(57)【要約】【課題】熱安定性の高い新規なフラビンレダクターゼ及びそれをコードするＤＮＡが提供する。【解決手段】電子供与体としてＮＡＤＨおよび電子受容体としてＦＭＮを基質とし、ＮＡＤ＋およびＦＭＮＨ２を生成する作用を示し、その反応の至適温度が６５℃から７５℃の範囲にあり、ｐＨ７で７０℃以下の温度においては、３０分間放置してもその活性を８０％以上保持しているフラビンレダクターゼ。【選択図】　　図１
2004113040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子供与体としてＮＡＤＨ、および電子受容体としてＦＭＮを基質とし、ＮＡＤ＋およびＦＭＮＨ２を生成する作用を示し、その反応の至適温度が６５℃から７５℃の範囲にあり、ｐＨ７で７０℃以下の温度においては、３０分間放置してもその活性を８０％以上保持しているフラビンレダクターゼ。
【請求項２】
Ｎ末端から３０残基目までのアミノ酸配列が配列表の配列番号：１記載の請求項１記載のフラビンレダクターゼ。
【請求項３】
アミノ酸配列が、配列表の配列番号：３記載の配列である請求項１または２記載のフラビンレダクターゼ。
【請求項４】
フラビンレダクターゼをコードする塩基配列であって、
（ａ）配列表の配列番号：４記載の塩基配列または、
（ｂ）前記配列番号：４の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載のＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項６】
請求項５に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養して、該形質転換体に組み込まれたプラスミドの有する塩基配列によりコードされたフラビンレダクターゼを生産させることを特徴とするフラビンレダクターゼの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フラビンレダクターゼ依存型酵素による酸化還元反応を産業上実用的な実現するために重要な、新規フラビンレダクターゼ及び該酵素をコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡで形質転換された形質転換細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フラビンレダクターゼの起源としては、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）　属（Ａｐｐｌｉｅｄ　　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．　６７，　Ｎｏ．　３，　ｐ１１７９−１１８４，　２００２　年）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　　ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｖｏｌ．９０，Ｎｏ．６，ｐ６０７−６１３，２０００年）などの細菌、放線菌に属する微生物が知られている。それらに由来するフラビンレダクターゼの物理化学的特性、生化学的特性、アミノ酸配列、ＤＮＡ配列などが報告されている。また、フラビンレダクターゼの工業的利用に関して、ロドコッカススピーシーズＩＧＴＳ８由来のフラビンレダクターゼによるジベンゾチオフェンの酸化的脱硫などが報告されている（特許公表２００２−５１５７２７）。
【０００３】
しかしながら、これらのフラビンレダクターゼの熱安定性は必ずしも高くない。最も熱安定性の高いパエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のフラビンレダクターゼでも、６５℃で３０分間熱処理した際の残存活性は２０％と報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｖｏｌ．９０，Ｎｏ．６，ｐ６０７−６１３，２０００年）。産業上実用的にフラビンレダクターゼを利用するためには、より熱安定性の高いフラビンレダクターゼが望まれていた。
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５１５７２７公報）
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｖｏｌ．９０，Ｎｏ．６，ｐ６０７−６１３，２０００年）
【０００６】
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｖｏｌ．９０，Ｎｏ．６，ｐ６０７−６１３，２０００年）
【０００７】
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｖｏｌ．９０，Ｎｏ．６，ｐ６０７−６１３，２０００年）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、産業上実用的な熱安定性を持つ新規なフラビンレダクターゼ及び該酵素をコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡで形質転換された形質転換細胞及びその生産方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく、種々の微生物由来のフラビンレダクターゼについて、それらの熱安定性を評価したところ、好熱性バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌である、バチルス・エスピーＤＳＭ４１１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＤＳＭ４１１）に、熱安定性の高いフラビンレダクターゼを見出した。そして、本酵素を単離精製しその物理的・生化学的性状、アミノ酸配列およびＤＮＡ配列を明らかにし、さらにその形質転換細胞による効率的生産方法を開発することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
