(57)【要約】【課題】未分化造血細胞検出用の遺伝子マーカー及びポリペプチドマーカーを提供すること、及び、該マーカーを用いた未分化造血細胞の検出・分離方法を提供すること。【解決手段】成体の骨髄の造血肝細胞等の未分化造血細胞において発現しているＪＡＭ−１の遺伝子及びポリペプチドを未分化造血細胞検出用のマーカーとして用いる。本発明においては、該ＪＡＭ−１遺伝子を検出するためのプローブ、及び該ＪＡＭ−１ポリペプチドを検出するための抗体を作製し、該プローブ及び抗体を用いて未分化造血細胞を検出し、更に該未分化造血細胞の分離を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＪＡＭ−１遺伝子からなる未分化造血細胞検出用遺伝子マーカー。
【請求項２】
ＪＡＭ−１遺伝子が、配列表の配列番号１、３、５、７、９、又は１１に示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１記載の未分化造血細胞検出用遺伝子マーカー。
【請求項３】
未分化造血細胞の検出が、造血幹細胞の検出であることを特徴とする請求項１又は２記載の未分化造血細胞検出用遺伝子マーカー。
【請求項４】
ＪＡＭ−１タンパク質からなる未分化造血細胞検出用ポリペプチドマーカー。
【請求項５】
ＪＡＭ−１タンパク質が、配列表の配列番号２、４、６、８１０、又は１２に示されるポリペプチドを有することを特徴とする請求項４記載の未分化造血細胞検出用ポリペプチドマーカー。
【請求項６】
未分化造血細胞の検出が、造血幹細胞の検出であることを特徴とする請求項４又は５記載の未分化造血細胞検出用ポリペプチドマーカー。
【請求項７】
請求項１又は２記載のＪＡＭ−１遺伝子のＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有する未分化造血細胞マーカー遺伝子検出用プローブ。
【請求項８】
請求項２記載の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる請求項７記載の未分化造血細胞マーカー遺伝子検出用プローブ。
【請求項９】
請求項７又は８記載のＤＮＡの少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とする未分化造血細胞マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ。
【請求項１０】
請求項４又は５記載のポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１１】
抗体が、モノクローナル抗体又は該抗体の可変領域をフレキシブルなペプチドリンカーで結合した一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１０記載の抗体。
【請求項１３】
請求項７〜９のいずれか記載の診断用プローブ及び／又は請求項１０〜１２のいずれか記載の抗体を用いて、被検細胞における未分化造血細胞検出用マーカー遺伝子及び／又は未分化造血細胞検出用マーカーポリペプチドの発現を検出することを特徴とする未分化造血細胞の検出方法。
【請求項１４】
未分化造血細胞が造血幹細胞であることを特徴とする請求項１３記載の未分化造血細胞の検出方法。
【請求項１５】
請求項７〜９のいずれか記載の診断用プローブ及び／又は請求項１０〜１２のいずれか記載の抗体を用いて、被検細胞における未分化造血細胞検出用マーカー遺伝子及び／又は未分化造血細胞検出用マーカーポリペプチドの発現を検出し、検出した未分化造血細胞を分離することを特徴とする未分化造血細胞の分離方法。
【請求項１６】
請求項１０〜１２のいずれか記載の抗体を用いた蛍光抗体法により被検細胞中における未分化造血細胞を標識化し、該標識化した未分化造血細胞をセルソーターを用いて分離することを特徴とする請求項１５記載の未分化造血細胞の分離方法。
【請求項１７】
請求項１０〜１２のいずれか記載の抗体を用いた被検細胞集団中における未分化造血細胞を標識化し、該標識化した未分化造血細胞を磁気ビーズ法を用いて分離することを特徴とする請求項１５記載の未分化造血細胞の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、未分化造血細胞検出用遺伝子マーカー及び未分化造血細胞検出用ポリペプチドマーカー、特にはＪＡＭ−１遺伝子からなる未分化造血細胞検出用遺伝子マーカー、ＪＡＭ−１タンパク質からなる未分化造血細胞検出用ポリペプチドマーカー、及び該マーカーを用いた未分化造血細胞の検出・分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
我々の体内を流れる血液には、酸素を運搬する赤血球、免疫系を構成し生体防御の担い手となる好中球、好酸球、好塩基球などの顆粒球、単球及びリンパ球からなる白血球、止血に関わる血小板など形態も機能も大きく異なる血液細胞が含まれている。これら全ての血液細胞は、骨髄に少数存在する造血幹細胞から様々な中間段階を経て分化・成熟する。成熟した血液細胞の寿命は短く、たとえばヒトにおいて、赤血球は約１２０日、血小板は約７日であり、白血球の中で最も多く存在する好中球では血中にわずか約８時間程度留まるだけである。このような消費を補うために、成人の体内では１日に約２０００億個の赤血球および血小板と約７００億個の好中球が産生されている。このように造血系は、骨髄中の造血幹細胞を起源として大量の血液細胞の産生を生涯にわたって維持するきわめて動的に制御されたシステムである。この造血系の起源となる造血幹細胞は、こうした造血系の特徴を保つために、１個の細胞からすべての系統の血液細胞を作り出せる多分化能と自分と同じ細胞を作り続けることが出来る自己複製能という２つの能力を持つ細胞と定義される。
【０００３】
造血幹細胞は、上記のように自己複製能と多分化能という２つの能力を有する。これらの能力によって、造血幹細胞は骨髄において、造血のホメオスタシス（恒常性）の維持や、感染やストレスに対処する誘導的造血のための正確な複製及び分化を行っている。造血幹細胞が、このような正確な自己複製能を維持するためには、造血幹細胞と造血支持環境との相互作用が重要である。こうした相互作用には、造血幹細胞と造血支持細胞とがインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ：細胞表面上の接着機能受容体分子）やノッチ（Ｎｏｔｃｈ）受容体などを介して接触することによる直接的な相互作用、及び幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ：ＳＣＦ）などの液性因子を介した間接的な相互作用があり、これらが相互に関連し造血を調節している。しかし、造血幹細胞は他の組織の幹細胞と比べてその存在箇所の特定は難しく、正確な自己複製能の維持に必要な造血環境の分子基盤であるニッチェ（生態学的箇所）の解明は遅れている。また、造血環境の形成に必要な因子もまだ不明な部分が多い。この原因の一つとして、灌流により得られる骨髄細胞中のストローマ細胞の割合が非常に低く（０．０５％未満）、単離が難しい事が挙げられる。
【０００４】
発生学的には、ヒトの造血組織は、胎児の卵黄嚢で始まり、胎生２ヶ月からは肝が造血の主座を占めるようになるが、胎生４ヶ月を頂点として次第に減少する。胎生４ヶ月からは骨髄造血が始まり、胎生７ヶ月からは骨髄が造血の主座となる。胎児の成熟に伴って肝、脾の造血機能は次第に低下し、骨髄が成人期の中心的な造血器官として機能する。
【０００５】
骨髄での造血は、造血幹細胞を全ての血液細胞を起源として、様々な段階の造血前駆細胞を経て分化・増殖し、最終的に成熟血球として血管内へ生み出される。該造血幹細胞は、自己複製能によって個体の生涯にわたって、造血を維持できる。該造血幹細胞は、分化を開始するとまず自己複製能を失って多分化能を持った多能性造血前駆細胞を経て、次第に各系統の血球に特徴的な構造と機能とを獲得し成熟血球となる。これらの過程で造血前駆細胞は盛んに増殖し、最終的に多数の血球を産生できる。
