(57)【要約】【課題】着色しない脱硫石油を生産しうる、微生物を用いた高品質脱硫方法を提供すること。【解決手段】含硫複素環式化合物に、カロテノイド生成遺伝子群を破壊された、含硫複素環式化合物分解能力を有するノカルディアフォーム型細菌（ゴルドニア属、ロドコッカス属、ミコバクテリウム属）を作用させることにより、実質的に着色のない脱硫石油を取得する、組換え微生物を用いた脱硫方法。【選択図】　図１
2004113117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイド生成遺伝子群を破壊された、含硫複素環式化合物分解能力を有する組換え微生物を作用させることにより、実質的に着色のない脱硫石油を取得することを特徴とする、含硫複素環式化合物の脱硫方法。
【請求項２】
微生物がトランスポゾンを用いた変異導入によってカロテノイド生成遺伝子群を破壊された組換え微生物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
組換え微生物がノカルディオフォーム型細菌に属する微生物である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ノカルディオフォーム型細菌に属する微生物がロドコッカス属に属する微生物である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
含硫複素環式化合物の分解がこれらを含有する培地中で微生物を培養することによって行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
微生物として休止菌体を作用させることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
含硫複素環式化合物がベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェンおよびそれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１以上の化合物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
含硫複素環式化合物がアルキル化ベンゾチオフェン類およびアルキル化ジベンゾチオフェン類からなる群より選ばれる少なくとも１以上の化合物である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
微生物がゴルドニア属ＴＭ４１４ＴＰｄ株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１３）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
含硫複素環式化合物分解能力を有するノカルディオフォーム型細菌に属する微生物にトランスポゾンを用いた変異導入を行うことによって得られる、カロテノイド生成遺伝子群を破壊された含硫複素環式化合物分解能力を有する組換え微生物。
【請求項１１】
ノカルディオフォーム型細菌に属する微生物がロドコッカス属に属する微生物である、請求項１０記載の組換え微生物。
【請求項１２】
ゴルドニア属　ＴＭ４１４ＴＰｄ株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１３）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カロテノイドによる着色がない高品質な石油を得るための、微生物脱硫方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
石油等の炭化水素燃料中には多種類の硫黄化合物が存在しており、環境規制に対応してその硫黄含量を低減させる脱硫操作が必要となる。
【０００３】
含硫化合物の脱硫方法としては、アルカリ洗浄、溶剤脱硫等の方法も知られているが、現在では水素化脱硫法が主流である。水素化脱硫法は、石油留分中の硫黄化合物を触媒存在下で水素と反応させ、硫黄を硫化水素として除去し、製品の低硫黄化をはかる方法である。触媒としては、アルミナを担体としたコバルト、モリブデン、ニッケル、タングステン等の金属触媒が使用される。しかし、金属触媒は一般にその基質特異性が低く、多様な種類の硫黄化合物を脱硫し、化石燃料全体の硫黄含量を低下させる目的には適しているが、特定のグループの硫黄化合物に対してはその脱硫効果が不十分となる場合がある。例えば、脱硫後の軽油中にはなおもアルキルベンゾチオフェン（アルキルＢＴ）、アルキルジベンゾチオフェン（アルキルＤＢＴ）などの種々の複素環式有機硫黄化合物（以下、含硫複素環化合物という）が残存している。
【０００４】
こうしたアルキル化ベンゾチオフェン類やアルキル化ジベンゾチオフェン類を水素化脱硫法により完全に除去するためには、より高い反応温度・圧力を必要とするため、莫大な設備投資と運転コストを必要とすることが予想される。
【０００５】
一方、微生物を用いた脱硫は、常温常圧での反応が可能なこと、脱硫プロセスにおけるＣＯ２発生量が触媒法に比べて著しく低いことから、安全、環境に配慮した脱硫プロセスとしてこれまで多数検討されてきた。しかも、触媒法では脱硫が困難とされる含硫複素環式化合物、例えば、４，６−ジメチルＤＢＴに対しても高い脱硫能を示すことから、触媒法の補完プロセスとして有用である。
【０００６】
