(57)【要約】【課題】安水処理プラントのＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥中に存在する新現微生物、及びその１６ＳｒＤＮＡ配列又はその断片の提供、活性汚泥法による安水処理プロセスの硝化又は脱窒性能評価方法の提供、活性汚泥を使用する安水の処理方法の提供。【解決手段】本発明は、上記微生物又はその１６ＳｒＤＮＡ配列を用いてＦＩＳＨ法により上記安水処理プロセスの硝化又は脱窒性能を評価する方法並びに上記微生物を含む活性汚泥を使用する安水処理方法をも提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は１８に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｍｍｏｎｉａ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項２】
配列番号２又は１９に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項３】
配列番号３に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項４】
配列番号２０に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項５】
配列番号４又は２２に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項６】
配列番号５又は２１に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項７】
配列番号６に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項８】
配列番号７に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項９】
配列番号８、２３又は２６に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ；Ｔｈｅｒｍａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項１０】
配列番号２４に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（ｈｉｇｈ  ＧＣ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項１１】
配列番号９又は２５に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項１２】
配列番号１０に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｒｏｕｐ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項１３】
配列番号１１に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項１４】
配列番号１２又は２７に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項１５】
配列番号１３に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌｕｓ  ｇｒｏｕｐ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項１６】
配列番号１４又は２８に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（ｈｉｇｈ  ＧＣ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項１７】
配列番号１５又は２９に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項１８】
配列番号１６又は３０に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ；Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ（ｌｏｗ  ＧＣ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項１９】
配列番号１７に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するδ−プロテオバクテリア（δ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ  ｇｒｏｕｐ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項２０】
配列番号４３、５４又は６７に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項２１】
配列番号４５に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項２２】
配列番号４７に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｓｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項２３】
配列番号４０、４９、５０、５８、６０、６９、７７、７９又は８７に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項２４】
配列番号３３に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｍｍｏｎｉａ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項２５】
配列番号３７、４１又は６２に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｒｏｕｐ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項２６】
配列番号４２に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌｕｓ  ｇｒｏｕｐ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項２７】
配列番号３１、４４、４８又は７８に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項２８】
配列番号３２又は８６に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項２９】
配列番号６３又は６６に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項３０】
配列番号７３に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ  ｇｒｏｕｐ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項３１】
配列番号７６に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項３２】
配列番号７１に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項３３】
配列番号８０に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項３４】
配列番号８５に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項３５】
配列番号８２に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項３６】
配列番号７４に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項３７】
配列番号８３に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項３８】
配列番号８８に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項３９】
配列番号３４、３５、５３、５５、５９、６１、６４、６８又は７２に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項４０】
配列番号３６、３８、３９、５２、５６、５７、７０又は８１に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項４１】
配列番号４６に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項４２】
配列番号５１に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ；Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項４３】
配列番号７５又は８４に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（ｈｉｇｈ  ＧＣ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項４４】
配列番号６５に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在する未分類細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片。
【請求項４５】
配列番号８９に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｍｍｏｎｉａ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ；Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２７ｆ−１５１８ｒ領域全長ＤＮＡ。
【請求項４６】
配列番号９０に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；ｓｕｌｆｕｒ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２７ｆ−１５１８ｒ領域全長ＤＮＡ。
【請求項４７】
配列番号９１に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２７ｆ−１５１８ｒ領域全長ＤＮＡ。
【請求項４８】
配列番号９２に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２７ｆ−１５１８ｒ領域全長ＤＮＡ。
【請求項４９】
配列番号９３に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２７ｆ−１４９２ｒ領域全長ＤＮＡ。
【請求項５０】
その１６ＳｒＤＮＡ中に請求項１〜４９のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片又は全長ＤＮＡを含み、かつ、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在する微生物。
【請求項５１】
その１６ＳｒＤＮＡ中に配列番号８９に示す配列を有し、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｍｍｏｎｉａ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ；Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ近縁細菌。
【請求項５２】
その１６ＳｒＤＮＡ中に配列番号９０に示す配列を有し、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；ｓｕｌｆｕｒ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ近縁細菌。
【請求項５３】
その１６ＳｒＤＮＡ中に配列番号９１に示す配列を有し、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ近縁細菌。
【請求項５４】
その１６ＳｒＤＮＡ中に配列番号９２に示す配列を有し、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌。
【請求項５５】
その１６ＳｒＤＮＡ中に配列番号９３に示す配列を有し、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌。
【請求項５６】
請求項５０〜５５のいずれか１項に記載の微生物又は細菌を硝化又は脱窒指標微生物として用いて、ＦＩＳＨ法により、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プロセスの硝化又は脱窒性能を評価する方法。
【請求項５７】
β−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｍｍｏｎｉａ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ；Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ近縁細菌、γ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；ｓｕｌｆｕｒ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ近縁細菌、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ近縁細菌、α−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌、及び／又はＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌を、硝化又は脱窒指標微生物として用いて、ＦＩＳＨ法により、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プロセスの硝化又は脱窒性能を評価する方法。
【請求項５８】
請求項５０に記載の微生物又は細菌を含む、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理装置の活性汚泥。
【請求項５９】
請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の微生物又は細菌を含む、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理装置の活性汚泥。
【請求項６０】
請求項５８又は５９に記載の活性汚泥を使用する安水の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、安水処理プラントの活性汚泥中に存在する微生物、及びその１６ＳｒＤＮＡ配列又はその断片に関する。本発明は、上記微生物又はその１６ＳｒＤＮＡ配列を用いて、ＦＩＳＨ法により上記安水処理プロセスの硝化又は脱窒性能を評価する方法並びに上記微生物を含む活性汚泥を使用する安水の処理方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
製鉄所においてコークス炉から発生する安水にはフェノール類、チオシアン、チオ硫酸などの環境上好ましくない成分や、高濃度のアンモニアが含まれている。現在の安水処理システムでは、ＣＯＤ成分となるフェノール類などの有機物や、チオシアン、チオ硫酸などの硫黄化合物が活性汚泥法で除去されている。さらに、この活性汚泥法のシステムに硝化脱窒性能を付加させることで、安水中の有機物と同時にアンモニアも同時に除去する方法が提案されており、試験的にパイロットプラント（安水処理プロセス）を運転し、有機物除去と同時にアンモニアを除去することに成功している。しかしながら、安水処理に用いる活性汚泥で具体的にどのような微生物が有機物やアンモニアの除去に関与しているのかは明らかではなく、微生物群集を解析した研究例はない。
【０００３】
一般に、活性汚泥中の微生物の培養可能性（ｃｕｌｔｕｒａｂｉｌｉｔｙ）は低いので、安水活性汚泥中の微生物群集構造を把握するために、パイロットプラント内の微生物について、１６ＳｒＤＮＡをターゲットとしたＰＣＲ−ＤＧＧＥ法によるモニタリング、クローンライブラリーの作成を行い、そして微生物群集を定量化するため、ＦＩＳＨを用いた解析を行う必要がある。
【０００４】
ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法は、以下の非特許文献１、非特許文献２等に記載されている。
【０００５】
ＦＩＳＨ法は、以下の非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５等に記載されている。
【非特許文献１】
栗栖ら、土木学会論文集Ｎｏ．６３６／ＶＩＩ  −１３，２３−３３，１９９９．１１
【非特許文献２】
Ｍｕｙｚｅｒ，  Ｇ．，  Ｗａａｌ，  Ｅ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｕｉｔｔｅｒｌｉｎｄｅｎ，  Ａ．Ｇ．  （１９９３）  Ｐｒｏｆｉｌｉｎ          ｇ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ            Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ａｍｐｌｉｆｉｅ          ｄ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  １６ＳｒＲＮＡ．  Ａｐｐｌ．
【非特許文献３】
Ａｍａｎｎ，  Ｒ．Ｉ．，  Ｌｕｄｗｉｇ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，  Ｋ−Ｈ．  （１９９５）．  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅ          ｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉ          ａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ５９，  １４３−１６９．
【非特許文献４】
Ｍａｎｚ，  Ｗ．，  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｍ．，  Ａｍａｎｎ，  Ｒ．Ｉ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，  Ｋ．−Ｈ．  （１９９４）          ．  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｎｓｏｒｔｉａ  ａｃｔｉｖｅ  ｉ          ｎ  ｔｗｏ  ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｗａｔｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２８，  １７１５−１７２３．
【非特許文献５】
秋山ら、水環境学会誌  第２３巻  第５号  ２７１−２７８  ２０００
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上のような背景から、本発明者らは、安水処理プロセスの活性汚泥内に存在する微生物群集を把握し、ＣＯＤ成分となるフェノール類などの有機物や、チオシアン、チオ硫酸などの硫黄化合物の除去および硝化脱窒に関与する有用な微生物を発見し、安水処理性能を良好に維持するための評価方法及び安水処理方法を提供する必要性がある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の１の態様においては、配列番号１又は１８に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｍｍｏｎｉａ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【０００８】
本発明の他の態様においては、配列番号２又は１９に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【０００９】
本発明の他の態様においては、配列番号３に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００１０】
本発明の他の態様においては、配列番号２０に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００１１】
