(57)【要約】【課題】電子移動の効率を損うことなく酵素を固定化した電気化学センサを提供し、キノン系メディエータの固定化も可能とする。【解決手段】炭素基材の表面を金で海島状に被覆したものをセンサ支持体とする。金の部分に選択的に酵素を固定化することにより、電子移動については炭素の表面が任うことになり、電子移動が損なわれない。キノン系メディエータを固定化してもメディエータとして機能することができる。【選択図】      図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素基材と、
該炭素基材を海島状に被覆する貴金属層とを具備するセンサ支持体。
【請求項２】
前記炭素基材は、アモルファス炭素を含む請求項１記載のセンサ支持体。
【請求項３】
前記炭素基材は結晶性炭素粉末をさらに含む請求項２記載のセンサ支持体。
【請求項４】
前記貴金属層は、金、白金、パラジウムまたは銀を含む請求項１〜３のいずれか１項記載のセンサ支持体。
【請求項５】
前記結晶性炭素粉末は、黒鉛ウィスカ、高配向性熱分解黒鉛、キッシュ黒鉛、天然黒鉛、人造黒鉛、カーボンナノチューブまたはフラーレンを含む請求項１〜４のいずれか１項記載のセンサ支持体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のセンサ支持体と、
該センサ支持体表面の貴金属層に選択的に固定化された酵素とを具備する電気化学センサ。
【請求項７】
前記貴金属層に選択的に固定化された電子伝達メディエータをさらに具備する請求項６記載の電気化学センサ。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項記載のセンサ支持体と、
該センサ支持体表面の貴金属層に選択的に固定化された電子伝達メディエータとを具備する電気化学センサ。
【請求項９】
有機樹脂に結晶性炭素粉末を混合し、
混合物を結晶が一方向に配向するようにしつつ所望の形状に成形し、
成形物を不活性雰囲気中または非酸化性雰囲気中で焼成し、
焼成物の表面を貴金属で海島状に被覆するステップを具備するセンサ支持体の製造方法。
【請求項１０】
焼成するステップにおいて、９００℃以上の温度で焼成される請求項９記載のセンサ支持体の製造方法。
【請求項１１】
焼成するステップにおいて、さらに２０００〜３０００℃の温度で黒鉛化処理が行なわれる請求項１０記載のセンサ支持体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項記載のセンサ支持体の貴金属層の表面に選択的に結合分子を吸着し、
結合分子に酵素を結合することによって、酵素をセンサ支持体に固定化するステップを具備する電気化学センサの製造方法。
【請求項１３】
結合分子に電子伝達メディエータを結合することによって、電子伝達メディエータをセンサ支持体に固定化するステップをさらに具備する請求項１２記載の電気化学センサの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項記載のセンサ支持体の貴金属表面に選択的に結合分子を吸着し、
結合分子に電子伝達メディエータを結合することによって電子伝達メディエータをセンサ支持体に固定化するステップを具備する電気化学センサの製造方法。
【請求項１５】
請求項６〜８のいずれか１項記載の電気化学センサを液体試料中に沈めるかまたは気体試料中に曝し、
試料中の電気化学センサに所定の電位を与え、
電気化学センサに流れる電流を測定することによって液体試料中の基質の濃度を測定するステップを具備する基質濃度測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医学、薬学、生物、環境、食品衛生のなどの無害、無毒性が厳しく要求される分野において、生理活性物質、環境ホルモン類似微量化学物質、添加食品安定剤などの精密測定を正確かつ簡易に行うに適した電気化学センサに用いるセンサ支持体とその製造方法、電気化学センサとその製造方法、および電気化学センサによる基質濃度測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
