(57)【要約】      （修正有）【課題】中脳後脳境界部による中脳視蓋部及び小脳の形成メカニズム等の解析を可能とする、FGFシグナル伝達に関与する新規な遺伝子を提供する。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする、FGFシグナル伝達に関与する遺伝子。（ａ）特定のアミノ酸配列を含むタンパク質（ｂ）特定のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、FGFシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする、ＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子。
（ａ）配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１８、２０及び２２に表すアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１８、２０及び２２に表すアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＦＧＦシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなるＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子。
（ａ）配列番号１、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９及び２１に表す塩基配列のうちいずれか１の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９及び２１に表す塩基配列のうちいずれか１の塩基配列に相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、ＦＧＦシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項３】
請求項１又は２記載のＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子を有するベクター。
【請求項４】
請求項１又は２記載のＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子の機能を欠損させた遺伝子導入細胞。
【請求項５】
請求項１又は２記載のＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子の機能を欠損させたトランスジェニック動物。
【請求項６】
請求項４記載の遺伝子導入細胞又は請求項５記載のトランスジェニック動物に対してリード化合物を作用させる工程と、
中脳・後脳境界部においてＦＧＦシグナルと関連して働くリード化合物を同定する工程とを含むスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ＦＧＦシグナル伝達に関与する新規な遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
中枢神経系のうち中脳視蓋部と小脳は中脳後脳境界部の持つオーガナイザー活性によって誘導的に形成されると考えられている。中脳後脳境界部の形成にはいくつかのシグナル分子（Ｗｎｔ１、ＦＧＦ８）や転写因子（Ｉｓｌｅｔ３、Ｏｔｘ２、Ｇｂｘ２、Ｐａｘ２／５／８、Ｅｎｇ１／２／３）が関与していることが報告されている（非特許文献１〜１１参照）。
しかしながら、これらの既知遺伝子の働きだけでは中脳後脳境界部による中脳視蓋部及び小脳の形成を説明することはできない。
【０００３】
【非特許文献１】
ＭｃＭａｈｏｎ，  Ａ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｂｒａｄｌｅｙ，  Ａ．，  １９９０．  Ｔｈｅ  Ｗｎｔ−１  （ｉｎｔ−１）  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ．  Ｃｅｌｌ  ６２，  １０７３−１０８５．
【非特許文献２】
ＭｃＭａｈｏｎ，  Ａ．Ｐ．，  Ｊｏｙｎｅｒ，  Ａ．Ｌ．，  Ｂｒａｄｌｅｙ，  Ａ．  ａｎｄ  ＭｃＭａｈｏｎ，  Ｊ．Ａ．，  １９９２．  Ｔｈｅ  ｍｉｄｂｒａｉｎ−ｈｉｎｄｂｒａｉｎ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  Ｗｎｔ−１−／Ｗｎｔ−１−  ｍｉｃｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ９．５  ｄａｙｓ  ｐｏｓｔｃｏｉｔｕｍ．  Ｃｅｌｌ  ６９，  ５８１−５９５．
【非特許文献３】
Ｃｒｏｓｓｌｅｙ，  Ｐ．Ｈ．，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｇ．Ｒ．，  １９９６．  Ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＦＧＦ８  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｙｏ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，  ６６−６８．
【非特許文献４】
Ｋｉｋｕｃｈｉ，  Ｙ．，  Ｓｅｇａｗａ，  Ｈ．，  Ｔｏｋｕｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｔｓｕｂｏｋａｗａ，  Ｔ．，  Ｈｏｔｔａ，  Ｙ．，  Ｕｙｅｍｕｒａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｏｋａｍｏｔｏ，  Ｈ．，  １９９７．  Ｏｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＬＩＭ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｓｌｅｔ−３  ＬＩＭ／ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｎ  １８，  ３６９−３８２．
【非特許文献５】
Ｂｒｏｃｃｏｌｉ，  Ｖ．，  Ｂｏｎｃｉｎｅｌｌｉ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｗｕｒｓｔ，  Ｗ．，  １９９９．  Ｔｈｅ  ｃａｕｄａｌ  ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  Ｏｔｘ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｔｈｅ  ｉｓｔｈｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，  １６４−１６８．
Ｍｉｌｌｅｔ，  Ｓ．，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｋ．，  Ｅｐｓｔｅｉｎ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｌｏｓｏｓ，  Ｋ．，  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｊｏｙｎｅｒ，  Ａ．Ｌ．，  １９９９．  Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｇｂｘ２  ｉｎ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｔｘ２  ａｎｄ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｉｄ／ｈｉｎｄｂｒａｉｎ  ｏｒｇａｎｉｚｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，  １６１−１６４．
