(57)【要約】【課題】正確かつ簡便で多数の検体処理が可能なホモシステインの酵素的測定方法及び測定用試薬を提供すること。【解決手段】Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しないＬ−システイン分解酵素を、ピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させることによりＬ−システインを試料中より消去し、ついでホモシステインおよびＬ−システインに反応する酵素を作用させることによりホモシステインを定量することを特徴とするホモシステインの測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホモシステインおよびＬ−システインを含有する試料中のホモシステインを測定する方法であって、Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しないＬ−システイン分解酵素を、ピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させることによりＬ−システインを試料中より消去し、ついでホモシステインおよびＬ−システインに反応する酵素を作用させることによりホモシステインを定量することを特徴とするホモシステインの測定方法。
【請求項２】
Ｌ−システイン分解酵素が、口腔内に存在する細菌由来のものである請求項１記載のホモシステインの測定方法。
【請求項３】
Ｌ−システイン分解酵素が、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）又はフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）のいずれかの細菌由来のものである請求項２に記載のホモシステインの測定方法。
【請求項４】
Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号１記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである請求項１〜３のいずれかに記載のホモシステインの測定方法。
【請求項５】
Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号２記載の塩基配列、その相補配列、又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列のいずれかによってコードされるものである請求項１〜３のいずれかに記載のホモシステインの測定方法。
【請求項６】
Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号３記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである請求項１〜３のいずれかに記載のホモシステインの測定方法。
【請求項７】
Ｌ−システイン分解酵素が、更にセリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンとも実質的に反応しない酵素である請求項１〜６のいずれかに記載のホモシステインの測定方法。
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの工程を有する請求項１〜７のいずれかに記載のホモシステインの測定方法。
（ａ）生成された硫化水素を、硫化物イオンの発色検出により測定する工程、
（ｂ）生成されたアンモニアを、グルタミン酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下において作用させ、反応に伴い減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する工程、
（ｃ）生成されたピルビン酸を、ピルビン酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下において作用させ、生成されたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する工程、
（ｄ）生成されたピルビン酸を、乳酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下において作用させ、反応に伴い減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する工程、
（ｅ）生成されたピルビン酸をピルビン酸酸化酵素の反応の基質とし、色原体及びペルオキシダーゼの存在下において作用させ、反応に伴い増加するキノン色素を発色定量する工程。
【請求項９】
Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しない酵素、ホモシステインおよびＬ−システインに反応する酵素及びピリドキサル−５’−リン酸を含むことを特徴とするホモシステインの測定用試薬。
【請求項１０】
Ｌ−システイン分解酵素が、口腔内に存在する細菌由来のものである請求項９記載のホモシステインの測定用試薬。
【請求項１１】
Ｌ−システイン分解酵素が、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）又はフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）のいずれかの細菌由来のものである請求項１０に記載のホモシステインの測定用試薬。
【請求項１２】
Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号１記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである請求項９〜１１のいずれかに記載のホモシステインの測定用試薬。
【請求項１３】
Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号２記載の塩基配列、その相補配列、又はそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列のいずれかによってコードされるものである請求項９〜１１のいずれかに記載のホモシステインの測定用試薬。
【請求項１４】
Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号３記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである請求項９〜１１のいずれかに記載のホモシステインの測定用試薬。
【請求項１５】
Ｌ−システイン分解酵素が、更にセリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンとも実質的に反応しない酵素である請求項９〜１４のいずれかに記載のホモシステインの測定用試薬。
【請求項１６】
