(57)【要約】　　　（修正有）【課題】アルツハイマー病、神経外胚葉腫瘍、悪性アストロサイトーマおよびグリオブラストーマの免疫診断法ならびに分子診断法および遺伝子治療法を提供する。【解決手段】上記疾患に関連する神経糸状タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え宿主およびベクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　実質上、天然の不純物を含有せず、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Manassass、Va.）に受託番号６９２６３として寄託されている大腸菌細胞中に存在する、図１６Ｅに示す配列を有するＡＤ２−２ ＤＮＡ分子によりコードされる神経糸状タンパク質（ＮＴＰ）。
【請求項２】
　アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Manassass、Va.）に受託番号６９２６３として寄託されている大腸菌細胞中に存在する、図１６Ｅに示す配列を有するＡＤ２−２ ＤＮＡ分子を含む神経糸状タンパク質（ＮＴＰ）をコードする単離された核酸分子。
【請求項３】
　ヒトのＮＴＰであるＮＴＰをコードする遺伝子配列を含む請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
　請求項２に記載の核酸分子を含むプラスミド。
【請求項５】
　請求項４に記載のプラスミドを用いて形質転換された宿主。
【請求項６】
　請求項４に記載のプラスミドを用いて、神経組織から単離される、ＮＴＰと反応しＰＴＰとは反応しないモノクローナル抗体と反応するＮＴＰを製造する方法であって、
　（ａ）　該ＮＴＰをコードする該遺伝子配列を含む該プラスミドを宿主細胞中に導入し、組換え宿主細胞を製造すること；
　（ｂ）　該組換え宿主細胞を培養すること；次いで
　（ｃ）　神経組織から単離される、ＮＴＰと反応しＰＴＰとは反応しないモノクローナル抗体と反応する該ＮＴＰを該組換え宿主細胞から単離すること
を包含する方法。
【請求項７】
　該ＮＴＰをコードする該遺伝子配列がアルツハイマー病の患者の脳組織から得られるものである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
　該ＮＴＰをコードする該遺伝子配列がヒトの神経腫瘍細胞系から得られるものである請求項６に記載の方法。
【請求項９】
　該宿主が大腸菌である請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
　該遺伝子がベクターに含まれている請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
　該遺伝子が誘導可能なプロモーターのコントロール下にある請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
　該プロモーターがラムダＰLプロモーターである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
　該プロモーターがｔａｃプロモーターである請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
　請求項２に記載の核酸分子を含有する発現ベクター。
【請求項１５】
　請求項１４に記載の発現ベクターを含有するビリオン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、遺伝子工学および分子生物学の分野に関する。この発明は、アルツハイマー病、神経外胚葉性腫瘍、悪性星状細胞腫（アストロサイトーマ）、および膠芽細胞腫（グリオサイトーマ）に付随する新規タンパク質を発現する組換え宿主に関する。この発明は、詳しくは、神経糸状タンパク質（neural thread proteins）をコードする遺伝子を含む組換え宿主およびベクターに関する。この発明はまた、実質的に純粋な神経糸状タンパク質、神経糸状タンパク質の存在を検出するための免疫診断および分子診断法、および遺伝子療法における神経糸状タンパク質をコードする核酸配列の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病
　アルツハイマー病（ＡＤ）は米国における痴呆の最も頻度の高い原因であり、毎年、２００万人以上の人が該疾患に罹患している。それは、記憶の喪失、錯乱、および漸進的な身体劣化を特徴とする退行性の脳疾患である。それは、第四の一般的死因である。この疾患の病因はわかっていないが、種々のウイルス、毒素、重金属、並びに遺伝的欠損などが挙げられている。この疾患は現在のところ不治である。
【０００３】
　ごく最近までアルツハイマー病は、老人性痴呆として分類される症例の比較的少数の原因であると考えられてきた。繰り返し性の穏やかな発作、甲状腺異常、アルコール中毒、およびある種のビタミンの不足を含む他の要因がかかる状態に導きうるが、これらの多くは潜在的に治癒しうるものである。それゆえ、アルツハイマー病に特異的な診断試験は、これら状態のすべてに共通する兆候を表す患者の臨床診断および適切な臨床治療に非常に有用であることが理解される。
【０００４】
　アルツハイマー病を有する個体の脳は、ニューロン細胞体内の神経原線維のもつれ（neurofibrillary tangles）、および神経炎性（または老年）斑として生じるコンゴ親和性の（congophilic）繊維状物質の病的な蓄積を特徴とする。神経原線維のもつれはまた、ある種の脳血管壁にも認められる。神経原線維のもつれの主要な有機的構造成員は、対をなしたらせん状のフィラメントである。定性的に区別できないアミロイドの沈着はまた正常人の老年の脳にも生じるが、その数ははるかに少なく、地誌的な分布も限られたものである。
【０００５】
　アルツハイマー病および他の神経学的疾患の神経炎性斑および神経原線維のもつれに認められるタンパク質の特徴付けに関し、近年、相当の研究活動がなされている。グレナー（Ｇlenner）らによって最初に記載されたアミロイドタンパク質の一つはクローニングされ、配列が決定されている（グレナーら、Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.１２０：１１３１〜１１３５（１９８４）；米国特許第４,６６６,８２９号）。神経炎斑および血管中に認められるＡ４アミロイドタンパク質は、グリコシル化された細胞表面レセプターとして機能すると提唱されているタンパク質である６９５アミノ酸前駆体の成員であることが決定されている（マスターズ（Ｍasters）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８２：４２４５〜４２４９（１９８５）、カング（Ｋang）ら、Ｎature３２５：７３３〜７３６（１９８７））。加えて、このアミロイドタンパク質は、細胞接着分子として、およびカルシウムイオンチャネルタンパク質として機能することが提唱されている（フーパー（Ｈooper）、Ｊ.ＮＩＨ Ｒes.４：４８〜５４（１９９２）；レンズバーガー（Ｒensberger）、Ｗayward Ｐrotein Ｍolecule Ｍay Ｂe Ｅlusive Ｋiller of Ｂrain Ｃells、ワシントンポスト紙、１９９３年１月２５日、Ａ３の§１（１９９３））。Ａ４をコードする遺伝子は第２１染色体上に位置するが（カングら、上記文献；ゴールドガバー（Ｇoldgaber）ら、Ｓcience２３５：８７７〜８８０（１９８７）；タンジ（Ｔanzi）ら、Ｓcience２３５：８８０〜８８５（１９８７）；セント・ジョージ−ヒスロプ（Ｓt.Ｇeorge−Ｈyslop）ら、Ｓcience２３５：８８５〜８８９（１９８７））、家族性の該疾患とは関係がないように思われる（バン・ブロークホーベン（Ｖan Ｂroekhoven）ら、Ｎature３２９：１５３〜１５５（１９８７））。アミロイドＡ４およびβタンパク質、その高分子量前駆体、および膵臓糸状タンパク質（pancreatic thread protein）（ＰＴＰ）との間にタンパク質配列の相同性は、もしあったにしても殆どないと思われる（グロス（Ｇross）ら、Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.７６：２１１５〜２１２６（１９８５））。
【０００６】
　ユビキチン、ＡＬＺ−５０、微小管結合タンパク質τおよびＭＡＰ２、およびニューロフィラメントタンパク質を含む多くの他のタンパク質が該疾患に関係していると考えられた（たとえば、マネット（Ｍanetto）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８５：４５０２〜４５０５（１９８８）；ウォロジン（Ｗolozin）ら、Ｓcience２３２：６４８〜６５１（１９８６）；セルコエ（Ｓelkoe）、Ｎeurobiol.Ａging ７：４２５〜４３２（１９８６）；ペリー（Ｐerry）ら、Ａlterations of the Ｎeuronal Ｃytoskeleton in Ａlzheimer's Ｄisease、プレナム、ニューヨーク、１３７〜１４９頁（１９８７）参照）。さらに最近では、α1−アンチ−キモトリプシン（α1−anti-chymotrypsin）と呼ばれるセリンプロテアーゼインヒビターがアルツハイマー病のアミロイド沈着物中に認められている（アブラハム（Ａbraham）ら、Ｃell ５２：４８７〜５０１（１９８８））。
　現在のところ、臨床的に使われているものでアルツハイマー病の診断試験に有用なものはない。信頼性のある診断は、死後または生存中に脳の生検を取り、該疾患を特徴付ける特徴的な斑、もつれ、対のらせん状フィラメント、および他の脳血管沈着を明らかにすることによってのみ可能である。そのような侵入性の外科的手段は本来危険であり、それゆえ利用されることはまずない。その結果、アルツハイマー病の臨床における誤診断は約２０％〜３０％と推定されている。
【０００７】
糸状タンパク質（Ｔhread Ｐroteins）
　原型となる糸状タンパク質分子は膵臓糸状タンパク質（ＰＴＰ）であり、このタンパク質は中性のｐＨで不溶性のフィブリルを形成するが酸性またはアルカリ性のｐＨでは高度に可溶性であるという異常な物理特性を有する（グロスら、上記文献）。ＰＴＰは非常に広く分布し、膵臓の胞状細胞によって合成され、膵液中に１ｍｇ／ｍｌを越える濃度で分泌される（同上）。ＰＴＰに対するモノクローナル抗体を用い、糸状タンパク質の免疫反応性が増加することがアルツハイマー病の病変を有する脳で示されている（オズターク（Ｏzturk）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８６：４１９〜４２３（１９８９））。加えて、非常の高感度の前（forward）サンドイッチ放射免疫（immunoradiometric）アッセイを用い、ＰＴＰと脳における関連タンパク質とに共通する少なくとも３つの異なる抗原性エピトープが存在することが示された（同上）。このような類似性にも拘わらず、膵臓糸状タンパク質と神経糸状タンパク質とは殆ど確実に異なるものである。というのは、そのｍＲＮＡ分子およびタンパク質はサイズが異なり、膵臓糸状タンパク質中に存在する抗原性エピトープの多くは脳組織では検出されないからである（ド・ラ・モント（de la Ｍonte）ら、Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.８６：１００４〜１０１３（１９９０）；ド・ラ・モントら、Ｊ.Ｎeurol.Ｓci.１１３：１５２〜１６４（１９９２）；ド・ラ・モントら、Ａnn.Ｎeurol.３２：７３３〜７４２（１９９２））。
【０００８】
　糸状タンパク質の中枢神経系の形態（以下、「神経糸状タンパク質」（ＮＴＰ）と称する）は、アルツハイマー病およびダウン症候群の脳組織中で同定されている（ウォンズ（Ｗands）ら、国際出願公開第ＷＯ ９０／０６９９３号）。ＮＴＰは、該疾患に特徴的な神経病理学的変化が存在する研究されたすべてのアルツハイマー病の脳で認められている（同上）。食塩水で抽出可能な可溶性の画分は、約１７〜２０ｋＤの分子量を有する（同上）。
【０００９】
　アルツハイマー病の脳の種々の領域におけるＮＴＰ免疫反応性を定量したところ、対照の脳の相当領域が１〜１１ｎｇ／ｇ組織（平均＝５ｎｇ／ｇ組織）であるのに比べて、１２〜２９５ｎｇ／ｇ組織（平均＝１１６ｎｇ／ｇ組織）のレベルであることが明らかとなった（同上）。
【００１０】
　ＰＴＰの膵臓形態に対して向けられたモノクローナル抗体を用いて行った免疫細胞化学は、ＮＴＰがアルツハイマー病およびダウン症候群の両方の脳において細胞内、神経網内の微細な突起内に局在するか、または細胞外性であることを示した（同上）。２つの型の細胞：すなわちニューロンおよび星状細胞がＮＴＰを含有する（同上）。罹患したニューロンは大きなピラミッド状の形態であり、アルツハイマー病の脳においてよく知られている神経原線維のもつれを一般に含有する（同上）。
【００１１】
　ニューロン内でのＮＴＰの蓄積が本質的に重要でありアルツハイマー病の病変の発生に必然的に関連しているということは、ダウン症候群の脳ではＮＴＰの免疫標識の同一のパターンが存在するのに対照の脳には存在しないことによって確証される（同上）。アルツハイマー病と同じ構造上の異常が、痴呆の有無を問わずダウン症候群の中年の個体すべての脳に認められることに注意することは重要である。ダウン症候群の患者の家族においてはアルツハイマー病の発症率も高い。さらに、ＮＴＰを含有するニューロン密度の領域における差異は、アルツハイマー病およびダウン症候群の両者において神経原線維のもつれの密度分布と一致する。このこともまた、ＮＴＰがアルツハイマー病の病理と密接な関係にあるという証拠をさらに提供する。ＮＴＰが異所性の細胞代謝または輸送の結果としてニューロンの核周囲部細胞体内に蓄積するのかどうかについては、まだわかっていない。
【００１２】
【特許文献１】米国特許第４,６６６,８２９号明細書
【特許文献２】国際公開第９０／０６９９３号パンフレット
【特許文献３】米国特許第４,３５８,５３５号明細書
【特許文献４】米国特許第４,６８３,２０２号明細書
【特許文献５】米国特許第４,６８３,１９５号明細書
【特許文献６】国際公開第８８／１０３１５号パンフレット
【特許文献７】欧州特許第３２０３０８号明細書
【特許文献８】欧州特許第３３６７３１号明細書
【特許文献９】国際公開第８９／０９８３５号パンフレット
【特許文献１０】米国特許第４,３７６,１１０号明細書
【特許文献１１】国際公開第９０／０９１８０号パンフレット
【特許文献１２】米国特許第４,８９７,３５５号明細書
【特許文献１３】米国特許第４,３９４,４４８号明細書
【特許文献１４】米国特許第４,２３５,８７１号明細書
【特許文献１５】米国特許第４,２３１,８７７号明細書
【特許文献１６】米国特許第４,２２４,１７９号明細書
【特許文献１７】米国特許第４,７５３,７８８号明細書
【特許文献１８】米国特許第４,６７３,５６７号明細書
【特許文献１９】米国特許第４,２４７,４１１号明細書
【特許文献２０】米国特許第４,８１４,２７０号明細書
【特許文献２１】国際公開第８９０３８４９号パンフレット
【特許文献２２】欧州特許第０２６３７４０号明細書
【特許文献２３】国際公開第９１／０６６２６号パンフレット
【特許文献２４】国際公開第９２／１０５９０号パンフレット
【特許文献２５】国際公開第９２／０７０６５号パンフレット
【特許文献２６】米国特許第５,１６８,０５３号明細書
【特許文献２７】国際公開第９２／０６６９３号パンフレット
【特許文献２８】米国特許第５,０８２,６７０号明細書
【特許文献２９】米国特許第４,８６６,０４２号明細書
【００１３】
【非特許文献１】グレナーら, Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.１２０：１１３１〜１１３５（１９８４）
【非特許文献２】マスターズ（Ｍasters）ら, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ８２：４２４５〜４２４９（１９８５）
【非特許文献３】カング（Ｋang）ら, Ｎature３２５：７３３〜７３６（１９８７）
【非特許文献４】フーパー（Ｈooper）, Ｊ.ＮＩＨ Ｒes.４：４８〜５４（１９９２）
【非特許文献５】レンズバーガー（Ｒensberger）, Ｗayward Ｐrotein Ｍolecule Ｍay Ｂe Ｅlusive Ｋiller of Ｂrain Ｃells、ワシントンポスト紙, １９９３年１月２５日、Ａ３の§１（１９９３）
【非特許文献６】ゴールドガバー（Ｇoldgaber）ら, Ｓcience２３５：８７７〜８８０（１９８７）
【非特許文献７】タンジ（Ｔanzi）ら, Ｓcience２３５：８８０〜８８５（１９８７）
【非特許文献８】セント・ジョージ−ヒスロプ（Ｓt.Ｇeorge−Ｈyslop）ら, Ｓcience２３５：８８５〜８８９（１９８７）
【非特許文献９】バン・ブロークホーベン（Ｖan Ｂroekhoven）ら, Ｎature３２９：１５３〜１５５（１９８７）
【非特許文献１０】グロス（Ｇross）ら, Ｊ. Ｃlin. Ｉnvest. ７６：２１１５〜２１２６（１９８５）
【非特許文献１１】マネット（Ｍanetto）ら, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ８５：４５０２〜４５０５（１９８８）
【非特許文献１２】ウォロジン（Ｗolozin）ら, Ｓcience ２３２：６４８〜６５１（１９８６）
【非特許文献１３】セルコエ（Ｓelkoe）, Ｎeurobiol. Ａging ７：４２５〜４３２（１９８６）
【非特許文献１４】ペリー（Ｐerry）ら, Ａlterations of the Ｎeuronal Ｃytoskeleton in Ａlzheimer's Ｄisease, プレナム, ニューヨーク, １３７〜１４９頁（１９８７）
【非特許文献１５】アブラハム（Ａbraham）ら, Ｃell ５２：４８７〜５０１（１９８８）
【非特許文献１６】サンブルック（Ｓambrook）ら, モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）
【非特許文献１７】ウイルバー（Ｗilber,Ｗ.Ｊ.）およびリップマン（Ｌipman,Ｄ.Ｊ.）, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ８０：７２６〜７３０（１９８３）
【非特許文献１８】レミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンスィズ（Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓciences）（１９８０）
【非特許文献１９】サノ（Ｓano）ら, Ｓcience ２５８：１２０〜１２２（１９９２）
【非特許文献２０】モレキュラー・バイオロジー・ラブファックス（Ｍolecular Ｂiology ＬabＦax）, ブラウン（Ｂrown, Ｔ. Ａ.）編、アカデミックプレス, ニューヨーク（１９９１）
【非特許文献２１】ハーディー（Ｈardy）, ＤＮＡクローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ Ｃloning：Ａ Ｐractical Ａpproach）, ＩＲＬプレス, ワシントン, ＤＣ（１９８５）中の「バシラス・クローニング・メソッズ（Ｂacillus Ｃloning Ｍethods）
【非特許文献２２】マリク（Ｍalik）ら, Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. ２６３：１１７４〜１１８１（１９８４）
【非特許文献２３】ローゼンバーグ（Ｒosenberg）ら, Ｇene ５９：１９１〜２００（１９８７）
【非特許文献２４】シネドリング（Ｓhinedling）ら, Ｊ. Ｍolec. Ｂiol. １９５：４７１〜４８０（１９８７）
【非特許文献２５】ヒュー（Ｈu）ら, Ｇene ４２：２１〜３０（１９８６）
【非特許文献２６】チャンバーリン（Ｃhamberlin）ら, Ｎature ２２８：２２７〜２３１（１９７０）
【非特許文献２７】ベイリー（Ｂailey）ら, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）８０：２８１４〜２８１８（１９８３）
【非特許文献２８】ダバンルー（Ｄavanloo）ら, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）８１：２０３５〜２０３９（１９８４）
【非特許文献２９】ザ・バクテリオファージ・ラムダ（Ｔhe Ｂacteriophage Ｌamda）, ハーシー（Ｈershey,Ａ.Ｄ.）編, コールドスプリングハーバープレス, コールドスプリングハーバー, ニューヨーク（１９７３）
【非特許文献３０】ラムダII（Ｌamda II）, ヘンドリックス（Ｈendrix,Ｒ.Ｗ.）編, コールドスプリングハーバープレス, コールドスプリングハーバー, ニューヨーク（１９８０）
【非特許文献３１】ウルマネン（Ｕlmanen）ら, Ｊ. Ｂacteriol. １６２：１７６〜１８２（１９８５）
【非特許文献３２】ギルマン（Ｇilman）ら, Ｇene ３２：１１〜２０（１９８４）
【非特許文献３３】グリクザン（Ｇryczan）, ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・バシライ（Ｔhe Ｍolecular Ｂiology of the Ｂacilli）, アカデミック・プレス, ニューヨーク（１９８２）
【非特許文献３４】ウォード（Ｗard）ら, Ｍol. Ｇen. Ｇenet. ２０３：４６８〜４７８（１９８６）
【非特許文献３５】グリック（Ｇlick）, Ｊ. Ｉnd. Ｍicrobiol. １：２７７〜２８２（１９８７）
【非特許文献３６】セナチエンポ（Ｃenatiempo）, Ｂiochimie ６８：５０５〜５１６（１９８６）
【非特許文献３７】ワトソン（Ｗatson）ら, モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン（Ｍolecular Ｂiology of the Ｇene）, 第４版, ベンジャミン・カミンズ, メンロパーク, カリフォルニア（１９８７）
【非特許文献３８】ゴッテスマン（Ｇottesman）, Ａnn. Ｒev. Ｇenet. １８：４１５〜４４２（１９８４）
【非特許文献３９】ハマー（Ｈamer）ら, Ｊ. Ｍol. Ａppl. Ｇen. １：２７３〜２８８（１９８２）
【非特許文献４０】マックナイト（ＭcＫnight）, Ｃell ３１：３５５〜３６５（１９８２）
【非特許文献４１】ベノイスト（Ｂenoist）ら, Ｎature（ロンドン） ２９０：３０４〜３１０（１９８１）
【非特許文献４２】ジョンストン（Ｊohnston）ら, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）７９：６９７１〜６９７５（１９８５）
【非特許文献４３】シルバー（Ｓilver）ら, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. （ＵＳＡ）８１：５９５１〜５９５５（１９８４）
【非特許文献４４】ゴーマン（Ｇorman）ら, ＤＮＡ Ｃloning：Ａ Ｐractical Ａpproach, II巻, ＩＲＬプレス, ワシントン,ＤＣ, １４３〜１９０頁（１９８５）中の「ハイ・エフィシャンシー・ジーン・トランスファー・イントゥ・ママリアン・セルズ（Ｈigh Ｅfficiency Ｇene Ｔransfer into Ｍammalian cells）」
【非特許文献４５】ウエットマー（Ｗetmur）ら, Ｊ. Ｍol. Ｂiol. ３１：３４９〜３７０（１９６８）
【非特許文献４６】シャープ（Ｓharp）ら, Ｊ. Ｍol. Ｂiol. ８６：７０９〜７２６（１９７４）
【非特許文献４７】ブリッテン（Ｂritten）ら, Ｓcience １６１：５２９〜５４０（１９６８）
【非特許文献４８】サットン（Ｓutton）, Ｂiochim. Ｂiophys. Ａcta ２４０：５２２〜５３１（１９７１）
【非特許文献４９】グセラ（Ｇusella）, ＦＡＳＥＢ Ｊ３：２０３６〜２０４１（１９８９）
【非特許文献５０】ハリソンズ・プリンシプルズ・オブ・インターナショナル・メディスン（Ｈarrison's Ｐrinciples of Ｉnternational Ｍedicine）, ブラウンウォルト（Ｂraunwald）ら編, 第１１版, マックグロー−ヒル・ブック・カンパニー, ニューヨーク, ２０１２〜２０１３頁（１９８７）
【非特許文献５１】パーク（Ｐark）, ＰＣＲプロトコールズ（ＰＣＲ Ｐrotocols）, イニス（Ｉnnis）ら編, アカデミックプレス, ニューヨーク, ４０７〜４１５頁（１９９０）中の「ＰＣＲ・イン・ザ・ダイアグノーシス・オブ・レチノブラストーマ(ＰＣＲ in the Ｄiagnosis of Ｒetinoblastoma)」
【非特許文献５２】グセラら, Ｎature ３０６：２３４〜２３８（１９８３）
【非特許文献５３】「A Textbook of Histology」，ブルーム(Bloom)およびファウセット(Faucett)編, ダブリュー・ビー・ソーンダース(Sounders)・カンパニー，フィラデルフィア（１９６４年）
【非特許文献５４】サノ(Sano)らのScience, ２５８:１２０〜１２２（１９９２年）
【非特許文献５５】ロー(Loh)らのScience, ２４３:２１７（１９８８年）
【非特許文献５６】リー(Li)らのNature, ３３５:４１４（１９８８年）
【非特許文献５７】クゥオー(Kwoh)らのProc. Natl. Acad. Sci. USA, ８６:１１７３(１９８９年)
【非特許文献５８】ウー(Wo)らのGenomics, ４:５６０（１９８９年）
【非特許文献５９】サンゾらのBio/Technology, ９:１３７８（１９９１年）
【非特許文献６０】クレイン(Klein)の「免疫学：自己−非自己の識別」， ジョン・ウイリー・アンド・サンズ，ニューヨーク（１９８２年）
【非特許文献６１】ケネット(Kennett)らの「モノクローナル抗体とハイブリドーマ:生物学的分析の新次元」, プレナム・プレス, ニューヨーク(１９８０年)
【非特許文献６２】キャンベル(Campbell)の"モノクローナル抗体テクノロジー", 「生化学と分子生物学における実験室テクニック」, １３巻(バードン(Burdon,R.)ら編)， エルセビア，アムステルダム（１９８４年）
【非特許文献６３】エイゼン（Eisen）の「マイクロバイオロジー」, 第３版, デービス(Davis)ら, ハーパー・アンド・ロウ, フィラデルフィア（１９８０年）
【非特許文献６４】ケーラー(Kohler)およびミルシュタイン(Milstein)のNature, ２５６：４９５〜４９７（１９７５年）
【非特許文献６５】キャロル(Carroll)らの"β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質の外来セグメントに対するポリクローナル抗体の産生と精製", 「ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ」，ＩＩＩ巻，ＩＲＬ・プレス，ワシントンＤＣ，８９〜１１１ｐｐ（１９８７年）
【非特許文献６６】モール(Mole)らの"大腸菌で産生された融合タンパク質に対するモノクローナル抗体の産生"，「ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ」，ＩＩＩ巻，ＩＲＬ・プレス，ワシントンＤＣ，１１３〜１１３９ｐｐ（１９８７年）」
