(57)【要約】【課題】ＤＮＡマイクロアレイを利用する定量分析に付随する、検定作業を著しく簡便化し、検体中に含まれる目的の塩基配列を有する核酸の定量、測定時に、その補正データを取得することが可能なＤＮＡマイクロアレイと、その際に利用さる検定用キットの提供。【解決手段】目的の塩基配列を有する核酸を検出する核酸プローブに加えて、検体に施される核酸増幅反応における増幅倍率の検定に利用される内部標準核酸の検出用の内部標準用プローブ一種以上、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定されるプローブの固定化効率の検定に利用される外部標準核酸の検出用の外部標準用プローブ一種以上、これらの一種以上の検定用プローブを具えるＤＮＡマイクロアレイとする。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に含まれる目的の塩基配列を有する核酸分子を検出するため使用される、該目的核酸分子の塩基配列に対して、相補的な塩基配列を持つ核酸プローブを基板上に固定化したＤＮＡマイクロアレイにおいて、
前記検体中に含まれる前記目的の塩基配列を有する核酸分子の含有濃度を定量するため、
一種以上の該目的塩基配列を有する核酸の増幅反応検定用に添加される内部標準用プローブ、一種以上の検出操作及びプローブ量検定用に添加される外部標準用プローブからなる群から選ばれる一種以上のプローブを有することを特徴とするＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２】
基板上に固定化される該内部標準用プローブ及び／もしくは該外部標準用プローブは、
４点以上の量もしくは密度で一連の群として基板上に固定化されていることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３】
該内部標準用プローブは、内部標準核酸に由来する増幅反応産物の異なる鎖長に対応する、二種以上のプローブで構成されることを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４】
該外部標準用プローブは、添加される外部標準核酸に対して、任意の核酸塩基数の非相補的な塩基配列を含む二種以上のプローブで構成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項５】
該内部標準用プローブおよび外部標準用プローブは、
合成核酸を基板上に固定化したものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項６】
該合成核酸の鎖長は、
１５塩基〜７５塩基の長さであることを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項７】
ＤＮＡマイクロアレイを利用して、目的の塩基配列を有する核酸を定量的に検出する際、該目的の塩基配列を有する核酸の増幅反応時に、該目的の塩基配列を有する核酸と同時に増幅に供される内部標準核酸の増幅反応用プライマーセットであって、
目的の塩基配列を有する核酸に由来する増幅産物の鎖長と、該プライマーセットが与える内部標準核酸に由来する増幅産物の鎖長とが同等になるように設計されていることを特徴とするプライマーセット。
【請求項８】
ＤＮＡマイクロアレイを利用して、目的の塩基配列を有する核酸を定量的に検出する際、該目的の塩基配列を有する核酸の増幅反応時に、該目的の塩基配列を有する核酸と同時に増幅に供される内部標準核酸の増幅反応用プライマーセットを含む検出用キットであって、
前記目的の塩基配列を有する核酸に由来する増幅産物の鎖長が二種以上ある際、該異なる鎖長に対応する請求項７に記載のプライマーセットを二種以上包含することを特徴とする目的塩基配列検出用キット。
【請求項９】
該プライマーセット複数が、増幅産物鎖長２００ｂｐ以下用、２００〜５００ｂｐ用、５００〜２０００ｂｐ用、２０００ｂｐ以上用として、各１種以上包含されていることを特徴とする請求項８に記載の目的塩基配列検出用キット。
【請求項１０】
ＤＮＡマイクロアレイを利用して、目的の塩基配列を有する核酸を定量的に検出する際、検体に添加される外部標準核酸を含む検出用キットであって、
検出可能な標識物で標識された合成核酸である外部標準核酸を二種以上包含することを特徴とする目的塩基配列検出用キット。
【請求項１１】
該標識物が、蛍光物質、放射性物質、発光物質のいずれかであることを特徴とする請求項９に記載の目的塩基配列検出用キット。
【請求項１２】
ＤＮＡマイクロアレイを利用して、目的の塩基配列を有する核酸を定量的に検出する際、該目的の塩基配列を有する核酸の増幅反応時に、該目的の塩基配列を有する核酸と同時に増幅に供される内部標準核酸を含む検出用キットであって、