【０００６】
このように血液細胞は、多能性造血幹細胞から種々の造血前駆細胞を経て分化し形成される。成熟の進んだ血液細胞は、細胞内顆粒などの特徴によって光学顕微鏡で形態的に区別できる。一方、造血幹細胞及び造血前駆細胞のような未分化な造血細胞では、形態的な区別がつかない。形態的に判別できる最も初期段階の細胞は、マクロファージに分化する単芽球、好酸球・好中球・好塩基球に分化する骨髄芽細胞、巨核球・血小板に分化する巨核球芽等が知られている。
【０００７】
形態的に判別できない該造血前駆細胞を、機能的に観察する公知の方法としてコロニー形成法（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｃｕｌｔｕｒｅ：ＣＦＵ−Ｃ）がある。本方法は、メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）を用いた固形培地に種々のサイトカインを加えて、被検細胞を培養し形成される血液コロニーを形態的に観察するものである。最も未分化な混合コロニー形成単位（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｍｉｘ：ＣＦＵ  ｍｉｘ）は、マクロファージ・顆粒球、赤血球・巨核球に分化できる細胞であり、これらの混在した血球コロニーとして観察される。混合コロニー形成単位より分化が進み、顆粒球マクロファージ系のみに分化が限定された造血前駆細胞は、顆粒球マクロファージコロニー形成単位（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ：ＣＦＵ−ＧＭ）として観察される。さらに分化が進むと、マクロファージに分化するマクロファージコロニー形成単位（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ：ＣＦＵ−Ｇ）となる。赤血球系にコミットした造血前駆細胞は、赤芽球バースト形成単位（Ｂｕｒｓｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ：ＢＦＵ−Ｅ）及び赤血球コロニー形成単位（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ：ＣＦＵ−Ｅ）として観察される。巨核球血小板系にコミットした造血前駆細胞は、巨核球コロニー形成単位（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ：ＣＦＵ‐Ｍｅｇ）として検出できる。
【０００８】
近年、造血幹細胞の発生に関して、マウスを用いたいくつかの研究の報告がなされている。該報告を用いて血液細胞の発生について詳細に説明すると、血液細胞は発生段階においていくつかの組織を経由した後に骨髄へと移行する（図１）。マウスの血液細胞は、胎生７．５日の卵黄嚢に現れる血球塊から最初に発生するが、この時期の血液細胞のほとんどが有核の胎生型赤血球で、成体型造血再建活性（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＬＴＲ−ＨＳＣ）を持つ造血幹細胞は存在しない（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  １，  ２９１−３０１，  １９９４）。ＬＴＲ−ＨＳＣ活性を有する造血幹細胞はそれより遅れて胎生１０日の大動脈−中腎−生殖隆起周辺の領域（Ａｏｒｔａ−ｇｏｎａｄ−ｍｅｓｏｎｅｐｈｒｏｓ：ＡＧＭ）から発生する事が確認されている（ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １９，２４６５−７４，２０００）。
【０００９】
ＡＧＭ領域では、造血幹細胞は大動脈内皮細胞に接着した状態で存在しており、ＥＳ細胞を用いた分化培養系でも内皮細胞マーカーであるＦｌｋ−１陽性、血液細胞マーカーであるＣＤ４５陰性細胞からＣＤ４５陽性の血液細胞が増殖して来ることから、血液細胞が血管内皮細胞と共通の前駆細胞（ヘマンジオブラスト：ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）から分化することが示唆されている（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  １６，  ６７３−８３，２００２；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １２４，  ２０３９−４８，  １９９７；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １２５，  １７４７−５７，  １９９８）。ＡＧＭ領域から発生した造血幹細胞は胎生１１．５日には、胎生期の主な造血器官である肝臓へと移行する。肝臓において造血幹細胞は活発に増殖と分化を繰り返しており、出生直後まで肝臓での造血は続くが、造血幹細胞は胎生１６日には脾臓、１８日に成体の造血器官である骨髄へと移行していき、これと並行して肝臓は次第に成体の主な役割である代謝器官へと性質を変える。
【００１０】
血小板の前駆細胞である巨核球は、１６〜３２Ｎに相当する多倍数体で、球形または卵形の直径３０〜１００μｍの大型血液細胞であり、止血作用に関与する血小板の産生を担っている。巨核球は、胎生期肝臓に初めて見い出され、脾臓及び骨髄にも存在し、これらの臓器で造血幹細胞から、混合コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）、巨核球系コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｍｅｇ）を経て分化する。
【００１１】
興味深いことに、巨核球と発生過程の造血前駆細胞とは共通した表面抗原を発現していることが知られている。例えば、巨核球系の表面抗原であるＣＤ４１は、ＡＧＭ領域の血球塊にも発現しており、ＥＳ細胞からのＥｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ（ＥＢ）培養法を用いた実験では、ＣＤ４１陽性細胞から血液細胞が発生することから、胎生期において発生過程の造血前駆細胞に発現していることが示唆されている（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２４３，  ３０１−１１，  ２００２；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １２９，  ２００３−１３，  ２００２；Ｂｌｏｏｄ，  １０１，  ５０８−１６，  ２００３）。また成体の造血系においても、巨核球の増殖因子として知られているＴｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＴＰＯ）が、より幼若な細胞であるｃｏｍｍｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ（ＣＭＰ）の増殖を促進し、ＴＰＯやその受容体であるであるｃ−ｍｐｌの遺伝子破壊マウスでは、巨核球のみならずＣＭＰの量が減少するという事から、巨核球と幼若な血液前駆細胞との関連性が示唆される（Ｂｌｏｏｄ，  ９２，  ４−１０，  １９９８；Ｂｌｏｏｄ，  ８７，  ２１６２−７０，  １９９６）。
【００１２】
一方で、巨核球は内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１やｖＷＦなどを発現し、逆にｃ−ｍｐｌが内皮細胞に発現していることから、内皮細胞との関連も示唆されている（Ｂｌｏｏｄ，  ９１，  ９２３−９，  １９９８）。
【００１３】
