(57)【要約】【課題】簡易な構成によって、各処理工程における塵埃や細菌等による汚染を低減する。【解決手段】少なくとも１つの主培養容器４と、培地を封入した少なくとも１つの培地容器５と、主培養容器４内の流体を収容可能な少なくとも１つの廃棄培地容器６とを、相互間の流体の流動を制限可能な連結管７，８により、外部に対して密封状態に連結した培養容器２と、主培養容器４に対する培地容器５および廃棄培地容器６の高さをそれぞれ調節可能な高低差調整手段３とを備える培養装置１を提供する。【選択図】　図１
2004097046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの主培養容器と、培地を封入した少なくとも１つの培地容器と、前記主培養容器内の流体を収容可能な少なくとも１つの廃棄培地容器とを、相互間の流体の流動を制限可能な連結管により、外部に対して密封状態に連結した培養容器と、
前記主培養容器に対する培地容器および廃棄培地容器の高さをそれぞれ調節可能な高低差調整手段とを備える培養装置。
【請求項２】
前記高低差調整手段が、長手軸を水平に配した状態で長手軸回りに回転可能に設けられ、前記主培養容器、培地容器および廃棄培地容器を、それぞれ異なる周方向位置に固定する回転ドラムからなる請求項１記載の培養装置。
【請求項３】
前記培養容器が、前記回転ドラムの外面に装着可能に設けられている請求項２記載の培養装置。
【請求項４】
前記主培養容器に、前記培養容器が回転ドラムに固定された状態で、半径方向外方に配される位置に、内部の細胞を取り出し可能な取り出し口が設けられている請求項２または請求項３に記載の培養装置。
【請求項５】
前記連結管がバルブを備え、該バルブにより連結管内の流体の流動が許容または制限される請求項１から請求項４のいずれかに記載の培養装置。
【請求項６】
前記連結管が、柔軟な材質からなり、潰れることで内部の流体の流動が制限されるチューブからなり、
該チューブを外部から径方向に挟むことにより流体の流動を制限し、チューブを開放することで流体の流動を許容するピンチバルブを備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の培養装置。
【請求項７】
前記主培養容器に、蛋白質分解酵素を封入した少なくとも１つの酵素容器が、相互間の流体の流動を制限可能な連結管により、外部に対して密封状態に連結され、
前記高低差調整手段が、前記主培養容器に対する酵素容器の高さをも調整可能である請求項１から請求項６のいずれかに記載の培養装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞を培養する培養装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞を培養するには、患者から抽出された骨髄液等の体液から培養すべき細胞を抽出する抽出工程、培養すべき細胞に適した培地を調製する培地調製工程、抽出された細胞を適当な培養容器内に培地とともに投入して所定の培養条件下に配する一次培養工程、一次培養された細胞を生体組織補填材と混合してさらに培養する二次培養工程等、複数の工程が順次行われる。
【０００３】
従来、この種の細胞の培養は、全体を密封して内部の塵埃量を管理したクリーンベンチにおいて行うことが考えられている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特公平３−５７７４４号公報（第２頁第３欄等）
【０００５】
すなわち、クリーンベンチ内においては、例えば、天井側から床側に向かって流れる空気流が形成されており、各処理工程において塵埃等が生じた場合には、空気流によって塵埃等が床側に流され、床下に配置された集塵機によって回収されることになる。クリーンベンチ内にはロボットアームが配置されていて、各工程間において細胞を移動させることができるようになっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このように全ての処理工程を比較的大きなクリーンベンチ内で行う場合には、各工程が行われる空間が連続しているために、一の工程において発生する塵埃が、他の工程に配されている細胞に混入する可能性がある。したがって、複数の細胞を同時に培養する場合には、細胞間の混合が生じたり、添加する物質が汚染されたりしないように充分に気を付ける必要がある。
【０００７】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な構成によって、各処理工程における塵埃や細菌等による汚染を低減することができる培養容器および培養装置を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、少なくとも１つの主培養容器と、培地を封入した少なくとも１つの培地容器と、前記主培養容器内の流体を収容可能な少なくとも１つの廃棄培地容器とを、相互間の流体の流動を制限可能な連結管により、外部に対して密封状態に連結した培養容器と、前記主培養容器に対する培地容器および廃棄培地容器の高さをそれぞれ調節可能な高低差調整手段とを備える培養装置を提供する。
