(57)【要約】【課題】従来の始原生殖細胞取得方法に比べて、回収率、精製率ともに高い始原生殖細胞取得方法を提供する。また、始原生殖細胞を用いてキメラ個体および非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法を提供する。【解決手段】Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨード−イソフタルアミド媒体中で始原生殖細胞を含む細胞集団を遠心処理し、始原生殖細胞を含む細胞集団より始原生殖細胞を分離する。本方法によれば、始原生殖細胞を安定して得ることができ、これに所望の遺伝子を導入し、非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨード−イソフタルアミド媒体中で始原生殖細胞を含む細胞集団を遠心処理し、前記始原生殖細胞を含む細胞集団より始原生殖細胞を分離することを特徴とする、始原生殖細胞の取得方法。
【請求項２】
前記Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨード−イソフタルアミド媒体が、前記遠心処理前に密度勾配をつけたものであることを特徴とする、請求項１に記載の始原生殖細胞の取得方法。
【請求項３】
前記始原生殖細胞が、鳥類由来であることを特徴とする、請求項１または２に記載の始原生殖細胞の取得方法。
【請求項４】
前記鳥類が、家禽類であることを特徴とする、請求項３に記載の始原生殖細胞の取得方法。
【請求項５】
前記家禽類が、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ダチョウおよび七面鳥からなる群より選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、請求項４に記載の始原生殖細胞の取得方法。
【請求項６】
前記始原生殖細胞を含む細胞集団が、胚発生ステージ４〜３６のニワトリ胚から得られる細胞集団であることを特徴とする、請求項１または２に記載の始原生殖細胞の取得方法。
【請求項７】
前記始原生殖細胞を含む細胞集団が、胚発生ステージ５〜１７のニワトリ胚の体液および／または血液から得られる細胞集団であることを特徴とする、請求項１または２に記載の始原生殖細胞の取得方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の始原生殖細胞の取得方法により得られた、始原生殖細胞。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか１項に記載の始原生殖細胞の取得方法によって得られた始原生殖細胞に所望の外来遺伝子を導入し、組み換え始原生殖細胞を作製する作製工程と、
前記始原生殖細胞の由来の胚と同種または異種の動物の胚に、前記組み換え始原生殖細胞を挿入する挿入工程と、
前記挿入工程によって得られた胚を発生させる発生工程と、
を含むキメラ個体の作製方法。
【請求項１０】
請求項９の方法によって得られる、キメラ個体。
【請求項１１】
請求項９の方法によって得られるキメラ個体を交配し、表現形および／またはゲノム解析によって、前記交配によって得られた個体から非ヒトトランスジェニック動物を判別して取得する、非ヒトトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１２】
請求項９の方法によって得られるキメラ個体を交配し、表現形および／またはゲノム解析によって、前記交配によって得られた個体から非ヒトトランスジェニック動物を判別して取得する非ヒトトランスジェニック動物の作製方法により得られる、非ヒトトランスジェニック動物およびその子孫。
【請求項１３】
請求項１１の方法によって得られる非ヒトトランスジェニック動物が鳥類である場合における、該非ヒトトランスジェニック鳥類が、産卵する卵。
【請求項１４】
請求項１１の方法によって得られる非ヒトトランスジェニック動物が鳥類である場合における、該非ヒトトランスジェニック鳥類の卵管上皮細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発生工学の材料または種の保存等に用いられる始原生殖細胞の取得方法に関し、詳しくは、効率的に始原生殖細胞を分離する始原生殖細胞の取得方法に関する。また、本発明は、本発明の方法により取得された始原生殖細胞に所望の外来遺伝子を導入し、これを同種または異種の胚に移植し発生させることを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物の作成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、発生工学の分野では、分化全能性を有する細胞に遺伝子操作を施し、その効果を代々子孫に伝える遺伝子工学的手法が一般的に用いられている。この遺伝子工学的手法を行なう場合、使用に適した分化全能性を有する細胞としては、受精卵、初期胚より得られる始原生殖細胞、胚性幹細胞などが候補として挙げられる。
