(57)【要約】      （修正有）【課題】イネにおいて効率よく発現し、長期間にわたって優れた害虫抵抗性を付与することのできる人工合成遺伝子、及び該遺伝子を導入した形質転換イネを提供。【解決手段】以下の(a)又は(b)に示すタンパク質をコードし、かつイネにおける使用頻度が高いコドンを選択することによってイネの中で高い発現効率を有するように改変された人工合成遺伝子。(a)特定のアミノ酸配列からなるタンパク質(b)特定のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ害虫抵抗性を付与する活性を有するタンパク質【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質をコードし、かつイネにおける使用頻度が高いコドンを選択することによってイネの中で高い発現効率を有するように改変された人工合成遺伝子。
（ａ）  配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ害虫抵抗性を付与する活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡからなる請求項１に記載の人工合成遺伝子。
（ｃ）  配列表の配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）  配列表の配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ害虫抵抗性を付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
請求項１又は２に記載の遺伝子に、シグナルペプチドをコードする遺伝子を付加した人工合成遺伝子。
【請求項４】
配列表の配列番号３に示す塩基配列を有する請求項３に記載の人工合成遺伝子。
【請求項５】
イネにおいて機能しうるプロモーターの下流に、請求項１から４のいずれかに記載の人工合成遺伝子及びターミネーターを導入したことを特徴とする組換えベクター。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載の遺伝子、又は請求項５に記載の組換えベクターを導入した形質転換イネ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、害虫抵抗性を付与するアビジンをコードする人工合成遺伝子、及び該遺伝子を導入した形質転換イネに関する。
【０００２】
【従来の技術】
米は小麦、トウモロコシと並ぶ世界の三大穀物の一つであり、日本においては国民の主食として最も重要な位置を占めている。イネの栽培に関しては、様々な害虫による被害を防ぐために農薬の使用が欠かせない。また収穫した米を貯穀害虫の被害から免れるためにも薫蒸剤が使用されている。しかしながら、近年における消費者側の安全性志向の流れ、また環境調和型の農業が求められている中で農薬および薫蒸剤の使用は大きな問題である。農薬の使用は、害虫のみならず益虫も殺傷することにより生態系のバランスを崩し、流出した農薬は環境を汚染し、農薬の散布自体が農業作業者の健康に悪影響を及ぼす可能性が考えられる。また、近年残留農薬の問題が消費者の不安を呼び起こし、安全な農産物が求められている。
【０００３】
これを解決する一つの手段として遺伝子組み換え手法により害虫に対する抵抗性を持たせることが考えられている。代表的な例としてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓが産生する毒素であるＢｔ毒素遺伝子をイネに組み込むことによって害虫抵抗性を獲得することが報告されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＮＹ），１９９３；  １１（１０）：  １１５１−１１５５）。しかし、Ｂｔ毒素は効果を示す害虫に選択性があり、対象となる害虫が限られていることが問題となっている。例えば、あるＢｔ毒素は鱗翅目の害虫に対して効果が認められるが、甲虫類に対しては効果がないなど、作用適性が限られていることが知られている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  １９８９；  ５３（２）：  ２４２−２５５）。また、こうした組み換え体による害虫防除に関しても長期間に渡って同じ種類の遺伝子を導入した作物を栽培し続ければ、害虫の側に耐性が生じる危険性がある。
【０００４】
一方、アビジンは、ビオチンと強固に結合する性質を持つ卵白中の塩基性タンパク質である。アビジンは双翅目であるイエバエの幼虫（非特許文献１）、鱗翅目および鞘翅目の昆虫（非特許文献２）など、広範囲の種類の昆虫に対して殺虫活性があることが報告されている。これらの知見をもとに、アビジン遺伝子が導入されたトウモロコシ（非特許文献３）やタバコ（非特許文献４）が作製され、これらの植物が害虫抵抗性を持つことが報告されている。しかしながら、イネに関してはアビジンを導入した形質転換植物が作製された例は報告されていない。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １９５９；  ３：  ２９３−３０５
【非特許文献２】
Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔａ  １９９３；  ６９：  ９７−１０８
【非特許文献３】
Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０００；  １８：  ６７０−６７４
【非特許文献４】
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２；  １１（２）：  １８５−１９８
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
イネに関する害虫防除手法として、従来技術である化学農薬の使用は、手間やコストがかかる、薬効が長続きしない、人体や環境への悪影響も懸念される等の問題がある。また、遺伝子組換え手法によっても、対象となる害虫の範囲が限定される、害虫側に耐性ができる、植物種によって発現効率が悪い、などといった問題がある。
従って、本発明の課題は、イネにおいて効率よく発現し、長期間にわたって優れた害虫抵抗性を付与することのできる人工合成遺伝子、及び該遺伝子を導入した形質転換イネを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、殺虫活性のあるアビジンタンパク質をコードする遺伝子をイネにおいて使用頻度の高いコドンを選択することによってイネの中で高い発現効率を有するように改変させた人工合成遺伝子をイネに導入すると、そのイネが優れた害虫抵抗性を発揮することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）    以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質をコードし、かつイネにおける使用頻度が高いコドンを選択することによってイネの中で高い発現効率を有するように改変された人工合成遺伝子。
（ａ）  配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ害虫抵抗性を付与する活性を有するタンパク質
（２）    以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡからなる（１）に記載の人工合成遺伝子。
（ｃ）  配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）  配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ害虫抵抗性を付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（３）    （１）又は（２）に記載の遺伝子に、シグナルペプチドをコードする遺伝子を付加した人工合成遺伝子。
（４）    配列表の配列番号３に示す塩基配列を有する（３）に記載の人工合成遺伝子。
（５）    イネにおいて機能しうるプロモーターの下流に、（１）から（４）のいずれかに記載の人工合成遺伝子及びターミネーターを導入したことを特徴とする組換えベクター。
（６）    （１）から（４）のいずれかに記載の遺伝子、又は（５）に記載の組換えベクターを導入した形質転換イネ。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
１．人工合成遺伝子の設計と合成
本発明の人工合成遺伝子（以下、本発明の遺伝子という）は、天然のアビジンタンパク質をコードする遺伝子を、イネにおける使用頻度が高いコドンを選択することによってイネの中で高い発現効率を有するように改変した遺伝子である。
本発明の遺伝子をイネに導入し、形質転換することにより、害虫抵抗性に優れたイネを作出することができる。
【００１０】
本明細書において、天然のアビジンタンパク質とは、ニワトリ由来アビジンタンパク質をいい、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。また、このアミノ酸配列からなるタンパク質が害虫抵抗性を付与する活性を有する限り、そのアミノ酸配列において複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号１で表わされるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。ここで、「害虫抵抗性を付与する活性」とは、イネ等の作物に対して食害などによりその生育に悪影響を及ぼす、またはその収穫物である穀類に対して被害を及ぼしその商品価値を低下させる害虫を防除・殺虫する活性をいう。上記の「害虫抵抗性を付与する活性を有する」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する上記活性と実質的に同等であることをいう。
【００１１】
上記アミノ酸の欠失、付加、及び置換は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又は  Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  シリーズキットを用いて変異が導入される。
【００１２】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子としては、具体的には、配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。また、配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ害虫抵抗性を付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も本発明に含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
