(57)【要約】【課題】同じ遺伝子または関連遺伝子から生じる核酸の同定、道程、分析および／またはクローニングを効率的に行なう。【解決手段】本発明は、互いに相補的な少なくとも２つの核酸アイソフォームを調製するステップと、少なくとも２つの核酸アイソフォームをハイブリッド形成させ、不対領域を含む二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと、ハイブリッド形成していない核酸と、不対領域を含まない核酸から、不対領域を含むＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを回収するステップと、回収された不対領域を含む核酸フラグメントを同定、分析および／またはクローニングするステップを含む、核酸アイソフォームの同定、分析および／またはクローニング方法を提供する。【選択図】        図２
2004187606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）互いに相補的な少なくとも２つの核酸アイソフォームを準備するステップと、
ｂ）前記少なくとも２つの相補的な核酸アイソフォームをハイブリッド形成させ、不対領域を含む二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと、
ｃ）ハイブリッド形成していない核酸と不対領域を含まない核酸とから、不対領域を含むＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを回収するステップと、
ｄ）回収された不対領域を含む核酸フラグメントを同定、分析および／またはクローニングするステップと
を含む核酸アイソフォームの同定、分析および／またはクローニング方法。
【請求項２】
ステップｃ）の回収が、遊離一本鎖核酸を切断するが、二本鎖核酸を切断しない少なくとも一の制限酵素および／または二本鎖核酸を切断するが、不対領域を切断しない少なくとも一の制限酵素を使用することにより実施される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遊離一本鎖核酸を切断するが、二本鎖核酸を切断しない制限酵素が、ＥｘｏＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＴ、ラムダエキソヌクレアーゼまたはＴ７エキソヌクレアーゼである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
二本鎖核酸を切断するが、不対領域を切断しない少なくとも一の制限酵素が使用される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
２つの制限酵素が使用される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
制限酵素が、二本鎖核酸の４個のヌクレオチドを含む認識部位を切断するが、不対領域は切断しない請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
制限酵素が、ＨａｐＩＩ、ＨｙｐＣＨ４１Ｖ、ＡｃｉＩ、ＨｈａＩ、ＭｓｐＩ、ＡｌｕＩ、ＢｓｔＵＩ、ＤｐｎＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＭｂｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＲｓａＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＴａｑαＩおよびＴｓｐ５０９Ｉから選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
一本鎖核酸結合分子を使用することにより、不対領域を含むＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドが、不対領域を含まないハイブリッド核酸から回収される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
一本鎖核酸結合分子がタグに結合されている請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
回収される核酸／一本鎖核酸結合分子／タグ複合体が、タグに結合する基質の使用により回収される請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
一本鎖核酸結合分子が、一本鎖核酸結合タンパク質、抗体、抗原、オリゴヌクレオチド、化学基または化学物質である請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
タグに結合するオリゴヌクレオチドが、ランダムオリゴヌクレオチドである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ランダムオリゴヌクレオチドが、１５〜３０個のヌクレオチドである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ランダムオリゴヌクレオチドが、２５個のヌクレオチドである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
タグが、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗体、抗原、タンパク質または核酸結合分子であり、基質が、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン結合分子、抗体またはそのリガンドおよび／または化学的基質である請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
標識がジゴキシゲニンであり、基質がジゴキシゲニン結合分子である請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
標識がビオチンであり、基質がアビジンまたはストレプトアビジンである請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
一本鎖核酸結合分子が、基質に共有結合している請求項８〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
基質が、金属ビーズ、磁気ビーズ、無機ポリマービーズ、有機ポリマービーズ、ガラスビーズ、およびアガロースビーズから成る群から選択される固体基質表面に連結されている請求項８〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
不対領域を含むＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドが、ハイブリッド核酸から回収され、一本鎖核酸結合分子から遊離される請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
不対領域を含む回収された核酸が、付着末端を含むＹ型配向リンカーに結合されている請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｙ型配向リンカーが、各一本鎖アームに異なるマーカー配列を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｙ型リンカーが、不対領域を含むフラグメントの付着末端にハイブリッド形成する付着末端を含む請求項２１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
Ｙ型リンカーの付着末端が、請求項４〜７のいずれか１項に記載の制限酵素により切断される不対領域を含むフラグメントの付着末端にハイブリッド形成する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも２つの核酸アイソフォームが、少なくとも１つの核酸ライブラリー、生物学的試料、細胞、組織、器官または生検材料から調製される請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
２つの核酸アイソフォームが、２つ以上の異なる核酸ライブラリー、生物学的試料、細胞、組織、器官または生検材料から調製される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも２つの核酸ライブラリー、生物学的試料、細胞、組織、器官または生検材料の少なくとも１つが腫瘍、処理された細胞および／またはアポトーシスを受けた細胞である請求項２５〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１のステップａ）、ｂ）、ｃ）および／またはｄ）で回収される不対領域を含む核酸を含む核酸が、核酸アイソフォームに富むライブラリーとして保存され、アイソフォームまたはクローンの分析に使用され、および／または更なるアイソフォームの検出に使用される請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
得られるライブラリーが、選択的スプライシングに富むライブラリーである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
不対領域を含む回収された核酸が増幅され、クローニングされる請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
不対領域が、異なるスプライシングを受ける遺伝子の一部に対応する請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
不対領域が、同じゲノムの中の異なる遺伝子座から得られる関連遺伝子の一部に対応する請求項１〜３１に記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
不対領域が、ゲノム中の同じ遺伝子座から得られる非関連遺伝子の一部に対応する請求項１〜３１に記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
不対領域が、異なるゲノムから得られる関連遺伝子の一部に対応する請求項１〜３１に記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
回収され、クローニングされた核酸が、不対領域の全配列を含む請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
不対領域がエキソンまたはイントロンに対応する請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも２つの相補的核酸アイソフォームが、それぞれが異なるプロモーター部位を認識する少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼおよび／またはＤＮＡポリメラーゼを使用することにより開始物質から調製される請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
ＲＮＡ転写物が、異なるプロモーター部位を認識するＲＮＡポリメラーゼを使用することにより開始物質から得られ、ｃＤＮＡが逆転写酵素を使用することによりＲＮＡ転写物から調製される請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
異なるプロモーター部位を認識する少なくとも２つのＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｋ１１  ＲＮＡポリメラーゼから成る群から選択される請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＤＮＡポリメラーゼと鎖特異的プライマーが使用される請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
ＤＮＡポリメラーゼと鎖特異的プライマーが線状増幅に使用される請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（クレノウ）フラグメント、またはエキソヌクレアーゼマイナスである請求項４０〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
ステップｃ）において、核酸アイソフォームがリンカーまたはプライマーを使用することにより回収される請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
リンカーまたはプライマーが特異的配列部位を認識する請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
アイソフォーム核酸が、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼとリンカーとを使用することにより回収される請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
リガーゼが、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、またはＴ４  ＲＮＡリガーゼである請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ベクターまたはプライマーが、核酸アイソフォームの末端における請求項４〜７に記載の４ｂｐ切断制限酵素の認識部位を導入するために使用される請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
核酸アイソフォームが、フラグメントゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、全長ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡから調製される請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
