(57)【要約】【課題】飽和脂肪酸の鎖長を酵素活性を利用して延長する手段を提供することを課題とする。【解決手段】鎖長延長酵素遺伝子を、適切な宿主に導入して形質転換体を作成する工程と、該形質転換体を培養して前記鎖長延長酵素を発現させると共に、該酵素に媒介された飽和脂肪酸特異的な鎖長延長反応により、Ｃ１８：０飽和脂肪酸をＣ２０：０飽和脂肪酸にする工程とを含む長鎖脂肪酸を合成する方法を提供する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎖長延長酵素による長鎖脂肪酸の合成法であって、
配列番号１記載の塩基配列、または前記配列において１もしくは数個の核酸が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなる鎖長延長酵素遺伝子を、適切な宿主に導入して形質転換体を作成する工程と、
前記形質転換体を培養して前記鎖長延長酵素を発現させると共に、前記酵素に媒介された飽和脂肪酸特異的な鎖長延長反応により、Ｃ１８：０飽和脂肪酸をＣ２０：０飽和脂肪酸にする工程とを含む方法。
【請求項２】
前記宿主が酵母である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、飽和脂肪酸特異的な鎖長延長酵素による脂肪酸の合成技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
以下の説明においては、［　］内のアラビア数字によって種々の文献を参照する。これら参照文献の完全な書誌的事項は、配列表の前に纏めて列記する。
パルミチン酸（Ｃ１６：０）及びステアリン酸（Ｃ１８：０）は、真核生物の細胞膜、及び貯蔵脂質の主な構成成分である。これらの飽和脂肪酸は、直接の栄養摂取、及び生理学的な要求に応答したデノボ生合成により供給される［１］。Ｃ１６：０は脂肪酸シンターゼの主な産物であり、鎖長延長されてＣ１８：０を生成し、さらにΔ９不飽和化反応を介してオレイン酸（Ｃ１８：１ｎ―９）に転換される［２］。
【０００３】
バクセン酸（Ｃ１８：１ｎ―７）、及び、Ｃ１６：０に由来する他のＣ１８：１異性体は、例えばパルミトオレイン酸（Ｃ１６：１ｎ―７）を経由した異なる経路に沿って生合成される。しかしながら、Ｃ１８：１ｎ―９と比較すると、多くの生物において、それらはむしろ少数の脂肪酸種に過ぎない。従って、このような脂肪酸合成の体系において、Ｃ１６：０の延長反応は、Ｃ１８及び他の長鎖脂肪酸の生合成における重要なステップであることが考えられる。
【０００４】
脂肪酸鎖長延長系（ＦＡＣＥＳ）は、哺乳類の肝臓及び脳においてその性状が調べられている［１］。
ＦＡＣＥＳの顕著な活性は小胞体（ＥＲ）に局在しており、また低レベルではあるがミトコンドリアにも局在している。小胞体系は、２つの基質、即ち、アシル・コエンザイムＡ（例えばパルミトイル・コエンザイムＡ）と、２−炭素部分を供給するマロニルコエンザイムＡとの縮合で始まる４つの連続反応を含んでいる。縮合反応後、β―ケトアシル・コエンザイムＡの還元、β―ヒドロキシアシル・コエンザイムＡの脱水、及びトランス―２―エノイル・コエンザイムＡの還元が続く。延長酵素（エロンガーゼ；ｅｌｏｎｇａｓｅ）により触媒される第１の反応は、全体の鎖延長反応の律速段階［３、４］であり、また食餌及びホルモンの状態により制御されることが知られている［１］。
【０００５】
これまでの研究は、１細胞において２以上のＦＡＣＥＳが存在することを示唆している。実験用ラットの絶食に続く通常食または無脂肪食の再給餌によって、肝臓におけるＣ１６：０及び多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、それぞれ異なる様式で延長反応の活性が変動した［５］。
【０００６】
加えて、インビトロでの競争的基質阻害実験によって、Ｃ１６：０は、Ｃ１８：２ｎ―９及びγ―リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ―６）の延長反応に影響しないのに対して、これらのＣ１８　ＰＵＦＡは互いの延長反応を阻害することが示された。この結果は、少なくとも２つの独立したＦＡＣＥＳの存在を指摘するものである。Ｐｒａｓａｄ等［６、７］は、ジ（２−エチルヘキシル）フタレート（ペルオキシゾーム増殖剤）が飽和脂肪酸の鎖延長を活性化する一方、Ｃ１８：３ｎ―６のミクロソームでの鎖延長反応を抑制するとの実験結果に基づいて、上記の概念を裏付けた。また、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸の延長活性における、キモトリプシンの異なる効果も報告されている［７］。
【０００７】
さらに、Ｌｕｔｈｒｉａ　及び　Ｓｐｒｅｃｈｅｒ［８］は、交叉抑制研究によって、ステアリドン酸（Ｃ１８：４ｎ―３）及びエイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５ｎ―３）は自身の鎖延長を妨げるが、Ｃ２２　ＰＵＦＡの鎖延長を妨げないことを示した。上記及び他の生化学的データは、哺乳類のＣ１６：０、並びにＣ１８、Ｃ２０及びＣ２２　ＰＵＦＡの鎖延長を触媒する酵素が少なくとも３つ存在することを示唆している。
【０００８】
現在まで、上記の延長酵素の遺伝子についてはほとんど情報がないが、酵母において、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）をパルミチン酸に変換する鎖長延長酵素ＥＬＯ１や、セラミド又はスフィンゴ脂質の生合成に関わるＥＬＯ２、ＥＬＯ３が同定された。また、最近では、前記ＥＬＯ１〜ＥＬＯ３遺伝子の夫々を欠損した酵母株を相補する、マウス遺伝子Ｓｓｃ１、Ｓｓｃ２、及びＣｉｇ３０が同定された。
【０００９】
Ｔｖｒｄｉｋ等［９］は、マウスにおいて極長直鎖脂肪酸及びスフィンゴ脂質の生合成に関与するいくつかの縮合酵素を記載している。これら酵素のうちでＣｉｇ３０は、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＥＬＯ２欠損変異体において、Ｃ２０―２４脂肪酸合成能の欠失を抑圧することが報告されている［１０］。また、Ｓｓｃ　１（酵母ＥＬＯ３の機能的なホモログである）［１０］は、スフィンゴ脂質のアシル部分の合成に関与するものであるとの報告がある。
【００１０】
ＥＬＯ１は、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）の延長に必要な延長酵素として最初に記載されたものである［１１］。延長酵素の基質特異性は脂肪酸シンターゼのそれとは異なるので、延長酵素の遺伝子を欠損する変異体は、Ｃ１６：０またはＣ１８：０の何れをも成育に必要としない。
【００１１】
最近、Ｃ１８　ＰＵＦＡに作用する延長酵素類が、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）［１２］、真菌類（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ａｌｐｉｎａ）［１３］、及びヒト［１４］において同定された。
【００１２】
興味深いことに、ヒト延長酵素（ＨＥＬＯ１）のみがＣ２０　ＰＵＦＡをも延長することができ、線虫及びＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属真菌類には存在しないＣ２２　ＰＵＦＡを供給できる。また、前記ヒト延長酵素は、Ｃ１６：０及びＣ１８：０の延長はできないが、Ｃ１６：１ｎ―７の延長をある程度触媒するものであった。
