(57)【要約】【課題】ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法の提供。【解決手段】ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌、例えば、ノボスフィンゴビウム・スバルクティカム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ｓｕｂａｒｃｔｉｃｕｍ）、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）などを用いて、石炭系油分で、石油系油分で又は鉱油等で汚染された土壌から当該油分を除去する方法を提供する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法。
【請求項２】
ノボスフィンゴビウム属細菌を含有する土壌を用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法。
【請求項３】
ノボスフィンゴビウム属細菌を含有する土壌スラリーを用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法。
【請求項４】
前記土壌スラリーが、油分汚染土壌と、海水、淡水若しくは製鉄所安水の活性汚泥処理水のいずれか又はこれらの混合水とにより形成されるスラリーである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
土壌スラリーのＯＲＰを、＋５０ｍＶ（銀／塩化銀飽和塩化カリウム電極基準）以上に維持することを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
土壌スラリーのｐＨを、６以上９未満に維持することを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項７】
前記油分の汚染が、コールタール、コークスを含む石炭系油分の汚染である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記油分の汚染が、原油、ガソリンを含む石油系油分の汚染である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌が、ノボスフィンゴビウム・スバルクティカム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ｓｕｂａｒｃｔｉｃｕｍ）又はノボスフィンゴビウム・アロマチシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コールタール、アスファルト、コークスなどに起因する石炭系油分で、原油、ガソリンなどに起因する石油系油分で又は鉱油等で汚染された土壌の当該微生物による浄化に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コールタール、アスファルトやコークスなど石炭系の油分で汚染された土壌又は原油、ガソリンなど石油系の油分や鉱油で汚染された土壌には、環境上好ましくないベンゼン、トルエン、キシレンなどの単環芳香族炭化水素（Ｍｏｎｏ　Ａｒｏｍａｔｉｃ　Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）やナフタレン、フェナンスレン、アントラセン、ピレンなどの多環芳香族系炭化水素（Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ　Ａｒｏｍａｔｉｃ　Ｈｙｄｒｏｃａｒｎｏｎｓ、略称ＰＡＨｓ）が含まれる。これら油分で汚染された土壌はさらに地下水汚染の原因となることも心配される。そこで、我が国でも２００３年１月から「土壌汚染対策法」が施行されることになっている。工場の廃止や宅地転用にともない、石炭系又は石油系などの油分によって汚染された土壌サイト、例えば、石炭製品製造工場、ガス製造工場、石油精製工場の跡地やガソリンスタンド跡地などが、多数顕在化することが懸念される。油分汚染土壌の浄化は産業又は環境保全上、解決されるべき大きな課題となっている。
【０００３】
石炭系又は石油系の油分によって汚染された土壌からの油分除去には、加熱による油分の揮発・脱離や、熱分解などの熱エネルギーを加える方法の他、酸化剤などを用いて化学的に油分を分解する方法などが知られている。一方、生物作用を利用して油分を土壌から除去することも試みられている。生物作用による土壌浄化には大きく分けてバイオスティミュレーション（ｂｉｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）とバイオオーグメンテーション（ｂｉｏ−ａｕｇｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）がある。バイオスティミュレーションでは汚染土壌に自生する微生物に対して、必要とする炭素源、塩類、酸素などを与えて、微生物の生息環境を制御して、汚染現場の土壌に自生する微生物を活性化させて、土壌から有害物質を取り除く方法である。一方、バイオオーグメンテーションでは、単離されている浄化作用のある有用微生物を大量に培養して、汚染現場の土壌中に微生物を注入・添加することにより汚染の浄化を企てるものである。このような生物作用を利用した土壌浄化は、微生物の機能を利用して常温、常圧で行うことが可能であり、２次汚染の可能性が小さいこと、省エネルギーであること、低コストであることなどに因り土壌浄化への応用が期待されている。バイオスティミュレーションもバイオオーグメンテーションも原位置で汚染土壌を移動させることなく浄化を行う方法であるが、一方、汚染土壌を掘り出して、浄化処理を施してから原位置に戻す方法もある。例えば洗浄処理では、土壌に含有・吸着している油分を水中に分散又は溶解させることができ、油分除去への応用も試みられている。さらに土壌をスラリーとして処理する方法では、洗浄処理と微生物処理の両者の長所を組み合わせて利用することができる。土壌スラリーは、土壌に水を添加し土壌スラリーとして、汚染物の微生物分解を図る方法であり、米国等で適用事例がある。
