(57)【要約】【課題】励起光の照射領域を励起光の波長よりも小さくすることを実現し、生体分子間相互作用を１分子レベルで高感度で検出、定量することを可能にする微小開口膜、及び生体分子間相互作用解析装置とその解析方法を提供する。【解決手段】直径φが励起光の波長より小さく、間隔ｄが顕微鏡の対物レンズの分解能より大きい複数の微小開口５が設けられた光を透過しない薄膜を用いる。微小開口５に励起光を照射すれば、微小開口５からエバネッセント場が生じ、このエバネッセント場を用いることで、励起光の波長より小さい領域で励起光を蛍光性生体分子に照射し、生体分子間相互作用を１分子レベルで高感度で検出、定量することができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小開口が設けられた光を透過しない薄膜からなることを特徴とする微小開口膜。
【請求項２】
前記薄膜は透明な基板に結合されていることを特徴とする請求項１記載の微小開口膜。
【請求項３】
前記微小開口は複数設けられ略等間隔に配列されていることを特徴とする請求項１又は２記載の微小開口膜。
【請求項４】
前記微小開口の最大開口幅は２００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の微小開口膜。
【請求項５】
励起光を発生する励起光発生手段と、最大開口幅が前記励起光の波長よりも小さい微小開口が設けられた光を透過しない薄膜からなる微小開口膜と、蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたことを特徴とする生体分子間相互作用解析装置。
【請求項６】
前記微小開口は複数設けられ等間隔に配列されているとともに、前記微小開口の間隔は前記蛍光検出手段の分解能と同じか又は前記蛍光検出手段の分解能よりも大きいことを特徴とする請求項５記載の生体分子間相互作用解析装置。
【請求項７】
励起光の波長よりも小さい微小開口から前記励起光によるエバネッセント場を発生させ、このエバネッセント場の領域をブラウン運動により通過する蛍光性生体分子を励起させ、その蛍光性生体分子の蛍光を検出することを特徴とする生体分子間相互作用解析方法。
【請求項８】
励起光の波長よりも小さい微小開口から前記励起光によるエバネッセント場を発生させ、この微小開口に付着させた第一の蛍光性生体分子と、前記エバネッセント場の領域にあって前記第一の蛍光性生体分子と相互作用する第二の蛍光性生体分子とを励起させ、これら第一の蛍光生体分子と第二の蛍光性生体分子の蛍光をそれぞれ検出することを特徴とする生体分子間相互作用解析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体分子間相互作用を１分子レベルで検出、定量するための微小開口膜、及び生体分子間相互作用解析装置とその解析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の生体分子間相互作用を１分子レベルで検出、定量する方法として、主として以下の２つの方法がある。
【０００３】
１つは、図９に示すように、ガラス１０１と水溶液１０２の界面１０３にレーザー光１０４を入射して全反射させ、水溶液１０２の界面１０３に発生するエバネッセント場１０５を利用して、蛍光性生体分子１０６をイメージングする方法である。エバネッセント場１０５は、界面１０３から浸入長１５０ｎｍで減衰するので局所励起が可能である。一方の蛍光性生体分子１０６をガラス１０１に固定し、他方の生体分子を別の蛍光波長の蛍光分子で標識して水溶液１０２に加えると、これら生体分子同士の結合、解離（分子間相互作用）を超高感度カメラ１０７で撮影することが可能である。この生体分子の１分子蛍光イメージング法は、発明者らによって１９９５年に開発され（Ｆｕｎａｔｓｕ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４，  ５５５−５５９）、さまざまな成果を収めてきた。しかし、１．水溶液１０２中の蛍光性生体分子１０６の濃度を５０ｎＭ以下にしないと１分子観察が困難であること、２．蛍光性生体分子がガラス１０１に非特異的に吸着し、分子間相互作用の検出が困難であるという問題点をかかえており、１分子計測できる生体分子相互作用は限られていた。
【０００４】
これらの問題が発生する理由は以下のとおりである。全反射により発生するエバネッセント場１０５は、界面１０３に垂直な方向に１５０ｎｍの局所励起を実現しているが、平行な方向については局所化していないので、水溶液中１０２の蛍光性生体分子１０６の濃度を５０ｎＭ以下にしなければ超高感度カメラ１０６に接続された光学顕微鏡の分解能（約２５０ｎｍ）の範囲で、個々の蛍光性生体分子１０６をイメージングすることができない。また、蛍光性生体分子１０６が発した蛍光１０８は、超高感度カメラ１０７まで伝播するあいだに回折の影響を受け、試料面で直径約２５０ｎｍに相当する大きさに広がってしまう。そのため、個々の蛍光性生体分子１０６を識別するためには、ガラス１０１に固定する蛍光性生体分子１０６の間隔を約２５０ｎｍよりも大きくしなければならない。そのため、ガラス１０１上に固定した蛍光性生体分子１０６が占める面積の割合は０．１％以下と小さくなり、水溶液１０２中に加えた生体分子のガラス１０１への非特異的吸着が問題となるのである。これらの問題は、蛍光性生体分子１０６を励起する領域をさらに小さくし、それらを超高感度カメラ１０７に接続された光学顕微鏡の分解能よりも離れた位置に配置することによって解決できると期待される。
