(57)【要約】【課題】増殖初期の個々の酵母の活性を正確に評価する方法、該評価方法を用いて増殖初期の活性の高い酵母を取得する方法、及び、該活性酵母を用いて発酵アルコール飲料を製造する方法を提供すること。【解決手段】増殖初期の酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化を指標とすることにより、酵母の活性を正確に評価することができる。該ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標としては、酵母における細胞周期Ｇ１期のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加、酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加ピークが発生するまでの時間、酵母細胞内のＲＮＡ含量に対するＤＮＡ含量の割合の変化、或いは、該酵母細胞内のＲＮＡ含量に対するＤＮＡ含量の割合（ＤＮＡ／ＲＮＡ）が略一定値に到達するまでの時間がある。該ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の相違を指標として、増殖初期の個々の酵母の活性を正確に評価できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖初期の酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化を指標として酵母の活性を評価することを特徴とする酵母活性評価方法。
【請求項２】
酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標が、該酵母における細胞周期Ｇ１期のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加であることを特徴とする請求項１記載の酵母活性評価方法。
【請求項３】
酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標としての酵母活性の評価が、Ｇ１期の一定時間後の劣化酵母と活性酵母のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の対比であることを特徴とする請求項１又は２記載の酵母活性評価方法。
【請求項４】
酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標が、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加ピークが発生するまでの時間であることを特徴とする請求項１記載の酵母活性評価方法。
【請求項５】
酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標としてのＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加ピークが発生するまでの時間の評価が、劣化酵母に対する活性酵母のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの増加ピークが発生するまでの時間の短縮の評価であることを特徴とする請求項４記載の酵母活性評価方法。
【請求項６】
活性酵母としての評価が、麦汁培地を用い、培養温度２５℃で、攪拌培養した場合において、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの増加ピークが発生するまでの時間が３時間以内であるとすることを特徴とする請求項４又は５記載の酵母活性評価方法。
【請求項７】
酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標が、酵母細胞内のＲＮＡ含量に対するＤＮＡ含量の割合の変化であることを特徴とする請求項１記載の酵母活性評価方法。
【請求項８】
酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標としての、酵母細胞内のＲＮＡ含量に対するＤＮＡ含量の割合ＤＮＡ／ＲＮＡの変化の評価が、酵母細胞内のＲＮＡ及びＤＮＡ含量のＤＮＡ／ＲＮＡが略一定値に到達するまでの時間であることを特徴とする請求項７記載の酵母活性評価方法。
【請求項９】
酵母細胞を固定する工程と該酵母細胞の核酸を染色する工程と、フローサイトメーターにより該酵母細胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量を測定する工程を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか記載の酵母活性評価方法。
【請求項１０】
酵母細胞を染色する工程で用いる染色化合物がアクリジン色素であることを特徴とする請求項９記載の酵母活性評価方法。
【請求項１１】
酵母細胞を染色する工程で用いるアクリジン色素がアクリジンオレンジであるであることを特徴とする請求項１０記載の酵母活性評価方法。
【請求項１２】
酵母細胞を染色する工程でアクリジンオレンジを用い、フローサイトメーターにより、酵母細胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量を測定する工程において、略５２０ｎｍ及び／又は略６３０ｎｍの波長の光線を用いることを特徴とする請求項１１記載の酵母活性評価方法。
【請求項１３】
酵母活性の評価が、ビール酵母の酵母活性の評価であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の酵母活性評価方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか記載の酵母活性評価方法を用いて活性の高い酵母を選別することを特徴とする活性酵母の取得方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか記載の酵母活性評価方法を用いて、細胞周期Ｇ０期からＧ１期への酵母活性の誘導及び／又はＧ１期における酵母活性の誘導を評価し、酵母活性の誘導・制御を行うことを特徴とする活性酵母の取得方法。
