(57)【要約】【解決手段】血液検体中のプレβ１−ＨＤＬを測定することからなる動脈硬化症の罹患を検査する方法。【効果】本発明によれば、これまで、初期診療や健康診断において、従来の脂質マーカーの検査値に異常がなく、糖尿病や高血圧といった危険因子に基づく所見も認められないため見落とされていた動脈硬化症の罹患を検査することができ、予防医学や公衆衛生学的に極めて有用である。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液検体中のプレβ１−ＨＤＬを測定することからなる動脈硬化症の罹患を検査する方法。
【請求項２】
血液検体中のプレβ１−ＨＤＬの存在量とそれ以外の指標とを関係付けることからなる動脈硬化症の罹患を検査する方法。
【請求項３】
血液検体中のプレβ１−ＨＤＬの存在量とＨＤＬ−コレステロールの存在量を関係付けることからなる動脈硬化症の罹患を検査する方法。
【請求項４】
血液検体中のプレβ１−ＨＤＬの存在量とアポ　Ａ−Ｉの存在量を関係付けることからなる動脈硬化症の罹患を検査する方法。
【請求項５】
動脈硬化症が、冠動脈硬化症である請求項１乃至４に記載の動脈硬化症の罹患を検査する方法。
【請求項６】
動脈硬化症が、脳動脈硬化症である請求項１乃至４に記載の動脈硬化症の罹患を検査する方法。
【請求項７】
血液検体中のプレβ１−ＨＤＬの存在量とＨＤＬ−コレステロールの存在量を関係付ける方法が、それらの存在量の比を求めることからなる請求項３に記載の動脈硬化症の罹患を検査する方法。
【請求項８】
血液検体中のプレβ１−ＨＤＬの存在量とアポ　Ａ−Ｉの存在量を関係付ける方法が、それらの存在量の比を求めることからなる請求項４に記載の動脈硬化症の罹患を検査する方法。
【請求項９】
血液検体が、（１）総コレステロール濃度が２２０ｍｇ／ｄＬ以下、（２）ＨＤＬ−コレステロール濃度が４０ｍｇ／ｄＬ以上、（３）中性脂肪が１５０ｍｇ／ｄＬ以下である被検者より得たものである請求項１乃至８に記載の動脈硬化症の罹患を検査する方法。
【請求項１０】
血液検体がさらに、（４）糖尿病でない、および／または（５）高血圧でない被検者より得たものである請求項９に記載の動脈硬化症の罹患を検査する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、動脈硬化症の罹患を検査する方法に関するものであり、特に、ＨＤＬ−コレステロールなどの従来公知の脂質マーカー、糖尿病、高血圧などの代謝性危険因子が見出されない被検者の動脈硬化症の罹患を検査する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動脈硬化症（ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）は、動脈壁の肥厚、弾力性の低下、内腔の狭窄を呈する動脈の疾患と定義され、発症と進展に血清脂質が関与している。また心筋梗塞などの冠動脈疾患における器質的狭窄を作る原因とされている。
【０００３】
動脈硬化症、特に粥状硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）と冠動脈疾患、血清脂質との関係は、多くの疫学調査あるいは大規模臨床試験を通じて研究され、血清総コレステロールの高値、ＨＤＬ−コレステロールの低値、ＬＤＬ−コレステロールの高値が冠動脈疾患発症の危険因子であることが証明された。そして、これら脂質による指標（脂質マーカー）に、耐糖能の異常（糖尿病）、肥満、高血圧などを指標として加え、危険因子群を集積し、複合的に動脈硬化性疾患の危険を把握しようとする概念が提唱され今日に至っている。
【０００４】
前記概念は、例えば、日本動脈硬化学会による「高脂血症治療ガイドライン」や米国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ）による「Ａｄｕｌｔ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｐａｎｅｌ　ＩＩＩ（ＡＴＰ　ＩＩＩ）」などで公表され、臨床の場においてリスクの評価と患者の管理に使用されている。
