(57)【要約】　【課題】　微生物を用いてＬ−スレオニンなどのＬ−アミノ酸を効率よく製造する。　【解決手段】　炭化水素代謝の全般的な制御因子であるmlc遺伝子を不活性化させたエシェリヒア属細菌を用いて、Ｌ−スレオニンなどのＬ−アミノ酸を製造する。　【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、mlc遺伝子が不活性化するように改変されたエシェリヒア属細菌。
【請求項２】
Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、請求項１に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項３】
Ｌ−スレオニンオペロンが高発現するように改変された、請求項２に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌を培地中で培養して、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積させる工程と、該培地からＬ−アミノ酸を採取する工程とを含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項５】
Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、請求項４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は微生物工業、特にmlc遺伝子が不活性化されたエシェリヒア属細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　Mlcタンパク質は炭化水素代謝の全般的な調節因子（抑制因子）である（例えば、非特許文献１〜３参照）。Mlcタンパク質はいくつかの遺伝子またはオペロンの発現を調節することが示されている。例えば、グルコースホスホトランスフェラーゼ系（PTS）の膜結合サブユニットIICB（Glc）をコードするptsG遺伝子（例えば、非特許文献２，４〜７参照）；一般的なPTSタンパク質をコードするPtsHIcrrオペロン（例えば、非特許文献２、４〜７参照）；マンノースPTSの第２酵素（enzyme II）をコードするmanXYZオペロン（例えば、非特許文献４参照）；及びマルトースレギュロン（regulon）の活性化因子をコードするmalT遺伝子（例えば、非特許文献８参照）などがMlcタンパク質による調節を受ける。
【０００３】
　mlcレギュロンの遺伝子はCRP-cAMP複合体によって正の制御を受ける（例えば、非特許文献２〜９参照）。一方、mlc遺伝子の転写調節は非常に複雑である。一つにはMlcタンパク質自身によって負の調節を受ける。リン酸化されていないEIICB（Glc）（ptsG遺伝子産物）が、直接タンパク質−タンパク質相互作用によって結合部位からMlcタンパク質を隔離し、グルコース応答時のmlcレギュロンの発現を誘導する（例えば、非特許文献１０〜１２参照）。もう一つには、mlc遺伝子の転写はP1とP2という２種類のプロモーターによって行われる（例えば、非特許文献１３参照）。P1プロモーターは構成的なシグマ因子σ70（Eσ70）を含むRNAポリメラーゼによってのみ認識されるのに対し、P2プロモーターはEσ70と、熱誘導性シグマ因子を含むEσ32の両方によって認識される。したがって、mlc遺伝子は、様々な環境に反応するために択一的にシグマ因子を結合するRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターを含んだ多重プロモーターから転写される遺伝子群に属する。さらに、よく保存されたCRP結合部位もmlcプロモーター内に存在する（例えば、非特許文献１３参照）。
【０００４】
　グルコースを制限した条件下で生育するエシェリヒア・コリの中に、mgl、mlc及びmalT遺伝子に変異を有する多重変異体が発見されている（例えば、非特許文献１４参照）。しかし、これまでのところ、mlc遺伝子を不活性化してＬ−アミノ酸生産のために用いるという報告はなかった。
【非特許文献１】Decker et al, Mol Microbiol 1998, vol. 27, No. 2, p381-390
【非特許文献２】Kimata et al, Mol Microbiol, 1998, vol. 29, No. 6, p1509-1519
【非特許文献３】Plumbridge, Mol Microbiol, 1998, vol. 27, No. 2, p369-380
【非特許文献４】Plumbridge, Mol Microbiol, 1998, vol. 29, No. 4, p1053-1063
【非特許文献５】Kim et al, J Biol Chem, 1999, vol. 274, No. 36, p25398-25402
【非特許文献６】Plumbridge, Mol Microbiol 1999, vol. 33, No. 2, p260-273
【非特許文献７】Tanaka et al, Genes Cells, 1999, vol. 4, No. 7, p391-399
【非特許文献８】Decker et al, Mol Microbiol 1998, vol. 27, No. 2, p381-390
【非特許文献９】Chapon and Colb, J. Bacteriol., 1983, vol. 156, p1135-1143
【非特許文献１０】Tanaka et al, EMBO J, 2000, vol. 19, No. 20, p5344-5352
【非特許文献１１】Lee et al, EMBO J, 2000, vol. 19, No. 20, p5353-5361
【非特許文献１２】Nam et al, EMBO J, 2001, vol. 20, No. 3, p491-498
【非特許文献１３】Shin et al, J. Biol. Chem. 2001, vol. 276, No. 28, p25871-25875
【非特許文献１４】Manch K., Genetics, 1999,vol. 153, No. 1, p5-12
