(57)【要約】【課題】新しい中枢神経細胞突起再生剤等を提供する。【解決手段】β−クリプトキサンチンを有効成分とすることを特徴とする中枢神経細胞突起再生剤、β−クリプトキサンチンを有効成分とすることを特徴とする中枢神経細胞のアポトーシス抑制作用を有する抗痴呆剤、及び所定量のβ−クリプトキサンチンを有効成分として配合して調製したことを特徴とする中枢神経細胞のアポトーシス抑制作用を有する機能性食品。【効果】β−クリプトキサンチンは、中枢神経細胞、特に、成熟中枢神経細胞に対して優れた突起再生作用を有し、該化合物を有効成分とする薬剤は、抗痴呆薬を含む神経変性疾患治療薬等として有用である。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−クリプトキサンチンを有効成分とすることを特徴とする中枢神経細胞突起再生剤。
【請求項２】
中枢神経細胞が、成熟中枢神経細胞である、請求項１に記載の中枢神経細胞突起再生剤。
【請求項３】
β−クリプトキサンチンを有効成分とすることを特徴とする中枢神経細胞のアポトーシス抑制作用を有する抗痴呆剤。
【請求項４】
所定量のβ−クリプトキサンチンを有効成分として配合して調製したことを特徴とする中枢神経細胞のアポトーシス抑制作用を有する機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、中枢神経細胞突起再生剤及び神経変性疾患（アルツハイマー型老年痴呆など）の治療薬等の高機能性製品に関するものであり、更に詳しくは、β−クリプトキサンチンを有効成分とする薬剤であって、中枢神経細胞の突起伸展作用を促す薬理作用を有する中枢神経細胞突起再生剤及び中枢神経細胞のアポトーシス抑制作用を有する抗痴呆剤、及びこれらの薬理作用を有する機能性食品に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、神経成長因子（ＮＧＦ）には、神経突起を伸長する作用や神経伝達物質の産生を調節する作用があり、老動物の神経細胞に対して再生作用を示すことが知られている。従来、中枢神経細胞突起再生薬の有効成分として、種々の物質が提案されており、例えば、細胞性粘菌由来の化合物であるジクチオステロール（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｒｏｌ）が、そのような薬理的作用を有することが報告されている（特開２００１−３１５７２号公報）。
【０００３】
このような中枢神経細胞突起再生薬は、神経回路網に損傷を受けたときの防御機構として働き、その生存維持、神経突起の発芽、伸展を促進する作用を持つ薬物のことを意味している。成熟した中枢神経細胞は、分裂、増殖を行わないことから、例えば、卒中や外傷あるいは原因不明の変性疾患によって神経損傷が起こると、神経細胞は細胞死に至り、それにとって代わる新たな細胞が出現しないために、高次神経機能は重篤な障害を被る。
【０００４】
損傷した神経回路網の再生のために特に重要なことは、神経細胞軸索突起を標的細胞へ向かって十分に伸張させることであり、近年、成熟細胞であっても切断された神経細胞突起の良好な再生が、神経栄養因子等の突起伸展促進因子の作用によって可能であることが報告されている〔Ｍ．Ｄ．Ｋａｗａｊａら，ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．），１２巻，２８４９頁（１９９２）〕。これらのことは、障害神経細胞そのものの再生あるいは周囲の健全な神経細胞からの発芽を促し、神経細胞突起の再生を図ることが可能であることを示唆するものである。
【０００５】
損傷した神経を死に至らせることなく生存させ、更に、軸索突起の再生を行うことにより神経回路網を再構築することは、近年、増えつつある神経変性疾患における種々の神経細胞の萎縮、脱落に対して有効であり、このことは、中枢神経細胞突起再生薬が有望なそれらの治療薬となり得ることを示唆するものである。
【０００６】
