(57)【要約】【課題】皮膚外用剤の有効成分と内服剤の有効成分との組み合わせをスクリーニングする方法。スクリーニング法により有効と判定された皮膚外用剤の有効成分と内服剤との組み合わせキットを提供すること。【解決手段】培地上に皮膚三次元モデルを載置し、皮膚外用剤を皮膚三次元モデル上に作用させると共に、内服剤を培地に添加することによって、皮膚外用剤と内服剤の皮膚三次元モデルに対する相互作用を評価することを特徴とする、皮膚外用剤と内服剤との相互作用を評価する方法。皮膚三次元モデルで皮膚外用剤と内服剤の相互作用を評価する方法によって選ばれたことを特徴とする皮膚外用剤の有効成分（ビタミンＣ、パセリ、小麦胚芽、茶、ユキノシタ等）と内服剤の有効成分（トコトリエノール、トコフェロール等）を組みあわせてキットとする。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地上に皮膚三次元モデルを載置し、皮膚外用剤を皮膚三次元モデル上に作用させると共に、内服剤を培地に添加することによって、皮膚外用剤と内服剤の皮膚三次元モデルに対する相互作用を評価することを特徴とする、皮膚外用剤と内服剤との相互作用を評価する方法。
【請求項２】
予め皮膚三次元モデルにダメージを与えることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤と内服剤の相互作用を評価する方法。
【請求項３】
皮膚三次元モデルに与えるダメージとして、培地液中に過酸化開始剤を添加することを特徴とする請求項２に記載の皮膚外用剤と内服剤の相互作用を評価する方法。
【請求項４】
皮膚三次元モデルにおける皮膚外用剤と内服剤の相互作用の評価手段として抗酸化力を指標とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の皮膚外用剤と内服剤の相互作用を評価する方法。
【請求項５】
皮膚三次元モデルにおける抗酸化力の指標として、特に過酸化脂質を測定することを特徴とする請求項４に記載の皮膚外用剤と内服剤の相互作用を評価する方法。
【請求項６】
皮膚三次元モデルにおける過酸化脂質の測定法として、脂質ペルオキサイドを定量することを特徴とする請求項５に記載の皮膚外用剤と内服剤の相互作用を評価する方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載された皮膚三次元モデルで皮膚外用剤と内服剤の相互作用を評価する方法によって選ばれたことを特徴とする皮膚外用剤の有効成分と内服剤の有効成分を組み合わせるキット。
【請求項８】
皮膚外用剤の有効成分としての抗酸化成分が、ビタミンＣ及びその誘導体並びにパセリ、小麦胚芽、茶、ユキノシタ、ボタン、リンゴ、ブドウ、グレープフルーツ、ホホバ、甘草、ローズマリー、豆類及びこれらの抽出物、米及び米ぬか抽出物および加水分解物、酵母、その加水分解物及び抽出物、パントテイン酸およびその誘導体、グルタチオン、アセチル化グルタチオン等のグルタチオン誘導体、システイン、Ｎ−アセチルシステイン等のシステイン誘導体、タウリン、ヒポタウリン、チオタウリン等のタウリン誘導体のようなチオール化合物、プロアントシアニジン、トコトリエノールおよびその誘導体、トコフェロールおよびその誘導体から選ばれる一種または二種以上であり、内服剤の有効成分としての抗酸化成分が、トコトリエノールおよびその誘導体、トコフェロールおよびその誘導体、ＣｏＱ１０、ビタミンＣおよびその誘導体、カロチノイド、イソフラボン、ルテオリン、アントシアニン、カテキン、クルクミン、リグニン及びその配糖体、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ナイアシンおよびその誘導体、パントテン酸およびその誘導体、葉酸、ビオチン、イノシトール、カルノシン、アンセリン並びにイチョウ、リンゴ、ブドウ及びこれらの抽出物から選ばれる一種又は二種以上であることを特徴とする請求項７に記載の皮膚外用剤の有効成分と内服剤の有効成分を組み合わせたキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、皮膚外用剤と内服剤の相乗効果を実証するインビトロ試験系、皮膚三次元モデルを用いて簡便且つ迅速に測定可能なスクリーニング法及び該スクリーニング法で有効と鑑別された有効成分を含有してなる皮膚外用剤と内服剤を組み合わせたキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚化粧料や皮膚外用医薬などの皮膚外用剤の分野において、その有効成分の鑑別は、複雑な細胞同士の連係作業の結果に起こる事象であることから、インビボの方法によることが殆どで、この為、ヒトを含めた動物間の個体差や部位差等のために再現性を得るためには例数を多くしなければ比較ができない状況にあった。また、その試験期間も、インビボである限り、生体の防御系が働くため、影響の差を出すための作用時間も長くなり、試験計画そのものが大がかりになってしまう傾向にあった。また、近年、健康食品の分野で美容効果を謳った内服剤が盛んに販売されているが、内服によって消化・吸収された成分が如何にして皮膚へ作用しているかは実証されておらず、皮膚外用剤と内服剤との併用効果を実証する手段も、ましてや未開拓である。最近、皮膚外用剤と内服剤を所定時間内に双方を服用させ、優れた皮膚老化防止効果を得られることが見出されている（特願２００２−０３７２３０号公報）。しかしながら、その皮膚外用剤と内服剤との併用効果を実証するために、インビボでのヒトを対象とした併用試験では２ヶ月間、インビトロでのリノール酸自動酸化抑制試験でも６日間の試験期間を要していた。また、リノール酸自動酸化抑制試験では、反応条件が実際の生体環境とは大きく異っていた。
