(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染を検出するために有効なポリペプチド、ならびに再発性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）誘導疾病を阻止するのに有効なワクチンおよびその製造方法を提供すること。【解決手段】  単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質（ｇＢ）をコードする、単離したヌクレオチド配列を含有する宿主細胞で産生される、組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチドの免疫学的に等価な断片。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質（ｇＢ）をコードする、単離したヌクレオチド配列を含有する宿主細胞で産生される、組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチドの免疫学的に等価な断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヘルペスウイルスには、１型（HSV-1）および２型（HSV-2）と名付けられた２つの密接に関連する変異体を含む単純ヘルペスウイルスが包含される。これらの型のウイルスは、強い交差反応を示すが、中和滴定により区別することができる。HSV-1およびHSV-2は様々なヒトの疾患（例えば、皮膚感染、陰部ヘルペス、ウイルス性脳炎など）の原因となっている。
【０００２】
単純ヘルペスウイルスは２本鎖DNAウイルスであって、膜内に被包された二十面体の核キャプシド内に約150〜160kbpのゲノムを有する。この膜には、数多くのウイルス特異的な糖タンパクが含まれ、それらのうち最も多いのは、gB、gC、gD、およびgEである。ここで、gBおよびgDは、１型と２型との間で交差反応を示す。
【０００３】
HSV-1およびHSV-2の両方に対するヒトヘの安全で効果的なワクチンを提供すること、および感染が生じた場合は、その疾患の治療法を提供することは、医学的にも科学的にも非常に興味ある問題である。
【０００４】
ある有望な試みは、単離された糖タンパクを予防に用いることであった。この糖タンパクは、マウスに注射し、次いで生きたウイルスを感染させた場合に、防御性を与えることが示されていた。しかし、単純ヘルペス糖タンパクの利用は、これまで、主にウイルスの培養と膜タンパクの単離とに依存してきた。糖タンパクの商業的生産においては、危険な病原体の取り扱い、培養細胞中におけるウイルスの維持、ウイルスゲノムまたはその一部を含まない糖タンパクの単離などに関する問題が、糖タンパクをワクチンとして用いることを妨げてきた。従って、ウイルスを培養し、そして膜タンパクを分離すること以外の方法により生産された糖タンパクを用いたワクチンを提供することが望ましい。
【０００５】
ヘルペスの感染を治療的に処置するための方法、すなわち個体がウイルスに感染した後で、その疾患を軽減したり、その疾患の再発を防止する処置法を開発することもまた非常に興味が持たれる。ウイルスの感染は、通常、抗生物質による治療に対しては抵抗性を示すので、著しい副作用を持たない他の方法に非常に興味が持たれている。再発性ヘルペス疾患の治療には、いくつかの薬剤（特に、アシクロビール(Acyclovir)）が有効であったが、再発を防止するために長期間にわたって連続投与を行う必要性があるので望ましくなく、治療の過程で薬剤抵抗性の変異体が生じる。
【背景技術】
【０００６】
EberleおよびMou（J. of Infectious Diseases(1983)148：436-444）は、ヒト血清中におけるHSV-1に特有のポリペプチド抗原に対する抗体の相対的な力価を報告している。Marsdenら（J.of Virology(1978) 28：624-642）は、HSV-1とHSV-2との間におけるタイプ内の組み換えにより、117キロダルトン(kd)の糖タンパクに対応する遺伝子がHSVの遺伝子地図上の0.35〜0.40地図単位内に位置することを報告している。Ruyechanら（同上(1979)29：677-679）は、糖タンパクＢ遺伝子の位置が、0.30〜0.42地図単位の間にあることを報告している。SkareおよびSummersVirology(1977) 76：581〜595）は、HSV-1 DNA上のEcoRＩ、XbaＩ、HindIIIのエンドヌクレアーゼ切断部位を報告している。Roizman（Ann.Rev. Genetics(1979) 13：25〜57）は、HSVゲノムの構成を報告している。DeLuccaら（Virology(1982) 122：411）は、0.345〜0.368地図単位の間のgB１構造遺伝子内に変異があると考えられるいくつかの表現型変異体の位置を決定している。
【０００７】
HSV-1またはHSV-2に感染したニワトリ胚細胞から抽出されたサブユニットワクチンが、米国特許第4,317,811号および第4,374,127号に述べられている。また、Hilfenhausら（Develop.Biol. Standard(1982)52：321-331）により、特定のHSV-1種（BW3）からのサブユニットワクチンの調製が述べられているのを参照されたい。Roizmanら（同上(1982)52：287-304）は、免疫感作したマウスにおいて効力を有することが示されている非感染性のHSV-1×HSV-2組換え体および欠失変異体の調製について述べている。Watsonら（Science(1982)218：381-384）は、カエル卵母細胞の核への注入によるクローン化断片の発現だけでなく、HSV-1gD遺伝子のクローニングおよびエセリヒア・コリー（E.coli）内における該遺伝子の低レベル発現について述べている。彼らはまた、gD遺伝子の塩基配列も示している。Weisら（Nature(1983)302：72-74）は、エセリヒア・コリー内におけるgDの高レベル発現について報告している。このポリペプチドは、ウサギにおいて中和抗体を誘導する。Bermanら（Science(1983)222：524-527）は、哺乳動物培養細胞中における糖タンパクＤの発現について報告している。Laskyら（Biotechnology(1984年6月)527-532）は、この糖タンパクＤをマウスの免疫化に用いることを報告している。Cohenら（J. Virol(1984) 49：102-108）は、成熟タンパクの８〜23残基内に含まれる、gDの特定の抗原決定基の位置および化学合成について報告している。
【０００８】
HSVを感染させた細胞からの膜タンパク調製物を、ヒトの感染後ワクチンとして、「治療」に用いることについては、Dundarov,S.ら（Dov. Biol.Standard(1987)57：351-357）およびSkinner, G.R.B.ら（同上(1982) 52：333-34）により報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
単純ヘルペスウイルス１型および２型に対する治療に用いるワクチンおよび組成物、ならびにそれらの生産方法が提供される。これらの治療法は、組換えDNA技術により生産されるウイルス特異的ポリペプチドの組み合わせを用いている。特に、HSVgBおよびgDは、改変された哺乳動物宿主で生産され、そして組み合わせて用いられた。これらのポリペプチドは、ヒトを含む動物における単純ヘルペスウイルス感染の治療に用いられうる。
【００１０】
従って、本発明のある局面は単純ヘルペスウイルス（HSV）感染の治療的処置に用いられるワクチンである。該ワクチンは、
ａ．免疫的に活性な単純ヘルペスウイルス糖タンパクＢ（gB）ポリペプチド；および；
ｂ．免疫的に活性な単純ヘルペスウイルス糖タンパクＤ（gD）ポリペプチドを含有する。
【００１１】
ここで、該ポリペプチドは哺乳動物細胞中において組換えDNA構築物を発現させて調製されたものであり、該ポリペプチドは、このワクチンが、HSVに一次感染した後の個体に投与される場合には、HSVに感染した該個体においてHSVにより誘導される疾患の再発を防止するのに効果的な量で存在する。
【００１２】
本発明の他の局面は、単純ヘルペスウイルス（HSV）感染の治療に用いられるワクチンである。該ワクチンは、
ａ．免疫的に活性な単純ヘルペスウイルス糖タンパクＢ（gB）ポリペプチド；または
ｂ．免疫的に活性な単純ヘルペスウイルス糖タンパクＤ（gD）ポリペプチドを含有する。
【００１３】
ここで、該ポリペプチドは、哺乳動物細胞中において組換えDNA構築物を発現させて得られたものであり、該ポリペプチドは、このワクチンが、HSVに一次感染した後の個体に投与される場合には、HSVに感染した該個体においてHSVにより誘導される疾患の再発を防止するのに効果的な量で存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明によれば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ１型（ｇＢ１）をコードする、図４〜７に記載の単離したヌクレオチド配列を含有する宿主細胞で産生される、組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチド、その免疫学的に等価な断片、またはそれらの混合物が提供される。
【００１５】
本発明によれば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ２型（ｇＢ２）をコードする、図４〜７に記載の単離したヌクレオチド配列を含有する宿主細胞で産生される、組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチド、その免疫学的に等価な断片、またはそれらの混合物が提供される。
【００１６】
本発明によれば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）およびその前駆体、あるいはそれらの類似体をコードするヌクレオチド配列を含有する宿主細胞で産生される、組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチド、その免疫学的に等価な断片、またはそれらの混合物であって：
該ヌクレオチド配列は、
i)図４〜７に記載のアミノ酸配列、または、
ii) 該アミノ酸配列の免疫学的等価物、
をコードするヌクレオチド配列を含有する、組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチド、その免疫学的に等価な断片、またはそれらの混合物が提供される。
【００１７】
本発明によれば、前記単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチドおよび/または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、その免疫学的に等価な断片、またはそれらの混合物を含む、再発性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）誘導疾病を阻止するのに有効なワクチンが提供される。
