(57)【要約】【課題】効率的で安価に天然型のＲ−メバロン酸を製造することができる方法を提供すること。【解決手段】メバロン酸を製造するに際して、メバロン酸経路を有しない宿主に対して、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の２種類を導入した該宿主を形質転換体とし、該形質転換体の細胞中に、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素蛋白質及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素蛋白質を生成させ、これらの酵素蛋白質の機能によりメバロン酸を生成、蓄積させることを特徴とする新規なメバロン酸の製造方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メバロン酸を製造するに際して、メバロン酸経路を有しない宿主に対して、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の２種類で形質転換して該宿主を形質転換体とし、該形質転換体の細胞中に、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素蛋白質及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素蛋白質を生成させ、これらの酵素蛋白質の機能によりメバロン酸を生成、蓄積させることを特徴とする新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項２】
上記宿主が、微生物である請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項３】
上記微生物が、放線菌である請求項２記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項４】
上記放線菌が、ストレプトマイセス  リビダンスである請求項３記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項５】
上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子が、放線菌由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子である請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項６】
放線菌由来の上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子が、ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子である請求項５記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項７】
上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子が、放線菌由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子である請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項８】
放線菌由来の上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子が、ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子である請求項７記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項９】
上記宿主が放線菌であり、該放線菌に対して、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の２種類で形質転換する際に、プラスミドベクターを用いる請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項１０】
上記プラスミドベクターが、大腸菌とのシャトルベクターである請求項９記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項１１】
宿主である放線菌ストレプトマイセス  リビダンス  ＴＫ２３株に対して、放線菌ストレプトマイセスｓｐ．  ＣＬ１９０株由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の２種類を組込んだプラスミドベクターｐＳＥＭＶ３４で形質転換して得たストレプトマイセス  リビダンス  ３４−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２０）又は３４−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２１）を培養することにより、培養液中にメバロン酸を生成、蓄積させることを特徴とする新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項１２】
宿主である放線菌ストレプトマイセス  リビダンス  ＴＫ２３株に対して、放線菌ストレプトマイセスｓｐ．  ＣＬ１９０株由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の２種類を組込んだプラスミドベクターｐＳＥＭＶ３５で形質転換して得たストレプトマイセス  リビダンス  ３５−６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２２）を培養することにより、培養液中にメバロン酸を生成、蓄積させることを特徴とする新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項１３】
メバロン酸経路を有しない宿主に対して、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の２種類で形質転換した形質転換体。
【請求項１４】
放線菌ストレプトマイセス  リビダンス  ３４−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２０）、３４−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２１）又は３５−６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２２）である請求項１３記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な天然型のメバロン酸の製造方法に関する。本発明のメバロン酸の製造方法により得られるメバロン酸は、主に医薬・化粧品・食品分野等、メバロン酸の生理活性が活用される分野で有用であり、また、メバロン酸を利用した各種有用化合物の合成に用いられる中間体としても有用である。
【０００２】
【従来の技術】
メバロン酸は、重要な生理活性物質群であり多くの生命維持に必須のテルペノイドと呼ばれる物質群の生合成中間体である、天然型のＲ−メバロン酸と、非天然型であるＳ−メバロン酸とが知られている。多くの場合、発酵法では天然型が得られ、化学合成方法では天然型及び非天然型の等量混合物であるラセミ体が得られる。また、メバロン酸は、無水状態では容易に脱水して分子内エステル化（ラクトン化）してメバロノラクトンとなるが、水溶液ないしアルカリ水溶液中で容易に水と反応してメバロン酸ないしメバロン酸塩となる。
【０００３】