【非特許文献６７】デラモンテらのJ. Clin. Invest., ８６：１００４〜１０１３（１９９０年）
【非特許文献６８】ワール(Wahl)らのJ. Nucl. Med., ２４：３１６〜３２５（１９８３年）
【非特許文献６９】ワーク（Work）らの「分子生物学における実験技術および生化学」，ノース・ホランド・パブリッシング・カンパニー，ニューヨーク（１９７８年）
【非特許文献７０】ペテルスドルフ(Petersdorf)らの「Harrison's Principles of Internal Medicine」 第１０版, マックグロー−ヒル・ブック・カンパニー，ニューヨーク，ｐ２０７６（１９８３年）
【非特許文献７１】ケネディー（Kennedy）らのClin.Chim.Acta, ７０：１〜３１（１９７６年）
【非特許文献７２】スカース(Schurs)らのClin. Chim. Acta, ８１：１〜４０（１９７７年）
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【非特許文献１０２】ササキ（Sasaki）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem.），２６８巻，１〜４頁，（１９９３年）
【００１４】
（発明の要約）
　アルツハイマー病に罹患しているかまたはその危険のあると思われる個体に行うことのできる信頼性のある診断試験に対する必要性が存在する。本発明は、そのような必要性を満たすものであり、さらに利点を提供する。
【００１５】
　これら目的および他の目的が本発明によって実現される仕方は、以下に記載する要約および詳細な記載から明らかとなるであろう。
【００１６】
　特に定義しない限り、本明細書において使用する術語は、本発明が属する当該技術分野においてよく理解されているのと同じ意味を有する。引用した刊行物はすべて、参照のため本明細書中に引用する。
【００１７】
　この発明は、アルツハイマー病、神経外胚葉性腫瘍、悪性星状細胞腫、および膠芽細胞腫に付随する新規タンパク質を発現する組換え宿主に関する。この発明はとりわけ、約８ｋＤａ、１４ｋＤａ、１７ｋＤａ、２１ｋＤａ、２６ｋＤａまたは４２ｋＤａの分子量を有する神経糸状タンパク質（ＮＴＰ）をコードする遺伝子を含有する組換え宿主およびベクターに関する。この発明はまた、実質的に純粋な神経糸状タンパク質、神経糸状タンパク質の存在を検出するための免疫診断および分子診断法、および遺伝子療法における神経糸状タンパク質をコードする核酸配列の使用に関する。
【００１８】
　とりわけ、本発明は、
（ａ）検出可能なレベルのＮＴＰを含有すると思われるヒト個体から採取した生物学的試料を該ＮＴＰと結合しうる分子と接触させ、ついで
（ｂ）該ＮＴＰに結合した該分子を検出する
ことを特徴とする、ヒト個体におけるＮＴＰの検出または定量法を包含する。
【００１９】
　本発明はさらに、該結合分子が
（ａ）天然の不純物を実質的に含まない抗体、
（ｂ）モノクローナル抗体および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の断片
よりなる群から選ばれたものである、上記方法を包含する。
【００２０】
　本発明はさらに、該検出分子が検出可能なように標識されており、そのような結合分子の組み合わせを用いる上記方法を包含する。
【００２１】
　本発明はさらに、本発明の組換えヒトＮＴＰに由来するポリヌクレオチドプローブを用いた、生物学的試料中のＮＴＰをコードする遺伝子配列の存在を検出する方法を包含する。
【００２２】
　本発明はさらに、ヒト個体における状態の存在を決定する方法を包含し、該状態は、アルツハイマー病、神経外胚葉性腫瘍の存在、悪性星状細胞腫の存在、および膠芽細胞腫の存在よりなる群から選ばれたものが含まれるが、これらに限られるものではない。
【００２３】
　本発明はさらに、アルツハイマー病に罹患していると思われるヒト個体におけるアルツハイマー病の存在の診断方法であって、
（ａ）ＮＴＰを有していると思われる該個体から採取した生物学的試料をＮＴＰを同定しうる分子とともにインキュベートし、ついで
（ｂ）該試料中の結合した該分子を検出する（該検出は該個体がアルツハイマー病に罹患していることを示す）
ことを特徴とする方法を包含する。
【００２４】
　本発明はさらに、神経外胚葉性腫瘍に罹患していると思われるヒト個体における神経外胚葉性腫瘍の存在の診断方法であって、
（ａ）ＮＴＰを有していると思われる該個体から採取した生物学的試料をＮＴＰを同定しうる分子とともにインキュベートし、ついで
（ｂ）該試料中の結合した該分子を検出する（該検出は該個体が神経外胚葉性腫瘍に罹患していることを示す）
ことを特徴とする方法を包含する。
【００２５】
　本発明はさらに、悪性星状細胞腫に罹患していると思われるヒト個体における悪性星状細胞腫の存在の診断方法であって、
（ａ）ＮＴＰを有していると思われる該個体から採取した生物学的試料をＮＴＰを同定しうる結合分子の存在下でインキュベートし、ついで
（ｂ）該試料中の結合した該分子を検出する（該検出は該個体が悪性星状細胞腫に罹患していることを示す）
ことを特徴とする方法を包含する。
【００２６】
　本発明はさらに、膠芽細胞腫に罹患していると思われるヒト個体における膠芽細胞腫の存在の診断方法であって、
（ａ）ＮＴＰを有していると思われる該個体から採取した生物学的試料をＮＴＰを同定しうる結合分子の存在下でインキュベートし、ついで
（ｂ）該試料中の結合した該分子を検出する（該検出は該個体が膠芽細胞腫に罹患していることを示す）
ことを特徴とする方法を包含する。
【００２７】
　本発明はさらに、生物学的試料を該分子に接触させる前に該試料をヒト個体から採取する上記方法を包含する。
【００２８】
　本発明はさらに、該タンパク質に結合した該分子の検出をインシトゥ造影により行う上記方法を包含する。
【００２９】
　本発明はさらに、該タンパク質に結合した該分子の検出をインビボ造影により行う上記方法を包含する。
【００３０】
　本発明はさらに、該生物学的試料と該結合分子との反応を該タンパク質の存在および分布を決定するのに充分な仕方および条件下で行う上記方法を包含する。
【００３１】
　本発明はさらに、ＮＴＰを検出しうるように標識した結合分子をヒト個体に投与する上記方法を包含する。
【００３２】
　本発明はさらに、該結合分子が該タンパク質にインビボで結合する上記方法を包含する。
【００３３】
　本発明はさらに、ＮＴＰが実質的に天然の不純物を含まず、約４２ｋＤａの分子量を有する上記方法を包含する。
【００３４】
　本発明はさらに、ＮＴＰが実質的に天然の不純物を含まず、約２６ｋＤａの分子量を有する上記方法を包含する。
【００３５】
　本発明はさらに、ＮＴＰが実質的に天然の不純物を含まず、約２１ｋＤａの分子量を有する上記方法を包含する。
【００３６】
　本発明はさらに、ＮＴＰが実質的に天然の不純物を含まず、約１７ｋＤａの分子量を有する上記方法を包含する。
【００３７】
　本発明はさらに、ＮＴＰが実質的に天然の不純物を含まず、約１４ｋＤａの分子量を有する上記方法を包含する。
【００３８】
　本発明はさらに、ＮＴＰが実質的に天然の不純物を含まず、約８ｋＤａの分子量を有する上記方法を包含する。
【００３９】
　本発明はまた、とりわけ、イムノアッセイが固相支持体に結合した２つの異なる抗体と、それと組み合わせた溶液中の検出しうるように標識した第三の異なる抗体を含む上記方法を包含する。
【００４０】
　本発明はまた、
（ａ）ＮＴＰをコードするヒト遺伝子を含む組換え宿主を培養し、ついで
（ｂ）該宿主から該ＮＴＰを単離する
ことを特徴とする、ＮＴＰの製造方法に関する。
　本発明はさらに、該方法によって得られた実質的に純粋なＮＴＰに関する。
【００４１】
　本発明はまた、ＮＴＰ核酸配列には相補的であるがＰＴＰ核酸配列には非相同である１５−〜３０−マーのアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドおよび薬理学的に許容しうる担体を含む医薬組成物に関する。
【００４２】
　本発明はまた、ＮＴＰ核酸配列には相補的であるがＰＴＰ核酸配列には非相同である標的配列を含むリボザイム、並びに該リボザイムおよび薬理学的に許容しうる担体を含む医薬組成物に関する。
【００４３】
　本発明はまた、許容しうる担体または発現ベクターによりＮＴＰ分子の脳への薬物送達（輸送）を行う方法に関する。
【００４４】
　本発明はまた、種々のＮＴＰ遺伝子（核酸配列）と三重鎖領域を形成し、ＰＴＰ核酸配列には非相同であるオリゴデオキシヌクレオチド、並びに該オリゴデオキシヌクレオチドおよび薬理学的に許容しうる担体を含む医薬組成物に関する。
【００４５】
　本発明はまた、アルツハイマー型のニューロン変性の痴呆を緩和または改善するためのＮＴＰ由来分子またはその断片の治療学的使用に関する。
【００４６】
　本発明はまた、散発性および家族性のアルツハイマー病の識別診断法に関する。
【００４７】
（定義）
　以下の記載において、組換えＤＮＡ技術において使用される多数の術語が広範に用いられる。かかる術語によって与えられる範囲を含めて本明細書および請求の範囲の明快かつ首尾一貫した理解を得るため、以下に定義を記載する。
【００４８】
クローニングベクター
　宿主細胞中で自律複製することができ、１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位であってベクターの必須の生物学的機能を失うことなく決定しうる仕方で切断される部位を有することを特徴とし、ＤＮＡ断片を複製およびクローニングするために該ＤＮＡ断片をスプライシングする、プラスミドまたはファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列。クローニングベクターはまた、該クローニングベクターでトランスフォームされた細胞の同定に用いるのに適したマーカーをさらに含有していてよい。マーカーは、たとえば、テトラサイクリン耐性またはアンピリシン耐性を付与する。
【００４９】
発現ベクター
　クローニングベクターと同様のベクターであるが、宿主にトランスフォームした後に、クローニングした遺伝子の発現を促進しうるものである。クローニングする遺伝子は、通常、プロモーター配列などのある種の制御配列の制御下に置かれる（すなわち、機能的に連結）。プロモーター配列は、構成的であっても誘導的であってもよい。
【００５０】
実質的に純粋
　本明細書においては、所望の精製したタンパク質が、ポリアクリルアミド−ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動後に単一のバンドによって示されるように、混入性の細胞成分（該細胞成分は、天然では該所望のタンパク質と結合している）を本質的に含まないことを意味する。混入性の細胞成分としては、タンパク質性の不純物、炭水化物性の不純物、または脂質性の不純物が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００５１】
　「実質的に純粋」なる語は、さらに、当業者によって用いられる１または２以上の純度または均一性特性によって均一である分子を意味する。たとえば、実質的に純粋なＮＴＰは以下のパラメータに関して標準実験偏差内で一定かつ再現性の特性を示すであろう：分子量、クロマトグラフ移動、アミノ酸組成、アミノ酸配列、ブロックしたまたはブロックしていないＮ末端、ＨＰＬＣ溶出プロフィル、生物学的活性、および他のパラメータ。しかしながら、この語は、該因子と他の化合物との人為的または合成の混合物を排除することを意図するものではない。加えて、この語は組換え宿主から単離したＮＴＰ融合タンパク質を排除することを意図するものではない。
【００５２】
組換え宿主
　本発明によれば、組換え宿主とは、発現ベクターまたはクローニングベクター上の所望のクローニング遺伝子を含有する原核または真核細胞である。この語はまた、その染色体またはゲノム中に所望の遺伝子を遺伝子工学により組み込んだ原核または真核細胞をも包含する。
【００５３】
組換えベクター
　所望のクローニング遺伝子を含むクローニングベクターまたは発現ベクター。
【００５４】
宿主
　複製しうる発現ベクターまたはクローニングベクターの受け入れ側である原核または真核細胞。本明細書において用いる「宿主」なる語はまた、よく知られた方法によって所望の遺伝子をその染色体またはゲノム上に含まれるように遺伝子工学により組み込むことのできる原核または真核細胞をも包含する。そのような宿主の例については、サンブルック（Ｓambrook）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）を参照。
【００５５】
プロモーター
　開始コドンの近位に位置し、遺伝子の５’領域として一般に記載されるＤＮＡ配列。隣接する遺伝子の転写はプロモーター領域で開始される。プロモーターが誘導性プロモーターである場合は、転写速度は誘導因子に応答して増加する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合は、転写速度は誘導因子によって制御されない。
【００５６】
遺伝子
　ポリペプチドまたはタンパク質を発現するための情報を含むＤＮＡ配列。
【００５７】
構造遺伝子
　メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、ついでこれが特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡ配列。
【００５８】
アンチセンスＲＮＡ遺伝子／アンチセンスＲＮＡ
　真核生物ではｍＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼIIによって転写される。しかしながら、特定のｍＲＮＡに相補的な配列を有するが通常は翻訳されないＲＮＡ配列が転写されるようなＲＮＡポリメラーゼII鋳型を含む遺伝子を構築することができることも知られている。そのような遺伝子構築物を本明細書では「アンチセンスＲＮＡ遺伝子」と称し、そのようなＲＮＡ転写物を「アンチセンスＲＮＡ」と称する。アンチセンスＲＮＡは、該アンチセンスＲＮＡ配列中に翻訳停止コドンが存在するために通常は翻訳されることはない。
【００５９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
　特定のｍＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡ分子。アンチセンスオリゴヌクレオチドは特定のｍＲＮＡ中の相補的な配列に結合し、該ｍＲＮＡの翻訳を抑制する。
【００６０】
アンチセンス療法
　対応タンパク質の発現を抑制するために、患者にアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する治療方法。
【００６１】
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
　「相補的ＤＮＡ」または「ｃＤＮＡ」遺伝子は、ｍＲＮＡの逆転写によって合成され、ｍＲＮＡから介在配列（イントロン）が除かれた組換え遺伝子をいう。
【００６２】
発現
　発現とは、構造遺伝子からポリペプチドが製造されるプロセスである。このプロセスには、該遺伝子のｍＲＮＡへの転写および該ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。
【００６３】
相同／非相同
　２つの核酸分子が、ＨＡＳＨ−コードアルゴリズムによって決定されるように（ウイルバー（Ｗilber,Ｗ.Ｊ.）およびリップマン（Ｌipman,Ｄ.Ｊ.）、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.８０：７２６〜７３０（１９８３））、ヌクレオチド配列が５０％を越える類似性を有する場合にはこれら核酸分子は「相同」であるという。２つの核酸分子が５０％未満のヌクレオチド配列の類似性を有する場合には「非相同」であるという。
【００６４】
リボザイム
　リボザイムは、触媒中心を含むＲＮＡ分子である。この語は、ＲＮＡ酵素、自己スプライシングＲＮＡ、および自己開裂ＲＮＡを包含する。
【００６５】
リボザイム療法
　標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制するために患者にリボザイムを投与する治療方法。
【００６６】
断片
　ＮＴＰなどの分子の「断片」とは、該分子のポリペプチド部分集合をいう。
【００６７】
機能性誘導体
　「機能性誘導体」なる語は、該分子の「変異体」、「類似体」または「化学的誘導体」を包含する。ＮＴＰなどの分子の「変異体」とは、分子の全体かまたはその断片のいずれかと実質的に類似の天然分子をいう。ＮＴＰなどの分子の「類似体」とは、分子の全体またはその断片と実質的に類似の非天然分子をいう。
【００６８】
　ある分子と他の分子とが実質的に同じアミノ酸配列を有し、かつ同様の生物学的活性を有する場合に、これら両分子は「実質的に類似」であるといわれる。それゆえ、これら分子が同様の生物学的活性を有することを条件として、たとえこれら分子の一方が他方にはないアミノ酸をさらに含んでいても、あるいはアミノ酸残基の配列が同一ではないとしても、これら両分子は本明細書において使用する意味において変異体であると考えられる。
【００６９】
　本明細書において、ある分子が他の分子の一部として通常含まれない化学残基をさらに有する場合に、該分子は該他の分子の「化学的誘導体」であるといわれる。そのような残基は、分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善する。これら残基はまた、該分子の毒性を減少させ、該分子の望ましくない副作用を除去または弱める。そのような効果を媒体する残基の例は、レミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンスィズ（Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓciences）（１９８０）に開示されており、当業者には明らかであろう。
【００７０】
ＮＴＰ
　「ＮＴＰ」なる語は、神経糸状タンパク質のファミリーをいう。ＮＴＰファミリーには、本明細書において記載するように、約８ｋＤａ、１４ｋＤａ、１７ｋＤａ、２１ｋＤａ、２６ｋＤａおよび４２ｋＤａの分子量を有するタンパク質が含まれる。
【００７１】
イムノ−複製連鎖反応
　特異的抗体−ＤＮＡ結合体を用いて抗原を検出する方法。この方法によれば、ＤＮＡと抗体とに対して２特異的な結合親和性を有するリンカー分子を用い、ＤＮＡ分子を抗原−抗体複合体に特異的に結合させる。その結果、特異的な抗原−抗体−ＤＮＡ結合体が生成する。結合したＤＮＡは、適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて複製連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することができる。特異的なＰＣＲ産物の存在はＤＮＡ分子が抗原−抗体複合体に特異的に結合したことを示し、それゆえ抗原の存在を示している（サノ（Ｓano）ら、Ｓcience２５８：１２０〜１２２（１９９２））。
【００７２】
　たとえば、上記サノらは、ビオチンおよび免疫グロブリンＧに対して特異的結合親和性を有するストレプトアビジン−プロテインＡキメラを構築した。このキメラ（すなわち、「リンカー分子」）を用い、ビオチン化したＤＮＡを、マイクロタイタープレートウエル上に固定化した抗原−モノクローナル抗体複合体に特異的に結合させた。結合したＤＮＡの部分を引き続きＰＣＲにより増幅した。
【００７３】
　この発明は、神経糸状タンパク質（ＮＴＰ）、ＮＴＰ ｍＲＮＡまたはアンチセンスｍＲＮＡをコードする遺伝子配列、該遺伝子配列を含む発現ベクター、該発現ベクターでトランスフォームした組換え宿主、およびそのようなトランスフォームされた組換え宿主の発現によって産生されたＮＴＰおよびアンチセンスＲＮＡに関する。この発明はさらに、ＮＴＰリボザイム、およびＮＴＰリボザイムおよびＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする組換えＤＮＡ分子に関する。この発明はさらに、ＮＴＰに対して向けられた抗体、並びに生物学的試料中のＮＴＰの存在を検出するためのＮＴＰ抗体およびＮＴＰ核酸配列の使用に関する。本発明はさらに、遺伝子療法におけるＮＴＰコード配列の使用に関する。
【００７４】
Ｉ．神経糸状タンパク質をコードするＤＮＡ配列の単離
　ＮＴＰをコードするＤＮＡ配列は、種々の採取源から得ることができる。これら採取源としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびその組み合わせが挙げられる。
【００７５】
　当該技術分野でよく知られた方法により（たとえば、サンブルックら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）参照）、ヒトＮＴＰゲノムＤＮＡをあらゆるヒト細胞または組織から抽出および精製することができる。本発明のＮＴＰゲノムＤＮＡは、天然のイントロンを含んでいてもよいし含んでいなくてもよい。さらに、そのようなゲノムＤＮＡは、ＮＴＰ遺伝子配列の５’プロモーター領域および／または３’翻訳終止領域が結合した状態で得てもよい。さらに、そのようなゲノムＤＮＡは、ＮＴＰ ｍＲＮＡの５’非翻訳領域をコードするＤＮＡ配列および／または３’非翻訳領域をコードする遺伝子配列が結合した状態で得てもよい。宿主細胞がｍＲＮＡおよびタンパク質の発現に付随して転写および／または翻訳制御シグナルを認識することができる程度にて、該天然遺伝子の５’および／または３’非転写領域、および／または該ｍＲＮＡの５’および／または３’非翻訳領域が転写および翻訳制御のために保持され用いられてよい。
【００７６】
　別法として、ＮＴＰを発現する細胞からＮＴＰ ｍＲＮＡを単離し、当該技術分野でよく知られた手段により（たとえば、サンブルックらの上記文献参照）ｃＤＮＡを製造するのに用いることができる。ｍＲＮＡ調製物は、天然のまま大量のＮＴＰを産生する細胞から単離することにより、またはインビトロでショ糖密度遠心分離などのような特定の配列についてｍＲＮＡ調製物を富ませるために通常用いる技術により、またはその両者により、ＮＴＰをコードするｍＲＮＡに富んでいるのが好ましい。ＮＴＰ ｍＲＮＡは、哺乳動物のニューロン組織から、または該組織に由来する細胞株から得ることがでできる。ヒトｃＤＮＡライブラリーは、１７〜１８週の胎児脳、２歳の側頭葉新皮質、末期アルツハイマー病の大脳皮質、またはヒトニューロン組織由来の細胞株から構築する。そのような細胞株としては、中枢神経系初期神経外胚葉性腫瘍細胞（本明細書に記載するＰＮＥＴ１またはＰＮＥＴ２など）、神経芽腫細胞（本明細書に記載するＳＨ−Ｓｙ５ｙなど）、または神経膠腫細胞（Ａ１７２：ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６２０など）が挙げられるが、これらに限られるものではない。別法として、ラット神経膠腫細胞、たとえばＣ６ラット神経膠腫細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０７）から単離したｍＲＮＡからラットｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。
【００７７】
　ベクター中にクローニングするには、適当なＤＮＡ調製物（ゲノム由来かまたはｃＤＮＡ）をそれぞれランダムに切断または酵素により開裂し、適当なベクター中にライゲートして組換え遺伝子（ゲノム由来かまたはｃＤＮＡ）ライブラリーを生成させる。ＮＴＰをコードするＤＮＡ配列は、ライゲーションのための平滑末端または付着末端、適当な末端を提供するための制限酵素消化、付着末端の適当な充填、望まない結合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および適当なリガーゼを用いたライゲーションを含む、常法に従ってベクター中に挿入することができる。そのような操作技術はサンブルックらの上記文献に開示されており、当該技術分野でよく知られている。
【００７８】
　ＮＴＰクローンを含有するライブラリーのスクリーニングおよびＮＴＰクローンの同定は、たとえば、（１）該タンパク質のＤＮＡに特異的な配列を有する適当な核酸プローブを用いたハイブリダイゼーションによる、または（２）天然のｍＲＮＡが当該クローンにハイブリダイズし、インビトロで翻訳され、ついで翻訳産物をさらに特徴付ける、ハイブリダイゼーション−選択した翻訳分析による、または（３）クローニングしたＤＮＡ配列自体がｍＲＮＡを発現しうる場合には、該クローンを含有する宿主によって産生された翻訳ＮＴＰ産物の免疫沈降による、などのＮＴＰ ＤＮＡを特異的に選択する手段によって行うことができる。
【００７９】
　ＮＴＰのクローンを同定するのに用いることのできるＮＴＰに特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、対応ＮＴＰのアミノ酸配列またはＰＴＰの相同領域に関する知見から設計することができる。別法として、オリゴヌクレオチドプローブはまた、ＰＴＰのヌクレオチド配列に関する知見から設計することができる（ド・ラ・モントら、Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.８６：１００４〜１０１３（１９９０））。
　ＮＴＰ遺伝子の断片をコードしうる適当なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセット（またはかかるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットに相補的なもの）は、当該技術分野でよく知られた方法（たとえば、サンブルックらの上記文献参照）により合成することができる。核酸ハイブリダイゼーションおよびクローン同定の技術はサンブルックらの上記文献に開示されている。ついで、そのようなハイブリダイゼーションをしうると認められた上記遺伝子ライブラリーの成員を分析し、これら成員に含まれるＮＴＰコード配列の程度および性質を決定する。
【００８０】
　所望のＮＴＰコード配列の検出を容易にするため、上記ＤＮＡプローブを検出可能な基で標識する。そのような検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有するものであればいかなる物質であってもよい。そのような物質は核酸ハイブリダイゼーションの分野でよく開発されており、一般にそのような方法に用いるほとんどの標識を本発明において用いることができる。特に有用なものは、32Ｐ、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉなどの放射性標識である。適切なシグナルを与え、充分な半減期を有するものであればいかなる放射性標識も用いることができる。ＤＮＡプローブは、当該技術分野でよく知られた他の方法のなかでもとりわけ、たとえば、ニックトランスレーションにより、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ置換合成により、またはランダムプライミングにより標識することができる（サンブルックらの上記文献参照）。
【００８１】
　別法として、ＤＮＡプローブは、ビオチン、酵素または蛍光基などの非放射性のマーカーで標識することができる。
【００８２】
　ＮＴＰ ＤＮＡ配列をクローニングする別の方法において、本明細書に記載するように３’−および５’−ＲＡＣＥ法を用い、細胞株および脳組織からｃＤＮＡを直接クローニングすることによりＮＴＰ ｃＤＮＡを得ることができる。ヒト神経外胚葉性腫瘍細胞株またはアルツハイマー病の脳組織をｍＲＮＡの採取源として用いるのが好ましい。
【００８３】
II．ＮＴＰをコードする遺伝子の発現
　それゆえ、上記方法は、ＮＴＰまたはその断片をコードするＤＮＡ配列を同定することができる。そのようなＤＮＡ配列をさらに特徴付けるため、および組換えタンパク質を製造するため、該ＤＮＡ配列がコードするタンパク質を発現させるのが望ましい。
