(57)【要約】　　　（修正有）【課題】物質を目的の部位に選択的に物質を送達することができる物質送達用のシステムを提供することを目的としている。【解決手段】ヘアピン構造をとることができるオリゴヌクレオチドの一方の末端に消光物質が結合し、他の末端の放出物質が結合した光分解性物質が結合した放出物質送達剤、並びに前記の放出物質送達剤を、標的となる遺伝子に接触させて（但し、人体中において接触させる場合を除く。）、光を照射して光分解性物質を光分解して放出物質を放出させることからなる放出物質の標的遺伝子への送達する方法、及び当該方法を用いた、放出された放出物質を測定することからなる標的遺伝子を検出、同定又は定量する方法に関する。【選択図】　　　　図１
2004097125.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘアピン構造をとることができるオリゴヌクレオチドの一方の末端に消光物質が結合し、他の末端の放出物質が結合した光分解性物質が結合した放出物質送達剤。
【請求項２】
放出物質が薬物である請求項１に記載の放出物質送達剤。
【請求項３】
消光物質が芳香族化合物である請求項１又は２に記載の放出物質送達剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の放出物質送達剤を、標的となる遺伝子に接触させて（但し、人体中において接触させる場合を除く。）、光を照射して光分解性物質を光分解して放出物質を放出させることからなる放出物質の標的遺伝子への送達する方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の放出物質送達剤におけるヘアピン構造をとることができるオリゴヌクレオチドが、標的となる遺伝子に接触することによりヘアピン構造が崩壊することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の方法において、放出された放出物質を測定することからなる標的遺伝子を検出、同定又は定量する方法。
【請求項７】
放出物質がビオチンである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ヘアピン構造をとることができるオリゴヌクレオチドの一方の末端に消光物質が結合し、他の末端の放出物質が結合した光分解性物質が結合したオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘアピン構造をとることができるオリゴヌクレオチドの一方の末端に消光物質が結合し、他の末端の放出物質が結合した光分解性物質が結合した放出物質送達剤、それを用いた放出物質の送達方法、及び当該オリゴヌクレオチドの相補配列を有する遺伝子の検出又は同定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
物質を目的の位置に送達する方法として各種の方法が提案されている。例えば、医薬などの薬物を目的の治療位置に送達する方法として各種の薬剤送達システム（ＤＤＳ）が提案されており、リポソームを使用する方法、抗体を用いる方法などが知られている。これらの方法は、送達の選択性や目的部位での薬物の放出性が必ずしも十分ではなく実用化には至っていないのが現状である。このような薬物の送達に限らず、検出や同定用の物質においても試薬を目的の位置に確実の送達する手法の開発が望まれている。検出・同定用の試薬が目的の物質に選択的に送達されることにより、検出・同定の感度及び精度が飛躍的の向上することになる。
【０００３】
また、オリゴヌクレオチドの両末端にそれぞれ蛍光部位と消光部位を連結し、ＤＮＡのコンホメーション変化を利用したＤＮＡの検出手法は、モレキュラービーコンと呼ばれて広く知られている。この方法は、オリゴヌクレオチドの一方の末端に蛍光物質を結合し、他方の末端に消光物質を結合したもので、オリゴヌクレオチドがヘアピン構造をとることにより、蛍光物質と消光物質が接近した状態になり、蛍光物質による蛍光を観察することができないが、オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を解除することにより消光物質と蛍光物質の距離が離れ、蛍光物質による蛍光を観察できるようになり、当該蛍光を観察することにより標的となるＤＮＡを検出する方法である。このような検出手法はインベーダー法によるＳＮＰｓの検出手法としても応用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、物質を目的の部位に選択的に物質を送達することができる物質送達用の担体を提供することを目的としている。また、本発明は、このための新規なオリゴヌクレオチドを提供するものである。さらに、本発明は、物質を目的の部位に選択的に物質を送達することができる物質送達用の担体を用いて、特定の物質を検出・同定するための方法を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ヘアピン構造をとることができるオリゴヌクレオチドの一方の末端に消光物質が結合し、他の末端の放出物質が結合した光分解性物質が結合した放出物質送達剤に関する。
