(57)【要約】【課題】移動相の移動速度が従来と同程度であり、従来と同程度の試料の分離のための固定相（例えば、クロマトグラフィー用カラム）で、簡単かつ容易に高分離能を有するクロマトグラフィー法を開発すること。【解決手段】固定相を含むクロマトグラフィー装置で試料中の標的物質を分離する方法であって、Ａ）該試料を該固定相に導入する工程；Ｂ）該固定相において第一の方向で第一の移動相を移動させる工程；およびＣ）該固定相において第二の方向で第二の移動相を移動させる工程であって、該第一の方向と該第二の方向とは相違する、工程、を包含する、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定相を含むクロマトグラフィー装置で試料中の標的物質を分離する方法であって、
Ａ）該試料を該固定相に導入する工程；
Ｂ）該固定相において第一の方向で第一の移動相を移動させる工程；および
Ｃ）該固定相において第二の方向で第二の移動相を移動させる工程であって、該第一の方向と該第二の方向とは相違する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第一の方向と前記第二の方向とは、１８０°異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一の移動相を移動させる条件と、前記第二の移動相を移動させる条件とは、同一ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の移動相を移動させる条件と、前記第二の移動相を移動させる条件とは、同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第一の移動相を移動させる条件と、前記第二の移動相を移動させる条件とは、温度、圧力、光、電流、溶媒の種類、水素イオン濃度、レーザー、溶媒密度、音波、磁場、電磁波および溶媒粘度からなる群より選択される少なくとも１つの条件が異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第一の移動相を移動させる条件と、前記第二の移動相を移動させる条件とにおいて、前記固定相、前記移動相および前記試料の間の分配平衡が変化する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第一の移動相を移動させる条件と、前記第二の移動相を移動させる条件とにおいて、前記標的物質の性質が相違しない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第一の移動相を移動させる条件と、前記第二の移動相を移動させる条件とにおいて、前記標的物質の性質が相違する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第一の移動相と前記第二の移動相とは同一の移動相であり、前記第一の移動相を移動させる条件と、前記第二の移動相を移動させる条件とにおいて、該同一の移動相の性質が相違する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一の移動相と前記第二の移動相とは異なる移動相である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一の移動相を移動させる条件と、前記第二の移動相を移動させる条件とにおいて、前記固定相の性質は変化しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一の移動相を移動させる条件と、前記第二の移動相を移動させる条件とにおいて、前記固定相は形状または性質が異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記形状または性質は、疎水性、親水性、網目構造、化学的性質、化学構造、担体サイズ、分子量、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、錯体形成能、レセプター−リガンド相互作用、細孔径サイズ、静電的相互作用およびホスト−ゲスト相互作用からなる選択される群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記固定相は、刺激応答性高分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記固定相は、温度応答性高分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程Ｂ）をｎ回以上および前記工程Ｃ）をｎまたはｎ−１回繰り返す工程であって、ｎは１以上の整数である、工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
Ｄ）該固定相において第三の方向で第三の移動相を移動させる工程であって、該第三の方向は、該第二の方向とも第三の方向とも相違する、工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
Ｅ）該固定相において第Ｘの方向で第Ｘの移動相を移動させる工程であって、Ｘは４以上の整数であり、該第Ｘの方向は、該第一の方向〜第Ｘ−１の方向のいずれとも相違する、工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程Ｂ）をｎ回および前記工程Ｃ）をｎ回またはｎ−１回以上繰り返す工程であって、ｎは１以上の整数である、工程をさらに包含し、
前記第一の方向と前記第二の方向とは、１８０°異なる、
請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記工程Ｂ）をｎ回および前記工程Ｃ）をｎ−１回以上繰り返す工程であって、ｎは１以上の整数である、工程をさらに包含し、ここで、
最後の工程Ｃ）は、所望の標的物質が溶出されるまで行われ、
前記第一の方向と前記第二の方向とは、１８０°異なる、
請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記クロマトグラフィー装置は、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ二次元クロマトグラフィー装置を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
クロマトグラフィー装置であって、
Ａ）固定相；
Ｂ）試料を導入する手段；
Ｃ）第一の移動相を提供する第一手段；
Ｄ）第二の移動相を提供する第二手段；および
Ｅ）移動相を移動させる手段であって、該移動させる手段は、該第一の移動相と該第二の移動相とを異なる方向に移動させ得る、手段、
を備える、クロマトグラフィー装置。
【請求項２３】
Ｆ）第三の移動相を提供する第三手段をさらに備える、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
Ｇ）第Ｘの移動相を提供する第Ｘ手段であって、Ｘは４以上の整数である、手段をさらに備える、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
マイクロチップをさらに備え、該マイクロチップは、前記第一手段および前記第二手段を制御する、請求項２１に記載の装置。
【請求項２６】
移動相および試料の性質を測定する手段をさらに備える、請求項２２に記載の装置。
【請求項２７】
前記固定相を移動相が移動するときの条件を変更する手段をさらに備える、請求項２２に記載の装置。
【請求項２８】
前記変更手段は、移動の速度、温度、圧力、光、電流、溶媒の種類、水素イオン濃度、レーザー、溶媒密度、音波、磁場、電磁波、溶媒粘度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を変更することができる、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
前記試料を導入する手段は、サンプルインジェクター、オートサンプラー、マイクロフィーダーおよび十字に加工したマイクロ流路に対して電気浸透流の方向を切り替えることで試料を導入する方法からなる群より選択される、請求項２２に記載の装置。
【請求項３０】
前記移動相を移動させる手段は、ペリスタティックポンプ、モーター駆動型ポンプ、ガス圧駆動型ポンプ、電気浸透流、遠心力、毛細管現象、熱媒体棒順収縮送液法およびピエゾ素子を利用した送液法からなる群より選択される、請求項２２に記載の装置。
【請求項３１】
前記移動相を移動させる手段は、前記第一の移動相が移動する方向と、前記第二の移動相が移動する方向を１８０°変化させる手段である、請求項２２に記載の装置。
【請求項３２】
前記クロマトグラフィー装置は、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ二次元クロマトグラフィー装置を含む、請求項２２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロマトグラフィー技術に関する。より詳細には、新規クロマトグラフィー分離法およびそれに使用するための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より有機化学、生化学はもとより化学一般において、クロマトグラフィー技術は広汎に使用されている。その上、クロマトグラフィーは環境分野、医薬品分野で重要な役割を担うデバイスとして、そのさらなる発展が期待されている。クロマトグラフィーの中で、カラムは混合物の分離を行う中枢部分であり分析化学が対象とする化合物の範囲を広めるために、その性能向上、すなわち分離度の向上を目的として様々な方法が検討されている。
【０００３】
その中で、分離性能の向上を行う最も簡単な方法が、カラム長を長くすることであるが、カラム長を長くするほどカラムの製造が困難になるとともに、移動相を送液する際の送液圧が非常に高くなってしまう。
