では、８１Ｂｒを含み、また３個が交換された（イオン化により１個の交換可能プロトンを欠く）、脱プロトン化分子を選択し、タンデム質量分析法で分析した。衝突誘起解離（ＣＩＤ）により、ｍ／ｚが４２９の前駆体イオンは２４９、２９７および３１２のフラグメント・イオンを生成した。ＥＳＩ源で起こるＨ／Ｄ交換からの、７９Ｂｒ−ＰＤ　０２００１２６の生成イオン・スペクトルと異なり、ＥＳＩ源での交換からの、８１Ｂｒ−ＰＤ　０２００１２６の生成イオン・スペクトルは、複雑でなく（図３Ａと図４Ｂを比較）、またオフライン溶液相Ｈ／Ｄ交換の後で得られた生成イオン・スペクトル（図４Ａ）にほぼ合致していた。Ｈ／Ｄ交換の後のフラグメント・イオンの２Ｄａの質量シフトにより、フラグメント化の帰属が確認された（図３Ａ、Ｂおよび図４Ａ、Ｂ）。
【００４６】
実施例４．　ウサギ血漿からのＰＤ　０２００１２６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９およびＭ１０
　これらのデータは、感度を評価し、また薬剤発見の初期段階に代謝物のキャラクタリゼーションをおこなうために開示された手法を用いる妥当性を例示するために得られた。これらの代謝物の構造の解明は、Ｄ２ＯとＨ２Ｏをそれぞれ、シース液と移動相に用いたＬＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて実施され、また比較のために、Ｄ２ＯあるいはＨ２Ｏをシース液と移動相の両方に用いた。
【００４７】
図５Ａは、３００ｍｇ／ｋｇのＰＤ　０２００１２６をウサギに経口投与した後の血漿から得られたＭ８を示し、図５Ｂは、３００ｍｇ／ｋｇのＰＤ　０２００１２６をウサギに経口投与した後の血漿から得られたＭ１０を示し、図５Ｃは、３００ｍｇ／ｋｇのＰＤ　０２００１２６をウサギに経口投与した後の血漿から得られたＭ９を示し、ならびに図５Ｄは、３００ｍｇ／ｋｇのＰＤ　０２００１２６をウサギに経口投与した後の血漿から得られたＰＤ　０２００１２６およびＭ７の抽出イオンクロマトグラム、さらに図５Ｅは、３００ｍｇ／ｋｇのＰＤ０２００１２６をウサギに経口投与した後の血漿から得られたＵＶスペクトルを示す。図５に示されるように、ウサギ血漿には、代謝物Ｍ７、Ｍ８およびＭ９に関連する、それぞれｍ／ｚが４２５、３１０および４１０の、３つの主なＵＶ成分が現れた。痕跡量のＰＤ　０２００１２６とＭ１０もまたそれぞれ、ｍ／ｚが４２５と４０９に認められた。代謝物Ｍ１〜Ｍ６はラットとマウスの肝細胞を含む別の研究においてキャラクタリゼーションがおこなわれた。
【００４８】
以下の実施例５〜実施例８では、実施例４に記載されたウサギ血漿試料についての水素／重水素交換実験により、少なくとも部分的には、得られたデータを用いる、代謝物Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９およびＭ１０の構造の解明が記載される。
【００４９】
実施例５．　代謝物Ｍ７の構造の解明
図５Ｅに示されるように、代謝物Ｍ７は母体薬剤ＰＤ　０２００１２６と類似の公称質量をもち、３６．１分で溶出した。代謝物Ｍ７イオンのｍ／ｚが奇数であるということは、Ｍ７が偶数個の窒素原子を含むということを示している。
【００５０】
図６Ａは、オフラインＨ／Ｄ交換、重水素化移動相を用いるＨＰＬＣ分離、およびＤ２Ｏシース液を用いるＥＳＩを利用するＬＣ−ＭＳにより得られた、Ｍ７代謝物の質量スペクトルを示し、図６Ｂは、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を利用するＬＣ−ＭＳにより得られた、Ｍ７代謝物の質量スペクトルを示し、図６Ｃは、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を利用するＬＣ−ＭＳにより得られた、Ｍ７代謝物の質量スペクトルを示す。