(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトサイトメガロウイルスに特異的なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球エピトープペプチドの提供。【解決手段】特定の配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、ヒトサイトメガロウイルスに特異的なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球エピトープペプチド。該ペプチドを用いたＨＣＭＶの感染を治療す又は予防するワクチン、受動免疫療法剤、ＨＣＭＶ特異的ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球の定量法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、ヒトサイトメガロウイルスに特異的なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球エピトープペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含む、ヒトサイトメガロウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチン。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドをパルスした抗原提示細胞を有効成分として含む、ヒトサイトメガロウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチン。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチド又は該ペプチドをパルスした抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、ヒトサイトメガロウイルスに対する受動免疫療法剤。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドから調製した主要組織適合抗原複合体及び／又は主要組織適合抗原複合体−テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させ、該主要組織適合抗原複合体及び／又は主要組織適合抗原複合体−テトラマーにＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、ヒトサイトメガロウイルスに対する受動免疫療法剤。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドから調製した主要組織適合抗原複合体−標識磁気ビーズと末梢血リンパ球とを反応させ、主要組織適合抗原複合体−標識磁気ビーズにＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、ヒトサイトメガロウイルスに対する受動免疫療法剤。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドで末梢血を刺激し、該ウイルスに特異的なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を得、該ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が産生するサイトカイン及び／又はケモカインを測定することを特徴とする、ヒトサイトメガロウイルスに特異的なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の定量方法。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドから主要組織適合性複合体及び／又は主要組織適合性複合体−テトラマーを調製し、該主要組織適合性複合体及び／又は主要組織適合性複合体−テトラマーと末梢血とを反応させる、該末梢血中のヒトサイトメガロウイルスに特異的なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、以下、ＨＣＭＶと称する）に特異的なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下、ＣＴＬと称する）エピトープペプチド、該ペプチドを用いたＨＣＭＶの感染を治療又は予防するワクチン、ＨＣＭＶに対する受動免疫療法剤、及びＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬの定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＣＭＶは大部分の健常な成人が潜在的に保有するウイルスであるが、がん患者、骨髄移植を行った患者、エイズ患者などにおいて免疫力が低下していると活動化する。活動化し、増殖したＨＣＭＶは致死的な間質性肺炎のほか、網膜炎、肝炎などを引き起す。このため、ＨＣＭＶを安全にかつ有効に制御する新しい方法が強く望まれている。
【０００３】
ＨＣＭＶ感染細胞の活動を制御している主な免疫担当細胞はＣＤ８＋ＣＴＬである。ＣＤ８＋ＣＴＬはＨＣＭＶ感染細胞を発見するとそれを破壊する能力を持っているため、その機能を有効に活性化すれば、ＨＣＭＶ関連疾患の新しい診断と治療法の開発につながる可能性が高い。
【０００４】
ＣＴＬがウイルス感染細胞を認識する際、以下のような特徴がある。
（１）    ＣＴＬはウイルス粒子そのものを認識することはできない。
（２）    ＣＴＬはウイルスタンパク質中の特定部位にある８〜１０個のアミノ酸からなるペプチド（以下、エピトープペプチドと称する）を認識して感染細胞を破壊する。
（３）    この特定の８〜１０個のアミノ酸は、ウイルス感染細胞表面にあるヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ、以下、ＨＬＡと称する）に結合してＣＴＬに提示される。
（４）    ＨＬＡは人種間、個人間によって異なり、ＨＬＡが異なると同じウイルスでもエピトープペプチドが異なる。
【０００５】
以上の（１）から（４）で述べたことから明らかなように、ＨＣＭＶに特異的なエピトープペプチドとなり得るアミノ酸を過不足なく決定することは、これらのウイルス感染症に対して有効な免疫があるか否かの診断、さらには、免疫治療法を施す際の必須の事項となり得る。
【０００６】
この問題を解決するために、すでに白人に多いＨＬＡ分子や、日本人に多いＨＬＡ−Ａ２４分子上に乗ってＴ細胞に提示されるペプチドとそれらの利用が報告されている。例えば、ＨＣＭＶタンパク質のアミノ酸配列について、ＨＬＡ−Ａ２４、Ａ２６、Ｂ６１の各結合モチーフを有する８〜１０個のアミノ酸よりなるエピトープペプチドを検索し得る、インターネット上に公開されているＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）のＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＃ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．）によって照合し、ＨＬＡ−Ａ２４、Ａ２６、Ｂ６１の各結合モチーフを有する８〜１０個のアミノ酸よりなる抗原エピトープ候補ペプチドを多数スクリーニングし、エピトープ候補ペプチドから同定されたＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドが報告されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
しかしながら、ＨＬＡ−Ａ２４を持たない日本人は全日本人の４５％に達し、日本人の多くが保有する上記以外のＨＬＡ分子によって提示されるＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドの報告は極めて少ない現状にあり、ＨＣＭＶの感染を治療又は予防するのに有用な、さらなるＨＬＡ型に対応したエピトープペプチドの同定、開発が求められている。
【０００８】
【特許文献】特開２００２−２５５９９７号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチド、特に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７、Ａ＊１１０１、Ｂ＊１５０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４００６、Ｂ＊４４０３、Ｂ＊５１０１、Ｃｗ＊０１０２、Ｃｗ＊０４０１、Ｃｗ＊０８０１、Ｃｗ＊１２０２又はＣｗ＊１５０２型に提示され得るエピトープペプチド、ＨＣＭＶの感染を治療又は予防するワクチン、ＨＣＭＶに対する受動免疫療法剤、及びＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬの定量方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、抗原性が強くＣＤ８＋ＣＴＬの標的となり、ＨＣＭＶの潜在感染中に発現するリン酸化タンパク質であるＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子の断片を活性化Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ等の抗原提示細胞内で発現させて、該遺伝子のどの部分（領域）がＣＴＬと反応するペプチドを有しているのかを探索し、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７、Ａ＊１１０１、Ｂ＊１５０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４００６、Ｂ＊４４０３、Ｂ＊５１０１、Ｃｗ＊０１０２、Ｃｗ＊０４０１、Ｃｗ＊０８０１、Ｃｗ＊１２０２又はＣｗ＊１５０２型に提示され、かつＣＤ８＋ＣＴＬに認識され得るエピトープペプチドを複数見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）を提供する。
