(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体のＲＮＡをタンパク質に翻訳させた核酸−タンパク質複合体、及び核酸−タンパク質複合体を用いたタンパク質の効率的な選択方法等の提供。【解決手段】（１）（ａ）一本鎖ＲＮＡの３’末端とアニーリング可能なＤＮＡ配列を３’末端側に含む一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の調製（ｂ）該一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体と一本鎖ＲＮＡとのアニーリング（ｃ）該アニーリング産物の一本鎖ＲＮＡの３’末端と一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の５’末端と連結しＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を調製する工程、（２）ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体のＲＮＡをタンパク質に翻訳しＲＮＡと該ＲＮＡにコードされたタンパク質から成る核酸−タンパク質複合体を構築する工程、（３）核酸−タンパク質複合体を選抜する工程、および、（４）選択された核酸−タンパク質複合体の核酸部分を増幅する工程とを含むことを特徴とする核酸および／またはタンパク質の選択方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（ａ）一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含み、かつその３’末端側に核酸誘導体が結合している一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体を調製し、（ｂ）該一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体と一本鎖ＲＮＡとをアニーリングさせ、（ｃ）該アニーリング産物の一本鎖ＲＮＡの３’末端と一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の５’末端とを連結させてＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を調製する調製工程、（２）調製工程で得られたＲＮＡ−ＤＮＡ結合体をタンパク質翻訳系に導入してＲＮＡをタンパク質に翻訳させてＲＮＡと該ＲＮＡによりコードされるタンパク質から成る核酸−タンパク質複合体を構築する構築工程、（３）構築工程で得られた核酸−タンパク質複合体を選抜する選抜工程、および、（４）選抜工程で選択された核酸−タンパク質複合体の核酸部分を増幅する増幅工程とを含むことを特徴とする核酸および／またはタンパク質の選択方法。
【請求項２】
増幅工程で得られた核酸を、一本鎖ＲＮＡとしてＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を調製する調製工程に供し、（１）調製工程、（２）構築工程、（３）選抜工程、および、（４）増幅工程を繰り返し行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１）（ａ）一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含み、かつその３’末端側に核酸誘導体が結合している一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体を調製し、（ｂ）該一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体と一本鎖ＲＮＡとをアニーリングさせ、（ｃ）該アニーリング産物の一本鎖ＲＮＡの３’末端と一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の５’末端とを連結させてＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を調製する調製工程、（２）調製工程で得られたＲＮＡ−ＤＮＡ結合体をタンパク質翻訳系に導入してＲＮＡをタンパク質に翻訳させてＲＮＡと該ＲＮＡによりコードされるタンパク質から成る核酸−タンパク質複合体を構築する構築工程、（３）構築工程で得られた核酸−タンパク質複合体を被験物質との相互作用に基づいて選抜する選抜工程、（４）選抜工程で選択された核酸−タンパク質複合体の核酸部分に変異を導入する変異導入工程、および、（５）変異導入工程で得られた核酸部分を増幅する増幅工程とを含むことを特徴とする核酸および／またはタンパク質の選択方法。
【請求項４】
増幅工程で得られた核酸を、一本鎖ＲＮＡとしてＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を調製する調製工程に供し、（１）調製工程、（２）構築工程、（３）選抜工程、（４）変異導入工程、および、（５）増幅工程を繰り返し行うことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（１）（ａ）一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含み、かつその３’末端側に核酸誘導体が結合している一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体を調製し、（ｂ）該一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体と一本鎖ＲＮＡとをアニーリングさせ、（ｃ）該アニーリング産物の一本鎖ＲＮＡの３’末端と一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の５’末端とを連結させてＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を調製する調製工程、（２）該ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体をタンパク質翻訳系に導入してＲＮＡをタンパク質に翻訳させてＲＮＡと該ＲＮＡによりコードされるタンパク質から成る核酸−タンパク質複合体を構築する構築工程、および、（３）構築工程で得られた核酸−タンパク質複合体と被験物質との相互作用を調べる検定工程とを含むことを特徴とするタンパク質と被験物質の相互作用の検出方法。
【請求項６】
一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体が、３’末端に核酸誘導体がスペーサーを介して結合している構造を有するものである請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体が、３’末端に、一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマーを有し、かつ核酸誘導体を末端に有するスペーサーが枝分かれした状態で結合している構造を有するものである請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体が、（ｉ）該一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端に、該一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列と、核酸誘導体を末端に有するスペーサーとが枝分かれした状態で結合しており、（ｉｉ）該一本鎖ＤＮＡ配列の５’末端側に親和性物質が結合している構造を有するものである、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体が、（ｉ）該一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端に、該一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列と、核酸誘導体を末端に有するスペーサーとが枝分かれした状態で結合しており、（ｉｉ）該一本鎖ＲＮＡとアニーリングしない５’末端側は、ループ領域を介して互いに相補的な二本鎖配列を形成しており、（ｉｉｉ）該ループ領域に親和性物質が結合している構造を有するものである、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体が、（ｉ）該一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端に、該一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列と、核酸誘導体を末端に有するスペーサーとが枝分かれした状態で結合しており、（ｉｉ）該一本鎖ＲＮＡとアニーリングしない５’末端側は、相補ＤＮＡ鎖と化学的に結合して互いに相補的な二本鎖配列を形成しており、（ｉｉｉ）該相補ＤＮＡ鎖の３’末端に親和性物質が結合している構造を有するものである、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
二本鎖配列中に制限酵素認識部位が存在する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
核酸誘導体が、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である、請求項１から１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
一本鎖ＲＮＡが、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーである、請求項１から１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
一本鎖ＲＮＡが、（１）プロモーター配列、（２）翻訳の際にリボソームによって認識されるＤＮＡ配列、及び、（３）目的タンパク質をコードする配列を有する、請求項１から１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
スペーサーが、高分子物質である、請求項６から１４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
親和性物質が、ビオチン又はポリＡ配列である、請求項８から１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
一本鎖ＲＮＡの３’末端と一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の５’末端との連結を、ＲＮＡリガーゼを用いて行う、請求項１から１６の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
翻訳を無細胞翻訳系で行う、請求項１から１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
増幅工程が、核酸−タンパク質複合体の核酸部分がＲＮＡとＤＮＡから成る場合、ＲＮＡ分解酵素処理を含むことを特徴とする、請求項１から１８の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸および／またはタンパク質の選択方法に関し、さらに詳しくは、標的ｍＲＮＡとそれがコードするタンパク質との連結体を用いる核酸および／またはタンパク質の選択方法、並びに、タンパク質と被験物質との相互作用の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９９０年に開発されたファージディスプレイ法（Ｓｃｏｔｔ　ＪＫ　＆Ｓｍｉｔｈ　ＧＰ，　（１９９０）　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４９；　３８６−３９０）は、様々なタンパク質を大腸菌ファージ表面に提示して特定のターゲット分子に特異的に結合するタンパク質を迅速に見い出すことができる進化分子工学的手法の一つである。ファージディスプレイ法の実用化により、この手法を利用して様々な応用が始まった。また、大腸菌等の細胞表面の膜タンパク質を利用してこのようなランダムな配列のペプチドを提示し、機能ペプチドを取得する方法も開発された（Ｌｕ，　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１３：　３６６−３７２）。
これらの方法はいずれも機能ペプチドを取得する有効な方法であるが、生細胞を用いるため、提示するペプチド配列に片寄りが生じるなどの問題点も有している。
【０００３】
一方、１９９７年に開発されたＩｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ法は、無細胞翻訳系中においてｍＲＮＡとそれによりコードされたタンパク質をｍＲＮＡの３’末端側にピューロマイシン付スペーサを介して連結させる方法である（Ｎｅｍｏｔｏ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．　　（１９９７）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４１４，　４０５−４０８，　Ｒｏｂｅｒｔｓ，　Ｒ．　Ｗ．　ｅｔ　ａｌ　（１９９７）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９４，　１２２９７−１２３０２）。このようにして作成されたＩｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ（ｍＲＮＡとタンパク質との結合体；以下これを単に「核酸−タンパク質複合体」と称することがある）では、無細胞翻訳系でタンパク質を発現させるために、生細胞を用いた場合に問題となる配列の片寄りが生じにくく、また、１回でスクリーニングするライブラリーサイズが大きいという利点を有する。しかしながら、下記するような幾つかの問題点も有している。
【０００４】
ファージディスプレイ法又は大腸菌の表面にペプチド等を提示する方法の場合には、培地中からのタンパク質又はペプチドの精製が容易であるが、無細胞翻訳系は細胞を破砕した中からの抽出物であるため、ＲＮＡ分解酵素やＤＮＡ分解酵素等のような夾雑物の含有量が極めて多い。また、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ法で作製されるＩｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎは、核酸とタンパク質が結合した形態であるが、このうちの核酸部分は遺伝子情報をコードしているため分解されることで大きなダメージを受ける。従って、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ法では、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを無細胞翻訳系から迅速に分離することが重要な課題である。また、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎのｍＲＮＡはなるべく早くＤＮＡに転化して分解されにくくすることが望ましい。しかし、無細胞翻訳系の中での逆転写は困難であるため、無細胞翻訳系からｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを迅速に分離することが望ましい。
【０００５】
