(57)【要約】【解決手段】ビーズを用いた特異的結合反応を行った後、ビーズに結合した蛍光又は発光標識物質を検出することよりサンプル中の目的物質を測定する方法において、反応後浮遊しているビーズを底面に沈降させ、それを底面に保持したまま励起光を照射し、生じた蛍光又は発光を測定することを特徴とするサンプル中の目的物質の測定方法、及び当該方法を使用するための蛍光又は発光検出装置。【効果】本発明の目的物質の測定方法を用いれば、励起光の通り道を邪魔するビーズが存在せず、蛍光又は発光物質から発せられた発光が検出ディテクターにダイレクトに届くため、検出感度を大きくすることができる。【選択図】　　　　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビーズを用いた特異的結合反応を行った後、ビーズに結合した蛍光又は発光標識物質を検出することよりサンプル中の目的物質を測定する方法において、反応後浮遊しているビーズを底面に沈降させ、それを底面に保持したまま励起光を照射し、生じた蛍光又は発光を測定することを特徴とするサンプル中の目的物質の測定方法。
【請求項２】
ビーズが磁性ビーズである請求項１記載の目的物質の測定方法。
【請求項３】
遠心分離又は磁気固定によりビーズを底面に沈降させるものである請求項１又は２記載の目的物質の測定方法。
【請求項４】
（Ａ）サンプルプレートを保持するプレート保持部、（Ｂ）プレート保持部下方から磁場を発生させる磁気回収部、（Ｃ）励起光をプレート上に発生する光照射部、（Ｄ）標識物質から放出される蛍光又は発光を感知する光検出部、（Ｅ）磁気回収部、光照射部及び光検出部の各機能を制御する制御部、（Ｆ）制御部の動作シーケンスを制御する指令部、（Ｇ）光検出部で感知された光量をデータとして出力するデータ表示部、を備えてなる蛍光又は発光検出装置。
【請求項５】
（Ａ）サンプルプレートを保持するプレート保持部、（Ｂ）プレート保持部を高速回転させる遠心分離回収部、（Ｃ）励起光をプレート上に発生する光照射部、（Ｄ）標識物質から放出される蛍光又は発光を感知する光検出部、（Ｅ）遠心分離回収部、光照射部及び光検出部の各機能を制御する制御部、（Ｆ）制御部の動作シーケンスを制御する指令部、（Ｇ）光検出部で感知された光量をデータとして出力するデータ表示部、を備えてなる蛍光又は発光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビーズに結合した蛍光又は発光標識物質を検出することより、サンプル中の目的物質を感度よく測定できる方法、及び当該方法を使用するための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、医療血液検査や環境検査の分野では、抗原抗体反応を利用した免疫分析やＤＮＡプローブを用いた核酸の検出のように、標識された物質とビーズ等に固定化された物質の特異的結合反応を利用してサンプル中の目的物質を測定することが行われている。例えば抗原抗体反応を利用した免疫分析においては、放射性同位元素を使用した放射免疫測定法（ＲＩＡ法）や、酵素を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、蛍光色素を使用した蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等が知られている。
【０００３】
斯かる測定法に用いられる、標識物質としては、従来放射性アイソトープが汎用されていたが、最近では非放射性の蛍光又は発光標識物質が種々開発され、特に蛍光物質は各種波長を持ったものが揃っており実用化されている。また、プローブを固定化する担体としては、目的物質と３次元的に反応させることができるポリスチレンビーズや磁性ビーズのような直径５０ｎｍ〜１ｕｍという大きさのビーズが用いられるようになってきている。
【０００４】
例えば、蛍光測定法による場合は、蛍光標識されたプローブを固定したビーズと目的物質を反応後、非特異物質を洗浄し、ビーズと結合している蛍光物質に単一波長の励起光を当てて励起し、発光する光の強度をＣＣＤ等のディテクターで検出し、目的物質を測定している。
【０００５】
