(57)【要約】【課題】簡便に短時間で複数の遺伝子を検査することの出来る遺伝子検査装置を提供する。【解決手段】コンピュータを利用した遺伝子検査装置であり、ＤＮＡマイクロアレイを支持するステージ４と、ＤＮＡマイクロアレイの温度を調節するための温度調節部９、５１、５３と、ＤＮＡマイクロアレイからの光学的信号を撮像するためのＣＣＤカメラ５と、ＤＮＡマイクロアレイ中の流体を出し入れするための流体輸送部４１と、装置を運転するためのアプリケーションを記憶した記憶部と、記憶部に記憶されたアプリケーションに従って装置全体を制御する制御部１０ａと、情報を表示するための表示部１６と、ユーザーから情報の入力を可能にするための入力部１５とを備えており、測定に関する各種のパラメータをユーザーが自由に設定できるようにアプリケーションによって制御される装置。【選択図】　図８
2004028775.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンピュータを利用した遺伝子検査装置であって、ＤＮＡマイクロアレイの温度を調節するための温度調節部と、ＤＮＡマイクロアレイからの光学的な信号を検出するための光検出器と、ＤＮＡマイクロアレイへ流体を給排するための流体輸送部と、装置を運転するためのアプリケーションに従って装置全体を制御する制御部と、情報を表示するための表示部と、ユーザーからの情報を入力可能にするための入力部とを備えており、測定に関する各種のパラメータをユーザーが自由に設定できるようにアプリケーションによって制御される装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置において、検出器がＣＣＤカメラである装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のコンピュータを利用した遺伝子検査装置であって、装置を運転するためのアプリケーションを記憶している記憶部を備えており、アプリケーションは、表示部に次に必要な操作を表示させてユーザーに指示を出したり、表示部に測定に関する様々な情報を表示させたりする装置。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載のコンピュータを利用した遺伝子検査装置であって、装置の各部に対する指示である様々なプロファイルをユーザーが自由に変更できるようにアプリケーションによって制御される装置。
【請求項５】
請求項４に記載のコンピュータを利用した遺伝子検査装置であって、プロファイルは、ポンプ動作指示や撮影指示や遅延時間指示や一定停止指示や温度変更指示や洗浄指示のうちの少なくとも一つを含んでいる装置。
【請求項６】
請求項１ないし請求項５のいずれか一つに記載のコンピュータを利用した遺伝子検査装置であって、表示部に情報の入力を促すメッセージを表示させ、入力部からの情報入力を待ち受けるようにアプリケーションによって制御される装置。
【請求項７】
請求項４に記載のコンピュータを利用した遺伝子検査装置であって、複数のプロファイルを組み合わせて構成されるサイクルを自由に設定できるようにアプリケーションによって制御される装置。
【請求項８】
請求項７に記載のコンピュータを利用した遺伝子検査装置であって、複数のサイクルを組み合わせて構成されるシーケンスを自由に設定できるようにアプリケーションによって制御される装置。
【請求項９】
請求項１ないし請求項８のいずれか一つに記載のコンピュータを利用した遺伝子検査装置であって、前記ＤＮＡマイクロアレイの基板が、多孔質体で、且つ、核酸プローブが固定されているプローブスポットを具備する装置。
【請求項１０】
請求項１ないし請求項９の何れか１項に記載の装置を使用した遺伝子検査方法であって、
（１）被験対象から採取した組織または細胞から抽出された核酸を増幅し、蛍光標識物質を付加すること；
（２）上記（１）で得られた標識された核酸を、所望の核酸プローブを具備するＤＮＡマイクロアレイに添加すること；
（３）上記（２）のＤＮＡマイクロアレイについて所望の条件下でハイブリダイゼーション反応を行うこと；
（４）上記（３）で得られたＤＮＡマイクロアレイについて蛍光強度を測定すること；
（５）上記（４）で得られた蛍光強度を基に、発現遺伝子量の判定および／または突然変異遺伝子の有無の判定を行うことにより遺伝子検査の結果を得ること；
を具備する方法。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項９の何れか１項に記載の装置を使用した遺伝子検査方法であって、
（１）被験対象から採取した組織または細胞から抽出された核酸を増幅し、蛍光標識物質を付加すること；
（２）上記（１）で得られた標識された核酸を、所望の核酸プローブを具備するＤＮＡマイクロアレイに添加すること；
（３）上記（２）のＤＮＡマイクロアレイについて所望の条件下でハイブリダイゼーション反応を行うこと；
（４）上記（３）の反応が終了した後に、ＤＮＡマイクロアレイに含まれる溶液を当該アレイの下部に留めさせること；
（５）上記（４）で得られたＤＮＡマイクロアレイについて蛍光強度を測定すること；
（６）上記（４）で当該アレイの下部に溜めた液体を再度撹拌すること；
（７）上記（６）のＤＮＡマイクロアレイについて必要に応じ所望の条件下でハイブリダイゼーション反応を繰り返すこと；
（８）上記（６）で得られたＤＮＡマイクロアレイについて蛍光強度を測定すること；
（９）上記（４）および（８）で得られた蛍光強度を基に、発現遺伝子量の判定および／または突然変異遺伝子の有無の判定を行うことにより遺伝子検査の結果を得ること；
を具備する方法。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１に記載の方法であって、更に、請求項１０の（４）または請求項１１の（８）で得られた蛍光強度を基に、発現遺伝子量の判定および／または突然変異遺伝子の有無の判定して得られた情報を、データベースに開示される公知の遺伝子情報および／または標準試料から得られた情報と比較することにより遺伝子検査の結果を得ることを具備する方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記（５）から（８）の操作を２回以上繰り返して行うことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現レベルおよび突然変異の有無を検出する装置、並びにそれを用いた検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子解析技術が進み、ヒトを含む多くの生物における遺伝子配列が明らかにされてきた。また、解析された遺伝子産物と疾病の因果関係も少しずつ解明されてきた。現在用いられている遺伝子検査方法は、生体試料から核酸を抽出する工程、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ法などと呼ばれる核酸増幅方法を用いて検査対象となるターゲット遺伝子を増幅する工程、核酸を放射性同位元素や蛍光分子等によって標識する工程、標識されたターゲット遺伝子の塩基配列またはその濃度を測定する工程から構成されている。最近は、蛍光標識された核酸を複数のキャピラリーを用いることで高速に多数のサンプルを処理できるキャピラリ電気泳動装置が数多く用いられている。これにより、従来の電気泳動装置などを用いた方法に比べて三分の１から四分の１程度の時間で行えるようになった。更に近年になって同時に複数の遺伝子を検査するためのＤＮＡチップを用いた検査方法が開発された。ＤＮＡチップは、ガラス基板の表面に多数のｃＤＮＡプローブを固定化するものや、半導体製造過程を応用してシリコン上の微小な領域に合成した多数のオリゴプローブを作製したものである。何れもサンプル中のＤＮＡの塩基配列や発現量を、複数、同時に決定出来る方法である。ＤＮＡチップの応用によって、多くの遺伝子発現量や複数の突然変異の解析を行うことが可能となった。また、ＤＮＡチップを用いて得られたデータから、多くの遺伝子を複数のグループに分類したり（即ち、クラスタリング）、発生や分化に伴う遺伝子の変動に関する情報が得られている。こうして得られた遺伝子情報は、インターネットを通じて容易にアクセス出来るようなデータベースとして利用されている。
【０００３】
