(57)【要約】【課題】走査型レーザ顕微鏡による共焦点観察とバネッセント照明による蛍光観察を同時または切換えて行うことができ、特に、走査型レーザ顕微鏡側の光軸方向の焦点位置を積極的に変化させても、エバネッセント照明による蛍光観察との使い勝手がすぐれた顕微鏡システムを提供する。【解決手段】Ａｒレーザ２のレーザ光を走査ユニット１０と対物レンズ２４を介し試料２５上に２次元走査可能に集光させ、グリーンヘリウムネオンレーザ３のレーザ光により試料２５上にエバネッセント照明を発生させ、Ａｒレーザ２からのレーザ光の光路に波面変換素子１４を配置し、試料２５上にエバネッセント照明を行なう条件を満足するように対物レンズ２４と試料２５の機械的な位置関係を固定して、波面変換素子１４によりレーザ光の試料２５面上の集光位置を制御可能とする。【選択図】    図１
2004309785.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を発生する第１の光源と、
前記第１の光源からのレーザ光を試料上に集光させる対物レンズと、
前記レーザ光を前記試料上で２次元走査する光走査手段と、
前記試料にエバネッセント照明を行うための光を発生する第２の光源と、
前記第１の光源からのレーザ光の光路に設けられ、前記レーザ光の前記試料上の集光位置を前記対物レンズの光軸方向に光学的に可変制御する集光位置制御手段と、
前記エバネッセント照明により発生する蛍光を撮像する撮像手段と、を具備し、
前記試料にエバネッセント照明を行なう条件を満足するように前記対物レンズと前記試料の機械的な位置関係を固定した状態で、前記集光位置制御手段により前記レーザ光の前記試料面上の集光位置を制御可能としたことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項２】
前記第１のレーザ光源からのレーザ光が集光される前記試料上の集光位置から発する光を共焦点観察する共焦点観察手段をさらに設けたことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡システム。
【請求項３】
前記第１のレーザ光源からのレーザ光は、前記試料上の集光位置に光化学反応を生じさせるものであることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡システム。
【請求項４】
前記第２の光源は、レーザ光を発生するレーザ光源からなり、且つ前記第１の光源とともに単一のレーザ光源ユニットを構成し、
前記第１および第２の光源は、それぞれレーザ光を導出するための第１および第２の光ファイバを各別に設け、
前記第１の光ファイバを通したレーザ光を前記対物レンズにより前記試料上に集光させるための光源および前記第２の光ファイバを通したレーザ光を前記試料にエバネッセント照明を行うための光源として用いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【請求項５】
前記レーザ光源ユニットは、前記第１および第２の光源よりそれぞれ発生される光の波長を同一にし、これら第１および第２の光源を一つの光源で構成したことを特徴とする請求項４記載の顕微鏡システム。
【請求項６】
前記第１および第２の光源は、それぞれ発生される光の波長が異なることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【請求項７】
前記集光位置制御手段は、波面変換素子であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【請求項８】
前記集光位置制御手段は、前記試料上に集光されるレーザ光のビーム径を変換するビーム径変換手段と、該ビーム径変換手段から出射するレーザ光のコリメート具合を可変する手段を有することを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【請求項９】
前記第１のレーザ光源は、２光子励起用パルスレーザを発生することを特徴とする請求項１、３、６、８記載の顕微鏡システム。
【請求項１０】
前記集光位置制御手段による前記レーザ光の前記試料面上の集光位置の制御および前記光走査手段による前記レーザ光の前記試料上での２次元走査の制御の少なくとも一方に、前記撮像手段による前記蛍光の撮像を同期させて制御することを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【請求項１１】
前記共焦点観察手段は、前記試料上の集光位置から発する光を検出する光検出手段を有しており、
前記光検出手段による検出と前記撮像手段による前記蛍光の撮像を同期させて制御することを特徴とする請求項１０記載の顕微鏡システム。
【請求項１２】
前記第１のレーザ光源からのレーザ光の前記試料への照射のタイミングと、前記第２の光源の前記試料への照射のタイミングを同期させて制御することを特徴とする請求項１０，１１記載の顕微鏡システム。
【請求項１３】
前記エバネッセント照明により発生する蛍光を撮像する撮像手段の撮像光路上に、前記第１の光源から前記試料上に集光されるレーザ光の波長をカットするフィルタ手段を設けたことを特徴とする請求項６、１０、１１記載の顕微鏡システム。
【請求項１４】
前記エバネッセント照明は、前記試料を挟んで前記対物レンズの対向側に配置されるコンデンサレンズを介して行なうことを特徴とする請求項１乃至１３のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【請求項１５】
レーザ光を発生する第１の光源と、
前記第１のレーザ光源からのレーザ光を試料上に集光させる対物レンズと、前記レーザ光を試料上で２次元走査する光走査手段と、
前記対物レンズを介して前記試料上の照明を行うための光を発生する第２の光源と、
前記第２の光源からの照明により前記試料より発する光を撮像する撮像手段と、
光走査手段からのレーザ光と前記第２の光源から発した光のそれぞれが前記対物レンズに向かう途中でそれぞれの光軸を同軸に導く光路合成手段と、
前記第１の光源からのレーザ光の光路に設けられ、前記レーザ光の前記試料上の集光位置を前記対物レンズの光軸方向に光学的に可変制御する集光位置制御手段と、を具備し、
前記対物レンズと前記試料の機械的な位置関係を固定した状態で、前記集光位置制御手段により前記レーザ光の前記試料面上の集光位置を制御可能としたことを特徴とする顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、走査型レーザ顕微鏡による共焦点観察とエバネッセント照明による蛍光観察に対応可能な顕微鏡システムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
最近、生体細胞の機能解析が盛んに行われるようになっている。
【０００３】
このような生体細胞の機能解析において、特に、厚みのある生物細胞のある部分に蛍光蛋白等の蛍光物質を局在化させ、その蛍光を観察することで３次元構造を解明するためのものとして、走査型レーザ顕微鏡が用いられている。
【０００４】
走査型レーザ顕微鏡は、例えば、特許文献１に開示されるように、レーザ光源からのレーザ光を対物レンズにより試料上に集光させ、その集光点を光学的に２次元走査し、試料からの光（特に蛍光）を再び対物レンズを通し、共焦点ピンホールを介して光検出器で検出し、２次元の情報を得るようにしている。つまり、走査型レーザ顕微鏡は、共焦点ピンホールを用いることで、焦点位置以外からの光をカットできるため、光軸方向の分解能があることが知られており、この特性を利用して対物レンズと試料の相対的な位置関係をステッピングモータなどの電動焦準機構により可変することで、複数の２次元スライス画像を取得し、これらの２次元画像を３次元に構築することにより試料の３次元像を取得することができる。
【０００５】
一方、生体細胞の機能解析に用いられる生物顕微鏡として、全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ：Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏ−ｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）と呼ばれる顕微鏡が注目されている。
【０００６】
この顕微鏡は、カバーガラスと試料の境界面で照明光を全反射させたときに、試料側に数１００ｎｍ以下のわずかな範囲に浸み出すエバネッセンス光と呼ばれる光を用いて蛍光物質を励起するようになっており、カバーガラス近傍のわずかな範囲の蛍光だけが観察されるので、バックグランドが非常に暗く、微弱な蛍光の観察を可能にしている。
【０００７】
