(57)【要約】【課題】　改良されたハイブリダイゼーションプローブおよび望ましくない二次構造を形成する傾向がある標的分子の領域内に含まれる配列を検出する方法を提供すること。【解決手段】　標的分子内の標的ヌクレオチド配列を増幅するための二目的プライマーであって、ここで、該標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位の目的部位または二次構造形成領域内に含まれる目的の部位を含み、該二次構造形成領域が、該プライマーの非存在下において、増幅条件下において形成されるアンプリコンにおいて、望ましくない二次構造を生じて、該目的の部位の検出を妨げ、ここで、該プライマーが、（ａ）該二次構造形成領域以外の標的ヌクレオチド配列のセグメントに相補的なプライマー配列；および（ｂ）該望ましくない二次構造の形成を妨げるための、該二次構造形成領域のセグメントに実質的に相補的なブロッキング配列を含む、プライマー。【選択図】　図１０
2004113240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　標的分子内の標的ヌクレオチド配列を増幅するための二目的プライマーであって、ここで、該標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位の目的部位または二次構造形成領域内に含まれる目的の部位を含み、該二次構造形成領域が、該プライマーの非存在下において、増幅条件下において形成されるアンプリコンにおいて、望ましくない二次構造を生じて、該目的の部位の検出を妨げ、ここで、該プライマーが、（ａ）該二次構造形成領域以外の標的ヌクレオチド配列のセグメントに相補的なプライマー配列；および（ｂ）該望ましくない二次構造の形成を妨げるための、該二次構造形成領域のセグメントに実質的に相補的なブロッキング配列を含む、プライマー。
【請求項２】
　請求項１に記載のプライマーであって、ここで、前記目的の部位が、核酸配列である、プライマー。
【請求項３】
　請求項２に記載のプライマーであって、ここで、前記目的の部位が、単一ヌクレオチド多型である、プライマー。
【請求項４】
　請求項１に記載のプライマーであって、ここで、前記プライマー配列が、前記標的ヌクレオチド配列を含む標的分子の１つの末端に相補的である、プライマー。
【請求項５】
　請求項１に記載のプライマーであって、前記プライマー配列と前記ブロッキング配列との間に、非ハイブリダイズスペーサーをさらに備える、プライマー。
【請求項６】
　請求項５に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、非ヌクレオチドである、プライマー。
【請求項７】
　請求項６に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、合成親水性オリゴマーから構成される、プライマー。
【請求項８】
　請求項７に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、エチレンオキシド、およびエチレンオキシドとプロピレンオキシドとの組み合わせから選択される、約３〜約５０のアルキレンオキシド単位から構成される、プライマー。
【請求項９】
　請求項５に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、ヌクレオチドである、プライマー。
【請求項１０】
　請求項９に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、非天然ヌクレオチドの配列から構成される、プライマー。
【請求項１１】
　請求項１０に記載のプライマーであって、ここで、前記非天然のヌクレオチドが、イソグアニンおよびイソシトシンから選択される、プライマー。
【請求項１２】
　請求項９に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、反復する単一ヌクレオチドから構成されるオリゴマーセグメントである、プライマー。
【請求項１３】
　請求項９に記載のプライマーであって、ここで、前記プローブ配列および前記スペーサーが、該プローブ配列と該スペーサーとの間の転写を停止させるための手段によって、互いに分離されている、プライマー。
【請求項１４】
　請求項１３に記載のプライマーであって、ここで、前記転写を停止させるための手段が、停止リンカーである、プライマー。
【請求項１５】
　請求項１４に記載のプライマーであって、ここで、前記停止リンカーが、少なくとも１つの改変ヌクレオシドを含む、プライマー。
【請求項１６】
　請求項１５に記載のプライマーであって、ここで、前記改変ヌクレオシドが、Ｎ４−改変ピリミジンである、プライマー。
【請求項１７】
　請求項１に記載のプライマーであって、検出可能な標識をさらに備える、プライマー。
【請求項１８】
　請求項１７に記載のプライマーであって、ここで、前記検出可能な標識が、蛍光剤、化学発光剤、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬、および放射性同位体からなる群より選択される、プライマー。
【請求項１９】
　標的分子内の標的ヌクレオチド配列を増幅するための方法であって、ここで、前記標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位の目的部位または二次構造形成領域内に含まれる目的の部位を含み、該二次構造形成領域が、増幅条件下において形成されるアンプリコンにおいて、望ましくない二次構造を形成し得、該方法が、以下：
　該標的ヌクレオチド配列を、ハイブリダイゼーション条件下で、該標的分子の第１鎖の１つの末端に相補的な請求項１に記載の二目的プライマー、該標的分子の第２鎖の反対の末端に相補的な第２プライマー、該増幅に適切なヌクレオチド、および該ヌクレオチドの重合のための薬剤と、一緒にまたは連続的に接触させる工程であって、ここで、該方法の間に形成されるアンプリコンが、該望ましくない二次構造を含まず、その結果、該目的の部位が、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに接近可能である、工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
　請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、ＤＮＡポリメラーゼである、方法。
【請求項２１】
　請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、ＤＮＡリガーゼである、方法。
【請求項２２】
　請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、ＲＮＡポリメラーゼである、方法。
【請求項２３】
　請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、ＲＮＡ逆転写酵素である、方法。
【請求項２４】
　第１末端および第２末端を有する二本鎖標的ＤＮＡ分子の配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行するための方法であって、該方法が、（ａ）該二本鎖ＤＮＡを含むサンプルを、該ＤＮＡを変性させるのに有効な温度まで加熱し、そしてそれによって、ＤＮＡの第１鎖およびＤＮＡの第２鎖を提供する工程、（ｂ）該変性されたＤＮＡを第１オリゴヌクレオチドプライマーおよび第２オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程であって、各プライマーが、それぞれ、第１ＤＮＡ鎖の第１末端および第２ＤＮＡ鎖の第２末端に相補的な標的結合配列から構成される、工程、（ｃ）該サンプルを冷却して、第１オリゴヌクレオチドプライマーおよび第２ヌクレオチドプライマーを、それぞれ、該ＤＮＡの第１鎖および第２鎖にハイブリダイズさせる、工程、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを使用して該ＤＮＡを複製し、そして上記工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返して、２本鎖ＤＮＡの配列の複数のコピーを提供する、工程を包含し、請求項１に記載の二目的プライマーを第１プライマーとして使用することを改良として包含する、方法。
【請求項２５】
　請求項２４に記載の方法であって、ここで、前記検出可能な標識が、蛍光剤、化学発光剤、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬、および放射性同位体からなる群より選択される、方法。
【請求項２６】
　標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする請求項１に記載のプライマーに対するＤＮＡポリメラーゼの作用によって形成される、アンプリコン。
【請求項２７】
　個体の遺伝子型を決定するためのキットであって、請求項１に記載の二目的プライマー、オリゴヌクレオチド配列の増幅に適切なヌクレオチド、およびヌクレオチドの重合のための薬剤を含む、キット。
【請求項２８】
　個体の遺伝子型を決定するためのキットであって、請求項１に記載の二目的プライマー、第２プライマー、ＤＮＡ増幅に適切なヌクレオチド、ヌクレオチドの重合のための薬剤、ヌクレオチド捕捉領域を有する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）プローブ、および該ＡＳＨプローブ上に該ヌクレオチド捕捉領域に相補的なヌクレオチド捕捉領域を有する色コード化決定手段を含み、
　ここで、該検出手段上の該ヌクレオチド捕捉領域が該ＡＳＨプローブに相補的であり、その結果、該標的ヌクレオチド配列が該検出手段の該色コードによって同定される、
キット。
【請求項２９】
　請求項２８に記載のキットであって、ここで、前記検出手段が、多重検出手段である、キット。
【請求項３０】
　請求項２９に記載のキットであって、ここで、前記多重検出手段が、検出可能な固体基材を含む、キット。
【請求項３１】
　請求項３０に記載のキットであって、ここで、前記検出可能な固体基材が、検出可能なミクロスフェアである、キット。
【請求項３２】
　ハイブリダイゼーションプローブであって、（ａ）標的分子内の第１ヌクレオチド配列に相補的なプローブヌクレオチド配列、および（ｂ）標的分子内の第２ヌクレオチド配列に実質的に相補的なブロッキング配列を含み、ここで、該ブロッキング配列と該第２ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが、第２ヌクレオチド配列における二次構造形成を妨げ、該二次構造が、該プローブ配列と該第１ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを妨害する、ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３３】
