(57)【要約】【課題】高血圧症の遺伝子診断に用いる核酸プローブおよびプライマーの提供。【解決手段】ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる核酸分子であって、前記遺伝子のプロモーター領域のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて前記変異を有してなるポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子のプロモーター領域のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を有してなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１中の第１〜３４６９ヌクレオチドで表わされるヌクレオチド配列において、配列番号１に示される第１２０４番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を有してなる、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において、配列番号１に示される第１２０４番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなる、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる核酸分子であって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項８】
高血圧症の予測または診断に用いるための、請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうるプライマーペアであって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、プライマーペア。
【請求項１０】
高血圧症の予測または診断に用いるための、請求項９に記載のプライマーペア。
【請求項１１】
ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子の変異を検出することにより、高血圧症を予知または検出する方法であって、
請求項５〜８のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項９もしくは１０に記載のプライマーペアを用いて、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項１２】
請求項５〜８のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項９もしくは１０に記載のプライマーペアを含んでなる、高血圧症の予測または診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子の変異を検出することによる高血圧症の遺伝子診断およびこれに用いるための核酸分子に関する。
【０００２】
背景技術
動脈硬化や高血圧に関連する因子の一つとして、酸化ストレスが知られている。そして、生体内における酸化ストレスに対する防御機構としてスカベンジャーによるものが知られており、このようなスカベンジャーとしてスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）が存在する。
【０００３】
ＳＯＤには、細胞内ＳＯＤ（Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ：ＳＯＤ１）、ミトコンドリア内ＳＯＤ（Ｍｎ−ＳＯＤ：ＳＯＤ２）、細胞外ＳＯＤ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ−ＳＯＤ：ＳＯＤ３）の３種類が存在する。これらのうち、ＳＯＤ３タンパク質は、ＳＯＤ３遺伝子（４ｐ１６．３−ｑ２１）により発現する。
【０００４】
このＳＯＤ３遺伝子においては幾つかの遺伝子多型が知られているが、そのうち、Ａｒｇ２１３Ｇｌｙ変異に関しては、ＳＯＤ３の機能や疾患との関連について報告されている。例えば、５０４人のスエーデン人のＳＯＤ３活性を測定したところ、２．２％にあたる人が１０倍程度の活性を示し、このような高い活性を示すＳＯＤ３がＡｒｇ２１３Ｇｌｙ変異を有することが報告されている（非特許文献１：Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ　Ｊ，　Ｎｉｌｓｓｏｎ　Ｐ，　Ｋａｒｌｓｓｏｎ　Ｋ，　Ｍａｒｋｌｕｎｄ　ＳＬ．，　１０−ｆｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｓｍａ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ａ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６９，　１９９４，　１９１６３−６）。この報告には、高い活性を有するＳＯＤ３が、通常のＳＯＤ３に比べて同等の比活性を有するものの、低いヘパリン親和性を有することも記載されている。また、血中での活性が高い上記ＳＯＤ３は、コレステロールやトリグリセリドの高値に関連することが報告されている（非特許文献２：Ｍａｒｋｌｕｎｄ　ＳＬ，　Ｎｉｌｓｓｏｎ　Ｐ，　Ｉｓｒａｅｌｓｓｏｎ　Ｋ，　Ｓｃｈａｍｐｉ　Ｉ，　Ｐｅｌｔｏｎｅｎ　Ｍ，　Ａｓｐｌｕｎｄ　Ｋ．，　Ｔｗｏ　ｖａｒｉａｎｔｓ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ−ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ：　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｔｏ　ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ａｎ　ｕｎｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｍｉｄｄｌｅ−ａｇｅｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，　Ｊ．　Ｉｎｔｅｒｎ．　Ｍｅｄ．　２４２，　１９９７，　５−１４）。さらに、Ａｒｇ２１３Ｇｌｙ多型は、２型糖尿病患者の心血管系疾患の発症に関連しないことが報告されている（非特許文献３：Ｕｋｋｏｌａ　Ｏ，　Ｅｒｋｋｉｌａ　ＰＨ，　Ｓａｖｏｌａｉｎｅｎ　ＭＪ，　Ｋｅｓａｎｉｅｍｉ　ＹＡ．，　Ｌａｃｋ　ｏｆ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｏｆ　ｃａｔａｌａｓｅ，　ｃｏｐｐｅｒ−ｚｉｎｃ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ　（ＳＯＤ），　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ＳＯＤａｎｄ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｍａｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｙｐｅ　２　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ，　Ｊ．　Ｉｎｔｅｒｎ．　Ｍｅｄ．　２４９，　２００１，　４５１−９）。
