(57)【要約】【課題】　新規のＶＥＧＦ阻害剤及びそれを有効成分として含む制ガン剤、新規の選択的ＣＯＸ−２阻害剤及びそれを有効成分として含む抗炎症剤及び制ガン剤の提供。【解決手段】　下記一般式（１）【化１】2004115504.tif 000021［式中、Ｒ１およびＲ２は、フェニル基；複素環基；フェニル基または複素環基の少なくとも１つの水素原子が、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、Ｒ３-Ｓ-基（ただし、Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基を表す）からなる群から選択される基またはハロゲン原子によって置換された基を表し、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ同一かまたは異なる基である］によって表されるＶＥＧＦ阻害剤及びそれを有効成分として含む制ガン剤、新規の選択的ＣＯＸ−２阻害剤及びそれを有効成分として含む抗炎症剤及び制ガン剤。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　下記一般式（１）
【化１】
2004115504.tif 000015
［式中、Ｒ１およびＲ２は、フェニル基；複素環基；フェニル基または複素環基の少なくとも１つの水素原子が、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、Ｒ３-Ｓ-基（ただし、Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基を表す）からなる群から選択される基またはハロゲン原子によって置換された基を表し、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ同一かまたは異なる基である］によって表される血管内皮細胞増殖因子阻害剤。
【請求項２】
　前記Ｒ１およびＲ２が、フェニル基の少なくとも１つの水素原子が、ヒドロキシ基またはメトキシ基によって置換された基である請求項１記載の血管内皮細胞増殖因子阻害剤。
【請求項３】
　下記式（２）または（３）
【化２】
2004115504.tif 000016
【化３】
2004115504.tif 000017
で表される請求項１または２に記載の血管内皮細胞増殖因子阻害剤。
【請求項４】
　請求項１〜３のいずれかに記載の血管内皮細胞増殖因子阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする制ガン剤。
【請求項５】
　下記一般式（１）
【化４】
2004115504.tif 000018
［式中、Ｒ１およびＲ２は、フェニル基；複素環基；フェニル基または複素環基の少なくとも１つの水素原子が、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、Ｒ３-Ｓ-基（ただし、Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基を表す）からなる群から選択される基またはハロゲン原子によって置換された基を表し、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ同一かまたは異なる基である］によって表されるＣＯＸ−２阻害剤。
【請求項６】
　前記Ｒ１およびＲ２が、フェニル基の少なくとも１つの水素原子が、ヒドロキシ基またはメトキシ基によって置換された基である請求項５記載のＣＯＸ−２阻害剤。
【請求項７】
　下記式（２）または（３）
【化５】
2004115504.tif 000019
【化６】
2004115504.tif 000020
で表される請求項５または６に記載のＣＯＸ−２阻害剤。
【請求項８】
　請求項５〜７のいずれかに記載のＣＯＸ−２阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする抗炎症剤。
【請求項９】
　請求項５〜７のいずれかに記載のＣＯＸ−２阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする制ガン剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、血管内皮細胞増殖因子阻害剤及びそれを有効成分として含む制ガン剤、ＣＯＸ−２阻害剤及びそれを有効成分として含む抗炎症剤と制ガン剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
　生体内で免疫応答時などに発現するサイトカインのひとつにＩＬ-１βがある。ＩＬ-１βは主に単球、マクロファージ及びその類縁細胞がエンドトキシン（ＬＰＳ）やウイルスの刺激を受けることにより産生され、視床下部体温調節中枢や血管内皮細胞などの組織内でのプロスタグランジンＥ２（以下、ＰＧＥ２と略記する）産生の亢進や破骨細胞の活性化を起こす。その結果、発熱や組織障害、ブラジキニンによる発痛の増強などの炎症反応や骨吸収の促進などが惹起される。そのためＩＬ-１βは関節リウマチや骨粗鬆症などの疾患との関与が示唆されている（例えば、非特許文献１，２参照）。
