(57)【要約】      （修正有）【課題】酸化ストレス判定方法および酸化ストレス判定キットとして、糖尿病や腎疾患の安定且つ簡便な汎用性の高い病態評価手段を提供する。【解決手段】インビトロ作製の変性物質と被検材料である体液由来産物の反応複合体に対して、該変性物質と反応する変性物質結合材を反応させる変性物質はメイラード反応由来産物，被検材料は糖尿病あるいは腎疾患の患者由来である。変性物質結合材は、ＲＡＧＥ誘導体あるいは抗体の何れかで構成される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ作製の変性物質と被検材料である体液由来産物との反応複合体に対して、該変性物質と反応する変性物質結合材を反応させることを特徴とする酸化ストレス判定方法。
【請求項２】
インビトロ作製の変性物質と被検材料である体液由来産物との複合体形成反応、および変性物質と該変性物質と反応する変性物質結合材との反応を同時に行うことを特徴とする酸化ストレス判定方法。
【請求項３】
前記変性物質あるいは前記反応複合体の少なくとも何れかかが、水不溶性担体に固相化されていることを特徴とする請求項１または２記載の酸化ストレス判定方法。
【請求項４】
前記変性物質がメイラード反応由来産物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の酸化ストレス判定方法。
【請求項５】
前記反応複合体中の前記変性物質結合材を特異的に検出することを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の酸化ストレス判定方法。
【請求項６】
前記変性物質結合材が前記被検材料には含まれない抗原性を有することを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載の酸化ストレス判定方法。
【請求項７】
前記変性物質結合材が、ＲＡＧＥ誘導体、あるいは、抗体の何れかで構成されることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載の酸化ストレス判定方法。
【請求項８】
前記被検材料が糖尿病あるいは腎疾患の少なくとも何れかを基礎疾患に持つ患者由来であることを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載の酸化ストレス判定方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れかに記載の酸化ストレス判定方法を用いた体液処理材料の評価方法。
【請求項１０】
請求項１〜８の何れかに記載の酸化ストレス判定方法を用いた腎疾患障害度の評価方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れかに記載の酸化ストレス判定方法用途の酸化ストレス判定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インビトロ作製の変性物質と被検材料である体液由来産物との反応複合体に対して、該変性物質と反応する変性物質結合材を反応させることを特徴とする酸化ストレス判定方法、体液処理材料の評価方法、並びに糖尿病や腎疾患障害度の評価方法、酸化ストレス判定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体内の物質は様々な酸化ストレスに曝されて、様々な変性物質が発生していることが分かりつつある。生体内の酸化ストレスが異常亢進する疾患のひとつに腎疾患が挙げられる。酸化ストレスの種類には、ヒドロキシラジカル、一酸化窒素、パーオキシナイトライト等に代表されるラジカル種によるラジカルストレスや、還元糖やその反応誘導体が属するジカルボニル化合物やα−ヒドロキシアルデヒド等に代表される反応性カルボニル種によるカルボニルストレスが知られている。上述の腎疾患患者に代表されるように酸化ストレスが亢進する体内には、様々な酸化ストレス産物が異常発生することが知られているが（例えば、非特許文献１参照。）、酸化ストレスに曝されることで発生した変性物質自身が病因物質となり、病態を更に悪化させることが知られるようになってきた（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００３】
例えば、糖尿病性合併症の共通の病変と言える血管病変を発症する病因物質の候補として、ＡＧＥ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）に代表される各種変性物質に注目が集まっている。これまで知られている糖尿病性合併症とＡＧＥの関係は、体内のＡＧＥ量が亢進するに伴い、糖尿病性合併症が悪化するという報告である（例えば、非特許文献３参照。）。上述したＡＧＥとは、主に糖尿病性合併症の原因物質と考えられているものであり、血液中に存在するブドウ糖に代表される還元糖やその代謝産物や反応産物と、タンパク質や脂質などの低分子が酵素の関与なしに、つまり、非酵素的に反応する前進性糖化反応（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）と呼ばれるメイラード反応の産物であり、総称してカルボニルストレス産物とも呼ばれることもある（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００４】
