(57)【要約】【課題】薄層流路をエッチング等により作製する必要が無く、安全かつ生産性よくフローセル化すること。【解決手段】薄膜電極が形成された絶縁性基板１と、試料導入用チューブ４及び試料排出用チューブ５が接続された高分子基板３を、穴開け加工を施した両面粘着性シート２で接着することにより薄層流路を有するフローセルとして構成されている。絶縁性基板１に接続されたサンプリング用キャピラリもしくはマイクロダイアリシスプローブにより試料溶液が導入される。フローセル化の際に目的とする流路の形に穴開け加工を施した両面粘着性シート２を、薄膜電極を有する絶縁性基板１と、フローセル化する高分子基板３との間に挟むことにより作製を行う。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薄膜電極が形成された絶縁性基板と、試料導入用キャピラリ及び排出用キャピラリが接続された高分子基板とを、穴開け加工を施した両面粘着性シートで接着することにより薄層流路を有するフローセルとし、前記高分子基板に接続されたサンプリング用キャピラリもしくはマイクロダイアリシスプローブにより試料溶液が導入されることを特徴とする電気化学オンライン型バイオセンサ。
【請求項２】
前記両面粘着性シートで形成した前記薄層流路の中心部から前記サンプリング用キャピラリもしくは前記マイクロダイアリシスプローブにより、前記薄層流路の中心部から試料を含む溶液が導入され、放射状に試料溶液がフローすることを特徴とする請求項１に記載の電気化学オンライン型バイオセンサ。
【請求項３】
前記両面粘着性シートで形成した前記薄層流路の一端に接続された前記サンプリング用キャピラリもしくは前記マイクロダイアリシスプローブにより導入された試料が、前記薄層流路内に集積化された電極上を通過し、該薄層流路のもう一端に接続された前記排出用キャピラリから廃液されることを特徴とする請求項１に記載の電気化学オンライン型バイオセンサ。
【請求項４】
前記両面粘着性シートには、円形、楕円又は矩形の穴開け加工が施され、該両面粘着性シートを用いて、これらの形状の前記薄層流路を形成することを特徴とする請求項１に記載の電気化学オンライン型バイオセンサ。
【請求項５】
前記薄層流路の中央に妨害物質を除去するための電極或いは酵素反応器が固定化され、該電極或いは酵素反応器を囲むように配置された複数の薄膜電極からなり、少なくとも一つ以上の電極に酵素やメディエータ等の生理活性物質と反応する物質が修飾されていることを特徴とする請求項２に記載の電気化学オンライン型バイオセンサ。
【請求項６】
絶縁性基板に薄膜電極を形成するとともに、高分子基板に試料導入用キャピラリ及び排出用キャピラリを接続し、前記絶縁性基板及び前記高分子基板を、穴開け加工を施した両面粘着性シートで接着することにより薄層流路を有するフローセルを形成し、前記高分子基板に接続されたサンプリング用キャピラリもしくはマイクロダイアリシスプローブにより試料溶液が導入されることを特徴とする電気化学オンライン型バイオセンサの製造方法。
【請求項７】
前記薄膜電極を有する基板ともう一方の基板を接着する際に穴開け加工を施した厚さ１μｍ以上、１ｍｍ以下の薄膜両面粘着性シートを用いることにより、常温で前記薄層流路を有するフローセルを形成することを特徴とする請求項６に記載の電気化学オンライン型バイオセンサの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気化学オンライン型バイオセンサ及びその製造方法に関し、より詳細には、生体内もしくは培養細胞近傍の生体物質を連続的に採取してフローセルに導入し、連続的に生体物質濃度を観測するための電気化学オンライン型バイオセンサ及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体機能の解明や医療現場での患者のオンサイトモニターのため、生体内分子をリアルタイムで計測しようとする試みが数多く報告されている。電気化学検出法を用いた生体分子の連続測定では、シリンジポンプ等を用いて培養細胞近傍溶液を連続的に吸引（例えば、非特許文献１参照）、もしくはマイクロダイアリシスプローブと呼ばれる微小透析膜を介して回収した生体分子を連続的に電極を有するフローセルに導入する方法が知られている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００３】
