(57)【要約】【課題】低免疫原性及び腫瘍組織への高浸潤性、安価な大量製造が可能であること、及び、遺伝子工学を利用した機能改変が容易であること等の優れた特性を有し、且つ、特にスーパー抗原を含んでいなくとも、効果及び投与後の安定性等の点で優れた、ダイアボディ型二重特異性抗体を提供すること。【解決手段】ヒト上皮細胞成長因子受容体に対する第一の特異性、及び食作用又は細胞障害活性を有する細胞で発現される表面抗原に対する第二の特異性を有することを特徴とする、ダイアボディ型二重特異性抗体、該抗体を構成する２本の一本鎖ポリペプチドのいずれか一方の一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域、それらをコードする核酸、該核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター、及び、該ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、それらを含有する医薬組成物。【選択図】  図１０
2004242638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト上皮細胞成長因子受容体に対する第一の特異性、及び食作用又は細胞障害活性を有する細胞で発現される表面抗原に対する第二の特異性を有することを特徴とする、ダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項２】
ヒト上皮細胞成長因子受容体がヒト上皮細胞成長因子受容体１（ＨＥＲ１）である、請求項１記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項３】
食作用又は細胞障害活性を有する細胞が細胞障害性Ｔ細胞である、請求項１又は２記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項４】
細胞障害性Ｔ細胞で発現される抗原がＣＤ３である、請求項１、２又は３に記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項５】
第一の特異性が抗ヒト上皮細胞成長因子受容体抗体５２８のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域に由来するものである、上記請求項のいずれか一項に記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項６】
第二の特異性が抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域に由来するものである、上記請求項のいずれか一項に記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項７】
ヒト型化抗体であることを特徴とする、上記請求項のいずれか一記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項８】
可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウス抗体由来であり、その他の部分がヒト抗体由来であることを特徴とする、請求項７記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項９】
ヒト型化抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３由来の可変領域において図２１に示されたアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の少なくとも一つのＣＤＲを有し、且つ、ヒト型化抗ヒト上皮細胞成長因子受容体抗体５２８由来の可変領域における図２２に示されたアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の少なくとも一つのＣＤＲを有することを特徴とする、請求項８記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項１０】
ヒト型化抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３由来の可変領域において図２１に示されたアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有し、且つ、ヒト型化抗ヒト上皮細胞成長因子受容体抗体５２８由来の可変領域における図２２に示されたアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有することを特徴とする、請求項９記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項１１】
ヒト型化抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３由来のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域が図２１に示されたアミノ酸配列有し、且つ、ヒト型化抗ヒト上皮細胞成長因子受容体抗体５２８由来のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域が図２２に示されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１０記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項１２】
ＣＤＲ構造に影響を与える可能性があるフレームワーク（ＦＲ）において部位特異的変異を有する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のダイアボディ型二重特異性抗体。
【請求項１３】
２種類の一本鎖ポリペプチドから構成される請求項１〜１２のいずれか一項に記載のダイアボディ型二重特異性抗体のいずれか一方の一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域を構成するポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載の一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域をコードする核酸。
【請求項１５】
核酸が発現される宿主細胞における至適コドンを有する、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
大腸菌に対する至適コドンを有する、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項１８】
プラスミドベクターである、請求項１７記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１７又は１８記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
大腸菌である請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１９記載の宿主細胞を培養して宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、請求項１３に記載の一本鎖ポリペプチドを回収し、精製することを特徴とする請求項１３に記載の一本鎖ポリペプチドの製造方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法で得られた一本鎖ポリペプチドを会合せしめ、形成された請求項１〜１２のいずれか一記載のダイアボディ型二重特異性抗体を分離して回収することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載のダイアボディ型二重特異性抗体の製造方法。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のダイアボディ型二重特異性抗体、  請求項１３記載の一本鎖ポリペプチド、  請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の核酸、  請求項１７又は１８記載のベクター、  及び請求項１９又は２０記載の宿主細胞から成る群から選ばれたものを有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２４】
腫瘍細胞を排除する、殺傷する、傷害する及び／又は減少せしめるためのものであることを特徴とする請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
食作用又は細胞障害活性を有する細胞におけるサイトカインの生産量を増加させるためのものであることを特徴とする請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体を有効成分とすることを特徴とする請求項２３、２４又は２５記載の医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のダイアボディ型二重特異性抗体を食作用又は細胞障害活性を有する細胞及びヒト上皮細胞成長因子受容体を発現する腫瘍細胞の培養系に添加することにより、食作用又は細胞障害活性を有する細胞におけるサイトカインの産生量を増加させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌特異的免疫療法に使用することのできるダイアボディ型二重特異性抗体、それを構成する一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域、該ポリペプチドをコードする核酸、該抗体の製造方法、及び、それらの医薬として用途等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌（悪性腫瘍）  に対する主な治療法として、外科的除去、化学療法、放射線療法、及び免疫療法等が組み合わされて用いられている。この中で、免疫療法は未だ開発途上ではあるが多くの可能性を秘めており、これからの進展が期待されている。
【０００３】
癌特異的免疫療法は、癌細胞にのみ細胞傷害活性が働く治療法のことを指す。抗体と細胞傷害活性を示す薬物とを結合させ、薬物に標的指向性を持たせるもので、現在ではミサイル療法とも呼ばれる。現在、癌細胞において異常に発現している物質または細胞の癌化に伴い多少の変化が起こる物質を標的にして、副作用を最小限にして抗体の能力を発揮できる抗原を使用するといった方向で研究が進められている。このような抗原は癌関連抗原と呼ばれる。
【０００４】
