(57)【要約】【課題】反応効率及びトラップ効率を向上させ、検出物質を、短時間、高感度に検出できる検出装置を提供する。【解決手段】ストリップ５の検出区域に、免疫学的なエピトープ１３を有する第１の試薬１１を固定化する。このエピトープに対して免疫学的親和性を有する第２の試薬１０と、検出物質１に対して免疫学的親和性をする第１の反応成分９とを、それぞれ複数結合させた、結合用粒子７と、検出物質１に免疫学的親和性を有する第２の反応成分４を結合させた標識試薬２とを反応させる。検出区域の第１の試薬１１で免疫複合物４０を捕捉する。結合用粒子７同士の凝集反応を抑制するために、結合用粒子７を負に帯電させる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上流から下流に向け液体試料のフローマトリックス内のクロマト的な移動を構成可能に形成されたストリップを備え、
前記ストリップの下流側には、免疫学的なエピトープを有する第１の試薬が固定化され、
前記ストリップにおいて、前記第１の試薬よりも上流側には、
検出物質に免疫学的親和性を有する第２の反応成分を標識した標識試薬と、
前記第１の試薬と検出物質とを結合させる結合用粒子とが、
分散化状態で運動自在となるように保持されており、
前記結合用粒子は、
粒子本体と、
前記粒子本体に、複数結合され、かつ、前記第１の試薬の前記エピトープに免疫学的親和性を有する第２の試薬と、
前記粒子本体に、複数結合され、かつ、検出物質に免疫学的親和性を有する第１の反応成分とを有する、検出装置。
【請求項２】
前記結合用粒子は、負に帯電している、請求項１記載の検出装置。
【請求項３】
前記粒子本体は、ラテックスを具備する請求項１から２記載の検出装置。
【請求項４】
前記ラテックスは、ＣＭＬ（カルボキシレートモディファイトラテックス）を具備する請求項３記載の検出装置。
【請求項５】
前記標識試薬は、目視にて検出できる標識材により標識されている、請求項１から４記載の検出装置。
【請求項６】
前記標識材は、金属コロイド粒子を具備する、請求項５記載の検出装置。
【請求項７】
前記金属コロイド粒子は、金コロイド粒子を具備する請求項６記載の検出装置。
【請求項８】
前記標識材は、着色ラテックスを具備する請求項５記載の検出装置。
【請求項９】
前記結合用粒子の前記第１の反応成分に検出物質が結合し、この検出物質に前記標識試薬の前記第２の反応成分が結合して構成される、免疫複合物は、前記ストリップの平均ポアーサイズよりも小である、請求項１から８記載の検出装置。
【請求項１０】
前記第１の試薬は、タンパク質、多糖類、ポリマーに結合されたハプテンからなる群から、一種又は二種以上を選択したものを含む、請求項１から９記載の検出装置。
【請求項１１】
前記ハプテンは、ＤＮＰ（２，４−ジニトロフェニル）、ＴＮＰ（２，４，６−トリニトロフェニル）、ＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアヌレート）、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、ビオチンからなる群から、一種又は二種以上を選択したものである、請求項１０記載の検出装置。
【請求項１２】
上流から下流に向け液体試料のフローマトリックス内のクロマト的な移動を構成可能に形成されたストリップであって、
前記ストリップの下流側には、免疫学的なエピトープを有する第１の試薬が固定化され、
前記ストリップにおいて、前記第１の試薬よりも上流側には、
検出物質に免疫学的親和性を有する第２の反応成分を標識した標識試薬と、
前記第１の試薬と検出物質とを結合させる結合用粒子とが、
分散化状態で運動自在となるように保持されており、
前記結合用粒子は、
粒子本体と、
前記粒子本体に、複数結合され、かつ、前記第１の試薬の前記エピトープに免疫学的親和性を有する第２の試薬と、
前記粒子本体に、複数結合され、かつ、検出物質に免疫学的親和性を有する第１の反応成分とを有する、
ストリップについて、
前記ストリップの上流側に、液体試料と接触させて、前記結合用粒子及び前記標識試薬を運動自在とし、
検出物質、前記結合用粒子及び前記標識試薬による、免疫学的親和性反応を生じさせながら、フローマトリックス内をクロマト的に、前記第１の試薬に向けて、移動させ、
前記第１の試薬によって、
前記結合用粒子の前記第１の反応成分に検出物質が結合し、この検出物質に前記標識試薬の前記第２の反応成分が結合して構成される、免疫複合物を、捕捉する、検出方法。
【請求項１３】
前記結合用粒子は、負に帯電している、請求項１２記載の検出方法。
【請求項１４】
前記粒子本体は、ラテックスを具備する請求項１２から１３記載の検出方法。
【請求項１５】
前記ラテックスは、ＣＭＬ（カルボキシレートモディファイトラテックス）を具備する請求項１４記載の検出方法。
【請求項１６】
前記標識試薬は、目視できる標識材により標識されている、請求項１２から１５記載の検出方法。
【請求項１７】
前記標識材は、金属コロイド粒子を具備する、請求項１６記載の検出方法。
【請求項１８】
前記金属コロイド粒子は、金コロイド粒子を具備する請求項１７記載の検出方法。
【請求項１９】
前記標識材は、着色ラテックスを具備する請求項１６記載の検出方法。
【請求項２０】
前記結合用粒子の前記第１の反応成分に検出物質が結合し、この検出物質に前記標識試薬の前記第２の反応成分が結合して構成される、免疫複合物は、前記ストリップの平均ポアーサイズよりも小である、請求項１２から１９記載の検出方法。
【請求項２１】
前記第１の試薬は、タンパク質、多糖類、ポリマーに結合されたハプテンからなる群から、一種又は二種以上を選択したものである、請求項１２から２０記載の検出方法。
【請求項２２】
