(57)【要約】【課題】  高い空間分解能と高い時間分解能を有する時間分解蛍光顕微鏡を提供する。【解決手段】共焦点倒立光学顕微鏡１９に設置された試料２６からの蛍光と、励起レーザ光を非線形光学素子３２に同時に入射させ、和周波光３４を発生させる。光学遅延用ディレイライン３３の遅延量を変化させることにより試料の時間分解蛍光を測定する。【選択図】  図１
2004309458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピンホールと、
試料を載置する試料ステージと、
前記ピンホールの像を前記試料ステージ上の試料に縮小投影するとともに試料から発生された蛍光を前記ピンホールに結像する対物レンズ系と、
パルスレーザ発生手段と、
前記パルスレーザ光発生手段から出射されたレーザ光を２分割する光分割手段と、
前記光分割手段によって分割された一方のレーザ光を試料励起光として前記ピンホールに入射させる手段と、
前記光分割手段によって分割された他方のレーザ光の光路長を可変する光路長可変手段と、
前記ピンホールから出射した試料からの蛍光と前記光路長可変手段を通ったレーザ光とを混合して両者の和周波光を発生させる非線形光学素子と、
前記非線形光学素子から発生された和周波光を分光する分光手段と、
前記分光手段からの出射光を検出する検出器と、
前記光路長可変手段によって前記他方のレーザ光の光路長を変化させたとき前記検出器から得られる出力を記録する記録手段と
を含むことを特徴とする時間分解蛍光顕微鏡。
【請求項２】
請求項１記載の時間分解蛍光顕微鏡において、前記光分割手段と前記ピンホールの間の試料励起光光路中にプリズム対を配置し、励起光に予め負の分散を与えることを特徴とする時間分解蛍光顕微鏡。
【請求項３】
請求項２記載の時間分解蛍光顕微鏡において、前記試料励起光の光路中に配置された１／２波長板と、前記１／２波長板の角度と前記光路長可変手段とを連動させて制御する制御部を更に備えることを特徴とする時間分解蛍光顕微鏡。
【請求項４】
請求項２記載の時間分解蛍光顕微鏡において、前記非線形光学素子と前記分光手段の間に前記非線形光学素子を通った光を平行にするコリメート用レンズと、アイリスと、集光用レンズとを配置し、前記非線形光学素子から発生された和周波光を分離して前記分光手段に入射させることを特徴とする時間分解蛍光顕微鏡。
【請求項５】
請求項４記載の時間分解蛍光顕微鏡において、前記ピンホールと前記対物レンズ系の間に光路を折り曲げる光学素子として全反射ミラーを配置したことを特徴とする時間分解蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小領域からの蛍光をフェムト秒オーダーで時間分解測定できる時間分解蛍光顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
時間分解蛍光分光法と光学顕微鏡を組み合わせた時間分解蛍光顕微鏡は、微小領域における分子の電子状態に関する情報を、他の要因に妨害されず、正確に与えてくれる優れた装置である。これまでの時間分解蛍光顕微鏡に用いられる時間分解の手法は、大きく分けて時間相関単一光子計測法とストリークカメラ法の二種類に分類できる。
【０００３】
図２は、時間相関単一光子計測装置の例を示す図である（非特許文献１参照）。レーザダイオード５１から発せられたパルス光は、フィルタ５２を通り、顕微鏡対物レンズ（油浸レンズ）５３によって集光され、励起光として試料５４の微小領域に照射される。試料の励起光照射位置は、ＣＣＤカメラ５５で撮像された試料の拡大画像をモニタ５６で観察しながら試料を微動することによって調整することができる。励起光照射によって試料から発生された蛍光は、フィルタ５７，５８によって波長選択された後、ピンホール５９を介してフォトダイオード６０で検出される。一方、レーザダイオード発光用の電気信号をトリガーとして、フォトダイオード６０で受けた試料からの蛍光によって生じた電気パルスを時間波高変換器（ＴＡＣ：time to amplitude converter）６１に入力する。ＴＡＣ６１はトリガー信号とフォトマルからの信号の時間差に応じた電気パルスを出力する。これをマルチチャンネルアナライザ（ＭＣＡ）６２に通して時間差と頻度の分布をとると、顕微鏡下に存在する試料による蛍光の時間減衰に相当する波形が得られる。
