(57)【要約】      （修正有）【課題】低温回避作物の開発等に有用な恒温植物ザゼンソウ由来の新規ＡＯＸ遺伝子を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するザゼンソウ由来シアン耐性呼吸酵素Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸをコードするザゼンソウ遺伝子Ｓｆａｏｘと、この遺伝子の発現産物であるシアン耐性呼吸酵素遺伝子Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸ。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するザゼンソウ由来シアン耐性呼吸酵素Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸをコードするザゼンソウ遺伝子Ｓｆａｏｘ。
【請求項２】
請求項１の遺伝子Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列、またはその一部連続配列を有する請求項２のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２または３のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
請求項２または３のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項６】
請求項２または３のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６の組換えベクターによる形質転換体細胞。
【請求項８】
請求項１のザゼンソウ遺伝子Ｓｆａｏｘの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するザゼンソウ由来シアン耐性呼吸酵素Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸ。
【請求項９】
請求項８の酵素Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸの一部であり、配列番号３のアミノ酸配列を有するミトコンドリア移行シグナルペプチドＳｆｍｉｔ１。
【請求項１０】
請求項８の酵素Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸの一部であり、配列番号４のアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア内膜に移行してシアン耐性呼吸酵素として機能するタンパク質ＳｆｍＡＯＸ。
【請求項１１】
請求項９のシグナルペプチドＳｆｍｉｔ１をコードするオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１０のタンパク質ＳｆｍＡＯＸをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、発熱（恒温）植物であるザゼンソウ（Ｓｙｍｐｌｏｃａｒｐｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）のシアン耐性呼吸酵素遺伝子とその発現産物に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、発熱による低温回避植物の開発等の植物育種分野、糖尿病や肥満の治療に関する医学分野、植物由来の新規発熱素材開発の工学分野、環境浄化微生物開発のための遺伝子工学分野において有用なザゼンソウ由来のシアン耐性呼吸酵素とこの遺伝子の発現産物であるタンパク質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
一般に植物は発熱能力がなく、その体温は気温の変化とともに変動するものと考えられているが、植物界には例外的に自ら発熱し体温を調節できるものが存在する。特に、早春に花を咲かせるザゼンソウは、これまでに知られている発熱植物の中で、寒冷環境下で発熱し、その体温を一定温度に維持する能力を有する唯一の植物種である。従来、発熱能力を持たない作物においては、低温障害あるいは凍結障害はその生産性を制限する最も重要な因子であると考えられていた（非特許文献１）。しかしながら、植物の発熱能力自体が一般的ではないことから、発熱による低温回避機能の開発はほとんど行われていなかった。
【０００３】
ザゼンソウの発熱部位は、小花が密集している肉穂花序に限定されている（非特許文献２）。事実、米国に自生するザゼンソウの肉穂花序内部の温度は外気温が−１５℃にまで低下しても、＋１０℃よりも高いレベルを示すことが報告されている（非特許文献３）。わが国に自生するザゼンソウの体温を解析した結果を図１に示す。この図からも明らかなように、ザゼンソウは、氷点下を含む外気温度の変動にもかかわらず、その体温を２３℃内外に維持できる。このような寒冷環境下に生育する恒温植物の例としては、ザゼンソウ以外には報告がない。
【０００４】
このような発熱現象については、発熱植物自体が例外的な存在であったため、その研究は多くはないが、細胞における呼吸反応が重要であるとされてきた。例えば、発熱植物の一つであるＰｈｉｌｏｄｅｎｄｒｏｎにおいては、発熱時においては、組織の酸素消費量が有意に増加することから、ミトコンドリアにおける呼吸活性の増大が発熱反応と密接に関連するものと推定されていた（非特許文献４）。
【０００５】
わが国に自生するザゼンソウのミトコンドリアにおける発熱因子については、脱共役タンパク質（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ＵＣＰ）と呼ばれる膜タンパク質が重要な機能を有することが示されている（非特許文献５）。ＵＣＰはミトコンドリア内膜内外に生じたＨ＋をＡＴＰ合成と共役することなく、マトリックス内に流入させる機能を有する。ザゼンソウは少なくとも２種類のＵＣＰ関連タンパク質を持つことが明らかになっており、そのうちの１種であるＳｆＵＣＰｂは、植物および哺乳動物において従来知られているいずれのＵＣＰとも異なるトポロジーを持つ因子であった（非特許文献５）。この出願の発明者は、このＳｆＵＣＰｂについて特許出願している（特許文献１）。