検出目的の塩基配列と相同性を持たない、微生物由来核酸もしくは、ウイルス由来核酸を内部標準核酸として二種以上包含することを特徴とする目的塩基配列検出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体中に含まれる目的の塩基配列を有する核酸量の定量分析に有用なＤＮＡマイクロアレイに関する。より具体的には、検体中に含まれる目的の塩基配列を有する核酸に対して、相補的な塩基配列を持つ核酸プローブを固相上に固定化してなるＤＮＡマイクロアレイを用いて、定量的分析を行う際、定量精度向上を可能とするＤＮＡマイクロアレイ、ならびに、該ＤＮＡマイクロアレイによる検出操作に利用する検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハイブリダイゼーション法に基づく、遺伝子ＤＮＡの検出、測定法の発展として、基板上に複数種の核酸プローブを固定し、検体試料中に含有される遺伝子ＤＮＡに対して、同時に複数の検出試験を行う用途を有する、遺伝子チップ（ＤＮＡチップ、マイクロアレイ）に関する研究が近年急速に進んでいる。かかる遺伝子チップ（ＤＮＡチップ、マイクロアレイ）を利用する検体試料中に含有される遺伝子ＤＮＡの検出、測定法は、分子生物学研究、遺伝子疾患、感染症診断など様々な分野での応用が期待されている。
【０００３】
遺伝子チップの基本形態は、ハイブリダイゼーション法に基づき、目的とする遺伝子ＤＮＡを検出するため、目的遺伝子の塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片複数種を、ガラスなどの基板表面にアレイ状に固定化したものである。目的遺伝子に対して、ハイブリダイゼーション・プローブとして利用される、相補的な塩基配列を持つ一本鎖核酸断片は、オリゴＤＮＡと呼ばれる、化学合成されたＤＮＡオリゴマーや、ｃＤＮＡと呼ばれる、生物組織由来の遺伝子を鋳型として、酵素的に生合成された相補鎖ＤＮＡ断片などが、一般的に利用される。一本鎖核酸断片の基板表面への固定化に関しては、オリゴＤＮＡでは、例えば、ＵＳ　５，４７４，７９６（または、特表平９−５００５６８号公報、出願人：ＰｒｏｔｏＧｅｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に記載される方法のように、予め末端を固定した上で、ＤＮＡ分子自体を基板上で逐次合成し、固定化された核酸断片とする方法と、例えば、特開平１１−１８７９００号公報（出願人：キヤノン株式会社）に記載される方法のように、オリゴＤＮＡを別途合成した後、種々の結合手段を利用して、核酸断片を基板上に固定化する方法とに大別される。
【０００４】
別途調製した核酸断片を、基板上へ固定化する手段として、様々な方式、例えば、基板の持つ電荷と核酸断片の電荷を利用した吸着固定法、また、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシランカップリング剤などを基板表面にコートし、このコート被膜を利用して固定効率の向上を図った固定法などが提案されている。
【０００５】
現在、一般に使用されているＤＮＡマイクロアレイは、目的の塩基配列を有する核酸の定量分析のための特別なプローブ等は搭載されていない。従来、固相表面での逐次合成法で作製されたＤＮＡマイクロアレイであっても、ピン法で作製されたＤＮＡマイクロアレイであっても、その作製方法に起因するバラツキ、例えば、核酸配列による合成効率のバラツキ、ピン・スポッターから基板に滴下されるプローブ液量のバラツキや、固定率のバラツキなどを内包するため、定量精度、再現性に問題があった。一方、これらＤＮＡマイクロアレイ作製時のバラツキを解決するべく、インクジェットを用いた作製法（特開平１１−１８７９００号公報）などが提案されている。
【０００６】
一方、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子検査に供される検体に対しては、感度の問題から、一般に、目的の塩基配列を有する核酸の増幅操作を施し、同時に検出可能な標識物を取り込ませた増幅産物を得る。この増幅操作の基本技術は、ＰＣＲと呼ばれ、米国特許第４６８３１９５、第４６８３２０２、第４９６５１８８などに記載されている。しかしながら、ＰＣＲは、その増幅反応の過程に制御の困難な要因を多数含み、例えば、同一のサンプルを同時に増幅した場合でも、増幅産物の収率は数倍から数十倍の間でバラツキを生じることもあることが知られている。この増幅産物収量の不確定性を解決すべく、多くの研究が行われ、競合（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）ＰＣＲ法などが発明された。競合ＰＣＲ法は、Ｐ．Ｄ．Ｓｉｅｂｅｒｔらの論文（Ｎａｔｕｒｅ　３５９　；　５５７−５５８　（１９９２）　，　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１４　；　２４４−２４９　（１９９３））などに詳しい。また、別の方法としては、患者等から採取された検体に、既知量の内部標準となる核酸を添加し、目的の塩基配列を有する核酸の増幅反応と同時に内部標準核酸も増幅して、この内部標準核酸の増幅率から目的の塩基配列の有する核酸の増幅率を推定する手法などが挙げられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上で述べたように、ＤＮＡマイクロアレイを用いて、目的の塩基配列を有する核酸の定量分析を行う上では、その定量性に影響を及ぼす、様々な不安定要因が存在している。
【０００８】
まず、ＤＮＡマイクロアレイ作製時、基板上に固定化されるプローブ量のバラツキに由来する精度、再現性の低信頼性がある。また、ＰＣＲ法における、目的の塩基配列を有する核酸の増幅効率の不確定性に起因し、検体に含まれる目的の塩基配列を有する核酸の増幅率にバラツキがある。従来、これら異なる要因のバラツキは、別途、様々な方法でそれぞれを検定した後、ＤＮＡマイクロアレイを用いた定量分析に供され、分析結果を、それぞれの検定結果に基づく補正を行って、実際の定量を得ていた。
