(57)【要約】【課題】安全かつ調製が容易で、新規なＡＧＥ生成阻害剤を提供すること。【解決手段】トマト搾汁液の漿液又はその分画物を有効成分として含有するＡＧＥ生成阻害剤を提供する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トマト搾汁液の漿液又はその分画物を有効成分として含有する、ＡＧＥ生成阻害剤。
【請求項２】
前記分画物が、前記トマト搾汁液の漿液を排除限界分子量約２０，０００の限外濾過膜を用いて濾過し、その結果得られる膜透過液である、請求項１に記載のＡＧＥ生成阻害剤。
【請求項３】
前記分画物が、前記膜透過液に最終エタノール濃度が５０％〜９５％となるようにエタノールを添加して、エタノール沈殿させ、その結果得られる上清である、請求項２に記載のＡＧＥ生成阻害剤。
【請求項４】
前記請求項１〜３の何れか一項に記載のＡＧＥ生成阻害剤を含有する医薬用組成物。
【請求項５】
前記請求項１〜３の何れか一項に記載のＡＧＥ生成阻害剤を含有する機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖化最終産物（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　Ｅｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ：以下ＡＧＥともいう）の生成を阻害する作用を有する物質を有効成分として含有するＡＧＥ生成阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血中の蛋白質が非酵素的に糖化されることはよく知られている。蛋白質の糖化の段階には、臨床的に糖尿病のコントロールの指標に用いられている糖化ヘモグロビンのような産物を生成する前記段階と、糖化最終産物（ＡＧＥ）を生成する後期段階とがあることが知られている。
【０００３】
このＡＧＥの生成過程の詳細は不明であるが、ＡＧＥは前記段階で蛋白質中に存在するアミノ基とグルコースなどの還元糖のアルデヒド基とが非酵素的に反応（Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）し、アルジミンというＳｃｉｆｆ塩基を経由してアマドリ転移生成物が形成された後、そのアマドリ転移生成物から長時間の複雑な開裂や縮合などの後期段階を経て形成されると考えられている。
【０００４】
このＡＧＥは、黄褐色を呈し蛍光を発する物質であって、近くに存在する蛋白と結合して架橋を形成する性質を有している。ＡＧＥは変性した蛋白であり、正常な機能を失している場合が多く、種々の組織において障害を生じるものと推定されている。
【０００５】
糖尿病の場合には、血糖の上昇に比例してこのＡＧＥの非酵素的な反応が増加するが、これが糖尿病の合併症を惹起する原因のひとつになるとされている（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，　Ｖｏｌ．　２８，　ｐａｇｅ　４３１　（１９７９）及びＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　Ｖｏｌ．　３１４，　ｐａｇｅ　４０３　（１９８６））。この過程は老化の一因とも考えられている。また、例えば老人性白内障、アテローム性動脈硬化症の病変、老化に伴う細血管の基底膜における肥厚及び腎臓の機能低下を惹起する腎糸球体基底膜の肥厚にもＡＧＥが関与していることが確認されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．　２３２，　ｐａｇｅ　１６２９　（１９８６））。
【０００６】
ＡＧＥの生成阻害剤としては、例えばアミノグアニジンが知られており（最新医学，Ｖｏｌ．　４２（２），　ｐａｇｅ　７８　（１９９４））、上記疾患予防、治療に期待される。しかし、アミノグアニジンはＡＧＥ生成の阻害に効果がある反面、種々の副作用を引き起こすという問題がある。
【０００７】
すなわち、前記アミノグアニジンは、アマドリ転移生成物からＡＧＥへの移行を抑制するとの報告（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．　２３２，　ｐａｇｅ　１６２９　（１９８６））がある一方で、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）誘発糖尿病ラットに８ヶ月投与することにより、腎腫瘍発生頻度が上昇した（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　４３　（Ｓｕｐｐｌ　１），　ｐａｇｅ　２０４　（１９９４））などの症例が副作用の例として報告されている。