しかしながら、通常、斯かる特異的結合反応はエッペンチューブ等の反応容器中で行われ、反応終了後新たに検出容器へ移し替え、検出を行っているため、反応容器中のビーズを漏れなく移し替えるためには、その前によく撹伴する必要があり、移し替えて検出するときには、ビーズが溶液中に分散された状態で行われていた。従って、この状態での検出は、ビーズに固定されている標識体をエネルギー励起する励起光が、ビーズのシャドー効果や光散乱のために乱れることにより、バックグラウンドに対する検出シグナルの比（Ｓ／Ｎ比）が悪くなり、感度良い計測ができないという問題があった。また、蛍光物質の種類（例えばストークスシフトの狭い蛍光物質）によっては、検出結果に定量性が見られず、ビーズを用いた検出系には使用できないものもあった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ビーズに結合した蛍光又は発光標識物質を感度よく検出できるサンプル中の目的物質の測定方法及び当該方法を使用するための装置を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、鋭意検討したところ、特異的反応後に浮遊しているビーズを積極的に底面に沈降させ、それを底面に保持したまま励起光を照射し、蛍光又は発光を測定することにより、励起光がビーズのシャドー効果や光散乱によって乱されることなく、感度よくサンプル中の目的物質を測定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、ビーズを用いた特異的結合反応を行った後、ビーズに結合した蛍光又は発光標識物質を検出することよりサンプル中の目的物質を測定する方法において、反応後浮遊しているビーズを底面に沈降させ、それを底面に保持したまま励起光を照射し、生じた蛍光又は発光を測定することを特徴とするサンプル中の目的物質の測定方法を提供するものである。
【０００９】
また本発明は、（Ａ）サンプルプレートを保持するプレート保持部、（Ｂ）プレート保持部下方から磁場を発生させる磁気回収部、（Ｃ）励起光をプレート上に発生する光照射部、（Ｄ）標識物質から放出される蛍光又は発光を感知する光検出部、（Ｅ）磁気回収部、光照射部及び光検出部の各機能を制御する制御部、（Ｆ）制御部の動作シーケンスを制御する指令部、（Ｇ）光検出部で感知された光量をデータとして出力するデータ表示部、を備えてなる蛍光又は発光検出装置を提供するものである。
【００１０】
更に本発明は、（Ａ）サンプルプレートを保持するプレート保持部、（Ｂ）プレート保持部を高速回転させる遠心分離回収部、（Ｃ）励起光をプレート上に発生する光照射部、（Ｄ）標識物質から放出される蛍光又は発光を感知する光検出部、（Ｅ）遠心分離回収部、光照射部及び光検出部の各機能を制御する制御部、（Ｆ）制御部の動作シーケンスを制御する指令部、（Ｇ）光検出部で感知された光量をデータとして出力するデータ表示部、を備えてなる蛍光又は発光検出装置を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明において、「ビーズを用いて特異的結合反応を行った後、ビーズに結合した蛍光又は発光標識物質を検出することより、サンプル中の目的物質を測定する方法」とは、ビーズに結合した特異的結合物質と、目的物質（被分析物質）及び蛍光又は発光物質で標識された特異的結合物質とを反応させ、ビーズ上の標識物質を検出することにより、目的物質を測定することに代表される分子生物学的又は生化学的測定法をいう。
【００１２】
本発明は、斯かる測定法において、反応後浮遊しているビーズを底面に積極的に沈降させ、それを底面に保持したまま励起光を照射し、生じた蛍光又は発光を測定するものであり、これにより励起光の通り道を邪魔するビーズが存在せず、蛍光又は発光物質から発された発光をダイレクトに検出することが可能となる。
【００１３】
反応後浮遊しているビーズを底面に沈降させる手段としては、例えば遠心分離による方法やビーズに磁性ビーズを用いて磁気固定する方法が挙げられる。
遠心分離の条件は、用いるビーズ、目的物質、バッファの種類によっても異なるが、通常４〜４０℃、８，０００〜２０，０００回転、１分〜１０分行うのが好ましい。
【００１４】
ここで、ビーズとしては、Ｂ／Ｆ分離が容易なものであれば特に限定はされないが、球体、特に平均直径２０ｎｍ〜１００μｍであり、好ましくは５０ｎｍ〜５μｍのものが好ましい。