このエバネッセント光を利用した全反射蛍光顕微鏡については、例えば、特許文献２に開示されている。ここでのエバネッセント照明は、試料全体に水銀灯などの励起光を照射する従来の同軸落射照明によるものと異なり、試料に対する照射範囲が試料の深さ方向に対して極めて浅いため、試料の表面付近の情報が高感度で得られるという特徴を有している。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００１−３５６２７２号公報
【０００９】
【特許文献２】
特開２００１−２７２６０６号公報
【００１０】
【特許文献３】
特開平１１−１０１９４２号公報
【００１１】
【特許文献４】
特開２００１−１６６２１３公報
【００１２】
【特許文献５】
特許第２８４８９５２号公報
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
このようにして、近年、生物細胞の蛍光観察には、走査型レーザ顕微鏡とエバネッセント照明を利用した全反射蛍光顕微鏡が用いられるが、これら顕微鏡のそれぞれの機能を同時に備えた顕微鏡システムは存在していない。
【００１４】
この理由は、走査型レーザ顕微鏡による観察は、３次元的に厚みを有する試料と対物レンズの相対的な位置関係を電動焦準ステージなどで光軸方向に積極的に変化させながら、試料の３次元的な観察を可能にしているが、仮に、対物レンズの焦点位置を試料内部に合わせたような状態では、カバーガラス付近の細胞表面付近の観察に限定されるエバネッセント照明による蛍光観察はできないからである。
【００１５】
このように、試料の３次元観察を行う走査型レーザ顕微鏡と、試料表面を観察するエバネッセント照明による全反射蛍光顕微鏡の両立は、システムとしての使い勝手の悪さを考えると実用的ではなかった。
【００１６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、走査型レーザ顕微鏡による共焦点観察とエバネッセント照明による蛍光観察を同時または切換えて行うことができ、特に、走査型レーザ顕微鏡側の光軸方向の焦点位置を積極的に変化させてもエバネッセント照明による蛍光観察との使い勝手がすぐれた顕微鏡システムを提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、レーザ光を発生する第１の光源と、前記第１の光源からのレーザ光を試料上に集光させる対物レンズと、前記レーザ光を前記試料上で２次元走査する光走査手段と、前記試料にエバネッセント照明を行うための光を発生する第２の光源と、前記第１の光源からのレーザ光の光路に設けられ、前記レーザ光の前記試料上の集光位置を前記対物レンズの光軸方向に光学的に可変制御する集光位置制御手段と、前記エバネッセント照明により発生する蛍光を撮像する撮像手段と、を具備し、前記試料にエバネッセント照明を行なう条件を満足するように前記対物レンズと前記試料の機械的な位置関係を固定した状態で、前記集光位置制御手段により前記レーザ光の前記試料面上の集光位置を制御可能としたことを特徴としている。
【００１８】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記第１のレーザ光源からのレーザ光が集光される前記試料上の集光位置から発する光を共焦点観察する共焦点観察手段をさらに設けたことを特徴としている。
【００１９】
請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記第１のレーザ光源からのレーザ光は、前記試料上の集光位置に光化学反応を生じさせるものであることを特徴としている。
【００２０】
請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記第２の光源は、レーザ光を発生するレーザ光源からなり、且つ前記第１の光源とともに単一のレーザ光源ユニットを構成し、前記第１および第２の光源は、それぞれレーザ光を導出するための第１および第２の光ファイバを各別に設け、
前記第１の光ファイバを通したレーザ光を前記対物レンズにより前記試料上に集光させるための光源および前記第２の光ファイバを通したレーザ光を前記試料にエバネッセント照明を行うための光源として用いることを特徴としている。
【００２１】
請求項５記載の発明は、請求項４記載の発明において、前記レーザ光源ユニットは、前記第１および第２の光源よりそれぞれ発生される光の波長を同一にして、これら第１および第２の光源を一つの光源で構成したことを特徴としている。
【００２２】
請求項６記載の発明は、請求項１乃至４のいずれかに記載の発明において、前記第１および第２の光源は、それぞれ発生される光の波長が異なることを特徴としている。
【００２３】
請求項７記載の発明は、請求項１乃至６のいずれかに記載の発明において、前記集光位置制御手段は、波面変換素子であることを特徴としている。
【００２４】
請求項８記載の発明は、請求項１乃至６のいずれかに記載の発明において、前記集光位置制御手段は、前記試料上に集光されるレーザ光のビーム径を変換するビーム径変換手段と、該ビーム径変換手段から出射するレーザ光のコリメート具合を可変する手段を有することを特徴としている。
【００２５】
請求項９記載の発明は、請求項１、３、６、８記載の発明において、前記第１のレーザ光源は、２光子励起用パルスレーザを発生することを特徴としている。
【００２６】
請求項１０記載の発明は、請求項１乃至９のいずれかに記載の発明において、前記集光位置制御手段による前記レーザ光の前記試料面上の集光位置の制御および前記光走査手段による前記レーザ光の前記試料上での２次元走査の制御の少なくとも一方に、前記撮像手段による前記蛍光の撮像を同期させて制御することを特徴としている。
【００２７】
請求項１１記載の発明は、請求項１０記載の発明において、前記共焦点観察手段は、前記試料上の集光位置から発する光を検出する光検出手段を有しており、前記光検出手段による検出と前記撮像手段による前記蛍光の撮像を同期させて制御することを特徴としている。
【００２８】
請求項１２記載の発明は、請求項１０、１１記載の発明において、前記第１のレーザ光源からのレーザ光の前記試料への照射のタイミングと、前記第２の光源の前記試料への照射のタイミングを同期させて制御することを特徴としている。
【００２９】
請求項１３記載の発明は、請求項６、１０、１１記載の発明において、前記エバネッセント照明により発生する蛍光を撮像する撮像手段の撮像光路上に、前記第１の光源から前記試料上に集光されるレーザ光の波長をカットするフィルタ手段を設けたことを特徴としている。
【００３０】
請求項１４記載の発明は、請求項１乃至１３のいずれかに記載の発明において、前記エバネッセント照明は、前記試料を挟んで前記対物レンズの対向側に配置されるコンデンサレンズを介して行なうことを特徴としている。
【００３１】
請求項１５記載の発明は、レーザ光を発生する第１の光源と、前記第１のレーザ光源からのレーザ光を試料上に集光させる対物レンズと、前記レーザ光を試料上で２次元走査する光走査手段と、前記対物レンズを介して前記試料上の照明を行うための光を発生する第２の光源と、前記第２の光源からの照明により前記試料より発する光を撮像する撮像手段と、光走査手段からのレーザ光と前記第２の光源から発した光のそれぞれが前記対物レンズに向かう途中でそれぞれの光軸を同軸に導く光路合成手段と、前記第１の光源からのレーザ光の光路に設けられ、前記レーザ光の前記試料上の集光位置を前記対物レンズの光軸方向に光学的に可変制御する集光位置制御手段と、を具備し、前記対物レンズと前記試料の機械的な位置関係を固定した状態で、前記集光位置制御手段により前記レーザ光の前記試料面上の集光位置を制御可能としたことを特徴としている。
【００３２】
この結果、本発明によれば、試料にエバネッセント照明を行なう条件を満足させる対物レンズと試料の機械的な位置関係を固定した状態で、光軸方向の観察断面の可変制御を含む走査型レーザ顕微鏡による共焦点観察を行なうと同時に、エバネッセント照明による蛍光観察を行なうことができる。
【００３３】
また、本発明によれば、２光子励起用パルスレーザを用いて、試料の厚み方向、面方向の３次元的な任意の位置にケージド解除を起こさせながら、エバネッセント照明による蛍光観察を行なうことができるので、試料表面の経時的変化を観察することができる。
【００３４】
さらに、本発明によれば、エバネッセント照明を、試料を挟んで対物レンズの対向側に配置されるコンデンサレンズを介して行なうようにしたので、対物レンズの制約（エバネッセント照明を発生させるための高ＮＡ、油浸対物）がなくなり観察の自由度を広げることができる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００３６】
（第１の実施の形態）
図１は本発明が適用される顕微鏡システムの概略構成を示している。
【００３７】