【請求項１６】
請求項１４又は１５のいずれか記載の方法により得られた活性酵母を、発酵又は醸造に用いることを特徴とする発酵アルコール飲料の製造方法。
【請求項１７】
発酵アルコール飲料が、発酵麦芽飲料であることを特徴とする請求項１６記載の発酵アルコール飲料の製造方法。
【請求項１８】
発酵麦芽飲料が、ビール又は発泡酒であることを特徴とする請求項１７記載の発酵アルコール飲料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母活性評価方法、特に、増殖初期の酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化を指標として酵母の活性を評価する酵母活性評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビールや清酒或いはパン等のように、従来より、酵母を用いて発酵又は醸造により種々の飲食品が製造されている。これらの飲食品の品質は、その製造工程である発酵工程或いは醸造工程における酵母の活性により重大な影響を受ける。したがって、品質の良い発酵又は醸造飲食品を製造するには、その発酵工程或いは醸造工程において、適正な活性を持つ酵母を使用する必要があり、そのためには酵母の活性を適切に評価し、調整して、活性のある酵母を用いることが重要である。
従来より酵母の活性評価方法としては、いくつかのものが提案されている。
【０００３】
まず、酵母の活性評価方法として、酵母を実際に培養してその増殖能力を評価する方法（プレートカルチャ法、スライドカルチャー法）が知られている（Ｊ．  Ｉｎｓｔ．  Ｂｒｅｗ．，  ８３，  １０９，  １９７７）。この方法は、培地上での酵母の増殖活性を直接検出する精度の高い酵母活性測定法であるが、結果が得られるまでに約１〜６日という長時間を要するため迅速性を欠き、発酵及び醸造作業工程での実用性に乏しい。また、この方法は、実際に培養を行うことにより、酵母の増殖能の有無を直接測定する方法であるから、活性の高低を判別することは可能であるが、しかし、ある発酵フェーズの酵母をもって来て、その活性を見ることはできない。
【０００４】
次に、酵母の活性を測定・評価する方法として、酵母を染色して測定・評価する方法（メチレンブルー法、フルオレセインジアセテート法）が知られている（Ｊ．  Ｉｎｓｔ．  Ｂｒｅｗ．，  ８３，  １０９，  １９７７、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｂｒｅｗ．  Ｃｈｅｍ．，  ３６，  １３，  １９７７）。この染色法は、死滅した酵母が染色されるのを利用して生死の判別を行う方法である。この染色法は操作が簡便で、短時間のうちに結果が得られるという点で有効であるが、基本的には死んだ細胞とそれ以外の細胞を判別するもの、即ち細胞の生死を判別するものであるため、生きている細胞の活性を精度良く適切に評価することは不可能である。
【０００５】
また、近年、酵母の活性を簡便に測定・評価する方法として、ＡＰＴ（Ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｏｗｅｒ  Ｔｅｓｔ）法が開発されている（Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２７，  ３９５−４０３，  １９８２）。この方法はその名の示すとおり系のｐＨを測定する方法であるから、一度にテストできる被検体数は所有するｐＨメーターの数により規制を受け、一度に多数の被検体をチェックするこは事実上不可能であるため、検査能率を阻害する原因となる。また、この方法は系全体のｐＨを測定する方法であるため、酵母の詳細な発酵能力を解明するには不十分であり、酵母添加後の系の発酵状況を予測できるような総合的な酵母活性の測定法ではない。ＡＴＰ法は、その変法もいくつか紹介されているが（特開平６−３１５３９８号公報）、測定法の基本原理は同様なために、酵母ごとの活性能力の微妙な差異まで測定可能な精度の飛躍的な向上は期待できない。
【０００６】
最近、酵母の細胞内ｐＨ・プロトンポンプに着目した新しい酵母活性測定法（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ法：ＩＣＰ法）が開発された（日本醸造協会誌，８８，９１４，１９９３、特開平５−７６３９３号公報）。この方法は、酵母を低ｐＨ環境下に所定時間曝したのち、蛍光試薬を用いて細胞内のｐＨを測定し、その値が当該酵母の活性と相関していることを利用して酵母の活性を測定する方法である。この方法は簡便であり、且つ酵母活性の差をよく調べることが出来る。この方法は、通常細胞活動がほとんど止まった休止期にある酵母の活性を測定するのに用いるものである。
【０００７】
このＩＣＰ法の改良方法として、酵母細胞を蛍光物質フルオレセインで染色し、ｐＨ６以下の酸性条件下に保持した後、該細胞に１種の励起光を照射して蛍光を発生させ、２種の蛍光強度をフローサイトメーターにより測定して、酵母細胞内ｐＨの測定を行う方法が開発されている（特開２００２−１６８８７０号公報）。すなわち、この方法では、ＩＣＰ法では蛍光光度計を使用するため、細胞集団の詳細な解析をするために細胞個々の情報を得ようとする場合には、複雑な顕微鏡測光と画像処理法が必要なため、実際に多数の検体を計測しようとすると膨大な時間がかかり、実用的とは言えなかった。そこでフローサイトメトリーの技法を適用し、更に、１種類の波長の励起光で、低ｐＨ側にある細胞の細胞内ｐＨを正確に計測するために、蛍光測定波長として２種類の波長を使用することにより、個々の細胞質内ｐＨの計測を可能とした。
【０００８】