【００１３】
本発明において、発明者等は哺乳類の延長酵素（ラット酵素に対してｒＥＬＯ２と命名した）を開示する。本発明で得られた知見は、哺乳類の複数のＦＡＣＥＳの構造的、及び、機能的な差異についての基礎的知識を提供する。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、飽和脂肪酸の鎖長を、酵素活性を利用して延長する手段を提供することであり、特に、Ｃ１８：０飽和脂肪酸の鎖長を延長してＣ２０：０飽和脂肪酸にするための手段を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明において、前記課題を解決するための手段として以下が提供される。即ち、
鎖長延長酵素による長鎖脂肪酸の合成法であって、
配列番号１記載の塩基配列、または前記配列において１もしくは数個の核酸が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなる鎖長延長酵素遺伝子を、適切な宿主に導入して形質転換体を作成する工程と、
前記形質転換体を培養して前記鎖長延長酵素を発現させると共に、前記酵素に媒介された飽和脂肪酸特異的な鎖長延長反応により、Ｃ１８：０飽和脂肪酸をＣ２０：０飽和脂肪酸にする工程とを含む方法が提供される。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜酵素蛋白質＞
本発明において使用する酵素蛋白質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる酵素蛋白質であり、基質となる脂肪酸、特に飽和脂肪酸の鎖長を延長する酵素蛋白質（ｒＥＬＯ２）である。この酵素は、基質としてのＣ１６：０飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：０飽和脂肪酸に対して作用し、これを鎖長が２炭素延長された脂肪酸、即ち、Ｃ１８：０飽和脂肪酸、より好ましくはＣ２０：０飽和脂肪酸に転換することができる。
また、本発明において使用する酵素蛋白質は、上記のように配列番号２記載のアミノ酸配列からなる酵素蛋白質（ｒＥＬＯ２）に加えて、該配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該酵素蛋白質と機能的に同等な蛋白質をも含むものである。
【００１７】
なお、本明細書において「機能的に同等な蛋白質」とは、脂肪酸の鎖長を２炭素単位延長する活性を有し、前記酵素蛋白質の作用により前記基質としての脂肪酸、好ましくはＣ１６：０飽和脂肪酸、より好ましくはＣ１８：０飽和脂肪酸を、夫々２炭素延長された脂肪酸、好ましくはＣ１８：０飽和脂肪酸、より好ましくはＣ２０：０飽和脂肪酸に転換する機能を有する酵素蛋白質を意味する。
【００１８】
＜遺伝子＞
本発明においては、上記の酵素蛋白質をコードする遺伝子を適切な宿主に形質転換し、該宿主内において発現された酵素蛋白質を用いる。ここで形質転換に使用する遺伝子は、例えば配列番号１記載の塩基配列からなるものである。
【００１９】
また、本発明においては、上記のように配列番号１記載の塩基配列からなる遺伝子以外に、該配列において１もしくは数個の核酸が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、前記酵素蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードする遺伝子を用いてもよい。
【００２０】
前記遺伝子は、例えば以下に記載する当業者に周知の方法によって作成できる。即ち、
配列番号１に記載の塩基配列に基づいて設計したプライマーセット、及び、ラットの肝臓から単離したｍＲＮＡをもとに逆転写反応を行い、作成されたｃＤＮＡライブラリーなどを鋳型として用いたＰＣＲ法によって増幅できる。また、前記塩基配列に基づき設計したプローブを用いて、前記ｃＤＮＡライブラリーを保持する大腸菌などの宿主生物に対してストリンジェントな条件においてハイブリダイゼーションを行うなどの方法により単離できる（本発明の遺伝子を単離する方法の詳細な例に関しては、下記の実施例の説明を参照されたい）。
【００２１】
既述した本発明の酵素蛋白質は、前記遺伝子の翻訳産物である。前記酵素蛋白質は前記遺伝子を適切なベクターに組み込んで、適切な宿主を形質転換した後に遺伝子発現を誘導することにより得ることができる。
【００２２】
＜ベクターおよび宿主＞
本発明において、前記遺伝子を宿主に形質転換するために適切なベクターを使用する。ここで使用するベクターは、該ベクターを導入して形質転換する宿主において前記遺伝子を発現せしめるものであればよく、使用する宿主などの種々の条件によって適切なものを適宜選択することが好ましい。例えば、前記宿主が酵母であれば、例えばガラクトース誘導性のプロモーターＧＡＬ１の支配下で導入遺伝子を発現する酵母発現ベクターｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　サンディエゴ、　ＵＳＡ）を使用することができる。
【００２３】
本発明における宿主は特に限定されることはなく、ラビリンチュラ類等の微生物、大腸菌等の細菌、哺乳類細胞、昆虫細胞などから目的に応じて適切な宿主が選択されるが、好ましくは酵母である。前記酵母は、例えば、酵母（Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株であるＩＮＶＳｃ１株（α／ａ，　ｈｉｓ３／ｈｉｓ３，　ｌｅｕ２／ｌｅｕ２，　ｔｒｐ１／ｔｒｐ１，　ｕｒａ３／ｕｒａ３；　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入できる）などを使用することができる。
【００２４】
形質転換の方法は、使用する前記ベクター及び前記宿主によって適切な方法を適宜選択することが好ましい。当業者であれば電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン法などの種々のベクター導入方法から適切な形質転換の方法を選択することができる。
【００２５】
＜Ｃ１８：０飽和脂肪酸をＣ２０：０飽和脂肪酸にする方法＞
本発明によれば、前記形質転換体を培養することによって、前記基質の鎖長を延長することができる。この方法では、前記形質転換体を、前記遺伝子が発現する条件下において、宿主にとって適切な培養条件で培養すればいい。その際、前記培地に基質となる脂肪酸を適切な濃度で添加してもよい。当業者であれば前記形質転換体を培養し、適切に前記遺伝子を発現させる条件を選択することができる。
【００２６】
例えば、前記ｐＹＥＳ２ベクターを使用して形質転換した酵母を用いる場合、一般的な酵母を培養するための適切な培養条件下で培養して前記方法を実施することができるが、例えば４％ラフィノース、アミノ酸非含有の０．７％酵母窒素ベース（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、　デトロイト、　ＵＳＡ）、１％　ｔｅｒｇｉｔｏｌ型　ＮＰ―４０、２０μｇ／ｍｌ　ヒスチジン、６０μｇ／ｍｌ　ロイシン、及び、４０μｇ／ｍｌ　トリプトファンを含む培地中で２８℃程度の温度条件下で培養できる。この場合、２％（ｗ／ｖ）程度のガラクトースの添加、及び３０時間程度の付加的な培養によって導入遺伝子の発現誘導を実施することができる。前記培地には所望により、０．１ｍＭから０．５ｍＭ程度の終濃度で脂肪酸基質を添加してもよい。