例えば、ＤＢＴを脱硫する微生物としてロドコッカス　エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）　ＫＡ２−５−１（例えば、非特許文献１参照）、ロドコッカス　ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＩＧＴＳ８　（ＡＴＣＣ５３９６８）　（例えば、非特許文献２参照）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．　ＳＹ−１　（例えば、非特許文献３参照）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　ｓｐ．　Ｇ３　（例えば、非特許文献４参照），　ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ　現ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ））ＣＹＫＳ１（例えば、非特許文献５参照）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　ｓｐ．　ＤＯ　（例えば、非特許文献６参照）や、ロドッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、旧アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ））　Ｋ３ｂ（例えば、非特許文献７参照）、ＢＴを脱硫する微生物として、例えば、ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ、現ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ））　２１３Ｅ　（例えば、非特許文献８参照）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）　Ｔ０９　（例えば、非特許文献９参照）、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）　Ｔ０８　（例えば、非特許文献１０参照）などが報告されている。また、ＤＢＴおよびＢＴの両者を脱硫する単一の微生物については、土壌より分離したペニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）Ａ　１１−１およびＡ
１１−２株（例えば、特許文献１参照）が報告されている。
【０００７】
上記微生物の大部分は、ロドコッカス、ゴルドニア、ミコバクテリウム等のノカルディオフォーム型細菌に分類される細菌類、あるいはコリネバクテリウム、ブレビバクテリウム等のコリネフォーム型細菌に分類される細菌類であり、石油のような疎水性有機溶媒中の含硫複素環式化合物を脱硫する特徴を有している（例えば、非特許文献１１参照）。
【０００８】
一方、石油類の品質に関しては、硫黄含量だけでなく、色調に関する規格も定められている。そのため、接触分解系軽油留分の触媒法による脱硫では、高温になると着色しやすいことから、通常より低い温度で二段反応を行うことにより、４４０ｎｍ付近の色調の改善を行ったという報告もある（例えば、非特許文献１２参照）。
【０００９】
微生物による脱硫法において頻繁に用いられているノカルディオフォーム型細菌は、ピンク、オレンジ、赤色のコロニーを形成するものが多く、これは当該微生物が生産するカロテノイド類によるものである。従って、これらの微生物を用いて石油のような疎水性有機溶媒存在下に微生物反応を行う、いわゆる水−有機溶媒二相系反応では、微生物の生産するカロテノイド類が溶媒側に抽出されて、着色した低品質の脱硫石油ができてしまうという問題点があった。
【００１０】
【特許文献１】
特開平１０−３６８５９号公報
【非特許文献１】
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｌｅｔｔ．，　１８７，　１２３−１２６　（２０００）
【非特許文献２】
Ｋｉｌｂａｎｅ，Ｊ．Ｊ．　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，　３，　６９−７０　（１９９０）
【非特許文献３】
Ｏｈｍｏｒｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８，９１１−９１５，　（１９９２）
【非特許文献４】
Ｎｅｋｏｄｚｕｋａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，　１５　１７−２７　（１９９７）
【非特許文献５】
Ｒｈｅｅ　Ｓ−Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，　２３２７−２３３１　（１９９８）
【非特許文献６】
ｖａｎ　Ａｆｆｅｒｄｅｎ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　　Ａｒｃｈ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５３，　３２４−３２８，　（１９９０）
【非特許文献７】
Ｄａｈｌｂｅｒｇ，　Ｍ．Ｄ．（１９９２）　Ｔｈｉｒｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｏａｌ，　Ｍａｙ４−７，　ＣｌｅａｒｗａｔｅｒＢｅａｃｈ，ＦＬ，ｐｐ．１−１０．Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　ＰａｌｏＡｌｔｏ，　ＣＡ．
【非特許文献８】
Ｇｉｌｂｅｒｔ．Ｓ．Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４４　２５４５−２５５３　（１９９８）
【非特許文献９】
