(57)【要約】【課題】ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの正確な測定方法の提供である。従来のＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定の主要な方法は、機器分析によるものであり、物質の構造そのものを検出し測定することから、構造の一部が変化したり、分解したりすると測定が不可能であった。ＥＩＡのような測定系は臨床検査の分野では繁用されているが、これまでＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定については、反応系に副反応が関与し、正確な測定は不可能とされてきた。本発明は、ＥＩＡのような臨床検査の領域で汎用される抗原抗体反応を利用した系によって、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの正確な測定方法を提供することである。【課題を解決するための手段】ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定にあたり、検体についての前処理における組合せを改良し、特に抗原抗体反応を利用した系によってＭＧ−ａｄｄｕｃｔを測定するための手段を提供し、その測定により、新規な臨床的意義が確立されたことにより本発明を完成した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中のメチルグリオキサール−アルギニン付加体を測定する方法において、生体試料の測定前処理として、塩酸加水分解処理工程を含むことを特徴とする測定方法。
【請求項２】
生体試料を還元処理及び塩酸加水分解処理工程を含むことを特徴とする請求項１の測定方法。
【請求項３】
生体試料を還元処理後に脱ほう酸処理及び塩酸加水分解処理の工程を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
メチルグリオキサール−アルギニン付加体を測定する方法が、メチルグリオキサール−アルギニン付加体を特異的に認識する抗体を利用する抗原抗体反応系である請求項１〜３の何れか一に記載の測定方法。
【請求項５】
アルグピリミジン構造を特異的に認識する抗体である請求項４に記載の測定方法。
【請求項６】
以下の構成の一を含むＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法による測定手段である請求項５に記載の測定方法。
１）アルグピリミジン（Ａｒｇｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）あるいはＢｏｃ−アルグピリミジンが固相化されており、固相化抗原と検体中のメチルグリオキサール−アルギニン付加体とを、メチルグリオキサール−アルギニン付加体に対する抗体と競合的に反応させ、固相化抗原と結合した抗メチルグリオキサール−アルギニン付加体抗体に対して、ペルオキシダーゼ標識抗体を接触させて反応させることによって、検体中のメチルグリオキサール−アルギニン付加体をアルグピリミジン量として測定する。
２）抗メチルグリオキサール−アルギニン付加体抗体が固相化されており、この固相化抗体と検体とを、所定量の酵素あるいはビオチン等で標識した標識化アルグピリミジンとを接触させ、競合的に反応させ、この固相化抗体と結合した標識化アルグピリミジンを測定することにより、検体中のメチルグリオキサール−アルギニン付加体をアルグピリミジン量として測定する。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一に記載の測定法による結果を指標とする、糖尿病性合併症の発症、進展の評価方法。
【請求項８】
請求項１〜６の何れか一に記載の測定法に使用する試薬を含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、メチルグリオキサール−アルギニン付加体（以下ＭＧ−ａｄｄｕｃｔということもある）を特異的に測定することを特徴とする測定方法、該測定法を利用した判定方法、及び該測定に利用する測定用キットに関する。さらに詳しくは、少なくともＭＧ−ａｄｄｕｃｔに対する抗体を利用して、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔを測定する際に、検体に対して特定の前処理することを特徴とするＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定法に関する。さらに本発明の測定方法を用いることを特徴とする、糖尿病性合併症の発症・進展に関する判定方法である。