【０００３】
また、現在、希少生物種の遺伝資源を効率的に保存、利用する際、生殖細胞系列の細胞を用いたキメラ個体を作製する手法を用いることが一般的に行なわれている。このキメラ個体作製において前記生殖細胞系列の細胞の中でも減数分裂前で、種の持つ一対の遺伝情報を保存している段階である始原生殖細胞を利用することが、最も有利と考えられている。
【０００４】
特に鳥類においては、始原生殖細胞の移植法等が開発されており、これを用いて各種の遺伝子操作を施したいわゆるトランスジェニック鳥類や、希少鳥類の保存のためのキメラ鳥類の作出に期待が高まっている。また、鳥類は高濃度のタンパク質を含む卵を産卵することから、目的とする有用タンパク質を高濃度に含む卵をトランスジェニック鳥類に産ませることも考えられている。
【０００５】
しかしながら、初期胚から得られる始原生殖細胞は、その分離の困難性や安定な細胞ラインが樹立されていないことなどから、その利用が遅れている。
【０００６】
上記問題点から、始原生殖細胞を取得する方法の研究がなされており、例えば、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）の濃度遠心勾配を用いた始原生殖細胞単離法（例えば、非特許文献１および２参照）、始原生殖細胞より小さな開口径を持つナイロンメッシュによって始原生殖細胞を回収するフィルター法（例えば、非特許文献３参照）、磁気細胞分離システム（ＭＡＣＳ）（例えば、非特許文献４参照）等が報告されている。
【０００７】
一方、非イオン性のヨード化合物であるＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨード−イソフタルアミドは、低細胞毒性で、かつオートクレーブ可能な密度勾配用分離剤としてＲｉｃｋｗｏｏｄ等によって紹介され（例えば、非特許文献５参照）、細胞内小器官等の分画精製に用いられている。具体的には、ヒト精子の分離（例えば、特許文献１参照）や臍帯血由来の造血前駆細胞に用いた例が報告されている（例えば、非特許文献６参照）。
【０００８】
【特許文献１】
特表２０００−５００３２７号公報
【非特許文献１】
Ｙａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．＆Ｆｅｒｔｉｌ．，９６：５２１−５２８，１９９２
【非特許文献２】
Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．Ｒｅｐｏｒｔ．，１６（９）：８５３−８５７，１９９２
【非特許文献３】
Ｔａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ’ｓ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ，ａｂｓｔｒａｃｔ  ｎｕｍｂｅｒ  ８０８，２０００
【非特許文献４】
Ｏｎｏ，Ｔ．＆Ｍａｃｈｉｄａ，Ｙ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ＰａｒｔＡ，１２２：２５５−２５９，１９９９
【非特許文献５】
Ｒｉｃｋｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２３，２３−３１，１９８２
【非特許文献６】
Ｙｕｒａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １７，５１７−５２５，１９９５
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、一般に回収率と精製率とを両立させることは困難であり、フィコールの濃度遠心勾配を用いた始原生殖細胞単離法においても、始原生殖細胞の回収率や精製率が低いという問題点があった。そこで回収率、精製率ともに高い始原生殖細胞の取得方法が求められていた。さらに、フィコールは、細胞毒性を有することから、細胞毒性を有さない試薬による始原生殖細胞の取得方法も望まれていた。
【００１０】
また、フィルター法および磁気細胞分離システム（ＭＡＣＳ）もフィコールの濃度遠心勾配を用いた始原生殖細胞単離法同様に始原生殖細胞の回収率、精製率が低かった。そこで、安定に始原生殖細胞を採取するための新たな方法が強く求められている。
