(57)【要約】      （修正有）【課題】緑色組織における選択性の高いプロモーター及びそのようなプロモーターを容易に利用可能たらしめるベクターを提供する。【解決手段】(a)特定の配列塩基配列を有するDNA；(b)特定の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ緑色組織特異的発現能を有するイネ由来のDNA；又は(c)特定の塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つ緑色組織特異的発現能を有するイネ由来のDNAからなるプロモーター、並びに当該プロモーターを含むベクター及び当該ベクターを植物体に導入する遺伝子の発現方法。【選択図】図１
2004357517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ緑色組織特異的発現能を有するイネ由来のＤＮＡ；又は
（ｃ）配列番号１の塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つ緑色組織特異的発現能を有するイネ由来のＤＮＡ
からなるプロモーター。
【請求項２】
請求項１記載のプロモーターを含むベクター。
【請求項３】
請求項１記載のプロモーターと、その下流に連結された、緑色組織特異的に発現することが所望される遺伝子とを含むベクターを植物体に導入する工程を含む、緑色組織特異的な遺伝子の発現方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物における遺伝子発現のための新規なプロモーター及びベクター、並びに遺伝子の発現方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、植物に各種機能を付与するために、発現したい物質をコードする遺伝子を導入した、種々の形質転換植物が開発されている。
【０００３】
形質転換植物においては、導入した遺伝子が、植物の各種器官組織のうち、発現することが望まれるもののみにおいて発現することが求められる場合がある。例えば、イネのアントラニル酸合成酵素αサブユニット遺伝子ＯＳＡＳＡ１をアミノ酸置換により改変したＯＳＡＳＡ１Ｄ遺伝子（特許文献１参照）を導入することにより植物体のトリプトファン合成を増大させようとする場合、アミノ酸の多くを産生する部位である葉等の緑色組織において当該遺伝子が選択的に発現するようにすることができれば、作物の生育に過剰な負担をかけずにトリプトファン合成量を増やせることが期待される。
【０００４】
遺伝子を植物体に導入し発現させる際には、当該遺伝子と共に用いるプロモータの選択が、発現の効率を左右する。プロモーターは、その候補となるＤＮＡを、レポーター遺伝子と連結し、植物体におけるその発現を測定することにより探索しうる。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子は、これと連結してＧＵＳを発現しうるプロモーターが通常殆どの多様な他の遺伝子と連結してもその発現をもたらしうることから、プロモーターの探索のためのレポーター遺伝子としてよく用いられる。
【０００５】
これまで、緑色組織において選択的に発現するプロモーターとしては、例えば特許文献２において列挙されるものなどが知られているが、連結された遺伝子を発現させる能力が高く、且つ緑色組織における発現をより選択的に行なうプロモーターが求められている。
【０００６】
【特許文献１】
国際公開パンフレットＷＯ９９／１１８００号
【特許文献２】
米国特許明細書第６０３３８９１号
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、緑色組織における選択性の高いプロモーター及びそのようなプロモーターを容易に利用可能たらしめるベクターを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、（ａ）配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ；（ｂ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ緑色組織特異的発現能を有するイネ由来のＤＮＡ；又は（ｃ）配列番号１の塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つ緑色組織特異的発現能を有するイネ由来のＤＮＡからなるプロモーターが提供される。
【０００９】
また、本発明によれば、前記プロモーターを含むベクターが提供される。
【００１０】
