(57)【要約】【課題】シクロイヌロヘプタオース（ＣＦ７）生成能に優れた新規な環状イヌロオリゴ糖生成酵素であるシクロイヌロオリゴサッカライド  フラクタノトランスフェラーゼ（ＣＦＴａｓｅ）、その製造方法および環状イヌロオリゴ糖の製造方法を提供すること。【解決手段】例えば、パエニバチルス  ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）ＭＧ−ＣＦ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５８）由来のＣＦＴａｓｅである。このＣＦＴａｓｅは、ＣＦ６とＣＦ７を両者の生成比率が１：０．４（重量比）以上で生成する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の理化学的性質を有することを特徴とする環状イヌロオリゴ糖生成酵素であるシクロイヌロオリゴサッカライド  フラクタノトランスフェラーゼ（ＣＦＴａｓｅ）。
（１）作用：イヌリンに作用させるとイヌリンのβ−２，１−フラクトシド結合を切断後ただちに分子内転移反応を生じさせ、６個のフラクトース分子がβ−２，１−フラクトシド結合したシクロイヌロヘキサオース（ＣＦ６）と７個のフラクトース分子がβ−２，１−フラクトシド結合したシクロイヌロヘプタオース（ＣＦ７）の少なくとも２種類の環状イヌロオリゴ糖を生成し、好適酵素反応条件下においてはＣＦ６とＣＦ７の生成比率が１：０．４（重量比）以上である。
（２）基質特異性：β−２，１−フラクトシド結合を有するフラクトースポリマーに作用し、β−２，６−フラクトシド結合のみを有するフラクトースポリマーには作用しない。
（３）至適ｐＨ：ｐＨ７．０付近
（４）ｐＨ安定性：４℃、１８時間の処理においてｐＨ６．０−９．０の範囲で安定
（５）至適温度：４５℃付近
（６）熱安定性：ｐＨ７．０、３０分間の処理において４０℃以下で安定
（７）分子量：１２８ＫＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、１１８ＫＤａ（ゲル濾過法）
【請求項２】
Ｎ−末端アミノ酸配列がＡｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−であることを特徴とする請求項１記載のＣＦＴａｓｅ。
【請求項３】
パエニバチルス  ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）に属する微生物由来であることを特徴とする請求項１記載のＣＦＴａｓｅ。
【請求項４】
微生物がＭＧ−ＣＦ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５８）であることを特徴とする請求項３記載のＣＦＴａｓｅ。
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされてなることを特徴とするＣＦＴａｓｅ。
【請求項６】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ、請求項１記載の理化学的性質を有することを特徴とするＣＦＴａｓｅ。
【請求項７】
パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を培養し、培養物から分離・精製して取得することを特徴とする請求項１記載のＣＦＴａｓｅの製造方法。
【請求項８】
イヌリンに請求項１記載のＣＦＴａｓｅを作用させることを特徴とする環状イヌロオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シクロイヌロヘプタオース（ＣＦ７）生成能に優れた新規な環状イヌロオリゴ糖生成酵素であるシクロイヌロオリゴサッカライド  フラクタノトランスフェラーゼ（ＣＦＴａｓｅ）、その製造方法および環状イヌロオリゴ糖の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
環状オリゴ糖は種々の物質を包接し、それにより包接された物質の光や熱に対する安定性を向上させたり、揮発性物質を安定に保持したり、さらに水難溶性物質を易溶性にするなど有用な作用を示すことから、食品、医薬品、化粧品などの分野で広く用いられている。環状オリゴ糖としては、α−１，４結合したグルコース６〜８分子からなるシクロデキストリン（ＣＤ）やβ−２，１結合したフラクトース６〜８分子からなる環状イヌロオリゴ糖であるシクロフラクタン（ＣＦ）などが知られている。これら環状オリゴ糖の性質の違いとして挙げられるのは、ＣＤは比較的水に溶けにくいという問題点を持つのに対し、ＣＦは水に対する溶解性が極めて高いという点である。従って、ＣＦは、その優れた溶解性から、ＣＤでは対応できなかった分野への利用も可能となり、従来よりも幅広い分野においてＣＦの有用性が期待されている。
【０００３】
ＣＦは、１９８９年に大阪教育大学の内山らによって世界で初めて発見され、この時、同時に、ＣＦ生成酵素であるＣＦＴａｓｅも発見された（下記の非特許文献１を参照）。このＣＦＴａｓｅは糖転移酵素の一種であり、キクイモ、チコリ、ゴボウ、ダリアなどのキク科、ユリ科、アヤメ科、ラン科などの植物の根、根茎から得られる炭水化物の主成分であるイヌリンに、この酵素を作用させることにより、フラクトース６〜８分子がβ−２，１結合で環状に連なったイヌロオリゴ糖を生成せしめることができる。
【０００４】
