(57)【要約】  【課題】本発明は、蛍光強度等の変化を指標として基板の蛍光強度等を測定するだけで酵素活性を検出することができ操作性に優れ、また、微量の検体溶液でも酵素活性の検出を行うことができるとともに検体溶液を注入するセル等を形成する必要がなく検出部の集積度を飛躍的に高めることができる酵素活性検出用基板を提供することを目的とする。  【解決手段】本発明の酵素活性検出用基板は、基板と、前記基板に直接結合した、又は、前記基板に一端が固定化された第１化合物を介して前記基板に結合した第１蛍光基と、前記第１蛍光基と酵素によって切断されるペプチド結合で結合した第２化合物と、を備える。  【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、前記基板に直接結合した、又は、前記基板に一端が固定化された第１化合物を介して前記基板に結合した第１蛍光基と、前記第１蛍光基と酵素によって切断されるペプチド結合で結合した第２化合物と、を備えていることを特徴とする酵素活性検出用基板。
【請求項２】
基板と、前記基板に一端が固定化された第３化合物の側鎖に導入され前記第３化合物を介して前記基板に結合した、又は、第４化合物と結合し前記基板に直接結合した第２蛍光基と、前記第３化合物又は前記第４化合物と酵素によって切断されるペプチド結合で結合した第５化合物と、前記第５化合物に結合し前記第２蛍光基と蛍光共鳴エネルギー移動がみられる第３蛍光基と、を備えていることを特徴とする酵素活性検出用基板。
【請求項３】
基板と、前記基板に一端が固定化された第６化合物と、前記第６化合物に導入された第４蛍光基と、前記第４蛍光基に結合した第７化合物と、前記第７化合物と酵素によって切断されるペプチド結合で結合した第８化合物と、前記第８化合物に結合し前記第４蛍光基と蛍光共鳴エネルギー移動がみられる第５蛍光基と、を備えていることを特徴とする酵素活性検出用基板。
【請求項４】
前記第５化合物又は前記第８化合物が、前記第４化合物又は前記第７化合物と前記酵素によって切断されるペプチド結合で結合しているのに代えて、前記第４化合物が前記第２蛍光基と前記酵素によって切断されるペプチド結合で結合している、又は、前記第７化合物が前記第４蛍光基と前記酵素によって切断されるペプチド結合で結合していることを特徴とする請求項２又は３に記載の酵素活性検出用基板。
【請求項５】
前記第２化合物、前記第５化合物、前記第８化合物の末端基、及び／又は、前記第３化合物の側鎖に導入された前記第２蛍光基が、アセチル化されていることを特徴とする請求項１乃至４の内いずれか１に記載の酵素活性検出用基板。
【請求項６】
請求項１乃至５の内のいずれか１に記載の酵素活性検出用基板に酵素を含む検体溶液を接触させ反応させる工程と、前記酵素活性検出用基板の蛍光測定を行う工程と、を備えていることを特徴とする酵素活性の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性を検出する酵素活性検出用基板及びそれを用いた酵素活性の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、病理学的診断などの医学的分野やプロテオーム解析等の研究的分野の発展に伴って、複数の酵素の活性を検出する必要性が生じており、酵素の活性を吸収光、蛍光等を用いて溶液中で測定する技術が種々研究されている。
例えば、（特許文献１）には、「タンパク質分解酵素の１種であるカスパーゼが特異的に切断する基質ペプチドの両端を、蛍光共鳴エネルギー移動が起こる蛍光基で修飾した蛍光プローブ」が記載されている。
【特許文献１】特開２０００−３１６５９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら上記従来の技術においては、以下のような課題を有していた。
（１）（特許文献１）に開示の技術は、溶液中に入れた蛍光プローブの基質ペプチドが酵素によって切断された結果、基質ペプチドの両端の蛍光基が蛍光共鳴エネルギーを起こし蛍光波長や蛍光強度が変化するので、これを測定することによって酵素活性を検出するものである。酵素活性の測定としては、蛍光測定用マイクロプレートに形成された開口部を有するセルに検体溶液を注入し、プレートリーダ上で蛍光を同時並行測定することにより高速測定を行う方法がある。この方法に用いる蛍光測定用マイクロプレートのセルの開口部の開口面積は、溶液を注入できるだけの十分な大きさに形成する必要がある。近年の医学的分野や研究的分野の発展に伴って、研究効率等を高めるために複数の酵素の活性を可能な限り高速で、かつ少量のサンプルで測定する必要性が増しており、蛍光測定用マイクロプレートのセルサイズを可能な限り小さくするとともにセルの数を増やす必要性が増している。しかしながら、原理的に検体溶液のセルサイズに限界があり、現行では９６穴等のミリメートルサイズのセルを有するマイクロプレート上での測定が可能であるにすぎないという課題を有していた。
（２）そのため、蛍光測定を行う際にはマイクロプレートの交換に時間を要し、測定効率を高めることができず測定に時間を要するという課題を有していた。
【０００４】
本発明は上記従来の課題を解決するもので、蛍光強度等の変化を指標として基板の蛍光強度等を測定するだけで酵素活性を検出することができ操作性に優れ、また、微量の検体溶液でも酵素活性の検出を行うことができるとともに検体溶液を注入するセル等を形成する必要がなく検出部の集積度を飛躍的に高めることができる酵素活性検出用基板を提供することを目的とする。
また、本発明は、微量の検体溶液でも酵素活性の検出を行うことができ、また検出感度を高くできるとともに測定時間を短縮化することができ作業性を高め測定効率を高めることができ、さらに種類の異なるペプチド等の各々に蛍光基が結合した酵素活性検出用基板を用いることで複数の酵素を含む検体溶液の酵素活性を短時間で測定できる酵素活性の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記従来の課題を解決するために本発明の酵素活性検出用基板及びそれを用いた酵素活性の検出方法は、以下の構成を有している。
本発明の請求項１に記載の酵素活性検出用基板は、基板と、前記基板に直接結合した、又は、前記基板に一端が固定化された第１化合物を介して前記基板に結合した第１蛍光基と、前記第１蛍光基と酵素によって切断されるペプチド結合で結合した第２化合物と、を備えた構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）基板に結合した第１蛍光基と、第１蛍光基に酵素によって切断されるペプチド結合で結合した第２化合物とを備えているので、酵素と反応させてペプチド結合の切断が起こると第２化合物が遊離される。第２化合物が遊離した第１蛍光基の蛍光波長又は所定の波長における蛍光強度は第２化合物とペプチド結合した第１蛍光基とは異なるので、蛍光強度等の変化を指標として酵素活性を検出することができる。
（２）基板に蛍光基が結合しているので、酵素を含む極微量の検体溶液を接触させ基板の蛍光強度等を測定するだけで酵素活性を検出することができ、酵素活性を検出できる検出部の集積度を飛躍的に高めることができる。
（３）酵素を含む極微量の検体溶液を接触させるだけで酵素活性を検出することができるので、測定の際に多量の検体溶液を必要とせず、微量の検体溶液でも酵素活性の検出を行うことができる。
【０００６】
ここで、基板としては、ペプチド結合を形成するための縮合反応に用いられるクロロホルム，ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，ジメチルスルホキシド等の極性有機溶媒、ジオキサン，テトラヒドロフラン等のエーテル類、メタノール，エタノール等のアルコール類、ピリジン等の溶媒に不溶性の合成樹脂（ポリスチレン等）製やガラス製等で平板状や球面等の湾曲面状等に形成されたものが用いられる。ミモートプス社製ランタンシリーズ（登録商標）等の市販の固相有機合成用担体も用いることができる。
【０００７】
第１化合物や第２化合物としては、アミノ酸、２個以上のアミノ酸がペプチド結合したペプチド等が用いられる。
第１化合物や第２化合物は、Ｃ末端のアミノ酸を基板上に固定しペプチドをＣ末端から伸長していく固相法等の通常のペプチド合成法を用いて合成することができる。また、目的とするアミノ酸配列のＣ末端側からＮ末端側へ逐次伸長していく逐次伸長法や、複数の短いペプチド断片を合成しペプチド断片間のカップリングにより伸長させる断片縮合法等を用いることができる。また、ペプチド合成機を用いて９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸やｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）アミノ酸等を導入して合成することもできる。さらに、プロテアーゼを用いてペプチド結合を生成したり、遺伝子工学を利用して合成することもできる。
【０００８】
第１化合物や第２化合物においてペプチド結合を形成するための縮合方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、ＤＣＣ−アディティブ法、活性エステル法、カルボニルジイミダゾール法、酸化還元法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法等が用いられる。
縮合反応を行う前に、公知の手段により、アミノ酸やペプチド中の反応に関与しないカルボキシル基，アミノ基等を保護したり、また反応に関与するカルボキシル基，アミノ基を活性化することもできる。
【０００９】
第１化合物としては、酵素によって切断されないアミド結合，エステル結合，エーテル結合，チオエーテル結合，ウレタン結合等によって基板と結合し、検体溶液内の酵素で切断されないようなアミノ酸やアミノ酸配列のペプチド等の化合物が用いられる。第１化合物が酵素によって切断されないようにすることにより、第１化合物を介して基板に結合した第１蛍光基が酵素の作用によって基板から遊離し、蛍光強度等に変化が生じた第１蛍光基が検体溶液内を漂うのを防止するためである。
【００１０】