多重特異性抗体のうちの一つである二重特異性抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＢｓＡｂ）は２つの異なる抗原に対して特異的に結合することが可能であるため、この特性を生かして特異的な抗腫瘍効果を持った治療薬としての利用法が可能であるとして、その研究が盛んに行われている。ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）とはこのような二重特異性抗体の最小単位であり、それぞれ同じ親抗体由来の重鎖（Ｈ鎖）の可変領域（Ｖ領域）（「ＶＨ」と表わされる）と軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域（Ｖ領域）（「ＶＬ」と表わされる）ＶＬとが互いに非共有結合によりヘテロ二量体を形成するという性質を利用し考案されたものである（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０，  ６４４４−６４４８，  １９９３）。
【０００５】
このようなダイアボディ型二重特異性抗体の特徴としては、低分子（分子量約６０，０００）であることによる低免疫原性及び腫瘍組織への高浸潤性、更には、例えば、大腸菌等の微生物を利用した安価な大量製造が可能であること、又、遺伝子工学を利用した機能改変が容易であることを挙げることができる。
【０００６】
従って、癌に対する従来の治療法における諸問題、特に、組織が入り組んだ部位にある癌細胞を完全に除去することは困難で、外科的に切除した後残った癌細胞の除去方法がないという問題を解決するにあたり、このようなダイアボディ型二重特異性抗体が有望視されており、その開発が切望されている。
【０００７】
これまでにも、ダイアボディ型二重特異性抗体の例として、癌関連抗原の一種であり腺細胞上に多く見られる糖蛋白質であるＭＵＣ１に対する抗体と抗ＣＤ３抗体に由来する二重特異性を有し、更に、細菌性エンテロトキシン等のスーパー抗原が抗体の可変領域と同一のポリペプチドに含まれている、融合タンパク質が開発されている（特許文献１）。
【０００８】
【特許文献１】
国際公開第ＷＯ２／０６４８６号パンフレット
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来、微生物を利用して製造された組換え蛋白質であるダイアボディ型二重特異性抗体は、化学合成された二重特異性抗体と較べて、効果及び投与後の安定性等の点で劣る場合があり、同程度の効果を得るには、高濃度の二重特異性抗体を含有する製剤を製造しなくてはならない等の解決すべき課題があった。
【００１０】
一方、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は細胞膜結合型の糖蛋白質であり、その一種であるＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ−２）  に対して特異的な抗体を単独で使用した場合に、乳癌患者の約２割で腫瘍の縮体等の効果が既に報告されている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の問題点を克服し更に優れた効果を有するダイアボディ型二重特異性抗体を作製すべく鋭意研究の結果、これまでに開発されたダイアボディ型二重特異性抗体及び化学合成された二重特異性抗体に比し、特にスーパー抗原を含んでいなくとも非常に低濃度でも顕著な効果を示すことが出来るダイアボディ型二重特異性抗体を作製することに成功した。更に、このヒト型化抗体も得ることが出来た。本発明は、かかる成果に基づき完成したものである。
【００１２】
即ち、本発明は第一の態様として、ヒト上皮細胞成長因子受容体に対する第一の特異性、及び食作用又は細胞障害活性を有する細胞で発現される表面抗原に対する第二の特異性を有することを特徴とする、ダイアボディ型二重特異性抗体に係る。
第二の態様として、ダイアボディ型二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドのいずれか一方の一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域を構成するポリペプチドに係る。
第三の態様として、該一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域をコードする核酸に係る。
第四の態様として、該核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクターに係る。
第五の態様として、該ベクターで形質転換された宿主細胞に係る。
第六の態様として、上記形質転換された宿主細胞を培養し宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、請求項１３に記載の一本鎖ポリペプチドを回収し、精製することを特徴とする上記一本鎖ポリペプチドの製造方法に係る。
第七の態様として、上記一本鎖ポリペプチドを会合せしめ、形成されたダイアボディ型二重特異性抗体を分離して回収することを特徴とするダイアボディ型二重特異性抗体の製造方法に係る。
第八の態様として、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体、一本鎖ポリペプチド、核酸、ベクター、及び宿主細胞から成る群から選ばれたものを有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物に係る。
第九の態様として、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を食作用又は細胞障害活性を有する細胞及びヒト上皮細胞成長因子受容体を発現する腫瘍細胞の培養系に添加することにより、食作用又は細胞障害活性を有する細胞におけるサイトカインの産生量を増加させる方法に係る。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本明細書において、「ダイアボディ型二重特異性抗体」とは、二つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントであり且つ小さなフラグメントであるものを指し、該フラグメントは、Ｈ鎖の可変領域（ＶＨ）に結合するＬ鎖の可変領域（ＶＬ）をその同じポリペプチド鎖  （ＶＨ−ＶＬ）  中に含有しているものである。代表的なダイアボディは、同一の鎖の上にある該二つのドメインの間ではその対合を形成するには短すぎる長さのリンカーを使用することにより、そのドメインを別の鎖の相補性のドメインと対合せしめ、二つの抗原結合部位を作り出すものである。ダイアボディ及びその製造技術については、米国特許第４，７０４，６９２  号明細書；米国特許第４，９４６，７７８  号明細書；米国特許第５，９９０，２７５  号明細書；米国特許第５，９９４，５１１  号明細書；米国特許第６，０２７，７２５  号明細書；ＥＰ  ４０４，０９７；  ＷＯ９３／１１１６１；  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ６４４４−６４４８  （１９９３）  を参照することができ、これらの文献における開示の内容はそれらを参照することにより本明細書の内容に含まれる。
【００１４】
より具体的には、「ダイアボディ型二重特異性抗体」とは、例えば、上記特許文献１の図２に記載されているように、（１）  第一の抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位（ａ）  と第二の抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位（ｂ）  とを同一のペプチド鎖上に有する第一のポリペプチド（ｉ）、及び（２）  第一の抗体のＬ鎖の可変領域の抗原結合部位（ｃ）  と第二の抗体のＨ鎖の可変領域の抗原結合部位（ｄ）とを同一のペプチド鎖上に有する第二のポリペプチド（ｉｉ）を含有し、異なる二種の抗原認識能を有する融合蛋白質を意味する。
【００１５】
従って、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体において、上記の第一の抗体はヒト上皮細胞成長因子受容体に抗体であり、第二の抗体は食作用又は細胞障害活性を有する細胞で発現される抗原に対する抗体である。本明細書の実施例で示されるように、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体は、インビボ及びインビトロにおいて優れた細胞障害活性を有するものである。
【００１６】
これら各抗体を産生する動物種に特に制限はないが、通常、ヒト、マウス及びラット等の哺乳類に由来するものである。更に、抗体の構造にも特に制限はないが、ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体は単一の抗原部位を認識し且つそれに対する特異性が高い為に、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を製造する上で好適である。
【００１７】
ヒト上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦ受容体）は、ＥＧＦファミリーの受容体であり、約１７０ｋＤａの糖蛋白質である。これまでに、ＨＥＲ−１／Ｅｒｂ１、ＨＥＲ−２／Ｅｒｂ２，ＨＥＲ−３／Ｅｒｂ３及びＨＥＲ−４／Ｅｒｂ４の４種類が同定されている。ここで、ＨＥＲ−２は腺癌（肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌、及び卵巣癌）の３０〜４０％で発現している。一方、ＨＥＲ−１／Ｅｒｂ１は、頭頚部癌で８０％＞、乳癌で１４〜９１％、非小細胞肺癌で４０〜８０％、大腸癌で２５〜７７％、膵臓癌で３０〜５０％、前立腺癌で４０〜８０％、卵巣癌で３５〜７０％、胃癌で３３〜７４％の割合で発現が認められている。このように、ＥＧＦ受容体はヒト癌表面抗原又は癌関連抗原である。
【００１８】
従って、本発明において「ヒト上皮細胞成長因子受容体」とは、これまでに同定された少なくとも上記の４種類のＥＧＦ受容体が含まれる。ヒト上皮細胞成長因子受容体に対する抗体は当業者に公知であるが、それらの中でも、本発明においては、ヒト上皮細胞成長因子受容体１（Ｈｅｒ１）に対する第一の特異性を有するダイアボディ型二重特異性抗体が好適である。このような特異性を提供できる抗体の一例としてマウスＢ細胞ハイブリドーマ５２８が産生するモノクローナル抗体である抗ヒト上皮細胞成長因子受容体抗体５２８を挙げることが出来る。従って、本発明の好適例において、第一の特異性が抗ヒト上皮細胞成長因子受容体抗体５２８のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域（図１）に由来する。
【００１９】
本明細書おいて「食作用又は細胞障害活性を有する細胞」の例としては、例えばＮＫ細胞、マクロファージ、Ｔ−ＬＡＫ  細胞などのＴ細胞などが挙げられ、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞として知られたＴ−ＬＡＫ  細胞である。該細胞で発現される表面抗原としては、例えばＣＤ２，  ＣＤ３，  ＣＤ４，  ＣＤ５，  ＣＤ６，  ＣＤ８，  ＣＤ１６，  ＣＤ２８，  ＣＤ４４などが挙げられ、好ましくは細胞障害性Ｔ細胞で発現されるＣＤ３  が挙げられる。
【００２０】