【０００５】
生体分子間相互作用を１分子レベルで検出する２つめの方法は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）である。これは、図１０に示すように、レーザービーム１１１を開口数の大きい対物レンズ１１２で回折限界まで絞込み、その中を通過する蛍光性生体分子１１３の蛍光強度のゆらぎを測定することにより、個々の蛍光性生体分子１１３の蛍光強度と拡散定数を求める方法である（Ｅｉｇｅｎ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｒｉｇｌｅｒ，  Ｒ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，  ５７４０−５７４７，特表平１１−５０２６０８号（特願平６−５１５７０号）公報）。レーザービーム１１１の焦点１１４の蛍光１１５だけを検出するために、レーザービーム１１１の結像位置にピンホールを置く共焦点光学系が用いられている。２種類の蛍光１１５の相関をとれば２種類の蛍光性生体分子１１３の分子間相互作用を解析することも可能である。この方法は、蛍光クロス相関分光法（ＦＣＣＳ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）と呼ばれる（Ｒｉｇｋｅｒ，  Ｒ．，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  −  ａ  ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６３：  ９７−１０９）。
【０００６】
この方法においても、照射領域が光の回折限界程度に広がるため、蛍光性生体分子１１３の濃度を１００ｎＭ程度までしか上げることができなかった。より高濃度で生体分子間相互作用を観察するために、光の回折限界を超える局所励起が望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】
特表平１１−５０２６０８号公報
【０００８】
【非特許文献１】
Ｆｕｎａｔｓｕ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４，  ５５５−５５９
【０００９】
【非特許文献２】
Ｅｉｇｅｎ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｒｉｇｌｅｒ，  Ｒ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，  ５７４０−５７４７
【００１０】
【非特許文献３】
Ｒｉｇｋｅｒ，  Ｒ．，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  −  ａ  ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６３：  ９７−１０９
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記の問題を解決することであり、励起光の照射領域を励起光の波長よりも小さくすることを実現し、生体分子間相互作用を１分子レベルで高感度で検出、定量することを可能にする微小開口膜、及び生体分子間相互作用解析装置とその解析方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の請求項１記載の微小開口膜は、微小開口が設けられた光を透過しない薄膜からなることを特徴とする。
【００１３】
この構成によれば、微小開口の最大開口幅を励起光の波長よりも小さくし、この微小開口に励起光を照射すれば、この微小開口からエバネッセント場が生じ、このエバネッセント場を用いることで、励起光の波長より小さい領域で励起光を蛍光性生体分子に照射することが可能になる。
【００１４】
本発明の請求項２記載の微小開口膜は、請求項１において、前記薄膜は透明な基板に結合されていることを特徴とする。
【００１５】
この構成によれば、基板に薄膜を支持することで薄膜の製造性と取り扱い性を向上させることができる。また、基板は透明なので励起光の透過を妨げることがない。
【００１６】
本発明の請求項３記載の微小開口膜は、請求項１又は２において、前記微小開口は複数設けられ略等間隔に配列されていることを特徴とする。
【００１７】
この構成によれば、複数の微小開口のうちの任意の微小開口において蛍光性生体分子の蛍光を観察することができるので、蛍光検出手段の位置合わせが容易になる。また、微小開口の間隔を蛍光検出手段の分解能と同じか又は蛍光検出手段の分解能よりも大きくすれば、それぞれの微小開口によって励起された個々の蛍光性生体分子の蛍光を分離して、１分子レベルで生体分子間相互作用を検出することができる。
【００１８】
本発明の請求項４記載の微小開口膜は、請求項１〜３のいずれか１項において、前記微小開口の最大開口幅は２００ｎｍ以下であることを特徴とする。
【００１９】
この構成によれば、微小開口の最大開口幅を励起光の波長より小さくすることができる。
【００２０】
本発明の請求項５記載の生体分子間相互作用解析装置は、励起光を発生する励起光発生手段と、最大開口幅が前記励起光の波長よりも小さい微小開口が設けられた光を透過しない薄膜からなる微小開口膜と、蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたことを特徴とする。
【００２１】