【００１１】
一方、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨード−イソフタルアミドを密度勾配用分離剤として用いる方法においては、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨード−イソフタルアミドが、ヒト精子や臍帯血由来の造血前駆細胞の分離に適していても、他の種類の細胞の分画精製に効果を示すかどうかについては全く不明である。さらに、一般に密度勾配を用いた分画精製法は、対象とする生物の細胞の比重、サイズ、密度勾配用分離剤の濃度、遠心力等の組み合わせによって、目的とする細胞の分離の成否が左右されるため、その組み合わせの決定には困難が伴う。つまり、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨード−イソフタルアミドが、ヒト精子や臍帯血由来の造血前駆細胞の分離に適していても、他の種類の細胞の分離に適するかどうかは不明であり、さらに分離に適するかどうか不明であるにもかかわらず分離に適した条件を決定することは容易ではない。
【００１２】
そこで、本発明は、上記問題点に鑑みてなされたもので、従来の始原生殖細胞取得方法に比べて、回収率、精製率がともに高い始原生殖細胞の取得方法を提供することを目的とする。また、本発明の取得方法によって得られた始原生殖細胞を用いてキメラ個体および非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、始原生殖細胞の取得法を鋭意検討した結果、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨード−イソフタルアミドを用いた遠心分離が始原生殖細胞の取得に適しているという知見を見出し、本発明を完成させるに至った。また、本方法によれば、従来、採取が困難とされていた始原生殖細胞を安定して得ることができ、これに所望の遺伝子を導入し、非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる。
【００１４】
即ち本発明は、下記の通りである。
〔１〕Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨード−イソフタルアミド媒体中で始原生殖細胞を含む細胞集団を遠心処理し、前記始原生殖細胞を含む細胞集団より始原生殖細胞を分離することを特徴とする、始原生殖細胞の取得方法。
〔２〕前記Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨード−イソフタルアミド媒体が、前記遠心処理前に密度勾配をつけたものであることを特徴とする、上記〔１〕に記載の始原生殖細胞の取得方法。
〔３〕前記始原生殖細胞が、鳥類由来であることを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載の始原生殖細胞の取得方法。
〔４〕前記鳥類が、家禽類であることを特徴とする、上記〔３〕に記載の始原生殖細胞の取得方法。
〔５〕前記家禽類が、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ダチョウおよび七面鳥からなる群より選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、上記〔４〕に記載の始原生殖細胞の取得方法。
〔６〕前記始原生殖細胞を含む細胞集団が、胚発生ステージ４〜３６のニワトリ胚から得られる細胞集団であることを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載の始原生殖細胞の取得方法。
〔７〕前記始原生殖細胞を含む細胞集団が、胚発生ステージ５〜１７のニワトリ胚の体液および／または血液から得られる細胞集団であることを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載の始原生殖細胞の取得方法。
〔８〕上記〔１〕から〔７〕のいずれか１つに記載の始原生殖細胞の取得方法により得られた、始原生殖細胞。
〔９〕上記〔１〕から〔７〕のいずれか１つに記載の始原生殖細胞の取得方法によって得られた始原生殖細胞に所望の外来遺伝子を導入し、組み換え始原生殖細胞を作製する作製工程と、
前記始原生殖細胞の由来の胚と同種または異種の動物の胚に、前記組み換え始原生殖細胞を挿入する挿入工程と、
前記挿入工程によって得られた胚を発生させる発生工程と、
を含むキメラ個体の作製方法。
〔１０〕上記〔９〕の方法によって得られる、キメラ個体。