第１蛍光基としては、第１蛍光基と第２化合物とのペプチド結合が酵素によって切断される前後において、蛍光波長や蛍光強度に変化が生じるものが用いられる。特に、第２化合物とペプチド結合したときは特定波長領域において非蛍光物質であり、ペプチド結合が切断されて第２化合物が遊離したときに該特定波長領域において蛍光を発する蛍光基、例えば、４−メチルクマリル−７−アミド（ＭＣＡ）、７−アミノ−４−カルボキシメチルクマリン（ＡＣＣ）、ｐ−ニトロアニリド、α−ナフチルアミド、α−ナフチルエステル等が好適に用いられる。
第１蛍光基と結合する第２化合物のアミノ酸は、酵素によってＣ末端側のペプチド結合が選択的に切断されるものが用いられる。これにより、第１蛍光基と結合していた第２化合物を遊離させて第１蛍光基の特定波長領域における蛍光強度を変化させることができるからである。
また、第２化合物を所定の長さ（例えば１５Å程度）以上のペプチド鎖で形成することにより、個々のアミノ酸に対する基質特異性が高くなく、むしろ比較的長いペプチド鎖を切断作用に必要とするエラスターゼ等の酵素の検出もできるようにすることができ、検出できる酵素の種類を増やすことができる。
【００１１】
酵素としては、トリプシン，キモトリプシン，トロンビン，プラスミン，カリクレイン，ウロキナーゼ，エラスターゼ等のセリンプロテアーゼ、ペプシン，カテプシンＤ，レニン，キモシン等のアスパラギン酸プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ，Ｂ，コラゲナーゼ，サーモリシン等のメタロプロテアーゼ、カテプシンＢ，Ｈ，Ｌ，カルパイン等のシステインプロテアーゼ等の内部のペプチド結合を切断するエンドペプチダーゼ、血液凝固系プロテアーゼ、捕体系プロテアーゼ、ホルモンプロセシング酵素等が用いられる。
【００１２】
本発明の請求項２に記載の酵素活性検出用基板は、基板と、前記基板に一端が固定化された第３化合物の側鎖に導入され前記第３化合物を介して前記基板に結合した、又は、第４化合物と結合し前記基板に直接結合した第２蛍光基と、前記第３化合物又は前記第４化合物と酵素によって切断されるペプチド結合で結合した第５化合物と、前記第５化合物に結合し前記第２蛍光基と蛍光共鳴エネルギー移動がみられる第３蛍光基と、を備えた構成を有している。
この構成により、請求項１に記載の作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）第３化合物又は第４化合物と結合し基板に結合した第２蛍光基と、第３化合物又は第４化合物と酵素によって切断されるペプチド結合で結合した第５化合物と、第５化合物に結合し第２蛍光基と蛍光共鳴エネルギー移動がみられる第３蛍光基と、を備えているので、酵素によってペプチド結合が切断されると第２蛍光基と第３蛍光基との距離が離れることにより蛍光共鳴エネルギー移動が起こらなくなり、第２蛍光基（又は第３蛍光基）からの蛍光スペクトルから第３蛍光基（又は第２蛍光基）からの蛍光スペクトルへのスペクトル変化を酵素活性の測定指標にすることができ、これにより、蛍光強度等の変化を指標として酵素活性を検出することができる。
（２）第２蛍光基と第３蛍光基を選択することにより、第２蛍光基の蛍光波長を可視部領域に設定することが可能になるので、市販のＣＣＤカメラ等の可視光検出装置を用いて測定することが可能になり汎用性に優れる。
（３）第５化合物を所定の長さ（例えば１５Å程度）以上のペプチド鎖で形成することにより、個々のアミノ酸に対する基質特異性が高くなく、むしろ比較的長いペプチド鎖を切断作用に必要とするエラスターゼ等の酵素の検出もできるようにすることができ、検出できる酵素の種類を増やすことができるとともに検出感度を高めることができる。
【００１３】
ここで、蛍光共鳴エネルギー移動とは、ある２つの蛍光化合物が距離的に近い位置に存在するとき、その２つの蛍光化合物のうちの一方（ドナーという）の蛍光スペクトルと他方（アクセプターという）の励起スペクトルとが重なりをもつ場合、ドナーの励起波長のエネルギーを当てると本来観察されるはずのドナーの蛍光が減衰し、代わりにアクセプターの蛍光が観察される現象をいう。
【００１４】
ここで、第２蛍光基や第３蛍光基としては、蛍光共鳴エネルギー移動が起こるドナーとアクセプターの組合せを用いることができる。例えば、第２蛍光基（又は第３蛍光基）の蛍光波長と重なる波長域に吸収帯をもつ原子団である第３蛍光基（又は第２蛍光基）等が用いられる。具体的には、（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル（ＭＯＡｃ），アントラニロイルベンジル（ＡＢｚ），Ｎ−メチルアントラニル酸（Ｎｍａ）等とジニトロフェニル（Ｄｎｐ）の組合せ、DabsylとEDANS（5−（2'-アミノエチル）アミノナフタレン−1−スルホン酸）の組合せ、トリプトファン（Ｔｒｐ）と５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホン酸（Ｄｎｓ）の組合せ、カルボキシジクロロフルオレセイン（ＣＤＣＦ）とカルボキシメチルローダミン（ＣＴＭＲ）の組合せ、カルボキシジクロロフルオレセイン（ＣＤＣＦ）とカルボキシＸ−ローダミン（ＣＸＲ）の組合せ、ルシファーイエロー（ＬＹ）とカルボキシメチルローダミン（ＣＴＭＲ）の組合せ等が用いられる。
これらのドナーやアクセプターのいずれが第２蛍光基になっても第３蛍光基になっても構わない。第２蛍光基にスペクトル変化が生じれば酵素活性の測定指標にすることができるからである。
【００１５】
なお、第２蛍光基が基板に直接結合する場合は、第２蛍光基は、複数の反応点を有するトリプトファン（Ｔｒｐ）等が用いられ、第４蛍光基は、それと蛍光共鳴エネルギー移動が起こる５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホン酸（Ｄｎｓ）等が用いられる。第２蛍光基は、基板及び第４化合物と結合する必要があるからである。
【００１６】
第３化合物や第４化合物としては、請求項１で説明した第１化合物と同様のものなので、説明を省略する。また、第５化合物としては、請求項１で説明した第２化合物と同様のものなので、説明を省略する。
【００１７】
なお、第３化合物又は第４化合物と第５化合物に各々結合した第２蛍光基と第３蛍光基の結合部間の長さは、１００Å以下であることが望ましい。第２蛍光基と第３蛍光基との結合部間の距離が長くなるにつれ蛍光共鳴エネルギー移動が小さくなり蛍光強度等の変化が小さくなる傾向がみられ、１００Åより長くなるとこの傾向が著しく蛍光強度の変化が著しく小さくなり感度が低下するからである。
【００１８】
本発明の請求項３に記載の酵素活性検出用基板は、基板と、前記基板に一端が固定化された第６化合物と、前記第６化合物に導入された第４蛍光基と、前記第４蛍光基に結合した第７化合物と、前記第７化合物と酵素によって切断されるペプチド結合で結合した第８化合物と、前記第８化合物に結合し前記第４蛍光基と蛍光共鳴エネルギー移動がみられる第５蛍光基と、を備えた構成を有している。
この構成によって、請求項１又は請求項２に記載の作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）第６化合物を所定の長さのペプチド等で形成することにより、基板と酵素作用点（第７化合物と第８化合物との間のペプチド結合）との距離を適正化して、基板の影響を受けずに酵素を作用させることができ酵素活性をより正確に検出することができ検出感度を高め、さらに、個々のアミノ酸に対する基質特異性が高くなく、むしろ比較的長いペプチド鎖を切断作用に必要とするエラスターゼ等の酵素の検出もできるようにすることができ、検出できる酵素の種類を増やすことができる。
【００１９】
ここで、第４蛍光基としては、複数の反応点を有し、第６化合物の側鎖や末端等に導入されるトリプトファン（Ｔｒｐ）等が用いられ、第５蛍光基としては、トリプトファン等と蛍光共鳴エネルギー移動が起こる５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホン酸（Ｄｎｓ）等が用いられる。第４蛍光基は、第６化合物及び第７化合物と結合する複数の反応点が必要だからである。
【００２０】
第６化合物としては、請求項１で説明した第１化合物と同様のものなので、説明を省略する。また、第７化合物、第８化合物としては、請求項１で説明した第２化合物と同様のものなので説明を省略する。
【００２１】
なお、第７化合物と第８化合物に各々結合した第４蛍光基と第５蛍光基の結合部間の長さは、請求項３で説明したのと同様に１００Å以下であることが望ましい。
【００２２】
本発明の請求項４に記載の発明は、請求項２又は３に記載の酵素活性検出用基板であって、前記第５化合物又は前記第８化合物が、前記第４化合物又は前記第７化合物と前記酵素によって切断されるペプチド結合で結合しているのに代えて、前記第４化合物が前記第２蛍光基と前記酵素によって切断されるペプチド結合で結合している、又は、前記第７化合物が前記第４蛍光基と前記酵素によって切断されるペプチド結合で結合している構成を有している。
この構成によって、請求項２又は３で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）第４化合物又は第７化合物が第２蛍光基又は第４蛍光基と酵素によって切断されるペプチド結合で結合しているので、第４化合物と第５化合物等は検体溶液内の酵素で切断されないようなアミノ酸で配列させることができ設計の自由度を高めることができる。
【００２３】
ここで、第２蛍光基と結合する第４化合物のアミノ酸や第４蛍光基と結合する第７化合物のアミノ酸は、酵素によってＣ末端側のペプチド結合が選択的に切断されるものが用いられる。これにより、第２蛍光基や第４蛍光基と結合していた第４化合物や第７化合物を酵素によって切断して遊離させ、第５化合物に結合した第３蛍光基と第２蛍光基、第８化合物に結合した第５蛍光基と第４蛍光基との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こらないようにして、第２蛍光基や第４蛍光基の蛍光強度等を変化させることができる。
【００２４】
