(57)【要約】【課題】高速且つ精度の高い遺伝子点変異解析方法を提供すること。【解決手段】完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブを、標的核酸とそれぞれプローブの種類ごとに接触させ、これらの間にハイブリッドを形成させ、ハイブリッドの結合強度の違いに基づいて変化し且つハイブリッドから発せられるシグナルを検出することにより標的核酸の配列情報を解析する方法において、標的核酸がＰＣＲにより調製され、ハイブリッドを形成する温度と当該シグナルを検出する温度とが異なり、各温度において、標的核酸を含む液体試料が、三次元的に液体を収容し得る微小な液体収容部を二次元的に複数配置してなるＤＮＡマイクロアレイの内外において流動させる。【選択図】　図４
2004028620.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列をＰＣＲにより増幅する工程、
標的核酸配列の少なくとも一部に対して完全に相補的な完全マッチプローブ、及び当該完全マッチプローブのうちの少なくとも一塩基が変異した不完全マッチプローブの１種以上を、三次元的に液体を収容し得る微小な液体収容部を二次元的に複数配置してなるＤＮＡマイクロアレイの当該液体収容部にそれぞれ配置する工程、
当該標的核酸を含む液体試料を当該ＤＮＡマイクロアレイの内外において流動させ、当該標的核酸と当該完全マッチプローブ及び当該不完全マッチプローブとの間にハイブリッドが形成される条件下で、当該標的核酸と完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブとを接触させる工程、並びに
当該ハイブリットの結合強度の違いに基づいて変化するシグナル強度を、非特異的ハイブリッドが解離し、特異的ハイブリッドは解離しない条件下で検出する工程、
を含むことを特徴とする遺伝子突然変異解析方法。
【請求項２】
前記ハイブリッド形成条件及び前記シグナル強度検出条件が、温度に関する条件である請求項１に記載の遺伝子突然変異解析方法。
【請求項３】
前記ハイブリッド形成の際の温度条件が、前記標的核酸と前記完全マッチプローブとの間のハイブリッドの二重鎖解離温度より低く、前記シグナル強度を検出する際の温度条件が、前記標的核酸と前記完全マッチプローブとの間のハイブリッドの二重鎖解離温度近傍である請求項２に記載の遺伝子突然変異解析方法。
【請求項４】
前記ハイブリッド形成が４５℃未満で行われ、前記シグナル強度検出が４５℃以上で行われるものである請求項２又は３に記載の遺伝子突然変異解析方法。
【請求項５】
前記ＰＣＲで増幅される標的核酸の塩基長が６０−１５０ｂｐである請求項１−４のいずれか１項に記載の遺伝子突然変異解析方法。
【請求項６】
前記標的核酸を、前記完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブとのハイブリッド形成反応前に、７０−１００℃で２−１０分間加熱し、その直後に５℃以下に冷却するものである請求項１−５のいずれか１項に記載の遺伝子突然変異解析方法。
【請求項７】
前記標的核酸と前記完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブとのハイブリッド形成反応を、０．１−６倍の塩濃度のＳＳＰＥ溶液中で行うものである請求項１−６のいずれか１項に記載の遺伝子突然変異解析方法。
【請求項８】
前記ハイブリッド形成反応における標的核酸濃度が、１０−５００ｎＭである請求項１−７のいずれか１項に記載の遺伝子突然変異解析方法。
【請求項９】
前記ＰＣＲで増幅される標的核酸が、ＰＣＲ増幅直後の未精製のものであり、４５℃未満でハイブリッド形成反応を行った後、シグナル強度検出前に４５℃以上で洗浄するものである請求項１−８のいずれか１項に記載の遺伝子突然変異解析方法。
【請求項１０】
前記シグナル強度を検出する工程の後に、前記標的核酸と前記完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブとのハイブリッドのシグナル強度の比率を決定する工程をさらに含むものである請求項１−９のいずれか１項に記載の遺伝子突然変異解析方法。
【請求項１１】
前記ＰＣＲが、蛍光標識されたプライマを利用するものである請求項１−１０のいずれか１項に記載の遺伝子突然変異解析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の突然変異を解析する方法に関し、より具体的には点突然変異または配列多型を解析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の突然変異情報の解析、疾病の予知や診断、ウイルスのタイピング等を行う遺伝子診断に関する技術が近年大幅に進歩している。例えば、正常な遺伝子配列又は既知の突然変異を有する遺伝子配列のそれぞれに相補的なＤＮＡプローブを予め用意しておき、ここに、変異の有無が不明である試料ＤＮＡを各種プローブにそれぞれ別個にハイブリダイズさせ、これらのハイブリッド量を検出・比較し、より多くハイブリダイズが行われるプローブの方がサンプルＤＮＡとの相補性が高いことを示すことに基づいて、試料ＤＮＡ中の変異の有無を判断する方法が、遺伝子診断法として行われている。
【０００３】
ハイブリッドの検出には、例えば試料ＤＮＡに検出可能な標識を施し、その標識を検出することで間接的にＤＮＡ量を検出する方法がとられている。一般にこのような標識には、蛍光や放射性同位体、化学発光等が用いられている。
【０００４】
また、このようなＤＮＡの持つ相補性を利用したハイブリダイズ反応をベースとし、数百個乃至数万個のＤＮＡプローブを格子状に２次元的に配列させ、試料溶液中のＤＮＡをこのアレイ上でハイブリダイズさせることで、複数の遺伝子の情報を一括して検出するＤＮＡマイクロアレイと呼ばれるシステムが普及し始めている。
【０００５】