【００１３】
本発明の遺伝子の設計と合成は、細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ７「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、９５〜１００頁、島本巧・佐々木卓治監修秀潤社、１９９７年７月１日刊行に記載の方法を参考に行うことができる。
【００１４】
具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を作成し、そのアミノ酸に対応するコドンとしてイネにおける使用頻度の高いコドンを選択することによって本発明の遺伝子の塩基配列を設計する。イネにおけるコドン使用頻度の情報（下記表１参照）は、例えば、当業者に公知のＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪなど）を利用して得ることができる。また、細胞外に運搬させるために上記のアミノ酸配列にシグナル配列を付加する場合には、これを含めたタンパク質全体のアミノ酸配列を作成する。シグナル配列を付与するのは、発現されたアビジンが植物に対しても毒性を示す可能性があるのでそれを回避するためである。シグナル配列としては、イネ又はイネに近縁の植物由来のものであることが好ましく、例えば、細胞外へ移行するシグナルであるオオムギ由来のα−アミラーゼのシグナル配列等が挙げられるが、これに限定はされない。また、細胞外へ移行させる以外に液胞移行シグナル配列を用いて液胞に移行させてもよい。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
以下、本発明の遺伝子作製の具体的手順を示す。
▲１▼  まず作成したアミノ酸配列に含まれる各アミノ酸の個数を求める。
▲２▼  イネのコドンの平均出現頻度に最も近くなるように、上記で求めた個数のアミノ酸について使用するコドンを割り当てる。
▲３▼  なるべく同一コドンが連続しないように、それぞれのコドンの使用順番をつける。
▲４▼  Ｎ末端側のアミノ酸から順番に、各アミノ酸について▲３▼で決定したコドンの順番通りに選び、そのアミノ酸残基のコドンと仮決定する。
▲５▼  ▲１▼〜▲３▼の手順を繰り返しＣ末端までの全アミノ酸のコドンを仮決定し、最後に終止コドンを配置する。
▲６▼  決定されたコドンからなる人工遺伝子について、植物において遺伝子の転写を阻害する配列であるＡＴＴＴＡ配列が存在しないことを確認する。この配列が存在した場合には、この配列にかかるコドンを別の部分で使用したコドンと交換する。
▲７▼  以降の操作で使用する制限酵素の認識配列が存在しないことを確認する。存在した場合には、この配列にかかるコドンを別の部分で使用したコドンと交換する。
▲８▼  再び▲６▼、▲７▼を確認する。
尚、遺伝子設計の際に、後の操作のために適当な制限酵素認識配列を５’および３’に付加しておくことが好ましい。
【００１７】
次に、上記で設計した塩基配列を有する遺伝子の合成は、ＰＣＲを用いた長鎖ＤＮＡ合成法を用いて行うことができる（島本ら、「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、同上参照）。この方法では、長い合成オリゴヌクレオチドプライマーのみを使用してＤＮＡを合成する。プライマーの対は、プライマーの各々の３’末端に約１０〜１２ｂｐの相補鎖またはオーバーラップをもつように合成され、お互いのプライマーを鋳型としてＤＮＡ合成を行う。プライマーの全長は、約６０〜１００ｍｅｒ、好ましくは約８０〜１００ｍｅｒである。
【００１８】
まず、設計された塩基配列をもとに例えば約９０塩基ごとにプライマーとするＤＮＡオリゴマーを設計し、合成する（図１参照）。ＤＮＡオリゴマーの合成は、β−シアノエチルホスホアミダイド法によりＤＮＡ合成機を用いて行うことができる。
まず、設計した塩基配列の中央部付近から５’側約９０残基上流までの配列を用いて第１のＤＮＡオリゴマー設計し、合成する。次にこの第１のＤＮＡオリゴマーの３’側１２残基の配列を含み、この部分より遺伝子の３’下流側に９０残基程度の長さの相補鎖オリゴマーを合成し、これを第２のＤＮＡオリゴマーとする。また、第１のＤＮＡオリゴマーの５’側１２残基を含み、この部分より遺伝子の５’上流側に９０残基程度の長さの相補鎖オリゴマーを合成し、これを第３のＤＮＡオリゴマーとする。さらに、第２のＤＮＡオリゴマーの５’側（遺伝子側からみると３’側）の１２残基の配列を含み、この部分より遺伝子の３’下流側に第２のＤＮＡオリゴマーの相補鎖を合成し、これを第４のＤＮＡオリゴマーとする。以下同様に第５、第６のＤＮＡオリゴマーを合成する。合成遺伝子は５５０残基程度なのでこれで全部の領域をカバーできるが、カバーできていない場合はカバーできるまでさらにオリゴマーを合成する。
【００１９】
