(57)【要約】【課題】マイクロチップの解凍操作において、細胞の培養状態を再現良く得ることができ、分析評価でも再現性の良いデータを得ることが可能で、かつ菌の汚染の危険性を抑えた、マイクロチップに含まれる動物細胞の解凍方法を提供すること。【解決手段】動物細胞が凍結保存されているマイクロチップを解凍装置に納め、マイクロチップと解凍装置との間隙に沿って気体を流通させて、動物細胞を解凍する動物細胞の解凍方法であり、好ましくはマイクロチップを納める部位の少なくとも一部に貫通孔を設け、マイクロチップの外表面の面積８０％以上が流通する気体と接触している動物細胞の解凍方法。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞が凍結保存されているマイクロチップを解凍装置に納め、マイクロチップと解凍装置との間隙に沿って気体を流通させて、動物細胞を解凍することを特徴とする動物細胞の解凍方法。
【請求項２】
マイクロチップの少なくとも培養面が設置されている部分についての厚さが５ｍｍ以下である請求項１記載の動物細胞の解凍方法。
【請求項３】
マイクロチップを納める部位の少なくとも一部に貫通孔を設け、解凍装置外部と貫通孔の間に気体を流通させる請求項１又は２記載の動物細胞の解凍方法。
【請求項４】
マイクロチップの外表面の面積８０％以上が流通する気体と接触している請求項１〜３いずれか記載の動物細胞の解凍方法。
【請求項５】
気体の流通は前記貫通孔から気体を流出させることで、マイクロチップの外表面へ気体を流通させる請求項３又は４記載の動物細胞の解凍方法。
【請求項６】
前記貫通孔から気体を流出させる方法が貫通孔から気体を吸引する方法である請求項５記載の動物細胞の解凍方法。
【請求項７】
解凍装置とマイクロチップとの間隙を流通する気体の流入時の温度が０〜３７℃の範囲である請求項１〜６いずれか記載の動物細胞の解凍方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養分野における、マイクロチップの微小空間中の培養面に接着して凍結保存されている動物細胞の解凍方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物細胞は一般に−８０℃以下のディープフリーザーや液体窒素中に凍結された状態で保存されている。動物細胞の凍結保存の形態は一般的にはアンプルや凍結保存用のチューブに凍結用培地ととも似細胞浮遊液の形で凍結されている。このように凍結され保存されている動物細胞は、必要なときに解凍されて、再び培養を行うことができる。
この解凍において、重要なことは速やかに解凍することである。解凍に時間がかかると細胞へのダメージが大きく、解凍時の生存率を下げることになる。また温度を高く上げすぎると細胞が死んだり、ヒートショックプロテインの発現のように細胞のストレス応答を惹起したりするため、一般的には３７℃の温水中に浸漬し解凍する方法がとられている。動物細胞の凍結保存の形態は一般的には上記のアンプルや凍結用チューブの場合が多く密閉状態を保つことができる構造であり、温水に浸漬しても容器中へ菌が混入する危険性は少ない。
【０００３】
近年は特公平５−７７３８９号公報に開示されているように培養容器に足場依存性動物細胞を接着した状態で凍結保存を行う方法が提唱されている。この凍結方法は培養器中に既に所定数の動物細胞が培養されており、解凍するだけで実験に使用できる細胞付の培養器を得られる。これは細胞の播種とその後の増殖培養を行うための時間と労力を削減できる点で、非常に魅力的である。
