(57)【要約】【課題】蛍光を検出する光検出器に到達する不所望な励起光の量を抑えつつも多く量の蛍光が光検出器に到達する蛍光顕微鏡を提供する。【解決手段】走査型蛍光顕微鏡は、励起光を含む光ビームを射出する光源部１と、光源部１からの光ビームを試料Ｓに照射する励起光照射光学系と、試料Ｓから発生した蛍光を含む光ビームを光源部１から試料Ｓに向かう光ビームから分離する分離光学素子５と、分離光学素子５で分離された蛍光を含む光ビームを二本に分割する光ビーム分割部１５と、分割された二本の光ビームからそれぞれ特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する二つの蛍光選択透過部１８と２３と、蛍光選択透過部１８と２３を透過した蛍光をそれぞれ検出する二つの光検出器１９と２４と、分離光学素子５と光ビーム分割部１５の間に位置し、それぞれの励起光を選択的に遮断する二つの励起光遮断光学素子１３と１４とを有している。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光ビームを試料に照射し試料から発する蛍光に基づいて試料を観察する蛍光顕微鏡であって、
少なくとも一種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出する光源部と、
光源部から射出された光ビームを試料に照射して試料から少なくとも一種類の蛍光を発生させる励起光照射光学系と、
試料から発生した少なくとも一種類の蛍光を含む光ビームを、光源部から試料に向かう光ビームから分離する分離光学素子と、
分離光学素子で分離された少なくとも一種類の蛍光を含む光ビームから特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する少なくとも一つの蛍光選択透過部を含む蛍光選択透過機構と、
蛍光選択透過機構を透過した蛍光を検出する少なくとも一つの光検出器を含む蛍光検出部と、
分離光学素子と蛍光選択透過部の間の光路上に位置し、光源部から射出された光ビームに含まれる少なくとも一種類の励起光を選択的に遮断する少なくとも一つの励起光遮断光学素子を含む励起光遮断部とを有している、蛍光顕微鏡。
【請求項２】
請求項１において、
光源部は、複数種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出し、
励起光照射光学系は、複数種類の単一波長の励起光を含む光ビームを試料に照射して試料から複数種類の蛍光を発生させ、
分離光学素子は、試料から発生した複数種類の蛍光を含む光ビームを光源部から試料に向かう光ビームから分離し、
蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子で分離された複数種類の蛍光を含む光ビームを、複数種類の蛍光の波長帯域に基づいて複数に分割する光ビーム分割部を有しており、
蛍光選択透過機構は、光ビーム分割部で分割された複数の光ビームから、それぞれ、特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する複数の蛍光選択透過部を有しており、
蛍光検出部は、複数の蛍光選択透過部を透過した蛍光をそれぞれ検出する複数の光検出器を有しており、
励起光遮断部は、光源部から射出された光ビームに含まれる複数種類の励起光をそれぞれ選択的に遮断する複数の励起光遮断光学素子を有している、蛍光顕微鏡。
【請求項３】
請求項１または請求項２において、励起光遮断光学素子はホログラフィックノッチフィルターである、蛍光顕微鏡。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれかひとつにおいて、励起光照射光学系は、励起光を含む光ビームを試料に収束させる対物レンズと、対物レンズにより試料に形成される励起光を含む光ビームのスポットを走査する走査光学系とを含んでいる、蛍光顕微鏡。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４のいずれかひとつにおいて、蛍光選択透過部は、特定の波長範囲から外れた波長の光を吸収する吸収フィルターである、蛍光顕微鏡。
【請求項６】
請求項１ないし請求項４のいずれかひとつにおいて、蛍光選択透過部は、入射する光ビームを波長分散させる分散素子と、分散素子により分散された光ビームを収束させる収束レンズと、収束レンズにより収束された光ビームの一部の波長域を通す光学的開口とを有し、収束レンズは入射した光ビームを波長成分に応じて異なる位置に収束させ、光学的開口は特定の波長成分の光を選択的に透過する、蛍光顕微鏡。
【請求項７】