更に、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸酸化酵素からなる群から選ばれる１種又は２種以上の酵素を含む請求項９〜１５のいずれかに記載のホモシステインの測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−システイン分解酵素を利用したホモシステインの測定方法およびホモシステイン測定用試薬に関するものである。さらに詳しくは本発明は、ホモシステインおよびＬ−システインを含有する試料中のホモシステインの測定において、Ｌ−システイン分解酵素を利用したＬ−システインの消去系を組み入れることにより、混在する試料中のホモシステインのみを定量する方法およびそのための試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ホモシステインは生体内では含硫黄アミノ酸、メチオニンからシステインへの代謝における代謝中間アミノ酸であり、通常低濃度で生体内に存在する。しかしながらこの代謝経路の異常はホモシステインレベルの上昇に直結し、各種疾患のインディケーターと成り得ることより臨床的に有用なアミノ酸の一つとされている。例えば、先天性代謝異常であるホモシスチン尿症においてはシスタチオニンβシンセターゼまたはメチルテトラヒドロ葉酸メチル転移酵素に欠失があることに由来するアミノ酸代謝異常である。また最近、血中ホモシステイン濃度の上昇がアテローム性動脈硬化症の発症に関連つけられるようになり、血中濃度の上昇が心臓疾患または脈管疾患の危険因子と結びつくものと考えられている。また糖尿病やアルコール中毒、肝および腎疾患や神経疾患等のインディケーターとしても報告されている。
【０００３】
ホモシステインの測定方法として広く知られた方法としては、クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、ホモシステインをＳ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素の存在下、アデノシンと反応させた後、生成物であるＳ−アデノシルメチオニンをＨＰＬＣで分離する方法がある（例えば、非特許文献１および非特許文献２参照）。また、ホモシステインを蛍光団と反応させ、ＨＰＬＣで蛍光分析する方法もある（例えば非特許文献３参照）。さらには、ホモシステインをＮ５−メチルテトラヒドロ葉酸存在下、Ｎ５−メチルテトラヒドロ葉酸−ホモシステインメチル転移酵素の作用によりメチオニンに変換した後、蛍光団と反応させ、ＨＰＬＣ、蛍光分析する方法も報告されている（例えば非特許文献４参照）。
【０００４】
また、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素を用いた非クロマトグラフィー定量法も報告されている（例えば特許文献１参照）。この方法においては、ホモシステインを、アデノシン、フルオレセイン標識Ｓ−アデノシルホモシステイン、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素と反応後、反応液に存在するＳ−アデノシルホモシステインを抗Ｓ−アデノシルホモシステイン抗体で捕捉し、蛍光偏光イムノアッセイを行う方法を中心に、Ｓ−アデノシルホモシステイン加水分解酵素を利用する方法が詳述されている。
【０００５】
このように、ホモシステインを測定する方法としては種々報告されているものの、いずれも満足なものではない。クロマトグラフィーを利用する測定方法は一般的に精巧な装置を必要とする。また費用的、時間的に負担が大きい方法である。また、イムノアッセイ法も一般生化学反応に比較すると複雑で時間がかかることが知られている。
【０００６】
これらの知見から、ホモシステインを迅速且つ簡便に測定出来る手法が待望されており、特に酵素の基質特異性を利用して測定する生化学的手法は有望と考えられている。酵素を応用したホモシステインの測定法で従来知られているものとしては、ホモシステインをホモシステインデスルファラーゼに作用させ、生成するアンモニア、α−ケト酪酸または硫化水素を測定に用いる方法が報告されている（例えば特許文献２参照）。しかしながら、ホモシステインデスルファラーゼは特異性が低く、ホモシステイン以外にシステインにも作用するので、正確なホモシステインの定量が困難である。
【０００７】
他にも、酵素を用いる手法が知られているが（例えば特許文献３及び特許文献４参照）、いずれも用いる酵素の基質特異性が低いために測定の特異性が高くない等の問題があり、臨床的測定法としては受け入れ難いものであった。
【０００８】
また、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素、ジメチルグリシンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼなどを用いる酵素的ホモシステイン測定方法（例えば特許文献５参照）、Ｏ−アセチルホモセリン−リアーゼやＬ−メチオニンγリア−ゼを用いる酵素的ホモシステイン測定方法（例えば特許文献６参照）、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドロラーゼを用いる酵素的ホモシステイン測定方法（例えば特許文献７参照）なども知られている。しかしながら、これらの方法においてもシステインの消去方法は開示されておらず、システインを含有する試料中のホモシステイン測定に関する記載も無い。
【０００９】
このように、システインを含有する試料中のホモシステイン量を正確に測定することは困難であった。
【００１０】
【特許文献１】
特表平８−５０６４７８号公報
【００１１】
【特許文献２】
国際公開第９８／０７８７２号パンフレット
【００１２】
【特許文献３】
特開２００１−１６１３９９号公報
【００１３】
【特許文献４】
特開２００１−１４９０９２号公報
【００１４】
【特許文献５】
特開２００１−１７１９８号公報
【００１５】
【特許文献６】
特開２０００−２７０８９５号公報
【００１６】
【特許文献７】
特開２００２−１０７８７号公報
【００１７】
【非特許文献１】
トタニら（Ｔｏｔａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．），バイオケミカル・ソサイエティー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｓｏｃｉｅｔｙ），１４（６），１１７１２（１９８８）
【００１８】
【非特許文献２】
シミズら（Ｓｈｉｍｉｚｕ　ｅｔ　ａｌ．），バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｔｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），８，１５３（１９８６）
【００１９】
【非特許文献３】
レフサムら（Ｒｅｆｓｕｍ　ｅｔ　ａｌ．），クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），３５（９），１９２１（１９８９）
【００２０】
【非特許文献４】
ガーラスら（Ｇａｒｒａｓ　ｅｔ　ａｌ．），アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１９９，１１２（１９９１）
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