図６Ｃに示されるように、Ｍ７は、Ｈ２Ｏをシース液として用いた場合、母体分子に類似した同位体クラスター・パターンを示した。しかし、Ｈ／Ｄ交換をおこなうと、Ｍ７の同位体クラスター・パターンは母体薬剤のそれとは違っていた。図２に示されるように、ＰＤ　０２００１２６がＨ／Ｄ交換を受けると、強度が最大の同位体クラスター・イオンは２Ｄａだけシフトしたが、Ｍ７では３Ｄａのシフトが認められた（図６Ｃと図６Ｂを比較）。代謝物Ｍ７では、３Ｄａの増加は、提案されたモノヒドロキシ−ＰＤ　０２００１２６−アミドあるいはモノヒドロキシ−ＰＤ　０３０７４４２構造（表１）における４個の交換可能な水素の存在と一致している。
【００５１】
図７Ａは、オフラインＨ／Ｄ交換、重水素化移動相を用いるＨＰＬＣ分離、およびＤ２Ｏシース液を用いるＥＳＩを利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（８１Ｂｒを含んだ脱プロトン化分子のＭＳによる単離）により得られた、代謝物Ｍ７の質量スペクトルを示し、図７Ｂは、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（８１Ｂｒを含んだ脱プロトン化分子のＭＳによる単離）により得られた、代謝物Ｍ７の質量スペクトルを示し、図７Ｃは、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（８１Ｂｒを含んだ脱プロトン化分子のＭＳによる単離）により得られた、代謝物Ｍ７の質量スペクトルを示す。用いられたＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件（１ｍＬ／ｍｉｎのＨＰＬＣ移動相の流量、０．２ｍＬ／ｍｉｎのシース液流量）のもとで、Ｍ７は、相対的強度が異なる以外は、その母体と類似のフラグメント化パターンを示した（図７Ｃと図４Ｃを比較）。ｍ／ｚが２９７の主フラグメント・イオンは、ブロモ−ビフェニル−４−スルホニル部分がそのまま残っているということを示唆している。ｍ／ｚが３１２のフラグメント・イオンは、ブロモ−ビフェニル−４−スルオニルアミノ部分もまたそのままであり、多分ヒドロキシル化である変異は、３−メチル−ブチルアミド部分で起こっているということを示唆している。
【００５２】
母体分子と異なり、代謝物Ｍ７では、ｍ／ｚが３６３に、［Ｍ−Ｈ−ＳＯ２］−に相当する高強度のフラグメント・イオンを生じるようなフラグメント化が起こった。類似のフラグメント化挙動は、代謝物Ｍ１０（ＰＤ　０３０７４４２）およびＰＤ　０２００１２６−アミド（ＭＳ／ＭＳスペクトルは記載されていない）でも認められた。これは、可能性として、Ｍ７がＰＤ　０２００１２６−アミドのモノヒドロキシル化誘導体であるということを示唆している。母体のＭＳ／ＭＳスペクトルに存在するフラグメント・イオンが現れるだけでなく（図７Ｃ）、Ｍ７ではまた、ｍ／ｚが４０９に、［Ｍ−Ｈ−Ｈ２Ｏ］−に相当する、痕跡量のフラグメント・イオンが現れた。このフラグメント・イオンは、表１で代謝物Ｍ７として与えられた構造の帰属をさらに支持している。
【００５３】
さらに、Ｈ／Ｄ交換後の、ｍ／ｚが４３０の前駆体イオンについての、ＭＳ／ＭＳスペクトルは、代謝物Ｍ７に対して提案された構造をはっきりと支持している（図７Ａと図７Ｂ）。フラグメント化スキームに示されるように、ｍ／ｚが２９７の主フラグメント・イオンは、ブロモ−ビフェニル−４−スルホニル部分がそのまま残っているということを示唆している。ｍ／ｚが３１３／３１４のフラグメント・イオンは、ブロモ−ビフェニル−４−スルホニルアミノ部分がそのまま残っているということを示唆しており、また交換可能な１個の水素の存在を確認させる。期待されるように、［Ｍ−Ｈ−ＳＯ２］−に相当する、ｍ／ｚが３６３のフラグメント・イオンは、ｍ／ｚが３６６まで、３Ｄａだけシフトした。Ｈ／Ｄ交換による情報および生成イオン・スペクトルのいずれも、Ｍ７は、ＰＤ　０３０７４４２のイソプロピル部分がヒドロキシル化により変異している代謝物質であるということを示唆している。図７のフラグメント化スキームに示されるように、ｍ／ｚが３５２のフラグメント・イオンおよびそれに関連する、ｍ／ｚが３５３の重水素交換フラグメント・イオンの存在は、ヒドロキシル化が、イソプロピル部分のメチル部分で起こっているようであるということを示唆している。