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　本発明の課題は、Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を向上させること及びこれらの株を用いてＬ−アミノ酸を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
　本発明者らは、PTSによって行われる炭化水素の輸送が、ある種のアミノ酸を過剰生産する場合において律速段階になる可能性があり、PTS遺伝子の発現を負に制御するmlc遺伝子産物を不活性化することによりアミノ酸生産を増加させ得ると考えた。このような考えに基いて鋭意検討した結果、エシェリヒア属細菌において、炭化水素代謝の抑制因子をコードするmlc遺伝子を不活性化することにより、Ｌ−スレオニンのようなＬ−アミノ酸の生産性が向上することを見出した。以上により、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
　　すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００８】
　（１）　Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、mlc遺伝子が不活性化するように改変されたエシェリヒア属細菌。
【０００９】
　（２）　Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、（１）のエシェリヒア属細菌。
【００１０】
　（３）　Ｌ−スレオニンオペロンが高発現するように改変された、（２）のエシェリヒア属細菌。
【００１１】
　（４）　（１）〜（３）のいずれかのエシェリヒア属細菌を培地中で培養して、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積させる工程と、該培地からＬ−アミノ酸を採取する工程とを含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【００１２】
　（５）　Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、（４）の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
　本発明のエシェリヒア属細菌を用いることによって、安価で効率よくＬ−アミノ酸、特にＬ−スレオニンを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
　以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
　＜１＞本発明の細菌
　本発明の細菌はＬ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、mlc遺伝子が不活性化されるように改変された細菌である。本発明において、「Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌」とは、培地中で培養した場合に、培地中にＬ−アミノ酸を蓄積する能力を有する細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、育種によって付与又は向上させられてもよい。「Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌」はまた、エシェリヒア・コリの野生株又はエシェリヒア・コリK-12株のような親株よりも多い量のＬ−アミノ酸を生産して培地中に蓄積することのできる細菌を意味する。
【００１６】
　「エシェリヒア属細菌」という用語は、微生物学の分野における当業者に知られた分類に従って、エシェリヒア属に分類される細菌を意味する。本発明に用いることのできるエシェリヒア属細菌としては、例えばエシェリヒア・コリ（E.coli）が挙げられる。本発明
に用いることのできるエシェリヒア属細菌は特に限定されないが、例えばNeidhardt, F. C.らによって記載された細菌（「エシェリヒア・コリとサルモネラ・ティフィムリウム」Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1987, vol. 2, p1208, Table 1）を挙げることができる。
【００１７】
　「mlc遺伝子が不活性化された」との文言は、mlc遺伝子が改変されて、改変遺伝子が制御能力の減少した変異タンパク質又は完全な不活性タンパク質をコードするようにされることを意味する。また、mlc遺伝子の一部の欠失、又はmlc遺伝子に隣接する領域の改変によって、改変されたDNA領域がMlcタンパク質を正常に発現できないようにされることも意味する。
【００１８】
　PTSの抑制因子をコードするmlc遺伝子の不活性化は、グルコースなどの炭化水素のＬ−アミノ酸生産菌の細胞への供給を増加させる。mlc遺伝子は炭化水素代謝系の全般的な制御因子であるMlcタンパク質をコードする。mlc遺伝子の塩基配列は種々の微生物由来のものが報告されているが、本発明においては、例えばエシェリヒア・コリのmlc遺伝子を用いることができる。エシェリヒア・コリのmlc遺伝子（gi:16129552; GenBankのアクセッション番号NC_000913.1の1665368番目から1666588番目）はエシェリヒア・コリK-12株の染色体上のb1593遺伝子とynfL遺伝子の間に位置する。
【００１９】
　本発明においてmlc遺伝子とは、上記のエシェリヒア・コリmlc遺伝子にコードされるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、炭化水素代謝を調節する活性を有するタンパク質をコードするものも含まれる。このようなmlc遺伝子のホモログとしては、上記のエシェリヒア・コリmlc遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、上記のエシェリヒア・コリmlc遺伝子の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２０】
　mlc遺伝子の不活性化はUV照射やニトロソグアニンジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）による変異処理、部位特異的変異法、相同組み換え及び／又は「Red-driven integration」とも呼ばれる挿入−欠失変異法（Datsenko K.A. and Wanner B.L.、 Proc.
