(57)【要約】【課題】例えば、間葉系幹細胞の再生医療に好適な、安価で取扱が容易で安全確実な細胞培養容器を提供する。【解決手段】上面の外殻に、エアフィルタ付きの接種口、培地供給口、および薬剤供給口が設けられた種培養容器と、この種培養容器の下部に設けられ、前記種培養容器と同様に、上面の外殻にエアフィルタ付きの接種口、培地供給口、および薬剤供給口が設けられた本培養容器とを備えると共に、当該本培養容器を前記種培養容器に連通させ、前記種培養容器で培養された細胞を、前記本培養容器に流下するように回収して本培養するようにした。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上面の外殻に、接種口、培地供給口、および薬剤供給口が設けられた種培養容器と、この種培養容器の下部に設けられ、前記種培養容器と同様に、上面の外殻に接種口、培地供給口、および薬剤供給口が設けられた本培養容器とを備えると共に、当該本培養容器を前記種培養容器に連通させ、前記種培養容器で培養された細胞を、前記本培養容器に流下するように回収して本培養するようにしたことを特徴とする細胞培養器。
【請求項２】
種培養容器の下部に本培養容器を一体に設けてなる細胞培養容器であって、当該種培養容器の外殻に、接種口、培地供給口、および薬剤供給口を設けると共に、当該種培養容器の内部に、前記接種口、培地供給口、および薬剤供給口の下方に配置され、細胞付着力を増大させる表面処理を施した種培養区画、当該種培養区画の一方側に配置された排液区画、および当該種培養区画の他方側に配置された細胞回収区画を形成する一方で、前記種培養容器と同様に、前記本培養容器の外殻に、接種口、培地供給口、および薬剤供給口を設けると共に、前記種培養容器と同様に、本培養容器の内部に、前記接種口、培地供給口、および薬剤供給口の下方に配置され、細胞付着力を増大させる表面処理を施した本培養区画、当該本培養区画の一方側に配置された排液区画、および当該本培養区画の他方側に配置された細胞回収区画を形成し、前記種培養容器の排液区画を下方に配置された前記本培養容器の排液区画に連通し、前記種培養容器の細胞回収区画を下方に配置された前記本培養容器の培養区画に連通し、さらに、前記本培養容器の細胞回収区画に細胞を外部に取り出す細胞回収口を、また、前記本培養容器の排液区画に廃液を外部取り出す排液口を設けたことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項３】
少なくとも前記本培養容器および前記種培養容器の底部を透明部材で形成すると共に、前記種培養容器を、種培養容器の底部の一部が、前記本培養容器からはみ出すようにオフセット配置し、本培養容器、および、はみ出した前記種培養容器の底部に付着する細胞の観察をマイクロスコープで観察可能に形成されたことを特徴とする請求項１または２記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記本培養容器および前記種培養容器を、ポリスチレンで形成されたことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、種培養容器で培養した後の種細胞を、本培養容器に移して継続して本培養を行って収穫する細胞培養容器に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細胞を培養・増殖させて相当量の細胞を収穫する場合、その特性上、所定の段階を踏んで培養する方法が採られる（スケールアップ）。すなわち、種培養というべき段階で小さな種培養容器（種細胞培養容器）に種細胞を少量接種し、接種された種細胞をある程度の量に増やした後、種細胞容器と同サイズの相当数の容器、または種細胞培養容器の数倍〜１０倍程度大きい培養容器に移し、更に細胞の培養を継続し、増殖させる段階（本培養）を経て培養する方法である。このような培養方法は、例えば、特開平６−３８７３４号公報や特開平５−３８２８１号公報に記載された技術では行うことはできない。