また、フローセル内には、目的とする分子と反応する酵素が固定化された電極を配置し、生成した過酸化水素を酸化或いは還元することにより検出、もしくは酵素反応による溶存酸素濃度の変化を、酵素センサを用いることにより連続的に生体物質濃度を観測する方法が報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
これら電気化学バイオセンサを用いて生体成分を検出する際には、生体内に広く存在するアスコルビン酸や尿酸等の易酸化物質が夾雑物質としてセンサに影響を与えるために正確に定量することが困難であった。このためフローセルに導入する直前に中空の白金チューブを接続し、これに電位を印加することによりアスコルビン酸等を酸化・分解し、検出電極でのアスコルビン酸等の影響を軽減させて定量を行っている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００５】
近年、これら電気化学オンライン型バイオセンサの時間・空間分解能を向上させるために、センサの小型化についても報告が行われている。具体的にはシリコンやガラス基板上に異方性エッチングやドライエッチング、ダイシングソー等により薄層流路を形成し、酵素が修飾された電極を有する基板と接合することにより、微小電気化学オンラインセンサを作製している（例えば、非特許文献５参照）。
【０００６】
【非特許文献１】
丹羽（Ｎｉｗａ）、堀内（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ）、鳥光（Ｔｏｒｉｍｉｔｓｕ）、バイオセンサンドバイオエレクトロニクス（Ｂｉｏｓｅｎｓｅｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，）、第１２巻、第３１１頁〜第３１９頁
【０００７】
【非特許文献２】
ルンテ（Ｌｕｎｔｅ）、スコット（Ｓｃｏｔｔ）、キッシンジャー（Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒ）、アナリティカルケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第６３巻、第７７３Ａ頁〜第７８０Ａ頁
【０００８】
【非特許文献３】
リーチ（Ｒｅａｃｈ）、ウイルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、アナリティカルケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第６４巻、第３８１Ａ頁〜第３８６Ａ頁
【０００９】
【非特許文献４】
オズボーン（Ｏｓｂｏｒｎｅ）、丹羽（Ｎｉｗａ）、加藤（Ｋａｔｏ）、山本（Ｙａｍａｍｏｔｏ）、ジャーナルオブニューロサイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、第７７巻、第１４３頁〜第１５０頁
【００１０】
【非特許文献５】
丹羽（Ｎｉｗａ）、栗田（Ｋｕｒｉｔａ）、堀内（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ）、鳥光（Ｔｏｒｉｍｉｔｓｕ）、エレクトロアナリシス（Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ）、第１１巻、第３５６頁〜第３６１頁
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
電気化学オンライン型バイオセンサでは、電極上もしくは流路内に目的とする生体分子と反応する酵素を固定化する必要がある。しかしながら、従来マイクロマシン技術で用いられてきた陽極接合法や熱融着法、フッ酸を用いた接合方法では、接合の際に固定化した酵素の活性が著しく低下してしまうという欠点があった。
【００１２】
また、接着剤を用いた接合では、酵素の活性を保つことは可能だが、望む形状と部分だけに接着層を形成、接合することが困難であり、接合の際に接着剤が試料溶液が流れる流路内に流れ込み、バイオセンサのセル電極としての歩留まりが低下し、生産性に欠けるという欠点があった。
【００１３】
また、薄層流路を形成する際に異方性エッチングでは酸、アルカリ溶液等の劇薬を用いる必要があり、ドライエッチング法では高価な装置を必要とし、長時間を要するという欠点があった。
【００１４】
一方、電気化学オンライン型バイオセンサを用いた生体測定では、夾雑物質として働くアスコルビン酸等を除去するため、白金チューブを接続すると、チューブ内では内容積も大きく、電気化学オンライン型バイオセンサでは時間分解能の低下につながるという欠点があった。また、チューブ内に妨害物質を除去する酵素などの生体分子を固定化するのは、再現性や機能の低下につながるという問題があった。
