(57)【要約】【課題】安価な構成で、Ｓ／Ｎおよび空間分解能を高くできる実用性に優れた顕微鏡を提供する。【解決手段】少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料２０に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するための第１の光源１１からの第１の光と、上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するための第２の光源１２からの第２の光とを、一部重ね合わせて照射して、試料２０からの発光を検出するようにした顕微鏡において、第１の光源１１または第２の光源１２の少なくとも一方を連続発振レーザを有して構成すると共に、該連続発振レーザからの光を強度変調して疑似パルス化する強度変調手段１３，１５（１４，１６）を設ける。【選択図】        図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するための第１の光源からの第１の光と、上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するための第２の光源からの第２の光とを、一部重ね合わせて照射して、上記試料からの発光を検出するようにした顕微鏡において、
上記第１の光源または上記第２の光源の少なくとも一方を連続発振レーザを有して構成すると共に、該連続発振レーザからの光を強度変調して疑似パルス化する強度変調手段を設けたことを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
上記第１の光源および上記第２の光源のそれぞれを連続発振レーザを有して構成すると共に、いずれか一方の光源からの光を上記強度変調手段により強度変調するように構成したことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
上記第１の光源および上記第２の光源のそれぞれを連続発振レーザを有して構成し、上記強度変調手段を上記第１の光源および上記第２の光源に対応して設けて、少なくとも上記第１の光を上記試料に照射するときは、上記第２の光も同時に上記試料に照射するように、上記第１の光および上記第２の光を強度変調するように構成したことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項４】
上記連続発振レーザは、ガスレーザ、イオンレーザ、半導体レーザ、固体レーザのいずれかであることを特徴とする請求項１，２または３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
上記強度変調手段は、電気光学素子または音響光学素子を有することを特徴とする請求項１，２，３または４に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の新しい光学顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図７〜図１０を参照して説明する。図７は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図７に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図８に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図９に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１０に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図８の吸収過程や図１０の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図８のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図９のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図９の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図７に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１１は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、更に波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図１１はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１１に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１２は、図１１と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１２において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１２の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