Ｍａｔｓｕｉ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　６４（３），５９６−５９９　（２０００）
【非特許文献１０】
Ｍａｔｓｕｉ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　５７，　２１２−２１５　（２００１）
【００１１】
【非特許文献１１】
Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ　ＤＪ，　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：　５４０−５４６　（２０００）
【非特許文献１２】
牛尾、畑山、ＰＥＴＲＯＴＥＣＨ、１７、７０１−７０７　　（１９９４）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、着色しない脱硫石油を生産しうる、微生物を用いた高品質脱硫方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは含硫複素環式化合物分解能を有するノカルディオフォーム型細菌、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属　ＴＭ４１４株のカロテノイド生成遺伝子群を破壊することにより、石油脱硫能を有し、カロテノイドを生成しない組換え脱硫菌の作製に成功し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１２）に関するものである。
（１）　カロテノイド生成遺伝子群を破壊された、含硫複素環式化合物分解能力を有する組換え微生物を作用させることにより、実質的に着色のない脱硫石油を取得することを特徴とする、含硫複素環式化合物の脱硫方法。
（２）　微生物がトランスポゾンを用いた変異導入によってカロテノイド生成遺伝子群を破壊された組換え微生物である、上記（１）記載の方法。
（３）　組換え微生物がノカルディオフォーム型細菌に属する微生物である、上記（１）または（２）記載の方法。
（４）　ノカルディオフォーム型細菌に属する微生物がロドコッカス属に属する微生物である、上記（３）記載の方法。
（５）　含硫複素環式化合物の分解がこれらを含有する培地中で微生物を培養することによって行われる、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）　微生物として休止菌体を作用させることを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）　含硫複素環式化合物がベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェンおよびそれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１以上の化合物である、上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８）　含硫複素環式化合物がアルキル化ベンゾチオフェン類およびアルキル化ジベンゾチオフェン類からなる群より選ばれる少なくとも１以上の化合物である、上記（７）記載の方法。
（９）　微生物がゴルドニア属ＴＭ４１４ＴＰｄ株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１３）である、上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）　含硫複素環式化合物分解能力を有するノカルディオフォーム型細菌に属する微生物にトランスポゾンを用いた変異導入を行うことによって得られる、カロテノイド生成遺伝子群を破壊された含硫複素環式化合物分解能力を有する組換え微生物。
（１１）　ノカルディオフォーム型細菌に属する微生物がロドコッカス属に属する微生物である、上記（１０）記載の組換え微生物。
（１２）　ゴルドニア属　ＴＭ４１４ＴＰｄ株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１３）。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、カロテノイド生成遺伝子群を破壊された含硫複素環式化合物脱硫能を有する組換え微生物を作用させることにより、実質的に着色していない脱硫生成物を取得することを特徴とする、含硫複素環式化合物の脱硫方法に関する。
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．　組換え微生物の作製
本発明で用いられる組換え微生物は、カロテノイド生成遺伝子群を破壊された含硫複素環式化合物脱硫能を有する微生物である。
【００１７】
１．１　親株
本発明で用いられる組換え微生物の親株は、含硫複素環式化合物の脱硫能力を有する微生物である限り特に限定されない。そのような微生物としては、例えばロドコッカス　エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）　ＫＡ２−５−１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１６２７７；　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｌｅｔｔ．，　１８７，　１２３−１２６　（２０００））、ロドコッカス　ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＩＧＴＳ８　（ＡＴＣＣ５３９６８）　（Ｋｉｌｂａｎｅ，Ｊ．Ｊ．　