（１）    配列番号１〜配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、ヒトサイトメガロウイルスに特異的なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球エピトープペプチド。
（２）    （１）に記載のペプチドを有効成分として含む、ヒトサイトメガロウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチン。
（３）  （１）に記載のペプチドをパルスした抗原提示細胞を有効成分として含む、ヒトサイトメガロウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチン。
（４）    （１）に記載のペプチド又は該ペプチドをパルスした抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、ヒトサイトメガロウイルスに対する受動免疫療法剤。
（５）    （１）に記載のペプチドから調製した主要組織適合抗原複合体及び／又は主要組織適合抗原複合体−テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させ、該主要組織適合抗原複合体及び／又は主要組織適合抗原複合体−テトラマーにＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、ヒトサイトメガロウイルスに対する受動免疫療法剤。
（６）    （１）に記載のペプチドから調製した主要組織適合抗原複合体−標識磁気ビーズと末梢血リンパ球とを反応させ、主要組織適合抗原複合体−標識磁気ビーズにＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、ヒトサイトメガロウイルスに対する受動免疫療法剤。
（７）    （１）に記載のペプチドで末梢血を刺激し、該ウイルスに特異的なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を得、該ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が産生するサイトカイン及び／又はケモカインを測定することを特徴とする、ヒトサイトメガロウイルスに特異的なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の定量方法。
（８）    （１）に記載のペプチドから主要組織適合性複合体及び／又は主要組織適合性複合体−テトラマーを調製し、該主要組織適合性複合体及び／又は主要組織適合性複合体−テトラマーと末梢血とを反応させる、該末梢血中のヒトサイトメガロウイルスに特異的なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の定量方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明についてさらに詳細に説明する。
【００１３】
１．エピトープペプチド
本発明でいうペプチドは、生理活性を有し、隣接するアミノ酸残基のα−アミノ基とカルボキシル基間のペプチド結合により相互に結合した線状のアミノ酸の分子鎖を意味する。ペプチドは特定長のものを意味するものではなく、種々の長さであり得る。また、無電荷又は塩の形態であってもよく、場合によっては、グリコシル化、アミド化、ホスホリル化、カルボキシル化、リン酸化等により修飾されていてもよい。さらには、本発明のエピトープの生理活性及び免疫活性を実質的に改変せず、投与した場合に有害な活性を有するものでない限り、１個又は数個（例えば、１〜１０個）のアミノ酸の挿入、付加、置換等が生じたペプチドも本発明に含まれる。例えば、ペプチドのＮ末端又はＣ末端に付加的アミノ酸配列が介在するものも含まれる。また、本発明のペプチドは、糖類、ポリエチレングリコール、脂質等が付加された複合体、放射性同位元素等による誘導体、あるいは重合体等の形態として用いることができる。
【００１４】
本発明のＣＤ８＋ＣＴＬとは、ヒトリンパ球上に存在する表面抗原分子の一つであるＣＤ８を発現しているＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を意味する。
【００１５】
また、ＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドとは、ＣＤ８＋ＣＴＬに認識され得るＨＣＭＶタンパク質中の特定部位にある８〜１０個のアミノ酸配列からなるペプチドであって、ＣＤ８＋ＣＴＬの抗原受容体と免疫的に結合するＨＣＭＶの構造部分であり、ＨＣＭＶ感染細胞を直接に傷害し、ウイルスを排除し得るＣＤ８＋ＣＴＬの細胞性免疫機構を活性化する抗原基を意味する。図１にその機構を示す。
【００１６】
ＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチド、特に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７、Ａ＊１１０１、Ｂ＊１５０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４００６、Ｂ＊４４０３、Ｂ＊５１０１、Ｃｗ＊０１０２、Ｃｗ＊０４０１、Ｃｗ＊０８０１、Ｃｗ＊１２０２又はＣｗ＊１５０２型に提示され得るエピトープペプチドは、ＣＤ８＋ＣＴＬの標的となるＨＣＭＶタンパク質の遺伝子を抗原提示細胞（例えば、ｐｐ６５遺伝子をコードするレトロウイルスベクター感染細胞）内で共発現させ、該ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子がどのＨＬＡによって提示され、ＣＴＬを刺激し得るのかを確認し、さらにＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子のどの領域がＣＴＬを刺激し得るエピトープペプチドとなり得るのかを検索することによって同定、取得することができる。
【００１７】
抗原提示細胞として利用し得る細胞としては、活性化Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ等が挙げられるが、特に活性化Ｂ細胞の使用が好ましい。なお、本明細書において抗原提示細胞とは、エピトープペプチドが結合し得るＨＬＡをその表面上に発現する細胞の中でＣＤ８＋ＣＴＬ刺激能を有するものを意味する。
【００１８】
また、本明細書において、抗原提示細胞内で発現させるＨＣＭＶタンパク質とは、抗原性が強くＣＤ８＋ＣＴＬの標的となり、ＨＣＭＶの潜在感染細胞内で発現するものであれば特に限定されないが、特に、抗原性の強さの点からＨＣＭＶ−ｐｐ６５タンパク質が好ましい。このタンパク質及び遺伝子（ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子）については、文献に詳細が報告されており（Ｒｕｇｅｒ  Ｂ，  Ｋｌａｇｅｓ  Ｓ，  Ｗａｌｌａ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｗｏ  ｖｉｒｉｏｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｐ６５  ａｎｄ  ｐｐ７１  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９８７；６１：４４６−４５３）、それらを参考にすることができる。
【００１９】
ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子、並びにＨＬＡ−Ａ＊０２０７、Ａ＊１１０１、Ｂ＊１５０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４００６、Ｂ＊４４０３、Ｂ＊５１０１、Ｃｗ＊０１０２、Ｃｗ＊０４０１、Ｃｗ＊０８０１、Ｃｗ＊１２０２及びＣｗ＊１５０２型の各種ＨＬＡ  ｃＤＮＡは、例えば、Ａｋａｔｓｕｋａらの文献及びＫｏｎｄｏらの文献（Ａｋａｔｓｕｋａ  Ｙ，  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＴＡ，  Ｋｏｎｄｏ  Ｅ，  Ｍａｒｔｉｎ  ＥＧ，  Ｏｂａｔａ  Ｙ，  Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ  Ｙ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，  Ｈａｎｓｅｎ  ＪＡ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｃＤＮＡ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．  ２００２；５９：５０２−５１１、及びＫｏｎｄｏ  Ｅ，  Ｔｏｐｐ  ＭＳ，  Ｋｉｅｍ  ＨＰ，  Ｏｂａｔａ  Ｙ，  Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ  Ｙ，  Ｋｕｚｕｓｈｉｍａ  Ｋ，  Ｔａｎｉｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｈａｒａｄａ  Ｍ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，  Ａｋａｔｓｕｋａ  Ｙ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４０−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００２；１６９：２１６４−２１７１）に基づいて構築したプラスミドｐｃＤＮＡ３−ｐｐ６５及びｐｃＤＮＡ３．１を用いることができる。
【００２０】
ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子及び各種ＨＬＡ  ｃＤＮＡの抗原提示細胞への共導入の方法については、Ｂｕｄｋｅｒ等の文献（Ｂｕｄｋｅｒ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：  ａ  ｎｅｗ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６；１４：  ７６０−７６４）に基づいて実施することができる。