現在までに知られているＣＦＴａｓｅは、バチルス  マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）に属するＣＦＣ１（下記の非特許文献２を参照）、バチルス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）に属するＯＫＵＭＺ  ３１Ｂ（前出の非特許文献１を参照）およびバチルス  サーキュランスに属するＭＣＩ−２５５４（下記の非特許文献３および特許文献１を参照）由来のものである。これらのいずれのＣＦＴａｓｅも、前出の非特許文献１、下記の非特許文献４および非特許文献５に記載の通り、シクロイヌロヘキサオース（ＣＦ６）とシクロイヌロヘプタオース（ＣＦ７）の生成比率が最大で１：０．２５〜１：０．２７（重量比）の範囲にあり、ＣＦ７の生成比率がＣＦ６に比較して１／４程度であることが知られている。
【０００５】
ＣＦ７は、ＣＦ６と比べて分子空洞が大きく幅広い物質を包接できるので、特にその有用性が期待できることから、ＣＦ７生成能に優れたＣＦＴａｓｅの探求は意義深い。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｍｉｓｈｉｏ  Ｋａｗａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｔａｋａｏ  Ｕｃｈｉｙａｍａ，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ．，  ｖｌ．２６０，  ｐ．２９７−３０４，  １９９４
【非特許文献２】
ＫＩＭ，  ＨＷＡ−Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  ＹＯＮＧ−ＪＩＮ  ＣＨＯＩ，  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ｖｌ．８，  ｎｏ．３，  ｐ．２５１−２５７，  １９９８
【非特許文献３】
Ｓａｃｈｉｋｏ  Ｋｕｓｈｉｂｅ，  Ｋａｏｒｉ  Ｍｉｔｓｕｉ，  Ｍａｓａｈｉｒｏ  Ｙａｍａｇｉｓｈｉ，  Ｋａｚｕｎｏｒｉ  Ｙａｍａｄａ  ａｎｄ  Ｙｕｕｋｉ  Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ｖｌ．５９，  ｎｏ．１，  ｐ３１−３４，  １９９５
【特許文献１】
特開平７−４１５００号公報
【非特許文献４】
川村三志夫、内山喬夫、澱粉科学  第３９巻、ｐ  １０９−１１６，  １９９２
【非特許文献５】
鎌田明、バイオインダストリー  Ｖｏｌ．  ９，  ２８−３３，  １９９２
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、シクロイヌロヘプタオース（ＣＦ７）生成能に優れた新規な環状イヌロオリゴ糖生成酵素であるシクロイヌロオリゴサッカライド  フラクタノトランスフェラーゼ（ＣＦＴａｓｅ）、その製造方法および環状イヌロオリゴ糖の製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために微生物のスクリーニングを重ねたところ、現在までに知られているＣＦＴａｓｅよりもＣＦ７の生成能が格段に高いＣＦＴａｓｅを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の環状イヌロオリゴ糖生成酵素であるシクロイヌロオリゴサッカライド  フラクタノトランスフェラーゼ（ＣＦＴａｓｅ）は、請求項１記載の通り、次の理化学的性質を有することを特徴とする。
（１）作用：イヌリンに作用させるとイヌリンのβ−２，１−フラクトシド結合を切断後ただちに分子内転移反応を生じさせ、６個のフラクトース分子がβ−２，１−フラクトシド結合したシクロイヌロヘキサオース（ＣＦ６）と７個のフラクトース分子がβ−２，１−フラクトシド結合したシクロイヌロヘプタオース（ＣＦ７）の少なくとも２種類の環状イヌロオリゴ糖を生成し、好適酵素反応条件下においてはＣＦ６とＣＦ７の生成比率が１：０．４（重量比）以上である。
（２）基質特異性：β−２，１−フラクトシド結合を有するフラクトースポリマーに作用し、β−２，６−フラクトシド結合のみを有するフラクトースポリマーには作用しない。
（３）至適ｐＨ：ｐＨ７．０付近
（４）ｐＨ安定性：４℃、１８時間の処理においてｐＨ６．０−９．０の範囲で安定
（５）至適温度：４５℃付近
（６）熱安定性：ｐＨ７．０、３０分間の処理において４０℃以下で安定
（７）分子量：１２８ＫＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、１１８ＫＤａ（ゲル濾過法）
また、請求項２記載のＣＦＴａｓｅは、請求項１記載のＣＦＴａｓｅにおいて、Ｎ−末端アミノ酸配列がＡｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−であることを特徴とする。
また、請求項３記載のＣＦＴａｓｅは、請求項１記載のＣＦＴａｓｅにおいて、パエニバチルス  ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）に属する微生物由来であることを特徴とする。
また、請求項４記載のＣＦＴａｓｅは、請求項３記載のＣＦＴａｓｅにおいて、微生物がＭＧ−ＣＦ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５８）であることを特徴とする。
また、本発明のＣＦＴａｓｅは、請求項５記載の通り、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされてなることを特徴とする。