したがって、現状では、手作業の場合、培地を用意したディッシュに細胞を接種し、培養（種培養）後、複数の同サイズの培地入りディッシュに均等に移し培養し、収穫する（本培養）方法が採られる。
また、自動細胞培養装置に使用される場合の培養容器としては、チューブで連結した種培養容器の数倍から１０倍程度大きい本培養容器が用いられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、手作業による場合にあっては、個別に形成された種培養容器から、本培養容器に細胞を移し替える作業が繁雑となり、多大の手間を要する問題がある。
また、大量処理（生産）が可能な自動細胞培養装置に用いる従来の培養容器にあっては、種培養容器と本培養を行う本培養容器とを、チューブで連結する構造であるため、２つの培養容器である種培養容器と本培養容器の取扱が不便で、チューブが切れたり、外れたりする事態を生じ、そのため、無菌性維持に支障を来したり、種細胞、培地、さらに種々の薬剤等を流加する機構が複雑となること、また、容器の滅菌のコストが高くなるといった点で種々の問題があった。
【０００４】
本発明は、上記問題点に鑑みて工夫されたものであり、本発明者の知り得た知見に基づき、従来の細胞培養容器に代わり、例えば、間葉系幹細胞の再生医療に好適な、安価で取扱が容易で安全確実な細胞培養容器を提供することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明においては、次のような構成を採ることした。すなわち、請求項１記載の細胞培養容器に係る発明は、上面の外殻に、接種口、培地供給口、および薬剤供給口が設けられた種培養容器と、この種培養容器の下部に設けられ、前記種培養容器と同様に、上面の外殻に、接種口、培地供給口、および薬剤供給口が設けられた本培養容器とを備えると共に、当該本培養容器を前記種培養容器に連通させ、前記種培養容器で培養された細胞を、前記本培養容器に流下するように回収して本培養するようにしたことを特徴とする。
【０００６】
また、請求項２記載の細胞培養容器に係る発明は、種培養容器の下部に本培養容器を一体に設けてなる細胞培養容器であって、当該種培養容器の外殻に、接種口、培地供給口、および薬剤供給口を設けると共に、当該種培養容器の内部に、前記接種口、培地供給口、および薬剤供給口の下方に配置され、細胞付着力を増大させる表面処理を施した種培養区画、当該種培養区画の一方側に配置された排液区画、および当該種培養区画の他方側に配置された細胞回収区画を形成する一方で、前記種培養容器と同様に、前記本培養容器の外殻に、接種口、培地供給口、および薬剤供給口を設けると共に、前記種培養容器と同様に、本培養容器の内部に、前記接種口、培地供給口、および薬剤供給口の下方に配置され、細胞付着力を増大させる表面処理を施した本培養区画、当該本培養区画の一方側に配置された排液区画、および当該本培養区画の他方側に配置された細胞回収区画を形成し、前記種培養容器の排液区画を下方に配置された前記本培養容器の排液区画に連通し、前記種培養容器の細胞回収区画を下方に配置された前記本培養容器の培養区画に連通し、さらに、前記本培養容器の細胞回収区画に細胞を外部に取り出す細胞回収口を、また、前記本培養容器の排液区画に廃液を外部に取り出す排液口を設けたことを特徴とする。
【０００７】
また、請求項３記載の発明は、請求項１または２記載の細胞培養容器に係り、少なくとも前記本培養容器および前記種培養容器の底部を透明部材で形成すると共に、前記種培養容器を、種培養容器の底部の一部が、前記本培養容器からはみ出すようにオフセット配置し、本培養容器、および、はみ出した前記種培養容器の底部に付着する細胞の観察をマイクロスコープで観察可能に形成されたことを特徴とする。
