(57)【要約】【課題】水又は水溶液中の核酸分解酵素を簡便迅速に測定する方法を提供することを目的とする。【解決手段】核酸を切断する性質を有する未知濃度の核酸分解酵素を含有する液に、前記核酸を固定した作用電極を浸漬して前記核酸に前記核酸分解酵素を作用させ、次いで電解液中において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、測定した前記電流の時間変化から前記核酸分解酵素の量を決定する。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を切断する性質を有する未知濃度の核酸分解酵素を含有する液に、前記核酸を固定した作用電極を浸漬して前記核酸に前記核酸分解酵素を作用させ、次いで電解液中において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、測定した前記電流の時間変化から前記核酸分解酵素の量を決定する方法。
【請求項２】
前記電流の時間変化は、前記電流のピーク値近傍における電圧での前記電流の時間変化である請求項１の方法。
【請求項３】
前記電流の時間変化は、前記電流のピーク値の時間変化である請求項１の方法。
【請求項４】
（１）核酸を切断する性質を有する既知濃度の核酸分解酵素を前記核酸に作用させ、電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を時間毎に測定し、前記電流のピーク値の時間変化率を決定し、
（２）前記時間変化率と核酸分解酵素の既知濃度の関係から前記核酸分解酵素の濃度の関係を示す検量線を決定し、そして
（３）前記核酸を切断する性質を有する未知濃度の前記核酸分解酵素を前記核酸に作用させ、電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、前記電流のピーク値の時間変化率を決定し、前記時間変化率から前記核酸分解酵素の濃度を決定する方法。
【請求項５】
（１）電解液に核酸を固定した作用電極を浸漬し、前記作用電極と対極との間に印加する電圧に対する電流Ｉ０を測定して電流ピーク値での電圧Ｖｐを決定し、
（２）前記核酸を切断する性質を有する既知濃度の核酸分解酵素を前記核酸に作用させ、電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧に対して電流Ｉを時間毎に測定して、前記電圧Ｖ０での前記電流Ｉの時間変化率を測定し、
（３）前記時間変化率と核酸分解酵素の既知濃度の関係から前記核酸分解酵素の濃度の関係を示す検量線を決定し、そして
（４）前記核酸を切断する性質を有する未知濃度の前記核酸分解酵素を前記核酸に作用させ、前記電解液と同じ電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、前記電圧Ｖｐにおける電流の時間変化率を決定し、前記時間変化率から前記核酸分解酵素の濃度を決定する方法。
【請求項６】
核酸を作用電極に固定する手段として、電気化学活性物質を核酸に固定化したもの、核酸中の塩基を電気化学活性を有する誘導体に変換したもの、もしくは電気化学活性な核酸結合試薬を用いて電気化学活性を有するように変換した核酸固定化電極を用いる請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項７】
作用電極は核酸の固定が可能で、前記電解液および核酸分解酵素を含有する液において溶解しない導電体から選択される請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項８】
対極は前記電解液および核酸分解酵素を含有する液において溶解しない導電体から選択される請求項１〜６のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸を切断する性質を持つ核酸分解酵素を検出する方法、特に水や電解質中の核酸分解酵素を検出する方法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸を扱う分子生物学実験において、核酸分解酵素の核酸試料や調製試薬への混入は、核酸試料の分解を引き起こす。特にリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）は熱安定性を有し、失活させることが困難であることから、ＲＮＡを取り扱う実験ではＲＮａｓｅの除去が不可欠である。しかし、取り扱う試薬類に混入している核酸分解酵素を簡便に検出する方法がないため、調製試薬類の核酸分解酵素が混入している可能性を払拭する為に、ＤＥＰＣ（Ｄｉｅｔｈｙｌｐｉｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理によりＲＮａｓｅを失活させている。