(57)【要約】【課題】  正確な定量的蛍光測定を可能にする改良された電気泳動装置を提供する。【解決手段】  電気泳動ゲルを保持するためのプラットホームと、電気泳動ゲルを照らすための光源１８０３と、電気泳動ゲルのラベル付き領域からの放射を第1 ディテクタ１８０９に画像化するための第1 レンズアセンブリ１８０７と、第2 レンズアセンブリ１８１５を通過する光源１８０３の照明の強度パターンを第2 ディテクタ１８１７で測定して光源プロファイルを決定するものである、第1 レンズアセンブリ１８０７から離れて、第2 レンズアセンブリ１８１５を介して光源１８０３の照明の少なくとも一部を反射させるためのミラー１８１１と、第1 および第2 ディテクタに連結されたプロセッサで、プロセッサは光源プロファイルを使用して電気泳動ゲルの画像を正規化するものと、を備える。【選択図】      図１８
2004163440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動ゲルを保持するためのプラットホームと、
前記電気泳動ゲルを照らすための光源と、
前記電気泳動ゲルのラベル付き領域からの放射を第1 ディテクタに画像化するための第1 レンズアセンブリと、
第2 レンズアセンブリを通過する前記光源の照明の強度パターンを第2 ディテクタで測定して光源プロファイルを決定するものである、前記第1 レンズアセンブリから離れて、前記第2 レンズアセンブリを介して前記光源の照明の少なくとも一部を反射させるためのミラーと、
前記第1 および第2 ディテクタに連結されたプロセッサで、前記プロセッサは前記光源プロファイルを使用して前記電気泳動ゲルの画像を正規化するものと、
を備えたことを特徴とする電気泳動システム。
【請求項２】
前記第2 ディテクタは、複数の個々のディテクタを備えるリニアディテクタアレイである、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項３】
前記第2 ディテクタはリニアCCD ディテクタアレイである、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項４】
前記ミラーに連結された可動ステージを備え、前記ステージは少なくとも第1 の位置と第2 の位置を持ち、
前記第1 位置の前記ステージは、前記第1 レンズアセンブリから離れた前記光源の照明の少なくとも一部を反射するための位置に前記ミラーを配置し、
前記第2 位置の前記ステージは、前記光源が前記第1 レンズアセンブリを妨害なく照明できる位置に前記ミラーを配置する、
請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項５】
前記ミラーがビームスプリッタである、請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項６】
前記ミラーに連結された可動ステージを備え、前記ステージは少なくとも第1 の位置と第2 の位置を持ち、
前記第1 位置の前記ステージは、前記第1 レンズアセンブリを通して前記第2 光源の照明を反射するための位置に前記ミラーを配置し、
前記第2 位置の前記ステージは、前記第1 光源が前記第1 レンズアセンブリを妨害なく照明できる位置に前記ミラーを配置する、
請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項７】
前記ミラーは、前記第１レンズアセンブリを通過する第2 光源の強度パターンを前記第１ディテクタで測定して第1 レンズアセンブリプロファイルを決定するものであり、前記第2 光源からの照明を前記第1 レンズアセンブリを介して前記第1 ディテクタに反射し、
前記プロセッサは、前記光源プロファイルと前記第1 レンズアセンブリプロファイルを使用して前記電気泳動ゲルの画像を正規化する、
請求項１に記載の電気泳動システム。
【請求項８】
前記ミラーに連結された可動ステージを備え、前記ステージは少なくとも第1 の位置と第2 の位置を持ち、前記第1 位置の前記ステージは、前記第1 レンズアセンブリから離れた前記第1 光源の照明の少なくとも一部を反射するための位置に前記ミラーを配置し、前記第1 レンズアセンブリを介して前記第2 光源の照明を反射するための位置に前記ミラーを配置し、前記第2 位置の前記ステージは、前記第1 光源が前記第1 レンズアセンブリを妨害なく照明できる位置に前記ミラーを配置する、
請求項７に記載の電気泳動システム。
【請求項９】
前記第2 光源は複数の個々の光源を備え、前記個々の光源のそれぞれからの照明強度は前記プロセッサによって個々に調整され、前記プロセッサは、第2 光源プロファイルが実質的に前記第1光源プロファイルと同じであるよう前記個々の光源強度を調整する、請求項７に記載の電気泳動システム。
【請求項１０】
電気泳動ゲル照明源からの光の一部を第1 ディテクタアレイに反射し、
前記電気泳動ゲル照明源について前記第1 ディテクタアレイの強度パターンを測定し、
前記測定した強度パターンから電気泳動ゲル照明源修正ファイルを決定し、
前記電気泳動ゲル照明源修正ファイルを格納し、
前記電気泳動ゲル照明源で電気泳動ゲルを照らし、前記照明されたゲルの少なくとも１つのラベル付き領域が蛍光を発し、
前記照らされた電気泳動ゲルを第2 ディテクタアレイに画像化し、
電気泳動ゲル画像ファイルを格納し、
前記電気泳動ゲル照明源修正ファイルで前記電気泳動ゲル画像ファイルを正規化し、
前記正規化した電気泳動ゲル画像ファイルを格納する、
各ステップを備えたことを特徴とする電気泳動ゲル画像を修正する方法。
【請求項１１】
前記正規化した電気泳動ゲル画像ファイルを表示するステップを備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記反射ステップは、前記電気泳動ゲル照明源からの光が前記第1 ディテクタアレイに当たる前に前記反射された光の一部を減らすステップを備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ミラーを第1 位置に移すことで、前記第1 位置の前記ミラーは前記反射ステップを実行し、