これとは別に、最近、マイクロリアクターやマイクロアナリシスシステムと呼ばれる微細加工技術を利用した化学反応や分離システムの微小化の研究が盛んになっており、マイクロチャンネルを持つマイクロチップ上で行う核酸、タンパク質などの分析や合成、微量化学物質の迅速分析、医薬品・薬物のハイスループットスクリーニングへの応用が期待されている。このようなシステムのマイクロ化の利点としては、サンプルや試薬の使用量あるいは廃液の排出量が軽減され、省スペースで持ち運び可能な安価なシステムの実現が考えられている。また体積に対する表面積の比率が向上することにより、熱移動・物質移動の高速化が実現でき、その結果、反応や分離の精密な制御、高速・高効率化、副反応の抑制が期待される。
【０００４】
上記の目的でマイクロチップに組み込まれるシステムの一つとして細胞培養も含まれており、マイクロチップ上で細胞培養を行う目的としては、培養細胞を利用した化学物質のスクリーニングやセンサー、神経伝達などの細胞間相互作用モデル化ほか様々のものが考えられる。
このようにマイクロチップ上で細胞培養が行われ様々な成果が示されているが、培養システムとしては十分なツールがまだ整備されている状態ではなく、シリンジなどで個々の研究者が独自の工夫を施して培養操作を行っている。
【０００５】
その中でも特に細胞を入手、調整してからマイクロチップに播種、培養を行うまでは、マイクロチップの特徴である反応の高速・高率化とは別に、細胞自身の培養環境への適合化の速度に依存するため、実際に実験・分析操作を行うまでには従来と同様に多大な労力と時間を費やしている。
またマイクロチップでは使用するサンプルなどの使用量は極微量であり、マイクロチップでの培養に使用する細胞も従来のシャーレやマルチウェルの培養方法と比べて極少量で十分であるが、実験毎に細胞播種を行っていては調整する細胞の量が少ないことも重なって、実験毎に細胞の生存率が大きくばらついてしまい、その結果として得られる分析評価データがばらついてしまう。
そこで前述した培養容器に足場依存性動物細胞を接着した状態で凍結保存を行う方法をマイクロチップの細胞培養で用いることにより、凍結保存したマイクロチップを解凍することで迅速に実験・分析作業を開始しすることが可能である。かつ同じロット及び条件で凍結されているので、毎回の実験・分析でも同じ条件で解凍操作を行うことにより、細胞の生存率を再現良く得ることができ、そして分析評価でも再現性の良いデータを得ることが可能となる。
【０００６】
マイクロチップのような小容積中の凍結細胞を解凍する方法として、凍結用チューブの解凍方法と同様に温水中に直接沈める方法が考えられる。しかし、マイクロチップの培養面に連絡してあるマイクロチャンネルは試薬の注入、採取を行うため、外部と通じる開口部を有しており、この方法で解凍を行うと温水が流入して、菌による汚染や保存していた細胞の死滅の要因となってしまう。マイクロチャンネルの開口部に蓋を取り付けて温水中に沈めた場合、直接温水がマイクロチャンネルに流入することはないが、取り上げた後にマイクロチップの外部には菌が付着しておりやはり菌の汚染原因になる。
温度コントロールしたホットプレートにマイクロチップをのせて解凍を行うと、マイクロチップの片面は加熱されるが、反対側の面は冷たい状態で外気に晒されるため、やはり結露による水滴が付着して、きちんと除去しないと菌が付着して汚染を招く恐れがある。またマイクロチップの加熱と同時にホットプレートも一時的に冷却されて、ホットプレートは熱を加えるための制御を行うが、温度の制御には時間的ズレがあるため、ホットプレートは一時的に許容範囲より加熱されて細胞が死んだり、ヒートショックプロテインの発現のように細胞のストレス応答を惹起したりする可能性がある。
また、培養用インキュベーターで解凍する方法も考えられるが、冷凍状態のマイクロチップを高湿状態のインキュベーターに投入するとマイクロチップの外部には結露による水滴が付着して、きちんと除去しないと菌が付着して汚染を招く恐れがある。
【０００７】
【特許文献１】