近年、骨髄培養の技術が進歩し、顕微鏡下で識別が可能な幼若細胞より更に未分化な造血前駆細胞を検出することも可能になった。また、そのような技術も開示されている（特表２０００−５０９２７７号公報）。しかし、造血前駆細胞から成熟血球に至る過程は、その機構の複雑さと、造血前駆細胞の未分化の段階での検出・分離の困難さから、まだそのメカニズムの多くが解明されていない。したがって、これらの研究を進展させるためには、該未分化段階での造血細胞を検出・分離する手段を開発することが重要である。特に、昨今は骨髄移植や細胞治療の技術が進展してきており、自己複製能を有するとともに、多種類の細胞にも分化できる造血幹細胞の検出・分離が重要となり、そのような手段の開発が切に望まれているところである。
【００１４】
【特許文献１】
特表２０００−５０９２７７号公報。
【非特許文献１】
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２４３，  ３０１−３１１，  ２００２。
【非特許文献２】
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １２９，  ２００３−２０１３，  ２００２。
【非特許文献３】
Ｂｌｏｏｄ，  １０１，  ５０８−５１６，  ２００３。
【非特許文献４】
Ｂｌｏｏｄ，  ９２，  ４−１０，  １９９８。
【非特許文献５】
Ｂｌｏｏｄ，  ８７，  ２１６２−２１７０，  １９９６。
【非特許文献６】
Ｂｌｏｏｄ，  ９１，  ９２３−９２９，  １９９８。
【非特許文献７】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １４２，  １１７−１２７，  １９９８。
【非特許文献８】
Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０４，  ５７２−５８１，  ２００１。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、未分化造血細胞検出用の遺伝子マーカー及びポリペプチドマーカーを提供すること、更には、該マーカーを用いた未分化造血細胞の検出・分離方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、血液細胞のマーカーとなる抗原を見い出すべく、胎生肝臓において巨核球様の細胞を強く染色する抗体を作成した。該抗体の抗原を探索した結果、接着因子の一つであるＪＡＭ−１（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）が、該抗体に特異的に結合される分子であった。該ＪＡＭ−１は、造血能の最も高い時期の胎生肝臓において発現しており、更に該ＪＡＭ−１が、成体の骨髄の造血幹細胞においても発現していることを見い出し、ＪＡＭ−１が未分化造血細胞検出用のマーカーとして用いることができることを確認して、本発明を完成するに至った。
【００１７】
本発明者らが本発明を完成するに至った経緯について説明すると、まず、本発明者らが造血支持因子の探索源に胎生肝臓を用いたのは、マウス胎生１４．５日では肝臓の約２０％が血液細胞以外の細胞であり培養なしに大量の造血支持細胞を調製することが出来ること、及び胎生肝臓では成体の骨髄よりも活発に造血幹細胞の増殖および分化が起こっており造血支持因子の探索に適していることによる。そこで、本発明者らは、最も造血能の高いマウス胎生１４．５日の肝臓を用い、シグナルトラップ法（ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｒａｐ：ＳＳＴ）、及び胎生肝臓抗原に対するモノクローナル抗体の作成とその抗原遺伝子の同定という２つの方法で造血支持因子の探索を行った。これら発生段階の方法は膜外に存在するタンパクを標的とし、細胞間の相互作用に関与する遺伝子のスクリーニングに有用な方法であると考えたからである。得られた抗体でマウス胎生１４．５日の肝臓の切片を染色して調べた結果、肝芽細胞や内皮細胞、星状細胞など様々な細胞を染色する抗体が存在していた。その中には、巨核球を強く染色する抗体も５種類（２４−１０，２７−８，２７−９，３４−８，３８−５）含まれていた（図２）。
【００１８】
本発明者らは、これらの得られた巨核球を染色する５種類の抗体が、幼若な血液細胞のマーカーとなることを期待し、抗原の同定および血液細胞における発現パターンの解析を主な目的として研究を進めた。最初に、これら５種類の抗体の内、４種類の抗体に対する抗原がＬＯ細胞（ＡＧＭ領域由来のヘマンジオブラスト様細胞株）に発現していることを確認した。そこで、抗原の同定のため、ＬＯ細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーを用いて、発現クローニングを行った。
その結果、４種類の抗体全てがＪＡＭ−１（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）を認識していることが判明した。次に、ＣＤ４１が胎生期特異的に幼若な血液細胞に発現していることを踏まえて、ＡＧＭ領域および胎生肝臓におけるＪＡＭ−１の発現を解析した。
【００１９】
その結果、どちらにおいても幼若な血液細胞でＪＡＭ−１が発現していた。実際に、胎生肝の血液細胞をＪＡＭ−１陽性と陰性に分け、コロニー形成能を比較した結果、ＪＡＭ−１陽性細胞の方が混合コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）の数が有意に多かった。また、フローサイトメトリー法による解析からは、骨髄細胞全体では、ＪＡＭ−１陽性細胞が１〜４％であったのに対して、成体の骨髄の造血幹細胞分画（ｃ−ｋｉｔ及びＳｃａ−１二重陽性の造血幹細胞分画）に存在する細胞では９５％以上がＪＡＭ−１を発現していることが判明した。更に、種々の造血組織から、ＪＡＭ−１陽性細胞を分離してコロニー形成を調べたところ、ＪＡＭは未分化造血前駆細胞を検出するマーカーとなることが明らかになった。以上の結果から、ＪＡＭ−１は発生段階に関わらず、幼若な血液細胞のマーカーとなりうることが確認された。
【００２０】
本発明の未分化造血細胞のマーカーとなるＪＡＭ−１は、膜一回貫通型のタンパク質で、膜外に２つのインテグリン様のループ構造を持つ接着因子である（図６）。ＪＡＭ−１は、内皮細胞及び上皮細胞、血液では巨核球と樹状細胞に発現していることが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １４２，  １１７−１２７，  １９９８；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０４，５７２−５８１，  ２００１）。本発明は、該ＪＡＭ−１の遺伝子及びポリペプチド（タンパク質）を未分化造血細胞の検出用マーカーとして用い、更には、該マーカー遺伝子検出用のプローブを作成し、及び該マーカーポリペプチド（タンパク質）に特異的に結合する抗体を作成し、未分化造血細胞の検出、分離を行うことよりなる。
【００２１】
すなわち具体的には本発明は、ＪＡＭ−１遺伝子からなる未分化造血細胞検出用遺伝子マーカー（請求項１）や、ＪＡＭ−１遺伝子が、配列表の配列番号１、３、５、７、９、又は１１に示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１記載の未分化造血細胞検出用遺伝子マーカー（請求項２）や、未分化造血細胞の検出が、造血幹細胞の検出であることを特徴とする請求項１又は２記載の未分化造血細胞検出用遺伝子マーカー（請求項３）や、ＪＡＭ−１タンパク質からなる未分化造血細胞検出用ポリペプチドマーカー（請求項４）や、ＪＡＭ−１タンパク質が、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示されるポリペプチドを有することを特徴とする請求項４記載の未分化造血細胞検出用ポリペプチドマーカー（請求項５）や、未分化造血細胞の検出が、造血幹細胞の検出であることを特徴とする請求項４又は５記載の未分化造血細胞検出用ポリペプチドマーカー（請求項６）や、請求項１又は２記載のＪＡＭ−１遺伝子のＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有する未分化造血細胞マーカー遺伝子検出用プローブ（請求項７）や、請求項２記載の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる請求項７記載の未分化造血細胞マーカー遺伝子検出用プローブ（請求項８）や、請求項７又は８記載のＤＮＡの少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とする未分化造血細胞マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ（請求項９）からなる。
