(57)【要約】　　　（修正有）【課題】目的とするタンパク質を植物、特にダイズの種子で大量に合成する方法、および植物（特にダイズ）の種子への安定蓄積を促進するための特定のアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。【解決手段】目的とするタンパク質のアミノ酸配列に、特定なアミノ酸配列または特定なアミノ酸配列のうち、Ｎ末端側の少なくとも４残基以上からなる配列がタンパク質貯蔵液胞への液胞輸送シグナルペプチドとしてＣ末端またはＮ末端のいずれかに付加されたタンパク質を遺伝子工学的に植物種子内で発現させる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とするタンパク質のアミノ酸配列に、配列番号１に示すアミノ酸配列または配列番号２に示すアミノ酸配列がタンパク質貯蔵液胞への液胞輸送シグナルペプチドとしてＣ末端またはＮ末端のいずれかに付加されたタンパク質。
【請求項２】
目的とするタンパク質のアミノ酸配列に、配列番号１に示すアミノ酸配列もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列のうちのＮ末端側の少なくとも４残基以上からなる配列、またはＰｒｏ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｓｅｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸）で表される配列がタンパク質貯蔵液胞への液胞輸送シグナルペプチドとしてＣ末端またはＮ末端のいずれかに付加されたタンパク質。
【請求項３】
目的とするタンパク質のアミノ酸配列と液胞輸送シグナルペプチド配列との間に特異的プロテアーゼ認識配列が存在することを特徴とする、請求項１または２記載のタンパク質。
【請求項４】
目的とするタンパク質のアミノ酸配列が複数個タンデムに連結されており、かつ該アミノ酸配列同士の間に特異的プロテアーゼ認識配列が存在することをさらなる特徴とする、請求項３記載のタンパク質。
【請求項５】
植物の種子で発現されると、タンパク質貯蔵液胞に輸送されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
植物が双子葉植物であることを特徴とする、請求項５記載のタンパク質。
【請求項７】
植物がダイズまたはシロイヌナズナであることを特徴とする、請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項９】
請求項８記載の核酸を含有する植物形質転換用ベクター。
【請求項１０】
上記核酸が植物細胞内で発現可能な形で含まれていることを特徴とする、請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
植物細胞が双子葉植物由来の細胞であることを特徴とする、請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
植物細胞がダイズまたはシロイヌナズナ由来の細胞であることを特徴とする、請求項１１記載のベクター。
【請求項１３】
請求項８記載の核酸を外来遺伝子として含有する植物細胞。
【請求項１４】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のベクターを含有する、植物細胞。
【請求項１５】
双子葉植物の細胞であることを特徴とする、請求項１３または１４記載の植物細胞。
【請求項１６】
ダイズまたはシロイヌナズナの細胞であることを特徴とする、請求項１５記載の植物細胞。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の植物細胞を含有する植物。
【請求項１８】
双子葉植物であることを特徴とする、請求項１７記載の植物。
【請求項１９】
ダイズまたはシロイヌナズナであることを特徴とする、請求項１８記載の植物。
【請求項２０】
目的とするタンパク質を生産する方法であって、
ｉ）　請求項８記載の核酸を得るステップ；
ｉｉ）　　該核酸を、発現可能な形で植物細胞内に導入するステップ；
ｉｉｉ）　該核酸が発現可能な条件下で、上記植物細胞を再生させてその種子を得るステップ；
ｉｖ）　　得られた種子から目的とするタンパク質を分離または単離するステップ；
を含む、上記方法。
【請求項２１】
植物が双子葉植物であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
植物がダイズまたはシロイヌナズナであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
上記ステップ（ｉ）における核酸にコードされるタンパク質が、請求項２または３記載のタンパク質であり、かつ、
ｖ）　上記ステップ（ｉｖ）で得られたタンパク質内の特異的プロテアーゼ認識部位を切断可能なプロテアーゼで切断して、所望のアミノ酸配列からなるタンパク質を得るステップ；
をさらに含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
配列番号１に示すアミノ酸配列もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のうちの少なくともＮ末端側の４残基からなる配列、またはＰｒｏ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｓｅｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸）で表される配列をコードする核酸配列を含み、かつ、植物プロモーターの制御下に、インフレームで１つ以上の所望の目的とするタンパク質をコードする核酸を挿入可能であり、それにより、目的とするタンパク質に配列番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のうちの少なくともＮ末端側の４残基からなる配列、またはＰｒｏ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｓｅｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸）で表される配列が付加されたタンパク質を発現することを可能とする、植物形質転換用発現ベクター。
