(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有する新規なペプチド又は該ペプチドを表面に呈示したファージを検出手段として用いたＩｇＧの検出方法を提供する。【解決手段】各種動物由来のＩｇＧのＦｃフラグメントをターゲット物質として用い、ファージディスプレイ法によりスクリーニングを行い、該ターゲット物質に結合性を有するペプチドのアミノ酸配列を同定する。このようにして得られた特定のアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージをＩｇＧの検出手段として用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることを特徴とするＩｇＧの検出方法。
【請求項２】
配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いる、請求項１に記載のＩｇＧの検出方法。
【請求項３】
配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いる、請求項１に記載のＩｇＧの検出方法。
【請求項４】
配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いる、請求項１に記載のＩｇＧの検出方法。
【請求項５】
配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いる、請求項１に記載のＩｇＧの検出方法。
【請求項６】
配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するモルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いる、請求項１に記載のＩｇＧの検出方法。
【請求項７】
配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いる、請求項１に記載のＩｇＧの検出方法。
【請求項８】
配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いる、請求項１に記載のＩｇＧの検出方法。
【請求項９】
配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するイヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いる、請求項１に記載のＩｇＧの検出方法。
【請求項１０】
配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いる、請求項１に記載のＩｇＧの検出方法。
【請求項１１】
配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いる、請求項１に記載のＩｇＧの検出方法。
【請求項１２】
配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するマウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いる、請求項１に記載のＩｇＧの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有する新規なペプチド又は該ペプチドを表面に呈示したファージを用いたＩｇＧの検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫反応の中心的な役割を担うタンパク質である抗体は、従来から医療や臨床診断をはじめとする幅広い分野で利用されている。
【０００３】
例えば、抗体は、微量物質を特異的に検出・測定する手段として広く利用されており、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法等に用いられている。これらの測定方法は、ターゲット物質に結合する抗体（一次抗体）と、前記一次抗体に結合する抗体であって、蛍光物質や酵素等で標識された抗体（二次抗体）を用いてターゲット物質を検出する方法であり、検査薬に応用されているほか、医学・薬学・生化学分野等の研究に欠くことのできないものとなっている。
【０００４】
一般的な抗体の作製方法としては、マウス、ウサギ、ヒツジ等の動物に抗原を接種して免疫することによって抗血清を調製し、その抗血清からポリクローナル抗体を精製する方法、ハイブリドーマをマウス等の腹腔にて増殖させ、モノクローナル抗体を含む腹水を調製し、その腹水から抗体を精製する方法、ハイブリドーマを血清培地や無血清培地中で培養してモノクローナル抗体を含む培養液を調製し、その培養液から抗体を精製する方法等がある。
【０００５】
一方、近年、ファージディスプレイ法によるターゲット物質に対して結合性を有するペプチドのスクリーニングも行われており、例えば、非特許文献１には、ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドとして、配列番号２８１〜２８７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが報告されており、これらのペプチドが、分析や医薬用途の抗体の精製工程におけるアフィニティリガンドとして利用できる可能性があることが記載されている。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２１  （１９９８）  １５１−１５７
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の方法による抗体の作製はいずれも非常に手間がかかり、また、大量調製も難しいため、抗体作製のコストが高くなってしまうという問題があった。また、二次抗体として用いられる抗ＩｇＧ抗体は、検出感度を上げるために多点で一次抗体に結合するポリクローナル抗体であることが望ましいが、ポリクローナル抗体を作製するためには動物を用いる必要があるため、得られる抗ＩｇＧ抗体の結合力等にばらつきを生じやすく、一定品質の抗体を安定供給しにくいという問題があった。更に、抗体を作製する毎に動物を屠殺しなければならないという倫理上の問題もあった。
【０００８】
一方、上記のようなＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドは、化学合成することができるので、一定品質のペプチドを安定して低コストで供給できるだけでなく、動物を使用しないので倫理上の問題もないといった利点を有しているが、上記非特許文献１に記載されたペプチド以外にＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドは報告されていない。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有する新規なペプチド又は該ペプチドを表面に呈示したファージを検出手段として用いたＩｇＧの検出方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明のＩｇＧの検出方法は、配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることを特徴とする。
【００１１】
本発明の検出方法によれば、ＩｇＧの検出手段として、配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを用いることにより、従来の抗ＩｇＧ抗体を用いた検出系に比べて、より安価なＩｇＧの検出系を提供できる。また、抗ＩｇＧ抗体のような品質のばらつきがないので、より安定したＩｇＧの検出系を提供できる。すなわち、上記ペプチドは化学合成により簡単に合成でき、また、上記ペプチドを表面に呈示しているファージは大腸菌等に感染させることにより簡単に増幅することができるので、一定品質のものを大量、かつ安価に調製することができる。
【００１２】
本発明の好ましい態様においては、配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることが好ましい。これによれば、抗ＩｇＧ抗体を用いた検出系に比べて、より安価なヒト由来ＩｇＧの検出系を提供できる。また、抗ＩｇＧ抗体のような品質のばらつきがないので、より安定したヒト由来ＩｇＧの検出系を提供できる。
【００１３】
また、別の好ましい態様においては、配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることが好ましい。これによれば、抗ＩｇＧ抗体を用いた検出系に比べて、より安価なウマ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。また、抗ＩｇＧ抗体のような品質のばらつきがないので、より安定したウマ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。
【００１４】
また、更に別の好ましい態様においては、配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることが好ましい。これによれば、抗ＩｇＧ抗体を用いた検出系に比べて、より安価なヒツジ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。また、抗ＩｇＧ抗体のような品質のばらつきがないので、より安定したヒツジ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。
【００１５】
また、更に別の好ましい態様においては、配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることが好ましい。これによれば、抗ＩｇＧ抗体を用いた検出系に比べて、より安価なウサギ由来ＩｇＧ検出系を提供できる。また、抗ＩｇＧ抗体のような品質のばらつきがないので、より安定したウサギ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。
【００１６】
また、更に別の好ましい態様においては、配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するモルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることが好ましい。これによれば、抗ＩｇＧ抗体を用いた検出系に比べて、より安価なモルモット由来ＩｇＧの検出系を提供できる。また、抗ＩｇＧ抗体のような品質のばらつきがないので、より安定したモルモット由来ＩｇＧの検出系を提供できる。
【００１７】
また、更に別の好ましい態様においては、配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることが好ましい。これによれば、抗ＩｇＧ抗体を用いた検出系に比べて、より安価なヤギ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。また、抗ＩｇＧ抗体のような品質のばらつきがないので、より安定したヤギ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。
【００１８】