しかるに、抗痴呆薬を含む神経変性疾患治療薬として注目されるものに、種々の神経栄養因子（ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ）が挙げられる。また、従来、神経細胞突起再生作用を示す物質として、例えば、スタウロスポリン〔神経科学，２６巻，２９９頁（１９８７）〕、ラクタシスチン〔ジャーナル・オブ・アンチバイオティックス（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ），４４巻，１１３頁（１９９１）〕、ＰＳ−９９０物質〔ジャーナル・オブ・アンチバイオティックス（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ），４７巻，１１７５頁（１９９４）〕、シューロチンＡ〔特開平８−１９８７５０号公報〕、ＤＱ９０Ｃ〔特開平９−１２４６８号公報〕、及び前記ジクチオステロール等の物質が知られている。
【０００７】
しかしながら、ヒトによるこれらの神経栄養因子の医療上の利用を考えた場合、より毒性が低く、しかも、より低濃度で中枢神経細胞の突起再生作用を示す新しい物質を開発することは極めて重要である。即ち、上記のような背景に鑑み、当該技術分野においては、中枢神経細胞、特に、成熟中枢神経細胞の突起再生に有用な新しい薬剤、及び抗痴呆薬を含む神経変性疾患治療薬剤の開発が強く望まれている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、中枢神経細胞の突起再生作用を有する因子及び抗痴呆作用を有する神経栄養因子として有用な新しい化合物を見出すべく鋭意研究を積み重ねた結果、β−クリプトキサンチンがそのような薬理作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、より毒性が低く、しかも、より低濃度で高い活性を有する、β−クリプトキサンチンを有効成分とする新しい中枢神経細胞突起再生剤を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、β−クリプトキサンチンを有効成分とする新しい抗痴呆剤を提供することを目的とするものである。
更に、本発明は、上記の薬理作用を有する機能性食品を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明は、（１）β−クリプトキサンチンを有効成分とすることを特徴とする中枢神経細胞突起再生剤、に係るものであり、また、本発明は、（２）中枢神経細胞が、成熟中枢神経細胞である前記（１）の中枢神経細胞突起再生剤、を望ましい態様としている。
また、本発明は、（３）β−クリプトキサンチンを有効成分とすることを特徴とする中枢神経細胞のアポトーシス抑制作用を有する抗痴呆剤、に係るものである。
更に、本発明は、所定量のβ−クリプトキサンチンを有効成分として配合して調製したことを特徴とする中枢神経細胞のアポトーシス抑制作用を有する機能性食品、に係るものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明者らは、上記の事情に鑑みて鋭意研究を続ける過程で、公知化合物であるがその薬理作用の未解明の部分が多々あったβ−クリプトキサンチンが、中枢神経細胞の突起伸展作用を促す薬理作用を有することを初めて見出すとともに、このβ−クリプトキサンチンを有効成分とする薬剤が、アルツハイマー型老年痴呆などの抗痴呆薬を含む神経変性疾患の治療薬として有用であることを初めて見出した。
【００１１】
一般に、β−クリプトキサンチンは、その分離、製造方法が既に知られており〔例えば、先行技術文献として、岡山大学報（６９），１７−２５（１９８７）、東京医科大学紀要第１８号（１９９２），ｐｐ．１−７、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，２７３−２８３（１９９５）、特開２０００−１３６１８１号公報、が例示される〕、それらの方法に従って、分離、製造することが可能であり、例えば、植物の果実（温州ミカンなど）から、以下の方法により高純度のβ−クリプトキサンチンを得ることができる。