【請求項２５】
上記の配列番号１に示すアミノ酸配列もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のうちの少なくともＮ末端側の４残基からなる配列、またはＰｒｏ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｓｅｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸）で表される配列をコードする核酸配列と、目的とするタンパク質をコードする核酸の挿入部との間に特異的プロテアーゼ認識部位をインフレームでコードする配列をさらに含むことを特徴とする、請求項２４記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、目的とするタンパク質を、植物、特にダイズの種子で大量に合成する方法、および植物（特にダイズ）の種子への安定蓄積を促進するための特定のアミノ酸配列を有するペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ダイズ種子は、タンパク質を最も豊富に含む種子であり、かつ、植物性油の量産可能かつ安価な原料としても非常に有用であり、広範な国および地域で利用されている。ダイズ種子から油脂成分を分離した脱脂ダイズの有効な用途の開発が食品業界の注目を集めている。
【０００３】
植物体で所望のタンパク質を産生させ、それを単離・精製することは、近年の遺伝子工学技術等の進展により可能となっている。そこで、ダイズ種子のタンパク質貯蔵型液胞（ＰＳＶ）中に豊富に貯蔵されているダイズ主要貯蔵タンパク質（１１Ｓグロブリン、７Ｓグロブリン等）のタンパク質がＰＳＶへ輸送されるメカニズムを解明し、それを応用することにより、ダイズ種子のＰＳＶ中に所望のタンパク質を蓄積させて、油脂成分を分離した脱脂ダイズから安価かつ効率的に所望の蛋白質を精製することが可能になると考えられる。
【０００４】
植物では液胞の機能は多岐にわたっている。これまでの研究より、最低２種類以上の液胞が存在することが示されており、そのうちの１つは分解型液胞（ＬＶ）で、もう１つはタンパク質貯蔵型液胞（ＰＳＶ）である（Ｖｉｔａｌｅ　ａｎｄ　Ｒａｉｋｈｅｌ，　１９９９）。オオムギやエンドウの根端細胞及びエンドウ登熟子葉細胞では、これらの液胞が共存しているという報告もある（Ｈｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５；　Ｐａｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６）。子葉細胞中では種子の登熟に伴い、ＬＶは消失し、ＰＳＶが発達する（Ｈｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）。ＰＳＶには、主な種子貯蔵タンパク質である１１Ｓ、７Ｓグロブリンや、レクチン、各種の酵素及びプロテアーゼインヒビターなどが貯蔵されている（Ｈｅｒｍａｎ
ａｎｄ　Ｌａｒｋｉｎｓ，　１９９９）。
【０００５】
ＬＶとＰＳＶへの可溶性タンパク質の輸送は異なる機構で行われていると考えられている。ＬＶへの輸送はトランスゴルジネットワークより出芽するクラスリン被覆小胞（ＣＣＶ）により行われており、ＣＣＶへの可溶性タンパク質の取り込みは、輸送されるタンパク質の持つシグナル（液胞輸送シグナル）が配列特異的にレセプターに結合することにより行われている（Ｖｉｔａｌｅ　ａｎｄ　Ｒａｉｋｈｅｌ，　１９９９；　Ａｈｍｅｄ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）。種子貯蔵タンパク質などのＰＳＶタンパク質の輸送はゴルジ体から出芽するデンスベシクル（ＤＶ）により（Ｈｏｈｌ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６；　Ｎｅｕｈａｕｓ　ａｎｄ　Ｒｏｇｅｒｓ，１９９８；　Ｈｉｌｌｍｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，　２００１）行われている。また、カボチャの種子細胞では、小胞体において形成されるＰＡＣベシクルによるゴルジ体を経由しない輸送経路の存在が示唆されている（Ｈａｒａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）。しかし、ＤＶやＰＡＣベシクルによるＰＳＶタンパク質の輸送機構については、まだほとんどわかっていない。
【０００６】
これまでの研究で調べられた植物の液胞タンパク質の液胞輸送シグナルは、配列特異的液胞輸送シグナル（ｓｓＶＳＤ）、Ｃ末端液胞輸送シグナル（ｃｔＶＳＤ）及び構造依存的シグナル（ｐｓＶＳＤ）の３種類に分類される（Ｎｅｕｈａｕｓ　ａｎｄ　Ｒｏｇｅｒｓ，　１９９８）。ｓｓＶＳＤはその配列がレセプターに認識されると考えられるものであり、ＮＰＩＲモチーフもしくはそれと類似した配列を含むものが見つかっている。ｃｔＶＳＤはＣ末端プロペプチドに存在する疎水性の強い配列であるが、長さはまちまちであり、共通する配列も見いだされていない。また、これらの輸送機構についてはほとんどわかっていない。ｐｓＶＳＤについては、その構造的特徴は未だ見いだされていない。
【０００７】
