(57)【要約】【課題】  ベータ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップおよびそれを用いたベータ−カテニン突然変異の検出方法の提供。【解決手段】  本発明は、β−カテニン遺伝子の突然変異集中誘発地域(mutational hot spot region)内で発生可能な様々な突然変異を検出するためのβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップ、前記マイクロチップの製造方法およびそれを用いてβ−カテニン遺伝子の突然変異を検出する方法に関するものであって、本発明の特異的なオリゴヌクレオチドはβ−カテニン遺伝子の特定突然変異集中コドン部位において様々なミスセンス突然変異と解読フレーム内欠失を検出できるように考案されたものである。本発明のβ−カテニンオリゴチップはβ−カテニン遺伝子の突然変異検出およびβ−カテニン遺伝子に関わる信号伝達システムの研究や癌機構の研究に有用である。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固形基板の表面に固定された複数個のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドがβ−カテニン遺伝子の突然変異集中コドン部位の様々な突然変異を検出できるように考案された、β−カテニン遺伝子の突然変異を検出するためのβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップ。
【請求項２】
β−カテニン遺伝子の突然変異集中コドン部位が、コドン２９、３１、３２、３３、３４、３５、３７、３８、４１、４５および４８であることを特徴とする請求項１記載のβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップ。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが、コドン２９、３１、３２、３３、３４、３５、３７、３８、４１、４５および４８に対して９つのタイプのミスセンス突然変異、１つのタイプの解読フレーム内欠失、および野生型を検出するように考案されることを特徴とする請求項１記載のβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップ。
【請求項４】
ミスセンス突然変異を検出するためのオリゴヌクレオチドがコドン２９に対しては配列番号２〜１０のオリゴヌクレオチド；コドン３１に対しては配列番号１３〜２１のオリゴヌクレオチド；コドン３２に対しては配列番号２４〜３２のオリゴヌクレオチド；コドン３３に対しては配列番号３５〜４３のオリゴヌクレオチド；コドン３４に対しては配列番号４６〜５４のオリゴヌクレオチド；コドン３５に対しては配列番号５７〜６５のオリゴヌクレオチド；コドン３７に対しては配列番号６８〜７６のオリゴヌクレオチド；コドン３８に対しては配列番号７９〜８７のオリゴヌクレオチド；コドン４１に対しては配列番号９０〜９８のオリゴヌクレオチド；コドン４５に対しては配列番号１０１〜１０９のオリゴヌクレオチド；およびコドン４８に対しては配列番号１１２〜１２０のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項３記載のβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップ。
【請求項５】
解読フレーム内欠失を検出するためのオリゴヌクレオチドがコドン２９に対しては配列番号１１のオリゴヌクレオチド；コドン３１に対しては配列番号２２のオリゴヌクレオチド；コドン３２に対しては配列番号３３のオリゴヌクレオチド；コドン３３に対しては配列番号４４のオリゴヌクレオチド；コドン３４に対しては配列番号５５のオリゴヌクレオチド；コドン３５に対しては配列番号６６のオリゴヌクレオチド；コドン３７に対しては配列番号７７のオリゴヌクレオチド；コドン３８に対しては配列番号８８のオリゴヌクレオチド；コドン４１に対しては配列番号９９のオリゴヌクレオチド；コドン４５に対しては配列番号１１０のオリゴヌクレオチド；およびコドン４８に対しては配列番号１２１のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項３記載のβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップ。
【請求項６】
野生型を検出するためのオリゴヌクレオチドがコドン２９に対しては配列番号１のオリゴヌクレオチド；コドン３１に対しては配列番号１２のオリゴヌクレオチド；コドン３２に対しては配列番号２３のオリゴヌクレオチド；コドン３３に対しては配列番号３４のオリゴヌクレオチド；コドン３４に対しては配列番号４５のオリゴヌクレオチド；コドン３５に対しては配列番号５６のオリゴヌクレオチド；コドン３７に対しては配列番号６７のオリゴヌクレオチド；コドン３８に対しては配列番号７８のオリゴヌクレオチド；  コドン４１に対しては配列番号８９のオリゴヌクレオチド；コドン４５に対しては配列番号１００のオリゴヌクレオチド；およびコドン４８に対しては配列番号１１１のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項３記載のβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップ。
【請求項７】
下記段階を含む請求項１〜６記載のいずれか一項に記載のβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップの製造方法：
１）β−カテニン遺伝子の突然変異集中コドン部位の突然変異を検出できるオリゴヌクレオチドの各々を微細集積溶液（spotting solution）に混合してウェルプレートに分株する段階；
２）前記オリゴヌクレオチドをマイクロアレイヤーを用いて固形基板の表面上に集積する段階；
３）前記固形基板の表面上にオリゴヌクレオチドを固定した後洗浄する段階；
４）前記固形基板を９５℃の熱水に浸漬して変性（denaturation）させた後水酸化ホウ素ナトリウム（sodium borohydride）溶液で処理する段階；および
５）前記固形基板を洗浄した後乾燥する段階。
【請求項８】
段階１）で用いられたオリゴヌクレオチドが各々５’アミノ変形（5’amino modification）を有する１２個の炭素スペーサー（carbon spacer）に連結されていることを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
段階２）の固形基板が、ガラス、変形シリコン、プラスチックカセットまたはポリカーボネートプレートであることを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１０】
固形基板がアルデヒドまたはアミンでコーティングされたことを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
段階２）の各々のオリゴヌクレオチドスポットが１００〜５００μｍ範囲の直径を有する円形であることを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１２】
段階２）のオリゴヌクレオチドスポットが２００〜８００μｍ範囲の間隔で多重行と列で配列されていることを特徴とする請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
下記段階を含む請求項１記載のβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップを用いてβ−カテニン遺伝子の突然変異を検出する方法：
１）対象患者の血液から蛍光染料が標識されたＤＮＡ試料を準備する段階；
２）前記標識ＤＮＡ試料をβ−カテニンオリゴチップ上のオリゴヌクレオチドスポットと反応させる段階；
３）非結合ＤＮＡ試料を除去するために前記β−カテニンオリゴチップを洗浄する段階；
４）蛍光リーダーを用いて特定のオリゴヌクレオチドスポットのハイブリダイゼーション様相を検出する段階；および
５）遺伝子突然変異の存在有無を確認する段階。
