(57)【要約】【課題】環境ストレス条件（土壌水分過剰条件、土壌乾燥条件、高温度条件、低温度条件、土壌高塩濃度条件などの過酷な栽培環境）において、植物種子の発芽を向上させ、安定的に植物を栽培できる方法を提供する。【解決手段】環境ストレス条件における土壌に植物種子を播種して栽培する方法において、使用する種子に、エンテロバクター・クロアカに属する細菌の付着処理を施すようにすることにより課題を解決する。環境ストレス条件下で優れた発芽向上効果を有するエンテロバクター・クロアカに属する細菌として、エンテロバクター・クロアカ　ＳＭ１０株を提供する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境ストレス条件における土壌に植物種子を播種して栽培する方法であって、使用する種子に、エンテロバクター・クロアカに属する細菌の付着処理が施されていることを特徴とする植物の栽培方法。
【請求項２】
前記細菌は、環境ストレス条件において発芽率向上効果を有することを特徴とする、請求項１に記載の栽培方法。
【請求項３】
前記細菌は、エンテロバクター・クロアカ　ＳＭ１０株であることを特徴とする、請求項１または２に記載の栽培方法。
【請求項４】
エンテロバクター・クロアカ　ＳＭ１０株の付着処理が施された種子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の栽培方法に関し、詳細には、環境ストレス条件（土壌水分過剰条件、土壌乾燥条件、高温度条件、低温度条件、土壌高塩濃度条件などの過酷な栽培環境）において種子の発芽率向上効果を有する細菌を用いて、植物を安定して発芽させ栽培する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、環境への負荷に配慮した環境保全型農業の推進が強く求められている。そのような状況の中で、化学肥料や化学合成農薬の使用を抑えること等を目的に、有用微生物を農作物栽培に応用する試みが積極的に行われている。その試みの具体的な目的としては、植物生育促進、病害虫防除や雑草防除などが挙げられる。例えば、植物生育促進に関しては以下の特許文献１が、病害虫防除に関しては以下の非特許文献１が挙げられる。また、以下の特許文献２〜８には、化学薬品等を用いて種子の発芽率を向上することが記載されている。
【０００３】
【特許文献１】
特公平６−５５０６８号公報
【特許文献２】
特公平８−７０６２５号公報
【特許文献３】
特公平８−７０６２６号公報
【特許文献４】
特開２００１−１０号公報
【特許文献５】
特開２０００−２３６７０８号公報
【特許文献６】
特開２０００−１３５００５号公報
【特許文献７】
特開２００２−１９１２０５号公報
【特許文献８】
特開２００１−１７８２１０号公報
【非特許文献１】
津田ら，ジャーナル　オブ　ジェネラル　プラント　パソロジー，２００１年，第６７号，ｐ７８−８４（Ｔｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　６７：７８−８４　（２００１）　）
【０００４】
特許文献１には、植物の生長促進作用を有する細菌のエンテロバクター・クロアカを用いて、この細菌を塗布された農作物の種子を播種し、或いは土壌に混入させた後に種子を播種して、農作物の栽培する方法が開示されている。そしてこの方法により、農作物の根や茎葉部の生長が促進されて栽培効率が高められることが確かめられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、特許文献１では、農作物の草丈や重量が増加する「生長促進作用」を確認しているに過ぎず、植物の種子の発芽に及ぼす作用については明らかにされていない。植物種子の発芽は、温度、土壌中の水分量および塩濃度などの栽培環境に強く影響されることが知られている。例えば、温暖化の進行した高温の地域、肥料の過剰施用や高塩濃度の灌漑水により塩類の蓄積された土壌、或いは砂漠や低湿地などの水分調節の困難な土壌では植物種子の発芽は著しく阻害される。また、そのような特別な地域や土壌に限らず、一般の栽培圃場でも不適切な栽培管理によって栽培環境が悪化し、発芽阻害が引き起こされる。これらの発芽阻害は生育株数の減少を招き、結果として植物の収量の著しい減少を引き起こすこととなる。