これまでの研究の流れでは、カルボニルストレスに代表される酸化ストレスが異常亢進する患者体内のＡＧＥを検出するための様々な試行が繰り返された（例えば、非特許文献５参照。）。特に、特異的検出方法の代表例として、ＡＧＥに対する抗体を用いた免疫化学的検出方法が好んで用いられたが、操作が煩雑な点や研究施設によって結果が異なる点や多種多様なＡＧＥ構造全てに対応できないという大きな課題があった。加えて、ＡＧＥ全てが病態悪化の原因とはならないことも知られるようになり（例えば、非特許文献４参照。）、ＡＧＥの病因性を如何に簡便に評価するかが望まれるようになった。
【０００５】
一方で、病因物質としての性質を持つ非酵素的変性物質は、主に細胞上のある特殊な受容体と結合することで引き起こされることが分かってきた。その多くは一般的にスカベンジャー受容体と呼ばれるものだが、本来別の機能を有する受容体にカルボニルストレス産物などの非酵素的変性物質が相互作用することで病因性を引き起こす場合も報告されている（例えば、非特許文献６参照。）。ガレクチン−３、ＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥ）などである。特にＲＡＧＥは糖尿病の３大合併症である腎症、網膜症、神経症の発症を引き起こすだけではなく、動脈硬化も助長することがわかってきた。最近になり、動物レベルでＲＡＧＥと糖尿病状態で亢進するある特定の物質との相互作用で糖尿病性合併症などの血管障害が引き起こされることが証明されつつある（例えば、非特許文献７参照。）。しかし、具体的にどのような構造のＡＧＥがＲＡＧＥと結合するのかはほとんど分かっておらず、ＡＧＥが関係する病態診断に注目した安定且つ簡便な汎用性の高い評価方法は見出されていなかった。更には、ＡＧＥが患者体内で亢進することを検出する方法のみ集中して開発が試みられ（特許文献１参照。）、患者体内のＡＧＥに代表される各種酸化ストレスによって生み出された変性物質に対する中和能力を簡便に評価する方法の開発はほとんどなかった。
【０００６】
また、ＡＧＥに代表される変性物質量が増加する病態としては、各種腎疾患や糖尿病合併症の他にも、人工透析、高脂血症、動脈硬化に代表される血管障害、老化、アルツハイマー病、癌等の様々な難治性の大衆疾患で関与すると知られるようになり、変性物質の病因性を安定且つ簡便に汎用性の高い評価方法で見出すことは、変性物質に注目した病態診断や治療技術の開発に大いに役立つ。
【０００７】
【特許文献１】
特開平１０−３３２６９３号公報
【０００８】
【非特許文献１】
ドネイト（Ｄｏｎａｔｅ  Ｔ），他１２名，  「透析患者に於けるタンパク質性の酸化ストレス（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．）」，アドバンシズ・イン・ペリトニール・ダイアリシス（ＡＤＶＡＮＣＥＳ  ＩＮ  ＰＥＲＩＴＯＮＥＡＬ  ＤＩＡＬＹＳＩＳ），２００２年，第１８巻，ｐ１５−１７
【０００９】
【非特許文献２】
キッカワ（Ｋｉｋｋａｗａ  Ｒ），  他２名，「糖尿病性腎症の進展（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．）」，アメリカン・ジャーナル・オブ・キドニー・ディジージズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ），２００３年，第４１巻，ｐＳ１９−Ｓ２１
【００１０】
【非特許文献３】
マキタ（Ｍａｋｉｔａ  Ｚ），他８名，  「糖尿病性神経障害患者における前進性糖化反応産物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．）」，ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１９９１年，第３２５巻，ｐ８３６−８４２
【００１１】
【非特許文献４】
ミヤタ（Ｍｉｙａｔａ  Ｔ），  他８名，「末期腎不全患者での前進性糖化最終産物の形成に於ける増加した酸化ストレスの関与（Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ．）」，キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ），１９９７年，第５１巻，４号，ｐ１１７０−１１８１
【００１２】
【非特許文献５】
マキタ（Ｍａｋｉｔａ  Ｚ），他３名，  「生体内の前進性糖化反応最終産物の免疫化学的検出（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．）」，ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１９９２年，第２６７巻，ｐ５１３３−５１３８
【００１３】
【非特許文献６】
シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＡＭ），他５名，「前進性糖化最終産物に対する細胞表面結合タンパク質によるヒト単核球系食細胞の移動制御（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）」，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ），１９９３年，第９１巻，ｐ２１５５−２１６８
【００１４】
【非特許文献７】
ヤマモト（山本靖彦），  他８名，「ヒトＲＡＧＥをトランスジーンとしたマウスの糖尿病性腎病変」，糖尿病（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ），１９９９年，第４２巻，補１，ｐＳ−１９４
