(57)【要約】      （修正有）【課題】豚萎縮性鼻炎予防用のワクチン等の医薬品組成物の主成分に利用するため、毒素活性を完全に消失し、かつ豚に対する免疫原性を保持する無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素とその製造法を提供する。【解決手段】パスツレラ・ムルトシダ毒素（ＰＭＴ）の特定のアミノ酸配列の１１６４番目に位置するセリンおよび１１６５番目に位置するシステインを他のアミノ酸に置換することにより、完全に無毒化された変異型ＰＭＴを提供できる。本成分は遺伝学的手法により大量に発現でき、提供した製造方法により精製が可能となる。この無毒変異型ＰＭＴは、豚の萎縮性鼻炎の予防のためのワクチンの主成分として利用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるパスツレラ・ムルトシダ毒素のポリペプチド中、１１６４番目に位置するセリンおよび１１６５番目のシステインを他のアミノ酸と置換したことを特徴とする、毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有する無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素。
【請求項２】
配列番号４で表されるポリペプチドであることを特徴とする毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有する無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素。
【請求項３】
請求項１または請求項２の無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素のポリペプチド中の毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有する領域からなることを特徴とするパスツレラ・ムルトシダ毒素由来部分ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１で表されるパスツレラ・ムルトシダ毒素のポリペプチド中、１１６４番目に位置するセリンおよび１１６５番目のシステインを他のアミノ酸と置換することを特徴とする、毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有する無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素の製造方法。
【請求項５】
１１６４番目に位置するセリンを置換するアミノ酸がアラニンであり、１１６５番目のシステインを置換するアミノ酸がセリンであることを特徴とする請求項４に記載の無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素の製造方法。
【請求項６】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドをコードする遺伝子。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有するポリペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列中の毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有する領域からなることを特徴とするパスツレラ・ムルトシダ毒素由来部分ポリペプチド
【請求項７】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【請求項８】
以下の（ａ）または（ｂ）の組換えタンパク質。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有するタンパク質
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列中の毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有する領域からなることを特徴とするパスツレラ・ムルトシダ毒素由来部分ポリペプチド
【請求項９】
請求項６または請求項７に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターにより請求項８に記載の組換えタンパク質を生産するように形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を培養し、形質転換体に請求項８に記載の組換えタンパク質を生成することを特徴とする無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素の製造方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の組換えタンパク質を有効成分とすることを特徴とする豚萎縮性鼻炎用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、豚萎縮性鼻炎の原因毒素であるパスツレラ・ムルトシダ毒素の一部のアミノ酸を遺伝子工学的に置換して作製した無毒変異型毒素に関する。更に詳細には、免疫したときに豚の萎縮性鼻炎を予防するワクチン等の医薬品組成物を提供するための免疫原としての無毒変異型毒素と、その製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
