(57)【要約】【課題】タキソールの合成原料であるタキサン類を微生物の培養によって安定して且つ大量に供給する新しい方法およびそのための微生物を提供する。【解決手段】ペスタロッチア属に属し、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ産生能を有することを特徴とするタキサン類産生微生物、および該微生物を培養し、培養物中に生成蓄積される１０−デアセチルバッカチンＩＩＩを採取することを特徴とする１０−デアセチルバッカチンＩＩＩの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペスタロッチア属に属し、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ産生能を有することを特徴とするタキサン類産生微生物。
【請求項２】
ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９８５である請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
請求項１に記載の１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ産生能を有する微生物を培養し、培養物中に生成蓄積される１０−デアセチルバッカチンＩＩＩを採取することを特徴とする１０−デアセチルバッカチンＩＩＩの製造方法。
【請求項４】
微生物がＦＥＲＭ−Ｐ１８９８５である請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タキサン類産生微生物およびその培養によるタキサン類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タキソールは、種々の癌細胞に対して強力な抗ガン作用を示し、特に、乳癌、卵巣癌、胃癌などに有効な制癌剤として日本でも既に承認されている（１９９７年７月）。
【０００３】
当初、タキソールは、イチイの樹皮から採取されていたが、自然保護の観点からイチイの木の伐採が禁止され、その入手が困難になった。しかし、最近ではイチイの葉からタキソールの前駆体である１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（１０−ＤＡＢと略す）が得られるようになった（例えば非特許文献１参照）。このような背景から、半合成法が実用的且つ重要な供給法となっている。該半合成法としては、例えば１０−ＤＡＢの１３位の水酸基でβ−ラクタムを開環する方法（例えば非特許文献２参照）及び１０−ＤＡＢの１３位の水酸基とフェニルイソセリン側鎖のカルボン酸をエステル化によって連結する方法（例えば非特許文献３参照）が知られている。
【０００４】
しかしながら、上記半合成法において出発原料とするイチイの葉に由来する前記前駆体は、その樹木中の含有量が低いと共に、樹木の成長管理が煩雑であり且つ広大な土地（植林地）と長期間の栽培を要するために、尚その供給が不安定で、スケールアップは容易でない不利がある。また該樹木からの抽出、精製操作なども煩雑である欠点が認められる。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｋｙｒｉａｃｏｓ　Ｃｏｓｔａ　Ｎｉｃｏｌａｏｕ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．　Ｅｎｇｌ．，　１９９４，　３３，　１５−４４
【０００６】
【非特許文献２】
Ｏｊｉｍａ，　Ｉ．；　Ｈａｂｕｓ，　Ｉ．；　Ｚｈａｏ，　Ｍ．；　Ｚｕｃｃｏ，　Ｍ．；　Ｐａｒｋ，　Ｙ．　Ｈ．；　Ｓｕｎ，　Ｃ．　Ｍ．；　Ｂｒｉｇａｕｄ，　Ｔ．　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，　１９９２，　４８，　６９８５−７０１２．
【０００７】
【非特許文献３】