【０００６】
また、植物種子の発芽率を向上する方法として、特許文献２〜４には、酸や植物ホルモンなどの化学薬品を種子に処理する方法が、特許文献５および６には、粘土系鉱物や高吸水性樹脂などを種子にコートする方法が、特許文献７および８には、種子に物理的な処理をする方法が記載されている。しかしながら、発明者の見る限りにおいて、有用微生物を利用して種子の発芽率を向上する方法に関する報告はない。本発明は、このような厳しい栽培環境条件において植物種子の発芽率を向上する細菌を用いることにより、その栽培環境条件での植物の栽培を可能とする方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の課題を解消すべく鋭意検討を重ねた結果、環境ストレス条件（土壌水分過剰条件、土壌乾燥条件、高温度条件、低温度条件、土壌高塩濃度条件などの過酷な栽培環境）では、従来より目安とされてきた根等の生長促進とは異なる作用である種子の発芽率向上作用が重要であることに着目することで上記の課題が解消できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、環境ストレス条件における土壌に植物種子を播種して栽培する方法であって、使用する種子に、エンテロバクター・クロアカに属する細菌の付着処理が施されていることを特徴するものである。ここで、「環境ストレス条件」とは、植物栽培を行う上で一般的に好適と判断される条件よりも過酷な環境条件を意味し、土壌水分過剰、土壌乾燥、土壌高塩濃度または高温度などの条件をさす。
植物の種類によりその範囲は異なるが、例えばホウレンソウの場合、土壌水分過剰条件として、土壌水分が圃場容水量の約１００％以上の条件が挙げられる。土壌乾燥条件として、土壌水分が圃場容水量の約６０％以下の条件が挙げられる。土壌高塩濃度条件として、灌漑水の塩化ナトリウム濃度が約３００ｍＭ以上の条件が挙げられる。さらに、高温度条件として、約３０℃以上の条件が挙げられる。しかしながら、これらの条件範囲に限定されるものではない。
【０００９】
エンテロバクター・クロアカが付着処理された種子は、例えばエンテロバクター・クロアカの細菌懸濁液を種子に浸漬処理することで得られる。処理に用いる細菌懸濁液の菌密度は、１０７　〜１０１１（個／ｍｌ）が好ましく、特に１０９　〜１０１１（個／ｍｌ）がより好ましい。
【００１０】
また、本発明は、上述の栽培方法において、前記細菌が環境ストレス条件において発芽率向上効果を有することを特徴とする方法である。ここで、「環境ストレス条件において発芽率向上効果を有する」とは、上記条件の土壌や温度において植物種子を播種した場合にその発芽率が対照となる種子と比較して有意に高められていることを意味する。
【００１１】
さらに、本発明は上述の栽培方法において用いる好ましい細菌として、エンテロバクター・クロアカ　ＳＭ１０株が挙げられる。
【００１２】