さらに、本発明によれば、前記プロモーターと、その下流に連結された、緑色組織特異的に発現することが所望される遺伝子とを含むベクターを植物体に導入する工程を含む、緑色組織特異的な遺伝子の発現方法が提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のプロモーターは、（ａ）配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ；（ｂ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ緑色組織特異的発現能を有するＤＮＡ；又は（ｃ）配列番号１の塩基配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つ緑色組織特異的発現能を有するＤＮＡからなる。
【００１２】
前記（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡは、いずれも、イネ由来のものとすることができるが、これに限定されず、他の植物から同じ配列を切り出すこと等により得ても良く、また、化学的に合成することによって得てもよい。また前記（ｂ）のＤＮＡについての「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」するとは、標準的なハイブリダイゼーション条件下に、２つの核酸断片が互いにハイブリダイズできることを意味し、本条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡに記載されている。詳しくは、「ストリンジェントな条件」とは、０．１〜０．６ｘ、好ましくは０．４ｘのＳＳＣ中で約４５℃にてハイブリダイゼーションを行い、そして２ｘ  ＳＳＣによって５０℃にて洗浄することにより達成しうる。
【００１３】
本発明において「緑色組織特異的発現能を有する」プロモーターとは、同じ植物体の他の組織又は器官の少なくとも１種におけるよりも強く、緑色組織において遺伝子を発現させることができるプロモーターをいう。より具体的には、本発明のプロモーターに他の遺伝子を連結した場合、同一の遺伝子を例えば公知のユビキチンプロモーター（特許文献１参照）に連結した場合に比べて、緑色組織において遺伝子の発現が相対的に強く、その他の組織又は器官において遺伝子の発現が弱い場合、緑色組織特異的発現能を有するものとすることができる。
【００１４】
配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡの配列は、イネ染色体に含まれている配列であるので、イネ染色体ＤＮＡを鋳型として適当なプライマーを用いてＰＣＲ増幅をする等の公知の方法により得ることができるが、菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＲｂｃＡｃ−ＩｎｔｒｏｎＧＵＳ／ＸＬ−１（特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３７７として２００３年５月３０日に寄託されている）中のプラスミドに含まれるＤＮＡを、本発明のプロモーターとして簡便に用いることができる。
【００１５】
本発明のベクターは、その塩基配列中に、上記本発明のプロモーターを含む。本発明のベクターのそれ以外の部分の配列は、特に限定されないが、本発明のプロモーターにより緑色組織に特異的に発現することが所望される遺伝子を含むことができる他、さらにプロモーターと対になり用いられるターミネーター遺伝子、遺伝子発現の指標となるレポーター遺伝子、ベクターが導入された細胞を選別するための選抜マーカー遺伝子、本発明のプロモーターの発現に影響しない他の配列等を必要に応じて含むことができる。前記レポーター遺伝子としては、例えばβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）等を挙げることができる。前記ターミネーターとしては、ｎｏｓターミネーターなどを用いることができる。前記選抜マーカー遺伝子としては、広く用いられているＨＰＴ（ハイグロマイシン耐性発現遺伝子）、ＮＰＴＩＩ（カナマイシン耐性発現遺伝子）を、広く用いられているｐｎｏｓプロモーター、ｐ３５Ｓプロモーター等の各種の適当なプロモーター等と共に用いることができる。なお、本発明のベクターは、前記本発明のプロモーターの下流に緑色組織に特異的に発現することが所望される遺伝子を連結したものを含むことは勿論のこと、そのような遺伝子を連結していない状態のもの、例えばそのような遺伝子を連結していない状態で提供され、そのベクターを提供された入手者が所望の遺伝子を簡便に連結し緑色組織に特異的に発現させることができるようにしたものをも含む。さらに具体的には、前記本発明のプロモーターの下流に、繁用される制限酵素により認識されうる配列を有するようにしたベクターを好ましく挙げることができる。