【００１５】
本発明は、このような問題に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、薄層流路をエッチング等により作製する必要が無く、かつ常温で、酸やアルカリ等も使用していないため酵素や抗体の活性を全く低下させることなく、安全かつ生産性よくフローセル化することが可能であるような電気化学オンライン型バイオセンサ及びその製造方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、このような目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、薄膜電極が形成された絶縁性基板と、試料導入用キャピラリ及び排出用キャピラリが接続された高分子基板とを、穴開け加工を施した両面粘着性シートで接着することにより薄層流路を有するフローセルとし、前記高分子基板に接続されたサンプリング用キャピラリもしくはマイクロダイアリシスプローブにより試料溶液が導入されることを特徴とする。
【００１７】
また、請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、前記両面粘着性シートで形成した前記薄層流路の中心部から前記サンプリング用キャピラリもしくは前記マイクロダイアリシスプローブにより、前記薄層流路の中心部から試料を含む溶液が導入され、放射状に試料溶液がフローすることを特徴とする。
【００１８】
また、請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、前記両面粘着性シートで形成した前記薄層流路の一端に接続された前記サンプリング用キャピラリもしくは前記マイクロダイアリシスプローブにより導入された試料が、前記薄層流路内に集積化された電極上を通過し、該薄層流路のもう一端に接続された前記排出用キャピラリから廃液されることを特徴とする。
【００１９】
また、請求項４に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、前記両面粘着性シートには、円形、楕円又は矩形の穴開け加工が施され、該両面粘着性シートを用いて、これらの形状の前記薄層流路を形成することを特徴とする。
【００２０】
また、請求項５に記載の発明は、請求項２に記載の発明において、薄層流路中央に妨害物質を除去するための電極或いは酵素反応器が固定化され、該電極或いは酵素反応器を囲むように配置された複数の薄膜電極からなり、少なくとも一つ以上の電極に酵素やメディエータ等の生理活性物質と反応する物質が修飾されていることを特徴とする。
【００２１】
また、請求項６に記載の発明は、絶縁性基板に薄膜電極を形成するとともに、高分子基板に試料導入用キャピラリ及び排出用キャピラリを接続し、前記絶縁性基板及び前記高分子基板を、穴開け加工を施した両面粘着性シートで接着することにより薄層流路を有するフローセルを形成し、前記高分子基板に接続されたサンプリング用キャピラリもしくはマイクロダイアリシスプローブにより試料溶液が導入されることを特徴とする。
【００２２】
また、請求項７に記載の発明は、請求項６に記載の発明において、前記薄膜電極を有する基板ともう一方の基板を接着する際に穴開け加工を施した厚さ１μｍ以上、１ｍｍ以下の薄膜両面粘着性シートを用いることにより、常温で前記薄層流路を有するフローセルを形成することを特徴とする。
【００２３】
このように、本発明は、フローセル化の際に目的とする流路の形に穴開け加工を施した両面粘着性の薄膜シートを、電極を有する基板とフローセル化する基板の間に挟むことにより作製を行う。これにより従来と比較し、薄層流路をエッチング等により作製する必要が無く、かつ常温で、酸やアルカリ等も使用していないため酵素や抗体の活性を全く低下させることなく、安全かつ生産性よくフローセル化することが可能である。
【００２４】
また、丸形薄膜電極とこれを同心円状に囲むように配置された複数の薄膜電極を用い、この丸形電極の中央から放射状に溶液が流れるよう薄層フローセルにすることにより、高効率に中央の丸形電極でアスコルビン酸などの妨害物質を除去し、周囲を取り囲む電極で目的物質を検出することが出来る。これにより従来と比較してデッドボリュームを大幅に増加させることなく易酸化物質の影響を除くことが可能である。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。
［実施形態１］