【０００８】
また、請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の細胞培養容器に係り、前記本培養容器および前記種培養容器を、ポリスチレンで形成されたことを特徴とする。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明の実施の形態を、図１乃至図４に基づき詳述する。
図１は、本実施の形態における細胞培養容器全体の外観斜視図、図２は、図１の矢印ＩＩ方向から視た細胞培養容器の側面図で、特に種培養容器と本培養容器との配置関係を理解し易いように透視断面で示した側断面図である（なお、培地供給口と薬剤供給口の配置は他の図と相違するが、機能的には同等である）。図３は、細胞培養容器の、外観構造を強調して示した外観斜視図、図４は、細胞培養容器の一部を破断して内部構造を理解し易いように示した一部破断外観斜視図である。
【００１０】
本実施の形態に係る細胞培養容器は、例えば、ポリスチレン製の如き合成樹脂材で成形されたボックス形状の種培養容器１（透明体）と、この種培養容器１より容量（形状）の大きい、ポリスチレン製の如き合成樹脂材で成型されたボックス形状の本培養容器２（透明体）より成る。本培養容器２の上面の角部には、種培養容器１が、その底部の一部分を後方外側にはみ出すようにオフセット配置した態様で一体化され、種培養容器１および本培養容器２とが一体化された細胞培養容器は、外部から内部の様子が観察可能となるようになっている。
【００１１】
先ず、種培養容器１の構成を説明する。すなわち、種培養容器１の上面の外殻１ａには、エアフィルタ１ｂ付きの細胞（組織）を接種するための接種口１ｃ、培地を供給するための培地供給口１ｄ、例えば増殖促進物質を含む薬剤や、洗浄剤を含む薬剤や、あるいは細胞剥離剤を含む薬剤等を添加するための薬剤添加口１ｅが設けられる。種培養容器１の内部は、前後方向に沿って中央部に種培養区画１Ａ、この種培養区画１Ａの右方に排液区画１Ｂ、および種培養区画１Ａの左方に細胞回収区画１Ｃの３つの区画に仕切られている。すなわち、種培養区画１Ａは、接種口１ｃ、培地供給口１ｄ、および薬剤添加口１ｅの下方に配置され、左右両側に仕切壁１Ａ１、１Ａ２が設けられ、仕切壁１Ａ１、１Ａ２の前半部間にＶ字状の上壁１Ａ３が形成されている。また、種培養区画１Ａの底部には、細胞の付着力を増大させるように、例えば、紫外線照射、あるいはコロナ放電等による表面処理が施されている。一方、排液区画１Ｂや細胞回収区画１Ｃには、細胞が付着して増殖することがないように、このような表面処理は施されていない。さらに、排液区画１Ｂの前方端には、上清（古い培地）を本培養容器２へ廃棄するための排液連絡孔１Ｂ１が、また、細胞回収区画１Ｃの前方端には、細胞を本培養容器２へ移す（供給する）ための細胞供給孔１Ｃ１が設けられている。
【００１２】
こうして、本培養容器２と一体になった種培養容器１を右方に傾けることで、種培養に不用となった液体が、種培養区画１Ａから仕切壁１Ａ１を乗り越えて排液区画１Ｂに流し出すことができ、左方に傾けることにより、種培養区画１Ａから仕切壁１Ａ２を乗り越えて細胞回収区画１Ｃに細胞を流し、本培養容器１に移していくことができる。
【００１３】
