(57)【要約】【課題】複数の試験を独立して実施することなく、単一試験の中で（例えば、雄性ホルモン受容体に対する作用と甲状腺に対する影響とを互いに干渉することなく）各ホルモン系における化学物質の影響度を適正に評価できる方法を提供すること。【解決手段】化学物質の甲状腺への影響度を評価する方法であって、６〜10週齢のげっ歯類動物の精巣を摘出する工程、前記動物を精巣摘出後の体重増加量及び摂餌量が精巣摘出前の体重増加量及び摂餌量と同等程度にまで回復するまで飼育する工程、前記動物に対して被験物質を８〜14日間少なくとも１日１回以上経口投与する工程、前記動物から甲状腺を摘出し摘出された甲状腺から薄切切片を作製し作製された薄切切片を染色した後光学顕微鏡にて組織像を観察する工程、観察された組織像と対照との差異に基づき前記被験物質の甲状腺への影響度を評価する工程を有することを特徴とする方法等が提供可能となった。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質の甲状腺への影響度を評価する方法であって、
（１）６〜10週齢のげっ歯類動物の精巣を摘出する第一工程、
（２）第一工程後、前記げっ歯類動物を、精巣摘出後の体重増加量及び摂餌量が精巣摘出前の体重増加量及び摂餌量と同等程度にまで回復するまで飼育する第二工程、
（３）第二工程後、前記げっ歯類動物に対して被験物質を８〜14日間、少なくとも１日１回以上、経口投与する第三工程、
（４）第三工程後、前記げっ歯類動物から甲状腺を摘出し、摘出された甲状腺から薄切切片を作製し、作製された薄切切片を染色した後、光学顕微鏡にて組織像を観察する第四工程、
（５）観察された組織像と対照との差異に基づき、前記被験物質の甲状腺への影響度を評価する第五工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
第三工程において、被験物質の経口投与と同時にテストステロン化合物を0.1〜0.4mg/kg/dayの割合で体重値により補正された投与量を少なくとも１日１回以上皮下投与する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学物質の甲状腺への影響度を評価する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体の生殖・発生・分化・成長及び代謝は、種々の内分泌系により影響を受ける。生体における主要な内分泌系として、雄性ホルモン系、雌性ホルモン系、甲状腺ホルモン系等が挙げられる。このようなホルモン系における各ホルモンには、それぞれ標的の器官又は組織があり、これら器官又は組織は、単一のホルモンに特異的に影響を受けたり、複数のホルモンにより複合的に影響を受けたりする。
このうち、雄性ホルモン系における、雄性ホルモン受容体に作用する化学物質を検定する方法として、例えば、精巣が摘出されたげっ歯類動物又は精巣が摘出されかつテストステロン化合物が投与されたげっ歯類動物を用いて、その雄性ホルモン依存性器官・組織の重量を測定する方法が用いられてきた（例えば、非特許文献１参照）。
一方で、甲状腺に対して影響する化学物質を検定するために、思春期ラットアッセイ法等が提案され、現在、開発段階にある。
このように、各ホルモン系における化学物質の影響度を評価するためには、各ホルモン系に適した特定な方法を選択して試験を行う必要があり、このために複数の試験を独立して実施する必要があった。
【０００３】
【非特許文献１】
Toxicol. Sci.,56:389-399 (2000)
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、かかる状況の下、鋭意検討した結果、化学物質が有する、雄性ホルモン受容体に対する作用と甲状腺に対する影響とを、互いに干渉することなく単一試験の中で評価することができる方法を見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．化学物質の甲状腺への影響度を評価する方法であって、
（１）６〜10週齢のげっ歯類動物の精巣を摘出する第一工程、
（２）第一工程後、前記げっ歯類動物を、精巣摘出後の体重増加量及び摂餌量が精巣摘出前の体重増加量及び摂餌量と同等程度にまで回復するまで飼育する第二工程、
（３）第二工程後、前記げっ歯類動物に対して被験物質を８〜14日間、少なくとも１日１回以上、経口投与する第三工程、
（４）第三工程後、前記げっ歯類動物から甲状腺を摘出し、摘出された甲状腺から薄切切片を作製し、作製された薄切切片を染色した後、光学顕微鏡にて組織像を観察する第四工程、