請求項６において、蛍光選択透過部は光学的開口に対する波長成分の収束位置を決め、分散素子の回転角度を変更可能とし、蛍光顕微鏡は、分散素子の回転角度を変えることにより、光学的開口を透過する光ビームの波長域を可変して、蛍光を細分化した波長帯域毎に検出し得る、蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光顕微鏡は、一般に、染色された試料に、少なくとも一種類の波長の励起光を含む光ビームを照射して試料を励起し、試料から発生した少なくとも一種類の蛍光を、少なくとも一つの検出器をで検出し、検出された蛍光に基づいて試料の画像（蛍光画像）を取得する。
【０００３】
このような蛍光顕微鏡は、例えば特開平１１−２３１２２２号公報に開示されている。
【０００４】
【特許文献１】
特開平１１−２３１２２２号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
蛍光顕微鏡においては、一般に、波長により分光し得るダイクロイックミラーを用いて、試料に照射される励起光から、試料から発生した蛍光が分離される。通常、試料からダイクロイックミラーに到達する光は、試料から発生した蛍光だけでなく、試料で反射した励起光も含まれている。
【０００６】
一般に、試料を励起する励起光と、試料から発生する蛍光は、比較的近い波長を有している。励起光と蛍光の分離のためには、ダイクロイックミラーは、特定の波長を境に二値的に変化する透過率特性を有していることが理想的であるが、実際の透過率特性は、比較的急峻に変化していても、その部分はある程度の幅を有している。また、その部分の両端における透過率も０と１ではない。このため、ダイクロイックミラーで分離された光には、蛍光だけでなく、試料で反射された励起光も含まれる。
【０００７】
また、蛍光を検出する光検出器の手前には、検出対象の蛍光だけを検出するために、検出対象の蛍光に合った波長帯域の光を選択的に透過するフィルター等の光学要素が配置される。前述したように、ダイクロイックミラーで分離された光には不所望な励起光も含まれるため、このようなフィルター等の光学要素は、単に検出対象の蛍光を透過するだけでなく、不所望な励起光を確実に遮断する機能も要求される。
【０００８】
通常、不所望な励起光を遮断することを優先すると、それに伴って光検出器に到達する検出対象の蛍光の量も減ってしまい、反対に、検出対象の蛍光を多く透過することを優先すると、光検出器に到達する不所望な励起光も増えてしまう。
【０００９】
このような事情は、複数種類の励起光を含む光ビームを試料に照射して複数種類の蛍光を発生させる場合、更に顕著である。
【００１０】
本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、蛍光を検出する光検出器に到達する不所望な励起光の量を抑えつつ、多く量の蛍光が光検出器に到達する蛍光顕微鏡を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の各項に列記する蛍光顕微鏡を含んでいる。
【００１２】
１．本発明の蛍光顕微鏡は、少なくとも一種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出する光源部と、光源部から射出された光ビームを試料に照射して試料から少なくとも一種類の蛍光を発生させる励起光照射光学系と、試料から発生した少なくとも一種類の蛍光を含む光ビームを、光源部から試料に向かう光ビームから分離する分離光学素子と、分離光学素子で分離された少なくとも一種類の蛍光を含む光ビームから特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する少なくとも一つの蛍光選択透過部を含む蛍光選択透過機構と、蛍光選択透過機構を透過した蛍光を検出する少なくとも一つの光検出器を含む蛍光検出部と、分離光学素子と蛍光選択透過部の間の光路上に位置し、光源部から射出された光ビームに含まれる少なくとも一種類の励起光を選択的に遮断する少なくとも一つの励起光遮断光学素子を含む励起光遮断部とを有している。
【００１３】
この蛍光顕微鏡においては、不所望な励起光は、それ専用の励起光遮断光学素子によって、良好に遮断される。これにより、蛍光選択透過部に要求される光学的特性が緩和される。このため、蛍光選択透過部は、比較的広い波長範囲の光を透過してもよい。その結果、光検出器に、多くの量の蛍光が到達する。
【００１４】
