(57)【要約】【課題】  ＤＮＡのＳＮＰを同定するための唯一の利用可能な方法は、配列決定によるものであり、これは高価で、困難で、そして労働力消費性である。そのため、安価で、簡易で、そして労働力が少なくてすむ配列決定法を提供することが目的である。さらには、疾患のゲノム基礎およびそのマーカーを同定するための方法を提供することが目的である。【解決手段】  健康体ヒトドナーからのゲノムサンプルのデータベースを創出するためのプロセスおよび方法、多型遺伝的マーカーおよび他のマーカーを同定し、そして疾患および状態と相関させるデータベースを使用する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルが取得される複数の健康体生物を表すデータポイント；および
それぞれの生物を同定するインデクサーを含むデータベースであって、ここで
（ａ）各データポイントが、生物型および他の同定のための情報を表すデータと、インデクサーによって連関される；かつ
（ｂ）該データが蓄積可能である；
データベース。
【請求項２】
データポイントが、コンピューター読み取り可能蓄積媒体に蓄積される、請求項１のデータベース。
【請求項３】
リレーショナルデータベースである、請求項１または２のデータベース。
【請求項４】
データポイントが、人種、年齢、性、身長、体重、アルコール摂取量、妊娠回数、生児出生回数、菜食主義、肉体的活動の型、住居の状態および／または特定の状態における居住の期間、教育レベル、親の死亡年齢、親の死亡原因、過去のまたは現在の喫煙者、喫煙者としての期間、喫煙頻度、肉親(親、兄妹、子供)における疾患の発生、処方薬の使用および／またはその理由、入院の期間および／または回数、および環境要因にさらされること、
からなる群から選択される、１または２以上のパラメータに関する質問に対する回答である、請求項１−３いずれかのデータベース。
【請求項５】
生物が動物、細菌、真菌、原生生物および寄生生物の中から選択されている、
請求項１−４いずれかのデータベース。
【請求項６】
サンプルが体液または組織である、請求項１−５いずれかのデータベース。
【請求項７】
サンプルが血液、血液画分、細胞、亜細胞性のオルガネラ、細胞、種子、微生物、病原体および生殖組織サンプルから選択される、請求項１−５いずれかのデータベース。
【請求項８】
生物由来の表現型データをさらに含む、請求項１−７いずれかのデータベース。
【請求項９】
生物から取得した核酸からの遺伝子型のデータをさらに含む、請求項１−８いずれかのデータベース。
【請求項１０】
遺伝子型データが、遺伝的マーカー、非コード領域、マイクロサテライト、ＲＦＬＰおよびＶＮＴＲを含む、請求項１−９いずれかのデータベース。
【請求項１１】
選択されたパラメータにしたがって請求項１−１０いずれかのデータベースを分類し、選択されたパラメータにマッチするサンプルを同定すること；
それぞれの同定されたサンプルから生体高分子を単離すること；
所望によりそれぞれ単離された生体高分子をプールすること；
所望により生体高分子の量を増幅すること；
プールした生体高分子を切断して、そのフラグメントを生成させること；
得られるフラグメントのマススペクトルを取得し、対照のマススペクトルと、該マススペクトルを比較し、スペクトル間の相違を同定し、それによって任意の多型を同定すること；
を含む集団における多型の発見方法；
ここで、
該対照のマススペクトルは、コレクション中の未分類のサンプルまたは異なるパラメーターに従って分類されたサンプルから取得される。
【請求項１２】
切断が生体高分子を酵素と接触させることにより行われる、請求項１１の方法。
【請求項１３】
酵素がヌクレオチドグリコシラーゼ、ニッカーゼおよびIIＳ型制限酵素からなる群から選択される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
生体高分子が核酸またはタンパク質である、請求項１１の方法。
【請求項１５】
質量分析の形式がマトリックス介助レーザー脱離／イオン化、飛行時間型(ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ)、電子スプレー(ＥＳ)、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ、イオンサイクロトロン共鳴(ＩＣＲ)、フーリエ変換およびそれらの組み合わせの中から選択される、請求項１１の方法。
【請求項１６】
選択されたパラメータにしたがって請求項１−１０いずれかのデータベースを分類し、選択されたパラメータにマッチするサンプルを同定すること；
それぞれの同定されたサンプルから生体高分子を単離すること；
それぞれ単離された生体高分子をプールすること；
所望により生体高分子の量を増幅すること；および
プールした生体高分子における多型の頻度を決定すること；
を含む多型をパラメータと相関させる方法；
ここで、
対照と比較したときの多型の頻度の変化は、多型と、選択されたパラメータとの相関を示しており；かつ
該対照は、未分類のデータベースまたは異なるパラメータに従って分類されているデータベースより同定されたサンプルから取得した、プールした生体高分子における多型の頻度である。
【請求項１７】
多型性の遺伝子座にリンクした任意の経路または遺伝子を同定することをさらに含む請求項１６の方法であって、ここで、
遺伝的マーカーの候補である多型性が同定される、方法。
【請求項１８】
頻度が、多型を含むプールした核酸中の核酸分子のパーセンテージである、請求項１６または１７の方法。
【請求項１９】
パラメータが、人種、年齢、性、身長、体重、アルコール摂取量、妊娠回数、生児出生回数、菜食主義者、肉体的活動の種類、住居の状態および／または特定の状態における居住の期間、教育レベル、親の死亡年齢、親の死亡原因、過去のまたは現在の喫煙者、喫煙者としての期間、喫煙頻度、肉親(親、兄妹、子供)における疾患の発生、処方薬の使用および／またはその理由、入院の期間および／または回数、および環境要因にさらされること、
からなる群から選択される、請求項１１−１８いずれかの方法。
【請求項２０】
パラメータが疾患の発生または肉親のメンバーにおける特定の疾患であり、それによって多型を該疾患と相関させる、請求項１９の方法。
【請求項２１】
パラメーターが、年齢、人種または性別であり、かつ、多型性の頻度が、健康体集団における、加齢で、人種で、または性別で決定される、
請求項１９の方法。
【請求項２２】
パラメータが年齢であり、それによって多型を死亡（率）、早期罹病（率）、または罹病（率）および早期死亡（率）に対する感受性と相関させる、請求項１９の方法。
【請求項２３】
切断が生体高分子を酵素と接触させることによりおこなわれる、請求項１１−２２いずれかの方法。
【請求項２４】
酵素がヌクレオチドグリコシラーゼ、ニッカーゼおよびIIＳ型制限酵素からなる群から選択される、請求項２３の方法。
【請求項２５】
生体高分子が核酸またはタンパク質である、請求項２３の方法。
【請求項２６】
多型が、
a)第１のオリゴヌクレオチドを標的核酸とハイブリダイズさせること；
b)第２のオリゴヌクレオチドを標的核酸の隣接領域とハイブリダイズさせること；
c)ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをライゲートさせること；および
ｄ)標的核酸の存在を指標として、ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを質量分析法により検出すること：
のステップを含む方法でサンプル中の標的核酸の存在を検出することにより同定される、請求項１６−２５いずれかの方法。
【請求項２７】
多型が、
a)第１のオリゴヌクレオチドを標的核酸とハイブリダイズさせ、第２のオリゴヌクレオチドを標的核酸の隣接領域とハイブリダイズさせること；
b)ハイブリダイズした第１および第２のオリゴヌクレオチドを切断酵素と接触させて切断生成物を形成させること；および
c)標的核酸の存在を指標として質量分析法により切断生成物を検出すること：
のステップを含む方法でサンプル中の標的核酸を検出することにより同定される、請求項１６−２５いずれかの方法。
【請求項２８】
核酸の領域を増幅しアプリコンを作成すること、ここで、得られるアプリコンには１または２以上の酵素制限部位が含まれ；
アプリコンを制限酵素と接触させ、フラグメントを作成すること；
得られるフラグメントのマススペクトルを取得すること、および
マススペクトルのシグナルを解析すること；
を含む、請求項１６−２５いずれかの方法；
ここで、
該多型はシグナルのパターンから検出される。
【請求項２９】
質量分析の形式がマトリックス介助レーザー脱離/イオン化、飛行時間型(ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ)、電子スプレー(ＥＳ)、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ、イオンサイクロトロン共鳴(ＩＣＲ)、フーリエ変換およびそれらの組み合わせの中から選択される、請求項２７または２８の方法。
【請求項３０】
プライマーオリゴ塩基伸長法(ＰＲＯＢＥ法)でサンプル中の標的核酸を同定することにより多型を同定する、請求項１６−２５いずれかの方法。
【請求項３１】
プライマーオリゴ塩基伸長法が、
a)標的ヌクレオチドを含む核酸分子を取得すること；
b)所望により核酸分子を固体支持体上に固定し、固定された核酸分子を作成すること；
c)核酸分子を、標的ヌクレオチドに隣接した部位で、核酸分子に相補的なプライマーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること；
d)ステップc)の生成物をジデオキシヌクレオシド・トリホスフェートまたは３’−デオキシヌクレオシド・トリホスフェートおよびポリメラーゼを含むコンポジションと接触させ、その結果、標的ヌクレオチドに相補的なジデオキシヌクレオシド・トリホスフェートまたは３’−デオキシヌクレオシド・トリホスフェートのみをプライマー上で伸長させること；および
e)伸長したプライマーを検出し、それにより標的ヌクレオチドを同定すること：
を含む、請求項３０の方法。
【請求項３２】
伸長したプライマーの検出を質量分析法により実施する請求項３１の方法であって、
ステップd)の生成物をイオン化し、気化させること；および
質量分析法により伸長したプライマーを検出し、それにより標的ヌクレオチドを同定すること；
を含む方法。
【請求項３３】
サンプルをチップ上のアレイとして質量分析計に提供し；そして
各サンプルが、マトリックス介助レーザー脱離／イオン化(ＭＡＬＤＩ)質量分析法で使用される質量分析計におけるレーザーにより発射されたレーザースポットほどの大きさの体積を占める、請求項３２の方法。
【請求項３４】
反応容器中に含まれる生物学的サンプルに対して、それぞれが処理(procedure)を実行する複数のプロセシング・ステーションを含むプロセスライン；
プロセシング・ステーションからプロセシング・ステーションへと反応容器を運ぶロボットシステム；
プロセスラインのテスト結果を受け取り、テスト結果を自動的にプロセッシングし、反応容器中の生物学的サンプルに関して決定をするデータ解析システム；
各プロセシング・ステーションでのテストをいつ終了させるかを決定し、それに応じて、反応容器を次のテストステーションへと移動させ、コントロールシステムが停止の指示を受けるまで逐次、反応容器を連続的にプロセッシングするコントロールシステム；および
自動化されたプロセスラインによりテストされるサンプルがデータベース内の対象からのサンプルを含む請求項１−１０いずれかのデータベース：
を含む生物学的サンプルのハイスループットプロセシングシステム。
【請求項３５】
プロセシング・ステーションのうちの１つが質量分析計を含む、請求項３４のシステム。
【請求項３６】
生物学的サンプルに関するテストデータが１または２以上のシグナルを含むように、データ解析システムが質量分析計からのテストデータを受け取ることによりテスト結果をプロセッシングし、その後、データ解析システムが各シグナルの曲線の下の面積を決定し、その結果を正規化し、テストされたサンプル中のコンポーネントの相対量を表す実質的に定量的な結果を取得する、請求項３５のシステム。
【請求項３７】
請求項１−１０いずれかのデータベース；
自動化されたプロセスライン、ここでサンプルはデータベース内の対象由来のサンプルを含む自動化されたプロセスラインによりテストされる；および
サンプル内の生体高分子の解析のための質量分析計；
を含む、生物学的サンプルのハイスループットプロセシングのためのシステム。
【請求項３８】
生物学的サンプルのハイスループットプロセシングのための方法であって：
反応容器中に含まれる１または２以上の生物学的サンプルに対してそれぞれが処理を実行する、複数のプロセシング・ステーションを有するプロセスラインを含んだ請求項３４のシステムにしたがって反応容器を運ぶこと；
各プロセシング・ステーションでのテスト処理をいつ終了させるかを決定し、それに応答して、反応容器を次のプロセシング・ステーションに移動させること；
プロセスラインのテスト結果を受け取り、自動的にテスト結果をプロセッシングし、反応容器中の生物学的サンプルに関してデータ解析決定を作成すること；そして
停止の指示を受けるまで逐次連続的に反応容器を処理すること；
を含む方法；
ここで、
自動化されたプロセスラインによりテストされるサンプルには、データベース内の患者由来のサンプルが含まれる。
【請求項３９】
プロセシング・ステーションのうちの１つが質量分析計を含む、請求項３８の方法。
【請求項４０】
サンプルが、プライマーオリゴ塩基伸長法(ＰＲＯＢＥ法)を含む方法により解析される、請求項３９の方法。
【請求項４１】
生物学的サンプルに関するテストデータが１または２以上のシグナルまたはシグナルを表す絶対値を含むように、質量分析計からのテストデータを受け取ることによりテスト結果をプロセッシングし、その後、データ解析システムが各シグナルの曲線の下の面積を決定し、その結果を正規化し、テストされたサンプル中のコンポーネントの相対量を表す実質的に定量的な結果を取得すること：
をさらに含む請求項４０の方法。
【請求項４２】
プライマーオリゴ塩基伸長法が、
a)標的ヌクレオチドを含む核酸分子を取得すること；
b)所望により核酸分子を固体支持体上に固定し、固定された核酸分子を作成すること；
c)核酸分子を、標的ヌクレオチドに隣接した部位で核酸分子に相補的なプライマーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること；
d)ステップc)の生成物をジデオキシヌクレオシド・トリフォスフェートまたは３’−デオキシヌクレオシド・トリホスフェートおよびポリメラーゼを含むコンポジションと接触させ、その結果、標的ヌクレオチドに相補的なジデオキシヌクレオシドまたは３’−デオキシヌクレオシド・トリホスフェートのみをプライマー上で伸長させること；および
e)プライマーを検出し、それにより標的ヌクレオチドを同定すること：
を含む、請求項４０の方法。
【請求項４３】
伸長したプライマーの検出を質量分析法により実施する、請求項４２の方法であって、
ステップd)の生成物をイオン化し、気化させること；および
質量分析法により伸長したプライマーを検出し、それにより標的ヌクレオチドを同定すること；
を含む方法。
【請求項４４】
サンプル中の標的核酸が、
a)第１のオリゴヌクレオチドを標的核酸とハイブリダイズさせること；
b)第２のオリゴヌクレオチドを標的核酸の隣接領域とハイブリダイズさせること；
c)次いでハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをライゲートさせること；および
c)標的核酸の存在を指標として、ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを質量分析法により検出すること：
のステップを含む方法により検出および／または同定される、請求項３９の方法。
【請求項４５】
サンプル中の標的核酸が、
a)第１のオリゴヌクレオチドを標的核酸とハイブリダイズさせ、第２のオリゴヌクレオチドを標的核酸の隣接領域とハイブリダイズさせること；
b)ハイブリダイズした第１および第２のオリゴヌクレオチドを切断酵素と接触させて切断生成物を形成させること；および
c)標的核酸の存在を指標として質量分析法により切断生成物を検出すること：
のステップを含む方法により、検出および／または同定される、請求項３９の方法。
【請求項４６】
評価されるべき健康体の標的集団および遺伝的変異を選択すること；
集団のメンバーから取得した生体高分子の複数のサンプルをプールすること；
変異を含む生体高分子を質量分析法により決定または検出すること；
マススペクトルまたはそのデジタル表示を取得すること；および
該集団の変異の頻度を決定すること：
を含む遺伝的変異の頻度のハイスループット決定方法。
【請求項４７】
変異が対立遺伝子変異、翻訳後修飾、核酸修飾、標識、核酸の質量的修飾およびメチル化からなる群から選択され；そして／または
関心のある生体高分子の濃度がそれぞれのサンプルにおいて同じである、生体高分子が核酸、タンパク質、多糖類、脂質、低分子有機メタボラリトまたは中間体であり；そして／または
該頻度が、ゲノム変異を含む生体高分子の質量に対応する、マススペクトルまたはそのデジタル表示のピークの下の面積を決定することを含む方法を評価することにより決定される；
請求項４６の方法。
【請求項４８】
頻度の決定方法が、バックグランドが補正されている、全体のマススペクトルの総面積に対するシグナルまたはそのデジタル表示の比率を決定することにより実施される、請求項４７の方法。
【請求項４９】
(a)選択されたパラメータにしたがって請求項１−１０いずれかのデータベースを分類し、選択されたパラメータにマッチするサンプルを同定すること；
(b)それぞれの同定されたサンプルから核酸を単離すること；
(c)所望によりそれぞれの単離された核酸をプールすること；
(d)核酸の量を増幅すること；
(e)１本鎖核酸を形成させ、それぞれの１本鎖を別個の反応容器に分けること；
(f)それぞれの１本鎖核酸をアダプター核酸と接触させ、アダプター複合体を形成させること；
(g)アダプター複合体をヌクレアーゼおよびリガーゼと接触させること；
(h)ステップ(g)の生成物を、ライゲートしたアダプターを増幅することができる混合物と接触させ、伸長した生成物を生成させること；
(i)ステップ(h)から得られるそれぞれの核酸のマススペクトルを取得し、伸長した生成物に対応するシグナルを同定することにより多型を検出すること；
(j)同じ鎖上の異なる配列にハイブリダイズする別のアダプター核酸とハイブリダイズ可能な核酸を利用して、ステップ(f)〜(i)を繰り返すこと；
を含む、核酸中の多型をハプロタイピングする方法；
ここで、
該多型は１より多い伸長生成物を検出することによりハプロタイピングされる。
【請求項５０】
ヌクレアーゼがＦｅｎ−１である、請求項４９の方法。
【請求項５１】
選択されたパラメータにしたがって請求項１−１０いずれかのデータベースを分類し、選択されたパラメータにマッチするサンプルを同定すること；
それぞれの同定されたサンプルから核酸を単離すること；
それぞれ単離された核酸をプールすること；
所望により核酸の量を増幅すること；
核酸を少なくとも１つの酵素と接触させ、そのフラグメントを生成させること；
得られるフラグメントのマススペクトルを取得すること；
を含む、集団中の多型をハプロタイピングする方法；
ここで、
該多型は、多型に対応するシグナルを検出することにより検出され；そして
該多型は、核酸の同じ鎖に位置する多型のマススペクトルから決定することによりハプロタイピングされる。
【請求項５２】
酵素がニッカーゼである、請求項４９の方法。
【請求項５３】
ニッカーゼがＮＹ２ＡおよびＮＹＳ１からなる群から選択される、請求項５２の方法。
【請求項５４】
多型を同定すること；
健康体集団における多型の頻度を、年齢によって請求項１−１１いずれかのデータベースを層化することによって決定すること：および
加齢による統計的有意性の相違は、該多型性が罹病（率）、早期死亡（率）、または罹病（率）および早期死亡（率）への感受性と相関することを指摘する、年齢群間の多型性頻度の相違の統計的有意性を決定すること；
を含む、多型性が罹病（率）、早期死亡（率）、または罹病（率）および早期死亡（率）への感受性と相関するか否か決定する方法。
【請求項５５】
核酸サンプル内のメチル化されたヌクレオチドの検出方法であって、
核酸のサンプルを別個の反応容器に分けること；
１つの反応容器中の核酸を亜硫酸塩と接触させること；
各反応容器中の核酸分子を増幅すること；
各反応容器中の核酸分子を切断し、そのフラグメントを生成させること；および
１つの反応容器から得られるフラグメントのマススペクトル、および別の反応容器から得られるフラグメントの別のマススペクトルを取得すること；
を含む方法；
ここで、
シトシンのメチル化はマススペクトル間のシグナルの相違を同定することにより検出される。
【請求項５６】
増幅のステップがｄＵＴＰの存在下で行われ；そして
切断のステップがウラシルグリコシラーゼで処理し、該核酸を切断のために有効な条件下でインキュベートすることにより行われる、請求項５５の方法。
【請求項５７】
核酸サンプル内のメチル化ヌクレオチドを検出する方法であって、
任意の非メチル化シトシンを脱アミノ化するために重亜硫酸塩で核酸分子を処理し、ウラシルを生産する、
処理した分子を増幅する、
増幅した核酸分子をフラグメント化する、
得られたフラグメントのマススペクトルを取得し、シトシンの代わりにウラシルを含むものを、処理してない核酸分子から得られるスペクトルと、処理した増幅フラグメントからのスペクトルとを比較することによって同定する、
ことを含む、方法。
【請求項５８】
フラグメント化が、ウラシルグリコシラーゼで、フォスフェートバックボーンを切断するのに有効な条件下で処理することによって実施される、請求項５７の方法。
【請求項５９】
請求項２−１０いずれかのデータベースを含むコンピューターシステム。
【請求項６０】
請求項２−１０いずれかのデータベースを含むデータ蓄積媒体。
【請求項６１】
請求項１−１０いずれかのデータベースおよび質量分析計を含む組み合わせ。
【請求項６２】
生物学的サンプルを解析するための自動化されたプロセスラインである、請求項６１の組み合わせ。
【請求項６３】
請求項１−１０いずれかのデータベースおよび
インデックスがサンプルが取得された対象を同定するインデックスを付されたサンプルのコレクション；
を含む組み合わせ。
【請求項６４】
血液、組織、体液、細胞、種子、微生物、病原体および生殖組織のサンプルからなる群から選択される、複数のサンプル；および
各サンプルのソースおよび／または履歴（history）を表す、サンプルを含むコンテナーのシンボロジー：
を含む標的集団由来のサンプルのサブコレクション；
ここで、
標的集団は疾患状態について選択されていない健康体集団であり；
核酸配列情報が該サンプルから由来し；
コレクションは健康体集団からのサンプルを含み；そして
サブコレクションは特異的なパラメータにしたがって該コレクションを分類することにより得られる。
【請求項６５】
核酸、胎児組織、タンパク質のサンプルからなる群から選択される、複数のサンプル；および
各サンプルのソースおよび／または履歴を表す、サンプルを含むコンテナーのシンボロジー；
を含む標的集団由来のサンプルのサブコレクション；
ここで、
該標的集団は疾患状態で選択されていない健康体集団であり；
該コレクションは、健康体集団からのサンプルを含み；そして
該サブコレクションは、特異的なパラメータにしたがってコレクションを分類することにより得られる。
【請求項６６】
パラメータが、人種、年齢、性、身長、体重、アルコール摂取量、妊娠回数、生児出生回数、菜食主義者、肉体的活動の型、住居の状態および／または特定の状態における居住の期間、教育レベル、親の死亡年齢、親の死亡原因、過去のまたは現在の喫煙者、喫煙者としての期間、喫煙頻度、肉親(親、兄妹、子供)における疾患の発生、処方薬の使用および／またはその理由、入院の期間および／または回数、および環境要因にさらされること、
からなる群から選択される、請求項６４または６５のサブコレクション。
【請求項６７】
シンボロジーがバーコードである請求項６４または６５のサブコレクション。
【請求項６８】
生物学的サンプルのコンポジションを示すデータセットを作成すること；
データセットのノイズを除去し、ノイズが除去されたデータを作成すること；
ノイズが除去されたデータからベースラインを削除し、中間データセット（intermediate data set）を作成すること；
生物学的サンプルに関して推定されるピークを定義すること；
推定されるピークを用いて残留ベースライン(residual baseline)を作成すること；
残留ベースラインを中間データセットから除いて、補正されたデータセットを作成すること；
残留ベースラインを除去することに応じて、補正されたデータセット中で有り得るピーク(probable peak)を位置決定すること；および
位置決定した有り得るピークを用いて生物学的サンプルを同定すること；
を含む、生物学的サンプルの同定方法；
ここで、作成される生物学的サンプルデータセットは、アッセイ用のフラグメントのセンス鎖およびアンチセンス鎖からのデータを含む。
【請求項６９】
同定が、
センス鎖とアンチセンス鎖からのデータを組み合わせること、およびデータを予測されるセンス鎖およびアンチセンス鎖の値と比較して生物学的サンプルを同定することを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
有り得るピークが、センス鎖のデータ由来であるか、アンチセンス鎖のデータ由来であるかに従い、当該同定が、有り得るピークについてピーク確率を導くことを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
当該同定が、有り得るピークについてピーク確率を導くこと、および有り得るピークの下の算出した面積と、データセットにおけるすべてのピークの下の算出した予測される平均面積との比率に応じて、対立遺伝子ペナルティーを適用することを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
生物学的サンプルのコンポジションを示すデータセットを作成すること；
データセットのノイズを除去し、ノイズが除去されたデータを作成すること；
ノイズが除去されたデータからベースラインを削除し、中間データセットを作成すること；
生物学的サンプルに関して推定されるピークを定義すること；
推定されているピークを用いて残留ベースラインを作成すること；
残留ベースラインを中間データセットから除いて、補正されたデータセットを作成すること；
残留ベースラインを除去することに応じて、補正されたデータセット中で有り得るピークを位置決定すること；および
位置決定した有り得るピークを用いて生物学的サンプルを同定すること；
を含む、生物学的サンプルの同定方法；
ここで、
当該同定には、有り得るピークについてピーク確率を導くこと、および有り得るピークの下の算出した面積と、データセットにおけるすべてのピークの下の算出される予測される面積との比率に応じて、対立遺伝子ペナルティーを適用することが含まれる。
【請求項７３】
同定が、適用される対立遺伝子ペナルティーを受け取らなかった有り得るピークからのデータを比較し、オリゴヌクレオチドの生物学的データにしたがってそれらの質量を決定することを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
対立遺伝子ペナルティーが、予測される面積値に対するピークの下の面積の比率が３０％より大きい、有り得るピークには適用されない、請求項７２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
以下の出願の優先権の利益をここに請求する：
Andreas Braun, Hubert Koster; Dirk Van den Boonの、米国仮出願番号６０／２１７６５８、７月１０日出願、名称「データベースを作成する方法および多型遺伝的マーカーを同定するためのデータベース」；Andreas Braun, Hubert Koster, Dirk Van den Boomの、米国仮出願番号６０／１５９１７６、１９９９年１０月１３日出願、名称「データベースを作成する方法および多型遺伝的マーカーを同定するためのデータベース」；Andreas Braunの、米国仮出願番号６０／２１７２５１、２０００年７月１０日出願、名称「多型キナーゼアンカータンパク質遺伝子配列、多型キナーゼアンカータンパク質および多型キナーゼアンカータンパク質およびそれらをコードしている核酸を検出する方法」；およびPing Yipの、米国出願番号０９／６６３９６８、２０００年９月１９日出願、名称「生物学的サンプルを同定するための方法および装置」。
許容される場合、前記の出願および仮出願を引用をもって、その全体をここに含ませる。
【０００２】
発明の分野
健康体ヒトドナーからのゲノムサンプルのデータベースを創出するためのプロセスおよび方法。当該データベースを使用して多型遺伝的マーカーおよび他のマーカーを同定し、そして疾患および状態と相関させる方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
すべての生物の疾患は、遺伝され、または体の環境ストレス、例えば、ウイルスおよび毒物への応答に起因する、遺伝的コンポーネントを有する。ゲノムリサーチを進める究極的目標は、この情報を使用して、これらの疾患を同定し、処置し、そして有効に治療する新しい方法を開発することである。第一のステップは、個体サンプルのレベルで疾患組織をスクリーニングし、そしてゲノム変化を同定することである。
【０００４】
次いで、これらの「疾患」マーカーの同定は、これらの誤りのある遺伝子または多型を検出する診断テストの開発および商業化を活気付ける。医学的および薬学的コミュニティーに対する問題提起は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト、タンデムリピート、新規にマッピングされたイントロンおよびエキソンを含む遺伝的マーカーの数を増加させることによって、疾患を同定するだけでなく、また疾患の進行に従い、そして処置に対する生物の応答を予測する、遺伝子型を同定することである。
【０００５】
現行の薬学的および生物工学的産業は、疾患を発見し、それからその疾患について、ゲノムの基礎を決定しようと試みる。このアプローチは、時間消費性で、そして高価であり、そして多くの場合、その疾患にどの経路が関係し得るかについて、調査者は推測しなければならない。
【０００６】
ゲノミクス
現在、利用可能なゲノム情報を分析するときに使用される２種の主要な戦略は、逆遺伝学的な力ずくの戦略および知識に基づく経路指向的（pathway oriented）フォワードジェネティックス（forward genetics）戦略である。この力ずくのアプローチによって、配列情報の大きなデータベースを得るが、医学的または配列情報の他の使用について、わずかな情報しか得られない。ゆえに、この戦略は、価値に疑問のある漠然とした産物をもたらす。知識に基づく戦略によれば、特定のＤＮＡ配列およびその経路の他の産物の医学的使用についての多くの情報を含む小さいデータベースが得られ、そして高価値の具体的な産物が得られる。
【０００７】
多型
多型は血液型の同定によって１９０１以来知られている。１９５０年代に、これらは大集団の遺伝的研究を使用して、タンパク質のレベルで同定された。１９８０年代および１９９０年代に、多くの既知のタンパク質多型が、ゲノムＤＮＡの遺伝子座と相関された。例えば、アポリポタンパク質Ｅ４型の対立遺伝子の遺伝子用量（gene dose）が、遅発型ファミリーのアルツハイマー病のリスクと相関され（例えば、Corder et al.(1993)Science 261: 921-923参照）；血液凝第Ｖ因子の突然変異が活性化タンパク質Ｃに対する抵抗性と連関され(例えば、Bertina et al. (1994)Nature 369:64-67参照)；ＨＩＶ−１感染に対する抵抗性がＣＣＲ−５ケモカインレセプター遺伝子の突然変異体対立遺伝子を有する白人個体で示され（例えば、Samson et al. (1996)Nature 382:772-725参照）；そして抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えばマクロファージ）の高頻度突然変異性トラクトがAshkenziユダヤ人バックグラウンドの個体の家族性結腸直腸癌で同定された（例えば、Laken et al. (1997)Nature Genet. 17:79-83参照）。ヒトゲノムの３百万より多い多型部位が存在し得る。多くは同定されたが、なお特徴を把握され、またはマッピングされ、またはマーカーと連関されていない。
【０００８】
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）
ゲノミクスの焦点の多くは、ＳＮＰの同定にあり、それは種々の理由のために重要である。それらは、間接的テスト（ハプロタイプの連関）および直接的テスト（機能変異体）をもたらす。これらは、最も豊富な、そして安定な遺伝的マーカーである。共通の疾患は、共通する遺伝的な変化によってとくにうまく説明され、そしてヒト集団の天然の変異は、疾患、治療および環境的相互作用の理解の助けとなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在、ＤＮＡのＳＮＰを同定するための唯一の利用可能な方法は、配列決定によるものであり、これは高価で、困難で、そして労働力消費性である。さらに、ひとたびＳＮＰが発見されると、それが真の多型なのか配列決定のエラーなのか決定するために確認しなければならない。また、次いで、発見されたＳＮＰは特定の表現型と連関されるかどうか、評価されなければならない。したがって、疾患についてのゲノム基礎を、およびそのマーカーを同定するための新規パラダイムを開発する必要がある。したがって、疾患のゲノム基礎およびそのマーカーを同定するための方法を提供することがここでの目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
要約
データベースおよびデータベースを使用する方法を、ここで提供する。このデータベースは、健康であるという基礎のみに基づき選択された集団の対象と連関するパラメータのセットを含む（すなわち、対象が哺乳動物、例えば、ヒトである場合、彼らは外観上の健康および検出可能な感染症がないことに基づいて選択される）。このデータベースは、１または２以上の選択されたパラメータに基づいて分類することができる。
【００１１】
