(57)【要約】【課題】安価で、簡単に製造することができる、優れた生理作用活性を有する植物系由来の生理作用活性化剤を提供すること。【解決手段】藍藻を培養した後、さらに前記培養温度より高い温度に加熱して、藍藻に熱ショックを与えて改質した藍藻からなる生理作用活性化剤。藍藻を培地に懸濁させた培養液中で培養した後、さらに前記培養液を前記培養温度より高い温度に加熱した後、前記培養液を分離して得られる培養上清からなる生理作用活性化剤。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
藍藻を培養した後、さらに前記培養温度より高い温度に加熱して、藍藻に熱ショックを与えて改質した藍藻からなる生理作用活性化剤。
【請求項２】
生理作用活性化剤がＳＯＤ様活性剤である請求項１記載の生理作用活性化剤。
【請求項３】
生理作用活性化剤が過酸化脂質生成抑制剤である請求項１記載の生理作用活性化剤。
【請求項４】
生理作用活性化剤が線維芽細胞増殖促進剤である請求項１記載の生理作用活性化剤。
【請求項５】
生理作用活性化剤が育毛剤である請求項１記載の生理作用活性化剤。
【請求項６】
生理作用活性化剤が突然変異抑制剤である請求項１記載の生理作用活性化剤。
【請求項７】
藍藻を培地に懸濁させた培養液中で培養した後、さらに前記培養液を前記培養温度より高い温度に加熱した後、前記培養液を分離して得られる培養上清からなる生理作用活性化剤。
【請求項８】
生理作用活性化剤が線維芽細胞増殖促進剤である請求項７記載の生理作用活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、藍藻を培養した後、さらに前記培養温度より高い温度に加熱して、藍藻に熱ショックを与えて改質した藍藻及び前記改質藍藻製造時の培養上清の新規機能に係る生理作用活性化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、酵母を利用した代謝活性化剤の技術が開示されている（特表平１０−５０５６１２公報）。しかしながら、酵母の活性成分の製造は煩雑であり、また酵母自体を培養するための培地も高価である。さらに、前記特表平１０−５０５６１２公報においては、生理作用を確認したデータは示されておらず、その作用の程度、範囲も不明である。
【０００３】
一方、近年植物系由来の代謝活性化剤等の生理作用活性化剤は依然として需要があるが、酵母は植物系由来ではない。また、植物系由来としてはクロレラの線維芽細胞増殖促進剤としての技術開示があるが（特開平１０−３６２８３公報）、その効果の程度は充分でない。
【０００４】
さらに、熱安定性スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をシアノバクテリア等の光合成微生物を用いて産生させてこれを抽出する方法が開示されているが（特開平７−１３５９７０公報）、そのＳＯＤ活性は充分でない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、その目的は、安価で、簡単に製造することができる、優れた生理作用活性を有する植物系由来の生理作用活性化剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、藍藻に熱ショックを与えて改質した藍藻及び藍藻改質過程で得られる培養上清に、高活性の生理作用活性化機能があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、藍藻を培養した後、さらに前記培養温度より高い温度に加熱して、藍藻に熱ショックを与えて改質した藍藻からなる生理作用活性化剤である。
【０００８】
前記改質藍藻からなる生理作用活性化剤としては、ＳＯＤ様活性剤、過酸化脂質生成抑制剤、線維芽細胞増殖促進剤、育毛剤、突然変異抑制剤が挙げられる。
【０００９】
また、本発明は、藍藻を培地に懸濁させた培養液中で培養した後、さらに前記培養液を前記培養温度より高い温度に加熱した後、前記培養液を分離して得られる培養上清からなる生理作用活性化剤である。この生理作用活性化剤としては、線維芽細胞増殖促進剤が挙げられる。
【００１０】
本発明において藍藻の最適培養温度とは、藍藻が指数的に増殖する最適な培養温度（培地の温度）である。
【００１１】
本発明においては、ＳＯＤ様活性、過酸化脂質生成抑制、育毛、突然変異抑制、線維芽細胞増殖促進等の作用を生理作用と称し、それらの生理作用機能を有するものを生理作用活性化剤と称する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態について詳述する。
【００１３】
本発明において、藍藻は公知の藍藻の中から選択され用いられる。藍藻としては、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属、Ｃｈｏｒｏｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ属、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ属、Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ属、Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ属、Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ属、Ｃｏｅｌｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ属、Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｐｓｉｓ属、Ｅｕｃａｐｓｉｓ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ属、Ｇｏｍｐｈｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ｈｏｌｏｐｅｄｉａ属、Ｍａｒｓｓｏｎｉｅｌｌａ属、Ｍａｒｓｓｏｎｉｅｌｌａ属、Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ属、Ｒｈａｂｄｏｄｅｒｍａ属、Ｔｅｔｒａｐｅｄｉａ属等の藍藻が挙げられる。