(57)【要約】      （修正有）【課題】改変型、特に耐熱性の向上したエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼの提供。【解決手段】Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａを由来とする、特定のアミノ酸配列から成るタンパク質、又は上記のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、１２０番目のリジン残基、１６６番目のイソロイシン残基及び３６５番目のアラニン残基のうち少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１２０番目のリジン残基がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１６６番目のイソロイシン残基がセリンに置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１６６番目のイソロイシン残基がスレオニンに置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項７】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも３６５番目のアラニン残基がバリンに置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項８】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１２０番目のリジン残基がグルタミン酸に、１６６番目のイソロイシン残基がセリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項９】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１２０番目のリジン残基がグルタミン酸に、１６６番目のイソロイシン残基がスレオニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１６６番目のイソロイシン残基がセリンに、３６５番目のアラニン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１６６番目のイソロイシン残基がスレオニンに、３６５番目のアラニン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１２０番目のリジン残基がグルタミン酸に、１６６番目のイソロイシン残基がセリンに、３６５番目のアラニン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１３】
配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１２０番目のリジン残基がグルタミン酸に、１６６番目のイソロイシン残基がスレオニンに、３６５番目のアラニン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１４】
請求項１に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項１５】
以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子ＤＮＡ。
（ａ）配列番号２記載の塩基配列から成る遺伝子ＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列又はその一部の配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ
【請求項１６】
請求項２に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項１７】
配列番号２記載の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成る請求項１６記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項３に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項１９】
配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目から３６０番目、４９６番目から４９８番目及び１０９３番目から１０９５番目の塩基のうち少なくとも１つの塩基が他の異なる塩基に置換された塩基配列から成る請求項１８記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２０】
請求項４に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目から３６０番目の塩基ＡＡＡがＧＡＡ又はＧＡＧに置換された塩基配列から成る請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２２】
配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目の塩基アデニンがグアニンに置換された塩基配列から成る請求項２０記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項５に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２４】
配列番号２記載の塩基配列において、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＧＣ、ＡＧＴ又はＴＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に置換された塩基配列から成る請求項２３記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２５】
配列番号２記載の塩基配列において、４９７番目の塩基チミンがグアニンに置換された塩基配列から成る請求項２３記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２６】
請求項６に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２７】
配列番号２記載の塩基配列において、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に置換された塩基配列から成る請求項２６記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２８】
配列番号２記載の塩基配列において、４９７番目の塩基チミンがシトシンに置換された塩基配列から成る請求項２６記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２９】
請求項７に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３０】
配列番号２記載の塩基配列において、１０９３番目から１０９５番目の塩基ＧＣＣがＧＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に置換された塩基配列から成る請求項２９記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３１】
配列番号２記載の塩基配列において、１０９４番目の塩基シトシンがチミンに置換された塩基配列から成る請求項２９記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３２】
請求項８に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３３】
配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目から３６０番目の塩基ＡＡＡがＧＡＡ又はＧＡＧ  に、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＧＣ、ＡＧＴ又はＴＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）にそれぞれ置換された塩基配列から成る請求項３２記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３４】
配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目の塩基アデニンがグアニンに、４９７番目の塩基チミンがグアニンにそれぞれ置換された塩基配列から成る請求項３２記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３５】
請求項９に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３６】
配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目から３６０番目の塩基ＡＡＡがＧＡＡ又はＧＡＧ  に、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）にそれぞれ置換された塩基配列から成る請求項３５記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３７】
配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目の塩基アデニンがグアニンに、４９７番目の塩基チミンがシトシンにそれぞれ置換された塩基配列から成る請求項３５記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３８】
請求項１０に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３９】
配列番号２記載の塩基配列において、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＧＣ、ＡＧＴ又はＴＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に、１０９３番目から１０９５番目の塩基ＧＣＣがＧＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）にそれぞれ置換された塩基配列から成る請求項３８記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４０】
配列番号２記載の塩基配列において、４９７番目の塩基チミンがグアニンに、１０９４番目の塩基シトシンがチミンにそれぞれ置換された塩基配列から成る請求項３８記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４１】
請求項１１に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４２】
配列番号２記載の塩基配列において、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に、１０９３番目から１０９５番目の塩基ＧＣＣがＧＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）にそれぞれ置換された塩基配列から成る請求項４１記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４３】
配列番号２記載の塩基配列において、４９７番目の塩基チミンがシトシンに、１０９４番目の塩基シトシンがチミンにそれぞれ置換された塩基配列から成る請求項４１記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４４】
請求項１２に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４５】
配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目から３６０番目の塩基ＡＡＡがＧＡＡ又はＧＡＧに、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＧＣ、ＡＧＴ又はＴＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に、１０９３番目から１０９５番目の塩基ＧＣＣがＧＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）にそれぞれ置換された塩基配列から成る請求項４４記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４６】
