(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシンとの融合蛋白質を提供する。【解決手段】ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ：ＨＴＬＶ）の抗原断片、その断片とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（Ｔｈｉｏ）との融合蛋白質、およびその融合蛋白質を作製するための方法を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：3に記載のアミノ酸配列を有するHTLV-I gp21の抗原断片を含む単離ペプチド。
【請求項２】
配列番号：4に記載のアミノ酸配列を有するHTLV-II gp21の抗原断片を含む単離ペプチド。
【請求項３】
配列番号：5に記載のアミノ酸配列を有するGST/HTLV-I gp21と称する融合蛋白質として作用するようにグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）をさらに含む、請求項1記載の単離ペプチド。
【請求項４】
配列番号：7に記載のアミノ酸配列を有するThio/HTLV-I gp21と称する融合蛋白質として作用するようにチオレドキシン（thio）をさらに含む、請求項1記載の単離ペプチド。
【請求項５】
配列番号：6に記載のアミノ酸配列を有するGST/HTLV-II gp21と称する融合蛋白質として作用するようにグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）をさらに含む、請求項2記載の単離ペプチド。
【請求項６】
配列番号：8に記載のアミノ酸配列を有するThio/HTLV-II gp21と称する融合蛋白質として作用するようにチオレドキシン（thio）をさらに含む、請求項2記載の単離ペプチド。
【請求項７】
HTLV-I gp21の抗原断片をコードする配列番号：55に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸。
【請求項８】
HTLV-II gp21の抗原断片をコードする配列番号：56に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸。
【請求項９】
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、請求項3記載の融合蛋白質GST/HTLV-Igp21をコードする配列番号：57に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項7記載の単離核酸。
【請求項１０】
チオレドキシン（Thio）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、請求項4記載の融合蛋白質Thio/HTLV-I gp21をコードする配列番号：59に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項7記載の単離核酸。
【請求項１１】
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、請求項5記載の融合蛋白質GST/HTLV-IIgp21をコードする配列番号：58に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項8記載の単離核酸。
【請求項１２】
チオレドキシン（Thio）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、請求項6記載の融合蛋白質Thio/HTLV-II gp21をコードする配列番号：60に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項8記載の単離核酸。
【請求項１３】
核酸の発現を制御するヌクレオチド配列調節要素に機能的に結合した請求項3記載の融合蛋白質GST/HTLV-I gp21をコードする核酸を含む発現ベクターであって、該核酸が配列番号：57に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項１４】
寄託番号第940407号として中華民国の台湾生物資源コレクション研究センター（Bioresources Collection andResearch Center）に寄託されたpGST/HTLV-I gp21である、請求項13記載の発現ベクター。
【請求項１５】
核酸の発現を制御するヌクレオチド配列調節要素に機能的に結合した請求項4記載の融合蛋白質Thio/HTLV-I gp21をコードする核酸を含む発現ベクターであって、該核酸が配列番号：59に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項１６】
寄託番号第940405号として中華民国の台湾生物資源コレクション研究センターに寄託されたpThio/HTLV-I gp21である、請求項15記載の発現ベクター。
【請求項１７】
核酸の発現を制御するヌクレオチド配列調節要素に機能的に結合した請求項5記載の融合蛋白質GST/HTLV-II gp21をコードする核酸を含む発現ベクターであって、該核酸が配列番号：58に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項１８】
