(57)【要約】【課題】ＥＩＡによる測定のように特殊な機械や試薬を用いず、標的ＲＮＡから適切なＲＮＡ断片を合成して、効率良くオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させる方法、及びその自己集合体の形成方法によって形成された自己集合体、並びにその自己集合体の形成方法を利用して、低コストで簡便に特定の遺伝子を検出する方法を提供する。【解決手段】標的ＲＮＡの所定の領域に隣接して結合するように構成された切断用プローブ及びＲＮＡ分解酵素を用いて、前記標的ＲＮＡから前記所定の領域を含むＲＮＡ断片を合成し、該合成されたＲＮＡ断片を用いたオリゴヌクレオチドの自己集合反応によりオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成するようにした。【選択図】  図１
2004242585.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＲＮＡの所定の領域に隣接して結合するように構成された切断用プローブ及びＲＮＡ分解酵素を用いて、前記標的ＲＮＡから前記所定の領域を含むＲＮＡ断片を合成し、該合成されたＲＮＡ断片を用いたオリゴヌクレオチドの自己集合反応によりオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成することを特徴とするＲＮＡ断片を用いたオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２】
前記切断用プローブがＤＮＡからなり、前記ＲＮＡ分解酵素としてＲＮａｓｅＨを用いることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項３】
前記自己集合反応が、互いに相補的な塩基配列領域がｎ（ｎ≧３）ヶ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成させる自己集合反応であることを特徴とする請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項４】
前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも一方が、前記ｎ（ｎ≧３）カ所の領域を含有するＲＮＡ断片であることを特徴とする請求項３記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項５】
前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの一方が、前記ｎ（ｎ≧３）カ所の領域を含有するＲＮＡ断片であり、前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの他方が、予め作製しておいたプローブであることを特徴とする請求項３又は４記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項６】
前記予め作製しておいたプローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項５記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項７】
前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対の構成が、１対１でハイブリダイゼーションする時に必ずｎ（ｎ≧３）ヶ所の相補的な部分の中で、一ヶ所ずつが特異的にハイブリダイゼーションするように構成されることを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項８】
前記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対の構成が、該塩基配列領域が少なくとも一ヶ所異なるｍ（ｍ≧２）種の一対のプローブからなることを特徴とする請求項３〜７のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチド・プローブの相補的塩基配列領域の端部に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、該プローブがハイブリダイズした際に少なくとも１つのＧ−Ｃ結合を相補的塩基配列領域の端部に形成させることを特徴とする請求項３〜８のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１０】
前記自己集合反応が、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３´側領域、中央領域、及び５´側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３´側領域及び５´側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３´側領域及び５´側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３´側領域及び５´側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成架橋プローブ含有系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応であることを特徴とする請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１１】
前記ｎ＝１であり、前記プローブの塩基配列を、
第一の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３´側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３´側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５´側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５´側領域、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３´側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３´側領域、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５´側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５´側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項１０記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１２】
前記ｎ＝１であり、前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３´側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３´側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５´側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５´側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３´側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３´側領域、
第１の系のＮＯ．１−オリゴヌクレオチドの５´側領域と第２の系のＮｏ．２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５´側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項１０記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１３】
前記プローブの少なくとも一つが、前記ＲＮＡ断片であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１４】
前記プローブの少なくとも一つが、前記ＲＮＡ断片であり、且つ前記プローブの少なくとも一つが、予め作製しておいたプローブであることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１５】