【０００２】
【従来の技術】
メチルグリオキサールの生体内における生成経路として、酵素反応による代謝的生成経路とメイラード反応の前期反応生成物であるアマドリ化合物の不均化分解反応による化学的生成経路が知られている。代謝的生成経路としては、解糖系あるいは脂質由来の中間代謝物であるジヒドロキシアセトンリン酸やグリセルアルデヒド３−リン酸を経由する生成経路、およびグリシン・スレオニンといったアミノ酸代謝の中間代謝物であるアミノアセトンを経由した生成経路が知られている。メチルグリオキサールは、化学的反応性の高い２−オキソアルデヒドであり、古くから細胞毒性を示すことが報告されている。メチルグリオキサールは、タンパク質を構成するアミノ酸側鎖、特に塩基性のリジンやアルギニン側鎖と化学反応し、組織再構成に関わるプロテアーゼやコラゲナーゼの酵素反応を阻害し組織障害を引き起こす一方、代謝・調節に関わる機能タンパクの活性中心を構成するアミノ酸側鎖を修飾失活させることで代謝毒性に関わっている。
【０００３】
メチルグリオキサールは、通常の酸化ストレスの亢進していない状態ではグルタチオンを補酵素とするグリオキサラーゼによりｄ−乳酸に解毒される。しかし、酸化ストレスが亢進しているとされる血糖管理状態の悪い糖尿病患者では、抗酸化物質、特にグルタチオンの供給が不十分となり、メチルグリオキサールの解毒機構に支障を生じ、結果として神経細胞や血管内へ障害を与え、神経障害や網膜症、腎症などの糖尿病性合併症の原因となると考えられている。
【０００４】
糖尿病性合併症の指標としてのメチルグリオキサールの直接定量実現のため、多くの試みがなされてきた。しかし、化学的反応性の高い、含量変化が制御困難なメチルグリオキサールの直接的測定は極めて困難である。
【０００５】
一方、生体内で解毒代謝されない過剰なメチルグリオキサールは高い化学的反応性により、一部は、タンパクのアルギニン側鎖と反応しＭＧ−ａｄｄｕｃｔを形成し、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの一つとして安定なＡＧＥｓの１種であるアルグピリミジンを形成することが報告されている（非特許文献１）。
【０００６】
そこで我々は、メチルグリオキサールの生体への影響を間接的に評価する指標としてアルグピリミジンの測定は、メチルグリオキサールで問題となる試料採取、保管および搬送を容易とし、糖尿病性合併症発症予知、防御および治療法開発のため指標として有用であると考え、鋭意研究を行ってきた。
【０００７】
初めに、先行文献（非特許文献２）を追試し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）による血漿・尿中のアルグピリミジン測定を試みた。しかし、文献記載の方法ではピークの同定が不可能であった。我々は、試料を加水分解後、イオン交換クロマトやＯＤＳ固相抽出等により部分精製し、高感度かつ特異的な測定が可能と考えられるアルグピリミジン内因性の蛍光特性を利用した検出法で、改良をさらに進めたＨＰＬＣ条件に供したが、夾雑物質の影響は低減されず、定量することは不可能であった。
【０００８】
さらに、我々は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析計）測定法についても測定法構築を試みた。測定は、試料加水分解後、直接測定することは不可能であったため、ＨＰＬＣ測定法において開発し最良と考えられた前処理法、即ちＯＤＳ固相抽出による前処理実施後に行った。しかし、測定材料としては尿のみが測定可能であり、血漿では添加回収試験不成立かつピーク同定困難なため測定は不可能であった（非特許文献３）。
【０００９】
一方、アルグピリミジンを特異的に認識するとされる抗ＭＧモノクローナル抗体（特許文献１）が市販されており、本抗体については、糖尿病性腎症や虚血性の脳梗塞における脳動脈傷害部の特異的免疫染色に有用とする報告（非特許文献４）、糖尿病性網膜症発症部位との関連性を示唆する報告（非特許文献５）、および糖尿病患者において血管合併症発症に有用とされる報告（非特許文献６）があり、ＥＩＡによるＭＧ−ａｄｄｕｃｔ測定に有用な抗体と考えられる。
【００１０】