【００１２】
即ち、高純度のβ−クリプトキサンチンは、例えば、以下の工程、１）ミカン果汁の沈澱物及び／又は該沈澱物を脱水又は乾燥した粉末からβ−クリプトキサンチンを含有する溶剤抽出分を調製する工程、２）これを加水分解した後、該加水分解物を一次展開溶媒と共に平均粒子径１０〜８０μＭのシリカ粉末が充填された第１カラムに線速度２ｃｍ／分以上の流速で導入してβ−クリプトキサンチンを含むフラクションを分離する工程、３）脱溶媒した後に、該分離物を二次展開溶媒とともに平均粒子径１０〜８０μＭのオクタデシルシランシリカが充填された第二カラムに線速度２ｃｍ／分以上の流速で導入して、β−クリプトキサンチンを９５重量％以上の量で含有するフラクションを分離する工程、により製造することができる。
しかしながら、β−クリプトキサンチンの分離、製造方法は、これらの方法に制限されるものではなく、本発明は、適宜の方法で分離、製造したβ−クリプトキサンチンを適宜使用することができる。
【００１３】
本発明は、上記β−クリプトキサンチンを有効成分として含むことを特徴とする中枢神経細胞突起再生剤、中枢神経細胞のアポトーシス抑制作用を有する抗痴呆剤、及びこれらの薬理作用を有する機能性食品に係るものであり、本発明のこれらの製品は、上記β−クリプトキサンチンと薬学的又は栄養学的に許容される成分を任意の配合比で混合して製造される。この場合、β−クリプトキサンチンの濃度は、特に制限されるものではなく、その使用目的や使用する薬剤の形態等に応じて任意に設計することができる。
また、本発明では、β−クリプトキサンチンとレチノイン酸を併用することにより、神経突起伸長作用を一層増加させることができることから、これらを所定の配合割合で併用することが好ましい。
また、本発明では、上記薬理作用を有する機能性食品の有効成分として上記β−クリプトキサンチンを適量配合することができる。
【００１４】
また、本発明では、本発明の中枢神経細胞突起再生剤、又は中枢神経細胞のアポトーシス抑制作用を有する抗痴呆剤を患者に投与するときは、従来、薬学的に良く知られたあらゆる種類の形態の薬剤及び投与経路を使用することができる。即ち、薬剤の形態については、例えば、散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、注射剤、液剤、軟膏剤、貼布剤等の適宜の形態を採用することができ、これらは経口又は非経口的に投与される。その投与量は、年齢、体重、症状、投与経路などによっても異なるが、好適には、例えば、１日あたり５ｍｇ〜５０ｍｇであり、これらは１回ないし数回に分けて投与される。更に、本発明では、所定量のβ−クリプトキサンチンを有効成分として添加配合して機能性食品を構築することができる。この場合、上記β−クリプトキサンチン以外の配合成分及び機能性食品の製品形態は、特に制限されるものではなく、適宜の成分及び形態の製品を設計することができる。これらの配合成分として、例えば、一例として、ビタミン類、有機酸、リン酸塩、アルコール類、無水カフェイン、アミノ酸、糖類、安息香酸塩、香料等を適量配合することができるが、これらの成分に制限されるものではなく、その製品の使用目的に応じて、適宜の種類の成分を任意に配合することができる。
【００１５】
上記各製品の有効成分のβ−クリプトキサンチンの薬理的作用をまとめると、後記する実施例に示されるように、β−クリプトキサンチンは、成熟中枢神経細胞に対する神経突起再生作用（分化誘導作用）を有し、レチノイン酸と併用するとその活性は、更に増加する。また、β−クリプトキサンチンは、細胞がアポトーシスを起こすと活性化する細胞のＤＥＶＤａｓｅ活性を誘発する作用を有していない。一方、β−クリプトキサンチンは、エトポシドで誘発したＮｅｕｒｏ
２ａ細胞のＤＥＶＤａｓｅ活性を抑制し、細胞のアポトーシス抑制作用を有する。
【００１６】