【０００４】
ノボスフィンゴビウム・スバルクティカム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍｓｕｂａｒｃｔｉｃｕｍ）は、別名スフィンゴモナス・スバルクティカ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｕｂａｒｃｔｉｃａ）であり、ノヒネック（Ｎｏｈｙｎｅｋ）らによってクロロフェノールの分解菌として１９９６年に報告されている（以下の非特許文献１を参照のこと）。
【０００５】
ノボスフィンゴビウム・アロマティシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）は、別名スフィンゴモナス・アロマティシボラン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）であり、フレドリクソン（Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ）らによってトルエン、ナフタレンなどの芳香族物質の存在下でも増殖できる微生物として１９９１年に報告されている（以下の非特許文献２を参照のこと）。
【０００６】
ノボスフィンゴビウム・アロマティシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）（別名スフィンゴモナス・アロマティシボラン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ））が芳香族物質の分解菌であることが、同じくフレドリクソンらにより１９９５年に報告されている（以下の非特許文献３を参照のこと）。
【０００７】
同じく、ノボスフィンゴビウム・アロマティシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）（別名スフィンゴモナス・アロマティシボラン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ））が芳香族物質の分解菌であることが、バルクウィル（Ｂａｌｋｗｉｌｌ）らにより１９９７年に報告されている（以下の非特許文献４を参照のこと）。
【０００８】
すなわち、ノボスフィンゴビウム・アロマティシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）（別名スフィンゴモナス・アロマティシボラン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ））に関しては、油分汚染と関連する芳香族物質の分解活性が知られていたが、土壌汚染への適用については、本願出願時には全く知られていなかった。またノボスフィンゴビウム・スバルクティカム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ｓｕｂａｒｃｔｉｃｕｍ）（別名スフィンゴモナス・スバルクティカ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｕｂａｒｃｔｉｃａ））関しては、クロロフェノールの分解菌として知られているのみであって、芳香族物質の分解や、さらに油分汚染土壌への適用については、本願出願時には全く知られていなかった。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｎｏｈｙｎｅｋ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４６，１０４２−１０５５
【非特許文献２】
Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ　ａｌ．（１９９１）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７，７９６−８０３
【非特許文献３】
Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１，１９１７−１９２２
【非特許文献４】
Ｂａｌｋｗｉｌｌ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４７，１９１−２０１
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の生物による油分汚染土壌の浄化処理には、以下のような問題点・課題がある。
【００１１】
１）バイオスティミュレーションでは汚染サイトに自生する微生物の働きを促進させる方法であるものの、油分に汚染された土壌に対してどのような微生物が浄化作用をもたらすか、微生物の正体がわからないまま実行されているのが現状である。
【００１２】
２）バイオオーグメンテーションでは外部から汚染土壌に投入した外来微生物による浄化作用を期待するが、効率が必ずしも高くない。これは大量培養した微生物を土壌中に注入・添加しても、土壌中に微生物が効果的に拡散・浸透できないことや、土壌中の環境条件を制御できないことから、添加した微生物を土壌環境中安定に棲息させて定着させることが容易でないことに起因する。また、培養が困難なＶＮＣ（Ｖｉｓｉｂｌｅ　ｂｕｔ　Ｎｏｎ　Ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ）である微生物が多く存在するため、土壌から浄化作用のある微生物を単離して大量培養すること自体が容易なことではない。したがって、一般的に培養される大腸菌、シュードモナス、枯草菌など培養が容易な外来微生物を油分汚染土壌中に常在させることは極めて難しい。したがって、油分に汚染された土壌にバイオオーグメンテーションのために外来微生物を用いることは容易でない。また十分量の外来微生物を培養により準備して、土壌修復処理のために用いることはコスト的にも不利である。
