(57)【要約】【課題】低塩濃度で生育可能な好熱菌を提供する。【解決手段】ＩＲＣＳ　９９１３８Ａ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０３１）が属する属の古細菌であって、７０℃以上の温度および０．２重量％以下の塩濃度で生育可能である古細菌。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＲＣＳ　９９１３８Ａ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０３１）が属する属の古細菌であって、７０℃以上の温度および０．２重量％以下の塩濃度で生育可能である古細菌。
【請求項２】
ＩＲＣＳ　９９１３８Ａ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０３１）で表される古細菌である請求項１に記載の古細菌。
【請求項３】
ＩＲＣＳ　９９１３８Ａ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０３１）が属する属の古細菌に由来する超耐熱性酵素。
【請求項４】
好気的条件下で安定である請求項３に記載の超耐熱性酵素。
【請求項５】
７０℃以上の温度かつ０．２重量％以下の塩濃度で分離源を培養し、分離源中の超好熱菌を選抜することを特徴とする超好熱菌のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項３に記載の酵素を基質と反応させて酵素反応生成物を製造する方法であって、該反応を、該酵素は通過しないが反応生成物は通過する分子量分画膜の一方側で行い、酵素を膜の一方側に残し、酵素反応生成物を膜の他方側で得ることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項２に記載の古細菌に対する抗体。
【請求項８】
請求項７に記載の抗体をサンプルと反応させて、該抗体と反応する菌株を有するサンプルを選別する工程を含む、請求項２に記載の古細菌と類似の古細菌をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、超好熱性菌、超耐熱性酵素および超好熱性菌のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、耐熱性酵素の酵素反応生成物を耐熱性酵素と分離して得る方法、古細菌に対する抗体、並びに該抗体を用いた古細菌のスクリーニング方法に関する。
【０００３】
【従来の技術およびその課題】
従来、超好熱菌としては、ピロコッカス・フリオサスが例示されるが、ピロコッカス・フリオサスは培地中の高い塩濃度と多種類の塩および粉末イオウを要求する嫌気性菌であるため培養に手間がかかり、その応用が限られる不具合があった。
【０００４】
本発明は、低塩濃度で生育する超好熱菌を提供することを目的とする。
【０００５】
また、本発明は、低塩濃度で生育する超好熱菌のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００６】
さらに、本発明は、該超好熱菌由来の好熱性蛋白質、特にプロテアーゼを提供することを目的とする。
【０００７】
さらに、本発明は、該超好熱菌由来の酵素反応生成物の製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
更に、本発明は、古細菌に対する抗体を提供することを目的とする。
【０００９】
更に、本発明は、古細菌に対する抗体を用いた古細菌のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の項１〜項８の発明に関する。
項１．　ＩＲＣＳ　９９１３８Ａ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０３１）が属する属の古細菌であって、７０℃以上の温度および０．２重量％以下の塩濃度で生育可能である古細菌。
項２．　ＩＲＣＳ　９９１３８Ａ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０３１）で表される古細菌である項１に記載の古細菌。