遺伝子の発現量の検査や突然変異の解析が電気泳動法やＤＮＡチップ法を用いて行われている。しかしながら電気泳動法では、検査に必要な時間が長く、また、一度に行える検査は少数に限られるのが欠点であった。ＤＮＡチップを用いた遺伝子解析方法は、一度に多数の検査を行える反面、検査時間が長く必要とされ、また、全体の検査工程が多く、且つ煩雑な操作が必要であった。そのために再現性のよい分析結果が得られない、という欠点があった。こうした欠点を克服するために、再現性がよく、且つ短時間でＤＮＡチップと同様の検査を行うことを目的として、ＤＮＡチップの担体として多孔質のフィルターを用いた方法や、ハイブリダイゼーション反応を電気的な力によって強制的に行う方法が開発された（特表平９−５０４８６４、特表平２０００−５１５２５１、特表平２００１−５０１３０１）。しかしながら、多孔質のフィルターを用いた方法においては、液体の移動と温度制御を行う反応部分と蛍光検出を行う測定部分が別々で、複雑な装置構成が必要とされることが欠点であった。また、電気的な力によって強制的にハイブリダイゼーションを行う方法（特表平２００１−５０１３０１）では、チップの中の電圧を厳密に制御したりする機構を設ける必要があった。そのため、これらの方法では臨床検査などにおける短時間に、且つ簡便に遺伝子の検査を行いたい、という要求に応えることはできなかった。
【０００４】
また、癌や糖尿病、または高血圧などのように、複数の遺伝子異常と環境要因が重ね合わされて発症するような多因子性の疾患においては、複数の遺伝子の異常を多面的に解析し、さらに、外部環境要因を分析することによって、より正確な診断が行えると考えられている。また、実際の化学治療に当たっては、薬の副作用を避け、且つ治療効果を向上するために、投与する薬剤に対する感受性（これは、体質とも解釈される）を予め正確に判定しておく必要がある。更に、Ｐ５３遺伝子等を用いた高度な遺伝子治療を行うに当たっては、予め、患者の体内の癌遺伝子、癌抑制遺伝子等の発現量や突然変異の有無、或いは細胞の情報伝達の状態などの遺伝子情報を正確に解析しておく必要がある。
【０００５】
以上のような状況において、現在、簡便に、且つ短時間で複数の遺伝子を検査することの出来る遺伝子検査システムの開発が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、簡便に、且つ短時間で複数の遺伝子を検査することの出来る遺伝子検査装置および方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を解決するための手段を、鋭意研究の結果見出した。即ち、コンピュータを利用した遺伝子検査装置であって、ＤＮＡマイクロアレイの温度を調節するための温度調節部と、ＤＮＡマイクロアレイからの光学的な信号を検出するための光検出器と、ＤＮＡマイクロアレイへ流体を給排するための流体輸送部と、装置を運転するためのアプリケーションに従って装置全体を制御する制御部と、情報を表示するための表示部と、ユーザーからの情報を入力可能にするための入力部とを備えており、測定に関する各種のパラメータをユーザーが自由に設定できるようにアプリケーションによって制御される装置である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
１．装置の概要
本発明の１側面に従うと、遺伝子の発現レベルと突然変異を１つの検体について容易に且つ短時間で検出する装置が提供される。
【０００９】
本発明の装置において実施される検出方法の基本的な原理は、配列が既知の固定化された核酸プローブを用いて、試料中に含まれる特定の配列をもった核酸鎖を検出するというものである。この方法では、例えば基板に一本鎖核酸の試料を固定化し、次に蛍光物質等で標識した試料中に含まれる核酸に接触させる。試料中の核酸が核酸プローブと相補的な配列を有していれば、核酸プローブとハイブリダイズして二本鎖を形成するので基板上に固定される。従って、洗浄により未反応の核酸鎖を除去した後で、プローブに付された標識を検出すれば、プローブに対して相補的な配列を有する標的核酸を検出することができるというものである。
【００１０】
例えば、図１に示す構成図を用いて、本発明の装置の１態様を以下に説明する。本発明の装置であるコンピュータを利用した遺伝子検査装置１は、そこにおいてサンプルを反応させるためのＤＮＡマイクロアレイ２２における事象を顕微鏡的に観察するための顕微鏡３と、ＤＮＡマイクロアレイ２２を有したスライドチップ２を支持するために前記顕微鏡３に具備されるステージ４と、前記顕微鏡３により観察されたＤＮＡマイクロアレイ２２における蛍光画像を撮像するためのＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｄｅｖｉｃｅ）カメラ５と、前記顕微鏡３により観察される視野を変更するために前記ステージ４に接続されるモータドライバ６を制御するＸＹステージコントローラ７と、前記ＤＮＡマイクロアレイ２２に接続されたジョイント部を介して流体を輸送するポンプドライバ８と、前記ＤＮＡマイクロアレイ２２に接触して配置されるヒーター部を介して該ＤＮＡマイクロアレイ２２の温度を調節する温度コントローラ９と、更に、前記遺伝子検査装置１に含まれる全てのデバイスに直接的または間接的に接続され且つそれらを総括して制御するコンピュータ１０とを具備する。
【００１１】
図１には示していないが、ここで前記ジョイント部は、ＤＮＡマイクロアレイ２２に含まれる液体を外部に漏出しないような様式で、ＤＮＡマイクロアレイ２２に接続される。更に該ジョイント部の他端はチューブを介して、ポンプドライバ８に接続され、更にポンプドライバ８は、その内部に所望の試薬等を含む試薬保持部に接続される。前記ポンプドライバ８は解析プログラムに従ってコンピュータ１０の指示により前記ＤＮＡマイクロアレイ２２に対する流体の出し入れを実行する。
【００１２】
同様に、図１には示していないが、前記ヒーター部は、スライドチップ２とステージ４の間に配置される。また、前記ヒーター部は、温度コントローラ９に接続されてコンピュータ１０の指示に従って温度コントローラ９によって温度が調節される。
【００１３】
前記コンピュータ１０は、一般的なコンピュータに具備される構成要素を含む。図１には示していないが、例えば、前記コンピュータ１０に具備される構成要素は、コンピュータ１０の各部を総括して制御する主制御部であるＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）１１と、前記ＣＰＵ１１における制御の基礎となる種々のプログラム等や表示されるべき画像データ等のファイルを記憶するメモリ１２と、前記ＣＰＵ１１により実行された結果等を一時的に格納するためのＲＡＭ（ｒａｎｄｏｍ　ａｃｃｅｓｓ　ｍｅｍｏｒｙ）１３と、プログラム等に基づく前記ＣＰＵ１１の指示に従ってそこにおいて画像データを生成する画像処理部１４と、前記コンピュータ１０にオペレーター、例えば、人間が情報を入力するためのキーボードおよびマウス等の入力部１５と、前記コンピュータ１０の指示により情報を表示する表示部１６とを少なくとも具備する。
【００１４】
また、ＣＣＤカメラ５により撮像された情報は、画像処理部１４に送られ、メモリ１２に記憶される解析プログラムに従いＣＰＵ１１の指示に従って画像処理部１４で処理されて蛍光強度として数値化される。
【００１５】
本発明で使用できるコンピュータは、一般的に使用される何れの電子コンピュータであってよい。
【００１６】
本発明で使用できる顕微鏡は、一般的に使用される蛍光顕微鏡であればよく、例えば、オリンパス社蛍光顕微鏡ＡＸ−７０またはＢＸ−４２ＴＦＲ等であってよいが、これに限られるものではない。以上の説明では、検出に用いる光学系に顕微鏡を用いた場合について説明を行ったが、本発明に適用できる光学系は、顕微鏡の光学系に制限されていないは言うまでもない。
【００１７】
本発明で使用できるＣＣＤカメラは一般的に使用されるＣＣＤカメラであればよく、例えば、一般的なデジタルカメラ、例えば、コダック社のＭｅｇａＰｌｕｓ　ＣＣＤカメラ、ローバー社のＣｏｏｌ　Ｓｎａｐ　ｃｆ　ｍｏｎｏ等のカメラ等であるが、これに限られるものではない。
【００１８】
また、ここで該ＤＮＡマイクロアレイ２２の温度を調節するための温度調節部は、該ＤＮＡマイクロアレイ２２を具備するスライドチップ２に直接的または間接的接触して熱を伝えるための加熱体（例えば、電熱ヒーター、電磁ヒーター、ウォーターバス、エアーバスおよびペルチエ素子等）、そこにおける温度を感知するセンサー、およびコンピュータの制御と前記センサーからの情報に従って加熱体における加熱を制御する温度コントローラを含み得る。
【００１９】
また更に、前記コンピュータに対して、総合デジタル通信網（以下、ＩＳＤＮと称する）への接続またはモデムを経由した電話回線、ＬＡＮへの接続がなされてもよい。
【００２０】
