(57)【要約】【課題】  抗血栓作用を有するペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物及びそれらをカラム精製して得られ得るカラム精製ペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物を提供する。【解決手段】  本発明は、豚肉を蛋白分解酵素で加水分解して得られ得る、平均分子量約１０００〜２５００（ゲル濾過法による）の抗血栓作用を有するペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物であり、更にそれらをカラム精製したペプチド又はそれを含有する畜肉精製物である。当該ペプチド及び畜肉加水分解物は、食経験の豊かな畜肉に由来することから安全性が高く、安心して摂取することができるという特長を有する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚肉を蛋白分解酵素で加水分解して得られ得る、平均分子量約１０００〜２５００（ゲル濾過法による）の抗血栓作用を有するペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物。
【請求項２】
請求項１記載のペプチド又は畜肉加水分解物をカラム精製して得られ得る、平均分子量約２３００（ゲル濾過法による）の抗血栓作用を有するペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物。
【請求項３】
豚肉を蛋白分解酵素で加水分解し、平均分子量約１０００〜２５００（ゲル濾過法による）の抗血栓作用を有するペプチド又はそれを含有する豚肉加水分解物を採取することからなる、抗血栓作用を有するペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物の製造方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法で得られたペプチド又は畜肉加水分解物をカラムに付して精製し、平均分子量約２３００（ゲル濾過法による）の抗血栓作用を有するペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物を得ることからなる、抗血栓作用を有するペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血栓作用を有するペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物に関し、より詳細には豚肉を蛋白分解酵素で加水分解して得られ得る平均分子量約１０００〜２５００（ゲル濾過法による、以下同様）の抗血栓作用を有するペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物及びそれらのカラム精製物である精製ペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食事の欧米化により、動脈硬化、これにより起こる心筋梗塞や脳梗塞による死亡や後遺症が大きな問題となっている。これらは、高脂肪の食品を摂ることによる血管への脂肪の蓄積により血管が細くなった状況で、凝集した血小板が詰まることによるといわれている。
このような障害の予防・治療として、血小板の凝集を阻害することは有効であり、係る治療法としてアスピリンの少量投与治療が行われている。
このアスピリンの作用は、血小板にあるプロスタグランジンの合成経路上の酵素シクロオキシゲナーゼを阻害することによっている。このシクロオキシゲナーゼの阻害はその産物である血管の収縮や血小板の凝集に働くトロンボキサンA2の産生抑制につながる。
アスピリンを少量投与するのは、大量に投与すると、血小板のシクロオキシゲナーゼよりも阻害されにくく、血管拡張や凝集阻害に働くプロスタグランジンＩ2を産生する血管内皮細胞内のシクロオキシゲナーゼも阻害することとなり、全体的に見れば治療効果がなくなるからである。
また、アスピリンの副作用として怪我や抜歯等の出血時に血が止まりにくく危険な状態になることがある。アスピリンの効果はシクロオキシナーゼに不可逆的に反応するため、アスピリンと反応した血小板がターンオーバーするまでの９日間はアスピリンの効果が続く。言い換えれば、アスピリンを服用した人は、９日間は、抜歯や手術を延期しなければならない問題があった。
【０００３】