また、本発明は、前記の放出物質送達剤を、標的となる遺伝子に接触させて（但し、人体中において接触させる場合を除く。）、光を照射して光分解性物質を光分解して放出物質を放出させることからなる放出物質の標的遺伝子への送達する方法、及び当該方法を用いた、放出された放出物質を測定することからなる標的遺伝子を検出、同定又は定量する方法に関する。
さらに本発明は、ヘアピン構造をとることができるオリゴヌクレオチドの一方の末端に消光物質が結合し、他の末端の放出物質が結合した光分解性物質が結合したオリゴヌクレオチドに関する。
【０００６】
本発明は、ヘアピン構造からターゲット認識による二本鎖構造への変化を積極的に利用した物質の送達システムを提供する。即ち、構造的に最も大きく変化するプローブＤＮＡの末端に光分解部位と消光部位を結合させ、プローブＤＮＡのコンホメーション変化に伴ってそれらのユニットの間の距離を変化させることにより、物質放出効率を変化させる手法を開発した。この手法は、ヘアピン構造を取りうるプローブＤＮＡ末端にそれぞれ薬剤を連結した光分解部位と消光部位で修飾する以外は、特別な処置を必要とせず、極めて簡便である。
本発明は、モレキュラービーコンに用いられる蛍光部位を光反応部位に置き換え、光反応を通して分子の放出の制御を行う。光照射により分子を放出する核酸はいくつか既知であるが、本発明のようにひとつの鎖の中に必要な全ての要素が含まれた核酸は、これまでには全く知られていない。
【０００７】
本発明の基本的な考え方を図１により説明する。
図１は本発明の手法の概要を示したものである。図１において、三角印で示されているものは放出される物質であり、丸印で示されているものは光分解性物質であり、六角形で示されているものは消光物質である。フラスコのように丸く示されているものがヘアピン構造をとることができるオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドの一方の末端に消光物質（図１の六角形で示されているもの）が結合し、他の末端の放出物質が結合した光分解性物質（図１の丸印と三角印で示されているもの）が結合している。このような状態のときに光を照射しても、光は消光物質に吸収され光分解性物質の光分解を誘起させることはできない。即ち、光分解性物質の光分解は消光物質により保護されているということもできる。
オリゴヌクレオチドの両端にそれぞれ消光物質と光分解性物質とを有する放出物質送達剤が、標的となる遺伝子に遭遇すると、ヘアピン構造が崩れ標的の遺伝子の塩基配列の部分において二本鎖構造になる。この状態を示したのが図１の下の段である。両端にそれぞれ消光物質と光分解性物質とを有するオリゴヌクレオチドのヘアピン構造が崩れ二本鎖構造となることにより、消光物質と光分解性物質との距離が離れることになる。このような状態になったときに光を照射すると、光分解性物質に直接光が照射されることになり光分解性物質の光分解が誘起されることになる。そして、光分解性物質の光分解により光分解性物質に結合されていた放出物質が放出される。
【０００８】
本発明は、モレキュラービーコンに用いられる蛍光部位を光反応部位に置き換えたようなものであるが、モレキュラービーコンは蛍光部位による蛍光を観察することを目的にするものであり、本発明のように光反応を通して分子の放出の制御を行うことを目的にするものとは技術的思想を全く異にするものである。
本発明者らは、本発明の放出物質送達剤により目的の物質が光照射により放出されるかどうかを放出物質としてビオチンを用いた実験により確認した。
消光物質としてナフタレン誘導体を用い、光分解性物質としてアセトフェノン誘導体を用いて、以下の合成経路により本発明の放出物質送達剤を製造した。
【０００９】
【化１】
2004097125.tif 000003
【００１０】
前記反応式の下に記載されている（ａ）〜（ｍ）は、各工程における試薬、反応条件及び収率である。
前記反応式により製造された（９ｂ）は、オリゴヌクレオチドとしてＴＧＣＴＣＧＣの配列を有するものであり、このものを用いて光り照射の実験をまず行った。光照射反応を次に示す。
【００１１】
【化２】
2004097125.tif 000004
【００１２】
波長３１２ｎｍを５分間照射することにより、光分解性物質が分解し、結合していた放出物質ビオチンを遊離した。
次にヘアピン構造を形成するオリゴヌクレオチドを有する（９ａ）を用いて実験した。２００ｐモルの（９ａ）の１５ｍＭのカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含むイソプロピルアルコール溶液に、その相補配列を有するオリゴヌクレオチド（５’−ｄ（ＣＡＴＡＧＧＴＣＴＴＡＡＣＴＴ）−３’）の存在下又は非存在下に、３１２ｎｍの光を照射した。各々の光照射産物をマイクロコーン遠心分離フィルター（ＹＭ−３、３０００ＮＭＷＬ）で濾過し、８６ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）及び１３０ｍＭの塩化ナトリウムを含む０．４３ｍｇのアビジン−ＨＡＢＡ複合体の溶液に混合し、この混合物の５００ｎｍでの吸収（Ａ５００）を測定した。結果を次の図２に示す。図２の横軸はビオチンの濃度（ｐモル）を示し、縦軸は５００ｎｍでの吸収（Ａ５００）を示す。