前記予め作製しておいたプローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項１４記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１６】
前記ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブの相補的な塩基配列領域の端部に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、該プローブがハイブリダイズした際に少なくとも１つのＧ−Ｃ結合を相補的な塩基配列領域の端部に形成させることを特徴とする請求項１０〜１５のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１７】
前記標的ＲＮＡが、遺伝子増幅反応により合成されたＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１８】
前記遺伝子増幅反応が、一対の増幅用プローブの少なくとも一方の５’末端にプロモーター領域を含有する該一対の増幅用プローブ、逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ及びＲＮＡ合成酵素を用いてＲＮＡを増幅する反応であることを特徴とする請求項１７記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項１９】
前記増幅用プローブがＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡとＲＮＡから構成されるキメラ型、のいずれかから選ばれ、且つＲＮＡ増幅を可能にし得る増幅用プローブであることを特徴とする請求項１８記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２０】
前記遺伝子増幅反応において増幅されるターゲット遺伝子にＤＮＡ及び／又はＲＮＡを用いることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２１】
前記遺伝子増幅反応において増幅されるターゲット遺伝子が１塩基多型であることを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法。
【請求項２２】
請求項１〜２２のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法を用いて形成されることを特徴とする自己集合体。
【請求項２３】
前記自己集合体がＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドであることを特徴とする請求項２２記載の自己集合体。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法を用いて自己集合体を形成させ、形成された前記自己集合体を検出することにより、前記標的ＲＮＡを検出することを特徴とする遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＲＮＡ断片を用いたオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法、形成された自己集合体、及びそれを利用した遺伝子の検出方法に関する。
【０００２】
【関連技術】
近年、微量のターゲット遺伝子の検出を目的に遺伝子を増幅する各種遺伝子増幅法が開発されている。中でも耐熱性核酸合成酵素を使用するＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  法（例えば、特許文献１及び２参照。以下、ＰＣＲ法と称する。）や耐熱性核酸連結酵素を使用するＬｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  法（例えば、特許文献３参照。以下、ＬＣＲ法と称する。）、及び、鎖置換型核酸合成酵素を使用するＳｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  法（例えば、特許文献４参照。以下、ＳＤＡ法と称する。）やＩｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ法（例えば、特許文献５参照。以下、ＩＣＡＮ法と称する。）はそれぞれ核酸を合成する酵素の特徴を利用して開発された遺伝子の増幅法である。
【０００３】
これらの遺伝子増幅法は、遺伝子の特定部位のみを繰り返し複製する反応であり、その特定部位からなる遺伝子断片が増幅されるものである。そのため遺伝子増幅法による増幅産物は直鎖状の遺伝子の断片であるため、簡便に検出することが困難であり、現在市販されている遺伝子診断キットにおける遺伝子の検出法においては、主にＥＩＡ（エンザイム・イムノ・アッセイ）との組み合わせによる検出、又は、あらかじめ蛍光物質を遺伝子に標識して標的遺伝子を検出している。
【０００４】
しかし、ＥＩＡや蛍光物質を遺伝子に標識した測定では、特殊な機械と試薬が必要であり、操作も煩雑で判定するまでに１時間以上の時間を要しており、既存の遺伝子増幅法により増幅された遺伝子を簡便かつ安価で検出可能な方法が望まれていた。
【０００５】
一方、本発明者らは、酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法（プローブ自己集合体の作製方法）を既に提案した（例えば、特許文献６〜８参照。）。この方法は、３個所の領域から構成される一対のプローブ（ＨｏｎｅｙＣｏｍｂ  Ｐｒｏｂｅ、以下、ＨＣＰと称する。）を用いる方法であり、第１プローブと第２プローブの各々の３個所の領域は互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする様に各領域の塩基配列を工夫したものである。この工夫により、複数の一対のプローブを反応させた場合、互いにハイブリダイズしてプローブの自己集合体を形成させることができる（Ｐｒｏｂｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｌｉｎｋ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、ＰＡＬＳＡＲ法と称する。）。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許第４，６８３，１９５号公報
【特許文献２】
米国特許第４，６８３，２０２号公報
【特許文献３】
米国特許第５，７９２，６０７号公報
【特許文献４】
特公平７−１１４７１８号公報
【特許文献５】
国際公開第００／５６８７７号パンフレット
【特許文献６】
米国特許第６，２６１，８４６号公報
【特許文献７】
特許第３２６７５７６号公報
【特許文献８】
欧州特許出願公開第１，００２，８７７Ａ号明細書
【特許文献９】
国際公開第９２／２０７０２号パンフレット
【非特許文献１】
Ｋｏｓｈｋｉｎ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９８．５４，３６０７−３６３０．
【非特許文献２】
Ｋｏｓｈｋｉｎ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９８．１２０，１３２５２−１３２５３．
【非特許文献３】
Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ．  ２０００．９７，５６３３−５６３８．
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記した従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、さまざまなオリゴヌクレオチドの自己集合体の形成方法について研究を重ねてきた。その結果、遺伝子増幅反応により増幅されたオリゴヌクレオチドを自己集合体の形成のためのオリゴヌクレオチドとして利用することを見出した。
【０００８】
しかしながら、既存の遺伝子増幅法で増幅されたＲＮＡの増幅産物は、長鎖であり、自己集合体形成のためのオリゴヌクレオチド・プローブとして用いることが困難であった。本発明者らは、この長鎖ＲＮＡ増幅産物を、自己集合体を形成することが可能な領域のみを有するように適切な長さに切断し、自己集合体形成の効率を高めるべく、鋭意研究を重ねた結果、本発明に到達したものである。
【０００９】