この場合、本実施の形態では、光走査手段を介して試料にレーザ光を照射する第１のレーザ光源とエバネッセント照明を行なう第２のレーザ光源を有する単一のレーザ光源ユニットを備えており、このレーザ光源ユニットから２本のシングルモードファイバにより、２つのポート、具体的にはエバネッセント照明を行なうための落射投光管と、光走査手段および共焦点観察手段を備えた走査ユニットとにそれぞれレーザ光を供給する構成としている。
【００３８】
図において、１はレーザ光源ユニットで、このレーザ光源ユニット１は、４８８ｎｍのレーザ光を発振するＡｒレーザ２と、５４３ｎｍのレーザ光を発振するグリーンヘリウムネオンレーザ３を有している。
【００３９】
グリーンヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４が配置されている。また、Ａｒレーザ２からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４で反射されるレーザ光との交点上にダイクロイックミラー５が配置されている。ダイクロイックミラー５は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、Ａｒレーザ２からのレーザ光を透過し、反射ミラー４で反射されるレーザ光を反射するようになっている。つまり、ここでのダイクロイックミラー５は、５４３ｎｍのレーザ光を反射し、４８８ｎｍのレーザ光を透過するような特性を有している。
【００４０】
ダイクロイックミラー５により合成されたレーザ光の光路上には、ビームスプリッタ７が配置されている。ビームスプリッタ７は、ダイクロイックミラー５により合成された光路を走査型レーザ顕微鏡照明用の光路６ａとエバネツセント照明用の光路６ｂの２つに分割するようにしている。ここでのビームスプリッタ７は、４８８ｎｍ、５４３ｎｍの両方の波長域で、走査型レーザ顕微鏡照明用の光路６ａに対して３０％反射し、エバネッセント照明用の光路６ｂに対して７０％透過するような特性を有している。このビームスプリッタ７での、反射と透過の比率は、一例であって、これ以外の比率に切換えることのできる構成とすることもできる。
【００４１】
ビームスプリッタ７により分離された光路６ａ、６ｂ上には、波長選択用の音響光学素子（ＡＯＴＦ）８ａ、８ｂが各別に配置されている。
【００４２】
走査型レーザ顕微鏡照明用の光路６ａには、第１の光ファイバとしてのシングルモードファイバ９ａの入射端が配置され、シングルモードファイバ９ａを介して走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光を走査ユニット１０に導くようになっている。
【００４３】
一方、エバネッセント照明用の光路６ｂには、第２の光ファイバとしてのシングルモードファイバ９ｂの入射端が配置され、シングルモードファイバ９ｂを介してエバネッセント照明用のレーザ光を落射投光管１１に導くようになっている。
【００４４】
走査ユニット１０には、シングルモードファイバ９ａから出射されるレーザ光を導入する可視レーザ光導入ポート１０ａが設けられている。また、可視レーザ光導入ポート１０ａより出射されるレーザ光の光路上には、コリメートレンズ１２、励起ダイクロイックミラー１３が配置されている。
【００４５】
コリメートレンズ１２は、可視レーザ光導入ポート１０ａより出射されるレーザ光をコリメート光に変換するものである。励起ダイクロイックミラー１３は、レーザ光の波長（４８８ｎｍ、５４３ｎｍ）を反射し、後述する試料２５から発する蛍光の波長領域（５００〜５３０ｎｍ及び５６０〜６５０ｎｍ）を透過するような特性を有している。
【００４６】
励起ダイクロイックミラー１３の反射光路上には、集光位置制御手段としての波面変換素子１４と光走査手段としてのガルバノミラーユニット１５が配置されている。
【００４７】
波面変換素子１４は、例えば、特許文献３や特許文献４に開示されるようにレーザ光の波面を変換可能にしたものである。つまり、素子自体に電圧を印加することで反射面を微小に変化させることのできるもので、この反射面を変化させ光学的なパワーを可変させることにより、後述するように試料２５内の光軸方向のビーム集光位置の移動を、対物レンズ２４と試料２５の機械的な位置関係を移動させることなく可能にしたものである。また、その際に生じる収差を相殺することも可能にしている。
【００４８】
図３は、波面変換素子１４の動作状態を説明するもので、反射面１４ａが図示実線のように平坦になっている場合は、光学的なパワーがなく、反射面１４ａを反射したレーザ光は、実線１４ｃのように平行光のまま出射され、電圧を印加して反射面１４ａを図示破線のように微小に変形（湾曲）させると、この変形された反射面１４ｂを反射したレーザ光は、破線１４ｄのように若干の発散光となって出射される。
【００４９】
波面変換素子１４の反射光路には、ガルバノミラーユニット１５が配置されている。ガルバノミラーユニット１５は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のガルバノミラー１５ａ、１５ｂを有し、これらのガルバノミラー１５ａ、１５ｂによりレーザ光を２次元方向に走査するようになっている。
【００５０】
一方、上述した励起ダイクロイックミラー１３の透過光路上には、共焦点観察手段を構成する共焦点レンズ１６、反射ミラー１７、共焦点ピンホール１８、励起レーザ光をカットし検出したい蛍光波長領域を取出すバリアフィルタ１９および光検出器２０が配置されている。ここでの光検出器２０には、例えばフォトマルチプライアが用いられる。
【００５１】
走査ユニット１０には、瞳投影レンズユニット２１を介して顕微鏡本体、ここでは倒立顕微鏡本体２２が接続されている。倒立顕微鏡本体２２は、テーブル５０上に形成した穴部５０ａに底面ポート２２ａを形成しており、この底面ポート２２ａに瞳投影レンズユニット２１を介して走査ユニット１０が接続されるようになっている。
【００５２】
そして、走査ユニット１０のガルバノミラーユニット１５より出射されるレーザ光の光路上には、瞳投影レンズユニット２１内の瞳投影レンズ２１ａ、倒立顕微鏡本体２２内の結像レンズ２３、対物レンズ２４が配置されている。
【００５３】
対物レンズ２４の先端レンズ２４ｂの集光位置には、蛍光標識された試料２５が配置されている。試料２５は、図２に示すようにステージ２６上に配置されたシャーレ２７に貼り付けられたカバーガラス２８に固定されている。この場合、シャーレ２７内には試料２５を保護するための液体、例えば水が満たされている。また、対物レンズ２４の先端レンズ２４ｂとカバーガラス２８の間には高いＮＡを確保してエバネッセント照明による全反射を起こさせるようにイマージョンオイルが充填されている。
【００５４】
一方、上述した落射投光管１１には、シングルモードファイバ９ｂから出射されるレーザ光を導入するレーザ光導入ポート１１ａが設けられている。また、レーザ光導入ポート１１ａより出射されるレーザ光の光路上には、コリメートレンズ３１、集光レンズ３２が配置されている。
【００５５】
コリメートレンズ３１は、レーザ光導入ポート１１ａより出射されるレーザ光をコリメート光に変換するものである。集光レンズ３２は、コリメートレンズ３１からのコリメート光を対物レンズ２４の瞳位置２４ａに集光するものである。
【００５６】
集光レンズ３２と対物レンズ２４の間（結像レンズ２３と対物レンズ２４との間）の光路には、エバネッセント用励起ダイクロイックミラー３３が配置されている。エバネッセント用励起ダイクロイックミラー３３は、走査ユニット１０からのレーザ光と落射投光管１１からのレーザ光のそれぞれが対物レンズ２４に向かう途中で、それぞれの光軸が同軸を導くように光路合成するもので、集光レンズ３２からのエバネツセント照明用のレーザ光を反射し、エバネッセント照明により試料２５より発する蛍光を透過し、その他の走査ユニット１０からの走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光の波長およびそのレーザ光の照射により試料２５から発せられる蛍光を透過するような特性を有している。
【００５７】
エバネッセント用励起ダイクロイックミラー３３はエバネッセント照明および走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光の波長、試料２５より発せられる蛍光の波長に応じて複数個用意されており、これらエバネッセント用励起ダイクロイックミラー３３は、ターレット３３１内に収容され、図示しない電動切替機構により選択的に光路上に切換えできるようになっている。
【００５８】
結像レンズ２３とエバネッセント用励起ダイクロイックミラー３３の間の光路には、分離ダイクロイックミラー３５が配置されている。この分離ダイクロイックミラー３５は、エバネッセント照明により発する試料２５からの蛍光を反射し、その他の走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光の波長およびそのレーザ光の照射により試料２５から発せられる蛍光の波長を透過するような特性を有している。