【０００６】
ミトコンドリアで機能する熱産生因子として、脱共役タンパク質以外に、シアン耐性呼吸酵素（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｏｘｉｄａｓｅ：  ＡＯＸ）の関与も示唆されている（非特許文献６）。ＡＯＸは、ミトコンドリアにおいてユビキノンから供与された電子を用いて酸化反応により水を産生する能力を持つ因子である（非特許文献７）。発熱反応におけるミトコンドリアにおける呼吸量の増大、および、恒温維持における外気温変化に対する呼吸量の変動性は、ユビキノン電子のＡＯＸ分子による酸化能力に依存すると考えられている。ＡＯＸによる酸化反応は、シアンなどのチトクロームｃ酸化経路の阻害剤に耐性をもつことから、この因子は、シアン耐性呼吸酵素とも呼ばれている。これまでの研究により、非発熱植物であるタバコやシロイヌナズナにおいてもＡＯＸタンパク質が存在しており、タバコＡＯＸタンパク質を過剰発現させるタバコが作成されているが、この形質転換タバコにおける発熱現象は確認できなかった旨の報告がなされている（非特許文献８）。一方、極めて短時間（３〜６時間）発熱能力を示すヨーロッパに自生するＶｏｏｄｏｏ  ｌｉｌｙなる植物（恒温性なし）からもＡＯＸ関連因子が得られているが（非特許文献９、１０）、非恒温植物であるＶｏｏｄｏｏ  ｌｉｌｙ由来のＡＯＸ分子には恒温性に関連する機能は存在しないことが推定されている。
【０００７】
一方、恒温植物であるザゼンソウにおいては、恒温性維持に関わる器官は、肉穂花序に存在することが明らかになっており、肉穂花序が熱産生とともに、温度センサーとしても機能することが判明している（非特許文献２）。しかしながら、植物界における例外的存在である恒温植物ザゼンソウにおいてＡＯＸが関与する温度制御分子については全く同定されていなかった。
【０００８】
【特許文献１】
特開２０００−３５４４８９号公報
【非特許文献１】
Ｌｅｖｉｔｔ，  １９８０，  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ  ｔｏ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓｔｒｅｓｓｅｓ．  ２ｎｄ  ｅｄ．
【非特許文献２】
Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．，  ２００３，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ
【非特許文献３】
Ｋｎｕｔｓｏｎ，  １９７４，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８６，  ７４６−７４７
【非特許文献４】
Ｓｅｙｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｐｌａｎｔａ  １６１，  ２２９−２３２
【非特許文献５】
Ｉｔｏ，  １９９９，  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  １４２，  ５７−６５
【非特許文献６】
ＭｃＩｎｔｏｓｈ，  １９９４，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０５，  ７８１−７８６
【非特許文献７】
Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅ  ＆  ＭｃＩｎｔｏｓｈ，  １９９７，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８，  ７０３−７３４
【非特許文献８】
Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅ，  １９９４，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０６，  １５０３−１５１０
【非特許文献９】
Ｒａｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７．  １６０１−１６０２
【非特許文献１０】
Ｅｌｔｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８６，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８２，  １−６
【発明が解決しようとする課題】
植物の発熱または恒温性に関与する遺伝子は、例えば、遺伝子組み換え技術を用いた低温回避作物等の開発に極めて有用である。この点について、この出願の発明者は、植物の新規発熱遺伝子としてザゼンソウ由来の脱共役タンパク質（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＵＣＰ）の一種（ＳｆＵＣＰｂ）を特許出願している（特許文献１）。
【０００９】
しかしながら、前記のとおり、植物の発熱や恒温性の維持には、ＵＣＰとは別のメカニズムで機能するシアン耐性呼吸酵素ＡＯＸも重要に関与している。
【００１０】
従って、対象植物の種や用途に応じて最も有効な低温回避作物等を開発するためには、ＵＣＰとは異なるメカニズムで機能するＡＯＸ遺伝子が不可欠である。
【００１１】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、これまでに同定されていない恒温植物ザゼンソウ由来の新規ＡＯＸ遺伝子を提供することを課題としている。また、この出願は、この新規遺伝子の発現産物であるザゼンソウＡＯＸタンパク質およびミトコンドリア移行シグナルペプチドを提供することを課題ともしている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（１２）の発明を提供する。