【００２１】
また、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子がいずれの型のＨＬＡに提示され、ＣＴＬを刺激し得るのかについては、エリスポットアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）で検討することができる。エリスポットアッセイは、文献（Ｋｏｎｄｏ  Ｅら（前述）、及びＧｅｇｉｎａｔ  Ｇ，  Ｓｃｈｅｎｋ  Ｓ，  Ｓｋｏｂｅｒｎｅ  Ｍ，  Ｇｏｅｂｅｌ  Ｗ，  Ｈｏｆ  Ｈ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｏｆ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ａｎｄ  ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ  ＣＤ４  ａｎｄ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００１；１６６：１８７７−１８８４）に基づいて実施することができる。
【００２２】
次いで、エリスポットアッセイの結果に基づき、以下のようにして、特定のＨＬＡ型に提示されるＨＣＭＶ−ｐｐ６５タンパク質の部位（領域）、すなわちエピトープペプチドを同定することができる。
【００２３】
ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子を、例えば、前述のプラスミドｐｃＤＮＡ３−ｐｐ６５を制限酵素ＡｐａＩ及びＢａｍＨＩで切断し、Ｅｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）でエキソヌクレアーゼＩＩＩ処理して段階的な３’欠失体を得る。この欠失体をＥ．ｃｏｌｉへ結合し、形質転換させて欠失突然変異体を得、該変異体より得られた各プラスミドクローンを配列決定し、選択することができる。
【００２４】
得られたＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子断片と前述のｐｃＤＮＡ３．１を、抗原提示細胞、例えば２９３Ｔ細胞等にリポフェクション等の常法に基づいて共導入し、続いてＣＴＬを刺激してエリスポットアッセイを行い、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５タンパク質のどの断片（領域）にＣＴＬが反応するペプチドが存在するのかを検索することによって、ＨＬＡに提示されＣＤ８＋ＣＴＬが認識し得るエピトープペプチドを同定し、取得することができる。
【００２５】
一方、別法として、ＨＣＭＶタンパク質のアミノ酸配列について、各種ＨＬＡ型（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７、Ａ＊１１０１、Ｂ＊１５０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４００６、Ｂ＊４４０３、Ｂ＊５１０１、Ｃｗ＊０１０２、Ｃｗ＊０４０１型等）の結合モチーフを有する８〜１０個のアミノ酸よりなるエピトープペプチドを検索し得る照合媒体、例えば、インターネット上に公開されているＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  （ＢＩＭＡＳ）のＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  （ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＃ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．）によって照合し、エピトープ候補ペプチドをスクリーニングすることもできる。得られたエピトープ候補ペプチドについては、例えば、以下に示すような方法のいずれかによりＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドであるか否かを決定することができる。
【００２６】
（１）エピトープペプチド決定方法１
１０％ウシ胎児血清含有ＩＭＤＭ培地にて培養中の２９３Ｔ細胞に、エピトープ候補ペプチド配列を含むさまざまな程度に３’端を欠失したｐｐ６５遺伝子又は８〜１０アミノ酸からなるペプチド配列をコードする遺伝子を含む遺伝子をＨＬＡ遺伝子と共に導入しておく。約４８時間後、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地にｐｐ６５遺伝子を導入した活性化Ｂ細胞で反復刺激して作成しておいた細胞傷害性リンパ球を約５×１０３／ｍｌの細胞濃度で浮遊し、上記で準備した２９３Ｔ細胞に添加し、炭酸ガス恒温槽にて３７℃で１晩培養する。次いで、エリスポットアッセイ（Ｋｕｚｕｓｈｉｍａ  Ｋ他著、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，  １０４巻：１６３−１７１頁，１９９９年等で報告されている）を実施してエピトープペプチドを決定する。
【００２７】
（２）エピトープペプチド決定方法２
１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地にｐｐ６５遺伝子を導入した活性化Ｂ細胞で反復刺激して作成しておいた細胞傷害性リンパ球を約５×１０３／ｍｌの細胞濃度で浮遊し、これにエピトープ候補ペプチドの中の任意の１種を１μｇ／ｍｌの濃度で処理した自己ＬＣＬ（Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）加える。炭酸ガス恒温槽にて３７℃で１晩培養する。これらのエピトープ候補ペプチドが刺激するか否かについては、エリスポットアッセイ等で判定する。
【００２８】
本発明の配列番号１〜１２のアミノ酸配列を有するペプチドは、上記のような方法における検討の結果、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７、Ａ＊１１０１、Ｂ＊１５０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４００６、Ｂ＊４４０３、Ｂ＊５１０１、Ｃｗ＊０１０２、Ｃｗ＊０４０１、Ｃｗ＊０８０１、Ｃｗ＊１２０２又はＣｗ＊１５０２型に提示され得るＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドとして確認されたものである。
【００２９】
本発明の配列番号１〜１２に示されるエピトープペプチドは、従来の各種のペプチド合成方法によって調製され得る。例えば、固相ペプチド合成法等の有機化学的合成法、あるいは、ペプチドをコードするＤＮＡを調製し、組換えＤＮＡ技術を用いて調製することも可能である。また、市販の化学合成装置（例えば、アプライドバイオシステムズ社の  ペプチド合成装置）による合成も可能である。
【００３０】
２．ワクチン
本発明のＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドは、能動免疫ペプチドワクチン療法においてワクチンとして用いることができる。すなわち、本発明のＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドを含んでなるワクチンを患者に投与し、ＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬを体内で増殖させ、疾患に対する予防及び治療に役立てることができる。使用するエピトープペプチドは１種のみの使用であっても、あるいはワクチンの使用目的に応じて２種以上のペプチドを組み合わせ、混合して使用することもできる。
【００３１】
また、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、活性化Ｂ細胞、マクロファージ等）に本発明のＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドをパルスしたもの（以下、ＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドパルス細胞と称する）を含むワクチンも使用することができる。ここで、パルスするとは、適当な培養液中で、抗原提示細胞と該ペプチドを３０分から１時間混合することを意味する。
【００３２】
本発明のＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチド、又はＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドパルス細胞を含んでなるワクチンは、当分野において公知の方法を用いて調製することができる。例えば、かかるワクチンとしては、本発明のＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチド又はＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドパルス細胞を有効成分として含有する注射剤又は固形剤等がある。エピトープペプチドは、中性又は塩の形態で処方することができ、例えば、薬学上許容され得る塩としては、塩酸、リン酸などの無機塩、又は、酢酸、酒石酸などの有機酸が挙げられる。また、本発明のエピトープペプチド又はエピトープペプチドパルス細胞は、製薬上許容され、該ペプチド又は該細胞の活性と相容性を有する賦形剤、例えば、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、ＤＭＳＯ、及びその他のアジュバント等、又はこれらの組み合わせと混合して用いることができる。さらに、必要に応じて、アルブミン、湿潤剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。
【００３３】
本発明のワクチンは、非経口投与及び経口投与により投与することができるが、一般には非経口投与が好ましい。非経口投与としては皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射等の注射剤、座薬等がある。また、経口投与としては、スターチ、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、セルロース等の賦形剤との混合物として調製することができる。