しかし、２００１年１１月に開催された第７回国際メイラード反応シンポジュームにてアルグピリミジンの発見者であるＮａｇａｒａｊに代表される、塩酸加水分解に安定である（非特許文献６）とする見解にたつＨＰＬＣ法による測定値報告と、Ｔｈｏｎａｌｌｙに代表される塩酸加水分解に不安定であり酵素反応後に測定する必要がある（非特許文献７）とする見解にたつアミノ酸分析法による測定報告に２分されている。アルグピリミジン自体の安定性と加水分解処理方法の適正が不明確であるため、ＥＩＡ測定値は機器分析法よりも信頼性はより低いと考えられ、既報のＥＩＡ法によるＭＧ−ａｄｄｕｃｔ測定の抱える問題点の本質について省みられることはほとんどなかった。
【００１１】
従来のＥＩＡ法による測定の報告は２報あるが、測定法が抱える共通の本質的問題点はペプチド結合切断に酵素処理を施し、ほう酸除去することなく試料を測定に供することである（非特許文献５および非特許文献８）。特に、生体試料には多種多様な夾雑物質が存在し、タンパク質の加水分解処理に、プロテアーゼ、ペプチダーゼおよび両者を混合する公知の酵素処理法では、アルグピリミジンのαアミノ基あるいはカルボキシル基側に少なからず、未分解のペプチド結合が残存することが予想される。しかし、断片化が不十分な試料であっても交叉反応性の差が小さい場合は、測定値への影響は小さいため採用することは実用上の問題とはならない。
【００１２】
そこで、分解の不十分な試料のモデル物質として、αアミノ基をＢｏｃで保護されたアルグピリミジンと塩酸加水分解による保護基の無い本来のアルグピリミジンとの交叉反応性を比較したところ、本来のアルグピリミジンに対する抗ＭＧモノクローナル抗体（特許文献１）の交叉反応率を１００％とすると、αアミノ基が保護されたものの交叉反応率は１０００％と１０倍強い親和性を示し、正しく測定するには、酵素加水分解処理は適さないことが明白となった。
【００１３】
我々は独自の研究により、上記問題点を明確にし、解決策を発見し、統合させ、本発明の創造に至った。
【００１４】
【先行文献】
【非特許文献１】Ａｒｃｈｉｅｖｅｓ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９９７，Ｖｏｌ．３４４，Ｎｏ．１，ｐｐ２９−３６
【非特許文献２】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１、Ｖｏｌ．２９０，Ｎｏ．２、ｐｐ３５３−３５８
【非特許文献３】２００２年日本薬学会第１２２年会ポスター発表番号：２６［Ｐ］Ｉ−２１５
【非特許文献４】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９９、Ｖｏｌ．２７４、Ｎｏ．２６、ｐｐ１８４９２−１８５０２
【非特許文献５】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００１，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２，ｐｐ１０６−１１５
【非特許文献６】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎｄ  ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ２００２、Ｖｏｌ．２９７、ｐｐ８６３−８６９
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２００２，Ｖｏｌ．３６４，Ｐｔ．１，ｐｐ１〜１４
【非特許文献８】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９８、Ｖｏｌ．２７３、Ｎｏ．１２、ｐｐ６９２８−６９３６
【特許文献１】特開平１１−２４６６００
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の解決しようとする課題は、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの正確な測定方法の提供である。つまり、従来のＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定の主要な方法は、機器分析によるものであり、構造そのものを検出し、定量することから、構造の一部が変化したり、分解したりすると測定は不可能であった。ＥＩＡような測定系は臨床検査の分野では繁用されているが、これまでＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定については、反応系に副反応が関与し、正確な測定は不可能とされてきた。本発明は、ＥＩＡのような臨床検査の領域で汎用される抗原抗体反応を利用した系によって、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの正確な測定方法を提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定にあたり、検体についての前処理における組合せを改良し、特に抗原抗体反応を利用した系によってＭＧ−ａｄｄｕｃｔを測定するための手段を提供し、その測定により、新規な臨床的意義が確立されたことにより本発明を完成した。