【０００３】
　従ってＩＬ-１βによるＰＧＥ２産生を阻害する物質は、ＰＧＥ２と関連して起こる炎症反応や疾患を予防及び治療するための医薬材料として有効である可能性があり、新規のＩＬ-１β誘導性ＰＧＥ２産生阻害物質が探求されている。本発明者らは、ＩＬ-１β誘導性ＰＧＥ２の産生阻害活性を有する物質を種々探索した結果、偶然にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ．の酢酸エチル抽出エキス中に強いＰＧＥ２産生阻害活性を有する物質を見出し、該物質を単離、同定した。
【０００４】
　本発明の式（１）で表される化合物のうち、式（２），（３）で表される化合物は、キサントシリンＸモノメチルエーテル、キサントシリンＸジメチルエーテルとして周知であるが、後述するように該化合物が血管内皮細胞増殖因子の阻害活性を有するとともに、ＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）の阻害活性を有していることは従来知られておらず、新規の事項である。
　キサントシリンＸ及びその誘導体は抗菌作用を有するため抗菌剤、あるいは抗ウイルス剤などとして用いられている他、キサントシリンＸモノメチルエーテルを有効成分とする駆虫剤も提案されている（例えば、特許文献１参照）。またキサントシリンＸ及びその類縁化合物がアロマターゼ阻害効果を有することから、該化合物をアロマターゼ阻害剤およびホルモン依存性疾患治療剤として用いることが提案されている（例えば、特許文献２参照）。また該物質およびその製造方法については、特許文献２の中で引用されている文献（非特許文献３〜６参照）等に記載されている。さらに、キサントシリンＸモノメチルエーテルはプロスタグランジン合成の阻害剤であることが知られている（非特許文献７参照）。
【非特許文献１】上野晃憲、大石幸子、「炎症・アレルギーとプロスタノイド（１）炎症」、日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）, 117, 255-261(2001)
【非特許文献２】岩倉洋一郎、「関節炎発症におけるＩＬ−１の役割」、最新医学、５７巻、４号、16(840)〜24(848)頁、2002.4
【特許文献１】特開平２−４０３２４号公報
【特許文献２】特開平７−６９８８３号公報
【非特許文献３】Pharmazie 12, 567-580(1957),The Merck Index 第10版 第9873項
【非特許文献４】J.Antibiotics 21, 587-591(1968)
【非特許文献５】J.Antibiotics 21, 671-679(1968)
【非特許文献６】J.Antibiotics 46,687-688(1993)
【非特許文献７】J. Antibiotics Vol.XXXIV No.12, 1556-1561(1981)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　近年、ガンの増殖において血管内皮細胞増殖因子（以下、ＶＥＧＦと記す）などの血管新生促進因子の役割と、血管新生を抑制してガンの増殖を抑制する研究が注目されている。すなわち、ガンの治療にＶＥＧＦ阻害剤を用いることで、ガンの血管新生を阻害し、ガンの増殖を阻止しようとする新しい治療法が確立されつつある。したがって、この新しいガンの治療の分野において、安全性が高く有効なＶＥＧＦ阻害剤の提供が望まれている。
【０００６】
　また、ＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）は炎症性細胞内に存在し、プロスタグランジンを合成する酵素として知られている。またＣＯＸ−２により産生されるプロスタグランジンは、ガン細胞の血管新生を誘導することが指摘されている。ＣＯＸ−２はヒトの大腸ガン、乳ガン、前立腺ガン、肺ガン等のガン細胞中に発現していることが見出されている。したがってＣＯＸ−２の活性を阻害するか又はその発現を阻害することで、ガンの血管新生を阻害し、ガンの増殖を阻止できる。一方、恒常型のＣＯＸ−１は正常な組織にも広く存在し、正常な生理機能において重要な役割を果たしているので、ＣＯＸ−１を阻害することは望ましくない。したがって、新しいガンの治療の分野において、または新しい抗炎症剤の開発分野において、ＣＯＸ−２を選択的に阻害する、安全性が高く有効な選択的ＣＯＸ−２阻害剤の提供が望まれている。
【０００７】
　本発明は、新規なＶＥＧＦ阻害剤とそれを含む制ガン剤、ＣＯＸ−２阻害剤とそれを含む抗炎症剤及び制ガン剤の提供を目的する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
　本発明は前記目的を達成するため、下記一般式（１）
【０００９】
【化１】