【００１８】
本発明によれば、抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）抗体および抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗体の両者と結合可能なポリペプチドを含有する、抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）抗体および抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗体の両者を検出する組成物であって、該抗体が、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）ポリペプチドおよびＨＳＶ  ｇＤポリペプチド、またはそれらの混合物により産生される、組成物が提供される。
【００１９】
本願発明によれば、前記の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００２０】
本願発明によれば、以下のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ構築物が提供される：
(a) 前記の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするヌクレオチド酸配列を有する単離したヌクレオチド配列：
(b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオチド配列と結合可能な制御配列。
【００２１】
本願発明によれば、前記のＤＮＡ構築物により形質転換された、宿主細胞が提供される。
【発明の効果】
【００２２】
本願発明により、単離した糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを利用して再発性単純ヘルペスウイルス誘導疾病を阻止するのに有効なワクチンを製造することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（ワクチン）
本発明のワクチンは、１型および２型の両方の組換えHSV糖タンパクＢおよびＤを用いている。成熟（全長）gBおよびgDタンパクは、これら成熟タンパクと免疫学的に等価な（すなわち、感染に対して防御性を与える）断片、前駆体、および類似体と同様に用いられる。請求の範囲で用いているように、「糖タンパクＢポリペプチド」および「糖タンパクＤポリペプチド」という用語は、このような断片、前駆体、および類似体を含むことが意図される。組換えgBおよびgDポリペプチドは、真核細胞、好ましくは酵母または哺乳動物細胞、最も好ましくは哺乳動物細胞において生産される。断片の長さは、少なくとも約15アミノ酸、好ましくは少なくとも約30アミノ酸である。ワクチンは、１型ポリペプチドの混合物、２型ポリペプチドの混合物、または１型および２型ポリペプチド両方の混合物、あるいは個々のポリペプチドのいずれをも含有し得る。
【００２４】
gBおよびgDポリペプチド混合物は、単独でも用いられるが、通常は、生理学的および薬理学的に受容される媒体、一般的には水、生理食塩水、リン酸緩衝液、糖などと共に用いられる。さらに、該ポリペプチド混合物は、生理学的に受容されるアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド誘導体など）と共に用いられ得る。実施例6.3で示されるように、様々なアジュバントが有効である。アジュバントの選択は、少なくとも部分的には、アジュバントを含んだワクチンの安定性、投与経路、ワクチン接種される個体種に対するアジュバントの効能、そしてヒトの場合には、このアジュバントが食品医薬品局（FDA）によってヒトヘの使用が認可されているかいないかといったことに依存する。ワクチンは、リポソームにより運搬されるか、および／またはインターロイキン１および２のような免疫調節剤と共に運搬される。ワクチンは都合のよい非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内、または腹腔内）により投与されうる。同一または異なった経路で投与されるワクチンを分割して投与することは有利である。ワクチンは、単純へルペスウイルスに一次感染した後に投与される。
【００２５】
感染後投与の効能は、実施例6.1に示されている。ウイルス感染後の宿主における免疫応答の増大に及ぼすワクチンの効果は、実施例6.2に示されている。単純ヘルペスウイルスのウイルス表面糖タンパクは、抗体が介在するウイルスの中和化と、抗体依存性細胞障害（ADCC）とによって認識される抗原であることが示されている。NorrildB.ら、Infect. Immun.(1980) 28：38-44。頻繁にHSV感染を再発する患者は、しばしば中和抗体およびADCCの両方を高いレベルで有する。Corey,L.およびSpear, P.G., Eng. N., J. Med. 314：686-691,1986。このような患者にとって、HSV特異的抗体の有力な誘導物質が、ウイルス糖タンパクであることが示された。Eberle,R., Mou, S.W.,およびZaia, J.A., J. Gen Virol. 65：1839-1843、1984。従って、２つのウイルス糖タンパクだけから構成され、他のウイルス抗原を含まない組換えサブユニットワクチンを、再発性陰部ヘルペスの治療へ臨床的に利用することは期待されなかった。
【００２６】
糖タンパクＢおよびＤは改変することなく用いられる。しかし、より小さな関連ポリペプチド（例えば、断片など）を用いる場合、および分子量が約5,000ダルトンより小さい（例えば、1,500〜5,000ダルトン）場合には、所望の免疫応答を誘導するために改変が必要とされる。より小さなハプテンは、適切な免疫原キャリアー（例えば、破傷風トキソイドなど）に結合させなければならない。
【００２７】
gBまたはgDポリペプチドをコードする短いDNA断片を、他の病原性生物やウイルスからのタンパクを発現する遺伝子に連結することもできる。このようにして、得られた融合タンパクは１種類より多くの病気に対して免疫性を与え得る。
【００２８】
１回の投与量あたりに用いられる組換えgBおよびgDポリペプチドの総量は、通常、宿主の体重１kgあたり、約0.1μg〜２mg、より一般的には約0.5μg〜１mg、そして特に約0.5μg〜10μgである。ワクチン中のgDに対するgBの割合は、通常、約0.1：１〜10：1、より一般的には約0.5：１〜10：１、そして好ましくは約0.5：１〜５：１である。１回の投与は、日単位から週単位の間隔で繰り返して行われ、通常は２週間から４週間の間隔で、通常は約２回から10回を越えずに行われる。しかし、実施例6.4に示されるように、ウイルスに一次感染した後の投与時間が、疾患の再発率に影響を及ぼす。従って、治療される種および／または個体に依存して、最も効果的な投与時間を決定する必要がある。最も効果的な時間は、例えば疾患の状態をモニターする疾患症候学または抗体価を用いる基本的な検査により決定し得る。さらに、疾患の急性期、すなわち個体がHSVにより誘導される病変を体に示す場合に、ワクチン投与が疾患の再発を著しく低減させることは、実施例6.4のデータに示されている。
（組換え糖タンパクＢ）
組換えgBポリペプチドの調製は、1985年10月24日に公開された国際公開No.WO85/04587の国際出願No.PCT/US85/00587に詳述されている。組換えgBポリペプチドを生産するのに用いる材料および方法については、以下で簡単に記述する。
【００２９】
実施例における図４〜図７は、gB１パットン株のヌクレオチド配列と、そのヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列とを表す。図４〜図７には、gB１とgB２との間の実質的な相同性も示されている。ヌクレオチド配列には多くの変化があり得る。独立した機能を有する種々の断片が用いられ得る。これら断片は成熟gB以外のタンパクに結合し得る。さらに、種々のコドンは、同じアミノ酸をコードするように改変され得るが、宿主の性質に従ってより効果的な発現を示す。例えば、これらコドンは、１種またはそれ以上のタンパク、あるいはタンパク群における特定コドンの出現頻度に従って改変され得る。これらタンパクは、例えば解糖系タンパクであって、特定の宿主（例えば、酵母）の全タンパクにおいて高い比率を占める。ある場合には、１個またはそれ以上のコドンは、あるアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることにより、異なるアミノ酸をコードするように改変し得る。この場合、変化の影響はタンパクの免疫原性や興味ある他の生物学的因子に有害ではない。ある場合には、Ｎ末端またはＣ末端にアミノ酸を付加することが望ましい。このようなアミノ酸の付加は好ましい結果をもたらす。このことは、成熟gB１またはその前駆体をコードする配列の5'末端または3'末端にコドンを付加することにより、容易に達成し得る。さらにgB２のアミノ酸配列はgB１のアミノ酸配列と20％だけ数が異なっているが、HSV-1またはHSV-2の他の株は、それぞれgB１パットン株またはgB２333株と同一または類似のgB糖タンパクを持っている。これらgB糖タンパクは、通常は５％より少ない数だけ、より一般的には２％より少ない数だけ、そして多くの場合は、0.5％より少ない数だけのアミノ酸が、gB１パットン株またはgB２333株のアミノ酸配列と異なっている。
【００３０】
gB１の配列、特にgB１パットン株は、タンパクのＮ末端から始まる４つのドメインに分けられる：１番目のアミノ酸から約30番目のアミノ酸にまで広がる第１の疎水性領域、第１の疎水性領域から約726番目のアミノ酸にまで広がり、極性が変化し得る領域；極性が変化し得る該領域から約795番目のアミノ酸にまで広がる第２の疎水性領域；そして904番目のアミノ酸のＣ末端にまで広がり、極性が変化し得る第２の領域である。
【００３１】
gBは膜の糖タンパクであるから、他の糖タンパクから類推すると、第１の疎水性領域は分泌および／または膜の配置を支配するシグナルリーダー配列であると考えられる。従って、極性が変化し得る第１の配列は、膜の外側にあり、gBが別のタンパクに対する受容体として、あるいはワクチン中の免疫原として作用する程度まで、認識配列として役立つ。第２の疎水性配列は、トランスメンブレン・インテクグレイター配列(transmembraneintegrator sequence)（しばしば、「アンカー(anchor)」と呼ばれる）としての役目を果たし得る。極性が変化し得る第２のアミノ酸配列は、細胞質内に存在すると考えられ、受容体がトランスメンブレン・インテクグレイター配列の外部にあるという程度まで、１つまたはそれ以上の細胞質プロセスを変更する役目を果たし得る。