前記ミラーを第2 位置に移すことで、前記第2 位置の前記ミラーが前記電気泳動ゲルを前記電気泳動ゲル照明源によって妨害なく照らす、
ステップを備える、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動システムの非均一性を除去するための電気泳動システムおよび電気泳動ゲル画像を修正する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物工学分野では、蛍光染料が感応非同位体ラベル（標識）として決まって用いられる。これらのラベルは、悪性腫瘍からDNA 配列の特定の染色体まで広範囲の細胞構造の同定および位置決定を行う。蛍光ラベル付けされたサンプルを読み取るため広範囲の装置が設計されている。
【０００３】
ゲル電気泳動は、蛍光染料その他マーカーと共に特定の分子およびその他の標識付けされたユニットを同定するため広く用いられる技術の１つである。この技術では、電界を用いてゲルまたは他の溶液中に標識付けユニットを移動させる。
【０００４】
米国特許第4,874,492 号では、サンプルを電気泳動ゲルに加える前に蛍光マーカーで処理するゲル電気泳動システムが開示される。ゲルは、UVソースで照らされ、冷却した電荷結合素子（CCD ）2 次元ディテクタアレイによって蛍光パターンが検出される。CCD アレイは、光感受性を向上させ、ダイナミックレンジを増やすため、少なくとも−25℃まで冷却される。
【０００５】
米国特許第5,162,654 号では、4 つの発蛍光団のどれが電気泳動ゲルで蛍光を発しているかを光学的に決定するシステムが開示される。ゲルによって放射される蛍光はまず4 個の別個の帯域フィルタを通過してから、4 個のウェッジプリズムを通過する。このような光学的構成により、放射された蛍光がディテクタアレイの4 個の分散領域に画像化される。放射ソースに励起された特定の発蛍光団を、4 個の検出領域で検出された蛍光の相対強度を比較することで決定する。
【０００６】
米国特許第5,294,323 号では、開示されるゲル電気泳動システムは縦の電気泳動プレートを利用している。レーザ光線は、電気泳動プレートの長手軸に対して垂直方向にゲルを水平に通過する。放射された蛍光は、反射パターンがレーザ光線の方向に平行になるようソリッドステート画像化センサに反射される。
【０００７】
米国特許第5,324,401 号では、毛管電気泳動のための蛍光検出システムで、複数の毛管内での蛍光プローブの同時励起および検出を行うものが開示される。励起ソースは、光学ファイバ束を通る毛管に連結されたレーザである。毛管アレイからの蛍光がレンズを介して集束され、CCD カメラに画像化されて分析される。
【０００８】
分析的生化学１６３、４４６−４５７(1987 年) に発表された「電気泳動ゲルからの蛍光の直接かつ迅速な定量化のための電子的画像化システム：臭化エチジウム染色DNA への適用」と題するSutherland他の論文で著者らは、CCD カメラを使用する画像化システムを説明する。CCD カメラは電気泳動ゲル、クロマトグラムその他ソースから受け取った蛍光を定量化する。この論文では、システムが正確な結果を取得する能力に影響する非均一性について原因をいくつか述べている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述より、正確な定量的蛍光測定を可能にする改良された電気泳動装置が求められていることは明白である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、電気泳動装置の非均一性を修正するための方法および装置を提供する。このような非均一性は画像化システムから生じる。これら非均一性を修正することで、電気泳動ゲルの定量的測定が可能で、電気泳動分析から得られる情報が増える。
【００１１】
本発明の形態では、照明源による非均一性は、リニアアレイディテクタによりソースの一部をサンプリングすることで特性化される。ソースをサンプリングするため、ミラーまたはビームスプリッタを、例えば電気泳動装置の中央光学軸に沿って適切に位置決めする。ミラーは、ソースの非均一性を測定する時は常にステージによってサンプリング位置に置かれるのが望ましい。反射光はリニアディテクタに測定される前に拡大される。
【００１２】
ソースのプロセッサファイルが決定されたら、修正ファイルが関連するデータプロセッサのメモリに格納される。修正ファイルには実際のサンプル画像ファイルと同じ数のデータポイントが入っていなければならないため、システムプロセッサによって多数の補正データポイントを記入しなければならない。これら追加の補正データポイントは内挿により、ソース対称を利用して決定する。完成した修正ファイルを格納したら、サンプルの画像を取り出し、対応する画像ファイルをメモリに格納する。修正した画像ファイルを作成するには、初期サンプル画像ファイルを修正ファイルで正規化する。
【００１３】
本発明による電気泳動システムの１つの形態では、電気泳動ゲルを保持するためのプラットホームと、前記電気泳動ゲルを照らすための光源と、前記電気泳動ゲルのラベル付き領域からの放射を第1 ディテクタに画像化するための第1 レンズアセンブリと、第2 レンズアセンブリを通過する前記光源の照明の強度パターンを第2 ディテクタで測定して光源プロファイルを決定するものである、前記第1 レンズアセンブリから離れて、前記第2 レンズアセンブリを介して前記光源の照明の少なくとも一部を反射させるためのミラーと、前記第1 および第2 ディテクタに連結されたプロセッサで、前記プロセッサは前記光源プロファイルを使用して前記電気泳動ゲルの画像を正規化するものと、を備えたことを特徴とする。
【００１４】
本発明による電気泳動ゲル画像を修正する方法は、電気泳動ゲル照明源からの光の一部を第1 ディテクタアレイに反射し、前記電気泳動ゲル照明源について前記第1 ディテクタアレイの強度パターンを測定し、前記測定した強度パターンから電気泳動ゲル照明源修正ファイルを決定し、前記電気泳動ゲル照明源修正ファイルを格納し、前記電気泳動ゲル照明源で電気泳動ゲルを照らし、前記照明されたゲルの少なくとも１つのラベル付き領域が蛍光を発し、前記照らされた電気泳動ゲルを第2 ディテクタアレイに画像化し、電気泳動ゲル画像ファイルを格納し、前記電気泳動ゲル照明源修正ファイルで前記電気泳動ゲル画像ファイルを正規化し、前記正規化した電気泳動ゲル画像ファイルを格納する、各ステップを備えたことを特徴とする。