【０００８】
即ち、現在迄の処、生体内でＡＧＥの生成を有効に阻害し、且つ安全性に優れた薬剤は見いだされていないのが実情である。そのため、副作用の可能性の少ない新たな薬剤が求められていた。
【０００９】
一方、トマトについては、ＡＧＥの生成を阻害する作用を有することは全く知られていなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記観点からなされたものであり、安全かつ調製が容易で、ＡＧＥ生成を阻害する作用（以下、ＡＧＥ生成阻害作用ともいう）を有する新規なＡＧＥ生成阻害剤を提供することを課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、トマトの漿液にＡＧＥ生成阻害作用があることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）トマト搾汁液の漿液又はその分画物を有効成分として含有する、ＡＧＥ生成阻害剤。
（２）前記分画物が、前記トマト搾汁液の漿液を排除限界分子量約２０，０００の限外濾過膜を用いて濾過し、その結果得られる膜透過液である、（１）に記載のＡＧＥ生成阻害剤。
（３）前記分画物が、前記膜透過液に最終エタノール濃度が５０％〜９５％となるようにエタノールを添加して、エタノール沈殿させ、その結果得られる上清である、（２）に記載のＡＧＥ生成阻害剤。
（４）上記（１）〜（３）の何れかに記載のＡＧＥ生成阻害剤を含有する医薬用組成物。
（５）上記（１）〜（３）の何れかに記載のＡＧＥ生成阻害剤を含有する機能性食品。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のＡＧＥ生成阻害剤
本発明のＡＧＥ生成阻害剤は、トマト搾汁液の漿液又はその分画物を有効成分として含有する。
【００１４】
トマト搾汁液を遠心分離することにより得られた漿液又はその分画物には、以下の実施例から明らかなようにＡＧＥ生成阻害作用がある。そこでトマト搾汁液の漿液又はその分画物を有効成分として、効果を示すに有効な量含有する剤は、ＡＧＥ生成阻害剤として好適に使用することができる。
【００１５】
また、上記トマト搾汁液の漿液の分画物である、漿液を排除限界分子量約２０，０００の限外濾過膜を用いて濾過することにより得られた膜透過液、又は、さらにこの膜透過液に最終エタノール濃度が５０％〜９５％となるようにエタノールを添加して、エタノール沈殿させることにより得られた上清にはＡＧＥ生成阻害作用を有する物質がより高濃度に含有されている。
【００１６】
そこで、これらの膜透過液又は上清からなるＡＧＥ生成を阻害する作用を有する画分を含有させると、より好ましいＡＧＥ生成阻害剤を得ることができる。
【００１７】
本発明でいうＡＧＥとは、糖と蛋白質の結合反応、転移反応、脱水反応などを繰り返して生成した架橋重合した化合物であり、溶解度が低下し、プロテアーゼの作用を受けにくくなった化合物をいい、具体的にはペントシジン、ピラリン、クロスリン、ＣＭＬ（カルボキシメチルリジン）などを例示することができる。また、老齢のレンズ蛋白質や硬膜のコラーゲンなどで観察することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．　２２１，　ｐａｇｅ　４９１　（１９８１），　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　Ｖｏｌ．　７５０，　ｐａｇｅ
９７　（１９８３）　）。
【００１８】
そして、本発明においてＡＧＥの生成を阻害するとは、糖と蛋白質の結合反応、転移反応、脱水反応などのいずれか、もしくはそのいくつかを阻害することをいう。例えば、後記実施例にもあるように、アルブミンとフルクトースを用いて蛍光強度を測定したとき、蛍光強度の上昇が抑えられる場合、本発明でいうＡＧＥ生成阻害作用があるといえる。
【００１９】
上記トマト搾汁液を得る方法としては、トマト果実からトマト搾汁液が得られれば特に制限はない。例えば、洗浄及び選別した生トマトをクラッシャー等を用いて破砕し、チューブヒーター等で加熱して殺菌および酵素失活を行った後、エクストラクター等を用いて搾汁する、あるいは、パルパー・フィニッシャー等を用いて搾汁する等の通常用いられている方法が挙げられる。
