(57)【要約】【課題】腫瘍組織内低酸素領域の酸素分圧を効率的に増大させるための安全性の高い酸素輸液製剤を提供する。【解決手段】ポルフィリン金属錯体を包接したアルブミン化合物を生理学的に許容され得る水系媒体に分散させた分散体を包含する酸素輸液製剤。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内の腫瘍組織の酸素濃度を上昇させるための酸素輸液製剤であって、該酸素輸液製剤は、ポルフィリン金属錯体を包接したアルブミン化合物を生理学的に許容され得る水系媒体に分散させた分散体を包含することを特徴とする酸素輸液製剤。
【請求項２】
前記ポルフィリン金属錯体が、一般式（Ｉ）：
一般式（Ｉ）：
【化１】
2004010495.tif 000009
［一般式（Ｉ）において、
Ｒ１　は、置換基を有していてもよい鎖式もしくは脂環式炭化水素基であり、
Ｒ２　は、式（Ａ）：
【化２】
2004010495.tif 000010
（ここで、Ｒ３　は、アルキレン基、Ｒ４　は、当該軸塩基配位子の中心遷移金属イオンＭへの配位を阻害しない基）で示される軸塩基配位子、または式（Ｂ）：
【化３】
2004010495.tif 000011
（ここで、Ｒ５　は、アルキレン基、Ｒ６　は、アルキル基）で示される軸塩基配位子であり、
Ｍは、周期律表第４〜第５周期の遷移金属イオンである］で示されるポルフィリン金属錯体、および／または一般式（ＩＩ）：
【化４】
2004010495.tif 000012
［一般式（ＩＩ）において、
Ｒ７　は、水素原子、または置換基を有していてもよい鎖式炭化水素基であり、
Ｒ８　は、アルキルオキシ基、アルキルアミノ基、またはアミノ酸基もしくはアミノ酸誘導体残基であり、
Ｒ９　は、式（Ｃ）：
【化５】
2004010495.tif 000013
（ここで、Ｒ１０は、アルキレン基、Ｒ１１は、当該軸塩基配位子の中心遷移金属イオンＭへの配位を阻害しない基）で示される軸塩基配位子、または式（Ｄ）：
【化６】
2004010495.tif 000014
（ここで、Ｒ１２は、アルキル基）で示される軸塩基配位子であり、
Ｍは、周期律表第４〜第５周期の遷移金属イオンである］で示されるポルフィリン金属錯体であることを特徴とする請求項１に記載の酸素輸液製剤。
【請求項３】
一般式（Ｉ）のポルフィリン金属錯体において、Ｒ１　が、１位にジメチル基を有するＣ１　〜Ｃ１９の鎖式炭化水素基または１位に置換基を有するＣ３　〜Ｃ１９の脂環式炭化水素基であり、Ｒ３　が、Ｃ１　〜Ｃ１０のアルキレン基であり、Ｒ４　が、水素原子、メチル基、エチル基またはプロピル基であり、Ｒ５　が、Ｃ１　〜Ｃ１０のアルキレン基であり、Ｒ６　が、Ｃ１　〜Ｃ１８のアルキル基であり、Ｍが、ＦｅまたはＣｏである請求項２に記載の酸素輸液製剤。
【請求項４】
一般式（ＩＩ）のポルフィリン金属錯体において、Ｒ７　が、水素原子、ビニル基、エチル基またはメトキシ基であり、Ｒ８　が、Ｃ１　〜Ｃ１８のアルキルオキシ基、Ｃ１　〜Ｃ１８のアルキルアミノ基またはアミノ酸もしくはその誘導体残基であり、Ｒ１０が、Ｃ１　〜Ｃ１０のアルキレン基であり、Ｒ１１が、水素原子、メチル基、エチル基またはプロピル基であり、Ｒ１２は、Ｃ１　〜Ｃ１８のアルキル基であり、Ｍが、ＦｅまたはＣｏである請求項２に記載の酸素輸液製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腫瘍組織を有する哺乳動物に投与し、その腫瘍組織内低酸素領域の酸素分圧を高めるために使用される、腫瘍組織の酸素濃度を上昇させるためのポルフィリン酸素輸液製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内では、赤血球中のヘモグロビンが酸素運送の役割を担っている。このヘモグロビンの酸素結合席であるプロトポルフィリン鉄（ＩＩ）錯体と類似の酸素輸送機能を合成の化合物で再現しようとする研究は、これまで数多く報告されており、例えばその先駆的な例としては、Ｊ．Ｐ．　Ｃｏｌｌｍａｎ，　Ａｃｃ．　Ｃｈｅｍ．　Ｒｅｓ．，　１０，　２６５　（１９７７）、Ｆ．　Ｂａｓｏｌｏ，　Ｂ．　Ｍ．　Ｈｏｆｆｍａｎ，　Ｊ．　Ａ．　ｉｂｅｒｓ，　ｉｂｉｄ，　８，　３８４　（１９７５）等がある。特に室温下で安定な酸素錯体を形成できるポルフィリン鉄（ＩＩ）錯体としては、５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィリン鉄（ＩＩ）（以下、ＦｅＴｐｉｖＰＰ錯体という）（Ｊ．　Ｐ．　Ｃｏｌｌｍａｎ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　９７，　１４２７　（１９７５）が知られている。ＦｅＴｐｉｖＰＰ錯体は、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン等の有機溶媒中、軸塩基、例えば、１−アルキルイミダゾール、１−アルキル−２−メチルイミダゾール、ピリジン誘導体等が共存すると、室温で、分子状酸素を可逆的に吸脱着することができる。