（５）観察された組織像と対照との差異に基づき、前記被験物質の甲状腺への影響度を評価する第五工程を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
２．第三工程において、被験物質の経口投与と同時にテストステロン化合物を0.1〜0.4mg/kg/dayの割合で体重値により補正された投与量を少なくとも１日１回以上皮下投与する工程を含むことを特徴とする前項１記載の方法；
等を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、詳細に本発明を説明する。
本発明方法における第一工程では、６〜10週齢のげっ歯類動物の精巣を摘出する。
本発明における「げっ歯類動物」とは、例えば、ラット、マウス等である。また「６〜10週齢」とは、生後６〜10週間経過した個体を意味している。
当該工程における精巣の摘出は、例えば、以下の手順で行えばよい。まずエーテル等を用いて前記動物に麻酔をかける。腹部を上にして当該動物を手術台に置き、陰嚢及びその周辺をアルコール綿等で消毒する。陰嚢の皮膚を６mm程度切開し、その下の筋膜を切開する。さらに精巣の周りの精巣鞘膜を切開し精巣をピンセットでつまみ出す。輸精管や精巣血管をそれらに付着している脂肪体と一緒に縫合糸で結紮し、精巣のみ又は精巣と精巣上体とを一緒に摘出する。対側の精巣も同様に摘出する。筋膜と皮膚を合わせて縫合糸又は縫合器で縫合する。傷口をヨードチンキ等で消毒する。
【０００６】
本発明方法における第二工程では、第一工程後、前記げっ歯類動物を、精巣摘出後の体重増加量及び摂餌量が精巣摘出前の体重増加量及び摂餌量と同等程度にまで回復するまで飼育する。
当該工程における飼育は、例えば、以下のように実施すればよい。まず、天秤を用いて毎日１回体重を個体別に測定し、前日からの差を体重増加量とする。摂餌量については、餌を入れた給餌器の重量を天秤で測定した後、当該餌を実験動物に与え、２日後に残餌の重量を給餌器込みで測定し、両者の差を仮摂餌量とする。ケージあたりの実験動物数及び測定期間（２日）で補正し、１日１匹あたりの摂餌量を算出する。このようにして、精巣摘出後の体重増加量及び摂餌量が精巣摘出前の体重増加量及び摂餌量と同等程度（例えば、約95〜105％程度）にまで回復するまで飼育する。通常、約１〜２週間の飼育期間を設置するとよい。
【０００７】
本発明方法における第三工程では、第二工程後、前記げっ歯類動物に対して被験物質を８〜14日間、少なくとも１日１回以上、経口投与する。
当該工程における被験物質の経口投与は、例えば、以下の手順で行えばよい。まず、投与液の作製に関して、被験物質を必要量秤量し、これを適当な溶媒（コーンオイルや約0.25〜0.5％のメチルセルロース溶液等）を用いて溶液又は均一な懸濁液を作製する。経口投与は、注射筒及び弾性カテーテル等を用いて１匹あたり約5mL/kg/dayの液量で少なくとも１日１回以上経口投与する。これを８〜14日間継続して行う。
尚、上記の方法において、（Ａ）精巣が摘出された後、テストステロン化合物が投与されないげっ歯類動物を利用する場合には、被験物質が有する雄性ホルモン受容体に対する作用のうち、雄性ホルモン活性を評価する場合に用いられる。一方、（Ｂ）精巣が摘出された後、テストステロン化合物が投与されたげっ歯類動物を利用する場合には、被験物質が有する雄性ホルモン受容体に対する作用のうち、抗雄性ホルモン活性を評価する場合に用いられる。
ここで、「テストステロン化合物」としては、テストステロン自身、テストステロンプロピオネート、テストステロンβ−シクロペンチルプロピオネート、テストステロンエナントエート等のテストステロンエステル、下垂体に働いて性腺刺激ホルモンの分泌を抑制する作用を有するテストステロン様化合物等をあげることができる。
後者（Ｂ）の場合において、被験物質の経口投与と同時にテストステロン化合物を0.1〜0.4mg/kg/dayの割合で体重値を補正した投与量を少なくとも１日１回以上皮下投与するには、まず、テストステロン化合物を必要量秤量する。テストステロン化合物の投与量は、実験動物の飼育時間毎での体重の変化に応じて変化させた量であって、約0.1〜0.4mg/kg/dayの割合で体重値により補正された投与量である。
次に、秤量されたテストステロン化合物を適当な溶媒（コーンオイルが望ましい。）を用いて溶解した後、これを１匹あたり約0.5mL/kg/dayの液量で、肩甲部に少なくとも１日１回以上皮下投与する。
