(57)【要約】【課題】光照射によるジフルオロシクロプロパン誘導体の環開裂によってＤＮＡやＲＮＡを切断する光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬および切断方法に関する。【解決手段】２，２−ジフルオロシクロプロパン環、光増感作用および電子吸引性がありシクロプロパン環の開裂を促すＡユニット、および水溶性をもたらすＢユニットを含み、光照射によって作動することを特徴とする、光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬、さらに、塩基配列の認識部位を含むＣユニットを含む光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬およびこれらの試薬を用いるポリヌクレオチドの切断方法を提供する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２，２−ジフルオロシクロプロパン環、光増感作用および電子吸引性がありシクロプロパン環の開裂を促すＡユニット、および水溶性をもたらすＢユニットを含み、光照射によって作動することを特徴とする、光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬。
【請求項２】
Ａユニットが芳香族カルボニル基を含む、請求項１記載の光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬。
【請求項３】
Ｂユニットが親水性官能基を含む、請求項１または２記載の光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬。
【請求項４】
芳香族カルボニル基を含むＡユニットおよび親水性官能基を含むＢユニットが、２，２−ジフルオロシクロプロパン環に結合している、請求項１〜３のいずれか１項記載の光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬。
【請求項５】
芳香族カルボン酸の２，２−ジフルオロ−３−アミノメチル−シクロプロピルメチルエステルである、請求項４記載の光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬。
【請求項６】
さらに塩基配列の認識部位を含むＣユニットを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬。
【請求項７】
さらに、スペーサーを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬。
【請求項８】
上記芳香族基が、アントラセン、ピレン、またはフルオレンから選ばれる、請求項２〜７のいずれか１項記載の光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬。
【請求項９】
親水性官能基が、アミノ基、アルキルアミノ基または４級アンモニウム基から選ばれる、請求項３〜８のいずれか１項記載の光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬。
【請求項１０】
９−アントラセンカルボン酸−（３−アミノメチル−２，２−ジフルオロ）シクロプロピルメチルエステルである、請求項５記載の光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載の光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬と、ポリヌクレオチドを接触させ、光を照射してポリヌクレオチドを切断することを特徴とする、ポリヌクレオチドの切断方法。
【請求項１２】
９−アントラセンカルボン酸−（３−アミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステルの（Ｒ，Ｒ）体、（Ｓ，Ｓ）体、（Ｓ，Ｒ）体、（Ｒ，Ｓ）体またはそれぞれのラセミ体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光照射によるジフルオロシクロプロパン誘導体の環開裂によってＤＮＡやＲＮＡを切断する光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬およびこの切断試薬を用いるポリヌクレオチドの切断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