寄託番号第940408号として中華民国の台湾生物資源コレクション研究センターに寄託されたpGST/HTLV-II gp21である、請求項17記載の発現ベクター。
【請求項１９】
核酸の発現を制御するヌクレオチド配列調節要素に機能的に結合した請求項5記載の融合蛋白質Thio/HTLV-II gp21をコードする核酸を含む発現ベクターであって、該核酸が配列番号：60に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項２０】
寄託番号第940406号として中華民国の台湾生物資源コレクション研究センターに寄託されたpThio/HTLV-II gp21である、請求項19記載の発現ベクター。
【請求項２１】
以下の段階を含む、HTLV gp21の抗原断片を作製する方法：
請求項13〜20のいずれか一項に記載の発現ベクターを細胞に導入する段階；
蛋白質の産生に適した条件下で細胞を培養する段階；および
細胞培養物から蛋白質を回収して、HTLV gp21の抗原断片を得る段階。
【請求項２２】
固相基質、
固相基質に固定した第一のHTLV gp21抗原断片、
固相基質上でHTLV gp21抗原断片の非結合領域をブロッキングするためのブロッキング溶液、
第二のHTLV gp21抗原断片、
洗浄溶液、および
第一および第二のHTLV gp21が請求項3〜6に記載のペプチドから選択される、第二のHTLV gp21抗原断片に機能的に結合してシグナルを産生するシグナル産生手段
を含む、ヒトTリンパ球向性ウイルス（HTLV）を検出するためのキット。
【請求項２３】
第一のHTLV gp21が請求項6記載の融合蛋白質Thio/HTLV-IIgp21であって、且つ第二のHTLV gp21が請求項3記載の融合蛋白質GST/HTLV-Igp21である、請求項22記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトTリンパ球向性ウイルス（human T-lymphotropic virus：HTLV）に関する。より詳しくは、本発明は、HTLVの抗原断片に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レトロウイルスに分類されるヒトTリンパ球向性ウイルス（HTLV）は、単離された最初のヒトレトロウイルスであった。HTLV I型は、1978年に初めて単離され、一方HTLVII型は1982年に単離された。HTLVは性的接触によって、母子感染によって、および汚染された血液製剤によって伝幡する。これは、日本の南部、カリブ海地域、南アフリカ、およびメラネシアにおいて流行している。ウイルスの伝幡を防止するために、献血をHTLVに関してスクリーニングすることが現在多くの国において日常的に行われている。1996年以降、台湾では、HTLV-IおよびHTTLV-IIに対する抗体を、ELISAおよびウェスタンブロッティングによってスクリーニングしている。
【０００３】
HTLVの予備スクリーニングをELISAによって行い、最終診断をウェスタンブロッティングおよびポリメラーゼ連鎖反応によって行うことができる。市販のHTLVアッセイ法は、抗原としてウイルスの全溶解物を利用して、保因者の血液から特異的抗体を検出する。より高い感受性および特異性を得るために、ウイルスエンベロープのペプチド断片をさらなる抗原として使用することができる。ウイルス全溶解物の調製は複雑で、リスクを有する可能性がある。したがって、安全かつ有効なHTLV抗原がなおも必要とされている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の主な目的は、ヒトTリンパ球向性ウイルス（HTLV）とグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）またはチオレドキシンとの融合蛋白質を提供することである。融合蛋白質は、HTLV-I/IIに対して非常に特異的で感受性が高いという利点を有し、これらの蛋白質製剤は安全かつ有効である。さらに、融合蛋白質は、HTLV-I/IIアッセイ法に適用することができる。ゲノム操作を用いた場合、大腸菌によって発現された抗原性のウイルス組換え蛋白質を、低コストで大量に調製することができる。さらに、HTLVの培養と精製とを行う必要がないことから、本発明の調製物は現行の調製物より安全である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
したがって、第一の局面において、本発明は、配列番号：3に記載のアミノ酸配列を有するHTLV-I gp21の抗原断片を含む単離ペプチドを特徴とする。
【０００６】
本発明はまた、配列番号：4に記載のアミノ酸配列を有するHTLV-II gp21の抗原断片を含む単離ペプチドも特徴とする。
【０００７】
さらに、本発明は、配列番号：55に記載のヌクレオチドを含む、HTLV-I gp21の抗原断片をコードする単離核酸を特徴とする。
【０００８】
本発明はまた、配列番号：56に記載のヌクレオチド配列を含む、HTLV-II gp21の抗原断片をコードする単離核酸を特徴とする。
【０００９】
本発明の抗原断片をコードする上記の核酸はいずれも、任意でグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、またはチオレドキシン（thio）と組み合わせて、以下のような4つの組換え核酸を形成することができる：
1．配列番号：57に記載のヌクレオチド配列を含む、GST/HTLV-I gp21融合蛋白質をコードする核酸。