【０００４】
【非特許文献６】
Ｐｆｅｆｆｅｒ，  Ｐ．Ｌ．，  Ｇｅｒｓｔｅｒ，  Ｔ．，  Ｌｕｎ，  Ｋ．，  Ｂｒａｎｄ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｂｕｓｓｌｉｎｇｅｒ，  Ｍ．，  １９９８．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｐａｘ２／５／８  ｆａｍｉｌｙ：  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｐａｘ５  ａｎｄ  Ｐａｘ８  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐａｘ２．１  （ｎｏｉ）  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５，  ３０６３−３０７４．
【非特許文献７】
Ｌｕｎ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄ，  Ｍ．，  １９９８．  Ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｎｏ  ｉｓｔｈｍｕｓ  （ｎｏｉ）  ａｌｌｅｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｐａｘ２．１  ｇｅｎｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｄｂｒａｉｎ−ｈｉｎｄｂｒａｉｎ  ｂｏｕｎｄａｒｙ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５，  ３０４９−３０６２．
【非特許文献８】
Ｆｊｏｓｅ，  Ａ．，  Ｎｊｏｌｓｔａｄ，  Ｐ．Ｒ．，  Ｎｏｒｎｅｓ，  Ｓ．，  Ｍｏｌｖｅｎ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｋｒａｕｓｓ，  Ｓ．，  １９９２．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２  ｇｅｎｅ．  Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．  ３９，  ５１−６２．
【非特許文献９】
Ｅｋｋｅｒ，  Ｍ．，  Ｗｅｇｎｅｒ，  Ｊ．，  Ａｋｉｍｅｎｋｏ，  Ｍ．Ａ．  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，  Ｍ．，  １９９２．  Ｃｏｏｄｉｎａｔｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｅｎｇｒａｉｌｅｄ  ｇｅｎｅｓ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１６，  １００１−１０１０．
【非特許文献１０】
Ｗｕｒｓｔ，  Ｗ．，  Ａｕｅｒｂａｃｈ，  Ａ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｊｏｙｎｅｒ，  Ａ．Ｌ．，  １９９４．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ：  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｍｉｄ−ｈｉｎｄｂｒａｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｆｏｒｅｌｉｍｂｓ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｎｕｍ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０，  ２０６５−２０７５．
【非特許文献１１】
Ｊｏｙｎｅｒ，  Ａ．Ｌ．，  Ｓｋａｒｎｅｓ，  Ｗ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｒｏｓｓａｎｔ，  Ｊ．，  １９８９．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  Ｅｎ−２  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３３８，  １５３−１５６．
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、中脳後脳境界部による中脳視蓋部及び小脳の形成メカニズム等の解析を可能とする、ＦＧＦシグナル伝達に関与する新規な遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題が解決するための手段】
上述した目的を達成するために、本発明者らが鋭意検討し、ＦＧＦシグナル伝達に関与する新規な遺伝子ファミリーを同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は以下を包含する。
（１）  以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする、ＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子。
（ａ）配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１８、２０及び２２に表すアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１８、２０及び２２に表すアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＦＧＦシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質。
【０００８】
（２）  以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなるＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子。
（ａ）配列番号１、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９及び２１に表す塩基配列のうちいずれか１の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９及び２１に表す塩基配列のうちいずれか１の塩基配列に相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、ＦＧＦシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【０００９】
（３）  上記（１）又は（２）記載のＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子を有するベクター。
（４）  上記（１）又は（２）記載のＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子の機能を欠損させた遺伝子導入細胞。
【００１０】
（５）  上記（１）又は（２）記載のＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子の機能を欠損させたトランスジェニック動物。