【０００９】
この発明によれば、主培養容器内に細胞を封入して、培地容器と主培養容器との間の連結管における流体の流動の制限を解除するとともに、高低差調整手段を作動させて、培地容器を主培養容器より高い位置に配置することにより、培地容器から連結管を通して主培養容器内に培地が流入する。この状態で上記連結管における流体の流動を再度制限することにより、主培養容器内部が他の容器に対して密封される。これにより、外部に対して密封された主培養容器内において細胞を培養することが可能となる。
【００１０】
また、所定時間が経過した後に主培養容器内の培地を交換する必要が生じた場合には、主培養容器と廃棄培地容器との間の連結管の流動制限を解除するとともに、高低差調整手段を作動させて主培養容器を廃棄培地容器よりも高い位置に配置することにより、主培養容器から廃棄培地容器に向けて培地が流動させられる。これにより、主培養容器内において不要となった廃棄培地を廃棄培地容器に排出することが可能となる。
【００１１】
その後、再度培地容器から主培地容器に向けて培地を流入させて連結管における流体の流動を制限することにより、細胞の培養が継続されることになる。
このように、この発明に係る培養容器によれば、完全に密封された容器内において、細胞の培養と、細胞の培養に必要な培地の供給・廃棄による交換を重力によって行うことが可能となる。
【００１２】
請求項２に係る発明は、請求項１記載の培養装置において、前記高低差調整手段が、長手軸を水平に配した状態で長手軸回りに回転可能に設けられ、前記主培養容器、培地容器および廃棄培地容器を、それぞれ異なる周方向位置に固定する回転ドラムからなる培養装置を提供する。
この発明によれば、回転ドラムの回転により、異なる周方向位置に固定されている主培養容器、培地容器および廃棄培地容器の高低差を簡易に調整することが可能となる。また、回転ドラムを連続回転させることで、遠心分離機としても利用することが可能となる。
【００１３】
請求項３に係る発明は、請求項２に記載の培養装置において、前記培養容器が、前記回転ドラムの外面に装着可能に設けられている培養装置を提供する。
この発明によれば、培養容器を回転ドラムの外面に装着可能とすることにより、共通の回転ドラムに対し多数の培養容器を入れ替えて培養を行う際の入れ替え作業を容易にすることが可能となる。
【００１４】
請求項４に係る発明は、請求項２または請求項３に記載の培養装置において、前記主培養容器に、前記培養容器が回転ドラムに固定された状態で、半径方向外方に配される位置に、内部の細胞を取り出し可能な取り出し口が設けられている培養装置を提供する。
この発明によれば、培養された細胞を最終的に主培養容器から回収する際に、回転ドラムを回転させて、主培養容器内の細胞を他の流体から遠心分離することにするだけで、主培養容器の半径方向外方に配されている取り出し口に細胞を集めることが可能となる。
【００１５】
請求項５に係る発明は、請求項１から請求項４のいずれかに記載の培養装置において、前記連結管がバルブを備え、該バルブにより連結管内の流体の流動が許容または制限される培養装置を提供する。
この発明によれば、バルブの制御により連結管内の流体の流動制御を行うことが可能となる。これにより、簡易に連結管の開閉を行い、培地容器から主培養容器への培地の流入、主培養容器から廃棄培地容器への培地の排出、主培養容器内における細胞の培養等の工程を切り替えることが可能となる。
【００１６】
請求項６に係る発明は、請求項１から請求項４のいずれかに記載の培養装置において、前記連結管が、柔軟な材質からなり、潰れることで内部の流体の流動が制限されるチューブからなり、該チューブを外部から径方向に挟むことにより流体の流動を制限し、チューブを開放することで流体の流動を許容するピンチバルブを備える培養装置を提供する。
この発明によれば、ピンチバルブの作動により、連結管が外部から径方向に押されると、柔軟な材質からなる連結管は潰れ、内部の流路が閉じられる。これにより、流体の流動が制限される。したがって、連結管にバルブを設けることなく、培養容器の構成を簡易にすることができる。培養容器が、細胞毎に使い捨てされる場合には、コストを低減することができるので好ましい。
【００１７】
請求項７に係る発明は、請求項１から請求項６のいずれかに記載の培養装置において、前記主培養容器に、蛋白質分解酵素を封入した少なくとも１つの酵素容器が、相互間の流体の流動を制限可能な連結管により、外部に対して密封状態に連結され、前記高低差調整手段が、前記主培養容器に対する酵素容器の高さをも調整可能である培養装置を提供する。