【００２７】
前記形質転換体により産生された脂肪酸の分離・分析は、当業者により通常用いられる方法を使用できるが、例えば以下の手法で分析できる。すなわち、
前記形質転換体の組織もしくは細胞を回収し、脱イオン水で洗浄し、そして、脂質画分をクロロホルム／メタノールの混合液（２：１、　ｖ／ｖ）で抽出する。次に総脂質画分を、１０％　塩酸メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、　東京化成、　東京、　日本）で処理する。前記工程でメチル化された脂肪酸をヘキサン中に抽出し、そしてフレーム・イオン化検出器を備えたガス―液体クロマトグラフ（ＧＣ、モデル　ＧＣ―１７Ａ、　島津、　京都、　日本）にアプライして分離する。
【００２８】
不飽和脂肪酸異性体を分離する場合には、異なる位置に二重結合を有する不飽和脂肪酸異性体を分離し得るカラム、例えばＴＣ―７０キャピラリーカラム（ＧＬサイエンス社、　東京、　日本）などを用いたクロマトグラフィにより分離できる。
【００２９】
生成した脂肪酸メチルエステルの同定は、脂肪酸メチルエステル標準液のピークを指標にしたソーティング、及び、ＧＣを接続した質量分析計（ＧＣ―ＭＳ、ＧＣ　Ｍａｔｅ、　ＪＥＯＬ、　東京、　日本）を使用した電子イオン化マススペクトルの比較分析などの手法により実施できる。
【００３０】
即ち、前記脂肪酸メチルエステルを２−アミノ―２―メチル１−プロパノールと混和して、１８０℃程度で１８時間程度加熱する。次にジクロロメタンによる抽出、そして脱イオン水による洗浄を行う、コントロールとなる標準脂肪酸を前記脂肪酸メチルエステルに対する方法と同様の条件下で処理し、両者をＧＣ−ＭＳ（ガス‐液体クロマトグラフィ−マススペクトル分析）により分析する。比較される標準脂肪酸が入手できない場合には、４，４―ジメチルオキサゾリン　（ＤＭＯＸ、　４，４―ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｘａｚｏｌｉｎｅ）誘導体を調製し，アシル鎖の二重結合の位置を同定することができる。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３２】
＜材料および方法＞
［材料］
一般の化学薬品は、シグマ（セントルイス、　ＵＳＡ）、カタヤマ化学（大阪、日本）またはナカライテスク（京都、　日本）から購入した。遺伝子の操作のための試薬および制限酵素は、宝酒造（京都、　日本）および東洋紡（大阪、　日本）から購入したものを使用した。
【００３３】
［ｃＤＮＡクローン化］
ｒＥＬＯ２遺伝子のクローン化のために、線虫（Ｃ．　ｅｌｅｇａｎｓ）の延長酵素遺伝子配列［１２］を、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによるＤＮＡ　ＤａｔａＢａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ　（ＤＤＢＪ）でのラット／マウスＥＳＴ（発現配列タグ）データベースを検索するクエリー配列として使用した。
【００３４】
前記検索により、線虫の前記遺伝子に部分的に相同性のある遺伝子としてマウスＥＳＴ（アクセッション番号ＡＷ４７５６８１）が検索されたが、このＥＳＴは延長酵素の推測上のＮ末端部分のみをコードするものであった。データベース上で前記遺伝子のヒトホモログを探す別のサーチにより、前記マウスＥＳＴ配列と非常に類似する１つのｃＤＮＡ配列（ＡＫ０２７０３１）が見つけられた。マウス遺伝子において欠損している３’領域の配列は、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ株のラット由来、　宝酒造）を鋳型とし、配列番号３のオリゴヌクレオチドプライマーＦＰ１　（５’−ＡＣＡＣＧＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＧＡＡ−３’）、及び、配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドプライマーＡ１４５　（５’−ＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＧ−３’）、並びに、ＥｘＴａｑ　ポリメラーゼ（宝酒造）を使用したＰＣＲにより増幅された。ここで、後者のプライマーは、ライブラリー構築のために使用されるプラスミドｐＡＰ２ｎｅｏ上の配列の一部と一致するものである。ＰＣＲ産物は、Ａ１４５およびＡＷ４７５６８１の配列に由来する内部プライマーである配列番号５のｒＢ２０７Ｆ　（５’−ＡＣＴＧＴＧＣＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＴＴＧＧＴＡＣＴＣＣＴＡ−３’）を使用して再び増幅された。
【００３５】
このＰＣＲにより、ＴＡＧ終止コドンおよび１７３５−ｂｐの長さの非翻訳領域を有する標的蛋白質のＣ末端部をコードする２０８９ｂｐの産物が得られた。ｒＥＬＯ２　ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を含むｃＤＮＡ断片を、それぞれＨｉｎｄ　ＩＩＩおよびＸｂａ　Ｉの認識部位を有するプライマーである、配列番号６のｒａｔＥｌｏＦ１（５’−ＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＡＣＴＴＴＡＣ−３’）、及び、配列番号７のｒａｔＥｌｏＲ１（　５’−ＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＣＴＴＣＧＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴ−３’）、並びに、ＫＯＤポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用したＰＣＲにより、ラットｃＤＮＡライブラリーから増幅して獲得した。
【００３６】
ＨＥＬＯ１遺伝子に相同性を有するマウスＥＳＴを、ＤＤＢＪ上で上記と同様の方法によりサーチした。結果として２つのＥＳＴクローン、ＡＵ０７９８９７およびＢＥ５３５１１８が候補として検索され、それぞれ、ＨＥＬＯ１相同遺伝子の開始および終止コドンをコードするＥＳＴであることがわかった。それぞれ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよびＸｂａ　Ｉ部位（イタリック体）を生成する、配列番号８のプライマーＨＥＬＯＦ１（　５’−ＡＧＧＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＣＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＧＴＣＡＣＴ−３’）、及び、配列番号９のＨＥＬＯＲ１（　５’−ＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴＣＧＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧ−３’）を、前記ＥＳＴ配列に基づいて設計し、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーからｒＥＬＯ１（酵母ＥＬＯ１のラットホモログ）のｃＤＮＡを獲得するために使用した。
