(57)【要約】【課題】角膜上皮細胞に対して選択的な増殖促進作用を発揮させることができることにより、種々の原因によって引き起こされる角膜上皮障害の治療にとりわけ有効な角膜障害治療剤を提供すること。【解決手段】α−トコフェリルレチノエートを含有することを特徴とする。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−トコフェリルレチノエートを含有することを特徴とする角膜障害治療剤。
【請求項２】
α−トコフェリルレチノエートを含有することを特徴とする角膜上皮障害治療剤。
【請求項３】
α−トコフェリルレチノエートを含有することを特徴とする角膜上皮細胞増殖促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の原因によって引き起こされる角膜上皮障害を伴う角膜障害に対してとりわけ有効な治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
角膜は眼の最前部に位置する無血管組織であり、透明性を維持しながら、外界の光を透過させるという重要な役割を担っている。また、外界の刺激や病原体の進入を防止するというバリア的な役割をも果たしている。角膜の構造は大きく分けて、外側から順に、角膜上皮層（５〜７層の上皮細胞から構成される）、ボーマン膜（角膜上皮層の基底膜）、角膜実質層（実質細胞とコラーゲン線維板、基質から構成される）、デスメ膜（内皮細胞の基底膜）、角膜内皮層（１層の内皮細胞からなる）からなる。
【０００３】
例えば、角膜ヘルペス、細菌性・真菌性角膜炎、春季カタル、シェーグレン症候群、スティーブン・ジョンソン症候群、眼球乾燥症候群（ドライアイ）、ビタミンＡまたはＢ２欠乏症等の疾患では角膜障害を伴うことがある。また、熱傷、外傷、アルカリ・酸等の化学物質、薬剤、紫外線、コンタクトレンズ装用、異物、睫毛、外気乾燥等による外的刺激により角膜が障害を受けることがある。さらに、角膜屈折矯正手術、白内障手術、眼内レンズ挿入手術、角膜移植手術、角膜異物除去手術、緑内障手術等のような角膜への外科的侵襲の場合にも角膜が障害を受けることがある。
このうち、角膜上皮が障害を受けて欠損したりした場合、その治癒過程においては、障害部周辺の上皮細胞が増殖を伴いながら進展移動し、上皮細胞の欠損部分を補う必要がある。角膜上皮細胞の増殖を促すことは、細胞の進展移動を推し進めると共に、角膜上皮層の修復をも促進するので、角膜のバリア的機能を早急に復元するために重要である。
従来から、種々の原因による角膜障害、特に角膜上皮障害に対する治療方法としては、角膜上皮細胞の進展促進作用を期待してヒアルロン酸点眼療法が適用されている。また、近年、角膜上皮細胞の進展促進作用に着目したフィブロネクチン点眼療法や増殖促進作用を期待したＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ：上皮細胞増殖因子）点眼療法等の治療方法も検討されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のいずれの療法も必ずしも満足できるに足る成果をあげているわけではなく、副作用の点においても解決すべき課題は多い。例えば、ＥＧＦ点眼療法は、角膜上皮細胞の増殖を促進することにより角膜障害を治療することを特徴とするものであるが、血管新生や発ガン性等が問題とされている。さらに、ＥＧＦは点眼剤の一般的な保存剤である塩化ベンザルコニウムによって不活化してしまうといった問題があり、実用面で多くの問題を抱えている。従って、角膜障害に対して安全で有効性の高い治療剤が望まれている。
また、角膜障害を引き起こす原因は多岐に渡り、その症状も様々であるため、その治療に際しては、標的組織や細胞を明確にした上で、それに適した治療剤を選択して使用することが本来望ましい姿と言える。しかしながら、今だそのような治療を行うことができる治療剤は実用に供されていないと言わざるを得ない。例えば、ＥＧＦ点眼療法は、ＥＧＦが角膜を構成する上皮細胞のみならず、実質細胞や内皮細胞にも増殖促進作用を示すことから、角膜の障害状態によっては、この療法を適用することが妥当でない場合もある。より具体的には、角膜上皮層のみに障害があるような場合、ＥＧＦ点眼療法を適用すれば、ＥＧＦは作用する必要がない角膜実質細胞の増殖をも促進させて角膜混濁を引き起こしたりして患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ）を低下させる恐れがある。このような点に鑑みれば、角膜上皮層は障害を受けやすいことから角膜上皮層のみに障害が起こる場合も多いので、角膜上皮に対して選択的に増殖促進作用を有する治療剤が切望されている。また、角膜障害が角膜実質層に及ぶ場合であっても、角膜上皮細胞を速やかに増殖させることは角膜組織の回復に有効であるので、角膜上皮細胞の増殖を促進する治療剤は価値が高いものである。
そこで本発明は、角膜上皮細胞に対して選択的な増殖促進作用を発揮させることができることにより、種々の原因によって引き起こされる角膜上皮障害の治療にとりわけ有効な角膜障害治療剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の点に鑑みて種々の検討を行った結果、α−トコフェロールとレチノイン酸（ビタミンＡ酸）とのエステルであり、皮膚疾患治療剤の有効成分等として知られているα−トコフェリルレチノエートに関し、これが角膜障害の治療に有効な化合物であることを見出すとともに、角膜上皮細胞に対して選択的な増殖促進作用を発揮させることができるという興味深い知見を得た。