メバロン酸の発酵生産方法としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａを用いる方法（特許文献１参照）、培地成分としてカゼイン由来のペプトン及びコーン  スティープ  リカーを用いる方法（特許文献２参照）、ＭＬ−２３６Ｂに耐性を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａを用いる方法（特許文献３参照）等が知られている。しかし、これらの方法で用いられる菌株は、すべてメバロン酸経路を生命維持に利用している生物であることが既に知られており、この経路により下記の有用物質（テルペノイド）等を生合成する必要があることから、人為的にメバロン酸経路をメバロン酸合成のためだけに働かせることは事実上不可能である。
【０００４】
テルペノイドは、炭素数５のイソプレン単位を基本骨格に持つ一群の有機化合物の総称であり、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の重合によって生合成される。（Ｃ５Ｈ８）ｎの不飽和炭化水素以外に、それらの酸化還元生成物（アルコール、ケトン、酸等）、炭素の脱離した化合物等が、多くの植物及び動物体内に見出されている。テルペノイドは、炭素数により、ヘミテルペン（Ｃ５）、モノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０、カロチノイド）及びその他のポリテルペンに分類することができる。アブシジン酸、幼若ホルモン、ジベレリン、フォルスコリン、ホルボール等、生理活性を示す化合物も多い。また、構造の一部にイソプレン構造を有する複合テルペンとして、クロロフィル、ビタミンＫ、ユビキノン、ｔＲＮＡ等があり、これらも有用な生理活性を示す。
【０００５】
例えば、テルペノイド化合物の一種であるユビキノンは、電子伝達系の必須成分として、生体内で重要な機能を果たしており、心疾患に効果のある医薬品として使用されているほか、欧米では健康食品としての需要が増大している。また、ビタミンＫは、血液凝固系に関与する重要なビタミンであり、止血剤として利用されているほか、最近では骨代謝への関与が示唆され、骨粗鬆症治療への応用が期待されており、フィロキノンとメナキノンは医薬品として許可されている。
また、ユビキノンやビタミンＫ類には、船体や橋脚等の建造物への貝類の付着阻害作用が在り、貝類付着防止塗料への応用が期待される。さらに、カロチノイドには抗酸化作用があり、β−カロチン、アスタキサンチン、クリプトキサンチン等、がん予防や免疫賦活活性を有するものとして期待されているものもある。
このように、テルペノイドには生体等にとって有用な物質が含まれているが、これらの化合物は全て基本骨格単位であるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を経由して生合成されることが知られている。
【０００６】
テルペノイド化合物の基本骨格であるＩＰＰは、動物や酵母等の真核生物ではアセチルＣｏＡからメバロン酸を経由して生合成されることが証明されている。
最近の研究から、生物には、テルペノイド生合成のために、全く異なる２種類の経路が存在することが明らかとなった。即ち、メバロン酸経路及び非メバロン酸経路である。
【０００７】
メバロン酸経路は、既に説明したように、動物や酵母等の真核生物に存在し、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（以下、ＨＭＧ  ＣｏＡと略記する）還元酵素が律速酵素であると考えられている（非特許文献１参照）。この観点から、酵母において、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素を高発現させて細胞内のメバロン酸レベルを上げることにより、カロチノイドの生産性を向上させる試みがなされている（非特許文献２参照）。
【０００８】
大腸菌等の多くの原核生物では、別の経路、即ちピルビン酸とグリセルアルデヒド−３−リン酸とが縮合して生じる１−デオキシ−Ｄ−キシルロース  ５−リン酸を経由してＩＰＰが生合成される非メバロン酸経路が発見されており（非特許文献３参照）、１３Ｃラベル化基質を使った実験から、１−デオキシ−Ｄ−エリスリトール  ４−リン酸を経由してＩＰＰへと転換されることが証明されている（非特許文献４及び５参照）。特に大腸菌では、ＩＰＰは非メバロン酸経路でのみ合成されることが実証されている（非特許文献６）。
【０００９】
一方、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株（非特許文献７参照）は、メバロン酸経由でＩＰＰを合成していることが分っており（非特許文献８及び９参照）、ＩＰＰを工業生産する可能性が記載されている（非特許文献１０参照）。本発明者等は、これまでに放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株からメバロン酸経路上の一つの反応を触媒する酵素であるＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子（ｈｍｇｒ）（非特許文献１１参照）、及びメバロン酸経路に関与する全ての酵素、即ちホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、メバロン酸キナーゼ、イソペンテニル  ２−リン酸イソメラーゼ、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素、全てを含む遺伝子クラスターを、既にクローニングした（特許文献４、非特許文献１２及び非特許文献１３参照）。
【００１０】
原核生物の菌体内や培養液中に天然型のＲ−メバロン酸が蓄積するという知見は、これまで報告がない。この理由は、多くの原核生物がＲ−メバロン酸の生合成酵素系を持たないためと考えられる。
【００１１】
このように、メバロン酸の発酵生産に関して、真核生物を利用して天然型のＲ−メバロン酸を生産することは従来から可能である。しかし、Ｒ−メバロン酸の生産の際には、Ｒ−メバロン酸を真核生物の細胞内又は細胞外に蓄積させる必要があるが、一方で、真核生物においては、メバロン酸は、生命維持に必要なテルペノイドの供給のために生合成され、テルペノイドへと変換されてしまう。即ち、蓄積と消費との綱引きとなるため、酵母等の真核生物を利用したＲ−メバロン酸の大量生産は、かなり困難な状況である。
【００１２】
さらに、メバロン酸合成酵素であるＨＭＧ  ＣｏＡ  還元酵素活性は、リン酸化、脱リン酸化等（活性化又は不活性化）による酵素活性調節や、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素の生合成の雛型であるｍＲＮＡ量の調節、生合成下流に位置する各種テルペノイドからの多価フィードバック調節等が複雑に関与することが知られており、単に真核生物のＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素活性を上げる手法によって天然型のＲ−メバロン酸の生産性を上げることは困難であった。
【００１３】
【特許文献１】
特開昭６３−２１６４８７号公報
【特許文献２】
特開平２−２１５３８９号公報
【特許文献３】
特開平３−２１０１７４号公報
【特許文献４】
特開２００１−１６１３７０号公報
【非特許文献１】
Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ，  ５，  ６５５  （１９９４）
【非特許文献２】
三沢ら、カロチノイド研究談話会講演要旨集  （１９９７）
【非特許文献３】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ，  ２９５，  ５１７  （１９９３）
【非特許文献４】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３８，  ４７６９  （１９９７）
【非特許文献５】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３９，  ４５０９  （１９９８）