ホモシステインの酵素的測定法は、操作性、測定時間などの面から有用と考えられるが、上述したように、システインを含有する試料中のホモシステインの測定においてホモシステインに対する反応の特異性の問題があり、ホモシステイン量が試料中のシステイン、特に生体内に存在するＬ−システインの影響を受けるため、正確な定量が困難である。
【００２２】
したがって、本発明の主な目的は、Ｌ−システインの影響を受けず、正確かつ簡便で多数の検体処理が可能なホモシステインの酵素的測定方法及び測定用試薬を提供することにある。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決することを主な目的として、本発明者らは鋭意検討を行った。より詳しくは、Ｌ−システインを含有する試料中のホモシステインの測定において、試料中のＬ−システインの消去反応をあらかじめおこなうことにより、ホモシステインを特異的に測定することのできる方法を提供することを課題とし、検討を行った。
【００２４】
その結果、Ｌ−システイン分解酵素を利用したホモシステインの測定方法およびホモシステイン測定用試薬を開発し、これによりホモシステインを特異的に測定することができることを見出した。すなわち、ホモシステインおよびＬ−システインを含有する試料中のホモシステインの測定において、Ｌ−システイン分解酵素を利用したＬ−システインの消去系を組み入れることにより、混在する試料中のホモシステインの正確な定量が可能であることを見出した。
【００２５】
さらに詳しくは、試料中のＬ−システインに、Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しないＬ−システイン分解酵素を、ピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させ、続いてホモシステインに反応する酵素を作用させてホモシステインを定量することを特徴とするホモシステインの測定方法およびホモシステイン測定用試薬を開発した。
【００２６】
本発明により、Ｌ−システインが混在する試料中のホモシステインを正確かつ簡便に測定することが可能となる。
【００２７】
即ち、本発明は以下の構成からなる。
【００２８】
１．ホモシステインおよびＬ−システインを含有する試料中のホモシステインを測定する方法であって、Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しないＬ−システイン分解酵素を、ピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させることによりＬ−システインを試料中より消去し、ついでホモシステインおよびＬ−システインに反応する酵素を作用させることによりホモシステインを定量することを特徴とするホモシステインの測定方法。
【００２９】
２．Ｌ−システイン分解酵素が、口腔内に存在する細菌由来のものである１記載のホモシステインの測定方法。
【００３０】
３．Ｌ−システイン分解酵素が、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）又はフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）のいずれかの細菌由来のものである２に記載のホモシステインの測定方法。
【００３１】
４．Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号１記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである１〜３のいずれかに記載のホモシステインの測定方法。
【００３２】
５．Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号２記載の塩基配列、その相補配列、又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列のいずれかによってコードされるものである１〜３のいずれかに記載のホモシステインの測定方法。
【００３３】
６．Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号３記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである１〜３のいずれかに記載のホモシステインの測定方法。
【００３４】
７．Ｌ−システイン分解酵素が、更にセリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンとも実質的に反応しない酵素である１〜６のいずれかに記載のホモシステインの測定方法。
【００３５】
８．以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの工程を有する１〜７のいずれかに記載のホモシステインの測定方法。
（ａ）生成された硫化水素を、硫化物イオンの発色検出により測定する工程、
（ｂ）生成されたアンモニアを、グルタミン酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下において作用させ、反応に伴い減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する工程、
（ｃ）生成されたピルビン酸を、ピルビン酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下において作用させ、生成されたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する工程、
（ｄ）生成されたピルビン酸を、乳酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下において作用させ、反応に伴い減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する工程、
（ｅ）生成されたピルビン酸をピルビン酸酸化酵素の反応の基質とし、色原体及びペルオキシダーゼの存在下において作用させ、反応に伴い増加するキノン色素を発色定量する工程。
【００３６】
９．Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しない酵素、ホモシステインおよびＬ−システインに反応する酵素及びピリドキサル−５’−リン酸を含むことを特徴とするホモシステインの測定用試薬。
【００３７】
１０．Ｌ−システイン分解酵素が、口腔内に存在する細菌由来のものである９記載のホモシステインの測定用試薬。
【００３８】
１１．Ｌ−システイン分解酵素が、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）又はフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）のいずれかの細菌由来のものである１０に記載のホモシステインの測定用試薬。
【００３９】