【００１５】
本発明の性質と利点は明細書の残りの部分および図面を参照することで理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
図１は、先行技術によるゲル電気泳動装置の断面図である。このシステムでは、ゲルプレート１０１が光源１０３によって照らされる。光源１０３は複数の個々の電球１０４から構成される。ソース１０３からの光は、サンプル１０１の特定の領域に含まれる発蛍光団または他の蛍光を発する材料に蛍光を放射させる。放射された蛍光は1 個以上のレンズ１０７を通過してディテクタ１０９に画像化される。受け取った画像に基づき、サンプル１０１の蛍光領域を決定することが可能である。
【００１７】
サンプル１０１からの蛍光の強度には、蛍光材料の数量など追加情報が含まれるが、この情報を定量化する能力は、照明源、画像化光学およびディテクタの非均一性のためこれまで限られていた。
【００１８】
ディテクタの非均一性は最も容易に取り除かれる。たとえば、広範囲の強度レベルにわたってリニア応答を提供する多数のCCD アレイが利用可能である。一般に、これらアレイは画素毎に非常に均一な応答も提供するため、ディテクタから生じる非均一性を劇的に減少させる。
【００１９】
個々の電球１０５からの光強度は、電球長さの大半にわたって比較的均一である。電球の両端で、輝度レベルは強度にわずかな低下を示す。この低下は、リフレクタ、マスク、拡散フィルタ、またはその組み合わせを利用することで最小限にできる。低下の影響も、単に長い電球を使用することで最小限にできる。電球を延長することで、輝度レベルの低下する電球端部が装置のサンプリング領域を過ぎるため、電球の比較的均一な長さのみサンプルの下に置かれる。
【００２０】
図２は、電球の軸に垂直に測定した１つの電球１０５の強度プロファイルである。予想通り、電球からの距離が増加するため、強度が急速に低下する電球の真上にプロファイルのピーク２０１が現れる。ディップ２０３は、ステージ上のスクライブマークの結果である。図３は、電球１０５の軸に垂直に測定したソース１０３の強度プロファイルを示す。ピーク３０１は、個々の電球１０５の中央線上にあり、谷３０３は電球間の中間点を表す。ソース均一性は、電球の数を増やし、電球間の分離を減少させることでさらに改良される。
【００２１】
図４は、照明源の均一性を改善する別の方法の図である。この方法では、サンプル１０１は１つのソース４０１に照らされる。ソース４０１は図示の通り1 個の電球から構成されるが、ソース４０１は複数の電球でも構成することができる。ソース４０１を電球の軸に垂直な方向４０３でスキャンし、中央電球部分に沿った高度な強度均一性を活用する。電球端部近くの強度低下の影響は、サンプル１０１の縁を過ぎて距離４０５だけ電球を延長することで最小限にできる。ソース４０１は電球均一性領域に垂直な方向にスキャンするため、スキャン速度が一定である限りサンプル１０１は均一に照らされる。
【００２２】
図５は、本発明に基づくレンズの非均一性について画像を修正する主なステップを概略するブロック図である。まず、レンズアセンブリの非均一性を測定する（ステップ５０１）。レンズの非均一性の決定には多くの技術を用いることができるが、以下でその一部を説明する。レンズアセンブリをアパーチャと倍率に初期セットについて特性化した後、これらの設定を変更し（ステップ５０３および５０５）、レンズを特性化する。このプロセスは、アパーチャ設定範囲と倍率設定範囲についてレンズアセンブリが特性化されるまで続く。そしてこの情報を使用してルックアップテーブルまたはマトリクスを作成する（ステップ５０７）。
【００２３】
レンズ特性化ルックアップテーブルを作成したら、このデータを修正ファイルルックアップテーブルに変換する（ステップ５０９）。このステップは、修正ファイル1 つあたりの修正データポイント数と、サンプル画像化プロセスによるデータポイント数を1 対1 で対応させるために必要になることがある。レンズアセンブリの特性化に用いる技術により、修正データポイントの数は結果としてサンプルポイント数より大幅に少なくなることがある。この場合、追加修正データポイントを周知の内挿技術を用いてデータプロセッサによって満たし、レンズアセンブリの対称があればそれを利用する。
【００２４】
修正ファイルのルックアップテーブルの作成後、システムを使って電気泳動サンプルゲルを画像化する（ステップ５１１）。このとき、ユーザは未修正のサンプル画像を見るか、未修正画像のサンプルファイルを修正のため格納して後で表示することができる。サンプル画像を修正する前に、サンプル画像の取得に用いたアパーチャと倍率の設定をまず決定しなければならないが（ステップ５１３）、修正ファイルルックアップテーブル内で該当する修正ファイルを見つけるのにこのデータが必要なためである。この情報は、システムによって自動的に決定されるか、またはユーザが単にレンズ設定を入力することができる。
【００２５】
サンプル画像からレンズアセンブリの非均一性を取り除くには、該当する修正ファイルで分けることでサンプルファイルを正規化する（ステップ５１５）。正規化の前に、修正ファイルをまず当業で周知のスムーズ化機能を用いてスムーズ化することができる。このスムーズ化機能によって、修正ファイルのノイズ源を正規化プロセスで増幅しないようにする。最後に、修正されたサンプル画像を将来の利用のため表示（ステップ５１７）または格納（ステップ５１９）する。
【００２６】
レンズおよびディテクタの非均一性の影響を取り除く１つの方法は、基準または較正標準の利用である。較正中、標準がサンプルに取って代る。好適な較正標準は、ソースで照らされた時、均一に蛍光を発する蛍光ガラスまたはプラスチック片である。標準がサンプルと共に使用するラベルと同じ波長を持つ蛍光を発し、標準がレンズおよびディテクタの非均一性を正確に再現するのが望ましい。
【００２７】