また、更に別の好ましい態様においては、配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることが好ましい。これによれば、抗ＩｇＧ抗体を用いた検出系に比べて、より安価なネコ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。また、抗ＩｇＧ抗体のような品質のばらつきがないので、より安定したネコ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。
【００１９】
また、更に別の好ましい態様においては、配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するイヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることが好ましい。これによれば、抗ＩｇＧ抗体を用いた検出系に比べて、より安価なイヌ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。また、抗ＩｇＧ抗体のような品質のばらつきがないので、より安定したイヌ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。
【００２０】
また、更に別の好ましい態様においては、配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることが好ましい。これによれば、抗ＩｇＧ抗体を用いた検出系に比べて、より安価なウシ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。また、抗ＩｇＧ抗体のような品質のばらつきがないので、より安定したウシ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。
【００２１】
また、更に別の好ましい態様においては、配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることが好ましい。これによれば、抗ＩｇＧ抗体を用いた検出系に比べて、より安価なブタ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。また、抗ＩｇＧ抗体のような品質のばらつきがないので、より安定したブタ由来ＩｇＧの検出系を提供できる。
【００２２】
また、更に別の好ましい態様においては、配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するマウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることが好ましい。これによれば、抗ＩｇＧ抗体を用いた検出系に比べて、より安価なマウス由来ＩｇＧの検出系を提供できる。また、抗ＩｇＧ抗体のような品質のばらつきがないので、より安定したマウス由来ＩｇＧの検出系を提供できる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明において、ＩｇＧの検出手段として用いられるペプチドは、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドであり、ペプチド中に配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するものである。
【００２４】
前記ペプチドは、上記の部分アミノ酸配列を有するものであれば、そのアミノ酸数は特に制限されないが、通常、アミノ酸数４〜５０個からなることが好ましく、アミノ酸数６〜２０個からなることがより好ましい。また、前記ペプチドは、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾（例えばアセチル化、アシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、糖鎖の付加等）、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失があってもよい。なお、前記ペプチドは、上記アミノ酸配列を複数個有していてもよい。
【００２５】
本発明において、配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列は、ＩｇＧのＦｃフラグメントをターゲット物質として用いたファージディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．Ｐ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８８，  １３１５−１３１７  （１９８５））によって決定されたものであるが、コンピューターソフト（日立Ｂｉｏ  Ｐａｃｋａｇｅ）を用いた解析によっても決定することができる。なお、ファージディスプレイ法は、ファージの外殻タンパク質に、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチド（通常、アミノ酸数５〜１２個程度）を融合タンパク質として呈示させたファージライブラリを用いて、ターゲット物質に結合するペプチドをスクリーニングする方法である。ファージライブラリは、例えば、Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｐ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８８，  １３１５−１３１７  （１９８５）、Ｊ．  Ｋ．  Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｐ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９，  ３８６−３９０  （１９９０）等に記載された方法にしたがって、ランダム化したＤＮＡを化学合成し、これをファージＤＮＡの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このＤＮＡを大腸菌に導入することにより調製することができる。また、ファージライブラリは市販されており、例えば、商品名「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ」、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製）等を用いることもできる。
【００２６】
そして、ファージディスプレイ法等により決定されたアミノ酸配列に基づいて、例えば、固相法、Ｆｍｏｃ法等の公知のペプチド合成法により、目的とするペプチドを簡単に合成することができる。
【００２７】
本発明において、ＩｇＧの検出手段として用いられるファージは、ファージの外殻タンパク質に、配列番号１〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドを融合タンパク質として呈示させたファージである。
【００２８】
このようなファージは、基本的には、Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｐ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８８，  １３１５−１３１７  （１９８５）、Ｊ．  Ｋ．  Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｐ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９，  ３８６−３９０  （１９９０）等に記載されたファージライブラリの作製方法にしたがって得ることができる。すなわち、上記のＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドをコードするＤＮＡを化学合成し、このＤＮＡをファージラブラリを作製するときと同様の方法で、ファージＤＮＡの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このＤＮＡを大腸菌に導入することにより、所望のペプチドを表面に呈示したファージを得ることができる。
【００２９】
本発明において、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドを呈示させるファージとしては、通常、ファージライブラリに用いられているファージが好ましく用いられる。このようなファージとしては、Ｍ１３ファージ等の繊維状ファージ、Ｔ系ファージ等が例示できる。例えば、Ｍ１３ファージの場合は、ファージの表面マイナータンパク質ｐＩＩＩ遺伝子に、上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドをコードしたＤＮＡを挿入し、このＤＮＡを大腸菌に導入することにより、ファージの表面マイナータンパク質ｐＩＩＩに、上記ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドを融合タンパク質として呈示させたファージを得ることができる。
【００３０】
以下、本発明で用いられるペプチドについて詳しく説明する。
配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列は、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、上記のようなファージライブラリを、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに接触させて選択操作（バイオパニング）を行い、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合するペプチドを発現したファージ群のみを選択し、このファージのＤＮＡを解析することにより、ファージ表面に呈示されたペプチドのアミノ酸配列を同定して得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１の表２参照）。
【００３１】
したがって、配列番号１〜８７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージは、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを特異的に認識することができるので、ヒト由来ＩｇＧの検出手段として好適に用いることができる。
【００３２】
配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列は、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質として、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例６の表５参照）。
【００３３】
したがって、配列番号８８〜９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージは、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを特異的に認識することができるので、ウマ由来ＩｇＧの検出手段として好適に用いることができる。
【００３４】