【００１７】
本発明は、以下からなる。
１．生体試料中のメチルグリオキサール−アルギニン付加体を測定する方法において、生体試料の測定前処理として、塩酸加水分解処理工程を含むことを特徴とする測定方法。
２．生体試料を還元処理及び塩酸加水分解処理工程を含むことを特徴とする前項１の測定方法。
３．生体試料を還元処理後に脱ほう酸処理及び塩酸加水分解処理の工程を含むことを特徴とする前項１又は２に記載の測定方法。
４．メチルグリオキサール−アルギニン付加体を測定する方法が、メチルグリオキサール−アルギニン付加体を特異的に認識する抗体を利用する抗原抗体反応系である前項１〜３の何れか一に記載の測定方法。
５．アルグピリミジン構造を特異的に認識する抗体である前項４に記載の測定方法。
６．以下の構成の一を含むＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法による測定手段である前項５に記載の測定方法。
１）アルグピリミジン（Ａｒｇｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）あるいはＢｏｃ−アルグピリミジンが固相化されており、固相化抗原と検体中のメチルグリオキサール−アルギニン付加体とを、メチルグリオキサール−アルギニン付加体に対する抗体と競合的に反応させ、固相化抗原と結合した抗メチルグリオキサール−アルギニン付加体抗体に対して、ペルオキシダーゼ標識抗体を接触させて反応させることによって、検体中のメチルグリオキサール−アルギニン付加体をアルグピリミジン量として測定する。
２）抗メチルグリオキサール−アルギニン付加体抗体が固相化されており、この固相化抗体と検体とを、所定量の酵素あるいはビオチン等で標識した標識化アルグピリミジンとを接触させ、競合的に反応させ、この固相化抗体と結合した標識化アルグピリミジンを測定することにより、検体中のメチルグリオキサール−アルギニン付加体をアルグピリミジン量として測定する。
７．前項１〜６の何れか一に記載の測定法による結果を指標とする、糖尿病性合併症の発症、進展の評価方法。
８．前項１〜６の何れか一に記載の測定法に使用する試薬を含んでなる試薬キット。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、検体中のＭＧ−ａｄｄｕｃｔを測定することを対象とする。このＭＧ−ａｄｄｕｃｔが含有する被測定試料としての血液成分とは、被検体より採血、またはヘパリン等の抗凝固剤を添加して採血して得た血液試料を、遠心分離などの常法に基づき成分分離して得られた血漿ないし血清成分である。また、被測定試料としては尿も用いることができる。
【００１９】
本発明で、還元処理とは、検体中に夾雑する本発明の抗原抗体反応による測定に際して使用する抗体と反応する副反応物質を除去することを目的として行う。
つまり、測定検体の前処理である。還元処理を行うことで、アマドリ化合物を安定化させ、他のＡＧＥｓ生成を抑制する。還元処理溶液として、０．２Ｎ−ＮａＢＨ４含む  ２Ｎ−ＮａＯＨ溶液を調製する。血漿５０μｌに、還元処理溶液５０μｌを添加し、攪拌する。反応は、室温下で３時間〜１８時間行う。
【００２０】
本発明のより好ましい態様においては、上記の還元処理を行ったのち、脱ほう酸処理をおこなう。これにより測定値の信頼性、安定性が期待できる。除去処理は、還元処理後、ほう酸除去溶液として酢酸：メタノール（１：１０）溶液２００μｌを添加し攪拌する。６５℃下、３０秒間反応させ、ほう酸メチルを形成させる。再び６５℃下で、窒素吹きつけにより乾固させる。このほう酸除去操作は２回繰り返すことで、遊離のほう酸を除去することができる。
【００２１】
本発明の更に好ましい別の態様は、検体の塩酸による加水分解である。これにより、蛋白質におけるペプチド結合の切断、αアミノ基の遊離が達成され、生体試料中の蛋白質に結合したアルグピリミジンを測定することが可能となる。塩酸による処理条件は、脱ほう酸処理後、６Ｎ−ＨＣｌ  １ｍｌを添加し、攪拌する。