遺伝子を切断する制限酵素は遺伝子工学にとり不可欠な存在であり、微生物や動植物から単離抽出した天然の酵素タンパク質であった。例えば大腸菌から単離されたＥｃｏＲ　Ｉなど様々な酵素が知られ、多くの種類の制限酵素が市販されている。市販の制限酵素はいずれも高価であり、タンパク質であるためにその機能を発揮するためには緩衝液中で反応させる必要があり、また保存には−２０℃という低温条件が求められている。さらに、化学試薬により容易に失活するなどと利用上の制限が数多く存在した。また、天然の酵素であるが故に、所望の箇所で自在に切断できない。
【０００３】
従って、室温で保存可能で、取り扱いが容易かつ安定で、ＤＮＡ、ＲＮＡの塩基配列を読みとり特定箇所で選択的に切断する機能を有する、いわばテーラーメイドな「ポリヌクレオチド切断試薬」が開発できれば、遺伝子工学によるタンパク質の生産、遺伝子治療などの医療分野や、ゲノム創薬研究を進展するために有用な武器になることが期待される。
【０００４】
例えば、ブレオマイシンなどＤＮＡを切断することで機能する抗生物質や抗癌剤が知られており、また、カリケアミシンなどのエンジイン化合物は、エンジイン構造が芳香環に縮環する際にビラジカルを生じ、このラジカルでＤＮＡを切断すると考えられており、また、極めて強力な抗癌剤として期待されている。
【０００５】
ＤＮＡを切断する機能をもつテーラーメイド人工酵素の重要性も広く認識され、人工制限酵素試薬の開発のために多くの研究がなされてきた。小宮山らによるＤＮＡを切断する機能を有する希土類錯体は良く知られており、最近では、戸嶋らが糖−キノキサリン誘導体を用いて光照射を引き金とする人工制限酵素合成を試み有望な成果を発表している（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，　２１２　（２００２））。しかしながら、実用化に至った人工制限酵素の例は未だ報告されていない。
【０００６】
本発明者らは、１，３−ビスヒドロキシメチル−２，２−ジフルオロシクロプロパンや、１，６−ビスヒドロキシメチル−２，２，５，５−テトラフルオロビシクロプロパンの誘導体が単純な光照射により分解され、このときフリーラジカルが生成する可能性に気づいた。ジフルオロシクロプロパンが開裂して生じるジフルオロメチルラジカルの寿命は長いことが知られている（例えば、Ｗ．　Ｒ．　Ｄｏｌｂｉｅｒ，　Ｊｒら，Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．　６４，　５４０　（１９９９））。そこで、ＤＮＡにジフルオロシクロプロパン誘導体を作用させ、ＤＮＡに損傷を与えないレベルの光でジフルオロシクロプロパンを分解することでＤＮＡが切断できるのではないかと考え、ＤＮＡへのインターカレート作用ならびに光増感作用を持つと考えられるアントラセンメチル基を導入したジフルオロシクロプロパン誘導体を合成し、そのＤＮＡ切断作用を調べた（第２５回フッ素化学討論会要旨集、２００１年１１月１８日、ｐｐ５４−５５）。ところがほとんど切断作用は得られなかった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的はＤＮＡやＲＮＡを識別して切断したり、あるいはランダムに切断することを自在に行うことのできる「人工制限酵素」として用い得る光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬を提供することにある。また、この機能は必然的に抗癌剤としても利用可能であると思われる。
【０００８】
本発明は、２，２−ジフルオロシクロプロパン環、光増感作用および電子吸引性がありシクロプロパン環の開裂を促すＡユニット、および水溶性をもたらすＢユニットを含み、光照射によって作動することを特徴とする、光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬を提供するものである（図１、モデル分子１〜３参照）。
【０００９】
さらに、塩基配列の認識部位を含むＣユニットを結合させることによって、例えば、ペプチド核酸の核酸部位に所望の塩基配列を認識させて切断し得るテーラーメイドな制限酵素機能を与えることができる（図１、ポリヌクレオチド選択的切断用モデル分子２および３）。ペプチド核酸認識部位は核酸が３以上であることが好ましい。Ｃユニットについては、ペプチド核酸を使わずにポリヌクレオチドの塩基を認識する原子団であればよく簡略化できる。
【００１０】
スペサーは、例えば、Ｃユニットに結合させるスペーサーによって、アミノ糖などの糖類を導入した構造に誘導し、さらに特徴的な分子認識能力を付加することができる。また、基本となる２，２−ジフルオロシクロプロパン環についてスペーサーを挟むとさらに多彩な官能基修飾が可能である（図１、ポリヌクレオチド選択的切断用モデル分子２および３参照）。
【００１１】
