(57)【要約】【課題】本発明は、新規還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子、当該遺伝子に基づく還元型ＰＫＳ、上述したＰＫＳ遺伝子を組み込んだ発現ベクター、その発現ベクターにより形質転換した形質転換体、および還元型ＰＫＳにより生成される新規化合物を提供することを課題とする。【解決手段】本発明の発明者らは、ジャガイモ夏疫病菌Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｓｏｌａｎｉから還元型ＰＫＳ遺伝子をクローニングし、これを配列決定することにより、新規還元型ＰＫＳ遺伝子、ＰＫＳＮ遺伝子を得、これに基づいて上記課題を解決した。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１に記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１に記載のヌクレオチド配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）をコードする遺伝子ＤＮＡ；
（ｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１に記載のヌクレオチド配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列からなる、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）をコードする遺伝子ＤＮＡ；または
（ｄ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１に記載のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列からなる、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）をコードする遺伝子ＤＮＡ；
からなる、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２】
（ｅ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｆ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２で示されるアミノ酸配列に１または複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）活性を有するタンパク質；または
（ｇ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２で示されるアミノ酸配列との間でアミノ酸配列相同性を有し、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）活性を有するタンパク質；
をコードする、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載の還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子ＤＮＡによりコードされる、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）。
【請求項４】
請求項１または２のＤＮＡおよびこれに機能可能に連結した制御配列を含む、発現ベクター。
【請求項５】
制御配列が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅのａｍｙＢプロモーターである、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
宿主を、請求項４または５に記載のベクターによりトランスフォームした、形質転換体。
【請求項７】
宿主がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅである、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
以下の式：
【化１】
2004097010.tif 000039
を有する、化合物。
【請求項９】
（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１の配列を有するＤＮＡにより形質転換された形質転換体を誘導培養し；
（ｉｉ）この誘導培養された形質転換体をから溶媒を使用して抽出物を得て；
（ｉｉｉ）得られた抽出物を精製する；
からなる工程により、請求項８に記載の化合物を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｓｏｌａｎｉ由来の還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）を単離することに関する。本発明はまた、この合成酵素（ＰＫＳ）を使用して、新規化合物を生成することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
二次代謝産物は、タンパク質、脂質、核酸、炭水化物のような生命に不可欠な一次代謝産物とは異なり、必ずしもその生産者の生存に不可欠と言うわけではない。しかしながら、その中には様々な生理活性物質があり、医薬資源として注目されている。微生物は、ポリエーテル、マクロライド、アントラサイクリン、アミノグリコシド、環状ペプチドなど多様な二次代謝産物を生産する能力を有しており、医薬、農薬あるいは動物薬として用いられている化合物も多い。
【０００３】
ポリケタイド化合物は、放線菌、糸状菌、植物などにより生産されている二次代謝産物であり、その構造の多様性や、抗菌、抗真菌、抗寄生虫、抗昆虫、さらには免疫抑制作用など広範な生理活性を有することから、注目を集めている。
【０００４】
ポリケタイド化合物は、酢酸などの低級脂肪酸から生合成されることが知られている。アシル鎖の伸長過程では、（１）アシル基転移、（２）縮合、（３）ケト還元、（４）脱水、（５）エノイル還元の５つの基本反応が行われるが、ポリケタイド化合物の生合成では、アシル鎖伸長過程の基本反応に多様性があり、（１）アシル基転移と（２）縮合は必須であるが、その他の反応である（３）ケト還元、（４）脱水、および（５）エノイル還元のうちのいくつかが欠如してアシル鎖伸長過程が進行するため、ケト基、水酸基、二重結合などβ位の炭素に多様性がみられる。さらには、５つの基本反応すべてを保有するものといくつかの反応が欠如したアシル鎖伸長反応を有するものが混在すること、アシル鎖の伸長過程で導入される低級脂肪酸の炭素数が、酢酸あるいはプロピオン酸由来のジカルボン酸（例えば、マロニルＣｏＡあるいはメチルマロニルＣｏＡ）である場合もあること、これらの縮合反応が何回行われたか、そして最終的に合成された炭素鎖の折り畳まれ方の相違などに基づいて、種々のポリケタイド化合物が生成される。この縮合、閉環の一連の反応を触媒する酵素が、ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）である。
【０００５】
ＰＫＳは、Ｉ型とＩＩ型に大きく分けられる。Ｉ型ＰＫＳは、放線菌あるいは糸状菌にみられる酵素であり、ポリケタイド生合成に必要な各活性中心が１つのポリペプチド上に存在する多機能型酵素である。放線菌のＩ型ＰＫＳは、１単位のアシル鎖伸長反応を触媒するために必要なケトアシル合成酵素（ＫＳ）、アシル基転移酵素（ＡＴ）、およびアシルキャリアープロテイン（ＡＣＰ）などのドメインが並んだモジュールを複数含むモジュール型であり、糸状菌のＩ型ＰＫＳは、同一の活性中心が縮合反応ごとに繰り返し関与して、伸長反応を行う繰り返し型である。
【０００６】
これに対してＩＩ型ＰＫＳは、放線菌にみられる酵素であり、ＡＣＰ、ＫＳのほか、場合によりＫＲ、芳香化酵素（ＡＲＯ）、環化酵素（ＣＹＣ）などの修飾酵素が存在する。この酵素では、これらの各反応をになう酵素タンパクは１つずつ独立に存在しており、複合体を形成して機能すると考えられている。
【０００７】
これまで糸状菌からクローニングされた数種類のＰＫＳ遺伝子は、いずれもＩ型ＰＫＳであり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓの６−メチルサリチル酸合成酵素（Ｆｕｊｉｉ，　Ｉ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９６）　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２５３，　１−１０）などのＤＨおよびＫＲを有する第一群、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓの胞子色素合成酵素ＷＡ（Ｍａｙｏｒｇａ，　Ｍ．Ｅ．，　Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ，　Ｗ．　Ｅ．　（１９９２）　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２３５，　２０５−２１２）やアフラトキシンの生合成に関与するＰＫＳＳＴ（Ｙｕ，　Ｊ．−Ｈ．，　Ｌｅｏｎａｒｄ，　Ｔ．Ｊ．　（１９９５）　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７７，　４７９２−４８００）などの環化酵素（ＣＹＣ）活性を有する第二群、およびＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ　ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ　の植物毒素Ｔ−ｔｏｘｉｎ合成酵素であるＰＫＳ１（Ｙａｎｇ，　Ｇ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９６）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　８，　２１３９−２１５０）やＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓのロバスタチン合成酵素ＬＮＫＳ（ＷＯ　９５／１２６６１）などの還元型ポリケタイドを生成する第三群に分類される（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，　Ｃ．Ｒ．，　Ｆｕｊｉｉ，　Ｉ．　（１９９５）　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　４９，　２０１−２３８；Ｔｓｏｉ，　Ｃ．Ｊ．，　Ｋｈｏｓｌａ，　Ｃ．　（１９９５）　Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．，　２，　３５−３６２）。
【０００８】
糸状菌の生産する還元型ポリケタイド化合物には、高脂血症治療薬であるロバスタチン、細胞内輸送阻害剤であるブレフェルディン（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）から、Ｔ−ｔｏｘｉｎなどの植物毒素にいたるまで、特異な生理活性と興味深い構造を持つ多様な化合物が存在する。