【０００５】
さらに高脂血症の薬物治療の結果を通じて、脂質マーカーの変動と虚血性脳卒中との関係も明らかになり、脂質マーカーが冠動脈に限らず、脳動脈や末梢動脈も含む全身の動脈硬化の発症や進展の指標として役立つことが示唆されている。
【０００６】
しかしながら、これらの複合的概念によってもなお、動脈硬化性疾患の病態のすべてを把握することは困難である。実際、心筋梗塞の既往があるか、冠動脈造影により５０％の狭窄が認められる患者においても、脂質マーカーの検査値には異常が認められず、さらに糖尿病や高血圧の危険因子も有さない患者が存在する。また心筋梗塞には無痛性のものがあり、自覚症状をあたえない場合も存在する。
【０００７】
これらの事実は、例えば、従来の動脈硬化性疾患の指標、特に脂質マーカーのみでは動脈硬化症の罹患に関する情報を得ることができず、結果として初期診療や健康診断において動脈硬化症が関与する疾患の発症の可能性を見落とすことにつながることを意味する。従って、公知の指標、特に公知の脂質マーカー群とは異なる新規な動脈硬化症の指標が求められていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、初期診療や健康診断において、従来の脂質マーカーの検査値に異常がなく、糖尿病や高血圧といった危険因子に基づく所見も認められない被検者より採血した血液試料を分析して動脈硬化症の罹患を検査する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記目的に適した指標の探索を行ったところ、コレステロール逆転送系に関与するリポ蛋白であるプレβ１−ＨＤＬが当該目的に使用できることを見出し本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、血液検体中のプレβ１−ＨＤＬを測定することからなる動脈硬化症の罹患を検査する方法を提供するものであり、初期診療や健康診断において、従来の脂質マーカーの検査値に異常がなく、糖尿病や高血圧といった危険因子に基づく所見も認められない被検者より採血した血液検体中のプレβ１−ＨＤＬを測定することからなる動脈硬化症の罹患を検査する方法を提供するものである。
【００１１】
プレβ１−ＨＤＬは、組織から過剰なコレステロールを引き抜き、肝臓に戻すというコレステロール逆転送系の中心的役割を担う高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）の亜分画の一つであり、前記コレステロールの引き抜きの初期に関与することが推察されている。その一方で、冠動脈性心疾患（ＣＨＤ：ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｈｅａｒｔ　ｄｉｓｅａｓｅ）、高中性脂肪血症（ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）、高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）において血中濃度が上昇することが報告されている（Ｓｖｉｒｉｄｏｖ，　Ｄ．　＆　Ｎｅｓｔｅｌ，　Ｐ．　；　Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，　１６１，　２４５−２５４（２００２））
【００１２】
また、被検者より採取した血液検体を経時的にインキュベートし、検体中のプレβ１−ＨＤＬの経時的な挙動を測定することにより、脂質代謝の異常あるいは脂質代謝の異常により惹起される疾病を検出する方法（特開２００１−０６６３１４）も報告されている。
【００１３】
このようにプレβ１−ＨＤＬは動脈硬化症に関与する知見が幾つか報告されていたが、従来の脂質マーカーの検査値に異常がなく、糖尿病や高血圧といった危険因子に基づく所見も認められない被検者より採血した血液試料中のプレβ１−ＨＤＬを測定することにより動脈硬化症の罹患に関する情報を与える指標になることについては全く知られていなかった。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明において、被検者より採取する血液検体は全血、血漿、血清のいずれであってもよい。血漿を使用する場合には、抗凝固剤としてＥＤＴＡやクエン酸ナトリウムなどを使用することができる。採血後は氷冷下におき、血漿あるいは血清を得る場合、冷却下で遠心分離することが好ましい。