（６）  上記（４）記載の遺伝子導入細胞又は上記（５）記載のトランスジェニック動物に対してリード化合物を作用させる工程と、
中脳・後脳境界部においてＦＧＦシグナルと関連して働くリード化合物を同定する工程とを含むスクリーニング方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者は、先ず、モデル動物としてゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）Ｉｓｌｅｔ−３  （Ｋｉｋｕｃｈｉ，  Ｙ．，  Ｓｅｇａｗａ，  Ｈ．，  Ｔｏｋｕｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｔｓｕｂｏｋａｗａ，  Ｔ．，  Ｈｏｔｔａ，  Ｙ．，  Ｕｙｅｍｕｒａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｏｋａｍｏｔｏ，  Ｈ．，  １９９７．  Ｏｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＬＩＭ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｓｌｅｔ−３  ＬＩＭ／ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｎ  １８，  ３６９−３８２．）  によって発現制御を受ける新規遺伝子群の探索を行った。ここで、Ｉｓｌｅｔ−３は、中脳・後脳境界部（以下、ＭＨＢと呼ぶ）の発生を促進する中脳からのシグナルの発現を制御するＬＩＭ／ホメオドメイン型の転写因子である。
【００１２】
そして、本発明者は、Ｉｓｌｅｔ−３による発現制御を受け、且つＦＧＦシグナル伝達に関与する新規な遺伝子ファミリーを同定した。この新規な遺伝子ファミリーを、ｃａｎｏｐｙ遺伝子ファミリーと呼ぶこととし、当該ファミリーに属する各遺伝子を「ｃｎｐｙ」なる文言を付して命名する。
【００１３】
ゼブラフィッシュ由来のｃｎｐｙ遺伝子ファミリーは、ｃｎｐｙ１〜４遺伝子の４種類存在している。ｃｎｐｙ１遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号１に示し、ｃｎｐｙ１遺伝子がコードするｃｎｐｙ１のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ｃｎｐｙ２遺伝子がコードするｃｎｐｙ２の部分アミノ酸配列を配列番号３に示す。ｃｎｐｙ３遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号４に示し、ｃｎｐｙ３遺伝子がコードするｃｎｐｙ３のアミノ酸配列を配列番号５に示す。ｃｎｐｙ４遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号６に示し、ｃｎｐｙ４遺伝子がコードするｃｎｐｙ４のアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【００１４】
また、ｃｎｐｙ１のアミノ酸配列（配列番号２）に基づいて、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）で公開されているヒトゲノムデータベースに対して相同性検索を行うことによって、ヒト由来のｃｎｐｙ遺伝子ファミリーを同定した。ヒト由来のｃｎｐｙ遺伝子ファミリーは、ヒトｃｎｐｙ１〜４遺伝子の４種類存在している。ヒトｃｎｐｙ１遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号８に示し、ヒトｃｎｐｙ１遺伝子がコードするヒトｃｎｐｙ１のアミノ酸配列を配列番号９に示す。ヒトｃｎｐｙ２遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号１０に示し、ヒトｃｎｐｙ２遺伝子がコードするヒトｃｎｐｙ２のアミノ酸配列を配列番号１１に示す。ヒトｃｎｐｙ３遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号１２に示し、ヒトｃｎｐｙ３遺伝子がコードするヒトｃｎｐｙ３のアミノ酸配列を配列番号１３に示す。ヒトｃｎｐｙ４遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号１４に示し、ヒトｃｎｐｙ４遺伝子がコードするヒトｃｎｐｙ４のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
【００１５】
ゼブラフィッシュ由来のｃｎｐｙ１とヒト由来のｃｎｐｙ１とについて相同性を測定した結果を図１に示す。このアライメントは、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ，  ｖｅｒ１０  （ゼネティクス）のＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法  （デフォルトパラメータ設定）で作製した。同様に、ゼブラフィッシュ由来のｃｎｐｙ２（部分アミノ酸配列）とヒト由来のｃｎｐｙ２とについて相同性を測定した結果を図２に示す。ゼブラフィッシュ由来のｃｎｐｙ３とヒト由来のｃｎｐｙ３とについて相同性を測定した結果を図３に示す。ゼブラフィッシュ由来のｃｎｐｙ４とヒト由来のｃｎｐｙ４とについて相同性を測定した結果を図４に示す。
【００１６】
図１乃至４に示すように、ゼブラフィッシュ由来のｃｎｐｙ遺伝子ファミリーとヒト由来のｃｎｐｙ遺伝子ファミリーとは、高い相同性を示すため、両ファミリーに属する遺伝子は同機能を有することが考えられる。
【００１７】
また、ｃｎｐｙ１のアミノ酸配列（配列番号２）に基づいて、ＮＣＢＩで公開されているマウスゲノムデータベースに対して相同性検索を行うことによって、マウス由来のｃｎｐｙ遺伝子ファミリーを同定することもできる。また、ゼブラフィッシュ、ヒト、マウスに限定されず、例えば、ウシ、ブタ、ラット、ニワトリ、カエル、ホヤ、ウニ、ショウジョウバエ、線虫等のデータベースを検索することによって、各種後生動物におけるｃｎｐｙ遺伝子ファミリーを同定することができる。
【００１８】
マウス由来のマウスｃｎｐｙ１遺伝子がコードするマウスｃｎｐｙ１の部分アミノ酸配列を配列番号１６に示す。マウスｃｎｐｙ２遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号１７に示し、マウスｃｎｐｙ２遺伝子がコードするマウスｃｎｐｙ２のアミノ酸配列を配列番号１８に示す。マウスｃｎｐｙ３遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号１９に示し、マウスｃｎｐｙ３遺伝子がコードするマウスｃｎｐｙ３のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。マウスｃｎｐｙ４遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号２１に示し、マウスｃｎｐｙ２遺伝子がコードするマウスｃｎｐｙ４のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。
【００１９】
本発明に係るＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子は、これら全てのｃｎｐｙ遺伝子ファミリーに含まれるｃｎｐｙ遺伝子を意味する。