【００５４】
実施例６．　代謝物Ｍ８の構造の解明
図５Ｅに示されるように、代謝物Ｍ８は４０．２分に溶出し、ｍ／ｚが３１０と３１２に、それぞれ７９Ｂｒと８１Ｂｒを含む脱プロトン化分子を生成した。代謝物Ｍ８イオンのｍ／ｚが偶数であるということは、Ｍ８が奇数個の窒素原子を含むということを示している。用いられたＭＳ／ＭＳ条件のもとで、ｍ／ｚが３１０の前駆体イオンはフラグメント化して、［Ｍ−Ｈ−ＳＯ２］−に相当する、ｍ／ｚが２４６のイオンを生じた（ＭＳ／ＭＳスペクトルは示されていない）。同様に、ｍ／ｚが３１２の前駆体イオンはフラグメント化して、［Ｍ−Ｈ−ＳＯ２］−に相当する、ｍ／ｚが２４８のイオンを生じた（ＭＳ／ＭＳスペクトルは示されていない）。６４Ｄａの低下は、スルホンが代謝物の一部分であるということを示唆しており、またｍ／ｚが２４８のフラグメント・イオンは、ブロモ−ビフェニルアミドがそのまま残っていることを示唆している。ＥＳＩ源でのＨ／Ｄ交換の後、分子イオン・クラスターは３１０／３１２から３１１／３１３にシフトし、交換可能な１個の水素の存在を確認させた。この情報に基づいて、ブロモ−ビフェニルスルホンアミドが代謝物Ｍ８に対して提案された（表１）。この提案された構造は参照標準（ＰＤ　０４０８２０８）の合成により確認された。合成標準体の保持時間、エレクトロスプレー質量スペクトル、およびタンデム質量スペクトルは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏで生成した代謝物Ｍ８から得られたものにほぼ一致した。
【００５５】
実施例７．　代謝物Ｍ９の構造の解明
図５Ｅに示されるように、代謝物Ｍ９は４０．９分に溶出し、ｍ／ｚが４１０と４１２に、それぞれ７９Ｂｒと８１Ｂｒを含む脱プロトン化分子を生じた。代謝物Ｍ９イオンのｍ／ｚが偶数であるということは、Ｍ９が奇数個の窒素原子を含むということを示している。
【００５６】
図８Ａは、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（７９Ｂｒを含んだ脱プロトン化分子のＭＳによる単離）により得られた、代謝物Ｍ９の質量スペクトルを示し、図８Ｂは、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（７９Ｂｒを含んだ脱プロトン化分子のＭＳによる単離）により得られた、代謝物Ｍ９の質量スペクトルを示す。ｍ／ｚが４１０の前駆体イオンはフラグメント化して、ｍ／ｚが２４７、２９５および３１０のイオンを生じた（図８Ｃ）。ｍ／ｚが２９５および３１０のフラグメント・イオンは、それぞれブロモ−ビフェニルスルホニルおよびビロモ−ビフェニルスルホニルアミノ部分がそのまま残っていることを示唆している。ｍ／ｚが２４７のフラグメント・イオンは［２９５−ＳＯ］−に関連しているようである。これらのＭＳ／ＭＳデータおよび分子量の情報に基づいて、ＰＤ　０２０１２６−カルボン酸の構造が提案された（表１）。
【００５７】
ｍ／ｚが４１０／４１２（Ｈ２Ｏシース）および４１１／４１３（Ｄ２Ｏシース）の分子イオン・クラスター以外に、ｍ／ｚが４０９／４１１（Ｈ２Ｏシース）および４１０／４１２（Ｄ２Ｏシース）の分子イオン・クラスターが、ＬＣ−ＭＳスペクトルで認められた。後者の２組は、代謝物Ｍ１０の共溶出、１個だけ重水素置換を受けた代謝物の共溶出、交換を受けていないある量のＭ９の存在、あるいはこれらの要因のある組合せにより生じたようである。Ｄ２Ｏがシース液として用いられた場合、Ｍ９からの分子イオン・クラスターの大部分は、４１１／４１３へと１Ｄａだけシフトし、このことは、２個の交換可能な水素が存在し、一方がイオン化の間に取り除かれる、ＰＤ　０２００１２６−カルボン酸という提案された構造（表１）と合致している。
