(57)【要約】【課題】サンプルの２次元の位置情報と波長情報を同時にかつリアルタイムに分光画像として測定することのできるリアルタイム分光画像分析装置及び分析方法を提供する。【解決手段】サンプルＳを載置する可動ステージ１と、サンプルＳの表面に白色光を照射する光源２と、白色光がサンプルＳの表面に反射して生じた反射光の１ライン上の領域を１度に分光する分光器４と、分光器４によって反射光から分光された分光スペクトルを１次元位置情報と波長情報として１フレームに取り込む白黒ＣＣＤカメラ５と、白黒ＣＣＤカメラ５で取り込まれた１次元位置情報と波長情報を記憶，解析，画像処理するとともに白黒ＣＣＤカメラ５のフレーム単位で前記可動ステージ１を１軸動作させるコンピュータ６とを備えた。【選択図】  図１
2004219092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを載置する可動ステージと、前記サンプルの表面に白色光を照射する光源と、前記白色光が前記サンプルの表面に反射して生じた反射光の１ライン上の領域を１度に分光する分光器と、この分光器によって前記反射光から分光された分光スペクトルを１次元位置情報と波長情報として１フレームに取り込む白黒ＣＣＤカメラと、この白黒ＣＣＤカメラで取り込まれた前記１次元位置情報と前記波長情報を記憶，解析，画像処理するとともに前記白黒ＣＣＤカメラのフレーム単位で前記可動ステージを１軸動作させるコンピュータとを備えたことを特徴とするリアルタイム分光画像分析装置。
【請求項２】
サンプル表面の１ライン上の領域をそれぞれ１度に分光した分光スペクトルを１次元位置情報と波長情報として取り込み、１軸位置移動したこれら１次元位置情報と波長情報から２次元位置情報と波長情報を得ることを特徴とするリアルタイム分光画像分析方法。
【請求項３】
前記サンプルは蛍光標識された生体分子であることを特徴とする請求項２記載のリアルタイム分光画像分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌などの生体サンプルの分光スペクトルをリアルタイムで分光画像として測定するリアルタイム分光画像分析装置及び分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、癌などの疾患の診断においては、内視鏡画像を用いて肉眼で観察し、疾患の疑いのある生体組織を採取して、その組織を病理学的に分析を行うのが主要な手段となっている。しかし、癌の場合、採取による診断はその手技によっては転移の虞があり、好ましくない。また、肉眼による観察は、疾患箇所の見落としや、診断者の経験、熟練度によって診断結果が左右される虞があるなどの問題があった。さらに、癌などの疾患は、早期に発見し適切な治療を施せば高い治癒率が得られることから、確実な早期診断と分析が求められている。
【０００３】
そこで、これらの問題を解決するための手法として、生体組織の採取を行わずに、分光画像測定装置を用いた分光画像測定法が候補に挙げられる。しかし、従来の診断用の分光画像測定法は、表示された画像中の１点の分光スペクトルのみしか採取できず、診断に十分な情報を得ることができないといった問題があった。
【０００４】
また、特開２０００−３５６５５２号公報などに開示されているような、印刷面の色彩・濃度を測定するための装置を診断用に用いることが考えられる。この装置は、印刷面に線状の光を照射して、その反射光を１ライン上で分割した微小領域について同時に分光し、得られた分光データから１ライン上の色彩・濃度を同時に求めることのできるものである。しかしながら、この装置は、測定範囲が１ライン上に限られているため、診断用に用いるには測定範囲が狭すぎるといった問題があった。
【０００５】
【特許文献１】
特開２０００−３５６５５２号公報
【特許文献２】
