(57)【要約】【課題】本発明は、キチン質分解酵素であるキチナーゼおよびキトサナーゼ遺伝子をリポーターとして利用する標識細菌モニタリング法を開発することを目的とする。【解決手段】本発明は、キチン質分解酵素遺伝子が導入された細菌を検出するための方法であって、前記キチン質分解酵素遺伝子が導入された細菌を、該細菌に特異的なバクテリオファージと接触させる工程と、前記バクテリオファージの感染によって溶菌した細菌のライセートとキチン質分解酵素基質を反応させる工程と、前記基質の分解を検出する工程と、を含む方法を提供する。【選択図】　　図２
2004097032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチン質分解酵素遺伝子が導入された細菌を検出するための方法であって、
前記キチン質分解酵素遺伝子が導入された細菌を、該細菌に特異的なバクテリオファージと接触させる工程と、
前記バクテリオファージの感染によって溶菌した細菌のライセートとキチン質分解酵素基質４−メチルウンベリフェリルＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラアセチル−β−Ｄ−キトトリオシド（４ＭＵ−（ＧｌｃＮＡｃ）３）を反応させる工程と、
前記基質の分解産物である４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の蛍光を検出する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記細菌が、Ｅｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅである方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記ファージが、ＥｃＰ−０１である方法。
【請求項４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、前記蛍光の検出が、ＵＶ照射によって、基質分解産物である４ＭＵの蛍光を可視化して検出することによる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キチン質分解酵素遺伝子が導入された細菌を迅速かつ効率的に検出するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来技術および発明の背景
植物の葉の表面に安定したコロニーを作る微生物は、葉面病原菌、または食葉害虫を抑制する分子を導入するための生物学的なベクターになると考えられ（Ａｎｄｒｅｗｓ　１９９２）、これら株の多くが、植物病原菌を生物学的に制御するための有効なアンタゴニストとして使用されている（Ｈａｄａｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９８３；　Ｗｉｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．　１９８７；　Ｈｏｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ　１９８８；　Ｎｅｌｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｒａｆｔ　１９９１；　Ｏｋａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．　２０００；　Ｔｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．　２００１）。
【０００３】
本発明者らは、日本中の温室トマトを荒らすうどんこ病菌および植物食性のテントウムシを効果的に生物防除するためのベクターとして使用できる葉面細菌を単離すべく、温室トマトの葉に生息する葉面細菌のスクリーニングを行った。その結果、葉面細菌Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅを単離することに成功した（Ｍａｔｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．　２００１）。
【０００４】
また、プラスミドが導入されたＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ細菌が、この細菌を噴霧した葉を与えられた草食性ヨトウムシ幼虫の腸内、および糞便のペレット中においても生存したままであることが報告されている（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　１９８９）。ＷａｔａｎａｂｅおよびＳａｔｏ　（１９９８）らは、このようなバクテリアによる処理をした餌を与えたカイコ幼虫の腸内、および糞便においても、植物および昆虫に生息するＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ株、および臨床株が生存していることを明らかにしている。
【０００５】
これまでに、本発明者らは、グラム陽性および陰性細菌からキチナーゼとキトサナーゼ遺伝子をクローニングしており、その酵素学的特徴についても詳細に検討を行っている。そこで、温室トマトを荒らす植物食性のテントウムシのキチン質を分解することによって、効果的に生物防除すべく、前記Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ細菌にキチン質分解酵素遺伝子を導入することを考え、これに成功した。
【０００６】
しかし、上述のようなトランスフォームされた細菌を使用する際に、この株を配慮なく使用することによって、この株が予想外に自然界に残存することとなり、標的としない植物および動物に日和見感染するといった潜在的なリスクが存在することも考慮しなければならない。このような生態学的なリスクを最小にするための主要な課題として、環境中に放出された細菌の移動、および行動を明らかにすることが必要であり、そのためには遺伝的に同じか、または異なったバックグランドの固有細菌を導入された細菌と特別することが必要である（Ｍａｈａｆｆｅｅ　ｅｔａｌ．　１９９７；　Ｒａｔｔｒａｙ　ｅｔ　ａｌ．　１９９５；　Ｒｏｂｂｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．　１９８８；　Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）。このような観点からも、Ｅｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅをモニターするための方法が、関連分野の研究において必要とされている。
【０００７】
上述のように、組換えＤＮＡ技術の適用が増加することについての懸念とともに、外来遺伝子が導入された細菌の使用の増加が予想されることから、一部の研究者は、免疫学的な技術を使用して環境中に放出される細菌を効果的に追跡する調査を始め（Ｌａｄｈａ　ｅｔ　ａｌ．　１９８３；　Ｐｅｒｄｅｒｓｅｎ　ａｎｄ　Ｌｅｓｅｒ　１９９２）、トランスジェニック・マーキング技術によって調査おこなっている（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　１９８９；　Ｒａｔｔｒａｙ　ｅｔ　ａｌ．　１９９５；　Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６；　Ｆｉｒｔｈ　１９９９）。
【０００８】
現在、細菌をモニターするために使用することができる技術としては、選択培地で細菌を培養して、内因性の抗生物質抵抗性を調べる方法、または蛍光産生を調べる方法、または免疫蛍光抗体法でコロニーを染色する方法（Ｍａｈａｆｆｅｅほか１９９７）などがある。さらに、より直接的な方法として、生体発光を生じるｌｕｘオペロン（Ｓｈａｗ　ｅｔ　ａｌ．　１９８８；　１９９２）、およびｌｕｘ遺伝子に連結された緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）（Ｕｎｇｅ　ａｎｄ　Ｊａｎｓｓｏｎ　２００１）などのリポーター遺伝子（Ｆｉｒｔｈ　１９９９）を使用する方法がある。これらのリポーター遺伝子は、植物の組織および器官において、マークした細菌の局在を可視化するために有用である。Ｅｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅを遺伝的にマークするために、ｌｕｘ遺伝子が使用されており、発明者らの研究室においても、根面または根圏に植物病原性、および非病原性の細菌を検出するために使用している（Ｔｏｙｏｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９３；　１９９７）。この方法では、効率は、主にコロニーからの生物発光の強度に依存している。したがって、固形の培地に小さなコロニーがたくさん形成された場合、細菌のバックグラウンド群から、マークされた細菌を区別できるほどの発光強度は得られない。一方、ＧＦＰでマークした細菌では、Ｕ．Ｖ．または青色光を照射することによって、検出することができるが、Ｕ．Ｖ．ランプの下で照らすと蒼白色−緑色となる蛍光性メタン発酵菌と区別することは困難であると考えられる（Ｄｏｄｄｅｍａ　ａｎｄ　Ｖｏｇｅｌｓ　１９７８；　Ａｓｈｂｙ　ｅｔ　ａｌ．　２００１）。
【０００９】
その他ビルレントバクテリオファージを使用する方法があり、リポーター遺伝子によって組換えバクテリオファージを構築ことにより、バクテリアをモニタリングする方法がある。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　（Ｐｅａｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）、およびＬｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ　（Ｌｏｅｓｓｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）に特異的なビルレントバクテリオファージのゲノムにルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ後、このバクテリオファージを細胞に感染させると生物発光し、感染後の溶菌段階でうまく検出される。したがって、このルシフェラーゼが組み込まれたバクテリオファージは、食品および環境サンプルを汚染する際の少量の個体群に対しても非常に感受性である。しかし、同種のバックグラウンド細菌に対してもリポーターバクテリオファージが感染してしまうため、環境中に放出されたトランスジェニック細菌をモニターするためにいつでも有効である訳ではない。したがって、遺伝的にトランスフォームされた細菌が環境中に放出された際に、これを直接追跡するための方法が所望されている。
【００１０】
今回、発明者らは、前記Ｅｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ特異的に感染するバクテリオファージを単離することにも成功している。また、このビルレントバクテリオファージが、宿主細菌細胞Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅを非常に特異的に認識し、感染細胞が急速に溶解されることに注目した。感染後、このビルレントバクテリオファージが、キチン遺伝子でトランスフォームされたＥｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅに感染して、溶解サイクルが起こったときに、キチン質分解酵素の大部分が放出される。このキチン質分解酵素の活性は、蛍光ラベルされたキチン質分解酵素の基質を使用することによって、容易かつ特異的に検出することができることがわかっている（Ｒｏｂｂｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．　１９８８；　ＭｃＣｒｅａｔｈ　ａｎｄ　Ｇｏｏｄａｙ　１９９２）。