〔１１〕上記〔９〕の方法によって得られるキメラ個体を交配し、表現形および／またはゲノム解析によって、前記交配によって得られた個体から非ヒトトランスジェニック動物を判別して取得する、非ヒトトランスジェニック動物の作製方法。
〔１２〕上記〔９〕の方法によって得られるキメラ個体を交配し、表現形および／またはゲノム解析によって、前記交配によって得られた個体から非ヒトトランスジェニック動物を判別して取得する非ヒトトランスジェニック動物の作製方法により得られる、非ヒトトランスジェニック動物およびその子孫。
〔１３〕上記〔１１〕の方法によって得られる非ヒトトランスジェニック動物が鳥類である場合における、該非ヒトトランスジェニック鳥類が、産卵する卵。
〔１４〕上記〔１１〕の方法によって得られる非ヒトトランスジェニック動物が鳥類である場合における、該非ヒトトランスジェニック鳥類の卵管上皮細胞。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の始原生殖細胞の取得方法は、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨード−イソフタルアミド媒体中で始原生殖細胞を含む細胞を遠心処理することにより、回収率、精製率ともに高く、始原生殖細胞を取得することができる。また、実験者の実験操作の習熟度によらず、安定して始原生殖細胞を取得することができる。
【００１６】
本発明に用いられるＮ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨード−イソフタルアミドは、下記の式（１）に示される化合物をいい（以下、本明細書では「化合物１」という。）、一般に市販されているものを用いることができる。また、「Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アセトアミド］−２，４，６−トリヨード−イソフタルアミド媒体（以下、「化合物１媒体」という。）」とは、化合物１を含んでいる媒体を意味し、化合物１を含んでいればどのような形態であってもよい。具体的には化合物１を水および／または溶剤等で希釈した溶液（以下、「化合物１溶液」という。）であってもよいし、ゲル状の形態になったものであってもよい。また、化合物１媒体には、化合物１の作用を阻害しない範囲で、ショ糖（シュークロース）、グリセロール、塩化セシウム、硫酸セシウム、メトリザマイド、フィコール等の他の密度勾配用媒体が含まれていてもよい。
【００１７】
【化１】
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【００１８】
化合物１媒体の密度勾配の形成は、例えば異なる濃度の化合物１溶液を遠沈管に重層して密度勾配を形成する方法、化合物１の均等溶液を遠沈管に入れ、凍結融解することにより密度勾配を得る方法、化合物１の均等溶液を遠心することにより密度勾配を得る方法、市販のグラジェントミキサーを使用して密度勾配を得る方法等様々な方法で形成することができ、いずれの方法を用いて密度勾配を形成してもよい。また、上記の方法を適宜組み合わせて密度勾配を形成してもよい。
【００１９】
化合物１媒体の密度勾配の形成は、遠心分離の前に予め作っておいてもよいし、遠心分離そのものの過程によって密度勾配を形成してもよい。すなわち、本発明における密度勾配遠心分離法は、沈降速度法（ゾーン遠心法）と呼ばれる方法に属する方法であっても、等密度遠心分離法（平衡密度勾配遠心法）と呼ばれる方法に属する方法であってもよい。始原生殖細胞と他の細胞との分離性の点では、より好ましくは遠心分離の前に密度勾配を予め作っておく沈降速度法と呼ばれる方法に属する方法が用いられる。具体的には、遠心前に予め作製した化合物１の密度勾配溶液の上に、始原生殖細胞を含む細胞集団を静置し、遠心処理することによって分離を行なうのが好ましい。始原生殖細胞に適した化合物１の濃度等の条件については後述する。
【００２０】
遠心処理は、一般的に生化学的手法で用いられる方法であればいかなる方法であってもよい。通常、遠心機を用いて行なわれ、具体的にはスイングバケットローター、バーティカルローター（垂直ローター）、固定角ローター等を供えた遠心機を用いて行なわれる。また、遠心処理は、通常室温以下で行なわれる。遠心処理の温度としては、好ましくは室温（例えば、２０℃）以下で、遠心処理される溶液が凍らない範囲の温度、特に好ましくは４℃程度である。遠心速度等の詳しい条件については後述する。
【００２１】