2004115504.tif 000002
【００１０】
［式中、Ｒ１およびＲ２は、フェニル基；複素環基；フェニル基または複素環基の少なくとも１つの水素原子が、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、Ｒ３-Ｓ-基（ただし、Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基を表す）からなる群から選択される基またはハロゲン原子によって置換された基を表し、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ同一かまたは異なる基である］によって表される血管内皮細胞増殖因子阻害剤を提供する。
　本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤は、前記Ｒ１およびＲ２が、フェニル基の少なくとも１つの水素原子が、ヒドロキシ基またはメトキシ基によって置換された基であることが好ましい。
　また本発明の血管内皮細胞増殖因子阻害剤は、下記式（２）または（３）
【００１１】
【化２】
2004115504.tif 000003
【００１２】
【化３】
2004115504.tif 000004
【００１３】
で表される化合物であることが好ましい。
【００１４】
　また本発明は、血管内皮細胞増殖因子阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする制ガン剤を提供する。
【００１５】
　さらに本発明は、下記一般式（１）
【００１６】
【化４】
2004115504.tif 000005
【００１７】
［式中、Ｒ１およびＲ２は、フェニル基；複素環基；フェニル基または複素環基の少なくとも１つの水素原子が、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、Ｒ３-Ｓ-基（ただし、Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基を表す）からなる群から選択される基またはハロゲン原子によって置換された基を表し、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ同一かまたは異なる基である］によって表されるＣＯＸ−２阻害剤を提供する。
　本発明のＣＯＸ−２阻害剤は、前記Ｒ１およびＲ２が、フェニル基の少なくとも１つの水素原子が、ヒドロキシ基またはメトキシ基によって置換された基であることが好ましい。
　また本発明のＣＯＸ−２阻害剤は、下記式（２）または（３）
【００１８】
【化５】
2004115504.tif 000006
【００１９】
【化６】
2004115504.tif 000007
【００２０】
で表される化合物であることが好ましい。
【００２１】
　また本発明は、前記ＣＯＸ−２阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする抗炎症剤を提供する。
【００２２】
　さらに本発明は、前記ＣＯＸ−２阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする制ガン剤を提供する。
【発明の効果】
【００２３】
　本発明によれば、新規のＶＥＧＦ阻害剤及びそれを有効成分として含む制ガン剤、新規の選択的ＣＯＸ−２阻害剤及びそれを有効成分として含む抗炎症剤及び制ガン剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
　本発明者らは、ＩＬ-１β誘導性ＰＧＥ２の産生阻害活性を有する物質を種々探索した結果、偶然にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ．の酢酸エチル抽出エキス中に強いＰＧＥ２産生阻害活性を有する物質を見出し、該物質を単離、同定した。この物質はキサントシリンＸジメチルエーテル、キサントシリンＸモノメチルエーテルとして公知の化合物であった。さらに本発明者らは、この物質がＶＥＧＦ阻害活性と、選択的なＣＯＸ−２阻害活性とを有していることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明のＶＥＧＦ阻害剤とＣＯＸ−２阻害剤は、下記一般式（１）
【００２５】
【化７】
2004115504.tif 000008
【００２６】
［式中、Ｒ１およびＲ２は、フェニル基；複素環基；フェニル基または複素環基の少なくとも１つの水素原子が、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、Ｒ３-Ｓ-基（ただし、Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基を表す）からなる群から選択される基またはハロゲン原子によって置換された基を表し、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ同一かまたは異なる基である］によって表される。前記式（１）で表される化合物の中でも、前記Ｒ１およびＲ２は、フェニル基の少なくとも１つの水素原子が、ヒドロキシ基またはメトキシ基によって置換された基であることが好ましく、例えば下記式（２）または（３）