【００５９】
分離ダイクロイックミラー３５は、図示しない電動移動機構により光路上から退避可能となっており、走査型レーザ顕微鏡による照明、観察のみを行なう時は光路上から退避させる。
【００６０】
分離ダイクロイックミラー３５の反射光路には、フィルタ手段としてのバリアフィルタ３６、結像レンズ３７および撮像手段としてのＣＣＤ検出器３８が配置されている。
【００６１】
バリアフィルタ３６は、エバネッセント照明および走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光のそれぞれの波長をカットし、エバネッセント照明により試料２５より発する蛍光の波長域を透過するような特性を有している。結像レンズ３７は、バリアフィルタ３６を通過したエバネッセント照明により発する試料２５からの蛍光をＣＣＤ検出器３８の受光面３８ａに結像させるものである。ＣＣＤ検出器３８は、受光面３８ａに結像された蛍光を撮像するものである。
【００６２】
なお、３９は制御ユニットで、この制御部３９は、エバネッセント用励起ダイクロイックミラー３３の電動切り換え、分離ダイクロイックミラー３５の光路への挿脱、ＣＣＤ検出器３８での撮像、走査ユニット１０内のガルバノミラーユニット１５、波面変換素子１４、光検出器２０の制御、レーザ光源ユニット１内の走査型レーザ顕微鏡、エバネツセントの各照明用レーザ波長の選択を行なうＡＯＴＦ８ａ、８ｂのそれぞれの制御を行なう。
【００６３】
次に、このように構成した第１の実施の形態の動作について説明する。
【００６４】
この実施の形態では、Ａｒレーザ２の４８８ｎｍのレーザ光によりエバネッセント照明を行い、グリーンヘリウムネオンレーザ３の５４３ｎｍのレーザ光により走査型レーザ顕微鏡の照明を行なうものとする。
【００６５】
この場合、エバネッセント用励起ダイクロイックミラー３３は、４８８ｎｍの波長を反射し、５００〜６５０ｎｍの波長域を透過する特性のものが用いられ、分離ダイクロイックミラー３５は、５００〜５３０ｎｍの波長域を反射し、５４３〜６５０ｎｍの波長域を透過する特性のものが用いられる。また、バリアフィルタ３６は、５００〜５３０ｎｍの波長域の蛍光を透過し、４８８ｎｍの波長と５４３〜７００ｎｍの波長域をカットする特性のものが用いられ、走査ユニット１０内のバリアフィルタ１９は、４８８〜５４３ｎｍの波長域をカットし、５６０〜６５０ｎｍの波長域を透過する特性のものが用いられる。
【００６６】
まず、エバネッセント照明を用いた蛍光観察について説明する。
【００６７】
この場合、Ａｒレーザ２により４８８ｎｍのレーザ光が発振すると、このレーザ光は、ＡＯＴＦ８ｂにより波長選択され、エバネッセント照明用としてシングルモードファイバ９ｂにより落射投光管１１に導かれる。
【００６８】
落射投光管１１に導入されたレーザ光は、コリメートレンズ３１によりコリメートされ、集光レンズ３２により対物レンズ２４の瞳位置２４ａの端に集光する。この場合、図２に示すように、対物レンズ２４の先端レンズ２４ｂは、カバーガラス２８の試料側界面２８ａに近接した試料２５領域にピントが合わせられている。これにより、対物レンズ２４の瞳位置２４ａの端に集光したレーザ光２４ｃ（斜線部）は、先端レンズ２４ｂにより平行光となり、ある角度で斜め方向からカバーガラス２８の試料側界面２８ａを照射される。この角度は、レーザ光２４ｃが、試料側界面２８ａで全反射を起こす角度に設定されており、全反射したレーザ光２４ｃは、図示２４ｃ’方向に抜ける。このとき、レーザ光のごく一部がカバーガラス２８の試料側界面２８ａから試料２５側へにじみ出し、この試料側界面２８ａから試料２５の深さ方向へにじみ出る光がエバネッセント光となる。この試料２５の深さ方向へにじみ出す量は、光源の波長程度（ここでは５００ｎｍ）となる。
【００６９】
従って、このようなエバネッセント照明により試料２５より発する蛍光の範囲は、深さ方向に波長幅程度となり、検出される蛍光画像は、バックグラウンドが少なくＳ／Ｎの良い観察が可能となる。このところの詳細な説明は、例えば、特許文献２に記載されている。
【００７０】
また、４８８ｎｍのエバネッセント照明用のレーザ光により試料２５から発せられる蛍光（５００〜５３０ｎｍ）は、対物レンズ２４の中心を通り、エバネッセント用励起ダイクロイックミラー３３を透過し、分離ダイクロイックミラー３５で反射される。そして、バリアフィルタ３６により、エバネッセント照明により試料２５から発した蛍光波長のみが透過され、ＣＣＤ検出器３８で撮像される。
【００７１】
次に、走査型レーザ顕微鏡照明を用いた蛍光観察について説明する。
【００７２】
この場合、グリーンヘリウムネオンレーザ３により５４３ｎｍのレーザ光が発振すると、このレーザ光は、ＡＯＴＦ８ａにより、波長選択され、走査型レーザ顕微鏡の照明用としてシングルモードファイバ９ａにより走査ユニット１０に導かれる。
【００７３】
走査ユニット１０に導入された５４３ｎｍのレーザ光は、コリメートレンズ１２によりコリメートされ、励起ダイクロイックミラー１３により反射される。
【００７４】
励起ダイクロイックミラー１３で反射されたレーザ光は、波面変換素子１４を反射され、ガルバノミラーユニット１５に入射する。そして、瞳投影レンズ２１ａ、結像レンズ２３を通り、分離ダイクロイックミラー３５、エバネッセント用励起ダイクロイックミラー３３を透過し、対物レンズ２４に入射し、試料２５内に結像する。
【００７５】
そして、試料２５に５４３ｎｍのレーザ光を照射すると、試料２５より発せられる蛍光（５６０〜６５０ｎｍ）波長は、上述の照明光の経路を逆方向に進み、走査ユニット１０内の励起ダイクロイックミラー１３を透過し、共焦点レンズ１６、反射ミラー１７を介して共焦点ピンホール１８上に集光する。この場合、共焦点ピンホール１８は、集光する光の回折限界程度に絞られている。これにより、試料２５より発せられる蛍光は、試料２５の焦点面以外からの光分をカットすることができる。そして、共焦点ピンホール１８を透過した蛍光（５６０〜６５０ｎｍ）はバリアフィルタ１９を透過し、光検出器２０により検出される。この場合、光検出器２０で検出される出力は、試料２５のスライス画像を取得するために用いられる。
【００７６】
次に、波面変換素子１４により、試料２５内での走査型レーザ顕微鏡の照明用レーザ光の集光位置を光軸方向に可変制御する場合を説明する。
【００７７】
この場合、図３に示す実線のように波面変換素子１４の反射面１４ａが平坦になっている場合は、光学的なパワーがなく、波面変換素子１４を反射したレーザ光は、図示実線１４ｃのように平行光のまま、ガルバノミラーユニット１５に入射し、瞳投影レンズ２１ａ、結像レンズ２３により、光束径が拡大されたのち、対物レンズ２４に平行光のまま入射する。この時のレーザ光が図２に示す実線２４ｅであり、試料２５内に結像する位置は、対物レンズ２４の焦点位置と一致し、エバネッセント照明により蛍光を観察するピント面と同一である。
【００７８】
次に、波面変換素子１４に電圧を印加すると、反射面１４ａが図示破線のように微小に変形（湾曲）し、この変形した反射面１４ｂを反射したレーザ光は、破線１４ｄのように若干の発散光となって出射される。
【００７９】
この発散光１４ｄは、対物レンズ２４に入射する時は、図２に示す点線の発散光２４ｆのようになり、試料２５内でカバーガラス２８の試料側界面２８ａより内側に入った位置２５ｆに集光する。
【００８０】
そして、試料２５内の位置２５ｆ部分から発した光は、上述の照明光と同じ経路を逆方向に進み、波面変換素子１４に戻り、波面変換素子１４の変形した反射面１４ｂにより、平行光に変換されて励起ダイクロイックミラー１３に戻り透過する。そして、共焦点レンズ１６、反射ミラー１７、共焦点ピンホール１８、バリアフィルタ１９を通り、光検出器２０で、試料２５内の位置２５ｆから発せられた光が検出される。
【００８１】
以下、同様にして、波面変換素子１４への印加電圧を可変して、反射面の形状を任意に変えることにより、走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光の試料２５内の光軸方向の集光位置を任意に変えることができるようになり、これらの焦点位置から発した光を検出することができる。
【００８２】
従って、このようにすれば、試料２５にエバネッセント照明を行なう条件を満足させるような対物レンズ２４と試料２５の機械的な位置関係を固定した状態で、光軸方向の観察断面の可変制御を含む走査型レーザ顕微鏡による共焦点観察とエバネッセント照明による蛍光観察の両方を行なうことができる。このことは、走査型レーザ顕微鏡側の光軸方向の焦点位置を積極的に変化させても、エバネッセント照明による蛍光観察との使い勝手がすぐれた顕微鏡システムを実現できる。また、波面変換素子１４の反射面形状の切換えは、例えば、特許文献３に開示されるように、数ＭＨｚと高速にできるので、走査型レーザ顕微鏡による試料２５内部の共焦点観察と、エバネッセント照明による細胞の表面の蛍光観察を高速で切り換えながら行なうことも可能となる。