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，　３，　６９−７０　（１９９０））、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．　ＳＹ−１　（Ｏｈｍｏｒｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８，９１１−９１５，　１９９２）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　ｓｐ．　Ｇ３　（Ｎｅｋｏｄｚｕｋａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，　１５　１７−２７　（１９９７）），　ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ　現ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ））ＣＹＫＳ１（Ｒｈｅｅ　Ｓ−Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，　２３２７−２３３１　（１９９８））、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　ｓｐ．　ＤＯ　（ｖａｎ　Ａｆｆｅｒｄｅｎ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　　Ａｒｃｈ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５３，　３２４−３２８，１９９０）や、ロドッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、旧アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ））　Ｋ３ｂ（Ｄａｈｌｂｅｒｇ，　Ｍ．Ｄ．（１９９２）　Ｔｈｉｒｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｏａｌ，　Ｍａｙ４−７，　ＣｌｅａｒｗａｔｅｒＢｅａｃｈ，ＦＬ，ｐｐ．１−１０．Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　ＰａｌｏＡｌｔｏ，　ＣＡ．）、ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ、現ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ））　２１３Ｅ　（Ｇｉｌｂｅｒｔ．Ｓ．Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４４　２５４５−２５５３　（１９９８））、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）　Ｔ０９　（Ｍａｔｓｕｉ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　６４（３），５９６−５９９　（２０００））、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）　Ｔ０８　（Ｍａｔｓｕｉ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　５７，　２１２−２１５　（２００１））などを挙げることができる。
【００１８】
本発明においては、前記親株の好適な例として、ノカルディオフォーム型細菌に分類される微生物　ゴルドニア属　ＴＭ４１４株を用いた組換え微生物、ＴＭ４１４ＴＰｄ株の作製例を記載した。ＴＭ４１４株は代表的な脱硫遺伝子ｄｓｚを有する脱硫菌であり、一般にバイオ脱硫に適しているといわれているノカルディオフォーム型細菌に属する菌株である。
【００１９】
前述したように、ノカルディオフォーム型細菌には、石油のような疎水性有機溶媒中の含硫複素環式化合物を脱硫する特徴を有する微生物が多く、微生物脱硫法に頻繁に用いられている。しかしながら、ノカルディオフォーム型細菌はカロテノイド類を産生するため、その脱硫産物が着色されてしまうという問題を有している。
【００２０】
ところで、ノカルディオフォーム型細菌とは、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌが採用する細菌の分類体系における３３のセクションのうちの１つで、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等が含まれる。この分類体系では、従来の階層的分類とは異なり、細菌をその特性−例えば、細胞形態、酵素に対する反応、グラム染色性、エネルギー代謝等により分類している。
【００２１】
したがって、同一セクション内では同様の遺伝的改変による共通の効果が期待される。すなわち、他のノカルディオフォーム型細菌についても、ＴＭ４１４株と同様の変異を加えることにより、脱硫能力を維持した状態でカロテノイド生成遺伝子群のみを特異的に破壊することが可能と考えられる。
【００２２】
１．２　カロテノイド生成遺伝子群の破壊
前記親株のカロテノイド生成遺伝子群の破壊は、当該遺伝子領域への変異（点変異）の導入によって行うことができる。
【００２３】
標的とするカロテノイド生成遺伝子群、当該微生物においてカロテノイドの産生に関与する遺伝子であれば特に限定されず、例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｉｎｅｎｓ　のフィトエンデサチュラーゼ（Ｋｒｕｂａｓｉｋ　Ｐ．，　Ｓａｎｄｍａｎｎ　Ｇ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２６３，　４２３−４３２　（２０００））のように、カロテノイド合成においてフィトエンをリコペンに変換する酵素等を挙げることができる。