配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目の塩基アデニンがグアニンに、４９７番目の塩基チミンがグアニンに、１０９４番目の塩基シトシンがチミンにそれぞれ置換された塩基配列から成る請求項４４記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４７】
請求項１３に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４８】
配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目から３６０番目の塩基ＡＡＡがＧＡＡ又はＧＡＧに、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に、１０９３番目から１０９５番目の塩基ＧＣＣがＧＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）にそれぞれ置換された塩基配列から成る請求項４７記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４９】
配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目の塩基アデニンがグアニンに、４９７番目の塩基チミンがシトシンに、１０９４番目の塩基シトシンがチミンにそれぞれ置換された塩基配列から成る請求項４７記載の遺伝子ＤＮＡ。
【請求項５０】
請求項１４〜４９いずれか１項に記載の遺伝子ＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組換えＤＮＡ。
【請求項５１】
請求項５０記載の組換えＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
【請求項５２】
請求項５１記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物からエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼを採取することを特徴とするエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼの製造方法。
【請求項５３】
フマル酸とジアミンとを、請求項５１記載の形質転換体又は形質導入体の存在下で反応させ、得られる反応産物からジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を採取することを特徴とするジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質、およびそれをコードする遺伝子ＤＮＡに関する。さらに該酵素の変異体として誘導されうる改変型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ、該改変型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼをコードする遺伝子ＤＮＡ、該改変型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼをコードする遺伝子ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ、該改変型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼをコードする遺伝子ＤＮＡを含む組換えＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体、およびそれら形質転換体または形質導入体を用いたジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸は、医農薬合成中間体として重要である一方、重金属を捕捉するという特異な性質を持つことから、自然界に放出された後に生分解を受けやすい可能性を持つ該化合物の光学活性体は、キレート剤や洗剤用ビルダーなどの用途が見込まれている。
【０００３】
本出願人らは先に、微生物の触媒作用を利用してフマル酸あるいはマレイン酸と各種アミンから効率よく光学活性Ｓ，Ｓ−ジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を合成する新規な製造方法を提案している（特開平９−１４０３９０号、同９−２８９８９５号および同１０−５２２９２号公報記載）。さらには、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を単離同定し、遺伝子組換えの手法を用いることで、菌体の触媒活性の向上および菌体生産性の改善に成功している（特開平１０−２１０９８４号公報記載）。
【０００４】
ところで、一般的に微生物菌体内にはフマラーゼが存在することが広く知られている。フマラーゼは、フマル酸に水添加してリンゴ酸を生成する酵素である。従って、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有する微生物を用いてジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造しようとする場合、リンゴ酸等の副生物の生成を避けるために、微生物菌体内のフマラーゼを失活させる必要がある。これを解決する手段として、本出願人らは先に、微生物菌体をアルカリ水溶液中で処理することにより、菌体内フマラーゼ活性を低減できることを見出している（特開平１１−１９６８８２号公報記載）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記方法によるフマラーゼ失活処理においては、フマラーゼの失活速度は処理温度に依存するため、高温であればあるほど短時間での失活が可能となる。また、宿主微生物によってフマラーゼの安定性は異なるが、フマラーゼが失活しにくい微生物を用いた場合においても、より高温での失活処理が望まれる。したがって、本発明は、耐熱性を向上させたエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、新規に見出されたブレブンディモナス・ディミニュタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＭＲ−Ｅ００１株由来であるエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼのアミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基を天然アミノ酸のグループから選択される残基で置換することにより、該酵素の耐熱性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本願は以下の発明を提供するものである。
【０００７】
（１）  配列番号１記載のアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
（２）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
（３）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、１２０番目のリジン残基、１６６番目のイソロイシン残基及び３６５番目のアラニン残基のうち少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
（４）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１２０番目のリジン残基がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
（５）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１６６番目のイソロイシン残基がセリンに置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
（６）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１６６番目のイソロイシン残基がスレオニンに置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
（７）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも３６５番目のアラニン残基がバリンに置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
（８）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１２０番目のリジン残基がグルタミン酸に、１６６番目のイソロイシン残基がセリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
（９）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１２０番目のリジン残基がグルタミン酸に、１６６番目のイソロイシン残基がスレオニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
（１０）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１６６番目のイソロイシン残基がセリンに、３６５番目のアラニン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
【０００８】
（１１）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１６６番目のイソロイシン残基がスレオニンに、３６５番目のアラニン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
（１２）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１２０番目のリジン残基がグルタミン酸に、１６６番目のイソロイシン残基がセリンに、３６５番目のアラニン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
（１３）  配列番号１記載のアミノ酸配列において、少なくとも１２０番目のリジン残基がグルタミン酸に、１６６番目のイソロイシン残基がスレオニンに、３６５番目のアラニン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列から成り、且つ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質。
（１４）  （１）に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（１５）  以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子ＤＮＡ。
（ａ）配列番号２記載の塩基配列から成る遺伝子ＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列又はその一部の配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ
（１６）  （２）に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（１７）  配列番号２記載の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成る（１６）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（１８）  （３）に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（１９）  配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目から３６０番目、４９６番目から４９８番目及び１０９３番目から１０９５番目の塩基のうち少なくとも１つの塩基が他の異なる塩基に置換された塩基配列から成る請求項１８記載の遺伝子ＤＮＡ。
（２０）  （４）に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【０００９】