さらに、波長λ１と波長λ２との２つの光の照射タイミングを工夫することで、Ｓ／Ｎを改善でき、かつ蛍光抑制を効果的に起す条件も提案されており、これにより超解像性をより効果的に発現することも可能である（例えば、特許文献３参照）。
【００１８】
このような超解像顕微鏡法の具体例として、蛍光ラベラー分子をＳ０状態からＳ１状態へ励起する波長λ１の光（特にレーザ光）をポンプ光とし、Ｓ１状態からＳ２状態へ励起する波長λ２の光をイレース光として、図１３に示すように、光源８１からポンプ光を、光源８２からイレース光をそれぞれ放射させ、ポンプ光はダイクロイックミラー８３で反射させた後、集光光学系８４により試料８５上に集光させ、イレース光は位相板８６で中空ビーム化した後、ダイクロイックミラー８３を透過させてポンプ光と空間的に重ね合わせて集光光学系８４により試料８５上に集光させるようにしたものが提案されている（例えば、特許文献４参照）。
【００１９】
この顕微鏡によると、イレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光は抑制されるので、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域（Δ＜０．６１・λ１／ＮＡ、ＮＡは集光光学系８４の開口数）に存在する蛍光ラベラー分子のみが観察されることになり、結果的に超解像性が発現することになる。なお、イレース光を中空ビーム化する位相板８６は、例えば、図１４に示すように、光軸に対して点対称な位置で位相差πを与えるように構成したものや、液晶面を用いた光空間変調器、あるいはミラー自身の形状を波長オーダーで制御するデフォーマブルミラーを用いることができる。
【００２０】
【特許文献１】
特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】
特開２００１−１００１０２号公報
【特許文献３】
特開平１１−９５１２０号公報
【特許文献４】
特開２００１−２７２３４５号公報
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、本発明者らによる種々の実験検討によると、従来提案されている超解像蛍光顕微鏡にあっては、以下に説明するような改良すべき点があることが判明した。
【００２２】
以下、超解像蛍光顕微鏡を図１５に示すように構成した場合を例にとって説明する。図１５に示す超解像蛍光顕微鏡は、上記の特許文献２に開示されているもので、ローダミン６Ｇで染色された試料１００を観察するものである。この顕微鏡では、モードロック型のＮｄ：ＹＡＧレーザ１０１から出射される波長１０６４ｎｍのレーザ光をベータ硼酸バリウム（ＢＢＯ）結晶からなる波長変換素子１０２により２倍高調波の波長５３２ｎｍのレーザ光に波長変換し、このレーザ光をハーフミラー１０３で透過光と反射光との二光路に分岐して、その透過光をポンプ光としてダイクロイックミラー１０４および１０５を順次透過させた後、対物レンズ１０６により二次元移動ステージ１０７上に載置された試料１００に集光させるようにしている。
【００２３】
また、ハーフミラー１０３での反射光は、反射ミラー１０８で反射させた後、Ｂａ（ＮＯ３）２  結晶からなるラマンシフタ１０９で波長５９９ｎｍのレーザ光に波長変換し、このレーザ光をイレース光として反射ミラー１１０で反射させた後、位相板１１１により中空ビームに整形し、さらにダイクロイックミラー１０４によりポンプ光と同軸上に揃えて、ダイクロイックミラー１０５を経て対物レンズ１０６により試料１００に集光させるようにしている。
【００２４】
一方、試料１００からの蛍光は、対物レンズ１０６を経てダイクロイックミラー１０５で反射させた後、蛍光集光レンズ１１２、シャープカットフィルタ１１３およびピンホール１１４を経てフォトマル１１５で受光するようになっている。なお、試料１００に投射されるポンプ光およびイレース光は、フォトマル１１６で受光され、その出力に基づいてＮｄ：ＹＡＧレーザ１０１から出射されるレーザ光の強度が一定となるようにフィードバック制御されるようになっている。
【００２５】
このような構成の超解像蛍光顕微鏡においては、ポンプ光およびイレース光の品質によって超解像性の発現精度が大きく影響される。すなわち、理想的な形状をもったポンプ光およびイレース光が、試料面の所望の位置に結像されないと、空間分解能が低下することになる。
【００２６】
ここで、ポンプ光およびイレース光のビーム品質は、レーザ光源によって決まる。その主な要素としては、１）位置安定性、２）レーザビーム波面の均一性、３）レーザ強度の安定性、が挙げられる。