【０００９】
ジャガイモの他にトマト、ナスなどのナス科や、一部のアブラナ科の植物にも寄生することが知られている糸状菌の一種のジャガイモ夏疫病菌Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｓｏｌａｎｉは、様々な構造の二次代謝産物を生合成している（Ｉｃｈｉｈａｒａ，　Ａ．，　Ｕｅｎｏ，　Ｔ．，植物病害の化学，　学会出版センター）。なかでも還元型ポリケタイドである植物毒素ソラナピロン（ｓｏｌａｎａｐｙｒｏｎｅ）は、分子内　Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ　閉環反応により生成することが明らかにされており、生合成的に非常に興味深い化合物である（Ｉｃｈｉｈａｒａ，　Ａ．，　Ｏｉｋａｗａ，　Ｈ．，　（１９９７）　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　６１，　１２−１８）。
【００１０】
このソラナピロンは、８個のＣ２単位および２個のメチオニン由来Ｃ１単位を還元型ＰＫＳの作用によって、基本炭素骨格を持つ鎖状前駆体プロソラナピロンＩを合成し、この前駆体をさらに酸化、環化することにより生成されると考えられている（Ｏｉｋａｗａ，　Ｈ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９８）　Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．，　６３，　８７４８−８７５６；Ｏｉｋａｗａ，　Ｈ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８９）　Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　Ｃｈｅｍ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１２８２−１２８３）。この還元型ＰＫＳは、興味深い分子ではあるものの、これまでこの遺伝子の解析は全く行われていなかった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子、および当該遺伝子に基づく還元型ＰＫＳを提供することを課題とする。
【００１２】
本発明はまた、上述したＰＫＳ遺伝子を組み込んだ発現ベクターおよびその発現ベクターにより形質転換した形質転換体を提供することもまた、課題とする。
本発明はさらに、還元型ＰＫＳにより生成される新規化合物を提供することもまた、課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者らは、ジャガイモ夏疫病菌Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｓｏｌａｎｉから還元型ＰＫＳ遺伝子をクローニングし、これを配列決定することにより、新規還元型ＰＫＳ遺伝子、ＰＫＳＮ遺伝子を得た。このＰＫＳＮ遺伝子は７８３１　ｂｐの配列を有し、この配列中に４個のイントロンの存在が推定され、全体で２５４６アミノ酸残基からなるタンパク質をコードするものと考えられる。配列全体に渡って、既知の還元型ＰＫＳ遺伝子と高い配列相同性を示していることから還元型ＰＫＳ遺伝子をコードしていると考えられる。またＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＥＲ、ＫＲ、ＡＣＰ各ドメインがこの順に並び還元型ＰＫＳ遺伝子の構造を有することが確認された。更に糸状菌ＰＫＳでは芳香族ＰＫＳも含めこれまでのところ、ＬＤＫＳとＬＮＫＳにしか見出されていないＭｅＴ（メチルトランスフェラーゼ）ドメインがＤＨとＥＲの間に存在していることも明らかになった。
【００１４】
本発明の発明者らは、この新規還元型ＰＫＳ遺伝子、ＰＫＳＮ遺伝子を提供することにより、上記第一の課題を解決した。
すなわち、本発明の発明者らは、（ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１に記載のヌクレオチド配列；（ｂ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１に記載のヌクレオチド配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子をコードするＤＮＡ；（ｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１に記載のヌクレオチド配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列からなる、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子をコードするＤＮＡ；または（ｄ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１に記載のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列からなる、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）をコードする遺伝子ＤＮＡ；からなる、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子ＤＮＡを提供する。本発明はまた、（ｅ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質；（ｆ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２で示されるアミノ酸配列に１または複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）活性を有するタンパク質；または（ｇ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２で示されるアミノ酸配列との間でアミノ酸配列相同性を有し、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）活性を有するタンパク質；をコードする、還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子ＤＮＡを提供する。
【００１５】
本発明において、１もしくは複数個の塩基もしくはアミノ酸という場合、１〜１０個、より好ましくは１〜６個、最も好ましくは１〜２個の塩基もしくはアミノ酸のことをいう。
【００１６】
本発明において、ストリンジェントなハイブリダイズ条件とは、目的のヌクレオチド配列が、ＰＫＳをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１）もしくはこれと縮重の関係にあるヌクレオチド配列との間で、特異的にハイブリダイズ可能である条件をいう。ハイブリダイズ条件は、温度、イオン濃度などの条件を考慮して決定されるが、一般的には温度が高いほど、またイオン濃度が低いほどストリンジェントな程度が高くなることが知られている。このようなストリンジェントな条件の設定は、当業者であれば、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ　（２００１））の記載に基づいて行うことができる。これらのストリンジェントな条件の具体的な例としては、例えば、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、２５℃ないし６８℃などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温度としては、より好ましくは４５℃ないし６８℃（ホルムアミド無し）または２５℃ないし５０℃（５０％ホルムアミド）を挙げることができる。
【００１７】
本発明において、ヌクレオチド配列相同性という場合、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＮ）プログラムによりヌクレオチド配列の配列相同性解析を行った場合に、少なくとも６０％同一であることをいい、より好ましくは少なくとも８０％同一であることをいい、最も好ましくは少なくとも９０％同一であることをいい、アミノ酸配列相同性という場合、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＰ）プログラムによりアミノ酸配列の配列相同性解析を行った場合に、少なくとも５０％同一であることをいい、より好ましくは少なくとも７０％同一であることをいい、最も好ましくは少なくとも８０％同一であることをいう。なお、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＮ）プログラムおよびＰｒｏｔｅｉｎ　ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＰ）プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。
【００１８】
本発明においては、アミノ酸あるいはヌクレオチド配列の配列相同性解析には、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラム、例えば、２つのタンパク質配列の配列相同性は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．，　４８：　４４３−４５３，　１９７０）のアルゴリズムに基づく、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、もまた、用いることができる。そのほかにも、アミノ酸あるいはヌクレオチド配列の配列相同性は、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。
【００１９】
本発明はまた、上述した（ａ）〜（ｇ）で定義される還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子ＤＮＡのうちのいずれかによりコードされる還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）もまた提供する。
【００２０】
本発明において還元型ポリケタイドという場合、アセチルＣｏＡを出発物質として、マロニルＣｏＡが脱炭酸しながら次々と結合して生じるβ−ケトメチレン鎖から還元段階を経て導かれる化合物のことをいう。そして本発明において還元型ＰＫＳの酵素活性という場合、目的とする（ａ）〜（ｇ）の遺伝子を発現させた場合、アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡを基質として還元型ポリケタイドを合成する活性を有することにより定義する。
【００２１】