ＤＮＡマイクロアレイにおいては複数の遺伝子の状態を同時に解析することが可能であり、通常は遺伝子の発現解析等に利用されることが多いが、遺伝子の突然変異やＳＮＰ（一塩基変異多型）の定性的な解析にも利用されはじめている。
【０００６】
ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子の突然変異等の定性的解析のための特に優れた手段を提供するものであるが、一塩基のみからなる変異を高速かつ感度よく検出することは、これまでのところ非常に困難であった。そのため、例えば特開２００１−５０９３１号公報においては、電気化学反応を利用したＤＮＡマイクロアレイにより反応を高速化する工夫がなされているが、電極が各アレイごとに設けられていることに起因して、マイクロアレイの構成が複雑なものになっている。
【０００７】
一塩基の変異検出の具体例としては更に、特表２０００−５１１４３４号公報が挙げられる。この方法は、塩基の変異に対応したプローブを用意し、その特異性を利用して変異を特定するものであるが、一塩基変異の差を確実に検出するために、ミスマッチヌクレオチドを含むプローブを利用している。これはパーフェクトマッチしたハイブリッドと一塩基が変異したプローブとのハイブリッドについてのＴｍ（二重鎖解離温度）の差よりも、一塩基が変異したプローブとのハイブリッドと二塩基が変異したプローブとのハイブリッドについてのＴｍの差の方が大きくなることを利用したものである。しかしこの方法においては、絶対的なハイブリダイズ強度が低下することに起因して、反応時間が長くなるという問題があり、更には感度の点でも問題がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従来のＤＮＡマイクロアレイにおいては、ハイブリダイズの反応は非常に遅く（通常は数時間乃至十数時間）、高速の検出を行うには、複雑な構成のチップを用いる必要があった。そのために装置や核酸の検出を行うチップが大型化し、製作コストの上昇につながっていた。また、特異性を上げて一塩基のみの変異を検出する場合には反応温度を上昇させる必要性があり、これに起因して反応時間の長時間化の問題と不十分な感度の問題が生じていた。
【０００９】
従来の方法は更に、二次元の基板表面へのプローブの固定化量に関して、各プローブスポット毎に無視できない程度のばらつきが存在するため、定量的な分析にＤＮＡマイクロアレイを利用することが困難であるという問題を内包している。即ち従来のＤＮＡマイクロアレイを使用する限りにおいては、試料中に正常な遺伝子と突然変異した遺伝子とが含まれている場合に、その混合比率を定量的に決定するということはできなかった。
【００１０】
特表２０００−５１５２５１号公報には、ＤＮＡマイクロアレイのこのような問題に鑑み、多孔質構造を有する金属酸化物を反応担体として利用し、一方の面から他方の面へと試料溶液を駆動させることにより、試料溶液の拡散速度を高めて反応を高速化させ、ハイブリダイズを高速かつ、精度よく行う方法が開示されている。
【００１１】
しかしながら、従来の二次元の基板表面にプローブを固定していたものと、上記のごとく多孔質構造を有する三次元構造を有する反応担体にプローブを固定していたものとでは、そもそも標的核酸とプローブとの間のハイブリダイズ反応の環境が大きく異なり、また、三次元構造を有する反応担体中に溶液を流動させながら検出を行うことから、反応条件の設定はより複雑になると考えられる。更に、一塩基のみの変異を精度良く定量的に検出するためには、各種反応条件を詳細に検討する必要があるが、反応担体の構造の差異及び溶液を流動させることとあいまって、その条件設定については全くもって不明である。反応条件の設定についての具体的指針に関し、従来技術は何ら教示も示唆もしていない。
【００１２】
たとえば標的ＤＮＡの全体の長さに対して一塩基のみしか変異していない核酸を検出しようとする場合には、プローブと標的ＤＮＡの相補性に関して測定可能な程度の差が大きくなく、ハイブリダイズの程度に実質的な差が生じないことが予想される。そのため、突然変異を検出することが非常に困難であると考えられる。仮にこの一塩基のみの差を精度よく検出しようとする場合には、ある最適な温度でハイブリダイズを行わせることとなるが、検出しようとする核酸は、正常な核酸と比較して一塩基のみしか異なっていないために、両者を区別してハイブリッドを形成させるためには非常に長時間のハイブリダイズ時間が必要であると考えられる。この問題に対処すべく、塩基長が短いものを利用して塩基長全体に対する変異の割合を高めることも考えられるが、配列が短すぎると、標的ＤＮＡに非特異的にハイブリダイズする量が増えてしまい、今度は精度の高い検出が行えなくなるというジレンマが生じる。したがって従来の方法においては、一塩基のみの変異の検出において、精度の良さと、高速性とを同時に満たすことは困難であると考えられる。
【００１３】
また上記のごとく三次元構造である多孔質構造を有する反応担体にプローブを固定したものを利用する場合、液体試料を当該三次元構造を有する反応担体中で流動させると、標的核酸とプローブとの間の反応条件の更なる調整が必要となるであろう。
【００１４】
上記の特表２０００−５１５２５１号公報においては、三次元構造である多孔質構造を有する反応担体を利用したＤＮＡマイクロアレイが開示されているが、これを利用して行うハイブリダイズ反応の条件については、わずかな例しか挙げられていない。核酸試料として挙げられている例としては、長さが１４５塩基のＲＮＡ遺伝子（ＨＩＶ−１）のみであり、ハイブリダイゼーションもリン酸緩衝液中において室温で行われるに過ぎず、三次元構造である多孔質構造を有する反応担体を利用して遺伝子の一塩基の突然変異を解析する場合のハイブリダイズ反応条件が十分に開示されているとは言えない。
【００１５】
従って本発明は、遺伝子突然変異、特に一塩基のみの変異の検出を、三次元的に液体を収容し得る微小な液体収容部を二次元的に複数配置してなるＤＮＡマイクロアレイの利用により、高速且つ精度良く行う方法を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは上記の問題に鑑み鋭意研究を行った結果、点変異の検出や配列多形を検出するのに最適な、遺伝子の突然変異を解析する方法を完成させた。