【００３４】
本発明のワクチンは、治療上有効な量で投与する。投与される量は、治療対象、免疫系に依存し、必要とする投与量は臨床医の判断により決定される。通常、適当な投与量は、患者一人当たり、エピトープペプチドでは１  〜１００ｍｇ、エピトープペプチドパルス細胞では１０６〜１０９個の含有量とする。また、投与間隔は、対象、目的により設定することができる。
【００３５】
３．受動免疫療法剤
本発明のＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドは、ＨＣＭＶに対する受動免疫免疫治療剤の調製に用いることができる。すなわち、１）末梢血リンパ球を該ペプチドで刺激して得られるＣＤ８＋ＣＴＬ、２）末梢血リンパ球を該ペプチドから調製した主要組織適合抗原複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ、以下、ＭＨＣと称する）又はＭＨＣ−テトラマーと反応させ、ＭＨＣ又はＭＨＣ−テトラマーにＣＤ８＋ＣＴＬが結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＤ８＋ＣＴＬ、又は、３）末梢血リンパ球を該ペプチドから調製したＭＨＣ−標識磁気ビーズと反応させ、ＭＨＣ−標識磁気ビーズにＣＤ８＋ＣＴＬが結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＤ８＋ＣＴＬ、を含む、受動免疫免疫治療剤を得ることができる。
【００３６】
ＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドを使用したＭＨＣ及びＭＨＣ−テトラマーは、例えば、以下のように調製することができる。タンパク質発現用の大腸菌から精製したＨＬＡ重鎖、β２ミクログロブリン及び本発明のＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドの複合体である、ＭＨＣをバッファー内で形成させる。組換えＨＬＡ重鎖タンパク質のＣ末端には予めビオチン結合部位を付加しておき、ＭＨＣ形成後この部位にビオチンを付加する。市販の標識色素ストレプトアビジンとビオチン化ＭＨＣをモル比１：４で混合することによってＭＨＣ−テトラマーを作製する。図２にＭＨＣ−テトラマーの調製方法を示し、図３にはＭＨＣ−テトラマーとＨＣＭＶに特異的なＣＴＬとの結合を示した。なお、各ステップにおいて、ゲル濾過によるタンパク質精製を行うのが好ましい。
【００３７】
受動免疫療法剤に含まれるＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬは、以下のような調製方法によって得ることができる。
（１）ＣＤ８＋ＣＴＬ調製方法１
リンパ球を末梢血等から分離し、これを適当な濃度のＭＨＣ又はＭＨＣ−テトラマーと３７℃、１５分間反応させる。ＭＨＣ又はＭＨＣ−テトラマーと結合したＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬは標識色素により染色されるので、フローサイトメーター、顕微鏡などを用いて染色されたＣＤ８＋ＣＴＬのみを単離する。あるいは、予め無菌プレートなどに固相化したＭＨＣ及び／又はＭＨＣ−テトラマーに反応させることもできる。プレートに固相化されたＭＨＣ及び／又はＭＨＣ−テトラマーに結合したＨＣＭＶ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを単離するためには、結合せずに浮遊している他の細胞を洗い流した後に、プレート上に残った抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬだけを新しい培養液に懸濁する。このようにして単離されたＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ−２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
【００３８】
（２）ＣＤ８＋ＣＴＬ調製方法２
前述のようにペプチドから調製したビオチン化ＭＨＣをストレプトアビジン標識磁気ビーズと結合させ、結合体（以下、ＭＨＣ−磁気ビーズと称する）を作製する。ＭＨＣ−磁気ビーズを図４に示す。リンパ球を末梢血等から分離し、適当な濃度の前記ＭＨＣ−磁気ビーズをリンパ球：ビーズ比、１：１０で反応させる。ＭＨＣ−磁気ビーズと結合したＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬの入った試験管を磁場におくと、ビーズと結合したＣＤ８＋ＣＴＬは磁石のある側の試験管内壁に寄せられる。その機構を図５に示す。その後、それ以外の細胞を洗い流した後に、試験管を磁場からはずし、試験管内壁に残ったＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬだけを新しい培養液に懸濁する。このように単離されたＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ−２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
【００３９】
（３）ＣＤ８＋ＣＴＬ調製方法３
末梢血から分離したリンパ球を本発明のＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドで直接刺激するか、該ペプチドをパルスした抗原提示細胞で刺激する。刺激によって誘導されたＣＤ８＋ＣＴＬを炭酸ガス恒温槽にて３７℃で７〜１０日培養する。その後ＩＬ−２を添加し、ＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドとＩＬ−２、又は該抗原提示細胞とＩＬ−２による刺激を週に１度くり返すことによって受動免疫療法に必要な細胞数のＣＤ８＋ＣＴＬを確保する。
【００４０】
上記のようにして得られたＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬはヒトアルブミン含有ＰＢＳ等に懸濁させて、ＨＣＭＶに対する受動免疫療法剤とすることができる。
【００４１】
４．ＣＤ８＋ＣＴＬの定量
ＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬが、ハイリスクの患者（何らかの原因により免疫能が低下した人、先天性免疫不全症、造血幹細胞移植又は固形臓器移植を受けて拒絶予防のために免疫抑制剤の投与を受けている患者、慢性ウイルス感染症患者、エイズ患者、高齢者、幼小児、妊婦等）の末梢血に存在するか否かを知ることは、抗ウイルス剤や免疫抑制剤の適正な使用を含め、これらの感染症管理の上で重要な情報である。ＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬの定量は、本発明のＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドを用いた以下の２つの方法によって行うことができる。
【００４２】
第１の定量方法は、末梢血から分離されたリンパ球を本発明のＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドで刺激することによって誘導されるＣＤ８＋ＣＴＬが産生するインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン等のサイトカイン及び／又はケモカインを定量する方法である。以下にＩＦＮγを例にとり具体的に方法を示す。
【００４３】
（１）サイトカイン定量による方法１（細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量）；
末梢血から分離したリンパ球を１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に２×１０６／ｍｌの細胞濃度で浮遊させ、本発明のＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で加える。さらに細胞内蛋白輸送阻止剤であるＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ等を加え、炭酸ガス恒温槽にて３７℃で５〜６時間培養する。培養後、細胞を固定、膜透過処理を行い、色素標識抗ＩＦＮγ抗体、抗ＣＤ８抗体と反応させる。フローサイトメーター等を用いて、ＣＤ８＋リンパ球中のＩＦＮγ陽性細胞％を定量する。
【００４４】
（２）サイトカイン定量による方法２（エリスポットアッセイ）；
９６穴ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＡプレート（Ｍｉ１１ｉｐｏｒｅ）を抗ＩＦＮγモノクローナル抗体で一晩、４℃でコーティングし各穴をＰＢＳで洗浄した後、末梢血から分離したリンパ球を各穴にまく。エピトープペプチドを各穴に入れ３７℃の５％  ＣＯ２培養器にて２０時間培養する。翌日、０．０５％Ｔｗｅｅｎ‐２０添加ＰＢＳでプレートを洗浄した後、抗ＩＦＮγウサギ血清、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ血清の順で各々９０分ずつ室温で反応させる。さらに３−ａｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｓｏｌｅ  （Ｓｉｇｍａ）と０．０１５％のＨ２Ｏ２を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ５．０）を各穴に入れ、室温で４０分反応させる。ＩＦＮγスポットを可視化し、実体顕微鏡でカウントする。
【００４５】
（３）サイトカイン定量による方法３（培養上清中に分泌されたＩＦＮγを定量する方法）；
末梢血から分離したリンパ球を１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に２×１０６／ｍｌの細胞濃度で浮遊させ、本発明のＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で加える。炭酸ガス恒温槽にて３７℃で２４−４８時間培養する。培養後、上清を回収し、その中に含まれるＩＦＮγ濃度を市販のＥＬＩＳＡ  キット（例えばＥＮＤＯＧＥＮ社のＨＵＭＡＮ  ＩＦＮ  ｇａｍｍａ  ＥＬＩＳＡ）を使用して定量する。