次に、本培養容器２の構成を説明する。この本培養容器２は、上記種培養容器１と同様の構造を有するものである。すなわち、本培養容器２の上面の外殻２ａには、エアフィルタ２ｂ付きの細胞（組織）を接種するための接種口２ｃ、培地を供給するための培地供給口２ｄ、例えば増殖促進物質を含む薬剤や、洗浄剤を含む薬剤や、細胞剥離剤を含む薬剤等を添加するための薬剤添加口２ｅが設けられる。本培養容器２の内部は、前後方向に沿って中央部に本培養区画２Ａ、この本培養区画２Ａの右方に排液区画２Ｂ、および本培養区画２Ａの左方に細胞回収区画２Ｃの３つの区画に仕切られている。すなわち、本培養区画２Ａは、接種口２ｃ、培地供給口２ｄ、および薬剤添加口２ｅの下方に配置され、左右両側に仕切壁２Ａ１、２Ａ２が設けられ、仕切壁２Ａ１、２Ａ２の前半部間にＶ字状の上壁２Ａ３が形成されている。また、本培養区画２Ａの底部には、細胞の付着力を増大させるように、例えば、紫外線照射、あるいはコロナ放電等による表面処理が施されている。
【００１４】
他方、排液区画２Ｂや細胞回収区画２Ｃには、細胞が付着して増殖することがないように、このような表面処理は行われていない。さらに、排液区画２Ｂの前方端には、上清（古い培地）を外部へ取り出する（廃棄する）ためのノズル形状の排液口２Ｂ１が、また、細胞回収区画２Ｃの前方端には、細胞を外部へ取り出すためのノズル形状の細胞回収口２Ｃ１が設けられている。
【００１５】
こうして、本培養容器２右方に傾けることで、培養に不用となった液体が、本培養区画２Ａから仕切壁２Ａ１を乗り越えて排液区画２Ｂに流し出して排液口２Ｂ１を経由して、また、左方に傾けることにより、本培養された細胞が、本培養区画２Ａから仕切壁２Ａ２を乗り越えて細胞回収区画２Ｃに流し出して細胞回収口２Ｃ１を経由して、それぞれ外部に取り出すことが可能になる。
【００１６】
また、種培養容器１の細胞回収区画１Ｃの細胞供給孔１Ｃ１には、Ｌ字状に曲がった連通管１Ｄが取り付けられ、その出口は本培養区画２Ａの上方で開口している。これにより、図５の（５）のように、種培養容器１を傾けて細胞回収区画１Ｃの細胞を一旦、この連通管１Ｄに流し込んで図５の（６）に示すような状態に受け止めるようにすることができるものである。
【００１７】
なお、培養中においては、最適培養条件となる無菌状態を維持するために、培地供給口１ｄ、２ｄ、および薬剤供給口１ｅ，２ｅはそれぞれ外部との連通を遮断するための栓部材（図示しない）が設けられ、培地や薬剤を供給するときのみ、栓部材を外して、ピンチ弁を有する供給チューブを連結するようになっている。同様に、細胞回収口２Ｃ１、排液口２Ｂ１も通常時は、栓部材（図示しない）で栓をしている。
【００１８】
次に、本実施の形態の作用を、図５を参照して、細胞の培養手順に沿って説明していく。なお、図５に示される培地供給口１ｄ、２ｄや薬剤供給口１ｅ，２ｅの配置を模式的に示しているため、図１，図３，図４に示したそれらと異なるが、機能的には同等のものである。
（種培養時の薬剤・培地の廃棄）
滅菌処理された種培養容器１の種培養区画１Ａに、種細胞を接種する。次に、培地供給口１ｄから培地を、薬剤供給口１ｅから薬剤を適宜量充填し、種細胞を培養する（図５（１）参照）。種培養区画１Ａにおける培地の培養液の深さは、例えば、底から略５ｍｍ程度である（後述の本培養区画も同様）。所定時間経過後、図５（２）のように、種培養容器１すなわち細胞培養容器を全体として右に傾けていき、図５（３）のように９０度傾けると、使用済み薬剤、古い培地（上清）は種培養区画１Ａの仕切壁１Ａ２を乗り越えて種培養容器１の排液区画１Ｂに流れ込む。さらに、細胞培養容器を全体として水平の状態に戻すと（図５（４）参照）、使用済み薬剤、古くなった培地は排液連絡孔１Ｂ１を経由して本培養容器２の排液区画２Ｂを通り、排液口２Ｂ１より外部に排出することができる。
【００１９】
新しい培地と適量の増殖促進物質等の薬剤とを種培養区画１Ａに供給して培養を継続する。一定時間経過後に、再び、使用済みの薬剤および古い培地を上記の方法で外部に排出する。このような、操作を数回繰り返し行う。
【００２０】
（種細胞の本培養区画への転送）
