(57)【要約】【課題】官能基に依存しない低分子化合物の固相担体への固定方法を提供する。【解決手段】光反応性化合物が表面に結合している固相担体に、低分子化合物を含む溶液を接触させる工程、低分子化合物を含む溶液を、固相担体に接触させた状態で乾固させる工程、及び固相担体に光を照射し、光反応性化合物と低分子化合物との間に共有結合を形成させる工程を含む低分子化合物の固相担体への固定方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする低分子化合物の固相担体への固定方法。
（１）光反応性化合物が表面に結合している固相担体に、低分子化合物を含む溶液を接触させる工程
（２）低分子化合物を含む溶液を、固相担体に接触させた状態で乾固させる工程
（３）固相担体に光を照射し、光反応性化合物と低分子化合物との間に共有結合を形成させる工程
【請求項２】
光反応性化合物が、ナイトレン、カルベン、ラジカル、又は炭素求電子剤を発生し得る化合物であることを特徴とする請求項１記載の低分子化合物の固相担体への固定方法。
【請求項３】
光反応性化合物が、ジアゾニウム基、アジド基、ジアジリン環、又はジアゾ基を部分構造として含む化合物であることを特徴とする請求項１記載の低分子化合物の固相担体への固定方法。
【請求項４】
光反応性化合物が、式（Ｉ）：
【化１】
2004309372.tif 000019
〔式中、Ｘは、−Ｎ３、−Ｃ＊（Ｒ１）Ｎ＝Ｎ＊（＊同士は連結して三員環を形成する）、−Ｎ２＋Ｚ−、−Ｃ（Ｒ２）＝Ｏ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ３、−Ｃｌ、又は−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ＝Ｎ２を表し；Ｒ１は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表し；Ｒ２は置換基を有していてもよいアリール基を表し；Ｚ−は陰イオンを表し；Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５のいずれか一つは固相担体表面に担持された官能基と反応して共有結合を形成しうる基を表し、他の四つはそれぞれ独立して水素原子又はハロゲン原子を表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項１記載の低分子化合物の固相担体への固定方法。
【請求項５】
固相担体が、マイクロアレイ用基板であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項記載の低分子化合物の固相担体への固定方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法によって得られる低分子マイクロアレイ。
【請求項７】
以下の工程を含むことを特徴とする低分子化合物と相互作用をする物質の検出方法。
（１）請求項６記載の低分子マイクロアレイに、標識された試料物質を含む溶液を接触させる工程
（２）低分子化合物と結合しない物質を除去する工程
（３）試料物質の標識を検出する工程
【請求項８】
以下の工程を含むことを特徴とする低分子化合物における相互作用部位の特定方法。
（１）光反応性化合物と、特定物質と相互作用をする低分子化合物を混合する工程
（２）前記混合物に光を照射し、光反応性化合物と低分子化合物との間に共有結合を形成させる工程
（３）光反応性化合物と低分子化合物の複合体を、低分子化合物の結合部位の違いにより分別する工程
（４）分別された前記複合体をそれぞれマイクロアレイ用基板に固定する工程
（５）前記基板上に固定された複合体に、標識された前記特定物質を含む溶液を接触させる工程
（６）基板上に固定された複合体のうち、標識が検出されないものを選択し、その結合体の低分子化合物と光反応性化合物との間の結合部位を特定する工程
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低分子化合物の固相担体への固定方法、並びにこの方法により得られる低分子マイクロアレイ、この方法を利用した低分子化合物と相互作用をする物質の検出方法、及び低分子化合物における相互作用部位の特定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガラススライドに代表される基板に、低分子化合物を微少量ずつ多種類導入し固定化した低分子マイクロアレイは、酵素等のタンパク質の阻害剤開発や機能解明のツールとして有用である。しかし現在までの低分子マイクロアレイ製造手法では、低分子化合物を固定化するには低分子側に水酸基やアミノ基等の官能基を一律に必要とするため、これらの官能基を一様に有した合成コンビナトリアルライブラリー化合物群のみアレイ化が可能であった（非特許文献１）。また、低分子化合物中、これらの官能基を含んだ部分構造は、基板との結合面に面しており、アレイ上でのタンパク質との結合実験においては無視されるが、低分子化合物をアレイ上から切り出し溶液中に溶解させた場合、またアレイに固定化させる前の化合物をバッファー等に溶解させた場合に、この部分と不特定のタンパク質との相互作用の可能性が生じるため、医薬開発の段階において副作用の原因となることが考えられた。