【０００６】
本発明は上記の知見に基づいてなされたものであり、本発明の角膜障害治療剤は、請求項１記載の通り、α−トコフェリルレチノエートを含有することを特徴とする。
また、本発明の角膜上皮障害治療剤は、請求項２記載の通り、α−トコフェリルレチノエートを含有することを特徴とする。
また、本発明の角膜上皮細胞増殖促進剤は、請求項３記載の通り、α−トコフェリルレチノエートを含有することを特徴とする。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の角膜障害治療剤は、α−トコフェリルレチノエートを含有することを特徴とするものである。本発明によれば、安全性等が確認されており、化学的安定性にも優れたα−トコフェリルレチノエートを有効成分として、選択的な角膜上皮細胞増殖促進作用に基づく角膜上皮障害治療剤を提供することが可能となる。
α−トコフェリルレチノエートの眼科領域での使用に関しては、ＷＯ００／２１５２８において、α−トコフェリルレチノエートとビタミンＡを併用した眼科用医薬組成物が提案されており、両者を併用することで紫外線やオゾンから眼を保護することができる旨の記載がある。しかしながら、角膜の部位との関係におけるα−トコフェリルレチノエートの作用については何ら検討がなされておらず、当該作用は上記のような記載から想起できるものではない。また、Ａｍ．　Ｊ．　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．　９５：　３５３−３５８（１９８３）には、ビタミンＡ酸が実験的角膜上皮障害の治癒促進効果を有する旨の記載があるが、ビタミンＡ、ビタミンＡのパルミチン酸エステルや酢酸エステルには効果がないとされている。また、Ａｎｎ．　Ｏｐｈｙｔａｌ．　１９：　１７５−１８０（１９８７）には、ビタミンＡ軟膏が白内障の切開の治癒を増進する旨の記載があるが、ビタミンＡは化学的安定性に劣る。従って、このような公知の知見のもとでは、α−トコフェリルレチノエートが角膜障害の治療に有効な化合物であること、α−トコフェリルレチノエートに角膜上皮細胞に対して選択的な増殖促進作用を発揮させることができるということは全く驚きに値する事実である。
【０００８】
本発明の角膜障害治療剤の有効成分であるα−トコフェリルレチノエートは、前述の通り、α−トコフェロールとレチノイン酸とのエステルである。α−トコフェロールには、ＤＬ−α−トコフェロール、Ｄ−α−トコフェロールおよびＬ−α−トコフェロールが含まれ、レチノイン酸には、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、１１−ｃｉｓ−レチノイン酸、９−ｃｉｓ−レチノイン酸が含まれる。望ましいレチノイン酸は、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸および１３−ｃｉｓ−レチノイン酸である。特に望ましいα−トコフェリルレチノエートとしては、ＤＬ−α−トコフェロールとａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸とのエステル（トレチノイントコフェリル：Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ　１２ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｎｏ．９６３９）が挙げられる。
【０００９】
本発明の角膜障害治療剤は、例えば、点眼剤、眼軟膏剤、ゲル剤等の各種の製剤形態で提供される。中でも望ましい製剤形態としては点眼剤が挙げられる。これらの製剤は、有効成分であるα−トコフェリルレチノエートとともに、個々の製剤を調製する際に通常使用される緩衝剤、溶解補助剤、等張化剤、安定化剤、保存剤、粘稠剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、清涼化剤等の各種の添加剤を通常使用量において配合した眼科用医薬組成物からなる。添加剤について具体的に説明すると、緩衝剤としては、例えば、ホウ酸またはその塩（ホウ砂等）、クエン酸またはその塩（クエン酸ナトリウム等）、リン酸またはその塩（リン酸一水素ナトリウム等））、酒石酸またはその塩（酒石酸ナトリウム等）、グルコン酸またはその塩（グルコン酸ナトリウム等）、酢酸またはその塩（酢酸ナトリウム等）、各種アミノ酸またはそれらの組み合わせ等が挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０等）、ポリエチレングリコール（マクロゴール４０００等）、ポリオキシエチレンソルビタン高級脂肪酸エステル（ポリソルベート８０等）、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）−ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）ブロックコポリマー（ポロクサマー４０７等）、プロピレングリコール等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等）、糖類（マンニトール、グルコース等）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール等）等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、エデト酸ナトリウム、シクロデキストリン、亜硫酸塩、クエン酸またはその塩、ブチルヒドロキシトルエン等が挙げられる。