相補鎖のＤＮＡの非存在下では吸収（Ａ５００）は０．９１３であり、２４ｐモル（１２％のビオチン放出）であったが、相補鎖の存在下では吸収（Ａ５００）は０．９０３で１６７ｐモル（８４％のビオチン放出）があった。この関係は直線状であり、相関係数Ｒ＝０．９９６６でｙ＝−７．０×１０−５ｘ＋０．９１４７の式で示された。
【００１３】
この実験からも明らかなように、本発明の放出物質送達剤は、標的となる遺伝子、即ちヘアピン構造が崩壊する相補配列を有する遺伝子が存在する箇所において選択的な光分解反応が進行し、当該光分解反応により放出物質が当該箇所において選択的に放出されることになる。
このように本発明においては、光分解反応により目的物質を選択的に標的位置において放出することができる放出物質送達剤を提供することができた。
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、ヘアピン構造を形成することができ、標的遺伝子の塩基配列と相補的な配列を有するものであれば特に制限はない。本発明のオリゴヌクレオチドの全部が標的遺伝子と２本鎖を形成できる塩基配列を有するほうが好ましいが、全部が必ずしも全体が２本鎖を形成できなくてもよい。必要なことは光分解反応が十分に進行するように消光物質との距離が保たれるだけの相補鎖を有していることである。
本発明のオリゴヌクレオチドの標的となる遺伝子としてはＤＮＡでもＲＮＡのいずれでもよく、本発明のオリゴヌクレオチドのヘアピン構造を崩壊させることができるものであればよい。このような遺伝子としては人工のものであってもよいし、天然のものであってもよい。例えば、発癌遺伝子を標的遺伝子とすることもできるし、担体などに固定化された遺伝子を標的とすることもできる。
本発明の消光物質としては、光分解反応に使用される波長を十分吸収できるできる物質であればよく、例えば各種の芳香族化合物、例えばα−ナフタレン酢酸などの置換ナフタレン、アズレン、スチルベンなどを有するものが挙げられる。本発明の光分解性物質としては、光の照射により分解する官能基や環などを有するものであればよく、好ましくは分解して放出される物質が送達物質して好ましい性質を維持できる要に分解できるものでことが必要である。好ましい光分解性物質としてはフェナシル基、ニトロベンジル基などを有するものが挙げられる。
本発明の放出物質は、標的の遺伝子が存在する部位において光分解反応により放出され、目的の部位に送達される物質である。このような物質としては特に制限はなく、前記光分解性物質に結合し得る官能基を有し、光化学反応により分解放出されものであればよい。
【００１５】
本発明の消光物質、及び放出物質が結合した光分解性物質をオリゴヌクレオチドに結合させる方法としては従来のオリゴヌクレオチドの修飾方法を使用することができる。これらの物質はオリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端のいずれに結合させてもよい。結合のときに使用されるリンカー部分としては従来法のものでよいが、余り長くなると消光物質と光分解性物質の距離が離れることにもなるので、両者が近距離で維持できるように選択するのが好ましい。
また、本発明は、ヘアピン構造をとることができるオリゴヌクレオチドの一方の末端に消光物質が結合し、他の末端の放出物質が結合した光分解性物質が結合したオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、塩基数で１０〜１５０、好ましくは２０〜１００、２０〜８０程度のものであり、末端に放出物質が結合した光分解性物質が結合していることを特徴とするものである。このような構造により、標的遺伝子の存在下において、選択的な光分解反応を起こすことができ、光分解性物質に結合した放出物質を標的遺伝子の存在する部位において選択的に放出することができる。
本発明の放出物質送達剤において放出物質として医薬を用いる場合には、標的遺伝子が発現している部位で選択的に医薬を放出することができる医薬組成物とすることができる。
【００１６】
本発明は、前記の放出物質送達剤を、標的となる遺伝子に接触させて、光を照射して光分解性物質を光分解して放出物質を放出させることからなる放出物質の標的遺伝子への送達する方法を提供するものである。当該方法において遺伝子との接触が人体中で起こる場合には、人の治療方法や診断方法に相当することから人の治療方法や診断方法が特許の対象とされて居ない場合にはこれらの人体中における場合は本発明の方法から除かれる。本発明のこの方法は標的の遺伝子が人体の外に存在している場合にも適用できるものである。