【０００４】
次に容易な方法は、カラムに充填する充填剤の粒子径を小さくすることで表面積を増大させ、高分離能を得る方法である。最も一般的に使用されている粒径５μｍの充填剤を充填したカラムの理論段数は３万段程度であるが、粒径１μｍの充填剤を充填したカラムの理論段数は数十万段であることが報告されている。しかし、粒径が小さいことに起因する移動相を送液する際に生じる圧力が数千気圧と非常に高くなってしまい、特殊なポンプが必要であるなど問題点もある。
【０００５】
また、二本のカラムを使用したＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅクロマトグラフィーが開発され、高分離能が得られたが、分析時間が非常に長い。さらに、リサイクル分離法、ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ法を用いることで、理論段数が数１００万段以上の高分離能が得られている。しかし、これらの手法は特殊なポンプが必要であったり、インジェクタバルブの操作を注入後ｌｏａｄ状態にする必要があるなど、様々な問題点がある（非特許文献４〜５）。
【０００６】
また、対象とする試料成分を分取する際に、その成分の近くに、その成分よりも高濃度の試料が溶出する場合、高濃度試料のテーリングなどが原因で、対象とする試料成分と重なり、分取を行うと高濃度試料が混合してしまう問題点があった。
【０００７】
これまでに、温度応答性高分子を用いたクロマトグラフィーが提案されているが、試料に対する温度可変時の分離挙動が異なることが示されているのみで、一方向に移動相を移動するとともに試料を分離する従来型のクロマトグラフィーの延長線上の技術でしかない（特許文献１、非特許文献１〜３）。従って、限られた固定相を用いて無限に分離能を拡大する技術に対する需要はなおも存在する。
【０００８】
【特許文献１】
特願平７−３１８５５１号公報
【非特許文献１】
Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４３５−４４０（１９９８）
【非特許文献２】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  １５：１５４５−１５５０（１９９７）
【非特許文献３】
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ２３，４７−５０（２００２年５月）
【非特許文献４】
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ２３，７３−７４（２００２年５月）
【非特許文献５】
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ２３，１２５−１２６（２００２年５月）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
移動相の移動速度（例えば、液体クロマトグラフィーにおける送液速度）が従来と同程度であり、従来と同程度の分離のための固定相の長さ（例えば、カラムクロマトグラフィーにおけるカラム長）で、簡単かつ容易に高分離能を有するクロマトグラフィー法を開発することが課題である。また、対象とする試料の近くに、より高濃度の試料が存在することで、分取を行う際、対象とする試料に高濃度試料の一部が混入する問題点を従来法よりも簡便に行う方法を開発することも課題としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、試料が固定相から溶出する前に移動相を移動させる方向を変化させることで固定相の分離に供する見かけの長さを長くできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
固定相に対して移動相を反転させるのみでは、固定相の性質が同じであり、かつ、方向が１８０°変化する（すなわち反転する）場合、反転直前に分離していた試料が反転後には再び同じ溶出位置に溶出する。このような場合の問題点を解決するために、本発明はさらに、カラム内の充填剤の性質、例えば、分離場の極性、構造、細孔径、架橋構造等を温度、圧力、光、電流、溶媒の種類、水素イオン濃度、レーザー、溶媒密度、音波、磁場、電磁波、溶媒粘度等により変化させることで、有限の長さを持つクロマトグラフィー用固定相を理論上無限の長さを有する固定相とし、高い分離能が得られることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明は以下を提供する。
【００１３】
（１）  固定相を含むクロマトグラフィー装置で試料中の標的物質を分離する方法であって、
Ａ）上記試料を上記固定相に導入する工程；
Ｂ）上記固定相において第一の方向で第一の移動相を移動させる工程；および
Ｃ）上記固定相において第二の方向で第二の移動相を移動させる工程であって、上記第一の方向と上記第二の方向とは相違する、工程、
を包含する、方法。
【００１４】
（２）  上記第一の方向と上記第二の方向とは、１８０°異なる、項目１に記載の方法。
【００１５】
（３）  上記第一の移動相を移動させる条件と、上記第二の移動相を移動させる条件とは、同一ではない、項目１に記載の方法。
【００１６】
（４）  上記第一の移動相を移動させる条件と、上記第二の移動相を移動させる条件とは、同一である、項目１に記載の方法。
【００１７】
（５）  上記第一の移動相を移動させる条件と、上記第二の移動相を移動させる条件とは、温度、圧力、光、電流、溶媒の種類、水素イオン濃度、レーザー、溶媒密度、音波、磁場、電磁波および溶媒粘度からなる群より選択される少なくとも１つの条件が異なる、項目１に記載の方法。
【００１８】
（６）  上記第一の移動相を移動させる条件と、上記第二の移動相を移動させる条件とにおいて、上記固定相、上記移動相および上記試料の間の分配平衡が変化する、項目１に記載の方法。
【００１９】
（７）  上記第一の移動相を移動させる条件と、上記第二の移動相を移動させる条件とにおいて、上記標的物質の性質が相違しない、項目１に記載の方法。
【００２０】
（８）  上記第一の移動相を移動させる条件と、上記第二の移動相を移動させる条件とにおいて、上記標的物質の性質が相違する、項目１に記載の方法。
【００２１】
（９）  上記第一の移動相と上記第二の移動相とは同一の移動相であり、上記第一の移動相を移動させる条件と、上記第二の移動相を移動させる条件とにおいて、上記同一の移動相の性質が相違する、項目１に記載の方法。
【００２２】
（１０）  上記第一の移動相と上記第二の移動相とは異なる移動相である、項目１に記載の方法。
【００２３】
（１１）  上記第一の移動相を移動させる条件と、上記第二の移動相を移動させる条件とにおいて、上記固定相の性質は変化しない、項目１に記載の方法。
【００２４】
（１２）  上記第一の移動相を移動させる条件と、上記第二の移動相を移動させる条件とにおいて、上記固定相は形状または性質が異なる、項目１に記載の方法。
【００２５】
（１３）  上記形状または性質は、疎水性、親水性、網目構造、化学的性質、化学構造、担体サイズ、分子量、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、錯体形成能、レセプター−リガンド相互作用、細孔径サイズ、静電的相互作用およびホスト−ゲスト相互作用からなる選択される群より選択される、項目１１に記載の方法。
【００２６】
（１４）  上記固定相は、刺激応答性高分子を含む、項目１に記載の方法。
【００２７】
（１５）  上記固定相は、温度応答性高分子を含む、項目１に記載の方法。
【００２８】
（１６）  上記工程Ｂ）をｎ回以上および上記工程Ｃ）をｎまたはｎ−１回繰り返す工程であって、ｎは１以上の整数である、工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
【００２９】
（１７）  Ｄ）上記固定相において第三の方向で第三の移動相を移動させる工程であって、上記第三の方向は、上記第二の方向とも第三の方向とも相違する、工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
【００３０】
（１８）  Ｅ）上記固定相において第Ｘの方向で第Ｘの移動相を移動させる工程であって、Ｘは４以上の整数であり、上記第Ｘの方向は、上記第一の方向〜第Ｘ−１の方向のいずれとも相違する、工程をさらに包含する、項目１５に記載の方法。
【００３１】
（１９）  上記工程Ｂ）をｎ回および上記工程Ｃ）をｎ回またはｎ−１回以上繰り返す工程であって、ｎは１以上の整数である、工程をさらに包含し、
上記第一の方向と上記第二の方向とは、１８０°異なる、
項目１に記載の方法。
【００３２】
（２０）  上記工程Ｂ）をｎ回および上記工程Ｃ）をｎ−１回以上繰り返す工程であって、ｎは１以上の整数である、工程をさらに包含し、ここで、
最後の工程Ｃ）は、所望の標的物質が溶出されるまで行われ、
上記第一の方向と上記第二の方向とは、１８０°異なる、
項目１に記載の方法。
【００３３】
（２１）  上記クロマトグラフィー装置は、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ二次元クロマトグラフィー装置を含む、項目１に記載の方法。
【００３４】
（２２）  クロマトグラフィー装置であって、
Ａ）固定相；
Ｂ）試料を導入する手段；
Ｃ）第一の移動相を提供する第一手段；
Ｄ）第二の移動相を提供する第二手段；および
Ｅ）移動相を移動させる手段であって、上記移動させる手段は、上記第一の移動相と上記第二の移動相とを異なる方向に移動させ得る、手段、
を備える、クロマトグラフィー装置。
【００３５】
（２３）  Ｆ）第三の移動相を提供する第三手段をさらに備える、項目２２に記載の装置。