【００１７】
即ち本願発明は、標的核酸配列をＰＣＲにより増幅する工程、標的核酸配列の少なくとも一部に対して完全に相補的な完全マッチプローブ、及び当該完全マッチプローブのうちの少なくとも一塩基が変異した不完全マッチプローブの１種以上を、三次元的に液体を収容し得る微小な液体収容部を二次元的に複数配置してなるＤＮＡマイクロアレイの当該液体収容部にそれぞれ配置する工程、当該標的核酸を含む液体試料を当該ＤＮＡマイクロアレイの内外において流動させ、当該標的核酸と当該完全マッチプローブ及び当該不完全マッチプローブとの間にハイブリッドが形成される条件下で、当該標的核酸と完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブとを接触させる工程、並びに当該ハイブリットの結合強度の違いに基づいて変化するシグナル強度を、非特異的ハイブリッドが解離し、特異的ハイブリッドは解離しない条件下で検出する工程、を含むことを特徴とするものである。
【００１８】
本発明の遺伝子突然変異解析方法において、前記ハイブリッド形成条件及び前記シグナル強度検出条件は、温度に関する条件であることが好ましく、更には前記ハイブリッド形成の際の温度条件は、前記標的核酸と前記完全マッチプローブとの間のハイブリッドの二重鎖解離温度より低く、前記シグナル強度を検出する際の温度条件は、前記標的核酸と前記完全マッチプローブとの間のハイブリッドの二重鎖解離温度近傍であることが好ましい。また、前記ハイブリッド形成は４５℃未満で行われ、前記シグナル強度検出は４５℃以上で行われるものであることが好ましい。
【００１９】
本発明の遺伝子突然変異解析方法において、前記ＰＣＲで増幅される標的核酸の塩基長は６０−１５０ｂｐであることが好ましく、更には、前記標的核酸を、前記完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブとのハイブリッド形成反応前に、７０−１００℃で２−１０分間加熱し、その直後に５℃以下に冷却するものであることが好ましい。
【００２０】
本発明の遺伝子突然変異解析方法において、前記標的核酸と前記完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブとのハイブリッド形成反応は、０．１−６倍の塩濃度のＳＳＰＥ溶液中で行われるものであることが好ましく、更に前記ハイブリッド形成反応における標的核酸濃度は、１０−５００ｎＭであることが好ましい。
【００２１】
本発明の遺伝子突然変異解析方法において、前記ＰＣＲで増幅される標的核酸は、ＰＣＲ増幅直後の未精製のものであり、４５℃未満でハイブリッド形成反応を行った後、シグナル強度検出前に４５℃以上で洗浄するものであってもよい。
【００２２】
本発明の遺伝子突然変異解析方法において、前記シグナル強度を検出する工程の後に、前記標的核酸と前記完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブとのハイブリッドのシグナル強度の比率を決定する工程をさらに含むことができる。
【００２３】
本発明の遺伝子突然変異解析方法において、前記のＰＣＲは、蛍光標識されたプライマを利用することが好ましい。
【００２４】
【発明の実施の形態】
（定義）
本願明細書においては、以下の用語を以下に定義した意味において用いる。
「核酸」とは、ＤＮＡ、及び人工的ヌクレオチドを含むＤＮＡの何れをも意味する。
「ハイブリッド」とは、上記の核酸の何れかの間に形成される二重鎖を意味する。
「シグナル」とは、適当な手段により適宜検出・測定可能な信号であって、蛍光、放射能、化学発光等が含まれる。
【００２５】
以下においては、本発明の実施態様についての、構成、実施方法、効果等について説明する。
本発明の遺伝子突然変異解析方法は、標的核酸配列をＰＣＲにより増幅する工程、標的核酸配列の少なくとも一部に対して完全に相補的な完全マッチプローブ、及び当該完全マッチプローブのうちの少なくとも一塩基が変異した不完全マッチプローブの１種以上を、三次元的に液体を収容し得る微小な液体収容部を二次元的に複数配置してなるＤＮＡマイクロアレイの当該液体収容部にそれぞれ配置する工程、当該標的核酸を含む液体試料を当該ＤＮＡマイクロアレイの内外において流動させ、当該標的核酸と当該完全マッチプローブ及び当該不完全マッチプローブとの間にハイブリッドが形成される条件下で、当該標的核酸と完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブとを接触させる工程、並びに当該ハイブリットの結合強度の違いに基づいて変化するシグナル強度を、非特異的ハイブリッドが解離し、特異的ハイブリッドは解離しない条件下で検出する工程、を含むことを特徴とする。
【００２６】
本願発明において使用する標的核酸は、ＰＣＲにより調製される。ＰＣＲ産物を標的核酸として利用する場合には、標的核酸の量の増大を通じて本願発明の遺伝子突然変異解析方法における検出感度が上昇すること、そして標的核酸を増幅するために使用するプライマ中に予め蛍光標識等を導入しておくことを通じて簡便に標識化できるという利点がある。ＰＣＲ産物に標識を導入する方法としては、プライマに予め蛍光標識を導入しておく方法以外に、ヌクレオチドに蛍光標識が付与されたものをＰＣＲにおいて使用し、鎖伸長中に標識をランダムに導入する方法も含まれる。
【００２７】
本願発明において使用するプローブは、完全マッチプローブと不完全マッチプローブとの二種類である。完全マッチプローブは、標的核酸の少なくとも一部の配列であって、連続する塩基配列全体に対し相補的である配列のみからなるものである。一方不完全マッチプローブは、本願においては完全マッチプローブの配列のうちの一塩基のみが変異した複数のプローブであり、その配列中における変異部位が同一箇所に有り、且つそれぞれの変異塩基が、Ａ、Ｔ、Ｇ、若しくはＣ、またはこれらの何れかに対応する非天然型のヌクレオチドのどれかであり、完全マッチプローブとあわせて４つ一組のものであることが好ましい。更に変異部位は、該同一箇所とは異なる箇所において一塩基のみが変異したプローブとすることも可能である。