上記の本発明者らによる新たな知見に基づいて成された本発明は以下の各態様を含むものである。
（１）　電子供与体としてＮＡＤＨ、および電子受容体としてＦＭＮを基質とし、ＮＡＤ＋およびＦＭＮＨ２を生成する作用を示し、その反応の至適温度が６５℃から７５℃の範囲にあり、ｐＨ７で７０℃以下の温度においては、３０分間放置してもその活性を８０％以上保持しているフラビンレダクターゼ。
（２）　Ｎ末端から３０残基目までのアミノ酸配列が配列表の配列番号：１記載の請求項１記載のフラビンレダクターゼ。
（３）　アミノ酸配列が、配列表の配列番号：３記載の配列である請求項１または２記載のフラビンレダクターゼ。
（４）　フラビンレダクターゼをコードする塩基配列であって、
（ａ）配列表の配列番号：４記載の塩基配列または、
（ｂ）前記配列番号：４の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（５）　請求項４記載のＤＮＡを含むプラスミド。
（６）　請求項５に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換細胞。
（７）　請求項６に記載の形質転換体を培養して、該形質転換体に組み込まれたプラスミドの有する塩基配列によりコードされたフラビンレダクターゼを生産させることを特徴とするフラビンレダクターゼの生産方法。
【００１１】
本発明にかかるフラビンレダクターゼを用いることでフラビンレダクターゼ依存型酵素による酸化還元反応を産業上実用的に行うことができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明にかかるフラビンレダクターゼは、電子供与体としてＮＡＤＨ、および電子受容体としてＦＭＮを基質とし、ＮＡＤ＋およびＦＭＮＨ２を生成する作用を示し、その反応の至適温度が６５℃から７５℃の範囲にあり、ｐＨ７で７０℃以下の温度においては、３０分間放置してもその活性を８０％以上保持しているという特性により規定することができる。
【００１３】
以下に本発明を詳細に説明するが、本発明にかかるフラビンレダクターゼは上記の特性を有するものであり、上記特性を有する酵素であれば、いかなる微生物由来であっても本発明に包含されるものとする。
【００１４】
（１）フラビンレダクターゼを含有する微生物及び培養法
本発明による新規なフラビンレダクターゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＤＳＭ４１１から単離・精製した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＤＳＭ４１１は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）、ＡＴＣＣ、ＪＣＭなどの菌株保存機関より分譲を受けることができる。
【００１５】
本微生物の培養は、公知の培養方法に準じて行うことができる。使用する培地は、一般微生物の栄養源として公知のものが使用でき、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ＮＺアミン等の有機栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、デンプン、有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム、鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用できる。培地のｐＨは、６〜９の範囲で選べばよく、培養温度は３０〜８０℃、好ましくは４５〜５５℃で好気的に培養を行う。培養期間は１〜７日間の範囲で目的のフラビンレダクターゼの含量が最大になるまで培養すればよい。
【００１６】
（２）フラビンレダクターゼの精製
フラビンレダクターゼの精製は、通常の酵素精製法を用いることができる。培養収量液より遠心分離等により菌体を集め、超音波処理、フレンチプレス、ダイノミル等の機械的方法によって菌体を破砕する。細胞片等の固形物を遠心により除き、粗酵素液を得る。次に硫酸アンモニウム等による塩析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、結晶化等を行うことにより精製される。これについては実施例にて１例を記載する。
【００１７】
（３）フラビンレダクターゼの活性測定法
２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭＮＡＤＨ、０．０２ｍＭＦＭＮ、および適当量のフラビンレダクターゼからなる０．５ｍｌの反応液中で酵素反応を行う。反応は６５℃で行い、この際分光光度計を用いて３４０ｎｍの吸光度をモニターする。ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸光係数をε＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１とし、３４０ｎｍの吸光度の減少速度からＮＡＤＨの減少速度を算出することにより酵素活性を算出した。酵素活性をあらわす単位Ｕは、μｍｏｌ／ｍｇ・ｍｉｎとする。酵素の添加量は、３４０ｎｍの吸光度減少速度から適切な添加量を設定すればよい。
【００１８】
（４）酵素の均一性
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をトリス−グリシン緩衝液を用い４−２０％ゲルにて、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ．２２７．６８０．１９７０年）で行った。クマシーブルーで染色後、均一な１本のタンパク質バンドが見られ、公知の標準タンパク質との比較から、このタンパク質の分子量は、１６０００±２０００となった。