しかし、実際にヘモグロビンの代替として酸素輸送能を発揮できる人工酸素運搬体（酸素輸液）として生体内での利用まで指向した場合には、生理条件下（つまり、生理塩水溶液中、ｐＨ７．４、温度≦４０℃）で、酸素を結合解離できる能力を備えていることが不可欠となる。そこで本発明者らは、このＦｅＴｐｉｖＰＰ錯体またはその類縁体をリン脂質からなる二分子膜小胞体に包埋させる方法（Ｄａｌｔｏｎ　Ｔｒａｎｓ．，　１９８４，　１１４７、特開昭５８−２１３７１）、油滴小球からなるマイクロスフェアーに内包または被覆させる方法（Ｅ．　Ｔｓｕｃｈｉｄａ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｓ，　Ａｃｔａ．，　１１０８，２５３−２５６　（１９９２）、特開平６−２６４６４１号公報）、両親媒性置換基を共有結合させて自己組織化させる方法（特開平６−９２９６６号公報）、または血清アルブミンの疎水ドメインへ包接させる法法（特開平８−３０１８７３号公報）などにより、水中に可溶化し、同時に酸素配位座近傍に構築される微小な疎水環境を活用して、生理条件下でも酸素を可逆的に吸脱着できる酸素輸液として実現することに成功している。また、これを生体内へ投与した場合でも、十分に酸素を輸送できる能力を備えていることを証明している（Ｅ．　Ｔｓｕｃｈｉｄａ，　ｅｔ．　ａｌ．，　Ａｒｔｉｆ．　Ｏｒｇａｎｓ　Ｔｏｄａｙ，　５，　２０７−２１５　（１９９６））。
【０００３】
上述したように、ＦｅＴｐｉｖＰＰ錯体が酸素を可逆的に結合解離するためには、過剰モル数の軸塩基配位子を外部から添加する必要があるが、本発明者らは、ポルフィリン鉄（ＩＩ）錯体の分子内へ、置換基として例えばアルキルイミダゾール誘導体、アルキルヒスチジン誘導体を供給結合させることにより、軸塩基を外部から添加しなくとも、安定な酸素錯体を生成できる系を具体化した（特開平５−８５１４１号公報）。軸塩基として広く用いられているイミダゾール誘導体には、薬理作用を持つものがあり、体内毒性の高い場合が多い。また、リン脂質小胞体、リピドマイクロスフェア、アルブミン等を担体とする場合、過剰に共存させたイミダゾール誘導体がその形態を不安定化させる要因ともなり得る。この軸塩基の添加量を極限的に少なくする方法は、分子内に共有結合でイミダゾール誘導体を導入することに他ならなかった。もちろん、これらが生体内に投与できる酸素輸液として機能することも継続して実験的に証明している（Ｅ．　Ｔｓｕｃｈｉｄａ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．，　１１，　４６−５０　（２０００））。
【０００４】
医療分野における酸素輸液の適応範囲は、実に広い。出血ショックの蘇生液（赤血球代替物）のみならず、心筋梗塞等における虚血部位への酸素供給液、移植臓器の灌流液や保存液、人工心肺等の体外循環回路の補填液、再生組織の培養細胞への酸素供給液などとしての利用にも期待が集まっている。また、近年、癌治療用増感剤としての応用、つまり腫瘍組織の低酸素領域改善効果への関心も高まってきている。
【０００５】
一般に、癌細胞は低酸素細胞であり、悪性腫瘍が放射線療法や化学療法に抵抗性を示す原因のひとつとして、低酸素細胞の存在がある。これには、（ｉ）腫瘍内の血流が一過性に変化し、ある血管の支配領域に血液が一時的に供給されなくなるために生じる急性低酸素細胞と、（ｉｉ）新生血管の生成が腫瘍の異常な増殖に追いつかず、血管から離れている細胞に十分な酸素が供給されなくなるために生じる慢性低酸素細胞とが存在する。実際に、酸素の存在下では、腫瘍細胞の放射線感受性が無酸素下よりも３倍高くなり、その生存率も低減する。放射線増感効果は、酸素濃度０Ｔｏｒｒから４０Ｔｏｒｒまでの間で顕著であり、それ以上はほとんど変わらない。
【０００６】
酸素効果の作用機序については未だ不明な点も多い。例えば、酸素分子は高い電子親和性を示す強力な酸化剤である。しかし、単純な水溶液中では酸素による放射線感受性は増加せず、標的物質として考えられているＤＮＡ分子に水溶液中で放射線を照射してもその酸素効果は現れない。現在のところ、細胞内の酸素効果は、酸素とグルタチオン（ＧＳＨ）の拮抗によって生じると考えられている。細胞内では、放射線の直接作用あるいは間接作用により細胞内標的分子（ＤＮＡ）がラジカルを生じ、これが原因で細胞が死滅するとされているが、ラジカルは細胞内に含まれるＧＳＨの還元反応によって減少し、細胞の放射線損傷を修復する。しかし、その際、酸素が多く存在すると、酸素はＧＳＨの作用を阻害し、酸素効果が現れる。
【０００７】
酸素輸液の投与により、低酸素状態にある腫瘍組織の酸素濃度を増大させ、抗癌剤や放射線感受性を高める試みが、これまで報告されている。酸素輸液としてのパーフルオロケミカル（ＰＨＣ）乳剤の有用性が注目されていた。１９８２年、穀内らは初めてＰＦＣ乳剤と化学療法の併用療法を提案した。脳腫瘍皮下移植モデルラットを用いてＰＦＣ乳剤投与による脳腫瘍組織内酸素濃度の変化を検討した（穀内ら、癌と化学療法、１１、２２０７−２２１１（１９８４）。ＰＦＣ乳剤投与に伴い、低酸素組織において、酸素分圧が上昇する。この結果から、末梢組織の酸素分圧を３００ｍｍＨｇ以上に保つという条件で、低酸素腫瘍組織に対するＰＦＣ乳剤と放射線療法の併用の有効性を示した。しかしながら、ＰＦＣ乳剤の酸素親和度は低いために、実際には、高圧テント等の高酸素雰囲気下で使用しなければならないという課題が残った。