本発明の他の態様においては、配列番号４又は２２に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００１２】
本発明の他の態様においては、配列番号５又は２１に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００１３】
本発明の他の態様においては、配列番号６に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００１４】
本発明の他の態様においては、配列番号７に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００１５】
本発明の他の態様においては、配列番号８、２３又は２６に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ；Ｔｈｅｒｍａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００１６】
本発明の他の態様においては、配列番号２４に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（ｈｉｇｈ  ＧＣ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００１７】
本発明の他の態様においては、配列番号９又は２５に示す配列を有するＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００１８】
本発明の他の態様においては、配列番号１０に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｒｏｕｐ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００１９】
本発明の他の態様においては、配列番号１１に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００２０】
本発明の他の態様においては、配列番号１２又は２７に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００２１】
本発明の他の態様においては、配列番号１３に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌｕｓ  ｇｒｏｕｐ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００２２】
本発明の他の態様においては、配列番号１４又は２８に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（ｈｉｇｈ  ＧＣ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００２３】
本発明の他の態様においては、配列番号１５又は２９に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００２４】
本発明の他の態様においては、配列番号１６又は３０に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ；Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ（ｌｏｗ  ＧＣ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００２５】
本発明の他の態様においては、配列番号１７に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するδ−プロテオバクテリア（δ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ  ｇｒｏｕｐ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−５１８ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００２６】
本発明の他の態様においては、配列番号４３、５４又は６７に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００２７】
本発明の他の態様においては、配列番号４５に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００２８】
本発明の他の態様においては、配列番号４７に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｓｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００２９】
本発明の他の態様においては、配列番号４０、４９、５０、５８、６０、６９、７７、７９又は８７に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００３０】
本発明の他の態様においては、配列番号３３に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｍｍｏｎｉａ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００３１】
本発明の他の態様においては、配列番号３７、４１又は６２に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｒｏｕｐ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００３２】
本発明の他の態様においては、配列番号４２に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌｕｓ  ｇｒｏｕｐ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００３３】
本発明の他の態様においては、配列番号３１、４４、４８又は７８に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００３４】
本発明の他の態様においては、配列番号３２又は８６に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００３５】
本発明の他の態様においては、配列番号６３又は６６に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００３６】
本発明の他の態様においては、配列番号７３に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ  ｇｒｏｕｐ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００３７】
本発明の他の態様においては、配列番号７６に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００３８】
本発明の他の態様においては、配列番号７１に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００３９】
本発明の他の態様においては、配列番号８０に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００４０】
本発明の他の態様においては、配列番号８５に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００４１】
本発明の他の態様においては、配列番号８２に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００４２】
本発明の他の態様においては、配列番号７４に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００４３】
本発明の他の態様においては、配列番号８３に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００４４】
本発明の他の態様においては、配列番号８８に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００４５】
本発明の他の態様においては、配列番号３４、３５、５３、５５、５９、６１、６４、６８又は７２に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００４６】
本発明の他の態様においては、配列番号３６、３８、３９、５２、５６、５７、７０又は８１に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００４７】
本発明の他の態様においては、配列番号４６に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００４８】
本発明の他の態様においては、配列番号５１に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ；Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００４９】
本発明の他の態様においては、配列番号７５又は８４に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（ｈｉｇｈ  ＧＣ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００５０】
本発明の他の態様においては、配列番号６５に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在する未分類細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５７ｆ−９０７ｒ領域ＤＮＡ断片が提供される。
【００５１】
本発明の他の態様においては、配列番号８９に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｍｍｏｎｉａ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ；Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２７ｆ−１５１８ｒ領域全長ＤＮＡが提供される。
【００５２】
本発明の他の態様においては、配列番号９０に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；ｓｕｌｆｕｒ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２７ｆ−１５１８ｒ領域全長ＤＮＡが提供される。
【００５３】
本発明の他の態様においては、配列番号９１に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２７ｆ−１５１８ｒ領域全長ＤＮＡが提供される。
【００５４】
本発明の他の態様においては、配列番号９２に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２７ｆ−１５１８ｒ領域全長ＤＮＡが提供される。
【００５５】
本発明の他の態様においては、配列番号９３に示す配列を有する、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２７ｆ−１４９２ｒ領域全長ＤＮＡが提供される。
【００５６】
本発明のさらに他の態様においては、その１６ＳｒＤＮＡ中に上記のいずれかのＤＮＡ断片又は全長ＤＮＡを含み、かつ、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在する微生物が提供される。
【００５７】
本発明の他の態様においては、その１６ＳｒＤＮＡ中に配列番号８９に示す配列を有し、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するβ−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｍｍｏｎｉａ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ；Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ近縁細菌が提供される。
【００５８】
本発明の他の態様においては、その１６ＳｒＤＮＡ中に配列番号９０に示す配列を有し、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するγ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；ｓｕｌｆｕｒ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ近縁細菌が提供される。
【００５９】
本発明の他の態様においては、その１６ＳｒＤＮＡ中に配列番号９１に示す配列を有し、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ近縁細菌が提供される。
【００６０】
本発明の他の態様においては、その１６ＳｒＤＮＡ中に配列番号９２に示す配列を有し、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するα−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌が提供される。
【００６１】
本発明の他の態様においては、その１６ＳｒＤＮＡ中に配列番号９３に示す配列を有し、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プラントの活性汚泥中に存在するＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌が提供される。
【００６２】
本発明のさらに他の態様においては、上記のいずれかに記載の微生物又は細菌を硝化又は脱窒指標微生物として用いて、ＦＩＳＨ法により、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プロセスの硝化又は脱窒性能を評価する方法が提供される。
【００６３】
本発明のさらに他の態様においては、β−プロテオバクテリア（β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ａｍｍｏｎｉａ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ；Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ近縁細菌、γ−プロテオバクテリア（γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；ｓｕｌｆｕｒ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ近縁細菌、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ近縁細菌、α−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ近縁細菌、及び／又はＣＦＢ；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ近縁細菌を、硝化又は脱窒指標微生物として用いて、ＦＩＳＨ法により、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理プロセスの硝化又は脱窒性能を評価する方法が提供される。
【００６４】
本発明のさらに他の態様においては、上記のいずれかに記載の微生物又は細菌を含む、ＣＯＤ削減のために用いる活性汚泥法による安水処理装置の活性汚泥が提供される。
【００６５】
本発明のさらに他の態様においては、上記のいずれかに記載の微生物又は細菌を含む、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による安水処理装置の活性汚泥が提供される。
【００６６】
本発明のさらに他の態様においては、上記の活性汚泥を使用する安水の処理方法が提供される。
【００６７】
【発明の実施の形態】
以下、実施例において詳細に説明するが、パイロットプラントから採取した汚泥に対して、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法、シーケンシング、クローニング法、ＦＩＳＨ法などを用いた解析を行い得られた結果を考察した結果、以下のことが分かった。
【００６８】
・安水処理プロセス内に存在する微生物群集は、ＰＣＲ−ＤＧＧＥでのバンド数が少ないことから、下水処理の微生物群集と比較して種数が少ない。アンモニアが高濃度に含まれる系の中で、フェノール類やチオシアン、チオ硫酸等の硫黄化合物の特殊な基質を利用して生存できる微生物は限られることが推測できる。・性能安定時には、安水処理プロセス内の微生物相の変化はほとんどなく、ＰＣＲ−ＤＧＧＥで目立つバンドはほぼ同じである。
・安水処理プロセス内の微生物は、系統学的に様々なグループに属している（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、δ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＣＦＢ、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ、高ＧＣグラム陽性細菌、低ＧＣグラム陽性細菌、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）。
【００６９】
・様々なグループが存在する中で、半定量的に活性を見ることが出来るＦＩＳＨ法の結果によると、γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａに属する細菌が多い。作成したクローンライブラリーの結果からは、γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、そして活性汚泥では報告例がほとんどないＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐに近縁な細菌が３０％ずつと大部分を占めていることが分かる。
・個々の細菌を見ると、安水硝化脱窒処理プロセス内の微生物の中で、Ｃｈｒｏｍａｔｉｃｅａｅ  Ｔｈｉｏｒｈｏｄｏｖｉｂｒｉｏに近縁な細菌と、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ  Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉに近縁な細菌が優占的に存在している可能性が高く、注目に値する細菌であると考えられる。
【００７０】
また、本発明者らは、安水処理プロセスのパイロットプラント内の微生物群集構造についてＰＣＲ−ＤＧＧＥ法、クローニング法によるクローンライブラリーの作成、ＦＩＳＨ法の３つの手法を用いて解析し総合的に判断することを試みた。ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法は、微生物群集の系時的な変化を追うのに適しているが、ＰＣＲバイアスがかかってしまう方法であり、また近縁種決定においては２００ｂｐ程度である為データの信頼性にかける部分が有る。クローンライブラリー作成については、ＤＧＧＥよりも長い塩基配列の解読が可能であり詳細な系統解析ができるが、ＰＣＲバイアスがかかってしまい量の議論はできない。また、ＦＩＳＨ法は、ＰＣＲ等のバイアスが大きくかかる操作を経ないため半定量的な解析を行うことができるが、存在種が既知でプローブが無い限り、グループレベルの考察にとどまってしまう。このように、３つの方法はそれぞれ一長一短であると言える。しかし、３つの方法を組み合わせることで、ある程度バイアスを排除しそれぞれの短所を補って議論することが可能であると考えられる。このことを証明することができるような結果を得ることができた。その例は以下の通りである。
・クローンライブラリーを作成したことにより、ＤＧＧＥのバンド切り出しで近縁種を決定したのよりも多くの種が存在することがわかった。
・クローンライブラリー作成の際に、全長産物のクローンをとることで興味を持った細菌について全長解塩基配列を決定し、詳細な系統解析を行うことができた。
【００７１】
・クローンライブラリー作成で使用するプライマーを変えることによって得られるクローンの全体像が大分変わり、ＰＣＲバイアスがかかっている可能性が高いことが示唆された。
・ＦＩＳＨ法により、ＤＧＧＥやクローンではあまり得られなかった、高ＧＣグラム陽性細菌に属する細菌が多く存在することがわかった。
【００７２】