従来のＩｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの精製技術としては大きく２つに分けることができる。一つは、ｐｏｌｙ　Ａを含むｐｕｒｏｍｙｃｉｎスペーサを利用してｏｌｉｇｏ　ｄＴで精製する方法（ＲＷ　Ｒｏｂｅｒｔｓ　＆　ＪＷ　Ｓｚｏｓｔａｃｋ　（１９９７）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９４，　１２２９７−１２３０２）であり（図１の（１）を参照）、もう一つは、遺伝子の両端にＦＬＡＧとＨｉｓ×６タグを連結させておき翻訳後、ＦＬＡＧ抗体及びＮｉ−ＮＴＡカラムで精製するやり方である（ＡＤ　Ｋｅｅｆｅ　＆　ＪＷ　Ｓｚｏｓｔａｋ，　（２００１）　Ｎａｔｕｒｅ，　４１０，　７１５−７１８）（図１の（２）を参照）。これらのスペーサによって精製は可能であるが、ｉｎｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを安定化するために逆転写することが難しい。
【０００６】
そこで、逆転写可能なＴ型のｐｕｒｏｍｙｃｉｎスペーサが提案された（Ｉ　Ｔａｂｕｃｈｉ，　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　ＦＥＢＳ　ｌｅｔｔ．　５０８（３）；　３０９−３１２）（図１の（３）を参照）。このようなＴ型のｐｕｒｏｍｙｃｉｎスペーサを用いることにより、逆転写が可能になりｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎをＤＮＡ化して安定化することができる。しかし、この場合、ｍＲＮＡとスペーサーの結合効率が悪いという問題点や、精製に際し、図１の（１）の場合のようにスペーサを用いて精製することができない等の問題点があった。また、図１の（２）の場合のようにタンパク質側で精製することは可能であるが、ｍＲＮＡにアフィニティータグをコードさせることが必要になる。
【０００７】
本発明者らは、上記した従来技術の問題点を解消することができるｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを作成するための一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体等の核酸構築物、該核酸構築物を用いて調製されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ（ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体）、該ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体のＲＮＡ部分を翻訳して得られるｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ（核酸−タンパク質結複合体）等を先に提案した（特願２００２−０１２８２０号および特願２００２−０３１７７９号明細書参照）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを効率よく構築可能な構造を有するＲＮＡ−ＤＮＡ結合体のＲＮＡをタンパク質に翻訳させた核酸−タンパク質複合体、及び煩雑な操作をすることなくｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅにタグを付け、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの精製に有用で、かつ支持体に固定化してプロテインチップを作成する際においても有用な核酸−タンパク質複合体を用いる、所望の機能を有するタンパク質の効率的な選択方法等の提供を目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端に、該一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列と、核酸誘導体を末端に有するスペーサー配列とが枝分かれした状態で結合したＴ字型の構造を有する一本鎖ＤＮＡ誘導体（以下、Ｔ−Ｓｐａｃｅｒとも称する）で、５’末端側に親和性物質と制限酵素認識部位を導入したＴ−Ｓｐａｃｅｒを用いることにより、一本鎖ＲＮＡとそれがコードするタンパク質との結合体を簡単に構築することができ、さらにこの核酸とタンパク質との結合体を用いることにより効率的に所望の機能を有するタンパク質を選択できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
即ち、本発明によれば、（１）（ａ）一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含み、かつその３’末端側に核酸誘導体が結合している一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体を調製し、（ｂ）該一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体と一本鎖ＲＮＡとをアニーリングさせ、（ｃ）該アニーリング産物の一本鎖ＲＮＡの３’末端と一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の５’末端とを連結させてＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を調製する調製工程、（２）調製工程で得られたＲＮＡ−ＤＮＡ結合体をタンパク質翻訳系に導入してＲＮＡをタンパク質に翻訳させてＲＮＡと該ＲＮＡによりコードされるタンパク質から成る核酸−タンパク質複合体を構築する構築工程、（３）構築工程で得られた核酸−タンパク質複合体を選抜する選抜工程、および、（４）選抜工程で選択された核酸−タンパク質複合体の核酸部分を増幅する増幅工程とを含むことを特徴とする核酸および／またはタンパク質の選択方法が提供される。
【００１１】
本発明の好ましい態様によれば、増幅工程で得られた核酸を、一本鎖ＲＮＡとしてＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を調製する調製工程に供し、（１）調製工程、（２）構築工程、（３）選抜工程、および、（４）増幅工程を繰り返し行うことを特徴とする上記方法が提供される。
【００１２】
また、本発明の別の態様によれば、（１）（ａ）一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含み、かつその３’末端側に核酸誘導体が結合している一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体を調製し、（ｂ）該一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体と一本鎖ＲＮＡとをアニーリングさせ、（ｃ）該アニーリング産物の一本鎖ＲＮＡの３’末端と一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の５’末端とを連結させてＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を調製する調製工程、（２）調製工程で得られたＲＮＡ−ＤＮＡ結合体をタンパク質翻訳系に導入してＲＮＡをタンパク質に翻訳させてＲＮＡと該ＲＮＡによりコードされるタンパク質から成る核酸−タンパク質複合体を構築する構築工程、（３）構築工程で得られた核酸−タンパク質複合体を被験物質との相互作用に基づいて選抜する選抜工程、（４）選抜工程で選択された核酸−タンパク質複合体の核酸部分に変異を導入する変異導入工程、および、（５）変異導入工程で得られた核酸部分を増幅する増幅工程とを含むことを特徴とする核酸および／またはタンパク質の選択方法が提供される。
【００１３】
本発明の好ましい態様によれば、増幅工程で得られた核酸を、一本鎖ＲＮＡとしてＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を調製する調製工程に供し、（１）調製工程、（２）構築工程、（３）選抜工程、（４）変異導入工程、および、（５）増幅工程を繰り返し行うことを特徴とする上記方法が提供される。
【００１４】
さらに、本発明の別の態様によれば、（１）（ａ）一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含み、かつその３’末端側に核酸誘導体が結合している一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体を調製し、（ｂ）該一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体と一本鎖ＲＮＡとをアニーリングさせ、（ｃ）該アニーリング産物の一本鎖ＲＮＡの３’末端と一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の５’末端とを連結させてＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を調製する調製工程、（２）該ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体をタンパク質翻訳系に導入してＲＮＡをタンパク質に翻訳させてＲＮＡと該ＲＮＡによりコードされるタンパク質から成る核酸−タンパク質複合体を構築する構築工程、および、（３）構築工程で得られた核酸−タンパク質複合体と被験物質との相互作用を調べる検定工程とを含むことを特徴とするタンパク質と被験物質との相互作用の検出方法が提供される。
【００１５】
本発明において、好ましくは、一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体は、３’末端に核酸誘導体がスペーサーを介して結合している構造を有するものである。
本発明において、好ましくは、一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体は、３’末端に、一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマーを有し、かつ核酸誘導体を末端に有するスペーサーが枝分かれした状態で結合している構造を有するものである。
本発明において、好ましくは、一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体は、（ｉ）該一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端に、該一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列と、核酸誘導体を末端に有するスペーサーとが枝分かれした状態で結合しており、（ｉｉ）該一本鎖ＤＮＡ配列の５’末端側に親和性物質が結合している構造を有するものである。
さらに好ましくは、一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体は、（ｉ）該一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端に、該一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列と、核酸誘導体を末端に有するスペーサーとが枝分かれした状態で結合しており、（ｉｉ）該一本鎖ＲＮＡとアニーリングしない５’末端側は、ループ領域を介して互いに相補的な二本鎖配列を形成しており、（ｉｉｉ）該ループ領域に親和性物質が結合している構造を有するものであるか、又は、（ｉ）該一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端に、該一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列と、核酸誘導体を末端に有するスペーサーとが枝分かれした状態で結合しており、（ｉｉ）該一本鎖ＲＮＡとアニーリングしない５’末端側は、相補ＤＮＡ鎖と化学的に結合して互いに相補的な二本鎖配列を形成しており、（ｉｉｉ）該相補ＤＮＡ鎖の３’末端に親和性物質が結合している構造を有するものである。
【００１６】
好ましくは、二本鎖配列中には、制限酵素認識部位が存在する。
好ましくは、核酸誘導体は、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である。
【００１７】
好ましくは、一本鎖ＲＮＡは、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーである。
好ましくは、一本鎖ＲＮＡは、（１）プロモーター配列、（２）翻訳の際にリボソームによって認識されるＤＮＡ配列、及び　（３）目的タンパク質をコードする配列を有するものである。
好ましくは、スペーサーは、高分子物質である。
好ましくは、親和性物質は、ビオチン又はポリＡ配列である。
好ましくは、一本鎖ＲＮＡの３’末端と一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の５’末端との連結を、ＲＮＡリガーゼを用いて行なう。
好ましくは、翻訳は、無細胞翻訳系で行なわれる。
好ましくは、増幅工程は、核酸−タンパク質複合体の核酸部分がＲＮＡとＤＮＡから成る場合、ＲＮＡ分解酵素処理を含む。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
（１）ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を調製する調製工程
（１−１）一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体
本発明で用いる一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体は、一本鎖ＲＮＡとそれがコードするタンパク質との結合体を作製するために使用するものであり、その構造は、一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含み、かつその３’末端側に核酸誘導体が結合している構造を有する。該一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体は、該一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端に、該一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列と、核酸誘導体を末端に有するスペーサーとが枝分かれした状態で結合している構造を有するものが好ましく、さらに該一本鎖ＤＮＡ配列の５’末端側に親和性物質が結合している構造を有するものも好ましい。
【００１９】
本発明で用いる一本鎖ＤＮＡ誘導体の一例の模式図を図２に示す。図２に示す一本鎖ＤＮＡ誘導体は、固定化したｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを固相（支持体）上から切り離すための制限酵素認識部位をもつ２本鎖ＤＮＡと、固相（支持体）に結合させるためのビオチンまたはｐｏｌｙ　Ａを有している。なお、図２は、一本鎖ＤＮＡ誘導体に一本鎖ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をアニーリングさせた状態を示している。
上記の通り、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの精製に関して、ｐｏｌｙＡを介しｄＴカラムによって精製する方法、ＨｉｓタグやＦＬＡＧ等を構造遺伝子領域に連結してタンパク質側で精製する方法がある。本発明の一本鎖ＤＮＡ誘導体（Ｔ−Ｓｐａｃｅｒ）においては、上記の２つの方法を併用することが可能である。
親和性物質をｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの精製に用いる例としては、親和性物質としてｐｏｌｙＡを用いる場合、ｄＴカラムによって精製する方法や、親和性物質としてＨｉｓ−ｔａｇを用いる場合にはＮｉを用いて精製する方法、並びに親和性物質としてＦＬＡＧペプチドを用いる場合にはこの抗体を用いて精製する方法等がある。