【非特許文献１】
Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ．ａｌ，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．，  ５９，  １３８７−１３９３，  １９９１
【非特許文献２】
Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．，  ５５，  １２８−１３８，  １９９１
【非特許文献３】
Ｗ  ａｒｄ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．，  ５６３６−５６４２，  １９９８
【０００３】
豚の萎縮性鼻炎は、鼻甲介の萎縮または変形を主徴とする慢性疾病であり、養豚業に多大な経済的損失をもたらしている。本病の原因は、グラム陰性細菌であるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（Ｂｂ）および毒素産生Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ（ｔＰｍ）の混合、またはそのいずれかの感染により呼吸器系に異常を生じ、続いて発育の遅延、飼料効率の低下、二次感染の誘発などしばしば重大な経済的損失をもたらす。我が国における本病の罹患率も高い。
【０００４】
なかでもｔＰｍの産生するパスツレラ・ムルトシダ毒素（以下「ＰＭＴ」と略称する）は本症の重要な発病要因となっている。ＰＭＴは分子量１４６  ｋＤａの１２８５個のアミノ酸からなるタンパク質（配列番号１）で、強い毒性をもち、各種培養細胞に対して強い細胞変性効果をもたらす。マウス、モルモットなどの各種動物に静脈あるいは筋肉内に注射すると致死させる。また、モルモットの背部皮下に接種すると２〜３日で接種部位に壊死斑が形成され、毒素量の定量にしばしばこの反応が利用される。宿主である豚に毒素を注射すると、高濃度では豚は致死し、低濃度では野外症例でみられるのと同様の鼻甲介萎縮や鼻中隔の変形が認められる。この鼻甲介病変の形成は、毒素の作用により破骨細胞が活性化されることによる骨吸収の異常亢進に起因すると考えられている。
【０００５】
ＰＭＴを主因とする豚の萎縮性鼻炎を予防するためには、豚群にＰＭＴに対する十分な免疫を賦与することが有効である。我が国においても、ＰＭＴを化学的に修飾することにより無毒化した成分（トキソイド）を含有する数種類のワクチンが市販されており、本病の予防に広く用いられている。しかし、このｔＰ  ｍの産生するＰＭＴは少量で、精製工程を経て純粋なＰＭＴを十分量得ることは極めて困難である。また、ＰＭＴの毒素活性を保持した菌を大量に培養し、さらに種々の操作を経て毒素を大量に調製する作業には大変な危険を伴う。
【０００６】
そこで、遺伝子工学的手法を用いることによって毒素分子自体のアミノ酸配列を変化させ、無毒でかつ免疫原性を保持した新規な分子の探索が各国の研究者により行われた。ＰｅｔｅｒｓｅｎらはＰＭＴに存在する構造遺伝子の５’末端側に存在する２つの制限酵素Ｂｃｌ  Ｉ切断部位を利用してこの間を欠損させ、Ｎ末端近傍領域に存在する１２１アミノ酸を欠失させた変異型ＰＭＴを作出した（非特許文献１）。この分子は毒性を消失し、免疫原性を保持していることが確認された。
【０００７】
Ｎｉｅｌｓｅｎらはこの分子をワクチンの成分に応用したところ、既存のホルマリンで不活化したＰＭＴと同等の有効性が示されることが確認された（非特許文献２）。しかし、この欠損変異型ＰＭＴは、アミノ酸を欠失しているためＰＭＴトキソイドを上回るほどの免疫原性は得られず、またその産生量も野生型のＰＭＴに比べると多いが、まだ十分ではなかった。
【０００８】
このため、分子全体の大きさを変化させることなく、特定のアミノ酸の置き換えによる変異型ＰＭＴの作出が試みられた。Ｗａｒｄらは１１６５番の位置に存在するシステインをセリンに置き換えたとき、培養細胞および豚への接種試験により毒性が認められなかったと報告した（非特許文献３）。しかしながら、本発明者らがこの変異型ＰＭＴをモルモットに皮内に注射したところ、弱いながらも注射部位に壊死斑の形成が認められ、無毒化は完全ではなかった。また、この変異型ＰＭＴの免疫原性は、現在のところ調べられていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