【０００３】
ところで、ＤＮＡを固相担体上に固定するに当たり、光反応性化合物を利用することが既に報告されている（特許文献１）。この固定化方法を低分子マイクロアレイの作製法に適用すれば、上述した従来の低分子マイクロアレイ作製方法の問題点を解決できると考えられる。しかしながら、現在までのところ、前述したＤＮＡの固定化方法を低分子化合物に適用したような事例は全く報告されていない。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００１−１７８４７２号公報
【０００５】
【非特許文献１】
ＭａｃＢｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９９，  １２１，  ７９６７
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように従来の低分子マイクロアレイの作製方法では、固定化可能な低分子は特定の官能基を持った一群の分子群に限定され、また、基板との結合に使われる官能基を含む部分構造は、アレイ上でのタンパク質等との結合実験では無視されてしまう。
【０００７】
本発明は以上のような技術的背景の下になされたものであり、上記問題点を解消した低分子マイクロアレイの作製手段を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、低分子化合物を、光反応性化合物を利用して基板上に固定することにより、官能基に依存せずに低分子化合物を固定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の工程を含むことを特徴とする低分子化合物の固相担体への固定方法である。
（１）光反応性化合物が表面に結合している固相担体に、低分子化合物を含む溶液を接触させる工程
（２）低分子化合物を含む溶液を、固相担体に接触させた状態で乾固させる工程
（３）固相担体に光を照射し、光反応性化合物と低分子化合物との間に共有結合を形成させる工程
また、本発明は、上記方法によって得られる低分子マイクロアレイである。
【００１０】
更に、本発明は、以下の工程を含むことを特徴とする低分子化合物と相互作用をする物質の検出方法である。
（１）上記低分子マイクロアレイに、標識された試料物質を含む溶液を接触させる工程
（２）低分子化合物と結合しない物質を除去する工程
（３）試料物質の標識を検出する工程
更に、本発明は、以下の工程を含むことを特徴とする低分子化合物における相互作用部位の特定方法である。
（１）光反応性化合物と、特定物質と相互作用をする低分子化合物を混合する工程
（２）前記混合物に光を照射し、光反応性化合物と低分子化合物との間に共有結合を形成させる工程
（３）光反応性化合物と低分子化合物の複合体を、低分子化合物の結合部位の違いにより分別する工程
（４）分別された前記複合体をそれぞれマイクロアレイ用基板に固定する工程
（５）前記基板上に固定された複合体に、標識された前記特定物質を含む溶液を接触させる工程
（６）基板上に固定された複合体のうち、標識が検出されないものを選択し、その結合体の低分子化合物と光反応性化合物との間の結合部位を特定する工程
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明の低分子化合物の固相担体への固定方法は、以下の（Ａ−１）〜（Ａ−３）の工程を含むことを特徴とするものである。
【００１３】
工程（Ａ−１）では、光反応性化合物が表面に結合している固相担体に、低分子化合物を含む溶液を接触させる。
【００１４】
光反応性化合物は、光照射により活性化され、低分子化合物との間に共有結合を形成できるものであれば特に限定されず、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の一群の化合物を挙げることができる。
（ａ）ナイトレン、カルベン、ラジカル、又は炭素求電子剤を発生し得る化合物