実際には、ユーザはまず問題のサンプルのI1(x,y) で表される画像を取得する。そしてサンプルが標準に置き換わり、第2 画像、I2 (x,y)が取得される。第２画像は、フラットフィールド画像として知られる。修正された画像を取得するには、カメラのシャッタを完全に塞いで第3 の露光を行う必要がある。第3 画像、D0(x.y) は、ダークフィールドを表す。修正された画像、CI (x,y)は次によって表される。
CI (x,y)＝〔｛ I1(x,y)−D0(x,y) ｝／ I2(x,y)−D0(x,y) ｝〕*M
ただし、M は平均I2(x,y) に等しい。
【００２８】
上記の技術を使ってサンプルの正確な、ひいては定量的な画像を取得することができるが、均一な照明源を想定すると、この技術は多くの用途にとって実際的ではない。この技術では、ユーザがサンプルを変更して一連の測定を行い、１つの修正された画像を取得する必要がある。
【００２９】
図６は、本発明の別の実施例の図である。図１に示す先行技術のシステムのように、サンプル１０１からの蛍光がレンズ１０７によってディテクタ１０９に画像化される。この実施例では、ユーザが修正された画像の取得を望むなら、較正標準６０１をステージ６０３で移動する。本発明の実施例では、標準６０１をレンズ１０７の入口アパーチャに近接して置く。ステージ６０３は回転ステージであるのが望ましい。前の技術のように、サンプル画像、較正画像、ダークフィールド画像の3 個の画像が必要である。修正された画像を取得する式は、上記のものと同じである。
【００３０】
レンズの非均一性を正確にマッピングするため、較正標準６０１はレンズのアパーチャを完全に塞がなければならない。しかしながら、標準６０１が前のシステムでサンプル面に置かれた標準よりレンズ１０７にはるかに近いため、標準６０１ははるかに小さくすることができる。この関係を図７に示す。集束アパーチャを点線７０１で示す。図示の通り、標準６０１はレンズに近接しているためレンズ１０７とほぼ同じサイズである。しかしながら、サンプル面に置かれた標準７０３は、レンズアパーチャを塞ぐためはるかに大きくしなければならず、製作コストと困難が増すことになる。
【００３１】
本発明はレンズおよびディテクタに関連する非均一性を克服するために用いることができるが、サンプル画像を定量化するには照明源が均一でなければならない。ソースが均一でないと、サンプル画像、I1(x,y) に関連する不正確性が、本発明の技術によっても完全に除去されない。照明の均一性は、複数の光源、リフレクタ、マスクまたはスキャニングライトシステムを使用して達成できる。
【００３２】
しかしながら、本発明の実施例の較正ステップ中は、光の均一性は必要ない。光均一性の増加は説明した較正技術の精度を増すが、標準６０１から光源１０３までの距離６０５を考えると、照明の均一性はこの技術の要件ではない。
【００３３】
図８は、光均一性と較正標準の配置との関係を示す。光源８０１は、光源８０１に近接して置かれる較正標準８０３を照らす。ランバートの法則に定義されるように、ソースJ θの小さいインクレメンタル領域の強度は、法線方向のインクレメンタル領域の強度、Joに、表面法線から測定した角度θのコサインを乗じたものに等しい。そのため、ソース８０１の領域８０７の真上にある標準８０３上のポイント８０５で測定した強度は、領域８０７の強度に等しい。これとは対照的に、標準８０３の対向端部のポイント８０９で測定した強度は大きく低下する。たとえば、80度の角度θを考えると、ポイント８０９の強度はポイント８０５で測定した強度のわずか１７パーセントである。そのため、ソース８０１が非均一である場合、較正標準８０３は非均一に照らされ、較正技術はレンズおよびディテクタの非均一性の関数としてのみでなく、照明の非均一性の関数となる。
【００３４】
対照的に、ソース８０１からある程度距離を置いた較正標準を使用すると、照明の非均一性は較正技術にほとんど影響を与えない。たとえば、直径2 センチメートルの測定値の較正標準８１１がソース８０１から65センチメートルにあると想定すると、ポイント８１３と８１５で測定した強度の差は1 パーセント未満である。そのため、較正標準をレンズ近くにソースから離して置くことで、照明の非均一性の影響は大幅に削減できる。
【００３５】
図９は、本発明の別の実施例の図である。この実施例は、図６に示すのと同じ要素にディフューザ９０１を加えている。ディフューザ９０１は、較正標準６０１とレンズ１０７との間に取り付ける。ディフューザ９０１によって、較正標準内の小さい非均一性もスムーズ化することで、システムがレンズとディテクタの非均一性のモニタのみ行うようにする。
【００３６】
図１０は、本発明の実施例の詳細な図である。この実施例では、サンプル１００１は光源１００３で照らされる。ソース１００３は、トレイ１００７内に配置される3 個の電球１００５から構成される。トレイ１００７は、モータ１０１１で制御されるプーリーおよびベルトシステム１００９に乗る。サンプリング中、光トレイ１００７は、ポイント１０１３から始めてポイント１０１５で終了するようサンプル１００１をスキャンする。スキャン速度、ソースの強度、および介入するフィルタ１０１７は、サンプル１００１を照らす放射強度を決定するため、サンプル１００１の適切にマークされた領域の蛍光を決定することになる。スキャニングソース１００３によって照明を均一にする。
【００３７】
サンプル１００１から放射された蛍光は、レンズアセンブリ１０２３によってディテクタ１０２５に画像化される前に、アパーチャ１０１９またはフィルタホイール１０２１のフィルタ１０１９を通過する。この実施例では、ディテクタ１０２５はCCD ディテクタ、望ましくは二次元アレイである。較正画像が必要な場合、フィルタホイール１０２１がレンズアセンブリの前に較正標準１０２７を置くため回転する。
【００３８】
較正標準１０２７を照明する方法にはいくつかある。まず、ソース１００３からサンプル１００１を通過する放射を使用することができる。ゲルサンプル１００１上のパターンのため、照明強度はきわめて非均一である。しかしながら、上記に示すように、この標準は照明の非均一性に対して相対的に感度が低い。ソース１００３は、通常スキャニングモードで用いるか、装置中央の静止位置に保持することができる。第2 に、サンプル１００１を取り除き、ソース１００３をスキャニングまたは静止モードで使用することができる。第3 に、別ソース１０２９を使用して、較正標準１０２７を照らすことができる。ソース１０２９を図示のようにサンプル面上に位置決めして、較正画像を取得する前にサンプル１００１を取り除く必要がないようにするのが望ましい。実施例では、1 組のソース１０２９を使用して標準１０２７を照らす、標準１０２７に到達する光の均一性を改善する。