【０００３】
この様な事象のメカニズムを知るためには、インビトロのスクリーニング系の構築が望まれていた。今までに、重層したコラーゲンゲルにダメージを受けた皮膚構成細胞との共培養（例えば、特許文献１参照）や市販の皮膚三次元皮膚モデル（例えば、特許文献２参照）を改良して擬似的な人工皮膚としてスクリーニング系に用いたり、生体成分である還元糖とタンパク質とを溶液系でインキュベートしてできるアドバンスド・エンド・グリケーションの生成抑制作用を鑑別する方法（例えば、特許文献３参照）が知られている。
【０００４】
特に、皮膚外用剤の有効成分のインビトロのスクリーニングにおいて、皮膚三次元モデルを用いて皮膚外用剤構成成分の安全性や有効性の評価方法が知られている。例えば、ヒト皮膚の完全疑似皮膚モデルであるＬＳＥ（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｓｋｉｎ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）は、分化して多層化したヒト上皮細胞からなる上層、およびコラーゲンゲル内にヒト皮膚線維芽細胞が埋め込まれた下層より構成されている。このような皮膚三次元モデルは、単層の培養細胞を用いただけの実験や実験動物では観測できない面が得られる（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、この皮膚三次元皮膚モデルも、例えば、皮膚外用剤における抗酸化剤の有用性評価として皮膚三次元モデルに紫外線を照射してその細胞死を防御する薬剤をスクリーニングする、といった用途に限定されていた。
【０００５】
また、抗酸化力を測る指標は、活性酸素種を消去する能力を測ったり、活性酸素種と生体成分と反応してできた酸化物などを定量する方法など、様々である。
【０００６】
特に、生体内の脂質と活性酸素とが反応して生成する過酸化脂質の定量法には、チオバルビツール酸との反応によって生じるチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）を比色あるいは蛍光分析で測定するものが一般的だが、過酸化脂質である脂質ヒドロペルオキシドに加えて、脂質ペルオキシドからβ解裂によって生じるマロンジアルデヒドを含むアルデヒド類、さらにはある種の脂質酸化物とタンパク質の酸化生成物も含まれていた。
【０００７】
また、脂質ヒドロペルオキシドと還元反応によって蛍光を発するジフェニル−１−ピレニルホスフィン  （同仁化学製、以下ＤＰＰＰ）は、過酸化脂質を定量的に、しかも高感度で検出可能な試薬である。一般的には、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）−ポストカラム法により各脂質別のヒドロペルオキシドの定量が可能であるが、生体内の複雑な脂質組成において、完全に各脂質別のヒドロペルオキシドの定量を実現することは難しい。（例えば、非特許文献２参照）。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００２−２１８９７１号公報
【特許文献２】
特開２００１−１０６６２０号公報
【特許文献３】
特開２００１−２１５４９号公報
【非特許文献１】
三羽  信比固編著、「バイオ抗酸化剤  プロビタミンＣ」平成１１年９月３０日（１９９９）発行（フレグランスジャーナル社）Ｐ９６−Ｐ９９
【非特許文献２】
五十嵐  脩・島崎  弘幸  編著、「生物化学実験法３４  過酸化脂質・フリーラジカル実験法」平成７年１月１日発行（学会出版センター）  Ｐ９５−Ｐ９９
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は，この様な状況下為されたものであり、皮膚三次元モデルを用いて皮膚外用剤と内服剤の相乗的な有効成分の組み合わせをスクリーニングする際のインビトロ系の試験方法、特に抗酸化剤の有効性を皮膚外用剤と内服剤を組み合わせてスクリーニングする方法を提供すること、これらのスクリーニング法で有効と判断された有効成分を含む皮膚外用剤と内服剤を組み合わせたキットを提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