【００２０】
また、トマト搾汁液から上記の漿液、膜透過液、又は上清の各画分を抽出する例を以下に示すが、本発明はこの抽出例に限定されるものではない。
【００２１】
トマト搾汁液を遠心分離し、漿液と沈殿物に分ける。これにより得られた漿液をＡＧＥ生成阻害剤に含有させることができる。尚、ここで、遠心条件は、６，０００ｒｐｍで、遠心時間は５分であると好ましい。
【００２２】
次に、上記トマト搾汁液の漿液を排除限界分子量約２０，０００の限外濾過膜、例えば、限外濾過膜（ＵＦ膜、ＡＣＰ−１０５０、旭化成工業（株）社製）等を用いて圧力０．１Ｍｐａ程度をかけ、時間あたり５００Ｌの流量で３時間の循環を行い、膜内部に残留する濃縮液と膜透過液に分ける。これにより得られた分子量２０，０００以下の化合物を取り出した膜透過液をＡＧＥ生成阻害剤に含有させることができる。
【００２３】
次に、上記膜透過液に最終エタノール濃度が５０％〜９５％となるようにエタノールを加え遠心分離により上清と沈殿に分ける。これにより得られた上清をＡＧＥ生成阻害剤に含有させることができる。
【００２４】
このようにして得られた漿液、膜透過液、又は上清の各画分のＡＧＥ生成阻害作用の確認方法としては、後記実施例に示す評価方法を用いることができる。
【００２５】
本発明のＡＧＥ生成阻害剤と、医薬用又は食品用として通常用いられている他の任意成分とを組み合わせれば、ＡＧＥの生成を阻害することができる医薬用組成物や機能性食品を提供することができる。
＜２＞本発明のＡＧＥ生成阻害剤を含有する医薬用組成物。
【００２６】
本発明の医薬用組成物は、本発明のＡＧＥ生成阻害剤が配合されている以外は、通常の医薬用組成物を適用することができる。本発明のＡＧＥ生成阻害剤は、通常の医薬用組成物で用いられている方法にしたがって配合することができる。本発明の医薬用組成物は、ＡＧＥ生成阻害作用が期待できるものであれば特に限定されるものではない。
【００２７】
また、本発明の医薬用組成物の剤型も特に限定されず、一般に製剤上許容される１または２種類以上の担体、賦形剤、統合剤、防腐剤、安定剤、香味剤等と共に混合して、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、水薬、ドリンク剤等の内服剤型とすることが好ましい。このような製剤化は、通常、医薬の製造に用いられる方法に従って製剤化することができる。
【００２８】
上記医薬用組成物の投与量としては、疾患の種類、症状、患者の年齢、体重等により異なるが、成人１日当たり、上記した漿液を例えば溶液の状態での重量で５〜１００ｇ、又は上記した膜透過液を例えば溶液の状態での重量で５〜１００ｇ含むＡＧＥ生成阻害剤を含有する医薬用組成物を、１回ないし数回に分けて投与するのが好ましい。又は、上記した上清で規定するとすれば、上記医薬用組成物の投与量としては、成人１日当たり、上記した上清を例えば凍結乾燥物での重量で１０〜２００ｍｇ含むＡＧＥ生成阻害剤を含有する医薬用組成物を、１回ないし数回に分けて投与するのが好ましい。
＜３＞本発明のＡＧＥ生成阻害剤を含有する機能性食品
本発明の機能性食品は、本発明のＡＧＥ生成阻害剤が配合されている以外は、通常の食品用組成物を適用することができる。本発明のＡＧＥ生成阻害剤は、通常の食品用組成物で用いられている方法にしたがって配合することができる。
【００２９】
本発明の機能性食品としては、ＡＧＥ生成阻害作用が期待できるものであれば特に限定されるものではないが、種々の食品に、食品として通常用いられている任意成分とともに、食品原料に上記した漿液、膜透過液、又は上清の各画分を所要量配合することができる。この漿液、膜透過液、又は上清画分を配合する際に特に留意することはなく、通常の製造方法により加工製造することにより、健康食品等を含む各種機能性食品を製造することができる。
【００３０】
配合量は、食品の種類により異なるが、食品の味を損なわず、且つ十分なＡＧＥ生成阻害する効果を得るためには、食品用組成物全量に対して、上記した漿液を例えば溶液の状態での重量で０．５〜５０重量％、より好ましくは２〜２０重量％、又は上記した膜透過液を例えば溶液の状態での重量で０．５〜５０重量％、より好ましくは２〜２０重量％割合で配合させるのが好ましい。又は、上記した上清で規定するとすれば、食品用組成物全量に対して、上記した上清を例えば凍結乾燥物での重量で０．００１〜１重量％、より好ましくは０．０１〜０．１重量％の割合で配合させるのが好ましい。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３２】