【００１６】
本発明のベクターの調製方法は特に限定されないが、前記本発明のプロモーターを、公知のもの等の他のベクターに組み込むことにより調製できる他、上記菌株ＲｂｃＡｃ−ＩｎｔｒｏｎＧＵＳ／ＸＬ−１から常法により取得したものをそのまま、または必要に応じてプロモーターの下流の遺伝子を組みかえて得ることもできる。
【００１７】
本発明の遺伝子の発現方法では、前記本発明のプロモーターと、その下流に連結された、緑色組織特異的に発現することが所望される遺伝子とを含むベクターを植物体に導入する工程を含む。
【００１８】
導入対象の植物体は、イネを好ましく挙げることができる。また、緑色組織に特異的に発現することが所望される遺伝子は特に限定されないが、具体的には例えば、特定のアミノ酸の合成を増大させる遺伝子を緑色組織に特異的に発現させ、かかる遺伝子による植物体の稔性や生育力の低下等の不所望な影響を避けながら、アミノ酸の合成量だけを増大させることができる。より具体的には、例えば、イネのアントラニル酸合成酵素αサブユニット遺伝子ＯＳＡＳＡ１をアミノ酸置換により改変したＯＳＡＳＡ１Ｄ遺伝子（特許文献１参照）を導入することにより、緑色組織におけるトリプトファン合成を促進して、植物体のトリプトファン合成を増大させることができる。また、リーフディスク法等により、いわゆるカルスではなく緑色組織から植物体を再生する場合、本プロモーターに前記選抜マーカー遺伝子をつないで、形質転換体を得ることができる。また他に、病害抵抗性遺伝子を葉で発現させることで抵抗性を付与しうる。
【００１９】
ベクターを植物体に導入する方法は、特に限定されないが、例えば、ベクターで植物細胞カルスを形質転換し、形質転換カルスを植物体に分化させることにより行なうことができる。
【００２０】
植物細胞カルスの調製は、具体的には例えば、イネのカルスの場合以下の方法等により行うことができるがこれに限定されない。
イネの完熟種子から籾殻を除き、得られた外皮付きコメ種子をエタノール溶液で殺菌、次いで次亜塩素酸ナトリウムの希水溶液で殺菌し、さらに滅菌水で洗浄する。ＭＳ培地等にショ糖、植物ホルモンとしての２，４−Ｄ（２，４−ｄｉｃｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、寒天等を加えてなる組成のカルス形成用培地に、外皮付きコメ種子を置く。２８℃で、暗黒条件下で３０〜４０日間培養すると、イネカルスが形成される。そのカルスを種子から切取り形質転換用カルスを得ることができる。
【００２１】
次いで、ベクターによる植物細胞カルスの形質転換は、例えば、ベクターを、アグロバクテリウム法によりカルス細胞に導入することにより行なうことができる。アグロバクテリウム法においては、まず、宿主であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）への組み込みを行う。組み込みは公知のエレクトロポレーション法、凍結融解法、トリペアレントメルティング法等により行うことができる。得られたアグロバクテリウム細菌を、例えば、細胞工学別冊（モデル植物の実験プロトコール、９３〜９８頁、１９９６年、秀潤社発行）等にしたがって、前記調製したイネの細胞カルスと共存培養することにより、ベクターをイネの細胞カルスに導入することができる。
【００２２】
ベクターが導入されたカルスは、必要に応じて、ベクターに組み込まれた上記選抜マーカーに基く耐性等により選抜し、植物体に分化させ、植物体とすることができる。得られた植物体においては、緑色組織に特異的に、本発明のプロモーターの下流に連結された遺伝子が発現されうる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお、以下の実施例で行われる実験操作の手順は、特に記述しない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」第２版（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９年発行）に記載される方法に従った。
【００２４】
【実施例１】
（本発明のプロモーター及びベクターの調製）
イネ成葉由来のｃＤＮＡライブラリーを、プラスミド（ＨｙｂｒｉＺＡＰ２．１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて大腸菌に導入して形質転換した。この大腸菌を培地プレート当り５×１０３ｃｆｕとなるよう広げてコロニーを形成させた。これをコロニーハイブリダイゼーション用のメンブレンに転写し、膜上で溶菌、アルカリによるＤＮＡの変性、中和を経て、紫外線照射を行ない、膜に菌体のＤＮＡを固定した。
【００２５】
