(57)【要約】【課題】抗ＣＤ４４抗体を有効成分とし、固形癌細胞に対する有用性の高い細胞死誘導剤を提供すること。また、抗ＣＤ４４抗体を有効成分とし、固形癌細胞に対する有用性の高い増殖抑制剤を提供すること。【解決手段】抗ＣＤ４４抗体を有効成分とする固形癌細胞の細胞死誘導剤、及び、抗ＣＤ４４抗体を有効成分とする固形癌細胞の増殖抑制剤。この細胞死誘導剤はアポトーシス誘導剤であることが好ましく、適用対象となる固形癌細胞は乳癌細胞であることが好ましい。また、この増殖抑制剤は、乳癌細胞の増殖抑制剤であることが好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ４４抗体を有効成分とする、固形癌細胞の細胞死誘導剤。
【請求項２】
「細胞死」が、アポトーシスであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞死誘導剤。
【請求項３】
「固形癌」が、乳癌であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞死誘導剤。
【請求項４】
抗ＣＤ４４抗体を有効成分とする、固形癌細胞の増殖抑制剤。
【請求項５】
「固形癌」が、乳癌であることを特徴とする、請求項４に記載の増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗ＣＤ４４抗体を有効成分とする固形癌細胞の細胞死誘導剤及び増殖抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
非特許文献１には骨髄性白血病細胞において、抗ＣＤ４４抗体が細胞死誘導作用や細胞増殖抑制作用を有することが記載されているが、固形癌において同抗体が単独で細胞死を誘導したり、細胞増殖を抑制したりする作用を有することについては知られていない。
【０００３】
【非特許文献１】Ｂｌｏｏｄ，  ９９（１）  ｐ２９０−２９９  （２００２）
日本での癌の治癒率は約５０％前後であり、その治癒は一般的に外科療法や放射線療法などの局所療法によりもたらされる場合が多い。この様な局所療法による技術は、現段階で上限に達していると考えられ、癌の治癒率の向上には、新たな薬剤、すなわち、化学療法の開発が求められている。
現在、化学療法に用いられている抗癌剤としては、主に、アルキル化薬、代謝拮抗薬、アントラサイクリン系薬剤、ビンカアルカロイド薬剤、エトポシド等の天然製剤及びその誘導体等が挙げられる。
この様な化学療法は、白血病のような造血器腫瘍や小児癌においては完治例も少なくない。しかし固形癌の場合、抗癌剤の腫瘍縮小効果から評価した奏功率は、癌腫によって異なるものの、単剤で概ね２０〜３０％であり、また術後の補助化学療法は、有効であるとする評価が確認されていない場合がほとんどである。
このように、今後の癌治癒率の向上にあたり、固形癌に有効な薬剤開発が期待されているのが現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、抗ＣＤ４４抗体を有効成分とする固形癌細胞の細胞死誘導剤及び増殖抑制剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、抗ＣＤ４４抗体が固形癌細胞の細胞死誘導作用及び増殖抑制作用を有することを見出し、これにより上記課題を解決しうる細胞死誘導剤及び増殖抑制剤を提供できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成されたものである。
【０００６】
すなわち本発明は、抗ＣＤ４４抗体を有効成分とする、固形癌細胞の細胞死誘導剤（以下、「本発明誘導剤」という）を提供する。本発明誘導剤は、アポトーシス誘導剤であることが好ましい。また本発明誘導剤は、乳癌細胞の細胞死誘導剤であることが好ましい。
【０００７】
また本発明は、抗ＣＤ４４抗体を有効成分とする、固形癌細胞の増殖抑制剤（以下、「本発明抑制剤」という）を提供する。本発明抑制剤は、乳癌細胞の増殖抑制剤であることが好ましい。
【０００８】
以下、本発明誘導剤及び本発明抑制剤及を併せて、単に「本発明誘導剤等」という。
【０００９】
【発明の実施の形態】
（１）本発明誘導剤等の有効成分
本発明誘導剤等の有効成分である「抗ＣＤ４４抗体」は、ＣＤ４４に結合する抗体である限りにおいて特に限定されない。また、この抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１０】
モノクローナル抗体は、ＣＤ４４を抗原として用いて、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５））によって製造することができる。
【００１１】
例えばＣＤ４４をマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリ等の被免疫動物の腹腔内、皮下、足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）等に投与する。
【００１２】
