(57)【要約】　　　（修正有）【課題】植物細胞における細胞増殖の制御に関わる細胞増殖制御因子のアミノ酸配列と、これをコードする遺伝子の塩基配列とを決定するとともに、特定された上記細胞増殖制御因子及びその遺伝子の利用方法を提案する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、該アミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる、植物の細胞増殖を制御するポリペプチドと、これをコードする遺伝子である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる、植物の細胞増殖を制御するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号５に示される塩基配列を含む遺伝子。
【請求項３】
タバコ由来である請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号１に示される塩基配列のうち、１５８７〜１７７２番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は３に記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号３に示される塩基配列のうち、７１８〜１２５４番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は３に記載の遺伝子。
【請求項６】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる、植物の細胞増殖を制御するポリペプチド。
【請求項８】
培養細胞を新鮮な培地に移し変えて培養したときに、培養時間が１２時間までに、当該培養細胞に特異的に発現する請求項６又は７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜５の何れか１項に記載の遺伝子を含む組み換え発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜５の何れか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１１】
請求項６〜８の何れか１項に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１２】
請求項１〜５の何れか１項に記載の遺伝子又は請求項６〜８の何れか１項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする植物の細胞増殖制御剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の細胞増殖を制御するポリペプチド、及びその遺伝子、並びにその利用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
植物細胞は様々な刺激を受けて増殖分化して生長する。特に、植物細胞の場合、細胞肥大による生長が極めて重要な部分を占めるが、生長の基本が細胞分裂であることはいうまでもない。細胞は、ゲノムＤＮＡの複製・分配・細胞の分裂という細胞周期の繰り返しによって増殖していく。
【０００３】
そのため、植物の細胞増殖（あるいは細胞周期）を人為的に制御することが可能となるということは、植物細胞の増殖を持続させたり停止させたりすることを可能とすることになる。具体的には、植物細胞の増殖を持続させることができれば、植物の活発な生長を維持することができ、その結果、より多くのバイオマスの生産が可能となる。一方、植物の増殖を停止させることができれば、植物の代謝を、細胞増殖から物質生産に変換させることが可能となり、より多くの有用物質を生産することが期待される。それゆえ、従来から、植物における細胞増殖の制御機構の解明及び理解は、学術的観点だけでなくアグリビジネスなどの産業的観点からも進められている。
【０００４】
酵母や動物では、従来、サイクリン遺伝子やＣＤＫ遺伝子等、細胞周期の制御に関わる遺伝子（細胞周期制御遺伝子）が単離されている。また、植物の細胞増殖に関連する遺伝子（細胞増殖関連遺伝子）としても、例えば、クロマチンを構成するヒストン遺伝子等が知られており、さらに、これら公知の細胞周期制御遺伝子や細胞増殖関連遺伝子を用いて、植物から新たな細胞増殖制御遺伝子を探索する試みもなされている。
【０００５】
ところで、植物細胞は葉緑体という細胞内小器官を有しているが、この葉緑体は、核やミトコンドリアのゲノムとは異なる独自のゲノム（複数の同一コピーの葉緑体ＤＮＡからなる）を持ち、独自の複製・転写・翻訳系を持つ。従って、葉緑体は植物細胞の増殖から独立した増殖（自己増殖）が可能となっている。この葉緑体の分裂を制御する遺伝子としては、例えば、ＦｔｓＺ遺伝子が知られている。
【０００６】
植物の細胞増殖を制御する試みとして、上記サイクリン遺伝子やＣＤＫ遺伝子を用いることが、非特許文献１に記載されている。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｎａｔｕｒｅ　３８０：４８１−４８２，　（１９９６）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、植物は、酵母や動物等の他の生物とは細胞増殖の制御機構に違いがあることが認められており、上述した公知の遺伝子のみでは、細胞増殖を有効に制御することはできないという課題がある。
【０００９】
特に、上述したように、植物細胞は、葉緑体という自己増殖可能な細胞内小器官を余分に有しており、植物細胞の細胞分裂は、この葉緑体の増殖と同調して制御されることが重要となる。すなわち、この同調を伴う制御が乱されると細胞死がもたらされると考えられ、この同調を伴う制御を円滑にすれば細胞分裂を促進できると考えられる。
【００１０】
実際、上記非特許文献１には、上述したサイクリン遺伝子やＣＤＫ遺伝子等、公知の遺伝子の発現のみでは、植物細胞の細胞増殖を制御することはできないことが知られている。