　請求項３２に記載のハイブリダイゼーションプローブであって、検出可能な標識をさらに備える、ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３４】
　請求項３３に記載のハイブリダイゼーションプローブであって、ここで、前記検出可能な標識が、化学発光標識、蛍光標識、放射性標識、多量体ＤＮＡ標識、色素、酵素、酵素モジュレーター、検出可能な固体基材、および金属イオンからなる群より選択される、ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３５】
　標的分子内の標的ヌクレオチド配列の存在を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイを実行する方法であって、ここで、該標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位であるかまたは二次構造形成領域内に含まれ、該二次構造形成領域が、該標的ヌクレオチド配列の検出を妨げる望ましくない二次構造を形成し得、該方法が、以下：
　該標的分子を、ハイブリダイゼーション条件下で、請求項３３に記載のハイブリダイゼーションプローブと接触させて、その結果、該標的分子への該プローブのハイブリダイゼーションが、該望ましくない二次構造の形成を妨げ、そして該標的ヌクレオチド配列の検出を可能にする、工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
　請求項３５に記載の方法であって、ここで、前記標的分子が、ヒト個体から得られている、方法。
【請求項３７】
　請求項３５に記載の方法であって、ここで、前記標的分子が、細菌起源である、方法。
【請求項３８】
　請求項３５に記載の方法であって、ここで、前記標的分子が、ウイルス起源である、方法。
【請求項３９】
　請求項３８に記載の方法であって、ここで、前記第１ハイブリダイゼーションプローブ配列と前記標的ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが、前記ウイルスによって引き起こされる疾患の診断である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、一般に、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出および定量に使用され得るような、他の増幅アッセイにおける使用のためのプライマーおよびプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
　核酸ハイブリダイゼーションは、核酸の特定の配列を同定するために、広範に用いられる方法である。ハイブリダイゼーションは、相補的な核酸鎖の間の対合に基づく。公知の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、目的の核酸分析物を含むサンプル溶液にこのプローブを曝露することにより、核酸分析物の標的配列を同定し得る。核酸分析物がプローブにハイブリダイズする場合、この分析物は、標的配列を必然的に含む。本方法の種々の局面は、詳細に研究されている。本質的に、全てのバリエーションは、相補的な塩基配列が対合し、そして二本鎖分子を形成することを可能にし、そしてＥｋｅｚｅらに対する特許文献１およびＹｌｉｋｏｓｋｉらに対する特許文献２に記載されるような、多数の方法が、対合が生じたか否かを決定するために当該分野で公知である。
【０００３】
　標的配列に対するプローブの結合を検出する別の方法は、非特許文献１により記載される。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の間に増幅されないヌクレオチド配列を含むプローブの使用を伴い、ここで、このプローブは、発蛍光団およびクエンチャーが自己消光するほどに近接しているヘパリン構造を形成するように設計されている。しかし、標的ヌクレオチド配列を用いる変性およびハイブリダイゼーションの際、以前にこのヘパリン構造であったプローブのセグメントは、増幅した標的配列とハイブリダイズし、そして増大した蛍光により検出され得る。この「Ｓｃｏｒｐｉｏｎ」プローブは、ＰＣＲプライマーと検出プローブの機能を併せ持ち、そして反応の速度および程度を増大させる、標的ヌクレオチド配列に対する蛍光プローブの結合反応の単分子性質に一部起因して、増大した増幅および検出を提供する。この技術はまた、Ｎｅｗｔｏｎに対する特許文献３に記載されている。個体に関する遺伝的バリエーションの検出は、配列特異的ハイブリダイゼーション技術の別の適用である。対立遺伝子バリエーションまたはＤＮＡ中のＳＮＰの検出および分析は、代表的に、特定の配列に標的化されたプライマーを用いる鎖の伸張および増幅に関する。次いで、増幅されたＤＮＡを、種々の標識されたオリゴヌクレオチドプローブについての標的として用いて、点変異体および対立遺伝子配列バリエーションを同定する。しかし、標的ＤＮＡが分子内二次構造を形成する場合、ＤＮＡは、プライマーにも標識プローブにも有効にハイブリダイズすることもできないかもしれないし、あるいはプライマーにも標識プローブにも全く結合することができないかもしれない。従って、二次構造の位置での、ＳＮＰの存在または非存在についてのシグナルを生じない。
【０００４】
　一本鎖核酸（例えば、ｒＲＮＡまたは変性したＤＮＡ）における、このような分子内二次構造は、一本鎖核酸自体の中での、相補的なヌクレオチド配列の間の水素結合の分子内形成から生じる。この残余の二次構造は、オリゴヌクレオチド（例えば、プローブとして用いられるＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴマー、およびプローブが標的とする、ＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、リボゾームＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡ）中のその相補的配列）の間のハイブリッド形成を、立体的に阻害得るか、またはブロックさえし得る。
【０００５】
　特定の標的核酸におけるＳＮＰの存在または非存在を決定するのが困難である場合が数多く存在する。例えば、チトクロムＰ４５０は、いくつかの対立遺伝子バリエーションに存在し、これは、薬物の変化した代謝および／または癌の罹患率に関係する。チトクロムＰ４５０の１つの改変体である、チトクロムＰ４５０　ＣＹＰ２Ｄ６は、Ｐ４５０　ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の４つのエキソンの各々においてＳＮＰを有する。これらのＳＮＰの存在について試験するために行われる実験において、エキソン１および２におけるＳＮＰを検出する際に、これらのエキソン中の目的の分析領域における有意な二次構造に起因して、困難が生じた。エキソン１および２は、従来のプライマーセットを用いて増幅され得るが、産物は、ＳＮＰアッセイにおいて検出することができない。エキソン１および２を調査する際の問題は、これらの２つのアンプリコンにおける分子内二次構造に最終的に関連している。この二次構造は、これらのＳＮＰについてのアッセイに用いられる対立遺伝子特異的識別プローブのハイブリダイゼーションを防止する。これらのエキソンの構造を図１に示し、ここで、エキソン６および９が、ＰＣＲおよび識別プローブとのハイブリダイゼーションについて比較的低い困難性を示し、一方、エキソン１および２が、ＳＮＰの領域における有意な二次構造を示すことが理解され得る。分析領域およびＳＮＰは、図１において赤で示す。
【０００６】
　標的配列が分子内二次構造を形成する場合に、標的ヌクレオチド配列に対するプローブのハイブリダイゼーションを増大させるというこの問題の１つの解決策は、Ｈｏｇａｎらに対する特許文献４において提唱されている。この特許において、Ｈｏｇａｎらは、どのように、核酸プローブ配列に対する過剰モル量（プローブの少なくとも約５倍およびプローブの１００倍までまたはそれ以上）のヘルパー核酸配列の付加が、標的配列に対するプローブ配列のハイブリダイゼーションを助けるのかを記載している。実際に、Ｈｏｇａｎらは、６０：１、１００：１、および２５０：１のヘルパーオリゴヌクレオチド対プローブオリゴヌクレオチドのモル比を用いるこれらのアプローチの有効性を実証する。さらに、Ｈｏｇａｎらは、このヘルパーオリゴヌクレオチドは、二次構造の形成をブロックする際に有効であるために、約２０〜約５０ヌクレオチドの長さより長くあるべきであると述べている。
【０００７】
　従って、改良されたハイブリダイゼーションプローブおよび望ましくない二次構造を形成する傾向がある標的分子の領域内に含まれる配列を検出する方法を提供する必要性が当該分野に存在する。Ｈｏｇａｎらにより記載される方法は、このような解決策の１つを提供する。しかし、この方法は、プローブオリゴヌクレオチドよりも大過剰のヘルパーオリゴヌクレオチドを必要とし、そしてこのヘルパーオリゴヌクレオチドの長さを制約するという不利益を有する。
【特許文献１】米国特許第５，６２２，８２２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２５６，５３５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５２５，４９４号明細書
【特許文献４】米国特許第５，０３０，５５７号明細書
【非特許文献１】Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら（１９９９）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｕｓｉｎｇ　ｓｅｌｆ−ｐｒｏｂｉｎｇ　ａｍｐｌｉｃｏｎｓ　ａｎｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１７：８０４−８０７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
　改良されたハイブリダイゼーションプローブおよび望ましくない二次構造を形成する傾向がある標的分子の領域内に含まれる配列を検出する方法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
　本発明によると、以下の項目１〜３９が提供され、上記目的が達成される。
【００１０】
　（項目１．）
　標的分子内の標的ヌクレオチド配列を増幅するための二目的プライマーであって、ここで、該標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位の目的部位または二次構造形成領域内に含まれる目的の部位を含み、該二次構造形成領域が、該プライマーの非存在下において、増幅条件下において形成されるアンプリコンにおいて、望ましくない（ｕｎｗａｎｔｅｄ）二次構造を生じて、該目的の部位の検出を妨げ、ここで、該プライマーが、（ａ）該二次構造形成領域以外の標的ヌクレオチド配列のセグメントに相補的なプライマー配列；および（ｂ）該望ましくない二次構造の形成を妨げるための、該二次構造形成領域のセグメントに実質的に相補的なブロッキング配列を含む、プライマー。