以上の経緯から、モルモットの皮内に接種しても接種局所に異常の認められない、完全に無毒化された変異型ＰＭＴを作出する必要があった。その際、このアミノ酸置換により免疫原性が損なわれないことが、豚萎縮性鼻炎用ワクチンの成分として利用するための必須条件となる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の問題点に鑑み、アミノ酸置換によって完全に無毒となる変異型ＰＭＴを成分とする有効なワクチン及びその製造法を提供することを目的として、遺伝子工学的手法によりＰＭＴの１１６４番目のセリンと１１６５番目のシステインの２箇所を他のアミノ酸に置換することにより、モルモットの皮下注射によってもまったく毒性の認められない、完全な無毒変異型ＰＭＴを作出することに成功した。さらに、精製した本無毒変異型ＰＭＴをワクチンの成分として注射された豚では、野生型のＰＭＴの攻撃に対して完全に本病の発症を阻止できることを見いだし、本発明に至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下を要点とするものである。
【００１２】
（１）  配列番号１で表されるパスツレラ・ムルトシダ毒素のポリペプチド中、１１６４番目に位置するセリンおよび１１６５番目のシステインを他のアミノ酸と置換したことを特徴とする、毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有する無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素。
【００１３】
（２）  配列番号４で表されるポリペプチドであることを特徴とする毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有する無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素。
【００１４】
（３）  上記１項または上記２項の無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素のポリペプチド中の毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有する領域からなることを特徴とするパスツレラ・ムルトシダ毒素由来部分ポリペプチド。
【００１５】
（４）  配列番号１で表されるパスツレラ・ムルトシダ毒素のポリペプチド中、１１６４番目に位置するセリンおよび１１６５番目のシステインを他のアミノ酸と置換することを特徴とする、毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有する無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素の製造方法。
【００１６】
（５）  １１６４番目に位置するセリンを置換するアミノ酸がアラニンであり、１１６５番目のシステインを置換するアミノ酸がセリンであることを特徴とする請求項４に記載の無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素の製造方法。
【００１７】
（６）  以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドをコードする遺伝子。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有するポリペプチド
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列中の毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有する領域からなることを特徴とするパスツレラ・ムルトシダ毒素由来部分ポリペプチド
【００１８】
（７）  以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【００１９】
（８）  以下の（ａ）または（ｂ）の組換えタンパク質。
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有するタンパク質
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列中の毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有する領域からなることを特徴とするパスツレラ・ムルトシダ毒素由来部分ポリペプチド
【００２０】
（９）  上記６項または上記７項に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
【００２１】
（１０）  上記９項に記載の発現ベクターにより上記８項に記載の組換えタンパク質を生産するように形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【００２２】
（１１）  上記１０項に記載の形質転換体を培養し、形質転換体に上記８項に記載の組換えタンパク質を生成することを特徴とする無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素の製造方法。