（１）    配列番号２のアミノ酸配列を有するザゼンソウ由来シアン耐性呼吸酵素Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸをコードするザゼンソウ遺伝子Ｓｆａｏｘ。
（２）    前記発明（１）の遺伝子Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
（３）    配列番号１の塩基配列、またはその一部連続配列を有する前記発明（２）のポリヌクレオチド。
（４）    前記発明（２）または（３）のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
（５）    前記発明（２）または（３）のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
（６）    前記発明（２）または（３）のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
（７）    前記発明（６）の組換えベクターによる形質転換体細胞。
（８）    前記発明（１）のザゼンソウ遺伝子Ｓｆａｏｘの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するザゼンソウ由来シアン耐性呼吸酵素Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸ。
（９）    前記発明（８）の酵素Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸの一部であり、配列番号３のアミノ酸配列を有するミトコンドリア移行シグナルペプチドＳｆｍｉｔ１。
（１０）  前記発明（８）の酵素Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸの一部であり、配列番号４のアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア内膜に移行してシアン耐性呼吸酵素として機能するタンパク質ＳｆｍＡＯＸ。
（１１）  前記発明（９）のシグナルペプチドＳｆｍｉｔ１をコードするオリゴヌクレオチド。
（１２）  前記発明（１０）のタンパク質ＳｆｍＡＯＸをコードするポリヌクレオチド。
【００１３】
すなわち前記発明（１）の遺伝子Ｓｆａｏｘは、発熱部位である肉穂花序特異的に発現するザゼンソウ遺伝子である。公知の方法（非特許文献５）により抽出したザゼンソウ全ＲＮＡについてノーザン解析（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，  １９９４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  ２０３６−２０４１）を行った結果、図２Ａに示したように、発熱中の植物体においては、発熱部位である肉穂花序においてのみその発現が観察された。さらに、図２Ｂに示したように、発熱中および発熱後の肉穂花序における遺伝子Ｓｆａｏｘの発現を同様に解析すると、その発現は、発熱中の肉穂花序に限定されていることが確認された。
【００１４】
この発明（１）の遺伝子が発現するタンパク質のうち、ミトコンドリア移行シグナルを含むと考えられるシアン耐性呼吸酵素Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸ（発明（８））のアミノ酸配列（配列番号２）を５種類の異なる植物から得られているＡＯＸタンパク質のアミノ酸配列と比較した（図４）。Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸのアミノ酸配列は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ａｏｘ１ａ）、イネ（Ｒｉｃｅ  Ａｏｘ１ａ）、Ｖｏｏｄｏｏ  ｌｉｌｙ（Ｓ．  ｇｕｔｔａｔｕｍ  ＡＯＸ）、ダイズ（Ｓｏｙｂｅａｎ  Ａｏｘ１）、およびタバコ（Ｔａｂａｃｃｏ  Ａｏｘ１）に対して、それぞれ、６７％、６７％、７０％、７８％および７４％同一である。
【００１５】
Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸのアミノ酸配列のミトコンドリア移行シグナルをドイツ・ミュンヘン  タンパク質配列解析センターの大型計算機で解析したところ、Ｓｆｍｉｔ１と命名した領域（配列番号３）が明確な移行シグナルおよびＳｆｐｒｅ−ＡＯＸタンパク質の切断部位として同定された。
【００１６】
Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸは、他のミトコンドリアＡＯＸタンパク質に共通に認められる構造を有している。それは、このタンパク質の特徴であるホモダイマーの形成に必要な第１７３番目のＣｙｓ、および酸化反応に必要な鉄原子を配位するたものモチーフである第１１７番目のＧｌｕから始まるＥＲＭＨ配列が保存されている点である（図４）。
【００１７】
ミトコンドリア内膜で機能するＳｆｍａｔｕｒｅ−ＡＯＸについては、そのＮ末端の相同性は他の植物から得られたＡＯＸタンパク質に比べて相同性が低いことが明らかである（図４）。これまでに植物から得られているＡＯＸタンパク質の機能調節領域の詳細な解析例が限られていることから、Ｎ末側の機能は不明の点が多いが、ザゼンソウ由来のＡＯＸタンパク質のＮ末側の相同性が低い領域のアミノ酸配列が、ザゼンソウの恒温性維持機構に関連している可能性も想定される。
【００１８】
なおこの発明において、「酵素」、「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。
【００１９】
「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が１００個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは２−９９個連結した分子を言う。
【００２０】