【００３６】
（２４）  Ｇ）第Ｘの移動相を提供する第Ｘ手段であって、Ｘは４以上の整数である、手段をさらに備える、項目２３に記載の装置。
【００３７】
（２５）  マイクロチップをさらに備え、上記マイクロチップは、上記第一手段および上記第二手段を制御する、項目２１に記載の装置。
【００３８】
（２６）  移動相および試料の性質を測定する手段をさらに備える、項目２２に記載の装置。
【００３９】
（２７）  上記固定相を移動相が移動するときの条件を変更する手段をさらに備える、項目２２に記載の装置。
【００４０】
（２８）  上記変更手段は、移動の速度、温度、圧力、光、電流、溶媒の種類、水素イオン濃度、レーザー、溶媒密度、音波、磁場、電磁波、溶媒粘度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を変更することができる、項目２７に記載の装置。
【００４１】
（２９）  上記試料を導入する手段は、サンプルインジェクター、オートサンプラー、マイクロフィーダーおよび十字に加工したマイクロ流路に対して電気浸透流の方向を切り替えることで試料を導入する方法からなる群より選択される、項目２２に記載の装置。
【００４２】
（３０）  上記移動相を移動させる手段は、ペリスタティックポンプ、モーター駆動型ポンプ、ガス圧駆動型ポンプ、電気浸透流、遠心力、毛細管現象、熱媒体棒順収縮送液法およびピエゾ素子を利用した送液法からなる群より選択される、項目２２に記載の装置。
【００４３】
（３１）  上記移動相を移動させる手段は、上記第一の移動相が移動する方向と、上記第二の移動相が移動する方向を１８０°変化させる手段である、項目２２に記載の装置。
【００４４】
（３２）  上記クロマトグラフィー装置は、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ二次元クロマトグラフィー装置を含む、項目２２に記載の装置。
【００４５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００４６】
（用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００４７】
本明細書において「クロマトグラフィー」とは、混合物の試料から，担体（固定相）中の移動度（分配平衡）の差を利用して試料中にある特定の標的物質または標的物質群を別の物質または物質群から分離する方法をいう。従って、試料の分離が達成される限りどのような技術もクロマトグラフィーの範囲内にある。クロマトグラフィーは、例えば、ある標的物質を混合物から分離する目的で使用され得るし、あるいは、ある標的物質について定性的または定量的な分析をするためにも使用され得る。例えば、通常クロマトグラフィーとは呼ばれない電気泳動技術もまた、通常試料中の少なくとも１つの成分を分離することができることから、本明細書においてクロマトグラフィーの範囲内にある。固定相は通常液体または固体であり得る。移動相は通常液体または気体であり得る。吸着剤などの固定相または移動相の一端に試料を吸着させ，これに適当な溶媒（移動相）を移動させると試料中の成分は固定相（固定相の表面または内部など固定相のある部分）を溶出と吸着を繰り返しながら移動する。その間に吸着されやすいものとされにくいものとの間に移動度の差を生じて，混合物の分離が可能になる。移動相が液体のものは、液体クロマトグラフィーとも呼ばれる。従来、移動相が液体か気体かによって液体クロマトグラフィー（ＬＬＣ、ＬＳＣなど。ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ（登録商標）などもこれに入る）とガスクロマトグラフィー（例えば、ＧＬＣ、ＧＳＣなど）とに分けられ、分離の機構によってキラルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィ（ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）などのゲルクロマトグラフィー）、塩析クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、高速向流分配クロマトグラフィー、パーフュージョンクロマトグラフィーなどが使用されている。また固定相の形状により、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（例えば、ペーパークロマトグラフィーなど）などが使用されている。本発明の方法は、どのような形態のクロマトグラフィーにおいても使用され得る。
【００４８】
本明細書において「固定相」（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ）とは、クロマトグラフィーにおいて、分離の場を形成するために、その場に固定して用いられる固体または液体のことをいい、試料となる物質（標的物質ともいう）をいったん分配平衡により固定または吸着するために用いられる物質のことをいう。本明細書では、クロマトグラフィーにおいて通常使用されるカラムも固定相の範疇に入る。固定相は液体または固体であり得る。例えば、吸着クロマトグラフィーにおける多孔性で表面活性な吸着剤、分配クロマトグラフィーにおける不活性な固体表面に保持される液体などが挙げられる。
【００４９】
本明細書において「移動相」（ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ）とは、クロマトグラフィーにおいて、試料中の成分を含んで移動する物質をいい、分離の場を流通していて、試料を移動させる役目、試料と固定相との間の分配を仲介する役目を果たす流体（例えば、液体、気体または超臨界流体）をいう。移動相は、そのクロマトグラフィーの種類、分離の機構、目的などによって当業者が適宜選択することができる。
【００５０】
本明細書において固定相および移動相は、そのクロマトグラフィーを使用する目的に応じて当業者が適宜選択することができる。そのような固定相および移動相の選定は、当該分野において周知であり、例えば、「ライフサイエンスのための高速液体クロマトグラフィー  基礎と実験」中川照真、牧野圭祐編、廣川書店に記載されている。
【００５１】
本明細書において「試料」は、その中の少なくとも１つの成分の分離を目的とするものであれば、どのような起源のものをも使用することができる。したがって、試料は、生物の全部または一部から取り出されたものであり得るが、それに限定されない。別の実施形態において、試料は、合成技術によって合成されたものであり得る。
【００５２】
本明細書において試料中の「標的物質」とは、試料中に含まれるかまたは含まれると予想される物質であって、分取、分離または分析の対象となる物質をいう。
【００５３】
本発明はまた、合成化学技術を用いてある物質を合成したときに、出発物質、中間体などから最終生成物を分離するときにも使用することができる。そのような合成化学技術には、有機化学合成技術、無機化学合成技術などが含まれるがそれらに限定されない。
【００５４】
本明細書において「刺激応答性高分子」とは、ある高分子について、ある刺激に対して応答して、その刺激のある前とその刺激を受けた後との形状および／または性質が変化するものをいう。そのような刺激としては、光照射、電場印加、温度変化、ｐＨ変化、化学物質の添加などが挙げられるがそれに限定されない。刺激応答性高分子としては、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチルメタクリレート）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ビニルフェロセン）共重合体、γ線照射したポリ（ビニルメチルエーテル）（ＰＶＭＥ）、ポリ（オキシエチレン）、核酸などの生体物質を高分子に組み込んだ樹脂、および上記高分子に対して架橋剤によって架橋し作製したゲルなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５５】
本明細書において「温度応答性高分子」とは、温度に応答して、その形状および／または性質を変化させる性質を有する高分子をいう。温度応答性高分子としては、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチルメタクリレート）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ビニルフェロセン）共重合体、γ線照射したポリ（ビニルメチルエーテル）および上記高分子に対して架橋剤によって架橋し作製したゲルなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチルメタクリレート）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム）共重合体および上記高分子に対して架橋剤によって架橋し作製したゲルなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５６】
例えば、γ線照射したポリビニルメチルエーテル水溶液は，室温では水和し膨潤しているが、温度が上がると脱水和して収縮する感熱性の高分子ゲルとなることが知られている。ゼリーのように均質透明なＰＶＭＥゲルを温めると白濁し透明性が変化する。多孔質構造のゲルを調製したり、繊維または粒子などの小さな形に成形すると高速で伸縮するようになる。このような多孔質構造をもつ繊維状ＰＶＭＥゲルの場合、伸縮速度は１秒末満という速さであるといわれる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｉｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ＮＩＭＣ／ｏｖｅｒｖｉｅｗ／ｖ２７−ｊ．ｈｔｍｌ、特開２００１−２１３９９２号および特開２００１−１３１２４９号参照）。Ｎ−イソプロピルアクリルアミドゲル（すなわち、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド））もまた、温度応答性ゲルとして知られる。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）に対して、疎水性のモノマーを共重合させると、形状および／または性質が変化する温度を低下させることができ、親水性のモノマーを共重合させると形状および／または性質が変化する温度を上げることができる。これを利用して、所望の刺激に応答した充填剤を調製することができる。このような手法は、他の温度応答性高分子に対しても適用することができる。