このような表面抗原に対するモノクローナル抗体としては、当業者に公知のＯＫＴ３，  Ｔ３，  Ｌｅｕ４，  Ｔ１１，  ＯＫＴ１１，  Ｌｅｕ５ｂ，  ＮＵ−Ｔ１，  Ｔ４，  ＯＫＴ４，  Ｌｅｕ３ａ，  ＮＵ−ＴＨ／Ｉ，  Ｔ８，  ＯＫＴ８，  Ｌｅｕ２ａ，  ＮＵ−Ｔｓ／ｃなどが挙げられ、好ましくはＯＫＴ３，  Ｔ３，  Ｌｅｕ４などが挙げられる。従って、本発明の好適例において、第二の特異性は抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域に由来する。
【００２１】
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体の可変領域を提供する抗体としては、上記に挙げた当業者に公知の市販されている各種の抗体に加えて、ヒト上皮細胞成長因子受容体、又は、食作用又は細胞障害活性を有する細胞で発現される表面抗原を免疫原として用いて、当業者に周知の各種方法で作成することが出来る。
【００２２】
例えば、ポリクローナル抗体であれば、マウス等の動物の体内にこれらの免疫原及び必要に応じてアジュバントを複数回、皮下及び腹腔内等の適当な径路で注射することによって、動物の体内に生成せしめることが出来る。
【００２３】
一方、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：  ４９５（１９７５）により最初に記述されたハイブリドーマ法を使用して実質的に均質な抗体の母集団から得られるし、あるいは組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７  号明細書）によって作ることができる。
【００２４】
更に、別法としては、トランスジェニック動物（例えばマウス）を作成して、この体内でヒト抗体を産生させることが可能である（例えば、Ｄｕｃｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８  （１９９２）；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ２５５１  （１９９３）；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：  ２５５−２５８（１９９３）；  Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７：  ３３  （１９９３）参照）。また、ヒト抗体はファージ・ディスプレイライブラリーから誘導することもできる  （Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：  ５８１−５９７  （１９９１）；  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：  ３８１  （１９９１）；  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １３０：  ４１−６８  （１９９２）；  Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １４：  ３０９  （１９９６））。
【００２５】
上記の抗体を得るための更なる方法として、抗体または抗体断片は、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４８：  ５５２−５５４（１９９０）  に記載されている技術を使用して抗体ファージライブラリーから、単離することができる  （Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：  ６２４−６２８  （１９９１）及びＭａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：  ５８１−５９７（１９９１）  には、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の単離についてのそれぞれの記載がある）  。適当な抗体または抗体断片を選択するためには、上記抗原を使用して行うことができる。さらには、チェイン・シャッフリング法（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）  によって高親和性（ｎＭのオーダーの範囲）のヒト抗体を産生したり（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：  ７７９−７８３  （１９９２））  、極めて大きいファージライブラリーを構築するための手法として、組合せ感染  （ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）及びインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２１：  ２２６５−２２６６  （１９９３））  なども知られている。
【００２６】
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を構成する２つのポリペプチドの少なくとも一方において、Ｈ鎖の可変領域とＬ鎖の可変領域とを連結するリンカーを含有している。本明細書中、「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」とは、Ｈ鎖の可変領域（ＶＨ）とＬ鎖の可変領域（ＶＬ）とを結合して一本鎖ポリペプチドを与える働きをするオリゴペプチド又はポリペプチドを指している。本明細書では、好ましくは該リンカーはペプチドリンカーである。該ペプチドリンカーは、二つのポリペプチドを機能的に結合せしめて一つの一本鎖ポリペプチドを与えることのできるものであれば特に限定されず、例えば当該分野で広く知られたものあるいは該公知のリンカーを改変したものの中から選択して使用することが可能である。該ペプチドリンカーは、例えば１〜約５０個のアミノ酸からなるペプチドであってよく、好ましくは約２〜３０個のアミノ酸からなるペプチド、さらに好ましくは約２〜２０個のアミノ酸からなるペプチドが挙げられる。ここで「機能的に結合」せしめるとは、ポリペプチドを適切に折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）  、オリジナルのタンパク質（当該ポリペプチドは該オリジナルのタンパク質に由来するものあるいは該オリジナルのタンパク質から誘導されたものである）の機能、例えば生物活性などの一部あるいはその全てを模擬することができる三次元構造を持った融合タンパク質を与えるような結合を意味する。
【００２７】
また、当該リンカーの長さは、結合されるプチドの性状にもよるが、生成する一本鎖ポリペプチド（あるいは融合タンパク質）に所望の活性を与えるものであればよい。該リンカーの長さは、生成せしめられる一本鎖ポリペプチドが適切に折り畳まれて所望の生物活性を得るに十分な長さのものであるべきである。また該リンカーの長さは、所望の生物活性について各種の長さのリンカーで結合した一連の一本鎖ポリペプチドをテストすることにより実験して決定することができる。リンカーについては、上記ダイアボディ及びその製造技術に関連して挙げられた文献などを参照することができる。
【００２８】
尚、一本鎖ポリペプチドにおけるＶＬとＶＨの配置は、Ｎ−末端側がＶＬでそれにリンカー、続いてＶＨと配置されているもの（ＶＬ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＶＨ  構築体）  でも、Ｎ−末端側がＶＨでそれにリンカー、続いてＶＬと配置されているもの（ＶＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＶＬ  構築体）  のいずれであってもよい。
【００２９】
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体はヒト型化抗体とすることが可能である。これらのヒト型化抗体は、例えばマウス抗体由来の高い反応特異性を有する一方で、その他の部分をヒト抗体由来とすることによって、ヒトに投与された際に免役原となり得る可能性が低減されている為にヒトに対する臨床上極めて有利な抗体である。
【００３０】
「ヒト型化抗体」とは、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の相補性決定領域  （ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；  ＣＤＲ）の残基の少なくとも一部において、マウス、ラット、またはウサギといったような非ヒト動物（ドナー抗体）であり且つ所望の特異性、親和性、および能力を有するＣＤＲ  に由来する残基によって置換されている抗体を意味する。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換される場合もある。さらに、ヒト型化抗体は、レシピエント抗体および導入されたＣＤＲ  またはフレームワーク配列のいずれにおいても見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに優れたものあるいは最適なものとするために行われる。更に詳しくは、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，  ５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，  ３２３−３２９  （１９８８）；ＥＰ−Ｂ−２３９４００；  Ｐｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２，  ５９３−５９６（１９９２）；  およびＥＰ−Ｂ−４５１２１６  を参照することができる。
【００３１】
ヒト型化抗体は当業者に公知の方法に従って作成することが出来る。例えば、レシピエント抗体及びドナー抗体の３次元イムノグロブリンモデルを使用し、種々の概念的ヒト型化生成物を分析する工程により、ヒト型化抗体が調製される。３次元イムノグロブリンモデルは、当業者にはよく知られている。更に詳細については、ＷＯ９２／２２６５３を参照することができる。
【００３２】
従って、ヒト型化抗体である本発明のダイアボディ型二重特異性抗体の例として、可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウス抗体由来であり、その他の部分がヒト抗体由来である抗体を挙げることができる。更にその好適例として、ヒト型化抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３由来の可変領域におけるＣＤＲが図２１に示されたアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の少なくとも一つのＣＤＲを有し、且つ、ヒト型化抗ヒト上皮細胞成長因子受容体抗体５２８由来の可変領域におけるＣＤＲが図２２に示されたアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の少なくとも一つのＣＤＲを有すること特徴とするダイアボディ型二重特異性抗体がある。特に、ヒト型化抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３由来のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域が図２１に示されたアミノ酸配列（配列番号２７及び２８）有し、且つ、ヒト型化抗ヒト上皮細胞成長因子受容体抗体５２８由来のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域が図２２に示されたアミノ酸配列（配列番号２９及び３０）を有することを特徴とするダイアボディ型二重特異性抗体が好ましい。
