(57)【要約】【課題】ダイナミックレンジを広げ高輝度から低輝度までのデータを取得できるマイクロアレイ観察における画像処理方法及び画像処理装置を提供すること。【解決手段】マイクロアレイ基板を観察する光検出手段（１）と、この光検出手段（１）で観察を行う際のレーザー出力またはＰＭＴ感度を制御する制御手段（２，３）と、この制御手段により前記マイクロアレイ基板に対する前記レーザー出力またはＰＭＴ感度を段階的に変化させて得たデータを基にマイクロアレイ画像を形成する画像形成手段（４）と、を具備。【選択図】    図１
2004317366.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイ基板の観察を行う際のレーザー出力またはＰＭＴ感度を制御し、
この制御により前記マイクロアレイ基板に対する前記レーザー出力またはＰＭＴ感度を段階的に変化させて得たデータを基にマイクロアレイ画像を形成することを特徴とするマイクロアレイ観察における画像処理方法。
【請求項２】
前記データを合成することによりマイクロアレイ画像を形成することを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ観察における画像処理方法。
【請求項３】
あらかじめ蛍光色素濃度とレーザー強度またはＰＭＴ感度との関係を調べておき、そのデータを元に観察可能な条件を設定することを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ観察における画像処理方法。
【請求項４】
前記マイクロアレイ基板に対して位置マーカーを配することでスポットの位置を決定し、多数のスポットを格子状に分割したことを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ観察における画像処理方法。
【請求項５】
一度目の観察で観察範囲外にあったスポットの位置を認識し、その部分のみ別条件で観察を行うことを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ観察における画像処理方法。
【請求項６】
前記マイクロアレイ基板に対して複数の蛍光色素を使用することを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ観察における画像処理方法
【請求項７】
色素濃度の判明している色素希釈系列を搭載したマイクロアレイ基板を使用することを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ観察における画像処理方法
【請求項８】
前記マイクロアレイ基板は核酸、抗体、タンパク質をプローブＤＮＡとして用いていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ観察における画像処理方法。
【請求項９】
マイクロアレイ基板を観察する光検出手段と、
この光検出手段で観察を行う際のレーザー出力またはＰＭＴ感度を制御する制御手段と、
この制御手段により前記マイクロアレイ基板に対する前記レーザー出力またはＰＭＴ感度を段階的に変化させて得たデータを基にマイクロアレイ画像を形成する画像形成手段と、
を具備したことを特徴とするマイクロアレイ観察における画像処理装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイクロアレイ観察における画像処理方法及び画像処理装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、大規模に遺伝子発現頻度やＳＮＰを解析する手法として、マイクロアレイ技術が利用されている。マイクロアレイ技術は、一度に多数の遺伝子について解析を行うことが可能であるため、ハイスループットで非常に有用な技術である。
【０００３】
このマイクロアレイ技術では、一般的に一定規格のスライドグラス（約７．５ｃｍ×２．５ｃｍ）を用いて、多数のプローブＤＮＡスポットをマイクロアレイ基板上に配し、ターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応後、蛍光を利用して検出する。そして、得られた画像データを数値化し、その数値結果を基に発現頻度の定量化を行う。蛍光観察には、共焦点方式の蛍光検出スキャナー等が広く利用されており、基材自身からのバックグラウンドノイズを低減させて、高解像度、高精度な蛍光検出を行うことが可能となっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前述したように、マイクロアレイ基板には多数のプローブＤＮＡスポットが固定化されており、これらがそれぞれ異なる蛍光強度値を示すため、高輝度と低輝度のスポットが混在している状態になっている。
【０００５】
しかしながら現状では、マイクロアレイ基板で解析可能な蛍光強度範囲、すなわちダイナミックレンジは、蛍光検出装置のそれよりも大きい。このため、装置性能の限界により、全てのスポットからのデータを取得することができない。
【０００６】
図４（ａ）（ｂ）は、従来例に係るマイクロアレイ観察画像を示している。（ａ）の観察条件は、レーザー強度４０％、ＰＭＴ（光電子増倍管）感度１００％であり、（ｂ）の観察条件は、レーザー強度６０％、ＰＭＴ感度１００％である。
【０００７】