【００２７】
蛍光抑制効果は、イレース光の瞬時強度のみに依存するため、上記の特許文献２をはじめとする先行例では、蛍光抑制効果を効率的に誘起するために、ポンプ光およびイレース光の光源として、容易に瞬時値の高い光を発生できるパルスレーザを用い、それらのレーザから発生するパルス光の同期を取って試料面に同時に照射するようにしている。
【００２８】
しかしながら、一般に、パルスレーザは発振が不安定であり、１ショット毎の強度変動や、レーザ光軸の位置ぶれを起こし易い。このため、強度変動によってＳ／Ｎが低下することになり、レーザ光軸の位置ぶれによって試料集光点の位置が変動して、実質的な空間分解能が低下することになる。
【００２９】
また、イレース光に対しては、波面の問題もある。すなわち、イレース光を光空間変調により中空ビーム化するためには、イレース光の波面の均一性が保証されていることが前提であり、少なくともλ／４以内で波面が揃っていないと、ビーム中央で強度極小値をもつ中空ビームは生成できない。
【００３０】
しかし、実際には、パルスレーザの波面は極めて悪い。そのため、通常は、光源に空間フィルタを挿入して、イレース光が均一波面をもつように工夫している。ところが、この方法ではイレース光の強度の大半が失われ、しかも空間フィルタのピンホールが損傷してしまうという深刻な問題がある。
【００３１】
なお、ビーム品質に優れた高性能なパルスレーザとして、モードロックＹＡＧレーザが知られているが、このレーザは非常に高価であるため、製品に組み込むには不適切であると共に、パルスの発振周波数が固定になっていることから、実用化の際のネックになっている。
【００３２】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、安価な構成で、Ｓ／Ｎおよび空間分解能を高くできる実用性に優れた顕微鏡を提供することにある。
【００３３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する請求項１に係る発明は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するための第１の光源からの第１の光と、上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するための第２の光源からの第２の光とを、一部重ね合わせて照射して、上記試料からの発光を検出するようにした顕微鏡において、
上記第１の光源または上記第２の光源の少なくとも一方を連続発振レーザを有して構成すると共に、該連続発振レーザからの光を強度変調して疑似パルス化する強度変調手段を設けたことを特徴とするものである。
【００３４】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、上記第１の光源および上記第２の光源のそれぞれを連続発振レーザを有して構成すると共に、いずれか一方の光源からの光を上記強度変調手段により強度変調するように構成したことを特徴とするものである。
【００３５】
請求項３に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、上記第１の光源および上記第２の光源のそれぞれを連続発振レーザを有して構成し、上記強度変調手段を上記第１の光源および上記第２の光源に対応して設けて、少なくとも上記第１の光を上記試料に照射するときは、上記第２の光も同時に上記試料に照射するように、上記第１の光および上記第２の光を強度変調するように構成したことを特徴とするものである。
【００３６】
請求項４に係る発明は、請求項１，２または３に記載の顕微鏡において、上記連続発振レーザは、ガスレーザ、イオンレーザ、半導体レーザ、固体レーザのいずれかであることを特徴とするものである。
【００３７】
請求項５に係る発明は、請求項１，２，３または４に記載の顕微鏡において、上記強度変調手段は、電気光学素子または音響光学素子を有することを特徴とするものである。
【００３８】
先ず、本発明の原理について説明する。本発明では、第１の光源または第２の光源の少なくとも一方を連続発振レーザを有して構成して、該連続発振レーザからの光を強度変調手段により強度変調して疑似パルス化を図る。これにより、高価なパルス発振型のレーザを用いることなく、Ｓ／Ｎおよび空間分解能を高くすることが可能となる。ここで、強度変調手段は、例えば電気光学素子あるいは音響光学素子を用いて構成することができる。
【００３９】
音響光学素子は、音波が光に及ぼす効果（例えば、偏向、回折、変調、位相シフト、周波数シフト、複屈折など）を利用したものである。この音響光学素子では、音波により光学的な屈折率を音速の周期で変動させ、その際に音と光の波長によって、以下の３種類の効果が現れる。
【００４０】
１）音の波長が長いときは、十分に細い光束を音の進行方向と直角方向に通すと、屈折率勾配が生じて光線が湾曲し、音の周波数で光線が偏向走査される。