2．配列番号：59に記載のヌクレオチド配列を含む、Thio/HTLV-I gp21融合蛋白質をコードする核酸。
3．配列番号：58に記載のヌクレオチド配列を含む、GST/HTLV-II gp21融合蛋白質をコードする核酸。
4．配列番号：60に記載のヌクレオチド配列を含む、Thio/HTLV-II gp21融合蛋白質をコードする核酸。
【００１０】
さらに、本発明はまた、核酸の発現を制御するヌクレオチド配列調節エレメントに機能的に結合した4つの融合蛋白質のいずれかをコードする核酸を含む発現ベクターと、HTLV抗原断片を作製する方法とを特徴とする。この方法には、4つの融合蛋白質のいずれかをコードする核酸を含む発現ベクターを細胞に導入する段階、融合蛋白質の産生に適した条件下で細胞を培養する段階、および融合蛋白質を細胞培養物から回収する段階が含まれる。
【００１１】
この方法の一つの態様において、細胞は、大腸菌（Escherichia coli）、例えばBL21（DE3）株である。GST/HTLV gp21融合蛋白質を作製する場合、グルタチオンセファロースカラムによって回収することができる；Thio/HTLVgp21融合蛋白質を作製する場合、Ni-NTAカラムによって回収することができる。
【００１２】
したがって、4つの核酸は以下のような4つの融合蛋白質をコードする：
1．配列番号：5に記載のアミノ酸配列を含むGST/HTLV-I gp21融合蛋白質。
2．配列番号：7に記載のアミノ酸配列を含むThio/HTLV-I gp21融合蛋白質。
3．配列番号：6に記載のアミノ酸配列を含むGST/HTLV-II gp21融合蛋白質。
4．配列番号：8に記載のアミノ酸配列を含むThio/HTLV-II gp21融合蛋白質。
【００１３】
本発明のもう一つの局面は、ヒトTリンパ球向性ウイルス（HTLV）を検出するためのキットを特徴とする。キットには、固相基質、固相基質に固定した第一のHTLVgp21抗原断片、固相基質上でのHTLV gp21抗原断片非結合領域をブロッキングするためのブロッキング溶液、第二のHTLV gp21抗原断片、洗浄液、および第二のHTLVgp21抗原断片に機能的に結合してシグナルを産生するシグナル産生手段が含まれ、第一および第二のHTLV gp21は、融合蛋白質のいずれかから選択される。
【００１４】
本発明におけるキットの一つの態様において、第一のHTLV gp21は、Thio/HTLV-II gp21融合蛋白質であり、第二のHTLV gp21は、GST/HTLV-Igp21融合蛋白質である。
【００１５】
本発明に係る単離ペプチドにおいては、（１）配列番号：3に記載のアミノ酸配列を有するHTLV-I gp21の抗原断片を含む単離ペプチドであることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係る単離ペプチドにおいては、（２）配列番号：4に記載のアミノ酸配列を有するHTLV-II gp21の抗原断片を含む単離ペプチドであることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に係る単離ペプチドにおいては、（３）配列番号：5に記載のアミノ酸配列を有するGST/HTLV-I gp21と称する融合蛋白質として作用するようにグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）をさらに含む、前記(1)記載の単離ペプチドであることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る単離ペプチドにおいては、（４）配列番号：7に記載のアミノ酸配列を有するThio/HTLV-I gp21と称する融合蛋白質として作用するようにチオレドキシン（thio）をさらに含む、前記(1)記載の単離ペプチドであることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る単離ペプチドにおいては、（５）配列番号：6に記載のアミノ酸配列を有するGST/HTLV-II gp21と称する融合蛋白質として作用するようにグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）をさらに含む、前記(2)記載の単離ペプチドであることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る単離ペプチドにおいては、（６）配列番号：8に記載のアミノ酸配列を有するThio/HTLV-I gp21と称する融合蛋白質として作用するようにチオレドキシン（thio）をさらに含む、前記(2)記載の単離ペプチドであることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る単離核酸においては、（７）HTLV-I gp21の抗原断片をコードする配列番号：55に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る単離核酸においては、（８）HTLV-II