図４（ａ）に示すように、多数のスポットが存在する中で最も高輝度のスポット（白色スポット）を観察しようとしたときには、その他のスポットからはほとんどシグナルが得られていない。また図４（ｂ）に示すように、低輝度のスポットを観察するために、蛍光検出装置のレーザー出力を上げた場合には、シグナルが飽和してしまうスポットが増えてしまい解析を行うことができない。
【０００８】
また従来では、画像の明るさや高解像度を保持したまま焦点深度を深くするために、合焦点位置の異なる複数の画像を加算し、これらの画像に適当な処理を加えることが考えられている。その例として、特開平４−８３４７８号公報には、部分画像の各被写体までの距離および明るさを自動的に計測し、入力および加算の条件を設定するようにし、これら入力した画像を加え合わす方法が開示されている。この処理は、顕微鏡の観察時に起こる階調飛びや、画像の焦点ボケを解消するために行われる。
【０００９】
一方、焦点深度の深い画像を得るだけでなく、様々な輝度の標本を観察する目的で、取得画像を加算して一つのデータとする事が考えられている。一例として特開平１０−２４３２８９号公報では、顕微鏡の観察標本を、露光時間を制御可能としたテレビカメラにより撮像し、加算および回復処理を加えることで、一連のデータとするようにしている。
【００１０】
しかし特開平１０−２４３２８９号公報については、露光時間の長短のみを指標に輝度変換を行っているため、蛍光観察時のレーザー強度またはＰＭＴ感度と出力シグナルとの関係を厳密には反映していない。実際の測定では、レーザー強度またはＰＭＴ感度出力シグナルは比例関係にはなく、対数的に変化している。そのため、露光時間の長さを指標に、一律の変換率を用いてデータを補正することはできない。
【００１１】
このように従来の手法では、一つの観察条件で得たマイクロアレイ観察画像を基にすべてのスポットからの数値を得ることはできない。
【００１２】
本発明の目的は、ダイナミックレンジを広げ高輝度から低輝度までのデータを取得できるマイクロアレイ観察における画像処理方法及び画像処理装置を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
課題を解決し目的を達成するために、本発明のマイクロアレイ観察における画像処理方法及び画像処理装置は以下の如く構成されている。
【００１４】
（１）本発明のマイクロアレイ観察における画像処理方法は、マイクロアレイ基板の観察を行う際のレーザー出力またはＰＭＴ感度を制御し、この制御により前記マイクロアレイ基板に対する前記レーザー出力またはＰＭＴ感度を段階的に変化させて得たデータを基にマイクロアレイ画像を形成する。
【００１５】
（２）本発明のマイクロアレイ観察における画像処理方法は上記（１）に記載の方法であり、かつ前記データを合成することによりマイクロアレイ画像を形成する。
【００１６】
（３）本発明のマイクロアレイ観察における画像処理方法は上記（１）に記載の方法であり、かつあらかじめ蛍光色素濃度とレーザー強度またはＰＭＴ感度との関係を調べておき、そのデータを元に観察可能な条件を設定する。
【００１７】
（４）本発明のマイクロアレイ観察における画像処理方法は上記（１）に記載の方法であり、かつ前記マイクロアレイ基板に対して位置マーカーを配することでスポットの位置を決定し、多数のスポットを格子状に分割している。
【００１８】
（５）本発明のマイクロアレイ観察における画像処理方法は上記（１）に記載の方法であり、かつ一度目の観察で観察範囲外にあったスポットの位置を認識し、その部分のみ別条件で観察を行う。
【００１９】
（６）本発明のマイクロアレイ観察における画像処理方法は上記（１）に記載の方法であり、かつ前記マイクロアレイ基板に対して複数の蛍光色素を使用する。
【００２０】
（７）本発明のマイクロアレイ観察における画像処理方法は上記（１）に記載の方法であり、かつ色素濃度の判明している色素希釈系列を搭載したマイクロアレイ基板を使用する。
【００２１】
（８）本発明のマイクロアレイ観察における画像処理方法は上記（１）に記載の方法であり、かつ前記マイクロアレイ基板は核酸、抗体、タンパク質をプローブＤＮＡとして用いている。
【００２２】
（９）本発明のマイクロアレイ観察における画像処理装置は、マイクロアレイ基板を観察する光検出手段と、この光検出手段で観察を行う際のレーザー出力またはＰＭＴ感度を制御する制御手段と、この制御手段により前記マイクロアレイ基板に対する前記レーザー出力またはＰＭＴ感度を段階的に変化させて得たデータを基にマイクロアレイ画像を形成する画像形成手段と、から構成されている。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
【００２４】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態に係る画像処理装置の概略構成を示すブロック図である。図１において、蛍光検出装置１にはレーザー出力制御部２とＰＭＴ感度制御部３が接続されている。また蛍光検出装置１には、画像形成部４が接続されている。蛍光検出装置１は、ＰＭＴとレーザー光源からなる。
【００２５】