これらの活性種を発生し得る化合物は、特開２００１−１７８４７２号公報、１９９５年発行のテトラへドロン誌（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）第５１巻、１２４７９−１２５２０ページのＳ．Ａ．Ｆｌｅｍｉｇの著した総説、および１９９８年発行の有機合成化学協会誌、第５６巻５８１−５９０ページの畑中保丸の著した総説などに記載されている。例えば、ナイトレンを発生する化合物としては、芳香族アジド、アルキルアジド、ヘテロ環アジドなどのアジド基を有する化合物であり、カルベンを発生する化合物としてはジアゾ基またはジアジリン環を有する化合物であり、ラジカルを発生する化合物としてはベンゾフェノン類やエノン類のような共役ケトン類、芳香族ハロゲン化物類、オレフィン類などであり、炭素求電子剤を発生する化合物としては芳香族ジアゾニウム塩、ニトロベンゼン類、スルホニウム塩、ホスホニウム塩、アンモニウム塩などである。
（ｂ）ジアゾニウム基、アジド基、ジアジリン環、又はジアゾ基を部分構造として含む化合物
これらの部分構造を持つ化合物も前述した特開２００１−１７８４７２号公報などに記載されている。
（ｃ）式（Ｉ）：
【００１５】
【化２】
2004309372.tif 000002
〔式中、Ｘは、−Ｎ３、−Ｃ＊（Ｒ１）Ｎ＝Ｎ＊（＊同士は連結して三員環を形成する）、−Ｎ２＋Ｚ−、−Ｃ（Ｒ２）＝Ｏ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ３、−Ｃｌ、又は−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ＝Ｎ２を表し；Ｒ１は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基を表し；Ｒ２は置換基を有していてもよいアリール基を表し；Ｚ−は陰イオンを表し；Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５のいずれか一つは固相担体表面に担持された官能基と反応して共有結合を形成しうる基を表し、他の四つはそれぞれ独立して水素原子又はハロゲン原子を表す。〕
で表される化合物
【００１６】
一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ１で表される基は好ましくは炭素原子数が１乃至６の置換基を有していてもよいアルキル基、炭素原子数が６乃至１２の置換基を有していてもよいフェニル基であり、特に好ましくはフッ素原子などの電子吸引基で置換されたアルキル基である。Ｒ２で表される基は好ましくはフェニル基である。Ｚ−で表される陰イオンは好ましくはハロゲン化物イオン、四フッ化ホウ素イオン、又は六フッ化リン酸イオンである。固相担体表面に担持された官能基と反応して共有結合を形成しうる基は、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５のいずれでもよいが、Ｙ３であることが好ましい。固相担体表面に担持された官能基と反応して共有結合を形成しうる基として好ましいものは、カルボキシル基、ホルミル基、活性エステル基、水酸基、チオール、スルフィド、アミノ基、ハロゲン置換アルキル基、トリアルコキシシリル基、およびこれらの置換基を有する基である。
【００１７】
一般式（Ｉ）で表される化合物の具体例として、以下の化合物１〜化合物２７を例示できるが、これらに限定されるわけではない。
【００１８】
【化３】
2004309372.tif 000003
【００１９】
【化４】
2004309372.tif 000004
【００２０】
【化５】
2004309372.tif 000005
【００２１】
【化６】
2004309372.tif 000006
【００２２】
【化７】
2004309372.tif 000007
【００２３】
【化８】
2004309372.tif 000008
【００２４】
【化９】
2004309372.tif 000009
【００２５】
【化１０】
2004309372.tif 000010
【００２６】
【化１１】
2004309372.tif 000011
【００２７】
【化１２】
2004309372.tif 000012
【００２８】
【化１３】
2004309372.tif 000013
【００２９】
【化１４】
2004309372.tif 000014
【００３０】
【化１５】
2004309372.tif 000015
【００３１】
【化１６】
2004309372.tif 000016
【００３２】
光反応性化合物を、固相担体表面に結合させる手段は特に限定されず、例えば、特開２００１−１７８４７２号公報記載の方法に従って行うことができる。光反応性化合物は、固相担体表面に直接結合させることが好ましいが、別の化合物を固相担体表面に結合させ、その化合物を介して結合させてもよい。また、光反応性化合物自体を結合させるのではなく、その前駆体を固相担体表面に結合させ、その後、適当な反応処理を施すことにより光反応性化合物に変換させてもよい。
【００３３】