【００３３】
本発明では更に、ヒト型化によって抗体自身の機能低下等が生起する場合があるので、一本鎖ポリペプチド中の適当な部位、例えば、ＣＤＲ構造に影響を与える可能性があるフレームワーク（ＦＲ）中の部位、例えば、ｃａｎｏｎｉｃａｌ  配列又はｖｅｒｉｎｅｒ  配列において部位特異的変異を起こさせることによってヒト型化抗体の機能の改善をすることが出来る。このようにして得られた抗体も本発明のヒト型化ダイアボディ型二重特異性抗体に含まれる。
【００３４】
既に記載したように、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体は２種類の一本鎖ポリペプチドから構成されるが、本発明はそのいずれか一方の一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域（例えば、各抗体由来の夫々の可変領域）を構成するポリペプチドにも係るものである。すでに記載したように、この一本鎖ポリペプチドは第一（又は第二）の抗体のＨ鎖の可変領域及び第二（又は第一）の抗体のＬ鎖、並びにこれらを連結するリンカーから構成されるが、更に、ブドウ球菌エンテロトキシン、大腸菌エンテロトキシン及びコレラ菌エンテロトキシンに代表される細菌性エンテロトキシンまたはそれらの各種誘導体等を含むことも出来る。更に、製造した一本鎖ポリペプチドの検出及び精製等を容易にする目的のために、当業者に公知の各種のペプチドタグ（例えば、ｃ−ｍｙｃタグ及びＨｉｓ−ｔａｇ）をその末端等に含むことが出来る。
【００３５】
但し、これらのスーパー抗原はＭＨＣｃｌａｓｓＩＩに対する強力な親和力によるサイトカイン依存性トキシックショック症候群を起こす可能性があることが知られている。それに対して、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体は、以下の実施例に示されているように、このようなスーパー抗原を含まない場合でも、非常に高い細胞障害活性を奏功することができる為に、スーパー抗原の有するこのような潜在的な危険性を回避できるという利点を有する。
【００３６】
本発明の一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域をコードする核酸は当業者に公知の方法で取得し、その塩基配列を決定することが出来る。例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより行うことができる  （Ｒ．  Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：  ３８３３−３８３７  （１９９３））。上記したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、こうした方法におけるＤＮＡの供給源として使用することが出来る。
【００３７】
より具体的には、本発明の一本鎖ポリペプチドをコードする核酸は、既に構築され当業者に公知である、一本鎖Ｆｖ（（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）又は「ｓｃＦｖ」）又はダイアボディ型二重特異性抗体をコードする核酸に基づき、その中のＶＨないしＶＬを別の特異性を有する抗体由来のものと夫々入れ換えることによって調製することが出来る。ここで「ｓｃＦｖ」とは、ある抗体のＶＨとＶＬのドメインを含有しているもので、該ドメインが一本のポリペプチド鎖中にあるものを指している。一般的には該ＦｖポリペプチドはさらにＶＨとＶＬのドメイン間にポリペプチドリンカーを含有し、抗原結合のために必要な構造を与えることを可能にしている。ｓｃＦｖについては、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  （Ｅｄ．），  “Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，  Ｖｏｌ．  １１３，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．２６９−３１５  （１９９４）を参照することができる。
【００３８】
更に、ヒト型化されたダイアボディ型二重特異性抗体の一本鎖ポリペプチドにおける可変領域をコードする核酸を作成する場合には、以下の実施例に記載されているように、予め設計されたアミノ酸配列に基づきオーバーラップＰＣＲ法により全合成することができる。尚、「核酸」とは、一本鎖ポリペプチドをコードする分子であれば、その化学構造及び取得経路に特に制限はなく、例えば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡ等を含むものものである。
【００３９】
具体的には、ｃＤＮＡライブラリーから、文献記載の配列に基づいてハイブリダイゼーションにより、あるいはポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）  技術により単離されうる。一旦単離されれば、ＤＮＡ  は発現ベクター中に配置され、次いでこれを、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ）細胞、ＣＯＳ  細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）  、またはイムノグロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞にトランスフェクションさせ、該組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させることができる。ＰＣＲ  反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えば  Ｒ．  Ｓａｉｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０：  １３５０，  １９８５；  Ｒ．  Ｓａｉｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：  ４８７，  １９８８  ；  Ｈ．  Ａ．  Ｅｒｌｉｃｈ  ｅｄ．，  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９  ；  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，  “ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｖｏｌ．  １，  （Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）  ；  Ｍ．  Ａ．  Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，  “ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９０））；  Ｍ．  Ｊ．  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  Ｑｕｉｒｋｅ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  （Ｅｄ．），  ＰＣＲ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９１）；  Ｍ．  Ａ．  Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５，  ８９９８−９００２  （１９８８）などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、ＰＣＲ  法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
【００４０】
ハイブリダイゼーションについてはＬ．  Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄ．），  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  ２９  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｐａｒｔ  Ｅ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９７４）  などを参考にすることができる。ＤＮＡ  など核酸の配列決定は、例えばＳａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４：  ５４６３−５４６７  （１９７７）などを参考にすることができる。また一般的な組換えＤＮＡ  技術は、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （ｅｄ．），  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）及び  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄ．），  “ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｖｏｌ．  １  ｔｏ  ４，  （Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）  などを参考にできる。
【００４１】
こうして取得された本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチド又はそれに含まれる各領域をコードする核酸は、目的に応じて、当業者に公知の手段により適宜所望のペプチド又はアミノ酸をコードするように改変することができる。この様にＤＮＡ  を遺伝子的に改変又は修飾する技術は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｍ．Ｊ．Ｍｃｐｈｅｒｓｏｎ  （Ｅｄ．），  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ（１９９１）  における総説において示されており、例えば、位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）、カセット変異誘発法及びポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）  変異生成法を挙げることができる。
【００４２】