特開２０００−３１４６１２号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記問題を解決することであり、サンプルの２次元の位置情報と波長情報を同時にかつリアルタイムに分光画像として測定することのできるリアルタイム分光画像分析装置及び分析方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の請求項１記載のリアルタイム分光画像分析装置は、サンプルを載置する可動ステージと、前記サンプルの表面に白色光を照射する光源と、前記白色光が前記サンプルの表面に反射して生じた反射光の１ライン上の領域を１度に分光する分光器と、この分光器によって前記反射光から分光された分光スペクトルを１次元位置情報と波長情報として１フレームに取り込む白黒ＣＣＤカメラと、この白黒ＣＣＤカメラで取り込まれた前記１次元位置情報と前記波長情報を記憶，解析，画像処理するとともに前記白黒ＣＣＤカメラのフレーム単位で前記可動ステージを１軸動作させるコンピュータとを備えたことを特徴とする。
【０００８】
上記構成によれば、サンプルの２次元の位置情報と波長情報を同時にかつリアルタイムに分光画像として測定することができ、確実かつ迅速な診断用の測定が可能になる。
【０００９】
本発明の請求項２記載のリアルタイム分光画像分析方法は、サンプル表面の１ライン上の領域をそれぞれ１度に分光した分光スペクトルを１次元位置情報と波長情報として取り込み、１軸位置移動したこれら１次元位置情報と波長情報から２次元位置情報と波長情報を得ることを特徴とする。
【００１０】
上記構成によれば、サンプルの２次元の位置情報と波長情報を同時にかつリアルタイムに分光画像として測定することができ、確実かつ迅速な診断用の測定が可能になる。
【００１１】
本発明の請求項３記載のリアルタイム分光画像分析方法は、前記サンプルは蛍光標識された生体分子であることを特徴とする。
【００１２】
上記構成に加えて蛍光標識に対応した励起光を用いれば、蛍光標識された生体分子の２次元の位置情報と波長情報を同時にかつリアルタイムに分光画像として測定することができ、確実かつ迅速な診断用の測定が可能になる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。はじめに図１〜図４に基づき、本発明のリアルタイム分光画像分析装置について説明する。図１において、１はサンプルを載置する可動ステージである。また、２は光源であり、可動ステージ１に載置されたサンプルＳに均一な白色光を照射するものである。光源２としては白色光を照射できるものであればどのようなものを用いてもよく、例えば、ハロゲンランプで構成することができる。また、蛍光標識に対応した励起光を用いれば、蛍光標識された生体分子の２次元の位置情報と波長情報を観測する事もできる。
【００１４】
可動ステージ１の上方には、スリット３を一体に備えた分光器４が設けられている。このスリット３は、光源２の白色光がサンプルＳの表面に反射して生じた反射光の１ライン上の微小な領域のみを分光器４内に透過させるものである。この分光器４は、透過型グレーティングを搭載したイメージング分光器であって、スリット３を透過した反射光の１ライン上の１次元位置情報を保持しながら同時に分光して分光スペクトルを得ることができるように構成されている。そして、分光器４によって分光された分光スペクトルの１次元位置情報と波長情報は、分光像として白黒ＣＣＤカメラ５の１フレームに取り込まれるように構成されている。
【００１５】
図２を参照して、分光器４の基本構成をさらに詳細に説明すると、スリット３はスリット本体３ａとレンズ３ｂを備え、レンズ３ｂは、サンプルＳの１ライン上たる直線Ａ−Ｂ上の反射光をスリット本体３ａに集めるように構成されている。また、分光器４は、２枚のレンズ４ａ，４ｃと、ＰＧＰというプリズム４ｂを備えている。そして、スリット本体３ａを透過したサンプルＳの直線Ａ−Ｂ上の反射光は、レンズ４ａ，４ｃとプリズム４ｂによって、直線Ａ−Ｂ上の位置関係を保持したまま分光され、白黒ＣＣＤカメラ５に取り込まれるようになっている。つまり、サンプルＳの直線Ａ−Ｂ上の領域が、その位置関係を保持したまま１度に分光され、白黒ＣＣＤカメラ５の１フレームに取り込まれるように構成されている。そして、白黒ＣＣＤカメラ５は、サンプルＳの直線Ａ−Ｂの分光スペクトルの１次元位置情報をＸ軸に、波長情報をＹ軸に取得するようになっている。
【００１６】