本発明の発明者らは、上述した（ａ）〜（ｇ）で定義される新規還元型ＰＫＳ遺伝子を使用して発現ベクターを調製し、その発現ベクターにより宿主を形質転換することにより、上記第二の課題を解決した。
【００２２】
すなわち、（ａ）〜（ｇ）で定義される還元型ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子ＤＮＡおよびこれに機能可能に連結した制御配列を含む、発現ベクターを提供するとともに、この発現ベクターによりトランスフォームした形質転換体を提供する。
【００２３】
本発明の発明者らはさらに、本発明の還元型ＰＫＳ遺伝子、ＰＫＳＮ遺伝子によりＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅを形質転換したところ、この形質転換体内で、新規なポリケタイド化合物が生成されることを見出した。そこで、この形質転換体により生成される新規化合物を単離し、そしてその調製方法を明らかにすることにより、上記第三の課題を解決した。
【００２４】
すなわち、本発明の発明者らは、以下の式：
【００２５】
【化２】
2004097010.tif 000002
【００２６】
を有する、化合物を提供するとともに、あわせて以下の工程：
本発明の発明者らは、また、（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１の配列を有するＤＮＡにより形質転換された形質転換体を誘導培養し；（ｉｉ）この誘導培養された形質転換体をから溶媒を使用して抽出物を得て；（ｉｉｉ）得られた抽出物を精製する；からなる工程により、上述の化合物を調製する方法を提供する。
【００２７】
この製造方法の好ましい態様において、溶媒としてアセトンを使用することができ、また、精製をシリカゲルを使用して行うこともできる。例えば、一態様において、以下の工程：
（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１の配列を有するＤＮＡにより形質転換されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ形質転換体を、誘導培養し；
（ｉｉ）この誘導培養された形質転換体からアセトン中で化合物を抽出し；
（ｉｉｉ）このアセトン抽出物を濃縮した後、酢酸エチルに転溶し；
（ｉｖ）この溶液を濃縮乾固した後、得られた油状物質をクロロホルムに溶解し；そして
（ｖ）シリカゲルカラムにより精製する；
からなる工程により、上述の化合物を調製する方法もまた提供する。
【００２８】
【発明の実施の形態】
ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
目的の生物種に由来するゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。ここで目的とする生物種としては、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属などの糸状菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属などの放線菌、Ｃａｓｓｉａ属、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ属などの植物などをあげることができる。
【００２９】
このゲノムＤＮＡライブラリーを作製する際に使用するベクターとしては、λファージベクター、プラスミドベクター、コスミドなどを使用することができる。当業者であれば、ベクターへのライゲーション効率、予想されるゲノム中に挿入すべきゲノムサイズ、大腸菌中での増殖の容易性、などの条件に基づいて、これらのいずれを選択すべきかを容易に決定することができる。
【００３０】
例えば、糸状菌または放線菌のゲノムＤＮＡライブラリーを作製する場合には、大腸菌および糸状菌または放線菌の両方で選択可能なマーカー遺伝子を有するベクターを使用して、ゲノムＤＮＡライブラリーを構築する。例えば、大腸菌および糸状菌または放線菌の両方で選択可能なマーカー遺伝子を有するベクターの例としては、ｐＡＮｓＣｏｓ１コスミドベクター（Ｏｓｉｅｗａｃｚ，　Ｈ．，　Ｄ．，（１９９４）　Ｃｕｒｒ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２６，　８７−９０）、ｐＯＪ４４６コスミドベクター（Ｂｉｅｒｍａｎ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９２）　Ｇｅｎｅ，　１１６，４３）をあげることができる。ｐＡＮｓＣｏｓ１コスミドベクターの場合、糸状菌の選択可能なマーカーであるハイグロマイシン耐性遺伝子を持つことから、糸状菌をホストとしたインサートの発現も可能であるという利点を有する。
【００３１】
ベクターを制限酵素で切断し、目的とする生物種由来のゲノムＤＮＡを同一の制限酵素または同一の末端を生成する他の制限酵素により切断し、これらのＤＮＡ断片をライゲーションする。このライゲーションしたベクターをｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングしたのち、大腸菌に感染させる。この大腸菌をＬＢ／アンピシリン寒天プレートに植菌し、例えば合計で１００００コロニーとなるように、コスミドゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。
【００３２】
ＰＫＳ遺伝子のクローニング
これまでにクローニングされたＰＫＳ遺伝子は、いずれも遺伝子間で高い相同性を有している。そこで、プライマーのデザインは、これらの公知の配列に基づいて、種々のＰＫＳ遺伝子のなかでも特によく保存されているアミノ酸配列から、縮重プライマーをデザインすることにより行う。
【００３３】
既知のＰＫＳ遺伝子としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓの６−メチルサリチル酸合成酵素（Ｆｕｊｉｉ，　Ｉ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９６）　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２５３，　１−１０）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓの胞子色素合成酵素ＷＡ（Ｍａｙｏｒｇａ，　Ｍ．Ｅ．，　Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ，　Ｗ．　Ｅ．　（１９９２）　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２３５，　２０５−２１２）、アフラトキシンの生合成に関与するＰＫＳＳＴ（Ｙｕ，　Ｊ．−Ｈ．，　Ｌｅｏｎａｒｄ，　Ｔ．Ｊ．　（１９９５）　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７７，　４７９２−４８００）、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ　ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ　の植物毒素Ｔ−ｔｏｘｉｎ合成酵素であるＰＫＳ１（Ｙａｎｇ，　Ｇ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９６）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　８，　２１３９−２１５０）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓのロバスタチン合成酵素ＬＮＫＳ（ＷＯ　９５／１２６６１）、放線菌におけるポリケタイド生合成遺伝子（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ，　Ｆ．，　Ｈｏｐｗｏｏｄ，　Ｄ．Ａ．　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ，　３０９，　４６２）、糸状菌の還元型ポリケタイドであるｆｕｍｏｎｉｓｉｎの生合成に関与するＰＫＳ遺伝子（Ｐｒｏｃｔｅｒ，　Ｈ．，Ｒ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９９）　Ｆｕｎｇａｌ　Ｇｅｎ．　Ｂｉｏｌ．，　２７，　１００−１１２）などを例としてあげることができる。
【００３４】
これらの配列に基づいて縮重プライマーをデザインして、このプライマーを用いて目的とする生物種に由来するゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。
上述した既知のＰＫＳ遺伝子中の保存性の高い部位は、当業者が既知の配列間で相同性を検索することにより、容易に選択することができる。例えば、ＰＫＳ遺伝子のケトシンターゼ（ＫＳ）ドメイン、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン、ケトリダクターゼ（ＫＲ）ドメイン、デヒドラターゼ（ＤＨ）ドメインなどが、保存性が高い部位としてあげられる（例えばＮｉｃｈｏｌｓｏｎ，　Ｔ．　Ｐ．，　ｅｔ　ａｌ．，（２００１）　Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．，　８，　１５７−１７８）を参照）。本発明において、新規ＰＫＳ遺伝子をクローニングするためには、これらの保存性が高い部位の配列に基づいて、縮重プライマーをデザインする。
【００３５】
調製された縮重プライマーを用いたＰＣＲは、当業者に周知な方法であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，　３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ　（２００１））に記載されるようなプロトコルにしたがって行うことができる。当業者であれば、プライマーの配列、長さ、ＧＣ含量などの性質、使用する試薬などの種々の条件に基づいて、ＰＣＲの手順に対して様々な修飾を加えることができることもまた、周知である。
【００３６】
本発明においては、例えば以下に示す試薬条件：すなわち３２０μｇ／ｍｌのゲノムＤＮＡを３μｌ、５０　ｐｍｏｌ／μｌの２０　ｍｅｒのフォワードプライマーおよび１８　ｍｅｒのリバースプライマーをそれぞれ１μｌ、１０×バッファーを５μｌ、２００　ｍＭのｄＮＴＰを５μｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２を３μｌ、そして２．５　ＵのＴａｑポリメラーゼを含む；で、また以下に示すサイクル条件：９５℃にて１２分間反応させた後、〔９４℃にて３０秒、５４℃にて３０秒および７２℃にて１分間〕を１サイクルとして４５サイクル行った後、７２℃にて５分間処理する；にてＰＣＲを行う。
【００３７】
ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