本発明は、ＥＩＡによる測定のように特殊な機械や試薬を用いず、標的ＲＮＡから適切なＲＮＡ断片を合成して、効率良くオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させる方法、及びその自己集合体の形成方法によって形成された自己集合体、並びにその自己集合体の形成方法を利用して、低コストで簡便に特定の遺伝子を検出する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明のＲＮＡ断片を用いたオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法は、標的ＲＮＡの所定の領域に隣接して結合するように構成された切断用プローブ及びＲＮＡ分解酵素を用いて、上記標的ＲＮＡから前記所定の領域を含むＲＮＡ断片を合成し、該合成されたＲＮＡ断片を用いたオリゴヌクレオチドの自己集合反応によりオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成することを特徴とする。
【００１１】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法において、上記切断用プローブがＤＮＡからなり、上記ＲＮＡ分解酵素としてＲＮａｓｅＨを用いることが好ましい。
【００１２】
上記自己集合反応の一例として、互いに相補的な塩基配列領域がｎ（ｎ≧３）ヶ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブ（以下、ＨＣＰと称す場合がある）の複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成させる自己集合反応を用いることができる。
【００１３】
上記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも一方として、上記ｎ（ｎ≧３）ヶ所の領域を含有するＲＮＡ断片を用いることができる。
【００１４】
上記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの一方が、上記ｎ（ｎ≧３）カ所の領域を含有するＲＮＡ断片であり、上記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの他方が、予め作製しておいたプローブであることが好適である。
【００１５】
上記予め作製しておいたプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成される。該プローブがＤＮＡである場合、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドからなる自己集合体が形成される。
【００１６】
上記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対の構成は、１対１でハイブリダイゼーションする時に必ずｎ（ｎ≧３）ヶ所の相補的な部分の中で、一ヶ所ずつが特異的にハイブリダイゼーションするように構成される。
【００１７】
上記一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対の構成が、該塩基配列領域が少なくとも一ヶ所異なるｍ（ｍ≧２）種の一対のプローブからなるものを用いることができる。
【００１８】
上記自己集合反応の別の例として、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３´側領域、中央領域、及び５´側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３´側領域及び５´側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３´側領域及び５´側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３´側領域及び５´側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成架橋プローブ含有系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応を用いることができる。
【００１９】
上記自己集合体の形成方法の別の例において、ｎ＝１の場合、第１の系のダイマープローブと第２の系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２通り存在する。上記ｎ＝１の一例として、上記プローブの塩基配列を、第一の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３´側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３´側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５´側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５´側領域、第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３´側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３´側領域、第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５´側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５´側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００２０】
ｎ＝１の場合の別の例として、上記プローブの塩基配列を、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３´側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３´側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５´側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５´側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３´側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３´側領域、第１の系のＮＯ．１−オリゴヌクレオチドの５´側領域と第２の系のＮｏ．２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５´側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００２１】
上記自己集合体の形成方法の別の例において、ｎ≧２の場合、第１、第３、・・、第（２ｎ−１）の系のダイマー形成用プローブと第２、第４、・・、第２ｎの系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２通り存在する。ｎ≧２の場合の１例として、上記プローブの塩基配列を、第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００２２】
ｎ≧２の場合の別の例として、上記プローブの塩基配列を、第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００２３】
上記ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブの少なくとも一つとして、上記ＲＮＡ断片を用いることができる。
【００２４】
上記ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブの少なくとも一つが、上記ＲＮＡ断片であり、且つ上記ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブの少なくとも一つが、予め作製しておいたプローブであることが好ましい。
【００２５】
上記架橋プローブの少なくとも一つとして、上記架橋プローブの２つの領域を含有するＲＮＡ断片を用いることが好ましい。
【００２６】