この他、天然物由来の抗血栓性物質として、トカラハブ由来の蛋白質に抗血栓作用があることが知られている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平８−３１９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、これらのものは、食物由来のものではなく、豊富な食経験に裏打ちされた実績が乏しく、長期にわたり安心、安全に使用するには問題があった。
係る問題から、発明者らは、従来より食品として食されてきた豚肉を特定の条件で蛋白分解酵素で加水分解処理し、精製することにより、その酵素処理物の特定精製物が上記の心筋梗塞等の治療に使用されているアスピリンと同等の作用を持つことを見出した。その作用の機構は、明確ではないが、上記のアスピリン等のように血栓形成の機構の中で働く酵素やレセプター蛋白等に働きかけその機能を阻害することにより、血栓形成を抑制しているものと考えられる。
血栓形成は、上記の様に生活習慣病の発症と進展に深く関わっており、豊富な食経験のある畜肉、特に豚肉由来であり、安全で安心に食べられる抗血栓物質は生活習慣病予防の点から重要な意義を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の課題を解決するためになされた本発明の要旨は、豚肉を蛋白分解酵素で加水分解して得られ得る、平均分子量約１０００〜２５００の抗血栓作用を有するペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物及びそれらをカラム精製して得られ得る、平均分子量約２３００の抗血栓作用を有するペプチド（以下、カラム精製ペプチドという）又はそれを含有する畜肉加水分解物である。
また本発明の製造方法は、上記ペプチド及び畜肉加水分解物の製造方法であり、豚肉を蛋白分解酵素で加水分解し、平均分子量約１０００〜２５００の抗血栓作用を有するペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物及びそれらをカラム精製して得られるカラム精製ペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物を採取することからなる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のペプチド及び畜肉加水分解物並びにカラム精製ペプチド及びそれを含有する畜肉加水分解物は、優れた抗血栓作用を有し、更に食経験の豊かな畜肉、特に豚肉に由来するので安全性が高いという特長を有し、血栓の予防・治療に有用である。
また、本発明のペプチド及び畜肉加水分解物並びにカラム精製ペプチド及びそれを含有する畜肉加水分解物の製造方法は、上記の性状を有するペプチド及び豚肉加水分解物並びにカラム精製ペプチド及びそれを含有する畜肉加水分解物を簡便に調製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
上述のように、本発明は抗血栓作用を有し、豚肉を蛋白分解酵素で加水分解して得られ得る、平均分子量約１０００〜２５００のペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物及びカラム精製ペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物である。
上記のペプチド及び畜肉加水分解物は、豚肉を蛋白分解酵素で加水分解して、平均分子量約１０００〜２５００の画分を採取することにより得ることができる。その一例を具体的に説明すると、豚肉を細切りし、脱脂後、水を加えて得たスラリーを、蛋白分解酵素で処理し、次いで分画し分子量約１０００〜２５００の分画物を採取することにより得ることができる。
【０００８】
ここで使用される豚肉は特に限定されないが、蛋白質含量の高い赤身肉を使用するのが好ましい。豚肉を含むスラリー中における蛋白質含量としては、１〜１０重量％程度、好ましくは３〜６重量％程度、より好ましくは５重量％程度とされる。
また、酵素反応に使用される蛋白分解酵素としては、蛋白質を分解できる酵素であればいずれのものも使用することができるが、例えばパパイン、ブロメライン、フィシンなどが例示でき、好ましくはパパインが使用される。蛋白分解酵素は２種以上を併用してもよい。
【０００９】