【請求項１４】
段階１）の蛍光染料がＣｙ５、Ｃｙ３、テキサスレッド（Texas Red）、フルオレセイン（Fluorescein）およびリサミン（Lissamine）からなる群から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項１５】
段階２）の反応が水蒸気で飽和された４５〜６０℃範囲のインキュベータ内で３〜９時間行われることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−カテニン遺伝子の突然変異集中誘発地域(mutational hot spot region)内での突然変異を検出するためのβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップ(β-catenin oligonucleotide microchip)、前記マイクロチップの製造方法およびそれを用いてβ−カテニン遺伝子の突然変異を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔ信号伝達経路（Wnt signaling pathway）において下流転写活性因子（downstream transcriptional activator）として作用するβ−カテニン（β−catenin）は、カドヘリン−媒介性細胞−細胞付着システム（cadherin-mediated cell-cell adhesion system）の膜性構成成分（submembrane component）である（Abraham, S. C. et al., Am. J. Pathol. 158:1005-1010, 2001; Abraham, S. C. et al., Am. J. Pathol., 158:1073-1078, 2001）。ＧＳＫ−３β（glycogen synthase kinase-3β）とともにＡＰＣ（adenomatous polyposis coli）腫瘍抑制因子タンパク質はβ−カテニン遺伝子のエクソン３内のセリン／トレオニン（serine/threonine）残基のリン酸化を促進して分解（degradation）を引き起こす(Araham, S. C. et al., Am. J. Pathol., 158:1073-1078, 2001)。ＡＰＣ遺伝子またはβ−カテニン遺伝子の突然変異はβ−カテニンタンパク質の蓄積およびβ−カテニン調節活性（regulatory activity）の消失をもたらすことが明らかになった（Abraham, S. C. et al., Am. J. Pathol., 158:1073-1078, 2001）。大部分のβ−カテニン突然変異は、子宮内膜癌（endometrial cancer）、胃癌、卵巣癌、肝母細胞腫癌（hepatoblastomas）または結腸直腸癌のような様々なヒト腫瘍においてＧＳＫ−３βリン酸化部位、たとえば、Ｓｅｒ−３３、Ｓｒ−３７、Ｔｈｒ−４１、Ｓｅｒ−４５および他の残基（Ａｓｐ−３２およびＧｌｙ−３４）において特異的であると報告されている（Saegusa, M. and Okayasu, I. J. Pathol., 194:59-67, 2001）。結腸直腸癌において０〜１６％に至る様々な頻度のβ−カテニン突然変異が報告されている（Nilbert, M. and Rambech, E. Cancer Genet. Cytogenet. 128:43-45, 2001; Mirabelli-Primdahl, L. et al., Cancer Res. 59:3346-51, 1999）。大部分のβ−カテニン突然変異はエクソン３内のいくつかのコドンに制限的であり、アミノ酸の変化をもたらすミスセンス突然変異（missense mutation）の形態であると知られている（Devereux, T. R. et al., Mol. Carcinog. 31:68-73, 2001; Udatsu, Y. et al., Pediatr. Surg. Int. 17:508-512, 2001; Koch, A. et al., Cancer Res. 59:269-273, 1999; de La Coste, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:8847-8851, 1998）。
【０００３】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single strand conformation polymorphism）または直接塩基配列分析などの従来の方法を用いてβ−カテニン遺伝子の突然変異を検出することが容易であっても、このようなβ−カテニン遺伝子の突然変異検出方法の低い敏感度に関わる技術的な問題が報告されている（Abraham, S. C. et al., Am. J. Pathol. 158:1005-1010, 2001）。したがって、β−カテニン遺伝子のための、信頼性があり、かつ迅速な突然変異検出方法の開発が要求されており、このような検出方法は腫瘍の研究、特に、Ｗｎｔ信号−関連機構の研究に有用である。
【０００４】
一方、高頻度ＭＳＩ（microsatellite instability, MSI-H）結腸直腸癌腫は、大体ＡＰＣ突然変異を有しないと知られており（Mirabelli-Primdahl, L. et al., Cancer Res. 59:3346-51, 1999）、β−カテニン遺伝子突然変異は主にＭＳＩ−Ｈ結腸直腸癌腫から誘導されると報告されている（Mirabelli-Primdahl, L. et al., Cancer Res. 59:3346-51, 1999; Shitoh, K. et al., Genes Chromosomes Cancer 30:32-37,2001; Samowitz, W. S. et al., Cancer Res. 59:1442-1444, 1999）。
【０００５】
トラベルソらは、ＭＳＩを大便内で近位結腸癌を診断するための診断マーカーとして用い（Traverso, G. et al., Lancet. 359:403-404, 2002）、いくつかの異なるマーカー、たとえば、ＡＰＣ、ｐ５３、ｌｏｎｇ  ＤＮＡ、およびＫ−ｒａｓのようなマーカーもまた、排泄物ＤＮＡを用いた結腸直腸癌の診断に用いられてきた（Ahlquist, D. A. et al., Gastroenterology 119:1219-1227, 2000; Dong, S. M. et al., J. Natl. Cancer. Inst. 93:858-865, 2001）。
【０００６】
近位結腸癌でβ−カテニン突然変異が頻繁に発生するという事実は、β−カテニン突然変異を近位結腸癌の診断に使用できることを提示するものである。したがって、本発明者らは、自動化されたマイクロアレイヤーを用いてβ−カテニン遺伝子の突然変異集中コドン部位で発生可能な様々な突然変異を検出できるように考案されたオリゴヌクレオチドを固形基板の表面に固定してβ−カテニン遺伝子の突然変異を検出できるβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップを開発した。本発明のβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップは、β−カテニン遺伝子の突然変異検出およびβ−カテニン遺伝子に関わる信号伝達システムの研究や腫瘍発生機構の研究に有用である。
【０００７】
【非特許文献１】Abrahamら著、2001年発行、Am. J. Pathol. 158:1005-1010
【０００８】
【非特許文献２】Abrahamら著、2001年発行、Am. J. Pathol., 158:1073-1078
【０００９】
【非特許文献３】Saegusa及びOkayasu著、2001年発行、I. J. Pathol., 194:59-67
【００１０】
【非特許文献４】Nilbert及びRambech著、2001年発行、E. Cancer Genet. Cytogenet. 128:43-45
【００１１】
【非特許文献５】Mirabelli-Primdahlら著、1999年発行、Cancer Res. 59:3346-51