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、インビトロ作製の変性物質と被検材料である体液由来産物との反応複合体に対して、該変性物質と反応する変性物質結合材を反応させることを特徴とする酸化ストレス判定方法および酸化ストレス判定キットであり、糖尿病や腎疾患の安定且つ簡便な汎用性の高い病態評価手段の提供を目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、酸化ストレスが亢進する被検体では変性物質との結合性能も有意に低下することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
つまり本発明は、上記目的を達成するために主として以下の構成を有する。
「（１）インビトロ作製の変性物質と被検材料である体液由来産物との反応複合体に対して、該変性物質と反応する変性物質結合材を反応させることを特徴とする酸化ストレス判定方法。」
「（２）上記（１）項に記載の酸化ストレス判定方法を用いた体液処理材料の評価方法。」
「（３）上記（１）項に記載の酸化ストレス判定方法を用いた腎疾患障害度の評価方法。」
「（４）上記（１）〜（３）項に記載の酸化ストレス判定方法用途の酸化ストレス判定キット。」
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
本発明で言うところの変性物質とは非酵素的な反応を介した反応産物を意味し、ラジカルストレス産物やカルボニルストレス産物、あるいは、両者の影響を受けた産物であっても良い。好ましくは、変性物質を作り出す原材料である被反応物と反応基質が非酵素的反応、つまり、化学反応して生成した反応産物が、続けて、他の反応基質と反応したり、更に、自己開裂、官能基脱離や自己酸化などの自己反応を複合的に起こして、連続的に反応産物の化学的構造が変化することができる反応産物を言う。連続的に起こる前進性反応に於いて、反応を触媒する物質（例えば、酵素や重金属化合物）が介在しても良く、また、酵素が介在しない反応、つまり、非酵素的反応と言った化学反応であっても良く、特に限定を受けない。
【００２０】
被反応物とは、生体内にある物質や外部から体内に取り込んで酵素的に代謝、又は、非酵素的に化学反応した物でも、化学合成された非生体物質でも良い。更に、この被反応物の生体内にある物質の例としては、体内に存在する有機化合物であればよく、例えば、タンパク質やペプチド、アミノ酸、核酸、脂質、糖及び多糖体、ビタミンやこれらの複合体（例えば、糖タンパク質や糖脂質、リン脂質）が挙げられるが、その中でも好ましくは塩基性官能基が含まれていれば良く、前進性反応し得る被反応物ならば特に限定を受けない。ここで言う前進性反応とは連続反応を意味し、その主たる反応例にはメイラード反応が挙げられる。メイラード反応の特徴として、反応中に薄黄色〜茶色に着色し、更に反応が進むことにより、場合によっては最終的に、褐色になる場合がある。本発明で言うところの着色性を評価するには、分光光度計（日立分光光度計）で着色度を評価する場合には、上記調製試料の濃度をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに調製した時の吸光波長３３０ｎｍの吸光度が、低分子アルデヒド由来の前進性反応を受ける前後で５％以上増加することを言い、更に２０％以上ならば好ましく、５０％以上ならばより好ましい。
【００２１】
更に、上記の被反応物と反応する反応基質とは、体内で代謝されて生成する物質や体外から体内に摂取される全炭素数２個以上のアルデヒド官能基やジカルボニル官能基やα−ヒドロキシアルデヒド基を有する化合物であれば、特に限定を受けない。具体的には、グルコース、フルクトースやリボース、或いはそれらリン酸化誘導体の他に、グリコールアルデヒドやグリセルアルデヒド、メチルグリオキサール、グリオキサール、３−デオキシグルコゾン等のα−ヒドロキシアルデヒド化合物やジカルボニル化合物、更には、アセトアルデヒドでもよく、前進性反応し得るものであれば特に限定を受けない。
【００２２】
本発明で言うところのインビトロ作製の変性物質とは、生体外の反応系で得られる変性物質であり、例えば、次に挙げる条件を適宜変更することで得ることが出来る。更なる添加物、反応温度、ｐＨ、反応時間、被反応物や反応基質濃度が適宜変更可能な条件であり、記載以外の反応条件についても変更することは可能である。
【００２３】
例えば、変性物質中の酸化反応を抑制する目的で、反応溶液中に極微量に含まれる銅イオン、鉄イオン等の重金属をキレートして重金属イオンが触媒する酸化反応を抑制するためにキレート剤を添加して前進性反応を進行させることが出来る。本反応系については、使用できるキレート剤を特に限定する必要はないが、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）やＤＴＰＡを使用することが可能である。好ましくは、ＤＴＰＡである。
【００２４】
また、本発明においてインビトロ作製の反応系での反応温度は特に記載の温度に限定される訳ではないが、１０℃〜９０℃の範囲であれば良く、好ましくは２０℃〜５０℃、更に好ましくは３０℃〜４０℃、最も好ましくは３７℃である。
【００２５】
更に、本反応系での反応溶液のｐＨも特に記載の温度に限定される訳ではないが、２〜１２の範囲であれば良く、好ましくは４〜１０、更に好ましくは６〜８、一層好ましくは６．８〜７．４である。
【００２６】
本反応系の反応時間についても記載の時間に限定されない。例えば、１時間以上から数年の範囲でも良い。但し、実験室で変性物質を標品として得るために容易に調製するには１時間以上が好ましく、より好ましくは１日間〜１０週間であり、更に好ましくは１週間〜８週間、最も好ましくは１週間である。
【００２７】
そして、本反応系で使用できる反応基質の濃度は、特に限定を受けない。例えば、生理的な濃度範囲が好ましいが、実験室で簡便に変性物資を調製するには、反応時間を短縮するために反応基質である反応基質濃度を非生理的な濃度以上に設定しても問題ない。例えば、反応基質濃度を１ｐＭ〜１０Ｍの幅広い濃度で用いても構わない。好ましくは０．０１Ｍ〜２Ｍの範囲である。