被免疫動物から脾臓細胞、リンパ細胞、末梢血液等を採取し、これらと腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを調製する。なお細胞融合に用いるミエローマ細胞は、種々の哺乳動物の細胞株を利用することができるが、被免疫動物と同種の動物の細胞株を用いることが好ましい。またミエローマ細胞は、細胞融合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにするために、未融合のミエローマ細胞が生存できずハイブリドーマだけが増殖できるように、マーカーを有するものを用いることが好ましい。またミエローマ細胞は、固有の免疫グロブリンを分泌しない株を使用することが、ハイブリドーマの培養上清から目的の抗体を取得することが容易となる点で好ましい。
【００１３】
得られたハイブリドーマを連続増殖させ、ＣＤ４４に結合する抗体を継続的に産生するハイブリドーマ株を選別する。なかでもＣＤ４４に特異的に結合する抗体を継続的に産生する株を選択することが好ましい。
【００１４】
こうして選別されたハイブリドーマ株を好適な培地で培養することによって、培地中にモノクローナル抗体が得られる。なお、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマ株を培養し、腹水等から単離することによって、モノクローナル抗体を大量に製造することもできる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、通常の抗体の精製方法によって精製してもよい。
【００１５】
またポリクローナル抗体は、ＣＤ４４を抗原として用いて以下の通り製造することができる。
【００１６】
前記のモノクローナル抗体の製造方法と同様に、ＣＤ４４を被免疫動物に投与する。
【００１７】
被免疫動物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用することは、抗体産生細胞を賦活するので望ましい。また初回免疫後、２〜３週目に常法によって追加免疫を行うと力価の高い抗血清が得られる。最終免疫から約１週間後に血液を採取し、血清を分離する。この血清を熱処理して補体を失活させた後、通常の抗体の精製方法によってイムノグロブリン画分を精製してもよい。
【００１８】
抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択的沈殿分別法、電気泳動法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−誘導体、ＣＭ（カルボキシメチル）−誘導体等のイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過法および超遠心法等を挙げることができる。
【００１９】
なお抗ＣＤ４４抗体を、抗原結合部位（Ｆａｂ）を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で処理して、Ｆａｂを含むフラグメント等としても良い。抗体のＦａｂを含むフラグメントとしては、Ｆａｂ以外に、Ｆａｂｃ、（Ｆａｂ’）２等が例示される。このようなものも、本明細書における「抗ＣＤ４４抗体」の概念に包含される。
【００２０】
また抗ＣＤ４４抗体をコードする遺伝子の塩基配列もしくは抗ＣＤ４４抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的に抗ＣＤ４４抗体のＦａｂを含むフラグメントやキメラ抗体（例えば抗ＣＤ４４抗体のＦａｂ部分を含むキメラ抗体等）を作製することもできる。このような抗ＣＤ４４抗体のＦａｂを含むフラグメントやキメラ抗体も、ＣＤ４４に結合する限り本明細書における「抗ＣＤ４４抗体」の概念に包含される。
【００２１】
製造された抗体がＣＤ４４に結合するか否か、あるいは特異的に結合するか否かは、ＣＤ４４を用いて、通常の方法によって当業者が容易に決定することができる。抗ＣＤ４４抗体は、ＣＤ４４に特異的に結合するものが好ましい。
【００２２】
抗ＣＤ４４抗体の免疫グロブリンクラスも特に限定されず、いずれのクラスのものも用いることができるが、ＩｇＧであるものが好ましく、ＩｇＧ２ａであるものがより好ましい。免疫グロブリンクラスがＩｇＧ若しくはＩｇＧ２ａである抗体は、抗ＩｇＧ抗体若しくは抗ＩｇＧ２ａ抗体を用いたスクリーニング等によって取得することができる。
【００２３】
また、抗ＣＤ４４抗体は、市販されているものを用いてもよい。
【００２４】
抗ＣＤ４４抗体は、高純度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものが好ましい。
【００２５】
本発明誘導剤等のエンドトキシン濃度は、０．３ＥＵ／ｍＬ以下であることが好ましい。本発明誘導剤等に含まれるエンドトキシン濃度は、当業者に周知慣用のエンドトキシンの測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。なおＥＵ（エンドトキシン単位）は、日本工業規格生化学試薬通則（ＪＩＳ  Ｋ８００８）に従って測定・算出できる。