また、本発明のＣＦＴａｓｅは、請求項６記載の通り、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ、請求項１記載の理化学的性質を有することを特徴とする。
また、本発明の請求項１記載のＣＦＴａｓｅの製造方法は、請求項７記載の通り、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を培養し、培養物から分離・精製して取得することを特徴とする。
また、本発明の環状イヌロオリゴ糖の製造方法は、請求項８記載の通り、イヌリンに請求項１記載のＣＦＴａｓｅを作用させることを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＣＦＴａｓｅは、好適酵素反応条件下においてＣＦ６とＣＦ７の生成比率が１：０．４（重量比）以上であり、現在までに知られているＣＦＴａｓｅよりもＣＦ７の生成能が格段に高い点において一線を画すものである。
【００１１】
本発明のＣＦＴａｓｅは、例えば、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物から取得することができる。本発明のＣＦＴａｓｅを産生する微生物の具体例としては、パエニバチルス  ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）に属するＭＧ−ＣＦ６が挙げられる。このＭＧ−ＣＦ６は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５８として寄託されている。ＭＧ−ＣＦ６は、本発明者らがＣＦ７の生成能に優れたＣＦＴａｓｅを取得する目的で、土壌よりフラクトオリゴ糖変換微生物のスクリーニングを行った結果、選抜されたものである。その菌学的性質は次の通りである。
【００１２】
〈形態〉  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ寒天培地上で生育し、コロニーは全縁で平山型、白色〜白黄色、グラム陽性桿菌、細胞の連鎖はほとんどなく、長さ３．５〜０．５μｍ×幅１．０±０．２μｍ、非運動性、芽胞は中端立で卵〜楕円形、膨らみは若干あり
〈生理的性質〉  カタラーゼ：陽性、オキシダーゼ：陰性、至適生育温度：３７℃（生育温度域１５〜５０℃）、至適ｐＨ：７．０（生育ｐＨ域  ｐＨ５．０〜１０．０）、ＰＦテスト：Ｆ、ゼラチンの加水分解：＋、カゼインの加水分解：−、硝酸塩の利用：＋、ＮａＣｌ濃度５％：＋、ＮａＣｌ濃度７％：−、クエン酸塩の利用：−または±、マロン酸塩の利用：−、Ｔｗｅｅｎ８０の分解：＋、ＤＮａｓｅの生産：−、ウレアーゼの生産：＋、リゾチームの耐性：＋、チロシンの分解性：−、炭素原の利用：陽性：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−（＋）−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−（−）−フルクトース、イヌリン、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、マルトース、シュクロース、ラクトース、陰性：イノシトール、Ｄ−（＋）−フコース、リボース、アドニトール、Ｌ−（−）−ソルボース
〈ジアミノ−アミノ酸〉  ｍｅｓｏ−ＤＡＰ
〈主要メナキノン〉  ＭＫ−７
〈菌体糖組成〉  グルコース、リボース
〈主要菌体脂肪酸〉  ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、ｉｓｏ−Ｃ１６：０、ｎ−Ｃ１６：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０
〈ＧＣ％〉  ４８±０．５％
【００１３】
なお、この菌株がＭＧ−ＣＦ６であることは、上記菌学的性質と１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて確認済みである。
【００１４】
以下、パエニバチルス  ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）ＭＧ−ＣＦ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５８）から本発明のＣＦＴａｓｅを取得する方法について説明する。
【００１５】
ＭＧ−ＣＦ６をＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ培地などの培地に接種して前培養した後、得られた培養液をβ−２，１−フラクトシド結合を有するフラクトースポリマーを炭素源として含有する本培養培地に移し、菌株を培養し、本発明のＣＦＴａｓｅを誘導産生させる。ここでフラクトースポリマーとはフラクトース分子が少なくとも２つ以上結合した糖類のことである。使用可能なフラクトースポリマーとしては、イヌリン、レバン、イヌロオリゴ糖類、フラクトオリゴ糖類、レバンオリゴ糖類、およびこれらを含有する植物抽出物または微生物などがあるが、特に好ましいのはイヌリンである。イヌリンとは、キクイモ、チコリ、ゴボウ、ダリアなどのキク科、ユリ科、アヤメ科、ラン科などの植物の根、根茎から得られる炭水化物の主成分である。本培養培地には、炭素源のほかに酵母エキス、リン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化第二鉄、炭酸カルシウム、硝酸ナトリウムなどを適宜含有させてもよい。
【００１６】