【００８３】
このとき、エバネッセント照明による蛍光を撮像するＣＣＤ検出器３８での撮像タイミング、ガルバノミラーユニット１５でのレーザ光の２次元走査、波面変換素子１４での反射面形状の切り換え、ＡＯＴＦ８ａ、８ｂの波長選択などの各制御は、制御部３９により同期させて行なう必要がある。例えば、走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光を試料２５内の位置２５ｆに焦点を合わせて、この位置２５ｆで面方向の一部領域を観察するような場合は、波面変換素子１４を、図３の点線に示す反射面１４ｂに変形させるとともに、光軸に直交する面内の試料２５の走査位置を指定するためにガルバノミラーユニット１５のガルバノミラー１５ａ、１５ｂの振り角を変更して走査する。また、光検出器２０は、ガルバノミラーユニット１５の振り角（走査位置）に対応する光の強度を検出するように制御する。また、ＡＯＴＦ８ａは、５４３ｎｍの光を選択し、ＡＯＴＦ８ｂでは、４８８ｎｍと５４３ｎｍともに選択しないようにする。
【００８４】
次に、エバネッセント照明による蛍光観察に切り換える時は、ＡＯＴＦ８ａは、４８８ｎｍ、５４３ｎｍのレーザ光をともに選択しないで、ＡＯＴＦ８ｂにより４８８ｎｍのレーザ光を選択する。そして、ＣＣＤ検出器３８により撮像を行なう。ここで、波面変換素子１４の切換えのみでなく、ＡＯＴＦ８ａ、８ｂの波長選択も数ＭＨｚと高速でできるので、双方の観察切り換えが高速にできる。
【００８５】
このようにして、エバネッセント照明による蛍光観察と走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光による共焦点観察を同期させて高速に切り換えることや、同時に観察することが容易に実現できる顕微鏡システムを実現できる。
【００８６】
なお、第１の実施の形態は、変形例として、走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光を共焦点観察に使用するのではなく、試料２５として細胞を用いる場合は、この細胞に光刺激を与えるために利用することが可能である。この場合は、試料２５内部の１点に光刺激を与えて、その時の細胞表面の蛍光量の経時変化をエバネッセント照明による蛍光観察によりタイムラプス観察することになる。この時の走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光による光刺激の位置の移動は、波面変換素子１４とガルバノミラーユニット１５の制御により高速で行なうことが可能である。この場合、ビームスプリッタ７により分離される光路６ａ、６ｂへのレーザ光の比率を変えることで、走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光の強度を最適な強度に調整することもできる。
【００８７】
また、上述した第１の実施の形態では、走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光とエバネッセント照明用のレーザ光の光源、つまりＡｒレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３を共通のレーザ光源ユニット１に収容し、これらＡｒレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３から発せられたレーザ光をビームスプリッタ７により２光路を分けて２本のシングルモードファイバ９ａ、９ｂに導入し、それぞれ照明光路に導いているが、Ａｒレーザ２とグリーンヘリウムネオンレーザ３を別々に設けるようにしても良い。この場合は、ビームスプリッタ７による光量減が生じない。
【００８８】
さらに、走査型レーザ顕微鏡の照明用のレーザ光とエバネッセント照明用のレーザ光の光源を１個のレーザ光源で実現するようにしてもよい。この場合は、走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光とエバネッセント照明用のレーザ光の波長が同じになるため、走査型レーザ顕微鏡による共焦点観察とエバネッセント照明による蛍光観察を交互に切換えて行なうようにすればよい。
【００８９】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。
【００９０】
図４は、本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００９１】
この第２の実施の形態は、走査型レーザ顕微鏡の照明用レーザ光として、２光子励起を試料に生じさせることができるＩＲパルスレーザを追加している。
【００９２】
ここでの２光子励起の走査型レーザ顕微鏡については、例えば、特許文献５に開示されており、赤外の波長で照明するので試料に対する照明光の浸透性が良く、照明光が試料の深部まで到達するので厚みのある試料に適していること、２光子励起が生じる位置が高い瞬間的エネルギーが集まるフォーカス位置に限定されるので、厚みのある試料の内部の一点に限定して蛍光や光化学反応を生じさせることが可能である等の特徴がある。この光化学反応の中には、ケージドのような、試料内の化学物質の局所的放出なども含まれる。通常、ケージドコンパウンドの解除には、波長が短くエネルギーが高い、紫外光を用いるが、２光子励起では、光子が２つ集まることで、エネルギーが低い、ＩＲパルスレーザを用いることが可能である。
【００９３】
図において、４１はＩＲパルスレーザユニットで、このＩＲパルスレーザユニット４１は、７２０ｎｍのパルス光を発振するパルスレーザ光源本体４２とレーザ照射の有無を高速で切り換えることができる音響光学モジュレータ（以下ＡＯＭ）４３から構成されている。このＡＯＭ４３は、制御部３９により制御される。
【００９４】
ＡＯＭ４３からの出射光の光路には、反射ミラー４４が配置されている。
【００９５】
反射ミラー４４の反射光路には、走査ユニット１０の第２のポート１０ｂが配置されている。走査ユニット１０の第２のポート１０ｂには、集光位置制御手段として、反射ミラー４４からのレーザ光のビーム径を適切な径に変換するビームエクスパンダユニット４５が取付けられている。
【００９６】
ビームエクスパンダユニット４５は、図５に示すようにレーザビーム径を光軸上で適切なビーム径に変換する手段を構成するレンズ４５ａ、４５ｂを有している。また、これらレンズ４５ａ、４５ｂのうち、レンズ４５ａの位置を光軸方向、つまり図示矢印４５ｃ方向に図示しない電動移動機構により移動可能になっていて、このレンズ４５ａの移動により、ビームエクスパンダユニット４５より出射されるビームのコリメート具合を可変できるようにもなっている。
【００９７】
ビームエクスパンダユニット４５からの出射光の光路には、反射ミラー４６が配置されている。また、反射ミラー４６の反射光路には、光路合成ダイクロイックミラー４７が配置されている。
【００９８】
光路合成ダイクロイックミラー４７は、コリメートレンズ１２と励起ダイクロイックミラー１３との間に光路に挿入されたもので、反射ミラー４６から入射される７２０ｎｍの波長を反射するとともに、４８８ｎｍ、５４３ｎｍの波長を透過し、反射ミラー４６の反射光路を可視レーザ光導入ポート１０ａからの可視光レーザ（４８８ｎｍ、５４３ｎｍ）の光路と結合するようにしている。
【００９９】
なお、このようなＩＲパルスレーザを使用した場合、２光子励起による蛍光断層像を取得することができるが、この場合の２光子励起現象は、結像位置のみで発生することで、共焦点ピンホールを不要にできるので、瞳投影レンズ２１ａと結像レンズ２３の間の光路から蛍光を取り出し、フォトマルチプライアなどの光検出器で検出するようにすればよい。
【０１００】
その他は、上述した図１と同様である。
【０１０１】
このようにした第２の実施の形態では、走査型レーザ顕微鏡の照明用レーザ光として、パルスレーザ光源本体４２からの波長７２０ｎｍのパルスレーザを用いて、試料２５の厚み方向、面方向の３次元的な任意の位置にケージド解除を起こさせながら、レーザ光源ユニット１に搭載されたＡｒレーザ２の波長（４８８ｎｍ）を用いてエバネッセント照明による蛍光観察を行なうことで、試料２５である細胞表面の経時的変化を観察することを可能にしている。
【０１０２】
次に、このように構成した第２の実施の形態の動作について説明する。
【０１０３】
この場合、エバネッセント用励起ダイクロイックミラー３３は、４８８ｎｍを反射し、５００〜９００ｎｍの波長域を透過する特性のものが用いられ、図示しない電動切替機構により選択的に光路上に切り換えできるようになっている。また、分離ダイクロイックミラー３５は、５００〜６５０ｎｍの波長域を反射し、７２０ｎｍの波長を透過する特性のものが用いられる。バリアフィルタ３６は、５００〜６５０ｎｍの波長域の蛍光を透過し、４８８ｎｍ、７２０ｎｍの波長をカットする特性のものが用いられる。また、走査ユニット１０内の励起ダイクロイックミラー１３ｂは、７２０〜９００ｎｍの波長域を反射し、５００〜６５０ｎｍの波長域を透過する特性のものが用いられる。