（２１）  配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目から３６０番目の塩基ＡＡＡがＧＡＡ又はＧＡＧに置換された塩基配列から成る（２０）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（２２）  配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目の塩基アデニンがグアニンに置換された塩基配列から成る（２０）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（２３）  （５）に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（２４）  配列番号２記載の塩基配列において、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＧＣ、ＡＧＴ又はＴＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に置換された塩基配列から成る（２３）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（２５）  配列番号２記載の塩基配列において、４９７番目の塩基チミンがグアニンに置換された塩基配列から成る（２３）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（２６）  （６）に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（２７）  配列番号２記載の塩基配列において、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に置換された塩基配列から成る（２６）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（２８）  配列番号２記載の塩基配列において、４９７番目の塩基チミンがシトシンに置換された塩基配列から成る（２６）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（２９）  （７）に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（３０）  配列番号２記載の塩基配列において、１０９３番目から１０９５番目の塩基ＧＣＣがＧＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に置換された塩基配列から成る（２９）記載の遺伝子ＤＮＡ。
【００１０】
（３１）  配列番号２記載の塩基配列において、１０９４番目の塩基シトシンがチミンに置換された塩基配列から成る（２９）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（３２）  （８）に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（３３）  配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目から３６０番目の塩基ＡＡＡがＧＡＡ又はＧＡＧ  に、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＧＣ、ＡＧＴ又はＴＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）にそれぞれ置換された塩基配列から成る（３２）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（３４）  配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目の塩基アデニンがグアニンに、４９７番目の塩基チミンがグアニンにそれぞれ置換された塩基配列から成る（３２）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（３５）  （９）に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（３６）  配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目から３６０番目の塩基ＡＡＡがＧＡＡ又はＧＡＧ  に、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）にそれぞれ置換された塩基配列から成る（３５）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（３７）  配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目の塩基アデニンがグアニンに、４９７番目の塩基チミンがシトシンにそれぞれ置換された塩基配列から成る（３５）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（３８）  （１０）に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（３９）  配列番号２記載の塩基配列において、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＧＣ、ＡＧＴ又はＴＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に、１０９３番目から１０９５番目の塩基ＧＣＣがＧＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）にそれぞれ置換された塩基配列から成る（３８）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（４０）  配列番号２記載の塩基配列において、４９７番目の塩基チミンがグアニンに、１０９４番目の塩基シトシンがチミンにそれぞれ置換された塩基配列から成る（３８）記載の遺伝子ＤＮＡ。
【００１１】
（４１）  （１１）に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（４２）  配列番号２記載の塩基配列において、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に、１０９３番目から１０９５番目の塩基ＧＣＣがＧＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）にそれぞれ置換された塩基配列から成る（４１）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（４３）  配列番号２記載の塩基配列において、４９７番目の塩基チミンがシトシンに、１０９４番目の塩基シトシンがチミンにそれぞれ置換された塩基配列から成る（４１）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（４４）  （１２）に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（４５）  配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目から３６０番目の塩基ＡＡＡがＧＡＡ又はＧＡＧに、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＧＣ、ＡＧＴ又はＴＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に、１０９３番目から１０９５番目の塩基ＧＣＣがＧＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）にそれぞれ置換された塩基配列から成る（４４）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（４６）  配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目の塩基アデニンがグアニンに、４９７番目の塩基チミンがグアニンに、１０９４番目の塩基シトシンがチミンにそれぞれ置換された塩基配列から成る（４４）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（４７）  （１３）に記載されたタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。
（４８）  配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目から３６０番目の塩基ＡＡＡがＧＡＡ又はＧＡＧに、４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣがＡＣＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）に、１０９３番目から１０９５番目の塩基ＧＣＣがＧＴＮ（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。）にそれぞれ置換された塩基配列から成る（４７）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（４９）  配列番号２記載の塩基配列において、３５８番目の塩基アデニンがグアニンに、４９７番目の塩基チミンがシトシンに、１０９４番目の塩基シトシンがチミンにそれぞれ置換された塩基配列から成る（４７）記載の遺伝子ＤＮＡ。
（５０）  （１４）〜（４９）記載の遺伝子ＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組換えＤＮＡ。
【００１２】
（５１）  （５０）記載の組換えＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
（５２）          （５１）記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物からエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼを採取することを特徴とするエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼの製造方法。
（５３）          フマル酸とジアミンとを、（５１）記載の形質転換体又は形質導入体の存在下で反応させ、得られる反応産物からジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を採取することを特徴とするジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明におけるエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ（「ＥＤＤＳａｓｅ」ともいう）とは、フマル酸とエチレンジアミンからエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を可逆的に生成する能力を持つ酵素を示すが、反応の条件によってはエチレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸を生成することもある。さらに本酵素は、エチレンジアミン以外のジアミン類にも反応性を示し、対応するジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を生成する。また、生成するジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸は、多くの場合光学活性体であるが、ラセミ体を生成する酵素もある。このような反応性を示す一群の酵素は、本出願人らにより自然界から分離同定された複数の属に属する細菌類に見出されており、これら細菌類は上記特開平９−１４０３９０号、同９−２８９８９５号および同１０−５２２９２号公報に記載されている。さらに、本出願人らは、特開平１０−５２２９２号公報記載のブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）ｓｐ．  ＴＮ−３株よりエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を単離し、そのアミノ酸配列および遺伝子配列を初めて明らかにするとともに、該遺伝子産物の大量発現の可能性を有する形質転換体の作出に成功している（特開平１０−２１０９８４号公報記載）。
【００１４】
一方、近年の組換えＤＮＡ技術の進歩により、酵素の作用を実質的に変えることなく、その酵素の構成アミノ酸の１個以上を欠失、付加、削除、挿入、もしくは他のアミノ酸で置換した変異体を作製することが可能となっている。これら変異体は、置換、欠失、付加、削除、もしくは挿入されるアミノ酸残基の個所および置換されるアミノ酸の種類によっては、変異の導入されていない野生型酵素と比較して、有機溶媒耐性、耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性、基質特異性、基質親和性などの性能が著しく向上することが知られている。これら性能の向上は、触媒としての酵素の安定化、反応工程の簡略化、反応収率の向上等を通じて、酵素反応を利用した工業的生産における生産コストの大幅な低減をもたらすことがある。従って、多くの酵素において様々な性能が向上した有用な改良酵素の創製が行われている。