例えば、被検体の中に存在している標的の遺伝子の検出、同定や定量に用いることもできるし、特定の場所のみで選択的に放出物質を放出させたい場合には当該場所に標的となる遺伝子を存在させて置くことにより、放出物質の選択的な放出が可能となる。したがって、本発明は、当該方法を用いた、放出された放出物質を測定することからなる標的遺伝子を検出、同定又は定量する方法をも提供するものである。
本発明は、ターゲットの核酸に対して、両末端にそれぞれ光分解部位と消光部位を連結したＤＮＡを加える他に、特別な手続き（分解試薬や消光剤．活性化剤の添加、ハイブリダイゼーション条件のコントロールなど）を必要としない簡便でかつＳ／Ｎ比のよい、新たな送達手法を提供するものである。
このような両末端にそれぞれ光分解部位と消光部位を連結した　ＤＮＡのコンホメーション変化を利用した配列選択的な物質、好ましくは薬物のようなドラッグ送達システムを用いることにより、１）遺伝子中の目的塩基配列での薬剤の放出、２）ジーンセンサーとして目的塩基配列や一塩基多型の検出、３）光機能性ドラッグデリバリーシステム等への利用が可能になる。
【００１７】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１　光分解性物質（３）の製造
以下に示す反応経路により光分解性物質（３）を製造した。
【００１９】
【化３】
2004097125.tif 000005
【００２０】
Ａ．Ｎ−［２−（４−アセチルフェノキシ）エチル］フタルイミド（１０）の製造
ｐ−ヒドロキシアセトフェノン（１）（８．５１　ｇ，　６２．５　ｍｍｏｌ）及びＮ−（２−ブロモエチル）フタルイミド（１９．０８ｇ，　７５．１　ｍｍｏｌ）　のアセトン（８５　ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（４４．８８　ｇ，　３２４　ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を１０時間還流した。溶媒を留去した後、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。抽出液を食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、減圧で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、白色固体の目的化合物（１０）を得た（４．５ｇ，２３％）。
ｍｐ　１６２−１６３℃；
１Ｈ　ＮＭＲ　（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ
５７．８９　（ｄ，　Ｊ　＝　９．０　Ｈｚ，　２Ｈ），　７．８６　（ｄｄ，　Ｊ　＝　３．１，　５．７　Ｈｚ，　２Ｈ），
７．７３　（ｄｄ，　Ｊ　＝　３．１，　５．７　Ｈｚ，　２Ｈ），　６．９１　（ｄ，　Ｊ　＝　９．０　Ｈｚ，　２Ｈ），
４．２８　（ｔ，　Ｊ　＝　５．７　Ｈｚ，　２Ｈ），　４．１３　（ｔ，　Ｊ　＝　５．７　Ｈｚ，　２Ｈ），
２．５３　（ｓ，　３Ｈ）；
１３Ｃ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）　δ
１９６．７，　１６８．１，　１６２．１，　１３４．１，　１３２．０，　１３０．７，　１３０．６，　１２３．４，　１１４．３，
６４．９，　３７．１，　２６．３；
ＦＡＢＭＳ　（ＮＢＡ／クロロホルム）　ｍ／ｅ　３１０　［（Ｍ＋Ｈ）＋］；　ＨＲＭＳ　　Ｃ１８Ｈ１６ＮＯ４　　　［（Ｍ＋Ｈ）＋］
計算値　　　　３１０．１０７９，
実測値　　　　３１０．１０８５
【００２１】
Ｂ．ｐ−（２−アミノエトキシ）アセトフェノン（２）の製造
前記したＡで製造した化合物（１０）（３．１５　ｇ，　１０．１８　ｍｍｏｌ）のクロロホルム（６３ｍＬ）及びメタノール（３２　ｍＬ）溶液に４０％メチルアミン水溶液（４．４１ｍＬ，　５０．９　ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を室温で５時間撹拌した。減圧で濃縮した後、この混合物を希塩酸で抽出し、酢酸エチルで洗浄した。水層を炭酸水素ナトリウムでｐＨ１０とした後、酢酸エチルで抽出した。抽出液を食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、減圧で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（９％メタノール／クロロホルム）で精製して、白色固体の目的化合物（２）を得た（１．１７ｇ，６４％）。
ｍｐ　＞３００℃；
１Ｈ　ＮＭＲ　（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ
７．９１　（ｄ，　Ｊ　＝　８．８　Ｈｚ，　２Ｈ），　６．９２　（ｄ，　Ｊ　＝　８．８　Ｈｚ，　２Ｈ），
４．０４　（ｔ，　Ｊ　＝　５．２　Ｈｚ，　２Ｈ），　３．１０　（ｔ，　Ｊ　＝　５．２　Ｈｚ，　２Ｈ），
２．５４　（ｓ，　３Ｈ）；
ＥＩ−ＭＳ，　ｍ／ｅ（％）　１７９（Ｍ＋）（４６），１５０（９４），１２１（１００）；