【００１８】
この発明によれば、例えば、間葉系幹細胞のような付着性の細胞を培養する場合に、所定の培養期間経過後には、主培養容器の内壁に細胞が付着して成長している。したがって、このような細胞を回収する場合に、主培養容器内の培地を廃棄培地容器内に排出した後に、酵素容器と主培養容器との間の連結管の流動制限を解除するとともに、高低差調整手段を作動させて、酵素容器を主培養容器より高い位置に配置させる。これにより、蛋白質分解酵素を主培養容器内に供給して、細胞を主培養容器の内壁から剥離させることが可能となる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
この発明の実施の形態を説明する前に、生体組織補填体としての骨補填体の製造工程について概略的に説明する。骨補填体を製造するには、図１７に示されるように、まず、患者の腸骨等から骨髄液を採取する。採取された骨髄液は遠心分離機にかけられて、旋回されることにより、比重の重い骨髄細胞を抽出される。
【００２０】
抽出された骨髄細胞は、予め調製されている培地とともに培養容器内に投入され混合される。培地の一部は取り出されて感染検査に回される。
この後に、混合された骨髄液および培地を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）、湿度（例えば、１００％）およびＣＯ２濃度（例えば５％）等の培養条件に維持することにより所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が一次培養される。細胞の培養途中の所定の交換時期には、培養容器内から培地が廃棄される。そして、再度培地を混合されて培養工程が繰り返し継続される。廃棄された培地の一部は感染検査に回される。
【００２１】
所定の培養期間が終了すると、培養容器内から培地が廃棄された後に、培養容器内にトリプシンのような蛋白質分解酵素が投入・混合される。これにより、培養容器の底面に付着して成長していた間葉系幹細胞が、主培養容器の底面から剥離される。そして、このように剥離された間葉系幹細胞は、遠心分離機にかけられることにより抽出される。
【００２２】
抽出された間葉系幹細胞は、細胞数調整が行われた後に、骨補填材と適当な培地が投入された培養容器内に混合される。実際には、間葉系幹細胞を骨補填材に付着させ、培地内に投入する。そして、上記と同様にして、混合された間葉系幹細胞と培地を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）、湿度（例えば、１００％）およびＣＯ２濃度（例えば５％）等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が二次培養される。
【００２３】
二次培養工程においても、一次培養工程と同様にして、定期的に培地の交換が行われ、投入される培地の一部および廃棄される培地の一部がそれぞれ、感染検査に回される。そして、所定の培養期間が経過したところで、出荷用の品質検査と感染検査のための検体抽出が行われ、製造された骨補填体は密封されて製品として提供される。
【００２４】
次に、この発明の第１の実施形態に係る培養装置について、図面を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る培養装置１は、上述した培養工程の内、特に、一次培養工程に利用される。
【００２５】
本実施形態に係る培養装置１は、図１および図２に示されるように、培養容器２と、該培養容器２を外周面に取り付ける回転ドラム（高低差調整手段）３とから構成されている。培養容器２は、図３に示されるように、１つの主培養容器４と、１つの培地容器５と、１つの廃棄培地容器６と、主培養容器４と培地容器５とを連結する第１の連結管７と、主培養容器４と廃棄培地容器６とを連結する第２の連結管８とから構成されている。
【００２６】
主培養容器４、培地容器５および廃棄培地容器６は、それぞれ硬質のポリスチレン等の材料により構成されている。また、第１および第２の連結管７，８は、塩化ビニルのような柔軟なチューブにより構成されている。これにより、各連結管７，８を撓ませて各容器４，５，６を任意の位置に配置することが可能となるとともに、連結管７，８の長さ方向の途中位置を半径方向に挟むクリップやピンチバルブによって潰されることで、内部の流体の流動を制限することができるようになっている。なお、第１、第２の連結管７，８は、回転ドラム３に取り付けられる前の状態においては、流体の流動を制限するために、例えば、取り外し可能なクリップ（図示略）によって閉鎖されている。
【００２７】