【００１１】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、植物細胞における細胞増殖の制御に関わる細胞増殖制御因子のアミノ酸配列と、これをコードする遺伝子の塩基配列とを決定するとともに、特定された上記細胞増殖制御因子及びその遺伝子の利用方法を提案することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、植物培養細胞の細胞分裂及び葉緑体増殖は、植物細胞を新鮮な培地に移植することにより誘導されるという知見から、植物細胞の細胞分裂と葉緑体の増殖とを同調させて制御する細胞増殖制御遺伝子がこの時期に発現していると考え、この知見に基づいて、植物培養細胞の培養初期に発現する新規な遺伝子を単離することを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明に係るポリペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドであり、本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする遺伝子である。
【００１４】
（ａ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００１５】
（ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる、植物遺伝子の発現を制御するポリペプチド。
【００１６】
（ｃ）配列番号５に示される塩基配列を含む遺伝子。
【００１７】
上記（ａ）のポリペプチドは、本発明者らが、今回新たにタバコ培養細胞から新規な細胞増殖制御因子として単離、同定したものである。上記（ａ）のポリペプチドをコードする本発明に係る遺伝子の一例としては、配列番号１に示される塩基配列のうち、１５８７〜１７７２番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する遺伝子や、配列番号３に示される塩基配列のうち、７１８〜１２５４番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する遺伝子が挙げられる。また、上記（ａ）のポリペプチドの一例としては、培養細胞を新鮮な培地に移し変えて培養したときに、培養時間が１２時間までに、当該培養細胞に特異的に発現するポリペプチドが挙げられる。
【００１８】
なお、本発明に係るポリペプチドには、比較的低分子のポリペプチド（分子量５０００以下のもの）だけでなく、より高分子のタンパク質（分子量５０００超のもの）も含まれるものとする。
【００１９】
本発明に係る組み換え発現ベクターは、上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする遺伝子、又は上記（ｃ）の遺伝子を含むものである。例えば、配列番号１に示される遺伝子が挿入された組み換え発現ベクターが挙げられる。組み換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることが出来るが、特に限定されるものではない。
【００２０】
本発明に係る形質転換体は、上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする遺伝子、又は上記（ｃ）の遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されたことを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織、器官のみならず、植物個体（シロイヌナズナやタバコなどの形質転換植物）を含む意味である。
【００２１】
本発明に係る抗体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質、又はその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる抗体である。
【００２２】
後述するように、本発明に係る遺伝子・ポリペプチド等は、植物細胞の増殖に大きく関与しているため、細胞増殖に特異的な遺伝子発現調節因子を単離することが可能であるとともに、特異性の高い指標遺伝子としての利用できる。また、本発明に係るポリペプチド及びその遺伝子は、植物の細胞増殖（あるいは細胞周期）を人為的に制御することに利用することが可能であるため、植物の各種研究における試薬等の薬剤として用いることができるだけでなく、広くアグリビジネス産業にも利用することが可能である。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
本発明は、植物における新規な細胞増殖制御遺伝子とこれにコードされる新たなタンパク質を見出すとともに、これら遺伝子及びポリペプチドの機能を解析し、これらの利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明の遺伝子、タンパク質の配列、構造について説明し、ついでこれら遺伝子、ポリペプチドの機能、利用方法等について説明することとする。
【００２５】
（１）本発明に係る遺伝子及びポリペプチドの配列、構造
本発明者は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ　Ｓａｍｓｕｎ　ＮＮ）の緑色培養細胞において、最もＦｔｓＺ遺伝子の発現が盛んとなる培養１２時間目の細胞と、発現が低下している１０日目の細胞からｍＲＮＡを抽出し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＰＣＲ−ｓｅｌｅｃｔｅｄｃＤＮＡＳｕｂｔｒａｃｔｉｏｎキットによりサブトラクションを行い、サブトラクトされたｃＤＮＡをサブクローニングし、それらの塩基配列を決定するとともに、このｃＤＮＡがコードするポリペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ決定した。
【００２６】
得られたｃＤＮＡのうち、第１の新規ｃＤＮＡを「１Ｈ０２遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるポリペプチドを「１Ｈ０２ペプチド」と称して説明する。また、第２の新規ｃＤＮＡを「２Ａ０３遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるポリペプチドを「２Ａ０３タンパク質」と称して説明する。さらに、第３の新規ｃＤＮＡを「２Ｂ０５遺伝子」と称して説明する。
【００２７】
なお、後述するように、１Ｈ０２ペプチドは比較的分子量が小さいと予測されるが、２Ａ０３タンパク質は、比較的分子量が大きいと予測されるので、本実施の形態では、前述したように、低分子のポリペプチドとより高分子のタンパク質を、「ポリペプチド」という語で包括して表現する。
【００２８】