このような状況に鑑みて、本発明者らは、皮膚外用剤と内服剤との組み合わせのスクリーニング法を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、皮膚三次元モデルを用いて、（１）皮膚モデルにダメージを与える薬剤の存在下及び（２）皮膚モデルにダメージを付与する薬剤の非存在下で培養し、この２条件下での皮膚三次元モデルへのダメージを指標として、皮膚外用剤を皮膚三次元モデル上に滴下し、内服剤を皮膚モデル培地を滴下するという実使用を想定した添加方法で、皮膚外用剤の有効成分と内服剤の有効成分が相乗的に効果を発揮する組み合わせをスクリーニングできることを見出し、発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）培地上に皮膚三次元モデルを載置し、皮膚外用剤を皮膚三次元モデル上に作用させると共に、内服剤を培地に添加することによって、皮膚外用剤と内服剤の皮膚三次元モデルに対する相互作用を評価することを特徴とする、皮膚外用剤と内服剤との相互作用を評価する方法、
（２）予め皮膚三次元モデルにダメージを与えることを特徴とする（１）に記載の皮膚外用剤と内服剤の相互作用を評価する方法、
（３）皮膚三次元モデルに与えるダメージとして、培地液中に過酸化開始剤を添加することを特徴とする（２）に記載の皮膚外用剤と内服剤の相互作用を評価する方法、
（４）皮膚三次元モデルにおける皮膚外用剤と内服剤の相互作用の評価手段として抗酸化力を指標とすることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の皮膚外用剤と内服剤の相互作用を評価する方法、
（５）皮膚三次元モデルにおける抗酸化力の指標として、特に過酸化脂質を測定することを特徴とする（４）に記載の皮膚外用剤と内服剤の相互作用を評価する方法、
（６）皮膚三次元モデルにおける過酸化脂質の測定法として、脂質ペルオキサイドを定量することを特徴とする（５）に記載の皮膚外用剤と内服剤の相互作用を評価する方法、
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載された皮膚三次元モデルで皮膚外用剤と内服剤の相互作用を評価する方法によって選ばれたことを特徴とする皮膚外用剤の有効成分と内服剤の有効成分を組み合わせるキット、
（８）皮膚外用剤の有効成分としての抗酸化成分が、ビタミンＣ及びその誘導体並びにパセリ、小麦胚芽、茶、ユキノシタ、ボタン、リンゴ、ブドウ、グレープフルーツ、ホホバ、甘草、ローズマリー、豆類及びこれらの抽出物、米及び米ぬか抽出物および加水分解物、酵母、その加水分解物及び抽出物、パントテイン酸およびその誘導体、グルタチオン、アセチル化グルタチオン等のグルタチオン誘導体、システイン、Ｎ−アセチルシステイン等のシステイン誘導体、タウリン、ヒポタウリン、チオタウリン等のタウリン誘導体のようなチオール化合物、プロアントシアニジン、トコトリエノールおよびその誘導体、トコフェロールおよびその誘導体から選ばれる一種又は二種以上であり、内服剤の有効成分としての抗酸化成分が、トコトリエノールおよびその誘導体、トコフェロールおよびその誘導体、ＣｏＱ１０、ビタミンＣおよびその誘導体、カロチノイド、イソフラボン、ルテオリン、アントシアニン、カテキン、クルクミン、リグニン及びその配糖体、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ナイアシンおよびその誘導体、パントテン酸およびその誘導体、葉酸、ビオチン、イノシトール、カルノシン、アンセリン並びにイチョウ、リンゴ、ブドウ及びこれらの抽出物から選ばれる一種又は二種以上であることを特徴とする請求項７に記載の皮膚外用剤の有効成分と内服剤の有効成分を組み合わせたキット、
に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
（１）本発明のスクリーニング法で用いる皮膚三次元モデル
本発明のスクリーニング法では、皮膚三次元モデルにダメージを付与し、そのダメージを受けている皮膚三次元モデルに対し皮膚外用剤の有効成分と内服剤の有効成分とを用いることを特徴とする。ここで用いる皮膚三次元モデルは、正常ヒト三次元皮膚モデルとして市販されているものを使用することができる。市販品として、例えば、ＴＥＳＴ  ＳＫＩＮ（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ社、ＵＳＡ）、ＳＫＩＮ２ＴＭＺＫ１３００（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ＵＳＡ）、Ｅｐｉｓｋｉｎ    （Ｅｐｉｓｋｉｎ    ＳＮＣ社、    Ｆｒａｎｃｅ）、    ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ    （Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ    ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社、Ｆｒａｎｃｅ）、ＬＳＥ（東洋紡社、ＪＡＰＡＮ）等を挙げることができる。
【００１３】
本発明においては、これらのいずれも用いることができ、上記のキットを用い、培地調整から始めても良いし、出来上がった皮膚三次元モデルを購入しても良い。
【００１４】
（２）本発明のスクリーニング法で用いるダメージ付与条件