この構成によれば、最大開口幅が励起光の波長よりも小さい微小開口膜の微小開口に励起光発生手段からの励起光を照射し、この微小開口に生じるエバネッセント場を用いることで励起光の波長より小さい領域で励起光を蛍光性生体分子に照射することができ、この蛍光性生体分子から発せられる蛍光を蛍光検出手段で検出することができる。また、励起光の波長より小さい領域で励起光を蛍光性生体分子に照射することによって、蛍光性生体分子の水溶液中の濃度を高くすることができ、さらに、蛍光性生体分子のガラス面などへの非特異的吸着の影響を抑えることができるので、生体分子間相互作用の検出、定量を確実に行うことができる。
【００２２】
本発明の請求項６記載の生体分子間相互作用解析装置は、請求項５において、前記微小開口は複数設けられ等間隔に配列されているとともに、前記微小開口の間隔は前記蛍光検出手段の分解能と同じか又は前記蛍光検出手段の分解能よりも大きいことを特徴とする。
【００２３】
この構成によれば、複数の微小開口のうちの任意の微小開口において蛍光性生体分子の蛍光を観察することができるので、蛍光検出手段の位置合わせが容易になる。また、微小開口の間隔は蛍光検出手段の分解能と同じか又は蛍光検出手段の分解能よりも大きいので、それぞれの微小開口によって励起された個々の蛍光性生体分子の蛍光を分離して、１分子レベルで生体分子間相互作用を検出することができる。
【００２４】
本発明の請求項７記載の生体分子間相互作用解析方法は、励起光の波長よりも小さい微小開口から前記励起光によるエバネッセント場を発生させ、このエバネッセント場の領域をブラウン運動により通過する蛍光性生体分子を励起させ、その蛍光性生体分子の蛍光を検出することを特徴とする。
【００２５】
この構成によれば、励起光の波長より小さい領域で励起光を蛍光性生体分子に照射することができ、生体分子間相互作用を１分子レベルで検出、定量することができる。
【００２６】
本発明の請求項８記載の生体分子間相互作用解析方法は、励起光の波長よりも小さい微小開口から前記励起光によるエバネッセント場を発生させ、この微小開口に付着させた第一の蛍光性生体分子と、前記エバネッセント場の領域にあって前記第一の蛍光性生体分子と相互作用する第二の蛍光性生体分子とを励起させ、これら第一の蛍光生体分子と第二の蛍光性生体分子の蛍光をそれぞれ検出することを特徴とする。
【００２７】
この構成によれば、励起光の波長より小さい領域で励起光を蛍光性生体分子に照射することができ、生体分子間相互作用を１分子レベルで検出、定量することができる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。はじめに、図１、図２に基づき、本発明の微小開口膜の一実施例について説明する。１は微小開口膜であり、解析対象となる蛍光色素で標識化した蛍光性生体分子２を励起する励起光３を透過しない薄膜によって構成されている。この微小開口膜１は、ガラスなどの透明な基板４に結合されており、例えば、蒸着などの手段によって、アルミニウム，クロム，金，銀，ゲルマニウムなどの金属や、炭化シリコン（ＳｉＣ）などの薄膜を基板４上に形成したものである。
【００２９】
この微小開口膜１には、前後左右方向にそれぞれ間隔ｄを隔てて等間隔に整然と配列した複数の微小開口５が形成されている。この微小開口５は直径φの円形に形成されている。なお、微小開口５は、必ずしも円形である必要はなく、微小開口５が円形でない場合は、直径φを微小開口５の最大開口幅とする。
【００３０】
そして、微小開口５の直径φは、励起光３の波長λｅｘよりも小さくなっている。なお、この直径φはできる限り小さいほうが好ましい。すなわち、直径φが小さいほど、後述するエバネッセント場６の領域が小さくなり、１分子レベルで蛍光性生体分子２を励起させるためには好都合であるため、好ましくは、直径φを２００ｎｍ以下とし、さらに好ましくは２０ｎｍ以下とする。
【００３１】
また、１分子レベルで蛍光性生体分子２が発する蛍光を検出するために、微小開口５の間隔ｄは、蛍光性生体分子２の蛍光７を検出する、後述する蛍光検出手段１２を構成する光学顕微鏡の対物レンズ１３の分解能と同じかそれよりも大きくなっている。すなわち、検出する光がコヒーレントでない場合、前記対物レンズ１３の開口数ＮＡに対し、蛍光７の波長をλｅｍとすると、その対物レンズ１３の分解能は式０．６１λｅｍ／ＮＡで表されるので、微小開口５の間隔ｄは、ｄ≧０．６１λｅｍ／ＮＡの式を満足する値になっている。例えば、蛍光７の波長λｅｍが５００ｎｍの場合、対物レンズ１３の開口数ＮＡが１．２として、対物レンズ１３の分解能は０．６１λｅｍ／ＮＡ≒２５０ｎｍとなる。したがって、開口数ＮＡが１．２の対物レンズ１３を用いる場合は、微小開口５の間隔ｄが２５０ｎｍ以上の微小開口膜１を用いれば、１分子レベルで蛍光性生体分子２が発する蛍光を検出することができることになる。
【００３２】
つぎに、作用について説明する。図２に示すように、基板４の微小開口膜１の結合していない側から励起光３を入射すると、微小開口５で励起光３の染み出し、すなわちエバネッセント場６が発生する。このエバネッセント場６の大きさは、微小開口５の大きさと同程度であり、微小開口５に近接した励起光３の波長λｅｘよりも小さい領域にある蛍光性生体分子２が局所的に励起され、蛍光７を発する。また、多数の微小開口５が、前記光学顕微鏡の対物レンズ１３の分解能よりも離れて配置しているため、それぞれの微小開口５によって励起された個々の蛍光性生体分子２の蛍光７を分離して１分子計測することが可能である。
【００３３】