【００５７】
本明細書において試料の「導入」は、その試料を固定相に接触させることをいう。アプライされた試料は通常、その固定相と共存する。導入の方法は、その試料がクロマトグラフィーの固定相に接触することができるようなものであれば、どのような技術を用いてもよい。本明細書において試料の導入は、試料のアプライともいい互換的に使用される。
【００５８】
本明細書において移動相を「移動させる条件」は、本発明の目的にかなうように当業者が容易に選択し得る。
【００５９】
本明細書において移動相の移動の方向を変えることは、当業者であれば、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。そのような技術としては、流路スイッチング、カラムスイッチングなどの手段を利用することが挙げられるがそれに限定されない。
【００６０】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に示す好ましい実施形態は本発明の例示の目的で提供されるものであり、本発明を何ら限定しない。
【００６１】
１つの局面において、本発明は固定相を含む固定相で試料中の標的物質を分離する方法を提供する。この方法は、Ａ）試料をクロマトグラフィー装置に導入する工程；Ｂ）固定相において第一の方向で第一の移動相を移動させる工程；およびＣ）固定相において第二の方向で第二の移動相を移動させる工程であって、該第一の方向と該第二の方向とは相違する、工程を包含する。
【００６２】
ここで、試料をクロマトグラフィー装置中の固定相に導入する方法は、当該分野において周知の技術に従って、行うことができる。そのような技術は、例えば、インジェクタを用いる方法、オンカラム法、試料を注入し移動相によってカラム内に流し込む方法、サンプルバルブによる方法などが挙げられるがそれらに限定されない。そのための装置として、例えば、サンプルインジェクタ、オートサンプラー、マイクロフィーダー、十字に加工したマイクロ流路に対して電気浸透流の方向を切り替えることで試料を導入する方法などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような技術は、例えば、「高速液体クロマトグラフィー」波多野博行編  化学の領域  増刊１０２号  南江堂；”高速液体クロマトグラフィーの装置及び付属装置”奥山典生、瀬田和夫著ｐ１１−４０など記載されている。本発明においては、試料の少なくとも一部が固定相を接触または通過するような条件を用いる限り、導入の方法はどのようなものでもよい。試料中に存在する、分離を目的とする成分が導入により固定相と相互作用するように接触されることが好ましい。ここで、固定相と相互作用するとは、固定相を形成する物質と、固定される物質との間に、共有結合または非共有結合による結合が生じることをいう。好ましくは、この結合は非共有結合であり得るが、それに限定されない。そのような非共有結合としては、例えば、水素結合、疎水性結合、分子間力による結合、抗原抗体反応などの特異的なアフィニティー結合などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６３】
試料がクロマトグラフィー装置に導入された後、固定相において第一の方向で第一の移動相を移動させる工程を行う。そのような移動相の移動の方法は、当該分野において周知であり、例えば、「高速液体クロマトグラフィーハンドブック」日本分析化学会関東支部編  丸善；「高速液体クロマトグラフィー」波多野博行編  化学の領域  増刊１０２号  南江堂など記載されている。本発明においては、移動相の少なくとも一部が固定相を通過するような条件を用いる限り、この移動相の移動方法はどのようなものでもよい。そのような移動をさせる手段としては例えば、モーター駆動型ポンプ（プランジャー型、シリンジ型、ダイヤフラム型、エアシリンダー型）、ガス圧駆動型ポンプ、電気浸透流、遠心力、毛細管現象、熱媒体膨潤収縮送液法、ピエゾ素子を利用した送液法などがあり、それらは「高速液体クロマトグラフィー」波多野博行編  化学の領域  増刊１０２号  南江堂；”高速液体クロマトグラフィーの装置及び付属装置”奥山典生、瀬田和夫著ｐ１１−４０などに記載され支持されている。移動相を移動させる際の流速は、一定であるほうが好ましいが、それに限定されない。従って、流速が定期的にまたは不定期的に変動してもよい。移動相の移動速度は、一定であるほうが好ましいが、移動方向の変化（例えば、反転）前後で変えてもよいし、一定方向に流している際に変えてもよい。
【００６４】
本発明において、固定相において第一の方向で第一の移動相を移動させる工程を行った後、第二の方向で第二の移動相を移動させる工程が行われる。ここで、この第一の方向とこの第二の方向とは互いに相違することが本発明の特徴の一つである。ここで、第二の移動相を移動させる方法は、当該分野において周知であり、第一の移動相を移動させる方法と同一であっても異なっていてもよく、例えば、カラムスイッチング、流路スイッチング等が挙げられる。そのような技術は、「高速液体クロマトグラフィーハンドブック」（改訂２版）日本分析化学会関東支部編  丸善  ＩＩ実務編など記載されている。第二の移動相を移動させる際の流速は、一定であるほうが好ましいが、それに限定されない。従って、流速が定期的にまたは不定期的に変動してもよい。第二の移動相は、第一の移動相と同一であってもよく、異なっていてもよい。簡便さの点から、第一の移動相と第二の移動相とは同一であることが好ましい。
【００６５】
第一の移動相の移動方向（第一の方向）と第二の移動相の移動方向（第二の方向）とは、同一でなければ、どのような様式で異なっていてもよい。第一の方向と第二の方向とは、１８０°異なること（すなわち正反対の方向）が好ましい。
【００６６】
第一の移動相と、第二の移動相とは、移動させる際の流速は、同一であるほうが好ましいが、それに限定されない。従って、第一の移動相の流速が第二の移動相の流速よりも速くても遅くてもよい。第一および第二の移動相を移動させる際の流速は、一定であるほうが好ましいが、それに限定されない。従って、流速が定期的にまたは不定期的に変動してもよい。
【００６７】
本発明において、必要に応じて、第三の移動相を第三の方向で固定相の中を移動させてもよい。このような第三の移動相は、第一の移動相または第二の移動相と同じであってもそれら双方と異なっていてもよい。また第三の方向は、第一の方向または第二の方向と同じであっても、それら双方と異なっていてもよい。ここで使用される第三の移動相に適用される技術は、第一の移動相および第二の移動相において適用される技術を用いることができる。第三の移動相を移動させる際の流速は、一定であるほうが好ましいが、それに限定されない。従って、移動相の移動速度は定期的にまたは不定期的に変動してもよい。
【００６８】
第三の移動相は、第一の移動相または第二の移動相と、移動させる際の流速は、同一であるほうが好ましいが、それに限定されない。従って、第三の移動相の流速は、第一の移動相および第二の移動相より速くても遅くてもよく、その中間の速度であってもよい。
【００６９】
本発明において、さらに必要に応じて、第Ｘの移動相を第Ｘの方向で固定相の中を移動させてもよい。ここでＸは４以上の整数である。このような第Ｘの移動相は、第一の移動相〜第Ｘ−１の移動相と同じであってもそれらすべてと異なっていてもよい。また第Ｘの方向は、第一の方向〜第Ｘ−１の方向と同じであっても、それらすべてと異なっていてもよい。ここで使用される第Ｘの移動相に適用される技術は、第一の移動相〜第Ｘ−１の移動相において適用される技術を用いることができる。第Ｘの移動相を移動させる際の流速は、一定であるほうが好ましいが、それに限定されない。従って、流速が定期的にまたは不定期的に変動してもよい。
【００７０】
第Ｘの移動相は、第一の移動相〜第Ｘ−１の移動相と、移動させる際の流速は、同一であるほうが好ましいが、それに限定されない。従って、第三の移動相の流速は、第一の移動相〜第Ｘ−１の移動相より速くても遅くてもよく、その最速の速度と最も遅い速度との中間の速度であってもよい。
【００７１】
１つの実施形態において、本発明において用いられる第一の移動相と、第二の移動相とは、各々の移動させる条件は同一であっても、同一でなくてもよい。好ましくは、各々の移動させる条件は、同一でないものが使用される。同一でない条件を用いることによって、固定相、移動相、試料または試料中の標的物質の性質または形状を異ならせることができ、それにより、従来にはない分離能を達成することができるからである。標的物質の精製を目的とする場合などでは、第一の方向で第一の移動相を移動させる工程における移動させる条件および第二の方向で第二の移動相を移動させる工程における移動させる条件は、両方とも、分離を目的とする標的物質の性質が変化しない条件であることが好ましい。そのような条件は、分離を目的とする標的物質によって変動するが、そのような変動は、当業者であれば、容易に理解することができ、そのような技術は、当該分野において周知の技術の範囲内にある。従って、当業者は、上記２つの移動させる条件を、分離を目的とする標的物質の性質が変化しない条件の中から適宜選択することができ、標的物質の性質が変化する条件もまた容易に選択することができる。