また、ＩＣＰ法に関連して、酵母細胞内のトレハロース含量、特に培養、発酵又は醸造後の保存中の酵母細胞内のトレハロース含量と、酵母細胞内ｐＨとの間に明確な相関関係があり、酵母細胞内のトレハロース含量を測定することによって、細胞内ｐＨから推察される酵母の発酵活性が急激に低下するターニングポイントを簡便に把握できることを見い出し、これを原理として、酵母細胞内のα−トレハロース含量を指標とした酵母活性の評価方法が開発された（特開平８−２６６２９７号公報）。更に、最近、酵母のアルシアンブルー色素に対する吸着能と酵母中脂肪酸に関する所定パラメータとの間に相関関係があることを見い出し、該相関関係を用いて、酵母のアルシアンブルー色素に対する吸着能を指標にして、酵母中脂肪酸並びに酵母活性を測定・評価する方法が開示された（特開２００２−２７２４９５号公報）。
【０００９】
また、発酵プロセスにおける酵母のコントロール方法として、フローサイトメーターを用いて細胞内のＤＮＡ含量を測定し、酵母の増殖フェーズの情報を得る方法が報告されている（Ｂｒａｕｗｅｌｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２００１／ＩＩ，  １２４−１２７、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２８ｔｈ  ＥＢＣ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｂｕｄａｐｅｓｔ  ２００１）しかし、該方法では、発酵プロセスのコントロールは示されているが、酵母の増殖初期の活性の測定については記載されていない。すなわち、酵母細胞周期のＧ１期の間は、酵母細胞内のＤＮＡ含量は殆ど変化しないため、該報告の方法では、酵母の増殖初期において、この間の変化を追跡することは困難である。
上記のとおり、従来より酵母の活性を評価する方法としては、いくつかのものが提案されているが、例えば、細胞周期でＧ１期のような、酵母の増殖初期において、酵母の活性を効果的に評価する方法は知られていなかった。
【００１０】
【特許文献１】
特開平５−７６３９３号公報。
【特許文献２】
特開平６−３１５３９８号公報。
【特許文献３】
特開平８−２６６２９７号公報。
【特許文献４】
特開２００２−１６８８７０号公報。
【特許文献５】
特開２００２−２７２４９５号公報。
【非特許文献１】
Ｊ．  Ｉｎｓｔ．  Ｂｒｅｗ．，  ８３，  １０９，  １９７７。
【非特許文献２】
Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｂｒｅｗ．  Ｃｈｅｍ．，  ３６，  １３，  １９７７。
【非特許文献３】
Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２７，  ３９５−４０３，  １９８２。
【非特許文献４】
日本醸造協会誌，８８，９１４，１９９３。
【非特許文献５】
Ｂｒａｕｗｅｌｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２００１／ＩＩ，  １２４−１２７。
【非特許文献６】
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２８ｔｈ  ＥＢＣ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｂｕｄａｐｅｓｔ  ２００１
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、酵母活性の評価方法及びその利用、特に、増殖初期の個々の酵母の活性を正確に評価する方法、及び該評価方法を用いて増殖初期の活性の高い酵母を取得する方法、更には、該活性酵母を用いて発酵アルコール飲料を製造する方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究する中で、増殖初期の酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化を指標とすることにより、酵母の活性を正確に評価することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。該ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標としては、酵母における細胞周期Ｇ１期のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加、酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加ピークが発生するまでの時間、酵母細胞内のＲＮＡ含量に対するＤＮＡ含量の割合の変化、或いは、該酵母細胞内のＲＮＡ含量に対するＤＮＡ含量の割合（ＤＮＡ／ＲＮＡ）が略一定値に到達するまでの時間を挙げることができる。すなわち、活性酵母と劣化酵母との該ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の相違を指標として、増殖初期の個々の酵母の活性を正確に評価することができる。
【００１３】
酵母のような真核細胞においては、細胞は増殖に際し、そのゲノムＤＮＡを複製し、娘細胞に均等に分配した後、分裂するというサイクルを繰り返す。これを細胞周期と呼ぶが、細胞週期は基本的に四つに区切られる。細胞分裂を行っていない休止期の細胞はＧ０期にある。Ｇ０期は、細胞分裂の周期から外れ、静止状態にある。細胞分裂の周期の中で、Ｇ１期は、最も長い期間で、この時期にＤＮＡ合成に必要なタンパク質が合成される。酵母においては、周囲の環境に応じて細胞周期に入り分裂を続けるか、或いは細胞周期のサイクルをはずれて増殖を停止し、静止期（Ｇ０期）に入るかの決定が行なわれる。例えば、酵母が培養条件において麦汁と接触すると、細胞周期に入り分裂して、増殖が行なわれる。この細胞周期のサイクルに入るか、或いは該サイクルから外れて静止期（Ｇ０期）に入るかの決定はＧ１期に行なわれる。
【００１４】