上記の方法によって得られた培養液から菌体を遠心分離、濾過などの固液分離手段で除去し、培養上清液とする。培養上清液からの本発明のＣＦＴａｓｅの精製は、公知の分離・精製方法が適用できる。具体的には、例えば、培養上清液から硫安分画（８０％飽和）、有機溶媒沈殿法などにより粗精製酵素を得、さらにこれをイオン交換、アフィニティーおよびゲル濾過などの各種クロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって本発明のＣＦＴａｓｅを得ることができる。
【００１７】
こうして得られた本発明のＣＦＴａｓｅは、以下の理化学的性質を有する。
（１）作用：イヌリンに作用させるとイヌリンのβ−２，１−フラクトシド結合を切断後ただちに分子内転移反応を生じさせ、６個のフラクトース分子がβ−２，１−フラクトシド結合したシクロイヌロヘキサオース（ＣＦ６）と７個のフラクトース分子がβ−２，１−フラクトシド結合したシクロイヌロヘプタオース（ＣＦ７）の少なくとも２種類の環状イヌロオリゴ糖を生成し、好適酵素反応条件下においてはＣＦ６とＣＦ７の生成比率が１：０．４（重量比）以上である。
（２）基質特異性：β−２，１−フラクトシド結合を有するフラクトースポリマーに作用し、β−２，６−フラクトシド結合のみを有するフラクトースポリマーには作用しない。
（３）至適ｐＨ：ｐＨ７．０付近
（４）ｐＨ安定性：４℃、１８時間の処理においてｐＨ６．０−９．０の範囲で安定
（５）至適温度：４５℃付近
（６）熱安定性：ｐＨ７．０、３０分間の処理において４０℃以下で安定
（７）分子量：１２８ＫＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、１１８ＫＤａ（ゲル濾過法）
【００１８】
このＣＦＴａｓｅは、Ａｇ＋、Ｆｅ２＋、Ａｌ３＋などの金属イオン存在下において酵素活性が阻害され、中でもＡｇ＋による酵素活性への影響は極めて大きい。また、そのＮ−末端アミノ酸配列はＡｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−であり、これを現在までに知られているＣＦＴａｓｅと比較すると、バチルス  サーキュランスＭＣＩ−２５５４由来のＣＦＴａｓｅの２３５〜２４４番目アミノ酸配列と相同性が高く、バチルス  マセランスＣＦＣ１由来のＣＦＴａｓｅの２５３〜２６２番目アミノ酸配列と完全に一致するものである。しかし、本発明のＣＦＴａｓｅは、好適酵素反応条件下（例えば、ｐＨ：ｐＨ６〜８、反応温度：３０〜５０℃、反応時間：１２〜１２０時間の反応条件）においてＣＦ６とＣＦ７の生成比率が１：０．４（重量比）以上であり、現在までに知られているＣＦＴａｓｅに比較してＣＦ７の生成比率が格段に高いことから、本発明のＣＦＴａｓｅは現在までに知られているＣＦＴａｓｅとは異なる性質を有する新規な酵素である。
【００１９】
こうして得られた本発明のＣＦＴａｓｅは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされてなる。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表の配列番号１９に記載の通りであるが、本発明のＣＦＴａｓｅは、このアミノ酸配列における２５２Ｔｈｒと２５３Ａｓｐとの間で切断が起こることで成熟体として産生されるものと考えられる。
【００２０】
なお、本発明のＣＦＴａｓｅは、推定される２５３ＡｓｐをＮ−末端とするアミノ酸配列で表されるものに限定されず、上記の理化学的性質を有するものであれば、この推定アミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、挿入されたアミノ酸配列により表されるものであってもよい。また、本発明のＣＦＴａｓｅは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ、上記の理化学的性質を有するものであってもよい。ここで、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、少なくとも１５０個、例えば、１８０個，２４０個，３００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを意味する。
【００２１】
本発明の環状イヌロオリゴ糖の製造方法は、フラクトースポリマーであるイヌリンに本発明のＣＦＴａｓｅを作用させるものである。この方法により、フラクトース６〜７分子がβ−２，１結合で環状に連なったイヌロオリゴ糖を製造することができる。環状イヌロオリゴ糖の製造に用いるＣＦＴａｓｅは、精製されたものに限定されず、ＭＧ−ＣＦ６などの本発明のＣＦＴａｓｅを産生する微生物を培養後、遠心分離などを用いて除菌して得られる、ＣＦＴａｓｅを含む培養上清液を用いてもよいし、その培養上清液から得られる粗精製酵素を用いてもよい。得られる環状イヌロオリゴ糖は、少なくともＣＦ６とＣＦ７を含む混合物であるが、好適酵素反応条件下においてＣＦ６とＣＦ７の生成比率は１：０．４（重量比）以上であり、現在までに知られているＣＦＴａｓｅを用いた場合よりも得られるＣＦ７の比率が格段に高い。
【００２２】
なお、ＣＦ６とＣＦ７の分離・精製は、β−２，１−フラクトシド結合を切断する能力を有するエキソ型酵素または当該酵素を産生する微生物を作用させ、直鎖オリゴ糖、イヌリンなどのフルクタンを低分子化させ、活性炭カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過などを用いて行うことができる。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下の記載になんら限定して解釈されるものではない。