【００３７】
ｒＥＬＯ２遺伝子について、更に詳細な単離手順を以下に示す。
《ｒＥＬＯ２遺伝子の保存領域の単離》
線虫の鎖長延長酵素Ｆ５６Ｈ１１．４のアミノ酸配列から保存領域と考えられる配列番号１０の２０アミノ酸（ＤＴＩＦＬＶＬＲＫＲＰＬＭＦＬＨＷＹＨＨ）を検索子としてマウスＥＳＴデータベース（ＮＣＢＩ）を対象に検索した。その結果、６種類のＥＳＴ配列が見つかった。６種類のＥＳＴ配列、ＡＷ４７５６８１、ＡＷ６１１２９８、ＡＩ５９５２５８、ＡＩ４２８１３０、ＡＩ２２５６３２、ＡＡ７９１１３３のうち、後者４個はマウスのＳｓｃ２遺伝子と高い相同性を示した。Ｆ５６Ｈ１１．４に最も相同性の高かったＡＷ４７５６８１の配列を元に２種類のプライマーである配列番号１１のｒＡＷ４７５ＦＰ１（５’−ＡＣＡＣＧＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＧＡＡ−３’）、及び、配列番号１２のｒＡＷ４７５ＲＰ１（５’−ＴＡＧＴＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＧＧＣＡＴＧＣＡ−３’）を保存領域を挟むように設計した。このプライマーを用いて以下のようにＰＣＲを行った。
【００３８】
2004097134.tif 000002
ＰＣＲプログラム
▲１▼９５℃　２分
▲２▼９５℃　３０秒
▲３▼５５℃　３０秒
▲４▼７２℃　１分　　▲２▼〜▲４▼を３５サイクル
▲５▼７２℃　１０分
このＰＣＲにより増幅された１６５ｂｐの遺伝子断片の配列を決定し、ネステッド　ＰＣＲ用の以下のプライマーを作製した。
【００３９】
配列番号５のｒＢ２０７Ｆ：５’−ＡＣＴＧＴＧＣＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＴＴＧＧＴＡＣＴＣＣＴＡ−３’
配列番号１３のｒＢ２０７Ｒ：５’−ＣＡＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＴＧＴ−３’
《５’―ＲＡＣＥ　ＰＣＲ》
Ｒａｔ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ，　ｌｉｖｅｒ　（Ｔａｋａｒａ）は、ｐＡＰｎｅｏ３ベクターにｃＤＮＡが一定方向にクローニングされている。ｐＡＰｎｅｏ３ベクター上の配列から３種類のＰＣＲ用プライマー配列番号１４のＡ１４３（５’−ＣＴＴＡＧＧＡＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’）、　配列番号４のＡ１４５　（５’−ＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＧ−３’）、及び、配列番号１５のＡ１４６　（５’−ＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣ−３’）を設計した。このうちＡ１４３は、ベクターにクローニングされているｃＤＮＡの５’上流側の配列に相当しており、５’ＲＡＣＥ　ＰＣＲを行うのに用いた。このＡ１４３プライマーとｒＡＷ４７５ＲＰ１プライマー及びｒＢ２０７Ｒプライマーを用いて種々の条件で５’―ＲＡＣＥ　ＰＣＲを試みたが、目的の遺伝子断片は単離できなかった。
【００４０】
《３’―ＲＡＣＥ　ＰＣＲ》
３’側の未取得部分を得るために、以下の条件で３’―ＲＡＣＥ　ＰＣＲを行った。なお、プライマーＡ１４５はｐＡＰｎｅｏ３ベクターにクローニングされているｃＤＮＡの３’上流側の配列に対応している。
【００４１】
2004097134.tif 000003
ＰＣＲプログラム
▲１▼９５℃　５分
▲２▼９５℃　１分
▲３▼５５℃　１分
▲４▼７２℃　３分　　▲２▼〜▲４▼を３５サイクル
▲５▼７２℃　１０分
アガロースゲル電気泳動による解析の結果、目的部分と思われるＤＮＡ断片が増幅されたことが確認できたので、ＰＣＲ反応液をテンプレートとしてさらにネステッド　ＰＣＲを行った。
【００４２】
2004097134.tif 000004
ＰＣＲプログラム
▲１▼９５℃　５分
▲２▼９５℃　１分
▲３▼５５℃　１分
▲４▼７２℃　３分　　▲２▼〜▲４▼を３５サイクル
▲５▼７２℃　１０分
このＰＣＲにより約２３００　ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されたのでシークエンス解析を行った結果、目的の断片であることが確認された。
【００４３】
《ｒＥＬＯ２全長遺伝子の単離》
マウスのＥＳＴクローンＡＷ４７５６８１の配列を元に設計した、配列番号６記載の開始コドンを含むプライマーｒａｔＥｌｏＦ１（５’−ＡＴＣＡａａｇｃｔｔＡＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＡＣＴＴＴＡＣ−３’；小文字部分はＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位）及び、３’―ＲＡＣＥ　ＰＣＲにより得られた断片の配列から設計した、配列番号７記載の終止コドンを含むプライマーｒａｔＥｌｏＲ１（５’−ＧＣＴｔｃｔａｇａＣＴＡＣＴＣＧＧＣＣＴＴＣＧＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴ−３’；小文字部分はＸｂａ　Ｉ部位）を用いて以下のようにＰＣＲを行った。なお、高フィデリティーを得るため、ＫＯＤポリメラーゼを用いた。
【００４４】
2004097134.tif 000005
ＰＣＲプログラム
▲１▼９４℃　２分
▲２▼９４℃　１５秒
▲３▼６０℃　３０秒
▲４▼６８℃　１分　　▲２▼〜▲４▼を３５サイクル
このＰＣＲにより得られた約８５０　ｂｐの遺伝子断片をシークエンス解析した結果、目的の遺伝子であることがわかった。
【００４５】
《ｒＥＬＯ２の開始コドン周辺の配列決定》
ｒＥＬＯ２の全長単離に用いたプライマーｒａｔＥｌｏＦ１はマウス由来の配列であるので、この部分についてはラット遺伝子の配列を決定する必要がある。そこでＡＷ４７５６８１の配列を元に、ｒａｔＥｌｏＦ１部分よりさらに５’上流側（開始コドン相当配列より約１１０　ｂｐ上流）の配列に対応する配列番号１６記載のプライマー　５ＡＷ４７５Ｆ１（５’−ＧＣＣＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴＣＣＴＡＣＧＧ−３’）を設計し、以下のようにＰＣＲを行った。
【００４６】
2004097134.tif 000006
ＰＣＲプログラム
▲１▼９５℃　２分
▲２▼９５℃　１分
▲３▼５５℃　１分
▲４▼７２℃　１分　　▲２▼〜▲４▼を３５サイクル
▲５▼７２℃　１０分
このＰＣＲにより約６００　ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認できたので、シークエンス解析を行ったところ、目的の遺伝子であることが確認された。開始コドン周辺部分の塩基配列を精査した結果、マウスの配列を元にして作製したｒａｔＥｌｏＦ１プライマーの配列のうち開始コドンＡＴＧのＡから１７番目のＧが、ラットにおいてはＴであることがわかった。したがって、ラットにおいては配列番号２記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号６のロイシンがマウスの該部位ではトリプトファンである。