種子のＰＳＶに存在する数々の可溶性タンパク質（タバコキチナーゼ、タバコグルカナーゼ、オオムギレクチン、インゲンマメファゼオリン、ブラジルナッツ２Ｓアルブミン、ヒマ種子リシン、オオムギフィテプシン）についても、液胞輸送シグナルが報告されている（Ｍａｔｓｕｏｋａ　ａｎｄ　Ｎｅｕｈａｕｓ，　１９９９；　Ｆｒｉｇｅｒｉｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８，２００１，　Ｔｏｒｍａｋａｎｇａｓ　ｅｔ　ａｌ．，　２００１）。リシンとフィテプシンではインターナルプロペプチドにシグナルが存在する。このうち、リシンでは、様々な植物種のリシン様タンパク質間で保存されているイソロイシンが輸送に関与しておりｓｓＶＳＤであることが示唆されている（Ｆｒｉｇｅｒｉｏ　ｅｔ　ａｌ，２００１ａ）。キチナーゼ、グルカナーゼ、レクチン、ファゼオリン、ブラジルナッツ２Ｓアルブミンでは、Ｃ末端プロペプチドがシグナルとなっており、共通する配列はなく、疎水性が強いことからｃｔＶＳＤであると考えられている。
【０００８】
しかしながら、これらのシグナルはいずれも種子以外の細胞を用いて解析されたものである。種子以外の組織の細胞において、種子細胞に特有のＤＶやＰＡＣベシクルによるＰＳＶへの輸送と同様の輸送が起こっているかどうかは、ＤＶやＰＳＶの形成に関わる分子がまだほとんど解明されていない現段階では判断ができない。このため、種子のＰＳＶタンパク質のシグナルについては種子を用いて解析する必要があると考えられる。
【０００９】
本発明において、液胞輸送シグナルについての研究に用いた、ダイズの主要な種子貯蔵タンパク質の一つであるβ−コングリシニンは、７Ｓグロブリンとも呼ばれ、その主要な構成サブユニットはα、α’、βの３種類であり、ダイズ種子中ではこれらのサブユニットがランダムに組み合わさった種々の分子種が存在している（Ｔｈａｎｈ　ａｎｄ　Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，　１９７６，　１９７８）。これらの３種のサブユニットのＣ末端部については、いずれもプロペプチドであるかどうかはわかっていないが、インゲンマメ７ＳグロブリンであるファゼオリンのｃｔＶＳＤ（ＡＦＶＹ）と類似した配列が存在していることがわかっている（Ｄｏｙｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８６；　Ｓｅｂａｓｔｉａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９０；　Ｍａｒｕｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物、特にダイズ種子において目的のタンパク質を大量に蓄積させることにより、目的のタンパク質を大量生産する手段を提供する。即ち、種子中に目的のタンパク質を大量に蓄積させることが可能な液胞輸送シグナルペプチド、該ペプチドを含有するタンパク質、これをコードする核酸、およびその使用を提供する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記課題を解決すべく、ダイズβ−コングリシニンの３種のサブユニットのうち、α’サブユニットを用いて、ＰＳＶへの輸送に関与する配列の特定を試み、Ｃ末端から数えて７〜１０位に存在するアミノ酸がα’サブユニットの液胞輸送シグナルペプチドとしてＰＳＶへの輸送に関与することを突き止め、本発明を完成させるに至った。Ｃ末端から数えて１〜１０位のアミノ酸配列（配列番号１）はαサブユニットとα’サブユニットとの間では１００％の相同性があり、さらにβサブユニットのＣ末端にも類似の配列（配列番号２）が存在することから、配列番号１に示す配列を有するペプチドと配列番号２に示す配列を有するペプチドとも、同様の機能を有していると考えられる。
【００１２】
したがって、本発明は、以下の１〜２５の態様：
１．目的とするタンパク質のアミノ酸配列に、配列番号１に示すアミノ酸配列または配列番号２に示すアミノ酸配列がタンパク質貯蔵液胞への液胞輸送シグナルペプチドとしてＣ末端またはＮ末端のいずれかに付加されたタンパク質、
２．目的とするタンパク質のアミノ酸配列に、配列番号１に示すアミノ酸配列もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列のうちのＮ末端側の少なくとも４残基以上からなる配列、またはＰｒｏ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｓｅｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸）で表される配列がタンパク質貯蔵液胞への液胞輸送シグナルペプチドとしてＣ末端またはＮ末端のいずれかに付加されたタンパク質、
３．目的とするタンパク質のアミノ酸配列と液胞輸送シグナルペプチド配列との間に特異的プロテアーゼ認識配列が存在することを特徴とする、上記１または２記載のタンパク質、
４．目的とするタンパク質のアミノ酸配列が複数個タンデムに連結されており、かつ該アミノ酸配列同士の間に特異的プロテアーゼ認識配列が存在することをさらなる特徴とする、上記３記載のタンパク質、
５．植物の種子で発現されると、タンパク質貯蔵液胞に輸送されることを特徴とする、上記１〜４のいずれかに記載のタンパク質、
６．植物が双子葉植物であることを特徴とする、上記５記載のタンパク質、
７．植物がダイズまたはシロイヌナズナであることを特徴とする、上記６記載のタンパク質、
８．上記１〜７のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸、
９．上記８記載の核酸を含有する植物形質転換用ベクター、
１０．上記核酸が植物細胞内で発現可能な形で含まれていることを特徴とする、上記９記載のベクター、
１１．植物細胞が双子葉植物由来の細胞であることを特徴とする、上記１０記載のベクター、
１２．植物細胞がダイズまたはシロイヌナズナ由来の細胞であることを特徴とする、上記１１記載のベクター、
１３．上記８記載の核酸を外来遺伝子として含有する植物細胞、
１４．上記９〜１２のいずれかに記載のベクターを含有する、植物細胞、
１５．双子葉植物の細胞であることを特徴とする、上記１３または１４記載の植物細胞、
１６．ダイズまたはシロイヌナズナの細胞であることを特徴とする、上記１５記載の植物細胞、