【００１１】
そこで、前記バクテリオファージを利用して、キチン質分解酵素遺伝子が導入された細菌をモニタリングするための、より簡便かつ感受性の高い方法を開発することを考えた。このアプローチによれば、前記バクテリオファージが、特異的に細菌に感染して溶菌することにより、キチン質分解酵素が放出されることとなり、このキチン質分解酵素活性を検出することによって、より効率的、かつ特異的にトランスフォーメーションされた細菌を検出できると考えた。
【００１２】
【非特許文献１】
Ｔｏｙｏｄａ，　Ｈ．，　Ｋｉｔａ，　Ｎ．，　Ｋａｋｕｔａｎｉ，　Ｋ．，　Ｍａｔｓｕｄａ，　Ｙ．，　Ｄｏｇｏ，　Ｍ．，　Ｋａｔｏ，　Ｙ．，　Ｎｏｍｕｒａ，　Ｔ．，　Ｂｉｎｇｏ，　Ｍ．，　Ｔａｍｐｏ，　Ｈ．，　Ｃｈａｔａｎｉ，　Ｋ．，　Ｓｈｉｍｉｚｕ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｏｕｃｈｉ，　Ｓ．、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔａｂｌｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｓｅｌｆ−ｐｏｌｌｉｎａｔｅｄ　ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｗｉｌｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｆ　ｃａｌｌｕｓ　ｏｆ　ｔｏｍａｔｏ．、“Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、（Ｊａｐａｎ）、１９９７年、１４巻、ｐ．１０５−１１０
【００１３】
【非特許文献２】
Ｔｏｙｏｄａ，　Ｈ．，　Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，　Ｍ．，　Ｋａｋｕｔａｎｉ，　Ｋ．，　Ｍｏｒｉｋａｗａ，　Ｍ．，　Ｆｕｋａｍｉｚｏ，　Ｔ．，　Ｇｏｔｏ，　Ｓ．，　Ｔｅｒａｄａ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｏｕｃｈｉ，　Ｓ．、Ｂｉｎａｒｙ　ｍｉｃｒｏｂｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｗｉｌｔ　ｏｆ　ｔｏｍａｔｏ：　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｒｏｏｔ−ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆａｎ　ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ　ｒｈｉｚｏｐｌａｎｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　ａ　ｃｈｉｔｉｎ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．、“Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ”、（Ｊａｐａｎ）、１９９３年、５９巻、ｐ．３７５−３８６
【００１４】
【非特許文献３】
Ｔｏｙｏｄａ，　Ｈ．，　Ｋａｋｕｔａｎｉ，　Ｋ．，　Ｉｋｅｄａ，　Ｓ．，　Ｇｏｔｏ，　Ｓ．，　Ｔａｎａｋａ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｏｕｃｈｉ，　Ｓ．、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｆ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｈｏｓｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ，、“Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ”、（Ｇｅｒｍａｎｙ）、１９９１年、１３１巻、ｐ．１１−２１
【００１５】
【非特許文献４】
Ｉｋｅｄａ，　Ｓ．，　Ｔｏｙｏｄａ，　Ｈ．，　Ｍａｔｓｕｄａ，　Ｙ．，　Ｋｕｒｏｋａｗａ，　Ｍ．，　Ｔａｍａｉ，　Ｔ．，　Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｋ．，　Ｋａｍｉ，　Ｃ．，　Ｉｋｅｍｏｔｏ，　Ｔ．，　Ｅｎｏｍｏｔｏ，　Ｍ．，　Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，　Ｋ．，　Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｓ．，　Ｈａｎａｏｋａ，　Ｍ．　ａｎｄ　Ｏｕｃｈｉ，　Ｓ．、Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｃｈｉｔｉｎａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｃｈｉＳＨ１　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｋｕｒｔｈｉａ　ｚｏｐｆｉｉ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｐｏｗｄｅｒｙ　ｍｉｌｄｅｗ　ｏｆ　ｂａｒｌｅｙ．、“　Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ”、（Ｊａｐａｎ）、１９９６年、６２巻、ｐ．１１−１６
【００１６】
【非特許文献５】
Ｍａｔｓｕｄａ，　Ｙ．，　Ｋａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｋ．，　Ｔａｋｉｋａｗａ，　Ｙ．，　Ａｉｋａｍｉ，　Ｒ．，　Ｎｏｎｏｍｕｒａ，　Ｔ．　ａｎｄ　Ｔｏｙｏｄａ，　Ｈ．、Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｎｅｗ　ｐｏｗｄｅｒｙ　ｍｉｌｄｅｗ　ｏｎ　ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ　ｔｏｍａｔｏ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．、“Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”、（日本）、２００１年、６７巻、ｐ．２９４−２９８
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、キチン質分解酵素であるキチナーゼおよびキトサナーゼ遺伝子をリポーターとして利用する標識細菌モニタリング法を開発することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、キチン質分解酵素遺伝子が導入された細菌を検出するための方法であって、
前記キチン質分解酵素遺伝子が導入された細菌を、該細菌に特異的なバクテリオファージと接触させる工程と、
前記バクテリオファージの感染によって溶菌した細菌のライセートとキチン質分解酵素基質を反応させる工程と、
前記基質の分解を検出する工程と、
を含む方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、前記キチン質分解酵素遺伝子が導入された細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅである。
【００２０】
また、本発明は、前記方法であって、前記基質が、４ＭＵ−（ＧｌｃＮＡｃ）３であり、前記基質の分解の検出が、ＵＶ照射によって基質分解産物である４ＭＵの蛍光を可視化して検出することによる方法を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、前記方法であって、前記バクテリオファージが、Ｅｃｐ−０１バクテリオファージであり、および前記基質が、４ＭＵ−（ＧｌｃＮＡｃ）３であり、前記基質の分解の検出が、ＵＶ照射によって基質分解産物である４ＭＵの蛍光を可視化して検出することによる方法を提供する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に記載する。
【００２３】
本発明の方法に使用する細菌は、どのような細菌であってもよいが、好ましくは、トマトの葉に生息する葉面細菌であり、特に好ましくは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ株である。前記細菌を単離する方法は、当業者に周知のいずれの方法を使用して単離してもよい。以下に、本発明の方法に使用する細菌の単離法の一例を、トマトの葉に生息する葉面細菌の単離を例にして示す。
【００２４】
トマトの葉をランダムに回収して、葉の上面を、２％（ｖ／ｗ）コロイド性キチンを補ったＭ９最小アガー培地を２分間接触させて、２６℃において４〜５日間インキュベートする。インキュベート後、それぞれの葉からコロニーが得られるので、これらコロニーを選択培地に移してコロニーを単離すればよい。本単離法によってトマトの葉から最も多く得られた単離体は、Ｅｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ細菌であり、これをＫＰＭ−００７Ｅ株とした。
【００２５】
本発明において、キチン質分解酵素とは、キチナーゼまたはキトサナーゼをいう。前記キチン質分解酵素遺伝子を上記細菌に導入するための方法は、当業者に既知のいずれの方法であってもよい。たとえば、一般的な遺伝子組換え技術を使用してキチナーゼまたはキトサナーゼ遺伝子を導入することができる。具体的には、グラム陽性細菌Ｋｕｒｔｈｉａ　ｚｏｐｆｉｉ（Ｉｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）に由来するキチナーゼ遺伝子ｃｈｉＳＨ１　（ＤＤＢＪ，　Ｄ６３７０２）を適切なプロモーター、たとえばＥｎｔ．ｃｌｏａｃａｅのｐｓｔオペロンのプロモーター（Ｋｕｓａｋａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７）につなぎ、プラスミドベクターに挿入する。前記プロモーター配列は、ヌクレオチド配列（ＤＤＢＪ、Ｄ６９９６３）にしたがって人工的に合成した一組のプライマーを使用して、通常のＰＣＲによってＥｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ　ＩＦＯ３３２０のゲノムＤＮＡを増幅することによって得ることができる。また、前記プラスミドベクターには、テトラサイクリン耐性遺伝子などの選択マーカーを含んでいることが好ましい。作製したプラスミドを、当業者に既知の方法によって前記細菌に導入することができる。たとえば、以前に記載した方法（Ｔｏｙｏｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９１）に従って、前記細菌にエレクトロポレーションによって導入すればよい。エレクトロポレーションした細菌は、たとえばテトラサイクリン耐性遺伝子マーカーを含むプラスミドを導入した場合、２０μｇ　ｍｌ−１のテトラサイクリンの存在下でスクリーニングすることによって、トランスフォームされた細菌を選択することができる。前記ＫＰＭ−００７Ｅ株に上述の方法でキチナーゼ遺伝子を導入した株をＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉと命名した。この株を独立行政法人産業技術総合研究所　特許性物寄託センターに寄託した（受託番号　　　　）。