また、培地容器５は主培養容器４側に、主培養容器４は廃棄培地容器６側に、それぞれ、培地容器５内の流体が主培養容器４へ、主培養容器４内の流体が廃棄培地容器６へ流れ込み易いようにする傾斜面５ａ，４ａを備えている。図３中、符号９は、回転ドラム３へ各容器４，５，６を装着するための取付孔である。
【００２８】
また、前記主培養容器４内および培地容器５内には、例えば、ＭＥＭ（ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）、抗生剤等を所定の配合比率、例えば、８４：１５：１で調整した培地が封入されている。ＦＢＳに代えて、ヒト血清を採用してもよい。抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
前記廃棄培地容器６には、無菌状態のガス、例えば、５％濃度のＣＯ２ガスが封入されている。
【００２９】
前記主培養容器４は、例えば、注射針を貫通可能で、かつ、注射針を引き抜いた後には弾性により閉塞される注入部１０を備えている。これにより、体液、例えば、骨髄液を採取した注射器の注射針を注入部１０に刺すことで、主培養容器４内に骨髄液を投入し、注射針を注入部１０から引き抜くことで、主培養容器４内を外部に対して遮断することができるようになっている。
【００３０】
前記回転ドラム３は、水平回転軸線を中心とする円筒面を有し、モータ（図示略）のような回転駆動源に接続されている。また、回転ドラム３の外周面である円筒面の外面には、前記各容器４，５，６を装着する容器装着部１１，１２，１３が設けられている。主培養容器４の容器装着部１１は、培地容器５の容器装着部１２と廃棄培地容器６の容器装着部１３との間に配置されており、それぞれ、回転ドラム３の周方向に間隔をあけた位置に配置されている。例えば、図１および図２に示す例では、回転ドラム３の周方向に９０°ずつ間隔をおいて配置されている。
回転ドラム３への各容器４，５，６の装着は、例えば、ボルト１４を用いて行われる。ボルト１４に代えて、蝶ネジ、ベルト、フック等任意の固定手段を用いてもよい。
【００３１】
また、各容器装着部１１，１２，１３に各容器４，５，６を装着したときに、容器４，５，６間の連結管７，８が配されることとなる連結管経路には、各連結管７，８の長さ方向の途中位置を半径方向に挟むピンチバルブ１５，１６が備えられている。ピンチバルブ１５，１６は、それぞれ、回転ドラム３の内部から円筒面外方に向けて半径方向外方に延びる２本にピン１５ａ，１６ａを備え、これらのピン１５ａ，１６ａの間に連結管７，８を挿入するだけで、ピン１５ａ，１６ａの距離を切り替えて連結管７，８を開閉することができるようになっている。各ピンチバルブ１５，１６は図示しないコントローラによって開閉制御されるようになっている。
【００３２】
このように構成された本実施形態に係る培養装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る培養装置１を用いて細胞を培養するには、まず、上述したように、骨髄液を採取した注射器の注射針を注入部１０に貫通させて主培養容器４内に骨髄液を注入する。
【００３３】
そして、回転ドラム３を所定角度回転させて、主培養容器４が最上位に水平に配される位置において回転ドラム３を固定する。この状態で、主培養容器４を所定の培養条件、例えば、温度（例えば、３７±０．５℃）、湿度（例えば、１００％）およびＣＯ２濃度（例えば５％）等の条件下に配することにより、培養を行う。そして、ＣＯ２濃度条件は、培地にＣＯ２を溶解させたり、主培養容器４の一部または全部をＣＯ２透過フィルタにより構成したりすることで達成可能である。
【００３４】
その後、所定の培地交換時期に達した時点で、図４に示されるように、回転ドラム３を所定角度回転させて、主培養容器４が廃棄培地容器６よりも上位に配されるようにする。本実施形態の場合には、培養中に主培養容器４が最上位に配されているので、回転ドラム３を回転させなくてもよい。しかし、よりスムーズに、主培養容器４内の培地を廃棄培地容器６へ移動させるために、例えば、図４に示されるように、主培養容器４が斜め上向き、廃棄培地容器６が斜め下向きになるような配置とすることが好ましい。
【００３５】
この状態で、第２の連結管８を閉鎖していたピンチバルブ１６を開く。これにより、主培養容器４から第２の連結管８を介して廃棄培地容器６内に不要となった培地が重力により排出される。主培養容器４内の所定量の培地が排出された時点で、ピンチバルブ１６を作動させて第２の連結管８を再度閉鎖する。
【００３６】
次いで、回転ドラム３を所定角度回転させて、図５に示されるように、主培養容器４が培地容器５よりも下位に配されるようにする。すなわち、主培養容器４が斜め下向き、培地容器５が斜め上向きになるように配置する。そして、第１の連結管７を閉鎖していたピンチバルブ１５を開く。これにより、培地容器５から主培養容器４へ第１の連結管７を介して新たな培地が供給される。これにより培地交換工程が終了するので、回転ドラム３を所定角度回転させて、主培養容器４が最上位となる位置に戻し、培養を継続する。