【００７２】
ここで、物質（例えば、試料中の標的物質）の「性質が変化しない」または「変質しない」とは、本明細書において使用される場合、物質の分離前後における状態の変化をいい、分離された物質の使用目的において、意図される目的を達成するに十分な性質を保持することをいう。従って、必ずしも、分離前の状態をすべて保持する必要はないが、分離前の状態をすべて保持することが好ましい。本明細書において、「性質」および「物性」は、物質について使用されるとき、互換可能に使用される。
【００７３】
ある実施形態において、標的物質において変化しないことが望まれる性質のパラメータとしては、例えば、疎水性、親水性、網目構造、化学的性質、化学構造、担体サイズ、分子量、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、錯体形成能、レセプター−リガンド相互作用、細孔径サイズ、静電的相互作用およびホスト−ゲスト相互作用に関する性質が挙げられるがそれらに限定されない。１つの実施形態において、例えば、分取または定量を目的とする場合、試料またはそれに含まれる標的物質の性質は変化しないことが好ましい。別の実施形態において、例えば、分析の場合、試料またはそれに含まれる標的物質の性質は、変化しても変化しなくてもよい。
【００７４】
１つの実施形態において、第一の移動相を移動させる条件と、第二の移動相を移動させる条件とにおいて、分離されるべき標的物質の性質は相違していてもよい。分離されるべき標的物質の性質が２またはそれを超える数の条件において相違することにより、より効率的な標的物質の分離を行うことができる。試料またはそれに含まれる標的物質の性質もまた、そのような条件の変動によって、性質が変化する可能性があるからである。特に、分析を目的とする場合、例えば、クロマトグラフィー装置で分析を行う前に試料を誘導体化して、感度を向上させて分析を行ってもよい。外部からの刺激により、試料または試料に含まれる標的物質の試料の性質の変化（例えば、温度で互変異性（温度を元に戻せば元の物質の構造に戻る）が生じる温度可逆的な構造を有するタンパク質など）させて、分離効率を変化（好ましくは上昇）させてもよい。そのような場合、標的物質の近傍に溶出してくる夾雑物質から標的物質を分離させることが容易になる。ここで、変化され得る標的物質の性質のパラメータとしては、上述の物質の性質が挙げられ、特に、温度変化、ｐＨ変化、イオン強度変化およびそれらの複合体変化に関する性質が好ましい。
【００７５】
別の実施形態において、第一の移動相と第二の移動相とは同一の移動相であり得る。この場合、第一の移動相を移動させる条件と、第二の移動相を移動させる条件とにおいて、この同一の移動相の性質が相違していてもよい。この同一の移動相の性質が２またはそれを超える数の条件において相違することにより、分離されるべき標的物質の分離がより効率よく行われ得、高い分離能が達成される。別の実施形態において、第一の移動相および第二の移動相は異なる移動相（物質）であり得る。
【００７６】
ここで、移動させる条件のパラメータとしては、例えば、温度、圧力、光、電流、溶媒の種類、水素イオン濃度、レーザー刺激の有無、溶媒密度、音波および磁場などが挙げられるがそれらに限定されない。ある実施形態において、移動させる条件のパラメータは、温度を包含することが好ましい。温度を変化させることにより、温度応答性高分子などの温度刺激に応答する固定相の性質または形状が変化し、本発明の目的を達成することができるからである。このように、当業者は、固定相に使用される物質および意図される分離の機構に基づいて、適切に、移動させる条件のパラメータを選択することができる。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム）共重合体などのｐＨおよび／または温度に応答する固定相を用いることができる。また、アゾベンゼンなどの光応答性官能基を有する高分子を固定相として用いることによって、光刺激などで本発明の新規クロマトグラフィー法を実施することができる。
【００７７】
このように、本明細書では、第一の移動相を移動させる条件と、第二の移動相を移動させる条件とにおいて、固定相、試料または試料中に含まれる標的物質および移動相からなる群より選択される少なくとも一つの物質の性質が変化することによって、本発明のクロマトグラフィー装置の分離能は劇的に改善する。１つの特定の実施形態では、第一の移動相を移動させる条件と、第二の移動相を移動させる条件とにおいて、固定相、試料または試料中に含まれる標的物質および移動相からなる群より選択される少なくとも２つの物質の性質（例えば、固定相および移動相、固定相および試料もしくは試料中に含まれる標的物質、または移動相および試料もしくは試料中に含まれる標的物質）が変化してもよい。別の特定の実施形態では、固定相、試料または試料中に含まれる標的物質および移動相からなる群より選択されるすべての物質の性質が変化することにより、標的物質の分離が行われ得る。
【００７８】
従って、ある実施形態において、本発明において用いられる固定相は、第一の移動相を移動させる条件と、第二の移動相を移動させる条件とで、形状または性質が異なり得る。固定相の形状または性質が変化することにより、本発明のクロマトグラフィー装置または方法は、目的に応じた効率よい標的物質の分離を行うことができる。好ましくは、固定相の形状または性質が変化すると同時に移動の方向を変化させることが好ましい。このように、変化が意図される固定相の形状または性質としては、例えば、極性、網目構造、化学的性質、化学構造、担体サイズ、分子量、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、錯体形成能、レセプター−リガンド相互作用、細孔径サイズ、静電的相互作用およびホスト−ゲスト相互作用に関する性質が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、変化が意図される固定相の形状または性質は、極性または網目構造であり得る。
【００７９】
従って、１つの好ましい実施形態において、本発明において用いられる固定相は、刺激応答性高分子を含む。刺激応答性高分子の例としては、例えば、温度、ｐＨ、光、化学物質、磁場およびそれらの複合型刺激応答性高分子などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような刺激応答性高分子としては、例えば、外部刺激である温度によって高速に、かつ、極性などの性質が大きく変化するものが挙げられるがそれに限定されない。温度応答性高分子としては、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、その共重合体（例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム）共重合体）などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、温度応答性高分子としてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）またはその共重合体が使用され得る。固定相にこのような刺激応答性高分子が含まれるとき、そのような高分子は、例えば、多孔質シリカ等の固体表面上に結合させた形態で使用され得る。
【００８０】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、固定相において第一の方向で第一の移動相を移動させる工程は１回以上繰り返す工程をさらに包含する。別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、固定相において第二の方向で第二の移動相を移動させる工程をさらに包含する。これらの工程を繰り返すことによって、本発明のクロマトグラフィー技術は、より効率的および／または分離度の高い分離を達成することができる。好ましい実施形態において、固定相において第一の方向で第一の移動相を移動させる工程および固定相において第二の方向で第二の移動相を移動させる工程は、両方とも１回以上繰り返すことができる。このような工程の繰り返しを重ねることによって、本発明のクロマトグラフィー技術は、さらに効率的および／または分離度の高い分離を達成することができる。
【００８１】
より好ましい実施形態において、本発明の方法は、上記工程Ｂ）およびＣ）を１回以上繰り返す工程をさらに包含し、ここで、第一の方向と第二の方向とは、１８０°異なる。１８０°の相違すなわち、移動方向を交互に反転させるような移動を行わせることによって、見かけ上のカラム長が長くなり、より高い分離能を得ることができる。このような場合、本明細書において反転送液型クロマトグラフィーとも称する。
【００８２】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記工程Ｂ）をｎ回および上記工程Ｃ）をｎ−１回以上繰り返す工程であって、ｎは１以上の整数である、工程をさらに包含する。したがって、工程Ｂ）をｎ回および前記工程Ｃ）をｎ回またはｎ−１回以上繰り返してもよい（ここで、ｎは１以上の整数）。ここで、第一の方向と第二の方向とは、１８０°異なってもよい。このことにより、見かけ上のカラム長が長くなりより効率のよい分離が達成され得る。必要に応じて最後の工程Ｃ）は、所望の標的物質が溶出するまで行うことができる。このように分離を行うことによって、対象とする試料成分の近くに、より高濃度の試料成分に溶出することで対象成分と重なることで分取が困難な場合などに、移動相の移動方向の反転を奇数回行うことで、試料成分の溶出順序を逆転させ高純度で対象とする試料を分取することが達成される。また、反転する際、高濃度の試料の一部または全部をカラム外へと溶出させることでより、所望でない物質が除去され、より高い分離が達成される。