２）音の波長が短くなると、音波は光束に対して回折格子として作用する。
３）音の波長が更に短くなって、光の波長オーダになると、垂直入射では回折が生じなくなり、特定の入射角において強いブラッグ回折を起こす。
【００４１】
周波数ｆの音波によるｍ次の回折光は、ドプラー効果によりｍｆだけ、その周波数をずらす。また、その回折角θｍは、光の波長をλ、音波の波長をΛとすると、ｓｉｎθｍ＝ｍλ／Λ、で与えられる。
【００４２】
レーザ光偏向や変調に用いる音響光学変調器は、この効果を応用したもので、図１はその原理的構成を示している。図１に示すように、音響光学変調器１は、音響光学素子２に圧電素子３を接着して構成され、圧電素子３により超音波を発生させて音響光学素子２を伝播させ、その状態で音響光学素子２に光を入射させることにより、入射光を回折させるもので、図１はブラッグ反射による回折を示している。この音響光学変調器１は、音響光学素子２として、例えばＰｂＭｏＯ４やＴｅＯ２結晶を用いれば、１０ＭＨｚ帯域まで変調が可能である。
【００４３】
また、電気光学素子は、物質に外部から電場を印加したときに、その物質の屈折率が変化する現象を利用したもので、その際の屈折率の変化が印加電場の一次に比例する場合をポッケルス効果と言われている。圧電結晶では、印加電場の周波数が圧電共鳴周波数より小さいときは、圧電効果による結晶の弾性変形が印加電場の変化に追従して、弾性変形による屈折率の変化が同時に起きる。一方、周波数が高い場合には、圧電結晶の弾性変形が追従できず、屈折率の変化は印加電場の強さの２乗に比例するようになる。この場合を束縛状態の二次電気光学効果によるカー効果と呼ばれる。このような電気光学効果は、光の強度変調に応用できる。
【００４４】
図２は、電気光学素子を用いた電気光学変調器の原理的構成を示すものである。この電気光学変調器５は、ポッケルス効果を利用したポッケルスセルで、光の入射側から出射側に向けて順次に配置された偏光子６、電気光学素子７、１／４波長板８、および検光子９を有しており、偏光子６と検光子９とは偏光軸が直交している。電気光学素子７は、ＫＤＰ（リン酸二水化カリウム）等のポッケルス効果の大きい圧電結晶を用い、この圧電結晶に電極（図示せず）を介して電源１０を選択的に接続することにより電場を印加する。電源１０の接続方法すなわち電場の印加方法には、光の進行方向と直角方向に印加する横型光強度変調法と、平行に電場を印加する縦型光変調方法とがある。図２は、縦型光変調方法の場合を示しており、この場合には電気光学素子７の入射端面および出射端面に、光路を遮らないように、リング状の電極や透明電極を設けて電源１０を選択的に接続するようにしている。
【００４５】
図２に示す電気光学変調器５において、電気光学素子７の圧電結晶が一軸性結晶の場合には、電源１０により光軸方向に電場を印加すると複屈折を生じ、偏光子６を経て電気光学素子７に入射した直線偏光は楕円偏光に変換されて、１／４波長板８を経て検光子９に入射し、検光子９の偏光軸方向の成分が透過することになる。これに対し、電気光学素子７に電場を印加しない状態では、電気光学素子７は一軸性で光は全く透過しない。このように、電気光学素子７に選択的に電場を印加することにより、入射光を変調でき、例えばナノ秒オーダの光スイッチングが可能となる。
【００４６】
本発明の好適一実施の形態においては、上記の音響光学変調器１または電気光学変調器５を、連続発振（ＣＷ）レーザ光源の光路に挿入して電気的に制御することにより、超解像顕微鏡システムと相応しいパルス光源を実現する。これにより、Ｈｅ・Ｎｅレーザ、Ａｒレーザ、Ｋｒレーザ、Ｔｉサファイアレーザ等のＣＷレーザの優れたビーム品質を保持したまま、パルス化が可能となる。しかも、電気的制御により任意の発振周波数を選ぶことができるので、例えばポンプ光とイレース光とのパルス発振のタイミングおよびパルス幅を電気的に簡便に制御でき、これにより超解像顕微鏡の基礎をなす蛍光抑制効果を効率的に誘起することが可能となる。
【００４７】
その結果として、超解像性も向上し、分解能において差別化された高機能な顕微鏡を提供することが可能となる。また、既にレーザ走査型顕微鏡システムにおいて幅広く導入され、実績も高いＨｅ・Ｎｅレーザ等のガスレーザの利用も可能となり、より実用面において優れたユーザーフレンドリーな顕微鏡システムを提供することが可能となる。
【００４８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明による顕微鏡の一実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００４９】
図３は、本発明の一実施の形態における顕微鏡の光学系の要部構成を示す図である。本実施の形態の顕微鏡は、ＣＷのポンプ光およびイレース光をともに音響光学変調器により強度変調して試料に照射するようにした超解像蛍光顕微鏡を示すものである。以下、ローダミン６Ｇで染色された生体試料を観察する場合を例にとって説明する。
【００５０】