【００２８】
本発明で言う被検材料である体液由来産物とは、血液、血漿、血清、髄液、リンパ液、関節液、腹水、尿、組織浸潤液、及びこれらから得られた分画成分をいうが、特に限定を受けない。より好ましくは、病変が発生する血管に常時接触している体液、すなわち、血液、血漿、血清から得られた希釈成分や分画成分であれば良い。また、いっそう好ましくは、酸化ストレスが亢進した被検体が良く、例えば、糖尿病や腎疾患、敗血症、血管障害、脳神経障害、癌、過炎症等が挙げられるが、特に記載の範囲のみに適用されるものではない。
【００２９】
本発明で言うところの変性物質あるいは反応複合体の水不溶性担体への固相化条件は、温度、固相化時間、固相化溶液濃度の影響を調整することで固相化量を安定化、且つ、最大限にすることができる。温度は０℃〜５０℃の範囲であれば特に制限を受けず、好ましくは４℃〜３７℃であり、さらに好ましくは４℃〜２５℃であり、最も好ましくは４℃である。固相化時間は１時間以上であり、好ましくは１時間〜２４時間であり、さらに好ましくは４時間〜１２時間である。固相化溶液濃度は０．０００００１ｍｇ／ｍｌ〜１ｇ／ｍｌの範囲で良く、好ましくは０．０００５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、さらに好ましくは０．０００５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｕｇ／ｍｌの範囲である。
【００３０】
固相化方法は変性物質結合材の変性物質に対する結合性を著しく阻害しなければ、特に限定を受けない。例えば、物理吸着反応や、共有結合、イオン結合、静電結合、配位結合に代表される化学結合でも制限無く用いることが可能であり、好ましくは、物理吸着である。
【００３１】
インビトロ作製の変性物質と被検材料である体液由来産物の反応複合体の作製条件は、ｐＨ範囲が４〜１０の範囲であれば良く、好ましくは、６〜８の範囲である。更には、上記複合体の作成条件には、塩濃度や温度にも好適範囲が存在し、塩濃度は０．００１Ｍ〜２Ｍの範囲であれば良く、好ましくは、０．１Ｍ〜０．２５Ｍであり、温度は０℃〜５０℃の範囲であれば特に制限を受けず、好ましくは、４℃〜３７℃であり、さらに好ましくは２５℃である。
【００３２】
本発明で言うところの変性物質結合材と変性物質との反応は、変性物質と被検材料との反応（反応複合体形成反応）と同時反応でも良いし、反応複合体形成後の反応でも良く、被検材料中の変性物質に対する結合度合いの差を変性物質結合材の結合量の違いで評価できる条件であれば特に限定を受けない。上記の変性物質結合材とは、特に限定を受けるものではないが、好ましくは、ＲＡＧＥ誘導体、或いは、変性物質と結合する抗体である。
【００３３】
ＲＡＧＥ誘導体とはＲＡＧＥの派生物を意味する。ＲＡＧＥとは、イムノグロブリンスーパーファミリーに属する細胞膜表面に存在する受容体である。ヒトＲＡＧＥは４０４個のアミノ酸から構成され、そのうちＮ末端から２２個のアミノ酸で構成されるシグナル配列を有するため、結果的に３８２個のアミノ酸として受容体を形成する。そのうち、細胞外ドメインは３４２個のアミノ酸で構成されている。また、細胞外ドメインは、さらに細かいドメインに分類され、即ち、全アミノ酸配列４０４個の中でＮ末端側からＶ型ドメイン（３１番目から１０６番目までの７６個のアミノ酸で構成）、Ｃ２型ドメイン１（１３７番目から２１４番目までの７８個のアミノ酸で構成）、Ｃ２型ドメイン２（２５２番目から３０８番目までの５７個のアミノ酸配列で構成）の３つの領域からなる。細胞外ドメインの中でＶ型ドメインと呼ばれるドメインはＩｇＶドメインとも呼ばれるが、この領域は特に重要で、ＡＧＥとの結合性能を持つことが確認されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７４巻、３１７４０頁、１９９９年）。現在のところ、ＲＡＧＥのアミノ酸配列が明らかとなっている動物種は、ヒト、ウシ、マウス、ラットである。
【００３４】
本発明でいうところのＲＡＧＥ誘導体は、好ましくは、ＩｇＶドメインを含むＲＡＧＥ誘導体であり、更に好ましくは、天然型のＲＡＧＥであり、また、上述のＡＧＥ結合性能を持つとされるＩｇＶドメイン、つまり、３１番目から１０６番目までの７６個のアミノ酸配列を含むＲＡＧＥ由来のペプチドであり、該ペプチドの０、１若しくは数個のアミノ酸を置換・付加・欠失していてもよい。さらに、Ｃ２型ドメイン１やＣ２型ドメイン２を含むＲＡＧＥ細胞外ドメインのようにＩｇＶドメイン以外の配列が含まれていてもよい。更に、ＩｇＶドメイン以外のアミノ酸配列にも置換・付加・欠失といった変異があってもよい。いっそう好ましくは、ＡＧＥなどに代表されるＲＡＧＥ結合物質が結合可能なＲＡＧＥ誘導体であることである。
【００３５】
本発明で言うところの抗体は、変性物質と結合できる抗体であれば特に限定を受けることはなく、好ましくは、ＡＧＥを認識するものであり、更に好ましくは、ＡＧＥの生物活性部分を認識する抗体である。
【００３６】