【０１０４】
いま、パルスレーザ光源本体４２から７２０ｎｍのパルスレーザが発振すると、このパルスレーザは、ＡＯＭ４３、反射ミラー４４を介して走査ユニット１０の第２のポート１０ｂに入射される。
【０１０５】
第２のポート１０ｂに導入されたパルスレーザ光は、ビームエクスパンダユニット４５を透過して、反射ミラー４６、光路合成ダイクロイックミラー４７を介して、励起ダイクロイックミラー１３で反射される。
【０１０６】
さらに、波面変換素子１４で反射され、ガルバノミラーユニット１５、瞳投影レンズ２１ａ、結像レンズ２３を通り、分離ダイクロイックミラー３５、エバネッセント用励起ダイクロイックミラー３３を透過し、対物レンズ２４により、試料２５内に集光される。
【０１０７】
これによりき試料２５内のパルスレーザ光の集光点において、試料２５が２光子励起され、ケージドが解除される。ケージド解除する試料２５内の位置は、ビームエクスパンダユニット４５のレンズ４５ａの図５に示す矢印４５ｃ方向の移動制御により試料２５の厚み方向である光軸方向に任意に可変でき、さらにガルバノミラーユニット１５の走査制御により試料２５内の光軸に直行する面内で任意に可変できる。
【０１０８】
ここで、ビームエクスパンダユニット４５の動作を、さらに図５および図２を用いて説明する。
【０１０９】
いま、ビームエクスパンダユニット４５内のレンズ４５ａを出射したビームが平行光（図示実線）の状態であれば、このときの対物レンズ２４には、図２の実線２４ｅに示すレーザ光が入射し、先端レンズ２４ｂによりカバーガラス２８と試料２５の界面２８ａ付近に集光する。一方、レンズ４５ａの位置を図示しない電動移動機構により、点線の位置４５ｄに移動すると、ビームエクスパンダユニット４５を出射するレーザ光のコリメート具合が変化し、破線４５ｆに示すように、若干の発散光となる。
【０１１０】
この発散光は、対物レンズ２４に入射する時は、図２に示す点線の発散光２４ｆのようになり、試料２５内でカバーガラス２８の試料側界面２８ａより内側に入った位置２５ｆに集光する。このようにビームエクスパンダユニット４５を制御することで試料２５内の光軸方向の集光位置を可変できる。
【０１１１】
このようにすれば、ビームエクスパンダユニット４５とガルバノミラーユニット１５の制御により、試料２５内の集光位置、つまり、パルスレーザを照射し、２光子励起によりケージド解除をさせることのできる位置を３次元的に自由に選択できる。
【０１１２】
なお、厳密には、対物レンズ２４に入射する光が発散光になると、波面収差が生じ、結像性能が劣化するが、問題となるレベルではない。特に、第２の実施形態では試料２５内に光化学反応を起させるために、走査ユニット１０からの照明光を使用しているので、検出側の性能劣化を考慮する必要がない。
【０１１３】
次にエバネッセント照明による蛍光観察の動作について説明する。
【０１１４】
この場合、レーザ光源ユニット１内のＡｒレーザ２より４８８ｎｍのレーザ光が発振すると、この４８８ｎｍのレーザ光は、ＡＯＴＦ８ｂにより、波長選択されシングルモードファイバ９ｂにより落射投光管１１に導かれる。そして、コリメートレンズ３１によりコリメートされ、集光レンズ３２により対物レンズ２４の瞳位置２４ａの端に集光する。この時、カバーガラス２８の試料側界面２８ａに近接した試料領域に対物レンズ２４のピントが合わせられている。これにより、カバーガラス２８の界面からから試料側へにじみ出たエバネッセント光により蛍光が発する。この蛍光の発する範囲が深さ方向に波長幅程度でありバックグラウンドの少なくＳ／Ｎの良い観察が可能となることは第１の実施の形態で述べたのと同じである。
【０１１５】
４８８ｎｍのエバネッセント照明により試料２５から発した蛍光（５００〜５３０ｎｍ）は対物レンズ２４の中心を通り、エバネッセント用励起ダイクロイックミラー３３を透過し、分離ダイクロイックミラー３５で反射される。そして、ＣＣＤ検出器３８によりエバネッセント照明による蛍光は撮像される。
【０１１６】
従って、このようにしても、走査型レーザ顕微鏡照明用の７２０ｎｍのレーザ光による試料２５の照射位置を、対物レンズ２４と試料２５の機械的な位置関係を変更せずに、ガルバノミラーユニット１５とビームエクスパンダユニット４５により自由に選択できるので、走査型レーザ顕微鏡照明用の７２０ｎｍのレーザ光により試料２５の深部の一部に光刺激を与え、２光子励起によりケージド解除を起させながら、エバネッセント照明による観察を行なうことができる。つまり、ビームエクスパンダユニット４５によるレーザ光の試料２５面上の集光位置の制御およびガルバノミラーユニット１５によるレーザ光の試料２５上での２次元走査の制御の少なくとも一方と、ＣＣＤ検出器３８による蛍光の撮像を同期させて行なうことにより、２光子励起によりケージド解除を起させながら、エバネッセント照明による観察を行なうことができる。
【０１１７】
この場合、７２０ｎｍのレーザ光の照射のタイミングをＡＯＭ４３により高速で制御できるので、例えば、走査ユニット１０からの７２０ｎｍのレーザ光によるケージド解除を起こす前後の期間で、エバネッセント照明による蛍光観察をＣＣＤ検出器３８で連続的に撮像したり、走査ユニット１０からの７２０ｎｍのレーザ光の照射を所定の周期で繰り返し、これらの間の期間で、エバネッセント照明による蛍光観察をＣＣＤ検出器３８で複数回ずつ撮像したりすることなどができる。こうすれば、例えば試料２５の深部のケージド解除による試料２５表面の経時変化を、リアルタイムで、高いＳ／Ｎで観察することができる。このような同期動作では、走査ユニット１０からの７２０ｎｍのレーザ光の照射タイミングとＣＣＤ検出器３８による撮像タイミングが必ずしも同時である必要はない。
【０１１８】
また、前述の説明では、ケージド解除を行なう試料２５内のポイントを１箇所としているが、複数のポイントとしてもよい。この場合、複数のポイントの切り換えは、試料２５の面内に対しては、ガルバノミラーユニット１５、光軸方向に対しては、ビームエクスパンダユニット４５、照射のタイミング制御に対しては、ＡＯＭ４３を、それぞれ、ＣＣＤ検出器３８での撮像に同期させて制御することにより行なう。
【０１１９】
こうすれば、試料２５内の複数のポイントに順次レーザ光を照射し、ケージド解除しながら、試料２５表面の経時変化を高いＳ／Ｎで観察できる走査型レーザ顕微鏡システムを得られる。また、エバネッセント照明およびＣＣＤ検出器３８による撮像と、走査ユニット１０からの７２０ｎｍのレーザ光の照射は、必ずしも同時である必要はなく、ＡＯＭ４３により７２０ｎｍのレーザ光の照射時間のタイミングを制御することで、ＣＣＤ検出器３８の各フレーム撮像の間の時間を狙って行なうことも可能である。この場合は、ＣＣＤ検出器３８の光路にあるバリアフィルタ３６の特性として、７２０ｎｍの波長の光をカットする必要がなくなり、製造が容易となるだけでなく取込む蛍光波長領域の透過率が向上するなどの利点がある。
【０１２０】
なお、この第２の実施の形態についても、前述の内容に限定されることはなく、さまざまな変形例が考えられる。例えば、分離ダイクロイックミラー３５、バリアフィルタ３６、走査ユニット１０内の励起ダイクロイックミラー１３、バリアフィルタ１９の特性を考慮することで、上述したシステムに、第１の実施の形態で説明したレーザ光源ユニット１から発振する５４３ｎｍの走査型レーザ顕微鏡の照明用レーザ光を用いることで共焦点観察を組み込むことも可能である。この場合、走査ユニット１０からの５４３ｎｍの照明用レーザ光の試料２５への照射タイミングと、４８８ｎｍのエバネッセント照明用のレーザ光の試料２５への照射タイミングを同期させるようにする。これにより、共焦点観察とエバネッセント照明による観察は同期して行われることとなり、光検出器２０での光検出とＣＣＤ検出器３８による蛍光の撮像のタイミングも同期して行われる。
【０１２１】
この場合、分離ダイクロイックミラー３５は、５００〜５３０ｎｍの波長域を反射し、５４３〜７２０ｎｍの波長域を透過する特性のものが用いられ、バリアフィルタ３６は、５００〜５３０ｎｍの波長域の蛍光を透過し、４８８ｎｍの波長と、５４３〜７２０ｎｍの波長域をカットする特性のものが用いられる。また、走査ユニット１０内の励起ダイクロイックミラー１３は、５４３ｎｍ、７２０ｎｍの波長は反射し、５６０〜６５０ｎｍの波長域を透過する特性のものが用いられ、バリアフィルタ１９は、４８８〜５４３ｎｍ、７２０ｎｍの波長をカットし、５６０〜６５０ｎｍの波長域を透過する特性のものが用いられる。
【０１２２】
なお、レーザ光源ユニット１からの５４３ｎｍのレーザ光による試料２５内部の共焦点観察を行なう場合は、試料２５内の集光位置の光軸方向の可変を波面変換素子１４で行なうようになることは、第１の実施の形態で説明したとおりである。
