(57)【要約】【課題】オキザリプラチンを含有する，安定かつ有効性の高いリポソーム製剤を提供すること。【解決手段】本発明は，オキザリプラチンを含有し，親水性ポリマーおよびリガンドで誘導化されているリポソーム製剤を提供する。また，このようなリポソーム製剤を含有する，腫瘍を治療するための医薬組成物も提供される。本発明のリポソーム製剤は，リガンドで誘導化されていることを特徴とする。リガンドは好ましくはトランスフェリンであり、腫瘍細胞表面に発現されているトランスフェリンレセプターを介して薬剤の腫瘍細胞内への取り込みを促進することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキザリプラチンを含有し，親水性ポリマーおよびリガンドで誘導化されているリポソーム製剤。
【請求項２】
リガンドが、トランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、糖鎖、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のＦａｂ’フラグメントである、請求項１記載のリポソーム製剤。
【請求項３】
リガンドがトランスフェリンである、請求項１記載のリポソーム製剤。
【請求項４】
親水性ポリマーが，ポリエチレングリコール，ポリメチルエチレングリコール，ポリヒドロキシプロピレングリコール，ポリプロピレングリコール，ポリメチルプロピレングリコールおよびポリヒドロキシプロピレンオキシドからなる群より選択される，請求項１記載のリポソーム製剤。
【請求項５】
親水性ポリマーが，ポリエチレングリコールである，請求項１記載のリポソーム製剤。
【請求項６】
請求項１−５のいずれかに記載のリポソーム製剤および薬学的に許容される担体を含む，腫瘍を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，抗腫瘍剤として用いられるリポソーム製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シスプラチンは抗腫瘍剤として，睾丸腫瘍，膀胱癌，腎盂・尿管腫瘍，前立腺癌，卵巣癌，頭頚部癌，非小細胞肺癌，食道癌，子宮頚癌，神経芽細胞腫，胃癌等の治療に広く用いられている。しかし，シスプラチンは毒性が強く，急性腎不全等の腎障害，骨髄機能抑制，悪心・嘔吐・食欲不振等の副作用を伴うという欠点を有している。このため，カルボプラチン，オキザリプラチン等のシスプラチン類似体が開発されている。オキザリプラチンは，シスプラチンと同等の治療活性を示し，かつ比較低い腎毒性および嘔吐性を示す。
【０００３】
一方，抗腫瘍剤が正常細胞に及ぼす毒性を軽減させるために，抗腫瘍剤をリポソーム中に封入して投与することが行われている。しかしながら，リポソーム中への抗腫瘍剤の取り込み，およびこのようなリポソーム製剤の安定性および標的細胞への効率的な輸送の点で，さらなる改良が必要である。
【０００４】
したがって，当該技術分野においては，抗腫瘍剤を含有するリポソーム製剤の保存安定性を高め，標的とする腫瘍細胞への薬剤の輸送効率を高める技術が求められている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は，オキザリプラチンを含有する，安定かつ有効性の高いリポソーム製剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は，オキザリプラチンを含有し，親水性ポリマーおよびリガンドで誘導化されているリポソーム製剤を提供する。
【０００７】
リガンドは、好ましくはトランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、ガラクトース、マンノースなどの糖鎖、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体のＦａｂ’フラグメントである。特に好ましくはトランスフェリンである。
【０００８】
親水性ポリマーは，好ましくは，ポリエチレングリコール，ポリメチルエチレングリコール，ポリヒドロキシプロピレングリコール，ポリプロピレングリコール，ポリメチルプロピレングリコールおよびポリヒドロキシプロピレンオキシドからなる群より選択される。より好ましくは，親水性ポリマーはポリエチレングリコールである。
【０００９】
本発明はまた，オキザリプラチンを含有し，親水性ポリマーおよびリガンドで誘導化されているリポソーム製剤および薬学的に許容される担体を含む，腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
リポソームは，水性の内部を有する球形の脂質二重層である。リポソームを形成する時に水性溶液中に存在する分子は，水性の内部に取り込まれる。リポソームの内容物は，外部微小環境から保護され，かつ，リポソームが細胞膜と融合するため細胞質内に効率的に輸送される。
【００１１】
