(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便、迅速で感度の良い微量アッセイ方法を提供する。【解決手段】微量反応容器内で小面積のメンブレンを用いて、サンプル中の標的物質とこの標的物質に結合可能な受容体との間のアフィニティ反応を行う微量アッセイ方法であって、（１）サンプルを微量取り、これをメンブレンにロードして、このサンプル中の標的物質を前記メンブレンに付着させるステップと、（２）前記メンブレンを前記微量反応容器に入れて、前記標的物質に結合可能な抗体（受容体）を含有する溶液を加えるステップと、（３）前記微量反応容器中で前記メンブレンを、前記メンブレンに付着した前記標的物質がアフィニティ反応により前記受容体に結合するのに十分な時間インキュベートして標的物質−受容体複合体を形成させるステップと、（４）前記標的物質−受容体複合体を検出するステップとを含む微量アッセイ方法と微量アッセイ方法を行うための装置も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微量反応容器内で小面積のメンブレンを用いて、サンプル中の標的物質とこの標的物質に結合可能な受容体との間のアフィニティ反応を行う微量アッセイ方法であって、次の（１）〜（４）の各ステップ：
（１）サンプルを微量取り、これをメンブレンにロードして、このサンプル中の標的物質を前記メンブレンに付着させるステップと、
（２）前記メンブレンを前記微量反応容器に入れて、前記標的物質に結合可能な抗体を含有する溶液を加えるステップと、
ここで該溶液の容量は、前記サンプルを付着している前記メンブレンの領域全体が十分浸る容量であり、
（３）前記微量反応容器中で前記メンブレンを、前記メンブレンに付着した前記標的物質がアフィニティ反応により前記受容体に結合するのに十分な時間インキュベートして標的物質−受容体複合体を形成させるステップと、
（４）前記標的物質−受容体複合体を検出するステップと
を含む微量アッセイ方法。
【請求項２】
次の（１’）、（３’）、（４’）の各ステップ：
（１’）ステップ（２）の前に、前記メンブレンを脱色するのに十分な時間、該メンブレンを脱色溶液に浸すステップと、
（３’）ステップ（４）の前に、前記メンブレンを脱色するのに十分な時間、該メンブレンを脱色溶液に浸すステップと、
（４’）前記標的物質−受容体複合体に結合した標識物質にシグナルを発生させ、該シグナルを観察して該標的物質の存在を決定する段階を含むステップ（４）と
を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
０．５μＬのテストサンプルを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルを鋭い先端を有するスティック又は針を用いて前記メンブレンにスポットを付けて、観察可能なスポットを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記スポットの直径が１ｍｍ未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記スポットの直径が０．５ｍｍ未満である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
３〜２００μＬの受容体溶液を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
２０〜５０μＬの受容体溶液を用いる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記メンブレンの材料が、ニトロセルロース、ナイロン、グラスファイバ、ＰＶＤＦ、レーヨン、ろ紙、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、ジアゾ紙、活性ビーズ、プロテインＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ビーズ、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ガラス及びプラスチックからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記メンブレンがニトロセルロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的物質−受容体複合体の検出を、該複合体にシグナル発生化合物の標識を付与することにより行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が発色剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標識が酵素、着色ラテックス粒子又は金属コロイドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標識が酵素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが液体サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが植物組織液である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが動物体液（動物の血清、全血、血漿又は尿）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが微生物生育培地である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記微量反応容器が直径１０ｍｍ未満の円状、だ円状、又は半円状の開口部を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記微量反応容器がフラスコ底部を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記微量反応容器が上部と下部に分かれ、下部の直径が上部の直径よりも小さいものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記微量反応容器が上部と下部に分かれ、下部の直径が上部の直径よりも小さいものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記メンブレンを固相に固着させることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記固相がプラスチックストリップである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
一以上の標的物質を同時に検出するのに用いることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的物質に結合可能な受容体溶液を用いることができる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
反応を行う微量反応容器内で小面積のメンブレンを用い、一以上の標的物質の存在を検出する方法であって、次の（１）〜（８）の各ステップ：
（１）前記標的物質と結合可能な第一の受容体の一以上のスポットを前記メンブレン上に安定に結合させるステップと、
（２）前記メンブレンをブロッキングするステップと、
（３）前記サンプルを微量取り、前記メンブレンのスポットにロードするステップと、
（４）必要に応じて、前記サンプルが吸着したメンブレンを、脱色溶液中で脱色させるのに十分な時間すすぐステップと、
（５）ステップ（４）で処理したメンブレンを前記微量反応容器中に入れるステップと、
（６）前記標的物質と結合可能な第二の受容体溶液２〜２００μＬを前記微量反応容器に加え、この反応容器中で前記メンブレンを、アフィニティ反応により前記ストリップのメンブレンに付着した標的物質が前記受容体に結合するのに十分な時間をかけてインキュベートして、標的物質−受容体複合体を形成させるステップと、
（７）必要に応じて、ステップ（６）で処理したメンブレンを数回洗浄し、余分な前記第二の受容体溶液を除去するステップと、
（８）前記標的物質−受容体複合体を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２８】
サンプル中の標的物質とこの標的物質に結合可能な受容体との間のアフィニティ反応を行う、請求項１に定義された微量アッセイ方法を実施するための装置であって、
（１）メンブレンと、
（２）微量反応容器と、
（３）コンポーネントと
を含み、
前記メンブレンは、該メンブレン上にサンプルをロードして標的物質を該メンブレン上に吸着させるものであり、
前記微量反応容器は、該容器内で前記標的物質を前記受容体とアフィニティ反応させ、標的物質−受容体複合体を形成させるものであり、
前記コンポーネントは、前記標的物質−受容体複合体を検出するのに用いられるものである装置。
【請求項２９】
次の（４）〜（６）：
（４）マイクロピペットと、
（５）他の試薬を含むボトルと、
（６）対照用ストリップ、即ちサンプルに比べ十分な量の標的物質を吸着したメンブレンであって、この標的物質の存在を決定するためのメンブレンと
を更に含む、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
次の（７）〜（１０）：
（７）前記標的物質を吸着することができるメンブレンを支持するロッド又はスティックであるテストストリップと、
（８）微量反応容器と、
（９）標識されている、又は、標識物質と結合できる前記受容体溶液に結合可能な試薬を含むボトルと、
（１０）シグナル発生試薬を含有するボトルと
を含み、必要に応じて更に、次の（１１）〜（１３）：
（１１）マイクロピペットと、
（１２）他の試薬を含有するボトルと、
（１３）対照用ストリップ、即ちサンプルに比べ十分な量の標的物質を吸着したメンブレンであって、この標的物質の存在を決定するためのメンブレンと
を含む、請求項２８に記載の装置。
【請求項３１】
前記ストリップに固定される前記メンブレンがニトロセルロース、ナイロン、グラスファイバ、ＰＶＤＦ、レーヨン、ろ紙、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、ジアゾ紙、活性ビーズ、プロテインＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ビーズ、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ガラス及びプラスチックからなる群から選択されるものである、請求項２８に記載の装置。
