(57)【要約】【課題】生体関連物質又は様々な化学物質を高密度に基盤上に固定化するための基盤スポット用溶液及びスポット方法を提供する。【解決手段】スポットされる生体関連物質又は化学物質を含有する溶液と、表面張力調整剤として無機微粉末を添加した溶液を混合して成る基盤スポット用溶液、及びスポット方法。【選択図】　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スポットされる生体関連物質又は化学物質を含有する溶液と、表面張力調整剤として無機微粉末を添加した溶液を混合して成る基盤スポット用溶液。
【請求項２】
前記無機微粉末が酸化ケイ素微粉末であることを特徴とする請求項１に記載の基盤スポット用溶液。
【請求項３】
前記酸化ケイ素微粉末がシリカゲルであることを特徴とする請求項２に記載の基盤スポット用溶液。
【請求項４】
前記無機微粉末が酸化アルミニウム微粉末であることを特徴とする請求項１に記載の基盤スポット用溶液。
【請求項５】
前記生体関連物質が、核酸、タンパク質、糖、糖タンパク質、血液、体液から選ばれることを特徴とすることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の基盤スポット用溶液。
【請求項６】
前記化学物質が、医薬品、環境有害物質から選ばれることを特徴とすることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の基盤スポット用溶液。
【請求項７】
前記基盤が、ガラス、プラスチック、又はセラミック製の基板、ないしは、ガラス、プラスチック、又はセラミック製のビーズから選ばれることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の基盤スポット用溶液。
【請求項８】
生体関連物質又は化学物質溶液と、表面張力調整剤として無機微粉末を添加した溶液を混合したスポット溶液を基盤表面にスポットするスポット方法。
【請求項９】
前記無機微粉末が酸化ケイ素微粉末であることを特徴とする請求項８に記載のスポット方法。
【請求項１０】
前記酸化ケイ素微粉末がシリカゲルであることを特徴とする請求項９に記載のスポット方法。
【請求項１１】
前記無機微粉末が酸化アルミニウム微粉末であることを特徴とする請求項８に記載のスポット方法。
【請求項１２】
前記生体関連物質が、核酸、タンパク質、糖、糖タンパク質、血液、体液から選ばれることを特徴とする請求項８から１１のいずれかに記載のスポット方法。
【請求項１３】
前記化学物質が、医薬品、環境有害物質から選ばれることを特徴とする請求項８から１１のいずれかに記載のスポット方法。
【請求項１４】
前記基盤が、ガラス、プラスチック、又はセラミック製の基板、ないしは、ガラス、プラスチック、又はセラミック製のビーズから選ばれることを特徴とする請求項８から１３のいずれかに記載のスポット方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガラス、プラスチック、セラミック等をはじめとする固定基盤上に生体関連物質及び医薬品をはじめとする種々の化学物質を固定化するための、基盤スポット用溶液及びスポット方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガラス基盤上に種々の遺伝子由来のＤＮＡを固定化したものは、ＤＮＡチップと呼ばれ生体内での遺伝子発現パターンを解析する手段となっている。このＤＮＡチップには、長鎖ＰＣＲ産物を基盤上に固定化したｃＤＮＡチップと、１００塩基以下の鎖長よりなる合成一本鎖オリゴヌクレオチドを固定化したオリゴヌクレオチドチップがある。後者のオリゴヌクレオチドチップには、基盤上で合成する方法も行われている。しかしながら、合成オリゴヌクレオチドを精製しないため、基盤上でのオリゴヌクレオチド合成は純度の面で劣るといった欠点を有している。そこで合成オリゴヌクレオチドを精製後、基盤上にスポットする方法がある。このスポット方法は、ｃＤＮＡチップにおいても用いられている方法であり、検体数が多くない場合、また高い純度のオリゴヌクレオチドを固定化する場合には有効である。
【０００３】