【非特許文献６】
Ｒｏｈｍｅｒ，  Ｍ．  Ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．  ２：  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｏｉｄｓ；  Ｂａｒｔｏｎ，  Ｄ．  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，  Ｋ．  Ｅｄｓ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  １９９９；  ｐｐ．  ４５−６７
【非特許文献７】
Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔ．  ４３：  ４４４  （１９９０）
【非特許文献８】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３１：  ６０２５  （１９９０）
【非特許文献９】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３７：  ７９７９  （１９９６）
【非特許文献１０】
バイオサイエンスとインダストリー、５７（７）、４５５−４５８  （２００１）
【非特許文献１１】
Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８１：  １２５６  （１９９９）
【非特許文献１２】
Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８２：  ４１５３  （２０００）
【非特許文献１３】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ９８：  ９３２  （２００１）
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、効率的で安価に天然型のＲ−メバロン酸を製造することができる方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上述したように複雑に代謝調節を受けている真核生物であるカビや酵母のメバロン酸経路を利用して、天然型のＲ−メバロン酸を生産させるよりも、むしろ、生命維持に天然型のＲ−メバロン酸を必要としない原核生物に生産させることにより、天然型Ｒ−メバロン酸を効率的で安価に提供できる可能性があることに着眼し、検討を重ねた。その結果、メバロン酸経路を有しない宿主に対してＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子の２種類で形質転換することにより、天然型のＲ−メバロン酸を生産させ得ることを見出し、本発明に至った。
【００１６】
即ち、本発明（請求項１記載の発明）は、メバロン酸を製造するに際して、メバロン酸経路を有しない宿主に対して、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の２種類で形質転換して該宿主を形質転換体とし、該形質転換体の細胞中に、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素蛋白質及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素蛋白質を生成させ、これらの酵素蛋白質の機能によりメバロン酸を生成、蓄積させることを特徴とする新規なメバロン酸の製造方法を提供するものである。
【００１７】
また、本発明（請求項２記載の発明）は、上記宿主が、微生物である請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法を提供するものである。
また、本発明（請求項３記載の発明）は、上記微生物が、放線菌である請求項２記載の新規なメバロン酸の製造方法を提供するものである。
また、本発明（請求項４記載の発明）は、上記放線菌が、ストレプトマイセスリビダンスである請求項３記載の新規なメバロン酸の製造方法を提供するものである。
【００１８】
また、本発明（請求項５記載の発明）は、上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子が、放線菌由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子である請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法を提供するものである。
また、本発明（請求項６記載の発明）は、放線菌由来の上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子が、ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子である請求項５記載の新規なメバロン酸の製造方法を提供するものである。
また、本発明（請求項７記載の発明）は、上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子が、放線菌由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子である請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法を提供するものである。
また、本発明（請求項８記載の発明）は、放線菌由来の上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子が、ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子である請求項７記載の新規なメバロン酸の製造方法を提供するものである。
【００１９】
また、本発明（請求項９記載の発明）は、上記宿主が放線菌であり、該放線菌に対して、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の２種類で形質転換する際に、プラスミドベクターを用いる請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法を提供するものである。
また、本発明（請求項１０記載の発明）は、上記プラスミドベクターが、大腸菌とのシャトルベクターである請求項９記載の新規なメバロン酸の製造方法を提供するものである。
【００２０】
また、本発明（請求項１１記載の発明）は、宿主である放線菌ストレプトマイセス  リビダンス  ＴＫ２３株に対して、放線菌ストレプトマイセスｓｐ．  ＣＬ１９０株由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の２種類を組込んだプラスミドベクターｐＳＥＭＶ３４で形質転換して得たストレプトマイセス  リビダンス３４−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２０）又は３４−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２１）を培養することにより、培養液中にメバロン酸を生成、蓄積させることを特徴とする新規なメバロン酸の製造方法を提供するものである。
また、本発明（請求項１２記載の発明）は、宿主である放線菌ストレプトマイセス  リビダンス  ＴＫ２３株に対して、放線菌ストレプトマイセスｓｐ．  ＣＬ１９０株由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の２種類を組込んだプラスミドベクターｐＳＥＭＶ３５で形質転換して得たストレプトマイセス  リビダンス３５−６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２２）を培養することにより、培養液中にメバロン酸を生成、蓄積させることを特徴とする新規なメバロン酸の製造方法を提供するものである。