【０００５】
また、日本人における、血清中のＳＯＤ３活性とＳＯＤ３遺伝子中の多型との関連が報告されている（非特許文献４：Ｙａｍａｄａ　Ｈ，　Ｙａｍａｄａ　Ｙ，　Ａｄａｃｈｉ　Ｔ，　Ｇｏｔｏ　Ｈ，　Ｏｇａｓａｗａｒａ　Ｎ，　Ｆｕｔｅｎｍａ　Ａ，　Ｋｉｔａｎｏ　Ｍ，　Ｍｉｙａｉ　Ｈ，　Ｆｕｋａｔｓｕ　Ａ，　Ｈｉｒａｎｏ　Ｋ，　ＫａｋｕｍｕＳ．，　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ　（ＥＣ−ＳＯＤ）　ｇｅｎｅ：　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ　ＥＣ−ＳＯＤ　ｌｅｖｅｌ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ，　Ｊｐｎ．Ｊ．　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅｔ．　４２，　１９９７，　３５３−６）。
【０００６】
しかし、ＳＯＤ３遺伝子をはじめとするＳＯＤ遺伝子における多型と高血圧症との関連についての報告はない。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ　Ｊ，　Ｎｉｌｓｓｏｎ　Ｐ，　Ｋａｒｌｓｓｏｎ　Ｋ，　Ｍａｒｋｌｕｎｄ　ＳＬ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６９，　１９９４，　１９１６３−６
【非特許文献２】
Ｍａｒｋｌｕｎｄ　ＳＬ，　Ｎｉｌｓｓｏｎ　Ｐ，　Ｉｓｒａｅｌｓｓｏｎ　Ｋ，　Ｓｃｈａｍｐｉ　Ｉ，　Ｐｅｌｔｏｎｅｎ　Ｍ，　Ａｓｐｌｕｎｄ　Ｋ．，　Ｊ．　Ｉｎｔｅｒｎ．　Ｍｅｄ．　２４２，　１９９７，　５−１４
【非特許文献３】
Ｕｋｋｏｌａ　Ｏ，　Ｅｒｋｋｉｌａ　ＰＨ，　Ｓａｖｏｌａｉｎｅｎ　ＭＪ，　Ｋｅｓａｎｉｅｍｉ　ＹＡ．，　Ｊ．　Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．　２４９，　２００１，　４５１−９
【非特許文献４】
Ｙａｍａｄａ　Ｈ，　Ｙａｍａｄａ　Ｙ，　Ａｄａｃｈｉ　Ｔ，　Ｇｏｔｏ　Ｈ，　Ｏｇａｓａｗａｒａ　Ｎ，　Ｆｕｔｅｎｍａ　Ａ，　Ｋｉｔａｎｏ　Ｍ，　Ｍｉｙａｉ　Ｈ，　Ｆｕｋａｔｓｕ　Ａ，　Ｈｉｒａｎｏ　Ｋ，　Ｋａｋｕｍｕ　Ｓ．，　Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅｔ．　４２，　１９９７，　３５３−６
【０００８】
【発明の概要】
本発明者らは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子において、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を見出し、さらにこの変異が高血圧症の診断に利用可能であることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００９】
従って、本発明は、上記の変異を有する変異型ポリヌクレオチド、高血圧症の遺伝子診断に用いるための核酸分子およびプライマーペア、診断用キット、ならびに高血圧症の予知／検出方法の提供を目的とする。
【００１０】
そして、本発明による変異型ポリヌクレオチドは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子のプロモーター領域のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を有してなるポリヌクレオチドである。
【００１１】
さらに、本発明による核酸分子は、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる核酸分子であって、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる核酸分子である。
【００１２】
さらに、本発明によるプライマーペアは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうるプライマーペアであって、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるプライマーペアである。
【００１３】
さらに、本発明による高血圧症の予知／検出方法は、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子の変異を検出することにより、高血圧症を予知または検出する方法であって、本発明による核酸分子、および／または本発明によるプライマーペアを用いて、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出する工程を含んでなる方法である。
【００１４】
さらに、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる、高血圧症の予測または診断用キットである。
【００１５】
【発明の具体的説明】
本発明によれば、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ３（本明細書において「ＳＯＤ３」という）遺伝子における変異を検出することにより、高血圧症の遺伝子診断が可能となる。
【００１６】