また本発明は、環境ストレス条件において発芽率向上効果を有するエンテロバクター・クロアカ　ＳＭ１０株の付着処理が施された種子に関するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明の発芽安定化方法においては、環境ストレス条件下で発芽率向上効果を有するエンテロバクター・クロアカに属する菌であれば特に限定されず、自然界からのスクリーニングで選択された菌株でも、このような菌株から誘導された変異株でも、細胞融合で得られた菌株でも、遺伝子組み換えなどの遺伝子操作によって得られた菌株であってもよい。とりわけ、これらのエンテロバクター・クロアカのうち、本発明の微生物であるエンテロバクター・クロアカ　ＳＭ１０株が好ましい株として挙げられる。
【００１４】
本発明による細菌の具体例であるエンテロバクター・クロアカ　ＳＭ１０株（以下では単にＳＭ１０株と省略して記載する場合もある）は、京都府船井郡瑞穂町内で栽培されていたホウレンソウ（品種　アクティブ）の根内部から分離されたものである。
【００１５】
ＳＭ１０株はホウレンソウの根内部に生息する植物内生菌であり、ホウレンソウ萎凋病を防除する作用を有する細菌として選抜された菌株である（非特許文献１）。
本発明によるＳＭ１０株の細菌学的性質は表１に示されるとおりであった。
【００１６】
【表１】
2004113176.tif 000002
【００１７】
以上の細菌学的性質から、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ．　１　（１９８４）　　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ社の記載に基づき検索したところ、ＳＭ１０株はエンテロバクター・クロアカに属する菌株であると同定した。
【００１８】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の参考例及び実施例にのみ限定されるものではない。
【００１９】
参考例１：　エンテロバクター・クロアカの培養
５００ｍｌ容三角フラスコにＬＢ液体培地（培地１リットル当たり　トリプトン１０ｇ、酵母エキス５　ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ含有）２００ｍｌを添加し、１　２１　℃、１５分間殺菌する。室温に冷却後、エンテロバクター・クロアカ　ＳＭ１０株を植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍ　、２４時間培養する。
【００２０】
参考例２：　エンテロバクター・クロアカの細菌懸濁液の調整
培養した培養液を７０００ｒｐｍ　、１０分間遠心分離した後、上清を捨てる。沈殿を滅菌蒸留水で懸濁して洗浄した後、７０００ｒｐｍ　、１０分間遠心分離して上清を捨てる。この洗浄操作を３回繰り返した後、沈殿を滅菌蒸留水で懸濁し所定の菌密度に調整し、細菌懸濁液として供試した。
【００２１】
実施例１：土壌水分過剰条件下でのホウレンソウの発芽率向上効果
滅菌した育苗用培土（粒状園芸培土　クレハ製）１００ｇを充填したプラスチックカップ（容量５００　ｍｌ）にホウレンソウ種子（品種名　おかめ）１０粒を播種し、同じ培土１００ｇで覆土した。カップ内の土壌水分がそれぞれ圃場容水量の８０、１００、１１０、１２０％になるように蒸留水を潅水して調整した。蒸散を抑えるためにラップしたのち、生育適温である２２℃の人工気象器内で育成し、播種１週間後に発芽率を調査した。各区１０反復とした。
実験区は以下のとおりとした。
対照区：滅菌蒸留水に２２℃、２４時間浸漬処理したホウレンソウ種子を用いた。
ＳＭ１０株処理区（実施例１）：上記の参考例に基づいて調整されたエンテロバクター・クロアカＳＭ１０株の細菌懸濁液（１０１１個／ｍｌ　）に２２℃、２４時間浸漬処理したホウレンソウ種子を用いた。
【００２２】