【００２０】
本発明で用いる一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の具体例の構造を図３に示す。一本鎖ＤＮＡ配列の５’末端側の構造としては、一本鎖ＤＮＡ配列がループ領域を介して互いに相補的な二本鎖配列を形成しており、該ループ領域に親和性物質が結合しており、該二本鎖配列中に制限酵素認識部位が存在している構造（図３のＴ−ｓｐｌｉｎｔ１ＦＢ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ４ＦＢ）、あるいは、相補ＤＮＡ鎖と化学的に結合して互いに相補的な二本鎖配列を形成しており、該相補ＤＮＡ鎖の３’末端に親和性物質が結合しており、該二本鎖配列中に制限酵素認識部位が存在している構造（図３のＴ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＢ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ６ＦＢ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ６ＦＡ）などが挙げられる。
【００２１】
なお、ここで言う「化学的に結合」の具体例としては、Ｐｓｏｒａｌｅｎを末端に有する核酸と別の核酸とを混合して、紫外線を照射することによって両核酸を化学的に結合する場合、架橋剤により結合する場合、ＲＮＡリガーゼなどによって結合する場合、あるいは前述のＹ−ライゲーションによって結合する場合などが挙げられる。架橋剤として具体的には、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシイミド等の２価性試薬が挙げられる。
【００２２】
以下、本発明で用いる一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の各構成要素について説明する。
（ＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡ配列）
本発明で用いる一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体は、一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含む。これにより、本発明では、互いに相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡと一本鎖ＤＮＡとを好適な条件下でアニーリングすることにより両者をアニーリングさせ、次いで、ＲＮＡリガーゼで処理することにより両者を効率よく連結することができる。
【００２３】
一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列とは、互いにアニーリングすることができる配列であり、ＲＮＡ配列に相補的な配列を有するＤＮＡ配列を言う。このような相補的な配列の長さは、両鎖がアニーリングすることができるのに十分な長さであれば特に限定されないが、一般的には１０から５０塩基、より好ましくは１０から３０塩基程度である。
【００２４】
本発明で用いる一本鎖ＤＮＡとしては、天然由来のＤＮＡから作成した一本鎖ＤＮＡでもよいし、遺伝子組換え技術により作成した一本鎖ＤＮＡでもよいし、化学合成により作成した一本鎖ＤＮＡでもよい。
また、一本鎖ＤＮＡの構成要素である核酸の全てがデオキシリボヌクレオチドである必要はなく、その一部のみがＤＮＡタイプであるものでもよく、それ以外の領域は、リボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもＰＮＡ（ペプチド核酸）タイプでもよい。また、ペプチドでも糖などが結合したものでもよい。
【００２５】
本発明で用いる一本鎖ＤＮＡの長さは、特に限定されないが、一般的には、数塩基から数十キロ塩基程度であり、例えば１０塩基から５００塩基程度であり、より好ましくは２０塩基から２００塩基程度である。
【００２６】
（プライマー配列）
本発明の一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端には、ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列が結合している。
本明細書で言う「一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列」とは、一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体（Ｔ−Ｓｐａｃｅｒ）と一本鎖ＲＮＡとのライゲーションにより得られるＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を逆転写反応系に導入した場合に、逆転写反応を開始するためのプライマー配列として作用する塩基配列を意味し、一般的には、一本鎖ＲＮＡの配列と相補的な配列から構成されることが好ましい。
【００２７】
このようなＲＮＡの逆転写のためのプライマーを有することにより、本発明の一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体を用いればｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎのＲＮＡのＤＮＡ化も容易に可能である。即ち、本発明の一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体は、逆転写プライマーの役割も持つため、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎをカラム等の固相に固定化する等してバッファー交換後、ただちに逆転写してＲＮＡをＤＮＡ化し、ｉｎｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを安定化することができる。従来のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎではタンパク質翻訳系の反応液中から精製できず、しかも外から添加した逆転写プライマーを一本鎖ＲＮＡにハイブリダイゼーションさせるために温度を上げることが必要であったが、これは連結させたタンパク質を変性させる可能性があり大きな問題となっていた。本発明の一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体では、このような問題がなく、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎのＤＮＡ化による安定化が容易である。
【００２８】
（核酸誘導体を末端に有するスペーサー）
本発明の一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端側には、核酸誘導体を末端に有するスペーサー配列が、ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列と一緒に枝分かれした状態で結合していることが好ましい。
このような一本鎖ＤＮＡの誘導体を使用して無細胞タンパク質翻訳系又は生細胞中でタンパク質の翻訳を行った場合、２本鎖でリボソームを止め、核酸誘導体（例えば、ピューロマイシンなど）がリボソームのＡサイトに入れることによりタンパク質と結合させることができる。
【００２９】
この核酸誘導体としては、無細胞タンパク質翻訳系又は生細胞中でタンパク質の翻訳が行われた時に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物である限り限定されないが、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似しているものを選択することができる。代表的な化合物として、アミド結合を有するピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ　ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　、　ＰＡＮＳ−アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸化合物が挙げられる。
【００３０】
また、３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，　ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えば、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸化合物を使用できる。
【００３１】
また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。さらにまた、核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格及び塩基を有する物質と、アミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質とを化学的に結合した化合物は、すべて本発明で用いられる一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体に含まれる。
【００３２】
核酸誘導体としては、ピューロマイシン、ＰＡＮＳ−アミノ酸もしくはＡＡＮＳ−アミノ酸がリン酸基を介してヌクレオシドと結合している化合物がより好ましい。これらの化合物の中でピューロマイシン、リボシチジルピューロマイシン、デオキシシチジルピューロマイシン、デオキシウリジルピューロマイシンなどのピューロマイシン誘導体が特に好ましい。
【００３３】
本発明では、核酸誘導体はスペーサーを介して一本鎖ＤＮＡに結合している。スペーサーとしては、ポリエチレン又はポリエチレングリコールなどの高分子物質が用いられ、好ましくはポリエチレングリコールが用いられる。スペーサーの長さは特に限定されないが、好ましくは、分子量１５０〜６０００であるか、または主鎖の原子数は１０原子から４００原子であり、さらに好ましくは、分子量６００〜３０００であるか、または主鎖の原子数が４０原子から２００原子である。
【００３４】
上記したような一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体は、それ自体既知の化学結合方法によって製造することができる。具体的には、リン酸ジエステル結合で合成ユニットを結合させる場合は、ＤＮＡ合成機に一般的に用いられているホスホアミダイド法などにより固相合成で合成することが可能である。ペプチド結合を導入する場合は、活性エステル法などにより合成ユニットを結合させるが、ＤＮＡとの複合体を合成する場合は、両方の合成法に対応が可能な保護基が必要になる。
【００３５】
（制限酵素認識部位）
本発明で用いる核酸構築物の好ましい態様においては、５’末端側には、制限酵素認識部位が存在する。５’末端側とは親和性物質に隣接する位置を意味する。制限酵素認識部位は、通常、ＤＮＡの２本鎖から構成される。このような制限酵素認識部位を導入することにより、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを親和性物質から切り離すことができる。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを親和性物質を介して固相に結合させている場合、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを固相（支持体）から切り離すことが可能になる。即ち、親和性物質同士（例えば、ビオチン−ストレプトアビジンなど）の結合等により、支持体に強く結合したｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを３７℃という温和な条件下で制限酵素によって切り離し精製することができる。制限酵素認識部位の配列は特に限定されず、Ｐｖｕ　ＩＩなど任意の制限酵素認識配列を使用することができる。
【００３６】
（親和性物質）
本発明で用いる一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体には、親和性物質が結合していてもよい。親和性物質を導入することにより、本発明の核酸構築物を作成したｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ並びにそれを用いて作成した各種核酸構築物を固相（支持体）に容易に結合させることができる。親和性物質としては、固相（支持体）との結合に用いうるものであれば、その種類は特に限定されないが、例えば、ビオチン、ポリＡ、各種の抗原又は抗体、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓタグなどが挙げられる。親和性物質は一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体に上記したようなスペーサーを介して結合していてもよい。
【００３７】
（１−２）一本鎖ＲＮＡ
本発明で用いる一本鎖ＲＮＡの種類は特に限定されず、天然の組織又は細胞由来のＲＮＡでも、ＤＮＡからインビトロで発現させたＲＮＡでもよい。
また、一本鎖ＲＮＡの構成要素である核酸の全てがリボヌクレオチドである必要はなく、その一部のみがＲＮＡタイプであるものでもよく、それ以外の領域は、リボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもＰＮＡタイプでもよい。また、ペプチドでも糖などが結合したものでもよい。
【００３８】
本発明で用いる一本鎖ＲＮＡの長さは、連結反応が可能である限り、特に限定されない。一般的には、一本鎖ＲＮＡの長さは、数十塩基から数十キロ塩基程度であり、例えば１０塩基から５０，０００塩基程度であり、より好ましくは２０塩基から１０，０００塩基程度である。
【００３９】
本発明で用いる一本鎖ＲＮＡは、タンパク質をコードする配列を含むことが好ましく、具体的にはｍＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーであることが好ましい。
本発明の方法で得られるＲＮＡ−ＤＮＡ結合体（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ）をタンパク質翻訳系に導入するような場合には、連結すべき一本鎖ＲＮＡは、（１）プロモーター配列、（２）翻訳の際にリボソームによって認識される塩基配列、及び、（３）目的タンパク質をコードする配列が含まれていることが好ましい。さらに、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓタグ等のタグ配列をコードする配列あるいはＰＣＲにより増幅するための共通配列を含むことができる。
【００４０】
プロモーター配列の種類は、適用する発現系に適したものを適宜選択すればよく特に限定されない。例えば、大腸菌ウイルスＴ７のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＴ７プロモーター配列あるいはＳＰ６プロモーター配列などが挙げられる。
【００４１】