本発明により検出されるＳＯＤ３遺伝子中の変異は、そのプロモーター領域中に存在するものであり、ＳＯＤ３遺伝子の翻訳開始点、すなわち翻訳開始コドン「ＡＴＧ」のうちの「Ａ」、に対して６７９７ヌクレオチド上流（第−６７９７番）に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異（本明細書において「Ｃ−６７９７Ｔ変異」という）である。ここで、「上流に位置する」とは、遺伝子において、そのヌクレオチド残基が比較対象となるヌクレオチド残基よりも５’側に存在することを意味する。ＳＯＤ３遺伝子のヌクレオチド配列としては、例えば、配列番号１で表わされるゲノム配列（Ｒ．Ｊ．　Ｆｏｌｚ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２２，　１６２−１７１，　１９９４；　Ｉ．Ｎ．　Ｚｅｌｋｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ．　３３，　３３７−３４９，　２００２；　ｍＲＮＡについてのＮＣＢＩアクセス番号：ＮＭ００３１０２）が挙げられる。配列番号１においては、翻訳開始点は第８００１番目のヌクレオチドに相当し、Ｃ−６７９７Ｔ変異の位置は第１２０４番目のヌクレオチドに相当する。
【００１７】
ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異は、高血圧症のリスクファクターとして使用できる。従って、Ｃ−６７９７Ｔ変異を検出することにより、高血圧症の予測または診断が可能となる。また、Ｃ−６７９７Ｔ変異は、本態性高血圧症の予測または診断において特に好ましいリスクファクターである。さらに、本発明において高血圧症の予測または診断の対象とする被検者は特に限定されないが、好ましくはヒトであり、より好ましくは男性のヒトである。
【００１８】
変異型ポリヌクレオチド
Ｃ−６７９７Ｔ変異を検出するためには、この変異を有するＳＯＤ３遺伝子（特にそのプロモーター領域）のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを標的とすることができる。すなわち、このような変異型ポリヌクレオチドの存在を確認することにより、Ｃ−６７９７Ｔ変異を検出することができる。
【００１９】
従って、本発明によれば、ＳＯＤ３遺伝子のプロモーター領域のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を有してなるポリヌクレオチドが提供される。上記のプロモーター領域のヌクレオチド配列としては、例えば、配列番号１中の第１〜３４６９ヌクレオチドで表わされるヌクレオチド配列を挙げることができ、その場合には、上記の変異により、配列番号１に示される第１２０４番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換される。なお、ＳＯＤ３遺伝子の転写開始点は、配列番号１中の第３４７０ヌクレオチドと考えられるが、第２９１２ヌクレオチドであるとの見解もあり、その場合には、上記プロモーター領域のヌクレオチド配列として配列番号１中の第１〜２９１１ヌクレオチドで表わされるヌクレオチド配列を挙げることができる。
【００２０】
本発明の他の態様によれば、ＳＯＤ３遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を有してなるポリヌクレオチドが提供される。上記のＳＯＤ３遺伝子のヌクレオチド配列としては、例えば、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を挙げることができ、その場合には、上記の変異により、配列番号１に示される第１２０４番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換される。
【００２１】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。
【００２２】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、既述の通り、Ｃ−６７９７Ｔ変異を検出する際の標的として有用であるが、さらには、ＳＯＤ３タンパク質の活性または発現量に影響を与え、これにより血圧を調整することのできる化合物をスクリーニングするためにも有用である。
【００２３】
核酸分子およびこれを用いた病態予知／検出方法
本発明による核酸分子は、ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異を検出しうる核酸分子である。この核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００２４】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとされる。
【００２５】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２６】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、本発明による核酸分子は、イントロンにハイブリダイズする部分だけでなく、エクソンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【００２７】
本発明による核酸分子は、ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異の検出において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【００２８】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドとする。
【００２９】
また、本発明による核酸分子は、ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異の検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記変異型ポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００３０】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜５０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとする。
【００３１】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料において、Ｃ−６７９７Ｔ変異を検出する上で好ましいものである。
【００３２】
核酸増幅法は通常プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異を検出しうるプライマーペアが提供される。このプライマーペアは、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して６７９７ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅しうるものである。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００３３】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異を検出することができ、これにより、高血圧症を予知または検出することができる。上記の検出の結果、Ｃ−６７９７Ｔ変異が検出された場合には、高血圧症が予知または検出されたと判断することができる。