具体的には、ラテックスビーズ等の高分子粒子や外部から磁気的に容易に運動制御できる磁性ビーズが挙げられる。
【００１５】
ビーズとして、上記磁性ビーズを用いた場合には、磁力発生源を検出容器底面設け、励起光を照射し蛍光又は発光を測定している間、磁力を発生させて磁性ビーズを磁気固定すればよい。斯かる磁気発生源としては、例えば、永久磁石、電磁石等が挙げられる。磁性ビーズが磁気固定され底面に沈降された状態の概念図を図１に示す。
尚、磁性ビーズとしては、水溶液中で不溶性であり且つ磁性を示すものであるならば特に限定されるものではないが、例えば、ＦｅＯ，γ−ＦｅＯ，Ｃｏ−γ−ＦｅＯ，ＮｉＣｕＺｎ）Ｏ・ＦｅＯ，（ＣｕＺｎ）Ｏ・ＦｅＯ，（ＭｎＺｎ）Ｏ・ＦｅＯ，（ＮｉＺｎ）Ｏ・ＦｅＯ，ＳｒＯ・６ＦｅＯ，ＢａＯ・６ＦｅＯ，ＳｉＯ２で被覆したＦｅＯ（粒径約２００Ａ）〔Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｎｏｌ．，ｖｏｌ２，ｐ．２−１０（１９８０）　参照〕、各種の高分子材料（ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン等）とフェライトとの複合微粒子及び磁性細菌が菌体内に合成する磁性細菌粒子等が挙げられる。
【００１６】
本発明の測定方法においては、標識物質として、蛍光物質又は発光物質が用いられるが、蛍光物質としては、例えばフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ＡＭＣＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５等が挙げられる。
【００１７】
発光物質としては、化学発光性物質や生物発光性物質及び発光現象を生じる酵素等が挙げられる。化学発光性物質としては、例えば、ルミノール、イソルミノールおよびベンゾペリレン等のルミノール類、アクリジニウムエステル等のアクリジン類、アクリジンオレンジ等が挙げられる。また、生物発光性物質としては、例えばペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素が挙げられる。
【００１８】
斯かる蛍光物質及び発光物質に照射される、励起光としては、キセノン光、ハロゲン光、アルゴンイオンレーザー等が挙げられる。
【００１９】
本発明の測定方法において用いられる、ビーズに結合した特異的結合物質、蛍光又は発光物質で標識された特異的結合物質としては、例えば、抗原と結合する抗体、抗体と結合する抗原、ストレプトアビジンと結合するビオチン、ビオチンと結合するストレプトアビジン、相補的な関係にあるＤＮＡ鎖／又はＲＮＡ鎖とこれらと相補的な関係にあるＤＮＡ鎖／ＲＮＡ鎖等が挙げられ、免疫学的測定として知られるいわゆる競合法及びサンドイッチ法等の何れもが包含される。
【００２０】
また、本発明において目的物質、すなわち被分析物質としては、特異的結合反応を利用して測定できる物質では特に限定されるものではなく、例えば、アレルゲン、ヒスタミン等のタンパク質関連物質、甲状腺ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン等のホルモン類、キャプテン、フロルピリホス等作物中の残留農薬やアヘン、コカ等の乱用薬物等の薬物、レジオネラ菌、セラチア、炭疽菌、ＭＲＳＡ等の微生物、アルキルフェノール・エトキシレート（ＡＰＥ）、ビスフェノールＡ（ＢＰＡ）、リニア・アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）等の環境ホルモン、Ｏ１５７の産生するベロ毒素等の毒素が挙げられる。
【００２１】
図２に、上記目的物質の測定方法に使用できる蛍光又は発光検出装置の例を示す。本検出装置を、免疫反応装置や核酸ハイブリダイゼーション装置と組み合わせて用いることより、感度よく目的物質の測定が可能となる。
すなわち、図２に示した装置は、プレート保持部の真下に磁石を設置し、スイッチをオンにすることでビーズ粒子を容器底面に凝集させ、保持する機能を備えた蛍光検出装置であり、プレート保持部１、磁気回収部２、光照射部３、光検出部４、制御部５、指令部６、データ表示部７から構成される。
【００２２】