１１０℃下、１８時間〜２４時間の塩酸加水分解を行う。
【００２２】
上記のような前処理後、塩酸加水分解物の一部を窒素乾固後、さらに中和処理としてトリエチルアミンを添加し、攪拌する。再び窒素吹き付けによる乾固後、標準品および検体希釈液で再溶解し、ｐＨ７付近に調製する。
【００２３】
検体は、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔを認識する抗体を利用する抗原抗体反応系によって、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定が行われる。抗体は、アルグピリミジン構造を特異的に認識する抗体である。この抗体は既に本発明の共同出願人の日本油脂株式会社によって実用化及び市場に提供されており、例えば特許文献１に開示される。抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のどちらも利用できるが、より好ましくはモノクローナル抗体である。抗体作製動物としてウサギ、ヒツジ、ヤギについていずれも利用でき特に限定されない。以下、本発明で利用される好適な抗体を抗ＭＧモノクローナル抗体として例示することもある。また、本発明で、使用する抗原とはアルグピリミジンあるいはＢｏｃ−アルグピリミジンを意味する。
【００２４】
本発明において利用される抗原抗体反応系における好適な手段は、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロット法、競合ＥＩＡ法等が例示され、固相に、調製した抗原または抗体を固定化する系が使われる。特に競合ＥＩＡ法が好適である。
【００２５】
固相抗原作製方法は、例えば０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中に、アルグピリミジン  ５０μｍｏｌとＢＳＡ  １μｍｏｌと１．５％グルタルアルデヒド溶液５０μｍｏｌと添加し、水浴にて２５℃下、２．５時間反応させる。次に、ＮａＢＨ４を約２ｍｇ添加し、攪拌溶解後、ＰＢＳ  ５Ｌにて４℃下、一晩の透析を行う。次に、ＰＤ−１０カラムを用いて、０．９％ＮａＣｌにてゲル濾過を行う。ＵＶ２８０ｎｍモニターを使用し、アルグピリミジン−ＢＳＡ分画を分取する。最後に、ＢＣＡ法により、タンパク定量し、濃度を算出する。
固相への抗原の固定化法は、公知手法で十分である。固定化条件は、例えばＰＢＳで５μｇ／ｍｌに調製したアルグピリミジン−ＢＳＡ溶液を、マイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ加え、４℃下、１８〜２４時間静置する。固相は、当該公知のプレートを用いうる。例えばＣｏａｓｔｅｒ  ＥＩＡ／ＲＩＡ  ＳｔｒｉｐｗｅｌｌＴＭＰｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭＭｏｄｕｌｅｓ（Ｎｕｎｃ社）等が使用できる。
【００２６】
固相への抗体の固定化法は、公知手段で十分である。固定化条件は、例えばｐＨ９．６に調製された緩衝液で、抗体を０．２５〜１０μｇ／ｍｌの終濃度となるように添加し、これをマイクロプレートに適量加え、１〜１０℃、特に好ましくは２〜６℃で、１０〜３０時間、特に好ましくは１５〜２５時間静置し固定化させる。固相は、当該公知のプレートやビーズを用いる。
【００２７】
非特異反応をおさえるためのブロッキング緩衝液は、たとえばブロックエース（大日本製薬）で行う。蛋白質としては、牛血清アルブミン、オヴァアルブミン、スキムミルクなどがあるが、これらはＡＧＥｓ類が検出されるため、ブロックエースを使用する。
ブロッキング剤による固相の処理は、抗体の固定化後に行う。固相が十分に浸漬される状態であれば特に制限はない。処理条件は３７℃下、４時間あるいは所望により、４℃下、一晩静置して反応させる。ブロッキング処理後は、界面活性剤０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ溶液の洗浄用緩衝液（以下、洗浄液）で十分に洗浄する。
【００２８】
検体との接触
測定にあたって、検体である血漿、血清或いは尿および組織は、至適な濃度に調製する。本発明にあっては、標準品および検体の希釈液を使用する。標準品および検体希釈液は、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液に、非特異反応を抑える為にブロックエースを２５％（Ｖ／Ｖ）を添加する。界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０やグリセリンを添加｛緩衝液中に各０．１％（Ｖ／Ｖ）を含む｝することが好ましい。また所望により、０．９％ＮａＣｌ添加が可能である。さらに保存剤として０．１％ＮａＮ３を添加することも可能である。