核酸又はタンパク質を基盤上にスポットするには、先端が極めて細く加工されたピン又はインクジェット法によるスポット等がある。いずれの場合も、基盤に上にスポットされたスポットの液滴が広がり過ぎる場合、高密度に多種類の物質をスポットすることが不可能となる。これまで有機溶媒を混合させ、あるいは塩強度を上げた溶液を用いるなどしてスポット溶液としていた。しかしながら、いずれの場合もスポットされた液滴は充分に小さな内径をもったものとはなっていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記背景から、本発明の課題は生体関連物質又は様々な化学物質を高密度に基盤上に固定化するための基盤スポット用溶液及びスポット方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究した結果、スポット用溶液に特定の表面張力調整剤を添加することで上記課題が解決されることを見出し、本発明に到達した。
第１に、本発明の基盤スポット用溶液は、スポットされる生体関連物質又は化学物質を含有する溶液と、表面張力調整剤として無機微粉末を添加した溶液を混合して成る。
第２に、本発明のスポット方法は、生体関連物質又は化学物質溶液と、表面張力調整剤として無機微粉末を添加した溶液を混合したスポット溶液を基盤表面にスポットする。
【０００６】
本発明において、表面張力調整剤として用いられる無機微粉末は、スポット溶液に添加されてその表面張力を高めることで、スポットが周辺に広がることを抑制し、スポット直後とほぼ同じ半径のスポット円で溶液が蒸発・乾燥するものである。表面張力調整剤として望ましい無機微粉末の性質は、微粉末であって、スポット後に生体関連物質又は化学物質の測定時に測定の邪魔とならないこと、白色又は白色に近い色相であって生体関連物質又は化学物質の測定時に測定の誤差とならないこと、不純物が少なく生体関連物質又は化学物質と非反応性であること、比重が重く表面張力と相まってスポットの広がりを防止すること等である。
【０００７】
本発明で用いられる無機微粉末としては、酸化ケイ素微粉末、特にシリカゲルが好ましく例示される。その他、酸化アルミニウム微粉末が好ましく例示される。更に、酸化チタン、チタン酸鉛、酸化ジルコン、硫化亜鉛、酸化アンチモン、酸化亜鉛、鉛白、リトポン、塩基性炭酸亜鉛、酸化マグネシウム、沈降硫酸バリウム、硫酸カルシウム（無水、２水塩）、タルク、炭酸カルシウム、カオリンクレー、マイカ、水酸化マグネシウム、ベントナイト、ドロマイト、炭酸カルシウム、塩基性炭酸マグネシウム、含水ケイ酸カルシウム、湿式法ホワイトカーボン等の微粉末が例示される。
【０００８】
本発明に用いる無機微粉末は、溶解性の点から２０００μｍ未満の粒径を有するものが好ましい。２０００μｍを越えるとスポット後の測定の邪魔となる。特に、無機微粉末の粒径が、１００〜４００μｍであるものが好ましい。
同様に、無機微粉末は、溶解性の点でメッシュ数が１〜４００のものが好ましい。
無機微粉末として、シリカゲルを用いる場合は、孔径１０〜１０００Åの多孔質であることが好ましい。
【０００９】
シリカゲルの具体例としては、Ｗａｋｏ　ｇｅｌ　ｃ３００（和光純薬工業株式会社の商品名）等が挙げられる。
本発明においてスポットされる生体関連物質としては、核酸、タンパク質、糖、糖タンパク質、血液、体液等が好ましく例示される。また、化学物質としては、医薬品や環境有害物質等が好ましく例示される。ここで、環境有害物質とは環境ホルモン、ダイオキシンなどである。
【００１０】
本発明において、スポット用溶液がスポットされる基盤としては、ガラス、プラスチック、又はセラミック製の基板、ないしは、ガラス、プラスチック、又はセラミック製のビーズから選ばれる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を示して本発明を説明する。
実施例１
Ｗａｋｏ　ｇｅｌ　ｃ３００（和光純薬工業株式会社の商品名）を滅菌水に溶解させ飽和溶液を調製した。この飽和溶液１ｍＬと０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を等量混合し、スポッティング溶液を作製した。下記の
５’ｄ（ＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ）３’
５’末端アミノ化オリゴヌクレオチド（１）（２０μＭ，１０μＬ）とスポッティング溶液（１０μＬ）を混合し、スポッター（ＳＰＢＩＯ２０００、日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社の商品名。ＳＰＢＩＯは登録商標）によって、スライドガラスにスポットした。
【００１２】
実施例２