一般に、痴呆、特に、アルツハイマーは、アポトーシスが関与しているといわれている。細胞がアポトーシスを起こすと、ＤＥＶＤａｓｅが活性化する。本発明では、このＤＥＶＤａｓｅ活性を指標として４種のカロチノイドの細胞のアポトーシスに対する影響を調べた結果、後記する実施例に示されるように、β−クリプトキサンチンは、アポトーシスを誘導しないことが分かった。また、抗ガン剤であるエトポシドは、細胞にアポトーシスを誘導することが知られている。このエトポシドで誘導したアポトーシスに対する影響を調べた結果、後記する実施例に示されるように、β−クリプトキサンチン、ゼアキサンチンが最も細胞のアポトーシスを抑制し、β−カロテンにはアポトーシスの抑制効果がみられないことが分かった。これらのことから、β−クリプトキサンチンは、神経細胞のアポトーシスを抑制する作用を有し、それにより、抗痴呆性作用を有する成分として期待できることが分かった。
【００１７】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明の有効成分化合物の製造例並びにその薬理活性を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例のみに限定されるものではない。
製造例１
本製造例では、β−クリプトキサンチンの製造方法の一例を示す。
愛媛県産のミカンを圧搾して得られた原料４ｋｇに、この原料の約１０倍量のアセトン４００リットルを用いて、カロテノイド類を抽出した。この抽出液から、エバポレーターを用いて、約４０℃の温度で減圧（４０ｍｍＨｇ）下にアセトンを除去した。こうして得られたカロテノイド類８００ｇに、３．　２リットルのジエチルエーテルを加えて、カロテノイド類のジエチルエーテル溶液を調製した。これとは別に、２０％水酸化カリウム水溶液のメタノール溶液４リットルを上記カロテノイド類のジエチルエーテル溶液に撹拌しながら加えた。
【００１８】
この容器に窒素ガスを導入して容器内の空気を窒素ガスで置換した後、冷蔵庫内（約５℃）で１夜放置した。一夜放置後、反応液の一部を取り、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ板；商品名；Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０，Ｍｅｒｃｋ社製、展開溶媒；ベンゼン／ジエチルエーテル／メタノール＝５０／４５／５（ｖ／ｖ／ｖ））を用いて展開させたところ、加水分解物に起因するＲｆの小さなスポットが生じ、加水分解反応が充分に進行していることが確認された。
【００１９】
上記反応液を分液ロートに移し、この反応液と同量のジエチルエーテル７．　２ｍｌを加えて、水層のカロテノイド類を上層のエーテル層に移行させた。カロテノイド類の移行に伴い、下層の水層の色が赤から黄色に変化するとともに、上層のエーテル層の色が赤乃至オレンジ色に変化した。一部にエマルジョンが形成され、下層と上層との境界が明確でないことから、２リットルのメタノールを加えた。これにより、上層と下層との境界が明確化したので、上層と下層とを分離した。分離した下層の水層に同様にジエチルエーテル３．　６リットルを加えて、更に水層に含有されるカロテノイド類を回収した。このようにして、ジエチルエーテルを用いた抽出を合計３回行った。最後の回の抽出の際には、水層の退色及びエーテル層に変色はほとんど認められなかった。
【００２０】
上記のようにして得られたエーテル溶液を分液ロートに移し、この分液ロートに等量の水を添加してエーテル溶液を洗浄した。この水洗を水層のｐＨ値が８になるまで５回行った。上記のようにして水洗されたエーテル溶液２０リットルに、無水硫酸ナトリウム４００ｇを添加して、このエーテル溶液を脱水した。次いで、このエーテル溶液をエバポレーターに移して、４０℃、４０ｍｍＨｇの減圧下にジエチルエーテルを留去した。ジエチルエーテルを留去した後、エバポレーターを減圧に戻す際に窒素ガスを導入して、エバポレーター内を窒素雰囲気にした。
【００２１】