Ｇ１期のＧ１／Ｓチェックポイント（ｃｈｅｃｋ  ｐｏｉｎｔ）を通過すると、Ｓ期への進行が決定され、その後細胞は細胞周期のサイクルを抜け出すことはない。Ｓ期（ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｈａｓｅ）では、ＤＮＡの複製が行なわれる。細胞は、次にＧ２期に入る。Ｇ２期は有糸分裂の準備期間で、染色質の凝縮とパッキングが起こり、核膜が消失する。Ｇ２期の細胞周期チェックポイントＧ２／Ｍチェックポイントを過ぎると、Ｍ期への進行が決定される。Ｍ期（有糸分裂：Ｍｉｔｏｓｉｓ）は、有糸分裂の開始から終了までの期間で、染色質は染色体構造をとり（前期）、二つの中心体に引かれるように中央に集合し（中期）細胞分裂（終期）が起きる。分裂した細胞はＧ１期に入り、Ｇ１期において、再度、細胞周期のサイクルに入るか、細胞周期のサイクルをはずれて増殖を停止し、静止期（Ｇ０期）に入るかの決定が行なわれる。
【００１５】
酵母細胞は、上記のようにして、分裂を繰り返し増殖するが、その間、核酸すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡが合成される。本発明では、該細胞周期によって増殖する酵母細胞の各増殖フェーズにおけるＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量及びその変異が、活性酵母と劣化酵母で異なることを発見し、該酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化を指標とすることにより、増殖初期においても酵母の活性を正確に評価することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、酵母における細胞周期Ｇ１期のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加、酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加ピークが発生するまでの時間、或いは、酵母細胞内のＲＮＡ含量に対するＤＮＡ含量の割合は、活性のある「活性酵母」と、活性の劣る「劣化酵母」とは明らかに相違し、これらのＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の相違を指標とすることにより、増殖初期の個々の酵母の活性を正確に評価することができる。
【００１６】
本発明においては、本発明の酵母活性評価方法を用いることにより、活性の高い酵母を選別することが可能となり、発酵や醸造に際して、原料として用いる酵母に活性の高い酵母を調製することが可能となる。また、該酵母活性評価方法を用いることにより、例えば麦汁等を用いて原料酵母を調製するに際し、細胞周期Ｇ０期からＧ１期への酵母の誘導を評価して、酵母活性の誘導・制御を行うことにより、酵母に活性の高い酵母を調製することが可能となる。更に、本発明の方法で取得された活性酵母を発酵又は醸造に用いることにより、品質の高い発酵飲食品、特には、発酵アルコール飲料等の製造を行なうことができる。
【００１７】
すなわち、具体的には本発明は、増殖初期の酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化を指標として酵母の活性を評価することを特徴とする酵母活性評価方法（請求項１）や、酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標が、該酵母における細胞周期Ｇ１期のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加であることを特徴とする請求項１記載の酵母活性評価方法（請求項２）や、酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標としての酵母活性の評価が、Ｇ１期の一定時間後の劣化酵母と活性酵母のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の対比であることを特徴とする請求項１又は２記載の酵母活性評価方法（請求項３）や、酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標が、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加ピークが発生するまでの時間であることを特徴とする請求項１記載の酵母活性評価方法（請求項４）や、酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標としてのＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加ピークが発生するまでの時間の評価が、劣化酵母に対する活性酵母のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの増加ピークが発生するまでの時間の短縮の評価であることを特徴とする請求項４記載の酵母活性評価方法（請求項５）や、活性酵母としての評価が、麦汁培地を用い、培養温度２５℃で、攪拌培養した場合において、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの増加ピークが発生するまでの時間が３時間以内であるとすることを特徴とする請求項４又は５記載の酵母活性評価方法（請求項６）や、酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標が、酵母細胞内のＲＮＡ含量に対するＤＮＡ含量の割合の変化であることを特徴とする請求項１記載の酵母活性評価方法（請求項７）や、酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標としての、酵母細胞内のＲＮＡ含量に対するＤＮＡ含量の割合ＤＮＡ／ＲＮＡの変化の評価が、酵母細胞内のＲＮＡ及びＤＮＡ含量のＤＮＡ／ＲＮＡが略一定値に到達するまでの時間であることを特徴とする請求項７記載の酵母活性評価方法（請求項８）や、酵母細胞を固定する工程と該酵母細胞の核酸を染色する工程と、フローサイトメーターにより該酵母細胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量を測定する工程を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか記載の酵母活性評価方法（請求