【００２２】
また本発明は、請求項４又は５記載のポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体（請求項１０）や、抗体が、モノクローナル抗体又は該抗体の可変領域をフレキシブルなペプチドリンカーで結合した一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１０記載の抗体（請求項１１）や、抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１０記載の抗体（請求項１２）からなる。
【００２３】
さらに本発明は、請求項７〜９のいずれか記載の診断用プローブ及び／又は請求項１０〜１２のいずれか記載の抗体を用いて、被検細胞における未分化造血細胞検出用マーカー遺伝子及び／又は未分化造血細胞検出用マーカーポリペプチドの発現を検出することを特徴とする未分化造血細胞の検出方法（請求項１３）や、未分化造血細胞が造血幹細胞であることを特徴とする請求項１３記載の未分化造血細胞の検出方法（請求項１４）や、請求項７〜９のいずれか記載の診断用プローブ及び／又は請求項１０〜１２のいずれか記載の抗体を用いて、被検細胞における未分化造血細胞検出用マーカー遺伝子及び／又は未分化造血細胞検出用マーカーポリペプチドの発現を検出し、検出した未分化造血細胞を分離することを特徴とする未分化造血細胞の分離方法（請求項１５）や、請求項１０〜１２のいずれか記載の抗体を用いた蛍光抗体法により被検細胞中における未分化造血細胞を標識化し、該標識化した未分化造血細胞をセルソーターを用いて分離することを特徴とする請求項１５記載の未分化造血細胞の分離方法（請求項１６）や、請求項１０〜１２のいずれか記載の抗体を用いた被検細胞集団中における未分化造血細胞を標識化し、該標識化した未分化造血細胞を磁気ビーズ法を用いて分離することを特徴とする請求項１５記載の未分化造血細胞の分離方法（請求項１７）からなる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＪＡＭ−１遺伝子及びＪＡＭ−１タンパク質を、未分化造血細胞検出用マーカーとして用いて、未分化造血細胞の検出及び／又は分離を行うことよりなる。本発明のＪＡＭ−１遺伝子からなる未分化造血細胞検出用遺伝子マーカーの遺伝子のＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１、３、５、７、９、及び１１に示されており、該ＤＮＡ配列情報は、ＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいて、それぞれアクセッションナンバーＮＭ０１６９４６（配列番号１）、ＮＭ１４４５０３（配列番号３）、ＮＭ１４４５０２（配列番号５）、ＮＭ１４４５０３（配列番号７）、ＮＭ１４４５０４（配列番号９）、ＮＭ（配列番号１１）によりアプローチすることができる。また、本発明のＪＡＭ−１タンパク質からなる未分化造血細胞検出用ポリペプチドマーカーのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、及び１２に示されており、該配列情報は、同じくＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいて、それぞれアクセッションナンバーＮＭ０１６９４６（配列番号２）、ＮＭ１４４５０３（配列番号４）、ＮＭ１４４５０２（配列番号６）、ＮＭ１４４５０３（配列番号８）、ＮＭ１４４５０４（配列番号１０）、ＮＭ（配列番号１２）によりアプローチすることができる。
【００２５】
本発明で、検出・分離する未分化造血細胞としては、造血幹細胞及びその他の未分化な造血前駆細胞を挙げることができる。特に、造血前駆細胞の分化における多能性のメカニズムの解明や、骨髄移植や遺伝子治療の目的のために、未分化造血細胞を検出・分離する場合は、自己複製能と多分化能とを有する造血幹細胞の検出・分離が重要である。
【００２６】
本発明の遺伝子マーカーにより、未分化造血細胞を検出、分離するために、ＪＡＭ−１遺伝子のＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有するプローブを用いることができる。該プローブを用いて未分化造血細胞を検出するには、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、配列表に示した遺伝子マーカーのＤＮＡ配列から適宜の長さのＤＮＡプローブを作成し、適宜蛍光標識等の標識を付与しておき、これを被検体とハイブリダイズすることにより、造血細胞の検出を行う。該ＤＮＡプローブとしては、配列表に示した本発明の遺伝子マーカーの塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる未分化造血細胞マーカー遺伝子検出用プローブを用いることができる。
また、該プローブを、少なくとも１つ以上を固定化させたマーカー遺伝子検出用のマイクロアレイ又はＤＮＡチップの形で用いることもできる。
【００２７】
なお、上記ＤＮＡプローブの作製に際して、本発明の塩基配列において、「ＪＡＭ−１遺伝子のＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２８】
更に、本発明においては、本発明のＪＡＭ−１タンパク質のポリペプチドマーカーの検出に際して、該タンパク質のポリペプチドによって誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いることができる。該抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を挙げることができる。また、ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）法等により作製された一本鎖（Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ）抗体も利用が可能である。該抗体の作製は、本発明のポリペプチドマーカーを抗原として、常法により作製することができる。本発明の抗体を用いて、被検細胞における未分化造血細胞検出用マーカーポリペプチドの発現を検出するには、公知の抗体を用いた免疫学的測定法を用いて実施することができる。該免疫学的測定法としては、例えばＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的測定法を挙げることができる。
【００２９】
本発明においては、本発明の診断用プローブ及び／又は本発明の抗体を用いて、被検細胞における未分化造血細胞検出用マーカー遺伝子及び／又は未分化造血細胞検出用マーカーポリペプチドの発現を検出し、検出した未分化造血細胞を分離して未分化造血細胞を取得することができる。