【００８４】
　ＮＴＰを発現するには、適当な宿主によって認識されうる転写および翻訳シグナルが必要である。上記方法により得られたクローニングしたＮＴＰ ＤＮＡ配列（好ましくは二本鎖の形態）を発現ベクター中での転写発現を制御する配列に「機能的に連結」し、原核もしくは真核の宿主細胞中に導入して組換えＮＴＰを産生させることができる。該ＮＴＰコード配列のいずれの鎖が転写発現を制御する配列に機能的に連結されているかにより、ＮＴＰのアンチセンスＲＮＡを発現させることも可能である。
【００８５】
　異なる宿主中でのＮＴＰの発現は異なる翻訳後修飾という結果となり、このことによってＮＴＰの特性が変化しうる。好ましくは、本発明は、真核細胞、とりわけ哺乳動物、昆虫、および酵母細胞中でのＮＴＰの発現を包含する。特に好ましい真核細胞宿主は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、折り畳みおよび／またはリン酸化を含む翻訳後修飾を組換えＮＴＰに与える。最も好ましくは、哺乳動物細胞は、ヒト中枢神経系の初期神経外胚葉性腫瘍細胞、ヒト神経芽腫細胞、ヒト神経膠腫細胞、またはラット神経膠腫細胞を包含する。特に好ましい初期神経外胚葉性腫瘍細胞としてはＰＮＥＴ１およびＰＮＥＴ２が挙げられ、特に好ましいヒト神経芽腫細胞としてはＨｇ１６およびＨｇ１７が挙げられ、特に好ましいヒト神経膠腫細胞としてはＡ１７２が挙げられ、特に好ましいラット神経膠腫細胞としてはＣ６が挙げられる（実施例１参照）。
【００８６】
　別法として、ＮＴＰは原核宿主細胞中で発現させることもできる。組換えＮＴＰは、本明細書に記載するように、かかる細胞によって融合タンパク質として発現されるのが好ましい。特に好ましい原核宿主は大腸菌である。好ましい大腸菌株としては、Ｙ１０８８、Ｙ１０８９、ＣＳＨ１８、ＥＲ１４５１、およびＥＲ１６４７が挙げられる（たとえば、モレキュラー・バイオロジー・ラブファックス（Ｍolecular Ｂiology ＬabＦax）、ブラウン（Ｂrown,Ｔ.Ａ.）編、アカデミックプレス、ニューヨーク（１９９１）参照）。他の好ましい宿主はバシラス・サチリス（Ｂacillus subtilus）であり、ＢＲ１５１、ＹＢ８８６、ＭＩ１１９、ＭＩ１２０、およびＢ１７０などの株を含む（たとえば、ハーディー（Ｈardy）、ＤＮＡクローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ Ｃloning：Ａ Ｐractical Ａpproach）、ＩＲＬプレス、ワシントン、ＤＣ（１９８５）中の「バシラス・クローニング・メソッズ（Ｂacillus Ｃloning Ｍethods）」を参照）。
　ＤＮＡなどの核酸分子は、それが発現制御配列を含み、該配列が転写制御情報を含み、そして該配列がタンパク質をコードするヌクレオチド配列に「機能的に連結されている」場合にポリペプチドを「発現しうる」ということができる。
【００８７】
　ある核酸分子の２つの配列は、両配列が同じＲＮＡ転写物に転写されるか、または一方の配列で開始されたＲＮＡ転写が第二の配列に伸長していくかのいずれかの仕方で互いに連結している場合に、機能的に連結しているということができる。それゆえ、プロモーター配列および他の「第二の」ＤＮＡまたはＲＮＡ配列などの２つの配列は、該プロモーター配列で開始された転写が該機能的に連結された第二の配列のＲＮＡ転写物を生成する場合に、機能的に連結しているという。機能的に連結しているためには、２つの配列は互いに密に隣接している必要はない。
【００８８】
　本発明のプロモーター配列は、原核細胞のもの、真核細胞のもの、またはウイルスのものであってよい。適当なプロモーターは、抑制性、構成的、または誘導性のものである。適当な原核細胞プロモーターとしては、Ｔ４ポリメラーゼを認識しうるプロモーター（マリク（Ｍalik）ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６３：１１７４〜１１８１（１９８４）；ローゼンバーグ（Ｒosenberg）ら、Ｇene５９：１９１〜２００（１９８７）；シネドリング（Ｓhinedling）ら、Ｊ.Ｍolec.Ｂiol.１９５：４７１〜４８０（１９８７）；ヒュー（Ｈu）ら、Ｇene４２：２１〜３０（１９８６））；Ｔ３、Ｓｐ６およびＴ７を認識し得るプロモーター（チャンバーリン（Ｃhamberlin）ら、Ｎature２２８：２２７〜２３１（１９７０）；ベイリー（Ｂailey）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）８０：２８１４〜２８１８（１９８３）；ダバンルー（Ｄavanloo）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）８１：２０３５〜２０３９（１９８４））；バクテリオファージラムダのＰRおよびＰLプロモーター（ザ・バクテリオファージ・ラムダ（Ｔhe Ｂacteriophage Ｌamda）、ハーシー（Ｈershey,Ａ.Ｄ.）編、コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９７３）；ラムダII（Ｌamda II）、ヘンドリックス（Ｈendrix,Ｒ.Ｗ.）編、コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８０））；大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック、およびＬａｃＺプロモーター；バシラス・サチリスのα−アミラーゼプロモーター（ウルマネン（Ｕlmanen）ら、Ｊ.Ｂacteriol.１６２：１７６〜１８２（１９８５））およびデルタ−２８−特異的プロモーター（ギルマン（Ｇilman）ら、Ｇene３２：１１〜２０（１９８４））；バシラスのバクテリオファージのプロモーター（グリクザン（Ｇryczan）、ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・バシライ（Ｔhe Ｍolecular Ｂiology of the Ｂacilli）、アカデミック・プレス、ニューヨーク（１９８２））；ストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）のプロモーター（ウォード（Ｗard）ら、Ｍol.Ｇen.Ｇenet.２０３：４６８〜４７８（１９８６））；バクテリオファージラムダのｉｎｔプロモーター；ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターなどが挙げられる。原核細胞のプロモーターについては、グリック（Ｇlick）、Ｊ.Ｉnd.Ｍicrobiol.１：２７７〜２８２（１９８７）；セナチエンポ（Ｃenatiempo）、Ｂiochimie６８：５０５〜５１６（１９８６）；ワトソン（Ｗatson）ら、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン（Ｍolecular Ｂiology of the Ｇene）、第４版、ベンジャミン・カミンズ、メンロパーク、カリフォルニア（１９８７）；ゴッテスマン（Ｇottesman）、Ａnn.Ｒev.Ｇenet.１８：４１５〜４４２（１９８４）；およびサンブルックらの上記文献に概説されている。
【００８９】
　好ましい真核細胞プロモーターとしては、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（ハマー（Ｈamer）ら、Ｊ.Ｍol.Ａppl.Ｇen.１：２７３〜２８８（１９８２））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（マックナイト（ＭcＫnight）、Ｃell３１：３５５〜３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（ベノイスト（Ｂenoist）ら、Ｎature（ロンドン）２９０：３０４〜３１０（１９８１））；および酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター（ジョンストン（Ｊohnston）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）７９：６９７１〜６９７５（１９８５）；シルバー（Ｓilver）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）８１：５９５１〜５９５５（１９８４））が挙げられる。上記文献をすべて参照のため本明細書に引用する。
【００９０】
　強力なプロモーターは、本発明の最も好ましいプロモーターである。そのような好ましいプロモーターの例は、Ｔ３、ＳＰ６およびＴ７ポリメラーゼプロモーターを認識するもの；バクテリオファージラムダのＰLプロモーター；ｒｅｃＡプロモーターおよびマウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーターである。原核細胞中で発現させるのに最も好ましいプロモーターは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターを認識しうるものである。そのようなポリメラーゼ認識配列の配列は、ワトソンら、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン、第４版、ベンジャミン・カミンズ、メンロパーク、カリフォルニア（１９８７）に開示されている。哺乳動物細胞中で発現させるのに最も好ましいプロモーターは、ＳＶ４０である（ゴーマン（Ｇorman）ら、ＤＮＡ Ｃloning：Ａ Ｐractical Ａpproach、II巻、ＩＲＬプレス、ワシントン、ＤＣ、１４３〜１９０頁（１９８５）中の「ハイ・エフィシャンシー・ジーン・トランスファー・イントゥ・ママリアン・セルズ（Ｈigh Ｅfficiency Ｇene Ｔransfer into Ｍammalian cells）」）。
【００９１】
III．ＮＴＰの検出方法
　この発明は、ＮＴＰ遺伝子または転写物にハイブリダイズしうる核酸プローブまたはＮＴＰに特異的な抗体を用いた、ヒト個体における神経学的疾患の検出方法に関する。「神経学的疾患」とは、アルツハイマー病（ＡＤ）、またはアルツハイマー型の病因変化を有する他の神経変性疾患（たとえば、アルツハイマー病型の神経変性を伴うパーキンソン病）、並びに神経外胚葉性腫瘍、悪性星状細胞腫、および膠芽細胞腫を意味する。「ヒト個体」とは、あらゆるヒト、または出生前のヒト胚もしくは胎児などの発達形態を意味する。本発明の診断方法は、神経組織の侵入性の除去を必要としない。
【００９２】
　本発明はさらに、光学もしくは電子顕微鏡による組織学、造影、放射性もしくは酵素ベースのアッセイなどを用いて細胞中またはヒト個体の生物学的流体中のＮＴＰの存在を検出するための、核酸ハイブリダイゼーションアッセイおよびイムノアッセイの両アッセイに関する。
【００９３】
ａ．核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
　核酸ハイブリダイゼーションアッセイを用いてＮＴＰについて組織試料を試験するに際して、ＲＮＡの組織からの単離は、クリオスタット上で切片化し、ＳＤＳなどの界面活性剤およびＥＤＴＡなどのキレート化剤を用いて該切片を溶解し、場合によりプロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ）で一夜消化することにより行うことができる。そのような組織は、剖検および生検により得ることができる。好ましい組織量は、１〜１０ｍｇの範囲である。タンパク質をフェノールおよびクロロホルム抽出により取り除き、核酸をエタノールで沈殿させる。オリゴｄＴカラム上でのクロマトグラフィーにかけ、そこから溶出することによってＲＮＡを単離する。当業者によく知られた方法に従い、さらに分画することもできる。
【００９４】
　モレキュラーハイブリダイゼーションのための多くの技術が、組織中のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出のために用いられる。これら技術は、それぞれ利点および欠点を有する。多量の組織が利用できる場合には、ハイブリダイゼーション動力学の分析により、存在するＤＮＡまたはＲＮＡの量を正確に定量し、並びにプローブと同一ではないが密接に関連した配列を識別し、相同性のパーセントを決定する機会が得られる。
【００９５】
　反応は、プローブの再会合の速度が最適となるようなハイブリダイゼーション条件下（温度は２５℃）で行う（ウエットマー（Ｗetmur）ら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.３１：３４９〜３７０（１９６８））。反応の動力学は、組織中の配列がプローブの配列と同一である場合には二次反応である。しかしながら、プローブ配列が組織中の配列と部分的な相同性を有する場合には、反応は複雑な動力学を示す（シャープ（Ｓharp）ら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.８６：７０９〜７２６（１９７４））。
【００９６】
　細胞ＲＮＡに対するプローブの比は、所望の感度により決定する。細胞当たり一つの転写物を検出するには、全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ １μｇ当たり約１００ｐｇのプローブが必要であろう。これら核酸を混合し、変性させ、適当な塩濃度および温度とし、種々の時間ハイブリダイズさせる。再会合の速度は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ブリッテン（Ｂritten）ら、Ｓcience１６１：５２９〜５４０（１９６８））かまたはＳ１ヌクレアーゼ消化（サットン（Ｓutton）、Ｂiochim.Ｂiophys.Ａcta２４０：５２２〜５３１（１９７１））のいずれかによりハイブリダイズしたプローブの量を定量することによって決定することができる。
【００９７】
　もっと順応性のあるハイブリダイゼーション法は、ノーザンブロット法である。この方法は、ハイブリダイゼーション反応の厳格さにおける変化、並びに分析下の試料中のレトロウイルス配列の状態の決定をもたらす。ノーザン分析は、本明細書に記載するようにして行うことができる。
【００９８】
　ＤＮＡまたはＲＮＡ配列のハイブリダイゼーション分析に関連して主として考慮しなければならないのは、研究下の試料中に存在する配列に対してプローブが有する関連性の程度である。このことはブロッティング法では重要である。というのは、ハイブリダイゼーションの非厳格条件下での中程度の配列相同性が、プローブと試料中に存在する配列とが非相同な遺伝子を表す場合においてさえも強いシグナルを生じうるからである。
【００９９】
　特定のハイブリダイゼーション法は本発明にとって本質的なことではなく、当該技術分野で通常用いられるあらゆる方法が本発明の範囲に包含される。典型的なプローブ法はファルコウ（Ｆalkow）らの米国特許第４,３５８,５３５号に記載されている（参照のため本明細書に引用する）。たとえば、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ：１.５Ｍ塩化ナトリウム、０.１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０）、５×デンハルト（１×デンハルト：０.２％ウシ血清アルブミン、０.２％ポリビニルピロリドン、０.０２％フィコール４００）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５％ＳＤＳおよび約１０7ｃｐｍのニックトランスレーションしたＤＮＡを含有する溶液中、６５℃にて１６時間行うことができる。
【０１００】
　上記標識プローブは、組織中のＮＴＰの検出のための一般的な診断法を提供する。この方法は、適度に速く、プロトコールが簡単であり、標準化可能で市販のキットとして提供される試薬を有し、多数の試料の迅速なスクリーニングを可能とする。
【０１０１】
　本手順を行う一つの方法において、ＲＮＡ転写物を含有する臨床単離物を支持体上に固定する。固定された核酸を、該ＮＴＰ遺伝子のコード鎖に相補的または相同な塩基配列を有する標識ポリヌクレオチドと接触させる。
【０１０２】
　本発明のハイブリダイゼーションアッセイは、キットの形態の製造および商品化に特に適している。該キットは、１または２以上のコンテナー手段（バイアル、試験管等）を受け入れるべく密に詰め込まれた担体手段を含み、各担体手段はハイブリダイゼーションアッセイに使用する別々の要素を一つ有する。
【０１０３】
　たとえば、コンテナー手段には、「ニックトランスレーション」（標準的な方法については、たとえば、サンブルックらの上記文献を参照）により標識するのに適したＮＴＰ ｃＤＮＡ分子、または標識したＮＴＰ ｃＤＮＡまたはＲＮＡ分子が含まれていてよい。別のコンテナー手段には、ＤＮＡポリメラーゼＩ／ＤＮＡアーゼおよび非標識のデオキシリボヌクレオチド（すなわち、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＡＴＰ）からなる、ＮＴＰ ｃＤＮＡのニックトランスレーションのための標識溶液が含まれていてよい。
【０１０４】
　ＮＴＰ ＲＮＡの存在は、被験組織中のプローブと関連したＲＮＡの出現および／または量の変化により決定する。
【０１０５】
　この発明のＤＮＡプローブはまた、遺伝性または家族性のアルツハイマー病と非遺伝性または散発性のアルツハイマー病との識別診断にも用いることができる。家族性のアルツハイマー病は、しばしば一層若年の年齢で生じ、家族内のダウン症候群と関連している。それゆえ、家族性のアルツハイマー病の遺伝子試験によって家族の遺伝子カウンセリングが可能となる。家族性のアルツハイマー病の遺伝子マーカーを特徴付けるべく多大の努力がなされているにもかかわらず（グセラ（Ｇusella）、ＦＡＳＥＢ Ｊ３：２０３６〜２０４１（１９８９）；フーパー（Ｈooper）、Ｊ ＮＩＨ Ｒes.４：４８〜５４（１９９２））、遺伝子連鎖分析によっては遺伝子マーカー配列が同定されるのみでゲノム配列の機能に関する知見については得られていない。対照的に、本明細書に記載され散発性アルツハイマー病の個体から得られたｃＤＮＡプローブは既知の機能を有する既知のタンパク質をコードしており、これがアルツハイマー病の患者の脳組織で過剰発現される。
【０１０６】
　アルツハイマー病については家族性の症例も多く記録されてはいるものの（グセラ、上記文献；ハリソンズ・プリンシプルズ・オブ・インターナショナル・メディスン（Ｈarrison's Ｐrinciples of Ｉnternational Ｍedicine）、ブラウンウォルト（Ｂraunwald）ら編、第１１版、マックグロー−ヒル・ブック・カンパニー、ニューヨーク、２０１２〜２０１３頁（１９８７））、ほとんどの症例は散発性であるように思われる。家族性のアルツハイマー病を有する患者は、散発性のアルツハイマー病の患者と違って該疾患にかかりやすくさせる変異を生殖細胞を通じて受け継いでいる。家族性の症例の幾つかは、常染色体の優性遺伝パターンに従うことが示されている（同上）。それゆえ、家族性のアルツハイマー病を有する患者のＤＮＡは、散発性のアルツハイマー病の患者のＤＮＡでは存在しない受け継がれた遺伝子変化を有するであろう。
【０１０７】
　ヒト個体における散発性および家族性のアルツハイマー病の識別法には、アルツハイマー病を有すると思われるヒト個体から生物学的試料を得ることが含まれる。ついで、該生物学試料からＤＮＡを精製する。最後に、得られたＤＮＡをハイブリダイゼーション条件下でＮＴＰ ＤＮＡプローブと接触させる。家族性のアルツハイマー病は該プローブとＤＮＡとのハイブリッド形成の検出によって示され、一方、散発性のアルツハイマー病はハイブリダイゼーションの検出の不在によって示される。
【０１０８】
　たとえば、生物学試料は血液試料であってよく、これを分別遠心分離にかけて回収の３日以内に白血球を富ませる（パーク（Ｐark）、ＰＣＲプロトコールズ（ＰＣＲ Ｐrotocols）、イニス（Ｉnnis）ら編、アカデミックプレス、ニューヨーク、４０７〜４１５頁（１９９０）中の「ＰＣＲ・イン・ザ・ダイアグノーシス・オブ・レチノブラストーマ(ＰＣＲ in the Ｄiagnosis of Ｒetinoblastoma)」）。ＤＮＡ試料の調製は、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム−プロテイナーゼＫ、フェノール、およびＲＮＡアーゼ法（サンブルックら、上記文献）を用いて行うことができる。ＤＮＡ分析は、ＤＮＡ試料（好ましくは５μｇ）を制限エンドヌクレアーゼ（Ｈｉｎｄ IIIなど）で消化することによって行うことができる。ついで、消化したＤＮＡを、好ましくは８９ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、８９ｍＭ硼酸ナトリウムおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液中でアガロースゲル電気泳動（好ましくは１％水平アガロースゲル）を１８時間行うことにより分画する（グセラら、Ｎature ３０６：２３４〜２３８（１９８３））。サザーン分析を常法（サンブルックら、上記文献）を用いて行うことができ、標識したアルツハイマー病のｃＤＮＡプローブを上記条件下でハイブリダイズさせることができる。この識別診断法のために好ましいＤＮＡプローブとしては、１−９ａ、ＡＤ３−４、ＡＤ４−４およびＧ２−２ ＰｓｔＩが挙げられる。
【０１０９】
　ｂ．イムノアッセイ
　本発明に従って、ＮＴＰに対する抗体を用い、ＡＤを検出および診断することができる。また本発明では、免疫組織化学的染色法などの種々の組織学的染色法を用いることもできる。銀染色法もまたＮＴＰを視覚化する方法のひとつである。その他の本発明に有用な染色法は当業者にとって熟知されているものであり、当業者であれば、その定量を適切に行えるであろう［たとえば一般に、「A Textbook of Histology」，ブルーム(Bloom)およびファウセット(Faucett)編,ダブリュー・ビー・ソーンダース(Sounders)・カンパニー，フィラデルフィア（１９６４年）を参照］。
【０１１０】
　得られた化合物がＮＴＰ官能性誘導体であるかどうかを決定するためのスクリーニング法のひとつに、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）法などの、ＮＴＰに対する特異的抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）の産生に基づくイムノアッセイが挙げられる。これらのアッセイ用の生体試料は、静脈穿刺（血液）、脊髄穿刺（大脳脊髄液（ＣＳＦ))、尿およびその他の分泌液（汗および涙など）から得られる。たとえば、ＲＩＡの一形態においては、放射標識された抗原の存在下、試験に付す物質を希釈した抗血清と混合する。この方法においては、試験物質の濃度は、特異的抗体に結合した放射標識抗原の量に反比例し、遊離の放射標識抗原の量に直線的に比例する。当業者であれば、その他の適当なスクリーニング法を容易に想像しうるであろう。
　また本発明は、標本または検体中のＮＴＰまたはその官能性誘導体の検出方法に関する。ＮＴＰまたはその官能性誘導体に対する特異的抗体を検出可能にするために、たとえば放射性同位体、酵素、蛍光標識、常磁性標識またはフリーラジカルなどの適当なマーカーで標識することができる。
【０１１１】
　別法として、イムノポリメラーゼ鎖反応の技術によって、ＮＴＰまたはその官能性誘導体に対する特異的抗体をＤＮＡで標識してもよい［サノ(Sano)らのScience, ２５８：１２０〜１２２（１９９２年）］。該ポリメラーゼ鎖（ＰＣＲ）操作では、変性、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによる該プライマーの伸長などの一連の手順を通して特異的核酸配列が増幅される［たとえば、ミュリス(Mullis)らの米国特許第４６８３２０２号；ミュリスらの米国特許第４６８３１９５号；ロー(Loh)らのScience, ２４３：２１７（１９８８年）を参照］。このようなステップを何回も繰り返し、オリジナルの特異的配列のコピーである多量の増幅物が得られる。ひとつのＤＮＡ配列のシングルコピー程度の配列を増幅して何百という数のナノグラム産物を得ることができる［リー(Li)らのNature,３３５：４１４（１９８８年）］。その他の公知の核酸増幅操作としては、転写に基づく増幅システム［クゥオー(Kwoh)らのProc. Natl. Acad. Sci. USA, ８６：１１７３(１９８９年)；ジンゲラス(Gingeras)らのＷＯ８８／１０３１５］、および得られる“ジオリゴヌクレオチド”の配列を有する核酸標的の存在下に２つ（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドを連結し、それによって該ジオリゴヌクレオチドを増幅するという“リガーゼ鎖反応”が挙げられる［ウー(Wo)らのGenomics, ４：５６０（１９８９年）；バックマン(Backman)らのＥＰ３２０３０８；ウォーレス(Wallace)のＥＰ３３６７３１；オーゲル(Orgel)のＷＯ８９／０９８３５］。たとえば、様々な量の試験物質をマイクロタイターウエルの表面に固定化して該イムノＰＣＲアッセイを行うことができる［サンゾらの前記文献の１２２頁脚注７を参照］。次いでＮＴＰモノクローナル抗体を加えて該ウエルをインキュベートし、洗浄し、さらにストレプトアビジン−タンパク質キメラに複合したビオチン化ＮＴＰ ＤＮＡ分子を加えてインキュベートする［同上文献］。このキメラはストレプトアビジン部分を介してビオチンに結合し、タンパク質Ａ部分を介して免疫グロブリンＧ分子のＦc部に結合する［同上文献の１２２頁；サンゾらのBio/Technology, ９：１３７８（１９９１年）］。次いでウエルを洗浄して非結合複合体を除去する。試験物質中に存在する幾らかのＮＴＰに、ＮＴＰモノクローナル抗体が結合し、さらにビオチン化ＮＴＰ ＤＮＡ−ストレプトアビジン−タンパク質Ａ複合体のタンパク質Ａ部分が結合する。次いでＰＣＲによって該ＮＴＰ ＤＮＡ配列を増幅する。簡単にいうと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸塩、ＮＴＰオリゴヌクレオチドプライマーおよびＴaqＤＮＡポリメラーゼを加えたマイクロタイターウエルをインキュベートするということである［サンゾらの同上文献の１２２頁脚注１１を参照］。自動熱循環器（ＰＴＣ−１００−９６Thermal Cycler,ＭＪ・リサーチ・インコーポレイテッド製など）を用いて標準的条件下でＰＣＲを行うことができる［同上文献］。次いで臭化エチジウムで染色した後、アガロースゲル電気泳動法でＰＣＲ産物を分析する。
【０１１２】
　このような検出可能に標識された抗体またはその官能性誘導体を製造し、検出する方法は、当業者には公知であり、下記文献に記載されている。免疫学の一般的原理について述べている標準的参考文献として、クレイン(Klein)の「免疫学：自己−非自己の識別」，ジョン・ウイリー・アンド・サンズ，ニューヨーク（１９８２年）；ケネット(Kennett)らの「モノクローナル抗体とハイブリドーマ:生物学的分析の新次元」, プレナム・プレス, ニューヨーク(１９８０年);キャンベル(Campbell)の"モノクローナル抗体テクノロジー", 「生化学と分子生物学における実験室テクニック」,１３巻(バードン(Burdon,R.)ら編)，エルセビア，アムステルダム（１９８４年）中；およびエイゼン（Eisen）の「マイクロバイオロジー」, 第３版, デービス(Davis)ら, ハーパー・アンド・ロウ, フィラデルフィア（１９８０年）が挙げられる。
【０１１３】