このメンブレンに対し、オリゴキャップ法で作成したイネ穂由来のｃＤＮＡを［α−Ｐ３２］ｄＣＴＰでラベルしたものをプローブとして用いコロニーハイブリダイゼーションを行なった。オートラジオグラフによりコロニーを検出した後、メンブレンフィルターから、穂由来ｃＤＮＡのハイブリダイズが検出された部分を取リ除いてから、さらにイネ成葉由来の全長ｃＤＮＡを同様にラベルしたものをプローブとして再度ハイブリダイゼーションを行なった。その結果、穂由来のプローブでは検出されず、葉由来のプローブでのみ検出されるクローンが見出された。このクローン４つを選び、プラスミドを抽出し、ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し塩基配列を決定したところ、それらのうち３つがＲｕｂｉｓｃｏ  ａｃｔｉｖａｓｅ遺伝子由来のｃＤＮＡであることが判明した。この配列を元にイネゲノム配列のデータベースを検索した結果、この遺伝子のゲノミックシーケンス情報が得られた。このｃＤＮＡ配列とゲノミックシーケンスをもとに、５’ＲＡＣＥ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｃｏｒｅ  ｋｉｔの使用手順に従った）により、転写開始点を決定し、さらにＲｕｂｉｓｃｏ  ａｃｔｉｖａｓｅのプロモーター領域を、配列番号１の通り同定した。
【００２６】
このプロモーター領域をＰＣＲにより増幅すべく、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ認識部位の配列を持たせた下記配列のプライマーＡ（配列番号２）及びプライマーＢ（配列番号３）を常法により合成した。
プライマーＡ：ＣＣＡＡＴ  ＴＣＡＣＣ  ＡＣＡＡＧ  ＣＴＴＣＴ  ＴＡＡＴＴ（配列番号２）
プライマーＢ：ＡＡＧＴＣ  ＧＡＴＧＡ  ＴＴＧＴＡ  ＧＡＧＧＡ  ＴＣＡＣＴ  Ｇ（配列番号３）
イネより得た染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーＡ及びＢを用い、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼによるＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲを行ない、配列番号１のプロモーターの両端に制限酵素認識部位を有するＤＮＡを増幅した。
【００２７】
増幅したＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで処理した。一方、ｐｎｏｓプロモーター、その下流に連結されたカナマイシン耐性を発現する配列（ＮＰＴＩＩ）、ＧＵＳ遺伝子領域、ｐ３５Ｓプロモーター、その下流に連結されたハイグロマイシン耐性を発現する配列（ＨＰＴ）、ｎｏｓターミネーター等を含む１５ｋｂサイズの公知のベクターｐＩＧ１２１−Ｈｍを同様にＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化した。これらをライゲーションし、ｐＩＧ１２１−ＨｍのＧＵＳ遺伝子領域の上流に、配列番号１のプロモーターを連結したプラスミドｐＲｂｃＡｃ−Ｉｎｔｒｏｎ  ＧＵＳベクター（図１参照）を得た。このプラスミドを、大腸菌に導入した菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ  ＲｂｃＡｃ−Ｉｎｔｒｏｎ  ＧＵＳ／ＸＬ−１として、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３７７として２００３年５月３０日に寄託した。
【００２８】
【実施例２】
（本発明のベクターをアグロバクテリウムＥＨＡ１０１に導入）
（１）ＬＢ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエクストラクト５ｇ／ｌ及びＮａＣｌ  ５ｇ、１Ｎ  ＮａＯＨ  ２ｍｌ）の液体培地３００ｍｌにアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０１（ＡＴＣＣ５３４８７として公衆により利用可能）を移植し、２８℃で６時間振とう培養し、菌液を得た。
（２）５０ｍｌのＹＥＢ培地（１Ｌあたり、バクトペプトン５ｇ、ビーフエキストラクト５ｇ、バクトイーストエキストラクト１ｇ、ショ糖５ｇ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．２）を入れたフラスコに（１）の菌液を０．５ｍｌ加え、３０℃で約９時間振とう培養した。
（３）遠心管に移し氷冷した後、６０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心し上清を除き、氷冷した１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５を２５ｍｌ加えて懸濁した。