Ｋａｎａｚａｗａ，　Ａ．　Ｍ．；　Ｄｅｎｉｓ，　Ｊ．；　Ｇｒｅｅｎｅ，　Ａ．　Ｅ．　Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．，　１９９４，　５９，　１２３８−１２４０．　（ｂ）　Ｇｅｎｎａｒｉ，　Ｃ．；　Ｃａｒｃａｎｏ，　Ｍ．；　Ｄｏｎｇｈｉ，　Ｍ．；Ｍｏｎｇｅｌｌｉ，　Ｎ．；　Ｖａｎｏｔｔｉ，　Ｅ．；　Ｖｕｌｐｅｔｔｉ，　Ａ．　Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．，　１９９７，　６２，　４７４６−４７５５．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、タキソールの半合成法のための出発原料である前記前駆体を、樹木の栽培によることなく、微生物の培養によって安定して且つ大量に供給する、新しい方法およびそのための微生物を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、イチイ属樹木の一種に生息するある種の糸状菌を単離、同定するに成功すると共に、該菌が上記目的に合致するタキソール前駆体の産生能を有しており、しかもその産生能がかなり高く、従って該菌の培養によって前記前駆体を容易に且つ大量に製造できるという新しい知見を得た。本発明はこの新知見を基礎として更に研究を重ねた結果、完成されたものである。
【００１０】
本発明の要旨は、下記項１−４に記載の通りである。
項１．　ペスタロッチア属に属し、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（以下、「１０−ＤＡＢ」と略す）産生能を有することを特徴とするタキサン類産生微生物。
項２．　ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９８５である項１に記載の微生物。
項３．　項１に記載の１０−ＤＡＢ産生能を有する微生物を培養し、培養物中に生成蓄積される１０−ＤＡＢを採取することを特徴とする１０−ＤＡＢの製造方法。
項４．　微生物がＦＥＲＭ−Ｐ１８９８５である項３に記載の方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明微生物およびこれを利用するタキサン類（１０−ＤＡＢ）の製造方法につき詳述する。
【００１２】
１．　本発明微生物
本発明微生物は、ペスタロッチア属に属し、１０−ＤＡＢ産生能を有することを特徴としている。
【００１３】
本発明微生物の一具体例としては、本発明者が、愛媛大学校内に栽培されているヨーロッパイチイ（Ｔａｘｕｓ　ｂａｃｃａｔａ）の内樹皮から新たに分離し、「ＴＷ−３」と命名した菌株を挙げることができる。該菌株は以下の性質を示す。
【００１４】
（１）　　形態学的特徴
本株は、麦芽エキス寒天培地、ポテト−デキストロース寒天（ＰＤＡ）培地、オートミール寒天培地などで良好に生育する。
【００１５】
気生菌糸は、白色で隔壁を有する。その表面は滑らかで、直径は約１−３μｍである。分化生子柄は、褐色から暗黒色で気生菌糸上に直立して形成される。その表面は平滑で棍棒状をしており、先端は最大約３０μｍまで膨れる。
【００１６】
分生子は、ａｒｔｈｒｏｓｐｏｒｅ型で出芽により連鎖し、紡錘形または楕円形であり、分生子の構成細胞数は５細胞である。厚さ最大約１０μｍまでの明瞭な淡黒色の隔壁を有する。型は長楕円形を示し、白色から淡褐色で、表面は平滑である。中心の３細胞は色が濃く（暗色）、先端細胞に１−４個の付属子が認められる。後部細胞の付属子は１本である。付属子を除いた分生子の大きさは、約１０−２５×５−１０μｍであり、先端細胞の付属子の大きさは約５−１５μｍであり、後部細胞の付属子の大きさは約２−６μｍである。
【００１７】
（２）　　各種培地上での性状
（２−１）　バレイショ−ブドウ糖寒天（ＰＤＡ）培地
生育は良好で、２５℃、２週間後のコロニーの直径は９０ｍｍ　である。表面は綿毛状の菌糸体よりなり、外縁は規則正しく縁取られている。気生菌糸の発達は良好であり、培養２週間で分生子の形成が認められる。中央部から中間部にかけて淡黄灰色からオリーブ色を呈し、周辺部は象牙色を呈する。中央部に部分的に暗褐色色素の生成が認められる。裏面中央部から中間部にかけて暗褐色を呈し、周辺部は灰白色を呈する。可溶性色素の生成は認められない。
【００１８】
（２−２）　麦芽エキス寒天培地
ＰＤＡ培地における生育状況とほぼ同様である。
【００１９】
（２−３）　オートミール寒天培地
ＰＤＡ培地における生育状況とほぼ同様である。
【００２０】
（２−４）　プレーンアガー培地（２％寒天培地）
ＰＤＡ培地における生育状況とほぼ同様である。
【００２１】
（３）　　生理学的性質