本発明のスクリーニング法は、上記皮膚三次元モデルに対してダメージを付与し、皮膚外用剤と内服剤とによる相乗的な美容効果が発揮する組み合わせのスクリーニング法を特徴とする。使用するダメージの種類としては、生活習慣の中で肌に影響を及ぼす因子、もしくはそれらの因子を想定したダメージを挙げることができる。ダメージの種類としては、過酸化水素水、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、２，２’−アゾビス−２−アミジノプロパン二塩酸塩、２，２’−アゾビス−２．４−ジメチルバレロニトリルなどの過酸化開始剤、紫外線、光、Ｘ線、マイクロウェーブなどの電磁波、タバコ煙、ヒドロキシラジカルやペルオキシラジカル、スーパーオキシドアニオンラジカルなどのラジカル種等が例示でき、特に好ましくは、過酸化開始剤を皮膚三次元モデルに培地添加するダメージ付与である。ダメージは、一つでもよいし、２つ以上を組み合わせて付与してもよい。
【００１５】
上記ダメージを与えた皮膚三次元モデルは、肌に対して過酸化反応やそれに付随して生じるシワ・たるみなどの肌老化、シミ等の色素沈着、ニキビといった種々の肌トラブルに合わせた皮膚三次元モデルと見なすことができる。
【００１６】
（３）上記スクリーニング法で用いる過酸化脂質定量法
本発明の皮膚外用剤と内服剤による相乗的な改善効果のスクリーニング法では、皮膚三次元皮膚モデルに与えたダメージの種類によって測定する指標は特に限定されないが、特に過酸化脂質を直接的に定量して、ダメージの改善程度を比較することが望ましい。特に、蛍光光度計を用いて過酸化脂質を測定することが好ましい。具体的には、脂質ヒドロペルオキシドと還元反応によって蛍光を発するＤＰＰＰを用いて脂質ペルオキシドを誘導体化し蛍光分析を行うことで、過酸化脂質を定量的に、しかも高感度で定量することができる。
【００１７】
（４）本評価方法によってスクリーニングされ得る有効成分
本発明の皮膚外用剤と内服剤による相乗的な肌生理改善効果のスクリーニング法では、過酸化脂質生成抑制効果を有する皮膚外用剤の有効成分と内服剤の有効成分との組み合わせを見出すことができる。過酸化脂質生成抑制は広義には抗酸化力を有する有効成分を例示できる。だが、抗酸化物質といっても、その作用機序は様々であり、活性酸素種と直接反応して単独で抗酸化作用を発揮する物質、あるいはこの反応を促進する触媒様の働きによって補助的に抗酸化作用を発揮する物質がある。従って、抗酸化物質については、これまでと同様、新たな抗酸化物質の探索に加え、それら抗酸化物質の単一の効果のみならず、複数の組みあわせによる効果の観点から、スクリーニングを実施した。有効成分の極性の違いにより、皮膚外用剤の抗酸化物質を含む有効成分は水溶性、内服剤の抗酸化物質を含む有効成分は油溶性であると好ましい。評価方法によって、皮膚外用剤の有効成分と内服剤の有効成分の相補的、相乗的効果が生み出される組み合わせを決定できる。さらに、皮膚外用剤の有効成分と内服剤の有効成分とは、抗酸化性の作用機序が互いに異なるので、それらを組みあわせると互いの抗酸化作用を相補・相加的に増強できることをも見出した。
【００１８】
水溶性抗酸化成分としては、過酸化脂質抑制効果を有するものであれば特に限定されるものではないが、植物およびその抽出物、植物、動物および微生物由来のスーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、以下ＳＯＤと省略）、ビタミンＣ及びその誘導体、グルタチオン、アセチル化グルタチオン等のグルタチオン誘導体、システイン、Ｎ−アセチルシステイン等のシステイン誘導体、タウリン、ヒポタウリン、チオタウリン等のタウリン誘導体のようなチオール化合物を例示できる。
【００１９】
なお、植物は、その植物自体、又はその植物を乾燥、細切及び粉砕などして加工した加工物、抽出物として使用される。
植物の抽出物は、その植物又は植物の加工物を溶媒で抽出した抽出物、圧搾や水蒸気蒸留などを行って得られる液体を捕集した留分、及びこのような抽出物や留分を液液抽出やカラムクロマトグラフィーで精製した精製物などとして使用される。
【００２０】
上述のような抽出物としては、いわゆるエキスが代表的であり、かかるエキスは、当該植物を極性溶媒で抽出したり、酸加水分解、酵素分解又は熱水抽出等により溶解させた後に濾過したり、当該溶液を乾燥し極性溶媒で抽出したりすることなどによって得られる。なお、抽出に供する植物は、乾燥及び／又は粉砕することができ、また抽出溶媒中でホモジナイズしたり、超音波で破砕してもよい。
【００２１】
抽出溶媒としては、水や極性有機溶媒などを使用できる。この極性有機溶媒としては、代表的には、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノール等の低級アルコール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール及びグリセリン等の多価アルコール、エチルエーテル及びプロピルエーテル等のエーテル類、酢酸エチル及び酢酸ブチル等のエステル類、並びにアセトン及びエチルメチルケトン等のケトン類などを挙げることができ、これらを任意に組み合わせた溶媒も使用可能である。