項９）や、酵母細胞を染色する工程で用いる染色化合物がアクリジン色素であることを特徴とする請求項９記載の酵母活性評価方法（請求項１０）や、酵母細胞を染色する工程で用いるアクリジン色素がアクリジンオレンジであるであることを特徴とする請求項１０記載の酵母活性評価方法（請求項１１）や、酵母細胞を染色する工程でアクリジンオレンジを用い、フローサイトメーターにより、酵母細胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量を測定する工程において、略５２０ｎｍ及び／又は略６３０ｎｍの波長の光線を用いることを特徴とする請求項１１記載の酵母活性評価方法（請求項１２）や、酵母活性の評価が、ビール酵母の酵母活性の評価であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の酵母活性評価方法（請求項１３）からなる。
【００１８】
また、本発明は、請求項１〜１３のいずれか記載の酵母活性評価方法を用いて活性の高い酵母を選別することを特徴とする活性酵母の取得方法（請求項１４）や、請求項１〜１３のいずれか記載の酵母活性評価方法を用いて、細胞周期Ｇ０期からＧ１期への酵母活性の誘導及び／又はＧ１期における酵母活性の誘導を評価し、酵母活性の誘導・制御を行うことを特徴とする活性酵母の取得方法（請求項１５）からなる。
【００１９】
更に、本発明は、請求項１４又は１５のいずれか記載の方法により得られた活性酵母を、発酵又は醸造に用いることを特徴とする発酵アルコール飲料の製造方法（請求項１６）や、発酵アルコール飲料が、発酵麦芽飲料であることを特徴とする請求項１６記載の発酵アルコール飲料の製造方法（請求項１７）や、発酵麦芽飲料が、ビール又は発泡酒であることを特徴とする請求項１７記載の発酵アルコール飲料の製造方法（請求項１８）からなる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明は、増殖初期の酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化を指標として酵母の活性を評価することよりなる。本発明において、酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化を指標として酵母の活性を評価するには、まず、第一に、測定する酵母における細胞周期Ｇ１期のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加を測定することよりなる。活性の低い酵母は、活性の高い酵母に比べて、Ｇ１期においてＤＮＡ及びＲＮＡ含量が増加するまでの時間が長いという特徴があり、そこで、酵母のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加、すなわち、酵母のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量が増加するまでの時間を測定することにより、酵母の活性を評価することができる。また、酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標としての酵母活性の評価を、Ｇ１期の一定時間後の劣化酵母と活性酵母のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量を対比することにより、酵母の増殖初期において活性の高い酵母を検出することができる。
【００２１】
本発明の酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標として、第二に、酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化において、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加ピークが発生するまでの時間を測定することにより、酵母活性を評価することができる。活性の低い酵母は、活性の高い酵母に比べ、ＤＮＡ及びＲＮＡ含量のいずれにおいても、増加ピークが発生するまでの時間が長いという特徴があり、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の増加ピークが発生するまでの時間を求めることにより、酵母の活性の評価を行なうことができる。すなわち、劣化酵母に対する活性酵母のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの増加ピークが発生するまでの時間の短縮を測定することにより、酵母の増殖初期において、活性の高い酵母を検出することができる。例えば、麦汁培地を用い、培養温度２５℃で、攪拌培養した場合において、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの増加ピークが発生するまでの時間が３時間以内であるとという指標を設けて、活性の高い酵母を検出することができる。
【００２２】
本発明の酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化の指標として、第三に、酵母細胞内のＲＮＡ含量に対するＤＮＡ含量の割合の変化を求めて、酵母活性の評価を行なうことができる。活性の低い酵母は、活性の高い酵母に比べ、酵母細胞内のＲＮＡ含量に対するＤＮＡ含量の割合（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の変化、すなわち、ＤＮＡ／ＲＮＡの低減化が遅いという特徴があり、この変化を測定することにより、酵母の活性の評価を行なうことができる。酵母細胞におけるＤＮＡ及びＲＮＡ含量の変化を見ると、ＲＮＡはＤＮＡに比べ、その増加速度は速く、更に、活性の高い酵母は、活性の低い劣化酵母に比べ、ＲＮＡが速くは増加するという特徴がある。したがって、活性の高い酵母はＤＮＡ／ＲＮＡの低減化が速く、また、活性の低い酵母はＤＮＡ／ＲＮＡの低減化が遅いということになり、そのＤＮＡ／ＲＮＡの低減化の変化を測定することにより、活性の高い酵母を検出することができる。該酵母細胞内のＲＮＡ含量に対するＤＮＡ含量の割合（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の変化の評価は、酵母細胞内のＲＮＡ及びＤＮＡ含量のＤＮＡ／ＲＮＡが略一定値に到達するまでの時間として測定することができる。