中性シリカゲルを滅菌水に溶解させ飽和溶液を調製した。この飽和溶液１ｍＬと０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を等量混合し、スポッティング溶液を作製した。５’末端アミノ化オリゴヌクレオチド（１）（２０μＭ，１０μＬ）とスポッティング溶液（１０μＬ）を混合し、スポッター（ＳＰＢＩＯ２０００、日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社の商品名。ＳＰＢＩＯは登録商標）によって、スライドガラスにスポットした。
【００１３】
実施例３
酸化アルミニウム（Ａｌｕｍｉｎａ）を滅菌水に溶解させ飽和溶液を調製した。この飽和溶液１ｍＬと０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を等量混合し、スポッティング溶液を作製した。５’末端アミノ化オリゴヌクレオチド（１）（２０μＭ，１０μＬ）とスポッティング溶液（１０μＬ）を混合し、スポッター（ＳＰＢＩＯ２０００、日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社の商品名。ＳＰＢＩＯは登録商標）によって、スライドガラスにスポットした。
【００１４】
実施例４
タイトボックスにろ紙を敷き、３００ｍＭリン酸水素二ナトリウム水溶液を湿らせ、溶液が付かないように実施例１、２あるいは３においてスポットされたスライドガラスを入れ、密閉後３７℃で放置した。１６時間後タイトボックスからスライドガラスを取り出しドライオーブンに移し６０℃で１５分間加温した。
【００１５】
実施例５　オリゴヌクレオチドスポットガラスのブロッキング
スライドガラスを０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ（２００ｍＬ）で室温５分間、０．０５％塩酸水溶液（２００ｍＬ）で室温２分間、０．１Ｍ　塩化カリウム（２００ｍＬ）で室温１０分間、滅菌水（２００ｍＬ）で室温１分間洗浄した。
続いて１Ｍ　トリス−グリシン溶液（ｐＨ＝９．０）にガラスを浸し、室温で１時間攪拌しブロッキングを行った。滅菌水で洗浄後、ドラフト内で乾燥させて冷蔵保存した。
【００１６】
実施例６（Ｃｙ５標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション）
５Ｘ　ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳに溶解した下記
５’ｄ（ＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ）３’
化学合成Ｃｙ５標識オリゴヌクレオチド（２）（０．２μＭ）を、実施例１、２において調製したスライドガラス上にのせた後、カバーグラスを溶液上にのせ、室温で２時間放置した。
【００１７】
ハイブリダイゼーション後、チップを４×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで５分間、続いて２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで１０分間洗浄した。乾燥させた後、チップスキャナー（Ｓｃａｎ　Ａｒｒａｙ、Ａ　Ｐａｃｋａｒｄ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ　の商品名）で検出した。検出結果を図１に示す。図１のＡ、Ｂ、Ｃは、異なるスポット溶液に溶解しスポットされたオリゴヌクレオチド（１）とＣｙ５オリゴヌクレオチド（２）とのハイブリダイゼーションを行った。いずれも同じ溶液に溶解させたものを３回スポットしている。図１Ａは、炭酸バッファーのスポット溶液、Ｂは、炭酸バッファー＋５０％飽和シリカゲル溶液のスポット溶液、Ｃは、炭酸バッファー＋２５％飽和シリカゲル溶液のスポット溶液である。
【００１８】
図１より、シリカゲル溶液を添加したスポット溶液は、広がりやにじみが少ないことが分かる。
以下、他の実施例を示す。
図２は、本実施例の全体を示すスキームである。
【００１９】
実施例７　スライドガラスの洗浄
スライドガラス（１０枚）を１０％水酸化ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）に１５分間浸した後、水（２００ｍＬ）、１％塩酸水溶液（２００ｍＬ）の順で洗浄した。メタノール（２００ｍＬ）に浸し５分間の超音波洗浄を行い、遠心によって乾燥させ、更に１２０度で２時間減圧乾燥した。
【００２０】
実施例８　アミノプロピルシラン化