【００３４】
また、Ｃ−６７９７Ｔ変異を有する場合の変異部位における遺伝子型としてはＣ／ＴおよびＴ／Ｔが考えられる。従って、本発明の他の態様によれば、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いて、ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異部位の遺伝子型を同定する工程を含んでなる、高血圧症を予知または検出する方法が提供される。
【００３５】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異を検出するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてＣ−６７９７Ｔ変異を検出する工程を含んでなる、高血圧症の予知法もしくは検出法または予測法もしくは診断法が提供される。
【００３６】
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異を検出することができる。核酸増幅法およびこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としてはＰＣＲ法等を用いることができる。
【００３７】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００３８】
上記の核酸増幅法とダイレクトシークエンス法とによりＣ−６７９７Ｔ変異を検出する場合には、例えば、以下の配列を有するプライマー：
フォワード：５’−ＧＴＴＴＧＡＡＧＴＡＡＴＣＴＧＧＴＴＧＧＧＴＡ−３’（配列番号２）；
リバース：５’−ＧＧＴＡＧＡＧＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＡＣＣＣＡ−３’（配列番号３）
を用いて核酸増幅法を行ない、このリバースプライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。
【００３９】
本発明による予測法または診断法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、一方のプライマーを変異部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを変異部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に前記変異にかかるいずれかのアレルが存在する場合には増幅産物が得られ、これが存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより特定のアレルの有無を判定することができる。
【００４０】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等によるＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異の検出にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、高血圧症の予知法もしくは検出法または予測法もしくは診断法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異にかかるいずれかのアレルの存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００４１】
この方法による診断に当たっては、例えば、被検者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異を検出することができる。核酸試料は、必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）を参照することができる。
【００４２】
ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異を検出する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００４３】
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、変異部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記変異部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の変異部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、変異部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４４】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４５】
ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異を検出する場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いることもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。
【００４６】
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法においては、Ｃ−６７９７Ｔ変異部位のヌクレオチドを含む領域に対して、ＣアレルおよびＴアレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができるため特に制限されないが、例えば、以下のようなヌクレオチド配列とすることができる：
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｃアレル用：　Ｆａｍ−ＴＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＡＡＴＧＴＡ−ＭＧＢ（配列番号４）
Ｔアレル用：　Ｖｉｃ−ＴＣＣＴＧＴＡＴＧＡＡＡＴＧＴＡＣ−ＭＧＢ（配列番号５）；
プライマー：
フォワード：５’−ＣＡＧＧＧＴＡＡＣＣＡＣＴＣＴＡＴＴＴＣＣＴＧＧ−３’（配列番号６）