【請求項３２】
前記ストリップに固定される前記メンブレンがニトロセルロースである、請求項２８に記載の装置。
【請求項３３】
前記標的物質−受容体複合体の検出を、該複合体にシグナル発生化合物の標識を付与することにより行う、請求項２８に記載の装置。
【請求項３４】
前記標識が発色剤である、請求項２８に記載の装置。
【請求項３５】
前記標識が酵素、着色ラテックス粒子又は金属コロイドである、請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
前記標識が酵素である、請求項３５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微量アッセイを行う方法及び装置に関する。特に、本発明は、イムノアッセイ等のアフィニティ反応のアッセイを提供する。
【０００２】
【従来の技術】
各種標的物質の存在を決定するため、標的物質と受容体を反応させるアフィニティ反応による分析技法において用いられる各種インジケータが何年にも亘り開発されてきた。各種放射性標識や蛍光インジケータ、その他の色素産生（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）インジケータを標識として用い、各種標的物質の存在を決定するのである（例えば、抗体に特異的に結合する抗原のイムノアッセイ）。
【０００３】
最近、酵素、着色ラテックス粒子、及び金属コロイドの使用が簡便、迅速な検出方法を提供すると了解されており、これらの結果は技術者でなくても裸眼で確認できる。しかしながら、簡便で迅速な方法は、感度や正確さが低いといったいくつかの欠点がある。特に、サンプル中の非常に低い濃度の標的物質を定量する場合には、望ましい結果を得ることは困難であった。
【０００４】
モノクローナル抗体及び他の抗体のドット−免疫結合アッセイ（ｄｏｔ−ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）については既に開示されている。この種のアッセイの原理は次の通りである。抗原の希釈溶液又は懸濁液をろ紙のニトロセルロース片にドット（斑点）を付け、このドットを、テスト抗体及び第一抗体に対抗するパーオキサイド結合第二抗体と共にインキュベートする。陽性の反応は着色ドットとして検出される。このアッセイの利点は、次の２点である。（１）アッセイに必要な抗原及び抗体の量が少ない、（２）ニトロセルロース紙は殆ど白色のバックグラウンドを与えるので、陽性反応の呈色を容易に観察できる。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１９，１４２−１４７（１９８２）を参照されたい。しかしながら、このイムノアッセイの欠点は、次の２点である。（１）アッセイを実施するのに、２０を超える希釈、インキュベーション、及び洗浄の工程が必要な複雑な技法である、及び（２）非常に時間がかかる。標準的なアッセイ実施に２０時間を超える時間を要する。
【０００５】
サンプル中の抗体又は抗原の存在を検出する別のイムノアッセイが米国特許第４，７７４，１７７号に開示されている。この方法では、小スポット（直径約３ｍｍ）が安定に結合した第一のリガンド（ハプテン又は抗体）を有するニトロセルロースキャリアを用いる。このニトロセルロースキャリアを、第一のリガンドに対し非特異的なグロブリンを含む液体で処理し、第一のリガンドの抗体結合部位以外の結合部位をブロックする。抗体が含まれている可能性のある液体サンプル（約５０μＬ）をニトロセルロースキャリア上のスポットに塗布する。次いで、このニトロセルロースキャリアを室温で十分な時間インキュベートして、サンプル中に存在し得る抗体を第一のリガンドに結合させ、リガンド−抗体複合体を形成する。この段階にかかる時間は約６分である。次に、標識された抗グロブリンを含む液体をこの複合体に加え、室温で約３分インキュベートして、標識された抗グロブリンをリガンド−抗体複合体に結合させる。このニトロセルロースキャリアを洗浄し、適切な発色剤を加え、アッセイを完了する。しかしながら、この方法のステップは複雑である。容器を使用せずに直接ニトロセルロースキャリアに液体を加え、抗グロブリン−抗体−リガンド複合体を形成する場合は、通常、インキュベート中に液体が乾燥してしまう。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来の各種方法の欠点の多くを克服するものであり、より簡便、迅速で感度の良い微量検出方法を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は次の微量アッセイ方法を提供する。即ち、微量反応容器内で小面積のメンブレンを用いて、サンプル中の標的物質とこの標的物質に結合可能な受容体との間のアフィニティ反応を行う微量アッセイ方法であって、次の（１）〜（４）の各ステップ：
（１）サンプルを微量取り、これをメンブレンにロードして、このサンプル中の標的物質を前記メンブレンに付着させるステップと、
（２）前記メンブレンを前記微量反応容器に入れて、前記標的物質に結合可能な抗体を含有する溶液を加えるステップと、
ここで該溶液の容量は、前記サンプルを担持している前記メンブレンの領域全体が十分浸る容量であり、