電気化学的測定に酵素センサを使用することは知られている。酵素センサのセンサ表面への酵素の固定化は、これまでは通常、重合体に結合させ、２官能性試薬によって架橋させて、膜の内側および膜の中に封入することによって、実施されてきた。これらの方法は、酵素分子が固相の厚い層の中に分布するという不都合がある。その結果、生成物が電極に拡散することが阻害され、センサの反応時間が長くなり、感度が低下する。
【０００３】
特開平８−２３３７７３公報には、貴金属表面を有する支持材上に吸着された結合分子を介して酵素を固定することが開示されている。
【０００４】
【特許文献１】
特開平８−２３３７７３号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記公報に記載の電気化学センサにおいては、支持材の表面全体が金などの貴金属であるため、チオールなどの結合分子を介して酵素を固定化しようとすると、表面全体が結合分子で覆いつくされてしまってその隙間で電極反応が起こることにより、チオールで覆われない裸の金電極と較べて電子移動の効率が著しく低下するという第１の問題がある。
【０００６】
また、電極表面全体が高価な貴金属であるため、コスト高になるという第２の問題もある。
【０００７】
電極反応を促進するために、メディエータが使用される。このメディエータを液体試料に溶解させるのでなく酵素と同様に電極表面に固定化できることが望まれるが、ドーパミン等のキノン系のメディエータは金のみからなる表面に固定化してもメディエータとしての機能を果たし得ない、という第３の問題がある。
【０００８】
したがって本発明の第１の目的は、液体試料中の基質の濃度を電気化学的手法により効率良く測定することの可能な電気化学センサを比較的安価に提供することにある。
【０００９】
本発明の第２の目的は、メディエータを固定化してもメディエータとしての機能を果たし得る電気化学センサを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、炭素基材と、該炭素基材を海島状に被覆する貴金属層とを具備するセンサ支持体が提供される。
【００１１】
なお、「炭素基材を貴金属層で海島状に被覆する」とは、炭素表面を多数の貴金属の島が覆っている状態、貴金属の海の中に炭素が多数の島として露出している状態、及び両者が混在している状態のすべてを含むものとする。
【００１２】
チオールなどの結合分子は貴金属表面のみに選択的に吸着されるので、炭素基材を貴金属層で海島状に被覆することにより、酵素の固定化が可能になると共にその際に炭素表面には結合分子が吸着されないで露出するので炭素表面における電極反応（電子移動）が阻害されない。
【００１３】
また、キノン系のメディエータを固定化した場合に前述したように貴金属表面では電極反応を起こし得ないが、貴金属表面に固定化されたメディエータの近傍に炭素の表面が存在することで電子移動が起こり、メディエータとして機能し得るようになる。
【００１４】
前述の炭素基材は、好ましくはアモルファス炭素および結晶性炭素粉末を含む。
【００１５】
前述の貴金属層は、好ましくは金、白金、パラジウムまたは銀を含む。
【００１６】
前述の結晶性炭素粉末は、好ましくは黒鉛ウィスカ、高配向性熱分解黒鉛、キッシュ黒鉛、天然黒鉛、人造黒鉛、カーボンナノチューブまたはフラーレンを含む。
【００１７】
本発明によれば、このセンサ支持体と、センサ支持体表面の貴金属層に選択的に固定化された酵素とを具備する電気化学センサもまた提供される。
【００１８】
この電気化学センサは、好ましくは、前記貴金属層に選択的に固定化された電子伝達メディエータをさらに具備する。
【００１９】
本発明によればこのセンサ支持体と、該センサ支持体表面の貴金属層に選択的に固定化された電子伝達メディエータとを具備する電気化学センサもまた提供される。
【００２０】
前述のセンサ支持体は、有機樹脂に結晶性炭素粉末を混合し、混合物を結晶が一方向に配向するようにしつつ所望の形状に成形し、成形物を不活性雰囲気中または非酸化性雰囲気中で焼成し、焼成物の表面を貴金属で海島状に被覆することにより製造される。
【００２１】
焼成は９００℃以上の温度で行なわれ、場合によってはさらに２０００〜３０００℃の温度で黒鉛化処理が行なわれる。
【００２２】
黒鉛化処理することにより、センサ支持体表面の炭素が露出している部分の電気伝導度が向上し、電子移動の効率が向上する。