【０００４】
ストリークカメラ法は、レーザからの電気信号をトリガーとして、顕微鏡下にある試料からの蛍光を分光器を通した後ストリーク管に導入する。入射した光は光電面にあたり、光から電子に変換される。発生した電子は加速された後、ストリーク管の上下に印加された電圧によって飛ぶ方向が変えられる。この印加電圧を高速に変化させることにより、蛍光の時間分布を空間変化として捕らえることができる（非特許文献２参照）。
【０００５】
また、バルク試料から発生された蛍光を時間分解測定する方法として、レーザから発せられたパルス光を２分し、その一方を試料励起光として、試料から発せられた蛍光と他方のパルス光（ゲートパルス）とを非線形光学結晶中で混合し、非線形光学結晶から発生される両者の和周波数の光を検出する和周波発生法（アップコンバージョン法）が知られている（非特許文献３参照）。この方法によると、ゲートパルスの遅延時間を変化させて測定を反復することにより、蛍光を時間分解測定することができる。
【非特許文献１】Review of scientific instruments, vol.70, p1835-1841, 1999
【非特許文献２】Applied Physics Letters, vol.80, no.18, p3340-3342, 2002
【非特許文献３】Journal of Physical Chemistry A, vol.101, p3052-3060, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般に物体の各種の動的挙動（化学反応、エネルギー移動等）の解明にはサブピコ秒（１０−１２秒以下）から数百フェムト秒（１０−１３秒）の時間分解能が必要である。しかしながら、これまで使用されている時間分解蛍光顕微鏡では、時間分解測定において単一光子計測装置やストリークカメラといった蛍光を電気的に処理する手法を用いるため、ナノ秒（１０−９秒）から数十ピコ秒（１０−１１秒）といった不十分な時間分解能しか得られていなかった。実際、時間相関単一光子計測法を用いた装置では時間分解能は４０ｐｓ程度が限界である。また、ストリーク管を用いた時間分解蛍光顕微鏡の時間分解能は最高でも５ｐｓ程度である。なお、ストリークカメラ法は、分光器を用いないで時間分解する方法も可能であり、その場合、３００フェムト秒程度の高い時間分解能が得られるが、蛍光波長の判別はできない。アップコンバージョン法は、高い時間分解能で蛍光を測定することが可能であるが、微小領域の測定について配慮されておらず、そのままでは顕微鏡的な空間分解能を期待することはできない。
【０００７】
また光学顕微鏡の一種である共焦点顕微鏡は、顕微鏡に設置したピンホール径を極限まで小さくすることにより、物体の深さ方向の情報を選んで測定できる装置であるが、実際の測定に際しては十分な強度の信号を得るためにピンホールの径をある程度大きくとることが必要であり、そのため深さ方向の空間分解能には限界があった。このように、微小領域における分子の化学反応の解明に最も期待される時間分解蛍光顕微分光の時間分解能は、現在でも十分満足できるものにはなっていない。
【０００８】
本発明は、このような従来技術の問題点に鑑み、光学顕微鏡を用いてサブ・マイクロメートルの微小領域からの蛍光をフェムト秒の時間分解能で時間分解測定できる、高い空間分解能と高い時間分解能を有する時間分解蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、時間分解蛍光顕微鏡における時間分解能と深さ方向の空間分解能を同時に改善するために和周波発生法（アップコンバージョン法）を適用し、時間分解能を従来法の１００倍程度（〜６００フェムト秒）まで改善し、また深さ方向の空間分解能を通常の共焦点顕微鏡の約２倍程度改善した。
【００１０】
従来法は、単一光子計測装置（ＴＡＣ）やストリークカメラ等の電気的手段を用いて時間分解測定を行うため、その電気的手段の性能できまる時間分解能が限界であり、このためフェムト秒領域での蛍光変化をモニタするには時間分解能が十分ではなかった。本発明ではアップコンバージョンとよばれる非線形光学効果を用いた光学的な時間分解の手法を採用することにより、フェムト秒の時間分解能（〜６００ｆｓ）を実現した。