（３）前記微量反応容器中で前記メンブレンを、前記メンブレンに付着した前記標的物質がアフィニティ反応により前記受容体に結合するのに十分な時間インキュベートして、標的物質−受容体複合体を形成させるステップと、
（４）前記標的物質−受容体複合体を検出するステップと
を含む微量アッセイ方法である。
また、本発明の別の目的は、本発明の微量アッセイ方法を行うための装置を提供することである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
「アフィニティ反応」とは、一対の分子であって、一方の分子は表面上に又はキャビティ中の或る領域が、他方の分子の特定の空間的及び極性的組織に特異的に結合することと定義される。特異的結合対を構成する分子としては、抗原と抗体、相補的な核酸断片同士、又は互いに特定の空間的及び極性的組織を認識できる一対のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０００９】
また、「アフィニティ反応アッセイ」とは、イムノアッセイ、又はハイブリッド形成検出方法のような、目的とするアフィニティ反応分析を実行するためのアッセイと定義される。本発明の実施形態は、直接検出イムノアッセイ又はサンドイッチ法イムノアッセイを含むイムノアッセイであるが、これらに限定されるものではない。アッセイは、シグナルを発生する系を用いて、アフィニティ結合の分光測定的性質を測定するアッセイ（例えば、酵素イムノアッセイ）であることが好ましい。
【００１０】
「標的物質」は、他の物質と相互作用する物質であれば如何なる物質であってもよく、リガンド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、病原体、受容体タンパク質、アビジンと結合するビオチン等の物質、更には他の物質に対し特異的な親和性相互作用（アフィニティ  インターラクション）を有する物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
「受容体」とは、通常、標的物質を認識してこれと結合できる物質をいう。受容体としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、抗原、ハプテン、核酸断片、タンパク質やタンパク質断片、受容体タンパク質、アビジンと結合するビオチン等の物質、更には他の物質に対し特異的な親和性相互作用を有する物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
本発明は、微量検出方法に関する。本方法の特徴は、検出に微量のテストサンプルしか必要でなく、且つ、簡便、迅速で感度良く検出ができることである。
【００１３】
本発明の理論は、ミハエリス−メンテンの反応速度論に基づいている。抗原−抗体複合体を例として、特異的な親和性相互作用を説明する（抗原をテストサンプルとする）。
Ａｇ＝抗原；  Ａｂ＝抗体；  ［Ｏ］＝物質Ｏの濃度；  Ｃｏｍｐｌｅｘ＝抗原−抗体の特異的な認識（結合）により形成された複合体とすると、
Ａｇ＋Ａｂ→ｃｏｍｐｌｅｘ
【００１４】
このとき、解離定数Ｋｄは次のように表すことができる。
Ｋｄ＝［Ａｇ］×［Ａｂ］／［Ｃｏｍｐｌｅｘ］
【００１５】
抗原−抗体反応の殆どにおいて、Ｋｄは１×１０−９Ｍ程度である。即ち、２種類の反応物質Ａｇ及びＡｂは、合計の濃度が１×１０−９Ｍ以上である場合、複合体が形成される傾向となる。従って、抗原の濃度が非常に低い場合は、Ａｂの濃度を増加させてＡｇ−Ａｂ複合体を形成する側に反応を進めることができる。本発明では特別の微量の設計となっているので、余分な費用をかけずともＡｂの有効濃度を容易に高くすることができる。更に、反応物質の濃度を高くすると、速度やテストストリップの感度も改良される。これは、ミハエリス−メンテンの式で次のように示すことができる。
Ｖ＝Ｖｍａｘ［Ｓ］／（［Ｓ］＋Ｋｍ）
【００１６】
ここで、Ｖ及びＶｍａｘはそれぞれ反応速度及び最大反応速度を示す。［Ｓ］は基質の濃度を示す。Ｋｍはこの反応の定常状態における解離定数を示す。
【００１７】
反応速度を改良するための本発明の理論は、ミハエリス−メンテンの式を用いて次のように示すことができる。
Ｖ＝Ｖｍａｘ［Ａｇ］／（［Ａｇ］＋Ｋｄ）
【００１８】
ここで、Ｖ及びＶｍａｘはそれぞれアフィニティ反応の反応速度及び最大反応速度を示す。［Ａｇ］は基質の濃度を示す。Ｋｄはこのアフィニティ反応の解離定数を示す。
【００１９】
上の式を変形すると、ラインウィーバー−バークの式を得ることができる。
１／Ｖ＝Ｋｄ／Ｖｍａｘ［Ａｇ］  ＋  １／Ｖｍａｘ
【００２０】
従って、この式から次のことが得られる。基質の濃度［Ａｇ］を高くすると、Ｖｍａｘ［Ａｇ］は最大に近づき、Ｋｄ／Ｖｍａｘ［Ａｇ］はゼロに近づき、１／Ｖは１／Ｖｍａｘに近づく。即ち、反応速度ＶがＶｍａｘに近づく。このため、キット中に最少量の反応物質と高濃度の標識抗体を用いる特別の設計では、検出の速度と感度の両方が最大に近づく。
【００２１】
本発明の方法は、簡単且つ時間のかからない方法によって非常に低濃度の標的物質を検出する方法を提供することによって、従来技術の方法と異なる。従来技術のイムノアッセイは８時間かかるのに対し、本発明の方法では数分から１時間でアッセイを実施できる。本発明は、その簡単なプロトコルや扱い易さという点でも従来技術に優っている。