本発明に係る遺伝子は、前述のように、（ａ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子か、（ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、或いは（ｃ）配列番号３に示す塩基配列を有する遺伝子であればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号１に示される塩基配列のうち、１５８７〜１７７２番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（１Ｈ０２遺伝子）、▲２▼配列番号３に示される塩基配列のうち、７１８〜１２５４番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（２Ａ０３遺伝子）、▲３▼配列番号５に示す塩基配列を有するｃＤＮＡ（２Ｂ０５遺伝子）、▲４▼これらｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡが例示される。これら遺伝子は、上述したように、何れもタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ　Ｓａｍｓｕｎ　ＮＮ）の緑色培養細胞由来である。
【００２９】
なお、本発明の「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。またＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００３０】
一方、本発明に係るポリペプチドは、上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドであればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号２に示されるアミノ酸配列を有しており、６１のアミノ酸残基からなる１Ｈ０２ペプチド、及び、▲２▼配列番号４に示されるアミノ酸配列を有しており、１７８のアミノ酸残基からなる２Ａ０３タンパク質が例示される。
【００３１】
上記１Ｈ０２ペプチド及び２Ａ０３タンパク質は、後述する実施例で説明するように、新規な細胞増殖を調節する因子（細胞増殖調節因子）である可能性が高い。それゆえ、本発明に係るタンパク質に含まれる上記（ｂ）のポリペプチドとは、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞増殖調節因子（ポリペプチド又はタンパク質）であればよい。
【００３２】
ここで、上記（ｂ）のタンパク質における「１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のポリペプチドは換言すれば、上記（ａ）のポリペプチドの変異体であり、ここにいう「変異」とは、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様のポリペプチドの変異体を単離精製したものであってもよい。
【００３３】
上記変異を持つポリペプチドには、野生型の活性、すなわち細胞増殖調節因子の機能等に異常を持つ変異体（機能欠失型の変異ポリペプチドと称する）が含まれてもよい。このような機能欠失型の変異ポリペプチドは、例えば、野生型ポリペプチドと構造を比較することにより、その構造の中で活性に必須な領域が明らかになるという、ポリペプチドの機能解析において有用である。また、本発明に係る遺伝子には、上記機能欠失型の変異ポリペプチドをコードする遺伝子が含まれても良い。このような遺伝子は、例えば、新たな形質転換体の作出に有用である。
【００３４】
本発明に係るポリペプチドは、その精製や検出等を容易に行うために、公知のＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）やＦＬＡＧ等の付加配列を末端に含ませてもよいし、他のタンパク質と融合させた融合タンパク質であってもよい。またＮ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎなどの各種修飾を受けてもよいし、二量体以上の多量体を形成するものであってもよい。
【００３５】
次に、本発明に係る上記３種類の遺伝子及び２種類のポリペプチドについて個別に説明する
＜１Ｈ０２遺伝子及び１Ｈ０３ペプチド＞
１Ｈ０２遺伝子は、配列番号１に示すように、２１３７塩基からなっており、１５８７〜１７７２番目の塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有すると予測される。また、上記１Ｈ０２遺伝子にコードされる１Ｈ０２ペプチドは、配列番号２にも示すように、６１アミノ酸残基からなる。
【００３６】
１Ｈ０２遺伝子は、培養開始から０時間から６時間の間に急激に発現の増加がみられ、６時間よりも早い時期に強い発現誘導がかかっており、図３（ａ）・（ｂ）に示すように、発現誘導はオーキシン（ＮＡＡ）のみに応答する。
【００３７】
また、上記予測したＯＲＦは、タンパク質をコードするには十分な長さではないとも考えられるが、図４に示すように、アミノ酸配列中に、耐熱性エンテロトキシン（細菌性毒素）の保存されるモチーフ配列（枠で囲った領域、３５〜４７番目のアミノ酸）を有している。
【００３８】
近年、植物の遺伝子発現調節において、ペプチド性の分子の関与が報告されてきており（例えば、Ｌｉｎｄｓｅｙ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．　７：　７８−８３　（２００２）等）、１Ｈ０２ぺプチドも新規なペプチド性ホルモン分子として、細胞増殖制御に関与することが考えられる。
【００３９】
＜２Ａ０３遺伝子及びタンパク質＞
２Ａ０３遺伝子は、配列番号３に示すように、１４０１塩基からなっており、７１８〜１２５４番目の塩基配列をＯＲＦとして有すると予測される。また、上記２Ａ０３遺伝子にコードされる２Ａ０３タンパク質は、配列番号４にも示すように、１７８アミノ酸残基からなる。
【００４０】
上記予測ＯＲＦから、２Ａ０３遺伝子にコードされる２Ａ０３タンパク質は、約１，９０００の分子量を有し、三回膜貫通型であると予測された。
【００４１】
上記２Ａ０３遺伝子と相同性を有する遺伝子は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）にて見出され、全体に高い相同性を示すと共に、いずれもプラスチド移行シグナル配列と思われる部位を有していた。また、マウス、ヒト、ショウジョウバエにも相同性を有する遺伝子が見出されたが、その何れも、プラスチド移行シグナル部分を欠いており、かつ、遺伝子機能は不明である。なお、データベースを参照すると、これら動物細胞由来の相同遺伝子は広範囲の組織からｃＤＮＡが得られており、ＰＳＯＲＴではゴルジ体や小胞体（ＥＲ）に局在すると予測された。