結果を表２に示す。土壌水分が発芽に適した圃場容水量の８０％の場合、対照区の発芽率は８３％、実施例１のＳＭ１０株処理区の発芽率は８４％であり、両者に差はなかった。土壌水分が圃場容水量の１００、１１０、１２０％と過剰状態になるに従って、対照区の発芽率は５９、２４、１８％と著しく低下した。一方、実施例１のＳＭ１０株処理区の発芽率は８７、８２、７２％と対照区より有意に高く、エンテロバクター・クロアカを種子処理することによって土壌水分過剰条件下での発芽率を向上することが出来た。
【００２３】
【表２】
2004113176.tif 000003
【００２４】
実施例２：土壌乾燥条件下でのホウレンソウの発芽率向上効果
実施例１に記載の方法と同様に、プラスティックカップにホウレンソウを播種して覆土した。土壌水分が圃場容水量の４０、５０、６０％になるように蒸留水を潅水してラップした。実験区は実施例１と同様に設定し、ＳＭ１０株処理区のものを実施例２として、潅水後のホウレンソウの育成及び発芽調査を実施例１に準じて行った。
【００２５】
結果を表３に示す。土壌水分が圃場容水量の６０、５０、４０％と乾燥状態になるにしたがって、対照区の発芽率は７５、５８、５１％と低下した。一方、実施例２のＳＭ１０株処理区の発芽率は８８、８６、７０％と対照区より有意に高く、エンテロバクター・クロアカを種子処理することによって土壌乾燥条件下での発芽率を向上することが出来た。
【００２６】
【表３】
2004113176.tif 000004
実施例３：高温度条件下でのホウレンソウの発芽率向上効果
実施例１に記載の方法と同様に、プラスティックカップにホウレンソウを播種して覆土した。土壌水分が圃場容水量の８０％になるように蒸留水を潅水してラップした後、３０℃の人工気象器内で育成し、播種一週間後に発芽調査を行なった。実験区は実施例１と同様に設定し、ＳＭ１０株処理区のものを実施例３として、潅水後のホウレンソウの育成及び発芽調査を実施例１に準じて行った。
【００２７】
結果を表４に示す。育成温度が生育適温より高い３０℃の場合には実施例３のＳＭ１０株処理区の発芽率は対照区よりも高く、エンテロバクター・クロアカを種子処理することにより高温度条件下での発芽率を向上することが出来た。
【００２８】
【表４】
2004113176.tif 000005
【００２９】
実施例４：土壌高塩濃度条件下でのホウレンソウの発芽率向上効果
実施例１に記載の方法と同様に、プラスティックカップにホウレンソウを播種した。土壌水分が圃場容水量の８０％になるように、蒸留水又は３００ｍＭ　の塩化ナトリウム溶液を潅水した。潅水後のホウレンソウの育成、及び発芽調査は実施例１に準じた。実験区は実施例１と同様に設定し、ＳＭ１０株処理区のものを実施例４として、潅水後のホウレンソウの育成及び発芽調査を実施例１に準じて行った。
【００３０】
結果を表５に示す。蒸留水を潅水した場合、ＳＭ１０株処理区と対照区の発芽率はそれぞれ８４、８３％と差がなかった。しかし、３００ｍＭ　塩化ナトリウム溶液を潅水した場合には、対照区の発芽率は４７％と著しく低かった。一方、実施例４のＳＭ１０株処理区の発芽率は６７％と対照区より有意に高く、エンテロバクター・クロアカを種子処理することにより土壌高塩濃度条件下での発芽率を向上することが出来た。
【００３１】
【表５】
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【００３２】
実施例５：ホウレンソウの発芽率向上効果におけるエンテロバクター・クロアカＳＭ１０株の処理菌密度の検討
１０７　、１０８　、１０９　、１０１０、１０１１（個／ｍｌ）の菌密度に調整したエンテロバクター・クロアカＳＭ１０株の細菌懸濁液に２２℃、２４時間浸漬処理したホウレンソウ種子を、実施例１に記載の方法に準じ土壌水分を圃場容水量の１００％に調整したプラスティックカップに播種して育成した。対照区には同様の方法で滅菌蒸留水に浸漬処理したホウレンソウ種子を用いた。播種１週間後に各菌密度処理区における発芽率を調査した。また、同じホウレンソウ種子を滅菌蒸留水で湿らせたろ紙を敷いたシャーレ内に播種して２２℃の恒温器内で育成し、２日後に根長を調査した。