【００３７】
そして、このような培地交換工程を複数回繰り返しつつ培養を継続することにより、主培養容器４の底面に間葉系幹細胞が充分に成長する。成長した間葉系幹細胞を収容した主培養容器４は、該主培養容器４に連結している全ての連結管７，８を熱により密封して切断することにより単独で搬送可能となる。
【００３８】
このように、本実施形態に係る培養装置１によれば、培養に必要な培地等を予め封入しておき、一次培養工程の培養期間中を通じて、外部に対して培養容器２の内部を密封状態に遮断することができる。これにより、外部からの塵埃等の混入を防止することができる。また、培地の飛沫が飛散しやすい培地交換作業も、回転ドラム３を回転させて各容器４，５，６を所定の位置に配置するだけで、各容器４，５，６および連結管７，８の内部に培地を密封した状態のまま、重力により容器４，５，６間において移動させることができる。したがって、外部の他の細胞に対しても混入等の影響を与えることがない。
【００３９】
なお、本実施形態における培養容器２は、所定の時期に複数回にわたり培地の交換を行いながら間葉系幹細胞を成長させる一次培養工程に適用可能なものとして説明したが、主培養容器４に、例えば、βリン酸三カルシウム多孔体等の骨補填材を封入しておき、一次培養工程において培養された間葉系幹細胞を投入できるようにしておくことにより、二次培養工程に適用可能に構成してもよい。
また、主培養容器４に採血管（図示略）を接続しておき、該採血管によって患者から採取した骨髄液を直接、主培養容器４内に投入することにしてもよい。
【００４０】
また、回転ドラム３に設けたピンチバルブ１５，１６により連結管７，８を開閉することとしたが、これに代えて、連結管７，８自体に開閉可能なバルブを設けることにしてもよい。
【００４１】
また、上記実施形態に係る培養装置１においては、主培養容器４、培地容器５、廃棄培地容器６を連結管７，８により相互に連結した培養容器２を例に挙げて説明したが、図６に示されるように、各種容器４，５，６および連結管７，８を、湾曲可能な柔軟なシート１７に一体的に取り付けることにしてもよい。シート１７には、回転ドラム３への取り付けようのボルト取付孔１８や、ピンチバルブ１５，１６のピンを貫通させる貫通孔１９を設けておく。
【００４２】
このように構成することで、回転ドラム３に培養容器２を取り付ける際には、各種容器４，５，６および連結管７，８を一体化したシート１７を図７に示すように円筒状に湾曲させて、回転ドラム３の外面に取り付けるだけで済む。したがって、各種容器４，５，６や連結管７，８ごとの位置決めを不要とすることができ、取付作業を容易にすることができる。
【００４３】
次に、この発明の第２の実施形態に係る培養装置について、図８を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態に係る培養装置２０の説明において、上述した第１の実施形態に係る培養装置１と構成を共通する箇所には同一符号を付して説明を簡略化することにする。
【００４４】
本実施形態に係る培養装置２０の培養容器２１は、図８に示されるように、主培養容器２２に第３の連結管２３を介して連結された酵素容器２４を備えている点、主培養容器２２に細胞回収管２５が設けられている点において、上記第１の実施形態における培養容器２と相違している。
酵素容器２４には、例えば、トリプシンのような蛋白質分解酵素が封入されており、第３の連結管２３は、取り外し可能なクリップによって閉鎖されている。酵素容器２４は、例えば、培地容器５と同じ周方向位置に、長手方向に並んで回転ドラム２６に装着されている。
【００４５】
回転ドラム２６には、酵素容器２４を装着する容器装着部２７が設けられているとともに、酵素容器２４が装着されたときに、第３の連結管２３を半径方向に挟んで閉鎖するピンチバルブ２８が設けられている。
【００４６】
前記細胞回収管２５は、主培養容器２２が回転ドラム２５に取り付けられたときに、半径方向外方に配されることとなる面の中央部に設けられている。また、この細胞回収管２５が設けられている主培養容器２２の面は、図９に示されるように、周辺から中央の細胞回収管２５に向かって漸次窄む漏斗状に形成されている。細胞回収管２５は、連結管７，８，２３と同様の塩化ビニルのような柔軟なチューブにより構成され、先端が閉塞された閉塞管である。
【００４７】
このように構成された本実施形態に係る培養装置２０の作用について、以下に説明する。
定期的な培地交換を行いながら細胞が培養されるまでの作用は第１実施形態に係る培養装置１と同様である。
【００４８】