【００１９】
（５）Ｎ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列の決定法
精製されたフラビンレダクターゼのＮ末端及び内部アミノ酸配列は、各種アミノ酸シーケンサーで決定するすることができる。内部アミノ酸配列については、精製されたフラビンレダクターゼをＣＮＢｒ等で処理し部分分解したのち、高速液体クロマトグラフィーで断片を取得することで解析することができる。
この結果、配列表１に示したＮ末端アミノ酸配列の３０残基及び配列表１に示した内部アミノ酸配列の１９残基を決定した。
また本発明におけるフラビンレダクターゼの熱安定性は、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した酵素溶液を、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００℃の各温度にて３０分間熱処理を行った後、上記の活性測定法と同様の方法で酵素反応を行い、熱処理を施さない酵素の活性を１００％として活性の残存残存率を算出することにより規定することができる。
さらに本発明におけるフラビンレダクターゼの至適反応温度は、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した酵素溶液を、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００℃の各温度で、上記の活性測定法に準じてと酵素反応を行うことで規定することができる。
【００２０】
本発明にかかるフラビンレダクターゼの物性は以下のとおりである。
分子量　：１６０００±２０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
至適ｐＨ：ｐＨ５〜７
至適温度：６５℃〜７５℃
熱安定性：７０℃／３０分の熱処理で８０％の残存活性を示す。
基質特異性：電子受容体　ＦＭＮ、ＦＡＤ及びリボフラビン、ルミフラビン等のフラビン化合物、４−ニトロアセトフェノン、４−ニトロ安息香酸等の芳香族ニトロ化合物、メチレンブルー等を電子受容体とする。なかでも、ＦＭＮが最も好適な電子受容体である。
電子供与体　ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨを電子供与体とするが、ＮＡＤＰＨを電子供与体とするときの活性は、ＮＡＤＨを電子供与体とするときの１０％以下である。
【００２１】
本発明におけるフラビンレダクターゼの一態様は、配列表の配列番号：３に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号：３に記載のアミノ酸配列に１もしくは２以上、好ましくは数個のアミノ酸がフラビンレダクターゼ活性を保持する範囲内で置換、欠失、修飾または挿入または付加されたアミノ酸配列を有する。
【００２２】
本発明におけるフラビンレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは配列表の配列番号：４に記載の塩基配列を含む。配列番号：４に示す塩基配列は、配列番号：２に示すタンパク質をコードする。ただし、配列番号：４に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列には、配列番号：３に示す塩基配列のみならず、異なるコドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。更に適宜置換、欠失、修飾または挿入または付加を導入する事によりポリヌクレオチドのホモログを得る事も可能である。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは配列番号：４に示す塩基配列に対して、これによりコードされるＤ−アシルアミラーゼが所定の酵素活性を維持し得る範囲内で塩基の置換、欠失または付加を行って得られるものである。このホモログには、例えば、配列番号：４の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２３】
このストリンジェントな条件でのハイブリダイゼ−ションは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載の方法によって行なう事ができ、市販のシステムとしては、ＧｅｎｅＩｍａｇｅシステム（アマシャム）を挙げる事ができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイゼ−ションを行なう事ができる。試験すべきＤＮＡまたはＲＮＡ分子を転写した膜を製品プロトコールに従って、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダイゼ−ションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼ−ションバッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、１／２０溶のキット添付のブロッキング試薬及び２〜７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬としては例えば、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ‘ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２％（重量／容量）Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ、２％（重量／容量）ＦｉｃｌｌＴＭ４００、２％（重量／容量）ポリビニルピロリドンを５倍濃度で調製したものを１／２０に希釈して使用する事ができる。２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、より好ましくは３〜６×ＳＳＣ、更に好ましくは４〜５×ＳＳＣの濃度で使用する。ハイブリダイゼ−ションの温度は４０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行なった後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、最も好ましくは０．１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子をプローブに用いた標識を利用して識別する事ができる。