２．本発明の別の蛍光顕微鏡は、第１項の蛍光顕微鏡において、光源部は、複数種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出し、励起光照射光学系は、複数種類の単一波長の励起光を含む光ビームを試料に照射して試料から複数種類の蛍光を発生させ、分離光学素子は、試料から発生した複数種類の蛍光を含む光ビームを光源部から試料に向かう光ビームから分離し、蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子で分離された複数種類の蛍光を含む光ビームを、複数種類の蛍光の波長帯域に基づいて複数に分割する光ビーム分割部を有しており、蛍光選択透過機構は、光ビーム分割部で分割された複数の光ビームから、それぞれ、特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する複数の蛍光選択透過部を有しており、蛍光検出部は、複数の蛍光選択透過部を透過した蛍光をそれぞれ検出する複数の光検出器を有しており、励起光遮断部は、光源部から射出された光ビームに含まれる複数種類の励起光をそれぞれ選択的に遮断する複数の励起光遮断光学素子を有している。
【００１５】
この蛍光顕微鏡においては、複数種類の励起光を含む光ビームを試料に照射して複数種類の蛍光を発生させる場合においても、不所望な励起光が良好に遮断されつつも、光検出器に多くの量の蛍光が到達する。
【００１６】
３．本発明の別の蛍光顕微鏡は、第１項または第２項の蛍光顕微鏡において、励起光遮断光学素子はホログラフィックノッチフィルターである。
【００１７】
この蛍光顕微鏡は、不所望な励起光を良好に遮断する好適な励起光遮断光学素子の一態様を与える。
【００１８】
４．本発明の別の蛍光顕微鏡は、第１項ないし第３項のいずれかひとつの蛍光顕微鏡において、励起光照射光学系は、励起光を含む光ビームを試料に収束させる対物レンズと、対物レンズにより試料に形成される励起光を含む光ビームのスポットを走査する走査光学系とを含んでいる。
【００１９】
この蛍光顕微鏡は、走査型蛍光顕微鏡を提供する。
【００２０】
５．本発明の別の蛍光顕微鏡は、第１項ないし第４項のいずれかひとつの蛍光顕微鏡において、蛍光選択透過部は、特定の波長範囲から外れた波長の光を吸収する吸収フィルターである。
【００２１】
この蛍光顕微鏡は、蛍光選択透過部の一態様を与える。
【００２２】
６．本発明の別の蛍光顕微鏡は、第１項ないし第４項のいずれかひとつの蛍光顕微鏡において、蛍光選択透過部は、入射する光ビームを波長分散させる分散素子と、分散素子により分散された光ビームを収束させる収束レンズと、収束レンズにより収束された光ビームの一部の波長域を通す光学的開口とを有し、収束レンズは入射した光ビームを波長成分に応じて異なる位置に収束させ、光学的開口は特定の波長成分の光を選択的に透過する。
【００２３】
この蛍光顕微鏡は、蛍光選択透過部の別の一態様を与える。
【００２４】
７．本発明の別の蛍光顕微鏡は、第６項の蛍光顕微鏡において、蛍光選択透過部は光学的開口に対する波長成分の収束位置を決め、分散素子の回転角度を変更可能とし、蛍光顕微鏡は、分散素子の回転角度を変えることにより、光学的開口を透過する光ビームの波長域を可変して、蛍光を細分化した波長帯域毎に検出し得る。
【００２５】
この蛍光顕微鏡は、検出対象の蛍光のスペクトルデータを取得可能である。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００２７】
第一実施形態
本実施形態は、走査型蛍光顕微鏡に向けられている。以下、図１と図３〜図８を参照しながら本実施形態について説明する。
【００２８】
図１に示されるように、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、少なくとも一種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出する光源部１を有している。光源部１は、これに限定されないが、例えば、複数の単一波長の光を含む光ビームを発するレーザ光源２と、レーザ光源２から発せられた光ビームの径を拡大するビームエキスパンダ３と、試料Ｓの励起に必要な特定の波長の光を選択的に透過するレーザーラインフィルター４とを有している。
【００２９】
例えば、レーザ光源２は、４８８ｎｍと５６８ｎｍと６４７ｎｍの波長の光を同時発振するクリプトンアルゴンレーザであり、レーザーラインフィルター４は、レーザ光源２から発せられた光のうち、４８８ｎｍと５６８ｎｍの波長の光を選択的に透過する。
【００３０】
従って、光源部１は、二種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出する。しかし、光源部１は、これに限定されるものではなく、一種類の単一波長の励起光から成る光ビームを射出してもよく、あるいは、三種類以上の単一波長の励起光を含む光ビームを射出してもよい。