一次展開溶媒として、石油エーテル／アセトン／メタノール＝９６．　５／３／０．５（ｖ／ｖ／ｖ）を調製した。二次展開溶媒として、アセトニトリル／ジクロロメタン＝９５／５（ｖ／ｖ）を調製した。また、第１カラムは、直径１００ｍｍ、長さ５００ｍｍのカラムに、粒子径１５〜３０μＭ（平均粒子径；２０μＭ）のシリカ粒子（綜研化学（株）製）を充填して調製した。更に、第２カラムは、直径１００ｍｍ、長さ５００ｍｍのカラムに、粒子径１５〜３０μＭ（平均粒子径；２０μＭ）のオクタデシルシランシリカ粒子（綜研化学（株）製）を充填して調製した。
【００２２】
エバポレーターによってエーテルを留去した残査を、上記一次展開溶媒とともに、第１カラムに導入した。このときの流速は３２０ｍｌ／分であり、一次展開溶媒の液送圧力は２０ｋｇ／ｃｍ２　であり、第１カラムの直径は１００ｍｍであることから、一次展開溶媒の線速度は４．１ｃｍ／分である。２１０ｎｍのＵＶ及び４５０ｎｍのＶＩＳを用いて、流出分からカロテノイドを検出し、カロテノイドを含有するフラクションを分液した。
【００２３】
この分液したフラクションから、一次展開溶媒を減圧下に除去した。得られた残査を二次展開溶媒とともに第２カラムに導入した。このときの流速は３２０ｍｌ／分であり、二次展開溶媒の液送圧力は３０ｋｇ／ｃｍ２　であり、第１カラムの直径は１００ｍｍであることから、二次展開溶媒の線速度は４．１ｃｍ／分である。流出分からβ−クリプトキサンチンを上記と同様のＵＶ及びＶＩＳを用いて検知し、このフラクションを分液した。二次展開溶媒を減圧下に留去することにより、９ｇ（１バッチ０．　６ｇ、１５バッチ）のβ−クリプトキサンチンを得た。得られたβ−　クリプトキサンチンの純度は、１００％であった。
【００２４】
実施例１
本実施例では、β−クリプトキサンチンの神経突起再生作用活性について試験した。
（１）方法
１）培養細胞と培養条件
培養細胞として、マウス由来神経芽腫細胞であるＮｅｕｒｏ　２ａ細胞を使用し、これを、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）及びＰｅｎｉｃｉｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤ−ＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）で、５％ＣＯ２　条件下、３７℃で培養した。
【００２５】
２）細胞の形態観察
Ｎｅｕｒｏ　２ａ細胞を９６ウエル−マルチプレートに０．５×１０４　〜１．０×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２　になるように播き、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭで２４時間培養した後、メディウムを２％ＦＢＳ−Ｄ−ＭＥＭに交換し、β−クリプトキサンチン、レチノイン酸（ＲＡ）などの試薬を添加して、更に、２４時間培養した後、光学顕微鏡で観察し、細胞の形態変化を観察した。
【００２６】
次いで、以下に示されるように、細胞直径の２倍以上の神経突起長を有する細胞を陽性細胞とし、１ウエル当り５視野中の総細胞数（２００〜３００ｃｅｌｌｓ）に対する陽性細胞数のパーセンテージを指標として評価した。
神経突起陽性細胞率（％）＝陽性細胞数／総細胞数×１００
総細胞数：１００倍率下５視野中の細胞数（２００以上）
陽性細胞数：細胞直径の２倍以上の神経突起長を有する細胞数
【００２７】
３）細胞内カルシウム濃度の測定
トリプシン処理して培養フラスコから回収した細胞を、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後、細胞内カルシウム指示薬であるｆｕｒａＰＥ３−ＡＭを４μＭ添加し、遮光下、３７℃で４５分間インキュベートした。洗浄後、Ｃａ２＋測定用ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、蛍光強度比を装置（Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＦＲ−５０００）を用いて測定した。３４０ｎｍ励起蛍光（Ｆ３４０）と３８０ｎｍ励起蛍光（Ｆ３８０）の４９０ｎｍでの蛍光強度比（Ｆ３４０／Ｆ３８０）をＲとすると、細胞内カルシウムイオン濃度〔Ｃａ２＋〕ｉは、次の式によって求めることができる。