１つの観点においては，本発明は，オキザリプラチンを含有し，親水性ポリマーおよびリガンドで誘導化されているリポソーム製剤を提供する。オキザリプラチン（トランス−１−１，２−ジアミノシクロヘキサンの白金（ＩＩ）シスオキサラト錯体）は，次式：
【化１】
2004010481.tif 000002
を有する白金錯体化合物である。オキザリプラチンは，シスプラチンと同等の治療活性を示し，かつ比較低い腎毒性および嘔吐性を示すため，抗腫瘍剤として有用である。オキザリプラチンの製造方法は当該技術分野において知られている（例えば，特開平９−４０６８５）。本発明のリポソーム製剤においては，オキザリプラチンは好ましくは１−２０ｍｇ／ｍｌの濃度の水溶液としてリポソーム中に捕捉されている。
【００１２】
リポソーム製剤は，リン脂質を適切な有機溶媒中に溶解し，これを薬剤を含有する水性溶液中に分散させて超音波処理または逆相蒸発法を行うことにより製造することができる。リン脂質としては，ホスファチジルコリン，ホスファチジルエタノールアミン，ホスファチジルイノシトール，スフィンゴミエリン，ホスファチジン酸等を用いることができる。さらに，脂質膜を安定化させるために，コレステロール等の脂質成分を加えることが好ましい。
【００１３】
さらに，リポソームの細網内皮系組織への取り込みを回避して腫瘍組織内取り込みを促進するために，リポソームの外表面を親水性ポリマーで修飾することができる。リポソームを親水性ポリマーで修飾することにより，リポソームの血中半減期を長くすることができることが知られている。このような親水性ポリマーの例としては，ポリエチレングリコール，ポリメチルエチレングリコール，ポリヒドロキシプロピレングリコール，ポリプロピレングリコール，ポリメチルプロピレングリコールおよびポリヒドロキシプロピレンオキシド等が挙げられる。特に好ましいものはポリエチレングリコールである。
【００１４】
さらに，本発明のリポソーム製剤は，リガンドで誘導化されていることを特徴とする。リガンドとは、細胞表面上に存在するレセプターまたは表面抗原と結合することができる物質をいう。リガンドは、好ましくはトランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、ガラクトース、マンノースなどの糖鎖、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のＦａｂ’フラグメントである。
【００１５】
本発明の特に好ましい態様においては、リガンドはトランスフェリンである。トランスフェリンは生体内に存在する鉄結合蛋白質であり，細胞表面上のトランスフェリンレセプターと結合して細胞内に取り込まれることにより，鉄を細胞に供給する役割を有する。トランスフェリンレセプターは、癌種を問わず正常組織に比べて発現量が高いため、薬剤をトランスフェリンと結合させることにより，トランスフェリンレセプターを介して薬剤の腫瘍細胞内への取り込みを促進することができると考えられる。
【００１６】
好ましくは，本発明のリポソーム製剤は，１−２０μｇ／ｍｇ脂質のオキザリプラチンおよび１００−３００μｇ／ｍｇ脂質のリガンドを有する。
【００１７】
本発明のリポソーム製剤は，逆相蒸発法（ＲＥＶ法）を用いて製造することができる（米国特許４，２３５，８７１号）。親水性ポリマーを脂質二重層中に安定して保持させるためには，あらかじめ親水性ポリマーのリン脂質誘導体を調製し，これをリン脂質および脂質とともに用いてリポソームを調製することが好ましい。親水性ポリマーのリン脂質誘導体は，例えば，米国特許５，０１３，５５６号に記載のようにして調製することができる。簡単には，ポリエチレングリコール等の親水性ポリマーを塩基性有機溶媒中でシアヌル酸で処理して一方の末端を活性化し，次にこれをホスファチジルエタノール等のリン脂質と反応させて，親水性ポリマーのリン脂質誘導体を得る。親水性ポリマーの他方の末端は，リガンドを結合させるための官能基，例えばカルボキシル基またはマレイミド基を有することが好ましい。
【００１８】
リン脂質（例えばジステアロイルホスファチジルコリン），脂質（例えばコレステロール）および親水性ポリマーのリン脂質誘導体（例えばポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン）を混合して，適当な有機溶媒中に溶解する。リン脂質と脂質との混合比率は３：１から１：３，好ましくは２：１から１：１である。親水性ポリマーのリン脂質誘導体の混合比率は，リン脂質に対して１−１０％，好ましくは約５％である。次にこの溶液をオキザリプラチンの水性緩衝液中の溶液と混合する。オキザリプラチンの水溶液中の濃度は１−２０ｍｇ／ｍｌ，好ましくは５−１０ｍｇ／ｍｌである。この溶媒混合物を超音波処理した後，溶媒を蒸発させる。次に，形成されたリポソームをサイズ分画して，約０．２ミクロンの直径を有するオキザリプラチン含有リポソームを調製することができる。
【００１９】