本発明の請求項５に記載の発明は、請求項１乃至４の内いずれか１に記載の酵素活性検出用基板であって、前記第２化合物、前記第５化合物、前記第８化合物の末端基、及び／又は、前記第３化合物の側鎖に導入された前記第２蛍光基が、アセチル化された構成を有している。
この構成により、請求項１乃至４の内いずれか１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）第２化合物、第５化合物等の末端基や、第３化合物の側鎖に導入された第２蛍光基がアセチル化されているので、Ｎ末端のペプチド結合に作用するアミノペプチダーゼ等のエキソペプチダーゼの活性を著しく低下させることができ、検体溶液中にこれらの酵素が含まれている場合でも基質特異性の高いエンドペプチダーゼ等の酵素活性を正確に検出することができる。
【００２５】
ここで、第２化合物又は第３化合物のペプチドの末端基や第３化合物の側鎖に導入されたトリプトファン等の第２蛍光基のＮ末端等をアセチル化するアセチル化剤としては、酢酸無水物，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアセテート等を用いることができる。
【００２６】
本発明の請求項６に記載の酵素活性の検出方法は、請求項１乃至５の内のいずれか１に記載の酵素活性検出用基板に酵素を含む検体溶液を接触させ反応させる工程と、前記酵素活性検出用基板の蛍光測定を行う工程と、を備えた構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）酵素を含む極微量の検体溶液を基板に接触させた後、基板の蛍光強度等を測定するだけで酵素活性を検出することができるので、測定時間を短縮化することができ作業性を高め測定効率を高めることができる。
（２）酵素を含む極微量の検体溶液を接触させるだけで酵素活性を検出することができるので、測定の際に多量の検体溶液を必要とせず、微量の検体溶液でも酵素活性の検出を行うことができる。
（３）蛍光測定によって酵素活性を検出するので、検出感度と測定精度を高めることができる。
（４）種類の異なるペプチド等の各々に蛍光基が結合した酵素活性検出用基板を用い、イメージセンサ等で広範囲の画像解析を行うことにより、複数の酵素を含む検体溶液の酵素活性を短時間で網羅的に測定し解析することができ測定効率を飛躍的に高めることができる。
【００２７】
ここで、酵素を含む検体溶液としては、酵素が活性を発現するようなｐＨに調整されたものが用いられる。このｐＨ調整剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ等の緩衝剤を反応バッファーとして添加することができる。また、酵素活性の発現に必要な塩類や活性保護剤を添加することもできる。
【発明の効果】
【００２８】
以上のように、本発明の酵素活性検出用基板及びそれを用いた酵素活性の検出方法によれば、以下のような有利な効果が得られる。
請求項１に記載の発明によれば、
（１）第２化合物が遊離した第１蛍光基の蛍光波長又は所定の波長における蛍光強度は第２化合物とペプチド結合した第１蛍光基とは異なるので、蛍光強度等の変化を指標として酵素活性を検出することができる汎用性に優れた酵素活性検出用基板を提供することができる。
（２）基板に蛍光基が結合しているので、酵素を含む極微量の検体溶液を接触させ基板の蛍光強度等を測定するだけで酵素活性を検出することができ、検出部の集積度を飛躍的に高めることができ、検体溶液を注入するためのセル等を形成することなく第１蛍光基を結合させただけの平板状等で、例えば縦２ｃｍ横３ｃｍの大きさの基板上に１００００個以上の検出部を有する蛍光測定用マイクロプレートを実現することができる。
（３）酵素を含む極微量の検体溶液を接触させるだけで酵素活性を検出することができるので、測定の際に多量の検体溶液を必要とせず、微量の検体溶液でも酵素活性の検出を行うことができ操作性に優れた酵素活性検出用基板を提供することができる。
【００２９】
請求項２に記載の発明によれば、請求項１の効果に加え、
（１）酵素によってペプチド結合が切断されると第２蛍光基と第３蛍光基との距離が離れることにより蛍光共鳴エネルギー移動が起こらなくなり、第２蛍光基（又は第３蛍光基）からの蛍光スペクトルから第３蛍光基（又は第２蛍光基）からの蛍光スペクトルへのスペクトル変化を酵素活性の測定指標にすることができ、これにより、蛍光強度等の変化を指標として酵素活性を検出することができる汎用性に優れた酵素活性検出用基板を提供することができる。
（２）第２蛍光基と第３蛍光基を選択することにより、第２蛍光基の蛍光波長を可視部領域に設定することが可能になるので、市販のＣＣＤカメラ等の可視光検出装置を用いて測定することが可能になり汎用性に優れた酵素活性検出用基板を提供することができる。
（３）第５化合物を所定の長さ（例えば１５Å程度）以上のペプチド鎖で形成することにより、個々のアミノ酸に対する基質特異性が高くなく、むしろ比較的長いペプチド鎖を切断作用に必要とするエラスターゼ等の酵素の検出もできるようにすることができ、検出できる酵素の種類を増やすことができるとともに検出感度を高めることができる酵素活性検出用基板を提供することができる。
【００３０】
請求項３の発明によれば、請求項１又は２の効果に加え、
（１）基板と酵素作用点との距離を適正化して、基板の影響を受けずに酵素を作用させることができ酵素活性をより正確に検出することができ検出感度を高め、さらに、個々のアミノ酸に対する基質特異性が高くなく、むしろ比較的長いペプチド鎖を切断作用に必要とするエラスターゼ等の酵素の検出もできるようにすることができ、検出できる酵素の種類を増やすことができる酵素活性検出用基板を提供することができる。
【００３１】
請求項４に記載の発明によれば、請求項２又は３の効果に加え、
（１）第４化合物と第５化合物等は酵素特異性を有さないように配列させることができ設計の自由度を高めることができる酵素活性検出用基板を提供することができる。
【００３２】
請求項５に記載の発明によれば、請求項１乃至４の内いずれか１の効果に加え、
（１）Ｎ末端のペプチド結合に作用するアミノペプチダーゼ等のエキソペプチダーゼの活性を著しく低下させることができ、検体溶液中にこれらの酵素が含まれている場合でも基質特異性の高いエンドペプチダーゼ等の酵素活性を正確に検出することができる検出精度に優れた酵素活性検出用基板を提供することができる。
【００３３】
請求項６に記載の発明によれば、
（１）酵素を含む極微量の検体溶液を基板に接触させた後、基板の蛍光強度等を測定するだけで酵素活性を検出することができるので、測定時間を短縮化することができ作業性を高め測定効率を高めることができる酵素活性の検出方法を提供することができる。
（２）酵素を含む極微量の検体溶液を接触させるだけで酵素活性を検出することができるので、測定の際に多量の検体溶液を必要とせず、微量の検体溶液でも酵素活性の検出を行うことができる酵素活性の検出方法を提供することができる。
（３）蛍光測定によって酵素活性を検出するので、検出感度の高い酵素活性の検出方法を提供することができる。
（４）種類の異なるペプチド等の各々に蛍光基が結合した酵素活性検出用基板を用い、イメージセンサ等で広範囲の画像解析を行うことにより、複数の酵素を含む検体溶液の酵素活性を短時間で網羅的に測定し解析することができ測定効率を飛躍的に高めることができる酵素活性の検出方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明を実施するための最良の形態を、図面を参照しながら説明する。
（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１における酵素活性検出用基板の酵素活性検出原理を示す模式図である。
図中、１は実施の形態１における酵素活性検出用基板、２はハロゲン化炭化水素類，エステル類等の溶媒に不溶性の合成樹脂（ポリスチレン等）製やガラス製等で平板状や球面等の湾曲面状等に形成された基板、３は基板２にペプチド結合等で直接結合し後述する第２化合物４とのペプチド結合が後述する酵素５によって切断される前後において、蛍光波長や蛍光強度に変化が生じる蛍光基の１種である４−メチルクマリル−７−アミド（ＭＣＡ）等の第１蛍光基、４は第１蛍光基３と後述する酵素５によって切断されるペプチド結合で結合したアミノ酸，ペプチド等の第２化合物、５は第１蛍光基３と第２化合物４とのペプチド結合を選択的に切断するセリンプロテアーゼ等の基質特異性を有する酵素、６は酵素５によって選択的に第２化合物４が遊離されたことにより蛍光波長等が変化した第１蛍光基である。
【００３５】
以上のように構成された酵素活性検出用基板１は、アミノ酸のＣ末端を基板２上に固定しペプチドをＣ末端から伸長していく固相法等の通常のペプチド合成法、目的とするアミノ酸配列のＣ末端側からＮ末端側へ逐次伸長していく逐次伸長法、複数の短いペプチド断片を合成しペプチド断片間のカップリングにより伸長させる断片縮合法、ペプチド合成機を用いてＦｍｏｃ法、Ｂｏｃ法等を導入して合成する方法等を用いて合成することができる。
【００３６】
以上のように構成された実施の形態１の酵素活性検出用基板について、以下その酵素活性の検出原理を説明する。
図１（ａ）に示す酵素活性検出用基板１の４−メチルクマリル−７−アミド（ＭＣＡ）等の第１蛍光基３は特定波長領域において非蛍光物質であり蛍光を示さない。この酵素活性検出用基板１に酵素５を含む検体溶液を接触させ反応させると、基質特異性を有するセリンプロテアーゼ等の酵素５は、第１蛍光基３と第２化合物４との間のペプチド結合を選択的に切断する（図１（ｂ）参照）。
第２化合物４が遊離した第１蛍光基６は７−アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣ）等の蛍光物質となり、蛍光波長又は該特定波長領域における蛍光強度は、第２化合物４とペプチド結合した第１蛍光基３とは異なるので、蛍光強度等の変化を指標として酵素活性を検出することができる（図１（ｃ）参照）。
【００３７】
以上のように、実施の形態１における酵素活性検出用基板は構成されているので、以下のような作用が得られる。