【０００８】
他方、Ｓｈｏｒｒらは、修飾ヘモグロビン（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾した分子量１２８ｋＤａのヘモグロビン（ＰＥＧ−Ｈｂ）の投与による低酸素腫瘍組織の酸素化、および放射線治療における促進効果を検証した（Ｒ．　Ｌｉｎｂｅｒｇ，　Ｃ．　Ｄ．　Ｃｏｎｏｖｅｒ，　Ｋ．　Ｌ．　Ｓｈｕｍ，　Ｒ．　Ｇ．　Ｓ．　Ｓｈｏｒｒ，　ｉｎ　ｖｉｖｏ，　１２，　１６７−１７４　（１９９８））。腫瘍は、骨肉腫、前立腺癌、肺癌、神経膠腫の４種を対象とし、異なるヘモグロビン製剤の投与による腫瘍酸素濃度変化を測定した。投与２時間後のＰＥＧ−Ｈｂが最も低酸素腫瘍組織の酸素濃度を増大（４〜７Ｔｏｒｒ）させることが明らかとなった。そこで、これら放射線感受性の異なる癌を移植したラットにＰＥＧ−Ｈｂを投与し、γ線を照射し、腫瘍径を経時的に測定したところ、どの腫瘍においても腫瘍径の減少が観察された。これらの結果から、ＰＥＧ−Ｈｂが、低酸素腫瘍組織内の酸素化と、放射線療法に有効であることが明確となった。しかしながら、一般に、ヘモグロビン製剤は、血管内皮から漏出し易く、平滑筋近傍に存在する血管内皮弛緩因子（一酸化窒素）を捕捉するために、血管収縮を誘起し、急激な血圧亢進を惹起することが知られている。
【０００９】
血管径の細い腫瘍細胞へ到達させるためには、できるだけ小さな粒径の分子からなる酸素輸液が適していることはいうまでもない。つまり、小さな分子であるが、血管内皮や腎から漏れ出し難い分子サイズと物理化学的特徴を兼備した人工酸素運搬体があれば、より効率よく腫瘍組織の低酸素領域を改善できるものと考えられ、それらの条件を満足する酸素輸液の設計と合成、利用上の技術改良と使用法の出現が待たれていたのが現状である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、従来技術の問題点を解消し、腫瘍組織近傍に投与することによって腫瘍内低酸素領域の酸素分圧を効率的に増大させるための安全性の高い酸素輸液製剤を提供しようとすることを主要目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、より小径であり、しかも血管内皮や腎から漏れ難い特徴を備えた人工酸素運搬体化合物、およびそれを高濃度に分散させた酸素輸液製剤の検索、利用方法、投与方法について鋭意研究を重ねた結果、酸素配位活性中心であるポルフィリン金属錯体を血清アルブミンに包接させて得たポルフィリン金属錯体包接アルブミン化合物が、腫瘍組織内低酸素領域へ高効率で酸素を供給できる製剤となり得るとの知見を得、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明によれば、生体内の腫瘍組織の酸素濃度を上昇させるための酸素輸液製剤であって、該酸素輸液製剤は、ポルフィリン金属錯体を包接したアルブミン化合物を生理学的に許容され得る水系媒体に分散させた分散体を包含することを特徴とする酸素輸液製剤が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００１４】
本発明は、ポルフィリン金属錯体を包接するアルブミン化合物を含む酸素輸液製剤を提供する。この酸素輸液製剤は、ポルフィリン金属錯体を包接するアルブミン化合物を生理学的に許容され得る水系媒体、好ましくはリン酸緩衝生理食塩のような生理食塩水中に分散させた分散体から構成され得る。
【００１５】
本発明において使用されるポルフィリン金属錯体は、好ましくは、一般式（Ｉ）：
【化７】
2004010495.tif 000002
［一般式（Ｉ）において、
Ｒ１　は、置換基を有していてもよい鎖式もしくは脂環式炭化水素基であり、
Ｒ２　は、式（Ａ）：
【化８】
2004010495.tif 000003
（ここで、Ｒ３　は、アルキレン基、Ｒ４　は、当該軸塩基配位子の中心遷移金属イオンＭへの配位を阻害しない基）で示される軸塩基配位子、または式（Ｂ）：
【化９】
2004010495.tif 000004
（ここで、Ｒ５　は、アルキレン基、Ｒ６　は、アルキル基）で示される軸塩基配位子であり、
Ｍは、周期律表第４〜第５周期の遷移金属イオンである］で示されるポルフィリン金属錯体、および／または一般式（ＩＩ）：
【化１０】
2004010495.tif 000005
［一般式（ＩＩ）において、
Ｒ７　は、水素原子、または置換基を有していてもよい鎖式炭化水素基であり、
Ｒ８　は、アルキルオキシ基、アルキルアミノ基、またはアミノ酸基もしくはアミノ酸誘導体残基であり、
Ｒ９　は、式（Ｃ）：
【化１１】