【０１２３】
以上の構成により、パルスレーザによる試料内部のケージド解除、レーザ光源ユニット１からの５４３ｎｍのレーザ光による試料２５内部の共焦点観察、レーザ光源ユニット１からの４８８ｎｍのレーザ光を用いたエバネッセント照明による試料２５表面の蛍光観察が、対物レンズ２４と試料２５の機械的な位置関係を固定した状態で、同時、又は、切換えて行なうことが可能な顕微鏡システムとなる。
【０１２４】
また、ＩＲパルスレーザを２光子励起による光化学反応を試料内に生じさせるために使用したが、例えば、ＩＲパルスレーザの波長を８００ｎｍ位に設定して、２光子励起により生じる試料２５内部の蛍光断層像の取得とエバネッセント照明による細胞表面の観察を組合せても良い。また、７２０ｎｍのパルスレーザの照射位置の光軸方向の可変をビームエクスパンダユニット４５で行なったが、波面変換素子１４の制御で行なっても良い。この場合は、ビームエクスパンダユニット４５によるものより高速切換えが可能となる。
【０１２５】
また、ＣＣＤ検出器３８の撮像をエバネッセント照明により生じる蛍光観察に限定しているが、これをニポウディスクや縞ディスクなどのディスクの回転による蛍光観察に置き換えても良い。
【０１２６】
図６は、このようなディスクを用いて蛍光観察系を可能にした顕微鏡システムの要部の概略構成を示すものである。この場合、照明光源としては、別個に水銀灯が用意される。この照明光源から照明光が出射すると、ビームスプリッタ６１に入射する。そして、ビームスプリッタ６１を透過した光は、モータにより一定速度で回転しているディスク（ニポウディスクや縞ディスク）６２に入射する。ディスク６２を透過した光は、結像レンズ６３に入射する。結像レンズ６３を通った光は、対物レンズ２４の瞳上で結像し試料２５を照射する。また、試料２５から戻った光は対物レンズ２４を通って平行光となり、結像レンズ６３を通ってディスク６２上で結像する。そして、ディスク６２から出た光は、ビームスプリッタ６１で反射し、撮像手段としてのＣＣＤ検出器６４により共焦点像として撮像される。つまり、ニポウディスクや縞ディスクの回転により取得される観察像は、細胞のスライス面をＣＣＤ検出器６４で撮像するものである。そして、このスライス面に対物レンズ２４の焦点位置を固定しておいて、走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光の集光位置を波面変換素子１４やガルバノミラーユニット１５を用いて選択するようにすれば、ＣＣＤ検出器６４による撮像と走査型レーザ顕微鏡による走査観察を同時または切換えて行なうことが可能になる。
【０１２７】
なお、上述では２光子励起により試料内に光化学反応を生じさせる場合と、走査型レーザ顕微鏡照明用のレーザ光による共焦点観察とを切換えることで可能な場合を述べたが、共焦点観察を行なわないのであれば、波面変換素子１４を省略できる。
【０１２８】
（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態を説明する。
【０１２９】
図７は、本発明の第３の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【０１３０】
第１の実施の形態では倒立顕微鏡を用いて、エバネッセント照明は落射投光管経由で対物レンズを介して行っていたが、第３の実施の形態では、正立顕微鏡を用いて、エバネッセント照明は試料を挟んで対物レンズの対向側にあるコンデンサユニット経由で行っている点が異なるところである。
【０１３１】
図において、５１は正立顕微鏡本体で、対物レンズ２４が固定されたレボアーム５２が、正立顕微鏡本体５１に対して、光軸方向に微動移動可能に連結されている。
【０１３２】
対物レンズ２４と光軸上で対向する位置には、コンデンサレンズ５３ａが配置されている。コンデンサレンズ５３ａは、コンデンサレンズユニット５３内に設けられている。コンデンサレンズユニット５３は、レボアーム５２と図示しないガイド機構により、連結されており、レボアーム５２に対して、光軸方向に移動可能に構成されている。
【０１３３】
対物レンズ２４とコンデンサレンズ５３ａの間には、図示しない支持部材により支持されたステージ５４が配置されている。ステージ５４上には、試料２５が載置されている。この場合、試料２５は、図８に示すように穴明きシャーレ２７の穴部に固着されたカバーガラス２８の上に載っており、対物レンズ２４の先端レンズ２４ｂと試料２５の間はシャーレ２７に入っている水２７ａにより充填されている。また、カバーガラス２８の裏側と、コンデンサレンズ５３ａの間はカバーガラス２８と水で充填された試料２５の界面で全反射を起させるためにイマージョンオイルが充填されている。
【０１３４】
コンデンサレンズユニット５３には、エバネッセント照明ユニット５５が取り付けられている。エバネッセント照明ユニット５５は、エバネッセント照明用のシングルモードファイバ９ｂの出射端に接続されており、シングルモードファイバ９ｂからの出射光をコリメートするコリメートレンズ５５ａ、コンデンサレンズ５３ａの後側焦点位置に、コリメート光を集光させる集光レンズ５５ｂが設けられている。
【０１３５】
コンデンサレンズユニット５３には、切換えミラー５３ｃが設けられている。この切換えミラー５３ｃは、エバネッセント照明を行なう時は、光路上に挿入され、透過照明ランプハウス５６による透過照明、観察を行う場合は光路から退避させられる（５３ｃ‘の位置）。
【０１３６】
対物レンズ２４の上方には、中間鏡筒５７が配置されている。この中間鏡筒５７は、水銀灯ランプハウス５８による蛍光の同軸落射照明を行うもので、リレーレンズ５７ａ、励起ダイクロイックミラー５７ｂが設けられている。この場合、励起ダイクロイックミラー５７ｂは、エバネッセント照明による観察をＣＣＤ検出器３８で行う時と走査ユニット１０による照明、走査観察を行う時は、光路から退避（５７ｂの位置）され、水銀灯ランプハウス５８の水銀灯による蛍光同軸落射照明、観察を行う時は光路に配置されている（５７ｂ‘の位置）。
【０１３７】
中間鏡筒５７の上方には、鏡筒５９が配置されている。この鏡筒５９は、結像レンズ６０、分離ダイクロイックミラー３５、バリアフィルタ３６を有し、分離ダイクロイックミラー３５は、図示しない電動機構により、制御部３９からの指令で光路上に挿脱可能な構成になっている。また、分離ダイクロイックミラー３５の反射光路上には、ＣＣＤ検出器３８が配置されている。このＣＣＤ検出器３８は、第１の実施の形態と同様に撮像のタイミングが制御部３９により制御されている。
【０１３８】
なお、２１は瞳投影レンズユニットで、鏡筒５９の上部に配置されており、さらに、走査ユニット１０が上部に配置されている。
【０１３９】
走査ユニット１０内の構成およびレーザユニット１の構成など、その他の構成は、図１と同様である。
【０１４０】
次に、このように構成した第３の実施の形態の動作について説明する。
【０１４１】
ここでは、第１の実施の形態で述べたと同様に、Ａｒレーザ２の４８８ｎｍのレーザ光によりエバネッセント照明を行い、グリーンヘリウムネオンレーザ３の５４３ｎｍのレーザ光により走査型レーザ顕微鏡の照明を行なうものとする。この場合、分離ダイクロイックミラー３５は、５００〜５３０ｎｍの波長域を反射し、５４３〜６５０ｎｍの波長域を透過する特性のものが用いられ、バリアフィルタ３６は、５００〜５３０ｎｍの波長域を透過し、４８８ｎｍと、５４３〜７００ｎｍの波長域をカットする特性のものが用いられる。また、走査ユニット１０内のバリアフィルタ１９は、４８８〜５４３ｎｍの波長域をカットし、５６０〜６５０ｎｍの波長域を透過する特性のものが用いられる。これらの特性は第１の実施の形態と同じである。
【０１４２】
また、水銀灯ランプハウス５８により同軸落射照明を行う中間鏡筒５７内の励起ダイクロイックミラー５７ｂは光路から外れた位置に退避させられ、コンデンサレンズト５３内の切換えミラー５３ｃと分離ダイクロイックミラー３５は、光路上に配置させられている。
【０１４３】
まず、エバネッセント照明を用いた蛍光観察についての動作について説明する。
【０１４４】
この場合、Ａｒレーザ２により４８８ｎｍのレーザ光が発振すると、このレーザ光は、ＡＯＴＦ８ｂにより波長選択され、エバネッセント照明用としてシングルモードファイバ９ｂによりエバネッセント照明ユニット５５に導かれる。
【０１４５】
エバネッセント照明ユニット５５に導入されたレーザ光は、コリメートレンズ５５ａによりコリメートされ、集光レンズ５５ｂによりコンデンサレンズ５３ａの後側焦点位置である開口絞り５３ｂの端に集光する。この場合、図８に示すように、対物レンズ２４の先端レンズ２４ｂは、カバーガラス２８の試料側界面２８ａに近接した試料２５領域にピントが合わせられており、また、コンデンサレンズユニット５３の開口絞り５３ｂは、対物レンズ２４の瞳位置と共役関係になるように位置決めされている。
【０１４６】
