(57)【要約】【課題】標準とする塩基配列とはある一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドを、微少な試料量で、迅速に精度良く検出する方法を提供すること。【解決手段】標準とする塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）と、該標準とする塩基配列とはある一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ｂ）とが、非選択的にプローブ化合物に結合する条件で、被検ポリヌクレオチドを短時間でプローブに結合させ、これらが脱離する際の脱離量を測定することにより、迅速に、かつ精度良く一塩基多型や一塩基突然変異を検出できる。また、被検ポリヌクレオチドをプローブ化合物が固定された微小な表面に接触させるだけで分析が可能であり、分析に必要な試料量が微少量でよく、多数の測定を同時に行う場合にも試料量が少なくてよい。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一種以上の被検ポリヌクレオチドから、標準とする塩基配列とはある一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドの有無や量を検出するポリヌクレオチドの分析方法であって、
（１）前記標準とする塩基配列と相補的な塩基配列を有するか、あるいは標準とする塩基配列と相補的な塩基配列とは、前記ある一塩基と対を成す塩基以外の塩基が１〜４塩基異なるプローブ化合物が固定された固相に、標準とする塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）と、前記標準とする塩基配列とはある一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ｂ）の両者が、非選択的にハイブリダイゼーションにより結合する条件で、被検ポリヌクレオチドを含有する検体溶液を接触させて、前記検体溶液中の被検ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションにより前記プローブ化合物に結合させる工程、
（２）前記ポリヌクレオチド（Ａ）と前記ポリヌクレオチド（Ｂ）とが共に可溶な液体中で、前記結合の平衡定数を減少させて、前記プローブ化合物から前記被検ポリヌクレオチドを脱離させる工程、
（３）前記プローブ化合物に結合した前記被検ポリヌクレオチドの残存量を測定する工程
を有することを特徴とするポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項２】
前記プローブ化合物を固定する固相が毛細管状の流路の内壁である請求項１に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項３】
前記プローブ化合物を固定した固相が、非多孔質の固体表面に固着して形成された厚み１〜２０μｍの多孔質層の細孔表面である請求項１に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項４】
前記特定の塩基配列が野生型ポリヌクレオチドの塩基配列である請求項１、２又は３に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項５】
前記（１）の工程において、前記プローブ化合物への前記検体溶液の接触が、検体溶液中のポリヌクレオチド（Ａ）がハイブリダイゼーションにより前記プローブ化合物に結合する量に対する、同じ濃度のポリヌクレオチド（Ｂ）がハイブリダイゼーションにより前記プローブ化合物に結合する量の比が０．５〜２となる条件で行う請求項１、２又は３に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項６】
前記（１）の工程において、前記プローブ化合物への前記検体溶液の接触時間が５秒〜３分である請求項５に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項７】
前記（２）の工程において、前記結合の平衡定数の減少が、前記プローブ化合物とそれに結合しているポリヌクレオチドとの結合部位を昇温することである請求項１、２又は３に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項８】
前記（２）の工程において、前記ポリヌクレオチドが可溶な液体を前記結合部位に接して該流路内を流動させつつ脱離を行う請求項１、２または３に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項９】
前記（２）の工程において、脱離したポリヌクレオチドを、電気泳動によって、前記プローブ化合物固定部位から流路の流れ方向に移動させる請求項１、２または３に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項１０】
前記（３）の工程において、前記残存量の測定が、前記プローブ化合物固定部位に於ける前記プローブ化合物と結合しているポリヌクレオチドの残存量の時間変化の測定である請求項１、２または３に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標準とする塩基配列とはある一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドを検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリヌクレオチドの塩基配列が分析を目的とする特定の塩基配列（以下、「標準塩基配列」と称する場合がある。）であるか、標準塩基配列とは置換、挿入、欠失などにより一塩基のみが異なる塩基配列でるか、あるいはこれらのポリヌクレオチドがどのような比で混合されているか、といったポリヌクレオチドの１塩基の違いを分析方法、例えば、ポリヌクレオチドの一塩基多型（ＳＮＰ）や一塩基突然変異を判定する方法として種々の方法が知られている。しかし、既知の分析方法ではそれぞれ欠点があり満足できるものではなかった。
【０００３】
例えば、ＤＮＡチップのように、固相に固定したプローブ化合物に被検ＤＮＡを選択的にハイブリッド形成（ハイブリダイゼーション）させる方法（例えば、非特許文献１参照）では、標準塩基配列とは一塩基のみ異なるような、塩基配列の鎖が小さいポリヌクレオチドも同様に該プローブ化合物とハイブリッド形成してしまうため、前記特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドを十分なコントラストで検出するには数時間以上のインキュベーションを要するといった問題があった。
【０００４】
アフィニティークロマトグラフィー（例えば、非特許文献２参照）は、プローブ化合物を固定した粉末状の担体を直径が数ミリのカラムに充填した充填カラムを使用する方法であるため、上記のＤＮＡチップなどに比べると、一回の実験で（即ち１本のカラムで）１種類のＤＮＡしか分析できず、分析処理効率の低いものであった。また、測定に必要な試料の量が多く、微量試料の分析が不可能であった。多種類のＤＮＡを同時に分析するために多数台並列設置すると、必要な試料の量はますます多くなるという問題があった。また、粉体状の担体をカラムに充填するという構造は、カラムの細径化に限界があり、微量の試料の測定は困難であった。
【０００５】
また、特許文献１には、野性型対立遺伝子に相補的なプローブ化合物（プローブ化合物）が結合した担体を用いた野性型対立遺伝子の分離を含む、多くの野性型対立遺伝子を含む試料中の突然変異対立遺伝子の検出方法が開示されている。該方法は野生型対立遺伝子に相補的な塩基配列を有する対立遺伝子を固定した充填カラムに野生型と変異型の混合対立遺伝子試料を流し、ハイブリッド形成によって野生型対立遺伝子を選択的にカラムに吸着させ、変異型対立遺伝子は吸着させずに流出させることで、変異型遺伝子を濃縮する方法である。
【０００６】
しかしながら、該方法は野生型対立遺伝子を該遺伝子に相補的な塩基配列を有する対立遺伝子とハイブリッド形成させることにより野生型対立遺伝子と変異型対立遺伝子を分離する方法であるため、一塩基多型や一塩基突然変異を検出できるような十分に高い選択性を実現するためには、前記ＤＮＡチップを使用した方法と同様に、長時間のインキュベーションが必要であった。
【０００７】
特許文献２には、上記ＤＮＡチップの各スポットにポリヌクレオチドを選択的にハイブリッド形成させた後、各スポットを加熱することにより、解離（脱ハイブリダーゼーション）させて、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドを回収する方法が開示されており、温度を徐々に上げることによって、塩基配列の異なるポリヌクレオチドを順次回収できることが示されている。しかしながら、該方法においても、一塩基多型や一塩基突然変異を検出できるような高い選択性を実現するためには、上記選択的ハイブリダイゼーション工程に、やはり長時間のインキュベーションが必要であった。
【０００８】
【特許文献１】
特表２００１−５１４５０４号公報
【特許文献２】
特開２０００−２７９１６９号公報
【非特許文献１】
大野典也，「ニュートン」，１９９９年，７月号，ｐ．６０−６１
【非特許文献２】
近藤壽彦，阿部修三，「クロマトグラフィー」，１９９７年，第１８巻，第２号，ｐ．１２２−１２５