また、この発明において使用するその他の用語や概念については、発明の実施形態や実施例の記載において説明する。なお、この発明を実施するために使用する様々な遺伝子操作技術や分子生物学的技術等は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５等）に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能なものである。
【００２１】
以下、各発明の実施の形態をさらに詳しく説明する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
発明（１）のザゼンソウ遺伝子ＳｆａｏｘＸは、配列番号２のアミノ酸配列を有するシアン耐性呼吸酵素遺伝子Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸをコードし、この遺伝子から転写されるｍＲＮＡからは配列番号１の塩基配列を有するｃＤＮＡが合成される。
【００２３】
発明（１）遺伝子Ｓｆａｏｘは、例えば、配列番号１の塩基配列またはその一部配列からなる精製ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとしてザゼンソウのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離するすることができる。あるいは、染色体に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって目的の遺伝子領域を同定することもできる。
【００２４】
得られたゲノム遺伝子は、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００２５】
なお、この発明（１）の遺伝子Ｓｆａｏｘには、それがコードするタンパク質の発現に対する制御領域（プロモーター／エンハンサー、サプレッサー等）も含まれる。これらの発現制御領域は、発現産物Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸやその遺伝子の更なる機能を解明するためにも有用である。また、発現制御領域に対する転写因子の探索は、例えば、植物に発熱、恒温性維持機能を付与するための新たな手段を提供する可能性がある。
【００２６】
発明（２）は、前記のゲノム遺伝子Ｓｆａｏｘやその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ等から精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片やＲＮＡ断片）である。このようなポリヌクレオチドの具体例として、発明（３）のｃＤＮＡが提供される。このｃＤＮＡはザゼンソウの細胞（特に肉穂花序）から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として合成することができる。ｃＤＮＡは、公知の方法（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２，  １６１−１７０，  １９８２；  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  ２５，  ２６３−２６９，  １９８３；  Ｇｅｎｅ，  １５０，  ２４３−２５０，  １９９４）を用いて合成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマ−として、細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。このようにして調製されるＳｆａｏｘ  ｃＤＮＡは、具体的には配列番号１の塩基配列またはその一部連続配列を有している。ここで「一部連続配列」とは、例えばタンパク質Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸをコードする領域（ＯＲＦ：１０３−１５２２ｎｔ）等を意味する。なお、一般に真核生物の遺伝子は多型が頻繁に認められる。従って、配列番号１において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているポリヌクレオチドもこの発明の範囲に含まれる。同様に、これらの塩基の変更によって生じる１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされているタンパク質もこの発明に含まれる。
【００２７】
以上の発明（２）および（３）のポリヌクレオチドは、例えばこの発明のタンパク質Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸの遺伝子工学的な製造に使用することができる。さらに、これらのポリヌクレオチドは、遺伝子組換え技術を用いた低温回避作物の開発のための導入遺伝子としても有用である。
【００２８】
発明（４）のオリゴヌクレオチドプローブは、前記のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片であり、例えば、配列番号１の塩基配列もしくはその相補配列における連続１０〜９９ｂｐのＤＮＡ断片等である。ここで、ストリンジェント条件とは、前記のポリヌクレオチドとプローブとの特異的なハイブリッド形成を可能とする条件であり、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアミド等）の濃度、温度条件によって規定される。詳しくは、米国特許Ｎｏ．  ６，１００，０３７等に詳しく規定されている。
【００２９】
発明（５）のプライマーセットは、前記のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するための１対のオリゴヌクレオチドである。これらのプライマーセットは、配列番号１の塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ  ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意すうことも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００３０】