なお、エバネッセント場６は、浸入長１５０ｎｍ程度で減衰するので、エバネッセント場６の領域は微小開口５の面積に比例する。したがって、従来のように、微小開口膜１を通さないで界面の全反射によるエバネッセント場を用いて蛍光性生体分子２を励起する場合に、蛍光性生体分子２を１分子レベルで検出するためには、対物レンズ１３の分解能である直径２５０ｎｍの範囲内に１分子のみが存在するように、蛍光性生体分子２の濃度を５０ｎＭ以下にする必要があった。しかし、本発明の微小開口膜１を用いれば、微小開口５の直径が１００ｎｍのときは蛍光性生体分子２の濃度を３００ｎＭ程度まで、さらに、微小開口５の直径が２０ｎｍのときは蛍光性生体分子２の濃度を８０００ｎＭ程度、すなわち、従来の１００〜１０００倍程度にまで増加させることができる。したがって、生体分子がガラス面などに非特異的に吸着することによる悪影響を従来の１／１００程度まで飛躍的に減少させることができる。
【００３４】
以上のとおり、前記実施例の微小開口膜１は、微小開口５が設けられた光を透過しない薄膜からなるので、微小開口５の最大開口幅φを励起光３の波長λｅｘよりも小さくし、この微小開口５に励起光３を照射すれば、この微小開口５からエバネッセント場６が生じ、このエバネッセント場６を用いることで、励起光３の波長λｅｘより小さい領域で励起光３を蛍光性生体分子２に照射することが可能になる。
【００３５】
また、前記薄膜たる微小開口膜１は透明な基板４に結合されているので、基板４に微小開口膜１を支持することで微小開口膜１の製造性と取り扱い性を向上させることができる。また、基板４は透明なので励起光３の透過を妨げることがない。
【００３６】
また、前記微小開口５は複数設けられ略等間隔に配列されているので、複数の微小開口５のうちの任意の微小開口５において蛍光性生体分子２の蛍光７を観察することができるので、蛍光検出手段の位置合わせが容易になる。また、微小開口５の間隔ｄを蛍光検出手段の分解能と同じか又は蛍光検出手段の分解能よりも大きくすれば、それぞれの微小開口５によって励起された個々の蛍光性生体分子２の蛍光７を分離して、１分子レベルで生体分子間相互作用を検出することができる。
【００３７】
さらに、前記微小開口５の最大開口幅たる直径φは２００ｎｍ以下であるので、微小開口５の直径φを励起光３の波長λｅｘより小さくすることができる。
【００３８】
つぎに、本発明の生体分子間相互作用解析装置の第一実施例について、図３、図４を参照して説明する。この生体分子間相互作用解析装置は、前記微小開口膜１を用い、蛍光相関分光法（ＦＣＳ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によって蛍光性生体分子２が発する蛍光７の強度や、蛍光性生体分子２の拡散係数を求めるための装置である。なお、微小開口膜１の構成は前記実施例と同様であるので、同じ符号を付しその詳細な説明を省略する。
【００３９】
１１は、励起光を発生する励起光発生手段たるレーザーである。なお、レーザー１１の代わりにランプを用いても良い。このレーザー１１は、蛍光性生体分子２の励起光３を微小開口膜１に照射するように構成されている。蛍光性生体分子２が含まれる水溶液８は、基板４の微小開口膜１の結合している側と、カバーガラス９との間に保持されており、励起光３は基板４の微小開口膜１の結合していない側から照射されるように構成されている。
【００４０】
カバーガラス９の外側には、蛍光性生体分子２から発せられる蛍光７を検出する蛍光検出手段１２が備えられている。この蛍光検出手段１２は、顕微鏡（図示せず）の対物レンズ１３，光学フィルター１４，ピンホール１５，検出器１６を備えている。対物レンズ１３は蛍光性生体分子２から発せられる蛍光７を集め、光学フィルター１４は散乱などの背景光を取り除き、蛍光７のみを通過させるように配置されている。また、ピンホール１５は、単一の微小開口５からの蛍光７を検出するために配置されるものであって、ピンホール１５の穴の大きさは、対物レンズ１３の分解能×倍率程度となっている。なお、対物レンズ１３の分解能は、前述のとおり、対物レンズ１３の開口数ＮＡに対し、式０．６１λｅｍ／ＮＡで表される。そして、ピンホール１５を通過した蛍光７は、高感度の検出器１６で検出され、その検出信号はデジタルカウンターやデジタル相関器などで処理されて、従来のＦＣＳの手法に従い解析されるように構成されている。
【００４１】
つぎに、上記生体分子間相互作用解析装置を用いた解析方法について説明する。まず、蛍光性生体分子２を含む水溶液８を微小開口膜１とカバーガラス９の間に加え、顕微鏡に装着する。微小開口５の裏面から励起光３を入射してエバネッセント場６を発生させる。蛍光性生体分子２がエバネッセント場６を通過すると励起されて蛍光７を発する。この蛍光７を対物レンズ１３で集め、散乱などの背景光を光学フィルター１４で除き、蛍光７のみを通過させる。そして、光学フィルター１４を通過した蛍光７をピンホール１５に通し、単一の微小開口５からの蛍光７のみを検出器１６で検出する。その後、その検出信号は、デジタルカウンターやデジタル相関器などで処理して、従来のＦＣＳの手法に従い解析される。
【００４２】
以上のとおり、前記実施例の生体分子間相互作用解析装置は、励起光３を発生する励起光発生手段たるレーザー１１と、最大開口幅たる直径φが前記励起光３の波長λｅｘよりも小さい微小開口５が設けられた光を透過しない薄膜からなる微小開口膜１と、蛍光７を検出する蛍光検出手段１２とを備えたものであり、直径φが励起光３の波長λｅｘよりも小さい微小開口膜１の微小開口５にレーザー１１からの励起光３を照射し、この微小開口５に生じるエバネッセント場６を用いることで励起光３の波長λｅｘより小さい領域で励起光３を蛍光性生体分子２に照射することができ、この蛍光性生体分子２から発せられる蛍光７を蛍光検出手段１２で検出することができる。また、励起光３の波長λｅｘより小さい領域で励起光３を蛍光性生体分子２に照射することによって、蛍光性生体分子２の水溶液８中の濃度を高くすることができ、さらに、蛍光性生体分子２のガラス面たる基板４面への非特異的吸着の影響を抑えることができるので、生体分子間相互作用の検出、定量を確実に行うことができる。