アイソフォームが不対領域を含む全長ｃＤＮＡまたはそのフラグメントである請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
アイソフォームが実質的に不対領域を含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
請求項１〜５０に記載の方法によって得られるアイソフォームを含むクローニングベクター。
【請求項５２】
請求項５１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５３】
請求項５２に記載の培養宿主細胞を調製することを含むアイソフォームポリペプチドの調製方法。
【請求項５４】
請求項１〜５０のいずれか１項に記載のアイソフォーム核酸を調製するステップと、無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系またはｉｎ  ｖｉｖｏ系を用いることによる対応するアイソフォームポリペプチドを調製するステップとを含むアイソフォームポリペプチドの調製方法。
【請求項５５】
請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法により得られる情報を使用するアイソフォームポリペプチドの同定方法。
【請求項５６】
ｉ）請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法により同定および／またはクローニングされた不対領域の全体の配列または一部の配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを調製するステップと、
ｊ）前記オリゴヌクレオチドプローブを、核酸アイソフォームを含む核酸にハイブリッド形成させるステップと、
ｋ）核酸アイソフォームを単離するステップと
を含む核酸アイソフォームの検出および／または分離方法。
【請求項５７】
オリゴヌクレオチドプローブが、全長の核酸アイソフォームを単離するために使用される請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
オリゴヌクレオチドプローブが、１つのエキソンまたはイントロンの少なくとも一部または全体の配列を含む請求項５６〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
アイソフォームの全長または部分的な配列決定を含む請求項１〜５８のアイソフォームの配列変異の決定方法。
【請求項６０】
配列アイソフォームの配列情報が、配列決定プライマーのデザインに使用される請求項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
遺伝情報を得るために、得られたアイソフォーム配列決定データをゲノム、ゲノム配列決定データおよび／またはｃＤＮＡ配列決定データに対してアラインさせる請求項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
情報が選択的スプライシングに基づく請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
核酸プローブ調製のための請求項１〜６２のいずれか１項から得られる情報の使用。
【請求項６４】
請求項５０に記載の核酸プローブ。
【請求項６５】
疾病、疾病状態、病理、生理的状態の検出および／または診断のため、毒性評価のため、試験化合物の治療能力評価のため、および／または検査または治療に対する患者の反応性評価のための請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法から得られる情報の使用。
【請求項６６】
請求項６２に記載の選択的スプライシングに基づく情報を使用することによる、腫瘍源、処理された細胞および／またはアポトーシスを受けた細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、生物学的試料、細胞、組織、器官または生検材料からの全長ｃＤＮＡの回収方法。
【請求項６７】
選択的スプライシングに基づく情報を使用することによる、腫瘍源、処理された細胞および／またはアポトーシスを受けた細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、生物学的試料、細胞、組織、器官または生検材料からの請求項１〜６６に記載のいずれか１項に記載の全長ｃＤＮＡの回収方法。
【請求項６８】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成のための不溶性支持体の調製のための、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法により得られるアイソフォームおよび／または請求項６４に記載の核酸プローブの使用。
【請求項６９】
支持体に固定、塗布および／または印刷された、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法により調製される１つの不対領域を含む少なくとも核酸、不対領域に相補的な核酸および／または請求項６４に記載のプローブを含む不溶性支持体。
【請求項７０】
固体基質である請求項６８〜６９のいずれか１項に記載の支持体。
【請求項７１】
マイクロアレイである請求項６８〜６９のいずれか１項に記載の支持体。
【請求項７２】
核酸アイソフォームの同定および単離のための請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の支持体の使用。
【請求項７３】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成のための請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の支持体の使用。
【請求項７４】
疾病、疾病状態、病理、生理的状態の検出および／または診断のため、毒性評価のため、試験化合物の治療能力の評価のため、検査または治療に対する患者の反応性の評価のため、核酸の検出および／または核酸アイソフォームの検出のための請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の支持体の使用。
【請求項７５】
支持体、マイクロアレイ、核酸ライブラリー、生物学的試料、細胞、組織、器官および／または生検材料からの核酸の検出および／または単離のための請求項１〜７４のいずれか１項により得られる遺伝情報の使用。
【請求項７６】
請求項１〜７５のいずれか１項に記載の方法により得られる遺伝情報の分析のための媒体に適用されるコンピュータープログラムおよび／またはソフトウェア。
【請求項７７】
ゲノムおよび／またはｃＤＮＡ配列情報に対する、請求項１〜７６のいずれか１項に記載の方法により得られる核酸アイソフォームの配列または情報のアラインメントのための媒体に適用されるコンピュータープログラムおよび／またはソフトウェア。
【請求項７８】
請求項１〜７７のいずれか１項に記載の方法により得られる核酸アイソフォームの配列または情報から得られるポリペプチドの機能領域の予測、決定および／または分析のための媒体に適用されるコンピュータープログラムおよび／またはソフトウェア。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸アイソフォームの同定、分析、選択、調製および／またはクローニングに関する。
【０００２】
【従来の技術】
真核遺伝子が、イントロンとエキソンから成るという２５年前の発見は、遺伝子構造に関する我々の理解を根本的に躍進させ、ｍＲＮＡプロセッシングに焦点を合わせた生命科学の新しい分野を切り開いた。イントロンとエキソンはどちらもプレｍＲＮＡに転写されるので、初期プレｍＲＮＡを成熟ｍＲＮＡに転換するためには更なるステップが必要で、そのステップにおいて非コーディングイントロンが除去され、コーディングエキソンが正しい順序で結合される。イントロンがプレｍＲＮＡから切り取られ、エキソンが特異的に再連結されるいわゆるスプライシングプロセスは、ｍＲＮＡ分子を適切に処理するために、また遺伝情報をタンパク質に正しく翻訳するために不可欠である。
【０００３】
プレｍＲＮＡのスプライシング反応は、スプライセオソームにより実施される。スプライセオソームは、５つの低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）と大量の関連タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体である。スプライセオソームは、エキソンとイントロンの境界に位置する特異的５’スプライス部位と３’スプライス部位（スプライスドナーとスプライスアクセプター）とを認識する。以下のスプライシング反応は、まずイントロンの５’末端が３’スプライス部位上流の分枝点配列のアデニン残基に結合され、分枝中間物、いわゆるイントロンラリアットを形成し、次の段階で２つのエキソンが結合され、イントロンラリアットが複合体から遊離される必要がある。このプロセスにおいて、エキソン認識はプレｍＲＮＡスプライシングの基本的問題である。スプライシング機序は、イントロンＲＮＡの巨大な延伸部（平均約３．５ｋｂ）内に位置する小さなエキソン配列（〜１５０ｂｐ）を認識できなくてはならない。更に、５’スプライス部位および３’スプライス部位は、一般に保存度が乏しく、イントロンはしばしば５’または３’スプライス部位の共通配列と類似した多数の潜在的スプライス部位を含む。従って、正常のスプライス部位が突然変異により変更されると、潜在的スプライス部位が選択される可能性がある。スプライシングドナーおよびスプライシングアクセプターの他に、エキソンの特異的配列成分は、エキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）として特徴づけられており、これは、保存的セリン／アルギニンに富むスプライシング因子、いわゆる  ＳＲタンパク質のファミリーと相互作用する。これらのＥＳＥは、スプライシング機序を補充し、それをフランキング５’スプライス部位および３’スプライス部位に誘導しなくてはならないので、エキソン配列は、コーディング情報だけでなく、ＳＲタンパク質への結合能に関しても、保存すべき複数の進化上の制約下にある。このような進化上の選択は、段階および組織特異的スプライシング現象の機序の出現に寄与してきた可能性がある。エキソン認識が一旦完了すると、２つのエキソンの両側に位置するスプライス部位は、エキソンの飛び越しを防止するために５’−３’の正しい順序に結合されなくてはならない。ＲＮＡポリメラーゼＩＩのカルボキシル末端ドメイン（ＣＴＤ）に結合されるスプライシング因子は、ポリメラーゼの出口から生じるにつれ、エキソンと相互作用する。これらの相互作用は、次のエキソンが合成されるまで、新たに合成されたエキソンをＣＴＤにつなぎ止める。転写をスプライシングと連結することにより、構成的にスプライスされたプレｍＲＮＡにおけるエキソンの飛び越しは防止されるはずであるが、ステージおよび組織に特異的な選択的プレｍＲＮＡスプライシング中にエキソンの飛び越しが望ましい場合がある。このような場合には、調節タンパク質の有無が、エキソンが認識され、続いて成熟ｍＲＮＡに含まれるかどうかを決定できる。
【０００４】
遺伝子の調節と発現に関するその原理の重要性に加えて、最近ｍＲＮＡスプライシングが真核ゲノムの配列決定後のゲノム研究の焦点となった。ヒト、線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、キイロショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、複雑な細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの様に異なる生物体由来の全ゲノム配列の分析から、各ゲノムによりコードされる遺伝子の総数には予想に反してわずかな差しかないことが明らかにされた。従って、ヒトゲノムは、比較的単純な線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの約１．５倍の遺伝子しかコードしていないと考えられる。この論理的に反する現象は、真核生物の進化において次第に適用されてきた選択的スプライシングの機序により説明できる。単一の遺伝子は、そのプレｍＲＮＡに特徴的なスプライシングを受けることにより、タンパク質レベルで異なる複数のアイソフォームをコードすることができる。これらのアイソフォームはそれぞれ選択的エキソン使用により互いに異なるものとなっている。
【０００５】
ヒトの疾患および老化異常がミススプライシングや選択的スプライシングにより生じたアイソフォームの欠如に関係しているという報告が増加するにつれ、そのような選択的スプライシングの機構やその結果生じる異なるタンパク質に対する理解が未だかつてなく重要になってきている。従って、分析法の新しい手段の開発を可能にし、薬物発見と診断のための標的を同定するために、選択的スプライシングが行われたｍＲＮＡ分子の検出と特徴付けに対する需要は極めて大きい。
【０００６】
このように、配列変異型の同定はかなり複雑で長時間を要する仕事である。特に、異なるスプライス変異型の同定に関しては、同じあるいは多くの異なるｃＤＮＡライブラリーから関連配列をクローニングし、それによって得られた個々のクローンを更に分析に進めることが必要である。個々のクローンの最初の分析は、制限酵素消化と、それに続く得られた断片の電気泳動分離により実施できるが、異なるクローンの全遺伝情報は全長の配列決定と更なるコンピューターアラインメントによってのみ得ることができる。このプロセスはかなり時間を要し、コスト的にも高くつき、更に処理量の多い分析に対してスケールを拡大することができない。配列の変異を並行に解析するための有効な手段はなく、異なるスプライスを受けたプレｍＲＮＡ分子に関する研究にそれらを応用できないことは、今日のゲノム研究および開発プロジェクトにおいて明らかな制限となっている。
【０００７】