【００２３】
（１２）  上記８項に記載の組換えタンパク質を有効成分とすることを特徴とする豚萎縮性鼻炎用ワクチン。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明において、毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有するパスツレラ・ムルトシダ毒素（以下、「無毒変異型ＰＭＴ」と略称する）は、配列番号１に示すアミノ酸数１８２５のＰＭＴのポリペプチド中、１１６４番目のセリンおよび１１６５番目のシステインを他のアミノ酸に置換したＰＭＴの変異体である。
【００２５】
置換するアミノ酸は、変異ＰＭＴが毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有するものであればよく、例えばＰＭＴの１１６４番目のセリンおよび１１６５番目のシステインを、それぞれをセリンおよびアラニンに置換した変異体が好ましい。
【００２６】
好ましい無毒変異型ＰＭＴのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００２７】
この無毒変異型ＰＭＴは、毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有するものであれば、上記２アミノ酸に加えて他のアミノ酸を１ないし複数個置換した変異体を含み、また、これらの変異を含むＰＭＴの分子全体であってもよいし、一部に付加や欠失のある変異体であってもよい。
【００２８】
詳細には、上記１１６４番目および１１６５番目のアミノ酸は、本毒素の活性中心に位置し、この２アミノ酸の変異は本毒素の無毒化と免疫原性の保持に必須である。けれども、毒素分子中の他の部位に位置するアミノ酸については、その置換、欠失、または付加によっても毒素の構造や機能に影響を及ぼさない箇所も存在する。従って、上記の特定２アミノ酸に加え、そのような本毒素の生物活性と無関係なアミノ酸の置換、付加または欠失した変異体であってもよい。
【００２９】
あるいは、毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有する領域を含むポリペプチドであれば、上記変異体ＰＭＴの部分ポリペプチドであってもよい。
【００３０】
詳細には、本毒素中、上記１１６４番目および１１６５番目のアミノ酸を中心とした周辺数十アミノ酸の領域が活性中心と考えられている。従って、本領域を含む部分ポリペプチドにおいても免疫原性を示すものもあることが予想され、そのような部分ポリペプチドにおいても、上記特定２アミノ酸を置換した変異体は、本特許に包含される。
【００３１】
本発明の無毒変異型ＰＭＴおよびその部分ポリペプチドは、それらをコードする遺伝子から翻訳されたものであってもよいし、化学合成法等によって生産されるものであってもよい。
【００３２】
請求項１ないし３に記載のタンパク質をコードする遺伝子は、他の部位に変異を含むものであってもよいし、一部に付加や欠失のあるもの、あるいはこれらの変異を含む部分断片であってもよい。これらの塩基配列は化学合成法、ＤＮＡ複製法などいずれの方法によって得たものであってもよい。請求項２の無毒変異型ＰＭＴをコードする遺伝子の具体的態様としては、配列番号３に示される塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。この塩基配列中のコーディング領域（配列番号２に示す配列）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例を示している。本発明の遺伝子は、かかる特定の遺伝子に限らず、各アミノ酸に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配列を有することもできる。
【００３３】
請求項１ないし３に記載のタンパク質をコードする遺伝子は、例えば５０％にホルムアルデヒドを含むハイブリダイゼーション用溶液中で、３７℃下といったストリンジェントな条件下で、配列番号２のＤＮＡとハイブリダイズする遺伝子を例示することができる。
【００３４】
本発明の無毒変異型ＰＭＴまたは無毒変異型ＰＭＴ由来部分ポリペプチドは、上記無毒変異型ＰＭＴをコードする遺伝子を用いて、遺伝子組換え技術により当該タンパク質を大量に生産することができる。
【００３５】
すなわち、請求項６または請求項７に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクターを調製して、該発現ベクターにより無毒変異型ＰＭＴまたはその部分ポリペプチドを生産するように形質転換した形質転換体を培養し、該形質転換体に無毒変異型ＰＭＴまたはその部分ポリペプチドを生成することにより、無毒変異型ＰＭＴを製造することができる。
【００３６】
上記の形質転換体は、例えば無毒変異型ＰＭＴまたはその部分ポリペプチドの生産細胞として作出することができる。