酸化ストレス判定方法において、変性物質結合材について更に好ましい用件とは、変性物質と被検材料と変性物質結合材とで構成された複合体から変性物質結合材だけを特異的に、且つ、高感度に検出できるようにする必要がある。その手段として、上記の変性物質結合材に直接蛍光色素や放射性元素や重金属コロイド、酵素のような何らかのマーカーを付与しても良く、更には、該変性物質結合材にのみ見出される抗原性にのみ反応するような標識抗体を反応させても良く、特に制限なく変性物質結合材の検出方法を選ぶことが出来る。上記抗原性の一例として挙げるならば、記載例にのみ限定されるわけではないが、遺伝子組み替え手法を用いて付与されたタグが好適に用いることができる。特に、ＲＡＧＥ誘導体の識別に有効である。タグの種類は特に限定を受けず、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、Ｆｃ、ＧＳＴ、ＰｒｏｔｅｉｎＡ、ＰｒｏｔｅｉｎＧ、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰなど、如何なるタグも制限無く使用することも可能である。更には、抗体の有効な識別には、特に記載例に限定されるわけではないが、遺伝子上、被検材料と異なる種の生物から得られた抗体を用いることが好ましく、更に好ましくは、変性物質由来の生物種とも異なる場合が良く、具体例として、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、トリ、ヒト、サルが挙げられる。
【００３７】
また、変性物質あるいは反応複合体が固相化されている水不溶性担体も特に限定されない。好ましくは固相化量が多くとれる、表面積が広い多孔質体形成可能な材料であり、より好ましくは体液由来の被検体と非特異的相互作用の少ない素材で構成されており、さらに、被検材料の構成である体液が血液等の細胞含有組成物であった場合には、血球細胞との副反応によって刺激を低く抑えられる素材であれば最適であるが、記載内容に限定されるものではない。また、担体は有機−有機、有機−無機の複合担体でも良く、無機担体としてはガラスビーズ、シリカゲル、金属ビーズなどがあり、有機担体には架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、架橋ポリスルホン等の合成高分子や結晶性セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体との組み合わせでも良い。担体の形状は、プレート状、フィルム状、粒状、繊維状またはそれらの高次加工品、中空糸状と任意に形状を選ぶことができ、その大きさも特に限定されない。
【００３８】
本発明で見出された酸化ストレス判定方法は、被検体の抗酸化ストレス能を簡便に評価できるだけでなく、様々な用途に応用可能である。例えば、腎障害の度合いや予後を評価できることに応用可能であり、被検体の由来である患者に対して有効な治療方法を選択可能にさせる。更には、人工腎臓やアフェレーシス治療用途に用いられるような体液処理材料が被検体の抗酸化ストレスにどの程度影響を与えるか評価することが出来ることで、体液中の抗酸化ストレス能に由来する体液成分をできるだけ低減しないような新たな材料設計にすることも可能にする。
【００３９】
また、本発明で見出された酸化ストレス判定キットは、記載内容のみに限定されるわけではないが、測定用プレート、変性物質結合材溶液、標識抗体、洗浄液、発色液、停止液で構成することができる。上記構成成分で最も重要なものは、測定用プレートと変性物質結合材溶液である。測定用プレート（例えば、９６穴プレート）は、インビトロ作製の変性物質が固相化された後で非特異反応を抑えるためのブロッキング処理と防腐剤処理が行われている。変性物質結合材溶液と標識抗体は試薬を失活させない程度の界面活性剤と適度な安定化剤を含んだ中性緩衝液で構成されている。標識抗体は変性物質結合材と特異的結合反応をするものであり、酵素が標識されている。酵素は特に限定を受けないが、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ等が好適に用いられる。発色液は標識酵素の基質であり、適度に反応させ発色させた後で、停止液を添加することで発色を停止させる。各反応工程では洗浄液を用いて、適宜の回数で洗浄すればよいという構成である。発色度は、プレートリーダー等で読み込むことになる。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。ただし、本発明はこれら記載の内容に限定されるものではない。
【００４１】
（１）：各種変性物質のインビトロ作製
本発明にかかる各種変性物質として、グルコース由来ＡＧＥ−ｒａｂｂｉｔ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｇｌｃ−ＡＧＥ−ＲＳＡ）とグルコース由来ＡＧＥ−ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｇｌｃ−ＡＧＥ−ＢＳＡ）、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥ−ｒａｂｂｉｔ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＧＲＡ−ＡＧＥ−ＲＳＡ）とグリセルアルデヒド由来ＡＧＥ−ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＧＲＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ）、グリコールアルデヒド由来ＡＧＥ−ｒａｂｂｉｔ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＧＬＡ−ＡＧＥ−ＲＳＡ）とグリコールアルデヒド由来ＡＧＥ−ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＧＬＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ）を以下のような方法で作製した。タンパク質定量は、ＢＳＡを標準物質としてＤｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて行った。