【００２６】
本発明の方法で使用するバクテリオファージは、前記細菌を指示菌として土壌試料から得ることができる。また、従来より見出されている特定の細菌を使用する場合は、該細菌に特異的に感染するバクテリオファージを、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能である。入手可能な株の詳細は、例えば、ＡＴＣＣによる「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　＆Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ」に公表されている。しかし、目的とする細菌に特異的に感染するバクテリオファージが発見されていない場合は、新たにこのようなバクテリオファージを土壌中から見出して使用すればよい。土壌中には、種々の細菌に特異的に感染するバクテリオファージが存在することが知られており、当業者に周知の方法（例えば、ＬｏｅｓｓｎｅｒおよびＢｕｓｓｅ、Ａｐｐｌｉｅｄａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５６巻、第１９１２〜１９１８頁（１９９０）、および「Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ」Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．　第４４７〜４５５頁（１９５９）を参照のこと）を使用してスクリーニングを行うことによって、特定の細菌にのみ感染するファージを得ることができる。たとえば、土壌試料から二重アガー層技術を使用して単離すればよい。土を滅菌水中に懸濁して、５分間激しく攪拌し、次に土壌粒子を除去するために低速で遠心する。上清をろ紙（細孔寸法０．２２μｍ）に通して、前記細菌（１０８細胞ｍｌ−１）を含む溶解Ｍ９アガー培地（６ｇアガーｌ−１）と混合して、ペトリプレート中のＭ９アガー（１５ｇアガーｌ−１）の底層の上へまく。３７℃において３日間インキュベーションした後、重なり合っていないプラークからバクテリオファージを回収して、単溶菌斑分離工程を数回行って精製する。さらに、Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．　（１９７０）の方法に従って、バクテリオファージをさらに精製してもよい。詳細には、前記細菌のライセートを、膵臓ＤＮａｓｅ、およびＲＮａｓｅで処理して、塩化ナトリウム遠心沈降を行う。遠心（１１，０００×ｇ　ｆｏｒ　１０分、４℃）した後、固体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　６０００）を沈殿したバクテリオファージ粒子の上清に、０．５ｇ　ｍｌ−１で添加する。このバクテリオファージペレットをＳＭバッファー（１ｌの水に５．８ｇ　ＮａＣｌ，　２ｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび５ｍｌの５％ゲラチンを含む１ｍｏｌ　ｌ−１　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５）に溶解して、塩化セシウム段階グラジエント（１．１５〜１．７ｇ　ｍｌ−１の層）の上へ層にして添加し、４℃において２００００×ｇで２時間遠心する。１．４５〜１．５０ｇ　ｍｌ−１の層の界面にあるバクテリオファージ粒子の青いバンドを、マイクロピペットで回収する。１００倍量のＳＭバッファーに対して透析して、塩化セシウムを除去することによって、バクテリオファージを精製することができる。
【００２７】
本発明の方法に使用するバクテリオファージは、前記キチン質分解酵素遺伝子が導入された細菌に特異的に感染することができるいずれのバクテリオファージでもよいが、好ましくは、以下の実施例において単離したＥｃＰ−０１である。このファージは、本発明者らの研究室（近畿大学農学部植物病理学研究室）において、分譲可能に保存されている。
【００２８】
本発明の方法において、前記キチン質分解酵素遺伝子が導入された細菌に、該細菌に特異的なバクテリオファージを接触させる工程は、たとえば上述のように得られた細菌の細菌懸濁液（４ＭＵ−（ＧｌｃＮＡｃ）３を３．０μｇ　ｍｌ−１で含むグルコースフリーのＭ９培地で前記細菌を培養した液）に、上述のように精製したバクテリオファージを接種すればよい。ここで、接触とは、前記バクテリオファージが細菌に感染できるように付着させることをいうが、定法にしたがってバクテリオファージが効率的に感染するような液体中で付着させることが好ましい。前記懸濁液は、たとえば、使用した細菌がＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅの場合、炭素源を含まない培地で１０９　ｃｆｕ　ｍｌ−１となるように培養した懸濁液が好ましい。また、前記バクテリオファージがＥｃＰ−０１の場合、１０９〜１０１１　ｐｆｕ　ｍｌ−１で接種することが好ましく、１０１１
ｐｆｕ　ｍｌ−１で接種することがより好ましい。
【００２９】
次に、本発明の方法において、前記バクテリオファージが感染することによって溶菌した細菌のライセートとキチン質分解酵素基質を反応させる工程では、前記細胞にバクテリオファージが感染することによって溶菌した結果、培地にキチン質分解酵素が迅速に放出されることとなり、キチン質分解酵素基質が切断される。前記キチン質分解酵素基質は、当業者に既知のいずれの基質を使用してもよいが、４−メチルウンベリフェリルＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラアセチル−β−Ｄ−キトトリオシド（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−ｔｒｉａｃｅｔｙｌｃｈｉｔｏｔｒｉｏｓｉｄｅ）（４ＭＵ−（ＧｌｃＮＡｃ）３）を使用することが好ましい。この基質は、キチン質分解酵素で切断されると、蛍光性の４ＭＵを放出する。
【００３０】
最後に、前記基質の分解産物である４ＭＵの蛍光を検出する工程は、４ＭＵの蛍光を、たとえばＵＶ照射によって可視的に検出すればよい。前記検出は、少量であってもマイクロタイタープレートのバックを暗色に配置することによって可視的に検出することができる。また、前記蛍光の検出は、ＵＶ照射による方法だけでなく、適切な蛍光検出器を使用して検出することもできるが、ＵＶ照射によれば簡便かつ迅速に、検出感度、検出速度ともに充分に満足できる結果を得ることができる。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明の実施例を記載する。
【００３２】
材料および方法
葉面細菌の単離および同定
温室（２６　±　６℃）で２月間生長させたトマト　（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ　Ｍｉｌｌ，　ｃｖ．　Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）　から、完全に成長した葉をランダムに回収して、ちぎった葉の上面を、２％　（ｖ／ｗ）コロイド性キチン質を補ったＭ９最小アガー培地（水１ｌ中に、１２．８ｇ　Ｎａ２ＨＰＯ４７Ｈ２Ｏ，　３ｇ　ＫＨ２ＰＯ４，　０．５ｇ　ＮａＣｌ，　１ｇ　ＮＨ４Ｃｌ　および４ｇ　グルコース）（Ｍ９−キチン質培地）を２分間接触させて、２６℃において４〜５日間インキュベートする。前記コロイド性キチン質は、ＨｉｒａｎｏおよびＮａｇａｏ　（１９８８）の方法に従って調製した。コロニーのまわりの透明な領域（ハロー）の形成されることによって、細胞外のキチナーゼが分泌されていることを判断した。得られた全ての微生物コロニーを、通常の濃度で抗生物質を含む（２０μｇ　ｍｌ−１テトラサイクリン、５０μｇ　ｍｌ−１アンピシリン、５０μｇ　ｍｌ−１ストレプトマイシン、５０μｇ　ｍｌ−１カナマイシン、および１００μｇ　ｍｌ−１クロラムフェニコール）Ｍ９−キチン質培地に移した。単離した細菌である単離ＫＰＭ−００７Ｅの細菌学的な特徴を調べ、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　（９ｔｈ　Ｅｄ．）によって分類学上の同定を行った。
【００３３】
ＫＰＭ−００７Ｅへのキチン遺伝子の導入
グラム陽性細菌Ｋｕｒｔｈｉａ　ｚｏｐｆｉｉ（Ｉｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）に由来するキチナーゼ遺伝子ｃｈｉＳＨ１　（ＤＤＢＪ，　Ｄ６３７０２）をＥｎｔ．ｃｌｏａｃａｅｐｓｔオペロンのプロモーター（Ｋｕｓａｋａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７）につなぎ、プラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４（Ｓ．　Ｙａｓｕｄａ，　国立遺伝学研究所、三島、日本によって提供された）に挿入した。このベクターは選択マーカーとしてテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいる。前記プロモーター配列は、ヌクレオチド配列（ＤＤＢＪ、Ｄ６９９６３）にしたがって人工的に合成した一組のプライマーを使用して、ＰＣＲでＥｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ　ＩＦＯ３３２０のゲノムＤＮＡを増幅することによって得た。新しく造られたプラスミド（ｐＡＣＹ／χ）は、以前に記載した方法（Ｔｏｙｏｄａｅｔ　ａｌ．　１９９１）に従って、ＫＰＭ−００７Ｅにエレクトロポレーションによって導入した。トランスフォームした細菌を、２０μｇ　ｍｌ−１のテトラサイクリンの存在下でスクリーニングして、そのキチナーゼ生産を検討した。４ＭＵ−（ＧｌｃＮＡｃ）３（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ，　ＵＳＡ）を基質として使用したＭｃＣｒｅａｔｈおよびＧｏｏｄａｙ　（１９９２）の方法によって、キチナーゼ活性を測定した。細菌培養液（１００μｌ）を遠心して沈殿させ、９００μｌのｐＨ７のＭｃＩｌｖａｉｎｅのバッファー（１７．８ｍｌの０．１ｍｏｌｌ−１クエン酸、および８２．２ｍｌの０．２ｍｏｌｌ−１二塩基性リン酸ナトリウム）に混合した。０．１３４ｍｇ　ｍｌ−１の４ＭＵ−（ＧｌｃＮＡｃ）３を５０μｌ添加して、酵素反応を開始した。３７℃において１０分間インキュベーションした後、１．２ｍｌの１ｍｏｌ　ｌ−１　グリシン／ＮａＯＨバッファー（ｐＨ　１０．６）を添加して反応を終結させ、島津ＲＦ−５０００の蛍光分光光度計を使用して、４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の蛍光をモニターした。４ＭＵ量は、ｐＨ７．０の同じバッファー中における、標準の４ＭＵの較正曲線にしたがって概算した。培養中に菌体の数は、血球計算板、および位相差顕微鏡法を使用して決定した。
【００３４】
ＫＰＭ−００７Ｅに対する感染力をもつビルレントバクテリオファージの単離