【００１２】
【非特許文献６】Devereuxら著、2001年発行、Mol. Carcinog. 31:68-73
【００１３】
【非特許文献７】Udatsuら著、2001年発行、Pediatr. Surg. Int. 17:508-512
【００１４】
【非特許文献８】Kochら著、1999年発行、Cancer Res. 59:269-273
【００１５】
【非特許文献９】de La Costeら著、1998年発行、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:8847-8851
【００１６】
【非特許文献１０】Shitohら著、2001年発行、Genes Chromosomes Cancer 30:32-37
【００１７】
【非特許文献１１】Samowitzら著、1999年発行、Cancer Res. 59:1442-1444
【００１８】
【非特許文献１２】Traversoら著、2002年発行、Lancet. 359:403-404
【００１９】
【非特許文献１３】Ahlquistら著、2000年発行、Gastroenterology 119:1219-1227
【００２０】
【非特許文献１４】Dongら著、2001年発行、J. Natl. Cancer. Inst. 93:858-865
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
したがって、本発明の目的は、β−カテニン遺伝子に関わる信号伝達システムの研究や腫瘍発生機構を研究するための、迅速、かつ信頼性のある診断道具として使用できるβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の一実施態様によって、本発明では、固形基板の表面に固定された複数個のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドがβ−カテニン遺伝子の突然変異集中コドン部位の様々な突然変異を検出できるように考案された、β−カテニン遺伝子の突然変異を検出するためのβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップおよびその製造方法が提供される。
【００２３】
また、本発明では前記β−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップを用いてβ−カテニン遺伝子の突然変異を検出する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、自動化されたマイクロアレイヤーを用いてβ−カテニン遺伝子の突然変異集中コドン部位の様々な突然変異を検出できるように考案され、固形基板の表面に固定されたオリゴヌクレオチドを含む、β−カテニン遺伝子の突然変異を検出できるβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップ（以下、「β−カテニンオリゴチップ」と略称する）を提供する。
【００２５】
まず、本発明においては、β−カテニン遺伝子の突然変異集中コドン部位であるエクソン３の１１個コドン（２９、３１、３２、３３、３４、３５、３７、３８、４１、４５および４８コドン）で発生可能なミスセンス突然変異（missense mutation）および解読フレーム内欠失（in-frame deletion）突然変異を検出できる様々なオリゴヌクレオチドを考案した。
【００２６】
β−カテニン遺伝子の突然変異は様々なヒトの悪性腫瘍（malignancies）から分離されたが、これらの大部分はエクソン３の突然変異集中コドン部位（hot-spot areas）に限定されたミスセンス突然変異であると知られている。β−カテニン遺伝子の突然変異はＭＳＩを有する結腸直腸癌と非常に深い関連がある。β−カテニン突然変異の７０％以上が結腸直腸癌から報告され、これらのうち９０％は１１個のコドン（コドン２９、３１、３２、３３、３４、３５、３７、３８、４１、４５および４８）から発見された。
【００２７】
本発明は、調査されたすべての場合の突然変異が９０％以上の頻度で示される前記突然変異集中コドンで発生可能なすべての突然変異を検出できるように考案されたオリゴヌクレオチドを提供する。本発明の対象遺伝子であるβ−カテニン遺伝子の突然変異は、遺伝子の特性上突然変異の９０％以上が特定な１１個のコドンにおいてただ一つの塩基が変形されたミスセンス突然変異および解読フレーム内欠失の形態として現れる。したがって、このようなβ−カテニン遺伝子の特性を考慮して製作された本発明のβ−カテニンオリゴチップはβ−カテニン遺伝子の突然変異検出率を９０％以上に高めることができる。また、本発明のβ−カテニンオリゴチップに用いられたオリゴヌクレオチドは１１個のコドンで誘発可能なすべての突然変異を検出できるように考案されたので、前記１１個のコドンでまだ報告されていないミスセンス突然変異が発生する場合にもこれを検出できる。さらに、本発明のβ−カテニンオリゴチップはまた、突然変異集中コドンの各々に対する解読フレーム内欠失（３ｂｐ欠失）も検出できる。すなわち、本発明のβ−カテニンオリゴチップは、β−カテニン遺伝子の特性を考慮して突然変異集中コドン部位に対するオリゴヌクレオチドを選択的に考案したため、本発明のβ−カテニンオリゴチップはβ−カテニン遺伝子突然変異を検出するにおいて向上した正確性と効率性を提供する。
【００２８】
本発明の一態様として、本発明のβ−カテニンオリゴチップは、好ましくは固形基板の表面に集積されて固定された１２１個のオリゴヌクレオチドを含むが、前記オリゴヌクレオチドはβ−カテニン遺伝子の突然変異集中コドン部位である１１個コドンの各々で発生可能なすべてのミスセンス突然変異と解読フレーム内欠失を検出できる。各々のオリゴヌクレオチドは正確な実験データを得るために４回繰り返して水平に集積されている。９個のオリゴヌクレオチド（Ｍ）が各々の突然変異集中コドン部位で発生可能なすべての置換を検出するように考案され、一個のオリゴヌクレオチド（Ｗ）が野生型を検出するように考案された。したがって、総１０個のオリゴヌクレオチドがコドン２３、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３８、４１および４８に対するミスセンス突然変異を検出するために考案された。また、１１個のオリゴヌクレオチド（Ｄ）が各突然変異集中コドン部位における解読フレーム内欠失（３ｂｐ−欠失）を検出するように考案された。全体的に、１２１個のオリゴヌクレオチドがエクソン３の１１個コドン内のすべての置換および解読フレーム内欠失を検出できる。
【００２９】
具体的に、コドン２９に用いられた９個のオリゴヌクレオチドは各々ＴＣＴ（セリン）をＡＣＴ（トレオニン）、ＧＣＴ（アラニン）、ＣＣＴ（プロライン）、ＴＡＴ（チロシン）、ＴＧＴ（シトシン）、ＴＴＴ（フェニルアラニン）、ＴＣＡ（セリン）、ＴＣＧ（セリン）およびＴＣＣ（セリン）で置換して得られ、１個の欠失オリゴヌクレオチドは３ｂｐのＴＣＴ欠失によって得られる。コドン３１に用いられた９個のオリゴヌクレオチドは各々ＣＴＧ（ロイシン）をＡＴＧ（メチオニン）、ＴＴＧ（ロイシン）、ＧＴＧ（バリン）、ＣＡＧ（グルタミン）、ＣＧＧ（アルギニン）、ＣＣＧ（プロライン）、ＣＴＡ（ロイシン）、ＣＴＣ（ロイシン）およびＣＴＴ（ロイシン）で置換して得られ、１個の欠失オリゴヌクレオチドは３ｂｐのＣＴＧ欠失によって得られる。コドン３２に用いられた９個のオリゴヌクレオチドは各々ＧＡＣ（アスパラギン酸）をＣＡＣ（ヒスチジン）、ＴＡＣ（チロシン）、ＡＡＣ（アスパラギン）、ＧＣＣ（アラニン）、ＧＴＣ（バリン）、ＧＧＣ（グリシン）、ＧＡＧ（グルタミン酸）、ＧＡＴ（アスパラギン酸）およびＧＡＡ（グルタミン酸）で置換して得られ、１個の欠失オリゴヌクレオチドは３ｂｐのＧＡＣ欠失によって得られる。コドン３３に用いられた９個のオリゴヌクレオチドは各々ＴＣＴ（セリン）をＡＣＴ（トレオニン）、ＧＣＴ（アラニン）、ＣＣＴ（プロライン）、ＴＧＴ（システイン）、ＴＡＴ（チロシン）、ＴＴＴ（フェニルアラニン）、ＴＣＡ（セリン）、ＴＣＧ（セリン）およびＴＣＣ（セリン）で置換して得られ、１個の欠失オリゴヌクレオチドは３ｂｐのＴＣＴ欠失によって得られる。