次に、これらオリゴマーを順番にＰＣＲ反応により結合する。まず第１と第２のＤＮＡオリゴマーをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う。次にこのＰＣＲ産物を鋳型として、第３、第４のＤＮＡオリゴマーをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応は、例えば、変性温度９４℃１分、アニール温度５１℃１分、伸長温度７２℃２分を１セットとして５サイクル反応させた後、変性温度９４℃１分、アニール温度６０℃１分、伸長温度７２℃２分を１セットして２０サイクル反応を行う。反応に使用するＤＮＡポリメラーゼは塩基の取り込みエラー率の低い酵素を使用することが好ましい。以下この操作を繰り返し、塩基配列を伸長し、目的の塩基配列を得る。目的の塩基配列の両端には、必要に応じて制限酵素部位を設け、常法に従いクローニングベクターに導入し、サブクローニングする。得られたクローンの塩基配列をＤＮＡシークエンサーで確認し、目的の塩基配列が得られたことを確認する。
【００２０】
２．組換えベクターの構築
１．で合成した人工合成遺伝子は適当なベクターに挿入し、イネなどの植物細胞へ導入して発現される。本発明の遺伝子を導入するためのベクターとしては、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクター、ｐＴＲＡ系のベクターが好適に用いられる。ｐＢＩ系及びｐＴＲＡ系のベクターは、アグロバクテリウムを介してイネに目的遺伝子を導入することができる。本発明においてはｐＢＩ系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３等が挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびアグロバクテリウムにおいて複製可能なベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるＬＢ配列とＲＢ配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のＤＮＡを植物核ＤＮＡに組み込むことが可能である（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９９１；１０（３）：６９７−７０４）。一方、ｐＵＣ系のベクターは、パーティクルガン法などでイネに目的遺伝子を直接導入することができ、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等が挙げられる。また、カルフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
【００２１】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法で行うことができる。
【００２２】
本発明の遺伝子は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこでベクターには、発現カセットとして、本発明の遺伝子の上流にプロモーター、下流にターミネーターを結合し、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）などを含めることができる。
【００２３】
「プロモーター」としては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。使用するプロモーターの種類を変更することによって、アビジンを発現させる部位を変えることが可能である。あるいは特定の生育段階で発現させることや特定の反応刺激によって誘導することもできる。使用することのできるプロモーターとしては、例えば、グルテリンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター等が挙げられる。グルテリン由来のプロモーターは種子特異的発現を誘導する性質を持ち（Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９９８；１４（６）：６７３−６８３）、貯穀害虫に対する効果の点からより好ましい。
【００２４】
「ターミネーター」は、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を集結できる配列であればよい。具体例としては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、カリフラワーモザイクウイルスポリＡターミネーター等が挙げられる。
【００２５】
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。
【００２６】
また、本発明の遺伝子の導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含めるか、もしくは選抜マーカー遺伝子  を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００２７】
３．形質転換イネの作製
形質転換イネは、本発明の遺伝子又は該遺伝子を含む組換えベクターを、該遺伝子が発現しうるようにイネ細胞に導入することにより得ることができる。
ここで、「イネ細胞」とは、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤などの細胞、カルス、懸濁培養細胞等をいう。
【００２８】
本発明の遺伝子又は組換えベクターをイネに導入する方法としては、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。例えばアグロバクテリウム法による遺伝子導入は、前記の組換えベクター（バイナリーベクター）をアグロバクテリウムに導入し、得られたアグロバクテリウムをイネ細胞に感染させることによる行う。以下に、具体的手順を示す。