図１は、本発明による電気化学オンライン型バイオセンサの構造図である。
このバイオセンサは、主に薄膜電極を有する絶縁性基板１と、両面粘着性シート２と、高分子基板３と、試料導入用チューブ４と、試料排出用チューブ５とから構成されている。つまり、薄膜電極が形成された絶縁性基板１と、試料導入用チューブ４及び試料排出用チューブ５が接続された高分子基板３を、穴開け加工を施した両面粘着性シート２で接着することにより薄層流路を有するフローセルとして構成されている。
【００２６】
図２（ａ）〜（ｃ）は、本発明による電気化学オンライン型バイオセンサの製造に用いる各部品の詳細図で、図２（ａ）は絶縁性基板、図２（ｂ）は両面粘着性シート、図２（ｃ）は高分子基板を示している。図中符号１４は白金薄膜電極、１５は丸形薄膜電極、１６は下層に西洋わさびペルオキシターゼを含むオスミウムポリビニルピリジン錯体を上層にグルコース酸化酵素を修飾した積層膜で修飾した電極、１７は銀ペーストをコートした電極、１８はリング状溝、１９は試料導入用穴、２０は試料排出用穴を示している。
【００２７】
まず、薄膜電極が形成された絶縁性基板１は、ガラス基板上にポジ型フォトレジスト（富士ハント社製）を１μｍの厚みにスピナー（ミカサ社製）を用いてスピンコートを行い、マスクアライナーＰＬＡ５０１（キヤノン社製）を用いて露光し、アルカリ現像により電極パターンを形成した。その後、マグネトロンスパッタ装置（日本シード社製）に上述したレジストパターンを有するガラス基板を取り付け、チタンを５ナノメートルスパッタした後、そのまま真空を保ち、さらに白金を４５ｎｍスパッタした。レジスト及びチタン、白金を有するガラス基板をメチルエチルケトン中で超音波をかけながら剥離を行い、図２（ａ）に示すような白金薄膜電極パターン１４を形成した。
【００２８】
その後、電極パターンに沿い１２×２３ｍｍにダイシングソー（ディスコ社製）を用いて切り出した。さらに、中央の丸形薄膜電極１５を囲む電極の１つに西洋わさびペルオキシターゼを含むオスミウムポリビニルピリジン錯体を１μｌ（ｌはリットル）、キャスト法により修飾した。室温で１時間乾燥させた後、２％牛血清アルブミンに重量比２％になるようにグルコース酸化酵素を混合し、さらに終濃度０．２％になるようにグルタルアルデヒドを加えた溶液を、西洋わさびペルオキシターゼを含むオスミウムポリビニルピリジン錯体が修飾された白金薄膜電極１４上に１μｌ（ｌはリットル）積層させた。
【００２９】
さらに、中央の丸形薄膜電極１５を囲む電極の１つは、トルエンに溶かした銀ペースト７を修飾して参照電極とした。両面粘着性シート２は、厚さ５０μｍ（きもと社製）のシートを用いた。カッティングプロッタ（ＭＩＭＡＫＩ社製）を用いて１２ｍｍ角に切り出した後、さらにカッティングプロッタを用いて切り出した両面粘着性シートの中央に直径６ｍｍの穴を形成した。
【００３０】
フローセル化するための高分子基板３は、厚さ１ｍｍのアクリル基板を、サンドブラスト法を用いて幅１ｍｍ、直径７ｍｍ、深さ０．３ｍｍのリング状溝１８を加工した。その後、１２ｍｍ角にダンシングソーを用いて切り出した。さらにリング中央及びリング上に０．７ｍｍの試料導入用穴１９と試料排出用穴２０をドリルで形成した。
【００３１】
リング中央に形成した試料導入用穴１９には、外径０．６５ｍｍ、内径６０ミクロンの中空チューブ（ＢＡＳ社製）を接続して試料導入用チューブ４とした。リング上に形成した試料排出用穴２０には同様に外径０．６５ｍｍ、内径６０ミクロンの中空チューブを接続して試料排出用チューブ５とした。
【００３２】
最後に、酵素が修飾された白金薄膜電極基板と試料導入用・試料排出用チューブ４，５が形成されたアクリル基板の間に中央に円形の穴が形成された両面粘着性シート２を挟み込み、フローセル化してグリコースセンサとした。
【００３３】
図３は、実施形態１に示した本発明の電気化学オンライン型バイオセンサを用いた測定装置の模式図である。
作製したセンサを、試料導入用チューブ４にマイクロダイアリシスプローブ２１（ＣＭＡ社製）を接続し、さらにシリンジポンプ２２（ＣＭＡ社製）に接続した。また、白金薄膜電極基板のパッドは、おのおのＡＬＳ１０００ポテンシオスタット２３（ＣＨＩ社製）に接続した。ポテンシオスタット２３から出力される電流値の変化はパーソナルコンピュータ（ＩＢＭ社製）２４に記録した。
【００３４】
測定はシリンジポンプ２２を用い、マイクロダイアリシスプローブ２１を介してｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を流速４μｌ／分で連続的にセンサに導入した。また、薄膜電極の電位はポテンシオスタット２３を用い、酵素等を修飾した電極は、−５０ｍＶにセンサ内の銀を修飾した参照電極に対して電位を印加した。