乾燥させたスライドガラスを３−アミノトリメトキシシラン（１３ｍＬ）、水（８ｍＬ）、メタノール（３８０ｍＬ）中に浸し、室温で少なくとも５時間攪拌させた。その後スライドガラスを取り出し、メタノール（２００ｍＬ）で２回洗浄して遠心後、１２０度で２時間減圧乾燥させた。
【００２１】
実施例９　イソチオシアネート化
あらかじめ１，４−フェニレンジイソチオシアネート（１８３６ｍｇ）を１０％ピリジン・ジメチルフォルムアミド溶液（１９０ｍＬ）に溶解させ、これに上記スライドガラスを入れ、室温下１６時間攪拌させた。スライドガラスを取り出し、ジメチルフォルムアミド（２００ｍＬ）、ジクロロメタン（２００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）の順で洗浄し、減圧下乾燥させ、実施例１０のイソチオシアネート化に供した。
【００２２】
実施例１０　デンドリマー化
デンドリマーとしてＰＡＭＡＭ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い、以下の反応を行った。実施例３でアミノ化されたスライドガラスをガラス容器に敷き、そこに１０％ＰＡＭＡＭメタノール溶液（１３０μＬ）を滴下し、密封して３７度で５時間反応させた。その後スライドガラスをメタノール（２００ｍＬ）で２回、アセトン（２００ｍＬ）で１回洗浄し、減圧下１時間乾燥させた。
【００２３】
実施例１１　デンドリマーコーティング後のイソチオシアネート化
実施例１０で得られた上記スライドガラスを、実施例９と同様の反応を行い、イソチオシアネート化し、オリゴヌクレオチドのスポットに供した。
【００２４】
実施例１２
実施例９で得られたスライドガラスをガラス容器に敷き、そこに２０または３０％　トリス（３−アミノプロピル）アミン・メタノール溶液（１３０μＬ）を滴下し、密封して３７度で５時間反応させた。その後スライドガラスをメタノール（２００ｍＬ）で２回、アセトン（２００ｍＬ）で１回洗浄し、減圧下１時間乾燥させた。
【００２５】
実施例１３　３−アミノプロピルアミンコーティング後のイソチオシアネート化実施例１２で得られた上記スライドガラスを、実施例９と同様の反応を行い、イソチオシアネート化し、これをオリゴヌクレオチドのスポットに供した。
【００２６】
実施例１４　オリゴヌクレオチドのスライドガラスへのスポットと結合反応
オリゴヌクレオチドライブラリー（８０ｐｍｏｌ；　ＭＷＧ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＧ社製）を滅菌水（４μＬ）に溶解し、スポット溶液（４μＬ；　１Ｍ　炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）：飽和Ｗａｋｏ　ｇｅｌ　Ｃ−３００（和光純薬工業株式会社の商品名）水溶液＝１：１）と混合させ、スポッター（ＳＰＢＩＯ２０００、日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社の商品名、ＳＰＢＩＯは登録商標）によって実施例１１、１３によって得られたコーティング済みスライドガラス上にスポットした。スポット後タイトボックスにろ紙を敷き、３００ｍＭリン酸水素二ナトリウム水溶液を湿らせ、溶液が付かないようにスポット済みのスライドガラスを入れ、密閉後３７℃で放置した。１６時間後タイトボックスからスライドガラスを取り出しドライオーブンに移し６０℃で１５分間加温した。
【００２７】
実施例１５　オリゴヌクレオチドスポットガラスのブロッキング
スライドガラスを０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ（２００ｍＬ）で室温５分間、０．０５％塩酸水溶液（２００ｍＬ）で室温２分間、０．１Ｍ　塩化カリウム（２００ｍＬ）で室温１０分間、滅菌水（２００ｍＬ）で室温１分間洗浄した。
続いて１Ｍ　トリス−グリシン溶液（ｐＨ＝９．０）にガラスを浸し、室温で１時間攪拌しブロッキングを行った。滅菌水で洗浄後、ドラフト内で乾燥させて冷蔵保存した。
【００２８】
（参考例）　逆転写反応
蛍光標識オリリボヌクレオチドを用いた逆転写反応