かかる蛋白分解酵素の豚肉に対する使用量は、0.05重量％以上、通常0.1〜2.0重量％程度とされる。酵素処理条件は、使用する酵素などにより適宜選択できるが、通常30〜55℃程度、好ましくは50℃程度で行われ、1〜36時間程度、好ましくは5〜30時間程度、より好ましくは10〜24時間程度処理することにより行われる。より高温・長時間の処理では酵素による分解が進みすぎて目的とする画分を得ることが困難になるため好ましくない。液性としては酵素が蛋白質を分解できるｐＨであれば特に限定されず、使用する酵素の至適ｐＨ付近のｐＨに調整するのが好ましい。
【００１０】
酵素反応終了後、必要に応じて、加熱処理などにより酵素を失活させたのち、酵素処理物の上澄みを分画して分子量10,000以下の画分を採取することにより、本発明のペプチド及び豚肉加水分解物を得ることができる。
上記の分画の方法は特には限定されず、慣用の方法に準じて行うことができるが限外濾過による方法が好ましい。また、ペプチドの精製も、常法に準じて、ゲル濾過、凍結乾燥などの方法により行うことができる。
【００１１】
なお、本発明のペプチドは、豚肉由来に限定されるものではなく、本発明のペプチドを含有し、同様な作用を有するものであれば、他の畜肉に由来するものであってもよく、他の畜肉としては例えば牛肉、鶏肉、羊肉、兎肉などが例示される。また、化学的方法で製造されたものであってもよい。
【００１２】
本発明のカラム精製ペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物は、上記のペプチド又は畜肉加水分解物を、エタノール分画し、９０％沈殿画分を分取し、その沈殿画分を、陽イオン交換カラムにかけて精製し、ｐＨ２〜３の溶出液、好ましくはｐＨ２．７の溶出液で溶出させて得ることができる。より好ましくは、更に、陰イオン交換カラムにて精製し、ｐＨ０．１〜２の溶出液、好ましくはｐＨ１の溶出液で溶出させて得ることができる。使用するイオン交換体及び溶出液は、この分野で慣用の交換体及び溶出液を使用することができる。
【００１３】
本発明のペプチド又は畜肉加水分解物及びカラム精製ペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物は、血栓の予防及び治療のため、飲食物、薬剤などの種々の形態で人に摂取又は投与することができる。
上記の飲食物としては、有効成分である本発明のペプチド又は畜肉加水分解物及びカラム精製ペプチド又はそれを含有する畜肉加水分解物をそのまま又は適当な形状に加工して摂取してもよいが、例えば、飲料類（例えば、ドリンク剤、ミルク飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、ジュースなど）、菓子類（例えば、ビスケット、クッキー、キャンディー、スナック菓子、ラムネ菓子など）、調味液類（例えば、たれ汁など）、食肉製品類（例えば、ハム、ソーセージなど）、魚肉製品類（例えば、かまぼこ、ちくわなど）、乳製品類（例えば、チーズなど）などの飲食物に有効成分を含有させ、それを飲食することにより有効成分を摂取してもよい。上記の飲食物は、その調製段階の適当な工程において有効成分を添加する以外は常法に準じて調製することができる。
また、上記の飲食物には、必要に応じて慣用の添加剤を添加してもよく、かかる添加剤としては、例えば、ビタミン類、ミネラル類、ホルモン類、生理活性物質、甘味料、酸味料、香料、塩分などが例示される。
【００１４】
また、薬剤として投与する場合、当該薬剤は種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセルなど）をとり得、有効成分のみ又は慣用の担体とともに経口剤、注射剤、吸入剤、坐剤などに製剤化されるが、経口剤が好ましい。経口剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。また、注射剤は常法により調製することができ、例えば、有効成分を適当な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。更に、坐剤も慣用の基剤（例えば、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン、マクロゴール、ウィテップゾル等）を用いた製剤上の常法によって調製することができる。また、吸入剤も製剤上の常套手段に準じて調製することができる。製剤中の有効成分の含量は、剤形、適用疾患などに応じて適宜調整することができる。
製剤化に関して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、グリシン、マンニトール、グルコース、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤を含んでいてもよい。液状製剤とした場合には凍結保存、又は凍結乾燥などにより水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