【００３７】
すなわち、宿主細胞がＣＨＯ細胞、ＢＨＫ―１細胞およびＨｅｌａ細胞等の真核細胞の場合には、例えば請求項１ないし３に示した無毒変異型ＰＭＴのアミノ酸配列をコードする請求項６または７のＤＮＡ断片をウイルス等のプロモーターと結合させ、真核細胞を形質転換させて無毒変異型ＰＭＴ生産細胞を作出することができる。また、バキュロウイルス等の組み換えウイルスベクターを用いた場合は、例えばＳｍｉｔｈらの方法（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．，  ３，  ２１５６−２１６５）に基づいて、組換えウイルスベクターを作出することができる。すなわち、無毒変異型ＰＭＴまたはその部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片をバキュロウイルスＤＮＡとともに昆虫細胞に導入し、得られた組換えバキュロウイルスの中から無毒変異型ＰＭＴを生産する組換えウイルスクローンを選択し、その組換えクローンを昆虫細胞に感染させ、無毒変異型ＰＭＴ生産細胞を作出することができる。また、該組換えクローンを昆虫に感染させて無毒変異型ＰＭＴを産生する昆虫を作出することができる。
【００３８】
また、宿主細胞が大腸菌、枯草菌等の原核生物である場合は、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＱＥ９、ｐＥＴ１６およびｐＵＢ１１０等の適当な発現ベクターに無毒変異型ＰＭＴまたはその部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を連結し、大腸菌等の原核細胞を形質転換させて無毒変異型ＰＭＴ産生細胞を作出することができる。この際、他のタンパク質との融合タンパク質として発現するようなベクターを選択してもよい。
【００３９】
これらの遺伝子組換え操作は既知の方法によって行えばよく、特に限定されない。遺伝子操作技術・細胞工学技術によって、例えばシグナル配列の付加や宿主−ベクター系の好適選択、遺伝子の発現制御部位の改良等により発現効率の調節などを図ることができる。このような操作はサムブロックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）等により述べられた既知の遺伝子操作技術・細胞工学技術にしたがって行う事ができる。
【００４０】
上記アミノ酸を有する無毒変異型ＰＭＴあるいはその部分ポリペプチドの発明によれば、これを有効成分として含有するワクチン等の動物用医薬品組成物を提供でき、ｔＰｍの感染により生ずる豚萎縮性鼻炎の発症を阻止するためのワクチンとして、有効に用いることができる。
【００４１】
本発明の配列番号３で表される無毒変異型ＰＭＴは以下の方法により得られる。
【００４２】
例えば、野生型ＰＭＴの１１６４番目のセリンをアラニンに、１１６５番目のシステインをセリンに変異させるための約３０塩基対の変異導入用のＤＮＡプライマー（主鎖および相補鎖）を合成する。例えば１１６４および１１６５番目のアミノ酸を含む野生型ＰＭＴ遺伝子の３  ’末端領域の約７００ｂｐのＤＮＡ断片をテンプレートとし、これらのプライマーとそれぞれベクター由来の例えばＭ３０−ＵｎｉｖｅｒｓａｌおよびＭ３０−Ｒｅｖｅｒｓａｌプライマーを用い、変異部分を挟んだ３  ’側および５  ’側の断片をそれぞれＰＣＲ反応により増幅させる。さらにこの３  ’側および５  ’側の断片を混合して、再度例えばＭ３０−ＵｎｉｖｅｒｓａｌおよびＭ３０−Ｒｅｖｅｒｓａｌプライマーを用いて増幅すると、変異導入用プライマーの配列を含んだＰＭＴ遺伝子の３  ’末端領域の約０．７  ｋｂｐのＤＮＡ断片を得ることができる。
【００４３】
この断片を、制限酵素切断部位を用いた通常の遺伝子クローニングにより、作製した当該ＤＮＡ断片を野生型のＰＭＴ遺伝子の３  ’末端領域の約０．７  ｋｂｐの同断片と置き換えると、変異導入用プライマーを含む完全長のＰＭＴ遺伝子を得ることができる。当該部分のみに変異があり、他の部分の塩基配列には変化がないことは、作製された変異型ＰＭＴをコードする遺伝子の全塩基配列を調べることにより確認することができる。
【００４４】
本遺伝子は、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）といったような市販の発現ベクターに挿入し、大腸菌Ｋ１２由来の派生株に導入することにより、変異型ＰＭＴを発現するための形質転換体を作製することができる。この形質転換体は例えば１ｍＭ  のＩＰＴＧ下で４時間培養する等の方法でベクターのプロモーターによる転写活性化を行い、大腸菌の菌体内に大量の変異型ＰＭＴタンパク質またはその部分ポリペプチドを生産することができる。
【００４５】