配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列は、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質として、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例７の表７参照）。
【００３５】
したがって、配列番号９１〜９３で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージは、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを特異的に認識することができるので、ヒツジ由来ＩｇＧの検出手段として好適に用いることができる。
【００３６】
配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列は、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドであり、ターゲット物質として、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことにより、アミノ酸配列を同定したものである（実施例８の表９参照）。
【００３７】
したがって、配列番号９４〜９７で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージは、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを特異的に認識することができるので、ウサギ由来ＩｇＧの検出手段として好適に用いることができる。
【００３８】
配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列は、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質として、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例９の表１１参照）。
【００３９】
したがって、配列番号９８〜１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージは、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを特異的に認識することができるので、モルモット由来ＩｇＧの検出手段として好適に用いることができる。
【００４０】
配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列は、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質として、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１０の表１３参照）。
【００４１】
したがって、配列番号１０５〜１０８で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージは、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを特異的に認識することができるので、ヤギ由来ＩｇＧの検出手段として好適に用いることができる。
【００４２】
配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列は、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質として、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１１の表１５参照）。
【００４３】
したがって、配列番号１０９〜１３１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージは、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを特異的に認識することができるので、ネコ由来ＩｇＧの検出手段として好適に用いることができる。
【００４４】
配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列は、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質として、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１２の表１７参照）。
【００４５】
したがって、配列番号１３２〜１５１で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージは、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを特異的に認識することができるので、イヌ由来ＩｇＧの検出手段として好適に用いることができる。
【００４６】
配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列は、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質として、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１３の表１９参照）。
【００４７】
したがって、配列番号１５２〜１５６で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージは、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを特異的に認識することができるので、ウシ由来ＩｇＧの検出手段として好適に用いることができる。
【００４８】
配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列は、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質として、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１４の表２１参照）。
【００４９】
したがって、配列番号１５７〜１６２で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージは、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを特異的に認識することができるので、ブタ由来ＩｇＧの検出手段として好適に用いることができる。
【００５０】
配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列は、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドの共通配列である。これらの共通配列は、ターゲット物質として、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを用い、上記と同様にしてファージディスプレイ法を行うことによって得られたペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定したものである（実施例１５の表２３参照）。
【００５１】
したがって、配列番号１６３〜１６４で表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＩｇＧのＦｃフラグメントに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージは、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントを特異的に認識することができるので、マウス由来ＩｇＧの検出手段として好適に用いることができる。
【００５２】
本発明においては、ＩｇＧの検出手段として用いられる上記ペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージは、公知の方法により、蛍光物質や酵素等の標識物質を結合させてから用いることが好ましい。これにより、上記ペプチド又はファージを二次抗体の代替品として、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法等に利用することができるので、抗ＩｇＧ抗体を用いた場合に比べて、より安価な酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法等を提供できる。
【００５３】
上記蛍光物質としては、ＦＩＴＣ（フルオレセイン）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ等が例示でき、例えば「超高感度酵素免疫測定法（石川栄治著  学会出版センター）」等に記載の方法に従って、これらの蛍光物質を上記ペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージに結合させることができる。
【００５４】
また、上記酵素としては、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等が例示でき、例えば「超高感度酵素免疫測定法」（石川栄治著  学会出版センター）等に記載の方法に従って、これらの酵素を上記ペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージに結合させることができる。
【００５５】
例えば、上記ペプチドに標識物質を結合させる場合には、ペプチドの末端等に標識物質との結合に利用可能な適当なスペーサーを挿入してもよい。スペーサーを挿入することにより、標識物質の結合を行いやすくなると共に、スペーサーの長さを調整することにより、立体障害を回避してターゲット物質（ＩｇＧのＦｃフラグメント）との接触をより容易にすることができ、検出感度の向上を図ることも可能となる。例えば、スペーサーがアミノ酸やペプチドである場合は、それらのスペーサーを挿入したペプチドを簡単に合成することができるので好ましい。
【００５６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００５７】
実施例１
（１）ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｈｕｍａｎ  Ｆｃと略記する。）に結合性を有するペプチドのスクリーニング
ターゲット物質として、ｈｕｍａｎ  Ｆｃを用い、ファージディスプレイ法により、ｈｕｍａｎ  Ｆｃに結合性を有するペプチドのスクリーニングを以下のようにして行った。なお、ファージディスプレイ法では、Ｍ１３ファージの表面のマイナータンパクｐＩＩＩにペプチドがランダムに呈示されるライブラリ（呈示されるランダムアミノ酸数が７個、１０個、１２個のペプチドライブラリ）を、Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．Ｐ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８８，  １３１５−１３１７  （１９８５）、Ｊ．Ｋ．  Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｇ．Ｐ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９，  ３８６−３９０  （１９９０）等の記載に基づいて作製し、この３種類のライブラリを用いた。