上記予め作製しておいたプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成される。該プローブにＤＮＡが含まれる場合、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドからなる自己集合体が形成される。
【００２７】
上記プローブのハイブリダイゼーションとして、あらかじめ上記ダイマー形成用プローブからダイマーを形成させた後、上記架橋プローブと該ダイマーをハイブリダイゼーションさせることが好ましい。
【００２８】
上記複数対のダイマー形成用プローブは、前記中央領域の異なるｍ（ｍ≧２）種のダイマー形成用プローブを用いることができる。
【００２９】
上記一対のダイマー形成用プローブの３’側領域及び／又は５’側領域を互いに同一な塩基配列とすることができる。
【００３０】
上記ＨＣＰ、ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブのような自己集合反応に用いられるオリゴヌクレオチド・プローブ（以下、単にプローブと称する場合がある。）の相補的塩基配列領域の端部に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、上記プローブがハイブリダイズした際に少なくとも１つのＧ−Ｃ結合を相補的塩基配列領域の端部に形成させることにより、塩基の積み重ね（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｓｅ）により塩基のπ電子の特殊な相互作用を生じさせ、より安定したオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させることができる。
【００３１】
上記標的ＲＮＡとして、遺伝子増幅反応により合成されたＲＮＡを用いることができる。
【００３２】
上記遺伝子増幅反応及び上記遺伝子増幅反応において増幅されるターゲット遺伝子は、特に限定されないものである。上記遺伝子増幅反応において増幅されるターゲット遺伝子としては、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを用いることができる。例えば、一本鎖のＲＮＡやＤＮＡ、二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ等が好適に用いられる。また、上記遺伝子増幅反応において増幅されるターゲット遺伝子に１塩基多型を用いることができる。
【００３３】
上記遺伝子増幅反応に、核酸合成酵素を使用することができる。上記核酸合成酵素としては、特に限定されないが、例えば、耐熱性核酸合成酵素、ＤＮＡ合成酵素、及びＲＮＡ合成酵素等が好適に用いられる。
【００３４】
また、上記遺伝子増幅反応に、逆転写酵素を使用することができる。上記逆転写酵素としては、特に限定されないが、例えば、ＲＮＡ依存ＤＮＡ合成酵素活性に加え、ＤＮＡ依存ＤＮＡ合成酵素活性を併せ持つもの、あるいはＲＮＡ依存ＤＮＡ合成酵素活性に加え、ＤＮＡ依存ＤＮＡ合成酵素活性及びＲＮａｓｅＨ活性を併せ持つものが好適に用いることができる。
【００３５】
上記標的ＲＮＡとして、ＤＮＡあるいはＲＮＡ合成酵素、逆転写酵素及びＲＮａｓｅＨを用いた遺伝子増幅反応により合成されたものが用いられる。
【００３６】
上記遺伝子増幅反応が、一対の増幅用プローブの少なくとも一方の５’末端にプロモーター領域を含有する該一対の増幅用プローブ、逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ及びＲＮＡ合成酵素を用いてＲＮＡを増幅する反応であることが好ましい。
【００３７】
上記遺伝子増幅反応に用いる増幅用プローブ（以下、プライマーと称することもある。）が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡとＲＮＡから構成されるキメラ型、のいずれかから選ばれ、且つＲＮＡ増幅を可能にし得る増幅用プローブであることが好ましい。
【００３８】
本発明の自己集合体は、上記本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法を用いて形成されるものである。
【００３９】
上記自己集合体として、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドからなる自己集合体を形成することが可能である。
【００４０】
本発明の遺伝子の検出方法は、上記本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法を用いて自己集合体を形成させ、形成された上記自己集合体を検出することにより、上記標的ＲＮＡを検出することを特徴とする。標的ＲＮＡとして、ターゲット遺伝子を遺伝子増幅反応により増幅した増幅ＲＮＡ産物を用いた場合、上記自己集合体を検出することにより、ターゲット遺伝子を検出することが可能である。
【００４１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
【００４２】
図１は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第１の態様の手順の大略を示すフローチャートである。図２は、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第２の態様の手順の大略を示すフローチャートである。
【００４３】
図１に示すように、まず、標的ＲＮＡの所定の領域に隣接して結合するように構成された切断用プローブを準備し（ステップ１０２）、この切断用プローブ及びＲＮＡ分解酵素を用いて、標的ＲＮＡから所定の領域を含むＲＮＡ断片を合成し（ステップ１０４）、このＲＮＡ断片と自己集合体を形成するようなオリゴヌクレオチド・プローブを添加し、合成されたＲＮＡ断片及び該プローブを用いた自己集合反応により（ステップ１０６）、オリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成することができる。
【００４４】
また、図２に示すように、ターゲット遺伝子から遺伝子増幅反応によりＲＮＡを合成し（ステップ１００）、合成されたＲＮＡを上記標的ＲＮＡとして用いて、自己集合体を形成することができる。
【００４５】
上記切断用プローブを構成する核酸は、特に限定されないが、ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されていることが好ましい。
【００４６】
上記切断用プローブとして、ＤＮＡからなるプローブを用いる場合、上記ＲＮＡ分解酵素としてＲＮａｓｅＨを用いて標的ＲＮＡからＲＮＡ断片を合成することができる。まず、切断用ＤＮＡプローブを標的ＲＮＡに結合させ部分的にＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させ、ＲＮａｓｅＨにより該ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を切断してＲＮＡ断片を合成することができる。
【００４７】
また、上記切断用プローブとしてＲＮＡからなるプローブを、ＲＮＡ分解酵素として二本鎖のＲＮＡを特異的に分解するＲＮａｓｅＩＩＩ等のＲＮアーゼを用いて、切断用ＲＮＡプローブを標的ＲＮＡに結合させ部分的に二本鎖のＲＮＡを形成させ、上記ＲＮアーゼにより該二本鎖のＲＮＡを切断してＲＮＡ断片を合成することも可能である。
【００４８】
上記添加されるオリゴヌクレオチド・プローブや切断用プローブを構成する核酸は、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、例えば、特許文献９参照。）やＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ、例えば、非特許文献１〜３参照。）が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
【００４９】
オリゴヌクレオチド・プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは１０〜１００塩基、さらに好ましくは１５〜５０塩基である。
【００５０】
これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
【００５１】
使用するオリゴヌクレオチド・プローブの本数は特に限定されないが、１０２〜１０１５本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐＨも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜９．０の範囲のものが使用できる。反応温度は４０〜８０℃、好ましくは５５〜７５℃である。