特公平５−７７３８９号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前述したマイクロチップの解凍操作を毎回同じ条件下で実施することにより、細胞の培養状態を再現良く得ることができ、そして分析評価でも再現性の良いデータを得ることが可能で、菌の汚染の危険性を抑えた、マイクロチップに含まれる動物細胞の解凍方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、
（１）　動物細胞が凍結保存されているマイクロチップを解凍装置に納め、マイクロチップと解凍装置との間隙に沿って気体を流通させ熱交換を行い、動物細胞を解凍することを特徴とする動物細胞の解凍方法、
（２）　マイクロチップの少なくとも培養面が設置されている部分についての厚さが５ｍｍ以下である（１）記載の動物細胞の解凍方法、
（３）　マイクロチップを納める部位の少なくとも一部に貫通孔を設け、解凍装置外部と貫通孔の間に気体を流通させる（１）又は（２）記載の動物細胞の解凍方法、
（４）　マイクロチップの外表面の面積８０％以上が流通する気体と接触している（１）〜（３）いずれか記載の動物細胞の解凍方法、
（５）　気体の流通は前記貫通孔から気体を流出させることで、マイクロチップの外表面へ気体を流通させる（３）又は（４）記載の動物細胞の解凍方法、
（６）　前記貫通孔から気体を流出させる方法が貫通孔から気体を吸引する方法である（５）記載の動物細胞の解凍方法、
（７）　解凍装置とマイクロチップとの間隙を流通する気体の流入時の温度が０〜３７℃の範囲である（１）〜（６）いずれか記載の動物細胞の解凍方法、
である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の解凍対象となるマイクロチップは内部または外表面に微小空間が設置されており、空間を構成する一部の面あるいは空間内に存在するビーズなどの担体表面を培養面として足場依存性動物細胞が培養することが可能であり、一つのマイクロチップに一つ、或いは二つ以上の微小空間が設置されている。
【００１０】
またマイクロチップの少なくとも培養面が設置されている部分についての厚さが５ｍｍ以下であることが好ましい。特にマイクロチップの厚さが薄いほうが培養面への加温効率が高くなり、細胞をより速やかに解凍することが可能となるため、好ましくは３ｍｍ以下、さらに好ましくは１ｍｍ以下である。マイクロチップの厚さが５ｍｍを超えると、マイクロチップ本体の熱容量が大きく、マイクロチップでの培養面の位置が内側の細胞ほど解凍効率が低下してしまい、均等に解凍を行うことができず、解凍時の細胞の生存率の低下やばらつきが発生してしまう。
マイクロチップの原材料としては−８０℃以下に対するの耐冷却性を有していれば特に限定はせず、例えば、ガラス、シリコン、またはポリプロピレンなどのプラスチックを用いることが可能である。
【００１１】
また、細胞はマイクロチップの培養面に接着した状態で凍結用培養液とともに凍結保存されている。
培養面に接着していない状態であると、解凍直後の凍結用培養液を培養用培養液に入れ替える操作で、凍結用培養液と共に解凍された細胞も排出されてしまう。本発明の解凍作業時の状態の模式図を図１に示す。（１）は動物細胞が凍結用培養液と共に凍結されたマイクロチップ、（２）は解凍装置、（３）は貫通孔、（４）はエアーポンプである。
また本発明の解凍装置は図１のような形態に限定されず、例えば図３のようであっても良い。
マイクロチップを解凍機の納める部位に設置し、エアーポンプを稼動すると、空気等の気体が解凍機内から流出するときにマイクロチップの外表面と接触し、マイクロチップは次々と解凍機のチップの出入り口から流入する気体と接触して熱を吸収することにより解凍が行われる。
【００１２】