【００５８】
ターゲットとなるｈｕｍａｎ  Ｆｃ（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製、ＰＵＲＩＦＩＥＤ  ＨＵＭＡＮ  ＩＧＧ  ＦＣ）は、商品名「ｓｕｌｆｏＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ」（ピアース社製）を用いてビオチン標識し、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（商品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２８０  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」、Ｄｙａｎａｌ社製）に、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用して固定化した。この磁気ビーズは非特異的な結合を最低限にするため、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液（１０ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ７．４）に懸濁してブロッキングを行った。
【００５９】
この磁気ビーズを用いて、常法にしたがってファージディスプレイ法（選択操作３回）を行い、配列番号１６５〜２０７で表されるｈｕｍａｎ  Ｆｃに結合性を有するペプチドのアミノ酸配列を決定した。
【００６０】
（２）得られたペプチドのｈｕｍａｎ  Ｆｃに対する結合性の確認
ターゲットとなるｈｕｍａｎ  Ｆｃを、コーニング社製ＥＬＩＳＡプレート（高結合タイプ）に以下のようにして固定化した。ｈｕｍａｎ  Ｆｃ（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製、ＰＵＲＩＦＩＥＤ  ＨＵＭＡＮＩＧＧ  ＦＣ）を１００μｇ／ｍｌとなるように炭酸バッファ（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．０）に溶解した溶液を調製し、この溶液を１００μｌずつプレートのウェルに入れて４℃で一晩放置して、ｈｕｍａｎ  Ｆｃフラグメントの固定化を行った。また、上記と同様にして、特異性の対照として、ニワトリ、ウサギ、ウマ、ヤギ由来の各種ＩｇＧのＦｃフラグメント（いずれもＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を、コーニング社製ＥＬＩＳＡプレート（高結合タイプ）に固定化した。
【００６１】
なお、ウェルは２４列用い、１列は抗ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体用（ポジティブコントロール）に、１列はｈｕｍａｎ  Ｆｃに結合性を有さないペプチドを呈示するファージ用（ネガティブコントロール）とし、残りの２２列は、配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを呈示したファージ用とした。
【００６２】
一晩放置した後、各ウェル中の溶液を捨て、３００μｌのブロッキングバッファ（２％（ｗ／ｖ）スキムミルク  ＰＢＳ溶液）を、上記Ｆｃフラグメント固定化ウェル、及びターゲット無しの空ウェル（コントロール用、２４個）に加えて、２時間室温で放置した。
【００６３】
一方、各ファージ（上記２２種のｈｕｍａｎ  Ｆｃに結合性を有するペプチドを呈示した各ファージと、ｈｕｍａｎ  Ｆｃに結合性を有さないペプチドを呈示したファージ）溶液（１０１１ｐｆｕ／μｌ）５０μｌをブロッキングバッファ６５０μｌに加えて３０分放置し、非特異的結合の低減前処理を行った。また、抗ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社製、ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ａｎｔｉｓｅｒｕｍ）３０μｌを６５０μｌのブロッキングバッファに溶解し、同様に非特異的吸着低減処理を行った。
【００６４】
各ウェルのブロッキングバッファを捨て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％Ｔｗｅｅｎ  ｉｎ  ＰＢＳ）で５回洗浄した後、上記の各ファージ溶液と抗ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体溶液を、ｈｕｍａｎ  Ｆｃ固定化ウェル、各動物種Ｆｃフラグメント固定化ウェル、コントロール用ウェルに１００μｌずつ加え、１時間軽く撹拌（２０ｒｐｍ／ｍｉｎ程度）しながら室温で放置した。
【００６５】
そして、各ウェル中の溶液を捨て、２００μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した後、各ウェルに、下記の発色用の抗体を含む溶液を１００μｌずつ加え、穏やかに撹拌しながら１時間放置した。
【００６６】
・ペプチド呈示ファージを加えたウェル：商品名「ａｎｔｉ  Ｍ１３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＨＲＰ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｃｏｎｊｕｇａｔｅ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｅｉｅｎｃｅｓ社製）を４μｌ／２０ｍｌとなるようにブロッキングバッファに溶解した溶液。
【００６７】
・抗ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体を加えたウェル：商品名「ＨＲＰ−ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｏａｔ）」（ＣＡＰＰＥＬ社製）を０．２μｌ／ｍｌとなるように２ｍｌのブロッキングバッファに溶解した溶液。
【００６８】
そして、各ウェル中の溶液を捨て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した後、ＡＢＴＳ発色溶液（ＡＢＴＳ（和光純薬製）を０．２２ｍｇ／ｍｌとなるようにクエン酸バッファ（５０ｍＭ、ｐＨ４．０）に溶解し、使用直前に１．８μｌ／ｍｌとなるように３０％過酸化水素水（和光純薬製）を加えたもの）を２００μｌずつ、各ウェルに加えて発色させて、吸光度（４０５ｎｍ）をプレートリーダー（「ＡＲＶＯ．ＳＸ」、ワラック社製）で測定した。その結果を図１に示す。なお、図１において、Ｙ軸は各Ｆｃフラグメント固定化ウェルの吸光度をコントロールのウェルの吸光度で割ったものである。
【００６９】
図１から、配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを呈示したファージは、ｈｕｍａｎ  Ｆｃに対する特異性が高いことが分かる。一方、ポジティブコントロールの抗体はｈｕｍａｎ  Ｆｃ以外にも結合しており、ポリクローナルの未吸収血清では特異性が低いことが分かる。
【００７０】
（３）得られた全てのペプチド（配列番号１６５〜２０７）について、上記（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｈｕｍａｎ  Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１に示す。なお、表１中の「発色値」は、ｈｕｍａｎ  Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｈｕｍａｎ  Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【００７１】
【表１】
2004187563.tif 000002
【００７２】
表１から、配列番号１６５〜２０７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ｈｕｍａｎ  Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｈｕｍａｎ  Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【００７３】
（４）ペプチドの共通配列の検索
配列番号１６５〜２０７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列から、表２のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１〜８７で表される共通配列を決定した。
【００７４】
【表２】
2004187563.tif 000003
【００７５】
実施例２
実施例１のｈｕｍａｎ  Ｆｃの代わりに、ヒト由来ＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ社製）そのものを用い、対照としてブタ、ウシ、マウス、ヤギ、ウサギ由来の各種ＩｇＧ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を用いた以外は、実施例１の（２）と同様の方法で実験を行い、配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのヒト由来ＩｇＧに対する特異性を検討した。その結果を図２に示す。
【００７６】
図２から分かるように、実施例１の場合とほぼ同様の結果が得られ、配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ヒト由来ＩｇＧそのものに対しても特異性が高いことが確認された。
【００７７】
実施例３
ｈｕｍａｎ  Ｆｃに対して結合性を有するペプチドを呈示したファージを作製し、このファージを用いてｈｕｍａｎ  Ｆｃ及びｈｕｍａｎ  ＩｇＧに対する結合性を確認した。
【００７８】
（１）配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドがファージ（Ｍ１３）のｐＩＩＩマイナーコートタンパクのＮ末端に呈示されるように、以下の方法により、配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを指定するＤＮＡ配列を、ファージゲノム上のｐＩＩＩ遺伝子のリーディング鎖５’末端側に組み込んだ。
【００７９】
上記ＤＮＡ配列を導入するためのＭ１３ＤＮＡとしては、Ｍ１３ＫＥ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を改変したものを用いた。このＭ１３ＫＥ（改変型）のｐＩＩＩ遺伝子の５’末端側、すなわち、配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを指定するＤＮＡ配列を挿入する部分の塩基配列を配列番号２８８に示す。配列番号２８８に示される塩基配列において、１〜５４番目の塩基配列はｐＩＩＩタンパク質のＮ末端にあるシグナル配列（ＶＫＫＬＬＦＡＩＰＬＶＶＰＦＹＳＨＳ）をコードする部分、５５〜６６番目の塩基配列はファージｐＩＩＩタンパクと呈示させるペプチドとの間にスペースを作るためのフレキシブルリンカーをコードする部分であり、それ以降（６７番目以降）の塩基配列が実際のＭ１３ｐＩＩＩタンパク質をコードする部分である。