次に，このリポソームの外表面にリガンドを結合させる。例えば、リガンドとしてトランスフェリンを用いる場合、トランスフェリンは精製された蛋白質として市販されている。リポソームの外表面にトランスフェリンを結合させるためには，親水性ポリマーのリン脂質誘導体にさらに官能基を導入しておくことが好ましい。非限定的例としては，リン脂質に，末端にカルボキシル基またはマレイミド基を導入した親水性ポリマーのリン脂質誘導体を添加してリポソームを形成させ，外表面にカルボキシル基またはマレイミド基を有するリポソームを得る。これに、例えば末端がカルボキシル基の場合には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを結合させる。次に，このリンカーを付加したリポソームをトランスフェリンと反応させると，外表面にトランスフェリンが結合したアポ型のトランスフェリン結合リポソームを得ることができる。これを，クエン酸鉄−クエン酸ナトリウムで処理して，ホロ型のトランスフェリン結合リポソームを得る（図１）。また、末端がマレイミド基の場合は、あらかじめトランスフェリンにＳＨ基を導入したものと反応させ、上述と同様に鉄を付加すればホロ型のトランスフェリン結合リポソームが得られる。
【００２０】
別の観点においては，本発明は，上述の本発明のリポソーム製剤および薬学的に許容される担体を含む，腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。担体としては，滅菌水，緩衝液および食塩水を用いることができる。医薬組成物は，さらに，種々の塩類，糖類，蛋白質，澱粉，ゼラチン，植物油およびポリエチレングリコール等を含んでいてもよい。本発明の組成物は，ボーラス注射または連続注入により非経口的に投与することができる。投与量は，投与経路，症状の重篤度，患者の年齢および状態，副作用の程度等により様々でありうるが，一般に，１０−１００ｍｇ／ｍ２／日の範囲である。
【００２１】
【実施例】
以下に実施例により本発明を具体的に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２２】
実施例１　オキザリプラチンの細胞毒性試験
オキザリプラチン（ｌ−ＯＨＰ）溶液は，オキザリプラチンを９％ショ糖溶液に８ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解することにより調製した。細胞生存率の測定には，市販の細胞毒性アッセイキットを用いた。１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養したＡｓＰＣ−１細胞を，種々の濃度のｌ−ＯＨＰ溶液で，３７℃，５％ＣＯ２で４８時間処理した。次に培地を除去し，基質を加えて，３７℃，５％ＣＯ２で２時間呈色させ，４５０ｎｍ（参照波長６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。
【００２３】
結果を図２に示す。ｌ−ＯＨＰの細胞毒性はＬＤ５０＞８μｇ／ｍｌであった。
【００２４】
実施例２　オキザリプラチン含有リポソームの製造
リポソームの組成は以下のとおりである：
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）
コレステロール（ＣＨ）
Ｎ−（カルバモイルメトキシポリエチレングリコール２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）
カルボキシルポリエチレングリコール３０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）
ＤＳＰＣ：ＣＨ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＭｅ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ＝２：１：０．１９：０．０１（ｍ／ｍ）
水相としては，ｌ−ＯＨＰ溶液（８ｍｇ／ｍｌ，９％ショ糖溶液中）を用いた。
【００２５】
ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ２Ｋ−ＯＭｅおよびＰＥＧ３Ｋ−ＣＯＯＨの２：１：０．１９：０．０１（ｍ／ｍ）混合物をクロロホルムおよびイソプロピルエーテルに溶解した。これにｌ−ＯＨＰ溶液（９％ショ糖溶液中）を加えて超音波処理した。６０℃で溶媒を蒸発させ，凍結融解を５回繰り返した。次にＥＸＴＲＵＤＥＲフィルターを用いて６０℃でサイジング（４００ｎｍで２回、次に１００ｎｍで５回）した後，２００，０００ｘｇで３０分間ｘ２回遠心分離した。沈殿物を９％ショ糖溶液またはＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）に再懸濁して，ｌ−ＯＨＰ−ＰＥＧ（−ＣＯＯＨ／−ＯＭｅ）リポソームを得た。
【００２６】