また、本発明に係るＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子は、２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１８、２０及び２２に表すアミノ酸配列のうちいずれかのアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＦＧＦシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質（以下、「変異型タンパク質」と総称する）をコードする遺伝子を含んでいる。すなわち、本発明に係るＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子は、変異型タンパク質をコードする遺伝子を含んでいる。
【００２０】
変異型タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９及び２１に示す塩基配列における１以上の塩基を欠失、置換又は付加することによって作製することができる。１以上の塩基を欠失、置換又は付加する際には、従来公知の手法を特に限定することなく、適宜使用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発方法を使用して、所定の塩基を置換することができる。部位特異的突然変異誘発方法としては、例えばＴ．クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）の部位特異的変異導入法（Ｋｕｎｋｅｌ，    Ｔ．    Ａ．    Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｉ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．    ８２，    ４８８−４９２  （１９８５）  ）、  Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等が挙げられる。また、通常のクンケル法で使用する１〜２本の改変用オリゴヌクレオチドを、最高１６本のオリゴヌクレオチドを同時に用いて多部位での効率よい置換を行う改良法なども採用することができる。本発明では、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（宝酒造社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（宝酒造社製））などを用いて、あるいは、宝酒造社製のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  シリーズキットを用いて変異を導入することもできる。
【００２１】
さらに、本発明に係るＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子は、配列番号１、４、６、８、１０、１２、１４、１７、１９及び２１に表すいずれかの塩基配列の相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、ＦＧＦシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、ストリンジェントな条件下において、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないことを意味する。例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い場合はハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１５〜９００ｍＭであり、温度が３７〜７０℃、好ましくは６８℃での条件を意味する。
【００２２】
ここで、「ＦＧＦシグナル伝達」とは、ＦＧＦが受容体に結合することにより進行するシグナルカスケードを意味する。「ＦＧＦシグナル伝達に関与する」とは、上記シグナルカスケードを構成する役割及び上記シグナルカスケードを活性化する機能を意味する。従って、「ＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子」とは、当該シグナルカスケードの一部に含まれる遺伝子や、当該シグナルカスケードを活性化する機能を有する遺伝子を意味する。ある遺伝子がＦＧＦシグナル伝達に関与するか否かは、当該遺伝子をノックアウトした細胞又はトランスジェニック動物において、上記シグナルカスケードの下流にある遺伝子の発現の有無や、上記シグナルカスケードの一部を構成するタンパク質を活性化するか否かにより確認できる。トランスジェニック動物としては、特に限定されないが、トランスジェニック・ゼブラフィッシュやトランスジェニック・マウス等を用いることができる。上記シグナルカスケードの下流にある遺伝子としては、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ遺伝子（Ｅｋｋｅｒ，  Ｍ．，  Ｗｅｇｎｅｒ，  Ｊ．，  Ａｋｉｍｅｎｋｏ，  Ｍ．Ａ．  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，  Ｍ．，  １９９２．  Ｃｏｏｄｉｎａｔｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｅｎｇｒａｉｌｅｄ  ｇｅｎｅｓ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１６，  １００１−１０１０．）、ｓｅｆ遺伝子（Ｆｕｒｔｈａｕｅｒ，  Ｍ．，  Ｌｉｎ，  Ｗ．，  Ａｎｇ，  Ｓ．Ｌ．，  Ｔｈｉｓｓｅ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｔｈｉｓｓｅ，  Ｃ．，  ２００２．  Ｓｅｆ  ｉｓ  ａ  ｆｅｅｄｂａｃｋ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  Ｒａｓ／ＭＡＰＫ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４，  １７０−４．；  Ｔｓａｎｇ，  Ｍ．，  Ｆｒｉｅｓｅｌ，  Ｒ．，  Ｋｕｄｏｈ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｄａｗｉｄ，  Ｉ．Ｂ．，  ２００２．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｆ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４，  １６５−９．）、ｓｐｒｏｕｔｙ２遺伝子（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，  Ｄ．，  Ｍｅｄｈｕｒｓｔ，  Ａ．Ｄ．，  Ｗａｌｓｈ，  Ｆ．Ｓ．，  Ｐｒｉｃｅ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｍａｓｏｎ，  Ｉ．，  ２０００．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ｍｉｄｂｒａｉｎ  −  ｈｉｎｄｂｒａｉｎ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｓｐｒｏｕｔｙ２：  ａｎ  ＦＧＦ８−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＦＧＦ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １５，  ２２−３５．）を挙げることができる。また、シグナルカスケードの一部を構成して活性化されるタンパク質としては、ＥＲＫ（Ｂｏｕｌｔｏｎ，  Ｔ．Ｇ．，  Ｎｙｅ，  Ｓ．Ｈ．，  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｉｐ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｒａｄｚｉｅｊｅｗｓｋａ，  Ｅ．，  Ｍｏｒｇｅｎｂｅｓｓｅｒ，  Ｓ．Ｄ．，  ＤｅＰｉｎｈｏ，  Ｒ．Ａ．，  Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，  Ｎ．，  Ｃｏｂｂ，  Ｍ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｇ．Ｄ．，  １９９１．  ＥＲＫｓ：  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  ＮＧＦ．  Ｃｅｌｌ  ６５，  ６６３−６７５．）を挙げることができる。