【００１１】
本発明による時間分解蛍光顕微鏡は、ピンホールと、試料を載置する試料ステージと、ピンホールの像を試料ステージ上の試料に縮小投影するとともに試料から発生された蛍光をピンホールに結像する対物レンズ系と、パルスレーザ発生手段と、パルスレーザ光発生手段から出射されたレーザ光を２分割する光分割手段と、光分割手段によって分割された一方のレーザ光を試料励起光として前記ピンホールに入射させる手段と、光分割手段によって分割された他方のレーザ光の光路長を可変する光路長可変手段と、前記ピンホールから出射した試料からの蛍光と光路長可変手段を通ったレーザ光とを混合して両者の和周波光を発生させる非線形光学素子と、非線形光学素子から発生された和周波光を分光する分光手段と、分光手段からの出射光を検出する検出器と、光路長可変手段によって前記他方のレーザ光の光路長を変化させたとき前記検出器から得られる出力を記録する記録手段とを含むことを特徴とする。
【００１２】
光分割手段とピンホールの間の試料励起光光路中にプリズム対を配置し、励起光に予め負の分散を与えることが好ましい。励起光に予め負の分散を与えることによりサンプル位置で最も時間幅が短いパルスでサンプルを励起することができる。プリズムを対で用いることにより、人工的に異常分散回路（負の群速度分散）を作ることができる。通常フェムト秒のパルス光がレンズやミラーなどの媒体を通過すると、パルスを構成する光の波長の違いにより（フェムト秒パルスでは、１０ｎｍ程度のスペクトル幅を持つ）媒質中での屈折率が違うので、各波長により媒質を通過する速度が変化し、結果としてレーザパルスの時間幅が延びることになる（長波長成分が短波長成分に比べ、速く進む）。プリズム対をパルスが通過することにより、長波長成分を遅らせ、短波長成分を進めることができ、結果としてパルス時間幅が圧縮される。本装置のプリズム対では、顕微鏡の対物レンズ等を通過することによって生じてしまう正の分散（パルスの時間的広がり）を予め打ち消すように負の分散を与えており、サンプル部を理想的には分散ゼロの光（最短パルス）で励起することが可能となる。
【００１３】
試料励起光の光路中に１／２波長板を配置し、その１／２波長板の角度と光路長可変手段とを連動させて制御する制御部を更に備えてもよい。この構成によると、励起光の偏向方向を自動制御しつつ蛍光の測定を行うことができ、自動で偏光異方性の測定が可能である。
【００１４】
また、非線形光学素子と分光手段の間に非線形光学素子を通った光を平行にするコリメート用レンズと、アイリスと、集光用レンズとを配置し、非線形光学素子から発生された和周波光を分離して分光手段に入射させるように構成するのが望ましい。また、ピンホールと対物レンズ系の間配置する光路を折り曲げる光学素子は、全反射ミラーとするのが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、試料のサブ・マイクロメートルの微小領域からの蛍光をフェムト秒の時間分解能で時間分解測定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は、本発明によるフェムト秒時間分解蛍光顕微鏡の模式図である。
【００１７】
Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザ１１により励起されたチタンサファイアレーザ１２の基本波（中心波長８００ｎｍ，光出力７５０ｍＷ，パルス繰り返し周波数８２ＭＨｚ，パルス時間幅７５ｆｓ）を非線形光学素子１３に集光し、発生した第二次高調波（４００ｎｍ，５０ｍＷ）を試料励起用の光源として用いる。発生された励起光（４００ｎｍ）は波長選択ミラー１４ａで反射され、分散補償用プリズム対１５により予め負の群速度分散を与えられた後、１／２波長板１６ａ、集光用レンズ１７、共焦点用ピンホール１８を通り、倒立型の光学顕微鏡１９へ導入される。励起光はさらに対物レンズ２１，２４によってステージ２５上の試料２６に集光される。試料２６からの蛍光は再び同じ対物レンズ２４，２１によって集められ、顕微鏡１９の外に取り出される。試料２６からの蛍光は、波長選択ミラー３０により励起光と分離された後、蛍光集光用レンズ３１ａによって非線形光学素子（１ｍｍ厚、β−ＢａＢ２Ｏ４（ＢＢＯ））３２に集光される。