【００３１】
図１において、走査型蛍光顕微鏡は更に、光源部１から射出された二種類の励起光を含む光ビームを試料Ｓに照射する励起光照射光学系を有している。励起光照射光学系は、励起光を含む光ビームを試料Ｓに収束させる対物レンズ１１と、励起光を含む光ビームを対物レンズ１１に向けて偏向するミラー８と、ミラー８から対物レンズ１１に至る間の光路上に配置された瞳投影レンズ９と結像レンズ１０とを含んでいる。
【００３２】
励起光照射光学系は更に、対物レンズ１１により試料Ｓに形成される励起光を含む光ビームのスポットを二次元的に走査する走査光学系７を有している。走査光学系７は、光源部１とミラー８の間の光路上に配置された、ガルバノメ一夕スキャナ７ａとガルバノメ一夕スキャナ７ｂとで構成されている。
【００３３】
二つのガルバノメ一夕スキャナ７ａと７ｂは、それぞれ、方向を変更可能な反射面を有しており、反射面の方向を変更することにより、反射面で反射された光ビームを一方向に沿って（つまり一次元的に）走査する。二つのガルバノメ一夕スキャナ７ａと７ｂは、その反射面で反射された光ビームを互いに直交する方向（Ｘ方向とＹ方向）に走査する。このため、走査光学系７により、試料Ｓに形成される光ビームのスポットは、二次元的に走査される。
【００３４】
試料Ｓは光ビームの照射に反応して蛍光を発する。試料Ｓは、照射された光ビームに含まれる励起光の種類に対応した種類の蛍光を発する。本実施形態では、試料Ｓは二種類の試薬で染色されており、試料Ｓには二種類の励起光を含む光ビームが照射される。このため、試料Ｓからは二種類の蛍光が発生する。試料Ｓから発生する二種類の蛍光は、それぞれ、試料Ｓに照射される二種類の励起光の波長帯域に対応した波長帯域を有する。
【００３５】
走査型蛍光顕微鏡は更に、試料Ｓから発生した蛍光を含む光ビームを、光源部１から試料Ｓに向かう光ビームから分離する分離光学素子５を有している。簡単に言えば、分離光学素子５は励起光と蛍光とを分離する。分離光学素子５は、例えば、光源部１と試料Ｓの間の光路上に位置するダイクロイックミラーで構成される。
【００３６】
図１において、走査型蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子５で分離された少なくとも一種類の蛍光を含む光ビームから特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する少なくとも一つの蛍光選択透過部を含む蛍光選択透過機構と、蛍光選択透過機構を透過した蛍光を検出する少なくとも一つの光検出器を含む蛍光検出部とを有している。
【００３７】
より詳しくは、試料Ｓからは二種類の蛍光が発生されることに対応して、走査型蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子５で分離された蛍光を含む光ビームを、それに含まれる二種類の蛍光の波長帯域に基づいて二本に分割する光ビーム分割部１５を有している。蛍光選択透過機構は、光ビーム分割部１５で分割された二本の光ビームから、それぞれ、特定の波長範囲内の蛍光を選択して透過する二つの蛍光選択透過部１８と２３を有している。蛍光検出部は、二つの蛍光選択透過部１８と２３を透過した蛍光をそれぞれ検出する二つの光検出器１９と２４を有している。
【００３８】
光ビーム分割部１５は、これに限定されないが、例えば、ダイクロイックミラーで構成される。二つの蛍光選択透過部１８と２３は、それぞれ、これに限定されないが、例えば、特定の波長範囲から外れた波長の光を吸収する吸収フィルターで構成される。二つの光検出器１９と２４は、それぞれ、これに限定されないが、例えば、フォトマルチプライヤ（ＰＭＴ）で構成される。
【００３９】
走査型蛍光顕微鏡は更に、分離光学素子５で分離された蛍光を含む光ビームを光ビーム分割部１５に向けて偏向するミラー１２と、光ビーム分割部１５を透過した光ビームを光検出器２４に向けて偏向するミラー２０とを有している。
【００４０】
走査型蛍光顕微鏡は更に、光ビーム分割部１５と蛍光選択透過部１８の間の光路上に配置された集光レンズ１６およびピンホール１７と、ミラー２０と蛍光選択透過部２３の間の光路上に配置された集光レンズ２１およびピンホール２２とを有している。
【００４１】
ピンホール１７とピンホール２２は、それぞれ、対物レンズ１１により試料Ｓに形成される励起光を含む光ビームのスポットに対して共焦点の位置関係に配置されている。このため、ピンホール１７とピンホール２２は、共焦点効果により、試料Ｓに形成される光ビームのスポットから外れた位置、特に光軸に沿って外れた位置から発生された蛍光を効果的に遮断する。このため、光検出器１９と２４は、試料Ｓに形成される光ビームのスポットの位置からの蛍光を選択的に検出し得る。