細胞剥離剤等の薬剤で処理した後、今度は、図５（５）のように細胞培養容器を左に傾けると、細胞を含んだ培地は、種培養区画１Ａの仕切壁１Ａ１を乗り越えて細胞回収区画１Ｃに流れ込み、さらに、細胞培養容器を垂直にした状態（図５（６）参照）にすると、細胞供給孔１Ｃ１を介して連通管１Ｄに一旦溜まるようになる。そして、再び細胞培養容器の姿勢を図５（７）に示すように、水平状態に戻すと、種細胞を含んだ培地は、本培養容器２の本培養区画２Ａに流下して供給されることとなる。
なお、細胞回収区画１ｃの容積は、培養溶液の量（容量）よりも約１．５倍程度大きくなるように設定されており、これにより細胞培養容器を図５（５）から図５（１）の状態に倒しても（戻しても）、培養液が元の場所に戻るのを回避できるようになっている。
【００２１】
さらに、本培養容器２において、上記種培養容器１で行ったと同様の培養操作を行い、使用済みの薬剤と古い培地は、細胞培養容器を右に傾けて仕切壁２Ａ２を乗り越えて排液区画２Ｂに流し込み、排液口２Ｂ１から外部に排出することができる。また、廃液を外部に排出した後、培地供給口２ｄや薬剤供給口２ｅから新しい培地や増殖促進剤等を投入し、培養を継続する。そして、本培養が終了した場合には、本培養容器２すなわち細胞培養容器を全体として左に傾けて仕切壁２Ａ１を乗り越えるように細胞回収区画２Ｃに流し込み、細胞回収口２Ｃ１から細胞を含んだ培地が、外部に取り出される。
【００２２】
また、種培養および本培養のプロセスにおいて、図２に示すように、オフセット配置された種培養容器１と本培養容器２の底部に、マイクロスコープ３Ａ、３Ｂを当接させて容器１，２底部に付着して、増殖する細胞の観察が可能であり、観察しながら培養を行うことができる。
【００２３】
本実施の形態によれば、一人の患者から接種した間葉系幹細胞等を培養し、相当量獲得するのに、一定時間毎の培地の交換や各種薬剤の添加を行いながら、種培養および本培養を実行するが、一体型細胞培養容器は、物質の移動を行うに際して重力作用を用いた方法で、これらの動作を行わしめるものである。このため、
培地供給口１ｄ、２ｄや薬剤供給口１ｅ，２ｅにチューブを連結しない状態で使用済みの薬剤や古い培地を排出したり、種培養容器１から本培養容器２に細胞を移したりすることができるので、細胞培養容器の取扱が簡単となり、無菌性維持を確保でき、滅菌処理に要するコストを安価にできるようになる。
【００２４】
なお、上記実施の形態では、細胞培養容器の材質をポリスチレンにした場合について説明したが、ポリスチレン以外の合成樹脂材や、透明ガラス材で形成したものであってもよい。この場合、種培養区画や本培養区画には、細胞の付着力を高めるような表面処理を適宜施すようにする。
また、上記実施の形態では、仕切壁１Ａ１，１Ａ２，２Ａ１，２Ａ２を底部から略垂直になるように形成したが、これらを互いに外側に拡がるように傾斜させることも可能である。また、接種口１ｃ、２ｃにはエアフィルター１ｂ、２ｂを一体に設けたが、この代わりにエアフィルター１ｂ、２ｂを接種口１ｃ、２ｃと別々に設けるように形成してもよい。
【００２５】
【発明の効果】
以上のように、請求項１記載の発明によれば、本培養容器の上に種培養容器が設けられているので、種培養容器で培養された細胞を、そのすぐ下に配置された本培養容器に、傾けたりして、重力の作用を利用しながら流下させることにより、移すことができるので、従来のようなチューブが途中で切れたり、外れたりして無菌性の維持を阻害するというようなことを回避し、また、細胞培養容器の取扱性を簡便にできる効果を奏する。
【００２６】
また、請求項２記載の細胞培養容器に係る発明によれば、上記請求項１記載の発明と同様に、種培養容器に種培養区画、排液区画、および細胞回収区画を設け、種培養容器の下部に設けられた本培養容器にも、同様に本培養区画、排液区画、および細胞回収区画を設ける一方で、種培養容器の細胞回収区画を本培養容器の本培養区画に連通しているので、種培養容器である程度の量に種細胞が増殖されるまでの間は、廃液は細胞培養容器全体を適宜の方向に傾けたりする操作をすることにより、使用済みの薬剤や古くなった培地を種培養容器の排液区画から本培養容器の排液区画を介して排液口から外部に排出できる。