【００４６】
第２の定量方法としては、本発明のＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドを使用して作製したＭＨＣ−テトラマーを用いて、末梢血中のＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬを定量することができる。ＭＨＣ−テトラマーの調製は前述のとおりである。定量は、例えば、以下のようにして実施することができる。末梢血などからリンパ球を分離し、適当な濃度のＭＨＣ−テトラマーと３７℃、１５分反応させる。該テトラマーと結合したＣＤ８＋ＣＴＬは標識色素により染色されるので、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いてカウントする。
【００４７】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４８】
［実施例１］  ＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドの同定
１．各種材料の調製
（１）血液の入手
ＣＭＶ血清反応陽性のドナー１１人およびＣＭＶ血清反応陰性のドナー８人から同意を得て末梢血の提供を受けた。血液中のＣＭＶ特異的ＩｇＧの存在については、酵素結合抗体免疫吸着アッセイでＣＭＶ血清陽性分析を行い、ＨＬＡ型についてはＨＬＡ研究所（Ｋｙｏｔｏ，  Ｊａｐａｎ）に依頼して確認した。また、ドナー末梢血単核細胞由来のＣＤ８陽性分画及び陰性分画は、末梢血単核細胞をフィコール密度勾配で遠心分離により分離し、ＣＤ８  マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離した。表１に陽性ドナー及び陰性ドナーから得た末梢血由来Ｔリンパ球の各ＨＬＡ型と抗ＣＭＶ抗体の有無を示す。
【００４９】
【表１】
2004242599.tif 000002
【００５０】
２．ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子及び各種ＨＬＡ遺伝子を導入した２９３Ｔ細胞又はＬＣＬによるＨＣＭＶに特異的なＣＴＬの誘導
（１）ＣＤ４０活性化Ｂ細胞の調製及びＬＣＬの樹立
ＣＤ４０活性化Ｂ細胞は、文献（Ｋｏｎｄｏ  Ｅら（前述）、及びＳｃｈｕｌｔｚｅ  ＪＬ，  Ｍｉｃｈａｌａｋ  Ｓ，  Ｓｅａｍｏｎ  ＭＪ，  Ｄｒａｎｏｆｆ  Ｇ，  Ｊｕｎｇ  Ｋ，  Ｄａｌｅｙ  Ｊ，  Ｄｅｌｇａｄｏ  ＪＣ，  Ｇｒｉｂｂｅｎ  ＪＧ，  Ｎａｄｌｅｒ  ＬＭ．  ＣＤ４０−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ：  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９７；１００：２７５７−２７６５）に基づいて、ドナー由来のＣＤ８−除去末梢血単核細胞から調製した。
【００５１】
すなわち、ＩＬ−４（４ｎｇ／ｍＬ；  Ｏｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，  Ｌｔｄ，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）及びＣｓＡ  （０．７μｇ／ｍｌ；  Ｓａｎｄｏｚ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む、プールしたヒト血清１０％含有ＩＭＤＭ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）２ｍＬ中で、全ＣＤ８−除去末梢血単核細胞を、γ−照射（９６Ｇｙ）したヒトＣＤ４０ＬをトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞株  （ｔ−ＣＤ４０Ｌ：Ｄｒ．  Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ、の好意により提供された）上で培養した。３〜４日毎に増殖した細胞を新たに調製したｔ−ＣＤ４０Ｌ細胞上に移し、ＣｓＡ非含有の新鮮な培地を供給した。その結果、ＣＤ４０活性化Ｂ細胞が得られた。
【００５２】
（２）ＬＣＬの樹立
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｇｕｎｍａ，  Ｊａｐａｎ）を含むＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ＣＤ４０活性化Ｂ細胞をエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）産生株（Ｂ９５−８，  ＡＴＣＣ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）の上清で処理してＬＣＬを樹立した。
【００５３】
（３）ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子及び各種ＨＬＡ遺伝子を導入した２９３Ｔ細胞又はＬＣＬの調製
２９３Ｔ細胞およびＬＣＬ細胞への導入に利用するプラスミド、ｐｃＤＮＡ３−ｐｐ６５、ｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及びｐｃＤＮＡ３．１（ＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ）の各ｃＤＮＡをコードするプラスミド）、は、文献（Ａｋａｔｓｕｋａ  Ｙ，  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＴＡ，  Ｋｏｎｄｏ  Ｅ，  Ｍａｒｔｉｎ  ＥＧ，  Ｏｂａｔａ  Ｙ，  Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ  Ｙ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，  Ｈａｎｓｅｎ  ＪＡ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｃＤＮＡ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．  ２００２；Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ、及びＫｏｎｄｏ  Ｅ，  Ｔｏｐｐ  ＭＳ，  Ｋｉｅｍ  ＨＰ，  Ｏｂａｔａ  Ｙ，  Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ  Ｙ，  Ｋｕｚｕｓｈｉｍａ  Ｋ，  Ｔａｎｉｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｈａｒａｄａ  Ｍ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，  Ａｋａｔｓｕｋａ  Ｙ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４０−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００２；１６９：２１６４−２１７１）に基づいて構築した。
【００５４】
各種プラスミドの２９３Ｔ細胞への導入は、文献（Ｂｕｄｋｅｒ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：  ａ  ｎｅｗ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６；１４：  ７６０−７６４）に従って実施した。
【００５５】
まず、各種ＨＬＡ  ｃＤＮＡとＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子をＴｒａｎｓＩＴ−２９３  （Ｍｉｒｕｓ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）によって２９３Ｔ細胞に共導入して行い、細胞を得た。それらの細胞は、以下、「２９３Ｔ／ｐｐ６５＋各種ＨＬＡ型」（例えば、２９３Ｔ／ｐｐ６５＋Ａ＊１１０１）で表す。また、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子のみ導入した２９３Ｔ細胞（以下、「２９３Ｔ／ｐｐ６５」と称する）、自己由来ＬＣＬ、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子のみ導入した自己由来（以下、「ＬＣＬ／ｐｐ６５」と称する）についても調製した。なおＬＣＬへの遺伝子の導入は文献（Ｋｏｎｄｏ  Ｅら（前述））に詳細したように、ｐｐ６５遺伝子をコードしたレトロウイルスベクターを感染させて行った。
また、導入率は、文献（Ｋｏｎｄｏ  Ｅら（前述））に基づいて評価した。
【００５６】
３．ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子及び各種ＨＬＡ遺伝子を導入した２９３Ｔ細胞又はＬＣＬによるＣＴＬ細胞の刺激とエリスポットアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）
１０３以上のＣＴＬとともに、上記で調製した２９３Ｔ／ｐｐ６５＋各種ＨＬＡ型細胞、２９３Ｔ／ｐｐ６５細胞、ＬＣＬ細胞、及びＬＣＬ／ｐｐ６５細胞をそれぞれプレートした。４時間、その９６ウェルプレート（３７９０；  Ｃｏｓｔａｒ）上のそれら細胞を完全培地２００μＬ中でインキュベートした後、細胞を浮遊させ、そのすべてエリスポットプレートへ移し、１６時間インキュベートした。
【００５７】