【００３９】
図１１は、ディテクタアセンブリ１０２５、レンズアセンブリ１０２３、フィルタホイール１０２１のクローズアップ図である。図示の通り、較正標準１０２７は較正測定ができる面に回転している。
【００４０】
図１２は、本発明のプロセスステップを示すブロック図である。当初、サンプルは試験装置に置く（ステップ１２０１）。本発明はゲル電気泳動用途に限られていないが、これが最もよく使われる用途の１つである。この例では、サンプルはゲルで、一定の領域、構造または分子が、マーカーの励起波長で放射された時に特定の波長で蛍光を発する蛍光マーカーでラベル付けしてある。放射波長が励起波長とは異なるため、放射をフィルタの使用によるソースからと区別することができる。選択した領域からの放射は、サンプルの画像を形成するため、ディテクタに画像化される（ステップ１２０３）。サンプル画像を取得したら、較正標準を移動させる（ステップ１２０５）。レンズおよびディテクタアセンブリの非均一性を正しく測定するため、システムのアパーチャおよび倍率設定は、サンプル画像化ステップ中に使用したものから変更されていない。サンプル照明源または上述の代替源を使用して、較正画像を取得する（ステップ１２０７）。そしてカメラのシャッタを閉じて（ステップ１２０９）、ダークフィールド画像を取得する（ステップ１２１１）。そして、上記の補正アルゴリズムなど周知の数学的関係を使ってサンプル画像を補正する（１２１３）。
【００４１】
図１３は、本発明の実施例によるシステムの主なコンポーネントの図である。この実施例では、中心的なシステムコンポーネントはプロセッサ１３０１に接続されている。プロセッサ１３０１は、プロセス全体を自動化することで、補正プロセスを直線的にして、ユーザエラーのリスクを最小限にできる。このシステムを使用するには、サンプル１００１をまず電気泳動装置１３０３内に置く。そしてユーザは、システムがこれらパラメータを自動的に選択するよう設計されていない限り、システムのアパーチャと倍率を手動で設定する。実施例では、ユーザはユーザインターフェース１３０５を介して、サンプル１００１について使用するマーカー（例：蛍光）をプロセッサ１３０１に入力する。この情報に基づき、プロセッサ１３０１は統合されたルックアップテーブルを使って適切な励起および放射設定を決定する。そして、プロセッサ１３０１はフィルタホイール１０２１の操作によって適切なフィルタを移動する。
【００４２】
システム操作パラメータを手動または自動で設定したら、ユーザはインターフェース１３０５を介してプロセッサ１３０１に該当する信号を送ることで実行を開始する。するとプロセッサ１３０１はソース１００３をオンにしてサンプル１００１の画像を取得する。ソース１００３が図１０に示すようにソースをスキャンしていると、プロセッサ１３０１もスキャニングモータ１０１１を制御することによってスキャン動作を制御する。  ディテクタ１０２５が取得した画像は、プロセッサ１３０１内に常駐するメモリに格納されると共にモニタ１３０７に表示される。ディテクタ１０２５がCCD カメラである場合、データは容易にデジタルフォーマットで格納されるため、後のデータ操作が容易になる。プロセッサ１３０１の構成により、いくつかの動作が次に起こり得る。システムが完全に自動モードだと、システムは自動的にサンプル画像の補正プロセスを始める。このモードでは、システムのセットアップにより初期の未補正画像は表示されることもされないこともある。初期画像を表示する利点は、画像に有益なデータが入っていないため補正技術を適用する前にサイクルを終了するということをユーザが判断できる点である。
【００４３】
自動モードでは、サンプル画像を取得した後、プロセッサ１３０１はソース１００３をオフにして、較正標準を移動する。較正標準はフィルタホイール１０２１内にあるため、プロセッサ１３０１は、適切なフィルタ凹部が来るまでホイールを単に回転させる。そしてプロセッサ１３０１は、ソース１００３または代替源１０２９の内、適切な照明源を起動し、フラットフィールド画像を取得する。この画像からのデータは常駐プロセッサメモリに格納される。較正標準画像が完成すると、プロセッサ１３０１はカメラアセンブリ１０２５のシャッタを閉じ、ダークフィールド画像を取得する。これら２つの追加画像を使って、プロセッサ１３０１はサンプル画像を補正し、モニタに補正した画像を表示する。未補正画像と補正画像およびフラットフィールドとダークフィールドの両方とも、後で取り出して使用するため格納することができる。
【００４４】
図１４は、レンズアセンブリの非均一性を判断する別の方法の図である。サンプル面１４０１は、光源１４０３で照らされる。この実施例では、光源１４０３は一連の電球１４０５で構成されるが、この技術は他の光源に等しく適用される。通常の利用では、たとえば電気泳動ゲルなどのサンプルはサンプル面１４０１内にある。かかるサンプルの励起された領域からの蛍光は、レンズアセンブリ１４０７によってディテクタ１４０９に画像化される。
【００４５】
レンズアセンブリ１４０７を特性化するため、二次ソース１４１１を使用する。ソース１４１１は、例えば一連の発光ダイオード（LED ）１４１３などのラインソースである。ソース１４１１は、一連の他のタイプのポイントソース、または長い電球など一列のラインソースで構成することもできる。ソース１４１１からの放射は、ミラー１４１７で反射される前にレンズ１４１５で拡大される。ミラー１４１７は部分リフレクタなので、システムの通常動作中はその場に留まることができる。ミラー１４１７をレンズ非均一性の測定作業専用にすることもできる。ミラー１４１７が専用ミラーである場合、ステージに置いて、通常のシステム動作中サンプル画像化パスから外して移動できるようにする。
【００４６】