本明細書において「始原生殖細胞」とは、生殖系列の細胞であって減数分裂以前の細胞をいう。生殖系列の細胞で減数分裂以前であれば分化の段階には限定されず、例えば始原生殖前駆細胞、減数分裂以前の生殖原細胞なども始原生殖細胞に含まれる。また、「始原生殖細胞を含む細胞集団」は、始原生殖細胞を含む細胞集団であればいかなる細胞集団であってもよい。好ましくは胚由来の始原生殖細胞を含む細胞集団や、胚の体液および／または血液から得られる始原生殖細胞を含む細胞集団である。細胞集団中に始原生殖細胞が含まれる割合が高いためである。ここで「胚の体液」には、例えば、生殖半月部域の体液、中胚葉と外胚葉との間の腔所内体液等の体液が含まれる。「胚の血液」は、いずれの部域からの採取も可能であるが、例えば、胚周縁の動脈および／または静脈から得られる血液等が含まれる。
【００２２】
本発明の始原生殖細胞の取得方法は、生物一般、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類に対しても適用することができるが、特に、鳥類に好適に用いることができる。鳥類の始原生殖細胞は、発生の途中で血液循環するという性質を持っており、採取が簡便である。始原生殖細胞の由来となる鳥類は、特に種類は問わないが、好ましくは家禽類である。一般に「家禽類」とは、家で飼う鳥の総称をいうが、本明細書で「家禽類」とは、広く一般的に家禽類と呼ばれるものに加えて、ダチョウ、七面鳥、ハト、エミュー、ホロホロチョウ、キジ、ヤマドリなどをも含む。好ましくは家禽類の中でも、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ダチョウ、七面鳥、ハト、エミュー、ホロホロチョウ、キジ、ヤマドリ、ガチョウである。材料入手および取り扱いが比較的容易であるためである。更に、これらの中でも特に好ましくはニワトリである。閉鎖環境下で完全な管理のもとに多数飼育が可能なこと、世代間隔が性成熟まで比較的短いこと、定常的に卵が得られること、飼育コストが家畜に比べて低いこと等の利点を有するためである。一般に鳥類の胚から採取した始原生殖細胞は、鳥類の胚体外組織、血液、更に発生の進んだ生殖巣原基に由来する。
【００２３】
本発明の取得方法に供せられる細胞集団は、好ましくは胚発生ステージ４〜３６のニワトリ胚から得られる細胞集団、特に好ましくは胚発生ステージ５〜１７のニワトリ胚の体液および／または血液から得られる細胞集団である。胚発生ステージ４〜３６のニワトリ胚からは始原生殖細胞を含む細胞集団を分離しやすく、また胚発生ステージ５〜１７のニワトリ胚の体液および／または血液中には、始原生殖細胞を含む細胞集団が遊離しているため、トリプシン処理など行なうことなく、始原生殖細胞を含む細胞集団を容易に回収することができる。ここで、「胚発生ステージ」とは、ハンバーガー−ハミルトンの胚発生ステージ表（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，Ｖ．ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｈ．Ｌ．（１９５１）．Ｊ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．８，４９−９２）によるものをいう。
【００２４】
得られた始原生殖細胞を含む細胞集団を、密度勾配溶液の最上層に重層しやすい程度の懸濁液量となるように、その細胞集団に適した培地等の溶液で懸濁し、始原生殖細胞含有試料とする。該始原生殖細胞含有試料を、始原生殖細胞が他の体細胞と分離できる化合物１の濃度等を適宜選択して、遠心処理し、分画精製すればよい。
【００２５】
ここで、沈降速度法（ゾーン遠心法）を用いた始原生殖細胞の取得についての実施の形態の一例を挙げる。予め、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ水溶液）で調整した６０％の化合物１ストック溶液を用い、目的とする始原生殖細胞に適した培地で化合物１の最終濃度が５〜４０％、好ましくは１１〜１２％になるよう希釈し、化合物１含有培地（第１層）として、遠心管（例えば５０ｍｌ容量）に予め５ｍｌ敷く。次いで、第１層の上に最終濃度１２％以下、好ましくは５．５〜６％とした化合物１含有培地（第２層）を５ｍｌを重層する。これらの最上層に始原生殖細胞含有試料を静かに重層する。これを１００〜１０００×ｇ、好ましくは約４００×ｇで１０〜１５分間、４℃で遠心する。遠心力、及び／または、遠心時間がこの範囲より小さくなると分離が不十分となり、一方、遠心力、及び／または、遠心時間がこの範囲より大きくなると始原生殖細胞含有試料中の全ての細胞が沈んでしまうので好ましくない。遠心処理後、第１層と第２層化合物１培地の界面から始原生殖細胞を採取することができる。
【００２６】