エリスポットアッセイは、文献（Ｋｏｎｄｏ  Ｅら（前述）、及びＧｅｇｉｎａｔ  Ｇ，  Ｓｃｈｅｎｋ  Ｓ，  Ｓｋｏｂｅｒｎｅ  Ｍ，  Ｇｏｅｂｅｌ  Ｗ，  Ｈｏｆ  Ｈ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｏｆ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ａｎｄ  ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ  ＣＤ４  ａｎｄ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００１；１６６：１８７７−１８８４）に基づいて実施した。すなわち、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＡ  ｐｌａｔｅ  （ＭＡＨＡ  Ｓ４５１０，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を抗−ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（Ｍ７００Ａ；  Ｅｎｄｏｇｅｎ，  Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）でコーティングし、エリスポットプレートとして使用した。
【００５８】
スポットの検出には、ビオチン標識抗−ヒトＩＦＮ―γ抗体（Ｍ７０１Ｂ；  １  μｇ／ｍｌ，  Ｅｎｄｏｇｅｎ、およびストレプトアビジン−アルカリ性フォスファターゼ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）を使用した。ＩＦＮγスポットは、スキャナ（Ｃａｎｏｎ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を用いてコンピューターで視覚化し、計測した。
【００５９】
その結果を図６に示す。図中の各横軸は、ＣＤ８＋ＣＴＬの１０３細胞についてのスポット数を表わす。
【００６０】
ドナーＰ０８の場合、ドナーＰ０８から調製された多数のＣＤ８＋ＣＴＬ細胞は、ＨＬＡ−Ｂ＊４００６の遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３．１プラスミドとｐｃＤＮＡ３−ｐｐ６５プラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞により刺激され、また、少数のＣＤ８＋ＣＴＬ細胞がＨＬＡ−Ｂ＊４４０３又はＣｗ＊０８０１の遺伝子を含む２９３Ｔ細胞によって刺激されたが、他のＨＬＡクラスＩ遺伝子であるＨＬＡ−Ａ＊２４０２、Ａ＊３３０３又はＣｗ＊１４０３を含む２９３Ｔ細胞には刺激されなかった。このことは、ドナーＰ０８由来のＣＤ８＋ＣＴＬ細胞が、少なくとも３種類の異なるＨＬＡクラスＩ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ｂ＊４００６、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３及びＣｗ＊０８０１）によって提示される複数のＨＣＭＶ−ｐｐ６５由来エピトープを認識し得ることを示唆している。
【００６１】
なお、ドナーＰ０６とＰ０７の場合、ＣＴＬ細胞がｐｐ６５遺伝子を単独導入した２９３Ｔ細胞を認識することが確認されているが、これは２９３Ｔ細胞がＡ＊０２０１を内在的に発現することが知られていることによる。このため、ドナーＰ０６及びＰ０７においては、優性Ａ＊０２０１に提示されるエピトープ（配列番号２１）を欠失した突然変異体ｐｐ６５遺伝子（ｐｃＤＮＡ３ｐｐ６５ΔＮＬＶ）と各種ＨＬＡ  ｃＤＮＡとを導入した２９３Ｔ細胞を使用した。
【００６２】
４．各種ＨＬＡ遺伝子により提示されたＨＣＭＶ−ｐｐ６５エピトープペプチドをコードする領域の同定
上記のＨＣＭＶ−ｐｐ６５に特異的なＣＴＬＣＤ８＋によって認識されるエピトープペプチドを同定を以下のようにして行った。
（１）    ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子断片の調製
Ａｋａｔｓｕｋａらの文献及びＫｏｎｄｏらの文献（前述）に基づいて作製したプラスミドｐｃＤＮＡ３−ｐｐ６５をＡｐａＩ及びＢａｍＨＩで切断し、Ｅｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）でエキソヌクレアーゼＩＩＩ処理して段階的な３’欠失体を得た。この欠失体でＥ．ｃｏｌｉを形質転換させて欠失突然変異体を含むプラスミドＤＮＡを得た。該変異体より得られた各プラスミドクローンをＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子断片として配列決定し、選択した。
【００６３】
以下の表２にＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子のＣ末端切断型フォームをコードする遺伝子断片の番号とその断片の遺伝子によってコードされるアミノ酸の長さを示す。
【００６４】
【表２】
2004242599.tif 000003
【００６５】
（２）    ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子断片のミニ遺伝子の構築
ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子断片のミニ遺伝子の構築を行うために、ＣＭＶプロモーター（Ｐｃｍｖ）およびｐｃＤＮＡ３．１のＢＧＨポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐＡ）をＰＣＲ（ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ；  Ｔｏｙｏｂｏ，  Ｊａｐａｎ）により増幅した。Ｐｃｍｖ用プライマーには、５’Ｐｃｍｖ：  ＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＣＧＴＴＴＴＧＣ（配列番号１３）及び３’Ｐｃｍｖ：  ＮＮＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡ（配列番号１４）を用い、ＢＧＨｐＡのプライマーには、５’ＢＧＨｐＡ：  ＮＮＴＡＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧ（配列番号１５）及び３’ＢＧＨｐＡ：  ＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧ（配列番号１６）を用いた。
【００６６】
さらに、上記プライマーとのオーバーラップ領域（下記５’ＧＳＰ（配列番号１７）の下線部分が上記３’Ｐｃｍｖ（配列番号１４）の下線部分のオーバーラップ領域であり、下記３’ＧＳＰ（配列番号１８）の下線部分が上記５’ＢＧＨｐＡ（配列番号１５）の下線部分のオーバーラップ領域である）と（１）で作成したｐｐ６５の欠失変異体を用いてエピトープの存在が推定された領域（センス鎖をＸで、アンチセンス鎖をＹで、またそれぞれの塩基長をｍ、ｎで示す）に特異的な付加ヌクレオチドとを含むセンスプライマー及びアンチセンスプライマー（５’ＧＳＰ：  ＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧ（配列番号１７）＋Ｘｍ及び３’ＧＳＰ：  ＧＡＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＡ（配列番号１８）＋Ｙｎ）を設計し、全長のｐｐ６５をコードするプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行った。例えばｐｐ６５のアミノ酸配列のアミノ酸位置３４１番から３４９番を含むペプチド断片（配列番号１０）をコードするミニ遺伝子を作るためには、Ｘｍ部分をＣＡＧＴＡＣＧＡＴＣＣＣＧＴＧＧ（配列番号１９）、Ｙｎ部をＧＡＡＧＡＧＣＧＣＡＧＣＣＡＣＧＧ（配列番号２０）とした。
【００６７】
Ｐｃｍｖ−ｐｐ６５ミニ遺伝子−ＢＧＨｐＡの順よりなるミニ遺伝子を発現させるためのカセットを作るために、各ＰＣＲ産物を１μＬずつ使用して鋳型とし、再度５’Ｐｃｍｖ：  ＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＣＧＴＴＴＴＧＣ（配列番号１３）および３’ＢＧＨｐＡ：  ＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧ（配列番号１６）を用いて３種類の断片をＰＣＲ法にて結合した。
【００６８】
なお、本発明の実施例において、ミニ遺伝子法により推定されたエピトープペプチドが実際に認識されるかどうかを確認するための実験に用いた合成ペプチドはＴｏｒａｙリサーチセンター  （Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）に合成を依頼し、購入した。
【００６９】
（３）    各種ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子断片を用いたＣＤ＋８ＣＴＬ細胞の刺激によるエピトープペプチド領域の確認
上記各種ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子３’欠失断片と各種ＨＬＡ  ｃＤＮＡ（ＨＬＡ−Ａ＊０２０７、Ａ＊１１０１、Ｂ＊１５０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４００６、Ｂ＊４４０３、Ｂ＊５１０１、Ｃｗ＊０１０２、Ｃｗ＊０４０１、Ｃｗ＊０８０１、Ｃｗ＊１２０２、Ｃｗ＊１５０２型及び対照としてのＨＬＡ−Ａ＊２４０２、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊５２０１）でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を用いて各ドナー由来のＣＴＬ細胞を刺激し、エリスポットアッセイによってＣＴＬ細胞の認識を確認した。その結果を図７に示す。なお、図中、縦軸にｐｐ６５遺伝子３’欠失断片の長さを示し、また「−」は、スポットがないことを示す。
【００７０】