例えば、本発明の抗体を用いて蛍光抗体法を用いて未分化造血細胞を、検出・分離するには、公知の方法により未分化造血細胞を標識化し、標識化した未分化造血細胞を公知のセルソーターにより分離し、採取する。すなわち、まず蛍光抗体法により未分化造血細胞を標識化するには、本発明の未分化造血細胞検出用ポリペプチドマーカーに特異的に結合する抗体を蛍光標識し、これを抗原を発現している未分化造血細胞に結合させて、造血細胞を標識化する（直接蛍光抗体法）か、或いは、抗原を発現している未分化造血細胞に、未標識の本発明の特異抗体を結合させた後に、標識化した二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）を結合させて造血細胞を標識化し（間接蛍光抗体法）、該標識化した造血細胞を蛍光活性化セルソーター（フローサイトメーターの一つ）等により、分離、採取する。
【００３０】
また、本発明の抗体を用いて公知のビーズによる細胞分離法を利用して未分化造血細胞を分離、採集できる。すなわち、未標識の本発明の未分化造血細胞検出ポリペプチドマーカーに特異的に結合する抗体を造血細胞に反応させて、抗原を発現している未分化細胞に結合させる。さらに、公知の磁気ビーズを結合した二次抗体を反応させて、該造血細胞を磁気によって標識化する。或いは、まず、本発明の未分化造血細胞検出用ポリペプチドを公知の方法によってビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）によって標識し、これを造血細胞に反応させ、抗原を発現している未分化造血細胞に結合させる。さらに、該造血細胞に、公知のビオチンに対して特異的に結合するストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ）を結合させた磁気ビーズを結合させて該造血細胞を磁気標識する。該磁気標識化した造血細胞を、磁気分離カラム等の磁気分離装置により、分離、採取する。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００３２】
［材料及び方法］
（パニング法による発現クローニング）
この実験ではＳｅｅｄらにより考案された方法（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４，  ３３６５−３３６９，  １９８７）を一部改良して行い、１週間の実験を１セットとしてインサート（挿入断片）が濃縮されるまで繰り返し作業を行った。
一日目に、ＬＯ細胞株のｃＤＮＡライブラリーを導入した大腸菌を５００ｍＬのＬＢ培地に接種し、Ｏ．Ｄ．６００ｎｍが０．６になるまで培養した後、クロラムフェニコールを加え更に一晩培養を続けた。一方で、ＣＯＳ７細胞株をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液でディッシュから剥がした後、６ｃｍディッシュに５〜１０×１０５の細胞を播種し培養した。
【００３３】
２日目に、培養した大腸菌を遠心して上清を十分取り除いた後、２０％ショ糖／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁した。懸濁した大腸菌溶液にリゾチーム溶液を添加し５分間氷上で静置した後、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加え、更に５分間氷上に静置した。次に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加え３７℃で５分間加温した後、再び氷上に戻して氷冷した１０％ショ糖／１０ｍＭ塩酸マグネシウム／ＤＭＥＭ（Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）を徐々に加え撹拌した。上記で処理したプロトプラスト（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）化大腸菌懸濁液をディッシュから培養液を取り除いたＣＯＳ７細胞に重層し、室温で１０分間、２，０００ｒｐｍで遠心した後、ディッシュから上清を取り除いた。
５０％（Ｗ／Ｗ）ポリエチレングリコール１４５０／ＤＭＥＭ溶液をディッシュ上に均一に加えた後、直ちにディッシュから過剰のポリエチレングリコール溶液を吸引し２分間細胞融合させた。ＤＭＥＭ培地で２回プレートを洗浄した後、１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地中で３〜４時間培養した。その後、培養液を交換し更に３日間培養した。
【００３４】
５日目に、大腸菌と融合したＣＯＳ７細胞を５ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳでディッシュから剥がし、細胞数をカウントした後、遠心して上清を除き各ハイブリドーマの上清を２ｍＬずつ加え氷上で３０分間反応させた。その後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、５×１０６細胞／ｍＬとなるように５％牛胎仔血清／ＰＢＳで懸濁し２００μＬの二次抗体結合ビーズ（Ｄｙｎａ  ｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  ｒａｔ  ＩｇＧ：Ｄｙｎａｌ社製）を加え氷上で３０分間反応させた。抗原を発現している細胞の回収には、マグネットホルダーを用いて５〜１０回洗浄を行ない、非結合の細胞を除くことにより行った。Ｄｙｎａ  ｂｅａｄｓと結合し残った細胞をＨｉｒｔ溶液により溶解し、５分の１量の５Ｍ  ＮａＣｌを加え４℃で一晩反応させた。
６日目に、細胞溶解液からフェノール・クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出によりタンパクを除去し、エタノール沈澱によりプラスミドの精製を行った。精製したプラスミドをエレクトロポレーション法により大腸菌に形質転換し、ＬＢ培地で一晩培養した。
７日目に、培養した大腸菌をグリセロールによりストックし、残りの大腸菌からプラスミドの回収およびｃＤＮＡインサートの確認をした。
【００３５】
（Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出）
頚椎脱臼したマウスを速やかに解剖し、各組織３００ｍｇを２ｍＬのＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に入れホモジナイザーで破砕した。各組織を１．５ｍＬの遠心チューブに移し、８０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しいチューブに移し２回クロロホルム抽出を行い、イソプロパノール沈澱によりＲＮＡを精製した。精製したＲＮＡは、５０μＬのＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）水に溶解し、吸光度計により濃度を測定し−８０℃に保存した。
【００３６】
（ジゴキシゲニンＤｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ（ＤＩＧ）ラベルプローブの作成）
ＪＡＭ−１のｃＤＮＡをノーザンブロット法用のプローブとして用いるため、ｃＤＮＡを含むプラスミドを制限酵素Ｎｏｔ  Ｉで処理し、フェノール・クロロホルム抽出及びクロロホルム抽出によりタンパクを除去した後、エタノール沈澱によりＤＮＡフラグメントを回収した。ＤＮＡフラグメントは、１μｇ／μＬになるように純水に溶解した後、１μＬを３５μＬの純水に希釈し、１０×ＰＣＲ緩衝液  ５μＬ、ジゴキシゲニン−ＤＮＡ標識液（ＤＩＧ−ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅ）  ４μＬ、１０ｐＭ  プライマー  ５μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ｒ−Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）  １μＬを混合し、熱変性９４℃  １分、アニーリング５０℃  ３０秒、伸長７２℃  １分の反応を４０サイクル行った。