次に、上述のようにして増幅されたＰＣＲ産物をプローブとして使用して、上述のようにして作製したゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。スクリーニングの方法は、例えば上述したＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌに記載されるような方法を使用して行うことができる。
【００３８】
例えば、スクリーニングを、次の様にして行うことができる。
ＬＢ／アンピシリン寒天プレート上でゲノムＤＮＡライブラリーを含む大腸菌を増殖させた後、形成された大腸菌コロニーをナイロン膜に移す。ＤＮＡをアルカリ変性の後、中和し、ナイロン膜の細胞壁等の残渣を洗浄して取り除いた後、紫外線を照射してＤＮＡを膜に固定する。このようにして固定化したゲノムＤＮＡに対して、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ；ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）でラベルしたＰＣＲ産物由来のプローブをハイブリダイズさせる。
【００３９】
検出はプレート上のコロニーと対応させやすいようにナイロン膜状に直接発色させる。余分なプローブを十分に洗浄した後、抗ＤＩＧ−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識抗体を加える。このＡＰを用いてニトロブルーテトラゾニウム塩溶液（ＮＢＴ）発色させることにより、プローブがハイブリダイズしたコロニーのみ発色することができる。この検出で強く発色したコロニーをポジティブクローンとする。
【００４０】
ポジティブクローンの解析
ゲノムＤＮＡライブラリーから得られたクローンを、様々な制限酵素で切断し、サザンハイブリダイゼーションにより解析することにより、これらのクローンがどのようなインサートを有しているか確認する。サザンブロット解析は、上述したＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌに記載された、既知の実験プロトコルを使用して行うことができる。
【００４１】
さらに、ベクターのクローニングサイト両側の配列が既知であることを利用して、この部分の配列をプライマーとして利用して、ベクター中のインサートを増幅し、その後この断片の配列決定を行う。配列決定は、当該技術分野において周知な方法を用いて行うことができる。例えば、上述のサザンブロット解析において、実際にハイブリダイズした断片を、配列決定に適したベクター、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど、の中に挿入してサブクローニングした後に、当該技術分野において周知の配列決定方法により配列決定することができる。しかし、一般的に１回の配列決定で解読できる塩基の数は、せいぜい１　ｋｂ程度であり、ゲノムＤＮＡの全長が１０　ｋｂ以上の長さを有するＤＮＡインサートを配列決定しようとすると、非常に煩雑な手順を行わなければならない。
【００４２】
そのような長い標的ＤＮＡ配列を配列決定するため、ゲノムプライミングシステム（ＧＰＳ法）を使用することができる。この方法は、トランスポゾンを使用して、長いＤＮＡ断片の配列決定を容易にする方法である。具体的には、薬物耐性遺伝子のＤＮＡ配列を２個のプライマーではさんで作成されたプライマー−薬剤耐性遺伝子−プライマーの構造を有するトランスプライマー（これがトランスポゾンとして機能する）を含み、複製開始点（ｏｒｉ）を含まないプラスミドを、ドナープラスミドとして作製する。このドナープラスミドは、複製開始点を含まないので、単独では増幅されることはない。
【００４３】
ドナープラスミドに含まれるトランスプライマーを、標的ＤＮＡ配列をインサートとして含むベクタークローンの中のランダムな位置に、トランスポゾンの転移を行うＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅの働きにより挿入する。これにより、標的ＤＮＡ配列中にランダムにトランスプライマーが挿入される。トランスプライマーが挿入されたベクタークローンの選択は、トランスプライマーに含まれる薬剤耐性を使用して容易に行うことができる。
【００４４】
トランスプライマーが配列決定すべき長いＤＮＡ断片の配列内に挿入されたベクタークローンを、制限酵素を使用するマッピングにより選択する。このようなベクターでは、配列決定すべき長いＤＮＡ断片が、間に挿入されたトランスプライマーにより２つに分断される。そこで、ベクタークローン由来の既知配列およびトランスプライマーに含まれるプライマー領域をプライマーとして使用して、この分断された配列決定すべきＤＮＡ断片を増幅した後、配列決定を行う。複数のトランスプライマー挿入ベクタークローンを解析し、得られた配列を組み合わせることによりもとの標的ＤＮＡ配列を決定することができる。
【００４５】
ＰＫＳ遺伝子発現ベクターの構築
上述した方法によりクローニングされたＰＫＳ遺伝子を、プロモーター、ターミネーターなどの発現を制御することができる制御配列と機能可能に連結することにより、ＰＫＳ遺伝子発現ベクターを構築する。
【００４６】
例えば糸状菌において使用することができる発現ベクターとしては、Ａ．　ｏｒｙｚａｅのａｍｙＢプロモーターを利用した糸状菌高発現ベクターｐＴＡｅｘ３（Ｆｕｊｉｉ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９５）　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　５９，　１８６９−１８７４）などを使用することができる。糸状菌高発現ベクターｐＴＡｅｘ３は、Ａ．　ｏｒｙｚａｅのａｍｙＢプロモーター下流に組み込まれた目的の遺伝子に対して、スターチやマルトース存在下では高発現し、グルコースやフルクトース存在下ではその発現を抑制するという特徴を有している。また選択マーカーとしてＡ．　ｎｉｄｕｌａｎｓのアルギニン生合成酵素をコードするａｒｇＢ遺伝子を有しているため、アルギニン要求性の宿主Ａ．　ｏｒｙｚａｅ　Ｍ−２−３を用いることにより、形質転換体はアルギニンを含まない最少寒天培地上でコロニーを形成できることにより選別できる。
【００４７】
クローニングした配列を、当該技術分野において既知の遺伝子組換え方法を用いて、発現ベクター中に組み込むことができる。遺伝子組換えは、たとえば上述したＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌに記載された、既知の実験プロトコルにしたがって行うことができる。
【００４８】
本発明の場合のように、目的の遺伝子が大型である場合に、その大型の遺伝子を発現ベクター中に組み込むため、Ｇａｔｅｗａｙクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの方法もまた使用することができる。Ｇａｔｅｗａｙクローニングシステムとは、大腸菌中のバクテリオファージλのサイト特異的な組み換えを利用したものであり、２段階の連続的な反応、すなわち、（１）ＢＰ反応、および（２）ＬＲ反応、により、目的とする配列を目的とするベクター中にクローニングする方法である。
【００４９】
ＢＰ反応とは、目的とする配列を、ドナーベクター中に組み込むための反応である。まず目的とする配列の両端に特異的な配列（Ｂ１とＢ２）をつけたものを用意する。これとは別に、特異的な配列であるＰ１とＰ２をもったＤｏｎｏｒ　Ｖｅｃｔｏｒを用意する。このドナーベクターは、クローニング部位としてＰ１配列とＰ２配列を有しており、選択マーカーとして２種類の遺伝子、すなわち、Ｐ１およびＰ２の２つの配列にはさまれた領域に致死遺伝子であるｃｃｄＢ遺伝子、およびこれとは別の部位にカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる。
【００５０】
両端にＢ１およびＢ２の特異的な配列を有する目的の遺伝子配列と、内部にＰ１およびＰ２の特異的なクローニング部位配列を有するドナーベクターとを、ＢＰクロナーゼ（ｃｌｏｎａｓｅ）酵素ミックスの存在下で反応させると、Ｂ１の途中とＰ１の途中、Ｂ２の途中とＰ２の途中との間でそれぞれ組換えが起こり、ドナーベクター中のＰ１−ｃｃｄＢ遺伝子−Ｐ２の配列が目的の遺伝子配列に組換えられる。このとき、Ｂ１の途中とＰ１の途中での組換えの結果Ｌ１配列が形成され、Ｂ２の途中とＰ２の途中での組換えの結果Ｌ２配列が形成される。
【００５１】
組換えが正しく行われたベクター（このようなベクターを、エントリークローンと呼ぶ）の選択は、カナマイシン含有培養プレート中でエントリークローンで形質転換した大腸菌を培養し、できたコロニーを選択することにより行う。この場合、組換えがおこらなかったドナーベクターにより形質転換された大腸菌は、ドナーベクター中にもともと含まれる致死遺伝子ｃｃｄＢ遺伝子の影響で、培地中で増殖することができない。
【００５２】
このようにしてエントリークローン中に挿入された目的の遺伝子を、ついで発現ベクター中に組み込む。この反応が、ＬＲ反応である。すなわち、ＬＲ反応は、エントリークローン中で、その両端を特異的な配列Ｌ１とＬ２で挟まれた状態にある目的とする遺伝子配列を、発現テンプレートベクター中に挿入する反応である。
【００５３】
ここで使用する発現テンプレートベクターは、発現ベクターとして使用するための制御配列を含むベクターである。この発現テンプレートベクター中には、クローニング部位としてＲ１配列とＲ２配列を有しており、選択マーカーとして２種類の遺伝子、すなわち、Ｒ１およびＲ２の２つの配列にはさまれた領域に致死遺伝子であるｃｃｄＢ遺伝子および、これとは別の部位にアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。
【００５４】
その両端に特異的な配列Ｌ１およびＬ２を有する目的の遺伝子配列を含むエントリークローンと、特異的なクローニング部位配列であるＲ１およびＲ２を有する発現テンプレートベクターとを、ＬＲクロナーゼ（ｃｌｏｎａｓｅ）酵素ミックスの存在下で反応させると、Ｌ１の途中とＲ１の途中、Ｌ２の途中とＲ２の途中との間でそれぞれ組換えが起こり、発現テンプレートベクター中のＲ１−ｃｃｄＢ遺伝子−Ｒ２の配列がエントリークローン中の目的の遺伝子配列と組換えられて、発現ベクターを形成する。
【００５５】
組換えが正しく行われた発現ベクターの選択は、アンピシリン含有培養プレート中で発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、できたコロニーを選択することにより行う。この場合、組換えがおこらなかった発現テンプレートベクターにより形質転換された大腸菌は、発現テンプレートベクター中にもともと含まれる致死遺伝子ｃｃｄＢ遺伝子の影響で、培地中で増殖することができない。また、目的とする遺伝子配列を含むエントリーベクターにより形質転換された大腸菌は、アンピシリン耐性遺伝子を含まないので、この培養プレート上では増殖することができない。したがって、アンピシリン含有培養プレート上で選択的に増殖できる大腸菌は、必ず目的の遺伝子を含む発現ベクターにより形質転換している。