本菌株の生育条件をＰＤＡ培地で調べた。生育温度範囲は４−３０℃であり、生育ｐＨ範囲は４−１０である。至適温度範囲は２０−２５℃であり、至適ｐＨ範囲は５−９である。
【００２２】
以上の菌学的性状を基に、不完全菌類Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ　ｄｅ　Ｎｏｔ．の文献（Ｍｅｍ．　Ｒ．　Ａｃｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　Ｔｏｒｉｎｏ　２，３：　８０，　１８３９；　Ｇｕｂａ，　１９３２，　１９６１；　Ｓｔｅｙａｅｒｔ，　１９４９，　１９５５，１９５６；　Ｓｕｔｔｏｎ，　１９６９；　Ｄｕｂｅ　＆　Ｂｉｌｇｒａｍｉ，　１９６６；　Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８６）；Ｓｍｉｔｈ　Ｇ．，　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，　Ｇ．　Ｃ．　Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ　ａｎｄ　Ｐ．　Ｈ．　Ａ．　Ｓｎｅａｔｈ　ｅｄ．，　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖ．　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　（１９６２），　ｐ．１１１および「植物病原菌類図説」編者：小林享夫、勝本謙、我孫子和雄、阿部恭久、柿島真、全国農村教育協会発行、１９９２年、ｐ．５６７を検索したところ、本菌株はペスタロッチア・ペジゾイデス　デ　ノット（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ　ｐｅｚｉｚｏｉｄｅｓ　ｄｅ　Ｎｏｔ．）を基準種とするペスタロッチア菌種に属するものと判定された。しかるに、従来ペスタロッチア菌が１０−ＤＡＢ産生能を有することは報告された例がなく、そのような１０−ＤＡＢ産生能を有する点で、本菌株は公知のペスタロッチア菌株とは区別される。従って、本発明者は本菌株を、不完全菌ペスタロッチア属に属する新しい菌株と同定した。
【００２３】
本菌株は、平成１４年８月２７日に茨城県つくば市東１−１−３、独立行政法人産業技術総合研究所　微生物寄託センターに、微生物の表示「ＴＷ−３」として受託されており、その受託番号は「ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９８５」である。
【００２４】
上記ＴＷ−３株はヨーロッパイチイの内樹皮から得られたものであるが、本発明者らはヨーロッパイチイをはじめとして、太平洋イチイ（Ｔａｘｕｓ　ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、日本イチイ（Ｔａｘｕｓ　ｃｕｓｐｉｄａｔａ）、キャラボク（Ｔａｘｕｓ　ｃｕｓｐｉｄａｔａ　ｖａｒ．　ｎａｎａ　Ｒｅｈｄｅｒ）などのイチイ属樹木から、上記ＴＷ−３以外にも各種のペスタロッチア属菌株を単離しており、これらの内にも、ＴＷ−３と同様に１０−ＤＡＢ産生能を有する菌株が存在することを確認している。従って、本発明微生物には、そのような各種イチイ属樹木から単離され、ペスタロッチア属に属し、且つ１０−ＤＡＢ産生能を有する微生物が包含される。
【００２５】
尚、ペスタロッチア属菌は、微生物の一般的性質として自然に変異を起こし得る。また通常の変異処理、例えばＸ線、γ線、紫外線などの放射線照射、種々の変異誘導剤による処理、薬剤を含有する培地上での培養などによって変異を誘導し得る。このような変異処理による変異株あるいは自然に得られる変異株であっても、１０−ＤＡＢ産生能を有するものは、すべて本発明に包含される。
【００２６】
また、本発明者らは、研究の結果、本発明微生物のうちに、１０−ＤＡＢ産生能のみならず、これと共に、タキソール産生能やその他のタキサン類の産生能を有するものが存在することをＴＬＣなどにより確認している。
【００２７】
２．　タキサン類の製造
本発明はペスタロッチア属に属し１０−ＤＡＢ産生能を有する微生物を培養し、培養物中に生成蓄積される１０−ＤＡＢを採取する１０−ＤＡＢの製造法を提供する。
【００２８】