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、標準とする塩基配列とはある一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドを、微少な試料量で、迅速に精度良く検出する方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、標準とする塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）と、該標準とする塩基配列とはある一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ｂ）とが、非選択的にプローブ化合物に結合する条件で、被検ポリヌクレオチドを短時間でプローブに結合させ、これらが脱離する際の脱離量を測定することにより、迅速に、かつ精度良く一塩基多型や一塩基突然変異を検出できる。また、被検ポリヌクレオチドをプローブ化合物が固定された微小な表面に接触させるだけで分析が可能であり、分析に必要な試料量が微少量でよく、多数の測定を同時に行う場合にも試料量が少なくてよい。
【００１１】
すなわち本発明は、一種以上の被検ポリヌクレオチドから、標準とする塩基配列とはある一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドの有無や量を検出するポリヌクレオチドの分析方法であって、
（１）前記標準とする塩基配列と相補的な塩基配列を有するか、あるいは標準とする塩基配列と相補的な塩基配列とは、前記ある一塩基と対を成す塩基以外の塩基が１〜４塩基異なるプローブ化合物が固定された固相に、標準とする塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）と、前記標準とする塩基配列とはある一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ｂ）の両者が、非選択的にハイブリダイゼーションにより結合する条件で、被検ポリヌクレオチドを含有する検体溶液を接触させて、前記検体溶液中の被検ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションにより前記プローブ化合物に結合させる工程、
（２）前記ポリヌクレオチド（Ａ）と前記ポリヌクレオチド（Ｂ）とが共に可溶な液体中で、前記結合の平衡定数を減少させて、前記プローブ化合物から前記被検ポリヌクレオチドを脱離させる工程、
（３）前記プローブ化合物に結合した前記被検ポリヌクレオチドの残存量を測定する工程
を有するポリヌクレオチドの分析方法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のポリヌクレオチドの分析方法は、少なくとも下記（１）〜（３）の工程、
（１）前記特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するか、あるいは標準とする塩基配列と相補的な塩基配列とは、前記特定の一塩基以外の塩基が１〜４塩基異なるプローブ化合物が固定された固相に、標準とする塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）と、前記標準とする塩基配列とは特定の一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ｂ）の両者が、非選択的にハイブリダイゼーションにより結合する条件で、被検ポリヌクレオチドを含有する検体溶液を接触させる工程、
（２）前記ポリヌクレオチド（Ａ）と前記ポリヌクレオチド（Ｂ）とが共に可溶な液体中で、前記結合の平衡定数を減少させて、前記プローブ化合物から前記被検ポリヌクレオチドを脱離させる工程、
（３）前記被検ポリヌクレオチドの残存量を測定する工程、
を有することにより、一種以上の被検ポリヌクレオチドから、標準とする塩基配列とは特定の一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドを検出できる。
【００１３】
［ポリヌクレオチド（Ａ）、ポリヌクレオチド（Ｂ）］
分析の基準となる標準の塩基配列（以下、「標準塩基配列」と称する。）を有するポリヌクレオチド（Ａ）（以下、単に「ポリヌクレオチド（Ａ）」という。）、および該標準塩基配列とはある一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ｂ）（以下、単に「ポリヌクレオチド（Ｂ）」という。）は任意であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他、修飾ポリヌクレオチドなどであり得る。ＤＮＡは、例えば、全ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、制限酵素で切断されたＤＮＡ断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等により増幅されたＤＮＡ断片等であり得る。これらの中で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等により増幅されたＤＮＡ断片であることが、特に有用であり好ましい。
【００１４】
ポリヌクレオチド（Ａ）およびポリヌクレオチド（Ｂ）の長さは、標準塩基配列の塩基数以上であること以外は任意であり、好ましくは、塩基数２０〜１０００、さらに好ましくは２５〜３００である。この範囲とすることによって、選択性を高めると同時に分析時間の短縮が図れるため好ましい。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）や制限酵素により調製される場合には、プライマーや制限酵素の選択により、これらのポリヌクレオチドの塩基数を設定できる。また、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の長さは、同一であっても異なっていてもよいが、同一の長さであると、分析精度が向上するため好ましい。
【００１５】
ポリヌクレオチド（Ｂ）は、置換、欠失、又は挿入により、標準塩基配列とはある一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド（Ｂ）中の、標準塩基配列とは異なるある一塩基は、標準塩基配列の端であっても内部であってもよい。このような一塩基変異の例としては、一塩基多型（ＳＮＰ）や突然変異遺伝子が挙げられる。本発明の方法は、一塩基多型の場合に、特に有用であり、また、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の異なる塩基の部位（ホットスポット）や塩基の種類が既知である場合には、特に本発明の分析方法の信頼性が高くなるため好ましい。また、ポリヌクレオチド（Ａ）、ポリヌクレオチド（Ｂ）は、各々一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖であることが有用であり好ましい。
【００１６】
［被検ポリヌクレオチド］
本発明の分析方法に供される検体溶液に含有される、分析対象である被検ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド（Ａ）、ポリヌクレオチド（Ｂ）のそれぞれ単独であってもよいし、混合物であってもよい。また、ポリヌクレオチド（Ａ）、ポリヌクレオチド（Ｂ）以外のポリヌクレオチドを含有していてもよい。本発明においては、特に、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の総和に対するポリヌクレオチド（Ｂ）の割合が、概ね０、１／２、１のいずれかである場合、即ち、一塩基多型のホモ野生型、へテロ型、ホモ変異型の判定の場合に、判定の信頼性が高くなり、好ましい。
【００１７】
［標準塩基配列］
本発明における標準塩基配列とは、分析の基準となる標準の塩基配列であって、被検ポリヌクレオチドがそれに対して一塩基の違いが有るか無いかを判定する基準である。標準塩基配列は、変異を生じる塩基部分が判明している場合には、すなわち一塩基多型（ＳＮＰ）部分や突然変異が生じやすい部分（ホットスポット）を含む塩基配列部分とする。この標準塩基配列は、例えば、野生型（正常型）ポリヌクレオチドであるか、変異型（異常型）ポリヌクレオチドであるかを判定するような場合には、野生型の塩基配列であってもよいし、変異型の塩基配列であってもよいが、野生型の塩基配列を標準塩基配列とすることが、分析時間の短縮が可能であり、好ましい。また、標準塩基配列は、被検ポリヌクレオチドの中の任意の部分の塩基配列として、該部分中に生じる未知の変異を判定することもできる。
【００１８】
標準塩基配列の長さは、プローブ化合物が、後述のように、標準塩基配列中にＮ個（但し、Ｎは０、１、２、３、又は４）の標準塩基配列に相補的でない塩基を有する時、標準塩基配列の塩基数の下限は、好ましくは（Ｎ＋６）以上、さらに好ましくは（Ｎ＋１０）以上、最も好ましくは（Ｎ＋１５）以上である。標準塩基配列の塩基数の上限は、好ましくは（８Ｎ＋５０）以下、さらに好ましくは（８Ｎ＋４０）以下、最も好ましくは（８Ｎ＋３０）以下である。この長さ範囲とすることによって、温度対脱離量若しくは温度対脱離速度の曲線が明確となり、かつ、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の検出温度の差が大きくなって、分析の信頼性が高くなる。
【００１９】