本実施形態に係る培養装置２０よれば、主培養容器２２内に間葉系幹細胞が付着状態に成長した後に、回転ドラム２６を所定角度回転させることにより、主培養容器２２を斜め上向きに、廃棄培地容器６を斜め下向きになるように配置する。そして、第２の連結管８を閉鎖していたピンチバルブ１６を作動させて、第２の連結管８を開放することにより、主培養容器２２内の廃棄すべき培地を所定量、重力によって廃棄培地容器６へ排出する。
【００４９】
その後に、再度、回転ドラム２６を所定角度回転させることにより、酵素容器２４を主培養容器２２よりも上位に配する。そして、第３の連結管２３を閉鎖していたピンチバルブ２８を作動させて第３の連結管２３を開放することにより、酵素容器２４内に貯留していたトリプシンを、第３の連結管２３を介して主培養容器２２へ重力により供給する。
【００５０】
そして、ピンチバルブ２８を作動させて第３の連結管２３を再度閉鎖した状態で、所定時間放置し、あるいは、回転ドラム２６の揺動動作によって、主培養容器２２に振動を加えることにより、主培養容器２２の底面に付着していた間葉系幹細胞を剥離させる。これにより、剥離された間葉系幹細胞は、細胞間の接着を切断された状態でトリプシンおよび培地からなる流体内に混合される。
【００５１】
この後に、回転ドラム２６を一方向に連続回転させることにより、主培養容器２２内の間葉系幹細胞とトリプシンを含む培地とを遠心分離する。間葉系幹細胞はトリプシン等の物質より比重が重いので、遠心分離されることによって、半径方向外方へ移動させられる。
【００５２】
本実施形態に係る培養装置２０によれば、主培養容器２２が漏斗状に形成されているので、半径方向外方へ移動させられた間葉系幹細胞は、漏斗状の容器壁によって中央部へ集められる。中央部には、細胞回収管２５が設けられているので、集められた間葉系幹細胞は、細胞回収管２５内に回収されることになる。
【００５３】
また、この細胞回収管２５は、熱により密封または溶着可能な塩化ビニルにより構成されているので、図１０（ａ）に示すように、せん断方向に移動する発熱板２９によって、同図（ｂ）に示すように、溶融させられながら切断されることにより、同図（ｃ）に示すように、内部を無菌かつ密封状態に維持しつつ、切断端部２５ａを閉塞することができるようになっている。以下、この切断方法を無菌的チューブ切断と言うことにする。
【００５４】
また、図１１（ａ）に示すように、平行に配した細胞回収管２５と他の連結管３０を同時に切断した後に、同図（ｂ）に示すように、細胞回収管２５と他の連結管３０とが一致するようにずらした後、同図（ｃ）に示すように、発熱板２９を除去することにより、細胞回収管２５と他の連結管３０とを連結することができるようになっている。連結部分は連結時には閉鎖されているが、外力により管壁どうしを連結させたまま内部流路を連通させることができるようになっている。すなわち、内部を無菌状態に保持したまま細胞回収管２５と他の連結管３０とを連結することができる。以下、この接続方法を無菌的チューブ接続と言うことにする。
【００５５】
すなわち、間葉系幹細胞を回収した細胞回収管２５を、生体組織補填材が封入された他の主培養容器（図示略）に連絡された連結管３０に、無菌的チューブ接続によって接続することにより、回収した間葉系幹細胞を無菌状態のまま、二次培養工程に引き渡すことが可能となる。
なお、細胞回収管２５の内部には、間葉系幹細胞が配されているので、発熱板２９により間葉系幹細胞が損傷するおそれがあるため、図１２に示されるように、細胞回収管２５の先端に、切断用の予備空間３１を形成しておいてもよい。すなわち、この予備空間３１を通過する切断線Ａによって切断することにより、発熱板２９が細胞回収管２５内の間葉系幹細胞に直接触れることが防止され、間葉系幹細胞の健全性を保持しつつ、無菌的チューブ接続を行うことが可能となる。
【００５６】
なお、本実施形態においては、酵素容器２４を設け、トリプシンにより間葉系幹細胞を剥離することとしたが、これに代えて、主培養容器２２の内壁に、所定の温度を境界として疎水性と親水性とが切り替わる温度応答性処理を施すことにしてもよい。
温度応答性処理は、温度応答性高分子ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を共有結合で固定することにより行われる。温度応答性処理された領域は、３２℃を境界温度として、それ以上では、市販の細胞用培養容器と同程度の弱い疎水性を呈するが、温度を境界温度以下に冷却することにより高い親水性を呈するようになる領域となる。したがって、例えば、３７℃で培養した後に３２℃以下に冷却することにより、主培養容器２２内面を高い親水性を呈するように変化させ、非侵襲的に間葉系幹細胞を剥離させることが可能となる。
【００５７】