【００４２】
後述の実施例で説明するように、上記２Ａ０３遺伝子の植物体における発現をさらに解析した結果、２Ａ０３遺伝子は、最も生長点に近い若い葉で非常に強く発現していることが示され、生長との関係が強く示唆された。
【００４３】
＜２Ｂ０５遺伝子＞
２Ｂ０５遺伝子は、配列番号５に示すように、７５２塩基からなっている。２Ｂ０５遺伝子にコードされるポリペプチドについては現段階では明らかではないが、後述の実施例で説明するように、この２Ｂ０５遺伝子は、上記２Ａ０３遺伝子と同様に、上位葉及び根でも強く発現しており、植物体においてもＦｔｓＺ遺伝子に近い発現パターンを示すことが明らかとなっている。
【００４４】
（２）本発明に係る遺伝子及びポリペプチドの機能
上記１Ｈ０２遺伝子、２Ａ０３遺伝子、及び２Ｂ０５遺伝子は、タバコ培養細胞を、新鮮な培地に移し変えた後、１２時間培養して得られた細胞に特異的に発現する遺伝子をから得られたものである。従って、これら遺伝子は、ヒストン遺伝子・ＦｔｓＺ遺伝子よりも早い時期に発現が認められるものであり、培養初期の時期に、細胞特異的に発現する遺伝子である。
【００４５】
また、２Ａ０３遺伝子及び２Ｂ０５遺伝子は、細胞分裂のマーカーであるヒストン遺伝子の発現に先立って発現が誘導され、かつ、生長点を含む上位葉及び根端において高い発現が認められる。
【００４６】
さらに、１Ｈ０２遺伝子は、２Ａ０３遺伝子及び２Ｂ０５遺伝子よりもさらに発現の特異性が高く、新鮮な培地に移し変えて培養を開始してから６〜１２時間目において特徴的な発現を示すことから、植物固体においても、生長点の分裂細胞に特異的に発現していると考えられる。
【００４７】
また、１Ｈ０２遺伝子は、植物の細胞分裂誘導因子として知られるオーキシンに特異的に応答し、一過的に発現することから、細胞増殖調節因子（細胞増殖制御因子）として機能すると推測される。つまり、１Ｈ０２遺伝子は、オーキシン誘導性を示すため、培養初期の植物細胞において、時期特異的でホルモン誘導性を有する遺伝子であると考えられる。
【００４８】
さらに、１Ｈ０２遺伝子の転写調節領域を用いることにより、任意の遺伝子を細胞増殖（ヒストン遺伝子やＦｔｓＺ遺伝子）に先立ち発現させることが可能である。その結果、細胞分裂を有効に制御することが可能である。また、１Ｈ０２遺伝子は、発現が極めて特異的であるために他の細胞には影響を与えない。
【００４９】
それゆえ、本発明に係る遺伝子及びこれにコードされるポリペプチドは、植物の細胞増殖の制御や、植物細胞の発現の制御に有効であり、特定の遺伝子を細胞特異的・時期特異的に発現を制御することが可能であると考えられる。
【００５０】
（３）本発明に係る遺伝子、及びポリペプチドの利用法
上記のように、本発明に係る遺伝子及びポリペプチドは、本発明者によって初めて明らかにされた新規な細胞増殖制御遺伝子及び細胞増殖制御因子である。従って、本発明に係る遺伝子、ポリペプチド等は以下の有用性を有する。
【００５１】
まず、本発明に係る遺伝子は、植物細胞の細胞増殖に強く関連していることが明らかとなっている。従って、これらの遺伝子を用いることにより、ＴＡＩＬ法などにより、例えば、ゲノム遺伝子から細胞増殖に特異的な遺伝子発現調節因子を単離することが可能である。
【００５２】
単離した塩基配列は、細胞増殖の指標として、例えば、β−クルクロニダーゼ遺伝子やＧＦＰ遺伝子等に結合することで、特異的な細胞の単離の指標として利用できる。また、１Ｈ０２遺伝子のように、オーキシンに特徴的に応答する遺伝子の場合、転写調節配列に安定な指標遺伝子を接続することにより、オーキシンのモニターに利用することが可能である。
【００５３】
細胞増殖因子は様々な外的な因子によってその発現が制御されているが、本発明で単離した遺伝子は、細胞増殖のより初期に応答する遺伝子であり、個別のシグナルを感知していると考えられることから、特異性の高い指標遺伝子としての利用とその応用が可能と考えられる。また、１Ｈ０２遺伝子については、その発現を恒常化することにより、オーキシン処理なしでも生育することが期待される。
【００５４】
さらに、細胞増殖は、ゲノムＤＮＡの複製・分配・細胞の分裂という細胞周期の繰り返しである。そのため、植物の細胞増殖あるいは細胞周期を人為的に制御する目的で本発明に係る遺伝子及びポリペプチド等を用いることが可能となる。具体的には、細胞周期や細胞増殖の研究用試薬・薬剤等として、本発明に係る遺伝子及び／又はポリペプチドを用いることができる。
【００５５】
また、本発明に係る遺伝子及びポリペプチドは、タバコだけでなくシロイヌナズナでも見出されており、さらにはマウス、ヒト、ショウジョウバエでも見出されている。従って、本発明に係る遺伝子に類似する塩基配列のＤＮＡは、幅広い種のゲノム中で保存されていることが示唆される。
【００５６】
それゆえ、本発明に係る遺伝子により、細胞増殖を制御することが可能となる植物としては、タバコに限定されるものではなく、幅広い種類の植物を用いることができる可能性は非常に高い。従って、本発明には、少なくとも本発明に係る遺伝子を導入してなるトランスジェニック植物も含まれる。
【００５７】
上記トランスジェニック植物では、本発明に係る遺伝子が発現するため、細胞増殖を有効に制御することが可能となる。それゆえ、植物細胞の増殖を持続させることができれば、植物の活発な生長を維持することができ、その結果、より多くのバイオマスの生産が可能となる。一方、植物の増殖を停止させることができれば、植物の代謝を、細胞増殖から物質生産に変換させることが可能となり、より多くの有用物質を生産することが期待される。
【００５８】
従って、本発明を好適に応用できる分野の一つとして、各種農作物として利用される植物の増殖や、当該植物により生産される各種天然化合物の生産等に利用する用途を挙げることができる。
【００５９】
本発明において、本発明に係る遺伝子を導入する宿主細胞としては、各種植物を挙げることができるが、特に限定されるものではない。また、上記植物には、完全な植物だけでなく、その一部、例えば、葉、種子、塊茎、挿木等を含めてもよい。さらには、上記植物には、予め形質転換された遺伝子組み換え植物やその子孫を起源とする植物組織、プロトプラスト、細胞、カルス、器官、植物種子、胚芽、花粉、卵細胞、接合子などの増殖可能な植物材料；花、茎、実、葉、根などを含む植物の一部；等も含めてよい。なお、上記植物材料は、有性的又は無性的にｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏで繁殖可能なものを指す。もちろん、植物以外の細胞に本発明に係る遺伝子を導入することも可能である。