【００１５】
本明細書中、「野生型」とは、自然界より分離されてきた微生物に保持されていた酵素を構成するアミノ酸配列、および該酵素をコードする遺伝子の塩基配列が、意図的または非意図的に欠失、削除、挿入、もしくは他のアミノ酸あるいは塩基で置換されていないことを意味する。
【００１６】
本出願人らは、更なる有用なエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼを求めて、該酵素活性を保有する微生物のスクリーニングを行った。その結果、高い該酵素活性を持つブレブンディモナス・ディミニュタＭＲ−Ｅ００１株（以下ＭＲ−Ｅ００１株ということがある）を単離するとともに、ＭＲ−Ｅ００１株よりエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を取得した。さらに、該酵素のアミノ酸配列において少なくとも一つ以上のアミノ酸残基を天然アミノ酸のグループから選択される残基で置換することにより該酵素の耐熱性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
本発明の改変型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼは、例えば、次のようにして得ることができる。先ず、ＭＲ−Ｅ００１株より、野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子の取得を行う。遺伝子の取得には、如何なる公知の手段を用いてもよい。例えば、ＭＲ−Ｅ００１株より調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、該遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を得る。ＰＣＲに用いるプライマーは、一般的には、該酵素を単離精製した後、アミノ酸分析を行い、得られたアミノ酸配列情報に基づいて設計したデジェネレイトプライマーを用いることができる。また、「目的とする該遺伝子の配列が既に知られている他生物種由来の該遺伝子の配列と相同性を有することが期待される」場合、あるいは「既に知られている他生物種由来の該遺伝子の配列と相同性を有する遺伝子の取得を目的とする」場合は、その既知の他生物種由来の該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列情報よりデジェネレイトプライマーを設計し、利用することも可能である。かくして設計されたプライマーを用い、ＭＲ−Ｅ００１株染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮＡ産物を後に行うコロニーハイブリダイゼーションのプローブとして用いる。
【００１８】
続いてＤＮＡライブラリーの作製を行う。公知の方法、例えばＳａｉｔｏ  ａｎｄ  Ｍｉｕｒａらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ７２，  ６１９（１９６３））に従って調製したＭＲ−Ｅ００１株染色体を適切な制限酵素により切断、または部分切断し、同制限酵素切断末端と連結可能な切断末端を生じさせることができる制限酵素で処理したベクターＤＮＡに連結し、適切な微生物宿主の形質転換体または形質導入体を作製することにより、該染色体のＤＮＡライブラリーを得る。形質転換体または形質導入体の宿主とする微生物は特に限定されるものではなく、例えば大腸菌を用いる場合、大腸菌Ｋ１２株、ＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株などを挙げることができる。形質転換体作製に用いるプラスミドＤＮＡとしては、例えば大腸菌を宿主とする場合、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）などが挙げられる。また、上記プラスミドベクターＤＮＡに限定されることなく、それ以外のファージベクターＤＮＡを用いて形質導入体を作製してもよい。
【００１９】
ここで、遺伝子操作に関する工程における説明中、作製する組換えＤＮＡを含む微生物は、プラスミドベクターＤＮＡを用いた場合は形質転換体といい、ファージベクターＤＮＡを用いた場合は形質導入体という。上記形質転換体及び形質導入体は、いずれも本発明に含まれる。以下、プラスミドベクターＤＮＡを用いた形質転換体の場合を例として述べる。
【００２０】
かくして得られた該染色体のＤＮＡライブラリーに対し、上述のＰＣＲによる増幅ＤＮＡ産物をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行う。コロニーハイブリダイゼーションは通常行いうる方法でよく、例えば次のようにして行うことができる。すなわち、寒天培地上に生育した該染色体ＤＮＡライブラリー形質転換体をナイロンメンブレン上に写し取った後、溶菌させてＤＮＡを固定化する。上述のＰＣＲによる増幅ＤＮＡ産物を、例えばＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて標識してプローブとした後、メンブレンに対してハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などを用いて、陽性クローンの選択を行うことができる。得られた陽性クローンより定法に従ってプラスミドＤＮＡを調製し、必要に応じてサブクローニングを行った後、挿入断片の塩基配列を決定する。塩基配列の決定方法は如何なる方法でもよく、通常、市販のキット等を用いたジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １０１，  ２０−７８，  １９８３）により決定することができる。このようにして、ＭＲ−Ｅ００１株由来野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を取得し、また、そのアミノ酸配列および塩基配列を決定することができる。
【００２１】
次いで、得られた野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼのアミノ酸配列において、少なくとも一つが他の天然アミノ酸残基で置換された改変型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼを得るには、如何なる方法でもよく、通常公知の方法で行ない得る。すなわち、野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子ＤＮＡに対して、例えば、ハイドロキシルアミンや亜硝酸等の変異源となる薬剤を接触・作用させる方法、紫外線照射により変異を誘発する方法、ＰＣＲを用いてランダムに変異を導入する方法、市販のキットを利用して部位特異的な置換を生じさせる方法、遺伝子ＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去・付加し連結する方法等が挙げられる。
【００２２】
上記処理のいずれかによって種々の変異を持つエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子ＤＮＡを得たのち、形質転換体を作製する。形質転換に用いることができるプラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合、上記ＤＮＡライブラリー作製工程で挙げたプラスミドベクターを用いることもできるが、後のスクリーニング工程において、熱処理後のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ残存活性を効率よく検出するため、発現効率の高い発現ベクター、例えばｔｒｃプロモーターを有する発現ベクターｐＫＫ２３３−２（アマシャム社製）、あるいは後の実施例で示すｐＫＫ２３３−２の誘導体ｐＦＹ５２９Ｖなどを用いることが好ましい。
【００２３】
但し、本発明において使用するベクター及び宿主は、上記プラスミド及び大腸菌に限定されるものではない。例えば、ベクターとしてはプラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。
【００２４】
本発明のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子ＤＮＡは、該遺伝子ＤＮＡが導入される宿主生物において発現されるように、遺伝子をベクターに組み込むことが必要である。そこで、本発明のベクターには、本発明の遺伝子ＤＮＡのほか、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２５】
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の細菌が挙げられる。また、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を用いることもできる。
【００２６】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等が挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が挙げられる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２７】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００２８】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００２９】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が用いられる。
【００３０】
植物細胞を宿主とする場合は、トウモロコシ、イネ、タバコ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等が用いられる。
【００３１】
上記の通り、種々のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡを保有する形質転換体を得ることができる。
【００３２】
宿主を大腸菌とした場合は、得られた形質転換体を寒天培地上で培養してコロニーを形成させた後、液体培養し、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼを生産させる。得られた培養物を、例えば、４０〜６５℃の温度下、３０分間の熱処理に供した後、残存エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を測定し、残存エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性の高い形質転換体を選択する。かくして得られた優良形質転換体の組換えＤＮＡに挿入されているエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子の塩基配列の決定は、例えば、ジデオキシ法により行なうことができる。
【００３３】
配列番号２に本発明のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子ＤＮＡの塩基配列を、配列番号１に本発明の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を例示する。
【００３４】
また、酵素に耐熱性を付与する複数の異なる単変異置換を組み合わせ、多重変異体とすることにより、単変異体よりもさらに耐熱性の向上した変異酵素を創製できる可能性があることが知られている。多重変異体を作製する手段は如何なる方法でもよく、例えば、合成一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて部位特異的な置換を生じさせる方法、複数の異なる単変異個所を含むＤＮＡ断片を制限酵素で切断して連結させる方法などが挙げられる。
【００３５】
したがって、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼがその酵素活性を有する限り、配列番号１に示すアミノ酸配列において複数個、好ましくは１又は数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【００３６】