そこで、３つの手法で得られた結果を総合的に判断すると、安水処理プロセスのパイロットプラントに存在する微生物群集構造は次のような全体像が考えられる。グループレベルでは、大きな割合を占めているものとしてγ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ、β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、高ＧＣグラム陽性細菌が挙げられ、それぞれ２〜３割程度を占めている。その他にＣＦＢ、α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、δ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、低ＧＣグラム陽性細菌の細菌がいる。これらの各グループの中に数種ずつの微生物種が存在する。微生物種について見ると、γ−ＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａのＣｈｒｏｍａｔｉｃｅａｅ  Ｔｈｉｏｒｈｏｄｏｖｉｂｒｉｏに近縁な細菌と、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ  Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉに近縁な細菌が優占的に存在している系であり、硝化は、Ｎｉｔｒｏｓｏｍａｓ属に属する細菌が行っている。
【００７３】
以下、実施例に用いた実験原理手順を説明する。
【００７４】
サンプリング
プラントから採取した汚泥を、汚泥：エタノール＝９：１で混ぜてしばらく４℃で保存した後、ＤＮＡ抽出用とＦＩＳＨ用の２種類に分けて保存した。ＤＮＡ抽出用のサンプリングは、採取した汚泥をバッファーで洗い、最終的にペレット状にして−２０℃で保存するという操作である。ＦＩＳＨ用のサンプリングは、ＦＩＳＨ法がｒＤＮＡではなくｉｎ  ｓｉｔｕの状態でｒＲＮＡをターゲットとする手法である為、細胞をできるだけそのままの状態で保存するように、液体窒素で急速に凍らして保存した。
【００７５】
１）ＤＮＡ抽出用サンプリング
１．２ｍｌチューブに汚泥を１ｍｌ取ったものを数個用意し、遠心分離にかけ上澄みを取り除く。
２．ペレットをＴＨ（ｐＨ８．０）バッファーで懸濁し、遠心分離で上澄みを取り除く。（洗浄操作）
３．−２０℃で保存する。
【００７６】
２）ＦＩＳＨ用サンプリング
１．−８０℃で保存可能なクライオチューブに、汚泥を２ｍｌ取ったものを１サンプルにつき数個用意する。
２．液体窒素中に保存する。
【００７７】
ＤＮＡ抽出
Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｓｏｉｌ（ＢＩＯ１０１）
Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｓｏｉｌ（ＢＩＯ１０１）は、５００ｍｇまでの土壌や他の環境サンプルから３０分以内で効率的にＤＮＡを抽出出来るＫｉｔである。ホモジナイズする装置が必要ではあるが、抽出作業時間が短い、フェノールやクロロホルムなどの有機溶媒が不要、また比較的抽出しにくいとされてきたグラム陽性細菌なども抽出可能、等の利点がある。
【００７８】
Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｓｏｉｌの操作は大きく分けて２つのステップからなる。
１）細胞の破砕・ＤＮＡの可溶化・タンパク質の可溶化
サンプルを、ホモジナイズとタンパク質の可溶化が可能なバッファーに溶解させ、それをセラミックとシリカからなるビーズと混ぜることにより、細胞を破砕しＤＮＡを可溶化する。この段階で、ほとんどＲＮＡの混入のないＤＮＡを得ることができる。
【００７９】
２）ＤＮＡの精製と濃縮
可溶化したＤＮＡのみをシリカ製のＢｉｎｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘに吸着させることで、混在する阻害物質を除去する。その後、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘに吸着したＤＮＡを溶出させて、精製ＤＮＡを得ることができる。
【００８０】
以下、手順を説明する。
１．サンプリングして保存しておいたペレットに、サンプルをホモジナイズしタンパク質を可溶化することのできるＳｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＢｕｆｆｅｒとＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、ペレットを懸濁する。
２．ビーズの入ったＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｅ  ｔｕｂｅに１を移す。
３．２をＦａｓｔ  Ｐｅｒｐに設置し、Ｓｐｅｅｄ５．０、３０ｓｅｃで２回処理を行い、細胞を破砕し溶解させる。
４．上澄みを新しいチューブに移し、ＰＰＳを加え、手で攪拌する。
５．遠心分離にかけタンパク質を沈殿させ、上澄みを新しいチューブに移すことでタンパク質を除去する。
【００８１】
６．５で移した上澄みと等量のＢｉｎｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘを加え、手で反転浸透した後数分静置してＢｉｎｄｉｎｇ  ＭａｔｒｉｘにＤＮＡを吸着沈殿させる。
７．上澄みを除去した後、残った液でＢｉｎｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ−ＤＮＡを懸濁し、それをＳｐｉｎ  Ｆｉｌｔｅｒに移す。
８．７を遠心分離にかけ、その後、ＳＥＷＳ−Ｍを加えてＦｉｌｔｅｒ上のＢｉｎｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ−ＤＮＡを洗浄濃縮する。
９．Ｆｉｌｔｅｒ上のＢｉｎｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ−ＤＮＡにＤＥＳを加えて、遠心分離によりＤＮＡを溶出させ、ＰＣＲグレードのＤＮＡを回収する。ＤＮＡは−２０℃で保存可能である。
【００８２】
ＰＣＲ
以下の実施においては、解析対象サンプル中に存在する微生物全体を追うため、１６ＳｒＤＮＡつまり真正細菌をターゲットとしたＰＣＲを行った。１６ＳｒＤＮＡの塩基配列には、多様性に富んだ部分（Ｖ１〜Ｖ９領域）と高度に保存されている部分があるため、微生物の系統解析には最もよく利用されており、データベースには多くの情報がある。本研究では、Ｖ３領域を含むプライマー（３５７ｆ−５１８ｒ）や、３５７−９０７ｒ、そして全長プライマーなどを目的に応じて使い分けた。ＰＣＲの条件については、使用プライマーや目的により異なる為、その都度示す。
【００８３】
１６ＳｒＤＮＡをターゲットとしたＰＣＲ法について、大まかに実験の流れを説明する。
１．ＤＮＡ抽出後、吸光光度計を用いてＤＮＡの濃度を測定する。
２．テンプレートとするＤＮＡを５０ｎｇ／μｌに調製する。
３．以下の表１に示すようにＰＣＲ  ｍｉｘｔｕｒｅを調製する。
【００８４】
【表１】
2004242578.tif 000002
【００８５】
使用するｐｒｉｍｅｒは以下の表２に示すように目的により選択する。
【００８６】
【表２】
2004242578.tif 000003
【００８７】
４．サーマルサイクラーＴ３  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）またはＧｅｎｅＡｍｐ９６００（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、目的に応じたプログラム条件でＰＣＲを行う。
５．１質量％アガロースゲル（アガロースを１×ＴＡＥに溶かし１質量％としたもの）を用いて１００Ｖで１５分間電気泳動を行い、その後１５分間のエチジウムブロマイド染色を行い、ＵＶトランスイルミネーター（東洋紡）でＰＣＲ産物が得られたかどうか確認をする。
【００８８】
ＤＧＧＥ
ＤＧＧＥはｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）の略であり、元来染色体ＤＮＡの点変異検出に用いられた技術である。ＤＧＧＥ法は、ＰＣＲと組み合わせることで、微量のサンプルから環境中に存在する微生物の遺伝子を培養過程を経ずに検出することができるということで、微生物生態分野において急速に普及した。ＤＧＧＥ法は、培養できない微生物の遺伝子でも検出できるという点ではクローニングと似ているが、バンドとして可視化出来るため、環境中にどれくらいの種類の微生物が存在するのかを容易に判断することができるという利点をもっている。
【００８９】
ＤＧＧＥは、ＤＮＡ変性剤（尿素とホルムアルデヒド）の濃度勾配をつけたポリアクリルアミドゲル中でＤＮＡ電気泳動を行うことにより、長さのそろった複数種の２本鎖ＤＮＡ（例えば、ＰＣＲ産物）を、塩基配列の違いにより分離できる方法である。図２５にその原理を示す。
【００９０】
ＧＣクランプ（ＧＣに富む配列）付きのプライマーセットを用いて、ＰＣＲで増幅した２本鎖ＤＮＡを変性剤の濃度勾配をつけたポリアクリルアミドゲルで電気泳動すると、ＤＮＡ変性剤の濃度上昇とともに２本鎖ＤＮＡ間の水素結合が切断され、二重らせん構造から１本鎖ＤＮＡに変性する。しかし、ＧＣクランプ部分は結合力が強いため、ＤＮＡは３方向に伸びた形になる。このように変性したＤＮＡは、ゲルを移動する速度が著しく小さくなるため、ある場所に集まり、バンドを形成する。配列の異なる複数の２本鎖（異なる微生物）のＤＮＡはＡ−Ｔ、Ｇ−Ｃ間の水素結合の数および配列の違いにより、異なるＤＮＡ変性剤濃度で解離するため、異なる位置にバンドが形成され、その結果、微生物を種類ごとに分離することができる。このようにして、サンプルごとにバンドプロファイルが得られ、そのパターンにより群集を評価することができるということになる。
【００９１】
以下、手順を説明する。
【００９２】
１）ポリアクリルアミドゲルの作成
１．変性剤について低濃度ゲル溶液、高濃度ゲル溶液、さらに０質量％のゲル溶液を調製する。ポリアクリルアミド濃度は８質量％とする。ゲルの組成を以下の表３に示す。
【００９３】
【表３】
2004242578.tif 000004
【００９４】
２．１をそれぞれ脱気したものについて、低濃度・高濃度ゲル溶液を１４ｍｌずつ用意する。
３．用意した高濃度ゲルにＤｙｅを加え、低濃度高濃度のそれぞれに架橋剤である０．５質量％ＡＰＳと０．０５質量％ＴＥＭＥＤを加える。
４．変性剤の濃度勾配をつけられる装置を用いてゲルキャスティングを行う。
５．１２時間放置することで重合を促進させる。
【００９５】
２）電気泳動
ＤＧＧＥの泳動装置には、Ｄ  ｃｏｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。
１．サンプルを用意する。（１６ＳｒＤＮＡ解析の場合は、ＧＣ付きのプライマーである３５７ｆＧＣと５１８ｒで増幅したＰＣＲ産物）。
２．サンプル２０μｌと６×Ｄｙｅ４μｌを混ぜ、調製する。
３．１×ＴＡＥ７Ｌを６０℃まで加温したチャンバーにゲルをセットし、サンプルをアプライする。
４．１３０Ｖで５〜６時間、電気泳動を行う。
【００９６】
３）画像取得と解析
画像取得とその解析はＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｅｒ５９５（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）Ｓｃａｎｎｅｒ  ＣｏｎｔｒｏｌとＩｍａｇｅ  Ｑ  ｗａｎｔ、ＦｒａｇｍｅＮＴを使用し行った。
１．泳動し終わったゲルを１万倍に希釈したＶｉｓｔｒａ  Ｇｒｅｅｎで１５分間染色する。
２．余分な染色液を取り除き、蛍光イメージアナライザーＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｅｒ５９５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）のＳｃａｎｎｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌを用いて、画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｑ  ｗａｎｔで画像を取り込む。
３．塩基配列決定の為、バンドを切り出す必要のある場合はバンドを切り出す。
４．バンド強度をもとめる等の解析をする場合は、画像解析ソフトＦｒａｇｍｅＮＴを利用して付属のマニュアルに従い解析を行う。
【００９７】
シーケンシング
以下の実施例において、ＳＱ−５５００とＡＢＩ３１０の２台のオートシーケンサーを使用した。ＳＱ−５５００はゲルスラブタイプの電気泳動でＤｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ法を採用しており、またＡＢＩ３１０はキャピラリー電気泳動でＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法を採用している。両者の方法について、実験の流れを示す。
１）オートシーケンサーＳＱ−５５００（日立製作所）
１．プロトコルに従いポリアクリルアミドゲルを作成する。ゲルの組成を以下の表４に示す。
【００９８】
【表４】
2004242578.tif 000005
【００９９】
２．Ｖｉｓｔｒａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｓｈｉａ）を用い、そのプロトコルに従ってシーケンシング反応のｍｉｘｔｕｒｅを調製する。
３．Ｔ３  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）またはＧｅｎｅＡｍｐ９６００（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、シーケンシング反応を行う。シーケンシング反応のプログラムは、増幅部位の長さに関わらず、＜９５℃５ｍｉｎ−〔９５℃：３０ｓｅｃ−６０℃：３０ｓｅｃ〕×２５−４℃＞を使用する。
【０１００】
４．ＨＩＴＡＣＨＩ  ＳＱ−５５００で１時間予備泳動したゲルに、３のサンプルをアプライする。
５．適当な時間、電気泳動を行う。（泳動時間は解読塩基長により異なり、ｎ時間で解読できる塩基長は（ｎ−１）×１００である。）
６．ｆｏｒｗａｒｄ鎖とｒｅｖｅｒｓｅ鎖のａｓｓｅｍｂｌｅを行い、必要に応じて修正し塩基配列を決定する。
【０１０１】
２）オートシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３１０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
１．Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてシーケンスを読みたいＰＣＲ産物から過剰プライマーやｄＮＴＰを除去する。
２．Ｂｉｇｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、そのプロトコルに従い目的のプライマーでシーケンシング反応を行う。ＰＣＲ条件は＜９６℃：３０ｓｅｃ−〔９６℃：１０ｓｅｃ−５０℃：５ｓｅｃ−６０℃：４ｍｉｎ〕×２５−４℃＞を使用する。
【０１０２】
３．Ｃｅｎｔｒｉｓｅｐ  スピンカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、過剰のＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを除去する。
４．本体のセットアップを行う。
５．３で用意したサンプルをマニュアルに従い処理を行い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎでシーケンスを解読する。
７．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｐｙｓｉｓでｆｏｒｗａｒｄ鎖とｒｅｖｅｒｓｅ鎖のａｓｓｅｍｂｌｅを行い、必要に応じて修正し塩基配列を決定する。
【０１０３】
クローニング
複合微生物系で、ある遺伝子を標的としたＰＣＲを行いそのＰＣＲ産物をテンプレートとしてクローニングを行うと、系の中に存在する様々な微生物がある確率で単離した状態で得られ、さらにクローンライブラリーを作成することで、存在微生物の全体像を知ることができる。安水を処理している硝化脱窒型活性汚泥法中の微生物群集解析で、１６ＳｒＤＮＡのｐｒｉｍｅｒで得たＰＣＲ産物からクローンライブラリーを作成し、系統樹を書くことで系の中の微生物群集について考察することができる。
【０１０４】
クローニングは、大きく分けて次の２段階の反応からなる。
ライゲーション
ライゲーションとは、プラスミドベクターにインサート（特定の遺伝子産物（ＰＣＲ産物））を組み込む操作である。クローニングに用いられるプラスミドベクターは、インサートを組み込む必要があるため、制限酵素で切断されるクローニングサイトをもつ必要がある。また、最終的にプラスミドを大腸菌に感染させて、大腸菌を増やすことでプラスミドに組み込まれたＰＣＲ産物を増やすことをするので、プラスミドベクターは大腸菌に認識される複製開始点を持ち、さらにプラスミドを持つ大腸菌を選択的に増殖させるために薬剤耐性遺伝子を持つ必要がある。
プラスミドベクターの調製は自分でも行うことはできるが、上記のように調製済みのベクターが市販されている。
【０１０５】
ライゲーションの際には、ＰＣＲ産物の末端の修飾方法やベクター／インサート比に注意が必要である。末端の修飾方法にはいくつかあるが、比較的よく行われているのは、ＰＣＲでのＤＮＡ合成の際に付加されるデオキシアデノシン（ｄＡ）を利用したＴＡクローニングという方法である。また、ベクター／インサート比については、効率よくライゲーションが行われるように通常は１／１〜１／１０程度にする必要がある。
【０１０６】
トランスフォーメーション（形質転換）
トランスフォーメーションとは、ライゲーションを行ったプラスミドを、ＤＮＡの取り込む能力のある大腸菌のコンピテント細胞に感染させる操作である。トランスフォーメーションした細胞を薬剤の含んだプレート上に播くことにより、薬剤耐性を持つ大腸菌、すなわちプラスミドを含む大腸菌が選択的に増殖してコロニーを形成する。一つのコロニーは一種類のみのインサートを含む大腸菌から成るので、複合微生物系において微生物ごとに遺伝子を分けることができる。
【０１０７】
１）クローニングの方法の検討
インサートの末端修飾には幾つかの方法があり、それに伴いライゲーションの方法もいくつかあるが、本実験では、操作が比較的簡単で、形質転換体が７０％程度の確率で得られるといわれるＴＡクローニング法の変法を採用した。ＴＡクローニング法は、ＰＣＲでのＤＮＡ合成の際に付加されるデオキシアデノシン（ｄＡ）を利用した方法であり、鋳型ＤＮＡの配列によってはＰＣＲ産物にｄＡが付加しない平滑状のものが混ざった状態なので、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡ等の条件によりクローニング効率が変わることに注意を要する。
【０１０８】
ＴＡクローニング法として市販されているものの中で、具体的にはＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＵＡクローニング）のＫｉｔを使用した。これは、ＴＡクローニング法の変法で、Ｔの代わりにＵの付いたベクターを用いたものである。Ｔは非相補的な塩基（Ｇ，Ｃ，Ｔ）とハイブリダイズしやすく、Ｔが付加されたベクターはベクター同士のアニーリング等の結果をもたらす可能性が有るが、Ｕは非特異的なベースペアを形成しにくい為、クローニング効率が高いと言われている（ＱＩＡＧＥＮプロダクトガイド）。本実験においても、ＴＡクローニングとＵＡクローニングの比較を行った。ＴＡクローニングはインサート率（出現コロニー当たりのインサートが入ったコロニーの割合）が半分程度であったが、ＵＡクローニングはインサート率が９割程度と高く、ＵＡクローニング法の方がクローニング効率がよいことが明らかとなった。
【０１０９】
２）適切なベクター／インサート比の検討
ベクター／インサート比については、通常１／１〜１／１０程度にする。これは、インサートが少ないとインサート率が悪くなり、逆にインサートが多すぎると複数のインサートが一つのベクターに入ってしまうという可能性も出てくるためである。本実験では、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＳｙｓｔｅｍのＫｉｔで推奨されている１／５と１／１０の両方について実験を行った。その結果、１／５と１／１０の両者で１／１０の方がコロニー数が１、２割程度多かったものの、顕著な差ではなかったため、１／５や１／１０程度の比であればどちらでもよいという結論に達した。
【０１１０】
３）インサートの確認方法の検討
インサートの確認には、コロニーを液体培養で増やし、ミニプレップでプラスミドの抽出・精製を行った後にＰＣＲまたは制限酵素処理を行い、アガロースゲル電気泳動をする方法を使用した。
【０１１１】
以下、手順を説明する。
【０１１２】
１）ＰＣＲ産物（インサート）の精製
１．クローニングしたい目的のＰＣＲ断片を含むＰＣＲ産物を１サンプルにつき数本用意する。
２．それらを集め、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて過剰なプライマーやｄＮＴＰを除去して精製を行う。