【００２２】
植物由来抗酸化成分として具体的には、茶、ユキノシタ、ボタン、リンゴ、ブドウ、グレープフルーツ、ホホバ、甘草、ローズマリー、豆類及びこれらの抽出物、米及び米ぬか抽出物および加水分解物等を挙げることができる。
【００２３】
植物由来のＳＯＤとして具体的には、パセリ、キャベツ、ケール、キュウリ、レタス、小麦胚芽及びこれらの抽出物を挙げることができる。
【００２４】
動物由来ＳＯＤとしては、ウシ属由来ＳＯＤ、ブタ属由来ＳＯＤ、ヒト由来ＳＯＤ等があり、臨床的利用が認められているＳＯＤを使用することができる。
微生物由来のＳＯＤとしては、酵母由来のものを使用することができる。
【００２５】
ビタミンＣの水溶性誘導体としては、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸塩、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸アミノプロピル、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド、などが使用できる。
【００２６】
油溶性抗酸化成分としては、過酸化脂質抑制効果を有するものであれば特に限定されるものではない。
【００２７】
カロチノイドは、動植物階に広く分布しており、黄色ないし赤色又は紫色の色素で、多数の共役二重結合を有する脂肪族又は脂環式のポリエン類であり、具体的には、αカロチン、βカロチン、γカロチン、リコピン、アスタキサンチン、レチノール、レチノイン酸、トレチノイン、ルテイン、クリプトキサンチン、ゼアキサンチン、イソゼアキサンチン、ロドキサンチン、カプサンチン、クロセチン等のカロチノイド及びその異性体が挙げられる。
【００２８】
トコフェロール類としては、天然のもの、合成のもののいずれも使用でき、ｄｌ−α（β、γ）−トコフェロール、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、ニコチン酸−ｄｌ−α−トコフェロール、リノール酸−ｄｌ−α−トコフェロール、コハク酸ｄｌ−α−トコフェロールのようなトコフェロール及びその誘導体を使用することができる。
【００２９】
トコトリエノールは、天然のもの、合成のもののいずれも使用でき、例えばパーム油、米油、米ぬか油からの抽出物を使用できる。
【００３０】
ビタミンＣの油溶性誘導体としては、２，３，５，６−Ｏ−テトラ−２−ヘキシルデカノイル−Ｌ−アスコルビン酸、６−Ｏ−パルミトイルアスコルビン酸、６−Ｏ−ステアロイルアスコルビン酸、２，６−Ｏ−ジパリミトイルアスコルビン酸などを使用することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
【実施例】
実施例１〜４を用いて、次の試験を行った。
［実施例１  過酸化開始剤の培地添加及び皮膚三次元モデル上滴下による脂質過酸化促進作用の測定］
ヒト皮膚三次元モデルは、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＬＳＥ−ｈｉｇｈ）（東洋紡製）を用い、プロトコールにしたがって培養した。培養液ＴＥＳＴＳＫＩＮＴＭ、ＬＳＥＴＭ  ＡＳＳＡＹ  ＭＥＤＩＵＭ（東洋紡製）に過酸化開始剤として２，２’−アゾビス−２−アミジノプロパン二塩酸塩（和光純薬製、以下ＡＡＰＨ）を溶解し、その溶液で２４時間培養した。アッセイリング内の組織上には、滅菌水、もしくは滅菌水にＡＡＰＨを溶解し、１００μｌ滴下した。培養終了後、生理食塩水（以下ＰＢＳ（−））で数回洗浄してバイオプシーパンチで組織を回収した。組織片からの脂質抽出はＦｏｌｃｈ法にしたがった。脂質抽出液を窒素ガス置換により除去し、脂質乾固物を得た。一方、培養液を分取し、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）法によって細胞毒性を定量化した。ＡＡＰＨ培地添加量が０ｍＭ（検体Ｎｏ．１）、０．１ｍＭ（検体Ｎｏ．２）、１．０ｍＭ（検体Ｎｏ．３）、１０ｍＭ（検体Ｎｏ．４）、及びＡＡＰＨ皮膚三次元モデル上滴下１０ｍＭとＡＡＰＨ培地添加１０ｍＭの併用（検体Ｎｏ．５）、５．０ｍＭ皮膚モデル上滴下と５．０ｍＭ培地添加の併用した時の細胞毒性を測定した。皮膚三次元モデルを用いた評価方法を図１に示す。皮膚三次元皮膚モデル上および培地への添加方法を表１に、過酸化開始剤の濃度変化における細胞毒性結果を図２に示す。なお、表１〜６に使われている矢印（↑や↓）は、↑が皮膚三次元モデルの培地添加、↓が皮膚三次元モデル上滴下を意味している。
【００３２】
【表１】
2004163326.tif 000003
【００３３】
この脂質乾固物を用いて、ＤＰＰＰ誘導体化による脂質ペルオキサイドの定量により、過酸化脂質量を調べた。脂質乾固物を１ｍｇ／ｍｌＤＰＰＰ／クロロホルム−メタノール混合液（１：１、ｖ／ｖ）で適当に溶解させ、６０℃で６０分反応させた。反応終了後、常温まで冷却し、蛍光分析グレードの２−プロパノール（和光純薬）を加えて直ちに蛍光分析に供した。ＤＰＰＰ誘導体化の反応から蛍光分析に供する過程は全て暗室内で実施した。蛍光分光光度計を用いて蛍光強度を測定した。蛍光光度計の測定条件は、励起波長３５２ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで積分時間５  ｓｅｃで行った。有効数字は、蛍光光度計の表示桁数（４桁）に合わせた。