さらに、具体的には、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＰＣＣ７９４２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ
ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ　ｓｐ．ＢＨ６８等が挙げられる。これらのうちで、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属の藍藻、特に、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＰＣＣ７９４２が好ましく用いられる。さらに好ましくは、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓである。
【００１４】
本発明においては、藍藻を培養した後、さらに前記培養温度より高い温度に加熱して、藍藻に熱ショックを与えて改質した藍藻（以下、改質藍藻という。）、及び藍藻を培地に懸濁させた培養液中で培養した後、さらに前記培養液を前記培養温度より高い温度に加熱した後、前記培養液を分離して得られる培養上清が用いられる。
【００１５】
藍藻は、まず通常の培養方法を用いて培養される。例えば、藍藻を培地中に懸濁させて培養する方法がとられる。培養は、該藍藻個々が有している最適培養温度で培養されることが好ましい。最適培養温度は、例えばＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓは５０〜５５℃程度、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ＰＣＣ６８０３は３０〜３４℃程度、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓは５０〜５７℃程度である。
【００１６】
培地としては、通常の藍藻を培養する培地、例えば無機培地が用いられる。培養は好気性条件下、光照射下で行うことが好ましい。
【００１７】
本発明においては、藍藻を好ましくは藍藻の最適培養温度で培養を行った後、さらに前記培養温度より高い温度に加熱される（この工程を加熱工程という。）。培養温度の加熱によって増殖した藍藻は熱ショックを受け改質される。なお、加熱工程時にも培養が継続され（前記培養を第一段階の培養とすれば継続される培養は第二段階の培養となる。）、藍藻が増殖されるであろうが、このこと自体は本発明の目的とは関係することはない。前記加熱工程時の加熱温度は、第一段階の培養温度より高い温度であればよいが、第一段階の培養温度より５〜２５℃高い温度が好ましい。さらに好ましくは１０〜２０℃高い温度である。
【００１８】
前記加熱工程の培養時間は任意に設定できるが、２〜５時間が好適である。また、前記加熱工程時には、培養液に光照射と通気が行われることが好ましい。
【００１９】
前記加熱工程後、培養培地から改質された藍藻を分離する。藍藻が懸濁された培養液を用いた場合は、必要に応じて冷却した後遠心分離などによって改質藍藻層と培養上清とに分けられ、改質藍藻を分離する。また、前記培養上清は後述するように藍藻とは別の生理活性もあるので分離して用いることができる。
【００２０】
前記改質藍藻は、破砕され破砕物として、また溶媒により抽出され抽出物として用いることが効果を充分に発揮させるために好ましい。特に、破砕物として用いることが好ましい。破砕は機械的に破砕するのが好ましく、例えばミキサー、凍結破砕装置、コロイドミル等が用いられる。また、抽出は公知の溶媒を用いた抽出方法が用いられる。
【００２１】
本発明における前記改質藍藻、前記培養上清には、後述するように、高活性の、過酸化脂質生成抑制、育毛、突然変異抑制、線維芽細胞増殖促進等の生理作用機能を有する。
【００２２】
したがって、本発明は、前記の生理作用機能を有する生理作用活性化剤を提供するものである。この生理作用活性化剤は、生理作用活性化剤として活用できる他、種々の応用が可能であり、生理作用活性化剤を配合して医薬品、医薬品部外品を含む化粧品、飲食品等の組成物として前記機能を発揮させることができる。
【００２３】
なお、前記改質藍藻は、特に線維芽細胞増殖促進作用とＳＯＤ様活性作用とを併せ持つので抗老化機能を有し、抗老化剤として活用できる。
【００２４】
また、前記改質藍藻は熱安定性に優れ、例えば、７０℃では１時間、７５℃では４０分間曝してもその強いＳＯＤ様活性等の生理活性は失われることはない。
【００２５】
【実施例】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。実施例の説明に先立ち本発明で用いた生理作用の測定方法について説明する。
【００２６】
［ＳＯＤ様活性の測定］