発明（６）の組換えベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。例えば、ｃＤＮＡまたはそのＯＲＦ領域をインサートとしてこの発明のタンパク質Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸを生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することができる。また、前記のゲノム遺伝子ＤＮＡをインサートとする場合には、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターやコスミドベクター等を使用することもできる。
【００３１】
発明（７）の形質転換体細胞は、例えば、前記発明（７）の組換えベクターを用いてタンパク質Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸを製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。
【００３２】
発明（８）のタンパク質Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸは、公知の方法、すなわち、ザゼンソウの肉穂花序などから単離する方法、この出願によって提供されるアミノ酸配列に基づいて化学合成によりペプチドを調製する方法、あるいはこの出願によって提供される前記のポリヌクレオチドを用いて組み換えＤＮＡ技術により生産する方法などにより取得することができる。例えば、組み換えＤＮＡ技術によってタンパク質を取得する場合には、この発明の前記組換えベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ転写を行うことにより、タンパク質を得ることができる。また、前記のポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに組み換え、この組み換えベクターで大腸菌、枯草菌、酵母、動植物細胞等を形質転換すれば、これらの形質転換体でタンパク質を大量に発現させることができる。
【００３３】
この発明のタンパク質Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸをインビトロ翻訳で生産させる場合には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターにポリヌクレオチド（Ｓｆａｏｘ  ｃＤＮＡ）を組み換え、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すればよい。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７，Ｔ３，ＳＰ６などが例示できる。
【００３４】
また、この発明のタンパク質Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸを大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボゾーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のポリヌクレオチドを組み換えて発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換した後、得られた形質転換体を培養すればよい。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加すれば、任意の領域を含むタンパク質断片を得ることができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させ、この融合タンパク質を適当なプロテアーゼで切断することによって目的とするタンパク質のみを取得することもできる。大腸菌発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００３５】
このタンパク質Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸを真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加領域等を有する真核生物用発現ベクターに組み換え、真核細胞内に導入する。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
上記の方法により原核生物や真核生物でタンパク質を発現させたのち、培養物から目的のタンパク質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行う。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等である。
【００３７】
なお、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などである。
【００３８】
発明（９）は、前記のタンパク質Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸの一部であって、配列番号３のアミノ酸配列を有するミトコンドリア移行シグナルペプチドＳｆｍｉｔ１である。このペプチドは、例えば公知の固相合成法によって作成する方法や、あるいは発明（１１）のオリゴヌクレオチド（具体的には、配列番号１の１０３−１６５ｎｔ）を前記の組換えＤＮＡ技術で発現させる方法等によって得ることができる。この発明（９）のシグナルペプチドは、例えば、任意のミトコンドリア膜内タンパク質を細胞内ターゲティング等の使用することができる。あるいは、発明（１１）のオリゴヌクレオチドは、有用タンパク質のコード配列と連結するなどして、その有用タンパク質を肉穂花序特異的に発現させるために使用することもできる。