【００１８】
一方、チタンサファイアレーザ１２の基本波は、波長選択ミラー１４ｂで反射され、光学遅延回路（ディレイライン）３３を通り、１／２波長板１６ｂを通った後、基本波集光用レンズ３１ｂによって非線形光学素子３２に集光される（ゲート光）。試料２６からの蛍光とレーザの基本波は非線形光学素子３２の同じ位置に重なるように集光され、両者の和周波光３４を発生させる（アップコンバージョン法）。アップコンバージョン法は、試料からの蛍光を他の波長のフェムト秒レーザパルスとともに非線形光学結晶中に集光させ、両者の和周波光（和のエネルギーをもった光）を発生させる方法である。この和周波光は試料からの蛍光とフェムト秒レーザパルスがまったく同一時間に結晶中に存在するときにのみ発生させることができるので、フェムト秒レーザパルス側に設置した光学遅延回路３３を前後させながら和周波光３４を観測することで、試料からの蛍光の時間挙動を和周波光の時間挙動としてモニタできる。また試料からの蛍光のどの波長の和周波光を発生させるかは、ＢＢＯ結晶３２の角度を変えることで調整する。
【００１９】
和周波光３４は、迷光カット用アイリス４２を通った後、ディスクリミネーター内蔵のフォトンカウンティング用光電子増倍管３５を接続した分光器３６に入射され、その信号がパーソナルコンピュータに接続したカウンタ３７により計測される。この際、光学遅延用のディレイライン３３を前後させることにより、和周波光３４の強度変化をモニタし、試料２６からの蛍光の時間分解測定を行う。
【００２０】
蛍光を測定する際に使用するフォトンカウンティング法は、蛍光の光子を１個づつ数える方法であり、非常に高感度な方法である。しかしながら、高感度であるゆえに迷光によるダークカウントも大きな値として観測してしまう。本装置においては、このダークカウントを最小にする目的で、非線形光学結晶３２によって生じた和周波光をアイリス（空間フィルタ）４２を用いて空間的に分離し、Ｓ／Ｎ比を向上させている。和周波光をコリメート用レンズ４１により平行光に戻し、アイリス４２を通した後、集光用レンズ４３を通して分光器３６に入射させる。アイリス４２を設置しない場合、ダークカウントは約６〜７カウント／ｓなのに対し、本方法を用いると、シグナル光強度は等しいまま、ダークカウントを約２〜３カウント／ｓまで低減することができる。アップコンバートされた信号のみを分光計３６に入射させるために、光学的バンドパスフィルタ３８が分光器３６の入射スリットの前に配置されている。
【００２１】
また、励起光の偏光を変化させるための１／２波長板１６ａを自動回転ホルダーに装着し、制御部４５によって、光学遅延回路３３と１／２波長板１６ａを装着した自動回転ホルダーを同期的に制御できるようにした。すなわち、制御部４５は、光学遅延回路３３にある遅延量を設定したとき、その遅延量において１／２波長板１６ａによる励起光の偏向方向を９０゜回転させた測定が行えるようにした。
【００２２】
光学顕微鏡１９について説明すると、対物レンズ２４と第二対物レンズ２１の間の、光が平行に進む部分にハーフミラー２２，２３を二枚入れ、一方を反射照明用の白色光源２７、他方をモニタ用のＣＣＤカメラ２８に割り当てた。これによって試料全体を照明光源２７の白色光で観察しながら、試料２６にレーザ光があたっている様子を同時に観測できる。レーザ光を結像系を通して光学顕微鏡に導入し、顕微鏡の前にピンホール１８を置くことで共焦点光学系を構成した。
【００２３】
またフェムト秒の極短パルス光が、顕微鏡内の光学素子によって与えられてしまう分散を小さくするために、最初に光を跳ね上げる光学素子を、可視域を高い反射率で反射するアルミニウムミラー２０とした。具体的には、光学顕微鏡１９内に配置された光学素子（プリズム）の代わりに５５０ｎｍ付近に反射極大を持つ全反射（アルミ）ミラーを取り付けた。これにより、励起光およびサンプルからの蛍光の強度が顕微鏡内でロスすることを防ぐことができる。同時に全反射ミラーに変更することにより、フェムト秒パルス光が媒質を通ことによって生じてしまう光の分散を防ぐことができ、サンプルからの蛍光を高い時間分解能で測定することを可能とする。対物レンズ２４と対向するように設けた透過照明用の白色光光源２９は、主にレーザ光の光軸調整用に用いる。光軸調整時には、この白色光を顕微鏡の外に導き、この光とレーザ光とを同軸にすることで光軸調整を行う。