【００２７】
そして、所定量の細胞が種培養容器の培養区画で種培養されたときには、種培養容器の種培養区画で培養された種細胞は、細胞剥離剤等の薬剤で処理した後、細胞培養容器を傾けることにより種培養容器の細胞回収区画から本培養容器の培養区画に流下させて移す。本培養容器に移された後の種細胞は、本培養容器の本培養区画で本培養される。その本培養の過程においては、本培養容器の外殻にある薬剤供給口等から投入される薬剤等の添加や培地の交換等により本培養される。本培養が完了するまでの過程においては、使用済みの廃液は、細胞培養容器全体を傾けたりして排液区画に流して排液口から外部に排出される。そして、本培養区画で本培養が終了すると、その本培養された細胞は、細胞剥離剤等の薬剤で処理した後、細胞培養容器全体を傾けて本培養容器の細胞回収区画に移し、細胞回収口から外部に取り出すようになる。
【００２８】
このように、請求項２記載の発明では、請求項１記載の発明と同様に、物質の重量作用を利用して、種細胞、培地、種々の薬剤等の流加の機構を形成したため、その構造が簡素に形成でき、そのてめ、細胞の培養作業を容易に行え、種培養から本培養する過程で、細胞を外部空気に触れないようにして培養できる機構であるため、培養容器に要する滅菌コスト、および廃液と細胞の分離回収を効率的に行なうことが可能となり、ひいては細胞培養に要するコストを全体として大幅に低減できるようになる。
そして、種培養容器を傾ける操作を行うことで、種細胞を本細胞容器の本細胞区画に無菌状態を維持しながら容易に移すことができ、細胞の培養を効率よく行える等の効果を奏する。
【００２９】
また、請求項３記載の発明によれば、種培養および本培養による培養過程において、マイクロスコープで細胞の培養状況を観察できるので、円滑に目的とする細胞を得ることができる効果を奏する。
【００３０】
この請求項４記載の発明によれば、ポリスチレン（透明の合成樹脂材）により種培養容器および本培養容器を形成しているので、例えば、紫外線照射やコロナ放電等によりその鏡面を、細胞の付着力を高めるような表面処理を行えるようになるので、細胞培養容器を傾けて廃液を排出する場合に、培養区画にある培養中の細胞が剥離して脱落することを回避できる効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る細胞培養容器全体の外観斜視図である。
【図２】図１の矢印ＩＩ方向から視た細胞培養容器の側面図で、特に種培養容器と本培養容器との配置関係を理解し易いように透視断面で示した側断面図である。
【図３】細胞培養容器の、外観構造を強調して示した外観斜視図である。
【図４】細胞培養容器の一部を破断して内部構造を理解し易いように示した一部破断外観斜視図である。
【図５】本実施の形態における細胞培養容器の細胞転送と薬剤廃棄のメカニズムを説明する作用説明図である。
【符号の説明】
１…種培養容器
１Ａ…種培養区画
１Ｂ…排液区画
１Ｃ…細胞回収区画
１Ｂ１…排液連絡孔
１Ｃ１…細胞供給口
１ａ、２ａ…上面の外殻
１Ａ１，１Ａ２…仕切壁
１Ｄ…連通管
２…本培養容器
２Ａ…本培養区画
２Ｂは排液区画
２Ｃ…細胞回収区画
２Ａ１，２Ａ２…仕切壁
２Ｂ１…排液口
２Ｃ１…細胞回収口
３Ａ、３Ｂ…マイクロスコープ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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