【００８３】
別の局面において、本発明は、上記クロマトグラフィー方法を行うためのクロマトグラフィー装置を提供する。このようなクロマトグラフィー装置は、Ａ）固定相；Ｂ）試料を導入する手段；Ｃ）第一の移動相を提供する第一手段；Ｄ）第二の移動相を提供する第二手段；およびＥ）移動相を移動させる手段であって、上記移動させる手段は、上記第一の移動相と上記第二の移動相とを異なる方向に移動させ得る、手段、を備える。
【００８４】
ここで、固定相は、クロマトグラフィーを行うために使用されるものであればどのようなものでも使用され得るが、そのような固定相は当該分野において周知であり、例えば、炭化水素、糖、脂質、核酸、タンパク質、ペプチド、天然高分子、合成高分子、金属（合金を含む）、金属化合物、金属錯体、非金属化合物、炭素などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、例えば、Ｃ１８Ｈ３７基、Ｃ８Ｈ１７基、シリカ、ポリスチレン樹脂、刺激応答性分子が挙げられるがそれらに限定されない。１つのより好ましい実施形態では、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）またはその共重合体を多孔質シリカ等の固体表面上に結合させた充填剤が使用される。そのような固定相は、本明細書において、特にカラムクロマトグラフィーにおいて、充填剤とも呼ぶことがある。
【００８５】
固定相は、固体支持体のみでも用いられ得るが、固体支持体などの支持体と（例えば、吸着などにより）分離するための分離用媒体とを含んでいてもよい。担体の支持体は、球状、破砕状、繊維状、多孔質状、細胞内壁などであり得る。ここで、固体支持体としては、クロマトグラフィー担体として使用されるものであればどのようなものでも使用することができる。そのような支持体は、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）、炭素などが挙げられるがそれらに限定されない。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。当然、市販のクロマトグラフィー樹脂を使用することができる。分離用媒体としては、例えば、アフィニティーカラムに用いられる媒体（例えば、抗原、抗体、リガンド、プロテインＡなど）、金属被覆担体、金属担体などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８６】
本発明のクロマトグラフィー装置において使用される試料を導入する手段は、試料を固定相に導入することができるようなものであれば、どのようなものでも使用することができる。そのような提供手段は、当該分野において周知であり、例えば、本明細書において上述したようなものが使用され得る。１つの好ましい実施形態では、インジェクタなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８７】
本発明のクロマトグラフィー装置において用いられる移動相を提供する手段（例えば、上述のＣ）第一の移動相を提供する第一手段、Ｄ）第二の移動相を提供する第二手段など）は、移動相（例えば、液体または気体などの流体）を提供することができる手段であれば、どのような手段をも用いることができる。そのような提供手段は、当該分野において周知であり、例えば、本明細書において上述したようなものが使用され得る。本明細書において上述したようなものが使用され得る。移動相を提供する手段は、第一のものと第二のものとで異なっていてもよいが、両者は同一であってもよい。そのような場合には、移動相の方向を変えるために、移動相を提供する手段は、流路スイッチング、カラムスイッチングに連結されることが好ましい。
【００８８】
本発明において用いられる移動相を移動させる手段は、移動相を固定相中で移動させることができ、かつ、移動相を少なくとも２種類以上の移動方向に移動させることができれば、どのようなものでも用いられる。このような移動させる手段は、移動相が少なくとも２種類以上の移動方向に移動することができる限り、特別な移動力を提供する供給源なしに、例えば、重力を利用して移動相を移動させてもよい。あるいは、外的に圧力などを加えた移動相を移動させてもよい。そのような移動手段は、当該分野において周知であり、例えば、本明細書において上述したようなものが使用され得る。
【００８９】
好ましい実施形態において、本発明のクロマトグラフィー装置は、Ｆ）第三の移動相を提供する第三手段をさらに備え得る。別の好ましい実施形態において、本発明のクロマトグラフィー装置は、Ｇ）第Ｘの移動相を提供する第Ｘ手段であって、Ｘは４以上の整数である、手段をさらに備える得る。
【００９０】
１つの好ましい実施形態において、本発明のクロマトグラフィー装置は、マイクロチップをさらに備える。このマイクロチップは、本発明の第一手段および第二手段を制御することができる。本発明の手法をマイクロチップに組み込むことで、例えば、温度平衡の時間が短縮され、または短いカラム長でも高い分離能を得ることができる。このマイクロチップはまた、必要に応じて、第三手段、および必要に応じて、第Ｘ手段（ここで、Ｘは４以上）を制御することができるように構成されていてもよい。
【００９１】
本発明のクロマトグラフィー装置は、移動相および／または試料もしくは試料中の標的物質の性質を測定する手段をさらに備え得る。そのような性質測定手段は、分離を目的とする標的物質の存在または定量（相対的または絶対的）を行うことができる手段であれば、どのような手段を用いてもよい。そのような性質を測定する手段を用いることによって、クロマトグラフィーにおける分離をリアルタイムにチェックすることができたり、分取した試料の特徴づけを行うことができる。そのような性質測定手段は、当該分野において周知であり、当業者であれば、目的に応じて適宜適切な手段を選択することができる。そのような性質測定手段としては、例えば、分光光度計、紫外線可視分光光度計、屈折率計、蛍光光度計、赤外分光光度計、質量分析計、核磁気共鳴装置、電気化学検出器、熱伝導度型検出器、水素炎イオン化検出器、電子捕獲検出器、炎光光度検出器、熱イオン化検出器などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、例えば、紫外線可視分光光度計、屈折率計、蛍光光度計、質量分析計、電気化学検出器、熱伝導度型検出器、水素炎イオン化検出器が挙げられるがそれらに限定されない。ある実施形態において、移動相および／または試料もしくは試料中の標的物質の性質を測定する手段は、少なくとも１つ取り付けられる。ある実施形態では、そのような測定手段は、固定相から移動相および／または試料もしくは試料中の標的物質が移動して入る位置もしくはその位置につながる位置および／または出てくる位置もしくはその位置につながる位置に取り付けられ得る。好ましくは、検出器の位置は、構造物（例えば、配管、カラム、カラムスイッチング、流路スイッチング、ポンプなど）を経由してカラムの片側または両側にあってもよい。ある実施形態では、移動相が固定相に入る位置もしくはその位置につながる位置、および出てくる位置もしくはその位置につながる位置の両方に取り付けられ得る。例えば、移動相の移動方向が１８０°変化するとき、上記測定手段は、固定相またはそれを保持するカラムの片端または両端に取り付けられ得る。
【００９２】
ある実施形態において、本発明は、固定相（例えば、カラム）および移動相の状態を測定する手段をそれぞれ少なくとも１つずつ備え得る。あるいは、別の実施形態において、移動相を移動させる手段（例えば、ポンプ）から、固定相（例えば、カラム）−測定手段−固定相（例えば、カラム）−測定手段の順に配置することも可能である。後者の場合、分離の中心となる真中に配置した固定相の両端に測定手段を配置することで、移動相の変化（例えば、反転）する位置を知ることができる。その上、それらの測定手段の両端に固定相（カラム）を配置することで、測定手段を通過してしまった試料が、クロマトグラフィー装置から溶出しないようにすることができることから、この実施形態は溶出して消失することが望ましくない場合に特に好ましい。
【００９３】
本発明のクロマトグラフィー装置は、必要に応じて固定相を移動相が移動するときの条件を変更する手段をさらに備えていてもよい。そのような条件変更手段は、本発明のクロマトグラフィー装置において、第一の移動相が移動するときと、第二の移動相が移動するときとの間で、所望の条件パラメータ（例えば、温度、圧力）を変更することができる限り、どのような手段でも使用することができる。従って、温度を変更する手段としては、例えば、気体、液体、固体などの媒体を用いて加熱または冷却することが挙げられるがそれらに限定されない。
【００９４】
上述のような手段を用いて、移動相が移動するときの条件を変更することによって、１つの実施形態では、固定相の性質または形状が変化する。あるいは、この固定相の性質は変化しなくてもよい。別の実施形態では、移動相が移動するときの条件を変更することによって、移動相または分離されるべき試料の性質が変化してもよい。あるいは移動相および分離されるべき試料の性質は、変化しなくてもよい。移動相（例えば、溶離液）または分離されるべき試料の性質（特に、分離されるべき目的の標的物質）が変化する場合は、固定相の性質または形状は変化してもよいしほとんどもしくは全く変化しなくてもよい。このような移動相（例えば、溶離液）または分離されるべき試料は、例えば、温度、圧力、光、電流、溶媒の種類、水素イオン濃度、レーザー、溶媒密度、音波、磁場などに応答してその性質が変化し得る。
【００９５】
本発明のクロマトグラフィー装置および方法においては、外部からの刺激により固定相の形状または性質が変動し、かつ、移動相（例えば、溶離液）または試料（または分離されるべき標的物質）の性質がその刺激により変化してもよい。
【００９６】