【００４２】
２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、あるいは、ＲＳＡを０．５Ｍのグルコースと５ｍＭのＤＴＰＡ（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と共に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して、３７℃で８週間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のグルコースを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、変性物質１（Ｇｌｃ−ＡＧＥ−ＢＳＡ）、変性物質２（Ｇｌｃ−ＡＧＥ−ＲＳＡ）を得た。
【００４３】
２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、あるいは、ＲＳＡを０．１Ｍのグリセルアルデヒドと５ｍＭのＤＴＰＡと共に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して、３７℃で１週間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のグリセルアルデヒドを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、変性物質３（ＧＲＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ）、変性物質４（ＧＲＡ−ＡＧＥ−ＲＳＡ）を得た。
【００４４】
２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、あるいは、ＲＳＡを０．１Ｍのグリコールアルデヒドと５ｍＭのＤＴＰＡと共に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して、３７℃で１週間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のグリコールアルデヒドを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、変性物質５（ＧＬＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ）、変性物質６（ＧＬＡ−ＡＧＥ−ＲＳＡ）を得た。変性物質１〜６の標品は、１０ｍｇ／ｍｌでメイラード反応産物の特徴である茶褐色を示していた。
【００４５】
（２）：ＲＡＧＥ誘導体の作製
ヒト肺ｃＤＮＡライブラリー（宝酒造（株））を鋳型にＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、細胞外領域上流及び下流の２つの断片を増幅した。ＰＣＲプライマーはヒトＲＡＧＥのデータベース配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ９１２１１）を基に４種類設計し、各々２種類ずつを上流及び下流増幅プライマーとして用いた。
・上流増幅プライマー：（プライマーのＲＡＧＥ中の位置ｏｒ  塩基番号（ＲＡＧＥの開始コドンＡＴＧのＡを１とした））
Ｓ（１〜２９）及びＡＳ（７３０〜７４９）
・下流増幅プライマー：（プライマーのＲＡＧＥ中の位置）
Ｓ（４６２〜４８１）及びＡＳ（１００７〜１０３２）
（上流には制限酵素ＥｃｏＲＩ、下流にはＢｇｌＩＩの切断部位を付加した。）また、プライマーの安定性と遺伝子発現効率を上げるためにいくつかの塩基は適宜置換した。さらに、ＲＡＧＥを可溶型とするため、細胞外ドメインの下流末端に終止コドン（ＴＧＡ）を付加した。
【００４６】
２種類の反応産物をアガロースゲル電気泳動した。さらに得られた各ＰＣＲ増幅断片を電気泳動のゲルから回収した後、ｐＵＣ１８ベクターにクローニングし、ＰＣＲ産物の塩基配列確認を行った。
【００４７】
次いで、バキュロウイルスベクターへのクローニングを以下のように行った。ベクターはｐＶＬ１３９３（ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた。まず、ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで切断し、アルカリフォスファターゼで脱リン酸化した後精製した。上記で得たＲＡＧＥ細胞外領域上流及び下流の２つの断片は以下に示す制限酵素で切断後、目的断片を精製した（目的断片の塩基数）。
・上流：ＥｃｏＲＩ／ＦｓｐＩ（６６６ｂｐ）
・下流：ＦｓｐＩ／ＢｇｌＩＩ（３８４ｂｐ）
精製した２断片をｐＶＬ１３９３ベクターのポリヘドリンプロモーターの下流に挿入した。得られたクローンについて電気泳動による挿入断片のサイズ確認と塩基配列決定により、目的ＤＮＡを持つクローンが構築できたことを確認した。
【００４８】
上記ＲＡＧＥプラスミドＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、細胞外領域下流末端にＨｉｓ−Ｔａｇを付加した断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、上述のヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインのクローニングで用いた下流増幅用プライマーの終止コドンの前にＨｉｓをコードするコドン（ＣＡＴ）の６回繰り返し配列を挿入したものを作製した。
・増幅プライマー：（プライマーのＲＡＧＥ中の位置ｏｒ  塩基番号（ＲＡＧＥの開始コドンＡＴＧのＡを１とした））