ポリヌクレオチドの塩基配列中で標準塩基配列とする部分は、ポリヌクレオチド（Ｂ）が標準塩基配列と異なる塩基部位（ホットスポット）を含む範囲であれば任意に設定できる。例えば、前記配列の異なる塩基を標準塩基配列の中程に含む範囲でもよいし、端近に含む範囲てもよいし、端に含む範囲でもよいが、標準塩基配列の端以外の部分とすることが好ましい。端以外の部分とすることによって、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の解離温度の差が大きくなって、分析の信頼性が高くなる。
【００２０】
［プローブ化合物］
プローブ化合物は、標準塩基配列に相補的な塩基配列を有するか、あるいは、標準塩基配列に相補的な塩基配列に対して１〜４個の塩基の配列が異なる塩基配列［以下、「（標準塩基配列に）相補的」なことを「（標準塩基配列と）完全マッチ」であると表現する場合がある、また、「（標準塩基配列に相補的な塩基配列に対して１〜４個の）塩基の配列が異なる」ことを「（標準塩基配列と１〜４塩基の）ミスマッチを生じる」と表現する場合がある］を有する化合物であれば任意である。このようなプローブ化合物は、ポリヌクレオチド（Ａ）と、それ以外のポリヌクレオチドより強くハイブリダイゼーションする。プローブ化合物が、標準塩基配列に対して１〜４のミスマッチを生じる場合には、該ミスマッチを生じる塩基は、置換、挿入、欠失のいずれであってもよいが、置換であることが、該ミスマッチを導入する効果が発揮されるため好ましい。
【００２１】
プローブ化合物が、前記標準塩基配列と２塩基のミスマッチを生じるものである場合にも、該部位の位置は上記と同様であり、ポリヌクレオチド（Ｂ）が標準塩基配列と異なる部位から、若しくは、前記異なる第１の塩基から、１〜４個目の塩基であることが好ましく、１又は２個目の塩基であることがさらに好ましい。この位置にすることによって、本発明の効果をより発揮することができる。特に、前記標準塩基配列とミスマッチを生じる２つの塩基を、ポリヌクレオチド（Ｂ）が標準塩基配列と異なる部位に隣接した両側とすることが好ましく、これによって、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物のハイブリッドの融解温度（以下。「Ｔｍａ」と称する。融解温度はハイブリッドの半量が解離する温度を言う。）とポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物のハイブリッドの融解温度（以下、「Ｔｍｂ」と称する）の差を大きくでき、分析の信頼性を増すことができる。
【００２２】
但し、プローブ化合物中の標準塩基配列とミスマッチを生じる部分は、ポリヌクレオチド（Ｂ）が標準塩基配列と異なる塩基と相補的でないものとする。その理由は、プローブ化合物が標準塩基配列に相補的塩基配列を有する場合のポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）が逆転した場合に相当し、本発明のポリヌクレオチド（Ａ）、ポリヌクレオチド（Ｂ）の定義に反するからである。例えば、ポリヌクレオチド（Ｂ）が、標準塩基配列中の或るグアニンがチミンに変異した塩基配列を有するとき、標準塩基配列に対してミスマッチとなる塩基が、前記チミンに相補的なアデニンであると、プローブ化合物は該部分でポリヌクレオチド（Ｂ）と相補的ポリヌクレオチド（Ａ）とミスマッチになってしまう。
【００２３】
このとき、プローブ化合物は、標準塩基配列に相補的な塩基配列に対して置換により１〜４個の塩基の配列が異なる塩基配列を有する場合、該置換された塩基は、ポリヌクレオチド（Ｂ）が標準塩基配列と異なる部位の塩基であっても、該部位の塩基の種類がポリヌクレオチド（Ｂ）に相補的でなければよい。例えば、標準塩基配列中の或るグアニンがチミンに変異したポリヌクレオチド（Ｂ）において、プローブ化合物の該変異部分に相対する部分をアデニンとシトシン以外の塩基、例えばグアニン、チミン、又はポリヌクレオチドを構成しない塩基にしてもよい。このようにすれば、上記のようなポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の定義に反する関係は生じず、本発明の方法によって分析可能である。
【００２４】
また、ポリヌクレオチド（Ｂ）が標準塩基配列と異なる塩基の位置と種類が既知の場合、例えば一塩基多型における野生型と変異型の場合、には、プローブ化合物は、前記標準塩基配列に対して１〜４のミスマッチを生じる塩基配列部分を、標準塩基配列の端以外の部分とする。端であってもよいが、本発明に於いては、説明の煩雑さを避けるため、塩基配列の端にある該１〜４塩基のミスマッチを生じる部位を除いた部分を標準塩基配列とする。これ以外であれば、該１〜４塩基異なる部位は任意であり、ポリヌクレオチド（Ｂ）が標準塩基配列と異なる部位に隣接した塩基（１個目の塩基）であってもよいし、２個目の塩基、３個目の塩基、或いは更に離れた位置の塩基であってもよい。これらの中で、１〜４個目の塩基であることが好ましく、１又は２個目の塩基であることがさらに好ましい。この位置にすることによって、本発明の効果をより発揮できる。
【００２５】
中でも、プローブ化合物を、少なくとも標準塩基配列中のホットスポットと連続する２塩基をミスマッチとなる配列とすることがさらに好ましく、少なくともホットスポットの両側の２塩基がミスマッチとなる配列にすることが最も好ましい。このような位置にミスマッチを持ってくることにより、ホットスポットにおける１塩基の変異による、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物のハイブリッドの融解温度（以下。「Ｔｍａ」と称する。融解温度はハイブリッドの半量が解離する温度を言う）とポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物のハイブリッドの融解温度（以下、「Ｔｍｂ」と称する）の差が大きくなり、分析の信頼性が向上する。プローブ化合物が、前記標準塩基配列に対して２塩基異なる塩基配列を有する場合にも、該部位の位置は任意であるが、ポリヌクレオチド（Ｂ）が標準塩基配列と異なる部位から、若しくは、前記異なる第１の塩基から、１〜４個目の塩基であることが好ましく、１又は２個目の塩基であることがさらに好ましい。この位置にすることによって、本発明の効果をより発揮できる。前記標準塩基配列に対して３又は４塩基異なる塩基配列を有する場合にも同様である。
【００２６】
プローブ化合物が、標準塩基配列に相補的な塩基配列に対して４個以上の塩基の配列が異なる塩基配列を有すると、標準塩基配列の全長が同じである場合には、解離温度が常温付近以下となりがちであり、前記（１）の工程を常温以下でする必要が生じたり、前記（２）の工程を、常温から一度冷却した後昇温する必要が生じるという不都合が生じ、また、全長を伸ばす場合には、ハイブリッド形成に必要な時間が長くなったり、分析の信頼性が低下するなどの不都合が生じるため好ましくない。
【００２７】
使用できるプローブ化合物としては、例えば、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、糖部分や燐酸基部分が修飾或いは置換されたオリゴＤＮＡやオリゴＲＮＡ、その他の任意の化合物であり得る。このようなプローブ化合物は、合成可能であるし、また、マイクロアレイ用などとして市販されている。
【００２８】
プローブ化合物は、上記１〜４塩基のミスマッチを生じる部分を有する場合も有しない場合も、標準塩基配列部分の端より外側に、無関係な部分を有していてよい。この場合には、標準塩基配部分と相補的または１あるいは２塩基異なる塩基配列部分のみがハイブリダイゼーションに寄与する。但しこの場合、前記無関係な部分は、ポリヌクレオチド（Ａ）と同等以上の塩基数でもってポリヌクレオチド（Ｂ）とハイブリダイズしない塩基配列である必要がある。
【００２９】
１〜４塩基のミスマッチを生じる場合も生じない場合も、プローブ化合物中の標準塩基配列以外の部分の長さは任意であるが、該塩基配列以外の部分の長さは短いほど好ましく、ゼロ、すなわち、プローブ化合物を標準塩基配列部分のみとすることが、分析の信頼性の向上免から好ましい。
【００３０】
プローブ化合物が標準塩基配列と相補的な塩基配列である場合、標準塩基配列を２０〜３０塩基程度にすると温度対解離量の曲線は急峻となり、分析の精度と信頼性が向上する。しかしこの時、解離温度が高くなるため、溶液中での気泡の発生による検出ノイズが増加しがちとなり、また、使い捨て可能なプラスチック製のデバイスを使用すると、耐熱性不足のため測定中に変形し、検出精度が低下しがちである。一方、標準塩基配列の長さを例えば１５塩基以下に短くすると、解離温度は低くなり、上述の不都合は回避されるが、温度対解離量の曲線が緩慢になり、分析の精度と信頼性が低下しがちとなる。そこで、有効なプローブ化合物の長さ、即ち、標準塩基配列を２０〜３０に保ち、１〜４のミスマッチを生じうる塩基配列を採用すると、解離温度が低下するにもかかわらず、温度対解離量の曲線の緩慢化の程度は、標準塩基配列の長さを短くする場合より少ないため、１〜４塩基のミスマッチを生じうる塩基配列とすることが好ましい。１塩基のミスマッチの導入による解離温度の低下は、標準塩基配列の長さ、ミスマッチの位置や塩基の種類、溶出液の塩濃度などにもよるが、通常３〜１０℃である。
【００３１】
プローブ化合物は、塩基配列でない部分を有していてもよい。塩基配列でない部分としては、例えば、プローブ化合物を固相合成する際に固相に固定するためのアミノ基などの官能基、塩基配列部分と前記固定用官能基の間のスペーサーとなるアルキレン基やポリエチレングリコール基、等を挙げることができる。
【００３２】