【００４３】
また、前記微小開口５は複数設けられ等間隔に配列されているとともに、前記微小開口５の間隔ｄは前記蛍光検出手段１２を構成する対物レンズ１３の分解能と同じか又は対物レンズ１３の分解能よりも大きいので、複数の微小開口５のうちの任意の微小開口５において蛍光性生体分子２の蛍光７を観察することができるので、蛍光検出手段１２の位置合わせが容易になる。また、微小開口５の間隔は蛍光検出手段１２を構成する対物レンズ１３の分解能と同じか又は対物レンズ１３の分解能よりも大きいので、それぞれの微小開口５によって励起された個々の蛍光性生体分子２の蛍光７を分離して、１分子レベルで生体分子間相互作用を検出することができる。
【００４４】
さらに、前記実施例の生体分子間相互作用解析方法は、励起光３の波長λｅｘよりも小さい微小開口５から前記励起光３によるエバネッセント場６を発生させ、このエバネッセント場６の領域をブラウン運動により通過する蛍光性生体分子２を励起させ、その蛍光性生体分子２の蛍光７を検出するので、励起光３の波長λｅｘより小さい領域で励起光３を蛍光性生体分子２に照射することができ、生体分子間相互作用を１分子レベルで検出、定量することができる。
【００４５】
つぎに、本発明の生体分子間相互作用解析装置の第二実施例について、図５、図６を参照して説明する。この生体分子間相互作用解析装置は、前記微小開口膜１を用い、蛍光クロス相関分光法（ＦＣＣＳ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によって、それぞれ異なる蛍光波長をもつ蛍光分子で標識した蛍光性生体分子２ａ，２ｂが発する蛍光７（７ａ，７ｂ）から蛍光性生体分子２ａ，２ｂの生体分子間相互作用を検出するための装置である。なお、前記実施例と同様の部分には同じ符号を付しその詳細な説明を省略する。
【００４６】
１１は、励起光を発生する励起光発生手段たるレーザーである。なお、レーザー１１の代わりにランプを用いても良い。このレーザー１１は、２種類の蛍光性生体分子２ａ，２ｂに共通な励起光３を微小開口膜１に照射するように構成されている。蛍光性生体分子２ａ，２ｂが含まれる水溶液８は、基板４の微小開口膜１の結合している側と、カバーガラス９との間に保持されており、励起光３は基板４の微小開口膜１の結合していない側から照射されるように構成されている。
【００４７】
カバーガラス９の外側には、蛍光性生体分子２ａ，２ｂから発せられる蛍光７（７ａ，７ｂ）を検出する蛍光検出手段２１が備えられている。この蛍光検出手段２１は、顕微鏡（図示せず）の対物レンズ１３，ピンホール１５，ダイクロイックミラー２２，光学フィルター１４ａ，１４ｂ，検出器１６ａ，１６ｂを備えている。対物レンズ１３は蛍光性生体分子２ａ，２ｂから発せられる蛍光７（７ａ，７ｂ）を集め、ピンホール１５は、対物レンズ１３で集められた蛍光７の中から単一の微小開口５からの蛍光７（７ａ，７ｂ）を検出するために配置されるものである。なお、ピンホール１５の穴の大きさは、対物レンズ１３の分解能×倍率程度となっている。なお、対物レンズ１３の分解能は、前述のとおり、対物レンズ１３の開口数ＮＡに対し、式０．６１λｅｍ／ＮＡで表される。
【００４８】
ダイクロイックミラー２２は、特定の波長だけを透過させ、その他の波長を反射するものであり、ここでは、ピンホール１５を通過した蛍光７のうち、蛍光性生体分子２ａから発せられた蛍光７ａを透過させ、蛍光性生体分子２ｂから発せられた蛍光７ｂを反射するように構成されている。また、光学フィルター１４ａ，１４ｂは、ダイクロイックミラー２２で透過，反射された蛍光７ａ，７ｂを含む光の中から、散乱などの背景光を取り除き、蛍光７ａ，７ｂのみをそれぞれ通過させるように配置されている。そして、光学フィルター１４ａ，１４ｂを通過した蛍光７ａ，７ｂは、それぞれ高感度の検出器１６ａ，１６ｂで検出され、その検出信号はデジタルカウンターやデジタル相関器などで処理されて、従来のＦＣＣＳの手法に従い蛍光７ａ，７ｂのクロス相関をとることにより、蛍光性生体分子２ａと蛍光性生体分子２ｂの結合を検出するように構成されている。
【００４９】
つぎに、上記生体分子間相互作用解析装置を用いた解析方法について説明する。まず、蛍光性生体分子２ａ，２ｂを含む水溶液８を微小開口膜１とカバーガラス９の間に加え、顕微鏡に装着する。微小開口５の裏面から励起光７を入射してエバネッセント場６を発生させる。蛍光性生体分子２ａ，２ｂがエバネッセント場６を通過すると励起されてそれぞれ蛍光７ａ，７ｂを発する。この蛍光７ａ，７ｂを対物レンズ１３で集め、ピンホール１５に通し、単一の微小開口５からの蛍光７ａ，７ｂのみを通過させる。そして、ピンホール１５を通過した蛍光７ａ，７ｂを、ダイクロイックミラー２２を用いて分離する。すなわち、蛍光７ａはダイクロイックミラー２２を透過し、蛍光７ｂはダイクロイックミラー２２で反射される。そして、ダイクロイックミラー２２で分離された蛍光７ａ，７ｂは、それぞれ光学フィルター１４ａ，１４ｂによって散乱などの背景光が除かれる。光学フィルター１４ａ，１４ｂを通過した蛍光７ａ，７ｂは、その後、それぞれ検出器１６ａ，１６ｂによって検出される。