【００２３】
上記シグナルカスケードの下流にある遺伝子の発現の有無は、定法に従って確認することができ、例えば、ノーザンハイブリダイゼイション、ウエスタンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼイション、ＲＴ−ＰＣＲ等の手法で確認することができる。
【００２４】
また、上記シグナルカスケードの一部を構成するタンパク質を活性化するか否かは、定法に従って確認することができ、例えば、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学法等の手法で確認することができる。
【００２５】
本発明に係るＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子によれば、中脳後脳境界部による中脳視蓋部及び小脳の形成メカニズム等の解析が可能となる。特に、ｃｎｐｙ１遺伝子の転写産物からの翻訳を阻害したトランスジェニック動物においては、中脳視蓋部の低形成及び中脳後脳境界部の形成異常が観察されることから、ｃｎｐｙ１遺伝子は、中脳視蓋部及び中脳後脳境界部の形成に関与しているといえる。また、ｃｎｐｙ３遺伝子の転写産物からの翻訳を阻害したトランスジェニック動物においては、中脳視蓋部の低形成、中脳後脳境界部の形成異常、耳石の形成異常及び発生後期におけるレンズの変性が観察されることから、ｃｎｐｙ３遺伝子は、中脳視蓋部、中脳後脳境界部及び耳胞の形成に関与しているといえる。
【００２６】
また、ＦＧＦシグナルは、中脳後脳境界部の形成以外にも、内耳、血管、肢芽、歯牙、等の様々な器官の形成や、細胞の癌化などに深く関わっている。このシグナルの活性を調節できる細胞外因子を発見できれば、器官形成や細胞の増殖の制御因子として広い応用の道が開けると期待される。したがって、本発明に係るＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子の機能を欠損させたトランスジェニック動物を用いれば、中脳・後脳境界部においてＦＧＦシグナルと関連して働く分子を同定することが可能となり、器官形成や細胞の増殖制御に深く関わるＦＧＦの働きの制御に繋がる新規分子を同定することができる。
【００２７】
すなわち、本発明に係るＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子を導入した遺伝子導入細胞又は本発明に係るＦＧＦシグナル伝達に関与する遺伝子を導入したトランスジェニック動物に対してリード化合物を作用させる工程と、中脳・後脳境界部においてＦＧＦシグナルと関連して働くリード化合物を同定する工程とを含むスクリーニング方法を提供することができる。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
〔実施例１〕ｃｎｐｙ遺伝子ファミリーの発現解析
本例では、先ず、ゼブラフィッシュ胚におけるｃｎｐｙ遺伝子ファミリーの発現を観察した。
ゼブラフィッシュ胚を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ  （０．８％  ＮａＣｌ，  ０．０２％  ＫＣｌ，  ０．０２  Ｍ  ＰＯ４，  ｐＨ７．３）で４  ℃で一晩固定し、ＰＢＳＴｗ  （ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で５分間４回洗う。胚をメタノールに置換し−２０ｏＣで３０分以上おいた後、７５，  ５０，  ２５％  メタノール／ＰＢＳＴｗで順次置換する。ＰＢＳＴｗで５分間２回リンスした後、受精後２４時間以降の胚についてはＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  （１０  ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  ＰＢＳＴｗ）で室温で３〜１０分間消化。２  ｍｇ／ｍｌ  グリシン／ＰＢＳＴｗでリンスした後、４％  パラホルムアルデヒド／ＰＢＳＴｗで２０分間固定する。ＰＢＳＴｗで５分間５回洗い、Ｈｂ４  （５０％  ホルムアミド、５ｘ  ＳＳＣ  （０．７５  Ｍ  塩化ナトリウム，  ７５  ｍＭ  クエン酸ナトリウム，  ｐＨ７．０），  ５０  ｍｇ／ｍｌ  ヘパリン，  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０，  ５  ｍｇ／ｍｌ  ｔｏｒｕｌａ  ＲＮＡ）を加え、６５  ℃で１〜８時間プレハイブリダイゼイションを行う。８０  ℃で１０分間の熱変性を行ったディゴキシジェニンラベルされたｃｎｐｙ１，  ｃｎｐｙ３，  ｃｎｐｙ４全長に対するアンチセンスリボプローブ／Ｈｂ４を加え、６５  ℃で一晩ハイブリダイゼイションを行う。その後、胚を５０％  ホルムアミド／２ｘＳＳＣＴｗ  （０．３  Ｍ  塩化ナトリウム，  ３０  ｍＭ  クエン酸ナトリウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で３０分間２回、２ｘＳＳＴｗで１５分間、０．２ｘＳＳＣＴｗで３０分間２回いずれも６５  ℃で洗浄を行う。２％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｒｏｃｈｅ）／ＭＢＴ  （０．１  Ｍマレイン酸、０．１５  Ｍ塩化ナトリウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を加え室温で１時間ブロッキングを行い、ＡＰ標識抗ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ）をＰＢＳＴｗで５０００倍希釈し、室温で２時間あるいは４  ℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳＴｗで２０分間６回洗浄した後、ＳＢ  （１００  ｍＭ  塩化ナトリウム、５０  ｍＭ  塩化マグネシウム、１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ９．５，  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間２回置換し、ＳＳ  （ＮＢＴ／ＢＣＩＰ  （Ｒｏｃｈｅ），  ＳＢ）で発色を行う。その後、ＰＢＳＴｗで５分間２回洗浄し、１００％  エタノールで１０分間脱色を行う。５０％  エタノール／ＰＢＳＴｗで５分間、ＰＢＳＴｗで５分間２回洗浄した後、２５，  ５０，  ７５％グリセロール／ＰＢＳＴｗで各５分間置換し、７５％  グリセロール／ＰＢＳＴｗでマウントし検鏡する。
【００３０】
ｃｎｐｙ１、ｃｎｐｙ３及びｃｎｐｙ４遺伝子のゼブラフィッシュ胚における発現を観察した結果を図５及び図６に示す。なお、図５は、左から１列目がｃｎｐｙ１遺伝子の発現、２列目がｃｎｐｙ３遺伝子の発現、３列目がｃｎｐｙ４遺伝子の発現を示しており、上から１行目が８細胞期にあるゼブラフィッシュ胚であり、２行目がドーム期（胞胚期）にあるゼブラフィッシュ胚であり、３行目が３０％  ｅｐｉｂｏｌｙ期（初期原腸胚期）にあるゼブラフィッシュ胚である。