解凍方法についてさらに詳細に述べる。本発明ではマイクロチップの外表面に次々と新しい気体と接触させて気体とマイクロチップの間で熱交換を行うことでマイクロチップの解凍を行う。冷たい固体が一定の湿度を有する暖かい気体と接触した場合、固体表面付近の気体の温度が低下し湿度が飽和状態に達することで、固体表面に結露を生じてしまい、除去しないと菌が付着して培養面が汚染されてしまう。しかし、本発明ではマイクロチップ外表面の気体を次々と入れ替えることで、気体の温度が低下し湿度が飽和状態に達する状況が生じないようにし、マイクロチップ表面に結露が発生することを防止し、菌が付着して培養面を汚染する危険性を抑えることが可能である。
気体の流れはチップ出入り口から貫通孔向き、逆に貫通孔からチップ出入り口向きのいずれでも実施可能である。だが、気体の流れが貫通孔からチップの出入り口向きの場合、エアーポンプからの圧力を受けて貫通孔から出てくる気体はジェット状の気流になりマイクロチップの一部にしか新しい気体が接触せず、マイクロチップの解凍効率にばらつきが生じる恐れがあるため、マイクロチップ全外表面で新しい気体と接触が行われるように、チップの出入り口から貫通孔向きへ気体を流通させることが好ましい。
また、貫通孔の位置であるが、マイクロチップ全外表面で新しい気体と接触が行われやすくなり、マイクロチップの解凍効率のばらつきを抑えることができれば特に制限は無い。
【００１３】
マイクロチップと解凍機の間隙を通過する気体はマイクロチップを解凍するために速やかに熱交換を行うことができれば特に限定はしないが、室温の空気が解凍を行うのに適宜な温度、熱量を有しており、最も入手しやすいので好適である。
気体の温度は０℃未満では解凍を行えないため不適であり、また高すぎると解凍処理を必要以上に行ってしまった場合、細胞が死んだり、ヒートショックプロテインの発現のように細胞のストレス応答を惹起したりする。具体的には気体の流入時の温度が０〜３７℃の範囲であると好適であり、さらに好適には、速やかに解凍を行うため３０〜３７℃である。
【００１４】
次にマイクロチップの解凍機の納める部位設置された時の状態は、マイクロチップ外表面が気体との接触を行えるように、マイクロチップは解凍装置の解凍機内の突起などでマイクロチップの端の部分だけで配置されている状態にする。このときマイクロチップが気体の流速で動かないように固定できればより良い。またマイクロチップ同士を重ねると、解凍時に厚み方向で解凍効率のばらつきが発生しマイクロチップ間の細胞生存率がばらつくため、１枚ごとマイクロチップ外表面と解凍機または他のマイクロチップの間に隙を置いて解凍を行う。マイクロチップの支持の方法は、図２の（６）マイクロチップの支持部のように、両端の数ミリ程度の接触で行うとし、マイクロチップのサイズが小さい場合でも解凍効率を考慮して両端からそれぞれ１０％以下の接触で支持するのが好ましく、具体的にはマイクロチップの外表面積の８０％以上が気体と接触させてマイクロチップを支持することが好ましい。このような条件でマイクロチップが解凍機内に配置されていれば、一つの解凍機に複数のマイクロチップを同時に設置して解凍することが可能である。
【００１５】
さらにマイクロチップと解凍機または他のマイクロチップとの間隔は、狭すぎると流入する気体の熱量が十分に供給されず、チップの出入り口側と貫通孔側での解凍効率が著しく異なってしまい、細胞の生存率がばらついてしまう。逆に広すぎると、エアーポンプによって得られる気体の流れは間隙の中央付近に速い流速を形成し、マイクロチップ外表面付近では緩慢になり結露しやすい。具体的にはマイクロチップと解凍機または他のマイクロチップとの間隔は０．３〜１０ｍｍが好適である。
強力なエアーポンプを用いれば、間隔が１０ｍｍ以上であってもマイクロチップ外表面付近でも充分量の気体の入れ替わりがあるため、結露を防止することが可能であるが、この場合は間隔を０．３〜１０ｍｍの範囲内に狭めて一つのチップを納める部位に複数のマイクロチップを同時に設置するか、あるいは複数のチップを納める部位を用意してそれぞれのチップを納める部位の貫通孔とエアーポンプを接続するチューブ集束することにより、同時に解凍するマイクロチップを増やすほうが効率的、経済的である。