１７．上記１３〜１６のいずれかに記載の植物細胞を含有する植物、
１８．双子葉植物であることを特徴とする、上記１７記載の植物、
１９．ダイズまたはシロイヌナズナであることを特徴とする、上記１８記載の植物、
２０．目的とするタンパク質を生産する方法であって、
ｉ）　上記８記載の核酸を得るステップ；
ｉｉ）　　該核酸を、発現可能な形で植物細胞内に導入するステップ；
ｉｉｉ）　該核酸が発現可能な条件下で、上記植物細胞を再生させてその種子を得るステップ；
ｉｖ）　　得られた種子から目的とするタンパク質を分離または単離するステップ；
を含む、上記方法、
２１．植物が双子葉植物であることを特徴とする上記２０記載の方法、
２２．植物がダイズまたはシロイヌナズナであることを特徴とする上記２１記載の方法、
２３．上記ステップ（ｉ）における核酸にコードされるタンパク質が、上記２または３記載のタンパク質であり、かつ、
ｖ）　上記ステップ（ｉｖ）で得られたタンパク質内の特異的プロテアーゼ認識部位を切断可能なプロテアーゼで切断して、所望のアミノ酸配列からなるタンパク質を得るステップ；
をさらに含む、上記２０〜２２のいずれかに記載の方法、
２４．配列番号１に示すアミノ酸配列もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のうちの少なくともＮ末端側の４残基からなる配列、またはＰｒｏ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｓｅｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸）で表される配列をコードする核酸配列を含み、かつ、植物プロモーターの制御下に、インフレームで１つ以上の所望の目的とするタンパク質をコードする核酸を挿入可能であり、それにより、目的とするタンパク質に配列番号１に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列のうちの少なくともＮ末端側の４残基からなる配列、またはＰｒｏ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｓｅｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸）で表される配列が付加されたタンパク質を発現することを可能とする、植物形質転換用発現ベクター、ならびに、
２５．上記の配列番号１に示すアミノ酸配列もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のうちの少なくともＮ末端側の、またはＰｒｏ　Ｘａａ　ＸａａＳｅｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸）で表される配列からなる配列をコードする核酸配列と、目的とするタンパク質をコードする核酸の挿入部との間に特異的プロテアーゼ認識部位をインフレームでコードする配列をさらに含むことを特徴とする、上記２４記載のベクター、
に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
ダイズ主要貯蔵タンパク質であるβ−コングリシニンのα’サブユニットのＣ末端の１０アミノ酸残基Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒからなる配列（配列番号１）が、タンパク質のＰＳＶへの輸送に十分な部位であることから、該配列をＣ末端に輸送シグナルとして有するタンパク質は、植物（特に、ダイズまたはシロイヌナズナ）の種子で発現されると、その中のＰＳＶに輸送されて蓄積されるため、植物体において大量に生産され得る。さらに、本発明者らの研究から配列番号１の配列のＣ末端側６残基がなくても、タンパク質はＰＳＶへ輸送されることがわかっており、配列番号１の配列のＮ末端側の少なくとも４残基Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　からなる配列がタンパク質のＰＳＶへの輸送を担っていると考えられる。したがって、少なくともかかる４残基を含む配列、またはα’サブユニットのＣ末端の１０残基を含む配列を液胞輸送シグナルペプチドとしてＮ末端またはＣ末端に有するタンパク質もまた、上記と同様に大量生産することができる。また、β−コングリシニンのβサブユニットのＣ末端の１０アミノ酸残基Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　ＬｅｕＴｙｒからなる配列（配列番号２）のうちのＮ末端側の４残基Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒを含む配列もまた液胞輸送シグナルペプチドとして機能し得ることが考えられるため、α’サブユニットの上記配列と同様に利用することが可能である。さらには、配列番号１および配列番号２のＮ末端側からの４残基、すなわち、Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　およびＰｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒのうち、共通する１残基めのＰｒｏ、４残基めのＳｅｒのみが保存されているＰｒｏ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｓｅｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸）の配列も同様に利用することが可能であろう。
【００１４】
かかるタンパク質の生産に使用する植物は、限定はされないが、双子葉植物が好ましく、さらにはマメ科植物がより好ましく、ダイズが特に好ましい。
【００１５】