１２．Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号１記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである９〜１１のいずれかに記載のホモシステインの測定用試薬。
【００４０】
１３．Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号２記載の塩基配列、その相補配列、又はそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列のいずれかによってコードされるものである９〜１１のいずれかに記載のホモシステインの測定用試薬。
【００４１】
１４．Ｌ−システイン分解酵素が、配列番号３記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むものである９〜１１のいずれかに記載のホモシステインの測定用試薬。
【００４２】
１５．Ｌ−システイン分解酵素が、更にセリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンとも実質的に反応しない酵素である９〜１４のいずれかに記載のホモシステインの測定用試薬。
【００４３】
１６．更に、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸酸化酵素からなる群から選ばれる１種又は２種以上の酵素を含む９〜１５のいずれかに記載のホモシステインの測定用試薬。
【００４４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００４５】
Ｌ−システイン分解酵素
本発明で用いられる酵素としては、Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しないＬ−システイン分解酵素であれば特に制限はない。
Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応は、具体的には、以下の化学式で表される。
【００４６】
【化１】
2004113138.tif 000002
【００４７】
また、Ｄ−システイン、ホモシステインと実質的に反応しないとは、Ｌ−システインとの反応と比較して、全く反応しないか又はほとんど反応しないことを意味する。例えば、図１においてＬ−システインのかわりにＤ−システイン、ホモシステインを用いて同様の試験を行った場合に、図１におけるＬ−システインが０ｍＭのときとほぼ同様の測定結果が得られることを意味する。測定結果の判定には、従来用いられている任意の検定方法を適宜採用することができる。
本発明のＬ−システイン分解酵素は、ホモシステインと実質的に反応せず、高い基質特異性を有していることから、試料中の測定対象であるホモシステイン量を変化させることが無い。したがって、Ｌ−システインの消去用酵素として適切であり、本酵素を消去用酵素として用いることによりホモシステインの正確な定量が可能となる。
【００４８】
本発明のＬ−システイン分解酵素は、更に、セリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンとも実質的に反応しないものが好ましい。セリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンと実質的に反応しないとは、Ｌ−システインとの反応と比較して、全く反応しないか又はほとんど反応しないことを意味する。
【００４９】
セリン、アラニン、Ｌ−システインメチルエステル、Ｌ−メチオニンとも実質的に反応しないことによって、反応産物の生成による測定系への影響を考慮する必要が無く、したがって、試料に対する測定精度が高まって、ホモシステインのより正確な定量が可能となる。
本発明のＬ−システイン分解酵素は、好ましくは、口腔内に存在する細菌由来、より好ましくは口腔内常在細菌由来のものである。ここで、口腔内常在細菌とは、頻繁に口腔内から検出される細菌を意味する。
口腔内常在細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・サリバリアス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｒａｌｉｓ）、アクチノマイセス・ネスランディー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、ペプトストレプトコッカス・ミクロス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｃｒｏｓ）、キャプノサイトファーガ・オクラセア（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｏｃｈｒａｃｅａ）、キャンピロバクター・グラシリス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ユーバクテリウム・ノダタム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｏｄａｔｕｍ）等が例示される。
このうち、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）又はフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）のいずれかの細菌に由来するＬ−システイン分解酵素が酵素反応性の点で好ましい。更に、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）に由来するＬ−システイン分解酵素が酵素反応性と、安定性の点でもっとも好ましい。
【００５０】
また、本発明における、Ｌ−システイン分解酵素として、好ましくは、以下のものが挙げられる。
【００５１】
配列番号１記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むＬ−システイン分解酵素。
【００５２】
配列番号２記載の塩基配列、その相補配列、又はそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列のいずれかによってコードされるＬ−システイン分解酵素。
【００５３】
配列番号３記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換した配列を含むＬ−システイン分解酵素。
【００５４】
配列番号１記載のアミノ酸配列を含むＬ−システイン分解酵素としては、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）由来の酵素が挙げられる。
【００５５】
配列番号２記載の塩基配列によってコードされるＬ−システイン分解酵素としては、ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）由来の酵素が挙げられる。
【００５６】
配列番号３記載のアミノ酸配列を含むＬ−システイン分解酵素としては、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）由来の酵素が挙げられる。
【００５７】