【００５２】
図３は、ＰＡＬＳＡＲ法による一対のＨＣＰ（Ｎｏ．１プローブ及びＮｏ．２プローブ）を用いた自己集合反応の一例を示す模式図である。同図において、Ｎｏ．１プローブは、Ｘ１領域、Ｘ２領域及びＸ３領域を有し、Ｎｏ．２プローブは、Ｘ１’領域、Ｘ２’領域及びＸ３’領域を有している［図３（ａ）］。このＮｏ．１プローブとＮｏ．２プローブは、両者をハイブリダイゼーションさせたとき、Ｘ１領域はＸ１’領域とだけ結合し、Ｘ２領域はＸ２’領域とだけ結合し、Ｘ３領域はＸ３’領域とだけ結合するような構成とされており、３つの結合パターンで一対のプローブが互い違いにハイブリダイゼーションする。［図３（ｂ）］。
【００５３】
３つの結合パターンで互い違いにハイブリダイゼーションした一対のＨＣＰの複数対は、図３（ｃ）に模式的な一例を示したように、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、オリゴヌクレオチドの自己集合反応により、二本鎖の自己集合体を形成させることができる。
【００５４】
図３は、相補的な塩基配列領域が３箇所からなるＨＣＰについて説明したが、相補的な塩基配列領域を４箇所以上有するＨＣＰを用いた場合についても同様に自己集合反応により自己集合体を形成させることができる。
【００５５】
図４は、ＰＡＬＳＡＲ法によるダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを用いた自己集合反応の一例を示す模式図である。図４に示した如く、第１の系の一対のダイマー形成用プローブは、一対のオリゴヌクレオチドを３つの領域に分け、中央領域を互いに相補的な領域とするとともに、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とし、ダイマープローブを形成する［図４（ａ）］。第２の系の一対の架橋プローブは、一対のオリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各領域を互いに非相補的な塩基配列とし、３’側領域は、ダイマー形成用プローブの３’側領域と、５’側領域はダイマー形成用プローブの５’側領域と、それぞれ相補的な塩基配列とする［図４（ｂ）］。第１の系のダイマープローブに対して、第２の系の架橋プローブが架橋するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成する［図４（ｃ）］。
【００５６】
図５は、ＰＡＬＳＡＲ法によるダイマー形成用プローブと架橋プローブを用いた自己集合反応の別の例を示す模式図である。ダイマー形成用プローブと架橋プローブの５’側領域及び３’側領域の相補的領域の組み合わせとしては、図４の組み合わせを図５に示した如く変更することも可能である。
【００５７】
図４及び図５において、第１の系からなるダイマー形成用プローブと第２の系からなる架橋プローブを用いた自己集合反応について説明したが、第１、３、・・（２ｎ−１）の系からなるダイマー形成用プローブと第２、４、・・２ｎの系からなる架橋プローブを用いた自己集合反応により自己集合体を形成させることもできる。
【００５８】
以下に、本発明の自己集合体の形成方法について図６〜図９を参照して更に具体的に説明する。
【００５９】
図６及び図７は、本発明の自己集合体の形成方法の工程順の第１の例を示す概略説明図であり、図６は上記ステップ１０４、図７は上記ステップ１０６についてそれぞれ示したものである。第１の例は、標的ＲＮＡとして、遺伝子増幅反応により増幅された長鎖ＲＮＡ増幅産物を用いた。また、切断用プローブとして２種のＤＮＡプローブを用い、ＲＮＡ分解酵素としてＲＮａｓｅＨを用いた。
【００６０】
まず、長鎖ＲＮＡ増幅産物の自己集合反応に用いる所定の領域の５’末、３’末にそれぞれ隣接した部位に相補的な配列をもつ２種の切断用ＤＮＡプローブを準備し（ステップ１０２）、図６に示した如く、該切断用ＤＮＡプローブを該長鎖ＲＮＡ増幅産物［図６（ａ）］とアニーリングさせる［図６（ｂ）］。ここで部分的にできたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部位は、ＲＮａｓｅＨの作用により切断される［図６（ｃ）］。これにより自己集合体形成に適した鎖長のＲＮＡ断片が形成される［図６（ｄ）］（ステップ１０４）。
【００６１】
上記形成されたＲＮＡ断片に対して自己集合体を形成するようなオリゴヌクレオチド・プローブを添加し、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、自己集合反応により（ステップ１０６）、自己集合体を形成させることができる。
【００６２】
上記自己集合反応（ステップ１０６）として、例えば、図７に示した如く、ＨＣＰを用いた自己集合反応を利用することができる。まず、合成されたＲＮＡ断片を３箇所以上に分け［図７（ｅ）］、一対のＨＣＰの一方（ＲＮＡ−ＨＣＰ）として用いる。図７（ｆ）に示した如く、該ＲＮＡ−ＨＣＰの各領域（Ｘ、Ｙ及びＺ領域）に対して相補的な領域（Ｘ’、Ｙ’及びＺ’領域）を有するオリゴヌクレオチド・プローブを別に用意しておき、上記ＲＮＡ断片合成後の溶液に添加することにより、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体が形成される［図７（ｇ）］。上記オリゴヌクレオチド・プローブとして、ＤＮＡプローブ（ＤＮＡ−ＨＣＰ）を用いた場合、上記ＲＮＡ−ＨＣＰとＤＮＡ−ＨＣＰとがハイブリダイズし、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドからなる自己集合体が形成される。
【００６３】
また、上記自己集合反応（ステップ１０６）において、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブによる自己集合反応を利用することもできる。この場合、合成されたＲＮＡ断片を一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブのいずれか一つとして用い、別に用意した残りのプローブを添加することにより、自己集合体を形成することができる。
【００６４】
図８及び図９は、本発明の自己集合体の形成方法の工程順の第２の例を示す概略説明図であり、図８は上記ステップ１０４、図９は上記ステップ１０６についてそれぞれ示したものである。第２の例は、標的ＲＮＡとして、遺伝子増幅反応により増幅された長鎖ＲＮＡ増幅産物を用いた。また、切断用プローブとして４種のＤＮＡプローブを用い、ＲＮＡ分解酵素としてＲＮａｓｅＨを用いた。
【００６５】
まず、長鎖ＲＮＡ増幅産物の自己集合反応に用いる所定領域２箇所の５’末、３’末にそれぞれ隣接した部位に相補的な配列をもつ４種の切断用ＤＮＡプローブを準備し（ステップ１０２）、図８に示した如く、該切断用ＤＮＡプローブを該長鎖ＲＮＡ増幅産物［図８（ａ）］とアニーリングさせる［図８（ｂ）］。ここで部分的にできたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部位は、ＲＮａｓｅＨの作用により切断される［図８（ｃ）］。これにより自己集合体形成に適した鎖長のＲＮＡ断片が２種形成される［図８（ｄ）］（ステップ１０４）。
【００６６】
ステップ１０６において、形成されたＲＮＡ断片は、図９に示した如く、２種の一対のＨＣＰの一方（ＲＮＡ−ＨＣＰ）［図９（ｅ）］として用いることが可能であり、別に用意した他方のＨＣＰを加えることにより［図９（ｆ）］、自己集合体を形成することができる。上記他方のＨＣＰとして、ＤＮＡプローブ（ＤＮＡ−ＨＣＰ）を用いた場合、上記ＲＮＡ−ＨＣＰとＤＮＡ−ＨＣＰとがハイブリダイズし、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドからなる自己集合体が形成される。
【００６７】
また、ステップ１０６において、上記ＲＮＡ断片をダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを用いた自己集合反応に利用することも可能である。例えば、２種のＲＮＡ断片を一対の架橋プローブとして用い、別に用意した一対のダイマー形成用プローブ又は該ダイマー形成用プローブから形成されたダイマーを添加し、自己集合体を形成することができる。
【００６８】
上記本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法により形成された本発明の自己集合体は、一般的なアガロースゲル電気泳動法等によって、簡単に確認することができる。