翻訳の際にリボソームによって認識されるＤＮＡ配列としては、翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されるＲＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ配列）に対応するＤＮＡ配列や原核細胞のリボソームによって認識されるシャイン・ダルガノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）、オメガ配列等のｔａｂａｃｃｏ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓのリボソームによって認識される配列、ｒａｂｂｉｔβ−ｇｌｏｂｌｉｎ、Ｘｅｎｏｐｕｓ　β−ｇｌｏｂｌｉｎあるいはｂｒｏｍｏ　ｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓのリボゾーム認識配列などが挙げられる。
目的タンパク質をコードする配列の種類は特に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。
【００４２】
（１−３）ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体とその製造
本発明においては、上記（１−１）に記載の一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体と一本鎖ＲＮＡとをアニーリングさせ、該一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の二本鎖領域の５’末端と一本鎖ＲＮＡの３’末端とをライゲーションさせることを特徴とする。
本発明では、互いに相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡと一本鎖ＤＮＡまたはその誘導体とを好適な条件下でアニーリングすることにより両者をアニーリングさせ、次いで、ＲＮＡリガーゼ処理することにより両者を効率よく連結することができる。
【００４３】
本発明の方法では、先ず、上記した互いに相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡと本発明の一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体とをアニーリングさせる。アニーリングは上記した２種の核酸を適当な緩衝液（以後の操作の便宜上から言うと、ＲＮＡリガーゼ用の緩衝液が好ましい）に溶解し、高温から段階的に低温にすることにより行なうことができる。このような温度変化はＰＣＲ装置などを用いて行なうこともできる。アニーリング条件の一例としては、９４℃から２５℃まで１０分かけて冷却するという条件が挙げられるが、これは一例にすぎず、温度および時間は適宜変更することができる。アニーリングの条件（緩衝液の組成、アニーリング温度、及びアニーリング時間など）は、アニーリング配列の長さや塩基組成などに応じて適宜設定することができる。
【００４４】
アニーリング反応における一本鎖ＲＮＡと、一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体とのモル比はアニーリング反応が進行する限り、特に限定されないが、反応効率の観点からは、１：１〜１：２．５程度であることが好ましい。
【００４５】
一本鎖ＲＮＡと一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体とのアニーリング後、アニーリング産物では、一本鎖ＲＮＡの３’末端と一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の５’末端とが連結される。この連結は、一本鎖ＲＮＡの３’末端と一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の５’末端とが連結すればいずれの方法によってもよいが、例えば、ＲＮＡリガーゼ、架橋剤など、上述の「化学的結合」を行う具体例に挙げた方法等を用いることができる。
本発明で用いるＲＮＡリガーゼは２つの一本鎖核酸同士を連結できるものであればよく、好ましくはＴ４ＲＮＡリガーゼを使用できる。
【００４６】
なお、アニーリングの際の溶液としてＲＮＡリガーゼの緩衝液として適当なものを使用した場合には、アニーリング生成物を含む溶液をそのままリガーゼ反応に使用することができ、そうでない場合には、アニーリング生成物を通常の核酸精製方法により回収した後、ＲＮＡリガーゼ用の緩衝液に溶解してリガーゼ反応用の溶液を調製する。
【００４７】
連結反応（リガーゼ反応）の条件は、使用するＲＮＡリガーゼの活性が発揮される条件であればよく、例えば、好適な緩衝液（例えば、Ｔ４　ＲＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５，　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１０ｍＭ　ＤＴＴ，　１ｍＭ　ＡＴＰ）など）中で、２５℃の温度一定で反応させたり、あるいは２５℃で３０分間と４５℃で２分間のサイクルを反復した後に２５℃で３０分間反応させたりすることができる。ここに示した温度及び反応時間は一例に過ぎず反応効率が高くなるように適宜設定変更することができる。
【００４８】
反応後にエタノール沈殿などの常法により反応生成物を精製することにより、ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ）を得ることができる。
【００４９】
（２）核酸−タンパク質複合体を構築する構築工程
上記（１−３）に記載のＲＮＡ−ＤＮＡ結合体をタンパク質翻訳系に導入して一本鎖ＲＮＡをタンパク質に翻訳する。
【００５０】
核酸からそれがコードするタンパク質を人工的に生成させるためのタンパク質翻訳系は当業者に公知である。具体的には、適当な細胞よりタンパク質合成能を有する成分を抽出し、その抽出液を用いて目的のタンパク質を合成させる無細胞タンパク質合成系が挙げられる。このような無細胞蛋白質合成系には、リボゾ−ム、開始因子、伸長因子及びｔＲＮＡ等の転写・翻訳系に必要な要素が含まれている。
【００５１】
このような無細胞タンパク質合成系（細胞溶解物由来の系）としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系が挙げられ、例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液などが使用できるが、ＤＮＡ又はＲＮＡから目的とするタンパク質を産生するものであればいずれでもよい。また、無細胞翻訳系はキットとして市販されているものを使用することができ、例えば、ウサギ網状赤血球抽出液　（Ｒａｂｂｉｔ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　Ｌｙｓａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｔｒｅａｔｅｄ，　Ｐｒｏｍｅｇａ）や小麦胚芽抽出液　（ＰＲＯＴＥＩＯＳ，　ＴＯＹＯＢＯ；　Ｗｈｅａｔ　Ｇｅｒｍ　Ｅｘｔｒａｃｔ，　Ｐｒｏｍｅｇａ）などが挙げられる。
【００５２】
タンパク質翻訳系としては、生細胞を使用してもよく、具体的には、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。
無細胞翻訳系又は生細胞などは、その中にタンパク質をコードする核酸を添加又は導入することによってタンパク質合成が行われるものである限り制限されない。
【００５３】
本発明では、ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ）を上記したようなタンパク質翻訳系に導入して一本鎖ＲＮＡをタンパク質に翻訳した後、リボゾームを除去することによって、ＲＮＡと該ＲＮＡによりコードされるタンパク質から成るＲＮＡ−タンパク質複合体（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ）を製造することができる。
【００５４】
本発明においては、上記（１−３）に記載のＲＮＡ−ＤＮＡ結合体または上記（２）に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体を逆転写反応に付することにより、ＤＮＡ結合体及びＤＮＡ−タンパク質複合体として用いてもよい。
即ち、ＲＮＡ部分を含む核酸を逆転写酵素で処理することにより、ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写が起こり、ＲＮＡ部分の塩基配列をＤＮＡに転換することができる。逆転写反応に必要な試薬及び反応条件は当業者に周知であり、必要に応じて適宜選択することができる。
【００５５】
かくして調製される核酸−タンパク質複合体には、必要に応じて親和性物質が結合している。従って、この親和性物質に親和性を有する物質を予め固定化した支持体に、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を用いて調製した核酸−タンパク質複合体を接触させることにより、当該核酸−タンパク質複合体を支持体上に容易に固定化することができる。この固定化物を洗浄後、適当な方法、例えば適当な溶出液により溶出する、核酸構築物中に存在する制限酵素認識部位を利用して支持体から切断する等して、核酸−タンパク質複合体を精製することができる。このようにして作製されるチップは例えば、下述の選択工程において有用である。
【００５６】
親和性物質とそれに親和性を有する物質の組み合わせとしては、ビオチン／ストレプトアビジン、ポリＡ配列／オリゴｄＴ配列、抗原／抗体、Ｈｉｓタグ配列／Ｎｉ、リガンド／レセプター、ＦＬＡＧ／抗ＦＬＡＧ抗体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
支持体としては、通常の核酸またはタンパク質の固定化に用いることができる支持体であれば特に限定されない。支持体としては、親和性物質同士の間の結合形成に悪影響を及ぼさないものであれば、その形状は特に限定されず、例えば、平板、マイクロウエル、ビーズ等の任意の形態をとることができる。支持体の材質としては、例えば、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス；ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー類；シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質を挙げることができる。
【００５８】
（３）核酸−タンパク質複合体を選抜する選抜工程
上記（２）で構築された核酸−タンパク質複合体（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ）中のタンパク質が有する機能（生物活性）を用いて所望の機能を有する核酸−タンパク質複合体として選択して取得することができる。
この選抜工程とは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを構成するタンパク質部の機能（生物活性）を評価し、目的とする生物活性に基づいてｉｎ　　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを選択する工程を意味する。即ち、構築されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎと相互作用をし得る被験物質、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、低分子化合物等との相互作用の有無や強弱に基づいて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを選択することができる。これらの被験物質は、前記した固相（支持体）に結合させて用いることもできる。このような工程はそれ自体既知の方法、例えば、Ｓｃｏｔｔ，　Ｊ．　Ｋ．　＆　Ｓｍｉｔｈ，　Ｇ．　Ｐ．　（１９９０）　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４９，　３８６−３９０；　Ｄｅｖｌｉｎ，　Ｐ．　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４９，　４０４−４０６；　Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，　Ｌ．　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９４）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９１，　９０２２−９０２６等に記載されている方法等により行うことができる。
【００５９】
選抜工程に付するｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎは、上記ＲＮＡ−タンパク質複合体でもよいし、ＲＮＡ部分をＤＮＡに逆転写したＲＮＡ−ＤＮＡ−タンパク質複合体でもよい。このうちＲＮＡ−ＤＮＡ−タンパク質複合体を用いれば、核酸部分の安定性がよいため好ましい。また、本明細書においては、ＲＮＡ−タンパク質複合体、ＲＮＡ−ＤＮＡ−タンパク質複合体を併せて「核酸−タンパク質複合体」または「ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ」と称することがある。
【００６０】
（５）増幅工程
上記（３）で選抜されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎは、これを再度被験物質との相互作用に基づいて選抜することにより、該相互作用がより適当なタンパク質を選抜および取得することができる。一度選抜されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを、再度被験物質と接触させるためには、選抜されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの一本鎖ＲＮＡ部分を必要に応じて逆転写する等した後に、これを増幅し、増幅されたＤＮＡ鎖をもとに（２）に記載の構築工程を行ってｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを製造して、（３）に記載の選抜工程に付することにより可能となる。
【００６１】
つまり、上記の選抜工程において、ターゲット（被験物質）に対し、表現型であるタンパク質部分で相互作用のあるｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを選択し、遺伝型である核酸部のＤＮＡを増幅することによって、該ターゲットに対して相互作用のあるｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓの鋳型となる核酸またはその一部が濃縮されたライブラリーを最構築することができる。この場合、増幅工程において、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの核酸部分の塩基配列（遺伝子の種類）により偏ることなく、また効率よく増幅が行われることが重要である。
【００６２】
これら（１）調製工程、（２）構築工程、（３）選抜工程、（５）増幅工程を必要に応じてくりかえし行うことにより、被験物質との相互作用がより適当なタンパク質を選抜および取得することができる。ここで、選抜工程に供するｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎは、ＲＮＡ−ＤＮＡ−タンパク質複合体が好ましい。これにより以降の工程におけるｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの安定性等が増加する。
【００６３】