【００３４】
ＡＡＰＨ培地添加量が０ｍＭ（検体Ｎｏ．１）、０．１ｍＭ（検体Ｎｏ．２）、１．０ｍＭ（検体Ｎｏ．３）、１０ｍＭ（検体Ｎｏ．４）、及びＡＡＰＨ皮膚三次元モデル上滴下１０ｍＭとＡＡＰＨ培地添加１０ｍＭの併用（検体Ｎｏ．５）、５．０ｍＭ皮膚モデル上滴下と５．０ｍＭ培地添加の併用（検体Ｎｏ．６）した時の過酸化脂質量を図３に示す。皮膚三次元皮膚モデル上および培地への添加方法をまとめたものが表２である。
【００３５】
【表２】
2004163326.tif 000004
【００３６】
図２、及び図３の結果より、ＡＡＰＨ無添加時の細胞毒性、過酸化脂質量に対してＡＡＰＨの濃度依存的に細胞毒性、過酸化脂質量が増加した。また、ＡＡＰＨ１０ｍＭを培地添加と皮膚三次元モデル上滴下とを併用した場合、ＡＡＰＨ１０ｍＭ培地添加と大差が無かったことから、ＡＡＰＨ１０ｍＭ培地添加が酸化ストレス負荷条件として適していると判明した。
【００３７】
［実施例２  ビタミンＣとビタミンＥの相乗効果による評価系の妥当性の検証］
ヒト皮膚三次元モデルは、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＬＳＥ−ｈｉｇｈ）（東洋紡製）を用い、プロトコールにしたがって培養した。培養ＴＥＳＴＳＫＩＮＴＭ、ＬＳＥＴＭ  ＡＳＳＡＹ  ＭＥＤＩＵＭ（東洋紡製）に、皮膚外用剤として、アスコルビン酸ＰＭ（Ｈタイプ）（  昭和電工製：以下ＶＣＰＭＧと省略））を滅菌水に溶解させ、皮膚三次元モデル上に滴下し、内服剤として、Ｍｉｘ  Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌｓ−９０（タマ生化学製：以下Ｔｏｃ）を溶解させ、その溶液で２４時間培養した。皮膚外用剤と内服剤どちらも無添加の群、皮膚外用剤を皮膚三次元モデル上に滴下した群、内服剤を培地添加した群、皮膚外用剤と内服剤とを併用した群を設定した。
【００３８】
２４時間培養終了後、アッセイリング内の溶液と培養液を回収し、ＰＢＳ（−）で数回洗浄後、過酸化開始剤ＡＡＰＨを１０ｍＭに調整した培養液で置換することで酸化ストレスを与えた。酸化ストレスを与えるのと同時にプレインキュベーションの時と同じ濃度に調整した抗酸化剤を培養液に添加、もしくは皮膚三次元モデル上に滴下した。溶液の置換終了後、２４ｈ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養終了後、培養液、及び皮膚モデル上へ滴下した溶液を回収し、ＰＢＳ（−）で数回洗浄してバイオプシーパンチで組織を回収した。以下の操作は、実施例１に従って皮膚三次元モデル中から脂質を抽出し、過酸化脂質を定量した。皮膚三次元皮膚モデル上および培地への添加方法を表３に、結果を図４に示す。
【００３９】
【表３】
2004163326.tif 000005
【００４０】
図４の結果より、ＶＣＰＭＧの皮膚三次元モデル上への滴下、及びＴｏｃの培地添加により、過酸化脂質生成が抑制されていた。また、両者を併用した場合、さらに過酸化脂質生成が抑制されていた。そこで、試験結果より、酸化抑制率を過酸化脂質量（Ｖａｌｕｅ）より算出した。以下に計算式を示す。
【００４１】
酸化抑制率（％）＝  １００  ×｛  １−（Ｖａｌｕｅ［抗酸化剤、酸化ストレス］−Ｖａｌｕｅ［コントロール；抗酸化剤フリー、酸化ストレスフリー］  ）／  （Ｖａｌｕｅ［酸化ストレス］）−Ｖａｌｕｅ［コントロール；抗酸化剤フリー、酸化ストレスフリー］  ）｝
【００４２】
図５に酸化抑制率のグラフを示す。この時の皮膚三次元皮膚モデル上および培地への添加方法を表４に示す。
【００４３】
【表４】
2004163326.tif 000006
【００４４】
ＶＣＰＭＧ  １５μ  Ｍ皮膚モデル上滴下及びＴｏｃ  １．５μ  Ｍ培地添加併用群の酸化抑制率８７．００％は、ＶＣＰＭＧ単独３０μＭ皮膚モデル上塗布の検体Ｎｏ．３における５２．３０％、Ｔｏｃ  ３．０μＭ培地添加における４９．１０％よりも高かった。それぞれ酸化抑制率を比較すると、両者同時添加の検体はＶＣＰＭＧ単独およびＴｏｃ単独より酸化抑制率が上回ったことから、皮膚三次元モデルを利用して、ビタミンＣとビタミンＥ両者併用による相乗効果が認められた。なお、既にビタミンＣとビタミンＥとの組み合わせは、リポソーム膜（脂質人工膜の一種）においても相乗的な抗酸化能が実証されており、本試験結果は、皮膚三次元モデルによる、実使用を想定した有効成分の添加方法で相乗効果を裏付けることができた。
また、検体Ｎｏ．６以外のＶＣＰＭＧとＴｏｃとを併用した検体Ｎｏ．７〜Ｎｏ．９についての酸化抑制率はそれぞれ、Ｎｏ．７→４８．５７％、Ｎｏ．８→５２．３５％、Ｎｏ．９→３６．１３％であり、ＶＣＰＭＧ単独での皮膚モデル上滴下（検体Ｎｏ．３〜５）、及びＴｏｃ培地添加における酸化抑制率と同レベルかそれよりも低かったため、これらの検体について相乗効果は認められなかった。このことから、皮膚外用剤と内服剤との相乗的な効果を発揮するには、皮膚外用剤の有効成分が水溶性で、内服剤の有効成分が油溶性の時に皮膚三次元モデルを作用点として的確に到達する浸透性を有していることが明らかになった。