この大腸菌を例えば超音波処理等の方法により菌体を破砕し、その遠心上清に変異型ＰＭＴタンパク質を抽出することができる。この抽出タンパク質を、例えば０．０２Ｍ  のリン酸緩衝液で透析し、ＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｃｅｌ等による陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、０．１Ｍ〜０．６Ｍ  ＮａＣｌによる連続濃度勾配液で溶出することにより、変異型ＰＭＴタンパク質を単離・精製することができる。
【００４６】
このようにして精製された変異型ＰＭＴタンパク質の０．２ｍＬ  をモルモットの背部皮下に注射しても注射局所に変状は認められず、また、マウスの腹腔内に注射しても動物は致死しない。このように、作製された変異型ＰＭＴが完全に無毒となっていることは、動物への接種試験により確認することができる。
【００４７】
当該変異型ＰＭＴタンパク質の例えば１６マイクログラム量を、水酸化アルミニウムゲルアジュバントとともに豚の筋肉内に３週間隔で２回免疫し、最終免疫後２週に野生型ＰＭＴを筋肉内に注射することにより攻撃を行う。対照豚は非免疫とし、毒素による攻撃のみを行う。すると、非免疫対照豚は攻撃後約３週には鼻甲介に顕著な萎縮性鼻炎の病変を形成するが、変異型ＰＭＴで免疫した豚には、このような病変は認められない。また、この時採血した血清について抗体検査を行うと、免疫豚には野生型ＰＭＴと反応する抗体が産生されていることがわかる。
【００４８】
このように、上記方法により作製した無毒変異型ＰＭＴまたはその部分ポリペプチドは、毒素活性をまったく示さず、豚に対して高度な免疫原性を示すことから、豚萎縮性鼻炎を予防するためのワクチン等の医薬品組成物の主成分として利用することができる。
【００４９】
【実施例】
以下、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【００５０】
（１）ＰＭＴ遺伝子への部位特異変異の導入
ＰＭＴ遺伝子の所定部位のアミノ酸を置換するため、次のようなプライマーの設計を行った。
【００５１】
野生型のＰＭＴ遺伝子の中の塩基番号３４８０番目から３５０９番目までの３０塩基の配列はｇ，ｇａａ，ｇｃｔ，ｇｇｃ，ｔｃｔ，ｔｇｔ，ｇａｔ，ｔｃａ，ｇｔａ，ａｇｃ，ｃｃで、この配列から翻訳されるアミノ酸配列はＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（１１６１番目〜１１７０番目）である。この内の１１６４番目のＳｅｒ（セリン）をＡｌａ（アラニン）に、１１６５番目のＣｙｓ（システイン）Ｓｅｒ（セリン）に変異させるために、変異誘導用プライマー（配列番号４）ｇ，ｇａａ，ｇｃｔ，ｇｇｃ，Ｇｃｔ，ＡｇＣ，ｇａｔ，ｔｃａ，ｇｔａ，ａｇｃ，ｃｃと（ＰＭＴ−Ｍ−Ｆ）とその相補配列（配列番号５）ｇｇ，ｇｃｔ，ｔａｃ，ｔｇａ，ａｔｃ，ＧｃＴ，ａｇＣ，ｇｃｃ，ａｇｃ，ｔｔｃ，ｃ（ＰＭＴ−Ｍ−Ｒ）の２種類のプライマーを作製した。これらの変異プライマーによってコードされるアミノ酸配列はＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏとなる。また、これらの塩基の置換によって、変異プライマー内に制限酵素ＮｈｅＩで切断される新たな制限酵素切断部位が形成される。
【００５２】
これらのプライマーを用いて実際のＰＭＴ遺伝子に変異を導入するため、遺伝子の３’末端領域部位である塩基番号３３９１のＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位から３’末端までの約０．７  ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のマルチクローニングサイト内のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ制限酵素切断部位に挿入した。
【００５３】
このＰＭＴ遺伝子の３’末端部分をテンプレートとして、ベクター由来のＭ３０  −２０  ＲｅｖｅｒｓａｌプライマーとＰＭＴ遺伝子変異用プライマーＰＭＴ−Ｍ−Ｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いたＰＣＲ反応、およびＰＭＴ遺伝子変異用プライマーＰＭＴ−Ｍ−Ｆ  ＦｏｒｗａｒｄプライマーとＭ３０  −２０  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマーを用いた２つのＰＣＲ反応を常法に従って実施した。次に、これら２つのＰＣＲ反応により得られた反応液のそれぞれ２μＬずつを混合し、あらたに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰおよび反応用緩衝液を加え、さらにＭ３０  −２０  ＲｅｖｅｒｓａｌプライマーとＭ３０  −２０  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマーを追加して二次ＰＣＲ反応を行った。その結果、変異前のＤＮＡ断片と同じ大きさである約０．７  ｋｂｐの塩基長をもつＤＮＡ断片が増幅された。この断片中には元の断片には存在しなかった制限酵素ＮｈｅＩ切断部位が存在したことから、変異に用いたプライマーと同じ配列がこの０．７  ｋｂｐ断片に導入されている可能性が示された。