ローダミン６Ｇは、波長５３０ｎｍ近傍に基底状態（Ｓ０）から第１電子励起状態（Ｓ１）に励起される吸収帯があり、また、波長６００ｎｍ〜６５０ｎｍの帯域に第１電子励起状態（Ｓ１）から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態（Ｓ２）に励起される二重共鳴吸収帯域が存在することが確認されている（例えば、Ｅ．Ｓａｈａｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｔｒｅｖｅｓ：ＩＥＥＥ，Ｊ．Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ．，ＱＥ−１３，６９２（１９７７）参照）。
【００５１】
そこで、本実施の形態では、ポンプ光を発生する光源として波長５４３．５ｎｍのレーザ光を連続発振するＨｅ・Ｎｅレーザ１１を用い、イレース光を発生する光源として波長６４７．１ｎｍのレーザ光を連続発振するＫｒレーザ１２を用いる。
【００５２】
Ｈｅ・Ｎｅレーザ１１からのポンプ光、およびＫｒレーザ１２からのイレース光は、それぞれ図１と同様の構成の音響光学変調器（ＡＯＭ）１３，１４に入射させ、これらＡＯＭ１３，１４を対応するパルス発生器１５，１６により制御して、それぞれ疑似パルス化する。すなわち、ＡＯＭ１３，１４に対し、対応するパルス発生器１５，１６から所望のパルス幅と周期の電圧を印加して、電圧印加時に入射光を音響光学変調することにより、ＡＯＭ１３，１４を透過させて疑似パルス光を得る。
【００５３】
ＡＯＭ１３を透過するポンプ光は、ビームコンバイナ１７およびハーフミラー１８で反射させて対物レンズ１９により試料２０に集光させる。また、ＡＯＭ１４を透過するイレース光は、位相板２１に入射させて中空ビームに空間変調した後、反射ミラー２２で反射させてビームコンバイナ１７に入射させることによりポンプ光と同軸上に合成して、ハーフミラー１８および対物レンズ１９を経て試料２０に集光させる。
【００５４】
位相板２１は、例えば図４に示すように、石英基板を光軸の周りに８分割し、各々の領域をイレース光の波長に対してλ／８ずつ位相差を段階的に与えて構成する。より具体的には、化学エッチング法により、石英基板を浸食して光路長を制御する。このような位相板２１を通すことで、イレース光はビーム面において、光軸に関して反対位相をもつ位相分布を持つようになり、その結果として、光軸中央で光強度がゼロとなるイレース光が得られる。
【００５５】
試料２０は、試料移動ステージ２３上に載置し、この試料移動ステージ２３を二次元駆動することで、ポンプ光およびイレース光により試料２０を二次元走査する。
【００５６】
一方、上記のポンプ光およびイレース光の照射により試料２０から発する蛍光は、対物レンズ１９を経た後、ポンプ光の波長成分（波長５４３．５ｎｍ）を除去するノッチフィルタ２４およびイレース光の波長成分（波長６４７．１ｎｍ）を除去するノッチフィルタ２５を経てハーフミラー２６に入射させ、該ハーフミラー２６で反射される試料２０からの蛍光をレンズ２７によりピンホール２８の中央に集光させて、ピンホール２８を透過した蛍光をレンズ２９によりフォトマル３０に入射させて検出する。ここで、ピンホール２８は共焦点位置に配置されており、空間フィルタとして機能する。これは、試料２０以外から発する、例えば光学系からの蛍光や散乱光をカットして測定のＳ／Ｎを高める作用をなすのと同時に、試料２０内の特定の深さ部分から発光した蛍光のみを選別するオプティカルセクショニングの機能をもつ。
【００５７】
また、ハーフミラー２６を通過した蛍光は、結像レンズ３１を有するＣＣＤカメラ３２により結像して蛍光スポット像を直接観察できるようにし、対物レンズ１９のピント合わせ等に利用する。
【００５８】
上記構成において、ＡＯＭ１３，１４は、音響光学素子として、例えばＰｂＭｏＯ４を用いれば、対応するパルス発生器１５，１６からの入力電気パルスに対する立ち上がり応答時間を５ｎｓｅｃ程度とすることができるので、ポンプ光およびイレース光の疑似パルス光として、ナノ秒パルスレーザと同等のパルス幅で、ＭＨｚオーダの繰り返し周波数を得ることができる。
【００５９】
本実施の形態では、図５に示すように、試料２０に照射するイレース光のパルス幅をポンプ光のそれよりも長く、かつポンプ光を試料２０に照射するときはイレース光も同時に照射するように、ＡＯＭ１３，１４を対応するパルス発生器１５，１６により制御して、生成するポンプ光およびイレース光の疑似パルスの位相および周波数を調整する。特に、位相に関しては、ＰｂＭｏＯ４の個体差により、数ナノ秒程度の変調時の位相差が発生するで、パルス発生器１５，１６により蛍光抑制効果の発現を最適化する。このようにすれば、時間領域においてポンプ光とイレース光とを確実に重複できるので、蛍光抑制効果を確実に誘導でき、超解像を実現することができる。
【００６０】