【００２９】
固相化抗原を使った競合ＥＩＡ法による場合は、抗ＭＧモノクローナル抗体を検体と固相化抗原に対して、競合的に反応させる。反応させる抗ＭＧモノクローナル抗体希釈には、抗体希釈液を使用する。抗体希釈液は、０．２Ｍトリス塩酸緩衝液に、ブロックエースを１０％（Ｖ／Ｖ）添加する。界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０やグリセリンを各０．１％（Ｖ／Ｖ）添加することが好ましい。さらに、保存剤として０．１％ＮａＮ３を添加することも可能である。
【００３０】
調製した抗原または抗体の固定化固相と検体の接触は、自体公知の方法に準ずれば十分である。検体５０μｌを添加し、２５℃下で、好ましくは２時間程度振とう反応させることが望ましい。または所望により、４℃下、一晩静置して反応させてもよい。反応完了後は洗浄液で十分に洗浄する。固相化抗原を使った競合ＥＩＡ法による場合は、この反応により、固相化抗原と抗ＭＧモノクロ−ナル抗体が結合する。
【００３１】
本発明の一態様では、固相化抗原の系を用いた競合ＥＩＡ法により、検体の検出を行う。この系では、上記で反応した抗ＭＧモノクローナル抗体に対して、ペルオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇ’ｓ抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社）を反応させることによって定量する。ペルオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇ’ｓ抗体は、酵素標識抗体希釈液にて調製する。酵素標識抗体希釈液は、ＰＢＳに、界面活性剤として０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加する。所望により、アミノアンチピリンを０．０５％（Ｖ／Ｖ）添加する。さらに所望により、プロクリンを０．２％（Ｖ／Ｖ）添加する。酵素標識抗体は、酵素標識抗体希釈液で５０００倍程度に希釈され、１００μｌが各プレートに添加される。
反応時間は、振とうさせながら３０分間程度である。反応完了後、洗浄液にて洗浄し、測定用反応物を得る。
【００３２】
本発明の別の一態様では、固相化抗体の系を用いた競合ＥＩＡにより、検体の検出を行う。この系では、試料中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔと所定量の酵素あるいはビオチン等の標識による標識化アルグピリミジンを、固相化抗体に対して、競合的に反応させることにより測定する。標識化アルグピリミジンの希釈には、酵素標識抗体希釈液の利用が可能であり、酵素標識抗体希釈液で５００〜５００００倍に希釈され、１００μｌが各プレートに添加される。反応時間は、振とうさせながら３０分間程度である。反応完了後、洗浄液にて洗浄し、測定用反応物を得る。
【００３３】
本発明で、ＥＩＡによる酵素は、ペルオキシダーゼ以外にも、アルカリホスファターゼ等も使用できる。
【００３４】
測定は、反応完了後、各酵素に応じた基質を添加し、その反応量から、検体中のＭＧ−ａｄｄｕｃｔをアルグピリミジン量として測定し、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔが特定される。
図１は、Ｂｏｃ−アルグピリミジンを塩酸加水分解によりＢｏｃ基を外し、アルグピリミジンとしたものを標準品とした。アルグピリミジンを標準品として、アルグピリミジン含むＭＧ−ａｄｄｕｃｔ量に応じた検量線を示しており、検体中のＭＧ−ａｄｄｕｃｔの定量が可能であることを示す。塩酸加水分解処理を選択した理由として、公知の酵素処理法ではアルグピリミジンのαアミノ基あるいはカルボキシル基側に少なからず、未分解のペプチド結合が残存することが考えられる。しかし、断片化が不十分な試料であっても交叉反応性の差が小さい場合には、測定値への影響は小さいため採用しても実用上の問題とはならない。αアミノ基をＢｏｃで保護されたアルグピリミジンと塩酸加水分解による保護基の無い本来のアルグピリミジンとの交叉反応性を比較したところ、本来のアルグピリミジンに対する抗ＭＧモノクロナール抗体（特許文献１）の交叉反応率を１００％とすると、αアミノ基が保護されたものの交叉反応率は１０００％と１０倍強い親和性を示したことから、酵素加水分解でなく、塩酸加水分解の方が妥当であると判断した。図２は、Ｂｏｃ−アルグピリミジンを１１０℃下で、１８時間の塩酸加水分解処理を行ったものと、Ｂｏｃ基が付いた状態の未処理のものとの抗ＭＧモノクローナル抗体に対する親和性の差を示す。