項３．　ＩＲＣＳ　９９１３８Ａ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０３１）が属する属の古細菌に由来する超耐熱性酵素。
項４．　好気的条件下で安定である請求項３に記載の超耐熱性酵素。
項５．　７０℃以上の温度かつ０．２重量％以下の塩濃度で分離源を培養し、分離源中の超好熱菌を選抜することを特徴とする超好熱菌のスクリーニング方法。
項６．　項３に記載の酵素を基質と反応させて酵素反応生成物を製造する方法であって、該反応を、該酵素は通過しないが反応生成物は通過する分子量分画膜の一方側で行い、酵素を膜の一方側に残し、酵素反応生成物を膜の他方側で得ることを特徴とする方法。
項７．　項２に記載の古細菌に対する抗体。
項８：　項７に記載の抗体をサンプルと反応させて、該抗体と反応する菌株を有するサンプルを選別する工程を含む、項２に記載の古細菌と類似の古細菌をスクリーニングする方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明において、ＩＲＣＳ　９９１３８Ａ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０３１）で表される古細菌が新属であることは、以下のようにして確認した。
【００１２】
分類の確認方法としては、国立遺伝学研究所の提供する相同性検索プログラムＢＬＡＳＴＮ　Ｖｅｒ．２．０．１１を利用し、解読した１６ＳｒＲＮＡ　１３２７ｂｐ（イントロンを除く）を登録されている全遺伝子配列と相同性を照合した（プログラム文献：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｆ．ら、（１９９７），　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：　ｐ３３８９−３４０２）。
【００１３】
その結果、相同性の高いものが全て古細菌であったので、本発明の菌株は古細菌であると同定した。新属であることは、１６ＳｒＲＮＡの相同性が最も近いものに比べて９３．８％（１０５９／１１２９）の一致しかみられず、かつ９３％の相同性を有する菌とは性質が大きく異なることに基づき確認した。たとえば近縁であったＳｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ　ａｃｈａｉｉｃｕｓ　（ｉｓｏｌａｔｅ　Ｐ８）を用いて同じ比較を行うと、同族のＳｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｍａｒｉｎｕｓとは１３４５／１３５８（９９．０％）の相同となり、最も近い別属のＤｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓｍｏｂｉｌｉｓとでも１３１８／１３７２（９６．１％）の相同性であった。
【００１４】
古細菌の性質に関し、古細菌の生物学（古賀洋介、亀倉正博編集、東京大学出版会）ｐ８２　表５−１には、好熱性古細菌がまとめて記載されている。相同性から最も近い結果となったものが所属するＳｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ属の基準種はＳ．　ｍａｒｉｎｕｓであり、該基準種とも（ａ）好気的条件で生育する、（ｂ）生育に塩を要求しない、（ｃ）生息地が陸上温泉である点で性質が明らかに異なるため、新属と判断できる。
【００１５】
なお、さらに大きな分類の“科”や“目”を見ても、培養温度、塩の要求、生育ｐＨなど同じ性質のものはない。
【００１６】
本発明の特許請求する超好熱性細菌とは、特に、配列番号１に記載する１６ＳｒＲＮＡ（イントロンを除く）とのホモロジーが９４％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の細菌が該当する。
【００１７】
ＩＲＣＳ　９９１３８Ａ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０３１）で表される古細菌が属する菌は、温度７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは８５℃以上、特に９０℃以上で生育することが可能である。なお、生育可能温度の上限は１００℃以下、好ましくは９８℃以下、より好ましくは９５℃以下である。