ところが、ＤＥＰＣは発ガン性を有するという報告（非特許文献１）があるほか、各種の分子生物学実験手順書において実験への影響が指摘されている物質である報告（非特許文献２）がある。よって、こうした薬剤を可能な限り使用しないためには、試薬類や試薬を調整するための水からＲＮａｓｅを除去する  ＤＥＰＣを使わない方法にて作成すると共に試薬類中の核酸分解酵素を簡便に定性もしくは定量できる方法が必要である。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｇａｒｃｉａ  Ａ，  Ｌａｍｂｅｒｔ  ＩＢ，  Ｆｕｃｈｓ  ＲＰ；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、９０、１３、５９８９−９３（１９９３）
【非特許文献２】
丸善、ラボマニュアルＰＣＲ、ｐ７７、（１９９６）
【０００４】
従来、ＲＮＡを測定対象水に溶解し電気泳動法を使用してＲＮＡの分解を検出することにより分解酵素を検出する方法、特開平０６−３１９５９６号に記載されているようにＲＮＡ分解酵素を含む試料をＲＮＡと蛍光色素を含む溶液に添加して反応させ、それに伴う蛍光の強度の減少値によりＲＮＡ分解酵素の量を知る方法などがある。後者の改良としてＡｍｂｉｏｎ社により提案されているように（ＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ法）蛍光レポータ分子で一端を標識し他端に蛍光抑制分子を結合したＲＮＡ鎖を測定対象水に溶解して水中のＲＮＡ分解酵素（リボヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ）によるＲＮＡの分解により生じる蛍光の時間減衰量を測定することにより分解酵素の量を検出する方法がある（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ＣａｔＮｕｍ．ｐｈｐ？１９６４）
【０００５】
【特許文献１】
特開平０６−３１９５９６号公報
【非特許文献３】
Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．２００１カタログ、１２４頁
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の方法はいずれもＤＮＡ或いはＲＮＡの核酸分解酵素（ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ）を簡便且つ迅速に測定できない。本発明は従来提案されていない原理を使用して、核酸分解酵素を簡便且つ迅速に検出する方法と提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
電解液中に核酸を固定した作用電極を浸漬し、この作用電極と対極との間に電圧を印加し、電流を計測すると、ある電圧範囲で電流が核酸の鎖長の関数として観測できることが分かった。すなわち、初期に固定した核酸が完全な長さの場合は最大電流が得られるが、作用電極上の核酸が核酸分解酵素に接触し反応すると核酸の一部又はすべてが切断され、初期電流値よりも電流が小さくなる。この電流値の変化を時間毎に観察してその変化量から酵素の量を測定することにより簡便且つ迅速な核酸分解酵素の測定が可能になる。
【０００８】
すなわち、本発明は、核酸を切断する性質を有する核酸分解酵素を含有する液に、前記核酸を固定した作用電極を浸漬して前記核酸に前記核酸分解酵素を作用させ、次いで電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、測定した前記電流の時間変化から前記核酸分解酵素の量を決定する方法を提供する。
好ましくは、前記電流の時間変化は、前記電流のピーク値近傍における電圧での前記電流の時間変化であるか、又は前記電流のピーク値の時間変化である。
より具体的には、本発明は（１）核酸を切断する性質を有する既知濃度の核酸分解酵素を前記核酸に作用させ、電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を時間毎に測定し、前記電流のピーク値の時間変化率を決定し、
（２）前記時間変化率と核酸分解酵素の既知濃度の関係から前記核酸分解酵素の濃度の関係を示す検量線を決定し、そして
（３）前記核酸を切断する性質を有する未知濃度の前記核酸分解酵素を前記核酸に作用させ、電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、前記電流のピーク値の時間変化率を決定し、前記時間変化率から前記核酸分解酵素の濃度を決定する方法を提供する。