2004010495.tif 000006
（ここで、Ｒ１０は、アルキレン基、Ｒ１１は、当該軸塩基配位子の中心遷移金属イオンＭへの配位を阻害しない基）で示される軸塩基配位子、または式（Ｄ）：
【化１２】
2004010495.tif 000007
（ここで、Ｒ１２は、アルキル基）で示される軸塩基配位子であり、
Ｍは、周期律表第４〜第５周期の遷移金属イオンである］で示されるポルフィリン金属錯体である。
【００１６】
これらポルフィリン金属錯体は、酸素配位活性中心を構成する。
【００１７】
一般式（Ｉ）のポルフィリン金属錯体において、Ｒ１　は、１位にジメチル基を有するＣ１　〜Ｃ１９の鎖式炭化水素基または１位に置換基を有するＣ３　〜Ｃ１９の脂環式炭化水素基であることが好ましい。後者の脂環式炭化水素の具体例を挙げると、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、２−置換ノルボルニル基、１−アダマンチル基であり、ここで、各置換基は、メチル基、Ｃ１　〜Ｃ１８のアルキルアミド基、Ｃ１　〜Ｃ１８アルカノイルオキシ基、Ｃ１〜Ｃ１８のアルコキシ基であり得る。
【００１８】
Ｒ３　は、Ｃ１　〜Ｃ１０のアルキレン基であることが好ましい。
Ｒ４　は、水素原子、メチル基、エチル基またはプロピル基であることが好ましい。
Ｒ５　は、Ｃ１　〜Ｃ１０のアルキレン基であることが好ましい。
Ｒ６　は、Ｃ１　〜Ｃ１８のアルキル基であることが好ましい。
【００１９】
また、一般式（ＩＩ）のポルフィリン金属錯体において、Ｒ７　は、水素原子、ビニル基、エチル基またはメトキシ基であることが好ましい。
Ｒ８　は、Ｃ１　〜Ｃ１８のアルキルオキシ基、Ｃ１　〜Ｃ１８のアルキルアミノ基またはアミノ酸もしくはその誘導体残基であることが好ましい。アミノ酸誘導体としては、アミノ酸−Ｏ−Ｃ１　〜Ｃ１８アルキルエステルが好ましい。
Ｒ１０は、Ｃ１　〜Ｃ１０のアルキレン基であることが好ましい。
Ｒ１１は、水素原子、メチル基、エチル基またはプロピル基であることが好ましい。
Ｒ１２は、Ｃ１　〜Ｃ１８のアルキル基であることが好ましい。
【００２０】
一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｍは、いずれも、ＦｅまたはＣｏであることが好ましい。
【００２１】
一般式（Ｉ）で示されるポルフィリン金属錯体は、特開平６−２７１５７７号公報、Ｔ．　Ｋｏｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍ．　Ｌｅｔｔ．，　２００１，　６６８−６６９　（２００１）等に記載されている。
【００２２】
一般式（ＩＩ）で示されるポルフィリン金属錯体は、Ｒ８　がアルキルアミノ基であるものを除いて、Ｔ．　Ｇ．　Ｔｒａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１０１，　６７１６−６７３１　（１９７９）、特開昭５８−１０３８８号公報、特開昭６０−１７３２６号公報等に開示されている。Ｒ８　がアルキルアミノ基であるポルフィリン金属錯体の合成例は、後の実施例の項に示されている。
【００２３】
ポルフィリン金属錯体を包接するアルブミン化合物としては、ヒト血清アルブミン、遺伝子組み換えヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン等の血清アルブミンを使用することができ、さらに、アルブミン化合物としては、は多量体の形態にあるアルブミンを使用することもでき、特に二量体の形態にあるアルブミンを使用することが好ましい。アルブミン二量体を使用することにより、包接化合物の循環系からの漏出がより一層抑止される。
【００２４】
ポルフィリン金属錯体をアルブミン化合物に包接させ、酸素輸液製剤を得るためには、特開平８−３０１８７３号公報やＥ．　Ｔｓｕｃｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．，　１０，　７９７−８０２　（１９９９）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．，　１１，　４６−５０　（２０００）に開示されている方法を採用することができる。本発明の酸素輸液製剤は、アルブミン化合物を通常１〜３０重量％、好ましくは５〜２５重量％の濃度で含有することが望ましい。アルブミン化合物１分子に対するポルフィリン金属錯体の結合数は、１〜８（モル／モル）であるから、ポルフィリン金属錯体の濃度は、０．１５〜３６ｍＭとなる。本発明の酸素輸液製剤の投与量は、４０ｍＬ／ｋｇ体重以下とすることが適切である。
【００２５】
本発明の酸素輸液製剤は、（ｉ）血漿タンパク質の約６０％を占める血清アルブミンを酸素配位活性中心であるポルフィリン金属錯体のキャリヤーとして用いているため、血管内の投与に際し、きわめて高い安全性と生体適合性を有するのみならず、（ｉｉ）分子径が８×３ｎｍと小さいため、赤血球（８μｍ）の到達し得ない腫瘍細胞の微小毛細血管内でも流動することができ、（ｉｉｉ）しかも、低い等電点（ｐＩ）を持つので、腎や血管内皮からは漏出し難いという腫瘍組織の酸素化に必要な好条件を兼ね備えている。