コドン３４に用いられた９個のオリゴヌクレオチドは各々ＧＧＡ（グリシン）をＴＧＡ（停止コドン）、ＡＧＡ（アルギニン）、ＣＧＡ（アルギニン）、ＧＴＡ（バリン）、ＧＣＡ（アラニン）、ＧＡＡ（グルタミン酸）、ＧＧＴ（グリシン）、ＧＧＧ（グリシン）およびＧＧＣ（グリシン）で置換して得られ、１個の欠失オリゴヌクレオチドは３ｂｐのＧＧＡ欠失によって得られる。コドン３５に用いられた９個のオリゴヌクレオチドは各々ＡＴＣ（イソロイシン）をＧＴＣ（バリン）、ＣＴＣ（ロイシン）、ＴＴＣ（フェニルアラニン）、ＡＣＣ（トレオニン）、ＡＧＣ（セリン）、ＡＡＣ（アスパラギン）、ＡＴＧ（メチオニン）、ＡＴＡ（イソロイシン）およびＡＴＴ（イソロイシン）で置換して得られ、１個の欠失オリゴヌクレオチドは３ｂｐのＡＴＣ欠失によって得られる。コドン３７に用いられた９個のオリゴヌクレオチドは各々ＴＣＴ（セリン）をＡＣＴ（トレオニン）、ＣＣＴ（プロライン）、ＧＣＴ（アラニン）、ＴＡＴ（チロシン）、ＴＧＴ（システイン）、ＴＴＴ（フェニルアラニン）、ＴＣＡ（セリン）、ＴＣＧ（セリン）およびＴＣＣ（セリン）で置換して得られ、１個の欠失オリゴヌクレオチドは３ｂｐのＴＣＴ欠失によって得られる。コドン３８に用いられた９個のオリゴヌクレオチドは各々ＧＧＴ（グリシン）をＡＧＴ（セリン）、ＣＧＴ（アルギニン）、ＴＧＴ（システイン）、ＧＡＴ（アスパラギン酸）、ＧＣＴ（アラニン）、ＧＴＴ（バリン）、ＧＧＡ（グリシン）、ＧＧＧ（グリシン）およびＧＧＣ（グリシン）で置換して得られ、１個の欠失オリゴヌクレオチドは３ｂｐのＧＧＴ欠失によって得られる。コドン４１に用いられた９個のオリゴヌクレオチドは各々ＡＣＣ（トレオニン）をＴＣＣ（セリン）、ＧＣＣ（アラニン）、ＣＣＣ（プロライン）、ＡＧＣ（セリン）、ＡＴＣ（イソロイシン）、ＡＡＣ（アスパラギン）、ＡＣＡ（トレオニン）、ＡＣＴ（トレオニン）およびＡＣＧ（トレオニン）で置換して得られ、１個の欠失オリゴヌクレオチドは３ｂｐのＡＣＣ欠失によって得られる。コドン４５に用いられた９個のオリゴヌクレオチドは各々ＴＣＴ（セリン）をＡＣＴ（トレオニン）、ＧＣＴ（アラニン）、ＣＣＴ（プロライン）、ＴＧＴ（システイン）、ＴＡＴ（チロシン）、ＴＴＴ（フェニルアラニン）、ＴＣＡ（セリン）、ＴＣＧ（セリン）およびＴＣＣ（セリン）で置換して得られ、１個の欠失オリゴヌクレオチドは３ｂｐのＴＣＴ欠失によって得られる。コドン４８に用いられた９個のオリゴヌクレオチドは各々ＧＧＴ（グリシン）をＡＧＴ（セリン）、ＴＧＴ（システイン）、ＣＧＴ（アルギニン）、ＧＡＴ（アスパラギン酸）、ＧＣＴ（アラニン）、ＧＴＴ（バリン）、ＧＧＡ（グリシン）、ＧＧＣ（グリシン）およびＧＧＧ（グリシン）で置換して得られ、１個の欠失オリゴヌクレオチドは３ｂｐのＧＧＴ欠失によって得られる。
【００３０】
各コドンには、１個の野生型オリゴヌクレオチド（Ｗ）が考案されていて突然変異タイプと直接比較が可能なようにし、同型突然変異（homozygous mutation）と異型突然変異（heterozygous mutation）をすべて検出できるようにした。たとえば、コドン２９のために１２個のオリゴヌクレオチドがスポットされていれば、１個は正常の塩基配列を検出するためのものであり、残りの１１個は突然変異塩基配列を検出するためのものである。全体的に、総１１０タイプの突然変異オリゴヌクレオチドが１１個の突然変異集中コドン部位で９９個のミスセンス突然変異の形態と１１個の解読フレーム内欠失タイプを検出できるように考案され、１１個のオリゴヌクレオチドが野生型（wild type）と陽性対照群を検出するために考案された。
【００３１】
本発明のβ−カテニンオリゴチップは下記のような段階を含む方法によって自動化されたマイクロアレイヤーを用いて固形基板の表面に１２１個のオリゴヌクレオチドを固定させることにより製作できる。
１）各々のオリゴヌクレオチドを微細集積溶液（micro spotting solution）に混合してウェルプレートに分株する段階；
２）前記オリゴヌクレオチドをマイクロアレイヤーを用いて固形基板の表面上に集積する段階；
３）オリゴヌクレオチドを固形基板に固定させた後洗浄する段階；
４）前記固形基板を９５℃の熱水に浸漬して固定されたオリゴヌクレオチドを変性（denaturation）させた後前記固形基板を水酸化ホウ素ナトリウム（sodium borohydride）溶液で処理する段階；
５）前記固形基板を洗浄した後乾燥する段階。
【００３２】
前記段階をより詳しく説明すると、段階１）ですべてのオリゴヌクレオチドは固形基板表面との安定的な結合を形成できるように官能基を有することが好ましい。たとえば、各々のオリゴヌクレオチドは、５’末端にアミノ変形（5’amino modification）を有する１２個の炭素スペーサー（carbon spacer）が連結されてもよいが、これはＨ２Ｎ−（ＣＨ２）１２−オリゴヌクレオチドで示される。前記アミン基はオリゴヌクレオチドと固形基板の間に強い結合を形成するために固形基板上のアルデヒド基とシッフ塩基結合（Schiff’s base reaction）によって共有結合を形成する。また、１２個の炭素スペーサーはスライド上のオリゴヌクレオチドと実際に蛍光が標識された患者ＤＮＡ間の接触をより容易にし、ハイブリダイゼーションの効率を増加させるために提供される。
【００３３】
段階１）で用いられた微細集積溶液（micro spotting solution）は種々の塩と重合体を含み、固形基板上へのオリゴヌクレオチドの適用を容易にする。
【００３４】
段階２）で用いられた固形基板はガラス；変形シリコン；プラスチックカセット；またはポリカーボネートまたはそのゲルのような重合体を材料にして製造できる。前記固形基板の表面はオリゴヌクレオチドが固形基板に安定的に結合できるようにする化学物質でコーティングされ得る。好ましくは、このようなコーティングのためにアルデヒド（aldehyde）またはアミン（amine）などの官能基を有する化学物質が使用され得る。好ましい一例として、本発明はアルデヒドでコーティングされたスライドガラスを用いる。
【００３５】
前記段階１）および２）に従って、総４８４個のオリゴヌクレオチドが自動化されたピンマイクロアレイヤーを用いてオリゴチップ基板上に精巧に整列される。各々のオリゴヌクレオチドスポットは約１００〜５００μｍの直径を有する円形であることが好ましい。固形基板の好ましい一例として、本発明ではチップ当たり約１００〜１０，０００個のスポットを受容できる３．７ｃｍ×７．６ｃｍのスライドガラスを用いる。好ましくは、各々１３０μｍの直径を有する総４８４個のオリゴヌクレオチドが２００〜８００μｍの間隔を置いて多重の行と列で配列される。
【００３６】
段階３）では、オリゴヌクレオチドのアミン基と固形基板のアルデヒド基の間にシップ塩基結合を通じてオリゴヌクレオチドが固形基板の表面に固定される。  固定されなかったオリゴヌクレオチドは固形基板をＳＤＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥなどで洗浄して除去する。
【００３７】
段階４）では、固定されたオリゴヌクレオチドを変性させた後固形基板に残っている未反応のアルデヒド基を水酸化ホウ素ナトリウム処理によって還元させ、失活させる。
【００３８】
前記のように製作された本発明のβ−カテニンオリゴチップは遺伝子の突然変異検出に有用であり、本発明の方法は従来の遺伝子突然変異検出方法に比べて遥かに簡便であり、非常に経済的である：ＳＳＣＰ（Single Strand Conformational Polymorphism）、ＰＴＴ（Protein Truncation Test）、ＲＦＬＰ（Rrestriction fragment length polymorphism）、クローニング（cloning）、直接塩基配列分析（direct sequencing）などのような従来の検出方法を用いて遺伝子の突然変異を検出するためには平均して数日〜数ヶ月かかる。しかし、本発明のβ−カテニンオリゴチップを用いれば、β−カテニン遺伝子突然変異を検出するためのＤＮＡ試料の分析結果は、約１０〜１１時間内に得られる。また、本発明のβ−カテニンオリゴチップは通常のチップよりも遥かに簡便で、かつ非常な安価な費用で製作できる。一旦必要なオリゴヌクレオチドが合成されると、本発明のスライドを大量生産できる。本発明のβ−カテニンオリゴチップを使用するにかかる試薬の量もまた従来の方法に比べて遥かに少ない。