前記ハプテンは、ＤＮＰ（２，４−ジニトロフェニル）、ＴＮＰ（２，４，６−トリニトロフェニル）、ＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアヌレート）、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、ビオチンからなる群から、一種又は二種以上を選択したものである、請求項２１記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体試料（尿や血液など）内における検出物質（生体成分）の存否を検出する検出装置及び検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体成分からなる検出物質の検出手法として、抗原又は抗体を用いた免疫学的検出方法がある。この方法は、高感度であり、特異性、簡便性に優れ、広く臨床検査領域で使用されている。
【０００３】
これらの免疫学的検出方法の１つに、イムノクロマトグラフィー法（特許文献１参照）がある。この方法によれば、特殊な技術や訓練を経なくとも検出を行え、しかも、その操作性及び判定性は優れており、短時間で検出結果が得られる。
【０００４】
この方法を利用した商品が、妊娠診断薬などとして、既に、多数一般大衆向けに販売されている。また、この方法は、病院内で緊急用あるいは一次スクリーニング用として、ＴＰ（トレポネーマパリダム）、ＨＢｓ−Ａｇ（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウィルス）等に関する検査にも、利用されている。
【０００５】
一般に利用されているイムノクロマトグラフィー法の測定原理は、次のとおりである。まず、クロマトグラフ媒体（通常、ニトロセルロース膜）を有するストリップ内で、フローマトリックスを構成できるようにする。
【０００６】
そして、抗原あるいは抗体などを、着色ラテックス、金コロイドなどにより標識した標識試薬と、ストリップ上の検出区域に抗原あるいは抗体などを固定化した無標識試薬とを用い、液体試料中の検出物質の存在下で、免疫複合物を生成させる。
【０００７】
そして、無標識試薬で、免疫複合物を捕捉し、捕捉された標識試薬を、目視確認するものである。
【０００８】
この方法によれば、検出者は、単に、液体試料を添加位置に添加し、一定時間後に、検出区域における標識試薬の着色量を目視確認しさえすればよい。
【０００９】
次に、図５を用いて、この古典的イムノクロマトグラフィー法について、具体的に説明する。まず、図５（ａ）に示す検出物質１に対し、図５（ｂ）に示す標識試薬２を用意する。この標識試薬２は、検出物質１に対し免疫学的親和性を有する第２の反応成分４を、着色ラテックス又は金コロイド等のマーカー３で標識したものである。
【００１０】
一方、図５（ｃ）に示すように、ストリップ５に、検出物質１に免疫学的親和性を有する無標識試薬６を固定化する。
【００１１】
ここで、もし、液体試料中に十分な量の検出物質１が含まれていれば、検出物質１と標識試薬２の第２の反応成分４とが結合してなる、免疫複合物が生成され、図５（ｄ）に示すように、この免疫複合物は、無標識試薬６により捕捉されることになる。
【００１２】
この古典的イムノクロマトグラフィー法は、非常に単純で大量生産性に優れた完成度の高いものである。
【００１３】
しかしながら、世の中の流れとして、最近では、より高感度に、より短時間に結果が得られる検出法が、希求されている。
【００１４】
高感度化、測定時間の短縮化を実現させるためには、反応量の増加が必要であるが、古典的イムノクロマトグラフィー法は、これらの要求に対して、決定的な欠陥を有している。この欠陥の要因は、無標識試薬６をストリップ５に固定化している点であり、この点により、反応量の増加が阻害される。
【００１５】
一般的に、免疫反応はもちろん、化学反応、酵素反応など、溶液中における全ての反応は、反応する物質同士が衝突して初めて起こるものである。よって、反応速度を上げる方策として、
温度を上げて物質の運動を速くし衝突回数を上げる、
反応する物質の濃度を濃くして衝突する確率を増加する、
等の技術がある。
【００１６】
ここで重要な点は、反応する物質が、自由溶液中で何の障害もなく自由に動き回れるかどうかである。
【００１７】
すなわち、古典的イムノクロマトグラフィー法のように、免疫反応に与かる一方の無標識試薬６をストリップ５に永久的に固定化してしまうと、標識試薬２と検出物質１の免疫複合物が、無標識試薬６をクロマト的に通過する、極めて短い時間の間に、無標識試薬６と、この免疫複合物とが、衝突する偶然に依存する。運悪く、この衝突が起こらなければ、免疫複合物が生成されていても、検出結果に反映されないことになる。これは、致命的な欠点である。
【００１８】
この欠点を解決するために、固定化する無標識試薬６の量を増やすことが考えられる。しかしながら、無標識試薬６をストリップ５に固定化できる量には限りがあり、無制限に固定化できるわけではない。また、固定化量が多くなりすぎると、無標識試薬６同士の立体的障害のため、逆に反応性が低下する結果になることが多い。
【００１９】
この改良法も種々の提案がなされている。主なものとしては、検出区域の表面積の増大が挙げられる。例えば、予めラテックスなどの粒子に、無標識試薬６を固定化したものを、ストリップ５に埋め込む等である。
【００２０】
こうすると、免疫複合物の衝突効率の向上に対して効果はあるにしても、流路が狭くなることによる偽陽性ラインの発生など問題が多いうえ、思ったほどの高感度化及び測定時間の短縮に寄与しない。
【００２１】
また、むやみに無標識試薬６を増やすと、逆に、非特異反応が増加する結果になることが多い。よって、これもまた実用的な手法とはいえない。
【００２２】