【００４２】
走査型蛍光顕微鏡は更に、光源部１から射出される光ビームに含まれる二種類の励起光をそれぞれ選択的に遮断する励起光遮断光学素子１３と励起光遮断光学素子１４とを有している。二つの励起光遮断光学素子１３と１４は共に分離光学素子５と光ビーム分割部１５の間の光路上に配置されている。二つの励起光遮断光学素子１３と１４は、好ましくは、それぞれ、ホログラフィックノッチフィルターで構成される。
【００４３】
走査型蛍光顕微鏡においては、光源部１から発せられた励起光を含む光ビームは対物レンズ１１により試料Ｓに収束される。対物レンズ１１により試料Ｓに形成された光ビームのスポットは、走査光学系７により試料Ｓの表面上あるいは内部を二次元的に走査される。試料Ｓに照射される光ビームは二種類の励起光を含んでおり、試料Ｓはそれに対応した二種類の試薬で染色されているため、試料Ｓからは二種類の蛍光が発生する。
【００４４】
試料Ｓから発生した二種類の蛍光は、それぞれ、光検出器１９と光検出器２４により検出される。特に、共焦点効果により、光ビームのスポットの位置から発生した蛍光が、光検出器１９と光検出器２４により選択的に検出される。光検出器１９と光検出器２４で得られる信号を、走査光学系７を制御する走査信号に同期させて処理することにより、それぞれの蛍光に基づく試料Ｓの蛍光画像が得られる。
【００４５】
前述したように、レーザ光源２は、４８８ｎｍと５６８ｎｍと６４７ｎｍの波長の光を発する。レーザーラインフィルター４は、図３に示される透過率特性を有しており、レーザ光源２で発せられた光のうち、４８８ｎｍと５６８ｎｍの光を選択的に透過する。従って、光源部１からは、４８８ｎｍと５６８ｎｍの励起光を含む光ビームが射出される。
【００４６】
光源部１から射出された４８８ｎｍと５６８ｎｍの励起光は試料Ｓに照射され、試料Ｓからは、４８８ｎｍの励起光に対応して、５００ｎｍ〜５４０ｎｍの波長帯域の蛍光が発生され、５６８ｎｍの励起光に対応して、５８５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長帯域の蛍光が発生される。
【００４７】
励起光と蛍光とを分離する分離光学素子５を構成するダイクロイックミラーは、例えば図４に示される透過率特性を有しており、光源部１から射出される４８８ｎｍと５６８ｎｍの波長の励起光を反射する一方、試料Ｓから発生される５００〜５４０の波長帯域の蛍光と５８５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長帯域の蛍光を良好に透過する。
【００４８】
図４から分かるように、分離光学素子５を構成するダイクロイックミラーは、４８８ｎｍと５６８ｎｍの波長の励起光をいくらかは透過する。このため、試料Ｓで反射された励起光のいくらかは、試料Ｓから発生された蛍光と一緒に分離光学素子５であるダイクロイックミラーを透過する。
【００４９】
励起光遮断光学素子１３を構成するホログラフィックノッチフィルターは、図５にＨＮＦ１３で示される透過率特性を有し、励起光遮断光学素子１４を構成するホログラフィックノッチフィルターは、図５にＨＮＦ１４で示される透過率特性を有している。
【００５０】
図５から分かるように、励起光遮断光学素子１３を構成するホログラフィックノッチフィルターは、４８８ｎｍの波長の近傍の帯域において、透過率がほとんど０である。従って、励起光遮断光学素子１３を構成するホログラフィックノッチフィルターは、４８８ｎｍの波長の励起光をほとんど完全に遮断する。
【００５１】
同様に、励起光遮断光学素子１４を構成するホログラフィックノッチフィルターは、５６８ｎｍの波長の近傍の帯域において透過率がほとんど０である。従って、励起光遮断光学素子１４を構成するホログラフィックノッチフィルターは、５６８ｎｍの波長の励起光をほとんど完全に遮断する。
【００５２】
その結果、光ビーム分割部１５に到達した光ビームは、試料Ｓで反射された４８８ｎｍと５６８ｎｍの波長の励起光を殆ど含まない。つまり、光ビーム分割部１５に到達した光ビームは、実質的に、検出対象である試料Ｓから発生された５００ｎｍ〜５４０ｎｍの波長帯域の蛍光と５８５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長帯域の蛍光で構成されている。
【００５３】