【００２８】
本発明の実施例におけるプローブの最適な長さは、Ｔｍ値を計算した結果、２１ｍｅｒとなり、変異の位置は、例えば２１ｍｅｒの中央に一塩基変異となるように設定する。なお、実施例では、一塩基置換の変異として説明しているが、固相化オリゴのプローブの種類によっては、それ以上の変異位置を設定し、複数の変異も検出することができる。
【００２９】
標的核酸と各プローブとの間の接触（ハイブリダイズ反応）は、他の核酸との間の二重鎖形成を阻害しないようにして核酸を固定することが可能な担体上に固定化されたプローブに対して、標的核酸を含む溶液を接触することにより行われる。本願におけるプローブは、三次元的に液体を収容し得る微小な液体収容部（多孔質体）が二次元的に複数配置されたＤＮＡマイクロアレイ中の各液体収容部に固定化されている。そして液体試料をこの多孔質性ＤＮＡマイクロアレイの内外において流動することにより、プローブと標的核酸との接触が行われる。
【００３０】
本願発明の遺伝子突然変異解析方法において使用できるＤＮＡマイクロアレイは、三次元的に液体を収容し得る微小な液体収容部（多孔質体）が二次元的に複数配置されたＤＮＡマイクロアレイであれば特に限定されるものではないが、液体収容部の材質の例としては、酸化アルミニウムが挙げられる。ここで、液体収容部は、プローブを固定するための最小単位であり、プローブスポットともよばれる。
【００３１】
マイクロアレイは、通常スライドチップ上に形成されているが、その大きさは、通常は０．５−２０．０ｃｍ　Ｘ　０．５−２０．０ｃｍ　Ｘ　０．０１−１．０ｃｍの範囲である。また、マイクロアレイの大きさは、通常は３．０ｍｍ２−１６ｃｍ２の範囲にある。更に、プローブスポットは、略円形、略矩形、又は多角形とすることができ、その直径又は一辺の長さは、通常、数百μｍ程度である。また、１マイクロアレイ中のプローブスポットの数は、１０−１０００の範囲にあることが通常である。実験条件に応じて、ここに定義した範囲以外の規格のＤＮＡマイクロアレイを使用することも勿論可能である。
【００３２】
標的核酸とプローブとの接触は、ハイブリッド形成が促進される条件、即ち当該標的核酸と当該完全マッチプローブ及び当該不完全マッチプローブとの間にハイブリッドが形成される条件下で行う。具体的に当該ハイブリッド形成が促進される条件は、温度についての条件であることが好ましく、更に好ましくは、標的核酸と完全マッチプローブとの間のハイブリッドの二重鎖解離温度（Ｔｍ）より低い温度である。本願発明においては、当該ハイブリッド形成を促進する温度は、概して４５℃未満である。このような温度では、標的核酸とプローブとの間の特異的な結合のみならず非特異的な結合も生じる。しかしながら両者間のハイブリダイズが促進され、反応時間の短縮化に寄与する。
【００３３】
ハイブリッドが形成された後、結合強度の違いに基づいて変化するシグナル強度を検出する。ハイブリッドの検出は、先のハイブリッド形成時の非特異的な結合を解消し、特異的に結合したハイブリッドのみを検出する条件で行う。具体的にはハイブリッドの検出条件は、温度についての条件であることが好ましく、更に好ましくは標的核酸と完全マッチプローブとの間のハイブリッドの二重鎖解離温度近傍の温度である。本発明において、ハイブリッドを検出する温度は、概して４５℃以上である。このような温度においては完全マッチプローブプローブと標的核酸との間のハイブリッドのみが選択的に検出される。
【００３４】
形成されるハイブリッドの結合強度は、温度のみならず、他の種々の条件、例えば反応溶液の組成（塩濃度やｐＨ）、反応溶液の種類（水溶液やアルコール溶液）にも依存して変化する。従って本願発明においてはその他の反応条件を変化させることにより、ハイブリッド反応の制御を行うことも可能である。
【００３５】
本発明の遺伝子突然変異解析方法においては、標的核酸であるＰＣＲ産物は、その長さが、６０乃至１５０塩基対であることが好ましい。最も好ましくは、ＰＣＲ産物の長さは１００塩基対程度である。本発明の標的核酸をＰＣＲで調製する際に５’及び３’の両プライマをそれぞれ２０ｍｅｒとし、ハイブリダイズさせる配列長は少なくとも２０ｍｅｒ必要であることから、標的核酸の長さを６０塩基対よりも短くすることは困難であり、また、１５０塩基対よりも長く場合すると、完全マッチプローブが形成するハイブリッドと不完全マッチプローブが形成するハイブリッドからのシグナル強度に差が出にくくなるために好ましくなく、従って上記の６０乃至１５０塩基対の範囲が好ましい。
【００３６】
本発明の遺伝子突然変異解析方法においては、標的核酸のＰＣＲ産物は、７０乃至１００℃で２乃至１０分間加熱して変性させ、その直後に５℃以下の温度に２乃至１０分間冷却することが好ましい。より好ましくは、９５℃以上の温度で１０分間変性させ、その直後に氷水中で１０分間急冷する。この条件から外れた範囲においては標的核酸の二本鎖が形成されやすく、ハイブリッドの検出においてシグナル強度が減少するため、上記の範囲が好ましい。
【００３７】
本発明の遺伝子突然変異解析方法において、標的核酸とプローブとの間のハイブリダイズ反応は、０．１乃至６倍の塩濃度のＳＳＰＥ溶液中で行うことが好ましい。ここでＳＳＰＥ溶液（２０倍）の組成は、３．０Ｍ　塩化ナトリウム、０．２Ｍ　リン酸ナトリウム、０．０２Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である。ＳＳＰＥ溶液の塩濃度については、より高い塩濃度の方がシグナル強度の増大に寄与するが、濃度が６倍を越えるとその増加率は減少する。また、塩濃度が小さい方がハイブリッド形成の特異性が上昇したが、その分、ハイブリッド形成のための時間が長期化する。従来の二次元の基板表面へ固定されたプローブを利用する場合には、塩濃度は１倍程度のものが低塩濃度側の限界であったが、本願発明においては、三次元構造を有する反応担体中を試料溶液を流動させるために感度の上昇が得られ、結果として、通常よりも低い塩濃度（０．１倍乃至１倍未満）でもハイブリッドを形成させて検出することが可能となる。これは、特異性上昇の観点において、従来技術と比較したときの利点を提供する。しかしながら、シグナル強度の点においては、塩濃度は、６Ｘ程度であることが好ましい。