（５）増幅工程は、ＰＣＲを用いて、例えば、以下のようにして行うことが好ましい。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの核酸中、増幅するのは、少なくともタンパク質をコードしている部分（以下、これを「ＯＲＦ」と称することがある）を含む領域である。該領域を増幅するのに用いられるＰＣＲプライマーとしては、特に制限はないが、全てのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎに共通に用いられる配列として、５’側のプライマーは、ＯＲＦの５’上流側に連結されている配列が、また３’側のプライマーは、ＯＲＦの３’側に連結されている配列が好ましく用いられる。具体的には、上記（１）および（２）に記載の構造を有するｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの場合、５’側のプライマーは、翻訳の際にリボソームによって認識されるＤＮＡ配列等が好ましく用いられ、３’側のプライマーは、タグ配列や共通配列が好ましく用いられる。
【００６４】
また、塩基配列（遺伝子の種類）によって隔たることなく、また効率良く増幅が行われるために、選抜されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓを予めＲＮＡ分解酵素で処理することが好ましい。ＲＮＡ分解酵素は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎに含まれるＲＮＡを分解氏得るものであれば如何なるものであってもよいが、ＲＮａｓｅ　Ｈが好ましく用いられる。
【００６５】
かくして増幅されたＤＮＡは、ＯＲＦのみを含むものであるので、上記（１）および（２）に記載のプロモーター配列、翻訳の際にリボソームによって認識されるＤＮＡ配列（以下、これらを「５’側付加配列」と称することがある）、タグ配列、共通配列、並びにアニーリング配列、ブランチ配列など（以下、これらを「３’側付加配列」と称することがある）を結合する。これらの配列の結合は、ＤＮＡリガーゼ、下述するオーバーラップエクステンション法、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。ＰＣＲのプライマーとしては、増幅されたＤＮＡの５’末端と共通配列を３’末端に有する５’付加配列からなるものと、増幅されたＤＮＡの３’末端と共通の配列を５’末端に有する３’付加配列からなるものが用いられる。
【００６６】
オーバーラップエクステンション法による結合方法は、まず増幅されたＤＮＡの５’末端と共通の配列を３’末端に有する５’付加配列を用意し、これをアニーリングさせた後に、ＤＮＡポリメラーゼ等を用いて２本鎖ＤＮＡを合成し、さらに増幅されたＤＮＡの３’末端と共通の配列を５’末端に有する３’付加配列を用意し、これをアニーリングさせた後に、ＤＮＡポリメラーゼ等を用いて２本鎖ＤＮＡを合成する方法である。上記の５’付加配列および３’付加配列の結合は、片方ずつ行っても、両方同時に行ってもよい。かくして合成された２本鎖ＤＮＡは、これを両末端の塩基配列を有するプライマー等を用いてさらにＰＣＲで増幅してもよい。
【００６７】
上記（３）で選抜されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ　は、ＩＶＶを用いたスクリーニングは、ターゲットに対し、表現型である蛋白質部分で相互作用のあるＩＶＶを選択し、遺伝型であるＤＮＡを増幅することによって、相互作用のあるＩＶＶが濃縮されたライブラリーを再構築することができる。このことから、ＤＮＡを増幅する過程が、遺伝子により偏ることなく、また効率よく行われることが重要である。このような方法として、ＲＮＡ−ＤＮＡ−タンパク質複合体を用いてＰＣＲを行う際、ＲＮａｓｅＨにて処理をする方法が好ましく用いられる。
【００６８】
（４）変異導入工程、（５）増幅工程、及び（６）検定工程
上記（３）で選択されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ（核酸−タンパク質複合体）の核酸部分に変異を導入し、増幅を行う。これら（１）調製工程、（２）構築工程、（３）選抜工程、（４）変異導入工程、（５）増幅工程を必要に応じて繰り返し行うことによりタンパク質の機能（生物活性）の改変及び新たな機能の創製が可能となる。この内、（１）及び（２）の工程については上記に詳述した構築方法に従って行うことができる。ここで、選抜工程に供するｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎは逆転写を行ったものが好ましい。これにより、以降の工程におけるｖｉｒｉｏｎの安定性等が増加する。
【００６９】
（４）変異導入及び（５）増幅の工程において、選択されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの核酸部に必要に応じて変異を導入してＰＣＲ等で増幅する。ここで、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの核酸部がｍＲＮＡの場合は、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後に変異の導入を行えば良く、核酸部の増幅は変異導入しながら行っても良い。変異導入は、すでに確立しているＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ　ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１，１１−１５）やＳｅｘｕａｌ　ＰＣＲ（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，１０７４７−１０７５１）を用いて容易に行うことができる。
【００７０】
さらに、変異が導入され増幅されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの核酸部を用いて、（１）調製工程にてＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を調製し、それを用いて（２）構築工程にてＲＮＡ−ＤＮＡ−タンパク質複合体を調製し、それを（３）選抜工程にかけ目的とする生物活性によって選択し、さらに（４）変異導入及び増幅を行うことができる。これらの工程を必要に応じて繰り返すことにより、タンパク質の機能改変及び新たな機能を有するタンパク質の創製が可能となる。
【００７１】
本発明のタンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸相互作用の検定方法における、核酸−タンパク質複合体を構築する構築工程は、一般には、（１）遺伝子ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーからｍＲＮＡを合成し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ（ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体）を調製する調製工程、及び、（２）無細胞タンパク質合成系を利用して、ｍＲＮＡとそれに対応するタンパク質とをリボソーム上で連結したｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ（核酸−タンパク質複合体）を構築する構築工程を含む。
【００７２】
（１）の工程は、配列既知のＤＮＡでＯＲＦに対応する配列を含むｃＤＮＡや配列未知のＤＮＡで適当な制限酵素で断片化した断片を含むｃＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを合成し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ（ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体）を構築することに相当する。
上記（１）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅの構築と、（２）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ（核酸−タンパク質複合体）の構築工程は、上記に詳述した方法に従って行うことができる。
【００７３】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ（核酸−タンパク質複合体）と他のタンパク質や核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）との相互作用を調べる検定工程（６）は、構築された核酸−タンパク質複合体の中から所望の機能をもつタンパク質を選抜する選抜工程（３）、必要に応じて、逆転写、増幅、配列決定等の工程も含まれる。
【００７４】
（３）の選抜工程では、標的のタンパク質や核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）や他の物質、例えば、薬物、糖質、脂質などをマイクロプレートやビーズに予め共有結合や非共有結合を介して結合させておき、これに（２）調製工程で調製したｉｎｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ（ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体）を加え、ある温度条件で、一定時間反応させた後、洗浄し、標的に結合しないｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ（核酸−タンパク質複合体）を除去する。その後、標的に結合したｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを遊離させる。この工程は、前記の通り、すでに確立している方法で行うことができる。
【００７５】
（６）の検定工程には、（３）の選抜工程で遊離したｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを、例えばＰＣＲにより増幅させ、増幅したＤＮＡを直接あるいはクローニングした後、その配列を決定する工程も含まれる。相互作用の検出は、ｖｉｒｉｏｎの逆転写後に行うのが好ましい。これにより、ｖｉｒｉｏｎの安定性が増し、また相互作用の妨害作用も減少し、より精度の高い相互作用の検出が可能となる。
【００７６】
本発明の検出方法により、（１）配列既知あるいは未知の遺伝子ＤＮＡからｍＲＮＡを合成し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ（ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体）を構築し、（２）それを用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ（核酸−タンパク質複合体）を構築し、（３）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ（核酸−タンパク質複合体）の中から標的のタンパク質あるいは核酸あるいは他の物質、たとえば薬物、糖質、脂質などと結合するもののみを選択し、（５）選択したｉｎ　ｖｉｔｒｏウイルスｖｉｒｉｏｎ（核酸−タンパク質複合体）を逆転写、増幅、クローニング、配列決定することにより、機能未知の遺伝子に対応する遺伝子産物（タンパク質）の機能を同定することが可能になる。
なお、本明細書における、上記した核酸の単離・調製、核酸の連結、核酸の合成、ＰＣＲ、プラスミドの構築、無細胞系での翻訳等の遺伝子操作技術は、特に明記しない限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓに記載の方法またはそれに準じた方法により行うことができる。
【００７７】
【実施例】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例によって限定されることはない。
実施例１：スペーサーの作製
以下のような修飾ＤＮＡをスペーサーの原料としてＤＮＡ合成機で合成した。
ＤＮＡ　１：　（ｔｈｉｏｌ）（Ｓｐｃ）（Ｓｐｃ）（Ｓｐｃ）（Ｓｐｃ）ＣＣ（ＺＦＰ）
ＤＮＡ　２：　ＣＣＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＴＣＡＴＣ（Ｂｔ）ＣＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣ（Ｆｔ）ＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧ（Ａｔ）ＣＣＧＣ
ＤＮＡ　３：　（Ｐｓｏ）ＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧ（Ａｔ）ＣＣＧＣ
ＤＮＡ　４：　ＣＣＣＧＧ（Ｆｔ）ＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
上記配列中の（ｔｈｉｏｌ）、（Ｓｐｃ）、（Ｂｔ）、（Ｆｔ）、（Ａｔ）及び（Ｐｓｏ）はユニットの略称であり、すべてグレンリサーチ社製の合成試薬を用いて配列中に導入した。これらユニットの略称、合成（導入）試薬の品名及びその化学名は、それぞれ次の通りである。
【００７８】
（ｔｈｉｏｌ）
５’−Ｔｈｉｏｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｃ６
（Ｓ−Ｔｒｉｔｙｌ−６−ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘｙｌ）−（２−ｃｙａｎｏｅｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
（Ｓｐｃ）
Ｓｐａｃｅｒ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　１８
１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
【００７９】
（Ｂｔ）
Ｂｉｏｔｉｎ−ｄＴ
５’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−５−［Ｎ−（（４−ｔ−ｂｕｔｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）−ｂｉｏｔｉｎｙｌ）−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）−３−ａｃｒｙｌｉｍｉｄｏ］−２’−ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ，３’−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
（Ｆｔ）
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄＴ
５’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−５−［Ｎ−（（３’，６’−ｄｉｐｉｖａｌｏｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌ）−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）−３−ａｃｒｙｌｉｍｉｄｏ］−２’−ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ，３’−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
【００８０】
（Ａｔ）
Ａｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｃ６　ｄＴ