【００３２】
gBの前駆体またはその機能的な断片をコードしているポリヌクレオチド配列は、適当な発現ベクターに該ポリヌクレオチド配列を挿入し、得られた発現構築産物を適合する宿主に導入することにより、クローン化され、そして発現され得る。コードしている断片は、約0.1地図単位未満、通常は約0.05地図単位未満である；ここで、1.0地図単位とはHSVゲノム全体の大きさである。発現ベクターは、染色体外に存在するか、あるいは宿主細胞のゲノム内に組み込まれた、低レベルまたは高レベルのマルチコピーベクターであり得る。そして、発現ベクターは、興味のあるポリペプチドを分泌または排泄させるか、あるいは興味のあるポリペプチドを細胞質内または膜内に保持させる。非常に数多くの発現ベクターが文献に発表されており、一般に、真核宿主で用いるのに有用である。真核宿主には、酵母（例えば、サッカロマイセス・セルビシア(S.cerevisiae)）および広範囲の永久増殖性哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞、サル細胞、ハムスター細胞（例えば、3T3、ベロ(Vero)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、または初代細胞系）が含まれる。分泌が必要とされる場合には、宿主に依存して、天然または非天然のいずれかの分泌リーダー配列を用いることができる。分泌リーダー配列を切断するプロセッシングシグナルは、天然のシグナル、または非天然の分泌リーダー配列に関連するシグナル、あるいはこの両方がタンデムになったものであり得る。
【００３３】
gB１パットンをコードするポリヌクレオチド配列を得るために、EcoRＩ制限酵素断片Ｆ上に、gB１コード配列の位置を地図に示した。Ｆ断片の３つの副断片が、単離され、pBR322中にサブクローン化された（図２）。次いで、これらサブクローンのDNA断片は、HSV-1が感染した細胞から単離したポリA+mRNAのノーザンブロットに対するプローブとして用いられた。gBに対して予測された大きさのmRNAにハイブリダイズした断片は、gBコード領域内に存在すると推定された。gBの転写方向もまた、DNAプローブのどの鎖がmRNAとハイブリダイズしたかを決定することにより明らかにされた。gB配列の同一性を確認するために、DNA断片をハイブリッド−セレクトHSV-1mRNAに対して用いた。このmRNAは、次いでインビトロで翻訳され、得られたタンパクはgB特異的抗体を用いてgBに関して分析された。
【００３４】
gB１をコードする断片は、今日では、制限酵素地図作成や塩基配列の決定を含む様々な方法で取り扱われ、制限酵素切断部位や発現のためのオープンリーディングフレーム領域が確証される。次いで、DNA配列は、完全なgB前駆体またはその断片をコードしている配列を与えることに限定される。次いで、これら配列は、適当な位置にある転写シグナルおよび適当な翻訳シグナルを有する適当な発現ベクターに挿入される。これは、突出部分を充填し、そしてアダプターなどを用いて平滑末端結合を行うことにより達成し得る。
【００３５】
増幅能力を有する遺伝子に対して遺伝子をタンデムに導入することは特に興味深いことである。有用な遺伝子には、メトトレキセートを用いることにより増幅し得るジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）遺伝子（ここで、dhfr遺伝子および隣接領域は反復している）；および重金属（例えば、銅）などで増幅し得るメタロチオネインが含まれる。発現構築産物は、形質転換、トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱などを含むいかなる有用な手段によっても、適当な宿主に導入することができる。次いで、宿主細胞は、特定の遺伝子を増幅することを選択するレベルに、適当な生物毒によりストレスがかけられる。次いで、これら細胞は培養され、所望のポリペプチドを有効に生産するまで増殖される。
【００３６】
上述の手順に従って、HSV-2 333株由来のgB２をコードしているポリヌクレオチド配列は、前駆体および成熟体の両方が単離され、クローン化され、そして構築物を与えるために操作される。その結果、１種またはそれ以上の宿主で発現し得る。gB１パットンをコードする断片の有用性を考慮すると、これら断片は、特異的HSV-2制限断片クローンヘのDNA部分をコードするgB２の位置付け、または感染した宿主細胞由来のgB２mRNAの単離のいずれのプローブとしても用いられる。便宜的には、gB１遺伝子の異なる領域をコードする複数のプローブが用いられる。このプローブにハイブリダイズするのにおおよそ適当な大きさを有する陽性DNA断片または豊富なmRNAのいずれもが選択される。次いで、mRNAは逆転写されてcDNAを与えるか、および／またはHSV-2ゲノムの断片とのハイブリダイゼーションに用いて、gB２をコードしているその機能を確認することができる。必要に応じて、gB２構造遺伝子の一部を含む１個より多くのクローン化された断片は、適当に、全コード領域および隣接領域を与えるために操作され、そして結合され得る。次いで、このコード領域は発現ベクター中に導入される。
（組換え糖タンパクＤ）
組換えgD１の調製は、1985年10月24日に公開された国際公開No.WO85/04587の国際出願No.PCT/US85/00587に詳述されている。組換えgDポリペプチドを生産するのに用いられる材料および方法については、以下で簡単に述べる。組換えgD２の調製に関する詳しい記述は以下の実施例に与えられている。
【００３７】
天然に存在する糖タンパクＤと免疫学的に交差反応を行うポリペプチドは、例えば酵母や哺乳類細胞（例えば、CHO細胞）の真核宿主において、組換えDNAの方法論により生産される。真核生物での生産は、真核宿主に関連して、例えば翻訳後修飾および／または分泌などの利点を与える。gDポリペプチドは、少なくとも約９個のアミノ酸をコードする比較的短い合成DNA断片から生産され、gDに特異的な免疫応答を誘導するのに有効なハプテンを与える。
【００３８】
gD DNA断片は、天然起源または合成起源のものであり得る。HSV-1の天然のgD遺伝子は、ウイルスゲノム上において、短い内部繰り返し（IRs）配列と、その3'末端にある短い終結繰り返し（TRs）配列との間に位置する。成熟タンパクをコードしているということは、約1.6kbpの断片がゲノムの2.9kbpSacＩ制限酵素断片上に位置しているのを見い出せることである。成熟タンパクの全コード領域は、2.9kbpSacＩ断片のうちのHindIII−NruＩ断片中に位置している。天然に存在するgD遺伝子は、修飾を受ける場合もあれば、受けない場合もある。遺伝子の領域は、望み通りに欠失させるか、および／または他のDNA断片と結合させ得る。gDDNA断片は、gB DNAの発現について上述したものと同様の材料および手順を用いて、発現ベクターに挿入され、そして発現され得る。天然に存在するgD遺伝子の特定断片の調製、クローニング、および発現については、以下の実施例において詳述する。
【００３９】
以下の実施例は、例示を目的として与えられたものであり、限定するものではない。以下の実施例において、第１節では組換えタンパクを生産するのに用いられる一般的な手順について、第２節では組換えgB１の調製について；第３節では組換えgB２の調製について；第４節では組換えgD１の調製について；第５節では組換えgD２の調製について；第６節ではgBおよびgDのポリペプチド混合物を用いたワクチンの研究について述べる。
【実施例】
【００４０】
（１．材料および方法）
HSV-1パットン株およびHSV-2 333株の生きた保存株は、Dr.Richard Hyman（Hershey Medical Center,Hershey, Pennsylvania）より入手した。これらのウイルスは、Dr.Evelyn Linnette（Viro Labs,Emeryville, California）またはAmerican Type Tissue Culture Laboratoryより入手したベロ細胞中で増殖させ得る。この増殖は標準的な手順に従って行われる。プラスミドpACYC184（ChangおよびCohen,J.Bacteriology(1978)134：1141）のEcoRＩ部位にクローン化されたHSV-1パットンEcoRＩ DNA断片（Kudlerら、Virology(1983)124：86-99）のライブラリーは、Dr.Hymanより得るか、あるいは簡便法で独自に調製し得る。２つのHSV-2 333クローン、すなわちpBR322（Sutcliffe,NucleicAcids Research(1978) 5：2731）のHindIII部位に挿入されたHindIII断片ＨおよびＬもまた、Dr.Hymanより得ることができる。
【００４１】
dhfr欠損CHO細胞系は、Dr.Y.W.Kan(University of California, San Francisco）より得た。この細胞系はもともと、UrlaubおよびChasin（Proc.Natl. Acad. Sci. USA(1980) 77：4216-4220）により記述されている。非選択条件下で、これらの細胞は、10％牛胎児血清、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、そして150μg/mlL-プロリンを追加したハムのF-12培地（Gibcoより入手、cat. no.176）で増殖させた。選択培地は、10％の透析された牛胎児血清と、ペニシリン、ストレプトマイシン、および150μg/mlL-プロリンとを追加したDEMであった。メトトレキセート（MTX）選択のために、濃縮MTX保存培地は、Lederleより得たMTXから調製し、使用直前に上記のDME選択培地に加えた。
（1.1 クローニング）
すべてのDNA操作は、標準的な手順に従って行われた。Maniatisら、Molecular
Cloning, CSH（1982）を参照されたい。制限酵素、T4 DNAリガーゼ、エセリヒア・コリー DNAポリメラーゼＩクレノー断片、そして他の生物学的試薬は、BethesdaResearch Laboratories、あるいは他の表示した市販品供給業者から購入し、製造業者の指示書に従って使用した。２本鎖DNAは１％アガロースゲル上で分離し、電気溶出により単離した。
（1.2 RNAの単離，ノーザンブロット解析，およびハイブリッド選択翻訳法）
全RNAは、細胞あたり10個のウイルスという多重度でHSV-1またはHSV-2に感染して６時間後のベロ細胞より調製した。細胞単分子層を洗浄し、抽出緩衝液でインキュベートし、そしてPachlら（Cell(1983)33：335-344）によって述べられているように処理した。ポリA+ RNAは、500mM NaCl, 10mM Tris HCl（pH7.5）、１mMEDTA、0.1％ SDS中に入ったオリゴdTセルロース（Collaborative Researchより得た）の３mlカラムに、２mgの全RNAを通し、次いで100mMNaCl, 10mM Tris