【００２４】
実施例１：本発明の環状イヌロオリゴ糖生成酵素であるシクロイヌロオリゴサッカライド  フラクタノトランスフェラーゼ（ＣＦＴａｓｅ）の取得と性質
パエニバチルス  ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）ＭＧ−ＣＦ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５８）をＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ培地（牛脳エキス末０．７５％、ハートエキス末０．８％、ペプトン１％、ブドウ糖０．２％、塩化ナトリウム０．５％およびリン酸一水素カリウム０．２５％、日水製薬社製）６０ｍｌに接種し、１９０ｒｐｍで３５℃、２４時間前培養した。得られた培養液を本培養培地（イヌリン４％、酵母エキス０．２％、硝酸ナトリウム０．５％、リン酸一水素カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．０５％、塩化鉄０．００１％および炭酸カルシウム０．１％）８００ｍｌに接種し、２００ｒｐｍで３５℃、７２時間培養した後、遠心分離（１８，５００×ｇ、２０分間）により菌体を除去し、培養上清液を得た。この培養上清液７８０ｍｌに８０％飽和となるように硫安を加え、タンパク質を沈殿させた。次いで、遠心分離（１８，５００×ｇ、２０分間）により沈殿物を集め、この沈殿物を少量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、不溶物を遠心分離（２７，０００×ｇ、１５分間）により除去して上清液１５．５ｍｌを得、予め上記緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ф２．６×５５ｃｍ、２９０ｍｌ）に展開した。カラムを上記緩衝液で溶出し、粗酵素液を得た。
得られた粗酵素液９２ｍｌを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トーヨーパール６５０Ｍカラム（Ф２．５×１８ｃｍ、８８ｍｌ）に展開し、イオン交換クロマトグラフィーを行った。カラムを上記緩衝液で洗浄後、０〜０．２５Ｍの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で直線濃度勾配をかけ、ＣＦＴａｓｅ活性を有する画分を溶出した。
この画分を限外濾過により濃縮して得られた濃縮液２０ｍｌを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したシクロイヌロヘキサオース（ＣＦ６）  結合ＡＨ−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（Ф１．４×８．３ｃｍ、１２．８ｍｌ）に展開した。カラムを上記緩衝液で洗浄後、０．５％イヌリンを含む上記緩衝液で溶出し酵素活性を有する画分を集めた。
次に、この画分を限外濾過により濃縮し、得られた濃縮液１．３５ｍｌを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（Ф１．６×７６ｃｍ、１５２ｍｌ）に展開した。そして、溶出液を送り出すペリスタルティックポンプのインレット側（溶媒側）のチューブとカラムから溶出した溶液の検出を行うＵＶモニターのアウトレット側のチューブとを連結して、リサイクルカラムクロマトグラフィーを行った。５回のリサイクリングを行った後、カラムを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出しフラクションコレクターで分取し、ＣＦＴａｅｓ画分１４ｍｌを集めた。このＣＦＴａｓｅ画分を限外濾過により１．３ｍｌまで濃縮後−３０℃で凍結保存し、本発明の環状イヌロオリゴ糖生成酵素であるシクロイヌロオリゴサッカライド  フラクタノトランスフェラーゼ（ＣＦＴａｓｅ）の精製酵素標品を得た。以上の精製操作により、比活性１４５．６  ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、精製度５２０倍の酵素標品が得られた。回収率は２１．４％であった。この酵素標品はＳＤＳ電気泳動において均一であった。なお、ＣＦＴａｓｅ活性１単位は１分間に１マイクロモルの環状イヌロオリゴ糖を生成する酵素量と定義した。また、この酵素が以下の理化学的性質を有し、そのＮ−末端アミノ酸配列がＡｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−であることを確認した。
（１）作用：イヌリンに作用させるとイヌリンのβ−２，１−フラクトシド結合を切断後ただちに分子内転移反応を生じさせ、６個のフラクトース分子がβ−２，１−フラクトシド結合したシクロイヌロヘキサオース（ＣＦ６）と７個のフラクトース分子がβ−２，１−フラクトシド結合したシクロイヌロヘプタオース（ＣＦ７）の少なくとも２種類の環状イヌロオリゴ糖を生成し、好適酵素反応条件下においてはＣＦ６とＣＦ７の生成比率が１：０．４（重量比）以上である。
（２）基質特異性：β−２，１−フラクトシド結合を有するフラクトースポリマーに作用し、β−２，６−フラクトシド結合のみを有するフラクトースポリマーには作用しない。
（３）至適ｐＨ：ｐＨ７．０付近
（４）ｐＨ安定性：４℃、１８時間の処理においてｐＨ６．０−９．０の範囲で安定
（５）至適温度：４５℃付近
（６）熱安定性：ｐＨ７．０、３０分間の処理において４０℃以下で安定