固相担体は、光反応性化合物を結合させ得るものであればどのようなものでもよく、マイクロアレイ用基板、ビーズ、繊維、管、容器（試験管やバイヤル）などを固相担体とすることができ、これらの中でもマイクロアレイ用基板が最も好ましい。低分子化合物を固定化したマイクロアレイ用基板は、低分子マイクロアレイとして、タンパク質などの検出に使用することができる。固相担体の材質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質、金などの導電性材料などを拳げることができ、これらの中でもガラス、シリコン、金などが好ましい。固相担体の表面は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基などを導入するため、ポリ陽イオンなどのポリマーによる被覆処理、あるいは固相担体表面への導入置換基を有するシランカップリング剤による処理が施されていてもよい。あるいはプラズマ処理により反応性官能基が導入されていてもよい。
【００３４】
本発明における低分子化合物とは、主に炭素、水素、酸素、窒素、硫黄を主成分の原子とする有機化合物で、オリゴ糖、ポリペプチド等の１次代謝産物、また、脂肪酸、ポリケチド（アセトゲニン）、イソプレノイド、フェニルプロパノイド、アルカロイド等の２次代謝産物、また、芳香環、複素環を含む分子量２０００程度までの合成有機化合物、またはこれらの複合体などを指し、主にタンパク質と結合することでそのタンパク質の機能を阻害もしくは昂進する可能性を有するものをいう。
【００３５】
低分子化合物溶液の調製に用いる溶媒は、低分子化合物の種類に応じて適宜決めることができ、例えば、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）、ジオキサン、アセトニトリル、クロロホルムなどを使用することができる。また、低分子化合物溶液の濃度は、低分子化合物や溶媒の種類、あるいは接触の方法により異なるが、例えば、分子量５００程度のポリケチドのＤＭＳＯ溶液を固相担体上に滴下する場合は０．１〜１０  ｍＭ程度、分子量１２００程度のポリペプチドのＤＭＳＯ溶液を固相担体上に滴下する場合は０．１〜１００  ｍＭ程度である。
【００３６】
低分子化合物溶液を、固相担体と接触させる方法は、光照射により低分子化合物を固相担体に固定できる方法であればどのようなものでもよく、例えば、固相担体がマイクロアレイ用基板の場合、低分子化合物を含む溶液をこの基板上に滴下すればよい。このときの滴下量は、低分子化合物の種類や溶液の濃度などにより異なるが、１  ｎＬ〜０．２  μＬ程度である。
【００３７】
工程（Ａ−２）では、低分子化合物を含む溶液を、固相担体に接触させた状態で乾固させる。
【００３８】
溶液を乾固させる方法は特に限定されず、自然乾燥によって乾固させてもよいが、真空ポンプ等を用いて人為的に乾燥させることが好ましい。
【００３９】
溶液を乾固させることにより、低分子化合物と光反応性基が密接に接近し、低分子化合物が、様々な部位で光反応性化合物と結合するようになる。これは、低分子化合物のあらゆる部位を固相担体の表面に露出していることになり、低分子化合物の分子全体の性質（結合能など）を調べることが可能になる。また、溶液の乾固により、低分子化合物の分子密度が高くなり、光反応性化合物との反応効率が向上するという効果も得られる。
【００４０】
工程（Ａ−３）では、固相担体に光を照射し、光反応性化合物と低分子化合物との間に共有結合を形成させる。
【００４１】
照射する光の波長は、光反応性化合物の種類に応じて決めればよく、通常、２００〜４００ｎｍの範囲の波長、好ましくは３６０ｎｍ付近の波長の光を照射する。光源は太陽光、水銀灯などの電灯光、レーザー光（半導体レーザー、固体レーザー、ガスレーザー）、発光ダイオードの発光、エレクトロルミネッセント素子の発光などが利用できる。光照射の方法は、水銀灯などの光源からの光を必要に応じて適当なフィルターを介して固相担体表面に均一に照射することもできるし、いわゆるマスクを用いて所望の形状のパターン露光をしてもよい。または、光をレンズや鏡を用いて集光し、微細な形状に照射してもよい。または、集光した光線を走査露光してもよい。照射時間は特に限定されない。
【００４２】
光照射後の固相担体は、適当な溶媒又はバッファーで洗い、固定されなかった低分子化合物を除去する。これにより、低分子化合物が固定された固相担体を得ることができる。
【００４３】
本発明の固定方法は、以下に述べる「低分子化合物と相互作用をする物質の検出方法」及び「低分子化合物における相互作用部位の特定方法」に応用できる。
【００４４】
本発明の低分子化合物と相互作用をする物質の検出方法は、以下の（Ｂ−１）〜（Ｂ−３）の工程を含むことを特徴とするものである。
【００４５】
工程（Ｂ−１）では、上述の本発明の固定方法により得られる低分子マイクロアレイに、標識された試料物質を含む溶液を接触させる。
【００４６】
試料物質は特に限定されないが、主としてタンパク質などの生体物質を使用する。試料物質の標識方法も特に限定されず、ＲＩ法で標識してもよいし、非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法等）で標識してもよい。