HCl(pH7.5)、１mM EDTA、0.1％ SDSでカラムを洗浄し、そして10mM Tris HCl(pH7.5)、１mM EDTA、0.1％ SDSでポリA+分画を溶出させることにより調製した。
【００４２】
ノーザンブロット解析を行うために、ポリA+ RNAを、グリオキサール（McMasterら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA(1977) 74：4835-4838）で変性させ、１％アガロースゲルの電気泳動により分別し、ニトロセルロースペーパー（Thomas, 同上(1980)77：5201-5205）に移し、そして32Ｐ標識プローブでハイブリダイズさせた。
【００４３】
ハイブリッド選択翻訳法に用いられる方法の詳細は、以前に記述されている（Pachlら、Cell(1983) 33：335-344）。DNAフィルターは、gBをコードする3.5kbのXho-Kpn断片３μg、またはHSV-1gDをコードする3.0kbのSstＩ−SstＩ断片２μgのいずれかを用いて調製した。このフィルターを、HSV-1が感染した細胞由来のポリA+ RNA40μgと共にインキュベートした、結合RNAを溶出し、網状赤血球無細胞系（Pachlら、J. Virol.(1983)45：133-139）で翻訳させた。翻訳産物は、12.5％SDSポリアクリルアミドゲル（Laemmli,Nature(1970) 227：689）で解析した。
（1.3 DNAトランスフェクション）
COS ７細胞（Gluzman,Cell(1981) 23：175-182）またはdhfr欠損CHO細胞（UrlaubおよびChasin(1980) 前出）の形質転換は、キャリアーDNAを省略したこと以外は、vander EbおよびGraham（Methods in Enz.(1980)65：826-839）の手順を、ParkerおよびStark（J. ofVirol.(1979) 31：306-369）により改変された手順を用いて行った。プラスミドDNAのリン酸カルシウム沈澱は、250mM CaCl2中のプラスミドDNAに、これと等容量の２倍に濃縮したHEPES-緩衝化生理食塩水（２×HBS）を１滴ずつ加えて混合することにより調製した（１×HBSは、0.14MNaCl、5mM KCl、0.7mM Na2HPO4、2.8mM グルコース、10mM HEPES（pH7.0）である）。室温で約20分間インキュベートした後、１mlのリン酸カルシウム-DNA懸濁液（15μgのDNAを含む）を、10cmの平板上で集密度が50％に達するまで増殖した細胞の培地へ加えた。６〜８時間後、DNAを含んだ培地を取り除き、細胞を15％グリセロール−１×HBSと共に４分間インキュベートした。次いで、これら細胞を２日間非選択培地（F12）で増殖させ、その後これら細胞を選択培地中に分割、すなわち植え継いだ。10日後には、dhfr陽性の細胞コロニーが現れ、14日後に、パスツールピペットで平板からコロニーの細胞を移すことにより、これらコロニーを分離した。分離した細胞を増殖のためにマルチウェルの平板に移した。
（1.4 細胞のインビボ標識および免疫沈澱）
35Ｓ−メチオニンで標識するために、細胞を3.5cmの平板で集密的に増殖させ、PBS（0.14M NaCl 2.7mM KCl、15.3mMNa2HPO4）で１回洗浄し、次いでメチオニンを除いた0.5mlの標識培地DEM（Gibcoから得たダルベッコの修正イーグル培地、cat.no.188G）に、１％の透析された牛胎児血清と、400μCi/mlの35Ｓ−メチオニン（＞1000μCi/mmol）を加えたものを、各平板に添加した。これら細胞を37℃にて適当な時間インキュベートした。標識期間の終わりには、培地を取り除き、単分子層をPBSで１回洗浄した。「冷」メチオニンチェイス（“cold”methioninechase）として、2.5mMのメチオニンを含むDMEで標識培地を置き換えた。免疫沈澱を行うために、細胞を、0.1mlの細胞溶液緩衝液（20mMTris-HCl（pH8）、100mM NaCl、１mM EDTA、0.5％ノニデットP40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、牛血清アルブミン、0.1％SDS、1.0mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、10mMベンズアミジン、１％アプロテニン、Sigma Chemical Companyより得た）中で溶解させた。細胞溶解物を、チューブにかき集め、手早くボルテックスミキサーにかけ、次いで４℃にて５〜10分間放置した。細胞破片物は、遠心分離により取り除き、透明になった溶解物は−70℃で貯蔵した。
【００４４】
免疫沈澱を行うために、細胞溶解物0.1mlは、普通血清と４℃で30分間インキュベートすることにより予め清澄させ、次いでプロテインＡセファロース（PAS）の20％溶液（溶解緩衝液中）50μlを加え、４℃で30分間、静かに振盪しながらインキュベートし続けた。PASは、14,000×gで１分間遠心分離することにより取り除き、５μlのHSV-1ポリクローナル抗体（DAKOより得た）またはgB特異的モノクローナル抗体F3AB（Universityof South AlabamaのDr.John Oakesより得た）を加えた。F3AB抗体を用いる場合は、溶解緩衝液から0.1％ SDSを省いた。４℃で30分間の後、75μlのPASを加え、上述のようにインキュベートした。PAS-免疫複合体を遠心分離により集め、BSAとプロテアーゼ阻害剤とを欠く溶解緩衝液で３回洗浄し、0.12MTris HCl（pH7.0）で１回洗浄した。免疫沈澱したタンパクをSDSサンプル緩衝液中で煮沸することによりPASから解離させ、次いで12％ポリアクリルアミドゲルで解析した。細胞培地から標識タンパクを免疫沈澱させるために、培地をまず遠心分離により清澄にし、次いで１/10容量の10倍溶解緩衝液を加えると、タンパクが上述のように沈澱した。
（1.5 免疫螢光）
COS細胞またはCHOクローンにおけるgBまたはgDの発現を分析するために、スライドのウェル内で増殖した細胞をPBSで３回洗浄し、100％メタノールを用いて−20℃にて10分間固定し、続いてさらにPBSで３回洗浄し、５％ヤギ血清（GS）を足したPBSで１回洗浄した。次いで、固定された細胞を、１次抗体（PBS-５％GSで１/100に希釈したHSV-1またはHSV-2ポリクローナル抗体）とともに37℃にて30分間インキュベートした。次に、この細胞をPBS-５％GSで３回洗浄し、２次抗体（PBS-５％GSで１/10に希釈したFITC−結合ヤギ抗−ウサギIgG（カペル）とともに37℃にて30分間インキュベートした。PBS-５％GSで４回洗浄した後、スライドを50％グリセロール−100mMトリス（pH8.0）を用いてカバー片でマウントし、螢光光学系を装備したライツ光学顕微鏡で観察した。生細胞の免疫螢光は、細胞をPBS-５％GSでの最初の洗浄に引き続き直ちに１次抗体とともにインキュベートしたことを除いては、上述のようにして行った。カバー片でマウントする前に、生細胞を５％ホルムアルデヒドを含有するPBSで固定した。螢光染色した細胞は、コダックのエクタクロムフィルム（KodacEktachrome film；ASA400）を用いて写真を撮った。
（1.6 ELISA分析）
CHO細胞を培養した培地中のgBタンパク濃度を、標準物質として精製した組換えgB調製物を用いた間接酵素結合免疫吸着分析法（ELISA）により測定した。PBSで１：1000に希釈されたF3AB抗体50μlを、室温で１時間インキュベートすることにより、96−ウェルの塩化ポリビニルプレート（DynatechLaboratories, Inc.）のウェルに吸着させた。過剰な抗体をPBS-５％GSで３回洗浄することにより除去した。50μlの培地試料またはPBS-1％GSで希釈したgBタンパク標準物質をウェルに添加し、室温にて１時間インキュベートした。次いで、このプレートをPBS＋１％GSで３回洗浄し、その後同じ緩衝液で１：1000に希釈した50μlのウサギ抗HSV-1ポリクローナル抗体（DAKOより入手）とともに３回目のインキュベーションを１時間行った。過剰な２次抗体は、PBS＋１％GSで３回洗浄することにより除去した。最後に、PBS-１％GSで１：500に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（BoehringerMannheim）の50μlを各ウェルに添加し、１時間インキュベートした、次いで、ウェルをPBS＋１％GSで１回洗浄し、続いてPBSで８回洗浄した後、１mg/mlの濃度の2,2'−アジド−ジ〔3−エチルベンズ−チオアゾリンスルホネート〕（BoehringerMannheim）を0.1Mクエン酸（pH4.0）、0.003％ H2O2中に含有する液50μlで呈色させた。この呈色反応を、５分後に50μlの10％SDSを添加することによって停止させ、吸光度をマイクロタィタープレートリーダーで414nmにて読み取った。
【００４５】
gDタンパクの濃度は、標準物質として精製した組換えgDおよびF3ABの代わりにgD−特異的モノクローナル抗体8D2（Rectorら、Infect. andImmun.(1982) 38：168-174）を使用したことを除いては、同様の方法で測定した。
（２．糖タンパク）
（2.1 gB１遺伝子の分離，クローニングおよび特徴付け）
糖タンパクgB１に対応する遺伝子を単離するために、HSV-1パットン株（Patton；SkareおよびSummers,Virology(1977) 76：581-595）のEcoRＩＦ制限断片の地図の座標0.345-0.40に及ぶDNA断片を、プラスミドpBR322にサブクローン化した。これらの断片は、プラスミドpACY184のEcoRＩ領域の適当な制限酵素消化物から調製され、TAE緩衝液（0.04Mトリス−酢酸、0.002M EDTA）を用いた１％アガロースゲルでの電気泳動により分離され、電気溶出された。単離された断片を、前もって適当な制限酵素で切断し、アルカリホスファターゼで処理してあるpBR322に結合した。HSV-1の全ゲノムの制限酵素切断地図を図１に示し、サブクローン化された領域のより詳細な地図を図２に示す。図１を参照すると、従来の地図が最初の２行で示されている（Roizman,1979）。点線はＬ−Ｓ連結部を示す。プロトタイプのアイソマーの配列のEcoRＩ制限酵素切断地図を、ハッチングを施した枠で囲むことにより示されるEcoRＩ断片Ｆとともに第３行に示す（SkareおよびSummers,1977；Roizman, 1979）。HSV-2のHindIII制限酵素切断地図を、ハッチングを施した枠で囲んだHindIII断片Ｈとともに第４行に示す（Roizman,1979）。１地図単位は、HSV-1のDNAの98.9メガダルトンまたは148.9kbpに相当し、HSV-2のDNAの105.6メガダルトンまたは160.5kbpに相当する。