なお、上記分光器４としては、フィンランドのＳｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｌｔｄ社の「ＩｍＳｐｅｃｔｅｒ」（分光範囲：３８０〜７８０ｎｍ，波長分解能：２ｎｍ）が好適に用いられる。また、本実施例の白黒ＣＣＤカメラ５には、光電子倍増管５ａ（Ｉｍａｇｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ）（輝度利得（Ｌｕｍｉｎａｎｃｅ  ｇａｉｎ）：２５０００，感度：２０μｌｕｘ，波長帯域３８０〜８５０ｎｍ，波長分解能２ｎｍ）が搭載されており、微弱な光を増幅して白黒ＣＣＤカメラ５に取得できるようになっている。
【００１７】
６は、白黒ＣＣＤカメラ５で取り込まれた１次元位置情報と波長情報を記憶，解析，画像処理するコンピュータである。また、可動ステージ１は１軸動作するように構成されており、可動ステージ１には１軸動作の速度などを調節する調節手段７が設けられている。そして、コンピュータ６は、白黒ＣＣＤカメラ５のフレーム単位ごとに一定の距離を可動ステージ１が１軸動作するように、調節手段７を制御するように構成されている。
【００１８】
そして、可動ステージ１を１軸動作させることによって、コンピュータ６に記憶されたサンプルＳの個々の１次元位置情報と波長情報から、サンプルＳの２次元位置情報と波長情報が得られるようになっている。これらの情報をもとに、コンピュータ６によって解析，画像処理することにより、例えば、分光スペクトルの波長５ｎｍごとの強度から色彩値Ｒ，Ｇ，Ｂを求め、サンプルＳの表面の様子をカラーＲＧＢ画像として表示したり、サンプルＳ上の任意の点の分光スペクトル、さらには任意の２点の分光スペクトルと差スペクトルの同時表示、または、生データ，反射率（透過率）などを表示したり、サンプルＳの表面を任意の波長の分光スペクトル強度をモノクロ階調画像（グレースケール）で表示することができるように構成されている。
【００１９】
つぎに作用について説明する。まず、可動ステージ１に測定対象となるサンプルＳを載置し、光源２によりサンプルＳの表面に白色光を照射する。サンプルＳの表面の１ライン上の微小な領域の反射光のみがスリット３を透過し、スリット３を透過した反射光は１ライン上の１次元位置情報を保持しながら分光器４で分光されて分光スペクトルとなり、この分光スペクトルの１次元位置情報と波長情報は、分光像として白黒ＣＣＤカメラ５の１フレームに取り込まれる。より詳細には、レンズ３ｂによって、サンプルＳの直線Ａ−Ｂ上の反射光がスリット本体３ａに集められ、スリット本体３ａを透過したサンプルＳの直線Ａ−Ｂ上の反射光がレンズ４ａ，４ｃとプリズム４ｂによって直線Ａ−Ｂ上の位置関係を保持したまま分光され、光電子倍増管５ａで増幅されて白黒ＣＣＤカメラ５に取り込まれる。そして、白黒ＣＣＤカメラ５は、サンプルＳの直線Ａ−Ｂの分光スペクトルの１次元位置情報をＸ軸に、波長情報をＹ軸に、分光像として取得する。この分光像の例を図３に示す。この図３は、縦軸（Ｘ軸）が位置情報、横軸（Ｙ軸）が波長情報となっている。白黒ＣＣＤカメラ５によって取得された１次元位置情報と波長情報は、コンピュータ６によって記憶される。
【００２０】
一方、コンピュータ６は、白黒ＣＣＤカメラ５のフレーム単位ごとに一定の距離を可動ステージ１が１軸動作するように、調節手段７を制御する。この１軸動作を連続して行うことにより、サンプルＳの表面の多数の１次元位置情報と波長情報を採取し、これら多数の１次元位置情報と波長情報をコンピュータ６に記憶し蓄積することにより、サンプルＳの表面の２次元位置情報と波長情報が測定される。例えば、上記の測定において、１ラインあたりの測定時間は０．１〜２．１秒とすると、サンプルＳの大きさにもよるが、サンプルＳの表面全体について３０秒程度で測定することができる。
【００２１】
その後、これらの２次元位置情報と波長情報情報を基に、コンピュータ６によって解析，画像処理し、必要に応じ、分光スペクトルの波長５ｎｍごとの強度から色彩値Ｒ，Ｇ，Ｂを求めたり、サンプルＳの表面の様子をカラーＲＧＢ画像として表示したり、サンプルＳ上の任意の点の分光スペクトル、さらには任意の２点の分光スペクトルと差スペクトルを同時表示、または、生データ，反射率（透過率）などを表示したり、サンプルＳの表面を任意の波長の分光スペクトル強度をモノクロ階調画像（グレースケール）で表示する。例として、サンプルＳの任意の点の分光スペクトルを図４に示す。この図４は横軸に波長，縦軸に強度を表している。
【００２２】
つぎに、実際の測定例をもとに、より具体的に説明する。なお、本発明はこれらの測定例に限定されるものではない。
【００２３】