キサンチンとＥＤＴＡを含む炭酸ナトリウム−塩酸緩衝液２．６ｍｌに、ＮＢＴ水溶液、０．１５％ＢＳＡ水溶液、および試料を混合し、２５℃にて１０分放置した。その後、酵素溶液を添加し、反応開始から２０分後に反応液の５６０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＮＢＴ還元抑制率を算出した。酵素反応によって発生したＯ２−がどのくらい消去されたかをＮＢＴの還元により調べ、その消去能をＳＯＤ様活性とした。
【００２７】
［過酸化脂質生成抑制作用の測定］
紫外線により引き起こされるリノレン酸の過酸化に対する、抑制効果をＴＢＡ法を用いて測定した。
【００２８】
［線維芽細胞増殖促進作用の測定］
あらかじめ細胞（ＮＢ１ＲＧＢ　理研ジ−ンバンクより購入）が増殖も減少もしないＦＢＳ濃度を検討し、０．５％ＦＢＳ−ＭＥＭ培地がこの条件を満たすことを確認し、試験試料のみの線維芽細胞増殖促進作用を評価できるようにした。細胞を１．５％ＦＢＳ−ＭＥＭ培地を用いて１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ（２ｍｌ）の密度となるように３５ｍｍ　ｄｉｓｈに播種し、２４時間５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。その後培養液を０．５％ＦＢＳ−ＭＥＭに交換し、試料を最高１０％の添加濃度となるように添加した。９日間培養後、細胞をビュルケルチュルク血球計算板でカウントした。生理食塩水を添加したブランクをもうけ、ブランクの細胞数を１００として、それに対する試料添加群の細胞生存率を示した。ｃｏｎｔｒｏｌとして１．５％ＦＢＳ−ＭＥＭを使用した。培養上清については、培地の測定も行いその分の作用を補正して、培養上清の作用とした。試料の添加量は５％とした。
【００２９】
［育毛作用の測定］
小川ら、フレグランスジャーナル、５，２０（１９８９）を参考に、試料を背部毛を除毛した８週齢のＣ３Ｈマウスの背部に塗布することにより育毛作用効果を評価した。
【００３０】
［突然変異抑制作用の測定］
紫外線照射によって細菌に誘発される突然変異を、ＤＮＡ傷害として計測した。突然変異の検出は、Ａｍｅｓ
Ｔｅｓｔの原理を利用し、突然変異菌及び生存菌から突然変異頻度を計算した。
【００３１】
次に、本発明に用いられる改質藍藻及び培養上清の製造実施例を参考製造例とともに説明する。
【００３２】
［参考製造例：藍藻の製造］
藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｕｌｃａｎｕｓ）１白金耳を５００ｍｌの無機培地中に懸濁した。この懸濁液を５０℃で２日間保持した。次いで、懸濁液を遠心分離し、培養上清とＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓからなる沈殿物層に分け、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓを得た。次いで、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｕｌｃａｎｕｓ５ｇを５０ｍｌの蒸留水で懸濁してミキサーで破砕し、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓの破砕物（藍藻Ａという。）を得た。
【００３３】
［製造例１：改質藍藻の製造１］
藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｕｌｃａｎｕｓ）１白金耳を５００ｍｌの無機培地中に懸濁した。この懸濁液を５０℃で２日間保持した。次いで、懸濁液を加熱し、６３℃に上昇させ、この温度に３時間保持した。この間光照射と通気を行った。次いで、懸濁液を遠心分離し、培養上清（培養上清Ａという。）と改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓからなる沈殿物層に分け、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓを得た。次いで、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｕｌｃａｎｕｓ５ｇを５０ｍｌの蒸留水で懸濁してミキサーで破砕し、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓの破砕物（改質藍藻Ａという。）を得た。
【００３４】
［製造例２：改質藍藻の製造２］
藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＰＣＣ７９４２）１白金耳を５００ｍｌの無機培地中に懸濁した。この懸濁液を３０℃で２日間保持した。次いで、懸濁液を加熱し、４２℃に上昇させ、この温度に３時間保持した。この間光照射と通気を行った。次いで、懸濁液を遠心分離し、培養上清（培養上清Ｂという。）と改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＰＣＣ７９４２からなる沈殿物層に分け、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＰＣＣ７９４２を得た。次いで、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＰＣＣ７９４２５ｇを５０ｍｌの蒸留水で懸濁してミキサーで破砕し、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＰＣＣ７９４２の破砕物（改質藍藻Ｂという。）を得た。