また、上述の態様に具備されるステージ４は、上述の通り、ＸＹステージコントローラ７により、ＸＹ移動が可能であるが、視野の変更は、このようなステージ側の移動に限らず、ＣＣＤカメラ５自身によって、或いはＣＣＤカメラ５とマイクロアレイ２２を繋ぐ光路を変更させるような種々のスキャニング機構を用いて行ってもよい。
【００２１】
以上の説明では、本発明で用いる検出器はＣＣＤカメラを例にとって説明したが、用いることのできる検出器は、目的によりＣＣＤカメラに限らず、フォトマルチプライヤー等を使用することが可能である。ただし、図２に開口部２２で示されるような１つの反応領域を同時に検出可能であることにより、ＣＣＤカメラが効果的である。
【００２２】
２．ＤＮＡマイクロアレイを具備するスライドチップ
本発明において使用されるＤＮＡマイクロアレイ２２の１態様を図２（Ａ）および（Ｂ）に示す。図２（Ａ）は、そこにおいて反応を行うＤＮＡマイクロアレイ２２を４つ具備するスライドチップ２の平面図である。図２（Ｂ）は、スライドチップ２の断面図である。
【００２３】
図２（Ｂ）に示すスライドチップ２は、多孔質体であるマイクロチャネル２４を具備するフィルタ１９と、フィルタ１９を支持するための支持板２０とを具備する。支持板２０は、２つの部材からなり、２つの部材がフィルタ１９を挟み込みスライドチップ２を構成する。図２（Ｂ）に従うと、フィルタ１９の上下に位置する支持板部材には、対面する各位置に、ＤＮＡマイクロアレイ２２を規定するための開口部２１が形成されている。
【００２４】
また、図２（Ｂ）に示されるように、フィルタ１９は、４つのＤＮＡマイクロアレイ２２の全てを含む大きな面積に亘って、二次元的に平坦に２つの支持板２０の間に位置する。また、支持板２０は、好ましくは遮光性のある部材により構成され、より好ましくは暗黒色の部材により構成される。好ましくは、２つの支持板２０は、フィルタ１９を間に挟んだ状態で接合される。
【００２５】
フィルタ１９の材質は、そこにおいて実施され得る温度制御の範囲内で壊れなければ、何れの任意の材質であってもよい。
【００２６】
「ＤＮＡマイクロアレイ」２２は、支持板２０に形成された開口部２１から露出するフィルタ１９の部分をいう。
【００２７】
該図２（Ｃ）および（Ｄ）では略円形の領域が示されているが、プローブスポット２３の輪郭は、略円形、略矩形または多角形であってもよい。
【００２８】
所望に応じて、複数のプローブスポット２３に対して同じプローブを固定してもよい。また、多孔質体に表面処理を施し、流体への摩擦抵抗やプローブ等の試薬の吸着性を調節してもよい。
【００２９】
本スライドチップの大きさは０．５〜２０．０ｃｍ×０．５〜２０．０ｃｍ×０．０１〜１．０ｃｍ、好ましくは１．０〜１０．０ｃｍ×１．０〜１０．０ｃｍ×０．０５〜０．５ｃｍである。特に好ましくは、３．０〜８．０ｃｍ×３．０〜８．０ｃｍ×０．０５〜０．２ｃｍである。実際の作成したスライドチップの１例は約７．５ｃｍ×約２．５ｃｍ×約０．１ｃｍである。
【００３０】
本マイクロアレイは、３．０ｍｍ２〜１６ｃｍ２、好ましくは１２．０〜４００ｍｍ２、特に好ましくは２０．０〜１００．０ｍｍ２であり、実際に作成したスライドチップ上の円形なマイクロアレイは直径約６ｍｍ（約２８．３ｍｍ２）である。
【００３１】
本ＤＮＡマイクロアレイに含まれるプローブスポットは直径１００〜３００μｍであり、好ましくは１２０μｍであり、１ＤＮＡマイクロアレイ当たり１０〜１０００、好ましくは４００のプローブスポットが具備される。以下に説明する核酸プローブは、プローブスポット毎に異なる種類のプローブを固定することも可能である。
【００３２】
本発明において使用するのに好ましいＤＮＡマイクロアレイの例は、例えば、特表２０００−５１５２５１号に記載のデバイス、特表平９−５０４８６４に記載の微細加工フロースルー多孔性装置であってよい。
【００３３】
また、図２には例えばＤＮＡマイクロアレイ２２を４つ具備するスライドチップ２を示したが、４以上としてもそれ以下としてもよい。本明細書では、１つの好ましい態様として４つのＤＮＡマイクロアレイ２２を具備するスライドチップ２について説明するが、これに限られるものではなく、また、その変更に伴い他の装置の構成および実行の際の手順が変更されることは当業者には明白であり、そのような変更も本発明の範囲に含まれるものである。
【００３４】
このように、４つのＤＮＡマイクロアレイ２２を具備するスライドチップ２を使用した場合、夫々のＤＮＡマイクロアレイ毎に異なる検体について検査してもよく、または１枚のチップ中で１つの検体について異なる４つの種類の解析、例えば、癌遺伝子の突然変異、発現解析、薬剤耐性遺伝子、および細胞内シグナル遺伝子の発現パターンの決定等を実施してもよい。
【００３５】
また、プローブスポットの配置密度、配置パターン、プローブスポットの直径等の大きさは、適宜変更できる。
【００３６】
上述した態様では、フィルタ１９の外観は、２次元的な広がりを有した平面を有し、且つ該平面に垂直な方向に一定の厚みを有した扁平な部材であるが、種々の多孔質体を適用することが可能である。例えば、その扁平な部材に対して垂直に、且つ直線的に貫通しその両端が開放されたキャピラリーが密に並列されて一体化された形態を有するものも使用することが可能である。また、例えば、該キャピラリーが、該扁平な部材に対して垂直に配置されず、例えば、所望の角度で直線的に貫通していてもよく、或いは非直線的（即ち、曲線状の）孔として配置されてもよい。また、ＤＮＡマイクロアレイ毎またはプローブスポット毎に、該キャピラリーの該扁平部材への角度が異なっていてもよく、曲線または直線の選択がなされてもよい。
【００３７】
さらに、上述した態様では、フィルタ１９を例にとって説明したが、フィルタのような多孔質体だけでなく、スライドグラス等の非多孔質体の表面にプローブスポットを有する場合にも適用可能である。しかしながら、種々の多孔質体を適用すると、ポンプにより液体を移動させ反応を促進する効果が高いので、より好ましい。
【００３８】
ここで使用される「核酸プローブ」の語は、一般的に、約１０ヌクレオチド以上約１００ヌクレオチド以下の核酸からなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであり、一般的にハイブリダイゼーションにより核酸を検出する場合に使用される核酸プローブを示す。
【００３９】
例えば、Ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ等の癌遺伝子や、癌抑制遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドであっても、疾患関連または感受性遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドであっても、多型部位を含む配列に対応するオリゴヌクレオチドであっても、何れの所望する核酸をプローブとして使用することが可能である。
【００４０】
また更に、解析の対象となる遺伝子の他に、試料の定常状態を測定するためのβグロブリンやアクチンなどのハウスキーピング遺伝子に対するプローブを使用してもよい。このようなハウスキーピング遺伝子の量を細胞内の基準的な遺伝子量として、実際の癌遺伝子や、癌抑制遺伝子または薬剤耐性遺伝子の発現量を測定してもよい。このようにすれば、より正確な細胞内の遺伝子発現量を測定することが可能である。
【００４１】
ここで使用される「標的核酸」の語は、試料に含まれる検出されるべき核酸を示す。
【００４２】
本発明の態様に従うと、上述したＤＮＡマイクロアレイ２２を配置したスライドチップ２を用いて分析を行う場合、このようなスライドチップ２には、複数のＤＮＡマイクロアレイ２２が含まれる。
【００４３】
例えば、プローブスポット毎に条件を変えれば（例えば、固定するプローブの種類を変更したり、表面処理を変更する等）、微小な１つのＤＮＡマイクロアレイ中で非常に多くの情報を充分な感度で得ることができる。また、ＤＮＡマイクロアレイ毎に温度制御や、測定データの解析を行えるので、小型の装置において多項目の反応結果を迅速に得ることができる。また、プローブスポット毎に温度制御したり、測定データを解析してもよく、その場合、更に、多項目の反応結果を迅速に得ることが可能である。
【００４４】
上述した本発明の態様では、多孔質体にプローブが固定された例を示したが、該プローブは必ずしも固定される必要はなく、多孔質体に試薬を固定しないで行う反応系に対しても、本発明は適用することが可能である。その場合、該プローブを固定化しないこと以外は、上述の態様と同様である。この場合、「プローブスポット」は「反応スポット」と称することも可能であるが、ここでは「反応スポット」はプローブスポットの１態様として包含され説明される。また、このような装置も本発明の範囲に含まれる。
【００４５】