本発明方法において、微生物の培養に用いられる培地は、用いる菌株が利用し得る栄養源を含むことを必須として、通常の各種のものから適宜選択することができる。また該培地は、液状でも固体状でもよい。特に、大量の微生物の培養には液状培地が適している。
【００２９】
培地に含ませる栄養源は、微生物が同化し得る炭素源、窒素源、無機物質乃至有機塩類、微量栄養源などの通常の栄養源のいずれでもよい。
【００３０】
炭素源としては、グルコース、乳糖、ショ糖、麦芽糖、デキストリン、澱粉、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、油脂類（綿実油、大豆油、ラード油、チキン油など）、ｎ−パラフィンなどを例示することができる。
【００３１】
窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、乾燥酵母、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、ペプトン、生大豆粉、綿実粉、トマトペースト、ピーナッツミール、廃糖蜜、尿素、アンモニア塩類（硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなど）などを例示することができる。
【００３２】
無機物質乃至有機塩類および微量栄養源としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどの金属の塩類（リン酸、ホウ酸、硫酸などの無機酸の塩類、酢酸、プロピオン酸などの有機酸の塩類）；鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケルなどの微量金属の塩類（上記と同様の無機酸および有機酸の塩類）などを例示することができる。
【００３３】
更に培地には、必要に応じて、アミノ酸（グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、リシン、メチオニン、プロピンなど）、ペプチド（ジペプチド、トリペプチドなど）、ビタミン類（ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ニコチン酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＣなど）、核酸類（プリン、ピリミジン、それらの誘導体など）などを含有させることができる。
【００３４】
また培地には、培地のｐＨを調整するために、無機酸、有機酸などの酸類、水酸化ナトリウムなどのアルカリ類、緩衝剤などを加えることもでき、消泡のために、油脂類、界面活性剤などを添加することもできる。
【００３５】
尚、微生物の培養のために各種の栄養源を配合して調製された各種の培地が、既に市販されており、本発明ではそのような市販の栄養培地を利用することもできる。
【００３６】
微生物の培養は、静置培養、振とう培養、通気攪拌培養などによることができる。大量培養には、いわゆる深部通気攪拌培養を採用するのが望ましい。培養条件は、培地の種類（組成）、菌株の種類、培養方法などに応じて適宜決定することができる。一般には、微生物の至適温度およびｐＨ条件、即ち約２０−２５℃の温度および約５−９のｐＨが採用されるが、特にこれに限定されるわけではない。培養時間は前記培地条件、培養条件などに応じて一定しないが、目的とするタキサン類の生産蓄積量が最大となるまで培養するのが望ましい。一般には、例えば液体培地を用いる振とう培養または通気攪拌培養の場合、通常約７−１４日間とするのが適当である。
【００３７】
上記微生物の培養によって目的とするタキサン類が培養液中に生産、蓄積される。培養液からの目的化合物の採取は、該化合物の理化学的性質などを利用した通常の方法に従って行うことができる。例えば、目的とするタキサン類は油溶性であるのでこの性質を利用して、一般的な有機溶媒による抽出手段により目的化合物を採取することができる。より詳しくは、培養液または培養濾液に炭酸水素ナトリウムを添加後、適当な有機溶媒、例えばジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素類；酢酸エチルなどのエステル類；メチルエチルケトンなどのケトン類；イソブチルアルコールなどのアルコール類などを加えて、目的とするタキサン類を抽出することができる。得られた有機溶媒層を水で洗浄後、乾燥および濃縮して所望化合物を含有する粗生成物を得ることができる。