本発明の光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬の１例として、芳香族カルボン酸または芳香族アミド基などの芳香族カルボニル基（インターカーレート性官能基）を含むＡユニットおよび親水性官能基を含むＢユニットが２，２−ジフルオロシクロプロパン環に結合している化合物を挙げることができる。この種の化合物はトランス体の場合、（Ｒ，Ｒ）体、（Ｓ，Ｓ）体、またはラセミ体であってもよいが、好ましくは（Ｒ，Ｒ）体である。また、シス体（（Ｓ，Ｒ）体、（Ｒ，Ｓ）体）であっても差し支えない。
【００１２】
本発明はまた、上記の光スイッチ型ポリヌクレオチド切断試薬をポリヌクレオチドと接触させ、光を照射してポリヌクレオチドを切断することを特徴とする、ポリヌクレオチドの切断方法を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
ジフルオロシクロプロパンがラジカル的に開裂することは知られているが、ＤＮＡ切断機構がラジカル種で引き起こされるものであれば、ＲＮＡについても同様な切断活性があることになる。すなわち、ジフルオロシクロプロパン誘導体は抗レトロウイルス剤としての機能を発現する可能性がある。以下では、ＤＮＡを例として記載されている場合があるが、ＲＮＡにも適用され得る。
【００１４】
ジフルオロシクロプロパンのよりスムーズな開環反応を実現するためにジフルオロシクロプロパンを適切に修飾する。また、ＤＮＡに作用させるために適切な親水性を付加する。すなわち、好ましくは、緩衝液に十分溶解する水溶性を有し、且つジフルオロシクロプロパン環が光照射で開環してジフルオロメチルラジカルを生じ得るジフルオロシクロプロパン誘導体である。
【００１５】
ジフルオロシクロプロパン環に連結させる官能基の性質が２，２−ジフルオロシクロプロパンの安定性に大きく寄与し、電子吸引性置換基が存在すると開環分解しやすくなる。従って、核となる２，２−ジフルオロシクロプロパンに連結するもう一方の官能基（Ａユニット）には、光増感作用をもち、電子吸引性でかつシクロプロパン環の開裂を促す様々な芳香族カルボン酸またはカルボン酸アミド基などの芳香族カルボニル基の導入が可能である（図１、モデル分子１〜３参照）。特にＤＮＡやＲＮＡにインターカーレートする芳香族官能基が望ましく、例えば、アントラセン、ピレン、またはフルオレンのカルボン酸またはカルボン酸アミドなどのカルボニル基が挙げられるが、カルボン酸が好ましい。
【００１６】
本発明のポリヌクレオチド切断試薬に水溶性をもたらすＢユニットには、例えば、親水性官能基が含まれ、アミノ基、アルキルアミノ基または４級アンモニウム基などを挙げることができる。
【００１７】
芳香環上に適当な水溶性官能基を導入することで、さらに水溶性やＤＮＡ分子との親和力を向上させ、切断活性をあげることができる。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチド切断試薬の１つとして合成された９−アントラセンカルボン酸−（３−アミノメチル−２，２−ジフルオロ）シクロプロピルメチルエステルは新規化合物である。なお、立体構造的には、（Ｒ，Ｒ）体、（Ｓ，Ｓ）体、（Ｓ，Ｒ）体、（Ｒ，Ｓ）体およびそれぞれのラセミ体が存在する。
【００１９】
スペーサーは、例えば、特定のＤＮＡ配列と相互作用して認識するユニットを導入できるし、また、この原理はＲＮＡにも適応可能と考えられる。アミノ基と水酸基という二つの官能基を併せ持つ場合のジフルオロシクロプロパン誘導体は、アミノ基部分を例えばコハク酸などのジカルボン酸、β−アミノ酸、ジアミドなどをスペーサー（リンカー）に用いて、核酸やペプチド核酸（ペプチドのアミノ基に核酸の塩基が結合したもので、ポリヌクレオチドミミックとして作用し得る）と連結することが可能である（図１、ポリヌクレオチド選択的切断用モデル分子２および３参照）。スペーサーは核酸やペプチド核酸と連結し得るものであれば、炭素鎖の数は問わないし、上記のジカルボン酸、β−アミノ酸、ジアミドに限定されるものではない。
【００２０】
プリン類やピリミジン類などＤＮＡやＲＮＡの塩基部分を構成する官能基のみをスペーサー（リンカー）を介して連結することもできる。
【００２１】
２，２−ジフルオロシクロプロパンは全く新しいタイプのＤＮＡ切断機能化合物であり、この化合物がＤＮＡを切断する機能は、環開裂でジフルオロメチルラジカルとメチレンラジカルが生じ、メチレンラジカルがデオキシリボースの５位の水素を引き抜くことによりデオキシリボースの５位にラジカルが生じ、これを引き金としてデオキシリボースが開環分解すると考えられる（図２参照）。
【００２２】
【実施例】
実施例１　（Ｓ，Ｓ）−９−アントラセンカルボン酸−（３−アミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（（Ｓ，Ｓ）−ＮＨ２−ｍｏｎｏ）（１）の合成
2004097050.tif 000002