【００２７】
【化８】
2004115504.tif 000009
【００２８】
【化９】
2004115504.tif 000010
【００２９】
で表される化合物が好適に用いられる。また、本発明の一般式（１）で表される化合物は、塩酸、リン酸、有機酸、金属イオン等と薬理的に許容される塩を形成し得る。本発明のＶＥＧＦ阻害剤及び選択的ＣＯＸ−２阻害剤は、このような薬理学的に許容される塩の形態となった一般式（１）で表される化合物をも包含する。
【００３０】
　本発明の一般式（１）で示される化合物のうち、式（２）で表される化合物はキサントシリンＸモノメチルエーテルとして、また式（３）で表される化合物はキサントシリンＸジメチルエーテルとして、さらに式（３）中の-ＯＣＨ３基が-ＯＨ基になった化合物はキサントシリンＸとして、それぞれ公知の化合物である。これらの化合物は、例えばキサントシリンＸは、ＶＥＢ Arzneimitiel werkDresden 社でBrevicidの商品名で製造されている (Pharmazie 12, 567-580(1957),The Merck Index 第10版 第9873項参照） 。また、これらの誘導体も従来よく知られている（同上誌) 。さらに、これらの化合物を、微生物より得る方法としては、Dichotomomyces albus Saitoを培養して培養液中からキサントシリンＸモノメチルエーテルを単離精製する方法〔J.Antibiotics 21, 587-591(1968) 〕、Aspergillus sp.(StrainNo.208又はNo.98)を用いてキサントシリンＸジエチルエーテル及びキサントシリンＸジメチルエーテルを単離する方法〔J.Antibiotics 21, 671-679(1968)〕あるいはAspergillus sp. No. FA 2692 を培養してキサントシリンＸモノメチルエーテル硫酸エステルを単離精製する方法〔J.Antibiotics 46,687-688(1993)〕等が知られている。従って、該化合物は公知の方法によって得ることができ、また全合成化学的ないし半合成化学的な製造方法によって作製できる。
【００３１】
　本発明の前記一般式（１）で表されるＶＥＧＦ阻害剤は、ヒト及びその他哺乳動物においてＶＥＧＦの産生を阻害する（後述する実験３参照）。ＶＥＧＦはガンの増殖に関与しており、ガン細胞はＶＥＧＦを産生して周囲の血管を新生し、増殖に必要な酸素や栄養分を得ている。したがって、ＶＥＧＦを阻害できれば、ガンによる血管新生が抑制され、ガンの増殖は阻止される。このようにＶＥＧＦ阻害活性を有する物質は、ガンの増殖を阻止し得る制ガン剤として用いることができる。
【００３２】
　また、本発明の前記一般式（１）で表されるＣＯＸ−２阻害剤は、ヒト及びその他の哺乳動物においてＣＯＸ−２を阻害（後述する実験４参照）し、ＣＯＸ−２によるプロスタグランジン産生を阻害する（後述する実験２参照）。ＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）は炎症性細胞内に存在し、プロスタグランジンを合成する酵素として知られている。ＣＯＸ−２により産生されるプロスタグランジンは、ガン細胞の血管新生を誘導することが指摘されている。ＣＯＸ−２はヒトの大腸ガン、乳ガン、前立腺ガン、肺ガン等のガン細胞中に発現していることが見出されている。したがってＣＯＸ−２の活性を阻害するか又はその発現を阻害することで、ガンの血管新生を阻害し、ガンの増殖を阻止できる。一方、恒常型のＣＯＸ−１は正常な組織にも広く存在し、正常な生理機能において重要な役割を果たしているので、ＣＯＸ−１を阻害することは望ましくない。したがって、ＣＯＸ−１を阻害せずにＣＯＸ−２を阻害する選択的ＣＯＸ−２阻害剤は、安全性が高く有効な抗炎症剤及び制ガン剤として用いることができる。
【００３３】
　この前記一般式（１）で表されるＶＥＧＦ阻害剤阻害剤を有効成分として含む本発明の制ガン剤及びＣＯＸ−２阻害剤を有効成分として含む抗炎症剤及び制ガン剤は、常法により錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、注射剤、吸入剤等の製剤形態、または軟膏、塗布液等の皮膚外用剤等の製剤とすることができ、経口または非経口投与により抗炎症剤として臨床に供し得る。投与量は治療するべき症状及び投与方法により左右されるが、通常は、成人１日あたり１μｇから１０ｇを単一投与または１日数回に分けて投与することができる。
【００３４】