Ｓ（４６２〜４８１）及びＡＳ（１００７〜１０３２  ＋  （ＣＡＴ）６  ＋  （ＴＧＡ）２  ＋  ＢｇｌＩＩ  ｓｉｔｅ  ）
プライマーの安定性と遺伝子発現効率を上げるためにいくつかの塩基は適宜置換した。確認の結果、ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインのＣ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇを融合した遺伝子配列を得た。
【００４９】
ヒトＲＡＧＥ誘導体の発現は次のように行った。バキュロウイルスを感染させる昆虫細胞はＳｆ−９を用いた。バキュロウイルス感染６０時間後の培養上清を回収して、４℃でリン酸緩衝生理食塩水中で十分透析した後で、濾過を行い、ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインを含む培養液を得た。
【００５０】
上記で得られたヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインを含む培養液から目的タンパク質を精製した。精製には、ＨｉｓＴｒａｐ（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた。精製後のヒトＲＡＧＥ細胞外ドメイン溶液は、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に０．１５ＭＮａＣｌを添加した緩衝液で十分透析処理して精製ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメイン−Ｈｉｓｔａｇ（変性物質結合材１）を得た。
【００５１】
（３）：各種変性物質に対する抗体の作製
各種変性物質（変性物質２、４、６）４ｍｇをフロイント完全アジュバント（和光純薬（株））と１：１の割合で乳化し、各種変性物質（免疫原）毎にニュージーランドホワイトラビット（雄、２．０ｋｇ）の背部数カ所に皮下注射した。初回免疫後、１週間おきに５回の追加免疫を抗体価が上昇するまで行った。追加免疫後、経時的にウサギの耳静脈より少量採血し、抗体価の確認を行った。抗体価の上昇の見られた時点からさらに２週間後、最終追加免疫を行い、その１０日後に抗血清の精製を行うために全採血を行い、抗血清を得た。免疫原（変性物質２）に対する抗血清は抗体２、免疫原（変性物質４）に対する抗血清は抗体４、免疫原（変性物質６）に対する抗血清は抗体６とした。
【００５２】
次いで以下の手法でアフィニティークロマトグラフィーを用いてそれぞれの抗血清（抗体２、４、６）から変性物質だけと結合するアフィニティー精製抗体を調製した。まず、Ｇｌｃ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（変性物質１）、ＧＲＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（変性物質３）、ＧＬＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（変性物質５）アフィニティーカラムを調製した。７．５ｇのＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  を１ｍＭ塩酸で膨潤後、２Ｌの１ｍＭ塩酸で洗浄した。リガンドとして１００ｍｇのＧｌｃ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（変性物質１）、ＧＲＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（変性物質３）、ＧＬＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（変性物質５）をＣｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．３）と別個に混合し、更に別々で２５ｍｌのＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂゲルと室温で１時間振とうしてカンプリングさせた。カップリング後、余分なリガンドはＣｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。ゲルの活性残基は、０．１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）とゲルを室温で２時間振とうしてブロッキングした。ブロッキング終了後、Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとＷａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．０）とで交互に３回洗浄し、更にＰＢＳで３回洗浄することでアフィニティー樹脂を調製した。Ｇｌｃ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（変性物質１）固定化樹脂をアフィニティー樹脂１、ＧＲＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（変性物質３）固定化樹脂をアフィニティー樹脂２、ＧＬＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（変性物質５）固定化樹脂をアフィニティー樹脂３とする。
【００５３】