そこで、古典的イムノクロマトグラフィー法の根本的な問題を解決する手段の一つとして、特許文献２記載の方法が提案されている。
【００２３】
この方法では、液相にて全ての成分を運動自在状態にしておいて、反応検出を行う。すなわち、第一の抗原（または抗体）に直接捕獲可能種（例えばビオチン）を結合させた試薬と、第二の抗原（あるいは抗体）を結合した検出可能な標識試薬と、検出物質を同一の液相系で自由反応状態にしておいて反応させる。
【００２４】
そして、発生した検出物質、直接捕獲可能種を結合させた試薬、標識試薬との三者による免疫反応複合物を、ストリップの検出区域に固定化した捕獲成分（例えば、ストレプトアビジンあるいはアビジンを感作したラテックスを検出区域に堆積する）で捕獲している。
【００２５】
しかしながら、この反応系において、免疫反応が自由溶液中で増大しても、基本的に、直接捕獲可能種を結合させた試薬と標識試薬とは、検出物質に対してそれぞれ一個ずつ結合するだけであり、図５に示した古典的イムノクロマトグラフィー法と、大同小異である。つまり、反応性増大による検出感度向上の効果は、顕著に現れない。
【００２６】
また、捕獲成分を粒子に固定化して単位面積当りの捕獲成分量を多くしたとしても、やはり捕獲成分による捕獲可能種のトラップ効率に問題があり、結果的に、反応性の増大は、あまり期待できない。また、トラップ効率を上げる方策として抗体濃度を上げることが考えられるが、コストの問題や非特異反応が生じる等、本来の目的から外れることになる。
【００２７】
さらに、この変法として、特許文献２では、ＦＩＴＣとそれに対する抗体を使用する方法が提示されている。しかし、検出区域に、抗ＦＩＴＣ抗体を固定しているため、濃度的な制約が多く、トラップ効率は、上述したアビジン−ビオチンシステムより劣り、結果は、芳しくない。
【特許文献１】特開平９−１７８７４８号公報
【特許文献２】特許第２５３２７８８号公報
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、古典的イムノクロマトグラフィー法、及びその改良法が本質的に持っている問題点を改善し、無標識試薬と検出物質との反応効率及び検出区域でのトラップ効率を向上させることにより、検出物質を、短時間で高感度にしかも安価で、免疫学的に検出する検出装置及び検出方法を提供することを目的とする。
【００２８】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の検出装置は、上流から下流に向け液体試料のフローマトリックス内のクロマト的な移動を構成可能に形成されたストリップを備え、
ストリップの下流側には、免疫学的なエピトープを有する第１の試薬が固定化され、
ストリップにおいて、第１の試薬よりも上流側には、
検出物質に免疫学的親和性を有する第２の反応成分を標識した標識試薬と、
第１の試薬と検出物質とを結合させる結合用粒子とが、
分散化状態で運動自在となるように保持されており、
結合用粒子は、
粒子本体と、
粒子本体に、複数結合され、かつ、第１の試薬のエピトープに免疫学的親和性を有する第２の試薬と、
粒子本体に、複数結合され、かつ、検出物質に免疫学的親和性を有する第１の反応成分とを有する。
【００２９】
この構成において、ストリップの上流側に、液体試料と接触させることにより、結合用粒子及び標識試薬を運動自在とし、検出物質、結合用粒子及び標識試薬による、免疫学的親和性反応を生じさせながら、フローマトリックス内をクロマト的に、第１の試薬に向けて、移動させる。
【００３０】
そして、結合用粒子の第１の反応成分に検出物質が結合し、この検出物質に標識試薬の第２の反応成分が結合して構成される、免疫複合物を、第１の試薬によって、捕捉する。
【００３１】
ここで、結合用粒子において、検出物質に免疫学的親和性を有する第１の反応成分が、その粒子本体に、複数結合されているため、第１の反応成分の個数倍だけ、１つの結合用粒子あたりの、標識試薬の数を、増すことができ、明確な呈色結果が得られる。
【００３２】
また、結合用粒子において、第１の試薬のエピトープに免疫学的親和性を有する第２の試薬が、その粒子本体に、複数結合されているため、第２の試薬の個数倍だけ、免疫複合物が、固定化された第１の試薬に衝突する確率を高めることができ、先鋭な検出結果が得られる。
【００３３】
請求項２記載の検出装置では、結合用粒子は、負に帯電している。
【００３４】
一般に、結合用粒子に、第１の反応成分を複数設けると、検出物質を介して、結合用粒子同士の凝集が発生しやすい。しかしながら、この構成を採用すると、結合用粒子同士が、電気的に反発しあい、凝集が回避される。しかも、負に帯電させているため、正に帯電させるよりも、一般的な免疫反応に使用されるｐＨ域において、取り扱いが容易となる。
【００３５】
請求項３記載の検出装置では、粒子本体は、ラテックスを具備する。
【００３６】
この構成により、ラテックスの表面積を活用して、第１の反応成分と第２の試薬とを、多数、粒子本体に設けることができ、感度を向上できる。しかも、ラテックスを粒子本体として使用することは、商業的に有利である。
【００３７】
請求項４記載の検出装置では、ラテックスは、ＣＭＬ（カルボキシレートモディファイトラテックス）を具備する。
【００３８】
この構成により、ラテックスの表面に存在するカルボキシル基を利用して、結合用粒子を、簡単に負に帯電させることができる。
【００３９】
請求項５記載の検出装置では、標識試薬は、目視にて検出できる標識材により標識されている。
【００４０】
この構成により、さらなる反応が不要であり、また分析機を使用しなくとも、免疫反応による呈色を、目視で直接確認できる。
【００４１】
請求項６記載の検出装置では、標識材は、金属コロイド粒子を具備する。
【００４２】