【００３５】
［製造例３：改質藍藻の製造３］
藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）１白金耳を５００ｍｌの無機培地中に懸濁した。この懸濁液を５０℃で２日間保持した。次いで、懸濁液を加熱し、６３℃に上昇させ、この温度に３時間保持した。この間光照射と通気を行った。次いで、懸濁液を遠心分離し、培養上清（培養上清Ｃという。）と改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｅｌｏｎｇａｔｕｓからなる沈殿物層に分け、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓを得た。次いで、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｌｏｎｇａｔｕｓ５ｇを５０ｍｌの蒸留水で懸濁してミキサーで破砕し、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓの破砕物（改質藍藻Ｃという。）を得た。
【００３６】
（実施例１）ＳＯＤ様活性の測定１
藍藻Ａ及び改質藍藻ＡのＳＯＤ様活性の結果を図１に示した。
【００３７】
【００３８】
図１の結果から明らかなように、改質藍藻ＡのＮＢＴ還元抑制率が藍藻Ａに比べ高く、藍藻Ａに比べて改質藍藻Ａが強いＳＯＤ様活性を有していることが分かる。
【００３９】
（実施例２）ＳＯＤ様活性の測定２
改質藍藻ＢのＳＯＤ様活性の結果を図２に示した。また、改質藍藻Ａを蒸留水で１０倍に希釈したもののＳＯＤ様活性も同様にして求め、その結果を同じ図２に示した。
【００４０】
【００４１】
図２の結果から明らかなように、改質藍藻ＢもＳＯＤ様活性を有することが確認できた。
【００４２】
（実施例３）ＳＯＤ様活性の耐熱性の測定
藍藻Ａおよび改質藍藻Ａを７５℃に４０分曝した後に、ＳＯＤ様活性を測定した。結果を図３に示した。
【００４３】
【図３】
2004059431.tif 000002
【００４４】
図３の結果から明らかなように、改質藍藻Ａは藍藻Ａに比べて７５℃に４０分間曝してもその強いＳＯＤ様活性は失われないことが確認できた。
【００４５】
（実施例４）過酸化脂質生成抑制作用
改質藍藻Ａの過酸化脂質生成抑制作用を測定した。結果を図４に示した。
【００４６】
【図４】
2004059431.tif 000003
【００４７】
図４の結果から明らかなように、改質藍藻Ａは過酸化脂質生成抑制率が高く、過酸化脂質生成抑制作用を有することが確認できた。
【００４８】
（実施例５）線維芽細胞増殖促進作用の測定１
改質藍藻Ａの線維芽細胞増殖促進作用を測定した。結果を図５に示した。
【００４９】
【図５】
2004059431.tif 000004
【００５０】
図５の結果から明らかなように、改質藍藻Ａは、線維芽細胞増殖促進作用を有することがが確認された。
【００５１】
（実施例６）線維芽細胞増殖促進作用の測定２
改質藍藻Ａ、改質藍藻Ｃ、培養上清Ａ及び培養上清Ｃの線維芽細胞増殖促進作用を測定した。結果を図６に示した。
【００５２】
【図６】
2004059431.tif 000005
【００５３】
図６の結果から明らかなように、改質藍藻Ａ、改質藍藻Ｃ、培養上清Ａ及び培養上清Ｃは、線維芽細胞増殖作用を有することが確認された。
【００５４】
（実施例７）育毛作用の測定
改質藍藻Ａの育毛作用を測定した。結果を図７に示した。
【００５５】
【図７】
2004059431.tif 000006
【００５６】
図７の結果から明らかなように、改質藍藻Ａは強い育毛作用が得られることが確認された。
【００５７】
（実施例８）突然変異抑制作用
改質藍藻Ａの突然変異抑制作用を測定した。結果を図８に示した。
【００５８】
【図８】
2004059431.tif 000007
【００５９】
図８の結果から明らかなように、改質藍藻Ａは強い突然変異抑制作用を有することが確認できた。
【００６０】
【発明の効果】
以上、詳述したように、本発明における改質藍藻は、ＳＯＤ様活性、過酸化脂質生成抑制、線維芽細胞増殖促進、育毛、突然変異抑制等の生理作用を発揮する機能を有することが明らかになり、このことから本発明によれば、前記改質藍藻からなるＳＯＤ様活性、過酸化脂質生成抑制、線維芽細胞増殖促進、育毛、突然変異抑制等の生理作用を有する新規な生理作用活性化剤が得られる。また、藍藻を培地に懸濁させた培養液中で培養した後、さらに前記培養液を前記培養温度より高い温度に加熱した後、前記培養液を分離して得られる培養上清には線維芽細胞増殖促進の生理作用を発揮する機能があることが明らかになり、このことから本発明によれば、前記培養上清からなる線維芽細胞増殖促進の生理作用を有する新規な生理作用活性化剤が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】藍藻Ａ及び改質藍藻ＡのＳＯＤ様活性を示す図である。
【図２】改質藍藻Ａ及び改質藍藻ＢのＳＯＤ様活性を示す図である。
【図３】藍藻Ａ及び改質藍藻ＡのＳＯＤ様活性の耐熱性を示す図である。
【図４】改質藍藻Ａの過酸化脂質生成抑制作用を示す図である。
【図５】改質藍藻Ａの線維芽細胞増殖促進作用を示す図である。
【図６】改質藍藻Ａ、改質藍藻Ｃ、培養上清Ａ及び培養上清Ｃの線維芽細胞増殖促進作用を示す図である。
【図７】改質藍藻Ａの育毛作用を示す図である。
【図８】改質藍藻Ａの突然変異抑制作用を示す図である。
【図１】