次に，ＰＥＧリポソームをトランスフェリン（Ｔｆ）で誘導化した。上述のように調製したｌ−ＯＨＰ−ＰＥＧ（−ＣＯＯＨ／−ＯＭｅ）リポソームに，１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）（脂質重量の２．７％）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓ−ＮＨＳ）（脂質重量の７．３％）を加え，室温で１０分間放置した。次に，トランスフェリン（Ｔｆ）（脂質重量の２０％）を加えて，室温で３時間撹拌した。２００，０００ｘｇで３０分間遠心分離し，沈殿物を９％ショ糖溶液に再懸濁した。
【００２７】
のようにして得たアポ型Ｔｆ（−ＰＥＧ）リポソームにクエン酸鉄−クエン酸ナトリウムを加え，室温で１５分間撹拌した。これを２００，０００ｘｇで３０分間遠心分離し，沈殿物を９％ショ糖溶液に再懸濁して，ホロ型Ｔｆ（−ＰＥＧ）リポソームを得た。
【００２８】
このようにして調製した非修飾リポソーム，ＰＥＧリポソームおよびＴｆ−ＰＥＧリポソームの特性を図３に示す。
【００２９】
実施例３　細胞表面のトランスフェリンレセプターの数の測定
細胞としては，ヒト正常白血球およびヒト悪性腫瘍由来の細胞株（Ｋ５６２，ＭＫＮ４５ＰおよびＨＬ６０）を用い、細胞の表面にあるＴＦレセプター数をスキャッチャード解析により行った。４℃において、１２５Ｉ標識したＴＦ溶液を種々の濃度で細胞の培養液中に添加し、１時間インキュベートした。ＴＦの濃度は蛋白質定量により求め、同時にγカウンターで放射活性を測定した。遠心分離により細胞を沈降させ、細胞画分を氷冷したバッファーで洗浄し、γカウンターで測定し、結合濃度を求めた。同時に、蛋白質定量により細胞数を求めた。既知の添加濃度より、結合濃度を差し引いて遊離型濃度を求めた。スキャッチャードプロット、つまり横軸に結合濃度、縦軸に結合濃度／遊離型濃度の比をプロットし、ｘ切片より結合数（レセプター数）を求めた。
それぞれの細胞の表面に結合した１２５Ｉ−Ｔｆの量を図４に示す。すなわち、正常白血球と比較して，ヒト悪性腫瘍由来の細胞においては，細胞表面に存在するトランスフェリンレセプターの数が有意に多いことが認められた。
【００３０】
実施例４　腹膜播種モデルにおけるｌ−ＯＨＰ含有リポソームの治療効果
動物モデルとしては，６−７週齢の雄ヌードマウスＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ−ｎｕマウスを，腫瘍細胞としては，ＡｓＰＣ−１細胞（ヒト膵臓癌由来）およびＭＫＮ４５Ｐ細胞（ヒト胃癌由来）を用いた。
【００３１】
実験の第０日に，ＡｓＰＣ−１細胞（２ｘ１０６）またはＭＫＮ４５Ｐ細胞（１ｘ１０７）をマウスに腹腔内注射した。第１日および第４日に実施例２で作成したリポソームまたはｌ−ＯＨＰ溶液（８ｍｇ／ｍｌ，９％ショ糖溶液中）を腹腔内注射した。オキザリプラチンの濃度はいずれも５ｍｇｌ−ＯＨＰ／ｋｇ体重に調節した。リポソームとしては，Ｔｆ−ＰＥＧリポソーム，ＰＥＧリポソームおよび未修飾リポソームを用い，負対照としてはＰＢＳを投与した。
【００３２】
ＡｓＰＣ−１細胞を用いる実験では第２１日に，ＭＫＮ４５Ｐ細胞を用いる実験では第１６日および第２６日にマウスを開腹して，血性腹水および腫瘍結節の有無を調べた。結果を図５に示す。
【００３３】
すなわち，本発明のＴｆ−ＰＥＧリポソームは，未修飾リポソームおよびＰＥＧリポソームと比較して，マウスにおける血性腹水および腫瘍結節の発生を有意に低下させることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は，本発明のトランスフェリン結合リポソームの製造方法を示す。
【図２】図２は，オキザリプラチンの細胞毒性を示す。
【図３】図３は，非修飾リポソーム，ＰＥＧリポソームおよびＴｆ−ＰＥＧリポソームの特性を示す。
【図４】図４は，正常白血球および腫瘍由来細胞株の細胞表面に存在するトランスフェリンレセプターの数を示す。
【図５】図５は，非修飾リポソーム，ＰＥＧリポソームおよびＴｆ−ＰＥＧリポソームを投与したマウスにおける血性腹水および腫瘍結節の発生を示す。
【図１】
2004010481.tif 000003
【図２】
2004010481.tif 000004
【図３】
2004010481.tif 000005
【図４】
2004010481.tif 000006
【図５】
2004010481.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成15年1月20日(2003.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキザリプラチンを８ｍｇ／ｍｌの濃度の９％ショ糖溶液として含有し，ポリエチレングリコールおよびリガンドで誘導化されており、前記リガンドが、トランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、糖鎖、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のＦａｂ’フラグメントから選ばれることを特徴とするリポソーム製剤。