【００３９】
本発明のβ−カテニンオリゴチップはピンマイクロアレイヤーを用いて容易に製作できる反面、従来のアフィメトリックス社（Affimatrix）製のオリゴチップは複雑で高値のフォトリソグラフィ技法を用いなければならない。
【００４０】
また、本発明のβ−カテニンオリゴチップは固形基板上で直接オリゴヌクレオチドを合成するため、オリゴヌクレオチドの精製と変形が難しい従来のアフィメトリックス社製のオリゴチップとは異なり、オリゴヌクレオチドの精製および変形が非常に容易である。したがって、本発明のβ−カテニンオリゴチップは従来のいずれの方法よりも非常に優れた実験の正確度を提供できる。
【００４１】
また、本発明は下記の段階を含む前記β−カテニンオリゴチップを用いてβ−カテニン遺伝子の突然変異の有無を検出する方法を提供する：
１）対象患者の血液から蛍光染料が標識されたＤＮＡ試料を準備する段階；
２）前記標識ＤＮＡ試料をβ−カテニンオリゴチップ上のオリゴヌクレオチドスポットと反応させる段階；
３）非結合ＤＮＡ試料を除去するために前記β−カテニンオリゴチップを洗浄する段階；
４）蛍光リーダーを用いて特性のオリゴヌクレオチドスポットのハイブリダイゼーション様相を検出する段階；および
５）遺伝子突然変異の存在の有無を確認する段階。
【００４２】
前記段階をより詳しく説明すると、段階１）においてＤＮＡ試料は対象患者の血液から抽出したＤＮＡに蛍光染料を付着して準備する。蛍光染料−標識ＤＮＡとオリゴチップ上の特定のオリゴヌクレオチドスポットとのハイブリダイゼーション反応は適当な応用プログラムを用いる蛍光リーダーを用いて分析できる。好ましい蛍光染料としては、Ｃｙ５、Ｃｙ３、テキサスレッド（Texas Red）、フルオレセイン（Fluorescein）、リサミン（Lissamine）などが使用でき、それ以外に商業的に利用可能な大部分の蛍光染料が使用可能である。
【００４３】
段階２）では、段階１）で準備された蛍光染料標識ＤＮＡ試料をハイブリダイゼーション反応溶液と混合して各々のオリゴヌクレオチドに滴加する。ハイブリダイゼーション反応は前記オリゴチップを水蒸気で飽和されたチューブ中に入れたまま４５〜６０℃の培養着内で３〜９時間行われる。その後、オリゴチップを洗浄して結合しなかったＤＮＡ試料を除去し、乾燥した後（段階３）、検出された蛍光を応用プログラムを用いる蛍光リーダーを用いて分析する（段階４）。段階５）では、９９％信頼区間の上限値を閾値（threshold）として設定し、前記閾値よりも高い蛍光信号を示す信号を突然変異が存在する陽性であると判別する。
【００４４】
本発明のβ−カテニンオリゴチップは結腸直腸癌、子宮内膜癌、胃癌、卵巣癌、肝母細胞腫癌などのような癌の診断に有用である。β−カテニン遺伝子はＷｎｔ信号伝達経路において下流転写活性因子として作用するため、本発明のβ−カテニンオリゴチップはβ−カテニン遺伝子に関わる信号伝達経路および腫瘍発生の研究のための非常に効果的な診断道具として使用できる。
【００４５】
本発明では、７４種の結腸直腸癌腫と３１種の結腸直腸癌細胞株を対象にβ−カテニンオリゴチップを用いてβ−カテニン突然変異の存在有無を確認した（図１参照）。総５個のβ−カテニン突然変異は近位結腸癌組織で発見されたが（Ｎ＝３４）、４０種の遠位結腸直腸癌組織では検出されなかった。５個のβ−カテニン突然変異のうち４個はコドン３２、４１および４５における点突然変異（point mutation）であり、残りの一つはコドン４５における解読フレーム内欠失（in-frame deletion；３ｂｐ欠失）であった。３１種の結腸直腸癌細胞株では４個のβ−カテニン突然変異が発見された。これらの４個の突然変異のうち３個はコドン４５で、残りの一つはコドン４１で発見された。
【００４６】
全体的に９個の突然変異が７４種の結腸直腸癌腫および３１種の結腸直腸癌細胞株から分離・同定された。これらのうち６個は、コドン４５で、２個はコドン４１で発見された。コドン４５における６個の突然変異のうち４個は同一なミスセンス突然変異（ＴＣＴ→ＴＴＴ、Ｓｅｒ→Ｐｈｅ；試料３９５、４００、ＳＮＵ−１０４７およびＬＳ１７４Ｔ）であり、２個は同一な解読フレーム内欠失（試料３９６およびＨＣＴ１１６）であった。コドン４１および４５はＧＳＫ−３βリン酸化部位と知られているが、これらの部位での突然変異はβ−カテニンの分解を遮断してβ−カテニンの蓄積を引き起こすと報告された（Saegusa, M. and Okayasu, I. J. Pathol. 194:59-67, 2001）。
【００４７】
残りの１個のβ−カテニン突然変異は結腸組織試料２０７内のコドン３２で発見された。コドン３２はβ−カテニン偏在性（ubiquitination）およびプロテアソーム−依存性分解において非常に重要な役割を担当すると知られている（Tong, J. H. et al., Cancer Lett. 163:125-130, 2001）。コドン３２における突然変異はＧＳＫ−３βキナーゼ（GSK-3β kinase）によるセリン３３接近性（accessibility）に影響を及ぼし、これらのリン酸化を抑制する（Koch, A. et al., Cancer Res. 59:269-273, 1999）。コドン４５における特定の突然変異（Ser45Phe）は結腸直腸癌腫で頻繁に発見され、肝母細胞腫で主に発見されるコドン４１突然変異は結腸直腸癌腫ではほとんど発見されないと報告されている（Koch, A. et al., Cancer Res. 59:269-273, 1999）。
【００４８】
本発明では、結腸直腸から検出された５個のβ−カテニン突然変異のうち３個と細胞株から検出された４個のβ−カテニン突然変異のうち３個がコドン４５で発見され、コドン４５における６個の突然変異のうち２個が解読フレーム内欠失突然変異であった。コドン４５における解読フレーム内欠失は以前結腸直腸癌細胞株と結腸直腸癌腫から報告されているが、他の形態の癌腫からは報告されていない（Ilyas, M et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10330-10334, 1997; Muller, O et al., Genes Chromosomes Cancer 22:37-41, 1998）。コドン４５における解読フレーム内欠失はＧＳＫ−３β酵素の標的として提供されるタンパク質部位内に高度に保存されたセリン残基が消失される結果をもたらす（Ilyas, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10330-10334, 1997）。これらのような結果は、解読フレーム内欠失を含め、コドン４５での突然変異が結腸直腸癌腫では一般的である反面、他の形態の癌腫では一般的でないことを示す。
【００４９】
β−カテニン遺伝子の突然変異分析をオリゴヌクレオチドマイクロアレイヤーを用いて行った。本発明のβ−オリゴチップを用いた突然変異分析結果、総６０個の試料のうち９個のβ−カテニン突然変異陽性試料が検出された。本発明者らは、β−カテニンオリゴチップによって検出された９個のβ−カテニン突然変異をＰＣＲ−ＳＳＣＰ、ＤＨＰＬＣ、直接塩基配列分析、クローニング−塩基配列分析などのような従来の突然変異検出方法によって比較した（表２参照）。突然変異分析に幅広く用いられている自動化直接塩基配列分析は本発明のβ−カテニンオリゴチップによって検出された９個のβ−カテニン突然変異のうち２個を正確に検出できず（図２参照）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰもまた１個のβ−カテニン突然変異を検出できなかった（図３参照）。このような結果は癌組織内に正常ＤＮＡが過密していること、または前記二つの方法の敏感性が低いことに起因すると判断される。
【００５０】