【００１１】
　（項目２．）
　項目１に記載のプライマーであって、ここで、前記目的の部位が、核酸配列である、プライマー。
【００１２】
　（項目３．）
　項目２に記載のプライマーであって、ここで、前記目的の部位が、単一ヌクレオチド多型である、プライマー。
【００１３】
　（項目４．）
　項目１に記載のプライマーであって、ここで、前記プライマー配列が、前記標的ヌクレオチド配列を含む標的分子の１つの末端に相補的である、プライマー。
【００１４】
　（項目５．）
　項目１に記載のプライマーであって、前記プライマー配列と前記ブロッキング配列との間に、非ハイブリダイズスペーサーをさらに備える、プライマー。
【００１５】
　（項目６．）
　項目５に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、非ヌクレオチドである、プライマー。
【００１６】
　（項目７．）
　項目６に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、合成親水性オリゴマーから構成される、プライマー。
【００１７】
　（項目８．）
　項目７に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、エチレンオキシド、およびエチレンオキシドとプロピレンオキシドとの組み合わせから選択される、約３〜約５０のアルキレンオキシド単位から構成される、プライマー。
【００１８】
　（項目９．）
　項目５に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、ヌクレオチドである、プライマー。
【００１９】
　（項目１０．）
　項目９に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、非天然ヌクレオチドの配列から構成される、プライマー。
【００２０】
　（項目１１．）
　項目１０に記載のプライマーであって、ここで、前記非天然のヌクレオチドが、イソグアニンおよびイソシトシンから選択される、プライマー。
【００２１】
　（項目１２．）
　項目９に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、反復する単一ヌクレオチド（ａ　ｒｅｃｕｒｒｉｎｇ　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）から構成されるオリゴマーセグメントである、プライマー。
【００２２】
　（項目１３．）
　項目９に記載のプライマーであって、ここで、前記プローブ配列および前記スペーサーが、該プローブ配列と該スペーサーとの間の転写を停止させるための手段によって、互いに分離されている、プライマー。
【００２３】
　（項目１４．）
　項目１３に記載のプライマーであって、ここで、前記転写を停止させるための手段が、停止リンカーである、プライマー。
【００２４】
　（項目１５．）
　項目１４に記載のプライマーであって、ここで、前記停止リンカーが、少なくとも１つの改変ヌクレオシドを含む、プライマー。
【００２５】
　（項目１６．）
　項目１５に記載のプライマーであって、ここで、前記改変ヌクレオシドが、Ｎ４−改変ピリミジンである、プライマー。
【００２６】
　（項目１７．）
　項目１に記載のプライマーであって、検出可能な標識をさらに備える、プライマー。
【００２７】
　（項目１８．）
　項目１７に記載のプライマーであって、ここで、前記検出可能な標識が、蛍光剤、化学発光剤、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｅｎｓｅ　ｒｅａｇｅｎｔ）、および放射性同位体からなる群より選択される、プライマー。
【００２８】
　（項目１９．）
　標的分子内の標的ヌクレオチド配列を増幅するための方法であって、ここで、前記標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位の目的部位または二次構造形成領域内に含まれる目的の部位を含み、該二次構造形成領域が、増幅条件下において形成されるアンプリコンにおいて、望ましくない二次構造を形成し得、該方法が、以下：
　該標的ヌクレオチド配列を、ハイブリダイゼーション条件下で、該標的分子の第１鎖の１つの末端に相補的な項目１に記載の二目的プライマー、該標的分子の第２鎖の反対の末端に相補的な第２プライマー、該増幅に適切なヌクレオチド、および該ヌクレオチドの重合のための薬剤と、一緒にまたは連続的に接触させる工程であって、ここで、該方法の間に形成されるアンプリコンが、該望ましくない二次構造を含まず、その結果、該目的の部位が、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに接近可能である、工程、
を包含する、方法。
【００２９】
　（項目２０．）
　項目１９に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、ＤＮＡポリメラーゼである、方法。
【００３０】
　（項目２１．）
　項目１９に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、ＤＮＡリガーゼである、方法。
【００３１】
　（項目２２．）
　項目１９に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、ＲＮＡポリメラーゼである、方法。
【００３２】
　（項目２３．）
　項目１９に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、ＲＮＡ逆転写酵素である、方法。
【００３３】
　（項目２４．）
　第１末端および第２末端を有する二本鎖標的ＤＮＡ分子の配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行するための方法であって、該方法が、（ａ）該二本鎖ＤＮＡを含むサンプルを、該ＤＮＡを変性させるのに有効な温度まで加熱し、そしてそれによって、ＤＮＡの第１鎖およびＤＮＡの第２鎖を提供する工程、（ｂ）該変性されたＤＮＡを第１オリゴヌクレオチドプライマーおよび第２オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程であって、各プライマーが、それぞれ、第１ＤＮＡ鎖の第１末端および第２ＤＮＡ鎖の第２末端に相補的な標的結合配列から構成される、工程、（ｃ）該サンプルを冷却して、第１オリゴヌクレオチドプライマーおよび第２ヌクレオチドプライマーを、それぞれ、該ＤＮＡの第１鎖および第２鎖にハイブリダイズさせる、工程、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを使用して該ＤＮＡを複製し、そして上記工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返して、２本鎖ＤＮＡの配列の複数のコピーを提供する、工程を包含し、項目１に記載の二目的プライマーを第１プライマーとして使用することを改良として包含する、方法。
【００３４】
　（項目２５．）
　項目２４に記載の方法であって、ここで、前記検出可能な標識が、蛍光剤、化学発光剤、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬、および放射性同位体からなる群より選択される、方法。
【００３５】
　（項目２６．）
　標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする項目１に記載のプライマーに対するＤＮＡポリメラーゼの作用によって形成される、アンプリコン。
【００３６】
　（項目２７．）
　個体の遺伝子型を決定するためのキットであって、項目１に記載の二目的プライマー、オリゴヌクレオチド配列の増幅に適切なヌクレオチド、およびヌクレオチドの重合のための薬剤を含む、キット。
【００３７】
　（項目２８．）
　個体の遺伝子型を決定するためのキットであって、項目１に記載の二目的プライマー、第２プライマー、ＤＮＡ増幅に適切なヌクレオチド、ヌクレオチドの重合のための薬剤、ヌクレオチド捕捉領域を有する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）プローブ、および該ＡＳＨプローブ上に該ヌクレオチド捕捉領域に相補的なヌクレオチド捕捉領域を有する色コード化決定手段を含み、
　ここで、該検出手段上の該ヌクレオチド捕捉領域が該ＡＳＨプローブに相補的であり、その結果、該標的ヌクレオチド配列が該検出手段の該色コードによって同定される、
キット。
【００３８】
　（項目２９．）
　項目２８に記載のキットであって、ここで、前記検出手段が、多重検出手段である、キット。
【００３９】
　（項目３０．）
　項目２９に記載のキットであって、ここで、前記多重検出手段が、検出可能な固体基材を含む、キット。
【００４０】
　（項目３１．）
　項目３０に記載のキットであって、ここで、前記検出可能な固体基材が、検出可能なミクロスフェアである、キット。
【００４１】
　（項目３２．）
　ハイブリダイゼーションプローブであって、（ａ）標的分子内の第１ヌクレオチド配列に相補的なプローブヌクレオチド配列、および（ｂ）標的分子内の第２ヌクレオチド配列に実質的に相補的なブロッキング配列を含み、ここで、該ブロッキング配列と該第２ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが、第２ヌクレオチド配列における二次構造形成を妨げ、該二次構造が、該プローブ配列と該第１ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを妨害する、ハイブリダイゼーションプローブ。
【００４２】
　（項目３３．）
　項目３２に記載のハイブリダイゼーションプローブであって、検出可能な標識をさらに備える、ハイブリダイゼーションプローブ。
【００４３】
　（項目３４．）
　項目３３に記載のハイブリダイゼーションプローブであって、ここで、前記検出可能な標識が、化学発光標識、蛍光標識、放射性標識、多量体ＤＮＡ標識、色素、酵素、酵素モジュレーター、検出可能な固体基材、および金属イオンからなる群より選択される、ハイブリダイゼーションプローブ。
【００４４】
　（項目３５．）
　標的分子内の標的ヌクレオチド配列の存在を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイを実行する方法であって、ここで、該標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位であるかまたは二次構造形成領域内に含まれ、該二次構造形成領域が、該標的ヌクレオチド配列の検出を妨げる望ましくない二次構造を形成し得、該方法が、以下：