【請求項２】
請求項１記載のリポソーム製剤および薬学的に許容される担体を含む，腫瘍を治療するための医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
１つの観点においては，本発明は，オキザリプラチンを含有し，親水性ポリマーおよびリガンドで誘導化されているリポソーム製剤を提供する。オキザリプラチン（トランス−１−１，２−ジアミノシクロヘキサンの白金（ＩＩ）シスオキサラト錯体）は，次式：
【化１】
2004010481.tif 000008
を有する白金錯体化合物である。オキザリプラチンは，シスプラチンと同等の治療活性を示し，かつ比較低い腎毒性および嘔吐性を示すため，抗腫瘍剤として有用である。オキザリプラチンの製造方法は当該技術分野において知られている（例えば，特開平９−４０６８５）。本発明のリポソーム製剤においては，オキザリプラチンは８ｍｇ／ｍｌの濃度の９％ショ糖溶液としてリポソーム中に捕捉されている。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明のリポソーム製剤は，逆相蒸発法（ＲＥＶ法）を用いて製造することができる（米国特許４，２３５，８７１号）。ポリエチレングリコールを脂質二重層中に安定して保持させるためには，あらかじめポリエチレングリコールの誘導体を調製し，これをリン脂質およびコレステロールとともに用いてリポソームを調製することが好ましい。親水性ポリマーのリン脂質誘導体は，例えば，米国特許５，０１３，５５６号に記載のようにして調製することができる。簡単には，ポリエチレングリコールを塩基性有機溶媒中でシアヌル酸で処理して一方の末端を活性化し，次にこれをホスファチジルエタノール等のリン脂質と反応させて，ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンを得る。ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンの他方の末端は，リガンドを結合させるための官能基，例えばカルボキシル基またはマレイミド基を有することが好ましい。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
リン脂質（例えばジステアロイルホスファチジルコリン），脂質（例えばコレステロール）およびポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンを混合して，適当な有機溶媒中に溶解する。リン脂質とポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンとの混合比率は２：１である。ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンの混合比率は，リン脂質に対して６％である。次にこの溶液をオキザリプラチンの水性緩衝液中の溶液と混合する。オキザリプラチンの水溶液中の濃度は８ｍｇ／ｍｌの濃度の９％ショ糖溶液である。この溶媒混合物を超音波処理した後，溶媒を蒸発させる。次に，形成されたリポソームをサイズ分画して，約０．２ミクロンの直径を有するオキザリプラチン含有リポソームを調製することができる。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
次に，このリポソームの外表面にリガンドを結合させる。例えば、リガンドとしてトランスフェリンを用いる場合、トランスフェリンは精製された蛋白質として市販されている。リポソームの外表面にトランスフェリンを結合させるためには，ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミンにさらに官能基を導入しておくことが好ましい。非限定的例としては，リン脂質に，末端にカルボキシル基またはマレイミド基を導入した親水性ポリマーのリン脂質誘導体を添加してリポソームを形成させ，外表面にカルボキシル基またはマレイミド基を有するリポソームを得る。これに、例えば末端がカルボキシル基の場合には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを結合させる。次に，このリンカーを付加したリポソームをトランスフェリンと反応させると，外表面にトランスフェリンが結合したアポ型のトランスフェリン結合リポソームを得ることができる。これを，クエン酸鉄−クエン酸ナトリウムで処理して，ホロ型のトランスフェリン結合リポソームを得る（図１）。また、末端がマレイミド基の場合は、あらかじめトランスフェリンにＳＨ基を導入したものと反応させ、上述と同様に鉄を負荷すればホロ型のトランスフェリン結合リポソームが得られる。