米国特許第６，２５１，５９０号は、異なるスプライスを受けた、１つの標準生体試料由来の核酸と１つの試験生体試料由来の核酸との同定および／またはクローニング方法を開示している。その方法は、１つの試料から複数のＲＮＡと、もう１つの試料から複数のＤＮＡとを調製し、続いてハイブリッド形成させてハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡを形成する。遺伝子の一部に対応する不対領域を含むＲＮＡ分子は、試料間で異なってスプライスされ、次いで同定される。米国特許第６，２５１，５９０に開示されている方法は、不対領域の同定方法が本質的に酵素リボヌクレアーゼＨの使用により実施されるため、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡに限定されている。この酵素はＤＮＡに結合されたＲＮＡを切断するが、一本鎖ＲＮＡ（不対領域）は切断せず、これはその後回収することができる。しかし、この方法はいくつかの欠点があり、効率が悪い。問題となるのは、１）リボヌクレアーゼＨが３〜１０個のヌクレオチドの断片においてＤＮＡとハイブリッド形成したＲＮＡを切断すること、２）ＤＮＡと一部だけハイブリッド形成したＲＮＡはリボヌクレアーゼＨによる切断後、一般に１０〜５０個のヌクレオチドからなるＲＮＡ断片混合物中に遊離されることである。これによって、不対領域の識別は困難となる。なぜならば、不対領域は、例えば約２０塩基からなる短い断片でありえるので、１〜１０個および１０〜５０個のヌクレオチドからなるＲＮＡ断片から不対領域を区別するのは難しくなるからである。研究者は、例えば電気泳動法によりサイズ選択法を実施しなくてはならないが、不純物の存在は避けられない。従って、研究者は、不対領域に対応する断片を決定するために、回収された全ての断片の配列決定をする必要がある。従って、この方法は、擬陽性のバックグラウンドが高くなり、人為的な結果を生じる。
【０００８】
米国特許第６，２５１，５９０号の著者は、不対領域を含むＲＮＡ分子の更なる回収方法を提唱している。この方法は、ランダムプライマーを使用することによる逆転写反応の実施が含まれる。しかし、問題は、ランダムプライマーが、不対領域内の位置も含めてあらゆる位置で不対領域を含むＲＮＡ分子とハイブリッド形成できる点である。この方法の結果は、不対領域の全長が回収されることは全くない点である。これに反して、不対領域の配列または断片の小さな部分は、回収される可能性が高い。従って、この方法は効率と精度を欠く。
【０００９】
従って、この分野の研究には、同じ遺伝子または関連遺伝子から生じる核酸の同定、選択、調製を確実にできる改善された効率的な方法が必要である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の方法は、この技術の問題を克服し、この様な核酸の同定、分析および／またはクローニングの効率的な方法を提供する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、核酸変異型またはアイソフォームの同定、分析、クローニングおよび／または調製のための新しい改善された柔軟性のある方法を提供する。
【００１２】
本発明は、
ａ）互いに相補的な少なくとも２つの核酸アイソフォームを調製するステップと、
ｂ）前記少なくとも２つの核酸アイソフォームをハイブリッド形成させ、不対領域を含む二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド（ループとしても表示される）を形成するステップと、
ｃ）ハイブリッド形成していない核酸と、不対領域を含まない核酸とから、不対領域を含むＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを回収するステップと、
ｄ）回収された不対領域を含む核酸フラグメントを同定、分析および／またはクローニングするステップと
を含む核酸アイソフォームの同定、分析および／またはクローニング方法を提供する。
【００１３】
本発明の特定の一態様によれば、上記の回収ステップｃ）は、遊離一本鎖核酸を切断するが、二本鎖核酸を切断しない少なくとも１つの制限酵素および／または二本鎖核酸は切断するが、不対領域は切断しない１つ以上の制限酵素を使用することにより実施される。
【００１４】
二本鎖核酸は切断するが、不対領域は切断しない制限酵素は、この目的のためのあらゆる制限酵素が使用できる。４個のヌクレオチドの二本鎖核酸を含む認識部位で切断するが、不対領域を切断しない制限酵素を使用できるのが好ましい。
【００１５】
本発明の実施例によれば、例えば、一本鎖核酸結合タンパク質、抗体、抗原、オリゴヌクレオチド、ランダムオリゴヌクレオチド、化学基または化学物質の様な核酸一本鎖結合分子を使用することにより、不対領域を含まないハイブリッド核酸から不対領域を含むＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドが回収される。核酸一本鎖結合分子は、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗体、抗原、タンパク質または核酸結合分子の様な標識に好ましくは結合される。標識は、金属ビーズ、磁気ビーズ、無機ポリマービーズ、有機ポリマービーズ、ガラスビーズ、およびアガロースビーズの様な固体基質表面に連結されている例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン結合分子、抗体またはそのリガンドおよび／または化学基質の様な基質に結合することにより回収できる。
【００１６】
更なる実施例によれば、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドは、リンカーまたはプライマーを使用することにより回収できる。例えば、上記の様にステップａ）のアイソフォームの調製時に導入される特異的配列を認識するリンカーまたはプライマーを用いることができる。
【００１７】
更なる実施例によれば、本発明は配列の配向性を導入するためのリンカーシステムを提供する。一実施例において、成型リンカー、好ましくは非対称リンカーが上記の様にハイブリッドを結合するために使用される。好ましくは、Ｙ型リンカーは付着末端を含み、これは不対領域を含むハイブリッドまたはハイブリッド断片にハイブリッド形成する。このシステムにより配向性を得た核酸アイソフォームは、配列決定および生物情報分析時に容易に識別できる。
【００１８】
上記の様に入手あるいは分離された不対領域を含む全てのハイブリッドまたはハイブリッド断片は、アイソフォームに富むライブラリー供給源の様に保存することができ、あるいは配列決定および遺伝情報決定分析を含むがそれらに限定されない種々の方法により分析できる。
【００１９】
更に、本発明はその後の同定、選択、分析、分離および／または更なる核酸アイソフォームの調製に有用な核酸調製のための本発明の方法により得られた遺伝情報を使用するための方法も提供する。
【００２０】
一実施例によれば、更なるアイソフォームの同定と分離に有用な核酸は、マイクロアレイの様な支持体に塗布、固定および／または印刷でき、アイソフォームスクリーニングに利用できる。更なる実施例によれば、本発明は本発明の一実施例によって得られる遺伝情報およびそれから得られるタンパク質の予測、決定および／または分析のための、好ましくは媒体に適用されるコンピュータープログラムおよび／またはソフトウェアを提供する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明は、核酸変異型またはアイソフォームの同定、分析、クローニングおよび／または調製のための新しい改善された柔軟な方法を提供する。
【００２２】
本発明において、「核酸アイソフォーム」または「核酸変異型」は、配列が異なり、同じ遺伝子または関連遺伝子から生成される核酸を意味する。本願明細書の記載においては、「アイソフォーム」または「変異型」のうち、どちらの用語も使用することができる。
【００２３】
核酸アイソフォームは、例えば、１）欠失および挿入の様な突然変異の結果；２）一本鎖一次ＲＮＡ転写物の中のエキソンとイントロンの選択的スプライシングによるもの；３）トランススプライシングの産物、すなわちＤＮＡの両方の鎖から生成されたＲＮＡエキソンの１つの転写物へのスプライシング；４）異なる発生段階、異なる器官または組織および疾病および形質転換の場合における同じ遺伝子の産物；５）関連遺伝子から生成される核酸を意味する場合もある；６）「パラログ」すなわち、ゲノム内で複製により別の類似遺伝子と関連する遺伝子から生成される核酸；７）「オルソログ」、すなわち発生上関連性のある種において別の遺伝子と類似機能を持つ遺伝子から生成される核酸；８）人工核酸と関連または類似する天然核酸；９）天然核酸と関連または類似する「人工核酸」であるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明のあらゆる実施例により調製されるアイソフォームまたは変異型は、不対領域（またはループ）を含み、この場合これらの領域は、既知、不明または部分的に不明の領域である。
【００２５】
上記のように、不対領域は、選択的スプライシングを含むが、それに限定されない異なる現象の結果である。図１は選択的スプライシングプロセスの例を図示したものである。
【００２６】
図２および３は、同じステップと本発明の方法の実施例を示す。
【００２７】
本発明は、
ａ）互いに相補的な少なくとも２つの核酸アイソフォームを調製するステップと、
ｂ）少なくとも２つの核酸アイソフォームをハイブリッド形成させ、不対領域を含む二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド（ループとしても表示される）を形成するステップと、
ｃ）ハイブリッド形成していない核酸と、不対領域を含まない核酸から、不対領域を含むＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを回収するステップと、
ｄ）回収された不対領域を含む核酸フラグメントを同定、分析および／またはクローニングするステップと
を含む核酸アイソフォームの同定、分析および／またはクローニング方法を提供する。
【００２８】
不対領域を含むＤＮＡ／ＤＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドを形成するために、少なくとも２つの核酸アイソフォームは互いに相補的、すなわち１つはセンス、もう１つはアンチセンスでなくてはならない（図６に示すように）。少なくとも２つの核酸アイソフォームは、少なくとも１つの核酸ライブラリー、生物学的試料、細胞、組織、器官または生検材料から調製できる。アイソフォームは、２つ以上の異なる核酸ライブラリー、生物学的試料、細胞、組織、器官または生検材料からも調製できる。引用する事により本明細書の一部をなすこととする米国特許第６，２５１，５９０号に示されている様に、アイソフォームは、例えば、標準試料と１つ以上の試験試料から得ることができる。試験または標準試料は、核酸ライブラリー、生物学的試料、細胞、組織、器官または生検材料が可能である。米国特許第６，２５１，５９０号に示されている様に、試験試料は、好ましくは腫瘍源、処理された細胞および／またはアポトーシスを受けた細胞または生理的または病的状態にあるその他の供給源から得ることができる。
【００２９】
異なる生物学的段階の試料も分析のために選択可能である。これらの段階は、同じ組織または細胞の異なる時点または発生段階が含まれるが、これらに限定されず、同じ生物体の異なる組織試料からも得られる。別の実施例において、本発明は、異なる生物体の遺伝情報を分析し、比較するために応用できる。その標準的応用例において、本発明は、２つの生物学的に異なる状態を反映する２つの異なる試料の内容を比較するために使用される。しかし、本発明は２つの試料の同時分析に限定されない。なぜならば、異なる試料の混合物にも応用できるからである。この場合、使用される試料の性質と、その生物学的状況によっては、特異的フランキング配列部位（フランキング配列標識またはフランキング配列マーカー部位とも表示される）により混合物中の個々の試料の供給源を識別することができる。本発明の別の実施例において、これらのフランキング配列標識は、特異的ＰＣＲプライマーによる増幅の識別選択により核酸分子混合物中の異なる供給源由来の試料を識別するために利用される。
【００３０】
試料として、標準試料と試験試料、ＲＮＡ標品、ゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡの断片から得られる核酸または個々の核酸分子の混合物から調製される個々の核酸が相補的なアイソフォームが利用できる。本発明は、取り扱いと増幅をよりよくするために、クローニングベクターまたはファージにクローニングしたＤＮＡ分子または組換えたＤＮＡ分子の使用が可能であるが、それらに限定されない。しかし、鎖状ＤＮＡ分子を直接本発明に利用するか、増幅ステップにより本発明に利用可能にすることができる。本発明の方法により比較される試料を、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ試料を含むが、それらに限定されないあらゆる種類の複数の核酸から得ることができ、また実験上の必要性に応じてどの様な順序でも試料を混合し、合わせることができる。
【００３１】
本発明は、多くの種類の異なる開始物質を使用することが可能で、従って、本発明はＤＮＡライブラリーのみの利用に限定されない。ＤＮＡライブラリーは、あらゆる種類のＤＮＡ断片、または天然供給源から得られるＤＮＡ断片、または直接合成されるか、生物体、組織、細胞株等から得られる遺伝子材料の操作により得られる人工的性質のＤＮＡ断片を含むことができる。更に、ＤＮＡライブラリーにクローニングされるＤＮＡ材料は、ＲＮＡから得られ、ｃＤＮＡの中に転写される情報を含むことが可能であり、あるいは断片化ゲノムＤＮＡから得ることができる。しかし、本発明はＤＮＡライブラリーから得られる核酸の利用に限定されない。なぜならば、天然供給源、または直接合成されるか、生物体、組織、細胞株等から得られる遺伝子材料の操作により得られる人工的性質の個々のＤＮＡ断片を、本発明を実施するため、またはこの様なＤＮＡ断片の配列情報を、１つ以上のＤＮＡ断片の配列情報と比較するために利用できる。一実施例において、本発明は、２つのｃＤＮＡライブラリーの分析に応用され、核酸アイソフォームの内容が比較される。次に、アイソフォームの相補的分子を１つ以上のライブラリーまたは試料から調製することもできる。この場合核酸は変性され、再連結される。