かかるタンパク質は、慣用の遺伝子工学技術を利用することにより、任意のアミノ酸配列を有するものとすることができる。例えば、当技術分野で利用可能な種々のデータベースに、種々のタンパク質のアミノ酸配列が公開されており、目的とするタンパク質のアミノ酸配列が得られる。該アミノ酸配列を基に、それをコードする核酸を得ることは当業者には容易に達成できる。さらには、目的とするタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸を種々の方法でクローニングすることにより入手することも当業者には容易である。
【００１６】
得られた核酸を、上記液胞輸送シグナルペプチドをコードする核酸とインフレームに連結して、目的とするタンパク質のアミノ酸配列の末端に上記アミノ酸残基からなる配列が付加されたタンパク質をコードする核酸を得ることができる。さらに、目的とするタンパク質のアミノ酸配列と上記液胞輸送シグナルペプチドの間に特定のプロテアーゼ（エンドペプチダーゼともいい、例えば、Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ、トロンビン等）によって認識されて切断され得るアミノ酸配列が挿入されたタンパク質をコードする核酸を作製することもできる。このようなプロテアーゼは、当技術分野でさまざまなものが知られており、目的とするタンパク質のアミノ酸配列中および上記液胞輸送シグナルペプチド中にその認識部位が存在しないものを選択するとよい。このような特異的プロテアーゼ認識部位を挿入することにより、種子中から分離したタンパク質にこのプロテアーゼを作用させることによって、付加された上記液胞輸送シグナルペプチドを目的とするタンパク質から切断することができる。
【００１７】
また、目的とするタンパク質をより大量に得るためには、該タンパク質をコードする核酸をインフレームでタンデムに連結させて、その連結部位に特異的プロテアーゼ認識部位を同じくインフレームとなるように挿入することも有利である。この場合は、目的とするタンパク質のアミノ酸配列から付加された液胞輸送シグナルペプチドの末端までをコードする核酸配列中にストップコドンが含まれないように設計する必要がある。すなわち、目的とするタンパク質のアミノ酸配列が、特異的プロテアーゼ認識部位を挟んでタンデムに連結されており、その末端に配列番号１もしくは配列番号２の１０残基からなるアミノ酸配列またはそのＮ末端側の少なくとも４残基からなる配列、またはＰｒｏ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｓｅｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸）で表される配列が液胞輸送シグナルペプチドとして付加されたタンパク質として発現することが可能となる。このタンパク質が植物の種子で発現されると、液胞輸送シグナルペプチドによりＰＳＶに輸送されて蓄積するため、種子から該タンパク質を分離または単離後、該タンパク質に上記プロテアーゼ認識部位を切断するプロテアーゼを反応させることにより、上記液胞輸送シグナルペプチド部分が切断により除去され、さらに、複数個が連結されていた目的とするタンパク質も、１つずつに切断されて、目的とするタンパク質を得ることができる。
【００１８】
目的とするタンパク質は、所望の任意のものでよいが、例えば、生理活性ペプチド（各種増殖因子およびペプチド性ホルモン等を含む）、抗体（可変領域を含む断片を含む）および酵素などのあらゆる種類のものが挙げられる。
【００１９】
上記のようにタンパク質を生産するために用いる核酸、すなわち、目的とするタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸の下流に、インフレームで（即ち、該アミノ酸配列と同じ読み枠内で）配列番号１もしくは配列番号２に示す１０残基またはそのＮ末端側の少なくとも４残基からなる配列、またはＰｒｏ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｓｅｒ（Ｘａａは任意のアミノ酸）で表される配列をコードする核酸配列（液胞輸送シグナルペプチドコード配列）を含む核酸が連結した核酸もまた、本発明に包含される。上記シグナルペプチドコード配列と目的とするタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列との間に１個以上のアミノ酸をコードする配列がインフレームで挿入されていてもよく、また、特異的ペプチダーゼ認識部位をコードする配列を含んでいると有利な場合がある（上述参照のこと）。さらに２つ以上（同種でも異種でもよい）の目的とするタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列がタンデムに連結されて、さらにその個々の間に特異的ペプチダーゼ認識部位をコードする配列が挿入された核酸もまた、有利な場合がある（上述参照のこと）。該核酸は、植物細胞で機能するプロモーター、好ましくは植物の種子特異的プロモーターの制御下に連結されていることが好ましい。このような核酸は、種々の植物の形質転換方法（例えば、プロトプラスト法、パーティクルガン法など）に用いることができ、形質転換した細胞から植物を再生させて、形質転換植物体を得る方法は、当技術分野で公知であり、多くのプロトコル集に開示されている（例えば、「モデル植物の実験プロトコール−遺伝学的手法からゲノム解析まで−」（秀潤社、２００１年発行島本功、岡田清孝監修）等）。
【００２０】
また上記核酸は、植物細胞の形質転換用ベクター中に組込まれていてもよい。例えば、アグロバクテリウムによる形質転換用の種々のＴｉプラスミド、ｐＢＩ１０１などのバイナリープラスミドおよびＲｉプラスミド等が挙げられる。かかるベクターは、植物の種子で上記核酸が発現可能な形で、すなわち、植物細胞において適切な発現プロモーターが機能し得る形で上記核酸に連結されていることが好ましい。植物細胞において適切な発現プロモーターは、種々のものが当業者に公知であるが、中でも植物の種子特異的プロモーターが好ましく、例えば、ダイズ主要貯蔵タンパク質の各サブユニットのプロモーター（βコンゴリシニンのα’サブユニットのプロモーターなど）が挙げられる。
【００２１】