【００６０】
本発明において、植物に対して本発明に係る遺伝子を導入する方法としては、当該遺伝子を含むベクターを用いて、宿主細胞すなわち上記植物を形質転換することによって導入する方法を用いることが可能である。
【００６１】
上記ベクターは、公知の形質転換方法によって植物（宿主細胞）に導入される。植物を形質転換する方法としては、具体的には、たとえば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウムによる形質転換法、直接遺伝子転移法、弾道粒子加速法、プロトプラスト形質転換／再生法などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。また、上記形質転換方法としては、標的となる植物の種類、たとえば単子葉植物・双子葉植物などに応じて適宜選択されるものであり、特に限定されるものではない。
【００６２】
また、本発明に係る遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いても良い。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーを含むプラスミド等を、本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターとともに宿主細胞へ導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することが出来る。
【００６３】
本発明では、植物中で上記遺伝子を安定して発現させる等の目的で、上記異遺伝子を組み換えてなる組み換えベクターを用いても構わない。なお、上記組み換え方法については、従来公知の方法を用いることが可能であり、特に限定されるものではない。上記ベクターとしては、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを挙げることができるが特に限定されるものではない。
【００６４】
たとえば、上記組み換えの一例としては、プロモーター・シグナル配列・転写ターミネーター等の適切な調節配列と本発明に係る遺伝子とを連結するような例が挙げられる。上記植物又は植物細胞中で有効に機能し得るプロモーターとしては、たとえばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９ＳＲＮＡプロモーター又は３５ＳＲＮＡプロモーター及びＣａＭＶ二重プロモーター；ノパリンシンターゼプロモーター；病因関連（ＰＲ）タンパク質プロモーター：等が挙げられるが特に限定されるものではない。
【００６５】
導入された本発明に係る遺伝子は、植物細胞中でベクターとして存在してもよいし、植物ＤＮＡ中に「外部」ＤＮＡ、又は「付加」ＤＮＡとして含まれてもよい。ここで言う「外部」ＤＮＡとは、植物ゲノム中には天然に存在しないが人為的操作の結果、植物ゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。また上記「付加」ＤＮＡとは、特定の植物ゲノム中に天然に存在するが、人為的操作の結果、さらに追加して植物ゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。
【００６６】
上記ベクターとして、一般的に用いられるものとしては、たとえば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドを挙げることができる。このＴｉプラスミドは、双子葉植物の形質転換にも単子葉植物の形質転換にも用いることが可能である。この場合、本発明に係る遺伝子は、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡに組み込まれた上で植物細胞に導入される。
【００６７】
上記Ｔｉプラスミドを植物細胞に導入する方法としては、特に限定されるものではなく、Ｔｉプラスミドを「完全な」植物に感染させる、上記植物材料に感染させる、あるいは、植物細胞をプロトプラスト化又はスフェロプラスト化して、これをアグロバクテリウム・ツメファシエンスと共に同時培養する等の方法を用いることが可能である。
【００６８】
また、本発明では、本発明に係る遺伝子を、植物細胞のゲノムに導入し、その植物細胞から形質転換された「完全な」植物（形質転換植物）を再生して、必要なら増殖させ、さらに、親世代又は継代される子孫世代として得られる形質転換植物から、植物の所望の一部、たとえば種子を得るような手法を用いることも可能である。なお、上記完全な植物の増殖には、水耕栽培や温室栽培等を含む、一般的な従来公知の農業の方法を利用すればよい。
【００６９】
また、本発明に係る遺伝子及びポリペプチド等は、植物研究用の各種試薬だけでなく、各種アグリビジネスに用いられる各種薬剤として応用することが可能である。
【００７０】
本発明に係る遺伝子やポリペプチド等の薬剤化については、従来公知の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば研究用試薬の場合、本発明に係る遺伝子を形質転換キット化したり、本発明に係る細胞増殖制御因子（ポリペプチド）を異種発現系で大量生産し精製したりすればよい。
【００７１】
同様に、本発明に係るポリペプチドに対する抗体の生産方法も特に限定されるものではなく、例えば、本発明に係る１Ｈ０２ペプチドや２Ａ０３タンパク質それ自体、又はその部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることが出来る。
【００７２】
また、本研究に係る遺伝子の一部配列をプローブやプライマーとして用いることが出来る。上記一部配列とは、上記１Ｈ０２遺伝子、２Ａ０３遺伝子、及び２Ｂ０５遺伝子に含まれる特徴的・特異的な配列であればよい。このようにプローブとして用いる場合としては、例えば、本発明に係る遺伝子の一部配列をチップ上に固定してＤＮＡチップ（マイクロアレイを含む）を構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査、診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００７３】
（４）本発明に係る遺伝子及びタンパク質の取得方法