gp21の抗原断片をコードする配列番号：56に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係る単離核酸においては、（９）グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記(3)記載の融合蛋白質GST/HTLV-Igp21をコードする配列番号：57に記載のヌクレオチド配列を有する、前記(7)記載の単離核酸であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る単離核酸においては、（１０）チオレドキシン（Thio）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記(4)記載の融合蛋白質Thio/HTLV-Igp21をコードする配列番号：59に記載のヌクレオチド配列を有する、前記(7)記載の単離核酸であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明に係る単離核酸においては、（１１）グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記(5)記載の融合蛋白質GST/HTLV-IIgp21をコードする配列番号：58に記載のヌクレオチド配列を有する、前記(8)記載の単離核酸であることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る単離核酸においては、（１２）チオレドキシン（Thio）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記(6)記載の融合蛋白質Thio/HTLV-IIgp21をコードする配列番号：60に記載のヌクレオチド配列を有する、前記(8)記載の単離核酸であることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る発現ベクターにおいては、（１３）核酸の発現を制御するヌクレオチド配列調節要素に機能的に結合した前記(3)記載の融合蛋白質GST/HTLV-Igp21をコードする核酸を含む発現ベクターであって、該核酸が配列番号：57に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクターであることを特徴とする。
【００２８】
また、本発明に係る発現ベクターにおいては、（１４）寄託番号第940407号として中華民国の台湾生物資源コレクション研究センター（BioresourcesCollection and Research Center）に寄託されたpGST/HTLV-I gp21である、前記(13)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明に係る発現ベクターにおいては、（１５）核酸の発現を制御するヌクレオチド配列調節要素に機能的に結合した前記(4)記載の融合蛋白質Thio/HTLV-Igp21をコードする核酸を含む発現ベクターであって、該核酸が配列番号：59に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクターであることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明に係る発現ベクターにおいては、（１６）寄託番号第940405号として中華民国の台湾生物資源コレクション研究センターに寄託されたpThio/HTLV-Igp21である、前記(15)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明に係る発現ベクターにおいては、（１７）核酸の発現を制御するヌクレオチド配列調節要素に機能的に結合した前記(5)記載の融合蛋白質GST/HTLV-IIgp21をコードする核酸を含む発現ベクターであって、該核酸が配列番号：58に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクターであることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明に係る発現ベクターにおいては、（１８）寄託番号第940408号として中華民国の台湾生物資源コレクション研究センターに寄託されたpGST/HTLV-IIgp21である、前記(17)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００３３】
また、本発明に係る発現ベクターにおいては、（１９）核酸の発現を制御するヌクレオチド配列調節要素に機能的に結合した前記(5)記載の融合蛋白質Thio/HTLV-IIgp21をコードする核酸を含む発現ベクターであって、該核酸が配列番号：60に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクターであることを特徴とする。
【００３４】
また、本発明に係る発現ベクターにおいては、（２０）寄託番号第940406号として中華民国の台湾生物資源コレクション研究センターに寄託されたpThio/HTLV-IIgp21である、前記(19)記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明に係る方法においては、（２１）以下の段階を含む、HTLV gp21の抗原断片を作製する方法であることを特徴とする：前記(13)〜(20)のいずれか一項に記載の発現ベクターを細胞に導入する段階；蛋白質の産生に適した条件下で細胞を培養する段階；および細胞培養物から蛋白質を回収して、HTLVgp21の抗原断片を得る段階。
【００３６】
また、本発明に係るキットにおいては、（２２）固相基質、固相基質に固定した第一のHTLV gp21抗原断片、固相基質上でHTLV gp21抗原断片の非結合領域をブロッキングするためのブロッキング溶液、第二のHTLVgp21抗原断片、洗浄溶液、および第一および第二のHTLV gp21が前記(3)〜(6)に記載のペプチドから選択される、第二のHTLV gp21抗原断片に機能的に結合してシグナルを産生するシグナル産生手段を含む、ヒトTリンパ球向性ウイルス（HTLV）を検出するためのキットであることを特徴とする。