【００３２】
標準および／または試験試料として、１つ以上のｃＤＮＡライブラリーを利用することもできる（例えば、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｔｈｅ  Ｆａｎｔｏｍ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ａｎｄ  ＲＩＫＥＮ  ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｒｏｕｐ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００２，Ｖｏｌ．４２０，５６３〜５７３により説明されたｃＤＮＡライブラリー）。ｃＤＮＡ分子は、例えば、Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｋ．，ａｎｄ  Ｓｕｇａｎｏ  Ｓ．，１９９４，Ｇｅｎｅ，１３８：１７１〜１７４の様に、本技術において公知のあらゆる方法により調製でき（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ参照）、全長ｃＤＮＡは、標準化および／またはサブトラクションされるキャップ−トラッパー法により調製される（Ｃａｒｎｉｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０００，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ，１０：１６１７〜１６３０）。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、Ｃａｒｎｉｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００１，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．７７，（１−２）：７９〜９０に説明されているように、ｃＤＮＡまたは全長ｃＤＮＡをベクターに挿入して調製できる。上記の様に、ゲノムＤＮＡ、ＥＳＴ、ＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡも開始点として相補的核酸アイソフォームの調製に使用できる。しかし、本発明は２つ以上の複数の核酸の使用に限定されない。なぜならば、ある試料が１つのｃＤＮＡまたは１つのゲノム断片を持つ１つのクローンの様な１つの核酸分子から構成されてもよいからである。そのクローンのゲノム情報は、本発明の手段により、異なる複数の核酸の形態で供給される生物学的または人工試料のあらゆる状況において修飾された、あるいは変更された、従って、選択的スプライシングによる変異型または変種の存在を研究できる。
【００３３】
相補的核酸アイソフォーム（ステップａ）は、本技術において公知の全ての方法により調製できる（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１を参照）。一実施例によれば、相補的ｃＤＮＡ鎖は、それぞれが異なるプロモーター部位を認識する少なくとも２つの異なるＲＮＡおよび／またはＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、開始物質として少なくとも２つの相補的核酸アイソフォームを使用することにより、１つ以上の試料からセンスアイソフォームおよびアンチセンスアイソフォームを転写することにより調製される。一実施例によれば、ＲＮＡ転写物は、異なるプロモーター部位を認識するＲＮＡポリメラーゼを使用することにより開始物質から得られ、またｃＤＮＡは、逆転写酵素を使用することによりＲＮＡ転写物から調製される（図４〜５参照）。異なるプロモーター部位を認識する少なくとも２つのＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼおよびＫ１１  ＲＮＡポリメラーゼまたはそれらの突然変異体から選択される（米国特許第６，３６５，３５０号参照）。
【００３４】
本技術において公知のこの使用法のためのあらゆるＤＮＡポリメラーゼを利用できる（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１）。ＤＮＡポリメラーゼと鎖特異的プライマーも、この目的に使用でき、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼマイナスであるＤＮＡポリメラーゼＩラージ（クレノウ）フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
図２〜５に説明されている一実施例によれば、２組の一本鎖ＤＮＡ分子が調製される。１組は、例えば、メラノサイト全長ｃＤＮＡライブラリーの様な試料１（あるいは図に示されている様に条件１）から、もう１組は、例えば、メラノーマ全長ｃＤＮＡライブラリーのような試料２（または条件２）から調製される。２組のライブラリーは、例えば、ＰＣＲによりファージとして、プラスミドＤＮＡとして、あるいはＤＮＡ断片として、標準増幅法により増幅できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１参照）。２組の二本鎖ｃＤＮＡは、１組目のライブラリーにおいてＴ３プロモーター部位を認識するＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを、２組目のライブラリーにおいてはＴ７プロモーター部位を認識するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをそれぞれ用いることにより逆転写される。その結果、（本明細書においては不対領域またはループとして示される配列が異なるか、配列が欠失した領域以外は）互いに相補的な２組のＲＮＡ転写物が転写される。本発明の方法により説明され、得られるＲＮＡは、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのレベルで本発明を実施するために応用でき、直接利用できるが、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにより形成されるループ構造分離を目的として、下記に開示されている様に本発明の方法により、一部不対の、従ってループ構造を形成するハイブリッドを高濃度にすることができる。
【００３６】
プライマーとＤＮＡポリメラーゼを使用して、標準技術によりＤＮＡ鎖が合成される（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１参照）。
【００３７】
次に、例えば、ＮａＯＨを加えてＲＮＡを加水分解する様な標準技術（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１参照）を用いることにより、ＲＮＡ鎖が二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖から除去される。
【００３８】
得られる産物は、互いに相補的な２組の一本鎖ＤＮＡである（図５に上下鎖として表示される）。
【００３９】
上記の様に、これら２組の相補的核酸は、不対領域またはループとして表示される配列が異なるか欠失している領域以外は互いに相補的な２つのアイソフォームに対応している。これらの不対領域は、同じゲノムの異なる遺伝子座由来の関連遺伝子の一部、１つのゲノムの同じ遺伝子座由来の非関連遺伝子の一部、異なるゲノム由来の関連遺伝子の一部に対応している。これらは、欠失、挿入、エキソンおよび／またはイントロンに対応していることがある。２組の相補的ｃＤＮＡは、１つ以上の不対領域を含み、図６に図示された構造を形成するＤＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドを形成するためにハイブリッド形成される（このステップはステップｂに対応する）。
【００４０】
上記の方法は、ＤＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドの調製に関して説明されているが、ＲＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドも標準技術に従って調製できる。上記に説明されているハイブリッドＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡの調製品または混合物は、核酸アイソフォームに富むライブラリーの供給源として保存でき、あるいは全長不対領域の分離に使用できる。
【００４１】
上記ＤＮＡ／ＤＮＡ調製品は、ハイブリッド形成していないか、部分的にハイブリッド形成している核酸または核酸領域から、および不対領域を含まない核酸ハイブリッドから、不対領域を含むＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを回収するために処理することができる。
【００４２】
どちらの処理も、互いに別々に実施することも、あるいは同時に実施することも可能で、またどの様な順序でも実施できる。
【００４３】
一実施例によれば、ハイブリッド形成していないか、部分的にハイブリッド形成している核酸または核酸領域の除去は、遊離一本鎖核酸は切断するが、二本鎖核酸は切断しない少なくとも１つの制限酵素を使用することにより実施される。遊離一本鎖核酸は切断するが、二本鎖核酸は切断しない制限酵素は、エキソヌクレアーゼであり、例えばＥｘｏＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＴ、ラムダエキソヌクレアーゼまたはＴ７エキソヌクレアーゼである。しかし、これらの種類の酵素は、このリストに限定されない。本技術に精通する者にとって公知の更なる酵素も利用できる。特に、ＥｘｏＶＩＩは、５’から３’および３’から５’方向のどちらでも機能するが、３’から５’方向で機能する他のエキソヌクレアーゼのどれでもそれら自体で利用できるか、あるいは一本鎖ＤＮＡの突出部を持つＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにより引き起こされるバックグラウンドまたは人為的結果を減少させるためのあらゆる特定の組み合わせで利用することができる。
【００４４】
遊離一本鎖核酸を切断するが二本鎖核酸を切断しない制限酵素を利用した効果が図７に図示されている。ハイブリッド形成しなかった一本鎖核酸と、ハイブリッド形成していない領域は、上記の様に酵素により消化され、二本鎖ＤＮＡ／ＤＮＡだけが残る。
【００４５】
上記エキソヌクレアーゼによる処理後、またはその処理とは無関係に、不対領域を含まないハイブリッドまたは核酸からの不対領域を含むＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの回収ステップを実施できる。この目的のために、二本鎖核酸は切断するが、不対領域は切断しない少なくとも１つの制限酵素が利用できる。好ましくは、二本鎖核酸は切断するが、不対領域は切断しない２つの制限酵素が利用される。
【００４６】
４個のヌクレオチドの二本鎖核酸を含む認識部位で切断するが、不対領域は切断しない制限酵素が好ましくは利用される。二本鎖核酸は切断するが、不対領域は切断しない制限酵素は、ＨａｐＩＩ、ＨｙｐＣＨ４１Ｖ、ＡｃｉＩ、ＨｈａＩ、ＭｓｐＩ、ＡｌｕＩ、ＢｓｔＵＩ、ＤｐｎＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＭｂｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＲｓａＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＴａｑアルファＩおよびＴｓｐ５０９１から選択されるが、これらのリストに限定されない。
【００４７】
本技術に精通する者にとって明らかなその他の適切な制限酵素も利用できる。これらの種類の制限酵素を使用することにより、不対領域を含まない二本鎖ＤＮＡが切断される。不対領域を含むハイブリッドアイソフォームの小さな断片だけがこれらの酵素により切断されない。
【００４８】
遊離一本鎖核酸を切断するが、二本鎖核酸を切断しない少なくとも１つの制限酵素を使用することにより（上記に開示されている様に）、および／または二本鎖核酸を切断するが、不対領域を切断しない少なくとも１つの制限酵素を使用することにより（上記に開示されている様に）、ハイブリッド形成していない核酸から、また不対領域を含まない核酸から、不対領域を除去する処理方法は本発明の方法にとって有用であるが（図２および３に概説されている様に）、その使用方法に限定されない。従って、上記制限酵素使用方法の一方または両方を使用することによる１つ以上の不対領域を含む核酸の一般的回収および分離方法も、本発明の範囲内である。
【００４９】
不対領域を含むハイブリッドアイソフォームの調製物は、本技術において公知の方法に従って、回収、分離が可能である。例えば、一本鎖核酸結合分子を使用することにより可能である。一本鎖核酸結合分子は、一本鎖核酸結合タンパク質、抗体、抗原、オリゴヌクレオチド、化学基または化学物質が可能である。オリゴヌクレオチドは、ランダム配列、好ましくは１５〜３０個のヌクレオチド、好ましくは２５個のヌクレオチド（「２５Ｎ」と表示される。）のランダムオリゴヌクレオチドが可能である。一本鎖核酸結合タンパク質は、この特徴を有する全てのタンパク質が可能である（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１参照）。一本鎖核酸と結合できるタンパク質は、例えば、プロメガ社、カタログ番号Ｍ３０１１により生産された大腸菌一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）であり、これは一本鎖ＤＮＡには高い親和性で結合するが、二本鎖ＤＮＡには結合しない（Ｓａｎｃａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７８，４２７４；Ｋｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，５３４６も参照）がある。一本鎖核酸結合タンパク質は、例えば、欧州特許出願第１０４１１６０号（引用することにより本明細書の一部を成すこととする。）にも開示されている。その他の一本鎖核酸結合物質は、例えば、欧州特許出願０６２２４５７号（引用することにより本明細書の一部を成すこととする。）にも開示されている。