　前記のように経口投与の製剤形態としては、錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤などがあり、これらの製剤には製薬上許容される賦形剤として、澱粉、乳糖、マンニット、エチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が配合され、滑沢剤としてステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウムが添加される。またゼラチン、アラビアゴム、セルロースエステル、ポリビニルピロリドン等を結合剤として用い得る。注射剤、吸入剤、外用剤等の非経口のための製剤としては無菌の水性または非水性の溶剤、または乳濁剤があげられる。非水性の溶液剤または懸濁剤の基剤としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、オリーブ油、コーン油、オレイン酸エチル等が用いられる。一方、坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴール等を用いることができる。
　以下、実施例により本発明の作用効果を実証する。
【実施例】
【００３５】
（実施例１及び２）
　前記式（２）で表される化合物（キサントシリンＸモノメチルエーテル）を実施例１の化合物、前記式（３）で表される化合物（キサントシリンＸジメチルエーテル）を実施例２の化合物として用いた。
【００３６】
［実験１：細胞増殖に及ぼす作用の確認］
　５．０×１０４cells／ｍＬ　１０％血清添加培地（ＦＢＳ添加α-ＭＥＭ）に調製した正常ヒト皮膚線維芽細胞（４次培養、クラボウ社製）の懸濁液に実施例１および２を添加し、９６ウェルマルチウェルプレート（ＢＤ Biosciences社製）に細胞を播種した。３７℃で７２時間培養後に細胞を洗浄し、Cell counting kit（DOJINDO社製）溶液を加えて発色させ、プレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１に示す。
　図１に示すグラフより、実施例１および実施例２の化合物は、１００ｎｇ／ｍＬの濃度において正常な細胞の増殖に影響を及ぼさないことが確認された。
【００３７】
［実験２：ＰＧＥ２産生阻害活性の確認］
　正常ヒト線維芽細胞を１０％ＦＢＳ-αＭＥＭを用いて４８穴マルチプレートに１×１０４個／２５０μＬの細胞密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の条件下でコンフルエントになるまで培養した。コンフルエント後、０．５％ＦＢＳ-αＭＥＭを用いて４８時間低血清培養を行った。
　その後、ＩＬ−１β（刺激物質）１ｎｇ／ｍＬ及び実施例１及び実施例２を下記表１中に記した各濃度で含む０．５％ＦＢＳ-αＭＥＭへと培地の交換を行い、薬剤処理として２４時間培養した。培養後回収した培地上清中のＰＧＥ２の産生量をＥＬＩＳＡ（Amersham Pharmacia Biotech社製、商品名Prostaglandin E２ Assayキットを使用して製造者の指示に従って測定）にて定量した。
　また、ＰＧＥ２産生阻害剤として周知の物質である下記式
【００３８】
【化１０】
2004115504.tif 000011
【００３９】
で表される化合物（以下、ＮＳ-３９８と記す、ケイマン社製の市販品を使用）を参考例として用い、実施例１，２と同様のアッセイを行った。
【００４０】
　それぞれの結果は、コントロール（ＩＬ-１β１ｎｇ／ｍＬ処理群）に対する阻害率（％）として、平均値±標準誤差で示し、スチューデントｔ検定（Student's t-test）を行った。結果を下記表１にまとめて記す。
【００４１】
【表１】
2004115504.tif 000012
【００４２】
　表１に示した結果から、本発明に係る実施例１，実施例２の各化合物は、参考例（ＮＳ-３９８）と同様にＩＬ−１βの刺激により誘発された細胞のＰＧＥ２産生を阻害したことから、参考例と同様の作用機序によりＩＬ-１β誘導性ＰＧＥ２の産生阻害活性を有していると示唆される。
　実施例１，２の化合物は、それぞれＩＣ５０が１６．６ｎＭおよび６３．３ｎＭという強いＰＧＥ２の産生阻害活性を有していることが実証された。
【００４３】
［実験３：ＶＥＧＦ阻害活性の確認］
　正常ヒト線維芽細胞を１０％ＦＢＳ添加α-ＭＥＭを用いて４８ウェルマルチウェルプレートに１×１０４個／２５０μＬの濃度で播種した。コンフルエントに達した正常ヒト線維芽細胞を０．５％ＦＢＳ添加α-ＭＥＭに４８時間置換し、ＩＬ-１β １ｎｇ／ｍＬとともに実施例１および２の化合物を処理した。ポジティブコントロールにＣＯＸ−２選択的阻害剤であるＮＳ−３９８（ＮＳ）を用いた。２４時間後に培養上清を回収し、培養上清中のＶＥＧＦ産生量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Systems社製、商品名Quantikine VEGF kit）で測定した。結果は、被験薬刺激群の各液性因子産生量をＩＬ-１β単独刺激群に対する阻害率として平均値±標準誤差(S.E.)で示し、スチューデントｔ検定（Student's t-test）を行った。結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】
