(57)【要約】【課題】高血圧症の遺伝子診断に用いる核酸プローブおよびプライマーの提供。【解決手段】エンドセリン１遺伝子における、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる核酸分子。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドセリン１遺伝子における、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、
配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、第２１７６番目のチミン（Ｔ）がグアニン（Ｇ）に置換されたものである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドの、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドの、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
エンドセリン１遺伝子における、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、
配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、プライマーペア。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項６に記載のプライマーペア。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、第２１７６番目のチミン（Ｔ）がグアニン（Ｇ）に置換されたものである、請求項６に記載のプライマーペア。
【請求項９】
エンドセリン１遺伝子の変異を検出することにより、高血圧症を予知または検出する方法であって、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項６〜８のいずれか一項に記載のプライマーペアを用いて、エンドセリン１遺伝子における、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定する工程を含んでなる、方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項６〜８のいずれか一項に記載のプライマーペアを含んでなる、高血圧症の予測または診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、高血圧症の遺伝子診断およびこれに用いるための核酸分子に関する。
【０００２】
背景技術
高血圧症患者の９０％以上は、遺伝素因や環境因子がその原因として複雑に関与している本態性高血圧症の患者である。本態性高血圧症はそれ自体無症候であることが多いが、脳卒中、虚血性心疾患、腎不全等の発症に強く関与する。従って、これらの重篤な疾患の発症を防ぐためには、本態性高血圧症を早期から予知し、生活習慣の改善、降圧薬による薬物療法等によりこれを予防することが望まれる。
【０００３】
本態性高血圧症には遺伝素因が関与するため、その原因遺伝子における遺伝的要因を調べることにより高血圧症を予知することができると考えられる。このような原因遺伝子としては、食塩感受性、インスリン抵抗性、交感神経活性等に関与する遺伝子、各種ホルモン遺伝子、心・血管作動性物質遺伝子などが考えられる。
【０００４】
本態性高血圧症に大きく関与する血管作動性物質の一つにエンドセリン（ＥＴ）がある。エンドセリンは、２１個のアミノ酸残基からなる極めて強力な血管収縮性ペプチドとして、ブタ血管内皮細胞からはじめて単離され、同定されたペプチドである（非特許文献１：Ｙａｎａｇｉｓａｗａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｐｏｔｅｎｔ　ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３３２，　４１１−４１５，　１９８８）。エンドセリンには３種類のアイソフォーム（ＥＴ−１、ＥＴ−２およびＥＴ−３）が存在することが知られており（非特許文献２：Ｉｎｏｕｅ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ　ｆａｍｉｌｙ：　Ｔｈｒｅｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ　ａｎｄ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｉｓｏｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｒｅｅ　ｓｅｐａｒａｔｅ　ｇｅｎｅｓ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８６，　２８６３−２８６７，　１９８９）、さらに、エンドセリン１は血管内皮細胞、肺、心房、大脳、大腸、および腎において発現し、エンドセリン２は腎および空腸において発現し、エンドセリン３は副腎、脳および空腸において発現することが知られている。また、エンドセリンは、その受容体であるＥＴＡおよびＥＴＢを介して広範な臓器で多様な生理活性を示し、血管においては昇圧作用および細胞増殖作用を示すことが知られている（非特許文献３：Ｙａｎａｇｉｓａｗａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｅ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ　ｓｙｓｔｅｍ．　Ａ　ｎｅｗ　ｔａｒｇｅｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８９，　１３２０−１３２２，　１９９４）。
【０００５】
エンドセリン遺伝子における多型と高血圧症との関連については、エンドセリン１遺伝子に関して幾つかの報告がある。まず、エンドセリン１遺伝子の全領域にわたる配列決定により５箇所の多型が同定されており、そのうち、第１９８番目のコドンでのリシン／アスパラギンのアミノ酸変異を伴う多型（Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ）が、欧州の心筋梗塞を対象とした集団（Ｔｈｅ　ＥＣＴＩＭ　Ｓｔｕｄｙ：患者６４８人、健常対照７６０人）および英国北グラスゴーの一般住民（Ｔｈｅ　Ｇｌａｓｇｏｗ　Ｈｅａｒｔ　Ｓｃａｎ　Ｓｔｕｄｙ：１２８２人）において、肥満高血圧に関連することが報告されている（非特許文献４：Ｔｉｒｅｔ　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｅ　Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１　ｇｅｎｅ　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｂｌｏｏｄ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｉｎ　ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ　ｐｅｏｐｌｅ．，　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　３３，　１１６９−１１７４，　１９９９）。
【０００６】
また、Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ多型は、日本人一般集団（１２５０人）においても、肥満者の拡張期血圧の上昇に関与することが報告されている（非特許文献５：Ａｓａｉ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１　ｇｅｎｅ　ｖａｒｉａｎｔ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ｂｌｏｏｄ　ｐｒｅｓｓｕｒｅｉｎ　ｏｂｅｓｅ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ．　Ｔｈｅ　Ｏｈａｓａｍａ　Ｓｔｕｄｙ．，　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　３８，　１３２１−１３２４，　２００１）。