ビルレントバクテリオファージは、二重アガー層技術（Ｈｕｒｓｔ　１９９７）によって、温室土壌試料から得た。土を滅菌水中に懸濁して、５分間激しく攪拌し、次に土壌粒子を除去するために低速で遠心した。上清をろ紙（細孔寸法０．２２μｍ）に通して、ＫＰＭ−００７Ｅ　（１０８　ｃｅｌｌｓ　ｍｌ−１）を含む溶解Ｍ９アガー培地（６ｇアガーｌ−１）と混合して、ペトリプレート中のＭ９アガー（１５ｇアガーｌ−１）の底層の上へかぶせた。３７℃において、３日間インキュベーションした後、重なり合っていないプラークからバクテリオファージを回収して、単溶菌斑分離工程を数回行って精製した。
【００３５】
Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．　（１９７０）の方法に従って、バクテリオファージをさらに精製した。細菌ライセートを、膵臓ＤＮａｓｅ、およびＲＮａｓｅで処理して、塩化ナトリウム遠心沈降を行った。遠心　（１１，０００×ｇ　ｆｏｒ　１０　ｍｉｎ　ａｔ　４℃）した後、固体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　６０００）を沈殿したバクテリオファージ粒子の上清に、０．５ｇ　ｍｌ−１で添加した。このバクテリオファージペレットをＳＭバッファー（１ｌの水に５．８　ｇ　ＮａＣｌ，　２ｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　および５　ｍｌ　の５％　ゲラチンを含む、１ｍｏｌ　ｌ−１　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ　７．５）に溶解して、塩化セシウム段階グラジエント（１．１５〜１．７ｇ　ｍｌ−１の層）の上へ層にして、４℃において２００００×ｇで２時間遠心した。１．４５〜１．５０　ｇ　ｍｌ−１の層の界面にあるバクテリオファージ粒子の青いバンドを、マイクロピペットで回収した。１００倍量のＳＭバッファーに対して透析して、塩化セシウムを除去した。接種のために、バクテリオファージ溶液をグルコースフリーのＭ９液体培地（アガーなし）で１０〜１００倍に稀釈した。
【００３６】
Ｅｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅの系統
本実験において使用した系統は、　ＳＭ１０　（Ｔｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．　２００１）、Ｔ−１−１４　（Ｏｋａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．　２０００）、ＪＣＭ　１２３２　（ＡＴＣＣ　１３０４７）　（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７）、Ｍｕｌｌ　１，　Ｈｉｍ　７ａ，　Ｔｏｂ　２３、およびＷＢＭ　Ｈ３　（Ｗａｔａｎａｂｅ　ａｎｄ　Ｓａｔｏ　１９９８）、並びにＩＦＯ３３２０　（ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）である。これらのＥｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ株に、二重アガー層技術によって単離されたバクテリオファージを接種した。すなわち、細菌を、バクテリオファージを含むＭ９　Ｔｏｐ−ｌａｙｅｒアガーで包理して、種々の温度において２日間インキュベートして、プラーク形成、またはサイズ、および形成したプラークの出現（透明または濁っている）を調べた。
【００３７】
電子顕微鏡観測
精製した細菌細胞、およびウイルス粒子をＢｒｅｎｎｅｒおよびＨｏｒｎｅ　（１９５９）の方法でネガティブ染色した。すなわち、０．２％ホルムバール膜で覆われたのグリッド（メッシュ・サイズ５０μｍ）を、パラフィルム上のサンプル液滴上に２分間浮かべて、余分なサンプルを吸い取り紙で吸い取った。グリッド上の細菌細胞、またはバクテリオファージ粒子は、２％リンタングステン酸塩（ＫＯＨでｐＨ６．７に合わせた）の液滴上に、１０〜３０秒間グリッドを浮かべることによって、直接染色した。次いで、日立Ｈ−８００電子顕微鏡を１００ｋＶで使用して観察した。
【００３８】
細菌ライセート中のキチナーゼ活性の測定、およびキチナーゼ遺伝子でマークした細菌のモニタリング
１ｍｌの細菌懸濁液（１０９　ｃｅｌｌｓ　ｍｌ−１）を等量のＥｃＰ−０１種菌（１０７〜１０１１　ｐｆｕ　ｍｌ−１）と混合して、３７℃において５分間インキュベートした。この細菌懸濁液の溶解は、懸濁液の濁度が減少することに基づいて、可視的に記録した。ライセート中のキチナーゼ活性を評価するために、バクテリオファージを接種して１時間後に種々の体積（５〜１００のμｌ）の混合物を回収し、遠心で除去した。活性は、すでに記載した蛍光アッセイによって測定した。隔離ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉは、次のように検出した。インキュベートしてから４８時間後に、Ｍ９培地内に形成された細菌のコロニーを、マイクロタイタープレートのウェル内の１０μｌの検出溶液中に直接懸濁して、３７℃において６時間インキュベートした。検出溶液は、ＥｃＰ−０１を１０１１ｐｆｕ　ｍｌ−１で、４ＭＵ−（ＧｌｃＮＡｃ）３　を３．０μｇ　ｍｌ−１で含むグルコースフリーのＭ９培地である。ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉの蛍光を発しているライセートは、ｕ．ｖ．光の下で可視的に検出した。
【００３９】
結果
葉面細菌の単離および分類学上の分類
本研究では、６０本のトマトから２００枚のトマトの葉をランダムに回収して、スタンプ培養に使用した。Ｍ９−キチン質培地中でゆっくりと葉をスタンプすることによって、６８枚、および３８５枚の葉から、それぞれ７０７種の細菌、および７６７３種の酵母（出芽細胞を形成）のコロニーが得られた。これらすべてのコロニーを選択培地に移して、三種の細菌、および五種の酵母単離体に予備的に分類した。細菌で得られたものである、ＫＰＭ−００７Ｅは、トマトの葉から最も多く得られた単離体であり（５４枚の葉から６７５コロニー）。このことは、この株が、トマト葉の表面に効率的にコロニーを作る株であることを示唆している。この株は、滑らかで、丸く、蛍光のない、光沢のない、白いコロニーを形成し、アンピシリンおよびストレプトマイシンに耐性であり、カナマイシンテトラサイクリン、およびクロラムフェニコールに感受性であった。ＫＰＭ−００７Ｅは、キチナーゼを分泌しなかった。この単離体を以下の実験において使用した。酵母単離体では、うまくキチン質分解酵素遺伝子が導入されなかったため、感染性ウイルスによる細胞溶解が起こらなかった。
【００４０】
バーギーの同定細菌学のマニュアルによる判定基準を使用して、ＫＰＭ−００７Ｅは、周毛の鞭毛を有するグラム陰性、運動性、棒状（幅０．７−０．８μｍ、長さ２．０−２．４μｍ）の菌であることが特徴づけられた。増殖に最適な温度は、３５−３７℃であり、最大で６０℃である。この細菌は、好気性で、酸化−発酵、ウレアーゼ、フェニルアラニン・デアミナーゼ、アルギニンジヒドロラーゼ、オルニチン脱炭酸酵素、フォゲス‐プロスカウエル試験、クエン酸塩（シモンズ）資化、およびエスクリン・ヒドロラーゼ活性に陽性であり、オキシダーゼ、リシン脱炭酸、インドール産生、および硫化水素産生葉、陰性であった。さらに、この細菌は、Ｌ−アラビノースおよびＤ−ソルビトールから好気的に酸を産生するが、Ｄ−アドニトール、ミオイノシトール、ラフィノース、およびＬ−ラムノースからは産生しなかった。
【００４１】
ｃｈｉＳＨ１−でトランスフォームされた細菌によるキチナーゼ生産
キチナーゼＳＨ１　（Ｉｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）を産生させるために、ＫＰＭ−００７ＥをｐＡＣＹ／ｃｈｉでトランスフォームした。表１は、Ｅｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅの親株（ＫＰＭ−００７Ｅ）、およびキチナーゼ遺伝子でトランスフォームした株（ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉ）の間で、増殖、およびキチナーゼ生産の比較したものを示す。ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉは、１〜３時間以内で指数関数的増殖を始め、およびインキュベーションから２４時間後、最大となった。ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉは、もとの親株（ＫＰＭ−００７Ｅ）と同様に増殖したことから、ｃｈｉ−ＳＨ１のトランスフォーメーションは、ＫＰＭ−００７Ｅの本質的な増幅には影響を与えないことがわかる。ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉによって分泌されたキチナーゼは、キチナーゼＳＨ１のＮ末端に位置するシグナル配列の作用によって、６時間後には培地中に検出することができ、インキュベーションから２４時間後に最大に達する（Ｉｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）。本発明者らは、このＥｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ　ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉを独立行政法人産業技術総合研究所　特許性物寄託センターに寄託した（受託番号　　　　）。
【００４２】
【表１】
2004097032.tif 000003
【００４３】
ビルレントバクテリオファージの単離、および感染性
本実験における選別によって、ＫＰＭ−００７Ｅに対する感染力をもつの２種の異なった型のバクテリオファージが得られた。図１Ａ、およびＢは精製されたバクテリオファージ粒子（ＥｃＰ−０１、およびＥｃＰ−０２）の電子顕微鏡写真である。それらは、ＫＰＭ−００７に感染した後、それぞれ透明、および濁ったプラークを形成した。透明バクテリオファージは、正二十面体のような等長性のヘッド（直径（４０−５０ｎｍ））、および短い尾部（１−２ｎｍ×０．０５−０．１のｎｍ）を備えていた。そして、若干の大腸菌バクテリオファージ（例えばＴ３、およびＴ７）を含むＰｏｄｏｖｉｒｉｄａｅファミリーと同様のものだった（Ａｃｋｅｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７）。濁ったバクテリオファージは、より長い尾部（７５−８５ｎｍ×１−２つのｎｍ）を伴った、より大きい二十面体の等長性のヘッド（６０−８０ｎｍ）を形成した。そして、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅファミリーに帰属しているＰ２大腸菌バクテリオファージと同様のものだった（Ａｃｋｅｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７）。両タイプのバクテリオファージでは、ベッドプレート、および２、３の尾部ピンを検出することができたが、尾部線維の構築は存在しないか、または検出するのに充分な構造保全を欠いていた。
【００４４】