保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、アルキル基の炭素数が１２の塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、ｐｏｌｙｑｕａｒｔｅｎｉｕｍ−１（商品名Ｐｏｌｙｑｕａｄ）、ｐｏｌｙａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｂｉｇｕａｎｉｄｅ（商品名Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　ＣＱ）、塩酸アルキルアミノエチルグリシン、塩化セチルピリジニウム、チメロサール等が挙げられる。粘稠剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー等が挙げられる。中でも、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コンドロイチン硫酸ナトリウムは、角膜の保湿や薬剤の滞留性の向上に寄与するので望ましい粘稠剤である。キレート剤としては、例えば、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、クエン酸またはその塩、ホウ酸またその塩、リン酸またはその塩、酢酸またはその塩、酒石酸またはその塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等���挙げられる。清涼化剤としては、例えば、メントール、ボルネオール、カンフル、ゲラニオール、リモネン、オイゲノール、ハッカ油、ユーカリ油、ウイキョウ油、ベルガモット油等が挙げられる。また、α−トコフェリルレチノエートの化学的安定性に配慮して、酢酸トコフェロールや亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤を添加することが望ましい。点眼剤を製造する際に用いることができる溶剤としては、滅菌精製水、精製水、生理食塩液、その他の適当な水性溶剤等が挙げられる。また、油性点眼剤に用いる非水性溶液としては、植物油（オリーブ油、大豆油、ごま油、綿実油等）、流動パラフィン、鉱物油、プロピレングリコール、ｐ−オクチルドデカノール等が挙げられる。眼軟膏剤の基剤としては、油性基剤（ワセリン、流動パラフィン、ゼレン５０Ｗ、プラスチベース等）、乳剤性基剤、水溶性基剤（ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、マクロゴール）等が挙げられる。ゲル剤には上記の成分の他、カラギーナン、ペクチン、グアヤガム、ジュランガム、寒天、アルギン酸ナトリウム、アルブミン、カードラン、キサンタンガム、ゼラチン等を添加することができる。なお、本発明の角膜障害治療剤を点眼剤として提供する場合における点眼剤のｐＨは眼科的に許容される範囲であれば特に制限はなく、通常ｐＨ４〜９の範囲であり、望ましくはｐＨ５〜８の範囲である。
【００１０】
所望する製剤は、有効成分であるα−トコフェリルレチノエートに、上記に挙げた緩衝剤、溶解補助剤、等張化剤、安定化剤、保存剤、粘稠剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、清涼化剤等、さらに適宜、他の成分を配合して常法通り眼科用医薬組成物を調製し、無菌環境下でこれを無菌ろ過し、適当な滅菌容器に充填して製造する。眼軟膏剤等のろ過できない製剤にあっては、無菌環境下で無菌的に操作する。滅菌容器は、製剤形態に応じて当該技術分野で通常用いられるものを用いることができるが、製剤安定性の確保等の点に鑑みれば、例えば、テフロン、シリコン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリアリレート等の素材からなる容器を用いることが望ましい。また、より高い製剤安定性を確保することを目的として、調製された眼科用医薬組成物を適当な滅菌容器に充填し閉塞した後、脱酸素剤とともに実質的に酸素を透過しない包装体に封入してもよい。実質的に酸素を透過しない包装体としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニリデン等のような合成樹脂フィルムをアルミニウム箔にラミネートしたフィルムで構成された袋状や筒状のものを用いることが望ましいが、実質的に酸素を透過しない素材からなる密閉可能なものであればいずれも便宜に用いることができる。
【００１１】
本発明の角膜障害治療剤におけるα−トコフェリルレチノエートの配合量は、通常、製剤当たり、０．００００１重量部〜１０重量部、望ましくは、０．００００５重量部〜５重量部、より望ましくは０．０００１重量部〜１重量部である。その適用に当たっては、１日１回〜数回にわたって点眼や塗布すればよい。その使用量は、症状の程度や患部の大きさに応じて決められる。
【００１２】