【００３１】
図６は、左から１列目がｃｎｐｙ１遺伝子の発現、２列目がｃｎｐｙ３遺伝子の発現、３列目がｃｎｐｙ４遺伝子の発現を示しており、上から１行目が胚盾期（中期原腸胚期）にあるゼブラフィッシュ胚であり、２行目が尾芽胚期にあるゼブラフィッシュ胚であり、３行目が受精後１８時間にあるゼブラフィッシュ胚であり、４行目が受精後２５時間にあるゼブラフィッシュ胚である。
【００３２】
図５及び図６から、ｃｎｐｙ１遺伝子は、マターナルな発現が弱く見られ、受精後１２時間頃から孵化腺原基での発現が見られるようになり、受精後１４時間以降はＭＨＢにおいて特異的に発現が見られることが判った。また、図５及び図６から、ｃｎｐｙ３遺伝子及びｃｎｐｙ４遺伝子は、マターナルな発現が強く見られ、胚性発現は胚全体に弱く見られることが判った。
【００３３】
次に、本例では、マウス胚におけるｃｎｐｙ遺伝子ファミリーの発現を観察した。
妊娠１０．５日目のマウス（ＩＣＲ）から胚を摘出し、ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで一晩固定した。エタノールで脱水後、７５，  ５０，  ２５％エタノール／ＰＢＳＴｗシリーズで再水和を行った。１０  ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ／ＰＢＳＴｗで５〜１５分間処理し、２  ｍｇ／ｍｌグリシン／ＰＢＳＴｗで５分間、ＰＢＳＴｗで５分間２回洗浄し、０．２％  グルタルアルデヒド／４％  パラホルムアルデヒド／ＰＢＳＴｗで２０分間固定した。ＰＢＳＴｗで５分間２回洗浄した後、７０  ℃で１時間処理した後氷水中で完全に冷やし、６％  Ｈ２Ｏ２／ＰＢＳＴｗを加え室温で１時間置く。ＰＢＳＴｗで５分間３回洗浄した後、７０  ℃で保温しておいたプレハイブリダイゼイション溶液（５０％  ホルムアミド、５ｘ  ＳＳＣ，  ｐＨ  ４．５，  ５０  ｍｇ／ｍｌ  ｔｏｒｕｌａ  ＲＮＡ，  １％  ＳＤＳ，  ５０  ｍｇ／ｍｌヘパリン）を加え、７０  ℃で５分間置いた後、新しいプレハイブリダイゼイション溶液を加え、１時間以上インキュベートする。８０℃で１０分間の熱変性を行ったディゴキシジェニンラベルされたｃｎｐｙ２，  ｃｎｐｙ３，  ｃｎｐｙ４全長に対するアンチセンスリボプローブ／プレハイブリダイゼイション溶液を加え、７０  ℃で揺らしながら一晩ハイブリダイゼイションを行う。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１  （５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，  ｐＨ４．５，  １％  ＳＤＳ）を加え７０  ℃で３０分間３回洗浄を行う。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１  ：  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２  （５ｘＳＳＣ，  ｐＨ４．５，  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を加え７０  ℃で１０分間洗浄を行う。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２を加え室温で５分間３回洗浄する。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２を加え室温で３０分間洗浄する。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３  （５０％  ホルムアミド，  ２ｘ  ＳＳＣ，  ｐＨ４．５，  １％  ＳＤＳ）を加え７０  ℃で５分間２回洗浄を行う。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３を加え７０  ℃で３０分間３回洗浄を行う。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３  ：  ＴＢＳＴｗ  （１５０  ｍＭ  塩化ナトリウム、１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ７．５，  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）  ＝１：１を加え７０  ℃で１０分間インキュベートする。ＴＢＳＴｗを加え、室温で５分間５回インキュベートする。２％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｒｏｃｈｅ）／ＴＢＳＴｗで６０分間ブロッキングを行う。ＡＰ標識抗ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ）をＴＢＳＴｗで５０００倍希釈し、４  ℃で一晩インキュベートする。ＴＢＳＴｗを加え、室温で５分間４回インキュベートする。ＴＢＳＴｗを加え、室温で１時間６回インキュベートする。ＮＴＭＴ  （０．１  Ｍ  塩化ナトリウム、０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ９．５，  ５０  ｍＭ塩化マグネシウム、１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を加え室温で５分間２回インキュベートする。発色液  （ＮＢＴ／ＢＣＩＰ／ＮＴＭＴ）を加え室温で遮光して１〜５時間発色を行う。ＰＢＳＴｗを加え室温で５分間５回洗浄する。１００％  エタノールで１０分間脱色を行う。５０％  エタノール／ＰＢＳＴｗで５分間、ＰＢＳＴｗで５分間２回洗浄した後、２５，  ５０，  ７５％グリセロール／ＰＢＳＴｗで各５分間置換し、７５％  グリセロール／ＰＢＳＴｗでマウントし検鏡する。
【００３４】
受精後１０．５日目のマウス胚を観察した結果を図７に示す。なお、図７において、左から順にｃｎｐｙ２遺伝子、ｃｎｐｙ３遺伝子及びｃｎｐｙ４遺伝子の発現を観察した結果である。図７から、ｃｎｐｙ２遺伝子、ｃｎｐｙ３遺伝子及びｃｎｐｙ４遺伝子ともにマウス胚全体に亘って発現が見られたが、特に肢芽及び尾部における強い発現を観察することができる。
【００３５】
〔実施例２〕アンチセンスモルフォリノオリゴによるノックダウン実験
ゼブラフィッシュにおいて、転写産物からタンパク質への翻訳をアンチセンスモルフォリノオリゴ（ＭＯ）の顕微注入により効果的に阻害できる（ノックダウン）ことが知られている。そこで、本例では、ｃｎｐｙ１遺伝子を同手法でノックダウンした胚（ｃｎｐｙ１−ＭＯノックダウン胚と呼ぶ。その他のｃｎｐｙ遺伝子ファミリーのノックダウン胚も同様に称する。）、ｃｎｐｙ３−ＭＯノックダウン胚、ｃｎｐｙ３／４−ＭＯノックダウン胚及びｃｎｐｙ４−ＭＯノックダウン胚を作製し、形態異常を観察した。
【００３６】
各アンチセンスモルフォリノオリゴの配列は以下の通りである。
ｃｎｐｙ１−ＭＯ；ＡＴＧＧＴＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＧ（配列番号２３）
ｃｎｐｙ３−ＭＯ；ＴＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＡＡＴＡＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣ（配列番号２４）
ｃｎｐｙ４−ＭＯ；ＧＴＡＡＡＣＡＴＴＴＣＣＡＴＡＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡ（配列番号２５）