（４）（３）の懸濁液を、再び同じ条件で遠心後、上清を除き、０．５ｍｌのＹＥＢ培地に懸濁した。
（５）エッペンドルフチューブで、実施例１で得たプラスミドｐＲｂｃＡｃ−Ｉｎｔｒｏｎ  ＧＵＳベクター５μｇを含むＹＥＢ培地０．１ｍｌと（４）で得た懸濁液０．２ｍｌとを混合した。
（６）液体窒素中に５分間静置し、凍結させた後、３７℃の恒温槽に２５分間静置し融解させた。この操作を２〜３回繰返した。
（７）１６ｍｌのＹＥＢ培地を含む３００ｍｌのフラスコに移し３０℃で約２時間振とう培養後、２００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１．５％の寒天Ｌブロスに広げた。３０℃で２日間静置培養した（０．２ｍｌで約２０コロニーが得られた）。
（８）得られたコロニーを上記の抗生物質を含む寒天Ｌブロス上にストリークし、単コロニーを取り再度同じ操作を行ない、単コロニーを純化し、組換えベクターが導入された形質転換アグロバクテリウムを得た。
【００２９】
（形質転換アグロバクテリウムをイネに導入）
（９）イネ（品種名「日本晴」、完熟種子）を殺菌して、２Ｎ６培地（Ｎ６基本培地に、カサミノ酸２ｇ／ｌ及び２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）２ｍｇ／ｌを添加したもの）に置床し、３週間後に誘導されたカルスを新しい２Ｎ６培地に移し、さらに１週間培養した。
【００３０】
（１０）上記（８）で調製したアグロバクテリウムをＡＡ培地の無機塩組成にショ糖２０ｇ／ｌ、２，４−Ｄ  ２ｍｇ／ｌ、カイネチン０．２ｍｇ／ｌ及びアセトシリンゴン１０ｍｇ／ｌを添加してなる液体培地３０ｍｌに懸濁し菌液を得た。この懸濁液を５０ｍｌのチューブに入れ、上記（２）で得たカルスを入れた後、５分間浸漬した。浸漬後、ペーパータオルで余分な菌液を除去した。Ｎ６培地の無機塩組成にショ糖３０ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｌ、２，４−Ｄ  ２ｍｇ／ｌ、カサミノ酸２ｇ／ｌ、ゲルライト２ｇ／ｌ及びアセトシリンゴン１０ｍｇ／ｌを添加してなる固体培地に、上記の浸漬したカルスを置床した。２４℃で３日間、暗黒下で培養し、イネのカルスへのアグロバクテリウムの感染を行った。感染終了後、カルスを滅菌水及び５００ｍｌ／ｌカルベニシリン溶液で洗浄し菌を除去した。
【００３１】
（１１）Ｎ６基本培地に、３５ｍｇ／ｌハイグロマイシンを添加した選抜培地に、カルス小片を置床し、２８℃で３週間培養し１次選抜を行った。増殖してきたカルスを新しい選抜培地に置床し、２８℃で３週間培養し２次選抜を行った。ここで増殖の見られたカルスを、再分化培地（ＭＳ基本培地にベンジルアデニン（ＢＡ）２ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）１ｍｇ／ｌを添加したもの）に移植し２週間培養したところ、緑色スポットが誘導された。これをさらにホルモン無添加培地で２週間培養して、シュートを形成させた。これをさらに、培養土の入ったカップに移し、閉鎖系温室（湿度６０％、２８℃）で生育させ、植物体を得た。
【００３２】
（１２）上記（１１）で得られた植物体から葉を採取し、その葉５０ｍｇを１．５ｍｌ容のマイクロチューブに入れた。抽出バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，  ２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．５％  ＳＤＳ）を０．３ｍｌ加え、これを磨砕した。３０分間静置後１５，０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた上精に等量のイソプロパノールを加え転倒撹拌し、１５，０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られたＤＮＡの沈澱を７０％エタノールでリンスした後、減圧下で乾燥した。１００  μｌの１／１０ＴＥ緩衝液にＤＮＡペレットを溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
【００３３】
（１３）実施例１で用いたプライマーＡ及びＢの各１μＭをプライマーとして用い且つ上記（１２）で得たＤＮＡ  ７．５μｇをテンプレートとして用い、これらを増幅用反応液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％ゼラチン、ｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニットを含む）１００μｌに加え、増幅反応を行った。用いた増幅反応液は、ＰＣＲキット（ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製））で調製した。