【００４７】
［酵母における遺伝子発現］
それぞれｒＥＬＯ１およびｒＥＬＯ２をコードするＰＣＲ産物を、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよびＸｂａ　Ｉで処理して、ガラクトース誘導性のプロモーターＧＡＬ１の支配下で導入遺伝子を発現する酵母発現ベクターｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　サンディエゴ、　ＵＳＡ）の対応する制限酵素認識部位にライゲーションした。全ての挿入ＤＮＡの配列を、ＤＹＥｎａｍｉｃ　ＥＴ　ターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　スウェーデン）、及び、ジェネッティックアナライザー（タイプ３１０、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、　フォスターシティー、　ＵＳＡ）による連鎖停止シークエンシングを用いて分析した。
【００４８】
前記プラスミドを、酵母（Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株であるＩＮＶＳｃ１株（α／ａ，　ｈｉｓ３／ｈｉｓ３，　ｌｅｕ２／ｌｅｕ２，　ｔｒｐ１／ｔｒｐ１，　ｕｒａ３／ｕｒａ３；　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）、又は、ＯＬＥ１（Δ９不飽和化酵素）欠損変異株Ｌ８―１４Ｃ（ａ，　ｏｌｅ１Δ：：　ＬＥＵ２，　ｕｒａ３，　ｈｉｓ４、ラトガーズ大学のＣ．　Ｅ．マーティンから提供された）［１５］に導入した。
【００４９】
酵母形質転換体を、ウラシルが欠損する培地プレート上で選択した。選択、維持、および生育に不飽和脂肪酸を要求するｏｌｅ１欠損変異体由来の形質転換体の初期培養時には、培地にそれぞれ０．５ｍＭのＣ１６：１ｎ―７およびＣ１８：１ｎ―９を添加した。前記酵母形質転換体を、４％ラフィノース、アミノ酸非含有の０．７％酵母窒素ベース（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　デトロイト、　ＵＳＡ）、１％　ｔｅｒｇｉｔｏｌ型　ＮＰ―４０、２０μｇ／ｍｌ　ヒスチジン、６０μｇ／ｍｌ　ロイシン、及び、４０μｇ／ｍｌ　トリプトファンを含む培地５０ｍｌ中で２８℃、一晩培養した。ここで最後に述べた２成分はｏｌｅ１欠損株には使用しなかった。
【００５０】
そして、〜５ｘ１０６　細胞／ｍｌの細胞密度に達する直前に培養液に０．１ｍＭ（ｏｌｅ１欠損株には０．５ｍＭ）の終濃度で脂肪酸基質を添加した。導入遺伝子の発現を、２％（ｗ／ｖ）までのガラクトースの添加、及び約３０時間までのさらなる培養によって行った。ｏｌｅ１欠損の遺伝的背景を有する系統においては、前記遺伝子の過剰発現が前記宿主の生長阻害を引き起こすことから、誘導期間を最高１０時間に設定した［１５］。
【００５１】
［脂肪酸分析］
酵母細胞を回収し、脱イオン水で洗浄し、そして、脂質画分を以前に記載のようにクロロホルム／メタノールの混合液（２：１、　ｖ／ｖ）で抽出した［１６］。
総脂質画分を、１０％　メタノリック・ハイドロクロライド（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、　東京化成、　東京、　日本）で処理した。メチル化された脂肪酸をヘキサン中に抽出し、フレーム・イオン化検出器を備えたガス―液体クロマトグラフ（ＧＣ、モデル　ＧＣ―１７Ａ、　島津、　京都、　日本）にアプライした。異なる位置に二重結合を有する不飽和脂肪酸異性体を分離し得るＴＣ―７０キャピラリーカラム（ＧＬサイエンス、　東京、　日本）上で昇温法（１℃／分で１９０〜２００℃）を用いてクロマトグラフィを行った。
【００５２】
脂肪酸メチルエステル標準液のピークを指標にしたソーティング、及び、以前に記載［１７］のようにマススペクトル分析に連結されたＧＣ（ＧＣ―ＭＳ、　ＧＣ　Ｍａｔｅ、　ＪＥＯＬ、　東京、　日本）を使用した電子イオン化マススペクトルの比較分析により各々のピークを同定した。比較される標準脂肪酸が利用できなかった場合には、４，４―ジメチルオキサゾリン　（ＤＭＯＸ、　４，４―ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｘａｚｏｌｉｎｅ）誘導体をアシル鎖の二重結合の位置を同定するために使用した［１８］。
【００５３】
脂肪酸メチルエステルを２−アミノ―２―メチル１−プロパノールと簡単に混和して、１８０℃で１８時間加熱した。ジクロロメタンによる抽出、及び、脱イオン水による二度の洗浄後、ＤＭＯＸ誘導体をメチルエステルに対する方法と同様の条件下でＧＣ−ＭＳ（ガス‐液体クロマトグラフィ−マススペクトル分析）により分析した。
【００５４】
Ｓｐｒａｇｕｅ―Ｄａｗｌｅｙ系統の雄ラット（〜１６０ｇ、　週齢）を、チャールズリヴァー日本（横浜、日本）から購入し、個々にケージに収容して約５日間随意に水及び食糧を与えた。
【００５５】
飼育環境に順応した後に３匹のラットを４８時間絶食させ、カロリー計算上、６３．９％の炭水化物、１６．９％の脂肪、及び１９．２％の蛋白質、ビタミン及びミネラルから成るコントロール食餌（ＡＩＮ―９３Ｇ、　オリエンタル酵母）を供給した。２４時間の食餌供給後に、ラットを再度４８時間絶食させた。そして、各々のラットにコントロール食餌中のダイズ油及びカゼインが、コーンスターチ及び脱脂カゼインに置き換えられた無脂肪食を食餌供給した。
【００５６】
その後、ラットを屠殺して、肝臓及び他の器官を迅速に摘出した。コントロール・ラットには前記期間にわたってコントロール食餌を供給し、各器官を上記と同様に摘出した。肝臓の総脂質をＦｏｌｃｈ等の方法［１９］により抽出し、脂肪酸組成を上記の通りに分析した。
【００５７】
［ＲＮＡプローブ及びノーザンブロット分析］
ｒＥＬＯ１（１―３６７ｂｐ）、及び、ｒＥＬＯ２（１―４２９ｂｐ）のｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　ラ・ホーヤ、　ＵＳＡ）ベクターにライゲーションして、ｃＤＮＡのすぐ上流のＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位で消化して線状化した。ラン・オフ・アンチセンス転写産物を、フルオレセインＲＮＡ標識混合物（ロシュ・ダイアゴニスティックス、　バーゼル、　スイス）、及び、線状化ＤＮＡ鋳型の存在下でＳＰ６またはＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを使用して産生した。ラットのステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素１（ＳＣＤ１）に対するＲＮＡプローブは、そのオープンリーディングフレームの１０３―１１７７　ｂｐに対応する領域を含むものである。β―アクチン遺伝子（５１３ｂｐの鎖長）の検出強度をもとにノーザン・ブロットのノーマライゼーション行った。前記プローブを使用の直前に５分間煮沸して変性させた。
【００５８】