【００４７】
試料物質溶液の調製に用いる溶媒は、試料物質の種類に応じて適宜決めることができ、例えば、水、リン酸バッファー、酢酸バッファー、トリスバッファーなどを使用することができる。また、試料物質溶液の濃度は、低分子化合物や溶媒の種類により異なるが、例えば、分子量１６０，０００程度の蛍光標識化タンパク質のバッファー溶液の場合は１０〜１００  μｇ／ｍＬ程度である。
【００４８】
試料物質溶液を、低分子マイクロアレイと接触させる方法は特に限定されず、例えば、試料物質溶液をマイクロアレイ上に滴下すればよい。このときの滴下量は、試料物質の種類や溶液の濃度などにより異なるが、０．１〜１  μＬ・ｍｍ−２程度である。
【００４９】
工程（Ｂ−２）では、低分子化合物と結合しない物質を除去する。
【００５０】
低分子化合物と結合しない物質の除去は、適当なバッファーや溶媒等で洗浄することにより行う。
【００５１】
工程（Ｂ−３）では、試料物質の標識を検出する。
【００５２】
標識の検出は、標識物質の種類に応じて行うことができる。例えば、蛍光物質により標識した場合は、蛍光スライドスキャナーなどにより検出することができる。
【００５３】
この工程で、標識が検出されれば、試料物質は低分子化合物と相互作用をする物質であると判断することができ、標識が検出されなければ試料物質は低分子化合物と相互作用をしない物質であると判断することができる。
【００５４】
従来のマイクロアレイ法は、特定の官能基を利用して低分子化合物を固相担体に固定するが、その際、官能基を含んだ部分構造は固相担体との結合面を向いており、固相担体の表面には露出しない。従って、その官能基を含んだ部分構造が試料物質との相互作用に関与しているような場合には、実際には試料物質と相互作用をする低分子化合物であっても、それを相互作用をしないものとして判断してしまう可能性がある。本発明の検出方法では、低分子化合物のあらゆる部分が基板表面に露出しているマイクロアレイを用いるので、前述したような誤った判断をする可能性がなく、高い精度で低分子化合物と相互作用をする物質を検出することができる。
【００５５】
本発明の低分子化合物における相互作用部位の特定方法は、以下の工程（Ｃ−１）〜（Ｃ−６）を含むことを特徴とするものである。
【００５６】
工程（Ｃ−１）では、光反応性化合物と、特定物質と相互作用をする低分子化合物を混合する。
【００５７】
光反応性化合物は、その形態が粉末状、油状を問わず、本発明の固定化方法と同様のものを使用できる。
【００５８】
低分子化合物は、本発明の固定化方法と同様の化合物を使用できるが、この方法ではそのような化合物の中でも特に既に特定物質と相互作用をすることが確認されているものを使用する。
【００５９】
工程（Ｃ−２）では、前記混合物に光を照射し、光反応性化合物と低分子化合物との間に共有結合を形成させる。
【００６０】
この工程は、本発明の固定方法の（Ａ−３）工程と同様に行うことができる。
【００６１】
工程（Ｃ−３）では、光反応性化合物と低分子化合物の複合体を、低分子化合物の結合部位の違いにより分別する。
【００６２】
複合体を分別する方法は特に限定されず、例えば高速液体クロマトグラフィーにより分別することができる。
【００６３】
工程（Ｃ−４）では、分別された前記結合体をそれぞれマイクロアレイ用基板上に固定する。
【００６４】
結合体をマイクロアレイ用基板上に固定する方法は常法に従って行うことができ、固相担体表面に担持された官能基を利用して固定化することが可能である。
【００６５】
工程（Ｃ−５）では、前記基板上に固定された複合体に、標識された前記特定物質を含む溶液を接触させる。
【００６６】
この工程は、本発明の検出方法の（Ｂ−１）工程と同様に行うことができる。但し、基板に接触させる物質は、低分子化合物と相互作用をするかどうかわからない物質（試料物質）ではなく、低分子化合物と相互作用をすることが確認されている物質である。
【００６７】
工程（Ｃ−７）では、基板上に固定された複合体のうち、標識が検出されないものを選択し、その結合体の低分子化合物と光反応性化合物との間の結合部位を特定する。
【００６８】
結合部位を特定する方法としては、例えば、マススペクトル、核磁気共鳴スペクトルなどによって行うことができる。
【００６９】
以上の低分子化合物における相互作用部位の特定方法を図１を用いて説明する。図中の低分子化合物は、ＳＨ基を持っており、この基が特定物質との相互作用に関与している。工程（Ｃ−１）及び（Ｃ−２）により、低分子化合物は、光反応性化合物と結合する。このとき、低分子化合物は、ＳＨ基の部分だけでなく、様々な部位で光反応性化合物と結合する（図１ｂ）。低分子化合物と光反応性化合物の結合体群は、工程（Ｃ−３）〜工程（Ｃ−４）により分別され、基板上に固定される。低分子化合物に特定物質を接触させると、本来ならばすべての低分子化合物は特定物質と相互作用するはずであるが、一部の低分子化合物は相互作用をしない（図１ｃ）。この特定物質と相互作用をしない低分子化合物の構造を遡って解析すれば（図１ｂ）、低分子化合物において、特定物質と相互作用をしていた部位（この図ではＳＨ基）を特定できる。