ＨＲＭＳ　　　Ｃ１０Ｈ１３ＮＯ２　（Ｍ＋）
計算値　　　１７９．０９４６，
実測値　　　１７９．０９４６
【００２２】
Ｃ．Ｎ−［２−（４−アセチルフェノキシ）エチル］マレイミド（１１）の製造前記Ｂで製造した化合物（２）（１．８０　ｇ，　１０．０４ｍｍｏｌ）のトルエン（５５　ｍＬ）溶液にマレイン酸無水物（１．００　ｇ，　１０．２０　ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を５時間還流した。溶媒を留去した後、反応混合物を無水酢酸に溶解し、酢酸ナトリウム（０．８５　ｇ，　１０．１３　ｍｍｏｌ）を加えて１．５時間還流した。反応終了後、溶媒を減圧で留去した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、抽出液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、減圧で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、目的化合物（１１）を得た（１．３４ｇ，４９％）。
ｍｐ　１４２−１４３℃；
１Ｈ　ＮＭＲ　（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ
７．８９　（ｄ，　Ｊ　＝　８．８　Ｈｚ，　２Ｈ），　６．８７　（ｄ，　Ｊ　＝　８．８　Ｈｚ，　２Ｈ），
６．７２　（ｓ，　２Ｈ），　４．１８　（ｔ，　Ｊ　＝　５．６　Ｈｚ，　２Ｈ），　３．９５　（ｔ，　Ｊ　＝　５．６　Ｈｚ，　２Ｈ），２．５３　（ｓ，　３Ｈ）；
１３Ｃ　ＮＭＲ　（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）　δ
１９６．７，　１７０．４，　１６２．１，　１３４．３，　１３０．８，　１３０．６，　１１４．２，　６４．８，　３７．０，２６．４；
ＦＡＢＭＳ　（ＮＢＡ／酢酸エチル），　ｍ／ｅ　２６０［（Ｍ＋Ｈ）＋］；
ＨＲＭＳ　　　Ｃ１４Ｈ１４ＮＯ４　［（Ｍ＋Ｈ）＋］
計算値　　　２６０．０９２３，
実測値　　　２６０．０９２４
【００２３】
Ｄ．Ｎ−２−［４−（ブロモアセチル）フェノキシ］エチルマレイミド（１２）
の製造
前記Ｃで製造した化合物（１１）（２１５　ｒａｇ，　０．８２９　ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５　ｍＬ）溶液にフェニルトリメチルアンモニウムトリブロマイド（３１２　ｍｇ，　０．８２９ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を室温で３時間撹拌した。反応後、混合物を酢酸エチルで抽出し、抽出液を食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、減圧で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（９％トルエン／酢酸エチル）で精製して、白色固体の目的化合物（１２）を得た（９７．３ｍｇ，３５％）。
ｍｐ　１３５−１３６℃；
１Ｈ　ＮＭＲ　（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ
７．９２　（ｄ，　Ｊ　＝　８．８　Ｈｚ，　２Ｈ），　６．９０　（ｄ，　Ｊ　＝　８．８　Ｈｚ，　２Ｈ），　６．７２　（ｓ，　２Ｈ）４．３６　（ｓ，　２Ｈ），　４．２０　（ｔ，　Ｊ　＝　５．６　Ｈｚ，　２Ｈ），　３．９５　（ｔ，　Ｊ　＝　５．６　Ｈｚ，　２Ｈ）；
１３Ｃ　ＮＭＲ　（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）　δ
１８９．９，　１７０．４，　１６２．７，　１３４．３，　１３１．３，　１２７．４，　１１４．６，　６４．８，　３６．９，３０，６；
ＦＡＢＭＳ　（ＮＢＡ／クロロホルム）　ｍ／ｅ　３３８［（Ｍ＋Ｈ）＋］；
ＨＲＭＳ　　Ｃ１４Ｈ１３ＮＯ４Ｂｒ　［（Ｍ＋Ｈ）＋］
計算値　　３３８．００２８，
実測値　　３３８．００３１
【００２４】
Ｅ．　ビオチンを含むマレイミド部分のフェナシルエステル（３）の製造
前記Ｄで製造した化合物（１２）（４５．４ｍｇ，　０．１３４ｍｍｏｌ）及び（＋）−ビオチン（３３．０　ｍｇ，　０．１３４　ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４００μＬ）溶液に、トリエチルアミン（２０．４　ｍｇ，　０．２０１　ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を２時間室温で撹拌した。反応後、反応混合物を酢酸エチルで抽出し、抽出液を食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、減圧で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（９％メタノール／クロロホルム）で精製して、白色固体の目的化合物（３）を得た（５１ｍｇ，７６％）。