【００２６】
また、ポルフィリン金属錯体立体構造を制御することにより、酸素親和度が制御できるので、患部の酸素分圧に応じて、より高い効率で酸素を輸送できる。
【００２７】
本発明の酸素輸液製剤は、腫瘍組織を有する哺乳動物生体内に投与することにより、その腫瘍組織における低酸素領域の酸素分圧を高めることがでる。
【００２８】
本発明の酸素輸液製剤は、動注、静注、局所投与、全身投与その他の投与方法で生体内に投与することができる。いうまでもなく、投与に際しては、ポルフィリン金属錯体の中心金属を酸素化しておく。
【００２９】
腫瘍組織を有する哺乳動物に本発明の酸素輸液製剤を投与し、その腫瘍組織における低酸素領域の酸素分圧を向上させる方法の一実験例をより詳しく説明すると次の通りである。
【００３０】
実験動物、例えば、ラット、ハムスター、家兎、ビーグル犬等の部位へ腫瘍細胞を移植し、担癌動物を作製する。以下、ラットの右大腿に移植する場合について記述する。
【００３１】
腫瘍が成長するまでラットを数日間飼育し、麻酔（例えば、ネンブタール、ジエチルエーテル、ハロセン麻酔ガス等を使用）下に実験を行う。頚部気管から挿管し、人工呼吸器で陽圧換気し、左頚動脈にポリエチレンカテーテルを総腸骨動脈分岐部手前まで挿入し、逆行カニュレーションを施して、下行大動脈に試料投与ラインを確保する。
【００３２】
腫瘍組織内酸素分圧は、例えば燐光プローブ（パラジウムコプロポルフィリン（ＰｄＰｏｒ）等を静注した後、光照射し、燐光の減衰消滅時間から、酸素分圧測定装置を用いて測定することができる。ＰｄＰｏｒは、試料投与の５〜２０分前に尾静脈より静注する。正常筋肉と腫瘍の両方が露出する２０ｍｍの小切開を大腿におき、測定用プローブを腫瘍直上に設置し、３７℃の温生理食塩水で腫瘍表面を濡らすことにより乾燥を防ぎながら測定を継続する。空気下、および酸素濃度９９％の雰囲気下の右脚腫瘍部の酸素分圧を酸素分圧測定装置（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｃｏｒｐ．製のＯｘｙＳｐｏｔ）を用いて５〜３０箇所測定し、コントロールとする。その後、酸素飽和させた試料（１〜２０ｍＬ／ｋｇ）をシリンジポンプを用いて定圧下、１〜２０分間で動注する。動注開始と同時に腫瘍部および正常部の酸素分圧の経時変化を測定する。測定終了後、腹部を切開し、試料動注カテーテルが総腸骨動脈分岐部手前付近にあることを確認し、腫瘍の大きさも測定する。
【００３３】
この場合、酸素飽和させた生理食塩水、ヒト血清アルブミン、遺伝子組み換えヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、アルブミン二量体等を動注しても腫瘍組織の酸素分圧（ＰＯ２　）には変化が見られない。これに対して、本発明のポルフィリン金属錯体包接アルブミン化合物を含む酸素輸液製剤を投与すると、腫瘍組織の酸素分圧は、有意に上昇する。本発明のポルフィリン金属錯体包接アルブミン化合物は、上に述べたように、粒子径が小さいため、変則的な腫瘍組織内血管を、赤血球よりも容易に通過できるので、腫瘍組織内の酸素分圧を効率的に上昇させることができると考えられる。
【００３４】
【実施例】
以下本発明を実施例により説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００３５】
合成例Ａ：８，１３−ビスビニル−２−メチルアミノカルボニルエチル−１８−（３−（１−イミダゾリル）プロピルアミノ）カルボニルエチル−３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン鉄錯体の合成
（Ｉ）８，１３−ビスビニル−２−メチルアミノカルボニルエチル−１８−（３−（１−イミダゾリル）プロピルアミノ）カルボニルエチル−３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリンの合成
１００ｍＬの三口ナスフラスコに，プロトポルフィリンＩＸ（０．１ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、蒸留ピリジン（１０ｍＬ）、トリエチルアミン（５１μＬ、０．４５ｍｍｏｌ）を加え、１０分間攪拌した。これに、（ベンゾトリアゾリルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（１２４ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を加え、１０分間攪拌し、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール（１５μＬ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加し、遮光下で４時間攪拌した。これに、さらにメチルアミンのテトラヒドロフラン溶液５ｍＬを添加して、さらに４時間攪拌した。真空ポンプでピリジンを減圧除去し、シリカゲルカラム（クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝８／１／１）で分画精製した。得られた画分を真空乾燥し、赤色固体である８，１３−ビスビニル−２−メチルアミノカルボニルエチル−１８−（３−（１−イミダゾリル）プロピルアミノ）カルボニルエチル−３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリンを２４ｍｇ（収率１９％）を得た。