【００２３】
前述の電気化学センサは、前述のセンサ支持体の貴金属層の表面に選択的に結合分子を吸着し、結合分子に酵素を結合することによって、酵素をセンサ支持体に固定化して製造される。
【００２４】
好ましくは、結合分子に電子伝達メディエータを結合することによって、電子伝達メディエータがセンサ支持体に固定される。
【００２５】
本発明の基質濃度測定方法は、前述電気化学センサを液体試料中に沈めるかまたは気体試料中に曝し、試料中の電気化学センサに所定の電位を与え、電気化学センサに流れる電流を測定することによって液体試料中の基質の濃度を測定するステップを具備する。
【００２６】
【実施例】
（実施例１：金まだらカーボン電極の作製１）
先ずカーボン電極の作製を行った。カーボン電極素材として、塩素化塩化ビニル樹脂（日本カーバイド社製Ｔ−７４１）３０部、フラン樹脂（日立化成社製ヒタフランＶＦ−３０２）４５部、の混合樹脂系を用い、これに黒鉛微粉末（日本黒鉛社製ＳＰ−３００Ｓ平均粒度２μｍ）２５部を複合した組成物１００部に対し、可塑剤としてジアリルフタレートモノマー２０部を添加して、ヘンシェル・ミキサーを用いて分散した後、表面温度を１２０℃に保ったミキシング用二本ロールを用いて十分に混練を繰り返してシート状組成物を得、ペレタイザーによってペレット化し成形用組成物を得た。このペレットをスクリュー型押出機で直径３．６ｍｍのダイスを用い脱気を行いつつ１３０℃で３ｍ／秒の速度で押し出し、これを枠に固定して、１８０℃に加熱されたエアー・オーブン中で１０時間処理してプリ・カーサー（炭素前駆体）線材とした。次に、これを窒素ガス中で５００℃までを１０℃／時、５００℃から１０００℃迄を５０℃／時の昇温速度で昇温し、その後１５００℃迄を１００℃／時で昇温し、１５００℃で３時間保持した後自然冷却することで断面部直径３ｍｍの円柱状カーボン電極を得た。
【００２７】
得られたカーボン電極の細孔直径を、湯浅アイオニクス社製ポロシメーター（オートスキャン−６０）を用いて水銀圧入法により測定した結果、最大細孔直径は１２０オングストロームであった。電極特性としては、柳本製ポーラログラフィクアナライザー（ＹＡＮＡＣＯ  Ｐ−１１００）を使用し、電極反応活性の目安として５×１０−３Ｍ  Ｆｅ（ＣＮ）６４−  と１Ｍ  ＫＣｌ系中でのフェロ／フェリシアンイオンのレドックス反応性を観察した結果、特別な前処理を施さなくてもブランク電流は小さく、シャープな酸化波、還元波のピークが得られ、ピーク電位の差ΔＥｐは理論値に近似した。又、電解液の侵入に伴なう電流値の増加は見られず、実質的にガラス状炭素並の電解液不浸透性を示した。
【００２８】
次に、当該カーボン電極材の先端断面部を、炭化珪素粉末のコートされた１２００番研磨シートにより研磨処理を行った後にＡｕ被覆を行った。Ａｕ被覆は、カーボン電極をスパッタ装置に装着しカーボン電極断面部にＡｕ膜を約１０ｎｍスパッタ被着させた後、更に無電解メッキ液（エヌイーケムキャット社製スーパーメックス液）を用いてスパッタ膜上にＡｕメッキ処理を行なうことで、カーボン電極断面部に５μｍの均一なＡｕ被覆を行った。
【００２９】
続いてＡｕ被覆面の一部を海島構造化する処理を行った。処理には炭化珪素粉末のコートされた４０００番手研磨シートによりＡｕ被覆率が６０％になるまでＡｕ膜除去処理を実施することで、表面部がカーボンとＡｕとの海島構造を有する電流（以下金まだらカーボン電極と称す）を得た。
【００３０】
上記のように全面にＡｕ被膜を施した後に一部のＡｕ膜の除去処理を行なって海島構造とする代わりに、マスクキングを介してＡｕをスパッタ被着させることにより、海島構造を直接形成することも可能である。
（実施例２：金まだらカーボン電極の作製２）
先ずカーボン電極の作製を行った。カーボン電極素材として、フラン樹脂（日立化成社製ヒタフランＶＦ−３０２）５０部、乾留ピッチ（呉羽化学工業社製ＭＨ−１Ｐ炭素残査収率８５％）３０部の混合樹脂系を用い、これに天然黒鉛微粉末（日本黒鉛社製ＣＳＳＰ−Ｂ平均粒度１μｍ）２０部を複合した組成物をヘンシェル・ミキサーを用いて分散した後、表面温度を１２０℃に保ったミキシング用二本ロールを用いて十分に混練を繰り返してシート状組成物を得、プランジャー型油圧押し出し成形機を用いて５ｍ／秒の吐出速度で真空押し出し成形を行った。以後の工程を実施例１と同様に行って目的とする断面部直径３ｍｍの円柱状カーボン電極を得た。