【００３７】
（ノーザンブロット）
各試料のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １０μｇを１％ホルムアルデヒド−アガロースゲルにて電気泳動し、核酸ブロッティング用メンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋  ｍｅｍｂｒａｎｅ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にブロッティング後、２分間、紫外線照射で固定した。次に、以下の条件でハイブリダイゼーションを行った。まず、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ７．０、２％  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ、０．１％サルコシル（ｓａｒｏｃｏｓｙｌ）、７％ＳＤＳ）で、４２℃、１〜４時間インキュベートした後、２０μｇ／ｍｌのプローブが入ったＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで４２℃、８〜１６時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを第一洗浄液（１ｓｔ  ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ：２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で、室温、５分、２回、第二洗浄液（２ｎｄ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ：２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で５８℃、１５分、２回洗浄した。次に、緩衝液１（Ｂｕｆｆｅｒ  １：０．１Ｍ  ｍａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＭＡＮＮＨＥＩＭ社製））で１分、緩衝液２（Ｂｕｆｆｅｒ  ２：２％  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅｇｅｎｔ  ｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １）で３０分ブロッキングしアルカリフォスファターゼ結合−抗ジゴキシゲニン抗体（Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＭＡＮＮＨＥＩＭ社製）で３０分間反応させた後、Ｂｕｆｆｅｒ１で１５分、２回洗浄した。アルカリ性のＡｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．５）で５分、化学発光基質（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含むアッセイ液で５分それぞれインキュベートし、アルカリフォスファターゼによる基質の化学発光をＸ線フィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に感光させた。
【００３８】
（抗体の精製）
抗体を大量に生産するため、前処理として１週間前に０．５ｍＬのｐｒｉｓｔａｎｅ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ｉｎｃ．製）を注射しＢａｌｂ／ｃ  ｓｌｃのヌードマウス（ＳＬＣ社）に、５００μＬのＰＢＳに懸濁した５×１０６のハイブリドーマを腹腔内に注射した。２〜３週間後に、ヌードマウスの腹部が膨らんできたら、頚椎脱臼後にシャーレ上で切開し腹水を回収した。回収した腹水は、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、脂肪と血球を除去し４℃で保存した。腹水からの抗体の精製には、ＭａｂＴｒａｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を使用し、方法はキットに添付のプロトコールに従い行った。実際に行った方法を手短に説明すると、１ｍＬの腹水と結合液（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）１ｍＬを混ぜ０．４５μｍのフィルターに通した後、５ｍＬの純水で一回洗浄し、３ｍＬの結合液で１回平衡化したカラムに通し、抗体をカラムに含まれるプロテインＧ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）に結合させた。抗体の結合したカラムを５ｍＬの結合液で洗浄し、５ｍＬの溶出液（Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で抗体をカラムから溶出した。この際、７５μＬの中和液（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を入れたチューブに１ｍＬずつ分注し各画分のタンパクの濃度を吸光度計のＯＤ値２８０で計った。精製した抗体はその後、ＳＬＩＤＥ−Ａ−ＬｙｚｅｒＤｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ社製）に入れＰＢＳに浸積し、４℃、１２〜１６時間透析することで余計な塩を取り除いた。
【００３９】
（抗体のビオチン化）
抗体のビオチン化は、ＥＣＬ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を使用し、方法はキットに添付のプロトコールに従って行った。手短に説明すると、抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう２ｍＬの炭酸緩衝液（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）に希釈し、８０μＬのビオチン化剤（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）を加え室温で１時間放置しビオチン化を行った。ビオチン化された抗体は、５ｍＬの０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ、２０ｍＬのＰＢＳの順に平衡化させたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５  ｃｏｌｕｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に通して精製した。
【００４０】
（胎生肝の分離およびフローサイトメトリー法による解析）
各発生段階の胎仔マウスより肝臓を摘出し、眼科用ハサミで細断した。１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ溶液で３７℃で１５分処理して細胞を分散させた。次に、低張の溶血液（１５ｍＭ    Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ    ＮＨ４Ｃｌ）で４℃、５分間処理し、混入している赤血球を破壊後、口径７０μｍのセルストレーナー（ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ）に通した。フローサイトメトリー法には、細胞を１サンプルあたり１×１０５から１×１０６／５０μＬになるよう５％牛胎仔血清−２ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで懸濁し、非特異的染色を防ぐため抗マウスＦｃ−受容体γ抗体を１μＬ加え、氷上で３０分間静置した。細胞をＰＢＳで洗浄後、５０μＬの５％ＦＣＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳに懸濁し１μＬの一次抗体を加え氷上で３０分間静置後、細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μＬの５％ＦＣＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳに懸濁して１μＬの二次抗体を加え更に３０分間氷上で静置した。抗体を結合させた細胞は、ＰＢＳで洗浄し５％ＦＣＳ−２ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳに懸濁した後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社））により解析した。