【００３５】
センサへの試料導入は、目的物質を含まないＰＢＳ２５にマイクロダイアリシスプローブ２１を浸して安定したベースラインを得た後、目的物質を含むＰＢＳ溶液２６にマイクロダイアリシスプローブ２１を浸すことにより、透析膜を介して行った。
【００３６】
図４は、マイクロダイアリシスプローブを１０ｍＭグルコース溶液に浸した際のセンサの応答電流値の変化を示す図である。マイクロダイアリシスプローブ２１を試料溶液に浸した後、約１分後に還元電流値が上昇し始め、さらに１分後に約１００ｎＡと一定の電流値に達した。再びマイクロダイアリシスプローブ２１を、試料を含まないＰＢＳに浸すと約１分後にベースラインに戻った。
【００３７】
図５は、実施形態１に示した１０ｍＭグルコース及び１００μＭアスコルビン酸混合溶液に対するセンサの応答電流値の変化を示す図である。次に、マイクロダイアリシスプローブ２１を１０ｍＭグルコース及び１００μＭアスコルビン酸の混合溶液に浸すと、約１分後に還元電流の増加が確認され、約４０ｎＡ付近で一定値に達した。混合溶液を導入して得られた還元電流値はアスコルビン酸を含まない１０ｍＭグルコース溶液と比較し著しく低下した。これはアスコルビン酸が電極を直接或いはオスミウム錯体を還元するため、正確にグルコース濃度のみを検出できないためである。
【００３８】
図６は、実施形態１に示した中央の丸形薄膜電極に５００ｍＶの電位を印加し、１０ｍＭグルコース及び１００μＭアスコルビン酸混合溶液をセンサに導入した際の応答電流値の変化を示す図である。
【００３９】
ポテンシオスタット２３を用いて中央の丸形薄膜電極１５に５００ｍＶの電位をセンサ内の参照電極に対して印加し、１０ｍＭグルコース及び、１０ｍＭグルコースと１００μＭアルコルビン酸混合溶液をセンサに導入した。センサはともに１００ｎＡを示し、アスコルビン酸共存下でもグルコース濃度を選択性よく検出することが出来た。これは薄層流路内に配置された丸形薄膜電極１５により高効率にアスコルビン酸を酸化・分解することが出来たためである。このように従来のセンサ構造に比べてセンサ内容積をそれほど増加させることなく、定量性良く目的物質の検出を行うことが出来る。
【００４０】
本発明のバイオセンサを構築する際には、陽極接合法のように加熱を行うことなく、また、フッ酸のような劇物を使用する必要もないために特別な装置、施設を必要とすることなく安全に作製することが可能であった。また、酵素活性の低下もおこらず高感度なセンサを作製することが可能である。また、接着剤を用いて作製した場合に比べ、短時間で作製することができ、接着剤の漏れ等もおこらないことから従来技術に比べ生産性に優れた作製方法であることも確認できた。
【００４１】
［実施形態２］
実施形態２は、上述した実施形態１と同様に白金薄膜電極基板を作製した後、丸形薄膜電極を囲む電極の一つを西洋わさびペルオキシターゼを含むオスミウムポリビニルピリジン錯体を１μｌ（ｌはリットル）、キャスト法により修飾した。室温で１時間乾燥させた後、２％牛血清アルブミン水溶液に重量比２％になるように乳酸酸化酵素を溶かし、さらに終濃度０．２％になるようにグルタルアルデヒドを加えた溶液を１μｌ（ｌはリットル）、西洋わさびペルオキシターゼを含むオスミウムポリビニルピリジン錯体が修飾されている電極上に積層した。さらに実施形態１と同様に上述した電極基板をフローセル化することにより乳酸センサとした。
【００４２】
また、実施形態２は、実施形態１と同様にマイクロダイアリシスプローブを接続し、シリンジポンプ２２を用いて流速４μｌ（ｌはリットル）／ｍｉｎでＰＢＳを連続的にセンサに導入した。薄膜電極の各パッドをポテンシオスタット２２に接続し、酵素等が修飾されている電極には参照電極に対して−５０ｍＶの電位を、中央の丸形薄膜電極１５には５００ｍＶの電位を印加した。マイクロダイアリシスプローブ２１を１０ｍＭの乳酸溶液に浸すと、約１分後に還元電流値が増加し、約９０ｎＡで一定値を示した。同様に１０ｍＭ乳酸溶液と１００μＭアスコルビン酸の混合溶液を、マイクロダイアリシスプローブ２１を介してセンサに導入すると約９０ｎＡの還元電流が観測された。これら結果は、丸形薄膜電極１５を囲む薄膜電極上に固定化する酵素を変えることにより、容易に様々なバイオセンサを構築することが可能であることを示している。グルタミン酸やモノアミンなど、酸化酵素の基質となる種々の生体分子のセンサへ応用可能である。