ミラー１４１７はパス１４１９に沿ったソース１４１１からの放射を反射する。そしてこの放射がレンズアセンブリ１４０７からディテクタ１４０９まで通過する。CCD アレイで取得可能な均一なディテクタ応答（感度など）を想定し、ミラー１４１７、レンズ１４１５、およびソース１４１１の均一性も想定すると、ディテクタ１４０９によって測定される非均一性があれば、レンズアセンブリ１４０７によるものである。
【００４７】
図１４に示す装置は、レンズアセンブリ１４０７が球対称を示すと想定するため、レンズの非均一性を１つの軸１４２１に沿ってのみ判断できる。レンズアセンブリ１４０７がこのような対称を示さない場合、他の軸に沿ってさらに非均一性測定を行わなければならない。
【００４８】
レンズアセンブリの非均一性を特性化する別の方法は、レンズアセンブリを取り外して電気泳動装置とは別に特性化することである。例えば図１５に示すシステムでは、レンズアセンブリ１５０１を電気泳動装置（図示せず）から取り外し、較正ベンチ１５０７のソース１５０３とディテクタ１５０５との間に置く。この環境では、非常に均一なソース１５０３とディテクタ１５０５を使用できるため、高度な特性化精度が確保される。特性化したら、レンズアセンブリ１５０１を電気泳動装置に再度取り付ける。
【００４９】
図１６は本発明によるシステムの主なコンポーネントの図である。この実施例で、中心となるシステムコンポーネントは、ユーザインターフェース１６０３に接続されたプロセッサ１６０１に連結されている。プロセッサ１６０１は内挿および正規化プロセスをタイムリーに実行するため必要である。この実施例は、レンズアセンブリ１６０５の非均一性の特性化に用いる方法に関係なく使用することができる。
【００５０】
サンプル画像を取得するには、ソース１６０７をオンにして適切にマークされたサンプル１６０９の領域に蛍光を発させる。蛍光は、レンズアセンブリ１６０５によってディテクタ１６１１に画像化される。サンプル画像は、直ちにディスプレイモニタ１６１３に表示されるか、プロセッサ１６０１に関連するメモリ内にサンプルファイルとして格納される。
【００５１】
レンズの非均一性についてサンプル画像を補正するには、サンプル画像取得中に用いたレンズのアパーチャと倍率の設定をプロセッサ１６０１に入力しなければならない。これらの設定は、プロセッサ１６０１が正規化プロセス中に用いる適切な修正ファイルを判断できるようにするため必要である。画像ファイルを適切な修正ファイルで正規化した後、修正した画像ファイルをモニタ１６１３に表示することができる。修正した画像ファイルはまた、後に取り出して使用するためメモリ内に格納することもできる。
【００５２】
プロセッサ１６０１によってレンズ設定を取得する方法には多数ある。ユーザにとってもっともわかりやすい方法は、インターフェース１６０３を使用して設定情報を手動で入力することである。第2 の方法は、レンズ設定をプロセッサ１６０１によって自動的に決定することである。この実施例では、レンズ１６０５には1 個以上の設定センサ１６１５が含まれる。センサ１６１５は、ライン１６１７によってプロセッサ１６０１に連結される。センサ１６１５は、機械的あるいは電気光学的で、周知の技術を採用している。
【００５３】
図１７は、１つの較正済み光源を利用してレンズ１０７のアパーチャおよび倍率設定を決定する別の技術の図である。光源は発光ダイオード（LED ）または容易に較正できる他のソース形式でよい。ソースは位置１７０１か、静止したフィールド外の位置１７０３に置くことができる。ソースを場所１７０１のようなイメージャの視野内に置く場合は、取り外し可能でなければならない。たとえば、ステージ１７０５を使ってソースを動かすことができる。
【００５４】
この方法を使ってレンズ設定を決定するには、較正済みソースを配置してオンにする。問題のサンプルの画像取得に用いたのと同じ設定を使用してソースの画像を取得する。倍率設定は、較正済みソースの画像サイズを見て決定するが、アパーチャ設定はソースの強度で決定する。
【００５５】
図１８は、本発明の別の実施例の図である。サンプル面１８０１が光源１８０３で照らされる。この実施例では、光源１８０３は一連の電球１８０５から構成されるが、本発明は他の光源にも等しく適用可能である。通常の利用では、たとえば電気泳動ゲルなどのサンプルは、サンプル面１８０１内にある。かかるサンプルの励起された領域からの蛍光は、レンズアセンブリ１８０７によってディテクタ１８０９に画像化される。ディテクタ１８０９は二次元CCD アレイであるのが望ましい。
【００５６】
照明源１８０３から生じる非均一性を取り除くためには、ミラー１８１１を使ってソースの一部をサンプリングする。本発明の1 実施例では、ミラー１８１１を部分リフレクタでコーティングし、ソース１８０３からの光の一部がレンズ１８０７とディテクタ１８０９に達するようにする。この実施例では、ソース１８０３からの光の第2 の部分がパス１８１３に沿って反射される。光のわずかな部分のみミラー１８１１によりパス１８１３に沿って反射されると想定すると、この実施例の主な利点の１つは、ミラー１８１１をシステムの通常動作中に取り外す必要がない点となる。しかしながら、この構成では、ミラー１８１１が非均一性を導入するため、補正プロセスではこれも考慮しなければならない。代替実施例では、ミラー１８１１をステージ（図示せず）に連結する。通常動作中、ステージはミラー１８１１をライトパスから外し、プレーン１８０１のサンプルから画像化レンズアセンブリ１８０７へのライトパスを妨害しないようにする。光源１８０３の非均一性を判断するため、ステージはミラー１８１１を図１８に示すようなサンプリング位置に動かす。
【００５７】
照明源１８０３の非均一性を判断するため、ミラー１８１１がレンズ１８１５を介してパス１８１３に沿ってソース１８０３の一部を反射する。レンズ１８１５は光をリニアディテクタアレイ１８１７に集束させる。ディテクタ１８１７はリニアCCD アレイであるのが望ましい。しかしながら、他の形式のインラインディテクタアレイを使用することができる。さらに、アレイ１８１７が連続している必要はない。それより、アレイ１８１７を一連のポイントディテクタと、測定済みポイントから内挿したポイントディテクタ間の均一性プロファイルから構成することができる。
【００５８】