2004059431.tif 000008
【図２】
2004059431.tif 000009
【図３】
2004059431.tif 000010
【図４】
2004059431.tif 000011
【図５】
2004059431.tif 000012
【図６】
2004059431.tif 000013
【図７】
2004059431.tif 000014
【図８】
2004059431.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成15年8月29日(2003.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【特許請求の範囲】
【請求項１】藍藻を培養した後、さらに前記培養温度より高い温度に加熱して、藍藻に熱ショックを与えて改質した藍藻からなる生理作用活性化剤。
【請求項２】生理作用活性化剤がＳＯＤ様活性剤である請求項１記載の生理作用活性化剤。
【請求項３】生理作用活性化剤が過酸化脂質生成抑制剤である請求項１記載の生理作用活性化剤。
【請求項４】生理作用活性化剤が線維芽細胞増殖促進剤である請求項１記載の生理作用活性化剤。
【請求項５】生理作用活性化剤が育毛剤である請求項１記載の生理作用活性化剤。
【請求項６】生理作用活性化剤が突然変異抑制剤である請求項１記載の生理作用活性化剤。
【請求項７】藍藻を培地に懸濁させた培養液中で培養した後、さらに前記培養液を前記培養温度より高い温度に加熱した後、前記培養液を分離して得られる培養上清からなる生理作用活性化剤。
【請求項８】生理作用活性化剤が線維芽細胞増殖促進剤である請求項７記載の生理作用活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、藍藻を培養した後、さらに前記培養温度より高い温度に加熱して、藍藻に熱ショックを与えて改質した藍藻及び前記改質藍藻製造時の培養上清の新規機能に係る生理作用活性化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、酵母を利用した代謝活性化剤の技術が開示されている（特表平１０−５０５６１２公報）。しかしながら、酵母の活性成分の製造は煩雑であり、また酵母自体を培養するための培地も高価である。さらに、前記特表平１０−５０５６１２公報においては、生理作用を確認したデータは示されておらず、その作用の程度、範囲も不明である。
【０００３】
一方、近年植物系由来の代謝活性化剤等の生理作用活性化剤は依然として需要があるが、酵母は植物系由来ではない。また、植物系由来としてはクロレラの線維芽細胞増殖促進剤としての技術開示があるが（特開平１０−３６２８３公報）、その効果の程度は充分でない。
【０００４】
さらに、熱安定性スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をシアノバクテリア等の光合成微生物を用いて産生させてこれを抽出する方法が開示されているが（特開平７−１３５９７０公報）、そのＳＯＤ活性は充分でない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、その目的は、安価で、簡単に製造することができる、優れた生理作用活性を有する植物系由来の生理作用活性化剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、藍藻に熱ショックを与えて改質した藍藻及び藍藻改質過程で得られる培養上清に、高活性の生理作用活性化機能があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、藍藻を培養した後、さらに前記培養温度より高い温度に加熱して、藍藻に熱ショックを与えて改質した藍藻からなる生理作用活性化剤である。
【０００８】
前記改質藍藻からなる生理作用活性化剤としては、ＳＯＤ様活性剤、過酸化脂質生成抑制剤、線維芽細胞増殖促進剤、育毛剤、突然変異抑制剤が挙げられる。
【０００９】
また、本発明は、藍藻を培地に懸濁させた培養液中で培養した後、さらに前記培養液を前記培養温度より高い温度に加熱した後、前記培養液を分離して得られる培養上清からなる生理作用活性化剤である。この生理作用活性化剤としては、線維芽細胞増殖促進剤が挙げられる。
【００１０】
本発明において藍藻の最適培養温度とは、藍藻が指数的に増殖する最適な培養温度（培地の温度）である。
【００１１】
本発明においては、ＳＯＤ様活性、過酸化脂質生成抑制、育毛、突然変異抑制、線維芽細胞増殖促進等の作用を生理作用と称し、それらの生理作用機能を有するものを生理作用活性化剤と称する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態について詳述する。
【００１３】