【００５８】
図８はまた、両方のスペクトル（Ｄ２ＯあるいはＨ２Ｏシース液）で、ｍ／ｚが２４７および２９５のイオンの存在を示しており、このことは、ブロモ−ビフェニルスルホニル部分がそのまま残っているということを示している。ｍ／ｚが３１０のフラグメント・イオンの３１１への質量シフトは、交換可能な１個の水素の存在ならびにブロモ−ビフェニルスルホンアミドのアミド部分がそのまま残っていることを示唆している。合成標準体（ＰＤ　０１６９４６９、表１）の保持時間、エレクトロスプレー質量スペクトル、およびタンデム質量スペクトルは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏで生成した代謝物Ｍ９から得られたものにほぼ一致した。
【００５９】
実施例８．　代謝物Ｍ１０の構造の解明
図５Ｅに示されるように、ウサギ血漿において主要ではないＵＶ成分である代謝物Ｍ１０は４１．０分に溶出し、ｍ／ｚが４０９と４１１に、それぞれ７９Ｂｒと８１Ｂｒを含む脱プロトン化分子を生じた。代謝物Ｍ１０イオンのｍ／ｚが奇数であるということは、Ｍ１０が偶数個の窒素原子を含むということを示している。ＰＤ　０２００１２６の分子量からの１６ａｍｕの減少に相当する４１０の分子量は、Ｍ１０がアミド代謝物のようであるということを示唆している。Ｍ１０の生成イオン・スペクトルとＰＤ　０２００１２６参照標準のそれとの比較ならびにｍ／ｚが２９５と３１０の生成イオンの存在は、ブロモ−ビフェニルスルホニルとブロモ−ビフェニルスルホニルアミノ部分がそれぞれそのまま残っていることを示唆している（ＭＳ／ＭＳスペクトルは示されていない）。その母体あるいはそのカルボン酸代謝物と異なり、Ｍ１０はフラグメント化して、ｍ／ｚが３４５に、［Ｍ−Ｈ−ＳＯ２］−に相当する高強度のイオンを生じる。
【００６０】
構造の帰属を確認するために、この代謝物についてＥＳＩ源でのＨ／Ｄ交換実験を実施した。分子イオン・クラスターが４１１／４１３へと２Ｄａだけシフトすることが認められ、３個の交換可能水素の存在が示された。ＣＩＤにより、ｍ／ｚが４１１の前駆体イオンは、ｍ／ｚが２９５、３１１および３４７のフラグメント・イオンを生じ、構造の帰属が確認された。最後に、合成標準体（ＰＤ　０３０７４４２、表１）の保持時間、エレクトロスプレー質量スペクトル、およびタンデム質量スペクトルは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏで生成した代謝物Ｍ１０から得られたものにほぼ一致した。
【００６１】
別の１組の実験が、ＥＳＩ源Ｈ／Ｄ交換が第Ｉ相変異すなわち１〜４個の交換可能な水素の追加による変異に限定されるか、あるいはそれはまた、グルクロニド化などの、５個を超える交換可能な水素が追加されることになる第ＩＩ相の変異にも適用できるかどうかを明らかにするために実施された。これらの実験により、ＥＳＩ源Ｈ／Ｄ交換は発見的（非放射能標識母体薬剤）代謝物同定だけでなく、開発研究（放射能標識母体薬剤）にも適用できるということが示された。
【００６２】
実施例９．　代謝物Ｍ２の構造の解明