【００２４】
本発明の新規なフラビンレダクターゼをコードするＤＮＡは、例えば、以下の様な方法によって単離することができる。微生物からゲノムＤＮＡを精製し、制限酵素によって消化した後に得られたＤＮＡを超遠心分離もしくは電気泳動等によって、その長さによって分画する。その分画試料のＤＮＡを回収してプラスミドに組み込むことによってプラスミドライブラリーを作成する。その中からフラビンレダクターゼ遺伝子を持つクローンを選抜してフラビンレダクターゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含むプラスミドを取得する。
【００２５】
フラビンレダクターゼ遺伝子の選抜は、Ｎ末端アミノ酸及び内部アミノ酸配列からプローブとなるオリゴヌクレオチドを合成し、ハイブリダイゼーション等の方法で行うことができる。
そのプラスミドの塩基配列を解析することによって、目的のフラビンレダクターゼ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列が判明し、ＤＮＡの塩基配列からコードされているフラビンレダクターゼのアミノ酸配列を推定することが出来る。
【００２６】
上記のようにして単離された本発明のフラビンレダクターゼをコードするＤＮＡを、例えば宿主が大腸菌の場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（−）、ｐＳＣ１０１などに代表される発現用のプラスミドに組み込むことにより、フラビンレダクターゼ発現プラスミドが提供される。尚、形質転換に使用する宿主生物としては、組換えベクターが安定、かつ自律的に増殖可能で、さらに外来性ＤＮＡの形質が発現できるものであればよく、例として大腸菌が挙げられるが、特に大腸菌に限定されるものではない。
【００２７】
そして、本発明においては該プラスミドで形質転換して得られた形質転換体を公知の情報に基づいて、培養することができ、本発明のフラビンレダクターゼを産生させることができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行なう事が出来る。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、菌株が生育しフラビンレダクターゼを産生できる条件であれば特に制限はない。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１：バチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＤＳＭ４１１の培養
蒸留水１リットル中に、ポリペプトン５ｇ、グリセロール２ｇ、酵母エキス２ｇ、エーリッヒ肉エキス２ｇ、リン酸水素２カリウム２ｇ、リン酸水素１カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．１ｇ、塩化カルシウム０．０５ｇを含み、ｐＨ７．２に調整した液体培地にあらかじめブイヨン寒天プレートに生育させた菌体を接種し５５℃、１８時間振とう培養してフラビンレダクターゼの活性を有する菌体を得た。
【００３０】
実施例２：フラビンレダクターゼの精製
実施例１に示される方法でバチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＤＳＭ４１１を培養して菌体を回収し、０．０５Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に懸濁した。懸濁液の状態で超音波破砕機によって菌体を破砕し、冷却遠心分離にて菌体破砕物を除去し、Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　　ｅｘｔｒａｃｔを得た。
このＣｅｌｌ−ｆｒｅｅ　　ｅｘｔｒａｃｔを上記バッファーで平衡化したＱ−セファロースカラムに供し、同バッファーで洗浄後、０．１Ｍ塩化カリウムを含むバッファーで溶出し、フラビンレダクターゼ活性を持つ画分を得た。
次にこの画分を２．０Ｍ硫酸アンモニウムを含む上記バッファーで平衡化したフェニルトヨパールカラムに供し、同バッファーで洗浄後、１．４Ｍ硫酸アンモニウムを含むバッファーで溶出し、フラビンレダクターゼ活性を持つ画分を得た。
さらに、得られた画分を１．５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したＦＭＮ−アガロースカラムに供し、同バッファーおよび０．９Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で洗浄後、蒸留水で溶出し、フラビンレダクターゼ活性を持つ画分を得た。
最後に０．０５Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したスーパーデックスによるゲルクロマトグラフィーを行い、フラビンレダクターゼの精製酵素液を得た。精製過程の総括した結果を、表１に示した。
【００３１】
【表１】
2004113040.tif 000003
【００３２】
この精製酵素液の一部を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、分子量約１６０００Ｄａの位置にバンドを確認した。