（２）本発明誘導剤等の剤型等
本発明誘導剤等の投与方法は、本発明誘導剤等による固形癌に対する細胞死誘導作用又は増殖抑制作用が発揮される限りにおいて特に限定されないが、例えば注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経鼻、経口、経皮、吸入等の投与経路または投与方法が挙げられる。その投与方法は適用する疾患、目的、部位等によって適宜選択される。
【００２６】
このような投与方法及び経路に応じて抗ＣＤ４４抗体を適宜製剤化して、本発明誘導剤等とすることができる。剤形としては、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等が挙げられるが、注射剤等の液剤の形態とすることが好ましい。
【００２７】
液剤は、例えば適当な水性溶媒あるいは医薬品に慣用される溶媒に抗ＣＤ４４抗体を溶解させることにより製造することができる。このような溶媒としては、蒸留水、緩衝液、生理食塩水、水性有機溶媒を含む水等が例示される。
【００２８】
本発明誘導剤等を注射剤として提供する場合、その形態は、溶液、凍結物、または凍結乾燥物のいずれであってもよい。これをアンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存して、注射剤として投与することができる。
【００２９】
本発明誘導剤等の製剤化には公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、抗ＣＤ４４抗体に悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分（例えば抗炎症剤、鎮痛剤、ビタミン剤、抗菌剤など）や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用できる。
（３）本発明誘導剤等の投与対象等
本発明誘導剤は、固形癌細胞の細胞死を誘導することを目的とするものであることから、細胞死の誘導が望まれる固形癌細胞やこれを含む組織や臓器に対して適用することができる。誘導される細胞死は、アポトーシスであることが好ましい。アポトーシスが誘導されたか否かは、アポトーシスの一般的な検出方法によって容易に検出することができる。アポトーシスの一般的な検出方法としては、例えば細胞のクロマチン凝縮やアポトーシス小体の有無を観察する方法やフローサイトメトリーを用いた方法等を挙げることができる。
【００３０】
また本発明抑制剤は、固形癌細胞の増殖を抑制することを目的とするものであることから、増殖の抑制が望まれる固形癌細胞やこれを含む組織や臓器に対して適用することができる。
【００３１】
細胞死の誘導や、増殖の抑制が望まれる固形癌細胞の具体例としては、例えば皮膚癌、肺癌、内分泌癌（副腎皮質腫瘍、膵島細胞癌、悪性カルチノイド、甲状腺癌）、消化器癌（結腸／直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、膵臓癌）、婦人科癌（乳癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌）、泌尿器癌（膀胱癌、前立腺癌、腎癌、睾丸腫瘍）等の細胞が例示される。なかでも乳癌細胞が好ましい。
【００３２】
本発明誘導剤等が投与される動物は、脊椎動物、特に哺乳動物が好ましく、とりわけヒトが好ましい。本発明誘導剤等は前記のような固形癌の予防、進行抑制（悪化防止）、症状の改善または治療等を目的として投与することもできる。
【００３３】
本発明誘導剤等における抗ＣＤ４４抗体の配合量、１回あたりの投与量、投与間隔等は、本発明誘導剤等の投与方法、投与形態、使用目的等、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、本発明誘導剤等の作用発揮が望まれている部位等における抗ＣＤ４４抗体の濃度が１０μｇ／ｍＬ以上となるように投与されることが好ましい。例えば、抗ＣＤ４４抗体の臨床量として成人１人１回当り１〜１００ｍｇが例示される。
【００３４】
また本発明誘導剤等の投与間隔は、１日１回程度でもよく、１日２〜３回に分けて投与することもできる。
【００３５】
また本発明誘導剤等は、細胞生物学等に関する実験用の試薬等としても使用することができる。
【００３６】
また本発明は、上記の本発明誘導剤及び本発明抑制剤だけでなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、固形癌細胞又はこれを有している生体組織等の適用対象に抗ＣＤ４４抗体を作用させて固形癌細胞の細胞死を誘導する方法や増殖を抑制する方法も包含する。
【００３７】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
＜実施例１＞  抗ＣＤ４４抗体の細胞死誘導効果
固形癌細胞に対する、抗ＣＤ４４抗体による細胞死誘導効果を、（１）ミトコンドリア内脱水素酵素の活性と、（２）光学顕微鏡による形態を指標にしてｉｎ  ｖｉｔｒｏの系で調べた。用いた方法等は以下の通りである。