【００３８】
本発明の遺伝子突然変異解析方法においては、ハイブリダイズ反応は４５℃未満の温度で行われる第一ステップと、４５℃以上の温度で行われる第二ステップとを含むことが好ましい。第一ステップでは、長さが６０乃至１５０塩基の標的核酸のＴｍ値よりも十分に低い４５℃未満の温度で、標的核酸と各種プローブとのハイブリッド形成が行われる。この温度においては、非特異的なハイブリッド形成も生じるが、その分、ハイブリッド形成に必要な時間の短縮につながる。一方、第二ステップは４５℃以上の温度で実施されるが、標的核酸と、使用するプローブから選択した一のプローブとの間のＴｍ値近傍の温度において実施されることが好ましい。このＴｍ値近傍の温度においては、標的核酸と完全にマッチするプローブが標的核酸と特異的にハイブリダイズするのに最適であり、よって非特異的な結合を含むハイブリッドは、この温度において次第に解離することとなる。第一ステップと第二ステップとを経ることで、反応時間の短縮と選択性（精度）の上昇が得られる。これは、精度の良さと高速性とを両立することが困難であった従来技術のＤＮＡマイクロアレイを利用した遺伝子解析方法に対する利点を提供する。
【００３９】
本発明の遺伝子突然変異解析方法においては、ハイブリダイズ反応における標的核酸の濃度が、１０乃至５００ｎＭであることが好ましい。標的核酸の濃度は、より高いほうが検出感度の上昇につながることから好ましいと考えられるが、５００ｎＭを越えるとバックグラウンドが上昇するために好ましくなく、また、１０ｎＭ未満では十分な感度が得られない。最も好ましくは、標的核酸の濃度は１００ｎＭ程度である。
【００４０】
本発明の遺伝子突然変異解析方法においては、ＰＣＲ産物はその増幅後の未精製のものを用いることができる。そのような場合には４５℃未満の温度でのハイブリダイズ反応の後に、４５℃以上の温度で洗浄する工程を含むことが好ましい。本発明の好ましい態様においては、標的核酸は、標識されたプライマで増幅されたＰＣＲ産物であるが、斯かるＰＣＲ反応の直後においては、未反応の標識化プライマが反応溶液中に存在している。この未反応プローブは、標的核酸から分離されない場合にはシグナル検出におけるバックグラウンドとして検出される可能性があるために、通常はカラムを利用するなどしてハイブリダイズ反応前に除去しておくことが必要であるが、本願発明の場合には、三次元構造を有する反応担体（多孔質）の内外で試料を流動させるため、一定の反応時間後に試料溶液を反応担体から外に流動させ、再び反応担体へ流入しないように担体外部に保持すれば、未反応プライマによるバックグラウンドは生じない。従って、ＰＣＲ産物を標的核酸として利用する本発明においては、ＰＣＲ後に増幅核酸を未反応プライマから分離する必要がなく、遺伝子解析自体にかかる時間を短縮できるという点で、従来技術の遺伝子解析方法と比較した利点を提供する。
【００４１】
本発明の遺伝子突然変異解析方法の一の態様においては、シグナルを検出する工程の後に、各プローブについてのシグナル強度の比率を決定する工程を更に含めることができる。このシグナル強度の比率は、各プローブと、これに相補的な標的核酸との間に形成されたハイブリッドの量比に対応するため、各プローブについてのシグナル強度の比率を求めることにより、標的核酸中の変異の存在比率を求めることができる。このように標的核酸中の変異の存在比率を求めることができるのは、本願発明で利用する、三次元的に液体を収容し得る微小な液体収容部を二次元的に複数配置してなるＤＮＡマイクロアレイに対して、プローブを定量的に固定化できることに起因している。これは、二次元の基板表面へ定量的にプローブを固定化できないために定量的な実験に利用できなかった従来のＤＮＡマイクロアレイに対する利点を提供する。
【００４２】
本願発明の遺伝子突然変異解析方法においては、ＰＣＲが、蛍光標識されたプライマを利用して行われたものであることが好ましい。蛍光標識されたプライマとしては、プライマの末端に標識が付与されたものが、調製の手間及び費用の点で好ましい。
【００４３】
本願発明の遺伝子の突然変異検出方法は、図１に概略が記載される装置を使用して行うことができる。この装置１は、そこにおいてサンプルを反応させるためのＤＮＡマイクロアレイ２２（図２に示す）における事象を顕微鏡的に観察するための顕微鏡３と、ＤＮＡマイクロアレイ２２を有したスライドチップ２を支持するために前記顕微鏡３に具備されるステージ４と、前記顕微鏡３により観察されたＤＮＡマイクロアレイ２２における蛍光画像を撮像するためのＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｄｅｖｉｃｅ）カメラ５と、前記顕微鏡３により観察される視野を変更するために前記ステージ４に接続されるモータドライバ６を制御するＸＹステージコントローラ７と、前記ＤＮＡマイクロアレイ２２に接続されたジョイント部を介して流体を輸送するポンプドライバ８と、前記ＤＮＡマイクロアレイ２２に接触して配置されるヒーター部を介して該ＤＮＡマイクロアレイ２２の温度を調節する温度コントローラ９と、更に、前記遺伝子検査装置１に含まれる全てのデバイスに接続され且つそれらを総括して制御するコンピュータ１０、入力デバイス１５、モニター１６とを具備する。
【００４４】