【００２３】
反応式１
2004097050.tif 000003
【００２４】
Ａ．アルゴン雰囲気下、酢酸−（２，２−ジフルオロ−３−ヒドロキシメチル−シクロプロピル）メチルエステル（１）（３．３７　ｇ，１８．７　ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸クロリド（４．２７　ｇ，　２２．４　ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０　ｍｌ）溶液に０℃でピリジン（２．２７　ｍｌ，　２８．１　ｍｍｏｌ）を加えた。これを室温で２９時間撹拌したのち、純水を加えて反応を停止し、ジクロロメタン、酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより酢酸−（２，２−ジフルオロ−３−ｐ−トルエンスルホニルオキシメチルシクロプロピル）メチルエステル（４．２０　ｇ，１２．０　ｍｍｏｌ）を収率６４％で得た（Ｉｔｏｈ，　Ｔ．；　Ｉｓｈｉｄａ，　Ｎ．；　Ｍｉｔｓｕｋｕｒａ，　Ｋ．；　Ｕｎｅｙａｍａ，　Ｋ．　Ｊ．　Ｆｌｕｏｒｉｎｅ　Ｃｈｅｍ．　２００１，　１１２，　６３−６８）。
【００２５】
Ｂ．アルゴン雰囲気下、酢酸−（２，２−ジフルオロ−３−ｐ−トルエンスルホニルオキシメチルシクロプロピル）メチルエステル（１００．３　ｍｇ，　０．３０　ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５　ｍｌ）溶液に室温でアジ化ナトリウム（２９．３　ｍｇ，　０．４５　ｍｍｏｌ）を加え、同温度で１１時間撹拌した。氷片を加えて反応を停止し、エーテル抽出を行い、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥したのち、減圧濃縮、シリカゲル薄層クロマトグラフィーで精製し、酢酸−（３−アジドメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（２）　（８９．５　ｍｇ，　０．４３　ｍｍｏｌ）を収率９７％で得た。
【００２６】
反応式２
2004097050.tif 000004
【００２７】
Ｃ．酢酸−（３−アジドメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（２）　（２７．０　ｍｇ，　０．１３　ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（１．５　ｍｌ）、メタノール（０．５　ｍｌ）混合溶液に水素雰囲気下、５％パラジウム・カーボン（５．４　ｍｇ）を加えて室温で３時間撹拌した。パラジウム・カーボンをセライトを詰めたグラスロートで濾過して除去し、濾液を濃縮し酢酸−（３−アミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（３）（２１．８　ｍｇ，０．１３　ｍｍｏｌ）を収率９３％で得た。
【００２８】
Ｄ．アルゴン雰囲気下、酢酸−（３−アミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（３）（３５　ｍｇ，　０．２０　ｍｍｏｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）クロリド（５０　ｍｇ，　０．２９ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（１．０　ｍｌ）溶液にピリジン（３１　ｍｇ，　０．３９ｍｍｏｌ）を室温で加え、５５℃で４時間撹拌した。反応混合液を室温まで放冷したのち酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水で有機層を洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮、シリカゲル薄層クロマトグラフィーで精製して、酢酸−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（４７．３　ｍｇ，　０．１５ｍｍｏｌ）を収率７７％で得た。
【００２９】
Ｅ．酢酸−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（１２．８　ｍｇ，　０．０４１　ｍｍｏｌ）のメタノール（０．２０　ｍｌ）溶液に無水炭酸カリウム（６．７　ｍｇ，　０．４９　ｍｍｏｌ）　を加えて室温で５．５時間撹拌した。氷片を加えたのち食塩（０．５ｇ）を加え、酢酸エチル抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥したのち減圧濃縮して１−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロ−３−ヒドロキシメチルシクロプロパン（４）（９．８　ｍｇ，　０．０３６　ｍｍｏｌ）を収率８８％で得た。