３．ソフトウェア
前記メモリ１２には、ＣＰＵ１１を介して本装置を制御するためのプログラム、ＣＰＵ１１により検索されて制御および判断の根拠となるデーブル等の情報、並びに、得られた結果を表示する場合に利用される画像データ等が記憶される。
【００４６】
例えば、解析プログラムは、遺伝子解析を実施するためのプログラムであり、当該解析をコンピュータによって処理させるための仕事の手順に関する命令を含んでよい。
【００４７】
例えば、反応進行プログラムは、ＤＮＡマイクロアレイ２２において行うべき反応をコンピュータによって処理させるための仕事の手順に関する命令を含んでよい。反応進行プログラムには、反応、即ち、ハイブリダイゼーションに必要な試薬の選択、使用する試薬の量、反応時間および反応温度等の反応条件、ポンピングの回数および時間、ポンピング開始時期の液体輸送および撹拌条件等に関する命令が予め含まれてもよく、或いは解析開始時にオペレーターにこれらの情報を入力するように指示する命令が含まれてもよい。また、これらの反応の条件に関しては反応条件プログラムとして反応の手順とは異なるプログラムとしてメモリ１２に記憶させてもよい。
【００４８】
上記のプログラムは本装置を制御するためのプログラムの例であるが、それ以外の必要なプログラムをメモリ１２に記憶させてもよい。
【００４９】
例えば、遺伝子対応テーブルは、得られた蛍光強度と、反応条件と、遺伝子発現量、発現遺伝子および遺伝子の突然変異等との関連付けを明記する表であってもよい。
【００５０】
４．装置の作用
図３に示したフローチャートを用いて上述した本態様の作用を説明する。
【００５１】
（Ｓ１）オペレーターが、ステージ４上にヒーター部と接触するようにスライドチップ２をセットし、前記スライドチップ２の各ＤＮＡマイクロアレイ２２に対してジョイント部を接続する。
【００５２】
（Ｓ２）オペレーターが入力部１５に入力して、本装置に対して解析開始の指示が出される。このときオペレーターは反応の条件に関する情報を入力するが、これらの情報は、ＲＡＭ１３に格納される。
【００５３】
（Ｓ３）オペレータにより解析開始の指示が出されると、ＣＰＵ１１は、予め設定されメモリ１２に記憶された座標とメモリ１２に記憶された解析プログラムに従って、ＸＹステージコントローラ７に対して、４つのＤＮＡマイクロアレイ２２の中で未解析で且つ認識番号の小さいＤＮＡマイクロアレイ２２がＣＣＤカメラ５の視野に入る位置にように指示し、指示されたＸＹステージコントローラ７がモータドライバ６を駆動して、ＸＹステージ４が動かされる。ここで、使用されるスライドチップ２におけるＤＮＡマイクロアレイの数と、夫々に対応する認識番号と、それが位置する座標とは、それらが対応付けられたテーブルとしてメモリ１２に記憶されている。従って、ＣＰＵ１１は、未解析のＤＮＡマイクロアレイ２２のうちで認識番号の最も若いものを選択し、前記テーブルを検索することにより、目的とするＤＮＡマイクロアレイ２２の座標を読み出し、それを基に指示を出す。
【００５４】
（Ｓ４）目的のＤＮＡマイクロアレイ２２がＣＣＤカメラ５の視野に入る位置に配置されると、ＣＰＵ１１は、メモリ１２に記憶された反応進行プログラムに従って指示を出し、ポンプドライバ８および温度コントローラ９を制御して、複数の反応を繰り返し実行させる。ＣＰＵ１１は、メモリ１２に記憶された反応進行プログラムに従って、各反応の終了毎にＣＣＤカメラ５に指示を出し、撮像を実行させる。（Ｓ４）については更に詳しく後述する。
【００５５】
（Ｓ５）Ｓ４におけるＣＣＤカメラ５による撮像がなされる毎に、ＣＰＵ１１は、得られた画像情報を画像処理部１４からＲＡＭ１３に転送させ一旦格納させる。
【００５６】
（Ｓ６）ＣＰＵ１１は、直前のＳ３で選択され反応に供されたＤＮＡマイクロアレイ２２の認識番号をＲＡＭ１３から読み出し、それを基にスライドチップ２に具備される４つのＤＮＡマイクロアレイ２２に未解析のものが残っているか否かを判断する。未解析のＤＮＡマイクロアレイ２２がある場合には（Ｓ３）へ進み、そうでない場合には（Ｓ７）に進む。
【００５７】
（Ｓ７）ＣＰＵ１１は、解析プログラムに基づいて（Ｓ５）でＲＡＭ１３に格納された画像情報を読み出し、該情報から蛍光強度を算出する。得られた蛍光強度とその蛍光強度を得たときの反応条件を基に、ＣＰＵ１１は、遺伝子対応テーブルを検索し、対応する遺伝子情報を読み出す。これらのデータから、ＣＰＵ１１は、画像処理部１４に遺伝子解析結果のテーブルを作製させ、算出された蛍光強度反応条件と遺伝子対応テーブルそのデータを画像処理部１４に送り、そこにおいて、結果のテーブルを作製させ、このテーブルをＲＡＭ１３に記憶させる。
【００５８】
（Ｓ８）ＣＰＵ１１は、画像処理部１４に対して、ＲＡＭ１３に記憶させた遺伝子解析結果のテーブルの画像を表示するように指示する。これにより画像処理部１４はＲＡＭから必要な情報を読み出して画像処理し、表示装置に表示する。
【００５９】
上述では、Ｓ２においてオペレーターが入力する反応条件に関する情報は、反応温度、反応時間、反応回数および試薬の選択等であってよい。または、これらの情報は、Ｓ２においてオペレーターにより入力されるのではなく、予めメモリ１２に記憶された反応進行プログラムまたは反応条件プログラムに含まれていてもよい。
【００６０】
また、上述の手順では、各ＤＮＡマイクロアレイ２２毎に解析を行う例を示したが、全てのＤＮＡマイクロアレイ２２に関して同時に解析を行ってもよい。また、上記では解析されるＤＮＡマイクロアレイ２２は、予め割り当てられた認識番号の順に自動的に選択される場合を記載したが、解析毎に、オペレーターが解析を実行するＤＮＡマイクロアレイ２２を選択し入力部１５から入力してもよい。
【００６１】
また、該コンピュータに対してＩＳＤＮまたはＬＡＮ、電話回線への接続を行えば、当該解析により得られた結果を、所望のゲノムデータベースまたは塩基配列データベースを検索して得られた情報と比較することも可能である。この手順は、メモリ１２に記憶された比較プログラムを基にＣＰＵ１１がデータベースを検索し、装置により得られた結果と比較し、同定するように設定してもよい。
【００６２】
５．ＤＮＡマイクロアレイにおける反応
上記（Ｓ４）における反応について、図４を用いて更に説明する。
【００６３】
（Ｓ４１）目的のＤＮＡマイクロアレイ２２がＣＣＤカメラ５の視野に入る位置に配置されると、ＣＰＵ１１は、メモリ１２に記憶された反応進行プログラムに従って、温度コントローラ９に指示を出しヒーター部を制御させることにより、目的のＤＮＡマイクロアレイ２２の温度を所定の第１の温度に維持する。更に、ＣＰＵ１１は、前記反応進行プログラムに従って、ポンプドライバ８に指示を出し、試料を目的のＤＮＡマイクロアレイ２２に添加させ、ポンピングにより撹拌を実行しながら、反応を実施させる。
【００６４】
（Ｓ４２）メモリ１２に記憶された反応進行プログラムに従って、所定の反応時間に亘って反応が実施された後、ＣＰＵ１１は、前記反応進行プログラムに従って、ポンプドライバ８に指示を出し、試料を目的のＤＮＡマイクロアレイ２２から一次退避させ、ＣＣＤカメラ５に撮像を実行させる。
【００６５】
（Ｓ４３）ＣＣＤカメラ５の撮像の終了後、ＣＰＵ１１は、前記反応進行プログラムに従って、ポンプドライバ８に指示を出し（Ｓ４２）において一次退避された試料を再びＤＮＡマイクロアレイ２２に添加させる。このとき、撹拌作用も機能している。
【００６６】
（Ｓ４４）ＣＰＵ１１は、前記反応進行プログラムと（Ｓ１）においてオペレーターにより入力されＲＡＭ１３に格納された条件を読み出し、更なる温度設定および／または溶媒組成等を変更した更なる反応条件下で反応を行う必要があるか否かを判断する。必要であれば（Ｓ４１）に進み、不要であれば（Ｓ５）へ進む。
【００６７】
６．解析対象および前処理
本発明の装置により実施可能な解析の例は、被験者における癌遺伝子等の突然変異の有無の検出、被験者における遺伝子の発現解析、薬剤耐性遺伝子の発現解析、被験者における疾患関連または感受性遺伝子の遺伝子型決定、被験者における細胞内シグナル遺伝子の発現パターンの決定等、臨床的な治療学的および診断学的解析、並びに非臨床的な基礎研究においても種々の遺伝子解析等である。
【００６８】
一般的に、遺伝子検査に用いるサンプルは、ヒトの場合、血液、培養細胞、生検または手術時に採取された細胞または組織等の生体組織等が使用できる。
【００６９】
例えば、内視鏡的に採取された組織切片の場合、該組織切片をスライドガラス上に固定し、染色し、病理検査を行った後のスライドグラスから、マイクロダイセクションシステムであるレーザーキャプチャーシステム、オリンパス社製ＬＣＳ２００によって癌病巣部分の組織の部分のみを採取したものを使用することができる。