データベースは、好ましくはリレーショナルデータベース（relational database）であり、それはそれぞれの対象を表すインデックスが、パラメータ（それらはデータ、例えば、年齢、人種、性別、病歴等、そして究極的には遺伝子型情報であり、データベースに入力され、そして蓄積された）を関連づけるのに役立つ。次いで、このデータベースは、これらのパラメータにしたがって分類することができる。最初に、そのパラメータ情報はそれぞれの対象（そこから体組織または体液サンプルを取得する）によって回答される質問票から取得される。それぞれのサンプルについてさらなる情報を取得するように、この情報をデータベースに入力することができ、そして分類パラメータとして役立てることができる。
【００１２】
健康体個体から取得したデータベースは、多くの使用（例えば、既知の多型を表現型または疾患と相関させること）を有する。このデータベースを使用して、有害である、有益である、そして疾患と相関のある対立遺伝子を同定することができる。
【００１３】
ここでの目的のために、遺伝子型情報を当業者に既知の任意の方法を使用して取得することができるが、好ましくは質量分析法を使用して取得する。
【００１４】
対象および遺伝子型および他のパラメータ、例えば、年齢、人種、種族および性の既存のデータベースの新規の使用を、またここで提供する。任意のデータベースを、ここでの方法にしたがって分類することができ、そして任意の分類パラメータと統計的に有意な相関を示す対立遺伝子を同定することができる。しかし、ここで提供するデータベースおよびランダムに選択したデータベースが、これらの方法でよりよく機能することが注目され、なぜなら、疾患に基づくデータベースは多くの限界（それらは比較的大きさが小さい点、選択された疾患集団の均質性、およびデータベースの選択のためのマーカーと連関する多型のマスキング効果を含む）をこうむっているからである。ゆえに、ここで提供する健康体のデータベースは、これまで認識され、または開拓されていない有利な効果を提供する。
【００１５】
しかし、ここで提供する方法は、多型の発見および相関のための分類を有する（または有しない）、疾患に基づくデータベースを含む、選択されたデータベースとともに使用することができる。さらに、ここで提供するデータベースは、多型の発見のために典型的に利用される選択されていないデータベースよりもより大きい遺伝的多様性を表し、したがって、これにより、効率的に多型を発見し、そして相関を得ることができる。
【００１６】
ここで提供するデータベースは、同定された多型を取得するために使用し、そしてデータを選択されたパラメータにしたがって分類するときに、それが頻度について変化するか確認することができる。
【００１７】
これらの方法のある使用は、既知の遺伝的マーカーの出現に従うことによって、特定のパラメータと選択されたマーカーを相関させることであり、それからこの相関を作成したら、疾患との相関を決定し、または同定する。この使用の例は、ｐ５３およびリポタンパク質リパーゼ多型である。ここで例示のように、既知のマーカーは、ある種の群、例えば、特定の人種または種族またはある性別と特定の相関を有することが示される。次いで、そのような相関によって、よりよい診断テストおよび処置養生法の開発が可能となる。
【００１８】
これらの方法は、１または２以上の遺伝的マーカーの同定のために有益であり、それらの頻度は、年齢、人種群、性別またはある他の基準の関数（function）として集団内で変化する。これは、以前未知である多型、そして究極的には、疾患の開始（onset）および進行に関係する遺伝子または経路の同定を可能とする。
【００１９】
ここで提供するデータベースおよび方法によって、とりわけ、その遺伝子基盤によって疾患プロセスのコンポーネント、特にキーコンポーネントの同定が可能となり、そしてまたプロセス、例えば個体の薬物応答の理解が可能となる。ここで提供するデータベースおよび方法は、また病理学的経路の解明に関係する方法で、新規診断アッセイの開発で、新規の可能性のある薬物標的の同定、および新規薬物候補の同定で使用することができる。
【００２０】
この方法およびデータベースは、インシリコ（in cilico）ＳＮＰ同定、インビトロＳＮＰ同定／明確化、大集団の遺伝的プロファイル、および生物統計的分析および解釈を含むがこれらに限定されない実験的処理とともに使用することができる。
【００２１】
ここで提供するデータベースおよびデータベースの対象からの生物学的サンプル、および好ましくはすべての対象またはデータベース中の複数の対象からの生物学的サンプルを含む組み合わせを、またここで提供する。組織および体液サンプルの収集物をまた提供する。
【００２２】
年齢と相関し、多型の同定を含み、そして健康体集団の年齢の増加について多型の頻度を決定する、遺伝的マーカーを決定するための方法を、またここで提供する。
【００２３】
遺伝的マーカーが病的状態（morbidity）に対する感受性、早期死亡（early mortality）、または病的状態および早期死亡と相関するか否かを決定するための方法であって、多型を同定し、そして健康体集団で年齢の増加にともなう多型の頻度を決定することを含む方法を、またここで提供する。
ここで記載の任意の方法を、マルチプレックスフォーマットで使用することができる。
【００２４】
遺伝的情報を正確に同定するための装置およびプロセスを、またここで提供する。遺伝的データから高度に自動化された態様で遺伝的情報を抽出することが、ここでのさらなる目的である。したがって、既知の通常のシステムの欠点を克服するために、生物学的サンプルを同定するための方法および装置を提案する。
【００２５】
簡単には、生物学的サンプルを同定するための方法およびシステムは、生物学的サンプルのコンポジションを示すデータセットを作成する。特定の例では、そのデータセットは、質量分析計から受けとられるＤＮＡスペクトロメトリーデータである。このデータセットは、ノイズが除去され、そしてベースラインが削除されている。生物学的サンプルのあり得るコンポジションが既知であり得るから、予測ピークエリア（area）を決定し得る。予測ピークエリアを使用し、残留ベースラインを作成し、データセットをさらに補正する。次いで、有り得るピーク（probable peak）が補正されたデータセットでは同定可能であり、それを、生物学的サンプルのコンポジションを同定するために使用する。開示の例では、統計的方法を使用して、有り得るピークが実際のピークである、または実際のピークではない、またはそのデータがあまりに決定的でないため利用（call）できない、確率を決定する。
【００２６】
生物学的サンプルを同定するための方法およびシステムは、コンポジションコール（composition call(s)）を高度に自動化された態様で正確に作成することが、有利である。そのような態様では、例えば、完全なＳＮＰプロファイル情報が効率的に収集され得る。収集されたデータが高度に正確な結果で分析されることがより重要である。例えば、特定のコンポジションがコールされるとき、結果は高い信頼性で信頼し得る。そのような信頼性を、使用の確固たる（robust）コンピューター的プロセスによって提供する。
【００２７】
図面の説明
図１は、例示的なサンプルバンクを示す。パネル１は、性別および人種の関数としてのサンプルを示す。パネル２は、年齢の関数として白人を示す。パネル３は、年齢の関数としてヒスパニックを示す。
図２Ａおよび２Ｃは、リポタンパク質リパーゼ遺伝子の２９１Ｓ対立遺伝子の年齢および性別分布を示し、全部で４３６人の男性および５８９人の女性を調査した。図２Ｂは、４３６人の男性について年齢の分布を示す。
【００２８】
図３は、集団に基づくサンプルバンキングのための例示的な質問票である。
図４は、血液サンプルコンポーネントのプロセッシングおよびトラッキングを示す。
図５は、「病気」対立遺伝子および「健康体」対立遺伝子の対立遺伝子頻度を年齢の関数として示す。健康体対立遺伝子の相対的頻度が年齢の増加とともに集団中で増加することが注目される。
図６は、ＡｐｏＥ遺伝子型の年齢依存性分布を示す（Schaechter et al. (1994)Nature Genetics 6:29-32参照）。
【００２９】
図７Ａ−Ｄは、データベース中の白人集団中のｐ５３（腫瘍サプレッサー）コドン７２の年齢依存性および遺伝子型頻度を示す。＊Ｒ７２および＊Ｐ７２はデータベース集団中の対立遺伝子の頻度を表す。Ｒ７２、Ｒ７２Ｐ、およびＰ７２は集団中の個体の遺伝子型を表す。ホモ接合性Ｐ７２対立遺伝子の頻度は、年齢とともに６．７％から３．７％に低下する。
図８は、年齢の関数として、ｐ２１  Ｓ３１Ｒ対立遺伝子の対立遺伝子および遺伝子型頻度を示す。
図９は、個体サンプルに対してプールされたＦＶＩＩ対立遺伝子３５３Ｑの頻度を示す。
【００３０】
図１０は、個体サンプルに対してプールされた、ＣＥＴＰ（コレステロールエステル輸送タンパク質）対立遺伝子の頻度を示す。
図１１は、個体サンプルに対してプールされた、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）５Ｇの頻度を示す。
図１２は、ＰＡＩ−１対立遺伝子のサンプルのマススペクトルおよび人種分布を示す。
図１３は、ＣＥＴＰ４０５対立遺伝子のサンプルのマススペクトルおよび人種分布を示す。
【００３１】
図１４は、第ＶＩＩ因子３５３対立遺伝子のサンプルのマススペクトルおよび人種分布を示す。
図１５は、プールされたＤＮＡサンプルを使用する、ＰＡＩ−１、ＣＥＴＰおよび第ＶＩＩ因子の人種分布を示す。
図１６は、ｐ５３−Ｒｂ経路およびその経路の種々の因子の間の関連を示す。
図１７は、ここで記載したプロセスおよびデータベースを提供する、コンピューター構築性のブロックダイヤグラムであり、これは、ここで提供するデータベースを蓄積し、そして分類するための、そしてここで提供する方法を実行する、典型的なコンピューターシステムを示す。
【００３２】
図１８は、多型遺伝的マーカーを同定するためのデータベースへのアクセスを維持し、そして提供するための、図１７に示されるコンピューターを使用して実行される、プロセッシングステップを示すフローダイヤグラムを示す。
図１９は、ＡＫＡＰ１０−１遺伝子座について、年齢および性別で層化された、白人集団での対立遺伝子および遺伝子型分布を示すヒストグラムである。明緑色のバーは、４０歳より若齢の個体での頻度を示す。暗緑色のバーは、６０歳より高齢の個体での頻度を示す。
図２０は、ＡＫＡＰ１０−５遺伝子座について、年齢および性別で層化された、白人集団の対立遺伝子および遺伝子型分布を示すヒストグラムである。明緑色のバーは、４０歳より若齢の個体の頻度を示す。暗緑色のバーは、６０歳より高齢の個体の頻度を示す。
【００３３】
図２１は、ｈ−ｍｓｒ−Ａ遺伝子座について、年齢および性別で層化された白人集団の、対立遺伝子および遺伝子型分布を示すヒストグラムである。明緑色のバーは、４０歳より若齢の個体での頻度を示す；暗緑色のバーは、６０歳より高齢の個体での頻度を示す。
図２２Ａ−Ｄは、健康体のデータベースのために使用する、サンプルデータ収集質問票である。
【００３４】
図２３は、アッセイフラグメントからのセンス鎖およびアンチセンス鎖の遺伝子型決定をおこなうときに、図２４のコンピューティング装置によって実行されるプロセッシングを示すフローチャートである。
図２４は、本発明に従うシステムを示すブロックダイヤグラムである。
図２５は、本発明に従う、生物学的サンプルを同定する方法のフローチャートである。
図２６は、質量分析計からのデータをグラフに表したものである。
図２７は、質量分析法データのウェーブレット変換のダイヤグラムである。
【００３５】
図２８は、ウェーブレットステージ０ｈｉデータをグラフに表したものである。
図２９は、ステージ０ノイズプロファイルをグラフに表したものである。
図３０は、ステージノイズ標準偏差の作成をグラフに表したものである。
図３１は、データステージのスレショルド（threshold）の適用をグラフに表したものである。
図３２は、希薄データセットをグラフに表したものである。
図３３は、シグナルをシフトさせる式である。
図３４は、ノイズを除去し、そしてシフトしたシグナルの、ウェーブレット変換をグラフに表したものである。
【００３６】
図３５は、ノイズを除去し、そしてシフトしたシグナルをグラフに表したものである。
図３６は、ピークセクションの除去をグラフに表したものである。
図３７は、ピークフリーシグナルの作成をグラフに表したものである。
図３８は、ベースライン補正を作成する方法のブロックダイヤグラムである。
図３９は、ベースラインおよびシグナルをグラフに表したものである。
図４０は、ベースラインを除去したシグナルをグラフに表したものである。
図４１は、圧縮したデータを示す表である。
図４２は、データを圧縮する方法のフローチャートである。
図４３は、マスシフティングをグラフに表したものである。
【００３７】
図４４は、ピーク幅の決定をグラフに表したものである。
図４５は、ピークの除去をグラフに表したものである。
図４６は、ピークを除去したシグナルをグラフに表したものである。
図４７は、残留ベースラインをグラフに表したものである。
図４８は、残留ベースラインが除去されたシグナルをグラフに表したものである。
【００３８】
図４９は、ピーク高の決定をグラフに表したものである。
図５０は、各ピークについて、シグナル−対−ノイズ決定をグラフに表したものである。
図５１は、各ピークについて、残留エラーの決定をグラフに表したものである。
図５２は、ピーク確率をグラフに表したものである。
図５３は、ピーク確率に対する対立遺伝子比率の適用をグラフに表したものである。
【００３９】
図５４は、ピーク確率の決定をグラフに表したものである。
図５５は、遺伝子型のコールをグラフに表したものである。
図５６は、遺伝子型をコールするための統計的処理を示すフロチャートである。
図５７は、標準を欠く遺伝子型決定をおこなうとき、図１のコンピューティング装置によって実行されるプロセッシングを示すフローチャートである。そして
図５８は、標準を欠く遺伝子型プロセッシングのための、ピーク確率に対する対立遺伝子比率の適用をグラフに表したものである。
【００４０】
詳細な説明
特記しない限り、ここで使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する業界の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本開示すべてにおいて、ここで引用される、すべての特許、出願、公開された出願および他の刊行物およびＧｅｎＢａｎｋおよび他のデータベースからの配列は、引用によってそのすべてが含まれる。
【００４１】
ここで使用するように、生体高分子は、核酸、タンパク質、多糖類、脂質および他の大分子を含むがこれらに限定されない。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそのフラグメントを含む。核酸はゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリア核酸、クロロプラスト核酸および別の遺伝的物質を有する他のオルガネラに由来し得る。
【００４２】
ここで使用するように、病的状態（率）（morbidity）は、状態、例えば、疾患または障害であって、生物、例えば、動物の健康および幸福を妥協する状態を言う。病的状態感受性または病的状態連関性遺伝子は、例えば、ヌクレオチド配列の変化によって変化されるとき、特異的な疾患臨床的表現型の発現を促進する（facilitate）遺伝子である。したがって、病的状態感受性遺伝子は、変化されるとき、生物が特定の疾患を発生させる、尤度または一般的なリスクを増加させるポテンシャルを有する。
【００４３】
ここで使用するように、死亡（率）（mortality）は、生物、特に動物が、予測される寿命全部を生存しない統計的尤度を意味する。
ゆえに、高い死亡（率）と連関する、特徴（trait）またはマーカー、例えば、多型は、集団のより若齢のセグメントよりもより高齢なもので、より低い頻度で観察される。
【００４４】
ここで使用するように、多型、例えば遺伝的変異は、集団中のゲノムの遺伝子の配列の変異、例えば対立遺伝子変異および発生し、または観察される他の変異を意味する。したがって、多型は、集団中の、２種またはより多い遺伝的に決定される別の配列または対立遺伝子の存在を意味する。これらの相違は、ゲノムのコードおよび非コード部分に存在することができ、そして例えば転写、プロセッシング、翻訳、輸送、タンパク質プロセッシング、トラフィッキング、ＤＮＡ合成、発現されたタンパク質、他の遺伝子産物または生物学的経路のまたはポスト翻訳修飾の産物および集団のメンバー中に明示される任意の他の相違を含む、核酸配列、遺伝子発現での相違として明示され、または検出されることができる。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、単一塩基変化、例えば、塩基の挿入、欠失または変化の結果として生じる多型を意味する。
【００４５】
多型マーカーまたは部位は、分岐が存在する遺伝子座である。そのような部位は、一塩基対（ＳＮＰ）と同じくらい小さくてよい。多型マーカーは、制限フラグメント長多型、種々の数のタンデムリピート（ＶＮＴＲの）、過剰可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、および他の反復パターン、単純配列リピートおよび挿入エレメント、例えばＡｌｕを含むがこれらに限定されない。多型形態は、また遺伝子について異なるメンデル的対立遺伝子として明示される。多型は、タンパク質の相違、タンパク質修飾、ＲＮＡ発現修飾、ＤＮＡおよびＲＮＡメチル化、遺伝子発現およびＤＮＡ複製を変化させる調節ファクター、およびゲノム核酸またはオルガネラ核酸の任意の他の明示または変化によって観察され得る。
【００４６】
ここで使用するように、健康体集団は、疾患フリーである、動物、バクテリア、ウイルス、寄生生物、植物、ユーバクテリア、およびその他を含むがこれらに限定されない生物の集団を意味する。疾患フリーの概念は、選択される生物の関数（function）である。例えば、哺乳動物について、それは、任意の疾患状態を明示しない対象を意味する。実際上、ヒトの場合に、健康体対象は、一般集団での最終的な使用のために、血液を献血する血液バンクの基準を通過するヒトドナーとして定義される。これらの基準は以下の通りである：
検出可能なウイルス性、バクテリア性、マイコプラズマ性、および寄生生物性感染症フリーで；貧血性でなく；それから質問票に関連する履歴（history）に基づいてさらに選択される（図３参照）。
【００４７】
したがって、健康体集団は、血液バンク基準にしたがって血液を献血するのに十分健康であり、任意の疾患状態についてさらに選択されていない、偏りのない集団を表す。典型的には、そのような個体は、いずれの明示も有しない。植物について、例えば、それは植物に連関する病害病理を明示しない植物集団である。バクテリアについて、それは環境ストレス、例えば選択物質、熱および他の病原なく複製しているバクテリア集団である。
【００４８】
ここで使用するように、健康体のデータベース（または健康な患者データベース）は、任意の特定の疾患について予め選択されていない対象のプロファイルのデータベースを意味する。ゆえに、予め決定された基準にしたがって、健康であるように、データベースのデータのソースとして役立つ対象が選択される。特定の疾患または他の形質（characteristic）を有する対象について予め選択された、他のそのようなデータベースと異なり、ここで提供するデータベースのための対象は、そのように選択されていない。
【００４９】
また、対象が疾患または他の状態を明示しているならば、発見され、または特徴付けられた任意の多型が、無関係の疾患または状態に関連付けられるべきである。好ましい実施態様では、対象がヒトである場合、健康な対象は、疾患症候を明示せず、そして基準、例えば血液ドナーのために血液バンクによってセットされたものに適合する。
【００５０】
したがって、データベースのための対象は、動物、植物、バクテリア、ウイルス、寄生生物および核酸を有する任意の他の生物または存在を含むがこれらに限定されない、任意の生物の集団である。好ましい対象には、哺乳動物、好ましいが必然的ではなくヒトが含まれる。そのようなデータベースは、集団の多様性を捕捉し、こうしてまれな多型の発見をすることができる。
【００５１】
ここで使用するように、プロファイルは、すべての、年齢、性別、人種、疾患履歴、家族履歴、表現型的な形質、例えば、身長、体重および他の表れるパラメータを必須でなく含むがこれらに限定されないが、これらに関連する情報を意味する。サンプル収集情報フォームは、図２２に示され、それはプロファイルの意図を例示している。
【００５２】
ここで使用するように、疾患状態は、状態または異常または障害であって、遺伝され、または環境ストレス、例えば、毒物、細菌、真菌およびウイルス性感染から生じ得るものである。
【００５３】
ここで使用するように、非選択的対象のセットは、共通の疾患または他の形質を有する予め選択されない対象を意味する。それらは、ここで定義されるように健康であるべきであるように選択することができる。
【００５４】
ここで使用するように、表現型は、生物の任意の区別可能な特徴を含むパラメータのセットを意味する。表現型は、身体的特徴であることができ、そして例えば、対象が動物である場合、精神的特徴、例えば感情的特徴であることができる。幾つかの表現型は、質問票によって導いた観察によって（例えば、図３および２２参照）または先行する医学的および他の記録を参照することによって決定することができる。ここでの目的のために、表現型は、データベースが分類（sort）されることができる周辺のパラメータである。
【００５５】
ここで使用するように、パラメータはデータベースを分類するための基礎として役立つ任意の入力データである。これらのパラメータは、表現型特徴、病歴、家族履歴および対象から引き出され、または対象について観察される任意の他のそのような情報を含む。パラメータは、対象、対象によって経験されるある種の履歴または現在の環境的または社会的影響、または対象に関連する者に及ぼす状態または環境的影響を説明し得る。パラメータは、ここで記載され、そして当業者に既知の任意のものを含むがこれらに限定されない。
【００５６】
ここで使用するように、ハプロタイプは、単一のＤＮＡ鎖に位置する２またはより多い多型を意味する。ゆえに、ハプロタイピングは、単一のＤＮＡ鎖上の２またはそれより多い多型の同定を意味する。ハプロタイプは、表現型を示すことができる。幾つかの障害については、単一の多型は、特徴を表すために十分で有り得る。その他の場合には、複数のもの（すなわちハプロタイプ）が必要とされ得る。ハプロタイピングを、核酸を単離し、そして鎖を分離することによって行うことができる。加えて、酵素、例えば、各鎖から異なるサイズのフラグメントを生成する、ある種のヌクレアーゼを使用するとき、鎖分離はハプロタイピングに必要ではない。
【００５７】
ここで使用する、使用するように、マススペクトルまたは質量分析法的分析の参照を有するパターンは、形質分布およびシグナルの数（そのようなピークまたはそのデジタル表示）を意味する。
【００５８】
ここで使用するように、マススペクトルのコンテクストおよびその分析におけるシグナルは、特定の質量を有する分子の数または相対数である、出力データを意味する。シグナルは、「ピーク」およびそのデジタル表示を含む。
【００５９】
ここで使用するように、アダプターは、Ｆｅｎリガーゼを使用するハプロタイピングを引用して使用するとき、所望の多型に特異的にハイブリダイズする核酸を意味する。アダプターは、部分的に二本鎖であることができる。アダプターがその標的にハイブリダイズするとき、アダプター複合体が形成される。
【００６０】
ここで使用するように、標的核酸は、サンプルの所望の任意の核酸を意味する。それは１または２以上のヌクレオチドを含むことができる。
【００６１】
ここで使用するように、標準を欠く分析は、内部標準に基づく決定を意味する。例えば、多型の頻度は、単一のマススペクトル内のシグナルを比較することによってここに決定することができる。
【００６２】
ここで使用するように、増幅は、生体高分子、特に核酸の量を増加させる手段を意味する。選択される５’および３’プライマーに基づき、増幅は、そしてまた分析の対象であるゲノムの領域を制限し、そして定義するように役立つ。増幅は、当業界で既知の任意の手段によってなされることができ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の使用を含む。多型の頻度を決定することが要求されるとき、増幅、例えばＰＣＲは、定量的にされなければならない。
【００６３】
ここで使用するように、切断は、生体高分子の非特異的および特異的フラグメント化を意味する。
ここで使用するように、マルチプレックシングは、１より多い多型の同時的な検出を意味する。マルチプレックシング反応を実施するための方法は、質量分析法と組み合せて、実際的に既知である（例えば米国特許番号６０４３０３１、５５４７８３５および国際ＰＣＴ出願番号９７／３７０４１参照）。
【００６４】
ここで使用するように、質量分析法の引用は、当業者に既知の、任意の適当な質量分析法形式を含む。そのような形式は、マトリックス介助レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ（例えば公開された国際ＰＣＴ出願番号９９／５７３１８および米国特許番号５１１８９３７参照）、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）、フーリエ変換およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。ＭＡＬＤＩ、特にＵＶおよびＩＲが好ましい形式に含まれる。
【００６５】
ここで使用するように、マススペクトルは、質量分析法によってグラフ的に、または数値的にコード化された生体高分子またはそのフラグメントを分析することから取得されたデータを表したものを意味する。
【００６６】
ここで使用するように、血液コンポーネントは、血液から分離されるコンポーネントを意味し、そして赤血球細胞および血小板、血液凝固因子、血漿、酵素、プラスミノーゲン、免疫グロブリンを含むがこれらに限定されない。細胞性血液コンポーネントは、血液のコンポーネント、例えば、細胞である赤血球細胞である。血液タンパク質は血液中に通常見出されるタンパク質である。そのようなタンパク質の例は、血液第ＶＩＩおよび第ＶＩＩＩ因子である。そのようなタンパク質およびコンポーネントは、当業者に周知である。
【００６７】
ここで使用するように、血漿を、当業者に既知の任意の方法によって分離することができる。例えば、それは赤色細胞にペレット化する力で血液を遠心分離することによって調製することができ、そして赤色細胞およびバフィーコート（buffy coat）（それは白血球を含み、さらにそれは血漿である）の間の界面を形成する。例えば、典型的な血小板濃縮物は少なくとも１０％の血漿を含む。
【００６８】
血液は、そのコンポーネント（血漿、血小板および赤血球細胞を含むがこれらに限定されない）に、当業者に既知の任意の方法によって分離することができる。例えば、血液は、十分な時間、そして十分な加速度で遠心分離し、赤血球細胞を含むペレットを形成することができる。白血球は、ペレットおよびバフィーコート領域の上清の界面で、おもに収集する。血漿、血小板、および他の血液コンポーネントを含む上清は、次いで除去され、そしてより高い加速度で遠心分離され、それによって血小板ペレットが得られ得る。
【００６９】
ここで使用するように、ｐ５３は、ＤＮＡ損傷を評価し、そして細胞成長、ＤＮＡ修復およびアポトーシスを制御する、転写因子調節遺伝子として働く、細胞周期コントロールタンパク質である。ｐ５３突然変異は、種々の頻度を有するすべての異なる型の白血球を含む、広く種々の異なる癌に見出される。通常のｐ５３機能の喪失は、ゲノムの不安定性および宿主細胞のコントロールされない成長を生じる。
【００７０】
ここで使用するように、ｐ２１は、通常細胞のＧ１相アレストと連関する、サイクリン依存性キナーゼインヒビターである。発現トリガーアポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、またＷｉｌｌｍの腫瘍、小児性腎臓癌と連関された。
【００７１】
ここで使用するように、第ＶＩＩ因子は独特な血液凝固カスケードと関係するセリンプロテアーゼである。この因子は、トロンビンによって活性化され、そして組織因子（第ＩＩＩ因子）と、第Ｘ因子の第Ｘａ因子へのプロセッシングにおいて働く。証拠は、遺伝子の多型と、心筋梗塞を含む、虚血性心臓血管疾患の高リスクを生じ得る第ＶＩＩ因子活性の増加の間の連関を支持した。
【００７２】
ここで使用するように、リレーショナルデータベースは、データの裂およびコラムを含む、例えば２次元の表、またはより高次元のマトリックスのような、マトリックスを表す形態で情報を蓄積する。例えば、１つの実施態様では、リレーショナルデータベースは、それぞれがパラメータを有する別々の表を有する。表は、記録された数と連結され、それはまたインデックスとして作用する。データベースは、表のデータを使用することによってサーチし、または分類することができ、そして任意の適当な蓄積媒体、例えばフロッピー(登録商標)ディスク、ＣＤロムディスク、ハードドライブまたは他の適当な媒体に蓄積される。
【００７３】
ここで使用するように、バーコードは、任意の望まれる大きさおよび形状の、所望により読み取り可能なマークの任意のアレイを意味し、それらは、必ずしも必須ではないのだが、好ましくは、１または２以上のコラムおよび１または２以上の列の参照コンテクストまたはフレームに編成される。ここでの目的のために、バーコードは、必ずしも「バー」である必要はないがドット、文字または任意のシンボル（複数含む）を含み得る、任意のシンボロジーを意味する。
【００７４】
ここで使用するように、シンボロジーは、サンプルに連結される、識別子（identifier）コードまたはシンボル、例えば、バーコードを意味する。インデックスは、それぞれのそのようなシンボロジーに参照符を付する。シンボロジーは、使用者によって知られ、または設計される任意のコードである。シンボルは、データベースに蓄積される情報と連関される。例えば、各サンプルを、コード化されたシンボロジーで独特に同定することができる。パラメータ、例えば、質問に対する回答および、サンプルの分析により取得される次の遺伝型および他の情報をデータベースに含ませ、そしてシンボロジーと連関させる。データベースを、任意の適当な記録媒体、例えば、ハードドライブ、フロッピー(登録商標)ディスク、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤディスクおよび任意の他の適当な媒体に蓄積する。
【００７５】
データベース
ヒトの遺伝子型決定は、現在は、疾患組織のサンプルを提供する、病院、組織バンクおよびリサーチ機関との共同に依存している。このアプローチは、疾患の開始および／または進行を、多型または他の遺伝的マーカーの存在と相関させることができるという概念に基づいている。このアプローチは、疾患が特異的なマーカーの存在および特異的なマーカーの不存在と相関しているべきものである、とは考えない。
【００７６】
マーカーの出現および消失の同定およびスコアー化は、これらのマーカーが健康体対象のバックグラウンドで測定され、ここで、疾患の開始が多型の存在の変化をマスクしないときのみ、可能であることがここで示される。疾患集団からの情報のデータベースは、サンプルの大きさが小さい点、選択の偏り、および不均質性をこうむっている。健康体集団からここで提供したデータベースは、サンプルバンドが大きい点、簡単な選択方法および不均質性を希釈することによってこれらの問題を解決する。
【００７７】
非選択性、特に健康な対象と連関した、パラメータの第１のデータベースをここで提供する。また、データベースと、各対象から取得されるインデックス化されたサンプルの組み合わせも提供する。さらに、第１のデータベースから作成されるデータベースを提供する。これらは、本来のパラメータ情報に加えて、例えば、サンプルに由来する、ゲノム配列情報を含むがこれらに限定されない遺伝子型情報を含む。
【００７８】
ここで健康体データベースと命名したデータベースは、特定の疾患について予め選択された対象から取得されないため、そのように命名する。ゆえに、個々のメンバーは疾患を有しているかもしれないが、個体の収集は特定の疾患を有するように選択されているわけではない。
【００７９】
パラメータを取得する対象は、好ましくはすべての集団にわたり、ランダムに選択されている対象のセット、または疾患フリーまたは健康であるように予め選択される、対象のセットのいずれかを含む。結果として、データベースは、任意の予め選択された表現型、遺伝子型、疾患または他の形質を表すようには選択されない。典型的には、データベースが調製される対象の数は、ここで提供する方法に使用するときに、統計的に有意な結果が得られるように選択される。
【００８０】
好ましくは、対象の数は、１００より多く、より好ましくは２００より多く、なおより好ましくは、１０００より多い。正確な数は、データベースを分類するために使用するべきパラメータ（複数含む）の頻度に基づいて経験的に決定することができる。一般に、集団は、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１００００またはより多い対象を有することができる。
【００８１】
対象の収集物を同定し、各対象についての情報を記録し、そしてデータベースとして各対象と連関させる。各対象と連関している情報は、対象の履歴的形質に関連する情報、表現型的形質およびまた遺伝型形質、医学的形質および任意の他の特徴および決定することのできる対象についての形質を含むがこれらに限定されない。この情報は、データベースを分類するための基礎として役立つ。
【００８２】
例示的実施態様では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトであり、そして情報は、１または２以上のパラメータ、例えば年齢、性別、病歴、人種および任意の他の要因と関連する情報である。そのような情報は、動物が例えばヒトであるとき、質問票によって、そして個体についての観察、例えば髪の色、目の色、および他の形質によって取得することができる。遺伝子伝型情報は、対象からの組織または他の体および体液サンプルから取得することができる。
【００８３】
健康体ゲノムデータベースは、血液サンプルのライブラリーから健康体個体からのプロファイルおよび多型を含むことができ、ここでライブラリーの各サンプルは、個体および分離血液または他の組織サンプルである。データベースの各サンプルは、ドナーの性別、年齢、人種群、および病歴についてプロファイル化される。
【００８４】
データベースは、最初に対象の健康体集団を同定し、そして各対象についてデータベースのパラメータを分類するように役立つ情報を取得することによって作成する。この情報を好ましくは蓄積媒体、例えば、コンピューターのメモリーに入力する。
【００８５】