【００３８】
上記で得られる粗生成物は、更に精製して純粋な化合物とすることができる。
該精製手段としては、公知の各種の手段をいずれも採用できる。より詳しくは、吸着クロマトグラフィー、分子篩いクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法などが挙げられる。
【００３９】
得られる目的化合物は、各種の物理化学的データ、ＮＭＲスペクトル分析などにより同定できる。
【００４０】
かくして、本発明微生物の利用によれば、樹木の栽培に比して、非常に短時間に、容易に、安定して、大量のタキサン類（１０−ＤＡＢ）を得ることでき、しかもその精製も、植物起源のそれに比して簡単である。
【００４１】
殊に、本発明により得られる１０−ＤＡＢは、種々の癌細胞に対して強力な抗ガン作用を示し、既に制癌剤として承認されているタキソールの合成原料として有用である。また、該タキソールよりも抗ガン性が高いことが報告されており、制癌剤としての用途が期待されるタキソール・アナログ（Ｑ．　Ｃｈｅｎｇ，　Ｔ．　Ｏｒｉｔａｎｉ，　Ｔ．　Ｏｒｉｇｕｃｈｉ，　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，　５６，　１６６７−１６６９　（２０００））、タキソールの７位にキシロースが結合した化合物（Ｍａｔｔｈｅｗ　Ｓｕｆｆｎｅｓｓ，　”ＴＡＸＯＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，　ＣＲＣＰｒｅｓｓ，　ＮｅｗＹｏｒｋ，　１９９５，　ｐ．３１７−３７５）などの製造原料としても有用である。更に、このものを免疫抗原として利用することによって、タキサン類を選択的に認識する抗体、特にモノクローナル抗体を製造することができ、該抗体は、例えば植物抽出物や組織培養物などの試料中のタキサン類の検出、定量や、該試料からのタキサン類の精製に有用である。
３．　タキソールの製造
本発明方法に従い得られるタキサン類、即ち、１０−ＤＡＢからのタキソールの合成は、例えば前述した公知の方法、即ち１０−ＤＡＢの１３位の水酸基でβ−ラクタムを開環する方法（非特許文献１参照）、１０−ＤＡＢの１３位の水酸基とフェニルイソセリン側鎖のカルボン酸をエステル化によって連結する方法（非特許文献２参照）などに従い実施することができる。
【００４２】
また、上記以外にも各種の半合成法が既に報告されており、これらの報告に従うことも可能である（例えば、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１９８８，　１１０，５９１７−５９１９；　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　Ｖｏｌ．　３３，　Ｎｏ．　３６，　ｐｐ．　５１８５−５１８８，　１９９２など参照）。
【００４３】
得られるタキソールは、種々の癌細胞に対する強力な制癌作用を有しており、特に、乳癌、卵巣癌、胃癌などに対する制癌剤として有用である。
【００４４】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。尚、各例における％は、特記しない限り重量基準（ｗ／ｗ％）による。
【００４５】
【実施例１】ペスタロッチア属菌のスクリーニング
（１）　　イチイ科樹木試料
ヨーロッパイチイ（Ｔａｘｕｓ　ｂａｃｃａｔａ）、太平洋イチイ（Ｔａｘｕｓ　ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、日本イチイ（Ｔａｘｕｓ　ｃｕｓｐｉｄａｔａ）およびキャラボク（Ｔａｘｕｓ　ｃｕｓｐｉｄａｔａ　ｖａｒ．　ｎａｎａ　Ｒｅｈｄｅｒ）の茎を試料として利用した。
【００４６】
（２）　　微生物培養用培地
培地としては、以下の通り調製したＰＤＡ培地を用いた。即ち、皮を剥いたジャガイモ２００ｇを細かく刻み、蒸留水を加えて約１時間蒸煮後、つぶして更に約１５分間蒸煮し、ガーゼで濾過し、得られた濾液にグルコース２０ｇを加え、更に全量が１Ｌとなるように蒸留水を加えた後、０．１Ｎ　ＨＣｌでｐＨを５．６に調整した。このものに寒天２０ｇを溶解し、オートクレーブで高圧滅菌（１２１℃、２０分間）し、直径９ｍｍの滅菌シャーレに１０ｍＬずつ分注した。
【００４７】
（３）　　試料の滅菌と培地への植え込み