【００７０】
本装置による解析に先駆けて、このようにして得られた生体サンプルは、フェノール・クロロホルム法、マイクロカラム法、または磁性粒子法等を利用した核酸抽出試薬によって処理し、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを抽出する。更に、抽出されたＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、例えば、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、Ｔ７増幅法等によって遺伝子増幅を行う。しかしながら、核酸量の多いサンプルの場合には、遺伝子増幅を行うことなくｃＤＮＡを調製すればよい。但し、何れの場合においても、プライマーの５’端か、合成されたヌクレオチドのどこかに標識物質、例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ３およびＣｙ５等、蛍光標識物質の何れかが付加されるように試薬組成を最適化することが好ましい。
【００７１】
このような解析に使用する試料の調製は、例えば、「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」（細胞工学別冊；ゲノムサイエンスシリーズ１、秀潤社、２０００年３月１６日発行）等に記載されるように、一般的にそれ自身公知の方法により行ってよい。
【００７２】
上記の蛍光標識を行った後、ピペットによってオペレーターが手動で得られた調製済みの試料をＤＮＡマイクロアレイに分注してもよい。その後、上述のような装置により、解析を行えばよい。
【００７３】
７．解析方法
以上のように我々は、短時間に高効率のハイブリダイゼーションを行うことが期待できる三次元ＤＮＡマイクロアレイを反応部に用いて、溶液制御用のポンプ、温度調節用の温調システム、高感度な蛍光検出装置とコンピューターによって制御する撮像デバイスを組み合わせた遺伝子検査システムを発明した。
【００７４】
このようなシステムにより実施される遺伝子解析方法も本発明の範囲に含まれる。図５のフローチャートを用いて本発明の方法を説明する。
【００７５】
（Ｓａ）先ず、試料を調製する。被験対象から採取した組織または細胞から核酸を、例えば、フェノール・クロロホルム法などにより抽出する。
【００７６】
（Ｓｂ）（Ｓａ）で得られた核酸を、例えば、ＰＣＲ法またはＮＡＳＢＡ法等により増幅し、且つ蛍光標識を行う。また、核酸の量が多い場合には、蛍光標識のみ行う。
【００７７】
（Ｓｃ）（Ｓｂ）で得られた蛍光標識された核酸を、スピンカラム法またはエタノール沈殿法などにより精製する。
【００７８】
（Ｓｄ）（Ｓｃ）で得られた核酸を変性により１本鎖標識核酸にする。その後、核酸プローブを固定化したＤＮＡマイクロアレイに、得られた１本鎖標識核酸を添加する。
【００７９】
（Ｓｅ）試料を含有するＤＮＡマイクロアレイについて、所望の条件下でハイブリダイゼーションを行う。このとき、ＤＮＡマイクロアレイ中の液体をポンピングまたはピペッティング等により撹拌することが好ましい。
【００８０】
（Ｓｆ）（Ｓｅ）でのハイブリダイゼーションを行った後、ＤＮＡマイクロアレイ中の液体を、該アレイの下部に留め、核酸プローブに結合した標識核酸に含まれる蛍光強度を測定する。
【００８１】
（Ｓｇ）（Ｓｆ）における蛍光強度の測定が終了した後、所望の反応条件下で、再度ハイブリダイゼーションを行い、上記同様、蛍光強度を測定する。種々の反応条件下でこの操作を必要な回数だけ繰り返す。
【００８２】
（Ｓｈ）（Ｓｇ）の反応が終了した後に、ＤＮＡマイクロアレイ中の試料をそのままの状態を維持しながら、即ち、希釈または不純物等のコンタミネーションのないように、回収し、その後、前記核酸プローブに結合した標識核酸に含まれる蛍光強度を測定する。
【００８３】
（Ｓｉ）（Ｓｆ）および（Ｓｈ）で得られた蛍光強度を基に、発現遺伝子量の判定および突然変異遺伝子の有無等の判定を行い、目的の遺伝子に関する情報を得る。
【００８４】
（Ｓｊ）（Ｓｉ）で得られた目的の遺伝子に関する情報を、データベースに開示される公知の遺伝子情報や、標準試料から得られた解析結果と比較する。
【００８５】
（Ｓｋ）（Ｓｊ）の比較の結果から、被検対象からの試料に関する遺伝子解析についての判定を行う。
【００８６】
ここでは、２つの反応条件を用いて２つの反応を連続して行ったが、必要に応じて、連続する反応の回数および蛍光強度の測定回数を増やすことも可能である。その場合、上記（Ｓｆ）から（Ｓｇ）を必要な回数で繰り返せばよい。
【００８７】
本発明の態様として上述した装置は、ステージに置かれた反応要素（即ち、スライドチップ）に対して液体の分注、撹拌、温度制御および測定を常時実行できる構成になっているので、あらゆる種類の反応系を小さなスペースで容易に達成できる。従って、本発明の装置は、あらゆる遺伝学的検査に有用な優れた手段となり得る。
【００８８】
また、本発明に従いＣＣＤカメラを検出器に用いた場合は、少なくとも１個のＤＮＡマイクロアレイは、充分にＣＣＤカメラの撮像可能な範囲に収まる程に小型であるので、測定すべきＤＮＡマイクロアレイ内の複数の別々のプローブスポットに対して、光学的なスキャニングを行う必要はない。このことにより、同一のＤＮＡマイクロアレイ内の各スポットの反応を同時に且つ継続的にモニタリングすることが可能となり、多項目の同時検査に非常に有利である。
【００８９】
本発明の更なる側面に従うと、本発明は、同一の試料に対して複数の検査を連続して行うことが可能であり、従って、複数の検査結果を迅速にまたは任意の時機に得ることが可能な装置を提供するものである。
【００９０】
本発明に従うと、このような測定装置において、プローブスポット毎に適用された各々の試薬（例えば、核酸プローブおよび核酸プライマー等）の種類または各々の反応条件を、各試薬毎または各反応条件毎に得た各々の測定データと照合しながら測定データの解析を行う解析用ソフトウエアも提供される。
【００９１】
また特に、本発明に従う装置では、同一のプローブスポットにおいて、複数種類の反応を同時、逐次、または順次に実行することが可能である。従って、そのような複数種類の反応を達成するために必要な反応条件を容易に整えること、およびそのような複数種類の反応により得られた複数のデータを正確に読み取り且つ処理することを可能にする新規な読み取り手段を、本発明に従う装置が具備していてもよい。
【００９２】
例えば、そのような読み取り手段は以下を実行するような手段であり得る；
ｉ）　１つのＤＮＡマイクロアレイにおいて測定されるべきプローブスポットの位置情報とそのプローブスポットへの制御情報（例えば、試薬毎の好適温度、検査目的など）とを組み合わせてなる検査項目情報を、メモリ回路等の記憶手段に記憶すること、
ｉｉ）　実際に前記ＤＮＡマイクロアレイ内の全てのスポットにおいて実施された制御をモニタリングし、そのモニタリングされた実際の制御条件と、前記　ｉ）　の検査項目情報とを照合し、その照合結果をメモリ回路等の記憶手段に記憶すること、および
ｉｉｉ）　前記　ｉｉ）　のモニタリングされた制御条件下で行われた測定結果を、前記ｉｉ）　で得られた照合結果と対応付けた測定データとしてメモリ回路等の記憶手段に記憶すること、または
ｉｖ）　前記　ｉｉ）　のモニタリングされた制御条件下で行われた測定結果を、前記　ｉｉ）　で得られた照合結果と対応付け、更に、ＣＰＵ等のデータ処理手段によって、前記測定結果を前記照合を基に補正するような演算処理を行うこと。
【００９３】
従って、そのような読み取り手段は、該検査項目情報、モニタリングされた制御条件、測定結果および測定データ等のデータを記憶するための記憶手段と、前記記憶手段に記憶された各データを読み出して比較および照合を行ったり、必要な演算処理するためのＣＰＵ等のデータ処理手段とを具備する。
【００９４】
また、このような新規な読み取り手段自体も、そのような読み取り手段を具備した装置も、本発明の態様として提供される。
【００９５】
係る読み取り手段によれば、同一のＣＣＤ視野内の全てのスポットについて、複数のスポット間で全部または一部の反応が時間的に重複するような異なる種類の反応結果や、少なくとも１つのスポットにて実行される複数の異なる反応条件での反応結果を、取り違えることなく記憶し、取り出して、所望の判定結果を出力することが可能である。
【００９６】
以上、本発明の実施の形態を詳細に説明したが、上述した詳細な説明および図面は、本発明の態様を例示することを目的とするものであり、従って、それらによってに本発明は限定されるものではなく、本発明は、種々の均等物および現在の自明な技術知識に基づく、種々の改良された発明または変形された発明を包含するものである。
