(57)【要約】【課題】簡易な構成によって、培養されることにより増殖した細胞の数を定量的に把握することを可能にする。【解決手段】培地を貯留し細胞を培養する容器本体２と、該容器本体２に設けられた細胞数計測部３とを備え、該細胞数計測部３が、容器本体２内に開口し、先端を閉塞された透明な材質からなる閉塞管４と、その管壁に設けられた目盛り７とから構成されている培養容器１を提供する。【選択図】　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地を貯留し細胞を培養する容器本体と、
該容器本体に設けられた細胞数計測部とを備え、
該細胞数計測部が、容器本体内に開口し、先端を閉塞された透明な材質からなる閉塞管と、その管壁に設けられた目盛りとから構成されている培養容器。
【請求項２】
前記容器本体が、前記細胞数計測部に向けて先細になる導入部を備えている請求項１に記載の培養容器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞を培養する培養容器に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、間葉系幹細胞等の幹細胞は、様々な組織に分化でき、その組織を再生することができる細胞として知られている。間葉系幹細胞は、骨髄液に多く含まれている。しかしながら、骨髄液から採取可能な間葉系幹細胞はごく微量であり、組織の再生に必要な量の間葉系幹細胞を得るためには、骨髄液を培養することにより増殖させる必要がある。
【０００３】
従来、間葉系幹細胞を培養するには、患者から採取した骨髄液を平坦な培養容器上に播種して、適当な培地内において培養する。骨髄液内の赤血球や白血球などの造血系の細胞は培地内に浮遊する一方、間葉系幹細胞は培養容器の底面に付着して増殖する性質を有している。したがって、培地交換によって造血系の細胞を廃棄することにより、培養容器の底面に付着して増殖した間葉系幹細胞のみを抽出することが可能となる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
【非特許文献１】
吉川，「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」，バイオインダストリー，株式会社シーエムシー出版，２００１年，第１８巻，第７号，ｐ．４６−５３
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このように培養容器の底面に付着して増殖する間葉系幹細胞がどの程度の細胞数まで増殖したかについては、オペレータが培養容器の底面における細胞の広がりを目視で確認するに留まり、これを定量的に把握することが困難であった。
【０００６】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な構成によって、培養されることにより増殖した細胞の数を定量的に把握することが可能な培養容器を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、培地を貯留し細胞を培養する容器本体と、該容器本体に設けられた細胞数計測部とを備え、該細胞数計測部が、容器本体内に開口し、先端を閉塞された透明な材質からなる閉塞管と、その管壁に設けられた目盛りとから構成されている培養容器を提供する。
【０００８】
この発明によれば、容器本体に培地を貯留して細胞を培養することにより、細胞が容器本体内において増殖する。そして、所定の培養期間が経過した後に、容器本体の底面等から増殖した細胞を剥離させ、例えば、遠心分離のような分離作業を行うことにより、培地から細胞を分離することが可能となる。この際に、成長した細胞を細胞数計測部へ導くことにより、細胞数計測部に細胞を集める。細胞数計測部は透明な材質からなる閉塞管によって構成されているので、集められた細胞は閉塞管内に集積され、集積された状態の細胞が外部から観察可能となる。閉塞管の管壁には目盛りが設けられているので、その目盛りを数えることにより、集積された細胞の量を目視で簡易に計ることができることになる。
【０００９】
請求項２に係る発明は、請求項１記載の培養容器において、前記容器本体が、前記細胞数計測部に向けて先細になる導入部を備えている培養容器を提供する。
この発明によれば、遠心分離等により培地から分離された細胞が細胞数計測部に導かれる際に、容器本体に備えられた導入部を通過させられる。導入部は、細胞数計測部に向けて先細に構成されているので、分離された細胞は導入部によって効果的に細胞数計測部へ集められていくことになる。したがって、容器本体内の細胞を無駄なく集めて、培養された細胞のほぼ全数を計測することが可能となる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この発明の実施の形態を説明する前に、生体組織補填体としての骨補填体の製造工程について概略的に説明する。骨補填体を製造するには、図５に示されるように、まず、患者の腸骨等から骨髄液を採取する。採取された骨髄液は遠心分離機にかけられて、旋回されることにより、比重の重い骨髄細胞を抽出される。
【００１１】
抽出された骨髄細胞は、予め調製されている培地とともに培養容器内に投入され混合される。培地の一部は取り出されて感染検査に回される。