（７）分子量：１２８ＫＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、１１８ＫＤａ（ゲル濾過法）
【００２５】
参考例１：粗酵素液のＣＦＴａｓｅ活性
パエニバチルス  ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）ＭＧ−ＣＦ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５８）をＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ培地（牛脳エキス末０．７５％、ハートエキス末０．８％、ペプトン１％、ブドウ糖０．２％、塩化ナトリウム０．５％およびリン酸一水素カリウム０．２５％、日水製薬社製）６０ｍｌに接種し、１９０ｒｐｍで３５℃、２４時間前培養した。得られた培養液を培地（イヌリン４％、酵母エキス０．２％、硝酸ナトリウム０．５％、リン酸一水素カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．０５％、塩化鉄０．００１％および炭酸カルシウム０．１％）８００ｍｌに接種し、２００ｒｐｍで３５℃、７２時間培養した後、遠心分離（１８，５００×ｇ、２０分間）により菌体を除去し、培養上清液を得た。この培養上清液７８０ｍｌに８０％飽和となるように硫安を加え、タンパク質を沈殿させた。次いで、遠心分離（１８，５００×ｇ、２０分間）により沈殿物を集め、この沈殿物を１００ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、粗酵素液を得た。この粗酵素液のＣＦＴａｓｅ活性は約９０単位であった。
【００２６】
実施例２：ＣＦＴａｓｅ遺伝子の塩基配列の決定
工程Ａ：ＭＧ−ＣＦ６からの染色体ＤＮＡの調製
ＭＧ−ＣＦ６を、Ｊ−Ｂｏｒｔｈ培地（０．５％ポリペプトン、１．５％酵母エキス、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．２％グルコース；ｐＨ７．０）５ｍｌ×４本で前々培養（３７℃、２４時間；振とう培養）、５０ｍｌ×４本で前培養、５００ｍｌ×４本で本培養し、集菌（４℃、６０００ｒｐｍ、１５分間）した。その後、Ｓａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡ：ｐＨ８．０）で洗浄、遠心を２回繰り返した。得られた湿菌体約５ｇをＳａｌｉｎｅ−Ｔｒｉｓ（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ；ｐＨ９．０）で十分懸濁し、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（２０ｍｇ／ｍｌ  Ｓａｌｉｎｅ−Ｔｒｉｓ）１ｍｌを加えて軽く撹拌し、３７℃で１０分間静置した。次に、ゆっくり振とうしながらＴｒｉｓ−ＳＤＳ｛５％ＳＤＳ、Ｓａｌｉｎｅ−Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ｐＨ７．５）｝１０  ｍｌを滴下し、６０℃  で３０分間静置した。等量（５０ｍｌ）の７０％フェノール（７０％フェノール、Ｓａｌｉｎｅ−Ｔｒｉｓ）を加え３０分間ゆっくり振とうし、遠心分離（３５００ｒｐｍ、６０分間）後、上層を分取した。上層に２倍量の冷却エタノールをゆっくり加え、ガラス棒でＤＮＡを巻き取り、巻き取ったガラス棒を７０、８０、９０％の冷却エタノールで順次洗浄し、静置風乾させた。これを０．１×ＳＳＣ溶液（２０×ＳＳＣ溶液をＳ．Ｄ．Ｗで希釈）２０ｍｌに溶解し、２０×ＳＳＣ溶液（２Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）１ｍｌを加えた。ＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）１０５μｌを加えて３７℃  で１時間静置後、等量（２０ｍｌ）の７０％フェノールを加え、３０分間ゆっくり振とうした。遠心分離（３５００ｒｐｍ、６０分間）後、上層を分取し、２倍量の冷却エタノールをゆっくり加え、ガラス棒でＤＮＡを巻き取った。巻き取ったガラス棒を７０、８０、９０％の冷却エタノールで順次洗浄し、静置風乾させた。これを０．１×ＳＳＣ溶液８ｍｌに溶解して透析チューブに移し、１ＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（１０×Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ；１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ；ｐＨ７．５）で一晩透析した。確認は精製したＤＮＡの吸収スペクトルの測定によって行った。
【００２７】
工程Ｂ：ＣＦＴａｓｅ遺伝子のコア領域のＰＣＲによる増幅
工程Ａにより調製した染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理して鋳型とし、ＤＮＡサーマルサイクラー（宝酒造社製）を用いてＰＣＲ法を行った。既知のＣＦＴａｓｅの配列に基づいて作成したプライマーとして、配列表の、配列番号２および配列番号４の組み合わせ、配列番号３および配列番号６の組み合わせ、ならびに配列番号５および配列番号７の組み合わせを用い、目的とするＰＣＲ増幅産物を得た。