〔Ｃａ２＋〕ｉ＝（Ｒ−Ｒｍｉｎ／Ｒｍａｘ−Ｒ）×β×Ｋｄ
【００２８】
なお、Ｒｍａｘは、全てのｆｕｒａ　ＰＥ−３がＣａ２＋に結合したときの蛍光強度比、Ｒｍｉｎは、全てのｆｕｒａ　ＰＥ−３が遊離型のときの蛍光強度比、βはＦ３８０における全てのｆｕｒａ　ＰＥ−３が遊離型のときと結合したときの蛍光比であり、ｋｄはｆｕｒａ　ＰＥ−３とＣａ２＋の解離定数であり、２２４（ｎＭ）である。
【００２９】
上記ＰＢＳ−ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）は、ＫＣｌ　０．２ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　　０．２ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ２　・６Ｈ２　Ｏ　０．１ｇ／ｌ、ＮａＣｌ　８．０ｇ／ｌ、Ｎａ２　ＨＰＯ４　・７Ｈ２　Ｏからなる。また、上記Ｃａ２＋測定用ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）は、ＣａＣｌ２　　０．１２ｇ／ｌ、ＫＣｌ　０．３８ｇ／ｌ、ＫＨ２　ＰＯ４　　０．１６ｇ／ｌ、ＮａＣｌ　７．３０ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ３　０．４２ｇ／ｌ、ｇｌｕｃｏｓｅ　１．０８ｇ／ｌ、ＨＥＰＥＳ　６．００ｇ／ｌからなる。
【００３０】
（２）結果
培養４８時間後及び７２時間後に、細胞の形態変化を顕微鏡で観察しながら、細胞直径の２倍以上の突起を伸展している神経細胞をカウントし、サンプル無添加の培地コントロールと比較した。その結果を図１に示す。図中、左側のグラフは４８時間培養、右側のグラフは７２時間培養であり、各グラフは左から順にＡ〜Ｈとした場合、以下の処理区分を示す。
【００３１】
Ａ：無処理
Ｂ：β−クリプトキサンチン単独処理（１０μＭ）
Ｃ：β−クリプトキサンチン単独処理（２０μＭ）
Ｄ：β−クリプトキサンチン単独処理（５０μＭ）
Ｅ：レチノイン酸（２０μＭ）処理
Ｆ：レチノイン酸（２０μＭ）＋β−クリプトキサンチン（１０μＭ）処理
Ｇ：レチノイン酸（２０μＭ）＋β−クリプトキサンチン（２０μＭ）処理
Ｈ：レチノイン酸（２０μＭ）＋β−クリプトキサンチン（５０μＭ）処理
【００３２】
図１に示されるように、β−クリプトキサンチンは、優れた神経突起伸長作用（分化誘導作用）を有しており、ポジティブコントロールであるレチノイン酸（ＲＡ）よりも中枢神経細胞に対して優れた神経突起再生作用を有していることが分かった。また、レチノイン酸（ＲＡ）と併用するとその活性は更に増加することが分かった。β−クリプトキサンチンの成熟中枢神経細胞に対する神経突起再生作用活性は、２０μＭにおいて最大値を示した。また、４８ｈと７２ｈを比べると、ほぼ同様の傾向を示した。
【００３３】
また、Ｎｅｕｒｏ　２ａ細胞は、カルシウムイオンをメディウムに添加すると神経突起を伸長することが報告されていることから、β−クリプトキサンチンによる細胞内カルシウムイオン濃度変化の有無について調べた。その結果、神経突起伸長が観察されたβ−クリプトキサンチン２０μＭによる変化は観察されなかった。
【００３４】
実施例２
本実施例では、細胞がアポトーシスを起こすと活性化するＤＥＶＤａｓｅ（カスパーゼ３）活性を指標として、β−クリプトキサンチンのＤＥＶＤａｓｅ活性に対する影響を調べた。
（１）試料
試料として、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、及び４種のカロテノイド（β−クリプトキサンチン、β−カロチン、アスタキサンチン、及びゼアキサンチン）を用いた。