【００３５】
（発明の効果）
以上のような方法からなる本発明のＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定方法は、従来にない正確なＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定を可能とし、生体におけるＭＧ−ａｄｄｕｃｔ量測定の新規な意義を提供し、その測定法を利用すれば早期の糖尿病性合併症の新規指標を提供する。以上のような測定法に使用する試薬を構成してなる試薬キットの提供は、新規な臨床診断手段を提供する。
【００３６】
【実施例】
以下で本発明を実施例を用いて説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
【実施例１】（検体の前処理）
塩酸加水分解処理の具体例
検体２５０μｌに、１２Ｎ−ＨＣｌを２５０μｌ添加し、攪拌する。この後、１１０℃、１８時間の塩酸加水分解処理を行う。この前処理では、反応中にアマドリ化合物化合物が生成することが予想された。
【００３８】
【実施例２】（検体の前処理）
還元処理、塩酸加水分解処理の具体例
検体２５０μｌに０．２Ｎ−ＮａＢＨ４含む２Ｎ−ＮａＯＨ溶液を２５０μｌ添加し、攪拌する。室温下、３時間静置し、還元処理を行う。この反応物に１２Ｎ−ＨＣｌを５００μｌ添加し、攪拌する。この後、１１０℃、１８時間の塩酸加水分解処理を行う。還元処理を加えることで、アマドリ化合物を安定化させ、他のＡＧＥｓ生成抑制することが予想されるが、局方水でも、血漿同様の濃度となり、改良の余地があった。
図３は、実施例１と実施例２との結果を比較したものである。検体希釈用緩衝液ブランク、血漿および対照として局方水を血漿と同様に還元処理かつ塩酸加水分解処理した結果とをＯＤ値として示したグラフである。
図４は、図３のＯＤ値を濃度算出した結果を示したグラフである。
【００３９】
【実施例３】（検体の前処理）
還元処理、脱ほう酸処理、塩酸加水分解処理の具体例
上記実施例２の還元処理後、その１００μｌに、脱ほう酸溶液｛酢酸：メタノール（１：１０）｝を２００μｌ添加し、攪拌後、６５℃、３０秒間反応させる。これを６５℃下窒素吹き付けにより乾固させて、再び脱ほう酸溶液２００μｌ添加し、同じ操作を繰り返す。これにより、ほう酸メチルとして遊離ほう酸を除去する。この脱ほう酸できた窒素乾固物に、６Ｎ−ＨＣｌを１ｍｌ添加し、攪拌する。この後、１１０℃、１８時間の塩酸加水分解処理を行う。脱ほう酸処理により、測定系への影響が是正された。図５は、実施例２と実施例３との結果を比較したものである。血漿、検体希釈用緩衝液ブランク、対照として局方水を血漿と同様に処理した結果とをＯＤ値として示したグラフである。図６は、図５のＯＤ値を濃度算出した結果を示したグラフである。
実施例１、２、３の後、それぞれの塩酸加水分解物の一部をとり、窒素吹き付けにより乾固させる。次に、中和処理としてトリエチルアミンを適量添加し、攪拌する。その後、再び窒素吹き付けにより乾固させ、標準品および検体希釈液にて再溶解する。ここまでの操作が前処理となる。この再溶解したものが、マイクロプレートへ添加するサンプルとなる。
【００４０】
【実施例４】（試薬の調製）
１）（固相化抗原の調製）
抗原アルグピリミジン−ＢＳＡをＰＢＳによって５μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートに１００μｌずつ加え、４℃で一晩静置し吸着させた。
２）（洗浄）
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ溶液（以下、洗浄液）で３回洗浄を行った。３）（ブロッキング処理）
２５％ブロックエース溶液を、マイクロプレートに３００μｌずつ加え、３７℃で４時間ブロッキングを行い、その後、洗浄液によって３回洗浄を行った。
【００４１】
【実施例５】
（検体と固相化抗原かつ抗体との接触）