【００３７】
また、本発明に係るキットにおいては、（２３）第一のHTLV gp21が前記(6)記載の融合蛋白質Thio/HTLV-II gp21であって、且つ第二のHTLVgp21が前記(3)記載の融合蛋白質GST/HTLV-I gp21である、前記(22)記載のキットであることを特徴とする。
【００３８】
本発明は、以下の説明および添付の図面を参照することにより、より十分に理解され、さらなる利点が明らかとなると思われる。
【００３９】
【発明の実施の形態】
HTLVは、HTLV-IおよびHTLV-IIとして分類される；HTLV-Iによって引き起こされる疾患には、感染患者の約2〜3％に発症する成人T細胞白血病／リンパ腫（ATL）、一般的に中年期（40〜50歳）に現れ、感染患者の2〜3％のみに発症するHTLV-I関連ミエロパシー／熱帯性痙性不全対麻痺（HAM/TSP）が含まれる。しかし、輸血によって感染した患者では、期間は1ヶ月〜4年に短縮され、感染患者の95％では症状が一生続くことはない。HTLV-IIは、異型毛状細胞白血病に関連して作用すると考えられている。
【００４０】
HTLVゲノムは、gag遺伝子、pol遺伝子、env遺伝子、tax遺伝子、およびrex遺伝子から構成されるss（+）RNAである。gag遺伝子は、ポリプロテインに翻訳された後、成熟コア蛋白質：p19、p24、p15等にスプライシングされる。pol遺伝子は逆転写酵素、インテグラーゼ、およびRNアーゼHに翻訳される。env遺伝子はエンベロープ蛋白質p21およびp46に翻訳される。tax遺伝子およびrex遺伝子はウイルス複製に関連している。感染後、HTLVは、ウイルスgag蛋白質、主にp24に対するヒト抗体を誘導する。抗体は、感染2ヶ月後に生じ、その後、ウイルス表面蛋白質に対する抗体が産生される。
【００４１】
本発明は、HTLV-I/IIの抗原決定基分析によって、HTLV-I gp21（配列番号：1）およびHTLV-II gp21（配列番号：2）の抗原決定基に富む領域が発見されたことに基づく。領域を以下に示す。
HTLV-I gp21断片（配列番号：3）
2004187671.tif 000002
HTLV-II gp21断片（配列番号：4）
2004187671.tif 000003
【００４２】
枠で囲った領域は抗原決定基を示す。
【００４３】
アセンブリPCRを用いて、改変HTLV-I gp21およびHTLV-II gp21遺伝子を、ジーンバンク（GeneBank）からの遺伝子配列に従って合成した。HTLV-Igp21遺伝子は大腸菌において好ましいコドンに改変した。これらの配列を鋳型として用いて、270 bpのgp21断片をPCRで増幅して、pGEX-KGまたはpThioHisBにクローニングした。
【００４４】
したがって、本発明は、単離された2つのペプチド、すなわち配列番号：3に記載のアミノ酸配列を有するHTLV-I gp21の抗原断片を含む単離ペプチドと、配列番号：4に記載のアミノ酸配列を有するHTLV-IIgp21の抗原断片を含む単離ペプチドとを特徴とする。
【００４５】
本発明の2つのペプチドは、2つの核酸、すなわち配列番号：55に記載のヌクレオチド配列を含むHTLV-I gp21の抗原断片をコードする単離核酸と、配列番号：56に記載のヌクレオチド配列を含むHTLV-IIgp21の抗原断片をコードする単離核酸によってコードされる。
【００４６】
上記の抗原断片の如何なるものも、任意でグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）またはチオレドキシン（thio）と組み合わせて、以下のように4つの組換え核酸を形成することができる。
1．配列番号：57に記載のヌクレオチド配列を含む、GST/HTLV-I gp21融合蛋白質をコードする核酸。
2．配列番号：59に記載のヌクレオチド配列を含む、Thio/HTLV-I gp21融合蛋白質をコードする核酸。
3．配列番号：58に記載のヌクレオチド配列を含む、GST/HTLV-II gp21融合蛋白質をコードする核酸。
4．配列番号：60に記載のヌクレオチド配列を含む、Thio/HTLV-II gp21融合蛋白質をコードする核酸。
【００４７】
さらに、本発明の範囲にはまた、核酸の発現を制御するヌクレオチド配列調節要素に機能的に結合した4つの融合蛋白質のいずれかをコードする核酸を含む発現ベクター、およびHTLV抗原断片を作製する方法が含まれる。この方法には、4つの融合蛋白質のいずれかをコードする核酸を含む発現ベクターを細胞に導入する段階、融合蛋白質の産生に適した条件下で細胞を培養する段階、および融合蛋白質を細胞培養物から回収する段階が含まれる。
【００４８】
発現ベクターの例には、pGST/HTLV-I gp21、pThio/HTLV-I gp21、pGST/HTLV-II gp21、およびpThio/HTLV-IIgp21が含まれる。上記の発現ベクターは、中華民国の台湾生物資源コレクション研究センターに寄託されており、寄託番号はそれぞれ、第940407号、第940405号、第940408号、および第940406号である。
【００４９】
この方法の一つの態様において、細胞は、大腸菌、例えばBL21（DE3）株である。GST/HTLV gp21融合蛋白質を作製する場合、グルタチオンセファロースカラムによって回収することができる；Thio/HTLVgp21融合蛋白質を産生する場合、Ni-NTAアフィニティカラムによって回収することができる。