別の形態として、本発明は（１）電解液に核酸を固定した作用電極を浸漬し、前記作用電極と対極との間に印加する電圧に対する電流Ｉ０を測定して電流ピーク値での電圧Ｖｐを決定し、
（２）前記核酸を切断する性質を有する既知濃度の核酸分解酵素を前記核酸に作用させ、電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧に対して電流Ｉを時間毎に測定して、前記電圧Ｖ０での前記電流Ｉの時間変化率を測定し、
（３）前記時間変化率と核酸分解酵素の既知濃度の関係から前記核酸分解酵素の濃度の関係を示す検量線を決定し、そして
（４）前記核酸を切断する性質を有する未知濃度の前記核酸分解酵素を前記核酸に作用させ、前記電解液と同じ電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、前記電圧Ｖｐにおける電流の時間変化率を決定し、前記時間変化率から前記核酸分解酵素の濃度を決定する方法が採用される。
本発明で好ましい作用電極は、金、白金、銀、それらの合金、炭素および  ＩＴＯ（インジウム−スズ酸化物）等のＲＮＡ固定化が可能で、測定電解液および核酸分解酵素を含有する液において溶解しない導電体である。また好ましい対極は金、白金、銀、それらの合金、および炭素等の測定電解液および核酸分解酵素を含有する液において溶解しない導電体である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明では、核酸を先ず作用電極に固定する。この核酸は核酸分解酵素が既知の場合には分解酵素により能率的に分解される核酸を選択する。核酸分解酵素が未知の場合には予備試験により効率的な核酸を選択しておく。一方、生物実験で使用する核酸が決まっている場合にはその核酸に対する分解酵素の存在を知りたいのであるから生物実験で使用する特定の核酸を作用電極に固定すればよい。
核酸は電気伝導性であり初期に固定した核酸が完全な長さの場合は最大電流が得られる。核酸が核酸分解酵素により切断されるとその分だけ電気伝導性が低下し固定電極の総合的な電気抵抗が増す。
【００１０】
【実施例】
本発明の核酸分解酵素の測定方法の実施に使用する装置を次に説明する。
図１は本発明の方法の実施に使用する測定装置（セル）の原理図を示し、容器１に核酸酵素が存在しない電解液２を収容する。この容器に核酸分子例えばＲＮＡを付着した金電極等のＲＮＡ担持作用電極３を挿入し浸漬する。電極３を正極として対極５との間に電圧を印加する。金電極３の電圧を変化させて電流を測定し、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極６に対する金電極３の電圧に対して電流値をプロットする。温度センサ４を使用して例えば１０℃の一定温度に電解液２の温度を管理する。
【００１１】
図２（ａ）は核酸を固定するための電極３の構造を示す。７はリード線であり、８は金めっき被覆を施こした金電極である。そのほか核酸を固定するための作用電極としては炭素、白金、銀などが使用できる。対極５としては同様な電極材料が使用できる。
【００１２】
金電極８に核酸を固定するには、先ず金電極をアルカリ水溶液で洗浄し、超純水で洗浄したのち、図２（ｂ）のように金電極にオリゴＤＮＡ（例えば１５ｍｅｒ  ＴＧ）９を付け、更に図２（ｃ）のように電気化学活性物質１１を付加したＲＮＡ（この例ではＰｏｌｙ  ＡＣ）１０をハイブリダイザーションさせる。なお、オリゴＤＮＡを金電極に固定するには他の任意の方法を採用しても良い。
電気化学活性物質としては、核酸へ結合できる電気化学活性物質であればどのようなものでも良い。例えば、インターカレータであるフェロセン化ナフタレンジイミド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ  ｄｉｉｍｉｄｅ）、キナクリン（ｑｕｎａｃｒｉｎｅ）、アクリジンオレンジ（ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ）、プロフラビン（ｐｒｏｆｌａｖｉｎｅ）、メチレンブルー（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｌｕｅ）、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍａｉｄｅ）、ドーノマイシン（ｄｕａｎｏｍｙｃｉｎ）、ドーノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ポリインターカレータであるエチノマイシン（ｅｃｈｉｎｏｍｙｃｉｎ）、溝結合試薬であるヘキスト（Ｈｏｅｃｈｅｓｔ  ３３２５８，  Ｈｏｅｃｈｅｓｔ  ３３３４２）、ＤＡＰＩ（４’，６−Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ，  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ディスタマイシン（ｄｉｓｔｍｙｃｉｎ）、静電的または疎水的（インターカレートやスタッキングを含む）結合によりＤＮＡに結合する金属錯体誘導体、Ｃｏ（ｐｈｅｎ）３３＋，  Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋などが挙げられる。なお共有結合的に電気化学活性物質を結合させたものを利用することも可能である。