【００１８】
また、ＩＲＣＳ　９９１３８Ａ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０３１）で表される古細菌が属する菌は、０．２重量％以下の塩濃度、好ましくは０．１重量％以下の塩濃度、より好ましくは０．０５重量％以下の塩濃度で生育可能である。
【００１９】
ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０３１株の菌学的性質及び同定の準拠を以下に示す。
・菌学的性質
形態：０．７−２．０μｍの球形
温度：７０℃〜９７℃で生育することを確認済み
酸素：好気的、培養、保存、植え継ぎなどあらゆる操作が簡便である（嫌気状態では増殖しない）
至適ｐＨ：７．５前後
その他：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を、遺伝子配列を登録したデータベースと比較することで系統解析を行った。結果を図１に示す。
【００２０】
本菌株ＩＲＣＳ　９９１３８Ａは、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに平成１４年９月２０日に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０３１として寄託した。
【００２１】
ＩＲＣＳ　９９１３８Ａ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０３１）が属する属の古細菌を適当な培地で培養し、菌体破砕液から酵素を回収することにより、超耐熱性酵素、たとえば超好熱性（プロテアーゼ、エステラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼなど）を得ることができる。本発明の超耐熱性酵素は、７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは８５℃以上、特に９０℃以上の温度で活性を有する。なお、活性を保持する温度の上限は１２０℃以下、好ましくは１１０℃以下である。
【００２２】
以下、耐熱性酵素として超耐熱性プロテアーゼを例に取り説明する。
【００２３】
超耐熱性プロテアーゼのプロテアーゼ活性（酵素によって、プロテアーゼ／エステラーゼは、両活性を示すものがある）は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）を基本緩衝液として測定可能である。
【００２４】
使用可能な他の緩衝液としては、ｐＨ５−７（ＭＥＳ）、ｐＨ７−８　（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ８．５−１０　（ＣＨＥＳ）が利用できる。酵素活性の測定法の一例としては、０．２５％　Ａｚｏｃａｓｅｉｎ（Ｓｉｇｍａ）０．５ｍｌと０．４ｍｌの緩衝液を測定温度に加温し、試料を０．１ｍｌ加えることで反応を開始、１０％　過塩素酸を１．５ｍｌ加えることで反応を停止し、室温に２０分以上置き、遠心分離操作後（１０，０００　ｇで１０分）上清の吸光度を４００ｎｍあるいは４３０ｎｍで測定することで、酵素活性を測定できる。
【００２５】
プロテアーゼなどの酵素の分離は、試料として菌体の培養上清、菌体回収物及び超音波処理、界面活性剤の添加などにより可溶化したものを用いる。酵素には、コール酸、Ｔｗｅｅｎなど作用の弱い界面活性剤並びにＳＤＳのような強力な界面活性剤を含む系でも活性を示すものが含まれる。
【００２６】
プロテアーゼについては、金属キレート剤（５ｍＭ　ＥＤＴＡ）を加えても、活性は変わらない酵素分画が存在することから、金属プロテアーゼでない酵素を含む。ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離してもプロテアーゼ活性を示す酵素が存在することから、単離した状態で活性を持つ酵素が存在する（複合系酵素による働きではない）。
【００２７】
本発明の酵素は、耐熱性が高く、また酸素に触れても失活しない点に特徴があり、このことが本発明の古細菌を利用する際の利点である。微生物本体或いは酵素の作用により廃棄蛋白質、プラスチックなどを分解し、廃棄物処理や未利用資源の有効活用が可能となる。