なお、ＰＣＲ法の反応液は、ＤＮＡ溶液１μｌ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液（宝酒造社製）５μｌ、ｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを各２．５ｍＭ；宝酒造社製）８μｌ、２種類のプライマー溶液（１０ｐｍｏｌ／ｍｌ）各１μｌに滅菌蒸留水を加えて全量４９．５μｌとなるよう調製し、９４℃・１０分間の熱変性後、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ２５０ユニット（宝酒造社製）０．５μｌ加え、反応を行った。ＰＣＲの反応条件は、変性９４℃で１分間、アニーリング４５℃で０．５分間、伸長反応７０℃で２分間の合成反応サイクルを３０サイクル行い、最後に７２℃で７分間の最終伸長を行った。
反応終了後、ＰＣＲ増幅産物を含む反応液に冷却エタノール１００μｌを加え−２０℃で３０分以上静置してＤＮＡを沈殿させ、吸引乾燥した。これを滅菌水で溶解し、５分の１量の４０％ショ糖を加えて泳動試料とし、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して、配列番号２および配列番号４の組み合わせで得られた約９００ｂｐのＤＮＡ断片、配列番号３および配列番号６の組み合わせで得られた約９００ｂｐのＤＮＡ断片、ならびに配列番号５および配列番号７の組み合わせで得られた約１２００ｂｐのＤＮＡ断片を確認した。確認後、目的とするＤＮＡ断片を含むゲル断片を切り出し、フィルター付きマイクロ遠心チューブＳＵＰＲＥＣＴＭ−０１（宝酒造社製）を用いてＤＮＡ断片を回収し、エタノール沈殿、吸引乾燥後、滅菌水に溶解して抽出ＤＮＡ標品とした。
【００２８】
工程Ｃ：ＰＣＲ増幅産物の塩基配列の決定
工程Ｂによって得られた抽出ＤＮＡ標品９．５μｌを鋳型として用い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｄ（アプライド  バイオシステムズ製）によりシーケンスを行った。その結果、配列表の、配列番号２および配列番号４の組み合わせによるＰＣＲ増幅産物ならびに配列番号３および配列番号６の組み合わせによるＰＣＲ増幅産物から１３８０ｂｐの塩基配列、配列番号５および配列番号７の組み合わせによるＰＣＲ増幅産物から１０７９ｂｐの塩基配列を決定しコア配列を得た。
【００２９】
工程Ｄ：ＣＦＴａｓｅ遺伝子のコア領域周辺のＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ
工程Ａにより調製した染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩで処理し、ライゲーションした後、再び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理し鋳型とし、ＤＮＡサーマルサイクラー（宝酒造社製）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行った。コア配列に基づいて作成したプライマーとして、配列表の、配列番号８および配列番号１３の組み合わせ、配列番号９および配列番号１２の組み合わせ、配列番号９および配列番号１３の組み合わせ、配列番号９および配列番号１４の組み合わせ、配列番号１０および配列番号１３の組み合わせ、配列番号１５および配列番号１３の組み合わせ、ならびに配列番号１５および配列番号１４の組み合わせを用い、目的とするＰＣＲ増幅産物を得た。これらのＰＣＲ増幅産物の塩基配列を工程Ｃに従って決定した。その結果、酵素Ｎ−末端を含むコア配列の５’末端の上流域の１５６０ｂｐおよび酵素Ｃ−末端を含むコア配列の３’末端の下流域の３２１ｂｐの配列を得た。
次に、工程Ａにより調製した染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで処理し、ライゲーションした後、再び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理して鋳型としＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行った。コア配列に基づいて作成したプライマーとして、配列表の、配列番号１１および配列番号１４の組み合わせを用い、目的とするＰＣＲ増幅産物を得た。
さらに、工程Ａにより調製した染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで処理し、ライゲーションした後、再び制限酵素ＥｃｏＲＩで処理して鋳型としＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行った。コア配列に基づいて作成したプライマーとして、配列表の、配列番号１５および配列番号１３の組み合わせ、配列番号１５および配列番号１６の組み合わせ、ならびに配列番号１５および配列番号１４の組み合わせを用い、目的とするＰＣＲ増幅産物を得た。これらのＰＣＲ増幅産物のシーケンスを行った結果、酵素のＣ−末端の配列を得た。
なお、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法の反応液は、ＤＮＡ溶液１μｌ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液（宝酒造社製）５μｌ、ｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを各２．５ｍＭ；宝酒造社製）８μｌ、２種類のプライマー溶液（１０ｐｍｏｌ／ｍｌ）各１μｌにＳ．Ｄ．Ｗを加えて全量４９．５μｌとなるよう調製し、９４℃・１０分間の熱変性後、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ２５０ユニット（宝酒造社製）０．５μｌ加え、反応を行った。ＰＣＲの反応条件は、変性９４℃で１分間、アニーリング４５℃で０．５分間、伸長反応７０℃で２分間の合成反応サイクルを３０サイクル行い、最後に７２℃で７分間の最終伸長を行った。