【００３０】
反応式３
2004097050.tif 000005
【００３１】
Ｆ．アルゴン雰囲気下、暗所にて９−アントラセンカルボニルクロリド（３９．３　ｍｇ，　０．１７　ｍｍｏｌ）と１−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロ−３−ヒドロキシメチルシクロプロパン（４）（４１．０　ｍｇ，　０．１５　ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．５　ｍｌ）溶液に、０℃でピリジン（６０．２　ｍｇ）を加えて室温で３時間撹拌した。少量の氷片を加えて反応を停止し、酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮、シリカゲル薄層クロマトグラフィー精製して、９−アントラセンカルボン酸−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（５）　（２４．３ｍｇ，　０．０５１ｍｍｏｌ）を収率３１％で得た。
【００３２】
Ｇ．９−アントラセンカルボン酸−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル　（５）（１４．６ｍｇ，　０．０３１ｍｍｏｌ）のメタノール（０．３ｍｌ）溶液に水素雰囲気下５％パラジウム・カーボン（３．０ｍｇ）を加え、暗所、室温にて１５時間撹拌した。グラスフィルターを用いてセライト濾過し、濾液を減圧濃縮し、９−アントラセンカルボン酸−（３−アミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（（Ｓ，Ｓ）−ＮＨ２−ｍｏｎｏ）（１０．０ｍｇ，　０．０３１ｍｍｏｌ）を定量的に得た。
【００３３】
これを１０ｍＭリン酸緩衝溶液に溶解しファージφ１４７プラスミド由来スーパーコイルドＤＮＡにつき、３６５ｎｍの光照射下でＤＮＡ切断試験を実施した。
【００３４】
実施例２　ＤＮＡの光切断試験
（Ｓ，Ｓ）−９−アントラセンカルボン酸−（１−アミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（（Ｓ，Ｓ）−ＮＨ２−ｍｏｎｏ）によるプラスミド　ＤＮＡの光切断試験
マイクロチューブに１０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐＨ７．０を９μＬ加え、ついで基質であるφＸ１７４　ＲＦＩ　ＤＮＡ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ，　Ｎ３０２１Ｓ　，　１５０μＭ）を１μＬ加え混合した。
【００３５】
対照（Ｃ）としてＤＮＡのみ、および比較試料として９−アントラセンカルボン酸エチルエステル（ａｎｔｈ−ＯＥｔ）、および被験試料の（Ｓ，Ｓ）−９−アントラセンカルボン酸−（１−アミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（（Ｓ，Ｓ）−ＮＨ２−ｍｏｎｏ）を、それぞれの濃度に調製して、その１μＬを加え、混合後ＵＶ−Ａ　ｌａｍｐ　（ｍａｘ＝３６５ｎｍ，　ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）を照射し３時間反応させた。電気泳動装置（８％　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ，　ＴＡＥ　ｂｕｆｆｅｒ，　１００　Ｖ，　３０　ｍｉｎ）でφＸ１７４ＲＦＩ　ＤＮＡを反応物と未反応物とに分離しｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅでφＸ１７４　ＲＦＩ　ＤＮＡを可視化した。定量はＮＩＨ　Ｉｍａｇｅ　１．６２を用いて行った。
【００３６】
φＸ１７４　ＲＦＩ　ＤＮＡの切断実験条件
2004097050.tif 000006
緩衝液：　１０　ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐＨ７．０
【００３７】
結果を図３および図４に示した。図３は切断処理後の電気泳動図であり、ｎｉｃｋｅｄ　ＤＮＡの濃度が増加することはＤＮＡが切断されていることを示す。図４は図３の結果を定量的に示す棒グラフである。
【００３８】
結果