ドナーＰ１１由来のＣＴＬ細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２  ｃＤＮＡと、クローン＃１７又は該クローンより長いクローンでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を認識することができる。これは、アミノ酸残基３３６と３６５（各々、クローン＃１６および＃１７のＣ末端位置）の間に、Ａ＊２４０２で提示されるＨＣＭＶ−ｐｐ６５エピトープペプチドが部分的に位置していることを示している。この結果は、先に同定されたＡ＊２４０２に提示されるエピトープペプチド（ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、３４１〜３４９番目のアミノ酸配列）と一致している（前述、特許文献１参照）。
【００７１】
また、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１およびＢ＊５２０１の結果についても、すでに報告されたエピトープペプチド、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、１２３〜１３１番目のアミノ酸配列（Ｇａｖｉｎ  ＭＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｌｋａｌｉ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｌｌｏｗｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ＭＨＣ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＣＴＬ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９３；１５１：３９７１−３９８０）およびＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、１５５〜１６３番目のアミノ酸配列（Ｂｕｎｄｅ  ＫＦ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  （ＣＭＶ）  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  ６５  ｍａｋｅｓ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｈａｐｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｎ  ＣＭＶ−ｅｘｐｏｓｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００２；１８５：１７０９−１７１６）と各々一致していた。
【００７２】
一方、その他のＨＬＡ型に提示されるＨＣＭＶ−ｐｐ６５エピトープペプチドについては未だ報告されていないので、未確定のＨＬＡクラスＩについて対応するＨＣＭＶ−ｐｐ６５エピトープペプチドの領域を調べた。
【００７３】
その結果、各ドナー由来のＣＴＬ細胞によって認識された最短の長さのＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子断片が次のように決定された：Ａ＊０２０７（ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子断片番号＃２３、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列の完全長）、Ａ＊１１０１（＃２２、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、１〜５１３番目のアミノ酸配列）、Ｂ＊４００２（＃１３、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、１〜２８３番目のアミノ酸配列）、Ｂ＊４００６（＃２３、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列の完全長）、Ｂ＊４４０３（＃１７、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、１〜３７８番目のアミノ酸配列）、Ｂ＊５１０１（＃２３、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列の完全長）、Ｃｗ＊０４０１（＃１６、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、１〜３５５番目のアミノ酸配列）、Ｃｗ＊０８０１（＃８、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、１〜２１１番目のアミノ酸配列）、Ｃｗ＊１２０２（＃１４、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、１〜３１０番目のアミノ酸配列）およびＣｗ＊１５０２（＃８、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、１〜４００番目のアミノ酸配列）。
【００７４】
Ｃｗ＊１２０２では、完全長プラスミドをトランスフェクトした細胞が、それより短いプラスミドをトランスフェクトした細胞よりも弱い刺激でスポットを生じさせることが確認された（１５３／ウエルに対して３７１／ウエル）。この結果により、上記のような、Ｐ０４、Ｐ０７およびＰ１０の場合になぜ少数のスポットだけが確認されるのかを説明できる。具体的には、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１２０２に提示されるエピトープは、ＣＴＬによって顕著に認識されるが、完全長のｐｐ６５遺伝子に比べ、短いエピトープペプチドの方が効果的に刺激する。
【００７５】
ＨＬＡ−Ｂ＊１５０１（ドナーＰ０１において、最も有力にｐｐ６５エピトープを提示したＨＬＡ分子である）に関して、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子断片＃９（ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、１〜２３４番目のアミノ酸配列）はＰ０１  ＣＴＬ細胞によって認識された最短のクローンであった。これは、アミノ酸残基２１２〜２３４の領域内に、ＨＬＡ−Ｂ＊１５０１で提示されるエピトープペプチドのＣ末端が含まれていることを示唆するものである。
【００７６】
Ｂ＊４００１の場合には、ドナーＰ０３のＣＴＬ細胞はＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子断片＃１３（ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、１〜２８７番目のアミノ酸配列）又はそれより長いクローンを顕著に認識するとともにＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子断片＃１０（ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、１〜２４９番目のアミノ酸配列）、＃１１および＃１２についてもやや弱いながらも認識することができる（図７中、半丸の部分）。これは、ドナーＰ０３のＣＴＬ細胞については、ＨＬＡ−Ｂ＊４００１が提示するエピトープペプチドが２種類存在することを意味する。
【００７７】
また、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１やＢ＊４４０３などの場合においても、ＣＴＬ細胞にわずかに認識される部分（図７中、小さな丸で示す部分）があり、優勢なエピトープ（大きな丸で示す部分）以外に、非常に弱く認識されている部分（小さな丸で示す部分）にさらなるエピトープペプチドの存在が考えられる。
【００７８】
５．各ＨＬＡ分子型によって提示されるＨＣＭＶ−ｐｐ６５エピトープペプチドのコンピューター・アルゴリズムによる同定
コンピューター・アルゴリズムによるエピトープ推定が多くの特定の腫瘍又はウイルス・ペプチドの同定に功を奏しているので、本試験においても結合モチーフを利用可能なＨＬＡ対立遺伝子に関してコンピューター・アルゴリズム、すなわち、上記エピトープペプチドを検索し得る照合媒体、例えば、インターネット上に公開されているＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ    （ＢＩＭＡＳ）のＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  （ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＃ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．）を使用した。
【００７９】
ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子によって提示されるエピトープは一般に８〜１０  ｍｅｒである。従って、図７で報告した領域のアミノ酸配列とそのＮ末端側の１０アミノ酸配列をとともにＢＩＭＡＳウェブサイトにあるコンピューター・アルゴリズムにかけた。そのエピトープペプチドの推定結果を表３に示した。
【００８０】
【表３】
2004242599.tif 000004
【００８１】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０７の場合、ＢＩＭＡＳウェブサイトにおいて、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７自体に対する推定は行えなかったが、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に類似性を示すＨＬＡ−Ａ＊０２０７の結合モチーフは既に報告されている。したがって、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７のエピトープペプチドを推定するため、分析オプションのＨＬＡ分子としてＨＬＡ−Ａ＊０２０１を選択した。
【００８２】
ＨＬＡ−Ｂ＊１５０１に関しては、トップ３のエピトープのスコアが類似している（６、４．４及び４）。したがって、別のアルゴリズム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒのウェブサイト）による推定を試みた。その結果、１つのエピトープだけが高いスコアを示し、そのスコアはＢＩＭＡＳウェブサイトによる３番目のスコアと一致した。