　語句「抗体」とは、実質的にホモ集団であるモノクローナル抗体およびヘテロ集団であるポリクローナル抗体の両方を意味する。ポリクローナル抗体は抗原で免疫感作した動物の血清から誘導される。特異的抗原に対するモノクローナル抗体（mＡbs）は、当業者に公知の方法で得ることができる。たとえば、ケーラー(Kohler)およびミルシュタイン(Milstein)のNature, ２５６：４９５〜４９７（１９７５年）および米国特許第４３７６１１０号を参照。このような抗体は、ＩgＧ，ＩgＭ，ＩgＥ，ＩgＡ，ＩgＤおよびそれらのサブクラスなどからなる免疫グロブリンクラスのいずれかに属する。
【０１１４】
　本発明に用いたモノクローナル抗体、特にmＡbs Ｔh７，Ｔh９およびＴh１０は、下記文献の記載に従って製造することができる［グロス(Gross)らのJ. Clin. Invest., ７６：２１１５〜２１２６（１９８５年）；オツーク(Otzturk)らのProc. Natl. Acad. Sci. USA, ８６：４１９〜４２３（１９８９年）；デラモンテ（de la Monte）らのJ. Clin. Invest., ８６：１００４〜１０１３（１９９０年）；デラモンテらのJ. Neurol. Sci., １１３：１５２〜１６４（１９９２年）；デラモンテらのAnn. Neurol., ３２：７３３〜７４２（１９９２年）］。Ｔhモノクローナル抗体は、精製すい臓型糸状タンパク質に対して産生された［同上文献］。ＮＴＰ特異的ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を、組換え宿主から単離された実質的に純粋なＮＴＰに対して産生させることもできる［たとえば、キャロル(Carroll)らの"β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質の外来セグメントに対するポリクローナル抗体の産生と精製", 「ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ」，ＩＩＩ巻，ＩＲＬ・プレス，ワシントンＤＣ，８９〜１１１ｐｐ（１９８７年）；モール(Mole)らの"大腸菌で産生された融合タンパク質に対するモノクローナル抗体の産生"，「ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ」，ＩＩＩ巻，ＩＲＬ・プレス，ワシントンＤＣ，１１３〜１１３９ｐｐ（１９８７年）」を参照］。別法として、ＮＴＰ特異的ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を、公知の技術を用いて、脳組織および細胞系などの生体物質から単離された実質的に純粋なＮＴＰに対して産生することができる。
【０１１５】
　たとえば、分子量がおよそ８，１４，１７，２１，２６kＤaおよび４２kＤaである種々のＮＴＰ分子に対して特異的なモノクローナル抗体を、組換え誘導タンパク質から製造してもよく、それらはcＤＮＡ（すなわち１−９a）、ゲノムクローン（Ｇ２−２ ＰstＩ）およびＡＤ−ＮＴＰ３−４cＤＮＡクローンから発現、単離および精製される。これらのＮＴＰ分子を、上記cＤＮＡおよびゲノムクローンから誘導し、挿入し、適当な発現ベクター中で製造する（図２Ａおよび図２Ｂを参照）。１−９aＮＴＰおよびＰＴＰの５'末端において、６０〜７０％相同である領域が存在するので、ＮＴＰ組換えタンパク質に特異的に結合し、すい臓型タンパク質に結合しないモノクローナル抗体を、通例の分画スクリーニングを行うことによって得ることができる［デラモンテらのJ. Clin. Invest., ８６：１００４〜１０１３（１９９０年）を参照］。ＮＴＰおよびＰＴＰの両方に結合するモノクローナル抗体が存在する可能性はあるけれども、種々の形体のＮＴＰ分子（たとえば８，１４，１７，２１，２６および４２kＤa）の間には実質的配列分化があり、エピトープは僅か６〜８アミノ酸によって決定されるため、ＮＴＰ特異的モノクローナル抗体を生産することは可能である。
【０１１６】
　また語句「抗体」は、完全分子およびそれらのフラグメント（断片）、たとえばＦabおよびＦ(ab')2などの両方を包含し、それらは抗原に結合可能である。ＦabおよびＦ(ab')2フラグメントは、完全分子からＦcフラグメントを除いたものであり、より速やかに循環から除去され、完全分子よりも非特異的組織結合性が弱い［ワール(Wahl)らのJ. Nucl.Med., ２４：３１６〜３２５（１９８３年）］。
　ＡＤを検出および診断するために、本明細書に記載の方法に従って、完全抗体を用いる場合と同様な方法で、本発明に有用なＦabおよびＦ(ab')2および抗体の他のフラグメントを用いてＮＴＰを検出および定量しうることが認められるであろう。このようなフラグメントを生産する代表的な方法は、タンパク質分解的切断であり、パパイン（Ｆabフラグメントが生じる）あるいはペプシン（Ｆ(ab')2フラグメントが生じる）などの酵素を使用する。
【０１１７】
　抗体が、ある分子と特異的に反応して該分子を抗体に結合することが可能であるならば、その抗体はその分子に対して“結合可能”であるという。語句「エピトープ」とは、その分子において、抗体が結合することが可能かつ抗体が認識しうる部分を意味する。エピトープ決定基は通常、分子の化学的に活性な表面存在基（アミノ酸または糖側鎖など）からなり、特殊な３次元構造および特殊な荷電特性を有している。
【０１１８】
　「抗原」とは、抗体が結合可能な分子であり、さらに言えば、動物において抗原のエピトープを結合しうる抗体の産生を誘発しうるものである。抗原は１つあるいはそれ以上のエピトープを有する。これまでに述べた「特異的反応」とは、抗原が、高度な選択性のもとにその対応する抗体と反応し、他の抗原によって産生を喚起される多数の他の抗体とは反応しないことを意味する。
【０１１９】
　本発明に有用な抗体あるいは抗体フラグメントを用いて、ＮＴＰ抗原を含む細胞の存在を定量的または定性的に検出することができる。したがって、本発明に有用な抗体あるいは抗体フラグメントを組織学に応用して、ＮＴＰの存在を検出または視覚化することができる。
【０１２０】
　このようなＮＴＰ検出アッセイは、通例、ＮＴＰを同定することができる検出可能に標識された結合分子（たとえば抗体）の存在下、ＮＴＰが存在する状態にあるとの疑いのある検体からの生体試料をインキュベートし、試料に結合する該結合分子を検出することから構成される。
【０１２１】
　したがって、本発明のこの態様においては、まず生体試料をニトロセルロース、または細胞，細胞粒子または可溶性タンパク質を固定しうるような他の固相支持体で処理する。次いで該支持体を適当な緩衝液で洗浄し、次いで検出可能に標識されたＮＴＰ特異的抗体で処理する。次いで固相支持体を緩衝液でもう一度洗浄して非結合の抗体を除去する。次いで支持体担体上に結合した標識の量を常套の手段で検出する。
【０１２２】
　「固相支持体」は、抗原または抗体を結合することができる支持体ならばどのようなものでもよい。公知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトなどが挙げられる。該担体の性質は、本発明の目的のために、ある程度までの可溶性であってもよいし、または不溶性であってもよい。支持体物質は、結合した分子が抗原または抗体に結合可能である限り、実際どのような構造的形状であってもよい。したがって、支持体の形状は、ビーズのような球体、試験管の内側表面またはロッドの外側表面などの円筒体であってよい。また、シート状、試験片などの平面であってもよい。好ましい支持体はポリスチレンビーズである。当業者ならば、モノクローナル抗体または抗原を結合するための適当な担体をその他に数多く想当し、通例の実験を行うことができよう。
【０１２３】
　ＮＴＰを含む生体試料における本発明の診断アッセイのひとつの具体例は、
　（ａ）検出可能に標識されたＮＴＰ特異的抗体を固相支持体と接触させて該ＮＴＰ特異的抗体またはそのフラグメントの固定化を行い；
　（ｂ）ＮＴＰを含む疑いのある試料を該固相支持体と接触させ；
　（ｃ）該検出可能に標識されたＮＴＰ特異的抗体を該支持体とともに、固定化されたＮＴＰ特異的抗体がＮＴＰに結合するに十分な時間インキュベートし；
　（ｄ）ステップ（工程）ｃで得られたインキュベーション混合物から固相支持体を分離し；および
　（ｅ）結合した標識を検出し、それによってＮＴＰを検出し、定量すること
からなる。
【０１２４】
　別法として、試料中の標識ＮＴＰ特異的抗体／ＮＴＰ複合体を、免疫グロブリンに対して特異的な固定化抗体またはタンパク質（たとえばスタフィロコッカス・タンパク質Ａ、スタフィロコッカス・タンパク質Ｇ、抗ＩgＭまたは抗ＩgＧ抗体など）と接触させることによって反応混合物から分離してもよい。このような抗免疫グロブリン抗体はポリクローナルであるが、モノクローナル抗体が好ましい。次いで固相支持体を適当な緩衝液で洗浄して、固定化ＮＴＰ／標識ＮＴＰ特異的抗体複合体を得る。次いで標識を検出してＮＴＰの測定を行うことができる。
【０１２５】
　この態様における本発明は、
　（ａ）ＮＴＰを含む疑いのある試料を、ＮＴＰに結合するＮＴＰ特異的抗体またはそのフラグメントと接触させ；および
　（ｂ）複合体が形成されるかどうかを検出すること
からなる試料中のＮＴＰまたはそのフラグメントの検出法に関する。
【０１２６】
　本発明は、さらに
　（ｃ）ステップａで得られた混合物を、固相支持体上に固定化されている、ＮＴＰ特異的抗体に特異的な抗体であるスタフィロコッカス・タンパク質Ａまたはスタフィロコッカ・スタンパク質ＧなどのＦc結合分子と接触させ、抗体複合体に固定化されたＮＴＰ／ＮＴＰ特異的抗体を得；
　（ｄ）ステップｃで得られた固相支持体を洗浄して非結合のＮＴＰ／ＮＴＰ特異的抗体複合体を除去し；および
　（ｅ）該固相支持体に結合した標識を検出すること
からなる試料中のＮＴＰの検出法に関する。
【０１２７】
　もちろん、検出可能に標識された抗体およびＮＴＰの特定の濃度、インキュベーションの温度と時間、およびその他のアッセイ条件は、試料中のＮＴＰの濃度、試料の性質などの種々の因子に応じて変化させてよい。得られたロットの結合活性は公知の方法に従って決定する。当業者ならば、通例の実験を行って各測定に対する有効な最適アッセイ条件を決定することができよう。
【０１２８】
　通例に従って、あるいは個々の状況に必要な場合、洗浄、撹拌、振とう、濾過などのその他のこのようなステップを該アッセイに付加することができる。
【０１２９】
　ＮＴＰ特異的抗体を検出可能になるように標識しうる方法のひとつは、該抗体を酵素に結合することである。この酵素は、後でその基質に触れさせたときに、該基質と反応して、分光光度法、蛍光法または視覚的手段などによって検出しうる化学的部位となる。ＮＴＰ特異的抗体を検出可能に標識するのに用いる酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１３０】
　検出は、色々なイムノアッセイのどれかを用いて行う。たとえばＮＴＰ特異的抗体または抗体フラグメントを放射標識することによって、ラジオイムノアッセイ法を用いてＮＴＰを検出することが可能となる。ラジオイムノアッセイに関しては、ワーク（Work）らの「分子生物学における実験技術および生化学」，ノース・ホランド・パブリッシング・カンパニー，ニューヨーク（１９７８年）、特にチャード（Chard）による“ラジオイムノアッセイおよび関連技術入門”と題する章に、優れた記載がある。この文献は本明細書の参考文献である。
【０１３１】
　放射性同位体は、ガンマ線カウンターまたはシンチレーションカウンターなどの手段またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。本発明の目的に特に有用な同位体は、3Ｈ，125Ｉ，131Ｉ，35Ｓ，14Ｃであり、125Ｉが好ましい。
【０１３２】
　蛍光化合物でＮＴＰ特異的抗体を標識することもできる。蛍光標識した抗体を適当な波長の光を照射すると、蛍光を発するのでその存在を検出することができる。最も一般的に用いられる蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレサミンである。
【０１３３】
　125Ｅｕまたは他のランタニド系列の金属などの蛍光発光金属を用いてＮＴＰ特異的抗体を検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を用いてＮＴＰ特異的抗体に付加することができる。
【０１３４】
　化学発光化合物にカップリングさせることによってＮＴＰ特異的抗体を検出可能に標識することもできる。次いで化学反応中に発生する発光の存在を検出することによって、化学発光化合物付加ＮＴＰ特異的抗体の存在を測定する。特に有用な化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、セロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキサレートエステルが挙げられる。
【０１３５】
　ビオチンでＮＴＰ特異的抗体を標識し、次いでアビジンと反応させてもよい。ビオチン標識ＤＮＡフラグメントは、アビジンブリッジを介してＮＴＰビオチン化モノクローナル抗体に結合する。次いで特定のプライマーを用いたＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を行い、ＮＴＰ分子を検出する[サノらのScience, ２５８:１２０〜１２２（１９９２年）］。
【０１３６】
　同様に、生物発光化合物を用いて、本発明のＮＴＰ特異的抗体を標識してもよい。生物発光は、生物に発見された化学発光のひとつであり、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める。発光の存在を検出することによって、生物発光タンパク質の存在を測定する。標識するという目的にとって重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびアクオリンである。
【０１３７】
　たとえば検出可能な標識がガンマ線放出ならばシンチレーションカウンターを用い、または該標識が蛍光物質ならばフルオロメーターを用いてＮＴＰ特異的抗体の検出を行ってもよい。酵素標識の場合、その酵素に対する基質を用いる比色法によって検出を行うことができる。同様に調製した標準と基質との酵素反応の範囲を視覚的に比較することによって検出を行ってもよい。
【０１３８】
　このような検出可能に標識された抗体の分布の中心を検出することは、前述の疾患または機能不全状態の指標となる。本発明アッセイによって、生体試料中に存在するＮＴＰを検出することができる。ＮＴＰを含むどのような試料でも使用することができる。しかし、本発明診断法の利点のひとつは、組織切除などの組織の損傷を与えることなく診断しうることである。それゆえに、試料は、大脳髄液、羊水、血液、血清および尿などの体液であることが好ましい。しかし、本発明は、これらの試料を用いたアッセイに限定されるものではなく、当業者であれば、他の試料を用いうるような適当な条件を決定することが可能である。
【０１３９】
　たとえば、３部位のモノクローナル抗体イムノラジオメトリックアッセイ（monoclonal antibody-based immunoradiometric assays:Ｍ−ＩＲＭＡ）を用いて体液（ＣＳＦなど）のＮＴＰ濃度を測定してもよい。ＡＤの疑いがある個体から通例の方法に基づいた髄液穿刺によってＣＳＦを得ることができる。したがって、この非侵入性イムノアッセイによってＡＤの診断を簡単に行うことでき、ＡＤ患者のＮＴＰ濃度が正常者のものよりも非常に高いことが示される。
【０１４０】
　上記具体例では、体液試料を取り出し、該試料を検出可能に標識された抗体（または抗体フラグメント）の存在下でインキュベートすることによってＡＤ検査が行われる。この技術が、磁気造影、フルオログラフィーなどの非侵入性の方法で行われるのが好ましい。
【０１４１】
　標識抗体（または抗体フラグメント）を被験者に投与するインビボ造影技術を用いてＮＴＰを有する細胞の検出を行い、あらかじめ組織試料を取り出すことなくＮＴＰの存在を検出するのが好ましい。このようなインビボ検出操作は、他の検出方法よりも侵入性が少ないという利点を持ち、さらに、脳組織などの容易に患者から取り出せない組織注のＮＴＰの存在を検出することができる。
【０１４２】
　ＡＤ患者では脳全体からＮＴＰが検出されるが、脳腫瘍の場合は分散した沈着物中にＮＴＰが局在するので、インビボ造影技術を用いてＡＤと脳腫瘍を区別することができる。たとえば、ＡＤ患者の脳では、ＮＴＰは側頭皮質、頭頂皮質および前頭皮質、ならびに扁桃体および海馬において発見される。星状細胞腫が発生しやすい部位は、小脳、視床、視神経交叉および脳橋［ペテルスドルフ(Petersdorf)らの「Harrison's Principles of Internal Medicine」, 第１０版, マックグロー−ヒル・ブック・カンパニー，ニューヨーク，ｐ２０７６（１９８３年）］および多形グリア芽腫は、主として大脳に局在する［同上文献，ｐ２０７５］。
【０１４３】
　当業者には公知のインビボ標識およ標識方法は多数ある。本発明に用い得る標識の例としては、放射性同位体および常磁性同位体が挙げられる。当業者であれば、本発明に用いた抗体を結合するための他の適当な標識を承知しているか、あるいは通例の実験法を用いてそれらを確認しえるであろう。さらに、これらの標識の抗体への結合は、当業者には一般的である標準の技術を用いて行うことができる。
【０１４４】
　インビボ診断用の放射性核種を選択する際の重要な因子は、放射性核種の半減期が、標的による最大アップテイク時にまだ検出可能である程度には長く、一方宿主に対する有害な放射線を最小にするために充分短いことである。インビボ造影に用いる放射性核種は、粒子は放射しないが、常套のガンマ線カメラで容易に検出しうるような１４０〜２００keＶの範囲の多数の光子を放出するものが理想的である。
【０１４５】
　インビボ診断を行うために、放射性核種を抗体に直接的または仲介官能基を用いて間接的に結合する。金属イオンとして存在する放射性同位体の結合にしばしば用いられる仲介官能基は、ＤＴＰＡおよびＥＤＴＡである。免疫グロブリンに結合しうるイオンの典型例は99mＴｃ， 123Ｉ， 111Ｉｎ， 131Ｉ， 97Ｒｕ， 67Ｃｕ, 67Ｇａ， 125Ｉ， 68Ｇａ， 72Ａｓ， 89Ｚｒおよび201Ｔｌである。
【０１４６】
　診断用インビボ造影をするために、利用できる検出装置の型が、放射性核種の選択における主要な因子となる。選択する放射性核種は、その検出装置で検出可能なタイプの崩壊をするものでなければならない。診断用造影を視覚化する常套の方法は概していずれも本発明に利用することができる。たとえば、ＰＥＴ，ガンマ，ベータおよびＭＲＩ検出器を用いて診断用造影を視覚化することができる。
　インビボ診断を行うために、本発明に有用な抗体を常磁性同位体で標識することもできる。磁気共鳴造影（ＭＲＩ）において特に有用な元素は、157Ｇｄ，55Ｍｎ，162Ｄｙおよび56Ｆｅである。
【０１４７】
　本発明に有用な抗体（または抗体フラグメント）は、身体組織、体液（ＣＳＦなど）あるいは細胞抽出液中のＮＴＰの存在を検出するインビトロイムノアッセイにも特に適している。このようなイムノアッセイにおいては、抗体（または抗体フラグメント）は液相で、あるいは好ましくは前述した固相担体に結合させて用いることができる。
【０１４８】
　当業者であれば、本発明に従って、他の利用しうる適当な標識について理解できよう。当業者には公知の標準的技術を用いて、これらの標識を抗体あるいは抗体フラグメントへ結合することができる。代表的な技術は、ケネディー（Kennedy）らのClin. Chim. Acta,７０：１〜３１（１９７６年）およびスカース(Schurs)らのClin.Chim.Acta,８１：１〜４０（１９７７年）に記載されている。後者に開示されたカップリング技術は、グルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法である。すべての方法は本明細書において参考とされる。
【０１４９】
　患者の組織学的標本を切除し、本発明の標識抗体を組み合わせて該標本に適用し、インシトゥ検出を行ってもよい。標識抗体（またはフラグメント）を生体試料に塗布するかまたは抗体で試料を被覆することによって適用するのが好ましい。このような操作を行うことによって、ＮＴＰの存在ばかりでなく、被検組織におけるＮＴＰの分布状態も測定することができる。当業者であれば、多種多様な組織学的方法（染色法など）のいずれの方法でも、適当な変更を加えることにより、本発明インシトゥ検出に適用できることが容易に理解されよう。
【０１５０】
　本発明の結合分子を、“ツーサイト”または“サンドイッチ”アッセイとしても知られる免疫測定アッセイにおいて利用してもよい。典型的な免疫測定アッセイにおいては、ある量の非標識抗体（または抗体フラグメント）を被検液体（ＣＳＦなど）に不溶である固相支持体に結合し、ある量の検出可能に標識された可溶性抗体を加え、固相抗体、抗原および標識抗体の間で形成された３成分複合体を検出および／または定量する。
【０１５１】
　代表的かつ好ましい免疫測定アッセイは、固相に結合した抗体が最初に被検試料と接触し、固相抗体−抗原からなる２成分複合体を形成することによって該試料から抗原を抽出する“前進(forward)”アッセイである。適当な時間インキュベーションを行った後、該固相支持体を洗浄して未反応の抗原（もし存在するなら）を含む液体試料の残りを除去し、次いで未知量の標識抗体（“リポーター分子”として機能する）を含む溶液と接触させる。第２のインキュベーションを行って標識抗体を、非標識抗体を介して固相支持体に結合した抗原と複合させた後、固相支持体に第２の洗浄を行い、未反応の標識抗体を除去する。このタイプの前進サンドイッチアッセイは、抗原が存在するかどうかを測定する単純な"イエス/ノー"アッセイであるかまたは標識抗体の測定結果を、既知量の抗原を含む標準試料から得られた結果と比較して定量を行うものである。このような“ツーサイト”または“サンドイッチ”アッセイは、ワイド(Wide)によって「ラジオイムノアッセイ法」，カーカム(Kirkham)およびハンター(Hunter)編, イー・アンド・エス・リビングストーン，エジンバラ（１９７０年）のｐ１９９〜２０６に記載されている。
【０１５２】
　これもまた本発明の抗原に使用しうる、別のタイプの“サンドイッチ”アッセイにおいては、いわゆる“同時（simultaneous）”および“逆行(reverse)”アッセイが用いられる。同時アッセイは、固相支持体に結合した抗体と標識抗体の両方を被検試料に同時に加えるという一回のインキュベーションステップからなる。インキュベーション完了後、固相支持体洗浄して液体試料の残りおよび未複合の標識抗体を除去する。次いで固相支持体に会合した標識抗体の存在を常套の“前進”サンドイッチアッセイで測定する。
【０１５３】
　“逆行”アッセイにおいては、最初、液体試料に標識抗体の溶液を段階的に加え、次いで適当な時間インキュベーションを行った後、固相支持体に結合した非標識抗体を加える。第２のインキュベーション後、固相を常套の方法で洗浄して被検試料の残りおよび未反応の標識抗体を除去する。次いで固相支持体に会合した標識抗体の定量を“同時”および“前進”アッセイで行う。
【０１５４】
　これまでに述べたインビトロまたはインビボ検出法を用いて組織を切除せずにＡＤを検出および診断することができる。このような検出法を用い、生体試料中のＮＴＰの濃度を算定し、比較することは、ＡＤにおける神経学的退行の測定の援助となる。
【０１５５】
　診断試薬（抗体または抗体フラグメントなど）の有効量とは、所望の区別が得られる診断結果に到達する量であり、患者の年令、健康状態、性別、疾患の程度、もしあれば対立指標、および医師によって判断されるべきその他の変数などの因子に応じて変化するものである。診断試験において代表的に使用される量は、一般的に０.１〜５mg、好ましくは０.１〜０.５mgである。
【０１５６】
　本発明のアッセイは、キットの製造にも適する。このようなキットは、閉じた境界内に受容するように仕切りをつけた担体手段、およびバイアル、チューブなどのひとつ以上のコンテナ手段からなり、該コンテナ手段にはそれぞれ別のイムノアッセイ成分が含まれる。
【０１５７】
　たとえば、固相支持体に固定化された第１の抗体の入ったコンテナ手段、および溶液中に第２の検出可能に標識された抗体の入った次のコンテナ手段である。さらなるコンテナ手段には検出されるべきＮＴＰの濃度連続希釈液を含む標準溶液を入れる。ＮＴＰの標準溶液を用いて、横座標にＮＴＰ濃度をプロットし、縦座標に検出シグナルをプロットして標準曲線を作成する。ＮＴＰ含有試料から得られた結果は、標準曲線から内挿法によってＮＴＰ濃度を算出する。
【０１５８】
ＩＶ．ＮＴＰの分離
　本発明のＮＴＰタンパク質または断片は、既述の組換えＤＮＡからの発現によって得ることができる。あるいはまた、ＮＴＰは生物材料から精製することができる。
【０１５９】
　本発明の目的において、以下の工程からなる精製法を例示するが、これに制限されるものではない。
【０１６０】
　ＮＴＰ精製の最初の工程には、尿素、ギ酸、界面活性剤、もしくはチオシアネートの様な可溶化剤を含むかまたは含まない緩衝液中で、脳組織もしくはＣＳＦの様な生物試料からＮＴＰ分画を抽出することが含まれる。
【０１６１】
　第二の工程には、可溶化物質をＭｏｎｏ−ＱまたはＭｏｎｏ−Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）イオン交換クロマトグラフィーにかけることが含まれる。同様に、可溶化物質は、分子を例えば荷電密度、荷電分布、および分子サイズに応じて分離することができるいかなる他の方法によっても分離することができる。イオン交換樹脂からのＮＴＰの溶離は、Ｍ−ＩＲＭＡの様なイムノアッセイによって各分画ごとにモニターする。次いで免疫反応のピークを透析し、凍結乾燥し、分子ふるいもしくはゲルクロマトグラフィーにかけることになろう。
【０１６２】
　分子ふるいまたはゲルクロマトグラフィーは、分子サイズに基づいて分離を行う分別クロマトグラフィーの１種である。この種の分離には通常、デキストラン、ポリアクリルアミド、およびアガロースゲルを用いる。本発明において有用なゲルは、セファロース １２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）である。しかし、当業者に知られた他の方法を用いてサイズに基づいて効率的に分子を分離することができる。
【０１６３】
　ＮＴＰの精製プロトコールにおける第四の工程には、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による免疫反応性ピークの分析、さらなるゲルクロマトグラフィーによる精製工程、および例えば銀染色の様な染色が含まれる。
【０１６４】
　精製法の第五工程には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に得られるＮＴＰをアフィニティークロマトグラフィーか、または分離される物質とこの物質が特異的に結合することができる分子の親和性に基づく他の何らかの方法にかけることが含まれる。ＮＴＰをさらに精製するためには、抗ＮＴＰ ｍＡｂｓ（Ｔｈ９または実質的に純粋なＮＴＰに対して生じたｍＡＢｓのような）が結合したセファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。逆相ＨＰＬＣの様な別の方法、または良好なピーク解像度を有する急速分離を特徴とする他の方法が有用である。
【０１６５】
　ＮＴＰを精製するための別の方法では、ＡＤ患者から得られた濃縮ＣＳＦを使用することができる。この方法では、凍結乾燥またはＡｍｉｃｏｎ濾過などによって３０〜４０ｍＬに濃縮し、二次元ゲル電気泳動にかける。タンパク質をｐＨグラジエント中で荷電によって一方向に分離し、次いで他の方向のポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子ふるいクロマトグラフィーにかける。ＮＴＰ免疫反応性断片はウエスタンブロット分析を用いるＴｈモノクローナル抗体（例えばＴｈ９）によって、スポットとして確認される。ゲルを切り出し、ゲルからＮＴＰタンパク質を溶離する。この方法で精製されるＮＴＰは、配列を調べるか、または新しいモノクローナル抗体を作製するために使用することができる。