また、かかるベクターは選択マーカー（栄養選択性または薬剤耐性マーカー等）を含有していてもよい。
アグロバクテリウムなどによる形質転換法の技術もまた、当業者には公知である。
【００２２】
したがって、これらのベクターを介して上記遺伝子により形質転換され、該遺伝子を外来遺伝子として有する細胞もまた本発明の範囲に包含される。該遺伝子を発現可能な形で（すなわち、適切なプロモーター制御下に）含む植物細胞が好ましい。本明細書でいう「外来遺伝子」とは、当該植物が天然に有しているゲノム内に存在した遺伝子以外の人為的に細胞内（ゲノム内も含む）に導入された遺伝子を指す。さらには、このような細胞から再生した植物体もまた本発明に含まれる。
【００２３】
かかる植物体から、シグナルペプチドを有するタンパク質を発現させた植物の種子を収穫してそこから該タンパク質を分離または単離することができる。かかる植物には、シロイヌナズナおよびダイズなどをはじめとする双子葉植物が好ましい。また、マメ科植物も好ましい。特にダイズは、種子をダイズ油の抽出に用いた残滓から該タンパク質を分離または単離することができるため、大量かつ安価にタンパク質を得ることができる点で有利である。種子からのタンパク質の分離または単離は、当技術分野における周知技術により達成することができる。
【００２４】
したがって、本発明は、上述の手法を用いる、目的とするタンパク質を生産するための方法を包含する。また、該方法により所望の任意のタンパク質を生産するために、該タンパク質をコードする遺伝子を挿入するだけで上記シグナルペプチドと連結したタンパク質が発現可能となるように、設計された発現ベクターも本発明に含まれる。
【００２５】
すなわち、該ベクターは、植物細胞、特に種子細胞における発現を可能とするプロモーター（上述参照のこと）の制御下であって、かつ上記シグナルペプチドをコードする配列の上流に、所望のタンパク質をコードする配列を、該シグナルペプチドとインフレームになるように挿入するためのベクターである。したがって、挿入部位に挿入するための制限酵素認識部位を有する環状ベクター、または直鎖状ベクターであってもよい。さらに、挿入部位とシグナルペプチドコード配列との間に、配列特異的プロテアーゼ認識部位をインフレームでコードする配列を含有させると、発現後のタンパク質に連結しているシグナル配列を切断除去することができ、有利である。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明の理解を容易にするために実施例を記載するが、本発明は下記実施例に限定されない。
野生型、末端切断型および変異型α’遺伝子の構築及び形質転換シロイヌナズナの作成
α’サブユニットのＰＳＶへの輸送に関与するＣ末端領域を特定するために、野生型（Ｗｉｌｄ）、Ｃ末端部６残基欠損（ΔＣＴ６）及びＣ末端部１０残基欠損（ΔＣＴ１０）α’サブユニットの遺伝子を構築した（図　１）。各遺伝子は種子特異的発現を調節することの知られているα’プロモーターの下流に機能し得る形で連結した。α’プロモーター、シグナルペプチド、プロペプチドコード領域はダイズ（品種；ワセスズナリ）のゲノムよりＰＣＲにより調製した。一方、エクステンション領域及びコア領域をコードする遺伝子はα’サブユニットのｃＤＮＡよりＰＣＲにより調製した。これらの各遺伝子を同時に植物形質転換用ベクターｐＢＩ１０１に挿入した。これらのプラスミドの左右境界配列間をアグロバクテリウム法により、シロイヌナズナの核ＤＮＡに導入した。形質転換された植物体の選抜はカナマイシンを用いて行い、各コンストラクトにつき３〜７個体の形質転換体（Ｔ１植物）を得た。また、同様に、図１に示すようなその他のコンストラクトも構築してその形質転換体を得、以下の実験に用いた。
【００２７】
形質転換シロイヌナズナ種子における野生型及び変異型α’の発現及び蓄積
Ｔ１植物から得られたＴ２種子中に野生型及び変異型α’が発現、蓄積されているかどうかを、抗α’（抗体を用いた完熟種子抽出液のウエスタンブロッティングを行い確認した。野生型はダイズから精製されたα’と同じサイズの位置にバンドが検出されたが、それよりも低分子側にも数本のバンドが検出され、コアのサイズの位置にメインのバンドが検出された（図２　レーン５）。ΔＰｒｏ、ΔＣＴ６及びΔＣＴ１０においても、ダイズα’とほぼ同じ分子量の位置と、コアのサイズの位置にバンドが検出された（図２　レーン６，８，９）。ΔＧｌｙでは、糖鎖の付加の起こらない大腸菌で発現させた成熟型α’と同じサイズの位置にバンドが検出され、分解物も大腸菌で発現させたα’ｃｏｒｅと同じサイズの位置にバンドが検出された（図２　レーン７）。このことからΔＧｌｙでは糖鎖が付加されていないことが確認された。なお、このようなコアのサイズまでの段階的な分解は、α’をペチュニア種子で発現させた際にも観察されたことが既に報告されており、α’を異種植物で発現させた際に見られる特有の現象であると思われる。エクステンション領域は分子表面に突出しているので、プロテアーゼによる分解を受けやすいのかもしれない。ΔＥｘｔ、Ｃｏｒｅはどちらもエクステンション領域がないので、コアのサイズにバンドが検出された（図２　レーン１０，１１）。また、ΔＥｘｔのサイズはＣｏｒｅと同じであったことから、ΔＥｘｔのプロ領域はプロセッシングにより取り除かれ、コア領域のみが蓄積されているといえる。ＣｏｒｅΔＧｌｙ　（図２　レーン１２）　については大腸菌で発現させ糖鎖の付加されていないα’ｃｏｒｅと同じサイズの位置にバンドが検出された。野生型及びいずれの変異型α’も、コアのサイズよりも低分子側にはバンドは検出されなかったことから、これらのタンパク質がＴ２種子中に安定に蓄積されているということが確認された。
【００２８】
野生型及び変異型α’の構造形成能