【００２２】
本発明は、微量反応容器内で小面積のメンブレンを用いて、サンプル中の標的物質とこの標的物質に結合可能な受容体との間のアフィニティ反応を行う微量アッセイ方法であって、次の（１）〜（４）の各ステップ：
（１）サンプルを微量取り、これをメンブレンにロードして、このサンプル中の標的物質を前記メンブレンに付着させるステップと、
（２）前記メンブレンを前記微量反応容器に入れて、前記標的物質に結合可能な抗体を含有する溶液を加えるステップと、
ここで該溶液の容量は、前記サンプルを担持している前記メンブレンの領域全体が十分浸る容量であり、
（３）前記微量反応容器中で前記メンブレンを、前記メンブレンに付着した前記標的物質がアフィニティ反応により前記受容体に結合するのに十分な時間インキュベートして標的物質−受容体複合体を形成させるステップと、
（４）前記標的物質−受容体複合体を検出するステップと
を含む微量アッセイ方法を提供する。
【００２３】
本発明の方法及び装置は、直接法イムノアッセイやサンドイッチ法イムノアッセイ、核酸ハイブリッド形成、その他既に知られている各種の親和性相互作用分析法を含むあらゆる種類の親和性相互作用に適しているが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
好ましくは、本発明は、動物、人間、植物の各種体液又は組織の検出に有用である。本発明によると、液状サンプルとしては、人間の体液、動物の体液、植物組織液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明に用いられるテストサンプルとしては、抗原、抗体、病原体、ウィルス、核酸断片、及びタンパク質断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、バックグラウンド色（例えば、植物組織の緑色液体、又は血液サンプルの赤色液体）を除去することが好ましい。脱色試薬（ｄｉｓｃｏｌｏｒｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）は、バックグラウンド色を除くことができる試薬であれば如何なるものであってもよく、例えば漂白剤、アルコール、クロロホルム、アセトン、四塩化炭素、又はこれらの混合物が挙げられる。
【００２５】
本発明では、テストサンプルの標的物質を吸収するために用いるメンブレンは、標的物質を吸収できるあらゆる多孔質材料であることができる。かかる多孔質材料としては、ニトロセルロース、ナイロン、グラスファイバ、ＰＶＤＦ、レーヨン、ろ紙、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、ジアゾ紙、活性ビーズ、プロテインＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ビーズ、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ガラス、プラスチック等が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の好ましい実施形態においては、ニトロセルロースを用いる。タグを付けた抗グロブリンのアッセイにおいては、観察可能なスポットを形成するのに有効な量のサンプルと結合できる限り、メンブレンの面積を可能な限り小さいものとする。メンブレンの面積は、１〜２００ｍｍ２が好ましく、例えば１００ｍｍ２である。
【００２６】
本発明においては、プラスチックストリップ等の固相を用いてメンブレンを実質的に支持するのが有利である。多様な材料や形状のものを用いることができる。本発明の一実施形態では、テストストリップ等のストリップやスティックの一体部分を用いて、ストリップの末端にメンブレンを保持する。固相の大きさは限定されない。例えば、幅は１０ｍｍ未満、好ましくは５ｍｍ未満である。メンブレンを支持するストリップの尖端を尖った形状にして、植物組織、人体、又は動物の体表面を貫通させ、テストサンプルをメンブレンに接触させたり、テストサンプル中の標的物質をメンブレン上に吸着させたりすることができる。
【００２７】
本発明の一実施形態では、幅が３ｍｍ以下のストリップを用いる。また、植物組織に貫通させることができるよう鋭くされた先端を有するストリップの一端が一片のメンブレンによって覆われている。
【００２８】
本発明の方法に適用される液体テストサンプルの量は非常に少量で、好ましくは０．５μＬ以下である。テストサンプルをメンブレン上に適用する方法は数多く本技術分野において知られており、これらを用いて本発明を実施することができる。例えば、テストサンプルをメンブレン上に滴下又はドットする、及び／又はメンブレンをテストサンプル溶液中ですすぐ等である。本発明の一実施形態では、鋭い先端を有するスティックや針を用いて液体テストサンプルをメンブレン上にドットする。観察可能なスポットの直径は、好ましくは０．２〜１．５ｍｍ、より好ましくは０．５ｍｍ未満である。
【００２９】
本発明のアフィニティ反応を行うにあたっては微量反応容器を用いる。該容器の形状は制限されず、容積がメンブレン、固相、又はストリップを反応溶液ですすぐのに十分であればよい。
【００３０】