【００１３】
３）特に、コールタールやコークスなど石炭系の油分で汚染された土壌の生物作用による浄化処理は一般に難しいとされている。石炭系の油分は石油系の油分と比較して微生物による分解を受け易い鎖状の分子構造をもつ炭化水素の割合が非常に少なく、微生物による分解を受けにくい多環系芳香族の割合が高いため、石炭系の油分に汚染された土壌の微生物作用による修復は難しいと考えられている。このような油分に汚染された土壌であっても、浄化作用を発揮できる微生物を用いることが望まれるが、そのような微生物がどのようなものであるのか、その正体も定かではない。
【００１４】
そこで、本発明は、これらの問題点・課題を解決して、石炭系又は石油系油分に汚染された土壌に対して油分を効率的に除去することができる生物を利用した新規土壌浄化方法を提供するものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、今般、上記の課題を解決すべく検討を重ねた結果、以下の方法により、汚染土壌、特に石炭系又は石油系油分に汚染された土壌から油分を効率的に除去する生物を利用した新規土壌浄化方法を確立することに成功した。本発明は、以下の（１）〜（９）の態様をもつ：
（１）ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法。
【００１６】
（２）ノボスフィンゴビウム属細菌を含有する土壌を用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法。
【００１７】
（３）ノボスフィンゴビウム属細菌を含有する土壌スラリーを用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法。
【００１８】
（４）前記土壌スラリーが、油分汚染土壌と、海水、淡水若しくは製鉄所安水の活性汚泥処理水のいずれか又はこれらの混合水とにより形成されるスラリーである、上記（３）に記載の方法。
【００１９】
（５）土壌スラリーのＯＲＰを、＋５０ｍＶ（銀／塩化銀飽和塩化カリウム電極基準）以上に維持することを特徴とする、上記（３）又は（４）に記載の方法。
【００２０】
（６）土壌スラリーのｐＨを、６以上９未満に維持することを特徴とする、上記（３）又は（４）に記載の方法。
【００２１】
（７）前記油分の汚染が、コールタール、コークスを含む石炭系油分の汚染である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【００２２】
（８）前記油分の汚染が、原油、ガソリンを含む石油系油分の汚染である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【００２３】
（９）ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌が、ノボスフィンゴビウム・スバルクティカム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ｓｕｂａｒｃｔｉｃｕｍ）又はノボスフィンゴビウム・アロマチシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、油分に汚染された土壌を生物学的に浄化するため、以下の手法を発明した。
【００２５】
まず、本発明者らは、油分に汚染された土壌中で汚染環境に馴化した微生物の中から、土壌からの油分除去に寄与し得る微生物を単離した。その結果、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属の細菌、別名スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属の細菌が油分除去能力を有することを発見した。したがって、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を用いて、あるいはこれらの微生物を含有する土壌又は土壌スラリーを用いて、油分に汚染された土壌を当該微生物の作用により修復することが可能ではないかと考えた。土壌からの油分除去能力を有する単離した微生物のうち、主要な単離微生物は、ノボスフィンゴビウム・スバルクティカム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ｓｕｂａｒｃｔｉｃｕｍ）（別名スフィンゴモナス・スバルクティカ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｕｂａｒｃｔｉｃａ））、及びノボスフィンゴビウム・アロマティシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）（別名スフィンゴモナス・アロマティシボラン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ））であった。これらについては、以下のような報告がある。まず、ノボスフィンゴビウム・スバルクティカム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ｓｕｂａｒｃｔｉｃｕｍ）は、別名スフィンゴモナス・スバルティカ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｕｂａｒｔｉｃａ）であり、ノヒネック（Ｎｏｈｙｎｅｋ）らによってクロロフェノールの分解菌として１９９６年に報告されている（非特許文献１参照）。