【００４６】
図２を参照すると、詳細な地図ライン（Ｉ）に示された制限酵素切断部位は次の通りである：E,EcoRＩ; B,BamHＩ; S,SalＩ; P,PstＩ;X,XhoＩ（DeLuccaらより, 1983）; N,NdeＩ; Xn, XmnＩ; V,EcoRV。0.355のDeLuccaらによってマッピングされたBstEII部位は、この株では欠失しており、0.357に新しいPstＩ部位が存在する。ラインIIは、gB１コード領域を含む３つのプラスミドのサブクローンを示す。これらは、0.345のBamHＩ部位から0.360のSalＩ部位までの範囲のpHS106；0.36のSalＩ部位から0.388のSalＩ部位までの範囲のpHS107；および0.345から0.40地図単位までの範囲のBamHＩ断片である。ラインIIIはgB１のmRNAをマッピングするために用いられる３つのプローブを示し；ラインIVはハイブリッド選択のために用いられる断片を示し；そして、ラインＶはgB２遺伝子の位置を決定するために用いられるこれらのプローブを示す（以下を参照）。これらの断片を作製するために用いた追加の制限酵素切断部位は、Nc,NcoＩ; K,KpnＩ; およびA,AluＩである。
【００４７】
EcoRＩ断片におけるgB１コード領域の位置を決定するために、HSV-1が感染したベロ細胞から単離したポリA+ mRNAのノザンブロッティングを、pHS106およびpHS107から単離された詳細な地図に示されたDNA断片をプローブとして行った。pHS106から単離された0.5kbPstＩ−SalＩ断片をHSV-1についてのプローブとして用いたとき、検出された主な種類は３kbのmRNAであった。PstＩ−SalＩ断片の約１kb上流に位置する0.49kbNcoＩ断片をプローブとして同様のブロッティングを行うと、gB１のmRNAと推定される３kbのmRNAとのハイブリダイズも検出された。このことは、gB１をコードする配列がPstＩ−SalＩ断片の少なくとも１kb上流まで延長されていることを示唆する。３kbのmRNAは、PstＩ−SalＩ断片から下流の最初のXhoＩ部位よりは延長されていない。なぜならば、0.5kbXhoＩ−XhoＩ断片がこのmRNAとハイブリダイズしないからである。gB１転写単位の転写の方向は右から左（3'←5'）であり、このことはPstＩ−SalＩおよびNcoＩ−NcoＩ断片の5'−3'の方向の鎖のみが３kbgB１ mRNAにハイブリダイズすることにより証明される。
【００４８】
ハイブリッド選択翻訳は、HSV-1ポリA+ mRNAを3.2kb KpnＩ−XhoＩ断片（gB１コード領域として示される領域を含む）とハイブリダイズさせることにより行った。結合したmRNAを溶出し、インビトロで翻訳させたとき、HSV-1感染ベロ細胞由来のgB１と同様の大きさの100kdタンパクが検出された。この100kdタンパクの同定の確認は、gB１−特異的モノクローナル抗体と免疫沈降することより行われた。KpnＩ−XhoＩ断片を用いたハイブリッド選択により、その他のいくつかのタンパクも検出されたが、おそらくこれはDNAのG＋C含有量が高いためにおこったmRNAの非特異的なハイブリダイズの結果である。HSV-1糖タンパクgDをコードする3.0kbのSstＩ−SstＩDNA断片を用いて同じRNAを選択すると、同様のタンパクのパターンが観察されたが、100kdのgBタンパクは検出されなかった。この結果は、gBがKpnＩ−XhoＩ断片に特異的であることを示唆する。
【００４９】
図３は、0.345地図単位のBamHＩ制限酵素切断部位から0.373地図単位のXhoＩ部位までの、3.95kb DNA断片の制限酵素切断地図を示す。gB１オープンリーディングフレームは枠で囲んで示されており、転写の方向は図示されているように右から左へである。実際のコード領域は、地図単位0.348から0.367までである。BamHＩ部位から3,640番目の唯一ではないAluＩ部位までのDNA配列を示し、AluＩ部位は（Ａ）で示す。図示されている制限酵素切断部位は、B,BamHＩ;B1, BalＩ;
Bs, BstEII; K, KpnＩ; Nc, NcoＩ; P,PstＩ; Pv, PvuII; S,SalＩ; Sc, SacＩ; X,XhoＩ; Xm,Xma３を含む。右側に示すAluＩ部位から末端のXhoＩ部位までの制限酵素切断部位は示されていない。生産されたgB１タンパクのグリコシル化の可能性がある部位および疎水性アンカーおよびシグナル領域（枠で囲い塗りつぶした部分）が示されている。
【００５０】
BamHＩ部位からヌクレオチド残基の3,640番目の唯一ではないAluＩ部位までのDNA配列を、SangerのM13ジデオキシヌクレオチド合成法を用いて決定した。コード領域の両DNA鎖を配列決定した。完全なDNA配列が、並べた制限酵素切断断片から集められ、このようにして該配列は診断片全部を通して読み取られる。図４〜図７は、gB１のDNA配列を示し（第３行）；gB１に対する予想アミノ酸配列は、DNA配列の下に示す（第４行）。
【００５１】
図４〜図７に示したgB１に対応するアミノ酸配列およびDNA配列は、国際特許公開第WO85/04587号（1985年10月24日公開）の表１に初めて示された配列とは異なる、ということは注意すべきである。この表１の中のDNA配列には誤りがあり、配列の607番目の位置にヌクレオチド（G）が付け加えられている。図４〜図７ではこのヌクレオチドは削除されており、この図は正しいDNA配列を示す。上記表１中のアミノ酸配列は、その中に示されている誤ったDNA配列から推定されたものであり；上記付け加えられたヌクレオチドによりリーディングフレームが変わっているため、該表１に示された配列は正しくない。図４〜図７は正しいDNA配列に基づいたアミノ酸配列を示し；図４〜図７のアミノ酸配列は、gB１のＮ−末端領域のアミノ酸配列決定により確認されている。この推定アミノ酸配列における変化は、疎水性および親水性の領域の推定された位置、およびgB１分子内のグリコシル化部位に関する訂正も結果する。正しい配列に基づいた推定アミノ酸配列を、該配列の下に示す。
【００５２】
22bpのオリゴヌクレオチド（残基473-494）を用いたプライマー延長は、gB１のmRNAの5'末端が残基188に位置することを示した。CATおよびTATA転写調節シグナルは、残基55-62および125-131であると推定される。残基438-440のATGから開始し、TGA停止コドンで終結する、2712個のヌクレオチドのオープンリーディングフレームが存在する。２つの推定されるポリアデニル化シグナルが、残基3166-3173および3409-3416の3'側の非コード領域に位置している。
【００５３】
記述されたアミノ酸配列は膜タンパクの特徴を示す。カルボキシ末端近くのアミノ酸残726から795番目までの範囲の非常に疎水性の領域が存在し、69個のアミノ酸は膜に結合し得る。Ｎ−末端における最初の30個のアミノ酸は主に疎水性である。この疎水性アミノ酸ドメインは、荷電したアミノ酸または親水性のアミノ酸が高度に集中した領域の前にある。Ｎ−末端の親水性の配列は分泌リーダーまたはシグナル配列として働き、該配列の次に分泌リーダーの切断および除去のためのプロセッシングシグナルがある。Ｃ−末端近くの疎水性の領域は、タンパクを細胞膜に結合するためのトランスメンブレン・インテグレーション配列として作用できる。
【００５４】
配列のデータは親水性の外部ドメイン内のasn-X-thr/ser配列（図３も参照のこと）により定義されるような９個の可能性のあるＮ−結合型グリコシル化部位が存在することも示唆する。もしも最初の30個のアミノ酸がプロセッシングにより除去され、可能性のある各Ｎ−結合型グリコシル化部位が部位あたり平均２kdの炭水化物を付加するのに利用されるならば、成熟タンパクの分子量は約123kdとなる。
（2.2 哺乳動物細胞におけるgB１の発現）
哺乳動物細胞でgB１を発現させるために、dhfrを欠くCHO細胞にプラスミドpHS112およびpHS114を導入して形質転換させた。この形質転換は、材料および方法に記述したようなカルシウム沈澱法を用いて行った。プラスミドpHS112およびpHS114で形質転換したE.coliHB101株は、ATCCに寄託されており、それぞれ受託番号39650および39651で受託されている。これらの株の構築は、国際特許公開第WO85/04587号（前出）に記載されている。形質転換された細胞は、チミジン、プリンおよびグリシンを欠いた選択培地を用いて選択した。細胞は、パスツールピペットで取り出すことにより単離し、複数のウェルを持つプレートで増殖させた。多数のクローンが単離され、該クローンはHSV-1ポリクローナル抗体またはgBに特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫螢光および放射性免疫沈降によりgBを生産することが示された。３個の細胞クローンpHS112-1、pHS112-9およびpHS112-23が単離され、該クローンは細胞内にある形の完全なgBタンパクを合成した。これら細胞で生産されたgBは、グリコシル化されていると考えられる。なぜならば、１時間パルス標識し、続いて５時間チェイスした後に、チェイスを行わなかった細胞に比べてより大きな分子量の形が検出され得、約10％のgBが培地中に分泌されたからである。不完全なgBを発現する５個の細胞クローン（pHS114-5、pHS114-6、pHS114-7、pHS114-11およびpHS114-12）も分析され、やはり培地中にいくらかのgBを分泌することが示された。これらの細胞系の１つであるpHS114-7は、MTXでさらに増幅するために選択された。クローンは最初は0.01、0.05、0.10および0.3μMMTXで選択された。免疫螢光分析で検出すると高レベルのgBを合成する３個のクローンが、0.3μM MTXで選択されたものから単離された。放射性免疫沈降により、これらのクローンpHS114-0.3μM-6、23および25は、35Ｓ−メチオニンで１時間標識している間に、増幅しなかったクローンpHS114-7よりも２〜３倍多くのgBを合成する。パルスチェイス実験は、１時間のパルスの間にこれらのクローンで合成されるgBの少なくとも８％が、５時間で細胞外に分泌されることを示す。
【００５５】
発現は、発現ベクターpHS137を用いても行われた。このベクターの地図を図９に示す。プラスミドpHS137は、シグナル配列の切断後の長さが690個のアミノ酸である不完全なgB１タンパクをコードする。
【００５６】
pHS137は、pHS108（2.1章で記述した）をXhoＩおよびBamHＩで分解し、続いて、得られた3.5kd断片を単離することにより構築した。この断片の末端はクレノーで平滑末端とした。この平滑末端とされたXhoＩ−BamHＩ断片をPVUIIで部分分解し、ゲルで2098bpのバンドとして移動したDNAを該部分分解物から単離した。単離されたXhoＩ−PVUIIバンドを、前もってSmaＩで分解されているpSV7dに連結し、得られたDNAをE.coliを形質転換するのに用いた。得られた細菌クローンを、gB１インサートが適当な方向で挿入されているプラスミドについてスクリーニングした。