【０００７】
さらに、Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ多型は妊娠中の子癇との間で明らかな関連は認められなかったことが報告されているが、同じ文献中において、同多型が血圧上昇に関与し、変異型のホモ接合体であるＴＴ型を示す被検者の血中エンドセリン１濃度が他の遺伝子型を有する被検者に比べて有意に高いことが報告されている（非特許文献６：Ｂａｒｄｅｎ　Ａ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１　ｇｅｎｅ　Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｂｌｏｏｄ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ａｎｄ　ｐｌａｓｍａ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１　ｌｅｖｅｌｓｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｔｉｃ　ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．，　Ｊ．　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．　１９，　１７７５−１７８２，　２００１）。
【０００８】
エンドセリン１遺伝子における多型としては、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドにおけるＴ／Ｇの一塩基多型が知られているが（ＮＣＢＩ　ＳＮＰ　ＣＬＵＳＴＥＲ　ＩＤ：　ｒｓ　２０７０６９９）、この多型と高血圧症との関連については報告されていない。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｙａｎａｇｉｓａｗａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３３２，　４１１−４１５，　１９８８
【非特許文献２】
Ｉｎｏｕｅ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８６，　２８６３−２８６７，　１９８９
【非特許文献３】
Ｙａｎａｇｉｓａｗａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８９，　１３２０−１３２２，　１９９４
【非特許文献４】
Ｔｉｒｅｔ　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　３３，　１１６９−１１７４，　１９９９
【非特許文献５】
Ａｓａｉ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　３８，　１３２１−１３２４，　２００１
【非特許文献６】
Ｂａｒｄｅｎ　Ａ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．　１９，　１７７５−１７８２，　２００１
【００１０】
【発明の概要】
本発明者らは、エンドセリン１遺伝子上の、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドにおけるＴ／Ｇの一塩基多型が、高血圧症の診断に利用可能であることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１１】
従って、本発明は、高血圧症の遺伝子診断に用いるための核酸分子およびプライマーペア、診断用キット、ならびに高血圧症の予知／検出方法の提供を目的とする。
【００１２】
そして、本発明による核酸分子は、エンドセリン１遺伝子における、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子であって、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる核酸分子である。
【００１３】
さらに、本発明によるプライマーペアは、エンドセリン１遺伝子における、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアであって、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるプライマーペアである。
【００１４】
さらに、本発明による高血圧症の予知／検出方法は、エンドセリン１遺伝子の変異を検出することにより、高血圧症を予知または検出する方法であって、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを用いて、エンドセリン１遺伝子における、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドがチミン（Ｔ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定する工程を含んでなる、方法である。
【００１５】
さらに、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる、高血圧症の予測または診断用キットである。
【００１６】
【発明の具体的説明】
本発明によれば、エンドセリン１遺伝子における多型部位のヌクレオチドを同定することにより、高血圧症の遺伝子診断が可能となる。
【００１７】
エンドセリン１遺伝子は、５つのエクソンと４つのイントロンとからなる。本発明により同定されるヌクレオチドは、エンドセリン１遺伝子に含まれる第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドであり、エンドセリン１遺伝子は、この位置においてＴ／Ｇの一塩基多型（本発明において「Ｔ１９０８Ｇ多型」という）を有する。エンドセリン１遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３で表わされるアミノ酸配列をコードするものであり、例えば、配列番号１で表わされるゲノム配列（ＮＣＢＩアクセス番号：Ｊ０５００８）が挙げられる。Ｔ１９０８Ｇ多型の位置は、配列番号１においては第２１７６番目のヌクレオチドに相当する。
【００１８】
Ｔ１９０８Ｇ多型におけるＧアレル、特にＧＧの遺伝子型は、高血圧症のリスクファクターとして使用できる。従って、Ｔ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドがＴであるかＧであるかを同定することにより、高血圧症の予測または診断が可能となる。さらに、上記のＧアレル（特にＧＧの遺伝子型）は、本態性高血圧症の予測または診断において特に好ましいリスクファクターである。
【００１９】
本発明による核酸分子は、エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドがチミン（Ｔ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるための核酸分子である。この核酸分子は、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００２０】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとする。
【００２１】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２２】
配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする上記ポリヌクレオチドは、Ｔ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドがチミン（Ｔ）であるヒトエンドセリン１遺伝子のゲノムＤＮＡとすることができる。前記ゲノムＤＮＡは、ヒトエンドセリン１遺伝子の全エクソン（エクソン１〜５）および全イントロン（イントロン１〜４）を含むものであればよく、従って、上記ポリヌクレオチドは、エクソン１の５’末端からエクソン５の３’末端まで、すなわち、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものであることが好ましい。