ミラー１８１１、レンズ１８１５、およびディテクタ１８１７の寸法および位置は、ソース１８０３の対称によって決まる。たとえば、図１８に示すようなソースは、個々の主要軸に沿って延長した電球１８０５の照明均一性のため、軸１８１９に沿って比較的均一になると予想できる。対照的に、ソース１８０３は、軸１８２１に沿って、図３に示すものと似た照明プロファイルを持つと予想できる。そのため、図示のように軸１８２１に沿ってソース１８０３のプロファイルを測定することで、ソース全体の非均一性を判断できる。
【００５９】
ソース非均一性を判断したら、サンプルの画像を補正できる。図１９は、本発明を使用して画像を補正する主なステップを概略するブロック図である。まず、ソースのプロファイルを上記に説明した技術を使って測定しなければならない（ステップ１９０１）。プロファイルを決定したら、修正ファイルをシステム画像プロセッサに関連するメモリ内に格納する（ステップ１９０３）。
【００６０】
修正ファイルには、サンプル画像化プロセスによるポイント数と同じ数の修正データポイントが入っていなければならない。修正データポイントの数は一般にサンプルポイントの数より大幅に少ないため、修正データポイントはプロセッサによって記入しなければならない。記入された修正データポイントは、ソースの対称とディテクタ１８１７の画素数をいずれも考慮する。図２０は、内挿プロセスを示す。マトリクス２００１は、修正データポイントの11x11 のマトリクスによって表され、これによって121 個のサンプルデータポイントのサンプル画像を再現する。軸１８１９に沿って均一で軸１８２１に沿って非均一な図１８に示すようなソースを想定すると、修正データポイントの大半をプロセッサによって記入することができる。図示の例では、列２００５の修正データポイント２００３が本発明を使って測定されている。列２００５の修正データポイント２００７は、内挿によって記入される。軸１８１９に沿ったソースの均一性を考えると、残りの列２００９は単に列２００５の再現である。
【００６１】
ソースプロファイルを測定したら、サンプル画像を取得し（ステップ１９０５）、格納する( ステップ１９０７) 。画像を正規化する前に、実施例では、修正ファイルがまず当業で周知のようなスムーズ化機能を使ってスムーズ化される（ステップ１９０９）。このスムーズ化機能によって、修正済みサンプル画像を不良とするような修正ファイルのノイズ源があれば正規化プロセスによって増幅しないようにする。最後に、修正されたサンプル画像ファイルを実現するには、サンプルファイルを修正ファイル（あるいはステップ１９０９を適用する場合はスムーズ化された修正ファイル）で分割することで正規化する（ステップ１９１１）。修正されたサンプル画像ファイルは、後の使用のため表示（ステップ１９１３）あるいは格納（ステップ１９１５）することができる。
【００６２】
図２１は、本発明の別の実施例によるシステムの主なコンポーネントの図である。この実施例では、中心となるシステムコンポーネントは、ユーザインターフェース２１０２に接続されたプロセッサ２１０１に接続される。内挿/ 正規化プロセスをタイムリーに実行するためプロセッサ２１０１が必要だが、これによってプロセスの多くを自動化することもできる。使用中、照明源のプロファイリング前または後に、サンプル画像を取得し、格納することができる。さらに、ソースが短期間は比較的コンスタントであるため、各サンプルランでソースをプロファイリングする必要はない。しかしながら、各サンプルランでのソースのプロファイリングによって補正精度が向上する。実施例では、ソースは定期的にのみプロファリングされ、電球の経年による変化などの変化があったか否かを判断するため、新しいプロファイルが最後のプロファイルと比較される。
【００６３】
サンプル画像をソースプロファイルより前に取得すると想定すると、サンプル２１０３はまず電気泳動装置２１０５内に入れられる。この実施例では、ソースプロファイルミラー２１０７をリトラクタブルステージ２１０９に取り付ける。サンプルラン中、ステージ２１０９が引き込まれ、ミラー２１０７が位置２１１１に来る。
【００６４】
サンプル画像を取得するには、ソース２１１３をオンにしてサンプル２１０３の適切にマークされた領域に蛍光を発させる。蛍光はレンズアセンブリ２１１５によってディテクタ２１１７に画像化される。サンプル画像は、プロセッサ２１０１に関連するメモリ内にサンプルファイルとして格納される。希望するなら、修正前にサンプル画像をモニタ２１１９に表示することができる。
【００６５】
ソースプロファイルを取得するには、サンプル２１０３を装置２１０５から取り外し、ミラー２１０７をステージ２１０９で動かす。ソース２１１３をオンにして、ソースプロファイルをレンズ２１２３でディテクタアレイ２１２１に画像化する。必要に応じて、ソース２１０３の対称により、追加ソースファイルを取得することができる。たとえば、ミラー２１０７、レンズ２１２３およびディテクタ２１２１を第2 軸に沿って複製することで、第1 に垂直な軸に沿って第2 のソースプロファイルを取得することができる。単数または複数のソースプロファイルを取得すれば、プロセッサ２１０１は、修正ファイルと、希望するならスムーズ化した修正ファイルを作ることができる。そしてこのデータを使用して上述のように画像を正規化する。
【００６６】
本発明の別の実施例では、ソースプロファイリングミラーを使ってレンズアセンブリをプロファイリングすることができる。この実施例を図２２に示す。この実施例を、ソースおよびレンズの非均一性について修正されたサンプル画像を取得するため、前に説明した実施例と使用することができる。ソースが均一ソースであるなら、この実施例を別個にしようしてレンズアセンブリのみの非均一性を補正することができる。ソースは、スキャニングソース、リフレクタおよび/ またはマスクなど広範囲な技術を使って均一にできる。
【００６７】
レンズアセンブリ１８０７による非均一性を取り除くには、二次ソース２２０１を使用する。ソース２２０１は、一連の発光ダイオード（LED ）２２０３などラインソースである。ソース２２０１はまた、一連の他タイプのポイントソースまたは長い電球のような１つのラインソースから構成することもできる。ソース２２０１からの放射は、ミラー１８１１が反射する前にレンズ２２０５で拡大される。前の実施例のように、ミラー１８１１は部分リフレクタであるため、システムの通常動作中、その場に留まることができる。ミラー１８１１を、レンズおよび/ または照明源の非均一性の測定作業専用にすることもできる。ミラー１８１７が専用ミラーである場合、ステージに置いて、通常のシステム動作中サンプル画像化パスから外して移動できるようにする。