【００２４】
また、本発明では共焦点光学配置をアップコンバージョン法と併用することにより、試料の垂直方向（光軸方向）の空間分解能を上げる。共焦点光学配置における垂直方向の分解能は顕微鏡前に置くピンホール径の大小に関係するが、通常５００マイクロメートル径のピンホールを用いて、１０マイクロメートルほどの分解能がある。しかしながら本発明においては試料からの蛍光は同時にアップコンバージョン過程を経るため、垂直方向の空間分解能の改善が行われる。例えば同様に５００マイクロメートル径のピンホールを使用した場合、垂直方向の空間分解能は４．６マイクロメートルと約２倍改善される。さらに小さい径のピンホールを共焦点配置用に使用することにより、より高い垂直方向の空間分解能が得られる。
【００２５】
同時に本発明においては試料の光励起において繰り返しの早い（〜８０ＭＨｚ）パルスレーザを用いる。これにより溶液相に存在するマイクロメートルオーダーの微小な物体のブラウン運動をレーザ光の光圧と溶媒と試料の屈折率の違いを利用したレーザトラップ法により停止させ、試料をレーザ光下でマニピュレートしながら時間分解蛍光測定することも可能である。従来のレーザトラップ法ではトラップ用に別のＣＷレーザ（Ａｒ＋等）を用意する必要があったが、本発明では試料の励起用レーザをトラップ光として併用できるため、装置が簡略化された。
【００２６】
次に、本発明の時間分解蛍光顕微鏡を用いた測定例について説明する。
〔測定例１〕
図３は励起光によりレーザトラップされた粒径４．９μｍのポリスチレンラテックスビーズのＣＣＤカメラ像である（励起パワーは１ｍＷ以下、１００倍の対物レンズを使用）。このポリスチレンラテックスビーズは、ビーズ内に色素分子、クマリン５１９を含むポリマー粒子である（セラダイン社製）。ビーズは水中に分散され、顕微鏡下で一粒を選択した。図に示すように繰り返しの早いレーザ光によりビーズのブラウン運動が止められ、なおかつビーズ内の蛍光分子が電子励起されることにより蛍光を発しているようすがわかる。
【００２７】
使用した蛍光ビーズは、波長５２０ｎｍに極大を持つ定常蛍光スペクトルを示す。この波長での蛍光を本装置によりフェムト秒の時間分解能で時間分解測定したものが図４である。得られた時間変化は２成分の減衰を示した。長い寿命成分はビーズ中の蛍光分子からの蛍光であり、早い寿命成分はビーズ自体からの蛍光であると考えられる。
【００２８】
ミクロスケールの物体を溶液中に分散させると、ブラウン運動により自由に動き回ってしまい、小物体一つを分光することは非常に困難である。このような場合、一般にはレーザトラップ法（レーザマニピュレーション法）という方法を用いて物体の動きを停止させる。これはレーザ光の光圧を用いる非常に有効な手段であるが、従来までの方法では、レーザトラップ用に（分光用レーザとは別に）もう一つレーザ（CW、連続光）を用意しなければならなかった。本方法では、分光用のレーザとして繰り返しの早い(82MHz)のチタンサファイアパルスレーザーを用いるため、トラップする対象にたいして、分光用レーザ光（励起光）をあたかも連続光のように扱うことができる。これによりトラップ用光源を省くことができ、装置の簡略化が行われた。
【００２９】
図５は、分光用レーザ（励起光）のみによる本発明のレーザトラップの説明図である。図５（ａ）及び図５（ｂ）は、本発明の時間分解蛍光顕微鏡を用いた分光用レーザ（励起光）による蛍光ビーズのレーザトラップを示す図である。励起光によりビーズのブラウン運動が停止させられ、蛍光ビーズの分光測定が可能になる。励起光をカットすると、図５（ｃ）、図５（ｄ）に示すように、蛍光ビーズはブラウン運動により動き始める。
【００３０】