２０ｍｌの各抗血清（抗体１、２、３）を各種アフィニティー樹脂（固定化樹脂１、２、３）で作製したカラム（２．５ｃｍ×５ｃｍ）に４℃で一晩吸着させた。すなわち、抗体１はアフィニティー樹脂１に吸着させ、抗体２はアフィニティー樹脂２に吸着させ、抗体３はアフィニティー樹脂３に吸着させた。吸着処理後にＰＢＳで洗浄して、吸着画分を１Ｍ  チオシアン酸カリウムを含んだ２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。溶出時は各フラクションを２８０ｎｍの吸光度でモニターし、ピーク部分を集めてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０で濃縮後、ＰＤ−１０ゲル濾過カラムを用いて緩衝液の置換を行った。得られたアフィニティー精製抗体は、Ｇｌｃ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（変性物質１）固定化樹脂で精製した抗体を精製抗体１、ＧＲＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（変性物質３）固定化樹脂で精製した抗体を精製抗体２、ＧＬＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（変性物質５）固定化樹脂で精製した抗体を精製抗体３とした。
【００５４】
（４）：腎疾患患者及び健常者由来血清の抗酸化ストレス判定
以下の手法で被検材料の酸化ストレス判定を行った。
【００５５】
Ｇｌｃ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例１）、ＧＲＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）、ＧＬＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）、ＢＳＡ（比較例１）をそれぞれ９６穴プレート（ヌンク製）のウェルにリン酸緩衝生理食塩水に１μｇ／ｍｌになるように希釈して、各ウェルに１００μｌずつ加え４℃で一晩吸着させ固相化した。次いで、ブロッキング溶液（０．５％ＢＳＡ含有リン酸緩衝生理食塩水）を４００μｌ加え室温で１時間インキュベートしてブロッキングを行った。洗浄液（０．０５％ツイーン２０含有リン酸緩衝生理食塩水）で１回洗浄後、希釈液（０．２５％ＢＳＡ含有洗浄液）で被検材料（腎疾患患者（糖尿病性腎症透析患者：検体数３、非糖尿病腎症透析患者：検体数６）及び健常者由来血清：検体数６）を１０倍希釈して１００μｌ分を各ウェルに添加し、室温で２時間振とう反応させた。反応後に洗浄液で３回洗浄して、更に、各ウェルにそれぞれ希釈液で０．５μｇ／ｍｌに希釈した各変性物質結合材（ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメイン−Ｈｉｓｔａｇ（変性物質結合材１）、各アフィニティー精製抗体（抗Ｇｌｃ−ＡＧＥ−ＢＳＡ精製抗体（精製抗体１）、抗ＧＲＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ精製抗体（精製抗体２）、抗ＧＬＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ精製抗体（精製抗体３）））を１００μｌ分を各ウェルに添加し、室温で１時間振とう反応させた。反応後に洗浄液で３回洗浄して、更に、固相化した変性物質に結合する各変性物質結合材の結合量を検出するために検出用の標識抗体を以下の手順で反応させた。変性物質結合材にヒトＲＡＧＥ細胞外ドメイン−Ｈｉｓｔａｇ（変性物質結合材１）を反応させている場合には、希釈液で０．１μｇ／ｍｌに希釈した抗Ｈｉｓｔａｇモノクローナル抗体（マウス由来、キアゲン製）を１００μｌ分を各ウェルに添加し、室温で１時間振とう反応させ、反応後に洗浄液で３回洗浄して、更に、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ標識を希釈液で適宜希釈して、室温で３０分間反応させて、洗浄液で３回洗浄して発色反応を行った。変性物質結合材に抗ＡＧＥ精製抗体（ウサギ由来、精製抗体１、２、３）を反応させている場合には、希釈液で０．１μｇ／ｍｌに希釈して各１００μｌ分を各ウェルに添加し、室温で１時間振とう反応させ、反応後に洗浄液で３回洗浄して、更に、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ標識を希釈液で適宜希釈して、室温で３０分間反応させて、洗浄液で３回洗浄して発色反応を行った。発色停止液は１Ｎ硫酸液を用い、適度な発色が得られた時点で発色反応を停止して、マイクロプレートリーダーで発色度を測定した。測定結果を表１に示す。結果から変性物質を固相化した場合にのみ、患者で健常者に比して有意に発色が高値となり、患者の血清の抗酸化ストレス能の低下を本発明の酸化ストレス評価方法により有意に測定できることが示された。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
【発明の効果】
本発明により、被検材料中の抗酸化ストレス能を簡便に検出できるようになった。特に、基礎疾患に糖尿病や腎疾患を持つ患者の抗酸化ストレス能が、変性物質を結合中和する性能で評価した場合に、健常者と比して有意に低下していることが初めて明らかとなった。特に、人工透析患者で有意に抗酸化ストレス能が低下していることが示された。
【００５８】
本発明で得られた酸化ストレス判定方法及び該判定キットは、医薬設計及び人工透析などのアフェレーシス治療のためのスクリーニング材料、診断材料、生体材料の劣化度評価等の用途に用いることが出来る。期待できる用途は、アルツハイマー等の一般の慢性神経疾患や腎症、糖尿病、高脂血症、透析合併症、老化、血管障害、アミロイド症、肝障害等の様々な酸化ストレスが発生しうる疾患対象にも、抗酸化ストレス能を数値化して安定した診断結果を提供する形で利活用できる。