本発明においては、特に、配列番号１に示すアミノ酸配列において１２０番目のＬｙｓ、１６６番目のＩｌｅ、３６５番目のＡｌａのうち少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものが好ましい。上記３箇所のアミノ酸置換は、任意に組み合わせることができる。好ましい置換の態様を以下に示す。なお、以下の置換の態様において、数字は配列番号１に示すアミノ酸配列の位置の番号、番号の左のアルファベットは置換前のアミノ酸（１文字表記）、数字の右のアルファベットは置換後のアミノ酸（１文字表記）である。
Ｋ１２０Ｅ
Ｉ１６６Ｓ
Ｉ１６６Ｔ
Ａ３６５Ｖ
（Ｋ１２０Ｅ，  Ｉ１６６Ｓ）
（Ｋ１２０Ｅ，  Ｉ１６６Ｔ）
（Ｉ１６６Ｓ，  Ａ３６５Ｖ）
（Ｉ１６６Ｔ，  Ａ３６５Ｖ）
（Ｋ１２０Ｅ，  Ｉ１６６Ｓ，  Ａ３６５Ｖ）
（Ｋ１２０Ｅ，  Ｉ１６６Ｔ，  Ａ３６５Ｖ）
【００３７】
また、Ｋ１２０Ｅの置換を生じさせるときの塩基置換は以下の通りである。
１２０番目のＬｙｓに対応する配列番号２に示す塩基配列の位置は３５８番目から３６０番目であり、その塩基配列は「ＡＡＡ」である。一方、グルタミン酸のコドンはＧＡＡ又はＧＡＧであるため、本発明においては、ＡＡＡがＧＡＡ又はＧＡＧとなるように塩基を置換させることができる。特に、３５８番目のＡをＧに置換すること（ＡＡＡ→ＧＡＡ）が好ましい。
【００３８】
上記と同様にして、Ｉ１６６Ｓの置換を生じさせるときは、配列番号２に示す塩基配列において４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣを、ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ又はＡＣＴに置換させることができる。特に、４９７番目のＴをＧに置換させること（ＡＴＣ→ＡＧＣ）が好ましい。Ｉ１６６Ｔの置換を生じさせるときは、配列番号２に示す塩基配列において４９６番目から４９８番目の塩基ＡＴＣを、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ又はＡＣＴに置換させることができる。特に、４９７番目のＴをＣに置換させること（ＡＴＣ→ＡＣＣ）が好ましい。
【００３９】
Ａ３６５Ｖの置換を生じさせるときは、配列番号２に示す塩基配列において１０９３番目から１０９５番目の塩基ＧＣＣを、ＧＴＡ、ＧＴＧ、ＧＴＣ又はＧＴＴに置換することができる、特に、１０９４番目のＣをＴに置換すること（ＧＣＣ→ＧＴＣ）が好ましい。
【００４０】
但し、本発明においては、置換後のアミノ酸は上記例に限定されるものではない。したがって、配列番号１に示すアミノ酸配列の１２０番目、１６６番目、３６５番目のアミノ酸のうち少なくとも１つのアミノ酸残基となるように、当該アミノ酸をコードするコドンの少なくとも１つの塩基を他の塩基に置換することができる。
【００４１】
ここで、「エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性」とは、フマル酸及びジアミンとを反応させてジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を生成するための触媒活性を意味する。
【００４２】
また、配列番号２記載の塩基配列又はその一部の配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡも本発明の遺伝子ＤＮＡに含まれる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡであって、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が３００〜２０００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が４０〜７５℃、好ましくは５５〜６５℃での条件をいう。
【００４３】
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明の遺伝子ＤＮＡを得ることができる。
【００４４】
本発明において、耐熱性とは、野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼが失活する温度範囲においても酵素活性を保持することができる性質を意味し、４５〜６０℃、好ましくは５０〜６０℃である。５０〜６０℃の範囲内において、改変型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼは５０℃のときの酵素活性と比較して６０％の酵素活性を維持することができる。
【００４５】
かくして得られた単変異あるいは多重変異が導入された改変型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドＤＮＡを保有する形質転換体を用いて、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼを製造することができる。また、上記形質転換体を用いて（例えば、大腸菌の形質転換体を用いて）、ジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造することもできる。
【００４６】
エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼを製造するには、上記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００４７】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４８】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには  ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはＩＡＡ等を培地に添加することができる。
【００４９】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５０】
培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより目的のタンパク質採取する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００５１】
形質転換体が植物細胞又は植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えばＭＳ基本培地、ＬＳ基本培地等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法、液体培養法のいずれをも採用することができる。
【００５２】
培養物から本発明のタンパク質を精製するには、まず、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により細胞を破壊する。次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去し、粗タンパク質溶液を得る。上記粗溶液から本発明のタンパク質を精製するには、塩析、各種クロマトグラフィー（例えばゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等を単独で又は適宜組み合わせて実施する。
【００５３】
ジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造するには、下記のようにして行なうことができる。大腸菌形質転換体を培養するには、通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。培養に用いる培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄若しくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。なお、培地の初発ｐＨは７〜９に調整するのが適当である。また、培養は、２５〜４２℃で６〜２４時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
【００５４】
培養終了後、得られた微生物菌体を集菌し、適当な緩衝液、例えば、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で菌体を洗浄した後、同緩衝液に懸濁することにより菌体懸濁液を調製する。この菌体懸濁液を、例えば、４０〜６５℃の温度下、３０分〜７２時間熱処理することにより、フマラーゼ活性が消失し、かつエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を有する菌体を調製することができる。かくして得られた菌体を、フマル酸あるいはマレイン酸と各種アミンを含む水溶液中に懸濁して反応させることにより、リンゴ酸等の副生物を含まない、光学活性Ｓ，Ｓ−ジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸水溶液を製造することができる。
なお、ブレブンディモナス・ディミニュタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＭＲ−Ｅ００１株の菌学的性質は下記表のとおりである。
【００５５】
【表１】
2004242533.tif 000002
【００５６】
なお、ブレブンディモナス・ディミニュタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＭＲ−Ｅ００１株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にＦＥＲＭ  Ｐ−１９２０３として２００３年２月５日付けで寄託されている。
【００５７】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施例は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲を何等限定するものではない。
【００５８】
［実施例１］  ＭＲ−Ｅ００１株由来野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子の取得
（１）  ＭＲ−Ｅ００１株染色体ＤＮＡの調製
ＭＲ−Ｅ００１株を  １００ｍｌのＥＤＤＳ培地  （０．２％エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、０．２％グルコース、０．１％バクトイーストエキス、  ０．０５％ポリペプトン、０．１％硫酸マグネシウム・７水塩、２５％（ｖ／ｖ）燐酸緩衝液（１Ｍ  、ｐＨ  ７．０）  、０．５％（ｖ／ｖ）  金属塩混合物溶液（硫酸ナトリウム  ５６ｇ、塩化マグネシウム・６水塩  ８ｇ  、塩化カルシウム０．８ｇ  、硫酸マンガン・４水塩  ０．６ｇ  、塩化第二鉄・６水塩  ０．１２ｇ、硫酸亜鉛  ０．０６ｇ／１００ｍｌ）中、３０℃にて４日間振盪培養した後に集菌し、この菌体を  Ｓａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８．０）  ４ｍｌ  に懸濁し、リゾチーム  ８ｍｇを加えて３７℃で１時間振盪した後凍結した。次に、１０ｍｌの  Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ  液（１％ＳＤＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ  、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  、ｐＨ  ９．０）  を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（メルク社製）（終濃度  １ｍｇ）  を加え３７℃で１時間振盪した。次に、等量のＴＥ飽和フェノール（ＴＥ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０）を加えて撹拌後遠心し、上層を採り２倍量のエタノールを加えた後ガラス棒でＤＮＡを巻きとり、９０％  、８０％  、７０％  のエタノールで順次フェノールを取り除いた。次に、ＤＮＡを  ３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼ  Ａ溶液（１００℃、１５分間の熱処理済み）を  １０ｍｇ／ｍｌの終濃度となるように加え３７℃で３０分間振盪した。さらにプロテイナーゼ  Ｋを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加え遠心し、上層と下層に分離させ上層を採取した（以後この操作をフェノール抽出と呼ぶ）。フェノール抽出を２回繰り返した後、同量のクロロホルム  （４％イソアミルアルコール含有）を加え同様の抽出操作を繰り返した（以後この操作をクロロホルム抽出と呼ぶ）。その後上層に２倍量のエタノールを加えガラス棒でＤＮＡを巻き取り回収し、染色体ＤＮＡ標品を得た。