【００５０】
なお、図５の中央の微小開口５のように、蛍光性生体分子２ａと蛍光性生体分子２ｂが結合している場合は、蛍光性生体分子２ａと蛍光性生体分子２ｂの蛍光７ａ，７ｂが同時に観察される。一方、図５の両端の微小開口５のように、２つの蛍光性生体分子２ａ，２ｂが結合していない場合は、一方の蛍光７（蛍光７ａ又は蛍光７ｂ）しか検出されない。その検出信号はデジタルカウンターやデジタル相関器などで処理されて、従来のＦＣＣＳの手法に従い、蛍光７ａ，７ｂのクロス相関をとることにより、蛍光性生体分子２ａと蛍光性生体分子２ｂの結合を検出する。
【００５１】
以上のとおり、前記実施例の生体分子間相互作用解析装置は、励起光３を発生する励起光発生手段たるレーザー１１と、最大開口幅たる直径φが前記励起光３の波長λｅｘよりも小さい微小開口５が設けられた光を透過しない薄膜からなる微小開口膜１と、蛍光７（７ａ，７ｂ）を検出する蛍光検出手段２１とを備えたものであり、直径φが励起光３の波長λｅｘよりも小さい微小開口膜１の微小開口５にレーザー１１からの励起光３を照射し、この微小開口５に生じるエバネッセント場６を用いることで励起光３の波長λｅｘより小さい領域で励起光３を蛍光性生体分子２ａ，２ｂに照射することができ、この蛍光性生体分子２ａ，２ｂから発せられる蛍光７ａ，７ｂを蛍光検出手段２１で検出することができる。また、励起光３の波長λｅｘより小さい領域で励起光３を蛍光性生体分子２ａ，２ｂに照射することによって、蛍光性生体分子２ａ，２ｂの水溶液８中の濃度を高くすることができ、さらに、蛍光性生体分子２ａ，２ｂのガラス面たる基板４面への非特異的吸着の影響を抑えることができるので、生体分子間相互作用の検出、定量を確実に行うことができる。
【００５２】
また、前記微小開口５は複数設けられ等間隔に配列されているとともに、前記微小開口５の間隔ｄは前記蛍光検出手段２１を構成する対物レンズ１３の分解能と同じか又は対物レンズ１３の分解能よりも大きいので、複数の微小開口５のうちの任意の微小開口５において蛍光性生体分子２ａ，２ｂの蛍光７ａ，７ｂを観察することができるので、蛍光検出手段２１の位置合わせが容易になる。また、微小開口５の間隔は蛍光検出手段２１を構成する対物レンズ１３の分解能と同じか又は対物レンズ１３の分解能よりも大きいので、それぞれの微小開口５によって励起された個々の蛍光性生体分子２ａ，２ｂの蛍光７ａ，７ｂを分離して、１分子レベルで生体分子間相互作用を検出することができる。
【００５３】
さらに、前記実施例の生体分子間相互作用解析方法は、励起光３の波長λｅｘよりも小さい微小開口５から前記励起光３によるエバネッセント場６を発生させ、このエバネッセント場６の領域をブラウン運動により通過する蛍光性生体分子２ａ，２ｂを励起させ、その蛍光性生体分子２ａ，２ｂの蛍光７ａ，７ｂを検出するので、励起光３の波長λｅｘより小さい領域で励起光３を蛍光性生体分子２ａ，２ｂに照射することができ、生体分子間相互作用を１分子レベルで検出、定量することができる。
【００５４】
つぎに、本発明の生体分子間相互作用解析装置の第三実施例について、図７、図８を参照して説明する。この生体分子間相互作用解析装置は、前記微小開口膜１を用い、１分子蛍光イメージ法、或いは、多分子の蛍光顕微定量法によって、それぞれ異なる蛍光波長をもつ蛍光分子で標識した蛍光性生体分子２ａ，２ｂを用いて、蛍光性生体分子２ｂが発する蛍光７ｂから蛍光性生体分子２ａ，２ｂの生体分子間相互作用を検出するための装置である。なお、前記実施例と同様の部分には同じ符号を付しその詳細な説明を省略する。
【００５５】
１１は、励起光を発生する励起光発生手段たるレーザーである。なお、レーザー１１の代わりにランプを用いても良い。このレーザー１１は、励起光３を微小開口膜１に照射するように構成されている。蛍光性生体分子２ａは、微小開口５に付着しており、蛍光性生体分子２ｂが含まれる水溶液８は、基板４の微小開口膜１の結合している側と、カバーガラス９との間に保持されている。そして、励起光３は基板４の微小開口膜１の結合していない側から照射されるように構成されている。
【００５６】
カバーガラス９の外側には、蛍光性生体分子２ａ，２ｂから発せられる蛍光７（７ａ，７ｂ）を検出する蛍光検出手段３１が備えられている。この蛍光検出手段３１は、顕微鏡（図示せず）の対物レンズ１３，光学フィルター１４，カメラ３２を備えている。対物レンズ１３は蛍光性生体分子２ａ，２ｂから発せられる蛍光７（７ａ，７ｂ）を集め、光学フィルター１４は散乱などの背景光を取り除き、蛍光７（７ａ，７ｂ）のみを通過させるように配置されている。なお、対物レンズ１３の分解能は、前述のとおり、対物レンズ１３の開口数ＮＡに対し、式０．６１λｅｍ／ＮＡで表される。そして、光学フィルター１４を通過した蛍光７（７ａ，７ｂ）の像は、高感度のカメラ３２で検出されるように構成されている。
【００５７】
つぎに、上記生体分子間相互作用解析装置を用いた解析方法について説明する。まず、蛍光性生体分子２ａを含む水溶液を微小開口膜１とカバーガラス９の間に加え、蛍光性生体分子２ａを微小開口５に付着させる。微小開口５に付着しなかった蛍光性生体分子２ａを洗い流した後、別の蛍光性生体分子２ｂを含む水溶液８を微小開口膜１とカバーガラス９の間に加え、顕微鏡に装着する。微小開口５の裏面から励起光７を入射してエバネッセント場６を発生させる。
【００５８】