【００２９】
まず、イネの完熟種子を次亜塩素酸で消毒後、２，  ４−ジクロロ酢酸を含む  寒天固形培地に置床して培養する。約３週間後胚盤組織より生じたカルスを寒天固形培地に移植して約３日又はそれ以上培養すると、アグロバクテリウム法に供試できるカルスが得られる。使用するイネの品種としては、例えば、コシヒカリ等の日本型品種および  ＩＲ３６  等のインド型品種があるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
次に、得られたカルスに組換えベクターを導入したアグロバクテリウムを感染させる。アグロバクテリウムは、例えばアグロバクテリウム・ツメファンシス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０１、ＬＢＡ４４０４  などを用いることができる。このアグロバクテリウムを選抜用薬剤を含む培地で培養することによって、本発明の遺伝子および選抜マーカー遺伝子が導入されたアグロバクテリウムのみを増殖することができる。最後に、遺伝子導入カルスから残存するアグロバクテリウムを除去し、ハイグロマイシンなどの選抜用薬剤を含んだ再分化誘導用培地にて培養し、形質転換されたカルスを選抜した後、シュートを誘導し、イネ植物体を形成させ、形質転換イネを得る。
【００３１】
なお、本発明において  形質転換イネとは、本発明の遺伝子を導入したカルスなどの植物培養細胞、植物体全体、植物器官（根、茎、葉、花、種子、実（種籾））を総称するものであり、種子の可食形態である玄米、精米、米粉および米飯を含む。植物培養細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには既知の組織培養法により器官又は個体を再生させればよい。
【００３２】
本発明の遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、形質転換細胞および組織から常法に従って  ＤＮＡを抽出し、公知の  ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。
【００３３】
本発明の形質転換イネは、自家受粉によって後代植物を作出することが可能であり、本発明の遺伝子を後代に遺伝させることできる。また、本発明の形質転換イネは他のイネとの交配により新たな品種を作出するためにも用いることができる。本発明の形質転換イネは、導入されたアビジン人工合成遺伝子により阻害されることなく正常に生育し、かつ該遺伝子の発現によって高い害虫抵抗性を示し、これを食害した貯穀害虫は死亡あるいは生育が抑制される。
【００３４】
ここで、抵抗性を示すことができる害虫の種類としては、例えば、直翅目（イナゴ、クサキリ等）、半翅目（アブラムシ、イネカメムシ、イネクロカメムシ、ウンカ、カメムシ、クモヘリカメムシ、シラホシカメムシ、セジロウンカ、ツマグロヨコバイ、トビイロウンカ等）、鱗翅目（アワヨトウ、イチモンジセセリ、イネアオムシ、イネツトムシ、イネヨトウ、コブノメイガ、ニカメイガ、ニカメイチュウ、ノシメマダラメイガ、イッテンコクガ、ガイマイツヅリガ、バクガ等）、双翅目（イネカラバエ、イネキモグリバエ、イネハモグリバエ等）、甲虫目（ヒラタコクヌストモドキ、イネクビホソハムシ、イネゾウムシ、イネドロオイムシ、コクヌストモドキ、コクゾウムシ、ココクゾウムシ等）などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により限定されるものではない。
【００３６】
（実施例１）  アビジンタンパク質をコードする人工合成遺伝子の設計および合成
大麦のアルファアミラーゼ由来のシグナル配列（配列番号４）に続いてアビジンのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列を作成した。このアミノ酸配列に含まれる各アミノ酸に前記手順に従ってイネにおいて使用頻度の高いコドンを割り当てることによって人工合成遺伝子のＤＮＡ配列を設計した（配列番号３）。遺伝子には５’側の末端にＢａｍＨＩサイトを、３’側末端にＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩサイトを（５’側からＨｉｎｄＩＩＩ  、ＢａｍＨＩの順番で）挿入した。
【００３７】
設計したＤＮＡ配列をもとに約９０塩基ごとに下記のＤＮＡオリゴマー合成業者（タバイエスペックオリゴ）に依頼して合成した。
Ａｖｉｄ３Ｆ（配列番号７）：
ａｇａｇｔｔｃａｃｔ  ｇｇｇａｃａｔａｃａ  ｔｔａｃｃｇｃａｇｔ  ｃａｃｇｇｃｇａｃｔ  ｔｃａａａｃｇａａａ  ｔｃａａａｇａｇｔｃ  ｇｃｃａｔｔｇｃａｃ  ｇｇｃａｃｃｃａｇａ  ａｔａｃａａｔｃａａ  ｃａ
Ａｖｉｄ４Ｒ（配列番号８）
ａａａｇｃａｔｔｇｇ  ｃｃｃｇｔｇａａｇａ  ｃｇｇｔｔｇｔａｃｔ  ｃｔｃｇｇａｇａａｃ  ｔｔｃｃａａｔｔｃａ  ｃａｇｔａａａｃｃｃ
ｇａａｇｇｔｃｇｇｃ  ｔｇｃｇｔａｃｇｃｔ  ｔｇｔｔｇａｔｔｇｔ  ａｔ
Ａｖｉｄ２Ｆ（配列番号６）
ｇｃｃａｇｇａａｇｔ  ｇｃｔｃｃｃｔｃａｃ  ｃｇｇｃａａｇｔｇｇ  ａｃｇａａｔｇａｃｃ  ｔｇｇｇｔａｇｃａａ  ｃａｔｇａｃｃａｔｔ
ｇｇｃｇｃｔｇｔｇａ  ａｃｔｃｔｃｇｃｇｇ  ａｇａｇｔｔｃａｃｔ  ｇｇ
Ａｖｉｄ５Ｒ（配列番号９）：