【００３７】
これらアンチセンスモルフォリノオリゴは、１ｘ  Ｄａｎｉｅａｕ  ｂｕｆｆｅｒ  （５８  ｍＭ塩化ナトリウム、０．７  ｍＭ塩化カリウム、０．５  ｍＭ硫酸マグネシウム、０．６  ｍＭ硝酸カルシウム、５．０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ７．６）にそれぞれ溶解した。１〜２細胞期のゼブラフィッシュ胚にアンチセンスモルフォリノオリゴを顕微注入した。
【００３８】
結果を図８及び図９に示す。図８において、（ａ）は正常なゼブラフィッシュ胚におけるＭＨＢ周辺を上方から撮影した写真であり、（ｂ）は正常なゼブラフィッシュ胚におけるＭＨＢ周辺を側方から撮影した写真であり、（ｃ）はｃｎｐｙ１−ＭＯノックダウン胚におけるＭＨＢ周辺を上方から撮影した写真であり、（ｄ）はｃｎｐｙ１−ＭＯノックダウン胚におけるＭＨＢ周辺を側方から撮影した写真であり、（ｅ）はｃｎｐｙ３−ＭＯノックダウン胚におけるＭＨＢ周辺を上方から撮影した写真であり、（ｆ）はｃｎｐｙ３−ＭＯノックダウン胚におけるＭＨＢ周辺を側方から撮影した写真である。図９において、左から順に、正常なゼブラフィッシュ胚、ｃｎｐｙ３−ＭＯノックダウン胚及びｃｎｐｙ３／４−ＭＯノックダウン胚における耳胞（矢印で示す）を撮影した写真である。
【００３９】
図８及び図９の結果から、各ノックダウン胚において以下の形態異常が観察された。ｃｎｐｙ１−ＭＯノックダウン胚では中脳視蓋部の低形成及びＭＨＢの形成異常が観察された。ｃｎｐｙ３−ＭＯノックダウン胚では軽度の耳胞及び耳石の形成異常が観察された。ｃｎｐｙ３／４−ＭＯノックダウン胚においては重度の耳胞及び耳石の形成異常が見られた。また、ｃｎｐｙ４−ＭＯ単独では異常はほとんど見られない（図示せず）ので、ｃｎｐｙ４遺伝子は耳胞及び耳石の形成においてｃｎｐｙ３遺伝子と協調的に働いていると考えられた。ＭＨＢ形成及び耳胞の形成においてＦＧＦシグナルが重要な役割を担っていることが知られているので、本例によってｃｎｐｙ遺伝子ファミリーはＦＧＦのシグナル伝達に関与していることが示唆された。
【００４０】
〔実施例３〕繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナルへの関与
実施例２によりｃｎｐｙ遺伝子ファミリーがＦＧＦシグナル伝達に関与することが示唆されたため、本例では、ｃｎｐｙ遺伝子ファミリーとＦＧＦシグナルとの関連について検討した。
【００４１】
＜ＦＧＦビーズ実験＞
間脳及び中脳付近にＦＧＦ８ｂに浸したビーズを埋め込むことによって異所的にｅｎｇｒａｉｌｅｄ遺伝子の発現が誘導されることが知られている（Ｃｒｏｓｓｌｅｙ，  Ｐ．Ｈ．，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｇ．Ｒ．，  １９９６．  Ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＦＧＦ８  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｙｏ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，  ６６−６８．）。そこで、正常なゼブラフィッシュ胚及びｃｎｐｙ１−ＭＯノックダウン胚にＦＧＦ８ｂビーズを埋め込み、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ遺伝子の発現誘導を確認した。
【００４２】
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ＦＧＦ−８ｂ  （Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳに溶解し、あらかじめＰＢＳで洗浄しておいたｈｅｐａｒｉｎ，  ｉｎｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｎ  ａｃｒｙｌｉｃ  ｂｅａｄｓ  （Ｓｉｇｍａ）を加え、０．５  ｍｇ／ｍｌの濃度で４  ℃で一晩インキュベートする。受精後１５時間の正常胚あるいはｃｎｐｙ１−ＭＯノックダウン胚にＦＧＦを浸したビーズを埋め込み、１／３希釈Ｒｉｎｇｅｒ液  （３９  ｍＭ塩化ナトリウム、０．９７  ｍＭ塩化カリウム、１．８  ｍＭ塩化カルシウム、１．７  ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，  ｐＨ７．２）中で３時間インキュベート後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼイションによってｅｎｇｒａｉｌｅｄ遺伝子の発現を調べた。
【００４３】
結果を図１０に示す。図１０から判るように、ｃｎｐｙ１−ＭＯノックダウン胚においては、ＦＧＦ８ｂビーズを埋め込んだところ、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ遺伝子の異所的な発現の程度が大幅に減少した。なお、正常なゼブラフィッシュ胚（正常胚）においては、ＦＧＦ８ｂビーズを埋め込むことによって、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ遺伝子の異所的な発現が増加していることが判る。この結果から、ｃｎｐｙ１遺伝子は、ＦＧＦシグナルの伝達に必須であることが明らかとなった。
【００４４】
＜活性化ＥＲＫのウエスタンブロットによる検出＞
ＦＧＦのシグナルはＦＧＦが受容体に結合しその下流にあるシグナルカスケードを活性化することによって伝わる。ＥＲＫの活性化はＦＧＦシグナルの指標となる（Ｇｏｔｏｈ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｄａ，  Ｅ．，  １９９６．  Ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｏｒ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＦＧＦ）／ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  （ＭＡＰＫ）  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２８８，  Ｆ１−７．）。そこで、ｃｎｐｙ１−ＭＯノックダウン胚及びｃｎｐｙ３／４−ＭＯノックダウン胚において活性化ＥＲＫをウエスタンブロットによって検出した。なお、正常なゼブラフィッシュ胚（正常胚）及びｆｇｆ３−ＭＯノックダウン胚をコントロールとした。
【００４５】