【００５９】
（２）  プローブの調製
本出願人らは先に、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）ｓｐ．  ＴＮ−３株よりエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子の単離に成功し、そのアミノ酸配列および遺伝子配列を初めて明らかにしている（特開平１０−２１０９８４号公報記載）。該公報において用いられたデジェネレイトプライマー、すなわち、配列番号３および配列番号４に示されるような配列を有する合成ＤＮＡ（それぞれ、プライマー＃１  および  ＃２とする）を用い、工程（１）で得られたＭＲ−Ｅ００１株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
プライマー＃１：ＡＴＧＡＣＩＣＣＩＣ  ＡＹＡＡＹＣＣＩＧＡ  ＹＧＣ（配列番号３）
プライマー＃２：ＣＣＤＡＴＹＴＧＣＡＴ  ＹＴＴＩＣＣＩＧＣ  ＲＡＣＩＧＡＩＣＣＤ  ＡＴＹＴＣ（配列番号４）
【００６０】
すなわち、ＭＲ−Ｅ００１株染色体ＤＮＡ  １μｌ  、１０倍濃度の反応緩衝液  １０μｌ  、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ  、プライマー＃１および＃２各々１μｌ（１００ｐｍｏｌ  濃度相当）、ＥｘＴａｑ  （宝酒造社製）１μｌ  を加えて１００  μｌ  とした。この溶液について、９５℃、３０秒間（デナチュレーション過程）、５５℃、３０秒間（アニーリング過程）、７２℃、２分間（エクステンション過程）のインキュベーションを３０サイクル行った。反応終了後、フェノール抽出およびクロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿により増幅されたＤＮＡを回収した。これを１．０％アガロースゲル電気泳動で分離後、ＭＲ−Ｅ００１株のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子の一部をコードすると考えられる約３００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。こうして得られたＤＮＡ断片をＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて標識し、プローブとした。
【００６１】
（３）  ＤＮＡライブラリーの作製
ＭＲ−Ｅ００１株染色体ＤＮＡ  １０μｌ  に１０倍濃度制限酵素反応用緩衝液５μｌ  、滅菌水３３μｌ  、制限酵素  ＫｐｎＩ  ２μｌ  を加え、３７℃にて１６時間反応させた後エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。アガロースゲル電気泳動を行い、６．５Ｋｂ  から  ５．５ＫｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＤＮＡ  ＰＲＥＰ（ダイアトロン社製）を用いて回収した。このＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて大腸菌ベクター  ｐＵＣ１８のＫｐｎＩ部位に挿入し、組換えＤＮＡライブラリーを作製した。ライゲーションに用いた  ｐＵＣ１８断片は次のように作製した。ｐＵＣ１８  保存液  ２μｌ  に対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液５μｌ  、滅菌水４０μｌ  、制限酵素  ＫｐｎＩ  ３μｌ  を加え、３７℃で２時間反応後、フェノール抽出およびクロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿させた後乾燥して５０μｌ  の滅菌水に溶解させた。さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）１μｌ  、１０倍濃度緩衝液１０μｌ  、滅菌水３９μｌ  を加え６５℃で反応後、フェノール抽出およびクロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿後乾燥して滅菌水に溶解させた。
【００６２】
（４）  大腸菌形質転換体の作製および組換えＤＮＡの選別
大腸菌  ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１％  バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％  ＮａＣｌ）  １ｍｌに接種し３７℃、５時間好気的に前培養し、この培養物  ０．４ｍｌを  ＳＯＢ培地  ４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ  、２．５ｍＭ  ＫＣｌ  、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４  、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ）  に加え、１８℃で２０時間培養した。この培養物を遠心分離により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ  ６．０）  、２００ｍＭ  ＫＣｌ  、１０ｍＭ    ＣａＣｌ２  、４０ｍＭ    ＭｎＣｌ２  ）  を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置した。その後、再度遠心し、上澄を除いた後、沈殿した大腸菌を冷ＴＦ溶液  ３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルフォキシドを加え０℃で１０分間放置した。こうして作製したコンピテントセル  ２００μｌ  に工程（３）で作製した組換えプラスミドＤＮＡを含有する溶液（ＤＮＡライブラリー）を１０μｌ  加え、０℃で３０分放置後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却後、ＳＯＣ  培地（２０ｍＭ  グルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ  、２．５ｍＭ  ＫＣｌ  、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４  、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ）１ｍｌ  を添加して３７℃にて１時間振盪培養した。これを  ２００μｌ  ずつＬＢＡｍｐ寒天培地（アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌ  、１．５％寒天を含有するＬＢ培地）にまき、３７℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニーについて、コロニーハイブリダイゼーション法によりエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を保有すると考えられる形質転換体を選別した。すなわち、寒天培地上に生育した形質転換体をナイロンメンブレン（バイオダイン  Ａ：日本ポール社製）上に移し、菌体を溶かしてＤＮＡを固定した後、これを工程（２）で作製したプローブ（約３００ｂｐ）で処理し、ＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用い、目的の組換えＤＮＡを持つコロニーを選択した。
【００６３】
（５）  組換えプラスミドの調製
工程（４）  で選択した形質転換体を  １００ｍｌのＬＢＡｍｐ培地（アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養し、集菌後、Ｆｌｅｘｉ  Ｐｒｅｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。得られた組換えプラスミドＤＮＡを  ｐＥＤＳ９００１と名付けた。
【００６４】
（６）  制限酵素地図の作製およびエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子領域の特定
工程（５）  で得られたプラスミド  ｐＥＤＳ９００１を数種の制限酵素を用いて切断し制限酵素地図を作製した（図１）。さらに、通常行われるようにサブクローニングを行った。すなわち、ｐＥＤＳ９００１  を制限酵素  ＢａｍＨＩで切断した後アガロースゲル電気泳動を行い、約５．３ＫｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＤＮＡ  ＰＲＥＰ（ダイアトロン社製）を用いて回収した。ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて自己連結反応を行った後、大腸菌  ＪＭ１０９株を形質転換することにより、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を含むと考えられる約２．６Ｋｂ  の断片が挿入されたプラスミド（ｐＥＤＳ９００３）（図２）を得た。
【００６５】
（７）  塩基配列の決定
工程（６）  で特定された領域周辺の塩基配列を蛍光シーケンサ  ＡＬＦＩＩ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて決定した。その結果、配列番号１に示されるアミノ酸配列から成るオープンリーディングフレームをコードする塩基配列（配列番号２）が見い出された。
【００６６】
［実施例２］  ＭＲ−Ｅ００１株由来野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を導入した形質転換体の活性評価
実施例１の工程（６）で得られたエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＥＤＳ９００３    ２μｌ  に対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液２μｌ  、滅菌水１５μｌ  、制限酵素  ＫｐｎＩ  １μｌ  を添加し、３７℃にて２時間反応させた。エタノール沈殿によりプラスミドＤＮＡを回収し、乾燥後１７μｌ  の滅菌水、  ２μｌ  の１０倍濃度制限酵素緩衝液、制限酵素  ＢａｍＨＩ  １μｌを添加して３７℃にて２時間反応させた。この反応液からアガロースゲル電気泳動により約２．６Ｋｂ  の断片を調製し、大腸菌ベクター  ｐＵＣ１１９  に挿入した。作製したライゲーション溶液を用いて大腸菌  ＪＭ１０９を形質転換して目的のプラスミドを得た。ここで作製したプラスミドを  ｐＥＤＳ９０２０  （図３）と名付け、また形質転換体を  ＪＭ１０９／  ｐＥＤＳ９０２０と名付けた。ＪＭ１０９／  ｐＥＤＳ９０２０  およびコントロールとしてＪＭ１０９／  ｐＥＤＳ０２０（特開平１０−２１０９８４号公報記載）を、それぞれＬＢＡｍｐ培地１ｍｌに接種して３７℃にて８時間振盪培養後、１ｍＭ  ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅを含有する４０ｍｌのＬＢＡｍｐ培地で３７℃、３０時間培養した。得られた培養物を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）で洗浄後、２ｍｌ  の同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液の一部を３４２ｍＭフマル酸と  １７１ｍＭエチレンジアミンを含むｐＨ  ８．０の水溶液５０ｍｌ  に懸濁し３０℃で反応させた。時間間隔を空けて反応混合液の一部を（０．１ｍｌ）を取り出し、０．４２ＮのＮａＯＨ水溶液０．９ｍｌ中に加え反応を停止した。菌体を遠心分離により除いた後、ＨＰＬＣを用いて生成したＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を分析した（ＷＡＫＯＳＩＬ５Ｃ８  （和光純薬社製）〔溶出液；１０ｍＭ水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭＣｕＳＯ４  を含む５０ｍＭリン酸；ｐＨ  ２〕）。上記測定条件下において１分間に１μｍｏｌのＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を生成させる酵素量を酵素単位（Ｕ）として、ＪＭ１０９／  ｐＥＤＳ９０２０  およびＪＭ１０９／  ｐＥＤＳ０２０の菌体あたり（ＯＤ６３０あたり）の活性を求めたところ、それぞれ１．２２  ｍＵ／ＯＤｍｌ、０．８９ｍＵ／ＯＤｍｌであり、ＭＲ−Ｅ００１株由来エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼが高い該酵素活性を有することが確認された。なお、ｐＥＤＳ９０２０は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にＦＥＲＭ  Ｐ−１９２０２として、２００３年２月５日付で寄託されている。