この後に、混合された骨髄液および培地を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）、湿度（例えば、１００％）およびＣＯ２濃度（例えば５％）等の培養条件に維持することにより所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が一次培養される。細胞の培養途中の所定の交換時期には、培養容器内から培地が廃棄される。そして、再度培地を混合されて培養工程が繰り返し継続される。廃棄された培地の一部は感染検査に回される。
【００１２】
所定の培養期間が終了すると、培養容器内から培地が廃棄された後に、培養容器内にトリプシンのような蛋白質分解酵素が投入・混合される。これにより、培養容器の底面に付着して成長していた間葉系幹細胞が、主培養容器の底面から剥離される。そして、このように剥離された間葉系幹細胞は、遠心分離機にかけられることにより抽出される。
【００１３】
抽出された間葉系幹細胞は、細胞数調整が行われた後に、骨補填材と適当な培地が投入された培養容器内に混合される。実際には、間葉系幹細胞を骨補填材に付着させ、培地内に投入する。そして、上記と同様にして、混合された間葉系幹細胞と培地を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）、湿度（例えば、１００％）およびＣＯ２濃度（例えば５％）等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が二次培養される。
【００１４】
二次培養工程においても、一次培養工程と同様にして、定期的に培地の交換が行われ、投入される培地の一部および廃棄される培地の一部がそれぞれ、感染検査に回される。そして、所定の培養期間が経過したところで、出荷用の品質検査と感染検査のための検体抽出が行われ、製造された骨補填体は密封されて製品として提供される。
【００１５】
次に、この発明の第１の実施形態に係る培養容器について、図面を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器は、上述した培養工程の内、一次培養工程に利用される容器である。
【００１６】
本実施形態に係る培養容器１は、図１に示されるように、容器本体２と該容器本体２に設けられた細胞数計測部３とを備えている。容器本体２および細胞数計測部３は、伸縮可能の柔軟な材質、例えば、塩化ビニルによって一体的に構成されている。容器本体２および細胞数計測部３を構成するチューブ４は、透明な材質からなり、外部から内部の収容物を観察できるように構成されている。なお、透明には、無色透明の他、有色透明、半透明も含まれる。
【００１７】
前記容器本体２は、略長方形の袋状に形成されており、その一側面の中央近傍に、前記細胞数計測部３が備えられている。該細胞数計測部３が備えられた側面には、中央の細胞数計測部３に向かって傾斜した傾斜面５が設けられており、この傾斜面５によって、細胞数計測部３に向けて漸次先細になる導入部６が構成されている。
【００１８】
前記細胞数計測部３は、図２に示されるように、一定の横断面形状を有するチューブ４により構成されている。このチューブ４の先端は閉塞されている。このチューブ４の管壁には、長さ方向に所定の間隔をあけた複数の目盛り７が形成されている。本実施形態では、細胞数計測部３が一定の横断面形状を有しているので、目盛り７は等間隔に形成されている。
【００１９】
このように構成された本実施形態に係る培養容器１を用いて細胞を培養するには、容器本体２の内部に適当な培地と、例えば、骨髄液から抽出した骨髄細胞とを供給する。培地は、例えば、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）、抗生剤を８４：１５：１の配合比率で混合したものである。なお、この配合比率は任意であり、また、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。
【００２０】
そして、一次培養工程は、混合された骨髄細胞および培地を所定の温度、湿度およびＣＯ２濃度等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって行われる。所定時間が経過すると、培地Ａ内の栄養分が減少し、排出物が増大するので、培養途中においてこれを補うために、定期的な培地交換が行われる。
【００２１】
一次培養工程においては、骨髄細胞中の間葉系幹細胞８が、容器本体２の底面に付着して成長し、造血系の細胞等は、培地Ａ内に浮遊する。したがって、培地交換を行うことにより、容器本体２内には間葉系幹細胞８が残り、他の細胞は廃棄されることになる。
【００２２】
このようにして複数回にわたる培地交換を行いながら実施される一次培養工程により、間葉系幹細胞８が容器本体２の底面に充分に成長する。この段階で、容器本体２内にトリプシンのような蛋白質分解酵素を投入することにより、容器本体２の底面から間葉系幹細胞８を剥離させる。そして、その後に培養容器１全体を遠心分離機にかけることにより、剥離されて培地Ａ内に浮遊している間葉系幹細胞８が培地Ａから分離されることになる。
【００２３】
このとき、容器本体２に設けられた細胞数計測部３が遠心方向外方になるように、培養容器１を遠心分離機にセットすることにより、遠心力により分離された間葉系幹細胞８は、細胞数計測部３に向けて移動させられる。
特に、本実施形態によれば、細胞数計測部３が設けられている容器本体２の側壁には、細胞数計測部３に向けて先細になる導入部６が設けられているので、分離された間葉系幹細胞８は、図３に矢印で示されるように、導入部６に沿って細胞数計測部３に集められる。そして、最終的には、容器本体２内のほぼ全ての間葉系幹細胞８が細胞数計測部３に集積されることになる。
【００２４】