またノボスフィンゴビウム・アロマティシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）は、別名スフィンゴモナス・アロマティシボラン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）であり、フレドリクソン（Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ）らによってトルエン、ナフタレンなどの芳香族物質の存在下でも増殖できる微生物として１９９１年に報告されている（非特許文献２参照）。また、同じくフレドリクソンらにより１９９５年に（非特許文献３参照）、さらに　バルクウィル（Ｂａｌｋｗｉｌｌ）らにより１９９７年に芳香族物質の分解菌として報告されている（非特許文献４参照）。以上のように、ノボスフィンゴビウム・アロマティシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）に関しては、油分汚染と関連する芳香族物質の分解活性が知られていたが、土壌汚染への適用については、本願出願時には全く知られていなかった。また、ノボスフィンゴビウム・スバルクティカム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ｓｕｂａｒｃｔｉｃｕｍ）関しては、クロロフェノールの分解菌として知られているのみであって、芳香族物質の分解や、さらに油分汚染土壌への適用については、本願出願時には全く知られていなかった。
【００２６】
本発明者らは、これらノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を用いて、あるいはこれらの微生物を含有する土壌又は土壌スラリーを用いて、油分に汚染された土壌から油分を除去する方法について鋭意検討した結果、本発明に係るノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を用いて油分に汚染された土壌から油分を除去する方法を完成させたのである。以下、本発明について詳細に説明する。
【００２７】
まず、本発明の油汚染についてであるが、コールタール、アスファルトやコークスなど石炭系の油分で汚染された土壌又は原油、ガソリンなど石油系の油分、鉱油等で汚染された土壌のいずれにも適用可能である。一般的に石炭系の油分に汚染された土壌の微生物による浄化処理は石油系油分に汚染された土壌に比較して、難しいと考えられている。しかしながら、本発明で用いるノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌は、石炭系の油分に汚染された土壌に馴化できることを確認しており、一般には困難とされる石炭系の油分に対しても油分汚染土壌からの高い油分除去効果を発揮することができる。
【００２８】
汚染サイトで原位置で油分除去を行う場合、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌が油分汚染土壌に自生するときは、通常、栄養塩添加、通気等によって微生物の浄化作用を高めるランドファーミング法（ｌａｎｄ　ｆａｒｍｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）を適用できる。この場合、土壌の撹拌を随時実施して微生物への栄養塩補給と通気を強制的に行うことが望ましい。当該細菌が自生していない場合には、培養したノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の培養液を、油分に汚染された土壌中に注入・添加することによって、当該細菌を油分に汚染された土壌からの油分除去に用いることができる。培養液の土壌への添加方法としては、専用孔により一定位置の土中へ注入しても構わないが、微生物が拡散できにくい問題がある。酸素を供給するために、土壌撹拌と組み合わせて、培養液を添加することで、当該細菌を汚染土壌中にまんべんなく分布させることが、より好ましい。また、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の培養液に替えて、当該細菌を含む土壌又は土壌スラリーを汚染土壌に添加して、油分除去効果を発揮させることもできる。温度としては１５℃以上４０℃以下が好ましいが、効率を高めるために、２０℃以上３７℃以下がより好ましい。しかしながら、この場合、浄化作用の微生物を十分に増殖させて油分除去を行うにはコスト的にもエネルギー効率的に問題がある。
【００２９】
本発明者らは、土壌中の微生物が空間的に不均一に分布するため浄化作用が非効率であるものと考えた。微生物による浄化作用を土壌全体に均一に行き届けさせる必要性を考慮した。そこで、土壌の洗浄処理と生物処理を組み合わせた土壌スラリーを形成させることによって空間的に微生物を均一に分布させることにより、土壌スラリー中に棲息する微生物の制御を容易にするとともに、土壌粒子同士の接触による油分除去効果をも期待できるものと考えた。
【００３０】
本発明において土壌スラリーの調製のために用いる土壌は、上記油分等に汚染された土壌である。この土壌中にノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌が存在しない場合、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を含む土壌、土壌スラリー又は培養液をさらに加えることで油分除去効果が得られる。そして汚染土壌を海水、淡水又は製鉄所安水の活性汚泥処理水のいずれかあるいはこれらの混合水を汚染土壌と混合することにより、土壌スラリーを調製する。調製したスラリーの含水率は１０質量％以上５０質量％未満が望ましい範囲である。５０質量％以上の場合は、攪拌動力が過大となり攪拌を維持することが難しく、一方、１０質量％未満では水使用量が増大してしまい経済的でないからである。