【００３１】
得られたカーボン電極材組織の最大細孔直径は、６５オングストロームであり、電極特性として５×１０−３Ｍ  Ｆｅ（ＣＮ）６４−  と１Ｍ  ＫＣｌ系中でのフェロ／フェリシアンイオンのレドックス反応性を観察した結果、特別な前処理を施さなくてもブランク電流は小さく、シャープな酸化波、還元波のピークが得られ、ピーク電位の差ΔＥｐは理論値に近似した。又、電解液の侵入に伴なう電流値の増加は見られず、実質的にガラス状炭素並の電解液不浸透性を示した。
【００３２】
次に、当該カーボン電極材の先端断面部に実施例１と同様なＡｕ膜スパッタ処理、Ａｕメッキ処理およびＡｕ膜除去処理を施すことで、表面部がカーボンとＡｕとの海島構造を有する電極を得た。
（実施例３：過酸化水素の測定）
実施例１で得られた金まだらカーボン電極を用い、０．０１Ｍのアミノエタンチオール溶液のサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を０Ｖから＋１．０Ｖの範囲で行い、アミノエタンチオールを金部分にチオール結合させた。用いた装置の構成を図１に示す。
【００３３】
次に２５％グルタルアルデヒド溶液に１時間浸し、グルタルアルデヒドをアミノエタンチオールのアミノ基に結合させた。洗浄後、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に１時間浸し、ＰＯＤを固定化した。このＰＯＤ固定化金まだらカーボン電極を用い、チオニンをメディエータとして溶解した過酸化水素溶液中で４０ｍＶ／ｓｅｃ  でＣＶを行ったところ過酸化水素の還元波が−０．１Ｖ  ｖｓ．ＳＣＥから現れはじめ−０．４Ｖ付近まで典型的なメディエータ電流が現れ、１ｍＭ過酸化水素で１８μＡの電流が観察された。（図２）。図２中、ａ，ｂは過酸化水素を添加しないときのサイクリックボルタモグラム、ｃ，ｄは過酸化水素１ｍＭを添加したときのサイクリックボルタモグラムである。過酸化水素単独での還元波は−０．５〜−０．６Ｖで出現するのに対して、溶液中のメディエータにより−０．１Ｖで出現している。
【００３４】
得られた検量線の直線範囲は０から４ｍＭの範囲であり、検出限界は５μＭ程度であった。この反応式を（１）から（３）に示す。
Ｈ２Ｏ２  ＋  ＰＯＤ  →  ＰＯＤ酸化型  ＋  ２Ｈ２Ｏ                  （１）
ＰＯＤ酸化型  ＋  チオニン還元型  →  ＰＯＤ  ＋  チオニン酸化型  （２）
チオニン酸化型  ＋  ２ｅ−  →  チオニン還元型                      （３）
（実施例４：グルコースの測定）
実施例３と同様に金まだらカーボン電極にアミノエタンチオールを固定化し、２５％グルタルアルデヒド処理後さらにグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）とＰＯＤの混合液中に１時間浸し、二つの酵素を同時固定した。この電極を用いて０．１ｍＭチオニンを溶解したグルコース溶液のＣＶを行ったところ、グルコースのメディエータ電流が観察された。５ｍＭグルコースで４．８μＡの電流が−０．３Ｖ  ｖｓ  ＳＣＥ  で観察された（図３）。この反応式を（４）から（７）に示す。
グルコース  ＋  Ｏ２  →  グルコノラクトン  ＋  Ｈ２Ｏ２              （４）
Ｈ２Ｏ２  ＋  ＰＯＤ  →  ＰＯＤ酸化型  ＋  ２Ｈ２Ｏ                  （５）
ＰＯＤ酸化型  ＋  チオニン還元型  →  ＰＯＤ  ＋  チオニン酸化型  （６）
チオニン酸化型  ＋  ２ｅ−  →  チオニン還元型                      （７）
（実施例５：メディエータと酵素同時固定化金まだらカーボン電極による過酸化水素の測定）