【０００９】
これら複数種の検定作業は、何れも、非常に煩雑であり、また、長時間の作業が必要であることから、多数の検体を処理する上で、検定作業がその作業性を阻害する要因となっていた。
【００１０】
本発明は前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、これらの検定作業を著しく簡便化し、検体中に含まれる目的の塩基配列を有する核酸の定量、測定時に、その補正データを取得することが可能なＤＮＡマイクロアレイと、その際に利用さる検定用キットを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記課題を解決すべく、鋭意検討を進めたところ、ＤＮＡマイクロアレイを作製する際、プローブの固定法として、インクジェットを利用して、別途作製した核酸プローブを基板上に塗布・固定する作製法（特開平１１−１８７９００号公報）を採用し、目的の塩基配列を有する核酸の検出用核酸プローブに加えて、同一のＤＮＡマイクロアレイ上に内部標準用プローブおよび／または外部標準用プローブを併せて、同じ手法で固定しているＤＮＡマイクロアレイとすることで、これらの検定作業を著しく簡便化できることを見出した。かかる知見に基づき、本発明者らは、前記のＤＮＡマイクロアレイを用いる検出操作において、これらの検定作業を精度良く、簡便に運用するためのキットをも考案し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明にかかるＤＮＡマイクロアレイは、
検体中に含まれる目的の塩基配列を有する核酸分子を検出するため使用される、該目的核酸分子の塩基配列に対して、相補的な塩基配列を持つ核酸プローブを基板上に固定化したＤＮＡマイクロアレイにおいて、
前記検体中に含まれる前記目的の塩基配列を有する核酸分子の含有濃度を定量するため、
一種以上の該目的塩基配列を有する核酸の増幅反応検定用に添加される内部標準用プローブ、一種以上の検出操作及びプローブ量検定用に添加される外部標準用プローブからなる群から選ばれる一種以上のプローブを有することを特徴とするＤＮＡマイクロアレイである。その際、基板上に固定化される該内部標準用プローブ及び／もしくは該外部標準用プローブは、
４点以上の量もしくは密度で一連の群として基板上に固定化されていることが好ましい。
【００１３】
なお、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定化される、該内部標準用プローブは、内部標準核酸に由来する増幅反応産物の異なる鎖長に対応する、二種以上のプローブで構成されることが望ましい。また、該外部標準用プローブは、添加される外部標準核酸に対して、任意の核酸塩基数の非相補的な塩基配列を含む二種以上のプローブで構成されていることが望ましい。
【００１４】
加えて、該内部標準用プローブおよび部標準用プローブは、合成核酸を基板上に固定化したものであることがより好ましい。その際、該合成核酸の鎖長は、１５塩基〜７５塩基の長さであることが好ましい。
【００１５】
さらには、本発明にかかるＤＮＡマイクロアレイが、内部標準用プローブを具えるものである際、目的の塩基配列を有する核酸の増幅反応時に、該目的の塩基配列を有する核酸と同時に、内部標準核酸を増幅に供し、増幅反応の増幅効率を測定するが、この内部標準核酸の増幅反応用プライマーセットの発明も本発明は提供する。すなわち、本発明にかかるプライマーセットは、
目的の塩基配列を有する核酸の増幅反応時に、該目的の塩基配列を有する核酸と同時に増幅に供される内部標準核酸の増幅反応用プライマーセットであって、目的の塩基配列を有する核酸に由来する増幅産物の鎖長と、該プライマーセットが与える内部標準核酸に由来する増幅産物の鎖長とが同等になるように設計されていることを特徴とするプライマーセットである。
【００１６】
また、本発明は、前記の内部標準核酸の増幅反応用プライマーセットを含め、本発明のＤＮＡマイクロアレイを利用して、目的の塩基配列を有する核酸を定量的に検出する用途に適合する検出用キットをも併せて提供する。すなわち、本発明にかかる目的塩基配列検出用キットは、
ＤＮＡマイクロアレイを利用して、目的の塩基配列を有する核酸を定量的に検出する際、該目的の塩基配列を有する核酸の増幅反応時に、該目的の塩基配列を有する核酸と同時に増幅に供される内部標準核酸の増幅反応用プライマーセットを含む検出用キットであって、
前記目的の塩基配列を有する核酸に由来する増幅産物の鎖長が二種以上ある際、該異なる鎖長に対応する請求項７に記載のプライマーセットを二種以上包含することを特徴とする目的塩基配列検出用キットである。その際、例えば、該プライマーセット複数が、増幅産物鎖長２００ｂｐ以下用、２００〜５００ｂｐ用、５００〜２０００ｂｐ用、２０００ｂｐ以上用として、各１種以上包含されていることを特徴とする目的塩基配列検出用キットとすることができる。
【００１７】
一方、本発明にかかる目的塩基配列検出用キットでは、
ＤＮＡマイクロアレイを利用して、目的の塩基配列を有する核酸を定量的に検出する際、該目的の塩基配列を有する核酸の増幅反応時に、該目的の塩基配列を有する核酸と同時に増幅に供される内部標準核酸を含む検出用キットであって、
検出目的の塩基配列と相同性を持たない、微生物由来核酸もしくは、ウイルス由来核酸を内部標準核酸として二種以上包含することを特徴とする目的塩基配列検出キットとすることが望ましい。