Natl. Acad. Sci. USA、 2000年, 第97巻、第12号、p6640-45）による遺伝子破壊などの一般的な方法によって行うことができる。
＜２＞本発明のＬ−アミノ酸生産菌
　本発明のＬ−アミノ酸生産菌は特に限定されないが、例えば、Ｌ−スレオニン生産菌を挙げることができる。したがって、本発明のＬ−アミノ酸生産菌として、例えば、mlc遺伝子が不活性化するように改変されたＬ−スレオニン生産菌を用いることができる。本発明のＬ−スレオニン生産菌は、Ｌ−スレオニン生合成経路に関与する一又はそれ以上の遺伝子の発現を上昇させるために改変されたものであってもよい。そのような遺伝子としては、例えばＬ−スレオニンオペロン、すなわちthrオペロンの遺伝子を挙げることができる。thrオペロンは、スレオニンによるフィードバック阻害に耐性を有するアスパルトキナーゼ ホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードする変異thrA遺伝子、ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子及びスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子を含むオペロンであることが好ましい。本発明のＬ−スレオニン生産細菌の別の好ましい態様は、推定上の膜タンパク質をコードするrhtA遺伝子の発現が上昇するように改変された細菌である。さらに別の好ましい態様は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子の発現が上昇するように改変された細菌
（ロシア特許出願第2002104983号明細書）である。特に好ましい態様は、aspC遺伝子、thrA遺伝子、thrB遺伝子、thrC遺伝子及びrhtA遺伝子の発現量が上昇するように改変され、かつmlc遺伝子が不活性化するように改変された細菌である。
【００２１】
　本発明の細菌の親株としては、Ｌ−スレオニン生産能を有するエシェリヒア属細菌、例えばE.coli VKPM B-3996株（米国特許第5,175,107号及び第5,705,371号明細書）、E.coli
NRRL-21593株（米国特許第5,939,307号明細書）、E.coli FERM BP-3756株（米国特許第5,474,918号明細書）、E.coli FERM BP-3519株及びFERM BP-3520株（米国特許第5,376,538号明細書）、E.coli MG442株（Gusyatinerら, Genetika （ロシア）, 1978年, 第14巻, p947-956）、E.coli VL643株及びE.coli VL2055株（いずれも欧州特許出願公開第1149911号明細書）などを用いることができる。
【００２２】
　本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を本来的に有している細菌において、mlc遺伝子を不活性化することによって得ることができる。また、本発明の細菌は、既にmlc遺伝子が不活性化された細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与することによっても得ることができる。
【００２３】
　プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化及び連結、形質転換、プライマー用オリゴヌクレオチドの設計などは、当業者によく知られた通常の方法によって行うことができる。これらの方法は、例えば、「モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook, J.、Fritsch, E.F.、Maniatis, T.、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年）」に記載されている。
＜３＞本発明の方法
　本発明の方法は、本発明の細菌を培地中で培養してＬ−アミノ酸を培地中に生成蓄積させる工程と、該培地からＬ−アミノ酸を採取する工程とを含む、Ｌ−アミノ酸の製造方法である。好ましくは、本発明の方法は、本発明の細菌を培地中で培養してＬ−スレオニンを培地中に生成蓄積させる工程と、該培地からＬ−スレオニンを採取する工程とを含む、Ｌ−スレオニンの製造方法である。
【００２４】
　本発明において、培養、Ｌ−アミノ酸の培地からの採取・精製等は、細菌を用いてアミノ酸を製造する従来の発酵法と同様の方法によって行うことができる。
【００２５】