【００６９】
また、本発明において形成される自己集合体の塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとることから、２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる「ハイポクロミズム」という淡色効果を発現させて自己集合体の状態を確認することも可能である。
【００７０】
さらには、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光強度の変化から自己集合体の状態を確認することも可能である。例えば、自己集合体は、オリゴヌクレオチドの二本鎖に挿入して蛍光を発する色素を添加し、セフェイド社のＩ−ＣＯＲＥＴＭ（Ｓｍａｒｔ  ＣｙｃｌｅｒＴＭ）等を用いて蛍光の発光状態を観察することにより検出可能である。
【００７１】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法によれば、標的ＲＮＡが存在する場合にのみ自己集合体が形成されるため、自己集合体の有無を確認することにより、低コストで簡便に標的ＲＮＡを検出することができる。更に、標的ＲＮＡが遺伝子増幅反応により増幅されたＲＮＡである場合、自己集合体を検出することにより、増幅されたターゲット遺伝子を検出することができる。
【００７２】
本発明において、遺伝子増幅反応により増幅されたＲＮＡを標的ＲＮＡとして用いる場合、該遺伝子増幅反応としては、最終的にＲＮＡが増幅される反応であればよく、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。また、増幅されるターゲット遺伝子も特に限定されず、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを用いることができる。具体的には、ターゲット遺伝子としてＲＮＡを用いる例として、例えば、下記図１０〜図１２に示したようなＲＮＡ増幅反応が好適に用いられる。
【００７３】
図１０〜図１２は、本発明において好適に利用されるＲＮＡ増幅反応の一例を示す概略説明図である。図１０に示した如く、ターゲット遺伝子（ＲＮＡ）［図１０（ａ）］に相補的な配列をもち、かつ、Ｔ７ＲＮＡプロモーター領域を含むプライマー１をターゲット遺伝子にアニーリングさせる［図１０（ｂ）］（ステップ２００）。逆転写酵素によりプライマー１は伸張し、その結果、ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドができる［図１０（ｃ）］（ステップ２０２）。このように、ステップ２００及びステップ２０２は逆転写反応による第１ｃＤＮＡの合成過程である。次に、ハイブリッドのＲＮＡ鎖は、ＲＮａｓｅＨにより分解され、一本鎖となる［図１０（ｄ）］（ステップ２０４）。さらに、図１１に示した如く、この一本鎖ｃＤＮＡにプライマー２がアニーリングし［図１１（ｅ）］（ステップ２０６）、続く逆転写酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性により伸張反応が起こり、Ｔ７ＲＮＡプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡができる［図１１（ｆ）］（ステップ２０８）。
【００７４】
次に、この２本鎖となったＴ７ＲＮＡプロモーター領域をＴ７ＲＮＡポリメラーゼが認識し、プライマー２の５’末までのａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅＲＮＡを多数合成する［図１１（ｇ）］（ステップ２１０）。なお、Ｔ７ＲＮＡプロモーターを含む１本の鋳型２本鎖ＤＮＡから１００−１０００コピーのａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅＲＮＡが産生される。新しく合成された多数のａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅＲＮＡ［図１１（ｇ）］にプライマー２がアニールし［図１１（ｈ）］（ステップ２１２）、逆転写酵素によりｃＤＮＡが合成される［図１２（ｉ）］（ステップ２１４）。このＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖は、ＲＮａｓｅＨにより分解され、ｃＤＮＡは一本鎖となる［図１２（ｊ）］（ステップ２１６）。さらに、このｃＤＮＡにＴ７ＲＮＡプロモーター配列をもつプライマー１がアニーリングすることで［図１２（ｋ）］（ステップ２１８）、逆転写酵素によりプライマー１が伸張し、Ｔ７ＲＮＡプロモーター領域を含む２本鎖ＤＮＡができる［図１２（ｌ）］（ステップ２２０）。ステップ２１０〜ステップ２２０のサイクルを繰り返すことにより、２本鎖ＤＮＡを鋳型として、さらに多数のａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅＲＮＡが増幅されていく［図１２（ｍ）］（ステップ２２２）。なお、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのみを基質とするＲＮＡ分解酵素のため、一本鎖ＲＮＡは分解されないものである。上記ＲＮＡ増幅反応は、１チューブ内にて一定温度で進行するため、短時間の反応で指数的（＞１０８）に標的ＲＮＡ  ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ鎖の合成が可能である。
【００７５】
本発明におけるターゲット遺伝子（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。本発明で用いられる標的ＲＮＡ測定用試料としては、ＲＮＡを含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。標的ＲＮＡとしては、例えば、上記したターゲット遺伝子測定用試料中のＲＮＡを上記と同様に用いても良く、また、上記試料中のターゲット遺伝子（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を公知の方法で増幅したＲＮＡも使用できる。
【００７６】
【実施例】
以下、本発明の実施例を具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
【００７７】
以下、実施例において用いたオリゴヌクレオチド・プローブを示す。
［１］プライマー１（前半下線部：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、後半下線部：ＨＣＶ  ＲＮＡの５’−ＮＣＲの一部に相補的な配列）
５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−ＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡ−３’
［２］プライマー２（ＨＣＶ  ＲＮＡのｃＤＮＡに相補的な配列）
５’−ＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ−３’
［３］切断ＤＮＡプローブ１
５’−ＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＧＴＧ−３’
［４］切断ＤＮＡプローブ２
５’−ＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧ−３’
［５］ＲＮＡ−ＨＣＰ（Ｘ−Ｙ−Ｚ）
５’−ＵＵＧＡＧＣＧＧＧＵＵＧＡＵＣ−ＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣＧＧ−ＵＣＧＵＣＣＵＧＧＣＡＡＵＵＣ−３’
［６］ＤＮＡ−ＨＣＰ（Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’）
５’−ＧＡＴＣＡＡＣＣＣＧＣＴＣＡＡ−ＣＣＧＧＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧ−ＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡ−３’
【００７８】
（実験例１及び比較例１）ＲＮＡの増幅及び増幅ＲＮＡの切断
１．目的
ＲＮＡ増幅法により増幅したＲＮＡを、ＲＮａｓｅＨにより切断し、自己集合体形成に適した鎖長のＲＮＡ断片（ＲＮＡ−ＨＣＰ）の切り出しを試みた。