【００２３】
このことは、ＲＮＡに対するＤＮＡの比（ＤＮＡ／ＲＮＡ）は、活性の高い酵母も、活性の低い酵母もやがてはある一定レベルに到達し、活性の低い酵母が時間をおいて活性の高い酵母とＤＮＡ／ＲＮＡが同レベルに到達するということは、活性の低い酵母は時間をおいて活性を回復したと考えることができ、したがって、このタイミングを捉えることにより、酵母の賦活化の程度を測ることができる。
本発明のＤＮＡ／ＲＮＡの割合を測定した酵母活性の評価方法は、酵母を例えば増殖条件で麦汁のような培地に接触した時に、増殖初期のＧ１期においては、ＤＮＡ含量の増加は、ほとんどないような状態にあり、ＤＮＡ含量のみからの酵母活性の評価が難しいことから、このような増殖初期における酵母活性の評価に特に有力である。
【００２４】
本発明において、増殖初期の酵母細胞内のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量の変化を指標として酵母の活性を評価するには、時間継続的に、酵母細胞中のＤＮＡとＲＮＡの含量を測定する。酵母細胞中のＤＮＡとＲＮＡ含量の測定は、測定対象とする酵母が生きた状態で測定しても良いし、エタノール等を用いて酵母細胞の細胞周期を固定してもよい。酵母が生きた状態で測定する場合は、状態が変化しない間にできるだけ素早く測定する必要がある。本発明において、酵母細胞中のＤＮＡとＲＮＡ含量の測定を行なうには、酵母細胞を固定する工程と該酵母細胞の核酸を染色する工程と、フローサイトメーター等により該酵母細胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ含量を測定する工程とを含む方法を用いることにより行なうことができる。本発明において、染色した核酸の蛍光強度の測定にフローサイトメーターを用いることにより、酵母細胞中のＤＮＡとＲＮＡ含量の測定を迅速、より詳細に測定することが可能であるとともに、波長の異なる２種類の蛍光強度を測定することが可能であり、酵母細胞中のＤＮＡとＲＮＡ含量を同時に測定することが可能となるという本発明の測定目的に適合した測定を行なうことができる。
【００２５】
本発明において、酵母細胞の核酸を染色する工程には、公知の種々の核酸の染色化合物を用いることができるが、核酸を蛍光染色するアクリジン色素を用いることが好ましい。アクリジン色素としては、アクリジンオレンジ、ホスフィン（Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）橙色、塩基性染料などが挙げられるが、本発明の目的において、アクリジンオレンジが特に好ましい。酵母細胞の核酸をアクリジンオレンジを用いて染色すると、酵母細胞中のＤＮＡは紫外線照射によりグリーンの蛍光を発し、ＲＮＡはオレンジの蛍光を発する。また、フローサイトメーターによる測定条件として、略５２０ｎｍ及び／又は略６３０ｎｍの波長の光線を用いることにより、ＤＮＡとＲＮＡ含量を測定することができる。
【００２６】
本発明の酵母活性の評価方法を、例示により概略的に説明すると、まず、酵母細胞中の１本鎖のＲＮＡを、２本鎖にならないように酸で処理をする。その後、該酵母細胞を所定の条件でアクリジンオレンジで染色する。次に、アルゴンレーザー又は紫外線を照射することで、ＤＮＡ−アクリジンオレンジ複合体は緑色の蛍光、ＲＮＡ−アクリジンオレンジ複合体はオレンジ色の蛍光を発生させる。次に、これらの蛍光強度をフローサイトメ−ターを用いて測定することにより、１つ１つの酵母細胞のＤＮＡとＲＮＡの含量を同時に測定することが可能になる。試料をまとめて測定したい場合は、細胞を染色するまで、酵母細胞をエタノール等の有機溶媒を含む溶液に懸濁し、細胞周期を固定しておけば良い。
【００２７】
本発明の酵母活性評価方法を用いて、発酵や醸造に用いるための活性酵母を取得することができる。ビールや清酒或いはパン等のように、酵母を用いて発酵又は醸造により製造される飲食品の品質は、その製造工程である発酵工程或いは醸造工程における酵母の活性により重大な影響を受ける。したがって、品質の良い発酵又は醸造飲食品を製造するには、その発酵工程或いは醸造工程において、適正な活性を持つ酵母を使用する必要がある。そこで、発酵や醸造を行うに際しては、酵母の活性を適切に評価し、調整して、活性のある酵母を用いることが重要であるが、本発明の酵母活性評価方法は、酵母活性を左右する酵母の分裂に直接関与する酵母細胞内の核酸の動向を直接測定するものであるから、酵母の増殖初期において、酵母の活性を正確に評価することができ、したがって、発酵や醸造を行うに際して、活性のある酵母を取得することができる。
【００２８】
また、本発明の酵母活性評価方法を用いて、発酵や醸造に用いるための酵母活性の誘導・制御を行うことができる。特に、発酵や醸造を行うに際して、用いる酵母の活性を高めるために、本発明の酵母活性の評価方法を用いて細胞周期Ｇ０期からＧ１期への酵母活性の誘導及び／又は酵母活性のＧ１期における誘導を評価し、培養条件を調整して、酵母活性の誘導・制御を行うことができる。該酵母活性の誘導・制御により酵母の賦活化を行い、活性の高い酵母を調製することができる。
実際に、活性の高い酵母を調製するために、酵母活性の誘導・制御を行うに際しては、該酵母の賦活化法としては、実際の製造条件からかけ離れた条件でなければ問題はないが、培養条件のギャップによる発酵挙動の変化や香味成分の変化が生じる可能性を考慮して、実際の製造に用いる発酵条件と近い条件で行うのが好ましい。酵母の賦活化法の例としては、酵母液に麦汁を添加し、５〜３０℃にて１〜１５時間通気する方法が考えられる。通気には、空気または純酸素を用いても構わない。酵母を賦活化させるまでの時間は、活性の高い酵母のＤＮＡ／ＲＮＡの比を指標にすることができる。例えば、麦汁に添加する直前の活性の高い酵母のＤＮＡ／ＲＮＡの比が１であれば、活性の低い酵母の賦活化を通じて、ＤＮＡ／ＲＮＡの比が同じ１になるまでの時間とすることができる。