　培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、ミネラル、及び必要に応じて細菌の生育に必要な栄養素を含むものである限り、合成培地であっても、天然培地であってもよい。炭素源はグルコース、スクロースのような種々の炭化水素や種々の有機酸を含むものであってもよい。使用する細菌の同化の程度によって、エタノールやグリセロールなどのアルコールを用いてもよい。窒素源としては、アンモニアや硫酸アンモニウムのようなアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトンのような天然の窒素源、大豆加水分解物及び発酵性微生物の消化物などを用いることができる。ミネラルとしては、モノリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウムなどを用いることができる。ビタミンとしては、チアミンや酵母エキスなどを用いることができる。
【００２６】
　培養は、振とう培養や通気しながらの攪拌培養などの好気的条件下で、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃で行う。培地のｐＨは通常５〜９、好ましくは６．５〜７．２に調整する。培地のｐＨはアンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基又は緩衝液で調整することができる。通常、１〜５日の培養で液体培地中に目的のＬ−アミノ酸が蓄積する。培養後、細胞などの固形物は遠心分離や膜ろ過などによって除くことができ、採取したＬ−アミノ酸はイオン交換、濃縮又は結晶化法などによって精製することができる
。
【００２７】
　［実施例］
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例１】
【００２８】
　mlc遺伝子が不活性化された株の構築
１．mlc遺伝子の欠失
　mlcの欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）によって行った。この方法に従って、mlc遺伝子及び鋳型プラスミドに抗生物質耐性を付与する遺伝子のそれぞれに近接する領域に、それぞれ相補的なプライマーmlcIL（配列番号１）及びmlcIR（配列番号２）を設計した。プラスミドpACYC184（NBL Gene Sciences
Ltd. （英国）、 GenBank/EMBL アクセッション番号 X06403）をＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲは次の条件で行った：９５℃、３分間の変性ステップ；９５℃、１分→３４℃、３０秒→７２℃、４０秒を２サイクル；９５℃、３０秒→５０℃、３０秒→７２℃、４０秒を３０サイクル；７２℃、５分。
【００２９】
　得られた935bpのPCR産物（図１）（配列番号３）をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリMG1655株をエレクトロポレーションするために用いた。プラスミドpKD46（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムの遺伝子（λ、β、exo遺伝子）を含むλファージの2154塩基のDNAフラグメント（GenBank/EMBL アクセッション番号 J02459, 第31088番目〜33241番目）を含む。プラスミドpKD46はPCR産物をMG1655株の染色体に組み込むために必要である。
【００３０】
　エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、100mg／Lのアンピシリンを含んだLB培地中で３０℃、一晩培養したエシェリヒア・コリMG1655株を、アンピシリンとL-アラビノース（1mM）を含んだ5mLのSOB培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook, J.ら、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））で100倍希釈した。得られた希釈物を３０℃で通気しながらＯＤ600が約０．６になるまで生育させた後、100倍に濃縮し、氷冷した脱イオン水で３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは７０μＬのコンピテントセルと約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのＳＯＣ培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook, J.ら、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））を加えて３７℃で２．５時間培養した後、３７℃でＬ−寒天培地上で平板培養し、ＣｍR（クロラムフェニコール耐性）組換え体を選択した。次に、pKD46プラスミドを除去するために、Ｃｍ（クロラムフェニコール）入りのL-寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験した。