ポリアデニル化したＲＮＡを抽出し、製造業者の指示どおりにμＭＡＣＳ　ｍＲＮＡ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ、　ドイツ）でラット組織から精製した。前記ｍＲＮＡを、１％のアガロース／ホルムアルデヒド・ゲルで分析し、それからＴｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅｒシステム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ、　ＵＳＡ）を使用してハイボンド―Ｎ　ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写した。前記ブロット膜を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、　パロアルト、　ＵＳＡ）中で１時間７０―７５℃でプレハイブリダイズした。
【００５９】
４ｎｇ／ｍｌの変性フルオレセイン標識ＲＮＡプローブを含む同様の緩衝液中で前記ブロット膜を７０〜７５℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、ブロットをＧｅｎｅ　Ｉｍａｇｅｓ　ＣＤＰ―Ｓｔａｒ検出モジュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して免疫化学的にフジＲＸフィルム上で検出した。
【００６０】
＜結果＞
［脂肪酸延長酵素をコードする２つの哺乳動物遺伝子のクローン化］
ｒＥＬＯ１及びｒＥＬＯ２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、それぞれ２９９及び２６７残基のアミノ酸ポリペチドをコードするＯＲＦを含むものであった。図１は、それらの推定アミノ酸配列と、他の哺乳類の延長酵素及び延長酵素類似蛋白質の配列とを整列させて比較したものである。
【００６１】
図１において、ｒＥＬＯ１（ＤＤＢＪアクセッション番号ＡＢ０７１９８５）及びｒＥＬＯ２（ＡＢ０７１９８６）のｃＤＮＡ配列をもとに翻訳したアミノ酸配列を、ＨＥＬＯ１（ＡＦ２３１９８１）、ｒＥＬＯ２のヒト・ホモログ（ｈＥＬＯ２、　ＡＫ０２７０３１）、及びマウス延長酵素であるＣｉｇ３０（ｍＣｉｇ３０、　Ｕ９７１０７）及びＳｓｃ１（ｍＳｓｃ１、　ＡＦ１７０９０７）の推測上のアミノ酸配列と共に整列させた。ｒＥＬＯ２と同一の残基は白黒を反転表示した。保存されたヒスチジン・ボックスには下線を引いた。アラインメントの上に付点を付けられた列は、ＴＭＰｒｅｄｉｃｔアルゴリズム分析［３３］によって、強い膜貫通ヘリックスを形成する可能性が高いことが推測されるｒＥＬＯ２配列の領域を示している。
【００６２】
ｒＥＬＯ１配列は、ヒト延長酵素　ＨＥＬＯ１（９３．０％同一）の配列に対して最も高い相同性を有しており、続いてマウス延長酵素類似蛋白質　Ｓｓｃ２（５７．４％；　配列示さず）、マウス延長酵素　Ｓｓｃ１（３４．３％）、Ｃｉｇ３０（２５．８％）の順番で相同性を有している。
【００６３】
また、ｒＥＬＯ２配列は、本発明においてｈＥＬＯ２と命名されたヒトの未知の蛋白質（ＡＫ０２７０３１）（９５．８％）をコードする配列、及び、マウスＣｉｇ３０（４２．９％）と類似していた。
【００６４】
ｒＥＬＯ１及びｒＥＬＯ２間の相同性スコアは２５．０％であった。アラインメントによって、全ての配列が脂肪酸不飽和化酵素［２０］及び延長酵素［１］（図１）を含む鉄含有酵素間で保存されている特徴的なＨＸＸＨＨモチーフ（配列番号１７に記載；Ｘは任意のアミノ酸を意味する）を共有していることが示された。これらの配列はＧＳＡモチーフ（ＮＡＤＰＨ−結合部位であると提唱されている）を欠いている。また、ＧＳＡモチーフは酵母ＥＬＯ１の配列中に認められたが、酵母ＥＬＯ２及び酵母ＥＬＯ３には認められなかった［１０］。
【００６５】
ｒＥＬＯ１と同様にｒＥＬＯ２ポリペチドの疎水性プロットのパターンは、以前に報告され５つの膜貫通領域の存在が予測された［９−１１］延長酵素のパターンと類似性を示した（図１）。したがって、ｒＥＬＯ１はＨＥＬＯ１のラット・ホモログであり、そしてｒＥＬＯ２及びそのヒト・ホモログ　ｈＥＬＯ２は、脂肪酸延長酵素ファミリーの新規メンバーであることが解明された。
【００６６】
［酵母におけるｒＥＬＯ１及びｒＥＬＯ２遺伝子の機能的発現］
ラット延長酵素と推測される遺伝子の機能を調査及び比較するために、前記遺伝子を酵母（Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＩＮＶＳｃ１、　野生型）に導入して発現誘導した。脂肪酸を添加しない条件下において、ｒＥＬＯ１遺伝子の発現は顕著量のＣ１８：１ｎ―７を新規に生成した（表１）。この結果は、ＨＥＬＯ１（ｒＥＬＯ１のヒト・ホモログ）を酵母で発現した［１４］際に観察される現象と同様であり、内因性のＣ１６：１ｎ―７が２−炭素ユニット延長したことを示唆している。
【００６７】
【表１】
2004097134.tif 000007
【００６８】
同様に、少量検出されるエイコセン酸（Ｃ２０：１ｎ―７及びＣ２０：１ｎ―９）は、それぞれ生成されたＣ１８：１ｎ―７及び内因性のＣ１８：１ｎ―９に由来する延長産物であると考えられた。
【００６９】
一方、野生型酵母でのｒＥＬＯ２遺伝子の発現は、ｒＥＬＯ１発現（表１）の場合と対照的に極めて微量のＣ１８：１ｎ―７（４．０％）を生成する一方で，Ｃ１８：　１ｎ―９含量（７１．０％）を著しく増加させた。これらＣ１８：１異性体上の二重結合の位置の相違により、我々はそれら生成物の由来を区別し得る、すなわち、上記のようにＣ１８：１ｎ―７はｒＥＬＯ１の作用によってＣ１６：１ｎ―７から転換されたものであり、一方、Ｃ１８：１ｎ―９は内在性の酵素（ＯＬＥ１ｐ）によるΔ９不飽和化を介してＣ１８：０から転換されたものである。
【００７０】
Ｃ１６：１ｎ―７が顕著に増加しなかったという事実は、内因性のＯＬＥ１ｐ活性がｒＥＬＯ２誘導によって増加した可能性を否定するものである。従って、我々の結果はｒＥＬＯ２発現によるＣ１８：１ｎ―９の増加がＣ１６：０の鎖延長反応の活性化によるものであることを示すものである。
【００７１】
さらに、ｒＥＬＯ２の過剰発現により、Ｃ１８：１ｎ―７と同様の微量レベルではあるが、Ｃ２０：０、及びそのΔ９―不飽和化産物であるＣ２０：１ｎ―１１に対応するピークを示した。しかし、Ｃ２０：１ｎ―９またはＣ２０：１ｎ―７は検出されなかった（表１）。従って、全ての検出可能なモノ不飽和脂肪酸は、Δ９位に二重結合を有し、対応する飽和種に由来するものである。
【００７２】
ｒＥＬＯ１及びｒＥＬＯ２の作用をより明確に示すために、一連の発現実験を酵母変異体（Ｌ８―１４Ｃ）を使用して行った。ＯＬＥ１（Δ９不飽和化酵素）遺伝子が破壊されているためにこの変異体においては飽和脂肪酸は不飽和化されない。ｏｌｅ１Δ遺伝子型の変異体は通常の成育に不飽和脂肪酸類を必要とするので、遺伝子誘導する培養培地中に０．５ｍＭのＣ１６：１ｎ―７を添加した。コントロール（ｐＹＥＳ２、　表２）でのＣ１８：１ｎ―７の微量の産生は、Ｃ１６：１ｎ―７に作用する現在未確認の内在性の延長酵素活性によるものかもしれない。
【００７３】
【表２】
2004097134.tif 000008
【００７４】
Ｃ１８：１ｎ―９が検出されなかったことは、ＯＬＥ１ｐの不活性化を証明するものであった。このような条件下において、ｒＥＬＯ１の発現は、コントロール（２．９％）と比較してＣ１６：１ｎ―７含量を若干減少させたものの，Ｃ１８：１ｎ―７（２０．３％）を著しく増加させた（表２）。他方、ｒＥＬＯ２発現は、Ｃ１８：０の増加及びＣ１６：０を減少させ、そのため飽和脂肪酸の組成においてＣ１８：０／Ｃ１６：０の割合がコントロール（１．０９）及びｒＥＬＯ１場合（１．１５）と比較して非常に高い２．６７という値にまで顕著に増加させた。この結果は、ｒＥＬＯ２の飽和脂肪酸指向性の延長活性を追認するものであった。
