(57)【要約】【課題】本発明は、遺伝子のタンパク発現法において、十分な天然型の活性をもつＭ毒素を効率的に大量に作製する方法を提示することを目的とするものである。【解決手段】細胞自体あるいは、細胞諸器官を用いてシャペロンタンパク質との共発現により、天然型あるいはそれに近い活性型の細胞障害タンパク質Ｍ毒素を発現する方法。細胞障害タンパク質Ｍ毒素の製造法。これら方法で得られた細胞障害タンパク質Ｍ毒素。このタンパク質を用いてスクリーニングする方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞自体あるいは、細胞諸器官を用いてシャペロンタンパク質との共発現により、天然型あるいはそれに近い活性型の細胞障害タンパク質Ｍ毒素を発現する方法。
【請求項２】
（１）一の抗生剤耐性遺伝子を有するプラスミドを用いて、細胞障害タンパク質Ｍ毒素遺伝子をその中の発現用プロモーター遺伝子の下流に組み入れた遺伝子組替え体を作成し
（２）（１）とは異なる複製起点と異なる抗生剤耐性遺伝子をもつプラスミドで、シャペロンタンパクの遺伝子を組み込んだ組替え体を作成し
（３）（１）あるいは（２）で作成した組替え体を用いて、コンピテント化した細胞に形質転換し
（４）（３）で得た形質転換体を再度、コンピテント細胞にして、もう一方の組替え体で形質転換を行う
工程からなる細胞障害タンパク質Ｍ毒素の製造法。
【請求項３】
請求項１または２記載の方法で得られた細胞障害タンパク質Ｍ毒素。
【請求項４】
形質転換体が独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２１８で寄託されている請求項１または２または３記載の細胞障害タンパク質Ｍ毒素。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質を用いて、そのタンパク質の活性を促進または阻害する化合物について、温血動物細胞を用いて陰性または陽性対照群との比較で、細胞増殖阻害活性、細胞障害活性あるいは細胞死により当該化合物をスクリーニングする方法。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質を用いて、そのタンパク質の活性を促進または阻害する化合物について、温血動物細胞以外のＭ毒素の活性の代位となる活性評価系について、陰性または陽性対照群との比較で、当該化合物をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘリコバクターピロリの産生する細胞障害タンパク質Ｍ毒素の新規な発現方法とその利用に関する。
【０００２】
【従来技術】
ヘリコバクターピロリは、胃炎、胃潰瘍、胃癌の原因とみなされながら、それらの病因の端緒と言うべき、胃粘膜細胞破壊の決定的毒性因子が長らく不明だったが、ようやく不可逆的で強力な粘膜破壊作用を示すＭ毒素が単離され、その病原性や治療、予防への一歩をしるすに至った。
【０００３】
しかし、このＭ毒素は、菌体より精製することは困難が多く、今後の研究のためには、遺伝子からの発現により直接生産されることが望まれている。
【０００４】
Ｍ毒素は、その由来がグラム陰性菌でもあり、他の哺乳類細胞等による発現では、本来存在しない余分な糖鎖付加の問題が生じるおそれも高く、大腸菌発現系による回収が望まれるところであるが、この方法おいても発現毒素タンパクがほとんど封入体としてしか回収されないという困難があった。この封入体をリフォールディング法により回収する方法も十分な活性のもの、すなわち天然型を確保する方法は確立されていないのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝子のタンパク発現法において、十分な天然型の活性をもつＭ毒素を効率的に大量に作製する方法を提示することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は１細胞内に２つのプラスミドを形質転換により同時に共存せしめた形質転換体を作成した。ここにおいて、ひとつのプラスミドにはＭ毒素の遺伝子を、もう一つのプラスミドにはシャペロンタンパクをコードする遺伝子を挿入し、おのおの別のプロモーターでＭ毒素とシャペロンタンパクが誘導されるように配した。ただし、用いる細胞はかならずしも細菌細胞に限定されず、タンパク合成、翻訳をおこなうすべての細胞で行いうる。また、形質転換に用いる遺伝子もプラスミドに限定されず、当該タンパクの転写、翻訳に関与しうる遺伝子体は広く利用しうる。
この形質転換体の細胞内において適宜、それぞれのタンパク質の誘導のタイミング、あるいは細胞培養の条件を検討することにより、目的とするＭ毒素の天然型と同等あるいはそれに近い活性を有するタンパクを作成しうる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の二重形質転換体は、公知の形質転換法を用いることにより製造できる。さらに詳細には本発明の二重形質転換体は次の（１）〜（４）の工程により製造される。即ち、
（１）一の抗生剤耐性遺伝子を有するプラスミドを用いて、Ｍ毒素遺伝子をそのなかの発現用プロモーター遺伝子の下流に組み入れた遺伝子組替え体を作成する。
（２）（１）とは異なる複製起点と異なる抗生剤耐性遺伝子をもつプラスミドで、シャペロンタンパクの遺伝子を組み込んだ組替え体を作成する。
（３）（１）あるいは（２）で作成した組替え体を用いて、コンピテント化した細胞に形質転換する。
（４）（３）で得た形質転換体をもう一度、コンピテント細胞にして、もう一方の組替え体で形質転換を行う。
以下、具体的な工程とその結果について詳述する。