【００５０】
したがって、4つの核酸は以下のような4つの融合蛋白質をコードする：
1．配列番号：5に記載のアミノ酸配列を含むGST/HTLV-I gp21融合蛋白質。
2．配列番号：7に記載のアミノ酸配列を含むThio/HTLV-I gp21融合蛋白質。
3．配列番号：6に記載のアミノ酸配列を含むGST/HTLV-II gp21融合蛋白質。
4．配列番号：8に記載のアミノ酸配列を含むThio/HTLV-II gp21融合蛋白質。
【００５１】
本発明はまた、ヒトTリンパ球向性ウイルス（HTLV）を検出するためのキットも特徴とする。キットには、固相基質、固相基質に固定した第一のHTLV gp21抗原断片、固相基質上でHTLVgp21抗原断片非結合領域をブロッキングするためのブロッキング溶液、第二のHTLV gp21抗原断片、洗浄液、および第二のHTLV gp21抗原断片に機能的に結合してシグナルを産生するシグナル産生手段が含まれ、第一および第二のHTLVgp21は、融合蛋白質のいずれかから選択される。
【００５２】
本発明におけるキットの一つの態様において、第一のHTLV gp21は、Thio/HTLV-II gp21融合蛋白質であり、第二のHTLV gp21は、GST/HTLV-Igp21融合蛋白質である。
【００５３】
キットの固相基質には、ガラス、シリコン、セラミック、金属、またはスチレン、エチレン、プロピレン、エステル、アクリル酸、アクリル酸エステル、アルキルアクリル酸もしくはアルキルアクリル酸エステルが含まれるがこれらに限定されることはない。
【００５４】
ブロッキング溶液には、BSA、カゼイン、またはゼラチンの溶液が含まれる。
【００５５】
洗浄液には、PBS、TBS、または0.05％ツイーン20を含むPBSTが含まれる。
【００５６】
シグナル産生手段には、放射性標識、蛍光標識、燐光標識、発光標識、または酵素が含まれる。発光標識には、生物発光標識または化学発光標識が含まれる。酵素には、アルカリホスファターゼ、水素ペルオキシダーゼ、またはβ-ガラクトシダーゼが含まれる。一つの態様において、キットはさらに基質を含み、基質は酵素と反応して色を生じる。
【００５７】
HTLVの検出キットのもう一つの態様において、シグナル産生手段にはさらに、ビオチンおよびアビジン、放射性標識に機能的に結合したアビジン、蛍光標識、燐光標識、発光標識、または酵素が含まれる。酵素には、アルカリホスファターゼ、水素ペルオキシダーゼ、またはβ-ガラクトシダーゼが含まれる。加えて、キットはさらに基質を含み、基質は酵素と反応して色を生じる。
【００５８】
【実施例】
実施例1．HTLV-I/II gp21の合成のためのアセンブリPCR
ジーンバンクD13784からのHTLV-I gp21遺伝子配列を、大腸菌において好ましいコドンに改変した。図1A（配列番号：9）に示すように、505 bpのHTLV-Igp21を合成するため、アセンブリPCRのための20個のプライマーを設計した。2つの末端はNde I（5'）およびXho I（3'）制限酵素切断部位を有するように設計した。20個のプライマーを以下に示す。
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【００５９】
ジーンバンクNC_001488からのHTLV-II gp21遺伝子配列に従って、図1B（配列番号：30）に示すように、514 bpのHTLV-II gp21を合成するため、20個のプライマーをアセンブリPCRのために設計した。2つの末端はNdeI（5'）およびXho I（3'）制限酵素切断部位を有するように設計した。20個のプライマーを以下に示す。
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【００６０】
実施例2．pHTLV gp21の構築
アセンブリPCRによって増幅された断片を2％アガロースゲルによって分離して、キアクイックゲル抽出キット（キアゲン社（QIAGEN））で精製した。DNAを50μlの溶出緩衝液（10 mMトリス塩酸、pH 8.5）で溶出して、Nde IおよびXho Iによって処理した。pET15bも同様にNde IおよびXho Iによって処理して、0.8％アガロースゲルによって分離して、キアクイックゲル抽出キット（QIAquickGel Extraction Kit）（キアゲン社）で精製して、2900 bpのDNA断片を得た。pET15bおよびHTLV gp21断片のライゲーションは、DNAライゲーションキット（タカラ社（TaKaRa））によって16℃で40分行った。ライゲーション産物をDH5aコンピテント細胞に形質転換した。組換え構築物を分析して、それぞれ「pB119/HTLV-Igp21」および「pB119/HTLV-II gp21」と名付けた。
【００６１】
実施例3．pGST/HTLV-I/II gp21の構築
pB119/HTLV-I gp21またはpB119/HTLV-II gp21を鋳型として用いて、270 bpのHTLV gp21抗原断片を2組のプライマーによって増幅した：NcoI（5'）およびHindIII（3'）制限酵素切断部位を有するようにHTLV-I gp21断片の2つの末端を設計し、BamHI（5'）およびHind III（3'）制限酵素切断部位を有するようにHTLV-IIgp21断片の2つの末端を設計した。
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【００６２】