【００５７】
発現を得るために、pHS137をプラスミドpADdhfrとともにdhfr欠損CHO細胞に導入して形質転換させた。得られたクローンはgB１を生産し、分泌した。このようなクローンの１つであるpHS137-7-B-50は、10mlの完全培地を入れたT75培養フラスコ中で、24時間に1-3×107細胞あたり6.91＋/−1.53μg/mlgB１タンパクを生産した。
（３．糖タンパクＢ２）
gB２遺伝子の単離、特徴付け、およびクローニングは、国際特許公開第WO85/04857号（前出）に記載されている。
（3.1 哺乳動物細胞でのgB２の発現）
HSV-2糖タンパクgBの発現は、pHS210単独で形質転換するか、またはpHS210とともに同時形質転換することにより、COS細胞（一時的な発現）で行われる。この２番目のプラスミドはdhfrを含む。
【００５８】
プラスミドpHS210は以下のようにして構築した；全gB２遺伝子を3.8kb NruＩ−BamHＩ断片としてpBR322にサブクローン化し、pHS208を作製した。図１０を参照のこと。遺伝子の5'末端のPstＩ部位（NruＩ部位の100bp右(下流)）を、M13でのインビトロでの変異によりHindIII部位に変えた。次いで、1.9kbのHindIIIからPvuIIまでの断片を、pSV1/dhfrをHindIIIおよびBglIIで分解することにより得られるpSV1に挿入した。図１０を参照のこと；pSV1/dhfrは、PCT国際特許公開第WO85/04587号に記載されている。このクローニング工程のために、pHS208をPvuIIで切断し、末端を平滑末端に修復した。次いで、この分子をHindIIIで切断し、1.9kbHindIII−(PvuII) 断片をゲル電気泳動により単離した。同様にpSV1/dhfrをBglIIで切断し、平滑末端に修復し、HindIIIで切断し、ゲル電気泳動により4.85kbHindIII−(BglII)ベクター断片を単離した。これら２つの断片（1.9kbおよび4.85kb）を、発現ベクターであるpHS210（図１０）を作製するために連結した。
【００５９】
プラスミドpHS210は、直接にCOS細胞を形質転換するのに用いた。発現は、１次抗体スクリーニング用として、gB特異的モノクローナル抗体であるF3ABおよび市販のポリクローナル抗体であるHSV-2抗体（DAKO）も用いた、免疫螢光分析により検出された。gB２の培地への分泌は、gB２−特異的ELISA分析により検出された。この目的のために、プレートをモノクローナル抗体でコートした。細胞培養培地試料をコートしたプレートに添加し、次いで結合したgB２を、ウサギ抗HSV-2ポリクローナル抗体（DAKO）に続いて西洋ワサビ結合ヤギ抗ウサギIgGを用いて検出した。
【００６０】
CHO細胞形質転換のためのプラスミドpHS210は、同時形質転換プロトコルでは、選択マーカとしてdhfrを含む第２のプラスミドとともに用いられた（図１０）。選択培地で続いて形質転換および増殖させることにより、約100個のdhfr+クローンが単離され、ELISA分析（ELISAプレートはF3AB特異的モノクローナル抗体でコートされている）を用いてgB２の合成および分泌についてスクリーニングされた。gB分泌のレベルが最も高いクローンpHS210  #3-1は、さらにgB２ポリペプチドの特徴について選択された。gB２タンパクは、〔35Ｓ〕−メチオニンで標識し、続いて放射性免疫沈降を行うことにより検出された。１時間パルス後、79kdおよび84kdのポリペプチドに相当する２つの拡散したバンドが細胞内で検出された。これらのタンパクは、637残基の不完全な遺伝子産物について推測された大きさよりも68,991ダルトン大きく、該タンパクは部分的にグリコシル化された前駆体に相当すると推測された。５時間チェイスした後、細胞内にgB２は検出されなかった。そして、89kdのポリペプチドが培地中に検出された。クローンpHS210#3-1の培地中に分泌された成熟型の大きさの完全なグリコシル化されたgB２は、pHS4-6により分泌された100kdのgB１よりもいくぶん小さかった。これは、gB１プラスミドに含まれる94アミノ酸に対応するコード配列が、pHS210から除去されたためである。
（４．糖タンパクD１）
（4.1 gD１の哺乳類発現ベクターの構築）
pBR322のEcoRＩ部位にクローン化したパットン株のHSV-1のEcoRＩ断片のライブラリーは、Dr.Richard Hyman, HersheyMedical Center, Hershey, PAにより作製された。gD１遺伝子は、このライブラリーのクローンＨのEcoRＩ断片内の2.9kb SacＩ断片中に完全に含まれている。15kbEcoRＩ挿入物を含むクローンＨはDr.Hymanから得た。この2.9kb断片をゲル電気泳動で精製し、次にHindIIIとNcoＩとで完全分解した。74bpの5'非翻訳配列とアミノ末端20アミノ酸をコードする60bpとからなるgD遺伝子の5'末端を134bpの断片としてゲルから単離した。gD遺伝子の3'末端は、pHYS119（国際公開No.WO85/04587（前出）を参照されたい）を、NcoＩとSalＩとで分解し、873bp断片を単離することにより得られた。これらの２断片（5'末端および3'末端）をあらかじめHindIIIおよびSalＩで分解したプラスミドpUC12と連結した。pUC12ベクターは、PharmasiaおよびP-LBiochemicalsから市販されており、得られたプラスミドはpHS131と名付けた。プラスミドpHS131をHindIIIで分解し、5'側の４塩基対の突出部をクレノーポリメラーゼで充填し、次にSalＩで分解した。gD遺伝子を含む1007bp断片をゲル単離し、そしてあらかじめSmaＩおよびSalＩで切断したプラスミドpSV7dに連結した。このプラスミドpSV7dについては以下に述べる。得られた発現ベクターはpHS132と名付ける。その誘導は図１１に概略を示す。
【００６１】
このプラスミドは、完全なタンパクの合計399個のアミノ酸のうちの25個のアミノ酸のシグナル配列を含むgD１タンパクの315個のアミノ酸をコードする。このタンパクはカルボキシル末端で切断されており、疎水性の膜アンカードメインと細胞質ドメインとを含む84アミノ酸を欠いており、得られたタンパクは培地に分泌される。
【００６２】
プラスミドpSV7dを以下のように構築した：SV40の複製起点と初期プロモーターを含む400bpのBamHＩ／HindIII断片を、SVgtＩ（Mulligan,R.ら、J. Mol. Cell Biol.(1981) 1：854-864）から切り出し、そして精製した。SV40のポリＡ付加部位を含む240bpのSV40BclＩ／BamHI断片を、pSV2／dhfr（Subramaniら、J.Mol. Cell Biol.(1981) 1：854-864）から切り出し、そして精製した。これらの断片を下のリンカー：
【００６３】
【化１】
2004242679.tif 000002
【００６４】
により融合させた。このリンカーは３つの全ての読み取り枠での停止コドンと共に５つの制限部位を含む。得られた670bp断片（SV40の複製起点、SV40の初期プロモーター、停止コドンを有するポリリンカー、およびSV40のポリアデニル化部位を含む）を約1.5kbが欠失したpBR322誘導体（LuskyおよびBotchan,Cell(1984)36：391）であるpMLのBamHＩ部位にクローン化し、pSV6を得た。pSV6のpML配列内のEcoRＩおよびEcoRV部位を、EcoRＩおよびEcoRVで分解することにより除去した後、各末端の約200bpを除去するために、Bal31ヌクレアーゼで処理し、最後に再連結してpSV7aを得た。Bal31切除により、EcoRV部位から約200bp離れたSV40領域に隣接する１つのBamHＩ制限部位を除去した。SV40領域に隣接する第２のBamHＩ部位を除去するために、pSV7aをNruＩで分解した。この酵素はpML配列を複製起点の上流で切断する。これを平滑末端連結により再環化させ、pSV7bを得た。
【００６５】
pSV7cおよびpSV7dは連続したポリリンカー置換物を意味する。まず、pSV7bをStuＩおよびXbaＩで分解した。次に、以下のリンカーをベクターに連結させ、pSV7cを得た：
【００６６】
【化２】
2004242679.tif 000003
【００６７】
その後、pSV7cをBglIIおよびXbaＩで分解し、以下のリンカーと連結させ、pSV7dを得た：
【００６８】
【化３】
2004242679.tif 000004
【００６９】
（4.2 gD１の哺乳類細胞での発現）
プラスミドpHS132のgD１発現は多くの実験で示されている。第１に、前述の方法を用い、かつ検出に市販の対HSV-1ウサギ血清（DAKO）を用いて感染させた後、特異的免疫螢光が、COS７細胞で観察された。第２に、gD１を分泌する安定なCHO細胞系が確立された。発現レベルはELISAで分析され、パルス標識し、チェイスした細胞溶解物と培地との放射免疫沈降により確認された。第３に、gD１がCHO細胞系D64のローラーボトル培養の培地から、硫安沈澱、免疫アフィニティークロマトグラフィー、および限外濾過という一連の工程により精製された。アフィニティークロマトグラフィーには、Rectorら(1982)（前出）に記載のgDモノクローナル抗体8D2を臭化シアン活性化セファロース4Bに結合させたものを用いた。
（５．糖タンパクD2）
（5.1 gD2の哺乳類発現ベクターの構築）
HSV-2の333株のHindIII断片は、文献（Kudlerら、Virology(1983) 124：86-99）に示されているように、Dr.RichardHymanによりpBR322にクローン化された。糖タンパクgD２の遺伝子は、Ruyechanら、J. Virol.(1970)29：677-697により、0.90〜0.945地図単位間のウイルスの短い特異領域に地図化されている。HindIIIＬ断片の占める領域は、Roizman,B.,Ann. Rev. Genet(1979)13：25-27のゲノム地図に示されている。gD２遺伝子のDNA配列が、Watson, Gene(1983)26：307-312により報告されている。
【００７０】