ｔｔｃｃａｇｔｃａｔ  ｃｇｃｃｔａｔｇｔｃ  ｇｔｔｃａｃｇｇａｇ  ｃｔｇｃｇｔａｇａａ  ｇｃｃａｃａｔｃｇｔ  ｃｔｔｇａｇａａｃｔ
ｔｃｔｔｔａｃｃａｔ  ｔｔｃｇａｔｃｇａｔ  ａａａｇｃａｔｔｇｇ  ｃｃ
Ａｖｉｄ１Ｆ（配列番号５）：
ｇｇａｔｃｃａｔｇｇ  ｃｔａａｃａａｇｃａ  ｃｃｔｃａｇｃｃｔｇ  ｔｃｃｔｔｇｔｔｃｃ  ｔｃｇｔｇｃｔｔｃｔ  ｃｇｇｃｃｔｇｔｃａ
ｇｃｃｔｃｇｃｔａｇ  ｃｇｔｃｔｇｇａｃａ  ｇｇｃｃａｇｇａａｇ  ｔｇｃ
Ａｖｉｄ６Ｒ（配列番号１０）：
ｇｇａｔｃｃａａｇｃ  ｔｔｔｃａｃｔｃｃｔ  ｔｃｔｇｇｇｔｃｃｔ  ｃａｇｔｃｔｔｇｔｇ  ａａｇａｔｇｔｔｇａ  ｔｔｃｃｔａｃｃｃｇ
ａｇｔｇｇｃｔｔｔｃ  ｃａｇｔｃａｔｃｇ
【００３８】
なお、上記Ａｖｉｄ３Ｆ（配列番号７）、Ａｖｉｄ４Ｒ（配列番号８）、Ａｖｉｄ２Ｆ（配列番号６）、Ａｖｉｄ５Ｒ（配列番号９）、Ａｖｉｄ１Ｆ（配列番号５）、Ａｖｉｄ６Ｒ（配列番号１０）は、それぞれ前記のオリゴマーＤＮＡ１，２，３，４，５，６に相当する。
【００３９】
最初に、上記ＤＮＡオリゴマーのうち、Ａｖｉｄ３Ｆ（配列番号７）およびＡｖｉｄ４Ｒ（配列番号８）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の組成を表２に示す。反応に使用したＤＮＡポリメラーゼはタカラバイオ社のＥｘＴａｑであり、酵素に添付された反応緩衝液を使用した。ＰＣＲの条件は、変性温度９４℃１分、アニール温度５１℃１分、伸長温度７２℃２分を１サイクルとして５サイクル、変性温度９４℃１分、アニール温度６０℃１分、伸長７２℃２分を１サイクルとして２０サイクルとした。
【００４０】
【表２】
2004357568.tif 000004
【００４１】
次に、上記ＰＣＲ反応の増幅産物の一部を取りこれをテンプレートとしてＡｖｉｄ２Ｆ（配列番号６）、Ａｖｉｄ５Ｒ（配列番号９）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は上記１回目の反応と同じでＰＣＲ反応液の組成は表３に示す通りである。
【００４２】
【表３】
2004357568.tif 000005
【００４３】
次に、上記ＰＣＲ反応の増幅産物の一部を取りこれをテンプレートとして増幅産物の一部を取り、最後にＡｖｉｄ１Ｆ（配列番号５）、Ａｖｉｄ６Ｒ（配列番号１０）を用いてＰＣＲ反応を行い、目的とする人工合成遺伝子を作製した。ＰＣＲ条件は上記１回目の反応と同じでＰＣＲ反応液の組成は表４に示す通りである。
ＰＣＲ反応終了後の反応液をキアゲン社のＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて合成ＤＮＡを精製し、次のサブクローニングに使用した。
【００４４】
【表４】
2004357568.tif 000006
【００４５】
（実施例２）  組換えベクターの構築及び形質転換イネの作製
（１）  組換えベクターの構築
実施例１で得られたＤＮＡ断片をＴＯＰＯ−ＸＬクローニングキット（インビトロジェン社製）用いて、キットに含まれるｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングした。サブクローニングしたＤＮＡ配列が正しいものであるかをＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマー社製ＡＢＩｐｒｉｓｍ３１０）で確認した。このサブクローニングしたプラスミドよりＢａｍＨＩで挿入断片を切り出した。農業生物資源研究所の高岩らが作成したＧｌｕＢ−１プロモーター（グルテリンプロモーター）がｐＵＣ１８に挿入されたベクターをＢａｍＨＩで切断し、上記の挿入断片を連結させた。ＧｌｕＢ−１プロモーターの３’下流に正方向に挿入されたクローンを選び、このクローンをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＧｌｕＢ−１プロモーターに連結されたアビジン人工合成遺伝子（アミラーゼシグナル配列を含む）を切り出した。
【００４６】
バイナリーベクターは農業生物資源研究所の川崎らが作成したベクターを改変したｐＢＩＧ−Ｈを用いた。このベクターは２つのボーダー配列の間にカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴ  ＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ）、β−グルクロニダーゼ遺伝子、ＳＡＲ配列を有する。このベクターを、ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、上記のＧｌｕＢ−１プロモーターに連結されたアビジン人工合成遺伝子を挿入した。図２に、アビジン人工合成遺伝子含有バイナリーベクター（Ａｖｉ−ｐＢＩＧ−Ｈと称する）の構造を示す（図２中、ＧｌｕＢ−１−ｐｒｏ：ＧｌｕＢ−１プロモーター、ａｍｙｌ−ａｖｉｄｉｎ：アビジンの人工合成遺伝子にアミラーゼのシグナル配列部分を付加した遺伝子、ＨｉｎｄＩＩＩ：ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位、ＲＢ：ライトボーダー、Ｎｏｓ−ｐｒｏ：ノパリン合成酵素プロモーター、ＮＰＴＩＩ：カナマイシン耐性遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ：ノパリン合成酵素ターミネーター、ＳＡＲ：スキャフォールドアタッチメントリージョン、３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ｉｎｔｒｏｎ−ＧＵＳ：イントロンを含むβ−グルクロニダーゼ遺伝子、ＨＰＴ：ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＬＢ：レフトボーダーを示す）。