【００３３】
結果を表６に示す。実施例５によるエンテロバクター・クロアカＳＭ１０株の処理菌密度が１０７　〜１０１１（個／ｍｌ）において土壌水分過剰条件下での発芽率向上効果が認められ、特に１０９　〜１０１１（個／ｍｌ）処理での効果が顕著であった。一方、エンテロバクター・クロアカＳＭ１０株を処理したホウレンソウの根の初期生長は抑制されており、エンテロバクター・クロアカ処理による土壌水分過剰条件下での発芽率向上効果は、生長促進作用とは異なることが認められた。
【００３４】
【表６】
2004113176.tif 000007
【００３５】
実施例６：４菌株のエンテロバクター・クロアカによるホウレンソウの発芽率向上効果
エンテロバクター・クロアカ　ＦＥＲＭ　ＢＰ−１５２９株（特許文献１）、理化学研究所微生物系統保存施設が保存するエンテロバクター・クロアカの標準菌株　ＪＣＭ１２３２株、財団法人発酵研究所が保存するエンテロバクター・クロアカの標準菌株　ＩＦＯ３３２０株及び本発明のエンテロバクター・クロアカ　ＳＭ１０株の各細菌懸濁液（１０１１個／ｍｌ）に２２℃、２４時間浸漬処理したホウレンソウ種子を、実施例１に記載した方法に準じ土壌水分を圃場容水量の１００％に調整したプラスティックカップに播種して育成した。播種１週間後にそれぞれの発芽率を調査した。対照区には同様の方法で滅菌蒸留水に浸漬処理したホウレンソウ種子を用いた。また、同じホウレンソウ種子を滅菌蒸留水で湿らせたろ紙を敷いたシャーレ内に播種して２２℃の恒温器内で育成し、２日後に根長を調査した。
【００３６】
結果を表７に示す。　　ＦＥＲＭ　ＢＰ‐１５２９株、ＪＣＭ１２３２株、ＩＦＯ３３２０株、ＳＭ１０株のいずれにおいても、土壌水分過剰条件下での発芽率向上効果が認められた。４菌株のいずれもホウレンソウの根の初期生長を抑制していた。また、各区の未発芽種子は土壌中で発根していないことが認められた。以上のことから、エンテロバクター・クロアカ処理による土壌水分過剰条件下での発芽率向上効果は、ＳＭ１０株に限定されない多くのエンテロバクター・クロアカが示す効果であることが認められた。また、生長促進効果を示すＦＥＲＭ　ＢＰ‐１５２９株を含め供試した４菌株はいずれもホウレンソウの根の初期生長を抑制していたことから、発芽率向上効果は生長促進作用とは異なることが認められた。
【００３７】
【表７】
2004113176.tif 000008
【００３８】
実施例７：土壌高塩濃度条件下でのキュウリの発芽率向上効果
滅菌した育苗用培土（粒状園芸培土　クレハ製）１００ｇを充填したプラスチックカップ（容量５００ｍｌ）にキュウリ種子（品種名　南極一号）３粒を播種し、同じ培土１００ｇで覆土した。土壌水分が圃場容水量の８０％になるように、蒸留水又は１００、１５０ｍＭ　の塩化ナトリウム溶液を潅水した。蒸散を抑えるためにラップして生育適温である２５℃の人工気象機器内で育成し、播種１週間後に発芽率を調査した。各区１０反復とした。
実験区は以下のとおりである。
対照区：滅菌蒸留水に２５℃、２４時間浸漬処理したキュウリ種子を用いた。
ＳＭ１０株処理区（実施例７）：参考例に基づいて調整されたエンテロバクター・クロアカ　ＳＭ１０株の細菌懸濁液（１０１１個／ｍｌ　）に２５℃、２４時間浸漬処理したキュウリ種子を用いた。
【００３９】
結果を表８に示す。蒸留水を潅水した場合、対照区と実施例７のＳＭ１０株処理区の発芽率に差はなかった。しかし、塩化ナトリウム溶液を潅水した場合、その濃度が高まるにしたがって対照区の発芽率は５３、７％と著しく低下した。一方、ＳＭ１０株処理区の発芽率は９０、６７％と対照区より有意に高く、エンテロバクター・クロアカの種子処理による土壌高塩濃度条件下でのキュウリの発芽率向上効果が認められた。