【００３９】
発明（１０）のタンパク質ＳｆｍＡＯＸは、前記のタンパク質Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸの一部であって、配列番号４のアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア内膜に移行してシアン耐性呼吸酵素として機能する成熟タンパク質である。このタンパク質ＳｆｍＡＯＸは、例えば公知の固相合成法によって作成する方法や、あるいは発明（１２）のポリヌクレオチド（具体的には、配列番号１の１６６−１５２２ｎｔ）を前記の組換えＤＮＡ技術で発現させる方法等によって得ることができる。
【００４０】
この発明（１０）のタンパク質Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸやその成熟タンパク質ＳｆｍＡＯＸ、あるいはこれらをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ユビキノンから供与される電子を水に酸化する機能として、呼吸鎖電子伝達系のバイパス経路を提供し、恒温熱産生反応の誘導や、過剰電子による生体酸化ストレスの抑制効果が期待される。さらにこのような呼吸鎖の人為的制御は、環境浄化微生物等の有用微生物の呼吸増大に伴う代謝活性の賦活化にも有望である。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１：ｃＤＮＡのクローニング
ザゼンソウの発熱部位である肉穂花序から全ＲＮＡを抽出し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりＲＮＡＡの精製度を確認した（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  １４２，  ５７−６５，  １９９９）。得られた全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により部分的なＡＯＸクローンを単離した。第１鎖ｃＤＮＡは、全ＲＮＡ（１．０μｇ）に２０ｐｍｏｌのオリゴｄＴプライマー（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）をアニールし、次いで、１０ユニットの逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、３７℃で３０分間、１０ｍＭ  １，４−ジチオトレイトールおよび０．５ｍＭ  ｄＮＴＰを含有する２０μｌの１ｘ  ＲＴ緩衝液で伸長した。さらに、得られた第１鎖ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行った。その際の反応溶液の組成は以下のとおりである。
【００４２】
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）；
５０ｍＭ  ＫＣｌ；
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ；
４  ｍＭ  ｄＮＴＰ  ；
０．２ユニットのＥｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）；および
ＡＯＸファミリー遺伝子の保存されたアミノ酸配列に対応する１０ｐｍｏｌの
２つのプライマー：
Ｆ１：５’−ＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＣＧ−３’（配列番号５）
Ｒ１：５’−ＡＴＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＣＧＡＧＧＧＧＣＧＣ−３’（配列番号６）
また、ＰＣＲサイクルは以下のとおりとした。
【００４３】
（９４℃：０．５分間、５５℃：１分間、７２℃：１分間）ｘ３５
以上の方法により得られたＰＣＲ産物のうち、約４５０ｂｐのｃＤＮＡフラグメントの配列から推定されるアミノ酸配列は、ＡＯＸ遺伝子群の一つのリーディングフレームと極めて高いホモロジーを示したので、このフラグメントをＴ−ベクターにクローニングし（クローンｐＺａｏｘ）、５’および３’ＲＡＣＥのためのプライマー設計に用いた。
【００４４】
肉穂花序から調製した全ＲＮＡを公知の方法で５’および３’−ＲＡＣＥを行った。詳細な反応組成は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに従った。その際、用いたプライマー配列は以下のとおりである。
【００４５】
５’−ＲＡＣＥ用プライマー：
Ｒ２−４：５’−ＣＧＡＧＧＣＧＡＡＧＴＧＧＴＴＧＡＣ−３’（配列番号７）
ＮＵＰ：５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３’（配列番号８）
３’−ＲＡＣＥ用プライマー
Ｆ１：  ５’−ＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＣＧ−３’（配列番号９）
ＮＵＰ：５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３’（配列番号１０）
それぞれの反応により、特異的なＤＮＡフラグメントが増幅された。５’−ＲＡＣＥ反応において増幅されたＤＮＡフラグメントは約１．１ｋｂであり、３’−ＲＡＣＥ反応で増幅されたＤＮＡフラグメントは約０．７ｋｂであった。それぞれのＤＮＡフラグメントの塩基配列を解析したところ、いずれもＡＯＸ遺伝子と高い相同性を示すことが明らかになった。
【００４６】
５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥから得られた塩基配列情報に基づき、全長ｃＤＮＡを単離するためのプライマーを以下のように設計した。
【００４７】
Ｆｕｌｌ  Ｆ０：５’−ＴＴＣＴＴＧＴＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＣＧＧ−３’（配列番号１１）