【００５４】
そこで、このＤＮＡ断片をオリジナルなＰＭＴ遺伝子の同部分と置き換える目的で、オリジナルＰＭＴ遺伝子をＥｃｏＲＩとＳａｃＩの制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化した約０．７  ｋｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って挿入した。このようにして、元のＰＭＴ遺伝子の３’末端部位を、上記変異ＤＮＡ断片に置き換えた変異型ＰＭＴ遺伝子（配列番号２）を作出した。
【００５５】
このようにして作製された変異型ＰＭＴ遺伝子の中に、はじめに用いた変異導入用プライマーと同じ配列が存在するか確認するため、ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＡＲ社製  ３１０型自動塩基配列決定装置を用いて本遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果、変異型ＰＭＴ遺伝子の塩基番号３４８０番目から３５０９番目の配列は確かにｇ，ｇａａ，ｇｃｔ，ｇｇｃ，Ｇｃｔ，ＡｇＣ，ｇａｔ，ｔｃａ，ｇｔａ，ａｇｃ，ｃｃとなっており、その他の部分に変異は認められなかった。このようにして、１１６４番目のＳｅｒ（セリン）をＡｌａ（アラニン）に、１１６５番目のＣｙｓ（システイン）をＳｅｒ（セリン）に置換した変異型ＰＭＴ（配列番号３）をコードする遺伝子を作出することができた。
【００５６】
（２）変異型ＰＭＴの精製
変異型ＰＭＴの毒性や免疫原性等の性状を確認するため、オリジナル（野生型）および変異型ＰＭＴを発現する組換え大腸菌からのそれぞれのタンパク質の精製を行った。
【００５７】
野生型または変異型のＰＭＴ遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ    ＫＳ（＋）ベクターに組み込み、これを大腸菌Ｋ１２の派生株であるＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に導入した。各遺伝子を含む組換え大腸菌は、１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ培地を用いて、３７℃で４時間振盪培養することにより各タンパク質の発現を行った。発現培養後、大腸菌を遠心・集菌し、超音波破砕装置（Ｂｒａｎｓｏｎ社製  Ｓｏｎｉｃ  Ｐｏｗｅｒ）で約５分間処理することにより菌体を破砕した。これを１０，０００  ×  ｇで２０分間遠心分離し、回収した上清に５０％飽和となるよう硫酸アンモニウムを加え、タンパク質を塩析した。これを１０，０００  ×  ｇで２０分間遠心して沈渣を回収し、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解した。本液を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）にて一夜透析後、カラムクロマトグラフィーに供した。
【００５８】
クロマトグラフィーの担体には、陰イオン交換体であるＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｃｅｌ（ファルマシア社製）を用い、これを直径４０  ｍｍ、高さ５０  ｃｍのガラスカラムに充填した。上記試料を添加し、カラムを洗浄して未吸着分画を排出し、０．１Ｍ〜０．６Ｍ  ＮａＣｌの連続濃度勾配液により溶出を行った。分画された溶出液のタンパク質の最終ピーク部分を回収し、これをポリエチレングリコール８０００（和光純薬社製）を用いて、約３０ｍＬとなるまで濃縮した。
【００５９】
野生型と変異型のＰＭＴについて、それぞれ上記クロマトグラフィーにより回収した分画（ピーク１、ピーク２および回収フラクション）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）により分析した（図１）。その結果、今回作製した変異型ＰＭＴは、野生型ＰＭＴと同じ分画に溶出された。また、各分画は分子量約１４６  ｋＤａの単一のタンパク質を含んでいた。このことから、変異型ＰＭＴは野生型と同じく、本方法により精製が可能であることが示された。
【００６０】
（３）変異型ＰＭＴの毒素活性
変異型ＰＭＴの毒素活性について、モルモット皮内接種による皮膚壊死毒素活性およびマウスの腹腔内接種による致死活性をそれぞれ調べた。
モルモット皮膚壊死活性の測定には、体重約３５０  ｇのハートレー系のモルモットを使用した。野生型ＰＭＴ（８０μｇタンパク量／ｍＬ）および変異型ＰＭＴ（３４μｇタンパク量／ｍＬ）をリン酸緩衝食塩液で階段希釈し、モルモットの背部皮内に０．２  ｍＬずつ注射した。注射後２日目に注射部位に形成された壊死斑を観察した。その結果を表１に示す。
【００６１】
【表１】
2004242608.tif 000002
【００６２】