光ビーム分割部１５を構成するダイクロイックミラーは、例えば図６に示される透過率特性を有しており、５００ｎｍ〜５４０ｎｍの波長帯域の蛍光を良好に反射する一方、５８５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長帯域の蛍光を透過する。
【００５４】
蛍光選択透過部１８を構成する吸収フィルターは、例えば図７にＢＡ１８で示される透過率特性を有し、蛍光選択透過部２３を構成する吸収フィルターは、図７にＢＡ２３で示される透過率特性を有している。
【００５５】
図７から分かるように、励起光遮断光学素子１３を構成するホログラフィックノッチフィルターの透過率特性ＨＮＦ１３と励起光遮断光学素子１４を構成するホログラフィックノッチフィルターの透過率特性ＨＮＦ１４に対応して、吸収フィルター１８と吸収フィルター２３は共に比較的広い透過帯域を有している。
【００５６】
比較例として、図１の構成から励起光遮断光学素子１３と励起光遮断光学素子１４とが省かれた構成（すなわち従来の走査型蛍光顕微鏡）において、蛍光選択透過部１８を構成する吸収フィルターに要求される透過率特性と、蛍光選択透過部２３を構成する吸収フィルターに要求される透過率特性を図８に示す。
【００５７】
図１の構成から励起光遮断光学素子１３と励起光遮断光学素子１４とが省かれた構成においては、蛍光選択透過部１８と蛍光選択透過部２３に到達した光は、検出対象の蛍光の他に、試料Ｓで反射された不所望な励起光も含んでいる。このため、蛍光選択透過部１８と蛍光選択透過部２３は、単にそれぞれの検出対象の蛍光を透過するだけでなく、不所望な励起光を良好に遮断することも要求される。
【００５８】
このため、蛍光選択透過部１８を構成する吸収フィルターの透過特性は、４８８ｎｍと５６８ｎｍの波長の励起光を良好に遮断するように、図８にＢＡ１８で示されるように、透過帯域が狭いものにならざるを得ない。同様に、蛍光選択透過部２３を構成する吸収フィルターの透過特性は、５６８ｎｍの波長の励起光を良好に遮断するように、図８にＢＡ２３で示されるように、透過帯域が狭いものものにならざるを得ない。
【００５９】
その結果、例えば、蛍光選択透過部１８は、５００ｎｍ〜５４０ｎｍの透過帯域を有する吸収フィルターで構成され、蛍光選択透過部２３は、５８５ｎｍ〜６５０ｎｍの透過帯域を有する吸収フィルターで構成される。図８において、「５８５ｎｍ（蛍光）」は蛍光のピーク波長を示しており、実際の蛍光はこの両側にある帯域を持って広がっている。従って、ＢＡ２３で示される特性の吸収フィルターであっても、蛍光を検出することは可能である。
【００６０】
このような透過帯域の狭い吸収フィルターは、好ましくないことに、検出対象である蛍光をも吸収してしまい、その後方に位置する光検出器１９や光検出器２４に到達する蛍光の量を減少させてしまう。
【００６１】
これに対して、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡においては、不所望な４８８ｎｍと５６８ｎｍの波長の励起光は、分離光学素子５と光ビーム分割部１５の間の光路上に配置された二つの励起光遮断光学素子１３と１４によって遮断される。このため、蛍光選択透過部１８と蛍光選択透過部２３に到達した光は、不所望な励起光を殆ど含まない。
【００６２】
従って、蛍光選択透過部１８と蛍光選択透過部２３には、不所望な励起光を良好に遮断することは要求されない。このため、蛍光選択透過部１８と蛍光選択透過部２３に、透過帯域の広い吸収フィルターを使用することが可能になる。具体的には、本実施形態における吸収フィルター（図７）の励起光遮断レベルは、従来例における吸収フィルター（図８）の励起光遮断レベルに比べて１桁から３桁程度低くてよく、その分、蛍光の透過帯域を広げることができる。これにより、蛍光選択透過部１８と蛍光選択透過部２３の後方にそれぞれ位置する光検出器１９と光検出器２４に、より多くの量の蛍光を到達させることができる。
【００６３】
その結果、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、励起光の波長に近い波長の蛍光も検出できる。これにより、例えば、より明るい蛍光画像を得ることができる。
【００６４】
第二実施形態
本実施形態は、走査型蛍光顕微鏡に向けられている。以下、図２を参照しながら本実施形態について説明する。
【００６５】
図２は、本発明の第二実施形態の走査型蛍光顕微鏡を示している。図２において、図１中の部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【００６６】
本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、主に蛍光選択透過機構の構成の点で、第一実施形態の走査型蛍光顕微鏡と相違している。