野生型及び変異型α’のＴ２完熟種子抽出液を用いてショ糖密度勾配遠心分離を行った。その結果、野生型及び、ΔＰｒｏ、ΔＧｌｙ、ΔＣＴ６及びΔＣＴ１０については、３量体の大きさである７Ｓの位置に主に沈降し（図３）、野生型及びこれら３つの変異型α’がダイズα’と同様に３量体を形成していることが確認された。ΔＥｘｔ、Ｃｏｒｅ、ＣｏｒｅΔＧｌｙについては、主に９Ｓの位置に沈降した（図３）。本発明者は、以前に、大腸菌で発現させたα’コアは９Ｓの位置に沈降し、それらは３量体が２個会合したものであるということを確認している。したがって、今回のΔＥｘｔ、Ｃｏｒｅ及びＣｏｒｅΔＧｌｙについても３量体を形成した後、それらが２個会合して９Ｓの大きさを示すようになったと考えられた。以上のことから、野生型及び全ての変異型α’はシロイヌナズナ種子中で正しく分子集合しているということが確認された。すなわち、今回施した変異は構造形成に不都合を来さなかったといえる。
【００２９】
野生型及び変異型α’のＰＳＶへの輸送と細胞外への分泌（液胞輸送シグナルの存在領域の確認）
野生型及び末端切断型α’が種子細胞内でＰＳＶへ輸送されたかどうかを完熟種子細胞の免疫電子顕微鏡観察により解析した。シロイヌナズナ完熟種子の電子顕微鏡用超薄切片に、抗α’抗体を反応させた後、金粒子をつけた二次抗体を反応させた。その結果、野生型を発現させたシロイヌナズナ種子細胞のＰＳＶには、多くの金粒子が存在していた（図４　Ａ）。また、金粒子は、ＰＳＶ中の他の部分とは外見的に異なる区画（本明細書ではこの区画を「クリスタロイド様構造」とよぶ）に特に多く存在した（図４　Ａ）。切片をダイズグリシニン（１１Ｓグロブリン）に対する抗体（抗グリシニン抗体）を用いて同様に処理を行い観察した結果、シロイヌナズナ内在性の１１Ｓグロブリンの存在を示す金粒子は、クリスタロイド様構造ではなく、その周辺に多く存在していた（図４Ｂ）。一方、クリスタロイド様構造やα’の存在を示す金粒子は非形質転換シロイヌナズナ種子では検出されなかった。このことから、野生型α’はシロイヌナズナ種子中でＰＳＶへ輸送され、クリスタロイド様構造に蓄積していることが確認された。
【００３０】
ΔＰｒｏ、ΔＥｘｔ、ΔＧｌｙ及びＣｏｒｅについても、完熟種子細胞のＰＳＶのクリスタロイド様構造に多くの金粒子が存在しており（図４　Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ）、これらの変異型α’も、ＰＳＶへ輸送、蓄積されたということが確認された。このことから、プロ領域、エクステンション領域、糖鎖のいずれもα’のＰＳＶへの輸送に必要ではないことが判明した。このことは、ＣｏｒｅΔＧｌｙがＰＳＶのクリスタロイド様構造に蓄積している（図４　Ｈ）ことからも確認された。すなわち、α’のＰＳＶへの輸送には、糖鎖を除いたコア領域のみが関与するということである。
【００３１】
一方、Ｃ末端部については、６残基を欠損させたΔＣＴ６はＰＳＶへ輸送されることが確認された（図４　Ｉ）。しかし、１０残基を欠損させたΔＣＴ１０では、金粒子は細胞間隙において検出された（図４　Ｊ，　Ｋ）　ことから、ΔＣＴ１０はＰＳＶへ選別輸送されずに、細胞間隙に分泌されたことが確認された。同様の結果が独立した３ラインを用いた解析においても得られた。さらに、抗グリシニン抗体を用いて同様の処理を行った結果、シロイヌナズナ内在性１１Ｓグロブリンは細胞間隙では検出されずＰＳＶ中のみで検出された（図４　Ｌ）。この結果は、ΔＣＴ１０の細胞外への分泌が、細胞の異常によるものではなく、ΔＣＴ１０がＰＳＶへ輸送されるための液胞輸送シグナルを欠損していることによるものであるということを示している。このことから、α’のＣ末端部１０残基中にＰＳＶへの輸送に必要な領域が存在することが判明した。
【００３２】
ＰＳＶ輸送におけるＣ末端部の主体的な関与の確認
次にＰＳＶへの選別輸送におけるα’サブユニットのＣ末端部の関与をさらに確認するために、３種類のキメラタンパク質（図　１　Ａ，　ｓｐＧＦＰ，　ｐｒｏＧＦＰ，　ＧＦＰ−ＣＴ２４）を発現する形質転換シロイヌナズナを作成した。レポーターとして、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰを用いた。ＧＦＰは細胞質タンパク質であるため、小胞体内に移行させるためにα’のシグナルペプチドをＮ末端側に付加した。α’の液胞輸送シグナルは、図４において、α’の輸送に必要であったＣ末端部１０残基中の配列より長い配列である可能性も考えられるため、Ｃ末端部１０残基の他に直前の配列１４残基を含む、２４残基を付加した。該２４残基をコードするＤＮＡ配列（配列番号３）を、ＰＣＲ法を用いてＧＦＰをコードする配列に付加したＤＮＡを作製し、これを発現させてＧＦＰ−ＣＴ２４タンパク質を作製した。尚、α’のＣ末端部２４残基は、分子表面で揺らいでいることが示唆されている。また、コントロールとして、液胞輸送に必要ではないことがわかっているプロ領域をＧＦＰのＮ末端部に付加したｐｒｏＧＦＰを用いた。
【００３３】
形質転換シロイヌナズナ種子中でのキメラタンパク質の蓄積を、種子抽出液のウエスタンブロッティングを行い、抗ＧＦＰ抗体を用いて確認した。その結果、いずれのキメラタンパク質でも、ＧＦＰの分子量である２７ｋＤａ付近にメインのバンドが検出された（図　５）。また、ＧＦＰ−ＣＴ２４では、約３ｋＤａ高分子側にバンドが検出された（図　５，　レーン　３）。このバンドは、Ｃ末端２４残基を付加したＧＦＰの分子量とほぼ同じである。これらのことから、いずれのキメラタンパク質も形質転換シロイヌナズナ種子中に蓄積していることが確認された。
【００３４】
シロイヌナズナ種子中でのキメラタンパク質の局在部位を乾燥種子の共焦点レーザー顕微鏡観察により確認した。ｓｐＧＦＰ　（図　６　Ａ）、ｐｒｏＧＦＰ　（図　６　Ｂ）では細胞間隙で特に強い蛍光が検出され、ＰＳＶでは検出されなかった。一方、ＧＦＰ−ＣＴ２４では、細胞内のＰＳＶにおいて蛍光が検出された（図　６Ｃ）。このことから、α’のＣ末端部２４残基はＧＦＰをＰＳＶへ輸送するのに十分であることが確認された。
【００３５】
ダイズ種子中でのＣ末端部のＰＳＶ輸送への関与および液胞輸送シグナルの存在領域の確認