【００２８】
また、高い耐熱性を示す酵素は、アルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ピペリジン、ピリジンなどの化学反応に利用する有機溶媒にも耐性を示すので、水系、有機溶媒を選ばず合成、分解反応の触媒として利用できる。その際、光学異性体の一方の優先的反応を行うことができる。
【００２９】
さらに、耐熱性酵素を科学実験や医療検査のリポーターとして、あるいはバイオセンサーのセンサー分子として使用すると、高温での処理や測定により、試験物に含まれる同じ作用の酵素は失活し、バックグラウンドの低減が容易になる。
【００３０】
本発明のスクリーニング方法は、７０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは８５℃以上、特に９０℃以上で行うことができ、塩濃度に関しては、０．２重量％以下、好ましくは０．１重量％以下、より好ましくは０．０５重量％以下で行うことができる。このような条件でスクリーニングすることにより、超好熱性で、低塩濃度で生育できる微生物（たとえば、細菌、古細菌等）を得ることができる。なお、温度の上限は１２０℃以下、好ましくは１１０℃以下である。
【００３１】
好ましいスクリーニング条件の一例を以下に示す。
【００３２】
スクリーニング条件を以下に列挙する。
温度：８５℃以上、
培地：酵母抽出物とペプトンのどちらか一方或いは両方を含み、塩濃度が０．２％以下。
培養：容器は試験管、フラスコなど特に何でもよい。還元剤を加えない好気的条件とし、容器のフタは綿栓、アルミキャップ、シリコン栓、スクリュー栓など材質によらない。静置或いは振トウ条件にて培養する。
分離：容器に入った培地の一部を順次移して希釈する限界希釈法により、統計学的に単一細胞となる濃度の画分を培養する操作を少なくとも３回繰り返す。
【００３３】
本明細書において、分離源としては、特に限定されないが、例えば温泉水、土壌、水、岩石などのあらゆるものを含む。
【００３４】
本発明の菌株は、遠心により回収できる（４０００ｇ或いはそれ以下）。回収した菌体は、培地に固形成分を含まないため、異物を含まないか少ない。
【００３５】
菌体の破砕は、超音波破砕、低濃度の界面活性剤により行うことができ、透明な菌体可溶成分液が得られる。この成分液から酵素活性の測定、有用物質含量の測定、遺伝子の取り出しなどの操作が簡便にできる。
【００３６】
本発明の菌の培養においては通常の細菌の培養方法が一般に用いられる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。
【００３７】
本発明のような超好熱性古細菌由来の耐熱性酵素において、反応が必要以上に進まないようにするため、あるいは酵素活性を含まない試料とするため酵素を失活させる場合、常温型の酵素のように簡単な熱処理では耐熱性酵素を失活させることができない。従って、反応のコントロールや品質の安定化のために耐熱性酵素の酵素活性を制御することが重要な課題である。
【００３８】
このような耐熱性酵素を用いて、酵素の基質から酵素活性フリーの反応生成物を得ようとする場合、酵素は通さないが基質の酵素反応生成物は通す分子量分画膜を用いるのが好ましい。酵素としては、耐熱性酵素をそのまま用いてもよく、或いは酵素を担体に固定化させたり、酵素を化学的に修飾したものを利用することができる。酵素の化学的修飾には、酵素同士を結合させたり、疎水性基、親水性基、荷電を有する側鎖などを導入したりすることが例示される。
【００３９】
例えば、耐熱性酵素が或る分子量分画膜を通過する場合には、通過可能な分子量がより低い分子量分画膜を使用してもよく、耐熱性酵素を担体に固定化したり、耐熱性酵素同士或いは耐熱性酵素と他の化合物を結合してより高分子量の酵素複合体を形成したり、親水性、疎水性、荷電を変えることで、分子量分画膜の通過を制御することも可能である。
【００４０】
具体的には、該分子量分画膜の一方側に耐熱性酵素及び基質を存在させて酵素反応を行うと、酵素は該分子量分画膜の一方側に局在し、酵素反応生成物は、該分子量分画膜の両側に分布するようになる。酵素の基質は該分子量分画膜を通過してもよいが、好ましくは該基質は該分子量分画膜を通過しにくいか通過しない。
【００４１】