ここで、核酸の「改変」とは、得られたオリジナルの核酸において、アミノ酸残基をコードする少なくとも一つのコドンにおける、塩基の挿入、欠失または置換を意味する。例えば、オリジナルのアミノ酸残基をコードするコドンを、別のアミノ酸残基をコードするコドンにより置換することにより一本鎖ポリペプチドを構成するアミノ酸配列自体を改変する方法がある。このようにして、本発明のヒト型化されたダイアボディ型二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチドを得ることが出来る。
【００４３】
又は、本明細書の実施例に記載されているように、アミノ酸自体は変更せずに、その宿主細胞にあったコドン（至適コドン）を使用するように、一本鎖ポリペプチドをコードする核酸を改変することも出来る。このように至適コドンに改変することによって、宿主細胞内における一本鎖ポリペプチドの発現効率等の向上を図ることが出来る。
【００４４】
尚、リンカー及びスーパー抗原等は、組換え技術等の遺伝子工学的手法及びペプチド化学合成等の当業者に公知の任意の技術手段を用いて、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を構成する一本鎖ポリペプチド内に適宜導入することが出来る。
【００４５】
一本鎖ポリペプチドは、当業者に公知の方法、例えば、遺伝子工学的手法又は化学合成等の各種手段を用いて製造することが出来る。遺伝子工学的手法としては、例えば、上記核酸を含有する複製可能なクローニングベクター又は発現ベクターを作製し、このベクターで宿主細胞を形質転換せしめ、該形質転換された宿主細胞を培養して宿主細胞中で該核酸を発現せしめ、それを回収し、精製することによって製造することが出来る。通常、このようなベクターには本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を構成する２種類の一本鎖ポリペプチドのうちのいずれか一方の一本鎖ポリペプチドをコードする核酸が含まれている。このような場合には得られる２種類のベクターは同一の宿主細胞に導入することが好ましい。或いは、２種類の一本鎖ポリペプチドの夫々をコードする２種類の核酸を同一のベクターに含有させることも可能である。
【００４６】
ここで、「複製可能な発現ベクター（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）」および「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）  」は、ＤＮＡ（通常は二本鎖である）の断片（ｐｉｅｃｅ）  をいい、該ＤＮＡは、その中に外来のＤＮＡの断片を挿入せしめることができる。外来のＤＮＡは、異種ＤＮＡ  （ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ＤＮＡ）として定義され、このものは、対象宿主細胞においては天然では見出されないＤＮＡ  である。ベクターは、外来ＤＮＡまたは異種ＤＮＡ  を適切な宿主細胞に運ぶために使用される。一旦、宿主細胞中に入ると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡ  とは独立に複製することが可能であり、そしてベクターおよびその挿入された（外来）ＤＮＡ  のいくつかのコピーが生成され得る。さらに、ベクターは外来ＤＮＡのポリペプチドへの翻訳を可能にするのに不可欠なエレメントを含む。従って、外来ＤＮＡによってコードされるポリペプチドの多くの分子が迅速に合成されることができる。
【００４７】
このようなベクターは、適切な宿主中で  ＤＮＡ配列を発現するように、適切な制御配列（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とそれが機能するように（ｏｐｅｒａｂｌｙ）（即ち、外来ＤＮＡが発現できるように）連結せしめられたＤＮＡ配列を含有する  ＤＮＡ構築物（ＤＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）  を意味している。そうした制御配列としては、転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）  させるためのプロモーター、そうした転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、リアデニル化配列、及び転写や翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）  の終了を制御する配列等が挙げられる。更にベクターは、、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子（選択遺伝子）、シグナル配列、リーダー配列等を必要に応じて適宜含むことが出来る。これらの各種配列又は要素は、外来ＤＮＡの種類、使用する宿主細胞、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することが出来る。
【００４８】
該ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、あるいは単純にゲノムの挿入体（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｓｅｒｔ）等の任意の形態が可能である。一旦、適切な宿主の中に形質転換で導入せしめられると、該ベクターは宿住のゲノムとは独立して複製したり機能するものであり得る。又は、該ベクターはゲノムの中に組み込まれるものであってもよい。
【００４９】
宿主細胞としては当業者に公知の任意の細胞を使用することができるが、例えば、代表的な宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）  等の原核細胞、及び、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）  、ヒト由来細胞などの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞等の真核細胞が挙げることができる。
【００５０】
このような宿主細胞における発現等により得られた一本鎖ポリペプチドは、好ましくは一本鎖ポリペプチドは、一般に分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるが、それが分泌シグナルを持たずに直接に産生された場合には宿主細胞溶解物から回収することが出来る。一本鎖ポリペプチドが膜結合性である場合には、適当な洗浄剤（例えば、トライトン−Ｘ１００）  を使用して膜から遊離せしめることができる。
【００５１】
精製操作は当業者に公知の任の方法を適宜組み合わせて行うことが出来る。例えば、遠心分離、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム等）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及びアフィニティクロマトグラフィーによって好適に精製される。アフィニティクロマトグラフィーは、一本鎖ポリペプチドが有するぺプチドタグとの親和力を利用した効率が高い好ましい精製技術の一つである。
【００５２】
尚、回収された一本鎖ポリペプチドは不溶性画分に含まれていることも多いために、精製操作は、一本鎖ポリペプチドを可溶化し変性状態にした上で行うことが好ましい。この可溶化処理は、エタノールなどのアルコール類、グアニジン塩酸塩、尿素などの解離剤として当業者に公知の任意の薬剤を使用して行うことが出来る。
【００５３】
更に、こうして精製された一本鎖ポリペプチドを会合（巻き戻し）せしめ、形成されたダイアボディ型二重特異性抗体を分離して回収することによって、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を製造することが出来る。
【００５４】
会合処理は、単独の一本鎖ポリペプチドを適切な空間的配置に戻すこによって、所望の生物活性を有する状態に戻すことを意味する。従って、会合処理は、ポリペプチド同志あるいはドメイン同志を会合した状態に戻すという意味も有しているので「再会合」ともいうことができるし、所望の生物活性を有するものにするという意味で、再構成ということもでき、或いは、リフォールディング  （ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）とも呼ぶことが出来る。会合処理は当業者に公知の任意の方法で行うことが出来るが、例えば、透析操作により、一本鎖ポリペプチドを含むバッファ溶液中の変性剤（例えば、塩酸グアニジン）の濃度を段階的に下げる方法が好ましい。この過程で、凝集抑制剤、及び酸化剤を反応系に適宜添加することによって、酸化反応の促進を図ることも可能である。形成されたダイアボディ型二重特異性抗体の分離及び回収も当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体、特にヒト型化されたダイアボディ型二重特異性抗体、一本鎖ポリペプチド、核酸、ベクター、及び形質転換された宿主細胞から成る群から選ばれたものを有効成分として含有することを特徴とする。かかる有効成分は、以下の実施例に示されているように、インビトロ及びインビボで上皮細胞成長因子受容体を発現する（陽性）腫瘍細胞を有意に排除・殺傷・傷害する作用を有しているので、本発明の医薬組成物はこのような腫瘍細胞に対する抗腫瘍剤として使用することが出来る。
【００５６】
更に、以下の実施例に示されているように、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を食作用又は細胞障害活性を有する細胞及びヒト上皮細胞成長因子受容体を発現する腫瘍細胞とインビボ又はインビトロで共存させることにより、食作用又は細胞障害活性を有する細胞におけるサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＦＮ−α等）の生産量を増加させることが出来るので、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体又はそれを有効成分として含有する医薬組成物はこの目的の為に使用することも出来る。例えば、インビトロでは、上記２種類の細胞を含む培養系に本発明のダイアボディ型二重特異性抗体を添加することによってサイトカインの生産を増加させることができる。
【００５７】
本発明の有効成分の有効量は、例えば治療目的、腫瘍の種類、部位及び大きさ等の投与対象における病状、患者の諸条件、及び投与経路等によって当業者が適宜決めることが出来る。典型的な１回の投与量又は日用量は、上記の条件に応じ、可能ならば、例えば当分野で既知の腫瘍細胞の生存又は生長についての検定法を使用して、まずインビトロで、そして次に、人間の患者のための用量範囲を外挿し得る適切な動物モデルで、適当な用量範囲を決定することもできる。
【００５８】