【０１６６】
　上記の好ましい方法の代わりに他の精製工程も使用し得ることは理解できよう。当業者は過度の実験を行うことなくこれに代わる精製工程を工夫することができよう。
【０１６７】
Ｖ．アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムを用いる遺伝子治療
　アンチセンスオリゴヌクレオチドは、原核生物（Ｍｉｚｕｎｏらの、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１９６６−１９７０（１９８４））ならびに真核生物（Ｈｅｙｗｏｏｄの、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：６７７１−６７７２（１９８６））において、遺伝子発現を抑える天然の生物学的阻害剤であると記載されて来た。おそらく、これらの配列は相補的なｍＲＮＡ配列とハイブリダイズすることによって機能し、翻訳のハイブリダイゼーション停止をもたらす（Ｐａｔｅｒｓｏｎらの、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：４３７０−４３７４（１９８７））。
【０１６８】
　アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子またはＲＮＡメッセージと相補的となるように製造された短い合成ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド分子である。標的とするＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列に対するこれらのオリゴマーの結合によって、当該遺伝子の転写または翻訳を選択的に阻害することができ、当該遺伝子によって生じた疾患の過程を停止させることができる（例えば、Ｊａｃｋ　Ｃｏｈｅｎの、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと）。ｍＲＮＡの細胞質における局在は、細胞に入り込むアンチセンスオリゴヌクレオチドに容易に接近できると思われる標的を提供するため、当該分野の多くの研究が標的となるＲＮＡに絞られてきている。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、インビトロおよび細胞培養における遺伝子発現の調節を研究するための有用な手段となる（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇらの、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８１：１５３９−１５４４（１９８９））。
【０１６９】
　アンチセンス治療とは、細胞内に局在する標的ポリヌクレオチドに結合する外因性オリゴヌクレオチドを投与することである。例えば、抗癌療法において、アンチセンスオリゴヌクレオチドを全身的に投与することができる（Ｓｍｉｔｈの、国際出願公開番号ＷＯ９０／０９１８０）。本明細書に記載したごとく、ＮＴＰ関連タンパク質は神経外胚葉腫瘍細胞、悪性アストロサイトーマ細胞ならびにグリオブラストーマ細胞によって産生され、またＡＤ患者の脳組織中に比較的高濃度（すなわち、対照に比較して）に産生される。したがって、本発明のＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、神経外胚葉腫瘍、悪性アストロサイトーマならびにグリオブラストーマ、およびＡＤに対する治療において活性を持ち得る。　本発明のＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドには、Ｓ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ、既述のＪａｃｋ　Ｃｏｈｅｎを参照のこと）の様な誘導体が含まれる。Ｓ−オリゴ（ヌクレオシドホスホロチオエート）は、リン酸基の架橋していない酸素原子が硫黄原子で置き換えられているオリコヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電性類似体である。本発明のＳ−オリゴは、対応するＯ−オリゴを硫黄伝達試薬である３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドで処理することによって製造することができる。Ｉｙｅｒらの、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３−４６９８（１９９０）、およびＩｙｅｒらの、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：１２５３−１２５４（１９９０）を参照のこと（これらの開示は本明細書の一部を構成する）。
【０１７０】
　本明細書に示すＮＴＰｃＤＮＡクローンの配列分析が示すように、ＮＴＰはＰＴＰ ＤＮＡ配列と相同性でない配列を含んでいる（図９を参照のこと）。したがって、本発明のＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＴＰに特異的なそのような配列と相補的で、またそのような配列と安定してハイブリダイズするＲＮＡおよびＤＮＡであろう。ＰＴＰを特定するｍＲＮＡとはハイブリダイズせずＮＴＰｍＲＮＡと選択的にハイブリダイズするために、この領域に相補的なオリゴヌクレオチドを使用することができる。好ましくは、本発明のＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは：
　１．　５’−ＣＣＧＡＴＴＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＴ−３’［配列番号：１］、
　２．　５’−ＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣ−３’［配列番号：２］、
　３．  ５’−ＣＣＡＡＡＣＣＧＡＴＴＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣ−３’［配列番号：３］、および
の様なＡＤ３−４ｃＤＮＡの非相同性配列をコードするアンチセンスＤＮＡ分子の１５〜３０量体断片である。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド（３０量体）の例には：
　１．　５’−ＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＣＡＴＣＴＣ−３’［配列番号：４］、
　２．　５’−ＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＧＣＧ−３’［配列番号：５］、および
　３．  ５’−ＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡ−３’［配列番号：６］
が含まれる。
【０１７１】
　本発明には、本発明の少なくとも１種類のＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量と医薬的に許容される担体との組み合せからなる医薬組成物も同様に含まれる。１つの態様として、単一のＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する。別の態様として、ＮＴＰゲノムの近傍領域に相補的な２種類のＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する。当該ゲノムの近傍領域に相補的な２種類のＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはそれに対応するｍＲＮＡを投与して、ＮＴＰゲノムの転写もしくはｍＲＮＡの翻訳をより効率的に阻害し、ＮＴＰ産生をより効果的に阻害することができるであろう。
【０１７２】
　ＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを、アンチセンス分子の細胞への取り込みを増強する薬剤と共に投与することが好ましい。例えば、ＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを、リポソームの形であってもよい脂肪親和性のカチオン化合物と組み合わせることができる。細胞内にヌクレオチドを導入するためのリポソームの使用については、例えば米国特許番号４，８９７，３５５および４，３９４，４４８に示されている（これらの開示は本明細書の一部を構成する）。生物材料を含むリポソームを製造するための一般的方法については、米国特許番号４，２３５，８７１、４，２３１，８７７、４，２２４，１７９、４，７５３，７８８、４，６７３，５６７、４，２４７，４１１、および４，８１４，２７０も参照のこと。
【０１７３】
　あるいはまた、ＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、コレステロール、コーレート、およびデオキシコール酸を含む多くのステロールのいずれとも組み合わせることができる。好ましいステロールはコレステロールである。
【０１７４】
　さらに、ＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞が取り込むペプチドと結合させることができる。有用なペプチドの例には、ペプチドホルモン、抗原もしくは抗体、およびペプチド毒素が含まれる。新生物性細胞が選択的に取り込むペプチドを選択することによって、アンチセンス薬剤の特異的な輸送を行うことができる。次いで、選択するペプチドは、アミノおよびスルフィドリル反応性ヘテロ２機能性試薬を介して、活性化ＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドと共有結合することができる。後者は、選択するペプチド中に存在するシステイン残基と結合する。選択するペプチドに結合するペプチドＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する細胞のばく露において、ペプチヂルアンチセンス薬剤はエンドサイトーシスによって取り込まれ、ＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ＮＴＰｍＲＮＡと結合して翻訳を阻害する（Ｈａｒａｌａｍｂｉｄらの、ＷＯ８９０３８４９、Ｌｅｂｌｅｕらの、ＥＰ０２６３７４０）。
【０１７５】
　本発明のＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその医薬組成物は、その意図する目的を達成するためのいかなる方法によっても投与することができる。例えば、非経口的、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、または経皮経路により投与することができる。投与する用量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、併用治療の種類（もしあれば）、治療頻度、および所望する効果の性質によるであろう。
【０１７６】
　本発明の範囲内の組成物には、対象癌細胞の増殖阻害および／または分化刺激を達成するか、またはＡＤを軽減するために有効な量のＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するすべての組成物が含まれる。個々の要求は異なるが、各成分の有効量の最適範囲の決定は当業者が行う。一般には、ＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチドは、哺乳動物（例えばヒト）に、１日当たり、体重に応じて０．００５〜１ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。また、それ相当する量のその医薬的に許容される塩を投与してもよい。
【０１７７】
　あるいはまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドは２本鎖ＤＮＡ（イントロン、エクソン、またはその両方を含む）の転写領域に結合し、三重らせんを形成することによってＮＴＰ遺伝子の転写と干渉するように計画して製造することができる（Ｆｒｏｅｈｌｅｒらの、ＷＯ９１／０６６２６；Ｔｏｏｌｅの、ＷＯ９２／１０５９０）。三重らせんを形成するための好ましいオリゴヌクレオチドは、当該オリゴヌクレオチドの少なくとも２領域の極性が逆転しているオリゴヌクレオチドである（同上）。その様なオリゴヌクレオチドは、Ｌがオリゴヌクレオチド間の０〜１０塩基のオリゴヌクレオチド結合を表す３'---５'-Ｌ-５'---３'、または５'---３'-Ｌ-３'---５'のような極性が反対であるタンデム配列を特徴とする。極性が逆になった形は、エキソヌクレアーゼによる分解に対して１本鎖オリゴヌクレオチドを安定化する（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、既述）。好ましい三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドは配列番号１〜３に基づいている：
　１．３’−ＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣＣ−５’−Ｌ−
　　　５’−ＣＣＧＡＴＴＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＴ−３’［配列番号：７］、
　２．３’−ＣＣＧＡＴＴＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＴ−５’−Ｌ−
　　　５’−ＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣＣ−３’［配列番号：８］、
　３．３’−ＣＣＡＣＣＴＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＣ−５’−Ｌ−
　　　５’−ＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣ−３’［配列番号：９］、
　４．３’−ＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣ−５’−Ｌ−
　　　５’−ＣＣＡＣＣＴＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＣ−３’［配列番号：１０］、
　５．３’−ＣＣＡＧＡＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣＣＡＡＡＣＣ−５’−Ｌ−
　　　５’−ＣＣＡＡＡＣＣＧＡＴＴＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣ−３’［配列番号：１１］、および
　６．３’−ＣＣＡＡＡＣＣＧＡＴＴＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣ−５’−Ｌ−
　　　５’−ＣＣＡＧＡＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣＣＡＡＡＣＣ−３’［配列番号：１２］。
【０１７８】
　したがって、三重らせんを形成するオリゴヌクレオチド１および２は、それぞれ３’［配列番号：１］５’−Ｌ−５’［配列番号：１］３’、および５’［配列番号：１］３’−Ｌ−３’［配列番号：１］５’で表される。三重らせんを形成するオリゴヌクレオチド３および４は、それぞれ３’［配列番号：２］５’−Ｌ−５’［配列番号：２］３’、および５’［配列番号：２］３’−Ｌ−３’［配列番号：２］５’で表される。三重らせんを形成するオリゴヌクレオチド５および６は、それぞれ３’［配列番号：３］５’−Ｌ−５’［配列番号：３］３’、および５’［配列番号：３］３’−Ｌ−３’［配列番号：３］５’で表される。もちろん、同様な三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドは配列番号：４〜６またはその断片を用いて製造することができる。
【０１７９】
　治療的応用において、三重らせん形成オリゴヌクレオチドは、既述した全身または局所投与を含む様々な投与法のために医薬製造物として製剤化することができる。
【０１８０】
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、既述のごとく当該分野の通常の技術を有する者によく知られたいずれの方法で製造してもよい。
【０１８１】
　リボザイムはｍＲＮＡ機能を阻害する別の方法を提供する。リボザイムはＲＮＡ酵素、自己スプライシングＲＮＡ、および自己開裂ＲＮＡであってよい（Ｃｅｃｈらの、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６７：１７４７９−１７４８２（１９９２））。ある標的配列の途中に対するエンドヌクレアーゼ活性を有する新たなリボザイムを構築することができる。これらのリボザイムは様々な配列に作用することができるので、リボザイムは実質的にいかなるＲＮＡ基質のためにも計画することができる。したがって、リボザイムは特定の遺伝子の発現を阻害するための非常に融通性のある道具である。
　クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｍＲＮＡに対するリボザイムの構築に成功している（Ｈａｓｅｌｏｆｆらの、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５ー５９１（１９８８）；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋらの、Ｎａｔｕｒｅ　３２８：５９６−６００（１９８７））。このリボザイムには３つの構造ドメインが含まれる：１）開裂部位の５’方向の隣の高度に保存された配列、２）リボソームの自然発生する開裂ドメインを含む、塩基対ステム（軸）を形成する高度に保存された配列、および３）開裂部位の両側の隣にある、その開裂部位に関連するリボザイムの正確な配列および基質ならびに酵素の結合を確実にする領域。インビトロでＲＮＡ配列に特定の開裂を生じさせるのに適した、このモデルに従って構築されたＲＮＡ酵素がすでに提供されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、既述）。
【０１８２】
　あるいはまた、活性部位がタバコ輪紋（ｒｉｎｇ　ｓｐｏｔ）ウイルスの付随ＲＮＡのマイナス鎖から誘導されるヘアピンリボザイムを用いてもよい（Ｈａｍｐｅｌらの、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８：４９２９−４９３３（１９８９））。最近、ヒト免疫不全ウイルス１型のＲＮＡを開裂させるヘアピンリボザイムが計画された（Ｏｊｗａｎｇらの、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０８０２−１０８０６（１９９２））。他の自己開裂ＲＮＡ活性は肝炎デルタウイルスに関連している（Ｋｕｏらの、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：４４２９−４４４４（１９８８））。
【０１８３】
　既述の通り、ＮＴＰリボザイムの好ましい標的は、ＰＴＰ配列と相同性でないヌクレオチド配列である。好ましくは、本発明のＮＴＰリボザイム分子は、既述のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼリボザイムまたはヘアピンリボザイムに基づいて計画される。あるいはまた、ＮＴＰリボザイム分子は、化学的および酵素的分解に対する安定性が増強され、治療薬として有用な、触媒的活性を有するリボザイム構造を開示しているＥｃｋｓｔｅｉｎらの記載（国際公開番号ＷＯ９２／０７０６５）に従って計画される。
【０１８４】
　別の研究方法において、外部ガイド配列（ＥＧＳ）を、内在性リボザイムのＲＮアーゼＰを細胞性リボザイムによって実質的に開裂される細胞内ＮＴＰｍＲＮＡに作用させるように構築することができる（Ａｌｔｍａｎらの、米国特許番号５，１６８，０５３）。ＮＴＰ ＥＧＳには、ＮＴＰｍＲＮＡ、およびＮがプリンであることが好ましい３’−ＮＣＣＡヌクレオチド配列に相補的な１０〜１５ヌクレオチド配列が含まれることが好ましい（同上）。ＮＴＰ ＥＧＳ分子を以下に既述するごとく細胞に供給してＮＴＰｍＲＮＡと相補性ＮＴＰ ＥＧＳ配列の間に塩基対を形成し、さらに塩基対形成領域の５’側のヌクレオチドにおいてＲＮアーゼＰによるＮＴＰｍＲＮＡの開裂を促進することによって、この分子を標的とするＮＴＰｍＲＮＡと結合させる（同上）。
【０１８５】
　本発明には、本発明の少なくとも１種類のＮＴＰリボザイムまたはＮＴＰ ＥＧＳの有効量と医薬的に許容される担体との組み合わせとを含む医薬組成物も含まれる。ＮＴＰリボザイムまたはＮＴＰ ＥＧＳは、本リボザイムまたはＮＴＰ ＥＧＳ分子の細胞への取り込みを増強する薬剤と併用投与することが好ましい。例えば、ＮＴＰリボザイムまたはＮＴＰ ＥＧＳは、既述したようにリポソームの形であってよい脂肪親和性カチオン化合物と組み合わせることができる。あるいはまた、ＮＴＰリボザイムまたはＮＴＰ ＥＧＳはコレステロール、コーレート、およびデオキシコール酸を含む多くのステロールのいずれかのような脂肪親和性担体とも組み合わせることができる。
【０１８６】
　本発明のＮＴＰリボザイムもしくはＮＴＰ ＥＧＳ、および医薬組成物は、その意図する目的を達成するための如何なる方法により投与してもよい。例えば、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、または経皮経路で投与することができる。投与する用量は、レシピエントの年齢、健康ならびに体重、もしあれば併用処置の種類、治療頻度、および所望する効果の性質に依存するであろう。例えば、７００ｍｇものアンチセンスオリゴヌクレオチドが、毒性徴候を示すことなく１０日間のクールにわたって患者に静脈内投与されている（すなわち、０．０５ｍｇ／ｋｇ／時）（Ｓｔｅｒｌｉｎｇの、「Ｔａｙｓｔｅｍｉｃ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｒｅｐｏｒｔｅｄ」Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ　１２（１２）：１，２８（１９９２））。
【０１８７】
　本発明の範囲内の組成物には、対象癌細胞の増殖を阻害し、ならびに／もしくはその癌細胞の分化を促進するか、またはＡＤを軽減するのに有効な量のＮＴＰリボザイムまたはＮＴＰ ＥＧＳを含有するすべての組成物が含まれる。個々の要求は異なるが、各成分の有効量の最適範囲の決定は当業者が行う。
【０１８８】
　溶液中の未加工の化学薬品としてＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはＮＴＰ ＥＧＳを投与することに加えて、この治療分子を、ＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはＮＴＰ ＥＧＳを加工処理して医薬的に使用し得る製造物治療分子とするのを促進する賦形剤および補助剤を含む適切な医薬的に許容される担体を含有する医薬製造物の一部として投与することができる。
【０１８９】
　非経口投与に適した製剤には、水溶性の形のＮＴＰアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＮＴＰ ＥＧＳ（例えば水溶性塩）の水溶液が含まれる。さらに、活性化合物の懸濁液を適切な油状注射用懸濁液として投与することができる。適切な脂肪親和性溶媒またはビークルには、脂肪油（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えばエチルオレエートもしくはトリグリセリド）が含まれる。水性注射用懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、この懸濁液の粘性を増大させる物質を含有することができる。この懸濁液には安定化剤が含まれていることがあってもよい。
【０１９０】
　あるいはまた、ＮＴＰアンチセンスＲＮＡ分子、ＮＴＰリボザイム、およびＮＴＰ ＥＧＳは、好ましくはインビボで複製することができないビリオンの形で投与されるＤＮＡ構築物にコードされることができる（例えば、Ｔａｙｌｏｒの、ＷＯ９２／０６６９３を参照のこと）。例えば、そのようなＤＮＡ構築物は、ヘルペスを基礎としたウイルスを用いて投与することができる（Ｇａｇｅらの、米国特許番号５，０８２，６７０）。あるいはまた、ＮＴＰアンチセンスＲＮＡ配列、ＮＴＰリボザイム、およびＮＴＰ ＥＧＳはレトロウイルスの様なビリオンの形で投与されるＲＮＡ構築物にコードされることができる。レトロウイルスベクターの製造法は当該分野でよく知られている（例えば、Ｂｒｏｗｎらの、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ，」ｉｎ　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，第３巻，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８７）を参照のこと）。
【０１９１】
　中枢神経系における遺伝子発現の特異性は、細胞特異的エンハンサーおよびプロモーターの様な適切な細胞特異的調節配列を用いることによって与えることができる。例えば、そのような配列には、ＪＣウイルスのオリゴデンドログリア特異的な発現、プロテオリピッドタンパク質のグリア特異的な発現、およびグリア線維性酸性タンパク質遺伝子を調節する配列が含まれる（Ｇａｇｅら、既述）。タンパク質のリン酸化は神経調節において重要であるため（Ｋｅｎｎｅｄｙの、「Ｓｅｃｏｎｄ　Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｓ　ａｎｄ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，」ｉｎ　Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｌｌ，Ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２））、プロテインキナーゼプロモーター配列を用いて十分なレベルのＮＴＰ遺伝子発現を得ることができる。
【０１９２】
　したがって、遺伝子療法を用いてＮＴＰが特定の形で不適切に発現するのを阻害することによりＡＤを軽減することができる。さらに、遺伝子療法を用いてＮＴＰの特定の形の適切な発現レベルをもたらすことによりＡＤを軽減することができる。この場合には、特定のＮＴＰ核酸配列を、既述したウイルスの形で投与するＤＮＡまたはＲＮＡ構築物にコードすることができる。あるいはまた、「ドナー細胞」を、ＮＴＰ配列を含むウイルスもしくはレトロウイルスベクターを用いるか、または外来ＤＮＡを細胞内に導入するための他のよく知られた技術を用いてインビトロで修飾することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、既述、を参照のこと）。そのようなドナー細胞には、線維芽細胞、神経細胞、グリア細胞、および結合組織細胞が含まれる（Ｇａｇｅら、既述）。遺伝子操作後、ドナー細胞を中枢神経系に移植し、遺伝的に修飾した細胞に治療型のＮＴＰを提供する（既述）。
【０１９３】