【００４５】
よって、皮膚外用剤の有効成分として水溶性の抗酸化剤を、内服剤の有効成分として油溶性の抗酸化剤を組み合わせることで、皮膚外用剤と内服剤との相乗的な相互作用が発揮される。
【００４６】
［実施例３  パセリ抽出物とトコトリエノールの相乗的な抗酸化能の検証］
ヒト皮膚三次元モデルは、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＬＳＥ−ｈｉｇｈ）（東洋紡製）を用い、プロトコールにしたがって培養した。培養液ＴＥＳＴＳＫＩＮＴＭ、ＬＳＥＴＭ  ＡＳＳＡＹ  ＭＥＤＩＵＭ（東洋紡製）に、皮膚外用剤として、ＳＯＤ（ウシ赤血球由来、和光純薬製）もしくはパセリ抽出物（太陽化学製）を滅菌水に溶解させ、皮膚モデル上に滴下し、内服剤として、Ｔｏｃを溶解させ、その溶液で２４時間培養した。皮膚外用剤と内服剤どちらも無添加の群、皮膚外用剤を皮膚三次元モデル上に滴下した群、内服剤を培地添加した群、皮膚外用剤と内服剤とを併用した群を設定した。
【００４７】
２４時間培養終了後、アッセイリング内の溶液と培養液を回収し、ＰＢＳ（−）で数回洗浄後、過酸化開始剤ＡＡＰＨを１０ｍＭに調整した培養液で置換することで酸化ストレスを与えた。酸化ストレスを与えるのと同時にプレインキュベーションの時と同じ濃度に調整した抗酸化剤を培養液に添加、もしくは皮膚三次元モデル上に滴下した。溶液の置換終了後、２４ｈ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養終了後、培養液、及び皮膚モデル上へ滴下した溶液を回収し、ＰＢＳ（−）で数回洗浄してバイオプシーパンチで組織を回収した。以下の操作は、実施例１に従って皮膚三次元モデル中から脂質を抽出し、過酸化脂質を定量した。皮膚三次元皮膚モデル上および培地への添加方法を表５に、結果を図６に示す。パセリ抽出物の「％」は質量百分率を示す。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
図６の結果より、ＳＯＤ、もしくはパセリ抽出物の皮膚三次元モデル上への滴下及びＴｏｃの培地添加により、過酸化脂質生成が抑制されていた。    図４の結果より、ＶＣＰＭＧの皮膚三次元モデル上への滴下、及びＴｏｃの培地添加により、過酸化脂質生成が抑制されていた。また、ＳＯＤとＴｏｃ、もしくはパセリ抽出物とＴｏｃを併用した場合、さらに過酸化脂質生成が抑制されていた。そこで、試験結果より、酸化抑制率を算出して各検体を比較した。酸化抑制率を過酸化脂質量（Ｖａｌｕｅ）より算出した。以下に計算式を示す。
【００５０】
酸化抑制率（％）＝  １００  ×｛  １−（Ｖａｌｕｅ［抗酸化剤、酸化ストレス］−Ｖａｌｕｅ［コントロール；抗酸化剤フリー、酸化ストレスフリー］  ）／  （Ｖａｌｕｅ［酸化ストレス］）−Ｖａｌｕｅ［コントロール；抗酸化剤フリー、酸化ストレスフリー］  ）｝
結果を図７に示す。この時の皮膚三次元皮膚モデル上および培地への添加方法を表６に示す。パセリ抽出物の「％」は質量百分率を示す。
【００５１】
【表６】
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【００５２】
抗酸化剤の皮膚モデル上への滴下と培地添加を併用した群である、パセリ抽出物０．５％皮膚モデル上滴下‐Ｔｏｃ  １．５μＭ培地添加を併用した検体（検体Ｎｏ．１１）ではそれぞれ単独添加での場合よりも高い抑制効果を示し、なおかつ、それぞれ単独の２倍量の濃度と比較しても高い抑制率を示したことから、両者の相乗効果が証明された。ＳＯＤ２５０Ｕ／ｍｌ皮膚モデル上滴下‐Ｔｏｃ１．５μＭ培地添加を併用した（検体Ｎｏ．１０）についても同様の結果が得られた。
【００５３】
［実施例４  インビボ試験系によるパセリ抽出物とトコトリエノールの相乗的な抗酸化能の検証］
（１）皮表過酸化脂質生成抑制効果試験
（試験方法）２０代から４０代女性２４名を対象に表７に示す化粧水を２ヶ月間連続塗布し、さらに表８示す成分を内包したソフトカプセルを内服し、その効果を評価した。すなわち、被験者の一方の頬に１日２回、皮膚外用剤実施例１、もう一方の頬に皮膚外用剤比較例１の化粧水を約０．１ｇ塗布し、さらにそのうちの１２名に対して内服剤実施例２を、残りの１２名対して内服剤比較例２のソフトカプセルを毎日朝食前に２錠ずつ内服し、試験開始前および試験終了後の過酸化脂質量を測定した。なお、２４名の被験者の両頬を試験しているので、検体数としては合計４８検体となる。
【００５４】
（過酸化脂質測定方法）
洗顔２時間以上経過した状態で市販のあぶらとり紙で皮表脂質を採取し、クロロホルム−メタノール混合液（１：１、ｖ／ｖ）で抽出する。さらに、窒素ガス置換で乾固後、ＤＰＰＰ／クロロホルム−メタノール混合液（１：１、ｖ／ｖ）を加え、６０℃６０分で反応させる。室温に冷却後、２−プロパノールを加え、励起波長３５２ｎｍ蛍光波長３８０ｎｍの蛍光強度を測定する。評価は単位皮表脂質量あたりの過酸化脂質量（ｐｍｏｌ／ｍｇ）を算出し、使用前後の過酸化脂質の変化を調べた。表９に試験開始時に対する試験開始２ヶ月後の単位皮表脂質量あたりの過酸化脂質量の増減を検体数によって示す。