【００４３】
［実施形態３］
石英基板上に熱ＣＶＤ法によりカーボン薄膜を１００ｎｍ堆積させた。ＣＶＤ法は石英基板をガラス管内に留置して１０００℃に保ちつつ、ペリレンなどの多環芳香族化合物を出発物質として４００℃で昇華させ石英基板上に堆積後、熱分解させた。カーボン薄膜を有する石英基板上にシリコン系フォトレジスト（ＮＴＴ−ＡＴ社製）をスピンコートし、露光、現像した。現像後の石英基板には電極パターンとする部分のみがフォトレジストで覆われている。上述した基板を反応性イオンエッチング装置ＤＥＭ４５１（アネルバ社製）を用いて、酸素プラズマエッチングを行った。エッチングは酸素流量１００ｓｃｃｍ、パワー７０Ｗ、圧力２パスカル、時間２５分とし、フォトレジストで覆われていないカーボン薄膜がすべてエッチングされる条件で行った。これにより実施形態１の金属電極と全く同じパターンのカーボン薄膜電極を得ることが出来た。
【００４４】
実施形態１と同様に、中央の丸形薄膜電極を囲む電極の一つに西洋わさびペルオキシターゼを含むオスミウムポリビニルピリジン錯体、さらにグルコース酸化酵素を積層した。さらに、実施形態１と同様に両面粘着性シートおよび試料導入用・試料排出用チューブ４，５を取り付けたアクリル基板を用いてフローセル化し、グルコースセンサとした。作製したセンサに流速１μｌ（ｌはリットル）／ｍｉｎから２０μｌ（ｌはリットル）／ｍｉｎまで変化させてＰＢＳを導入したが、カーボン薄膜電極上でも本方法は接着強度が十分で液漏れ等は全くなかった。
【００４５】
このように、薄膜電極は、白金のみでなくカーボン薄膜や金電極でも同様に本発明のセンサとして有効であった。
【００４６】
［実施形態４］
図７（ａ）〜（ｃ）は、本発明による電気化学オンライン型バイオセンサの各部品の構成図で、図７（ａ）は薄膜電極を有する絶縁性基板、図７（ｂ）は両面粘着性シート、図７（ｃ）は高分子基板を各々示している。
【００４７】
このバイオセンサは、薄膜電極を有する絶縁性基板２７と、両面粘着性シート２８と、高分子基板２９と、試料導入用キャピラリ３０と、試料排出用キャピラリ３１と、第一作用電極３２と、第二作用電極３３と、参照電極３４と、対向電極３５とから構成されている。
【００４８】
図７（ａ）に示すように、薄膜電極を有する絶縁性基板２７は、上述した実施形態１と同様にリフトオフ法により金／チタン薄膜電極パターンを形成した。薄膜電極は試料が導入される上流から第一作用電極３２、第二作用電極３３、参照電極３４、対向電極３５とした。第二作用電極３３上には、グルコース酸化酵素を、ポリピロールを用いて固定化した。
【００４９】
グルコース酸化酵素の固定化は、０．２Ｍピロール及び１Ｍ塩化カリウム及び５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ（ｌはリットル）のグルコース酸化酵素を溶かした水溶液に電極基板を浸し、銀・塩化銀参照電極に対して０．７Ｖの電圧を０．５秒印加し、その後０Ｖの電位を印加した。この電位変化のサイクルを１０回繰り返すことにより、電極上にポリピーロールを電解重合し、同時にグルコース酸化酵素をポリピロール中に取り込ませ固定化した。参照電極３４には銀ペーストを修飾した。
【００５０】
一方、図７（ｃ）に示すように、高分子基板２９にダイシングソーを用いてキャピラリ取り付け用溝３６を２箇所形成し、試料導入用キャピラリ３０及び試料排出用キャピラリ３１を接続した。
【００５１】
次に、図７（ｂ）に示すように、カッティングプロッタを用いて厚さ５０μｍの両面粘着性シートを、幅１０ｍｍ、長さ３０ｍｍに切断した。さらに、カッティングプロッタを用いて、切り出した両面粘着性シート２８の中央に幅１ｍｍ、厚さ２０ｍｍの穴開け加工を行った。穴開け加工を施した両面粘着性シート２８を、電極を有する絶縁性基板２７及びキャピラリを有する高分子基板２９の間に挟みフローセル化した。
【００５２】
試料排出用キャピラリ３１はシリンジに接続し、シリンジはシリンジポンプ２２を用いて流速２μｌ（ｌはリットル）／ｍｉｎで吸引した。試料導入用キャピラリ３０の先端はＰＢＳに浸し、連続的にＰＢＳをフローセル内に導入した。作製したフローセルの絶縁基板上に形成された第一作用電極３２及び第二作用電極３３、参照電極３４、対向電極３５の各パッドをそれぞれポテンシオスタット２３に接続し、第一作用電極３２には０．５Ｖを、第二作用電極３３には０．３Ｖをフローセル内の参照電極３４に対して電位を印加した。
【００５３】