本発明の医薬組成物には、有効成分の種類、薬剤形態、投与方法・目的、投与対象の病態等の各種条件に応じて、有効成分に加えて当業者に周知の薬学上許容し得る各種成分（例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、等）を適宜添加することが出来る。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、上記各種条件に応じて、錠剤、液剤、粉末、ゲル、及び、噴霧剤、或いは、マイクロカプセル、コロイド状分配系（リポソーム、マイクロエマルジョン等）、及びマクロエマルジョン等の種々薬剤形態をとり得る。
【００６０】
投与方法としては、静脈内、腹腔内、脳内、脊髄内、筋肉内、眼内、動脈内、特には胆管内、又は病変内経路による注入又は注射、及び持続放出型システム製剤による方法が挙げられる。本発明の活性物質は、輸液により連続的に、または大量注射により投与されることができる。尚、本発明の医薬組成物を投与する場合には、食作用又は細胞障害活性を有する細胞と共に投与することが好ましい。或いは、投与前に本発明のダイアボディ型二重特異性抗体のような有効成分と上記細胞とを混合することによって、投与前に該抗体を予め該細胞に結合させておくことが好ましい。
【００６１】
持続放出製剤は、一般的には、そこから本発明の活性物質をある程度の時間放出することのできる形態のものであり、持続放出調製物の好適な例は、蛋白質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性担体を含み、該担体は、例えばフィルムまたはマイクロカプセル等の成型物の形態のものである。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法、例えば日本薬局方解説書編集委員会編、第十三改正  日本薬局方解説書、平成８年７月１０日発行、株式会社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜選択して製造することができる。
【００６３】
なお、明細書及び図面において、用語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【００６４】
以下に実施例を参照して本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
【００６５】
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。    なお、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処理条件などは、ＤＮＡ  クローニングでは  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８９）    及び  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，  “ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｖｏｌ．  １  ｔｏ  ４，  （Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）  ；  特にＰＣＲ  法では、Ｈ．  Ａ．  Ｅｒｌｉｃｈ
ｅｄ．，  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９  ；  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｖｏｌ．  １，  （Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）      及び  Ｍ．  Ａ．  Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９０）に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）  や添付の薬品等を使用している。
【００６６】
【実施例１】
【００６７】
実施例１  抗上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体のクローニング
抗ＥＧＦＲ抗体産生マウスＢ細胞ハイブリドーマ５２８を東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターより分譲して頂き、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いｍＲＮＡを抽出、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によりｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを参考論文１に基づき合成したクローニングプライマーを用いＰＣＲを行い５２８可変領域ＶＨ（以下５Ｈ）、ＶＬ（以下５Ｌ）の配列を明らかにした（図１）。
【００６８】
○参考論文１  −  Ｋｒｅｂｂｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ａｎｄ  ｓｐｌｅｅｎ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａ  ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１，  ３５−５５．  （１９９７）．
【００６９】
実施例２ Ｅｘ３  ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターの作製
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体の代表例であるＥｘ３  ｄｉａｂｏｄｙ（以下Ｅｘ３）は５ＨＯＬとＯＨ５Ｌの二つの分子から作製される。発現ベクターはすでに本発明者らによって構築されているＭＵＣ１及びＣＤ３を標的としたＭｘ３  ｄｉａｂｏｄｙ（以下Ｍｘ３）発現ベクターを基に作製した（特許文献１参照）。即ち、制限酵素部位を導入したＡ−Ｂプライマーを用いＰＣＲ法により５Ｈを増幅後ＮｃｏＩ−ＥａｇＩで消化し、Ｍｘ３発現ベクターの一つｐＳＮＥ４−ＭＨＯＬ（抗ＭＵＣ１抗体ＭＵＳＥ１１  ＶＨ（以下ＭＨ）−ＧＧＧＧＳ（以下Ｇ１）−抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３  ＶＬ（以下ＯＬ））のＭＨと入れ換えｐＲＡ−５ＨＯＬを作製した。同様にＣ−Ｄプライマーを用い５Ｌを増幅後ＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩＩで消化し、ｐＳＮＥ４−ＯＨＭＬ（ＯＫＴ３  ＶＨ（以下ＯＨ）−Ｇ１−ＭＵＳＥ１１  ＶＬ（以下ＭＬ））のＭＬと入れ換えｐＲＡ−ＯＨ５Ｌを作製した（図２）。Ｃ末端側には検出のためのｃ−ｍｙｃペプチドタグ、並びに精製のためのＨｉｓ−ｔａｇ  （Ｈｉｓｘ６：ヒスチジン６量体ｔａｇ）が並列に導入されている。
【００７０】
2004242638.tif 000003
【００７１】
実施例３  大腸菌を用いた５ＨＯＬ並びにＯＨ５Ｌの発現
発現ベクターｐＲＡ−５ＨＯＬとｐＲＡ−ＯＨ５Ｌでそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、培養は２ｘＹＴ培地を用い２８℃で行った。Ｏ．Ｄ．６００＝約０．８となったところで、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧにより発現を誘導し、一晩振盪培養した。菌体を遠心分離後（この操作により分けられた上清を培地上清とする）、超音波破砕し、さらに遠心分離後の上清を菌体内可溶性画分、沈殿を菌体内不溶性画分とした。各画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、及びＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った結果、５ＨＯＬ、ＯＨ５Ｌ共にほとんどが菌体内不溶性画分に発現していることが確認されたため、この画分からの蛋白質の調製を行った（図３）。
【００７２】
実施例４ ５ＨＯＬ、ＯＨ５Ｌの精製、及び巻き戻し
菌体内不溶性画分を６Ｍ塩酸グアニジン／ＰＢＳに一晩４℃で浸し、タンパク質を可溶化した後、変性状態でＨｉｓ  Ｔａｇと特異的に結合する金属キレート樹脂（ＴＡＬＯＮＴＭ：ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いた金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製を行った。精製後の収量は形質転換培養液１Ｌ当たりそれぞれ約５ｍｇであった。
【００７３】
精製されたタンパク質は塩酸グアニジンにより変性状態となっているので活性を保持した三次構造をもつタンパク質を得るためには巻き戻し操作が必要となる。５ＨＯＬ、ＯＨ５Ｌそれぞれを７．５μＭに希釈し等量混合（全蛋白質濃度７．５μＭ：Ｅｘ３濃度３．７５μＭ）した後、全蛋白質の５０倍量の２−メルカプトエタノール（β−Ｍｅ、終濃度３７５μＭ）を添加し４℃で４時間静置し、還元反応を行った。続いてサンプルを透析膜に入れ外液の塩酸グアニジン濃度を３Ｍ（６ｈｒ）、２Ｍ（６ｈｒ）、１Ｍ（１２ｈｒ）、０．５Ｍ（１２ｈｒ）、０Ｍと徐々に下げていく段階透析法によって、変性剤の除去を行い、途中の１Ｍと０．５Ｍの透析段階において、酸化剤として酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を終濃度３７５μＭ、凝集抑制剤としてＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）を終濃度０．４Ｍ透析外液に加え４℃に保温することによる酸化反応の促進を図った（図４）。巻き戻し効率は約３０％だった。精製、５ＨＯＬ、ＯＨ５Ｌ等量混合後巻き戻したＥｘ３のＳＤＳ−ＰＡＧＥから非常に精製度が高く、かつ均一なヘテロ二量体を形成していることが確認された（図３）。
【００７４】
実施例５ Ｅｘ３の機能評価▲１▼  −  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  
フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）によりＥｘ３の各細胞に対する結合を調べた。標的細胞に対し一次抗体としてＥｘ３を１００μＬ加え３０分、４℃で静置後、０．１％ＮａＮ３／ＰＢＳで２回洗浄し、続いて二次抗体としてａｎｔｉ−ｃ−ｍｙｃ抗体を加え同様の操作を行った。最後に三次抗体としてＦＩＴＣ標識したａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ
抗体を加え同様の操作を行った後、蛍光を測定した。ネガティブコントロール（以下ＮＣ）は二次抗体以降の操作を行い、ポジティブコントロール（以下ＰＣ）には二次抗体としてＴ−ＬＡＫ細胞に対してはＯＫＴ３  ＩｇＧ、ＴＦＫ−１細胞（ヒト胆菅癌細胞株）に対しては５２８  ＩｇＧをそれぞれ用いた。結果はどちらの細胞に対しても結合することが分かった（図５（上））。
【００７５】
また生理的な条件下（３７℃、ＲＰＭＩ  １６４０培地中）で４８時間静置後、同様の操作を行い安定性を調べた結果、結合活性にほとんど変化はなかった（図５（下））。
【００７６】