単離したバクテリオファージが認識する宿主株を決定するために、二重アガー層技術を使用して、種々のＥｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ株にＥｃＰ−０１、およびＥｃＰ−０２を接種した（表２）。発明者らの事前の実験において、接種後の温度に依存して、ＥｃＰ−０１のプラークサイズが変化することがわかっている。したがって、種々の温度において二重層アガープレートをインキュベートした後に、両バクテリオファージによって形成されるプラークを調査した。両バクテリオファージは、限られた数の菌株にのみ感染することができた。ＥｃＰ−０１は、もとの宿主（ＫＰＭ−００７Ｅ）に対して３７℃において大きな透明なプラークを形成した。また、ＥｃＰ−０２は、ＫＰＭ−００７ＥおよびＩＦＯ３３２０に対して、テストしたすべての温度において濁ったプラークを形成した。さらに、ＥｃＰ−０１およびＥｃＰ−０２は、キチナーゼ遺伝子でトランスフォームされた株（ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉ）に対しても、それぞれのタイプのプラークを形成したことから、これら二種のバクテリオファージは、ＫＰＭ−００７Ｅ株のもとの細胞、およびｃｈｉＳＨ１形質転換体のいずれに対しても、同様の感染性を有することが示された。このファージＥｃＰ−０１、およびＥｃＰ−０２は、本発明者らの研究室（近畿大学農学部植物病理学研究室）において、分譲可能に保存されている。
【００４５】
【表２】
2004097032.tif 000004
【００４６】
バクテリオファージ感染によす細菌懸濁液の溶解、およびライセート中のキチナーゼ活性の検出
ＫＰＭ−００７ＥおよびＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉ細菌懸濁液（１０９　ｃｆｕ　ｍｌ−１）に、１０９〜１０１１　ｐｆｕ　ｍｌ−１のＥｃＰ−０１およびＥｃＰ−０２を、炭素源の非存在下で接種した。接種後の細菌懸濁液が溶解する時間経過を、表３に示す。これらのバクテリオファージが感染して溶菌した結果、炭素源のない条件下においても、濁った細菌懸濁液が透明になっていった。バクテリオファージ粒子の添加量を増加すると、透明になるのも早くなった。最も早く透明になった（接種から１時間後）のは、ＥｃＰ−０１を１０１１　ｐｆｕ　ｍｌ−１で接種した場合であった。ＫＰＭ−００７ＥおよびＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉの間で、細菌が溶解する時期は同じであった。図２には、ＥｃＰ−０１を１０１１　ｐｆｕ　ｍｌ−１で接種した細菌培養液（１０９　ｃｅｌｌｓ　ｍｌ−１）のライセートにおける４ＭＵの蛍光を示したものである。４ＭＵを検出するために１００μｌのライセートを使用した場合、蛍光は、接種してから１時間後に検出され、急速に増加して、３〜５時間後に最大に達した。４ＭＵの蛍光は、酵素反応に少量のライセートを使用した場合と同じであった。一方、親株であるトランスフォームされていない細菌のライセートでは、接種してからも全く蛍光がなかった（ｄａｔａ　ｎｏｔ　ｓｈｏｗｎ）。
【００４７】
【表３】
2004097032.tif 000005
【００４８】
キチナーゼ遺伝子がトランスフォームされたバクテリアの迅速な検出
接種から４８時間後のＭ９培地において形成されたＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉの単一コロニーを、グルコースフリーの液体Ｍ９培地に少量（１０μｌ）滴下して移し、細胞濃度を見積もった。これらの濁った懸濁液は、１０９ｍｌ−１以上の菌体（１．１ｘ１０９〜４．８ｘ１０９　ｃｅｌｌｓ　ｍｌ−１の間）を含み、マイクロタイタープレートのバックを暗色に配置することによって、懸濁液の溶解を可視化することができた。したがって、小規模の細菌培養においても、このモニター方がうまくいくことが明らかとなった
表４では、小スケールの細菌サンプルにおける４ＭＵの蛍光を、ｕ．ｖ．照射によって検出可能なことを示している。ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉの単一コロニーを検出溶液にバクテリオファージとともに移した場合にのみ、短いインキュベーション時間（３０秒）で蛍光が放射された。インキュベーションしてすぐに、弱い蛍光が検出でき、蛍光強度は３０秒後に最大となった。一方、トランスフォームされていない親株（ＫＰＭ−００７Ｅ）では、インキュベーション期間にわたって蛍光はなかった。本アプローチでは、Ｋ．　ｚｏｐｆｉｉ　ＫＩ２−１１９株（この株は、細胞外にキチナーゼを分泌し、Ｍ９キチン質培地上のコロニーのまわりに大きいハローを形成した（Ｉｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３））の単一コロニーにおいても、同様の４ＭＵ蛍光の放射を調査したが、グルコースフリーの液体Ｍ９培地で６時間インキュベートしても蛍光は放射されなかった。
【００４９】
【表４】
2004097032.tif 000006
【００５０】
この検出系が、他のＥｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ株にも適用可能であるかを調べるために、ＩＦＯ３３０２をｐＣＡＹ／ｃｈｉでトランスフォームして、単一コロニーから細菌をとり、ビルレントなバクテリオファージＥｃＰ−０２を含む検出溶液に懸濁した。その結果、同じ期間インキュベートすると、ＥｃＰ−０２が感染することによって溶解するために４ＭＵの蛍光が検出された（表４）。このことは、他のＥｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ株においても、キチナーゼ遺伝子でトランスフォームして、ビルレントなバクテリオファージを感染した後の検出に、本検出系が、有用であることを示している。
【００５１】
考察
スタンプ培養法を使用することにより、Ｅｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅを含む葉に生息する微生物を、温室で育てたトマトの葉から単離して、容易に培地に移すことができた。これは、微生物が、葉に緩やかに接着しているためであろう。単離したＫＰＭ−００７Ｅは、温室トマトにおいて最も多く検出された株である。Ｅｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅが葉面でコロニーを形成することは、数人の研究者によって報告されており（Ｌａｄｈａ　ｅｔ　ａｌ．１９８３；　Ｐｅｒｄｅｒｓｅｎ　および　Ｌｅｓｅｒ　１９９２）、Ｅｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅの主要な特徴の一つである。この株が安定してコロニーを形成するメカニズムは、明らかではないが、トランスポゾンに変異のあるＥｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅでは、カザミノ酸の非存在下において、キュウリの種子表面にコロニーを形成できないことが報告されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）。また、このタイプの細菌は、多糖から成る糸のような繊維によって不活性表面に付着するか、またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細菌細胞の被包性の表面構造能力を示すだろうと指摘されている。葉の表面で安定してコロニーを形成することは、葉面で植物病原菌または草食性害虫に遭遇する生物防除剤の必要条件である（Ａｎｄｒｅｗｓ　１９９２）。これらの葉面細菌は、接合するか、または形質転換することによって改良され、微生物ベクターとなる可能性がある。実際に、Ｅｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅの株は、遺伝子で遺伝的にトランスフォーメーションされて、桑実状メイガ幼虫に対する生態防除剤として使用されている（Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．　２０００）。本実験において、発明者らは、効率よくキチナーゼ遺伝子でＫＰＭ−００７Ｅをトランスフォームさせて、このトランスジェニック株がキチナーゼＳＨ１を産生することを証明した。実際に、この実験では、キチン質である病原体の細胞壁、または昆虫中腸のペリトロフィック膜を酵素で消化することにより、トマトの着生菌類病原体または葉食性害虫を抑制することを目的とした。
【００５２】
【発明の効果】
本発明において、発明者らは、植物葉から葉面細菌を単離することができ（たとえば、ＫＰＭ−００７Ｅ）、該葉面細菌にキチナーゼ遺伝子を導入することができ（たとえば、ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉ）、該キチン質分解酵素が導入された細菌によく感染するバクテリオファージ（たとえば、Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ−型バクテリオファージ（ＥｃＰ−０１））を単離することに成功し、キチン質分解酵素遺伝子をトランスフォームしたバクテリアに、このビルレントバクテリオファージを感染させて溶菌させることよってモニタリングする系を開発することが可能となった。このモニタリング系では、バクテリオファージ（たとえばＥｃＰ−０１）がキチン質分解酵素遺伝子をトランスフォームされた細菌に感染すると、溶解して培地にキチン質分解酵素が迅速に放出されるので、もとの細菌とトランスフォームされた細菌を容易、かつ迅速に区別することが可能となる。また、このバクテリオファージは、炭素源の非存在下においても宿主細菌細胞に感染するため、このような炭水化物のない条件（グルコース、およびキチン質のないＭ９培地）を使用すれば、混入細菌の増殖を最小限にすることができ、たとえば、前記マークされたバクテリアを非滅菌条件下で検出することが可能となる。実際に、グルコース存在下ではキチン質分解性の葉面細菌は、キチン質分解酵素を分泌して、そのコロニーの周りにハローを形成するが、炭素源を欠いた培地中では、全く蛍光を産生しなかった。したがって、本発明のキチン質分解酵素遺伝子がトランスフォームされた細菌は、この細菌に特異的なバクテリオファージが感染して溶菌することを指標として追跡が可能であり、トランスフォームされていないもとの株、またはその他のＥｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ株、およびキチン質分解酵素を分泌する細菌による影響を受けることもない。さらに、本アッセイ方法は、簡便で、迅速、かつ安価であり、種々の細菌株に対しても容易に適用可能である。したがって、このモニタリング系は、細菌をモニタリングするために日常的に使用することができ、トランスジェニックさいきん（たとえばトランスジェニックＥｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ株）を植物病に対する拮抗的生体制御剤として使用した場合の影響を調査するためにも使用できる。
【００５３】
すなわち、方法は広範囲の細菌種に適用可能であり、目的とする細菌を特異的に追跡調査できることから、生物防除資材として使用する細菌の挙動解析などにも有効である。
【００５４】
【参照文献】
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Ｂｉｓｈｏｐ，　Ａ．　Ｌ．　（１９９０）　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｄｅｃａｙ　ｏｆ　ｏｎｉｏｎｓ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ．　Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ　７４，　６９２−６９４．