安定した電流値のベースラインを得た後、ＰＢＳに終濃度が１ｍＭになるようにグルコース溶液を加えると、徐々に還元電流値が増加していき、約１分後に３ｎＡの電流値を示した。また同様に１ｍＭグルコース及び１００μＭアスコルビン酸を含むＰＢＳをフローセル内に導入すると徐々に還元電流値が増加していき、約１分後に３ｎＡの電流値を示し、アスコルビン酸添加の影響は確認できなかった。しかしながら、第二作用電極３３に０．３Ｖの電位を印加し、第一作用電極３２には電圧を印加せずに、１ｍＭグルコース及び１００μＭアスコルビン酸を含むＰＢＳをフローセル内に導入すると約１００ｎＡの電流値を示した。
【００５４】
これらの結果は、薄膜粘着性シートを用いてのフローセルの作製はラジアルフローセルのみでなく、チャネルフローセル等の作製にも有効であり、流路内に酵素を修飾する事により、本発明のバイオセンサとして有効であった。
【００５５】
［実施形態５］
図８は、本発明による電気化学イムノアッセイフローセルの流路構造の模式図で、図中符号３６は絶縁性電極基板、３７は両面粘着性シートで作製したＹ字薄層流路、３８はアルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）ラベル化した抗原ｍｏｕｓｅ  −ＩｇＥ、３９はＩｍＭ  の４−アミノフェニルフォスフェート（４−  ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ）溶液、４０は抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ）固定化位置、４１は作用電極、４２は参照電極、４３は対向電極、４４，４５は試料導入用穴、４６は試料排出用穴を各々示している。
【００５６】
作用電極４１と参照電極４２と対向電極４３は、上述した実施形態１と同様に、フォトリソグラフィ法により白金薄膜電極を形成して作製した。参照電極４２は、上述した実施形態１と同様に銀ペースを修飾した。その後、作用電極４１より上流となる流路内４０に１０ｍＭ  ｎ−ｏｃｔａｄｅｃｙｌｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅベンゼン溶液をキャストし疎水化した。その後、１ｍｇ／ｍｌ（ｌはリットル）のプロテインＡ（和光純薬社製）リン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）に３０分浸し、さらに５ｍｇ／ｍｌ（ｌはリットル）のａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ    抗体トリスバッファ溶液（ｐＨ８．２）に３０分間浸し、ＩｇＥ  抗体を固定化した。
【００５７】
その後、図８に示すように、Ｙ字型に穴開け加工した両面粘着性シート及びアクリル板を用いてＹ字薄層流路３７を有するフローセル化した。アクリル板には上述した実施形態１と同様に、ドリルを用いて試料導入用穴４４、試料導入用穴４５、試料排出用穴４６を加工し、中空キャピラリを取り付けた。フローセル化したイムノアッセイフローセルには、１０％アルブミン水溶液を１０分間導入し、セル内の非特異吸着を抑制した。
【００５８】
まず目的とする試料ｍｏｕｓｅ−ＩｇＥ  を１ｐｇ／ｍｌ（ｌはリットル）含む水溶液に終濃度０．１％になるようにグルタルアルデヒドを加え、２４時間５℃で反応させアルカリフォスファターゼ酵素をラベル化した。フローセル内の電極には、ポテンシオスタットを用いて参照電極に対して０．６Ｖを作用電極に電位を印加した。酵素ラベル化した試料溶液を試料導入用穴４４より流速１μｌ（ｌはリットル）／ｍｉｎで１分間イムノアッセイフローセルに導入した。
【００５９】
その後、試料導入用穴４５より１ｍＭの４アミノフェニルフォスフェートを流速１μｌ（ｌはリットル）／ｍｉｎで導入すると、酸化電流値が約２ｎＡ増加した。これは流路内に固定化された抗体４０に酵素ラベル化された目的試料が抗原抗体反応により固定化され、同時に流路内に固定化された酵素により４アミノフェニルフォスフェートが酸化され４−アミノフェノールが生成し、４−アミノフェノールが電極上で酸化されたためである。
【００６０】
次に、ｍｏｕｓｅ−ＩｇＥ  が５ｐｇ／ｍｌ（ｌはリットル）含まれる試料を用いて同様の実験を行った際には、約１０ｎＡの酸化電流値の上昇が観測され、観測される酸化電流値は試料溶液に含まれる抗原の濃度にほぼ比例した。これにより試料溶液中の抗原濃度を知ることが出来た。
【００６１】
これらの結果は、薄膜粘着性シートを用いてのフローセル作製には固定化酵素を用いたオンラインバイオセンサ作製のみでなく、抗原や抗体を固定化する際にこれらの活性を落とすことなく作製できることからイムノアッセイ用セルの作製にも有効であることが確認できた。