（１）基板に蛍光基が結合しているので、これを検出部として酵素を含む極微量の検体溶液を接触させ所定時間後における基板の蛍光強度等を測定するだけで、酵素の作用を受けて修飾された分子の数に相当する蛍光強度等の変化を指標として酵素の量や酵素の種類等による酵素活性を検出することができ、基板に検体溶液を注入するセル等を形成する必要がなく検出部を微小化できるので、基板において検出部の集積度を飛躍的に高めることができる。
（２）酵素を含む極微量の検体溶液を接触させるだけで酵素活性を検出することができるので、測定の際に多量の検体溶液を必要とせず、微量の検体溶液でも酵素活性の検出を行うことができる。
【００３８】
なお、本実施の形態においては、第１蛍光基３が基板２に直接結合された場合について説明したが、基板２に結合したアミノ酸，ペプチド等の第１化合物に第１蛍光基３を結合させ、第１蛍光基３を第１化合物を介して基板２に結合させる場合もある。この場合も、実施の形態１で説明したのと同様に、第１蛍光基３には酵素５によって切断されるペプチド結合で第２化合物４を結合させる。これにより、基板２と酵素作用点（第１蛍光基３と第２化合物４との間のペプチド結合）との距離を適正化して、基板の影響を受けずに酵素を作用させることができ酵素活性をより正確に検出することができるという作用が得られる。なお、この場合、第１化合物は検体溶液内の酵素で切断されないような配列のペプチド等で合成する。第１化合物が酵素によって切断されないようにすることにより、第１化合物を介して基板２に結合した第１蛍光基３が酵素の作用によって基板から遊離し、酵素を接触させた前後において蛍光強度等に変化が生じた第１蛍光基３が検体溶液内を漂い、第１蛍光基３の基板２への結合箇所と、その箇所における蛍光強度等の変化との関係が不明確になるのを防止するためである。これにより、１枚の基板上に種類の異なるアミノ酸配列を有するペプチド等を複数箇所に結合させた酵素活性検出用基板に検体溶液を接触させれば、基板の蛍光強度等を測定するだけで酵素の種類によって異なる蛍光強度等のパターンが得られ、アミノ酸配列によって特徴付けられる酵素活性を検出することができる。
【００３９】
（実施の形態２）
図２は本発明の実施の形態２における酵素活性検出用基板の酵素活性検出原理を示す模式図である。なお、実施の形態１と同様のものは、同じ符号を付して説明を省略する。
図中、１０は実施の形態２における酵素活性検出用基板、１１は基板２に一端が固定化されたアミノ酸，ペプチド等の第３化合物、１２は第３化合物１１の側鎖に導入され後述する第３蛍光基１４と蛍光共鳴エネルギー移動がみられる（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル（ＭＯＡｃ），トリプトファン（Ｔｒｐ）等の第２蛍光基、１３は第３化合物１１と酵素５によって切断されるペプチド結合で結合したアミノ酸，ペプチド等の第５化合物、１４は第５化合物１３に結合したジニトロフェニル（Ｄｎｐ），５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホン酸（Ｄｎｓ）等の第３蛍光基である。第２蛍光基１２と第３蛍光基１４は互いに蛍光共鳴エネルギー移動がみられる距離（１００Å以下）で結合している。１５は第３蛍光基１４が結合した第５化合物１３が酵素５によって選択的に遊離されたことにより蛍光波長等が変化した第２蛍光基である。
【００４０】
以上のように構成された実施の形態２の酵素活性検出用基板について、以下その酵素活性の検出原理を説明する。
図２（ａ）に示す酵素活性検出用基板１０の第２蛍光基１２と第３蛍光基１４は互いに蛍光共鳴エネルギー移動がみられる距離で結合しているので、第２蛍光基１２の蛍光スペクトルと第３蛍光基１４の励起スペクトルとが重なりをもち、第２蛍光基１２の励起波長のエネルギーを当てると本来観察されるはずの第２蛍光基１２の蛍光が減衰し、代わりに第３蛍光基１４の蛍光が観察される。
酵素活性検出用基板１０に酵素５を含む検体溶液を接触させ反応させると、基質特異性を有する酵素５は、第３化合物１１と第５化合物１３との間のペプチド結合を切断する（図２（ｂ）参照）。
第３蛍光基１４が結合した第５化合物１３が遊離すると、第３蛍光基１４と第２蛍光基１２との間で蛍光共鳴エネルギー移動がみられなくなるので、第２蛍光基１２の励起波長のエネルギーを当てると本来観察されるはずの第２蛍光基１２の蛍光波長が観察されるようになり、酵素５の反応前の蛍光波長とは異なるため、蛍光強度等の変化を指標として酵素活性を検出することができる（図２（ｃ）参照）。
【００４１】
以上のように実施の形態２における酵素活性検出用基板は構成されているので、実施の形態１に記載の作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）第２蛍光基と第３蛍光基を選択することにより、第２蛍光基の蛍光波長を可視部領域に設定することが可能になるので、市販のＣＣＤカメラ等の可視光検出装置を用いて測定することが可能になり汎用性に優れる。
（２）第５化合物を所定の長さ（例えば１５Å程度）以上のペプチド鎖で形成することにより、個々のアミノ酸に対する基質特異性が高くなく、むしろ比較的長いペプチド鎖を切断作用に必要とするエラスターゼ等の酵素の検出もできるようにすることができ、検出できる酵素の種類を増やすことができるとともに検出感度を高めることができる。
【００４２】
（実施の形態３）
図３は本発明の実施の形態３における酵素活性検出用基板の模式図である。なお、実施の形態２と同様のものは、同じ符号を付して説明を省略する。
図中、２０は実施の形態３における酵素活性検出用基板、２１は基板２と直接結合する複数の反応点を有するトリプトファン（Ｔｒｐ）等の第２蛍光基１２が側鎖若しくは末端等に導入されたアミノ酸，ペプチド等の第４化合物である。第５化合物１３は第４化合物２１と酵素によって切断されるペプチド結合で結合している。
実施の形態３における酵素活性検出用基板が実施の形態２と異なる点は、基板２と直接結合した第２蛍光基１２が、第４化合物２１と結合している点である。
以上のように構成された実施の形態３の酵素活性検出用基板における酵素活性の検出原理は、実施の形態２で説明したものと同様のものなので、説明を省略する。
【００４３】
以上のように実施の形態３における酵素活性検出用基板は構成されているので、実施の形態２に記載の作用に加え、基板に第２蛍光基を固定した後、通常のペプチド合成法を用いて第４化合物や第５化合物を伸長させていくだけで合成できるので、酵素活性検出用基板の合成の操作性に優れるとともに製品得率を高めることができるという作用が得られる。
【００４４】
なお、本実施の形態においては、第５化合物１３が第４化合物２１と酵素によって切断されるペプチド結合で結合している場合について説明したが、第５化合物１３と第４化合物２１は酵素によって切断されないアミノ酸配列にして、第２蛍光基１２と第４化合物２１とが、酵素によって切断されるペプチド結合で結合するようにする場合もある。これにより、第４化合物や第５化合物を構成するアミノ酸の配列の自由度を高め設計を容易にすることができるという作用が得られる。
【００４５】
（実施の形態４）
図４は本発明の実施の形態４における酵素活性検出用基板の模式図である。なお、実施の形態１と同様のものは、同じ符号を付して説明を省略する。
図中、３０は実施の形態４における酵素活性検出用基板、３１は一端が基板２と結合したアミノ酸，ペプチド等の第６化合物、３２はひとつの反応点が第６化合物３１と結合したトリプトファン（Ｔｒｐ）等の第４蛍光基、３３は第４蛍光基３２の別の反応点が結合したアミノ酸，ペプチド等の第７化合物、３４は第７化合物３３と酵素によって切断されるペプチド結合で結合したアミノ酸，ペプチド等の第８化合物、３５は第８化合物３４と結合し第４蛍光基３２と蛍光共鳴エネルギー移動がみられる５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホン酸（Ｄｎｓ）等の第５蛍光基である。
以上のように構成された実施の形態４の酵素活性検出用基板における酵素活性の検出原理は、実施の形態２で説明したものと同様のものなので、説明を省略する。
【００４６】
以上のように実施の形態４における酵素活性検出用基板は構成されているので、実施の形態２に記載の作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）第６化合物３１を所定の長さのペプチド等で形成することにより、基板２と酵素作用点（第７化合物３３と第８化合物３４との間のペプチド結合）との距離を適正化して、基板２の影響を受けずに酵素を作用させることができ酵素活性をより正確に検出することができ検出感度を高め、さらに、個々のアミノ酸に対する基質特異性が高くなく、むしろ比較的長いペプチド鎖を切断作用に必要とするエラスターゼ等の酵素の検出もできるようにすることができ、検出できる酵素の種類を増やすことができる。
【００４７】
なお、本実施の形態においては、第８化合物３４が第７化合物３３と酵素によって切断されるペプチド結合で結合している場合について説明したが、第８化合物３４と第７化合物３３は酵素によって切断されないアミノ酸配列にして、第４蛍光基３２と第７化合物３３とが、酵素によって切断されるペプチド結合で結合するようにする場合もある。これにより、第７化合物や第８化合物を構成するアミノ酸の配列の自由度を高め設計を容易にすることができるという作用が得られる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本実施例で説明するアミノ酸、ペプチド、保護基、溶媒等は、当該技術分野で慣用されている略号又はIUPAC-IUBの命名委員会で採用された略号を使用している。例えば、以下の略号を使用している。Ala：アラニン、Pro：プロリン、Lys：リジン、Phe：フェニルアラニン、Aca：アミノカプロン酸、Ac：アセチル、ACC：７−アミノ−４−カルボキシメチルクマリン、Boc：ｔ−ブチルオキシカルボニル、Lys(Boc)：側鎖ｔ-ブチルオキシカルボニル保護リジン、DCC：ジシクロヘキシルカルボジイミド、DCM：ジクロロメタン、DIEA：N,N−ジイソプロピルエチルアミン、DMF：N,N−ジメチルホルムアミド、EtOH：エタノール、Fmoc：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、HATU：ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、HBTU：ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、HOAt：１−ヒドロキシ−７−アゾベンゾトリアゾール、HOBt：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、TFA：トリフルオロ酢酸、Trp：トリプトファン、Dns：５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホン酸。