図９Ａは、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を利用するＬＣ−ＭＳにより得られた、Ｍ２代謝物の質量スペクトルを示し、図９Ｂは、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を利用するＬＣ−ＭＳにより得られた、Ｍ２代謝物の質量スペクトルを示し、また図９Ｃは、対応するラジオクロマトグラムも示す。［１４Ｃ］ＰＤ　０２００１２６とイヌ肝細胞との１８０分間のインキュベーションの後、全体の９０％を越える放射能を示す主な放射能成分は、ＰＤ　０２００１２６−グルクロニド（Ｍ２）に関連づけられ、少ない量の放射能がＭ９と関連づけられた。図９に示されるように、ＥＳＩ源Ｈ／Ｄ交換を受けると、ｍ／ｚが６０１／６０３に認められる分子イオン・クラスターはシフトし、ｍ／ｚが６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７および６０８のイオンを生じた。同様に、ｍ／ｚが６２３／６２５の［Ｍ−２Ｈ＋Ｎａ］−イオンは、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８および６２９にシフトした。ｍ／ｚが６０６／６０８のイオンの存在は、ＰＤ　０２００１２６−グルクロニドの全６個の交換可能水素（イオン形成のため１個は取り除かれる）が交換を受けることができ、これらのイオンの前駆体は、ｍ／ｚが６０１／６０３のイオンのようであるということを示している。ナトリウム付加物の生成は第２のプロトンあるいはデューテリウムを取り除くことになり、交換可能な水素が１個少なくなる。
【００６３】
これらの観察は、Ｍ２がＰＤ　０２００１２６のグルクロニド抱合体であり、Ｍ７の抱合体でないということを示している。仮にＭ２がＭ７のグルクロニド抱合体であるとすると、交換反応では７個の水素が交換可能であろう。提案されたＭ２の構造はさらに、β−グルクロニダーゼによる加水分解実験により確認された。Ｍ２の構造の解明によりさらに、ＥＳＩ源Ｈ／Ｄ交換が、交換可能な水素の代謝的付加が限られたものである第Ｉ相型生体内変化に限定されないということが確認された。さらに、本実験の組立ては、発見型代謝物同定研究に限定されず、代謝物に関する構造情報ならびに定量的放射能情報を得ることを可能とするであろう（スプリット−フロー法を用いて）。
【００６４】
結論
オンラインＨ／Ｄ交換実験を実施するために、ＥＳＩ源とシース液としての酸化デューテリウムを備える液体クロマトグラフィ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）の実現可能性が示された。実験は、ＥＳＩ源Ｈ／Ｄ交換は速度により制限されており、また交換効率はＤ２Ｏに溶かされ、さらにＤ２Ｏ移動相を用いる試料のように大きくはないが、薬剤および代謝物の交換可能な水素の数を迅速に定め、またそれらのキャラクタリゼーションをするためにこの方法を用いることができるということを示す。
【００６５】
水素／重水素交換実験により、同一の公称質量と同一の元素組成をもつ、母体薬剤と代謝物Ｍ７とを識別することができた。さらに、臭素原子の存在−特に母体薬剤における独特の同位体クラスター分布−により、タンデム質量分析法による情報を得るための、イオン源でのＨ／Ｄ交換の有効性を評価することができた。ＥＳＩ源Ｈ／Ｄ交換ならびに重水素化移動相を用いる溶液（オフライン）Ｈ／Ｄ交換の後に生成した前駆体イオンを用いて得られた生成イオン・スペクトルの比較は、Ｈ／Ｄ交換が完全には進んでいない前駆体イオンを用いることにより、代謝物の構造の解明をすることができるということを示している。
【００６６】
本発明者等の実験はまた、ＥＳＩ源Ｈ／Ｄ交換は、第Ｉ相の生体内変化に伴うもののような、比較的少数の交換可能な水素が追加されて生成する代謝物に限定されず、通常５個以上の交換可能な水素が追加されることにより生成する代謝物（硫酸化ではなく、グルクロニド化およびグルタチオン）を生じる第ＩＩ相生体内変化のキャラクタリゼーションをおこなうために、それを用いることができるということを示している。このように、ＥＳＩ源Ｈ／Ｄ交換を用いることにより、薬剤発見の初期段階において非常に有用でありうる、曖昧さのない代謝物の同定を、ＮＭＲもしくはＬＣ−ＮＭＲのための大規模な調製を用いることなく、あるいは重水素化移動相を含む溶剤（オフライン）によるＨ／Ｄ交換を実施することなく実施することができる。