図には示していないが、ここで前記ジョイント部は、ＤＮＡマイクロアレイ２２に含まれる液体を外部に漏出しないような様式で、ＤＮＡマイクロアレイ２２に接続される。更に該ジョイント部の他端はチューブを介して、ポンプドライバ８に接続され、更にポンプドライバ８は、その内部に所望の試薬等を含む試薬保持部に接続される。前記ポンプドライバ８は解析プログラムに従ってコンピュータ１０の指示により前記ＤＮＡマイクロアレイ２２に対する流体の出し入れを実行する。
【００４５】
同様に、図には示していないが、前記ヒーター部は、スライドチップ２とステージ４の間に配置される。また、前記ヒーター部は、温度コントローラー９に接続されてコンピュータ１０の指示に従ってコントロール９によって温度が調節される。
【００４６】
前記コンピュータ１０は、一般的なコンピュータに具備される構成要素を含む。
【００４７】
また、ＣＣＤカメラ５により撮像された情報は、画像処理部に送られ、メモリに記憶される解析プログラムに従いＣＰＵの指示に従って画像処理部で処理されて蛍光強度として数値化される。
【００４８】
本発明で使用できる顕微鏡は、一般的に使用される蛍光顕微鏡であり、具体的にはオリンパス社蛍光顕微鏡ＡＸ−７０またはＢＸ−４２ＴＦＲ等である。
【００４９】
本発明で使用できるＣＣＤカメラは一般的に使用されるＣＣＤカメラであり、一般的なデジタルカメラ、例えば、コダック社のＭｅｇａＰｌｕｓ　ＣＣＤカメラ、フォトメトリック社のＣｏｏｌ　Ｐｉｘカメラ等を使用することができる。
【００５０】
また、ここで該ＤＮＡマイクロアレイ２２の温度を調節するための温度調節部は、該ＤＮＡマイクロアレイ２２を具備するスライドチップ２に接触して熱を伝えるための加熱体（例えば、電熱ヒーター、電磁ヒーター、ウォーターバス、エアーバスおよびペルチエ素子等）、そこにおける温度を感知するセンサ、およびコンピュータの制御と前記センサからの情報に従って加熱体における加熱を制御する温度コントローラを含んでいる。
【００５１】
またステージ４は、ＸＹステージコントローラ７によるか、またはＣＣＤカメラ５自身によって、或いはＣＣＤカメラ５とマイクロアレイ２２を繋ぐ光路を変更させるような種々のスキャニング機構を用いて、視野の変更が行われる。
【００５２】
ＤＮＡマイクロアレイ２２は、図２（Ａ）および（Ｂ）にその概略が示されるものを使用した。図２（Ａ）は、そこにおいて反応を行うＤＮＡマイクロアレイ２２を４つ具備するスライドチップ２の平面図である。図２（Ｂ）は、スライドチップ２の断面図である。
【００５３】
図２（Ｂ）から明かであるように、スライドチップ２は、多孔からなるマイクロチャネル２４を具備するフィルタ１９と、フィルタ１９を支持するための支持板２０とを具備する。支持板２０は、２つの部材からなり、２つの部材がフィルタ１９を挟み込みスライドチップ２を構成する。図２（Ｂ）に従うと、フィルタ１９の上下に位置する支持板部材には、対面する各位置に、ＤＮＡマイクロアレイ２２を規定するための開口部２１が形成されている。
【００５４】
また、図２（Ｂ）に示されるように、フィルタ１９は、４つのＤＮＡマイクロアレイ２２の全てを含む大きな面積に亘って、二次元的に平坦に２つの支持板２０の間に位置する。また、支持板２０は、好ましくは遮光性のある部材により構成され、より好ましくは暗黒色の部材により構成される。好ましくは、２つの支持板２０は、フィルタ１９を間に挟んだ状態で接合される。
【００５５】
フィルタ１９の材質は、そこにおいて実施され得る温度制御の範囲内で壊れなければ、何れの任意の材質であってもよい。
【００５６】
ＤＮＡマイクロアレイ２２は、支持板２０に形成された開口部２１から露出するフィルタ１９の部分をいう。フィルタ１９は複数の多孔質構造を有する。その各々の多孔質構造をマイクロチャネル２４と称する。各マイクロチャネル２４は、フィルタ１９の厚み方向に平行して、且つその厚みを通して連通する微細な多孔質構造である。また、フィルタ１９の全てのマイクロチャネル２４はほぼ等間隔に配置される。
【００５７】
ここで、フィルタ１９の厚みを一定にし、更に、具備される全てのマイクロチャネル２４の形状がなるべく等しくなるようにフィルタ１９を製造すれば、何れのマイクロチャネル２４もほぼ均等な容積を具備するものとなる。またここで、フィルタ１９の厚みを充分に薄くし、マイクロチャネル２４の口径も充分に小さいサイズとすれば、所要量のサンプルおよび／または試薬を多数のマイクロチャネルに分配して収容させることができるので、反応面積を増大しながら二次元的な画像測定も容易に行える。従って、該フィルタの１表面の特定面積当たりに、所望量の液体を収容するのに必要な個数のマイクロチャネルを作成し、その所定の面積に対してサンプルおよび／または試薬を供給すればフィルタ１９のマイクロチャネル内で安定した分析を実行することができる。例えば、フィルタ１９の片方ないし両方の面を制御された所望温度の気体と接触させることによって、各マイクロチャネル内の液体を直接的に昇温および降温操作できる。これに対して、１本の細長い管状キャピラリからなる反応容器において反応を行う場合、そこに所定量のサンプルおよび／または試薬を収容し分析を行う際に、温度制御を充分に行うためには、なるべく伝熱性の高い材質を選択する必要があり、且つ良好な光測定のためには、なるべく該キャピラリの壁面が平坦な側壁形状である必要がある。
【００５８】
更に、スライドチップ２の直ぐ上部に示す拡大図（Ｃ）に示される通り、各ＤＮＡマイクロアレイ２２には、複数のプローブスポット２３が具備される。
【００５９】
プローブスポット２３は、その直ぐ上部に示される更なる拡大図（Ｄ）に示される通り、複数のマイクロチャネル２４からなる特定の領域を示すものである。拡大図（Ｄ）では、便宜上、プローブスポット２３に含まれるマイクロチャネル２４を黒丸で示した。通常、プローブスポット２３は、支持板２０から露出されたフィルタ１９に存在するマイクロチャネル２４のうち、そこにおいて１種類のプローブを固定するための最小単位と見なすことができる。即ち、プローブの固定は、プローブスポット２３に含まれるマイクロチャネル２４の内壁面に対してのみ行えばよい。言い換えれば、その内壁面にプローブが固定されているマイクロチャネル２４からなる領域がプローブスポット２３である。