【００２３】
また、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする上記ポリヌクレオチドは、Ｔ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドがグアニン（Ｇ）であるヒトエンドセリン１遺伝子のゲノムＤＮＡとすることができる。前記ゲノムＤＮＡは、ヒトエンドセリン１遺伝子の全エクソン（エクソン１〜５）および全イントロン（イントロン１〜４）を含むものであればよく、従って、上記ポリヌクレオチドは、エクソン１の５’末端からエクソン５の３’末端まで、すなわち、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、第２１７６番目のチミン（Ｔ）がグアニン（Ｇ）に置換されたものであることが好ましい。
【００２４】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、本発明による核酸分子は、イントロンにハイブリダイズする部分だけでなく、エクソンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【００２５】
本発明による核酸分子は、エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【００２６】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドとする。
【００２７】
また、本発明による核酸分子は、エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００２８】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜５０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとする。
【００２９】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料において、上記Ｔ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドを同定する上で好ましいものである。
【００３０】
核酸増幅法は通常プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドがチミン（Ｔ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、高血圧症の予測または診断に用いるためのプライマーペアが提供される。このプライマーペアは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、第２イントロン中の第３０番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅しうるものである。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００３１】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドを同定することができ、これにより、高血圧症を予知または検出することができる。上記の同定の結果、Ｔ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドがＧであった場合には、高血圧症が予知または検出されたと判断することができる。
【００３２】
また、Ｇアレルを有する場合の遺伝子型としてはＧ／ＧおよびＧ／Ｔが考えられるが、被検者がＧ／Ｔを有する場合よりもＧ／Ｇを有する場合の方が、より確実に高血圧症の予知または検出を判断することができる。従って、本発明の好ましい態様によれば、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いて、エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位の遺伝子型を同定する工程を含んでなる、高血圧症を予知または検出する方法が提供される。
【００３３】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドを同定するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドを同定する工程を含んでなる、高血圧症の予知法もしくは検出法または予測法もしくは診断法が提供される。
【００３４】
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸増幅法およびこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としてはＰＣＲ法等を用いることができる。
【００３５】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００３６】
上記の核酸増幅法とダイレクトシークエンス法とによりＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、例えば、以下の配列を有するプライマー：フォワード：５’−ＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＴ−３’（配列番号４）；
リバース：５’−ＣＣＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＣＴＧＴＧＡ−３’（配列番号５）
を用いて核酸増幅法を行ない、このフォワードプライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。
【００３７】
本発明による予測法または診断法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、一方のプライマーを多型部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを多型部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に前記多型にかかるいずれかのアレルが存在する場合には増幅産物が得られ、これが存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより特定のアレルの有無を判定することができる。
【００３８】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等によるエンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドの同定にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、高血圧症の予知法もしくは検出法または予測法もしくは診断法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型にかかるいずれかのアレルの存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００３９】
この方法による診断に当たっては、例えば、被検者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）を参照することができる。
【００４０】
エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００４１】
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、一塩基多型の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基多型の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４２】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４３】
エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いることもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。