データベースを作成するために使用する集団の各対象について取得された情報を、コンピューターメモリーまたは他の適当な蓄積媒体に蓄積する。この情報を各対象と連関された識別子（identifier）と連結させる。ゆえに、データベースは、対象を、例えば、バーコードの表すデータポイントによって同定し、それから個体について、すべての情報、例えば、質問票からの情報をデータポイントと連関させる。情報が収集されるように、データベースは作成される。
【００８６】
したがって、例えば、プロファイル情報、例えば、質問票から取得される対象履歴を、データベースに収集する。得られたデータベースは、標準的ソフトウェアーを使用し、例えば、年齢、性別および／または人種によって、望まれるように分類することができる。サンプルが取得されるべき対象のための例示的質問票を、図２２Ａ−Ｄに示す。各質問票を、好ましくはバーコード、特にデータベースへの入力のため機械読み取り可能バーコードによって同定する。対象がデータを提供し、そして健康であると思われる後（すなわち、献血のための基準に適合する）、質問票のデータをデータベースに入力し、そしてバーコードと連関させる。組織、細胞または血液サンプルを対象から取得する。
【００８７】
図４は、血液サンプルコンポーネントのプロセッシングおよび追跡（tracking）を例示する。各コンポーネントをバーコードで追跡し、日付を付し、データベースに入力し、そして対象および対象のプロファイルと連関させる。典型的には、全血を遠心分離し、血漿、赤血球細胞（ペレット性である）および間の層であるバフィーコートに見出される白血球を生成する。種々のサンプルを取得し、そしてバーコードでコード化し、そして必要な使用のために蓄積する。
【００８８】
サンプルを対象から収集する。サンプルは、組織、細胞、および流体、例えば核酸、血液、血漿、羊水、滑膜液、尿、唾液、水性体液、汗、精液サンプルおよび脳髄液を含むがこれらに限定されない。サンプルの特定のセットは集団の生物に依存することが理解される。
【００８９】
ひとたびサンプルを取得すると、収集物を好ましい実施態様では貯蔵することができ、各サンプルを識別子、特に機械読み取り可能コード、例えばバーコードでインデックスを付する。分析のために、サンプルまたはサンプルのコンポーネント、特に生体高分子および小分子、例えば核酸および／またはタンパク質およびメタボライトを単離する。
【００９０】
サンプルの分析後、この情報を蓄積媒体のメモリーにおいてデータベースに入力し、そして各対象と連関させる。この情報は、遺伝子型情報を含むがこれらに限定されない。特に、多型を示す核酸配列情報および他の情報、例えば、ＰＣＲフラグメントの質量、ペプチドフラグメント配列または質量、生体高分子および小分子のスペクトルおよび遺伝子、遺伝子産物または集団内の多型の存在が推論されることができる他のマーカーの構造または機能の他の印。
【００９１】
例示的実施態様では、データベースは、血液サンプルの収集物に由来することができる。例えば、図１（また図１０参照）は、５０００個体サンプルを超える収集物の状態を示す。サンプルを、ＳＯＰ（標準的取り扱い処理）ガイドラインにしたがって実験室でプロセッシングした。任意の標準的血液プロセッシングプロトコルを使用し得る。
【００９２】
ここで記載の例示的データベースのために、以下の基準を使用して対象を選択した：
感染性物質についてはテストはしない。
年齢：少なくとも１７歳
体重：最小で１１０ポンド
永久に不適格：
肝炎の履歴（１１歳より後）
白血病リンパ腫
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＡＩＤＳ
慢性腎臓疾患
【００９３】
一時的不適格：
妊娠−出産、流産、中絶後６週まで
大きな外科手術または点滴−１年間
単球増加症−完全な回復まで
全血献血のまえ−８週間
注射による抗生物質、１週間；口により、４８時間、
皮膚複合感染のための抗生物質を除く；
年繰り延べ
もし除去されないなら、内部癌および皮膚癌は、なおり、そして再発はない
これらは献血について血液バンク基準に対応し、そしてヒト健康体データベースについてここで定義されるような健康体集団を表す。
【００９４】
データベースの構造
当業者に既知の任意の適当なデータベース構造およびフォーマットを使用し得る。例えば、リレーショナルデータベースは好ましいフォーマットであり、そこではデータが各対象を同定するインデクサー（indexer）によって連結されたパラメータのマトリックスまたは表として蓄積される。データベースを分類することを含む、調製および操作のためのソフトウェアーを、商業的に利用可能であるソフトウェアー、例えば、マイクロソフトアクセスから容易に開発し、または適合させることができる。
【００９５】
質コントロール
質コントロール処理を実行することができる。例えば、サンプルの収集の後、バンクの収集物の質を評価することができる。例えば、混合したサンプルを、既知のマーカー、例えば性別についてのテストによってチェックすることができる。サンプルの人種による分離の後、サンプルを特定の人種、例えば、ＨＬＡ  ＤＱＡ１群特異的コンポーネントと連関するマーカーについてランダムにテストし、サンプルが適当に人種群によって分類されたかどうか評価する。例示的サンプルバンクを図４に示す。
【００９６】
データベースのための遺伝子型データおよび他のパラメータの取得
情報および履歴パラメータのデータベースへの入力の後、各対象から取得されるサンプルからの材料を分析する。分析する材料は、タンパク質、メタボライト、核酸、脂質および任意の他の望まれる材料の構成物を含む。例えば、核酸、例えば、ゲノムＤＮＡを配列決定によって分析することができる。
【００９７】
配列決定を当業者に任意の既知の方法を使用して、行うことができる。例えば、多型が同定され、または既知であり、そしてデータベースの対象のその頻度または存在を評価することが望まれるなら、各サンプルからの所望の領域を、例えば、ＰＣＲまたは制限フラグメント、ハイブリダイゼーションまたは当業者に既知の他の適当な方法によって単離することができ、そして配列決定する。ここでの目的のために、配列決定分析は、好ましくは質量分析法（例えば、米国特許番号５５４７８３５、５６２２８２４、５８５１７６５、および５９２８９０６参照）を使用して実施する。核酸は、ハイブリダイゼーションによって、また配列決定することができ（例えば米国特許番号５５０３９８０、５６３１１３４、５７９５７１４参照）、これらは質量分析法による分析を含む（米国出願番号０８／４１９９９４および０９／３９５４０９参照）。
【００９８】
他の検出方法では、対立遺伝子変異体を同定する前に、まず増幅することが必要である。増幅は、当業界で既知の方法にしたがって、例えばＰＣＲおよび／またはＬＣＲによって行うことができる。ある実施態様では、細胞のゲノムＤＮＡを２種のＰＣＲプライマーに曝露し、そして望まれる量の増幅されたＤＮＡを生成するのに十分な何回かのサイクルの増幅に付する。好ましい実施態様では、プライマーは、１５０ないし３５０塩基対離れて位置する。
【００９９】
別の増幅方法は、下記のものを含む：
自己持続性配列複製（Guatelli, J. C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874-1878）、転写的増幅系（Kwoh, D. Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86: 1173-1177）、Q-Beta Replicase（Lizardi, P. M.et al., 1988, Bio/Technology 6:1197）、または任意の他の核酸増幅方法、次いで当業界で周知の方法を使用する増幅された分子の検出。これらの検出スキームは、そのような分子が非常に少量で存在するならば、核酸分子の検出のために特に有用である。
【０１００】
核酸は、また検出方法およびプロトコル、特に質量分析法によるものによって分析することができる（例えば、米国特許番号５６０５７９８、６０４３０３１、共係属している、米国出願番号０８／７４４４８１、米国出願番号０８／９９０８５１、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９９／３１２７３、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２００１９参照）。これらの方法は、自動化することができる（例えば、共係属している、米国出願番号０９／２８５４８１および公開された国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／０８１１１であって自動化されたプロセスラインを記載するもの参照）。
【０１０１】
ここでの分析の方法の好ましいものは、検出のため質量分析法でのプライマーオリゴ塩基伸長（ＰＲＯＢＥ）反応に関係するものを含む（ここで記載され、そして他に、例えば、米国特許番号６０４３０３１参照；また米国出願番号０９／２８７６８１、０９／２８７６８２、０９／２８７１４１および０９／２８７６７９、共係属している米国出願番号０８／７４４４８１、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２００１９として公開され、そして米国出願番号０８／７４４４８１、０８／７４４５９０、０８／７４６０３６、０８／７４６０５５、０８／７８６９８８、０８／７８７６３９、０８／９３３７９２、０８／７４６０５５、０８／７８６９８８および０８／７８７６３９に基づく、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０４４４参照；また米国出願番号０９／０７４９３６、米国特許番号６０２４９２５、および米国出願番号０８／７４６０５５および０８／７８６９８８および公開された国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２００２０参照）。
【０１０２】
分析を実施するための好ましいフォーマットは、固体支持体、例えば、シリコンまたはシリコンコート基質に生体高分子が連結されているチップに基づくフォーマット、好ましくはアレイの形態である。より好ましくは、分析を、質量分析法、特にＭＡＬＤＩを使用して実施するとき、小さいナノリットルレベルの体積のサンプルを負荷し、こうして得られるスポットはレーザースポットのサイズくらい、またはより小さい。これは達成されるとき、質量分析分析から得られる結果は定量的であることが見出される。得られる質量スペクトルのシグナルの面積は濃度に比例的である（バックグラウンドについて標準化され、そして補正されるとき）。
【０１０３】
そのようなチップを調製し、そして使用する方法は、米国特許番号６０２４９２５、共係続している、米国出願番号０８／７８６９８８、０９／３６４７７４、０９／３７１１５０および０９／２９７５７５に記載され；また米国出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０１９５であってＷＯ９８／２００２０として公開されているもの参照。これらの分析を実施するためのチップおよびキットは、ＳＥＱＵＥＮＯＭから商標ＭａｓｓＡＲＲＡＹで商業的に入手可能である。ＭａｓｓＡｒｒａｙは、結果をより迅速に送達するために、ミニチュア化されたアレイおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス介助レーザー脱離イオン化−飛行時間型）質量分析法と結合された酵素的プライマー伸長反応の忠実性による。それは、タグのない遺伝的変異体と連関したＤＮＡフラグメントのサイズの単一塩基変化を正確に区別する。
【０１０４】
ここで提供する方法は、対立遺伝子の定量的な決定を可能とする。マススペクトルのシグナルの面積は、定量的な決定のために使用することができる。頻度は、すべてのスペクトルの総面積に対するシグナルの比率（ratio）から決定され、バックグラウンドについて補正される。これは前記出願に記載されたようなＰＲＯＢＥ技法により可能であり、引用によりここに含ませる。
【０１０５】
核酸を分析するさらなる方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ミニＰＣＲ、ローリングサークル増幅、自己触媒的方法、例えば、Ｑβレプリカーゼ、ＴＡＳ、３ＳＲ、および当業者に既知である任意の他の適当な方法を含む、増幅に基づく方法を含む。
【０１０６】
多型の分析およぼ同定および検出のための他の方法は、対立遺伝子特異的プローブ、サザン分析、および他のそのような分析を含むがこれらに限定されない。
【０１０７】
以下に記載の方法は、質量分析法がフラグメント混合物を分析するために使用されるとき、所望の増幅され、または非増幅性ヌクレオチド配列をフラグメント化し、それによって質量シグナルのセットを生成する方法を提供する。増幅されたフラグメントは、標準的ポリメラーゼ連鎖反応（ＵＳ４６８３１９５および４６８３２０２）によってもたらされる。フラグメント化方法は、ＤＮＡの一本鎖または二本鎖を切断する酵素およびＤＮＡをライゲートする酵素の使用に関係する。切断酵素はグリコシラーゼ、ニッカーゼ、および部位特異的および部位非特異的ヌクレアーゼであることができ、グリコシラーゼ、ニッカーゼ、および部位特異的ヌクレアーゼが最も好ましい。
【０１０８】
グリコシラーゼフラグメント化方法
ＤＮＡグリコシラーゼはある種のタイプのヌクレオ塩基を所望のＤＮＡフラグメントから特異的に除去する。これらの酵素は、それによって脱塩基(abasic)部位を生成する事ができ、それらは、脱塩基部位で特異的にさらされたフォスフェート骨格を切断し、そして配列を示すヌクレオ塩基特異的フラグメントのセットを生成する、さらなる切断酵素によって、またはアルカリ溶液およびまたは熱のような化学的手段によって認識することができる。ＤＮＡグリコシラーゼおよびその標的化されたヌクレオチドのある組み合わせの使用は、任意の所望の標的領域の塩基特異的シグナチュアパターンを生成するために十分である。
【０１０９】
多くのＤＮＡグリコシラーゼが既知であり、酵素の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ標的に対応し、例えば、ＤＮＡグリコシラーゼはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ、ピリミジンヒドレートＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙＤＮＡグリコシラーゼ、チミジンミスマッチＤＮＡグリコシラーゼ、ヒポキサンチンＤＮＡグリコシラーゼ、５−ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＨｍＵＤＧ）、５−ヒドロキシメチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ、または１，Ｎ６−エテノアデニンＤＮＡグリコシラーゼであることができる（例えば米国特許番号５５３６６４９、５８８８７９５、５９５２１７６および６０９９５５３、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９７／０３２１０、ＷＯ９９／５４５０１参照；またEftedal et al.(1993)Nucleic Acids Res 21:2095-2101, Bjelland and Seeberg (1987)Nucleic Acids Res. 15:2787-2801, Saparbaev et al. (1995)Nucleic Acids Res. 23:3750-3755, Bessho(1999)Nucleic Acids Res. 27:979-983参照）。好ましいグリコシラーゼはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）である。
【０１１０】
例えばウラシルは、通常のＤＮＡ前駆体ヌクレオチド（例えば、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＧＴＰ）およびｄＵＴＰの存在下で、ＤＮＡを増幅することによって増幅ＤＮＡ分子に組み込むことができる。増幅された産物がＵＤＧで処理されるとき、ウラシル残基が切断される。ＵＤＧ反応からの産物の次の化学的処理によって、フォスフェート骨格の切断およびヌクレオ塩基特異的フラグメントの生成を得る。さらに、グリコシラーゼ処理の前に、増幅産物の相補鎖の分離により、生成されるべきフラグメント化の相補的パターンを得る。
【０１１１】
したがって、ｄＵＴＰおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼの使用によって、相補鎖のＴ特異的フラグメントの生成が可能となり、したがってこれは、所望の配列内のＴおよびＡ位置の情報を提供する。これと同様に、両方の（相補的）鎖（すなわちＣ特異的グリコシラーゼ）のＣ特異的反応は、もし両方の増幅鎖のフラグメント化パターンが別個に分析されるならば、所望の配列内のＣおよびＧ位置の情報をもたらす。したがって、グリコシラーゼ法および質量分析法によって、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ特異的フラグメント化パターンの全シリーズが分析されることができる。
【０１１２】
ニッカーゼフラグメント化法
ＤＮＡニッカーゼ、またはＤＮアーゼを使用して、ＤＮＡ二重らせんの１の鎖を認識し、そして切断することができる。多くのニッカーゼが既知である。これらのうちに、例えば、ニッカーゼＮＹ２ＡニッカーゼおよびＮＹＳ１ニッカーゼ（Megabase）があり、以下の切断部位を有する；
ＮＹ２Ａ：５’・・・Ｒ  ＡＧ・・・３’
３’・・・Ｙ  ＴＣ・・・５’、ここで、Ｒ＝ＡまたはＧおよびＹ＝ＣまたはＴ
ＮＹＳ１：５’・・・ＣＣ〔Ａ／Ｇ／Ｔ〕・・・３’
３’・・・ＧＧ〔Ｔ／Ｃ／Ａ〕・・・５’。
【０１１３】
Ｆｅｎリガーゼフラグメント化法
Ｆｅｎリガーゼ法は、２種の酵素：Ｆｅｎ−１酵素およびリガーゼに関係する。Ｆｅｎ−１酵素は“フラップ”エンドヌクレアーゼとして知られる部位特異的ヌクレアーゼである（米国特許５８４３６６９、５８７４２８３および６０９０６０６）。この酵素は、標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズされる２種のオリゴヌクレオチドのオバーラップによって創出されるＤＮＡ“フラップ”を認識し、そして切断する。この切断は高度に特異的であり、そして単一塩基対突然変異を認識することができ、これにより所望のあるＳＮＰの個々のヘテロ接合性から単一ホモログの検出、それからフラグメント内に存在する他のＳＮＰのそのホモログの遺伝子型決定を可能とする。Ｆｅｎ−１酵素は、Ｆｅｎ−１様ヌクレアーゼ、例えばヒト、ハツカネズミ、およびツメガエル属ＸＰＧ酵素および酵母ＲＡＤ２ヌクレアーゼまたは例えば、M.jannaschii、P. furiosus、およびP. woeseiからのＦｅｎ−１エンドヌクレアーゼであることができる。好ましい酵素には、Ｆｅｎ−１酵素が含まれる。
【０１１４】
リガーゼ酵素は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間のホスホジエステル結合を形成する。リガーゼは、ＤＮＡリガーゼＩまたはＤＮＡリガーゼＩＩＩであることができる（例えば、米国特許番号５５０６１３７、５７００６７２、５８５８７０５および５９７６８０６参照；またWaga. et al. (1994)J. Biol. Chem. 269: 10923-10934、Li et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:632-638、Arrand et al.(1986) J. Biol. Chem. 261: 9079-9082, Lehman (1974) Science 186: 790-797、Higgins and Cozzarelli(1979)Methods Enzymol. 68:50-71、Lasko et al. (1990)Mutation Res. 236:277-287、およびLindahl and Barnes (1992)Ann. Rev.Biochem. 61:251-281参照）。
【０１１５】
熱安定性リガーゼ（Epicenter Technologies）は、ここでの使用のための好ましいリガーゼに含まれ、ここで“熱安定性”は、ＤＮＡの２つの鎖を分離するために必要である温度への曝露の後、なお活性を保持しているリガーゼを意味する。
【０１１６】
タイプＩＩＳ酵素フラグメント化法
制限酵素は、特定の認識配列内、またはそれに隣接する特異的部位で二本鎖ＤＮＡに特異的に結合し、そして切断する。これらの酵素を、当業者に知られているように２種の群に分類する（例えばタイプＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ）。タイプＩおよびタイプＩＩＩ酵素の特性のために、これらは分子生物学的応用に広く使用されていない。したがって、本発明のためにタイプＩＩ制限酵素が好ましい。当業界で既知である何千もの制限酵素のうち、１７９種の異なるタイプＩＩ特異性がある。１７９種の独特のタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼのうち、３１種が４塩基認識配列を有し、１１種が５塩基認識配列を有し、１２７種が６塩基認識配列を有し、そして１０種が６塩基より大きい認識配列を有する（米国特許５６０４０９８）。カテゴリータイプＩＩのうち、タイプＩＩＳが好ましい。
【０１１７】
タイプＩＩＳ酵素は、Ａｌｗ  ＸＩ、Ｂｂｖ  Ｉ、Ｂｃｅ  ８３、Ｂｐｍ  Ｉ、Ｂｓｇ  Ｉ、Ｂｓｍ  ＡＩ、Ｂｓｍ  ＦＩ、Ｂｓａ  Ｉ、Ｂｃｃ  Ｉ、Ｂｃｇ  Ｉ、Ｅａｒ  Ｉ、Ｅｃｏ  ５７１、Ｅｓｐ  ３１、Ｆａｕ  Ｉ、Ｆｏｋ  Ｉ、Ｇｓｕ  Ｉ、Ｈｇａ  Ｉ、Ｍｍｅ  Ｉ、Ｍｂｏ  ＩＩ、Ｓａｐ  Ｉ、等であることができる。好ましいタイプＩＩＳ酵素はＦｏｋ  Ｉである。
Ｆｏｋ  Ｉ酵素エンドヌクレアーゼは、例示的な周知の、タイプＩＩＳクラスの特徴を把握されたメンバーである（例えば、米国特許５７１４３３０、５６０４０９８、５４３６１５０、６０５４２７６および５８７１９１１参照；またSzybalski et al. (1991)Gene 100:13-26、Wilson and Murray(1991)Ann. Rev. Genet. 25:585-627、Sugisaki et al.(1981)Gene 16:73-78、Podhajska and Szalski(1985) Gene 40:175-182参照。Ｆｏｋ  Ｉは配列５’ＧＧＡＴＧ−３’を認識し、そしてそれによりＤＮＡを切断する。タイプＩＩＳ制限部位は、ＤＮＡ標的を増幅するために使用されるプライマーにタイプＩＩＳ制限部位を組み込むことによって、ＤＮＡ標的に導入することができる。Ｆｏｋ  Ｉでの消化によって生成したフラグメントは、部位特異的であり、そして質量分析法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法、ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析法、および当業者に周知である任意の他のタイプの質量分析法によって分析することができる。
【０１１８】
かつて、多型が年齢のようなパラメータと相関していることが見出された。対立遺伝子脱落のための誤りの結果の可能性を、ゲノムの隣接領域で比較ＰＣＲを行うことによって試験することができる。
【０１１９】
分析
データベースの使用では、対立遺伝子頻度を集団にわたり、集団の各サンプルを個々に分析し、各個体サンプルの所望の対立遺伝子またはマーカーの存在または不存在を決定し、それから集団のマーカーの頻度を決定することによって決定することができる。次いで、このデータベースを分類し（層化し）、標準的統計的分析を使用して、対立遺伝子および選択されたパラメータの間の任意の相関を同定することができる。もし相関、例えば、年齢と特定のマーカーの減少または性別または他のパラメータとの相関が観察されるならば、そのときはそのマーカーがさらなる研究、例えば、関係する遺伝子または経路を同定するための遺伝的マッピングのための候補である。
【０１２０】
次いで、例えば、マーカーは疾患と相関づけられ得る。ハプロタイピングを、また実施することができる。遺伝的マッピングを標準的方法を使用して実施することができ、そしてまた他のデータベースの使用、例えば、障害と連関されるべき予め決定されたデータベースを要し得る。
例示的な分析を実施し、そしてこれらを図に示し、そしてここで考察する。
【０１２１】
サンプルをプールする
ここで提供するデータベース、またはそのような情報の任意の他のデータベースを使用して、それぞれのサンプルを別々に試験することによって取得された実質的に同じ頻度を、サンプルを、例えば、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００または任意の他の数のバッチでプールすることによって取得することができることが見出される。正確な数を必要ならば経験的に決定し、そして３より小さいことができる。
【０１２２】
ある実施態様では、遺伝子型の、および他のマーカーの頻度を、サンプルをプールすることによって取得することができる。この標的集団を実施するために、そして評価すべき遺伝的変異を選択し、複数の生体高分子のサンプルを集団のメンバーから取得し、そしてマーカーまたは遺伝子型を推論することができる生体高分子を決定し、または検出する。プール中のテストするサンプルを個々に比較し、そしてその分類した結果を図９に示し、第ＶＩＩ因子対立遺伝子３５３Ｑの頻度を示す。図１０は、プール性対個体サンプルにおける、ＣＥＴＰ対立遺伝子ＣＥＴＰの頻度を示す。図１５は、データを取得するためにプールしたＤＮＡサンプルを使用する、データベース中の種々の人種の群のなかの人種の多様性を示す。図１２−１４はこれらのサンプルについてマススペクトルを示す。
【０１２３】
テストサンプルをプールすることは、ここで提供する健康体のデータベースに応用できるだけでなく、また疾患性集団に由来する典型的なデータベースを含む、対象および遺伝子型の情報の任意のデータベースへの入力のためのデータを集めるときに使用できる。ここで実証されることは、達成した結果は、もし各サンプルを別に分析するならば達成されるのと統計的に同じ結果であるという、発見である。方法、例えばここで提供する質量分析法によってプールしたサンプルの分析によって、そのようなデータの解決および結果の数量化が可能となる。
【０１２４】
第ＶＩＩ因子についてＲ５３Ｑ酸多型を評価する。図９では、“個体”データは９２個体の反応物で観察された対立遺伝子頻度を表す。プールしたデータは、単一のプローブの反応にプールした同じ９２個体の対立遺伝子頻度を表す。個体のドナーのサンプル中のＤＮＡの濃度は、２５０ナノグラムである。プールしたサンプルのＤＮＡの総濃度は、また２５０ナノグラムであり、ここですべての個々のＤＮＡの濃度は、２．７ナノグラムである。
【０１２５】
スペクトルの質または検出するサンプルの量を定量する能力の何らの変化なく、２．７ナノグラムから０．２７ナノグラムに、プールしたサンプルの個体のＤＮＡ濃度を減少させることが可能であることがまた示された。ゆえに、低濃度のサンプルを、このプールする方法で使用し得る。
【０１２６】
データベースおよびそれによって同定したマーカーの使用
ゲノムの首尾よい使用は、科学的な仮説（すなわち一般的な遺伝的変異、例えば、ＳＮＰ）、研究計画（すなわち複合的な障害）、サンプルおよび技術、例えばチップに基づく質量分析分析（例えば、米国特許番号５６０５７９８、米国特許番号５７７７３２４、米国特許番号６０４３０３１、共係属している米国出願番号０８／７４４４８１、米国出願番号０８／９９０８５１、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２００１９、共係属している米国出願番号０９／２８５４８１であって分析のための自動化されたプロセスラインを記載しているもの参照；また例えば、米国出願番号０８／６１７２５６、０９／２８７６８１、０９／２８７６８２、０９／２８７１４１および０９／２８７６７９、共係属している米国出願番号０８／７４４４８１、米国出願番号０８／７４４４８１、０８／７４４５９０、０８／７４６０３６、０８／７４６０５５、０８／７８６９８８、０８／７８７６３９、０８／９３３７９２、０８／７４６０５５、０９／２６６４０９、０８／７８６９８８および０８／７８７６３９に基づき、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２００１９として公開された、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０４４４参照；また米国出願番号０９／０７４９３６参照）を要求する。これらの態様のすべては、ここで提供するデータベースおよび収集中のサンプルと結合させて使用することができる。
【０１２７】
それによって同定したデータベースおよびマーカーを、例えば、以前同定されていない、または未知の遺伝的マーカーの同定のために、そして既知のマーカーの新規な使用を同定するために、使用することができる。同定されるマーカーとして、これらをデータベースに入力し、さらなる相関を決定し得るパラメータを分類するように使用するため、データベースに入力し得る。
【０１２８】
予め同定されていない未知の遺伝的マーカー
健康体のデータベースのサンプルを使用して、またデータベースの集団の多型を調査するときに、任意のマッピング、配列決定、増幅および他の方法論を使用し、新規の多型および遺伝的マーカーを同定することができる。次いで、こうして同定した多型を、各サンプルについてデータベースに入力することができ、そしてその多型を分類用パラメータとして使用して、データベースを分類（層化）することができ、例えば同定したマーカーの頻度の年齢相関性変化を表す、任意のパターンおよび相関を同定することができる。相関を同定するならば、マーカーの遺伝子座をマッピングし、そしてその機能または効果を評価し、または演繹することができる。
【０１２９】
こうして、ここにデータベースは以下のための手段を提供する：
集団で、年齢の増加にともなうマーカーの発生または消失を比較することによって、遺伝子的要因の有意に異なる対立遺伝子頻度を同定し、それからそのマーカーと疾患または生化学的経路を連関させること；
【０１３０】
男性を女性集団と比較し、または他の選択された層化された集団を比較することによって、疾患を生じる遺伝的要因の有意に異なる対立遺伝頻度を同定し、そしてそのマーカーを疾患または生化学的経路と連関させること；
【０１３１】
異なる人種群を比較することによって、疾患を生じる遺伝子的要因の有意に異なる対立遺伝子変異を同定し、そしてそのマーカーをその人種群に高頻度で存在すると知られている、疾患または生化学的経路と連関させること；
【０１３２】
年齢、性別、および人種起源にしたがって層化された、全般に任意交配された集団中の遺伝子の潜在的に機能的な変異体をプロファイルし、そしてそれによって調査した集団の身体的状態への変異体遺伝子の寄与を実証すること；
【０１３３】
年齢、性別、および人種起源にしたがって層化された、全般に任意交配された集団内で遺伝子不平衡分析を実施することによって機能的に関連のある遺伝子変異体を同定し、そしてそれによって調査した集団の身体的状態へのそれらの寄与を実証すること；
【０１３４】
年齢、性別、および人種起源にしたがって層化された、全般に任意交配された集団内で連鎖不平衡分析を実施することによって、潜在的に機能的な染色体または染色体の部分の変異体を同定し、そしてそれによって調査した集団の身体的状態に対するそれらの寄与を実証すること。
【０１３５】
同定したマーカーおよび既知のマーカーの使用
このデータベースを、また既知マーカーと組み合せて使用し、任意の相関を同定するために分類し得る。例えば、データベースは、以下のために使用することができる；
医学的に関連のある多型マーカーの存在を、決定および評価すること；
【０１３６】
医学的に関連のある遺伝的要因の診断的な特異性を決定および評価すること；
医学的に関連のある遺伝的要因の肯定的な予測値を決定および評価すること；
原因となる遺伝的要因に関して、全体の集団内で、例えば、糖尿病、高血圧、自己免疫性疾患、アテローム性動脈硬化症、癌および他の疾患を含むがこれらに限定されない、複合的な疾患の発生を決定し、および評価すること；
【０１３７】
予防的な疾患処置のための適当な戦略を描くこと；
原発性疾患介入のための適当なタイムラインを描くこと；
これらの一般的な利用可能性に関して単離した集団で同定された関連のある遺伝的要因を医学的に確認すること；
これらの一般的な利用可能性に関して単離された集団で同定されたすべての潜在的な標的構造を含む疾患経路を確認すること；および
これらの一般的な利用可能性に関して単離された集団内で同定された適当な薬物標的を確認すること。
【０１３８】
多型が連鎖し得る疾患および障害には、先天性の代謝の誤りに連鎖したもの、後天性の代謝的障害、介在性代謝、発癌経路、血液凝固経路、およびＤＮＡ合成および修復経路ＤＮＡ修復／複製／転写因子および活性、例えば発癌、加齢および血液凝固に関係する遺伝子および血栓に関連する関連性生化学的経路、塞栓、発作、心筋梗塞、脈管形成および発癌を含み得る。
【０１３９】
例えば、多くの疾患が、中間代謝の酵素の不足または欠損によって引き起こされ、または関係し（例えば、以下の表１および２参照）、それは酵素基質を摂取すると、臓器および組織（特に、幼児の脳および他の臓器に発生し、精神的遅滞および他の発育障害を生じる）を損傷させる有害なメタボライトの蓄積を生じる。
【０１４０】
非常に興味ある障害のマーカーおよび遺伝子の同定
モデル系
幾つかの遺伝子系、例えば、ｐ２１、ｐ５３およびリポタンパク質リパーゼ多型（Ｎ２９１Ｓ）を選択した。ｐ５３遺伝子は、多様な腫瘍タイプで突然変異している腫瘍抑制遺伝子である。ある共通する対立遺伝子変異体がコドン７２に存在する。ｐ５３遺伝子で同定された多型、すなわちＲ７２Ｐ対立遺伝子は、当該遺伝子のコドン７２でアルギニンからプロリンへのアミノ酸の置換を生じる。
【０１４１】
疾患性集団を使用して、米国のアフリカ系アメリカ人および白人のなかのこれらの対立遺伝子の対立遺伝子分布の人種間相違があることが示された。この結果はここに、この発見を支持し、そしてまた健康体のデータベースから取得された結果が意義深いことを実証している（図７Ｂ参照）。
【０１４２】
２９１Ｓの対立遺伝子は、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）（これはアテローム性動脈硬化症、特に、心筋梗塞の男性の高いリスクと連関する）を生じる（Reymer et al. (1995) Nature Genetics 10:28-34参照）。
【０１４３】