【００６２】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、薄膜電極を有する絶縁性基板と他の基板を両面粘着性シートで張り合わせたフローセルでは、以下のような効果を奏する。
１．フッ酸によるウエットエッチングやドライエッチング装置など、危険な試薬や高価で長時間を要する装置を試用することなく、使用する両面粘着性シート厚みを変えることにより、容易に任意の深さ及び形状の薄層流路を形成することが可能である。
２．フローセル化する際には陽極接合や熱融着のように加熱する必要が無く室温で接合することが可能であるため、酵素の活性を低下させることなく容易にフローセル化することが可能である。また接着剤も用いないため接着剤の漏れ等もなく、歩留まり良く生産性に優れた作製方法である。
３．固定化酵素のみでなく、抗原や抗体を失活させることなくセルの作製が可能であることから、容易に電気化学イムノアッセイ用セルの作製が可能である。
４．丸形薄膜電極とこれを囲むように電極を配置させた絶縁性基板と他の基板を両面粘着性シートで張り合わせ、薄層流路の中央部から放射状に試料が導入するようにキャピラリもしくはマイクロダイアリシスプローブを接続することにより、薄層流路の中央に配置された丸形薄膜電極によって高効率にセンサの妨害物質となる易酸化物質を酸化・除去することが出来、センサ内の容積を増加させることなく、周囲に配置された薄膜電極では定量性良く目的物質を検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による電気化学オンライン型バイオセンサの構造図である。
【図２】本発明による電気化学オンライン型バイオセンサの製造に用いる各部品の詳細図で、（ａ）は絶縁性基板、（ｂ）は両面粘着性シート、（ｃ）は高分子基板を示す図である。
【図３】実施形態１に示した本発明の電気化学オンライン型バイオセンサを用いた測定装置模式図である。
【図４】マイクロダイアリシスプローブを１０ｍＭグルコース溶液に浸した際のセンサの応答電流値の変化を示す図である。
【図５】実施形態１に示した１０ｍＭグルコース及び１００μＭアスコルビン酸混合溶液に対するセンサの応答電流値の変化を示す図である。
【図６】実施形態１に示した中央の丸形薄膜電極に５００ｍＶの電位を印加し、１０ｍＭグルコース及び１００μＭアスコルビン酸混合溶液をセンサに導入した際の応答電流値の変化を示す図である。
【図７】本発明による電気化学オンライン型バイオセンサの各部品の構成図で、（ａ）は薄膜電極を有する絶縁性基板、（ｂ）は両面粘着性シート、（ｃ）は高分子基板を各々示す図である。
【図８】本発明による電気化学イムノアッセイフローセルの流路構造の模式図である。
【符号の説明】
１  絶縁性基板
２  両面粘着性シート
３  高分子基板
４  試料導入用チューブ
５  試料排出用チューブ
１４  白金薄膜電極
１５  丸形薄膜電極
１６  積層膜で修飾した電極
１７  銀ペーストをコートした電極
１８  リング状溝
１９  試料導入用穴
２０  試料排出用穴
２１  マイクロダイアリシスプローブ
２２  シリンジポンプ
２３  ポテンシオスタット
２４  パーソナルコンピュータ
２５  ＰＢＳ
２６  目的物質を含むＰＢＳ
２７  絶縁性基板
２８  両面粘着性シート
２９  体分子基板
３０  試料導入用キャピラリ
３１  試料排出用キャピラリ
３２  第一作用電極
３３  第二作用電極
３４  参照電極
３５  対向電極
３６  絶縁性電極基板
３７  両面粘着性シートで作製した薄層流路
３８  アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）ラベル化した抗原ｍｏｕｓｅ−ＩｇＥ
３９  １ｍＭの４−アミノフェニルフォスフェート（４−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液
４０  抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ）固定化位置
４１  作用電極
４２  参照電極
４３  対向電極
４４，４５  試料導入用穴
４６  試料排出用穴
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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