【００２１】
また、本発明（請求項１３記載の発明）は、メバロン酸経路を有しない宿主に対して、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の２種類で形質転換した形質転換体を提供するものである。
また、本発明（請求項１４記載の発明）は、放線菌ストレプトマイセス  リビダンス  ３４−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２０）、３４−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２１）又は３５−６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２２）である請求項１３記載の形質転換体を提供するものである。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のメバロン酸の製造方法は、Ａ）天然型のＲ−メバロン酸の生合成に関与する２種の酵素蛋白質をコードするＤＮＡを有する形質転換体の作製と、Ｂ）該酵素蛋白質をコードするＤＮＡを有する形質転換体での該酵素蛋白質の発現及びこれらの作用による天然型のＲ−メバロン酸の発酵生産よりなる。
【００２３】
まず、Ａ）天然型のＲ−メバロン酸の生合成に関与する２種の酵素蛋白質をコードするＤＮＡを有する形質転換体の作製について詳述する。
本発明のメバロン酸の製造方法では、天然型のＲ−メバロン酸の生合成に関与する酵素蛋白質をコードするＤＮＡとして、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子の２種類で形質転換することが必須である。
【００２４】
本発明のメバロン酸の製造方法において使用するＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、実質的にＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素蛋白質、即ちアセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡとからＨＭＧ  ＣｏＡを生成する反応を触媒する活性を持つ酵素蛋白質をコードするＤＮＡ配列であればよい。また、酵素反応にＮＡＤＰＨ等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
【００２５】
また、本発明のメバロン酸の製造方法において使用するＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、実質的にＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素蛋白質、即ちＨＭＧ  ＣｏＡからメバロン酸を生成する反応を触媒する活性を持つ酵素蛋白質をコードするＤＮＡ配列であればよい。また、酵素反応にＮＡＤＰＨ等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
【００２６】
上記ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及び上記ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、いずれも、メバロン酸経路を持つ生物に由来するものであればよく、放線菌等の微生物由来のもの、動物細胞由来のもの、植物細胞由来のもの等が挙げられるが、放線菌由来のものが好ましく、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のものが特に好ましい。
【００２７】
また、上記ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及び上記ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、後述する宿主の細胞中で酵素遺伝子から産生される酵素蛋白質の発現効率が高いものが好ましい。また、発現した酵素蛋白質が、高い触媒機能を発現できるように、上記ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及び上記ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子と、宿主との組合せを選択するのが好ましい。これらの点から、宿主としてメバロン酸経路を持たない微生物を用いる場合は、微生物由来、特に放線菌由来のＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子が好ましい。宿主としてメバロン酸経路を持たない放線菌を用いる場合は、放線菌由来のＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子が好ましい。
【００２８】
これらの２種類の酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主細胞中で発現させるためには、まず目的とする該ＤＮＡ断片を制限酵素あるいはＤＮＡ分解酵素で該酵素遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後、発現ベクター中においてプロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
【００２９】
本発明のメバロン酸の製造方法において使用する宿主は、非メバロン酸経路を利用している（メバロン酸経路を有しない）生物であればよく、メバロン酸経路を有しない生物としては、グラム陽性菌である、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、多くのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、グラム陰性菌である、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、光合成グラム陰性細菌である、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、藍藻である、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ属、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ属、Ｓｙｎｎｅｃｏｃｃｕｓ属、緑藻である、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｎ属等に属する生物が挙げられる。
【００３０】
ちなみに、メバロン酸経路を利用している（メバロン酸経路を有している）生物としては、動物、真菌、酵母、グラム陽性菌である、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ属、  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、一部のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、グラム陰性菌である、Ｃｈｌｏｒｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｎａｎｎｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、古細菌である、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｒｄａｒｅｌｌａ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属等が知られている。
【００３１】