【００３５】
（２）方法
１）エトポシド（抗ガン剤；ラステット（日本化薬）無添加の場合
Ｎｅｕｒｏ　２ａ細胞（２×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に４種のカロテノイドを添加し、３６ｈ後に培養フラスコから剥ぎ取り、ＰＢＳ（−）で洗浄後、氷冷ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒに懸濁、２０分氷冷した。Ｐｏｗｅｒｓｏｎｉｃ　ＭＯＤＥＬ　５００を用いて細胞を超音波破砕し、４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心後、上清を活性測定用サンプルとした。上清の１部をＢＩＯ　ＲＡＤマイクロアッセイ法を用い、タンパク量を吸光度より算出した。石英セルにａｓｓａｙ　ｂｕｆｆｅｒと一定量のタンパク質を含んだ上清を入れ、３７℃、１０分間平衡化させ、蛍光基質ＤＥＶＤ−ＭＣＡ　１０μＭ添加した。ＡＭＣの蛍光強度の変化をＳｈｉｍａｄｚｕ　ＲＦ−５００を用い、励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定した。
上記１）及び２）の方法により、Ｎｅｕｒｏ　２ａのＤＥＶＤａｓｅ活性を指標にして、上記４種のカロテノイドのアポトーシスに対する影響を調べた。
【００３６】
（３）結果
その結果を図２に示す。エトポシド０μＭの場合、β−クリプトキサンチンでは、ＤＥＶＤａｓｅ活性はゼロであり、アポトーシスを誘導しないことが分かった。エトポシド２０μＭ添加の場合、β−クリプトキサンチンとゼアキサンチンでは最もＤＥＶＤａｓｅ活性が低く、これらは、最もアポトーシスを抑制した。一方、β−カロチンでは、ＤＥＶＤａｓｅ活性が高く、アポトーシスの抑制効果がみられなかった。以上の結果から、β−クリプトキサンチンは、Ｎｅｕｒｏ２ａのＤＥＶＤａｓｅ活性を高める作用を有しないこと、及び抗ガン剤であってアポトーシスを誘導する作用を有するエトポシドによるアポトーシス誘導作用を顕著に抑制し、抗痴呆性成分として期待できること、が分かった。
【００３７】
実施例３
本実施例では、β−クリプトキサンチンを有効成分として配合して、中枢神経細胞のアポトーシス抑制作用を有する機能性食品を製造した。全量５０ｍｌ中に、配合成分として、β−クリプトキサンチン５０ｍｇ、ニコチン酸アミド２５ｍｇ、ビタミンＢ１　硝酸塩２ｍｇ、ビタミンＢ２　リン酸エステル２ｍｇ、ビタミンＢ６　２ｍｇ、無水カフェイン５０ｍｇ、添加物としての安息香酸塩及び香料、及び水を含有するドリンクタイプの機能性食品を製造した。
【００３８】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、β−クリプトキサンチンを有効成分として含有する中枢神経細胞突起再生剤、中枢神経細胞のアポトーシス抑制作用を有する抗痴呆剤、及び機能性食品に係るものであり、本発明により、１）中枢神経細胞、特に、成熟中枢神経細胞に対して優れた突起再生作用を有し、抗痴呆薬を含む神経変性疾患治療薬として有用な中枢神経細胞突起再生剤及び抗痴呆剤を提供することができる、２）これらの薬理作用を有する機能性食品を提供することができる、という格別の作用効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｎｅｕｒｏ　２ａ細胞におけるβ−クリプトキサンチンの神経突起伸長作用（分化誘導作用）の影響を示す説明図である。
【図２】エトポシドで誘発したＮｅｕｒｏ　２ａのＤＥＶＤａｓｅ活性におけるカロテノイドの効果を示す説明図である。
【符号の説明】
−　コントロール
Ｖ　ＤＭＳＯ
β　β−クリプトキサンチン
Ｃ　β−カロチン
Ａ　アスタキサンチン
Ｚ　ゼアキサンチン
【図１】
2004059438.tif 000002
【図２】
2004059438.tif 000003