【００１８】
また、本発明にかかるＤＮＡマイクロアレイが、外部標準用プローブを具えるものである際、本発明は、前記の外部標準核酸を含め、本発明のＤＮＡマイクロアレイを利用して、目的の塩基配列を有する核酸を定量的に検出する用途に適合する検出用キットをも併せて提供する。すなわち、本発明にかかる目的塩基配列検出用キットは、
ＤＮＡマイクロアレイを利用して、目的の塩基配列を有する核酸を定量的に検出する際、検体に添加される外部標準核酸を含む検出用キットであって、
検出可能な標識物で標識された合成核酸である外部標準核酸を二種以上包含することを特徴とする目的塩基配列検出用キットである。なお、その際、該標識物が、蛍光物質、放射性物質、発光物質のいずれかであることが好ましい。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明にかかる第一の形態は、内部標準用プローブをＤＮＡマイクロアレイ上に搭載することである。
【００２０】
内部標準用プローブとは、広義としては、目的の塩基配列を有する核酸の定量を補助するために利用する内部標準核酸を検出するためのプローブである。検体中において存在量が判明している、内部標準核酸（遺伝子）と相補的な塩基配列を有し、内部標準核酸（遺伝子）と結合しうる核酸プローブであって、内部標準核酸の存在量と、目的の塩基配列を有する核酸の存在量との相対比を測定することで、目的の塩基配列を有する核酸の存在量の定量を可能とするものを指す。例えば、生体細胞で細胞骨格を形作る遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）産物は、その発現量に変動が少なく、発現量も比較的多いので内部標準核酸として用いられることが多い。具体的には、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、リボゾーマルＲＮＡなどが挙げられる。
【００２１】
さらに、狭義の内部標準核酸は、ＰＣＲに代表される核酸の増幅反応を利用して、核酸量の増倍や、目的とする塩基配列を有する核酸に検出可能な標識物を付加するため、増幅反応を行う際に、検体中に添加する、既知の塩基配列を有し、既知量の添加を行う核酸を指す。検体中に添加された既知の塩基配列、既知量の核酸（内部標準核酸）は、目的の塩基配列を有する核酸に対する増幅反応もしくは標識反応と同時に、目的の塩基配列を有する核酸と同じ効率で増幅もしくは標識されるように条件を設定する。増幅反応もしくは標識反応の後、この添加された内部標準核酸の量を定量することで、増幅倍率や標識付加率を算定する上で利用でき、また、目的の塩基配列を有する核酸の存在量を、内部標準核酸の存在量に対する相対比として求めることが可能なものを指す。
【００２２】
本発明にかかる第二の形態は、外部標準用プローブをＤＮＡマイクロアレイ上に搭載することである。
【００２３】
外部標準核酸とは、主として、ＤＮＡマイクロアレイの作製工程及び／または検出、測定工程でのバラツキなどを補正する目的で、検体中に添加される既知の塩基配列を有する核酸を指す。具体的には、合成ＤＮＡ、プラスミッドＤＮＡなどの純度の高い核酸に、検出、定量可能な標識物を導入したものを使用する。また、かかる外部標準核酸に付されている標識に関して、その標識効率などを事前に検定したものである。この外部標準核酸は、ＤＮＡマイクロアレイの種類（対象遺伝子）に依らず、検出目的の塩基配列とは相同性を示さない塩基配列を有するものであれば、全てのＤＮＡマイクロアレイに同じものを使用できる。外部標準用プローブは、前記の外部標準核酸に対して、相補的な塩基配列を有し、選択的に結合可能な核酸プローブである。
【００２４】
また、外部標準核酸、外部標準用プローブは、数種類のセットを同時に用いることで、ＤＮＡマイクロアレイの有する性能、すなわち、定量性の検定が可能となる。具体的には、例えば、３種類以上、好ましくは、５種類以上の外部標準用プローブを搭載したＤＮＡマイクロアレイを用意し、これに対応した標識済み外部標準核酸を、目的の塩基配列を有する核酸の検出操作にそれぞれの種類ごとに濃度（既知量）を変えて添加する。これらの外部標準核酸の検出量をプロットすることで、検量線を作成することが可能となる。また、一種類の外部標準核酸と外部標準用プローブのセットを用いて、ＤＮＡマイクロアレイに固定されているプローブ量を検定することも可能である。つまり、一種類のセットを用いて、ＤＮＡマイクロアレイ間（基板間）において、プローブ固定効率のバラツキを補正することも可能である。この方法は、まず、外部標準用プローブを３種以上、好ましくは、５種以上の別濃度でＤＮＡマイクロアレイ上に固定化し、搭載する。これに、十分量の標識済み外部標準核酸を反応させて、結合した外部標準核酸の量を測定することで、ＤＮＡマイクロアレイ上に実際に固定されているプローブの分子数比が測定できる。
【００２５】
本発明にかかる第三の形態は、上記する第一及び第二の形態のＤＮＡマイクロアレイを利用する検出、定量法を、より有効かつ簡便に活用するために用いられる検出用キットである。
【００２６】
この検出用キットには、内部標準用プローブを具えるＤＮＡマイクロアレイを利用する際には、まず、内部標準核酸の増幅用プライマーセットが包含される。また、外部標準用プローブを具えるＤＮＡマイクロアレイを利用する際には、検出、定量可能な標識物で標識され、その標識率が検定された外部標準核酸が包含される。これらは、いずれも内部標準用プローブ、外部標準用プローブに対応させて、少なくとも、一種類、必要に応じて、数種類〜十数種類がセットとして、検定用キットに組み込まれる。