なお、図６は、光学顕微鏡の最初に光を跳ね上げる光学素子２０を、プリズムに代えて５５０ｎｍ付近に反射極大を持つ全反射ミラーとしたことの効果を示す図である。図６（ａ）は光学素子２０としてプリズムを用いた場合に、本発明の時間分解蛍光顕微鏡によって測定されたレーザトラップ中の蛍光ビーズからの蛍光の時間変化を表す図である。励起光は４００ｎｍ、蛍光測定波長は５２０ｎｍである。このときの時間分解能は約１．２ｐｓであった。図６（ｂ）は、光学素子２０として５５０ｎｍ付近に反射極大を持つ全反射ミラーを用いた以外は、同じ条件で測定した蛍光ビーズからの蛍光の時間変化を表す図である。時間変化曲線の立ち上がりが急になっており、時間分解能が改善したことがわかる（このときの時間分解能は約６００ｆｓ）。また縦軸の蛍光強度も時間原点付近を比べると、ほぼ３．５倍ほど信号強度が強くなっており顕微鏡（プリズム）による蛍光のロスを防ぐことができる。
【００３１】
〔測定例２〕
図７（ａ）は、文献”Chem. Phys. Lett., 1993, 211, 364”の記述に従って調製したαペリレン微結晶のＣＣＤカメラ像である。ペリレンの結晶には２種類の結晶構造、すなわちαペリレンとβペリレンがある。αペリレンでは４分子がユニットセルを構成し、二量体結晶構造を作っている。またβペリレンでは２分子がユニットセルを構成する。これら２種類の結晶は異なる蛍光スペクトルを示すので、定常状態の蛍光スペクトルをチェックして顕微鏡下でαペリレン微結晶を選択した。室温でαペリレンは、６００ｎｍ付近に最大強度を有する非常に広い可視領域の蛍光を発する。この広い領域の蛍光は、光励起により生成したエキシトンからの発光に起因すると考えられる。高エネルギー領域の蛍光は、光励起によって直接発生されたフリーエキシトンによる発光であることが分かっている。フリーエキシトンはＹ状態（部分的に緩和されたエキシマー）に緩和され、５３０ｎｍ付近の蛍光がＹ状態に対応する。次に、Ｙ状態は６００ｎｍ付近に広く強い蛍光を発するＥ状態（完全に緩和したエキシマー、セルフトラップドエキシトン）に緩和する。Ｅ状態からの発光が室温で観察される定常状態蛍光を支配している。我々は、室温における微結晶中のエネルギー緩和過程を明らかにするために、本発明の時間分解蛍光顕微鏡を用いて時間分解蛍光測定を行った。
【００３２】
図７（ａ）は、αペリレン微結晶の中心部分から観察された時間分解蛍光（５２０ｎｍ）を示す。図７（ｂ）は、光励起中のＣＣＤカメラ像である。観察された時間変化は、装置応答時間を考慮した三つの指数関数の和でよく再現される。２つの時定数は高い精度でτ１＝２．２ｐｓ、τ２＝３８．７ｐｓと決定されたが、第３の時定数は寿命が長いため高い精度で決定するのが困難であった。観察された蛍光の時間変化は、３つの成分の相対強度と同様に、励起パルスエネルギーの変化によって影響されなかった。このことは、この実験条件下では生成されたエキシトンの濃度は比較的小さく、エキシトン−エキシトン消滅による時定数への影響は無視できることを示している。
【００３３】
観察された３種類の減衰成分の帰属は時間分解蛍光信号の波長依存性に基づいて行われた。フリーエキシトンからの発光が主である４８０ｎｍにおける蛍光減衰（図８（ｂ））は、５２０ｎｍにおける蛍光変化に比較して、第一寿命（τ１）成分に非常に大きく寄与している。第二寿命（τ２）成分は非常に小さく、第３のゆっくりした成分は見当たらない。他方、長寿命成分からの大きな寄与は６００ｎｍにおける蛍光減衰に観察された（図８（ｃ））。観察された時間分解蛍光の波長依存性は、τ１成分及びτ２成分はそれぞれフリーエキシトン及びＹ状態に起因し、第３のゆっくりした成分はＥ状態に割り当てられることを直接的に示している。
【００３４】
〔測定例３〕
本発明のフェムト秒時間分解顕微鏡の高い空間分解能を利用して、αペリレン微結晶におけるエキシトン発光の位置依存性を調べた。
【００３５】
図９（ａ）は、微結晶の縁部を光励起して測定した時間分解蛍光（５２０ｎｍ）を示す。図７（ｃ）は、光励起中の微結晶のＣＣＤカメラ像であり、明るいスポットが励起レーザ光の照射領域を示している。観察された減衰曲線は、微結晶の中心を励起した場合と同様に三つの指数関数の和でよく再現された。しかしフリーエキシトン及びＹ状態の寿命は著しく短く、τ１＝１．４ｐｓ、τ２＝２９．８ｐｓであった。微結晶の中心部励起と縁部励起とで定常状態の蛍光スペクトルに差異を見出すことはできなかったが、局所的な環境がエキシトンの緩和に大きく影響していることは明らかである。結晶の縁部は中心部に比べて規則性が劣化しており、欠陥濃度が高いことが予想される。従って、観察されたエキシトン緩和の変化は、微結晶中の欠陥濃度の差による可能性が高い。