尚、投与液の逆流を防ぐため、被験物質の経口投与を先に実施し、その後、すみやかに（例えば、約20分間以内）にテストステロン化合物を皮下投与することが望ましい。
【０００８】
本発明方法における第四工程では、第三工程後、前記げっ歯類動物から甲状腺を摘出し、摘出された甲状腺から薄切切片を作製し、作製された薄切切片を染色した後、光学顕微鏡にて組織像を観察する。
当該工程における光学顕微鏡にて組織像を観察するには、例えば、以下のように実施すればよい。まず、最終投与（第三工程）の翌日、実験動物をエーテル等の適切な麻酔薬により麻酔する。次に、例えば、麻酔された実験動物の腹大動脈から採血し致死させた後、当該実験動物から甲状腺を気管に付けたままの状態で摘出する。摘出された甲状腺を、10％中性緩衝ホルマリン液に入れて固定する。通常約１日間程度固定した後（７日間程度までの固定は、当該評価の結果に対して影響を与えないことをすでに確認している。）、気管から甲状腺を分離する。分離された甲状腺から、通常の方法によりパラフィン薄切切片を作製する。作製された薄切切片にヘマトキシリン・エオジン染色を施した後、光学顕微鏡にて組織像を形態観察する。
【０００９】
本発明方法における第五工程では、観察された組織像と対照との差異に基づき、前記被験物質の甲状腺への影響度を評価する。
当該工程における「対照」とは、例えば、被験物質を含まない投与液が経口投与された実験動物（以下、対照動物と記すこともある。）を用いた系における観察された組織像を意味する。
当該対照と被験物質を含む投与液が経口投与された実験動物（以下、被験動物と記すこともある。）を用いた系における観察された組織像との差異を調べ、調べられた差異に基づき、前記被験物質の甲状腺への影響度を評価すればよい。例えば、被験動物を用いた系における組織像が、対照動物を用いた系における組織像と比較して有意に増加又は減少した場合には、被験物質には甲状腺への何らかの影響があると判定し、またその増加又は減少の割合に応じて影響の程度を評価することもできる。
【００１０】
このような本発明方法は、甲状腺に対する影響を調べる際に、雄性ホルモン受容体に対する作用に何ら影響を与えることなく、適正に甲状腺に対する影響を調べることができる方法である。つまり、単一試験の中で同時に雄性ホルモン受容体に対する作用をも評価することができる方法であって、単一試験の中で各ホルモン系における化学物質の影響度を、複数の試験を独立して実施することなく、簡便にかつ適正に評価できる方法として極めて有用である。
【００１１】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１２】
実施例１  （実験動物の準備及び精巣摘出）
５週齢のCrj:CD(SD)IGS雄ラット（日本チャールス・リバーから購入）を、１週間の検疫期間の後、６週齢で精巣を摘出する手術に供した。エーテル麻酔下、80％エタノール水溶液で下腹部を消毒した後、陰嚢切開式にて精巣摘出を実施した。即ち、陰嚢の皮膚を６mm程度切開し、その下の筋膜を切開した。さらに精巣の周りの精巣鞘膜を切開し精巣をピンセットでつまみ出し、輸精管及び精巣血管をそれらに付着している脂肪体と一緒に縫合糸で結紮した後、精巣と精巣上体とを一緒に摘出した。対側の精巣も同様に摘出した。筋膜と皮膚とを合わせて縫合器で縫合した後、傷口にヨードチンキを塗布することにより術後消毒を行った。
手術後の雄ラットについて、天秤を用いて毎日１回体重を個体別に測定し、同時に、餌を入れた給餌器の重量を天秤で測定した後、当該餌を前記雄ラットに与え、２日後に残餌の重量を給餌器込みで測定しながら飼育を続けた。
尚、体重増加量に関しては前日からの差から算出した、また、摂餌量に関しては２日後からの差から仮摂餌量をまず算出し、これをケージあたりの実験動物数及び測定期間（２日）で補正することにより、１日１匹あたりの摂餌量を算出した。
このようにして、精巣摘出後の体重増加量及び摂餌量が精巣摘出前の体重増加量及び摂餌量とほぼ同等（約９５〜１０５％程度）にまで回復するまで飼育した。当該飼育期間は、１週間であった。
【００１３】
実施例２  （被験物質の投与及び対照動物の育成）
実施例１により回復するまで飼育された雄ラット及び当該雄ラットにテストステロンプロピオネート（以下、TPと記すこともある。）を0.2mg/kg/dayの投与量で、かつ0.5mL/mg/dayの液量で、肩甲部に注射により皮下投与された雄ラットに対して、被験物質として、甲状腺に対して影響を与えることが知られているプロピルチオウラシル（以下、PTUと記すこともある。）及びフェノバルビタール（以下、PBと記すこともある。）を、前者は2.5 mg/kg/dayの投与量で、かつ後者は125mg/kg/dayの投与量で、いずれも5mL/mg/dayの液量で１日１回10日間反復強制経口投与した。投与液は、いずれも溶媒としてコーンオイルを用いた。被験物質の投与は、注射筒及び弾性カテーテルを用いた。