５’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ−５−［Ｎ−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）−３−ａｃｒｙｌｉｍｉｄｏ］−２’−ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ，３’−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
（Ｐｓｏ）
Ｐｓｏｒａｌｅｎ　Ｃ６　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
２−［４’−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−４，５’，８−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｓｏｒａｌｅｎ］−ｈｅｘｙｌ−１−Ｏ−（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
【００８１】
また、（ＺＦＰ）はＮ−α−（Ｎ−α−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ）−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ残基を示し、支持体ＣＰＧに固定してＤＮＡ合成機上で使えるようにしたものを特願２００２−０４４９５５号明細書に記載の方法に準じて次の通り合成して配列の３’末端に導入した。
【００８２】
ピューロマイシン２塩酸塩（和光純薬工業）２５０　ｍｇを水３　ｍｌに溶かし、ジメトキシエタン　（ＤＭＥ）　２　ｍｌ、１０％炭酸ナトリウム水溶液０．５　ｍｌを加えた。撹拌しながらこの溶液にＺ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ　（Ｎ−α−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ　ｅｓｔｅｒ；　ＢＡＣＨＥＭ社）　２００　ｍｇ（１．１当量）をＤＭＥ　２　ｍｌに溶かした溶液を加え、さらに１０％炭酸ナトリウム水溶液０．５　ｍｌを加えた。１時間室温で撹拌したのち析出した固体をグラスフィルター上で濾取し、５０％ＤＭＥ水溶液２　ｍｌで２回、水２　ｍｌで３回、冷却したＤＭＥ　２　ｍｌで２回洗浄したのち真空ポンプで乾燥してＮ−α−（Ｎ−α−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ）−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ　（ＺＦ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を３３０　ｍｇ得た。
【００８３】
ＺＦ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ　３１５　ｍｇをピリジン２．５　ｍｌに溶かし、塩化ジメトキシトリチル１４９ｍｇを加えて室温で１時間撹拌した。氷浴で冷却してから水０．１　ｍｌを加え、１０分撹拌したのち水と酢酸エチルで分液し、有機層を水で３回洗ってから濃縮し、真空ポンプで乾燥して粗５’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ　ＺＦ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ　（ＤＭＴｒ−ＺＦ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を４５０　ｍｇ得た。
【００８４】
ＤＭＴｒ−ＺＦ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ　４５０　ｍｇをピリジン２　ｍｌに溶かし、無水コハク酸６１　ｍｇ、ジメチルアミノピリジンの０．５　Ｍピリジン溶液４０μｌを加えて、窒素雰囲気下、室温で３日間撹拌した。氷浴で冷却してから水０．１　ｍｌを加え、１０分撹拌したのち水と酢酸エチルで分液し、有機層を水で３回、飽和食塩水で１回洗ったのち濃縮した。酢酸エチルを展開溶媒としてシリカゲルクロマトグラフィで精製し、目的物であるＤＭＴｒ−ＺＦ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを３８５　ｍｇ得た。
【００８５】
ＤＭＴｒ−ＺＦ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ　２５５　ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　０．４　ｍｌに溶かし、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）の１．０　Ｍ　ＤＭＦ溶液０．２　ｍｌとＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の０．５　Ｍ　ＤＭＦ溶液０．４　ｍｌを加え、１６時間室温で撹拌した。この溶液にＣＰＧ　（ＣＰＧ　ＬＣＡ００５００Ａ　；　０．１７　ｍｍｏｌ／ｇ）　５００　ｍｇを加えて２時間室温で撹拌し、さらにＤＩＣの１．０　Ｍ　ＤＭＦ溶液０．１５　ｍｌとＨＯＢｔの０．５　Ｍ　ＤＭＦ溶液０．３　ｍｌを加えて１６時間室温で撹拌した。ＣＰＧをグラスフィルター上に濾取し、ＤＭＦ、５０％　ＤＭＦ水溶液、アセトニトリルで洗ったのちポンプで乾燥した。全量をＤＭＦ　２　ｍｌに懸濁させ、ピリジン０．５　ｍｌ、無水酢酸１２５　ｍｇを加えて１時間室温で撹拌したのちＣＰＧを濾取してＤＭＦとアセトニトリルで洗浄した。真空ポンプで乾燥し、ＺＦ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ　ＣＰＧを５２０　ｍｇ得た。一部を固相反応用の容器に入れ、トリクロロ酢酸の３％塩化メチレン溶液を加えて室温で１分撹拌し、アセトニトリルで洗浄したのち濃アンモニア水を加えて室温で２時間撹拌した。回収されたＺＦ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを定量し、ＣＰＧ　１グラム当たり２８　μｍｏｌと算出した。
【００８６】
（１）Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ１ＦＢ
ＤＮＡ　２　（４　ｎｍｏｌ）を０．１　Ｍ　リン酸水素２ナトリウム水溶液１５μｌに溶かし、Ｎ−（６−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＥＭＣＳ）（架橋剤；同仁化学製）の５　ｍＭ　ＤＭＦ溶液４μｌを加えて２０分室温で撹拌した。この溶液にＤＮＡ　１（２０　ｎｍｏｌ）を０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　７．１）４０μｌに溶かした溶液を加え、さらに室温で１６時間撹拌した。逆相高速液体クロマトグラフィ（逆相ＨＰＬＣ）でＤＮＡ　１とＤＮＡ　２が架橋剤を介して結合した目的物を単離し、５０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　８．０）に溶かしてキモトリプシン溶液を基質に対して酵素の重量比が１０％程度になるように加えて３６℃で１時間放置した。逆相ＨＰＬＣで精製し、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ１ＦＢを得た。
【００８７】
（２）Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ
ＤＮＡ　３　（１２　ｎｍｏｌ）とＤＮＡ　４　（１２　ｎｍｏｌ）をＴＢＳ緩衝液　（２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１００　ｍＭ　ＮａＣｌ）　０．４８　ｍｌに溶かし、８５℃で４０秒加熱したのち室温で放冷した。氷浴上で５分放置したのちハンディＵＶランプ（３６５　ｎｍ）で８分間光照射し、反応生成物を逆相ＨＰＬＣで精製した。これをＴ−ｓｐｌｉｎｔ１ＦＢ調製の際と同様にＥＭＣＳでＤＮＡ　１と架橋し、キモトリプシン処理ののち精製してＴ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡを得た。
【００８８】
実施例２：転写用ＤＮＡの構築とｍＲＮＡの作製
転写効率の高い大腸菌ウィルスＴ７のＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって認識されるＤＮＡ配列（Ｔ７プロモーター配列）と翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されるＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ配列）と原核細胞のリボソームによって認識される（シャイン・ダルガノ配列：Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）を有し、その下流にＯｃｔ−１の一部　（ＰＯＵ；配列番号１）とＦＬＡＧ配列、Ｔ−Ｓｐａｃｅｒと連結するための配列（Ｙ−ｔａｇ）をコードしたＤＮＡを構築した。
【００８９】
2004097213.tif 000002
【００９０】
上記の方法で作製したＤＮＡを、反応液１００μｌあたり１０μｇを加え、ＲＮＡ合成キットＲｉｂｏｍａｘ　Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　ＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を使ってｍＲＮＡに転写した。翻訳効率をあげるためにキャップアナログ（ＲＮＡ　Ｃａｐｐｉｎｇ　Ａｎａｌｏｇ　；　Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ製）を最終濃度が７．２ｍＭになるように加え、ｍＲＮＡの５’側を修飾した。キャップアナログおよび過剰のＮＴＰ（ヌクレオチド３リン酸）を除去するために、プライマー除去剤（Ｐｒｉｍｅｒ　Ｒｅｍｏｖｅｒ　；　Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使ってエタノール沈澱を行った。
【００９１】
実施例３：ｍＲＮＡとＴ−スペーサーとのライゲーション
上記の実施例１で作製したＴ−スペーサー　（Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ）と上記の実施例２で作製したｍＲＮＡとのライゲーションは、特開２００２−２９１４９１号明細書に記載の方法に準じて行なった。具体的には以下の通りである。
上記で作製した　ｍＲＮＡとＴ−スペーサーを１：１．２〜１．５の割合（モル比）で混合し、Ｔ４　ＲＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＡＴＰ）に溶解し、特異性をあげるため変性剤としてＤＭＳＯ　（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を最終濃度５％になるように加えた。得られた混合物は、ＰＣＲ装置を用いて、９４℃〜２５℃まで１０分かけて冷却することによりアニーリングした。
【００９２】
つづけて、上記のアニーリングした溶液中にＴ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ　（Ｔａｋａｒａ製）とＴ４　ＲＮＡ　ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ製）を至適量加え、２５℃で３０分間反応させた。反応後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ製）を使って、ライゲーション産物を精製した。ライゲーションの効率を確認するために、４％アクリルアミド８Ｍ尿素変性ゲル電気泳動、６５℃、２５０Ｖの条件でサンプルを泳動し、Ｖｉｓｔｒａ　Ｇｒｅｅｎ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で染色し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ製）で画像化した。また、Ｔ−スペーサーに導入してある蛍光（Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）についても確認した。この結果から、ｍＲＮＡとＴ−　スペーサーとの結合率（ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体の形成率）は８０〜９０％であることが確認された。
【００９３】
実施例４：Ｔ−スペーサーを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ形成
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅが、実際にｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを形成できるかどうか確認した。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ　４　ｐｍｏｌを小麦胚芽無細胞翻訳系ＰＲＯＴＥＩＯＳ　（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、２６℃で３０分間反応し翻訳させ、ピューロマイシンに翻訳されたペプチドを結合させる（ｖｉｒｉｏｎ化）ために最終濃度が４０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１　Ｍ　ＫＣｌになるように塩を加え、２６℃で１時間反応させた。
Ｖｉｒｉｏｎ化の効率を確認するために、５Ｍ尿素変性５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、２０ｍＡの条件でサンプルを泳動した。
【００９４】
実施例５：Ｔ−スペーサーを用いた　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓの精製
Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを形成した後、Ｔ−スペーサーを用いて、実際に精製できるかどうかを確認した。
（１）ビオチン　（Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ１ＦＢ）
８ｐｍｏｌのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅを上記の方法でｖｉｒｉｏｎ化し、ｂｕｆｆｅｒ交換をするために、Ｍｉｃｒｏ　ＢｉｏＳｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ−６　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いて脱塩後、１Ｍ　ＮａＣｌ、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００になるように調製し、ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ　（Ｔａｋａｒａ製）　５μｌと４℃、約２時間結合させる。その後、上清をとり、洗浄ｂｕｆｆｅｒ　（１Ｍ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）２０μｌで３回洗い、その後、ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡを２つにわけ、一方を制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩ　（Ｔａｋａｒａ製）　３７℃、約１時間処理し、その上清を得て、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　が精製できるかどうか確認した。