これにより、コンデンサレンズユニット５３の開口絞り５３ｂの端に集光したレーザ光５３ｄ（斜線部）は、コンデンサレンズ５３ａにより平行光となり、ある角度で斜め方向からカバーガラス２８の試料側界面２８ａを照射する。この角度は、レーザ光５３ｄが、試料側界面２８ａで全反射を起こす角度に設定されており、全反射したレーザ光５３ｄは、図示５３ｄ’方向に抜ける。この時、レーザ光のごく一部がカバーガラス２８の試料側界面２８ａから試料２５側へにじみ出し、この試料側界面２８ａからにじみ出た光がエバネッセント光となる。この試料２５の深さ方向へにじみ出す量は、光源の波長程度（ここでは５００ｎｍ）となる。
【０１４７】
従って、このようなエバネッセント照明により試料２５より発する蛍光の範囲は、深さ方向に波長幅程度となり、検出される蛍光画像は、バックグラウンドの少なくＳ／Ｎの良い観察が可能となる。また、４８８ｎｍのエバネッセント照明用のレーザ光により試料から発した蛍光（５００〜５３０ｎｍ）は、対物レンズ２４、結像レンズ６０を通り、分離ダイクロイックミラー３５で反射される。そして、バリアフィルタ３６により、エバネッセント照明により試料から発した蛍光波長（５００〜５３０ｎｍ）のみが抽出され、ＣＣＤ検出器３８で撮像される。
【０１４８】
次に、走査型レーザ顕微鏡照明を用いた蛍光観察について説明する。
【０１４９】
この場合、グリーンヘリウムネオンレーザ３により５４３ｎｍのレーザ光が発振すると、このレーザ光は、ＡＯＴＦ８ａにより、波長選択され、走査型レーザ顕微鏡の照明用としてシングルモードファイバ９ａにより走査ユニット１０に導かれる。
【０１５０】
走査ユニット１０に導入された５４３ｎｍのレーザ光は、コリメートレンズ１２によりコリメートされ、励起ダイクロイックミラー１３により反射される。
【０１５１】
励起ダイクロイックミラー１３で反射されたレーザ光は、波面変換素子１４を反射され、ガルバノミラーユニット１５に入射する。そして、瞳投影レンズ２１ａ、結像レンズ２３を通り、分離ダイクロイックミラー３５、エバネッセント用励起ダイクロイックミラー３３を透過し、対物レンズ２４に入射し、試料２５内に結像する。
【０１５２】
そして、試料２５に５４３ｎｍのレーザ光を照射すると、試料２５より発せられる蛍光（５６０〜６５０ｎｍ）波長は、上述の照明光の経路を逆方向に進み、走査ユニット１０内の励起ダイクロイックミラー１３を透過し、共焦点レンズ１６、反射ミラー１７を介して共焦点ピンホール１８上に集光する。共焦点ピンホール１８を透過した蛍光（５６０〜６５０ｎｍ）はバリアフィルタ１９を透過し、フォトマルチプライアからなる光検出器２０により検出される。
【０１５３】
この状態で、波面変換素子１４の反射面の形状を電圧を印加して変化させる。例えば、波面変換素子１４の反射面を変化させて、図８に示す点線２４ｊのようにレーザ光を若干収束光にして対物レンズ２４に入射させると、試料２５の内側に入った地点２５ｆで集光される。そして、この地点２５ｆから発せられる蛍光は、照明光と同じ経路を逆方向に進み、波面変換素子１４に戻ってくる。さらに波面変換素子１４を反射し、平行光に変換されて励起ダイクロイックミラー１３に戻り透過する。そして、共焦点レンズ１６、反射ミラー１７、共焦点ピンホール１８、バリアフィルタ１９を通り、光検出器２０で、試料２５の地点２５ｆから発した蛍光として検出される。このように、波面変換素子１４の反射面の形状を、電圧を印加して任意に可変することで、走査ユニット１０からの走査型レーザ顕微鏡の照明用レーザ光の試料２５内での光軸方向の集光位置を任意に変えることが可能となる。
【０１５４】
従って、このようにしても、第１の実施の形態と同様に対物レンズ２４と試料２５の機械的な位置関係を固定した状態で、光軸方向の観察断面の可変制御を含む走査型レーザ顕微鏡による共焦点観察とエバネッセント照明による蛍光観察の両方を行なうことができることになる。
【０１５５】
また、走査型レーザ顕微鏡による試料内部の観察とエバネッセント照明による試料表面の観察の高速切換えや、走査型レーザ顕微鏡の照明を試料の光刺激に使用することも、第１の実施の形態と同様に可能であることは言うまでもない。
【０１５６】
さらに、第１の実施の形態では得られない本実施の形態独自の効果として、エバネッセント照明を対物レンズ２４側から行うのではなく、コンデンサレンズ５３ａ側から行っているので、対物レンズ２４の制約（エバネッセント照明を発生させるための高ＮＡ、油浸対物）がなくなり観察の自由度が広がることになる。また、エバネッセント用励起ダイクロイックミラー（第１の実施の形態では３３に相当）が、走査型レーザ顕微鏡照明用の光路及び観察光路、エバネッセント照明による蛍光観察の光路に存在しなくなるので、明るい観察が可能となる。このことは、さらに、走査型レーザ顕微鏡で使用するレーザ波長と蛍光、エバネッセント照明で使用するレーザ波長と蛍光の組合せの自由度があがることになる。
【０１５７】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。
【０１５８】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【０１５９】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、走査型レーザ顕微鏡による共焦点観察とバネッセント照明による蛍光観察を同時または切換えて行うことができ、特に、走査型レーザ顕微鏡側の光軸方向の焦点位置を積極的に変化させても、エバネッセント照明による蛍光観察との使い勝手がすぐれた顕微鏡システムを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態の要部を拡大した概略構成を示す図。
【図３】第１の実施の形態に用いられる波面変換素子を説明するための図。
【図４】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図５】第２の実施の形態に用いられるビームエクスパンダユニットを説明するための図。
【図６】第２の実施の形態の変形例の概略構成を示す図。
【図７】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【図８】第３の実施の形態の要部を拡大した概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…レーザ光源ユニット、２…Ａｒレーザ
３…グリーンヘリウムネオンレーザ、４…反射ミラー
５…ダイクロイックミラー、６ａ．６ｂ…光路、７…ビームスプリッタ
８ａ．８ｂ…ＡＯＴＦ、９ａ．９ｂ…シングルモードファイバ
１０…走査ユニット、１０ａ…可視レーザ光導入ポート
１０ｂ…第２のポート、１１…落射投光管、１１ａ…レーザ光導入ポート
１２…コリメートレンズ、１３…励起ダイクロイックミラー
１３ａ…励起ダイクロイックミラー、１４…波面変換素子
１４ａ、１４ｂ…反射面、１４ｄ…発散光
１５…ガルバノミラーユニット、１５ａ．１５ｂ…ガルバノミラー
１６…共焦点レンズ、１７…反射ミラー、１８…共焦点ピンホール
１９…バリアフィルタ、２０…光検出器、２１…瞳投影レンズユニット
２１ａ…瞳投影レンズ、２２…倒立顕微鏡本体、２２ａ…底面ポート
２３…結像レンズ、２４…対物レンズ、２４ａ…瞳位置
２４ｂ…先端レンズ、２４ｆ…発散光、２５…試料
２６…ステージ、２７…シャーレ、２７ａ…水、２８…カバーガラス
２８ａ…試料側界面、３１…コリメートレンズ、３２…集光レンズ
３３…エバネッセント用励起ダイクロイックミラー
３３１…ターレット、３５…分離ダイクロイックミラー
３６…バリアフィルタ、３７…結像レンズ、３８…ＣＣＤ検出器
３８ａ…受光面、３９…制御部、４１…ＩＲパルスレーザユニット
４２…パルスレーザ光源本体、４３…ＡＯＭ、４４…反射ミラー
４５…ビームエクスパンダユニット、４５ａ．４５ｂ…レンズ
４６…反射ミラー、４７…光路合成ダイクロイックミラー
５０…テーブル、５０ａ…穴部、５１…正立顕微鏡本体
５２…レボアーム、５３…コンデンサレンズユニット
５３ａ…コンデンサレンズ、５３ｃ…ミラー
５３ｄ…レーザ光、５４…ステージ、５５…エバネッセント照明ユニット
５５ａ…コリメートレンズ、５５ｂ…集光レンズ
５６…透過照明ランプハウス、５７…中間鏡筒、５７ａ…リレーレンズ
５７ｂ…励起ダイクロイックミラー、５８…水銀灯ランプハウス
５９…鏡筒、６０…結像レンズ、６１…ビームスプリッタ
６２…ディスク、６３…結像レンズ、６４…ＣＣＤ検出器
【図１】
2004309785.tif 000003
【図２】
2004309785.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
2004309785.tif 000007
【図６】
2004309785.tif 000008
【図７】
2004309785.tif 000009
【図８】
2004309785.tif 000010