【００３６】
このことを確かめるため、微結晶の中心部に大出力のレーザ光を照射して損傷を与え、損傷を与える前後の時間分解蛍光信号を比較した。その結果、図９（ｂ）に示すように、フリーエキシトン及びＹ状態の寿命は、損傷を与えた後では明らかに短くなった。損傷箇所の欠陥濃度は高いため、この結果は、欠陥の存在がエキシトン発光の時間変に影響を与え、エネルギー緩和を加速することを示している。
【００３７】
図１０は、再び文献”Chem. Phys. Lett., 1993, 211, 364”の記述に従って調製した約２０×２０μｍのαペリレン微結晶における位置の違いによる自由励起子の寿命の変化を二次元等高線プロットとして表したものである。図中の数値の単位はピコ秒である。結晶の中央部では図８で示したように２．２〜２．４ｐｓ程度の寿命を持った自由励起子からの発光が主に観測されるが、結晶の端、または一部中央では著しく異なった寿命が観測されることがわかる。このようにフェムト秒の時間分解能を利用した“ダイナミクス・イメージング”を行うことにより、単なる顕微鏡像や、時間分解能が十分でない従来の時間分解蛍光顕微鏡からでは得られない、新しいタイプの物質のイメージ（情報）を得ることができる。
【００３８】
本発明のフェムト秒時間分解蛍光顕微鏡は、フェムト秒の時間分解能と、サブマイクロメータの空間分解能を有する。本発明の時間分解蛍光顕微鏡により、微結晶中の位置を空間的に分解しながら、超高速のエキシトン蛍光を観測できた。本発明のフェムト秒時間分解蛍光顕微鏡は、上記測定例で示したような有機微結晶だけでなく、デバイスあるいは生体細胞を含む、微細構造を有する材料の超高速現象の研究に適用可能である。このように本発明の時間分解蛍光顕微鏡は、マイクロメータ構造中の分子の特性の探求にとって強力なツールとなるものであり、ナノ・サイエンス及びナノ・テクノロジーのキーとなるものである。
【００３９】
〔測定例４〕
本発明のフェムト秒時間分解顕微鏡は、制御部４５により光学遅延回路３３と１／２波長板１６ａを装着した自動回転ホルダーを同期的に制御できるため、蛍光の時間変化の偏光依存性を容易にかつ正確に測定することができる。
【００４０】
一般の溶液は非常に早いフェムト秒の時間領域で、溶質のダイポールモーメントの変化に伴う溶媒の配向変化や溶質分子の回転運動が行われる。溶媒の配向変化（ダイナミクスストークスシフト）は物質の反応性に、また溶質の回転運動は物質の輸送に大きく関連しており、両者は溶液中での化学反応において非常に重要な意味を持っている。このダイナミクスストークスシフトや回転運動を観測するにはフェムト秒の時間分解能が必要であると同時に励起光の偏光をある遅延時間で変化させ、その違いを正確に観測することが必要となる。本装置はこのことを可能にした。
【００４１】
偏光板の回転制御は次のようにして行った。ある遅延時間で（ステージを固定して）励起光の偏向方向がゲート光の偏向方向と平行な場合と垂直な場合を測定する。偏光測定の順番を平行→垂直→平行→垂直‥‥のようにするのではなく、図１１に示すように平行→垂直、垂直→平行、平行→垂直‥‥と移動させる。この方法により偏光子ホルダーの回転回数を少なくすることができ（回転に最短でも５秒程度かかる）、測定時間を短縮することができる。測定の際、各点について（例えば垂直の２）１秒積算を通常５回（回数は可変）行う。図１１の例の場合、平行と垂直を３回（ペア）づつ測定するので、遅延時間Ａでの並行及び垂直成分は３ｘ５回の積算を行ったことになる。
【００４２】
図１２は、本発明のフェムト秒時間分解顕微鏡による測定例を示し、レーザトラップ中の微小液滴（クマリン５１９のトルエン溶液を水中に分散させたもの）から得られた蛍光の時間変化を表したものである。励起波長は４００ｎｍ、測定した蛍光波長は５２０ｎｍである。図１２（ａ）は、励起光がゲート光と平行及び垂直の時に得られた信号を表している。上記の手法を用いると、各遅延時間における偏光による蛍光強度の違いを正確に得ることができる。図１２（ａ）から偏光異方性（anisotropy；（Ｉ//−Ｉ⊥）／（Ｉ//＋２＊Ｉ⊥））を計算すると、図１２（ｂ）に示すように液滴中でのクマリンの回転定数が求められる。偏光異方性の値を指数関数でフィットすることにより回転緩和の時定数は２５．２ｐｓと求められた。