【００７５】
Ｃ２０：０は検出可能な水準以下であった（データ示さず）が、この結果はＣ１８：０基質が少量であったため、及び、ｒＥＬＯ２活性がｏｌｅ１Δの遺伝的背景において顕著でなかったためである可能性がある。延長酵素に類似の構造（図１）を有していることを考え合わせても、以上の結果はｒＥＬＯ２が主にＣ１６：０、及び、より低レベルでＣ１８：０に作用する脂肪酸延長酵素であるという結論を支持するものである。
【００７６】
Ｃ１８：１ｎ―７含量がｒＥＬＯ２を発現した酵母（表１及び２）において多少増加した点にも注目した。これはｒＥＬＯ２の広い基質特異性を示唆する結果である。ｒＥＬＯ１もＣ１６：　１ｎ―７からＣ１８：　１ｎ―７への延長反応（表１及び２）を触媒したので、２つの延長酵素の基質範囲はオーバーラップすると考えられた。ｒＥＬＯ１、またはｒＥＬＯ２遺伝子を保持する野性型酵母形質転換株を使用して、その可能性を検証した。
【００７７】
表３に要約された結果に見られるように、ｒＥＬＯ１発現はＣ１８：４ｎ―３、次いでＣ１８：３ｎ―６に対して高い転換割合を示した。これらのケースの各々において、それぞれＣ２２：　４ｎ―３及びＣ２２：　３ｎ―６の低レベルの生成が観察された。この結果は生成された脂肪酸（Ｃ２０：４ｎ―３及びＣ２０：３ｎ―６）が更に延長されたことを示すものである。ｒＥＬＯ１の発現によって各々の２炭素延長された産物は、アラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ―６）及びＣ２０：５ｎ―３に加えて、リノール酸（Ｃ１８：２ｎ―６）及びα―リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ―３）の存在下でさえ生成した。
【００７８】
【表３】
2004097134.tif 000009
【００７９】
ジホモ―γ―リノレン酸（Ｃ２０：３ｎ―６）、及び、ミード酸（Ｃ２０：３ｎ―９）に対する転換割合は３％未満であった。この他、ｒＥＬＯ２発現の場合、Ｃ１８　ＰＵＦＡがそれぞれ対応するＣ２０　ＰＵＦＡに延長されたが、その延長反応は低レベル（３―７％）であり、Ｃ２０　ＰＵＦＡの更なる転換は観察し得なかった。同条件下でｐＹＥＳ２を保持するコントロール酵母を発現誘導しても、いかなる延長産物も生成しなかった（データ示さず）。
【００８０】
これらの結果は、長鎖ＰＵＦＡに関してＣ１８及びＣ２０　ＰＵＦＡの延長がｒＥＬＯ１により触媒され、そして、軽微なレベルのＣ１８不飽和物の延長がｒＥＬＯ２によっても行われることを示唆するものである。ｒＥＬＯ１及びｒＥＬＯ２とも、Ｃ２２　ＰＵＦＡに対して延長活性を呈さなかった。
【００８１】
［延長酵素の遺伝子発現の食餌制御］
ラット肝臓ミクロソームにおいて、Ｃ１６：０に対する総延長活性（Δ９不飽和化活性と同様に）は絶食によって低下し、通常食または無脂肪食の再給餌により迅速に高水準にまで上昇すると報告されている［５、２１］。
【００８２】
アクチノマイシンＤ（ＲＮＡ転写阻害剤）が鎖延長反応における再給餌効果を抑制したので［２１］、延長活性の増大は遺伝子発現の誘導によって引き起こされるのかもしれない。この可能性を検証するために、肝臓遺伝子のノーザン分析をｒＥＬＯ１、ｒＥＬＯ２及びＳＣＤ１遺伝子に相補的なＲＮＡプローブを使用して行った。図２において、（Ａ）はノーザン分析を、ｒＥＬＯ２、ｒＥＬＯ１、ＳＣＤ１またはβ−アクチンに相補的なＲＮＡプローブを使用して、コントロール（ＣＴ）及びＦＦＤラットの各々３匹から抽出した肝臓のｍＲＮＡ（０．２μｇ／レーン）に対して行った結果である。バンドの推定サイズをキロベース（ｋｂ）として示した。（Ｂ）は（Ａ）のバンドの検出シグナル強度をデンシトメトリで測定した数値をグラフで示したものである。各値は、β−アクチンの測定値に対する各々の測定値の水準の平均値に標準偏差を付して示した。「＊」は対応するコントロールより顕著に高い（ｐ＜０．０１）ものに付した。この実験は３回反復し、その何れにおいても同様の結果が示された。図２に示されるように、ｒＥＬＯ２及びＳＣＤ１転写産物の量は、ラットの絶食及び再給餌スケジュール（ＦＦＤ）の２回の繰り返しによって４〜５倍にまで増加した。対照的にＦＦＤ処理は、ｒＥＬＯ１の発現にほとんど影響しなかった。この結果は２つの延長酵素の発現制御機構における相違を示唆している。
【００８３】
以前のデータと同様に、ラットのＦＦＤ処理は肝臓の脂肪酸組成に対して顕著な影響を及ぼした。即ち、Ｃ１６：　１ｎ―７及びＣ１８：　１ｎ―９の含量は、コントロール・ラットと比較して、それぞれ、５倍及び２倍増加した（表４）。この結果は報告されているようにＳＣＤ１の活性化を示すものである［２２―２４］。
【００８４】
【表４】
2004097134.tif 000010
【００８５】
この際、　Ｃ１８：０含量は若干減少（５６％にまで）した。しかし、デノボ経路のＣ１８脂肪酸（Ｃ１８：　０及びＣ１８：　１ｎ―９）の量は１．３倍まで上昇した。これはＦＦＤ処理によるｒＥＬＯ２誘導の結果であるかもしれない。一方、ｎ―６及びｎ―３系の主要なＰＵＦＡの含量は若干減少するか又は不変であった。ＰＵＦＡ組成のいかなる変動も、ｒＥＬＯ１の活性化または抑制を示唆するものではなかった。これらのデータは、ｒＥＬＯ１及びｒＥＬＯ２活性の発現がＦＦＤ処理によって異なる様式で制御されることを更に示唆するものである。
【００８６】
ＦＦＤラットのノーザン分析によって遺伝子発現の組織分布を調べた。図３においては、図の上側に示したＦＦＤラットの各器官のｍＲＮＡサンプル（０．２μｇ／レーン）を使用したノーザン分析を、ｒＥＬＯ１、ｒＥＬＯにまたはβ−アクチンに対するＲＮＡプローブを使用して行った。この実験は３回反復し、その何れにおいても同様の結果を得た。結果として，ｒＥＬＯ１が多様な組織において発現していることがわかり、肺臓及び脳（図３）においては最も高いレベルで発現していることがわかった。この結果は精巣での結果を除いては以前の報告［１４］と同様であった。対照的に、ｒＥＬＯ２の発現は主に肝臓において、及び、わずかに脳において観察されたが、他の組織（図３）、又は、コントロール・ラット（データ示さず）の全ての検査した組織においては観察されなかった。ｒＥＬＯ２の肝細胞における発現は、ＦＦＤ処理で抑制された長鎖脂肪酸の迅速な合成に寄与し得ると考えられた。
【００８７】
ワックス［９］、及び、中鎖／長鎖脂肪酸［１０―１４］の生合成に関与する脂肪酸延長酵素の分子同定における最近の進歩は、それら酵素の構造上の特性を明らかにした。それらの特性には、ＨＸＸＨＨ（配列番号１７）として表現される特徴的なモチーフを有することなどが含まれ、前記モチーフは脂肪酸不飽和化酵素及び炭化水素ヒドロキシラーゼのようなジイオン−オキソ（ｄｉｉｏｎ―ｏｘｏ）酵素［２０］に認められているものである。
【００８８】
保存されたモチーフのヒスチジン残基は、酸素がＯ２−依存的レドックス反応の電子移動に寄与するＦｅ―Ｏ―Ｆｅクラスタを形成するＦｅ―キレーティングリガンドとして作用すると信じられている［２５］。
【００８９】