【００５６】
形質転換体の作出
形質転換は、プロトプラスト−ＰＥＧ法（Ｇｏｍｉ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８７）　Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｌｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５１，　２５４９−２５５５）、エレクトロポレーション法などの方法に従って行うことができる。本発明においては、プロトプラスト−ＰＥＧ法を使用することが好ましい。
【００５７】
例えば、発現ベクターとして上述の糸状菌高発現ベクターｐＴＡｅｘ３を使用し、宿主としてアルギニン栄養要求性Ａ．　ｏｒｙｚａｅ　Ｍ−２−３を使用する場合、Ａ．　ｏｒｙｚａｅ　Ｍ−２−３をＤＰＹ（グルコース２．０　ｇ／ｌ、ポリペプトン１．０　ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　０．５　ｇ／ｌ、ＮａＮＯ３　０．１　ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０５　ｇ／ｌ、酵母抽出液０．２　ｇ／ｌ）培地で培養した後、溶解酵素で細胞壁を溶解させてプロトプラスト溶液を調製する。このプロトプラスト溶液に対して上記で調製した目的の遺伝子ＤＮＡを含む発現ベクターを加え、形質転換し、アルギニンを含まない最小培地上で培養する。プレート上に出現するコロニーは、糸状菌高発現ベクターｐＴＡｅｘ３により形質転換されている。
【００５８】
形質転換体内部で生成される生産化合物の単離
得られた形質転換体に対して、誘導発現を行う。誘導発現は、当該技術分野において既知であり、例えば、誘導発現の例としては、炭素源としてグルコースを含むＣＤ培地で６日間培養後、スターチを含むＣＤ培地に移し２日間誘導培養する方法などが知られている。
【００５９】
形質転換体から分泌された物質またはその菌体中に含まれる物質を、既知の方法にしたがって抽出する。培地中に分泌される物質は、例えば培地をを１　Ｎ　ＨＣｌで酸性にした後、等量の酢酸エチルで抽出する方法などが知られている。菌体中に含まれる物質は、菌体を一晩アセトンに冷浸することにより抽出する。
【００６０】
抽出された物質は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、マススペクトロメトリー（ＭＳ）、ＬＣ−ＭＳ、核磁気共鳴（ＮＭＲ）など、当該技術分野において既知の方法を使用して解析し、その分子量、化学構造などを明らかにする。
【００６１】
以下の実施例において、本発明の内容を、さらに具体的に説明する。なお、この内容は、本発明の範囲を限定的に解釈するためのものではない。
【００６２】
【実施例】
実施例１：　Ａ．　ｓｏｌａｎｉ還元型ＰＫＳ遺伝子のクローニング
本実施例においては、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｓｏｌａｎｉゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことにより還元型ＰＫＳ遺伝子をクローニングした。
【００６３】
Ａ．　ｓｏｌａｎｉゲノムＤＮＡは、Ａ．　ｓｏｌａｎｉ　５４８株（Ｉｃｈｉｈａｒａ，　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８３）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，　２４，　５３７３−５３７６）から、以下の様にして調製した。すなわち、この菌体５　ｇを液体窒素下において、乳鉢および乳棒を用いて破砕し、ここに溶解バッファー（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．５％ＳＤＳ）２０　ｍｌとＰｒｏｎａｓｅ（１０　ｍｇ）を加え、３７℃で８０分間インキュベーションする。この後フェノール／クロロホルム抽出を３回、クロロホルム抽出、エタノール沈澱を各１回行い、ＴＥ　５　ｍｌに溶解する。さらにこの溶液に対してＲＮａｓｅ（１５μｇ）を加え、３７℃で３０分間インキュベーションした後、フェノール／クロロホルム抽出を２回、クロロホルム抽出、エタノール沈澱を各１回行った後、ＴＥ　５００μｌに溶解することにより、ゲノムＤＮＡを調製した（３１３μｇ／ｍｌ）。
【００６４】
ＰＫＳの機能ドメインの中でも特に相同性が高い領域であるＫＳドメインとＡＴドメインとから、それぞれＡｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　４）およびＧｌｙ　ＧｌｎＧｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　５）という保存性の高いアミノ酸配列を選択し、これらの配列をもとにして、縮重プライマーとしてフォワードプライマーＫＳＤ−Ｆ（５’−ｇｃｎ　ｃａｙ　ｇｇｎ　ａｃｎ　ｇｇｎ　ａｃ−３’：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　６）およびリバースプライマーＫＳＤ−Ｒ（５’−ｃｃａ　ｙｔｇ　ｎｇｃ　ｎｃｃ　ｙｔｇ　ｎｃｃ−３’ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　７）を作製した。ここで、ｒはｇまたはａを示し、ｙはｔまたはｃを示し、そしてｎはａ、ｔ、ｃまたはｇのいずれかの塩基を示す。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ装置：Ｒｏｂｏ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＧＲＡＤＩＥＮＴ　４０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、常法にしたがって行った。
【００６５】
ＰＣＲで増幅した断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ　Ｔ−ベクターにサブクローニングし、大腸菌に形質転換したところ、１２個のクローンのインサートが目的のサイズであり、３種類の配列断片が確認された。このうちの一つは、ロバスタチン、Ｔ−Ｔｏｘｉｎなどの還元型ＰＫＳと高い相同性を示すことがわかり、以下においてこの配列断片をプローブとしてＡ．　ｓｏｌａｎｉゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行うこととした。
【００６６】
実施例２：　Ａ．　ｓｏｌａｎｉのゲノムＤＮＡライブラリーの作製とスクリーニング
Ａ．　ｓｏｌａｎｉの還元型ＰＫＳ遺伝子は、既知の還元型ＰＫＳ遺伝子のサイズを参考に考えると、約１０　ｋｂとかなり大きいことが予想された。また、近傍に位置すると考えられる修飾酵素遺伝子とクラスターを形成していることが予想されることから、ｐＡＮｓＣｏｓ１およびｐＯＪ４４６コスミドベクターを用いて、Ａ．　ｓｏｌａｎｉゲノムＤＮＡライブラリーを構築した。
【００６７】
ｐＡＮｓＣｏｓ１ベクターを用いたゲノムＤＮＡライブラリーは、ｐＡＮｓＣｏｓ１（５０μｇ）を２つのｃｏｓサイトの間で切断するＸｂａ　Ｉ（５０　Ｕ）で完全に消化した後、さらにＢａｍ　ＨＩで消化し、ここにインサートをライゲーションすることにより作製した。インサートはＡ．　ｓｏｌａｎｉ　５４８（前述）より調製したゲノムＤＮＡ（１００μｇ）をＳａｕ　３ＡＩ（０．１Ｕ）で３７℃にて１０分間消化することにより、サイズが約４０　ｋｂになるようにランダムに消化したものを用いた。
【００６８】
このライゲーション溶液を、Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩＩ　ＸＬ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、基本的に製造者が作成したマニュアルに基づいて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングした。すなわち、ライゲーション溶液（４μｌ）をパッケージング抽出物に加え、２２℃にて１００分間インキュベーションし、ここに５００μｌのＳＭバッファー（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　７．５、１００　ｍＭ　ＮａＣｌ、７　ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．０１％ゼラチン）を加え、さらにクロロホルム２０μｌを加え、静かに撹拌することによりパッケージングを行った。このパッケージングされたウィルス溶液の上清２５μｌを、大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’）に混ぜて３７℃で３０分間インキュベーションし、ＬＢ　２００μｌを加えさらに３７℃で６０分間インキュベーションすることにより感染させた。この大腸菌をＬＢ／アンピシリン寒天プレートに植菌し、一晩３７℃で培養し、最終的に１０×１４　ｃｍ２のプレートに１枚約１０００コロニーになるように大腸菌を植菌、一晩３７℃で培養し、計１００００コロニーのＡ．　ｓｏｌａｎｉのコスミドゲノムライブラリーを作製した。
【００６９】
ｐＯＪ４４６ベクターを用いたゲノムＤＮＡライブラリーは、ｐＯＪ４４６（５０μｇ）を２つのｃｏｓサイトの間で切断するＨｐａ　Ｉ（５０　Ｕ）で完全に消化した後、さらにＢａｍ　ＨＩで消化し、ここにインサートをライゲーションすることにより作製した。インサートの調製、ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングは先のｐＡＮ１Ｃｏｓ１の場合と同様に行い、計１００００コロニーのライブラリーを作成した。
【００７０】
これらのゲノムＤＮＡライブラリーに対して、Ａ．　ｓｏｌａｎｉ還元型ＰＫＳ遺伝子のＰＣＲ産物をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーションを行うことにより、スクリーニングを行った。
【００７１】
コロニーハイブリダイゼーション法は、以下の様にして行った。すなわち、１枚当たり約１０００コロニーになるように大腸菌を植菌し、３７℃で一晩培養したＬＢ／アンピシリン寒天プレート（１０×１４　ｃｍ２）上で形成されたコロニーを、ナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ）に移した。そのナイロン膜上のＤＮＡをアルカリ変性し、中和した後、ナイロン膜を洗浄し、ついで紫外線を照射することによりＤＮＡを膜に固定した。固定化したＤＮＡに対してジゴキシゲニン（ＤＩＧ；ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）（ＤＩＧ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ非放射線、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）でラベルしたプローブをハイブリダイズ（６８℃で一晩；０．２×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％ＳＤＳ）させた。