【００４４】
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法においては、Ｔ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドを含む領域に対して、ＴアレルおよびＧアレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができるため特に制限されないが、例えば、以下のようなヌクレオチド配列とすることができる：
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｔアレル用：　Ｆａｍ−ＡＴＴＧＴＡＡＣＣＣＴＡＴＴＣＡＴＴＣＡ−ＭＧＢ（配列番号６）
Ｇアレル用：　Ｖｉｃ−ＴＧＴＡＡＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＴＣ−ＭＧＢ（配列番号７）；
プライマー：
フォワード：５’−ＴＧＧＡＣＡＴＣＡＴＴＴＧＧＧＴＣＡＡＣＡ−３’（配列番号８）
リバース：５’−ＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＴＧＧ−３’（配列番号９）。
【００４５】
また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭとＶＩＣの組合せを用いる。このＰＣＲ反応においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の遺伝子型（Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ｔ、またはＴ／Ｔ）が容易に決定される。
【００４６】
本発明による予知法、検出法、予測法および診断法において、エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドがグアニン（Ｇ）であると評価されたサンプル、特に遺伝子型がＧ／Ｇであると評価されたサンプルは、高血圧症、特に本態性高血圧症を有するものと、あるいは将来においてその可能性があるものと診断することができる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００４７】
以上のような高血圧症の予知、検出、予測および診断のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、エンドセリン１遺伝子におけるＴ１９０８Ｇ多型部位のヌクレオチドを同定するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００４８】
【実施例】
例１：エンドセリン１遺伝子上の多型と高血圧症との関連
以下の遺伝子解析においては、国立循環器病センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ）にて健康診断を行なった被検者３３９０人を対象とした。遺伝子解析に先立ち、被検者全員から遺伝子解析についてのインフォームドコンセントを取得し、連結不可能匿名化した。
【００４９】
まず、日本人４７人について、エンドセリン１遺伝子をダイレクトシークエンスし、これにより、７箇所の一塩基多型および２箇所の挿入／欠失多型が同定された。このうち、両アレルの頻度がともに１０％以上となる多型は、第２イントロンの第３０番目のヌクレオチドにおけるＴ／Ｇ多型（Ｔ１９０８Ｇ）、第２イントロンの第１３９３番目のヌクレオチドにおけるＴ／Ｃ多型（Ｔ３２７１Ｃ）、および肥満者における血圧上昇との関連が報告されているＬｙｓ１９８Ａｓｎ多型の３種類であった。
【００５０】
次いで、このうちのＴ１９０８Ｇ多型に関し、被検者全員についてＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法によるタイピングを行なった。ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法は、ＴａｑＭａｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を用いて行なった。このＴａｑＭａｎシステムにおいては、ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＡＢＩ）、１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、下記のＴａｑＭａｎプローブ、および下記のプライマーを含む全１２．５μｌの反応溶液を９６ウェルプレート上に調製し、９５℃で１０分間の反応の後、９２℃で１５秒間−６２℃で１分間の反応を３５サイクル行なった。ＰＣＲ産物の蛍光は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて測定した。また、３８４ウェルプレートを用いる場合には、ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＡＢＩ）、６ｎｇのゲノムＤＮＡ、下記のＴａｑＭａｎプローブ、および下記のプライマーを含む全７．５μｌの反応溶液を調製し、９５℃で１０分間の反応の後、９２℃で１５秒間−５８℃で１分間の反応を４０サイクル行なった。ＰＣＲ産物の蛍光は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて測定した。
【００５１】
ＴａｑＭａｎプローブ
Ｔアレル用：　Ｆａｍ−ＡＴＴＧＴＡＡＣＣＣＴＡＴＴＣＡＴＴＣＡ−ＭＧＢ（配列番号６）（２５０ｎＭ）
Ｇアレル用：　Ｖｉｃ−ＴＧＴＡＡＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＴＣ−ＭＧＢ（配列番号７）（３５０ｎＭ）
プライマー
フォワード：５’−ＴＧＧＡＣＡＴＣＡＴＴＴＧＧＧＴＣＡＡＣＡ−３’（配列番号８）（８００ｎＭ）
リバース：５’−ＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＴＧＧ−３’（配列番号９）（８００ｎＭ）
アレル頻度においては、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡が成り立つことが確認された（ＧＧ２１％、ＧＴ５０％、ＴＴ２９％）。
【００５２】
次いで、得られたデータを共分散分析によって解析し、各遺伝子型間で血圧を比較した。この解析においては、血圧に影響する因子として、年齢、ＢＭＩ、高脂血症、糖尿病、虚血性心疾患、喫煙および飲酒を共変量とした。その結果を下記の表１に示す。
【００５３】
【表１】
2004097086.tif 000002
男性ではＧＧ：１２８．４／７８．９、ＧＴ：１２９．１／７９．１、ＴＴ：１２５．９／７７．３ｍｍＨｇ（収縮期：ｐ＝０．０２０、拡張期：ｐ＝０．０２６）であり、女性ではＧＧ：１３４．３／７９．２、ＧＴ：１３２．０／７８．０、ＴＴ：１３１．１／７７．６ｍｍＨｇ（収縮期：ｐ＝０．０８９、拡張期：ｐ＝０．１４８）であった。従って、男性では有意差が認められた。また、男性では、Ｇアレルを有する者とＴＴ遺伝子型を有する者との間で有意差が認められた（Ｇアレル：１２８．９／７９．１；ＴＴ：１２５．９／７７．２ｍｍＨｇ、収縮期：ｐ＝０．００３、拡張期：ｐ＝０．００２）。
【００５４】
さらに、１２０／８０ｍｍＨｇ未満の至適血圧を示す群（ＮＴ）と１６０／１００ｍｍＨｇ以上の中等以上の高血圧を示す群（ＨＴ）との間のアレル頻度の比較を、χ２検定により行なった。その結果を下記の表２に示す。
【００５５】
【表２】
2004097086.tif 000003
2004097086.tif 000004
女性ではＧアレル頻度がＨＴで有意に高率であった（ｐ＝０．０２０９、オッズ比：１．６２８、９５％ＣＩ：１．０３１〜２．５７１）。
【００５６】
以上の解析結果から、Ｔ１９０８Ｇ多型におけるＧアレル、特にＧＧの遺伝子型は、高血圧症のリスクファクターとして使用できることがわかる。
【００５７】
【配列表】
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2004097086.tif 000006
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