請求項７記載の検出装置では、金属コロイド粒子は、金コロイド粒子を具備する。
【００４３】
請求項８記載の検出装置では、標識材は、着色ラテックスを具備する。
【００４４】
これらの構成により、従前の検出法から大幅な変更を経ずに、本発明を適用できる。
【００４５】
請求項９記載の検出装置では、結合用粒子の第１の反応成分に検出物質が結合し、この検出物質に標識試薬の第２の反応成分が結合して構成される、免疫複合物は、ストリップの平均ポアーサイズよりも小である。
【００４６】
この構成により、免疫複合物の流動をスムーズにすることができる。
【００４７】
請求項１０記載の検出装置では、第１の試薬は、タンパク質、多糖類、ポリマーに結合されたハプテンからなる群から、一種又は二種以上を選択したものを含む。
【００４８】
この構成により、第１の試薬が効率よく、免疫複合物を捕捉し、トラップ率を向上できる。また、第１の試薬の、単位面積当たりのエピトープの量を、１分子当たりのハプテンの結合量を増減することにより、トラップ率を自由にコントロールでき、一般的なタンパク質を用いるよりも、遙かに反応性の自由度を広くすることができる。
【００４９】
請求項１２記載の検出装置では、ハプテンは、ＤＮＰ（２，４−ジニトロフェニル）、ＴＮＰ（２，４，６−トリニトロフェニル）、ＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアヌレート）、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、ビオチンからなる群から、一種又は二種以上を選択したものである。
【００５０】
この構成により、入手しやすい材料により、本発明を実施できる。
【００５１】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。まず、図１及び図２を用いて、その概要を述べる。なお以下、従来の構成を示す図５と同様の構成要素については、同一符号を付すことにより、説明を省略する。
【００５２】
さて、図１（ａ）及び図１（ｂ）に示すように、検出物質１と標識試薬２とは、図５と同様にして差し支えない。ところで、本形態では、図１（ｃ）に示す結合用粒子７と、図１（ｄ）に示す第１の試薬１１とを使用する。
【００５３】
図１（ｃ）に示すように、結合用粒子７は、粒子本体８と、粒子本体８に、複数結合され、かつ、第１の試薬１１のエピトープ１３に免疫学的親和性を有する第２の試薬１０と、粒子本体８に、複数結合され、かつ、検出物質１に免疫学的親和性を有する第１の反応成分９とを有する。
【００５４】
また、図１（ｄ）に示すように、第１の試薬１１は、ストリップ５上であって、下流側に固定される土台部１２と、土台部１２の上部に複数存在するエピトープ１３とを有する。
【００５５】
そして、結合用粒子７が液体試料に接触し、運動自在になった際、液体試料に、検出物質１が含まれていれば、図１（ｅ）に示すように、結合用粒子７の第１の反応成分９と、検出物質１とが結合する。さらにこのとき、その周囲に、標識試薬２が存在すれば、図１（ｆ）に示すように、検出物質１に、標識試薬２の第２の反応成分４が結合し、免疫複合物４０が形成される。
【００５６】
免疫複合物４０がストリップ５をクロマト的に移動し、第１の試薬１１に近づくと、結合用粒子７の第２の試薬１０が第１の試薬１１のエピトープ１３に結合し、免疫複合物４０が捕捉されることになる。
【００５７】
ここで、図１（ｇ）を見れば明らかなように、本形態によれば、結合用粒子７に複数設けられた第２の試薬１０のいずれかが、第１の試薬１１に、複数存在するエピトープ１３のいずれかに結合すれば、免疫複合物４０が捕捉されるのであり、従来法よりも、トラップ効率が向上する点が理解されよう。
【００５８】
また、一旦、免疫複合物４０が捕捉されれば、免疫複合物４０には、複数の標識試薬２が結合できるから、呈色が鮮明にあらわれるものである。
【００５９】
ここで、図１（ｅ）に示すように、結合用粒子７に複数の第１の反応成分９を設けると、結合用粒子７の第１の反応成分９に検出物質１が結合した際、一般に、図２（ａ）に示すように、検出物質１を介して、結合用粒子同士が凝集してしまうことがある。この凝集が連鎖的に発生すると、ストリップ５のポアーサイズよりも大きな、巨大な凝集物が形成され、自由な流動が阻害される。
【００６０】
しかしながら、本形態では、後に詳述するように、結合用粒子７を負に帯電させているため、図２（ｂ）に示すように、結合用粒子７と結合用粒子７とが、電気的に反発しあって、図２（ａ）のような凝集を回避でき、自由な流動を担保できる。
【００６１】
以下、さらに詳しく説明する。さて本形態では、液体試料中の検出物質１の検出又は測定のためのイムノクロマトグラフィーにストリップ５を使用する。
【００６２】
そして、ストリップ５の、下流側のフローマトリックス内に、検出区域を設け、この検出区域に、免疫学的なエピトープを有する第１の試薬を固定化する。
【００６３】
また、この検出区域よりも上流側に、結合用粒子７と、標識試薬２とを、乾燥状態で保持する。結合用粒子７と、標識試薬２とは、液体試料と接触させることにより再分散化され、検出物質１、結合用粒子７及び標識試薬２は、免疫学的親和性反応を生じながら、ストリップ５内をクロマト的に検出区域へ向けて移動する。
【００６４】
そして、検出区域において、第１の試薬１１が、免疫複合物４０を捕捉することにより、検出物質１の存在の有無（陽性／陰性）を、標識試薬２により、目視あるいはセンシングによって、判定可能となる。
【００６５】
なお、第１の反応成分９と第２の反応成分４は、同一であっても同一でなくても良い。
【００６６】
結合用粒子７は、その表面に元々陰イオンにチャージするイオン種を持っていても良いし、後に陰イオン性を有する物質を付加しても良い。