本発明に用いるプローブ化合物は１本鎖プローブ化合物であっても、２本鎖プローブ化合物であっても良く、目的に応じて選択できるが、１本鎖プローブ化合物であることが好ましい。一塩基多型の分析の場合には、互いに相補的な塩基配列を有する一対のプローブ化合物を１本鎖状態でそれぞれ独立に固定することが好ましい。
【００３３】
［プローブ化合物の固定］
プローブ化合物が固定される固相表面は任意であり、板状固相の表面、マイクロウェルの内面、溝状の流路の内面、毛細管状の流路の内面、電極の表面、電界効果トランジスタなどの電子素子の表面、磁性体の表面、多孔質体の細孔表面、粒子の表面などであり得る。これらの中でも、毛細管状の流路の内面であることが、微量の検体溶液で分析可能であり、また温度制御が容易で本発明の効果を発揮させ易いため好ましい。毛細管状の流路は、単なる毛細管でも良いが、マイクロ流体デバイス中に形成された流路であることが好ましい。ここでいうマイクロ流体デバイスは、マイクロ・フルイディック・デバイス、マイクロ・ファブリケイテッド・デバイス、ラブ・オン・チップ、又はマイクロ・トータル・アナリティカル・システム（μ−ＴＡＳ）などとも呼ばれるものであり、流体を流入し流出するまでの経路内で、流体が温度変化をうける機構、濃度調整される機構、化学反応をうける機構、流動の流速、流動の分岐、混合若しくは分離などの制御をうける機構、又は電気的、光学的な測定をうける機構等を設けた毛細管状の流路を有するデバイスである。特に、本発明に使用する検体溶液を調製する機構、例えば、蛋白質変性用加熱機構、濾過などの試料前処理機構、濃度調節用希釈混合機構、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）反応槽、などが形成されたマイクロ流体デバイスであることがさらに好ましい。また、ポンプ機構が形成されたマイクロ流体デバイスであることも好ましい。マイクロ流体デバイスは板状の外形を有するものであると取り扱いが容易なため好ましい。
【００３４】
プローブ化合物を固定する部分の面積は任意であるが、後述のように、本発明においては、該部分の蛍光強度が精度良く測定できる寸法であれば任意であるため、その面積を極小さくすることが可能である、例えばＤＮＡマイクロアレイの場合と同様の寸法にすることが可能であり、好ましくは３μｍ２〜１ｍｍ２、さらに好ましくは１０μｍ２〜０．１ｍｍ２、最も好ましくは３０μｍ２〜０．０１ｍｍ２である。蛍光強度測定が問題なくできる限り上記固定面積を小さくすることで、分析に必要な試料の量を少なくすることができる。
【００３５】
プローブ化合物を固定した固相がマイクロ流体デバイスの流路の内表面である場合には、前記検体溶液中のポリヌクレオチドと固定プローブ化合物との接触確率を増大させるため、プローブ化合物の固定部位はできるだけ流路径が小さいことが望ましい。一般に拡散による混合時間は流路径の２乗に比例するため、流路径の小さな流路では通過するポリヌクレオチドが流路壁に固定した固定プローブ化合物と接触する確率が高くなるからである。このためマイクロ流体デバイスの流路径は３〜２００μｍが好ましく、更に５〜１００μｍであることがより好ましい。流路径が３μｍより小さいと圧力損失が大きくなり、流路に検体溶液を流すことが困難となる。一方、流路径が２００μｍを超えると、前記検体溶液中のポリヌクレオチドと固定プローブ化合物との接触が不十分となり、分析感度の低下や分析時間の増大をまねく。ただし、流路の断面形状に異方性がある場合、例えば楕円やスリット状の場合には、上記の流路径は短径を言うものとする。
【００３６】
また、プローブ化合物が固定される固相表面は、多孔質体の細孔表面が好ましい。多孔質体とすることで表面積が増大し、見かけの面積あたりの固定量が増えて、検出感度が増加する。多孔質体は多孔質膜でもよいが、固体表面に固着して形成された薄い多孔質層であることが好ましい。多孔質層の厚みは１〜２０μｍが好ましく、２〜１０μｍが更に好ましい。固体表面に固着して形成することで、自立不能なほど薄い多孔質層が形成可能であり、多孔質層を薄くすることで、例えば昇温によりプローブ化合物から脱離したポリヌクレオチドを速やかにプローブ化合物固定部位から除去することが出来るため、分析の迅速化が計れる。多孔質層は、流路の内面に形成されたものであることも好ましく、流路の１面に形成さえたものであることが、多孔質部位の光学的な観察が容易で好ましい。
【００３７】
また、多数種のプローブ化合物を多数の独立したスポットとして固定することで、従来のＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）と同様に、多数並列測定を行うことができる。前記プローブ化合物を固定する固相が前記マイクロ流体デバイスの流路の内表面である場合は、複数種のプローブ化合物を流路の内表面の互いに独立した領域に固定することもでき、前記同様多数並列測定ができ好ましい。このとき、分析の目的によって、１つの流路中の複数の領域に独立にプローブ化合物を固定したり、並列に形成された複数の流路にそれぞれ別々にプローブ化合物を固定しても良い。１つの流路中の複数の領域に独立にプローブ化合物を固定することで、１つの検体溶液について多項目の塩基配列の分析が可能となる。一方、並列に形成された複数の流路にそれぞれ別々にプローブ化合物を固定することで、多数の検体溶液の同時測定が可能となり、また、前記固定部位より下流側の流路において脱離したポリヌクレオチドの濃度を測定することによって脱離量を知る方法を採ることが出来る。
【００３８】
本発明に用いるプローブ化合物を固相表面に固定する方法は任意であるが、固定したプローブ化合物が最高温度に曝された場合であっても実質的に固相から脱離しないことが必要である。そのような固定方法としては、例えばビオチン−アビジンなどの蛋白質を介する結合や、共有結合による固定が挙げられるが、結合が強く固相からのプローブ化合物の脱離が起こりにくいことから共有結合による固定であることが好ましい。
【００３９】
［（１）の工程］
前記（１）の工程は、プローブ化合物を固定している固相表面に、検体溶液を接触させ、該検体溶液に含有される被検ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションにより固定プローブ化合物に結合させる工程である。本発明に於いては、このとき、標準塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）と該ポリヌクレオチド（Ａ）とは前記標準塩基配列中に於いて１塩基異なるポリヌクレオチド（Ｂ）の両者共にハイブリッド結合する条件、即ちポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）が非選択的にハイブリッド結合する条件で実施する。前記非選択的の程度は、検体溶液中のポリヌクレオチド（Ａ）がハイブリダイゼーションにより前記プローブ化合物に結合する量に対する、同じ濃度のポリヌクレオチド（Ｂ）がハイブリダイゼーションにより前記プローブ化合物に結合する量の比が好ましくは０．５〜２、さらに好ましくは０．７〜１．４、最も好ましくは０．８〜１．２５である。
【００４０】
このような条件は、検体溶液をプローブ化合物が固定された固相に接触させる条件を、低温、短時間の条件とすることで実施できる。該接触温度は、前記検体溶液の凝固点以上で、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物のハイブリッドの融解温度（Ｔｍｂ）以下であれば任意であるが、好ましくは（Ｔｍｂ−３０℃）〜（Ｔｍｂ−３℃）の範囲、さらに好ましくは（Ｔｍｂ−２５℃）〜（Ｔｍｂ−５℃）の範囲、最も好ましくは、（Ｔｍｂ−２０℃）〜（Ｔｍｂ−７℃）の範囲である。この接触温度が過度に低いと標準塩基配列以外の部分でのハイブリダイゼーションが生じて、分析の信頼性が低下し、過度に高いと、選択性が高くなり、ポリヌクレオチド（Ｂ）の結合量が低下する。なお、標準塩基配列が２５塩基の場合、上記Ｔｍｂは通常５０〜８０℃である。上記Ｔｍｂは、本発明の（３）の工程における測定値から求めることが得きる。
【００４１】
また、接触時間は、ハイブリダイゼーションによる結合が平衡に達しない時間内の接触で十分に分析が可能であるため、本工程に要する時間を短縮できる上、被検ポリヌクレオチドのプローブ化合物との結合の選択制の低下により、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の結合量の比を１に近くできる。
【００４２】
ただし、接触させる時間が過度に短いと、前記検体溶液中のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによる結合量が少なくなり、検出感度が低下するおそれがある。このため、最適な接触時間としては、温度、緩衝液のイオン強度、固定プローブ化合物の長さ、被検ポリヌクレオチドの長さ、検体溶液中の被検ポリヌクレオチドの濃度、などにより異なるが、好ましくは、５秒〜３分、さらに好ましくは２０秒〜２分、最も好ましくは３０秒〜１分である。最適な条件は、後述の第３の工程においてプローブ化合物に結合したポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の量をモニターすることで決定できる。このように、本発明においてはポリヌクレオチドを非選択的にハイブリッド形成させることで、選択的にハイブリッド形成させる方法に比べて分析時間を大幅に短縮できる。
【００４３】