ｍｐ　１０８−１０９℃；
１Ｈ　ＮＭＲ　（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ
７．９０　（ｄ，　Ｊ　＝　９．０　Ｈｚ，　２Ｈ），　７．０４　（ｓ，　２Ｈ），　７．０４　（ｓ，　２Ｈ），
７．０１　（ｄ，　Ｊ　＝　９．０　Ｈｚ，　２Ｈ），　６．４３　（ｓ，　１Ｈ），　６．３６　（ｓ，　１Ｈ），
５．３９　（ｓ，　２Ｈ），　４．３０　（ｄｄ，　Ｊ　＝　５．２，　７．６　Ｈｚ，　１Ｈ），
４．２２　（ｔ，　Ｊ　＝　５．４　Ｈｚ，　２Ｈ），　４．１６−４．１５　（ｍ，　１Ｈ），
３．８０　（ｔ，　Ｊ　＝　５．４　Ｈｚ，　２Ｈ），　３．１３−３．０８　（ｍ，　１Ｈ），
２．８２　（ｄｄ，　Ｊ　＝　５．２，　１２．２　Ｈｚ，　１Ｈ），　２．５７　（ｄ，　Ｊ　＝　１２．２　Ｈｚ，　１Ｈ），
２．４２　（ｔ，　Ｊ　＝　７．４　Ｈｚ，　２Ｈ），　１．６８−１．３１　（６Ｈ）；
１３Ｃ　ＮＭＲ　（ＤＭＳＯ−ｄ６，１００ＭＨｚ）　δ
１９１．１，　１７２．３，　１７０．７，　１６２．６，　１６２．３，　１３４．６，　１３０．０，　１２７．１，　１１４．５，
６５．９，　６４．９，　６１．０，　５９．１，　５５．３，　３９．８，　３６．５，　３３．０，　２７．９，　２７．８，　２４．５；
ＦＡＢＭＳ　（ＮＢＡ／ＤＭＳＯ）　ｍ／ｅ　５０２　［（Ｍ＋Ｈ）＋］；
ＨＲＭＳ　　　Ｃ２４Ｈ２８Ｎ３Ｏ７Ｓ　［（Ｍ＋Ｈ）＋］
計算値　　　５０２．１６４８，
実測値　　　５０２．１６５０
【００２５】
実施例２　消光物質（５）の製造及びオリゴヌクレオチド（９）の製造
以下に示す反応経路により、消光物質を製造し、それをオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の５’末端に結合した。
【００２６】
【化４】
2004097125.tif 000006
【００２７】
Ａ．Ｎ−［２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）エチル］−１−ナフタレン酢酸アミド（１３）の製造
１−ナフチル酢酸（４）（３．７２　ｇ，　２０　ｍｍｏｌ）及びチオニルクロライド（３０　ｍＬ）の混合物を２時間還流した。減圧で濃縮した後、生成した粗１−ナフチル酢酸塩化物をそのまま次の工程に使用した。
２−アミノエタノール（１．００　ｇ，　１６．３７　ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（４．９４　ｇ，　３２．７４　ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（５．０６　ｇ，　５０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２０　ｍＬ）溶液に４−ジメチルアミノピリジン（３６７　ｍｇ，　３．０　ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を室温で３．５時間撹拌した。次に、この反応混合物に１−ナフチル酢酸塩化物のテトラヒドロフラン（１０　ｍＬ）溶液を加え、室温で１２時間撹拌した。反応後、反応混合物を酢酸エチルで抽出し、抽出液を食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、減圧で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１７％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、淡いオレンジ色の固体の目的化合物（１３）を得た（２．４０ｇ，４３％）。
ｍｐ　９０−９３℃；
１Ｈ　ＮＭＲ　（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）　δ
７．９４　（ｄ，　Ｊ　＝　８．４　Ｈｚ，　１Ｈ），　７．８５　（ｄ，　Ｊ．＝　７．２　Ｈｚ，　１Ｈ），
７．７９　（ｄ，　Ｊ　＝　８．０　Ｈｚ，　１Ｈ），　７．５６−７．３５　（４Ｈ），　５．６８　（ｂｒ，　１Ｈ），
４．０２　（ｓ，　２Ｈ），　３．４５　（ｔ，　Ｊ　＝　５．２　Ｈｚ，　２Ｈ），
３．２５　（ｄｔ，　Ｊ　＝　５．２，　５．２　Ｈｚ，　２Ｈ），　０．６３　（ｓ，　９Ｈ），−０．２４　（ｓ，　６Ｈ）；
１３Ｃ　ＮＭＲ　（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）　δ
１７０．７，　１３４．０，　１３２．０，　１３１．０，　１２８．８，　１２８．５，　１２８．４，　１２６．８，　１２６．１，
１２５．６，　１２３．７，　６１．４，　４１．８，　４１．５，　２５．６，　１７．９，−５．８；
ＦＡＢＭＳ　（ＮＢＡ／クロロホルム），　ｍ／ｅ　３４４［（Ｍ＋Ｈ）＋］；
ＨＲＭＳ　　Ｃ２０Ｈ３０ＮＯ２Ｓｉ　［（Ｍ＋Ｈ）＋］
計算値　　　３４４．２０４６，
実測値　　　３４４．２０４４
【００２８】