【００４９】
（実施例１）
実施例１では、酵素活性検出用基板としてのペプチジル蛍光基結合球状基板を合成して酵素の活性測定を行った。以下、その方法について説明する。
＜ペプチジル蛍光基結合球状基板の合成＞
基板としては球状の市販のNH2-PEGA-resin（渡辺化学工業製）を用いた。固相合成用ベッセルを垂直に固定し、NH2-PEGA-resin(0.05 mmol/g, 0.5 g)を入れてコックを開いた状態でDMF(10 ml)を流し溶媒を置換した。次いで、ベッセルのコックを閉じ、Fmoc-Aca-OH (0.13 mmol, 44 mg), HBTU(0.13 mmol, 48 mg), DIEA(0.13 mmol, 0.022ml)をDMF(2 ml)に溶解させて加え、一晩反応させた。反応後、コックを開きDMF(10 ml)および メタノール(10 ml)で洗浄し、Fmoc-Aca-PEGA resinを得た。
次に、ベッセル中のFmoc-Aca-PEGA resin(0.05 mmol/g, 0.5 g)に、コックを開いた状態でDMF(10 ml)を流し、溶媒置換および洗浄を行った。コックを閉じて20%ピペリジン／DMFを入れ、３０分反応させ、脱Fmocを行った。その後、コックを開いて20%ピペリジン／DMFを除去し、次いでDMF(10 ml) を用いて洗浄した。次に、コックを閉じた状態でFmoc-Aca-OH(3 eq), HATU(3 eq), HOAt(3eq), DIEA(5eq)をDMF(2 ml)に溶解させて加え、３時間反応させた。その後コックを開け、DMF(10 ml),メタノール(10 ml)を用いて洗浄し、基板（PEGA resin）に第１化合物（Aca-Aca-）が結合したFmoc-Aca-Aca-PEGA resinを得た。
次に、20%ピペリジン／DCM (1 mL) を用いて30分撹拌してFmoc基の除去を行った。DCM(1 ml)で３回、DMF (1 ml)で１回洗浄した後、DMF 1 mlに溶解させたFmoc-Lys(Boc)-ACC-OH (36 mg, 54 mmol), DCC (11 mg, 54 mmol), HOBt・H2O (8.3 mg, 54 mmol)を加え24 時間反応させた。反応終了後、DMF (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回、EtOH (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回洗浄した後、減圧下乾燥させて第１蛍光基（ACC）が第１化合物（Aca-Aca-）に結合したFmoc-Lys(Boc)-ACC-Aca-Aca- PEGA resin を得た。
その後、DMF (1 ml)で１回洗浄し、DIEA (32 ml, 183 mmol) および無水酢酸(8.5 ml, 90 mmol)をDMF (1 ml)に希釈して加え１時間撹拌させた。その後、DMF (1 ml)で３回、 DCM (1 ml)で３回洗浄を行い、未反応物のアセチル化を行った。
次いで、20%ピペリジン／DCM (1 ml) を用いて30分撹拌してFmoc基の除去を行った。その後、DCM(1 ml)で３回、DMF (1 ml) 洗浄を行った後、Fmoc-Pro-OH (18 mg, 54mmol), HATU (20 mg, 54 mmol), HOAt (7 mg, 54 mmol), DIEA (16 ml, 90 mmol) をDMF (1 ml)に溶解させて加え1時間反応させた。その後、DMF (1 ml)で３回、DCM (1 ml)で３回洗浄しFmoc-Pro-Lys(Boc)- ACC-Aca-Aca- PEGA resinを得た。
以下、Fmoc-Pro-Lys(Boc)-ACC-Aca-Aca-PEGA resin にFmoc-Ala-OHを用いて同様の操作を繰り返しペプチドを伸長し、第１蛍光基（ACC）に第２化合物（Ala-Ala-Pro-Lys）が結合したAla-Ala-Pro-Lys(Boc)-ACC-Aca-Aca-PEGA resinを得た。その後、コックを閉じてDIEA (2.5 mmol, 0.435 ml),無水酢酸(1.25 mmol, 0.117 ml)をDMF(2 ml)に希釈して加え１時間反応させて第２化合物の末端基がアセチル化されたAc-Ala-Ala-Pro-Lys(Boc)-ACC-Aca-Aca-PEGA resinを得た。
ベッセルにAc-Ala-Ala-Pro-Lys(Boc)-ACC-Aca-Aca-PEGA resin(0.05 mmol, 0.5 mg)を入れ、コックを開いた状態でDCM(10 ml)を流し溶媒を置換した後、コックを閉じて25%TFA／DCM(2 ml)を入れ、３０分反応させ、脱Bocを行った後、DCM(10 ml),H2O (10 ml)を用いて洗浄し、目的とする実施例１のペプチジル蛍光基結合球状基板(Ac-Ala-Ala-Pro-Lys-ACC-Aca-Aca-PEGA resin)を得た。
【００５０】
＜酵素活性の測定＞
９６ウェルの蛍光測定用マイクロプレートのウェルＡ〜Dに、実施例１の酵素活性検出用基板としてのペプチジル蛍光基結合球状基板Ac-Ala-Ala-Pro-Lys-ACC-Aca-Aca-PEGA resinと以下の溶液を入れ、実験開始時の蛍光値と３０分後の蛍光値との差を測定した。蛍光値は、WALLAC ARVOTM SX 1420 マルチラベルカウンタ（パーキンエルマー製）を用いて励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定した。
Ａ：Ac-Ala-Ala-Pro-Lys-ACC-Aca-Aca-PEGA resin (wet) 5 mg、20 mM Tris HCl buffer(pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaCl2 )240 μl、トリプシン(1 mg/1 ml)から10μl
Ｂ：Ac-Ala-Ala-Pro-Lys-ACC-Aca-Aca-PEGA resin (wet) 5 mg、20 mM Tris HCl buffer(pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaCl2 )240 μl、キモトリプシン(1 mg/1 ml)から10 μl
Ｃ：Ac-Ala-Ala-Pro-Lys-ACC-Aca-Aca-PEGA resin (wet) 5 mg、20 mM Tris HCl buffer(pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaCl2 )250μl
Ｄ：20 mM Tris HCl buffer (pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaCl2 )250μl,  
なお、ウェルＡとウェルＢとの異なる点は酵素の種類であり、ウェルＡ（又はウェルＢ）とウェルＣとの異なる点は酵素の有無であり、ウェルＡ（又はウェルＢ，Ｃ）とウェルＤとの異なる点は酵素活性検出用基板の有無である。
各ウェルについて実験開始時の蛍光値と３０分後の蛍光値との差を（表１）に示す。
【００５１】
【表１】
2004357706.tif 000003
【００５２】
（表１）のウェルＡ，ＢとウェルＣの蛍光値を比較して、実施例１の酵素活性検出用基板は、トリプシンが存在するウェルＡでは約３１５倍、キモトリプシンが存在するウェルＢでは約１０倍異なることが確認された。これにより、実施例１の酵素活性検出用基板は酵素の量や酵素の種類等による酵素活性の検出が可能であることが示された。また、ウェルＡとウェルＢの蛍光値を比較して、実施例１の酵素活性検出用基板は、トリプシンの場合の蛍光値がキモトリプシンの場合の蛍光値と比較して約３０倍以上大きいことが確認された。これは、実施例１の酵素活性検出用基板の第１蛍光基と結合する第２化合物のアミノ酸がリジンであり、トリプシンは主にリジンのＣ末端側のペプチド結合を選択的に切断する特異性を有していることから発現したものであると推察される。一方、キモトリプシンは主に芳香族アミノ酸残基のＣ末端側のペプチド結合を選択的に切断する特異性を有しているため、反応前後の蛍光値の変化が小さかったと推察される。
これにより、実施例１の酵素活性検出用基板は酵素によって特異性を有するため、活性を有する酵素の定性分析が可能であることが示された。また、同一の種類の酵素活性検出用基板に同一種類の酵素を含有する検体溶液を接触させ所定時間後における蛍光値を測定すれば、蛍光値の変化は酵素の作用を受けて修飾された分子の数に対応するので、酵素の定量分析が可能であると推察された。
【００５３】
（実施例２）
実施例２では、酵素活性検出用基板としてのペプチジル蛍光基結合平面基板を合成して酵素の活性測定を行った。以下、その方法について説明する。
＜ペプチジル蛍光基結合平面基板の合成＞
基板としては、ペプチド合成用多板状合成樹脂製担体(ミモートプス社製ランタンシリーズ（登録商標）)を１プレートだけ切り離し平面状とした合成樹脂製担体を用いた。