【００２４】
変異の導入方法は、化学的変異導入法、紫外線照射による変異導入法、あるいはトランスポゾンや相同組み換え法による点変異導入法など、当該技術分野で公知の変異導入法を用いることができる。なかでも、標的遺伝子以外の遺伝子（特に、脱硫活性に関与する遺伝子群）に影響を与えることなく、カロテノイド生成遺伝子群にのみ特異的に変異を与えうるという点でトランスポゾンを用いた点変異法が望ましい。
【００２５】
（１）トランスポゾンを用いた点変異導入
本発明の好ましい態様として、トランスポゾンを用いた点変異導入によるカロテノイド生成遺伝子群の破壊について説明する。
【００２６】
トランスポゾンは転移性遺伝因子とも呼ばれ、宿主生物の染色体内において新たな位置へ移動する独特な能力（転移能力）を有している。そのため、染色体相同組換え法とは大きく異なり、該因子と標的部位との間に相同性のあるＤＮＡ領域を必要としない。またトランスポゾンはその構造上、ＤＮＡの両末端の塩基配列のみがトランスポゾンとしての基本機能、すなわち転移に必要であり、この両末端の塩基配列に挟まれた領域に種々の機能性因子、例えば抗生物質耐性遺伝子のようなマーカー遺伝子、制限酵素切断部位等の任意のＤＮＡ配列を組み込むことが出来る。しかも、他の遺伝子には影響を与えることなく標的遺伝子のみを特異的に改変することができる。
【００２７】
トランスポゾンを用いた変異導入方法は、染色体への変異導入の強力なツールとして既に当技術分野では公知であり、例えばトランスポゾン複合体（商品名ＥＺ：：ＴＮＴＭ＜ＫＡＮ−２＞Ｔｎｐ　Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ　ＴＭ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）等の市販品を用いて容易に実施することができる。
【００２８】
トランスポゾンには、組換え体の選抜をより容易にするために、適当なマーカー遺伝子をレポーター遺伝子とともに挿入することができる。該マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
トランスポゾンの導入は、公知の形質転換、形質導入、接合伝達（ｃｏｎｊｕｇａｌ　ｍａｔｉｎｇ）または電気穿孔法等により行うことができる。
【００２９】
（２）カロテノイド生成遺伝子群を破壊された組換え体の選抜
カロテノイド生成遺伝子群を破壊された組換え体は、上述のトランスポゾン上のマーカー遺伝子と、形成されるコロニーの色によって容易に選抜することができる。例えば、カナマイシン耐性遺伝子をマーカー遺伝子として含むトランスポゾンを用いた場合であれば、トランスポゾン処理後の菌体をカナマイシンを含む培地で培養し、形成されたコロニーのうち、白色のコロニーを選択する。選択したコロニーは、必要であればさらに培養して純化した後、ジベンゾチオフェン等の含硫複素環式化合物を含有する培地で培養することにより、親株の脱硫能力が維持されているか否かを確認することができる。
【００３０】
１．３　組換え微生物：ゴルドニア属　ＴＭ４１４ＴＰｄ株
上記の方法によって得られる本発明の組換え微生物の好適な例として、ゴルドニア属　ＴＭ４１４ＴＰｄ株を挙げることができる。ＴＭ４１４ＴＰｄ株は、ゴルドニア属　ＴＭ４１４株にトランスポゾン点変異を導入して得られた、カロテノイド非生成脱硫菌である。このＴＭ４１４ＴＰｄ株の菌学的性質は後述する実施例１の表１に記載したとおりである。
【００３１】
なお、ＴＭ４１４ＴＰｄ株は、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１　　中央第６）に、２００２年９月１３日付けで寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１３を得ている。
【００３２】
なお、本発明においては、上記ＴＭ４１４ＴＰｄ株には当該菌株と実質的に同等の菌学的性質を有する菌株をも含むものとする。ここで、「実質的に同等の菌学的性質を有する菌株」とは、ＴＭ４１４ＴＰｄ株と同様にカロテノイドを生成することなしに含硫複素環式化合物の脱硫することできるが、ＴＭ４１４ＴＰｄ株とは他の１つ以上の性質において異なっている、ＴＭ４１４ＴＰｄ株の変異株や形質転換体を挙げることができる。
【００３３】
２．　組換え微生物を用いた高品質脱硫方法
本発明にかかる脱硫方法は、本発明の組換え微生物を含硫複素環式化合物を含む培養液中に添加し、該微生物を培養することにより実施することができる。具体的には、本発明の脱硫方法は以下のようにして行われる。
【００３４】
２．１　組換え微生物の菌体生産（培養）
前項で作製された組換え微生物を、脱硫方法に供する菌体生産ために培養する。培養は、微生物の通常の培養法にしたがって行われる。培養の形態は固体培養でも液体培養でもよいが、液体培養が好ましい。培地の栄養源としては通常用いられているものが広く用いられる。炭素源としては利用可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコール、スクロース、ラクトース、コハク酸、クエン酸、酢酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物などの有機栄養物質が使用される。分解反応に影響を与える可能性のある硫黄化合物を含まない培地で培養するのが望ましい場合には、塩化アンモニウムのような無機窒素化合物も使用することができる。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン類などが必要に応じて用いられる。