【００６７】
図２に示されるように、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、分離光学素子５とミラー１２の間の光路上に、分離光学素子５で分離された蛍光を含む光ビームを収束させる結像レンズ２５と、結像レンズ２５の結像位置に配置された共焦点絞り２６と、共焦点絞り２６を通過し発散光ビームを平行光ビームに変えるレンズ２７とを有している。
【００６８】
共焦点絞り２６は、対物レンズ１１により試料Ｓに形成される励起光を含む光ビームのスポットに対して共焦点の位置関係に配置されている。このため、共焦点絞り２６は、共焦点効果により、試料Ｓに形成される光ビームのスポットから外れた位置、特に光軸に沿って外れた位置から発生された蛍光を効果的に遮断する。これにより、最終的に得られる蛍光画像の分解能の向上に貢献する。
【００６９】
本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、光ビーム分割部１５から光検出器１９に至る光路上に蛍光選択透過部２８を有し、光ビーム分割部１５からミラー２０を経て光検出器２４に至る光路上に蛍光選択透過部３２を有している。
【００７０】
別の観点から、図１に示される第一実施形態の走査型蛍光顕微鏡との相違に注目して述べれば、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、分離光学素子５とミラー１２の間の光路上に結像レンズ２５と共焦点絞り２６とレンズ２７とが追加されており、第一実施形態の走査型蛍光顕微鏡の集光レンズ１６とピンホール１７と蛍光選択透過部１８が蛍光選択透過部２８に置き換えられ、集光レンズ２１とピンホール２２と蛍光選択透過部２３が蛍光選択透過部３２に置き換えられた構成をしている。
【００７１】
蛍光選択透過部２８は、入射する光ビームを波長分散させる分散素子（反射回折格子）２９と、分散素子２９により分散された光ビームを収束させる収束レンズ３０と、収束レンズ３０により収束された光ビームの一部の波長域を通す光学的開口すなわちスリット３１とを有している。
【００７２】
同様に、蛍光選択透過部３２は、入射する光ビームを波長分散させる分散素子（反射回折格子）３３と、分散素子３３により分散された光ビームを収束させる収束レンズ３４と、収束レンズ３４により収束された光ビームの一部の波長域を通す光学的開口すなわちスリット３５とを有している。
【００７３】
蛍光選択透過部２８と蛍光選択透過部３２は、例えば、グレーティングガルバノで構成される。蛍光選択透過部２８と蛍光選択透過部３２は全く同様の機能を有している。このため、以下では、代表的に、蛍光選択透過部２８の動作について述べる。
【００７４】
蛍光選択透過部２８において、分散素子２９に入射した光ビームは、波長に従って異なる方向に分散される。つまり、入射光ビームに含まれる光は、波長成分毎に異なる方向に変更される。このため、収束レンズ３０に入射した光は、光軸を横切る方向に関して、波長成分に応じて異なる位置に収束される。つまり、収束レンズ３０は入射した光ビームを波長成分に応じて異なる位置に収束させる。このため、蛍光選択透過部２８に入射した光のうち、特定の波長範囲の光だけがスリット３１を通過し得る。つまり、スリット３１は特定の波長成分の光だけを選択的に透過する。その結果、スリット３１を通過した特定の波長範囲の光だけが光検出器１９で検出される。
【００７５】
全く同様にして、蛍光選択透過部３２に入射した光ビームのうち、特定の波長範囲の光だけが、スリット３５を通過して光検出器２４で検出される。
【００７６】
本実施形態の走査型蛍光顕微鏡においては、二つの励起光遮断光学素子（好ましくはホログラフィックノッチフィルター）１３と１４によって、蛍光選択透過部２８と蛍光選択透過部３２に到達する前に、不所望な励起光が除去される。このため、蛍光選択透過部２８と蛍光選択透過部３２に入射した光は、不所望な励起光を殆ど含まない。このため、スリット３１とスリット３５は、開口の大きさを比較的大きくすることが可能である。これにより、スリット３１とスリット３５の後方にそれぞれ位置する光検出器１９と光検出器２４に、より多くの量の蛍光を到達させることができる。
【００７７】
その結果、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、励起光の波長に近い波長の蛍光も検出できる。これにより、例えば、より明るい蛍光画像を得ることができる。
【００７８】