【００８０】
したがって、配列番号２８８に示される塩基配列の１〜５４番目の塩基配列部分と、５５〜６６番目の塩基配列部分との間に、配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド指定するＤＮＡ配列を挿入するために、配列番号２８９、２９０に示される塩基配列を有するプライマー（プライマーの作製はＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＩＳ社に依頼）と、鋳型Ｍ１３（改変型）一本鎖ＤＮＡを混合し、商品名「Ｅｘ  Ｔａｑ」（ＴａＫａＲａ製）を用いて常法に従ってＰＣＲ反応を行った。
【００８１】
配列番号２８９に示されるプライマーは、Ｍ１３ＫＥ（改変型）のｐＩＩＩ遺伝子の５’末端の塩基配列（配列番号２８８）中、３３〜５４番目の塩基配列にアニーリングするように設計されたプライマーである。また、配列番号２９０に示されるプライマーの１〜２１番目の塩基配列は、配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド（ＫＬＹＨＬＳＩ）をコードし、２２〜４３番目の塩基配列はｐＩＩＩ遺伝子の５’末端の塩基配列（配列番号２８８）中、５５〜７６番目の塩基配列の相補鎖にアニーリングするように設計されたプライマーである。
【００８２】
ＰＣＲ反応終了後、増幅されたＭ１３ＤＮＡ（上記ＤＮＡ配列が挿入されたＭ１３ＤＮＡ）の両末端を結合して、環状２本鎖Ｍ１３ＤＮＡを構成するため、両末端を平滑化し、リン酸化し、リゲーション反応を行った。なお、この一連の反応は、商品名「ＢＫＬキット」（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。
【００８３】
（２）組み込んだＭ１３ファージゲノムＤＮＡの大腸菌へのトランスフォーム
上記で得られたファージ２本鎖ＤＮＡをエレクトロポレーションにより大腸菌にトランスフォームした。
【００８４】
まず、リゲーションを行ったＭ１３ＤＮＡ溶液から塩を除くため、エタノール沈殿法を行い、滅菌済み超純水に再溶解した。ホストとなる大腸菌はＪＭ１０９を用い、これを定法により予めエレクトロコンピテントセル（エレクトロポレーション用の前処理）とした。エレクトロポレーションはＥＣＭ３９９（ＢＴＸ社製）のエレクトロポレーション用機器を用い、印可電圧は２５００Ｖ、キャパシタンス２５μＦ、キュベットは２ｍｍ電極幅で行った。電圧を印可後、すぐにＳＯＣ培地を１ｍｌ加え試験管に移し、３７℃で１時間振とう培養を行った。
【００８５】
（３）配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを呈示したファージの選別
上記トランスフォームした大腸菌（ＪＭ１０９）をアガローストップ法によって選別した。トランスフォームされたかどうかはプラークによって確認できる（トランスフォームされた大腸菌（ＪＭ１０９）は青色のプラークとなって識別される。）。
【００８６】
すなわち、上記振とう培養後、培養液３００μｌをアガローストップ３ｍｌに加えて撹拌し、直ちにＩＰＴＧとＸ−Ｇａｌを加えたＬＢプレート培地に上層し、数分乾燥後、ふたをして３７℃で一晩放置した。
【００８７】
出現したプラーク（１２個）を楊枝でつつき、それぞれ予め６００ｎｍの吸光度で０．６まで培養していた大腸菌（ＥＲ２５３７）５ｍｌ（ＬＢ培地）に入れ、これを３７℃で４．５時間激しく振とう培養した。
【００８８】
その後、それぞれの培養液を遠沈管に移して遠心（１００００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ）し、上澄みを別の遠沈管に移し、更に同条件で再度遠心し、上澄みを別の遠沈管に移して上澄み液の１／５量のＰＥＧ・ＮａＣｌ溶液（２０％ＰＥＧ＃６０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を加えて撹拌後、４℃で一晩（４時間以上）放置した。
【００８９】
放置後、遠心（１００００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ）して上澄みを捨て、沈殿を１ｍｌのＴＢＳバッファで溶解して１．５ｍｌ容の遠心チューブに移し、遠心（１００００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ）し、上澄みを別の１．５ｍｌ容チューブに移して、２００μｌのＰＥＧ・ＮａＣｌ溶液を加えて氷中で３０分放置した。その後、遠心（１００００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ）して上澄みを捨て、沈殿を２００μｌのＴＢＳバッファに溶解してそれぞれのファージ溶液を調製した。
【００９０】
それぞれのファージ溶液５０μｌを取り、常法に従ってファージの一本鎖ＤＮＡを調製し、目的のペプチド（配列番号１６６）が呈示されるファージであるかを、ダイ・プライマー法ＤＮＡシークエンスによって確認した。
【００９１】
シークエンスには、蛍光物質（Ｃｙ５）で５’末端を標識した配列番号２９１に示されるプライマー（プライマーの作製はＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＩＳ社に依頼）を用い、上記で調製したそれぞれの一本鎖Ｍ１３ＤＮＡを鋳型に、「ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ７−ｄｅａｚａ  ｄＧＴＰ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）でシークエンス反応後、「ＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓＩＩ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で、ｐＩＩＩ遺伝子の５’
末端側の塩基配列を決定した。
【００９２】
その結果、得られた全てのファージ（１２個）で、所定の箇所（配列番号２８８に示される塩基配列において、シグナル配列をコードする部分（１〜５４番目の塩基配列）とフレキシブルリンカーをコードする部分（５５〜６６番目）との間）に、配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの指定配列（ＡＡＡＣＴＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＴＣＴＡＴＴ）が挿入されていることが確認され、これらのファージが、ｐＩＩＩマイナーコートタンパクのＮ末端に配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを呈示していることが確認された。
【００９３】
（４）選別されたファージがｈｕｍａｎ  Ｆｃ及びｈｕｍａｎ  ＩｇＧ本体に結合するかの確認実施例１（２）、及び実施例２と同様の方法で、選別されたファージのｈｕｍａｎ  Ｆｃ及びｈｕｍａｎ  ＩｇＧ本体に対する結合性を確認した。その結果を表３に示す。なお、表３中の「発色値」は、ターゲット物質（ｈｕｍａｎ  Ｆｃ又はｈｕｍａｎ  ＩｇＧ）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ターゲット物質に対する親和性が強いことを示す。
【００９４】
【表３】
2004187563.tif 000004
【００９５】
表３から、上記の方法により作製した配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを呈示するファージは、ｈｕｍａｎ  Ｆｃ及びｈｕｍａｎ  ＩｇＧに対して結合性を有することが分かる。
【００９６】
実施例４
（１）ＨＲＰ標識されたファージの作製
ファージのＨＲＰ標識には、商品名「ＡｃｔｉＺｙｍｅ−ＨＲＰ：Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ  Ｋｉｔ」（ＺＹＭＥＤ社製）を用い、以下のようにしてファージのＨＲＰ標識を行った。
【００９７】
商品名「ＡｃｔｉＺｙｍｅ−ＨＲＰ  ：Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ  Ｋｉｔ」（ＺＹＭＥＤ社製）の「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ」２ｍｇを、１ｍｌの１００ｍＭ炭酸ナトリウムバッファ（ｐＨ９．０）に加えて溶解してＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ溶液を調製し、このＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ溶液５００μｌを、予め１００ｍＭ炭酸ナトリウムバッファ（ｐＨ９．５）を５００μｌ入れておいた１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに加えて混合し、Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ濃度１ｍｇ／ｍｌのＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ溶液を調製した。このＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ溶液５００μｌを、予め１００ｍＭ炭酸ナトリウムバッファ（ｐＨ９．５）を５００μｌ入れておいた１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに加えて混合し、Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ濃度０．５ｍｇ／ｍｌのＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ溶液を調製した。同様の操作を行い、Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．０６２５ｍｇ／ｍｌのＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ溶液をそれぞれ調製した。
【００９８】
一方、配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを呈示するファージを、常法に従って大腸菌に感染させて増幅し、１０１１ｐｆｕ（≒１０１１ファージ／１μｌ）濃度のファージ溶液を調製し、このファージ溶液５００μｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに入れ、Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ濃度１ｍｇ／ｍｌのＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ溶液５００μｌを加え、４℃で一晩インキュベートした。また、Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ濃度０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．０６２５ｍｇ／ｍｌのＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ溶液を用いて、同様にしてそれぞれファージのＨＲＰ標識を行った。