【００７２】
検出はプレート上のコロニーと対応させやすいようにナイロン膜状に直接発色させた。余分なプローブを十分に洗浄（６８℃で３０分間×２；０．２×ＳＳＣ）した後、抗ＤＩＧ−ＡＰ（アルカリホスファターゼ）標識抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加えた。ＡＰをアルカリで活性化させ、そこにニトロブルーテトラゾニウム塩溶液（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート（Ｘ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を加え暗所、室温でインキュベートすることにより、プローブがハイブリダイズしたコロニーのみを発色させた。この検出で強く発色したコロニーをポジティブクローンとした。
【００７３】
ｐＡＮｓＣｏｓ１ベクターを用いたゲノムライブラリーからは２個のポジティブクローンが、ｐＯＪ４４６ベクターを用いたゲノムライブラリーからは１４個のポジティブクローンが、それぞれ得られた。これらのクローンを用いて実際の配列解析を行うことにより、還元型ポリケタイド生合成遺伝子クラスター全体の解析を行った。
【００７４】
実施例３：ｐＡＮｓＣｏｓ１ポジティブクローンの解析
ｐＡＮｓＣｏｓ１を用いて作製したライブラリーから得られたクローン２個のうちの１個ｐＡＮ１がどのようなインサートを有しているか確認するため、サザンハイブリダイゼーションおよび配列決定により解析した。
【００７５】
ｐＡＮ１を、Ｘｂａ　Ｉ、Ｅｃｏ　ＲＩ、Ｐｓｔ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉで切断した後、上述したＰＣＲ産物をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行い、各クローンでハイブリダイズする断片を比較した。この結果、Ｘｂａ　Ｉで切断した場合には約１２　ｋｂの長さの断片がハイブリし、Ｅｃｏ　ＲＩで切断した場合には約５　ｋｂの長さの断片とハイブリダイズした。
【００７６】
ベクターのクローニングサイト両側のプライマー領域を利用し、ｐＡＮ１のインサートの両端からの約７００　ｂｐの配列決定を行った。配列決定は、ＤＮＡシークエンサー４０００Ｌ（ＬＩ−ＣＯＲ）を用いて、常法にしたがって行った。その結果、ｐＡＮ１のインサート右端がプローブとしたＰＣＲ断片の配列とオーバーラップしていること、そしてインサートは、ＰＣＲ断片の配列の上流約１２　ｋｂを含んでいることが分かった（図１）。
【００７７】
プローブとしたＰＣＲ断片とは、ＰＫＳ遺伝子のＫＳからＡＴにかけての配列であり、これはＰＫＳ遺伝子全体から見るとＮ末側にあたる。そのため、このｐＡＮ１クローン中に含まれるインサートには、ＰＫＳ遺伝子の下流領域が含まれていない。これに関しては、別途配列を採取することとした。
【００７８】
このｐＡＮ１は約１２　ｋｂ程度のインサートを有していることから、ｐＡＮ１インサートの具体的な塩基配列を、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｉｍｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＰＳ法）により決定した。
クロラムフェニコール耐性であるドナープラスミドと３７℃でインキュベートすることで、ｐＡＮ１に対してランダムにトランスプライマーを挿入した。トランスプライマーが挿入された目的クローンを含む反応液を、大腸菌にトランスフォーメーションして、ＬＢ／アンピシリン／クロラムフェニコールプレートに広げ、一晩３７℃で培養し、得られたクローンについてプラスミドを調製した。それぞれのクローンについておおよそのマッピングを行い、必要と考えられるクローンについてシークエンスを行った。この結果、ｐＡＮ１中にランダムにトランスプライマーを挿入した４４個のクローンの配列決定を行い、これらの配列を組み合わせてｐＡＮ１のインサートの配列約１２　ｋｂを決定した。
【００７９】
実施例４：ｐＯＪ４４６ポジティブクローンの解析
ｐＯＪ４４６を用いて作製したライブラリー由来のポジティブクローンの中から、ＰＫＳをコードする領域全体を完全な形で保持しているクローンを探し、これに注目して解析を行った。目的の領域は、ｐＡＮ１由来の配列から下流側である。したがってｐＡＮ１の配列と照らし合わせて、インサートの始まりがｐＡＮ１の配列と重なり、かつ下流側の配列を持ち、インサートの長さが十分に長いものを探した。インサート両端を配列決定し、以上の条件を満たすクローン、ｐＪ１８を得、これに注目して解析を行うこととした。効率よく目的の領域の解析を行うため、ｐＪ１８を適当な制限酵素で切断した後、実施例３においてプローブとして用いた上述ＰＣＲ断片とハイブリダイズする断片をサブクローニング、配列決定することによりｐＪ１８のインサートの解析を行った。
【００８０】
ｐＪ１８クローンをＢａｍ　ＨＩとＳｍａ　Ｉを用いて切断した後、実施例３において行ったコロニーハイブリダイゼーションと同じ条件で、実施例３でもプローブとして使用したＰＣＲ産物をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、Ｂａｍ　ＨＩで切断した場合には７　ｋｂの断片が、Ｓｍａ　Ｉで切断した場合には５　ｋｂの断片が、それぞれプローブであるＰＣＲ産物とハイブリダイズした。
【００８１】
これらのハイブリダイズした断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。すなわち、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをそれぞれ別々にＢａｍ　ＨＩとＳｍａ　Ｉで完全に切断した後、サザンハイブリダイゼーションにおいてハイブリダイズしたＢａｍ　ＨＩとＳｍａ　Ｉ断片を切り出してインサートとし、これをベクターとライゲーションした。ついで、このベクターを大腸菌にトランスフォーメーションし、得られたクローンからプラスミドを調製した。インサート両端を配列決定した結果、それぞれ、Ｂａｍ　ＨＩ断片をサブクローニングしたクローンとＳｍａ　Ｉ断片をサブクローニングしたクローンについて、目的のＰＣＲ断片の配列を含んでいることが示された。
【００８２】
Ｓｍａ　Ｉ断片を、ｐＡＮ１の場合と同様に、サブクローニングしたクローンについて、ＧＰＳ法により塩基配列を決定した。その結果、４９００　ｂｐを有するＳｍａ　Ｉ断片は、ＰＫＳ遺伝子の開始コドンから４５４３　ｂｐを、その上流３５７　ｂｐとともに含んでいることが明らかになった。
【００８３】
Ｂａｍ　ＨＩ断片の下流の配列をもとにフォワードプライマーＢａｍ−ｆ：５’　ｃｔｇ　ｃａａ　ｇｃｔ　ｇｃｔ　ｇｃｔ　ａａａ　ｇｃｃ　ａｇ　３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　８）およびリバースプライマーＢａｍ−ｒ：５’ｇａｔ　ｃｃａ　ｇａｔ　ｃｇａ　ｇａｃ　ａｇｇ　ｃａａ　ｇｇ　３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　９）をデザインし、これらを用いて（５０　ｐｍｏｌ）、ｐＪ１８（３．１　ｐｇ）を鋳型にして、Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＰＣＲを行った。ＰＣＲの温度サイクルは、９５℃にて１２分→（９４℃にて３０秒間→５６℃にて３０秒間→７２℃にて９０秒間）×（４５サイクル）→７２℃にて５分間として行った。その結果、予想されたサイズである約６５０　ｂｐの断片が増幅されので、この断片をプローブとした。
【００８４】
ついで、ｐＪ１８をＥｃｏ　ＲＶで切断した後、さらにサザンハイブリダイゼーションを行った。上記のプローブとハイブリダイズするＥｃｏ　ＲＶで切断した時の８　ｋｂ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、その両端を配列決定し、上述のＳｍａ　Ｉ断片の続きであることを確認した。その後、このクローンについて、ＧＰＳ法により全塩基配列を決定した。その結果、Ｅｃｏ　ＲＶ断片（７５５３　ｂｐ）はＳｍａ　Ｉ断片のヌクレオチド３５１４番から始まっていること、さらに相同性検索の結果、ＰＫＳ遺伝子のＣ末側と、更に下流４．５　ｋｂを含んでいることが示された。
【００８５】
実施例３において配列決定されたｐＡＮ１のインサート配列、および上述したＳｍａ　Ｉ断片およびＥｃｏ　ＲＶ断片の位置関係を図２に示す。この結果、ｐＡＮ１のインサート１３　ｋｂとこれにオーバーラップするｐＪ１８のインサート１２　ｋｂを合わせて２２　ｋｂの塩基配列を決定した（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３）。
【００８６】
実施例５：塩基配列の解析
実施例４で得られた２２　ｋｂの塩基配列のオープンリーディングフレームの検索とホモロジーサーチの結果、上流から２つのＰ−４５０、Ｐ−４５０（１）とＰ−４５０（２）、およびこれと逆向きに転写されるオキシダーゼ、さらにはその下流側にＰＫＳの各遺伝子がクラスターを構成していることが明らかになった（図３）。
【００８７】
はじめのＰ−４５０（１）は、イントロンが無く５３７　ａａであると推定した。このＰ−４５０（１）は、ヘムに配位すると考えられるシステイン残基を持ち、全体にわたって既知のＰ−４５０であるチトクロームＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ　ｈａｎｓｅｎｉｉ）と、ヌクレオチドレベルで４６％、アミノ酸レベルで３４％と、高い相同性を示した（図４）。
【００８８】
次のＰ−４５０（２）はイントロンが３個存在し５０９　ａａであると考えられる。このＰ−４５０（２）は、ヘムに配位すると考えられるシステイン残基を持ち、全体にわたって既知のＰ−４５０であるチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）と、ヌクレオチドレベルで４６％、アミノ酸レベルで３３％と、高い相同性を示した（図５）。
【００８９】
次のオキシダーゼはイントロンが３個存在し４８２　ａａであると推定される。以下に示すような配列と高い相同性を示した。
推定ＦＡＤ−依存性オキシダーゼＥｎｃＭ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）とヌクレオチドレベルで４６％、アミノ酸レベルで１９％と（図６）、そして６−ヒドロキシ−Ｄ−ニコチンオキシダーゼ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ）とヌクレオチドレベルで４７％、アミノ酸レベルで１７％と（図７）、それぞれ高い相同性を示した。
【００９０】