【００３５】
好適な培地としては、Ａ培地（Ｉｚｕｍｉ　Ｙ．，Ｏｈｓｈｉｒｏ　Ｔ．，Ｏｇｉｎｏ　Ｈ．，Ｈｉｎｅ　Ｙ．，ＳｈｉｍａｏＭ．，　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　２２３−２２６　（１９９４））を挙げることができる。培養は、微生物が生育可能である温度、ｐＨで行われ、使用する微生物の最適培養条件で行うのが好ましい。一般的には、培地のｐＨを適当なｐＨ、例えばｐＨ６〜８とし、また、適当な温度、例えば２５〜３７℃、好ましくは約３０℃付近にて、振盪または通気条件下で好気的に行われる。
【００３６】
２．２　含硫複素環式化合物
本発明の脱硫方法の対象となる含硫複素環式化合物は、特に限定されず、例えば、石油等の化石燃料油中に含まれる含硫複素環式化合物類を広く対象とすることができる。例えば、ベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン類やアルキル化ベンゾチオフェンやアルキル化ジベンゾチオフェン類を挙げることができる。該アルキル化ベンゾチオフェンとしては２−メチルジベンゾチオフェン、３−メチルベンゾチオフェン、５−メチルベンゾチオフェン、５−メチルベンゾチオフェン、２−エチルチオフェン等が例示される。アルキル化ジベンゾチオフェンとしては、４−メチルジベンゾチオフェン、４−エチルジベンゾチオフェン、４−プロピルジベンゾチオフェン、４−ブチルジベンゾチオフェン、４−ペンチルジベンゾチオフェン、４−ヘキシルジベンゾチオフェン、４，６−ジメチルベンゾチオフェン、４，６−ジエチルジベンゾチオフェン、４，６−ジプロピルジベンゾチオフェン、３，４，６−トリメチルジベンゾチオフェン、３−プロピル，４，８−ジメチルジベンゾチオフェン等が例示される。
【００３７】
２．３　脱硫反応（含硫複素環式化合物の分解）
含硫複素環式化合物の分解は、含硫複素環式化合物を含有する培地中で前記組換え微生物を培養することにより実施することができる。
添加される含硫複素環式化合物類の培地中の濃度は、好ましくは５〜１０，０００ｐｐｍであり、より好ましくは　２５〜２００　ｐｐｍである。
【００３８】
（１）　微生物の培養条件
微生物の培養は、微生物の通常の培養法にしたがって行われる。培養の形態は固体培養でも液体培養でもよいが、液体培養が好ましい。
【００３９】
培地の栄養源としては通常用いられているものを広く用いることができる。すなわち、炭素源としては、利用可能な炭素化合物であれば特に限定されず、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、コハク酸、クエン酸、酢酸などを使用することができる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であれば特に限定されず、例えば、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物、などの有機栄養物質を使用できる。含硫複素環式化合物類の分解反応に影響を与える可能性のある硫黄化合物を含まない培地で培養することが望ましい場合には、塩化アンモニウムのような無機窒素化合物も使用できる。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン類、などを必要に応じて用いてもよい。
【００４０】
培養は、微生物が生育可能な温度、ｐＨで行われ、使用する微生物の最適培養条件で行うことが好ましい。一般的には、例えば、ｐＨ６〜８、温度２５〜３７℃、好ましくは約３０℃付近にて、振盪または通気条件下で好気的に培養される。
【００４１】
（２）　休止菌体の調整
含硫複素環式化合物の分解反応に供される微生物はどのような状態のものであってもよいが、休止菌体を用いることが好ましい。休止菌体は、例えば、以下のようにして調製することができる。
【００４２】
まず、新鮮な培地に対し適当量、例えば１〜２％容量の種菌を接種し、ｐＨ６〜８、温度２５〜３７℃、好ましくは約３０℃付近で、１〜２日間往復あるいは回転振とう培養を行う。この際、種菌としては対数増殖期初期から定常期のいずれの状態の菌でも構わないが、対数増殖期後期のものが好適である。また、接種量は必要に応じて増減してもよい。
【００４３】
培地としては、特に限定するものではないが、Ａ培地（Ｉｚｕｍｉ　Ｙ．，Ｏｈｓｈｉｒｏ　Ｔ．，Ｏｇｉｎｏ　Ｈ．，Ｈｉｎｅ　Ｙ．，Ｓｈｉｍａｏ　Ｍ．，　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　２２３−２２６　（１９９４））を用いることが好適である。培養後、菌体を培地から分離集菌し、洗浄することにより休止菌体が得られる。ここで、集菌は、培養菌体が対数増殖期初期から定常期までのいずれの状態にある時に行ってもよいが、対数増殖期中期から後期の状態にある時に行うことが好ましい。また、集菌は、遠心分離の他、濾過、沈降分離等のいかなる方法で行ってもよい。菌体の洗浄には、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等の任意の緩衝液を使用することができ、また、水を用いて洗浄することもできる。
【００４４】
（３）　休止菌体による分解反応
休止菌体による分解反応は、休止菌体を適当な緩衝液に懸濁して調製した菌懸濁液に、基質である含硫複素環式化合物類を添加して培養・増殖させることにより行う。
【００４５】