【００９５】
精製効率を確認するために、５Ｍ尿素変性５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、２０ｍＡの条件でサンプルを泳動した。スペーサーに導入してある蛍光（Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）を使って、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ製）で画像化した。その結果を図４に示す。
【００９６】
図４において、レーン１は、ｖｉｒｉｏｎ化しＢｉｏＳｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ−６を用いて脱塩されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓを泳動したものを示し、レーン２は、ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡと結合させた後の上清を泳動したものを示し、レーン３〜５は、上清を除いた後のＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡを洗浄したものを泳動し、レーン６は、洗浄した後のＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡを泳動し、レーン７は、洗浄したＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡを制限酵素で処理した後の上清を泳動し、レーン８は、ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡを制限酵素で処理した後のＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡを泳動したものを示す。洗浄したＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡを制限酵素で処理した後の上清に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓが存在することから、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔスペーサーを使ってｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓが精製できることが確認された。
【００９７】
（２）Ｐｏｌｙ　Ａ（Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ）
８ｐｍｏｌのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅを上記（１）の方法でｖｉｒｉｏｎ化し、ｂｕｆｆｅｒ交換をするために、Ｍｉｃｒｏ　ＢｉｏＳｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ−６　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いて脱塩後、１Ｍ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００になるように調整し、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）　Ｐｒｏｂｅ　（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を結合させたＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ　（Ｔａｋａｒａ製）　５μｌと４℃、約１時間結合させる。その後、上清をとり、洗浄ｂｕｆｆｅｒ　Ａ　（１ＭＮａＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）、０．２５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）　２０μｌで３回洗い、ｂｕｆｆｅｒＢ　（５００ｍＭ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）、０．２５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）　２０μｌで１回洗い、　ｂｕｆｆｅｒ　Ｃ　（２５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）、０．２５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）　２０μｌで１回洗い、その後、Ｄｅｐ水　１０μｌで３回溶出してｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎが精製できるかどうか確認した。
【００９８】
精製効率を確認するために、５Ｍ尿素変性５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、２０ｍＡの条件でサンプルを泳動した。スペーサーに導入してある蛍光（Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）を使って、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ製）で画像化した。その結果を図５に示す。
【００９９】
図５において、レーン１は、ｖｉｒｉｏｎ化しＢｉｏＳｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ−６を用いて脱塩されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅを泳動したものを示し、レーン２は、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）　Ｐｒｏｂｅを結合させたＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡと結合しなかった上清を泳動したものを示し、レーン３〜７は、上清を除いた後のＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）　Ｐｒｏｂｅを結合させたＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡを洗浄したものを泳動し、レーン８〜１０は、洗浄したＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）　Ｐｒｏｂｅを結合させたＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡを溶出したものを泳動し、レーン１１は、溶出した後のＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）　Ｐｒｏｂｅを結合させたＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡを泳動したものを示す。Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）　Ｐｒｏｂｅを結合させたＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡを溶出したものにｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎが存在することから、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔスペーサーを使ってｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎが精製できることが確認された。
【０１００】
実施例６：Ｔ−スペーサーを用いた　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓの精製後の逆転写反応
Ｔ−ｓｐａｃｅｒを用いた　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ精製時の溶出画分の１と２を混ぜ、ＴｒｕｅＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　（ｓａｗａｄｙ製）を用いて逆転写した。さらに、ネガティブコントロールとしてｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ、ポジティブコントロールとしてｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅを逆転写したもの（図４）とともに、センスプライマー　５’−ＧＴＴ　ＴＡＡ　ＣＴＴ　ＴＡＡ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＴＧ−３’（配列番号２）とアンチセンスプライマー　５’−ＴＴＴ　ＣＣＣ　ＧＣＣ　ＧＣＣ　ＣＣＣ　ＣＧＴ　ＣＣＧ　ＣＴＴ　ＣＣＧ　ＣＣＣ　ＴＴＧ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＴＣＡ　ＴＣＣ　ＴＴＧ　ＴＡＡ　ＴＣ−３’（配列番号３）をもちいて、ポリメラーゼ連鎖反応　（ＰＣＲ）を行った。ＤＮＡ合成酵素は、ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　（ＴＡＫＡＲＡ製）をもちいた。結果を確認するために、６Ｍ尿素変性６％ポリアクリルアミドゲル、２５０Ｖの条件でサンプルを泳動し、Ｖｉｓｔｒａ　Ｇｒｅｅｎ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で染色し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ製）で画像化した。その結果を図６に示す。
【０１０１】
図６において、レーン１は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ、レーン２は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ　を逆転写したもの、レーン３は、ビリオン化後に精製して逆転写したｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓを鋳型としてＰＣＲを行ったサンプルを泳動したものを示す。ビリオン化後に精製して逆転写したｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅを逆転写したものを鋳型としてＰＣＲを行ったものと同様に、目的のＤＮＡが増幅できていた。この結果から、ビリオン化後に精製したｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎが、Ｔ−ｓｐａｃｅｒを用いて逆転写できたことが確認された。
【０１０２】
実施例７：ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓの核酸部分の増幅方法の検討
（１）転写用ＤＮＡの構築とｍＲＮＡの作成
転写効率の高い大腸菌ウィルスＴ７のＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって認識されるＤＮＡ配列（Ｔ７プロモーター配列）と翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されるＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ配列）と原核細胞のリボソームによって認識される（シャイン・ダルガノ配列：Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）を有し、その下流にＯｃｔ−１の一部（ネガティブコントロール／ＰＯＵ；配列番号１）あるいはｐｒｏｔｅｉｎ　ＡのＢドメイン（配列番号４）とＦＬＡＧ配列、Ｔ−Ｓｐａｃｅｒと連結するための配列（Ｙ−ｔａｇ）をコードしたＤＮＡを構築した。
2004097213.tif 000003
構築されたＤＮＡを実施例２に記載の方法に従って転写し、ｍＲＮＡを調製した。
【０１０３】
（２）ｍＲＮＡとＴ−スペーサーとのライゲーション
実施例１で作成したＴ−Ｓｐａｃｅｒ（Ｔｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ）と上記（２）作成した各ｍＲＮＡとを、実施例３に記載の方法に従ってライゲーションし、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅを調製した。
（３）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ形成
実施例４に記載の方法で、上記（２）で調製したｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅを用いてｖｉｒｉｏｎ形成をさせた。
Ｖｉｒｉｏｎ形成は、単独で行う場合にはＢドメインと　ＰＯＵのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅをそれぞれ８　ｐｍｏｌ用い、混合して行う場合には、１：１であわせて８　ｐｍｏｌになるようにして翻訳させた。
（４）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの精製
実施例５（２）に記載の方法に準じてｖｉｒｉｏｎ精製を行った。
（５）精製ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの逆転写反応
上記（４）で得られたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ精製画分を用いて、実施例６に記載の方法に準じて逆転写を行った。
【０１０４】
（６）ＰＣＲのための鋳型の調製方法の検討
（ａ）処理なし、（ｂ）熱処理（ＰＣＲ反応を行う直前に９５℃、５分加熱）、（ｃ）Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｋ処理（１００　μｇ／ｍｌ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｋ（ＧＩＢＣＯ製），　ｆｉｎａｌ　１００ｍＭ　ＫＣｌ（ｐＨ８．０），　５０ｍＭ　ＥＤＴＡ，　５００ｍＭ　ＮａＣｌ，　３７℃，　３０分）、（ｄ）ＲＮａｓｅ　Ｈ処理（１０ｕｎｉｔ　ＲＮａｓｅ　Ｈ（ＴＯＹＯＢＯ製），　３７℃，　３０分）し、エタノール沈澱後ＰＣＲを行った。ＤＮＡ合成酵素は、ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　（ＴＡＫＡＲＡ製）を用いた。プライマーは、センス側：ＧＴＴ　ＴＡＡ　ＣＴＴ　ＴＡＡ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＴＧ（配列番号２）、アンチセンス側：ＴＴＴ　ＣＣＣ　ＧＣＣ　ＧＣＣ　ＣＣＣ　ＣＧＴ　ＣＣＧ　ＣＴＴ　ＣＣＧ　ＣＣＣ　ＴＴＧ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＴＣＡ　ＴＣＣ　ＴＴＧ　ＴＡＡ　ＴＣ（配列番号３）を用いた。