次に、この発明の第３の実施形態に係る培養装置４０について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養装置４０は、図１３および図１４に示されるように、主培養容器４１、該主培養容器４１に連結管４２，４３を介して接続された培地容器４４および廃棄培地容器４５を有する培養容器４６と、該培養容器４６を搭載し、その傾斜角度を変化させる載置台（高低差調整手段）４７とを備えている。
【００５８】
前記主培養容器４１は、平坦な薄い箱状に形成されており、比較的広い底面積を有している。前記培地容器４４および廃棄培地容器４５は、前記主培養容器４１よりも高さの高い箱状に形成され、かつ、主培養容器４１の内容積に対して数倍の大きさの内容積を有している。これら培地容器４４および廃棄培地容器４５は、前記主培養容器４１の同一の側面に配置されている。
また、主培養容器４１および培地容器４４には上述したものと同様の培地が封入されており、廃棄培地容器４５内は空の状態になっている。
【００５９】
前記載置台４７は、培養容器４６を固定するトレー部４８と、該トレー部４８を水平軸回りに揺動させる揺動装置４９とを備えている。トレー部４８には、第１の実施形態と同様のピンチバルブ５０，５１が設けられており、各連結管４２，４３の長手方向の途中位置を径方向に挟んで連結管４２，４３を開閉することができるようになっている。揺動装置４９は、ベース５２と、ベース５２に対してトレー部４８を揺動させるモータ５３とを備えている。
【００６０】
このように構成された本実施形態にかかる培養装置４０の作用について、以下に説明する。
本実施形態にかかる培養装置４０を用いて細胞を培養するには、まず、主培養容器４１内に骨髄細胞を供給し、トレー部４８を水平にして、主培養容器４１の底面を水平状態に保持したまま、上記実施形態に示したのと同様の所定の培養条件下において細胞を培養する。
そして、所定の培地交換時期になったときに、載置台４７のモータ５３を作動させてトレー部４８をベース５２に対して揺動させることにより、図１５に示すように、主培養容器４１を廃棄培地容器４５よりも高い位置に配置する。
【００６１】
この状態で、トレー部４８に設けられているピンチバルブ５０，５１の内、主培養容器４１と廃棄培地容器４５とを連結している連結管４３を閉鎖していたピンチバルブ５１を開放する。これにより、主培養容器４１内の廃棄すべき培地が廃棄培地容器４５内へと重力により排出される。主培養容器４１内には、付着性の間葉系幹細胞が底面に付着した状態で残るので、上記ピンチバルブ５１を作動させて連結管４３を再度閉鎖する。
【００６２】
この後に、載置台４７のモータ５３を作動させて、図１６に示されるように、培地容器４４を主培養容器４１よりも高い位置に配置する。そして、主培養容器４１と培地容器４４とを連結している連結管４２を閉鎖していたピンチバルブ５０を開放する。これにより、培地容器４４内に封入されていた新たな培地が主培養容器４１内へと重力により供給される。その結果、主培養容器４１内の培地が新たな培地に入れ替えられるので、上記ピンチバルブ５０を再度閉鎖することにより培地交換が終了する。
【００６３】
この培地交換工程を複数回繰り返しながら培養を継続することにより、主培養容器４１の底面に沿って、間葉系幹細胞が、必要数まで増殖させられる。培養を終了した主培養容器４１は、無菌的チューブ切断によって連結管４２，４３を切断することにより、内部に間葉系幹細胞を封入した状態で、独立して搬送することが可能となる。
【００６４】
このように、本実施形態に係る培養装置４０によれば、トレー部４８を揺動させるだけで主培養容器４１内の培地交換を行い、細胞を無菌状態のまま、必要数まで増殖させることができる。また、培養容器４６内部を外部に対して密封した状態で細胞の培養を行うので、外部の他の細胞等への混入等を防止することができる。さらに、トレー部４８を揺動させるだけの簡易な構成を採用できるので、コストが低くて済み、また、操作も簡易である。
【００６５】
また、主培養容器４１を薄い箱状に形成して、必要最小限の培地深さを達成しているので、培地の使用量を抑えることが可能となる。
また、各種容器４１，４４，４５および連結管４２，４３を平坦なトレー部４８上に装着するので、その装着作業が容易である。
【００６６】
なお、本実施形態においては、主培養容器４１の同一の側面に培地容器４４および廃棄培地容器４５を連結したが、これに代えて異なる側面や上下面に連結してもよい。この場合には、主培養容器４１とこれに取り付けられた培地容器４４または廃棄培地容器４５とに高低差を生ずるようにトレー部４８を揺動させる機構が設けられている必要がある。また、主培養容器４１に酵素容器その他の容器を接続することにしてもよい。
【００６７】