［測定例１］  実験動物として、ＢＡＬＡ／ｃ系マウス雄性５週齢（三協ラボ東京）を用いた。ＢＡＬＡ／ｃマウス雄性５週齢の右大腿部皮下に１×１０６個の腫瘍（Ｍｅｔｈ−Ａ  ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ）細胞を移植すると、１週間後に腫瘍の径が約１ｃｍの担癌マウスが得られた。この担癌マウスを麻酔死させた後、腫瘍を採取し、採取した腫瘍を１０％の中性ホルマリンで固定した。その後、腫瘍をエタノール系列の溶剤を用いて脱水し、パラフィン包埋後、厚さ１０μｍの切片を作成した。上記切片をキシレン・エタノール系列の溶剤を用いて脱パラフィンし、ヘマトキシン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、これをサンプルＳとして本発明のリアルタイム分光画像分析装置を用いて観察した。
【００２４】
ヘマトキシン・エオジン染色したサンプルＳを可動ステージ１上に載置し、この可動ステージ１を１ｍｍ／分で駆動させ、白黒ＣＣＤカメラ５と同期を取ってサンプルＳの表面の２次元位置情報と波長情報を採取した。このとき、対物レンズたるレンズ３ｂは、１０倍のものを用いた。
【００２５】
採取した２次元位置情報と波長情報としての分光スペクトルをもとに、コンピュータ６によって解析，画像処理してＲＧＢを算出し、サンプルＳの表面をカラーＲＧＢ画像で表示したものを図５に示す。この図５の画像は、カラーカメラにより撮影した画像と完全に一致していることが確認された。
【００２６】
図５に示すＡ〜Ｅの各点は、Ａは癌組織が存在していない部位、Ｂは細胞質においてエオジン染色の強い部位、Ｃはエオジン染色の弱い部位、Ｄは組織周辺の染色性の少ない橙色の部位、Ｅは核の部位でヘマトキシンとエオジン染色部位を示すものである。
【００２７】
図５で示したＡ〜Ｅそれぞれの点における分光スペクトルを本発明のリアルタイム分光画像分析装置に記録されている分光スペクトルの情報、ずなわち画像分光情報より、瞬時に画像処理したものを図６に示す。この図６に示す分光スペクトルは、ハロゲン光源を使用して測定した分光スペクトルであるため、生情報である。そのため４００ｎｍ付近では強度が弱くなっている。そこで、図６におけるＡのデータを透過率１としてＡに対するＢ，Ｃ，Ｄ，Ｅそれぞれのデータ値を換算し、データの補正を行い図７に示した。エオジン染色部位であるＢ及びＣでの吸収波長は、５３５ｎｍにピークと５００ｎｍに肩を持つ分光スペクトルが観測された。一方、ヘマトキシンとエオジン染色部位であるＥの吸収波長はエオジンのみで染色されたＢ，Ｃと同様に５３５ｎｍにピークと５００ｎｍに肩を持ち、さらに５６０〜６００ｎｍにかけて肩を持つ分光スペクトルが観測された。橙色の部位Ｄは吸収が弱いものの、エオジン染色部位と同一の波長におけるピークに加え、４２０〜４６０ｎｍにピークを持っていた。
【００２８】
つぎに、画像分光データから指定されたそれぞれの波長における画像を取り出し表示した。図８は波長４２５ｎｍ，図９は波長５０５ｎｍ，図１０は波長５３５ｎｍ，図１１は波長６００ｎｍでのサンプルＳの画像である。図８に示されるように、波長４２５ｎｍの画像では癌組織周辺に濃い部分が見られる。これは図５におけるＤ部位の橙色の吸収帯４２０〜４６０ｎｍのピーク部位に対応していた。また、図９，図１０に示されるように、波長５００ｎｍ及び５３５ｎｍでの画像は、細胞質のエオジン染色部位を濃く表していた。また、図１１に示されるように、６００ｎｍでの画像では、細胞質より核が明確に観測され、５６０〜６００ｎｍに吸収帯を持つヘマトキシンに依存する画像となっていることが明確に確認できた。
【００２９】
以上のとおり、本発明のリアルタイム分光画像分析装置を用いることによって、瞬時に分光スペクトルの各波長において図８〜図１１のような強度分布図を作成することが可能になり、染色されたサンプルＳ上の物質の分布を明確に観測することができた。
【００３０】
［測定例２］  測定例１と同様に、本発明のリアルタイム分光画像分析装置を用いて癌細胞組織の観測を行った。癌細胞組織のサンプルＳから得られた２次元位置情報と波長情報からコンピュータ６を用いて、各点の５ｎｍごとの分光スペクトル強度を用いて色彩値Ｒ，Ｇ，Ｂを求め、カラーＲＧＢ画像として表示したものを図１２に示す。この図１２の画像は、カラーカメラにより撮影した画像と完全に一致していることが確認できた。