pBR322にクローン化されたHindIIIＬ断片を、Dr.Richard Hymanから入手し、図１２のＡに示す制限地図を決定した。gD２の遺伝子はgD１をコードする2.9kbSacＩ断片をプローブとしてHindIIIＬ断片の制限酵素分解物をサザンブロットすることにより、2.4kb XhoＩ断片上に存在することが見いだされた。XhoＩ断片の地図とgD２遺伝子の位置とを図１２のＢに示す。この2.4kbXhoＩ断片をXhoＩ部位を含むpBR322誘導体ベクターにクローン化し、プラスミドpHS204を得た。３つの異なるgD２発現ベクター、プラスミドpHS211、pHS212、およびpHS213を次のように構築し、模式図を図１３に示した。プラスミドpHS211はシグナル配列を含むgD２の初めの305個のアミノ酸をコードする。その構築には、pHS204をSmaＩおよびBamHＩで切断し、２つの制限断片をゲルから単離した：5'非翻訳配列の82bpを含む該遺伝子の5'末端を含む250bpSmaＩ断片、および該遺伝子の内部を含む3'隣接の746bpのSmaＩ−BamHＩ断片。哺乳類細胞発現ベクターpSV7d（第4.2節に記載）をEcoRＩで切断し、5'の４bpの突出部分をクレノーポリメラーゼで平滑末端にし、次いでBamHＩで切断した。pHS204の２断片を分解されたpSV7dに連結し、そして細菌の形質転換体からSmaＩ断片が正しい方向に入っているものを選択し、ベクターpHS211を得た。
【００７１】
gD２の352個のアミノ酸およびpHS211に存在する遺伝子を越える付加的な47個の残基をコードするプラスミドpHS212を、pHS204のHaeIIでの分解、そしてクレノーポリメラーゼでの末端平滑化、およびBamHＩでの分解により構築した。（HaeII）（括弧は末端が充填されていることを表わす）からBamHＩまでの141bpの断片をゲル単離した。プラスミドpHS211をE.coliGM272株に導入し、プラスミドDNAを調製し、それを次にBclＩで分解後、クレノーポリメラーゼで平滑化し、そしてBamHＩで分解した。大きいベクター断片（約3.4kb）をゲル単離し、141bp(HaeII)−BamHＩ断片に連結し、プラスミドpHS212を得た。gD２配列とプラスミドベクター配列の、該遺伝子の3'末端側での融合により、gD２遺伝子の3'末端側にナンセンスDNAの27コドンが付加される。これらのナンセンス配列を除去するために、プラスミドpHS213を、pHS211のSalＩでの部分分解、１ヶ所切断されたプラスミドのゲル単離、次いでクレノーポリメラーゼでの平滑化およびBamHＩでの分解、により構築した。pHS204の（HaeII）からBamHＩの141bp断片を、線状化したpHS211に連結し、プラスミドpHS213を得た。
（5.2 哺乳類細胞におけるgD２の発現）
哺乳類細胞におけるgD２の発現は、pHS211、pHS212およびpHS213でCOS７細胞にトランスフェクトすることにより、一過性の発現についてまず分析した。gD２の発現は、免疫螢光、およびCOS７が培養された培地の捕捉ELISA分析、の両方法により、免疫螢光に対してはウサギ抗HSV-2抗体を用いて、そしてELISAにおける捕捉抗体については、gD型の共通抗体である8D2（Rectorら（1982）前出）を用いて検出した。
【００７２】
次に、Addhfrを有するプラスミドpHS211またはpHS213でトランスフェクトし、dhfr獲得について選択し、gD２の発現についてERISA分析でスクリーニングすることにより、永久CHO細胞系を確立した。
Ad-dhfrの記述：
dhfr遺伝子を持つプラスミドを、アデノウイルス−２由来の主要好気プロモーター（Ad-MLP、地図単位16〜17.3）を5'末端でマウスdhfr cDNAに融合させることにより構築した。SV40小ｔ抗原に対するイントロンとSV40初期領域ポリアデニル化部位とをコードするDNAを、SouthernおよびBerg,J. Mol. Appl. Genet.(1982) 1：327-341に記載されているpSV2-neoより得て、dhfr cDNAの3'末端に融合させた。これら３つの断片をpBR322にサブクローン化し、プラスミドAd-dhfrを得た。このプラスミドは、KauhmanおよびSharp,Molec. and Cell Biol.,(1982)
2：1304-1319に記載されているdhfrプラスミドと機能的には同様である。
（６．gB−gDワクチンを用いた治療的処置）
（6.1 一次感染後に投与した組換えHSV糖タンパクワクチンがモルモットの再発性ヘルペス疾患に及ぼす効果）
雌のハートレイモルモットの膣内に、第１日目に５×105pfu HSV-2 MS株を接種した。これら動物を、アシクロビール（５mg／ml）を飲料水に加えることにより、第１〜10日目において処置した。アシクロビールは、一次感染の症状を軽減し、従って２次的な細菌感染の発生、および生殖器の傷の発生を減少させる。一次感染中におけるアシクロビールの使用は、モルモットに対する処置を停止した後の疾患の経過には影響がないことが示されている（Bernsteinら、Virology,(1986)67：1601）。一次感染から回復した後、これら動物を、HSV-2全糖タンパク調製物（gP2）で免疫化し、組換えgB１およびgD１の混合物（HSV-1gB＋gD）で免疫化するか、あるいは処置しなかった。処置グループを下に示している。
グループ        処置            投与量      アジュバント    経路  Ｎ
Ｉ            なし            なし          なし        なし    11
ＩＩ      HSV-1 gB＋gD    25μg＋25μg  フロインド    足蹠    11
ＩＩＩ    gP2 50μgフロインド                          足蹠    11
ＩＶ    対照アジュバントのみ  なし          フロインド  足蹠    9
後方の足蹠にワクチンを注射することにより、第21日目と、さらに第42日目に動物を免疫化した。組換えタンパクgB１およびgD１の両方を、前述のように哺乳類細胞において生産した。結果は表１および図１４に報告する。
【００７３】
これらの結果は、再発性ヘルペス疾患のパターンがＩ群およびIV群について同じであったことを示しており、それ故にこれらの群を分析用にプールした（対照，ｎ＝20）。
【００７４】
表１および図１４に示されている結果は、組換え糖タンパクによるワクチン接種が疾患の再発頻度に対して顕著な影響を及ぼすことを示している。加えて、gB＋gDの組み合わせは天然の糖タンパクの混合物より優れている。
【００７５】
特定の時間内に起こる病害日数により測定した疾患の再発率は、再発エピソードの頻度と持続期間との両方を考慮する評価である。図１５のＡは、ヘルペス疾患が認められた週あたりの平均日数として表されている再発性ヘルペス疾患の感染率を示している。免疫化したグループは、gBgDおよびgD-2でワクチン投与された動物の両方を含む。図１５のＡに示されているように、疾患の再発率（週あたりの病害日数）は、評価期間が最初の感染から遠ざかるにつれて、全てのグループで低下したが、低下率はワクチン投与した動物では大きかった。対照動物と免疫化した動物との間における再発性ヘルペス疾患の感染率の差を図１５のＢに示す。図１５のＢから明らかなように、糖タンパクによる免疫化が疾患の再発率に及ぼす効果は、図１４より推論されるように、２回目の投与後よりもむしろ１回目の免疫化投与に続いて確立されているようであった。
【００７６】
【表１】
2004242679.tif 000005
【００７７】
（6.2 一次感染後に投与した組換えHSV糖タンパクワクチンが宿主の免疫応答に及ぼす効果）
感染後の糖タンパク投与が宿主の免疫応答に及ぼす効果は、感染した動物によって生産される抗HSV抗体を、感染前と、HSV糖タンパクワクチンで免疫化した後とに測定することにより、決定された。
【００７８】
6.1節で述べたように、これら動物にHSV-2 ms株で接種し、アシクロビールで処置し、そしてHSV糖タンパクワクチンで処置した。これら動物から血清を第41日目と第95日目に集めた。血清中の抗HSV抗体は、本質的にはPachl,C.ら、Jof Virology(1987)61：315-325に記載されているように、1.6節に述べた方法である、ELISAにより測定した。捕捉抗原には、HSV-1糖タンパク混合物（gP-1）、HSV-1糖タンパクＤ（gD-1）、あるいはHSV-2糖タンパクＤ（gD-2）が含まれていた。
【００７９】
HSV糖タンパクワクチン投与が抗HSV抗体の力価に及ぼす効果は、データが幾何平均で表されている表２に示されている。抗体は、HSV接種前に集めた血清中には検出されなかった。表２に見られるように、未処置の対照動物では、抗HSV抗体の力価は第95日目よりも第41日目の方が大きかった。それとは対照的に、糖タンパクで処置した動物は、一般的に第95日目までずっと高い力価を示していた。またHSV糖タンパクでワクチン接種すると、未処置の対照に比べて抗HSV抗体の力価が顕著に増加した（P<.05）。さらに、gP-2混合物での処置は、抗体の力価が1.4〜７倍上昇したが、組換えHSV-1gBgDワクチンでの処置は、対照値に比べて力価が９〜31倍上昇した。このように、HSV糖タンパクを動物に投与すること、特に組換えHSV糖タンパクgBgDを投与することは、宿主の免疫応答を増加させ、そして6.1節に示したように、再発性HSV疾患の頻度および症状を軽減する。
【００８０】
【表２】
2004242679.tif 000006
【００８１】
（6.3 gD１を含むHSV糖タンパクワクチンにより誘導された免疫応答におけるアジュバントの影響）
いくつかのアジュバントを、HSV糖タンパクワクチンによる免疫治療処置におけるその影響を調べるために試験した。試験を行なったアジュバントは、完全フロインドアジュバント（CFA）、水酸化アルミニウム、およびN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1'−2'−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン（MTP−PEと呼ばれる）であった。
【００８２】
アジュバントの影響は、gD１を含むワクチン（これはまた、種々のアジュバントを含む）を投与した後の抗gD１抗体量を測定することにより調べられた。gD１のみを含むワクチンは、gBgDを含むワクチンのモデルとして働く。なぜなら、アジュバントの影響は、ワクチン中のHSV糖タンパクの型に特異的であるようには考えられないためである。
【００８３】
以下の研究において、gD１をpHS132から合成し、4.2節に記載されているように、単離した。雌のモルモットに、35μgのgD１と種々のアジュバント組成物とから成る混合物を３週間間隔で３回にわたり足蹠から投与し免疫化した。２回目の免疫化の１週間後、そして３回目の免疫化の１，５，９および13週間後に、動物から採血し、そして抗gD力価を、1.6節に述べたようにELISAにより決定した。
【００８４】
次に示す結果により、試験したアジュバントのうちで最も有望なのはMTP-PEであることが示唆される。なぜなら、MTP-PEは実験動物中で高い抗gD１力価を恒常的に生産するためである。力価についてはCFAほどは長期間保持されなかったが、これらのレベルはCFAについて見られたものと同等であった。
（6.3.1 CFAと水酸化アルミニウムとの比較）