本第１の実施の形態では、高輝度から低輝度までのスポットを含むマイクロアレイ基板を観察する際に、あらかじめスポットに含まれる蛍光色素毎に（複数の蛍光色素を使用している場合）、マイクロアレイ基板に対するレーザー強度やマイクロアレイ基板からの蛍光に対するＰＭＴ感度を段階的に変化（変調）させ、蛍光色素濃度とＰＭＴ感度またはレーザー強度との関係を調べておく。その実測データをレファレンスとし、画像データの変換を行う。この場合、用いる蛍光色素によって特性が異なるため、競合反応時における色素間の違いも低減させることが可能である。なお、本実施の形態のマイクロアレイ基板は、核酸、抗体、タンパク質をプローブＤＮＡとして用いている。
【００２６】
図２（ａ）（ｂ）は、ＰＭＴ感度またはレーザー強度の変化に伴う蛍光強度数値を示す図である。図２（ａ）（ｂ）では、１種類の蛍光色素Ｃｙ３を適用した平板状の基板について、ＰＭＴ感度またはレーザー強度と出力値（蛍光強度）との関係を表わすデータを示している。
【００２７】
図２（ａ）は、蛍光検出装置１のレーザー光源のレーザー強度をレーザー出力制御部２により固定し、ＰＭＴ感度制御部３によりＰＭＴ感度を５０％〜１００％まで５％毎に変化させながら取得した蛍光検出数値をグラフ化している。具体的には、Ｃｙ３色素（アマシャムファルマシア）を１０−６Ｍから２倍希釈で６段階作製した色素希釈系列を搭載したガラス製マイクロアレイ基板Ａｔｌａｓ  Ｈｕｍａｎ３．８（ベクトンディッキンソン）のデータをまとめてある。このように、蛍光色素濃度とＰＭＴ感度とには対数的な変化が見られており、様々な色素濃度について同実験を行うと、ひとつの面として最適な観察条件のデータを表すことができる。
【００２８】
このグラフにおいて、蛍光強度数値が２５５を越えるようなスポットは数値が飽和しており、データの解釈が不可能である。また蛍光強度数値が低い場合には、検出時のさまざまな誤差の影響を受け数値が安定しないため、ある程度の蛍光強度数値が保持されている条件での取得データを解析に用いることが望ましい。
また図２（ｂ）に示すように、レーザー強度を変化させたデータについても同様の傾向が見られる。このように蛍光観察では、ＰＭＴ感度またはレーザー強度のどちらかを固定化し、一度ラフスキャンによりデータを取得した後、そのデータを元にして、最適な観察条件にてそれぞれの領域を観察可能な、強度変調方式または時間幅（パルス幅）変調方式によりデータを取得する。
【００２９】
図３は、マーカー付きマイクロアレイ基板の構成を示す図である。図３に示すように、マイクロアレイ基板上のスポットの位置を、何らかの位置マーカーを配することで決定して認識可能とし、多数のスポットに対して格子状の領域区分（分割）をしておく。これにより、初回の観察にて観察範囲外にあり最適に観察できなかったスポットの位置を認識し、そのスポットのみ、更に別条件でデータを取り直すことも可能である。固定した動作でなく、目的のスポットをランダムにスキャンすることにより、観察時間の削減と、蛍光色素の褪色等への影響が少なくなると考えられる。
【００３０】
また、絶対的な濃度を必要とする際には、マイクロアレイ基板側に補正用の濃度既知スポットを置いておくとよい。
【００３１】
これらの工程により、観察データにＰＭＴ感度、レーザー強度などの変換率を反映させて、ダイナミックレンジの広がった連続的なデータを取得することができる。そして取得されたデータを基に、画像形成部４にてマイクロアレイ画像を形成することができる。
【００３２】
（第２の実施の形態）
本第２の実施の形態では、高輝度から低輝度までのスポットを含むマイクロアレイ基板に対して、ＰＭＴ感度またはレ一ザー強度のどちらかの条件を固定化し、固定化した以外の条件を段階的に変化させていき複数枚のデータを取得する。さらに、マイクロアレイ基板上に、濃度が段階的に既知な複数のコントロールスポットを置き、これらのコントロールスポットに対してＰＭＴ感度またはレーザー強度を変化させ取得したデータを補正データとする。
【００３３】
そして画像形成部４にて、取得しているマイクロアレイ基板のデータに対して、各補正データを加算（合算）していき一連のデータを得て、この一連のデータを合成してマイクロアレイ画像を形成する。なお、合算手法は一般的に行われている手法で実現可能である。
【００３４】
以上のように本実施の形態によれば、高輝度から低輝度までのプローブＤＮＡを含むマイクロアレイ基板のすべてのスポットから、広いダイナミックレンジのデータを取得することが可能になる。
【００３５】
なお、本発明は上記各実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、ダイナミックレンジを広げ高輝度から低輝度までのデータを取得できるマイクロアレイ観察における画像処理方法及び画像処理装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る画像処理装置の概略構成を示すブロック図。
【図２】本発明の実施の形態に係るＰＭＴ感度またはレーザー強度の変化に伴う蛍光強度数値を示す図。
【図３】本発明の実施の形態に係るマーカー付きマイクロアレイ基板の構成を示す図。
【図４】従来例に係るマイクロアレイ観察画像。
【符号の説明】
１…蛍光検出装置
２…レーザー出力制御部
３…ＰＭＴ感度制御部
４…画像形成部
【図１】
2004317366.tif 000003
【図２】
2004317366.tif 000004
【図３】
2004317366.tif 000005
【図４】
2004317366.tif 000006