前記緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等、種々の緩衝液を使用することができる。緩衝液のｐＨは特に限定されないが、ｐＨ６〜８が好適である。また、緩衝液の代わりに、水や培地等を使用することもできる。菌体懸濁液の濃度は、ＯＤ６６０が１〜１００の間が好適であり、必要に応じて増減できる。基質である含硫複素環式化合物類の培地中の濃度は、好ましくは５〜１０，０００ｐｐｍであり、より好ましくは　２５〜２００ｐｐｍであるが、必要に応じて増減できる。反応温度は２５〜３７℃、好ましくは３０℃付近が好適であるが、特に限定されない。また反応時間は、通常１〜５００時間の間で、培地中の含硫複素環式化合物の量や用いる微生物の量によって適宜設定すればよいまた、基質を添加する前に反応温度と同じ温度に反応液を予備加熱してから行ってもよい。
【００４６】
また、含硫複素環式化合物を溶解するために使用可能な有機溶媒としては、ｎ−テトラデカンの他、Ｃ８　〜Ｃ２０のｎ−パラフィンやケロシン、軽油、重油などが挙げられる。また、必要に応じて反応液上方の気相を酸素で置換封入してもよい。
【００４７】
脱硫率の測定は、高速液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー／質量スペクトル、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー／質量スペクトル分析などを使用して行うことができる。また、必要に応じて他の分析方法を併せて利用してもよい。
【００４８】
２．４　本発明の脱硫方法の利点
本発明の脱硫方法は、カロテノイド生成遺伝子群の破壊により、カロテノイドを生成することなく石油等の含硫複素環式化合物の脱硫を行うことができる。したがって、この方法で得られる石油は実質的に着色していない高品質の脱硫石油である。ここで実施的に着色していないとは、微生物によって産生されるカロテノイド等の着色物質を含まないことを意味する。本発明の脱硫方法は微生物を用いて行われるため、常温常圧下で温和に反応に進み、しかも無着色の脱硫石油が得られる高品質な脱硫法として利用価値が高い。
【００４９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。
〔実施例１〕　ＴＭ４１４株への点変異導入によるＴＭ４１４ＴＰｄ株の取得
１．変異の導入
ＬＢ培地１００ｍｌに一白金耳量のゴルドニア属ＴＭ４１４株を植菌し、３０℃で４８時間培養した。得られた培養液の６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６６０）を測定したところ、１．０であった。この培養後を７０００ｒｐｍ　１０分の条件で遠心分離して上清を除去した後、得られた菌体を１０％グリセロール水溶液で１回洗浄後、ＯＤ４０になるように１０％グリセロール水溶液に懸濁調整した。
【００５０】
この懸濁液８０μｌにトランスポゾン複合体（商品名ＥＺ：：ＴＮＴＭ＜ＫＡＮ−２＞Ｔｎｐ　Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ　ＴＭ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１μｌを添加し、ジーンパルサーＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いて２５μＦ、４００Ω、２０ｋＶ／ｃｍの条件で処理した。処理液にＳＯＣ培地０．４２ｍｌを添加し、３０℃、３時間培養を行った。得られた培養液は、カナマイシン硫酸塩１００ｍｇ／ｌおよび寒天末１５　ｇ／ｌを含むＬＢ培地（ＬＢＡＫ培地）に塗末し、３０℃、４８時間培養した。ＬＢＡＫ培地においてコロニーを形成した菌のうち、白色のコロニーを再度新鮮なＬＢＡＫ培地に画線することによって菌体を純化し、これをＴＭ４１４ＴＰｄ株と命名した。
【００５１】
２．ＴＭ４１４ＴＰｄ株の菌学的性質
このＴＭ４１４ＴＰｄ株は、表１に示すような菌学的性質を有していた。
【表１】
2004113117.tif 000003
2004113117.tif 000004
このＴＭ４１４ＴＰｄ株は、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１　　中央第６）に、２００２年９月１３日付けで寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１３を得ている。
【００５２】
〔実施例２〕　ＴＭ４１４ＴＰｄ株の遺伝子解析
１．試験方法
ＴＭ４１４ＴＰｄ株をカナマイシン５０　ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地１０ｍｌに一白金耳量植菌し、３０℃で４８時間培養した。培養後の液を１５，０００ｒｐｍ　５分の条件で遠心分離して上清を除去した後、得られた菌体からＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社）を用いて１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸−１　ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解したゲノムＤＮＡを調整した。得られたゲノムＤＮＡ溶液５　μｌを制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩを用いて消化し、消化液５　μｌにＢＡＰ処理ｐＵＣ１１８（ニッポンジーン社）１　μｌ、ライゲーションキットｖｅｒ．２　（タカラバイオ社）６　μｌを添加し、１６℃、２時間反応させた。この反応液を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社）を添付の説明書に従って形質転換した。