３．精製したサンプルのＤＮＡ濃度を測定する。
【０１１３】
２）クローニング
クローニングの基本的操作は、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍのプロトコルに準じた。
１．Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅを作成する。（ライゲーション反応液内のベクター／インサート比については、各サンプルにつき１／５と１／１０の両方を調製する。）
２．ＧｅｎｅＡｍｐ９６００（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、１６℃で３０分間インキュベーションし、ライゲーション反応を行う。
【０１１４】
３．トランスフォーメーションの操作をプロトコル通りに行う。
４．トランスフォーメーション液を寒天プレートに播く。
５．出来上がったプレートを３７℃で１７時間程度（一晩）インキュベートする。
【０１１５】
３）プラスミド抽出
１．コロニーの生えたプレートを１時間程度４℃でコールドインキュベーションする。
２．プラスミドが入っているホワイトコロニーのみを楊枝でピックアップし、液体培地に入った１５ｍｌチューブに楊枝ごと入れる。
３．２を振とうしながら８〜１０時間培養する。
４．ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて付属のプロトコルに従いプラスミド抽出を行う。（このＫｉｔでは、大腸菌からプラスミドを溶出させ、精製、濃縮を行っていることになり、フェノール／クロロホルム抽出やエタノール沈殿等の操作を改めて行う必要は無い。）
【０１１６】
４）Ｍ１３  ＰＣＲ
１．得られたプラスミド抽出液をテンプレートとし、インサートよりも外側に位置している以下の表５に示すＭ１３プライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ条件はインサートの長さにより変える必要がある。
【０１１７】
【表５】
2004242578.tif 000006
【０１１８】
ＦＩＳＨ
ＦＩＳＨとはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの略である。ＦＩＳＨ法は、標的とする核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を持つ核酸（プローブ）を蛍光標識したものを用いる。この蛍光標識プローブを単離株や複合微生物系等のサンプルに加えることで、標的核酸にのみハイブリダイズさせ、サンプルを蛍光顕微鏡で観察すると、目的微生物を蛍光によって検出することが出来る。ＦＩＳＨ法を微生物の検出に用いる場合、リボソームにあるｒＲＮＡを標的とし、プローブにはオリゴヌクレオチドを用いて行う。リボソームは１つの細胞に１０３〜１０５個存在しており、プローブもそれだけの量の菌体に入ることになる為、菌体一つ当たりの蛍光が大きくなり、顕微鏡下で蛍光が観察可能になる。図２６にその原理を示す。
【０１１９】
ＦＩＳＨ法を微生物に適用する目的としては、まず、サンプル中に標的微生物が存在しているかどうかということ、また存在位置を調べることが挙げられる。さらには、検出された蛍光の面積または菌体数を計測することによりサンプル中の標的種の割合を調べることも可能である。
【０１２０】
１）検出方法
以下の実施例において、サンプル中に目的とする細菌がどれだけ存在するのかという定量を行うために、ＦＩＳＨ法を用いた。全細菌を標識する蛍光色素として、レーザーでしか検出できないＣｙ５は用いずＦＩＴＣを使用し、また標的細菌については、ＣＬＳＭの時と同様Ｃｙ３標識のプローブを使用した。２重染色を行い、共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＣＬＳＭ，Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で画像を取得して面積定量した。
【０１２１】
２）明るい蛍光を得る検討
蛍光顕微鏡で蛍光は検出できるようになったものの、グラム陰性細菌を標的とするプローブを用いた時でさえも、明るい蛍光がなかなか得られないという問題があり、幾つかの検討を行った。得られる蛍光が暗い最大の原因には、プローブの細胞へ浸透が上手くいっていないことであると考え、この原因を解決する手段として報告されている方法を試してみた。まずは、パラホルムアルデヒド固定の前に、５０質量％エタノール固定を行う方法であり、これはグラム陽性細菌等に有効であることが報告されている。パラホルムアルデヒド固定は通常１〜３時間程度行うが、その前にエタノール固定を１時間程度行うことで、浸透しにくい細胞へのプローブの浸透をよくすることを検討した。しかし、やはり満足のいく明るい蛍光は得られなかった。これは、対象サンプルが製鉄所の安水という特殊な排水を処理している活性汚泥であるということで、活性汚泥中に混入している不純物等がプローブの浸透を妨げている、または存在微生物自体の細胞構造やフロック構造によりプローブの浸透がしにくいという可能性が考えられ、通常の下水処理の活性汚泥に対しておこなうＦＩＳＨとはだいぶ感覚が異なるのではないかということが予想された。そこでさらに、プローブの浸透を良くする方法として報告されていた、パラホルムアルデヒド固定の後にＬｙｓｏｚｙｍｅとＭｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ処理を行ってからプローブをサンプルに作用させるということを試してみた。その結果、ある程度の明るい蛍光を得ることに成功した。また、プローブの浸透を検討していたのと同時に、超音波分散をかける時間についても検討を行った。分散をかけないで観察すると、大きなフロック構造を取っていた。そこで、フロック構造を出来るだけ壊しプローブの浸透をよくするために、当初は１０Ｗで３分間、超音波分散で処理をしていた。しかし、３分間処理するとフロック構造はほぼなくなるが、細胞まで壊して逆に蛍光が弱くなってしまうおそれがあると考えた。全く分散処理をしていないサンプルでも前述したＬｙｓｏｚｙｍｅとＭｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ処理をすれば蛍光が観察できることが分かり、その後は、１０Ｗで１分の超音波分散を行ったサンプルを用意し、顕微鏡観察・定量を行った。１分間という長さは、本サンプルに関して蛍光顕微鏡を用いて定量化する上で、細胞を壊さない程度かつ定量化に必要な最小限の長さであると判断した。
【０１２２】
３）複数のプローブを同時に作用させる時のプローブ濃度とホルムアミド濃度の検討
本実験でのＦＩＳＨは、定量化をする手段として利用したので、全細菌（ＥＵＢプローブ）に対する標的細菌の割合を求める為に、同時に複数のプローブを作用した。例えば、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ−αの定量の際は、ＥＵＢ（ＦＩＴＣ標識）とＡＬＦ９６８（Ｃｙ３）を混ぜてサンプルにハイブリダイズすることとなり、さらには本実験でのＥＵＢはＥＵＢｍｉｘという３つのプローブを混ぜたものを用いている。ＥＵＢｗｍｉｘを先に調製してから、ターゲットプローブと混ぜた。この方法により、プローブを複数混ぜることでハイブリバッファーのホルムアミド濃度が、設定よりも低くなることをある程度防ぐことができた。
【０１２３】
以下の表６にプローブの混合方法を示す。
【０１２４】
【表６】
2004242578.tif 000007
【０１２５】
以下、ＦＩＳＨの手順を示す。
【０１２６】
１）サンプルの固定とスライドガラスの作成
１．液体窒素で保存していたサンプルを常温で溶かし、５０質量％エタノールで４℃１時間の固定を行う。
２．３質量％パラホルムアルデヒドで４℃、１〜３時間サンプルを固定する。
３．ＰＢＳとエタノールを１：１で混ぜた溶液に懸濁させ、−２０℃で保存する。
４．保存しておいたサンプルを、１０Ｗで１分間超音波分散を行う。
５．スライドガラスをゼラチンコート（組成：０．１質量％牛骨ゼラチン、０．０１質量％クロムみょうばん）する。
【０１２７】
６．固定したサンプルについて、ゼラチンコートしたスライドガラスのウェルに２μｌずつ滴下し、空気乾燥する。
７．５を５０質量％、８０質量％、９８質量％エタノールに順に３分ずつ浸し、脱水を行う。（出来たスライドガラスは半永久的に保存可能である。）
【０１２８】
２）ハイブリダイゼーション
１．プローブの浸透をよくするために、ｌｙｓｏｚｙｍｅとｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎで処理を行う。
ｌｙｓｏｚｙｍｅ処理：ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解した２５００ｕｎｉｔｓのｌｙｓｏｚｙｍｅをウェルに滴下し１０分処理を行う。その後５０質量％、８０質量％、９８質量％エタノールに順に３分ずつ浸し、脱水を行う。
ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ処理：０．１ｍｏｌ／ｌ  のｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８）に溶解した５０ｕｎｉｔｓのｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎをウェルに滴下し１０分処理を行う。その後５０質量％、８０質量％、９８質量％エタノールに順に３分ずつ浸し、脱水を行う。
２．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを以下の表７に示すように調製する。
【０１２９】
【表７】
2004242578.tif 000008
【０１３０】
３．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで湿らせた紙を入れた５０ｍｌチューブを４６℃で数分インキュベーションする。
４．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒとプローブを表６に示したように混合する。
５．各ウェルに３を適当量滴下し、２の容器に入れて、４６℃で３時間Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行う。（ＥＵＢプローブとその他のプローブの２重染色でＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ条件の異なるプローブを使用する際、ＥＵＢ以外の標的プローブのホルムアミド濃度に合わせて１度でＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行う。）
６．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ終了後、以下の表８に示す組成をもつＷａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで、洗い流して浸し、４８℃で２０分間洗浄する。
【０１３１】
【表８】
2004242578.tif 000009
【０１３２】
７．ＭｉｌｌｉＱで、スライドガラスについたＢｕｆｆｅｒを洗い流し、即座に水分を切って空気乾燥する。
８．ＤＡＰＩ染色が必要な時は、ＤＡＰＩ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１．２５μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ，０．９Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．２））を１０μｌずつウェルに滴下し、５分間の染色を行う。
９．蛍光退色防止剤Ｓｌｏｗ  Ｆａｄｅ  Ｌｉｇｈｔをスライドガラスに滴下し、カバーガラスをのせ、マニュキュアコートで周りを固めて乾燥を防ぐように、プレパラートとする。
【０１３３】
３）顕微鏡観察と画像取得
顕微鏡観察は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１蛍光顕微鏡を用いた。ここでは、画像取り込みの際に注意した点を挙げる。
・細胞が出来るだけばらけているところを対象として画像を取得した。
・蛍光標識ごとに画像取り込みの際のシャッタースピードをマニュアルで操作し、バックグランドとシグナルの差がはっきりと区別できるようにする。具体的には、取り込んだ画像について、ＲＧＢカラーの各色のピクセル数を見ながら、蛍光標識に相当する色のピクセル数がバックグランドの部分で５０以下になるようにした。
・明らかに自家蛍光であるシグナルが入っている画像は解析対象からはずした。
・定量化のため、同一視野について取り込んだＥＵＢプローブの画像と標的プローブの画像、そして位相差画像を１セットとして、評価対象のサンプルにつき２０セット以上取得した。
【０１３４】
４）定量解析
蛍光面積の定量には、画像解析システムＱｗｉｎ６００ＨＲ（Ｌｅｉｃａ）を使用する。
１．Ｑｗｉｎ６００ＨＲ（Ｌｅｉｃａ）で、取得したＲＧＢカラー画像ファイルを開き、Ｒ，Ｇそれぞれの色の明るさがある数値以上のピクセルを選択する。ある数値というのは、画像ファイルによって多少前後するが、多数の画像を解析しているうちに、数値がほぼ決まり、ある程度オートマチック化できる。しかし、主観に頼らざるを得ないところも少なからずある。
２．同一視野のＥＵＢとターゲットのそれぞれの画像について、選択した部分の面積を求める。
３．２の比をとることで、ターゲットの存在比を求める。
４．誤差をできるだけ少なくする為に、取得している２０セット以上について１〜３の操作を行い、平均を求め、これをターゲットの全細菌に対する割合とする。
【０１３５】
【実施例】
実施例１：パイロットプラントの運転
２００１年５月、製鉄所において安水のＣＯＤ削減すなわち、フェノール類などの有機物と、チオシアン、チオ硫酸などの硫黄化合物の除去とアンモニアの除去を行う試験的なパイロットプラントの運転を開始し、２００３年１月の現時点まで比較的安定な運転を行っている。この間、水質データのモニタリングを行い、また定期的に活性汚泥サンプルの採取を行った。
【０１３６】
図２７に、安水処理プロセスのパイロットプラントの概要を示す。
パイロットプラントは、安水のＣＯＤ削減とアンモニア除去を行うため硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法を採用している。対象製鉄所において発生する実安水を海水希釈混合槽で海水によって１：２（安水：海水）に希釈する。
希釈後の組成を以下の表９に示す。
【０１３７】
【表９】
2004242578.tif 000010
【０１３８】
希釈排水は嫌気槽（脱窒槽）、硝化槽（好気槽）、沈殿槽を経て処理される。硝化液の循環率は２００％、汚泥返送率は１００％であり、また処理水へ一部のＳＳが流出している為ＭＬＳＳが安定しており、汚泥の引き抜きは行っていない。各水質項目の測定は、希釈原水（流入水）、脱窒槽出口、処理水の３ヶ所と硝化槽・脱窒槽で行い、測定項目を以下の表１０に示す。また微生物群集解析用の活性汚泥サンプルは脱窒槽と硝化槽の２ヶ所から採取した。
【０１３９】
【表１０】
2004242578.tif 000011
【０１４０】
以下にパイロットプラントの運転状況を示す。途中でプラントの制御方法を変えたりしたため、２００１年５月〜２００２年７月までをＲＵＮ１〜ＲＵＮ４と分けた。
以下の表１１にＲＵＮ１とＲＵＮ２の概要を示す。
【０１４１】
【表１１】
2004242578.tif 000012
【０１４２】
また、ＲＵＮ１〜ＲＵＮ２の基質や窒素分の処理状況については、図２８〜図３１に示す。
【０１４３】
１）基質の処理状況
ＲＵＮ１〜ＲＵＮ２を通して、流水排水中に含まれる基質のうち、フェノール類、チオシアンは処理水ではほとんど残っておらず、ほぼ全て処理されている。チオ硫酸については、流入２００〜４００ｍｇ／Ｌのうち数１０ｍｇ／Ｌが処理水に出てきてしまっているが、大部分は処理されている。よって、活性汚泥中の主な基質であるフェノール類やチオシアン、チオ硫酸は脱窒の基質として又は酸化分解を受けて、硝化脱窒処理プロセスにおいてほぼ処理されることがわかった。
【０１４４】
２）窒素分の処理状況
原水中の含有窒素分の処理状況については、ＲＵＮによって異なるので、以下に記す。
ＲＵＮ１
原水中のＤＴＮは６００〜１０００ｍｇ／Ｌ程度で推移している。ＲＵＮ１の２００１年５月は立ち上げの為、窒素の処理が安定せず硝化率・窒素除去率共に０〜０．０３というように低い値で大きく変動している。ＲＵＮ１の２００１年７月４日は一時的に性能が良好で、ΔＤＴＮが４００ｍｇ／Ｌを超えているが、その後はΔＤＴＮが２００ｍｇ／Ｌ前後での変動にとどまっており、硝化率・窒素除去率は平均で０．３程度となっている。
処理水中にＮＯ２−Ｎはごく微量残っているが、ＮＯ３−Ｎはほとんど残っていないことから、硝化された窒素分の脱窒は上手く機能しており、硝化が律速となっている系であると考えられる。
【０１４５】
ＲＵＮ２
２００２年１月２３日〜２００２年２月１３日に汚泥槽腐食で改修工事のため原水を停止して空運転をし、その後２００２年２月１４日に製鉄所実機（標準活性汚泥法）の汚泥を等量（１：１）加えて運転を再開した経緯があり、ＲＵＮ２はＲＵＮ１とは種汚泥が異なる系での立ち上げ期である。また、ＲＵＮ１で硝化が律速になっている可能性のあることがわかったので脱窒槽と硝化槽の比を１：２から１：３とし、硝化槽の容積を増やした。ＭＬＶＳＳについては、ＲＵＮ２はＲＵＮ１と比べると硝化槽、脱窒槽の両方で４０００ｍｇ／ＬとＲＵＮ１よりは低い値で推移している。
【０１４６】
立ち上げの当初（２００２年２月２０日）は一時的に、硝化率・窒素除去率はよかったが、その後、２００２年４月２３日頃まで性能が悪くなり、それから２００２年６月３日までは安定しながら徐々に硝化率・窒素除去率がよくなり、最も良い時で０．４程度、ＤＴＮは約４００ｍｇ／Ｌ脱窒されていた。硝化や脱窒に関して徐々に性能がよくなるという立ち上げ期を比較的良くモニタリングできた系であると言える。
【０１４７】
処理水中にはＮＯ３−Ｎはほとんど出ていない。ＮＯ２−Ｎについては性能がよくなるにつれて、５０〜８０ｍｇ／Ｌ程度処理水中に残っている。これは、アンモニア態窒素が硝酸態窒素まで硝化されずに亜硝酸態窒素の状態で止まってしまっているか、または脱窒素反応の過程で完全に窒素まで脱窒されずに途中で止まってしまっている可能性が考えられる。しかし、いずれにしても処理水中に残っているＮＯ２−Ｎは５０〜８０ｍｇ／Ｌ程度であり、硝化された窒素分のほとんどについては脱窒されていると言える。ＲＵＮ１と２を通して、硝化率は平均０．２〜０．３程度と低く、硝化が律速となっていてその為に窒素除去率も硝化率とほぼ同じ値で低く推移していると考えられる。
【０１４８】
実施例２：ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による微生物群集モニタリング
ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法は、環境サンプル等の培養できない微生物の遺伝子でも検出、またバンドとして可視化でき、さらにはバンドを切り出すことでそのバンドの塩基配列情報を得ることができるため、近年、複合微生物系である環境サンプルの解析などにおいて急速に普及してきた技術である。また、微生物の変化を系時的にバンドの変化として追うことができるという利点を有しており、安水硝化脱窒処理プロセスのパイロットプラント内に存在している微生物群集をモニタリングする手法として適切であると考え、パイロットプラントのＲＵＮ１、ＲＵＮ２の微生物群集についてＰＣＲ−ＤＧＧＥ法を用いてモニタリング、解析を行った。
【０１４９】
以下、手順を説明する。
【０１５０】
パイロットプラントＲＵＮ１とＲＵＮ２において、系時的に採取した汚泥サンプルからＤＮＡを抽出し、ＧＣ付きプライマーで１６ＳｒＤＮＡのＶ３領域（３５７ｆ−５１８ｒ）を増幅して解析対象とした。ＰＣＲ条件は、＜９５℃：１０ｍｉｎ−〔９４℃：３０ｓｅｃ−５３℃：３０ｓｅｃ−７２℃：３０ｓｅｃ〕×３５−７２℃：１０ｍｉｎ−４℃＞である。その後、ＤＧＧＥのプロトコルに従い４０〜６０質量％の変性剤濃度勾配をつけたゲルを用いて、１３０Ｖで６時間電気泳動を行った。
【０１５１】
予備実験
硝化槽サンプルと脱窒槽サンプルの比較
同日に採取した活性汚泥サンプルについて、硝化槽と脱窒槽の出口ではＤＧＧＥのバンドパターンが異なるのかどうかの検討を行った。結果を図３２の左図に示す。左から２００１年５月１日の硝化槽と脱窒槽、２００１年５月７日の硝化槽と脱窒槽であり、この結果から、硝化槽と脱窒槽でのバンドパターンの差異はほとんどないと考え、脱窒槽のサンプルのみで解析を行うことにした。
【０１５２】
泳動時間の検討
同一のサンプルを用いて、サンプルを１時間ごとに異なるウェルにアプライし、５〜８時間の泳動時間でバンドパターンの異なり方を見て、最適泳動時間の検討を行った。結果を図３２の右図に示す。この結果を見ると、今回の実験の最短である５時間でバンドの分離は完了していた。よって解析対象のサンプルについては、バンドパターンを見るには５ｈの泳動で充分であることが分かった。ゲルの下の方にあるバンドは６時間泳動すれば、ほぼ止まりきれいに分離している。８時間まで泳動すると、上の方にあるバンドの間隔がつまってしまい、バンドの切り出しをするにはよくないと考えられる。これらのことから、実験対象のサンプルのＤＧＧＥ解析においては、泳動時間は５時間で充分であり、下の方にあるバンドの切り出し等を行うには６時間泳動を行うとよいことが分かった。