より好ましくは、蛍光選択透過部２８は分散素子２９の方向を調整可能であり、蛍光選択透過部３２は分散素子３３の方向を調整可能であるとよい。例えば、蛍光選択透過部２８において、分散素子２９の方向を変えることにより、蛍光を細分化した波長帯域毎に検出することも可能である。同様に、蛍光選択透過部３２において、分散素子３３の方向を変えることにより、蛍光を細分化した波長帯域毎に検出することも可能である。
【００７９】
つまり、本実施形態の走査型蛍光顕微鏡は、蛍光選択透過部２８と蛍光選択透過部３２をこの様に構成することにより、検出対象の蛍光のスペクトルデータを取得することも可能である。
【００８０】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施の形態を述べたが、本発明は、これらの実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【００８１】
上述した実施形態では、光源部１は二種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出し、試料Ｓからは二種類の蛍光が発生されることに対応して、蛍光選択透過機構は二つの蛍光選択透過部を有し、蛍光検出部は二つの光検出器１９と２４を有し、励起光遮断部は二つの励起光遮断光学素子１３と１４を有している。
【００８２】
しかし、蛍光選択透過部と光検出器と励起光遮断光学素子の個数は、これに限定されるものではなく、光源部１から射出される光ビームに含まれる単一波長の励起光の種類、あるいは、試料Ｓから発生される蛍光の種類に対応して、適宜変更されてよい。
【００８３】
前述したように、光源部１は一種類の単一波長の励起光を含む光ビームを射出してもよい。その場合、蛍光選択透過機構は一つの蛍光選択透過部を有し、蛍光検出部は一つの光検出器を有し、励起光遮断部は一つの励起光遮断光学素子を有していればよい。
【００８４】
また、光源部１は三種類以上の単一波長の励起光を含む光ビームを射出してもよい。その場合、蛍光選択透過機構は対応する個数の蛍光選択透過部を有し、蛍光検出部は対応する個数の光検出器を有し、励起光遮断部は対応する個数の励起光遮断光学素子を有しているとよい。
【００８５】
結局、光源部１は少なくとも一種類以上の単一波長の励起光を含む光ビームを射出し、それに対応して、蛍光選択透過機構は少なくとも一つの蛍光選択透過部を有し、蛍光検出部は少なくとも一つの光検出器を有し、励起光遮断部は少なくとも一つの励起光遮断光学素子を有していればよい。
【００８６】
また、光源部１から射出される光は、レーザー光のようなほぼ単一波長の光が最も好ましいが、レーザー光でなくとも帯域の狭い光であってもよい。帯域の狭い光は、それ自体が光源から射出されるものに限らず、光源から射出された光からフィルター等の波長選択手段によって作られたものであってもよい。
【００８７】
【発明の効果】
本発明によれば、蛍光を検出する光検出器に到達する不所望な励起光の量を抑えつつ、多く量の蛍光が光検出器に到達する蛍光顕微鏡が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第一実施形態の走査型蛍光顕微鏡の構成を概略的に示している。
【図２】本発明の第二実施形態の走査型蛍光顕微鏡の構成を概略的に示している。
【図３】図１と図２に示された光源部内のレーザーラインフィルターの透過率特性を示している。
【図４】図１と図２に示された分離光学素子であるダイクロイックミラーの透過率特性を示している。
【図５】図１と図２に示された励起光遮断素子であるホログラフィックノッチフィルターの透過率特性を示している。
【図６】図１と図２に示された光ビーム分割部であるダイクロイックミラーの透過率特性を示している。
【図７】図１と図２に示された蛍光選択透過部である吸収フィルターの透過率特性を示している。
【図８】図１の構成からホログラフィックノッチフィルターが省かれた構成である従来の走査型蛍光顕微鏡において要求される吸収フィルターの透過率特性を示している。
【符号の説明】
１…光源部、２…レーザ光源、３…ビームエキスパンダ、４…レーザーラインフィルター、５…分離光学素子、７…走査光学系、７ａ…ガルバノメ一夕スキャナ、７ｂ…ガルバノメ一夕スキャナ、８…ミラー、９…瞳投影レンズ、１０…結像レンズ、１１…対物レンズ、１２…ミラー、１３…励起光遮断光学素子、１４…励起光遮断光学素子、１５…光ビーム分割部、１８…蛍光選択透過部、１９…光検出器、２３…蛍光選択透過部、２４…光検出器、２８…蛍光選択透過部、３２…蛍光選択透過部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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