なお、密度勾配は２層に限られるわけではなく、始原生殖細胞の分離が適切に行なわれれば何層にしても構わない。層の数が多くすれば細かい分離が可能となるが、作業は煩雑となる。また、目的の始原生殖細胞の比重、サイズ等にあわせて、上記のように遠心前に密度勾配を形成して遠心分離してもよく、遠心そのものの過程によって密度勾配を形成しつつ始原生殖細胞を分離しても良い。さらに、化合物１含有培地中に塩類等を加え、浸透圧の幅を適宜調節しても良い。
【００２７】
以下、更に詳しく白色レグホーン系ニワトリ又は日本ウズラの始原生殖細胞の取得について、実施の形態の一例を述べる。
【００２８】
まず、白色レグホーン系ニワトリ受精卵は４８〜５４時間、日本ウズラ受精卵は３５〜４３時間、３６〜３９℃で孵卵して発生段階の胚を得る。次に、これらの胚からガラスマイクロピペットを用いて、胚の周縁静脈から血液（胚体血）を採取し、５０ｍｌ容量の遠心管を用いる場合には採取した血液（胚体血）をＫＡｖ−１培地（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，４０：１０６１−１０６４（１９９６））の１〜３ｍｌに懸濁し、始原生殖細胞含有試料とする。
【００２９】
次いで、予め調整した６０％の化合物１ストック溶液を用い、ＫＡｖ−１培地で化合物１の最終濃度が５〜４０％、好ましくは１１〜１２％になるよう希釈し、化合物１含有培地（第１層）として遠心管（例えば５０ｍｌ容量）に予め５ｍｌ敷く。次いで、第１層の上に最終濃度１２％以下、好ましくは５．５〜６％とした化合物１含有培地（第２層）５ｍｌを重層する。これらの最上層に始原生殖細胞含有試料を静かに重層する。これを１００〜１０００×ｇ、好ましくは約４００×ｇで１０〜１５分間遠心して第１層と第２層化合物１培地の界面から始原生殖細胞を含む培地を採取する。これを新しい培地で希釈洗浄後、遠心処理し、始原生殖細胞を得ることができる。
【００３０】
さらに、上記取得方法で取得した始原生殖細胞に外来遺伝子を導入し、これを異種または同種の動物の胚に挿入して得られた胚を発生させることによりキメラ個体の作製を行うことができる。外来遺伝子としては、例えば、乳、卵中などに生産させようとする有用タンパク質の遺伝子、ノックアウト非ヒトトランスジェニック動物を作製するための目的遺伝子を破壊した遺伝子等が挙げられる。
【００３１】
外来遺伝子の導入は、ＯＢＡプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＣＭＶプロモータ等の通常遺伝子の発現に用いられるプロモータの制御下にある外来遺伝子を直接導入し、薬剤耐性等の選択マーカを利用して既遺伝子が導入された始原生殖細胞を選択する（細胞の分子生物学第３版、教育社）。導入の方法はマウス等の培養細胞等で定法とされるエレクトロポレーション法（細胞工学、１８，Ｎｏ．８（１９９９）；１８，Ｎｏ．９（１９９９）；１８，Ｎｏ．１０（１９９９）；１８，Ｎｏ．１１（１９９９）；１８，Ｎｏ．１２（１９９９）；１９，Ｎｏ．１（２０００）；１９，Ｎｏ．２（２０００）；１９，Ｎｏ．３（２０００））、不活化レトロウィルスベクター法（Ｈｉｐｐｅｎｍｅｙｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，７６１９−７６３２（１９８８））、マイクロインジェクション法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００３２】
遺伝子組み換え始原生殖細胞は、Ｋａｇａｍｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍ．Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，４８，５０１−５１０（１９９７）に記載されている方法で、始原生殖細胞の由来の胚と同種または異種の生物の胚の中、詳しくは胚盤葉期胚の中央部に挿入される。ここで、「始原生殖細胞の由来の胚と同種または異種の動物の胚」とは、始原生殖細胞を取得した元の生物の種と挿入先の胚の生物種が同じであっても、異なっていてもよいことを意味する。異種の生物の胚（宿主胚）への挿入の例としては、ニワトリの始原生殖細胞をウズラの胚へ挿入する例が挙げられる。
【００３３】
鳥類の場合、始原生殖細胞が血流にのって循環する時期があるので、その時期の胚（胚発生ステージ表１４〜１５）を用いて、遺伝子組み換え始原生殖細胞を胚に挿入し、生殖巣原基に到達させることも可能である（実験医学  ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．２，１９９４）。該方法を以下、「鳥類始原生殖細胞の胚間移植法」という。
【００３４】