2004115504.tif 000013
【００４５】
　表２の結果から、実施例１，２の化合物は、正常細胞の増殖に影響を及ぼさない濃度（実験１参照）において、優れたＶＥＧＦ阻害活性を有しており、ＶＥＧＦ阻害剤として有用であることが確認された。
【００４６】
［実験４：選択的ＣＯＸ−２阻害活性の確認］
　６０ｍｍ dishに播種しコンフルエントに達した正常ヒト皮膚線維芽細胞に、ＮＳ-３９８ １００ｎＭ、インドメタシン１００ｎＭ、実施例１の化合物１００ｎｇ／ｍＬ、実施例２の化合物１００ｎｇ／ｍＬを４時間処理した。細胞をリン酸緩衝液で回収し、遠心後の上清を除去し０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を３００μＬ添加した。ホモジナイザーで細胞を粉砕して、遠心後の上清を採取し、ＣＯＸ−１酵素液とした。
　ＣＯＸ−２酵素液は、在来ＣＯＸの活性を抑えるためアスピリン１００μＭで４時間処理した細胞に、ＩＬ-１β（１ｎｇ／ｍＬ）とともにＮＳ-３９８、インドメタシン、実施例１および２の化合物を６時間処理してＣＯＸ−１酵素液と同様に抽出した。
　１μＭヘマチンを含む０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）中に酵素液（２０μｇ protein相当）を入れ、３７℃、１０分間プレインキュベートした。そこにアラキドン酸（５０μＭ）を添加し、３７℃、３分間反応後、１Ｍ塩酸で反応停止、１Ｍ水酸化ナトリウムで中和し、反応液中のＰＧＥ２をＥＬＩＳＡで測定した。ＣＯＸ−１では薬剤非処理群を、ＣＯＸ−２ではＩＬ-１β単独刺激群をコントロールとして、コントロールのＰＧＥ２産生量に対する抑制率を求めた。
【００４７】
　図２に示す結果より、実施例１及び２の化合物は、正常細胞の増殖に影響を及ぼさない濃度（実験１参照）において、優れた選択的ＣＯＸ−２阻害活性を有しており、ＣＯＸ−２阻害剤として有用であることが確認された。
【００４８】
［実験５：ＣＯＸ−１，２のｍＲＮＡに対する影響の確認］
　６０ｍｍ dishに播種してコンフルエントに達した正常ヒト皮膚線維芽細胞を０．５％ＦＢＳ添加α-ＭＥＭに２４時間置換後、ＩＬ-１β １ｎｇ／ｍＬ及び各被験薬を４時間作用させた。反応終了後培地を除去し、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）１ｍＬを加えて細胞を回収した。常法に従ってトータルＲＮＡを回収した。トータルＲＮＡ１μｇよりＲＴ-ＰＣＲ法を用いてＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２ｍＲＮＡを検出した。コントロールとしてグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現を確認した。反応にはRNA PCR Kit（ＡＭＴ）Ver.2.1（TaKaRa Biochemicals社製）を使用した。逆転写反応を４２℃、１時間行った後、逆転写酵素失活のため９９℃、５分間インキュベートした。ＰＣＲ反応におけるプライマーと反応条件は以下に示した。
【００４９】
ＣＯＸ−１　Sense: 5'-TGC CCA GCT CCT GGC CCG CCG CTT-3'
　　　　　　Antisense: 5'-GTG CAT CAA CAC AGG CGC CTC TTC-3'
　　　　　　95℃,5min-(94℃ 1min,55℃ 1min,72℃ 1min)x32cycles-72℃ 7min
　　　　　　PCR product:303bp
ＣＯＸ−２　Sense: 5'-GGA ACA CAA CAG AGT ATG CG-3'
　　　　　　Antisense: 5'-GAC AGC CCT TCA CGT TAT TG-3'
　　　　　　95℃,5min-(94℃ 30sec,55℃ 30sec,72℃ 1min)x30cycles-72℃ 7min
　　　　　　PCR product:806bp
ＧＡＰＤＨ　Sense: 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'
　　　　　　Antisense: 5'-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3'
　　　　　　95℃,5min-(94℃ 30sec,55℃ 30sec,72℃ 1min)x20cycles-72℃ 7min
　　　　　　PCR product:457bp
【００５０】
　反応終了後、２％アガロースゲルでＴＡＥバッファー（４０ｍＭ tris[hydroxymethyl]aminomethane, ４０ｍＭ酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）による電気泳動を行いSYBR-gold（Molecular Probes社製）を用いて検出した。得られたＰＣＲ産物のシークエンス解析は、北海道システムサイエンス社に依頼した。