ＢＡＴ−２６マーカーを用いたＭＳＩ分析において、本発明はＭＳＩが近位結腸癌と密接な関わりがあるという既存の報告を再確認した（ｐ＜０．０１）（Mirabelli-Primdahl, L. et al., Cancer Res. 59:3346-51, 1999; Traverso, G. et al., Lancet. 359:403-404, 2002）。ＭＳＩは３４種の近位結腸癌組織のうち１０種（２９％）において検出された反面、４０種の遠位結腸直腸癌腫では専ら２種（５％）のみにおいて検出された。ＭＳＩとβ−カテニン突然変異との間の相関関係において、β−カテニン突然変異はＭＳＩを示す１２種の結腸直腸癌腫のうち５種（４２％）で発見されたが、ＭＳＳ（microsatellite stability）を示す６２種の結腸直腸癌腫ではいかなるβ−カテニン突然変異も発見されなかった。ＭＳＩを示す５種の結腸癌腫で検出された５個のβ−カテニン突然変異はすべて近位結腸癌組織で発見された。このような結果はＭＳＩがβ−カテニン突然変異にかなり関与しており、近位結腸癌と非常に密接に関わっていることを立証するものである。
【００５１】
結腸直腸癌において、β−カテニン突然変異がＡＰＣ突然変異を特異的に代替でき、β−カテニン突然変異が正常のＡＰＣを有する結腸直腸癌の約半分を占めていることは既に報告されている（Sparks, A. B. et al., Cancer Res. 59998: 1130-1134, 1998）。本発明では、β−カテニン突然変異を示す９種の試料のうち一つの結腸直腸癌細胞株  （ＳＮＵ−１０４７）のみがＭＣＲ内にＡＰＣ突然変異を有する。最近、いくつかのグループがＡＰＣ、ｐ５３、ｌｏｎｇ  ＤＮＡ、Ｋ−ｒａｓなどのような様々な分子的マーカー  （molecular markers）を用いて結腸直腸癌を診断しようと試みた（Traverso, G. et al., Lancet. 359:403-404, 2002; Ahlquist, D. A. et al., Gastroenterology 119:1219-1227, 2000; Dong, S. M. et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:858-865, 2001）。ＭＳＩを含む５個のマーカーのうち３個は排泄物ＤＮＡを対象に結腸直腸癌を診断するために用いられた（Ahlquist, D. A. et al., Gastroenterology 119:1219-1227, 2000; Dong, S. M. et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:858-865, 2001）。また、ＭＳＩは結腸直腸癌のうち肛門から最も遠く離れているため検出することが難しい近位結腸癌を診断するために用いられた（Traverso, G. et al., Lancet. 359:403-404, 2002）。β−カテニン突然変異が近位結腸内腫瘍の位置と関わりがあれば、β−カテニンは近位結腸癌の診断マーカーとして用いることができるであろう。本発明では近位結腸癌のうち２９％においてＭＳＩが、１５％においてβ−カテニン突然変異が検出された。β−カテニン突然変異を有するすべての試料がＭＳＩを示すとしても、β−カテニン突然変異は単独またはＭＳＩとともに近位結腸癌の診断のために使用できる。実際に、このようなシステムは対象試料として排泄物ＤＮＡを使用する場合、特に有用な診断道具として自動化された高度の統合シ
ステム（throughout system）の形態で提供され得る。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００５３】
［実施例１］β−カテニンオリゴチップの製作
９個のオリゴヌクレオチドがβ−カテニン遺伝子の１１個突然変異集中コドン部位（コドン２３，２９，３１，３２，３４，３５，３７，３８，４１，４５および４８）で発生可能なすべての置換を検出するように考案され、１個のオリゴヌクレオチドが野生型のために考案された。また、一つのオリゴヌクレオチドが前記コドンの各々に対して解読フレーム内欠失を検出するように考案された。総１２１個のオリゴヌクレオチドがエクソン３の１１個コドンで発生可能なすべての置換と解読フレーム内欠失とを検出できるように考案された。
【００５４】
配列番号１，１２，２３，３４，４５，５６，６７，７８，８９，１００および１１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは野生型である。突然変異集中コドンのうち一つにおいて、ミスセンス突然変異を有するオリゴヌクレオチドは次の通りである：コドン２９に対して配列番号２〜１０のオリゴヌクレオチド；コドン３１に対して配列番号１３〜２１のオリゴヌクレオチド；コドン３２に対して配列番号２４〜３２のオリゴヌクレオチド；コドン３３に対して配列番号３５〜４３のオリゴヌクレオチド；コドン３４に対して配列番号４６〜５４のオリゴヌクレオチド；コドン３５に対して配列番号５７〜６５のオリゴヌクレオチド；コドン３７に対して配列番号６８〜７６のオリゴヌクレオチド；コドン３８に対して配列番号７９〜８７のオリゴヌクレオチド；コドン４１に対して配列番号９０〜９８のオリゴヌクレオチド；コドン４５に対して配列番号１０１〜１０９のオリゴヌクレオチド；およびコドン４８に対して配列番号１１２〜１２０のオリゴヌクレオチド。
【００５５】
また、突然変異集中コドンのうち一つにおいて、解読フレーム内欠失を有するオリゴヌクレオチドは次の通りである：コドン２９に対して配列番号１１のオリゴヌクレオチド；コドン３１に対して配列番号２２のオリゴヌクレオチド；コドン３２に対して配列番号３３のオリゴヌクレオチド；コドン３３に対して配列番号４４のオリゴヌクレオチド；コドン３４に対して配列番号５５のオリゴヌクレオチド；コドン３５に対して配列番号６６のオリゴヌクレオチド；コドン３７に対して配列番号７７のオリゴヌクレオチド；コドン３８に対して配列番号８８のオリゴヌクレオチド；コドン４１に対して配列番号９９のオリゴヌクレオチド；コドン４５に対して配列番号１１０のオリゴヌクレオチド；およびコドン４８に対して配列番号１２１のオリゴヌクレオチド。
【００５６】
前記のように考案された１２１個のオリゴヌクレオチドはアルデヒド基と結合してシップ塩基反応を行うアミン残基で修飾された５’−末端に連結された１２個−炭素スペーサー（carbon spacers）を有し、ＭＷＧ−バイオテック社（Ebrasberg, Germany）から購入し、ＨＰＬＣで分離・精製された。
【００５７】
【表１ａ】
2004208689.tif 000003
【００５８】
【表１ｂ】
2004208689.tif 000004
【００５９】
【表１ｃ】
2004208689.tif 000005
【００６０】
【表１ｄ】
2004208689.tif 000006
【００６１】
前記のように製作されたオリゴヌクレオチドの各々を微細集積溶液（micro spotting solution, TeleChem International Inc, Sunnyvale, CA）と１：１の比率で混合した後、９６ウェルプレートに４０μｌずつ分株した。コドン３７、４１および４５に対するオリゴヌクレオチドは２０ｐｍｏｌ／μｌの濃度、残りの８個のコドンに対するオリゴヌクレオチドは４０ｐｍｏｌ／μｌの濃度で滴加した。前記９６ウェルプレートをピンマイクロアレイヤー（microarrayer; Microsys 5100 Cartesian, Cartesian Technologies Inc, Irvine, CA）内に取り付け、各々のオリゴヌクレオチドをアルデヒドコーティングされたガラススライド（aldehyde-coated glass slide, 26×76×1mm、CEL associates社）上にスポットした。各々１３０μｍの直径を有するスポットを３００μｍの間隔を置いて行と列で整列させた。オリゴヌクレオチドが整列された前記ガラススライドを０．２％ＳＤＳで２回洗浄した後、さらに蒸留水で１回洗浄した。前記ガラススライドを９５℃の熱水に浸漬してオリゴヌクレオチドを変性（denaturation）させた後水酸化ホウ素ナトリウム（Sodium borohydride）溶液に５分間浸漬して非結合されたアルデヒド基を失活させた。その後、前記ガラススライドを０．２％ＳＤＳで２回、蒸留水で１回洗浄した後遠心分離器を通じて水分を除去して乾燥した。
【００６２】
［実施例２］β−カテニンオリゴチップを用いたβ−カテニン突然変異の調査
（段階１）ＤＮＡ試料の準備