リバース：５’−ＴＴＡＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＴＧＡＡＡＡＧＣＡ−３’（配列番号７）。
【００４７】
また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭとＶＩＣの組合せを用いる。このＰＣＲ反応においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の遺伝子型（Ｃ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔ）が容易に決定される。
【００４８】
本発明による予知法、検出法、予測法および診断法において、ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異が検出されたと評価されたサンプルは、高血圧症、特に本態性高血圧症を有するものと、あるいは将来においてその可能性があるものと診断することができる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００４９】
以上のような高血圧症の予知、検出、予測および診断のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、ＳＯＤ３遺伝子におけるＣ−６７９７Ｔ変異を検出するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００５０】
【実施例】
例１：ＳＯＤ３遺伝子上の多型と高血圧症との関連
以下の遺伝子解析においては、日本国大阪府吹田市の住民から無作為に選抜された被検者３３９０人を対象とした。遺伝子解析に先立ち、被検者全員から遺伝子解析についてのインフォームドコンセントを取得し、連結不可能匿名化した。
【００５１】
まず、日本人４６人について、ＳＯＤ３遺伝子のプロモーター領域およびエクソン領域をダイレクトシークエンスし、これにより、１８箇所の一塩基多型が同定された。このうち、両アレルの頻度がともに５％以上となる多型を選択し、さらに、その中から、プロモーター領域中に見られる一つの多型を選択した。この多型は、翻訳開始点（すなわち、翻訳開始コドン中のＡ）を第１番目のヌクレオチドとし、その５’側に隣接するヌクレオチドを第−１番目のヌクレオチドとした場合の、第−６７９７番目のヌクレオチドにおけるＣ／Ｔ多型（Ｃ−６７９７Ｔ多型）である。
【００５２】
次いで、このＣ−６７９７Ｔ多型に関し、被検者全員についてＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法によるタイピングを行なった。ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法は、ＴａｑＭａｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を用いて行なった。このＴａｑＭａｎシステムにおいては、ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＡＢＩ）、１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、下記のＴａｑＭａｎプローブ、および下記のプライマーを含む全１２．５μｌの反応溶液を９６ウェルプレート上に調製し、９５℃で１０分間の反応の後、９２℃で１５秒間−６２℃で１分間の反応を３５サイクル行なった。ＰＣＲ産物の蛍光は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて測定した。また、３８４ウェルプレートを用いる場合には、ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＡＢＩ）、６ｎｇのゲノムＤＮＡ、下記のＴａｑＭａｎプローブ、および下記のプライマーを含む全７．５μｌの反応溶液を調製し、９５℃で１０分間の反応の後、９２℃で１５秒間−５８℃で１分間の反応を４０サイクル行なった。ＰＣＲ産物の蛍光は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて測定した。
【００５３】
ＴａｑＭａｎプローブ
Ｃアレル用：　Ｆａｍ−ＴＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＡＡＴＧＴＡ−ＭＧＢ（配列番号４）（２７７ｎＭ）
Ｔアレル用：　Ｖｉｃ−ＴＣＣＴＧＴＡＴＧＡＡＡＴＧＴＡＣ−ＭＧＢ（配列番号５）（２６２ｎＭ）
プライマー
フォワード：５’−ＣＡＧＧＧＴＡＡＣＣＡＣＴＣＴＡＴＴＴＣＣＴＧＧ−３’（配列番号６）（８００ｎＭ）
リバース：５’−ＴＴＡＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＴＧＡＡＡＡＧＣＡ−３’（配列番号７）（８００ｎＭ）
アレル頻度においては、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡が成り立つことが確認された（ＣＣ０．４％、ＣＴ１１．２％、ＴＴ８８．４％）。
【００５４】
次いで、得られたデータを共分散分析によって解析し、各遺伝子型間で血圧を比較した。この解析においては、血圧に影響する因子として、年齢、ＢＭＩ、高脂血症、糖尿病、虚血性心疾患、喫煙および飲酒を共変量とした。その結果を下記の表１に示す。
【００５５】
【表１】
2004097088.tif 000002
男性では、Ｔアレルを有する者とＣＣ遺伝子型を有する者との間で有意差が認められた（ＴＴ＋ＣＴ：１３０．７／８０．２；ＣＣ：１２７．２／７８．４ｍｍＨｇ、収縮期：ｐ＝０．０１９、拡張期：ｐ＝０．０４５）。
【００５６】
さらに、１２０／８０ｍｍＨｇ未満の至適血圧を示す群（ＮＴ）と１６０／１００ｍｍＨｇ以上の中等以上の高血圧を示す群（ＨＴ）との間のアレル頻度の比較を、χ２検定により行なった。その結果を下記の表２に示す。
【００５７】
【表２】
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2004097088.tif 000004
男性では、Ｔアレル頻度がＮＴに比べてＨＴで有意に高率であった（ＴＴ＋ＣＴとＣＣとの比較：ｐ＝０．００８；オッズ比：２．２６７；９５％ＣＩ：１．２２１〜４．２１１、ＴアレルとＣアレルとの比較：ｐ＝０．０１３；オッズ比：２．０８５；９５％ＣＩ：１．１５１〜３．７７５）。
【００５８】
以上の解析結果から、Ｃ−６７９７Ｔ多型におけるＴアレルは、高血圧症のリスクファクターとして使用できることがわかる。
【００５９】
【配列表】
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