また、一部のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属は、メバロン酸経路及び非メバロン酸の両方を利用していることが知られている。
【００３２】
本発明のメバロン酸の製造方法において使用する宿主としては、上述したメバロン酸経路を有しない生物の中でも、微生物、特に放線菌が好ましく、該放線菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｒｇｅｎｔｅｏｒｕｓ等が挙げられるが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓが特に好ましい。
【００３３】
また、上記発現ベクターとしては、上記宿主の細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。細菌等の微生物の細胞を宿主細胞として用いる場合は、上記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは、該微生物の細胞中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡ及び転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３４】
上記発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４８，  ６６９  （１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５３，  ２７７  （１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２，  ４３０６  （１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔ｇｅｎｅ，３３，  １０３  （１９８５）〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，  ３３，  １０３  （１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８号公報）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７２，  ２３９２（１９９０）〕、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）等が挙げられる。
【００３５】
上記プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が挙げられる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように、人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００３６】
上記リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【００３７】
本発明のメバロン酸の製造方法においては、形質転換においてプラスミドベクターを用いるのが好ましく、該プラスミドベクターとしては、大腸菌とのシャトルベクターが特に好ましい。
【００３８】
上記組換えベクター等の発現ベクターの導入方法としては、上記宿主の細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６９，  ２１１０  （１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２号公報）、又はＧｅｎｅ，  １７，  １０７  （１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １６８，  １１１  （１９７９）に記載の方法等が挙げられる。
【００３９】
本発明のメバロン酸の製造方法における形質転換体は、以上詳述したようにして得ることができるが、本発明のメバロン酸の製造方法においては、形質転換体として、放線菌ストレプトマイセス  リビダンス  ３４−１株、３４−７株又は３５−６株を用いるのが好ましい。これらの菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、微生物の表示が、寄託者が付した識別のための表示「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４−１」、受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２０」；寄託者が付した識別のための表示「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４−７」、受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２１」；寄託者が付した識別のための表示「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３５−６」、受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２２」としてそれぞれ寄託されている。尚、形質転換体であるこれらの菌株の作製については、実施例において説明する。
【００４０】
次に、Ｂ）天然型のＲ−メバロン酸の生合成に関与する２種の酵素蛋白質をコードするＤＮＡを有する形質転換体での該酵素蛋白質の発現及びこれらの作用による天然型のＲ−メバロン酸の発酵生産について詳述する。
【００４１】
該酵素蛋白質の発現及びこれらの作用による天然型のＲ−メバロン酸の発酵生産のためには、Ａ）において作製した、上記ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養する。この培養によって、該形質転換体の細胞中にＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素蛋白質及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素蛋白質が発現し、次いで、これらの酵素蛋白質の作用による発酵生産により、天然型のＲ−メバロン酸が生成され、培養物中に天然型のＲ−メバロン酸を蓄積させることができる。培養物中に蓄積された天然型のＲ−メバロン酸は、該培養物より採取されて、各種用途に供される。
【００４２】
天然型のＲ−メバロン酸の生合成能力を付与した上記形質転換体を培地に培養する方法は、使用した宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００４３】
例えば、上記形質転換体が、宿主として、大腸菌、放線菌等の原核生物、又は酵母菌等の真核生物を使用した形質転換体である場合、培地は、これらの微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれでもよいが、形質転換体の培養を効率的に行えるものが好ましい。
【００４４】
上記炭素源としては、宿主として使用した微生物が資化し得るものであればよいが、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
【００４５】
上記窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が用いられる。
【００４６】
上記無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００４７】
培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うのが好ましい。培養温度は１５〜４０℃が好ましく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中、ｐＨは、３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００４８】