本発明において、藍藻は公知の藍藻の中から選択され用いられる。藍藻としては、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属、Ｃｈｏｒｏｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ属、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ属、Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ属、Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ属、Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ属、Ｃｏｅｌｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ属、Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｐｓｉｓ属、Ｅｕｃａｐｓｉｓ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ属、Ｇｏｍｐｈｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ｈｏｌｏｐｅｄｉａ属、Ｍａｒｓｓｏｎｉｅｌｌａ属、Ｍａｒｓｓｏｎｉｅｌｌａ属、Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ属、Ｒｈａｂｄｏｄｅｒｍａ属、Ｔｅｔｒａｐｅｄｉａ属等の藍藻が挙げられる。さらに、具体的には、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＰＣＣ７９４２、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ
ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ　ｓｐ．ＢＨ６８等が挙げられる。これらのうちで、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属の藍藻、特に、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｕｌｃａｎｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＰＣＣ７９４２が好ましく用いられる。さらに好ましくは、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓである。
【００１４】
本発明においては、藍藻を培養した後、さらに前記培養温度より高い温度に加熱して、藍藻に熱ショックを与えて改質した藍藻（以下、改質藍藻という。）、及び藍藻を培地に懸濁させた培養液中で培養した後、さらに前記培養液を前記培養温度より高い温度に加熱した後、前記培養液を分離して得られる培養上清が用いられる。
【００１５】
藍藻は、まず通常の培養方法を用いて培養される。例えば、藍藻を培地中に懸濁させて培養する方法がとられる。培養は、該藍藻個々が有している最適培養温度で培養されることが好ましい。最適培養温度は、例えばＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｖｕｌｃａｎｕｓは５０〜５５℃程度、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ＰＣＣ６８０３は３０〜３４℃程度、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｌｏｎｇａｔｕｓは５０〜５７℃程度である。
【００１６】
培地としては、通常の藍藻を培養する培地、例えば無機培地が用いられる。培養は好気性条件下、光照射下で行うことが好ましい。
【００１７】
本発明においては、藍藻を好ましくは藍藻の最適培養温度で培養を行った後、さらに前記培養温度より高い温度に加熱される（この工程を加熱工程という。）。培養温度の加熱によって増殖した藍藻は熱ショックを受け改質される。なお、加熱工程時にも培養が継続され（前記培養を第一段階の培養とすれば継続される培養は第二段階の培養となる。）、藍藻が増殖されるであろうが、このこと自体は本発明の目的とは関係することはない。前記加熱工程時の加熱温度は、第一段階の培養温度より高い温度であればよいが、第一段階の培養温度より５〜２５℃高い温度が好ましい。さらに好ましくは１０〜２０℃高い温度である。
【００１８】
前記加熱工程の培養時間は任意に設定できるが、２〜５時間が好適である。また、前記加熱工程時には、培養液に光照射と通気が行われることが好ましい。
【００１９】
前記加熱工程後、培養培地から改質された藍藻を分離する。藍藻が懸濁された培養液を用いた場合は、必要に応じて冷却した後遠心分離などによって改質藍藻層と培養上清とに分けられ、改質藍藻を分離する。また、前記培養上清は後述するように藍藻とは別の生理活性もあるので分離して用いることができる。
【００２０】
前記改質藍藻は、破砕され破砕物として、また溶媒により抽出され抽出物として用いることが効果を充分に発揮させるために好ましい。特に、破砕物として用いることが好ましい。破砕は機械的に破砕するのが好ましく、例えばミキサー、凍結破砕装置、コロイドミル等が用いられる。また、抽出は公知の溶媒を用いた抽出方法が用いられる。
【００２１】
本発明における前記改質藍藻、前記培養上清には、後述するように、高活性の、過酸化脂質生成抑制、育毛、突然変異抑制、線維芽細胞増殖促進等の生理作用機能を有する。
【００２２】
したがって、本発明は、前記の生理作用機能を有する生理作用活性化剤を提供するものである。この生理作用活性化剤は、生理作用活性化剤として活用できる他、種々の応用が可能であり、生理作用活性化剤を配合して医薬品、医薬品部外品を含む化粧品、飲食品等の組成物として前記機能を発揮させることができる。
【００２３】
なお、前記改質藍藻は、特に線維芽細胞増殖促進作用とＳＯＤ様活性作用とを併せ持つので抗老化機能を有し、抗老化剤として活用できる。
【００２４】
また、前記改質藍藻は熱安定性に優れ、例えば、７０℃では１時間、７５℃では４０分間曝してもその強いＳＯＤ様活性等の生理活性は失われることはない。