また、対照動物とする雄ラットには、TPを投与された系及びTPが投与されていない系において、投与液に被験物質を含まないこと以外は上記の方法と同様の処理を行った。
【００１４】
実施例３  （甲状腺の病理組織学的検査）
最終投与の翌日、被験物質が投与された雄ラット及び対照動物とする雄ラットをエーテル麻酔下にて腹大動脈から採血して安楽死させた。致死させた雄ラットから甲状腺を気管に付けたままの状態で摘出した。摘出された甲状腺を、10％中性緩衝ホルマリン液に入れて固定した。１日間固定した後、それぞれを分離し、付着した脂肪を取り除いた後、気管から甲状腺を分離した。分離された甲状腺から、定法によりパラフィン薄切切片を作製した。作製された薄切切紙にヘマトキシリン・エオジン染色を施した後、光学顕微鏡にて形態観察した。その結果、甲状腺の薄切切片には被験物質の影響と考えられる組織像の差異が認められた。その結果を表１及び表２に示した。
【００１５】
【表１】
2004163107.tif 000002
数値は発現例数を示す。
PB：フェノバルビタール
PTU：プロピルチオウラシル
被験物質の雄性ホルモン活性を評価する場合：精巣が摘出された後、テストステロン化合物が投与されないげっ歯類動物を利用した。
【００１６】
【表２】
2004163107.tif 000003
数値は発現例数を示す。
PB：フェノバルビタール
PTU：プロピルチオウラシル
被験物質の抗雄性ホルモン活性を評価する場合：精巣が摘出された後、テストステロン化合物が投与されたげっ歯類動物を利用した。
【００１７】
実施例４  （雄性ホルモン依存性の各種器官の摘出・重量測定）
実施例３で安楽死させた雄ラットから、前立腺（腹葉及び背側葉）並びに精嚢（凝固腺含む）を分離しないで一括して摘出し、さらに尿道球腺も摘出した。これらを10％中性緩衝ホルマリン液に入れ固定した。さらにまた、肛門挙筋及び球海綿体筋を摘出し、付着した脂肪を取り除いた後、即座に湿重量を測定した。前立腺腹葉、前立腺背側葉、精嚢（凝固腺含む）、尿道球腺については、10％中性緩衝ホルマリン液で１日間固定した後、それぞれを分離し、付着した脂肪を取り除いた後、紙ウエスで水分を吸収させ、その後、湿重量を測定した。その結果を表３及び表４に示した。
【００１８】
【表３】
2004163107.tif 000004
単位：mg
平均±SD、ｎ＝６
PB：フェノバルビタール
PTU：プロピルチオウラシル
被験物質の雄性ホルモン活性を評価する場合：精巣が摘出された後、テストステロン化合物が投与されないげっ歯類動物を利用した。
【００１９】
【表４】
2004163107.tif 000005
単位：mg
平均±SD、ｎ＝６
**：統計学的に有意差あり（p<0.01）
PB：フェノバルビタール
PTU：プロピルチオウラシル
被験物質の抗雄性ホルモン活性を評価する場合：精巣が摘出された後、テストステロン化合物が投与されたげっ歯類動物を利用した。
【００２０】
実施例５  （評価）
実施例３での甲状腺の病理組織学的検査の結果、甲状腺の薄切切片には被験物質の影響と考えられる組織像の差異が認められた（表１及び表２）。一方、さらにまた、実施例４での雄性ホルモン活性を評価する系において、雄性ホルモン依存性の各種器官の重量に対しては何らの影響も与えないことが判明した（表３及び表４）。尚、抗雄性ホルモン活性を評価する系において、フェノバルビタール投与群における肛門挙筋及び球海綿体筋の重量が有意に低下していたが、その他の器官の重量に対しては何らの影響も与えないことから、これ単独の変化のみでは当該被験物質に抗雄性ホルモン活性が存在するとは判断できず、本発明方法は、甲状腺に対する影響を調べる際に、雄性ホルモン受容体に対する作用に何ら影響を与えることなく、適正に甲状腺に対する影響を調べることができる方法であることが確認された。
【００２１】
【発明の効果】
本発明方法は、甲状腺に対する影響を調べる際に、雄性ホルモン受容体に対する作用に何ら影響を与えることなく、適正に甲状腺に対する影響を調べることができる方法である。つまり、単一試験の中で同時に雄性ホルモン受容体に対する作用をも評価することができる方法であって、単一試験の中で各ホルモン系における化学物質の影響度を、複数の試験を独立して実施することなく、簡便にかつ適正に評価できる方法として極めて有用である。