７４種の結腸直腸癌の標本を韓国のソウル大学病院から入手し、３１種の結腸直腸癌細胞株は韓国細胞株銀行（Korean Cell Line Bank; KCLB）から入手した。７４種の結腸直腸癌の標本のうち３４種は近位結腸（盲腸から脾臓湾曲まで）部位から、４０種は遠位結腸直腸（脾臓湾曲から直腸まで）部位から由来した。３１種の結腸直腸癌細胞株のうち７種は近位結腸部位から由来し、６種は遠位結腸直腸部位から由来した。残りの１８種の結腸直腸癌細胞株は由来した正確な部位を確認できなかった。β−カテニン突然変異の陽性対照群として胃癌細胞株ＳＮＵ−６３８およびＳＮＵ−７１９を用いた（Woo, D. K. et al., Int. J. Cancer 95:108-113, 2001）。ＳＮＵ−６３８は、コドン４１にトレオニンがアラニンに変形されたβ−カテニン突然変異（ＡＣＣ→ＧＣＣ，Ｔｈｒ→Ａｌａ）を有し、ＳＮＵ−７１９はコドン３４にグリシンがバリンに変形された突然変異（ＧＧＡ→ＧＴＡ，Ｇｌｙ→Ｖａｌ）を有する。
【００６３】
ゲノムＤＮＡは冷凍標本からＴＲＩ試薬（TRI reagent, Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA）または全自動磁性ビーズ−基本システム（automatic magnetic bead-based system, KingFisher, ThermoLabsystems, Finland）を用いて抽出した。蛍光染料が標識されたＤＮＡ試料を製造するために、前記で抽出されたＤＮＡを鋳型にし、配列番号１２２〜１２５の塩基配列を有するプライマー対（Metabion, Germany）を用いてＰＣＲを行った。下記表２に示すように、エクソン３に対する配列番号１２２および１２３のＰＣＲプライマーはミラベリらによって報告された方法に従って製作し（Mirabelli-Primdahl, L. et al., Cancer Res. 59:3346-51, 1999）、β−カテニン遺伝子内の広い部位の欠失（interstitial large deletion）に対する配列番号１２４および１２５のプライマーはウダツらによって報告された方法に従って製作した（Udatsu, Y. et al., Pediatr. Surg. Int. 17:508-512, 2001）。
【００６４】
【表２】
2004208689.tif 000007
【００６５】
具体的に、各々のＰＣＲ反応溶液（１５μｌ）はゲノムＤＮＡ１００ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌ、ｄＣＴＰ４０μＭ、蛍光染料（Fluorescent dye）が標識されたＣｙ５−ｄＣＴＰ（ＮＥＮ社）あるいはＣｙ３−ｄＣＴＰ（Amersham社）２０μＭを含む。ＰＣＲ反応はプログラムされた熱循環器（Perkin Elmer Cetus 9600; Roche Molecular Systems, Inc., NJ）内で９４℃で５分間変性させることから始めた。ＰＣＲ反応条件は９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分間の反応を３５回繰り返し、最後に７２℃で７分間増幅させた。ＰＣＲ増幅後、Ｃｙ５あるいはＣｙ３が標識されたＰＣＲ産物をＤＮＡ精製用キット（purification kit, Qiagen社）を用いて精製した後、０．２５Ｕ  ＤＮａｓｅＩ（Takara社、Shiga、Japan）を１μｌ処理して２５℃で１０分間反応させて分解した。残った酵素を８５℃で１０分間処理して失活させた後、前記精製過程を繰り返して除去し、Ｃｙ５またはＣｙ３標識ＤＮＡ試料を回収した。
【００６６】
（段階２）ハイブリダイゼーション反応および分析
段階１）で準備されたＣｙ５またはＣｙ３で標識されたＤＮＡ試料を５×ハイブリダイゼーション溶液（hybridization solution, TeleChem社）と混合して総量が２〜４μｌになるように懸濁した。実施例１で準備された２μｌの混合ＤＮＡ試料をガラススライド上に滴加し、前記ガラススライドをカバーガラス（cover slide）で覆った。ハイブリダイゼーション反応は水蒸気で飽和された５６℃チューブ（saturated vapor tube）内に前記スライドガラスを入れて約３時間行った。ハイブリダイゼーション反応が終わったガラススライドを０．２％ＳＤＳおよび２×ＳＳＣ混合溶液で１５〜３０分間、蒸留水で５分間洗浄した後遠心分離器を用いて水分を除去して乾燥した。前記ガラススライドを読取機（Scan Array Lite, Packard Instrument Co, Meriden, CT）を用いてスキャンし、イマジン（Imagene, Biodiscovery, version 4.2）および定量的マイクロアレイ分析ソフトウエア（quantitative microarray analysis software, QuantArray, version 2.0）を用いて分析した。
【００６７】
１１個コドンの各々に対する野生型信号（Ｗ）を互いに比較し、信号標準化（signal normalization）によって同様に調整した。各コドンで検出された残りの１１０個の信号もまた野生型信号と同様な方法で調整した。信号標準化後、すべての信号をキムらの方法に従って再分析した（Kim, I. J. et al., Clin. Cancer Res. 8:457-463, 2002）。背景信号（background signals）の平均（ＢＡ）および標準偏差（ＢＳＤ）を計算し、（ＢＡ＋２．５８ＢＳＤ）によって閾値（cutoff level）を決定した。（ＢＡ＋２．５８ＢＳＤ）は９９％の信頼区間の上限線を意味するもので、この値を超える検出信号を特異的な信号としてみなした。すべてのデータ分析はシグマプロット（SigmaPlot, SPSS Inc., San Rafael, CA）を用いて行い、マイクロソフトエクセルプログラム（Microsoft Excel Program）を用いて平均および標準偏差を計算した。結腸直腸癌腫および結腸直腸癌細胞株を対象にした前記突然変異分析結果を下記表３に示す。
【００６８】
【表３】
2004208689.tif 000008
【００６９】
表３に示すように、７４種の結腸直腸癌組織のうち５種の試料（組織試料２０７，３９５，３９６，４００および４３５）（５／１４，７％）からβ−カテニン遺伝子の突然変異が発見された。これらの５個のβ−カテニン突然変異はすべて３４種の近位結腸癌由来組織から発見され（１５％，５／３４）、４０種の遠位結腸直腸癌組織からは検出されなかった（０％，０／４０）。３４種の近位結腸癌のうち５個のβ−カテニン突然変異は２５種の右向（right-sided）結腸癌組織から発見され、９種の横行（transversｅ）結腸癌組織からはいかなる突然変異も発見されなかった。このような結果はβ−カテニン突然変異が近位結腸内腫瘍と関わっていることを示す（ｐ＝０．０１７）。
【００７０】
３１種の結腸直腸癌細胞株のうち、４個のβ−カテニン突然変異がＳＮＵ−４０７、ＳＮＵ−１０４７、ＬＳ１７４ＴおよびＨＣＴ１１６細胞株から発見された。これらの４個のβ−カテニン突然変異のうち２個は横行結腸から由来する細胞株であるＳＮＵ−４０７およびＳＮＵ−１０４７から発見された。β−カテニン突然変異を有する他の２個の細胞株（ＬＳ１７４ＴおよびＨＣＴ１１６）の起源は明らかにされていない。
【００７１】
総９個の突然変異が７４種の結腸直腸癌組織および３１種の結腸直腸癌細胞株で発見された。これらの９個の突然変異のうち８個がＧＳＫ−３βリン酸化部位で発見された。すべての点突然変異はアミノ酸が置換されたもので、コドン３２、４１および４５から引き起こされた。これらのうち６個の突然変異はコドン４５に集中されていた。これらのコドン４５における６個の点突然変異のうち４個は同一なミスセンス突然変異（ＴＣＴ→ＴＴＴ，Ｓｅｒ→Ｐｈｅ，試料３９５，４００，ＳＮＵ−１０４７およびＬＳ１７４Ｔ）であり、残りの２個は同一は解読フレーム内欠失（試料３９６およびＨＣＴ１１６）であった。β−カテニン遺伝子内の広い部位の欠失（interstitial large deletion）は検出されなかった。
【００７２】