【００３１】
図１２に示すＡ〜Ｃの各点は、Ａは癌組織が存在していない部位、Ｂは細胞質においてエオジン染色の強い部位、Ｃは核の部位でヘマトキシンとエオジン染色部位を示すものである。
【００３２】
図１２で示したＡ〜Ｃそれぞれの点における分光スペクトルを本発明のリアルタイム分光画像分析装置に記録されている画像分光情報より、背景であるＡの分光スペクトルを基準にして、Ａ，Ｂ，Ｃそれぞれの点における分光スペクトル瞬時に画像処理したものをそれぞれ図１３〜図１５に示す。エオジン染色部位であるＢでは、５６０ｎｍにピークと６００ｎｍに肩を持つ分光スペクトルが観測された。一方、ヘマトキシンとエオジン染色部位であるＣの吸収波長はエオジンのみで染色されたＢと同様な５６０ｎｍのピークに加え、６００〜７００ｎｍにかけて肩を持つ分光スペクトルが観測された。
【００３３】
つぎに、画像分光データから指定されたそれぞれの波長における画像を取り出し表示した。図１６は波長４６０ｎｍでの癌細胞組織の画像である。図１７は波長５００ｎｍ、図１８は波長５６０ｎｍ、図１９は波長６００ｎｍ、図２０は波長６５０ｎｍ、図２１は波長７００ｎｍでの癌細胞組織の画像である。図１６に示されるように、単一波長４６０ｎｍの画像では癌組織周辺に濃い部分が見られる。図１８，図１９に示されるように、５６０ｎｍ及び６００ｎｍの画像では細胞質のエオジン染色部位が濃く表されていた。また、図２１に示されるように、７００ｎｍの画像では、細胞質より核が明確に観測され、６００〜７００ｎｍにかけて吸収帯を持つヘマトキシンに依存する画像となっていることが明確に確認できた。
【００３４】
以上のとおり、本発明のリアルタイム分光画像分析装置を用いることによって、各波長における分光スペクトルの強度分布図を作成し、染色されたサンプル組織における疾患部位の分布状態が観測できた。
【００３５】
［測定例３］  日本白色ウサギ生後２年４ヶ月前後（日本医科学動物資材研究所  東京）に、高コレステロールの餌（０．５％コレステロール含有）を連続して２５週間投与すると、高脂血症ウサギが得られた。この高脂血症ウサギには、動脈血管内壁硬化部位が充分に形成されていた。この高脂血症ウサギの静脈内に、体重１ｋｇあたり５ｍｇの割合でＮＰｅ６（Ｍｏｎｏ−Ｌ−ａｓｐａｒｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｎｅ  ｅ６）を投与し、投与から６時間後にネブタール麻酔死させ、動脈硬化部位を含む血管を摘出した。
【００３６】
つぎに、摘出した血管を素早く−８０℃に凍結し、大動脈弓部を横断面としてクリオスタットで１０μｍの厚さに切断し、これをスライドグラス上に張付けてサンプルＳとした。そして、このサンプルＳを可動ステージ１上に載置し、この可動ステージ１を１ｍｍ／分で駆動させ、白黒ＣＣＤカメラ５と同期を取ってサンプルＳの表面の２次元位置情報と波長情報を採取した。このとき、対物レンズたるレンズ３ｂは、１０倍のものを用いた。
【００３７】
なお、Ｎｐｅ６は、テトラピロール環のＤ環にある２重結合が１つ開裂したクロリン環の炭素１７位にアミド結合によりアスパラギン酸塩を１つ側鎖に付けた構造を有する分子量７９９の光感受性物質で、腫瘍や動脈硬化部位などの病態組織に集積される一方、正常組織からはすぐに排泄される特性を有している。また、ＮＰｅ６はｐＨ７．４のリン酸緩衝液中でＳｏｒｅｔ帯（３９８ｎｍ）とＱ帯（５０２，５３０，６２０，６５４ｎｍ）にそれぞれ吸収のピークを持っており、これら吸収のピークは腫瘍や動脈硬化部位などの生体構成要素に取り込まれると１０ｎｍほど長波長側へ移動する。
【００３８】
採取した２次元位置情報と波長情報としての分光スペクトルをもとに、コンピュータ６によって解析，画像処理してＲＧＢを算出し、サンプルＳの表面をカラーＲＧＢ画像で表示した。また、本発明のリアルタイム分光画像分析装置を用いたことで、コンピュータ６による画像処理を利用してサンプルＳ上の任意の点の分光スペクトルを瞬時に表示することができ、これら分光スペクトルの吸収波長とＮＰｅ６を比較することで、動脈硬化部位が存在している部位の診断を迅速に行うことができた。さらに、ＮＰｅ６の吸収波長における単一波長の画像もコンピュータ６を用いて瞬時に表示することができ、動脈硬化部位が存在している部位を一目で確認することができた。