【００９９】
インキュベート後、未反応の「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ」を反応させるため、１ＭＬｙｓｉｎｅ溶液を４００μｌ加えて室温で２時間放置した。次に、余分なＨＲＰやＬｙｓｉｎｅを除去するため、上記反応後のファージ溶液に、ＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ＃６０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）２５０μｌを加えて撹拌し、氷中に３０分放置した後、遠心（１００００ｒｐｍ、１０分）して上清を除去し、ＰＢＳ（１０ｍＭ  リン酸、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）１ｍｌを加えて沈殿を再懸濁した。この再懸濁液に、ＰＥＧ溶液を２００μｌ加えて氷中に３０分放置してから、遠心（１００００ｒｐｍ、１０分）して上清を除去した。このような操作を３回繰り返して行い、最終的に得られた沈殿にＰＢＳを５００μｌ加えて懸濁し、ＨＲＰ標識されたファージ（ＨＲＰ標識ファージという）を含む溶液を得た。このようにして得られたＨＲＰ標識ファージは、１ヶ月程度であれば冷蔵庫で保存可能であり、数ヶ月保存する場合は、５０％となるようにグリセロールを加えて−２０℃で保存すればよい。
【０１００】
（２）ｈｕｍａｎ  Ｆｃの検出
上記ＨＲＰ標識ファージを用いて、ｈｕｍａｎ  Ｆｃを検出できるかどうかを確認した。これによって、ヒト由来ＩｇＧ自体の検出も可能であることが示唆される。
【０１０１】
まず、ｈｕｍａｎ  Ｆｃ（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製、ＰＵＲＩＦＩＥＤ  ＨＵＭＡＮ  ＩＧＧ  ＦＣ）を１００μｇ／ｍｌとなるように炭酸バッファ（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．０）に溶解した溶液を調製し、この溶液を１００μｌずつ、９６穴のＥＬＩＳＡプレート（コーニング社製、Ｃｏｓｔａｒ高結合タイプ、ｃａｔ．  Ｎｏ９０１８）のウェルに入れて４℃で一晩放置して、ｈｕｍａｎ  Ｆｃフラグメントの固定化を行った。
【０１０２】
固定化後、各ウェル中の溶液を捨て、３００μｌのブロッキングバッファ（２％（ｗ／ｖ）スキムミルク  ＰＢＳ溶液）を、ｈｕｍａｎ  Ｆｃ固定化ウェル、及び空ウェル（コントロール用）に加えて、室温で１時間放置した。
【０１０３】
一方、上記ＨＲＰ標識ファージを含む溶液５０μｌをブロッキングバッファ２００μｌに加えて１５分放置し、非特異的結合の低減前処理を行った。
【０１０４】
各ウェルのブロッキングバッファを捨て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％Ｔｗｅｅｎ  ｉｎ  ＰＢＳ）で５回洗浄した後、上記の非特異的結合の低減前処理を行ったＨＲＰ標識ファージ溶液を、ｈｕｍａｎ  Ｆｃ固定化ウェル及びコントロール用ウェルに１００μｌずつ加え、軽く撹拌（２０ｒｐｍ／ｍｉｎ程度）しながら室温で１時間放置した。
【０１０５】
そして、各ウェル中の溶液を捨て、２００μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで７回洗浄した後、ＡＢＴＳ発色溶液（ＡＢＴＳ（和光純薬製）を０．２２ｍｇ／ｍｌとなるようにクエン酸バッファ（５０ｍＭ、ｐＨ４．０）に溶解して作製し、使用直前に１．８μｌ／ｍｌとなるように３０％過酸化水素水（和光純薬製）を加えたもの）を２００μｌずつ、各ウェルに加えて発色させて、吸光度（４０５ｎｍ）をプレートリーダー（「ＡＲＶＯ．ＳＸ」、ワラック社製）で測定した。その結果を図３に示す。なお、図３において、Ｙ軸は、ｈｕｍａｎ  Ｆｃ固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、Ｘ軸の１、２、３、４、５は、それぞれＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ濃度が１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｌ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．０６２５ｍｇ／ｍｌのＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ溶液を用いて標識したファージの結果を表す。
【０１０６】
図３から、直接ＨＲＰで標識した、配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを呈示するファージを用いることにより、ｈｕｍａｎ  Ｆｃを検出できることが分かる。
【０１０７】
実施例５
配列番号１７３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを呈示するファージを用いた以外は、実施例３と同様にしてファージのＨＲＰ標識を行い、ｈｕｍａｎ  Ｆｃの検出を行った。その結果を図４に示す。なお、図４において、Ｙ軸は、ｈｕｍａｎ  Ｆｃ固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、Ｘ軸の１、２、３、４、５は、それぞれＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ濃度が１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｌ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．０６２５ｍｇ／ｍｌのＰｅｒｏｘｙｄａｓｅ溶液を用いて標識したファージの結果を表す。
【０１０８】
図４から、直接ＨＲＰで標識した、配列番号１７３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを呈示するファージを用いることにより、ｈｕｍａｎ  Ｆｃを検出できることが分かる。
【０１０９】
以上の結果から、直接ＨＲＰで標識した、ｈｕｍａｎ  Ｆｃに対して結合性を有するペプチドを呈示したファージを用いることにより、ｈｕｍａｎ  Ｆｃを検出でき、二次抗体の代替品として十分に利用できることが示唆される。
【０１１０】
実施例６
ターゲット物質として、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｈｏｒｓｅ  Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｈｏｒｓｅ  Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２０８〜２１２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１１１】
得られた全てのペプチド（配列番号２０８〜２１２）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｈｏｒｓｅ  Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表４に示す。なお、表３中の「発色値」は、ｈｏｒｓｅ  Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｈｏｒｓｅ  Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１１２】
【表４】
2004187563.tif 000005
【０１１３】
表４から、配列番号２０８〜２１２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ｈｏｒｓｅ  Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｈｏｒｓｅ  Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１１４】
また、配列番号２０８〜２１２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列から、表５のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号８８〜９０で表される共通配列を決定した。
【０１１５】
【表５】
2004187563.tif 000006
【０１１６】
実施例７
ターゲット物質として、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｓｈｅｅｐ  Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｓｈｅｅｐ  Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２１３〜２１６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１１７】
得られた全てのペプチド（配列番号２１３〜２１６）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｓｈｅｅｐ  Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表５に示す。なお、表６中の「発色値」は、ｓｈｅｅｐ  Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｓｈｅｅｐ  Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１１８】
【表６】
2004187563.tif 000007
【０１１９】
表６から、配列番号２１３〜２１６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ｓｈｅｅｐ  Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｓｈｅｅｐ  Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１２０】
また、配列番号２１３〜２１６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列から、表７のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号９１〜９３で表される共通配列を決定した。
【０１２１】
【表７】
2004187563.tif 000008
【０１２２】
実施例８
ターゲット物質として、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｒａｂｂｉｔ  Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｒａｂｂｉｔ  Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２１７〜２２０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１２３】