　該標的分子を、ハイブリダイゼーション条件下で、項目３３に記載のハイブリダイゼーションプローブと接触させて、その結果、該標的分子への該プローブのハイブリダイゼーションが、該望ましくない二次構造の形成を妨げ、そして該標的ヌクレオチド配列の検出を可能にする、工程、
を包含する、方法。
【００４５】
　（項目３６．）
　項目３５に記載の方法であって、ここで、前記標的分子が、ヒト個体から得られている、方法。
【００４６】
　（項目３７．）
　項目３５に記載の方法であって、ここで、前記標的分子が、細菌起源である、方法。
【００４７】
　（項目３８．）
　項目３５に記載の方法であって、ここで、前記標的分子が、ウイルス起源である、方法。
【００４８】
　（項目３９．）
　項目３８に記載の方法であって、ここで、前記第１ハイブリダイゼーションプローブ配列と前記標的ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが、前記ウイルスによって引き起こされる疾患の診断である、方法。
【００４９】
　（発明の要旨）
　本発明は、当該分野における上記の要求を扱い、第１の実施形態において、標的分子中の標的ヌクレオチド配列を増幅するのに有効なプライマー配列、および標的分子の一本鎖形態、または増幅アッセイの間に形成されるアンプリコンにおける二次構造の形成を破壊するブロッキング配列の両方を含むプライマーを提供する（従って、このプライマーは、時々、本明細書中で、「二目的（ｄｕａｌ−ｐｕｒｐｏｓｅ）」プライマーといわれる）。これらの組み合わされた性質を有するプライマーは、二次構造形成領域内に含まれるか、またはこの領域に近接する目的の部位（例えば、ＳＮＰ）の存在または非存在を検出するための方法において有用であり、ここで、目的の部位は、プライマーの非存在下で、望ましくない二次構造の形成により隠される。上で議論した方法のような、二次構造内に潜在的に「隠される」核酸配列を検出するための従来の方法とは対照的に、本発明は、単一のプライマーオリゴヌクレオチドを用いる増幅を可能にし、ここで、このプライマーは、従来技術のブロッキングプローブ（例えば、Ｈｏｇａｎらにより記載されるもの）よりも実質的により短いものであり得るブロッキング配列を含み、そして望ましくない二次構造を形成する標的分子の領域と完全な相補性を有さない。
【００５０】
　別の実施形態では、方法は、標的分子中の標的ヌクレオチド配列を増幅する方法において二目的プライマーを用いるために提供され、ここで、この標的ヌクレオチド配列は、増幅条件下で形成されるアンプリコンにおいて望ましくない二次構造を形成し得る領域を形成する二次構造に近接するか、またはこの二次構造内に含まれる、目的の部位を含み、そしてこの方法は、以下を包含する：ハイブリダイズする条件下で標的ヌクレオチド配列を、標的分子の第１の鎖の一方の末端に相補的である本発明の二目的プライマー、標的分子の第２の鎖の反対の末端に相補的な第２のプライマー、増幅に適切なヌクレオチド、およびこのヌクレオチドの重合のための試薬（例えば、ポリメラーゼ）と共にまたは連続して接触させる工程であって、ここで、この方法の間に形成されるアンプリコンは、目的の部位が、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに接近可能であるように、望ましくない二次構造を含まない。
【００５１】
　好ましいこのような方法は、第１の末端および第２の末端を有する二本鎖標的ＤＮＡ分子の配列を増幅するためにＰＣＲを用いる状況において実行され、この方法は、以下：（ａ）二本鎖ＤＮＡを含むサンプルを、ＤＮＡを変性させるのに有効な温度まで加熱し、それにより、ＤＮＡの第１の一本鎖およびＤＮＡの第２の鎖を提供する工程、（ｂ）変性したＤＮＡを、第１のＤＮＡ鎖の第１の末端および第２のＤＮＡ鎖の第２の末端のそれぞれに対して相補的である標的結合配列を各々からなる、第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程、（ｃ）ＤＮＡの第１および第２の鎖のそれぞれに対する、第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションを可能にするように、サンプルを冷却する工程、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡを複製する工程、および上記の工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返して、二本鎖ＤＮＡの配列の複数のコピーを提供する工程を包含し、ここで、改良点は、第１のプライマーとして、本明細書中で提供されるような二目的プライマーを用いることを含む。
【００５２】
　関連する実施形態では、本発明は、標的分子中の標的ヌクレオチド配列に対するプライマーのハイブリダイゼーションの後に、本発明の二目的プライマーに対するＤＮＡポリメラーゼの作用によって形成されるアンプリコンを包含する。
【００５３】
　さらなる実施形態では、キットは、本発明の二目的プライマーを用いる増幅方法を実行するために提供される。このようなキットの１つは、個体の遺伝子型を決定するためのキットであり、ここで、このキットの構成要素は、本発明の二目的プライマー、オリゴヌクレオチド配列の増幅に適切なヌクレオチド、およびこのヌクレオチドの重合のための試薬を含む。個体の遺伝子型を決定するための別のキットは、本発明の二目的プライマー、第２のプライマー、ＤＮＡ増幅のために適切なヌクレオチド、このヌクレオチドの重合のための試薬、ヌクレオチド捕捉領域を有する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）プローブ、およびＡＳＨプローブのヌクレオチド捕捉領域に相補的なヌクレオチド捕捉領域を有するカラーコード化された（ｃｏｌｏｒ−ｃｏｄｅｄ）検出手段を含み、ここで、この検出手段におけるヌクレオチド捕捉領域は、標的ヌクレオチド配列が、この検出手段のカラーコードにより同定されるように、ＡＳＨプローブに相補的である。
【００５４】
　別の実施形態では、本発明は、以下：（ａ）標的分子中の第１のヌクレオチド配列に相補的なプローブヌクレオチド配列、および（ｂ）標的分子中の第２のヌクレオチド配列に実質的に相補的であるブロッキング配列の二目的ハイブリダイゼーションプローブを提供し、ここで、第２のヌクレオチド配列とのブロッキング配列のハイブリダイゼーションは、さもなければ、第１のヌクレオチド配列に対するプローブ配列のハイブリダイゼーションを妨害する第２のヌクレオチド配列における二次構造の形成を防止する。ハイブリダイゼーションプローブは、任意のアッセイ形式で用いられ得るが、このプローブは、標的分子中の標的ヌクレオチド配列の存在を検出するためのアッセイにおいて最も有用であり、ここで、標的ヌクレオチド配列は、標的ヌクレオチド配列の検出を防止する望ましくない二次構造を形成し得る、二次構造が形成する領域に近接しているか、または二次構造の中に含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
　（発明の詳細な説明）
　本発明を詳細に記載する前に、他に示されない限り、本発明は、ＤＮＡの特定の供給源、特定の配列、または特定のアッセイ形式に制限されず、それ自体変化し得ることを理解するべきである。本明細書中で用いられる用語は、特定の実施形態を記載するのみの目的のためのものであり、そして限定することを意図していないこともまた理解されるべきである。
【００５６】
　本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそれ以外であると分からない限り、複数の対象を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、用語「オリゴヌクレオチド（ａｎ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、単一のオリゴヌクレオチド、同一または異なり得る２つ以上のオリゴヌクレオチドなどを意味することを意図される。
【００５７】
　本発明を記載および主張する際に、以下の用語が、以下に示す定義に従って用いられる。
【００５８】
　本明細書中で用いられる場合、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、従来のプリン塩基およびピリミジン塩基（すなわち、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびウラシル（Ｕ））のみならず、修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドもまた含むヌクレオシドおよびヌクレオチドをいうことが理解される。このような修飾としては、プリン部分またはピリミジン部分のメチル化またはアシル化、ピリミジン環またはプリン環系の１つもしくは両方の環についての異なるヘテロ環式環構造の置換、および例えば、アセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイルなどのような保護基を用いる、１つ以上の官能基の保護が挙げられるが、これらに限定されない。修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、糖部分に対する修飾（例えば、１つ以上のヒドロキシル基が、ハロゲン化物および／またはヒドロカルビル置換基（後者の場合、代表的には、脂肪族基）と置換されるか、またはエーテル、アミンなどとして官能化される）を含む。一般のアナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチル−アデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモ−グアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチル−アミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル、１−メチルシュードウラシル、キューオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン、および２，６−ジアミノプリン。イソ−グアニンおよびイソ−シトシンは、ハイブリダイゼーションが所望されない場合、配列の間の潜在的交差反応性を低減するためにオリゴヌクレオチドに取り込まれ得る。
【００５９】