プローブ化合物を固定している固相表面に検体溶液を接触させる方法は任意であり、該プローブ化合物が固定した固相が例えば板状の固体表面である場合には、従来のＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）と同様の方法、例えば、検体溶液を該板状の固相表面に滴下し、カバーグラスを被せた状態で接触させる方法や、該プローブ化合物を固定した固相を該検体溶液に浸漬する方法が使用できる。該プローブ化合物を固定した固相が後述のように流路の内表面である場合には、該流路に検体溶液を流通させた状態、或いは滞留させた状態で接触させることが出来る。
【００４４】
前記検体溶液中のポリヌクレオチドが２本鎖ポリヌクレオチドである場合には、本（２）の工程に先立って、ポリヌクレオチド（Ａ）対の融解温度（Ｔｍａ）以上まで検体溶液を昇温することが好ましい、即ち、Ｔｍａ以上まで検体溶液を昇温してから、上述のＴｍａ未満、検体溶液の凝固点以上に冷却して、固定プローブ化合物と接触させること、或いは、検体溶液を固定プローブ化合物と接触させた状態で、該Ｔｍａ以上まで昇温し、Ｔｍａ未満、検体溶液の凝固点以上に冷却して所定時間保持することが好ましい。
【００４５】
また、工程（１）における、検体溶液と固定プローブ化合物との接触は、分離カラム中にある体積をもって充填された担体に接触させる必要のあるアフィニティークロマトグラフィーとは異なり、検体溶液をプローブ化合物が固定された微小な表面に接触させるだけでよいため、少量の試料量でも精度良く分析が可能である。
【００４６】
［（２）の工程］
次に、前記（２）の工程について説明する。
前記（２）の工程は、前記（１）の工程後に、ポリヌクレオチドが可溶な液体中で前記結合の平衡定数を減少させて前記プローブ化合物と結合したポリヌクレオチドを脱離させる工程である。
【００４７】
前記液体中において前記結合の平衡定数を減少させる方法は、ハイブリダイゼーションの結合の平衡定数に影響する外部パラメーターを変化させる方法が挙げられる。例えば、温度の上昇（昇温）、緩衝液のイオン強度の減少、Ｍｇ２＋濃度の増加、ＥＤＴＡ濃度の増加、ホルムアミドなどの有機溶剤濃度の増加、超音波照射、マイクロ波照射、などが挙げられるが、昇温であることが好ましい。勿論、これらの方法を併用しても良い。
【００４８】
前記液体中において前記結合の平衡定数を減少させる速度（時間変化）、例えば昇温の速度は任意である。該速度は、ポリヌクレオチドの判定論理により、好適な値をとりうる。例えば、徐々に昇温し、各温度における前記残存量から判定する場合には、該昇温の速度の最適値は、固定プローブ化合物の長さ、前記検体溶液中のポリヌクレオチドの長さや濃度、一塩基多型の分析か多塩基置換の分析かなどによって異なるが、簡単な実験によって求めることが出来る。一般的には、０．０２〜０．５℃／ｓが好ましく、０．０５〜０．２℃／ｓがさらに好ましい。また平行定数を急激に減少させる場合、例えば急激に昇温し、該変化に遅れて追従する残存量の時間変化の程度から判定する場合には、１℃／ｓ〜１００℃／ｓが好ましい。
【００４９】
前記平衡常数を減少させる方法が昇温である場合、該昇温する方法は任意であり、例えば、波前記ハイブリド形成部位に接触又は近接して設置されたヒートブロックのプログラム温調、温度変化させた気体又は液体との接触、レーザーや赤外線などの輻射によるプログラム温調等が挙げられる。これらの中で、前記徐々に昇温する場合には、ヒートブロックが、温調が正確に再現性よく行えるため好ましく、前記急激に昇温する場合には、異なる温度の液体の接触又は輻射による方法が、急激な昇温が容易であり好ましい。
【００５０】
前記昇温の起点温度は任意であるが、前記（１）の工程における検体溶液と固定プローブ化合物とを接触させる温度を起点とすることが好ましく、測定時間短縮のために、前記（１）の工程の温度より高く、且つ（Ｔｍｂ−１０℃）〜（Ｔｍｂ−３℃）とすることがさらに好ましい。この時、該起点温度までの昇温速度は任意であるが、前記平衡定数を減少させるための昇温速度より急速な昇温であることが分析時間の短縮のために好ましい。
【００５１】
前記（２）の工程が昇温によるものである場合の昇温の終点温度は、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物のハイブリッドの融解温度（Ｔｍｂ）以上である。この温度であれば、前記（３）の工程において、ポリヌクレオチド（Ｂ）の存在の有無または存在量が確認可能であるため、分析時間を短縮できる。しかし、該終点温度は、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物のハイブリッドの融解温度（「Ｔｍａ」と称する）以上とすることが、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｍ）の両者を検出出来るため好ましい。該終点温度の上限は任意であるが、検体溶液の沸点以下であることが好ましい。昇温曲線も任意であり、直線、曲線、階段状などであり得る。
【００５２】
また、前記昇温はポリヌクレオチドが可溶な液体中で行う。該液体は検体溶液自体であっても、検体溶液と異なる液体であっても良い。但し、前記（３）の工程の検出方法によっては、検体溶液が使用できない場合があり、このときは、プローブ化合物（Ａ）もポリヌクレオチド（Ｂ）も含有しない液体（「以下、「溶出液」と称する場合がある」が好ましい。
【００５３】
溶出液としては、例えば緩衝液、食塩水、純水、マグネシウムイオン含有水溶液、ＥＤＴＡ含有水溶液、ホルムアミドやＮ，Ｎ−ジメチルスルホキシドなどの有機溶剤、及びこれらの混合液などが挙げられる。
【００５４】
前記昇温は、前記（３）の工程における脱離量の測定手段にもよるが、接触させている前記液体を流動させつつ行うことが好ましい。これにより、前記プローブ化合物と結合したポリヌクレオチドの脱離を促進させることができるし、また、脱離したポリヌクレオチドを他の位置へ移動させることにより、（３）の工程における検出が容易になり検出精度が上がる。
【００５５】
例えば、前記被検ポリヌクレオチドとして蛍光標識ポリヌクレオチドを使用し、脱離量の測定がプローブ化合物の固定部分の蛍光の観測である場合には、脱離したポリヌクレオチドに由来する蛍光を観測部分から除去するために前記液体を流動させることが好ましい。前記液体の流動は、プローブ化合物を固定した固相が浸漬された前記液体の揺動や流動、プローブ化合物を固定した流路中の前記液体の流通などであって良いが、プローブ化合物を固定した流路中の前記液体の流通であることが測定の容易さや分析速度の面から好ましい。流動速度は任意であり、また、流動は連続的であっても間欠的であっても良い。階段状の昇温と同期させた間欠的な流動であることも好ましい。
【００５６】
なお、本発明において、検体溶液とは異なる液体を流動させてポリヌクレオチドを脱離させる場合であっても、脱離したポリヌクレオチドは前記液体の溶液となって、前記溶液の流動速度と同じ速度で移動する。この点で、ポリヌクレオチドの移動速度が展開液（溶出液）の移動速度より遅いアフィニティークロマトグラフィーと異なる。
【００５７】
あるいは、前記被検ポリヌクレオチドとして蛍光標識ポリヌクレオチドを使用し、脱離量の測定がプローブ化合物の固定部分の蛍光の観測である場合には、脱離したポリヌクレオチドに由来する蛍光を観測部分から除去するために前記液体を流動させる代わりに、電気泳動を利用することも好ましい。この場合には、検体溶液を前記溶出液に交換した後に、前記溶出液を滞留させた状態で、昇温しつつ流路の長手方向に電圧を印可する。この方式は、再現性のある流速、例えば一定速度で液体を移動させる必要がないため、定量ポンプが不要となり好ましい。
【００５８】
前記平衡定数の低減が昇温以外の方法、例えば溶液組成を変化させて行うものである場合には、前記平衡定数を徐々に減少させる場合には、該組成の変化を階段状に変化させてもよいが、連続的に変化させることが好ましい。前記平衡定数を急激に減少させる場合には１段の段状が好ましい。これらの操作に関しても、上記の昇温による平行定数の低下と同様である。
【００５９】
［（３）の工程］
次に、前記（３）の工程について説明する。
脱離量の測定方法は任意であり、公知の方法を利用することができる。例えば、前記検体溶液中のポリヌクレオチドとして、蛍光標識したポリヌクレオチドを使用しプローブ化合物固定部分の蛍光を測定する方法、色素や着色粒子で標識したポリヌクレオチドを使用しプローブ化合物の固定部分の着色や吸光度を測定する方法、蛍光インターカレーターを添加しプローブ化合物固定部分の蛍光を測定する方法、プローブ化合物固定部分付近けられた電極間の電位差や抵抗を測定する方法、電界効果トランジスタ上にプローブ化合物を固定し、出力電圧を測定する方法、ＥＬＩＳＡ法、即ち、酵素で標識したポリヌクレオチドを使用し、基質との反応生成物濃度を、着色、吸光度、蛍光、電気伝導度、過酸化水素濃度、酸素濃度、水素イオン濃度などにより測定する方法、プローブ化合物を固定する固相が流路の内面であり、該流路に液体を流して、前記固定部の下流部分の溶液中のポリヌクレオチド濃度を蛍光などによって測定する方法などを挙げることができる。
【００６０】
また、脱離量の測定は、前記プローブ化合物と結合しているポリヌクレオチドの残存量を測定し、脱離前の量と比較して算出することが、分析精度が高まり好ましい。前記残存量の測定は、オリゴヌクレオチド固定部位の蛍光測定であることが、感度、精度共に高く、好ましい。このとき、被検ポリヌクレオチドが一本鎖であり、蛍光インターカレーターを用いた検出は、前記（２）の工程において接触させる液体が検体溶液のままでよいため好ましい。
【００６１】