なおこのベクターにはＨｉｎｄＩＩＩ挿入部位の３’下流にＮｏｓターミネーター配列が存在し、正方向に遺伝子を導入すると導入した遺伝子のターミネーターとして機能する。また、ＳＡＲ配列とはＭＡＲ配列とも呼ばれ、核マトリックスと親和性のあるＤＮＡ配列でＳＡＲ配列の近傍にある遺伝子の転写効率を高めることが報告されている（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９３；２（２）：９３−１００）。
【００４７】
（２）    発現用バイナリーベクターのイネへの導入
（１）で作製したＡｖｉ−ｐＢＩＧ−Ｈベクターをアグロバクテリウムに導入した。遺伝子導入は、エレクトロポレーション装置（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ社製ＥＣＭ３９５）を使用し、１．４５ｋｅＶで荷電することにより行った。形質転換したアグロバクテリウムは５０％グリセロールを含むＬＢ培地を用いて−８０℃で保存した。また、これと同様にｐＢＩＧ−Ｈ（対照）を同様にしてアグロバクテリウムに導入した。Ａｖｉ−ｐＢＩＧ−Ｈ、ｐＢＩＧ−Ｈ導入アグロバクテリウムをそれぞれ用いてイネ（日本晴）を形質転換した。
【００４８】
（３）    アビジン遺伝子の発現の確認
形質転換イネにおけるアビジンタンパク質の発現をウェスタンブロッティング法により検出した。方法は、タンパク質実験ノート、２４−３２頁、岡田雅人・宮崎香編集、羊土社、１９９６年１０月１５日刊行に記載の方法に準じた。形質転換イネ及び対照イネ（対照用のｐＢＩＧ−Ｈで形質転換）の種子より可溶性タンパク質を抽出し、３０μｇずつＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。電気泳動した後、ゲル内のタンパク質を平板型転写装置セミドライタイプ（日本エイドー社製）を用いて転写膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐｓｑ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。検出のための１次抗体としてウサギ抗卵白アビジンポリクローナル抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）を用い、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識したヤギ抗ＩｇＧ抗体（バイオ・ラッド社製）を用いた。検出にはＡＰ発色キット（バイオ・ラッド社製）を用いた。図３に、形質転換イネ及び対照イネのそれぞれの種子から抽出した可溶性タンパク質をウェスタンブロッティング法によって解析した結果を示す（図３中、レーン１：対照イネ種子の抽出液（タンパク質量３０μｇ）、レーン２：形質転換イネ種子の抽出液（タンパク質量３０μｇ）、レーン３：標準アビジン（１００ｎｇ）を示す）。形質転換イネ種子の可溶性タンパク質のレーンでは強いシグナルがみられ、アビジンタンパク質が発現していることが確認された。また、検出されたシグナルより推定される分子量は標準品のアビジンよりやや小さかった。一方、対照イネの可溶性タンパク質ではシグナルが検出されなかった。
【００４９】
（実施例３）  形質転換イネ米に含有されるアビジン量の測定
ＥＬＩＳＡ法により形質転換イネ米に含有されるアビジン量を測定した。実験方法は「タンパク質実験の進め方」、９４〜９６頁、岡田雅人・宮崎香編集、羊土社、１９９８年１０月１日刊行に記載の方法に準じた。実施例２で得られた形質転換イネの玄米１粒に０．１モルリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えてホモジナイズし、１００００×ｇ、１０分間遠心分離して得られた上澄み可溶性液を試験に供した。ＥＬＩＳＡ試験用マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ３８０１−０９６）にこの可溶性液５０μｌずつ分注した。室温で２時間放置し、サンプルを取り除いた後、ＰＢＳ（ＮａＣｌ  ８ｇ，  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ２．９ｇ，  ＫＣｌ  ０．２ｇ，  ＫＨ２ＰＯ４  ０．２ｇを１Ｌの精製水に溶解して作製）を各ウェル当たり１００μｌ分注して３回洗った。ブロッキング溶液（２．５％牛血清アルブミン、５％ショ糖を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））を１００μｌずつ分注し室温で２時間放置した。ブロッキング溶液を取り除き、ブロッキング溶液で１０００分の１に希釈した１次抗体（実施例２で使用）を６０μｌずつ分注し３７℃で１時間放置した。未結合の一次抗体を取り除くため、１００μｌのＰＢＳで５回洗った。続いて、ブロッキング溶液で１０００分の１に希釈した２次抗体（実施例２で使用）を６０μｌずつ分注し３７℃で１時間放置した。未結合の二次抗体を取り除くため、１００μｌのＰＢＳで５回洗った。ＰＢＳを捨て、発色用反応液（バイオラド１７２−１０６３）を１００μｌ加えて室温で１時間反応させた。マイクロプレートリーダー（東ソー  ＭＰＲ−Ａ４）により４１０ｎｍの吸光度を測定した。実施例２で作製した形質転換イネ１９系統のうち、ウェスタンブロット法による解析で強いシグナルが認められた３系統について８粒ずつ分析したところ、それぞれ平均値で５４、１１４、７６ｐｐｍのアビジンを含んでいた。白米ではタンパク質含量が約９０％に減少するので（５訂日本食品成分表、科学技術庁資源調査会編（２０００年））、白米における推定アビジン含量はそれぞれ４９、１０３、６８ｐｐｍとなる。