　結果を図３に示す。
【００５１】
　図３に示す通り、ＣＯＸ−２はＩＬ−１βにより誘導される。実施例１，２の化合物は、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２とも遺伝子レベルでは阻害していない。
【００５２】
[実験６：ＣＯＸ−１，２タンパク産生に対する影響の確認]
　６０ｍｍ dishに播種してコンフルエントに達した正常ヒト皮膚線維芽細胞から培地を除去し、リン酸緩衝液でセルスクレーパーを用いて回収した。遠心後、上清を除去しリン酸緩衝液を３００μＬ添加した。ホモジナイザーで細胞を粉砕して、遠心後の上清を採取し、ＣＯＸ−１タンパク液とした。
　ＣＯＸ−２タンパク液は、細胞にＩＬ-１β １ｎｇ／ｍＬとともにＮＳ−３９８ １００ｎＭ、実施例１の化合物１００ｎｇ／ｍＬ、実施例２の化合物１００ｎｇ／ｍＬを６時間処理後、ＣＯＸ−１タンパク液と同様に抽出した。
　１μＬ（タンパク含量５０ｎｇ）のＣＯＸ−１もしくはＣＯＸ−２スタンダード(Std,Cayman Chemical社製）及び１０μＬ（タンパク含量３０μｇ）のＣＯＸ−１もしくはＣＯＸ−２タンパク液を５−２０％グラディエントＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ATTO社製）にアプライし、電気泳動を行った。泳動後、ゲルをＰＶＤＦメンブレン（ATTO社製）にブロッティングした。１％スキムミルク（和光純薬社製）でブロッキングしたメンブレンにＣＯＸ−１ポリクローナル抗体（Oxford社製）、もしくはＣＯＸ−２ポリクローナル抗体（Cayman Chemical社製）を４℃、一晩反応させた。０．１％Tween-20（Bio-Rad社製）添加リン酸バッファーで洗浄後、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識二次抗体（Amersham Biosciences社製）を室温で１時間反応させた。二次抗体を洗浄後、ECL-plus（Amersham Biosciences社製）で生じた化学発光をライトキャプチャー（ATTO社製）で検出し、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２タンパク発現を確認した。
　結果を図４に示す。
【００５３】
　図４に示す通り、実施例１，２の化合物は、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２ともタンパクレベルの発現に作用していない。
【００５４】
　実験４〜６の結果から、本発明に係る実施例１，２の化合物は、ＣＯＸ−１，２の遺伝子レベル及びタンパク産生レベルでは作用せず、ＣＯＸ−２を選択的に阻害し、プロスタグランジンＥ２の産生を抑制していることが確認された。
【００５５】
［抗炎症効果の確認］
　ｄｄＹマウス（６週齢、雄）の右耳介にアセトンに溶かした実施例１の化合物及びＮＳ−３９８をマイクロピペットを用いて２０μＬ塗布した。３０分後、ＴＰＡ（tetradecanoylphorbol acetate）を２０μＬ塗布（２μｇ／耳）し、５時間後の同耳介の厚さをダイヤルシックネスゲージ（尾崎製作所社製）で測定した。データは、ＴＰＡ処理後の各マウスの右耳介の厚さから処理前の厚さを差し引いた値を示した。統計処理は、一元分散分析した後に多重検定（Dunnett's）を行った。結果を表３に示す。
【００５６】
【表３】
2004115504.tif 000014
【００５７】
　実施例１の化合物は、１００μｇ／耳および５００μｇ／耳の用量で有意にＴＰＡ誘導による耳介浮腫を抑制した。また、ＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳ−３９８も５００μｇ／耳の用量で実施例１の化合物と同程度に浮腫を抑えた。これらの結果より、実施例１の化合物は動物実験において抗炎症効果を有しており、抗炎症剤としての有効性が確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖に及ぼす実施例１，２の化合物の作用を示すグラフである。
【図２】正常ヒト皮膚線維芽細胞由来ＣＯＸ−１及び−２活性に対する実施例１，２の化合物の阻害活性を示すグラフである。
【図３】ＩＬ−１β刺激正常ヒト皮膚線維芽細胞におけるＣＯＸ−１及び−２ｍＲＮＡに対する実施例１，２の化合物の作用を示すバンド図である。
【図４】ＩＬ−１β刺激正常ヒト皮膚線維芽細胞におけるＣＯＸ−１及び−２タンパク産生に対する実施例１，２の化合物の作用を示すバンド図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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