【００４１】
（フローサイトメトリー法により分取した細胞の形態的観察）
回収用セルソーター（ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ：Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により分取した細胞を１×１０４となるよう１００μＬのＰＢＳに懸濁し、集細胞装置（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ社）で３００ｒｐｍ，３分間遠心してスライドガラスに張り付けた。風乾後、グリュワイド溶液で３分間固定し水道水で余分な溶液を洗い流した。次に、ギムザ溶液で、３０分間染色し、水道水で余分な溶液を洗い流した。光学顕微鏡により細胞の形態を観察した。
【００４２】
（骨髄における造血幹細胞分画の解析）
頚椎脱臼したマウスから取り出した大腿骨および頚骨を、ＰＢＳにより灌流し骨髄の血液細胞を回収した。回収した血液細胞は、溶血液により赤血球を除去した。さらに分化した血球を除く目的で、１０７の細胞を５００μＬの５％ＦＣＳ／ＰＢＳに懸濁し、分化マーカーであるＴｅｒ１１９、Ｇｒ−１、Ｂ２２０、ＣＤ４およびＣＤ８抗マウスラット抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を５μＬずつ加え氷上３０分間反応させた。細胞をＰＢＳで洗浄後、２ｍＬの５％ＦＣＳ／ＰＢＳに懸濁しＤｙｎａ  ｂｅａｄｓを３００μＬ加え４℃、３０分間、穏やかに震盪させながら反応させた。Ｄｙａｎａ  ｂｅａｄｓに結合した細胞はマグネットホルダーにより除去し、残った未分化な細胞をフローサイトメトリー法により解析した。
【００４３】
［実施例の結果］
（「巨核球様細胞を染色する抗体の抗原の発現」−抗原はＡＧＭ由来の細胞株ＬＯに発現している−）
巨核球のマーカーであるＣＤ４１は胎生期特異的に幼若な血液細胞に発現しており、また巨核球のマーカーとなる分子が内皮細胞に多く発現していることから、巨核球様の細胞を染色する５つの抗体（２４−１０，２７−８，２７−９，３４−８，３８−５）がヘマンジオブラストに発現している可能性が考えられた。
そこで、これらの抗体が我々の研究室で樹立したＡＧＭ由来のヘマンジオブラスト様細胞株ＬＯにおいて発現しているかフローサイトメトリー法により解析した。この際、細胞株を用いた理由として、恒常的に抗原を発現している細胞株が存在すると、抗原の特定やその他の解析に有用であると考えられたからである。その結果、これら５種類の抗体のうち、２４−１０，２７−９，３４−８および３８−５がＬＯ細胞で発現していることが分かった（図３）。一方で、２７−８に関しては、発現が確認できなかった。
【００４４】
（「巨核球様細胞を染色する抗体の認識」−抗体のうち、４種類は（ＪＡＭ−１）ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１を認識している−）
巨核球様細胞を染色する抗体のうち４種類の抗体の抗原がＬＯ細胞で発現していることが確認できたので、これらの抗原をクローニングするため、我々の研究室で作製したＬＯ細胞のｃＤＮＡライブラリーを用いて発現クローニングを行った。スクリーニングは３回行い、１回目と２回目は４種類の抗体を全て混ぜて、３回目のみ各抗体に分けて行ったが、２回目のスクリーニングの段階で既に特定のｃＤＮＡ断片の濃縮が確認され、３回目の各抗体に分けて行ったスクリーニングでは、どの抗体を用いた場合にも同じ長さのｃＤＮＡ断片が確認された。そこで、３回目のスクリーニングにより得られたプラスミドを大腸菌に形質転換して植菌しコロニーを１０個単離して解析したところ、１０クローン中６クローンが同じ長さのｃＤＮＡであった（図４）。
【００４５】
ｃＤＮＡの塩基配列をシークエンシング反応により調べたところ、接着分子の一つｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＪＡＭ−１）であった。ＪＡＭ−１は、膜一回貫通型のタンパクで、膜外に２つのインテグリン様のループ構造を持つ接着因子である（図５）。また、ＪＡＭ−１は内皮細胞および上皮細胞、血液細胞では巨核球と樹状細胞に発現していることが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４２，  １１７−１２７，  １９９８、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０４，  ５７２−５８１，  ２００１）。ＪＡＭ−１の成体の各組織での発現パターンをノーザンブロット法により調べたところ、発現量に差が有るもののほとんど全ての組織でＪＡＭ−１が発現していた（図６）。しかし、最初の２回のスクリーニングは抗体を混ぜて行ったため、４種類の抗体全てがＪＡＭ−１を認識しているのか確認する必要があった。そこで、ＪＡＭ−１をリポフェクションによりＣＯＳ７細胞に強制発現させ、これらの抗体が実際にＪＡＭ−１を認識するかフローサイトメトリー法により解析した。その結果、これら全ての抗体がＪＡＭ−１を認識していることが判明した（図７）。
【００４６】
（「ＡＧＭ領域におけるＪＡＭ−１の発現」−ＡＧＭ領域では８０％以上の細胞がＪＡＭ−１を発現している−）
ＪＡＭ−１は、成体の血液細胞では巨核球および血小板で発現していることが報告されている。そこで、前述したように巨核球のマーカーとなる複数の遺伝子が胎生期の未分化な血液細胞に多く発現しているということ、及びヘマンジオブラスト様細胞株ＬＯに発現していたことから、造血幹細胞の発生部位であるＡＧＭ領域でのＪＡＭ−１の発現解析を試みた。この実験では、ＪＡＭ−１陽性集団をより詳細に解析するため、ビオチン化したＪＡＭ−１抗体（２７−９）を用いた多重染色でのフローサイトメトリー法により行った。その結果、ＡＧＭ領域の８０％以上の細胞がＪＡＭ−１を発現していた（図８）。その中でも、ほぼ全てのＦｌｋ−１陽性の血管内皮細胞、ＰＣＬＰ１陽性ＣＤ４５陰性のヘマンジオブラストが存在すると考えられる集団（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１，  ５６７−５７８，  １９９９）の約９０％およびｃ−Ｋｉｔ，ＣＤ３４共陽性の造血幹細胞集団の約７５％がＪＡＭ−１を発現していた。しかし、この時期のＴｅｒ１１９陽性の赤血球ではＪＡＭ−１は発現しておらず、ＣＤ４５陽性の血液細胞での発現は４０％程度であった。
【００４７】
（「胎生期肝臓の血液細胞におけるＪＡＭ−１陽性細胞集団の比率」−ＪＡＭ−１陽性細胞集団の比率は発生段階が進むにつれて低下する）