まず、蛍光性生体分子２ａを励起して、その蛍光７ａの像をカメラ３２で観察して蛍光性生体分子２ａの位置を確認しておく。１分子蛍光イメージング法の場合は、個々の微小開口５に関し、付着した蛍光性生体分子２ａの数が１以下になるように調節する。多分子の蛍光顕微定量法の場合は、個々の微小開口５に関し、付着した蛍光性生体分子２ａの数を１以上の任意の値に設定することが可能である。
【００５９】
つぎに、別の蛍光性生体分子２ｂを励起して、その蛍光７ｂの像をカメラ３２で捉えることによって、微小開口５に付着した蛍光性生体分子２ａと別の蛍光性生体分子２ｂの結合、解離などの相互作用の様子を観察する。なお、１分子蛍光イメージング法の場合は、個々の微小開口５ごとに解析を行う。また、１分子蛍光イメージング法で用いる装置と同じ装置を用いて、観測する分子を多くすれば多分子の蛍光顕微定量法による観測を行うことができるが、多分子の蛍光顕微定量法の場合は、複数の微小開口５からの蛍光７ｂを同時に検出する。したがって、多分子の蛍光顕微定量法の場合は、カメラ３２以外に、光電子倍増管などの検出器を用いてもよい。以上の方法で、生体分子間相互作用の結合速度定数，解離速度定数，解離定数などを得ることができる。
【００６０】
以上のとおり、前記実施例の生体分子間相互作用解析装置は、励起光３を発生する励起光発生手段たるレーザー１１と、最大開口幅たる直径φが前記励起光３の波長λｅｘよりも小さい微小開口５が設けられた光を透過しない薄膜からなる微小開口膜１と、蛍光７（７ａ，７ｂ）を検出する蛍光検出手段３１とを備えたものであり、直径φが励起光３の波長λｅｘよりも小さい微小開口膜１の微小開口５にレーザー１１からの励起光３を照射し、この微小開口５に生じるエバネッセント場６を用いることで励起光３の波長λｅｘより小さい領域で励起光３を蛍光性生体分子２ａ，２ｂに照射することができ、この蛍光性生体分子２ａ，２ｂから発せられる蛍光７ａ，７ｂを蛍光検出手段３１で検出することができる。また、励起光３の波長λｅｘより小さい領域で励起光３を蛍光性生体分子２ａ，２ｂに照射することによって、蛍光性生体分子２ａ，２ｂの水溶液８中の濃度を高くすることができ、さらに、蛍光性生体分子２ａ，２ｂのガラス面たる基板４面への非特異的吸着の影響を抑えることができるので、生体分子間相互作用の検出、定量を確実に行うことができる。
【００６１】
また、前記微小開口５は複数設けられ等間隔に配列されているとともに、前記微小開口５の間隔ｄは前記蛍光検出手段３１を構成する対物レンズ１３の分解能と同じか又は対物レンズ１３の分解能よりも大きいので、複数の微小開口５のうちの任意の微小開口５において蛍光性生体分子２ａ，２ｂの蛍光７を観察することができるので、蛍光検出手段３１の位置合わせが容易になる。また、微小開口５の間隔は蛍光検出手段３１を構成する対物レンズ１３の分解能と同じか又は対物レンズ１３の分解能よりも大きいので、それぞれの微小開口５によって励起された個々の蛍光性生体分子２ａ，２ｂの蛍光７ａ，７ｂを分離して、１分子レベルで生体分子間相互作用を検出することができる。
【００６２】
さらに、前記実施例の生体分子間相互作用解析方法は、励起光３の波長λｅｘよりも小さい微小開口５から前記励起光３によるエバネッセント場６を発生させ、この微小開口５に付着させた第一の蛍光性生体分子２ａと、前記エバネッセント場６の領域にあって前記第一の蛍光性生体分子２ａと相互作用する第二の蛍光性生体分子２ｂとを励起させ、これら第一の蛍光生体分子２ａと第二の蛍光性生体分子２ｂの蛍光７ａ，７ｂをそれぞれ検出するので、励起光３の波長より小さい領域で励起光３を蛍光性生体分子２ａ，２ｂに照射することができ、生体分子間相互作用を１分子レベルで検出、定量することができる。
【００６３】
以上、上記実施例で詳細に説明したとおり、本発明は、微小開口からのエバネッセント場の生成，１分子蛍光イメージング法，ＦＣＳ，ＦＣＣＳなどの既知の方法を巧みに組み合わせることにより、従来の原理的な問題を解決して水溶液中に従来の限界濃度の１００〜１０００倍もの高濃度の分子を加えることを可能にしたほか、ガラス面などへの非特異的吸着の影響を従来の１／１００程度にまで抑えることを可能にしている。
【００６４】
そして、本発明は、生体分子間相互作用を１分子レベルで高感度に定量することを可能とするものであって、生物学、医学、薬学などの広範な分野で利用可能である。特に、ポストゲノム研究として、タンパク質間相互作用の研究が重要になっているが、本発明により、生体分子間相互作用、特に、タンパク質間相互作用を１分子レベルで高感度に検出し、機能解析を行ことが可能になる。そして、本発明によれば、従来は不可能であった結合定数が１０６Ｍよりも小さい弱い相互作用を検出することができる。本発明は、ＤＮＡチップやタンパク質チップに直ちに応用可能であり、タンパク質間相互作用の解析に大きな威力を発揮するであろう。
【００６５】
なお、本発明は上記の実施例に限定されるものでなく、本発明の要旨の範囲内において種々の変形実施が可能である。例えば、微小開口が多数ある微小開口膜を例にとって説明したが、微小開口が１つの微小開口膜であってもよい。
【００６６】
【発明の効果】
本発明の請求項１記載の微小開口膜は、微小開口が設けられた光を透過しない薄膜からなるものであり、微小開口の最大開口幅を励起光の波長よりも小さくし、この微小開口に励起光を照射すれば、この微小開口からエバネッセント場が生じ、このエバネッセント場を用いることで、励起光の波長より小さい領域で励起光を蛍光性生体分子に照射することが可能になる。
【００６７】
本発明の請求項２記載の微小開口膜は、請求項１において、前記薄膜は透明な基板に結合されているものであり、基板に薄膜を支持することで薄膜の製造性と取り扱い性を向上させることができる。また、基板は透明なので励起光の透過を妨げることがない。