【００６７】
［実施例３］  改変型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子の取得
（１）野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子への変異導入
実施例２で得られたプラスミドｐＥＤＳ９０２０をもとに、野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子へのランダム変異導入を行った。変異導入は、ＰＣＲにおけるヌクレオチドの誤取り込みによる塩基置換を利用した。エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子開始コドン領域を含むオリゴヌクレオチドＥＤ−０１（配列番号５）と、該遺伝子終止コドンより約５０ｂｐ下流領域を含むＥＤ−０２（配列番号６）を変異誘発ＰＣＲのプライマーとし、以下のような組成のＰＣＲ反応液１００μｌを調製した。
プライマー：
ＥＤ−０１：ＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣ  ＣＣＧＣＡＴＡＡＣＣ  ＣＡＧＡＴＧＣＣＡＣ  Ｃ（配列番号５）
（下線部分は制限酵素ＮｃｏＩ切断認識部位）
ＥＤ−０２：ＡＡＡＣＡＡＧＣＴＴ  ＣＧＴＣＡＴＧＧＣＴ  ＡＴＣＣＣＣＴＣ（配列番号６）
（下線部分は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断認識部位）
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ（上記工程で調製したｐＥＤＳ９０２０）  １μｌ
１０×  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＩＢＣＯ社製）  １０μｌ
５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ＧＩＢＣＯ社製）  ３μｌ
プライマーＥＤ−０１    １μｌ
プライマーＥＤ−０２    １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  各々２μｌ
１０ｍＭ  ｄＩＴＰ    ２μｌ
１０ｍＭ  ｄＢｒａＵＴＰ  ２μｌ
滅菌水  ７１μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ社製）  １μｌ
【００６８】
上記反応液に対し、９４℃、３０秒（デナチュレーション過程）、６８℃、１８０秒（アニーリング過程・エクステンション過程）のインキュベーションを３０サイクル行った。上記ＰＣＲ終了後、反応液１０μｌを０．７％アガロースゲルにより電気泳動を行って、約１．５ｋｂの増幅断片の検出を行った。また、耐熱性評価のコントロールとして用いるため、通常のＰＣＲにて野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を増幅した。すなわち、以下のような組成のＰＣＲ反応液１００μｌを調製した。
鋳型ＤＮＡ（ｐＥＤＳ９０２０）  １μｌ
１０×  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）  １０μｌ
プライマーＥＤ−０１    １μｌ
プライマーＥＤ−０２    １μｌ
５ｍＭ  ｄＮＴＰ  各々２μｌ
滅菌水  ７８μｌ
ＰｙｒｏｂｅｓｔＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）  １μｌ
【００６９】
上記反応液に対し、９４℃、３０秒（デナチュレーション過程）、６８℃、１８０秒（アニーリング過程・エクステンション過程）のインキュベーションを３０サイクル行った。上記ＰＣＲ終了後、反応液１０μｌを０．７％アガロースゲルにより電気泳動を行って、約１．５ｋｂの増幅断片の検出を行った。
【００７０】
プライマーＥＤ−０１およびＥＤ−０２中には、制限酵素ＮｃｏＩ切断認識部位および制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断認識部位がそれぞれ導入されており（プライマーＥＤ−０１及びＥＤ−０２の塩基配列の下線部分）、増幅ＤＮＡ産物を両制限酵素で切断することにより、後述する発現ベクターｐＦＹ５２９ＶのＮｃｏＩ部位−ＨｉｎｄＩＩＩ部位間に容易に挿入することが可能となる。
【００７１】
（２）発現ベクターの構築
後述のスクリーニング工程において、熱処理後のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ残存活性を効率よく検出するため、コピー数と発現効率の高い大腸菌発現ベクターｐＦＹ５２９Ｖを作製した（図４）。ｔｒｃプロモーターを有する発現ベクターｐＫＫ２３３−２（アマシャム社製）５μｌに制限酵素ＮａｅＩ  １μｌ  、ＳｃａＩ  １μｌ、１０倍濃度制限酵素反応用緩衝液１μｌ、滅菌水２μｌを加え、３７℃にて１２時間切断反応を行った。切断後、０．７％アガロースゲルにより電気泳動を行い、該プラスミドの複製開始点を含まないＮａｅＩ−ＳｃａＩ断片（１．２ｋｂ）を切り出し、ＤＮＡ    ＰＲＥＰ（ダイアトロン社製）を用いて、該ＤＮＡ断片を含むＴＥ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）３μｌを回収した。この操作と並行して、高コピー数ベクターであるｐＵＣ１８  ２μｌに制限酵素ＰｖｕＩＩ  １μｌ  、ＳｃａＩ  １μｌ、１０倍濃度制限酵素反応用緩衝液１μｌ、滅菌水５μｌを加え、３７℃にて１２時間切断反応を行った。切断後、０．７％アガロースゲルにより電気泳動を行い、該プラスミドの複製開始点を含むＰｖｕＩＩ−ＳｃａＩ断片（１．６ｋｂ）を切り出し、ＤＮＡ    ＰＲＥＰ（ダイアトロン社製）を用いて、該ＤＮＡ断片を含むＴＥ  １μｌを回収した。こうして得られた両ＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）により連結させた。ｐＫＫ２３３−２由来ＮａｅＩ−ＳｃａＩ断片溶液３μｌ、ｐＵＣ１８由来ＰｖｕＩＩ−ＳｃａＩ断片溶液１μｌ、キット中のＡ液１６μｌ、キット中のＢ液４μｌを混合し、１６℃にて１６時間連結反応を行った。連結反応後の反応液を用い、実施例１  （４）記載の方法により大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体コロニーより約１０クローンをＬＢＡｍｐ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃で１２時間振盪培養した。培養後、この培養物を遠心分離により集菌した後、Ｆｌｅｘｉ  Ｐｒｅｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いることにより、プラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで切断後、０．７％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ｐＫＫ２３３−２由来ＮａｅＩ−ＳｃａＩ断片（１．２ｋｂ）とｐＵＣ１８由来ＰｖｕＩＩ−ＳｃａＩ断片（１．６ｋｂ）が正しく連結されているクローンを選んでｐＦＹ５２９Ｖと命名し、変異ライブラリーの発現ベクターとして用いた。
【００７２】
（３）変異ライブラリーの作製
工程（１）のＰＣＲで得られた変異導入エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を含む反応液を、常法に従ってエタノール沈殿により精製を行い、沈殿物を７０μｌの滅菌水に再懸濁した。１０倍濃度制限酵素反応用緩衝液１０μｌ、制限酵素ＮｃｏＩ  １０μｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ  １０μｌを加え、３７℃にて１２時間切断反応を行った。切断反応後、フェノール抽出およびクロロホルム抽出を行った後、エタノール沈殿を行い、沈殿物を１００μｌの滅菌水に再懸濁して変異ＤＮＡ断片溶液とした。この操作と並行して、工程（２）で作製した発現ベクターｐＦＹ５２９Ｖ  ３μｌに、滅菌水６７μｌ、１０倍濃度制限酵素反応用緩衝液１０μｌ、制限酵素ＮｃｏＩ  １０μｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ  １０μｌを加え、３７℃にて１２時間切断反応を行った。切断後、フェノール抽出およびクロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿により精製した後、沈殿物を１０μｌの滅菌水に再懸濁して切断済みｐＦＹ５２９Ｖ溶液とした。変異ＤＮＡ断片と発現ベクターｐＦＹ５２９Ｖの連結は、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて行った。上記の変異ＤＮＡ断片溶液３μｌ、切断済みｐＦＹ５２９Ｖ溶液１μｌ、キット中のＡ液１６μｌ、キット中のＢ液４μｌを混合し、１６℃にて１６時間連結反応を行った。連結反応後の反応液を用いて、実施例１（工程（４））記載の方法により大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、種々の変異導入ＥＤＤＳａｓｅ遺伝子を保有する形質転換体を得た。また、以上と同様の操作を、工程（１）で増幅した野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を挿入断片として行った。得られた形質転換体コロニーよりプラスミドを抽出し、蛍光シークエンサーＡＬＦ  ＩＩ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて塩基配列を確認した結果、実施例１（工程（７））で決定した野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼの塩基配列（配列番号２）と同一であった｛但し、プライマーＥＤ−０１のＮｃｏＩ部位導入による、４番目の塩基変化（Ａ→Ｇ）は除く｝。このプラスミドをｐＥＤＴｒｃ９００３と命名し、該プラスミドを含む大腸菌、すなわちＪＭ１０９／  ｐＥＤＴｒｃ９００３を、後述する（４）の耐熱性向上エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼのスクリーニング工程におけるコントロールとして用いた。なお、ｐＥＤＴｒｃ９００３は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にＦＥＲＭ  Ｐ−１９２０１として２００３年２月５日付けで寄託されている。
【００７３】
（４）耐熱性向上エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼのスクリーニング
工程（３）で得られた変異エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を含むＪＭ１０９形質転換体およびコントロールとするＪＭ１０９／  ｐＥＤＴｒｃ９００３を、４８穴マルチディッシュに１．５ｍｌずつ分注したＬＢＡｍｐ培地にそれぞれ接種し、３７℃にて１２時間液体培養した。得られた培養物を、５０℃の温度下、３０分間の熱処理に供した後、実施例２記載の方法により、残存エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性の測定を行った。工程（３）で得られた形質転換体約１００００株についてスクリーニングを行った結果、野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼを保有するＪＭ１０９／  ｐＥＤＴｒｃ９００３がもはや完全にその活性を消失していたのに対し、該酵素活性が残存している株が４株得られた。
【００７４】
（５）変異の同定