Ｂｒｅｎｎｅｒ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｈｏｒｎｅ，　Ｒ．　Ｗ．　（１９５９）　Ａ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓｅｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　３４，　１０３−１１０．
Ｄａｗ，　Ｍ．　Ａ．，　Ｃｏｒｃｏｒａｎ，　Ｇ．　Ｄ．，　Ｆａｌｋｉｎｅｒ，　Ｆ．　Ｒ．　ａｎｄ　Ｋｅａｎｅ，　Ｃ．　Ｔ．　（１９９２）　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｌｏａｃｉｎ　ｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　２０，　１４１−１５１．
Ｄｏｄｄｅｍａ，　Ｈ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｖｏｇｅｌｓ，　Ｇ．　Ｄ．　（１９７８）　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３６，　７５２−７５４．
Ｆｉｒｔｈ，　Ｊ．　Ｒ．　（１９９９）　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｆｏｒ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．　Ｉｎ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　ｅｄ．　Ｅｄｗａｒｄｓ，　Ｃ．　ｐｐ．　１８７−１９９．　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ：　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ．
Ｇａｓｔｏｎ，　Ｍ．　Ａ．　（１９８７）　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ−ｔｙｐｉｎｇ　ｓｅｔ　ｆｏｒ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　２４，　２８５−２９０．
Ｈａｄａｒ，　Ｙ．，　Ｈａｒｍａｎ，　Ｇ．　Ｅ．，　Ｔａｙｌｏｒ，　Ａ．　Ｇ．　ａｎｄ　Ｎｏｒｔｏｎ，　Ｊ．　Ｍ．　（１９８３）　Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆ　ｐｒｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅａ　ａｎｄ　ｃｕｃｕｍｂｅｒ　ｓｅｅｄｓ　ａｎｄ　ｏｆ　ｓｅｅｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ｏｎ　ｒｏｔｓ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　Ｐｙｔｈｉｕｍ　ｓｐｐ．　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　７３，　１３２２−１３２５．
Ｈｅ，　Ｘ．　Ｑ．　ａｎｄ　Ｐａｎ，　Ｒ．　Ｎ．　（１９９２）　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ｌｙｔｉｃ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｆｏｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ，　ｓｈｉｇｅｌｌａｅ，　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，　Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ，　ａｎｄ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３０，　５９０−５９４．
Ｈｉｒａｎｏ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｎａｇａｏ，　Ｎ．　（１９８８）　Ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　ｃｈｉｔｉｎ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ．　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５２，　２１１１−２１１２．
Ｈｏｗｅｌｌ，　Ｃ．　Ｒ．，　Ｂｅｉｅｒ，　Ｒ．　Ｃ．　ａｎｄ　Ｓｔｉｐａｎｏｖｉｃ，　Ｒ．　Ｄ．　（１９８８）　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｍｏｎｉａ　ｂｙ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｐｙｔｈｉｕｍ　ｐｒｅｅｍｅｒｇｅｎｃｅ　ｄａｍｐｉｎｇ−ｏｆｆ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　７８，　１０７５−１０７８．
Ｈｕｒｓｔ，　Ｃ．　Ｊ．　（１９９７）　Ｓａｍｐｌｉｎｇ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｆｒｏｍ　ｓｏｉｌ．　Ｉｎ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｅｄ．　Ｈｕｒｓｔ，　Ｃ．　Ｊ．，　Ｋｎｕｄｓｅｎ，　Ｇ．　Ｒ．，　ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，　Ｍ．　Ｊ．，　Ｓｔｅｔｚｅｎｂａｃｈ，　Ｌ．　Ｄ．　ａｎｄ　Ｗａｌｔｅｒ，　Ｍ．　Ｖ．　ｐｐ．　４００−４０５．　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，　ＤＣ：　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．
Ｉｋｅｄａ，　Ｓ．，　Ｔｏｙｏｄａ，　Ｈ．，　Ｍａｔｓｕｄａ，　Ｙ．，　Ｋｕｒｏｋａｗａ，　Ｍ．，　Ｔａｍａｉ，　Ｔ．，　Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｋ．，　Ｋａｍｉ，　Ｃ．，　Ｉｋｅｍｏｔｏ，　Ｔ．，　Ｅｎｏｍｏｔｏ，　Ｍ．，　Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，　Ｋ．，　Ｍｉｙａｍｏｔｏ，　Ｓ．，　Ｈａｎａｏｋａ，　Ｍ．　ａｎｄ　Ｏｕｃｈｉ，　Ｓ．　（１９９６）　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｃｈｉｔｉｎａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｃｈｉＳＨ１　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｋｕｒｔｈｉａ　ｚｏｐｆｉｉ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｐｏｗｄｅｒｙ　ｍｉｌｄｅｗ　ｏｆ　ｂａｒｌｅｙ．　Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ　６２，　１１−１６．
Ｋｕｓａｋａ，　Ｋ．，　Ｓｈｉｂａｔａ，　Ｋ．，　Ｋｕｒｏｄａ，　Ａ．，　Ｋａｔｏ，　Ｊ．　ａｎｄ　Ｏｈｔａｋｅ，　Ｈ．　（１９９７）　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｈｉｃｈ　ａｒｅ　ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｉｎ　ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ　ｔｏｗａｒｄ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
１７９，　６１９２−６１９５．
Ｌａｄｈａ，　Ｊ．　Ｋ．，　Ｂａｒｒａｑｕｉｏ，　Ｗ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｉ．　（１９８３）　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｉｘｉｎｇ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ａｎｄ　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｉｃｅ　ｐｌａｎｔｓ．　Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　２９，　１３０１−１３０８．
Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，　Ｍ．　Ｊ．，　Ｎｅｕｇｉｒｇ，　Ｅ．，　Ｚｉｎｋ，　Ｒ．　ａｎｄ　Ｓｃｈｅｒｅｒ，　Ｓ．　（１９９３）　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ　ｆｏｒ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１３９，　２６２７−２６３３．
Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，　Ｍ．　Ｊ．，　Ｒｅｅｓ，　Ｃ．　Ｅ．　Ｄ．，　Ｓｔｅｗａｒｔ，　Ｇ．　Ｓ．　Ａ．　Ｂ．　ａｎｄ　Ｓｃｈｅｒｅｒ，　Ｓ．　（１９９６）　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ａ５１１：：ｌｕｘＡＢ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉａｂｌｅ　Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｃｅｌｌｓ．　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　６２，　１１３３−１１４０．
Ｌｏｐｅｒ，　Ｊ．　Ｅ．，　Ｉｓｈｉｍａｒｕ，　Ｃ．　Ａ．，　Ｃａｒｎｅｇｉｅ，　Ｓ．　Ｒ．　ａｎｄ　Ｖａｎａｖｉｃｈｉｔ，　Ｐ．　（１９９３）Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｅｒｏｂａｃｔｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｇｅｎｔ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ．　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　５９，　４１８９−４１９７．