【００５０】
一本鎖核酸結合物質は、好ましくは標識分子に結合される。標識分子は、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗体、抗原、タンパク質、核酸結合分子から選択できる。一本鎖核酸結合分子／標識分子複合体は、基質を使用することにより回収できる。基質は、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン結合分子、抗体またはそのリガンドおよび／または化学基質から選択できる。しかし、上記の標識および基質のリストは、上記に表示された化合物に限定されない。
【００５１】
標識がビオチンの場合、基質はアビジンまたはストレプトアビジンが可能である。標識が、ジゴキシゲニンの場合、基質はジゴキシゲニン結合分子（ロッシュ社カタログ参照）が可能である。標識が抗原の場合、基質は抗体が可能である。一本鎖核酸結合分子は、基質に共有結合することもできる。例えば、共有結合に使用できるアミノ基を持つオリゴヌクレオチドがその例である。
【００５２】
好ましくは所望の核酸アイソフォームの回収は、基質が固体基質表面と好都合に連結された状態で実施される。基質固体表面は金属ビーズ、磁気ビーズ、無機ポリマービーズ、有機ポリマービーズ、ガラスビーズ、およびアガロースビーズから選択できる。無機ポリマーには、シリカ、セラミック等が含まれる。有機ポリマーには、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコールなどが含まれる。金属には、鉄、銅などが含まれる。標識、基質および基質固体表面は、欧州特許出願０６２２４５７（引用することにより本明細書の一部を成すものとする。）に記載されている。
【００５３】
上記回収の例が図９に図示されている。
【００５４】
不対領域を含むＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドアイソフォームは、不対領域を含まないハイブリッドからこの方法で分離され、標準技術、例えば、４０〜６０℃、好ましくは５０℃で加熱することにより一本鎖結合分子から遊離され、回収される。一本鎖核酸結合分子としてランダムオリゴヌクレオチドを使用する場合、ランダムオリゴヌクレオチドは完全にハイブリッド形成していないため、一本鎖核酸結合分子からハイブリッドアイソフォームを遊離するには軽度の加熱で十分である。
【００５５】
上記方法により得られたアイソフォームの調製品は、アイソフォームを多く含むライブラリーとして保存でき、あるいは不対領域を含むアイソフォームの調製に次のステップで処理することができる。
【００５６】
ＤＮＡ／ＤＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド調製で起こり得る一状況は、２つのＤＮＡ（または２つのＲＮＡ）のハイブリッドが配向性を欠失している場合で、配列決定および／または更なる生物情報分析時に、２つのＤＮＡ（またはＲＮＡ）が相補的かセンス分子かが不明となる。
【００５７】
この問題を克服するために、本発明者等は、ハイブリッドアイソフォームの各鎖に配向性を導入する方法も提供し、この方法は本発明の更なる実施例を示す。
【００５８】
この実施例は、Ｙ型リンカー（図１０および１１参照）の調製にある。これらの種類のＹ型リンカーは、二本鎖本体領域と２つの一本鎖アームから成る。Ｙ型リンカーは、例えば、Ｔａｚａｖｏｉｅ  ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５６６〜５７１により開示されている。
【００５９】
本発明の実施例によれば、Ｙ型リンカーの各アームは異なる特異的マーカー部位配列または標識配列を含む。例えば、１つのアームがマーカー配列（１）を持ち、もう１つのアームがマーカー（２）を持つとする。配列決定され、分析されると、マーカー（１）を持つ配列とマーカー（２）を持つ核酸配列は、相補的核酸配列として扱われる。結合のための突出部を供給する必要がある場合には、１種類以上のＹ型リンカーを同時に利用できる。しかし結合のための突出部に加えて、１種類のみのリンカーを使用できる（図１０、１１も参照）。
【００６０】
Ｙ型リンカーは、本技術において公知のあらゆる方法により、回収されるハイブリッドＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡアイソフォームに付着させることができる。例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡリガーゼを使用することによる。これらのリガーゼの例として、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、またはＴ４  ＲＮＡリガーゼがある。
【００６１】
好ましい実施例によれば、Ｙ型リンカーは付着末端を二本鎖本体末端に有する。これは回収されるハイブリッド二本鎖核酸の付着末端とハイブリッド形成する（この場合、不対領域を含むハイブリッドＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡアイソフォーム）。ハイブリッド核酸の特異的付着末端は、特異的制限酵素により導入できる。例えば、二本鎖核酸を消化するために上記の４つの切断制限酵素が使用されると、ハイブリッドＤＮＡ／ＤＮＡアイソフォームの付着末端とハイブリッド形成できる付着末端を持つＹ型リンカーが調製できる。
【００６２】
別の実施例によれば、リンカーの付着末端は、ハイブリッド核酸のどの様な付着末端ともハイブリッド形成できる様にランダム配列である。
【００６３】
配向性を付与するためのＹ型リンカーの使用は、本発明のハイブリッド二本鎖アイソフォームの結合に限定されず、一般にあらゆる二本鎖核酸の回収と、それに対する配向性の付与に利用できる。従って、本発明は上記Ｙ型リンカーを使用することによる二本鎖核酸の２本の鎖に配向性を付与する方法も開示している。
【００６４】
上記に開示されているリンカーに結合された不対領域を含むハイブリッドＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡアイソフォームは、例えば、１サイクル以上のＰＣＲにより増幅され（図１１参照）、クローニングされる（図１１、１２参照）。クローニングは、本技術において公知のあらゆる方法により実施できる（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１参照）。例えば、クローニングベクターを使用する（図１２参照）。クローニングベクター調製方法およびクローニング方法は、例えば、国際公開番号ＷＯ０２／０７０７２０Ａ１に開示されている（引用することにより本明細書の一部を成すものとする）。
【００６５】
ハイブリッドＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡアイソフォームの回収および／またはクローニングシステムに関して、その他の方法も利用できる。例えば、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、増幅ステップ時（図３、４）またはＲＮＡ合成時（図５）に、ライブラリーファージに導入されたＲＮＡの特異的配列部位（認識部位または配列標識とも表示される）を認識するプライマーを使用することにより標準方法に従って、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの逆転写により回収および／またはクローニングできる。例えば、図４に関して、Ｔ３プロモーター部位およびＴ７プロモーター部位を含むプライマーにより特異的認識部位を導入できる。
【００６６】
クローニングベクターにおいて上記の様に回収されたアイソフォームは（図１２）、標準方法に従って、宿主細胞に導入できる（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１参照）。従って、本発明は、上記宿主細胞の培養を含むポリペプチドの調製方法も提供する。
【００６７】
本発明の回収されたアイソフォーム核酸のポリペプチドは、無細胞系ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｋｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４４２，１５〜１９）またはｉｎ  ｖｉｖｏシステムの方法の様なその他の公知の技術に従って調製することもできる。
【００６８】
クローニングベクターに含まれる不対領域を含むアイソフォームは、配列決定され、分析される。
【００６９】
本発明は、２つ以上の複数の核酸分子間の差を規定するハイブリッドアイソフォームに特に富むＤＮＡライブラリーの調製方法も提供する。本発明により得られるライブラリーは、分子生物学の技術に精通する者にとって公知の標準技術により分析でき、それに応用できる（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１参照）。配列決定は、Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０００，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，（１１）：１７５７〜１７７１の説明に従って、実施できる。本明細書は、挿入断片の部分または全長の配列決定、ハイブリッド形成実験用プローブ作製、ＲＮＡまたはタンパク質の形態でそれらを操作または発現できる様にするための挿入断片またはその一部の他のＤＮＡ分子へのサブクローニングまたは組換えが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｃａｒｎｉｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００１，Ｖｏｌ．７７，（１−２），７９〜９０に説明されている方法に従って、クローニングベクターの中に含まれる回収されるアイソフォームは、実際に配列決定に適したベクターの中に移すことができる。
【００７０】
別の実施例において、本発明は、本発明の実施中に得られるＤＮＡまたはＲＮＡ分子から得られる配列情報の分析方法を提供する。これらの選択されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、２つ以上の分析試料間で異なるＤＮＡまたはＲＮＡアイソフォーム断片に富むので、それから得られる配列情報は、異なる生物学的ステージ中の遺伝情報の利用を分析するための有用な情報源である。配列情報の分析は、１つの実験から得られる配列群における重複を減らし、同じ配向性のマーカーを持つ配列を分類するために、ＤＮＡ配列を複数のアラインメントにより開始される。同じ配向性のマーカーを持つ配列は、同じく投入された試料または試料混合物から得られる。少なくとも２つの配向性のマーカーを識別することにより、本発明のために、それぞれの配列と関連クローンの由来を遡って追跡することができる。本発明の実験方法により、それぞれの配列は、フランキング領域に関する情報と配列の変異型に関する情報を含むはずである。従って、本発明により、最初の核酸試料における配列変異型の境界の同定と、隣接領域の同定が可能である。個々の配列情報は更に、本技術に精通する者にとって公知の基準データベースの検索により更に分析できる。例えば生物情報学の方法の様なあらゆる配列比較および情報入手方法を利用できる。選択的スプライシングが行われた核酸から得られる情報は、その機能を発見するために、生物情報学の方法により分析できる。例えば、コンピューターツール（ＴＡＰ）を使用することにより選択的スプライシングが行われた情報をゲノム配列データと配列比較することにより分析できる。選択的スプライシングが行われた分子の機能に関する理解は、選択的スプライシングがヒトの疾病に関与することから、研究において非常に有用である（Ｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８３７〜１８４５）。基準データベースの検索には、部分的ｃＤＮＡまたは全長ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡ配列の配列比較が含まれるが、これらに限定されない。最初の配列情報は、基準配列との配列比較により延長でき、これによって遺伝情報の利用とそれから得られるタンパク質に関する更に徹底的な配列分析が可能となる。更に別の実施例において、本発明は、ゲノムの転写領域内のイントロンとエキソン、およびスプライスされたｍＲＮＡ分子内のそれらの選択的利用に関する同定と分析に利用でき、応用できる。この場合、本発明は、互いに異なるスプライシングを受けたプレｍＲＮＡ分子のコーディング領域とそれから得られるタンパク質に関する関連情報も提供する。更に別の実施例において、本発明は、互いに異なるスプライシングを受けたｍＲＮＡのクローニングと特徴付けのための更なる操作のために、またその実験手段として、イントロンまたはエキソンに特異的核酸分子を提供する。
【００７１】