　本明細書中で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである任意の他の型のポリヌクレオチド、ならびに、ポリマーが、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるような、塩基対合および塩基スタッキングを可能にする立体配置にある核酸塩基を含む場合、非ヌクレオチド骨格（例えば、タンパク質核酸およびＡｎｔｉ−Ｇｅｎｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｇｒｏｕｐ，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇｏｎから、ＮｅｕｇｅｎｅＴＭポリマーとして市販されている、合成の配列特異的核酸ポリマー）または非標準的な連結を含む他のポリマーを包含する。従って、本明細書中の「オリゴヌクレオチド」としては、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ、ならびにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが挙げられ、そして、例えば、以下のような公知の型の修飾されたオリゴヌクレオチドもまた挙げられる：１つ以上の天然に存在するヌクレオチドがアナログと置換されているオリゴヌクレオチド；例えば、荷電していない連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、負に荷電した連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、および正に荷電した連結（例えば、アミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）を有するオリゴヌクレオチドのような、ヌクレオチド間修飾を含むオリゴヌクレオチド、例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む）のようなペンダント部分を含むオリゴヌクレオチド、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するオリゴヌクレオチド、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含むオリゴヌクレオチド、アルキレーターを含むオリゴヌクレオチド。用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」との間で、長さの区別は意図されておらず、そしてこれらの用語は、交換可能に用いられる。これらの用語は、分子の一次構造のみをいう。本明細書中で用いられる場合、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドについての記号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　９：４０２２，１９７０）に従う。
【００６０】
　オリゴヌクレオチドは、公知の方法により合成され得る。一般に、オリゴヌクレオチドを合成するための方法に関する背景の参考文献としては、β−シアノエチルホスフェート保護基の使用に基づく５’から３’への合成に関するもの（例えば、ｄｅ　Ｎａｐｏｌｉら（１９８４）Ｇａｚｚ　Ｃｈｉｍ　Ｉｔａｌ　１１４：６５；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　２４：１６９１；ＢｅｌａｇａｊｅおよびＢｒｕｓｈ（１９７７）Ｎｕｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１０：６２９５）が挙げられ；溶液相の５’から３’への合成を記載する参考文献に関しては、ＨａｙａｔｓｕおよびＫｈｏｒａｎａ（１９５７）Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　８９：３８８０；ＧａｉｔおよびＳｈｅｐｐａｒｄ（１９７７）Ｎｕｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　４：１１３５；ＣｒａｍｅｒおよびＫｏｓｔｅｒ（１９６８）Ａｎｇｅｗ　Ｃｈｅｍ　Ｉｎｔ　Ｅｄ　Ｅｎｇｌ　７：４７３；およびＢｌａｃｋｂｕｒｎら（１９６７），Ｊ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　Ｐａｒｔ　Ｃ，２４３８が挙げられる。さらに、ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　１０３：３１８５−９１は、オリゴヌクレオチドの調製におけるホスホクロリダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｌｏｒｉｄｉｔｅ）の使用を記載している。ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　２２：１８５９−６２、および米国特許第４，４１５，７３２号は、オリゴヌクレオチドの調製のためのホスホルアミダイトの使用を記載した。Ｓｍｉｔｈ，Ａｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｌａｂ（ＡＢＬ）１５−２４（１９８３年１２月）は、自動固相オリゴデオキシリボヌクレオチド合成を記載する。本明細書中で引用される参考文献、およびＷａｒｎｅｒら（１９８４）ＤＮＡ　３：４０１−１１（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと。Ｔ．ＨｏｒｎおよびＭ．Ｓ．Ｕｒｄｅａ（１９８６）ＤＮＡ　５：４２１−２５は、ビス（シアノエトキシ）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィンを用いる固体支持されたＤＮＡフラグメントのリン酸化を記載している。Ｔ．ＨｏｒｎおよびＭ．Ｓ．Ｕｒｄｅａ（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　２７：４７０５−０８もまた参照のこと。
【００６１】
　本明細書中で用いられる場合、用語「プローブ」は、標的配列とプローブ中の少なくとも１つの配列の相補性に起因して、分析を受けるサンプル中の分子（「標的分子」）に含まれる標的配列とハイブリッド構造を形成する、ポリヌクレオチドからなる構造をいう。任意の特定のプローブのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／または合成ヌクレオチドアナログであり得る。用語「プライマー」とは、精製制限消化におけるように、天然で生成されようと、合成により生成されようと、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、適切な緩衝液中かつ適切な温度にて、重合のために適切なヌクレオチドおよび試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下）に置かれた場合に、合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドをいう。
【００６２】
　用語「支持体」とは、プローブ、分析物分子、または他の化学実体が係留され得る、任意の固体表面（半固体表面を含む）をいう。適切な支持材料としては、固相化学合成に代表的に用いられる支持体（例えば、ポリマー材料（例えば、ポリスチレン、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロリド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフルオライド、ポリカーボネート、ジビニルベンゼンスチレンベースのポリマー）、アガロース（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））、デキストラン（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標））、セルロースポリマーおよびポリサッカリド、シリカおよびシリカベースの材料、ガラス（特にコントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅ　ｇｌａｓｓ）、すなわち「ＣＰＧ」）、ならびに官能化されたガラスおよびセラミック）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい支持体は、微粒子およびナノ粒子を含む、ビーズまたは粒子の形態の固体基材である。
【００６３】
　「ＰＣＲ」は、米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）および同第４，６８３，２０２号（本明細書中で参考として援用される）においてＭｕｌｌｉｓにより記載される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を本明細書中で意味する。ＰＣＲ技術において、短いオリゴヌクレオチドプライマーが、所望の配列の反対側の末端と一致するように調製される。プライマーの間の配列は、既知である必要はない。ＤＮＡ（またはＲＮＡ）のサンプルが抽出され、そして（好ましくは熱により）変性される。次いで、オリゴヌクレオチドプライマーが、ｄＮＴＰおよびポリメラーゼ（好ましくは、熱に対して安定であるＴａｑポリメラーゼ）と共に、過剰モル量で添加される。ＤＮＡは複製され、次いで、再び変性される。これは、（１つの二重鎖ＤＮＡ分子あたり）それぞれのプライマーで始まる２つの「長い産物」および２つの本来の鎖を生じる。次いで、反応混合物は、（例えば、温度を低下させるか、変性剤を不活化するか、またはさらにポリメラーゼを添加することにより）重合条件に戻され、そして第２のサイクルが開始される。この第２のサイクルは、２つの本来の鎖、サイクル１由来の２つの長い産物、（本来の鎖から複製された）２つの新規の長い産物、および長い産物から複製された２つの「短い産物」を提供する。この短い産物は、各々の末端に、プライマーと共に標的配列（センスまたはアンチセンス）の配列を有する。各々のさらなるサイクルにおいて、さらなる２つの長い産物を生成し、そして多数の短い産物は、以前のサイクルの終了時に残っている長い産物と短い産物の数に等しい。従って、短い産物の数は、各サイクルと共に指数関数的に増える。特定の分析物配列のこの増幅は、非常に少量のＤＮＡの検出を可能にする。
【００６４】
　本明細書中で用いられる場合、用語「３ＳＲ」は、標的核酸増幅の方法をいい、そしてまた、欧州特許公報第３７３，９６０号（１９９０年６月２０日発行）に記載されるような、「自立配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」系としても公知である。
【００６５】
　本明細書中で用いられる場合、用語「ＬＣＲ」とは、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１８９−１９３により記載されるような「リガーゼ連鎖反応」としてもまた公知である、標的核酸増幅の方法をいう。
【００６６】