組織４００の場合、野生型信号とともに付加的な信号が検出されたが、これはコドン４５におけるミスセンス突然変異（ＴＣＴ→ＴＴＴ，Ｓｅｒ→Ｐｈｅ）を示す（図１）。β−カテニン突然変異を有する９個の試料のうち８個が各コドンにおける野生型信号と突然変異信号をともに示したが、これは異型接合突然変異（heterozygous mutations）の存在を示す。これに対し、細胞株ＬＳ１７４Ｔはコドン４５において野生型信号なしに専ら突然変異信号のみを示したが、これは細胞株ＬＳ１７４Ｔが同型接合（homozygous）β−カテニン突然変異を有することを意味するものである。
【００７３】
β−カテニン突然変異を有する９個の試料のすべてがＭＣＲ（mutation cluster region、コドン１２６３〜１５１３）内にＡＰＣ突然変異を有するかを調査した。これらのうちただ一つの細胞株（ＳＮＵ−１０４７）のみがコドン１３６９においてＡＰＣ切断突然変異（４１０７ｄｅｌＣ）を有していた。β−カテニン突然変異を有しないと報告された細胞株ＬＳ１７４Ｔが本発明ではβ−カテニン突然変異（コドン４５，ＴＣＴ→ＴＴＴ，Ｓｅｒ→Ｐｈｅ）を有することが確認された（Ilyas, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10330-10334, 1997）。
【００７４】
［実施例３］β−カテニンオリゴチップによって検出されたβ−カテニン突然変異の確認
本発明のβ−カテニンオリゴチップによって検出された突然変異を確認するために、β−カテニン突然変異が検出された９種の試料を対象にＰＣＲ−ＳＳＣＰ、ＤＨＰＬＣ、ＰＴＴ、クローニング塩基配列分析および直接塩基配列分析を行った。
【００７５】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰおよびＤＨＰＬＣ分析はキムらによって報告された方法に従って行った（Kim, I. J. et al., Int. J. Cancer 86:529-532, 2000; Wagner, T. et al., Genomics 62:369-376, 1999）。ＤＨＰＬＣ分析はＷＡＶＥ（Transgenomic, Omaha, NE）を用いて行い、運行条件はＷＡＶＥＭＡＫＥＲソフトウエアを用いて最適化した。タンパク質切断テスト（protein truncation test, PTT）は、ＡＰＣ遺伝子の突然変異集中部位（ＭＣＲ、コドン１２６３〜１５１３）の突然変異を検出するためにウォンらによって報告された方法に従って行った（Won, Y. J. et al., J. Hum. Genet. 44:103-108, 1999）。クローニング過程においては、増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）に挿入し、ＴＡクローニングベクターシステム（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてサブクローニングした。両方向塩基配列分析（bi-directional sequencing）は、Ｔａｑジデオキシターミネーター循環塩基配列分析キット（Taq dideoxy terminator cycle sequencing kit）とＡＢＩ３１００  ＤＮＡ塩基配列分析器（Applied Biosystems, Forster City, CA）を用いて行った。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
従来の突然変異検出方法のうち、突然変異の分析に幅広く使用されている自動化直接塩基配列分析は、本発明のβ−カテニンオリゴチップによって検出された９個のβ−カテニン突然変異のうち２個を正確に検出できなかった（図２）。ＰＣＲ−ＳＳＣＰもまた１個のβ−カテニン突然変異を検出できなかった（図３）。このような結果は、癌組織内の過度な正常ＤＮＡまたは前記二つの方法の低い敏感性に起因すると判断される。
【００７８】
［実施例４］β−カテニン突然変異とＭＳＩの相関関係調査
ＭＳＩ（Microsatellite Instability）状態は近位結腸癌と密接な関連があり、ＭＳＩが結腸癌の診断のための診断マーカーとして使用できることが報告されている（Traverso, G. et al., Lancet. 359:403-404, 2002）。そこで、ＭＳＩ状態を決定するために、７４種の結腸直腸癌から抽出したゲノムＤＮＡをＢＡＴ−２６マーカーを用いてＰＣＲで増幅させた（Shitoh, K. et al., Genes Chromosomes Cancer 30:32-37, 2001; Samowitz, W. S. et al., Am. J. Pathol. 158:1517-1524, 2001）。
【００７９】
各々のＰＣＲ反応溶液（２５μｌ）は癌組織と正常の組織からPicoll-PaqueおよびTrizol試薬を用いて抽出したＤＮＡ１００ｎｇ、配列番号１２６および１２７の塩基配列を有する１０ｐｍｏｌ  ＢＡＴ２６−ＦおよびＢＡＴ２６−Ｒプライマー各０．２５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝溶液２．５μｌ、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ  ０．２５μｌ、Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素（５単位／μｌ）０．１μｌを混合して製造した。ＰＣＲ反応はプログラムされた熱循環器内で９４℃で５分間変性させることによって開始した。ＰＣＲ反応条件は９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で１分間の反応を３５回繰り返し、最後に７２℃で７分間増幅させた。増幅反応が終わった反応溶液を９５℃で５分間加熱した後氷浴に浸漬して冷却した。冷却した反応溶液３５μｌを４０％ポリアクリルアミド（２９：１）ゲルに電気泳動させた後ゲルを乾燥し、Ｘ−線フィルムに感光させて分析した。
【００８０】
β−カテニン突然変異、ＭＳＩおよび腫瘍位置間の相関関係を決定するために、χ２またはフィッシャーの正確度テスト（Fisher's exact test）を用いて統計学的分析（Statistical Methods）を行った。この際、ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡソフトウエア（StatSoft Inc., Tulsa, OK）を用いてα＝０．０５を有意義的な水準に決めた。
【００８１】
ＢＡＴ−２６マーカーを用いた結果、７４種の結腸直腸癌組織のうち１２個（１６％）においてＭＳＩを示した。３４種の近位結腸癌のうち１０個（２９％）がＭＳＩを有すると確認され、４０種の遠位結腸直腸癌の中では２個（５％）のみがＭＳＩを示すものと調査された。ＭＳＩは統計学的に近位部位と密接に関わっていた（ｐ＜０．０１）。５個のβ−カテニン突然変異のいずれもＭＳＩを有する１２種の結腸直腸癌から発見され（４２％，５／１２）、ＭＳＳ（microsatellite stability）を有する６２種の結腸直腸癌からは全く発見されなかった。このような結果から、β−カテニン突然変異はＭＳＳよりはＭＳＩを有する結腸直腸癌腫においてより一般的であることを確認できた（ｐ＜０．００１）。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】本発明のβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップを用いて結腸癌組織試料においてβ−カテニン突然変異を検出した結果である。
【図２】本発明のβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップを用いてβ−カテニン突然変異が確認された結腸癌組織試料を直接塩基配列分析した結果である。
【図３】本発明のβ−カテニンオリゴヌクレオチドマイクロチップを用いてβ−カテニン突然変異が確認された結腸癌組織試料をＰＣＲ−ＳＳＣＰで分析した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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