得られた断片は、配列番号：55および56に示す通りである。図2Aに示したマップのように、2つの断片をpGEX-KGにクローニングして、それぞれ図2Bおよび図2Cに示すようにpGST/HTLV-Igp21およびpGST/HTLV-II gp21と名付けた。GST/HTLV-I gp21のヌクレオチド配列を配列番号：57に示し、GST/HTLV-IIgp21のヌクレオチド配列を配列番号：58に示す。
【００６３】
実施例4．pチオレドキシン／HTLV-I／II gp21の構築
pB119/HTLV-1 gp21またはpB119/HTLV-II gp21をNcoI（5'）およびXho I（3'）によって処理して、N末端にヒスチジン6個を有するgp21断片を得た。gp21断片を、マップを図3Aに示すpThioHisB（インビトロジェン社（Invitrogen））にサブクローニングした。得られた発現構築物は、図3Bおよび図3Cにおいてそれぞれ示すようにpThio/HTLV-Igp21およびpThio/HTLV-II gp21と名付けた。Thio/HTLV-I gp21のヌクレオチド配列を配列番号：59に示し、Thio/HTLV-IIgp21のヌクレオチド配列を配列番号：60に示す。
【００６４】
実施例5．蛋白質発現のIPTG誘導
発現構築物をBL21（DE3）発現宿主に形質転換して、1LのLB/Ampにおいて37℃で200 rpmの振動培養を行った。細菌をO.D.595＝0.8となるまで増殖させて、細菌培養物1mlを「発現対照」（T0）のために残しておいた。1mLの1MIPTG（イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド）を培養物の残りに加えて蛋白質発現を誘導した。3時間誘導した後、細菌培養物1mLをTaとして残しておいた。異なる時間間隔で採取した細菌を溶解緩衝液によって個々に溶解した。溶解緩衝液の容量は、O.D.×容量（μl）／20＝溶解緩衝液容量（μl）の等式に従って変動する。次に、等量の試料緩衝液を加えて、反応物を95℃で5分間加熱した。
試料10μlをSDS-PAGEで分析した。培養物の残りを8000 rpmで15分間遠心して、その後の蛋白質精製のために細菌を採取した。
【００６５】
実施例6．発現された蛋白質型の確認
遠心した細菌を0.1％トライトン-100を含む100 mlのIMAC-5に再懸濁し、ホモジナイズした。細菌をマイクロフルイダイザーによって溶解して15000rpmで30分間遠心して、上清と沈殿物とを分離した。発現された蛋白質が可溶性型であるか封入体であるかをSDS-PAGEによって確認した。
【００６６】
実施例7．GST融合蛋白質の精製
GST/HTLV-I gp21（33 kDa）またはGST/HTLV-II gp21（33 kDa）をグルタチオンセファロース（商標）4B（アマシャムファルマシアバイオテック社（AmershamPharmacia Biotech））で精製した。遠心した細菌を0.1％トライトン-100を含む100 mlのIMAC-5に再懸濁し、ホモジナイズした。細菌をマイクロフルイダイザーによって溶解して、15000rpmで30分間遠心し、上清を分離した。グルタチオンセファロース（商標）4Bカラム2mlを調製して、0.1％トライトン-100を含む10 mlのIMAC-5で平衡化した。50mlの上清をカラムに2回通過させた。結合していない蛋白質および不純物を、0.1％トライトン-100を含む10 mlのIMAC-5で洗浄した。最後に、GST融合蛋白質を30mlの10 mMグルタチオンによって溶出した。
【００６７】
実施例8．Ni-NTAアフィニティカラムによるチオレドキシン融合蛋白質の精製
Thio/HTLV-I gp21およびThio/HTLV-II gp21の封入体型を精製するために、ホモジナイゼーション後の不溶性の沈殿物を、8M尿素を含む60mlのIMAC-5に再懸濁し、一晩攪拌した。溶液を15000 rpmで30分間遠心して、上清を得た。上清をNi-NTAアフィニティカラム2.5 mlに2回または3回通過させた。不純物を、下記の緩衝液によって順に洗浄した：緩衝液B（8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.001 Mトリス塩酸、pH 8.0）；緩衝液C（8M尿素、0.1 M NaH2PO4、0.001Mトリス塩酸、pH 6.3）；緩衝液D（8M尿素、0.1 M NaH2PO4、0.001 Mトリス塩酸、pH5.9）；緩衝液E（8M尿素、0.1 M NaH2PO4、0.001 Mトリス塩酸、pH 4.5）。最終的な蛋白質は100mM EDTAを含む8M尿素によって溶出した。工程は全て室温で行った。
【００６８】
実施例9．HTLV-I/II抗原性蛋白質の分析
蛋白質発現および可溶性型蛋白質を増加させるために、融合蛋白質GST/HTLV-I/II gp21を調製した。精製融合蛋白質GST/HTLV-I/IIgp21の結果を図4に示し、GST/HTLV-I gp21（レーン1）およびGST/HTLV-II gp21（レーン2）は、いずれも約33 kDaであって、純度は90％より高い。
【００６９】
バックグラウンドにおいて非特異的シグナルを減少させる直接サンドイッチELISAのために、融合蛋白質Thio/HTLV-I/II gp21を調製した。精製融合蛋白質Thio/HTLV-I/IIgp21の結果を図5に示し、Thio/HTLV-I gp21（レーン1）およびThio/HTLV-II gp21（レーン2）は、いずれも約25 kDaであって、純度は95％より高い。
【００７０】