Ｍａｈａｆｆｅｅ，　Ｗ．　Ｆ．，　Ｂａｕｓｋｅ，　Ｅ．　Ｍ．，　ｖａｎ　Ｖｕｕｒｄｅ，　Ｊ．　Ｗ．　Ｌ．，　ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｗｏｌｆ，　Ｊ．　Ｍ．，　ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｉｎｋ，　Ｍ．　ａｎｄ　Ｋｌｏｅｐｐｅｒ，　Ｊ．　Ｗ．　（１９９７）　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔａｉｎｉｎｇ，　ａｎｄ　ａ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍａｒｋｅｒ　（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）　ｆｏｒ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｆａｔｅ　ｏｆ　ａ　Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　６３，　１６１７−１６２２．
Ｍａｔｓｕｄａ，　Ｙ．，　Ｋａｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｋ．，　Ｔａｋｉｋａｗａ，　Ｙ．，　Ａｉｋａｍｉ，　Ｒ．，　Ｎｏｎｏｍｕｒａ，　Ｔ．　ａｎｄ　Ｔｏｙｏｄａ，　Ｈ．　（２００１）　Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｎｅｗ　ｐｏｗｄｅｒｙ　ｍｉｌｄｅｗ　ｏｎ　ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ　ｔｏｍａｔｏ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　６７，　２９４−２９８．
ＭｃＣｒｅａｔｈ，　Ｋ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｇｏｏｄａｙ，　Ｇ．　Ｗ．　（１９９２）　Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ，　１４，　２２９−２３７．
Ｎｅｌｓｏｎ，　Ｅ．　Ｂ．　ａｎｄ　Ｃｒａｆｔ，　Ｃ．　Ｍ．　（１９９１）　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ｉｎ　ｇｏｌｆ　ｃｏｕｒｓｅ　ｔｕｒｆ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｄｏｌｌａｒ　ｓｐｏｔ．　Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ　７５，　５１０−５１４．
Ｎｉｓｈｉｊｉｍａ，　Ｋ．　Ａ．　ａｎｄ　Ｃｏｕｅｙ，　Ｈ．　Ｍ．　（１９８７）　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ，　ａ　ｂａｃｔｅｒｉａｌｄｉｓｅａｓｅ　ｏｆ　ｐａｐａｙａ　ｆｒｕｉｔｓ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ．　Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ　７１，　１０２９−１０３４．
Ｏｋａｍｏｔｏ，　Ｈ．，　Ｓａｔｏ，　Ｍ．，　Ｍｉｙａｔａ，　Ｙ．，　Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，　Ｍ．　ａｎｄ　Ｉｓａｋａ，　Ｍ．　（２０００）　Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ　ｏｆ　ａｎｇｅｌｉｃａ　ｔｒｅｅｓ　ｂｙ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ａｎｄ　Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ　ｓｔｒａｉｎｓ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　６６，
８６−９４．
Ｐｅａｒｓｏｎ，　Ｒ．　Ｅ．，　Ｊｕｒｇｅｎｓｅｎ，　Ｓ．，　Ｓａｒｋｉｓ，　Ｇ．　Ｊ．，　Ｈａｔｆｕｌｌ，　Ｇ．　Ｆ．　ａｎｄ　Ｊａｃｏｂｓ　Ｊｒ．，　Ｗ．　Ｒ．　（１９９６）　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄ２９　ｓｈｕｔｔｌｅ　ｐｈａｓｍｉｄｓ　ａｎｄ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｐｈａｇｅｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．　Ｇｅｎｅ　１８３，　１２９−１３６．
Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，　Ｊ．　Ｃ．　ａｎｄ　Ｌｅｓｅｒ，　Ｔ．　Ｄ．　（１９９２）　Ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅｏｎ　ｌｅａｖｅｓ　ａｎｄ　ｉｎ　ｓｏｉｌ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｉｎ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｐｌａｔｉｎｇ．　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｒｅｌｅａｓｅｓ　１，　９５−１０２．
Ｒａｔｔｒａｙ，　Ｅ．　Ａ．　Ｓ．，　Ｐｒｏｓｓｅｒ，　Ｊ．　Ｉ．，　Ｇｌｏｖｅｒ，　Ｌ．　Ａ．　ａｎｄ　Ｋｉｌｌｈａｍ，　Ｋ．　（１９９５）　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ　ａｔ　ｔｈｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ　ｌｅｖｅｌｓ．　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｇｙ　６１，　２９５０−２９５７．
Ｒｏｂｂｉｎｓ，　Ｐ．　Ｗ．，　Ａｌｂｒｉｇｈｔ，　Ｃ．　ａｎｄ　Ｂｅｎｆｉｅｌｄ，　Ｂ．　（１９８８）　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｌｉｃａｔｕｓ　ｃｈｉｔｉｎａｓｅ　（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ−６３）　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６３，　４４３−４４７．
Ｒｏｂｅｒｔｓ，　Ｄ．　Ｐ．，　Ｍａｒｔｙ，　Ａ．　Ｍ．，　Ｄｅｒｙ，　Ｐ．　Ｄ．　ａｎｄ　Ｈａｒｔｕｎｇ，　Ｊ．　Ｓ．　（１９９６）　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ａ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｉｍｐａｉｒｅｄ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ｉｎ　ｃｕｃｕｍｂｅｒ　ｓｐｅｒｍｏｓｐｈｅｒｅ．　Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　４２，　１９６−２０１．
Ｓａｌａｓ，　Ｓ．　Ｄ．　ａｎｄ　Ｇｅｅｓｅｙ，　Ｇ．　Ｇ．　（１９８３）　Ｓｕｒｆａｃｅ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｓｅｄｉｍｅｎｔ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｏｆ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ．　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　９，　３０７−３１５．
Ｓｈａｗ，　Ｊ．　Ｊ．，　Ｓｅｔｔｌｅｓ，　Ｌ．　Ｇ．　ａｎｄ　Ｋａｄｏ，　Ｃ．　Ｉ．　（１９８８）　Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　Ｔｎ４４３１　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｐｖ．　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ：　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｍｕｔａｎｔ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｌｏｃｕｓ　ｆｏｒ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　１，　３９−４５．
Ｓｈａｗ，　Ｊ．　Ｊ．，　Ｄａｎｅ，　Ｆ．，　Ｇｅｉｇｅｒ，　Ｄ．　ａｎｄ　Ｋｌｏｅｐｐｅｒ，　Ｊ．　Ｗ．　（１９９２）　Ｕｓｅ　ｏｆ　ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｒｅｌｅａｓｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　５８，　２６７−２７３．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，　Ｙ．，　Ｔａｋａｈａｓｈｉ，　Ｋ．，　Ｓａｔｏ，　Ｍ．，　Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｋａｗａｎｏ，　Ｔ．　（１９９７）　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｌｅａｆ　ｒｏｔ　ｏｆ　Ｏｄｏｎｔｉｏｄａ　ｏｒｃｈｉｄｓ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ．　Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ　６３，　１６４−１６９．
Ｔｏｙｏｄａ，　Ｈ．，　Ｋａｋｕｔａｎｉ，　Ｋ．，　Ｉｋｅｄａ，　Ｓ．，　Ｇｏｔｏ，　Ｓ．，　Ｔａｎａｋａ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｏｕｃｈｉ，　Ｓ．（１９９１）　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｆ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｈｏｓｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ，　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　１３１，　１１−２１．
Ｔｏｙｏｄａ，　Ｈ．，　Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，　Ｍ．，　Ｋａｋｕｔａｎｉ，　Ｋ．，　Ｍｏｒｉｋａｗａ，　Ｍ．，　Ｆｕｋａｍｉｚｏ，　Ｔ．，　Ｇｏｔｏ，　Ｓ．，　Ｔｅｒａｄａ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｏｕｃｈｉ，　Ｓ．　（１９９３）　Ｂｉｎａｒｙ　ｍｉｃｒｏｂｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｗｉｌｔ　ｏｆ　ｔｏｍａｔｏ：　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｒｏｏｔ−ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ　ｒｈｉｚｏｐｌａｎｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　ａ　ｃｈｉｔｉｎ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．　Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ　５９，　３７５−３８６．