両方の遺伝的多型が白人集団に基づくサンプルバンクの一部の中にプロファイルされた。リポタンパク質リパーゼ遺伝子に位置する多型について、１０２５人の非選択性個体（４３６人の男性および５８９人の女性）のすべてをテストした。ゲノムＤＮＡを当該個体から取得した血液サンプルから単離した。
【０１４４】
実施例および図面に示すように、約５０００の対象を含む、例示的データベースは、質問票に対する回答（図３参照）、そして遺伝子型情報を層化する。特定の既知の対立遺伝子を選択し、そして質量分析法を使用してマーカーについてサンプルをテストし、特定のＰＲＯＢＥ（実施例参照）を使用して、各サンプル中の多型を同定した。データベース中の集団を、種々のパラメータにしたがって分類し、そして相関を観察した。例えば、図２Ａ−Ｃは、データベース中の白人集団のリポタンパク質リパーゼ遺伝子についての、年齢および性別によるデータの分類を示している。結果は、男性について年齢にともなってこの対立遺伝子の頻度は減少するが、女性ではそのような減少がないことを示している。データベースに対してテストした他の対立遺伝子は、ｐ５３、ｐ２１および第ＶＩＩ因子を含む。年齢によって分類したときの結果を図に示す。
【０１４５】
これらの例は、一般的な集団内の疾患を生じる遺伝的要因の変化した頻度の影響を実証している。これらの結果の科学的な解釈によって、多型性の遺伝的変化の医学的な関連性の予測が可能となる。さらに、これらの一貫性、診断的な特異性、肯定的な予測値、疾患の開始、予防戦略の最も適当な開始、および任意交配された集団について単離された集団で同定された遺伝的変化の一般的な利用可能性について結論を引き出すことができる。
【０１４６】
したがって、人種的に同質である、年齢および性別で層化された集団に基づくサンプルバンクは、それらの潜在的な医学的有用性に関して遺伝子要因の迅速な同定および確認のための適当なツールである。
【０１４７】
データベースシステムを創出し、分類し、そしてプロセッシングするための例示的コンピューターシステム
データベースを含む、コンピューターを含むシステムをここで提供する。コンピューターおよびデータベースを、例えば、ＡＰＬシステム（共係属している米国出願番号０９／２８５４８１参照）と組み合せて使用することができる。これは、生体高分子、特に核酸を分析するための自動化されたシステムである。ＡＰＬシステム由来の結果をデータベースに入力することができる。
【０１４８】
任意の適当なコンピューターシステムを使用し得る。コンピューターシステムをサンプル分析、例えば、ここで記載の自動化プロセスラインのためにシステムに組み込み得る（例えば、共係属している米国出願番号０９／２８５４８１参照）。
【０１４９】
図１７は、ここで記載のデータベースを提供し、そしてプロセッシングするための、構築されたコンピューターのブロック図である。データベースを維持し、そして方法および処理を実施するプロセッシングを、同様の構築を有するすべての複数コンピューター上で実施し得、または単一の、総合的なコンピューターによって実施し得る。例えば、データをデータベースに加えるコンピューターを、データベースを蓄積するコンピューターから分離し得、またはそれによって総合化し得る。別の編成では、プロセッシングを実施するコンピューターは、図１７に例示されるような構築を有し得る。
【０１５０】
図１７は、前記のデータベースを維持する例示的なコンピューター１７００のブロック図であり、そしてこの方法および処理を実行する。各コンピューター１７００は、中央プロセッサーユニット（ＣＰＵ）１７０２、例えば、“ペンティアム”マイクロプロセッサーの制御下で作動し、そしてインテルコーポレーション（Snata Clara, California, USA）から入手可能である総合的サーキットチップと連関している。コンピューター使用者は、コマンドおよびデータをキーボードおよびディスプレイマウス１７０４から入力することができ、そしてディスプレイ１７０６で入力およびコンピューター出力を見ることができる。ディスプレイは、典型的には、ビデオモニターまたはフラットパネルディスプレイ装置である。
【０１５１】
コンピューター１７００はまた、直接的アクセス蓄積装置（ＤＡＳＤ）１７０７、例えば、固定ハードディスクドライブをも含む。メモリー１７０８は、典型的には、揮発性セミコンダクターランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）を含む。各コンピューターは好ましくは、プログラム製品リーダーがデータを読むことができる（そしてそれが所望によりデータを書き込むことができる）、プログラム製品蓄積装置１７１２を許容する、プログラム製品リーダー１７１０を含む。
【０１５２】
プログラム製品リーダーは、例えば、ディスクドライブを含むことができ、そしてプログラム製品蓄積装置は取り外し可能蓄積媒体、例えば磁気フロッピー(登録商標)ディスク、光学的ＣＤ−ＲＯＭディスク、ＣＤ−Ｒディスク、ＣＤ−ＲＷディスク、またはＤＶＤデータディスクを含むことができる。要すれば、コンピューターは相互に、ネットワーク１７１３上の他の接続されたコンピューターと通信することができるように、接続することができる。各コンピューター１７００は、ネットワークとコンピューターの間の接続１７１６上の通信を可能とする、ネットワークインターフェース１７１４を経由して、ネットワーク１７１３上の接続された他のコンピューターと通信することができる。
【０１５３】
コンピューター１７００は通常のコンピューター構築物にしたがう、メモリー１７０８に一時的に蓄積される、プログラミングステップの制御下で作動する。プログラミングステップをＣＰＵ１７０２によって実行するとき、付属システムコンポーネントはそのそれぞれの機能を実行する。こうして、プログラミングステップは前記のようなシステムの機能性を履行する。プログラミングステップを、プログラム製品リーダー１７１２を経由して、またはネットワーク接続１７１６を経由して、ＤＡＳＤ１７０７から受け取ることができる。
【０１５４】
蓄積ドライブ１７１０は、プログラム製品を受け取り、そこに記録されたプログラミングステップを読み、そしてＣＰＵ１７０２による履行のためにメモリー１７０８へプログラミングステップを送達することができる。前記のように、プログラム製品蓄積装置１７１０は、磁気フロッピー(登録商標)ディスクおよびＣＤ−ＲＯＭ蓄積ディスクを含む、記録されたコンピューター読み取り可能指令を有する、複数の取り外し可能媒体のいずれかを含むことができる。他の適当なプログラム製品蓄積装置は、磁気テープ、およびセミコンダクターメモリーチップを含むことができる。この方法で、作動のために必要なプロセッシングステップをプログラム製品上に埋め込むことができる。
【０１５５】
あるいは、プログラムステップを、ネットワーク１７１３上で作動しているメモリー１７０８へと受け取ることができる。このネットワーク方法では、ネットワーク通信がさらなる説明なくして当業者によって理解される周知の方法によってネットワーク接続１７１６上に確立された後に、ネットワークインターフェース１７１４を経由して、コンピューターがプログラムステップを含むデーターをメモリー１７０８に受け取る。プログラムステップを次いで、ガーメントデータベースシステムのプロセッシングを履行するために、ＣＰＵ１７０２によって実行する。
【０１５６】
システムのすべてのコンピューターが好ましくは図１７に示すのと同様の構築物を有し、したがって図１７のコンピューター１７００に関して記載された詳細がシステム１７００のすべてのコンピューターにあてはまることが理解されるべきである。このことは、ネットワーク１７１３に接続されて示される、複数のコンピューター１７００によって指摘される。コンピューター１７００のいずれかは、それらが他のコンピューターと通信することができ、そしてここで記載の機能性を支持することができる限り、別の構築物を有する。
【０１５７】
図１８は、図１７に例示したコンピューターを使用し、データベース、例えば、多型遺伝的マーカーを同定するためのデータベースを維持し、そしてアクセスを提供して実施されるプロセッシングステップを例示する、フロー図である。特に、データベースに含まれる情報を、図１７に例示されるのと同様の構築を有するコンピューターに蓄積する。図１８に指摘のように、データベースを維持するための第１のステップは、集団の健康なメンバーを同定することである。前記の様に、集団メンバーは健康であることのみを基礎に選択される対象であり、そしてここで、対象は哺乳動物、例えば、ヒトであり、彼らは／これらは好ましくは外観上の健康および検出可能な感染症の不存在に基づいて選択される。同定するステップは、１８０２の数を付したフロー図ボックスによって表す。
【０１５８】
１８０４の数を付したフロー図ボックスによって表される次のステップは、同定される集団のメンバーに関連する、同定のための、そして履歴的情報およびデータを取得することである。情報およびデータは、それぞれの集団メンバー、例えば、メンバーの年齢、人種、性別、医学的履歴、および最終的には遺伝子型情報についてのパラメータを含む。最初に、パラメータ情報を、体組織または体液サンプルがまた取得される、各メンバーによって回答された質問票から取得する。これらのパラメータをコンピューターのデータベースに入力し、そして蓄積するステップを、１８０６の数を付したフロー図ボックスによって表す。各集団についてのさらなる情報として、メンバーおよび対応するサンプルを取得し、この情報をデータベースに入力し、そして蓄積パラメータとして役立てることができる。
【０１５９】
１８０８の数を付したフロー図ボックスによって表した、次のステップでは、メンバーのパラメータをインデクサーと連関させる。このステップを、例えば、新規のデータ記録がリレーショナルデータベース構造にしたがって蓄積され、そしてその構造にしたがって他の記録と自動的に連結されるとき、データベース蓄積操作の一部として実行し得る。ステップ１８０６はまた、データベース入力が入力サーチにしたがってサーチされ、またはデータの寄与を決定するためのキー値をインデックス化する、通常のデータ分類または修復プロセスの一部として履行し得る。
【０１６０】
例えば、そのようなサーチおよび分類技術を使用し、既知の遺伝的マーカーの存在にしたがい、それからそれらが企図していた、疾患との相関があるかどうか決定し得る。この使用の例は、ｐ５３およびリポタンパク質リパーゼ多型の頻度を評価するためのものである。
【０１６１】
そのようなデータベースのサーチはまた、集団ないの頻度が年齢、年齢、人種群、性別、またはある他の基準の関数として変化する、１または２以上の遺伝的マーカーを同定するために有益であってよい。これは以前未知の多型の同定および、最終的には疾患の開始および進行と関係する遺伝子または経路の同定をもたらすことができる。
【０１６２】
さらに、データベースは、同定された多型を取得するために使用することができ、そして選択されたパラメータにしたがってデータを分類するとき、頻度について変化するかどうか確認することができる。
【０１６３】
この方法では、ここで提供するデータベースおよび方法が、とりわけ、コンポーネント、特に疾患プロセスのキーコンポーネントの同定が、その遺伝的基盤の理解、およびまたプロセス、例えば個体の薬物応答の理解によって可能となる。ここで提供するデータベースおよび方法をまた、病理学的経路の解明に関係する方法で、新規な診断アッセイの開発で、新規の可能性のある薬物標的の同定、および新規薬物候補の同定で、使用することができる。
【０１６４】
病的状態および／または早期死亡関連性多型
何らの特定の疾患について選択されていない、健康な血液ドナーの集団によって提供された情報を含むデータベースを使用して、存在し、年齢にともない頻度が減少する多型および対立遺伝子を同定することができる。これらは病的状態感受性マーカーおよび遺伝子を表し得る。
【０１６５】
ゲノムの多型は遺伝子機能、タンパク質機能またはゲノム不安定性の変化につながることができる。臨床的関連性／有用性を有するこれらの多型を同定することが、全世界の科学的努力の目標である。そのような多型性の発見が、疾患を治療するための新規薬物化合物の同定および開発に基本的な影響を有することを期待することができる。しかし、種々の多型を同定するための戦略は、煩雑であり、そして非常に多数の患者、および疾患連関を示すためのコントロールコホートの利用可能性に依存する。特に、任意の疾患（病的状態感受性遺伝子）に罹患している集団の一般的リスクを生じる遺伝子により、これらのケース／コントロール研究から完全に免れる。
【０１６６】
広範な異なる疾患に存在する、病的状態感受性遺伝子を同定するためのスクリーニング戦略をここに記載する。病的状態感受性遺伝子の定義は、多くの異なる細胞型または組織に発現されている遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）であり、そしてその変化した機能は、この障害に特異的な経路と関係する、疾患特異的感受性遺伝子によって生じた臨床的表現型の発現を促進することができる。換言すると、これらの病的状態感受性遺伝子は、この疾患についてのその遺伝子的な構成（make-up）にしたがって、ヒトに明瞭な疾患を発生させる素因をつくる。
【０１６７】
病的状態感受性遺伝子の候補は、転写、翻訳、熱ショックタンパク質、タンパク質トラフィッキング（protein trafficking）、ＤＮＡ修復、細胞内構造（例えば、ミトコンドリア、ペルオキシソームおよび他の細胞内ミクロボディー）についての組みたてシステム、レセプターシグナルカスケード、免疫等に関係する経路の根本のレベルで見出すことができる。これらの経路は、細胞内レベルで、並びに全生物について生命の質を制御する。
【０１６８】
これらの経路についてのタンパク質をコードする遺伝子に位置する突然変異／多型は、細胞の適応性を減少させ、そして生物をより感受性にさせ、疾患特異的感受性遺伝子の作用によって生じた、臨床的な表現型を発現させることができる。したがって、これらの病的状態感受性遺伝子は、すべてでないにしても、広範な種々の複合的な疾患に潜在的に関係することができる。疾患特異的感受性遺伝子は、グルコース、脂質、ホルモン代謝、等のような疾患特異的経路として考えることができる経路に関係する。
【０１６９】
例示した方法は、とりわけ、病的状態および／または死亡に対するヒトの全般的な感受性と関係する、遺伝子および／または遺伝子産物の同定；ヒトの疾患の遺伝子的基盤を解明するための研究におけるこれらの遺伝子および／または遺伝子産物の使用；疾患特異的感受性遺伝子なく、またはそれとともに組みあわせによる統計的分析におけるこれらの遺伝子および／または遺伝子産物の使用；疾患感受性遺伝子の一貫性を予測するためのこれらの遺伝子および／または遺伝子産物の使用；素因および／または急性医学的診断におけるこれらの遺伝子および／または遺伝子産物の使用、および疾患を治療するためおよび／またはヒトの寿命を延長するための薬物を開発するためのこれらの遺伝子および／または遺伝子産物の使用を可能とする。
【０１７０】
スクリーニングプロセス
年齢、性および人種等によって層化された健康体集団は、遺伝子に連関する病的状態についての、大変効率的で、普遍的なスクリーニング手段である。高齢な集団と比較したときの若齢の集団中の対立遺伝子頻度の変化は、推定的な病的状態感受性遺伝子を示すことが期待される。この健康体集団ベースの個々のサンプルを、スループットをさらに増加させるためにプールすることができる。原則的な実験の証明において、若齢および高齢な白人女性および男性のプールを適用して、多くの異なる遺伝子に位置する、４００より多いランダムに選択された単一ヌクレオチド多型をスクリーニングした。
【０１７１】
対立遺伝子的な相違が、両方または一方のみの性について、若齢および高齢者の間で８％より大きいならば、候補多型が同定された。当初の結果を、少なくとも１つの独立的な次の実験でもう一度アッセイした。反復実験は、不安定な生化学的反応をみとめるために必要であり、そしてそれは約２−３％の頻度で存在し、そして年齢関連性の対立遺伝子頻度の相違に似ていることができる。
【０１７２】
平均の頻度の相違および標準偏差を、当初の結果の良好な再現性があった後に算出する。最終的な対立遺伝子頻度を次いで、白人ＣＥＰＨサンプルプールの引用集団と比較する。結果は、若齢白人集団の対立遺伝子頻度に類似することを示すものとする。次いで、遺伝子型情報を含む、候補の正確な対立遺伝子頻度を、すべての個々のサンプルを分析することによって取得した。この処理は、時間およびコストに関して単純である。それは莫大な数のＳＮＰのスクリーニングを可能とする。したがって、年齢に対して高度に有意な連関を有する幾つかのマーカーを同定し、そして以下に記載する。
【０１７３】
一般に、統計的に有意な結果を得るために、スクリーニングされるべき、層化した集団の少なくとも５の個体が必要である。年齢層化集団について、対立遺伝子の頻度を決定する。次いで、カイ二乗分析を対立遺伝子頻度に基づいて実施し、年齢の群の間の相違が統計的に有意かどうか決定する。０．１より小さいｐ値は、統計的に有意な相違であることを示すと考えられる。より好ましくはｐ値は、０．０５より小さいものとする。
【０１７４】
臨床試験
集団内の頻度が年齢とともに減少するマーカーの同定によって、またよりよく設計され、そしてバランスが取れている臨床試験を得ることができる。現在では、臨床試験が研究で重要な指標（endpoint）としてマーカーを利用し、そしてそのマーカーが年齢とともに消失するならば、そのときは研究の結果は不正確かもしれない。ここで提供した方法を使用することによって、マーカーが年齢とともに頻度が減少するかどうか確認することができる。研究を計画するとき、この情報を考慮し、そして管理する（control）ことができる。例えば、年齢に独立的なマーカーは、適当な場合に置換し得る。
【実施例】
【０１７５】
以下の実施例は、解説目的のみのために含まれ、本発明の範囲の制限を目的とするものではない。
【０１７６】
実施例１
この実施例は、年齢に伴う既知遺伝的マーカーの対立遺伝子頻度の分布を測定するための任意の特定疾患で選択されているわけではない健康体血液ドナー集団により提供される情報を含むデータベースの使用および当該データベースの白人部分集団における性別により提供される情報を含むデータベースの使用について記載する。この実施例に記載の結果により、疾患関連遺伝的マーカーまたは多型は、年齢、性別および人種のようなパラメーターまたはパラメーター群による健康体データベースの分類より同定され得る。
【０１７７】
データベースの作成
血液は、提供される血液用の血液バンク基準を満たしたヒト対象から静脈穿刺により得た。血液サンプルは、ｐＨ８．０のＥＤＴＡで保存し、ラベルした。各ドナーから、年齢、性別、人種、病歴および家族の病歴のような情報を得た。各サンプルを、情報の同定を提示するバーコードでラベルした。データベースは、商業的に利用可能なソフトウエア、例えばMicrosoft Accessを用いコンピューター保存媒体のメモリ中に入れられる、各ドナーについての、相当する対象の識別子(identifier)および情報を入力することにより、作成した。
【０１７８】
モデル遺伝的マーカー
幾つかのレベルで疾患と連関すると知られている多型の頻度は、データベースで提示される対象の部分集団において測定された。これら既知多型は、ｐ２１、ｐ５３およびリポタンパク質リパーゼ遺伝子中で生じる。特に、アミノ酸コドン２９１でセリンとアスパラギンとの置換を生じるリポタンパク質リパーゼ遺伝子のＮ２９１Ｓ多型(Ｎ２９１Ｓ)は、男性のアテローム性動脈硬化および特に心筋梗塞の危険性の増加と連関する、高密度リポタンパク質コレステロール(ＨＤＬ−Ｃ)のレベルを低下することにつながる(Reymer et al. (1995) Nature Genetics 10: 28-34)。
【０１７９】
ｐ５３遺伝子は、ＤＮＡ損傷を評価する細胞周期制御タンパク質をコードし、細胞増殖、ＤＮＡ修復およびアポトーシス(プログラム化された細胞死)を制御する転写因子制御遺伝子として作用する。ｐ５３遺伝子中の突然変異は、種々の頻度を有する、種々の型の白血病を含む広く多種の癌で見つかった。通常のｐ５３機能の喪失は、非制御細胞増殖をゲノム的に不安定とする。ｐ５３遺伝子中で同定された多型、すなわち、Ｒ７２Ｐ対立遺伝子は、当該遺伝子のアミノ酸コドン７２でプロリンとアルギニンとの置換を生じる。
【０１８０】
ｐ２１遺伝子は、通常細胞のＧ１期進行停止を伴うサイクリン依存キナーゼインヒビターをコードする。ｐ２１遺伝子の発現はアポトーシスを誘発する。ｐ２１遺伝子の多型は、Wilm's腫瘍、小児科腎臓癌と連関する。ｐ２１遺伝子の１つの多型、Ｓ３１Ｒ多型は、アミノ酸コドン３１においてアルギニンとセリンの置換を生じる。
【０１８１】
データベース分析
特定パラメーターによる対象の分類
遺伝的多型は、サンプルバンクの白人部分集団のセグメント内でプロファイルした。ｐ５３のプロファイルの場合、年齢１８−５９歳の合計１２７７人の白人対象および年齢６０−７９歳の合計４５７人の白人対象の血液から単離したゲノムＤＮＡを分析した。ｐ２１のプロファイルの場合、年齢１８−４９歳の合計９１０白人対象および年齢５０−７９歳の合計８２４白人対象の血液から単離したゲノムＤＮＡを分析した。リポタンパク質リパーゼ遺伝子のプロファイルの場合、年齢６０歳未満の合計１４６４人の白人女性および合計１４７０人の白人男性ならびに６０歳を超える合計４７８人の白人女性および合計５６０人の白人男性を分析した。
【０１８２】
ゲノムＤＮＡの単離および分析
ゲノムＤＮＡは、個体から得た血液サンプルから単離した。各個体からの全血１０ｍｌを２０００×ｇで遠心分離した。バフィーコート(buffy coat)１ｍｌを、１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、および０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡの９ｍｌに加え、室温で１０分間インキュベーションし、１０分間２０００×ｇで遠心分離した。上清を取り除き、白色の細胞ペレットを、１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３および０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ中で洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳの４．５ｍｌ中に再懸濁した。タンパク質は、６ｍＭ 酢酸アンモニウム、ｐＨ７．３により細胞ライゼートより沈殿させ、次いで、３０００×ｇの遠心分離により分離した。当該核酸を、同体積の１００％イソプロパノールの添加および２０００×ｇの遠心分離により上清から取り除いた。当該乾燥核酸ペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６および１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ中で水和し、４℃で保存した。
【０１８３】
既知遺伝的マーカーの存在または非存在を決定するゲノムＤＮＡのアッセイは、ＢｉｏｍａｓｓＰＲＯＢＥ(商標)検出方法(プライマーオリゴ塩基伸張)反応を用い開発した。当該方法は、単一の検出プライマーを用い、その後オリゴヌクレオチド伸張ステップを行い、質量分析法、特にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により容易に分解し得る産物を得た。当該産物は、多型の存在または非存在に依存して長さが異なる。この方法では、検出プライマーは、可変ヌクレオチドまたはヌクレオチド配列の部位に隣接してアニーリングし、当該プライマーは、１以上のジデオキシＮＴＰ、所望により１以上のデオキシＮＴＰの存在下ＤＮＡポリメラーゼを用い伸張する。当該得られた産物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により、分解する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定するような当該産物の質量は、可変部位に存在するヌクレオチドの決定を可能とする。
【０１８４】
最初に、各白人ゲノムＤＮＡサンプルを、ｐ２１(Ｓ３１Ｒ対立遺伝子)、ｐ５３(Ｒ７２Ｐ対立遺伝子)およびリポタンパク質リパーゼ(Ｎ２９１Ｓ対立遺伝子)の遺伝子の多型部位の５'および３'部位に相当するプライマーを用い核酸増幅した。各プライマー対の１プライマーを、固体支持体に増幅産物を固定化し得るようにビオチニル化した。特に、ｐ２１、ｐ５３およびリポタンパク質リパーゼの遺伝子の関連セグメントの増幅に用いるポリメラーゼ連鎖反応プライマーを以下に示す：ｐ２１の遺伝子増幅のためのＵＳ４ｐ２１ｃ３１−２Ｆ(配列番号９)およびＵＳ５ｐ２１−２Ｒ(配列番号１０)；ｐ５３の遺伝子増幅のためのＵＳ４−ｐ５３−ｅｘ４−Ｆ(ｐ５３−ｅｘ４ＵＳ４(配列番号２)としても示される)およびＵＳ５−ｐ５３／２−４Ｒ(ＵＳ５ｐ５３／４Ｒ(配列番号３)としても示される)；およびリポタンパク質リパーゼの遺伝子増幅のためのＵＳ４−ＬＰＬ−Ｆ２(配列番号１６)およびＵＳ５−ＬＰＬ−Ｒ２(配列番号１７)。
【０１８５】
各ＤＮＡ配列の増幅は、標準的なプロトコールにより行った。例えば、プライマーは濃度８ｐｍｏｌで用い得る。当該反応混合物(例えば、全体積５０μｌ)は、１０×緩衝液およびｄＴＮＰを含むＴａｑ−ポリメラーゼを含み得る。ポリメラーゼ連鎖反応増幅のサイクリング条件は、典型的には、最初に９５℃５分間、その後、９４℃１分間、５３℃４５秒、および７２℃３０秒を４０サイクル、最終伸張として７２℃５分間、行い得る。増幅産物は、製造者説明に従い、Qiagen PCR精製キット(No.28106)を用い精製し得る。カラムから精製した産物の溶出は、ＴＥ緩衝液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５)５０μｌ中で行うことができる。
【０１８６】
精製増幅産物を、ビオチン−アビジン連結を介し、ストレプトアビジン被覆ビーズに固定化し、二本鎖ＤＮＡを変性させた。次いで、検出プライマーを、例えば、以下のような条件を用い、固定化ＤＮＡにアニーリングさせた：５０℃の５０μｌアニーリング緩衝液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ (ＮＨ４)２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ２、１％ Triton X-100、ｐＨ８)で１０分間、その後、ビーズを洗浄緩衝液(４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Tween 20、ｐＨ８．８)２００μｌで３回洗浄し、ＴＥ緩衝液２００μｌで１回洗浄した。
【０１８７】
ＰＲＯＢＥ伸張反応は、例えば、ＵＳＢからのＤＮＡシーケンシングキット(Ｎｏ．７０７７０)の幾つかの内容物およびPharmaciaのｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰを用いることにより、行った。典型的なプロトコールには、水２１μｌ、シークエナーゼ緩衝液６μｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ溶液３μｌ、０．５ｍＭの３つのｄＮＴＰ４．５μｌ、２ｍＭの非含有(missing)の１つのｄｄＮＴＰ４．５μｌ、グリセロール酵素希釈緩衝液５．５μｌ、シークエナーゼ２．０ ０．２５μｌ、およびピロホスファターゼ０．２５μｌを含む、全反応物体積４５μｌが含まれ得る。次いで、当該反応物を氷上でピペッティングし、１５分間室温でそして５分間３７℃でインキュベーションし得る。当該ビーズを洗浄緩衝液２００μｌで３回洗浄し、７０ｍＭ ＮＨ４クエン酸溶液６０μｌで１回洗浄した。
【０１８８】
当該ＤＮＡを変性し、固定化鋳型から伸張プライマーを開放させた。それぞれの得られた伸張産物を、マトリックスとして３−ヒドロキシピコリン酸(３−ＨＰＡ)およびＵＶレーザーを用いＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により別々に分析した。
【０１８９】
特に、ＰＲＯＢＥ反応に用いるプライマーは以下のように示される：ｐ２１多型部位のＰＲＯＢＥ分析用のＰ２１／３１−３(配列番号１２)；ｐ５３多型部位のＰＲＯＢＥ分析用のＰ５３／７２(配列番号４)；およびリポタンパク質リパーゼ遺伝子多型部位のＰＲＯＢ分析用のＬＰＬ−２。ｐ２１多型部位のＰＲＯＢＥ分析において、伸張反応は、ジデオキシＣを用い行った。“野生型”対立遺伝子鋳型(この場合、コドン３１はセリンをコードする)で起こる反応からおよび多型Ｓ３１Ｒ対立遺伝子鋳型(この場合、コドン３１はアルギニンをコードする)で起こる反応から生ずる産物は、以下のように示し、それぞれ、Ｐ２１／３１−３Ｓｅｒ(ｗｔ)(配列番号１３)およびＰ２１／３１−３Ａｒｇ(配列番号１４)のように設計した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で測定できるような各産物の質量がまた、提供される(野生型産物の場合、４９００．２Ｄａおよび多型産物の場合、５２１３．４Ｄａ)。
【０１９０】
ｐ５３多型部位のＰＲＯＢＥ分析において、当該伸張反応はジデオキシＣを用い行った。“野生型”対立遺伝子鋳型(この場合、コドン７２はアルギニンをコードする)で起こる反応からおよび多型Ｒ７２Ｐ対立遺伝子鋳型(この場合、コドン７２はプロリンをコードする)で起こる反応から生ずる産物を、以下のように示し、それぞれ、Ｃｏｄ７２ Ｇ Ａｒｇ(ｗｔ)およびＣｏｄ７２ Ｃ Ｐｒｏのように設計した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定され得るような各産物の質量がまた、提供される(野生型産物の場合、５７３４．８Ｄａおよび多型産物の場合、５４０５．６Ｄａ)。
【０１９１】
リポタンパク質リパーゼ遺伝子多型部位のＰＲＯＢＥ分析において、当該伸張反応はｄｄＡおよびｄｄＴの混合物を用い行った。“野生型”対立遺伝子鋳型(この場合、コドン２９１はアスパラギンをコードする)で起こる反応からおよび多型Ｎ２９１Ｓ対立遺伝子鋳型(この場合、コドン２９１はセリンをコードする)で起こる反応から生ずる産物は、以下のように示し、それぞれ、２９１Ａｓｎおよび２９１Ｓｅｒのように設計した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定され得るような各産物の質量がまた、提供される(野生型産物の場合、６４３８．２Ｄａおよび多型産物の場合、６７５８．４Ｄａ)。
【０１９２】
Ｐ５３−１(Ｒ７２Ｐ)
ＰＣＲ産物の長さ：４０７ｂｐ(配列番号１)
【化１】
2004158005.tif 000002
プライマー(配列番号２−４)
【化２】
2004158005.tif 000003
質量
【表１】
2004158005.tif 000004
ビオチン化ＵＳ５プライマーをＰＣＲ増幅に用いる。
【０１９３】
ＬＰＬ−１(Ｎ２９１Ｓ)
リポタンパク質リパーゼ遺伝子のコドン２９１のアスパラギンをセリンにアミノ酸置換する。
【０１９４】
ＰＣＲ産物の長さ：２５１ｂｐ(配列番号１５)
ＵＳ４−ＬＰＬ−Ｆ２(配列番号１６)
【化３】
2004158005.tif 000005
プライマー(配列番号１６−１８)
【化４】
2004158005.tif 000006
質量
【表２】
2004158005.tif 000007
ビオチン化ＵＳ５プライマーをＰＣＲ増幅に用いる。
【０１９５】
Ｐ２１−１(Ｓ３１Ｒ)
腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ２１のコドン３１のセリンをアルギニンにアミノ酸置換する。産物の長さ：２０７ｂｐ(配列番号８)
【化５】
2004158005.tif 000008
プライマー(配列番号９−１１)
【化６】
2004158005.tif 000009
質量
【表３】
2004158005.tif 000010
ビオチン化ＵＳ５プライマーをＰＣＲ増幅に用いる。
【０１９６】
各白人対象ＤＮＡサンプルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により個々に分析し、多型部位のヌクレオチドの同一性を測定した。各アッセイの遺伝子型結果をデータベースに入力できる。次いで、結果を、年齢および／または性別により分類し、年齢および／または性別の対立遺伝子頻度の分布を測定した。各ケースの結果のヒストグラムを示す図中で示すように、ｐ２１、ｐ５３およびリポタンパク質リパーゼ遺伝子の多型の遺伝的マーカーの対立遺伝子頻度の差異分布があった。
【０１９７】
図８は、ｐ２１遺伝的マーカーアッセイの結果から、年齢(年齢１８−４９歳を年齢５０−７９歳と比較した)の白人のヘテロ接合遺伝子型(Ｓ３１Ｒ)の頻度に統計的に有意な減少(１３．３％から９．２％)が見られることを示す。２つの年代群のホモ接合(Ｓ３１およびＲ３１)遺伝子型の頻度もまた、２つの年代群におけるＳ３１およびＲ３１対立遺伝子(図中、それぞれ＊Ｓ３１および＊Ｒ３１として命名した)の全体的頻度であるため、示される。
【０１９８】
図７Ａ−Ｃは、ｐ５３遺伝的マーカーアッセイの結果を示し、年齢(年齢１８−５９歳を年齢６０−７９歳と比較した)の白人のホモ接合遺伝子型(Ｐ７２)の頻度に満足できる有意な減少(６．７％から３．７％)を示す。２つの年代群のホモ接合“野生型”遺伝子型(Ｒ７２)およびヘテロ接合遺伝子型(Ｒ７２Ｐ)の頻度もまた、２つの年代群におけるＲ７２およびＰ７２対立遺伝子(図中、それぞれ＊Ｒ７２および＊Ｐ７２として設計した)の全体的頻度であるため、示される。これらの結果は、ｐ５３が第二のタンパク質、細胞周期を通して細胞を動かす必要のあるサイクリン依存キナーゼ(ＣＤＫ)を阻害するｐ２１の発現を制御する(何れかの遺伝子の変異が細胞周期を崩壊させ、細胞分裂の増加を生ずる)ため、対立遺伝子が良性ではないという観察からなる。
【０１９９】
図２Ｃは、リポタンパク質リパーゼ遺伝子遺伝的マーカーアッセイの結果は、年齢(またReymer et al. (1995) Nature Genetics 10: 28-34参照)の白人男性の多型対立遺伝子(Ｓ２９１)の頻度に統計的に有意な減少(１．９７％から０．５４％)が見られることを示す。別の年代群の白人女性のこの対立遺伝子頻度もまた示される。
【０２００】
実施例２
この実施例は、因子ＶＩＩ遺伝子の多型対立遺伝子(３５３Ｑ対立遺伝子)の存在または非存在を評価する複数対象の個々サンプルおよびプールしたサンプルとして多くの対象のＤＮＡサンプルを分析し、対象の群中の対立遺伝子頻度を決定するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法の使用について記載する。この研究結果は、本質的に、同じ対立遺伝子頻度は、別々に各サンプルを分析するようにプールしたＤＮＡサンプルを分析することにより得られ、それにより、核酸の分析におけるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法の量的性質が説明されることを示す。