増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムズ社製））内で、変性９４℃、１分、アニーリング５５℃、３０秒、伸張７２℃、１分の３つの反応操作を３０回繰り返すことによって実施した。得られた反応液を、常法によりアガロース電気泳動により分析し、配列番号１のプロモーターの増幅によるＤＮＡ断片に由来するバンドの存在を確認した。
【００３４】
【実施例３】
（葉におけるＧＵＳ遺伝子の選択的発現の評価）
実施例２（１１）で選抜したカルス片１００ｍｇ、又は実施例２（１１）で得た植物体の成葉５０ｍｇに、３００μｌのＧＵＳ染色液（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）０．５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０、２０％メタノール、及び０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）を入れ、６０分間脱気してから、３７℃で２４時間インキュベートした後、染色液を除去し、１００％エタノール１０００μｌを加えて反応を停止させ、反応液の色を目視で確認した。測定は、８系統の形質転換体について行なった。それぞれの結果を表１に示す。
【００３５】
【実施例４】
（葉におけるＧＵＳ遺伝子の発現の定量的測定）
実施例２（１１）で得た植物体の成葉１００ｍｇを、液体窒素にて破砕した後、抽出バッファー（５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％  Ｎ−ラウロイルサルコシネートを含む）と混和した。これを１２０００ｒｐｍで遠心分離した後、上清を１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに移した。この上清１０μｌと、９０μｌの蛍光アッセイバッファー（１ｍＭ  ４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド；４ＭＵＧ）とを混和後３７℃で３０分間インキュベートした。９００μｌの停止反応液（０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３）を加え混和後、蛍光度計（励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４４５ｎｍ）で測定し、０、１０、１００及び１０００ｎＭの４−ＭＵ（４−メチルウンベリフェロン）を標準として４−ＭＵ量を求め、また、各抽出液中のタンパク質量をブラッドフォード法により定量し、ＧＵＳ活性（ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク）を求めた。結果を表１に示す。
【００３６】
【比較例１】
本発明のプロモーターの代わりに、公知のユビキチンプロモーターをつないだベクターを用いた他は、実施例２と同様に形質転換及びカルス選抜を行ない、植物体を得た。このカルス及び植物体について、実施例３及び４と同様にＧＵＳの発現を調べた。測定は、４つの形質転換体系統について行なった。結果を表１に示す。
【００３７】
【比較例２】
形質転換をしていないイネ（日本晴）について、実施例３及び４と同様にＧＵＳの発現を調べた。結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
2004357517.tif 000003
【００３９】
【発明の効果】
本発明のプロモーター及びベクター並びに本発明の遺伝子の発現方法は、緑色組織特異的に遺伝子を発現させることができ、しかもその発現力が、組織非特異的だが強力なプロモーターとして知られているユビキチンプロモーターを用いた場合に比べても非常に強い。したがって、植物体の稔性や生育力の低下等の不所望な影響を避け、作物の生育に過剰な負担をかけずに緑色組織において顕著に遺伝子を発現させうる。
【００４０】
【配列表】
2004357517.tif 000004
2004357517.tif 000005
2004357517.tif 000006
2004357517.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において得た、本発明のプロモーターを含むベクターの概略図である。
【図１】
2004357517.tif 000008