【００３９】
［測定例４］  ヒトの腕をきつく締め上げ、動脈を圧迫し、３０秒後に圧迫を解く作業を行った。このときの手の甲をサンプルＳとして、本発明のリアルタイム分光画像分析装置を用いて、動脈圧迫時から動脈圧迫解放時までの血液中酸素量の変化を計時的に観測した。血液中に含まれるヘモグロビンは、動脈圧迫時には、酸素と結合できずにデオキシヘモグロビンとなり、動脈圧迫解放時には、鮮血が一気に供給されるため、血液中に含まれる酸素と結合しオキシヘモグロビンとなる。
【００４０】
サンプルＳを可動ステージ１上に載置し、この可動ステージを１ｍｍ／分で移動させ、白黒ＣＣＤカメラ５と同期を取ってサンプルＳの表面の２次元位置情報と波長情報を採取した。このとき、対物レンズたるレンズ３ｂは、１０倍のものを用いた。
【００４１】
なお、血液中に含まれるヘモグロビンは、酸素と結合したオキシヘモグロビン（ｏｘｙｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）は５７７，５４０ｎｍの２本の吸収帯を持ち、酸素が外れたデオキシヘモグロビン（ｄｅｏｘｙｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）は５５５ｎｍに１本の吸収帯を持っている。
【００４２】
採取した２次元位置情報と波長情報としての分光スペクトルをもとに、コンピュータ６によって解析，画像処理してＲＧＢを算出し、サンプルＳの表面をカラーＲＧＢ画像で表示したものを図２２に示す。
【００４３】
図２２に示すＡ，Ｂの各点は、Ａはデオキシヘモグロビン量が多い動脈圧迫時、Ｂはオキシヘモグロビン量が多い動脈圧迫解放時を示すものである。
【００４４】
図２２で示したＡ，Ｂ各点における分光スペクトルを本発明のリアルタイム分光画像分析装置に記録されている画像分光情報より、瞬時に画像処理したものを図２３に示す。動脈圧迫時であるＡの吸収波長は、５５５ｎｍにピークを持つ分光スペクトルが観測された。一方、動脈圧迫解放時であるＢの吸収波長は、５４０，５７７ｎｍにピークを持つ分光スペクトルが観測された。この図２３の分光スペクトルは、デオキシヘモグロビン，オキシヘモグロビンの吸収帯と一致していることが確認できた。
【００４５】
以上のとおり、本発明のリアルタイム分光画像分析装置を用いて、オキシヘモグロビン，デオキシヘモグロビンの吸収波長を比較することで、血液中酸素量の変化を判断することができ、赤血球が存在している部位の診断を迅速に行うことができた。さらに、オキシヘモグロビン，デオキシヘモグロビンの吸収波長における単一波長の画像もコンピュータ６を用いて瞬時に表示することができ、赤血球が存在している部位を一目で確認することができた。
【００４６】
［実施例５］  本発明のリアルタイム分光画像装置を用いてＤＮＡの分析を行った。ＤＮＡ合成機上で蛍光色素を直接オリゴヌクレオチドの５′末端にカップリングさせる蛍光アミドダイトを用いる方法により、蛍光色素をＤＮＡ各塩基（アデニン，  チミン，シトシン，  グアニン）のプライマーに付加させた。蛍光色素は、ＦＡＭ（５′−カルボキシフルオレセイン）、ＨＥＸ（５′−ヘキサクロロフルオレセイン）、ＴＥＴ（５′−テトラクロロフルオレセイン）、ＮＥＤ（４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）を用いた。塩基ごとにこれらの異なる蛍光色素で標識されたＤＮＡサンプルをカバーガラス上にのせ、これをサンプルＳとして本発明のリアルタイム分光画像分析装置を用いて観測した。
【００４７】
塩基ごとに異なる蛍光色素で標識されたＤＮＡサンプルＳを可動ステージ１上に載置し、この可動ステージ１を１ｍｍ／分で駆動させ、白黒ＣＣＤカメラ５と同期を取ってサンプルＳの表面の２次元位置情報と波長情報を採取した。
【００４８】
なお、蛍光色素のＦＡＭは５２５ｎｍに、ＨＥＸは５５６ｎｍに、ＴＥＴは５３６ｎｍに、ＮＥＤは５６０ｎｍにそれぞれ吸収のピークを持っている。
【００４９】