本発明の角膜障害治療剤には、必要に応じて種々の薬学的有効成分、例えば、充血除去剤（塩酸ナファゾリン、塩酸テトラヒドロゾリン、塩酸フェニレフリン等）、メチル硫酸ネオスチグミン、消炎・収斂剤（イプシロン−アミノカプロン酸、アラントイン、塩化ベルベリン、硫酸亜鉛、塩化リゾチーム等）、抗ヒスタミン剤（塩酸ジフェンヒドラミン、塩酸イソチペンジル、マレイン酸クロルフェニラミン等）、脂溶性ビタミン類［活性型ビタミンＥ、ビタミンＡ］、水溶性ビタミン類［活性型ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２］、アミノ酸類（Ｌ−アスパラギン酸カリウム、Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム、アミノエチルスルホン酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム等）、サルファ剤、殺菌剤（イオウ、イソプロピルメチルフェノール、ヒノキチオール等）、局所麻酔剤（リドカイン、塩酸リドカイン、塩酸プロカイン、塩酸ジブカイン等）、糖類（グルコース等）等を適宜配合することができる。
【００１３】
【実施例】
本発明を以下の実験と実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１４】
実験その１：角膜上皮細胞へのトレチノイントコフェリルの作用
２４ウェル培養プレート上に、正常ウサギ角膜上皮細胞（ＮＲＣＥ）を２×１０４個／ウェルで播種し、培養液としてウサギ角膜上皮細胞用培地（ＲＣＧＭ：クラボウ社製）を使用し、３７℃，５％ＣＯ２条件下で培養した。２４時間後、未接着細胞とともに培養液を除去してから、１０−８，１０−７，１０−６および１０−５Ｍのトレチノイントコフェリルを含む培養液を各ウェルに加え、さらに７２時間培養した。培養終了後、トレチノイントコフェリルを含む培養液を除去してから、新たに培養液を各ウェルに加え、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ−８（同人化学社製）を使用して細胞数を測定した。結果を図１に示す。
【００１５】
実験その２：角膜実質細胞へのトレチノイントコフェリルの作用
日本白色種家兎より摘出した角膜より、上皮および内皮組織を取り除いた角膜実質組織片を、１０００Ｕ／ｍｌのディスパーゼ（合同酒精社製）にて３７℃で６０分間酵素処理し、角膜実質細胞を単離した。２４ウェル培養プレート上に、単離した角膜実質細胞を２×１０４個／ウェルで播種し、培養液としてウシ胎児血清（インビトロジェン社製）を２％添加したイーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）を使用し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。２４時間後、未接着細胞とともに培養液を除去してから、１０−８，１０−７，１０−６および１０−５Ｍのトレチノイントコフェリル、もしくは１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）を含む培養液を各ウェルに加え、さらに７２時間培養した。培養終了後、トレチノイントコフェリルもしくはＥＧＦを含む培養液を除去してから、新たに培養液を各ウェルに加え、実験その１と同様にして細胞数を測定した。結果を図２に示す。
【００１６】
実験結果：
図１と図２から明らかなように、トレチノイントコフェリルは、１０−８Ｍ以上の溶液濃度で濃度依存的に角膜上皮細胞増殖促進作用を示した。一方、トレチノイントコフェリルは、１０−８Ｍ以上の溶液濃度であっても角膜実質細胞には増殖促進作用を示さなかった。以上の結果より、トレチノイントコフェリルは、角膜上皮細胞に対して選択的な増殖促進作用を発揮することができることから、角膜上皮障害を伴う角膜障害の治療に有用であることがわかった。
【００１７】
実施例１〜実施例８：
表１に示す処方の配合成分を精製水に溶解し、必要に応じて０．１Ｎ塩酸および０．１Ｎ水酸化ナトリウムを適量加えて所定のｐＨに調整した後、全量を１００ｍｌにした。得られた水溶液を無菌環境下でろ過滅菌し、洗浄滅菌済み点眼薬容器に充填し、無色澄明な点眼剤を得た。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
実施例９：
トレチノイントコフェリル０．１ｇをとり、流動パラフィンで研和泥状とした後、眼科用白色ワセリンを徐々に加えて練合し、全質均等として全量１００ｇとした。得られた眼軟膏を、滅菌した軟膏チューブに充填した。以上の操作は無菌環境下で無菌的に行った。
【００２０】
【発明の効果】
本発明によれば、角膜上皮細胞に対して選択的な増殖促進作用を発揮させることができることにより、種々の原因によって引き起こされる角膜上皮障害の治療にとりわけ有効な角膜障害治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例におけるトレチノイントコフェリルの角膜上皮細胞に対する作用を示すグラフである。
【図２】実施例におけるトレチノイントコフェリルの角膜実質細胞に対する作用を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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