【００６７】
原則として良好な反応性を持たせるために、粒子本体８は、球状あるいは球状に近い形状とすることが望ましい。
【００６８】
また、免疫複合物４０の大きさは、フローマトリックス内を生物学特異的免疫反応を生じながら自由に移動できるために、ストリップ５のポアーサイズより小さくする。
【００６９】
粒子本体８の大きさは、使用するストリップ５を用いて実験的に設定できる。液体試料と同じ移動速度での移動を可能にするためには、ストリップ５のポアーサイズの１／５以下の直径を有する粒子が理想的である。
【００７０】
即ち、一般的に使用されるニトロセルロースメンブレンフィルターでは、０．８μｍ以下の粒子径が有効である。下限は特に制限はないが、取扱い上０．０６μｍ以上の粒子径の使用が好ましい。
【００７１】
粒子本体８として、商業的に有用なのは、重合化スチレン又は他の重合化アルケン／アルカジエンである所謂ラテックス粒子である。
【００７２】
これらのラテックスの表面に、陰性電荷を持たせるためには、（第１の試薬１１のエピトープに対する免疫学的親和性を有する）第２の試薬１０と、第１の反応成分９をラテックス表面に固定化した後、ｐｏｌｙ（ｓｏｄｉｕｍ  ４−ｓｔｙｒｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）等の陰イオン、特にスルホネート基を有するポリマーや、カゼインなどのタンパクでコーティングする方法、やＣａｒｂｏｘｙｌ  Ｌａｔｅｘ、Ｃａｒｂｏｘｙｌ／Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｌａｔｅｘ、ＣＭＬ（Ｃａｌｂｏｘｙｌａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｌａｔｅｘ）と称される一群のラテックスを使用する方法もある。
【００７３】
それらの中で最も実用的なのは、ＣＭＬである。ＣＭＬの表面には、カルボキシル基が多数存在し、陰イオンバリアーを形成して粒子同士の凝集を防いでいる。通常、このカルボキシル基は、Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇのための結合基として使用されるが、本形態では、カルボキシル基を、イオンバリアーとしてそのまま残すため、Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ法は、使用しない。なお、第１の反応成分９及び第２の試薬１０は、粒子本体８に、通常の物理的吸着法で固定化して設ける。
【００７４】
ＣＭＬの表面に存在するカルボキシル基の数によって、結合用粒子７同士の電荷的な反発力が変わる。このカルボキシル基の数を示す効果的な表現方法として、ＰＡ（Ｐａｒｋｉｎｇ  Ａｒｅａ）がある。このＰＡは、カルボキシル基一個が占有するラテックス粒子の表面積を示しており、ＰＡの値が大きいことは、カルボキシル基のラテックス表面の密度が低いことを意味している。
【００７５】
通常使用できるＣＭＬの電荷密度は、ＰＡの値として、３０〜１２０位である。これ以外でも使用できるが、ＰＡが小さくなりすぎると、結合用粒子７への標識試薬の接近が阻害されて、反応性が抑制される傾向が強くなり、好ましくない。
【００７６】
逆に、ＰＡが１２０より大きくなると、図２（ｂ）に示した、免疫的凝集反応の抑制力が弱まり、結合用粒子７同士が凝集を起こして、マトリックス内を自由に移動できないようになり、好ましくない。
【００７７】
ＣＭＬを含むラテックス類は、ＩＮＴＥＲＦＡＣＩＡＬ  ＤＹＮＡＭＩＣＳ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ社（ＵＳＡ），ＰＯＬＹＳＣＩＥＮＣＥ社（ＵＳＡ），ＢＡＮＧＳ  ＬＡＢ社（ＵＳＡ），ＳＥＲＡＤＹＮ社（ＵＳＡ），積水化学（日本）等から容易に入手可能である。
【００７８】
ここで使用している第１の試薬１１に対する第２の試薬１０は、ポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体どちらも使用可能である。
【００７９】
また、第１の試薬１１につき、免疫複合物４０を効率良く捕獲するために、通常の抗原になりうるタンパク質ではなく、土台部１２として、タンパク質、デキストランなどの多糖類、あるいはラテックスなどのポリマーを使用する。そして、エピトープ１３として、所謂ハプテン（ＤＮＰ（２，４−ジニトロフェニル）、ＴＮＰ（２，４，６−トリニトロフェニル）、ＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアヌレート）、ＤＩＧ（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ビオチン等）を、土台部１２の１分子当たり、少なくとも数個、好ましくは、１０個以上結合させる。
【００８０】
これら第１の試薬１１は、試験材の製法例１または同例２で示すような方法で、自ら作製可能であるし、１部はＳＩＧＭＡ社（ＵＳＡ）などから市販されているので市販品を利用することもできる。
【００８１】
マーカー３と第２の反応成分４とを有する標識試薬２は、検出物質１に対する抗体を感作した金コロイド等の金属ゾル、着色ラテックスなどのポリマーが有効であるが、この場合も、反応効率の点から、球状粒子が望ましい。
【００８２】
また、標識試薬２は、粒子本体８と同じ大きさか、もしくはそれよりも小さく形成することが望ましい。
【００８３】
ストリップ５は、通常クロマトグラフィーに使用されている担体、例えばニトロセルロース、ナイロン、ガラスフィルター、ろ紙などで構成する。
【００８４】
なお、説明の都合上、検出物質が抗原である場合を述べているが、本発明は、検出物質が抗体である場合にも適用でき、この場合も本発明に包含される。