本発明の一実施形態では、微量反応容器は円形又は半円形の開口部とフラスコ底部を有するか、又は上部と下部に分割されている。下部の直径は上部より小さい。
【００３１】
本発明では、アフィニティ反応する標的物質と受容体は、メンブレンを完全にすすぐのに十分な量、例えば３〜２００μＬ、好ましくは２０〜５０μＬ、の溶液であるが好ましい。
【００３２】
本発明では、テストサンプルを吸収したメンブレンのインキュベート時間はアフィニティ反応の完了と標的物質−受容体複合体の形成を確実に達成するのに十分な時間でなければならない。反応容量が非常に小さいので、反応速度を速くすることができる。反応時間は数分に短縮することができ、従来の方法に比べ非常に短い。
【００３３】
本発明の実施にあたっては、標的物質と結合することができる受容体は、市販のものを使用したり、慣用の各種技法により調製することができる。例えば、抗体は従来の免疫学的技法を用いて調製することができる。
【００３４】
標的物質−受容体複合体は、知られている標準的アフィニティ反応分析によって検出することができる。例えば、シグナルを発生することができる標識された物質を用いて検出することができる。本発明において、これらの標識された物質としては次のものが挙げられるが、これらに限定されない。
（１）酵素、例えば：
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（基質の例：１，１’−トリメチレン−ビス（４−ホルミルピリジニウムブロミド）ジオキシム（ＴＭＢ）、２，２’−ｏ−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）、ＤＡＢ／コバルト、クロロナフトール、又は蛍光分析用ラベル又は冷光ラベル）；
大豆ペルオキシダーゼ（基質：上に同じ）；
アルカリホスファターゼ（基質：ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、ニトロ−ブルー  テトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェート−ｐ−トルイジン塩（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）、ファストレッド  ＴＲ／ＡＳ、及び蛍光分析用ラベル又は冷光ラベル）；
β−ガラクトシダーゼ（基質の例：ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド／５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ））；
グルコースオキシダーゼ（基質：ＮＢＴ、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ））
（２）ビオチン−アビジン
（３）着色ラテックス粒子
（４）金属コロイド
（５）蛍光分析用物質
（６）ラジオアイソトープ、例えば１２５Ｉ、及び３５Ｓ。
【００３５】
本発明によれば各種標的物質の検出のための簡単な技法が達成されたので、熟練者でなくてもアッセイを実施することができる。このことは、検出測定を視認により行う場合に非常に重要である。特に、シグナルは裸眼により観察することができ、好ましくは例えばペルオキシダーゼ、着色ラテックス粒子、及び金属コロイド等で発色させて観察できる。本発明の好ましい実施形態では、アルカリホスファターゼを用いる。
【００３６】
標識物質と受容体との結合は、標識結合受容体を標的物質に結合させる前とすることができる。酵素は特定の抗イムノグロブリンと共有結合させ、次いで検出対象の抗体と結合させることができる。
【００３７】
本発明の好ましい一様相は“サンドイッチ法イムノアッセイ”に関し、ここでは標的物を受容体と結合させ、更に第二の標識受容体を添加してシグナルを発生させる。
【００３８】
本発明では、標的物質−受容体複合体を注意深く洗浄し、非特異的に結合している標的物質、受容体及び／又は標識物質を取り除くべきである。洗浄用緩衝液は、水、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）、トリス緩衝液（ＴＢＳ）、又は食塩水であることができる。必要に応じてＴｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００等の界面活性剤を加えてもよい。
【００３９】
本発明では、十分な時間インキュベーションした後、シグナル発生化合物からシグナルが発生する。結果の読み違いを避けるため、停止液を加えて反応を停止させることができる。例えば、酵素と基質との相互作用が完結した後、上述の停止液や他の停止試薬を加えて反応を停止させる。
【００４０】
本発明では、希釈用緩衝液は、少量のタンパク質、例えば０．５〜１５％の無脂肪ミルク、０．１〜５％のウシ血清アルブミン、卵アルブミン、又はこれらの混合物、を添加した洗浄用緩衝液であることができる。必要に応じてＴｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００等の界面活性剤を加えてもよい。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態では、アフィニティ反応を行う微量アッセイ方法に微量反応容器内で小面積のメンブレンを用い、サンプル中の標的物質とこの標的物質に結合可能な受容体との間のアフィニティ反応を行う。この方法は次の（１）〜（６）の各ステップを含む：