【００７０】
低分子化合物のどの部位が、タンパク質等との相互作用に関与しているのかを特定することは、医薬等の開発において非常に重要である。従来このような部位の特定は、低分子化合物中に存在する官能基を一つずつ変換して相互作用の有無を調べるといった煩雑な作業が必要であった。しかし、本発明の方法によれば、そのような煩雑な作業は不要であり、一回の作業で相互作用をする部位を特定することができる。
【００７１】
【実施例】
〔実施例１〕  光親和性原子団へのポリエチレングリコールリンカーの導入
【００７２】
【化１７】
2004309372.tif 000017
４−（３−トリフルオロメチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）−安息香酸（化合物Ａ）（１７．９ｍｇ、７２．０μｍｏｌ）、｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物Ｂ）（７３．８ｍｇ、２９７μｍｏｌ、４．１ｅｑ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（３．１ｍｇ、２５．４μｍｏｌ、０．３５ｅｑ）の無水ＴＨＦ溶液（１ｍＬ）に室温で１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（２４．１ｍｇ、１２６μｍｏｌ、１．７ｅｑ）を加え、暗所で２０時間攪拌した。溶媒を減圧下留去後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（１ｇ、クロロホルム：メタノール＝２５：１）で精製して［２−（２−｛２−［４−（３−トリフルオロメチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）−ベンゾイルアミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エチル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物Ｃ）を２７．６ｍｇ（５９．９μｍｏｌ、収率８３％）得た。
【００７３】
得られた化合物Ｃ（２７．６ｍｇ、５９．９μｍｏｌ）をジクロロメタン（１ｍＬ）とトリフルオロ酢酸（１５０μＬ）に溶解させ、室温で７０分間攪拌した。溶媒を減圧下で留去後、逆相カラムクロマトグラフィー（メタノール：水＝４：１メタノール）で精製し、Ｎ−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−４−（３−トリフルオロメチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）−ベンズアミドのトリフルオロ酢酸塩（化合物Ｄ）を２１．１ｍｇ（４４．５ｍｍｏｌ、収率７４％）得た。
化合物Ｄ：無色油状物質、１Ｈ−ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）δ７．９０（２Ｈ，  ｂｒｄ，  Ｊ＝８．６Ｈｚ），  ７．３４（２Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝８．６Ｈｚ），  ３．６２−３．７１（８Ｈ，  ｍ），  ３．５８（２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝４．８Ｈｚ），  ３．０７（２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝５．６Ｈｚ）．
【００７４】
〔実施例２〕  ガラス基板の修飾
アミノ化スライドガラス〔松浪ガラス製ＤＮＡマイクロアレイ用コートスライドグラス（高密度アミノ基導入タイプ１スライド）７６ｘ２６ｍｍ〕上に、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル  カルボネート（７４．２ｍｇ、２９０μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４８ｍＬ、２７６μｍｏｌ）、ＤＭＦ（６００μＬ）の混合液を、０．１８μＬ・ｍｍ−２の割合で添加し、室温で１６時間処理した。処理後のスライドガラスを順にエタノール、脱イオン水、エタノール、脱イオン水で各１０分間洗浄後、脱水遠心機（４００ｘｇ）で１分間脱水し、更に真空乾燥させ、スクシンイミジル化スライドを得た。
【００７５】