動物を、gD１とCFAまたは水酸化アルミニウムのいずれかとを含むワクチンで免疫化した。抗gD力価におけるアジュバントの影響を表３に示す。表３ではデータを幾何平均で表している。表５に見られるように、最も効果的なアジュバントはCFAであった。最も長く持続し最も高い抗体力価は、CFAワクチンで免疫化した群に見られた。他のアジュバントの影響を、CFAで得られた力価に比較した割合（パーセント）として示す。10％水酸化アルミニウム懸濁液をアジュバントとして用いることにより、最も低い抗gD１力価が得られた。
【００８５】
【表３】
2004242679.tif 000007
【００８６】
（6.3.2 CFA，nor−MDP，およびMTP-PEの比較）
動物を、gD１と、CFA、nor−MDP、およびMTP-PEのうちのいずれかとを含むワクチンで免疫化した。MTP-PEをリポソームにカプセル化し、そしてこの後者のアジュバントを、外因性のgD１とともに、そして、リポソームに取込まれたgD１とともに、投与した。リポソームは、合成ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびMTP-PE（またはMTP-PEおよびgD１）を、懸濁媒体（滅菌したCa++およびMg++塩を含まない等張ダルベッコ緩衝液、pH7.2）中に175：75：1の割合加え、ボルテックスにより撹拌することにより調製された。表４に見られるように、CFAを含むワクチンでの免疫化により最も高い抗gD１平均力価を得た。nor-MDPで得られた力価は、CFAで免疫化した群で得られた平均力価の44から74％の範囲であった。MTP-PEおよび外因性gD１で得られた平均力価は、nor−MDPで得られたものよりもいくらか低く、CFAで得られたものの32から72％の範囲であった。MTP-PEおよびリポソームでカプセル化されたgD１で得られた力価が非常に低いのは、カプセル化された形のgD１のレベルが非常に低いためであり得る。カプセル化されたgD１の投与量は外因性のgD１の投与量の約７％のみであった。この低い投与量は、リポソーム中へのgD１の取込みが、非常に低い効率であることに起因するものであった。この非常に低い取込みは、抗原のサイズにより引き起こされ得る。リポソームの他の処方によれば、抗原をさらによい効率で取込むことができた。
【００８７】
【表４】
2004242679.tif 000008
【００８８】
（6.3.3 MTP-PEを含む異なる処方物の比較）
動物を、高油性デリバリー系（スクアレン／アルラセル）中のMTP-PEで処方されたワクチン、および低油性デリバリー系中のMTP-PEで処方されたワクチンを含むgD１で免疫化した。油性度の低いMTP-PE処方物は、４％のスクアレンおよび0.008％のTween80を含んでいた。これらのアジュバント処方物で得たgD１抗体力価を表５に示す。
【００８９】
表５に見られるように、MTP-PE処方物は、オイル−界面活性剤の割合の低い処方物中の唯一の成分として用いたときでさえも、アジュバントとして効果的であった。［それは、RIBI中のCWS成分の効果的な代替物でもあったし、さらにRIBIと比較してもその効果は時間とともに増大した。３回目の採血時に、MTP-RIBIで得られた力価はRIBIで得られたものの２倍であった。］１回目の採血後、MTP-PE低油性処方物は、高油性デリバリーシステム（スクアレン／アルラセル）よりも高い力価を示した。
【００９０】
【表５】
2004242679.tif 000009
【００９１】
（6.4 治療的研究：モルモットの再発性ヘルペス病予防に効果的なワクチンにおけるアジュバントの影響，投与部位，および投与時期）
gBgDワクチンは、SDS-PAGEにより判断するとおよそ70−80％の単一性にまで精製した組換えgB１およびgD１のそれぞれ25μgを含む。組換えgB１タンパクは、pHS113-9-10-21およびpHS137-7-B-50セルラインから調製したgB１の50：50の混合物であった。これらのセルラインは、ベクターpHS113およびpHS137をそれぞれ保有するCHOセルラインである。pHS113およびpHS137の調製については、2.2節に記載されている。gBタンパクは、Pachlら、Jof Virology,61：315-325（1987）に記載されているように精製され、このことについては2.2節に記載されている。アフィニティークロマトグラフィーによる精製中において、C4D2の代わりに8D2を用いたこと以外は、4.2節に記載されているように、gD１を調製した。
【００９２】
この実施例においては、２つのアジュバント、nor-MDPおよびCFAの効果を比較している。アジュバントnor-MAPを、50％スクアレン／アルラセルおよび抗原で乳化し、50μg／投与で用いた。
【００９３】
本研究はまた、２つの投与経路についても比較を行なっている。つまり、足蹠内投与と、筋肉内または皮下投与との比較を行なっている。最後に、モルモットでの再発性ヘルペス病の予防における投与の種々の時間を比較している。実験計画を表６に示す。
【００９４】
【表６】
2004242679.tif 000010
【００９５】
体重350〜400gの雌のハートレイモルモットに、第１日目に5.7／log10pfuのHSV-2 MS株を膣内に植菌した。膣内植菌24時間後に収集した膣からの清拭試料からHSVを回収することにより、動物が感染していることを確めた。一次感染の医療経過を、Stanberryら、JInfec Dis(1987)155：914で述べられているように、生殖器の皮膚の病変により、追跡し、定量化した。一次感染より回復後、動物を表10に示してあるような処理群に無作為化した。急性の疾病が消散後、11日目から100日目までの間、疾病の再発の徴候について、動物を毎日調べた。疾病日は、再発した疾病が観察された日として定義し、重症の再発は１個を越える数の水泡が認められた日であり、そしてエピソードは、病変のない日に続いて新しく疾病が発生することを示す。
【００９６】
第22日から第76日の間の動物の分析より得た結果を表７に示す。表９のデータにより、IM注射において、nor-MDPが効果的なアジュバントであることが示唆される。これは、疾病全日数がより低いこと、重症の再発がより低率であること、および、ヘルペス性のエピソードの全数が減少することに反映される。さらに、nor-MDPを含むワクチンおよび投与されたIMは、CFAを含みそして足蹠中に投与されたワクチンと同程度に効果的であると考えられる。
【００９７】
【表７】
2004242679.tif 000011
【００９８】
種々のアジュバントを含むワクチンの注射により生じる局所的な反応もまた、監視した。その結果を表８に示す。注射部位での局所的な紅斑および硬変の発生率は、nor-MDPを含むワクチンについて同様であった。さらに、局所的な反応生成性も基づき、nor-MDPはワクチンにおける使用が可能であると考えられる。
【００９９】
【表８】
2004242679.tif 000012
【０１００】
表７の結果によっても、免疫治療の開始と急性の疾病の始まりとの間の間隔が減少するにつれて、処置の相対的な効力が増強することが示される。最初の感染後、８、15または21日後にCFAを含むgBgDワクチンの接種を受けた動物のうち、膣内植菌後最も短時間のうちワクチンを受けた動物が、未処置のコントロールに比較すると、疾病の期間が最も短く、重い再発の割合が最も低く、そして、全エピソードが最も少なかった。感染15日後に、ワクチンを接種した動物について得た値は、８日後にワクチン接種した群について得たものよりも高く、そして21日後に接種した群は15日後に接種した群よりも高かった。この効果は図１６にも示されている。図１６は、HSV-2植菌８、15または21日後に、最初にワクチン接種した動物について、膣内に植菌した後の日々における再発数のグラフを示す。
【０１０１】
図１６のデータは、再発した疾病の割合の減少（％）を計算するために用いられた（疾病の再発率の有意性についての説明は6.1節を参照されたい）、このデータは表９に示されている。表９では、最も早い期間（つまり14〜50日）において８日目に最初のワクチンを接種することにより、再発した疾病の割合（パーセント）が最も大きく減少するのが観察され得る。しかし、HSVを膣内に植菌した15日後に最初のワクチン接種を行なうことにより、51〜92日目から、最も効果的な保護が得られた。HSV-2に初めに接触させてから21日後に最初のワクチン接種を行なったときに最も弱い保護効果がか得られた。
【０１０２】
モルモットにおいては、病気の急性な時期が、ウイルスの感染後14〜21日の期間に起こるということを銘記すべきである。この急性な時期において、HSVにより誘導された疾病が、動物の身体に見い出される。従って、図16のデータにより、51〜92日目における最も効果的な保護が、感染の急性な時期の期間でのワクチンの投与により得られたことが示される。
【０１０３】
【表９】
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【０１０４】
本発明によれば、単純ヘルペスウイルスの感染後に投与することにより、単純ヘルペスウイルス１型および２型の治療処置に効果のあるワクチンが提供される。
【０１０５】
上記発明は、その内容を明快に理解するために、例示し、実施例を挙げることによりいくぶん詳細に述べてきたが、添付の請求の範囲内において、ある変更および修飾がなされ得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】HSV-1およびHSV-2の物理的地図、プロトタイプのアイソマーの配置に対するEcoRＩ切断地図、およびHSV-2のHindIII制限酵素切断地図を表す。
【図２】HSV-1地図におけるgB１コード領域の制限酵素切断地図を表す。
【図３】gB１コード領域の制限酵素切断地図である。
【図４】gB１およびgB２のDNAアミノ酸配列を表す。
【図５】図４の続きである。
【図６】図５の続きである。
【図７】図６の続きである。
【図８】HSV-2の物理的地図であり、gB２コード領域が示されている。
【図９】プラスミドpHS137のいくつかの重要な特徴を示す地図である。
【図１０】gB２の制限酵素切断地図である。
【図１１】gD１の哺乳動物発現ベクターであるpHS132の構築に関するフローチャートである。
【図１２】HSV-2の物理的地図であり、gD２コード領域が示されている。
【図１３】gD２に対する哺乳動物ベクターの構築に関するフローチャートである。
【図１４】一次感染した後に行われる組換えgB−gDを用いたワクチン接種が再発性ヘルペス疾患に及ぼす効果を表す。
【図１５】Ａは、ヘルペスウイルス糖タンパクによる免疫化が再発性ヘルペスの感染率に及ぼす効果を表す。Ｂは、対照のモルモットと感作したモルモットとの間における週単位の再発率の差を表す。
【図１６】gBgDワクチンの投与時間がヘルペス疾患の再発に及ぼす効果を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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