【０２０１】
因子ＶＩＩ
因子ＶＩＩは、外来的血液凝固カスケード中に含まれるセリンプロテアーゼである。この因子はトロンビンにより活性化され、因子Ｘから因子Ｘａへのプロセッシングにおいて組織因子(因子ＩＩＩ)と共に働く。因子ＶＩＩ遺伝子中の多型間の関連および心筋梗塞を含む虚血性心血管疾患の危険性を増大し得る因子ＶＩＩ活性の増加をサポートする証拠がある。本研究で調査する多型は、Ｒ３５３Ｑである(すなわち、因子ＶＩＩ遺伝子のコドン３５３においてグルタミン酸残基からアルギニン残基への置換)(表５参照)。
【０２０２】
因子ＶＩＩ遺伝子の３５３Ｑ対立遺伝子の存在または非存在に関するＤＮＡサンプルの分析
ゲノムＤＮＡは、群あたり９２対象の複数の群に分けた大多数の対象から得られた別々の血液サンプルから単離された。ゲノムＤＮＡの各サンプルは、実施例１に記載するようなＢｉｏｍａｓｓＰＲＯＢＥ(商標)アッセイを用い分析し、因子ＶＩＩ遺伝子の３５３Ｑ多型の存在または非存在を決定した。
【０２０３】
最初に、各サンプル由来のＤＮＡを、以下に示すように、Ｆ７−３５３ＦＵＳ４(配列番号２４)およびＦ７−３５３ＲＵＳ５(配列番号２６)を用い、例えば、実施例１に記載するような標準的な条件を用いポリメラーゼ連鎖反応において増幅した。プライマーの１つをビオチニル化し、増幅産物を固体支持体に固定化し得た。精製増幅産物を、ストレプトアビジン被覆ビーズへのビオチン−アビジン連結を介して固定化し、二本鎖ＤＮＡを変性した。次いで、検出プライマーを、例えば、実施例１に記載のような条件を用い固定化ＤＮＡにアニーリングした。検出プライマーは、以下のようにＦ７−３５３−Ｐ(配列番号２７)として示す。ＰＲＯＢＥ伸張反応は、例えば、実施例１に示すような条件を用い行った。当該反応は、ｄｄＧを用い行った。
【０２０４】
ＤＮＡを変性し、固定化鋳型から伸張プライマーを開放した。それぞれの得られた伸張産物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により別々に分析した。３−ヒドロキシピコリン酸(３−ＨＰＡ)のようなマトリックスおよびＵＶレーザーをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法分析に用いた。“野生型”対立遺伝子鋳型(この場合、コドン３５３はアルギニンをコードする)で起こる反応からおよび多型３５３Ｑ対立遺伝子鋳型(この場合、コドン３５３はグルタミン酸をコードする)で起こる反応から生ずる産物は、以下のように示し、それぞれ、３５３ ＣＧＧおよび３５３ＣＡＧのように設計した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定され得るような各産物の質量がまた、提供される(すなわち、野生型産物の場合、５６４６．８Ｄａおよび多型産物の場合、５９６０Ｄａ)。
【０２０５】
各ＤＮＡサンプルのＰＲＯＢＥ反応のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法分析は、各サンプルにおいて最初に別々に行われる(分析あたりのＤＮＡの合計濃度２５０ｎｇ)。９２対象の群における３５３Ｑ多型の対立遺伝子頻度は、検出される多くの各対象に基づき算出された。
【０２０６】
次に、９２対象のサンプルをプールし(任意の個々ＤＮＡの濃度が２．７ｎｇである、ＤＮＡの合計濃度２５０ｎｇ)、ＤＮＡのプールをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法分析した。生じるスペクトルにおける３５３Ｑ多型ＰＲＯＢＥ伸張産物の質量に相当するシグナルの下の領域が、存在するＤＮＡ量を定量するため、組込まれた。合計ＤＮＡに対する、この量の割合が用いられ、対象の群における３５３Ｑ多型の対立遺伝子頻度が測定された。この型の個々サンプル対プールしたサンプルの分析を、９２種サンプルの多種の群について繰り返した。
【０２０７】
９２の各群の９２種のサンプルの各ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法分析に基づき算出される頻度を、図９において、９２サンプルからのＤＮＡのプールのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法分析に基づき算出したものと比較する。これらの比較を、図中、棒グラフで“対”として示し、各対は、別々の“プール”番号、例えば、Ｐ１、Ｐ１６、Ｐ２などとして標識されている。そのため、例えば、Ｐ１の場合、９２サンプルそれぞれの別々の分析により算出される多型の対立遺伝子頻度は、１１．４１％であり、９２ＤＮＡサンプル全てのプールの分析により算出される頻度は、１２．０９％であった。
【０２０８】
別々のＤＮＡサンプルを個々に分析することによりおよびＤＮＡサンプルのプールにより算出される頻度の類似性から、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法の量的性質を通して、プールしたサンプルを分析し、正確な頻度測定を得ることが可能となることが証明される。プールしたＤＮＡサンプルの分析能は、本明細書に記載されたような非選択性の健康体データベースの使用を含む時間および費用を有意に減少する。スペクトルの特質または検出されたサンプル量を図る能力を全く変化せずにプール混合物中の個々サンプルのＤＮＡ濃度を２．７ｎｇから０．２７ｎｇに減少させることが可能となることもまた示される。
【０２０９】
因子ＶＩＩＲ３５３ＱＰＲＯＢＥアッセイ
コード３５３ ＣＧＧ＞ＣＡＧ(Ａｒｇ＞Ｇｌｎ)、エキソン９Ｇ＞ＡのためのＰＲＯＢＥアッセイ
【０２１０】
ＰＣＲフラグメント：１３４ｂｐ(ＵＳタグを含む；配列番号２２および２３)
対立遺伝子頻度：ヨーロッパ人約０．１、日本人／中国人約０．０３−０．０５(Thromb. Haemost. 1995, 73: 617-22; Diabetologia 1998, 41: 760-6)：
【化７】
2004158005.tif 000011
質量
【表４】
2004158005.tif 000012
【０２１１】
結論
上記実施例から、一般的な群の遺伝的因子に起因する疾患の頻度を変化させる効果が証明される。これらの結果から、多型遺伝的変化の医学的関連性が予測され得ると解釈される。加えて、結論が、浸透度、診断特異性、陽性適中率、疾患の攻撃、予防ストラテジーの最も適する攻撃、および単離された群を任意交配した群と同定する遺伝的変化の一般的適用可能性を導く。そのため、人種的に同種である、年齢および性別で層化した群に基づくサンプルバンクは、可能性ある医療的有用性に関し、遺伝的因子の迅速な同定および確認のための適当なツールとなる。
【０２１２】
実施例３
病的状態および死亡のマーカー
サンプルバンドおよび初期スクリーニング
健康体サンプルは、San Bernardino, CAの血液バンクを通じて取得した。ドナーに、血液回収の前に同意書にサインしてもらい、血液をヒトの加齢に関する遺伝的研究に使用することに同意してもらった。すべてのサンプルをアノミマイズ(anomymize)した。サンプルのトラッキングバック(tracking back)は可能ではない。
【０２１３】
健康体ドナー群の血液サンプルからのＤＮＡの単離
血液を静脈穿刺により取得し、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０で保存する。各ドナーからの全血１０ｍｌを２０００×ｇで遠心分離した。バフィーコート(buffy coat)１ｍｌを、１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、および０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡの９ｍｌに加え、室温で１０分間インキュベーションし、１０分間２０００×ｇで遠心分離した。上清を取り除き、白色の細胞ペレットを、１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３および０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ中で洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳの４．５ｍｌ中に再懸濁した。タンパク質は、６Ｍ 酢酸アンモニウム、ｐＨ７．３により細胞ライゼートより沈殿させ、次いで、３０００×ｇの遠心分離により核酸から分離した。当該核酸を、同体積の１００％イソプロパノールの添加および２０００×ｇの遠心分離により上清から取り除いた。当該乾燥核酸ペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６および１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ中で水和し、４℃で保存した。
【０２１４】
この研究では、サンプルを表１に示すようにプールした。血液ドナーの両親は白人起源であった。
表１
【表５】
2004158005.tif 000013
【０２１５】
４００を超えるＳＮＰを４つ全てのプールを用い試験した。試験を行った後、３４アッセイを少なくとも一度、再アッセイするよう選択した。最終的に、１０アッセイにより、幾らかの割合の対立遺伝子頻度に繰り返しの相違が見られ、それによって、各サンプルを用い試験される基準を満たした。平均対立遺伝子頻度および標準偏差を表２に表とする。
表２
【表６】
2004158005.tif 000014
１０のうち７の可能性のある病的状態のマーカーが充分に分析された。これらＳＮＰが位置する遺伝子に関する更なる情報を、Ｇｅｎｂａｎｋのような公共のデータベースを通じて集めた。
【０２１６】
ＡＫＡＰＳ
候補の病的状態および死亡のマーカーには、シグナルトランスダクションに含まれる遺伝子のようなハウスキーピング遺伝子が含まれる。その遺伝子には、タンパク質リン酸化を含むシグナルトランスダクション経路に関係するＡキナーゼアンカータンパク質(ＡＫＡＰ)遺伝子がある。タンパク質リン酸化は、酵素制御、および真核細胞の細胞膜を通過する細胞外シグナルのトランスダクションに重要な機構である。酵素、膜レセプター、イオンチャンネルおよび転写因子を含む広範の種類の細胞性基質は、細胞と相互作用する細胞外シグナルに応答してリン酸化され得る。ホルモンおよび神経伝達物質に応答する細胞性タンパク質のリン酸化において鍵となる酵素は、サイクリックＡＭＰ(ｃＡＭＰ)依存タンパク質キナーゼである（ＰＫＡ）。そのため、ｃＡＭＰによる活性化において、ＰＫＡは、その細胞外シグナルに対する種々の細胞性応答を仲介する。ＰＫＡアイソザイムのアレイは、哺乳類細胞中で発現する。ＰＫＡは、通常、制御(Ｒ)サブユニットダイマーおよび２つの触媒(Ｃ)サブユニットを含む不活性テトラマーとして存在する。３つのＣサブユニット(Ｃα、ＣβおよびＣγ)および４つのＲサブユニット(ＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩαおよびＲＩＩβ)をコードする遺伝子を同定した(Takio et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79: 2544-2548; Lee et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 3608-3612; Jahnsen et al. (1996) J. Biol. Chem. 261: 12352-12361; Clegg et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 3703-3707;およびScott (1991) Pharmacol. Ther. 50: 123-145参照)。型Ｉ(ＲＩ)αおよび型ＩＩ(ＲＩＩ)αサブユニットは、偏在的に分布し、この場合、ＲＩβおよびＲＩＩβは主に脳に存在する(例えば、Miki and Eddy (1999) J. Biol. Chem. 274: 29057-29062参照)。型Ｉ ＰＫＡホロ酵素(ＲＩαおよびＲＩβ)は、細胞質中に主に存在し、一方、多数の型ＩＩ ＰＫＡ(ＲＩＩαおよびＲＩＩβ)は細胞性構造および細胞小器官に関係する(Scott (1991) Pharmacol. Ther. 50: 123-145)。多くのホルモンおよび他のシグナルがレセプターを介して作用し、ＰＫＡのＲサブユニットに結合し、放出し、タンパク質をリン酸化するＣサブユニットを活性化するｃＡＭＰを生ずる。タンパク質キナーゼおよびその基質は広く細胞全体に分布するため、異なるシグナルに対するタンパク質キナーゼ仲介応答を局在化させる細胞中に存在する機構がある。その機構の１つには、特定の細胞小器官または細胞骨格コンパートメントにきわめて接近してＰＫＡを位置させ、それによりより特異的なＰＫＡ相互作用および局在化応答を提供するＡキナーゼアンカータンパク質(ＡＫＡＰ)と呼ばれる、アンカータンパク質の付随を介するＰＫＡの亜細胞性ターゲッティングが含まれる(例えば、Scott et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 21561-21566; Bregman et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 7207-7213; およびMiki and Eddy (1999) J. Biol. Chem. 274: 29057-29062参照)。アンカーは好ましい基質に近づけてキナーゼを位置させるばかりでなく、所望により第二メッセンジャーｃＡＭＰの揺らぎ(fluctuation)に応答し得る部位にＰＫＡホロ酵素を位置させる(Mochly-Rosen (1995) Science 268: 247-251; Faux and Scott (1996) Trends Biochem. Sci. 21: 312-315; Hubbard and Cohen (1993) Trends Biochem. Sci. 18: 172-177参照)。
【０２１７】
７５％までの型ＩＩ ＰＫＡは、制御サブユニット(ＲＩＩ)によるＡＫＡＰとの会合を介して様々な細胞内部位に局在する(例えば、Hausken et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 29016-29022参照)。ＰＫＡのＲＩＩサブユニットは、ナノモーラーの親和性でＡＫＡＰと結合し(Carr et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 13376-13382)、多くのＡＫＡＰ−ＲＩＩ複合体が、細胞抽出物から単離された。ＰＫＡのＲＩサブユニットは、マイクロモーラーのみの親和性でＡＫＡＰに結合する(Burton et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 11067-11072)。ＰＫＡ ＲＩサブユニットによるＡＫＡＰへの結合の証明は報告されており(Miki and Eddy (1998) J. Biol. Chem. 273: 34384-34390)、それは、ＲＩα特異的およびＲＩα／ＲＩＩβ二重特異性ＰＫＡアンカードメインは、ＦＳＣ１／ＡＫＡＰ８２で同定された。ＰＫＡの型Ｉおよび型ＩＩ制御サブユニットと相互作用するＤ−ＡＫＡＰ１およびＤ−ＡＫＡＰ２と呼ばれる、更なる二重特異的ＡＫＡＰもまた報告されている(Huang et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 8057-8064; Huang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 11184-11189)。
【０２１８】
２０を超えるＡＫＡＰは、種々の組織および種で報告されている。ＡＫＡＰをコードする相補ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)は、Caenorhabditis elegansおよびDrosophiliaからヒトまでの範囲の多様な種から単離された(例えば、Colledge and Scott (1999) Trends Cell Biol. 9: 216-221参照)。ＰＫＡのＲＩＩサブユニットとの会合を仲介するＡＫＡＰ内の領域を同定した。約１０−１８アミノ酸残基のこれらの領域は、実質的に、第一の配列で変化するが、第二の構造予測から、ヘリックスの面に沿って並ぶ疎水性残基および他のものに沿った荷電性残基と共に両親媒性ヘリックスを形成するようであることが示されている(Carr et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 14188-14192; Carr et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 13376-13382)。長い脂肪族側鎖を有する疎水性アミノ酸、例えば、バリン、ロイシンまたはイソロイシンは、ＲＩＩサブユニットへの結合に関連し得る(Glantz et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12796-12804)。
【０２１９】
多くのＡＫＡＰがまた、他のシグナリング酵素を含む複数のタンパク質に結合する能力を有する。例えば、ＡＫＡＰ７９は、ＰＫＡ、タンパク質キナーゼＣ(ＰＫＣ)、およびプロテインホスファターゼカルシニュリン(ＰＰ２Ｂ)に結合する(Coghlan et al. (1995) Science 267: 108-112およびKlauck et al. (1996) Science 271: 1589-1592)。そのため、ニューロン性シナプス後膜に対するＡＫＡＰ７９のターゲッティングにより、単一複合体における逆触媒活性を有する酵素が同時に得られる。
【０２２０】
そのため、ＡＫＡＰは、ｃＡＭＰ仲介応答の選択性および強度を増大する可能性ある制御機構としての役割をする。そのため、細胞の基礎となる機能においてこれらのタンパク質が担う重要な役割を完全に理解するため、ＡＫＡＰの構造的および機能的な性質を明らかにし解明する必要がある。
【０２２１】
ＡＫＡＰ１０
ヒトＡＫＡＰ１０ ｃＤＮＡ(Ｄ−ＡＫＡＰ２とも称する)の配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、受け入れ番号ＡＦ０３７４３９(配列番号３１)およびＮＭ００７２０２として利用可能である。ＡＫＡＰ１０遺伝子はクロモソーム１７上に位置する。
【０２２２】
マウスＤ−ＡＫＡＰ２ｃＤＮＡの配列もまた、ＧｅｎＢａｎｋデータベース(受け入れ番号ＡＦ０２１８３３)において利用可能である。マウスＤ−ＡＫＡＰ２タンパク質は、Ｇαサブユニットと相互作用しＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質様活性を有するタンパク質の特性であるアミノ末端近辺のＲＧＳドメインを含む(Huang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 11184-11189)。ヒトＡＫＡＰ１０タンパク質はまた、ＲＧＳドメインと相同な配列を有する。マウスＤ−ＡＫＡＰ２タンパク質のカルボキシ末端４０残基は、ＰＫＡの制御サブユニットとの相互作用に応答する。この配列は、マウスＤ−ＡＫＡＰ２とヒトＡＫＡＰ１０タンパク質との間で完全に保存されている。
【０２２３】
ヒトＡＫＡＰ１０遺伝子の多型および多型ＡＫＡＰ１０タンパク質
遺伝子発現、制御、タンパク質構造および／またはタンパク質機能を変化させる、ＡＫＡＰ遺伝子の多型は、遺伝子および／またはタンパク質機能を変えない多型よりも、酵素(特にＰＫＡ)活性の制御、シグナルの細胞性形質導入およびその応答においてならびに細胞の基礎機能において、より重要な効果を有するようである。本明細書で提供される多型ＡＫＡＰに含まれるものは、番号６４６位に異なるアミノ酸残基を含むヒトＡＫＡＰ１０タンパク質である。
【０２２４】
ヒトＡＫＡＰ１０タンパク質のアミノ酸６４６は、ＰＫＡのＲサブユニットの結合に関係するセグメント内のタンパク質のカルボキシ末端領域に位置する。このセグメントは、カルボキシ末端４０アミノ酸を含む。
【０２２５】
ヒトＡＫＡＰ１０タンパク質の６４６位に関し報告されているアミノ酸残基はイソロイシンである。本明細書で提供される多型ヒトＡＫＡＰ１０タンパク質は、アミノ酸配列であるが、当該タンパク質の６４６位アミノ酸のイソロイシン以外の残基を含む。本明細書で提供される多型ヒトＡＫＡＰ１０タンパク質の特定の実施態様では、６４６位のアミノ酸は、バリン、ロイシンまたはフェニルアラニン残基である。
【０２２６】
ヒトＡＫＡＰ１０コーディング配列のヌクレオチド２０７３位におけるＡからＧへの変化
本明細書で記載の通り、コーディング配列の２０７３位の特異的多型を含み、それにより、６４６位でバリンをコードするヒトＡＫＡＰ１０遺伝子の対立遺伝子は、ヒト集団のより若齢およびより高齢のセグメント由来のＤＮＡサンプルにおいて多様な頻度で検出された。この対立遺伝子において、ＡＫＡＰ１０遺伝子コーディング配列の２０７３位のＡは、ＡからＧに変化させ、アミノ酸６４６のコドンをイソロイシンのコードのＡＴＴからバリンのコードのＧＴＴへと変化させて変化した配列を生じさせた。
【０２２７】
病的状態マーカー１：ヒトタンパク質キナーゼＡアンカータンパク質(ＡＫＡＰ１０−１)
健康体ドナー集団におけるＡＫＡＰ１０−１のＰＣＲ増幅およびＢｉｏｍａｓｓＰＲＯＢＥアッセイ検出
ＡＫＡＰ１０のドナー集団のＰＣＲ増幅
ＰＣＲプライマーは、ＯＰＥＲＯＮにより、ホスホラミダイト化学を用い合成された。ＡＫＡＰ１０標的配列の増幅は、ＰＣＲ反応物５０μｌ中に、プールしたヒトゲノムＤＮＡ１００ｎｇ−１μｇを有する単一のＰＣＲ反応物５０μｌ中で行った。プールしたサンプル内の各ＤＮＡ濃度は、最終濃度１−２５ｎｇの範囲の等濃度で存在した。各反応物は、１×ＰＣＲ緩衝液(Qiagen, Valencia, CA)、２００μＭ ｄＮＴＰ、１Ｕ Hotstar Ｔａｑポリメラーゼ(Qiagen, Valencia, CA)、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、ならびにユニバーサルプライマー配列および標的特異的配列5'-TCTCAATCATGTGCATTGAGG-3'(配列番号４５)を含む２５ｐｍｏｌフォワードプライマー、および２ｐｍｏｌリバースプライマー5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGGATCACACAGCCATCAGCAG-3'(配列番号４６)、ならびにＰＣＲアンプリコンの５’末端に相補的なビオチニル化ユニバーサルプライマー１０ｐｍｏｌ 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'(配列番号４７)を含む。特異的フォワードおよびリバースプライマーを用いる最初のラウンドの増幅の後、次いで、５’ビオチニル化ユニバーサルプライマーをハイブリダイズさせ、リバースプライマーとして作用させ、それにより、３’ビオチン捕捉部分を当該分子中に導入した。当該増幅プロトコールは、５’−ビオチニル化二本鎖ＤＮＡアンプリコンを生じ、遺伝子型決定(genotyping)に用いる５’ビオチン標識各フォワードプライマーの必要性を除くことによるハイスループット遺伝子型決定の費用を劇的に減少する。サーマルサイクリングは、０．２ｍＬチューブまたは９６ウェルプレート中で、MJ Research Thermal Cycler(算出温度)を用い、以下のパラメーターで行った：９４℃５分間；４５サイクル：９４℃２０秒、５６℃３０秒、７２℃６０秒；７２℃３分間。
【０２２８】
ＤＮＡの固定化
ＰＣＲ反応物５０μｌを、事前に３回洗浄し１Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、０．０６Ｍ ＮＨ４ＯＨ中に再懸濁したストレプトアビジン被覆磁性ビーズ２５μｌに加えた。ＰＣＲアンプリコンは、室温で１５分間でビーズに結合し得る。次いで、当該ビーズを、磁石を用い回収し、非結合ＤＮＡを含む上清を取り除いた。非結合鎖は、１００ｍＭ ＮａＯＨ中でインキュベーションし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０でビーズを３回洗浄することにより二本鎖アンプリコンから解放した。
【０２２９】
ＡＫＡＰ１０−１のドナー集団のＢｉｏｍａｓｓＰＲＯＢＥアッセイ分析(クローン４８３１９)
ＢｉｏｍａｓｓＰＲＯＢＥアッセイ法を用いる遺伝子型決定は、２６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５、６．５ｍＭ ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ 各ｄＴＴＰおよび５０ｍＭ 各ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕ(Amersham)ならびに鋳型特異的オリゴヌクレオチドＰＲＯＢＥプライマー5'-CTGGCGCCCACGTGGTCAA-3'(配列番号４８)(Operon)にＤＮＡ被覆磁性ビーズを再懸濁することにより行った。プライマー伸張は、オリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーションおよび伸張の３サイクルで生じる。当該伸張産物は、５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌで鋳型から変性させ、各サンプル１５０ｎＬを、Ｈ３ＰＡマトリックス物質１５０ｎＬで事前負荷したシリコンチップへ移した後、分析した。当該サンプル物質を結晶化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Bruker, PerSeptive)で分析した。ＡＫＡＰ１０中に存在するＳＮＰは、ＡＫＡＰ１０遺伝子(ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＣ００５７３０(配列番号３６)のゲノムクローンの配列のヌクレオチド番号１５６２７７においてＴをＣに変化する。配列番号３５は、ヒトＡＫＡＰ１０遺伝子のゲノムヌクレオチド配列を含むヒトクロモソーム１７のヌクレオチド配列を示し、配列番号３６は、ヒトＡＫＡＰ１０−１対立遺伝子のゲノムヌクレオチド配列を含むヒトクロモソーム１７のヌクレオチド配列を示す。ＢｉｏＭａｓｓプローブ反応に使用したプライマーの質量は、５５００．６ダルトンであった。ＳＮＰの存在下、当該プライマーは、質量５７７３．８のｄｄＣの添加により伸張する。野生型遺伝子は、ｄＴおよびｄｄＧをプライマーに添加し、質量６１０１ダルトンを有する伸張産物を産生する。
【０２３０】
ＳＮＰの頻度は、年齢で選択した健康個体の集団で測定した。年齢１８−３９歳の五百五十二(５５２)個体(２７６女性、２７６男性)および年齢６０−７９の５５２個体(年齢６０−６９では１８４女性、年齢６０−７９では３６８男性)を、ＡＫＡＰ１０の非翻訳３’領域中に局在する多型の存在に関し試験した。増加する年齢の群にともなってのこの多型の頻度における相違が、健康個体で観察された。統計学的な分析により、“より若齢”および“より高齢”の集団の間の対立遺伝子に関する対立遺伝子頻度の相違の有意なレベルは、ｐ＝０．０００９および遺伝子型の有意なレベルはｐ＝０．００３であることが示された。年齢群の間の相違は、有意である。すべての集団対立遺伝子有意性は、ｐ＝０．０００９であり、遺伝子型の有意性は、ｐ＝０．００３である。
【０２３１】
最善の有意性を生ずるこのマーカーは、年齢分類集団における対立遺伝子および遺伝子型頻度に関する結果である。図１９は、両性および集団全体における対立遺伝子および遺伝子型頻度を示す。対立遺伝子に関する後者の有意性は、ｐ＝０．０００９であり、遺伝子型の有意性は、ｐ＝０．００３であった。若齢および高齢の集団は、ハーディ-ヴァインベルグ平衡であった。ある特定の遺伝子型の好ましい変化は、見られなかった。
【０２３２】
多型は、ヒトプロテインキナーゼＡアンカータンパク質(ＡＫＡＰ１０)をコードする遺伝子の非翻訳３’−領域中に局在する。当該遺伝子は、クロモソーム１７に局在する。その構造には、１５エキソンおよび１４介在配列(イントロン)を含む。コードタンパク質は、ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼの亜細胞局在に応答し、それによって、Ｇ−プロテイン仲介レセプターシグナリング経路において鍵の役割をする(Huang et al. (1007) PNAS 94: 11184-11189)。その局在は、コーディング領域の外側であるため、この多型は、アミノ酸置換およびその後のタンパク質の機能変化を誘引し得る他の非同義性多型と共に、ほぼ連鎖不平衡(ＬＤ)であるようである。この遺伝子に関する異なるＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列比較により、さらに６つの可能性ある多型が示され、その２つ各アミノ酸の変化が考えられる(表３参照)。
【表７】
2004158005.tif 000015
【０２３３】
病的状態マーカー２：ヒトプロテインキナーゼＡアンカータンパク質(ＡＫＡＰ１０−５)
ＡＫＡＰ１０−５対立遺伝子(配列番号３３)の発見
ゲノムＤＮＡは、ＡＫＡＰ１０−１遺伝子座で遺伝子型ＣＣを有する十七(１７)個体および単一のヘテロ接合性個体(ＣＴ)(上記のように)の血液(上記のように)から単離された。Ｃ末端ＰＫＡ結合ドメインをコードするＡＫＡＰ１０−１遺伝子中の標的配列は、ポリメラーゼ連鎖反応を用い増幅した。ＰＣＲプライマーは、ＯＰＥＲＯＮにより、ホスホラミダイト化学を用い合成した。ＡＫＡＰ１０−１標的配列の増幅は、ヒトゲノムＤＮＡ鋳型２５ｎｇを有する各ＰＣＲ反応物５０μｌで行った。各反応物は、１×ＰＣＲ緩衝液(Qiagen, Valencia, CA)、２００μＭ ｄＮＴＰ、１Ｕ Hotstar Ｔａｑポリメラーゼ(Qiagen, Valencia, CA)、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、ユニバーサルプライマー配列および標的特異的配列5'-TCCCAAAGTGCTGGAATTAC-3'(配列番号５３)を含む２５ｐｍｏｌのフォワードプライマー(Ｅｘ１３Ｆ)、および２ｐｍｏｌリバースプライマー(Ｅｘ１４Ｒ)5'-GTCCAATATATGCAAACAGTTG-3'(配列番号５４)を含む。サーマルサイクリングは、０．２ｍＬチューブまたは９６ウェルプレート中で、MJ Research Thermal Cycler(MJ Research, Waltham, MA)(算出温度)を用い、以下のサイクリングパラメーターで行った：９４℃５分間；４５サイクル：９４℃２０秒、５６℃３０秒、７２℃６０秒；７２℃３分間。増幅後、当該アンプリコンは、クロマトグラフィーを用い精製した(Mo Bio Laboratories (Solana Beachm, CA))。
【０２３４】
標的領域を示す１８アンプリコンの配列は、ＰＣＲアンプリコン２５ｎｍｏｌ、３．２μＭ ＤＮＡシーケンシングプライマー5'-CCCACAGCAGTTAATCCTTC-3'(配列番号５５)、および鎖終結ローダミン標識２’，３’ジデオキシヌクレオチド(PE Biosystems, Foster City, CA)を伴う標準的サンガーサイクルシーケンシング法を用い、以下のサイクリングパラメーターに従い決定した：９６℃１５秒；２５サイクル：５５℃１５秒、６０℃４分間。当該シーケンシング産物は、０．３Ｍ ＮａＯＡｃおよびエタノールにより沈殿した。当該沈殿を遠心分離し、乾燥させた。当該ペレットを脱イオン化ホルムアミド中に再懸濁し、５％ポリアクリルアミドゲルで分離した。当該配列は、“Sequencher”ソフトウェアを用い決定した(Gene Codes, Ann Arbor, MI)。
【０２３５】
アンプリコンのＡＫＡＰ１０−１ＳＮＰについてホモ接合性である、１７すべてのアンプリコンの配列は、ＡとＧが置換えられたヌクレオチド１５２１７１位(ＡＫＡＰ１０ゲノムクローン(配列番号３５)についてＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号AC005730)の多型を示す。このＳＮＰはまた、野生型ＡＫＡＰ１０(ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号AF037439)(配列番号３１)のｃＤＮＡクローンのヌクレオチド２０７３位に位置するように設計できる。ヒトＡＫＡＰ１０タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３２として提供する。この単一のヌクレオチド多型は、ＡＫＡＰ１０−５(配列番号３３)として命名され、ヒトＡＫＡＰ１０タンパク質(配列番号３２)のアミノ酸配列のアミノ酸６４６位でバリンとイソロイシンとの置換を生じる。
【０２３６】
健康体ドナー集団におけるＡＫＡＰ１０−５のＰＣＲ増幅およびＢｉｏｍａｓｓＰＲＯＢＥアッセイ検出
年齢により層化される健康体集団は、高齢の集団と比べ若齢の集団において対立遺伝子頻度の変化を検出し得ることにより、病的状態随伴遺伝子用の非常に有効でユニバーサルなスクリーニングツールである。この健康体集団ベースの各サンプルは、更にスループットを増加させるためプールすることができる。
【０２３７】
健康体サンプルは、San Bernardino, CAの血液バンクを通じて得た。血液ドナーの両親は、白人起源であった。事実上、ヒトであるとき、健康対象体は、一般的集団における結果としての使用のため血液が提供される血液バンクの基準を有するヒトドナーとして定義される。これらの基準は、以下の通りである：検出可能なウイルス、細菌、マイコプラズマ、および寄生体感染がないこと；貧血症でないこと；および次いで更に病歴に関する質問表に基づき選択する(図３参照)。そのため、健康体集団は、血液バンク基準に従い血液が提供された充分に健康の先入観のない集団を示し、更に任意の疾患の状態に関して選択されることはない。典型的にその個体は、任意の薬物療法を受けていない。
【０２３８】