マウス肝臓由来のｔｏｔａｌ　ＲＮＡ（１００μｇ）を逆転写反応用ｏｌｉｏ　ｄｏｔプライマー（２μＬ；０．５μｇ／μＬ）と滅菌水に溶解して全量を３０μｌとし、これを７０度で５分間、４２度で２分間加温した。その後あらかじめ調製しておいた色素を含む溶液（５０μＬ；逆転写反応用緩衝液（ｘ５、２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓｈ　ｐＨ８．３、３７５　ｍｏｍ　Ｃｌ、１５　ｍｏｍ　ＭｃＧｉｌｌ２、５０　ｍｏｍ　ＤＴＴ：１６μＬ）、０．１Ｍ　ジチオスレイトール（８μＬ）、１０ｘｄＮＴＰ溶液（８μＬ；２ｍＭ　ｄＴＴＰ、５ｍＭ　ｄＡＴＰ、　５ｍＭ　ｄＣＴＰ、　５ｍＭ　ｄＧＴＰ）、１ｍＭ　Ｃｙ３−ｄＵＴＰ又はＣｙ５−ｄＵＴＰ（８μＬ）、Ｒａｚｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　（１０μＬ；４０ｕｎｉｔｓ／μＬ））を上記ＲＮＡ溶液と混合し、続けて逆転写酵素（１μＬ、２００ｕｎｉｔｓ；Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＮａｓｅ　Ｈ＝；ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を添加し４２度で加温した。１時間後、上記逆転写酵素０．５μＬを更に加え、４２度で１時間反応させた。この反応液に滅菌水（４０μＬ）、０．５ＭＥＤＴＡ（１０μＬ）、１Ｎ　ＮａＯＨ（２０μＬ）を加え、６５度で３０分間加温し、１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５；５０μＬ）と１Ｎ　ＨＣｌ（１５μＬ）を加え中和し、氷冷した。エタノール沈殿を行った後、滅菌水（５０μＬ）を加え、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ　Ｐ３０（ＢＩＯ　ＲＡＤ社の商品名）により脱塩した。溶出液をＳｐｅｅｄ　Ｖａｃで濃縮した。
【００２９】
実施例１６　マウス肝臓ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション
参考例に従って調製された蛍光標識ｃＤＮＡに２０　Ｘ　ＳＳＣ（　１０μＬ）、１０％　ＳＤＳ　（０．４μＬ）、及び滅菌水を加え全量４０μＬのプローブ溶液を作成した。そのプローブＤＮＡ溶液を静かにＤＮＡチップ上にのせた後、カバーグラスを溶液上にのせ、４０度で１６時間放置した。
【００３０】
ハイブリダイゼーション後、チップを１×ＳＳＣ−０．０５％　ＳＤＳ溶液（４０度）に１０分間洗浄し、続いて０．２　ｘ　ＳＳＣ（２００ｍＬ）、０．０５ｘ　ＳＳＣ（２００ｍＬ）でそれぞれ室温で洗浄した。乾燥させた後、チップスキャナー（Ｓｃａｎ　Ａｒｒａｙ、Ａ　Ｐａｃｋａｒｄ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ　の商品名）で検出した。マウス肝臓由来のＲＮＡをＣｙ３−ｄＵＴＰ又はＣｙ５−ｄＵＴＰで標識したｃＤＮＡを調製し、オリゴヌクレオチドチップによって解析した結果、緑色がＣｙ３、赤色がＣｙ５の検出波長の結果であった。
【００３１】
実施例１７　オリゴヌクレオチドのスライドガラス上への固定化の確認
１ｍＭ　Ｃｙ５−ｄｕｍｐ　（４μＬ）、ジメチルスルフォキシド（４μＬ）、２５ｍｏｍ　塩化コバルト溶液（４μＬ）、反応緩衝溶液（ｘ５、１Ｍ　カコジル酸カリウム、２５ｍｏｍトリス−塩酸、１．２５ｍｇ／ＢＳＡ、　ｐＨ６．８；８μＬ）、ターミナルトランスフェレース（５０ｕｎｉｔｓ）に滅菌水を加えて全量４０μＬとした反応溶液を調製後、直ちにスライドガラスに全量滴下した。カバーガラスを反応液上にのせ、３７度で放置した。１５分後４ＸＳＳＣバッファー（０．６ＭＮａＣｌ、０．１２Ｍクエン酸二水和物）、０．１％ＳＤＳ溶液、５０％メタノール水溶液で洗浄し乾燥させ検出機（スキャンアレイ）で測定した。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の基盤スポット用溶液及びスポット方法によれば、スポットの広がりとにじみを抑制し、生体関連物質又は様々な化学物質を高密度に基盤上に固定化することが出来る。
【００３３】
【配列表】
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2004028872.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、炭酸バッファーのスポット溶液、Ｂは、炭酸バッファー＋５０％飽和シリカゲル溶液のスポット溶液、Ｃは、炭酸バッファー＋２５％飽和シリカゲル溶液のスポット溶液である。
【図２】本実施例の全体を示すスキームである。
【図１】
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【図２】
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