投与方法としては、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与されうる。その投与量、投与回数などは、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整することができる。
【実施例】
【００１５】
以下に、実施例をもって本発明をより具体的に説明するが、これらは実施例の一例として示すものであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
豚肉由来の本発明のペプチドの調製
豚赤身肉をミートグラインダーにて細切りし、脱脂後、凍結乾燥し、これに水を加えて豚赤身肉スラリー（蛋白質濃度約５％）を調製した。これにパパインを0.1重量％（豚肉に対して）添加し、50℃、pH7.0にて24時間反応させ、その後に90℃にて１時間加熱し、酵素を失活させた。得られたパパイン加水分解物の上澄みを濾取した後、限外濾過にて分子量10,000以下の画分を採取し、凍結乾燥し、破砕し、50メッシュ以下の乾燥粉末を得ることにより、豚肉由来の本発明のペプチド（以下、ポークペプチドという）を得た。得られたポークペプチドの平均分子量はゲル濾過法で約２５００であり、このサンプルを以下の試験に供した。
【００１７】
試験例１（in vitroの試験）
ズリ惹起血栓形成法（ヘモスタトメトリー法）
本試験例で使用されるin vitro系のズリ惹起血栓形成法（ヘモスタトメトリー法）について簡単に説明する。抗凝固剤を加えずに、ラット腹大動脈より採取した血液に、実施例１のポークペプチドを加え混和し、一定の圧力下でポリエチレンチューブに流す。次いで、生理食塩水中で針でチューブを穿刺する。穿刺後、約375 dyne/cm2のズリ応力により血小板が活性化され、穿刺で出来たチューブの穴は血小板止血栓で塞がる。止血栓形成後、血液は再びチューブ内を流れるが、やがて凝固により血流は停止する。これらの変化をヘモスタトグラムに示される圧変化としてとらえる（図１参照）。
穿刺による圧低下から止血栓形成により圧が回復するまでの圧曲線により囲まれた面積、即ち図１のH1,H2を血小板反応性の指標とした。
その結果を図２に示す。図２に示されるように、H2はポークペプチド終濃度100μM、1mMにおいて阻害された。このことから、ポークペプチドが血小板反応性阻害作用を持つことがin vitroの系で明らかになった。
【００１８】
試験例２（in vivoの試験1）
He-Neレーザー惹起マウス頸動脈血栓形成法（経動脈投与）
血栓形成実験には9〜11週齡の雄性C57/BL/6マウスの頸動脈を用いた（図３参照）。ネンブタール麻酔後、左大腿動脈にポリエチレンチューブを留置した。次いでマウス頸部を切開し、左総頸動脈を露出した。マウスを顕微鏡の載物台に固定した。その後水晶（石英）ファイバーを用いて鏡筒内に導入し、ダイクロイックミラーで反射、対物レンズにより集光したHe-Neレーザーをマウス頸動脈に照射した。
血栓形成はカニューレよりEvans blueを動脈注射して開始させた。血栓形成過程は頸動脈を落射照明下で観察し、画像を、鏡筒上部に設置したCCDカメラを介して、パソコンに取り込んだ。取り込んだ画像を、画像解析ソフトを用いて血栓体積の算出を行った。即ち画像に一定の輝度閾値を与えて血栓の輪郭を求め、輪郭の面積を計測した。この値に輝度値を乗じて血栓サイズの近似値とした。
血栓は飛翔血栓として血流により流されながら、増減を繰り返す。Evans blue動注から10秒間隔で10分間、合計60画像の血栓サイズを計測し、合算したものを易血栓性の指標とした。結果はmean±SEMで表した。
ポークペプチドを動脈カニューレより投与し、抗血栓性を試験した。
その結果を図４に示す。図４に示されるように、ポークペプチド2.2mg/kg投与群では、有意差は認められないが、6.7mg/kg、20mg/kg投与群では、有意な抗血栓作用が認められた。
【００１９】
試験例３（in vivoの試験2）
He-Neレーザー惹起マウス頸動脈血栓形成法（経口投与）
上記のように、ポークペプチド動脈注射により抗血栓作用が認められたので、経口投与による抗血栓作用を検討した。