【００４０】
【表８】
2004113176.tif 000009
【００４１】
実施例８：土壌水分過剰条件下でのニンジンの発芽率向上効果
滅菌した育苗用培土（粒状園芸培土　クレハ製）１００ｇを充填したプラスチックカップ（容量５００　ｍｌ）にニンジン種子（品種名　夏蒔鮮紅五寸）１０粒を播種し、同じ培土１００ｇで覆土した。カップ内の土壌水分がそれぞれ圃場容水量の８０、１４５％になるように蒸留水を潅水して調整した。蒸散を抑えるためにラップして生育適温である２２℃の人工気象器内で育成し、播種１週間後に発芽率を調査した。各区１０反復とした。
実験区は以下のとおりである。
対照区：滅菌蒸留水に２２℃、２４時間浸漬処理したニンジン種子を用いた。
ＳＭ１０株処理区（実施例８）：上述の参考例に基づいて調整されたエンテロバクター・クロアカＳＭ１０株の細菌懸濁液（１０１１個／ｍｌ　）に２２℃、２４時間浸漬処理したニンジン種子を用いた。
【００４２】
結果を表９に示す。土壌水分が圃場容水量の８０％の場合には、対照区の発芽率が９１％、ＳＭ１０株の発芽率が８８％と差がなかった。土壌水分過剰状態である１４５％では対照区の発芽率が７％であるのに対し、実施例８のＳＭ１０株処理区の発芽率は２０％であり、エンテロバクター・クロアカの種子処理による土壌水分過剰条件下でのニンジンの発芽率向上効果が認められた。
【００４３】
【表９】
2004113176.tif 000010
【００４４】
実施例９：土壌水分過剰条件下でのコムギの発芽率向上効果
滅菌した育苗用培土（粒状園芸培土　クレハ製）１００ｇを充填したプラスチックカップ（容量５００ｍｌ）にコムギ種子（品種名　農林６１号）１０粒を播種し、同じ培土１００ｇで覆土した。カップ内の土壌水分がそれぞれ圃場容水量の８０、１５０％になるように蒸留水を潅水して調整した。蒸散を抑えるためにラップして生育適温である２２℃の人工気象器内で育成し、播種１週間後に発芽率を調査した。各区１０反復とした。
実験区は以下のとおりである。
対照区：滅菌蒸留水に２２℃、２４時間浸漬処理したコムギ種子を用いた。
ＳＭ１０株処理区（実施例９）：上述の参考例に基づいて調整されたエンテロバクター・クロアカＳＭ１０株の細菌懸濁液（１０１１個／ｍｌ　）に２２℃、２４時間浸漬処理したコムギ種子を用いた。
【００４５】
結果を表１０に示す。土壌水分が発芽に適した圃場容水量の８０％の場合には、対照区とＳＭ１０株処理区の発芽率には有意な差がなかった。土壌水分が過剰な１５０％では、対照区の発芽率は著しく低下したが、実施例９のＳＭ１０株処理区の発芽率は対照区よりも大幅に高く、エンテロバクター・クロアカの種子処理による土壌水分過剰条件下でのコムギの発芽率向上効果が認められた。
【００４６】
【表１０】
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【００４７】
なお、本発明は上述した実施例には限られない。例えば、上記の植物以外の花卉類、飼料作物、緑化植物などに本発明の栽培方法を適用することも可能である。さらに、例えばエンテロバクター・クロアカを直接土壌に処理したり、エンテロバクター・クロアカで処理した資材を土壌中に混入して種子を播種して栽培するようにしても構わない。
【００４８】
【発明の効果】
以上詳述したように、エンテロバクター・クロアカを用いた本発明の栽培方法によれば、環境ストレス条件（土壌水分過剰条件、土壌乾燥条件、高温度条件、低温度条件、土壌高塩濃度条件などの過酷な栽培環境）での種子の発芽率を有意に向上させることが可能である。したがって、植物の栽培が一般的に困難とされる過酷な環境においても、植物を安定して発芽させ栽培できるという効果を奏する。