【実施例１】＜試料抽出方法＞
試料の抽出方法は、以下のように行った。尚、以下の抽出方法の概略を図１に示す。
【００３３】
トマト搾汁液（１０ｋｇ）を遠心分離（６，０００ｒｐｍ×５分）にて漿液（９．０５ｋｇ）と沈殿物（０．９５ｋｇ）に分けた。漿液は、限外濾過膜（ＵＦ膜、ＡＣＰ−１０５０、旭化成工業（株）社製）に圧力０．１Ｍｐａをかけ、時間あたり５００Ｌの流量で３時間の循環を行い、膜内部に残留する濃縮液（以下、ＳＡともいう）（１．８１ｋｇ）と膜透過液（以下、ＳＢともいう）（７．２４ｋｇ）に分離した。
【００３４】
ＳＢのうちの一部（１００ｇ）は、２００ｍｌのエタノール（９９．５ｖ／ｖ％、和光純薬工業（株））を加え、５℃で２４時間攪拌後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ×１０分）にて上清と沈殿に分け、上清を凍結乾燥にて乾燥させた。上清の乾燥物に再度８０％エタノール１００ｍｌを加え、５℃で２４時間攪拌後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ×１０分）により上清と沈殿に分け、それぞれを凍結乾燥し、上清画分（以下、ＳＢ−Ｅｓともいう）（０．７６６ｇ）と沈殿画分（以下、ＳＢ−Ｅｐともいう）（０．０３９ｇ）を得た。
【００３５】
【実施例２】＜ＡＧＥ生成阻害活性評価＞
ＡＧＥ生成阻害活性評価は、次に示すｉｎ　ｖｉｔｒｏの評価系において測定した。
＜評価１＞
ＡＧＥはその生成割合と比例して、特定波長の蛍光強度が上昇することが知られているため、蛋白質としてウシ血清由来のアルブミン（ＢＳＡ）、糖としてフルクトースを用い、ＡＧＥ生成阻害に対する作用を蛍光強度を指標として測定した。
【００３６】
すなわち、ＢＳＡ２５ｍｇとフルクトース１８．０ｇをＰＢＳ−ｓａｌｉｎｅ緩衝液（１３７ｍＭ　塩化ナトリウム、８．１０ｍＭ　リン酸水素二ナトリウム１２水和物、２．６８ｍＭ　塩化カリウム、１．４７ｍＭ　リン酸水素二カリウム、ｐＨ７．４）５ｍｌに溶解させた後、上記のようにして得られたトマト搾汁液の漿液、又は膜内部に残留する濃縮液（ＳＡ）、又は膜透過液（ＳＢ）を、それぞれ１０μｌ添加し（コントロール群には、同量の蒸留水）、さらに防腐剤としてアジ化ナトリウム１ｍｇを加え、３７℃にてインキュベートして経時的に溶液の蛍光強度（Ｅｘ３７０ｎｍ、Ｅｍ４４０ｎｍ）を測定した。
【００３７】
結果を表１に示す。尚、表１において、ＡＧＥ生成阻害率（％）は以下のようにして求めた。また、表１において、＊は、そのデータがコントロール群と比較して危険率５％以下で有意であることを示す。
【００３８】
【数１】
2004059516.tif 000003
【００３９】
【表１】
2004059516.tif 000004
その結果、コントロールと比較して、ＳＡを添加した場合は、ＡＧＥ生成阻害効果は全く認められなかった。
【００４０】
一方で、トマト漿液とＳＢはＡＧＥの生成を有意に抑制することが明らかとなった。
＜評価２＞
試験は評価１の蛍光強度を指標とする方法に準じて行った。サンプルはＳＢ−Ｅｓ、ＳＢ−Ｅｐをそれぞれ０．１％の濃度となるように水に溶解させ、それぞれ２００μｌ使用した。
【００４１】
その結果を表２に示す。尚、表２中、ＡＧＥ生成阻害率（％）の計算方法及び＊印は表１のそれと同様である。
【００４２】
【表２】
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その結果、ＳＢ−ＥｓはＡＧＥの生成を有意に抑制することが明らかとなった。
【００４３】
以上、上記評価実験から明らかなように、トマト搾汁液の漿液及びその分画物には、ＡＧＥ生成阻害作用が認められた。よって、トマト搾汁液の漿液又はその分画物を有効成分として含有する剤は、ＡＧＥ生成阻害剤として好適に使用することができる。
【００４４】
【発明の効果】
本発明により、安全かつ調製が容易で、新規なＡＧＥ生成阻害剤を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の分画方法を説明する概略図。
【図１】
2004059516.tif 000006