なお、本発明は上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記実施の形態では、ＣＷのポンプ光およびイレース光の双方を、それぞれ音響光学変調器により強度変調して疑似パルス化したが、いずれか一方のみを疑似パルス化するように構成することもできる。また、音響光学変調器に代えて、図２に示したようなポッケルス効果を利用する電気光学変調器を用いることもできる。特に、電気光学変調器は、電気光学素子として例えばＫＤＰを用いることにより、耐レーザ閾値を高くできるので、比較的強度の高いイレース光を用いる超解像顕微鏡には好適である。
【００６１】
また、強度変調手段は、上述した音響光学変調器や電気光学変調器に限らず、図６に示すような回転板３５を用いて構成することもできる。回転板３５は、回転中心の周りに透過部３６と遮光部３７とを交互に配置して構成し、この回転板３５を高速で回転させてＣＷレーザ光をチョップすることにより、ＣＷレーザ光を疑似パルス化する。生成する疑似パルスの発振周波数は、回転板３５の回転数で調整し、パルス幅は透過部３６と遮光部３７との面積比で調整する。この回転板３５は、図３において、ビームコンバイナ１７とハーフミラー１８との間の光路に配置して、ポンプ光とイレース光とを同時にパルス化したり、Ｈｅ・Ｎｅレーザ１１とビームコンバイナ１７との間の光路またはＫｒレーザ１２とビームコンバイナ１７との間の光路に配置してポンプ光またはイレース光をパルス化したり、あるいは両光路に配置してポンプ光およびイレース光を独立してパルス化したり、することができる。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によれば、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するための第１の光を発生する第１の光源、または上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するための第２の光を発生する第２の光源の少なくとも一方を連続発振レーザとし、かつ、該連続発振レーザからの光を強度変調手段により強度変調して疑似パルス化するようにしたので、安価な構成で、Ｓ／Ｎおよび空間分解能の高い実用性に優れた顕微鏡を実現することができる。特に、連続発振レーザとして、ビームの波面および位置安定性の良好なガスレーザーを用いれば、第２の光（イレース光）のビーム整形や、ビームの位置ズレよる空間分解能劣化を防止できるので、超解像性および分解能に優れた超解像顕微鏡を実現することができる。したがって、レーザを専門としない一般ユーザ、特に生物系研究者にとって作業性の良い顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る顕微鏡に使用可能な音響光学変調器の原理的構成を示す図である。
【図２】同じく、電気光学変調器の原理的構成を示す図である。
【図３】本発明の実施の形態を示す超解像顕微鏡の概略構成図である。
【図４】図３に示す位相板の構成を示す図である。
【図５】図３に示す実施の形態によるポンプ光とイレース光との疑似パルスを示す図である。
【図６】本発明の変形例を説明するための図である。
【図７】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図８】図７の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図９】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図１０】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図１１】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１２】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１３】従来の超解像顕微鏡の一例の構成を示す図である。
【図１４】図１３に示す位相板の構成を示す平面図である。
【図１５】従来の超解像顕微鏡の他の例の構成を示す図である。
【符号の説明】
１  音響光学変調器
２  音響光学素子
３  圧電素子
５  電気光学変調器
６  偏光子
７  電気光学素子
８  １／４波長板
９  検光子
１０  電源
１１  Ｈｅ・Ｎｅレーザ
１２  Ｋｒレーザ
１３，１４  音響光学変調器（ＡＯＭ）
１５，１６  パルス発生器
１７  ビームコンバイナ
１８，２６  ハーフミラー
１９  対物レンズ
２０  試料
２１  位相板
２２  反射ミラー
２３  試料移動ステージ
２４，２５  ノッチフィルタ
２７，２９  レンズ
２８  ピンホール
３０  フォトマル
３１  結像レンズ
３２  ＣＣＤカメラ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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