【００２９】
本発明の酵母活性評価方法は、酵母を用いて発酵や醸造により製造される種々の飲食品の製造に際して用いることができるが、特に、ビール又は発泡酒のような発酵麦芽飲料等の発酵アルコール飲料の製造に際して、活性の高い酵母の調製に有効に用いることができる。
【００３０】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【００３１】
実施例１．酵母活性の評価
［測定・評価方法］
（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  （Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，  １９９４）の方法を改良）
【００３２】
（細胞周期の固定）
（１）細胞数が４，０００，０００になるように、エッペンドルフチューブに発酵液を採取する。
（２）１４，０００ｒｐｍ、０℃、２分間遠心する。
（３）上清を捨て、沈殿に５ｍＭ  ＥＤＴＡ入りＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１ｍｌ加え、ｖｏｒｔｅｘ（攪拌）にかける。
（４）  （２）と同じ条件で遠心する。
（５）  （３）と（４）の操作を繰り返す。
（６）上清を捨て、沈殿にＥＤＴＡ入りＰＢＳ（リン酸緩衝溶液：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）を３００μｌとエタノール７００μｌを加え、ｖｏｒｔｅｘにかける。
（７）冷蔵保存する。
【００３３】
（細胞の染色）
（１）上記チューブを１４、０００ｒｐｍ、０℃、２分間遠心する。
（２）上記、「細胞周期の固定」の（３）、（４）の操作を２回繰り返す。
（３）沈殿にＥＤＴＡ入りＰＢＳを８００μｌ加え、ｖｏｒｔｅｘ（攪拌）にかける。
（４）２００μｌを別のエッペンドルフチューブに移し、氷冷しておく。
（５）Ａ液（下記参照）を４００μｌ穏やかに加え、１５秒間氷冷する。
Ａ液（４℃保存）：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．１％、ＨＣｌ  ８０ｍＭ、
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ
（６）Ｂ液（下記参照）を１．２ｍＭ穏やかに加え、その後２〜１０分の間にフローサイトメーターで測定する。
Ｂ液：Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ    ６６μｇ／ｍｌ（２０μＭ）、
ＥＤＴＡ−２Ｎａ  １ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、１００ｍＭ
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ  ６．０）
（７）フローサイトメーターによる測定条件
Ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＣＳ  ＸＬ−ＭＣＬ，  ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ，  Ｂｅｃｋｍａｎ，          Ｍｉａｍｉ，  ＦＬ）
Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４８８ｎｍ
Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ：５２０ｎｍ（グリーン）
Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ：６３０ｎｍ（オレンジ）
【００３４】
［試験内容］
活性の良い酵母と活性の悪い酵母について、増殖初期（Ｇ１フェーズ）におけるＲＮＡとＤＮＡ含量の変化の相違を検証する。
１．細胞周期試験
（試験方法）
（１）新鮮酵母（活性の高い酵母）と劣化酵母（活性の低い酵母：冷蔵庫又は高い温度で保存したもの）を用意する。それぞれのＩＣＰ（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ）、ＦＩＰ（Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃａｌ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ）、死滅率の測定をする。
（２）供試酵母を麦汁に添加して発酵を行う（２５℃）。
（３）発酵中にサンプリングを行い、以下の項目を測定する。
ａ．酵母細胞数、酵母細胞径・・・シスメックス製測定装置による。
ｂ．ＤＮＡ、ＲＮＡ含量・・・フローサイトメトリーによる。
【００３５】
（試験結果）
（１）酵母活性
新鮮酵母及び劣化酵母それぞれに対するＩＣＰ法により、酵母の細胞内ｐＨを測定した酵母活性の測定結果、及び細胞の死滅率は以下のようであった：
新鮮酵母（ＩＣＰ：６．１１、死滅率：１．６％）
劣化酵母（ＩＣＰ：５．６０、死滅率：１５．１％）
【００３６】
（２）酵母細胞数・酵母細胞径
培養開始からの酵母細胞数の増加は、新鮮酵母は７時間で細胞数が２倍以上になったが、劣化酵母では１．４倍であった。新鮮酵母及び劣化酵母のそれぞれについての、時間の経過と酵母細胞数の増加を図１に示す。
培養開始からの酵母細胞径の増大について、酵母が所定の大きさに達するまでの時間を見てみると、新鮮酵母の方が劣化酵母よりも、到達時間が短いことが明らかとなった。新鮮酵母と劣化酵母のそれぞれについての、時間の経過と酵母細胞径の増大との測定結果を図２に示す。
【００３７】
（３）ＤＮＡ及びＲＮＡ含量の変化