また、トレー部４８をその法線回りに回転させる回転機構を設けておくことにより、主培養容器４１内において培養された間葉系幹細胞を遠心分離することにしてもよい。さらに、遠心分離された間葉系幹細胞を回収し、あるいは他の培養容器へ引き渡すための閉塞連結管を主培養容器４１の一側面に設けておくことにしてもよい。
【００６８】
また、連結管４２，４３を無菌的チューブ切断することによって、各容器４１，４４，４５を分離することができるので、培養した間葉系幹細胞と、廃棄された培地等との関連が不明確となるのを防止するために、各容器４１，４４，４５に、関連する容器であることを示す記号、特に、バーコードを付けておくことにしてもよい。バーコードは、同一のバーコードでも、相互に関連づけられたバーコードでもよい。
【００６９】
また、主培養容器４１の一部または全部を透明に構成し、主培養容器４１を搭載するトレー部４８に観察窓（図示略）を形成してもよい。これによれば、培養期間中に、観察窓を通して、例えば、倒立顕微鏡により培養状態の観察を行うことが可能となる。
【００７０】
また、上記各実施形態においては、培養する細胞として間葉系幹細胞を例に挙げて説明したが、これに代えて、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の他の体細胞を培養する場合に適用してもよい。
また、主培養容器４，２２，４１に供給する体液としては、骨髄液の他、末梢血、臍帯血でもよい。また、採取した骨髄液を遠心分離して得られた骨髄細胞のみを主培養容器４，２２，４１内に供給することにしてもよい。
また、生体組織補填材としては、βリン酸三カルシウムからなる骨補填材の他、他のセラミックスやコラーゲン、ポリ乳酸等任意の生体適合材料を使用することにしてもよい。
【００７１】
また、回転ドラム３，２６、載置台４７や各種容器４，５，６，２２，２４，４１，４４，４５の形状は、上記各実施形態に示したものに限定されるものではない。また、各容器４，５，６，２２，２４，４１，４４，４５はそれぞれ１つずつ設けたものを例に挙げて説明したが、これに代えて、例えば、培地容器５，４４や廃棄培地容器６，４５を複数設けることにしてもよい。また、これらの各容器４，５，６，２２，２４，４１，４４，４５の他に、例えば、二次培養工程の場合には、デキサメタゾンのような分化誘導因子を封入した容器等を予め連結しておき、あるいは、無菌的チューブ接続により接続することにしてもよい。
【００７２】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係る培養装置によれば、開閉可能な連結管によって連結した主培養容器、培地容器および廃棄培地容器に高低差を与えるだけで、重力により培地交換を行うことができる。したがって、培養容器内における密封状態を維持したまま培地交換を行うことができ、培養される細胞に、外部から塵埃等が混入することを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施形態に係る培養装置を示す正面図である。
【図２】図１の培養装置を示す側面図である。
【図３】図１の培養装置に用いられる培養容器を示す正面図である。
【図４】図１の培養装置において、主培養容器から廃棄培地容器へ培地を排出する工程を示す正面図である。
【図５】図１の培養装置において、培地容器から主培養容器へ培地を供給する工程を示す正面図である。
【図６】図１の培養装置における培養容器の変形例を示す正面図である。
【図７】図６の培養容器を示す斜視図である。
【図８】この発明の第２の実施形態に係る培養装置を示す側面図である。
【図９】図８の培養装置を示す正面図である。
【図１０】無菌的チューブ切断を説明する説明図である。
【図１１】無菌的チューブ接続を説明する説明図である。
【図１２】細胞回収管の端部構造を示す縦断面図である。
【図１３】この発明の第３実施形態に係る培養装置を示す平面図である。
【図１４】図１３の培養装置を示す正面図である。
【図１５】図１３の培養装置において、主培養容器から廃棄培地容器へ培地を排出する工程を示す正面図である。
【図１６】図１３の培養装置において、培地容器から主培養容器へ培地を供給する工程を示す正面図である。
【図１７】この発明を適用する培養工程を説明する説明図である。
【符号の説明】
１，２０，４０　培養装置
２，２１，４６　培養容器
３，２６　回転ドラム（高低差調整手段）
４，２２，４１　主培養容器
５，４４　培地容器
６，４５　廃棄培地容器
７，８、２３，３０，４２，４３　連結管
１５，１６，２８，５０，５１　ピンチバルブ
２４　酵素容器
２５　細胞回収管（取り出し口）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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