【００３１】
本発明において、スラリーを調製する際に使用する水は海水、淡水又は製鉄所安水の活性汚泥処理水のいずれかあるいはこれらを混合したものが好ましい。これは本発明では汚染土壌に自生する微生物を賦活化して油分除去などの浄化を行うものであるが、土壌には臨海埋立地のように海水由来塩分を多く含む土壌や内陸の塩分を殆ど含まない土壌が存在するからである。汚染土壌中に自生する微生物はそれぞれ汚染土壌のおかれた環境によって、塩分濃度に対しても海水のように高い塩濃度に適応しているものやしていないものが存在するものと考えられる。したがって、臨海埋立地などの汚染土壌では、海水のような塩分濃度の高い水を用いて土壌スラリーを調製することが好ましく、一方、内陸地の汚染土壌では淡水を用いて土壌スラリーを調製することが好ましいが、勿論、これに制限されるものではない。
【００３２】
尚、土壌スラリー調製のため、汚染土壌に添加する水としては、海水が容易に得られる場合は海水を用いることが望ましい。また、海水に淡水を混合して用いてもかまわない。海水が流入している汽水域の河川水を用いてもかまわない。海水は、微生物処理に必要な微量栄養源を含有しており、沿岸域、汽水域であれば窒素、リンの濃度も高い場合がある。また、ｐＨが８．１程度であってｐＨ緩衝能があり、安価で大量入手可能であり、水温がほぼ一定であるとういう特長がある。また、汚染土壌中の間隙水は河川等の淡水に比べ、イオン濃度、言い換えれば電気伝導度が高い場合が多く、この状況に応じた微生物が生息しており、海水と河川水、工業用水などの淡水の混合によってこの状況を作り出せる。また、製鉄所のコークス工場から発生する安水の活性汚泥処理水の活性汚泥処理水を汚染土壌に添加する水として用いてもかまわない。これは、製鉄所のコークス工場から発生する安水の活性汚泥処理水の活性汚泥処理水は、廃水と海水を混合させて活性汚泥処理しており、海水を廃水に対して１５０容積％から３００容積％添加しているためである。安水の活性汚泥処理水もｐＨ緩衝能があり、通常海水希釈した安水の活性汚泥処理水はｐＨ６以上９未満で安定している。また、安水の活性汚泥処理水は水温も約３０℃から３８℃で一定しているため、冬場の微生物活性の低下する時期には最適である。さらに、微生物の栄養源である窒素、リンなども大量に含有しているため、汚染土壌をスラリー化して用いる水として望ましい。
【００３３】
土壌スラリーによる汚染物質の分解を促進するためには、スラリーの酸化還元電位（ＯＲＰ）が＋５０ｍＶ（銀／塩化銀複合電極基準、以下同じ）以上に維持されるように、ブロアー及び／又は攪拌機の回転数を制御し、空気を供給することが望ましい。汚染物質の分解反応は、好気的雰囲気で促進されるため、溶存酸素の維持は反応促進に必要である。ＯＲＰ値としては、＋５０ｍＶ以上が好ましい。ＯＲＰ値の上限値は特に限定はないが、＋４００ｍＶ未満が好ましい。
【００３４】
土壌スラリーのｐＨは、微生物の生育に適した６以上９未満に維持されることが望ましい。油分の土壌粒子からの洗浄効果のみを考えると、ｐＨは高い方が望ましいことは知られているが、ｐＨが９以上では油分の洗浄効果は増大しても、微生物の活性が急激に低下するので、ｐＨは９未満であることが必要である。また、ｐＨが６未満では洗浄効果が小さく、また微生物の活性も衰えるため、ｐＨは６以上であることが望ましい。このように、スラリー反応槽又はスラリーラグーンのｐＨは、洗浄促進効果と微生物による分解促進効果の両面から決定すべきであり、より好ましくは、ｐＨは７以上９未満である。ｐＨ調整剤としては、希硫酸や水酸化ナトリウムの水溶液を用いればよい。海水を用いたスラリーであれば、ｐＨ緩衝作用があるため、薬品費も削減できるという利点がある。
【００３５】
土壌スラリーの土壌と上澄み液は沈降分離、遠心分離、フィルタ分離、脱水機などにより分離することができる。処理された土壌は、通常、油分が除去されたことを確認した上で、元の位置に埋め戻して再利用することができる。
【００３６】
また、発生した廃水については、未分解の油分や細かく砕かれた土壌粒子が含まれ、ＣＯＤ（化学的酸素要求量）も高いため、水処理操作によって廃水基準を満たすまで処理する必要がある。このような水処理操作として、活性汚泥のような微生物処理が適用できる。汚染土壌中に存在する微生物は、汚染物質、例えば、油分や芳香族系炭化水素で既に馴養されており、固液分離した廃水にも馴養された微生物が含まれていることから、汚染物質である油分や芳香族系炭化水素で馴養された微生物を有する活性汚泥で処理することが好ましい。油分や芳香族系炭化水素で馴養された微生物であれば特に種類は問わないが、製鉄所のコークス工場から発生する安水を処理している活性汚泥が望ましい。安水の活性汚泥は、安水に含まれる油分や多種類の芳香族系炭化水素で十分に馴養されており、また、海水でも馴養されているため、油分や芳香族系炭化水素の分解を加速することができるからである。
【００３７】
【実施例】
実施例１：ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を含む土壌スラリーによる油分汚染された土壌からの油分除去