【００６７】
前記の説明は例示のためであり限定のためではないということが理解されるべきである。前記の説明を読むことにより、当分野の技術者には多くの実施形態が明らかとなるであろう。したがって、本発明の範囲は、前記の説明を参照して定められるべきではなく、特許請求の範囲が権利を有する、最も広い範囲の等価物と共に、添付の特許請求の範囲を参照して定められるべきである。全ての論文と参考文献は、特許出願および刊行物を含めて、あらゆる目的のために、全体として、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｈ／Ｄ交換を実施するためのオンライン・システムの概略図である。
【図２Ａ】ＥＳＩ源を用い、オフラインＨ／Ｄ交換、重水素化移動相を用いるＨＰＬＣ分離、およびＤ２Ｏシース液を用いるＥＳＩを利用するＬＣ−ＭＳにより得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示す図である。
【図２Ｂ】ＥＳＩ源を用い、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を利用するＬＣ−ＭＳにより得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示す図である。
【図２Ｃ】ＥＳＩ源を用い、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を利用するＬＣ−ＭＳにより得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示す図である。
【図３Ａ】ＥＳＩ源（７９Ｂｒを含んだ、脱プロトン化分子のＭＳによる単離）を用い、オフラインＨ／Ｄ交換、重水素化移動相を用いるＨＰＬＣ分離、およびＤ２Ｏシース液を用いるＥＳＩを利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示す図である。
【図３Ｂ】ＥＳＩ源（７９Ｂｒを含んだ、脱プロトン化分子のＭＳによる単離）を用い、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示す図である。
【図３Ｃ】ＥＳＩ源（７９Ｂｒを含んだ、脱プロトン化分子のＭＳによる単離）を用い、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示す図である。
【図４Ａ】ＥＳＩ源（８１Ｂｒを含んだ、脱プロトン化分子のＭＳによる単離）を用い、オフラインＨ／Ｄ交換、重水素化移動相を用いるＨＰＬＣ分離、およびＤ２Ｏシース液を用いるＥＳＩを利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示す図である。
【図４Ｂ】ＥＳＩ源（８１Ｂｒを含んだ、脱プロトン化分子のＭＳによる単離）を用い、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示す図である。
【図４Ｃ】ＥＳＩ源（８１Ｂｒを含んだ、脱プロトン化分子のＭＳによる単離）を用い、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより得られた、ＰＤ　０２００１２６の質量スペクトルを示す図である。
【図５Ａ】３００ｍｇ／ｋｇのＰＤ　０２００１２６をウサギに経口投与した後の血漿から得られた、Ｍ８を示す図である。
【図５Ｂ】３００ｍｇ／ｋｇのＰＤ　０２００１２６をウサギに経口投与した後の血漿から得られた、Ｍ１０を示す図である。
【図５Ｃ】３００ｍｇ／ｋｇのＰＤ　０２００１２６をウサギに経口投与した後の血漿から得られた、Ｍ９を示す図である。
【図５Ｄ】３００ｍｇ／ｋｇのＰＤ　０２００１２６をウサギに経口投与した後の血漿から得られた、ＰＤ　０２００１２６およびＭ７の抽出イオンクロマトグラムを示す図である。