Ｔｏｙｏｄａ，　Ｈ．，　Ｋｉｔａ，　Ｎ．，　Ｋａｋｕｔａｎｉ，　Ｋ．，　Ｍａｔｓｕｄａ，　Ｙ．，　Ｄｏｇｏ，　Ｍ．，　Ｋａｔｏ，　Ｙ．，　Ｎｏｍｕｒａ，　Ｔ．，　Ｂｉｎｇｏ，　Ｍ．，　Ｔａｍｐｏ，　Ｈ．，　Ｃｈａｔａｎｉ，　Ｋ．，　Ｓｈｉｍｉｚｕ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｏｕｃｈｉ，　Ｓ．　（１９９７）　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔａｂｌｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｓｅｌｆ−ｐｏｌｌｉｎａｔｅｄ　ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｗｉｌｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｆ　ｃａｌｌｕｓ　ｏｆ　ｔｏｍａｔｏ．　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４，　１０５−１１０．
Ｔｓｕｄａ，　Ｋ．，　Ｋｏｓａｋａ，　Ｙ．，　Ｔｓｕｇｅ，　Ｓ．，　Ｋｕｂｏ，　Ｙ．　ａｎｄ　Ｈｏｒｉｎｏ，　Ｏ．　（２００１）　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ＳＭ１０　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｓｐｉｎａｃｈ　ｒｏｏｔｓ　ｆｏｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｗｉｌｔ　ｏｆ　ｓｐｉｎａｃｈ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　６７，　７８−８４．
Ｕｎｇｅ，　Ａ．　ａｎｄ　Ｊａｎｓｓｏｎ，　Ｊ．　（２００１）　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｓｉｚｅ，　ａｃｔｉｖｉｔｙ，　ａｎｄ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｆｐ−ｌｕｘＡＢ−ｔａｇｇｅｄ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　ＳＢＷ２５　ｄｕｒｉｎｇ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ．　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　４１，　２９０−３００．
Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｓａｔｏ，　Ｍ．　（１９９８）　Ｐｌａｓｍｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｉｎｓｅｃｔ−ｒｅｓｉｄｅｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ，　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ，　ａｎｄ　ｐｌａｎｔ−ｅｐｉｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ，　ｉｎ　ｇｕｔｓ　ｏｆ　ｓｉｌｋｗｏｒｍ　ｌａｒｖａｅ．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
３７，　３５２−３５５．
Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｋ．，　Ａｂｅ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｓａｔｏ，　Ｍ．　（２０００）　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ａｎ　ｉｎｓｅｃｔ　ｐｅｓｔ　ｂｙ　ｇｕｔ−ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｃｅ　ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　８８，　９０−９７．
Ｗｉｌｓｏｎ，　Ｃ．　Ｌ．，　Ｆｒａｎｋｌｉｎ，　Ｊ．　Ｄ．　ａｎｄ　Ｐｕｓｅｙ，　Ｐ．　Ｌ．　（１９８７）　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｒｏｔ　ｏｆ　ｐｅａｃｈ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ．　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　７７，
３０３−３０５．
Ｙａｍａｍｏｔｏ，　Ｋ．　Ｒ．，　Ａｌｂｅｒｔｓ，　Ｂ．　Ｍ．，　Ｂｅｎｚｉｎｇｅｒ，　Ｒ．，　Ｌａｗｈｏｒｎｅ，　Ｌ．　ａｎｄ　Ｔｒｅｉｂｅｒ，　Ｇ．　（１９７０）　Ｒａｐｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ　ｖｉｒｕｓ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　４０，　７３４−７４４．
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｅｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ　ＫＰＭ−００７Ｅに感染性のバクテリオファージＥｃＰ−０１（Ａ）およびＥｃＰ−０２（Ｂ）の電子顕微鏡写真（線は２０ｎｍである）。
【図２】ＥｃＰ−０１が感染することによって溶菌したＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉのキチナーゼによって４ＭＵ−（ＧｌｃＮａｃ）３が分解された結果生じた４ＭＵ蛍光を示す図（キチナーゼ活性の検出には、各時間培養後の１０μｌ（白丸）および１００μｌ（黒丸）のライセートを使用した）。
【図１】
2004097032.tif 000007
【図２】
2004097032.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成14年10月4日(2002.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明において、キチン質分解酵素とは、キチナーゼまたはキトサナーゼをいう。前記キチン質分解酵素遺伝子を上記細菌に導入するための方法は、当業者に既知のいずれの方法であってもよい。たとえば、一般的な遺伝子組換え技術を使用してキチナーゼまたはキトサナーゼ遺伝子を導入することができる。具体的には、グラム陽性細菌Ｋｕｒｔｈｉａ　ｚｏｐｆｉｉ（Ｉｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）に由来するキチナーゼ遺伝子ｃｈｉＳＨ１　（ＤＤＢＪ，　Ｄ６３７０２）を適切なプロモーター、たとえばＥｎｔ．ｃｌｏａｃａｅのｐｓｔオペロンのプロモーター（Ｋｕｓａｋａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７）につなぎ、プラスミドベクターに挿入する。前記プロモーター配列は、ヌクレオチド配列（ＤＤＢＪ、Ｄ６９９６３）にしたがって人工的に合成した一組のプライマーを使用して、通常のＰＣＲによってＥｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ　ＩＦＯ３３２０のゲノムＤＮＡを増幅することによって得ることができる。また、前記プラスミドベクターには、テトラサイクリン耐性遺伝子などの選択マーカーを含んでいることが好ましい。作製したプラスミドを、当業者に既知の方法によって前記細菌に導入することができる。たとえば、以前に記載した方法（Ｔｏｙｏｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９１）に従って、前記細菌にエレクトロポレーションによって導入すればよい。エレクトロポレーションした細菌は、たとえばテトラサイクリン耐性遺伝子マーカーを含むプラスミドを導入した場合、２０μｇ　ｍｌ−１のテトラサイクリンの存在下でスクリーニングすることによって、トランスフォームされた細菌を選択することができる。前記ＫＰＭ−００７Ｅ株に上述の方法でキチナーゼ遺伝子を導入した株をＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉと命名した。この株を独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託したが受託拒否されたため、本発明者らの研究室（近畿大学農学部植物病理学研究室）において、分譲可能に保存されている。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
キチナーゼＳＨ１　（Ｉｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）を産生させるために、ＫＰＭ−００７ＥをｐＡＣＹ／ｃｈｉでトランスフォームした。表１は、Ｅｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅの親株（ＫＰＭ−００７Ｅ）、およびキチナーゼ遺伝子でトランスフォームした株（ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉ）の間で、増殖、およびキチナーゼ生産の比較したものを示す。ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉは、１〜３時間以内で指数関数的増殖を始め、およびインキュベーションから２４時間後、最大となった。ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉは、もとの親株（ＫＰＭ−００７Ｅ）と同様に増殖したことから、ｃｈｉ−ＳＨ１のトランスフォーメーションは、ＫＰＭ−００７Ｅの本質的な増幅には影響を与えないことがわかる。ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉによって分泌されたキチナーゼは、キチナーゼＳＨ１のＮ末端に位置するシグナル配列の作用によって、６時間後には培地中に検出することができ、インキュベーションから２４時間後に最大に達する（Ｉｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）。本発明者らは、このＥｎｔ．　ｃｌｏａｃａｅ　ＫＰＭ−００７Ｅ／ｃｈｉを独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託したが受託拒否されたため、本発明者らの研究室（近畿大学農学部植物病理学研究室）において、分譲可能に保存されている。