【０１５３】
結果・考察
予備実験より、同日に採取した硝化槽の汚泥と脱窒槽の汚泥では、ＤＧＧＥのバンドパターンはほとんど変化しないことが分かったので、脱窒槽の汚泥サンプルのみを用いてＲＵＮ１とＲＵＮ２の２００２年４月１６日までに関してＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による解析を行った。その結果を図３３に示す。
【０１５４】
図３から、まず、ＲＵＮ１とＲＵＮ２を通してバンドの数が、比較的少ないことが読み取れる。通常の下水を処理する活性汚泥をＰＣＲ−ＤＧＧＥ法で解析すると、バンドが密集してしまうのだが、このようにバンド数が少ないのは、安水という特殊な排水を処理している汚泥であり、フェノール類やアンモニアなどが高濃度に含まれる系で生存できる微生物が限られている為であると考えられる。
また、ＲＵＮ１とＲＵＮ２では種汚泥が異なる（種汚泥を採取したプラントは一緒で採取時期が異なる）が、性能が安定してきた２００１年７月４日以降のバンドパターンはあまり変化がないことから、安水の硝化脱窒処理を行うプロセスに存在する微生物相はほとんど変化しないのではないか、ということが示唆された。
【０１５５】
塩基配列解読によるＤＧＧＥバンドの近縁種決定
得られたバンドについて、それぞれどのような微生物なのかを確認し、パイロットプラント内に存在する微生物の全体像を把握するため、各バンドの近縁種の決定を試みた。
方法
ＤＧＧＥのゲルから主要なバンドを切り出し、滅菌ｍｉｌｌｉＱとともに凍結融解を３回繰り返すことで、ゲル片からＤＮＡを回収し、それをテンプレートとしてＰＣＲ−ＤＧＧＥを行うという精製の操作を繰り返し、ＤＧＧＥのゲル上で一本のバンドにした。最増幅のＰＣＲ条件は、＜９５℃：１０ｍｉｎ−〔９４℃：３０ｓｅｃ−５３℃：３０ｓｅｃ−７２℃：３０ｓｅｃ〕×２５または２０−７２℃：１０ｍｉｎ−４℃＞である。その後、精製したＤＮＡをテンプレートとしてＧＣ無しのプライマーでＶ３領域の３５７ｆ−５１８ｒ部位を再増幅（ＰＣＲ条件：＜９５℃：１０ｍｉｎ−〔９４℃：３０ｓｅｃ−５３℃：３０ｓｅｃ−７２℃：３０ｓｅｃ〕×２５−７２℃：１０ｍｉｎ−４℃＞）し、シーケンシング反応のテンプレートとした。シーケンシング反応は先に説明したプロトコルに従い、またシーケンサーはＨＩＴＡＣＨＩ（ＳＱ−５５００）を用いた。それぞれの３５７ｆ−５１８ｒの塩基配列を決定した後、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｒａｌ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｂｌａｓｔ．ｓｈｔｍｌ）を用いて既知種の中から相同性の高い塩基配列を検索し、ＤＧＧＥ各バンドの近縁種を決定した。系統樹は、ＤＤＢＪのＣｌａｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｈｙｐｅｒｎｉｇ．ｎｉｇ．ａｒ．ｊｐ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｓｈｔｍｌ  ）によりアライメント解析を行い、作成した。既知種の塩基配列は、Ｅｎｔｒｅｚ−ＰｕｂＭｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／  ）のＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅで、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．を用いて取得した。
【０１５６】
結果・考察
図３４と図３５は、ＲＵＮ１とＲＵＮ２それぞれについてＰＣＲ−ＤＧＧＥ法で解析し、切り出したバンドを示した写真である。ＲＵＮ１の２００１年７月４日を解析したレーンから主要バンドを１７本切り出し（１−１〜１−１７）、またＲＵＮ２の２００２年５月２８日を解析したレーンから主要バンドを１５本切り出した（２−１〜２−１５）その後に、塩基配列を解読して近縁種を特定した結果を以下の表１２と表１３に示す。塩基配列の決定は、１６ＳｒＤＮＡのＶ３領域の２００ｂｐ弱について行っており、２００ｂｐ程度では詳しい系統解析は出来ないが、属レベルまでの決定は可能であると言われている。また、２００ｂｐでは類似度が１００％のもの以外は同一種である可能性は大変低く、あくまでも最近縁種ということを念頭におく必要がある。
【０１５７】
【表１２】
2004242578.tif 000013
【表１３】
2004242578.tif 000014
【０１５８】
結果を見ると、主要バンドは少ないつまり存在微生物の種類は少ないが、真正細菌の様々なグループに属していることがわかる。切り出したバンドとそれぞれの最近縁種を入れて描いた系統樹（図３６）では、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＣＦＢ、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ、グラム陽性細菌（ＨＧＣ，ＬＧＣ）など、に属している細菌が存在していることが見て取れる。また、ＲＵＮ１とＲＵＮ２を通して性能が安定している時に常に濃いバンドを形成しているバンド１−５（２−４）と１−８（２−６）はそれぞれ、γ−ＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａのＥｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａｃｅａｅに類似度９３％で近縁なもの、そしてＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐのＤｅｉｎｏｃｏｃｃｉに類似度９２％で近縁な細菌であることがわかった。両者とも類似度低いことから、２００ｂｐ以上読んだ時に最近縁種が変わる可能もあるが、いずれにしてもバンドが濃く目立っているので、この系において注目すべき細菌であることは確かである。
【０１５９】
実施例３：クローンライブラリー作成による系統解析
ＤＧＧＥバンドを切り出して精製し塩基配列を決定する場合、絶対量が少なくある程度の濃さとして現れないバンドを構成する微生物や、近くにバンドがあり精製が困難なバンドを構成する微生物は、塩基配列を決定することができないという問題点がある。また、ＤＧＧＥの検出限界は５００ｂｐ前後であり長くなるほどバンドが鮮明でなくなると言われていることから、実施例２では２００ｂｐ前後で解析を行っており、詳しい系統解析を行うには不充分な長さであった。
【０１６０】
これらの理由により、さらに詳細な系統解析を行う目的で、１６ＳｒＤＮＡ全長のクローニングを行い、その後、ＤＧＧＥからのバンド切り出しによる塩基配列決定より長い３５７ｆ−９０７ｒ部位（約５５０ｂｐ）の塩基配列を決定してクローンライブラリーを作成した。クローニングでは、ＰＣＲで増幅することができさえすれば、サンプル内に存在する微生物全てが、ある確率でクローンとして得られることになる。
【０１６１】
方法
クローニングの操作は、先に説明したプロトコルに従って行った。
ＲＵＮ１の性能安定時２００１年１１月２１日脱窒槽のサンプルについて、ＤＮＡ抽出液から２７ｆ−１５１８ｒ（Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ａ）と２７ｆ−１４９２ｒ（Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂ）部位をＰＣＲ増幅し（ＰＣＲ条件＜９５℃：１０ｍｉｎ−〔９４℃：３０ｓｅｃ−５０℃：３０ｓｅｃ−７２℃：２ｍｉｎ〕×２５−７２℃：１０ｍｉｎ−４℃＞）、その産物を精製してクローニングを行った。その後、得られたコロニープレートからそれぞれのクローンライブラリー用に５０クローン強ずつ取り、液体培養後プラスミド抽出をして、Ｍ１３プライマーを用いてＰＣＲ増幅をした（ＰＣＲ条件＜９５℃：１０ｍｉｎ−〔９４℃：３０ｓｅｃ−５０℃：３０ｓｅｃ−７２℃：２ｍｉｎ〕×３０−７２℃：１０ｍｉｎ−４℃＞）。
【０１６２】
次に、ＤＧＧＥでクローン産物のスクリーニングを行うために、Ｍ１３ＰＣＲ産物をテンプレートとして同様にＶ３領域を増幅し、ＤＧＧＥによるスクリーニングを行った。通常、クローン産物のスクリーニングにはＲＦＬＰ法を用いるが、既に２００１年１１月２１日のサンプルについては、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ解析を行っており、それをマーカーとすることである程度のスクリーニングを行えるのではないかと考えた。クローニングライブラリー作成の為に最終的に塩基配列を読むものについては、スクリーニングの結果同じ位置にいくつかバンドがあるものは、それらのうちの一つを選び、その他のものについては全て、シーケンスを行う対象とした。
【０１６３】
クローンライブラリーを作成する為の塩基配列の決定は、３５７ｆ−９０７ｒの５５０ｂｐ程度とした。まず、Ｍ１３  ＰＣＲ産物をテンプレートとして３５７ｆ−９０７ｒでＰＣＲ増幅した（ＰＣＲ条件＜９５℃：１０ｍｉｎ−〔９４℃：３０ｓｅｃ−５３℃：３０ｓｅｃ−７２℃：１ｍｉｎ〕×３０−７２℃：１０ｍｉｎ−４℃＞）。それをシーケンス反応のテンプレートとし、ＡＢＩ３１０（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ３１０）のプロトコルに従いシーケンス反応を行った。その後ＡＢＩ３１０で、３５７ｆ−９０７ｒ部位の塩基配列を解読した。
【０１６４】
塩基配列を決定した後に、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｒａｌ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｂｌａｓｔ．ｓｈｔｍｌ）を用いて既知種の中から相同性の高い塩基配列を検索し、各クローンの近縁種を決定した。また、近縁種が似ているものどうしを集めて、ＤＤＢＪのＣｌａｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｈｙｐｅｒｎｉｎｇ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｓｈｔｍｌ）によりアライメント解析を行い、９７％以上配列が一致しているものを１つのＯＴＵ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ＴａｘｏｎｏｍｙＵｎｉｔ）とした。さらに、ＤＤＢＪのＣｌａｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｈｙｐｅｒｎｉｇ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｓｈｔｍｌ  ）でアライメント解析を行い、系統樹を作成した。系統樹作成の際の既知種の塩基配列は、Ｅｎｔｒｅｚ−ＰｕｂＭｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／  ）のＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅで、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．を用いて取得した。
【０１６５】
結果・考察
Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ａ
まず、パイロットプラントの２００１年１１月２１日脱窒槽の汚泥について１６ＳｒＤＮＡ２７ｆ−１５１８ｒ部位のクローニングを行い、各クローンの３５７ｆ−９０７ｒ部位の塩基配列決定し作成したＣｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ａの結果を図３７に示す。全５２クローンのＣｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ａの内訳を見てみると、活性汚泥では通常優占しているＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａが大部分を占めており、α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａに近縁な細菌が１０％、β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａが２２％、γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａが３４％、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐが３０％そしてＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ等その他が４％となっていた。クローニングはＰＣＲ等のバイアスがかかる為、定量的ではないが、活性汚泥ではあまり報告例が無くＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの仲間には属さないＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐに近縁な細菌が３０％を占めていることは注目に値すると考えられる。
【０１６６】
以下の表１４と表１５に、各ＯＴＵの最近縁種等の情報を示す。
【０１６７】
【表１４】
2004242578.tif 000015
【表１５】
2004242578.tif 000016
【０１６８】
個別に見てみると、ＯＴＵ８のγ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ；Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ；Ｔｈｉｏｒｈｏｄｏｖｉｎｒｉｏに９０％で近縁な細菌が１２クローン（２３％）、ＯＴＵ２０のＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉに９０％で近縁な細菌が９クローン（１７％）が目立って多いことが分かった。これらの２種の細菌は、実施例２の結果のＤＧＧＥで濃く目立っていたものとして２つ示した細菌と一致しており、ＤＧＧＥのバンドパターンとクローンライブラリーの両方の結果から、系の中で優占している可能性が高いと考えられる。また続いて多かったのは、ＯＵＴ４のＡｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅに属する細菌（１２％）や、ＯＴＵ２１のＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉに近縁な細菌（１２％）であった。
【０１６９】
Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂ
Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ａでは、ＤＧＧＥから切り出したバンドの塩基配列解読で比較的多く存在した、ＣＦＢに近縁な細菌が全くいなかった。この原因として、ＰＣＲのプライマーセットによるバイアスが考えられた為、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒの他のプライマーセットを用いてＣｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂを作成した。具体的には、クローニングを行うときに、Ｃｌｏｎｅｌｉｂｒａｒｙ  ＡではインサートとなるＰＣＲ産物を２７ｆ−１５１８ｒで得たが、Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂでは、２７ｆ−１４９２ｒとした。Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ａと同じく３５７ｆ−９０７ｒ部位の塩基配列を決定したが、全４５クローンの内訳は図３８のようになった。予想通り、ＣＦＢに近縁な細菌がＯＴＵ１２−１９の７種類得られ、ＣＦＢ全体の割合も２５％と多かった。これは、明らかにプライマーによるＰＣＲバイアスがかかっていることを示した結果となった。また、他の微生物グループについては、β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａに近縁な細菌が１４％、γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａが２７％、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐが３０％となっており、これらはＣｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ａの割合とほぼ一緒である。また、α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａに近縁な細菌は０％と、全く検出されなかったが、この原因は、１４９２ｒのプライマーは一般的なＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａを引っ掛けるようにデザインされているので、プライマーによるＰＣＲバイアスよりも、クローン数が少なく確率的にα−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａのクローンが得られなかったと考えられる。クローンライブラリーを作成する際のクローン数は少なくとも５０クローン程度は必要であるとされており、クローンを多く取れば取るほどそのライブラリーの正確さは増すことになる。
【０１７０】
Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ＡとＢのまとめ
上述のように、Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ＡとＣｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂでは、プライマーによるＰＣＲバイアスがかかった顕著な差が見られたので、その差を出来るだけ解消しＣｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙの構成クローンについて総合的に判断する目的で、Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ＡとＢの全９７クローンをまとめた円グラフを図３９として作成した。まとめた結果、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａが全体の約５３％を占めており、その内訳はα−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａに近縁な細菌が５％、β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａが１７％、γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａが３１％であった。さらに、ＣＦＢに近縁な細菌が１２％、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐに近縁な細菌が２９％、グラム陽性細菌等のその他が４％であった。グループレベルでは、Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ＡとＣｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂの両方で多かった。γ−ＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａとＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐに属する細菌がそれぞれ３０％前後となっていることが特徴的である。また、個別に見ても、各Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙと同様にＯＴＵ８のγ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ；Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ；Ｔｈｉｏｒｈｏｄｏｖｉｎｒｉｏに近縁な細菌が２３％、ＯＴＵ２０のＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉに近縁な細菌が１６％と多く、続いて、ＯＴＵ２０と非常に近いＯＴＵ２１のＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐに近縁な細菌も１２％と比較的多かった。
【０１７１】
Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙで得られたＯＴＵ数は２５であり、下水や他の産業排水を処理している活性汚泥中の微生物相と比較すると、存在している微生物の種類が少ないと考えられる。また、一種類の微生物で数１０％を占めるものもいることから、２５ＯＴＵｓの中でも優占している微生物が存在することがわかった。また、微生物の種類は比較的少ないが、それぞれが属するグループはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの各ｄｉｖｉｓｉｏｎ、ＣＦＢ、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、ＨＧＣグラム陽性細菌、と広く分布していることも分かった。
【０１７２】
次に、表１４と表１５に整理したＣｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ＡとＢのクローンについて、その最近縁種を含めた系統樹（図４０）を作成した。Ｏｕｔ  Ｇｒｏｕｐは古細菌（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＲＣ１８０７３）に設定し、ｂｏｏｔ  ｓｔｒａｐは１０００回とした。系統樹からは、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの仲間、ＣＦＢの仲間、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐの仲間と枝分かれが大きくグループ化していることが読みとれる。また、グラム陽性細菌等その他の細菌（ＯＴＵ２３，２４，２５）は古細菌に近いところから比較的深い枝として分かれている。各グループに注目すると、まずＣＦＢに属すると思われるクローンはＯＴＵ１２−１９と種類が多いが、同じＣＦＢのＢａｃｔｅｒｉｏｒｏｉｄｅｔｅｓに近縁な細菌であってもそれぞれが比較的離れた位置に存在し、多様性が高いことがわかった。さらに、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐに近縁なクローン（ＯＴＵ２１−２２）は互いに近い位置に存在しているが、それぞれの最近縁種としてデータベースであがっていたＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐの細菌とは異なった枝に位置している。このことから、ＯＴＵ２１−２２は、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐには属す可能性が高いが、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐで報告されている細菌数は少ないこともあり、未だ報告されていない新しい科や属に属する細菌であることが予想される。
【０１７３】
実施例４：ＦＩＳＨ法によるグループレベルの微生物群集定量解析
実施例１〜３で述べた結果は、すべてＤＮＡ抽出やＰＣＲを経て得たデータであり、これらは多かれ少なかれＤＮＡ抽出とＰＣＲのバイアスがかかっていると言ってよい。ＤＮＡ抽出では、グラム陽性細菌は細胞壁が硬い為抽出されにくいこともあると言われているように、細菌によって抽出され易さが異なる。またＰＣＲでは、１６ＳｒＤＮＡのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒを用いて、系内に存在する全ての細菌を完全に拾うことは不可能であり、それは、ある細菌はＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒの結合部位の配列にミスマッチがあってｐｒｉｍｅｒが結合できなかったり、またある細菌は遺伝子の立体構造によりｐｒｉｍｅｒが上手く結合できなかったりすることがある為である。さらには、ＰＣＲはサイクル反応を繰り返すことで遺伝子を増幅させる操作であるので、ＰＣＲの後では、微生物間の量の関係を議論することには注意が必要である。
【０１７４】
このようにＤＮＡ抽出、ＰＣＲの操作を経ると定量性がほぼ失われてしまい推測の領域となってしまう。そこで、ＤＮＡ抽出やＰＣＲを行わずにｉｎ  ｓｉｔｕの状態で直接顕微鏡観察が出来、半定量的な手法とされているＦＩＳＨ法を用いて、違う角度からパイロットプラントの微生物群集解析を行った。
【０１７５】
方法
基本的な操作は、先に説明したプロトコルに従った。
解析したサンプルは、実施例３で、ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙを作成したものと同じ、パイロットプラント２００１年１１月２１日脱窒槽のサンプルであり、定量評価用に用いたプローブは以下の表１６の通りである。
【０１７６】
【表１６】
2004242578.tif 000017
【０１７７】
具体的には、グループレベルのプローブである各Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＣＦＢ、ＨＧＣグラム陽性細菌それぞれのプローブを使用し、全細菌（ＥＵＢ）に対する割合を求めた。
【０１７８】
実施例３の手法に従い、それぞれのターゲットプローブとＥＵＢプローブを混ぜたプローブをサンプルにアプライし、ハイブリダイゼーションを行った。Ｗａｓｈｉｎｇの操作後、場合に応じて５分間ＤＡＰＩ染色を行った。ＦＩＳＨ画像は、蛍光顕微鏡ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５１を用いて、ＣＣＤカメラを通して取得した。定量評価を行う為、各プローブにつき、同視野についてのＥＵＢ画像（ＦＩＴＣ標識）、ターゲット画像（Ｃｙ３標識）、位相差の画像のセットを２０セットずつ撮った。また、ＥＵＢプローブが全細菌の何％にハイブリダイズしているかを確認する目的で、ＤＡＰＩ染色についても１０視野程度取得した。得られた、画像の解析及び定量操作には、画像解析ソフトＬｅｉｃａ，Ｑｗｉｎ６００を使用した。画像解析ソフトによる定量方法の詳細は、実施例３で説明した通りである。
【０１７９】
結果・考察
使用プローブの検討
ＦＩＳＨのプローブに関する既往の研究については、実施例２に述べた。それらを踏まえた上で、本サンプルの微生物グループレベルでの解析に使用するＦＩＳＨプローブを検討した。まず、ＤＧＧＥバンドの切り出し後のシーケンスや、クローンライブラリーの微生物近縁種の結果で、α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、δ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＣＦＢ、高ＧＣグラム陽性細菌、低ＧＣグラム陽性細菌、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ／Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｇｒｏｕｐの９つのグループに近縁な微生物が得られているので、この９つのグループに特異的なプローブを使用して解析することを考えた。しかし、δ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＬＧＣグラム陽性細菌、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ／Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｇｒｏｕｐの３つのグループについては、適当な既存プローブが見つからず、残りの５つのグループについてのみＦＩＳＨを行い定量することにした。
【０１８０】
５つのプローブとＥＵＢプローブについてもそれぞれ検討した点があり、以降それらについて記す。まず、α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａについては、本サンプルについてＡＬＦ１ｂとＡＬＦ９６８の両方を試してみた。比較した結果、明らかに従来のＡＬＦ１ｂの方が蛍光を発している細胞が多く、ＡＬＦ９６８の方は光っている細胞はまれであった。しかしながら、最近の論文ではα−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの定量評価に、ＡＬＦ９６８を使用しているものが目立つことから本研究においてもＡＬＦ９６８を用いることにした。
【０１８１】
次に、β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａとγ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａについては、通常使用されているプローブは、ＢＥＴ４２ａとＧＡＭ４２ａである。これらは、表１６のように２３ＳｒＲＮＡの同一の部分をターゲットとしていてプローブの配列は一塩基のみ異なるため、それぞれのプローブが１ミスマッチで違うターゲットにくっついてしまうおそれがあることが報告されている。本サンプルについても、ＢＥＴ４２ａやＧＡＭ４２ａのプローブをそれぞれ単独で用いた時に、ある程度細胞が密集している所はＢＥＴ４２ａやＧＡＭ４２ａでも光ってしまっているように思えた。そこで、出来るだけ正確に定量する為に、β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａを定量する際はＢＥＴ４２ａと共にＢＥＴ４２ａ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ（ＧＡＭ４２ａと同じ塩基配列を持つ蛍光標識なしのプローブ）をアプライし、γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａについても同様にＧＡＭ４２ａ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ（ＢＥＴ４２ａと同じ塩基配列を持つ蛍光標識なしのプローブ）を利用した。
【０１８２】
さらに、ＣＦＢをターゲットとするプローブについては、ＣＦ３１９ａがもともと有名なプローブとして存在している。ＣＦ３１９ａは、ＣＦＢ全体のプローブとして利用するには、網羅していない細菌も多く不完全であるということで、最近では他のプローブも開発されていている。そこで、それらのプローブを混合して使用することを考えたが、本サンプルに存在するＣＦＢ数種の全長塩基配列を決定していない為、開発されているプローブのうち本サンプルを定量するためにはどれを使用すべきか判断できず、本実験では多少過小評価になる可能性のあることを考慮した上でＣＦＢに対してＣＦ３１９ａのみを使用した。
【０１８３】
最後に、全細菌をターゲットとするＥＵＢプローブについてだが、従来使用されてきたＥＵＢプローブが、やはり不完全であることが報告されており、さらに２つのプローブを加えたＥＵＢｍｉｘを使用することが常識となりつつある。よって本実験においてもＥＵＢｍｉｘ（ＥＵＢＩ，ＥＵＢＩＩ，ＥＵＢＩＩＩ  を混合したもの）を使用した（プローブ混合方法については先に説明した通りである）。
【０１８４】
定量評価
ＦＩＳＨによる解析結果を円グラフにしたものを図４１に示す。実施例３において図３９で示した、Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙの各グループの構成比と比較すると、α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、β−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＣＦＢの割合はほぼ一致している。しかし、ＨＧＣについては、ＦＩＳＨによる割合は１７％となっておりＣｌｏｎｅｌｉｂｒａｒｙでは数％とであったのと比べてだいぶ多くなっている。この原因としては、Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ作成の過程で、ＤＮＡ抽出・ＰＣＲでのバイアスがかかっている為と考えられる。特にＤＮＡ抽出では、グラム陽性細菌はバイアスがかかり易い。また、ＰＣＲのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰｒｉｍｅｒはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａを中心として設計されていることから、系内に存在しているグラム陽性細菌が使用したＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒとミスマッチがあることも多いに考えられる。いずれにしても、Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙにおいては、ＨＧＣについて過小評価している可能性が高いことが示唆された。また、全体を見ると、８０％に満たないが、これについてはＣｌｏｎｅｌｉｂｒａｒｙの結果から、既存プローブが無く評価できなかったＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐに近縁な細菌が残りの大部分を占めることが推測できる。
【０１８５】
実施例５：プラントの硝化脱窒性能の指標となる微生物の探索
実施例１〜４において、まず、安水硝化脱窒処理プロセスのパイロットプラントに存在する微生物相の全体について、様々な手法を用いて把握した。
パイロットプラントを立ち上げた本来の目的は、生物学的手法（活性汚泥法）で有機物のみだけでなく、安水中のアンモニアを同時に除去することを検討することにある。アンモニアの除去は、硝化反応と脱窒素反応を経て完了するため、プラントの運転側の立場からは、硝化脱窒性能を良好に維持することが必要となってくる。本実施例においては、硝化脱窒性能の裏付けをする為に、微生物群集解析の立場から硝化脱窒性能の指標となるような微生物を探索することを試みた。
プラント立ち上げ期のＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による微生物群集変化
硝化脱窒性能の指標となるような微生物を見つける方法として、硝化脱窒性能が悪い時と良い時の微生物相を見比べることを考えた。そこで、パイロットプラントの運転の中で、トラブルにより運転を一時停止し、種汚泥を再度加えて立ち上げ直した時期に注目した。その時期は、２００２年２月１４月〜２００２年６月１３日のＲＵＮ２に相当する。ＲＵＮ２の前の２００２年１月２３日〜２００２年２月１３日の２０日間、汚泥槽腐食による改修工事のために、流入水を停止し空運転を行い、その後標準活性汚泥法で処理している実機の汚泥を等量（１：１）加えて運転を開始したという立ち上げ直した経緯がある。ＲＵＮ２の硝化や脱窒の状況は、図３０と図３１に示した通りであるが、立ち上げ当初の２００２年２月２０日は一時的に硝化脱窒が良かったが、その後一度悪くなり、２００２年４月２３日〜２００２年６月３日にかけて硝化脱窒が良くなった。このパイロットプラントの運転状況から、微生物相は、立ち上げ当初は加えた種汚泥または空運転していた汚泥に存在した微生物が一時的に硝化や脱窒反応を加えたが、その後だんだんと嫌気好気という硝化脱窒処理プロセスに順応した微生物の菌体量が増えてきたのではないかと推測できる。つまりＲＵＮ２で増加した微生物は硝化脱窒性能の指標となり得るということである。
【０１８６】
このような立ち上げ期の微生物の増減をモニタリングする手段としては、微生物をバンドとして可視化でき、さらにバンドの太さによって増減を議論できるＰＣＲ−ＤＧＧＥ法が適当であると考え、パイロットプラントＲＵＮ２についてＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による解析を行った。
【０１８７】
方法
パイロットプラントＲＵＮ２で、系時的に採取した汚泥からＦａｓｔ  ＤＮＡＫｉｔ  ｆｏｒ  ｓｏｉｌ（ＢＩＯ１０１）によりＤＮＡを抽出し、ＧＣ付きプライマーで１６ＳｒＤＮＡのＶ３領域（３５７ｆ−５１８ｒ）を増幅した。ＰＣＲ条件は、＜９５℃：１０ｍｉｎ−〔９４℃：３０ｓｅｃ−５３℃：３０ｓｅｃ−７２℃：３０ｓｅｃ〕×３５−７２℃：１０ｍｉｎ−４℃＞である。その後、ＤＧＧＥ法により４０〜６０質量％の変性剤濃度勾配のゲルを用いて、１３０Ｖで５時間電気泳動を行った。
【０１８８】
結果
ＲＵＮ２についてＰＣＲ−ＤＧＧＥ法で解析した結果を図４２に示す。
図４２から、各バンドは大きく分けて以下の４種類の挙動を示していることがわかる。
１．実機での存在の有無に関わらず硝化脱窒性能が良くなるに連れてバンドが濃くなった微生物（実線矢印）（各バンドの強度の変化については図４３と図４４を参照）
２．標準活性汚泥で処理している実機にも比較的多く存在しているが、硝化脱窒プロセスの立ち上がりに連れて一度減り、その後再び濃くなるという挙動を示した微生物（点線矢印）
３．標準活性汚泥処理の実機でも硝化脱窒処理でもほとんど変わらず存在する微生物
４．実機では存在していたが硝化脱窒処理にすることで減少した微生物
【０１８９】
まず、図４２の１の実線の矢印で示したバンドであるが、図４２からも読み取れるようにバンド強度の増加が実機と比べて顕著であり、これらは汚泥が硝化脱窒処理プロセスに馴致され硝化脱窒性能が良くなるに連れて増加した微生物であると考えられる。よって実線の矢印で示した微生物は硝化脱窒性能の指標となり得るだろう。特にバンドａ，ｂ，ｃ，ｅ，ｇ，ｉは、好気処理の実機ではほとんど存在しておらず（図４３と図４４）、それぞれ硝化能、脱窒能を持つために増えたと考えることもでき、硝化脱窒性能の指標となる有力な候補である。
【０１９０】
図４２の２の点線の矢印で示したバンドは、プラントの立ち上がりにともない一度経るが、その後再び濃くなるため、実線矢印と同じように硝化脱窒性能の指標となる可能性がある。しかし、好気処理のみの実機において、ある程度多い量で存在している為、嫌気槽での脱窒に関与しているかどうかは明らかではない。好気的に基質を酸化分解している可能性もある。
【０１９１】
また、上記３の微生物は、実機でも硝化脱窒プロセスでもほとんど変化無く存在しているので、好気槽で基質の酸化分解を行いエネルギーを得て存在している可能性が高いと推測できる。
【０１９２】
以上、解析結果から考察を行ったが、やはりバンドの挙動のみで各微生物がどのような反応に関わっているのかを判断することは難しいと言える。しかしながら、少なくとも図４２の１の実線で示した微生物については、硝化脱窒性能の指標とすることが出来ると考えられ、以降、この実線矢印の微生物に絞った解析を行っていくことにした。
【０１９３】
立ち上げ期に増加傾向にあるＤＧＧＥバンドの塩基配列解読による近縁種決定
図４２の実線矢印で示した、ＲＵＮ２のプラント立ち上げ期に増加した微生物について、それぞれどのような微生物であるのかを調べる目的で、近縁種の決定を行った。
方法
図４２の実線矢印で示したバンドをゲルから切り出し、滅菌ｍｉｌｌｉＱとともに凍結融解を３回繰り返すことで、ゲル片からＤＮＡを回収した。それをテンプレートとしてＰＣＲ−ＤＧＧＥを行うという操作を繰り返し、ＤＧＧＥのゲル上で一本のバンドまで精製した。その後、精製したＤＮＡをテンプレートとしてＧＣ無しのプライマーでＶ３領域の３５７ｆ−５１８ｒ部位を再増幅（ＰＣＲ条件：＜９５℃：１０ｍｉｎ−〔９４℃：３０ｓｅｃ−５３℃：３０ｓｅｃ−７２℃：３０ｓｅｃ〕×２５−７２℃：１０ｍｉｎ−４℃＞）し、シーケンシング反応のテンプレートとした。シーケンシング反応は先に説明したプロトコルに従い、またシーケンサーはＨＩＴＡＣＨＩ（ＳＱ−５５００）を用いた。それぞれの３５７ｆ−５１８ｒの塩基配列を決定した後、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｒａｌ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｂｌａｓｔ．ｓｈｔｍｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０））を用いて既知種の中から相同性の高い塩基配列を検索し、ＤＧＧＥ各バンドの近縁種を決定した。
結果
近縁種決定結果を以下の表１７にまとめた。
【０１９４】
【表１７】
2004242578.tif 000018
【０１９５】
ｂａｎｄ  Ｎｏ．は図４２で用いたものであり、カッコ内の番号は、実施例２における図３４と図３５の番号に対応している。
【０１９６】
近縁種を決定したところ、ＣＦＢ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ−Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）に属するものがｂ，ｈ，ｉの３種と多かった。しかし、ＣＦＢに属する細菌は多様であり、３種のバンドとも単離されている株との相同性が低く、科のレベルについても特定することが難しかった。ＣＦＢに属する細菌の中には脱窒機能を持つものがいるという報告がある（Ｚｕｍｆｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２））ので、これらの細菌も脱窒能を持っている可能性がある。その他には、β−ＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａのＣｏｍａｍｏｎａｓ科に近縁な細菌がｃ，ｅの２種と続いて多い。この２種も単離株との相同性が９０％と低いため属レベルの特定が出来ない。Ｃｏｍａｍｏｎａｓ科に属する細菌の中には、脱窒に関与しているものがいることが報告されており、様々な研究がなされているので、本研究のパイロットプラント内においても脱窒に関与している可能性が高いと考えられる。