ＰＣＲプライマーは、ＯＰＥＲＯＮによりホスホラミダイト化学を用いて合成した。ＡＫＡＰ１０標的配列の増幅は、ＰＣＲ反応物５０μｌにおいて、プールしたヒトゲノムＤＮＡ１００ｎｇ−１μｇを伴う単一のＰＣＲ反応物５０μｌ中で行った。プールしたサンプル内の各ＤＮＡ濃度は、最終濃度１−２５ｎｇの範囲の等濃度で存在した。各反応物は、１×ＰＣＲ緩衝液(Qiagen, Valencia, CA)、２００μＭ ｄＮＴＰ、１Ｕ Hotstar Ｔａｑポリメラーゼ(Qiagen, Valencia, CA)、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、ならびにユニバーサルプライマー配列および標的特異的配列5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGGAGCTAGCTTGGAAGATTGC-3'(配列番号４１)を含む２５ｐｍｏｌのフォワードプライマー、および２ｐｍｏｌリバースプライマー5'-GTCCAATATATGCAAACAGTTG-3'(配列番号５４)、ならびにＰＣＲアンプリコンＢＩＯの５’末端に相補的なビオチニル化ユニバーサルプライマー１０ｐｍｏｌ：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'(配列番号４３)を含む。特異的フォワードおよびリバースプライマーを用いる標的の最初のラウンドの増幅の後、次いで、５’ビオチニル化ユニバーサルプライマーをハイブリダイズさせ、フォワードプライマーとして作用させ、それにより、５’ビオチン捕捉部分を当該分子中に導入した。当該増幅プロトコールは、５’−ビオチニル化二本鎖ＤＮＡアンプリコン中で生じ、遺伝子型決定に用いる５’ビオチン標識各フォワードプライマーの必要性を除くことによるハイスル−プット遺伝子型決定の費用を劇的に減少する。
【０２３９】
サーマルサイクリングは、０．２ｍＬチューブまたは９６ウェルプレート中で、MJ Research Thermal Cycler(算出温度)を用い、以下のパラメーターで行った：９４℃５分間；４５サイクル：９４℃２０秒、５６℃３０秒、７２℃６０秒；７２℃３分間。
【０２４０】
ＤＮＡの固定化
ＰＣＲ反応物５０μｌを、事前に３回洗浄し１Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、０．０６Ｍ ＮＨ４ＯＨ中に再懸濁したストレプトアビジン被覆磁性ビーズ(Dynal, Oslo, Norway)２５μｌに加えた。二本鎖ＰＣＲアンプリコンの一本鎖の５’末端は、室温で１５分間でビーズに結合し得る。次いで、当該ビーズを、磁石を用い回収し、非結合ＤＮＡを含む上清を取り除いた。ハイブリダイズしているが非結合の鎖は、１００ｍＭ ＮａＯＨ中でインキュベーションし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０でビーズを３回洗浄することにより二本鎖アンプリコンから解放した。
【０２４１】
ＢｉｏｍａｓｓＰＲＯＢＥ(商標)アッセイを用いるＡＫＡＰ１０−５の検出
ＡＫＡＰ１０−５(配列番号３３)のドナー集団のプライマー伸張分析(米国特許番号６，０４３，０３１)のＢｉｏｍａｓｓＰＲＯＢＥ(商標)アッセイを用いた。これらの方法を用いる遺伝子型決定は、２６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５、６．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ｄＴＴＰおよび５０ｍＭ 各ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、２．５Ｕ 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ(Amersham)ならびに鋳型特異的オリゴヌクレオチドＰＲＯＢＥプライマー5'-ACTGAGCCTG CTGCATAA-3'(配列番号４４)(Operon)にＤＮＡ被覆磁性ビーズを再懸濁することにより行った。プライマー伸張は、ハイブリダイゼーションおよび伸張を伴うオリゴヌクレオチドプライマーの３サイクルで生じる。当該伸張産物は、５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌで鋳型から変性させ、各サンプル１５０ｎＬを、Ｈ３ＰＡマトリックス物質１５０ｎｌで事前負荷したシリコンチップへ移した後、分析した。当該サンプル物質を結晶化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Bruker, PerSeptive)で分析した。当該プライマーは、質量５４８３．６ダルトンを有する。ＳＮＰはプライマーにｄｄＣを付加し、質量５７５６．８ダルトンの伸張産物を得た。当該野生型は、プライマーへＴおよびｄｄＧを付加し、質量６１０１ダルトンを得る。
【０２４２】
ＳＮＰの頻度は、年齢で選択した健康個体の集団で測定した。年齢４０歳未満の七百十三(７１３)個体(３６０女性、３５３男性)および６０歳を超える年齢の７０３個体(３２２女性、３８１男性)を、ＳＮＰ、ＡＫＡＰ１０−５(配列番号３３)の存在下、試験した。結果を以下の表１に示す。
【表８】
2004158005.tif 000016
【表９】
2004158005.tif 000017
【０２４３】
図２０は、年齢および性別で分類された白人集団における対立遺伝子および遺伝子型の分布の結果を描写的に示す。
【０２４４】
病的状態マーカー３：ヒトメチオニンスルホキシドレダクターゼＡ(ｍｓｒＡ)
両性および集団全体におけるこのマーカーの年齢関連の対立遺伝子および遺伝子型の頻度を図２１に示す。高齢の男性集団におけるホモ接合ＣＣ遺伝子型の減少は、高度に有意である。
【０２４５】
メチオニンスルホキシドレダクターゼＡ(＃６３３０６)
ヒト健康体ドナー集団におけるヒトメチオニンスルホキシドレダクターゼＡ(ｈ−ｍｓｒ−Ａ)のＰＣＲ増幅およびＢｉｏｍａｓｓＰＲＯＢＥアッセイ検出
ｈ−ｍｓｒ−Ａのドナー集団のＰＣＲ増幅
ＰＣＲプライマーは、ＯＰＥＲＯＮにより、ホスホラミダイト化学を用い合成した。ＡＫＡＰ１０標的配列の増幅は、ＰＣＲ反応物５０μｌ中に、プールしたヒトゲノムＤＮＡ鋳型１００ｎｇ−１μｇを有する単一のＰＣＲ反応物５０μｌ中で行った。プールしたサンプル内の各ＤＮＡ濃度は、最終濃度１−２５ｎｇの範囲の等濃度で存在した。各反応物は、１×ＰＣＲ緩衝液(Qiagen, Valencia, CA)、２００μＭ ｄＮＴＰ、１Ｕ Hotstar Ｔａｑポリメラーゼ(Qiagen, Valencia, CA)、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、ならびにユニバーサルプライマー配列および標的特異的配列5'-TTTCTCTGCACAGAGAGGGC-3'(配列番号４９)を含む２５ｐｍｏｌのフォワードプライマー、および２ｐｍｏｌリバースプライマー5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGGCTGAAATCCTTCGCTTTACC-3'(配列番号５０)、ならびにＰＣＲアンプリコンの５’末端に相補的なビオチニル化ユニバーサルプライマー１０ｐｍｏｌ 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'(配列番号５１)を含む。特異的フォワードおよびリバースプライマーを用いる標的の最初のラウンドの増幅の後、次いで、５’ビオチニル化ユニバーサルプライマーをハイブリダイズさせ、リバースプライマーとして作用させ、それにより、３’ビオチン捕捉部分を当該分子中に導入した。当該増幅プロトコールは、５’−ビオチニル化二本鎖ＤＮＡアンプリコンを生じ、遺伝子型決定に用いる５’ビオチン標識各フォワードプライマーの必要性を除くことによってハイスル−プット遺伝子型決定の費用を劇的に減少する。サーマルサイクリングは、０．２ｍＬチューブまたは９６ウェルプレート中で、MJ Research Thermal Cycler(算出温度)を用い、以下のサイクリングパラメーターで行った：９４℃５分間；４５サイクル：９４℃２０秒、５６℃３０秒、７２℃６０秒；７２℃３分間。
【０２４６】
ＤＮＡの固定化
ＰＣＲ反応物５０μｌを、事前に３回洗浄し１Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、０．０６Ｍ ＮＨ４ＯＨ中に再懸濁したストレプトアビジン被覆磁性ビーズ(Dynal)２５μｌに加えた。ＰＣＲアンプリコンは、室温で１５分間でビーズに結合し得る。次いで、当該ビーズを、磁石を用い回収し、非結合ＤＮＡを含む上清を取り除いた。非結合鎖は、１００ｍＭ ＮａＯＨ中でインキュベーションし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０でビーズを３回洗浄することにより二本鎖アンプリコンから解放した。
【０２４７】
ｈ−ｍｓｒ−Ａのドナー集団のＢｉｏｍａｓｓＰＲＯＢＥアッセイ分析
ＢｉｏｍａｓｓＰＲＯＢＥアッセイ法を用いる遺伝子型決定は、２６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５、６．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ｄＴＴＰおよび５０ｍＭ 各ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、２．５Ｕ 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ(Amersham)ならびに２０ｐｍｏｌの鋳型特異的オリゴヌクレオチドＰＲＯＢＥプライマー5'-CTGAAAAGGGAGAGAAAG-3'(Operon)(配列番号５２)にＤＮＡ被覆磁性ビーズを再懸濁することにより行った。プライマー伸張は、ハイブリダイゼーションおよび伸張を伴うオリゴヌクレオチドプライマーの３サイクルで生じる。当該伸張産物は、５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌで鋳型から変性させ、各サンプル１５０ｎｌを、Ｈ３ＰＡマトリックス物質１５０ｎｌで事前負荷したシリコンチップへ移した後、分析した。当該サンプル物質を結晶化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Bruker, PerSeptive)で分析した。ＳＮＰは、２つのＥＳＴの配列におけるＴからＣへの変化として示される。野生型は、野生型ヒトｍｓｒＡ遺伝子(配列番号３９)の一部であるＥＳＴのヌクレオチド配列を示す、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＷ１９５１０４の１２８位にＴを有することにより示される。ＳＮＰは、ヒトｍｓｒＡ遺伝子(配列番号４０)の対立遺伝子の一部であるＥＳＴのヌクレオチド配列を示す、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＷ８７４１８７の１２９位のＣとして示される。
【０２４８】
ゲノム配列において、ＳＮＰは、ＡからＧへの変化として示される。ＢｉｏＭａｓｓプローブ反応で使用するプライマーは、質量５６５４．８ダルトンを有していた。ＳＮＰの存在下、当該プライマーは、ｄｄＣの組込みにより伸張し、質量５９２８を有する。野生型の存在下、当該プライマーは、ｄＴおよびＤＤＣの添加により伸張し、質量６２３２．１ダルトンを生ずる。
【０２４９】
ＳＮＰの頻度は、年齢で選択した健康個体の集団で測定した。年齢１８−３９歳の五百五十二(５５２)個体(２７６女性、２７６男性)および年齢６０−７９の５５２個体(年齢６０−６９では１８４女性、年齢６０−７９では３６８男性)を、ｈ−ｍｓｒ−Ａの非翻訳３’領域中に局在する多型の存在に関し試験した。
【０２５０】
健康体個体間の男性年齢群の遺伝子型の相違が有意であった。男性集団の場合、対立遺伝子有意性は、ｐ＝０．０００９および遺伝子型有意性はｐ＝０．００３である。両性および集団全体における、このマーカーの年齢関連の対立遺伝子および遺伝子型の頻度を図２１に示す。高齢の男性集団におけるホモ接合ＣＣ遺伝子型の減少は、非常に有意である。
【０２５１】
多型は、ヒトメチオニンスルホキシドレダクターゼＡ(ｈ−ｍｓｒ−Ａ)をコードする遺伝子の非翻訳３’−領域中に局在する。当該正確な局在は、ストップコドン(ＴＡＡ)の４５１塩基対下流である。このＳＮＰは、コーディングまたはプロモーターの領域よりも上流の他の多型と共に連鎖不平衡(ＬＤ)となるようであり；そのため、直接病的状態の原因とはならない。酵素メチオニンスルホキシドレダクターゼは、複数の生物学的機能を示すことが提唱されている。酸化性タンパク質損傷の修復ばかりでなく、生物学的機能の活性化または不活性化によるタンパク質の制御においてまた重要な役割をする(Moskovitz et al. (1990) PNAS 95: 14071-14075)。その活性が、アルツハイマー患者の脳組織において有意に減少することもまた示された(Gabbita et al. (1999) J. Neurochem 73: 1660-1666)。反応性酸素種の代謝に含まれるタンパク質が疾患に関係すると、科学的に考えられる。
【０２５２】
結論
健康体集団の使用は、病的状態マーカーの同定を提供する。Ｇ−プロテイン結合シグナリング形質導入経路にまたは酸化ストレスの緩和に含まれるタンパク質の同定は、説得力のある結果であると考えられる。ヒトプロテインキナーゼＡアンカータンパク質をコードする遺伝子においてin silicoで既に同定されている他の可能性ある多型の更なる確認および検証は、病的状態に強力に付随し、この遺伝子産物は、適当な医薬的または診断的標的であることを証明する。
【０２５３】
実施例４
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法分析
以下に挙げた酵素アッセイの産物のすべてをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により分析した。水で２．５倍に希釈された１：１ 水：アセトニトリル中の１０：１ ３−ヒドロキシピコリン酸：クエン酸アンモニウムを含む希釈マトリックス溶液(０．１５μＬ)は、ＳｐｅｃｔｒｏＣｈｉｐ(Sequenom, Inc.)にピペッティングし、結晶化することができた。次いで、サンプル０．１５μｌを加えた。陽性イオンモードで操作する、直線状のPerSeptive Voyager DEマススペクトロメーターまたはBruker Biflex ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメーターを測定に使用した。当該サンプルプレートを各ＵＶレーザーショット(合計約２５０レーザーショット)後は４００ｎｍの１８．２ｋＶで維持し、次いで、標的ボルト数を２０ｋＶに上昇させた。オリジナルのスペクトルは、５００ＭＨｚでデジタル化した。
【０２５４】
実施例５
サンプルコンディショニング
以下の実施例に示す場合、酵素消化物の産物は、ZipTip(Millipore, Bedford, MA)で精製した。ZipTipは、５０％アセトニトリル１０μｌで事前に濡らしておき、０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ１０μｌで４回平衡化した。オリゴヌクレオチドフラグメントを、連続的アスピレーションおよび各サンプルをZipTipに分配することにより、Ｃ１８に結合させた。各消化オリゴヌクレオチドを、０．１Ｍ ＴＥＡＡｃ１０μｌで洗浄し、その後、Ｈ２Ｏ１０μＬで４回洗浄ステップを行うことによりコンディショニングした。ＤＮＡフラグメントは、５０％アセトニトリル７μＬを用いZipTipから溶出させた。
【０２５５】
当該サンプルのコンディションの任意の方法を用い得る。一般的にピーク分解の増大に使用するコンディショニングの方法が、既知である(例えば、国際特許出願番号WO98/20019参照)。
【０２５６】
実施例６
ＤＮＡグリコシラーゼ仲介配列分析
ＤＮＡグリコシラーゼは、特異的核酸塩基がＤＮＡ中に存在する各位置においてＤＮＡを修飾し、それにより、脱塩基部位を生ずる。他の酵素、化学、または熱によるその後の反応において、脱塩基部位のリン酸バックボーンが切断され得る。
【０２５７】
以下の手順に従い利用されるグリコシラーゼは、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ(ＵＤＧ)であった。ウラシル塩基は、ウラシルの存在下ＤＮＡ標的配列を増幅することによりチミン塩基が通常占める各位置においてＤＮＡフラグメント中に組込まれた。各ウラシル置換ＤＮＡアンプリコンは、アンプリコン中の各ウラシル塩基を切断するＵＤＧと共にインキュベーションし、次いでＤＮＡフラグメントを生ずる各脱塩基部位でバックボーン切断に効果的なコンディションにした。ＤＮＡフラグメントをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法分析した。次いで、標的ＤＮＡの遺伝的変異性をマススペクトルを分析することにより評価した。
【０２５８】
本明細書に記載のように、ヌクレオチド類似体または修飾ヌクレオチドに特異的なグリコシラーゼが以下の手順でＵＤＧで置換され得る。下記のグリコシラーゼ法は、リン酸バックボーン切断およびＭＡＬＤＩと共に用いられ、ＳＮＰスキャンニング、細菌型別化、メチル化分析、マイクロサテライト分析、遺伝子型決定、およびヌクレオチド配列決定および再配列決定の目的でＤＮＡフラグメントを分析し得る。
【０２５９】
Ａ．遺伝子型決定
グリコシラーゼ手順を用い、ＵＣＰ−２(非結合タンパク質２)をコードするＤＮＡ配列を遺伝子型決定した。ＵＣＰ−２の配列は、受け例番号ＡＦ０９６２８９でＧｅｎＢａｎｋに登録されいてる。以下の手順で遺伝子型決定した配列の変化は、ヌクレオチド４７９０位におけるシトシン(Ｃ−対立遺伝子)からチミン(Ｔ−対立遺伝子)への変化であり、その結果、ＵＣＰ−２ポリペプチドの５５位においてアラニンからバリンへの変異を生ずる。
【０２６０】
ＤＮＡは、配列5'-TGCTTATCCCTGTAGCTACCCTGTCTTGGCCTTGCAGATCCAA-3'(配列番号９１)を有する５ｐｍｏｌビオチニル化プライマー、配列5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGCCATCACACCGCGGTACTG-3'(配列番号９２)を有する１５ｐｍｏｌ非ビオチニル化プライマー、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣＴＰ、２００μＭ ｄＧＴＰ、６００μＭ ｄＵＴＰ(完全にｄＴＴＰに置換され得る)、１．５ｍＭから３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１Ｕ Hotstar Ｔａｑポリメラーゼ、およびＣＥＰＨ ＤＮＡ２５ｎｇを含む反応体積５０μＬにＰＣＲ手順を用い増幅した。増幅は、アニーリング温度５６℃で４５サイクル行った。
【０２６１】
次いで、増幅産物は、事前に洗浄したDynabeads５μＬを伴う増幅反応物５０μＬを室温で２０分間インキュベーションすることにより、固体支持体に固定化した。上清を取り除き、ビーズを０．１Ｍ ＮａＯＨ５０μｌと共に室温５分間インキュベーションし、一本鎖ＤＮＡをビーズに連結させた方法で二本鎖ＰＣＲ産物を変性させた。次いで、当該ビーズを１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ(ｐＨ８)５０μＬで３回洗浄することにより中性化した。当該ビーズを６０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ７．９)溶液中で再懸濁し、１Ｕ ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを３７℃で４５分間、当該溶液に加え、ビーズに連結する一本鎖ＤＮＡ中に存在するウラシルヌクレオチドを取り除いた。次いで、当該ビーズを、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ(ｐＨ８)２５μＬで２回洗浄し、水１０μＬで１回洗浄した。次いで、ビオチン化鎖を、６０℃で１０分間、２Ｍ ＮＨ４ＯＨ１２μｌでビーズから溶出した。ＤＮＡのバックボーンを、９５℃１０分間、サンプルをインキュベーションすることにより(密閉のふたと共に)、切断し、アンモニアを、サンプルを８０℃で１１分間インキュベーションすることによりサンプルから蒸発させた。
【０２６２】
次いで、切断フラグメントを、実施例４に記載のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法より分析した。Ｔ対立遺伝子は、３２５４ダルトンの特有フラグメントを生じた。Ｃ対立遺伝子は、４７８８ダルトンの特有フラグメントを生じた。これらのフラグメントは、マススペクトルで識別可能であった。そのため、上記同定手順は、ＵＣＰ−２中のＣ対立遺伝子およびＴ対立遺伝子にヘテロ接合の個体の遺伝子型決定に成功的に利用できた。
【０２６３】
Ｂ．プールしたＤＮＡサンプルを用いるグリコシラーゼ分析
グリコシラーゼアッセイを、プールしたサンプルを用い構成し、ＵＣＰ−２遺伝子配座の遺伝的多様性を検出した。既知遺伝子型のＤＮＡを１１個体からプールし、固定濃度の５ｎｇ／μＬに希釈した。実施例３Ａで提供された手順は、配列5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGTCTTGGCCTTGCAGATCCAAG-3'(配列番号９３)を有するフォワードプライマー２ｐｍｏｌおよび配列5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGCCATCACACCGCGGTACTG-3'(配列番号９４)を有するリバースプライマー１５ｐｍｏｌを用いることができた。加えて、配列5'bioCCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'(配列番号９７)を有するビオチニル化プライマー５ｐｍｏｌを、約２サイクル後にＰＣＲ反応物に導入し得る。当該フラグメントは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法(実施例４)で分析した。実施例３Ａで測定したように、３２５４ダルトンの特有のフラグメントを生じるＴ対立遺伝子は、マススペクトルで、４７８８ダルトンの特有のフラグメントを生じるＣ対立遺伝子と区別し得る。プールしたサンプルの対立遺伝子頻度は、対立遺伝子フラグメントに相当する各シグナルの下の領域を積算することにより定量された。積算は、当業者に既知の等式を用い手計算で行った。１１サンプルのプールにおいて、この手順は、４０．９％の個体がＴ対立遺伝子を保有し、５９．０９％の個体がＣ対立遺伝子を保有することを提唱した。
【０２６４】
Ｃ．グリコシラーゼ仲介マイクロサテライト分析
グリコシラーゼ手順を用い、Bradykinin Receptor 2(ＢＫＲ−２)配列のマイクロサテライトを同定した。ＢＫＲ−２の配列は、受け入れ番号Ｘ８６１７３でＧｅｎＢａｎｋに登録されている。ＢＫＲ−２は、プロモーター領域にＣからＴへの変化のＳＮＰを含み、そして繰り返し単位中にＧからＴへの変化のＳＮＰを含む。実施例３Ａで提供された当該手順を用い、プロモーター領域中のＳＮＰ、マイクロサテライト繰り返し単位領域中のＳＮＰ、およびＢＫＲ−２のマイクロサテライト領域の繰り返し単位の数を同定した。特に配列5'-CTCCAGCTGGGCAGGAGTGC-3'(配列番号９５)を有するフォワードＰＣＲプライマーおよび配列5'-CACTTCAGTCGCTCCCT-3'(配列番号９６)を有するリバースプライマーを用い、ウラシル存在下、ＢＫＲ−２ＤＮＡを増幅した。当該アンプリコンは、ＵＤＧによりフラグメント化し、その後、バックボーン切断した。当該切断フラグメントは実施例４で記載のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により分析した。
【０２６５】
ＣからＴへの変化を有するＢＫＲ−２プロモーター領域中のＳＮＰに関し、Ｃ対立遺伝子は、質量７３４２．４ダルトンを有する特有のフラグメントを生じ、Ｔ対立遺伝子は、質量７０５３．２ダルトンを有する特有のフラグメントを生じた。これらフラグメントは、マススペクトルで区別できた。そのため、上記特定した手順は、ＢＫＲ−２のプロモーター領域中のＣ対立遺伝子およびＴ対立遺伝子についてヘテロ接合の個体を遺伝子型決定するため成功的に利用できた。
【０２６６】
ＧからＴへの変化を有するＢＫＲ−２の繰り返し領域中のＳＮＰに関し、Ｔ対立遺伝子は、質量１７８４ダルトンを有する特有のフラグメントを生じ、それは、容易にマススペクトルで検出できた。それゆえ、Ｔ対立遺伝子の存在は、ＢＫＲ−２の繰り返し領域中のＧからＴへの配列変化を示唆した。
【０２６７】
加えて、繰り返し領域の数は、ＢＫＲ−２中に、２つの繰り返し配列を有する個体と３つの繰り返し配列を有する個体とを区別できた。これら個体のＤＮＡは、各繰り返し配列がＳＮＰ遺伝子配座でＧを含んでいるため、繰り返し配列中のＧからＴへの配列変化を保持していなかった。繰り返し領域の数は、質量２７７１．６ダルトンを有する特有のＤＮＡフラグメントに相当するシグナルの下の面積を算出することにより、個々のサンプルで決定された。２つの繰り返し領域を有する個体から生ずるスペクトルにおけるこのシグナルは、３つの繰り返し領域を有する個体から生ずるスペクトル中の同じシグナルの下の面積の３３％未満の領域である、領域を有していた。そのため、上記考察の手順を用い、ＢＫＲ−２中に存在する繰り返し領域の数について個体の遺伝子型決定することができた。
【０２６８】
Ｄ．グリコシラーゼ消化と合わせたバイサルファイト
ゲノムＤＮＡのバイサルファイト処置を用い、ＤＮＡ内のメチル化シトシン残基の位置を分析することができる。バイサルファイトによる核酸処置により、シトシン残基をウラシル残基にジアミノ化し、その一方、メチル化シトシンは修飾しないままである。そのため、バイサルファイトで処置していないゲノムＤＮＡから生ずるＰＣＲ産物の配列を、バイサルファイトで処置するゲノムＤＮＡから生じたＰＣＲ産物の配列と比較することにより、核酸中およびシトシンがメチル化されている位置におけるメチル化の程度を推測することができる。
【０２６９】
ゲノムＤＮＡ(２μｇ)を、制限酵素１μＬで３７℃２時間インキュベーションすることにより消化した。３Ｍ ＮａＯＨのアリコートを添加し、消化溶液中、最終濃度０．３Ｍ ＮａＯＨを得た。当該反応物を３７℃１５分間インキュベーションし、その後、５．３５Ｍ 尿素、４．４４Ｍ バイサルファイトおよび１０ｍＭ ヒドロキノリンで処置し、この場合、ヒドロキノリンの最終濃度は０．５ｍＭであった。
【０２７０】
バイサルファイト(サンプルＡ)で処置したサンプルを、バイサルファイト処置(サンプルＢ)していない同じ消化サンプルと比較した。サンプルＡを上記のようにバイサルファイトで処置した後、サンプルＡおよびサンプルＢを標準的なＰＣＲ手順により増幅した。当該ＰＣＲ手順には、各サンプルをミネラルオイルで覆い、当該サンプルをサーマルサイクリング(５５℃１５分間、その後、９５℃３０秒間の２０サイクル)するステップを含む。当該ＰＣＲ反応物には、４つのヌクレオチド塩基、Ｃ、Ａ、Ｇ、およびＵを含む。当該ミネラルオイルを各サンプルから取り除き、ＰＣＲ産物をガラスミルクで精製した。ヨウ化ナトリウム(３体積)およびガラスミルク(５μＬ)をサンプルＡおよびサンプルＢに添加した。次いで、当該サンプルを氷上に８分間置き、冷緩衝液４２０μＬで洗浄し、１０秒間遠心分離し、上清画分を取り除いた。この方法を２回繰り返し、次いで、水２５μＬを添加した。サンプルを３７℃５分間インキュベーションし、２０秒間遠心分離し、上清画分を回収し、そしてこのインキュベーション／遠心分離／上清画分回収の手順を繰り返した。次いで、０．１Ｍ ＮａＯＨ５０μＬを当該サンプルに添加し、ＤＮＡを変性させた。当該サンプルを室温５分間インキュベーションし、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ(ｐＨ８)５０μＬで３回洗浄し、そして６０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．９ １０μＬ中に再懸濁した。
【０２７１】
次いで、サンプルＡおよびサンプルＢからのＰＣＲ産物の配列を２Ｕ ＵＤＧ(MBI Fermentas)で処理し、次いで、上記のようにバックボーンを切断した。各サンプルＡおよびサンプルＢから得られたフラグメントは実施例４に記載のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により分析した。サンプルＡは、サンプルＢから得られるフラグメントの数よりも多いフラグメントの数が生じ、これは、核酸が少なくとも１つのメチル化シトシン部分を保持することを示唆する。
【０２７２】
実施例７
Ｆｅｎリガーゼ仲介ハプロタイピング
ハプロタイピング手順により、個体の２つの相同性クロモソームの１つからフラグメントを選択し得、そしてそのフラグメントにおける連鎖したＳＮＰを遺伝子型決定し得る。ハプロタイプの直接決定により、情報コンテントを増加し、任意の連鎖疾患遺伝子の診断を改善し、またはこれら疾患の関連を同定することができる。従前の研究では、ハプロタイプは、典型的には、系統分析(系統が利用可能である場合)を介して、困難で信頼性のない対立遺伝子特異的ＰＣＲを介して、または当分野に既知の単一分子希釈を介して、再構成された。
【０２７３】
ハプロタイピング手順を用い、ＤＮＡサンプル中の一本鎖に存在する、ＳＮＰ１およびＳＮＰ２と称せられる２つのＳＮＰの存在を決定した。ハプロタイピング手順を、Ｆｅｎ−１を利用するこのアッセイに使用し、ＤＮＡ“フラップ(flap)”を切断する部位特異的“フラップ”エンドヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドのオーバーラップにより作成した。この実施例の当該２つのオーバーラッピングオリゴヌクレオチドは、短アームおよび長アーム対立遺伝子特異的アダプターであった。標的ＤＮＡは、変性しＳＮＰ１およびＳＮＰ２を含む増幅核酸であった。
【０２７４】
短アームアダプターには、標的ＤＮＡには見られない特有の配列を含む。短アームアダプターの３'末端ヌクレオチドは、ＳＮＰ１対立遺伝子の１つと同一であった。更に、長アームアダプターには、２つの領域：短アームに相補的な３’領域およびＳＮＰに隣接する目的のフラグメントに相補的な５’遺伝子特異的領域を含む。アダプターとその相同体の１つとの間にマッチがあれば、Ｆｅｎ酵素は、認識し、オーバーラッピングフラップを切断する。次いで、当該アダプターの短アームを標的フラグメントの残り(ＳＮＰ部位を除く)にライゲーションした。このライゲーションしたフラグメントを、ライゲーションした相同体のみを増幅する第二のＰＣＲ反応のフォワードプライマーとして用いた。次いで、第二のＰＣＲ産物(ＰＣＲ２)を質量分析法で分析した。アダプターと標的ＤＮＡとの間にマッチがなければ、Ｆｅｎ−１によるオーバーラップまたは切断はなく、そのため、目的のＰＣＲ２は存在しない。
【０２７５】
目的配列中に１を超えるＳＮＰが存在するならば、第二のＳＮＰ(ＳＮＰ２)は、ＳＮＰ２に特異的なアダプターを用いることにより、および第一のＳＮＰを含むＰＣＲ２産物にアダプターをハイブリダイズさせることにより、発見できた。Ｆｅｎリガーゼおよび増幅手順は、第一のＳＮＰを含むＰＣＲ２産物で繰り返した。増幅産物が第二のＳＮＰを生ずるならば、ＳＮＰ１およびＳＮＰ２は同じフラグメントにあった。
【０２７６】
ＳＮＰが知られていないならば、４つの対立遺伝子特異的アダプター(例えば、Ｃ、Ｇ、ＡおよびＴ)を用い標的ＤＮＡとハイブリダイズさせることができる。次いで、基質を、増幅を含むＦｅｎリガーゼプロトコールで処理する。ＰＣＲ２産物を本明細書に記載のようにＰＲＯＢＥで分析し、どのアダプターがＤＮＡ標的にハイブリダイズするかを決定し、それにより、当該配列中のＳＮＰを同定し得る。
【０２７７】
Ｆｅｎリガーゼアッセイを用い、因子ＶＩＩ中に存在する２つのＳＮＰを検出した。これらのＳＮＰは、お互いから８１４塩基対離れて位置している。ＳＮＰ１は、８４０１位(ＣからＴへ)に位置し、ＳＮＰ２は、９２１５位(ＧからＡへ)に位置する(配列番号＃)
【０２７８】
Ａ．最初の増幅ステップ
ＰＣＲ産物(ＰＣＲ１)は、ＳＮＰの５'末端から僅かに離れたＳＮＰ１における既知ヘテロ接合個体として生じた。特に、ＰＣＲ反応物１０μＬは、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ 各ｄＮＴＰ、０．５Ｕ Hotstar ポリメラーゼ、配列5'-GCGCTCCTGTCGGTGCCA-3'(配列番号５６)を有するフォワードプライマー０．１μＭ、配列5'-GCCTGACTGGTGGGGCCC-3'(配列番号５７)を有するリバースプライマー０．１μＭ、およびゲノムＤＮＡ１ｎｇを混合することにより行った。アニーリング温度は５８℃であり、増幅処理により、長さが８６１であるフラグメントを得た。
【０２７９】
ＰＣＲ１反応混合物を半分に分け、１．０μＬ ＳＡＰおよび０．１μＬ エキソン１を含むエキソヌクレアーゼ１／ＳＡＰ混合物(０．２２μＬ混合物／５μＬ ＰＣＲ１反応物)で処理した。エキソヌクレアーゼ処理は、３７℃３０分間行い、次いで、８５℃２０分間行いＤＮＡを変性させた。
【０２８０】
Ｂ．アダプターオリゴヌクレオチド
アダプターあたり、１つの長および１つの短オリゴヌクレオチドを含む対立遺伝子特異的アダプター(ＣおよびＴ)の溶液を調製した。各アダプター(１０μＭ)の長アームおよび短アームオリゴヌクレオチドを、１：１の割合で混合し、９５℃３０秒間加熱した。当該温度を、アニーリングのため２℃の誤差で、３７℃に下げた。Ｃアダプターは、5'-CATGCATGCACGGTC-3'(配列番号５８)の短アーム配列および5'-CAGAGAGTACCCCTCGACCGTGCATGCATG-3'(配列番号５９)の長アーム配列を有する。これゆえ、アダプターの長アームは３０ｂｐ(１５ｂｐ遺伝子特異的)であり、短アームは１５ｂｐであった。Ｔアダプターは、5'-CATGCATGCACGGTT-3'(配列番号６０)の短アーム配列および5'-GTACGTACGTGCCAACTCCCCATGAGAGAC-3'(配列番号６１)の長アーム配列を有した。当該アダプターはまた、３から１０ヌクレオチド(配列番号１１８)を含むループにより短および長アームが分離されるヘアピン構造を有し得る。
【０２８１】
Ｃ．Ｆｅｎリガーゼ反応
２つのチューブに(サンプルあたりの各対立遺伝子特異的アダプターとして１チューブ)、１０ｍＭ １６％ＰＥＧ／５０ｍＭ ＭＯＰＳ３．５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １．２μｌ、１０×Ampligase緩衝液１．５μｌ、および２．５μｌＰＣＲ１を含む溶液(溶液Ａ)を入れた。溶液Ａを含む各チューブは、９５℃５分間インキュベーションし、ＰＣＲ１産物を変性させた。Ampligase(熱安定性リガーゼ、Epicentre Technologies)１．６５μｌ、２００ｎｇ／μｌ ＭＦＥＮ(Methanocuccus jannaschii由来)１．６５μｌおよび対立遺伝子特異的アダプター(ＣまたはＴ)３．０μｌを含む第二の溶液(溶液Ｂ)を調製した。溶液Ｂの種々の変化物、種々の対立遺伝子特異的アダプターを含む各変化物を作成した。溶液Ｂを９５℃で溶液Ａに添加し、５５℃３時間インキュベーションした。全反応物体積をアダプター特異的反応物あたり１５．０μｌとした。二対立遺伝子システム(bi-allelic system)では、２×１５．０μｌ反応物を必要とした。