　用語「ハイブリダイゼーション条件」は、相補的な配列の少なくとも一部がお互いにアニールすることを可能にするのに十分な、時間、温度、ならびにｐＨ、ならびに反応物および試薬の必要な量および濃度の条件を意味することを意図される。当該分野で周知であるように、ハイブリダイゼーションを達成するために必要とされる、時間、温度、およびｐＨの条件は、ハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドプローブのサイズ、オリゴヌクレオチドプローブと標的との間の相補性の程度、およびハイブリダイゼーション反応混合物中の他の材料の存在に依存する。各ハイブリダイゼーション工程のために必要な実際の条件は、当該分野で周知であるか、または過度の実験なしに決定され得る。
【００６７】
　代表的なハイブリダイズ条件は、約７〜約８．５のｐＨに緩衝化された溶液、および約３０℃〜約６０℃、好ましくは約３７℃〜約５５℃の温度の、約１秒〜約１日、好ましくは約１５分間〜約１６時間、そして最も好ましくは約１５分〜約３時間の期間の間の使用を含む。
【００６８】
　「ハイブリダイゼーション条件」はまた、効果的な緩衝液を含む。プローブおよび他の成分に対して適合性（すなわち、化学的に不活性）であり、さらに相補的な塩基対の間のハイブリダイゼーションを可能にする任意の緩衝液が、使用され得る。１つの特に好ましい緩衝液は、３×ＳＳＣ、５０％のホルムアミド、１０％の硫酸デキストラン（ＭＷ　５００、０００）、０．２％のカゼイン、１０μｇ／ｍＬのポリＡ、および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ（ここで、１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウムである）および０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムを含む。別の特に好ましい緩衝液は、５×ＳＳＣ、０．１〜０．３％のドデシル硫酸ナトリウム、１０％の硫酸デキストラン、１ｍＭのＺｎＣｌ２、および１０ｍＭのＭｇＣｌ２（ここで、１×ＳＳＣは、上で定義されるとおりである）を含む。他の適切な緩衝液は、当業者に公知である。
【００６９】
　用語「標的分子」とは、ヌクレオチドセグメント（オリゴマーまたはポリマーのいずれか）を含む分子、または完全にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドから構成される分子をいう。「標的ゲノム」は、本明細書中で使用される場合、本発明の方法により分析されることが求められる１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドをいう。標的ゲノムは、一般的に哺乳動物ゲノムであり、そして好ましくはヒトゲノムであるが、ウイルスまたは細菌のゲノムでもあり得る。標的ゲノムとしては、ヒトＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ），およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７０】
　用語「シングルプレックス（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）」とは、他のどのアッセイとも同時に行われない単一のアッセイをいう。しかし、「シングルプレックス」アッセイは、連続して行われる個々のアッセイをいうために使用される。一般的に、このアッセイは、ハイブリダイゼーションアッセイである。
【００７１】
　用語「マルチプレックス」とは、同時に行われる複数のアッセイをいい。ここで検出工程および分析工程は、一般的に並行して行われる。上記のように、これらのアッセイは、代表的にハイブリダイゼーションアッセイである。
【００７２】
　用語「相補的」および「実質的に相補的」とは、ヌクレオチド間または核酸間（例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の２つの鎖間、またはオリゴヌクレオチドプライマーと配列決定されるかまたは増幅される一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間）の塩基対合をいう。相補的ヌクレオチドは、一般的に、ＡおよびＴ（またはＡおよびＵ）、またはＣおよびＧである。２つの一本鎖ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子は、一方の鎖のヌクレオチドが、最適に整列されて比較され、そして適切なヌクレオチド挿入または欠失を有する場合、少なくとも９０％〜９５％、そしてより好ましくは少なくとも約９８％〜９９．５％で対合する場合に、「相補的」であると言われる。２つの一本鎖ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子は、一方の鎖のヌクレオチドが、最適に整列されて比較され、そして適切なヌクレオチド挿入または欠失を有する場合、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％で対合する場合に、「実質的に相補的」であると言われる。
【００７３】
　用語「停止（ａｒｒｅｓｔｉｎｇ）リンカー」とは、本明細書中で使用される場合、プローブまたはプライマーにおけるヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーをいい、これは、増幅酵素により増幅されない。
【００７４】
　用語「検出可能な標識」とは、本明細書中で使用される場合、検出可能な（好ましくは定量的）シグナルを生じるために使用され得、かつ共有結合または非共有結合相互作用（例えば、イオン性結合もしくは水素結合を介して、または固定化、吸着などを介して）を介して核酸またはタンパク質に結合され得る任意の原子または分子をいう。標識は、一般的に蛍光、化学発光、放射能、比色法、質量分析、Ｘ線回折もしくは吸収、磁性、酵素活性などにより検出可能なシグナルを生じる。適切な標識としては、蛍光団、発色団、放射性原子（特に３２Ｐおよび１２５Ｉ）、電子稠密（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｅｎｓｅ）試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドが挙げられる。酵素は、代表的にそれらの活性により検出される。例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、通常、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を青色色素（分光光度計で定量可能）に変換するその能力により検出される。上記の記載は、種々の標識を個々のクラスに分類することを意味しない。なぜなら、単一の標識は、２つ以上の異なる方法を使用して検出され得るからである。例えば、１２５Ｉは、放射性標識として、および電子稠密試薬として作用し得る。ＨＲＰは、酵素として、またはモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の抗原として作用し得る。さらに、所望の効果について種々の標識を組み合わせ得る。例えば、Ｍａｂおよびアビジンはまた、本発明の実施において標識を必要とする：従って、プローブをビオチンで標識し得、そして１２５Ｉ、またはＨＲＰで標識された抗ビオチンＭＡｂ、またはアビジンもしくはストレプトアビジンに対して結合体化されたＨＲＰ分子で標識されたアビジンでその存在を検出し得る。他の組み合わせおよび可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして等価物とみなされる。
【００７５】
　本明細書中で使用される場合、用語「重複（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）配列」とは、部分的な共通の配列を共有する２つのオリゴヌクレオチド配列をいう。例えば、オリゴヌクレオチドＧＡＡＴＴＣとＡＡＴＴＣＣとは、それらの共通の配列ＡＡＴＴＣにおいて重複する。これら２つのオリゴヌクレオチドは、両方とも配列ＧＡＡＴＴＣＣに由来するが、ヌクレオチド１つ分離れた開始点を有するので、これら２つのヌクレオチドは、本明細書中で１ヌクレオチドまで重複するという。
【００７６】
　本明細書中で使用される場合、「不連続プローブ」とは、標的核酸の２つ以上の不連続な領域に対応する２つ以上の領域を有するオリゴヌクレオチドプローブをいう。このプローブの２つ以上の領域は、直接かまたは介在するヌクレオチド配列を介して、もしくは有機リンカー部分を介して、共有結合で連結される（ここで、「有機リンカー部分」とは、その２つの末端において２つの個別のオリゴヌクレオチドに結合され得る本質的に直鎖状のスペーサー有機分子をいう）。
【００７７】
　用語「アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」とは、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（Ｌｉｇａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＲ）、または代替の増幅技術を使用する核酸の増幅から生じた増幅産物をいう。
【００７８】
　本発明の方法における使用のために、このアンプリコンは、標識されなければならない。第１の技術において、標識されたプライマーは、増幅工程の間に使用され、それにより、標識されたプライマーがこのアンプリコン中に組み込まれるにつれて、標識されたアンプリコンが生じる。標識されたプライマーは、ＣＰＧ，Ｉｎｃ．（Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐａｒｋ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）のような業者から入手可能であり、または標識されていないプライマーに対する標識の結合体化を介して調製され得る。プライマーのようなオリゴヌクレオチドを標識することは、従来のカップリング手順を使用して実施され得る。しかし、具体的なカップリング手順は、標識および／またはオリゴヌクレオチド上に存在する反応性基（単数または複数）に依存して変化する。
【００７９】
　例えば、当業者に公知のニックトランスレーション手順は、ＤＮａｓｅＩおよび他の酵素の使用により標識していないヌクレオチドを標識されたヌクレオチドに置換し、それにより標識されたアンプリコンを提供するために有用である。別の標識方法としては、標識されたデオキシヌクレオチドターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ、Ｐａｎ　Ｖｅｒａ　Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎのような業者から入手可能）（ＤＮＡフラグメントの３’末端への標識されたデオキシヌクレオチドの付加を触媒し得るＤＮＡポリメラーゼ）での付加が挙げられる。