（１）抗ＣＤ４４抗体処理
ほぼ集密的（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になるまで培養したＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳ガン細胞；ＡＴＴＣ社製）を９６ウェルのプレートに２５００細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％  ＣＯ２下で、１０％  ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するイーグルの最小必須培地（Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）培地中で２４時間、前培養した。前培養後の細胞に、抗ＣＤ４４モノクローナル抗体（ＢＵ７５、マウスＩｇＧ２ａ；Ａｎｃｅｌｌ社製）を終濃度が０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、又は１０μｇ／ｍＬとなるように添加して、３７℃、５％  ＣＯ２下で培養した。
（２）細胞増殖活性の測定
上記（１）で抗体処理を施した細胞について、キットＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、細胞増殖活性を調べた。同方法は、ミトコンドリア内脱水素酵素活性により、ＭＴＳ試薬（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−５−（３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）が水溶性の呈色フォルマザンへ変化することを利用した細胞増殖活性測定法であり、方法は常法に従った。すなわち、各ウェルにＭＴＳ／ＰＭＳ溶液（ＰＭＳ；ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）を２０μＬずつ添加し、３７℃、５％  ＣＯ２下で２時間インキュベートした後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（３）アポトーシス細胞の検出
前記（１）で抗体処理を施した細胞について、光学顕微鏡下で観察し、細胞膜のｂｌｅｂｂｉｎｇ（細胞の表面に突起が出現し、膜が泡状化した状態）や萎縮を起こしたアポトーシス様の形態を示す細胞を観察した。無作為に選んだ四視野について一視野あたり１００の細胞をカウントし、この中で上記アポトーシス様の形態を示す細胞を数え、アポトーシスを起こした細胞の割合（％）を算出した。
【００３８】
抗ＣＤ４４抗体の存在下で４４時間培養した場合における細胞増殖活性の測定結果（ＭＴＳアッセイによる４９０ｎｍにおける吸光度の測定結果）を図１に、アポトーシス細胞の検出結果（アポトーシスを起こした細胞の割合（％））を図２に示す。また、抗ＣＤ４４抗体の存在下で７２時間培養した後に、培地交換をしてさらに抗ＣＤ４４抗体の存在下で７２時間培養した場合における細胞増殖活性の測定結果（ＭＴＳアッセイによる４９０ｎｍにおける吸光度の測定結果）を図３に示す。なお、図中の＊＊は、無処理群に対してｐ＜０．０００１で有意差があることを示す（Ｄｕｎｎｅｔの多重比較検定）。
【００３９】
この結果、無処理群では、細胞増殖活性の低下も細胞死の増加も認められなかったが、抗ＣＤ４４抗体（１０μｇ／ｍＬ）による処理によって、有意な細胞増殖活性の低下及び細胞死（アポトーシス）の増加がみられた（図１〜図３）。またこの作用は再現性のあるものであった（図１及び図３）。
【００４０】
この結果から、抗ＣＤ４４抗体は、単独で、固形癌細胞の細胞死の誘導作用や増殖抑制作用を発揮することが示された。
＜実施例２＞  製剤例
抗ＣＤ４４モノクローナル抗体（ＢＵ７５、マウスＩｇＧ２ａ；Ａｎｃｅｌｌ社製）を終濃度  １０ｍｇ／ｍＬとなるように無菌濾過したリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に溶解し、１ｍｌずつアンプルに分注して凍結乾燥させることにより注射剤を製造した。
【００４１】
【発明の効果】
抗ＣＤ４４抗体を有効成分とする本発明誘導剤及び本発明抑制剤は、前記実施例の結果からも明らかな通り、固形癌細胞の増殖を抑制し、また、固形癌細胞の細胞死を誘導でき、これにより固形癌の増大を抑制し、固形癌の死滅を誘導できることから極めて有用である。
【００４２】
【図面の簡単な説明】
【図１】抗ＣＤ４４抗体で４４時間処理した場合における細胞増殖抑制効果を示す図である。
【図２】抗ＣＤ４４抗体で４４時間処理した場合における細胞死（アポトーシス）の誘導を示す図である。
【図３】抗ＣＤ４４抗体で計１４４時間処理した場合における細胞増殖抑制効果を示す図である。
【図１】
2004182700.tif 000002
【図２】
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【図３】
2004182700.tif 000004