【００１６】
またマイクロチップと解凍機または他のマイクロチップとの間隙を流れる気体の速度も遅すぎてはマイクロチップ外表面付近の気体の入れ替わりが不十分で結露しやすい。逆に速度が必要以上に速いと、解凍機内部の構造とマイクロチップの配置によっては著しい速度差が生じ、解凍効率がばらつく可能性がある。より具体的には、解凍機とマイクロチップの間隙を流通する気体の流速は２０〜２００ｃｍ／秒が好ましく、気体の流量としてはチップを納める部位の単位容積あたりでは１．２〜１２　Ｌ／分・ｃｍ３が好ましい。
【００１７】
【実施例】
（実施例１）
大きさ７５ｍｍ×２５ｍｍ、厚さ１ｍｍのガラス製基板の内部に直径３ｍｍ、厚さ１００μｍの微小空間に連絡する分注用と排出用の直径１００μｍのマイクロチャンネルが２本設けられているマイクロチップに、ＨｅＬａ細胞を懸濁した培養液をマイクロチャンネルより注入して、微小空間の培養面に播種した。培養液は５％子牛血清を添加したＭＥＭ培地を用いた。培養面一つあたり約２０００個の細胞を播種し、炭酸ガスインキュベーター中で培養を行った。顕微鏡観察によりサブコンフルエントな状態に達したところで細胞と共にマイクロチップごと数枚を凍結した。凍結の手順は以下の通り。
培養していた培養液を除去し、ＤＭＳＯを１０％の濃度で上記培養用の培養液に添加した凍結用培養液を各微小空間に充填し、無菌操作で大きさ６０ｍｍ×８５ｍｍ、フィルム厚さ０．０４ｍｍのポリエチレン製の袋に納め、シールし、直ちにディープフリーザー中で１分間あたり１℃の割合で−８０℃まで冷却し凍結した。その後、ディープフリーザー中に−８０℃で保存した。
解凍装置のチップを納める部位は幅７７ｍｍ、高さ５ｍｍ、奥行き５０ｍｍで、空間の両端に幅２ｍｍ、奥行き２８ｍｍ、高さ１．５ｍｍの段を設け、段の上面に幅２６ｍｍ、深さ１ｍｍの溝を設け、マイクロチップを挿入し固定できるようにした。さらにチップを納める部位の奥の面中央に幅１０ｍｍ、高さ５ｍｍの貫通孔を設け、貫通孔とエアーポンプの吸気側を接続した。
保存の後、ディープフリーザーのマイクロチップを袋から取り出し、ピンセットを用いて解凍機にマイクロチップを設置し、エアーポンプを起動して解凍機に室温の空気を流入させて解凍を行った。解凍に要した時間は約３０秒であった。即座に凍結用の培養液を排出し、培養用の培養液を充填して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。
【００１８】
（比較例１）
実施例１で用いたマイクロチップにＨｅＬａ細胞を懸濁した培養液をマイクロチャンネルより注入して、微小空間の培養面に播種した。培養液は５％子牛血清を添加したＭＥＭ培地を用いた。培養面一つあたり約２０００個の細胞を播種し、炭酸ガスインキュベーター中で培養を行った。顕微鏡観察によりサブコンフルエントな状態に達したところで細胞と共にマイクロチップごと数枚を凍結した。凍結の手順は以下の通り。
培養していた培養液を除去し、ＤＭＳＯを１０％の濃度で上記培養用の培養液に添加した凍結用培養液を各微小空間に充填し、無菌操作で大きさ６０ｍｍ×８５ｍｍ、フィルム厚さ０．０４ｍｍのポリエチレン製の袋に納め、シールし、直ちにディープフリーザー中で１分間あたり１℃の割合で−８０℃まで冷却し凍結した。その後、ディープフリーザー中に−８０℃で保存した。
保存の後、ディープフリーザーのマイクロチップを袋から取り出し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で完全に解凍した。解凍に要した時間は約６０秒であった。マイクロチップの外表面に結露した液滴を滅菌済みの脱脂綿で除去した後に凍結用の培養液を排出し、培養用の培養液を充填して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。
【００１９】
（比較例２）