【０２８２】
次いで、各チューブにおけるＦｅｎリガーゼ反応物を、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ８．０μｌを加えることにより不活性化した。次いで、エキソＩＩＩ／緩衝液(７０％／３０％)溶液１．０μｌを各サンプルに加え、３７℃３０分間、７０℃２０分間(エキソＩＩＩを不活性化)、および９５℃５分間(サンプルを変性させ、使用していないアダプターを鋳型から分離した)インキュベーションした。当該サンプルを氷スラリーで冷却し、長さ１００塩基対未満のすべてのフラグメントを取り除くUltraClean PCR Clean-up(MoBio)スピンカラムで精製した。当該フラグメントはＨ２Ｏ５０μｌで溶出した。
【０２８３】
Ｄ．第二の増幅ステップ
第二の増幅反応(ＰＣＲ２)を、各サンプルチューブにおいて、フォワードプライマーとして短アームアダプター(ＣまたはＴ)配列を用い(ＳＮＰ１部位を除く)、行った。ライゲーション相同体のみを増幅した。標準的ＰＣＲ反応物は、１×緩衝液(最終濃度)、１．５ｍＭ 最終濃度ＭｇＣｌ２、２００μＭ最終濃度ｄＮＴＰ、０．５Ｕ Hotstar ポリメラーゼ、０．１μＭ 最終濃度フォワードプライマー5'-CATGCATGCACGGT-3'(配列番号６２)、０．１μＭ 最終濃度リバースプライマー5'-GCCTGACTGGTGGGGCCC-3'(配列番号６３)、および精製ＦＥＮリガーゼ反応溶液１．０μｌを含む全体積１０．０μｌで行った。アニーリング温度は、５８℃であった。ＰＣＲ２産物を実施例４で示したようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で分析した。Ｆｅｎ ＳＮＰ１のマススペクトルは、質量６０８４．０８ダルトンであり、それは、Ｃ対立遺伝子を示している。
【０２８４】
Ｅ．付加ＳＮＰの遺伝子型決定
第二のＳＮＰ(ＳＮＰ２)は、ＳＮＰ２に特異的なアダプターを用いることにより、および第一のＳＮＰを含むＰＣＲ２産物にアダプターをハイブリダイズさせることにより、発見できる。Ｆｅｎリガーゼおよび増幅手順は、第一のＳＮＰを含むＰＣＲ２産物で繰り返す。増幅産物が第二のＳＮＰを生ずるならば、ＳＮＰ１およびＳＮＰ２は同じフラグメントにある。Ｔ対立遺伝子を示すＳＮＰ２のマススペクトルは質量６３５９．８８ダルトンであった。
【０２８５】
このアッセイはまた、プールしたＤＮＡで行い、本明細書で記載するようにハプロタイプ頻度を生ずることが可能である。Ｆｅｎリガーゼアッセイを用い、本明細書に記載のようにマルチプレックスを分析できる。
【０２８６】
実施例８
ニッカーゼ仲介配列分析
ＤＮＡニッカーゼまたはＤＮａｓｅを用い、ＤＮＡ二重らせんの一本鎖を認識し切断した。使用した２つのニッカーゼはＮＹ２ＡニッカーゼおよびＮＹＳ１ニッカーゼ(Megabase)であり、それらは以下の部位でＤＮＡを切断する：
【化８】
2004158005.tif 000018
【０２８７】
Ａ．ニッカーゼ消化
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(１０ｍＭ)、ＫＣｌ(１０ｍＭ、ｐＨ８．３)、酢酸マグネシウム(２５ｍＭ)、ＢＳＡ(１ｍｇ／ｍＬ)、および６Ｕ Ｃｖｉ ＮＹ２ＡまたはＣｖｉ ＮＹＳ１ニッカーゼ(Megabase Research)を、標準的ホスホラミダイト化学を用い合成される配列5'-CGCAGGGTTTCCTCGTCGCACTGGGCATGTG-3'(配列番号９０、Operon, Alameda, CA)を有する二本鎖オリゴヌクレオチド鋳型２５ｐｍｏｌに加えた。全体積２０μＬを用い、当該反応混合物を３７℃５時間インキュベーションし、当該消化産物を実施例５に記載するようにZipTip(Millipore, Bedford, MA)を用い精製した。当該サンプルを、実施例１に記載するようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で分析した。ニッカーゼＣｖｉ ＮＹ２Ａは質量４０４９．７６ダルトン、５４７３．１４ダルトンおよび９５４０．７１ダルトンの３つのフラグメントを生じた。Ｃｖｉ ＮＹＳ１ニッカーゼは質量２０６３．１８ダルトン、３０５６．４８ダルトン、６４９２．８１ダルトンおよび７４５０．１４ダルトンのフラグメントを生じた。
【０２８８】
Ｂ．プールしたサンプルのニッカーゼ消化
ＤＱＡ(HLA ClassII-DQ Alpha、予想フラグメントサイズ＝２２５ｂｐ)は、１００の健康個体のゲノムＤＮＡから増幅した。ＤＱＡは、標準的ＰＣＲ化学を用い、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ(ｐＨ８．３)、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ 各ｄＮＴＰ、配列5'-GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG-3'(配列番号６４)を有するフォワードプライマー１０ｐｍｏｌ、配列5'-CACGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTTG-3'(配列番号６５)を有するリバースプライマー１０ｐｍｏｌ、１Ｕ ＤＮＡポリメラーゼ(Stoffel fragment, Perkin Elmer)、およびヒトゲノムＤＮＡ(２ｎｇＤＮＡ／個体)２００ｎｇを含む全体積５０μｌを有する反応物中で増幅した。当該鋳型を９４℃５分間変性させた。サーマルサイクリングは、９４℃２０秒、５６℃３０秒、７２℃１分間の４５サイクルおよび７２℃３分間の最終伸張を含むタッチダウンプログラムで続けた。粗ＰＣＲ産物をその後のニッカーゼ反応に用いた。
【０２８９】
非精製ＰＣＲ産物をニッカーゼ消化した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(１０ｍＭ)、ＫＣｌ(１０ｍＭ、ｐＨ８．３)、酢酸マグネシウム(２５ｍＭ)、ＢＳＡ(１ｍｇ／ｍＬ)、および５Ｕ Ｃｖｉ ＮＹ２ＡまたはＣｖｉ ＮＹＳ１ニッカーゼ(Megabase Research)を、全反応物体積２０μＬを有する増幅鋳型２５ｐｍｏｌに加えた。次いで、当該反応混合物を３７℃５時間インキュベーションした。当該消化産物を実施例５に記載するようにZipTip(Millipore, Bedford, MA)を用い精製した。当該サンプルを、実施例４に記載するようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で分析した。また、このアッセイを用い、本明細書に記載のように、マルチプレックシングし、標準的遺伝子型決定を行い得る。
【０２９０】
ニッカーゼマススペクトルを単純化するため、２つの相補鎖は、捕捉プローブとして一本鎖非消化ＰＣＲ産物を用いた消化の後、分離することができる。このプローブ(以下の実施例８Ｃで示した調製物)を、２００ｍＭ クエン酸ナトリウムおよび１％ブロッキング剤(Boehringer Mannheim)を含むハイブリダイゼーション緩衝液中のニッカーゼフラグメントにハイブリダイズさせることができる。当該反応物を、thermal cycler(PTC-200 DNA engine, MJ Research, Waltham, MA)を用い９５℃５分間加熱し、３０分間を超えて室温で冷却する。捕捉プローブニッカーゼフラグメントをストレプトアビジン被覆磁性ビーズ１４０μｇ上に固定化した。その後、当該ビーズを７０ｍＭ クエン酸アンモニウムで３回洗浄する。捕捉一本鎖ニッカーゼフラグメントを、５０ｍＭ 水酸化アンモニウム ５μＬ中で８０℃５分間加熱することにより、溶出する。
【０２９１】
Ｃ．捕捉プローブの調製
捕捉プローブは、ＰＣＲ法を介し、ＧｅｎｅＡｍｐ １×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、各プライマー(フォワードプライマー5'-ACTGGGCATGTGGAGACAG-3'(配列番号６６))１０ｐｍｏｌおよびビオチニル化リバースプライマー bio5'-GCACTTTCTTGCCATGAG-3'(配列番号６７)、２Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、およびヒトゲノムＤＮＡ２００ｎｇを含む全体積５０μＬ中でヒトβ‐グロビン遺伝子を増幅することにより、調製する。当該鋳型は９４℃８分間で変性させる。サーマルサイクリングは、９４℃２０秒、６４℃３０秒、７２℃１分間の１１サイクルおよび７２℃５分間の最終伸張を含むタッチダウンプログラムで続けた。当該アンプリコンは、UltraClean(商標) PCR clean-upキット(MO Bio Laboratories, Solano Beach, CA)を用い精製する。
【０２９２】
実施例９
マルチプレックスＩＩＳ型ＳＮＰアッセイ
ＩＩＳ型アッセイを用い、既知ＳＮＰを有するヒト遺伝子配列を同定した。このアッセイ中で使用したＩＩＳ型酵素は、標的ＤＮＡを二本鎖切断するフォークＩであった。当該アッセイは、増幅のステップおよびアンプリコンのフォークＩ処理を含む。増幅ステップでは、フォークＩ認識配列がアンプリコンの５’および３’末端に組込まれるため、設計遺伝子標的の各ＰＣＲ産物が１００塩基未満となるように当該プライマーを設計した。そのため、フォークＩで切断されるフラグメントは、目的のＳＮＰを含む中央フラグメントを含んだ。
【０２９３】
既知ＳＮＰを有する１０のヒト遺伝子標的は、このアッセイにより分析された。１０の遺伝子標的、および標的領域の増幅に用いるプライマーの配列を表５に示す。１０の標的は、リポタンパク質リパーゼ、プロトロンビン、因子Ｖ、コレステロールエステル転移タンパク質(ＣＥＴＰ)、因子ＶＩＩ、因子ＸＩＩＩ、ＨＬＡ−Ｈエキソン２、ＨＬＡ−Ｈエキソン４、メチレンテトラヒドロフォレートレダクターゼ(ＭＴＨＲ)およびＰ５３エキソン４コドン７２であった。
【０２９４】
１０の遺伝子配列の増幅は、５ＰＣＲ反応チューブ中にヒトゲノムＤＮＡ鋳型２０ｎｇを有する単一の５０μＬ体積ＰＣＲ反応物中で行った。各反応バイアルは、１×ＰＣＲ緩衝液(Qiagen)、２００μＭ ｄＮＴＰ、１Ｕ Hotstar Ｔａｑポリメラーゼ(Qiagen)、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、および各プライマー１０ｐｍｏｌを含んでいた。5'TCAGTCACGACGTT3'(配列番号６８)の配列を有するＵＳ８、および5'CGGATAACAATTTC3'(配列番号６９)の配列を有するＵＳ９を、それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして使用した。更に、当該プライマーは、フォークＩ認識部位がアンプリコンの５'および３'末端に組込まれるように、設計した。サーマルサイクリングは、０．２ｍＬチューブまたは９６ウェルプレート中で、MJ Research Thermal Cycler(算出温度)を用い、以下のサイクリングパラメーターで行った：９４℃５分間；４５サイクル：９４℃２０秒、５６℃２０秒、７２℃６０秒；および７２℃３分間。
【０２９５】
ＰＣＲ後、当該サンプルを、０．２ＵエキソヌクレアーゼＩ(Amersham Pharmacia)およびＳアルカリホスファターゼ(Amersham Pharmacia)で処理し、組込まれていないプライマーおよびｄＮＴＰを取り除いた。典型的に、０．２ＵエキソヌクレアーゼＩおよびＳＡＰをＰＣＲサンプル５μＬに加えた。次いで、当該サンプルを３７℃１５分間インキュベーションした。次いで、エキソヌクレアーゼＩおよびＳＡＰを、８５℃までの温度で１５分間サンプルを加熱することにより、不活性化した。フォークＩ消化は、２Ｕ フォークＩ(New England Biolab)をＰＣＲサンプル５μＬに加えることにより、および３７℃３０分間インキュベーションすることにより、行った。フォークＩ制限酵素部位は、アンプリコンの両サイドに位置するため、５'および３'カットオフフラグメントはＳＮＰを含む中央フラグメントよりも大きい質量を有する。次いで、当該サンプルを陰イオン交換により精製し、実施例４に記載のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により分析した。このマルチプレックシング実験からの遺伝子フラグメントの質量を表６に挙げる。これら遺伝子フラグメントはマススペクトルで分解し、それにより、この遺伝子中の配列変化をマルチプレックシング分析し得る。
表５
マルチプレックシングＩＩＳ型アッセイの遺伝子
【表１０】
2004158005.tif 000019
【表１１】
2004158005.tif 000020
表６
ＩＩＳアッセイによる１０種のＳＮＰの分類分けのための中央フラグメントの質量
【表１２】
2004158005.tif 000021
【０２９６】
実施例１０
健康体データベースの層化のための親病歴パラメーターの典型的使用
健康体データベースを用い、年齢と対立遺伝子、特にホモ接合遺伝子型との間に強力な関係が見られることが判明した特定対立遺伝子(ＳＮＰ)と疾患状態とを関連させることができる。当該方法は、年齢に依存する関連性の同定に用いられる同じ健康体データベースを用いることを含むが、層化は、両親が患っている通常疾患(ドナーの家族性の病歴)に関するドナーにより提供される情報に基づく。ドナーが両親の健康状態に関し得られる３つの可能性ある答えがある：全く影響はない、一方の影響を受ける、または両方の影響を受ける。ドナーの両親が臨床的疾患の表現型が見られるぐらいにまで加齢していなければならないため、疾患に依存して、特定の最小年齢を超えるドナーのみを用いる。これらの各群の遺伝子型頻度が決定され、互いに比較される。ドナーのマーカーが疾患と関連すれば、ヘテロ接合遺伝子型の頻度は増大する。ホモ接合遺伝子型の頻度は、健康体集団において表示不足（underrepresented）が有意であるため、増大しない。
【０２９７】
実施例１１
生物学的サンプルを同定する方法および装置
詳細
本発明に従い、生物学的サンプルを同定する方法および装置を提供する。ここで、図２４について言及すると、生物学的サンプルを同定する装置１０を開示する。生物学的サンプルを同定する装置１０は、一般的に、コンピューティング装置２０に伝達するマススペクトロメーター１５を含む。好ましい実施態様では、マススペクトロメーターは、Bruker-Franzen Analytik GmbHにより製造されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメーターであり得る；しかし、他のマススペクトロメーターが置換され得ることが認識される。コンピューティング装置２０は、好ましくは汎用コンピューティング装置である。しかし、コンピューティング装置は、他に形成され得、例えば、マススペクトロメーターに組込まれ得るか、または巨大なネットワークシステム中のコンピューターの一部であり得ることが認識される。
【０２９８】
生物学的サンプルを同定するための装置１０は、マススペクトロメーター１５の受入エリア３１にサンプルプレート２９を送達するよう形成したロボットアーム２７を有するロボット２５を有する自動化同定システムとして操作し得る。その形式では、同定されるサンプルをプレート２９に置き、それは自動的にマススペクトロメーター１５中へと受け取られる。次いで、生物学的サンプルをマススペクトロメーター中で処理し、生物学的サンプル中でＤＮＡフラグメントの質量を示すデータを得る。このデータをコンピューティング装置２０に直接送るか、またはマススペクトロメーター内で行われるプレプロセッシングまたはフィルタリングをし得る。好ましい実施態様では、マススペクトロメーター１５は、未プロセッシングおよび未フィルタリングの質量分析法データをコンピューティング装置２０に伝達する。しかし、コンピューティング装置での分析を、マススペクトロメーター内で行われるプレプロセッシングまたはフィルタリングに対応するように調節し得ることが認識される。
【０２９９】
ここで、図２５について言及すると、生物学的サンプルを同定するための一般的方法３５を示す。方法３５では、データは、ブロック４０中の試験装置からコンピューティング装置中へ受け取られる。好ましくは、当該データは、未処理、未プロセスおよび未フィルターの形態で受け取られるが、他に、適用される幾つかの形態のフィルタリングまたはプロセッシングであり得る。好ましい実施対応の試験装置は、上記のようなマススペクトロメーターである。しかし、他の試験装置がマススペクトロメーターと置換されることが認識される。
【０３００】
試験装置により生ずるデータ、および特にマススペクトロメーターは、生物学的サンプルの同定を示す情報を含む。より特に、当該データは、生物学的サンプルのＤＮＡ組成物を示す。典型的に、ＤＮＡ増幅技術から得られたＤＮＡサンプルから集められた質量分析法データは、例えば、典型的なタンパク質サンプル由来のものよりもノイズが多い。これは、タンパク質サンプルがより容易により多量に調製されること、およびタンパク質サンプルはＤＮＡサンプルと比較してより容易にイオン化することに一部起因する。従って、通常のマススペクトロメーターデータ分析技術は、一般的に、生物学的サンプルのＤＮＡ分析に効果的ではない。ＤＮＡ組成物データがより容易に識別できるように分析能を改善するため、好ましい実施態様は、ＤＮＡ質量分析法データを分析するためのウェーブレット技術を用いる。ウェーブレットは、シグナルプロセッシング、数値解析、および数学的モデリングのための分析ツールである。ウェーブレット技術は、データセットに適用される基本的な拡張機能を提供する。ウェーブレット分解を用い、当該データセットを同時に時間および頻度の範囲内で分析し得る。ウェーブレット変換は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＤＮＡデータのような複雑な時間(質量)および頻度の領域を示すデータの分析における選択の技術である。本明細書で述べるようなウェーブレット変換は、通常のフーリエ分析技術との比較として優れたノイズ除去性を有する。ウェーブレット変換は、ＤＮＡサンプルの固有のノイズＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルのインタープリティングに特に効果的であることが証明された。ウェーブレットの使用では、“小さな波”または“スケーリング関数”を用いステージにデータセットを変換し、各ステージはデータセット中の頻度コンポーネントを示す。ウェーブレット変換を用い、質量分析法データをプロセスし、フィルターし、および生物学的サンプルのＤＮＡ組成物の同定に有用な有意な識別で分析し得る。
【０３０１】
再び、図２５について言及すると、ブロック４０で受け取るデータは、ブロック４５でノイズ除去される。次いで、ノイズが除去されたデータは、ブロック５０で適用されるベースライン補正を有する。ベースライン補正は、試験装置、特にマススペクトロメーター装置から来るデータとして一般的に必要であり、一般的に、指数的減衰手法で配列されるデータを有する。この一般的な指数的減衰配列は、生物学的サンプルの組成物には起因しないが、試験装置の物理的性質および特性の結果であり、他の化学物質には、ＤＮＡサンプル調製物が含まれる。従って、ベースライン補正は、実質的にデータを校正し、試験システムに帰するデータ、およびサンプル調製物特性のコンポーネントを取り除く。
【０３０２】
ブロック４５でノイズ除去し、ブロック５０でベースライン補正した後、シグナルは残存し、生物学的サンプルの組成物を一般的に示す。しかし、生物学的サンプルのＤＮＡ組成物の分析に必要とされる通常以上の識別のため、当該組成物は、ノイズ除去化および校正化シグナルからは容易には明白とはならない。例えば、シグナルはピーク領域を含み得るが、これらの“推定”ピークが実際にＤＮＡ組成物を表しているのかどうか、または推定ピークが合成的もしくは化学的な異常型の結果であるかどうか、まだ明らかとはならない。更に、生物学的サンプルの組成物の任意のコール(call)は、臨床的または治療的目的としては受け入れがたいエラーの可能性を有し得る。そのような危険な状態では、サンプルの任意のコールまたは同定が正確であるという、高い程度の確実性が必要である。そのため、更なるデータプロセッシングおよびインタープリテーションが、サンプルを正確におよび確実に同定する前に必要となる。
【０３０３】
各質量分析法試験から得られたデータの量は、典型的には数千のデータポイントであり、自動システムがセットされて時間あたり数百または更には数千の試験を行うため、得られた質量分析法データの量は膨大となる。質量分析法データの効率的伝達および保存を促進するため、ブロック５５は、ノイズ除去化およびベースライン補正データが圧縮されることを示す。
【０３０４】
好ましい実施態様では、生物学的サンプルを選択し、制限された範囲の可能な組成物のみを有するよう処理をする。従って、そのため、組成物を示すピークがどこに位置するかが、存在するならば、判る。これら予想されるピークの位置を知る利点があるため、ブロック６０において、方法３５は、プロセスしたシグナルのおける推定ピークを予想ピークの位置にマッチさせる。その方法では、生物学的サンプルの組成物を示す実際のピークであるデータ内の各推定ピークの確率を決定することができる。各ピークの確率をブロック６０で一旦決定すると、次いで、ブロック６５において、方法３５は、生物学的サンプルの組成物を統計学的に決定し、遺伝子型をコールする程度に確実性が高いならば決定する。
【０３０５】
再びブロック４０について言及すると、データは、試験装置、好ましくはマススペクトロメーターから受け取られる。特定の説明では、図２６は、マススペクトロメーターからのデータの例を示す。当該マススペクトロメーターデータ７０は、ｘ軸７１およびｙ軸７２に沿って分布するデータポイントを一般に含んでいる。ｘ軸７１は、決定された粒子の質量を示し、その一方、ｙ軸７２は、当該粒子の数値濃度を示す。図２６に示すように、質量分析法データ７０は、ｘ軸７１のより重い端(heavier end)７４のデータの方向へ一般的に指数的に減衰するｘ軸７３の左端のデータに伴って、一般に指数的に減衰する。しかし、当該データの一般的な指数的表示は、生物学的サンプルの組成物を示さないが、合成エラーおよび特性をより反映させる。更に、上記および図２６に示すように、相当なノイズが質量分析法ＤＮＡデータ７０に存在する。
【０３０６】
再びブロック４５について言及すると、ブロック４０で受けた未処理データをノイズ除去化する場合、ノイズ除去化プロセスをより詳細に記載する。図２５に示したように、ノイズ除去化プロセスは、一般に、１)未処理データにおいてウェーブレット変換を行い、未処理データをウェーブレットステージ係数に分解すること、２)ウェーブレット係数の最も高いステージからノイズプロファイルを作成すること、および３)ウェーブレット変換における他のステージにスケール化ノイズプロファイルを適用することを必要とする。ノイズ除去プロセスの各ステップを更に以下に記載する。
【０３０７】
ここで図２７について言及すると、未処理質量分析法データのウェーブレット変換を一般的にダイアグラム化する。ウェーブレット変換技術を用い、その後、質量分析法データ７０をステージに変換する。各ステージステップでは、当該データをＨｉステージおよびＬｏｗステージにおいて示し、Ｌｏｗステージは次のその後のステージへの入力として作用する。例えば、質量分析法データ７０を、ステージ０ハイデータ８２およびステージ０ローデータ８３に変換する。次いで、ステージ０ローデータ８３を次のレベルの変換への入力として用い、ステージ１ハイデータ８４およびステージ１ローデータ８５を得る。同様の方法で、ステージ１ローデータ８５を、ステージ２ハイデータ８６およびステージ２ローデータ８７へ変換する入力として使用する。変換は、より有用な情報が更なるウェーブレット変換により得ることができなくなるまで、続ける。例えば、好ましい実施態様では、２４ポイントウェーブレットを用いる。より特に、Daubechies２４として通常言及されるウェーブレットを用い、未処理データを分解する。しかし、他のウェーブレットがウェーブレット変換に使用できることが認識される。ウェーブレット変換の各ステージは前のステージのデータポイントの半分となるため、ウェーブレット変換は、ステージｎローデータ８９が約５０ポイントとなるまで続けることができる。従って、ステージｎハイ８８は、約１００データポイントを含む。好ましいウェーブレットは２４ポイント長であるため、小さなデータまたは情報が、約５０ポイントのデータセットにおいてウェーブレット変換続けることにより得ることができる。
【０３０８】
図２８は、ステージ０ハイデータ９５の例を示す。ステージ０ハイデータ９５は質量分析法データにおいて最も高い頻度を一般的に示すため、ステージ０ハイデータ９５は質量分析法データにおける高頻度ノイズの量に密接に関連する。図２９において、指数フィッティング式(exponential fitting formula)をステージ０ハイデータ９５に適用し、ステージ０ノイズプロファイル９７を得る。特に、指数フィッティング式は、式Ａ０＋Ａ１ＥＸＰ(−Ａ２ｍ)である。他の指数フィッティング式または他の型のカーブフィットも用い得ることが認識される。
【０３０９】
ここで図３０ついて言及すると、他のＨｉステージのノイズプロファイルを決定する。各ステージの後のデータポイントは、各ステージのノイズのレベルを示すようであるため、各ステージの後のデータポイントのみを用い、特定ステージのノイズコンテントを示す標準偏差図を得る。より特に、各残りステージのノイズプロファイルの作成において、各ステージの最後５％のデータポイントのみを分析し、標準偏差数を決定する。他に多くのポイントまたは他の方法を用い、その標準偏差図を得ることが認識される。
【０３１０】
各ステージの標準偏差数をステージ０ノイズプロファイル(指数曲線)９７と共に用い、各ステージのスケール化ノイズプロファイルを得る。例えば、図３０は、ステージ１ハイデータ９８がエリア９９により示される最後５％のデータポイントと共にステージ１ハイデータ１０３を有することが示される。エリア９９のポイントを評価し、ステージ１ハイデータ１０３のノイズコンテントを示す標準偏差数を決定する。次いで、標準偏差数をステージ０ノイズプロファイル９７と共に用いステージ１ノイズプロファイルを得る。
【０３１１】
同様の方法で、ステージ２ハイ１００は、エリア１０１により示される最後５％のポイントと共にステージ２ハイデータ１０４を有する。次いで、エリア１０１のデータポイントを用い標準偏差数を算出し、次いで、それを用い、ステージ０ノイズプロファイル９７をスケール化し、ステージ２データのノイズプロファイルを得る。この同じプロセスを、ステージｎハイ１０５により示されるように各ステージハイデータについて続ける。ステージｎハイ１０５に関し、ステージｎハイデータ１０８は、エリア１０６により示される最後５％のデータポイントを有する。エリア１０６のデータポイントを用い、ステージｎの標準偏差数を決定する。次いで、ステージｎ標準偏差数をステージ０ノイズプロファイル９７と共に用い、ステージｎのノイズプロファイルを得る。従って、各ハイデータステージはノイズプロファイルを有する。
【０３１２】
図３１は、どのようにノイズプロファイルを各ステージのデータに適用するかを示す。一般にノイズプロファイルを用い、各ステージのデータに適用するスレショルド(threshold)を得る。ノイズプロファイルを既にスケール化し、各ステージのノイズコンテントを調製するため、スレショルドの算出により、除かれるノイズの量を調節する調製が可能となる。スレショルド未満のウェーブレット係数は無視でき、その一方、スレショルドの上のものは維持される。従って、残りデータは、除かれるノイズコンテントの実質的な一部を有する。
【０３１３】
ウェーブレット変換の特性のため、ステージ０および１のような低いステージは、ステージ２またはステージｎのような後のステージよりもよりノイズコンテントを有している。実際、ステージｎローデータは、殆どノイズを有してないようである。そのため、好ましい実施態様では、ノイズプロファイルを、より低いステージではより積極的に適用し、より後のステージではあまり積極的に適用しない。例えば、図３１は、ステージ０ハイスレショルドがステージ０ノイズプロファイルを４つの因子に掛けることにより決定されることを示す。その方法で、ステージ０ハイデータ９５内のデータポイントの有意な数はスレショルド未満となり、それゆえ、除かれる。ステージ１ハイスレショルド１１２は、ステージ１ハイデータのノイズプロファイルの２倍のセットであり、ステージ２ハイスレショルド１１４は、ステージ２ハイのノイズプロファイルと等しいセットである。そのため、このゲノム経過の後、ステージｎハイスレショルド１１６は、(１／２ｎ−２)に等しい因子による各ステージｎハイのノイズプロファイルのスケーリングにより決定される。他の因子が各ステージのノイズプロファイルのスケールに適用されることが認識される。例えば、ノイズプロファイルを多かれ少なかれ積極的にスケールし、特異的組織特性またはサンプル組成物に適応させる。上記したように、ステージｎローデータ１１８は僅かにノイズコンテントを有するか全く有していないと想定すると、ステージｎローデータは、適用されるノイズプロファイルを有してはいない。スケール化ノイズプロファイルを各ハイデータステージに適用した後、質量分析法データ７０はノイズ除去され、容易に更にプロセッシングされる。ノイズ除去化シグナルのウェーブレット変換は、図３１に示すように希薄データセット１２０を生ずる。
【０３１４】
図２５について再び言及すると、ブロック４０で受ける質量分析法データをブロック４５でノイズ除去し、ベースライン補正のためブロック５０に移す。ベースライン補正を行う前に、ウェーブレット変換手順により導入されるアーテファクト(artifact)を好ましくは取り除く。ウェーブレット変換は、ウェーブレットのポイントを開始点として用いることに僅かに依存する変化を生ずる。例えば、好ましい実施態様は、２４ポイントのDaubechies２４ウェーブレットを用いる。ウェーブレットの０ポイントの変換の開始により、僅かに異なる結果が、ウェーブレットのポイント１または２で開始する場合よりも得られる。そのため、ノイズ除去データは、各利用可能な開始点を用い変換し、その結果を平均し最終的なノイズ除去化およびシフト化シグナルを決定する。例えば、図３３は、ウェーブレット係数を２４種の時間に適用し、次いで、その結果を平均し最終データセットを得る。他の技術を用いウェーブレットシフティングにより導入される僅かなエラーを適応させる。
【０３１５】
式１２５は、図３３で一般的に示される。シグナルを、一旦、ノイズ除去およびシフトすると、ノイズ除去化およびシフト化シグナル１３０を図５８に示されるように生ずる。図３４は、ノイズ除去化およびシフト化シグナル１３０からのウェーブレット係数１３５データセットの例を示す。
【０３１６】
図３６は、推定ピークエリア１４５、１４７および１４９は、ノイズ除去化およびシフト化シグナル１５０に位置することを示している。推定ピークエリアを、シグナル１５０に沿って移動平均すること、および移動平均に関連するスレショルドを超えるシグナル１５０のセクションを同定することにより組織的に同定される。他の方法を用い、シグナル１５０における推定ピークエリアを同定し得る。
【０３１７】
推定ピークエリア１４５、１４７および１４９をシグナル１５０から取り除き、図３７に示すようにピークフリーシグナル１５５を作成する。ピークフリーシグナル１５５を更に分析し、残存最小値１５７を同定し、残存最小値１５７を接続し、ピークフリーシグナル１５５を得る。
【０３１８】
図３８は、ピークフリーシグナル１５５を用い図３９に示すようにベースライン１７０を得るプロセスを示す。ブロック１６２に示すように、ウェーブレット変換をピークフリーシグナル１５５で行う。ウェーブレット変換からの全ステージを、ｎＬｏｗステージを除くブロック１６４で排除する。ｎＬｏｗステージは、一般的に、ピークフリーシグナル１５５の最も低い頻度コンポーネントを示し、それにより、一般的に、システム指数特性を示す。ブロック１６６は、シグナルはｎロー係数から再構成され、ベースラインシグナル１７０をブロック１６８で得る。
【０３１９】
図３９は、校正ベースライン１７０に隣接して位置するノイズ除去化およびシフト化データシグナル１７２を示す。ベースライン補正１７０は、ノイズ除去化およびシフト化シグナル１７２から差し引かれ、図４０に示すように適用されたベースライン補正を有するシグナル１７５を得る。そのノイズ除去化、シフト化および校正化シグナルは、殆どの同定目的に重要であるが、シグナル１７５中の推定ピークは、生物学的サンプルのＤＮＡ組成物をコールする有意な正確性または確実性を伴って同定できない。
【０３２０】
再び図２５について言及すると、ベースライン補正５０のデータをブロック５５で圧縮し、好ましい実施態様に用いる圧縮技術を図４１に詳述する。図４１では、ベースライン補正化データ内のデータは、連関データ値１８４を有するｘ軸ポイント１８３と共にアレイフォーマット１８２に存在する。ｘ軸は、ゼロではないウェーブレット係数による指標となり、連関する値は、ウェーブレット係数の値である。表１８２の解説データ例では、最大値１８４は、１０００となることを示す。質量分析法データに特に利点の圧縮技術を示すが、他の圧縮技術も使用し得ることが認識される。好ましくないが、当該データはまた、圧縮なしに保存され得る。
【０３２１】
好ましい実施態様によるデータ圧縮において、中間フォーマット１８６を得る。中間フォーマット１８６は、一般的に、自然数部分１８８および少数部分１９０を有する実数を含む。自然数部分は、ｘ軸ポイント１８３であり、その一方、少数部分は、最大値で割られる値データ１８４である。例えば、データ１８２では、データ値“２５”は、ｘ軸ポイント“１００”で示される。このデータポイントの中間値は“１００．０２５”となり得る。
【０３２２】
中間圧縮データ１８６から、最終圧縮データ１９５を得る。中間データファイルの最初のポイントは、圧縮データの開始点となる。その後、圧縮データ１９５の各データポイントは、以下のように算出される：自然数部分(少数点の左)は、現在の自然数と過去の自然数との間の違いにより置換えられる。残り部分(小数点の右)は未処理のままである。例えば、圧縮データ１９５の開始点は、“１００．０２５”である中間データポイントと同じであると示されている。最初の中間データポイント“１００．０２５”と第二の中間データポイント“１５０．２２０”との間は、“５０．２２０”である。そのため、“５０．２２０”は圧縮データ１９５の第二のポイントとなる。同様の方法で、第二の中間ポイントは、“１５０．２２０”であり、第三の中間データポイントは“５００．０００１”である。そのため、第三の圧縮データは、“３５０．０００”となる。決定された圧縮データポイントの算出は、データポイントの全アレイが実数の単一アレイに変換されるまで続ける。