（１）サンプルを微量取り、これをメンブレンにロードして、このサンプル中の標的物質を前記メンブレンに付着させるステップと、
（２）必要に応じ、このメンブレンを脱色溶液中で十分な時間をかけてすすぐステップと、
（３）前記メンブレンを前記微量反応容器に入れ、前記標的物質に結合可能であると共にシグナル発生化合物で標識された受容体を含有する溶液を加えるステップと、
ここで該溶液の容量は、前記サンプルを付着している前記メンブレンの領域全体が十分浸る容量であり、
（４）  前記微量反応容器中で前記メンブレンを、前記メンブレンに付着した前記標的物質がアフィニティ反応により前記受容体に結合するのに十分な時間インキュベートして標的物質−受容体複合体を形成させるステップと、
（５）ステップ（４）で処理したメンブレンを数回洗浄し、未結合受容体を含む溶液を除去するステップと、
（６）シグナルを観察し、標的物質の存在を決定するステップ。
【００４２】
この検出アッセイでは、標識された受容体を標的物質とアフィニティ反応させることにより、一又は数種類の標的物質を同時に検出することができる。
【００４３】
また、本発明は、一以上の標的物質の存在を単一の液体テストサンプル中で同時に検出する方法を提供するものである。一又は数個のスポットを、第一の受容体に結合可能な前記メンブレンに結合させる。希釈用緩衝液を加えてメンブレンをブロックし、干渉を防ぐ。このメンブレンを第二の受容体と共にインキュベートする。一以上の標的物質の存在を検出する本方法は、次の（１）〜（８）の各ステップを含む：
（１）前記標的物質と結合可能な第一の受容体の一以上のスポットを前記メンブレン上に安定に結合させるステップと、
（２）タンパク質を少量含む溶液を添加することにより前記メンブレンをブロッキングするステップと、
（３）サンプルを微量取り、前記メンブレンのスポットにロードするステップと、
（４）必要に応じて、前記サンプルが吸着したメンブレンを、脱色溶液中で脱色させるのに十分な時間すすぐステップと、
（５）前記メンブレンを前記微量反応容器中に入れるステップと、
（６）前記標的物質と結合可能な第二の受容体溶液２〜２００μＬを前記微量反応容器に加え、この反応容器中で前記メンブレンを、アフィニティ反応によりストリップのメンブレンに付着した標的物質が前記受容体に結合するのに十分な時間をかけてインキュベートして標的物質−受容体複合体を形成させるステップと、
（７）必要に応じて、ステップ（６）で処理したメンブレンを数回洗浄し、余分な前記第二の受容体含有溶液を除去するステップと、
（８）前記標的物質−受容体複合体を検出するステップ。
【００４４】
また、本発明は、サンプル中の標的物質とこの標的物質に結合可能な受容体との間のアフィニティ反応を行う、微量アッセイ方法を実施するための装置であって、次の（１）〜（３）の構成要素：
（１）サンプルをロードして標的物質を吸着させるメンブレンと、
（２）前記標的物質と前記受容体をアフィニティ反応させて、標的物質−受容体複合体を形成させる微量反応容器と、
（３）前記標的物質−受容体複合体を検出するのに用いるコンポーネントと
を含む装置を提供する。
更に、アフィニティ反応を行う微量アッセイを実施するために次の（４）〜（６）の構成要素：
（４）マイクロピペットと、
（５）他の試薬を含むボトルと、
（６）対照用ストリップ、即ちサンプルに比べ十分な量の標的物質を吸着したメンブレンであって、この標的物質の存在を決定するためのメンブレンと
を用いてもよい。
【００４５】
本発明の更なる様相では、本発明のアフィニティ反応を実施するための装置を提供し、この装置は、次の（１）〜（７）を含む：
（１）前記標的物質を吸着することができるメンブレンを支持するストリップ又はスティックであるテストストリップと、
（２）微量反応容器と、
（３）標識されている、又は、標識物質と結合できる受容体に結合可能な試薬を含むボトルと、
（４）シグナル発生試薬を含有するボトルと
を含み、必要に応じて更に、次の（５）〜（７）：
（５）マイクロピペットと、
（６）他の試薬を含有するボトルと、
（７）対照用ストリップ、即ちサンプルに比べ十分な量の標的物質を吸着したメンブレンであって、この標的物質の存在を決定するためのメンブレン。
【００４６】
次に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００４７】
実施例１：標識抗体の調製
精製したズッキーニイエローモザイクウィルス（ｚｕｃｃｈｉｎｉ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（１ｍｇ／ｍＬ）と完全アジュバント又は不完全アジュバントを激しく混合し、ニュージーランドラビットに注射する。７日毎に再注射する。１ヵ月後、ウィルスに対する最適な抗体応答が得られる。硫酸アンモニウム沈殿及びＤＥＡＥカラムクロマトグラフィ分離によってラビット抗ウィルスＩｇＧを得、これとホースラディシュペルオキシダーゼを結合させる。この反応液に１．５％ウシ血清アルブミンと０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を加える。
【００４８】
実施例２：テストストリップの作製
プラスチックストリップを３ｍｍ×７５ｍｍに切り取り、これに３ｍｍ×５ｍｍのニトロセルロース片を取り付ける。