スクリュー管に 基板としてのlantern 1個 (ミモートプス社D-series, 導入率18 mmol / 個) を入れ、20%ピペリジン／DCM (1 mL) を用いて30分撹拌しFmoc基の除去を行った。DCM (1 ml)で３回、DMF (1 ml) で洗浄した後、Fmoc-Aca-OH（19 mg 54 mmol）, DCC (17 mg 81 mmol), HOBt・H2O (8 mg  54 mmol)をDMF (1 ml)に溶解させて加え24時間反応させた。反応終了後、DMF (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回、EtOH (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回洗浄した後、減圧下乾燥させてFmoc-Aca-lanternを得た。
次に、20%ピペリジン／DCM (1 ml) を用いて30分撹拌してFmoc基 の除去を行った。その後、DCM(1 ml)で３回、DMF (1 ml) 洗浄を行った後、Fmoc-Aca-OH (19 mg, 54mmol), HATU (20 mg, 54 mmol), HOAt (7 mg, 54 mmol), DIEA (16 ml, 90 mmol) をDMF (1 ml)に溶解させて加え1時間反応させた。その後、DMF (1 ml)で３回、DCM (1 ml)で３回洗浄し、基板（lantern）に第１化合物（Aca-Aca）の一端が固定化したFmoc-Aca-Aca-lanternを得た。
次いで、20%ピペリジン／DCM (1 mL) を用いて30分撹拌してFmoc基の除去を行った。DCM(1 ml)で３回、DMF (1 ml)で１回洗浄してlanternを膨潤させ、DMF 1 mlに溶解させたFmoc-Lys(Boc)-ACC-OH (36 mg, 54 mmol), DCC (11 mg, 54 mmol), HOBt・H2O (8.3 mg, 54 mmol)を加え24 時間反応させた。反応終了後、DMF (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回、EtOH (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回洗浄した後、減圧下乾燥させて第１化合物（Aca-Aca）に第１蛍光基（ACC）が結合したFmoc-Lys(Boc)-ACC-Aca-Aca-lanternを得た。
【００５４】
その後、DMF (1 ml)で１回洗浄し、DIEA (32 ml, 183 mmol) および無水酢酸(8.5 ml, 90 mmol)をDMF (1 ml)に希釈して加え１時間撹拌させた。その後、DMF (1 ml)で３回、 DCM (1 ml)で３回洗浄を行い、未反応物のアセチル化を行った。
次に、20%ピペリジン／DCM (1 ml) を用いて30分撹拌してFmoc基 の除去を行った。その後、DCM(1 ml)で３回、DMF (1 ml) 洗浄を行った後、Fmoc-Pro-OH (18 mg, 54mmol), HATU (20 mg, 54 mmol), HOAt (7 mg, 54 mmol), DIEA (16 ml, 90 mmol) をDMF (1 ml)に溶解させて加え1時間反応させた。その後、DMF (1 ml)で３回、DCM (1 ml)で３回洗浄しFmoc-Pro-Lys(Boc)-ACC-Aca-Aca-lanternを得た。
以下、Fmoc-Pro-Lys(Boc)-ACC-Aca-Aca-lantern にFmoc-Ala-OHを用いて同様の操作を２回繰り返してペプチドを伸長させ、第１蛍光基（ACC）に第２化合物（Ala-Ala-Pro-Lys）が結合したFmoc-Ala-Ala-Pro-Lys(Boc)-ACC-Aca-Aca- lanternを得た。
その後、20%ピペリジン／DCM (1 ml) を用いて30分撹拌してFmoc基 の除去を行った。その後、DCM(1 ml)で３回、DMF (1 ml) 洗浄を行った後、DMF (1 mL)、DIEA 32 ml (183 mmol) および無水酢酸8.5 ml(90 mmol) をDMF (1 mL)に希釈して加え、１時間撹拌させた。その後、DMF (1 ml)で３回、DCM (1 ml)で３回lanternを洗浄し、25% TFA／DCMを用いて３０分反応させてBoc基の除去を行った。その後、DCM(1 ml)で３回、H2O (1 ml)で５回、DCM(1 ml)で３回洗浄し、減圧乾燥を行い、第２化合物（Ala-Ala-Pro-Lys）の末端基がアセチル化されたAc-Ala-Ala-Pro-Lys(Boc)-ACC-Aca-Aca- lanternを得た。
25%TFA/DCM(1ml)を用いてLys側鎖のBoc基を除去し、目的とする実施例２の酵素活性検出用基板(Ac-Ala-Ala-Pro-Lys-ACC-Aca-Aca-lantern)を得た。
【００５５】
＜酵素活性の測定＞
実施例２の酵素活性検出用基板に、20 mM Tris HCl buffer（pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaCl２）を100 μl, メタノール100 μl, トリプシン（1 mg/1 ml）を 50 μl加え、反応前と反応後の蛍光値を測定した。蛍光値は、WALLAC ARVOTM SX 1420 マルチラベルカウンタ（パーキンエルマー製）を用いて励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定した。
その結果、初期蛍光値は39000、１８時間反応後の蛍光値は145000であり、蛍光値が約４倍変化することが確認された。これにより、基板としてlanternを用いた実施例２の酵素活性検出用基板においても、活性を有する酵素の検出が可能であることが示された。
【００５６】
（実施例３）
実施例３では、酵素活性検出用基板としてのペプチジル蛍光基結合平面基板を合成して酵素の活性測定を行った。以下、その方法について説明する。
＜ペプチジル蛍光基結合平面基板の合成＞
基板としては、ペプチド合成用多板状合成樹脂製担体(ミモートプス社製ランタンシリーズ（登録商標）)を１プレートだけ切り離し平面状とした合成樹脂製担体を用いた。
スクリュー管に基板としてのlantern 1個 (ミモートプス社D-series, 導入率18 mmol / 個) を入れ、20%ピペリジン / DCM (1 mL) を用いて30分撹拌しFmoc基を切り出した。 DCM洗浄 (1 ml×3) 後、DMF (1 ml×1) でlanternを膨潤させDMF 1 mlに溶解させたFmoc-Aca-OH 20.0 mg (56.6 mmol), DCC 17.5 mg (84.5 mmol), HOBt・H2O 8.8 mg  (57.5 mmol)を加え23時間撹拌した。DMF (1 ml×2), DCM (1 ml×2), DCM / EtOH = 1:1 (1 ml×2), EtOH (1 ml×2), DCM (1 ml×1), ジエチルエーテル(1 ml×1)で樹脂を洗浄した後乾燥させ、Fmoc-Aca-lanternを得た。
20%ピペリジン／DCM (1 mL) を用いて30分撹拌してFmoc基を切り出しDCM洗浄 (1 ml×3)した後、DMF 1 mlに溶解させたFmoc-Aca-OH 23.0mg (65.1mmol), HATU 21.6 mg (56.8 mmol), HOAt 8.1 mg (59.5 mmol), DIEA 15.7 ml (90.2 mmol) を加え1時間撹拌させた。DMF (1 ml×3), DCM (1 ml×3) で洗浄し基板（lantern）に第１化合物（Aca-Aca）の一端が固定化したFmoc-Aca-Aca-lanternを得た。次いで、20%ピペリジン／DCM (1 mL) を用いて30分撹拌してFmoc基を除去し、DCM洗浄 (1 ml×3)を行ってH-Aca-Aca-lanternを得た。
【００５７】
次いで、DMF 1 mlに溶解させたFmoc-Phe-ACC-OH（33.4 mg 56.7 mmol）、DCC 12.5 mg (60.6 mmol), HOBt・H2O 8.9 mg (58.0 mmol)を加え22時間撹拌した。DMF (1 ml×2), DCM (1 ml×2), DCM / EtOH = 1:1 (1 ml×2), EtOH (1 ml×2), DCM (1 ml×1), ジエチルエーテル(1 ml×1)で洗浄後、乾燥させ第１化合物（Aca-Aca）に第１蛍光基（ACC）が結合したFmoc-Phe-ACC-Aca-Aca-Lanternを得た。
次に、20%ピペリジン／DCM (1 mL) を用いて30分撹拌してFmoc基を除去し、DCM洗浄 (1 ml×3)した。次いで、DMF 1 mlに溶解させたFmoc-Pro-OH 24.7mg (73.2 mmol), HATU 21.4 mg (56.2 mmol), HOAt 8.2 mg (60.2 mmol), DIEA 15.7 ml (90.2 mmol) を加え1時間撹拌させた後、DMF (1 ml×3), DCM (1 ml×3)で洗浄しFmoc-Pro-Phe-ACC-Aca-Aca-lanternを得た。
以下、これと同様の操作を行ってFmoc-Ala-OHを２回導入し、第１蛍光基（ACC）に第２化合物（Ala-Ala-Pro-Phe）が結合したFmoc-Ala-Ala-Pro-Phe-ACC-Aca-Aca-lanternを得た。
その後、20%ピペリジン／DCM (1 mL) を用いて30分撹拌してFmoc基を除去し、DCM洗浄 (1 ml×3) 後、DMF (1 mL)、DIEA 32 ml (183 mmol) および無水酢酸8.5 ml(90 mmol) を加え、１時間撹拌させた。その後、DMF (1 ml×3), DCM (1 ml×3) で洗浄を行い、第２化合物（Ala-Ala-Pro-Phe）の末端基をアセチル化して、目的とする実施例３の酵素活性検出用基板としてのペプチジル蛍光基結合平面基板Ac-Ala-Ala-Pro-Phe-ACC-Aca-Aca-lanternを得た。
【００５８】
＜酵素活性の測定＞
蛍光測定用マイクロプレートのウェルＡ，Ｃに実施例２の酵素活性検出用基板（導入率２μmol／基板）を、ウェルＢ，Ｄに実施例３の酵素活性検出用基板（導入率２μmol／基板）を入れ、各々に20 mM Tris HCl buffer（pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaCl２）を100 μl, メタノール100 μlを加え、さらに以下の酵素５０μｇを加えて反応させた。