得られた全てのペプチド（配列番号２１７〜２２０）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｒａｂｂｉｔ  Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表８に示す。なお、表８中の「発色値」は、ｒａｂｂｉｔ  Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｒａｂｂｉｔ  Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１２４】
【表８】
2004187563.tif 000009
【０１２５】
表８から、配列番号２１７〜２２０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ｒａｂｂｉｔ  Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｒａｂｂｉｔ  Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１２６】
また、配列番号２１７〜２２０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列から、表９のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号９４〜９７で表される共通配列を決定した。
【０１２７】
【表９】
2004187563.tif 000010
【０１２８】
実施例９
ターゲット物質として、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２２１〜２２７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１２９】
得られた全てのペプチド（配列番号２２１〜２２７）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１０に示す。なお、表１０中の「発色値」は、ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１３０】
【表１０】
2004187563.tif 000011
【０１３１】
表１０から、配列番号２２１〜２２７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１３２】
また、配列番号２２１〜２２７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列から、表１１のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号９８〜１０４で表される共通配列を決定した。
【０１３３】
【表１１】
2004187563.tif 000012
【０１３４】
実施例１０
ターゲット物質として、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｇｏａｔ  Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｇｏａｔ  Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２２８〜２３２で表されるアミノ酸配列を同定した。
【０１３５】
得られた全てのペプチド（配列番号２２８〜２３２）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｇｏａｔ  Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１２に示す。なお、表１２中の「発色値」は、ｇｏａｔ  Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｇｏａｔ  Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１３６】
【表１２】
2004187563.tif 000013
【０１３７】
表１２から、配列番号２２８〜２３２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ｇｏａｔ  Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｇｏａｔ  Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１３８】
また、配列番号２２８〜２３２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列から、表１３のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１０５〜１０８で表される共通配列を決定した。
【０１３９】
【表１３】
2004187563.tif 000014
【０１４０】
実施例１１
ターゲット物質として、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｃａｔ  Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｃａｔ  Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２３３〜２４８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１４１】
得られた全てのペプチド（配列番号２３３〜２４８）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｃａｔ  Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１４に示す。なお、表１４中の「発色値」は、ｃａｔ  Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｃａｔ  Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１４２】
【表１４】
2004187563.tif 000015
【０１４３】
表１４から、配列番号２３３〜２４８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ｃａｔ  Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｃａｔ  Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１４４】
また、配列番号２３３〜２４８で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列から、表１５のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１０９〜１３１で表される共通配列を決定した。
【０１４５】
【表１５】
2004187563.tif 000016
【０１４６】
実施例１２
ターゲット物質として、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｄｏｇ  Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｄｏｇ  Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２４９〜２６１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１４７】
得られた全てのペプチド（配列番号２４９〜２６１）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｄｏｇ  Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１６に示す。なお、表１６中の「発色値」は、ｄｏｇ  Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｄｏｇ  Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１４８】
【表１６】
2004187563.tif 000017
【０１４９】
表１６から、配列番号２４９〜２６１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ｄｏｇ  Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｄｏｇ  Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１５０】
また、配列番号２４９〜２６１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列から、表１７のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１３２〜１５１で表される共通配列を決定した。
【０１５１】
【表１７】
2004187563.tif 000018
【０１５２】
実施例１３
ターゲット物質として、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｂｏｖｉｎｅ  Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｂｏｖｉｎｅ  Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２６２〜２６７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１５３】
得られた全てのペプチド（配列番号２６２〜２６７）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｂｏｖｉｎｅ  Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表１８に示す。なお、表１８中の「発色値」は、ｂｏｖｉｎｅ  Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｂｏｖｉｎｅ  Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１５４】
【表１８】
2004187563.tif 000019
【０１５５】
表１８から、配列番号２６２〜２６７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ｂｏｖｉｎｅ  Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｂｏｖｉｎｅ  Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１５６】