　さらに、そのようなビリオンは、脳に輸送するために血流中に導入することができる。これは血液脳関門の浸透性を破壊した後にビリオンを投与することによって成し遂げられる（例えば、Ｎｅｕｗｅｌｔの、米国特許番号４，８６６，０４２を参照のこと）。血液脳関門はマンニトール、アラビノース、またはグリセロールの様な医薬的に活性な無毒性の高張溶液を投与することによって破壊することができる（既述）。
【０１９４】
　大腸菌中の以下のクローンは、ブダペスト条約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２０８５２）に寄託された：Ｇ２−２ ＰｓｔＩ−ＤＨ５（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．６９２５７）；Ｇ５ｄ−ＰｓｔＩ−ＤＨ５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９２５８）；１−９ａ−ＬＸ−１ ｂｌｕｅ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９２５９）；ＡＤ３−４−ＤＨ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９２６０）；ＨＢ４−ＸＬ−ｂｌｕｅ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．６９２６１）；ＡＤ１０−７−ＤＨ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９２６２）；ＡＤ２−２−ＤＨ１−（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９２６３）；Ｇ５ｄ−１ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ−ＤＨ５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９２６４）；およびＧ２−２ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ-ＤＨ５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６９２６５）。
【０１９５】
　本発明における一般的な記載は、例示のために示された以下の実施例に対する引用例によってより容易に理解されるであろうが、これらは特に示さない限り本発明を制限することを意図するものではない。
【０１９６】
実施例１
細胞株におけるＮＴＰ免疫反応性の発現
　中枢神経系由来の細胞株７株について、膵臓型の糸状タンパク質に対して生じた（Ｇｒｏｓｓらの、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２１１５−２１２６（１９８５））、脳組織および脳脊髄液中に存在する糸状タンパク質と交差反応する（Ｏｚｔｕｒｋらの、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４１９−４２３（１９８９）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６：１００４−１０１３（１９９０）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１１３：１５２−１６４（１９９２）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３２：７３３−７４２（１９９２））Ｔｈ９モノクローナル抗体を用いて、糸状タンパク質に対する免疫反応性を発現することを確認した。それらの中には以下のものがあった：初期神経外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）細胞株２株、ＰＮＥＴ１およびＰＮＥＴ２；グリオブラストーマ細胞株３株、Ｈｇｌ １６、Ｈｇｌ １７、およびＣ６；グリア細胞株Ａ１７２；および神経芽細胞腫細胞株ＳＨ−Ｓｙ５ｙ。グリオブラストーマ細胞株およびＡ１７２細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。ＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞はＳｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ記念病院のＤｒ．Ｂｉｅｄｌｅｒから得た。ＰＮＥＴ細胞株は以前に記載されており（Ｔｈｅらの、Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　３：６２−６６（１９９３）、ＭＧＨ癌センターのＤｒ．Ｒｅｎｅ’Ｂｅｒｎａｒｄｓから得た。すべての細胞株は１０％ウシ胎児血清添加、抗生物質不含Ｅａｒｌ変法Ｅａｇｌｅ培地中で維持した。
【０１９７】
　細胞の糸状タンパク質および他の免疫反応性を試験するために、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４．３ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．４ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．３））中に回収し、スライド当り１０5細胞を用いてサイトスピン標本を作製した。サイトスピン標本を１００％メタノール（−２０℃）中で速やかに固定し、風乾し、使用するまで−８０℃に保存した。スライドを室温で平衡化し、ＰＢＳで水和した後、免疫染色を行った。非特異的な抗体結合を３％非免疫ウマ血清でブロックした。同じ培養からの複製サイトスピン標本を、一次抗体５または１０μｇ／ｍＬと４℃で一夜インキュベーションした。免疫反応の証明は、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　Ｅｌｉｔｅ　ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）をメーカーのプロトコールに従って用い、さらにクロモゲンとして３−３’ジアミノベンジジン（０．５ｍｇ／ｍＬ ＋ ０．０３％過酸化水素）を用いるアビジン−ビオチンホースラディッシュパーオキシダーゼ法によって行った。次に、細胞をヘマトキシリンで対比染色し、段階的アルコール溶液中で脱水し、キシレンで透徹して、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ(Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてカバーグラス下に保存した。
【０１９８】
　各細胞株のサイトスピン標本を糸状タンパク質モノクローナル抗体Ｔｈ９、Ｔｈ７、Ｔｈ１０、Ｔｈ２９、Ｔｈ３４、ＴＨ４６、Ｔｈ６７、およびＴｈ９０を用いて免疫染色した。さらに、複製スライドを陽性（ニューロフィラメント、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ならびにビメンチン）および陰性（デスミン、Ｂ型肝炎表面抗原−５Ｃ３）対照モノクローナル抗体によって免疫染色した。発明者の研究室で作製した５Ｃ３（Ｆｕｊｉｔａらの、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９１：１３５７−１３６３（１９８６））を除く対照抗体は購入した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。すべての血清学的試薬は１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで希釈し、一次抗体を除くすべてのインキュベーションは加湿チャンバー内で室温で行った。スライドは各工程の間でＰＢＳを３回交換して洗浄した。
【０１９９】
　ＰＮＥＴ１細胞およびＰＮＥＴ２細胞は共に、高分子量ならびに中分子量のニューロフィラメントタンパク質を発現し、グリア線維性酸性タンパク質またはビメンチンはほどんどあるいは全く発現しなかった。ＰＮＥＴ１、ＰＮＥＴ２、およびＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞は、未成熟ニューロンおよび再生細胞増殖を受けたニューロン中に高度に発現する豊富なカルモジュリン結合リンタンパク質であるＧＡＰ−４３を発現した（Ｂｅｎｏｗｉｔｚらの、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：２１５３−２１６３（１９８３）；ＤｅＧｒａａｎらの、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．６１：２３５−２４１（１９８５）；Ｋａｌｉｌらの、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：２５６３−２５７０（１９８６））。Ａ１７２細胞およびＣ６細胞はＧＦＡＰおよびビメンチンを発現した。しかし、Ａ１７２はニューロフィラメントに対する免疫反応性をも示し、それが純粋にグリア細胞の性状を持つかに対する疑問が生じた。いずれの細胞株もデスミンまたはＢ型肝炎表面抗原に対するモノクローナル抗体との免疫反応性を生じなかった。陰性対照細胞株として肝細胞癌細胞株Ｈｕｈ７も同様に免疫染色し、既述の抗体との免疫反応性を示さないことが示された。しかし、Ｈｕｈ細胞は、本細胞株の陽性対照として用いられるインスリン受容体基質タンパク質のＩＲＳ−１に対するモノクローナル抗体（Ｓａｓａｋｉらの、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１−４（１９９３））との免疫反応性を示した（データ示さず）。
【０２００】
　Ｔｈ９モノクローナル抗体を用いて、糸状タンパク質に対する免疫反応性を、原発性ＰＮＥＴ（Ａ）、原発性グリオブラストーマ（Ｆ）、ＰＮＥＴ１（Ｂ）、およびＣ６細胞（Ｇ）において検出したが、肝細胞癌細胞株では検出されなかった（図１Ａ−１Ｊ）。さらに、Ｔｈ９免疫反応性を、試験した原発性ヒトＣＮＳ ＰＮＥＴ８〜９株および原発性ヒトグリオブラストーマ５株すべての組織切片において検出した（図１Ａ−１Ｊ）。細胞株５株はすべてＴｈ９モノクローナル抗体との強い免疫反応性を示したが、これら細胞株の他のＴｈモノクローナル抗体に対する免疫反応性に差がみられた。Ｔｈ１０（Ｃ、Ｈ）、Ｔｈ７（Ｄ、Ｉ）、またはＴｈ４６モノクローナル抗体によって生じる免疫染色反応は、ＰＮＥＴ１（Ｃ−Ｅ）およびＣ６（Ｈ−Ｊ）において低レベル(Ｃ、Ｄ)であるか、または欠如していた(Ｈ、Ｉ、Ｅ、Ｊ）。ＰＮＥＴ２細胞はＴｈ７およびＴｈ２９と低レベルの免疫反応性しか示さず、他のＴｈモノクローナル抗体では免疫染色されなかった。Ａ１７２、Ｃ６、およびＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞はＴｈ９以外のＴｈモノクローナル抗体とほとんどまたは全く免疫反応性を示さなかった。Ｈｕｈ７細胞は使用した如何なる糸状タンパク質モノクローナル抗体とも免疫応答性を示さなかったが、ヒト膵臓組織は精製膵臓型糸状タンパク質に対して生じたＴｈ抗体すべてと免疫反応性を示した（Ｇｒｏｓｓの、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２１１５−２１２６（１９８５））。
【０２０１】
実施例２
モノクローナル抗体に基づく免疫放射測定アッセイ（Ｍ−ＩＲＭＡ）による糸状タンパク質の分析
　培養細胞をＰＢＳで洗浄し、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に回収した。細胞を１０００×ｇ、１５分間遠心して沈さとし、さらに５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ4Ｐ2Ｏ7、２ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4 、１００μｇ／ｍＬフェニルメチルスルホニルフロリド、１μｇ／ｍＬアプロチニン、１μｇ／ｍＬペプスタチンＡ、および１μｇ／ｍＬ ロイペプチンを含む溶解緩衝液中に再浮遊させた。溶解物を１４，０００×ｇ、１０分間遠心して得た上清分画をウエスタンブロット分析、免疫沈降試験、およびＭ−ＩＲＭＡに用いた。タンパク質濃度はローリー比色分析法によって測定した。試料は−４０℃に保存した。
【０２０２】
　Ｍ−ＩＲＭＡは、細胞溶解物、組織培養液、組織ホモゲネート、および体液中のｐモラーのＮＴＰを定量することができる高感度の２または３部位前方サンドイッチアッセイである（Ｏｚｔｕｒｋらの、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４１９−４２３（１９８９）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６：１００４−１０１３（１９９０）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１１３：１５２−１６４（１９９２）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３２：７３３−７４２（１９９２）；Ｇｒｏｓｓらの、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２１１５−２１２６（１９８５））。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと組み合わせると、Ｍ−ＩＲＭＡを用いて糸状タンパク質および関連タンパク質の分子サイズを決定することができる（Ｏｚｔｕｒｋらの、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４１９−４２３（１９８９）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６：１００４−１０１３（１９９０）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１１３：１５２−１６４（１９９２）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３２：７３３−７４２（１９９２））。Ｍ−ＩＲＭＡには、固相マトリックスに固定したモノクローナル抗体Ｔｈ７およびＴｈ１０を用いて生物試料中に存在する免疫反応性糸状タンパク質を捕捉し、次いで当該タンパク質に対する第三放射能標識トレーサーモノクローナル抗体（Ｔｈ９）を用いて捕捉した抗原を検出することが含まれる。簡単には、１／４”ポリスチレンビーズ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｂａｌｌ，Ｉｎｃ）を糸状タンパク質（通常Ｔｈ７＋Ｔｈ１０）に対する１または２種類のモノクローナル抗体でコートした。細胞溶解物または組織ホモゲネートの上清分画（Ｏｚｔｕｒｋらの、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：４１９−４２３（１９８９）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６：１００４−１０１３（１９９０）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１１３：１５２−１６４（１９９２）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３２：７３３−７４２（１９９２））を当該コートしたビーズと一夜インキュベーションし、試料中に存在する糸状タンパク質を捕捉する。このビーズをＰＢＳで５回洗浄し、次いでトレーサーとして125Ｉ標識Ｔｈ９とインキュベーションし、捕捉された糸状タンパク質を検出する。細胞溶解物または組織ホモゲネート中の糸状タンパク質濃度を、既知量の精製糸状タンパク質によって作製した標準曲線から決定した。この高感度のアッセイは溶液中のわずか１０ｐモルもの糸状タンパク質を検出することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した糸状タンパク質をアッセイするために、湿潤したゲルを２ｍｍ間隔でスライスし、当該タンパク質をＰＢＳ０．５ｍＬ中で室温で２４時間振とうすることにより溶離した。この溶離物中の糸状タンパク質をＭ−ＩＲＭＡによって直接アッセイした。
【０２０３】
　Ｔｈ７、Ｔｈ１０、Ｔｈ３４、およびＴｈ２９によるＰＮＥＴ１細胞の広範な免疫細胞化学染色に対応するこれらの細胞の糸状タンパク質に対する免疫反応性をＭ−ＩＲＭＡによって容易に測定した。換言すれば、Ｔｈ７、Ｔｈ１０、Ｔｈ３４、およびＴｈ２９モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を単一でかまたは２種類を一緒にして捕捉抗体として用い、125Ｉ標識Ｔｈ９をトレーサーに用いて、同様に高レベルの糸状タンパク質を測定した（図２）。反対に、Ｔｈ９と強い免疫反応性を示すが、抗原を捕捉するために用いたＴｈモノクローナル抗体ではほとんどまたは全く免疫細胞化学的に染色されないＰＮＥＴ２、Ｃ６、およびＡ１７２細胞において、Ｍ−ＩＲＭＡによって検出される糸状タンパク質レベルは、ＰＮＥＴ１細胞において測定されるものよりはるかに低かった（図２）。同様に、いかなる糸状タンパク質モノクローナル抗体による免疫細胞化学染色も示さなかったＨｕｈ７細胞の細胞溶解物中の糸状タンパク質は、Ｍ−ＩＲＭＡによって実質的に検出不能なレベルであった。細胞溶解物中の糸状タンパク質濃度は、Ｔｈ７およびＴｈ１０を捕捉抗体に用いる精製ＰＴＰを用いて作製した標準曲線から計算した。総タンパク質１ｍｇ当りの平均Ｓ．Ｄ．ｐｇで表した結果は以下の通りである：ＰＮＥＴ１−１３．１±０．３９；ＰＮＥＴ２−２．０６±０．１０；Ａ１７２−３．３８±０．３７；Ｃ６−２．５２±０．２２；およびＨｕｈ７−０．３４±０．０５。
【０２０４】
実施例３
腫瘍細胞株の神経糸状タンパク質の特徴づけ
　ウエスタンブロット分析において、タンパク質１００μｇを含む試料を、予め標識した分子量標準と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画化した。タンパク質を、半乾燥トランスファー装置（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてナイロン膜（Ｉｍｍｕｂｉｌｏｎ−Ｐトランスファー膜、Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ）上にブロットした。膜をトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；１０ｍＭトリス、０．８５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）で洗浄し、次いで３％ＢＳＡを含むＴＢＳでブロックした。ブロットしたものを125Ｉ標識Ｔｈ９モノクローナル抗体と４℃で一夜インキュベーションした。膜を室温でＴＢＳ−ＢＳＡ中、１５分３回、さらに３０分１回洗浄することにより非特異的に結合したプローブを除去した。結果はコダックＸＡＲフィルムを用いるオートラジオグラフィーによって分析した。
【０２０５】
　免疫沈降試験用の試料を調製するために、タンパク質約１ｍｇ／ｍＬを含む細胞溶解物試料１ｍＬを免疫沈降試験に用いた。この溶解物を最初に非関連抗体（５Ｃ３または抗デスモシン）で、次いでプロテインＡセファロースで予めきれいにする。糸状タンパク質はＴｈ９ ５〜１０μｇおよびプロテインＡセファロースを用いて免疫沈降させた（Ｓａｓａｋｉらの、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１−４（１９９３））。遠心によって回収した免疫複合体を２％ＳＤＳおよび１０ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む緩衝液中に再懸濁し、変性および還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた（同上）。粗細胞溶解物（１００μｇタンパク質）を同様に分析した。タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜上にブロットし、125Ｉ標識（同上）Ｔｈ９をプローブとして糸状タンパク質および関連分子を検出した。Ｂ型肝炎表面抗原（５Ｃ３）またはデスミンに対するモノクローナル抗体を用いて、同時に陰性対照試験を行った。
【０２０６】
　１００ｍｍ2ペトリ皿中で培養した単層の細胞を用いて代謝標識試験を行った。標識前に、細胞をメチオニンおよびシステイン不含培地に２時間ばく露した。ついで、培地を［35Ｓ］メチオニンまたは［35Ｓ］システイン各３００μＣｉを含むＤＭＥＭ３ｍＬに置き換えた。３時間標識した後、細胞を様々な間隔で、放射性標識したアミノ酸を含まない１０ｍＭメチオニン添加完全培地でインキュベーションした。細胞溶解物を既述のごとく調製した。糸状タンパク質をＴｈ９モノクローナル抗体およびプロテインＡセファロースを用いて免疫沈降させ、免疫沈降生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびフィルムオートラジオグラフィーによって分析した。
【０２０７】
　インビボのリン酸化試験において、代謝標識試験について記載したごとく培養した細胞をＴＢＳで２回洗浄し、１０％透析ウシ胎児血清を含むリン酸不含Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＭＥＭで２時間インキュベーションした。次に、細胞をＴＢＳで洗浄し、［32Ｐ］オルソリン酸４００μＣｉ／ｍＬを含む同じ培地で３時間インキュベーションした。細胞溶解物を糸状タンパク質、および陽性（ｐ３６）ならびに陰性（デスミン）対照モノクローナル抗体との免疫沈降、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０２０８】
　神経糸状タンパク質のグリコシル化状態を試験するため、タンパク質約１００μｇを含む細胞培養溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、分画化したタンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。Ｏ−およびＮ−グリカンを、ペリオデート酸化、次いでビオチニル化により、さらにＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼプローブおよび比色分析用基質としてＮＢＴ／ＢＣＩＰを用いるウエスタンブロット分析によって検出した。本アッセイは、ＧｌｙｃｏＴｒａｃｋ Ｋｉｔ（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｇｌｙｃｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｅｄａｌｅ，ＮＹ）をメーカーのプロトコールに従って用いることにより行った。
【０２０９】
　Ｔｈ９免疫反応性タンパク質を、４つの異なる方法によってＰＮＥＴ１、ＰＮＥＴ２、ＳＨ−Ｓｙ５ｙ、Ｃ６、およびＡ１７２細胞の溶解物中に検出した：ウエスタンブロット分析、免疫沈降後のウエスタンブロット分析、代謝標識後の免疫沈降、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥとＭ−ＩＲＭＡとの組み合せ。125Ｉ標識Ｔｈ９を用いる粗細胞分解物のウエスタンブロット分析によって、上記細胞株において〜２１ｋＤａのバンド（図３中の矢印で表示）が示されたが、その信号強度は弱かった。反対に、ヒトすい臓組織の分解物では、予想された１７ｋＤａの非開裂型および１４ｋＤａの開裂型のすい臓糸状タンパク質がウエスタンブロット分析によって容易に検出された（図３）。糸状タンパク質は、ヒト肝細胞癌細胞株の溶解物中に検出されなかった。神経およびグリア細胞株と比較してすい臓組織中の糸状タンパク質が著しく大量であったことは、脳組織および脳脊髄液と比較してすい臓およびすい液中の糸状タンパク質濃度が１０6倍高かった以前の知見と一致している（Ｏｚｔｕｒｋらの、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：４１９−４２３（１９８９）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６：１００４−１０１３（１９９０）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１１３：１５２−１６４（１９９２）；ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅらの、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３２：７３３−７４２（１９９２））。ＰＮＥＴおよびグリア細胞によって合成された糸状タンパク質がＰＴＰおよびＮＴＰの場合と同様に分泌されると予想する者もあるであろうが、糸状タンパク質は、ウエスタンブロット分析において、組織培養培地を凍結乾燥により４ないし５倍に濃縮した後も培地中に検出されなかった。
【０２１０】
　Ｔｈ９免疫反応性糸状タンパク質は、ＴＨ７＋Ｔｈ１０もしくはＴｈ９のいずれかを用いて溶解物から最初の免疫沈降を行い、次いで125Ｉ標識Ｔｈ９（直接）または125Ｉ標識プロテインＡと非標識Ｔｈ９（間接）を用いるウエスタンブロット分析を行うことによって、ＰＮＥＴおよびグリア細胞中により容易に検出された（図３）。 ２つの方法においても、ウエスタンブロット分析によって検出されたものと同様の２１ｋＤａ糸状タンパク質関連タンパク質が検出された。さらに、ＰＮＥＴおよびグリア細胞において〜１７ｋＤａのバンドも観察されたが、その信号はウエスタンブロット分析によって検出されたものと同様、一致せず、低レベルであった。陰性対照として、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、およびＦＯＣＵＳ（Ｌｕｎらの、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）２０：４９３−５０４（１９８４））ヒト肝細胞癌細胞株を同様の条件下で同時に試験し、それらの細胞溶解物中にＴｈ９免疫反応性タンパク質を検出しなかった。
【０２１１】
　ＰＮＥＴおよびグリア細胞中に存在する糸状タンパク質の分子サイズは、35Ｓ−メチオニンまたは35Ｓ−システインによる代謝標識、次いでＴｈ９モノクローナル抗体を用いる免疫沈降によって最も顕著に証明された。デスミンまたはＢ型肝炎表面抗原（５Ｃ３）に対するモノクローナル抗体を免疫沈降の陰性対照として使用した。ＰＮＥＴおよびグリア細胞株において、〜２６および〜２１ｋＤａ Ｔｈ９免疫反応性タンパク質が免疫沈降生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって検出された（図４Ｂ）。ＰＮＥＴ１細胞において、２１ｋＤａのバンドが二重に見えた（図４Ａ）；付随するわずかに高い分子量のバンドは〜２１ｋＤａの主バンドより大きくないようであった。さらに、ＰＮＥＴおよびグリア細胞株において、〜２１ｋＤａのバンドとほぼ同じ強度のバンドと関連する〜１７ｋＤａのＴｈ９免疫反応性タンパク質も認められた。Ｃ６細胞において、ＰＮＥＴ細胞では検出されない〜２６ｋＤａ、〜１４ー１５ｋＤａ、および〜８ｋＤａのＴｈ９免疫反応性タンパク質も認められた（図４Ａおよび４Ｂ、矢印）。
【０２１２】
　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／Ｍ−ＩＲＭＡから、２１ｋＤａならびに１７ｋＤａの糸状タンパク質はＳｈ−Ｓｙ５ｙ、ＰＮＥＴ１、Ａ１７２、ならびにＣ６細胞中には認められるが、肝細胞癌細胞中には認められないことが明らかとなった（図５Ａ−５Ｅ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画化した細胞タンパク質を２ｍｍ間隔でスライスしたゲルから溶離し、Ｔｈ７＋Ｔｈ１０を捕捉抗体に、125Ｉ標識Ｔｈ９をトレーサーに用いるＭ−ＩＲＭＡによって、糸状タンパク質を直接アッセイした。低レベルにもかかわらず、２つの明瞭なピークがすべての神経外胚葉細胞株に認められたが、同時に同じ方法でアッセイしたＨｕｈ７肝細胞癌細胞株には本ピークは認められなかった。これらゲルの解像度では、存在しているかもしれない〜１４−１５ｋＤａのタンパク質と〜１７ｋＤａのタンパク質を区別できなかった。