２．mlc遺伝子欠失のPCRによる確認
　Cm耐性遺伝子によって識別できるmlc遺伝子の欠失を含む変異体を、PCRによって確認した。部位特異的プライマーmlcPL（配列番号４）及びmlcPR（配列番号５）を確認のためのPCRに用いた。PCRの条件は以下のとおり：９４℃、３分間の変性ステップ；９４℃、３０秒→５２℃、３０秒→７２℃、２分を３０サイクル；７２℃、７分。その結果、Mlc+である親株MG1655株の細胞のＤＮＡを鋳型にして得られたPCR産物の長さは1492bpであった（図２、配列番号６）。一方、変異株MG1655Δmlc::cat株の細胞のＤＮＡを鋳型にして得られたPCR産物の長さは1191bpであった（図２、配列番号７）。
【００３１】
　スレオニン生産株エシェリヒア・コリTDH7/pRT614（VKPM B-5318,米国特許第6,132,999号明細書）に、P1トランスダクション（transduction）の標準的手法（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook, J.ら、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））によってCm耐性を付与した。ここで、ドナーとして前記MG1655Δmlc::cat株を用いた。プライマーmlcPL（配列番号４）及びmlcPR（配列番号５）を用いたPCRにより、得られたTDH7Δmlc::cat/pRT614株がΔmlc::cat欠失を有することを確かめた。エシェリヒア・コリTDH7/pRT614株は、オールユニオン　リサーチ　インスティテュート　オブ　アンチバイオティックス（All-Union Research Institute of Antibiotics）の微生物コレクションに登録番号2070で、またロシア国立工業微生物コレクション（Russian National Collection of Industrial Microorganism）（ロシア113545、モスクワ、1 Dorozhny proezd、1）に登録番号VKPM B-5318で1990年5月3日に寄託された。
【実施例２】
【００３２】
　mlc遺伝子が不活性化されたエシェリヒア・コリ株によるＬ−スレオニンの生産
　ストレプトマイシン（50μg/mL）を含むＬ−寒天培地上で、エシェリヒア・コリTDH7/pRT614株及びTDH7/Δmlc::cat/pRT614株を37℃で18〜24時間培養した。次に一掻き分の細胞を５０ｍＬのＬ−培地（トリプトン10g/L、酵母エキス5g/L、NaCl 5g/L）に移した。シェーカー（140rpm）を用いて37℃、4時間培養した細胞（OD540＝0.12、50ｍL）を発酵用の培地450ｍLに植菌した。1.0Lの容量の実験室用ファーメンター内で1200rpmの回転数で攪拌通気（1/1vvm）しながら３９℃でバッチ発酵を行った。pHの値は８％液体アンモニアで自動的に６．６に調整した。結果を表１に示した。
【００３３】
　発酵培地の組成（g/L）：
　　Glucose                 100.0
　　NH4Cl                   1.75
　　KH2PO4                  1.0
　　MgSO4 ・7H2O            0.8
　　FeSO4 ・7H2O            0.01
　　MnSO4 ・5H2O            0.01
　　Mameno (TN)             0.15
　　Betaine                 1.0
　グルコースと硫酸マグネシウムは別々に滅菌した。pHは6.6に調整した。
【００３４】
【表１】
2004097221.tif 000002
【００３５】
　表１に示されるように、mlc遺伝子を不活性化することによって、TDH/pRT614株によるＬ−スレオニンの蓄積が向上した。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】プラスミドpACYC184上において、cat遺伝子の増幅に用いられるプライマーmlcILとmlcIRの相対的な位置を示す図。
【図２】不活性化されたmlc遺伝子を含む染色体DNAフラグメントの構築を示す図。
【図１】
2004097221.tif 000003
【図２】
2004097221.tif 000004
【配列表】
2004097221000001.app