サンプルＳから得られた２次元位置情報と波長情報としての分光スペクトルをもとに、コンピュータ６によって解析，画像処理してＲＧＢを算出し、サンプルＳの表面をカラーＲＧＢ画像で表示した。また、本発明のリアルタイム分光画像分析装置を用いたことで、コンピュータ６による画像処理を利用してサンプルＳ上の分光スペクトルを瞬時に表示することができた。ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＮＥＤの蛍光色素で標識されたそれぞれのＤＮＡサンプルＳにおける、分光スペクトルを画像処理したものをそれぞれ図２４〜図２８に示す。図２４は蛍光色素ＦＡＭで標識されたＤＮＡサンプルの分光スペクトル，図２５は蛍光色素ＨＥＸで標識されたＤＮＡサンプルの分光スペクトル，図２６は蛍光色素ＴＥＴで標識されたＤＮＡサンプルの分光スペクトル，図２７は蛍光色素ＮＥＤで標識されたＤＮＡサンプルの分光スペクトルを示した図である。図２８は、異なる蛍光色素で標識されたＤＮＡサンプルのそれぞれの分光スペクトルと、４種の蛍光色素を混合したＤＮＡサンプルの分光スペクトルを示した図である。これらの分光スペクトルは、各蛍光色素の吸収波長と完全に一致していることが確認できた。
【００５０】
以上のとおり、本発明のリアルタイム分光画像分析装置を用いることによって、複数種の蛍光標識されたＤＮＡを観測することができた。
【００５１】
また、本発明は蛍光標識されたＤＮＡの分析のみならず、タンパク質の分析にも同様に適応することができる。
【００５２】
以上のように、本発明のリアルタイム分光画像分析装置は、サンプルＳを載置する可動ステージ１と、前記サンプルＳの表面に白色光を照射する光源２と、前記白色光が前記サンプルＳの表面に反射して生じた反射光の１ライン上の領域を１度に分光する分光器４と、この分光器４によって前記反射光から分光された分光スペクトルを１次元位置情報と波長情報として１フレームに取り込む白黒ＣＣＤカメラ５と、この白黒ＣＣＤカメラ５で取り込まれた前記１次元位置情報と前記波長情報を記憶，解析，画像処理するとともに前記白黒ＣＣＤカメラ５のフレーム単位で前記可動ステージ１を１軸動作させるコンピュータ６とを備えたものである。
【００５３】
上記構成によれば、サンプルＳの２次元の位置情報と波長情報を同時にかつリアルタイムに分光画像として測定することができ、確実かつ迅速な診断用の測定が可能になる。また、癌組織部位や動脈硬化部位などの疾患部位の分析観測に用いることにより、全面的な疾患部位の分布状態をリアルタイムで測定することができる。また、ＲＧＢのフィルタを用いることなく、生の波長で瞬時にスペクトル分布データを得ることができるので、従来のカラーセンサーなどとは異なり、正確な分光情報を得ることができる。
【００５４】
本発明のリアルタイム分光画像分析方法は、サンプルＳの表面の複数の１ライン上の領域をそれぞれ１度に分光した分光スペクトルを１次元位置情報と波長情報として取り込み、これら１次元位置情報と波長情報から２次元位置情報と波長情報を得るものである。
【００５５】
上記構成によれば、サンプルＳの２次元の位置情報と波長情報を同時にかつリアルタイムに分光画像として測定することができ、確実かつ迅速な診断用の測定が可能になる。
【００５６】
また、本発明のリアルタイム分光画像分析方法は、前記サンプルＳは蛍光標識された生体分子たるＤＮＡや蛋白質であることを特徴とする。
【００５７】
上記構成によれば、蛍光標識されたＤＮＡや蛋白質の２次元の位置情報と波長情報を同時にかつリアルタイムに分光画像として測定することができ、確実かつ迅速な診断用の測定が可能になる。
【００５８】
また、光電倍増管５ａを用いることにより、光の照度が暗いサンプルであっても鮮明な分光画像を得ることができる。
【００５９】
なお、本発明は上記の実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内において種々の変形実施が可能である。例えば、診断以外にも色彩や化学組成などに関連する画像認識など、多様な用途にも用いることができる。また、診断用の内視鏡に本発明のリアルタイム分光画像分析装置を組み込んでもよい。
【００６０】
【発明の効果】