酵素反応生成物が、基質と電荷或いは帯電の程度が異なる場合（例えば、基質が中性で生成物が陽イオン又は陰イオン；基質が陰イオンで生成物が中性又は陽イオン；基質が陽イオンで生成物が中性又は陰イオン、或いはその帯電の程度が異なる場合、或いは同じ電荷でもその帯電の程度が異なる場合）、膜の一方側と他方側にそれぞれ電極を作用させることで、基質と生成物を分離しやすくすることができる。
【００４２】
酵素反応温度は、室温でもよいが、高温で行うほど、酵素反応速度や生成物の拡散速度が大きくなり、雑菌の繁殖も抑制されるので好ましい。好ましい反応温度は、６０〜１００℃程度、より好ましくは７０〜９５℃程度である。
【００４３】
本発明の１つの実施形態において、例えば、酵素としてプロテアーゼを用いた場合、分子量分画膜を利用して反応中あるいは反応後のポリペプチドを含むサンプルから低分子化したペプチド・アミノ酸を得ることができる。酵素がプロテアーゼ以外であっても、酵素反応生成物を耐熱性酵素と分離して、酵素活性のない酵素反応生成物を同様に得ることができる。
【００４４】
また、該プロテアーゼは、プロテアーゼを含む複数の酵素の混合物であっても、プロテアーゼを単離した後に反応に使用してもよい。
【００４５】
このように、分子量分画膜（例えば、透析膜、限外濾過膜、中空糸フィルターなど）を用いることにより、酵素を失活させることなく容易に酵素反応生成物を得ることができる。
【００４６】
本発明は、超好熱性古細菌に特異的な抗体にも関する。この抗体は、請求項１，２の古細菌、或いはそれから得られる成分を抗原として用いて生産されるポリクローナル又はモノクローナル抗体が例示される。
【００４７】
該抗体を使用した蛍光免疫染色法により、サンプル中にＩＲＣＳ−９９１３８Ａあるいは、これに類似の超好熱性古細菌が存在するかを迅速に判定できる。超好熱菌を株にまで分離するには、比較的手間のかかる限界希釈法を使うため、多数のサンプルを処理することが困難であった。しかし、特異抗体を利用すると、まず類似の菌株が存在するサンプルに絞り込んで操作を行うことが出来る。
【００４８】
該抗体を粒子や繊維などの担体に結合するか、抗体をあとで回収できるようにすると、サンプル中からＩＲＣＳ　９９１３８Ａ類似の菌体を回収することができる。
【００４９】
例えば、ビオチン−アビジン結合を利用して、一方を抗体に、他方を担体に導入すると、水溶液中で混ぜ合わせると抗体が回収される。また、抗ＩＲＣＳ　９９１３８Ａ抗体を認識する抗体を利用することで、回収することも可能である。
【００５０】
さらに、抗体結合菌体を培地中に移して高温で培養すると抗体は変性し、回収した菌体が培養できる。これは、類似菌のスクリーニングを容易にする。実際に、該抗体を用いて種々のサンプルについて古細菌のスクリーニングを行うと、これまでに存在が知られなかった様な古細菌であるのに、初めにＩＲＣＳ　９９１３８Ａを得たサンプルと全く別のサンプルから次々と類似の菌株が得られるようになり、より多くの耐熱性酵素などを開発するために利用できる微生物・遺伝子資源が得られる。
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば、超好熱性菌を得ることができ、該菌から超好熱性の酵素（例えばプロテアーゼなど）を得ることができる。
【００５２】
また、本発明のスクリーニング方法によれば、超好熱性菌を容易にスクリーニングすることができる。
【００５３】
本発明の酵素を作用させた生成物の製造方法によれば、以下のような効果が得られる。
・失活しにくい耐熱性酵素活性を含まない試料が得られる
・高温での処理を行うため、反応中および反応後どちらでも、膜の通過が早くなるため効率的な回収行程である。
・高温での操作であるため、微生物の増殖や試料由来の酵素反応など好ましくない現象が生じないか、抑制できる。
・組成、濃度、温度、膜の分画サイズや面積、形状などを変えることで、反応速度、得られる試料の分子量や分離速度が調節できる。
・膜の前後に電位を与えることや膜表面に極性や電荷の異なる分子を配することで分解物から特定の化合物（例えばペプチド・アミノ酸など）の取得効率を制御できる。
【００５４】
本発明の抗体を利用すると、ＩＲＣＳ−９９１３８Ａに類似の菌株の存在を迅速に評価でき、サンプルの絞り込みが出来る。しかも、担体などを利用して回収すると分離に成功する可能性を飛躍的に高めることが出来る。