【００３６】
Ｒｆ：０．６（クロロホルム／メタノール＝３／１）
ＩＲ（ｃｍ−１）：νｃ＝Ｏ（アミド）：１６３１
ＵＶ−ｖｉｓ／λｍａｘ（ｎｍ）（ＣＨＣｌ３）：６３１；　５７９；　５４２；　５０８；　４０９
１Ｈ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ））（ＣＤＣｌ３）：−４．０　（ｓ，　２Ｈ，　ｉｎｎｅｒ）；　１．８−２．４　（ｍ，　４Ｈ，　−Ｃ２Ｈ４−Ｉｍ）；　２．７　（ｍ，　４Ｈ，　−ＣＨ２−ＣＯＯ−，　−ＣＨ２−ＮＨ−）；　３．５−３．７　（ｍ，　１５Ｈ，　Ｐｏｒ−ＣＨ３，　ＣＯＮＨＣＨ３）；　４．２　（ｓ，　４Ｈ，　Ｐｏｒ−ＣＨ２−）；　５．８　（ｓ，　１Ｈ，　Ｉｍ）；　６．１−６．４　（ｑ，　４Ｈ，　ＣＨ２＝ＣＨ−）；　６．６　（ｄ，　１Ｈ，　Ｉｍ）；　８．２　（ｍ，　２Ｈ，　ＣＨ２＝ＣＨ−）；　９．５−１０．０　（ｑ，　４Ｈ，　ｍｅｓｏ）　ＦＡＢ−ＭＡＳ［ｍ／Ｚ］：６８３。
【００３７】
（ＩＩ）鉄錯体の合成
５０ｍＬの三口ナスフラスコに上記（Ｉ）で得たポルフィリン化合物（２３．９ｍｇ、３４．６μｍｏｌ）のジメチルホルミアミド溶液５ｍＬを入れ、２０分間窒素で脱気した。これに、塩化鉄四水和物（６８．８ｍｇ、３４６μｍｏｌ）をすばやく添加し、窒素雰囲気下で、７０℃で３時間攪拌した。反応の完了は、反応溶液のクロロホルム希釈溶液に塩酸を一滴加え、その紫外−可視スペクトルにジカチオン由来のピーク（４５０ｎｍ付近）が出現しないことにより確認した。真空ポンプで溶媒を減圧除去し、シリカゲルカラム（クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝８／１／１）で分画精製し、真空乾燥後、褐色固体を７．６ｍｇ（収率２９％）得た。
【００３８】
Ｒｆ：０．１（クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝８／１／１）
ＩＲ（ｃｍ−１）：νｃ＝Ｏ（アミド）：１６４９
ＵＶ−ｖｉｓ／λｍａｘ（ｎｍ）（ＣＨＣｌ３）：５８３；　５３１；　４０６
ＦＡＢ−ＭＡＳ［ｍ／Ｚ］：７３６。
【００３９】
合成例Ｂ：８，１３−ビスビニル−２−ドデシルアミノカルボニルエチル−１８−（メチル−Ｏ−ヒスチジン）カルボニルエチル−３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン鉄錯体の合成
合成例Ａの（Ｉ）において、１−（３−アミノプロピル）イミダゾールの代わりに、ヒスチジン−Ｏ−メチルエステルを用い、メチルアミンの代わりにドデシルアミンを用いた以外は、同様にして、８，１３−ビスビニル−２−ドデシルアミノカルボニルエチル−１８−（メチル−Ｏ−ヒスチジン）カルボニルエチル−３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリンを収率２５％で得た。
【００４０】
Ｒｆ：０．４（クロロホルム／メタノール＝１５／１）
ＩＲ（ｃｍ−１）：νｃ＝Ｏ（アミド）：１６４０
ＵＶ−ｖｉｓ／λｍａｘ（ｎｍ）（ＣＨＣｌ３）：６３１；　５７５；　５４０；　４０９
１Ｈ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ））（ＣＤＣｌ３）：−４．０　（ｓ，　２Ｈ，　ｉｎｎｅｒ）；　０．８　（ｓ，　３Ｈ，　−（ＣＨ２）１０ＣＨ３）；　１．２−１．８　（ｍ，　２０Ｈ，　−ＣＨ２−）；　１．９　（ｔ，　４Ｈ，　−ＣＨ２（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−）；　３．２　（ｓ，　２Ｈ，　−Ｉｍ−ＣＨ２−）；　３．３　（ｔ，　２Ｈ，　−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨＣＨ２−）；　３．５−３．７　（ｍ，　１２Ｈ，　Ｐｏｒ−ＣＨ３）；３．７　（ｍ，　３Ｈ，　Ｈｉｓ−ＯＭｅ）；　４．２　（ｓ，　４Ｈ，　Ｐｏｒ−ＣＨ２−）；　４．８　（ｓ，　１Ｈ，　Ｈｉｓ−ＣＨ２ＣＨ−）；　６．１−６．４　（ｑ，　４Ｈ，　ＣＨ２＝ＣＨ−）；　６．８　（ｓ，　１Ｈ，　Ｉｍ）；　７．６　（ｓ，　１Ｈ，　Ｉｍ）；　８．２　（ｍ，　２Ｈ，　ＣＨ２＝ＣＨ−）；　９．５−１０．０　（ｑ，　４Ｈ，　ｍｅｓｏ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ［ｍ／Ｚ］：８８１。