【００６０】
図２（Ｃ）および（Ｄ）では略円形の領域が示されているが、プローブスポット２３の輪郭は、略円形、略矩形または多角形であってもよい。
【００６１】
所望に応じて、複数のプローブスポット２３に対して同じプローブを固定してもよい。また、マイクロチャネルの内壁に表面処理を施し、流体への摩擦抵抗やプローブ等の試薬の吸着性を調節してもよい。
【００６２】
本スライドチップの大きさは０．５−２０．０ｃｍＸ０．５−２０．０ｃｍＸ０．０１−１．０ｃｍ、好ましくは１．０−１０．０ｃｍＸ１．０−１０．０ｃｍＸ０．０５−０．５ｃｍある。特に好ましくは、３．０−８．０ｃｍＸ３．０−８．０ｃｍＸ０．０５−０．２ｃｍである。実際の作成したスライドチップの１例は約７．５ｃｍＸ約２．５ｃｍＸ約０．１ｃｍである。
【００６３】
本マイクロアレイは、３．０ｍｍ２−１６ｃｍ２、好ましくは１２．０−４００ｍｍ２、特に好ましくは２０．０−１００．０ｍｍ２であり、実際に作成したスライドチップ上の円形なマイクロアレイは直径約６ｍｍ（約２８．３ｍｍ２）である。
【００６４】
本ＤＮＡマイクロアレイに含まれるプローブスポットは直径１００−３００μｍであり、好ましくは１２０μｍであり、１ＤＮＡマイクロアレイ当たり１０−１０００、好ましくは４００のプローブスポットが具備される。更に１つのプローブスポット当たり１００−１０００本、好ましくは１０００本のマイクロチャネルが具備され、その直径は、０．０５−０．６μｍ、好ましくは０．２μｍである。以下に説明する核酸プローブは、プローブスポット毎に異なる種類のプローブを固定することも可能である。
【００６５】
本発明において使用するのに好ましいＤＮＡマイクロアレイの例は、特表２０００−５１５２５１号に記載のデバイス（即ち、ワットマン社Ａｎｏｔｅｃｈフィルター）、特表平９−５０４８６４に記載の微細加工フロースルー多孔性装置であってよい。
【００６６】
また、図２にはＤＮＡマイクロアレイ２２を４つ具備するスライドチップ２を示したが、４以上としてもそれ以下としてもよい。４つのＤＮＡマイクロアレイ２２を具備するスライドチップ２を使用した場合、夫々のＤＮＡマイクロアレイ毎に異なる検体について検査してもよい。
【００６７】
また、アレイ１個当たりに含まれるマイクロチャネル２２の本数、配置密度、配置パターン、口径等の大きさは、適宜変更でき、１チャネルの形状および／口径を、長さ方向の異なる箇所間で異ならせてもよい。
【００６８】
上述した態様では、フィルタ１９の外観は、２次元的な広がりを有した平面を有し、且つ該平面に垂直な方向に一定の厚みを有した肉薄（例えば１ｍｍ以下、好ましくは０．０５−０．７ｍｍ）扁平な部材であるが、詳細には、その扁平な部材に対して貫通しその両端が開放されたキャピラリが密に並列されて一体化された形態を有するものである。しかしながら、本発明に従って使用されるフィルタはこのような形状に限られるものではない。例えば、該キャピラリが、所望の角度で直線的に貫通していてもよく、或いは非直線的（即ち、曲線状の）孔として配置されてもよい。また、ＤＮＡマイクロアレイ毎またはプローブスポット毎に、該キャピラリの該扁平部材への角度が異なっていてもよく、曲線または直線の選択がなされてもよい。
【００６９】
【実施例】
（実施例１）
三次元構造を有する多孔質体にプローブを固定したチップ（特表２０００−５１５２５１号）を使用し、遺伝子ｐ５３の変異についての解析を行った。
【００７０】
（実験方法）
ヒトリンパ芽球細胞ＴＫ６（野生型ｐ５３）とＷＴＫ１（変異型ｐ５３）細胞から、当該技術分野において既知の方法（ＤＮＡの抽出「遺伝子解析の基礎」第二巻、秀潤社）によりゲノムＤＮＡを分離し、ＰＣＲにより標的核酸の増幅を行った。ＰＣＲは、９８ｍｅｒのプライマ（５’末端側にＦＩＴＣを標識したもの：０．２μＭ）を使用し、９４℃で５分間加熱した後、９４℃３０秒、６１℃３０秒、及び７２℃３０秒からなる温度サイクルを４０サイクル行い、７２℃５分の加熱後に４℃にした。ＰＣＲ産物は、カラムにより精製し、その精製度をアガロース電気泳動により確認した。プローブには、ｐ５３遺伝子の点変異部分を挟み、５’側と３’側にそれぞれ１０塩基が付加された２１ｍｅｒの完全マッチプローブ（配列番号：１）と、これに対応する不完全マッチプローブ３種類（配列番号：２−４）（これら４つのプローブは、ｐ５３の点変異部位に対応する塩基がそれぞれＡ／Ｔ／Ｇ／Ｃの何れかとなっている）を用いた。ＰＣＲにより調製した標的核酸は、９５℃以上の温度で１０分間加熱し、その直後に氷水中で１０分間冷却した。これに最終塩濃度が６ＸＳＳＰＥとなるように２０ＸＳＳＰＥ溶液を添加し、ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーションの条件は以下の通りであった。
ＰＣＲ産物の反応液濃度・量：　１００ｎＭ（５０μｌ／ウェル）
標的核酸の量：１００−２００ｎｇ
反応溶液の組成：６ＸＳＳＰＥ
反応温度：室温（約２５℃）でのハイブリダイゼーションを６０サイクル（約１時間）行った後、５２℃に温度を上昇させ、その温度でハイブリダイゼーションを３サイクル行った
サンプル混合比（ＴＫ６：ＷＴＫ１）：１０：０、８：２、及び５：５の３種類
【００７１】
（結果）
解析結果を図３に示した。ＴＫ６：ＷＴＫ１が１０：０である試料のハイブリダイゼーション（図３の１）においては、パーフェクトマッチのスポットにおいて、他のミスマッチスポットに比較して、極めて高い輝度を発していることがわかる。また、ＴＫ６：ＷＴＫ１が５：５の割合であるハイブリダイゼーション（図３の２）においては、ＴＫ６とＷＴＫ１のパーフェクトマッチのスポットがそれぞれ９０−１００％の相対強度の輝度を発し、その輝度の比率は、混合比にほぼ一致した。更に、ＴＫ６：ＷＴＫ１を８：２で混合した試料のハイブリダイゼーションにおいては、ＷＴＫ１に対する完全マッチプローブにおいて、最高輝度を有するスポット（ＴＫ６に対する完全マッチプローブに対応）の５０％以上のハイブリ輝度が得られた（図３の３）。その他のプローブの輝度は、パーフェクトマッチスポットの約１／４であった。