得られたスクシンイミジル化スライド上に、Ｎ−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−４−（３−トリフルオロメチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）−ベンズアミドのトリフルオロ酢酸塩（化合物Ｄ）（１７．４ｍｇ、３６．７μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（４０μＬ、２３０μｍｏｌ）、ＤＭＦ（３６０μＬ）の混合液を０．１１μＬ・ｍｍ−２の割合で添加し、暗所、室温で１４時間処理した。スライド上に残った過剰の試薬をエタノール、脱イオン水で順に除去し、脱水遠心機（４００ｘｇ）で１分間脱水した。このスライドにエタノールアミンの１Ｍ  ＤＭＦ溶液を７２ｎＬ・ｍｍ−２の割合で添加し、ブロッキング処理を暗所、室温で１時間行った。スライド上に残った過剰の試薬をエタノール、脱イオン水で順に除去し、脱水遠心機（４００ｘｇ）で１分間脱水して、光親和性原子団導入スライドを得た。以上のガラス基板の修飾工程の概要を図２に示す。
【００７６】
〔実施例３〕  低分子化合物の固定化
【００７７】
【化１８】
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光親和性原子団導入スライド上に、あらかじめ１００、１０、１、０．１、０．０１ｍＭに調製された低分子化合物（ビオチン、ロダミンＢ、ジゴキシン）の各ＤＭＳＯ溶液を各０．２μＬずつスポットした。このスライドを３５℃のインキュベーターで３時間乾燥させた後、真空ポンプを用いて２０時間乾燥させた。このスライドに３６５  ｎｍ  の紫外線を３０分間照射した後、スライド上に固定化されなかった過剰の低分子化合物をエタノールで洗い流した。更にこのスライドをエタノール、ＤＭＦ、ＴＨＦ、エタノール、脱イオン水（各１時間）に順に浸して震盪洗浄し、低分子が固定化されたスライドを得た。
【００７８】
〔実施例４〕  低分子−タンパク質間結合の検出
低分子固定化スライドに、タンパク質溶液（１６２μｇ／ｍＬ  抗ジゴキシンモノクローナル抗体クローンＤＩ−２２−ＦＩＴＣ結合体、３．７μｇ／ｍＬ  ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３結合体、１％（ｗ／ｖ）スキムミルク、７７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５）を０．１８ｍＬ・ｍｍ−２の割合で添加し、室温下１時間処理した。このスライドを洗浄バッファー（７７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５）で３回震盪洗浄した後、脱イオン水ですすぎ、脱水遠心機（４００ｘｇ）で１分間脱水した。このスライドを波長が各々４８８、５３２、６３５ｎｍの光で励起させ、生じた蛍光を蛍光スライドスキャナーを用いて観測した。この結果を図３に示す。図３において、左列の画像はタンパク質溶液に浸す前のスライドを蛍光スキャナーで観測したものであり、右列の画像はタンパク質溶液で処理後に蛍光スキャナーで観測したものである。
【００７９】
図３に示すように、６３５ｎｍの波長の光を照射した場合は、ビオチン溶液をスポットした部分にのみ蛍光が検出され、ビオチンがタンパク質（ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３結合体）と結合したことが確認された。また、４８８ｎｍの波長の光を照射した場合は、ジゴキシン溶液をスポットした部分にのみ蛍光が検出され、ジゴキシンがタンパク質（抗ジゴキシンモノクローナル抗体クローンＤＩ−２２−ＦＩＴＣ結合体）と結合したことが確認された。
【００８０】
【発明の効果】
本発明の固定方法は、官能基非依存的に低分子化合物を固定できるので、従来の固定方法よりも、多様な化合物を固定化できる。また、固定される低分子化合物は、分子中の様々な部位で、固相担体と結合しているので、低分子化合物のあらゆる部分が固相担体表面に露出することになり、この結果、低分子化合物の分子全体の結合性等を調べることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の低分子化合物における相互作用部位の特定方法を模式的に表した図である。
【図２】ガラス基板の修飾工程の概要を示す図である。
【図３】４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、６３５ｎｍの波長の光を照射した低分子固定化スライドを、蛍光スキャナーで観測した画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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