この５６ｋＤａタンパク質についてＮ末端アミノ酸配列の分析をアミノ酸シークエンサーを用い行ったところ、配列番号：１に示す様に部分断片のアミノ酸配列であると決定された。
さらに、精製酵素液の一部をエバポレーターにより乾固させた後、７０％ギ酸に溶解させ、ＣＮＢｒを添加し、窒素を充填した容器中で一晩放置した。得られた標品をエバポレーターにより乾固し、０．１％トリフルオロ酢酸に溶解し、ＨＰＬＣに供した。Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８ＡＲカラムを用い、２０分まで０．１％トリフルオロ酢酸で洗浄後、２０分から１２０分にかけてアセトニトリル濃度を０から１００％まで上昇させて溶出し、ペプチド断片を分離した。
分取した断片のアミノ酸配列の分析をアミノ酸シークエンサーを用い行ったところ、配列番号：２に示す様に決定された。
【００３３】
実施例３：フラビンレダクターゼの熱安定性及び至適反応温度の測定
実施例２で得られたフラビンレダクターゼを、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解し、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００℃の各温度にて３０分間熱処理を行った。その後、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭＮＡＤＨ、０．０２ｍＭＦＭＮ、および適当量の熱処理酵素液からなる０．５ｍｌの反応液中で酵素反応を行った。反応は６５℃で行い、この際分光光度計を用いて３４０ｎｍの吸光度をモニターした。ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸光係数をε＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１とし、３４０ｎｍでの吸光度の減少速度からＮＡＤＨの減少速度を算出することにより酵素活性を算出した。熱処理を施さない際の酵素活性を１００％として、各熱処理後の活性残存残存率を算出した結果を図１に示した。
【００３４】
フラビンレダクターゼの至適反応温度は、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した酵素溶液を、反応温度のみを３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００℃の各温度に設定し、上記の活性測定法に準じてと酵素反応を行った。７０℃での酵素活性を１００％として、各反応温度の相対活性値を図２に示した。
【００３５】
実施例４：フラビンレダクターゼプローブの作製
実施例１に示した培養方法でバチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＤＳＭ４１１を２日間培養し、遠心分離で菌体を回収し、０．０５Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）で洗浄した。この菌体より「基礎生化学実験法２　抽出・分離・精製　阿南功一他著　丸善株式会社出版」記載によるバクテリアゲノムＤＮＡの分離方法に従い、ゲノムＤＮＡを調製した。
【００３６】
実施例２で決定したフラビンレダクターゼのＮ末端アミノ酸配列と内部アミノ酸配列をもとに、配列番号５及び配列番号６に示したフラビンレダクターゼ遺伝子増幅用プライマーを設計し、ＤＮＡ合成装置で合成した。
調製したゲノムＤＮＡとフラビンレダクターゼ遺伝子増幅用プライマーを用い以下の条件で、ＰＣＲを行いフラビンレダクターゼ遺伝子断片を増幅した。その結果、約４５０ｂｐの増幅断片を得た。
この増幅断片を、ロシュ・ダイアグノスティックス社製ジギキシゲニンラベルかキットを用い蛍光ラベルし、フラビンレダクターゼプローブとした。
【００３７】
2004113040.tif 000004
【００３８】
実施例５：フラビンレダクターゼプローブによるサザンハイブリダイゼーション
実施例４で調製したゲノムＤＮＡを各種制限酵素で完全消化し、アガロースゲル電気泳動を行った後、ＤＮＡをメンブレンにブロッティングし、実施例４で調製したフラビンレダクターゼプローブを用い、以下の条件でサザンハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼ−ションバッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、１／２０溶のキット添付のブロッキング試薬及び２〜７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬としては例えば、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ‘ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２％（重量／容量）Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ、２％（重量／容量）ＦｉｃｏｌｌＴＭ４００、２％（重量／容量）ポリビニルピロリドンを５倍濃度で調製したものを１／２０に希釈して使用する事ができる。２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、より好ましくは３〜６×ＳＳＣ、更に好ましくは４〜５×ＳＳＣの濃度で使用する。ハイブリダイゼ−ションの温度は４０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行なった後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、最も好ましくは０．１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、蛍光フラビンレダクターゼプローブがハイブリダイズしたＤＮＡ分子を検出した。