また、培養中、必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン、チオストレプトン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４９】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、必要に応じて、インデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を培地に添加してもよく、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００５０】
形質転換体の培養物からの天然型のＲ−メバロン酸の採取は、メバロン酸ないしメバロン酸の分子内エステルであるメバロノラクトンの通常の単離精製方法、即ち、形質転換体の分離、抽出、蒸留、クロマトグラフィ、再結晶等を適宜組み合わせることにより行うことが出来る。
【００５１】
メバロン酸は、分子量（ｍｗ：１４８）が小さいことから、多くの場合、形質転換体の細胞膜を透過できるため培養ろ液中に蓄積し、形質転換体の細胞中で検出されるメバロン酸は比較的僅かである。このため、培養ろ液を得るために形質転換体を遠心分離やろ過により除去することが好ましい。ただし、形質転換体の細胞内に蓄積する場合は、形質転換体もしくは形質転換体を含めた培養ろ液から抽出してもよい。
【００５２】
メバロン酸の抽出は、通常の酸性有機物の抽出方法に従って行うことが出来る。即ち、培養物を有機酸ないし無機酸を用いてｐＨ１．０〜４．０とした後、酢酸エチル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸ブチル、アセトン等の有機溶媒を用いて抽出できる。また、必要に応じて、培養物に塩化ナトリウム等の電解質を溶解させてもよい。さらに、抽出液中に含有する水分を減らす必要があれば、無水硫酸ナトリウム等で脱水してもよい。得られた抽出液から蒸留や減圧下で抽出溶媒を留去することにより、抽出物を得ることが出来る。ただし、メバロン酸は、有機溶媒で抽出すると、容易に分子内エステル化（ラクトン化）して、メバロノラクトンとなる。メバロノラクトンをメバロン酸として使用したい場合は、メバロノラクトンと等モル量の水酸化ナトリウム等のアルカリを用いて、中和することによりメバロン酸のナトリウム塩を得ることが出来る。
【００５３】
抽出物はシリカゲルクロマト等のカラムクロマトグラフィーに吸着させヘキサン／酢酸エチル等の溶媒を用いて溶出することで精製することが可能である。また、蒸留により直接メバロノラクトンを精製することも可能である。また、適当な溶媒を用いることにより結晶化することも可能である。
【００５４】
【実施例】
本発明の実施例を以下に示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、実施例で示した遺伝子組換え実験は、特に言及しない限り、モレキュラー・クローニング  第二版に記載の方法（以下、常法と呼ぶ）を用いて行った。
【００５５】
〔実施例１〕Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のＨＭＧ  ＣｏＡ  合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子、並びにこれらの遺伝子の上流域の塩基配列を含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の形質転換用プラスミドベクターｐＳＥＭＶ３４の構築
１−１）  大腸菌と放線菌で複製可能なシャトルベクターｐＳＥ１０１の構築：
ｐＵＣ１９（宝酒造）を制限酵素ＡａｔＩＩで消化後、ＢｇｌＩＩリンカー（宝酒造）をライゲーションし、ＡａｔＩＩサイトをＢｇｌＩＩサイトに変えたプラスミドベクターｐＵＣ１９Ｂを作成した。
ｐＵＣ１９Ｂを、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＢｇｌＩＩ−ＫｐｎＩ処理ｐＵＣ１９Ｂ断片を取得した。
放線菌用ベクターｐＩＪ７０２  （Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＢｇｌＩＩ−ＫｐｎＩ処理ｐＩＪ７０２断片を取得した。
【００５６】
上記で取得されたＢｇｌＩＩ−ＫｐｎＩ処理ｐＵＣ１９Ｂ断片とＢｇｌＩＩ−ＫｐｎＩ処理ｐＩＪ７０２断片とを混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで、３７℃にて１６時間振盪培養した。
【００５７】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドは、大腸菌と放線菌の両方で複製可能なシャトルベクターであり、ｐＳＥ１０１と命名した。
【００５８】
１−２）  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のメバロン酸経路遺伝子クラスター及び該クラスターの上流のプロモーター領域を含むｐＵＭＶ３３の構築：
特開２００１−１６１３７０号公報に記載のｐＵＭＶ１９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のメバロン酸経路遺伝子クラスターを含むプラスミドであり、ＨＭＧ  ＣｏＡ  合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子を含む（ＰＣＴ／ＪＰ００／０８６２０、放線菌由来のメバロン酸経路に関与する酵素の遺伝子）。ｐＵＭＶ１９にクローニングされている６７９８  ｂｐからなるＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１に記す。
【００５９】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株１白金耳を、１００ｍｌのＫＧ液体培地（グルコース２重量％、可溶性でんぷん２．５重量％、大豆粉１．５重量％、ドライイースト０．２重量％、炭酸カルシウム０．４重量％、ｐＨ６．２）に植菌し、３０℃で３日間培養した。培養菌体より、常法に従い染色体ＤＮＡを単離・精製した。
【００６０】
配列番号２と配列番号３の塩基配列の組合せを有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマーと、ＴａＫａＲａ  ＬＡ−ＰＣＲ（登録商標）  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）、Ｅｘｐａｎｄ（登録商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社製）又はＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、ＤＮＡ増幅装置  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）でＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
【００６１】
ＰＣＲ終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動し、約２．３ｋｂのＥｃｏＲＩサイトを両端に持つＤＮＡ断片を取得した。
上記で取得したＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。
【００６２】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号４記載の塩基配列２３７０  ｂｐを有するＤＮＡをｐＣＬ３３０１６と命名した。
【００６３】