固定相（例えば、充填剤）の性質または形状（極性または構造など）を変化させる際には、その性質はどのような状態からはじめてもよい。例えば、性質の変化が極性の変化の場合、Ｃ１８逆相系充填剤を含む固定相を用いるとき、先にその固定相（すなわち充填剤）を高温側の温度環境下において極性を疎水性にした環境下で、順方向に送液を行って試料の分離を行った後に、その固定相を低温側の温度環境下において極性を親水性にした環境下で、送液を反転させ逆方向で試料の分離を行ってもよい。あるいは、先に固定相を低温側の温度環境下において極性を親水性にした環境下で、順方向に移動相（例えば、溶離液）を行って試料の分離を行った後に、その固定相を高温側の温度環境下において極性を疎水性にした環境下、移動相（例えば、溶離液）を反転させ逆方向で試料の分離を行ってもよい。これは、試料の性質によって当業者が適宜決めることができる。例えば、逆相系の充填剤を使用する場合、試料としてイソフタル酸ジメチル、アニソールなどを用いると、高温側からスタートし、ベンゼン、トルエンなどを試料とする場合、低温から開始することが好ましい。
【００９７】
刺激により固定相または移動相（例えば、溶離液）もしくは分離されるべき試料（または標的物質）の性質を変化させる際、平衡に達するまでに時間が必要な刺激（例えば、温度など）を用いる場合には、固定相（例えば、カラム内の充填剤）の温度が目的とする温度に達するまでに時間を要するが、この際、移動相（例えば、溶離液）を移動させるための手段（例えば、ポンプ）は、止めても止めなくてもよいが、止める方が好ましい。ポンプを止めない場合には試料の拡散は小さくなるが、固定相の性質が変化するまでに移動相（例えば、溶離液）が反転しているので分離しようとする物質同士のカラム内での位置（溶出位置）が近づいてしまう欠点がある。一方、ポンプを止めるとカラム内での試料もしくは試料中の標的物質の拡散が生じやすくなる傾向があるが、実際には、数分以内であれば、拡散はほとんど起こらない。従って、この方法を用いるほうがより好ましい。ただし、拡散を防ぐためにポンプを停止する時間は極力短いほうがよい。そのような停止時間としては、例えば、カラム外径が１ｍｍ以上の場合には１秒以上、好ましくは１０秒以上、カラム外径が１ｍｍ未満の場合には、ポンプを止めなくてもよいが、好ましくは０．００１秒以上の時間が挙げられるがそれに限定されない。場合によってはポンプは停止させてもよい。刺激として温度を用いた場合には、移動相を移動させる手段（例えば、ポンプ）の圧力をモニターすることによって固定相（カラム内の充填剤）が温度平衡に達したかどうか判断することができる。
【００９８】
移動相の移動方向を変化（例えば、反転）させる位置は、分離対象となる試料がクロマトグラフィー装置から一部溶出してもかまわない。移動方向を変化（例えば、反転）する際の位置は、分離対象となる試料の中で、早く溶出する試料の直前であってもよいが、一部がクロマトグラフィー装置から溶出した位置であってもよい。本明細書において「一部がクロマトグラフィーから溶出した位置」とは、送液方向を逆転しても再びカラム内に試料が入らない位置のことをいう。試料が溶出する直前に反転する場合は、分離対象とする試料中に含まれるほぼ全物質を固定相内に残すことを意味しており、定量、定性または分取を行う場合に好ましい方法である。一方、対象とする試料の一部がクロマトグラフィー装置から溶出させることは、定性または分取を行う場合に適用する際に好ましい方法である。例えば、分離の対象となる試料の前後に高濃度の試料が溶出する場合、分離対象となる試料を分取する際に、高濃度試料のテーリングなどが原因でピークが重なってしまい、分離されるべき試料内の物質が混合物として分取することになる。そのような場合、対象とする試料および高濃度試料をクロマトグラフィー装置から溶出させなくとも移動方向の変化（例えば、反転）を行うことで、試料の溶出順序を逆転させ、高濃度試料の混入を最小限にすることができるが、高濃度試料をクロマトグラフィー装置から溶出させた方が分取対象試料に対する不純物の混入の機会をより低下させることができるのでより好ましい。高濃度試料がカラム内を早く溶出する場合、一部の高濃度試料をクロマトグラフィー装置から溶出させた後に、送液方向の反転を行い、最終的に不純物である高濃度試料に対する分離対象試料の感度を高め、より高分離を得ることができる。分離対象としている試料中の標的物質の前後に溶出する試料中の標的物質、すなわち、分離対象外の標的物質は、クロマトグラフィー装置から必ずしも溶出させる必要はないが、溶出させるほうが好ましい。
【００９９】
本発明の好ましい実施形態において、固定相（例えば、カラム内の充填剤）の形状または性質（例えば、極性、構造など）の変化および移動相の移動方向の変化（反転）は少なくとも１回行うことが好ましい。移動相の移動方向の変化の回数および固定相の性質または形状の変化の回数は、１回以上であれば何回でもよく、特に限定しない。
【０１００】
移動相の移動方向の変化（例えば、反転）の回数が多いほど、試料由来のピークの分離が進行するとともに分離対象とする試料中の物質同士の溶出時間差が大きくなる（すなわち、分離能が上がる）。固定相（例えば、カラム）内にこれらの試料を保持しておくことが意図される場合、本発明で使用するカラムは、長いほうが好ましい。マイクロチップ上に固定相を集積する場合には１ｎｍ以上、マイクロチップ上に固定相を集積しない場合には、１ｍｍ以上のカラム長であればよい。カラムの外径は、刺激による充填剤内の平衡を早くするために、細ければ細いほどよい。マイクロチップ上にカラムを集積する場合には１ｃｍ以下、マイクロチップ上に集積しない場合には、１ｍ以下の直径であればよい。そのようなマイクロチップを用いた分離の用途としては例えば、ＤＮＡ解析が挙げられる。そのような技術は、例えば、蛋白質  核酸  酵素ｖｏｌ．４５（２０００）７６−８５に詳述されている。この文献にも記載されているように、本発明の技術は、ナノチップテクノロジーにおいても十分応用可能である。上述のマイクロチップを作製する技術も当該分野において周知である。そのような技術は、例えば、蛋白質  核酸  酵素ｖｏｌ．４５（２０００）８６−９１に記載されている。また、マイクロクロマトグラフィーの技術は、例えば、高分解能クロマトグラフィー  化学の領域増刊１３８号  南江堂  波多野博行編４５〜５７を参照のこと。
【０１０１】
ある実施形態において、移動相の移動方向を変化（例えば、反転）させる方法は、流路スイッチングまたはカラムスイッチングを用いることが最も好ましいが、移動方向を変化（例えば、反転）させることができれば、特に限定はしない。
【０１０２】
流路スイッチングまたはカラムスイッチングを使用するとき、スイッチング装置から測定手段までの間の領域において、反転時には試料の一部が残っているので、この距離は可能な限り短くするか、または配管を細くすることが好ましい。
【０１０３】
測定手段からの信号による移動相の移動方向の変化を行うタイミング、移動方向を制御するための、例えば、カラムスイッチングなどのクロマトグラフィー装置の制御は、マニュアルで行ってもよいし、コンピュータ制御によるソフトウェアで行ってもよい。１つの実施形態では、コンピュータ制御によるソフトウェアによって行うことほうが好ましい。そのようなソフトウェアは、記録媒体に記録されて提供され得るが、アプリケーションサービスプロバイダ（ＡＳＭ）のような形態で提供されてもよい。記録媒体は、例えば、フレキシブルディスク、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、ＤＶＤ＋ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、メモリーカード、ハードディスクなどであり得るがそれらに限定されない。
【０１０４】
本発明をコンピュータを用いて実施する際の形態を図４を参照して説明する。図４は、本発明のコンピュータでの実行方法を示す。図４では、本発明のクロマトグラフィー方法の処理を実行するコンピュータの５００の構成例が示されている。
【０１０５】
コンピュータ５００は、入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４と、バス５０５とを備える。入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４とは、バス５０５によって相互に接続されている。入力部５０１と出力部５０３とは入出力装置５０６に接続されている。
【０１０６】
以下、コンピュータ５００によって実行されるクロマトグラフィー方法の処理の概略を説明する。
【０１０７】
クロマトグラフィー方法を実行させるプログラム（以下、選択プログラム）は、例えば、メモリ５０２に格納されている。あるいは、選択プログラムは、フレキシブルディスク、ＭＯ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭのような任意のタイプの記録媒体に記録され得る。あるいは、アプリケーションサーバに格納されていてもよい。そのような記録媒体に記録された選択プログラムは、出入力装置５０６（例えば、ディスクドライブ、ネットワーク（例えば、インターネット））を介してコンピュータ５００のメモリ５０４にロードされる。ＣＰＵ５０２が選択プログラムを実行することによって、コンピュータ５００は、本発明のクロマトグラフィー方法の処理を実行する装置として機能する。
【０１０８】
入力部５０１を介して、必要な情報、例えば、反転回数、反転ごとの温度、流速、反転開始時間などを入力する。
【０１０９】
ＣＰＵ５０２は、入力部５０１で入力された情報をもとに、クロマトグラフィー処理に関する実際のパラメータを計算し、メモリ５０４にそのパラメータを格納する。その後、ＣＰＵ５０２は、これらのパラメータをもとに出力部５０３を通じてクロマトグラフィー装置（示さず）に対して適切な命令を発信する。クロマトグラフィー装置から得られた分離に関する情報は、入力部５０１を通じてメモリ５０４に格納することもできる。