その結果、制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで完全消化した約５．５ｋｂの位置にバンドが検出された。
【００３９】
実施例６：　バチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＤＳＭ４１１のゲノミックＤＮＡライブラリー作成
実施例４調製したゲノムＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで完全消化してアガロースゲル電気泳動にてＤＮＡの長さによって分画し、約５．５ｋｂのＤＮＡを回収した。そのＤＮＡを、制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して５’末端を脱リン酸化したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＳＫ（−）に連結し、プラスミドライブラリーを作成した。このプラスミドライブラリーによって大腸菌ＤＨ５αを形質転換したものを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）アガロース培地に塗布して静置培養し、コロニーを出現させた。
【００４０】
実施例７：プラスミドライブラリーからのフラビンレダクターゼ遺伝子のクローニング
実施例６で出現した個々のコロニーをメンブレンにトランスファーし、フラビンレダクターゼプローブを用いコロニーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクローンを選抜した。
このクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素ＳａｌＩで消化し２．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＳＫ（−）に連結し、プラスミドｐＢＦＲ４１１を得た。さらに、２．２ｋｂの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーで決定した。塩基配列の決定はＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔを用い、同社製Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　３１０にて行った。その結果配列番号４に示すフラビンレダクターゼ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列が得られた。該フラビンレダクターゼ遺伝子の塩基配列をアミノ酸翻訳したものを配列番号３に示す。そのアミノ酸配列中には、実施例２で決定した配列番号１に示すフラビンレダクターゼＮ−末端アミノ酸配列及び配列番号２に示す内部アミノ酸配列が含まれた。また、該アミノ酸配列からフラビンレダクターゼの分子量は約１７ｋＤａと推定された。
【００４１】
実施例８：フラビンレダクターゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌によるフラビンレダクターゼの生産
（菌体懸濁液の調製）
実施例７で作製したプラスミドｐＢＦＲ４１１で形質転換した大腸菌をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及び１ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地で１６時間３７℃で振とう培養を行なった。培養後、遠心分離により集菌、０．０５Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．０）で洗浄後に菌体を０．０５Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．０）に懸濁した。
（フラビンレダクターゼ発現確認）
菌体懸濁を超音波葉再処理にかけ、無細胞抽出液を調製した。この無細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した結果、１６ＫＤａの位置にタンパク質のバンドが確認できた。
（フラビンレダクターゼ活性測定）
２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭＮＡＤＨ、０．０２ｍＭＦＭＮ、および適当量の無細胞抽出液からなる０．５ｍｌの反応液中で酵素反応を行った。反応は６５℃で行い、この際分光光度計を用いて３４０ｎｍの吸光度をモニターした。ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸光係数をε＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１とし、３４０ｎｍでの吸光度の減少速度からＮＡＤＨの減少速度を算出することにより酵素活性を算出した。
その結果、プラスミドｐＢＦＲ４１１で形質転換しない宿主大腸菌に対し約７倍のフラビンレダクターゼ活性が検出された。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、熱安定性の高い新規なフラビンレダクターゼ及びそれをコードするＤＮＡが提供される。本発明のフラビンレダクターゼは産業上の有用性に優れた酵素であり、フラビンレダクターゼ依存型酵素による酸化還元反応を産業上実用的に実現することができる。
【００４３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】フラビンレダクターゼの熱安定性を示す図である。
【図２】フラビンレダクターゼの至適反応温度を示す図である。
【図１】
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【図２】
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