本発明は、２つ以上の複数の核酸をマッチングすることにより配列変異型分析の有効な手段を提供する。ループ構造と二本鎖フランキング領域から成り、それらの由来を明らかにする異なる配向性の２つのＤＮＡ鎖から組み立てられたＤＮＡハイブリッドの選択的濃縮により、本発明は配列変異型の分離と特徴付けを可能にする。それには、試料間の関連遺伝情報の異なる使用方法が含まれ、それらが示されている。従って、本発明は、生物学的状況において、異なるスプライシングを受けたプレｍＲＮＡ分子の新しい分析方法を提供する。その方法が普遍的設計であるため、本発明は、ｍＲＮＡ調製品またはｃＤＮＡライブラリーから得られるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子のプール全体を比較することにより、極めて複雑な核酸混合物の分析を可能とするが、それに限定されない。本発明は、同じプレｍＲＮＡの異なるスプライス変異型またはゲノムの一定の転写領域のみが検討される、より的を絞った方法にも応用できる。本発明を応用することにより、核酸分子とそれから得られる配列情報を更なる分析のために得ることができ、それによって既知の核酸の機能的特徴を明らかにすることが可能となり、あるいは更に未知の核酸の同定および分離が可能となる。本発明は遺伝子の発見とゲノム研究において広範囲の応用例に利用できるため、この方法は、この分野における学問的および商業的研究開発に大いに貢献する。
【００７２】
従って、本発明は、本発明のあらゆる実施例に従って、回収されるアイソフォーム配列の分析により得られる情報を使用することにより、アイソフォーム核酸および／またはポリペプチドの同定方法を提供する。
【００７３】
本発明は、
ｌ）本発明のあらゆる実施例により同定および／またはクローニングされる不対領域の全体または一部を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを調製するステップと、
ｍ）オリゴヌクレオチドプローブを、核酸アイソフォームを含む核酸とハイブリッド形成させるステップと、
ｋ）核酸アイソフォームを分離するステップと
を含む核酸アイソフォームの検出および／または分離方法も提供する。
【００７４】
上記の様に調製されたオリゴヌクレオチドプローブは、全長核酸アイソフォームの分離に使用できる。オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１つのエキソンまたはイントロンを含むことができる。核酸プローブは、本発明により得られる配列決定および生物情報学の情報を使用する本技術において公知の化学合成法を用いても調製できる。
【００７５】
本発明は、上記に説明されている方法により得られる核酸プローブも開示している。本発明のあらゆる実施例により得られるアイソフォームの配列変異の決定は、アイソフォームの全長または部分的配列決定を含めることができる。
【００７６】
更なる実施例に従って、配列アイソフォームの配列情報は配列決定プライマーのデザインに使用される。従って、本発明は配列決定に適した配列を用いてデザインされるそのようなプライマーも提供する。
【００７７】
本発明のあらゆる実施例により得られるアイソフォームの配列決定データは分析可能で、ゲノム、ゲノム配列決定データおよび／またはｃＤＮＡ配列決定データとの配列比較で遺伝情報が得られる。このように得られた情報は、選択的スプライシングの情報であると思われる。
【００７８】
本発明は更に、疾病、疾病状態、病態、生理学的状態の検出および／または診断のために、毒性評価のために、試験化合物の治療効果の可能性評価のために、および／または検査または治療に対する患者の反応性を評価するために、本発明の配列決定および／または分析方法により得られる情報の利用法にも関する。疾病または生理学的および／または病的状態のこの種の検出、同定および／または診断のための利用法の具体例は、米国特許第６，２５１，５９０号（引用することにより本明細書の一部を成すものとする）に説明されている。
【００７９】
更に、本発明は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成のための不溶性支持体の調製のための、本発明のあらゆる実施例により得られるアイソフォームの使用、および／または上記の様に調製された核酸プローブに関する。従って、本発明は、本発明のあらゆる方法により調製された不対領域を含む少なくとも１つの核酸、不対領域に相補的な核酸および／または上記の様に調製されたプローブがその上に固定、塗布および／または印刷された不溶性支持体の調製に関する。
【００８０】
核酸またはポリペプチド分子を持つ支持体の一例は、保存および／または配達に関して米国特許第６，２５８，５４２号（引用することにより本明細書の一部を成すものとする）に説明されている。
【００８１】
本発明のあらゆる方法により調製された不対領域を含む少なくとも１つの核酸、不対領域に相補的な核酸および／または上記の様に調製されたプローブがその上に固定、塗布および／または印刷されたその他の不溶性支持体、好ましくは固体基質を、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成に利用できる。この支持体の一例は、バイオチップおよび／またはマイクロアレイである。従って、本発明のあらゆるアイソフォーム、不対領域および／またはプローブを含むマイクロアレイは本発明の範囲内である。マイクロアレイは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２００２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに説明されている方法の様な標準技術により調製、利用可能である。
【００８２】
この方法で調製されるマイクロアレイは、更に既知または未知の核酸アイソフォームの同定と分離に利用できる。
【００８３】
本発明により調製される支持体またはマイクロアレイは、疾病、疾病状態、病態、生理学的状態の検出および／または診断のために、毒性評価のために、試験化合物の治療効果の可能性評価のために、および／または検査または治療に対する患者の反応性を評価するために、核酸の検出のために、核酸アイソフォームの検出のために利用できる。従って、本発明は、支持体、マイクロアレイ、核酸ライブラリー、生物検体、細胞、組織、器官および／または生検から核酸を検出および／または分離するための本発明のあらゆる実施例により得られる遺伝情報の利用に関する。
【００８４】
更なる実施例により、本発明は、上記に説明されている配列決定と情報の分析により得られる遺伝情報分析のための媒体に適用するためのコンピュータープログラムおよび／またはソフトウェアに関する。コンピュータープログラムおよび／またはソフトウェアは、本発明のあらゆる実施例により得られる核酸アイソフォームの配列または情報由来のポリペプチドの機能領域の予測、決定および／または分析のためにも利用できる。
【００８５】
本発明の配列分析は、１項目以上の以下に示す要素、特徴、ステップおよび／または検討事項である。
−配列決定読み取りと「有効読み取り」のカットオフ値の定義に関する精度管理；
−その由来を示す配向性マーカーに基づく配列のグループ分け；
−クラスタの更なる分析および統計分析のためのそのセットにおける冗長を減じるためのクラスタに分類するための読み取りのアラインメント；
−公衆または予備データセットへの代表クラスタのアラインメントと結果の分析；
−可能な場合にはゲノム情報への代表クラスタのマッピング；
−マッピング結果に基づくゲノム領域、予測または同定されるイントロン−エキソン構造が含まれるが、それらに限定されない遺伝子座に関する利用可能な情報の分析；
−既に同定され、予測されたか、あるいは新たに認識されたエキソンまたはイントロンの確認；
−スプライス部位を確認し、それらの信頼性に従って、それらを階級付けするためのコンピューター手段のデザイン；人為的結果をフィルタリングで除外；
−本発明により同定されるエキソンによりコードまたは修飾されるタンパク質の予測またはそのタンパク質に翻訳するためのコンピューター手段；
−ハイブリッド形成によるエキソンまたはイントロンの分析のための特異的プローブのデザイン；
−ＰＣＲによるエキソンまたはイントロンの分析のための特異的プライマーのデザイン；
−制限酵素の認識部位の一覧表；
−配列決定反応によるエキソンおよびイントロンの分析のための特異的プライマーのデザイン。
【００８６】
本発明は更に、本発明のあらゆる実施例により得られる核酸の分析に関する。本発明は、支持体、特にマクロアレイまたはマイクロアレイのデザインと調製のためのこれらの核酸の利用に関する。本発明のあらゆる実施例により、例えばＰＣＲの様な増幅法により得られる核酸の分析が可能である。例えば、ＰＣＲの様な増幅法と、その後の一群の制限酵素による分析による、本発明のあらゆる実施例より得られる核酸の分析が可能となる。特異的配列決定プライマーを使用する部分的または伸長された配列決定により、発明のあらゆる実施例により得られる核酸の分析を行なうことができる。ｃＤＮＡのクローニング、ゲノムＤＮＡのクローニングおよび／またはＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子の化学合成のための本発明のあらゆる実施例により得られる核酸の利用に関する。本発明は、核酸により部分または全体がコードされたタンパク質合成のための本発明のあらゆる実施例により得られる核酸の利用に関する。本発明はさらに、２つ以上の生物試料由来の本発明のあらゆる実施例により得られる核酸の比較の応用に関する。また本はつめは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの断片由来の本発明のあらゆる実施例により得られる核酸の比較の１つ以上の異なる生物試料由来の試料への応用に関する。
【００８７】
本発明は、以下の具体例を参照することにより更に詳細に説明される。
【００８８】
【実施例】
［具体例１］
選択的スプライシングエキソンライブラリー法のプロトコール
メラノサイトおよびメラノーマの細胞計培養からの全長ｃＤＮＡライブラリーは、Ｃａｒｎｉｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０００  Ｏｃｔ；１０（１０）；Ｃａｒｎｉｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００１Ｓｅｐ；７７（１−２）７９−９０により開発された方法を用いて作製された。Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．，Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．，１９９４．Ｇｅｎｅ  １３８，１７１−１７４により開発された他の方法も用いることができる。ラムダベクターｐＦＬＣＣＩＩ（アンピシリン耐性プラスミドｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ−ＳＫ（＋）に由来する，Ｃａｒｎｉｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．７７，（１−２），７９−９０）。ｃＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡの５’末端でＸｈｏＩ部位、３’末端でＢａｎＨＩ部位によりベクターに挿入された。
【００８９】
我々は、Ｔ３プライマーを用いて５’ＥＳＴ、Ｔ３プライマーを用いて３’ＥＳＴを配列決定した。以下をライブラリー作製に使用できる。ライブラリーファージ溶液の原液を、７０ｍｌのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、和光化学、日本）を９３０ｍｌのファージ溶液に加えて作製し、手で静かに混合した。原液を−８０℃で保存した。
【００９０】
［第１部：  増幅されたファージからのＤＮＡ抽出］
１ｍｌのファージ原液に、１０ｕ／μｌのリボヌクレアーゼと１ｕ／μｌのデオキシリボヌクレアーゼ（共にプロメガ社）、２μｌの各酵素をそれぞれ加え、静かに混合した。溶液を３７℃で２０分間インキュベーションした。その後、５００μｌの予め膨潤させた微小顆粒陰イオン交換体ＤＥ５２（ジエチルアミノエチルセルロース、ホワットマン社）を、手で混合し続けながら約１０分間作用させた。混合物を室温で１分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を１．５ｍｌの新しい試験管に移し、上記と同じ条件で遠心分離した。２回目の遠心分離後、上清を２ｍｌの新しい試験管に移し、１００μｌのＺｎＣｌ2と共に３７℃で５分間インキュベーションした。遠心分離後、白い沈殿が観察され、上清を廃棄した。沈殿を１００μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡと９００μｌの７ＭのＧｕ−ＨＣｌと共に十分再懸濁し、１００μｌの基質（珪藻土、シグマ社）を作用させた。約５分間静かに充分に混合してから、溶液を遠心分離し、８００μｌの上層を廃棄し、残りの部分（約４００μｌ）を１．５ｍｌの試験管に設置したフィルター装置に加えた。溶液を室温で１２，０００ｒｐｍで１分間短時間の遠心分離により回転し、流出分を廃棄した。フィルターを４００μｌの７Ｍ  Ｇｕ−ＨＣｌ、洗浄液（２回）および４００μｌの８０％エタノール（２回）により各回洗浄した。フィルター装置を１．５ｍｌ試験管の中に移し、予め暖めた１００μｌのＴＥをフィルターの中央にかけた。濃縮と品質チェックのために、２分後遠心分離にかけ、５μｌのＤＮＡ溶液をアガロースゲルに加えた（ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース、タカラ）（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅ．，２００１による）。ＤＮＡ溶液をＳ４００カラム（アメルシャムファルマシア）を用いて更に精製した。４℃にて３０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、試料をカラムにかけ流出させた。
【００９１】
＜挿入断片のＰＣＲ増幅＞
ＤＮＡ溶液を更に挿入断片のＰＣＲ増幅のために利用した。ＰＣＲプライマーは、ベクターｐＦＬＣＣＩＩ（Ｃａｒｎｉｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００１，Ｖｏｌ．７７，（１−２），７９−９０）の一部に関して、挿入断片の配列に可能な限り近接してデザインされた。ファージプロモーター配列Ｔ３およびＴ７は、ＰＣＲプライマーに付着され、両ＰＣＲ産物に組み入れられた。反応条件は以下の通りである：２．５μｌのプライマー（それぞれ１０μＭ）：
Ｔ３ＧＷ１：