【００１５】
血液検体中のプレβ１−ＨＤＬは保存や凍結融解により濃度変動することが知られているが、血液検体に単糖類、二糖類またはグリセロールを共存させることにより安定化させることができる。
【００１６】
プレβ１−ＨＤＬの測定は、公知の非変性二次元電気泳動法（Ｍｉｉｄａ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ　；Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　４２，　１９９２−１９９５（１９９６））、限外濾過アイソトープ希釈法（Ｏ’ｃｏｎｎｏｒ，　ＰＪ．，　ｅｔ　ａｌ；　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２５１，　２３４−２４０（１９９７））、ゲル濾過法（Ｎａｎｊｅｅ，　ＭＮ．　＆　Ｂｒｉｎｔｏｎ，　ＥＡ．　；　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．，　４６，　２０７−２２３（２０００））、ＥＬＩＳＡ法（Ｍｉｙａｚａｋｉ，　Ｏ．，　ｅｔ　ａｌ　；　Ｊ．　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．，　４１，　２０８３−２０８８（２０００））などを使用することができる。これらの測定法のうち、ＥＬＩＳＡ法が再現性、簡便性などに優れており好適である。
【００１７】
本明細書において、動脈硬化症の罹患を検査するとは、被検者から採取した血液検体中のプレβ１−ＨＤＬの存在量を測定した時点で（１）「測定の時点より以前に被検者に動脈の閉塞あるいは狭窄が存在した」、（２）「測定の時点で被検者に動脈の閉塞あるいは狭窄が存在する」、（３）「測定の時点より以降に動脈の閉塞あるいは狭窄が発生する」のいずれかに関する情報を得ることをいう。ここでいう動脈とは、冠動脈、脳動脈、末梢動脈のいずれも包含する。なお、疾病の理解は研究の進歩により変化するものである。例えば、血管の狭窄の度合いと心筋梗塞発症の関係（危険度）について、急性心筋梗塞は、冠動脈造影上５０％未満の病変で６８％発症しているとする報告（Ｆｏｌｋ，　Ｅ．，　ｅｔ　ａｌ，；　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，　９２，　６５７−６７１（１９９５））等があり、血管の狭窄度のみならず、病変の質すなわち脂質に富む不安定プラークの存在が危険因子であるとの最近の理解がある。したがって、本発明における動脈硬化症の罹患の語は、これらの病態も含め、その機序を限定することなく、冠動脈疾患、脳動脈疾患、末梢動脈疾患を対象に最も広義に解釈されるべきである。
【００１８】
動脈硬化症罹患の検査は、血液検体中のプレβ１−ＨＤＬの存在量（濃度）について一定の基準を設定し、測定した血液検体の値を基準と比較、評価することで実施できる。基準の設定の仕方としては、健常者側、患者側のいずれからでも設定することができる。具体的には、臨床検査の分野で用いられる９５パーセンタイル値を用いる方法を挙げることができる。ここで９５パーセンタイル値とは、母集団のプレβ１−ＨＤＬ値を低い方から並べ、母集団の９５％がその値より低くなる値をいう。また、疫学調査などの結果をもとに設定することも可能である。重要なのは所望の情報を効率良く得ることができるよう設定することである。
【００１９】
また前記評価を、プレβ１−ＨＤＬの測定値単独で行う方法、プレβ１−ＨＤＬの測定値とそれ以外の指標、例えば公知の脂質マーカーの測定値を関連付けて行う方法が挙げられる。ここで、関連付ける脂質マーカーとしては、ＨＤＬ−コレステロールあるいはアポＡ−Ｉを挙げることができる。なお本明細書において、存在量と存在量を関係付けるとは、計算式を使用してプレβ１−ＨＤＬ単独では得ることができなかった情報を得ることをいう。