【００８０】
　標識アンプリコンを調製するための第２の技術は、別個の標識工程を包含し、ここで標識されていないアンプリコンは、連続して標識にカップリングされる。プライマーの標識に関して上記した技術もまた使用して、標識されていないアンプリコンに標識を結合し得る。
【００８１】
　任意の型の標識がアンプリコンに結合され得る。好ましい標識としては、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段により検出可能な部分が挙げられる。このような標識としては、限定することなく、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、電子稠密試薬、および放射性同位体（例えば、３２Ｐ）が挙げられる。この標識部分は、直接的または間接的にアンプリコンに結合され得る。好ましくは、この標識は、プライマーに直接結合される場合、変性条件に耐えるように選択されるべきである。必ずしも必要ではないが、標識は、ビオチンであることが好ましく、このビオチンは、蛍光物質にカップリングされたストレプトアビジン（例えば、ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体）との結合を介して検出され得る。
【００８２】
　本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」とは、生物（例えば、ヒトのような哺乳動物）から得られた流体または組織をいい、これは、特徴づけされるべき核酸検体を含有する。このようなサンプルは、当該分野で公知であり、これらとしては、血液；血漿；血清；脊髄液；リンパ液；細胞溶解物；精液；皮膚または呼吸器、腸もしくは尿生殖器管の分泌物；涙；唾液；乳汁；および白血球が挙げられる。
【００８３】
　用語「単一ヌクレオチド多型（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」（または「ＳＮＰ」）とは、参照核酸配列と配列中の１つの核酸だけが異なる核酸配列をいい、ここでＳＮＰの存在は、疾患または他の独特の状態に関連し、従って、重要な診断機能を果たす。図１に示されるように、目的の部位（例えば、ＳＮＰ）は、分子内２次構造内または２次構造付近に位置し得、それ故、配列特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いるハイブリダイゼーションには利用不可能であり得る。２次構造を妨害し、そして「マスクされた」配列を検出可能にするために、ブロッキングプローブを使用して標的ヌクレオチド配列の領域を妨害し、その結果、目的の配列が、不要な２次構造には含まれず、そしてハイブリダイゼーションプローブから本質的に「隠される」ことが望ましい。米国特許第５，０３０，５５７号（Ｈｏｇａｎら）は、外来のブロッキングプローブの付加は、このような２次構造の形成を防止し、そして目的の配列の検出を可能にするために有効であることを示唆する。しかし、外来ブロッキングプローブは、有効となるためには、標的ヌクレオチド配列の濃度に対してモル大過剰でなければならず、従って、有効となるブロッキング配列のサイズに制限を課すという欠点を有する。対照的に、本発明は、別の「ブロッカー」分子を必要とすることなく、不溶な２次構造の形成を防止するために有効であるプライマーおよびプローブを提供する。本発明のプライマーおよびプローブは、ブロッキング配列とハイブリダイゼーション配列との組合せ（すなわち、プライマーにおける「プライマー配列」、およびプローブにおける「標的結合配列」）を含む。このコンビネーションプライマー、または「二目的（ｄｕａｌ−ｐｕｒｐｏｓｅ）」プライマーは、従来のプライマーの使用に対して、少なくとも１００倍のシグナルの増加、および上記の外来ブロッキングプローブを用いて実行される対応する増幅プロセスに対して少なくとも５倍〜７倍のシグナルの増加を生じる（実施例１を参照のこと）。ブロッキング配列を含むプローブを使用して、任意の目的の特異的部位を検出し得、これはＳＮＰまたは対立遺伝子改変体に限定されないが、これらは、一般的には、標的ヌクレオチド配列内の目的の好ましい部位である。ブロッキング配列を含むプローブは、任意の標的ヌクレオチド配列と共に使用され得るが、標的ヌクレオチド配列が、特定の配列の検出をマスキングする分子内２次構造を形成する場合に最も有用である。
【００８４】
　特定の標的ヌクレオチド配列（例えば、対立遺伝子改変体またはＳＮＰに関連する配列）の検出の感度を増大させるために、ブロッカー配列を含むプライマーが設計され、ここで、このブロッカー配列は、干渉する分子内２次構造の形成がブロッカーにより妨害されるようなアンプリコンにおける分子内２次構造の領域（標的ヌクレオチド配列における分子内２次構造を形成する領域に対応する）とハイブリダイズする。次いで、特定のハイブリダイゼーションプローブ（例えば、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブ）を使用して、アンプリコン中の目的の配列を検出し得る。
【００８５】
　本発明のプライマーおよびプローブ、ならびにこのプライマーおよびプローブを使用する方法は、以下により詳細に記載される。
【００８６】
　この実施形態において、標的分子内の標的ヌクレオチド配列を増幅するために使用される二目的プライマーが提供され、その産物は、「アンプリコン」と呼ばれる。標的ヌクレオチド配列は、二次構造形成領域に近位であるかまたは二次構造形成領域内に含まれる目的の部位を含み、この二次構造形成領域は、この二目的プライマーの非存在下では、目的の部位を隠してしまう所望されないアンプリコンの二次構造を生じ、すなわち、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって目的の部位にアクセスすることを妨害する。目的の部位は、２つ以上のヌクレオチドの核酸配列であり、代表的には、３つ以上のヌクレオチドの核酸配列である。しばしば、目的の部位は、可能性のある単一ヌクレオチド多型に対応する３ヌクレオチド配列である。
【００８７】
　図５に示されるように、二目的プライマーは、標的ヌクレオチド配列を含む標的分子の一方の末端に相補的である。このプライマーは、二次構造形成領域（Ｂ’）以外の標的ヌクレオチド配列のセグメントに相補的であるプライマー配列（Ｐ）、および所望されない二次構造の形成を回避するための二次構造形成領域のセグメントに実質的に相補的なブロッキング配列（Ｂ）を含む。このプライマー配列は、比較的短く、一般的に、１０塩基〜３０塩基程度の長さである。このブロッキング配列もまた、比較的短くあり得、本明細書中のいずれかに考察されるように、以前の方法で使用されるブロッキングプローブよりもかなり短い。例えば、このブロッキング配列は、たった約８塩基〜約１２塩基の長さであり得る。
【００８８】
　このプライマーはさらに、このプライマー配列とブロッキング配列との間に任意のスペーサーを含み、ここで、このスペーサーは、ハイブリダイズすることも、本方法を実行するために必要なハイブリダイゼーション事象を妨害することもないように設計され、そうなので本明細書中では「非ハイブリダイズ」スペーサーと称される。このスペーサーは、イソ−グアニンおよびイソ−シトシンのような非天然のヌクレオチドの配列または単一ヌクレオチドの繰り返し配列を含む、ヌクレオチドスペーサーであり得る。このスペーサーはまた、例えば、ポリ（アルキレンオキシド）鎖のような合成親水性オリゴマーを含む、非ヌクレオチドスペーサーであり得る。任意のスペーサーを調製するのに適した方法は、文献から公知である。ポリエチレングリコールスペーサーの調製は、例えば、Ｋｅｒｎら（１９７９）Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１５０：２５３９によって記載される。他のスペーサーが、類似の様式で調製され得る。
【００８９】
　好ましい実施形態において、このプライマーは、プローブ配列とヌクレオチドスペーサーとの間の転写を停止させるための手段を含む。一般的に、転写を停止させるための手段は、２つのプライマーセグメントを連結させるリンカーであり、このリンカーは、使用されるポリメラーゼがプローブ配列−ヌクレオチドスペーサー連結部位をわたって複製を続けることを妨害する。このようなリンカーは、本明細書において「停止リンカー」と称される。好ましい停止リンカーは、上記の様式で作用するように改変された少なくとも１つのヌクレオチドを含み、ここで、この改変は、ヌクレオシドの分子中心から広がる分子セグメントであり、代表的に、プリン環構造もしくはピリミジン環構造内に含まれる窒素原子から広がる分子セグメントである。特に好ましい停止リンカーの例としては、Ｎ４−改変ピリミジン（例えば、５−メチル−Ｎ４−（Ｏ−６−オキシヘキシル）−２’−デオキシシチジン、５−メチル−Ｎ４−（Ｏ−ＦＭＯＣ−６−オキシヘキシル）−２’−デオキシシチジン、５−メチル−Ｎ４−（Ｏ−レブリニル−６−オキシヘキシル）−２’−デオキシシチジン、および５−メチル−Ｎ４−（Ｏ−６−オキシヘキシル）−２’−チミジン）が挙げられるが、これらに限定されず、これらは、必ずしもそうではないが、一般的に、対応する３’置換ヌクレオシドおよび５’置換ヌクレオシド（例えば、ＤＭＴを用いた３’位で置換されるヌクレオシドおよびホスホラミデートを用いた５’位で置換されるヌクレオシド）を用いたプライマー合成の間に導入される。プライマーオリゴヌクレオチドへの組み込みのための詳細な手順を含めて適切な停止リンカーに関する他の情報は、米国特許第５，２００，３１４号（Ｕｒｄｅａ）に見出され得る。
【００９０】
　プライマーは、検出可能な標識を含み得るが、標識はまた、増幅アッセイの間に例えば標識プローブを介して導入され得る。前者の場合、標識されたプライマーは、標識プライマーがアンプリコンに組込まれるので、標識アンプリコンを生じる。標識プライマーは、ＣＰＧ，Ｉｎｃ．（Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐａｒｋ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）のような市販の供給業者から入手可能であるか、または標識プライマーは、標識の未標識プライマーへの結合体化を介して調製され得る。プライマーのようなオリゴヌクレオチドの標識は、従来のカップリング手順を用いて実行され得る。しかし、特定のカップリング手順は、標識および／またはオリゴヌクレオチド上に存在する反応基に依存して変化する。好ましい標識としては、分光手段、光化学手段、生化学手段、免疫化学手段、または化学手段によって検出可能な部分が挙げられる。このような標識としては、蛍光剤、化学ルミネセンス剤、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、電子高密度試薬、および放射性同位元素（例えば、３２Ｐ）が挙げられるが、これらに限定されない。標識部分は、プライマーに直接または間接的に結合され得る。好ましくは、標識は、プライマーに直接結合される場合、変性条件に耐えるように選択されるべきである。必須ではないが、標識がビオチンであることが好ましく、ビオチンは、蛍光剤に結合されたストレプトアビジンとの結合を介して検出され得る（例えば、ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体）。