Ｂ．Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−１−ナフチル酢酸アミド（５）の製造
前記Ａで製造した化合物（１３）（２．００　ｇ，　５．８２　ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２０　ｍＬ）溶液に１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒドロフラン（５．８　ｍＬ，　５．８　ｍｍｏｌ）溶液を加え、この混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出し、抽出液を食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、減圧で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０％メタノール／クロロホルム）で精製して、酢酸エチルから再結晶した。無色結晶の目的化合物（５）を得た（１．０９ｍｇ，８２％）。
ｍｐ　１１０−１１１℃；
１Ｈ　ＮＭＲ　（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）　δ
８．１３　（ｔ，　Ｊ　＝　５．６　Ｈｚ，　１Ｈ），　８．１０−８．０５　（ｍ，　１Ｈ），　７．９２−７．８８　（ｍ，　１Ｈ），
７．８０　（ｄｄ，　Ｊ　＝　２．０，　７．２　Ｈｚ，　１Ｈ），　７．５５−７．３９　（４Ｈ），
４．６７　（ｔ，Ｊ　＝　５．６　Ｈｚ，　１Ｈ），　３．８９　（ｓ，　２Ｈ），
３．４０　（ｄｒ，　Ｊ　＝　５．６，　５．６　Ｈｚ，　２Ｈ），　３．３２　（ｓ，　２Ｈ），
３．１３　（ｄｒ，　Ｊ　＝　５．６，　５．６　Ｈｚ，　２Ｈ）；
１３Ｃ　ＮＭＲ　（ＤＭＳＯ−ｄ６，１００ＭＨｚ）　δ
１７０．１，　１３３．３，　１３２．８，　１３１．９，　１２８．３，　１２７．６，　１２７．６，　１２６．９，　１２５．８，
１２５．５，　１２５．４，　１２４．２，　５９．８，　４１．６，　３９．９；
ＦＡＢＭＳ　（ＮＢＡ／クロロホルム），ｍ／ｅ　２３０［（Ｍ＋Ｈ）＋］；
ＨＲＭＳ　　Ｃ１４Ｈ１６ＮＯ２　［（Ｍ＋Ｈ）＋］
計算値　　　２３０．１１８１，
実測値　　　２３０．１１８２
【００２９】
Ｃ．Ｎ−［２−（Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエトキシホスホニルオ
キシ）エチル］−１−ナフチル酢酸アミド（６）の製造
前記Ｃで製造した化合物（５）（５０　ｍｇ，　０．２３　ｍｍｏｌ）及びテトラゾール（２１　ｍｇ，０．２９９　ｍｍｏｌ）の乾燥アセトニトリル溶液に２−シアノエチル　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミデート（６９．３　ｍｇ，　０．２３　ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応後、粗生成物（６）を精製すること無くＤＮＡ自動合成機の原料として使用した。
【００３０】
Ｄ．末端にジスルフィド基を有するオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）（７）の製造オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）（７）は、アプライドバイオシステム社のモデル３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて、３’−チオール−モディファイドＣ３Ｓ−Ｓの制御された孔ガラス担体（１μｍｏｌ）によるシアノエチルホスホノアミデート法により製造した。オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の合成終了後、２８％アンモニア水で１時間処理してＯＤＮを担体から切り放し、その溶液を１２時間５５℃に加熱して脱保護した。合成されたＯＤＮは逆相ＨＰＬＣで精製され、０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン塩（ＴＥＡＡ）（ｐＨ７．０）と０％から６０％アセトニトリルの直線状の濃度勾配の混合溶媒により流速３．０ｍＬ／分で６０分で溶出された。
【００３１】
Ｅ．末端にチオール基を有するオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）（８）の製造
前記Ｄで製造したオリゴヌクレオチド（７）の溶液（総容量　４２０μＬ）の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　８．４）に１０ｍＭジチオソレイトール（４００μＬ）を加え、２３℃で１２時間インキュベートした。反応混合物を逆相ＨＰＬＣで精製し、０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン塩（ＴＥＡＡ）（ｐＨ７．０）と０％から６０％アセトニトリルの直線状の濃度勾配の混合溶媒により流速３．０ｍＬ／分で６０分で溶出された。得られたＯＤＮ（８）を直ちに次の工程に使用した。