（Ｓ，Ｓ）−９−アントラセンカルボン酸−（３−アミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（（Ｓ，Ｓ）−ＮＨ２−ｍｏｎｏ）では強いＤＮＡ切断活性が発現した。すなわち、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０にφＸ１７４プラスミド由来のス−パ−コイルドＤＮＡをとり、ＮＨ２−ｍｏｎｏを１００　μＭ、５００　μＭ、　１２００　μＭの濃度で添加し、３６５　ｎｍの光を照射したところ、明らかに濃度依存的にＤＮＡが切断されス−パ−コイルドＤＮＡからニックドＤＮＡが生成した。この時、照射した３６５　ｎｍの光では実験に用いたスーパーコイルドＤＮＡの切断は起こらないことを確認した。
【００３９】
考察
この実験では、φＸ１７４プラスミド由来のスーパーコイルドＤＮＡをランダムに切断したわけであるが、本分子をＤＮＡの各塩基と相互作用を持つ官能基で修飾すれば、切断箇所をコントロールすることも可能になると考えられる。
【００４０】
癌細胞は通常細胞よりも盛んに細胞分裂を繰り返していることが知られている。そこで、今回合成した９−アントラセンカルボン酸−（３−アミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステルを癌細胞に作用させれば、抗癌剤として作用することも期待できる。
【００４１】
実施例３　（Ｒ，Ｒ）−９−アントラセンカルボン酸−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステルの合成
（Ｒ，Ｒ）−ビスヒドロキシメチル−２，２−ジフルオロシクロプロパンから出発して実施例１と同様の工程で、（Ｒ，Ｒ）−体の９−アントラセンカルボン酸−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステルを合成した。
【００４２】
実施例４　（Ｒ，Ｒ）−９−アントラセンカルボン酸−（３−アミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（（Ｒ，Ｒ）−ＮＨ２−ｍｏｎｏ）の合成（別方法によるもの）
2004097050.tif 000007
【００４３】
反応式４
2004097050.tif 000008
【００４４】
Ａ．（Ｒ，Ｒ）−酢酸−（３−アセトキシメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（＞９９％ｅｅ，　Ｉｔｏｈ，　Ｔ．；　Ｍｉｔｓｕｋｕｒａ，　Ｋ．；　Ｆｕｒｕｔａｎｉ，　Ｍ．　Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．　１９９８，　９０３−９０４）（１）（６６７　ｍｇ，　３．０　ｍｍｏｌ）のメタノール（１５ｍｌ）溶液に無水炭酸カリウム（８３０ｍｇ，　６．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で６時間撹拌した。減圧濃縮してメタノール溶媒を完全に留去して（Ｒ，Ｒ）−１，３−ビスヒドロキシメチル−２，２−ジフルオロシクロプロパン（３５３　ｍｇ，　２．５６　ｍｍｏｌ）を収率８５％で得た。
【００４５】
Ｂ．アルゴン雰囲気下，（Ｒ，Ｒ）−１，３−ビスヒドロキシメチル−２，２−ジフルオロシクロプロパン（３５３　ｍｇ，　２．５６　ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２０　ｍｌ）に溶解し、０℃でｔ−ブチルジフェニルクロルシラン（９８１　ｍｇ，　３．５８　ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５　ｍｌ）溶液を加え、さらにイミダゾール（２６１　ｍｇ，　３．８４　ｍｍｏｌ）のＤＭＦ　（２．５　ｍｌ）を加えた。この混合液を室温で１２時間撹拌したのち、氷片を加えて反応を停止し、ジクロロメタンで抽出し、有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥したのち、減圧濃縮、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、１−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル−３−ヒドロキシメチル−２，２−ジフルオロシクロプロパン（７）（４６３ｍｇ，　１．２３ｍｍｏｌ）を収率４８％で得た。なお、１，３−ビス−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル−２，２−ジフルオロシクロプロパン（６７６　ｍｇ，　１．１０　ｍｍｏｌ）が収率４３％で副生した。
【００４６】