【００５３】
得られた形質転換体よりカナマイシン耐性株を選抜し、３１０型ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｚｅｒ　（パーキンエルマー社）を用いて、ゲノム内に挿入されたトランスポゾン由来のカナマイシン耐性遺伝子上流および下流の塩基配列それぞれ約５００ｂｐを決定した。この塩基配列分析結果から、さらにユニバーサルコードに従ってアミノ酸配列を推定し、アライメント解析ツールＢＬＡＳＴを用いてタンパク質解析データベースＰＩＲに登録された既知のタンパク質アミノ酸配列との相同性を解析した。
【００５４】
２．解析結果
その結果、カナマイシン耐性遺伝子上流（４９８塩基、１６４アミノ酸；配列番号１）、および下流（３８７塩基、１３５アミノ酸；配列番号２）はＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｉｎｅｎｓ　のフィトエンデサチュラーゼ（Ｋｒｕｂａｓｉｋ　Ｐ．，　Ｓａｎｄｍａｎｎ　Ｇ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．２６３，　４２３−４３２　（２０００））のアミノ酸配列とそれぞれ５２．７％、５３．２％の相同性を示した。この酵素は、カロテノイド合成においてフィトエンをリコペンに変換する酵素である。すなわち、ＴＭＴＰ４１４ＴＰｄ株は、赤いコロニーを形成する親株ＴＭＴＰ４１４株のカロテノイド合成系酵素合成が破壊されたことにより、カロテノイドを生成できず、白いコロニーを形成するようになったことが強く示唆された。
【００５５】
〔実施例３〕　ＴＭ４１４ＴＰｄ株による４．６−ジメチルジベンゾチオフェンの分解
１．試験方法
４．６−ジメチルジベンゾチオフェン（４，６−ＤＭＤＢＴ）約５０　ｍｇ／ｌを溶解したｎ−テトラデカン２ｍｌをＡ培地（Ｉｚｕｍｉ　Ｙら、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　２２３−２２６　（１９９４））　２ｍｌに添加後、１白菌耳量のＴＭ４１４ＴＰｄ株を植菌し、３０℃、１５０　ｒｐｍで７２時間培養した。この培養液に６規定塩酸水溶液０．１ｍｌおよび酢酸エチル２　ｍｌを添加し、攪拌抽出を行い、得られた酢酸エチル抽出液をガスクロマトグラフィーにより定量した。ガスクロマトグラフィー分析は、ＧＣ−１４Ａ（島津製作所社製）にカラムＤＢ−５（０．２５ｍｍ×０．２５μｍ×３０ｍ　；Ｊ＆Ｗサイエンティフィック社製）を装着し、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）にてカラム温度２５０℃で分析した。対照として、ＴＭ４１４ＴＰｄ株の代わりにＴＭ４１４株を植菌して同様に培養を行った。さらに、４，６−ＤＭＤＢＴの非生物学的な分解を確認するために微生物を植菌せずに同様の操作も行った。
【００５６】
さらに培養中にｎ−テトラデカン相に移行したカロテノイド量をｎ−テトラデカン相の４５０ｎｍにおける吸光度により測定した。さらに、培養液を１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して得られるｎ−テトラデカン相の吸光度をＤＵ６４０型吸光度計（ベックマン社製）を用いて２００−８００ｎｍの範囲で測定した。
【００５７】
２．結果
（１）ガスクロマトグラフィー分析
それぞれの結果を表２に示す。ＴＭ４１４およびＴＭ４１４ＴＰｄを植菌、培養した場合のみ保持時間４分に生成物ピークが認められ、ＧＣ／ＭＳのスペクトルパターンからジメチルヒドロキシビフェニルと同定された。この結果から、ＴＭ４１４ＴＰｄはＴＭ４１４とほぼ同等に４，６−ＤＭＤＢＴを分解し、脱硫化合物ＤＭＨＢＰを生成しており、実施例１の変異導入によってその脱硫能力の低下はないことが確認された。
【００５８】
【表２】
2004113117.tif 000005
【００５９】
（２）吸光度測定（ｎ−テトラデカン相に移行したカロテノイド量の測定）
ＴＭ４１４ＴＰｄでは４５０ｎｍにおける吸収は検出されなかった。また、培養液を１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して得られるｎ−テトラデカン相の２００−８００ｎｍにおける吸光度測定の結果、ＴＭ４１４ＴＰｄ株では、カロテノイドに特徴的な４５０ｎｍの吸光度のみが消失していることが確認された（図１）。
【００６０】
以上より、ＴＭ４１４ＴＰｄ株は、油水二相系での脱硫能を保持しつつ、カロテノイド生成能を欠失させることにより油相の着色を抑制することができる変異型脱硫微生物であることが確認された。
【００６１】
【発明の効果】
本発明によれば、疎水性有機溶媒中の含硫複素環式化合物を微生物を利用することにより穏和な条件で、着色することなく脱硫することができる。この方法は、着色のない脱硫石油を得るための高品質な脱硫法として利用価値が高い。
【００６２】
【配列表】
2004113117.tif 000006
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2004113117.tif 000008
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＴＭ４１４株（Ａ）およびＴＭ４１４ＴＰｄ株（Ｂ）による４，６−ジメチルジベンゾチオフェン分解後の培養液のｎ−テトラデカン相の、２００−８００ｎｍにおける吸光度測定結果を示すグラフである。
【図１】
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