上記において、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したものとは、従来周知の技術により得ることができ、かつ、上述した酵素の性質及び機能が失われていない範囲内のものである。
【００５８】
また、上記において、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件とは、通常、「１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，３７℃」程度、好ましくは「０．５ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」程度、更に好ましくは、「０．２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」程度である。
【００５９】
本発明で用いられる酵素は、該酵素を生産する微生物、例えば上述した口腔内に存在する細菌を培養して菌体を回収し、この菌体を超音波処理等により破砕して得られる破砕液を、必要に応じて、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトゲル、ゲル濾過等のカラムクロマトグラフィを組合せて精製することにより得ることができる。
【００６０】
Ｌ−システインの消去方法
本発明のＬ−システインの消去方法は、試料中のＬ−システインに、上述のＬ−システイン分解酵素を、ピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させ、Ｌ−システインをアンモニア、ピルビン酸、硫化水素のいずれかの反応生成物へ変換することを特徴とする。
【００６１】
本発明のＬ−システインの消去方法におけるＬ−システイン分解酵素の使用濃度は特に限定されないが、０．０００５〜１ｍｇ／ｍｌであり、特に０．００２〜０．１ｍｇ／ｍｌの範囲とすることが好ましい。
【００６２】
また本発明において、補酵素として用いるピリドキサル−５’−リン酸の使用濃度も特に限定されないが、通常０．００１〜０．１ｍｍｏｌ／ｍｌであり、特に０．００５〜０．０５ｍｍｏｌ／ｍｌの範囲が好ましい。
【００６３】
本発明においては、緩衝液として、ｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等の、通常使用されるものを用いることができる。
【００６４】
本発明の測定方法が適用される試料（検体）としては、Ｌ−システインを含有しホモシステインの濃度を測定したいものであれば特に制限はない。例えば、血液、血清、血漿、髄液、尿などの生体試料、又はこれらの生体試料から調製された試料等が好適に使用される。
【００６５】
ホモシステインの測定方法
本発明のホモシステインの測定方法は、まず、試料中のＬ−システインに、上述のＬ−システイン分解酵素を、ピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させて消去し、ついでホモシステインおよびＬ−システインに反応する酵素を作用させて、生成された反応生成物のいずれかを定量することを特徴とする。
【００６６】
ホモシステインおよびＬ−システインに反応する酵素としては、例えば、ホモシステインデスルファラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリン−リアーゼ、Ｌ−メチオニンγリア−ゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドロラーゼ、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素などが挙げられる。
ホモシステインデスルファラーゼは、更に、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸酸化酵素などと組合わせて測定に用いる。またベタイン−ホモシステインメチル転移酵素は、更に、ジメチルグリシンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼなどと組合わせて測定に用いる。
【００６７】
このうち、ホモシステインデスルファラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリン−リアーゼ、Ｌ−メチオニンγリア−ゼが、酵素の最適条件に測定系を至適化することが容易である点で、好適に用いられる。
【００６８】
反応生成物を定量する方法としては、例えば、生成された硫化水素を、一般的に知られた硫化物イオンの測定法、すなわち、発色検出として、２，２’−ジピリジルジスルファイド（スベンソン（Ｓｖｅｎｓｏｎ），アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０７；５１〜５５（１９８０））やニトロプルシッドナトリウムを用いる方法、強酸性下で、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｐ−フェニレンジアミンと塩化第二鉄を用いてメチレンブルーを生成させ青色発色を検出する方法（メチレンブルー法）、セレニウムを触媒として色素（トルジンブルーやメチレンブルー）の退色量及び速度を測定する方法（マウサビ（Ｍｏｕｓａｖｉ）等，ブレチン・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティー・オブ・ジャパン（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ），６５；２７７０〜２７７２（１９９２）、（ゴックメン）Ｇｏｋｍｅｎ等，アナリスト（Ａｎａｌｙｓｔ），１１９；７０３〜７０８（１９９４））などで定量する方法等が挙げられる。
【００６９】
また、生成されたアンモニアを、グルタミン酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下において作用させ、反応に伴い減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する方法等が挙げられる。
【００７０】
また、生成されたピルビン酸を、ピルビン酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下において作用させ、生成されたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する方法、或いは、生成されたピルビン酸を乳酸脱水素酵素の反応の基質とし、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下において作用させ、反応に伴い減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを紫外部吸光により定量する方法等が挙げられる。また、生成されたピルビン酸をグルタミン酸酸化酵素の反応の基質とし、色原体及びペルオキシダーゼの存在下において作用させ、反応に伴い増加するキノン色素を発色定量するなどの手法と組合せることもできる。
【００７１】
本発明の測定方法におけるＬ−システイン分解酵素の使用濃度は特に限定されないが、０．０００５〜１ｍｇ／ｍｌであり、特に０．００２〜０．１ｍｇ／ｍｌの範囲とすることが好ましい。