さらに、遺伝子組み換え始原生殖細胞の挿入効率を高めるために、生殖細胞が局在する明域中央部を除去することにより宿主胚自身の生殖細胞を排除したり、鳥類始原生殖細胞の胚間移植法においては、１回に注入する始原生殖細胞の数を多くし、宿主胚側の始原生殖細胞の数を減少させるために血液を抜き取る操作を行なったりしてもよい。
【００３５】
次いで、挿入によって得られた胚を発生させる。「胚を発生させる」とは、胚を体内体外に関わらず、分化、成長させることをいう。胚を発生させる発生工程では、例えばキメラ個体作製において具体的に述べると、挿入によって得られた胚を代用母体内に移植し、分化、成長させ、キメラ個体を出産させてもよいし、鳥類始原生殖細胞の胚間移植法等を用いた場合は、体外で胚を孵卵、若しくは培養することによってキメラ個体を得てもよい。ここで、宿主胚として作製されたキメラ個体のマーカとなるよう表現形の異なる系統の宿主胚を使用しておくことが望ましい。利用される表現形としては、羽毛の色等が挙げられる。
【００３６】
得られたキメラ個体においては、始原生殖細胞に由来する遺伝子をもつ細胞は体細胞あるいは生殖細胞系にランダムに含まれている。そこで、生殖細胞系に始原生殖細胞由来遺伝子が取り込まれた個体を得るために、キメラ個体と野生型の個体との交配を行ない、導入された遺伝子を片方の染色体にもつヘテロ変異（ヘテロ接合体）の非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる。生殖細胞系に始原生殖細胞由来遺伝子が取り込まれたキメラ個体では、遺伝子組み換え始原生殖細胞由来の精子、卵子の形成が起こることから、この交配によって遺伝子組換えゲノムを受け継いだヘテロ変異（ヘテロ接合体）の非ヒトトランスジェニック動物が、高い確率で産出されることとなる。また、ヘテロ変異（ヘテロ接合体）の非ヒトトランスジェニック動物同士を交配することによって、その子孫を得ることができる。
【００３７】
次いで、表現形および／またはゲノム解析等の方法によって、上記交配で得られた個体のうちから非ヒトトランスジェニック動物を判別して取得することができる。ここで、利用される表現形としては、羽毛の色等が挙げられ、ゲノム解析としては、ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析、ＰＣＲによって遺伝子型を解析する等の通常の方法を用いることができる。
【００３８】
さらに、ヘテロ変異（ヘテロ接合体）の非ヒトトランスジェニック動物同士の兄妹交配により、導入された遺伝子を両方の染色体上にもつホモ変異（ホモ接合体）の非ヒトトランスジェニック動物を取得することができる。また、ホモ変異（ホモ接合体）の非ヒトトランスジェニック動物同士を交配することによって、その子孫を得ることができる。
【００３９】
非ヒトトランスジェニック動物を用いることにより、ゲノム遺伝子機能の解析、遺伝子発現の細胞特異性、時期特異性に関与するＤＮＡ構造の解析、遺伝子産物の機能的役割の解析、未知の遺伝子の探索などが可能であり、さらに遺伝的疾患モデル動物の作製、家畜の品種改良、生理活性タンパク質等の有用タンパク質の生産など、様々な応用が可能である。
【００４０】
有用タンパク質の生産の場合、例えば目的とする有用タンパク質の遺伝子を、始原生殖細胞に導入し、鳥類のような卵生動物の非ヒトトランスジェニック動物（非ヒトトランスジェニック鳥類）を得ることにより、目的タンパク質を高濃度に含んだ卵を得ること等が可能である。ニワトリ等の家禽を用いることにより、閉鎖環境下で完全な管理のもとに多数飼育が可能なこと、世代間隔が性成熟まで比較的短いこと、定常的に卵が得られること、飼育コストが家畜に比べて低いことなどから、非ヒトトランスジェニック動物よりも産業上有用性が高いと考えられる。また、栄養付加した食用卵、アレルゲン除去した食用卵なども生産可能となる。
【００４１】
また、鳥類の卵白成分は、卵管上皮細胞によって製造されるので、該非ヒトトランスジェニック鳥類から卵管上皮細胞を採取し、卵管上皮細胞の培養を行なうことにより、卵管上皮細胞培養液および卵管上皮細胞中から目的タンパク質を得ることができる。卵管上皮細胞の培養は哺乳類の細胞培養条件に準ずればよく、特に制限はないが、具体的にはＭＥＭ、Ｍ１９９、Ｈａｎｋｓ、ｃＨａｎｋ’ｓ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，９６，５２１−５２８（１９９２）等）に５〜１０％のウシ胎児血清等を加えたもので培養することができる。卵管上皮細胞を用いて目的タンパク質を製造する方法は、微生物による製造方法に比べて医薬品としての活性発現に関与する糖修飾が可能である点で優れている。また、非ヒトトランスジェニック鳥類を飼育しなくてよいため、飼育設備の必要がなく、飼育の手間もかからない点で優れている。