実施例10．抗原性蛋白質のビオチン化
GST/HTLV-I/II gp21（33 kDa）を1mg/mlの濃度に濃縮して、PBS緩衝液に対して透析した。溶解したビオチン蛋白質溶液を蛋白質溶液に絶えず攪拌しながら徐々に加えた。4℃で2時間反応させた後、トリス塩酸を最終濃度50mMとなるように加えて、反応を終了させた。次に、ビオチン標識蛋白質を50 mMトリス塩酸に対して透析して、その後直接サンドイッチELISAを行った。
【００７１】
実施例11．ヒト血清に関する特異性および感度の測定
予備試験の結果は、Thio/HTLV-II gp21を、ビオチン標識GST/HTLV-I gp21と共にコーティングするために用いることができることを示している。HTLV融合蛋白質が良好な感度を有するか否かを調べるために、HTLV血清標準対照（抗HTLVI/II混合力価パフォーマンスパネル、BBI）およびウェスタンブロッティングによって陽性であると同定されたタイナン（Tainan）献血センターからの血清を用いた。正常血清は融合蛋白質の特異性を調べるために用いた。下記の方法において、100μlのコーティング緩衝液（0.013 M Na2CO3、0.035 M NaHCO3、pH9.6）で希釈した1μg Thio/HTLV-II gp21／ウェルを96ウェルプレートにコーティングした。37℃で1時間インキュベートした後、プレートをPBST（0.05％ツイーン20を含むPBS）によって3回洗浄した。200μlのオーバーコーティング緩衝液（overcoating buffer）（GBC社）をウェルに加えて、37℃で2時間インキュベートした。液体を除去して、その後の実験までプレートを−20℃で保存した。5H標本希釈液C（5HSpecimen Diluent）（GBC社）で20倍希釈した100 μlの試料血清をウェル当たり加えて、プレートを37℃で1時間インキュベートした。次に、プレートをPBSTによって6回洗浄した。2Ha結合希釈液（2Haconjugate buffer）（GBC社）で250倍希釈した100 μlのビオチン標識GST/HTLV-I gp21をウェル当たり加えて、プレートを37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBSTによって6回洗浄した。2Ha結合希釈液（GBC社）で5000倍希釈した100μlのアビジン結合APをウェル当たり加えて、プレートを37℃で1時間インキュベートした。次にプレートをPBSTによって6回洗浄した。5 mgのp-ニトロフェニルホスフェート（シグマ社（Sigma））を、発色溶液として5mlの発色緩衝液（10％ジエタノールアミン、0.5 mM MgCl2）に溶解した。100 μlの発色溶液をウェル当たり加えて、プレートを37℃で15分間インキュベートした。結果をELISAリーダー（バイオラッド（Bio-Rad）モデル550）によって405nmで読み取った。
【００７２】
結果は、平均吸光度が、ウェスタンブロッティングによって陽性であると同定された台湾献血センター（Taiwan Blood Donation Center）からの血清（HTLV-I陽性試料19例）に関して1.052であること、抗HTLV-I/II混合力価パフォーマンスパネル（BBI）（HTLV-I陽性試料7例およびHTLV-II陽性試料11例）に関して1.098であったこと、および正常血清92例に関して0.1528であることを示している。結果は、陽性試料と陰性試料の間で有意差を示す。融合蛋白質は良好な感度および特異性を有し、いずれも99％を超えている。従って、融合蛋白質は、HTLVに対する検出物質として作用することができる。
【００７３】
本発明は、特に、その好ましい態様を参照し、記述してきたが、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、その形態および詳細に様々な変更を行いうることを理解すると思われる。
【００７４】
【発明の効果】
本発明により、ヒトTリンパ球向性ウイルス（HTLV）の抗原断片、そのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）またはチオレドキシン（Thio）との融合蛋白質、およびその融合蛋白質を作製するための方法が提供された。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】HTLV抗原断片のヌクレオチド配列を示す図である。ＡはHTLV-1 gp21の全配列を表し、およびＢはHTLV-II gp21の全配列を表す。
【図２】ＡはベクターpGEX-KGを示し、Ｂは構築物pGST/HTVL-I gp21を示し、Ｃは構築物pGST/HTLV-II gp21を示す図である。
【図３】ＡはベクターpThioHis Bを示し、Ｂは構築物pThio/HTLV-I gp21を示し、Ｃは構築物pThio/HTLV-II gp21を示す図である。
【図４】精製GST/HTLV-I gp21（レーン1）およびGST/HTLV-II gp21（レーン2）融合蛋白質（33 kDa）に関するSDS-PAGE分析を表す図である。
【図５】精製Thio/HTLV-1 gp21（レーン1）およびThio/HTLV-II gp21（レーン2）融合蛋白質（25 kDa）に関するSDS-PAGE分析を表す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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