検体希釈液で希釈調製した標準品もしくは実施例１〜３で前処理した検体試料（血漿）を５０μｌずつマイクロプレートに入れた。ついで、抗ＭＧモノクローナル抗体（日本油脂株式会社）（商品番号  Ｎ２１３４３０）を、抗体希釈液によって２０００倍に希釈調製した。これを、マイクロプレートに５０μｌずつ加え、室温で２時間振とう反応させた。その後、洗浄液で４回洗浄を行った。
（標識化）
ペルオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇ’ｓ抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社）を、標識抗体希釈液によって５０００倍に希釈調製した。これを、マイクロプレートに１００μｌずつ加え、室温で３０分間振とう反応させた。その後、洗浄液で４回洗浄を行った。
（測定）
ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社）を、マイクロプレートに１００μｌずつ加えて発色させ、１０〜３０分後に２Ｎ−Ｈ２ＳＯ４  １００μｌを加えて反応を停止させた。そして、測定波長４５０／６３０ｎｍの吸光度を測定した。
（検量線）
以上の系を使い、アルグピリミジンを標準品とした典型的な検量線を得た。これにより、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定が可能であることが確認できた。
【００４２】
【実施例６】（ＳＴＺ糖尿病ラットにおける尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定）
ＳＴＺ誘発糖尿病モデルラットは、１週間飼育後、ＳＴＺを投与して作製した。正常群（ＳＤ系ラット、オス、６匹）およびＳＴＺ誘発糖尿病モデルラット群（ＳＤ系ラット、オス、６匹）を使い、ＳＴＺ投与後３週目を基準（０週）とし、８、１２、１６および２４週目に採尿して検体とした。正常ラットも同様に採尿した。この検体を、実施例１、２、３の前処理及び無前処理についての実施例４及び５の測定系で尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔを測定した。
図７には、正常群とＳＴＺ投与群との比較（尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの変化）を、図８には、正常群とＳＴＺ投与群との比較（尿中アルブミンの変化）を示した。尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔは、糖尿病の合併症を生じる前から、正常ラット群と比較して、ＳＴＺ誘発糖尿病モデルラット群では高値を示した（図７）。また尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔは、糖尿病性腎症の指標となる尿中アルブミン（図８）よりも先に変化があり、増加する傾向が認められた。この結果から、尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔ測定は、早期の糖尿病性合併症において有用な指標となることが推測された。
【００４３】
【発明の効果】
本発明は、ＭＧ−ａｄｄｕｃｔの測定法として新規な手段を臨床検査の場に提供するものである。この測定系により、糖尿病性合併症についての新規な臨床検査手技を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】標準品アルグピリミジン濃度で作成した検量線のグラフである。
【図２】抗ＭＧモノクローナル抗体のＢｏｃ−アルグピリミジンとアルグピリミジンに対する親和性の差を示したグラフである。
【図３】塩酸加水分解処理と還元処理および塩酸加水分解処理したものとの比較で、ＯＤ値を示したグラフである。
【図４】図２のＯＤ値を濃度算出して示したグラフである。
【図５】還元処理および塩酸加水分解処理と還元後脱ほう酸処理し、塩酸加水分解処理したものとの比較で、ＯＤ値を示したグラフである。
【図６】図４のＯＤ値を濃度算出して示したグラフである。
【図７】尿中ＭＧ−ａｄｄｕｃｔ測定において、正常ラット群と比較して、ＳＴＺ誘発糖尿病モデルラット群では高値を示したグラフである。
【図８】尿中アルブミン測定において、正常ラット群とＳＴＺ誘発糖尿病モデルラット群とも、２４週とやや遅く、高値となる濃度変化が認められたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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