【００７９】
２．材料
（ＲＮＡの増幅工程）
（ａ）ターゲット遺伝子として、ＨＣＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）のＲＮＡを用いた。
【００８０】
（ｂ）ＨＣＶ  ＲＮＡの５’−ＮＣＲ（ｎｏｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）の塩基配列の一部を増幅するためのプライマ−として、５’末端側にＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む領域と３’末端側に５’−ＮＣＲの一部に相補的な領域の２領域を含むプライマー１及び、ＨＣＶ  ＲＮＡのｃＤＮＡに相補的な配列からなるプライマー２を設計し用いた。
【００８１】
（ｃ）ＲＮＡ増幅反応を行うに際して、市販のＮＡＳＢＡ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ（ＴＯＹＯＢＯ社製）の緩衝液（４×反応液；ヌクレオチド、ＤＴＴ、ＭｇＣｌ２他含、１００％ＤＭＳＯ溶液、２Ｍ  ＫＣｌ溶液、ＮＡＳＢＡ水）及び、酵素溶液（ＡＭＶ−ＲＴ、ＲＮａｓｅＨ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＢＳＡ含）を用いた。
【００８２】
（増幅ＲＮＡの切断工程）
（ｄ）増幅したＲＮＡの塩基配列からＨＣＰに適した配列を切り出すため、ＨＣＰとして設定した増幅ＲＮＡ領域の５’末３’末にそれぞれ隣接した増幅ＲＮＡ部位に相補的な配列をもつ切断ＤＮＡプローブ１及び、切断ＤＮＡプローブ２を設計し用いた。
【００８３】
（ｅ）増幅ＲＮＡと切断ＤＮＡプローブのアニーリングによりできたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を分解する酵素としてＲＮａｓｅＨ（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。
【００８４】
３．方法及び結果
（実験例１−１及び比較例１）
（ａ）反応液の調製及びＲＮＡ増幅反応
実験例１−１では、最終溶液量４０μＬの反応系において、酵素溶液添加後の終濃度が１×反応溶液、１５％ＤＭＳＯ溶液、７０ｍＭ  ＫＣｌ溶液、０．２μＭプライマー１、０．２μＭプライマー２となるように調製し、最終溶液量が４０μＬになるようにＮＡＳＢＡ水を加えた。この溶液にターゲット遺伝子となる２×１０４コピーのＨＣＶ  ＲＮＡ（１０μＬ）を加え、サーマルサイクラー（パーキンエルマー社製）を用いて、６５℃５分、４１℃５分間加熱後、酵素溶液を１０μＬ添加し４０μＬとした。この溶液をさらに４１℃で５分間加熱後、遠心し、最終的に４１℃にて９０分間反応させた。また、対照として、ターゲット遺伝子の代わりにＮＡＳＢＡ水を添加したサンプルも同様に反応させた（比較例１）。
【００８５】
（ｂ）アガロースゲル電気泳動
上記実験例１−１及び比較例１で得られたＲＮＡ増幅反応後の反応液８μＬを、２％Ｎｕｓｉｅｖｅ３：１  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）にて１００Ｖ、３０分間電気泳動を行った。泳動後のゲルはＥｔＢｒで染色し、増幅産物を確認した。分子サイズマーカーとして１００ｂｐＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
【００８６】
実験例１−１及び比較例１の結果を図１３に示した。ターゲット遺伝子を添加していないサンプルを泳動した比較例１を実験例１−１と比較すると、実験例１−１においてのみ、プライマ−１とプライマ−２により増幅された特異的なバンドが矢印で示した部位にみられた。
【００８７】
（実験例１−２）
（ｃ）増幅ＲＮＡの切断
上記実験例１−１で得られたＲＮＡ増幅反応後の反応液１０μＬに、２０μＭ切断ＤＮＡプローブ１、及び２０μＭ切断ＤＮＡプローブ２をそれぞれ０．２５μＬ、さらにＲＮａｓｅＨ（３０Ｕ）を添加後、６０℃１分、３７℃４０分間反応させ、増幅ＲＮＡを切断しＲＮＡ断片（ＲＮＡ−ＨＣＰ）を切り出した。
【００８８】
（ｄ）アガロースゲル電気泳動
上記実験例１−２で得られた切断後の反応液８μＬを、４％Ｎｕｓｉｅｖｅ３：１  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）にて１００Ｖ、３０分間電気泳動を行った。また、対照として、ＲＮＡ増幅反応後のサンプルである実験例１−１も共に泳動した。泳動後のゲルはＥｔＢｒで染色し、切断産物を確認した。分子サイズマーカーとして１０ｂｐＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
【００８９】
実験例１−２及び実験例１−１の結果を図１４に示した。実験例１−１と実験例１−２を比較すると、増幅されたＲＮＡに、切断プローブとＲＮａｓｅＨを添加し反応させた実験例１−２において、ＲＮＡ−ＨＣＰを切り出すべく、増幅ＲＮＡが切断されていることがわかる。
【００９０】
（実験例２、比較例２及び３）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド自己集合体の形成
１．目的
ＲＮＡ−ＨＣＰとＤＮＡ−ＨＣＰを用いた自己集合反応による自己集合体の形成を試みた。
【００９１】
２．材料
（ａ）上記実験例１−２で切り出されるＲＮＡ−ＨＣＰの塩基配列をもつ４５ｍｅｒの合成ＲＮＡ−ＨＣＰと、これと自己集合体形成可能な配列をもつ合成ＤＮＡ−ＨＣＰを設計し用いた。
【００９２】
（ｂ）緩衝液として２０×ＳＳＣ溶液（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０）を用いた。
【００９３】
３．方法
（ａ）反応液の調製
最終溶液量２０μＬの反応系において、２０×ＳＳＣ溶液１０μＬ及び、終濃度が１．２５μＭとなるようにＲＮＡ−ＨＣＰ、ＤＮＡ−ＨＣＰをそれぞれ添加し、最終溶液量２０μＬとなるようＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加えた。
【００９４】
（ｂ）自己集合反応
サーマルサイクラー（パーキンエルマ−社製）を用いて、まず９４℃３０秒で加熱後、各反応液を５０℃（実験例２−１）、５２℃（実験例２−２）、５４℃（実験例２−３）、５６℃（実験例２−４）、５８℃（実験例２−５）又は６０℃（実験例２−６）で１時間反応させ、自己集合反応により自己集合体形成を行った。
【００９５】
（ｃ）アガロースゲル電気泳動
上記自己集合反応後の反応液８μＬを、０．５％Ｎｕｓｉｅｖｅ３：１  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）にて１００Ｖ、３０分間電気泳動を行った。
【００９６】
また、対照として、総溶液量（２０μＬ）の５０％量の２０×ＳＳＣ溶液に、ＤＮＡ−ＨＣＰのみを終濃度１．２５μＭになるように添加し、ＮＡＳＢＡ水を加えた溶液Ａ（比較例２）、及びＲＮＡ−ＨＣＰのみを終濃度１．２５μＭになるように添加し、ＮＡＳＢＡ水を加えた溶液Ｂ（比較例３）を共に泳動した。泳動後のゲルはＥｔＢｒで染色し、自己集合体を確認した。分子サイズマーカーとして１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
【００９７】
４．結果
実験例２−１〜２−６、比較例２及び比較例３の結果を図１５に示した。同図のレーン１〜６（実験例２−１〜２−６）に示された如く、温度依存的に矢印で示した部位に自己集合体が形成されることが示された。これにより、ＤＮＡ／ＤＮＡ−ＨＣＰの自己集合体形成のみならず、ＲＮＡ／ＤＮＡ−ＨＣＰの自己集合体形成も可能であることが示された。
【００９８】
（実施例１及び比較例４）
１．目的
ＲＮＡ増幅反応により増幅したＲＮＡを切断しＲＮＡ断片（ＲＮＡ−ＨＣＰ）を切り出した後、この増幅ＲＮＡ−ＨＣＰと合成ＤＮＡ−ＨＣＰによる自己集合反応により自己集合体形成を行うことにより、ターゲット遺伝子の検出を試みた。
【００９９】
２．材料
（ａ）ＲＮＡの増幅工程及び、増幅ＲＮＡの切断工程ともに、上記実験例１で用いたターゲット遺伝子、プライマー、ＮＡＳＢＡ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＫＩＴの緩衝液及び酵素溶液、切断ＤＮＡプローブ並びにＲＮａｓｅＨを用いて行った。
【０１００】
（ｂ）上記実験例２で用いたＤＮＡ−ＨＣＰを用いた。
【０１０１】