【００１３】
次に、測定の原理を説明するに、核酸分子を付着した金電極を、電解液（具体的には後で説明する）を収容した１０℃に恒温した電気化学測定セルに挿入し、差動パルス電圧計（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｐｕｌｓｅ  Ｖｏｌｔｏｍｅｔｅｒ）により電圧を加えて電流を測定する。試料の核酸分解酵素を作用させない金電極を上記電解液に浸漬した場合の測定結果は図３に示すように電流ピークを有する電流特性を示す。この電流特性は基準として使用される。温度を１０℃にしたのは基準を動かさないためである。
【００１４】
次に、図４のように、３７℃に管理した試料溶液（リボヌクレアーゼを含有する水溶液）８を収容した試料容器７に、ＲＮＡ核酸分子を付着した金電極を短時間浸漬し、この電極を取り出して直ちに上記の電気化学測定セルに浸漬し、電圧を振らせて電流を測定する。
一定時間毎（例えば５分おき）に同じ浸漬及び測定操作を繰り返し電流値の時間変化を観察する。その結果の例を図５に実線で示す。点線は図３の特性曲線である。図５から分かるように２つの曲線の間にはリボヌクレアーゼによるＲＮＡの分解に応じた電流値の差が観測される。この差分（負値）を記録したものが次に実施例に関連して示す図６である。時間の経過と共にＲＮＡの分解が進むので、この差分は間の経過と共に大きくなる。特に電流のピーク値近傍での差分が大きく観測されるのでピーク値近傍の電圧での時間に対する傾き（又はピーク値の差分の時間に対する傾きでも良い）を算出して、リボヌクレアーゼの濃度に対してプロットすると図７の結果が得られる。
ＲＮＡとそれに対する既知濃度のリボヌクレアーゼの測定時間に対する測定電流の傾き（電流の時間変化率）を示す検量線を作成しておけば、未知濃度のリボヌクレアーゼに対する電流の傾き（電流の時間変化率）を測定することにより、容易にリボヌクレアーゼの濃度を知ることができる。
【００１５】
次に本発明の実施例を説明する。
実施例
（作用電極の調製）
２ＭのＮａＯＨで煮沸後、濃硝酸に浸積してクリーン化した面積２ｍｍ２の金電極上に、１μｌの５’−末端チオール化１５ｍｅｒＴＧオリゴヌクレオチ１０ピコｍｏｌを３７℃、２時間接触させて修飾化し、更に１０ミリｍｏｌの６−メルカプトヘキサノールを乗せ４５℃で１時間放置し、金電極の非修飾部位をマスクした。この電極に５０ピコｍｏｌのＰｏｌｙＡＣオリゴヌクレオチド、５０μＭのフェロセン化ナフタレンジイミドになるように調整された２×ＳＳＣ緩衝液を電極上に載せ、先のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。
（電圧対電流特性の測定）
この電極を銀／塩化銀参照電極、白金製対極と一緒に酢酸緩衝液０．１Ｍ、塩化カリウム０．１Ｍ、フェロセン化ナフタレンジイミド５０μＭ混合測定溶液中にて、ディファレンシャルパルスボルタモメトリー法にて０．２Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌから０．６Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの範囲で電流を測定した。この時の測定溶液温度は１０℃である。測定結果は図３に示す。
次に１ｎｇ／ｍＬに調整した３７℃のリボヌクレアーゼＡ中に電極を浸し、時間毎に引き上げ前述の測定溶液に戻し同様に測定した。
次に１０ｎｇ／ｍＬのリボヌクレアーゼＡを同様に断続的に測定した。
更にリボヌクレアーゼＡを含まない超純水についても同様に測定した。
これらの結果から得た電圧電流曲線はいずれも図５の実線のような傾向を示す。
【００１６】
（電流の差分）
図３の標準液の電流値の測定結果と上記３種の試料の電流値の測定結果の差分を求め、プロットした一例として、１０ｎｇ／ｍＬのリボヌクレアーゼＡを測定した電流値との差分を算出した結果を図６に示す。０．４４−０．４６Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの付近に観察されるピーク電流は時間毎に小さくなっていることが観察された。