結果を確認するために、６Ｍ尿素変性４％ポリアクリルアミドゲル、２５０Ｖの条件でサンプルを泳動し、Ｖｉｓｔｒａ　Ｇｒｅｅｎ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で染色し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ製）で画像化した。その結果を図７に示す。図から明らかなように、ＰＯＵおよびＢドメインのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎが混合された状態では、ＲＮａｓｅＨ処理した場合に、それぞれの核酸部分が遺伝子により偏ることなく効率よく行われることがわかった（図７（ｄ）レーン１）。
【０１０５】
実施例８：　Ｐｏｏｌ（ネガティブコントロール／ＰＯＵ）からのｐｒｏｔｅｉｎ　ＡのＢドメインの選択
（１）転写用ＤＮＡの構築
転写効率の高い大腸菌ウィルスＴ７のＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって認識されるＤＮＡ配列（Ｔ７プロモーター配列）と翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されるＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ配列）と原核細胞のリボソームによって認識される（シャイン・ダルガノ配列：Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）を有し、その下流にＯｃｔ−１の一部（ネガティブコントロール／ＰＯＵ；配列番号１）あるいはｐｒｏｔｅｉｎ　ＡのＢドメイン（配列番号４）とＦＬＡＧ配列、Ｔ−Ｓｐａｃｅｒと連結するための配列（Ｙ−ｔａｇ）をコードしたＤＮＡを構築した。
2004097213.tif 000004
【０１０６】
（２）ｍＲＮＡの作成
上記（１）で構築されたＤＮＡを実施例２に記載の方法に従って転写し、ｍＲＮＡを調製した。
【０１０７】
（３）ｍＲＮＡとＴ−スペーサーとのライゲーション
実施例１で作成したＴ−Ｓｐａｃｅｒ（Ｔｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ）と上記（２）で作成した各ｍＲＮＡとを、実施例３に記載の方法に従ってライゲーションし、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅを調製した。
【０１０８】
（４）Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ形成
実施例４に記載の方法で、上記（３）で調製したｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅを用いてｖｉｒｉｏｎ形成をさせた。
Ｖｉｒｉｏｎ形成させる際に、Ｂドメインと　ＰＯＵのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅを、１：１、１：２０、１：２００あるいは１：２００、１：２００００、１：２００００００、１：２００００００００であわせて８　ｐｍｏｌになるようにして翻訳させた。
【０１０９】
（５）Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの精製
実施例５（２）に記載の方法に準じてｖｉｒｉｏｎ精製を行った。
【０１１０】
（６）精製ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの逆転写反応
上記（５）で得られたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ精製画分を用いて、実施例６に記載の方法に準じて逆転写を行った。
【０１１１】
（７）Ｂドメインの選択−１
逆転写反応したもの（それぞれ４０ｕｌ）を、ｆｉｎａｌ　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．２５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５０μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、０．５　μｇ／ｍｌ　ｔＲＮＡになるように調製した（ｔｏｔａｌ　５０μｌ）。これを、１０μｇの抗ＦＬＡＧ　Ｍ２抗体　（ｓｉｇｍａ製）　を結合させたプロテインＧセファロースビーズ１０μｌ　（アマシャム・ファルマシア）に４℃、１時間結合させ、４０μｌのＴＢＳで３回洗い、２０μｌの０．１Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ　（ｐＨ２．７）　で３回溶出し、それぞれ１Ｍ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ９．０）を１μｌ加えることによって、中性にし、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを得た。
上記の溶出画分を集め、その１／１０量６μｌを選択前のサンプルとした。残りの溶出画分を、ｆｉｎａｌ　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．２５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、０．５μｇ／ｍｌ　ｔＲＮＡになるように調製した（ｔｏｔａｌ　６０．９μｌ）。これを、ＩｇＧセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に、４℃で１時間〜一晩結合させ、４０μｌのＴＢＳで３回洗った。洗浄後のビーズを選択後のサンプルとした。
【０１１２】
選択前、後のサンプルをＲＮａｓｅ　Ｈ処理（１０ｕｎｉｔ　ＲＮａｓｅ　Ｈ　（ＱＩＡＧＥＮ製），　３７℃，　３０分）し、次いでｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ処理（１００　μｇ／ｍｌ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｋ（ＧＩＢＣＯ製）　，　ｆｉｎａｌ　１００ｍＭ　ＫＣｌ（ｐＨ８．０），　５０ｍＭ　ＥＤＴＡ，　５００ｍＭ　ＮａＣｌ，　３７℃，　３０分）し、エタノール沈澱後ＰＣＲを行った。ＤＮＡ合成酵素は、ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　（ＴＡＫＡＲＡ製）を用いた。プライマーは、センス側：ＧＴＴ　ＴＡＡ　ＣＴＴ　ＴＡＡ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＴＧ（配列番号２）、アンチセンス側：ＴＴＴ　ＣＣＣ　ＧＣＣ　ＧＣＣ　ＣＣＣ　ＣＧＴ　ＣＣＧ　ＣＴＴ　ＣＣＧ　ＣＣＣ　ＴＴＧ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＴＣＡ　ＴＣＣ　ＴＴＧ　ＴＡＡ　ＴＣ（配列番号３）を用いた。
【０１１３】
結果を確認するために、６Ｍ尿素変性４％ポリアクリルアミドゲル、２５０Ｖの条件でサンプルを泳動し、Ｖｉｓｔｒａ　Ｇｒｅｅｎ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で染色し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ製）で画像化した。その結果を図８に示す。
【０１１４】
バンドの定量はＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅｒ　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ製）で画像化したものを、解析ソフトを用いて数値化した。その結果を表１及び表２に示す。表中の値は、ＰＯＵの量を１としたときの　Ｂドメインの比である。なお、１：２００以上の割合いでＰＯＵが存在している場合には、ＰＣＲのバンドとしてＢドメインのバンドは検出できなかった。
【０１１５】
【表１】
2004097213.tif 000005
【０１１６】
【表２】
2004097213.tif 000006
【０１１７】
（８）Ｂドメインの選択−２
上記（７）１ｓｔ　ｒｏｕｎｄで選択、濃縮されたＢドメインとネガティブコントロール（ＰＯＵ）ＤＮＡをもちいて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ用に再ライブラリー化し、さらに、Ｂドメインを次の通り選択した。
【０１１８】
先ず、１ｓｔ　ｒｏｕｎｄで選択、濃縮されたＢドメインとネガティブコントロール（ＰＯＵ）ＤＮＡをアガロースゲルで分離し、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　キット（ＱＩＡＧＥＮ製）で精製した。そのＤＮＡに５’非翻訳領域を連結させた。ＤＮＡ合成酵素は、ＴａＫａＲａＥｘ　Ｔａｑ　（ＴＡＫＡＲＡ製）をもちいた。連結させた５’非翻訳領域の配列は次の通りである。
2004097213.tif 000007
転写以降は、１ｓｔ　ｒｏｕｎｄと同様に行った。その結果を図９に示す。
【０１１９】
（９）選択結果の評価
上記の通り、本実施例７においては、１ｓｔ　ｒｏｕｎｄでＩｇＧと反応しないＰＯＵ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅに、それぞれの割合いで結合するＢドメイン　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅを混ぜて、ビリオン化以降の反応を共に行った。その際、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅを、計約８ｐｍｏｌになるように調整して反応を行い、それぞれの過程を踏んだ後、ＩｇＧに結合させる前にはｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎとしては０．１　ｐｍｏｌ程度になっている。これを、１／１０量とっておき選択前のサンプルとした。残りの９／１０をＩｇＧカラムに結合させ、洗浄したあと残ったものを選択後のサンプルとした。それぞれについてＰＣＲ　を行い、泳動したものを図８及び９に示した。
【０１２０】
図８は、選択前と選択後のＰＯＵとＢドメインのバンドの濃さを示しているが、そのまま定量してＢドメインとＰＯＵが１：２０や１：２００になっているわけではない。検出されているバンドの比にから逆算して、初め１：２００で混ぜたものが、選択後には１：２０の選択前に近い比を示すので、１０倍濃縮されたというように考える。今回の結果から考えると、１：２００で始めたものは１００倍濃縮されて１：２程度に、１：２万ではじめたものは１万倍濃縮されて１：２程度に、１：２００万ではじめたものは１０万倍濃縮されて１：２０程度に、１：２億ではじめたものは１０００万倍濃縮されて１：２０程度になる。
【０１２１】
この選択後のものからｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを作製し、２ｎｄ　ｒｏｕｎｄを行った。１ｓｔ　ｒｏｕｎｄでそれぞれ１：２から１：２０まで濃縮されているので、１ｓｔ　ｒｏｕｎｄの１：１から１：２０でみられた濃縮パターンと同じような結果が得られた（図９）。
今回は、ライブラリーのサイズとして選択時に約１ｘ１０１１のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓビリオンを用いて行ったが、目的に合わせてサイズは増減できる。
【０１２２】
【発明の効果】
本発明で用いるＴ−スペーサーは、ｍＲＮＡとライゲーションすることにより、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅを効率的に構築することができ、さらにこれを翻訳することでｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを容易に作製することができる。また、このＴ−スペーサーには、ｍＲＮＡの逆転写のためのプライマーとして作用するＤＮＡ配列を有していることから、上記で得られたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを逆転写反応に付することにより、ｍＲＮＡをＤＮＡに転換することができる。
【０１２３】
さらに、本発明で用いるＴ−スペーサーは親和性物質を有することにより、ｍＲＮＡ側でｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの精製を行なうことができるだけでなく、ｍＲＮＡを支持体に固定化してプロテインチップ作成する際においても有用である。
かかる特長を有するＴ−スペーサーを用いて製造された核酸−タンパク質複合体（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ）を用いて、所望の機能を（生物活性）を有するタンパク質および／または核酸の効率的な選択、相互作用の検出や機能の解析などが可能となる。
【０１２４】
【配列表】
2004097213.tif 000008
2004097213.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、従来のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの精製技術の具体例を示す。
【図２】図２は、本発明で使用可能な一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の構造を示す。
【図３】図３は、本発明で使用可能な一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体の具体例を示す。
【図４】図４は、Ｔ−スペーサー（親和性物資としてビオチンを使用）を用いて　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを精製した結果を示す。
【図５】図５は、Ｔ−スペーサー（親和性物資としてＰｏｌｙ　Ａを使用）を用いて　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを精製した結果を示す。
【図６】図６は、Ｔ−スペーサーを用いた　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎの精製後の逆転写反応の結果を示す。
【図７】図７は、本発明の方法に従いｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ　ｐｏｏｌ（ネガティブコントロール／ＰＯＵ）の核酸部分の増幅反応の結果を示す。
【図８】図８は、本発明の方法に従いｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ　ｐｏｏｌ（ネガティブコントロール／ＰＯＵ）からｐｒｏｔｅｉｎ　ＡのＢドメインを有するｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを選択した結果を示す。
【図９】図９は、本発明の方法に従いｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎ　ｐｏｏｌ（ネガティブコントロール／ＰＯＵ）からｐｒｏｔｅｉｎ　ＡのＢドメインを有するｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖｉｒｕｓ　ｖｉｒｉｏｎを選択した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004097213.tif 000016
【図８】
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【図９】
2004097213.tif 000018