【０１９７】
また１種ずつの細菌として、ａはＮｉｔｏｒｏｓｏｍｏｎａｓ属に近縁な細菌、ｄはＥｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａｃｅａｅに近縁な細菌、ｆはＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐに近縁な細菌、ｇはＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に近縁な細菌、ｊは低ＧＣグラム陽性細菌のＢａｃｉｌｌｕｓに近縁な細菌となっていた。この中でａのＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓはアンモニア酸化細菌として有名な微生物であり相同性も９８％と高い為、本パイロットプラントの中で硝化を担っていると考えられ、硝化性能の指標となる微生物であることはほぼ間違えない。その他の細菌については、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓは脱窒能力があるという報告は見当たらないが、グラム陽性細菌のＢａｃｉｌｌｕｓに属する細菌は脱窒能力を持つものが多数報告されている。脱窒能を持つ細菌については特定されていないものが多いとされており、いずれにしても、上述した細菌は硝化脱窒プロセスで増加していることから脱窒に関与している可能性が高く、脱窒性能の指標となり得ると考えられる。
【０１９８】
特筆すべき点としては、ｄのＥｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａｃｅａｅとｆのＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐに近縁なそれぞれの細菌は、微生物全体の解析で系内に優占的に存在しているであろうと結論付けた細菌であることである。硝化脱窒処理プロセスにすることで菌体量が増加し、さらには系内で優占しているとなると、硝化脱窒性能の指標とするには最適な細菌となる可能性が高い。
【０１９９】
立ち上げ期に増加傾向にある微生物の１６ＳｒＤＮＡ全長塩基配列決定
以上、安水の硝化脱窒処理パイロットプラントにおいて、硝化や脱窒を担っている可能性のある性能の指標となり得る微生物を特定することができた。そこで、それらの微生物についてさらに詳細な系統学的地位を調べる為、それぞれの１６ＳｒＤＮＡ全長の塩基配列決定を行うことにした。
全長配列を決定すると、データベースから得られる最近縁種の情報が正確になることに加え、さらにはその種に特異的なプローブを設計してＦＩＳＨを行うことで顕微鏡を通してｉｎ  ｓｉｔｕの状態でその細菌を確認することが可能になる。
【０２００】
方法
まず、解析対象のバンド（図４２のａ〜ｊ）について、実施例３に示したクローンライブラリー内に対応するクローンが存在するかどうか調べた。その結果は以下の表１８の通りである。
【０２０１】
【表１８】
2004242578.tif 000019
【０２０２】
実施例３において作成したクローンライブラリーは、全長をターゲットとしたＰＣＲ産物のクローニングを行っている為、バンドに対応するクローンがあれば、１６ＳｒＤＮＡの全長塩基配列を決定することができる。解析したいバンドのうちクローンが得られていたものは、ａ，ｄ，ｆ，ｇ，ｉの５種のみであった。クローンの無かったものの中で特にｂ，ｃ，ｅについてはＤＧＧＥでのバンド強度の増加が目立って良かった（図４２）ので、全長を決定できないのは残念な結果である。クローンライブラリーのクローン数を増やせば得られる可能性はあるが、今回は時間の関係で省略せざるを得なかった。よって以下の操作はａ，ｄ，ｆ，ｇ，ｉの５種に限って行った。
【０２０３】
先に説明したように、クローニング後にＭ１３プライマーで増幅したＰＣＲ産物をテンプレートとし、全長プライマーを用いてＰＣＲを行った（ａ，ｄ，ｆ，ｇは２７ｆ−１５１８ｒ、ｉは２７ｆ−１４９２ｒ）。その後、得られた全長ＰＣＲ産物について、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて過剰プライマーやｄＮＴＰを除去し精製を行った。その後、精製液のＤＮＡ濃度を測定し、シーケンス反応のテンプレートに最適な濃度に調製した。
【０２０４】
次に全長シーケンスについてだが、１６ＳｒＤＮＡは１，５００ｂｐ程度と長い為、全長シーケンスを一度に取ることはできない。ＡＢＩ３１０シーケンサーのキャピラリーにはショートとロングがあり、比較的長い塩基配列の解読用のロングキャピラリーでもせいぜい読めるのは５００ｂｐ程度である。そこで、約１５００ｂｐの塩基配列を数種のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒでいくつかに分けて読むことになる。分け方は様々であり幾つか考案されているが、理論的にはＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒのいくつかを使用すれば読めることになる。本研究では、図４５のように８つのプライマーを用いて全長を分けて解読を試みた。シーケンス反応に使用したプライマーの配列は以下の表１９の通りであり、またシーケンス反応については、先に説明したプロトコルに準じた。
【０２０５】
【表１９】
2004242578.tif 000020
【０２０６】
各断片の塩基配列を解読した後、ＡＢＩ３１０の解析ソフトを用いてクローンごとに断片のＡｓｓｅｍｂｌｅを行い、全長塩基配列とした。そして、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｒａｌ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｂｌａｓｔ．ｓｈｔｍｌ）を用いて既知種の中から相同性の高い塩基配列を検索し、最近縁種を決定した。さらに、各クローンの系統学的な位置を示す為に系統樹を作成した。系統樹はＤＤＢＪのＣｌａｓｔａｌ  Ｗ（ｈｔｔｐ：／／ｈｙｐｅｒｎｉｇ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｓｈｔｍｌ  ）でアライメント解析を行って作成した。系統樹作成の際の既知種の塩基配列は、Ｅｎｔｒｅｚ−ＰｕｂＭｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／  ）のＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅで、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．を利用し取得した。
結果
各クローンの全長配列決定による最近縁種の検索結果は以下の表２０のようになった。
【０２０７】
【表２０】
2004242578.tif 000021
【０２０８】
最近縁種が２種書いてあるものは、相同性（％）が同じ値で名前が異なる最近縁種が検索結果として得られたためである。また、最近縁種がｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄのみのクローンに関しては、近縁種として得られた細菌の最も上位にある単離株を載せるつもりであったが、Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙがかけ離れていた為載せることができなかったものである。
【０２０９】
それぞれのクローンについて、ｂｌａｓｔで得られた近縁種検索結果の上位約１０種と、最近縁種と近い属の細菌を入れた系統樹を作成した結果を図４６〜図５０に示す。最近縁種と系統樹を総合して考察を行う。
【０２１０】
まずｃｌｏｎｅ  Ａ３については、最近縁種はＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ．であったが、同じＳｉｍｉｌａｒｉｔｙでＮｉｔｏｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．も検索結果に挙がっていた。系統樹を書いてみたところ（図４６）、系統学的に最も近い細菌はホモロジー検索で４位であったＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（ＡＪ２２４４１０）（９７％）であることがわかった。系統樹の同じ枝はＮｉｔｏｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．でほとんどが占められているので、ｃｌｏｎｅ  Ａ３はＡｍｍｏｎｉａ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａのＮｉｔｏｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．に属すると考えられる。しかし、株レベルでＳｉｍｉｌａｒｉｔｙが１００％一致するものは無かったため、新しい株である可能性は高い。いずれにしても、ｃｌｏｎｅ  Ａ３全長配列決定の結果、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓであることが分かったので、パイロットプラント内で硝化を担っていることは確かであり、硝化脱窒性能の中でも硝化に対する指標微生物とすることができる。
【０２１１】
Ｃｌｏｎｅ  Ａ１４は、最近縁種を見ると上位１０種でもｓｕｌｆｕｒ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａやｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒなど様々な細菌が挙がっていた。またいずれも９２％以下とＳｉｍｉｌａｒｉｔｙが低く、属名の決定も難しい。図４７の系統樹での位置は、同じ枝に入る細菌が全く存在せず、単独となっていることから、新属である可能性もある。よって、近縁種から脱窒能を持つかどうか検討することはできなかった。系統学的に近い位置にｓｕｌｆｕｒ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａやＴｈｉｏｒｈｏｄｏｖｉｂｒｏ等、硫黄に関連した代謝を行っている細菌が多いことから、Ｃｌｏｎｅ  Ａ１４は安水中のチオ硫酸やチオシアン等の分解に関与している可能性が高い。
【０２１２】
次にＣｌｏｎｅ  Ａ２８は、最近縁種はＴｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐのＤｅｉｎｏｃｏｃｃｉ（８９％）であった。Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｕｓ  ｇｒｏｕｐのいくつかの単離株を含めた系統樹（図４８）では、Ｔｈｅｒｍｕｓ科とＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ科のかたまりのうち、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ科の方に属することはわかったが、最近縁種であるＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄのバクテリアのみしか同じ枝に含まれない為、さらに小さいくくりであるＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属に属すかどうかはわからなかった。Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属のかたまりとは、ｂｏｏｔｓｔｒａｐが９９４で分かれているので、新属である可能性もある。Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ科に属する細菌はもともと種類が少なく、既知の脱窒菌は報告されていないが、本プラントの系内では、脱窒に関与している可能性が高い。
【０２１３】
Ｃｌｏｎｅ  Ａ１９は最近縁種はＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．であり、Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙが９６％と比較的高い。Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属のその他の種を含めた系統樹（図４９）では、Ｃｌｏｎｅ  Ａ１９はＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属し、さらに種レベルでは、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．の仲間に入る細菌であることがわかった。Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属はα−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの中の比較的新しい分類であり、これまで違う属であった細菌がＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に再分類されるなど、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属の細菌の数は増えてきている。Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属の細菌で脱窒能を持つものは報告例は見当たらなかったが、近縁な属の細菌で脱窒能を持つものが報告されており、脱窒細菌が系統学的に広い範囲に分布していることを考慮すると、Ｃｌｏｎｅ  Ａ１９も本プラントで脱窒に関与している可能性も十分考えられる。
【０２１４】
Ｃｌｏｎｅ  Ｂ３６については、最近縁種がｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍとなっているが、相同性検索の上位を見ると、ＣＦＢグループに属する細菌であることが判明した。ＣＦＢはＣｙｔｏｐｈａｇａ−Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの略であるが、ＣＦＢに属する細菌は系統的に多様で、系統樹にでは同じ属の細菌が違う枝に入ってしまうことも良くある。また、様々環境に生息しているのでデータベース中の登録数は多いが、Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄつまり単離されていないものが多く、それゆえ大半は機能が調べられていない。ＣＦＢに属する既知の細菌を入れて作成した図５０の系統樹を見ると、Ｃｌｏｎｅ  Ｂ３６はＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍのかたまりに属していた。また近い位置にはＣｙｔｏｐｈａｇａが多いことから、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ−Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの中では、Ｃｙｔｏｐｈａｇａに近い位置にあることがわかった。Ｃｙｔｏｐｈａｇａに属する細菌で脱窒能が報告されているものが存在することから、Ｃｌｏｎｅ  Ｂ３６は脱窒性能の指標となる可能性がある。
【０２１５】
ＦＩＳＨ法による硝化脱窒性能評価の可能性の検討
以上のように、硝化脱窒性能の指標となるような微生物の候補を得ることができた。実際に、この微生物を用いてプラントの性能を評価する場合、方法としてはＦＩＳＨ法の利用が考えられる。つまり、性能の指標となるような微生物に特異的なプローブを用いてサンプルに対してＦＩＳＨを行い蛍光の割合（標的微生物の割合）によって、性能を評価するという方法である。ＦＩＳＨ法以外には、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法で微生物相をバンドとして可視化し、標的微生物のバンドの濃さで性能を評価する方法も考えられるが、ＰＣＲ−ＤＧＧＥを行うにあたってＤＮＡ抽出やＰＣＲ等の操作に時間がかかり、さらにはどのバンドが標的微生物なのかを常に把握しておく必要がある為、継続的にＰＣＲ−ＤＧＧＥ法で解析を行っていない場合は、バンドパターンの解釈が難しく標的微生物のバンドを特定しづらいという欠点がある。それと比較してＦＩＳＨ法は、ＦＩＳＨの操作や蛍光の見分け方に慣れれば、操作は比較的簡単であり短時間で行え、またｉｎ  ｓｉｔｕの状態で顕微鏡下で実際の微生物を観察できるので、評価手法としては適切であると考えられる。
そこで、硝化脱窒性能の指標となる可能性のある微生物について、プローブを作成し、プラントの性能と対応させながら、ＦＩＳＨ法を用いた定量評価を試みた。
【０２１６】
方法
プローブの作成
まず、決定した全長塩基配列について、既存の種特異的プローブが有るかどうかｐｒｏｂｅ  ｂａｓｅ  ｎｅｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｂａｓｅ）を利用して調べた。既存のプローブで使えるものが無いものは、以下で述べる操作にしたがってプローブを作成した。
プローブ作成は次の２段階の過程を経て行った。まず、ＡＮＧＩＳのＢｉｏ  Ｍａｎａｇｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｂｎ１．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕ／ｂｉｏｎａｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｗｒａｐ．ｗｐ／ｇｕｉ／ｓｔａｒｔ）のＰｒｉｍｅｒ３プログラムを用いて、プローブの候補を検索し、その後、Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ＩＩ（ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｈｔｍｌ／ａｎａｌｙｓｅｓ．ｈｔｍｌ  ）のＰｒｏｂｅ  Ｍａｔｃｈプログラムで、プローブ自身の自己相補結合（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）があるかどうかを確認し、無いものを最終的にプローブとした。
【０２１７】
具体的には、Ｐｒｉｍｅｒ３を起動し、先に得られた１６ＳｒＤＮＡの全長塩基配列を入力して行った。その時の検索条件としては、プローブのＧＣ含量が低くなりすぎて変性温度Ｔｄが低くなり、非標的種との区別が難しくならないよう、ＧＣ含量を５０％以上とした。さらにプローブの長さは、基本的には一般的に用いられている１８ｍｅｒとし、１８ｍｅｒでターゲットに特異的なプローブの候補が見つからない場合は２０ｍｅｒまでの中で候補を探した。Ｐｒｉｍｅｒ３でプローブの候補を検索すると、指定した数の候補が得られるが、それらのスクリーニングは、ＤＤＢＪの相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｒａｌ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｉｐ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｂｌａｓｔ．ｓｈｔｍｌ）を用いて次のように行った。本研究では、一つの種類の細菌にターゲットを絞ったプローブを作ることが目的のため、プローブの配列が、ｒＲＮＡのデータベースに登録されている全ての細菌と一致しないものを作成することが理想である。しかしプローブの長さは１８〜２０ｂｐ程度であるので、それが難しい場合は、できるだけ一致または数ミスマッチの配列を持っている細菌が少ないもの、そして完全に一致してしまう細菌がある場合には、それらがプローブを作成するターゲットの細菌と同じ属や科に含まれているものを選んだ。このような過程を経た後に、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ＩＩのＰｒｏｂｅ  Ｍａｔｃｈプログラムにかけ、自己相補結合が無いかどうかを確認し、最終的なプローブとした。
【０２１８】
定量評価
基本的な操作は先に説明したプロトコルに準じた。
解析に用いたサンプルはＲＵＮ２の立ち上げ時に等量で加えた実機プラントの汚泥（標準活性汚泥法）、さらに２００２年４月２２日、２００２年５月２８日の汚泥である。図３０、図３１のパイロットプラントの運転状況から判断して、立ち上げ期をＦＩＳＨ法により評価する目的でこの３サンプルを選んだ。定量評価は、ＦＩＳＨ法を用いて、標的細菌に特異的なプローブ（Ｃｙ３標識）と全細菌に対するプローブＥＵＢｍｉｘ（ＦＩＴＣ標識）の２重染色を行い、ターゲットの全細菌に対する割合を求めた。また、ＦＩＳＨの後に、５分間のＤＡＰＩ染色を行った。
【０２１９】