【０００８】
本発明者は、Ｍ毒素とシャペロンタンパクの共発現系に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた。
Ｍ毒素の遺伝子はｐＥＴ４４ＥＫ／ＬＩＣ  （Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて組換え体を作成した。この挿入遺伝子の鋳型はヘリコバクター６０１９０よりプルーフリーディングの校正機能のあるＰＣＲ法により得られたものを使用した。これにより得られた遺伝子のセンス鎖の５‘側にはＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧが付加されたものを、またアンチセンス鎖の３’側にはＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＴＴＡが付加されたものをプライマーとしてＰＣＲ法により作成した。この作成した挿入遺伝子を２５ｍＭｄＡＴＰと１００ｍＭＤＴＴの存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼによりベクターのＬＩＣ部位に合うように削りこみをおこなったのち、突出部分を接続させ、２５ｍＭＥＤＴＡ存在下で加温し、挿入を完成した。
一方、シャペロンタンパクを組込んだプラスミドは、ｐＧ−ＫＪＥ８，およびｐＧｒｏ７，（いずれもＨＳＰ研究所）を用いた。これらは、シャペロンタンパクとしてｐＧ−ＫＪＥ８はｄｎａＫ，  ｄｎａＪ，  ｇｒｐＥ，  ｇｒｏＥＳ，  ｇｒｏＥＬを、  ｐＧｒｏ７はｇｒｏＥＳ，  ｇｒｏＥＬをそれぞれ組み込まれている。また、これらはクロラムフェニコール耐性遺伝子をマーカーとし、ｐＡＣＹＣを複製起点としている。このことはｐＥＴ４４が複製起点としてｐＢＲ３２２であり、アンピシリン耐性遺伝子をマーカーとしているため、不和合性の問題を回避し、抗生剤による選択性の観点からも好ましい組み合わせだった。
【０００９】
そこで、まずｐＧ−ＫＪＥ８，およびｐＧｒｏ７を用いて、塩化カルシウム法でＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。さらにこれをもう一度、塩化カルシウム法でコンピテント細胞としたのち、上記でえられたｐＥＴ４４で形質転換した。
【００１０】
これにより、２種類の二重形質転換体すなわち、（Ａ）  ｐＧ−ＫＪＥ８  とｐＥＴ４４とで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）と（Ｂ）ｐＧｒｏ７とｐＥＴ４４とで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（２００３年６月２日、ＩＰＯＤ特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３９０で寄託）をそれぞれ含むものが、クロラムフェニコールとアンピシリンを含む選択培地において選択された。
【００１１】
このＡ，  ＢについてＭ毒素と、おのおののシャペロンタンパクの誘導をおこない、それぞれの可溶画分における細胞障害活性を評価した。即ち、それぞれをアンピシリン５０μｇ／ｍｌとクロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地中でコンフルエントになるまで前培養したのち、再度ＬＢ培地で１０分の１希釈したものにＬ−アラビノース４ｍＭを加え、３７℃、１分間２００回転で振蕩培養する。吸光度５９５ｎｍで約０．４まで増殖した段階で、イソプロピルチオガラクトシドを１ｍＭ加え、さらに２−３時間振蕩培養をおこなった。
【００１２】
これを遠心，集菌したものを培養液の１０分の１量の蒸留水中へ懸濁した。これをさらに超音波により破砕し、遠心により大腸菌の可溶画分と不溶画分に分離し可溶画分を評価に用いた。
【００１３】
イソプロピルチオガラクトシドを添加せず、同様に調整したものを比較対照として用いた。（図１）
なお、細胞障害活性は、９６穴プレート中にＨｅＬａ細胞を１穴あたり、培地１００μｌ中１００００個ずつ前日から培養したものへ、得られた可溶画分を１０分の１量となるように加え、一晩３７℃で静置したものに対し、細胞生存率を評価する。細胞生存率は、吸光度４１５ｎｍで細胞内のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の還元型と酸化型の変換を測定することによって評価した。
【００１４】
これにより（Ａ）、（Ｂ）ともに比較対照と比べて、誘導されたＭ毒素タンパクによる細胞障害活性が認められるが、（Ｂ）の方が細胞障害活性が強いと考えられた。そこで（Ｂ）の可溶画分をアフィニティ精製をおこない、Ｍ毒素タンパク画分のみとしたものについて、比較対照とともに細胞障害活性を評価した。  また、そのタンパク質濃度の測定により、比活性を求め、天然型Ｍ毒素と比較した。なお細胞障害活性１単位は、さきの実験条件下で比較対照の細胞生存率の１／２の吸光度４１５ｎｍの値をタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）で除したものを１単位とした。（図１、図２）
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｍ毒素誘導における細胞の生存率を示すグラフである。
【図２】Ｍ毒素発現可溶画分によるヒーラ細胞の形態変化を示す図。
【図１】
2004357586.tif 000002
【図２】
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