【００７２】
また本発明において、補酵素として用いるピリドキサル−５’−リン酸の使用濃度も特に限定されないが、通常０．００１〜０．１ｍｍｏｌ／ｍｌであり、特に０．００５〜０．０５ｍｍｏｌ／ｍｌの範囲が好ましい。
【００７３】
また、本発明において用いるホモシステイン及びＬ−システインに反応する酵素の使用濃度も特に限定されないが、１〜２００Ｕ／ｍｌ程度、特に１０〜５０Ｕ／ｍｌ程度の範囲とすることが好ましい。
【００７４】
本発明において、更に補酵素（電子供与体）としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用いる場合には、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの使用濃度は、通常０．０１〜１０ｍｍｏｌ／ｍｌであり、特に０．０５〜０．２ｍｍｏｌ／ｍｌの範囲が好ましい。補酵素の還元体を定量するために、還元されることによって発色する発色剤を併用してもよい。かかる発色剤は、使用する補酵素に応じて適宜選択すればよく、例えばＮＡＤの還元体であるＮＡＤＨを定量するために、電子キャリアーとして、フェナジンメトサルフェートやジアホラーゼとテトラゾリウム塩を共存させ、生成されるホルマザン色素を比色定量する方法等が挙げられる。
【００７５】
本発明においては、緩衝液として、ｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等の、通常使用されるものを用いることができる。
【００７６】
本発明の測定方法が適用される試料（検体）としては、ホモシステインの濃度を測定したいものであれば特に制限はない。例えば、血液、血清、血漿、髄液、尿などの生体試料、又はこれらの生体試料から調製された試料等が好適に使用される。
【００７７】
ホモシステイン測定用試薬
本発明のホモシステイン測定用試薬は、上述したＬ−システイン分解酵素、ホモシステインおよびＬ−システインに反応する酵素及びピリドキサル−５’−リン酸を含むことを特徴とする。
【００７８】
ホモシステインおよびＬ−システインに反応する酵素としては、例えば、ホモシステインデスルファラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリン−リアーゼ、Ｌ−メチオニンγリア−ゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドロラーゼ、ベタイン−ホモシステインメチル転移酵素などが挙げられる。
【００７９】
本発明のホモシステイン測定用試薬には、更に、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸酸化酵素、からなる群から選ばれる１種又は２種以上の酵素を含むことが好ましい。
【００８０】
本発明のホモシステイン測定用試薬は、２種以上の試薬構成とすることができる。例えば、Ｌ−システイン分解酵素とピリドキサル−５’−リン酸を含む第１試薬を生体試料に添加してＬ−システインの消去反応を行わせた後、ホモシステインおよびＬ−システインに反応する酵素を含む第２試薬を添加して、生体試料中のホモシステインに作用させ、生成された１種又は２種以上の反応生成物を定量することによって、ホモシステインの測定を行うことができる。
【００８１】
ただし、本発明のホモシステイン測定用試薬の試薬構成は第１試薬にＬ−システイン分解酵素とピリドキサル−５’−リン酸を含むものであればよく、補酵素及び測定用酵素を別々に組合せたものでもよい。
【００８２】
例えば、Ｌ−システイン分解酵素とピリドキサル−５’−リン酸、並びに乳酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、及びピルビン酸酸化酵素からなる群から選ばれる１種又は２種以上の酵素を含む第１試薬と、ホモシステインおよびＬ−システインに反応する酵素及びＮＡＤＨを含む第２試薬との組合わせなどが挙げられる。
【００８３】
また、Ｌ−システイン分解酵素とピリドキサル−５’−リン酸、およびＮＡＤＨとを含む第１試薬と、ホモシステインおよびＬ−システインに反応する酵素、並びに、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素及びピルビン酸酸化酵素からなる群から選ばれる１種又は２種以上の酵素を含む第２試薬との組合わせなども挙げられる。
【００８４】
本発明の測定試薬におけるＬ−システイン分解酵素の含有濃度は特に限定されないが、通常０．０００５〜１ｍｇ／ｍｌであり、特に０．００２〜０．１ｍｇ／ｍｌの範囲とすることが好ましい。
【００８５】
また、ピリドキサル−５’−リン酸の含有濃度も特に限定されないが、通常０．００１〜０．１ｍｍｏｌ／ｍｌであり、特に０．００５〜０．０５ｍｍｏｌ／ｍｌの範囲が好ましい。
【００８６】
更に補酵素（電子供与体）としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用いる場合には、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの含有濃度は、通常０．０１〜１０ｍｍｏｌ／ｍｌであり、特に０．０５〜０．２ｍｍｏｌ／ｍｌの範囲が好ましい。
【００８７】
また、ホモシステイン及びＬ−システインに反応する酵素の使用濃度も特に限定されないが、１〜２００Ｕ／ｍｌであり、特に１０〜５０Ｕ／ｍｌの範囲とすることが好ましい。
【００８８】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８９】
酵素製造例（Ｌ−システイン分解酵素の製造）
（１）染色体ＤＮＡ　の調製
ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）　ＦＷ７３株をブレインハートインフージョン（ｂｒａｉｎ　ｈｅａｒｔ　ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ブロス中において、５％二酸化炭素存在下で３７℃、一昼夜培養した。定常期に達した菌液に等量の培地を加えて、さらに同じ条件下で約１時間培養した。さらに、培養液の３／２０容量の２０％　グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）溶液を加え、約１時間培養した。その後、培養液を遠心して上清を取り除き、培養液の１／５０容量の緩衝液（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　５０　ｍＭ　ｇｌｕｃｏｓｅ，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ；　ｐＨ　８）で菌体を懸濁した。同懸濁液　（２５０　μｌ）　に　１．０　ｍｇ／ｍｌ　（１，０００　Ｕ／ｍｌ）　のムタロライシン　Ｋ−１（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ　Ｋ−１）　（２５　μｌ）　を加え３７℃で３０分間反応させた。