工程（４）で得られた４株の耐熱性向上候補株に含有される変異導入エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子について、どの部位にどのような変異が導入されたのかを確認すべく以下のように解析を行った。４株の耐熱性向上候補株に含まれる組換えプラスミドＤＮＡを、Ｆｌｅｘｉ  Ｐｒｅｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製し、得られた組換えプラスミドＤＮＡをそれぞれｐＥＤＴｒｃＩ−２、ｐＥＤＴｒｃＩ−２３、ｐＥＤＴｒｃＪ−０５、ｐＥＤＴｒｃＫ−０１と命名した。また、それぞれのプラスミドに含まれる変異酵素自体をＩ−２、Ｉ−２３、Ｊ−０５、Ｋ−０１と命名した。これらの組換えプラスミドＤＮＡに含まれる変異エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子の塩基配列を、蛍光シークエンサーＡＬＦ  ＩＩ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて決定した。決定した各変異エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子の塩基配列と野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼの塩基配列（配列番号２）とを比較解析した結果、ｐＥＤＴｒｃＩ−２では１６６番目のイソロイシン残基（ＡＴＣ）がスレオニン（ＡＣＣ）に、ｐＥＤＴｒｃＩ−２３では１２０番目のリジン残基（ＡＡＡ）がグルタミン酸（ＧＡＡ）に、ｐＥＤＴｒｃＪ−０５では１６６番目のイソロイシン残基（ＡＴＣ）がセリン（ＡＧＣ）に、ｐＥＤＴｒｃＫ−０１では３６５番目のアラニン残基（ＧＣＣ）がバリン（ＧＴＣ）にそれぞれ置換されている単変異体であることが明らかになった［（）内は、各々のアミノ酸をコードする塩基配列の変化を示す］。
【００７５】
（６）単変異体の耐熱性評価
工程（５）で同定された４種類の単変異体エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ（Ｉ−２、Ｉ−２３、Ｊ−０５、Ｋ−０１）の耐熱性をより詳細に調べた。単変異体エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼを保有する大腸菌４株（ＪＭ１０９／ｐＥＤＴｒｃＩ−２、ＪＭ１０９／ｐＥＤＴｒｃＩ−２３、ＪＭ１０９／ｐＥＤＴｒｃＪ−０５、ＪＭ１０９／ｐＥＤＴｒｃＫ−０１）、および野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼを保有する大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＤＴｒｃ９００３を、ＬＢＡｍｐ培地１．５ｍｌに接種して３０℃にて８時間振盪培養した後、それぞれの培養液を５００ｍｌ容の三角フラスコに調製したＬＢＡｍｐ培地４０ｍｌに４００μｌずつ接種し、３７℃にて１２時間振盪培養した。得られた培養物より１．５ｍｌを採取し、遠心分離により集菌した後、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄した後、１．５ｍｌの同緩衝液に懸濁することにより菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液に対して超音波破砕を行い、粗酵素抽出液を得た。得られた粗酵素抽出液を４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃の各温度下、それぞれ３０分間熱処理した後、直ちに４℃に冷却した。熱処理後、実施例２記載の方法により、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性の測定を行い、熱処理を行わずに４℃で保冷したものをそれぞれの相対活性値のコントロール（１００％）として、残存相対活性を求めた。
【００７６】
結果を図５に示す。図５において、縦軸は残存エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を、横軸は処理温度を示す。野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼは５０℃で完全に該酵素活性が消失していたのに対し、単変異体Ｉ−２、Ｉ−２３、Ｊ−０５、Ｋ−０１はそれぞれ５０℃で７５％、５０℃で８５％、６０℃で１２％、５５℃で１２％の残存相対活性を保持しており、野生型と比較してこれらの単変異体の耐熱性が向上していることが確認された。
【００７７】
［実施例４］  多重変異体の作製と耐熱性評価
（１）  多重変異体の作製
実施例３で耐熱性の向上が確認された４種類の単変異体におけるアミノ酸残基の置換を組み合わせることにより、多重変異体を作製した。単変異体Ｉ−２、Ｉ−２３、Ｊ−０５、Ｋ−０１の変異個所は、それぞれ１６６番目のイソロイシン残基、１２０番目のリジン残基、１６６番目のイソロイシン残基、３６６位のアラニン残基であり、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＡｃｃＩ、ＣｌａＩで切断することにより、これらの変異個所を各々一つずつ含むＤＮＡ断片が得られる（図６）。切断した単変異体のＤＮＡ断片を、異なる単変異体由来の対応するＤＮＡ断片と置き換えて再連結することにより、二重変異あるいは三重変異を持つキメラ酵素遺伝子を作製した（図６）。例えば、二重変異体Ｃｈ−４の作製は、先ず、単変異体Ｉ−２３をコードする遺伝子を含むｐＥＤＴｒｃＩ−２３を制限酵素ＮｃｏＩおよびＡｃｃＩで切断し、切断の結果生じた短いほうのＤＮＡ断片（約０．５ｋｂ）をアガロースゲル電気泳動により切り出した。同時に、単変異体Ｊ−０５をコードする遺伝子を含むｐＥＤＴｒｃＪ−０５を制限酵素ＮｃｏＩおよびＡｃｃＩで切断し、切断の結果生じた長いほうのＤＮＡ断片（約３．８ｋｂ、ベクター含む）をアガロースゲル電気泳動により切り出した。両ＤＮＡ断片を、ＤＮＡ  ＰＲＥＰ（ダイアトロン社製）を用いて回収し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて連結した後、常法に従って大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、制限酵素ＮｃｏＩおよびＡｃｃＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動により正しく連結されていることを確認し、このプラスミドＤＮＡをｐＥＤＴｒｃＣｈ−４、キメラ酵素をＣｈ−４と命名した。同様に、単変異体Ｉ−２３由来ＮｃｏＩ−ＡｃｃＩ断片（約０．５ｋｂ）と、単変異体Ｉ−２由来ＮｃｏＩ−ＡｃｃＩ断片（約３．８ｋｂ、ベクター含む）を連結して得られるプラスミドＤＮＡをｐＥＤＴｒｃＣｈ−６、キメラ酵素をＣｈ−６と命名した。同様な手法により、単変異体Ｊ−０５由来ＮｃｏＩ−ＣｌａＩ断片（約１ｋｂ）と、単変異体Ｋ−０１由来ＮｃｏＩ−ＣｌａＩ断片（約３．３ｋｂ、ベクター含む）を連結して得られるプラスミドＤＮＡをｐＥＤＴｒｃＣｈ−１、キメラ酵素をＣｈ−１とし、単変異体Ｉ−２由来ＮｃｏＩ−ＣｌａＩ断片（約１ｋｂ）と、単変異体Ｋ−０１由来ＮｃｏＩ−ＣｌａＩ断片（約３．３ｋｂ、ベクター含む）を連結して得られるプラスミドＤＮＡをｐＥＤＴｒｃＣｈ−２、キメラ酵素をＣｈ−２とした。また、三重変異体についても、単変異体Ｉ−２３由来ＮｃｏＩ−ＡｃｃＩ断片（約０．５ｋｂ）と単変異体Ｊ−０５由来ＡｃｃＩ−ＣｌａＩ断片（約０．５ｋｂ）および単変異体Ｋ−０１由来ＮｃｏＩ−ＣｌａＩ断片（約３．３ｋｂ、ベクター含む）を連結して得られるプラスミドＤＮＡをｐＥＤＴｒｃＣｈ−８、キメラ酵素をＣｈ−８とし、単変異体Ｉ−２３由来ＮｃｏＩ−ＡｃｃＩ断片（約０．５ｋｂ）と単変異体Ｉ−２由来ＡｃｃＩ−ＣｌａＩ断片（約０．５ｋｂ）および単変異体Ｋ−０１由来ＮｃｏＩ−ＣｌａＩ断片（約３．３ｋｂ、ベクター含む）���連結して得られるプラスミドＤＮＡをｐＥＤＴｒｃＣｈ−１０、キメラ酵素をＣｈ−１０とした。かくして得られたキメラ酵素の構造を図６に示す。
【００７８】
（２）  多重変異体の耐熱性評価
工程（１）で作製した６種類の多重変異体エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ（Ｃｈ−４、Ｃｈ−６、Ｃｈ−１、Ｃｈ−２、Ｃｈ−８、Ｃｈ−１０）の耐熱性を調べた。多重変異体エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼを保有する大腸菌６株（ＪＭ１０９／  ｐＥＤＴｒｃＣｈ−４、ＪＭ１０９  ／ｐＥＤＴｒｃＣｈ−６、ＪＭ１０９／ｐＥＤＴｒｃＣｈ−１、ＪＭ１０９／ｐＥＤＴｒｃＣｈ−２、ＪＭ１０９  ／ｐＥＤＴｒｃＣｈ−８、ＪＭ１０９／  ｐＥＤＴｒｃＣｈ−１０）、および野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼを保有する大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＤＴｒｃ９００３を、ＬＢＡｍｐ培地１．５ｍｌに接種して３０℃にて８時間振盪培養した後、それぞれの培養液を５００ｍｌ容の三角フラスコに調製したＬＢＡｍｐ培地４０ｍｌに４００μｌずつ接種し、３７℃にて１２時間振盪培養した。得られた培養物より１．５ｍｌを採取し、遠心分離により集菌した後、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄した後、１．５ｍｌの同緩衝液に懸濁することにより菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液に対して超音波破砕を行い、粗酵素抽出液を得た。得られた粗酵素抽出液を４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃の各温度下、それぞれ３０分間熱処理した後、直ちに４℃に冷却した。熱処理後、実施例２記載の方法により、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性の測定を行い、熱処理を行わずに４℃で保冷したものをそれぞれの相対活性値のコントロールとして、残存相対活性を求めた。結果を図７に示す。図７において、縦軸は残存エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ活性を、横軸は処理温度を示す。野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼは５０℃で完全に該酵素活性が消失していたのに対し、多重変異体Ｃｈ−４、Ｃｈ−６、Ｃｈ−１、Ｃｈ−２、Ｃｈ−８、Ｃｈ−１０はそれぞれ６０℃で７２％、５５℃で８９％、６０℃で５６％、５５℃で２５％、６０℃で９０％、５５℃で９７％の残存相対活性を保持しており、野生型および単変異体と比較してこれら多重変異体の耐熱性が向上していることが確認された。
【００７９】
【発明の効果】
本発明により、ブレブンディモナス・ディミニュタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＭＲ−Ｅ００１株由来野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼの塩基配列およびアミノ酸配列が提供される。また、野生型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼより誘導された改変型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼの塩基配列およびアミノ酸配列が提供される。さらには、野生型および改変型エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体、該形質転換体または形質導入体を用いたジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法が提供される。本発明により、効率よくジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造することが可能となる。
【００８０】
【配列表】
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【００８１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：ＸａａはＭｅｔ又は欠失を表す
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＥＤＳ９００１の制限酵素地図。
【図２】プラスミドｐＥＤＳ９００３の制限酵素地図。
【図３】プラスミドｐＥＤＳ９０２０の制限酵素地図。
【図４】発現ベクターｐＦＹ５２９Ｖの構築図。
【図５】単変異体の耐熱性評価を示す図。
【図６】単変異体および多重変異体の構造を示す模式図。□はＴ４９７Ｃ（Ｉｌｅ１６６Ｔｈｒ）の変異を、△はＡ３５８Ｇ（Ｌｙｓ１２０Ｇｌｕ）の変異を、○はＴ４９７Ｇ（Ｉｌｅ１６６Ｓｅｒ）の変異を、◇はＣ１０９４Ｔ（Ａｌａ３６５Ｖａｌ）の変異をそれぞれ示す。
【図７】多重変異体の耐熱性評価を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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