【００４９】
実施例３：微量反応検出アッセイ
１．健全なかぼちゃ組織と各標準テストサンプル（ズッキーニイエローモザイクウィルス濃度：６．４、３．２、１．６、０．８、０．４、０．２、及び０．１ｎｇ／μＬ）から、それぞれ０．２μＬの液体を量り取る。
２．健全なかぼちゃ組織と各標準テストサンプルからの上記液体を実施例２で作製したテストストリップのメンブレンにそれぞれドットする。スポットの直径は０．５ｍｍ未満が好ましい。
３．実施例１で調製した反応液から２５μＬをピペットで量り取り、微量反応容器に添加する。
４．ステップ２で調製したかぼちゃ組織の液体を吸収したストリップを容器内ですすぎ、４０分間インキュベートする。
５．ストリップを洗浄用緩衝液で洗浄する。
６．ストリップを発色剤を入れた容器に入れ、７分間インキュベートする。
７．ストリップを脱色溶液に浸すとストリップの緑色のバックグラウンド色を取り除くことができる。ストリップ上の余分な脱色溶液を清潔な吸収紙でぬぐい取る。
【００５０】
図１に示す結果から、健全なかぼちゃ組織から得た液体の色は変化しないが、ズッキーニイエローモザイクウィルスを次の濃度で含む各テストサンプルは明確に発色することがわかる；ウィルス濃度：（Ｂ）６．４ｎｇ／μＬ、（Ｃ）３．２ｎｇ／μＬ、（Ｄ）１．６ｎｇ／μＬ、（Ｅ）０．８ｎｇ／μＬ、（Ｆ）０．４ｎｇ／μＬ、（Ｇ）０．２ｎｇ／μＬ、（Ｈ）０．１ｎｇ／μＬ。この方法では０．０２ｎｇに至る高感度の検出ができる。
【００５１】
実施例４：微量反応検出アッセイ
１．健全なかぼちゃ組織と各標準テストサンプル（ズッキーニイエローモザイクウィルス濃度：６．４、３．２、１．６、０．８、０．４、０．２ｎｇ／μＬ）から、それぞれ０．５μＬの液体を量り取る。
２．健全なかぼちゃ組織と各標準テストサンプルからの各液体を実施例２で作製したテストストリップのメンブレンにそれぞれドットする。スポットの直径は０．５ｍｍ未満が好ましい。
３．ストリップを脱色溶液に浸すとストリップの緑色のバックグラウンド色を取り除くことができる。ストリップ上の余分な脱色溶液を清潔な吸収紙でぬぐい取る。
４．実施例１で調製した反応液から２５μＬをピペットで量り取り、微量反応容器に添加する。
５．かぼちゃ組織の液体を吸収したストリップを容器内ですすぎ、３５分間インキュベートして反応を完結させる。
６．  ストリップを洗浄用緩衝液で洗浄する。
７．  ストリップを発色剤を入れた容器に入れ、５分間インキュベートする。
【００５２】
図２に示す結果から、健全なかぼちゃ組織から得た液体の色は変化しないが、パンプキンイエローモザイクウィルスを次の濃度で含む各テストサンプルは明確に発色することがわかる（ウィルス濃度：（Ｂ）６．４ｎｇ／μＬ、（Ｃ）３．２ｎｇ／μＬ、（Ｄ）１．６ｎｇ／μＬ、（Ｅ）０．８ｎｇ／μＬ、（Ｆ）０．４ｎｇ／μＬ、（Ｇ）０．２ｎｇ／μＬ）。この方法では０．１ｎｇに至る高感度の検出ができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３の、（Ａ）健全なかぼちゃ組織、（Ｂ）６．４ｎｇ／μＬ、（Ｃ）３．２ｎｇ／μＬ、（Ｄ）１．６ｎｇ／μＬ、（Ｅ）０．８ｎｇ／μＬ、（Ｆ）０．４ｎｇ／μＬ、（Ｇ）０．２ｎｇ／μＬ、及び（Ｈ）０．１ｎｇ／μＬのズッキーニイエローモザイクウィルスを含むテストサンプルからの液体の図である。用いたテストサンプルの量は０．２μＬである。
【図２】実施例４、（Ａ）健全なかぼちゃ組織、（Ｂ）６．４ｎｇ／μＬ、（Ｃ）３．２ｎｇ／μＬ、（Ｄ）１．６ｎｇ／μＬ、（Ｅ）０．８ｎｇ／μＬ、（Ｆ）０．４ｎｇ／μＬ、（Ｇ）０．２ｎｇ／μＬのズッキーニイエローモザイクウィルスを含むテストサンプルからの液体の図である。用いたテストサンプルの量は０．５μＬである。
【図１】
2004177321.tif 000002
【図２】
2004177321.tif 000003
【外国語明細書】
2004177321.tif 000004
2004177321.tif 000005
2004177321.tif 000006
2004177321.tif 000007
2004177321.tif 000008
2004177321.tif 000009
2004177321.tif 000010
2004177321.tif 000011
2004177321.tif 000012
2004177321.tif 000013
2004177321.tif 000014
2004177321.tif 000015
2004177321.tif 000016
2004177321.tif 000017
2004177321.tif 000018
2004177321.tif 000019
2004177321.tif 000020
2004177321.tif 000021
2004177321.tif 000022
2004177321.tif 000023
2004177321.tif 000024
2004177321.tif 000025
2004177321.tif 000026
2004177321.tif 000027
2004177321.tif 000028
2004177321.tif 000029
2004177321.tif 000030
2004177321.tif 000031