【００５５】
【実施例】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
実施例１：菌株の分離
分離源として、秋田県秋ノ宮温泉水（温度：７１−７６℃、ｐＨ７．６８（ガラス電極法、２３℃））を用いた。該温泉水を培地（０．１％　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ，　０．１％Ｐｅｐｔｏｎの液体培地、ｐＨ７．２）中，　温度９０℃で、１８ｍｍφ試験管中で静置培養を行った。限界希釈法により９０℃の培養液中で増殖可能な菌株を得た。
【００５６】
得られた菌株は、培地：０．１％酵母抽出物＋０．１％　ペプトンの液体培地中、ｐＨ中性から弱アルカリ性、好ましくはｐＨ７．０〜８．９で良好に生育した。また、温度７０℃〜９７℃で生育することを確認した。
【００５７】
至適ｐＨは７．５前後であり、少なくともｐＨ７．０〜８．９で増殖可能であった。
【００５８】
得られた菌株の増殖中の菌液を９０℃に予備加熱した滅菌培地に１／１００量植菌すると、約３日でもとの菌濃度にまで増えた。
【００５９】
菌株濃度測定は、培地が透明なので、吸光度により増殖をモニターできる。
【００６０】
本発明の菌株の１６Ｓ　ｒＲＮＡの部分核酸配列と、比較対照となった本発明の菌株と最も近い属の公知菌株（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ　ａｃｈａｉｉｃｕｓ　（Ｐ８））の１６Ｓ　ｒＲＮＡの部分核酸配列を、それぞれ配列番号１，２に示す。
【００６１】
また、本発明の菌株と公知の菌株の１６Ｓ　ｒＲＮＡの部分核酸配列の対比を図３Ａ〜図３Ｂに示す
本発明者は、以下のことをさらに確認した。
・回収菌体がその後の実験に使用しやすい。
・超好熱プロテアーゼが存在（金属キレート剤で阻害されない）する。
・菌体破砕液には９５〜９９℃で最も高い酵素活性を示すプロテアーゼが存在する（測定法：アゾカゼイン酸沈殿法）。
【００６２】
アミラーゼ及びリパーゼ活性は極めて低いかない。
【００６３】
その他：ＳＯＤ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、アリルアミダーゼ、α、β−グルコシダーゼ、α−マンノシダーゼなどがある。
＊栄養要求性（炭素化合物要求性）
炭素源としては、酵母抽出物では生育可能であるが、グルコース＋微量（０．００５重量％以下）の酵母抽出物では生育不良であった。
本菌株の嫌気条件での増殖のチェック方法
０．１％酵母抽出物、０．１％ペプトン、ｐＨ７．１に還元状態の表示試薬（最終濃度０．４ｍｇ／Ｌ　レサズリン）、還元剤（最終濃度０．５ｇ／ＬのＮａ２Ｓ、ｐＨ７）をそれぞれ　加え、オートクレーブ後に窒素ガスにてレサズリンの色が変わるまで還元し　た。菌液１／１０００容量を植菌、８５℃にて振トウ培養（６０ｒｐｍ）、　細胞数濃度はサンプリングし、ＤＡＰＩにて染色、フィルター濾過し、蛍光　顕微鏡下で菌数をカウントすることにより調べた。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
実施例２
ＩＲＣＳ　９９１３８Ａを０．１％酵素抽出物、０．１％ペプトン、ｐＨ７を培地として５日間培養した培養液から遠心分離（８５００ｇ，　１５ｍｉｎ）により上清を得て、これを限外ろ過膜濃縮（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社ＶＩＶＡＦＬＯＷ５０，　膜ポアサイズ３０，０００）により３００倍に濃縮したものを酵素液とした。
【００６６】
タンパク質は、絹の精練工程により生じたセリシン画分（Ａｂｓ２８０ｎｍ＝１１．３）をオートクレーブ処理したものを、分子量分画膜としては透析膜チューブ（ＶＩＳＫＡＳＥ　ＳＡＬＥＳ　ＣＯＲＰ．　製造、三光純薬株式会社販売　ＵＣ２０−３２−１００：分画分子量１２，０００〜１４，０００）を、緩衝液としてダルベッコ緩衝液（ｐＨ７．４）を各々使用した。タンパク質液３０ｍｌ、酵素液２ｍｌ（あるいは酵素液０．５ｍｌ＋１．５ｍｌ蒸留水）、緩衝液８ｍｌを透析膜チューブ中に加え、９５℃にて加温した緩衝液を含む外液につけ、おだやかに振トウ（１１５ｒｐｍ）をおこなった。反応中に外液を極少量回収し、吸光度（Ａｂｓ２８０ｎｍ）を測定することで膜外に得られたタンパク質分解物の増加を調べた。