【００６８】
ミラー１８１１は、パス２２０７に沿ってソース２２０１からの放射を反射する。すると放射はレンズアセンブリ１８０７を通ってディテクタ１８０９まで通過する。CCD アレイで取得可能な均一なディテクタ応答（感度など）を想定し、ミラー１８１１、レンズ２２０５、およびソース２２０１の均一性も想定すると、ディテクタ１８０９によって測定される非均一性はレンズアセンブリ１８０７によるものである。
【００６９】
図２２に示す装置は、レンズアセンブリ１８０７が球対称を示すと想定するため、レンズの非均一性を１つの軸２２０９に沿ってのみ判断できる。レンズアセンブリ１８０７がこのような対称を示さない場合、他の軸に沿ってさらに非均一性測定を行わなければならない。
【００７０】
レンズの非均一性が判断されたら、図１９に概略するのと同じステップに従ってサンプル画像を補正することができる。唯一の相違は、ソースのプロファイルを測定する代わりに、ステップ１９０１ではレンズアセンブリ１８０７のプロファイルを測定している点である。修正ファイルの作成とその後、修正ファイルをサンプルファイルの正規化に利用するなどの残りのステップは前述と同じである。
【００７１】
図２３は本発明によるシステムの図で、レンズの非均一性測定の実行に必要なコンポーネントを含む。この図は図２１に示すものと同一だが、ソース２２０１とレンズ２２０５を加えている。この実施例では、ソース２２０１をプロセッサ２１０１に接続し、レンズの非均一性測定を自動化できるようにしている。
【００７２】
図２４は、本発明の別の実施例に従って用いられる主なステップを概略するブロック図である。この実施例では、ソースのプロファイルをまず上述のシステムを使って決定する（ステップ２４０１）。ソースプロファイルが決定したら、二次ソースのプロファイルを変更して、実際ソースの測定されたプロファイルを模すことができる（ステップ２４０３）。このステップでは、ソース２２０１を個々に制御可能な一連のポイントソース２２０３で構成する必要がある。ポイントソース２２０３は予め較正されプロセッサ２１０１によって制御されるのが望ましい。ソース２２０１は、ソース２４０３と同じプロファイルを提供するため調整されているので、格納された修正ファイルは、照明源２４０３の非均一性とレンズアセンブリ２４０７の非均一性を両方考慮する。前の実施例同様、修正ファイルはサンプル画像化プロセスによるデータポイント数と同じ修正データポイント数が入っていなければならない。そのため、修正ファイルには、測定されていないが、標準内挿機能を使用してプロセッサ２１０１によって計算された修正データポイントが多数入っている。
【００７３】
修正プロセッサファイルを測定して適切な修正データファイルを格納した後、サンプル画像を取得し（ステップ２４０９）、格納し（ステップ２４１１）、正規化する（ステップ２４１３）。前の実施例同様、必要に応じて、サンプル画像の正規化に用いる前に、修正データファイルにスムーズ化機能を適用することができる。最後に、修正されたサンプルファイルは後の使用のため格納するか（ステップ２４１５）、直ちに表示する（ステップ２４１７）。
【００７４】
当業者にとっては理解されるように、本発明はその精神や本質的特性から逸脱することなく他の特定の形式で具現化することができる。たとえば、本発明は特定の励起および放射波長に限定されない。そのため、可視波長で蛍光を発するUV励起マーカーを使用することができる。また、レンズの非均一性特性化の他の技術を使用することができる。従って、本書の開示および説明は図示のためのもので、以下の特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】従来技術によるゲル電気泳動装置の断面図である。
【図２】バルブの軸に垂直に測定した１つの電球の強度プロファイルである。
【図３】複数のバルブを持つソースの強度プロファイルの図である。
【図４】照明源の均一性を改善する方法を示す図である。
【図５】本発明に基づくレンズ非均一性のため画像を修正する基本ステップを概略するブロック図である。
【図６】本発明の実施例を示す図である。
【図７】レンズアパーチャと較正標準のサイズとの関係を示す図である。
【図８】光の均一性と較正標準との関係を示す図である。
【図９】較正標準と共にディフューザを利用した本発明の別の実施例を示す図である。
【図１０】本発明の実施例の詳細図である。
【図１１】図１０に示す実施例のディテクタアセンブリ、レンズアセンブリ、フィルタホイールのクローズアップ図である。
【図１２】本発明のプロセスステップを示すブロック図である。
【図１３】本発明の望ましい実施例によるシステムの主なコンポーネントを示す図である。
【図１４】レンズアセンブリの非均一性を決定する別の方法を示す図である。
【図１５】レンズアセンブリの非均一性を決定する別の方法を示す図である。
【図１６】本発明によるシステムの主なコンポーネントを示す図である。
【図１７】レンズアセンブリのアパーチャおよび倍率設定を決定するために使用される方法を示す図である。
【図１８】本発明の実施例を示す図である。
【図１９】本発明による照明の非均一性のため画像を修正する時に用いられる主なステップを概略するブロック図である。
【図２０】修正ファイル作成に用いられる内挿プロセスを示すの図である。
【図２１】本発明の望ましい実施例によるシステムの主なコンポーネントを示す図である。
【図２２】照明源とレンズアセンブリ両方の非均一性測定に用いることのできる本発明の別の実施例を示す図である。
【図２３】レンズの非均一性測定を実行するのに必要なコンポーネントを含む本発明によるシステムを示す図である。
【図２４】本発明の別の実施例により用いられる主なステップを概略するブロック図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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