GAGAGAGAGAATTAACCCTCACTAAAGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGC（配列番号１）
およびＴ７ＧＷ２：
GAGAGAGAGAATTAACCTCACTAAGGGACCACTTTGTACAAGAAAGC（配列番号２）。
４μｌの鋳型（約４０ｎｇ）、５０μｌの２ＳＧＣ緩衝液、１６μｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）、２５μｌのＨ2Ｏ。９５℃の高温で開始し、１μｌのＬＡ  Ｔａｑ（全てタカラ、日本）を加える。ＰＣＲを１０〜２０サイクル実施した：９５℃１分間、５５℃３０秒間、７２℃８分間。反応後、プロテイナーゼＫ消化を実施し、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルム（Ｃａｒｎｉｎｃｉ  ａｎｄ  Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９；３０３：１９−４４）を用いて抽出し、ｃＤＮＡを沈殿させ、１００μｌのＨ2Ｏに溶解した。
【００９２】
＜ＲＮＡ合成＞
ＲＮＡ合成は、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ，ＢＲＬ、５０ｕ／μｌ）を使用して実施され、センスランオフＲＮＡが調製された。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ，ＢＲＬ，５０ｕ／μｌ）を使用してアンチセンスランオフＲＮＡが調製され、１０μｌのＰＣＲ試料（３μｇ）が鋳型として使用され、反応混合物を３７℃で５時間インキュベーションした。反応は、以下の条件で実施された：３μｌのＴ７またはＴ３ＲＮＡポリメラーゼを、４０μｌの５×Ｔ７／Ｔ３緩衝液（ライフテクノロジーズ，ＢＲＬ）、２０μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ（（ライフテクノロジーズ，ＢＲＬ）、１．６μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（（ライフテクノロジーズ，ＢＲＬ）、１０μｌの１０ｍＭｒＮＴＰ（ベーリンガーマンハイム）、１１５．４μｌのＨ2Ｏに加え、総容量２００μｌとした。
【００９３】
溶液は徐々に白色に変わり、ＲＮＡが合成された。その後、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＲＱ１，リボヌクレアーゼを含まない、プロメガ、１μｌ）処理を約３０分間実施した：１０ｍＭ  ＣａＣｌ2と１μｌのデオキシリボヌクレアーゼを加えた。試料を１００μｌの水に溶解し、キアゲン精製キット（キアゲン）を用いて、製造者の指示に従って、更に精製した。溶液の最終容量を１００μｌの水で調整した。次にプロテイナーゼＫ消化を行い、続いてフェノール／クロロホルムとクロロホルムを用いて抽出を行い、ｃＤＮＡを沈殿させた。
【００９４】
＜第１の鎖のｃＤＮＡ調製＞
５μｇのＲＮＡセンス鎖の溶液（３１μｌ）を、５μｌの第１の鎖のプライマー（配列番号２）と合わせ、総容量３６μｌとした（溶液Ａ）。５μｇのＲＮＡアンチセンス鎖（３１μｌ）を５μｌのもう１つの第１の鎖のプライマー（配列番号１）と合わせ、総容量３６μｌとした（溶液Ｂ）。２つの溶液はそれぞれ別々に（溶液Ａと溶液Ｂ）、６５℃で１０分間変性させ、２本の試験管に入れた（１本は変性溶液Ａを、もう１本は変性溶液Ｂを含む）。同時に、１００μｌの２Ｘの緩衝液ＧＣ（タカラ）、２０μｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）、４０μｌの飽和トレハロース（約８０％、低金属含量；Ｆｌｕｋａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ）、４μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（２００ｕ／μｌ）を合わせて、最終容量１６４μｌとした（溶液Ｃ）。更に、０．２μｌの［３２Ｐ］ｄＧＴＰを３本目の試験管に入れた。溶液Ａを氷上で溶液Ｃと混合し、混合物のアリコート（２０％）をすばやく、［３２Ｐ］ｄＧＴＰを含む試験管に加えた。第１の鎖のｃＤＮＡ合成は、以下のプログラムに従って、加熱されたふた付きサーモサイクラーにおいて実施された：ステップ１）４５℃で２分間；ステップ２）勾配アニーリング：１分間で３５℃に冷却；ステップ３）完全アニーリング：３５℃で２分間；ステップ４）５０℃で５分間；ステップ５）１秒あたり０．１℃で６０℃まで上昇させる。ステップ６）５５℃で２分間；ステップ７）６０℃で２分間；ステップ８）ステップ６に戻り、更に１０サイクル行う。放射能を組み込むことにより、ｃＤＮＡの収量を推定することが可能となった（Ｃａｒｎｉｎｃｉ  ａｎｄ  Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９；３０３：１９−４４）。得られたｃＤＮＡは、プロテイナーゼＫで処理し、フェノール／クロロホルムとクロロホルムで抽出し、５ＭのＮａＣｌを用いてエタノール沈殿させた。
【００９５】
溶液Ａに実施されたのと同じ手順が溶液Ｂに実施され、同様にｃＤＮＡが得られ、処理された。
【００９６】
＜ＲＮＡ除去＞
ペレットを、１００μｌの水で溶解し、同量の１５０ｍＭ  ＮａＯＨ／１５ｍＭ  ＥＤＴで処理した。４５℃で１０分間インキュベーション後、以下の溶液：１００μｌの１Ｍトリス塩酸ｐＨ７．０（このステップで２つの試料を合わせることができる）、２μｌリボヌクレアーゼＩ（１０Ｕ）、２μｌリボヌクレアーゼＨ（１２０ｕ）（タカラ）を加え、３７℃で１５分間インキュベーションした。試料をプロテイナーゼＫで再度処理し、フェノール／クロロホルムを用いて抽出し、５ＭのＮａＣｌを用いてエタノール沈殿させた。１００μｌの水に溶解したペレットを、Ｓ４００カラムにかけた。このステップ中に、同じ方向の試料に同じカラムを使用することができる。試料をイソプロパノールで沈殿させ、８０％エタノールで２回洗浄した。
【００９７】
［第２部：ハイブリッド形成とＥｘｏＶＩＩ−制限酵素処理］
ハイブリッド形成は、４０％ホルムアルデヒド（脱イオン化原液より）、０．３７５ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液において、コット値１から２０で実施された。ハイブリッド形成は、４２℃の乾燥オーブン中で１４時間実施された。ハイブリッド形成後、容量２．５倍の無水エタノールを添加して試料を沈殿させ、氷上で３０分間インキュベーションした。次に、試料を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、７０％エタノールで２回洗浄した；ハイブリッドを氷上の９０μｌの水に再懸濁した。
【００９８】
エキソヌクレアーゼＶＩＩ処理：ハイブリッド形成していない一本鎖ＤＮＡを分解するためのもので、１０ＸＬ緩衝液（タカラ）と０．５μｌの酵素を加えることにより実施した。反応混合物を３７℃で４０分間インキュベーションした。後に残ったハイブリッドをプロテイナーゼＫで処理し、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムを用いて抽出し、５ＭのＮａＣｌを用いてエタノール沈殿させた。試料を８５μｌのＴＥに溶解した。５μｌの試料を用いて、Ｓ１ヌクレアーゼをチェックした。０．５μｌの１０ＸＳ１緩衝液（３００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５ｍＭ  ＺｎＳＯ４）（タカラ）を試料に加え、緩衝液−試料混合物から２μｌを取り出し、ＤＥ８１濾紙（ホワットマン）に載せ、放射活性をチェックした（標準法）。その後、２μｌの酵素Ｓ１（３０Ｕ）を加え、３７℃で３０分間インキュベーションし、２μｌを取り出し、ＤＥ８１濾紙（ホワットマン）に載せ、Ｓ１感受性率を計算した（Ｃａｒｎｉｎｃｉ  ａｎｄ  Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９；３０３：１９−４４）。制限酵素消化を、２μｌのＨａｐＩＩと１．５μｌのＨｐｙＣＨ４１Ｖを反応混合物（試料８０μｌ、１０Ｘ１緩衝液１０μｌ、ＢＧＳＡμｌ）に添加することにより実施した。３７℃で２時間インキュベーション後、２μｌのＮａＣｌ（５Ｍ）と１．５μｌのＡｃｉＩを加え、インキュベーションを更に２時間続けた。３つの制限酵素全てが同じＣＧ５’突出部を生じ、これは更にリンカー結合に使用される。具体例において使用される３つの制限酵素は、断片末端で同じクローニング部位を提供し、具体例に例示されている同じリンカーに直接結合できる様に選択された。しかし、本発明は、これらの酵素の使用に限定されない。なぜならば、他のあらゆる制限酵素と共に、他のあらゆる４ｂｐ切断制限酵素、または他のあらゆる４ｂｐ切断制限酵素の組み合わせ、または１つ以上の４ｂｐ切断制限酵素の他のあらゆる組み合わせが利用できるからである。具体例に使用されている以外の制限酵素を使用する場合、リンカーのクローニング部位は変更されなくてはならず、あるいは、ＤＮＡ切断により得られる付着末端は、平滑末端に転換されなくてはならない。このようなリンカーの変更または、一本鎖突出部の転換は、分子生物学の技術に精通する者にとって公知の標準技術により実施できる。消化されたｃＤＮＡハイブリッドは、プロテイナーゼＫにより処理し、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムにより抽出し、５ＭのＮａＣｌを用いてエタノール沈殿させた。
【００９９】
［第３部：  捕捉−遊離］
次のステップは、ビオチン化ランダムＮ’２５ｍｅｒオリゴヌクレオチド（インビトロゲン）を使用して、ハイブリッド形成していない選択的スプライシングを行ったエキソンループ（不対領域とも呼ばれる）を捕捉するために実施された。まず、ＭＰＧ−ストレプトアビジン磁気ビーズ（ＣＰＧ社）を前処理した：５００μｌの磁気ビーズ、５μｌのｔＲＮＡ（２０μｇ／μｌ）を氷上で時々混合しながら約３分間インキュベーションした。１ＸＣＴＡＢ緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣＴＡＢ（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド，Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５）で３回洗浄し、５００μｌの１ＸＣＴＡＢ緩衝液、５μｌのｔＲＮＡ（２０μｇ／μｌ）を加えた。捕捉−遊離は、Ｎ’２５ｍｅｒランダムオリゴヌクレオチドを用いて実施し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇＬａｂ．Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  ｐｒｓｓ，１９８９）、５μｌ（５μｇ）をまず９４℃で３０秒間インキュベーションした。それを氷上に置き、５μｇのｃＤＮＡ（ハイブリッド形成した）を氷上の混合物に加えた。次に、３７℃で３分間、室温の同容量の２ＸＣＴＡＢ緩衝液（０．４２Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣＴＡＢ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を室温で加え、４５℃で２０分間インキュベーションした（インキュベーションは、３７℃で２０分間または室温で２０分間実施することも可能である）。インキュベーション後、試料を磁気ビーズ処理したｔＲＮＡ（シグマ）と混合し、室温で３０分間回転し、５００μｌのＴＭＡ緩衝液（３Ｍ）（テトラメチルアンモニウムクロライド，シツマ）（３Ｍ  ＴＭＡ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５）で４〜５回洗浄した。収量を推定するために、手順の前後に標識試料の放射線照射療法活性を測定した。５０μｌの０．２５Ｘ溶液は、０．５％ビオチンと共に４Ｍグアニジウムチオシアナート、０．５％ｎ−ラウリルサルコシン、２５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含み、３７℃で１０分間インキュベーションされた。上清を回収し、放射活性を再度測定した。ステップを８０％以上のｃＤＮＡハイブリッドが回収されるまで繰り返した。イソプロパノールを用いて試料を沈殿させ、遊離ビオチン化沈殿物を除去するために、セファデックスＧ−５０（アメルシャムファルマシア）を用いて２〜３回精製を行った。ここで捕捉遊離ステップを少なくとももう１回繰り返すことができる。
【０１００】
［第４部：  リンカー結合、ＰＣＲ、クローニング］
ＨｐａＩＩ、ＨｐｙＣＨ４１Ｖ、ＡｃｉＩによりＤＮＡハイブリッドを処理後生成された５’Ｃ／Ｇ突出部に結合できるＧＣ３’突出部と共に、Ｙ型リンカーがデザインされた。４０ｎｇ／μｌのＡＳＥＬ９。Ｙ型リンカーの２本の鎖は以下の通りである：
Up-5' AAAAAGCAGGCTCGAGTCGAGTCGACGAGAGAGGC（配列番号３）
Down 3' P-CGGCCTCTCTCGGATCCGAATTCACCCAGCTT（配列番号４）。
２．５μｌのリンカーが５μｌ（約２００ｎｇ）のＤＮＡに結合され、完全な反応のために以下の試薬：１０ＸＴ４リガーゼ緩衝液０．７５μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（共にＮＥＢ）、１μｌのＨ２０が添加され、１６℃で一晩インキュベーションされた。プロテイナーゼＫ処理、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムによる抽出、５Ｍ  ＮａＣｌを用いるエタノール沈殿を、結合ステップ後に実施した。試料を８μｌのＴＥに溶解し、電気泳動にかけた（２％ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース、タカラ）。上記ゲルの６０〜８０ｂｐの部分を（リンカー切除のために）切り出し、ゲル抽出キット（キアゲン）により精製し、ｃＤＮＡハイブリッドを回収するために、６０μｌの水を濾過装置に作用させた。ＰＣＲを行い、選択的スプライシングを実施したエキソンを含むハイブリッドのそれぞれの鎖を増幅した。反応は以下の条件で実施された：０．７５μｌの１０ｍＭプライマーＡＳＥＬ９−１
GTGTGTGCGGCCGCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCGAGTCGA（配列番号５）
７５μｌの１０ｍＭプライマーＡＳＥＬ９−２
CTTCTTGCGGCCGCACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGAATTCGGATC（配列番号６）
【０１０１】
総容量２０μｌ中に２ｍｌの１０ＸＥｘｔａｑ緩衝液（タカラ、日本）、４μｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）（タカラ、日本）、０．４μｌの*ｄＧＴＰ、５μｌの鋳型。以下の条件で反応混合物をＰＣＲサイクラー（ＧｅｎｅＡＭＰ９７００、アプライドバイオシステムズ）に加えた：９５℃で高温開始し、ＥｘＴａｑ（タカラ、日本）０．３μｌを加え、９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分を約４または８サイクル、クローニングのみを目的として二本鎖ＤＮＡを調整するために行った。本発明の別の実施例において、ＰＣＲ反応は２０サイクル実施でき、あるいは別の実施例においては、クローニングだけでなく、他の応用例にＰＣＲ産物を直接利用するために充分両のＰＣＲ産物を得るために３０から４０サイクル実施できる。プロテイナーゼＫ消化を行い、続いてフェノール／クロロホルムおよびクロロホルムを用いて抽出し（Ｃａｒｎｉｎｃｉ  ａｎｄ  Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９；３０３：１９〜４４）、試料を４０μｌのＴＥで溶解した。
【０１０２】
＜クローニング＞
クローニング部分には、ベクター調製（キアゲンキット、キアゲン社により消化および断片精製）、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩによるｃＤＮＡの制限消化および断片のベクター内へのクローニングが含まれた。ベクターｐＦＬＣ１（ｃａｒｎｉｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００１，Ｖｏｌ．７７，（１−２）：７９〜９０）は、総容量１００μｌで１０μｌの１０×ＳａｌＩ緩衝液（全てＮＥＢ）と１０μｌの１０×ＢＳＡを用いて、１μｌのＳａｌＩと１μｌのＢａｍＨＩにより二重消化し、３７℃で１時間インキュベーションした。プロテイナーゼＫ処理後、フェノール／クロロホルムとクロロホルムで抽出し、５ＭのＮａＣｌを用いてエタノール沈殿させ、ベクターの線状断片を１００μｌに溶解し、電気泳動にかけた（０．８％ＮｕＳｉｅｖｅ）。ＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ゲル抽出キット（キアゲン）により精製した。ベクターを１００μｌの水に溶解した。ＰＣＲ産物の消化も、総容量１００μｌで１０μｌの１０×ＳａｌＩ緩衝液（全てＮＥＢ）と１０μｌの１０×ＢＳＡを用いて、１μｌのＳａｌＩと１μｌのＢａｍＨＩにより実施し、３７℃で１時間インキュベーションした。プロテイナーゼＫ処理後、フェノール／クロロホルムとクロロホルムで抽出し、５ＭのＮａＣｌを用いてエタノール沈殿させ、ベクターの線状断片を１００μｌに溶解し、電気泳動にかけた（０．８％ＮｕＳｉｅｖｅ）。二量体が存在する可能性のある場所をゲルから切り出し、ゲル抽出キット（キアゲン）により精製した。ベクターを１００μｌの水に溶解した。
【０１０３】
次に、試料とベクターを混合し、９９％エタノールで沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで１回洗浄し、乾燥させた。その後、ペレットをＴ４連結反応混合物（タカラ）で直接溶解し、１６℃で１２時間、次いで６５℃で５分間インキュベーションした。後に連結反応混合物を、エレクトロポレーションによりＤＨ１０Ｂ大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。
【０１０４】
＜クローン分離と配列分析＞
力価チェック後、クローンを市販のピッキングマシン（Ｑ−ｂｏｔおよびＱ−ｐｉｘ；ジネティクス、英国）で収集し、３８４−ミクロウェルプレートに移した。プラスミドを調製するために重複プレートを使用した。３８４ウェルプレートのそれぞれから得られるベクターＤＮＡを含む大腸菌クローンを、４つの９６ディープウェルプレートに分けて、増殖させた。一晩増殖後、プラスミドを手動（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２５：１３１５〜１３１６）または自動（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．９：４６３〜４７０）で抽出した。挿入断片の品質を、ＰｖｕＩＩで個々のクローンを消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にかけてチェックした。配列は、典型的には、Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０００  Ｎｏｖ；１０（１１）により説明されている様な標準配列決定方法に従って、ＲＩＳＡ配列決定装置（島津，日本）にかけるか、またはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ３７７を使用した。
【０１０５】
＜配列決定の結果＞
上記の実験により、合計４６，１５９のクローンを得ることが可能となった。全てのクローンの挿入断片を、Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｖ；１０（１１）Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０００により説明されている配列ライン法を用いて配列決定した。それによって、３７，１５０のクローンから、マウスゲノムに対する挿入断片の同定とマッピングがなされた。残りのデータは、主にサイズが小さいため（＞＝９５％＞＝１００ｂｐ）、位置の特定は困難であった。後に、３７，１５０のクローン全てがその配列由来に基づき６，０５２のグループに編成され（各グループには少なくとも、２つのクローンが含まれた）、これは選択的エキソン変異型の同定により合計４６７のサブグループに分けられた。
【０１０６】
［具体例２］
＜挿入断片のＰＣＲ増幅＞
本具体例は、プライマーＴ３ＧＷ１とＴＴ７ＧＷ２の代わりに、第１部のラムダ−ＦＬＣＩＩの以下のＴ３ＧＷ２とＴ７ＧＷ１ＰＣＲプライマーをそれぞれ用いてＰＣＲが実施された点が異なるが、具体例１と同様に実施された。
プライマーＴ３ＧＷ２：
GAGAGAGAGAATTAACCTCACTAAGGGACCACTTTGTACAAGAAAGC（配列番号７）
およびＴ７ＧＷ１：
GAGAGAGAGTAATACGACTCACTATGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGC（配列番号８）
【０１０７】
［具体例３］
本具体例は、具体例１と同様に実施したが、その第４部に違いがある。
【０１０８】
クローニングを以下の様に実施した。
【０１０９】
Ｔ４リガーゼによる１６℃で一晩ＣｌａＩ（タカラ、日本）により消化されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ（ストラタジーン、米国）への結合、エタノール沈殿、ＤＨ１０Ｂへのエレクトロポレーションのために５μｌ  １μｌ使用、ＰｖｕＩＩによる力価チェック挿入断片品質チェック、配列決定。上記全ステップを具体例１と同様に実施した。
【０１１０】
［具体例４］
メラノサイトおよびメラノーマの様な、選択的スプライシングの比較分析に利用される全長ｃＤＮＡライブラリーを３８４ウェルプレートに配列し（Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０００  Ｎｏｖ；１０（１１）：１７５７〜７１）、クローンをナイロン膜に移す（Ｇｒｅｓｓ  ＴＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ．１９９２；３（１１）：６０９−１９）。Ｇｒｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．において説明されている様に、その様なオリゴヌクレオチドの選択的スプライシングにより得られた情報をハイブリッド形成プローブとして使用する。シグナルが陽性のコロニーを回収し、全長の情報と選択的スプライシングされたｃＤＮＡの天然クローンを得るために、完全挿入断片配列決定に供する（Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００２  Ｄｅｃ  ５；４２０（６９１５）：５６３−５７３）。
【０１１１】
［具体例５］
メラノサイトおよびメラノーマの様な、選択的スプライシングの比較分析に利用される全長ｃＤＮＡライブラリーを３８４ウェルプレートに配列し（Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０００  Ｎｏｖ；１０（１１）：１７５７−７１）、続いて５’末端および／または３’末端の配列決定を行う。ｃＤＮＡを分類後（Ｋｏｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００１  Ｆｅｂ；１１８２）：２８１−９）、完全に配列決定されたｃＤＮＡクローンまたはゲノムに対し配列比較（アライン）した（Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ．２００２  ｄｅｃ；４２０（６９１５）：５６３〜５７３）。説明されている様に（Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ．２００２  Ｄｅｃ  ５；４２０（６９１５）：５６３〜５７３）、選択的スプライシングの検出が所望の全長ｃＤＮＡライブラリーの５’末端および／または３’末端配列と共に、全長のゲノムを転写単位の中に配列比較した。次に、ｃＤＮＡの部分を含む具体例１〜３で得られた情報を、前に得られた転写単位と配列比較するために使用した。このマッピングにより、我々は具体例１〜３のｃＤＮＡの選択的スプライシングに対応する全長ｃＤＮＡの候補をリストアップすることができた。
【０１１２】
候補クローンのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ同定後、候補ｃＤＮＡをピックアップし、説明されている様に（Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ．２００２  ｄｅｃ；４２０（６９１５）：５６３〜５７３）完全挿入断片配列決定に供し、選択的スプライシングが行われた全長ｃＤＮＡが更なる機能研究のために得られた。
【０１１３】
［具体例６］
メラノサイトおよびメラノーマの様な、選択的スプライシングの比較分析に利用される全長ｃＤＮＡライブラリーをプラスミドＤＮＡ（Ｃａｒｉｃｉｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００１  Ｓｅｐ；７７（１−２）：７９〜９０）、次に一本鎖ＤＮＡ（Ｂｏｎａｌｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９６  Ｓｅｐ；６（９）：７９１〜８０６）の中に転換した。遺伝情報を用いて、選択的スプライシングが行われたｃＤＮＡ（具体例１〜３の様に）に対応するビオチン化オリゴヌクレオチド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を調製した。その後、製造者の指示に従ってＧｅｎｔｒａｐキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に説明されているように、一本鎖ｃＤＮＡとビオチン化オリゴヌクレオチドを混合し、ハイブリッド形成させた。あるいは次に目的のライブラリー由来の選択的スプライシング全長ｃＤＮＡを回収し、アガロースで平板培養後（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ）、コロニーを取り出し、１回の配列決定を行い（Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０００  Ｎｏｖ；１０（１１）：１７５７−７１）、次にクローンを完全挿入断片配列決定に供し（Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ．２００２  ｄｅｃ；４２０（６９１５）：５６３〜５７３）、選択的スプライシングが行われた全長ｃＤＮＡが得られた。
【０１１４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｍＲＮＡスプライシングプロセスの原理を示す。
【図２】本発明の方法に含まれるステップの大要を示す。
【図３】鎖特異的ハイブリッド形成プローブの調製を示す。
【図４】ＰＣＲ産物の調製を示す。
【図５】試料特異的一本鎖ＤＮＡ合成を示す。
【図６】試料特異的一本鎖ＤＮＡ分子のハイブリッド形成を示す。
【図７】エキソヌクレアーゼＶＩＩとのハイブリッド形成産物のインキュベーションを示す。
【図８】４ｂｐ切断制限酵素とのハイブリッド形成産物のインキュベーションを示す。
【図９】ビオチン化およびランダムオリゴヌクレオチドによるループ構造（不対領域）の捕捉を示す。
【図１０】Ｙ型様非対称リンカーの構造を示す。
【図１１】Ｙ型様非対称リンカーを用いるリンカー結合を示す。
【図１２】試料分析のためのベクターへのクローニングを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【外国語明細書】
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