【００２０】
前記存在量と存在量を関連付ける方法としては、プレβ１−ＨＤＬの存在量を公知の脂質メーカーの存在量で除し、求めた比（二つの存在量の比）を新たな指標とすることなどを例示することができる。これにより検査の精度を向上させることができる。また、ＨＤＬ−コレステロールやアポ　Ａ−Ｉ以外の物質の測定値（前述のように脂質以外の指標であっても良い）と適宜組み合わせて精度を向上させることは可能であり、それらは本発明に当然に含まれる。
【００２１】
なお、プレβ１−ＨＤＬは、現在、臨床上の意義、生理的役割についての知見の蓄積が行われているところであり、本出願の時点で、国際的な標準物質が存在せず、また統一された値付け方法も確立していない。従って本出願の後、国際的な標準物質や値付けの方法が提唱されることが考えられるが、その場合においても、本明細書に記載された標準物質を適宜換算することにより、支障なく本発明を実施することができることはいうまでもない。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によれば、これまで、初期診療や健康診断において、従来の脂質マーカーの検査値に異常がなく、糖尿病や高血圧といった危険因子に基づく所見も認められないため見落とされていた動脈硬化症の罹患を検査することができ、予防医学や公衆衛生学的に極めて有用である。
【００２３】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００２４】
（プレβ１−ＨＤＬの測定）
（１）検体の準備
早朝空腹時に肘静脈よりＥＤＴＡ入り採血管あるいは血清分離剤入り採血管により採血した全血を、冷却下で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、ＥＤＴＡ加血漿および血清をそれぞれ得た。得られたＥＤＴＡ加血漿および血清に対し５０％　ショ糖水溶液を血漿あるいは血清の２０倍容量加え測定まで凍結して保存した。
【００２５】
（２）ＥＬＩＳＡ試薬
特開２０００−２３９３００に記載された「（１）分子量が１５万以下で、かつヒトアポリポ蛋白質Ａ−ＩＩを持たないＨＤＬに存在するヒトアポリポ蛋白質Ａ−Ｉおよび（２）脂質と結合していないヒトアポリポ蛋白質Ａ−Ｉと特異的に反応するモノクローナル抗体５５２０１（ハイブリドーマ５５２０１が産生するモノクローナル抗体）を使用するＥＬＩＳＡ試薬」を使用した。なお、標準品として使用する精製ヒトアポ蛋白質Ａ−Ｉは、ヒト血漿より抗アポＡ−Ｉ抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーおよびゲルろ過法によって精製し、ウシ血清アルブミンを較正物質としてＢＣＡ法により蛋白定量してプレβ１−ＨＤＬ量を設定した。
【００２６】
（脂質マーカーの測定）
総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、中性脂肪は酵素法、アポＡ−Ｉは免疫比濁法（すべて第一化学薬品製）による試薬を使用した。
【００２７】
（被検者の群分けの基準）
（１）脂質マーカーの基準
日本動脈硬化学会による「高脂血症治療ガイドライン」に従い血清総コレステロール濃度が２２０ｍｇ／ｄＬ未満、中性脂肪濃度が１５０ｍｇ／ｄＬ未満、ＨＤＬ−コステロール濃度が４０ｍｇ／ｄＬ以上を脂質マーカーの異常が無いものとして扱った。なお当該基準を満たす場合、ＮＬ（Ｎｏｒｍｏｌｉｐｉｄｅｍｉａ、正脂血症）と略記することがある。
【００２８】
（２）糖尿病（ＤＭ）の基準
日本糖尿病学会のガイドラインに従い、次の条件を満たしたものを糖尿病として扱った。即ち、静脈血漿における、空腹時血糖が１２６ｍｇ／ｄＬ以上、７５ＯＧＴＴ２時間値が２００ｍｇ／ｄＬ以上、随時血糖値が２００ｍｇ／ｄＬ以上のいずれかの値が、検査日を変えて２回以上確認された場合、および１回の検査の確認だけで、次のいずれかが満たされた場合である。即ち、糖尿病の典型的症状（口渇、多飲、多尿、体重減少）が存在する場合、ヘモグロビンＡ１ｃ値が６．５％以上の場合、確実な糖尿病網膜症が存在する場合である。