０ｎｇ／ｍＬ及び１ｎｇ／ｍＬのリボヌクレアーゼＡについても同様である。
【００１７】
（電流差分の変化率）
これらピーク電流の変化を一次の近似曲線で傾き（電流の時間変化率）を求め、リボヌクレアーゼＡをＸ軸に、傾きの値をＹ軸にプロットしたのが図７である。この検量線で、未知試料の測定が可能となった。
【００１８】
ピーク電流の変化を追跡して未知試料のリボヌクレアーゼＡを測定する場合には、上記のように差分を求めなくても直接ピーク電流の時間変化率を測定できる。
【００１９】
【発明の効果】
以上のように、本発明によると核酸を切断する性質を有する核酸分解酵素を含有する電解液に、前記核酸を固定した作用電極を浸漬して、前記核酸に前記核酸分解酵素を作用させながら、前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、測定した電流値の時間変化から、予め測定してある検量線を利用して前記核酸分解酵素の量を簡易に決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における電解液測定装置の概要を示す図である。
【図２】本発明で使用する金電極の構造とプローブであるＲＮＡを金電極に固定する工程を示す図である。
【図３】本発明の測定装置において、リボヌクレアーゼを付着しないプローブを浸漬して得た電流対電圧曲線である。
【図４】本発明のプローブにリボヌクレアーゼを付着するために、プローブをリボヌクレアーゼを含む溶液に浸漬した状態を示す。
【図５】本発明の測定装置において、リボヌクレアーゼを上記プローブに付着した場合に得た電流対電圧の関係を示す。
【図６】本発明の実施例において図５のような電流対電圧曲線から算出した電流差分対電圧の関係を示す。
【図７】図６の時間変化率から算出した傾き（電流の時間変化率）とリボヌクレアーゼの濃度の関係を示す検量線である。
【符号の説明】
１  容器
２  電解液
３  作用電極
５  対極
６  参照電極
７  リード線
８  金電極
９  オリゴＤＮＡ（１５ｍｅｒ  ＴＧ）
１０  ＲＮＡ（Ｐｏｌｙ  ＡＣ）
１１  電気化学活性物質
【図１】
2004242524.tif 000003
【図２】
2004242524.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2004242524.tif 000008
【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年4月3日(2003.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を切断する性質を有する未知濃度の核酸分解酵素を含有する液体に、前記核酸を固定した作用電極を浸漬して前記核酸に前記核酸分解酵素を作用させ、次いで電解液中において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、測定した前記電流の時間変化から前記核酸分解酵素の量を決定する方法。
【請求項２】
前記電流の時間変化は、前記電流のピーク値近傍における電圧での前記電流の時間変化である請求項１の方法。
【請求項３】
前記電流の時間変化は、前記電流のピーク値の時間変化である請求項１の方法。
【請求項４】
（１）核酸を切断する性質を有する既知濃度の核酸分解酵素を作用電極に固定した前記核酸に作用させ、次いで電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を時間毎に測定し、前記電流のピーク値の時間変化率を決定し、上記工程を複数の既知濃度の核酸分解酵素に対して繰り返し、
（２）前記時間変化率と核酸分解酵素の既知濃度の関係から前記核酸分解酵素の濃度の関係を示す検量線を決定し、そして
（３）前記核酸を切断する性質を有する未知濃度の前記核酸分解酵素を作用電極に固定した前記核酸に作用させ、次いで電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、前記電流のピーク値の時間変化率を決定し、前記時間変化率から前記核酸分解酵素の濃度を決定する方法。
【請求項５】
（１）電解液に核酸を固定した作用電極を浸漬し、前記作用電極と対極との間に印加する電圧に対する電流Ｉ０を測定して電流ピーク値での電圧Ｖｐを決定し、上記工程を複数の既知濃度の核酸分解酵素に対して繰り返し、
（２）前記核酸を切断する性質を有する既知濃度の核酸分解酵素を前記核酸に作用させ、電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧に対して電流Ｉを時間毎に測定して、前記電圧Ｖｐでの前記電流Ｉの時間変化率を測定し、
（３）前記時間変化率と核酸分解酵素の既知濃度の関係から前記核酸分解酵素の濃度の関係を示す検量線を決定し、そして