α’のＣ末端部２４残基がダイズ種子細胞においてもＧＦＰをＰＳＶへ輸送するかどうかを確かめるために、ＧＦＰ−ＣＴ２４（図　１　参照）をコードする遺伝子をパーティクルガンでダイズ登熟種子に導入し、２４時間後に、発現したＧＦＰ−ＣＴ２４の細胞内での存在部位を共焦点レーザー顕微鏡観察により確認した。その結果、ＧＦＰの蛍光がＰＳＶで検出され　（データは示していない）、シロイヌナズナ種子中と同様にＧＦＰ−ＣＴ２４はＰＳＶへ輸送、蓄積されたことが確認された。コントロールとして、シグナルペプチドのみを連結したｓｐＧＦＰ（図　１　参照）についても同様の方法で観察を行った。その結果、ｓｐＧＦＰではＧＦＰの蛍光は主に小胞体及び細胞間隙で検出された（　図　７Ａ，Ｂ）。このことから、ＧＦＰ−ＣＴ２４に付加されたα’のＣ末端部２４残基はダイズ登熟種子においてもＧＦＰをＰＳＶへ輸送することができるということが確認された。また、ダイズ登熟子葉で発現させたｓｐＧＰＦおよびＧＦＰ−ＣＴ２４がどちらも形質転換シロイヌナズナを用いた観察（図　６）と同じ結果であったということは、形質転換シロイヌナズナを用いた解析（図　４）はダイズ種子細胞中で起こっている現象を再現できているということを強く示唆している。
【００３６】
形質転換シロイヌナズナ種子を用いた解析　（図　４）　において、α’のＣ末端部１０残基はα’を液胞へ輸送するのに必要であることが確認された　（図　４　Ｊ，　Ｋ）　が、このＣ末端部１０残基のみでＧＦＰをＰＳＶへ輸送することができるかどうかを、ＧＦＰ−ＣＴ１０（図　１）をコードする遺伝子を同様の方法でダイズ登熟種子に導入して観察を行った。その結果、ＧＦＰの蛍光は主にＰＳＶで検出され、細胞間隙においては検出されなかった（図　７　Ｃ，　Ｄ）ことから、ＧＦＰ−ＣＴ１０はＰＳＶへ輸送、蓄積されたことが確認された。このことから、Ｃ末端部１０残基はＧＦＰをＰＳＶへ輸送することができることが確認された。
【００３７】
以上の結果より、植物種子内でのタンパク質のＰＳＶへの輸送には、Ｃ末端部の６残基では不十分であり、同１０残基ではＰＳＶへの輸送に必要かつ十分であることがわかった。この領域にＰＳＶへの液胞輸送シグナルが存在するということが示唆された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明により、植物、特にダイズまたはシロイヌナズナの種子において、所望のタンパク質を大量に蓄積させることを含む、所望のタンパク質の生産が可能となる。ダイズは、全世界で大量に栽培されている作物植物であり、さらにダイズ種子からダイズ油を抽出後の残滓から所望のタンパク質を大量に分離することを可能とする。
【００３９】
【配列表】
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【００４０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、使用したα’サブユニットの野生型および末端切断型変異体タンパク質と、同じく使用したＧＦＰ変異体とを模式的に示す図である。
【図２】図２は、Ｔ１植物から得られたＴ２種子中に野生型および末端切断型（（が発現、蓄積されているかどうかを確認するために、抗α’抗体を用いた完熟種子抽出液のウエスタンブロッティングを行った結果である。レーン１は、ダイズより精製した天然型α’サブユニット、レーン２は大腸菌で発現させた組換え型α’サブユニット、レーン３は大腸菌で発現させた組換え型α’サブユニットＣｏｒｅ、レーン４は非形質転換シロイヌナズナ種子抽出液、レーン５はα’サブユニットを発現されたシロイヌナズナ種子抽出液、レーン６はΔＰｒｏを発現されたシロイヌナズナ種子抽出液、レーン７はΔＧｌｙを発現されたシロイヌナズナ種子抽出液、レーン８はΔＣＴ６を発現されたシロイヌナズナ種子抽出液、レーン９はΔＣＴ１０を発現されたシロイヌナズナ種子抽出液、レーン１０は、ΔＥｘｔを発現されたシロイヌナズナ種子抽出液、レーン１１は、Ｃｏｒｅを発現されたシロイヌナズナ種子抽出液、レーン１２は、Ｃｏｒｅ　ΔＧｌｙを発現されたシロイヌナズナ種子抽出液である。
【図３】図３は、野生型及び各種変異型α’のＴ２完熟種子抽出液を用いてショ糖密度勾配遠心分離を行い、ウエスタンブロッティングを行った結果である。
【図４】図４は、野生型及び各種変異型α’が種子細胞内でＰＳＶへ輸送されたかどうかを完熟種子細胞の免疫電子顕微鏡観察により解析した結果を示す。Ａは、野生型α’サブユニットを発現させたシロイヌナズナ種子の切片を抗α’サブユニット抗体で処理したもの、Ｂは、野生型α’サブユニットを発現させたシロイヌナズナ種子の切片を抗グリシニン（ダイズ１１Ｓ）抗体で処理したものであり、Ｃは、非形質転換シロイヌナズナ種子の切片、ＤはΔＰｒｏＥはΔＥｘｔ、ＦはΔＧｌｙ、ＧはＣｏｒｅ、Ｈは、Ｃｏｒｅ　ΔＧｌｙ、ＩはΔＣＴ６、ＪはΔＣＴ１０を、それぞれに発現させたシロイヌナズナ種子の切片を抗α’サブユニット抗体で処理したものである。Ｋは、Ｊの細胞間隙の部分の拡大図である。Ｌは、ΔＣＴ１０を発現させたシロイヌナズナ種子切片を抗グリシニン（ダイズ１１Ｓ）抗体で処理した図である。
【図５】図５は、形質転換シロイヌナズナ種子中でのダイズ由来のシグナルペプチドとＧＦＰとのキメラタンパク質の蓄積を、種子抽出液の抗ＧＦＰ抗体を用いるウエスタンブロッティングによって解析した結果である。レーン１はｓｐＧＦＰ、レーン２はｐｒｏＧＦＰおよびレーン３はＧＦＰ−ＣＴ２４である。レーン４は非形質転換シロイヌナズナ種子抽出液である。
【図６】図６は、シロイヌナズナ種子中でのＧＦＰキメラタンパク質である、ｓｐＧＦＰ　（Ａ）、ｐｒｏＧＦＰ　（Ｂ）　ＧＦＰ−ＣＴ２４（Ｃ）の局在部位を乾燥種子の共焦点レーザー顕微鏡観察により解析した結果を示す。
【図７】図７は、ＧＦＰ−ＣＴ２４をコードする遺伝子（ＣおよびＤ）またはシグナルペプチドのみを連結したｓｐＧＦＰをコードする遺伝子（コントロール；ＡおよびＢ）をパーティクルガンでダイズ登熟種子に導入し、２４時間後に、発現したＧＦＰ−ＣＴ２４の細胞内での存在部位を共焦点レーザー顕微鏡観察により確認した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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