【００９７】
【実施例】
１．遺伝子解析
図１に示すような本発明の態様を用いて遺伝子解析を行う。
【００９８】
遺伝子を測定する容器として、検査対象であるターゲット遺伝子と相補性を有する複数の遺伝子を表面に固定化した多孔質のフィルターを収めたチップを用いる。この多孔質のフィルターを収めたスライドチップを、蛍光顕微鏡のステージに置かれた反応部分（インキュベーター部分）に設置する。この蛍光顕微鏡は、ホストコンピュータによって、励起光シャッター、蛍光キューブ、ステージ移動などを自動的に制御することが出来るように構成されている。また、蛍光顕微鏡にはＣＣＤなどの画像を撮影するデバイスが設置されていて、撮影のタイミングもホストコンピュータによって制御されている。また、露出時間、画像の保存、冷却状態などの制御も、同じコンピュータによって制御することが出来る。また、インキュベーターには、液体を輸送するためのポンプ、および温度制御用のヒーターかベルチエ素子が設けられていて、これらの制御もまたホストコンピューターによって行うことができる。
【００９９】
サンプルをチップの測定領域に滴下したあと、ポンプによって反応液を移動させてハイブリダイゼーション反応を加速する。インキュベーターの下部の溶液を移動させ、反応液の液面がフィルターの上面に接した時に励起光シャッターを開けてフィルター表面の蛍光画像をＣＣＤカメラなどのデバイスによって撮影する。撮影された画像データは、コンピュータの指定されたフォルダー中に保存され、別にインストールされた解析用のプログラムによって測定結果を解析する。
【０１００】
このように、ハイブリダイゼーションを促進するためのポンプ、温度変化をチップに与えるためのヒーター、更に、必要に応じて、溶液組成を変化させるピペッターシステムをインキュベーターの周囲に配置することによって、この一個の検査システムによって連続して様々な温度や溶液状態におけるハイブリダイゼーションのパターンを得ることができる。また、測定に用いる蛍光標識の種類に応じて異なる波長によって励起し、異なる蛍光波長の画像を撮影することが出来るので、試料の中に複数の蛍光色素によって標識された物質が入っている場合でも、フィルターキューブを自動的に切り替えることにより、例えば、２色の蛍光強度比などを簡単に測定することができる。このようにして得られたスポットの蛍光強度から、チップ表面に固定化されたプローブとハイブリダイゼーションしたターゲット遺伝子の量を解析する。この検査装置を用いることによって、Ｃ−ｍｙｃ等の癌化に従って、発現量が大きく変動する遺伝子の発現量を鋭敏に検出することが出来る。
【０１０１】
また、インキュベーターの温度変化によって生じる蛍光スポットの蛍光強度変化のパターンを解析することにより、Ｋ−Ｒａｓ、Ｐ５３といった癌化に大きな影響のある遺伝子の突然変異を検出することができる。このようにして細胞内部で複雑な細胞機能を制御している遺伝子の発現量と、遺伝子の内部に生じた突然変異という２つの生理学的に重要な遺伝子の変異を短時間のうちに同一の装置によって解析することが可能となる。また、ここで、用いられるサンプルの調製方法は、従来の遺伝子検査で用いられているものと同様であり、この装置によって得られた結果は、インターネット上で公開されているＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースにある遺伝子情報と容易に比較検討することが出来る。
【０１０２】
このような本発明の態様に従う装置を用いることによって、反応部分の溶液の状態や、温度条件を変化させながらターゲット遺伝子のハイブリダイゼーションの程度をリアルタイムで測定することができる。このような装置を用いることによって、反応部分の溶液の状態や、温度条件を変化させながらターゲット遺伝子のハイブリダイゼーションの程度をリアルタイムで測定することができるようになった。この発明を用いることによって、対象遺伝子の発現量を正確に測定することが出来るようになった。また、発現量の測定に引き続いて、自動的にマイクロアレイの温度や反応溶液の溶液組成を変化させることによって、異なるプローブへのハイブリダイゼーションの効率を強制的に変化させ、その結果から、ターゲット遺伝子内に生じている突然変異、例えば、一塩基多型（以下、ＳＮＰと称す；Ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等の種類を検出することが出来る。このシステムを用いることによって、癌などの進展の程度や悪性度、或いは転移の可能性、疾病のステージなどがより正確に予測できることが期待される。
【０１０３】
また、同時に治療薬に対する感受性に影響するＰ４５０などの薬剤感受性遺伝子の発現量と、活性に影響ある　ＳＮＰｓ　の検査も同時に行うことが出来る。このようにして疾患の原因遺伝子の異常のみならず、薬剤に対して感受性のある遺伝子のの異常を同時に検査することで、選択する治療薬の種類や温度を患者の体質に合わせて最適化することが可能になる。また、得られた遺伝子異常に関する情報を元にして、将来的に高い治療効果が期待されている遺伝子治療に用いる遺伝子の選択が正確に行える。
【０１０４】
２．Ｃ−ｍｙｃ、エストロゲンレセプター、テロメラーゼの発現量の測定
Ｃ−ｍｙｃ、エストロゲンレセプター、テロメラーゼの発現量の測定をおこなうためのスライドチップを図６に示す。該スライドチップには、図６（Ａ）に示されるようなｃ−ｍｙｃを含む複数の遺伝子に対するプローブと、ハウスキーピング遺伝子が固定される。図６（Ｂ１）には、ＤＮＡマイクロアレイに含まれるプローブスポットに固定された図６（Ａ）の核酸プローブの固定位置を模式的に示したものである。夫々の種類の核酸プローブは、種類毎にプローブスポットに固定されている。図６（Ｂ２）および（Ｂ３）は解析結果を模式的に示した図である。図６（Ｂ２）は正常な被験者からの試料により得られる結果を示し、（Ｂ３）には異常のある被験者からの試料により得られる結果を示す。このような結果から蛍光の有無を判定することにより、被験者において発現された遺伝子を検出することが可能である。
【０１０５】
このようなスライドチップを使用し、発現解析を行ったチップの周囲温度や溶液組成を変更することにより、または試料中の標識核酸とプローブ近傍の温度をＴＭ（Ｍｅｌｔｉｎｇ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値に近い条件にすることによって、各プローブの至適反応条件が達成され、それによりこれらの遺伝子の内部に生じた突然変異の解析を行うことが可能である。
【０１０６】
図７には、異なる塩基配列を有するプローブに対して生じた蛍光スポット強度の比較を行うことにより、癌抑制遺伝子Ｐ５３の遺伝子内部に生じた突然変異を検出する場合の例を示した。蛍光強度の違いによって、発現量を検出することが可能である。
【０１０７】
以上のような遺伝子の検出と発現量の解析は、１つのＤＮＡマイクロアレイにおいて１つの試料について連続して行うことが可能である。
【０１０８】
このように発明の装置および方法により、癌化のステージを判定したり、悪性度や転移のし易さ、または薬剤耐性の個人差などを正確に予測することが可能である。
【０１０９】
遺伝子検査技術とコンピュータ科学の進展に伴い、現在までにすでに多くの遺伝子の異常としての発現量の変化や突然変異の種類、またはＳＮＰｓが同定されている。そしてそれらの公知の情報は、データベースとしてインターネット上で広く公開され、容易に入手が可能である。上述のように、本発明の装置および方法により得られた遺伝子検査の結果を、既に公知の情報と比較評価することにより、更に臨床的に有用な正確な判定が可能となる。例えば、アメリカ癌研究所（ＮＣＩ）により標準化された正確な転移の予測や治療指針の決定を行うことが可能になり、国や施設による判定基準の違いなどから生じる誤判定の可能性を少なくできる。将来的には、遺伝子治療を行う場合の導入遺伝子の選択においても、重要な情報を提供することが期待される。
【０１１０】
８．補足：装置の制御系と操作の手順
遺伝子検査装置１の制御ブロックを図８に示す。
【０１１１】
図８に示されるように、遺伝子検査装置１は、制御部１０ａとカメラコントローラ１０ｂと顕微鏡コントローラ１０ｃとを含んでおり、これらはコンピューター１０に相当している。また、遺伝子検査装置１は、前述したように、（好適には冷却型の）ＣＣＤカメラ５と、ステージ４と、ステージコントローラ７と、温度コントローラ９と、入力部１５と、表示部１６を有している。ステージ４はそれを駆動するためのモータ４ａを含んでいる。
【０１１２】