今回クローニングされたＰＫＳ遺伝子をＰＫＳＮ遺伝子と命名した。このＰＫＳＮ遺伝子は７８３１　ｂｐであり（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１）、４個のイントロンの存在が推定され、２５４６　ａａ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２）をコードするものと考えられる。配列全体にわたって、既知の還元型ＰＫＳと高いヌクレオチド相同性およびアミノ酸相同性を示した（図８）。またケトシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、デヒドロゲナーゼ（ＤＨ）、エノイルリダクターゼ（ＥＲ）、ケトリダクターゼ（ＫＲ）、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）の各ドメインが、この順に並び還元型ＰＫＳの構造を持つことが確認された。さらに、糸状菌ＰＫＳでは芳香族ＰＫＳも含めこれまでのところ、ＬＤＫＳとＬＮＫＳにしか見出されていないメチルトランスフェラーゼ（ＭｅＴ）ドメインがＤＨとＥＲの間に存在している（図９および図１０）。
【００９１】
実施例６：ＰＫＳＮ発現ベクターの構築
はじめにＰＫＳＮ遺伝子の両端に特異的な、フォワードプライマーＰＫＳ−ｆ：５’　ｃｔｇ　ｃｃａ　ｃｃａ　ｔｇｇ　ａｃａ　ａｇｃ　ｃａｇ　ｔｃ　３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１０）およびリバースプライマーＰＫＳ−ｒ：５’　ｃａａ　ｃｃｔ　ｃａａ　ｇｃｃ　ｔｇｇ　ｃｃａ　ａｇｇ　ａｇ　３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１１）をデザインした。このプライマーを用いて、ＲＥＤＡｃｃｑＴａｑ（Ｓｉｇｍａ）によりＰＣＲを行った。ＰＣＲの温度サイクルは、９４℃にて２分→（９４℃にて３０秒間→６０℃にて３０秒間→６８℃にて９分間）×（３０サイクル）→６８℃にて２０分間として行った。結果、予想された約８　ｋｂの断片が特異的に増幅された。この予想された約８　ｋｂの断片の両端につけたプライマーの配列に、ゲートウェイクローニングシステムを用いるための特異的な配列Ｂ１とＢ２をつけたフォワードプライマーａｔｔ−ＰＫＳｆ：５’　ｇｇｇ　ｇａｃ　ａａｇ　ｔｔｔ　ｇｔａ　ｃａａａａａ　ａｇｃ　ａｇｇ　ｃｔｔ　ａｃｔ　ｇｃｃ　ａｃｃ　ａｔｇ　ｇａｃ　ａａｇ　ｃｃａ　ｇｔｃ　３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１２）およびリバースプライマーａｔｔ−ＰＫＳｒ：５’　ｇｇｇ　ｇａｃ　ｃａｃ　ｔｔｔ　ｇｔａ　ｃａａ　ｇａａ　ａｇｃ　ｔｇｇ　ｇｔｔｃａａ　ｃｃｔ　ｃａａ　ｇｃｃ　ｔｇｇ　ｃｃａ　ａｇｇ　３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１３）を用いて、ＲＥＤＡｃｃｑＴａｑにより再びＰＣＲを行った。ＰＣＲの温度サイクルは、９４℃にて２分→（９４℃にて３０秒間→６５℃にて３０秒間→６８℃にて９分間）×（３０サイクル）→６８℃にて２０分間として行った。この結果、前と同様に特異的に増幅された約８　ｋｂの断片を得た。この断片を用いて、ゲートウェイクローニングシステムを行った。
【００９２】
ゲートウェイクローニングシステムでは、はじめに、ＢＰ反応を行って、ドナーベクターにＰＫＳ遺伝子を導入した。すなわち、ＢＰ反応は、両端にＢ１およびＢ２を有する得られたＰＣＲ断片とドナーベクターとをＢＰクロナーゼ酵素ミックス下で２５℃で２時間インキュベーションすることにより行い、ついでＢＰ反応を終了させるためＰＫ酵素ミックスを加え３７℃で１０分間インキュベーションした。その反応液をそのまま大腸菌にトランスフォーメーションしＬＢ／カナマイシン培地に植菌した。３７℃で一晩培養した後、得られたコロニーのプラスミド液を調製した。このプラスミドを、エントリーベクターとして次のＬＲ反応に用いた。
【００９３】
次にＬＲ反応を行って、エントリーベクター中の目的の配列を、発現ベクター中に組み換えた。この反応のため、まず糸状菌発現ベクターｐＴＡｅｘ３（Ｆｕｊｉｉ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９５）　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　５９，　１８６９−１８７４）に、Ｒ１−ｃｃｄ　Ｂ−Ｒ２のサイトを導入した発現テンプレートベクターｐＴＡｅｘ３Ｒを作製した。組み換えの効率を上げるためこのベクターｐＴＡｅｘ３Ｒをサイト中のＭｌｕ　Ｉで切断した後、これに上記で得られたエントリークローンとＬＲクロナーゼ酵素ミックスを加え、２５℃で１時間インキュベーションして、ＬＲ反応を行った。ＬＲ反応を終了させるため、ＰＫ酵素ミックスを加え３７℃で１０分間インキュベーションした。その反応液をそのまま大腸菌にトランスフォーメーションしＬＢ／アンピシリン培地に植菌した。３７℃で一晩培養した後、得られたコロニーのプラスミドを調製した。その結果、目的のサイズの断片が、意図する方向で入っているものが得られ、これをＰＫＳ１０ベクターと命名した。以下の実施例においては、このベクターを発現に用いることにした。
【００９４】
実施例７：ＰＫＳＮ遺伝子の形質転換
実施例６で作製した発現ベクターを使用して、異種糸状菌であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅを形質転換し、その形質転換体内でＰＫＳＮを発現させ、その結果生成される化合物を確認した。
【００９５】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅの形質転換は、プロトプラスト−ＰＥＧ法（Ｇｏｍｉ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８７）　Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｌｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５１，　２５４９−２５５５）に従って行った。まず、１００　ｍｌのＤＰＹ培地を分注した５００　ｍｌ三角フラスコ中に、アルギニン栄養要求性Ａ．　ｏｒｙｚａｅ　Ｍ−２−３の胞子懸濁液１００μｌを接種して、３７℃、２００　ｒｐｍにて２日間震盪培養した後、グラスフィルター（３Ｇ１）にて濾取した。これを２０　ｍｌのプロトプラスト溶液（２　ｇ溶解酵素、０．８　Ｍ　ＮａＣｌ、１０　ｍＭ　ＮａＰｉ　ｐＨ６）に懸濁して、３７℃にて３時間インキュベートして細胞壁を溶解させ、３Ｇ３グラスフィルターにて濾過し、濾液を２０００　ｒｐｍにて５分間遠心することによりプロトプラストを回収した。このプロトプラストを０．８　Ｍ　ＮａＣｌで２　回、そして溶液Ｉ（０．８　Ｍ　ＮａＣｌ、１０　ｍＭ　ＣａＣｌ２、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　７．５）で１回洗浄したのち、２　ｍｌの溶液ＩＩ（５０　ｍＭ　ＣａＣｌ２、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　７．５中、４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００）に懸濁させ、１．６×１０６／ｍｌのプロトプラスト溶液を調製した。このプロトプラスト溶液０．２　ｍｌに対して１５μｇのプラスミドＤＮＡを加え、形質転換し、アルギニンを含まないＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ（ＣＤ）最小培地上、３０℃で培養した。３−４日後プレート上に出現したコロニーを、ＰＤＡ培地に移し保存した。この形質転換体Ａ．　ｏｒｙｚａｅ／ＰＫＳ　１０ａを、以下の実験に用いた。
【００９６】
実施例８：ＰＫＳＮ遺伝子の発現および生成化合物の確認
得られた形質転換体Ａ．　ｏｒｙｚａｅ／ＰＫＳ　１０ａを用いて、誘導発現を行った。誘導発現は、以下の様にして行った。まず、５０　ｍｌ遠心チューブに、炭素源としてグルコースを含む２０　ｍｌのＣＤ／ｇｌｃ培地（ＮａＮＯ３を３．０　ｇ、ＫＣｌを２．０　ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１．０　ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５　ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．０１　ｇ、ポリペプトン１０　ｇ、グルコース２０　ｇ、ｄＨ２Ｏを１　ｌ、ｐＨ５．５）に菌体を接種し、２８℃、２００　ｒｐｍで３日間振盪培養した後、２００　ｍｌのＣＤ／ｇｌｃ培地（２００　ｍｌ）を分注した５００　ｍｌ三角フラスコに培地ごと移して、同じ条件でさらに３日間振盪培養した（合計６日間の培養）。その後、滅菌したグラスフィルター（１１Ｇ１）で菌体を濾取し、スターチを含むＣＤ培地（ＣＤ／ｓｔｒ）で良く洗った後、　２００　ｍｌ　ＣＤ／ｓｔｒ培地（２００　ｍｌ）を分注した５００　ｍｌ三角フラスコにうつし、２８℃、２００　ｒｐｍで２日間誘導培養することにより行った。培養後、菌体をブフナー漏斗で濾取しｄＨ２Ｏで良く洗った後、できるだけ水気を切って、　−８０℃で保存した。
【００９７】
形質転換体内に含まれる生成化合物を、形質転換体を一晩アセトンに冷浸することにより抽出した。形質転換体抽出物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により展開したところ、ＴＬＣ上でコントロール（Ａ．　ｏｒｙｚａｅ／ｐＴＡｅｘ３）には見られない化合物のスポットが認められた。
【００９８】
この抽出物を、カラムとして逆相クロマトグラフィー用ＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ、４０℃にて、溶媒Ａ：Ｈ２Ｏおよび溶媒Ｂ：ＣＨ３ＣＮを％Ｂ溶媒グラジエントが（０分、５０％）〜（２０分、７０％）〜（２５分、１００％）〜（３０分、１００％）〜（３５分、５０％）となるように制御しながらＴｏｓｏｈ　８０２０（Ｔｏｓｏｈ）を使用してＨＰＬＣにより分離し、これをＵＶ　２３０ｎｍのＵＶ検出器にて検出した。このＨＰＬＣ分析の結果、形質転換体内ではこの化合物がメインに生産されていること（ｒ．ｔ．３０　ｍｉｎ）、コントロールにこの化合物は蓄積されていないことが分かった（図１１）。
【００９９】
次にＬＣ−ＭＳによる分析を行った。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）はＯＤＳ−８０Ｔｓカラムを使用して、上記と同様の条件で、行った。このＬＣから溶出された画分を、そのままマススペクトロメトリーの装置（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｑｕｅｓｔ　ＬＣＱ）に導き、質量分析を行った。その結果、この化合物の分子量は４２８であることが示された（図１２）。