Ｃ．アルゴン雰囲気下、（Ｒ，Ｒ）−１−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル−２，２−ジフルオロ−３−ヒドロキシメチルシクロプロパン（７）（４６３　ｍｇ，　１．２３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０　ｍｌ）溶液に、塩化ｐ−トルエンスルホニル（６７６　ｍｇ，　２．４６　ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２．３　ｍｌ）溶液を０℃で加え、ついでピリジン（１９５　ｍｇ，　２．４６　ｍｍｏｌ）を滴下し、混合液を室温で１６時間撹拌した。氷片を加えて反応を停止したのち、ジクロロメタン抽出、有機層を減圧条件で留去したのち、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、（Ｒ，Ｒ）−１−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル−２，２−ジフルオロシクロプロパン（４５６　ｍｇ，　０．８６　ｍｍｏｌ）を収率７０％で得た。
【００４７】
Ｄ．アルゴン雰囲気下、（Ｒ，Ｒ）−１−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル−２，２−ジフルオロシクロプロパン（４５６　ｍｇ，　０．８６　ｍｍｏｌ）のＤＭＦ　（８．６　ｍｌ）アジ化ナトリウム（８９　ｍｇ，　１．２９ｍｍｏｌ）を加えて室温で２４時間撹拌した。氷片を加えて反応を停止したのち、エーテル抽出を行い、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥したのち、減圧濃縮、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、（Ｒ，Ｒ）−１−アジドメチル−３−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル−２，２−ジフルオロシクロプロパン（８）（３２８　ｍｇ，　０．８１７　ｍｍｏｌ）を収率　９５％で得た。
【００４８】
反応式５
2004097050.tif 000009
【００４９】
Ｅ．アルゴン雰囲気下、　１−アジドメチル−３−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル−２，２−ジフルオロシクロプロパン（８）（４９４　ｍｇ，　１．２３　ｍｍｏｌ）　の１．４％含水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１２　ｍｌ）にトリフェニルホスフィン（３５５　ｍｇ，　１．３５　ｍｍｏｌ）を加えて室温で２０時間撹拌した。そのまま減圧濃縮し溶媒を留去し、１−アミノメチル−３−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル−２，２−ジフルオロシクロプロパンを得た（粗収量８７０ｍｇ）。これを生成することなく次の反応に用いた。
【００５０】
Ｆ．１−アミノメチル−３−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル−２，２−ジフルオロシクロプロパン（未精製、８７０　ｍｇ）を減圧して乾燥したのち、１，４−ジオキサン（１０　ｍｌ）を加え、ベンジルオキシカルボニル　（Ｃｂｚ）　クロリド（４２０　ｍｇ，　２．４６　ｍｍｏｌ）、ピリジン（０．３０　ｍｌ）を加えて５５℃で１１時間撹拌した。放冷後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄したのち、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮後、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、（Ｒ，Ｒ）−１−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロ−３−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチルシクロプロパン（９）（５３３　ｍｇ，　１．０５　ｍｍｏｌ）を収率８５％で得た：［α］２６Ｄ−３．６°　（ｃ０．９０，　ＣＨＣｌ３）．
【００５１】