実施例１で用いたマイクロチップにＨｅＬａ細胞を懸濁した培養液をマイクロチャンネルより注入して、微小空間の培養面に播種した。培養液は５％子牛血清を添加したＭＥＭ培地を用いた。培養面一つあたり約２０００個の細胞を播種し、炭酸ガスインキュベーター中で培養を行った。顕微鏡観察によりサブコンフルエントな状態に達したところで細胞と共にマイクロチップごと数枚を凍結した。凍結の手順は以下の通り。
培養していた培養液を除去し、ＤＭＳＯを１０％の濃度で上記培養用の培養液に添加した凍結用培養液を各微小空間に充填し、無菌操作でマイクロチャンネルの開口部に蓋を取り付けて、直ちにディープフリーザー中で１分間あたり１℃の割合で−８０℃まで冷却し凍結した。その後、ディープフリーザー中に−８０℃で保存した。
保存の後、ディープフリーザーからマイクロチップを取り出し、３７℃の温水中に沈め完全に解凍した。解凍に要した時間は１０秒未満であった。マイクロチップの外表面に付着した液滴を滅菌済みの脱脂綿で除去した後に凍結用の培養液を排出し、培養用の培養液を充填して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。
【００２０】
（比較例３）
実施例１で用いたマイクロチップ１枚にＨｅＬａ細胞を懸濁した培養液をマイクロチャンネルより注入して、微小空間の培養面に播種した。培養液は５％子牛血清を添加したＭＥＭ培地を用いた。培養面一つあたり約２０００個の細胞を播種し、炭酸ガスインキュベーター中で培養を行った。
【００２１】
（マイクロチップの細胞の生存率及びチップ間のばらつき、及び菌の汚染状況）
実施例１及び比較例１、２を用いた。また比較例３は数回実施した。
培養２時間後、生細胞数確認用試薬（ＷＳＴ−１（同仁））を１０％含有する培養液で培地交換を行い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で２時間培養した。その後生細胞数に応じて生成されるホルマザンをマイクロチップより採取して、吸光光度計により波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
解凍時の細胞生存率は、数枚のマイクロチップの凍結を行う前に、コントロールとして凍結まで同条件で同時に行われたマイクロチップにＷＳＴ１を加えた培養液で培地交換して２時間培養を継続し、生成したホルマザンの吸光度を測定して、その平均値で実施例及び比較例１、２の吸光度を除すことにより算出した。ばらつきは、変動係数（ＣＶ値）で比較した。比較例３については各回のホルマザンの吸光度についてＣＶ値を算出した。
またさらに培養を継続し、菌の汚染についての状況を確認した。
それぞれの結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
2004097170.tif 000003
【００２３】
【発明の効果】
本発明に従うと、足場依存性動物細胞が凍結されたマイクロチップの解凍操作を毎回同じ条件下で実施することにより、細胞の生存率を再現良く得ることができ、そして分析評価でも再現性の良いデータを得ることが可能で、菌の汚染の危険性を抑えた、マイクロチップに含まれる動物細胞の解凍方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の動物細胞の解凍方法の一実施例の模式図である。
【図２】本発明の動物細胞の解凍方法の一実施例の模式の拡大図である。
【図３】本発明の動物細胞の解凍方法の他の実施例の模式図である。
【符号の簡単な説明】
１　　　　　　マイクロチップ
２　　　　　　解凍装置
３　　　　　　貫通孔
４　　　　　　エアーポンプ
５　　　　　　チューブ
６　　　　　　マイクロチップの支持部
【図１】
2004097170.tif 000004
【図２】
2004097170.tif 000005
【図３】
2004097170.tif 000006