【０３２３】
図４２は、一般的に、質量分析法データを圧縮する方法を記載し、それは、ブロック２０１のデータファイルがブロック２０２で係数のアレイとして表されることを示す。当該データ開始点および最大は、ブロック２０３に示すように決定され、中間実数は、上記のようにブロック２０４で算出される。得られた中間データポイントを用い、圧縮データをブロック２０５で得る。記載された圧縮方法は、質量分析法装置からのプロセス化データセットのような圧縮データセットに高い利点および効果がある。当該方法は、多数使用し、ｘ軸データにおいて部分的なギャップを有するようにプロセスする、質量分析法データのようなデータに特に有用である。従って、プロセス化質量分析法データのｘ−ｙデータアレイは、１０×またはそれを超える効果的な圧縮率で保存され得る。圧縮技術が質量分析法データに適用されるが、当該方法は、他のデータセットに有利に適用されることが認識される。
【０３２４】
再び図２５について言及すると、ピークの高さは、ブロック６０で決定される。ピークの高さを決定する最初のステップを図４３に示し、この場合、シグナル２１０は、左または右にシフトし、それは予測ピークの位置に相当する。質量分析法データを生ずる前に生物学的サンプルにおいて可能性ある組成物のセットが判るため、予測ピークの可能な位置は既に判る。これらのあり得るピークを、予測ピーク２１２、２１４および２１６のような予測ピークとして称する。校正または試験装置データ中の他のエラーのため、全シグナルは、実際の位置から左または右にシフトし得、そのため、推定ピーク２１８、２２２および２２４のようなシグナルに位置する推定ピークを予測ピーク２１２、２１４および２１６とそれぞれ比較し得る。次いで、全シグナルを、推定ピークが予測ピークにより近づいて位置するようにシフトする。
【０３２５】
推定ピークが一旦シフトし、予測ピークとマッチすると、最も強い推定ピークが図４４で同定される。好ましい実施態様では、最も強いピークを、ピークの全体の高さおよびピークの真下のエリアの分析の組合せとして算出する。例えば、幅の広いピークでなく適度な高さのピークは、極端に幅が狭く非常に高いよりも強力となり得る。推定ピーク２２５のような同定される最も強力な推定ピークを用い、ガウス２２８カーブをピーク２２５にフィットさせる。一旦、ガウスをフィットさせると、ガウスの幅(Ｗ)を測定し、将来的に算出のためのピーク幅として使用する。
【０３２６】
一般に上記のような取り組みとして、ノイズ除去化、シフト化、およびベースライン補正化シグナルは、生物学的サンプルのＤＮＡ組成物を確実にコールするほどには充分にはプロセスされない。例えば、ベースラインは、一般に取り除かれるが、なお、現在の残留ベースライン効果が存在する。そのため、これら残留ベースライン効果を取り除き、同定の正確性および確実性を増大させる。
【０３２７】
残留ベースライン効果を取り除くため、図４５は、推定ピーク２１８、２２２および２２４をベースライン補正シグナルから取り除くことを示す。当該ピークを、推定ピーク２１８、２２２および２２４、それぞれのセンターライン２３０、２３２、および２３４を同定することにより、および同定センターラインの左および右にエリアを取り除くことにより、取り除く。各推定ピークの場合、ガウスの２倍の幅(Ｗ)に等しいエリアをセンターラインの左から取り除き、その一方、５０ダルトンに等しいエリアをセンターラインの右から取り除く。５０ダルトンを示すエリアを適合させ、実際のピークに付随し得る塩付加物の効果を充分に適当に取り除くことが発見された。その付加物は、実際のピークの右に現れ、マススペクトルの取得を含む化学からの自然効果を有する。５０ダルトン緩衝液を選択するけれども、他の範囲または方法が使用され付加物の効果を減少させるか取り除き得ることが認識される。
【０３２８】
当該ピークが取り除かれ、シグナル２４５の作成に関連する最小２４７により図４６で示されるように位置する最小２４７が残存する。四次多項式をシグナル２４５に適用し、図４７に示すように残留ベースライン２５０を得る。残留ベースライン２５０を、シグナル２２５から差し引き、図４８に示すように最終シグナル２５５を得る。残留ベースラインは、シグナル２４５への四次フィットの結果であるが、他の技術を用い残留ベースラインをスムーズにするか、フィットさせ得る。
【０３２９】
図４９に示すようにピークの高さを決定するため、ガウス２６６、２６８および２７０のようなガウスを、それぞれピーク２６０、２６２、および２６４のような各ピークにフィットさせる。従って、ガウスの高さは、高さ２７２、２７４、および２７６として決定する。一旦、各ガウスピークの高さを決定すると、次いで、生物学的化合物３５を同定する方法は、図２５に示すように遺伝子型決定フェーズ６５へと移ることができる。
【０３３０】
各推定ピークが実際のピークであるという確実性の現れ(indication)は、各推定ピークについてノイズ対シグナル比率(signal to noise ratio)を算出することにより認識し得る。従って、ノイズに対する強力なシグナルの比を有する推定ピークは、ノイズに対するより低いシグナルの比を有する推定ピークよりもより実際のピークとなるようである。上記および図５０に示したように、高さ２７２、２７４、および２７６のような各ピークの高さを各ピークについて決定し、この場合、高さが各ピークのシグナル強度インディケーターとなる。ノイズプロファイル９７のようなノイズプロファイルを、同定ピークを通してノイズプロファイル２８０に外挿する。各ピークのセンターラインにおいて、ノイズ値をノイズ値２８２、２８３、および２８４のように決定する。得られるシグナル値およびノイズ値を用い、ノイズ対シグナル比率を各ピークで算出することができる。例えば、図５０の最初のピークについてのノイズ対シグナル比率は、ノイズ値２８２で割ったシグナル値２７２として算出し、同様の方法で、図５０の中央ピークのノイズ対シグナル比率は、ノイズ値２８３で割ったシグナル２７４として決定し得る。
【０３３１】
ノイズ対シグナル比率は、実際ピークの存在の有用な一般的なインディケーターであるが、更なるプロセッシングにより、サンプルが同定され得る確実性を増大することが発見された。例えば、好ましい実施態様において各ピークに関するノイズ対シグナル比率は、好ましくは、ガウスと各推定ピークとの間でのフィットの長所により調節される。それは、通常の分布に一般的に従う方法でサンプル物質を検出するマススペクトロメーターの特性である。従って、少ない通常分布を有するシグナルよりも、よりよい確実性が、ガウス形を有する推定シグナルを付随する。非ガウス形を有することから生ずるエラーを“残留エラー”と称する。
【０３３２】
図５１について言及すると、残留エラーは、データシグナルにおけるガウス２９３と推定ピーク２９０との間で二乗平均を算出することにより、算出する。当該算出は、ガウスのセンターラインの何れかの側の１つの幅内のデータで行う。残留エラーは、：
【数１】
2004158005.tif 000022
として算出される。この場合、Ｇはガウスシグナル値であり、Ｒは推定ピーク値であり、そしてＮは−Ｗから＋Ｗまでのポイントの数である。算出残留エラーを用い、下記のような、調節されたノイズ対シグナル比率(adjusted signal to noise ratio)を得る。
【０３３３】
調節されたシグナルノイズ比率は、式
【化９】
2004158005.tif 000023
を用いる各推定ピークについて算出する。この場合、Ｓ／Ｎはノイズ対シグナル比率であり、Ｒは上記で決定した残留エラーである。好ましい実施態様で、各ピークの残留エラーを用いる調節されたノイズ対シグナル比率を算出するが、他の技術を用い、ガウスと実際のシグナルとの間でのフィットの長所が説明されることが認識される。
【０３３４】
図５２について言及すると、推定ピークが実際のピークとなる確率を決定する。ピークの確率の決定において、調節されたノイズ対シグナル比率がｘ軸であり、確率がｙ軸である、確率プロファイル３００を得る。確率は、確率０％と、１として示される確率１００％との範囲にあることが必要である。一般的に、調節されたノイズ対シグナル比率が高くなればなるほど、推定ピークが実際のピークである確実性が高くなる。
【０３３５】
調節されたノイズ対シグナル比率の幾つかの標的値において、確率が１００％であるとは、推定ピークが実際のピークであり、確実に生物学的サンプルのＤＮＡ組成物同定に用い得ることであると判る。しかし、確率が１００％であるとみなせる場合、調節されたノイズ対シグナル比率の標的値は、適用特異的基準に従うセットである可変パラメーターとなる。例えば、標的のノイズ対シグナル比率は、試行実験、サンプル特性およびシステム全体の許容可能エラー耐性に応じて、調節される。より特異的に、エラーを許容できない保存アプローチを必要とする状態では、標的の調節されたノイズ対シグナル比率がセットされ得、例えば実施例１０、より高くなり得る。従って、１００％確率が、調節されたノイズ対シグナル比率が１０またはそれを超えないならば、ピークに割り当てられない。
【０３３６】
他の状況では、サンプルデータが明白であるか、またはエラーの危険性を減少し得るため、より積極的なアプローチを取り得る。その状況で、当該システムをセットすると、５またはそれ以上の標的のノイズ対シグナル比率が１００％の確率とみなされ得る。もちろん、エラーの極度の危険性がみなされるとき、中間のノイズ対シグナル比率標的図を、７のように選択する。標的の調節されたノイズ対シグナル比率を、一旦当該方法にセットすると、次いで、任意の調節されたノイズ対シグナル比率に関し、確率により、推定ピークが実際のピークであると決定され得る。
【０３３７】
同定試験、特にＤＮＡ増幅により調製されるサンプルの質量分析法試験の実行を含む化学により、最も高いピークのシグナル強度と二番目(または三番目など)に高いピークのシグナル強度の間の対立遺伝子比率は、予想される比率内に含まれる。対立遺伝子比率が通常のガイドラインの外側に含まれるならば、好ましい実施態様は、当該確率に対し対立遺伝子比のペナルティーを強要することとなる。例えば、図５３は対立遺伝子ペナルティー３１５を示し、それは、最も高いピークのシグナル強度で割った二番目に高いピークのシグナル強度の間の割合であるｘ軸を有する。ｙ軸３１９は、決定された対立遺伝子比に依存した０から１の間のペナルティーとみなせる。好ましい実施態様では、３０％を超える対立遺伝子比率が予測範囲内に含まれ、それにより、ペナルティーは適用されないとみなせる。１０％と３０％との間の比において、ペナルティーは、１０％未満の対立遺伝子比率において二番目に高いピークが現実でないとみなせるまで、直線的に増大する。１０％と３０％との間の対立遺伝子比率の場合、対立遺伝子ペナルティーチャート３１５を用いペナルティー３１９を決定し、図５２で決定したピーク確率によりマルチプレックシングし、最終ピークの確率を決定する。好ましい実施態様を、対立遺伝子比率ペナルティーに組込み、可能な化学エラーを考慮するが、他の技術を使用し得ることが認識される。同様の処置を他のピークに適用する。
【０３３８】
決定される各ピークのピーク確率を用い、種々組成物コンポーネントの統計学的確率を決定し得る。実施例のように、２つのピーク、ピークＧ、ピークＣおよびＧＧ、ＣＣおよびＧＣの組合せのそれぞれ３つの可能な組合せの確率を決定するためである。図５４は、最もあり得るピーク３２５を測定すると、最終ピーク確率９０％を有していたことを示す。ピーク３２５は、生物学的サンプル中にＧコンポーネントを示すように位置する。従って、Ｇが生物学的サンプル中に存在する確率９０％が維持され得る。図５４に示す例においても、二番目に高い確率はピーク３３０であり、２０％のピーク確率を有する。ピーク３３０はＣ組成物を付随する位置にある。従って、Ｃが生物学的サンプル中に存在する確率２０％が維持され得る。
【０３３９】
開始点としてＧ存在の確率(９０％)およびＣ存在の確率(２０％)により、ＧおよびＣ存在の組合せの確率を算出し得る。例えば、図５４は、ＧＧ存在の確率３２９が７２％として算出されることを示す。これは、ＧＧの確率が、Ｃが存在しない確率(１００％−２０％)を掛けたＧ存在の確率(９０％)に等しくなると、算出される。Ｇ存在の確率が９０％であり、Ｃが存在しない確率が８０％ならば、ＧＧの確率は７２％である。
【０３４０】
同様の方法で、ＣＣが存在する確率は、Ｇが存在しない確率(１００％−９０％)を掛けたＣ存在の確率(２０％)に等しくなる。図５４に示すように、Ｃ存在の確率が２０％である一方、Ｇが存在しない確率は１０％であり、そのため、ＣＣの確率は２％のみである。最終的に、ＧＣ存在の確率は、Ｃ存在の確率(２０％)を掛けたＧ存在の確率(９０％)に等しくなる。Ｇ存在の確率が９０％であり、Ｃ存在の確率が２０％であるならば、ＧＣ存在の確率は１８％である。略式の形式では、次いで、生物学的サンプルの組成物の確率は、
ＧＧの確率：７２％
ＧＣの確率：１８％、および
ＣＣの確率：２％
である。
【０３４１】
可能性ある組合せのそれぞれの確率を一旦決定すると、図５５は、遺伝子型をコールする重要な確実性が存在するかどうかの決定に使用される。図５５は、最も高い組合せ確率と二番目に高い組合せ確率との比率であるｘ軸３３７を有するコールチャート３３５を示す。ｙ軸３３９は、当該比率が、遺伝子型のコールを正しいとするほどに充分に高いかどうかを単に示す。当該比率の値はＭ３４０で示し得る。Ｍ値は、試行データ、サンプル組成物およびエラー許容能に依存するセットである。例えば、Ｍ値は、値４のように比較的高いセットとなり得、そのため、最も高い確率は、確実性により遺伝子型のコールを確立する前に二番目に高い確率よりも少なくとも約４倍大きくなければならない。しかし、特定レベルのエラーが許容されるならば、Ｍ値は３のようなより積極的な値のセットであり得、そのため、最も高い確率と二番目に高い確率との間の比率は、３のみの比またはそれ以上となることが必要となる。もちろん、適度の危険性を許容できるとき、適度の値がＭに関し選択され得る。ＧＧの確率が７２％であり、ＧＣの確率が１８％である図５４の例を用い、７２％と１８％との間の比率は、４．０であり、そのため、Ｍのセットは３、３．５、または４の何れかとなり、そのシステムはＧＧとして遺伝子型をコールし得る。好ましい実施態様が、遺伝子型が確実にコールするかどうかを決定する２つの最も高いピーク確率間の比を用いるが、他の方法が置換され得ることが認識される。上記技術が、確率の算出および２を超えるピークの組合せを含む遺伝子型(またはより一般的なＤＮＡパターン)の決定に用いられ得る。
【０３４２】
ここで図５６について言及すると、フローチャートを示しており、上記の遺伝子型の統計学的コールのプロセスを一般的に定義している。図５６では、ブロック４０２は、各ピークの高さを決定し、ブロック４０４におけるノイズプロファイルが各ピークについて外挿されることを示す。当該シグナルを、ブロック４０６の各ピークの高さから決定し、各ピークのノイズを、ブロック４０８のノイズプロファイルを用い決定する。ブロック４１０では、ノイズ対シグナル比率を各ピークについて算出する。非ガウスピーク形を説明するため、残留エラーをブロック４１２で決定し、調節されたノイズ対シグナル比率をブロック４０４で算出する。ブロック４１６は、確率プロファイルを作成すること、この場合、存在する各ピークの確率がブロック４１８に見られることを示す。対立遺伝子ペナルティーをブロック４２０に適用し得、この場合、対立遺伝子ペナルティーを、ブロック４４２の調節されたピーク確率に適用する。コンポーネントの各組み合わせの確率をブロック４２４で算出し、この場合、２つの最も高い確率の間の比をブロック４２６で決定する。次いで、確率の比率がスレショルド値を超えるならば、次いで、遺伝子型をブロック４２８でコールする。
【０３４３】
本発明の他の実施態様では、コンピューティング装置２０(図２４)は、推定ＳＮＰを含むデータピークを同定することにより“標準”遺伝子型決定をサポートする。例えば、標準遺伝子型決定を用い、この場合、サンプルについての情報が充分に知られておらず、予想ピークの位置を決定し、それに対し、上記のような対立遺伝子ペナルティーが確実性をもって算出される。これにより、標的ＤＮＡ分子をフラグメント化する任意のアッセイにより生ずるデータから推定ＳＮＰが含まれるピークの同定に関しコンピューティング装置を用い得る。その標準遺伝子型決定の場合、データスペクトル中の他のピークの典型的エリアから有意に誘導されるデータ曲線の下のエリアに付随するピークが同定され、その相当する質量(ｘ軸に沿った位置)を決定する。
【０３４４】
より特に、データ中の他のピークの平均エリアから有意に誘導されるピークを同定し、データピーク間の予想対立遺伝子比率を、データピークの下のエリアの比率について定義する。理論的には、各遺伝的配座が同じモル濃度のアナライトを有する場合、各相当するピークの下のエリアは同じであり、そのため、任意の２つのピーク間に１．０比率のピークエリアを生ずる。本発明により、データ中の他のピークに比例してより小さくなる比を有するピークは、ピークとして認識されない。より特に、ピークエリアの見た目の値に比例して３０％未満となるエリア比率を有するピークを対立遺伝子ペナルティーとする。残存ピークの質量(当該データのｘ軸に沿った位置)をオリゴヌクレオチド標準に基づき決定する。
【０３４５】
図５７は、標準遺伝子型決定を行うとき、コンピューティング装置２０(図２４)によるプロセッシングのフローダイアグラム表示を示す。フローダイアグラムボックス番号５０２により示される、最初の操作において、コンピューティング装置は、マススペクトロメーターからデータを受ける。次に、データサンプル中の各推定ピークの高さを、ブロック５０４により示されるように、決定した。マススペクトロメーターデータ内の各ピークの高さを決定した後、ノイズ除去プロセス５０５を行い、ノイズプロファイルの外挿を開始し(ブロック５０６)、その後、各ピークのノイズを発見し(ブロック５０８)、そして各データサンプル(ブロック５１０)のノイズ対シグナル比率を算出する(ブロック５１０)。各これらの操作は、図２５のノイズ除去操作４５のため上記により行い得る。他の適当なノイズ除去操作が当業者により思いつく。
【０３４６】
次の操作は、各データポイントに連関する残留エラーを見つけることである。これは、図５７のブロック５１２により表されている。次のステップ、ブロック５１４は、各同定ピークの調節されたノイズ対シグナル比率を算出することを含む。確率プロファイルは、次(ブロック５１６)で作成され、その後、ブロック５１８でピーク確率を決定する。好ましい実施態様では、ブロック５０２からブロック５１８までを含む図５７のノイズ除去操作は、図５６と関連する相当する、ブロック４０２からブロック４１８、それぞれのための上記操作を含む。
【０３４７】
標準遺伝子型決定プロセッシングのための次の動作で、ブロック５２４により示される各ピークの対立遺伝子ペナルティーを決定する。上記のように、図５７の標準遺伝子決定プロセッシングは、ピークの下のエリアを比較することにより対立遺伝子ペナルティーを決定する。そのため、上記図５３のような対立遺伝子ペナルティーを決定する比較シグナル強度比以外では、標準プロセッシングは、各同定ピークの下のエリアを決定し、これらエリアの比率を比較する。各ピークの下のエリアの決定は、実験データの曲線の下のエリアを計算するための通常の多くの分析技術を用い計算し得る。
【０３４８】
そのため、対立遺伝子ペナルティーを、０．３０(３０％)を超える予想平均エリア値に比例するピークエリアを有するピークに割り当てられるペナルティーはないことを示す図５８により割り当てる。対立遺伝子ペナルティーを、図５２に記載のようなプロセスにより決定され得る、ピーク確率値に適用する。ピークを３０％未満の比とする対立遺伝子ペナルティーより、ピークが更なる測定およびプロセッシングから取り除かれるということが、図５８から明白となる。しかし、他のペナルティースキームを、当業者が決定するように、プロセスされるデータに関する知識により、課す。
【０３４９】
対立遺伝子ペナルティーを決定し適用した後、標準遺伝子型プロセッシングは、残存推定ピークとオリゴヌクレオチド標準の位置を比較し、ブロック５２４のプロセッシングにおいて相当する質量を決定する。標準遺伝子型データの場合、図３３のブロック４２４、４２６、および４２８に相当する操作を行うよりもむしろ、ブロック５２４のプロセッシングを行い、質量および遺伝子型を決定する。その比較を行い、質量を測定する技術は当業者に既知である。
【０３５０】
他の実施態様では、コンピューティング装置２０(図２４)により、アッセイにおいて生ずるフラグメントのセンスおよびアンチセンス鎖の質量(当該データのｘ軸に沿った位置)の検出および決定が可能となる。望ましいならば、コンピューティング装置はまた、標準遺伝子型プロセッシングのための上記した同様技術を用い、各センスおよびアンチセンス鎖の量(各ピークの下のエリア)を検出し、決定し得る。次いで、各型の鎖を生ずるデータを合わせ、データ冗長を達成し、それにより、決定化遺伝子型の確実性レベルを増大する。この技術により、他の診断方法からデータ中にしばしば観察されるプライマーピークを事前に除去し、それにより、より高いレベルのマルチプレックシングが可能となる。加えて、定量化を、プールした実験で用いるとき、測定ピークエリアの比率は、データ冗長のため、ピーク同定技術よりもより確実に算出される。
【０３５１】
図２３は、センスおよびアンチセンスプロセッシングを行うコンピューティング装置２０により実行するプロセッシングを示すフローダイアグラムである。フローダイアグラムボックス番号６０２により示される最初の操作で、コンピューティング装置は、マススペクトロメーターからデータを受け取る。このデータは、アッセイフラグメントのセンス鎖およびアンチセンス鎖のデータを含む。次に、データサンプル中の各推定ピークの高さをブロック６０４で示すように決定する。マススペクトロメーターデータ中の各ピークの高さを決定した後、ノイズ除去プロセス６０５を行い、ノイズプロファイルに外挿する操作(ブロック６０６)を開始し、その後、各ピークのノイズを発見し(ブロック６０８)、そして各データサンプルのノイズ対シグナル比率を算出する(ブロック６１０)。各これらの操作は、図２５のノイズ除去操作４５のため上記により行い得る。他の適当なノイズ除去操作が当業者により思いつく。次の操作は、各データポイントに付随する残留エラーを発見することである。これは、図３６のブロック６１２により示す。
【０３５２】
センス鎖およびアンチセンス鎖のデータのための残留エラーを行った後、遺伝子型を同定するプロセッシングは、センス鎖で行い、また、アンチセンス鎖で行う。そのため、図２３は、プロセッシングにはセンス鎖プロセッシング(ブロック６３０)およびアンチセンス鎖プロセッシング(ブロック６４０)が含まれることを示す。各ブロック６３０、６４０には、図５６のブロック４１４から４２６と関連する上記するような、ノイズ対シグナル比率を調節すること、確率プロファイルを作成すること、対立遺伝子ペナルティーを決定すること、対立遺伝子ペナルティーによりピーク確率を調節すること、遺伝子型決定の確率を算出すること、および遺伝子型確率比を試験すること、に相当するプロセッシングが含まれる。各ブロック６３０、６４０のプロセッシングには、望ましいならば、図５７と関連する上記のような標準プロセッシング操作が含まれる。標準プロセッシングは、図５６のプロセッシング操作に代えてまたはそれに加えて、含まれ得る。
【０３５３】
遺伝子型確率プロセッシングを行った後、センス鎖およびアンチセンス鎖プロセッシングからのデータを合わせ、予測データベース値と比較すると、センス鎖とアンチセンス鎖との間のデータ冗長の利点を得る。当業者ならば、技術により、アッセイフラグメントのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の既知のデータ冗長が利点となることを理解し得る。このプロセッシングをブロック６５０に示している。二本鎖からのデータをプロセッシングのために合わせた後、遺伝子型プロセッシングを行い(ブロック６６０)、遺伝子型を同定する。
【０３５４】
修飾が当業者に明白であるため、本発明が添付の請求の範囲にのみによって限定されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０３５５】
【図１−Ａ】図１は、例示的なサンプルバンクを示す。図１−Ａは、性別および人種の関数としてのサンプルを示す。
【図１−Ｂ】図１は、例示的なサンプルバンクを示す。図１−Ｂは、年齢の関数として白人を示す。
【図１−Ｃ】図１は、例示的なサンプルバンクを示す。図１−Ｃは、年齢の関数としてヒスパニックを示す。
【図２−Ａ】図２−Ａは、リポタンパク質リパーゼ遺伝子の２９１Ｓ対立遺伝子の年齢および性別分布を示し、全部で４３６人の男性および５８９人の女性を調査した。
【図２−Ｂ】図２−Ｂは、４３６人の男性について年齢の分布を示す。
【図２−Ｃ】図２−Ｃは、リポタンパク質リパーゼ遺伝子の２９１Ｓ対立遺伝子の年齢および性別分布を示し、全部で４３６人の男性および５８９人の女性を調査した。
【図３】図３は、集団に基づくサンプルバンキングのための例示的な質問票である。
【図４】図４は、血液サンプルコンポーネントのプロセッシングおよびトラッキングを示す。
【図５】図５は、「病気」対立遺伝子および「健康体」対立遺伝子の対立遺伝子頻度を年齢の関数として示す。健康体対立遺伝子の相対的頻度が年齢の増加とともに集団中で増加することが注目される。
【図６】図６は、ＡｐｏＥ遺伝子型の年齢依存性分布を示す（Schaechter et al. (1994)Nature Genetics 6:29-32参照）。
【図７−Ａ】図７−Ａは、データベース中の白人集団中のｐ５３（腫瘍サプレッサー）コドン７２の年齢依存性および遺伝子型頻度を示す。＊Ｒ７２および＊Ｐ７２はデータベース集団中の対立遺伝子の頻度を表す。Ｒ７２、Ｒ７２Ｐ、およびＰ７２は集団中の個体の遺伝子型を表す。ホモ接合性Ｐ７２対立遺伝子の頻度は、年齢とともに６．７％から３．７％に低下する。
【図７−Ｂ】図７−Ｂは、データベース中の白人集団中のｐ５３（腫瘍サプレッサー）コドン７２の年齢依存性および遺伝子型頻度を示す。＊Ｒ７２および＊Ｐ７２はデータベース集団中の対立遺伝子の頻度を表す。Ｒ７２、Ｒ７２Ｐ、およびＰ７２は集団中の個体の遺伝子型を表す。ホモ接合性Ｐ７２対立遺伝子の頻度は、年齢とともに６．７％から３．７％に低下する。
【図７−Ｃ】図７−Ｃは、データベース中の白人集団中のｐ５３（腫瘍サプレッサー）コドン７２の年齢依存性および遺伝子型頻度を示す。＊Ｒ７２および＊Ｐ７２はデータベース集団中の対立遺伝子の頻度を表す。Ｒ７２、Ｒ７２Ｐ、およびＰ７２は集団中の個体の遺伝子型を表す。ホモ接合性Ｐ７２対立遺伝子の頻度は、年齢とともに６．７％から３．７％に低下する。
【図７−Ｄ】図７−Ｄは、データベース中の白人集団中のｐ５３（腫瘍サプレッサー）コドン７２の年齢依存性および遺伝子型頻度を示す。＊Ｒ７２および＊Ｐ７２はデータベース集団中の対立遺伝子の頻度を表す。Ｒ７２、Ｒ７２Ｐ、およびＰ７２は集団中の個体の遺伝子型を表す。ホモ接合性Ｐ７２対立遺伝子の頻度は、年齢とともに６．７％から３．７％に低下する。
【図８】図８は、年齢の関数として、ｐ２１  Ｓ３１Ｒ対立遺伝子の対立遺伝子および遺伝子型頻度を示す。
【図９】図９は、個体サンプルに対してプールされたＦＶＩＩ対立遺伝子３５３Ｑの頻度を示す。
【図１０】図１０は、個体サンプルに対してプールされた、ＣＥＴＰ（コレステロールエステル輸送タンパク質）対立遺伝子の頻度を示す。
【図１１】図１１は、個体サンプルに対してプールされた、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）５Ｇの頻度を示す。
【図１２】図１２は、ＰＡＩ−１対立遺伝子のサンプルのマススペクトルおよび人種分布を示す。
【図１３】図１３は、ＣＥＴＰ４０５対立遺伝子のサンプルのマススペクトルおよび人種分布を示す。
【図１４】図１４は、第ＶＩＩ因子３５３対立遺伝子のサンプルのマススペクトルおよび人種分布を示す。
【図１５】図１５は、プールされたＤＮＡサンプルを使用する、ＰＡＩ−１、ＣＥＴＰおよび第ＶＩＩ因子の人種分布を示す。
【図１６】図１６は、ｐ５３−Ｒｂ経路およびその経路の種々の因子の間の関連を示す。
【図１７】図１７は、ここで記載したプロセスおよびデータベースを提供する、コンピューター構築性のブロックダイヤグラムであり、これは、ここで提供するデータベースを蓄積し、そして分類するための、そしてここで提供する方法を実行する、典型的なコンピューターシステムを示す。
【図１８】図１８は、多型遺伝的マーカーを同定するためのデータベースへのアクセスを維持し、そして提供するための、図１７に示されるコンピューターを使用して実行される、プロセッシングステップを示すフローダイヤグラムを示す。
【図１９】図１９は、ＡＫＡＰ１０−１遺伝子座について、年齢および性別で層化された、白人集団での対立遺伝子および遺伝子型分布を示すヒストグラムである。明緑色のバーは、４０歳より若齢の個体での頻度を示す。暗緑色のバーは、６０歳より高齢の個体での頻度を示す。
【図２０】図２０は、ＡＫＡＰ１０−５遺伝子座について、年齢および性別で層化された、白人集団の対立遺伝子および遺伝子型分布を示すヒストグラムである。明緑色のバーは、４０歳より若齢の個体の頻度を示す。暗緑色のバーは、６０歳より高齢の個体の頻度を示す。
【図２１】図２１は、ｈ−ｍｓｒ−Ａ遺伝子座について、年齢および性別で層化された白人集団の、対立遺伝子および遺伝子型分布を示すヒストグラムである。明緑色のバーは、４０歳より若齢の個体での頻度を示す；暗緑色のバーは、６０歳より高齢の個体での頻度を示す。
【図２２−Ａ】図２２−Ａは、健康体のデータベースのために使用する、サンプルデータ収集質問票である。
【図２２−Ｂ】図２２−Ｂは、健康体のデータベースのために使用する、サンプルデータ収集質問票である。
【図２２−Ｃ】図２２−Ｃは、健康体のデータベースのために使用する、サンプルデータ収集質問票である。
【図２２−Ｄ】図２２−Ｄは、健康体のデータベースのために使用する、サンプルデータ収集質問票である。
【図２３】図２３は、アッセイフラグメントからのセンス鎖およびアンチセンス鎖の遺伝子型決定をおこなうときに、図２４のコンピューティング装置によって実行されるプロセッシングを示すフローチャートである。
【図２４】図２４は、本発明に従うシステムを示すブロックダイヤグラムである。
【図２５】図２５は、本発明に従う、生物学的サンプルを同定する方法のフローチャートである。
【図２６】図２６は、質量分析計からのデータをグラフに表したものである。
【図２７】図２７は、質量分析法データのウェーブレット変換のダイヤグラムである。
【図２８】図２８は、ウェーブレットステージ０ｈｉデータをグラフに表したものである。
【図２９】図２９は、ステージ０ノイズプロファイルをグラフに表したものである。
【図３０】図３０は、ステージノイズ標準偏差の作成をグラフに表したものである。
【図３１】図３１は、データステージのスレショルド（threshold）の適用をグラフに表したものである。
【図３２】図３２は、希薄データセットをグラフに表したものである。
【図３３】図３３は、シグナルをシフトさせる式である。
【図３４】図３４は、ノイズを除去し、そしてシフトしたシグナルの、ウェーブレット変換をグラフに表したものである。
【図３５】図３５は、ノイズを除去し、そしてシフトしたシグナルをグラフに表したものである。
【図３６】図３６は、ピークセクションの除去をグラフに表したものである。
【図３７】図３７は、ピークフリーシグナルの作成をグラフに表したものである。
【図３８】図３８は、ベースライン補正を作成する方法のブロックダイヤグラムである。
【図３９】図３９は、ベースラインおよびシグナルをグラフに表したものである。
【図４０】図４０は、ベースラインを除去したシグナルをグラフに表したものである。
【図４１】図４１は、圧縮したデータを示す表である。
【図４２】図４２は、データを圧縮する方法のフローチャートである。
【図４３】図４３は、マスシフティングをグラフに表したものである。
【図４４】図４４は、ピーク幅の決定をグラフに表したものである。
【図４５】図４５は、ピークの除去をグラフに表したものである。
【図４６】図４６は、ピークを除去したシグナルをグラフに表したものである。
【図４７】図４７は、残留ベースラインをグラフに表したものである。
【図４８】図４８は、残留ベースラインが除去されたシグナルをグラフに表したものである。
【図４９】図４９は、ピーク高の決定をグラフに表したものである。
【図５０】図５０は、各ピークについて、シグナル−対−ノイズ決定をグラフに表したものである。
【図５１】図５１は、各ピークについて、残留エラーの決定をグラフに表したものである。
【図５２】図５２は、ピーク確率をグラフに表したものである。
【図５３】図５３は、ピーク確率に対する対立遺伝子比率の適用をグラフに表したものである。
【図５４】図５４は、ピーク確率の決定をグラフに表したものである。
【図５５】図５５は、遺伝子型のコールをグラフに表したものである。
【図５６】図５６は、遺伝子型をコールするための統計的処理を示すフロチャートである。
【図５７】図５７は、標準を欠く遺伝子型決定をおこなうとき、図１のコンピューティング装置によって実行されるプロセッシングを示すフローチャートである。
【図５８】図５８は、標準を欠く遺伝子型プロセッシングのための、ピーク確率に対する対立遺伝子比率の適用をグラフに表したものである。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図２−Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−Ａ】
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【図７−Ｂ】
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【図７−Ｃ】
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【図７−Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−Ａ】
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【図２２−Ｂ】
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【図２２−Ｃ】
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【図２２−Ｄ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
2004158005.tif 000090
【図５８】
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【配列表】
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