同反応液に１００　μｌ　のリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ；　和光純薬工業）を加え、３７℃で６０分間反応させた。その後、溶液中のＲＮＡを除去するために、１０　μｌのリボヌクレアーゼ（１０　ｍｇ／ｍｌ；　ニッポンジーン）を加え、３７℃で３０分間反応させた。さらに、　１０　μｌ　のプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ）　（１４０　Ｕ／ｍｌ；　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，　ＵＳＡ）　を混合し、３７℃で６０分間反応させた。続いて同反応液にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を１％になるように加え、穏やかに混合した。この反応液を用いて、フェノール・クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）混合溶液による抽出を４回程度行い、さらにクロロホルムによる抽出を１回行った。この抽出液と等量のイソプロパノールを緩やかに混合した際、白雲状に認められる染色体ＤＮＡをガラス棒で絡め取り、７０％エタノールで洗浄した後、適当量のＴＥ溶液（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ；　ｐＨ　８．０）に溶解し、使用時まで４℃で保存した。なお、本実施例で用いたストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）　ＦＷ７３株は、九州大学大学院歯学研究院口腔保健推進学講座で継代保存されているものを用いた。
【００９０】
（２）Ｌ−システイン分解酵素遺伝子を発現させるプラスミドの構築
ストレプトコッカス・アンジノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）　ＦＷ７３株のＬ−システイン分解酵素をコードする遺伝子は、すでに、吉田らによってクローン化され、その塩基配列は国際ＤＮＡデータベースである、ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ　（ＤＤＢＪ）に登録されている（登録番号：ＡＢ０８４８１２）。その塩基配列をもとに、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩの制限酵素サイトを付したプライマーを設計した（フォワードプライマー；　５’−ＴＣＣＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＡＴＴＴＴＣＡＡＡ−３’（配列番号４）、リバースプライマー；　５’−ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＣＣＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡ−３’（配列番号５））。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ストレプトコッカス・アンジノサス　ＦＷ７３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法にてＬ−システイン分解酵素をコードする約１．２　ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。以上のＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）　を用いて未反応のｄＮＴＰおよびプライマーを除去した。発現ベクターとして、Ｎ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ　（ＧＳＴ）をコードする遺伝子および　プレサイション　プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ）切断部位を含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１　（Ａｍａｒｓｈａｍ）を用いた。得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断した後に、同様にＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、脱リン酸化処理した発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−Ｉと等モルずつライゲーションした。こうして得られたプラスミドをエシェリヒア　コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）ＢＬ２１株に形質導入した。本プラスミドはｐＭＩＬＣＤ１１０と名付けた。
【００９１】
（３）組換えＬ−システイン分解酵素の精製
組換えＬ−システイン分解酵素の精製にはＲｅｄｉＰａｃｋ　ＧＳＴ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｍｏｄｕｌｅ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　を用い、操作はキットに添付されている指示書にしたがって行った。まず、ＢＬ２１株にｐＭＩＬＣＤ１１０を導入した形質転換株を、１００　μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む　２　×ＹＴ培地を用いて３７°Ｃで培養し、この菌液が５５０　ｎｍでの吸光度約１．０　に達した時点でＩＰＴＧを１　ｍＭになるように加え、さらに３７°Ｃで１．５時間培養した。その後、培養液を４°Ｃ、６，０００×ｇで１０分間遠心して集菌した。この菌体を１　ｇ　（湿重量）　あたり２−５　ｍｌの氷冷したＰＢＳ　（１４０　ｍＭ　ＮａＣｌ、２．７　ｍＭ　ＫＣｌ、１０　ｍＭ　Ｋ２ＨＮＯ３、１．８　ｍＭ　ＫＨ２ＮＯ３；　ｐＨ　７．３）　で懸濁し、超音波破砕機　（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ　Ｉｎｃ．，　ＵＳＡ）　を用いて、氷上にて冷却しながら出力３０％、パルス幅０．５秒で３０秒の菌体破砕を、冷却のため６０秒の休止をおきながら合計５回行った。菌体破砕液は４°Ｃ、１２，０００×ｇで３０分間遠心して上清を回収した。次に、グルタチオン　セファロース（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４Ｂの入ったカラムを氷冷したＰＢＳ　６００　μｌで平衡化した後、６００　μｌの菌体破砕液上清を加え、４°Ｃ、３，０００×ｇで１分間遠心してカラムに吸着させた。このカラムを６００　μｌの氷冷したＰＢＳで３回洗浄したのち、６００　μｌの氷冷したプレサイションクリベージバッファー（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ｂｕｆｆｅｒ）　（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；　ｐＨ　７．０）　で２回洗浄した。これに１８０　μｌのプレサイションクリベージバッファー（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ｂｕｆｆｅｒ）および１０　μｌのプレサイションプロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ））　を加え、４°Ｃで一晩ＧＳＴ融合タンパクを消化した後に、カラムを４°Ｃ、３，０００×ｇで１分間遠心して精製し、Ｌ−システイン分解酵素であるＬ−システインデスルフヒドラーゼ（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｄｅｓｕｌｆｈｙｄｒａｓｅ）を得た。