【００４１】
得られたポルフィリンを用いて、合成例Ａの（ＩＩ）と同様にして、その鉄錯体を合成した。
【００４２】
実施例１
＜本発明の酸素輸液製剤の調製＞
ヒト血清アルブミン（２５重量％）１０ｍＬ（２．５ｍｇ、３７．５μｍｏｌ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ８．１）１Ｌをセパラブルフラスコ（２Ｌ）に入れ、５００ｍＬの滴下漏斗を装着した。別のナス型フラスコ（３００ｍＬ）に２−８−（２−メチル−１−イミダゾリル）オクタノイルオキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバロイルアミドフェニル）ポルフィリン鉄（ＩＩ）錯体（以下、ＦｅｐｉｖＰ（Ｉｍ））３９０ｍｇ、３００μｍｏｌ）のエタノール溶液２５０ｍＬを入れ、先のセパラブルフラスコとテフロンチューブで連結し、そのチューブを液面に接触しないようにした。ＦｅｐｉｖＰ（Ｉｍ）のエタノール溶液の入ったナス型フラスコ側に一酸化炭素をバブルし、排気をアルブミン水溶液側に流した。同時に、アルブミンの溶液が泡立たない程度に行った。このバブリングと排気のフローは、約６０分間行った。一酸化炭素雰囲気下で、ＦｅｐｉｖＰ（Ｉｍ）のエタノール溶液にアスコルビン酸水溶液（０．６Ｍ）を２５０μＬ加え、５分間攪拌した。こうしてヘムが還元されて一酸化炭素錯体を形成するので、溶液の色は鮮紅色に変化した。
【００４３】
この一酸化炭素化したＦｅｐｉｖＰ（Ｉｍ）のエタノール溶液をセパラブルフラスコに装着した滴下漏斗に移し、ゆっくりとアルブミン水溶液中に滴下した。滴下終了後、さらに３０分間攪拌した。
【００４４】
以後の操作はアルミホイル等を使って遮光下で行った。循環式限外ろ過装置（ＰＥＬＬＩＣＯＮ−２　ＭＩＮＩ　ＨＯＬＤＥＲ，　Ｃａｔ．　ＮＯ．　ＸＸ４２ＰＭＩＮＩ）に膜面積０．１ｍ２　、分画分子量１０ｋＤａの限外ろ過膜Ｐ２Ｂ０１０Ａ０１（ＭＩＬＩＰＯＲＥ）を装着し、得られたアルブミン−ヘムの２０％エタノール溶液１．２５Ｌをろ過した。ろ過液が５０ｍＬ出た時点でリン酸緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ７．３）を５０ｍＬ加えた。この操作を１０Ｌ（１．２５×８Ｌ）のリン酸緩衝液が透過するまで繰り返した。その後、アルブミン−ヘム溶液を約１００ｍＬまで濃縮し、溶液を容器に回収した。
【００４５】
このようにして得た濃縮液（約２００ｍＬ）をフィルター（ＤＩＳＭＩＣ０．４５μｍ）でろ過し、ろ液を限外ろ過器（ＵＨＰ−７６Ｋ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ）で、溶液量が約５０ｍＬになるまで濃縮した。
【００４６】
得られた濃縮溶液に、塩化ナトリウム濃度が１４０ｍＭとなるように、２０重量％濃度の塩化ナトリウム水溶液を加えた。
【００４７】
このアルブミン−ヘム溶液のｐＨ、Ｎａ＋　濃度をｐＨメーター、塩メーターにより測定した。アルブミン濃度は、ブロモクレゾールグリーン（ＢＣＧ）法により、ＦｅｐｉｖＰ（Ｉｍ）濃度は、ＩＣＰ（誘導結合プラズマ）発光分析による定量から測定した。
【００４８】
アルブミン−ヘム（一酸化炭素錯体）溶液（２０ｍＬ）を１００ｍＬナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターに取り付けた。ナス型フラスコを氷水浴で冷やしながら、回転させ、冷却管の上部コックから酸素を２０分間通気（フロー）した。その後、ハロゲンランプ（５００Ｗ）を、回転しているナス型フラスコの１５〜２０ｃｍ上に固定し、アルブミン−ヘム溶液に１０分間光照射した。アルブミン−ヘム溶液の紫外可視スペクトルのλｍａｘと吸光度から酸素錯体の生成を確認した。得られた酸素錯体のモル吸光係数（ε４２６）は、およそ１．１６×１０５　Ｍ−１ｃｍ−１であった。
【００４９】
＜正常細胞および腫瘍細胞における酸素分圧の測定＞
ドンリュウラット（Ｃｒｊ−Ｄｏｎｒｙｕ；　Ｎｉｐｐｏｎ　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）（雄、体重約２００ｇ、６週齢）をバイオクリーンシステムにより固形飼料および水分の自由摂取下で飼育し、これを用いた。移植腫瘍細胞は、Ａｓｃｉｔｅｓ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ＬＹ８０を腹腔内継代移植し、担癌ラット作製には、移植後７日目の細胞を採取し、これを用いた。移植８日前に、ラット右大腿に小切開をおき、２７Ｇと１ｍＬシリンジを用いて大腿筋直下に５×１０６細胞（０．０５ｍＬ）を移植した。腫瘍組織内酸素分圧は、パラジウムコプロポルフィリン（ＰｄＰｏｒ）を静注した後、光照射し、燐光の減衰消滅時間から酸素分圧測定装置（Ｏｘｙｓｐｏｔ　Ｐｈｏｔｏｍｅｒｉｃ　Ｏｘｙｇｅｎ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍ　（ＯｘｙＳｐｏｔ，　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｃｏｒｐ．）を用いて測定した。ＰｄＰｏｒは、試料投与の１５分前に尾静脈より２４Ｇサーフロー針を用いて静注した。正常筋肉と腫瘍の両方が露出する２０ｍｍの小切開を大腿におき、測定用プローブは腫瘍直上から５ｍｍの位置に設置し、３７℃の温生理食塩水で腫瘍表面を洗浄することにより、乾燥を防ぎながら測定を行った。