【００２９】
（３）高血圧（ＨＴ）の基準
日本高血圧学会のガイドラインに従い、収縮期圧１４０ｍｍＨｇ以上および／または拡張期圧９０ｍｍＨｇ以上を高血圧として扱った。
【００３０】
（被検者の群分け）
（Ａ群）：健常　男３３名、女２０名、計５３名
狭心症および心筋梗塞の既往歴がなく、脂質マーカーの検査値が前記基準を満たしており、糖尿病および高血圧に該当しない群。（ＣＡＤ−／ＮＬ／ＤＭ−／ＨＴ−）
（Ｂ群）：冠動脈疾患　男９２名、女２２名、計１１４名
心筋梗塞の既往歴があるか、または冠動脈造影の結果、５０％以上の狭窄病変を有する群。（ＣＡＤ＋）
（Ｃ群）：男３５名、女５名、計４０名
前記Ｂ群の内、脂質マーカーの検査値が基準を満たす群。（ＣＡＤ＋／ＮＬ）
（Ｄ群）：男１３名、女０名、計１３名
前記Ｃ群の内、糖尿病および高血圧に該当しない群。（ＣＡＤ＋／ＮＬ／ＤＭ−／ＨＴ−）
（Ｅ群）：男１２名、女３名、計１５名
前記Ｃ群の内、糖尿病に該当し、高血圧に該当しない群。（ＣＡＤ＋／ＮＬ／ＤＭ＋／ＨＴ−）
（Ｆ群）：男７名、女１名、計８名
前記Ｃ群の内、高血圧に該当し、糖尿病に該当しない群。（ＣＡＤ＋／ＮＬ／ＤＭ−／ＨＴ＋）
（Ｇ群）：男３名、女１名、計４名
前記Ｃ群の内、糖尿病および高血圧に該当する群（ＣＡＤ＋／ＮＬ／ＤＭ＋／ＨＴ＋）
（Ｈ群）：脳梗塞、男１３名、女４名
脳梗塞の既往がある群。（ｓｔｒｏｋｅ＋）
（Ｉ群）：男５名、女２名、計７名
前記Ｈ群の内、脂質マーカーの検査値が基準を満たす群。（Ｓｔｒｏｋｅ＋／ＮＬ）
【００３１】
（実施例１）
前記Ａ群５３名の内、プレβ１−ＨＤＬ低値側から９５％が含まれる値（３９．０ｍｇ／ｄＬ）を基準値として、各群のプレβ１−ＨＤＬを評価した。結果を表１に示した。
【００３２】
【表１】
2004028606.tif 000002
【００３３】
Ａ群に対して、Ｂ〜Ｉのいずれの群でもプレβ１−ＨＤＬの値は有意に高値であった。Ｃ〜Ｉ群において基準値以上の患者が見出された。Ｃ〜Ｇ群では基準値以上の例数の群内での比率は何れも３０％以上であった。この成績は、プレβ１−ＨＤＬを指標にした場合、従来、動脈硬化症の罹患が見落とされていたＣ群、Ｄ群およびＩ群（冠動脈疾患、脳動脈疾患）の被検者において動脈硬化症の罹患を検出することができることを示している。
【００３４】
（実施例２）
プレβ１−ＨＤＬの検査値をアポＡ−Ｉの検査値で除して比率を求めた（プレβ／Ａ−Ｉ値）。Ａ群５３名の内、プレβ／Ａ−Ｉ値が低値側から９５％が含まれる値（２．８０）を基準値として、各群のプレβ／Ａ−Ｉ値を評価した。結果を表２に示した。
【００３５】
【表２】
2004028606.tif 000003
【００３６】
Ａ群に対して、Ｂ〜Ｉのいずれの群でもプレβ／Ａ−Ｉ値は有意に高値であった。Ｃ〜Ｉ群において基準値以上の例数の群内での比率は、Ｅ群およびＩ群がプレβ１−ＨＤＬ単独での比較の場合と変わらなかったが、それ以外の群では何れも検出率が向上した。この成績は、プレβ／Ａ−Ｉ値を指標にした場合、従来、動脈硬化症の罹患が見落とされていたＣ群、Ｄ群およびＩ群（冠動脈疾患、脳動脈疾患）の被検者において動脈硬化症の罹患を検出することができることを示している。
【００３７】
（実施例３）
プレβ１−ＨＤＬの検査値をＨＤＬ−コレステロールの検査値で除して比率を求めた（プレβ／ＨＤＬ値）。Ａ群５３名の内、プレβ／ＨＤＬ値が低値側から９５％が含まれる値（６．８０）を基準値として、各群のプレβ／ＨＤＬ値を評価した。結果を表３に示した。
【００３８】
【表３】
2004028606.tif 000004
【００３９】
Ａ群に対して、Ｂ〜Ｉのいずれの群でもプレβ／ＨＤＬ値は有意に高値であった。Ｃ〜Ｉ群において基準値以上の例数の群内での比率はＥ群でも４０％以上となり、その他の群はいずれも５０％以上であった。この成績は、プレβ／ＨＤＬ値を指標にした場合、従来、動脈硬化症の罹患が見落とされていたＣ群、Ｄ群およびＩ群（冠動脈疾患、脳動脈疾患）の被検者において動脈硬化症の罹患を検出することができることを示している。