遺伝子検査装置１は更に、蛍光観察用の顕微鏡３内に含まれるミラーユニット３１とシャッタユニット３２と照明ユニット３３とを有し、ＤＮＡマイクロアレイ２２の温度を調節するための温調器を構成する上部ヒーター５１と下部ヒーター５２と冷却ファン５３とを有し、ＤＮＡマイクロアレイ２２を通して液体を移動させるためのポンプ４１とを有している。
【０１１３】
フィルタユニット３１はそれを駆動するためのモータ３１ａを、シャッタユニット３２はそれを駆動するためのモータ３２ａを含んでおり、上部ヒーター５１はその温度を測定するための測温抵抗体５１ａを、下部ヒーター５２はその温度を測定するための測温抵抗体５１ｂを含んでいる。ポンプ４１は、これを駆動制御するためのコントローラ４１ａを含んでいる。ここで、ミラーユニットは、例えば、照射光の中から励起波長帯の光のみを透過させる励起フィルタと、対象物からの蛍光だけを透過させ、励起光を遮断する吸収フィルタと、所定の波長の光に対して、それよりも短い光を反射し、長い波長を透過するダイクロイックミラーとを一体化した構成とすることができる。
【０１１４】
カメラコントローラ１０ｂはＣＣＤカメラ５を制御し、顕微鏡コントローラ１０ｃは、ミラーユニット３１のモータ３１ａやシャッタユニット３２のモータ３２ａや照明ユニット３３を制御する。温度コントローラ９は、上部ヒーター５１を測温抵抗体５１ａからの情報に基づいて制御すると共に、下部ヒーター５２を測温抵抗体５２ａからの情報に基づいて制御し、ステージコントローラ７は、ステージ４のモータ４ａを制御する。
【０１１５】
制御部１０ａは、カメラコントローラ１０ｂと、顕微鏡コントローラ１０ｃと、温度コントローラ９と、ステージコントローラ７と、ポンプ４１のコントローラ４１ａを制御する。更に制御部１０ａは、表示部１６に適当なメッセージや情報を表示させたり、入力部１５から入力される情報を取得したりする。
【０１１６】
遺伝子検査装置１は、専用に設計されたアプリケーションに従って運転される。アプリケーションは、前述した解析プログラムや反応進行プログラムなどの種々のプログラムを含んでおり、装置１の各部を適正に制御すると共に、遺伝子検査装置１の運転中、制御部１０ａに指令を出して、表示部１６に次に必要な操作を表示してユーザーに指示を出したり、表示部１６に測定に関する様々な情報を表示したりする。
【０１１７】
特にアプリケーションは、ポンプ動作指示や撮影指示や遅延時間指示や一定停止指示や温度変更指示や洗浄指示など、装置の各部に対する指示である様々なプロファイルを、入力部１５と表示部１６を利用して、ユーザーが自由に変更できるように装置全体を制御する。つまり、遺伝子検査装置１は、アプリケーションによって、測定に関する各種のパラメータをユーザーが自由に設定できるようにその運転が制御される。そのために、アプリケーションからの指令に従って制御部１０ａは、例えば、表示部１６に情報の入力を促すメッセージを表示させて、入力部１６からの情報入力を待ち受ける。
【０１１８】
遺伝子検査装置１は、例えば図９に示されるフローチャートに示された操作に従って運転される。
【０１１９】
１．装置の電源を入れる。
２．ユーザーログインを行う。このとき、ユーザー名を既存のリストの中から選択するか、あるいはユーザー名を新規に記述して作成する。
３．アプリケーションを起動する。このとき、制御部１０ａは、顕微鏡コントローラ１０ｂやポンプ４１・温調器・ステージコントローラ７・ＣＣＤカメラ５等の接続機器の接続確認と初期化を行う。
【０１２０】
４．給水する。すなわち配管内に水を充満させる。これは、例えば、水を収容した給水用トレイをインキュベータにセットし、インキュベータを装置内に挿入し、ポンプ４１により給水用トレイから水を吸引することにより行われたり、排水用トレイをインキュベータ内にセットし、インキュベータを装置内に挿入し、ポンプ４１により図示しない給水タンクから水を吸引して排水トレイに排出することにより行うことができる。
【０１２１】
５．温調を開始する。インキュベータの温度を指定する。すなわちヒーター５１の目標温度を設定する。
【０１２２】
６．条件を設定する。温度の設定、ミラーユニットの設定、撮影条件の設定、ポンプ動作条件の設定を行う。
【０１２３】
７．プロファイルとサイクルを設定する。ここに、プロファイルは、装置の各部に対する指示であり、ポンプ動作指示や撮影指示や遅延時間指示や一定停止指示や温度変更指示や洗浄指示などを含んでいる。サイクルは、これらのプロファイルの適当な組み合わせで構成される。
【０１２４】
８．シーケンスを設定する。シーケンスは、サイクルの適当な組み合わせで構成され、どのサイクルを、どのような順序で、何回行うかを指定する。シーケンスにより測定の順番が決まる。
９．測定ウエルやファイル名などを設定する。観察するウエルや、そのウエルの画像を保存するフォルダ名、サンプル名、サンプル情報などを設定する。
１０．反応部分（インキュベータ部分）を装置外に排出する。
１１．測定対象であるＤＮＡマイクロアレイを含むカセットをインキュベータ部分にセットする。
【０１２５】
１２．測定対象物をセットしたインキュベータ部分を装置内に挿入する。
１３．先に設定したシーケンスに従って測定する。輝度測定したい個所を指定することによりグラフ表示する。
１４．インキュベータ部分を装置外に排出して、測定の終了したカセットを取り出す。
１５．アプリケーションを終了する。このとき、装置は初期化され、これにより、ポンプは初期状態に戻り、温調器は停止され、インキュベータ部分は原点位置に移動される。
【０１２６】
上述した操作６〜操作８すなわち条件やプロファイルやサイクルやシーケンスの設定は、例えば、表示部１６に入力すべき情報の項目を示した入力画面を表示してユーザーに情報の入力を促し、これに応じてユーザーが画面上の各項目に適切な数値などを入力部１５から入力することにより行われる。
【０１２７】
しかし、操作６〜操作８は、このような手法に限定されるものではなく、他の適当な手法によって行われてもよい。例えば、必要な情報を記録したファイル（データファイル）を予めコンピュータの補助記憶装置、例えばハードディスクやフロッピーディスクなどに保存しておき、測定の際に、ユーザーが入力部１５から情報を入力する代わりに、補助記憶装置からデータファイルを読み出して必要な情報を得ることにより行われてもよい。
【０１２８】
このようなデータファイルは、例えば、ユーザーが前回の測定で使用した設定値などを記録することで作成され得る。あるいは、データファイルは、スライドチップ２のメーカー側が、例えばスライドチップ２の種類毎に適した情報を記録して作成してもよい。この場合、データファイルは、例えば、スライドチップ２に添付するなどの形態でユーザーに供給されるとよい。
【０１２９】
操作７におけるプロファイルの設定では、例えば、以下に示す動作等を指示する。これにより様々な動作に対応できる。
【０１３０】
ａ．ポンプ動作：ポンプを引く（吸引する）か戻す（排出する）かを設定する。このときに駆動させる量と速度とを任意に設定できる。通常、検体を反応させる場合は、ポンプの駆動量は、検体量とほぼ同じ量を設定することが多い。ただし、蛍光を撮影する場合には、ＤＮＡチップ上に検体液が存在すると、ピント位置が移動したり、検体液中の蛍光物質がノイズとなるので好ましくない。そこで、蛍光を撮影するタイミングでは、検体液より、やや多い量を設定することが好ましい。この量は、検体液の粘度やポンプの駆動速度に依存する。検体液の量、粘度、チップのウエルサイズ（チップの種類によりウエルのサイズが違う可能性あり）によりポンプの駆動量を最適値に設定できる。検体液の移動速度により反応状態が異なるため、最適条件で反応させるために、最適なポンプの駆動速度を設定できる。
【０１３１】
ｂ．撮影：撮影に使用するフィルターと露光時間を設定する。検体の標識に使用している蛍光色素に合わせてフィルターを選択し、蛍光を観察するために適した露光時間を任意に設定できる。輝度が低い場合には、露光時間を長く設定することができる。
【０１３２】
ｃ．遅延時間：動作を止める時間を設定する。遅延時間を設定することにより、例えばポンプの駆動では、液がチップしたまたは上にくるまで時間を最適値に設定できる。
【０１３３】
ｄ．一時停止：再開の指示が出るまで、動作を停止させ続ける。
【０１３４】
ｅ．洗浄：未反応の蛍光標識サンプルを除去し、反応した結果以外の余分な蛍光を観察しないようにするために行う。アプリケーションの指示に従い、インキュベータ部分を装置外に出し、ユーザーに洗浄液の滴下を指示する。ポンプを駆動させることにより、洗浄液を上下させチップを洗浄する。以上の作業を手動で行う。洗浄は、必要な場合も、必要でない場合もある。
【０１３５】