（４）前記核酸を切断する性質を有する未知濃度の前記核酸分解酵素を前記核酸に作用させ、前記電解液と同じ電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、前記電圧Ｖｐにおける電流の時間変化率を決定し、前記時間変化率から前記核酸分解酵素の濃度を決定する方法。
【請求項６】
核酸を作用電極に固定する手段として、電気化学活性物質を核酸に固定化したもの、核酸中の塩基を電気化学活性を有する誘導体に変換したもの、もしくは電気化学活性な核酸結合試薬を用いて電気化学活性を有するように変換した核酸固定化電極を用いる請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項７】
作用電極は核酸の固定が可能で、前記電解液および核酸分解酵素を含有する液において溶解しない導電体から選択される請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項８】
対極は前記電解液および核酸分解酵素を含有する液において溶解しない導電体から選択される請求項１〜６のいずれかの方法。
【手続補正書】
【提出日】平成15年4月21日(2003.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を切断する性質を有する未知濃度の核酸分解酵素を含有する液体に、前記核酸を固定した作用電極を浸漬して前記核酸に前記核酸分解酵素を作用させ、次いで電解液中において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、測定した前記電流の時間変化から前記核酸分解酵素の量を決定する方法。
【請求項２】
前記電流の時間変化は、前記電流のピーク値近傍における電圧での前記電流の時間変化である請求項１の方法。
【請求項３】
前記電流の時間変化は、前記電流のピーク値の時間変化である請求項１の方法。
【請求項４】
（１）核酸を切断する性質を有する既知濃度の核酸分解酵素を作用電極に固定した前記核酸に作用させ、次いで電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を時間毎に測定し、前記電流のピーク値の時間変化率を決定し、上記工程を複数の既知濃度の核酸分解酵素に対して繰り返し、
（２）前記時間変化率と核酸分解酵素の既知濃度の関係から前記時間変化率と前記核酸分解酵素の濃度の関係を示す検量線を決定し、そして
（３）前記核酸を切断する性質を有する未知濃度の前記核酸分解酵素を作用電極に固定した前記核酸に作用させ、次いで電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、前記電流のピーク値の時間変化率を決定し、前記検量線を用いて前記時間変化率から前記核酸分解酵素の濃度を決定する方法。
【請求項５】
（１）電解液に核酸を固定した作用電極を浸漬し、前記作用電極と対極との間に印加する電圧に対する電流Ｉ０を測定して電流ピーク値での電圧Ｖｐを決定し、
（２）前記核酸を切断する性質を有する既知濃度の核酸分解酵素を前記核酸に作用させ、電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧に対して電流Ｉを時間毎に測定して、前記電圧Ｖｐでの前記電流Ｉの時間変化率を測定し、上記工程を複数の既知濃度の核酸分解酵素に対して繰り返し、
（３）前記時間変化率と核酸分解酵素の既知濃度の関係から前記核酸分解酵素の濃度の関係を示す検量線を決定し、そして
（４）前記核酸を切断する性質を有する未知濃度の前記核酸分解酵素を前記作用電極に固定した前記核酸に作用させ、前記電解液と同じ電解液において前記作用電極と対極との間に印加する電圧範囲に対して電流を測定し、前記電圧Ｖｐにおける電流の時間変化率を決定し、前記検量線を用いて前記時間変化率から前記核酸分解酵素の濃度を決定する方法。
【請求項６】
核酸を作用電極に固定する手段として、電気化学活性物質を核酸に固定化したもの、核酸中の塩基を電気化学活性を有する誘導体に変換したもの、もしくは電気化学活性な核酸結合試薬を用いて電気化学活性を有するように変換した核酸固定化電極を用いる請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項７】
作用電極は核酸の固定が可能で、前記電解液および核酸分解酵素を含有する液において溶解しない導電体から選択される請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項８】
対極は前記電解液および核酸分解酵素を含有する液において溶解しない導電体から選択される請求項１〜６のいずれかの方法。