プレート保持部１はマイクロプレート等のサンプルプレートを保持するものであり、その下部に磁場を発生させる磁気回収部２が設置され、プレート下方から磁場を発生できるようになっている。
図３に磁気回収部２の側面図を示す。
磁気回収部は、磁性粒子がプレートの底部のみに不動化されるように磁力を発生させることができれば良い。プレート保持部１の各ウェル部に磁石８が埋め込まれている。
【００２３】
光照射部３は、プレート保持部１の上方に設置され、励起光を発する光源３ａ、その光を絞る集光レンズ３ｂ及び特定の波長のみを通過させる干渉フィルター３ｃを備えている。光照射部３から放出された特定の励起光がサンプルプレート中のサンプルに照射され、蛍光又は発光物質から放出される発光を光検出部４にて感知される。
【００２４】
光検出部４は、放出された発光強度を感知するディテクター４ａ、その光を絞る集光レンズ４ｂ、特定の波長のみを通過させる干渉フィルター４ｃを備えている。
【００２５】
磁気回収部２、光照射部３、光検出部４の各機能は、制御部５により制御され、更にこれらの動作シーケンスは指令部６により制御されている。
光検出部４により感知された光量は、データ表示部７によりデータとして出力される。
【００２６】
図４に、遠心分離回収部を有する蛍光又は発光検出装置の例を示す。
プレートを保持するプレート保持部１、水平回転する遠心分離回収部９及び当該遠心分離回収部を回転させる駆動部（図示せず）を備えている。回転速度及び時間は制御部５により制御され、更にこれらの動作シーケンスは指令部６により制御されている。
【００２７】
【実施例】
実施例１
ＡＭＣＡ蛍光標識された磁性ビーズをウェルに分注し、図２に示す装置を用いて、（Ａ）混合した状態及び、（Ｂ）底面磁気固定した状態を調整し、蛍光量を測定した。コントロールとして蛍光標識していないビーズについても同条件で測定し、この二つのデータからＳ／Ｎ比を算出した。結果を表１及び図５に示す。
【００２８】
【表１】
2004028682.tif 000003
【００２９】
これより、（Ｂ）底面磁気固定した場合のＳ／Ｎ比は、（Ａ）混合した状態の場合のＳ／Ｎ比の約６倍であった。
【００３０】
実施例２
本発明の蛍光検出装置を用いて、目的物質を測定する方法を以下に示す。
（１）免疫反応装置や核酸ハイブリダイゼーション装置で処理された処理溶液（磁性ビーズを含む）を十分に撹拌した後、検出プレートに１００μＬを分注する。
（２）本装置のプレート保持部へ検出プレートを設置する。
（３）装置の始動スイッチを投入し、磁性ビーズが十分に底面回収できるとあらかじめ定められている所定の時間を待機する。
（４）光照射部から特定の励起光を検出プレート中の処理溶液に照射し、蛍光物質から放出される発光を光検出部にて感知する。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の目的物質の測定方法を用いれば、励起光の通り道を邪魔するビーズが存在せず、蛍光又は発光物質から発せられた発光が検出ディテクターにダイレクトに届くため、検出感度を大きくすることができる。また、本発明の測定方法を用いることにより、ビーズの光散乱のために使用することができなかった蛍光物質、具体的には励起波長に対する放出波長のずれ（ストークスシフト）が２０〜３０ｎｍと狭い物質も使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は磁性ビーズが磁気固定された状態の概念図である。
【図２】図２は磁気回収部を有する本発明検出装置の概念図である。
【図３】図３は磁気回収部の側面図である。
【図４】図４は遠心分離回収部を有する本発明検出装置の概念図である。
【図５】図５は底面磁気固定した場合の検出感度を示す図である。
【符号の説明】
１　プレート保持部
２　磁気回収部
３　光照射部
４　光検出部
５　制御部
６　指令部
７　データ表示部
８　磁石
９　遠心分離回収部
ａ　磁気発生源
ｂ　磁性ビーズ
３ａ　光源
３ｂ　集光レンズ
３ｃ　干渉フィルター
４ａ　ディテクター
４ｂ　集光レンズ
４ｃ　干渉フィルター
【図１】
2004028682.tif 000004
【図２】
2004028682.tif 000005
【図３】
2004028682.tif 000006
【図４】
2004028682.tif 000007
【図５】
2004028682.tif 000008