ＡＧＭ領域では、内皮細胞やヘマンジオブラストだけで無く幼若な血液細胞もＪＡＭ−１を発現していた。そこで、ＡＧＭ領域から発生した造血幹細胞の移行先である肝臓でのＪＡＭ−１の発現を発生段階に従って、フローサイトメトリー法により解析した。解析には、ＡＧＭ領域から造血幹細胞が移行し始める胎生１１．５日、造血能が最も高い胎生１４．５日および成体の造血器官である骨髄および脾臓へ造血幹細胞が移行を始める胎生１８．５日の肝臓を用いた。その結果、ＣＤ４５陽性の血液細胞集団の中でのＪＡＭ−１の発現頻度が胎生１１．５日では２８％、胎生１４．５日では１５％，胎生１８．５日では７％と発生段階の進行に伴い減少することが分かった（図９）。また、自家蛍光を発する肝細胞が多く存在する側方散乱光（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳＣ）の値が高い細胞集団においては、肝臓での造血能が高い胎生１４．５日まで約７０％程度の細胞がＪＡＭ−１を発現しているが、それ以降の胎生１８．５日では１６．５％と急激に減少していく傾向が見られた。しかし、内皮細胞のマーカーであるＦｌｋ−１陽性の細胞集団においては発生段階に関わらずほぼ全ての細胞がＪＡＭ−１を発現していた。
【００４８】
血液細胞全体では、ＪＡＭ−１陽性の細胞は発生段階の進行と共に減少していく傾向が見られたことから、ＪＡＭ１は未分化な血液細胞に多く発現している可能性が考えられた。そこで、未分化な血液細胞のマーカーであるｃ−ｋｉｔ，ＣＤ３４二重陽性の細胞集団に限定してＪＡＭ−１の発現を調べた。その結果、ｃ−ｋｉｔ，ＣＤ３４二重陽性の細胞集団において、ＪＡＭ−１を発現している細胞の割合は胎生１１．５日目で６０％以上と最も高く、胎生１４．５日目以降では低下するものの発生段階に関わらずｃ−Ｋｉｔ，ＣＤ３４共陽性細胞の２０％以上がＪＡＭ−１を発現していることが確認できた（図１０）。
【００４９】
（「胎生期の肝臓のＪＡＭ−１陽性血液細胞」−ＪＡＭ−１陽性血液細胞には未分化な細胞が多く存在する−）
胎生期の肝臓細胞でのフローサイトメトリー法による解析から、未分化な血液細胞がＪＡＭ−１を発現している可能性が示唆された。そこで、コロニーアッセイ法により、実際にＪＡＭ−１陽性の血液細胞が未分化な細胞であるかを、胎生１１．５日，１４．５日および１８．５日の肝臓を用いて調べた。まず、最初にそれぞれの発生段階のＣＤ４５陽性の血液細胞をＪＡＭ−１陽性とＪＡＭ−１陰性にセルソーター（ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ）により精製回収し、形態を観察した。意外な事に、ＪＡＭ−１陽性とＪＡＭ−１陰性の血液細胞に形態的な差はほとんど見られず、ＪＡＭ−１陰性の方が球状の細胞が多かった（図１１）。また、胎生１８．５日のＪＡＭ−１陽性血液細胞の中には、分化した形態の細胞も多く存在していた。しかし、コロニー形成能は、ＪＡＭ−１陽性細胞の方がＪＡＭ−１陰性細胞よりも高かった。形成されたコロニーの総数では、各発生段階においてＪＡＭ−１陽性細胞の方がＪＡＭ−１陰性細胞より約１．５倍多く、未分化な血液細胞のコロニーであるＣＦＵ−Ｍｉｘの数では、ＪＡＭ−１陽性細胞の方がＪＡＭ−１陰性細胞より胎生１１．５日では約４倍、胎生１４．５日および胎生１８日では約１０倍と非常に顕著な差が認められた（図１２）。また、ＪＡＭ−１陽性細胞由来のコロニーは個々のコロニーが大きく、ＪＡＭ−１陽性細胞が盛んな増殖能力を持っていることを示した（図１３）。
【００５０】
（「成体の骨髄におけるＪＡＭ−１の発現」−成体の骨髄では造血幹細胞あるいは造血前駆細胞がＪＡＭ−１を発現している−）
胎生期の肝臓のほぼ全ての発生段階において、ＪＡＭ−１が未分化な血液細胞に発現していることが示唆された。そこで、成体の主な造血器官である骨髄においてもＪＡＭ−１が未分化な血液細胞に発現しているか調べるため、造血幹細胞分画でのＪＡＭ−１の発現をフローサイトメトリー法により解析した。骨髄に存在する血液細胞の９５％以上は分化段階の進んだ血液細胞であるため、最初に分化マーカーであるＢ２２０，ＣＤ４，ＣＤ８，Ｇｒ−１，Ｔｅｒ１１９を発現している細胞をＤｙｎａ  ｂｅａｄｓにより除去した。この作業では、分化マーカー陽性細胞を完全には除去しきれないため、分化マーカー陽性細胞がどの程度残っているかフローサイトメトリー法により確認したところ、全体の約５０％程度まで減少していた。次に、分化マーカー陽性細胞の除去により、ＪＡＭ−１の発現頻度がどのように変化するか調べた。その結果、骨髄細胞全体ではＪＡＭ−１陽性細胞が１〜４％であったのに対して、分化マーカー陽性細胞を除去した後では、ＪＡＭ−１陽性細胞が約１５％に増加していた（図１４）。
【００５１】
次に、これらの細胞を造血幹細胞のマーカーであるｃ−ｋｉｔとＳｃａ−１抗体で染色し、ｃ−ｋｉｔ，Ｓｃａ−１二重陽性の造血幹細胞を含む分画におけるＪＡＭ−１陽性細胞の頻度を調べた。その結果、この分画の９５％以上の細胞がＪＡＭ−１を発現していることが判明した。反対にＪＡＭ−１陽性細胞において、ｃ−ｋｉｔおよびＳｃａ−１の発現を検討した結果、ｃ−ｋｉｔ強陽性の分画にＪＡＭ−１陽性細胞が局在していることが分かった。しかし、この実験系では、分化マーカー陽性の細胞が完全に除去されたわけでは無く、ＪＡＭ−１陽性集団が本当に分化マーカー陰性の細胞か確認する必要があった。そこで、フローサイトメトリー法の解析時に分化マーカーを完全に除去し、Ｓｃａ−１陽性細胞におけるＪＡＭ−１の発現を調べた。その結果、完全に分化マーカーを除去した後でも、ＪＡＭ−１，Ｓｃａ−１共陽性の細胞は存在していることが判明した。以上の結果から、成体の骨髄では造血幹細胞あるいは造血前駆細胞がＪＡＭ−１を発現していることが示唆された。
【００５２】
【発明の効果】
造血前駆細胞の分化における多能性のメカニズムの解明や、骨髄移植や遺伝子治療の目的のために、未分化造血細胞を検出、分離することが必要になる。特に、これらの目的のために、自己複製能と多分化能とを有する造血幹細胞の検出、分離が重要となる。本発明により、ＪＡＭ−１遺伝子及びポリペプチドが未分化な造血細胞において発現され、該造血細胞の良いマーカーとして利用できることが確認できたことにより、該マーカーを使用して未分化造血細胞を容易に検出、分離することが可能となった。
【００５３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】マウス胎生期の造血組織の移行を示す図である。
【図２】本発明の実施例における、巨核球細胞を染色する各抗体を示す図である。
【図３】本発明の実施例における、各巨核球抗体に対する抗原のＬＯ細胞での発現パターンを示す図である。
【図４】本発明実施例における、３回目のスクリーニングで得られたライブラリーをシングルクローンにし、ｃＤＮＡインサートの長さを確認した結果を示す図である。
【図５】本発明でマーカーとして用いるＪＡＭ−１の構造を示す図である。
【図６】本発明の実施例における、ＪＡＭ−１遺伝子の発現組織分布を示す図である。
【図７】本発明の実施例における、フローサイトメトリー法により巨核球様細胞を染色する抗体が、ＪＡＭ−１を認識することを確認したことを示す図である。
【図８】本発明の実施例における、フローサイトメトリー法による、ＡＧＭ領域おけるＪＡＭ−１の発現パターンを示す図である。
【図９】本発明の実施例における、肝臓の各発生段階におけるＪＡＭ−１の発現パターンの変化をフローサイトメトリー法により解析した結果を示す図である。
【図１０】本発明の実施例における、肝臓の各発生段階の未分化な血液細胞におけるＪＡＭ−１の発現パターンの変化をフローサイトメトリー法により解析した結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例における、ＪＡＭ−１陽性及び陰性の血液細胞の形態を示す図である。
【図１２】本発明の実施例における、ＪＡＭ−１陽性及び陰性血液細胞由来のコロニー数を示す図である。
【図１３】本発明の実施例における、胎生肝臓の各発生段階における、ＪＡＭ−１陽性及び陰性の血液細胞由来のコロニーの形態を示す図である。
【図１４】本発明の実施例における、骨髄の未分化な細胞におけるＪＡＭ−１の発現パターンを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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