【０２１３】
　ＰＮＥＴ１およびＣ６細胞を32Ｐまたは35Ｓメチオニンで代謝標識し、Ｔｈ９モノクローナル抗体を用いて糸状タンパク質を溶解物から免疫沈降させた(図６)。陰性対照として、細胞溶解物とデスミンに対するモノクローナル抗体を同じ割合で用いて免疫沈降試験を行った。（図６、右図）。35Ｓメチオニンで標識した細胞において、Ｔｈ９免疫反応性バンドが、〜２６ｋＤａならびに〜２１ｋＤａ（上の矢印）、〜１７ｋＤａ（下の矢印）、および〜１４−１５ｋＤａにも検出された（図６）。32Ｐ標識後に、２１ｋＤのバンドのみがＴｈ９モノクローナル抗体による免疫沈降によって観察された；他の分子量のバンドはリン酸化されていないようであった（図６）。リン酸化したＴｈ９免疫反応性タンパク質はＣ６細胞において検出され、ＰＮＥＴ１細胞では検出されなかったが、これはＰＮＥＴ１細胞はＣ６細胞より増殖が遅いため標識効率が悪かったことによるのかも知れない。免疫沈降にデスミンに対するモノクローナル抗体を用いると、１４ｋＤａ〜２６ｋＤａの範囲のバンドは検出されなかった（図６）。Ｔｈ９免疫沈降タンパク質中に炭水化物成分は検出されなかった（データ示さず）。
【０２１４】
　糸状タンパク質濃度は、ＰＮＥＴ１細胞のコンフルエント前（すなわち、対数増殖期中）の培養中において最高濃度を示し、一夜の血清欠乏培養（増殖停止）において最低濃度を示した（図７）。１００％コンフルエントとなった培養における糸状タンパク質の発現も、増殖期の培養に比べて低レベルであった。Ｈｕｈ７肝細胞癌細胞（陰性対照）についても同じ培養条件で同時に試験したが、糸状タンパク質レベルは全体を通じて低いままであった。
【０２１５】
　驚くべきことに、これらの様々な条件下で培養したＰＮＥＴ細胞の糸状タンパク質免疫細胞化学染色の程度に変化が見られなかった。しかしながら、Ｍ−ＩＲＭＡ測定によって変化する糸状タンパク質レベルの程度は、免疫細胞化学によって検出不能であるように思われる。それにもかかわらず、血清の欠乏によって誘発された細胞糸状タンパク質含有量の減少は、細胞の表現型の変化と関連していた。細胞が１００％コンフルエントとなったとき、または細胞を一夜血清欠乏状態においた後において、細胞体の大きさは減少し、ニューロフィラメントタンパク質、ＧＡＰ−４３、およびＧＦＡＰに対する免疫反応性の程度ならびに分布の顕著な変化が認められた（図８）。５０％コンフルエントのＰＮＥＴ培養において、細胞はニューロフィラメントの斑点状ならびにしばしば極性分布、およびＧＡＰ−４３免疫反応性を示したが、１００％コンフルエントならびに血清欠乏ＰＮＥＴ培養では、ニューロフィラメントおよびＧＡＰ−４３に対するび慢性の核周囲部における免疫反応性が認められた。び慢性の免疫反応性は神経突起におけるニューロフィラメントおよびＧＡＰ−４３の分布と関連があるものと思われる。反対に、５０％コンフルエントＰＮＥＴ培養ではＧＦＡＰに対する免疫反応性がみられなかったが、１００％コンフルエントおよび血清欠乏培養にはＧＦＡＰ陽性細胞が顕著な割合で認められた。さらに、ＧＦＡＰ免疫反応性細胞の割合は、１００％コンフルエント血清欠乏培養において最も大きく、次いで１０％ウシ胎児血清添加培地による１００％コンフルエント培養が大きかった。したがって、一夜血清欠乏としたＰＮＥＴ細胞において測定された糸状タンパク質レベルの低下は、細胞のアストロサイト表現型への分化によるものであろうと思われる。Ｃ６細胞および他のグリオブラストーマ細胞株はＴｈ９モノクローナル抗体との強い免疫反応性を示したが、Ｍ−ＩＲＭＡによって測定した糸状タンパク質レベルはしばしば低く、これはおそらくＴｈ７およびＴＨ１０を含む他の糸状タンパク質抗体との免疫反応性が低レベルであることによるものであろう（図１Ａ−１Ｊを参照のこと）。
【０２１６】
実施例４
ヒトｃＤＮＡライブラリーからの糸状タンパク質のクローニング
　１７〜１８週齢の胎児脳から作成したヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ.，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、２年齢の側頭葉新皮質（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、及び最終段階のアルツハイマー病大脳皮質（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）をラットＰＴＰｃＤＮＡのヌクレオチド２３５〜６５０に対応する４１６ｂｐＤＮＡフラグメントから作成したプローブを用いてスクリーニングした。Ｏ１８と呼ばれるラットＰＴＰｃＤＮＡは、公表された配列のヌクレオチド４５〜１０４及び３４５〜４０４に対応する合成６０マー（量体）ＤＮＡプローブを用いてラット膵臓ｃＤＮＡライブラリーから単離した［テラゾノ（Terazono）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem.），２６３巻，２１１１〜２１１４頁，（１９８８年）；ワタナベ(Watanabe）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem.），２６５巻，７４３２〜７４３９頁，（１９９０年）］。各ライブラリー由来の約２×１０6のプラーク又はコロニーを標準的な方法［サンブルーク（Sambrook）ら，前掲参照］を用いるローストリンジェンシーハイブリダイゼーションでもってスクリーニングした。推定上のクローンをプラーク／コロニー精製し、ＤＮＡ挿入物をＴ７ポリメラーゼ（ＵＳＢシークエナーゼ；Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ.，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いるジデオキシヌクレオチド チェイン ターミネーション法により配列決定した。この配列をＧｅｎｅｂａｎｋデータベースと比較し、他の糸状タンパク質ｃＤＮＡの核酸配列とともに配列させた。
【０２１７】
１．ヒト胎児脳ライブラリーから単離されたＣＮＳ神経糸状タンパク質ｃＤＮＡ
　小断片のみが読み取り枠に対応し、残りは３’非翻訳領域に対応する１.３５キロベース（ｋｂ）の１−９ａＣＮＳ糸状タンパク質の部分的ｃＤＮＡを単離した（図９Ａ）。さらなる１５０ヌクレオチドの配列を５’アンカーＰＣＲ増幅生成物から得た。２回目の５’アンカーＰＣＲ増幅によりさらに６００ｂｐ上流の生成物を得た（図９Ｂ）。１−９ａ ｃＤＮＡ配列の部分はヒトＰＴＰｃＤＮＡの５’末端及びＲｅｇ遺伝子に有意の相同性を共有している（図１０Ｂ）。さらに、始めの５’アンカーＰＣＲ増幅生成物はＲｅｇ遺伝子の５’末端と６０％の相同性を有し、ヒトＲｅｇ遺伝子のエクソン２と６３％の相同性を有している（図１０Ｃ）。さらに、１−９ａ ｃＤＮＡの５９０ｂｐの５’末端フラグメントから作成したプローブをヒト脳及び膵臓ｍＲＮＡとハイブリダイズさせた(図１２Ａ−１２Ｃ)。１−９ａ配列はまた、これらの完全な配列の一方の末端においてオーバーラップがかなりあるという点においてＡＤ２−２及びＡＤ３−４ ｃＤＮＡと相同でもある（図１０Ｃ）。
【０２１８】
２．２年齢の側頭皮質ライブラリーから単離したＣＮＳ神経糸状タンパク質ｃＤＮＡ
　ＨＢ４クローンは２年齢の側頭皮質ライブラリーから単離した５９３塩基対の部分的ｃＤＮＡである。このｃＤＮＡは５’末端に読み取り枠を含みヌクレオチド２７５で終結している。ヌクレオチド４７５で始まるポリアデニル化シグナルがありこの配列はポリ−Ａテールで終わる（図１１Ｄ）。部分的ＨＢ４クローンの推論されるアミノ酸配列は、分子量１０.４ｋＤａでｐＩが１２.１のタンパクを予言する。ＨＢ４ｃＤＮＡはヒトＰＴＰｃＤＮＡ（図１１Ｅ）、ヒトＲｅｇ遺伝子断片（図１１Ｅ）と核酸全体で５０％の相同性を示す。
【０２１９】
３．アルツハイマー病ライブラリー由来の神経糸状タンパク質ｃＤＮＡの単離
　Ｏ１８ラットＰＴＰｃＤＮＡプローブを用いて４つの関連するｃＤＮＡをＡＤ脳ライブラリーから単離した。これらのクローンはＡＤ２−２、ＡＤ３−４、ＡＤ４−４及びＡＤ１６ｃ（ＡＤ１０−７とも呼ばれる）と命名されている（図１６Ｄ−１６Ｓ）。
【０２２０】
　ＡＤ２−２ｃＤＮＡはおよそ１.２ｋｂであり、１−９ａ ｃＤＮＡ、ＡＤ１６ｃ、ラットＰＴＰｃＤＮＡ及びヒトＲｅｇ遺伝子のエクソン１と有意の相同性を共有している（図１７）。ＡＤ２−２プローブはＡＤ３−４プローブで得られるのと同様のゲノムサザンブロットパターンを生じる。図１６ＥはＡＤ脳ライブラリーから単離されたＡＤ２−２ｃＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を示す。ランダムプライマーは膵臓ＲＮＡを有するグリアセルライン（細胞株）とはハイブリダイズしないがヒト脳及びニューロン試料とハイブリダイズするこの配列に基づいてプローブを生じる。
【０２２１】
　図１６Ｆ、１６Ｉ、１６Ｊ及び１６ＫはＡＤ脳ライブラリーから単離されたＡＤ３−４ｃＤＮＡクローンの部分的なヌクレオチド配列を示している。ランダムプライマーで生じたＡＤ３−４プローブは、１.６ｋＢ及び３.４ｋＢの２つのｍＲＮＡ転写物を生じた。これらのｍＲＮＡの種はＡＤ脳において過剰に発現し、同年齢の対照と比較すると平均で２倍上昇する（Ｎ＝８）。
【０２２２】
　ＡＤ３−４ｃＤＮＡ１.６ｋｂクローンは同時に単離された別のクローン（ＡＤ５−３）と同一である（図１８Ｂ）。ＡＤ３−４／ＡＤ５−３ｃＤＮＡは１−９ａ ５’アンカーＰＣＲ生成物と実質的な相同性を示し（図１８Ｃ）、同様にヒトＲｅｇ遺伝子及びＧｅｎ２ａ−ＥＰゲノムクローンと実質的な相同性を示す（図１８Ｃ）。ＡＤ３−４プローブによるヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット分析はＡＤ２−２プローブにより得られたものと同様のパターンを示した。
【０２２３】
　図１６Ｌ及び１６ＭはＡＤ４−４の部分的ヌクレオチド配列を示し、これは同時に単離された別のｃＤＮＡ（ＡＤ３−５）と同一である０.８ｋｂの部分的ｃＤＮＡクローンである。このＡＤ４−４クローンはＡＤ２−２及び１−９ａ ｃＤＮＡと実質的に相同な配列を共有している（図１９）。図１６ｉはＡＤ脳ライブラリーから単離された部分的なｃＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を示している。このｃＤＮＡは脳及びニューロンセルラインｍＲＮＡとハイブリダイズし、１.４ｋＢの転写物を単独で生じた。
【０２２４】
　図１６Ｏは、ＡＤ２−２と７２％相同である０.５ｋｂの部分的なｃＤＮＡクローンＡＤ１６ｃ（ＡＤ１０−７とも呼ばれる）のヌクレオチド配列を示しており、これもまたヒトＰＴＰ及びヒトＲｅｇ遺伝子配列とともに並んでいる（図２０Ｂ及び２０Ｃ）。
【０２２５】
　図１６ＲはＡＤ脳ライブラリーから単離されたＡＤ１０−７クローンの完全なヌクレオチド配列を示している。アンチセンスｃＲＮＡプローブ又はＤＮＡプローブを生じるランダムプライマーのいずれかを用いるノーザンブロットのハイブリダイゼーションは、ニューロン細胞において２.６、１.９、１.４及び０.９ｋＢのｍＲＮＡ転写物を検出した。ニューロンセルラインは最も大きい２つの転写物のみを発現し、一方成熟した成人のヒトの脳は最も小さい２つの転写物を主に発現し、低いレベルか又は検出不可能なレベルの２.６ｋＢ及び１.９ｋＢの転写物を発現した。ヒトの肝臓、卵巣、ファローピウス管、結腸、胃、脾臓、直腸、甲状腺、１２週目の胎盤及び腎臓から得られたＲＮＡのＡＤ１０−７プローブを用いるノーザンブロット分析はネガティブであった。
【０２２６】
　図１６ＳはＡＤ脳ライブラリーから単離されたＡＤ１６ｃ ｃＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を示している。ＤＮＡプローブを生じるランダムプライマーを用いるノーザンブロットのハイブリダイゼーションからＡＤ１０−７クローンで得られた結果と同じ結果を得た。ＡＤ１６ｃクローンはＡＤ１０−７と同一に近い６５０ｂｐの断片を共有している。さらにノーザンブロット分析により年齢対照脳と比較してＡＤ１６ｃｍＲＮＡのレベルの上昇がＡＤ脳において検出された。
【０２２７】
実施例５
脳糸状タンパク質遺伝子発現の分析
　糸状タンパク質ｍＲＮＡ発現は以下の神経外胚葉腫瘍誘導セルラインにおいて試験した；ＰＮＥＴ１及びＰＮＥＴ２と命名されている中枢神経系初期神経外胚葉腫瘍細胞；ＨＧＬ−１６及びＨＧＬ−１７ヒトグリア芽腫細胞；Ａ１７２ヒトグリオーム細胞；Ｃ６ラットグリオーム細胞；及びＳＨ−Ｓｙ５ｙ神経芽腫細胞。さらにアルツハイマー病の患者又は神経学的疾病のない患者（年齢対照）由来のヒト脳組織、及び胚の及び生後発達するラット脳を糸状タンパク質ｍＲＮＡ発現について分析した。ヒト及びラット膵臓から抽出したＲＮＡはポジティブな対照として用いた。
【０２２８】
　ＲＮＡは５Ｍ　グアジニウムイソシアナート中で抽出し、次いで塩化セシウムのステップグラジェントで遠心分離することにより単離した［サンブルーク（Sambrook）ら，前掲参照］。ＲＮＡを２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸収を測定することにより定量した。糸状タンパク質ｍＲＮＡ転写物の大きさをノーザンブロット分析により分析し、発現のレベルをＲＮＡドットブロットハイブリダイゼーションにより評価した。ノーザンブロット分析は細胞全ＲＮＡ １５μｇを含む試料を１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルで電気泳動することにより行った。ＲＮＡをナイロン膜に移し、紫外線で架橋させて１−９ａ ｃＤＮＡクローンの６００ｂｐフラグメントから作成したプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション実験で用いたフラグメントはヒトＰＴＰｃＤＮＡと最も相同な領域を含んでいる。プローブはランダムプライマー法（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）により［32P］α−ｄＣＴＰで標識した。ブロットは５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ（１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓは２％フィコール、２％ウシ血清アルブミン、２％ポリビニルピロリジンである）、０.５％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、及び１００μｇ／ｍｌのせん断し失活させたサケの精子ＤＮＡを含む緩衝液中、２×１０6ｄｐｍ／ｍｌのプローブでもって４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。膜を標準的な方法を用いて０.２５％ＳＤＳを含むＳＳＰＥ中で洗浄した。オートラジオグラムは膜を−８０℃にてＫｏｄａｋ ＸＡＲフィルムにさらすことによって作成した。続いて膜からプローブを除いた後、１８ｓＲＮＡに対応する合成３０マーと再度ハイブリダイズさせて試料のローディングを評価した。
【０２２９】
　１−９ａ ｃＤＮＡから作成されたプローブを用いる全細胞ＲＮＡのノーザン分析により中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍セルラインにおける２つの主要な転写物が現れた。転写物の１つは１.６ｋｂで他方は０.９ｋｂであった（図１２Ａ）。さらに、ＳＨ−Ｓｙ５ｙ神経芽腫及びＰＥＮＥＴ１セルラインにおいてはより大きい４.２ｋｂのｍＲＮＡ転写物も検出された。４.２ｋｂの転写物は前処理されたｍＲＮＡを示すのかもしれない。同じ大きさの転写物が成体（Ｒ.Ｂｒａｉｎ）及び新生（ＮＢ）ラットにおいて検出されたが０.９ｋｂの転写物は成体の脳においてより多く、一方、１.６ｋｂの転写物は新生ラットの脳においてより多かった。ラット膵臓（Ｒ.Ｐａｎｃ.）においては０.９ｋＢの転写物のみが検出され、これはラットＰＴＰｍＲＮＡの大きさに相当する［テラゾノ（Terazono）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem.），２６３巻，２１１１〜２１１４頁，（１９８８年）；ワタナベ（Watanabe）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem.），２６５巻，７４３２〜７４３９頁，（１９９０年）］。ｍＲＮＡ転写物は正常な肝臓からは検出されなかった（Ｎｌ　Ｌｉｖｅｒ）。１−９ａ ｃＤＮＡの３’領域から作成したプローブを用いると、０.９ｋｂの転写物ではなく１.６ｋｂの転写物が現れた（図１２Ｂ）。５’最末端の１−９ａ ｃＤＮＡに対応する３０マーのプローブを用いるとより高い分子量のｍＲＮＡ転写物が検出された（図１２Ｃ）。０.９ｋｂの転写物もブロットをより長く露出させると明らかになった。
【０２３０】
　ヒト脳ＲＮＡのノーザン分析によって主に１.６ｋｂの転写物が現れたが、１.２ｋｂ、０.９ｋｂ及び０.８ｋｂの２つの、時には３つのより小さな転写物も現れた（図１３Ｂ）。セルラインにおける結果とは対照的に４.２ｋｂのｍＲＮＡ転写物は成人のヒト脳においてまれにしか観察されなかった。ヒト膵臓とのハイブリダイゼーションにより０.８ｋｂの転写物が現れ、これはＰＴＰｍＲＮＡの大きさに相当する。１−９ａプローブを用いてヒト脳及び膵臓において検出された転写物は、ＰＴＰｃＤＮＡプローブを用いて観察された転写物の大きさと同一であった。
【０２３１】
　１−９ａ ｃＤＮＡ（ＮＴＰ）の６００ｂｐフラグメントを用いる全ＲＮＡ ５μｇへのドットブロットＲＮＡハイブリダイゼーションは年齢対照脳と比較してＡＤにおける高いレベルの発現を示した（図１３Ａ）。β−アクチンに対応するｃＤＮＡによる同じ膜の再度のハイブリダイゼーションは各ドットにおいて同様のＲＮＡのローディングを示した。ＡＤ脳組織内における１−９ａ関連ｍＲＮＡレベルの上昇が観察されたことは、ヒトＰＴＰｃＤＮＡに対応する６０マーのプローブを用いて、すでに報告されたものと同様である［デ・ラ・モンテ（de la Monte）ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J．Clin．Invest.），８６巻，１００４〜１０１３頁，（１９９０年）］。ＡＤと対照脳の間の違いは、図１３Ａおよび１３Ｂに示したように１.６ｋｂ、０.９ｋｂ及び０.８ｋｂの転写物のレベルの違いによるようである。
【０２３２】
　ＡＤライブラリーから単離されたＡＤ−ＮＴＰ３−４ｃＤＮＡはニューロン由来神経外胚葉腫瘍セルライン及びヒト脳組織からのＲＮＡとハイブリダイズする。このセルラインにおいて、１−９ａプローブを用いて認められる１.６ｋｂ及び０.９ｋｂの転写物が検出された（図２１Ｃ）。しかし、ヒト脳 においては約４ｋｂ、１.６ｋｂ、及び０.９ｋｂの転写物が検出され、３つの転写物すべての発現のレベルは年齢対照脳と比較するとＡＤにおいてより高かった（図２１Ｄ）。
【０２３３】
　ＡＤ４−４ｃＤＮＡプローブは０.９ｋｂの転写物のみと、しかもニューロンセルラインのみにおいてハイブリダイズした。
【０２３４】
実施例６
神経外胚葉腫瘍セルライン及びアルツハイマー病脳由来の糸状タンパク質ｃＤＮＡの直接クローニング及びシークエンシング
　糸状タンパク質ｃＤＮＡは、ＰＮＥＴ１、ＰＮＥＴ２、ＳＨ−Ｓｙ５ｙ、及びＡ１７２細胞、及びアルツハイマー病及び年齢対照脳由来のＲＮＡから、３'−及び５'−ＲＡＣＥ法を用いて直接クローニングした［フローマン（Frohman）ら，プロシーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンセス・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．USA），８５巻，８９９８頁，（１９８８年）；オオハラ（Ohara）ら，プロシーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンセス・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．USA），８６巻，５６７３頁，（１９８９年）；ロー（Loh）ら，サイエンス（Science），２４３巻，２１７頁，（１９８９年)］。要するに、ＲＮＡはオリゴ−ｄＴプライマーを用いて逆転写した。５'−ＲＡＣＥ反応についてはｃＤＮＡは１−９ａ配列の５'−領域に対応する特異的な１７マー及び１７ｄＴプライマーを用いるポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）によってｃＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ生成物は、別の内部の、しかし重複している５'−末端プライマー、及び１−９ａ配列の３'−領域に対応する特異的な３'−１７マーを用いて別の増幅に付した。３'−ＲＡＣＥ反応についてはｃＤＮＡは最初にターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いてｄＣＴＰでテイリングし、次いで、１−９ａクローンのヌクレオチド７８１〜７９７に対応する特異的１７マー及びｄＧ（１７マー）を用いて増幅した。２回目のＰＣＲ増幅は３'末端のヌクレオチド７６６〜７９２に対応する特異的１７マー及び５'末端についてはｄＧＴＰ（１７マー）を用いて行った。ＰＣＲ生成物は１−９ａ ｃＤＮＡクローンの内部のＤＮＡフラグメント及びＯ１８ラットＰＴＰｃＤＮＡクローンから作成したプローブを用いるサザンブロット分析に付した。ＰＣＲ生成物はゲル精製し、ウラシルデオキシトランスフェラーゼを用いてｐＡｍｐｌベクターに結合させた。サブクローンしたＤＮＡ挿入物をＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いるデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により配列させた。
【０２３５】
　ＣＮＳ糸状タンパク質転写物は、逆転写とそれに続く１−９ａ ｃＤＮＡ配列の５'及び３'領域に対応する特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって神経外胚葉腫瘍セルライン及びヒトＡＤ脳組織において検出された。ＰＣＲ精製物のサザンブロット分析は、０.８ｋｂ及び１.０ｋｂの主に２つのクロスハイブリダイズしたものを示した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。さらに、ＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞においてはより大きな１.８ｋｂのＰＣＲ生成物も検出された。ＰＮＥＴ１、ＰＮＥＴ２、ＳＨ−Ｓｙ５ｙ、及びＡ１７２細胞においては１−９ａプローブとハイブリダイズする０.４ｋｂのＰＣＲ生成物が観察された。アルツハイマー病脳における糸状タンパク質ｍＲＮＡのより高いレベルに対応して、ＡＤ試料におけるハイブリダイゼーションシグナルは年齢対照試料と比較するとより強かった。
【０２３６】
　ＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞から生成したＰＣＲ生成物をサブクローンし配列決定した。クローンしたフラグメントのサザンブロット分析により１−９ａ ｃＤＮＡとの強いハイブリダイゼーションが示され、Ｏ１８ｃＤＮＡとは弱いが明確なハイブリダイゼーションを示した（ラットＰＴＰ）（図１４Ｃ）。ＳＨ−Ｓｙ５ｙＰＣＲクローン（Ｓｙ−ＮＴＰ）の核酸配列は１−９ａ ｃＤＮＡ配列と同一であった。
【０２３７】
実施例７
ヒト脳糸状タンパク質をコードするゲノムクローンの単離
　ヒトゲノムＤＮＡライブラリーを２年齢の側頭皮質ライブラリーから単離した１−９ａ ヒト脳糸状タンパク質ｃＤＮＡの６００ｂｐフラグメントで作成したプローブを用いてスクリーニングした。１−９ａ ｃＤＮＡフラグメントはヒトＰＴＰと６０％の核酸配列が相同である領域を含んでいた。コロニー精製の後、推定上のゲノムクローンはＯ１８ラットＰＴＰｃＤＮＡフラグメントとのクロスハイブリダイゼーションにつきチェックした。１−９ａ及びＯ１８プローブの両方とハイブリダイズするＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、及びＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ制限フラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ IIベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にサブクローンし、次いでＴ７ポリメラーゼ（ＵＳＢシークエナーゼ）又はポリメラーゼチェイン反応増幅及びＶｅｎｔポリメラーゼのいずれかを用いるデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法によって配列決定した。
【０２３８】
　Ｇ２−２ＰｓｔＩ、Ｇ２−２ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ、Ｇ５ｄ−１ＰｓｔＩ、及びＧ５ｄ−１ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩと命名された４つのゲノムフラグメントをヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離した（図２２Ｂ〜２２Ｅ）。これらのゲノムフラグメントはすべて１−９ａとＯ１８ｃＤＮＡプローブの両方とハイブリダイズし、それらは１.５ｋｂから３ｋｂの範囲の大きさである。部分的な核酸配列の情報は、Ｇ２−２ＰｓｔＩとヒトＲｅｇ遺伝子、及びヒト及びラットＰＴＰｃＤＮＡとの間（図２３Ｂ）；Ｇ２−２ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩと両方のＲｅｇ遺伝子、及びラットＰＴＰｃＤＮＡとの間（図２３Ｃ）、またＡＤ２−２、ＡＤ３−４及び１−９ａ ｃＤＮＡ（データなし）との間；Ｇ５ｄ−１ＰｓｔＩとＲｅｇ遺伝子、及びヒトＰＴＰとの間（図２３Ｄ）；及びＧ５ｄ−１ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩとＲｅｇ遺伝子、ヒトＰＴＰ、１−９ａ、及びＡＤ４−４との間の相同性を示している。
【０２３９】
実施例８
ＬａｃＺ融合タンパクのインビトロ発現及び糸状タンパク質に対する関連性の実証
　１−９ａ ｃＤＮＡクローンを含むバクテリア内の融合タンパクの発現、又は４つのゲノムクローンの内の１つを標準的な方法（Sambrookら，前掲）を用いてイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。誘導された又は誘導されなかった培養細胞からの未精製のバクテリアのリゼイト（溶解物）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、糸状タンパク質に対するＴｈ９モノクローナル抗体［ササキ（Sasaki）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem.），２６８巻，１〜４頁，（１９９３年）］及び125Ｉで標識されたタンパクＡを用いるウエスタンブロット分析に付し、結合した抗体を検出した。さらに、クローンしたＤＮＡを含んでいるバクテリアの菌叢を、ＩＰＴＧで融合タンパクを発現させるために誘導し、レプリカフィルターをＴｈ９モノクローナル抗体、次いで125Ｉ標識タンパクＡで直接プローブした。