本発明のリアルタイム分光画像分析装置は、サンプルを載置する可動ステージと、前記サンプルの表面に白色光を照射する光源と、前記白色光が前記サンプルの表面に反射して生じた反射光の１ライン上の領域を１度に分光する分光器と、この分光器によって前記反射光から分光された分光スペクトルを１次元位置情報と波長情報として１フレームに取り込む白黒ＣＣＤカメラと、この白黒ＣＣＤカメラで取り込まれた前記１次元位置情報と前記波長情報を記憶，解析，画像処理するとともに前記白黒ＣＣＤカメラのフレーム単位で前記可動ステージを１軸動作させるコンピュータとを備えたものであり、サンプルの２次元の位置情報と波長情報を同時にかつリアルタイムに分光画像として測定することができ、確実かつ迅速な診断用の測定が可能になる。また、癌組織部位や動脈硬化部位などの疾患部位の分析観測に用いることにより、全面的な疾患部位の分布状態をリアルタイムで測定することができる。また、ＲＧＢのフィルタを用いることなく、生の波長で瞬時にスペクトル分布データを得ることができるので、正確な分光情報を得ることができる。
【００６１】
本発明のリアルタイム分光画像分析方法は、サンプルの表面の１ライン上の領域をそれぞれ１度に分光した分光スペクトルを１次元位置情報と波長情報として取り込み、１軸位置移動したこれら１次元位置情報と波長情報から２次元位置情報と波長情報を得るものであり、サンプルの２次元の位置情報と波長情報を同時にかつリアルタイムに分光画像として測定することができ、確実かつ迅速な診断用の測定が可能になる。
【００６２】
本発明のリアルタイム分光画像分析方法は、前記サンプルは蛍光標識された生体分子であり、蛍光標識された生体分子の２次元の位置情報と波長情報を同時にかつリアルタイムに分光画像として測定することができ、確実かつ迅速な診断用の測定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のリアルタイム分光画像分析装置の一実施例を示す概略図である。
【図２】同上、分光器の基本構成を示す説明図である。
【図３】同上、１ラインの分光像の例である。
【図４】同上、分光スペクトルの例である。
【図５】同上、マウスの癌組織の測定例においてサンプルの表面を示す画像である。
【図６】同上、サンプル上の複数の点の分光スペクトルを示すグラフである。
【図７】同上、図６のＡのデータを透過率１として補正したグラフである。
【図８】同上、波長４２５ｎｍでのサンプルの表面を示す画像である。
【図９】同上、波長５０５ｎｍでのサンプルの表面を示す画像である。
【図１０】同上、波長５３５ｎｍでのサンプルの表面を示す画像である。
【図１１】同上、波長６００ｎｍでのサンプルの表面を示す画像である。
【図１２】同上、別の癌組織の測定例においてサンプルの表面を示す画像である。
【図１３】同上、図１２のＡ点の分光スペクトルを示すグラフである。
【図１４】同上、図１２のＡ点の分光スペクトルを基準にしたＢ点の分光スペクトルを示すグラフである。
【図１５】同上、図１２のＡ点の分光スペクトルを基準にしたＣ点の分光スペクトルを示すグラフである。
【図１６】同上、波長４６０ｎｍでのサンプルの表面を示す画像である。
【図１７】同上、波長５００ｎｍでのサンプルの表面を示す画像である。
【図１８】同上、波長５６０ｎｍでのサンプルの表面を示す画像である。
【図１９】同上、波長６００ｎｍでのサンプルの表面を示す画像である。
【図２０】同上、波長６５０ｎｍでのサンプルの表面を示す画像である。
【図２１】同上、波長７００ｎｍでのサンプルの表面を示す画像である。
【図２２】同上、手の甲のヘモグロビン変化の測定例においてサンプルの表面を示す画像である。
【図２３】同上、図２２の分光スペクトルを示すグラフである。
【図２４】同上、蛍光色素ＦＡＭで標識されたＤＮＡサンプルの分光スペクトルを示すグラフである。
【図２５】同上、蛍光色素ＨＥＸで標識されたＤＮＡサンプルの分光スペクトルを示すグラフである。
【図２６】同上、蛍光色素ＴＥＴで標識されたＤＮＡサンプルの分光スペクトルを示すグラフである。
【図２７】同上、蛍光色素ＮＥＤで標識されたＤＮＡサンプルの分光スペクトルを示すグラフである。
【図２８】同上、異なる蛍光色素で標識されたＤＮＡサンプルのそれぞれの分光スペクトルと、４種の蛍光色素を混合したＤＮＡサンプルの分光スペクトルを示した図である。
【符号の説明】
１  可動ステージ
２  光源
４  分光器
５  白黒ＣＣＤカメラ
６  コンピュータ
Ｓ  サンプル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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