経口投与の場合、吸収率を10％と想定して、動脈注射による有効投与量6.7mg/kgの約10倍の70mg/kgを投与した。ポークペプチド及びアスピリン（比較例）は蒸留水に溶解し、血栓形成実験開始2時間前に、ゾンデを用いてマウス胃内に経口投与した。血栓形成傾向は He-Neレーザー惹起マウス頸動脈血栓形成法により評価した。
実験方法は、試験例２の方法に準じ、上記の経動脈投与と同じでネンブタール麻酔下のマウス大腿動脈にカニューレを留置し、左頸動脈を露出した（図３参照）。左頸動脈にHe-Neレーザーを照射した状態でEvans Blueを動脈注射し、血栓形成を惹起した。血栓形成過程は落射照明下でビデオに録画し、画像をパソコンに取り込み、血栓サイズは画像解析ソフトにより計測した。その結果を図５に示す。
図５の左側にポークペプチドの結果を示すが、投与量に依存して血栓形成阻害が認められた。有意な阻害は210mg/kg、700mg/kgで認められた。また、アスピリンの結果を図５右側に示す。アスピリンは投与量に依存して血栓形成を阻害し50mg/kgで有意に阻害した。
今回の試験により、ポークペプチドは210mg/kgの経口投与で有意な抗血栓作用を示した。ポークペプチドの動脈投与での最少有効濃度が6.7mg/kgであったことから、ポークペプチドの吸収率は約3％と考えられた。ポークペプチドの最少有効濃度210mg/kgをアスピリン50 mg/kgとモル数で比較するとほぼ同じとなるので、このペプチドはアスピリンと同程度の抗血栓作用を示したことになる。
【００２０】
実施例２
ポークペプチド高活性画分の調製１
実施例１の方法で調整されたポークペプチドをエタノール分画し90％沈殿画分を分取した。このポークペプチドのエタノール90％沈殿画分を20mMギ酸にて平衡化させた陽イオン交換カラム（AG50W: BioRad社製）にて分画した（測定波長280nm,流速8ml/min）。蛋白質のピークとして高かった20mMギ酸（pH2.7）にて溶出した３画分と20mMギ酸アンモニウム(pH6.0及びpH4.8)にて溶出した３画分を分取（表２）した。カラム処理条件を表１のカラム処理Ａ及び表２に示した。各画分を、前記ヘモスタトメトリー法にてH2を測定した。その結果を表３に示す。同表に示されるように、ギ酸溶出画分（画分Ａ(1)、画分Ａ(2)、画分Ａ(3)）を合わせたもので、抗血栓効果が認められた（表３ No.５）。中でも、画分Ａ(2)と画分Ａ(3)を合わせたものに陽イオン交換カラムにかける前のポークペプチドより強い活性を認めた（表３ No.４）。
【００２１】
実施例３
ポークペプチド高活性画分の調製２
実施例２の方法で調製されたポークペプチド陽イオン交換カラム処理物（画分Ａ(2)＋画分Ａ(3)）を更に、20mMギ酸アンモニウムにて平衡化させた陰イオン交換カラム（AG1：BioRad社製）にて分画した（測定波長280nm,流速８ml/min）。蛋白質のピークとして高かった20mMギ酸アンモニウム(pH4.8)にて溶出した３画分（画分Ｂ(1)、画分Ｂ(2)、画分Ｂ(3)）と20mMギ酸アンモニウム(pH4.8)から0.3Mギ酸(pH2.1)のグラジェント及び0.3Mギ酸(pH2.1)にて溶出した３画分（画分Ｂ(4)、画分Ｂ(5)、画分Ｂ(6)）と0.1M塩酸(pH1.0)にて溶出した１画分（画分Ｂ(7)）を分取した。カラム処理条件を表１のカラム処理Ｂ及び表２に示した。各画分を、前記ヘモスタトメトリー法にてH2を測定した。その結果を表３に示す。同表に示されるように、0.1M塩酸溶出画分（画分Ｂ(7)）で、抗血栓効果が認められた（表２No.13）。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
【表２】
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【００２４】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】試験例１で使用されるin vitro系のズリ惹起血栓形成法（ヘモスタトメトリー法）の概略を示す図である。
【図２】ポークペプチドの血小板反応性に及ぼす影響を示す図である。
【図３】試験例２で使用されるHe-Neレーザー惹起マウス頸動脈血栓形成法の概略を示す図である。
【図４】経動脈投与されたポークペプチドの血栓形成に及ぼす影響を示す図である。
【図５】経口投与されたポークペプチドの血栓形成に及ぼす影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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