Ｆｕｌｌ  Ｒ１：５’−ＣＧＡＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣ−３’（配列番号１２）
その後、ＲＴ−ＰＣＲ法により合成した第１鎖ｃＤＮＡを用いて、以下のようなＰＣＲ反応を行った。
【００４８】
（９４℃：２分間、６０℃：１５秒間、６８℃：１．５分間）ｘ  ２５
以上の方法により得られたおよそ１．２ｋｂの産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングして組換えプラスミド（ｐＡＯＸｆｕｌｌ１）を構築し、そのインサートの全塩基配列を解読した。また、得られた配列データはＧＥＮＥＴＹＸ−Ｈｏｍｏｌｏｇｙソフトウエアシステム・バージョン５．０（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を使用して解析した。
【００４９】
以上のとおりの方法によって得られたＳｆａｏｘ  ｃＤＮＡの塩基配列は、配列番号１のとおりである。このＳｆａｏｘ  ｃＤＮＡは１，２３３ｂｐの塩基配列を有しており、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、３４９個のアミノ酸を含んでおり、このＯＲＦには、配列番号２で示したアミノ酸配列を有する約３９．２ｋＤａのタンパク質Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸがコードされていた。また、このＳｆｐｒｅ−ＡＯＸアミノ酸配列には、ミトコンドリア移行シグナルが存在しており、ミトコンドリア内へ移行したＳｆｐｒｅ−ＡＯＸは配列番号４のアミノ酸配列を有する約３６．８ｋＤａの成熟タンパク質Ｓｆｍａｔｕｒｅ−ＡＯＸとなる。なお、Ｓｆｐｒｅ−ＡＯＸのミトコンドリア移行シグナルは、約２．４ｋＤａのペプチド（Ｓｆｍｉｔ１）であり、配列番号３のアミノ酸配列を有している。
実施例２：ｃＤＮＡのインビトロ転写
実施例１で得た組換えプラスミド（ｐＡＯＸｆｕｌｌ）を直線化し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを使用して、センスまたはアンチセンスＲＮＡを転写した。等量のＲＮＡ（２μｇ）を３５Ｓ−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の存在下で小麦胚芽抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたインビトロ翻訳反応に供した。翻訳産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲルを固定し、Ａｍｐｌｉｆｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中でインキュベーションした後に、乾燥し、蛍光分析を行った。
【００５０】
その結果、図４に示したように、センスＲＮＡを鋳型とした際、ある特定の濃度の酢酸カリウム濃度の反応条件で特異的な翻訳産物が生成されることが判明した。したがって、実施例１で単離したｃＤＮＡの開始コドンおよび終止コドンが正しく機能していることが示された。
【００５１】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、恒温植物であるザゼンソウ由来の新規シアン耐性呼吸酵素遺伝子Ｓｆａｏｘ、およびその発現産物であるＳｆｐｒｅ−ＡＯＸ、Ｓｆｍａｔｕｒｅ−ＡＯＸ、ならびにＳｆｍｉｔ１、さらにはこれらのタンパク質を遺伝子工学的に大量生産するための遺伝子ｃＤＮＡが提供される。これらの遺伝子およびタンパク質によって、恒温性を持つ低温耐性植物の開発、過剰電子による生体酸化ストレスの抑制機能の付加さらに、環境浄化微生物等の有用微生物の呼吸増大に伴う代謝活性の賦活化などの開発が可能である。
【００５２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ザゼンソウの肉穂花序の恒温性を示したグラフである。群落地に自生しているザゼンソウの発熱部位である肉穂花序温度と気温を１分おきに収集した。
【図２】発熱中のザゼンソウの各器官におけるＳｆａｏｘの発現（Ａ）および発熱中および発熱後の肉穂花序におけるＳｆａｏｘの発現プロファイル（Ｂ）を示したノーザンブロッティングの結果である。それぞれの下側の図は、用いた全ＲＮＡが分解されていないことをｒＲＮＡのエチジウムブロマイド染色により示したものである。
【図３】ザゼンソウＡＯＸ（Ｓ．  ｆｏｅｔｉｄｕｓ  ＡＯＸ）と、既存のシロイヌナズナＡＯＸ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ａｏｘ１ａ）、イネＡＯＸ（Ｒｉｃｅ  Ａｏｘ１ａ）、Ｖｏｏｄｏｏ  ｌｉｌｙ  ＡＯＸ（Ｓ．  ｇｕｔｔａｔｕｍ  ＡＯＸ）、ダイズＡＯＸ（Ｓｏｙｂｅａｎ  Ａｏｘ１）、および、タバコＡＯＸ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ａｏｘ１）のアミノ酸配列と比較した図である。配列下段の星記号（＊）は同一アミノ残基を示し、点記号（．）は全ての配列内での保存的なアミノ酸の変化を示す。配列アライメントを最適化するために導入したギャップをダッシュ記号（−）で示す。枠で囲まれたＣは酸化反応による２量体形成に必要なしステイン残基を示す。また、枠で囲まれたＥＲＭＨ配列は、酸化反応に必要な鉄原子が配位する領域を示す。
【図４】遺伝子ＳｆａｏｘのｃＤＮＡを鋳型とするインビトロ翻訳の結果である。図上に示されている濃度は、反応液中の酢酸カリウム濃度を示す。ＥはＲＮＡを含まないコントロール区を、ＳはセンスＲＮＡ区を、そして、ＡＳはアンチセンスＲＮＡ区を示す。星印記号（＊）は非特異的反応により生成した低分子量の人工合成産物を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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