ノボスフィンゴビウム・スバルクティカム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍｓｕｂａｒｃｔｉｃｕｍ）（別名スフィンゴモナス・スバルクティカ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｕｂａｒｃｔｉｃａ））が自生する油分汚染土壌に対して、等体積の人工海水（アクアマリン）を加えた。ステンレス製羽根を有する撹拌機によって強化ガラス容器中で土壌と海水を混合することにより、土壌スラリーを形成させた。強制的に空気を通気することで、土壌スラリーのＯＲＰを＋５０ｍＶ以上に制御した。また、酸性にするため、ｐＨを７に保つようにアルカリを加えて維持した。温度は２０℃一定に保った。経時的に土壌スラリーを採取して、ＧＦＢろ紙にて吸引ろ過して残留土壌とろ液に分けた。この土壌中の油分をノルマルヘキサン抽出物質として、ＪＩＳ　Ｋ０１０２　２４に基づいて定量した。
【００３８】
図１に土壌スラリーでの微生物処理による油分除去の結果を示す。４０日間の土壌スラリー処理により、汚染土壌の９０％以上の油分除去を達成できた。
【００３９】
実施例２：土壌スラリーでの微生物作用による油分汚染された土壌から油分除去を行う際の微生物モニタリング
土壌スラリーで油分汚染された土壌から油分除去を行う際の、微生物の存在状態をモニタリングした。上記実施例１における、土壌スラリーでの微生物作用で汚染土壌からの油分を除去している処理工程において、土壌スラリーを経時的に採取した。採取した土壌スラリーは、８０００ｒｐｍで３０分間遠心後、沈殿物を回収した。この沈殿物３ｇを緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁してホモジナイザーにより分散した。次いで、塩化ベンジル法によりＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡはエタノール沈澱で濃縮回収した。回収したＤＮＡについてＧＦＸＴＭ　ＰＣＲ　ＤＮＡ　ａｎｄＧｅｌ　Ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＤＮＡを精製して土壌からの夾雑物を除いた。精製したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりＤＮＡの検出感度を上げるとともに、ＤＧＧＥ法により僅かな塩基配列の違いでも検出できるようにした。使用したプライマーを以下の表１：
【００４０】
【表１】
2004097934.tif 000002
【００４１】
に示す。ＤＮＡポリメラーゼはＡｍｐｌｉＴａｑ　ＧｏｌｄＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、サーマルサイクラーにはＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲＳｙｓｔｅｍｓ　９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＰＣＲの条件は、９４℃、７分＋（９４℃、３０秒、６５〜５５℃、６０秒、７２℃、９０秒）×２０サイクル（ここで２サイクル毎にアニーリング温度を１℃下げた（６５〜５５℃）＋（９４℃、３０秒、５５℃、６０秒、７２℃、９０秒）×１５サイクル＋７２℃、１０分として実施した。ＰＣＲ産物はＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。このＰＣＲ産物の確認には２質量％アガロースゲルを用いて電気泳動した。電気泳動ゲルを臭化エチジウム染色して、紫外線照射下、マーカーＤＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ）と比較して、目的の長さのＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。精製されたＤＮＡＭはＤｃｏｄｅ　ＤＧＧＥ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＤＧＧＥ解析した。変性剤として尿素を使用した。変性剤濃度勾配は電気泳動方向に３０質量％から６０質量％までとし、ポリアクリルアミドゲル濃度は５質量％から１０質量％までとした。泳動条件は電圧１３０Ｖで７時間とした。電気泳動後、ゲルをＣｙｂｅｒ　Ｇｒｅｅｎ（ＴＡＫＡＲＡ）で染色して、ＵＶ１３０ｎｍ照射下でＤＧＧＥ後のＤＮＡバンド像をＣＣＤカメラで撮影した。結果を図２に示す。スラリー処理により、７日目からノボスフィンゴビウム・スバルクティカム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ｓｕｂａｒｃｔｉｃｕｍ）（別名スフィンゴモナス・スバルクティカ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｕｂａｒｃｔｉｃａ））の明確なＤＮＡバンドが出現した。したがって、当該細菌が土壌スラリー処理において急速に増殖して、図１に示すような土壌からの油分除去に寄与したことがわかる。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、コールタール、アスファルトやコークスなどに起因する石炭系油分で汚染された土壌又は原油、ガソリンなどに起因する石油系油分、鉱油等で汚染された土壌の微生物、ノボスフィンゴビウム属細菌による新規浄化技術を、提供することができる。
【００４３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】土壌スラリーでの微生物処理による油分除去の結果を示すグラフである。
【図２】土壌スラリーによる油分汚染からの油分除去（図１）におけるＰＣＲ−ＤＧＧＥによる微生物モニタリング結果を表す図面に代わるゲル電気泳動写真。
【図１】
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【図２】
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