細胞数計測部３には、目盛り７が形成されているので、細胞数計測部３内に集積された間葉系幹細胞８の体積は、該集積された間葉系幹細胞８と培地Ａとの界面までの体積を目盛り７により計測することができる。遠心分離機の遠心力を予め設定しておくことにより、集積される間葉系幹細胞８の単位体積当たりの細胞数を設定しておくことができるので、間葉系幹細胞８の体積が判れば、細胞数が定量的に把握されることになる。
【００２５】
このように本実施形態に係る培養容器１によれば、容器本体２内部の細胞を細胞数計測部３内に集積させるだけで、細胞数を定量的に把握することができる。したがって、一次培養工程から二次培養工程に移行する前の段階で、一次培養工程における細胞の成長の度合を正確に把握することができ、二次培養工程における培養に充分な細胞数であるか否かを判断することができる。また、細胞数に合わせて二次培養工程において使用する生体組織補填材の量あるいは成長因子、分化誘導因子の量を調整することも可能となる。
【００２６】
なお、本実施形態においては、容器本体２の底面に付着して成長した間葉系幹細胞８をトリプシンのような蛋白質分解酵素を添加して剥離させることとしたが、これに代えて、容器本体２の内壁に、所定の温度を境界として疎水性と親水性とが切り替わる温度応答性処理を施すことにしてもよい。
温度応答性処理は、温度応答性高分子ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を共有結合で固定することにより行われる。温度応答性処理された領域は、３２℃を境界温度として、それ以上では、市販の細胞用培養容器と同程度の弱い疎水性を呈するが、温度を境界温度以下に冷却することにより高い親水性を呈するようになる領域となる。したがって、例えば、３７℃で培養した後に３２℃以下に冷却することにより、容器本体２内面を高い親水性を呈するように変化させ、非侵襲的に間葉系幹細胞８を剥離させることが可能となる。
【００２７】
また、上記各実施形態においては、培養する細胞として間葉系幹細胞８を例に挙げて説明したが、これに代えて、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の他の体細胞を培養する場合に適用してもよい。
また、容器本体２に供給する体液としては、骨髄液の他、末梢血、臍帯血でもよい。また、採取した骨髄液を遠心分離して得られた骨髄細胞のみを容器本体２内に供給することにしてもよい。
【００２８】
また、容器本体２に細胞数計測部３が設けられただけの培養容器１について説明したが、容器本体２に、培地Ａを貯留する培地容器、廃棄培地を収容する廃棄培地容器およびトリプシンを収容する酵素容器を、それぞれ開閉可能なバルブを介して接続しておくことにしてもよい（図示略）。このようにすることで、培地交換およびトリプシンによる剥離工程を密封された培養容器１内において行うことができる。
【００２９】
また、細胞数計測部３を構成するチューブ４を、例えば、加熱したカッタで切断しつつ、他のチューブに接合する無菌的チューブ接続方法を利用して、二次培養工程のための他の培養容器に接続することとすれば、集積させて細胞数を計測した全ての細胞を無菌的に他の容器に引き渡し、二次培養工程を継続して行うことが可能となる。
【００３０】
また、上記実施形態においては、細胞数計測部３を構成するチューブ４を一定の横断面を有するチューブ４とし、目盛り７を等間隔に形成することとしたが、これに代えて、横断面積が長さ方向に変化するチューブを採用してもよいし、目盛り７の間隔が異なるように形成してもよい。
また、導入部６は備えられていなくてもよい。
【００３１】
また、上記実施形態においては、容器本体２の形状を略長方形の袋状のものとして説明したが、これに限定されるものではなく、円形、楕円形等任意の形状を採用することができる。また、細胞数計測部３を容器本体２の一側面の中央部に設けることとしたが、これに代えて、略長方形の袋状をした容器本体２の角部に配置することにしてもよい。また、容器本体２等の材質も塩化ビニルに限定されるものではない。
【００３２】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係る培養容器によれば、容器本体に設けた細胞数計測部により、簡易に定量的に細胞数を把握することができるという効果を奏する。
その結果、測定された細胞数が予想された細胞数よりも少ない場合には、培養条件の不備を認識でき、あるいは、培養条件を改良することが可能となる。
また、一定の培養条件下において培養された細胞の細胞数を知ることで、細胞の活性度を把握することもできる。
その結果、その後に行われる二次培養工程における生体組織補填体の製造速度等を推定する１つの指標とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施形態に係る培養容器を示す平面図である。
【図２】図１の培養容器の細胞数計測部を示す正面図である。
【図３】図１の培養容器において、剥離された細胞が細胞数計測部へ導かれる様子を示す平面図である。
【図４】図２の細胞数計測部に細胞が集積された状態を示す正面図である。
【図５】この発明に係る培養容器が用いられる培養工程を説明する説明図である。
【符号の説明】
Ａ　培地
１　培養容器
２　容器本体
３　細胞数計測部
４　チューブ（閉塞管）
６　導入部
７　目盛り
８　間葉系幹細胞（細胞）
【図１】
2004113174.tif 000003
【図２】
2004113174.tif 000004
【図３】
2004113174.tif 000005
【図４】
2004113174.tif 000006
【図５】
2004113174.tif 000007