本発明に係る上記１Ｈ０２遺伝子、２Ａ０３遺伝子、及び２Ｂ０５遺伝子の取得方法は、活発に分裂・生長している培養細胞から、従来公知の手法を用いて、細胞増殖制御遺伝子を単離する方法であれば特に限定されるものではない。
【００７４】
本発明においては、前述したように、植物の培養細胞を新鮮な培地へ移し変えて培養した後、１２時間という極めて早い培養時期に発現する遺伝子を単離することが好ましく、葉緑体の分裂因子の１つであるＦｔｓＺ遺伝子を指標として、その発現と同調的に発現する遺伝子をサブトラクション法により濃縮し、さらに、その発現を解析することにより、培養初期に特異的に発現する遺伝子を単離することがより好ましい。
【００７５】
また、本発明に係るポリペプチドをコードするｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを作製し、各種植物のゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記１Ｈ０２ペプチドや２Ａ０３タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００７６】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作製及びその塩基配列の決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００７７】
また、上記プローブの配列を、上記１Ｈ０２ペプチドや２Ａ０３タンパク質をコードするｃＤＮＡの機能上重要と考えられる領域（エンテロトキシン様配列、３回幕貫通領域配列等）の中から選択し、各種植物やその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、１Ｈ０２ペプチドや２Ａ０３タンパク質と同等の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
【００７８】
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記１Ｈ０２遺伝子、２Ａ０３遺伝子、２Ｂ０５遺伝子の塩基配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いて植物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含む断片を大量に取得できる。
【００７９】
本発明に係るポリペプチドを取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記１Ｈ０２遺伝子又は２Ａ０３遺伝子等）を導入した組み換え発現ベクター作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞等に組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、上記１Ｈ０２ペプチド、２Ａ０３タンパク質等の本発明に係るポリペプチドを容易に取得する事が出来る。
【００８０】
上記１Ｈ０２ペプチドや２Ａ０３タンパク質の変異体を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，　Ｇｅｎｅ　１５２，　２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法等を利用して塩基配列に点変異を導入し変異ポリペプチドや変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの公知の変異タンパク質作製法を用いて、上述のようにして取得された遺伝子の塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することが出来る。また、変異体の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００８１】
【実施例】
以下の実施例では、本発明に係る１Ｈ０２遺伝子、２Ａ０３遺伝子、及び２Ｂ０５遺伝子をタバコ培養細胞から取得した具体的な方法、及び本発明に係る上記遺伝子の発現を調べた結果について、順番に説明する。
【００８２】
〔実施例１〕：培養初期のタバコ培養細胞に特異的に発現する遺伝子ライブラリーの作成
培養初期のタバコ培養細胞に特異的に発現する遺伝子ライブラリーを作成するために、ＰＲ−Ｓｅｌｅｃｔ　ｃＤＮＡ　Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）によるｃＤＮＡサブトラクション法を用いた。ｃＤＮＡ合成には培養開始から１２時間後と１０日後のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ．　Ｓａｍｓｕｎ　ＮＮ）培養細胞ＮＩ株から抽出したｍＲＮＡを用いた。
【００８３】
タバコＮ１培養細胞を、チアミン、イノシトールの濃度を２倍にしたＬＳ培地で２週間周期にて振盪培養し、培養開始から１２時間後と１０日後にサンプリングし、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡの精製にはｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いた。各サンプル約２ｇから全量でおよそ２０μｇのｍＲＮＡを精製した。逆転写反応及びＰＣＲによる増幅は、ＳＭＡＲＴ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて行った。なお、マニュアルでは制限酵素ＲｓａＩで処理した後にフェノール処理を行っているが、今回はＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。
【００８４】
サブトラクションには、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ　ｃＤＮＡ　Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いた。前記方法で得たｃＤＮＡを用い、キットに付属のマニュアルに従ってｃＤＮＡサブトラクションを行った。
【００８５】
具体的には、ＴｅｓｔｅｒとＤｒｉｖｅｒを入れ替えて２回のｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行い、それぞれ培養開始から１２時間後に特異的な遺伝子、１０日後に特異的な遺伝子の濃縮を行った。なお、ＰＣＲによる増幅は、培養開始から１２時間後のサンプルでは１７サイクル、１０日後のサンプルでは１５サイクルで行った。また、特異的遺伝子の濃縮が起こらないようにアダプターを結合したｃＤＮＡも同様にＰＣＲを行い、コントロールとした。