また、配列番号２６２〜２６７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列から、表１９のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１５２〜１５６で表される共通配列を決定した。
【０１５７】
【表１９】
2004187563.tif 000020
【０１５８】
実施例１４
ターゲット物質として、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｓｗｉｎｅ  Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｓｗｉｎｅ  Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２６８〜２７７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１５９】
得られた全てのペプチド（配列番号２６８〜２７７）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｓｗｉｎｅ  Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表２０に示す。なお、表２０中の「発色値」は、ｓｗｉｎｅ  Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｓｗｉｎｅ  Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１６０】
【表２０】
2004187563.tif 000021
【０１６１】
表２０から、配列番号２６８〜２７７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ｓｗｉｎｅ  Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｓｗｉｎｅ  Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１６２】
また、配列番号２６８〜２７７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列から、表２１のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１５７〜１６２で表される共通配列を決定した。
【０１６３】
【表２１】
2004187563.tif 000022
【０１６４】
実施例１５
ターゲット物質として、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｍｏｕｓｅ  Ｆｃと略記する。）を用いた以外は、実施例１の（１）と同様にしてファージディスプレイ法（選択操作４回）を行い、ｍｏｕｓｅ  Ｆｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを行い、配列番号２７８〜２８０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【０１６５】
得られた全てのペプチド（配列番号２７８〜２８０）について、実施例１（２）と同様の方法（ＥＬＩＳＡ法）で、ｍｏｕｓｅ  Ｆｃに対する結合性を調べた。その結果を表２２に示す。なお、表２２中の「発色値」は、ｍｏｕｓｅ  Ｆｃ（ターゲット物質）固定化ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）／コントロール（空）ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）を表し、「発色値」が大きいほど、ｍｏｕｓｅ  Ｆｃに対する親和性が強いことを示す。
【０１６６】
【表２２】
2004187563.tif 000023
【０１６７】
表２２から、配列番号２７８〜２８０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ｍｏｕｓｅ  Ｆｃに対する親和性が異なるものの、いずれもｍｏｕｓｅ  Ｆｃに対して結合力を有していることが分かる。
【０１６８】
また、配列番号２７８〜２８０で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのアミノ酸配列から、表２３のような組み合わせで共通配列の検索を行い、配列番号１６３〜１６４で表される共通配列を決定した。
【０１６９】
【表２３】
2004187563.tif 000024
【０１７０】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１〜８７：ファージディスプレイ法で得られたヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号８８〜９０：ファージディスプレイ法で得られたウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号９１〜９３：ファージディスプレイ法で得られたヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号９４〜９７：ファージディスプレイ法で得られたウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定されたアミノ酸配列である。
配列番号９８〜１０４：ファージディスプレイ法で得られたモルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１０５〜１０８：ファージディスプレイ法で得られたヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１０９〜１３１：ファージディスプレイ法で得られたネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１３２〜１５１：ファージディスプレイ法で得られたイヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１５２〜１５６：ファージディスプレイ法で得られたウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１５７〜１６２：ファージディスプレイ法で得られたブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１６３〜１６４：ファージディスプレイ法で得られたマウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドから決定された共通配列である。
配列番号１６５〜２０７：ファージディスプレイ法によって得られた、ヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２０８〜２１２：ファージディスプレイ法によって得られた、ウマ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２１３〜２１６：ファージディスプレイ法によって得られた、ヒツジ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２１７〜２２０：ファージディスプレイ法によって得られた、ウサギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２２１〜２２７：ファージディスプレイ法によって得られた、モルモット由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２２８〜２３２：ファージディスプレイ法によって得られた、ヤギ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２３３〜２４８：ファージディスプレイ法によって得られた、ネコ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２４９〜２６１：ファージディスプレイ法によって得られた、イヌ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２６２〜２６７：ファージディスプレイ法によって得られた、ウシ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２６８〜２７７：ファージディスプレイ法によって得られた、ブタ由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２７８〜２８０：ファージディスプレイ法によって得られた、マウス由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２８１〜２８７：非特許文献１に記載されたヒト由来ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチドである。
配列番号２８８：Ｍ１３ＫＥ（改変型）のｐＩＩＩ遺伝子の５’末端側の塩基配列である。
配列番号２８９：Ｍ１３ＫＥ（改変型）のｐＩＩＩ遺伝子の５’末端の塩基配列（配列番号２８８）中、３３〜５４番目の塩基配列にアニーリングするように設計されたプライマーである。
配列番号２９０：配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を有するペプチド（ＫＬＹＨＬＳＩ）をコードする塩基配列を含み、かつｐＩＩＩ遺伝子の５’末端の塩基配列（配列番号２８８）中、５５〜７６番目の塩基配列の相補鎖にアニーリングするように設計されたプライマーである。
配列番号２９１：Ｍ１３ＤＮＡのシークエンス用のプライマーである。
【０１７１】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、上記のＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド又は該ペプチドを表面に呈示しているファージを、ＩｇＧの検出手段として用いることにより、抗ＩｇＧ抗体を用いた検出系に比べて、より安価なＩｇＧの検出系を提供できる。また、抗ＩｇＧ抗体のような品質のばらつきがないので、より安定したＩｇＧの検出系を提供できる。
【０１７２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを呈示したファージのｈｕｍａｎ  Ｆｃに対する結合性の確認試験の結果を表す図である。
【図２】配列番号１６５〜１６７、１６９、１７０、１７２、１７３、１７５〜１８９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを呈示したファージのヒト由来ＩｇＧに対する特異性を検討した結果を示す図である。
【図３】配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを呈示したファージを二次抗体として用い、ｈｕｍａｎ  Ｆｃを検出した結果を示す図である。
【図４】配列番号１７３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを呈示したファージを二次抗体として用い、ｈｕｍａｎ  Ｆｃを検出した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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