【００９２】
実施例
上記酵素製造例で得られたＬ−システイン分解酵素、ホモシステインデスルフラーゼ（プロテウス・モルガニー（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｏｒｇａｎｉｉ）ＩＦＯ３１６８由来）：メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），　Ｖｏｌ．２，　ｐ３１８　（１９５５）；　ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　Ｖｏｌ．１９２，　ｐ３７１　（１９５１）；　特開２００１−１６１３９９号公報参照）、Ｌ−乳酸脱水素酵素（ブタ由来：東洋紡績製）、及び、電子供与体として補酵素ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母製）を用いて、以下に示すホモシステイン定量用試薬を作成した。
【００９３】
試薬組成：
＜第１試薬＞
５０ｍＭ：リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
０．０１ｍＭ：ピリドキサル−５’−リン酸
０．０１ｍｇ／ｍｌ：Ｌ−システイン分解酵素
１００Ｕ／ｍｌ　：Ｌ−乳酸脱水素酵素
０．２ｍＭ：ＮＡＤＨ
＜第２試薬＞
５０ｍＭ：リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
５０Ｕ／ｍｌ　：ホモシステインデスルフラーゼ
ここで、３７℃において１分間に１μｍｏｌｅの反応を触媒する酵素量を１Ｕとする。そして、この試薬を用いて、以下に示すようにして、各種ホモシステイン濃度（０〜０．５ｍＭ）およびＬ−システイン濃度（０．１〜０．５ｍＭ）の試料溶液を測定した。
【００９４】
各濃度の試料溶液各１０μｌに対し、第１試薬０．１５ｍｌを添加して３７℃で５分反応させ、次に第２試薬０．１５ｍｌを添加して３７℃で５分反応させ、波長３４０ｎｍの吸光度を１２秒毎に測定して、生成されたＮＡＤの定量、すなわちＮＡＤＨの減少量の定量を行った。これらの操作は、日立７１５０形自動分析装置により行った。
【００９５】
１２秒毎の測定を１ポイントとし、５０ポイントの値より２６ポイントの値を引くことで、測定値を求めた。その結果を図１に示す。
【００９６】
図１から明らかなように、ホモシステイン濃度０〜０．５ｍＭまで、直線的な吸光度変化の上昇が得られた。得られた直線の関係は、ｙ＝１６２〜１６６ｘ、ｒ２＝０．９９８〜１．００（ここで、ｙは吸光度変化、ｘはホモシステイン濃度、ｒは相関係数）であって、正確なホモシステインの定量が可能であることが分かった。
【００９７】
比較例
Ｌ−システイン分解酵素およびピリドキサル−５’−リン酸を使用せず、ホモシステインデスルフラーゼ（プロテウス・モルガニー（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｏｒｇａｎｉｉ）ＩＦＯ３１６８由来）：メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），　Ｖｏｌ．２，　ｐ３１８　（１９５５）；　ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　Ｖｏｌ．１９２，　ｐ３７１　（１９５１）；　特開２００１−１６１３９９号公報）、Ｌ−乳酸脱水素酵素（ブタ由来：東洋紡績製）、及び、電子供与体として補酵素ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母製）を用いて、以下に示すホモシステイン定量用試薬を作成した。
【００９８】
試薬組成：
＜第１試薬＞
５０ｍＭ：リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
１００Ｕ／ｍｌ　：Ｌ−乳酸脱水素酵素
０．２ｍＭ：ＮＡＤＨ
＜第２試薬＞
５０ｍＭ：リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
５０Ｕ／ｍｌ　：ホモシステインデスルフラーゼ
そして、この試薬を用いて、実施例と同様の方法により、各種ホモシステイン濃度（０．１〜０．５ｍＭ）およびＬ−システイン濃度（０．１〜０．５ｍＭ）の試料溶液を測定した。
【００９９】
実施例と同様に、１２秒毎の測定を１ポイントとし、５０ポイントの値より２６ポイントの値を引くことで、測定値を求めた。その結果を図２に示す。
【０１００】
図２から明らかなように、測定結果は試料中のＬ−システインの影響を受け、同濃度のホモシステインに対し、正確な吸光度変化が得られなかった。すなわち、本発明の方法であるＬ−システイン分解酵素をピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させてＬ−システインを試料中より消去することによって初めて、正確なホモシステインの定量が可能であることが明らかとなった。
【０１０１】
【発明の効果】
このように、本発明によれば、ホモシステインおよびＬ−システインを含む試料に、Ｌ−システインに反応してアンモニア、ピルビン酸及び硫化水素を生成する反応を触媒し、Ｄ−システイン、ホモシステインとは実質的に反応しないＬ−システイン分解酵素を、ピリドキサル−５’−リン酸の存在下において作用させることにより、Ｌ−システインを消去させ、更に、ホモシステインおよびＬ−システインと反応する酵素を作用させるという構成を有することによって、正確なホモシステインの定量が可能となる。また、本発明により、正確かつ簡便なホモシステインの測定用試薬も提供される。
【０１０２】
本発明を利用することにより、汎用の自動分析装置を用いて多数の検体処理を行うことも可能となる。
【０１０３】
【配列表】
2004113138.tif 000003
2004113138.tif 000004
2004113138.tif 000005
2004113138.tif 000006
2004113138.tif 000007
2004113138.tif 000008
2004113138.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の実施例によるホモシステイン測定の結果を示す。
【図２】図２は、本発明の比較例によるホモシステイン測定の結果を示す。
【図１】
2004113138.tif 000010
【図２】
2004113138.tif 000011