【０２４０】
　糸状タンパク質の免疫反応性は、ＩＰＴＧを誘導したコロニーへの抗体の直接の結合によってバクテリア融合タンパクにおいて示された（図２４Ａ−２４Ｄ）。糸状タンパク質の免疫反応性はＰＴＰに対するＴｈ９、Ｔｈ７、及びＴｈ１０モノクローナル抗体のカクテル［ササキ（Sasaki）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．Biol．Chem.），２６８巻，１〜４頁，（１９９３年）］、及び125Ｉで標識されたタンパクＡを用いて検出した。
【０２４１】
実施例９
ＡＤ及び年齢対照脳におけるＡＤ１６ｃ ｍＲＮＡの相対レベル
　ノーザンブロット分析をＡＤ１６ ｃＤＮＡプローブを用いて行った。ブロットは再度プローブして１８ｓリボソームＲＮＡを検出し、各レーン中のＲＮＡのローディングを評価した。不飽和（ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ）のオートラジオグラムをＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｉｍａｇｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒを用いる濃度分析に付した。ＡＤ１６ｃ及び１８ｓＲＮＡハイブリダイゼーションシグナルの比率をそれぞれの場合についてプロットし、結果を図２５Ａおよび２５Ｂにグラフで示した。平均の比率（ＡＤ１６ｃの相対レベル）を標準誤差とともに小さい右側のグラフに示した。結果は、年齢を一致させた対照が６の内１つであることと比較してＡＤ脳は９の内６つにＡＤ１６ｃ ｍＲＮＡ発現のレベルが上昇していることを確認した。平均レベルの違いは統計学的に高い有意性がある（Ｐ＜０.００５）。同様の結果がＡＤ１０−７プローブを用いて得られた。これらの結果は、対照脳と比較してＡＤ脳における発現レベルにおいて統計学的に有意な上昇があることを示している。
【０２４２】
実施例１０
組み換えＡＤ１０−７融合タンパクの調製及びモノクローナル抗体によるそれらの検出
　ＡＤ１０−７ｃＤＮＡを３つの異なる読み取り枠内（２つは不正確なＡ及びＢ、そして正確なＣ）でｐＴｒｃＨＩＳベクター（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）に結合した。３つのプラスミドの内の１つで形質転換したバクテリアをＩＰＴＧで誘導し、バクテリアのリゼイトをタンパクの発現について０、１及び５時間後に試験した。タンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ウエスタンブロット分析を発現した標識タンパクに対するモノクローナル抗体（Ｔ７−標識マウスモノクローナル抗体；Ｎｏｖｏｇｅｎ）を用いて行った。ブロットはアビジン−ビオチン、色原体としてジアミノベンジジンを用いるセイヨウワサビペルオキシダーゼ法で展開した（図２６）。約４５ｋＤＡに相当するバンドをＡＤ１０−７が正確な読み取り枠（Ｃ）にのみ結合しているプラスミドＤＮＡで形質転換したバクテリア内に検出した（矢印）。同じ大きさのタンパクがウサギ網状赤血球リゼイト分析系においてインビトロのＡＤ１０−７ｃＤＮＡの翻訳によって観察された。両方の系において融合相手のペプチドは約３ｋＤＡであり、約４２ｋＤＡのタンパクをコードするｃＤＮＡであることを示している。約４２ｋＤＡのＮＰＴ種はニューロンセルライン及びヒト脳組織のウエスタンブロット分析によって通常どおり検出される。
【０２４３】
実施例１１
インシトゥハイブリダイゼーションによるＡＤ１０−７ｍＲＮＡ発現のニューロンの局在化の実証
　センス及びアンチセンスｃＲＮＡプローブはＳＰ６又はＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて直線化したＡＤ１０−７プラスミドＤＮＡからそれぞれ作成した。アンチセンスプローブはこのクローンについて前記したようにニューロンセルラインｍＲＮＡとハイブリダイズした。一方、ｃＲＮＡセンスプローブはノーザンブロット分析ではＲＮＡとハイブリダイズしなかった。ジゴキシゲニン−ＵＴＰで標識されたｃＲＮＡプローブは初期のＡＤ由来のヒト脳組織断片とハイブリダイズした。この断片をよく洗浄した後［デ・ラ・モンテ（de la Monte）ら，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J．Clin．Invest.），８６巻，１００４〜１０１３頁，（１９９０年）］ハイブリダイズしたプローブを、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼを抱合したジゴキシゲニンに対するモノクローナル抗体を用いて検出し、標準的な方法を用いて比色反応した。明視野及び暗視野顕微鏡による断片の試験はニューロンにおいてのみＡＤ１０−７のハイブリダイゼーションが示された（図２７；（図２７Ａ）の細胞体上の白い粒子の集塊）。対照的に、ノーザンブロット分析による結果と同様にセンスＡＤ１０−７ｃＲＮＡプローブは脳組織（図２７Ｂ）とハイブリダイズしなかった。
【０２４４】
　前記の記載は特定の好ましい態様であるけれども、本発明がそのように制限されないことは理解されるであろう。当業者は様々な変更をして開示された態様になし得ることを想到し得るが、そのような態様は本発明の範囲内にあり、本発明は以下の請求の範囲によって定義される。
【０２４５】
　本明細書中で記載したすべての出版物及び特許出願は本発明に属する技術分野における技術レベルを表す。すべての出版物及び特許出願は、それぞれの出版物又は特許出願がそれらの全内容において引用されるものとして特別にそして個別に示されるのと同程度に参考のために引用される。
【０２４６】
微　生　物
（寄託機関の名称）
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（寄託機関の住所）
アメリカ合衆国メリーランド２０８５２、
ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１号
（寄託日）　　　　　　　　 （受託番号）
１９９３年　３月１６日　　　６９２５７
（追加表示）
エセリヒア　コリ（大腸菌）：Ｇ２−２ＰstＩ−ＤＨ５
微　生　物
（寄託機関の名称）
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（寄託機関の住所）
アメリカ合衆国メリーランド２０８５２、
ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１号
（寄託日）　　　　　　　　 （受託番号）
１９９３年　３月１６日　　　６９２５８
（追加表示）
エセリヒア　コリ：Ｇ５d−ＰstＩ−ＤＨ５
　                              微　生　物
（寄託機関の名称）
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（寄託機関の住所）
アメリカ合衆国メリーランド２０８５２、
ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１号
（寄託日）　　　　　　　　 （受託番号）
１９９３年　３月１６日　　　６９２５９
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エセリヒア　コリ：１−９a−ＬＸ−１ blue
微　生　物
（寄託機関の名称）
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（寄託機関の住所）
アメリカ合衆国メリーランド２０８５２、
ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１号
（寄託日）　　　　　　　　 （受託番号）
１９９３年　３月１６日　　　６９２６０
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エセリヒア　コリ：ＡＤ３−４−ＤＨ１
微　生　物
（寄託機関の名称）
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（寄託機関の住所）
アメリカ合衆国メリーランド２０８５２、
ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１号
（寄託日）　　　　　　　　 （受託番号）
１９９３年　３月１６日　　　６９２６１
（追加表示）
エセリヒア　コリ：ＨＢ４−ＸＬ−ｂlue
微　生　物
（寄託機関の名称）
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（寄託機関の住所）
アメリカ合衆国メリーランド２０８５２、
ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１号
（寄託日）　　　　　　　　 （受託番号）
１９９３年　３月１６日　　　６９２６２
（追加表示）
エセリヒア　コリ：ＡＤ１０−７−ＤＨ１
微　生　物
（寄託機関の名称）
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（寄託機関の住所）
アメリカ合衆国メリーランド２０８５２、
ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１号
（寄託日）　　　　　　　　 （受託番号）
１９９３年　３月１６日　　　６９２６３
（追加表示）
エセリヒア　コリ：ＡＤ２−２−ＤＨ１
微　生　物
（寄託機関の名称）
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（寄託機関の住所）
アメリカ合衆国メリーランド２０８５２、
ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１号
（寄託日）　　　　　　　　 （受託番号）
１９９３年　３月１６日　　　６９２６４
（追加表示）
エセリヒア　コリ：Ｇ５d−１ＰstＩ−ＥcoＲＩ−ＤＨ５
微　生　物
（寄託機関の名称）
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（寄託機関の住所）
アメリカ合衆国メリーランド２０８５２、
ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１号
（寄託日）　　　　　　　　 （受託番号）
１９９３年　３月１６日　　　６９２６５
（追加表示）
エセリヒア　コリ：Ｇ２−２ＰstＩ−ＥcoＲＩ−ＤＨ５
【図面の簡単な説明】
【０２４７】
【図１】図１Ａ−１Ｊは、中枢神経系由来の腫瘍における神経糸状タンパク質の免疫反応性を示す。
【図２】図２は、前サンドイッチモノクローナル抗体ベースの放射免疫アッセイ（Ｍ−ＩＲＭＡ）により測定したＰＮＥＴ１、ＰＮＥＴ２、Ａ１７２、Ｃ６、およびＨｕｈ７肝細胞癌腫細胞中の神経糸状タンパク質レベルを示すグラフである。
【図３】図３は、Ｔｈ９モノクローナル抗体を用いた免疫沈降およびウエスタンブロット分析により決定したＳＨ−Ｓｙ５ｙ、Ａ１７２、およびＣ６細胞中の神経糸状タンパク質の分子サイズを示す。
【図４】図４Ａ−４Ｂは、35Ｓ−メチオニンを用いたパルスチェイス代謝標識、およびＴｈ９モノクローナル抗体を用いた免疫沈降（図４Ａ）により示された、ＰＮＥＴ１細胞（ａ）およびＣ６膠芽細胞腫細胞（ｂ）中の神経糸状タンパク質の分子サイズを示す。分子量は８、１４、１７、２１、２６および４２ｋＤａである（矢印）。
【図５】図５Ａ−５Ｅは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／Ｍ−ＩＲＭＡにより、ＳＨ−Ｓｙ５ｙ、ＰＮＥＴ１、Ａ１７２、およびＣ６細胞中の２１ｋＤａおよび１７ｋＤａ神経糸状タンパク質の存在およびＨｕｈ７細胞中の該タンパク質の不在を示す５つの一連のグラフを示す。
【図６】図６は、Ｃ６膠芽細胞腫細胞中の２１ｋＤａ神経糸状タンパク質がリン酸化されていることを示すゲルを示す。
【図７】図７は、増殖期のＰＮＥＴ１細胞における変化した神経糸状タンパク質発現を示す棒グラフを示す。
【図８】図８Ａ−８Ｆは、細胞増殖が停止し一夜血清飢餓（欠乏）させたＰＮＥＴ１細胞の変化した表現型を示す。
【図９】図９Ａ−９Ｂは、１−９ａ部分ｃＤＮＡ配列を示し、図９Ｂは該１−９ａ ｃＤＮＡの５'領域に対応する第二の５’アンカーＰＣＲ産物の部分配列（ＷＰ５’配列）を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、１−９ａとヒトＰＴＰおよびＲｅｇ遺伝子（ヒトＰＴＰのゲノムクローンに対応する核酸配列）との部分配列のアラインメントを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、１−９ａとヒトＲｅｇ遺伝子のエクソン２とのアラインメント、および１−９ａの第一の５’アンカーＰＣＲ産物（ＷＰ０３−４１７）とエクソン２およびＲｅｇとのアラインメントを示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、１−９ａおよびその第二の５’アンカーＰＣＲ産物（ＷＰ５’）とＡＤ３−４およびＡＤ２−２ ｃＤＮＡとのアラインメントを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＨＢ４ ｃＤＮＡの部分核酸配列およびそれから導かれたアミノ酸配列を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、タンパク質親水性ウインドウプロット（protein hydrophilicity window plot）を示す。親水性ウインドウサイズ＝７、スケール＝Kyte-Doolittle。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、タンパク質親水性ウインドウプロット（protein hydrophilicity window plot）を示す。親水性ウインドウサイズ＝７、スケール＝Kyte-Doolittle。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ＨＢ４とヒトＰＴＰとのアラインメントを示す。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、ＨＢ４とヒトＲｅｇ遺伝子とのアラインメントを示す。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｃは、神経外胚葉性腫瘍細胞株およびラット膵臓における１−９ａ中枢神経系神経糸状タンパク質ｃＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡ分子の発現を示す。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｂは、ヒト脳における１−９ａ中枢神経系神経糸状タンパク質ｃＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡ転写物を示す。この図はまた、老年の匹敵対照に比べてアルツハイマー病の脳において一層高レベルの１−９ａ中枢神経系神経糸状タンパク質関連ｍＲＮＡを示している（図１３Ａ）。図１３Ｂは、老年の対照に比べてアルツハイマー病において分子サイズの小さなｍＲＮＡが豊富な４つの異なる転写物を示す。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｃは、神経外胚葉性細胞株におけるＲＴ／ＰＣＲ由来ｃＤＮＡの１−９ａサザーンブロット分析を示す。神経外胚葉細胞株における１−９ａ ｍＲＮＡのＡ−およびＢ−ＰＣＲ増幅、新生のラット（ＮＢ）脳、アルツハイマー病の脳、および老年対照脳を使用。図１４Ａは図１４Ｂよりも長く暴露したものである。図１４ＣはＯ１８ラットＰＴＰプローブを用いた同ブロットのハイブリダイゼーションを示す。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＳＥ−ＲＴ／ＰＣＲは、ｍＲＮＡを逆転写し、１−９ａ部分ｃＤＮＡの既知配列に対応するプライマーを用いて増幅することによってＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞から単離した幾つかのクローンとの１−９ａおよびＯ１８プローブのハイブリダイゼーションを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、アルツハイマー病の脳ライブラリーから単離したＡＤ２−２ ｃＤＮＡの部分核酸配列を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＡＤ２−２Ｔ７の親水性ウインドウプロットを示す。親水性ウインドウサイズ＝７、スケール＝Kyte-Doolittle。
【図１６Ｃ】ＡＤ２−２Ｔ７の親水性ウインドウプロットを示す。親水性ウインドウサイズ＝７、スケール＝Kyte-Doolittle。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、アルツハイマー病の脳ライブラリーから単離したＡＤ２−２ ｃＤＮＡの部分核酸配列を示す。
【図１６Ｅ】図１６Ｅは、アルツハイマー病の脳ライブラリーから単離したＡＤ２−２ ｃＤＮＡの部分核酸配列を示す。
【図１６Ｆ】図１６Ｆは、アルツハイマー病の脳ライブラリーから単離したＡＤ３−４ ｃＤＮＡの部分核酸配列を示す。
【図１６Ｇ】図１６Ｇは、ＡＤ３−４の親水性ウインドウプロットを示す。親水性ウインドウサイズ＝７、スケール＝Kyte-Doolittle。
【図１６Ｈ】図１６Ｈは、ＡＤ３−４の親水性ウインドウプロットを示す。親水性ウインドウサイズ＝７、スケール＝Kyte-Doolittle。
【図１６Ｉ】図１６Ｉは、アルツハイマー病の脳ライブラリーから単離したＡＤ３−４ ｃＤＮＡの部分核酸配列を示す。
【図１６Ｊ】図１６Ｊは、アルツハイマー病の脳ライブラリーから単離したＡＤ３−４ ｃＤＮＡの部分核酸配列を示す。
【図１６Ｋ】図１６Ｋは、アルツハイマー病の脳ライブラリーから単離したＡＤ３−４ ｃＤＮＡの部分核酸配列を示す。
【図１６Ｌ】図１６Ｌは、アルツハイマー病の脳ライブラリーから単離したＡＤ４−４ ｃＤＮＡの部分核酸配列を示す。
【図１６Ｍ】図１６Ｍは、アルツハイマー病の脳ライブラリーから単離したＡＤ４−４ ｃＤＮＡの部分核酸配列を示す。
【図１６Ｎ】図１６Ｎは、アルツハイマー病の脳ライブラリーから単離したＡＤ４−４ ｃＤＮＡの部分核酸配列を示す。
【図１６Ｏ】図１６Ｏは、アルツハイマー病の脳ライブラリーから単離したＡＤ１６ｃ（ＡＤ１０−７とも称する）ｃＤＮＡの部分核酸配列を示す。
【図１６Ｐ】図１６Ｐは、ＡＤ１６ｃ−Ｔ７の親水性ウインドウプロットを示す。親水性ウインドウサイズ＝７、スケール＝Kyte-Doolittle。
【図１６Ｑ】図１６Ｑは、、ＡＤ１６ｃ−Ｔ７の親水性ウインドウプロットを示す。親水性ウインドウサイズ＝７、スケール＝Kyte-Doolittle。
【図１６Ｒ】図１６Ｒは、アルツハイマー病のライブラリーから単離したＡＤ１０−７ ｃＤＮＡクローンの完全ヌクレオチド配列を示す。
【図１６Ｓ】図１６Ｓは、アルツハイマー病の脳ライブラリーから単離したＡＤ１６ｃ ｃＤＮＡの完全核酸配列を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＡＤ２−２とヒトＲｅｇ遺伝子との部分配列のアラインメントを示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＡＤ２−２とＲｅｇのエクソン１およびラットＰＴＰとの部分配列のアラインメントを示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＡＤ２−２と１−９ａとの部分配列のアラインメントを示す。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、ＡＤ２−２とＡＤ１６ｃとの部分配列のアラインメントを示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＡＤ３−４（ＡＤ５−３とも称する）とＲｅｇ遺伝子との部分配列のアラインメントを示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＡＤ３−４と１−９ａ ｍＲＮＡの５’アンカーＰＣＲ産物（ＷＰＯ３−５および１８−４と称する）との部分配列のアラインメントを示す。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、ＡＤ３−４とＧ２ａ−ａ ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩゲノムクローンとの部分配列のアラインメントを示す。
【図１９】図１９は、ＡＤ４−４とＡＤ２−２および１−９ａ（１−９ａと同一のＰＣＲクローンに対応してＳＥ−４とも称する）との部分配列のアラインメントを示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、ＡＤ１６ｃとＲｅｇ遺伝子との部分配列のアラインメントを示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ＡＤ１６ｃとヒトＰＴＰとの部分配列のアラインメントを示す。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、ＡＤ１６ｃとＡＤ２−２との部分配列のアラインメントを示す。
【図２１】図２１Ａは、プローブとしてＡＤ３−４を用いたゲノムサザーンブロット分析を示す。図２１Ｂは、プローブとしてＡＤ２−２を用いたゲノムサザーンでの同様のハイブリダイゼーションパターンを示す。図２１Ｃは、プローブとしてＡＤ３−４を用いた神経外胚葉性腫瘍細胞株のノーザンブロット分析を示す。ＡＤ３−４転写物を示す４つの細胞株は表現型がニューロン性である。Ｃ６神経膠腫細胞のｍＲＮＡはＡＤ３−４プローブとハイブリダイズしなかった。図２１Ｄは、ＡＤ３−４プローブを用いたヒトアルツハイマー病および老年対照の脳側頭葉組織のノーザン分析を示し、老年対照脳（Ｃのレーン）に比べてアルツハイマー病（Ａのレーン）においては対応遺伝子が過剰発現していることを示している。
【図２２】図２２Ａ−２２Ｉは、４つのゲノムクローン（プローブとして１−９ａ ｃＤＮＡおよびＰＴＰ Ｏ−１８ ｃＤＮＡの両者を使用して単離）の部分配列を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、Ｇ２ａ−２ ＰｓｔＩの部分配列とＲｅｇ遺伝子とのアラインメントを示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、Ｇ２ａ−２ ＰｓｔＩの部分配列とＲｅｇ遺伝子とのアラインメントを示す。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、Ｇ２ａ−２ ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ配列とＲｅｇ遺伝子およびラットＰＴＰとのアラインメントを示す。
【図２３Ｄ】図２３Ｄは、Ｇ５ｄ−１ ＰｓｔＩ配列とＲｅｇ遺伝子とのアラインメントを示す。
【図２３Ｅ】図２３Ｅは、Ｇ５ｄ−１ ＰｓｔＩ配列とＲｅｇ遺伝子とのアラインメントを示す。
【図２４】１−９ａ ｃＤＮＡ（図２４Ａ）およびＧ２ａ−２ ＰｓｔＩゲノムクローン（図２４Ｂ）による神経糸状タンパク質の発現を示す。図２４Ｃおよび図２４Ｄは、それぞれ、Ｇ５ｄ−１ ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩゲノムクローン、およびｐＢluescript（クローン化挿入物を欠く）による陰性発現を示す。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、アルツハイマー病の脳および老年対照脳におけるＡＤ１６ｃ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。これらデータは、老年匹敵対照では６のうち１であるのに比べてアルツハイマー病では９のうち６というふうに、ＡＤ１６ｃ ｍＲＮＡの発現レベルが上昇した。
【図２６】図２６は、発現した標識タンパク質に対するモノクローナル抗体（Ｔ７−標識したマウスモノクローナル抗体）を用いたＡＤ１０−７融合タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。
【図２７】図２７Ａおよび２７Ｂは、初期アルツハイマー病のヒト脳組織切片へのセンスおよびアンチセンスｃＲＮＡプローブのインシトゥハイブリダイゼーションの明野および暗野顕微鏡分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
2004097227.tif 000032
【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１６Ｋ】
2004097227.tif 000038
【図１６Ｌ】
2004097227.tif 000039
【図１６Ｍ】
2004097227.tif 000040
【図１６Ｎ】
2004097227.tif 000041
【図１６Ｏ】
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【図１６Ｐ】
2004097227.tif 000043
【図１６Ｑ】
2004097227.tif 000044
【図１６Ｒ】
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【図１６Ｓ】
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【図１７Ａ】
2004097227.tif 000047
【図１７Ｂ】
2004097227.tif 000048
【図１７Ｃ】
2004097227.tif 000049
【図１７Ｄ】
2004097227.tif 000050
【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
2004097227.tif 000052
【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
2004097227.tif 000056
【図２０Ｃ】
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【図２１】
2004097227.tif 000058
【図２２Ａ】
2004097227.tif 000059
【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
2004097227.tif 000062
【図２２Ｅ】
2004097227.tif 000063
【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
2004097227.tif 000065
【図２２Ｈ】
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【図２２Ｉ】
2004097227.tif 000067
【図２３Ａ】
2004097227.tif 000068
【図２３Ｂ】
2004097227.tif 000069
【図２３Ｃ】
2004097227.tif 000070
【図２３Ｄ】
2004097227.tif 000071
【図２３Ｅ】
2004097227.tif 000072
【図２４】
2004097227.tif 000073
【図２５】
2004097227.tif 000074
【図２６】
2004097227.tif 000075
【図２７】
2004097227.tif 000076