（ｃ）自己集合反応の際、ＲＮａｓｅＨ阻害剤としてＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ、ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。
【０１０２】
３．方法
（ａ）ＲＮＡ増幅法によるＲＮＡの増幅：反応液の調製及びＲＮＡ増幅反応
最終溶液量１００μＬの反応系において、酵素溶液添加後の終濃度が１×反応溶液、１５％ＤＭＳＯ溶液、７０ｍＭ  ＫＣｌ溶液、０．２μＭプライマー１、０．２μＭプライマー２となるように調製し、最終溶液量が１００μＬになるようにＮＡＳＢＡ水を加えた。この溶液にターゲット遺伝子となる５×１０４コピーのＨＣＶ  ＲＮＡ（２５μＬ）を加え、サーマルサイクラー（パーキンエルマー社製）を用いて、６５℃５分、４１℃５分間加熱後、酵素溶液を２５μＬ添加し１００μＬとした。この溶液をさらに４１℃で５分間加熱後、遠心し、最終的に４１℃にて９０分間反応させた。
【０１０３】
（ｂ）ＲＮＡ−ＨＣＰの切り出し：増幅ＲＮＡの切断
ＲＮＡ増幅反応後の反応液２０μＬに、２０μＭ切断ＤＮＡプローブ１、及び２０μＭ切断ＤＮＡプローブ２をそれぞれ０．２５μＬ、さらにＲＮａｓｅＨ（１Ｕ）を添加後、６０℃１分、３７℃４０分間反応させ、増幅ＲＮＡを切断した。
【０１０４】
（ｃ）自己集合反応
２０×ＳＳＣ溶液１０μＬ、切断した増幅ＲＮＡを含む反応溶液９．５μＬ、５０μＭ  ＤＮＡ−ＨＣＰ  ０．５μＬ、及びＤＥＰＣ  ０．２μＬを加え、総溶液量２０μＬとなるようＮＡＳＢＡ水を加えた反応液１（実施例１）を調整した。また、対照として、切断した増幅ＲＮＡを含む反応溶液９．５μＬに、２０×ＳＳＣ溶液を加えた反応液２（比較例４）も共に調製した。
【０１０５】
上記反応液１及び２をそれぞれサーマルサイクラー（パーキンエルマ−社製）を用いて、９４℃３０秒、５６℃１６時間で反応させ、自己集合反応による自己集合体形成を行った。
【０１０６】
（ｄ）蛍光顕微鏡による観察
上記自己集合反応後の反応液１及び２にそれぞれ０．０１ｍｇ／ｍＬのＥｔＢｒを等量加え、１５分後に蛍光顕微鏡（５８０ｎｍ）にて観察した。対照として、これらの透過光下での状態も観察した。実施例１及び比較例４の蛍光顕微鏡による観察結果を図１６に示した。
【０１０７】
４．結果
図１６に示した蛍光像を比較すると、実施例１において蛍光下にて自己集合体とみられる粒子が多数観察できた。一方、比較例４では、透過光下及び蛍光下において共に粒子が観察されなかった。
【０１０８】
以上に示した如く、ターゲットより増幅し切り出したＲＮＡ−ＨＣＰとＤＮＡ−ＨＣＰにてＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドからなる自己集合体を形成させることができ、これにより、ターゲット遺伝子の検出が可能であることが示された。
【０１０９】
【配列表】
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【０１１０】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法によれば、ＥＩＡによる測定のように特殊な機械や試薬を用いず、標的ＲＮＡから適切なＲＮＡ断片を合成して、効率良くオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させることができる。本発明の遺伝子の検出方法により、機械や煩雑な操作を用いずに、低コストで簡便に特定の遺伝子を検出することができる。本発明の自己集合体は、本発明の自己集合体の形成方法により効率的に形成されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第１の態様の手順の大略を示すフローチャートである。
【図２】本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法の第２の態様の手順の大略を示すフローチャートである。
【図３】本発明において利用したＰＡＬＳＡＲ法による一対のＨＣＰを用いた自己集合反応の一例を示す模式図であり、（ａ）は一対のＨＣＰ、（ｂ）はＨＣＰの結合態様の一例、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図４】本発明において利用したＰＡＬＳＡＲ法によるｎ＝１の場合のダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを用いた自己集合反応の一例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブ、（ｂ）は一対の架橋プローブ、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図５】本発明において利用したＰＡＬＳＡＲ法によるｎ＝１の場合のダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを用いた自己集合反応の別の例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブ、（ｂ）は一対の架橋プローブ、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図６】本発明の自己集合体の形成方法の工程順の第１の例におけるステップ１０４を示す概略説明図であり、（ａ）は標的ＲＮＡ、（ｂ）は切断用プローブと標的ＲＮＡの結合、（ｃ）はＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解、（ｄ）はＲＮＡ断片の合成をそれぞれ示す。
【図７】本発明の自己集合体の形成方法の工程順の第１の例におけるステップ１０６を示す概略説明図であり、（ｅ）はＲＮＡ断片のＨＣＰの一方としての使用、（ｆ）は他方のＨＣＰの添加、（ｇ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図８】本発明の自己集合体の形成方法の工程順の第２の例におけるステップ１０４を示す概略説明図であり、（ａ）は標的ＲＮＡ、（ｂ）は切断用プローブと標的ＲＮＡの結合、（ｃ）はＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解、（ｄ）はＲＮＡ断片の合成をそれぞれ示す。
【図９】本発明の自己集合体の形成方法の工程順の第２の例におけるステップ１０６を示す概略説明図であり、（ｅ）はＲＮＡ断片のＨＣＰの一方としての使用、（ｆ）は他方のＨＣＰの添加、（ｇ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図１０】本発明において好適に利用されるＲＮＡ増幅反応の一例におけるステップ２００〜ステップ２０４を示す概略説明図であり、（ａ）はターゲット遺伝子、（ｂ）はターゲット遺伝子へのプライマー１の結合、（ｃ）は逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成、（ｄ）はＲＮａｓｅＨによるＲＮＡの分解をそれぞれ示す。
【図１１】本発明において好適に利用されるＲＮＡ増幅反応の一例におけるステップ２０６〜ステップ２１２を示す概略説明図であり、（ｅ）は一本鎖ｃＤＮＡへのプライマー２の結合、（ｆ）は逆転写酵素によるＤＮＡの合成、（ｇ）はＲＮＡ合成酵素によるＲＮＡの合成、（ｈ）は合成されたＲＮＡへのプライマー２の結合をそれぞれ示す。
【図１２】本発明において好適に利用されるＲＮＡ増幅反応の一例におけるステップ２１４〜ステップ２２２を示す概略説明図であり、（ｉ）は逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成、（ｊ）はＲＮａｓｅＨによるＲＮＡの分解、（ｋ）は一本鎖ｃＤＮＡへのプライマー１の結合、（ｌ）は逆転写酵素によるＤＮＡの合成、（ｍ）はＲＮＡ合成酵素によるＲＮＡの合成をそれぞれ示す。
【図１３】実験例１−１及び比較例１の２％アガロースゲルを用いた電気泳動法の結果を示す写真である。
【図１４】実験例１−１及び実験例１−２の４％アガロースゲルを用いた電気泳動法の結果を示す写真である。
【図１５】実験例２−１〜２−６、比較例２及び比較例３の結果を示す写真である。
【図１６】実施例１及び比較例４の結果を示す写真であり、（ａ）は実施例１（蛍光）、（ｂ）は比較例４（蛍光）、（ｃ）は実施例１（透過光）及び（ｄ）は比較例４（透過光）の結果をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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