ｐＣＬ３３０１６をＥｃｏＲＩ消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約２．３  ｋｂのＥｃｏＲＩ処理ＤＮＡ断片を取得した。
ｐＵＭＶ１９を、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＥｃｏＲＩ処理ｐＵＭＶ１９断片を取得した。
【００６４】
上記で取得された約２．３  ｋｂのＥｃｏＲＩ処理ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ処理ｐＵＭＶ１９断片と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。
【００６５】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号５記載の塩基配列８７１９  ｂｐを有するＤＮＡをｐＵＭＶ３３と命名した。
【００６６】
１−３）  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及び異なる塩基長のプロモーター領域を含むｐＵＭＶ３４とｐＵＭＶ３５の構築：
ｐＵＭＶ３３を制限酵素Ａｏｒ５１ＨＩで完全消化後、引き続き、制限酵素ＳｎａＢＩで部分消化し、約７．５ｋｂと約６．４ｋｂのＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡ断片それぞれを５μｌの蒸留水に溶解し、それぞれセルフライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
それぞれの組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたそれぞれのアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個ずつについて、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。
【００６７】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮＡをｐＵＭＶ３４と命名した。配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡをｐＵＭＶ３５と命名した。
【００６８】
１−４）  ｐＢＭＶ３４の構築（両端に制限酵素サイトを付与するためブルースクリプトへのベクター交換）：
ｐＵＭＶ３４を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約３．２  ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＵＭＶ３４を取得した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）断片を取得した。
【００６９】
上記で取得された約３．２  ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＵＭＶ３４をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで、３７℃にて１６時間振盪培養した。
【００７０】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＢＭＶ３４と命名した。
【００７１】
１−５）  放線菌発現プラスミドｐＳＥＭＶ３４  （プロモーター領域０．８  ｋｂを含む）の構築：
ｐＢＭＶ３４をＥ制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約３．２ｋｂのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢＭＶ３４を取得した。
ｐＳＥ１０１を、制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＳＥ１０１断片を取得した。
【００７２】
上記で取得された約３．２ｋｂのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢＭＶ３４をＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＳＥ１０１と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで、３７℃にて１６時間振盪培養した。
【００７３】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＳＥＭＶ３４と命名した。
【００７４】
〔実施例２〕プラスミドベクターｐＳＥＭＶ３４  による放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換
プラスミドベクターｐＳＥＭＶ３４  による、放線菌Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （ＩＳＢＮ  ０−７０８４−０６２３−８、Ｔｏｂｉａｓ  Ｋｉｅｓｅｒ他、ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ社）に記載の方法を用いて行った。
得られた形質転換体のコロニー数個について、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌのＳＫ−ＩＩ液体培地（可溶性でんぷん２重量％、グルコース０．５重量％、酵母エキス０．５重量％、Ｂａｃｔｏ（登録商標）    Ｐｅｐｔｏｎｅ  ０．３重量％、肉エキス０．３重量％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０２重量％、ＭｇＳＯ４  ０．００６重量％）で３０℃、３日間振盪培養した。
【００７５】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換体の一株をＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２０）と命名した。
【００７６】
〔実施例３〕形質転換株Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４−１株によるメバロン酸の発酵生産
実施例２で形質転換して得たＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４−１株を、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含むＳＫ−ＩＩ液体培地１０  ｍｌに１白金耳植菌し、振とう培養器で３０℃、１２０  ｒｐｍで２日間培養を行った。得られた培養液を各２  ｍｌずつ、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含むＫＧ液体培地１００  ｍｌを入れたバッフル付き三角フラスコに分注し、さらに７日間培養を継続した。得られた培養液を３５００  ｒｐｍで１０分遠心分離を行い、培養ろ液７２００  ｍｌを得た。
【００７７】
この培養ろ液２  ｍｌにリン酸３滴、無水硫酸ナトリウム１  ｇ、酢酸エチル４  ｍｌを添加し３０秒間撹拌後、３５００  ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、上層である酢酸エチル層２  ｍｌを別の試験管にとり、遠心エバポレーターで乾固後、抽出物をイソプロパノール０．１  ｍｌに溶解し、以下に示す分析条件でＨＰＬＣを用いて分析を行った。その結果、Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４−１株の培養ろ液中から得られた物質は、メバロノラクトンの標品と一致し、メバロノラクトン濃度は０．０５５  ｍｇ／ｍｌであった。