【００８６】
それぞれのＰＣＲ産物を、β−アクチン遺伝子をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った結果、サブトラクションによって特異的遺伝子の濃縮が行われていることが示された。
【００８７】
〔実施例２〕：培養初期のタバコ培養細胞に特異的に発現する遺伝子の塩基配列の決定と選択
まず、前記実施例１で得られたサブトラクションライブラリーに目的とする遺伝子が存在するかを確認するために、ｃＤＮＡを大腸菌にサブクローニングし、それら遺伝子の発現をマクロアレイ法で解析した。
【００８８】
前記サブトラクションライブラリーをもとに、ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ反応を行い、全量で約１μｇのＰＣＲ産物を得た。これに、２００ｎｇのｐＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ社）を加え、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．　２（宝酒造社）を用いてライゲーションした。このプラスミドを大腸菌ＸＬ−１０−Ｇｏｌｄ　ｕｌｔｒａｃｏｍｐｉｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）にヒートショック法で導入し、ＬＢ寒天培地（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　１００μｇ／ｍｌ）で、１晩培養し、約５，０００個のコロニーを得た。
【００８９】
このプラスミドライブラリーを導入した大腸菌（ＸＬ−１０　Ｇｏｌｄ）を、ＩＰＴＧ　８００μｇ，Ｘ−Ｇａｌ　８００μｇを含むＬＢ寒天培地（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　１００μｇ／ｍｌ）で発色により選抜し、液体培養したのち、Ｍ１３Ｍ４　ｐｒｉｍｅｒとＭ１３ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　を用いてインサートＤＮＡの増幅を行った。
【００９０】
増幅したＰＣＲ産物をＳｕｂ−Ｃｅｌｌ　ＧＴ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯＲＡＤ社）を電気泳動したのち、キャピラリートランスファーによってメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｈｙｂｏｎｄ　Ｎ＋）にブロッティングした。これらメンブレンに対し、培養開始から１２時間後と１０日後のタバコ培養細胞から抽出したｍＲＮＡを元に作製したｃＤＮＡをプローブとして、その発現を確認した。
【００９１】
マクロアレイによってシグナルが検出できたクローンのうち、３６％（３０６クローン中１１１クローン）程度の割合で、培養開始から１２時間後に高い発現を示すものがあった。一方、シグナルの検出されなかったクローンも多く存在し、これらにおいてもほぼ同等の割合で、培養開始から１２時間後に高い発現を示すクローンが存在すると考えられた。これにより、マクロアレイで陽性と認められたクローンと同時に、これらシグナルが検出できなかったクローンについても解析（塩基配列決定）を行った。
【００９２】
〔実施例３〕：サブトラクションライブラリーの塩基配列決定
大腸菌にサブクローニングしたｃＤＮＡクローンを、前記実施例２で説明したようにＰＣＲで増幅し、このＰＣＲ産物を用いて塩基配列決定を行った。塩基配列決定にはＭｅｇａＢＡＣＥ　１０００　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いた。シークエンスケミストリーにはＤＹＥｎａｍｉｃ　ＥＴ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｆｏｒ　ＭｅｇａＢＡＣＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用い、プライマーはＭ１３Ｍ４又はＭ１３　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒを用いた。ＭｅｇａＢＡＣＥ　１０００の操作は付属のマニュアルに従って行った。
【００９３】
得られた配列情報をもとに、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸの相同検索プログラムを用いて、ＤＤＢＪのデータベースに登録されている遺伝子、タンパク質との相同検索を行った。
【００９４】
サブトラクションライブラリーにはリボソームタンパク質等のタンパク質合成に関わる遺伝子が非常に多く存在し、それに次いでストレス耐性、細胞分裂に関わる遺伝子が多いことがわかった。そこで、機能未知の遺伝子のうち、十分な長さの塩基配列（２２０〜５１２ｂｐ）が得られているものに関して、常法に従い、ノザン解析を行い、図１（ａ）〜（ｆ）に示すように、培養開始から１２時間後の培養細胞で特に顕著な発現を示す機能未知遺伝子のクローン５種類を同定した。各クローンの名称を、２Ａ０３遺伝子（図１（ａ））、１Ｈ０２遺伝子（図１（ｂ））、２Ｂ０５遺伝子（図１（ｃ））、２Ａ１０遺伝子（図１（ｄ））、２Ｄ０４遺伝子（図１（ｅ））、２Ｆ０４遺伝子（図１（ｆ））とした。
【００９５】
これら遺伝子のうち、２Ａ０３遺伝子、２Ｂ０５遺伝子、１Ｈ０２遺伝子を用い、再度、培養細胞　（０日、１／４日、１／２日、２日、５日、１０日、１４日）、及びタバコ植物体（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ．　Ｓａｍｓｕｎ　ＮＮ）における発現解析を行った。
【００９６】
その結果、図２に示すように、特に、１Ｈ０２遺伝子については、培養開始から０時間から６時間の間に急激に発現の増加がみられ、６時間よりも早い時期に強い発現誘導がかかっていることが明らかとなった。
【００９７】
また、図２に示すように、２Ａ０３遺伝子及び２Ｂ０５遺伝子は、上位葉及び根でも強く発現しており、植物体においてもＦｔｓＺ遺伝子に近い発現パターンを示すことが明らかとなった。
【００９８】
さらに、１Ｈ０２遺伝子は、培養後短時間で強い発現誘導がかかることが明らかとなった。そこで、培地に含まれるオーキシン（ＮＡＡ）、サイトカイニン（ｋｉｎｅｔｉｎ）、スクロースのうち、何れに対して応答するのかを確認するため、それぞれの因子を除いた培養培地に細胞を移植・培養して検討した。その結果、図３（ａ）・（ｂ）に示すように、オーキシンのみに応答することが明らかとなった。