植物体から採取した試料（枝先端部分から約３０ｃｍにあたる枝部分、直径約１ｃｍ程度）を、１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液（アンチホルミン）で１０分間殺菌した。殺菌後、試料をクリーンベンチ内に入れ、滅菌水で３回洗浄した。試料の茎を０．５ｃｍずつに切り（葉は切り落とす）、更に縦に半分に切り、切り口が培地と接するように置床した。２５℃、暗所で、１−２週間静置培養した。
【００４８】
（４）　　ペスタロッチア菌の単離
（３）に従う１−２週間の培養後、シャーレ上に生育してくる黒色の胞子を形成している菌叢（ペスタロッチア菌）をかきとり、新しく調製したＰＤＡ培地に移して継代して純化した。継代はシャーレいっぱいに広がった菌（２週間培養）をクリーンベンチ内でＰＤＡ培地を分注したシャーレに白金耳を使って植え付け、２５℃、暗所で２週間培養することにより実施した。最終培養後、シャーレをパラフィンフィルム（商品名「パラフィルム」）でシールし、冷蔵庫保存した。
【００４９】
上記に従って、ヨーロッパイチイから３種のペスタロッチア菌を単離し、それぞれ「ＷＴ−１」、「ＷＴ−２」および「ＷＴ−３」と命名した。
【００５０】
得られたペスタロッチア菌ＷＴ−３（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９８５）は、前述した形態学的特徴、ＰＤＡ培地上での性状および生理学的性質を有していた。その分生子の顕微鏡写真撮影結果を図１に示す。
【００５１】
【実施例２】ペスタロッチア菌の培養
（１）　　液体培養
ペスタロッチア菌の培養には下記表１記載の組成に調製した改良Ｍ１Ｄ培地を使用した。
【００５２】
【表１】
2004097104.tif 000002
【００５３】
クリーンベンチ内で２Ｌの培養フラスコに改良Ｍ１Ｄ培地５００ｍＬを分注したものに、実施例１で継代、純化したペスタロッチア菌（シャーレで２週間培養したもの）を、直径５ｍｍのコルクボーラーで培地ごと打ち抜いたものを５個加えた。その後、綿栓をして、２５℃、暗所で３週間静置培養した。
【００５４】
（２）　　培地中タキサン類の抽出
上記（１）の培養後、ブフナー濾斗を用いて菌体と培養濾液に分けた。培養濾液に０．１２５ｇ（培養濾液５００ｍＬ当たり）の炭酸水素ナトリウムを添加した後、ジクロロメタン２５０ｍＬで分層した。この操作を２回行い、ジクロロメタン可溶部を得た。
更に、水層を酢酸エチル２５０ｍＬで分層した。この操作を２回行い、酢酸エチル可溶部を得た。各可溶部を減圧濃縮し、ジクロロメタン抽出物と酢酸エチル抽出物を得た。得られた各抽出物は、真空乾燥機中、減圧下に五酸化二リン上で充分に乾燥した。
【００５５】
【実施例３】タキサン類の同定
（１）　　抽出物中のタキソールのイムノアッセイによる定量
市販のタキソールイムノアッセイキット（Ｈａｗａｉｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｇｒｏｕｐ，　ＩＮＣ．，Ｔａｘｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｋｉｔ，　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　Ｎｏ．　ＴＡ０２）を用いて、ジクロロメタン抽出物中のタキソールを定量した。
【００５６】
結果を図２（縦軸：タキソール生産量（μｇ／Ｌ）、横軸：培養菌の種類（ＴＷ−１，　ＴＷ−２，　ＴＷ−３））に示す。
【００５７】
図２に示される結果から、ＴＷ−３菌が最も多量のタキソールを産生することが判る。尚、このイムノアッセイは、高い分析精度を有しており、抗原抗体反応の特異性も高いため、得られた結果に他のタキサン類の混入による影響はないと考えられたが、タキソールのイムノアッセイではある種のタキサン類も検出されるといわれていることから、このタキサン類の検出のために、以下のＴＬＣ分析およびＬＣ／ＭＳ分析を実施した。
【００５８】
（２）　　抽出物のＴＬＣ分析
実施例２で得た各抽出物をメタノール１ｍＬに溶解し、薄層クロマトグラフプレート上にスポットした。また、標品としてタキソールおよび１０−ＤＡＢの各１ｍｇ／ｍＬメタノール溶液をスポットとした。展開溶媒としては、クロロホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ）を用いた。展開後、紫外線吸収でスポットを確認した後、１％バニリン硫酸で呈色して、タキサン類の検出を行った。