ｆ．温度変更：現在の設定温度から、測定の途中で温度を変更したいときに使用する。変更温度、変更温度へ到達してからの待ち時間を設定する。検出する遺伝子により最適な反応温度や反応の温度プログラムがあるため、最適な温度条件を設定できる。
【０１３６】
操作７におけるサイクルの設定では、例えば、以下に示す動作を指示する。これにより様々な動作に対応できる。
【０１３７】
サイクル１：前洗浄
１．洗浄液を滴下する。
２．洗浄液を流動させる
３．洗浄液を吸引して廃棄する。
４．洗浄後のフィルタ画像を撮影する。
５．サンプルを滴下する。
【０１３８】
サイクル２：状況確認
１．サンプル液をフィルタ下に吸引する。
２．撮影する。
３．サンプルをフィルタ上に排出する。
【０１３９】
サイクル３：ポンプ駆動
１．サンプル液をフィルタ下に吸引する。
２．サンプルをフィルタ上に排出する。
【０１４０】
サイクル４：反応結果撮影
１．サンプル液をピペットで取り除く。
２．洗浄液を滴下する。
３．ポンプを駆動する。
４．撮影する。
【０１４１】
上記のサイクル２とサイクル３は反応が終了するまで繰り返す。また、サイクル４中の３と４は条件を変えながら繰り返す。
【０１４２】
操作８におけるシーケンスの設定の一例を下記に示す。
１．サイクル１を１回実行する。
２．サイクル２を１回実行する。
３．サイクル３を２９回実行する。
４．サイクル２を１回実行する。
５．サイクル３を２９回実行する。
６．サイクル２を１回実行する。
７．サイクル３を２９回実行する。
８．サイクル２を１回実行する。
９．サイクル３を２９回実行する。
１０．サイクル２を１回実行する。
１１．サイクル３を２９回実行する。
１２．サイクル２を１回実行する。
１３．サイクル４を２回実行する。
【０１４３】
上述したサイクル１〜サイクル４における各部材レベルの動作を下記に示す。
【０１４４】
サイクル１：前洗浄
１．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ引き、そのまま１秒停止する。
２．５秒そのまま停止する。
３．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ戻し、そのまま１秒停止する。
４．１０秒そのまま停止する。
５．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ引き、そのまま１秒停止する。
６．５秒そのまま停止する。
７．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ戻し、そのまま１秒停止する。
８．１０秒そのまま停止する。
９．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ引き、そのまま１秒停止する。
１０．５秒そのまま停止する。
１１．ＦＩＴＣ用ミラーユニットを用いて露光時間３０００ｍｓで撮影した後、Ｃｙ３用ミラーユニットで同様に撮影する。
１２．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ戻し、そのまま１秒停止する。
１３．３０秒そのまま停止する。
【０１４５】
サイクル２：状況確認
１．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ引き、そのまま１秒停止する。
２．５秒そのまま停止する。
３．ＦＩＴＣ用ミラーユニットを用いて露光時間２００ｍｓで撮影した後、Ｃｙ３用ミラーユニットで同様に撮影する。
４．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ戻し、そのまま１秒停止する。
５．１０秒そのまま停止する。
【０１４６】
サイクル３：ポンプ駆動
１．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ引き、そのまま１秒停止する。
２．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ戻し、そのまま１秒停止する。
３．５秒そのまま停止する。
【０１４７】
サイクル４：反応結果撮影
１．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ引き、そのまま１秒停止する。
２．ＦＩＴＣ用ミラーユニットを用いて露光時間１０００ｍｓで撮影した後、Ｃｙ３用ミラーユニットで同様に撮影する。
３．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ戻し、そのまま１秒停止する。
４．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ引き、そのまま１秒停止する。
５．ＦＩＴＣ用ミラーユニットを用いて露光時間１０００ｍｓで撮影した後、Ｃｙ３用ミラーユニットで同様に撮影する。
６．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ戻し、そのまま１秒停止する。
７．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ引き、そのまま１秒停止する。
【０１４８】
８．ＦＩＴＣ用ミラーユニットを用いて露光時間１０００ｍｓで撮影した後、Ｃｙ３用ミラーユニットで同様に撮影する。
９．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ戻し、そのまま１秒停止する。
１０．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ引き、そのまま１秒停止する。
１１．ＦＩＴＣ用ミラーユニットを用いて露光時間１０００ｍｓで撮影した後、Ｃｙ３用ミラーユニットで同様に撮影する。
１２．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ戻し、そのまま１秒停止する。
１３．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ引き、そのまま１秒停止する。
１４．ＦＩＴＣ用ミラーユニットを用いて露光時間１０００ｍｓで撮影した後、Ｃｙ３用ミラーユニットで同様に撮影する。
１５．シリンジを５μｌ／ｓの速度で５０μｌ戻し、そのまま１秒停止する。
【０１４９】
このようにアプリケーションに従って遺伝子検査装置１を運転することによって、ユーザーは、入力部１５や表示部１６やデータファイルを利用して、種々のパラメータを希望通りの条件や動作で測定を行える。
【０１５０】
なお、本発明は、目的によっては遺伝学的検査に限定されずに、他の種々の生物学的反応（酵素反応、抗原抗体反応、代謝反応、生物学的運動動態試験等）をハイスループットで実行しモニターリングする技術として広く医療分野に提供し得る点に注目して挙げるものである。本発明は、ＤＮＡプローブを用いた遺伝子検査装置について説明を行ったが、ＤＮＡプローブだけでなく、例えば、抗体や組織等をプローブとして用いた場合にも、適用可能である。
【０１５１】
【発明の効果】
このような本発明の態様に従う装置を用いることによって、簡便に、且つ短時間で複数の遺伝子を検査することの出来る遺伝子検査装置および方法が提供される。また、このような装置および方法により、反応部分の溶液の状態や、温度条件を変化させながらターゲット遺伝子のハイブリダイゼーションの程度をリアルタイムで測定することができる。従って、この発明を用いることによって、対象遺伝子の発現の有無およびその発現量が、容易に、且つ、効率良く、正確に測定することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の１態様を示す構成図。
【図２】スライドチップの例を示す図。
【図３】解析手順を示すフローチャート。
【図４】反応手順を示すフローチャート。
【図５】解析方法を示すフローチャート。
【図６】Ｐ５３エクソン７突然変異解析用スライドチップの例を示す図。
【図７】発現量解析用スライドチップを示す図。
【図８】図１の遺伝子検査装置の制御ブロックを示す図。
【図９】遺伝子検査装置の操作手順を示すフローチャート。
【符号の説明】
１．遺伝子検査装置　　２．スライドチップ　　３．顕微鏡　　４．ステージ
５．ＣＣＤカメラ　　６．モータドライバ　　７．ＸＹステージコントローラ
８．ポンプドライバ　　９．温度コントローラ　　１０．コンピュータ
２２．ＤＮＡマイクロアレイ　　２３．プローブスポット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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