【図５Ｅ】３００ｍｇ／ｋｇのＰＤ　０２００１２６をウサギに経口投与した後の血漿から得られた、ＵＶスペクトルを示す図である。
【図６Ａ】ＥＳＩ源を用い、オフラインＨ／Ｄ交換、重水素化移動相を用いるＨＰＬＣ分離、およびＤ２Ｏシース液を用いるＥＳＩを利用するＬＣ−ＭＳにより得られた、Ｍ７代謝物の質量スペクトルを示す図である。
【図６Ｂ】ＥＳＩ源を用い、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を利用するＬＣ−ＭＳにより得られた、Ｍ７代謝物の質量スペクトルを示す図である。
【図６Ｃ】ＥＳＩ源を用い、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を利用するＬＣ−ＭＳにより得られた、Ｍ７代謝物の質量スペクトルを示す図である。
【図７Ａ】ＥＳＩ源（８１Ｂｒを含んだ、脱プロトン化分子のＭＳによる単離）を用い、オフラインＨ／Ｄ交換、重水素化移動相を用いるＨＰＬＣ分離、およびＤ２Ｏシース液を用いるＥＳＩを利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより得られた、代謝物Ｍ７の質量スペクトルを示す図である。
【図７Ｂ】ＥＳＩ源（８１Ｂｒを含んだ、脱プロトン化分子のＭＳによる単離）を用い、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより得られた、代謝物Ｍ７の質量スペクトルを示す図である。
【図７Ｃ】ＥＳＩ源（８１Ｂｒを含んだ、脱プロトン化分子のＭＳによる単離）を用い、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより得られた、代謝物Ｍ７の質量スペクトルを示す図である。
【図８Ａ】ＥＳＩ源（７９Ｂｒを含んだ、脱プロトン化分子のＭＳによる単離）を用い、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより得られた、代謝物Ｍ９の質量スペクトルを示す図である。
【図８Ｂ】ＥＳＩ源（７９Ｂｒを含んだ、脱プロトン化分子のＭＳによる単離）を用い、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を利用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより得られた、代謝物Ｍ９の質量スペクトルを示す図である。
【図９Ａ】ＥＳＩ源を用い、Ｄ２Ｏシース液を用いるオンラインＨ／Ｄ交換および水性移動相を利用するＬＣ−ＭＳにより得られた、代謝物Ｍ２の質量スペクトルを示す図である。
【図９Ｂ】ＥＳＩ源を用い、水性移動相およびＨ２Ｏシース液を利用するＬＣ−ＭＳにより得られた、代謝物Ｍ２の質量スペクトルを示す図である。
【図９Ｃ】対応するラジオクロマトグラムを示す図である。
【符号の説明】
１０　オンライン・システム
１２　高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）
１４　質量分析計（ＭＳ）
１６　フロー・スルー放射能検出器（任意選択）
１８　分離カラム
２０　入口
２２　出口
２４　ＨＰＬＣポンプ
２６　検体検出器（任意選択）
２８　第１導管
３０　第２導管
３２　ガード・カラム
３４　オートサンプラー（任意選択）
３６　第３導管
３８　第１Ｔ字管
４０　第４導管
４２　第５導管
４４　エレクトロスプレー・イオン化源
４６　質量分析計
４８　シース液ポンプ
５０　第６導管
５２　第２Ｔ字管
５４　インライン逆止弁
５６　第７導管
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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