ここで言う脱離量とは、前記（１）の工程を行う前の結合量（Ｃ１）と前記（１）の工程により脱離させた後の結合量（残存量）（Ｃ２）（但し、Ｃ２は経時的に変化する場合がある。）の差（Ｃ１−Ｃ２）を言うが、この差を前記（２）の工程を行う前の結合量（Ｃ１）で除した値［（Ｃ１−Ｃ２）／Ｃ１］、即ち、結合量（Ｃ１）によって正規化した値であっても良い。正規化することによって、前記（１）の工程に於ける結合量のバラツキの影響が除去されるため好ましい。或いは、前記（２）の工程により脱離させた後の結合量（Ｃ２）を結合量（Ｃ１）で除した値（Ｃ２／Ｃ１）を用いても良い。
或いは、脱離量は、脱離によってポリヌクレオチドが可溶な液体中に溶出したポリヌクレオチド濃度を測定し、溶出濃度の積載値として脱離量を算出することも出来る。この場合も、最終的な全溶出量で各時間や温度毎の脱離量を除して正規化することも好ましい。
【００６２】
前記脱離量の測定結果から、前記ポリヌクレオチド（Ｂ）の存在の有無、及び／又は含有量を判定できる。含有量は絶対量や絶対濃度であってもよいし、ポリヌクレオチド（Ａ）の含有量に対する比であってもよい。前記判定は、固定プローブ化合物とミスマッチの数が多いポリヌクレオチドほど、前記平衡定数を減少させた場合の脱離速度が速くかつ脱離量も多いことを利用する。本発明に於いては、塩基配列の１つの違いも、脱離速度の差又は脱離量の差として判別出来る。勿論、分析論理は種々のバリエーションがあり得る。例えば、
（１）各温度における残存量から判定する方法（検量線法）：徐々に昇温する方法において、残存量（正規化してもよい）対温度の検量線を予め作成し、該検量線と比較する方法により、被歩がポリヌクレオチド（Ａ）樽かポリヌクレオチド（Ｂ）であるか、又その量的関係を知ることが出来る。またこのとき、ポリヌクレオチド（Ｂ）の検量線より低温で脱離するポリヌクレオチドが認められる場合には、該被検ポリヌクレオチドは標準塩基配列に対して２塩基以上の違いを有するポリヌクレオチドであると判定できる。
【００６３】
さらに、上記残存量対温度の曲繊に於いて、温度を直線的に上昇させたときに階段状の解離曲線が得られれば、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）が混在していると判定でき、段差から混合比も推定できる。プローブ化合物として野生型オリゴヌクレオチドを用いれば、ポリヌクレオチド（Ｂ）が脱離した時点で変異型ＳＮＰの存在の有無を判定できるため、分析時間を短縮できる。
【００６４】
（２）各温度における残存量から判定する方法（比較法）：徐々に昇温する方法において、例えば野生型ポリヌクレオチドと変異型ポリヌクレオチドにそれぞれ相補的な塩基配列を有するプローブ化合物（又は、ホットスポット以外の部分で１〜４ミスマッチを生じる塩基配列を有するプローブ化合物）を、互いに独立した固定部位に別々に固定し、同じ検体溶液をそれぞれの固定部位に接触させた後、前記各固定部位における脱離量の温度依存性を比較して分析することが出来る。この方法に於いては、例えば、野生型を固定した部位より変位型を固定した固定部位の脱離量が高ければ、検体溶液中には野生型が含有されると判定できる。逆であれば、変異型が含有されると判定できる。両方が同程度の脱離量を示せば、両者がほぼ同量含有されると判定できる。
【００６５】
（３）残存量変化の時間遅れから判定する方法（検量線法）：前記（１）の判定論理と同じ環境において、徐々に昇温する代わりに急激に昇温し、残存量が該温度変化に追従しきれずに、その変化より遅れて低下する程度（残存量の減少速度）の検量線を予め作成し、該検量線と比較する方法により、被検ポリヌクレオチドがポリヌクレオチド（Ａ）であるかポリヌクレオチド（Ｂ）であるか、又その量的関係を知ることが出来る。即ち、昇温後の温度と融解温度の差が大きなポリヌクレオチド（Ｂ）はより速く減少する。このとき、ポリヌクレオチド（Ｂ）の検量線より高速で減少するポリヌクレオチドが認められる場合には、該被検ポリヌクレオチドは標準塩基配列に対して２塩基以上の違いを有するポリヌクレオチドであると判定できる。
【００６６】
（４）残存量変化の時間遅れから判定する方法（比較法）：前記（２）の判定論理と同じ環境において、徐々に昇温する代わりに急激に昇温し、残存量が該温度変化に追従しきれずに、その変化より遅れて低下する程度（残存量の減少速度）を前記異なるプローブ化合物の固定部位間で比較することにより判定することが出来る。この方法に於いては、例えば、野生型を固定した部位より変位型を固定した固定部位の残存量の減少速度が高ければ、検体溶液中には野生型が含有されると判定できる。逆であれば、変異型が含有されると判定できる。両方が同程度の減少速度を示せば、両者がほぼ同量含有されると判定できる。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチドの分析方法は、種々の用途目的に使用できる。例えば、農林水産業などに於ける種の改良などを目的とした、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列と機能の関係の解明のための使用や、感染症の原因微生物の分析、疾患に掛かりやすい遺伝的因子の保有の分析、患者の薬物感受性の分析、ガンであるか否かあるいはその種類の分析、生体移植の適合性の分析などの医療用途での使用や、同一人判定、親子判定、男女判定などの法務鑑定での使用、生物学的あるいは考古学的研究での使用、農作物において特定種であるか否か又はあるいは遺伝子組み換え作物であるか否かの分析などを挙げることができる。
【００６８】
【実施例】
以下、実施例及び比較例を用いて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は、以下の実施例の範囲に限定されるものではない。
【００６９】
［製造例１］
本発明に使用するマイクロ流体デバイスの製造例を示す。
【００７０】
〔紫外線ランプ２による照射〕
２５０Ｗ高圧水銀ランプを光源とするウシオ電機株式会社製のマルチライト２５０Ｗシリーズ露光装置用光源ユニットを用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が５０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を、特に指定が無い限り室温、窒素雰囲気中で照射した。
【００７１】
〔蛍光強度測定方法〕
ライカ株式会社製の共焦点レーザー顕微鏡ＴＣＳ−ＮＴを用いて測定した。測定条件はＰＭＴ感度５２０Ｖ、ピンホール１．００とした。
【００７２】
〔エネルギー線硬化性組成物（ｉ）の調製〕
平均分子量２０００の３官能ウレタンアクリレートオリゴマー（大日本インキ化学工業株式会社製の「ユニディックＶ−４２６３」）７２質量部、ジシクロペンタニルジアクリレート（日本化薬株式会社製の「Ｒ−６８４」）１８質量部、メタクリル酸グリシジル（和光純薬工業株式会社製）１０質量部、デカン酸メチル（和光純薬工業株式会社製）を１５０質量部、揮発性の良溶剤としてアセトンを１０質量部、紫外線重合開始剤として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン（チバガイギー社製の「イルガキュア１８４」）３質量部を、均一に混合して組成物（ｉ）を調製した。
【００７３】
〔エネルギー線硬化性組成物（ｉｉ）の調製〕
活性エネルギー線架橋重合性化合物として、「ユニディックＶ−４２６３」を８０質量部、及び１，６−ヘキサンジオールジアクリレート（第一工業製薬株式会社製の「ニューフロンティアＨＤＤＡ」）を２０質量部、光重合開始剤として「イルガキュア１８４」を５質量部を均一に混合して組成物（ｉｉ）を調製した。
【００７４】
〔エネルギー線硬化性組成物（ｉｉｉ）の調製〕
活性エネルギー線架橋重合性化合物として、「ユニディックＶ−４２６３」を６０部、「ニューフロンティアＨＤＤＡ」４０部、光重合開始剤として「イルガキュア１８４」５部、及び重合遅延剤として２，４−ジフェニル−４−メチル−１−ペンテン（関東化学株式会社製）０．５部を均一に混合して組成物（ｉｉｉ）を調製した。
【００７５】
〔マイクロ流体デバイスの作製〕
＜塗膜層２の形成＞
基材１としてポリアクリレート（三菱レイヨン社製の「アクリライトＬ　０００番」）製の板を用い、これにスピンコーターを用いて組成物（ｉｉ）を塗布し、紫外線ランプ１により紫外線を３秒照射して、厚み約８０μｍの樹脂層２を形成した。
【００７６】
＜多孔質層３の形成＞
この樹脂層２の上に、スピンコーターを用いて組成物（ｉ）を塗布し、紫外線ランプ１により紫外線を４０秒間照射した後、ｎ−ヘキサンでデカン酸メチルを洗浄除去して厚み約５μｍの多孔質層３を形成した。
【００７７】
＜プローブ化合物固定部の形成＞
上記多孔質層３の上にに、スピンコーターを用いて組成物（ｉｉｉ）を塗布し、該組成物（ｉｉｉ）の一部を多孔質層３に染みこませ、の氷を該層３の上の塗膜４とした。フォトマスク（図示せず）を通して、プローブ化合物固定部３ａとなる部分以外の前記塗膜４に紫外線照射を１２０秒間行って照射部の該塗膜４を硬化させ、非照射部分の未硬化の前記組成物（ｉｉｉ）をエタノールで除去して、面の一部に多孔質で形成されプローブ化合物固定部３ａが露出した、厚み約８０μｍの樹脂層４を樹脂層２上に形成した。
【００７８】
＜流路の形成＞
上記樹脂層４の上に、スピンコーターを用いて組成物（ｉｉｉ）を塗工し、該組成物（ｉｉｉ）の塗膜５を形成し、フォトマスク（図示せず）を通して紫外線照射を１２０秒間行い前記組成物（ｉｉｉ）の塗膜５を硬化させて厚み約８０μｍの樹脂層５とし、非照射部分の未硬化の前記組成物（ｉｉｉ）をエタノールで除去して、樹脂層４とプローブ化合物固定部３ａを底面に持つ、流路１０となる溝１０を形成した。
【００７９】