【００８５】
（実施例）
以下に実施例をあげて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、この実施例により何ら限定されるものではない。
【００８６】
試験材の製法  例１
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）へのＤＮＰ基の導入
ＢＳＡ  ２０ｍｇと炭酸カリウム２０ｍｇを精製水に溶解し１ｍｌとする。この溶液に２，４ジニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＮＢＳ）を２０ｍｇ加え、３７℃で遮光下に緩やかに攪拌しながら２４時間反応させる。
【００８７】
反応終了後、ＤＮＰ−ＢＳＡと未反応のＤＮＢＳ及び分解物のジニトロフェノールをセファデックスＧ２５カラムで分離し、限外濾過用フィルターを用いて濃縮する。０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過し、遮光下冷蔵保存する。
【００８８】
試験材の製法  例２
ＢＳＡへのＦＩＴＣの導入
２００ｍｇのＢＳＡを０．５Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）１０ｍｌに溶かし、攪拌下に１０ｍｇのＦＩＴＣを加える。遮光下、３０℃で緩やかに攪拌を続けながら６時間反応させる。ＦＩＴＣ−ＢＳＡと未反応物をセファデックスＧ２５を用いて分離し、限外濾過用フィルターを用いて濃縮する。０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過し、遮光下冷蔵保存する。
【００８９】
試験材の製法  例３
ＣＭＬへの抗ＦＩＴＣ抗体及び抗ＨＢｓＡｇ抗体の固定化
ＣＭＬ（０．１５０μｍ，ＰＡ＝６０，１０ｗｔ％  ｓｏｌｉｄ）を５０μｌ採り、遠心機を用いてラテックスを沈殿させて、上清を除く。精製水を加えて、ソニケーションによりラテックスを再分散させて、更に遠心洗浄を繰り返す。最終的に０．５ｗｔ％になるように５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝６．０）に分散させる。
【００９０】
このラテックス溶液に、抗ＦＩＴＣマウスモノクローナル抗体２００μｇと抗ＨＢｓ−Ａｇマウスモノクローナル抗体（１ｅ１１、ＩｇＭ、Ｍｉｚｕｈｏ  Ｍｅｄｙ社製）４００μｇを同時に添加し、よく混合後、緩やかに攪拌させながら２５℃で２時間以上インキュベートする。１０％ＢＳＡ溶液を１００μｌ加えて、ブロッキング処理をする。
【００９１】
更に、３０分以上インキュベートし、ブロッキング処理を完結させる。遠心洗浄により未吸着成分を除く。最終的に０．５ｗｔ％濃度のラテックス溶液として、５ｍＭ濃度のＥＰＰＳ緩衝液に分散させて、冷蔵保存する。
【００９２】
試験材の製法  例４
抗ＨＢｓＡｇ抗体感作金コロイドの作製法
粒径３０ｎｍの金コロイドを、Ｇ．  Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ，２４１，２０，１９７３）法に従い作製した。金コロイド溶液９０ｇに５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝６．５）を１０ｇ加えてよく混合し、最終ｐＨを６．５とする。０．５ｍｇの抗ＨＢｓ−Ａｇマウスモノクローナル抗体（１ｆ９、ＩｇＧ、Ｍｉｚｕｈｏ  Ｍｅｄｙ社製）を金コロイド溶液に加え、穏やかに混合後、２５℃で２時間以上インキュベートする。１０％ＢＳＡ溶液を１ｍｌ加えて更に３０分以上インキュベートし、ブロッキング処理を完結させる。遠心洗浄により未吸着の抗体を除く。５ｍＭ濃度のＥＰＰＳ緩衝液に分散させて、最終的に４．５ｇ（２０倍濃縮）量とする。冷蔵保存する。
【００９３】
試験材の製法  例５
ＣＭＬへの抗ＦＩＴＣ抗体及び抗ｈＣＧ抗体の固定化
ＣＭＬ（０．１５０μｍ，ＰＡ＝６０，１０ｗｔ％  ｓｏｌｉｄ）を５０μｌ採り、遠心機を用いてラテックスを沈殿させて、上清を除く。精製水を加えて、ソニケーションによりラテックスを再分散させて、更に遠心洗浄を繰り返す。最終的に０．５ｗｔ％になるように５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝６．０）に分散させる。
【００９４】
このラテックス溶液に、抗ＦＩＴＣマウスモノクローナル抗体２００μｇと抗ｈＣＧマウスモノクローナル抗体２００μｇを同時に添加し、よく混合後、緩やかに攪拌させながら２５℃で２時間以上インキュベートする。１０％ＢＳＡ溶液を１００μｌ加えて、ブロッキング処理をする。
【００９５】
更に、３０分以上インキュベートし、ブロッキング処理を完結させる。遠心洗浄により未吸着成分を除く。最終的に０．５ｗｔ％濃度のラテックス溶液として、５ｍＭ濃度のＥＰＰＳ緩衝液に分散させて、冷蔵保存する。
【００９６】
試験材の製法  例６
抗ｈＣＧ抗体感作金コロイドの作製法
粒径３０ｎｍの金コロイドを、Ｇ．  Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ，２４１，２０，１９７３）法に従い作製した。金コロイド溶液９０ｇに５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝６．５）を１０ｇ加えてよく混合し、最終ｐＨを６．５とする。０．５ｍｇの抗ｈＣＧマウスモノクローナル抗体を金コロイド溶液に加え、穏やかに混合後、２５℃で２時間以上インキュベートする。１０％ＢＳＡ溶液を１ｍｌ加えて更に３０分以上インキュベートし、ブロッキング処理を完結させる。遠心洗浄により未吸着の抗体を除く。５ｍＭ濃度のＥＰＰＳ緩衝液に分散させて、最終的に４．５ｇ（２０倍濃縮）量とする。冷蔵保存する。