【００５９】
結果を図３に示す。
【００６０】
図３は、タキソール標品、実施例２で得たジクロロメタン抽出物および酢酸エチル抽出物、並びに１０−ＤＡＢ標品について行われたＴＬＣ分析の結果を示す図であり、レーン１はタキソール標品の結果であり、レーン２はジクロロメタン抽出物の結果であり、レーン３は酢酸エチル抽出物の結果であり、レーン４は１０−ＤＡＢ標品の結果である。
【００６１】
該図に示される結果から、ジクロロメタン抽出物および酢酸エチル抽出物のいずれについても、タキソールと同じ位置（Ｒｆ値、レーン１参照）に紫外線吸収および呈色反応を示すスポットは確認できないことが判った（レーン２，３参照）。また、ジクロロメタン抽出物（レーン２）には、タキサン類の呈色を示すスポットが２つ確認された。更に、酢酸エチル抽出物（レーン３）について、１０−ＤＡＢと同一Ｒｆ値（レーン４参照）に、同一の呈色反応を示すスポットの存在を確認した。
【００６２】
これらのことから、試験したＴＷ−３培養物中におけるタキソール量は検出限界以下であったのに対して、１０−ＤＡＢおよび他のタキサン類が産生蓄積されることが明らかとなった。
【００６３】
（３）　　抽出物のＬＣ／ＭＳによる分析
実施例２で得た各抽出物をそれぞれ適量のメタノールに溶解し、フィルターを通した後、以下の条件でＬＣ／ＭＳ分析を行った。
ＬＣ条件（カラム：ＳＵＰＥＬＣＯＳＩＬ　ＴＭ−ＬＣ−Ｆ；　ＵＶ波長：２２７ｎｍ；　流速：　１．５ｍＬ／ｍｉｎ；　展開溶媒：　アセトニトリル：テトラヒドロフラン：水＝１７：２８：５５（ｖ／ｖ））
ＭＳ条件（Ｓｏｕｒｃｅ　ｓｅｔｔｉｎｇ：　Ｓｐｒａｙ　ｔｉｐ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　３６０２．９７；　ＡＰＩ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｓｅｔｔｉｎｇ：　Ｎｏｚｚｌｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　８０．８；　Ｓｋｉｍｍｅｒ　１　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　１２．０１；　Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ＤＣ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　７．６９；　Ｄｅｆｒｅｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｔａｇｅ　０．４９；　Ｅｉｎｚｅｌ　ｌｅｎｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　−３５．０１；　Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ＲＦ　ｖｉｌｔａｇｅ　Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ｔｅｍｐａｒａｔｕｒｅ　２００．０１；　Ｎｏｚｚｌｅ　ｔｅｍｐｒａｔｕｒｅ　２００．０１；Ａｎａｌｙｚｅｒｓｅｔｔｉｎｇ：　Ｐｕｓｈ　ｐｕｌｓｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　６５６．１３；　Ｐｕｌｌ　ｐｕｌｓｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　１３９９．９９；　Ｄｅｔｅｃｔｅｒ　ｖｏｌｔａｇｅ　１８４９．６９；　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ａｃｑｕｉｓｉｏｎ　ｓｅｔｔｉｎｇ：　Ｆｉｒｓｔ　ｍａｓｓ　２５０．００；　Ｌａｓｔ　ｍａｓｓ　１０００．００）
その結果、タキソール標品（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて同様に実施されたスタンダードの結果と対比して、ジクロロメタン抽出物および酢酸エチル抽出物のいずれの場合も、ＬＣ分析結果を示すＴＩＣチャートにおいて、同一ピークは観察されず、このことから、各抽出物中にタキソールは実質的に存在しないと考えられた。