＜プローブ化合物導入のための前処理＞
上記で作製した溝１０を有する部材を、１０％ポリアリルアミン溶液（日東紡製のＰＡＡ−１０Ｃ）を純水にて希釈し得られる５質量％ポリアリルアミン水溶液に浸漬して、概要液をプローブ化合物固定部３ａ中に染みこませ、５０℃にて２時間保持して、ポリアリルアミン中の一部のアミノ基をプローブ化合物固定部３ａのエポキシ基と反応させた。その後、流水で３０分間洗浄することによって余剰のポリアリルアミンを除去して、プローブ化合物固定部３ａへアミノ基を導入した。
【００８０】
次いで、上記溝１０を有する部材を５質量％グルタルアルデヒド溶液［和光純薬工業製の２５％グルタルアルデヒド溶液を和光純薬工業製リン酸緩衝液にて５倍希釈しｔもの］中に入れ、５０℃、２時間反応させ、プローブ化合物固定部３ａに導入されたほぼ全てのアミノ基を、該グルタルアルデヒド中の片方のアルデヒド基と反応させた後、流水で５分洗浄して、プローブ化合物固定部３ａへアルデヒド基を導入した。
【００８１】
＜プローブ化合物の固定＞
５’末端に炭素数６のアルキレン基を介してアミノ基修飾した（以下、「５’末端アミノ基修飾」と称する）２５塩基標準塩基配列（表１参照）に相補的なＤＮＡ鎖、及び、５’末端アミノ基修飾を有せず、２５塩基標準塩基配列と同じ塩基配列のＤＮＡ鎖（いずれもエスペックオリゴサービス株式会社製）を等量混合し、ＤＮＡの２本鎖を形成させ、該ＤＮＡ３本鎖を５０μＭ含むプローブ化合物溶液を１０μＬ調製した。
【００８２】
前記にてアルデヒド基を導入したプローブ化合物固定部３ａを底面の一部にもつ溝１０に、プローブ化合物溶液を５μＬ滴下して、湿度１００％、５０℃にて１５時間反応させ、ＤＮＡの末端アミノ基をプローブ化合物固定部３ａの多孔質層のアルデヒド基と反応させた後、０．２質量％のテトラヒドロ硼酸ナトリウム水溶液中で５分間還元反応させ、次いで、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液でリンスし、次に、０．２×ＳＳＣでリンスし、該プローブ化合物固定部植板３ａへのプローブ化合物を導入した。
【００８３】
次いで、上記部材全体を、０．１ＸＴＢＥ緩衝液（和光純薬工業製の１０ＸＴＢＥの１００倍希釈液）中に入れ、９５℃にて５分間煮沸しプローブ化合物固定部３ａに導入されたＤＮＡの２本鎖から標準塩基配列を持つ対立鎖を解離除去し、前記標準塩基配列に相補的なＤＮＡ鎖のみをプローブ化合物として、プローブ化合物固定部３ａに固定した。
【００８４】
＜上板の固着＞
組成物（ｉｉ）を、一時的な支持体である７．５ｃｍ×２．５ｃｍ×３０μｍのポリプロピレンフィルム（二村化学工業社製の「二軸延伸ポリプロピレンフィルム「太閤」ＦＯＲ　３０番」、図示せず））のコロナ放電処理された面上に、バーコーターを用いて塗工した。該組成物（ｉｉ）の塗膜５に、紫外線ランプ１により紫外線を３秒照射して半硬化させ、上記樹脂層４び上に張り合わせ、紫外線ランプ１により、紫外線を４０秒間照射して完全に硬化させた後、該一時的な支持体を剥離して該塗膜５を樹脂層４に固着された樹脂層５となすと共に、溝１０を流路１０とした。
【００８５】
＜開口部の形成＞
樹脂層５上に組成物（ｉ）を塗布して塗膜６を形成し、さらにその上に上板７として、基材１と同じポリアクリレート製の７．５ｃｍ×２．５ｃｍ×１ｍｍの板を張り合わせ、紫外線を窒素雰囲気中にて塗膜６全面に４０秒間照射し、塗膜６を硬化させて厚み約８０μｍの樹脂層６にすると共に、上板７を樹脂層５に接着した。
次いで、上板７、樹脂層６、及び樹脂層５に、それぞれ流路１０に通じる直径１ｍｍの穴を、ドリルを使用して流路の両末端に形成し、さらにこれら２つの穴にそれぞれ内径３ｍｍ、高さ５ｍｍのポリ塩化ビニル管を接着して開口部１１、１２とした。
以上の方法により、マイクロ流体デバイスを作製した。
【００８６】
［製造例２］
上記、製造例１において、多孔質層３を形成する際に、フォトマスクを用いて、基板１の中心付近に直径０．５ｍｍの円形部分のみに紫外線を照射したこと、及び、その他の樹脂層４、５、６、上板７、流路１０、開口部１１、１２を形成しなかったこと、以外は製造例１と同様にして、基板１，樹脂層２の表面に。直径３ｍｍ、厚み約５μｍの多孔質で形成されたプローブ化合物固定部３ａを有するＤＮＡチップ型のデバイス（図示せず）を作製した。
このデバイスに、製造例１と同様にしてプローブ化合物を固定した。但しプローブ化合物の固定に当たっては、前記プローブ化合物溶液をプローブ化合物固定部３ａに滴下し、カバーガラスで覆って、保湿箱中で固定した。
【００８７】
［実施例１］
〔被検ポリヌクレオチド、検体溶液の調製〕
５’末端がＦＩＴＣ（蛍光色素）にて修飾された、２５塩基標準塩基配列（表１参照）を持つ２５塩基のＤＮＡ鎖［ポリヌクレオチド（Ａ）、被検ポリヌクレオチド］５００μＭと、５’末端がＦＩＴＣにて修飾されておらず、標準塩基配列に相補的な配列を持つ２５塩基のＮＡ鎖５００μＭとをそれぞれ１μＬずつ、１０×ＴＢＥ溶液を５μＬ、さらに滅菌水を９３μＬ加え、検体溶液（１−１）とした。
他方、３’側から１３番目のＣをＴ、ｇをＡに変えたこと以外は同様にしてポリヌクレオチド（Ｂ）とその相補鎖を作製し、上記と同様にして被検溶液（１−２）を調製した。
【００８８】
〔分析１−１〕
＜（１）の工程＞
エッペンドルフチューブ（図示せず）中で９５℃に加熱した検体溶液（１−１）を、　マイクロピペット（図示せず）にて５０μＬ取り、ヒートブロック（図示せず）上で全体を５０℃に温度調節したマイクロ流体デバイスの開口部１１に注入したところ、該溶液は流路に入り込み、全量が入った状態で停止した。その状態で、該温度に２分保った。
【００８９】
＜（２）の工程＞
マイクロシリンジ（図示せず）を開口部１１に押し当てて溶出液（０．５ＸＴＢＥ緩衝液）を注入し、検体溶液を開口部１２から全て押し出し、その後も溶出液を約５００μＬを流路に流して流路及びプローブ化合物固定部を洗浄した。次いで、開口部（１１）に陽極となる白金電極を、開口部（１２）に陰極となる白金電極を挿入し、白金電極間に５００Ｖを印加すると共に、前記ヒートブロックの温度を５０℃から９５℃まで、１．５℃／分の速度で直線的に昇温した。
【００９０】
＜（３）の工程＞
ライカ株式会社製の共焦点レーザー顕微鏡ＴＣＳ−ＮＴを用い、マイクロ流体デバイスの上面から、流路のプローブ化合物固定部３ａにおける蛍光強度の経時変化を測定した。その結果、蛍光強度は約８２℃から減衰が急になり、８４℃で初期の約５５％（後述の残存量を差し引くと約１／２）となり、８６℃以上でほぼ一定値（初期の約７％）になる逆Ｓ字型の曲線を示した（表２）。この曲線を微分すると、８４℃にピークを持つ曲線となった。
このことから、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物のハイブリッドの融解温度Ｔｍａは約８４℃であることが分かる。
分析に要した時間は、前記（１）の工程が２分、前記（２）の工程が３０分、計約３２分であった。ポリヌクレオチドの解離曲線が判明している場合、即ち、後述の分析（１−２）の結果が判明している場合には、昇温開始温度を例えば７０℃程度にすることによって、さらに分析時間の短縮が図れる。この場合には、計約１９分となる。
【００９１】
〔分析１−２〕
検体溶液として検体溶液（１−２）を用いたこと以外ｈ分析１−１と同様の分析を行ったところ、蛍光の減衰開始温度、半減温度、収束温度がそれぞれ、７７℃、７９℃、８１℃であること以外は同様の結果を得た。
即ち、１塩基だけ配列の違うポリヌクレオチド（Ｂ）は半減温度が５℃低下し、明確な差として測定された。
【００９２】
また。減衰開始温度までの温度範囲における蛍光強度は、分析１−１の強度の０．９２倍であった。このことから、ポリヌクレオチド（Ｂ）は分析１−１におけるポリヌクレオチド（Ａ）とほぼ同量プローブ化合物とハイブリッド形成しており、前記（１）の工程は非選択的なハイブリッド形成条件であることがわかる。
分析時間は、前記分析（１−１）と同様に計約３２分であったが、ポリヌクレオチド（Ｂ）の有無のみを測定すればよい場合には、昇温範囲を７０℃〜８５℃程度にすることが出来、分析時間の短縮が図れる。この場合、分析時間は計約１２分となる。
【００９３】
〔分析１−３〕
検体溶液として検体溶液（１−１）と検体溶液（１−２）の１：１混合液を用いたこと以外は分析１−１と同様の分析を行ったところ、蛍光は７７℃から減衰が急となり、７９℃で傾きが大になり、８１〜８２℃で、５０℃の約１／２の強度にて減衰の傾きが一旦小さくなり、８４℃で又大になり、約８６℃でほぼ一定値に収束する２段の階段状減衰曲線を示した。この曲線を微分すると、７９℃と８４℃にピークを持つ曲線となった。
このことから、検体溶液にはポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の両者がほぼ等量含まれることが判定できる。
【００９４】
［実施例２］
プローブ化合物として、３’側から１１番目のＡ（標準塩基配列の１１番目のＴに相補的な塩基）をＣに変えたものを用いたこと、前記（１）の工程の温度を４５℃としたこと、前記（２）の工程における昇温範囲を４５〜８５℃としたこと以外は、実施例１と同様の測定を行った。
その結果、蛍光の減衰曲線が全体に約３℃低温側へシフトしたこと以外は、実施例１と同様の結果を得た。ポリヌクレオチド（Ａ）の分析（分析２−１）とポリヌクレオチド（Ｂ）の分析（分析２−２）に関するこれらの温度を表２にまとめて示した。分析時間は、前記（１）の工程が２分、前記（２）の工程が約２７分、計約２９分であった。
【００９５】
［実施例３］