【００９７】
実施例１
試験材製法  例２に示す方法で作製したＦＩＴＣ−ＢＳＡをリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、ＦＩＴＣによる吸収である４９５ｎｍの吸光度が０．１Ａｂｓになるように濃度を調製し、ＢＩＯ  ＤＯＴ  ＸＹＺ３０００（商標）塗布機（ＢＩＯ  ＤＯＴ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ社，ＵＳＡ）を用いて、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ＨＦ１３５（商標）ニトロセルロースメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社，ＵＳＡ）に１μｌ／ｃｍで塗布し、自然乾燥させて固定化し、テストラインとした。
【００９８】
また、反応の確認のためのリファレンスラインとして、１ｍｇ／ｍｌ濃度の抗マウス抗体を同様に１μｌ／ｃｍで塗布し、自然乾燥させて固定化した。
【００９９】
ガラスフィルター  Ｆ０７５−１７（商標）（Ｗｈａｔｍａｎ社，Ｅｎｇｌａｎｄ）に１０％ショ糖、試験材の製法例３及び同例４による方法で作成した、感作ＣＭＬと感作金コロイド、少量の塩及びタンパク質、安定化剤、２０ｍＭ  ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ＝８．０）の混合溶液を塗布し、凍結乾燥してコンジュゲートパッドを作製した。
【０１００】
一方、同ガラスフィルターに同緩衝液に可溶化したマウス血清を塗布し、同じく凍結乾燥により検体吸収パッドを作製した。
【０１０１】
これらの部材を用いて、ＨＢｓ抗原の検査装置を作製した。図３（ａ）は、本発明の一実施の形態におけるＨＢｓ抗原検査装置の外観図である。
【０１０２】
図３（ａ）に示すように、ケーシング１４内には、検査用のストリップ５が収納されている。ケーシング１４には、滴下窓１５、検出窓１６、リファレンス窓１７が開設されている。
【０１０３】
滴下窓１５には、液体試料１００μｌが滴下され反応が開始する。検出窓１６には、ＨＢｓ抗原が存在した場合、金コロイドの赤紫のラインが出現する。リファレンス窓１７には、反応の確認用のラインがあらわれ、クロマト反応がうまくいった場合、陽性／陰性にかかわらず、常に、金コロイドの赤紫のラインが出現する。
【０１０４】
図３（ｂ）は、同ストリップの断面図である。吸収パッド１９は、免疫的な非特異反応回避部であり、その下部に感作ラテックスと感作金コロイドを含んだコンジュゲートパッド２０が位置している。
【０１０５】
吸水部２２は、通常アブソーベントペーパーとして市販されているものから選択されるが、ここでは、３ＭＭ  ｃｈｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社）を使用している。
【０１０６】
ニトロセルロースメンブレンフィルター１８において、検出窓１６内には、ＦＩＴＣ−ＢＳＡから構成される第１の試薬１１が固定化されている。また、リファレンス窓１７内には、反応確認用の抗マウスモノクローナル抗体２１が固定化されている。
【０１０７】
比較例として、ＦＩＴＣ−ＢＳＡの代わりに、抗ＨＢｓ−Ａｇ抗体を１ｍｇ濃度でニトロセルロースメンブレンフィルターの検出区域に塗布固定化してテストラインとし、コンジュゲートパッドは感作金コロイドのみをガラスフィルターに塗布し、凍結乾燥した。それ以外は、上記と同様に、古典的イムノクロマトシステムを構築した。ハウジングは、図３（ａ）と同じものを用いた。
【０１０８】
実施例１と比較例とによる、ＨＢｓ抗原を測定する検出装置を作製し、各濃度に調製したＨＢｓ抗原コントロール試料を１００μｌ検体滴下部に添加し、１５分後、検出区域における金コロイドの呈色強度を調べ、実施例１と古典的イムノクロマトシステム法との感度比較を行った。
【０１０９】
【表１】
2004219241.tif 000003
【０１１０】
結果を表１に示す。表１の評価結果において、−は着色なし、±は僅かに着色、＋は着色、＋＋強く着色を表す。表１により、本発明の検出方法の方が、感度が良好であることが、理解されよう。
【０１１１】
実施例２
試験材の製法例３に示す方法に従い、感作ＣＭＬを作製した。
【０１１２】
また同様に、通常のポリスチレンラテックス（ＰＳ，０．１５０μｍ）を用いて抗ＨＢｓ−Ａｇ抗体（１ｅ１１）４００μｇと抗ＦＩＴＣ抗体（１０−Ｆ５０）２００μｇを固定化したものを２種作製し、一方は、ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、感作ラテックス（ＰＳ−ＢＳＡ）とした。他方は、乳製カゼイン（ＳＩＧＭＡ）を用いてブロッキング処理し、感作ラテックス（ＰＳ−Ｃａｓｅｉｎ）とした。
【０１１３】
実施例１と同様に、ＨＢｓ抗原を測定する検出装置を作製し、結合用粒子表面上の陰イオン付与による免疫凝集反応の阻止効果を調べた。
【０１１４】
また、ハウジングを分解し、コンジュゲートパッド部から検出区域にかけてのメンブレン上の金コロイドによる着色が有るか無いかに従って、結合用粒子同士による凝集の有無を確認した。
【０１１５】
【表２】
2004219241.tif 000004
【０１１６】
結果を表２に示す。表２の評価結果において、−は着色なし、±は僅かに着色、＋は着色、＋＋強く着色を表す。表２により、実施例２では、凝集が効果的に抑制され、しかも感度が良好なことが理解されよう。
【０１１７】
実施例３