【００２７】
内部標準核酸の増幅用プライマーセットは、様々な要件によってその内容は変化する。まず、内部標準核酸を鋳型とする増幅反応において、内部標準用プローブと相補的な塩基配列を有する増幅産物を生じるように、プライマーセットの塩基配列（対応位置）が設定されていなくてはならない。また、同時に、目的の塩基配列を有する核酸を増幅する際に、目的の塩基配列を有する核酸を鋳型として、意図しない増幅産物を生じないように留意する必要もある。さらに、内部標準として、定量性の精度を向上させるためには、目的の塩基配列を有する核酸の増幅反応で生じる増幅産物の核酸鎖長と、内部標準核酸を本キットに含まれる増幅用プライマーを用いて増幅した際に得られる増幅産物の核酸鎖長とが、著しく異なることを避けるべきである。具体的には、内部標準核酸に由来する増幅産物の核酸鎖長を数種類のレンジに設定し、目的の塩基配列を有する核酸に由来する増幅産物の鎖長と、内部標準核酸に由来する増幅産物の鎖長のいずれかが同等となるように選択することが望ましい。例えば、得られる増幅産物の鎖長が、２００ｂｐ以下用、２００〜５００ｂｐ用、５００〜２０００ｂｐ用、２０００ｂｐ以上用の４種類となる、四種のプライマーセットを用意し、目的の塩基配列を有する核酸に由来する増幅産物の鎖長に合わせて、適合するものを選択することが望ましい。もちろん、この増幅産物鎖長のレンジ設定をさらに細分化して、多数のプライマーセットを用意することは何ら問題ない。
【００２８】
内部標準核酸に利用される核酸は、既知の塩基配列を有し、かつ高い純度のものを入手できるものが好適に利用でき、例えば、分子生物、医療分野で一般に市販されている核酸、例えば、プラスミッドベクター、ファージＤＮＡ、微生物ゲノムなどを利用することができる。特に、プラスミッドベクター、ファージＤＮＡ等は、純度の高い、単一種の試料を比較的簡便に入手できることから、より好適に用いられる。
【００２９】
一方、検出、定量可能な標識物で標識され、その標識率が検定された外部標準核酸も、既知の塩基配列を有し、かつ高い純度のものを入手できるものが好適に利用でき、例えば、合成ＤＮＡ、プラスミッドベクターなどがより好適に用いられる。合成ＤＮＡは、安定した標識効率であり、また、分子量当たりの標識率の高いものが得られることから特に好適に用いられる。
【００３０】
加えて、本発明にかかるＤＮＡマイクロアレイでは、内部標準用プローブと外部標準用プローブとの双方を具える形態とすることがより好ましい。それに伴い、検定用キットは、内部標準核酸の増幅用プライマーセットと、外部標準核酸とを双方ともに具えたキットとすることが好ましい。
【００３１】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ここに挙げる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、かかる実施例に示す形態に限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）内部標準用核酸の調製
内部標準用核酸として、既知の塩基配列を有するプラスミッドＤＮＡ：ｐＵＣ１１８（３，１６２ｂｐ、宝酒造株式会社製）を選択した。ＰＣＲのテンプレートとする必要から、定法に従って、前記プラスミッドｐＵＣ１１８を、制限酵素ＥｃｏＲ　Ｉで切断し、直鎖ＤＮＡとした。次に、アガロースゲル電気泳動で切断状況を確認した後、制限酵素切断反応液をフェノール処理し、エタノール沈澱により、目的の直鎖ＤＮＡを回収した。回収した直鎖ＤＮＡを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ．７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に、最終濃度１０ｎｇ／μｌ（２．４　ｐｍｏｌ／ｍｌ）となるように溶解し、内部標準用核酸溶液とした。
【００３３】
（実施例２）内部標準用核酸の増幅用プライマーの調製
実施例１で調製した、直鎖状ＤＮＡ：ｐＵＣ１１８　ＥｃｏＲ　Ｉ　Ｄｉｇｅｓｔ　の塩基配列情報に基づき、ＰＣＲ用プライマーとして、下記表１に示す、順方向プライマー５種：Ｐ１〜Ｐ５、逆方向プライマー４種：ＲＰ１〜ＲＰ４を選択した。
【００３４】
【表１】
2004028695.tif 000002
【００３５】
表１中に示されるポジションは、制限酵素ＥｃｏＲ　Ｉの認識部位の先頭をポジション１として、ナンバリングしなおした際、当該プライマーの塩基配列の位置を示す。なお、表１中の逆方向プライマー；ＲＰ１〜ＲＰ４に関しては、相補鎖上における塩基配列の位置を示す。
【００３６】
表１に塩基配列を示す各プライマーは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、それぞれ、最終濃度１０　ｐｍｏｌ／μｌ　となるようにＴＥ緩衝液に溶解し、プライマー溶液とした。
【００３７】
図１に、実施例１で調製される、内部標準用核酸：ｐＵＣ１１８　ＥｃｏＲ　Ｉ　Ｄｉｇｅｓｔを鋳型として、表１に示すプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅反応を行った際に取得される増幅産物の鎖長、ならびに、利用される順方向プライマーと逆方向プライマーとの組み合わせを示す。なお、逆方向プライマーには、５’末端に蛍光標識（ローダミン）を行ったものを別途に用意し、上記未標識のプライマーと同様の処理を行って蛍光標識プライマー溶液とした。