【００２５】
【実施例】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。実施例の説明に先立ち本発明で用いた生理作用の測定方法について説明する。
【００２６】
［ＳＯＤ様活性の測定］
キサンチンとＥＤＴＡを含む炭酸ナトリウム−塩酸緩衝液２．６ｍｌに、ＮＢＴ水溶液、０．１５％ＢＳＡ水溶液、および試料を混合し、２５℃にて１０分放置した。その後、酵素溶液を添加し、反応開始から２０分後に反応液の５６０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＮＢＴ還元抑制率を算出した。酵素反応によって発生したＯ２−がどのくらい消去されたかをＮＢＴの還元により調べ、その消去能をＳＯＤ様活性とした。
【００２７】
［過酸化脂質生成抑制作用の測定］
紫外線により引き起こされるリノレン酸の過酸化に対する、抑制効果をＴＢＡ法を用いて測定した。
【００２８】
［線維芽細胞増殖促進作用の測定］
あらかじめ細胞（ＮＢ１ＲＧＢ　理研ジ−ンバンクより購入）が増殖も減少もしないＦＢＳ濃度を検討し、０．５％ＦＢＳ−ＭＥＭ培地がこの条件を満たすことを確認し、試験試料のみの線維芽細胞増殖促進作用を評価できるようにした。細胞を１．５％ＦＢＳ−ＭＥＭ培地を用いて１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ（２ｍｌ）の密度となるように３５ｍｍ　ｄｉｓｈに播種し、２４時間５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。その後培養液を０．５％ＦＢＳ−ＭＥＭに交換し、試料を最高１０％の添加濃度となるように添加した。９日間培養後、細胞をビュルケルチュルク血球計算板でカウントした。生理食塩水を添加したブランクをもうけ、ブランクの細胞数を１００として、それに対する試料添加群の細胞生存率を示した。ｃｏｎｔｒｏｌとして１．５％ＦＢＳ−ＭＥＭを使用した。培養上清については、培地の測定も行いその分の作用を補正して、培養上清の作用とした。試料の添加量は５％とした。
【００２９】
［育毛作用の測定］
小川ら、フレグランスジャーナル、５，２０（１９８９）を参考に、試料を背部毛を除毛した８週齢のＣ３Ｈマウスの背部に塗布することにより育毛作用効果を評価した。
【００３０】
［突然変異抑制作用の測定］
紫外線照射によって細菌に誘発される突然変異を、ＤＮＡ傷害として計測した。突然変異の検出は、Ａｍｅｓ　Ｔｅｓｔの原理を利用し、突然変異菌及び生存菌から突然変異頻度を計算した。
【００３１】
次に、本発明に用いられる改質藍藻及び培養上清の製造実施例を参考製造例とともに説明する。
【００３２】
［参考製造例：藍藻の製造］
藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓ）１白金耳を５００ｍｌの無機培地中に懸濁した。この懸濁液を５０℃で２日間保持した。次いで、懸濁液を遠心分離し、培養上清とＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓからなる沈殿物層に分け、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓを得た。次いで、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓ５ｇを５０ｍｌの蒸留水で懸濁してミキサーで破砕し、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓの破砕物（藍藻Ａという。）を得た。
【００３３】
［製造例１：改質藍藻の製造１］
藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓ）１白金耳を５００ｍｌの無機培地中に懸濁した。この懸濁液を５０℃で２日間保持した。次いで、懸濁液を加熱し、６３℃に上昇させ、この温度に３時間保持した。この間光照射と通気を行った。次いで、懸濁液を遠心分離し、培養上清（培養上清Ａという。）と改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓからなる沈殿物層に分け、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓを得た。次いで、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓ５ｇを５０ｍｌの蒸留水で懸濁してミキサーで破砕し、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｖｕｌｃａｎｕｓの破砕物（改質藍藻Ａという。）を得た。
【００３４】
［製造例２：改質藍藻の製造２］
藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＰＣＣ７９４２）１白金耳を５００ｍｌの無機培地中に懸濁した。この懸濁液を３０℃で２日間保持した。次いで、懸濁液を加熱し、４２℃に上昇させ、この温度に３時間保持した。この間光照射と通気を行った。次いで、懸濁液を遠心分離し、培養上清（培養上清Ｂという。）と改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＰＣＣ７９４２からなる沈殿物層に分け、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＰＣＣ７９４２を得た。次いで、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＰＣＣ７９４２５ｇを５０ｍｌの蒸留水で懸濁してミキサーで破砕し、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＰＣＣ７９４２の破砕物（改質藍藻Ｂという。）を得た。