【００８３】
各ＣＴＬにより推定されるエピトープの認識は、推定エピトープ又は無関係なｐｐ６５のペプチドをコードするミニ遺伝子をオーバーラッピングＰＣＲによって作成し、ミニ遺伝子の導入細胞を使用して、エリスポットアッセイによって評価した。
【００８４】
図８に示すように、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１以外の推定されたエピトープはすべて、適当なＨＬＡ遺伝子の存在下において各ｐｐ６５特異的ＣＴＬによって十分に認識され、その特異性が確認された。
【００８５】
ドナーＰ０１由来のＣＴＬ細胞は、ｐｐ６５のアミノ酸番号２１５〜２２３をコードするミニ遺伝子とＨＬＡ−Ｂ＊１５０１でコトランスフェクトした２９３Ｔ細胞によって刺激されるが、それは、完全長ｐｐ６５遺伝子で同様にコトランスフェクトした２９３Ｔ細胞による刺激に匹敵した。一方、ｐｐ６５遺伝子のアミノ酸番号２２７〜２３５をコードするミニ遺伝子で同様にコトランスフェクトした２９３Ｔ細胞では刺激が生じなかった。この結果、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、２１５〜２２３番目のアミノ酸配列（配列番号３）が、ＨＬＡ−Ｂ＊１５０１が提示するｐｐ６５遺伝子由来のエピトープペプチドの少なくとも１種であることが確認された。
【００８６】
ＨＬＡ−Ｂ＊４００１に関しては、ドナーＰ０３由来のＣＴＬ細胞が表３に挙げられた２種類のミニ遺伝子（ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、２３２〜２４０番目のアミノ酸配列（配列番号４）および２６７〜２７５番目のアミノ酸配列（配列番号５））をともによく認識した。これは、クローン（図７）を使用したエリスポットアッセイの結果と類似していた。
【００８７】
さらに、ドナーＰ０２由来のＣＴＬ細胞は、ＨＬＡ−Ｂ＊４００１中の２種類のミニ遺伝子をともに認識することができ（データは示さず）、両ミニ遺伝子がＨＬＡ−Ｂ＊４００１によって提示される優性ｐｐ６５−エピトープペプチドであることが確認された。
【００８８】
ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１の場合、推定されたエピトープ（ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、５４７〜５５５番目のアミノ酸配列）をコードするミニ遺伝子又は２番めに高いスコア（ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、５４５〜５５３番目のアミノ酸配列）を有するミニ遺伝子は、ドナーＰ０５由来のＣＴＬ細胞にあまり認識されなかった。このため、他の様々なミニ遺伝子についても検討したところ、９アミノ酸からなるペプチド（ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、５４５〜５５２番目のアミノ酸配列（配列番号８））をコードするミニ遺伝子がよく認識されることがわかった。この９アミノ酸からなるペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１についてすでに報告された結合モチーフと一致しており、第２位置がアラニン又はプロリンで、Ｃ末端がイソロイシンである。
【００８９】
これらの結果により、表４に示すように、ＨＬＡ−Ａ＊０２０７、Ａ＊１１０１、Ｂ＊１５０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４００６、Ｂ＊４４０３、Ｂ＊５１０１、Ｃｗ０１０２、Ｃｗ＊０４０１、Ｃｗ＊０８０１、Ｃｗ＊１２０２及びＣｗ＊１５０２で各々提示される新規ｐｐ６５由来エピトープペプチドが明らかになった。
【００９０】
【表４】
2004242599.tif 000005
【００９１】
６．コンピューター・アルゴリズムが利用できないＨＬＡ分子型によって提示されるＨＣＭＶ−ｐｐ６５エピトープペプチドの同定
ＨＬＡ−Ｃ＊０８０１、Ｃ＊１２０２、Ｃ＊１５０２に提示されるペプチドモチーフが十分判明していないため、これらのＨＬＡ型に対しては現在コンピューター・アルゴリズムが利用できない。従って上記と同様の方法で特定した図７に示す領域のアミノ酸配列をコードするミニ遺伝子（長さ８〜１０）を、Ｎ末端側から１アミノ酸ずつずらしながら多数作成し、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトして、各ドナー（Ｐ０８、Ｐ０９およびＰ０２）由来のＣＴＬ細胞を刺激し、エリスポットアッセイによってＣＴＬ細胞の認識を確認した。その結果を図９に示す。  図９から明らかなように、ＨＬＡ−Ｃ＊０８０１およびＣ＊１５０２によって提示されるｐｐ６５のエピトープペプチド配列は同一であり、  ＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、１９８〜２０６番目のアミノ酸配列（配列番号１１）であることが判明した。同様に、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１２０２によって提示されるｐｐ６５のエピトープペプチド配列はＨＣＭＶ−ｐｐ６５のアミノ酸配列のうち、２９５〜３０２番目のアミノ酸配列（配列番号１２）であることがわかった。
【００９２】
ＨＬＡ−Ｃ＊０８０１、Ｃ＊１２０２及びＣ＊１５０２で各々提示される新規ｐｐ６５由来エピトープペプチドを表５に示す。
【００９３】
【表５】
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【００９４】
［実施例２］ワクチン注射剤
ＤＭＳＯに、配列番号１〜１２のペプチドを最終濃度２０ｍｇ／ｍｌとなるように各々溶解し、ろ過滅菌した。得られたペプチド含有溶液を滅菌バイアル瓶に１ｍｌずつ分注密栓し、ワクチン注射剤とした。
【００９５】
［実施例３］エピトープペプチドによるＣＴＬ株の誘導
ＣＭＶ血清反応陽性のドナー３人（Ｐ０１、Ｐ０３およびＰ０８）の末梢血単核細胞由来のＣＤ８除去末梢血単核細胞から調製したＣＤ４０活性化Ｂ細胞に、上述のように作製し、上記で同定した５種のエピトープペプチド（配列番号４、５、６、１０及び１１）を合成して添加した。エピトープペプチドによって刺激されたＣＤ４０活性化Ｂ細胞を刺激細胞とし、自己のＣＤ８陽性細胞と共培養した。刺激細胞による刺激を２回反復し、２１日目に、ｐｐ６５遺伝子を導入した自己ＬＣＬ（ＬＣＬ／ｐｐ６５）、該ペプチドを添加したか或いは行わないＥＧＦＰ遺伝子導入自己ＬＣＬ（ＬＣＬ／ＥＧＦＰ）を標的として、細胞傷害試験を行った。その結果を図９に示す。図中、■はＬＣＬ／ｐｐ６５、○はＬＣＬ／ＥＧＦＰ、●は１μＭの同起源ペプチドでパルスしたＬＣＬ／ＥＧＦＰを示す。図９から明らかなように、Ｐ０３ではＨＬＡ−Ｂ＊４００１によって提示される２つのペプチド（配列番号４、配列番号５）およびＣｗ＊０４０１によって提示されるペプチド（配列番号１０）の計３種のエピトープペプチドのついて検討したところ、いずれのペプチドで刺激・誘導されたＣＴＬ株も該ペプチドを添加したＬＣＬ／ＥＧＦＰのみならず、全長のｐｐ６５を発現しているＬＣＬ／ｐｐ６５とも良好に傷害した。一方、該ペプチドを添加しなかった自己ＬＣＬ／ＥＧＦＰは傷害しなかった。同様に、Ｐ０８ではＨＬＡ−Ｂ＊４００６で提示されるペプチド（配列番号６）、Ｐ０１ではＨＬＡ−Ｃｗ＊１５０２によって提示されるペプチド配列番号１１）を用いてＣＴＬ株の誘導を行い、細胞傷害性試験を行ったところ、図９に示すように該ペプチドを添加したＬＣＬ／ＥＧＦＰのみならず、全長のｐｐ６５を発現しているＬＣＬ／ｐｐ６５とも良好に傷害した。以上の結果は、本発明で同定されたエピトープペプチドがＴ細胞を刺激しＣＴＬ株を誘導する生理活性を有することを示している。
【００９６】
【発明の効果】
本発明により、ＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドを提供することができる。また、該エピトープペプチドを用いてＨＣＭＶの感染を管理、治療又は予防することができる。さらに、ＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬを定量することが可能である。
【００９７】
【配列表】
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2004242599.tif 000015
【００９８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１４：ｎはＡ又はＣ又はＧ又はＴを表す（存在位置：１及び２）
配列番号１５：ｎはＡ又はＣ又はＧ又はＴを表す（存在位置：１及び２）
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＤ８＋ＣＴＬによるウイルス感染細胞の認識機構を示す図である。
【図２】ＭＨＣ−テトラマーの調製方法を示す図である。
【図３】ＭＨＣ−テトラマーとＨＣＭＶに特異的なＣＴＬの結合を示す図である。
【図４】ＭＨＣ−磁気ビーズを示す図である。
【図５】ＭＨＣ−磁気ビーズと結合したＨＣＭＶに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬの磁場における反応を示す図である。
【図６】各ＨＬＡ型とＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子断片を共導入した２９３Ｔ細胞を用いてＣＴＬを刺激してエリスポットアッセイを行った結果を示す図である。
【図７】各ドナー由来のＣＴＬによって認識された最短の長さのＨＣＭＶ−ｐｐ６５遺伝子断片を示す図である。
【図８】コンピューター・アルゴリズムを用いたＨＣＭＶに特異的なエピトープの同定結果を示す図である。
【図９】エピトープペプチドによるＣＴＬ株の誘導を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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