【００６７】
その結果、グラフ（図２）に示すように酵素の添加量が多いほど早く分解物が得られ、得られた分解物にはタンパク質分解酵素活性は認められなかった。
実施例３
ａ）抗体の作成
ＩＲＣＳ　９９１３８Ａの菌体を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，　１５ｍｉｎ）により湿重量で（０．１１ｇ）回収し、０．１％ＳＤＳにより菌体を壊し、これに滅菌した蒸留水６ｍｌへの懸濁と遠心分離による回収を３回繰り返し、これを滅菌した生理食塩水に懸濁して免疫用抗原のための膜画分とした。
【００６８】
膜画分（タンパク質量１．２ｍｇ）を用いて定法によりウサギ（日本白色種メス）で抗体作成を行い、ＩＲＣＳ−９９１３８Ａに対する特異的な抗体を含む血清を得た。
【００６９】
これをタンパク質、抗体作成用のアジュバントとしてウサギに皮下注射を２週間毎に合計５回行った。ウサギは麻酔処置の後、無痛状態で全血液を回収し、ＩＲＣＳ　９９１３８Ａに対する特異抗体を含む血清を得た。
ｂ）蛍光免疫染色
以下の試験を行い、温泉などの高温環境から得たサンプル中に本発明の菌株と類似の菌株が含まれるかを観察した。
【００７０】
サンプル中の粗い沈殿物を除いた１ｍｌを遠心分離処理にかけ、上清を捨て、沈澱に抗体を含む血清（コントロールには抗体を含まない血清）を１／１０００量加えた０．５ｍｌの培地（０．１％酵母エキス、０．１％ペプトン、ｐＨ７）を注ぎ、１次抗体反応を室温で１時間行った。
【００７１】
次に、遠心分離による沈澱回収と培地による洗浄操作を３回繰り返し、沈澱に蛍光剤ラベルされた抗ウサギＩｇＧ抗体（ＦＩＴＣラベル抗ウサギＩｇＧ抗体，　Ｆｉ−１２００、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ　ＣＡ）を１／１００量加えた培地を注ぎ、２次抗体反応を室温で１時間あるいは４℃で１晩行った。
【００７２】
蒸留水を用いて１次抗体反応後と同様の洗浄操作を３回繰り返し、沈澱を１０−２００μｌの緩衝液に懸濁し、この一部を蛍光顕微鏡あるいは共焦点蛍光レーザー顕微鏡により観察した。ごく少数の菌体が蛍光像として観察され、この数をカウントすることで定量的な計測も可能である。
【００７３】
ｃ）抗体による類似菌体の回収
抗体を含む血清を１／１０量加えた生理緩衝液（１０ｍＭ　のリン酸緩衝液ｐＨ８．１＋１５０ｍＭＮａＣｌ）５００μｌに磁気ビーズ担体（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ，　ＤＹＮＡＬ社、Ｐｒｏｄ．Ｎｏ．：１００．０１：プロテインＡを介して抗体が担体表面に結合する）１０μｌを加えて緩やかに撹拌しながら室温で３時間結合させた。
【００７４】
次に、磁石を溶液が入った容器の外から近づけて磁気ビーズを回収し、生理緩衝液を加えての洗浄を３回繰り返して加えてこれを抗体結合ビーズとした。
【００７５】
温泉など高温環境から得たサンプル１ｍｌに抗体結合ビーズを２μｌ加え、撹拌しながら室温で１時間おいた後、磁石による回収と緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２）での洗浄を３回繰り返した。
【００７６】
これを単純に培地で培養するあるいは、本発明のスクリーニング方法の材料として使用するとＩＲＣＳ　９９１３８Ａと類似するが別株の超好熱性古細菌の分離に成功した。これは、耐熱酵素などを開発するための微生物・遺伝子資源となる。
【００７７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の菌株を示す系統図である。
【図２】タンパク質分解物の回収結果を示す。
【図３Ａ】本発明の菌株と公知の菌株の１６Ｓ　ｒＲＮＡの部分核酸配列の対比を示す
【図３Ｂ】本発明の菌株と公知の菌株の１６Ｓ　ｒＲＮＡの部分核酸配列の対比を示す
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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