【００５０】
（実施例４）  形質転換イネ米を用いた害虫成育抑制試験
実施例２で得られた形質転換イネ（試験区）と対照イネ（対照区）の玄米を用意した。これら玄米を別々にミルサー（イワタニ社製）を用いて粉砕し、１．５ｍｌマイクロチューブに５０ｍｇずつ分けて入れこれを試験区、対照区とも各２０個用意した。マイクロチューブの蓋には呼吸用の穴を３カ所針先で開けた。このチューブにヒラタコクヌストモドキの孵化幼虫を１頭ずつ放ち、３０℃下で飼育試験を行った。結果を表５に示す。形質転換イネ米を飼料とした場合、試験２週間後で生存個体は２頭となり、最終的に成虫になった個体は存在しなかった。一方、対照区では試験開始２週間後で１８個体が生存し、最終的には１６頭が成虫となった。従って、アビジンを含む形質転換イネの玄米は強力に害虫の成育を抑制することが判明した。
【００５１】
【表５】
2004357568.tif 000007
【００５２】
（実施例５）  プロモーターの発現効率の比較
イネ種子におけるプロモーターとしての誘導効率に関し、ＧｌｕＢ−１プロモーターと植物の遺伝子導入の際に汎用されている３５Ｓプロモーターとの比較を行った。ハトムギ由来のシスタチン遺伝子（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２；６６（１０）：２２８７−２２９１）を３５ＳプロモーターおよびＧｌｕＢ−１プロモーターの下流に結合したコンストラクトをそれぞれ作製し、バイナリーベクターに導入した。これらのベクターを用いて実施例２に記載の通りアグロバクテリウム法により形質転換イネを作製した。それぞれの形質転換体イネから得た稔実種子（４粒）の可溶性タンパク質３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ウェスタンブロッティング法により解析し、発現量を比較した。図４にその結果を示す（図４中、レーン１：３５Ｓプロモーター形質転換体、レーン２：ＧｌｕＢ−１プロモーター形質転換体、レーン３：プロモーターおよびシスタチン遺伝子を含まない形質転換体、矢印：導入したシスタチンのシグナルを示す）。その結果、ＧｌｕＢ−１プロモーターを用いた場合の方が３５Ｓプロモーターより強いシグナルが検出された。ＮＩＨ  ｉｍａｇｅソフトウェアによりシグナルを定量化したところ、ＧｌｕＢ−１プロモーターを使用した場合の方が約４倍のシグナル強度があり、ＧｌｕＢ−１プロモーターの使用は従来から汎用されている３５Ｓプロモーターより種子における転写効率が高いと考えられる。従って、種子におけるアビジンの発現に関しては３５ＳプロモーターよりＧｌｕＢ−１プロモーターが有効であると考えられる。
【００５３】
（実施例６）ユビキチンプロモーターを使用した形質転換イネ
実施例２におけるＧｌｕＢ−１プロモーターの代わりにイネユビキチンプロモーター（ＰＬＡＮＴ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０００  Ｊｕｌ  ２８；１５６（２）：２０１−２１１）を使用して形質転換イネを作製したところ、１系統の植物体が得られた。この植物体の葉にはアビジンが発現していることをウェスタンブロット法による解析で確認できたが、稔実しなかった。従って、ユビキチンプロモーターはアビジンを葉茎などに発現させる場合には有用であるが、種子における発現にはＧｌｕＢ−１プロモーターの方が適していると考えられる。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、殺虫活性のあるアビジンタンパク質をコードする遺伝子をイネにおいて使用頻度の高いコドンを選択することによってイネの中で高い発現効率を有するように改変させた人工合成遺伝子が提供される。この人工合成遺伝子を導入した形質転換イネは優れた害虫抵抗性を有する。
【００５５】
【配列表】
2004357568.tif 000008
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【図面の簡単な説明】
【図１】人工合成アビジン遺伝子の作製に用いたＤＮＡオリゴマーの模式図を示す。
【図２】アビジン人工合成遺伝子含有バイナリーベクター（Ａｖｉ−ｐＢＩＧ−Ｈ）の構造を示す。
【図３】形質転換イネ及び対照イネのそれぞれの種子から抽出した可溶性タンパク質をウェスタンブロッティング法によって解析した結果を示す。
【図４】ＧｌｕＢ−１プロモーターおよび３５Ｓプロモーターにより誘導されるタンパク質発現量をウェスタンブロッティング法によって解析した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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