ＦＩＳＨ画像は、蛍光顕微鏡ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５１を用いて、ＣＣＤカメラを通して取得した。定量評価を行う為、各プローブにつき、同視野についてのＥＵＢ画像（ＦＩＴＣ標識）、ターゲット画像（Ｃｙ３標識）、位相差の画像のセットを２０セットずつ撮った。また、ＥＵＢプローブが全細菌の何％にハイブリダイズしているかを確認する目的で、ＤＡＰＩ染色についても１０視野程度取得した。得られた、画像の解析及び定量操作には、画像解析ソフトＬｅｉｃａ製Ｑｗｉｎ６００を使用した。画像解析ソフトによる定量方法の詳細は、先に説明した通りである。
【０２２０】
結果
既存プローブの有無の確認とプローブ作成
先に決定した全長配列に基づき、既存プローブで使用できるものが無いかどうかを確認した。その結果は、以下の表２１に示すとおりである。
【０２２１】
【表２１】
2004242578.tif 000022
【０２２２】
ｃｌｏｎｅ  Ａ３は、アンモニア酸化細菌ということで、既存プローブを検索の結果Ｎｓｍ１５６とＮｓｏ１２２５の２つのプローブの配列と完全に相補的であった。一般的に、Ｎｓｍ１５６はＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓの一部をターゲットとするプローブであり、Ｎｓｏ１２２５はアンモニア酸化細菌を広く網羅するプローブである。ｃｌｏｎｅ  Ａ３のみのアンモニア酸化細菌をＦＩＳＨで定量評価することが目的であるため、ここでは、よりターゲットが狭いプローブであるＮｓｍ１５６を使う方が良いと考えられる。しかし、系内アンモニア酸化細菌はｃｌｏｎｅ  Ａ３の一種類のみしか検出されておらず、実際に一種類しか居ないことも考えられるので、補足としてＮｓｏ１２２５プローブによる定量も行うことにした。
【０２２３】
またｃｌｏｎｅ  Ａ１９は、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓに属する細菌であり、既存プローブの検索結果において、ＳＰＨ１２０プローブと完全に相補的であった。ＳＰＨ１２０プローブは、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属を標的としたプローブであるが、数株のＺｙｍｏｍｏｎａｓ属（系統的にＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属のクラスターの中に位置している）の細菌も含んでいるプローブである。もし、系内にｃｌｏｎｅ  Ａ１９以外の他のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属の細菌が存在した場合、ＳＰＨ１２０プローブでｃｌｏｎｅ  Ａ１９以外の細菌もひっかかってしまうことになるが、先の実施例においてその他のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属の細菌が検出されていない結果を踏まえて、このＳＰＨ１２０プローブをｃｌｏｎｅ  Ａ１９の定量評価に用いることにした。
【０２２４】
ｃｌｏｎｅ  Ｂ３６は、ＣＦＢの細菌であり、既存プローブ検索を行ったところ、ＣＦ３１９ａが挙げられた。しかし、ＣＦ３１９ａプローブはグループレベルでＣＦＢに特異的なプローブであり、ｃｌｏｎｅ  Ｂ３６以外にＣＦＢが存在する本プラントの汚泥には適用出来ない。そこで、ｃｌｏｎｅ  Ｂ３６については、出来る限り種特異的なプローブを作成することを試みた。また、ｃｌｏｎｅＡ１４とｃｌｏｎｅ  Ａ２８については、使用できる既存プローブが無かった為、それぞれに特異的なプローブを作成した。
【０２２５】
属レベルのプローブを用いたＦＩＳＨ法による定量評価
表２０に示したように、各細菌を種または属レベルで検出可能な既存のＦＩＳＨプローブのあった、ｃｌｏｎｅ  Ａ３とｃｌｏｎｅ  Ａ１９について定量評価を行った。ｃｌｏｎｅ  Ａ３は硝化性能指標微生物、ｃｌｏｎｅ  Ａ１９は脱窒性能指標微生物の候補であり、それぞれを分けて考察する。定量評価に用いたサンプルは、方法のところで述べたように、性能と比較して定量が行えるようにパイロットプラントＲＵＮ２の立ち上げ期の３点（種汚泥（実機）、２００２年４月２２日、２００２年５月２８日）を選んだ。
【０２２６】
ｃｌｏｎｅ  Ａ３（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ近縁細菌）による硝化性能評価の可能性
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓの一部をターゲットとしているＮｓｍ１５６を用いて定量した結果を図５１に、そしてアンモニア酸化細菌全体をターゲットとするＮｓｏ１２２５を用いて定量した結果を図５２に示す。また、同立ち上げ期を解析したＰＣＲ−ＤＧＧＥにおいてｃｌｏｎｅ  Ａ３と同じ細菌であるバンドのバンド強度変化も合わせて図５３に示す。
まず、図５１のＮｓｍ１５６プローブを使用した結果であるが、プラント立ち上げに伴い硝化脱窒が良くなるに連れて（図３１）、Ｎｓｍ１５６のプローブが付く細菌つまりＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ（ｃｌｏｎｅ  Ａ３）が増加していることがわかった。２００２年４月２２日と２００２年５月２８日は標準偏差を示すバーが重なっており、顕著な差は見られないが、標準活性汚泥法で処理している実機の汚泥とは明らかな差が見られた。つまり、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ（ｃｌｏｎｅ  Ａ３）は硝化脱窒プロセスの性能が良くなるに連れて増加していることがわかる。このことから、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓは硝化脱窒性能の指標のひとつとなり得ることが示唆された。
【０２２７】
また、図５２のＮｓｏ１２２５プローブを使用した結果であるが、Ｎｓｍ１５６プローブと同じようにプラン立ち上げに伴ってアンモニア酸化細菌が増加するという結果を得ることが出来た。こちらも２００２年４月２２日と２００２年５月２８日は標準偏差のバーが重なってしまっていてこの差は不確かであるが、標準活性汚泥法で処理している実機の汚泥とは明らかな差が見られた。Ｎｓｍ１５６の結果と比較すると２００２年４月２２日、２００２年５月２８日ともに５割程度増えた結果となっており、これはＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ以外にも系内にアンモニア酸化細菌が存在するかもしれないことを示唆している。しかし、標準偏差のバーが示すように視野ごとに値のばらつきも大きく、ｃｌｏｎｅ  Ａ３のＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ以外にアンモニア酸化細菌が存在するかどうかについては、はっきりとはわからない。
【０２２８】
いずれにしてもこれらの結果から、両方のプローブで、プラントの性能と対応付けたＦＩＳＨの結果を得ることが出来た。全細菌に対する割合が数％であるため、誤差が大きく効いてくる可能性があり、この少ない割合での増減の議論をすることに注意する必要はあるが、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓは一般に硝化を担っている細菌であり、パイロットプラント内においても硝化性能の指標生物としてよいと考えられる。また、Ｎｓｍ１５６とＮｓｏ１２２５プローブのどちらを硝化脱窒性能評価に使用すればよいかということについてであるが、ｃｌｏｎｅ  Ａ３の挙動で評価する場合には、狭い範囲を標的とするＮｓｍ１５６を使用する方が確実である。ただし、アンモニア酸化細菌は硝化脱窒処理プロセスで硝化脱窒が上手く機能するには必須の微生物であり、もしｃｌｏｎｅ  Ａ３以外のアンモニア酸化細菌が存在する場合、その細菌も硝化性能の指標生物となる。よって、硝化の評価を行う際には、ｃｌｏｎｅ  Ａ３も確実に捉えさらに他のアンモニア酸化細菌もターゲットとしているＮｓｏ１２２５を使用してもよいと考えられる。
【０２２９】
ｃｌｏｎｅ  Ａ１９（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ近縁細菌）による脱窒性能評価の可能性
主としてＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属をターゲットとして設計された既存のＳＰＨ１２０プローブを用いて定量した結果を図５４に示す。また、同立ち上げ期を解析したＰＣＲ−ＤＧＧＥのバンドの中でｃｌｏｎｅ  Ａ１９と同じ細菌であるバンドのバンド強度変化も合わせて図５５に示す。
【０２３０】
ＰＣＲ−ＤＧＧＥ  ｃｌｏｎｅ  Ａ１９と同じ細菌であるバンドは、種汚泥ではほとんど存在せず硝化脱窒性能が上昇するに連れて、バンド強度が目立って強くなっていた（図５５）。ＦＩＳＨ法を用いた解析でも、図５４のように、ＳＰＨ１２０がターゲットとする細菌つまりＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓに属する細菌が増加しているという結果を得ることが出来た。２００２年４月２２日と２００２年５月２８日では、標準偏差のバーが重なっており、どちらが多いかはっきりとは言えず、脱窒率（窒素除去率）は、２００２年４月２２日は０．１程度、２００２年５月２８日では０．３程度と差がある（図３１）が、ＦＩＳＨによる結果ではその差を議論することはできなかった。しかし、標準活性汚泥法で処理している実機から採取した種汚泥とのＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓの割合の差は明らかであった。以上のことから、ＦＩＳＨでの結果は脱窒性能と対応するものであるかどうか判断することは難しいが、ＤＧＧＥバンドパターンを再現することは出来ており、さらに半定量的に硝化脱窒プロセスの立ち上げ期に増加したことを評価できたことから、脱窒性能の指標の１つとなることが期待できる結果であると考えられる。
【０２３１】
その他、既存のプローブで適用可能なものが無かったｃｌｏｎｅ  Ａ１４、ｃｌｏｎｅ  Ａ２８、ｃｌｏｎｅ  Ｂ３６については、プローブ作成プログラムを利用して各３つずつのプローブを作成することに成功した。ｃｌｏｎｅ  Ａ１４、ｃｌｏｎｅ  Ａ２８、ｃｌｏｎｅ  Ｂ３６は、硝化脱窒プロセスで馴養することで増加している為、脱窒をすることが出来る細菌であることが予想され、パイロットプラントの脱窒性能の指標となる可能性が高い。
【０２３２】
まとめ
・ＰＣＲ−ＤＧＧＥの結果で、立上げ期（ＲＵＮ２）に目立って増加した微生物が１０種程度存在した。これらの微生物は、硝化脱窒処理プロセスに馴致されたことで増加していると考えられ、硝化や脱窒に関与している可能性が高く、硝化脱窒の指標微生物になり得る。
・脱窒性能の指標微生物の候補について、近縁種を決定したところ、ＣＦＢに近縁な細菌が３種、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅに近縁な細菌が２種、また、Ｎｉｔｏｒｏｓｏｍｏｎａｓ属に近縁な細菌ｓｕｆｕｒ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍに近縁な細菌、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐに近縁な細菌、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に近縁な細菌、低ＧＣグラム陽性細菌のＢａｃｉｌｌａｓに近縁な細菌が１種ずつであった。
・特に、ｓｕｆｕｒ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍに近縁な細菌、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐに近縁な細菌は系内で優占している可能性が高いと結論付けた細菌であるので、脱窒性能の指標とするには、最適であると考えられる。
【０２３３】
・硝化脱窒性能の指標微生物の候補である１０種の微生物のうち、５種について１６ＳｒＤＮＡ全長を解読し系統解析を行うことができた。
・硝化性能の指標微生物の候補であるＮｉｔｒｏｓｏｍａｓ属の細菌をＦＩＳＨを利用して定量した結果、Ｎｓｍ１５６、Ｎｓｏ１２２５の両方のプローブで硝化脱窒プロセスの立上げ期に増加するという定量結果を得ることができた。Ｎｉｔｒｏｓｏｍａｓ属の細菌は、硝化に関与することが知られている為、パイロットプラントの硝化性能はこのＮｓｍ１５６、Ｎｓｏ１２２５プローブを用いて評価できると考えられる。
【０２３４】
・脱窒性能の指標微生物の候補であるＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属の細菌について、ＳＰＨ１２０プローブでＦＩＳＨを利用して定量した結果、硝化脱窒プロセスの立上げ期に増加するという定量結果を得ることができた。脱窒性能の評価にＳＰＨ１２０プローブが使用できるかどうかは、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属の細菌の機能が明らかでない為わからないが、パイロットプラント脱窒性能の指標となる可能性は高い。
・既存プローブが存在しなかったｓｕｆｕｒ−ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍに近縁な細菌、Ｔｈｅｒｍｕｓ／Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐに近縁な細菌、ＣＦＢ；Ｃｙｔｏｐｈａｇａに近縁な細菌に対するＦＩＳＨプローブを作成することができた。
【０２３５】
【発明の効果】
本発明は、安水処理プロセスの活性汚泥内に存在する微生物群集を把握し、ＣＯＤ成分となるフェノール類などの有機物や、チオシアン、チオ硫酸などの硫黄化合物の除去および硝化脱窒に関与する有用な微生物を発見した。さらに、これにより、安水処理性能を良好に維持するための評価方法及び安水処理方法を提供することを可能にした。
【０２３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号１〜８、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−５１８ｒ領域を示す図である。
【図２】配列番号１２〜１７、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−５１８ｒ領域を示す図である。
【図３】配列番号１８〜３０、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−５１８ｒ領域を示す図である。
【図４】配列番号３１〜３４、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒ領域を示す図である。
【図５】配列番号３５〜３８、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒ領域を示す図である。
【図６】配列番号３９〜４２、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒ領域を示す図である。
【図７】配列番号４３〜４６、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒ領域を示す図である。
【図８】配列番号４７〜５０、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒ領域を示す図である。
【図９】配列番号５１〜５４、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒ領域を示す図である。
【図１０】配列番号５５〜５８、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒを示す図である。
【図１１】配列番号５９〜６２、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒを示す図である。
【図１２】配列番号６３〜６６、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒを示す図である。
【図１３】配列番号６７〜６９、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒを示す図である。
【図１４】配列番号７０〜７３、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒを示す図である。
【図１５】配列番号７４〜７７、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒを示す図である。
【図１６】配列番号７８〜８１、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒを示す図である。
【図１７】配列番号８２〜８４、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒを示す図である。
【図１８】配列番号８５〜８８、１６ＳｒＤＮＡ  ３５７ｆ−９０７ｒを示す図である。
【図１９】配列番号８９、１６ＳｒＤＮＡ  ２７ｆ−１５１８ｒを示す図である。
【図２０】配列番号９０、１６ＳｒＤＮＡ  ２７ｆ−１５１８ｒを示す図である。
【図２１】配列番号９１、１６ＳｒＤＮＡ  ２７ｆ−１５１８ｒを示す図である。
【図２２】配列番号９２、１６ＳｒＤＮＡ  ２７ｆ−１５１８ｒを示す図である。
【図２３】配列番号９３、１６ＳｒＤＮＡ  ２７ｆ−１４９２ｒを示す図である。
【図２４】図１〜図２３中に用いたヌクレオチド略語表を示す。
【図２５】ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法の原理を示す図である。
【図２６】ｒＲＮＡを標的としてＦＩＳＨ法の原理を示す図である。
【図２７】安水処理パイロットプラントの構成を示す図である。
【図２８】ＲＵＮ１、２における基質の処理状況を示す図である。
【図２９】ＲＵＮ１、２における脱窒槽と硝化槽のＭＬＶＳＳの変化を示す図である。
【図３０】ＲＵＮ１、２における含有窒素分の処理状況を示す図である。
【図３１】ＲＵＮ１、２における窒素除去率と硝化率の変化を示す図である。
【図３２】硝化槽汚泥と脱窒槽汚泥のバンドパターンの比較（左図）、及び泳動時間の検討（右図）を示す図である。
【図３３】ＲＵＮ１とＲＵＮ２の微生物群集解析結果を示す図である。
【図３４】ＲＵＮ１の解析結果と切り出したバンドを示す図である。
【図３５】ＲＵＮ２の解析結果と切り出したバンドを示す図である。
【図３６】系統樹を示す図である。
【図３７】Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ａ（２７ｆ−１５１８ｒ）を示す図である。
【図３８】Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂ（２７ｆ−１４９２ｒ）を示す図である。
【図３９】Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ａと  Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｂのまとめを示す図である。
【図４０】Ｃｌｏｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ａ、Ｂで得られたクローンとその最近縁種を含めた系統樹を示す図である。
【図４１】ＦＩＳＨによる微生物グループレベルでの定量結果を示す図である。
【図４２】ＲＵＮ２のＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による解析結果を示す図である。
【図４３】実線矢印（図４２）で示したバンドの経時的なバンド強度の変化を示す図である。
【図４４】実線矢印（図４２）で示したバンドの経時的なバンド強度の変化を示す図である。
【図４５】１６ＳｒＤＮＡ配列決定における使用プライマーの位置を示す図である。
【図４６】系統樹（ｃｌｏｎｅ  Ａ３）を示す図である。
【図４７】系統樹（ｃｌｏｎｅ  Ａ１４）を示す図である。
【図４８】系統樹（ｃｌｏｎｅ  Ａ２８）を示す図である。
【図４９】系統樹（ｃｌｏｎｅ  Ａ１９）を示す図である。
【図５０】系統樹（ｃｌｏｎｅ  Ｂ３６）を示す図である。
【図５１】Ｎｉｔｒｏｓｏｍａｓ定量結果（Ｎｓｍ１５６ｐｒｏｂｅ）を示す図である。
【図５２】アンモニア酸化細菌定量結果（Ｎｓｏ１２２５ｐｒｏｂｅ）を示す図である。
【図５３】ｃｌｏｎｅ  Ａ３と同じ細菌のＰＣＲ−ＤＧＧＥでのバンド強度の変化を示す図である。
【図５４】Ｓｐｈｉｇｏｍｏｎａｓの定量評価（ＳＰＨ１２０ｐｒｏｂｅ）を示す図である。
【図５５】ｃｌｏｎｅ  Ａ１９と同じ細菌のＰＣＲ−ＤＧＧＥでのバンドの強度の変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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