さらに、Ｅｘ３の認識部位が各親抗体ＩｇＧと同じであるかを調べるため、一次抗体としてＥｘ３を加えた後、ＰＣと同様の操作を行い親抗体の結合阻害を調べた。結果は、通常のＰＣに比べて結合能の低下が見られたためＥｘ３と各親抗体の認識部位は同じであることが示された（図６）。
【００７７】
Ｅｘ３を過剰のＴ−ＬＡＫ細胞、あるいはＴＦＫ−１細胞と反応させた後の上清をそれぞれの細胞に対してＦｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを行う吸収試験を行った結果、どの組み合わせにおいても結合能が低下した。Ｅｘ３溶液の中でＴ−ＬＡＫ細胞に結合する分子とＴＦＫ−１細胞に結合する分子が異なっている場合は結合の低下が起こらないため、この結果よりＥｘ３一分子が両方の細胞に対して結合する、即ち二重特異性を有していることが分かった（図７）。
【００７８】
実施例６ Ｅｘ３の機能評価▲２▼  −  顕微鏡観察 
癌細胞を一晩培養し付着させた後、Ｔ−ＬＡＫ細胞単独、またはＥｘ３と混合したＴ−ＬＡＫ細胞を加えて経時的に顕微鏡観察を行った。Ｔ−ＬＡＫ単独では１２時間後でもほとんど変化がないのに対して、Ｅｘ３を添加したプレートでは２時間後には癌細胞周辺へのＴ−ＬＡＫの集簇開始が観察され、１２時間後にはほぼすべてのＴ−ＬＡＫ細胞が癌細胞に集簇した（図８）。
尚、本明細書に添付の図中、「Ｅ／Ｔ」又は「Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／Ｔａｒｇｅｔ」はｅｆｆｅｃｔｏｒ（Ｔ−ＬＡＫ細胞）／ｔａｒｇｅｔ（ＴＦＫ−１細胞）比を意味する。
【００７９】
また各種ＩｇＧを加えた阻害試験では、添加後１８時間で親抗体であるＯＫＴ３、及び５２８ＩｇＧを加えたプレートではほぼ完全に集簇が見られなかったのに対し、系に無関係のＯＫＴ８（抗ＣＤ８抗体）、ＭＵＳＥ１１（抗ＭＵＣ１抗体）ＩｇＧを加えたプレートではＩｇＧを加えなかった場合と同様の集簇が見られた（図９）。
【００８０】
実施例７ Ｅｘ３の機能評価▲３▼  −  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害試験（ＭＴＳ  ａｓｓａｙ）  
ＭＴＳ  ａｓｓａｙ  により、ＴＦＫ−１細胞がＴ−ＬＡＫ細胞によりどれほど傷害されたかを測定した。セルカウントを行い、ＲＰＭＩ  １００μＬあたり細胞１０４個になるよう調整し、９６穴プレートに１００μＬずつ分注、３７℃で一晩静置した。目的蛋白質を目的濃度になるようにＲＰＭＩで希釈、前日準備したプレートに蛋白質を５０μＬずつ分注。ＬＡＫ  細胞を目的Ｅ／Ｔ比になるようにＲＰＭＩで希釈し、５０μＬずつ分注した。３７℃で４８時間培養した後、プレートの培養液を取り除き、ＰＢＳ  により洗浄、ＭＴＳ、ＰＭＳ、ＲＰＭＩを加え、３７℃で３０〜６０分インキュベートした。プレートリーダーで４９０ｎｍ  の吸光度を測定した。その結果、従来のＭｘ３あるいは、ｍＳＥＡを融合したｍＳＥＡ−Ｍｘ３に比べ非常に強い効果が見られた。ＴＦｋ−１細胞を１００％殺傷するのに必要なＥｘ３の濃度はｍＳＥＡ−Ｍｘ３が同等の効果を示す量の約１／１００である１ｐｍｏｌ／ｍＬ（約６０ｎｇ／ｍＬ）という低濃度であった（図１０）。（注）  ＭＴＳ  試薬  （ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ，  Ｐｒｏｍｅｇａ社製）  、ＰＭＳ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ  社製）
【００８１】
またＯＫＴ３  ｓｃＦｖと５２８  ｓｃＦｖを等ｍｏｌ混合した場合とＥｘ３の効果を比較検討した結果、ｓｃＦｖ同士の混合では高濃度でもまったく傷害活性が得られなかった。このことから各々の抗体の効果（ＯＫＴ３のＣＤ３刺激によるＴ−ＬＡＫの活性化能、及び５２８のＥＧＦＲブロックによるＴＦＫ−１の成長阻害）だけではなく、リンパ球と癌細胞の物理的な架橋、即ち二重特異性抗体により接近させることが重要であることが分かる（図１１）。
【００８２】
実施例８ Ｅｘ３の機能評価▲４▼−  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害試験（５１Ｃｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）  
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害活性の評価はＭＴＳ  ａｓｓａｙにより簡便に行えるが、これは腫瘍細胞の成長阻害（ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を評価する方法でまた付着細胞にしか用いることができない。このため直接的な傷害活性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を調べるため５１Ｃｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙを行った。結果はＥｘ３の添加によりＥ／Ｔ比に依存した有意な傷害活性が見られ、また養子免疫療法としてＴ−ＬＡＫ細胞のような一旦体外で活性化させたリンパ球を使わない場合を想定したＰＢＭＣ（末梢血単核球；  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）をｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞として用いた場合も同様にＥｘ３の濃度に依存した傷害活性の増加が見られた（図１２）。
【００８３】
他のＥＧＦＲ（Ｈｅｒ１）陽性胆管癌細胞株に対しても同様にＥｘ３の存在、及びＥ／Ｔ比に依存した傷害活性の増加が見られた（図１３）。またＥＧＦＲ陰性の細胞株に対してはＥｘ３を添加してもＴ−ＬＡＫ細胞の傷害活性を全く増強させなかった（表１）。尚、表１及び以下の各図において、細胞を示す英語標記の意味は以下の通りである。
ＴＦＫ−１：ヒト胆菅癌；
ＯＣＵＣｈ‐ＬＭ１：ヒト胆菅癌；
ＨｕＣＣ−Ｔ１：ヒト胆菅癌；
ＯＢＡ−ＬＫ１：ヒト肺大細胞癌；
Ａ５４９：ヒト肺腺癌；
ＣＲＬ１５００：ヒト乳癌；
ＳＫ−ＢＲ−３：ヒト乳癌；
Ａ４３１：ヒト類表皮癌；
ＭＣＦ−７：ヒト乳癌；
ＮＣＩ−Ｈ６９：ヒト肺小細胞癌；
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣細胞
【００８４】
【表１】
2004242638.tif 000004
【００８５】
さらに各種ＩｇＧを加えた阻害試験では、親抗体であるＯＫＴ３、及び５２８  ＩｇＧでは濃度に依存した傷害活性の低下が見られたが、系に無関係のＯＫＴ８、ＭＵＳＥ１１  ＩｇＧの添加では全く傷害活性の阻害が見られなかった（図１４）。
【００８６】
実施例９ Ｅｘ３の機能評価▲５▼−  各種サイトカインの分泌 
以上の実験系におけるＴ−ＬＡＫ細胞の傷害活性の増強に寄与する因子を同定するため各種サイトカインの産生量を調べた。ＴＦＫ−１細胞をプレートに付着させ一晩静置後、Ｔ−ＬＡＫ細胞単独、あるいはさらにＥｘ３を濃度を変化させて添加し４８時間後の培養上清中の各種サイトカイン量をＥＬＩＳＡキット（ＥＮＤＯＧＥＮ社）により測定した。Ｔ−ＬＡＫ細胞単独、Ｔ−ＬＡＫ細胞とＥｘ３、Ｔ−ＬＡＫ細胞とＴＦＫ−１細胞を加えたプレートは顕著なＩＦＮ−γの産生の増加は見られなかったが、Ｔ−ＬＡＫ細胞とＴＦＫ−１細胞にＥｘ３を添加することで濃度に依存したＩＦＮ−γの産生の増加が見られた。また親抗体であるＯＫＴ３、あるいは５２８  ＩｇＧをさらに加えたプレートでは阻害効果が見られ、ＩＦＮ−γの産生は見られなかった（図１５）。
【００８７】
ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αについてもほぼ同様の結果が得られた（図１６、１７）。しかしＩＬ−２に関しては濃度に依存した産生の増加は見られず若干の低下が見られた（図１８）。
【００８８】
続いて、各種サイトカインの産生量の経時変化をＥＩＬＳＡを用いて測定した。ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦは経時的に、また濃度依存的な産生量の増加が見られたが、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２は１２時間をピークにその後は急激な減少が見られた。これは１２時間で標的細胞であるＴＦＫ−１細胞が死滅し、その後はＩＬ−２などの産生が起こらずＴ−ＬＡＫ細胞に取り込まれため消費されたと考えられ、図１８の結果とも一致する（図１９）。
【００８９】
実施例１０ Ｅｘ３の機能評価▲６▼−  ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害試験 
ＳＣＩＤマウスを納入後、１０数日後に５ｘ１０６個のＴＦＫ−１細胞をマウスに皮下注射した。ＴＦＫ−１細胞移植後１０日後（腫瘍径約４  ｍｍから６  ｍｍ）、２ｘ１０７個のＴ−ＬＡＫ細胞と各抗体を混合した後、マウス尾静脈より４日連続で注入した。一週間ごとに腫瘍径を測定し、長径と短径から腫瘍体積を概算した。実験はコントロールの腫瘍径が２０ｍｍを越えたときに終了した。
【００９０】
その結果、Ｔ−ＬＡＫ細胞単独を投与した群はＰＢＳを投与したコントロール群と同様に腫瘍が成長し続けたのに対し、Ｅｘ３を混合し投与した群は顕著な成長阻害が見られた。またＥｘ３を２０μｇ／ｍｏｕｓｅ投与した群では化学合成により作製したＥｘ３  ｂｓＡｂとほぼ同等の腫瘍の縮退効果が見られた（図２０）。
【００９１】
実施例１１  ヒト型化Ｅｘ３遺伝子の作製
ヒト型化ＯＫＴ３可変領域はすでに報告されており、マウスＯＫＴ３に比べて十分に活性を保持していることも確かめられている（参考論文２）。参考論文２に記載されているヒト型化ＯＫＴ３可変領域のアミノ酸配列を基に、オーバーラップＰＣＲ法により遺伝子の全合成を行った。この際にコドンは大腸菌における至適コドンを用いた。至適コドンに置換した全合成遺伝子を用いることでの大腸菌における発現量の増加はすでに報告されている（図２１）。
【００９２】
５２８可変領域のヒト型化はＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇ法により行った。まずＶＨ、ＶＬそれぞれ相同性検索を行い、各ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）の長さ等を考慮した上でもっとも相同性の高いＦＲ（ｆｒａｍｅ  ｗｏｒｋ）をもつヒト抗体配列を選択する。選択したヒト抗体のＣＤＲを５２８のＣＤＲと入れ換えたアミノ酸配列を設計し、対応するコドンについては先と同様に大腸菌至適コドンを用い、オーバーラップＰＣＲ法により遺伝子の全合成を行った（図２２）。
【００９３】
○参考論文２  −  Ａｄａｉｒ，  Ｊ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＯＫＴ３．  Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５，  ４１−７．  （１９９４）．
【００９４】
実施例１２  ヒト型化Ｅｘ３発現ベクターの作製