【００５５】
【表７】
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【００５６】
【表８】
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【００５７】
【表９】
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【００５８】
表９からも明らかなとおり、本発明の皮膚外用剤実施例１であるパセリ抽出物配合化粧水と内服剤実施例２であるトコトリエノール配合ソフトカプセルの同時使用のときに最も過酸化脂質生成量の減少した人数が多く、相乗的な抗酸化能を示した。
【００５９】
（２）  肌理改善効果
（試験方法）皮表過酸化脂質生成抑制効果試験と同じ２０代から４０代女性２４名を対象に表１に示す化粧水を２ヶ月間連続塗布し、さらに表２の成分を内包したソフトカプセルを内服し、その効果を評価した。すなわち、被験者の一方の頬に１日２回、皮膚外用剤実施例１、もう一方の頬に皮膚外用剤比較例１の化粧水を約０．１ｇ塗布し、さらにそのうちの１２名に対して内服剤実施例２を、残りの１２名に対して内服剤比較例２のソフトカプセルを毎日朝食前に２錠ずつ内服し、試験開始前および試験終了後の頬部に対して山田粧業製二剤混合型レプリカ剤スキンキャストを用いてレプリカを採取し、顕微鏡観察により肌理の状態を以下の判定基準により判定した。結果を表１０に示す。
（判定基準）
著        効  ；明瞭で細かい肌理が観察される
有        効  ；明瞭だがやや粗い肌理が観察される
やや有効  ；やや不明瞭な肌理が観察される
無        効  ；不明瞭な肌理が観察される
（判定）
○；被験者のうち著効および有効を示す検体数が２０検体以上の場合
△；被験者のうち著効および有効を示す検体数が１０検体以上１９検体以下の場合
×；被験者のうち著効および有効を示す検体数が９検体以下の場合
【００６０】
【表１０】
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【００６１】
表１０からも明らかなように、本発明の皮膚外用剤実施例１であるパセリ抽出物配合化粧水と内服剤実施例２であるトコトリエノール配合ソフトカプセルの同時使用のときに肌理改善効果が最も高く、優れた美容効果があることがわかった。このことは、（１）皮表過酸化脂質生成抑制効果試験で証明された皮膚外用剤と内服  剤の相乗的な抗酸化能に起因している。
【００６２】
実施例４の結果から、インビボ試験系でパセリ抽出物とトコトリエノールとの相乗的な抗酸化能、その相乗的な抗酸化作用に起因して起こる優れた肌理改善効果が証明され、これは、実施例３で証明されたインビトロでの相乗的な抗酸化能を反映している。実施例４では、被験者の個体差があるために再現性を得るために試験期間２ヶ月間という長期間を要したが、実施例３のインビトロ試験系では皮膚三次元モデル購入後、３日間という短期間で結果を得た。本試験によって、インビトロで、しかも簡便且つ短期間で皮膚外用剤と内服剤との相乗効果の現れる有効成分の組み合わせをスクリーニングできた。
【００６３】
【発明の効果】本発明により、皮膚三次元モデルを用いて、皮膚外用剤の有効成分と内服剤の有効成分との併用効果を３日間という短期間で検証できた。その試験結果はインビボでの試験結果を反映し、少ない設備投資で定量性のある結果が得られた。皮膚外用剤の有効成分と内服剤の有効成分の組み合わせを容易に決定できた。さらに、個人や適性に応じた組み合わせの評価も容易に決定できる。また、これらのスクリーニング法で有効と判断された有効成分を含む皮膚外用剤と内服剤を組み合わせたキットを提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】皮膚外用剤と内服剤との相互作用評価方法を示す。
【図２】過酸化開始剤の濃度変化における細胞毒性の結果を示す。
Ｘ軸−検体Ｎｏ、Ｙ軸−細胞毒性（培地中（６４倍希釈物）の乳酸＠脱水素酵素活性（Ｏ．Ｄ．５７０ｎｍで表示）
【図３】酸化開始剤の濃度変化における過酸化脂質量を示す。
Ｘ軸−検体Ｎｏ、Ｙ軸−過酸化脂質量（ｐｍｏｌ）
【図４】ＶＣＰＭＧとＴｏｃ併用による過酸化脂質抑制効果を示す。
Ｘ軸−検体Ｎｏ、Ｙ軸−過酸化脂質量（ｐｍｏｌ）
【図５】ＶＣＰＭＧ  とＴｏｃとの併用による酸化抑制率を示す。
Ｘ軸−検体Ｎｏ、Ｙ軸−酸化抑制率（％）
【図６】パセリ抽出物−Ｔｏｃ、ＳＯＤ−Ｔｏｃ併用における過酸化脂質量を示す。
Ｘ軸−検体Ｎｏ、Ｙ軸−酸化抑制率（％）
【図７】パセリ抽出物−Ｔｏｃ、ＳＯＤ−Ｔｏｃ併用における酸化抑制率を示す。
Ｘ軸−検体Ｎｏ、Ｙ軸−酸化抑制率（％）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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