ｆｇｆ３−ＭＯの配列はＣＡＴＴＧＴＧＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＡＴＧＴＣＧＧＣ（配列番号２６）である。受精後１８時間の正常胚、ｆｇｆ３−ＭＯノックダウン胚、ｃｎｐｙ３／４−ＭＯノックダウン胚、及びｃｎｐｙ１−ＭＯノックダウン胚の卵膜と卵黄を取り除く。胚をＳａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ  （１２５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ６．８，  ２％  ＳＤＳ，  １０％グリセロール、５０  ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）で溶解し、９５  ℃、５分間処理する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに１レーンあたり３匹分のサンプルをアプライし、電気泳動を行う。泳動後、エレクトロブロッティングによりタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写する。５％スキムミルク／ＴＢＳＴｗ  （ＴＢＳ，  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で一晩４  ℃でブロッキングを行う。活性化ＥＲＫを検出するためには１％スキムミルク／ＴＢＳＴＷで１：１００００希釈したａｎｔｉ−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ＥＲＫ  （ｓｉｇｍａ）を加え、全ＥＲＫを検出するためには１％スキムミルク／ＴＢＳＴＷで１：１００００希釈したａｎｔｉ−ＥＲＫ１  （Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を加え、３７  ℃で１時間インキュベートする。ＴＢＳＴｗで１０分間３回洗浄する。活性化ＥＲＫを検出するためには１％スキムミルク／ＴＢＳＴＷで１：１００００希釈したａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  （Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を加え、全ＥＲＫを検出するためには１％スキムミルク／ＴＢＳＴＷで１：２００００希釈したａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  （Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を加え、３７  ℃で１時間インキュベートする。ＴＢＳＴｗで１０分間３回洗浄する。Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いシグナルを検出する。
【００４６】
結果を図１１に示す。図１１から判るように、ｃｎｐｙ１−ＭＯノックダウン胚及びｃｎｐｙ３／４−ＭＯノックダウン胚においては、ｆｇｆ３−ＭＯノックダウン胚と同様に、活性化ＥＲＫがほぼ消失していることが分かった。この結果からも、ｃｎｐｙ１遺伝子はＦＧＦシグナルの伝達に必須であることが明らかとなった。また、ｃｎｐｙ３遺伝子及びｃｎｐｙ４遺伝子は、ＦＧＦシグナルの伝達に必須であることが明らかとなった。
【００４７】
＜免疫組織化学による活性化ＥＲＫの検出＞
ウエスタンブロットにより活性化ＥＲＫの消失が確認されたので、免疫組織化学によって、ゼブラフィッシュ胚のどの部分で活性化ＥＲＫが消失したのかを調べた。
受精後１８時間の正常胚あるいはｆｇｆ３−ＭＯ，  ｃｎｐｙ１−ＭＯ，  ｃｎｐｙ３−ＭＯ各ノックダウン胚を４％パラホルムアルデヒドで４  ℃で一晩固定する。ＰＢＳＴｗで５分間４回洗浄する。１００％メタノールで脱水し、−２０  ℃に３０分以上おく。７５，  ５０，  ２５％メタノール／ＰＢＳＴｗで各５分間おく。ＰＢＳＴｗで５分間２回洗浄する。２％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ／ＭＢＴを加え、８０  ℃、２０分間及び、室温で１時間インキュベートする。ＰＢＳＴｗで１：１００００希釈したａｎｔｉ−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ＥＲＫを加え、４  ℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳＴｗで２０分間６回洗浄を行う。ＰＢＳＴｗで１：１０００希釈したａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，  Ｂｉｏｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  （ｓｉｇｍａ）を加え４  ℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳＴｗで２０分間６回洗浄を行う。ＡＢＣ  ｃｏｍｐｌｅｘ  （Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を加え室温で２時間インキュベートする。ＰＢＳＴｗで２０分間６回洗浄を行う。０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ８．２で５分間２回置換する。ＤＡＢ／０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ８．２を加え２０分おき、１：１０００希釈した過酸化水素水を適量加え発色を行う。ＰＢＳＴｗで５分間２回洗浄する。２５，  ５０，  ７５％グリセロール／ＰＢＳＴｗで各５分間置換し、７５％  グリセロール／ＰＢＳＴｗでマウントし検鏡する。
【００４８】
結果を図１２に示す。図１２から判るように、正常胚においては、活性化ＥＲＫは終脳及びＭＨＢに多くみられたが、ｃｎｐｙ１−ＭＯノックダウン胚あるいはｃｎｐｙ３−ＭＯノックダウン胚においてはこれらの領域での活性化ＥＲＫが消失していた。この結果からも、ｃｎｐｙ１遺伝子及びｃｎｐｙ３遺伝子は、ＦＧＦシグナルの伝達に必須であることが明らかとなった。
【００４９】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明により、ＦＧＦシグナル伝達に関与する新規な遺伝子を提供することができる。本発明に係る遺伝子を使用することによって、中脳後脳境界部による中脳視蓋部及び小脳の形成メカニズム並びに、内耳、血管、肢芽、歯牙、等の様々な器官の形成メカニズムや、細胞の癌化メカニズム等の解析が可能となる。
【００５０】
【配列表】
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【００５１】
【配列表フローテキスト】
配列番号２３〜２６は合成ＤＮＡである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトｃｎｐｙ１とゼブラフィッシュｃｎｐｙ１との相同性を検討した結果を示す図である。
【図２】ヒトｃｎｐｙ２とゼブラフィッシュｃｎｐｙ２との相同性を検討した結果を示す図である。
【図３】ヒトｃｎｐｙ３とゼブラフィッシュｃｎｐｙ３との相同性を検討した結果を示す図である。
【図４】ヒトｃｎｐｙ４とゼブラフィッシュｃｎｐｙ４との相同性を検討した結果を示す図である。
【図５】ｃｎｐｙ１、ｃｎｐｙ３及びｃｎｐｙ４遺伝子のゼブラフィッシュ胚における発現を観察した顕微鏡写真である。
【図６】ｃｎｐｙ１、ｃｎｐｙ３及びｃｎｐｙ４遺伝子のゼブラフィッシュ胚における発現を観察した顕微鏡写真である。
【図７】ｃｎｐｙ２遺伝子、ｃｎｐｙ３遺伝子及びｃｎｐｙ４遺伝子のマウス胚における発現を観察した顕微鏡写真である。
【図８】正常胚及びノックダウン胚におけるＭＨＢ周辺の形態異常を観察した顕微鏡写真である。
【図９】正常胚及びノックダウン胚における耳胞の形態異常を観察した顕微鏡写真である。
【図１０】正常なゼブラフィッシュ胚及びｃｎｐｙ１−ＭＯノックダウン胚にＦＧＦ８ｂビーズを埋め込み、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ遺伝子の発現誘導を観察した顕微鏡写真である。
【図１１】ｃｎｐｙ１−ＭＯノックダウン胚及びｃｎｐｙ３／４−ＭＯノックダウン胚において活性化ＥＲＫをウエスタンブロットによって検出した電気泳動写真である。
【図１２】免疫組織化学法によって、ゼブラフィッシュ胚のどの部分で活性化ＥＲＫが消失したのかを検出した顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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