Ｇ．アルゴン雰囲気下、１−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロ−３−ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチルシクロプロパン（９）（５２０　ｍｇ，　１．０２　ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１０　ｍｌ）　溶液にテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）の１．０Ｍ　ＴＨＦ溶液１．５３ｍｌを室温で加えて１４時間撹拌した。氷片を加えて反応を停止したのち、酢酸エチル抽出を行い、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥したのち、減圧濃縮、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して（Ｒ，Ｒ）−１−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロ−３−ヒドロキシメチルシクロプロパン（（Ｒ，Ｒ）−４）（２４９　ｍｇ，　０．９１８　ｍｍｏｌ）を収率９０％で得た：［α］２７Ｄ−１２．６°　（ｃ１．４０，　ＣＨＣｌ３）．
【００５２】
反応式６
2004097050.tif 000010
【００５３】
Ｈ．アルゴン雰囲気下、（Ｒ，Ｒ）−１−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロ−３−ヒドロキシメチルシクロプロパン（（Ｒ，Ｒ）−４）（１１０　ｍｇ，　０．４０６　ｍｍｏｌ）と９−アントラセンカルボン酸（１３５　ｍｇ，　０．６０８　ｍｍｏｌ）のクロロホルム（ＣＨＣｌ３）（２．０　ｍｌ）溶液に１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）（２７３　ｍｇ，　１．４２　ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３　（２．０　ｍｌ）溶液を０℃で加え、暗所、室温にて２１時間撹拌した。酢酸エチル（２０　ｍｌ）で希釈し、有機層を純水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した後、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、（Ｒ，Ｒ）−９−アントラセンカルボン酸−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（（Ｒ，Ｒ）−５）（７７．２　ｍｇ，　０．１６　ｍｍｏｌ）を収率４０％で得た。
【００５４】
Ｉ．（Ｒ，Ｒ）−９−アントラセンカルボン酸−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（（Ｒ，Ｒ）−５）（１４．０　ｍｇ，　０．０３０　ｍｍｏｌ）のメタノ−ル（０．３　ｍｌ）溶液に水素雰囲気下１０％パラジウム・カーボン（４．２　ｍｇ）を加え、暗所、室温にて４８時間撹拌した。グラスフィルターを用いてセライト濾過し、濾液を減圧濃縮し、（Ｒ，Ｒ）−９−アントラセンカルボン酸−（３−アミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステル（（Ｒ，Ｒ）−ＮＨ２−ｍｏｎｏ）（１０．１　ｍｇ，　０．０３０　ｍｍｏｌ）を定量的に得た。
【００５５】
実施例５　ＤＮＡの光切断試験
実施例２に記載の方法と同様にして、（Ｒ，Ｒ）−９−アントラセンカルボン酸−（３−ベンジルオキシカルボニルアミノメチル−２，２−ジフルオロシクロプロピル）メチルエステルＤＮＡ切断活性を調べたところ、８５．５μＭでほぼ完全にニックドＤＮＡが生成し、ラセミ体にくらべてはるかに強力な切断活性が得られた。
【００５６】
結果
ジフルオロシクロプロパン環の立体配置は、ラセミ体であっても差し支えがないが、（Ｒ，Ｒ）−体が望ましい。また、シス体のジフルオロシクロプロパンも光照射で容易にシクロプロパン環が開裂して分解した。従って、ジフルオロシクロプロパン環はトランス体でもシス体でもＤＮＡを切断できる。
【００５７】
【発明の効果】
本発明のジフルオロシクロプロパン誘導体を用いて、ＤＮＡやＲＮＡを自在に切断できる人工制限酵素が創製でき、遺伝子工学への応用が期待できる。人工的な化合物であるために、塩基対認識部位を自在に設計可能であり、天然の酵素では不可能な箇所でポリヌクレオチドを切断できる人工制限酵素の設計が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかるポリヌクレオチドランダム切断用およびポリヌクレオチド選択的切断用モデル分子１および２の概念図である。
【図２】推定されるジフルオロシクロプロパン誘導体によるＤＮＡ切断機構を示す概念図である。
【図３】切断処理後の電気泳動図である。
【図４】図４は図３の結果を定量的に示す棒グラフである。
【図１】
2004097050.tif 000011
【図２】
2004097050.tif 000012
【図３】
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【図４】
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