【００３２】
Ｆ．フェナシルエステルで修飾されたＯＤＮ（９）の製造
前記Ｅで製造されたＯＤＮ（８）の溶液（総容量　１２０μＬ）の５００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　７．０）溶液に１ｍＭの化合物（３）の水溶液（１００μＬ）を加え、２３℃で終夜インキュベートした。反応混合物を逆相ＨＰＬＣで精製し、０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン塩（ＴＥＡＡ）（ｐＨ７．０）と０％から６０％アセトニトリルの直線状の濃度勾配の混合溶媒により流速３．０ｍＬ／分で６０分で溶出して、標題のＯＤＮ（９）を得た。
ＯＤＮ（８）への化合物（３）の取り込みは、酵素分解してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルで確認した。
2004097125.tif 000007
【００３３】
実施例３　９ａ及び９ｂの光化学反応
１本鎖の９ａ（６．７μＭ）、９ｂ（２０μＭ）、及び５’−ｄ（ＣＡＴＡＧＧＴＣＴＴＡＡＣＴＴ）−３’との２本鎖の９ａ（６．７μＭ　２本鎖の濃度）のそれぞれの光反応を、１５ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ　７．０）−２−プロパノール（２：１）中で行った。内部標準として２５μＭのデオキシアデノシンを存在させた。これらの溶液にトランスイルミネーター（３１２ｎｍ）により０℃で光を照射した。減圧で２−プロパノールを除去した後、反応混合物を逆相ＨＰＬＣで、０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン塩（ＴＥＡＡ）（ｐＨ７．０）と０％から６０％アセトニトリルの直線状の濃度勾配の混合溶媒により流速１．０ｍＬ／分で６０分で溶出させて分析した。
【００３４】
実施例４　アビジンに結合している２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン）安息
香酸（ＨＡＢＡ）の９ａから放出されたビオチンによる置換
相補配列を有するＤＮＡ　５’−ｄ（ＣＡＴＡＧＧＴＣＴＴＡＡＣＴＴ）−３’の存在下又は非存在下における２００ｐｍｏｌの９ａへの３１２ｎｍの光照射をモノクロメーター（ＪＡＳＣＯ　ＣＲＭ−ＦＤ，３００Ｗ　Ｘｅランプ，４０カウント；光照射の１カウントは約０．０２Ｊ／ｃｍ２の表面エネルギーに相当する。）、１５ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ　７．０）−２−プロパノール（２：１）中で室温で行った。光反応の生成物をマイクロコーン遠心フィルター（ＹＭ−３，３０００ＮＭＷＬ）で濾過した後、アビジン−ＨＡＢＡ複合体（０．４３ｍｇの免疫学的に純粋な（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ）アビジン（ＰＩＥＲＣＥ）及び６２．５ｍｇの免疫学的に純粋な（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ）ＨＡＢＡ（ＰＩＥＲＣＥ））の８６ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）及び１３０ｍＭ塩化ナトリウム溶液と混合したこの混合物の５００ｎｍの吸収（Ａ５００）を測定した。放出されたビオチンの量は、０、１００及び２００ｐｍｏｌのビオチンの存在下にアビジン−ＨＡＢＡ溶液を用いて測定されたＡ５００に基づいて作製された直線（ｙ＝−７．０×１０−５ｘ＋０．９１４７；Ｒ＝０．９９６６）に合わせて定量した。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の手法は、ターゲットになる配列を認識したときに起こるヘアピンから二本鎖へのコンホメーション変化を利用しており、それによってプローブＤＮＡの両末端に連結した光分解部位と消光部位との間の位置関係が変化することで光駆動型分子放出を制御する方法である。ヘアピン構造の時は、光分解部位と消光部位との間が近接いるため光を照射しても光分解部位での分解は生じにくいが、特定の配列を検出するとヘアピン構造から直線的な二本鎖構造に構造を変えるため光分解部位と消光部位との間の距離が大きくなり、光を照射すると光分解部位にて効果的に鎖の切断が生じる。したがって、光分解部位の先に薬剤等を連結させておくことによって、光駆動型配列選択的ドラッグリリースを達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の概要を模式的に示したものである。
【図２】図２は、本発明の放出物質送達剤を標的遺伝子の存在下又は非存在下に光を照射したときの放出物質の放出量を測定した結果を示したものである。
【図１】
2004097125.tif 000008
【図２】
2004097125.tif 000009