新鮮酵母及び劣化酵母それぞれにおける、培養開始からの経時的な酵母細胞内のＲＮＡ含量の変化を図３に示す。図３をみてみると、２時間のところで新鮮酵母の方が劣化酵母よりも細胞内のＲＮＡが速く増加していることが分かる。したがって、この増加速度の増大の相違を測定することにより、酵母活性の評価が可能となる。出芽による変化は、新鮮酵母では４時間に現れているが、劣化酵母では５時間であった。細胞内のＲＮＡ含量のピークは、新鮮酵母では約３時間、劣化酵母では約４時間に現れ、新鮮酵母の方が劣化酵母に比べ、ＲＮＡ含量のピークが早く現れることが判る。したがって、この細胞内のＲＮＡ含量のピークが発生するまでの時間を測定することにより、酵母活性の評価が可能となる。
【００３８】
新鮮酵母及び劣化酵母それぞれにおける、培養開始からの経時的な酵母細胞内のＤＮＡ含量の変化を図４に示す。ＤＮＡについても新鮮酵母では約３時間のところで新たなピークが出現したが、劣化酵母では約４時間であった。したがって、ＲＮＡの場合と同様に、この細胞内のＤＮＡ含量のピークが発生するまでの時間を測定することにより、酵母活性の評価が可能となる。新鮮酵母及び劣化酵母それぞれにおける、培養開始からの経時的な酵母細胞内のＲＮＡ及びＤＮＡ含量の変化を対比すると、新たなピークが出現するまでの時間帯では、ＲＮＡの方がＤＮＡよりも増加速度が速かった。
【００３９】
新鮮酵母及び劣化酵母それぞれにおける、培養開始からの経時的な酵母細胞内のＲＮＡ及びＤＮＡ含量の変化において、酵母細胞内ＲＮＡ含量に対するＤＮＡ含量の割合（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の変化を図５に示す。酵母細胞内のＲＮＡ及びＤＮＡ含量のＤＮＡ／ＲＮＡが略一定値に到達するのが、新鮮酵母では約３時間以内であるのに対して、劣化酵母では約７時間かけて到達した。したがって、ＤＮＡ／ＲＮＡが略一定値に到達するまでの時間を測定することにより、酵母活性の評価が可能となる。ＤＮＡ／ＲＮＡを酵母活性の指標とする方法は、酵母の増殖初期（Ｇ１期）においては、酵母細胞内のＤＮＡ含量の変化が特に少ないことから、この時期の酵母活性評価の指標として有力となる。
【００４０】
実施例２．試験醸造
［試験方法］
（１）新鮮酵母と劣化酵母を用意する。
（２）それぞれを１５０Ｌ規模の試験醸造に供する。
（３）発酵挙動を追跡すると共に、酒下し、製品の分析値（発酵液糖度；ＴＤＡ（オフフレーバー：Ｔｏｔａｌ  Ｄｉａｃｅｔｙｌ）；アセトアルデヒド；アミノ酸）を比較する。
【００４１】
［試験結果］
新鮮酵母及び劣化酵母は、本発明の酵母活性の評価方法で測定したところ（測定のための酵母の増殖は、１３℃の麦汁培地中で行った）、ＤＮＡ及びＲＮＡ含量の増加ピークが発生するまでの時間が、新鮮酵母においては約１３時間、劣化酵母においては約１５時間であった。
該新鮮酵母及び劣化酵母を用いて発酵試験を行ったところ、劣化酵母は、主発酵に８日間かかり、糖度は２．４１°Ｐとなった。新鮮酵母は主発酵７日間で糖度が１．９１°Ｐになった。アミノ酸の消費速度も新鮮酵母の方が速く、最終製品での残存アミノ酸量も新鮮酵母の方が少なかった。１日発酵日数が違うため、酒下しのＴＤＡ値はほぼ等しかった。しかし、酒下しのアセトアルデヒドは新鮮酵母が３．９ｍｇ／Ｌだったのに対し、劣化酵母では１１．５ｍｇ／Ｌと高かった。エステル類の分析値は、アルデヒドほど、新鮮酵母と劣化酵母での差は認められなかった。新鮮酵母及び劣化酵母を用いた発酵試験において、糖度の経時変化についての測定結果を図６に示す。その他の測定結果を、表１に示す（表中の※は、主発酵開始から８日目のＴＤＡの値（ｍｇ／ｌ）を示している。）。
【００４２】
【表１】
2004357618.tif 000002
【００４３】
【発明の効果】
ビールや清酒或いはパン等のように、酵母を用いて発酵又は醸造により製造される飲食品の品質は、その製造工程である発酵工程或いは醸造工程における酵母の活性により重大な影響を受ける。したがって、品質の良い発酵又は醸造飲食品を製造するには、その発酵工程或いは醸造工程において、適正な活性を持つ酵母を使用する必要があるが、本発明の酵母活性評価方法を用いることにより、発酵や醸造に用いるための酵母の活性を短期間且つ簡便に評価することができ、該酵母活性の評価方法を用いて、活性の高い酵母を取得することができる。更に、本発明の酵母活性評価方法の特徴として、本発明の酵母活性の評価方法は酵母活性を左右する酵母の分裂に直接関与する酵母細胞内の核酸の動向を直接測定するものであるから、酵母の活性を正確に評価することができると共に、酵母の増殖初期においての評価が可能となる酵母活性の評価方法とすることができる。
【００４４】
また、本発明の酵母活性の評価方法は、増殖初期においての酵母活性の評価を可能とすることから、本発明の酵母活性評価方法を用いて、発酵や醸造に用いるための酵母活性の誘導・制御を行うことができる。特に、発酵や醸造を行うに際して、用いる酵母の活性を高めるために、本発明の酵母活性の評価方法を用いて細胞周期Ｇ０期からＧ１期への酵母の誘導を評価し、培養条件を調整して、酵母活性の誘導・制御を行うことにより、ビールや発泡酒のような発酵麦芽飲料等の製造に際して、酵母の賦活化を行い、活性の高い酵母を調製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例の試験結果において、新鮮酵母と劣化酵母の培養時間の経過と細胞数の増加との関係を示す図である。
【図２】本発明の実施例の試験結果において、新鮮酵母と劣化酵母の培養時間の経過と細胞径の増大との関係を示す図である。
【図３】本発明の実施例における酵母活性評価試験の結果において、新鮮酵母と劣化酵母の培養時間の経過と酵母細胞内のＲＮＡ含量の関係を示す図である。
【図４】本発明の実施例における酵母活性評価試験の結果において、新鮮酵母と劣化酵母の培養時間の経過と酵母細胞内のＤＮＡ含量の関係を示す図である。
【図５】本発明の実施例における酵母活性評価試験の結果において、新鮮酵母と劣化酵母の培養時間の経過と酵母細胞内に含有されるＤＮＡとＲＮＡ含量の比、即ち、ＤＮＡ／ＲＮＡの関係を示す図である。
【図６】本発明の実施例における、新鮮酵母と劣化酵母を用いた発酵試験において、糖度の経時変化についての測定結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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