表１に示した結果から明らかなとおり、モルモット皮膚壊死活性については、野生型ＰＭＴでは１６０倍希釈まで壊死斑の形成が認められたのに対し、変異型ＰＭＴでは原液においても壊死斑の形成は認められなかった。このように、変異型ＰＭＴにおいてモルモット皮膚壊死活性は消失しているものと考えられた。
【００６３】
マウス致死活性の検査には、４週齢のｄｄＹマウス５０匹を使用した。野生型ＰＭＴおよび変異型ＰＭＴをマウス１匹あたり１ｍｇ、１００μｇ、１０μｇ、１μｇおよび１００  ｎｇとなるよう調整し、各タンパク量当り５匹のマウスの腹腔内に接種した。接種後１週間観察し、生死を判定した。その結果を表２に示す。
【００６４】
【表２】
2004242608.tif 000003
【００６５】
表２に示した結果から明らかなように、マウス致死活性については、野生型ＰＭＴでは、１ｍｇおよび１００μｇ注射群では５頭中全頭が、１０μｇ注射群では５頭中１頭が死亡した。一方、変異型ＰＭＴでは、最高量の１ｍｇ注射群においても死亡は認められなかった。本成績からＬＤ５０（５０％致死量）は、野生型ＰＭＴで２０μｇタンパク量であったのに対して、変異型ＰＭＴでは３２００μｇタンパク量以上と計算された。このように、変異型ＰＭＴはマウス致死活性を示さなかった。
【００６６】
以上の成績から、変異型ＰＭＴではモルモットの皮膚壊死活性およびマウスの致死活性のいずれも検出されず、当該部位のアミノ酸置換により、毒素活性を完全に消失することが判明した。
【００６７】
（４）変異型ＰＭＴの免疫原性
作製された無毒変異型ＰＭＴが豚に対する免疫原性を保持しているかどうかを調べるため、無毒変異型ＰＭＴで免疫した豚を野生型ＰＭＴで攻撃することにより、その防御効果を調べた。
【００６８】
約５週齢のＢｂおよびｔＰｍフリー豚５頭を用いた。３頭は免疫群とし、１回あたり無毒変異型ＰＭＴの１６μｇタンパク量を水酸化アルミニウムゲルアジュバントとともに３週間隔で２回、筋肉内に注射した。残り２頭は非注射対照群とした。第２回注射後３週に免疫群の豚を、非注射対照群とともに体重１ｋｇあたり４μｇタンパク量の野生型ＰＭＴを筋肉内に注射することにより攻撃した。攻撃後２週に剖検して、鼻甲介に形成された病変の程度を肉眼的に観察した。また両群の豚について免疫前と攻撃時に採血を行い、血液中に産生されたＰＭＴに対する抗体をＥＬＩＳＡによって調べた。変異型ＰＭＴ免疫豚において、免疫時に発熱、沈うつ、食欲不振等の臨床的異常は認められず、また注射局所にも腫脹、発赤等の異常な反応はなく、変異型ＰＭＴの無毒化が完全であることが確認された。
【００６９】
抗体検査において、免疫前の血清では全例でＰＭＴに対する抗体は検出されなかった。免疫群では、第２回注射後２週の攻撃時には全例で抗体陽性となり、平均Ｅ値も０．２９まで上昇した（表３）。一方、対照群の２頭は陰性で経過した。
【００７０】
野生型ＰＭＴによる攻撃後３週に剖検して鼻甲介を肉眼的に調べた。その結果を図２に示す。免疫群の３頭にはいずれも萎縮性鼻炎を示す病変は認められなかった。一方で非免疫対照群の２頭ではそれぞれスコア３及び２の病変（鼻甲介の消失）が認められた（表３および図２）。
【００７１】
【表３】
2004242608.tif 000004
【００７２】
このように、本発明において作製した無毒変異型ＰＭＴで免疫された豚は、ＰＭＴに対する抗体が誘導され、野生型ＰＭＴによる攻撃から防御されることが示された。
【００７３】
【発明の効果】
請求項１ないし３および請求項８に係る本発明は、毒素活性を発現せず豚萎縮性鼻炎に対する免疫活性を有するタンパク質であり、豚に免疫したときに野生型ＰＭＴによる攻撃から豚を防御でき、請求項１２に記載した豚萎縮性鼻炎に対するワクチンとして用いることができる。
【００７４】
また、請求項６または７に係る本発明によれば、この無毒変異型ＰＭＴをコードする遺伝子が得られ、請求項９および１０の遺伝学的手法により発現させることで、当該タンパク質を大量に得ることができる。さらに、請求項１１に記載した方法で精製することにより、ワクチンの成分として好適な不純物のない無毒変異型ＰＭＴを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】野生型（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）および変異型（Ｍｕｔａｎｔ）ＰＭＴを陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分画後、ピーク１、ピーク２および回収フラクションについてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った時の電気泳動写真。
【図２】変異型ＰＭＴ免疫豚３頭および非注射対照豚２頭に対して野生型ＰＭＴで攻撃後、３週目に剖検して鼻甲介に形成された病変を示す写真。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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