実施例３と同様にアミノエタンチオールを固定化させた後、０．０１Ｍドーパミンの酸化ＣＶを−０．４Ｖから＋０．２Ｖ  ｖｓ  ＳＣＥ  で行い、ドーパミンメディエータを固定化させた（図４）。図４中には、溶液中（右側）および固定化後（左側）のドーパミンの電極反応がそれぞれ模式的に示されている。洗浄した後にドーパミンがキノン体となってアミノエタンチオールのアミノ基に結合したと考えられるメディエータの酸化還元波が得られた（図５ａ，ｂ）。さらに、グルタルアルデヒドとＰＯＤの溶液に順に浸してＰＯＤを固定化させ、過酸化水素のＣＶ測定を行った。その結果、−０．１Ｖ  ｖｓ  ＳＣＥ  以下で過酸化水素の還元電流が得られ（図５：ｃ，ｄ）、−０．４Ｖ  ｖｓ  ＳＣＥ  において５ｍＭ過酸化水素で７０μＡと大きな電流が得られた（図６）。図７にメディエータと酵素を同時固定した金まだらカーボン電極の表面を模式的に示す。なおメディエータを固定しない電極で−０．４Ｖ  ｖｓ  ＳＣＥ  で定電位アンペロメトリーを行ったところ０．１μＡ以下であった。キノンは金電極では全く還元波を示さず、メディエータとして機能しないがカーボン電極表面では速やかにハイドロキノンに還元され、すぐれたメディエータとして働くことが知られている。本実施例においても、金電極では全くメディエータ電流が観察されず、金とカーボンのまだら電極にして初めて金表面に固定した酵素反応のメディエータとしてドーパミンキノンを機能させることが実現したものである。この実施例における反応式を以下に示し、図８にまだら電極上に固定されたＰＯＤとドーパミンと、溶液中の過酸化水素の間で起こる反応を模式的に示す。金表面に固定されたドーパミンと、その近傍に存在するカーボン表面との間で電極反応が起きている。
Ｈ２Ｏ２  ＋  ＰＯＤ  →  ＰＯＤ酸化型  ＋  ２Ｈ２Ｏ                  （８）
ＰＯＤ酸化型  ＋  ドーパミン  →  ＰＯＤ  ＋  ドーパミンキノン    （９）
ドーパミンキノン  ＋  ２ｅ−  ＋２Ｈ＋  →  ドーパミン                （１０）
（実施例４：アスコルビン酸の増幅測定）
ドーパミンメディエータ固定金まだらカーボン電極でアスコルビン酸のＣＶを行うとアスコルビン酸の酸化波が著しく増幅し、０Ｖ  ｖｓ  ＳＣＥ  から酸化波が現れ、金電極に比べ酸化波が約＋０．３Ｖ低い電位にシフトした（図９）。従って、ドーパミンメディエータは酵素反応におけるメディエータだけでなく、酸化剤、還元剤のメディエータとして優れている。図１０に検量線を示す。
アスコルビン酸  ＋  ドーパミンキノン  →  酸化型アスコルビン酸
＋  ドーパミン                                                    （１１）
ドーパミン  ＋  ２ｅ−  ＋２Ｈ＋  →  ドーパミンキノン                （１２）
【００３５】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の金まだらカーボン電極を使用することにより、電子移動の効率を損うことなく酵素を電極表面に固定化することが可能となり、キノン系のメディエータの固定化も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例において用いた測定装置の構成を示す図である。
【図２】ＰＯＤ固定化金まだらカーボン電極による、過酸化水素を添加しないとき（ａ，ｂ）および過酸化水素を添加したとき（ｃ，ｄ）のチオニンメディエータのサイクリックボルタモグラムである。
【図３】ＰＯＤおよびＧＯＤ同時固定化金まだらカーボン電極による、チオニンをメディエータとしたグルコースのサイクリックボルタモグラムである。
【図４】ドーパミンの固定化および溶液中、固定化後における電極反応を模式的に示す図である。
【図５】ドーパミンメディエータおよびＰＯＤ同時固定化電極による、過酸化水素非添加（ａ，ｂ）および添加後の（ｃ，ｄ）サイクリックボルタモグラムである。
【図６】メディエータおよび酵素同時固定化電極による過酸化水素の検量線を示すグラフである。
【図７】ドーパミンメディエータと酵素を同時固定した金まだらカーボン電極の表面を模式的に示す図である。
【図８】メディエータと酵素同時固定化電極上での反応を模式的に示す図である。
【図９】メディエータ固定化電極によるアスコルビン酸のサイクリックボルタモグラムである。
【図１０】メディエータ固定化電極によるアスコルビン酸の検量線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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