【０１００】
実施例９：生成化合物の単離・精製
次に、実施例８で得られた分子量４２８の化合物の分子式、構造などをさらに詳細に明らかにするため、実施例７で作製した形質転換体Ａ．ｏｒｙｚａｅ／ＰＫＳ　１０ａを大量培養し、生成化合物の単離、精製を行うこととした。
【０１０１】
形質転換体Ａ．ｏｒｙｚａｅ／ＰＫＳ１０ａの２００　ｍｌの誘導培養１０　本から、形質転換体を回収し（Ｆ．Ｗ．　３０　ｇ）、これををアセトンで一晩冷浸することにより生成化合物を抽出した。菌体を濾過して除いた後、このアセトンエキスを蒸発させて濃縮した後、酢酸エチルに転溶し、濃縮乾固し、約３５　ｍｇの油状物質を得た。これをクロロホルムに溶かし、その半量をシリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ　Ｃ−２００、２×２０　ｃｍ）にかけ、クロロホルムで溶出した。主画分をまとめ、約１５　ｍｇの生成化合物を無色油状物質として単離精製した。
【０１０２】
実施例８におけるＬＣ−ＭＳの結果から、生成化合物の分子量は４２８と推定したが、精製化合物について、ＨＲＥＩ−ＭＳ（ＪＥＯＬ　ＭＳ　７００）とＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ＪＥＯＬ　ＭＳ　７００）を測定し、〔Ｍ＋Ｈ〕＋イオンとしてｍ／ｚ　４２９．３３２９（Ｃ２８Ｈ４５Ｏ３に関する計算値４２９．３２６９）を観測し、本化合物の分子式をＣ２８Ｈ４４Ｏ３と決定した（図１３）。この生成化合物の不飽和度は７であった。
【０１０３】
実施例１０：生成化合物の構造決定
次に、実施例９で単離・精製された生成化合物の、分子式および化学構造を決定した。まず、精製した化合物について、ＣＤＣｌ３中、１３Ｃ−ＮＭＲを測定した（ＪＥＯＬ−ａｌｐｈａ・５００　５００　ＭＨｚ）。Ｃｏｍｐｌｅｔｅより２８個の炭素全てが分離して観測され、また、ＤＥＰＴの結果より、１級９個、２級５個、３級６個、４級８個の存在が確認できた。また、最も低磁場の４級炭素はエステルカルボニルと推定され、ラクトン構造の存在が推定された。またｓｐ２炭素の数から二重結合が５つ存在すると考えられた。
【０１０４】
次に、生成化合物について、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。各プロトンのピークはほとんど分離しており、また２個のｓｉｎｇｌｅｔ−ＣＨ３、５個のｄｏｕｂｌｅｔ−ＣＨ３（うち３個はｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ　ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、１個のｔｒｉｐｌｅｔ−ＣＨ３が存在することが示された。
【０１０５】
以下の表に、生成化合物の１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲのデータを記載する。
【０１０６】
【表１】
2004097010.tif 000003
【０１０７】
次に、生成化合物についてのＨＭＱＣスペクトルを調べた。これにより直接結合したＣ−Ｈの相関を確認した。
さらに、ＨＭＢＣスペクトルによりＣ−Ｈの長距離の相関を見たところ、ラクトン構造を含む部分構造、末端メチル基から二重結合を含む部分構造、共役した二重結合を含む部分構造の存在が推定された。
【０１０８】
上記でで推定した構造について、さらにＨ−Ｈ　ＣＯＳＹスペクトルを測定、Ｈ−Ｈ相関を確認し、推定した構造と矛盾しないことを確認した。
この生成化合物の二重結合のシス、トランスを決定するため、それぞれ１６位と１０位、８位のメチルを照射しＮＯＥを測定した。その結果１６位のメチルは１７位のプロトンとはＮＯＥを示さず、１８位のメチルとのＮＯＥを示し、１６位−１７位の二重結合がトランスであると決定した。１０位のメチルについては９位、１２位のプロトンとＮＯＥを示し、１０位−１１位の二重結合がトランスであると決定した。８位のメチルは、１１位、６位のプロトンとＮＯＥを示し、８位−９位の二重結合がトランスであると決定した。
【０１０９】
以上の生成化合物の解析に基づいて、実施例９でその分子式が決定されたＣ２８Ｈ４４Ｏ３は、以下の式：
【０１１０】
【化３】
2004097010.tif 000004
【０１１１】
で示される平面構造を有する、化合物であることが明らかになった。この化合物は新規化合物であり、これをアルタナピロン（ａｌｔｅｒｎａｐｙｒｏｎｅ）と命名した。
実施例１１：ポリケタイド合成酵素　ＰＫＳＮ　によるアルタナピロンの生成機構
本発明のＰＫＳＮは還元型のＰＫＳであり、また、そのポリペプチド中央にＭｅＴドメインを有することから、ＰＫＳ反応中にＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からポリケトメチレン鎖へのメチル基導入を触媒するものと推定された。糸状菌　ＰＫＳ　において、ジカルボン酸伸長単位として専らマロニルＣｏＡが使われることを考えると、スターターの末端メチル基を除く８つの側メチル基はＳＡＭ由来と考えられた。ＰＫＳＮはデカケタイド合成酵素であり、ＰＫＳ反応中８つのメチル基導入を行うという、極めて興味深いＰＫＳである。ロバスタチン生合成のＰＫＳであるＬＤＫＳ、ＬＮＫＳもＭｅＴドメインを有するが、共に導入されるメチル基は１個のみであり、ＰＫＳＮのように多数のメチル基を導入するＰＫＳがクローニングされ、同定されたのは始めてのことである。
【０１１２】
【配列表】
2004097010.tif 000005
2004097010.tif 000006
2004097010.tif 000007
2004097010.tif 000008
2004097010.tif 000009
2004097010.tif 000010
2004097010.tif 000011
2004097010.tif 000012
2004097010.tif 000013
2004097010.tif 000014
2004097010.tif 000015
2004097010.tif 000016
2004097010.tif 000017
2004097010.tif 000018
2004097010.tif 000019
2004097010.tif 000020
2004097010.tif 000021
2004097010.tif 000022
2004097010.tif 000023
2004097010.tif 000024
2004097010.tif 000025
2004097010.tif 000026
2004097010.tif 000027
2004097010.tif 000028
2004097010.tif 000029
2004097010.tif 000030
2004097010.tif 000031
2004097010.tif 000032
2004097010.tif 000033
2004097010.tif 000034
2004097010.tif 000035
2004097010.tif 000036
2004097010.tif 000037
2004097010.tif 000038
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、目的とするインサートを含むｐＡＮ１の構造の概略を示す図である。
【図２】図２は、配列決定されたｐＡＮ１のインサート配列、および上述したＳｍａ　Ｉ断片およびＥｃｏ　ＲＶ断片の位置関係を示す図である。
【図３】図３は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３で示される２２　ｋｂの塩基配列が、上流から２つのＰ−４５０、Ｐ−４５０（１）とＰ−４５０（２）、およびこれと逆向きに転写されるオキシダーゼ、さらにはその下流側にＰＫＳの各遺伝子がクラスターを構成していることを示す図である。
【図４】図４は、Ｐ−４５０（１）の、既知のＰ−４５０であるチトクロームＰ４５０アルカンヒドロキシラーゼ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ　ｈａｎｓｅｎｉｉ）に対するアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【図５】図５は、Ｐ−４５０（２）の、既知のＰ−４５０であるチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）に対するアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【図６】図６は、オキシダーゼの、推定ＦＡＤ−依存性オキシダーゼＥｎｃＭ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）に対するアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【図７】図７は、オキシダーゼの、６−ヒドロキシ−Ｄ−ニコチンオキシダーゼ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ）に対するアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【図８】図８は、本発明のＰＫＳＮの、既知還元型ＰＫＳに対するアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【図９】図９は、ＰＫＳＮおよび他の還元型ＰＫＳの構造を示す概略図である。
【図１０】図１０は、本発明のＰＫＳＮ遺伝子のゲノム配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３）を示す図である。
【図１１】図１１は、ＰＫＳＮ遺伝子による形質転換体Ａ．　ｏｒｙｚａｅ／ＰＫＳ　１０ａの菌体内において生成された化合物をＨＰＬＣ解析した結果を示す図である。
【図１２】図１２は、ＰＫＳＮ遺伝子による形質転換体Ａ．　ｏｒｙｚａｅ／ＰＫＳ　１０ａの菌体内において生合成された化合物を、ＬＣ−ＭＳにより解析した結果を示す図である。
【図１３】図１３は、ＰＫＳＮ遺伝子による形質転換体Ａ．　ｏｒｙｚａｅ／ＰＫＳ　１０ａの菌体内において生合成された化合物の、ＦＡＢ−ＭＳおよびＥＩ−ＭＳの結果を示す図である。
【図１】
2004097010.tif 000040
【図２】
2004097010.tif 000041
【図３】
2004097010.tif 000042
【図４】
2004097010.tif 000043
【図５】
2004097010.tif 000044
【図６】
2004097010.tif 000045
【図７】
2004097010.tif 000046
【図８】
2004097010.tif 000047
【図９】
2004097010.tif 000048
【図１０】
2004097010.tif 000049
【図１１】
2004097010.tif 000050
【図１２】
2004097010.tif 000051
【図１３】
2004097010.tif 000052