試験材の製法例２によりＦＩＴＣ−ＢＳＡを作製した。４９５ｎｍの吸光度が０．１ＡｂｓとなるようにＰＢＳで希釈した。この溶液を実施例１と同様にＢＩＯ  ＤＯＴ  ＸＹＺ３０００（商標）を使用して、Ｉｍｍｕｎｏｐｏｒｅ  ＦＰ（商標）（Ｗｈａｔｍａｎ社，Ｅｎｇｌａｎｄ）ニトロセルロースメンブレンフィルターに１μｌ／ｃｍで塗布し、自然乾燥させ、テストラインとした。
【０１１８】
リファレンスラインは、実施例１と同様、抗マウス抗体を塗布した。試験材の製法例５及び同例６で作製した感作ＣＭＬ及び感作金コロイド、１０％ショ糖、１％ＢＳＡを２０ｍＭ  ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ＝８．０）に投入し、ガラスパッドに塗布し、凍結乾燥してコンジュゲートパッドを作製した。
【０１１９】
比較例として、特許文献２記載の方法で、クロマトシステムを構築した。即ち１．０２μｍのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ（Ｓｅｒａｄｙｎ社，ＵＳＡ）を、Ｉｍｍｕｎｏｐｏｒｅ  ＦＰに堆積した。試験材の製法例５で使用した抗ｈＣＧマウスモノクローナル抗体をＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社，ＵＳＡ）で処理し、ビオチン化抗ｈＣＧマウスモノクローナル抗体を作製した。
【０１２０】
感作金コロイドは、上記と同じ物を使用した。ビオチン化抗ｈＣＧ抗体、感作金コロイドを含む緩衝液成分を上記と同様にガラスパッドに塗布し、凍結乾燥してコンジュゲートパッドを作製した。
【０１２１】
実施例３及び比較例により、図４（ａ）、（ｂ）に示すｈＣＧ検査装置を作製した。図４（ａ）は、本発明の一実施の形態における採尿部のＷｉｃｋ用のキャップを外したｈＣＧ検査装置の外観図である。
【０１２２】
ケーシング３０には、検出窓３１とリファレンス窓３２とが開設されている。検出窓３１内には、結果が陽性の場合、金コロイドによる赤紫のラインが出現する。リファレンス窓３２内には、反応がうまくいった場合、陽性／陰性にかかわらず、常に、金コロイドのラインがあらわれる。
【０１２３】
また、採尿部３３として、ＴＲＡＮＳＯＲＢ  Ｗｉｃｋ（Ｆｉｌｔｒｏｎａ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ社，ＵＳＡ）を界面活性剤を含んだ緩衝液成分で処理したものを使用した。
【０１２４】
図４（ｂ）は、同ストリップの断面図である。コンジュゲートパッド３４には、感作ラテックス及び感作金コロイドが含めてある。吸水部３６として、実施例１と同様にＷｈａｔｍａｎの３ＭＭｃｈｒを使用した。
【０１２５】
ニトロセルロースメンブレンフィルター３５において、コンジュゲートパッド３４と吸水部３６の間の検出区域には、第１の試薬１１としてＦＩＴＣ−ＢＳＡを固定化した。
【０１２６】
比較例として、コンジュゲートパッド３４のかわりに、ビオチン化抗ｈＣＧ抗体、及び感作金コロイドを含んだコンジュゲートパッドを用い、第１の試薬１１のかわりに、ストレプトアビジン固定化ラテックスを、ニトロセルロースメンブレンフィルター３５の検出区域に堆積したものを、用意した。
【０１２７】
実施例３と比較例による、検査装置を用いて、各濃度に調製したｈＣＧコントロール液を１ｍｌ採尿部に添加し、３分後の検出部の金コロイドによるラインの呈色強度を調べ、実施例３と従来から知られている古典的イムノクロマトグラフィー法の改良法（特許文献２）との感度比較を行った。
【０１２８】
【表３】
2004219241.tif 000005
【０１２９】
結果を表３に示す。表３の評価結果において、−は着色なし、＋は着色、＋＋強く着色を表す。表３より、本発明によれば、より短時間に、かつ、高感度に、ｈＣＧ抗原を検出できることが理解されよう。
【０１３０】
【発明の効果】
本発明によれば、古典的イムノクロマトグラフィー法、及びその改良法が本質的に持っている問題点を改善し、無標識試薬と検出物質との反応効率及び検出区域でのトラップ効率を向上させることができ、検出物質を、短時間で高感度にしかも安価で、免疫学的に検出できる。
【０１３１】
また、結合用粒子を負に帯電させることにより、ＨＢｓ抗原のような多価抗原タンパク検出時においても、結合用粒子同士の凝集を回避して、高感度に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）本発明の一実施の形態における検査法の過程説明図
（ｂ）同過程説明図
（ｃ）同過程説明図
（ｄ）同過程説明図
（ｅ）同過程説明図
（ｆ）同過程説明図
（ｇ）同過程説明図
【図２】（ａ）同凝集の説明図
（ｂ）同凝集回避の説明図
【図３】（ａ）同ＨＢｓ抗原検査装置の外観図
（ｂ）同ストリップの断面図
【図４】（ａ）同ｈＣＧ検査装置の外観図
（ｂ）同ストリップの断面図
【図５】（ａ）従来の検査法の過程説明図
（ｂ）同過程説明図
（ｃ）同過程説明図
（ｄ）同過程説明図
【符号の説明】
１  検出物質
２  標識試薬
３  マーカー
４  第２の反応成分
５  ストリップ
６  無標識試薬
７  結合用粒子
８  粒子本体
９  第１の反応成分
１０  第２の試薬
１１  第１の試薬
１２  土台部
１３  エピトープ
１４、３０  ケーシング
１５  滴下窓
１６、３１  検出窓
１７、３２  リファレンス窓
１８、３５  ニトロセルロースメンブレンフィルター
１９  吸収パッド
２０、３４  コンジュゲートパッド
２１  抗体
２２、３６  吸水部
３３  採尿部
４０  免疫複合物
【図１】
2004219241.tif 000006
【図２】
2004219241.tif 000007
【図３】
2004219241.tif 000008
【図４】
2004219241.tif 000009
【図５】
2004219241.tif 000010