Ａ：キモトリプシン
Ｂ：キモトリプシン
Ｃ：トリプシン
Ｄ：トリプシン
測定は、WALLAC ARVOTM SX 1420 マルチラベルカウンタ（パーキンエルマー製）を用いて励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで、酵素を加える前の蛍光値と酵素を加えてから３０分後の蛍光値とを測定し、その差を求めた。
各ウェルにおける算出された蛍光値の差を（表２）に示す。
【００５９】
【表２】
2004357706.tif 000004
【００６０】
（表２）によれば、キモトリプシンに対しては、第１蛍光基と結合する第２化合物のアミノ酸が芳香族アミノ酸の１種のフェニルアラニンである実施例３の酵素活性検出用基板で大きな蛍光値の変化が確認された。また、トリプシンに対しては、第１蛍光基と結合する第２化合物のアミノ酸がリジンである実施例２の酵素活性検出用基板で大きな蛍光値の変化が確認された。これらの変化の差は、キモトリプシンは主に芳香族アミノ酸残基のＣ末端側のペプチド結合を選択的に切断する特異性を有しており、トリプシンは主にリジンのＣ末端側のペプチド結合を選択的に切断する特異性を有していることから発現したものであると推察される。
これにより、第１蛍光基と結合する第２化合物のアミノ酸の種類を変えることにより、酵素の種類に対する活性検出能を変えられることが明らかになった。
【００６１】
（実施例４）
実施例４では、酵素活性検出用基板としてのペプチジル蛍光基結合平面基板を合成して酵素の活性測定を行った。以下、その方法について説明する。
＜ペプチジル蛍光基結合平面基板の合成＞
基板としては、ペプチド合成用多板状合成樹脂製担体(ミモートプス社製ランタンシリーズ（登録商標）)を１プレートだけ切り離し平面状とした合成樹脂製担体を用いた。
スクリュー管に 基板としてのlantern 1個 (ミモートプス社D-series, 導入率18μmol / 個) を入れ、20%ピペリジン／DCM (1 ml) を用いて30分撹拌しFmoc基の除去を行った。DCM (1 ml)で３回、DMF (1 ml) で2回洗浄した後、Fmoc-Aca-OH（19 mg, 54μmol）, DCC (17 mg, 81μmol), HOBt・H2O (8 mg,54 mmol)をDMF (1 ml)に溶解させて加え24時間反応させた。反応終了後、DMF (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回、EtOH (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回洗浄した後、減圧下乾燥させてFmoc-Aca-lanternを得た。
次に、20%ピペリジン／DCM (1 ml) を用いて30分撹拌してFmoc基の除去を行った。その後、DCM(1 ml)で３回、DMF (1 ml) で2回洗浄を行った後、Fmoc-Aca-OH (19 mg, 54μmol), HATU (20 mg, 54μmol), HOAt (7 mg, 54μmol), DIEA (16μl, 90μmol) をDMF (1 ml)に溶解させて加え1時間反応させた。その後、DMF (1ml)で３回、DCM (1ml)で３回洗浄しFmoc-Aca-Aca-lanternを得た。
【００６２】
次いで、20%ピペリジン／DCM (1ml) を用いて30分撹拌してFmoc基の除去を行った。DCM(1ml)で３回、DMF (1ml)で１回洗浄してlanternを膨潤させ、DMF 1 mlに溶解させたFmoc-Lys(Ac-Trp(Boc)-)-OH (38 mg, 54 mmol), DCC (11 mg, 54 mmol), HOBt・H2O (8.3 mg, 54 mmol)を加え24 時間反応させた。反応終了後、DMF (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回、EtOH (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回洗浄した後、減圧下乾燥させて（-Lys-Aca- Aca-）の側鎖に(Ac-Trp(Boc)-)が導入されたFmoc-Lys(Ac-Trp(Boc)-)-Aca- Aca-lanternを得た。
次に、20%ピペリジン／DCM (1 ml) を用いて30分撹拌してFmoc基の除去を行った。その後、DCM(1 ml)で３回、DMF (1 ml) で2回洗浄を行った後、Fmoc-Lys(Boc)-OH (25 mg, 54μmol), HATU (20 mg, 54μmol), HOAt (7 mg, 54μmol), DIEA (16μl, 90μmol) をDMF (1 ml)に溶解させて加え1時間反応させた。その後、DMF (1 ml)で３回、DCM (1 ml)で３回洗浄しFmoc-Lys(Boc)-Lys(Ac-Trp(Boc)-)-Aca-Aca-lanternを得た。
以下、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Ac-Trp(Boc)-)-Aca-Aca-lantern にFmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OHを導入する実施例３と同様の操作を繰り返してペプチドを伸長させ、更にDns-Clを反応させることによりDns-Ala-Ala-Pro-Lys(Boc)-Lys(Ac-Trp(Boc)-)-Aca-Aca- lanternを得た。
次いで、DMF (1 ml)で３回、DCM (1 ml)で３回lanternを洗浄し、25% TFA／DCMを用いて３０分反応させてBoc基の除去を行った。その後、DCM(1 ml)で３回、H2O (1 ml)で５回、DCM(1 ml)で３回洗浄し、減圧乾燥を行い、第３化合物と第５化合物とが結合した（Ala-Ala-Pro-Lys-Lys-Aca-Aca）の側鎖に第２蛍光基としてのTrpと、末端に第３蛍光基としてのDnsとを備えた目的とする実施例４の酵素活性検出用基板Dns-Ala-Ala-Pro-Lys-Lys(Ac-Trp-)-Aca-Aca- lanternを得た。
【００６３】
＜酵素活性の測定＞
実施例４の酵素活性検出用基板に、20 mM Tris・HCl buffer（pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaCl２）を100 μl, メタノール100 μl, トリプシン（1 mg/1 ml）を 50 μl加え、反応前と反応後の蛍光値を測定した。蛍光値は、FP-6600蛍光分光光度計（Jasco製）を用いて励起波長280 ｎｍ、蛍光波長350 ｎｍで測定した。
その結果、初期蛍光値は３７、１８時間反応後の蛍光値は５６７であり、蛍光値が約１５倍変化することが確認された。これにより、実施例４の酵素活性検出用基板においても、活性を有する酵素の検出が可能であることが示された。
【００６４】
（実施例５）
実施例４と同様にして、スクリュー管に 基板としてのlantern 1個 (ミモートプス社D-series, 導入率18μmol / 個) を入れ、ピペリジン／DCM を用いてFmoc基の除去を行った後、DCM、DMFで洗浄してlanternを膨潤させ、DMFに溶解させたFmoc-Trp(Boc)-OH、 DCC、 HOBt・H2Oを加え反応させた。反応終了後、DMF、DCM 、EtOH で洗浄し減圧下乾燥させて、基板（lantern）に(Fmoc-Trp(Boc)-)が結合したFmoc-Trp(Boc)-lanternを得た。
次に、ピペリジン／DCMを用いてFmoc基の除去を行い、DCM、DMFで洗浄した後、Fmoc-Lys(Boc)-OH、 HATU、 HOAt、DIEAをDMFに溶解させて加え反応させた。その後、DMF、DCMで洗浄しFmoc-Lys(Boc)-Trp(Boc)-lanternを得た。
以下、Fmoc-Lys(Boc)-Trp(Boc)-lantern にFmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OHを導入する実施例３と同様の操作を繰り返してペプチドを伸長させ、更にDns-Clを反応させることによりDns-Ala-Ala-Pro-Lys(Boc)-Trp(Boc)-lanternを得た。
次いで、DMF、DCMでlanternを洗浄し、TFA／DCMを反応させてBoc基の除去を行った。その後、DCM、H2O、DCMで洗浄し、減圧乾燥を行い、第４化合物と第５化合物とが結合した（Ala-Ala-Pro-Lys）の末端に第２蛍光基としてのTrpと、末端に第３蛍光基としてのDnsとを備えた目的とする実施例５の酵素活性検出用基板Dns-Ala-Ala-Pro-Lys-Trp-lanternを得た。
実施例５の酵素活性検出用基板の酵素活性検出能を実施例４と同様にして測定したところ、実施例５の酵素活性検出用基板においても、実施例４とほぼ同様の検出能が確認された。これにより、実施例５の酵素活性検出用基板においても、活性を有する酵素の検出が可能であることが示され、反応点を複数有するトリプトファン等の蛍光基を用いることにより、基板に結合させるペプチド等のアミノ酸配列の設計の自由度をより高めることができることが明らかになった。
【００６５】
（実施例６）
スクリュー管に 基板としてのlantern 1個 (ミモートプス社D-series, 導入率18μmol / 個) を入れ、実施例４と同様の操作によって、基板にFmoc-Aca-OHを導入し、Fmoc-Aca-Aca-lanternを得た。
次いで、ピペリジン／DCMを用いてFmoc基を除去し、DCM、DMFで洗浄してlanternを膨潤させ、DMFに溶解させたFmoc-Trp(Boc)-OH、 DCC、 HOBt・H2Oを加え反応させ、基板（lantern）に第６化合物（Aca- Aca）が結合したFmoc-Trp(Boc)-Aca- Aca-lanternを得た。