【００７８】
（分析条件）
カラム：ヌクレオジル５Ｎ（ＣＨ３）２  （ドイツ、Ｍ．  ナーゲル社製）、サイズ直径４．６  ｍｍ×  長さ２５０  ｍｍ、４  ０  ℃
移動層：Ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速２．０  ｍｌ／分
検出：示差屈折計  （昭和電工（株）製、ＳＥ−６１型）、注入量  ０．００５  ｍｌ
【００７９】
〔実施例４〕形質転換株Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４−１株により得られたメバロン酸が天然型（Ｒ体）であることの確認
実施例３で得られた培養ろ液７２００  ｍｌにリン酸を滴下してｐＨ  ２．０とした後、食塩を２．０  ｋｇ添加し溶解した。次に、得られた溶液は、メチルエチルケトン８Ｌを用いて抽出を行った。培養液層はさらに２回メチルエチルケトン８Ｌを用いて抽出し、抽出液を計２４Ｌ得た。得られたメチルエチルケトン層は無水硫酸ナトリウムを用いて脱水後ロータリーエバポレーターを用いて乾固し、メバロノラクトンを含む抽出物６．４  ｇを得た。この抽出物を５２０  ｇのシリカゲルカラム（移動層：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）を用いて精製することによりメバロノラクトン１９０  ｍｇを得た。これは１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲによりメバロノラクトン標品のスペクトルと完全に一致し、比旋光度は  −２２．８３°（０．１９０ｇ、ＥｔＯＨ、１５ｍｌ、２０℃、Ｄ線）であった。天然型のＲ−メバロノラクトンは左遷性を示すことから、得られたメバロノラクトンは天然型のＲ−メバロノラクトンであることを確認した。
【００８０】
〔実施例５〕形質転換株Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４−７株によるメバロン酸の発酵生産
実施例２と同様の操作を実施して、Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換体を得た。得られた形質転換体の一株をＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２１）と命名した。
Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４−７株を用い、且つ最終的に調製する培養液量を５０  ｍｌとする以外は、実施例３と同様に培養を行い、培養ろ液４５  ｍｌを得た。この培養ろ液を実施例３と同様に抽出し、ＨＰＬＣで分析した結果、０．０２８  ｍｇ／ｍｌのメバロン酸を生産していた。
【００８１】
〔実施例６〕Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のＨＭＧ  ＣｏＡ  合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子、並びにこれらの遺伝子の上流域の塩基配列を含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の形質転換用プラスミドベクターｐＳＥＭＶ３５の構築
６−１）  ｐＢＭＶ３５の構築（両端に制限酵素サイトを付与するためブルースクリプトへのベクター交換）：
ｐＵＭＶ３５を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約４．３  ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＵＭＶ３５を取得した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）断片を取得した。
【００８２】
上記で取得された約４．３  ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＵＭＶ３５をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで、３７℃にて１６時間振盪培養した。
【００８３】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＢＭＶ３５と命名した。
【００８４】
６−２）  放線菌発現プラスミドｐＳＥＭＶ３５の構築  （プロモーター領域１．９  ｋｂを含む）：
ｐＢＭＶ３５をＥ制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約４．３  ｋｂのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢＭＶ３５を取得した。
ｐＳＥ１０１を、制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＳＥ１０１断片を取得した。
【００８５】
上記で取得された約４．３  ｋｂのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢＭＶ３５をＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＳＥ１０１と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで、３７℃にて１６時間振盪培養した。
【００８６】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＳＥＭＶ３５と命名した。
【００８７】
〔実施例７〕プラスミドベクター  ｐＳＥＭＶ３５  による放線菌Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換
プラスミドベクターｐＳＥＭＶ３５  による、放線菌Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （ＩＳＢＮ  ０−７０８４−０６２３−８、Ｔｏｂｉａｓ  Ｋｉｅｓｅｒ他、ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ社）に記載の方法を用いて行った。
得られた形質転換体のコロニー数個について、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌのＳＫ−ＩＩ液体培地で３０℃、３日間振盪培養した。
【００８８】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換体の一株をＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３５−６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２２）と命名した。
【００８９】
〔実施例８〕形質転換株Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３５−６株によるメバロン酸の発酵生産
Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４−１株に代えてＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３５−６株を用い、且つ最終的に調製する培養液量を５０  ｍｌとした以外は、実施例３と同様に行い、培養ろ液４５  ｍｌを得た。この培養ろ液を実施例３と同様に抽出し、ＨＰＬＣで分析した結果、０．０４７  ｍｇ／ｍｌのメバロン酸が生産されていた。
【００９０】
【発明の効果】
本発明によれば、効率的で安価に天然型のＲ−メバロン酸を製造することができる。
【００９１】
【配列表】
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