【００３８】
（実施例３）内部標準用プローブの調製
実施例１で調製される、直鎖状ＤＮＡ：ｐＵＣ１１８　ＥｃｏＲ　Ｉ　Ｄｉｇｅｓｔ　の塩基配列情報に基づき、直鎖状プラスミッド：ｐＵＣ１１８　ＥｃｏＲ　Ｉ　Ｄｉｇｅｓｔ　の配列情報より以下の内部標準用プローブを設定した。
【００３９】
【表２】
2004028695.tif 000003
【００４０】
表２中に示されるポジションは、制限酵素ＥｃｏＲ　Ｉの認識部位の先頭をポジション１として、ナンバリングしなおした際、当該プローブの塩基配列の位置を示す。
【００４１】
表２に塩基配列を示す内部標準用プローブ４種は、それぞれ、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定するための官能基として、合成後、定法に従って、各核酸の５’末端にスルファニル基を導入した。官能基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥した内部標準用プローブは、冷凍庫中、−３０℃で保存した。
【００４２】
図１に、内部標準用プローブ４種がハイブリダイズする、標的塩基配列の位置を示す。また、各ＰＣＲ増幅産物についても、併せて、標的塩基配列の位置を示す。
【００４３】
（実施例４）外部標準核酸の調製
実施例１で準備した直鎖状プラスミッド：ｐＵＣ１１８　ＥｃｏＲ　Ｉ　Ｄｉｇｅｓｔ　の配列情報より以下の外部標準核酸を設定した。
【００４４】
【表３】
2004028695.tif 000004
【００４５】
表３中に示されるポジションは、制限酵素ＥｃｏＲ　Ｉの認識部位の先頭をポジション１として、ナンバリングしなおした際、当該外部標準核酸の塩基配列の位置を示す。この外部標準核酸４種は、表２に示す内部標準用プローブ４種に対して、相補的な塩基配列を有する。
【００４６】
表３に塩基配列を示す外部標準核酸４種は、それぞれ、検出、定量用の標識として、合成後、定法に従って、各核酸の５’末端に蛍光色素（ローダミン）を導入した。蛍光標識の導入後、精製し、最終濃度５μＭになるようにＴＥ緩衝液に溶解し、外部標準核酸溶液とした。この外部標準核酸溶液は、遮光処理を施した容器に入れた上で、冷凍庫中、−３０℃で保存した。
【００４７】
図１に、外部標準核酸４種に関しても、それと相補的な塩基配列を有する、上記内部標準用プローブ４種がハイブリダイズする、標的塩基配列の位置と併せて、その塩基配列の位置を示す。
【００４８】
（実施例５）ＤＮＡマイクロアレイの作製
［１］ガラス基板の洗浄
合成石英ガラス基板（サイズ：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を、耐熱性、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、洗浄液から基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に、１０分間基板を浸した。再び、純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の洗浄済石英ガラス基板を用意した。
【００４９】
［２］表面処理
シランカップリング剤；ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、濃度１ｗｔ％となるように、純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、洗浄済ガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で基板表面を洗浄した後、基板の両面に窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。次に、乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、表面のカップリング剤処理を完結させた。このアミノシランカップリング剤処理に伴い、基板表面にアミノ基が導入される。
【００５０】
一方、同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ、以下、ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１（体積比）混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベークの終了後、ガラス基板を放冷し、次いで、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この処理により、シランカップリング剤処理によって表面に導入されたアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、基板表面にＥＭＣＳに由来するマレイミド基が導入される。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のジメチルスルホキシドとエタノールの混合溶媒を用いて洗浄する。さらに、エタノールにより洗浄した後、表面処理を施したガラス基板を窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００５１】