以下、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OHを導入する実施例３と同様の操作を繰り返してペプチドを伸長させ、更にDns-Clを反応させることによりDns -Ala-Ala-Pro-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Aca-Aca-lanternを得た。
次いで、DMF 、DCMで洗浄し、TFA／DCMを用いてBoc基の除去を行った後、DCM、H2O、DCMで洗浄し、減圧乾燥を行い、第７化合物と第８化合物とが結合した（Ala-Ala-Pro-Lys-）が第４蛍光基としてのTrpに結合し、末端に第５蛍光基としてのDnsが結合した実施例６の酵素活性検出用基板Dns-Ala-Ala-Pro-Lys-Trp-Aca-Aca-lanternを得た。
実施例６の酵素活性検出用基板の酵素活性検出能を実施例４と同様にして測定したところ、実施例６の酵素活性検出用基板においても、実施例４とほぼ同様の検出能が確認された。これにより、実施例６の酵素活性検出用基板においても、活性を有する酵素の検出が可能であることが示され、反応点を複数有するトリプトファン等の蛍光基を用いることにより、基板に結合させるペプチド等のアミノ酸配列の設計の自由度をより高めることができることが明らかになった。
【００６６】
（実施例７）
実施例７では、酵素活性検出用基板としてのペプチジル蛍光基結合平面基板を合成して酵素の活性測定を行った。以下、その方法について説明する。
＜ペプチジル蛍光基結合平面基板の合成＞
基板としては、ペプチド合成用多板状合成樹脂製担体(ミモートプス社製ランタンシリーズ（登録商標）)を１プレートだけ切り離し平面状とした合成樹脂製担体を用いた。
スクリュー管に 基板としてのlantern 1個 (ミモートプス社D-series, 導入率18μmol / 個) を入れ、20%ピペリジン／DCM (1 mL) を用いて30分撹拌しFmoc基の除去を行った。DCM (1 ml)で３回、DMF (1 ml) で洗浄した後、Fmoc-Aca-OH（19 mg, 54μmol）, DCC (17 mg, 81μmol), HOBt・H2O (8 mg,54μmol)をDMF (1 ml)に溶解させて加え24時間反応させた。反応終了後、DMF (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回、EtOH (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回洗浄した後、減圧下乾燥させてFmoc-Aca-lanternを得た。
次に、20%ピペリジン／DCM (1 ml) を用いて30分撹拌してFmoc基 の除去を行った。その後、DCM(1 ml)で３回、DMF (1 ml) で2回洗浄を行った後、Fmoc-Aca-OH (19 mg, 54μmol), HATU (20 mg, 54μmol), HOAt (7 mg, 54μmol), DIEA (16μl, 90μmol) をDMF (1 ml)に溶解させて加え1時間反応させた。その後、DMF (1 ml)で３回、DCM (1 ml)で３回洗浄しFmoc-Aca-Aca-lanternを得た。
【００６７】
次いで、20%ピペリジン／DCM (1 mL) を用いて30分撹拌してFmoc基の除去を行った。DCM(1 ml)で３回、DMF (1 ml)で１回洗浄してlanternを膨潤させ、DMF 1 mlに溶解させたFmoc-Lys(Ac-Trp(Boc)-)-OH (38 mg, 54μmol), DCC (11 mg, 54μmol), HOBt・H2O (8.3 mg, 54μmol)を加え24 時間反応させた。反応終了後、DMF (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回、EtOH (1 ml)で２回、DCM (1 ml)で２回洗浄した後、減圧下乾燥させてFmoc-Lys(Ac-Trp(Boc)-)-Aca- Aca-lanternを得た。
次に、20%ピペリジン／DCM (1 ml) を用いて30分撹拌してFmoc基の除去を行った。その後、DCM(1 ml)で３回、DMF (1 ml) で2回洗浄を行った後、Fmoc-Phe-OH (21 mg, 54μmol), HATU (20mg, 54μmol), HOAt (7 mg, 54μmol), DIEA (16μl, 90μmol) をDMF (1 ml)に溶解させて加え1時間反応させた。その後、DMF (1 ml)で３回、DCM (1 ml)で３回洗浄しFmoc-Phe-Lys(Ac-Trp(Boc)-)-Aca-Aca-lanternを得た。
以下、Fmoc-Phe-Lys(Ac-Trp(Boc)-)-Aca-Aca-lantern にFmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OHを導入する実施例３と同様の操作を繰り返してペプチドを伸長させ、更にDns-Clを反応させることによりDns-Ala-Ala-Pro-Phe-Lys(Ac-Trp(Boc)-)-Aca-Aca- lanternを得た。
DMF (1 ml)で３回、DCM (1 ml)で３回lanternを洗浄し、25% TFA／DCMを用いて３０分反応させてBoc基の除去を行った。その後、DCM(1 ml)で３回、H2O (1 ml)で５回、DCM(1 ml)で３回洗浄し、減圧乾燥を行い、第３化合物と第５化合物とが結合した（Ala-Ala-Pro-Phe-Lys-Aca-Aca）の側鎖に第２蛍光基としてのTrpと、末端に第３蛍光基としてのDnsとを備えた目的とする実施例７の酵素活性検出用基板Dns-Ala-Ala-Pro-Phe-Lys(Ac-Trp-)-Aca-Aca- lanternを得た。
【００６８】
＜酵素活性の測定＞
蛍光測定用マイクロプレートにウェルを４つ（Ａ〜Ｄ）準備し、ウェルＡ，Ｃに実施例４の酵素活性検出用基板（導入率２μmol／基板）を、ウェルＢ，Ｄに実施例７の酵素活性検出用基板（導入率２μmol／基板）を入れ、各々に20 mM Tris HCl buffer（pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaCl２）を100 μl, メタノール100 μlを加え、さらに以下の酵素５０μｇを加えて反応させた。
Ａ：キモトリプシン
Ｂ：キモトリプシン
Ｃ：トリプシン
Ｄ：トリプシン
蛍光値は、FP-6600蛍光分光光度計（Jasco製）を用いて励起波長２８０ｎｍ、蛍光波長３５０ｎｍで、酵素を加える前の蛍光値と酵素を加えてから２０分後の蛍光値とを測定し、その差を求めた。
各ウェルにおける算出された蛍光値の差を（表３）に示す。
【００６９】
【表３】
2004357706.tif 000005
【００７０】
（表３）によれば、キモトリプシンに対しては、結合した第３化合物と第５化合物に、芳香族アミノ酸の１種のフェニルアラニンを有する実施例７の酵素活性検出用基板で大きな蛍光値の変化が確認された。また、トリプシンに対しては、結合した第３化合物と第５化合物にリジンを有する実施例４の酵素活性検出用基板で大きな蛍光値の変化が確認された。これらの変化の差は、実施例３において推察したのと同様に、キモトリプシンは主に芳香族アミノ酸残基のＣ末端側のペプチド結合を選択的に切断する特異性を有しており、トリプシンは主にリジンのＣ末端側のペプチド結合を選択的に切断する特異性を有していることから発現したものであると推察される。
これにより、蛍光基が結合したペプチド等のアミノ酸配列の種類を変えることにより、酵素の種類に対する活性検出能を変えられることが明らかになった。本実施例ではキモトリプシンやトリプシンのように配列中のアミノ酸残基１つの違いで結果が変化する例を示したが、蛍光エネルギー移動が起こる範囲内で可能なかぎり、検出する酵素に対応するために配列全長にわたって自由にアミノ酸配列を設計することができるので、アミノ酸配列の設計によって無限の基質特異性を発現させ、多種多様な酵素の検出が可能な酵素活性検出用基板が得られることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、酵素活性を検出する酵素活性検出用基板及びそれを用いた酵素活性の検出方法に関し、蛍光強度等の変化を指標として基板の蛍光強度等を測定するだけで酵素活性を検出することができ操作性に優れ、また、微量の検体溶液でも酵素活性の検出を行うことができるとともに検体溶液を注入するウェル等を形成する必要がなく検出部の集積度を飛躍的に高めることができる酵素活性検出用基板を提供することができ、微量の検体溶液でも酵素活性の検出を行うことができ、また検出感度を高くできるとともに測定時間を短縮化することができ作業性を高め測定効率を高めることができ、さらに種類の異なるペプチド等の各々に蛍光基が結合した酵素活性検出用基板を用いることで複数の酵素を含む検体溶液の酵素活性を短時間で測定できる酵素活性の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】実施の形態１における酵素活性検出用基板の酵素活性検出原理を示す模式図
【図２】実施の形態２における酵素活性検出用基板の酵素活性検出原理を示す模式図
【図３】実施の形態３における酵素活性検出用基板の模式図
【図４】実施の形態４における酵素活性検出用基板の模式図
【符号の説明】
【００７３】
１，１０，２０，３０  酵素活性検出用基板
２  基板
３，６  第１蛍光基
４  第２化合物
５  酵素
１１  第３化合物
１２，１５  第２蛍光基
１３  第５化合物
１４  第３蛍光基
２１  第４化合物
３１  第６化合物
３２  第４蛍光基
３３  第７化合物
３４  第８化合物
３５  第５蛍光基
【図１】
2004357706.tif 000006
【図２】
2004357706.tif 000007
【図３】
2004357706.tif 000008
【図４】
2004357706.tif 000009