延長酵素蛋白質の別の特性としては、膜貫通領域と予測される５つの疎水性のストレッチが存在することが挙げられる。この特性は、主にミクロソーム膜画分において脂肪酸延長活性が局在するとの知見と一致するものである。しかし、これらの構造上の特色は、それぞれ、Ｃ１６：０、及び、より長鎖の飽和脂肪酸の鎖延長における縮合反応を触媒するＫＡＳ　ＩＩ［２６］、及び、ＦＡＥ１［２７］を含む植物酵素では認められていない。この事実はそれら植物酵素の反応スキームにおける異なる機構の存在を示唆するものである。この機構の違いは，触媒し得る脂肪酸基質の誘導体群の構造上の相違に関係する可能性がある。実際に、植物酵素は基質としてアシルキャリア蛋白質またはグリセリドに結合する脂肪酸を利用するが、動物（および、おそらく酵母を含む真菌類）の延長酵素は、コエンザイムＡ―活性化基質を要求する。Ｃ１８：　０合成に関与する縮合酵素に関して、本発明で同定された哺乳類延長酵素　ｈＥＬＯ２、及び、ｒＥＬＯ２は後者の最初の例であって、植物酵素とは構造的類似性を有さないものである。
【００９０】
本発明において、ｒＥＬＯ２のＣ１６：　０による延長活性を示すために酵母の異種宿主発現系を利用した。野性型の酵母を宿主として使用した際に、ｒＥＬＯ２の過剰発現はＣ１８：　１ｎ―９含量の著しい増加を生じた（表１）。実験系からＯＬＥ１ｐの関与を排除するため、次にｏｌｅ１欠損酵母変異体Ｌ８―１４ＣにおいてｒＥＬＯ２の発現系を構築し、遺伝子発現誘導によりＣ１８：　０の増加を観察した（表２）。しかし、変異体のＣ１６：　０（２．６７）に対するＣ１８：　０の割合は、野性型宿主で観察された割合ほど高いものではなかった（７．３２、　表１）。この結果は、ｏｌｅ１Δ宿主に対するガラクトースの添加後の培養時間を、野生型宿主の場合より短く設定したためであると思われた。遺伝子の過剰発現に対してｏｌｅ１Δ宿主が不安定であることから、培養時間の制限を回避することができない［１５］。これに加えて、多量に加わられたｒＥＬＯ２のマイナーな基質であるＣ１６：　１ｎ―７がＣ１６：０の競争者となったのかもしれない。
【００９１】
ＰＵＦＡに対するｒＥＬＯ１及びｒＥＬＯ２の基質特異性について調べた結果、ｒＥＬＯ１がＣ１８：　４ｎ―３及びＣ１８：　３ｎ―６を延長する顕著に高い活性を有することがわかった（表３）。また以前の報告と同様に、Ｃ２０：　５ｎ―３、Ｃ１８：　３ｎ―３、Ｃ２０：　４ｎ―６及びＣ１８：　２ｎ―６を含む他のＰＵＦＡは、中程度または低程度の転換率で延長された［１４］。
【００９２】
同じ鎖長の脂肪酸と比較して、不飽和度が高い基質及びｎ―３位置に二重結合を有する基質は、ｒＥＬＯ１によって優先的に延長される傾向にあった。主要なｎ―３　ＰＵＦＡの鎖長（Ｃ２０：５ｎ―３及びＣ２２：６ｎ―３）が主要なｎ―６　ＰＵＦＡ（Ｃ１８：２ｎ―６及びＣ２０：４ｎ―６）より長いという脂肪酸分布を示す哺乳動物細胞において、このようなｎ―３　ＰＵＦＡに対する高い選択性は、Ｃ１８、Ｃ２０及びＣ２２　ＰＵＦＡの含量割合を部分的に反映しているのかもしれない。一方、ｒＥＬＯ２の基質特異性はＣ１８　ＰＵＦＡの転換を低レベルながら触媒するが，ｒＥＬＯ１の基質特異性とは対照的なものであった。
【００９３】
これらの結果は、延長酵素の基質選択性はさほど厳密ではなく、基質のアシル基の鎖長、及び、不飽和度の双方により特異性が異なることを強調するものである。また、ｒＥＬＯ１が飽和脂肪酸に作用しなかった点に留意するべきであり、この事実はＣ１６：　０の延長反応におけるｒＥＬＯ２の重要性を示唆している。さらに、延長酵素のいずれもがＣ２２　ＰＵＦＡに対して検出可能なレベルの延長活性を示さなかったという事実は、未同定の延長酵素の存在を示唆するものである。
【００９４】
Ｎａｋａｇａｗａ等［２２］は、肝臓ミクロソームのＣ１６：　０―コエンザイムＡの延長（ｒＥＬＯ２によると思われる）及びΔ９不飽和化（ＳＣＤ１による）の双方が、どのようにラットの絶食及び再給餌によって活性化されるかを記載している。ＳＣＤ１の活性化は、２−３回の高炭水化物／低脂肪食の食餌スケジュールの反復によって更に増強した［２８］。
【００９５】
本発明において、我々は同様の条件下において肝細胞のＳＣＤ１及びｒＥＬＯ２転写産物量が、それぞれのコントロールより４―５倍増大していることを観察した（図２）。コレステロールを含む脂質の場合と同様に、これらの酵素活性が血糖及びインシュリン量の変化を介した栄養状態及びホルモン状態により調整されることは以前から知られている［１、２３、２９］。これらの栄養的パラメーターの変化も、Ｃ１６：０を供給する脂肪酸シンターゼの遺伝子発現の変調を生じる［３０］。
【００９６】
最近の研究は、食餌脂質の長期間欠乏後の再給餌処理におけるステロール制御因子結合蛋白質１の活性化を介したＳＣＤ１転写の制御機構の存在を示唆している［３１、３２］。ｒＥＬＯ２発現が、ＳＣＤ１調節に関与する因子に共通の細胞内情報伝達によって少なくとも部分的に制御されることは充分考えられる。これらの脂質合成系酵素とは対照的に、ラットのＦＦＤ処理はｒＥＬＯ１の発現を肝細胞で顕著に誘導しなかった（図２）。この結果は、ミクロソームにおけるＣ１８：　３ｎ―６に対する延長活性が、上記のような制限された栄養状態により影響されなかったという以前のデータと一致するものである［５］。
【００９７】
これらのデータは、細胞の飽和及び不飽和脂肪酸のホメオスタシスにおけるデノボ脂肪酸及びＰＵＦＡの生合成系の制御における新規の機構の存在を示唆するものである。
【００９８】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、飽和脂肪酸の鎖長を酵素活性を利用して延長できる。より具体的には、本発明の酵素蛋白質による飽和脂肪酸特異的な鎖長延長反応を介して、Ｃ１８：０飽和脂肪酸をＣ２０：０飽和脂肪酸にすることができる等、顕著な効果を得ることができる。
【００９９】
【参照文献】
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２６）　ｖｏｎ　Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ−Ｋｎｏｗｌｅｓ，　Ｐ．，　Ｏｌｓｅｎ，　Ｊ．　Ｇ．，　Ａｒｎｖｉｇ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｌａｒｓｅｎ，　Ｓ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　β−ｋｅｔｏａｃｙｌ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　（ＫＡＳ）　ｃａｔａｌｙｓｉｓ．　Ｉｎ　”Ｒｅｃｅｎｔ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｌｉｐｉｄｓ”，　ｅｄｓ．　Ｈａｒｗｏｏｄ，　Ｊ．　Ｌ．　ａｎｄＱｕｉｎｎ，　Ｐ．　Ｊ．，　Ｐｏｒｔｌａｎｄ　Ｐｒｅｓｓ，　ｐｐ．　６０１−６０７　（２００１）．
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】哺乳類脂肪酸延長酵素のマルチプルアライメントを示す図である。
【図２】ラット延長酵素遺伝子発現の栄養条件的制御を示す写真及びグラフである。
【図３】ラット延長酵素遺伝子発現の組織分布を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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