プローブ化合物として、３’側から１１番目のＡ（２５塩基標準塩基配列の１１番目のＴに相補的な塩基）をｇに、及び、３’側から８番目のｇ（２５塩基標準塩基配列の８番目のＣに相補的な塩基）をＴに変えたものを用いたこと、前記（１）の工程の温度を４０℃としたこと、前記（２）の工程における昇温範囲を４０〜８０℃としたこと以外は、実施例１と同様の試験を行った。
ポリヌクレオチド（Ａ）の分析（分析３−１）とポリヌクレオチド（Ｂ）の分析（分析３−２）に関する結果を表２にまとめて示した。減衰曲線はあまり緩慢に成らずに、半減温度が実施例１に比べて７℃低下していることが分かる。分析時間は、前記（１）の工程が２分、前記（２）の工程が約２７分、計約２９分であった。
【００９６】
［実施例４］
プローブ化合物として、３’側から１１番目のＡ（２５塩基標準塩基配列の１１番目のＴに相補的な塩基）をｇに、３’側から１０番目のＣ（２５塩基標準塩基配列の１０番目のｇに相補的な塩基）をＡに、及び、３’側から８番目のｇ（２５塩基標準塩基配列の８番目のＣに相補的な塩基）をＴに変えたものを用いたこと、前記（１）の工程の温度を３５℃としたこと、前記（２）の工程における昇温範囲を３５〜７５℃としたこと以外は、実施例１と同様の試験を行った。
ポリヌクレオチド（Ａ）の分析（分析４−１）とポリヌクレオチド（Ｂ）の分析（分析４−２）に関する結果を表２にまとめて示した。減衰曲線はあまり緩慢に成らずに、半減温度が実施例１に比べて１９℃以上低下し、さらにプローブ化合物（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の差が拡大していることが分かる。
【００９７】
［実施例５］
プローブ化合物として、２０塩基標準塩基配列（表１参照）に相補的な２０塩基の、５’末端アミノ基修飾ＤＮＡを用いたこと、前記（２）の工程の温度を４０℃としたこと、前記（３）の工程における昇温範囲を４０〜７０℃としたこと以外は、実施例１と同様の試験を行った。
ポリヌクレオチド（Ａ）の分析（分析５−１）とポリヌクレオチド（Ｂ）の分析（分析５−２）に関する結果を表２にまとめて示した。実施例１に比べて、減衰曲線はやや緩慢になり、半減温度が２６℃低下し、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の差が７℃に拡大していることが分かる。
【００９８】
［実施例６］
プローブ化合物として、３’側から１２番目のＡ（２０塩基標準塩基配列の１２番目のＴに相補的な塩基）をｇに変えたものを用いたこと以外は、実施例５と同様の試験を行った。
ポリヌクレオチド（Ａ）の分析（分析６−１）とポリヌクレオチド（Ｂ）の分析（分析６−２）に関する測定結果を表２にまとめて示した。減衰曲線はあまり緩慢に成らずに、各温度が低下していることが分かる。
【００９９】
［実施例７］
〔マイクロ流体素子の作成〕
実施例１と同じマイクロ流体素子を作製し使用した。
〔分析７−１、７−２〕
前記（２）の工程に於いて、脱離したポリヌクレオチドを電気泳動により移動させる代わりに、開口部１１にシリンジポノプ（図示せず）を接続し、上記緩衝液を２０μＬ／分の流量で導入したこと以外は実施例１と同様にして分析２−１と分析２−２を行った。
ポリヌクレオチド（Ａ）の分析（分析７−１）とポリヌクレオチド（Ｂ）の分析（分析７−２）に関する測定結果を表２にまとめて示した。実施例１と比べて全体に約１℃低いこと以外は、実施例１と同様の結果であった。
【０１００】
【表１】
2004097209.tif 000002
【０１０１】
【表２】
2004097209.tif 000003
【０１０２】
［実施例８］
本実施例に於いては、減少速度の遅れから判定する方法について述べる。
実施例１と同じマイクロ流体デバイスを使用し、前記（２）の工程が、マイクロ流体デバイスを、あらかじめ９５℃に調節しておいたヒートブロック（図示せず）に接触させて急激に昇温したこと以外は実施例１と同様にして測定した。なお、別途、流路部分に熱伝対を組み込んだマイクロ流体デバイスを用いて昇温時間を測定したところ、９０℃に到達する時間は約９秒であった。
その結果、ハイブリッドの残存量度が初期値の１／２に減衰する時間は、ポリヌクレオチド（Ａ）では（２）の工程における昇温開始後約３３秒、ポリヌクレオチド（Ｂ）では約２５秒であった。
測定に要した時間は、前記（１）の時間が２分、その温度で洗浄する時間が約２分、前記（２）の工程は約４３秒、計約５分で分析が可能であった。
【０１０３】
［実施例９］
本実施例では、ＤＮＡチップ型のデバイスを用いた分析について述べる。
（１）の工程
検体溶液をプローブ化合物固定部３ａに滴下し、カバーガラスで覆って、保湿箱中で所定温度に保持したこと以外は実施例１と同様にしてハイブリッド形成させた。
（２）、（３）の工程
前記（２）及び（３）の工程が、溶出液として蒸留水を用いたこと、溶出液をポンプで送液して脱離ポリヌクレオチドを除去する代わりに、前記ＤＮＡチップ型デバイスを所定温度の溶出液中に浸漬し、２分間撹拌して洗浄した後、プローブ化合物固定部３ａ部の蛍光強度を測定する操作を、溶出液温度を２℃づつ上げながら９０℃まで行ったこと、以外は実施例１と同様にして、被検ポリヌクレオチドとしてプローブ化合物（Ａ）を用いた分析９−１、プローブ化合物（Ｂ）を用いた分析９−２、プローブ化合物（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の等量混合物を用いた分析９−３を実施した。
その結果、表３に示したように、残存量が急激に低下する温度が、ポリヌクレオチド（Ｂ）を用いた分析９−２の結果は、ポリヌクレオチド（Ａ）を用いた分析９−１に比べて約３．５℃低下し、分析９−３では該２つの温度で急激に低下した。
測定に要した時間は、溶出液の昇温時間と蛍光測定に要した時間を別として、前記（１）の時間が２分、前記（２）の工程が４０分、計４２分であった。この場合も、実施例１と同様に、昇温範囲を限定することで、さらに分析時間の短縮が図れる。
【０１０４】
［実施例１０］
プローブ化合物をして、３’側から１２番目のＴ（標準塩基配列の１２番目のＡに相補的な塩基）をＧに変えたものを用いたこと、及び工程（１）のハイブリッド形成温度を４５℃としたこと、以外は、実施例９と同様の分析を行った。被検ポリヌクレオチドとしてプローブ化合物（Ａ）を用いた分析１０−１、プローブ化合物（Ｂ）を用いた分析１０−２、プローブ化合物（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の等量混合物を用いた分析１０−３について、結果を表３に示した。
測定に要した時間は、溶出液の昇温時間と蛍光測定に要した時間を別として、前記（１）の時間が２分、前記（２）の工程が４６分、計４８分であった。この場合も、実施例１と同様に、昇温範囲を限定することで、さらに分析時間の短縮が図れる。
【０１０５】
［実施例１１］
プローブ化合物をして、３’側から１２番目のＴ（標準塩基配列の１２番目のＡに相補的な塩基）をＧに、かつ、３’側から１４番目のＧ（標準塩基配列の１４番目のＣに相補的な塩基）をＡに変えたものを用いたこと、及び工程（１）のハイブリッド形成温度を４０℃としたこと以外は、実施例９と同様の分析を行った。被検ポリヌクレオチドとしてポリヌクレオチド（Ａ）を用いた分析１１−１、ポリヌクレオチド（Ｂ）を用いた分析１１−２、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の等量混合物を用いた分析１１−３について、結果を表３に示した。
測定に要した時間は、溶出液の昇温時間と蛍光測定に要した時間を別として、前記（１）の時間が２分、前記（２）の工程が４４分、計４６分であった。この場合も、実施例１と同様に、昇温範囲を限定することで、さらに分析時間の短縮が図れる。
【０１０６】
【表３】
2004097209.tif 000004
【０１０７】
上記実施例１〜１１より、本発明の方法により標準塩基配列とは特定の一塩基が異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドを短時間で、精度良く検出できることが示された。また、各種プローブ化合物や検出装置を使用した場合にも本発明の方法が適用できることが明らかであった。
【０１０８】
【発明の効果】
本発明のポリヌクレオチドの分析方法は、標準とする塩基配列に対する一塩基の配列の違いを、短時間に、かつ高い信頼性で検出することができる。また、プローブ化合物の塩基配列を、前記検出すべき１塩基配列が異なる部位以外の部分において、標準塩基配列と０〜４のミスマッチを生じるような塩基配列とすることにより、高い精度と信頼性を維持しながら、分析に必要な最高温度を低下させることが出来るため、使い捨て可能なプラスチック製のマイクロ流体デバイスとして耐熱性の低い素材が使用できる。
【０１０９】
さらに本発明の方法によると、検体溶液を微小な領域の固定プローブ化合物に接触させるため、少量の試料量でも精度良く分析が可能である。また、複数のプローブ化合物を固定した複数の微小な領域を近接して設けることにより、多種類のポリヌクレオチドを同時に分析するような場合にも、試料量が過大になることがない。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例に使用したマイクロ流体デバイスの模式図であり、（ａ）は平面模式図であり、（ｂ）は側面模式図である。
【図２】図１中のＩ−Ｉ線に沿う断面模式図である。
【符号の説明】
１　基材
２、４、５、６　塗膜、樹脂層
３　多孔質層
７　上板
１０　溝、流路
１１、１２　開口部
【図１】
2004097209.tif 000005
【図２】
2004097209.tif 000006