［３］プローブＤＮＡ
実施例３で調製した内部標準用プローブ４種を利用し、下記表４に示す組成表に従って、純水に溶解し、種々の濃度を有する溶液の調製、混合溶液の調製を行った。各内部標準用プローブ溶液は、調製後一定量毎に小分けし、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００５２】
【表４】
2004028695.tif 000005
【００５３】
［４］ＢＪプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、表４に示す、予め小分け調製した２７種類のプローブ溶液凍結乾燥物を、上記の混合溶媒所定量に加え、規定濃度なるように溶解した。得られたＤＮＡプローブ溶液を、バブルジェット・プリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０　キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００５４】
なお、ここで使用するバブルジェット・プリンターは、平板への印刷が可能なように改造を施したものである。また、このバブルジェット・プリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、対応するパターンにインクドットの吐出を行い、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液を約１２０マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００５５】
続いて、この改造バブルジェット・プリンターを用いて、１枚の表面処理済ガラス基板に対して、図２に示す配列順序に従って、２７種類のプローブ溶液をそれぞれ、スポッティングした。目的とするスポット印字が行われていることを確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置して、ガラス基板表面のマレイミド基とＤＮＡプローブ５’末端のスルファニル基とを反応させた。
【００５６】
［５］洗浄
３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面にマトリックス状にスポットされた一本鎖ＤＮＡが固定した遺伝子チップ（ＤＮＡプローブ・アレイ基板）を得た。
【００５７】
（実施例６）外部標準核酸による基板の検定
実施例５で作製したＤＮＡマイクロアレイを８枚用意した。この８枚のＤＮＡマイクロアレイに対して、以下に示す組成のブロッキング溶液に浸し、室温で３時間放置し、ブロッキング処理を施した。
【００５８】
【表５】
2004028695.tif 000006
【００５９】
一方、下記表６に示す組成の外部標準核酸を含んだハイブリダイゼーション溶液を８種類作製した。なお、ハイブリダイゼーション溶液の基本溶媒は、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）（以下、基本緩衝液と称す。）であり、表６に示す外部標準核酸の単独または混合物を、この基本緩衝液に、それぞれ、合計の最終核酸濃度として３０ｎＭになるように溶解した。
【００６０】
【表６】
2004028695.tif 000007
【００６１】
表６中、外部標準核酸の欄に記入した略号は、表３に示した外部標準核酸名称の頭文字であり、その外部標準核酸が含有されることを示す。
【００６２】
ブロッキング処理終了後、ＤＮＡマイクロアレイを基本緩衝液でリンスした。
用意した８種類のハイブリダイゼーション溶液に、ブロッキング処理済みのＤＮＡマイクロアレイを各１枚浸し、ビニールパックで密閉した。それぞれ、４５℃で３時間、ハイブリダイゼーション反応を行わせた。
【００６３】
反応終了後、ＤＮＡマイクロアレイをビニールパックから取り出し、以下の洗浄を行った。
２×ＳＳＣ＋０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　５５℃　５分×３回０．１×ＳＳＣ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　室温　１分×１回なお、２×ＳＳＣの組成は、ＮａＣｌ　１７．５ｇ／ｌ、クエン酸三ナトリウム・２水和物　８．８ｇ／ｌであり、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ　７．０に調整したものである。
【００６４】
洗浄終了後、エアブローを用いて液切りを行い、乾燥させた。乾燥後、ＤＮＡアレイスキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ　４０００Ｂ、Ａｘｏｎ社製）を用いて、各スポットの蛍光量を測定した。測定データは、ＤＮＡアレイスキャナー付属の解析ソフトウェア（ＧｅｎｅＰｉｘ　Ｐｒｏ　３．０）を用いて解析を行った。
【００６５】
（実施例７）固定プローブの密度検定
測定した蛍光量から各プローブの密度比を求めた。表７に示す。
【００６６】
【表７】
2004028695.tif 000008
【００６７】
密度比は、Ｉｎｋ　Ｎｏ．５におけるＤＮＡプローブの固定密度を１００％とした際、それに対する相対比として求めた。また、各外部標準核酸の標識率は、別途測定し、その標識率による補正を行った、密度比を示す。
【００６８】