【００４３】
〔測定例５〕
本発明のフェムト秒時間分解顕微鏡の高い時間分解能を利用して、微小領域中でおきる励起エネルギーの移動を調べることが可能となる。
【００４４】
図１３に、アントラセンとテトラセンの混合微結晶を励起した際に得られた定常蛍光スペクトルを示す（混合モル比  １：０．０１）。得られたスペクトルは、ほぼ５００，５３０，５７０，６２０ｎｍに極大を持ち、これは溶液中のテトラセンの蛍光スペクトルとの比較から、アントラセン結晶中に存在するモノマーのテトラセンからの発光であると帰属できる。テトラセンの単結晶を励起した場合には、図１３に示すような弱い蛍光しか観測されないのに対し、混合結晶中ではテトラセンからの非常に強い蛍光が観測される。これは混合結晶中においてアントラセンからテトラセンへの効率的な励起エネルギー移動が行われていることを示している。また、図１４に５００ｎｍで観測した蛍光の時間変化を示す。得られた時間変化は６．９ｐｓの時定数を持った指数関数的な立ち上がりと、時定数約４００ｐｓの減衰を示した。また蛍光の時間変化をアントラセン単結晶からの発光が観測される波長４７０ｎｍで観測すると、τ１と同じ時定数をもった非常に弱い蛍光の減衰が観測されることから、τ１はアントラセンからテトラセンへの励起エネルギー移動（励起子拡散）の時間を表していると結論できる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明によるフェムト秒時間分解蛍光顕微鏡の模式図。
【図２】時間相関単一光子計測装置を用いた時間分解蛍光顕微鏡の模式図。
【図３】レーザトラップ中の蛍光ビーズ（粒径４．９mｍ）を示す図。
【図４】蛍光ビーズからの蛍光（５２０ｎｍ）の時間変化を示す図。
【図５】分光用レーザ（励起光）のみによる本発明のレーザトラップの説明図。
【図６】光学顕微鏡の最初に光を跳ね上げる光学素子をプリズムに代えて全反射ミラーとしたことの効果を示す図。
【図７】αペリレン微結晶のＣＣＤカメラ像を示す図。
【図８】微結晶の中心で得られたフェムト秒時間分解蛍光を示す図。
【図９】微結晶の縁部で得られたフェムト秒時間分解蛍光を示す図。
【図１０】約２０×２０μｍのαペリレン微結晶における位置の違いによる自由励起子の寿命の変化を二次元等高線プロットとして表した図。
【図１１】偏光板と光学遅延用ディレイラインの制御方法を示す説明図。
【図１２】本発明のフェムト秒時間分解顕微鏡による測定例を示す図。
【図１３】anthracene - tetracene 混合微結晶の定常蛍光スペクトルを示す図。
【図１４】anthracene - tetracene 混合微結晶から得られた時間分解蛍光（500 nm）を示す図。
【符号の説明】
【００４６】
１１…Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザ、１２…チタンサファイアレーザ、１３…非線形光学素子、１５…分散補償用プリズム対、１６ａ，１６ｂ…１／２波長板、１８…共焦点用ピンホール、１９…倒立型光学顕微鏡、２２，２３…ハーフミラー、２４…対物レンズ、２６…試料、２７…反射照明用白色光源、２８…ＣＣＤカメラ、２９…透過照明用白色光光源、３２…非線形光学素子、３３…光学遅延用ディレイライン、３４…和周波光、３５…光電子増倍管、３６…分光器、４１…コリメート用レンズ、４２…アイリス、４３…集光用レンズ、４５…制御部、５１…レーザダイオード、５２…フィルタ、５３…顕微鏡対物レンズ、５４…試料、５５…ＣＣＤカメラ、５６…モニタ、５７，５８…フィルタ、５９…ピンホール、６０…フォトダイオード、６１…時間波高変換器、６２…マルチチャンネルアナライザ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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