【００４２】
得られた非ヒトトランスジェニック動物がほ乳類、例えば、乳牛等であれば乳の中に目的とする有用タンパク質を生産させることも可能である。
【００４３】
また、目的遺伝子を破壊した遺伝子を始原生殖細胞に導入することによってノックアウト非ヒトトランスジェニック動物を作製することも可能である。ノックアウト非ヒトトランスジェニック動物は、疾患と遺伝子異常との関連や発症メカニズムの解析に好適に用いることができる。
【００４４】
また、家畜の品種改良、希少動物種の保存にも非ヒトトランスジェニック動物の作製法は、好適に用いることができる。
【００４５】
【実施例】
以下、本発明の実施例を示し、本発明について更に詳細に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４６】
（実施例１）
白色レグホーン系ニワトリ受精卵を４８〜５４時間、３８℃で孵卵して胚発生ステージ表による発生段階１３〜１５の胚（ｎ＝１６）を得た。これらの胚からガラスマイクロピペットを用いて胚の周縁静脈から胚血液を採取した後、これを３ｍｌのＫＡｖ−１培地に分散した。次いで、これを３ｍｌの始原生殖細胞含有試料として、遠心管（５０ｍｌ容量）に予め１１％の化合物１培地５ｍｌ、その上に５．５％化合物１培地５ｍｌを重層したものの最上層に静かに重層した。これを４００×ｇで１５分間遠心処理して、５．５％化合物１培地と１１％化合物１培地の界面から少量の培地を採取し、これを培地で希釈洗浄して遠心処理し、始原生殖細胞を含む細胞懸濁液を得た。この際の回収率は、６７．７％であり、精製率は、７６．４％であった。ここで、「回収率」とは、始原生殖細胞を含んだ細胞集団（Ａ）に対する、そこから取得した始原生殖細胞の量（Ｂ）の百分率（回収率＝Ｂ／Ａ×１００）をいい、「精製率」とは、取得した始原生殖細胞を含む細胞懸濁液中に始原生殖細胞が含まれる割合（例えば、細胞懸濁液中の総細胞数が１００個であるとき、その中に始原生殖細胞が６０個含まれていた場合は精製率６０％となる。）をいう。回収率、精製率の定義は、以下の実施例においても同じである。これらの結果より、本発明の取得方法が、回収率、精製率ともに高いことが明らかとなった。
【００４７】
（実施例２）
白色レグホーン系ニワトリ受精卵を４８〜５４時間、３８℃で孵卵して、胚発生ステージ表による発生段階１２〜１４の胚（ｎ＝１５）を得た。これらの胚からガラスマイクロピペットを用いて胚の周縁静脈から胚血液を採取し、これを３ｍｌのＫＡｖ−１培地に分散した。次いで、これを３ｍｌの培地容量として、遠心管に予め１１％の化合物１培地５ｍｌ、その上に５．５％化合物１培地５ｍｌを重層したものの最上層に静かに重層した。これを４００×ｇで１５分間遠心処理して、沈殿した細胞を残して５．５％化合物１培地と１１％化合物１培地の全てを回収、これを培地で希釈洗浄して遠心処理し、始原生殖細胞を含む細胞懸濁液を得た。この際の回収率は、１００％、精製率は、５３．３％であった。これらの結果より、本発明の取得方法が、回収率、精製率ともに高いことが明らかとなった。
【００４８】
（実施例３）
日本ウズラ受精卵を３５〜４１時間、３８℃で孵卵して胚発生ステージ表による発生段階１２〜１５の胚（ｎ＝３０）を得た。これらの胚からガラスマイクロピペットを用いて胚の周縁静脈から胚血液を採取した後、これを３ｍｌのＫＡｖ−１培地に分散した。これを３ｍｌの培地容量として、遠心管に予め１２％の化合物１培地５ｍｌ、６％化合物１培地５ｍｌを重層したものの最上層に静かに重層した。これを４００×ｇで１５分間遠心処理して、６％化合物１培地と１２％化合物１培地の全てを回収し、これを培地で希釈洗浄して遠心処理し、始原生殖細胞を含む細胞懸濁液を得た。この際の回収率は、１００％、精製率は、６１．４％であった。これらの結果より、本発明の取得方法が、回収率、精製率ともに高いことが明らかとなった。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、従来の始原生殖細胞取得方法に比べて、回収率、精製率ともに高く、安定した始原生殖細胞取得方法を提供することができる。また、本発明の方法を用いて得られた始原生殖細胞は、キメラ個体の作製等の遺伝子工学的手法に好適に用いることができる。
【００５０】
さらに、得られた始原生殖細胞を用いて、キメラ動物、非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる。また、該非ヒトトランスジェニック動物から有用タンパク質等を含む卵、および／または、卵管上皮細胞を得ることができる。