ヒト型化Ｅｘ３  ｄｉａｂｏｄｙ（以下ｈＥｘｈ３）はｈ５ＨｈＯＬとｈＯＨｈ５Ｌの二つの分子から作製される。発現ベクターはＥｘ３を構成する各々の発現ベクターを基に作製した。即ち、制限酵素部位を導入したＥ−Ｆプライマーを用いＰＣＲ法によりヒト型化５Ｈ（以下「ｈ５Ｈ」：配列番号２９）を増幅後ＮｃｏＩ−ＥａｇＩで消化し、ｐＲＡ−５ＨＯＬの５Ｈと入れ換えた。引き続きヒト型化ＯＬ（以下「ｈＯＬ」：配列番号２８）をＧ−Ｈプライマーを用い増幅後ＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩＩで消化し、ＯＬと入れ換えｐＲＡ−ｈ５ＨｈＯＬを作製した。同様にＩ−Ｊプライマーを用いヒト型化ＯＨ（以下「ｈＯＨ」：配列番号２７）を増幅後ＮｃｏＩ−ＥａｇＩで消化、ｐＲＡ−ＯＨ５ＬのＯＨと入れ換え、Ｋ−Ｌプライマーを用いヒト型化５Ｌ（以下「ｈ５Ｌ」；配列番号３０）を増幅後ＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩＩで５Ｌと入れ換えｐＲＡ−ｈＯＨｈ５Ｌを作製した。Ｅｘ３発現ベクターと同様Ｃ末端側には検出のためのｃ−ｍｙｃペプチドタグ、並びに精製のためのＨｉｓ−ｔａｇ  （Ｈｉｓｘ６：ヒスチジン６量体ｔａｇ）が並列に導入されている（図２３）。
【００９５】
2004242638.tif 000005
【００９６】
実施例１３  大腸菌を用いたｈ５ＨｈＯＬ並びにｈＯＨｈ５Ｌの発現、精製、及び巻き戻し
発現ベクターｐＲＡ−ｈ５ＨｈＯＬとｐＲＡ−ｈＯＨｈ５Ｌを用いて、実施例３と同様の方法で培養を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ結果、各画分にそれぞれ発現が見られたが、ｈ５ＨｈＯＬ、ｈＯＨｈ５Ｌ共に菌体内不溶性画分に最も多く発現していたことから、Ｅｘ３の場合と同様この画分からの調製を行った（図２４）。
【００９７】
精製、巻き戻しは実施例４と同様の方法で行った。ｈ５ＨｈＯＬ、ｈＯＨｈ５Ｌを個別に精製後、等量混合し、巻き戻した後のｈＥｘｈ３のＳＤＳ−ＰＡＧＥからＥｘ３同様非常に精製度が高く、かつ均一なヘテロ二量体を形成している様子が分かる（図２４）。
【００９８】
実施例１４ ｈＥｘｈ３の機能評価  −  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  
実施例５と同様にＦｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによりｈＥｘｈ３の各細胞に対する結合を調べた。ＮＣ、ＰＣも実験例５と同様に行った。結果はＥｘ３と同様、Ｔ−ＬＡＫ細胞、ＴＦＫ−１細胞両者への結合が見られた（図２５）。
【００９９】
実施例１５ ｈＥｘｈ３の部位特異的変異導入による機能改変の検討 
変異の導入によるｈＥｘｈ３の機能改変の検討を行った。ヒト型化による抗体自身の機能の低下、あるいは損失はしばしば報告されているため、ＦＲ中のＣＤＲの構造に関与しうる配列、即ちｃａｎｏｎｉｃａｌ構造（いくつかの固定化されたＣＤＲ構造）やｖｅｒｉｎｅｒ残基を中心にヒト型化により配列が変化した部分を再びマウスの配列に戻す部位特異的変異導入が必要とされている。
【０１００】
ｖｅｒｉｎｅｒ残基は参考論文３により提唱されたＦＲ中のＣＤＲの前後に位置する残基の中でＣＤＲの土台を築き、ＣＤＲの構造を調整して抗原への結合に関与している残基である。しかし活性回復に関与するｖｅｒｉｎｅｒ残基は抗体により異なり、詳細な構造解析によりある程度予測はできるものの実際は複数の変異体を作製し、結合活性等の機能評価により選択するのが一般的である（参考論文４、５）。
【０１０１】
各変異導入はオーバーラップＰＣＲ法を用いて行った。即ち、ｈ５ＨをプライマーＥ−ＮでＰＣＲ増幅させた産物とＦ−ＭでＰＣＲ増幅させた産物を混合したものを２ｎｄ  ＰＣＲの鋳型とし、プライマーＥ−Ｆにより２ｎｄ  ＰＣＲを行い、ＮｃｏＩ−ＥａｇＩで消化後、ｐＲＡ−ｈ５ＨｈＯＬのｈ５Ｈと入れ換えた。これによりｈ５ＨのＭ４８Ｉ（４８位のＭｅｔをＩｌｅ）変異体（以下ｈ５Ｈ−ｍ０１）を含むｐＲＡ−ｈ５ＨｈＯＬが作製される。同様の手法を用い以下の１０個の変異体を作製した（表２、図２６）。
【０１０２】
【表２】
2004242638.tif 000006
【０１０３】
2004242638.tif 000007
【０１０４】
○参考論文３  −  Ｆｏｏｔｅ，  Ｊ．  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｇ．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２４，  ４８７−９９．  （１９９２）．
○参考論文４  −  Ｓａｔｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ａ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３，  ８５１−６．  （１９９３）．
○参考論文５  −  Ｓａｔｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｔｗｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎｓ．  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１，  ３７１−８１．  （１９９４）．
【０１０５】
実施例１６ ｈＥｘｈ３とｈＥｘｈ３各変異体の機能評価  −  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害試験（ＭＴＳ  ａｓｓａｙ）
実施例７と同様にＭＴＳ  ａｓｓａｙによりｈＥｘｈ３、及びｈＥｘｈ３各変異体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を評価した。結果は数カ所の変異の導入により、細胞傷害活性に大きく影響を与えることが分かり、いくつかの変異体は変異導入前のｈＥｘｈ３より若干強い活性を有していた（図２７）。
また濃度依存性的な細胞傷害活性も見られ、ｈＥｘｈ３（左のバー）及びｈ５Ｈ−ｍ０９（中央のバー）はＥｘ３（右のバー）と同等の効果を有することが分かった（図２８）。
【０１０６】
【発明の効果】
本発明のダイアボディ型二重特異性抗体は、インビボ及びインビトロにおいて優れた細胞障害活性を発揮することが確認された。又、該抗体を食作用又は細胞障害活性を有する細胞及びヒト上皮細胞成長因子受容体を発現する腫瘍細胞の培養系に添加することにより、食作用又は細胞障害活性を有する細胞におけるサイトカインの生産量を有意に増加させることが判明した。更に、ヒト型化したダイアボディ型二重特異性抗体を作製し、この抗体がマウス由来のダイアボディ型二重特異性抗体に匹敵する活性を有することを実証した。
又、本発明のダイアボディ型二重特異性抗体は、抗体を数ヶ月間凍結保存した後にもこのような活性が保存されていることが確認され、優れた安定性も有することが判明した。
従って、これらのダイアボディ型二重特異性抗体等を有効成分として含有する医薬組成物は、インビトロ及びインビボで腫瘍細胞を有意に排除・殺傷・傷害する作用を有し、抗腫瘍剤として使用することが出来る。
【０１０７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】抗体ＥＧＦＲ抗体５２８の可変領域のアミノ酸配列を示す。
【図２】Ｅｘ３発現ベクターである、ｐＲＡ−５ＨＯＬ  及びｐＲＡ−ＯＨ５Ｌの構造を示す模式図である。
【図３】大腸菌ＢＬ２１における５ＨＯＬ及びＯＨ５Ｌの発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上）及びＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ（下）の結果を示す写真である。
【図４】段階透析による巻き戻しの工程を示す。
【図５】Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによるＥｘ３の各細胞に対する結合を調べた結果を示す。
【図６】Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによるＥｘ３の阻害試験の結果を示す。
【図７】Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによるＥｘ３の吸収試験の結果を示す。
【図８】Ｅｘ３によるＴＦＫ−１細胞へのＴ−ＬＡＫ細胞の集簇を示す顕微鏡写真である。
【図９】ＩｇＧによる集簇の阻害を示す顕微鏡写真である。
【図１０】Ｅｘ３等の各種ダイアボディ型二重特異性抗体によるインビトロ細胞障害試験（ＭＴＳ  ａｓｓａｙ）の結果を示す。
【図１１】Ｅｘ３（左側のバー）と各ｓｃＦｖを混合した場合（右側のバー）のインビトロ細胞障害活性の比較を示す。
【図１２】Ｅｘ３の各種ダイアボディ型二重特異性抗体によるインビトロ細胞障害試験（５１Ｃｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）の結果を示す。
【図１３】Ｅｘ３の各種ダイアボディ型二重特異性抗体による各種細胞に対するインビトロ細胞障害試験（５１Ｃｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）の結果を示す。
【図１４】ＩｇＧを加えた阻害試験の結果を示す。
【図１５】Ｅｘ３添加によるＩＦＮ−γの産生量の増加を示す。
【図１６】Ｅｘ３添加によるＧＭ−ＣＳＦの産生量の増加を示す。
【図１７】Ｅｘ３添加によるＴＮＦ‐αの産生量の増加を示す。
【図１８】Ｅｘ３添加によるＩＬ−２の産生量の変化を示す。
【図１９】各サイトカイン産生量の経時変化を示す。
【図２０】ＳＣＩＤマウスを用いたインビボ細胞傷害試験の結果を示す。
【図２１】全合成したヒト型化抗体ＯＫＴ３の可変領域配列のアミノ酸配列を示す。
【図２２】全合成したヒト型化抗体５２８の可変領域配列のアミノ酸配列を示す。
【図２３】ｈＥｘ３発現ベクターである、ｐＲＡ−ｈ５ＨＯＬ  及びｐＲＡ−ｈＯＨ５Ｌの構造を示す模式図である。
【図２４】ｈ５ＨＯＬ  及びｈＯＨ５Ｌの発現を確認するＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す写真である。
【図２５】Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによるｈＥｘ３の細胞に対する結合を調べた結果を示す。
【図２６】ｈ５Ｈへの部位特異的変異の導入を示す。
【図２７】ｈＥｘ３とその各変異体のインビトロでの細胞障害試験（ＭＴＳ  ａｓｓａｙ）の結果を示す。
【図２８】ｈＥｘ３とその各変異体のインビトロでの細胞障害試験（ＭＴＳ  ａｓｓａｙ）における濃度依存性の結果を示す。図中、ｈＥｘｈ３（左のバー）、ｈ５Ｈ−ｍ０９（中央のバー）及びＥｘ３（右のバー）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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