【００５０】
エーテル吸入麻酔後、頚部気管から１４Ｇ−Ａｎｇｉｏｃａｔｈを挿管し、ハロセン麻酔ガス（ＦｉＯ２　、１％ハロタンフローセン）を空気または酸素に１％混合したガスを、Ｓｍａｌｌ　Ａｎｉｍａｌ　Ａｎｅｓｔｈｅｔｉｚｅｒで送入し、人工呼吸器（シナノ製作所製Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒ　Ｍｏｄｅｌ　ＳＮ　４８０−７）で陽圧換気を行った（８０回／分）。左頚動脈にポリエチレンカテーテル（ＳＰ１０、シングルルーメン、内径０．２８ｍｍ、外径０．６１ｍｍ）を総腸骨動脈分岐部の１ｃｍ手前まで挿入し（約９．５ｃｍ）、逆行カニュレーションを施して、下行大動脈に試料投与ラインを確保した。
【００５１】
右脚腫瘍細胞の皮膚を剥離し、ＰｄＰｏｒ（０．２４ｃｃ（１０ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍＬ／ｋｇ））をラットの尾静脈から注入し、空気下および酸素濃度９９％の雰囲気下の右脚腫瘍部の酸素分圧をＯｘｙＳｐｏｔを用いて２０箇所測定し、コントロールとした。その後、酸素飽和させた試料（１０ｍＬ／ｋｇ）シリンジポンプ（ＦＰ−Ｗ−１００、Ｍａｔｙｓ、東洋産業（株））を用いて定圧下、４分間で動注した（２．５ｍＬ／ｋｇ／分）。動注開始と同時に腫瘍部および正常部の酸素分圧の経時変化を測定した（それぞれ５点ずつ、１５分間）。測定終了後、腹部を切開し、試料動注カテーテルが総腸骨動脈分岐部手前付近にあることを確認し、腫瘍の大きさも測定した。
【００５２】
９９％酸素雰囲気下での右脚正常部および右脚腫瘍部の酸素分圧（ＰＯ２　）は、表１に示すように、それぞれ、１４〜１６Ｔｏｒｒおよび１．４〜１．７Ｔｏｒｒであり、腫瘍部の酸素分圧は、正常組織に比較して著しく低く、単にラットの呼吸中酸素濃度を高めただけでは、酸素分圧は上昇しないことを確認した。
【００５３】
ｒＨＳＡ−ヘム投与群（４匹）およびｒＨＳＡ投与群（４匹）についての種々のパラメータの基礎値を下記表１に示す。
【００５４】
【表１】
2004010495.tif 000008
【００５５】
次に、まず、酸素飽和させた遺伝子組み換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を動注したところ、腫瘍組織の酸素分圧（ＰＯ２　）に変化はなかった。これに対して、上で調製した本発明の酸素輸液製剤を投与すると、腫瘍組織の酸素分圧は、３．５Ｔｏｒｒまで上昇した。これらの結果を図１に示す。本発明の酸素輸液製剤を投与した後の値は、投与前の値の２．５倍に相当する。本発明のポルフィリン金属錯体包接アルブミン化合物は、上に述べたように、粒子径が小さいため、変則的な腫瘍組織内血管を、赤血球よりも容易に通過できるので、腫瘍組織内の酸素分圧を効率的に上昇させることができると考えられる。
【００５６】
実施例２
実施例１で用いたＦｅｐｉｖＰ（Ｉｍ）の代わりに、２−８−（１−イミダゾリル）オクタノイルオキシメチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサノイル）アミノフェニル）ポルフィリン鉄（ＩＩ）錯体を用いた以外は同様の手法により、腫瘍組織の低酸素領域の酸素供給効果を観測した。腫瘍組織の酸素分圧は、約７．０Ｔｏｒｒまで上昇した。かくして、人工酸素運搬体であるアルブミン−ヘム投与による低酸素腫瘍組織への酸素供給効果が実証された。
【００５７】
実施例３
実施例１で用いたＦｅｐｉｖＰ（Ｉｍ）の代わりに、８，１３−ビスビニル−２−メトキシカルボニルエチル−１８−（３−（１−イミダゾリル）プロピルアミノ）カルボニルエチル−３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン鉄（ＩＩ）錯体を用いた以外は同様の手法により、腫瘍組織の低酸素領域の酸素供給効果を観測した。腫瘍組織の酸素分圧は、約１．６Ｔｏｒｒまで上昇した。かくして、人工酸素運搬体であるアルブミン−ヘム投与による低酸素腫瘍組織への酸素供給効果が実証された。
【００５８】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、腫瘍組織近傍に投与することによって腫瘍内低酸素領域の酸素分圧を効率的に増大させるための安全性の高い酸素輸液製剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酸素輸液製剤の投与による腫瘍組織における酸素分圧の変化を示すグラフ。
【図１】
2004010495.tif 000015