以上より、最高輝度の約５０％のハイブリ輝度が得られた場合、その部分に対応するＰＣＲ産物が存在すると判断でき、そのスポットが変異に相当するスポットである場合、サンプル中に変異遺伝子が混在している可能性があると判断できる。また、その際に、正常遺伝子と変異遺伝子の混合比を予測することも可能である。
【００７２】
なお、標的核酸の長さ、反応溶液中における標的核酸の濃度、ハイブリダイゼーションにおける塩濃度、及び標的核酸の変性条件について検討したところ、次のような結果が得られた。
【００７３】
（標的核酸の長さ）
標的核酸の長さが、１７８ｂｐのものと、９８ｂｐのものとでハイブリッドのシグナル強度を比較した場合、９８ｂｐの方が強い輝度が得られた。したがって、本願発明においては、標的核酸の長さは１００ｂｐ程度が好ましいと考えられる。
【００７４】
（標的核酸の濃度）
反応溶液中の標的核酸の濃度を、１００ｎＭと５００ｎＭとで比較検討したところ、５００ｎＭの方が輝度は高かったが、同時にバックグラウンドも高かった。また、１０ｎＭ乃至１００ｎＭの範囲でも検討したが、概して輝度は低かった。従って、本発明の場合には、ハイブリダイゼーション反応溶液中における標的核酸の濃度は、１００ｎＭ程度が好ましいと考えられる。
【００７５】
（ハイブリダイゼーションにおける塩濃度）
ハイブリダイゼーション反応は、ＳＳＰＥの濃度を、０．６Ｘ、２．０Ｘ、４．０Ｘ、６．０Ｘ、及び８．０Ｘにして行ったが、０．６Ｘから６．０Ｘまでは塩濃度の増加に伴ってシグナルの強度も増大し、それ以上は増大しなくなった。従って本願発明の場合には、輝度を高める観点からは６．０Ｘの塩濃度であることが好ましいと考えられる。
【００７６】
（標的核酸の変性条件）
標的核酸を９５℃で１０分間変性させた後、試料を次に何れかの条件においた。
１．変性後直ちにハイブリダイゼーションを行う；
２．変性後、氷水中で２分間急冷してからハイブリダイゼーションを行う；
３．変性後、氷水中で１０分間急冷してからハイブリダイゼーションを行う。
上記の３．の場合に最も強いシグナル強度が得られた。従って、本発明においては、標的核酸を９５℃以上の温度で１０分間程度変性し、その直後に氷水中で１０分間程度冷却することが好ましいと考えられる。
【００７７】
（実施例２）
（実験方法）
実施例１と同様の試料、及び装置を利用し、ＴＫ６及びＷＴＫ１をそれぞれ、別個のマイクロアレイ上でハイブリッド形成反応に供した後、４５℃で、液体試料の流動を３サイクル行い、その次に５２℃で液体試料の流動を３サイクル行い、それぞれの温度においてハイブリッドの検出を行った。
【００７８】
（結果）
図４の１−３に結果を示す。図４の３は、マイクロアレイ上のプローブの配置を示す。図４の１及び２より明らかな通り、室温でのハイブリッド形成時、及び４５℃でのハイブリッド検出時においては、ともにミスマッチを含むハイブリッドも検出されたが、温度を５２℃に上昇させることにより、ミスマッチを含むハイブリッドからの輝度が顕著に減少し、完全にマッチするハイブリッドが最も強く検出されている。
【００７９】
（実施例３）
（実験方法）
実験条件は、実施例１及び２と基本的に同一条件で行った。但し、標的核酸には、ＰＣＲによる増幅後に反応産物をカラムで精製していないものを使用した。また、ハイブリダイズ形成反応は、多孔質のマイクロアレイの内外に試料溶液を室温で６０サイクル流動させて行った。その後、６．０ＸのＳＳＰＥ緩衝液で１サイクルの流動を室温で行って、多孔質を洗浄した。温度を５２℃に上げて、６．０ＸのＳＳＰＥ緩衝液で６サイクルの流動をおこなって多孔質の洗浄を行った。
【００８０】
（結果）
結果は、図５に示す。図５Ａは、未精製のＰＣＲ産物を利用して行ったハイブリダイズの結果を示しているが、ここでは完全にマッチしているハイブリッド及びミスマッチを含むハイブリッドの何れにおいてもシグナルがかなりの強度で検出されている。図５Ｂは、室温で洗浄した時のものを示すが、ここでは、シグナル強度が全体的に減少している。図５Ｃは、５２℃での洗浄時のものを示すが、ここでは、完全にマッチしているハイブリッド（矢印で示す）のみが検出されている。
なお、実施例では、一塩基置換の変異として説明しているが、固相化オリゴのプローブの種類によっては、それ以上の変異位置を設定し、複数の変異も検出することができる。
【００８１】
以上のように、本発明においては、余剰量の試料溶液中に多孔質のマイクロアレイを浸漬したままの状態で反応させるよりも、所定量（例えば５０−２００μｌ）をマイクロアレイ中に供給・保持した後に、ポンプなどの気圧を利用して各マイクロチャンネルの内外を移動するように複数サイクル反復して流動させたほうが、顕著に反応が促進され、検出感度が高まるとともに、スループットが向上することが確認された、また、肉薄なアレイ領域から二次元的な画像解析のための情報を効率よく得ることができる。
【００８２】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、一塩基のみからなる変異であっても高速且つ高感度に検出することができる。
【００８３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】この図は、本発明の遺伝子の突然変異検出方法を実施するための装置の概略図である。
【図２】この図は、本発明において使用するＤＮＡマイクロアレイの構造を示したものである。
【図３】この図は、本願の実施例１の解析結果を示す図である。
【図４】この図は、本願の実施例２の解析結果を示す図である。
【図５】この図は、本願の実施例３の解析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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