【００３０】
工程Ｅ：ＣＦＴａｓｅ遺伝子のコア配列間の未知領域の決定
工程Ａにより調製した染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで処理して鋳型とし、ＤＮＡサーマルサイクラー（宝酒造社製）を用いてＰＣＲ法を行った。コア配列に基づいて作成したプライマーとして、配列表の配列番号１７および配列番号１８の組み合わせを用い、目的とするＰＣＲ増幅産物を得た。このＰＣＲ増幅産物のシーケンスを行い、コア配列間の未知領域を決定した。なお、ＰＣＲ法の反応条件は工程Ｂと同様に行った。
以上、工程Ａから工程Ｅまでの結果と既知のＣＦＴａｓｅ遺伝子の塩基配列（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ  ＣＦＣ１：ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＦ２２２７８７、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＭＣＩ−２５５４：ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  Ｄ８７６７２）に基づいて、ＭＧ−ＣＦ６由来のＣＦＴａｓｅ遺伝子の塩基配列を決定した。その塩基配列を配列表の配列番号１に記載する。また、その推定アミノ酸配列を配列表の配列番号１９に記載する。このＣＦＴａｓｅ遺伝子は３９９９ｂｐからなり、１３３３アミノ酸をコードしていた。
得られたＣＦＴａｓｅ遺伝子と既知のＣＦＴａｓｅ遺伝子の相同性検索を行ったところ、このＣＦＴａｓｅ遺伝子は、ＣＦＣ１由来のＣＦＴａｓｅ遺伝子と相同性９５％、ＭＣＩ−２５５４由来のＣＦＴａｓｅ遺伝子と相同性８３％であった（ＣＦＣ１由来のＣＦＴａｓｅ遺伝子とＭＣＩ−２５５４由来のＣＦＴａｓｅ遺伝子の相同性は８４％）。
【００３１】
実施例３：環状イヌロオリゴ糖の製造（その１）
イヌリン（チコリ根、ｓｉｇｍａ社）９０ｇを９００ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加熱溶解後、３５℃のウォーターバスで２０分間保った。この溶液に参考例１で製造した粗酵素液１００ｍｌを添加した。この反応混合物を３５℃で７２時間（３日間）インキュベーションした。その後、反応溶液を沸騰水浴中で５分間加熱して酵素反応を止めた。この溶液を活性炭カラム（１８００ｍｌ）に展開し７Ｌの蒸留水で洗浄後、７Ｌの３０％エタノール水溶液で溶出した。溶出液を減圧濃縮し、凍結乾燥により粗環状イヌロオリゴ糖の粉末（８０ｇ）を得た。この粉末中のＣＦ含量は約５０％であった。またこの粉末は、フラクトオリゴ糖と未分解のイヌリンを含んでいた。
【００３２】
実施例４：環状イヌロオリゴ糖の分離・精製（その１）
実施例３で得た環状イヌロオリゴ糖を含有する粉末より、環状イヌロオリゴ糖のみを分離・精製するため、以下のように実施した。実施例３で得た粉末５０ｇをクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）５００ｍｌに溶解した。この溶液にインベルターゼ（生化学工業製）２００ｍｇを添加し、５０℃で４８時間インキュベーションした。この反応溶液を活性炭カラム（６００ｍｌ）に展開し３Ｌの蒸留水で洗浄後、３Ｌの３０％エタノール水溶液で溶出した。溶出液を減圧濃縮し、凍結乾燥により環状イヌロオリゴ糖の粉末２４ｇを得た。この粉末中の環状イヌロオリゴ糖の含有量は約９５％であった。この環状イヌロオリゴ糖粉末３ｇを６５％エタノール水溶液に溶解し、同濃度のエタノール水溶液で平衡化したＱＡＥ−トーヨーパール５５０Ｃ（ＳＯ４−  ｆｏｒｍ）カラム（Ф４４×８９０ｍｍ、１３５０ｍｌ）に展開し、上記エタノール溶液で溶出した。ＣＦ６とＣＦ７を含む画分をそれぞれ集め減圧濃縮後、凍結乾燥した。この操作を５回繰り返し、ＣＦ６（８．１ｇ）およびＣＦ７（３．７ｇ）の粉末を得た。精製した環状オリゴ糖の純度は、それぞれ９７％以上であることを高速液体クロマトグラフィーで確認した。以上の結果から、ＣＦ６とＣＦ７の組成比率は約１：０．４５（重量比）であることがわかった。
ＭＧ−ＣＦ６由来のＣＦＴａｓｅ遺伝子とＣＦＣ１由来のＣＦＴａｓｅ遺伝子の相同性は９５％であり、その違いは僅か５％であるが、この僅かな違いがＣＦ６とＣＦ７の生成比率の違いに深く関与していることは驚きに値する。
【００３３】
実施例５：環状イヌロオリゴ糖の製造と分離・精製（その２）
実施例１で得たＣＦＴａｓｅを用いて実施例３と実施例４と同様にして環状イヌロオリゴ糖の製造と分離・精製を行った。そして生成するＣＦ６とＣＦ７の組成比率は１：０．４（重量比）以上であることを確認した。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によれば、シクロイヌロヘプタオース（ＣＦ７）生成能に優れた新規な環状イヌロオリゴ糖生成酵素であるシクロイヌロオリゴサッカライド  フラクタノトランスフェラーゼ（ＣＦＴａｓｅ）、その製造方法および環状イヌロオリゴ糖の製造方法を提供することができる。
【００３５】
【配列表】
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