【０１１０】
上述のような方法では、マイクロチップを用いることもできる。そのような場合においても、本明細書において記載されるような技術的特徴を適用することができる
このようにマイクロチップを使用する場合などにおいて、チップ上にクロマトグラフィーを集積した”Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ”のようにカラム長を長くすることができないとき、本発明は特に威力を発揮する。チップ上にカラムを集積するので短いカラム長を持つカラムしか使用することができず分離度は高くならない。しかし、チップ上に集積したカラムは直径が小さく、昇温、下温等の外部刺激による充填剤の分離場の性質の変化が容易となるため、本発明は、特に顕著な効果を達成することができる。
【０１１１】
１つの実施形態において、本発明の方法または装置は、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ二次元クロマトグラフィー法と組み合わせて使用され得る。二本のカラムを使用したＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅクロマトグラフィーは高分離能が達成されるものの、分析時間が非常に長かった。本発明の原理を組み合わせることによって、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅクロマトグラフィーの高分解能を保ちあるいは改善しながら、分析時間も短縮することができる。使用され得るＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅクロマトグラフィーとしては、例えば、極性カラムおよび無極性カラムを用いたＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅクロマトグラフィー、ポリマーベースのアミノカラムとＯＤＳカラムとを組み合わせたシステム、シリカベースのアミノカラムとモノリスカラムとを組み合わせたシステムが挙げられるがそれに限定されない。
【０１１２】
本発明の方法、装置などは、単なる物質に関する分離、定性もしくは定量分析に使用され得ることはもちろん、その他の応用分野、例えば、診断、法医学、新規遺伝子の同定、薬物探索（医薬品のスクリーニング）および開発、分子生物学的分析（例えば、遺伝子配列分析）、タンパク質特性および機能の分析、薬理ゲノム学、プロテオミクス、環境調査ならびにさらなる生物学的、医学的、薬学的、農学的、物理学的および化学的な分析において使用され得る。
【０１１３】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１１４】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１１５】
【実施例】
次に、実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１１６】
（実施例１  逆相クロマトグラフィーを利用した例）
本実施例では、逆相クロマトグラフィーを用いて本発明の効果を実証した。
【０１１７】
逆相クロマトグラフィー用充填剤を充填した４．６φ×１５０ｍｍのカラムをＬＣ−１０ＡＤｖｐポンプ、ＳＣＬ−１０Ａｖｐシステムコントローラー、ＳＩＬ−１０ＡＦオートサンプラー、ＳＰＤ−Ｍ１０Ａｖｐフォトダイオードアレイ検出器（（株）島津製作所、京都府）、Ｎａｎｏｓｐａｃｅ  ＳＩ−２（（株）資生堂、東京都）から構成されたクロマトグラフィーシステムに接続した。なお、Ｎａｎｏｓｐａｃｅ  ＳＩ−２による流路スイッチングの模式図を図２に示した。
【０１１８】
試料として、イソフタル酸ジメチル、アニソールの混合物を用いた。溶離液として７５％のメタノール水溶液を用いた。クロマトグラフィーの適用において、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２５４ｎｍ、送液方向が順方向のときは温度４０℃、逆方向のときは温度３℃という条件で分析を行った。
【０１１９】
図３の（Ａ−１）に示したように、温度４０℃で順方向に送液した場合、すなわち、反転を全く行っていない場合には、２つのピークは部分的に重なり合い、このときの分離度は１．２８、溶出時間差は０．５０３分であった。温度４０℃のウォーターバス中で順方向に送液した後、５．９分後に送液方向を反転し、温度３℃の冷水中に温度平衡のために１分間ポンプを停止させた後、送液を行った後のクロマトグラムを示した。２つのピークの溶出順序は逆転し、アニソールのほうが先に溶出した。溶出時間差は０．３２９分、分離度は０．２７であった。また、２つのピークは、４０℃のときと比較して、溶出時間が近づいた。図３の（Ａ−２）に、４０℃で５．９分間順方向に送液した後、送液方向を反転し、温度３℃の冷水中で温度平衡のために１分間ポンプを止め、６．６分間送液を行った後、送液方向を反転、すなわちカラムに対して順方向に溶離液が流れるように流路スイッチングを行った後、４０℃のウォーターバス中にカラムを入れ、温度平衡のために１分間ポンプを止めた後、送液を開始し、分析した結果である。２つのピークが図３の（Ａ−１）と比較して分離し始め、その分離度は１．５９と増加した。溶出時間差は、０．７７６分であった。図３の（Ａ−４）に、反転を６回行ったときのクロマトグラムを示した。図３（Ａ−１）のクロマトグラムと比較すると明らかに２つのピークは分離し、その分離度は１．８９と大きく向上した。溶出時間差は１．２１３分となった。
【０１２０】
また、図３（Ｂ）に、反転回数と理論段数との関係を示した。反転回数が０回のときには、理論段数は５１００であったが、反転回数を６回とすると、理論段数は７２０００と大きく向上した。
【０１２１】
（実施例２：温度応答性高分子）
本実施例は、温度応答性高分子を使用した場合を実証する。
【０１２２】
試料として二種の化合物（ベンゼンおよびトルエン）を充填剤として温度応答性ポリマー結合した多孔質シリカを用いた場合を例として用いた。図１の模式図に示した多孔質シリカの表面に温度応答性ポリマーであるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を結合した充填剤を充填した。このカラムを液体クロマトグラフィー装置に接続した。図１の（Ｉ）に示したように、カラムの温度をポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ，  ｌｏｗ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）よりも高温（５０℃）にすると充填剤の分離場は疎水性となり、この状況下で、溶離液をカラムに対して正方向に送液した。疎水性になったことは、分離のパターンからも確認することができた。
【０１２３】
次に試料を導入すると、逆相クロマトグラフィーに類似の挙動で試料は分離し、より親水性の高い試料ベンゼン（溶出時間３．９２分）はカラム内を溶出し（カラムの右側）、より疎水性の高い試料トルエン（溶出時間４．５４分）はカラム内を遅く溶出（カラムの左側）した。再び試料導入を行い、試料がカラムから全て溶出する前（３．３分）に、図１の（ＩＩ）に示したように、カラムの温度をＬＣＳＴより数度低く（２０℃）設定することで、カラム内の充填剤の分離場を親水性とし、さらに、溶離液をカラムに対して逆方向に送液すると、カラムの左側の試料、すなわちより疎水性の高い試料トルエンはカラム内の分離場が親水性であるのでより早くカラム内を溶出し（７．２１分）、カラムの右側の試料、すなわちより親水性の高い試料ベンゼンは分離場が親水性であるのでよりカラム内を遅く溶出した（７．４１分）。
【０１２４】
さらに、図１の（ＩＩＩ）に示したように、カラムの温度をＬＣＳＴよりも高い５０℃に設定するとカラム内の充填剤の分離場は疎水性となる。ここで、溶離液の送液方向を逆転させカラムに対して正方向に送液すると、カラムの右側の試料、すなわち、より親水性の高い試料ベンゼンは、カラム内を早く溶出し（１０．１７分）、カラムの左側の試料、すなわち、より疎水性の高い試料トルエンは、カラム内を遅く溶出し（１３．４４分）、一度反転を行ったそきよりも２つの試料の分離はさらに進行した。
【０１２５】
ベンゼンの理論段数は、反転回数が０回の場合は３５８であったが、反転回数が２回になると１１７０となった。同様に、トルエンの理論段数は０回の場合には１６６であったが、２回になると５２４となった。このように反転回数の増加とともに２つの試料の分離は進行し、理論段数も大きくなった。
【０１２６】
このように、温度応答性高分子を使用した場合に、カラムの長さをそれほど要求することなく、高い分離能が達成されることが実証された。
【０１２７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【０１２８】
【発明の効果】
本発明のクロマトグラフィー技術およびそれに用いる装置は、固定相として使用するために限られた資源を用いて、ほぼ無限大の分離能を達成することができるという格別な効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、温度応答性高分子を用いたときのクロマトグラフィー分離の様子の１例を表す。
【図２】図２は、送液方向を逆転させることで見かけのカラム長を無限大にするための流露スイッチング方法の一例を示す。
【図３】図３は、本発明の反転送液型クロマトグラフィーによる分離の例を示す。
【図４】図４は、本発明のクロマトグラフィー分離技術をコンピュータシステムを用いて実施したときの実施例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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