【００３５】
［製造例３：改質藍藻の製造３］
藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）１白金耳を５００ｍｌの無機培地中に懸濁した。この懸濁液を５０℃で２日間保持した。次いで、懸濁液を加熱し、６３℃に上昇させ、この温度に３時間保持した。この間光照射と通気を行った。次いで、懸濁液を遠心分離し、培養上清（培養上清Ｃという。）と改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓからなる沈殿物層に分け、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓを得た。次いで、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓ５ｇを５０ｍｌの蒸留水で懸濁してミキサーで破砕し、改質Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓの破砕物（改質藍藻Ｃという。）を得た。
【００３６】
（実施例１）ＳＯＤ様活性の測定１
藍藻Ａ及び改質藍藻ＡのＳＯＤ様活性の結果を図１に示した。
【００３７】
【図１】
【００３８】
図１の結果から明らかなように、改質藍藻ＡのＮＢＴ還元抑制率が藍藻Ａに比べ高く、藍藻Ａに比べて改質藍藻Ａが強いＳＯＤ様活性を有していることが分かる。
【００３９】
（実施例２）ＳＯＤ様活性の測定２
改質藍藻ＢのＳＯＤ様活性の結果を図２に示した。また、改質藍藻Ａを蒸留水で１０倍に希釈したもののＳＯＤ様活性も同様にして求め、その結果を同じ図２に示した。
【００４０】
【図２】
【００４１】
図２の結果から明らかなように、改質藍藻ＢもＳＯＤ様活性を有することが確認できた。
【００４２】
（実施例３）ＳＯＤ様活性の耐熱性の測定
藍藻Ａおよび改質藍藻Ａを７５℃に４０分曝した後に、ＳＯＤ様活性を測定した。結果を図３に示した。
【００４３】
【図３】
【００４４】
図３の結果から明らかなように、改質藍藻Ａは藍藻Ａに比べて７５℃に４０分間曝してもその強いＳＯＤ様活性は失われないことが確認できた。
【００４５】
（実施例４）過酸化脂質生成抑制作用
改質藍藻Ａの過酸化脂質生成抑制作用を測定した。結果を図４に示した。
【００４６】
【図４】
【００４７】
図４の結果から明らかなように、改質藍藻Ａは過酸化脂質生成抑制率が高く、過酸化脂質生成抑制作用を有することが確認できた。
【００４８】
（実施例５）線維芽細胞増殖促進作用の測定１
改質藍藻Ａの線維芽細胞増殖促進作用を測定した。結果を図５に示した。
【００４９】
【図５】
【００５０】
図５の結果から明らかなように、改質藍藻Ａは、線維芽細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【００５１】
（実施例６）線維芽細胞増殖促進作用の測定２
改質藍藻Ａ、改質藍藻Ｃ、培養上清Ａ及び培養上清Ｃの線維芽細胞増殖促進作用を測定した。結果を図６に示した。
【００５２】
【図６】
【００５３】
図６の結果から明らかなように、改質藍藻Ａ、改質藍藻Ｃ、培養上清Ａ及び培養上清Ｃは、線維芽細胞増殖作用を有することが確認された。
【００５４】
（実施例７）育毛作用の測定
改質藍藻Ａの育毛作用を測定した。結果を図７に示した。
【００５５】
【図７】
【００５６】
図７の結果から明らかなように、改質藍藻Ａは強い育毛作用が得られることが確認された。
【００５７】
（実施例８）突然変異抑制作用
改質藍藻Ａの突然変異抑制作用を測定した。結果を図８に示した。
【００５８】
【図８】
【００５９】
図８の結果から明らかなように、改質藍藻Ａは強い突然変異抑制作用を有することが確認できた。
【００６０】
【発明の効果】
以上、詳述したように、本発明における改質藍藻は、ＳＯＤ様活性、過酸化脂質生成抑制、線維芽細胞増殖促進、育毛、突然変異抑制等の生理作用を発揮する機能を有することが明らかになり、このことから本発明によれば、前記改質藍藻からなるＳＯＤ様活性、過酸化脂質生成抑制、線維芽細胞増殖促進、育毛、突然変異抑制等の生理作用を有する新規な生理作用活性化剤が得られる。また、藍藻を培地に懸濁させた培養液中で培養した後、さらに前記培養液を前記培養温度より高い温度に加熱した後、前記培養液を分離して得られる培養上清には線維芽細胞増殖促進の生理作用を発揮する機能があることが明らかになり、このことから本発明によれば、前記培養上清からなる線維芽細胞増殖促進の生理作用を有する新規な生理作用活性化剤が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】藍藻Ａ及び改質藍藻ＡのＳＯＤ様活性を示す図である。
【図２】改質藍藻Ａ及び改質藍藻ＢのＳＯＤ様活性を示す図である。
【図３】藍藻Ａ及び改質藍藻ＡのＳＯＤ様活性の耐熱性を示す図である。
【図４】改質藍藻Ａの過酸化脂質生成抑制作用を示す図である。
【図５】改質藍藻Ａの線維芽細胞増殖促進作用を示す図である。
【図６】改質藍藻Ａ、改質藍藻Ｃ、培養上清Ａ及び培養上清Ｃの線維芽細胞増殖促進作用を示す図である。
【図７】改質藍藻Ａの育毛作用を示す図である。
【図８】改質藍藻Ａの突然変異抑制作用を示す図である。
【符号の説明】