【００９９】
〔実施例４〕：得られた候補遺伝子の全長塩基配列決定
前述した実施例で用いた、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ　ｃＤＮＡ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔでは、ｃＤＮＡをＲｓａＩで切断することで、ｃＤＮＡの長さをそろえ、サブトラクション効率が均一になるように設計されている。従って、上述の単離遺伝子もＲｓａＩで切断されたものであるため、ｃＤＮＡ全長の塩基配列を決定し直す必要が生じた。
【０１００】
そこで、サブトラクションによってすでに得られているｃＤＮＡの部分配列をもとにＰＣＲプライマーを設計し、ｃＤＮＡライブラリーから３’，５’ＲＡＣＥ法により３’末端及び５’末端の塩基配列の増幅を行った。
【０１０１】
ＰＣＲの鋳型に用いるｃＤＮＡライブラリーには、ＳＭＡＲＴ　ＰＣＲ　ｃＤＮＡ　ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて培養開始から１２時間後の培養細胞から作製したものを用いた。このｃＤＮＡには、ＳＭＡＲＴ　ＩＩ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　（ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧ）と呼ばれるＡｄａｐｔｏｒ配列が５’末端に付加され、この部分と内部配列とでＰＣＲプライマーを設計することで、５’末端配列を増幅することができる。すでに得られているｃＤＮＡの部分配列をもとに内部プライマーを設計した。Ａｄａｐｔｏｒ配列にアニールするプライマーはキットに付属のＰＣＲ　Ｐｒｉｍｅｒ（ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ）を用いた。
【０１０２】
得られたＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲルで電気泳動し、最もよく増幅されている部分を切り出し、それをｐＴ７　Ｂｌｕｅ　Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ　（Ｎｏｖａｇｅｎｅ社）にサブクローニングし、大腸菌ＤＨ５α株に導入した。得られたコロニーをテンプレートにして内部プライマーでコロニーＰＣＲを行い、目的のサイズとなるバンドの増幅がみられたコロニーについてプラスミドを抽出し、インサート部の塩基配列を決定した。得られた塩基配列を、すでに明らかとなっている部分塩基配列と比較し、目的の遺伝子の末端配列が増幅されていることを確認した。これらの塩基配列をつなぎ合わせ、ｃＤＮＡ全長の配列とした。
【０１０３】
本実施例では、配列番号１及び３に示すように、１Ｈ０３遺伝子及び２Ａ０３遺伝子を対象に全長塩基配列を決定したが、他の遺伝子の塩基配列に対しても同様にクローニングすることが可能である。例えば、配列番号５〜８に、それぞれ、２Ｂ０５遺伝子、１Ａ０９遺伝子、２Ａ１０遺伝子、２Ｄ０４遺伝子の塩基配列を示す。
【０１０４】
得られた全長配列をもとにＯＲＦを予測したところ、１Ｈ０２遺伝子では十分な長さのＯＲＦを見出すことができなかったが、配列の中に耐熱性エンテロトキシン（細菌性毒素）の保存されるモチーフ配列を持つものがあった。近年、植物の遺伝子発現調節においてペプチド性の分子の関与が報告されてきており（例えば、文献Ｌｉｎｄｓｅｙ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．　７：　７８−８３　（２００２）等）、１Ｈ０２遺伝子も新規なペプチド性ホルモン分子として、細胞増殖制御に関与することが考えられる。
【０１０５】
一方、２Ａ０３遺伝子の全長塩基配列を決定した結果、コードされている２Ａ０３タンパク質は分子量約１９，０００であり、三回膜貫通型と予測された。シロイヌナズナにも、２Ａ０３遺伝子と相同性を有する遺伝子が存在し、全体に高い相同性を示すとともに、いずれもプラスチド移行シグナル配列と思われる部位をもっていた。
【０１０６】
また、マウス、ヒト、ショウジョウバエにも２Ａ０３遺伝子と部分的に高い相同性を持つ遺伝子が存在したが、そのいずれも、プラスチド移行シグナル部分を欠いており、かつ、遺伝子機能は不明である。なお、データベースを参照すると、これら動物細胞由来の遺伝子は広範囲の組織からｃＤＮＡが得られており、ＰＳＯＲＴではゴルジ体や小胞体に局在すると予測された。また、２Ａ０３遺伝子の植物体における発現をさらに解析した結果、２Ａ０３遺伝子は、最も生長点に近い若い葉で非常に強く発現していることが示され、生長との関係が強く示唆された。
【０１０７】
【発明の効果】
以上のように、本発明に係る遺伝子、ポリペプチド等は、植物細胞の増殖に大きく関与しているため、細胞増殖に特異的な遺伝子発現調節因子を単離することが可能であるとともに、特異性の高い指標遺伝子としての利用できるという効果を奏する。
【０１０８】
また、本発明に係るポリペプチド及びその遺伝子は、植物細胞の増殖に大きく関与していることから、植物の細胞増殖（あるいは細胞周期）を人為的に制御することに利用することが可能である。それゆえ、植物の各種研究における試薬等の薬剤として用いることができるだけでなく、広くアグリビジネス産業にも利用することが可能であるという効果を奏する。
【０１０９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）〜（ｆ）は、本発明に係る遺伝子である、２Ａ０３遺伝子、１Ｈ０２遺伝子、２Ｂ０５遺伝子、２Ａ１０遺伝子、２Ｄ０４遺伝子、２Ｆ０４遺伝子において、ノーザンブロッティング解析による培養初期特異的発現を示す図である。
【図２】培養０〜１４日の培養細胞、並びにタバコ植物体の上位葉、下位葉、及び根における２Ａ０３遺伝子、１Ｈ０２遺伝子、２Ｂ０５遺伝子の発現を示す図である。
【図３】（ａ）・（ｂ）は、本発明に係る１Ｈ０２遺伝子の培地中成分に依存する発現誘導の結果を示す図である。
【図４】本発明に係る１Ｈ０２ペプチドのアミノ酸配列を示す図である。なお、枠線で囲った配列はエンテロトキシン様配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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