【００６８】
本発明の請求項３記載の微小開口膜は、請求項１又は２において、前記微小開口は複数設けられ略等間隔に配列されているものであり、複数の微小開口のうちの任意の微小開口において蛍光性生体分子の蛍光を観察することができるので、蛍光検出手段の位置合わせが容易になる。また、微小開口の間隔を蛍光検出手段の分解能と同じか又は蛍光検出手段の分解能よりも大きくすれば、それぞれの微小開口によって励起された個々の蛍光性生体分子の蛍光を分離して、１分子レベルで生体分子間相互作用を検出することができる。
【００６９】
本発明の請求項４記載の微小開口膜は、請求項１〜３のいずれか１項において、前記微小開口の最大開口幅は２００ｎｍ以下であり、微小開口の最大開口幅を励起光の波長より小さくすることができる。
【００７０】
本発明の請求項５記載の生体分子間相互作用解析装置は、励起光を発生する励起光発生手段と、最大開口幅が前記励起光の波長よりも小さい微小開口が設けられた光を透過しない薄膜からなる微小開口膜と、蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたものであり、最大開口幅が励起光の波長よりも小さい微小開口膜の微小開口に励起光発生手段からの励起光を照射し、この微小開口に生じるエバネッセント場を用いることで励起光の波長より小さい領域で励起光を蛍光性生体分子に照射することができ、この蛍光性生体分子から発せられる蛍光を蛍光検出手段で検出することができる。また、励起光の波長より小さい領域で励起光を蛍光性生体分子に照射することによって、蛍光性生体分子の水溶液中の濃度を高くすることができ、さらに、蛍光性生体分子のガラス面などへの非特異的吸着の影響を抑えることができるので、生体分子間相互作用の検出、定量を確実に行うことができる。
【００７１】
本発明の請求項６記載の生体分子間相互作用解析装置は、請求項５において、前記微小開口は複数設けられ等間隔に配列されているとともに、前記微小開口の間隔は前記蛍光検出手段の分解能と同じか又は前記蛍光検出手段の分解能よりも大きいものであり、複数の微小開口のうちの任意の微小開口において蛍光性生体分子の蛍光を観察することができるので、蛍光検出手段の位置合わせが容易になる。また、微小開口の間隔は蛍光検出手段の分解能と同じか又は蛍光検出手段の分解能よりも大きいので、それぞれの微小開口によって励起された個々の蛍光性生体分子の蛍光を分離して、１分子レベルで生体分子間相互作用を検出することができる。
【００７２】
本発明の請求項７記載の生体分子間相互作用解析方法は、励起光の波長よりも小さい微小開口から前記励起光によるエバネッセント場を発生させ、このエバネッセント場の領域をブラウン運動により通過する蛍光性生体分子を励起させ、その蛍光性生体分子の蛍光を検出するものであり、励起光の波長より小さい領域で励起光を蛍光性生体分子に照射することができ、生体分子間相互作用を１分子レベルで検出、定量することができる。
【００７３】
本発明の請求項８記載の生体分子間相互作用解析方法は、励起光の波長よりも小さい微小開口から前記励起光によるエバネッセント場を発生させ、この微小開口に付着させた第一の蛍光性生体分子と、前記エバネッセント場の領域にあって前記第一の蛍光性生体分子と相互作用する第二の蛍光性生体分子とを励起させ、これら第一の蛍光生体分子と第二の蛍光性生体分子の蛍光をそれぞれ検出するものであり、励起光の波長より小さい領域で励起光を蛍光性生体分子に照射することができ、生体分子間相互作用を１分子レベルで検出、定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の微小開口膜の一実施例を示す正面図である。
【図２】同上微小開口によるエバネッセント場の発生を示す模式図である。
【図３】本発明の生体分子間相互作用解析装置の第一実施例を示す微小開口を用いたＦＣＳの測定原理の模式図である。
【図４】同上微小開口を用いたＦＣＳ装置の模式図である。
【図５】本発明の生体分子間相互作用解析装置の第二実施例を示す微小開口を用いたＦＣＣＳの測定原理の模式図である。
【図６】同上微小開口を用いたＦＣＣＳ装置の模式図である。
【図７】本発明の生体分子間相互作用解析装置の第三実施例を示す微小開口を用いた１分子蛍光イメージング法の測定原理の模式図である。
【図８】同上微小開口を用いた１分子蛍光イメージング装置の模式図である。
【図９】従来の全反射によるエバネッセント場を用いた生体分子観察法を示す模式図である。
【図１０】従来のＦＣＳの原理を示す模式図である。
【符号の説明】
１  微小開口膜
２，２ａ，２ｂ  蛍光性生体分子
３  励起光
４  基板
５  微小開口
６  エバネッセント場
７，７ａ，７ｂ  蛍光
１１  レーザー（励起光発生手段）
１２，２１，３１  蛍光検出手段
１３  対物レンズ（蛍光検出手段）
ｄ  間隔
φ  直径（最大開口幅）
λｅｘ  波長
【図１】
2004163122.tif 000003
【図２】
2004163122.tif 000004
【図３】
2004163122.tif 000005
【図４】
2004163122.tif 000006
【図５】
2004163122.tif 000007
【図６】
2004163122.tif 000008
【図７】
2004163122.tif 000009
【図８】
2004163122.tif 000010
【図９】
2004163122.tif 000011
【図１０】
2004163122.tif 000012