【００６４】
また、ＭＳ分析結果を示すチャートでも、タキソールにプロトンが付加したマスピーク（ｍ／Ｚ＝８５４）は確認されなかった。但し、この結果は、各抽出物中のタキソール含量が低すぎたことに基づくものであり、別途、高濃度抽出物について行った同一試験では、ピークが観察された。
【００６５】
また、酢酸エチル抽出物については、ＭＳ分析の結果、１０−ＤＡＢのマスピーク（Ｍ＋＋Ｈ＝５４５）が観察され、これは１０−ＤＡＢ標品におけるそれと一致した。一方、ジクロロメタン抽出物については、ＭＳ分析によって、タキサン類のキシロサイドを示唆するマスピーク（ｍ／Ｚ＝６４１）が観察された。
【００６６】
（４）　　抽出物のＨＰＬＣ分析
実施例２で得た酢酸エチル抽出物をメタノール２ｍＬに溶解し、フィルターを通した後、その５μｌをサンプル管に注入して、以下の条件でＨＰＬＣ分析を行った。尚、メタノールに溶解した１０−ＤＡＢ標品についても同一試験を実施した。
【００６７】
１０−ＤＡＢの同定は、該標品とのリテンションタイムの一致およびスパンキングにより行った。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯＳＩＬ　ＴＭ−ＬＣ−Ｆ；　ＵＶ波長：２２７ｎｍ；　流速：　１．５ｍＬ／ｍｉｎ；　移動相：　アセトニトリル：テトラヒドロフラン：水＝１７：２８：５５（ｖ／ｖ）
結果（ＨＰＬＣチャート）を図４に示す。図４において、上段は１０−ＤＡＢ標品の結果であり、下段が酢酸エチル抽出物の結果である。また、矢印で示したピークが１０−ＤＡＢ（１０−ｄｅａｃｅｔｙｌｂａｃｃａｔｉｎ　ＩＩＩ）である。
【００６８】
該図に示されるとおり、酢酸エチル抽出物中の１０−ＤＡＢに相当するリテンションタイムを持つピークは、１０−ＤＡＢ標品のそれと一致した。またスパンキングによってもこれらが同一物であることが確認された。このことから、酢酸エチル抽出物中には、１０−ＤＡＢが存在することが明らかとなった。
【００６９】
更に、予め作製した検量線を用いて、該１０−ＤＡＢの定量を行った結果、ＴＷ−３菌は、約０．１５ｍｇ／Ｌの１０−ＤＡＢを生産することが判った。
【００７０】
（５）　　ＴＷ−３菌の大量培養による１０−ＤＡＢの単離
実施例２の（１）および（２）と同様にして、ＴＷ−３菌を培養した培養液（５０Ｌ）から、ジクロロメタン抽出物８．２ｇおよび酢酸エチル抽出物１０．２ｇを得た。
【００７１】
得られた酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５０：１，　３０：１，　１０：１および５：１（ｖ／ｖ））にかけて精製した。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ））でモニターしながら、１０−ＤＡＢを含むフラクションを得た。このフラクションを分取ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ））にかけて、１０−ＤＡＢを６．１ｍｇ（融点：　２４３−２４６℃（分解））得た。
【００７２】
かくして単離された化合物が１０−ＤＡＢであることは、１０−ＤＡＢ標品と融点が一致すること、混融試験による融点降下が認められないことなどから確認された。
【００７３】
【発明の効果】
本発明によれば、１０−ＤＡＢ産生微生物および該微生物の培養による１０−ＤＡＢの製造法が提供される。該１０−ＤＡＢは、例えば制癌効果を有するタキソールの合成中間体として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明微生物ＴＷ−３の分生子の顕微鏡写真撮影結果を示す図である。
【図２】本発明微生物の培養によって得られる培養物のジクロロメタン抽出物中のタキソールを定量した結果を示すグラフである。
【図３】タキソール標品、実施例２で得たジクロロメタン抽出物および酢酸エチル抽出物、並びに１０−ＤＡＢ標品について行われたＴＬＣ分析の結果を示す図である。
【図４】実施例３の（４）に従い得られた本発明微生物を培養した培養抽出物のＨＰＬＣ分析結果を示すグラフである。
【図１】
2004097104.tif 000003
【図２】
2004097104.tif 000004
【図３】
2004097104.tif 000005
【図４】
2004097104.tif 000006