表７中、Ｉｎｋ　Ｎｏ．１〜４の密度比（蛍光量）が、理論値の２００％に満たないのは、プローブ核酸の固定量が、基板の許容量（飽和量）に達しているためである。
【００６９】
また、表４中に示したＩｎｋ　Ｎｏ．１７〜２７の混合プローブにおける、各プローブの密度比は、それぞれ、対応する各プローブ濃度の単独プローブ密度比に準じた値を示した。
【００７０】
（実施例８）外部標準核酸を用いた検量線の作成
実施例７の結果から、各プローブの固定量が検定され、この補正データを用いて検量線を作成した。
【００７１】
具体的には、実施例５で作製したＤＮＡマイクロアレイを用いて、実施例６と同様にハイブリダイゼーション実験を行った。但し、外部標準核酸の添加量は、以下に示す混合量とした。
外部標準核酸の混合比
Ａ−Ｒｈｏ：６６．７％（２０ｎＭ）
Ｃ−Ｒｈｏ：２５．０％（７．５ｎＭ）
Ｅ−Ｒｈｏ：　６．７％（２．０ｎＭ）
Ｇ−Ｒｈｏ：　１．７％（０．５ｎＭ）
実施例６と同様の手順で、測定及び解析を行った。
【００７２】
測定結果と、実施例７で求められたプローブ密度の補正値を用いて、検量線を作成した。図３に、作成された検量線を示す。
【００７３】
（実施例９）ＰＣＲ産物を用いた検量線の作成
実施例１で調製した内部標準用核酸、及び、実施例２で調製したと内部標準用プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅産物の検量線作成を行った。
【００７４】
まず、表８の内部標準用プライマーの組み合わせを用いて、定法に従ってＰＣＲ増幅反応を行った。ＰＣＲ反応液組成は、以下の通りである。なお、本実施例で使用した逆方向プライマーには、実施例３において準備した５’末端に蛍光標識を行ったものを使用した。
【００７５】
ＰＣＲ反応液
ＰＣＲ　　プレミック反応液（２×）　　２５μｌ
ｐＵＣ１１８　　ＥｃｏＲ　Ｉ　Ｄｉｇｅｓｔ　　　　　１μｌ
混合プライマー（表８）　　　　　　６μｌ
純水　　　　　　　　　　　　　　　１８μｌ　　／　トータル　５０μｌ
温度サイクル
（９２℃：１０秒　６２℃：１５秒　７２℃：３０秒　２４サイクル）
【００７６】
【表８】
2004028695.tif 000009
【００７７】
反応後、ゲルろ過を行い、ＰＣＲ増幅産物を精製した。ＴＥ緩衝液を用いて容量調整した後、２４０ｎｍの吸光度と蛍光量を測定して、核酸量と蛍光標識量を定量し、標識率を求めた。
【００７８】
標識率を求めた内部標準増幅産物を用いて、実施例８と同様にハイブリダイゼーション反応を行い、プローブに結合した内部標準増幅産物に起因する蛍光量を測定した。
【００７９】
測定結果から、内部標準増幅産物標識率と実施例７で求められたプローブ密度の補正値を用いて、検量線を作成した。図４に、作成された検量線を示す。
【００８０】
図４に示す検量線を検討すると、増幅産物の分子量（鎖長）に依存して、検量線の傾きに差異がある。すなわち、目的の塩基配列を有す核酸の定量を、より高い確度で行うためには、目的の塩基配列を有する核酸の増幅産物と、同等の鎖長を有する内部標準増幅産物を与えるプライマー組み合わせを採用することが必要であると判断される。
【００８１】
【発明の効果】
本発明にかかるＤＮＡマイクロアレイでは、基板上に固定化されるプローブの固定化効率の検定作業を、ＤＮＡマイクロアレイ上に同時に作製される外部標準用プローブを利用して、検体試料中に添加する、既知濃度の標識率検定済み外部標準核酸を検出することで行い、一方、検出前に施される、核酸増幅、標識付加反応における、増幅倍率、標識効率の検定作業は、ＤＮＡマイクロアレイ上に同時に作製される内部標準用プローブを利用して、かかる核酸増幅、標識付加反応に同時に供される、既知濃度の内部標準核酸における増幅倍率、標識効率を測定することで行うことで、実際の目的とする核酸の検出操作と同時に、検定作業を簡便に実施することができる。また、その検定作業自体、同時に行う結果、高い精度の検定結果を得られる。そのため、本発明にかかるＤＮＡマイクロアレイを利用することによって、目的とする核酸分子の定量分析における定量性精度は、著しく向上される。また、その定量分析操作では、本発明にかかるＤＮＡマイクロアレイに対応させて、内部標準増幅用プライマー、外部標準核酸を検出用キットとして用いることで、利用者は非常に簡便に本発明を利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態の一例を示し、内部標準用プローブ、外部標準用プローブ、外部標準核酸、ならびに、内部標準核酸の増幅用プラーマーセット、その増幅産物を示す図である。
【図２】本発明にかかるＤＮＡマイクロアレイの一実施態様を模式的に示し、ＤＮＡマイクロアレイ中に具える内部標準用プローブの配置を示す図である。
【図３】本発明にかかるＤＮＡマイクロアレイを利用する定量分析において、ＤＮＡマイクロアレイ中に具える外部標準用プローブを利用する、プローブ固定化率を算定するための、検量線の作成例を示す図である。
【図４】本発明にかかるＤＮＡマイクロアレイを利用する定量分析において、ＤＮＡマイクロアレイ中に具える内部標準用プローブを利用する、ＰＣＲ増幅倍率の算定時における検量線と、増幅産物の核酸鎖長による検出感度の相違を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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