【００９１】
　上記に示されるように、二目的プライマーは、標的分子中の標的ヌクレオチド配列を増幅するための方法において有用であり、ここで、この標的ヌクレオチド配列は、増幅条件下で形成されるアンプリコン中に所望されない二次構造を形成し得る二次構造領域に近位であるか、またはこのような二次構造領域内に含まれる目的の部位を含む。増幅は、従来の技術を用いて実行され得るが、任意の公知の増幅方法が使用され得、好ましい方法としては、ＰＣＲ、３ＳＲ、およびＬＣＲが挙げられ、ＰＣＲが、最も好ましい。
【００９２】
　本発明の二目的プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、標的分子、二本鎖標的分子の一方の鎖の一方の末端に相補的な二目的プライマー、標的分子の第二鎖の反対側の末端に相補的な第二オリゴヌクレオチドプライマー、４種類の過剰なオリゴヌクレオチド（ｄＮＴＰ）モノマー、およびＰＣＲを実行するのに適した緩衝液を含む水（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、およびＭｇＣｌ２を含む従来の緩衝液を含む）、およびヌクレオチドの重合のための試薬（例えば、Ｔａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼ）を含む混合物中で実行される。次いで、この混合物は、温度に基づいた一連の複製サイクルに曝される。例えば、この混合物は、数分間約９４〜９６℃に加熱され、この間に、任意の二本鎖ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡに変性される。次に、混合物の温度は、約５０〜６５℃に低下され、この間に、オリゴヌクレオチドプライマーは、水素結合を介して相補配列にハイブリダイズする。最後に、この混合物の温度は、約７２℃に上昇され、この間に、ポリメラーゼが結合し、そして各プライマーから相補鎖を伸ばす。配列は、各サンプルから二重に増幅されるので、理論上１０億の増幅が達成され得、それによって本方法のための豊富な核酸分析物を提供する。
【００９３】
　標的ヌクレオチド配列の増幅のためにプライマーを用いる方法は、図２に例示される。アンプリコンに提供されるブロッキング配列は、アンプリコン中の所望されない二次構造の形成を破壊し、従って、「差次的ハイブリダイゼーションプローブ」として図２に参照されるプローブを用いた目的の部位（ここではアンプリコン）のプローブ化を容易にする（図５もまた参照のこと）。目的の部位が対立遺伝子バリエーションまたはＳＮＰ部位を含む場合、プライマーは、対立遺伝子バリエーションまたはＳＮＰ部位を含む標的ヌクレオチド配列の領域を増幅し、次いで、この対立遺伝子バリエーションまたはＳＮＰ部位は、検出可能な標識などを含む異なるハイブリダイゼーションプローブを用いて検出され得る。従って、本発明のこのプライマーおよび方法はまた、個体の遺伝子型の決定方法において有用である。特に好ましい方法は、次の出願明細書に開示されている。（第１国米国出願第６０／４１２４７７号に基づき優先権主張して平成１５年９月１９日に出願された日本国特許出願（出願代理人の事務所整理番号Ｆ１０３Ｃ２６Ｂ０Ｕ、発明の名称「複数の核酸配列バリエーションの検出のための方法」。
【００９４】
　プライマーおよび重合剤（例えば、標的ヌクレオチド配列の相補体を生成し得るＤＮＡポリメラーゼまたは他の酵素）によって媒介される標的ヌクレオチド配列の増幅において、アンプリコンは、上記の検出可能な標識の存在によって検出され得、そしてプライマーは、試験される個体のゲノムＤＮＡ由来の標的ヌクレオチド配列を増幅するために使用され、これは、個体の遺伝子型を決定する方法において使用され得る。
【００９５】
　特定の標的ヌクレオチド配列の検出のために、本発明の対立遺伝子特異的プローブは、上記で言及したように、プライマーとテンプレートとしての標的ヌクレオチドとを使用して生成される増幅産物内で、目的のＳＮＰまたは他の配列を検出するために使用される。本発明はまた、複合様式（すなわち、同時に実行される並行ハイブリダイゼーション実験）でのＳＮＰまたは他の標的ヌクレオチドの検出および分析を容易にし、ここで、この対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブは、図２に示されるように、各々、特有の標識で標識される。好ましい実施形態において、各対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブに結合される特有の標識は、ミクロスフェアであり、このミクロスフェアは、フローサイトメーターを用いて有利に検出および分析され得る。
【００９６】
　最適には、１つ以上の検出手段に接続されたフローサイトメーターが、複合体を検出するために使用されるが、標識およびシグナルの型に依存して、捕捉された複合体を検出および計数するための他の手段もまた使用される。ハイブリダイゼーション溶液中の複合体は、フローサイトメーターを通され、それによって各複合体の検出を可能にする。好ましくは、フローサイトメーターは、（標識されたアンプリコンの）標識を検出するための第一の検出手段ならびに固体基材と関連したシグナルを検出するための第二の検出手段と接続される。フローサイトメーターを用いて標識およびシグナルを検出し、かつ複合分析を実行する能力を有する適切な装置および方法は、米国特許第５，９８１，１８０号（Ｃｈａｎｄｌｅｒら）および同第６，０４６，８０７号および同第６，１３９，８００号（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）に記載される。市販のシステムもまた、Ｌｕｍｉｎｅｘ　Ｃｏｒｐ．（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）から入手可能であり、そして例えば、ＬｕｍｉｎｅｘＴＭ１００機器が挙げられる。最も好ましい実施形態において、ミクロスフェアは、ＬｕｍｉｎｅｘＴＭミクロスフェアである。しかし、単一対立遺伝子バリエーションについて個体の遺伝子型を決定する目的のために、二つの特有な標識が、改変体対立遺伝子に対する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブの結合と比較した、野生型対立遺伝子に対する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブの結合との間の識別に十分である。
【００９７】
　プローブおよびプライマー配列は、ハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチドまたはそのアンプリコンとハイブリダイズするために完全な相補性を有する必要はないことが理解される。標的ヌクレオチド配列中に存在し得る特定の配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして本発明のプローブを使用する際に、ブロッキング配列と標的ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションの安定性が、プローブの配列特異的部分と標的ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションの安定性とほぼ同じであることが望ましい。この実施形態において、ブロッキング配列は、プローブの配列特異的部分のハイブリダイゼーションに対して偽陽性の結果を提供することなく、標的ヌクレオチド配列の二次構造形成領域とハイブリダイズし、そしてプローブの配列特異的部分のハイブリダイゼーションを妨害する二次構造をブロックする。実際、２つの類似する標的ヌクレオチド配列（例えば、検出することが所望される野生型対立遺伝子および変異体対立遺伝子）間を識別するように設計された２つのプローブが、調製される。これらのプローブはさらに、特有の同定標識および検出することが所望される標的ヌクレオチド配列の配列と特異的にハイブリダイズするように設計された配列特異的部分を含む。
【００９８】
　あるいは、プローブの二次構造ブロッキング配列は、このプローブの配列特異的部分よりも標的ヌクレオチド配列と強力にハイブリダイズし得る。偽陽性結果の出現を回避するために、このハイブリダイゼーションプローブの配列特異的部分が、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズされることを示すかまたはそのことを表わさなければならない。蛍光プローブ（ここで、その蛍光は、二重鎖ヌクレオチドの存在によって増強されるかクエンチされるかの、いずれかである）のような標識の存在によって、この結果が達成される。別の有用なシグナルは、プローブの配列特異的部分の自己消光発蛍光団−クエンチャー対であり、ここで、標的ヌクレオチド配列への結合の際に、この発蛍光団−クエンチャー対を含む配列は、線形配置であると想定され、この配置において、蛍光はもはやクエンチされない。
【００９９】
　上記プライマーに加えて、本発明はまた、新規の「二目的」ハイブリダイゼーションプローブを提供する。このプローブは、以下を含む：１）第一の標的ヌクレオチド配列に相補的な、第一のプローブヌクレオチド配列、および２）第二の標的ヌクレオチド配列に実質的に相補的な、第二のプローブ配列。ここで、第二のプローブ配列の、第二の標的ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションは、第一のプローブ配列の第１のヌクレオチド配列との結合をしばしば妨害する標的ヌクレオチド配列における二次構造形成をブロックする。この二目的プローブは、当該分野で公知の任意のハイブリダイゼーションアッセイと併用して使用され得る。この二目的プローブは、標的ヌクレオチド配列（ＲＮＡかＤＮＡのいずれか）が、上記のような望ましくない二次構造を形成する場合に、特に有用であり、ここで、この二次構造は、その標的ヌクレオチド配列内に含まれる目的部位を効果的にマスクする。このプローブの二次（ブロッキング）配列は、標的ヌクレオチド配列における二次構造の形成を破壊し、かつ第一のプローブヌクレオチド配列を用いた目的部位の探索を容易にする。このプローブは、目的配列が、しばしば検出不能である対立遺伝子変異またはＳＮＰ部位を含む場合に、特に有用であり、従って、個々の遺伝子型を決定する改善された方法を提供する。
【０１００】
　本発明の新規プローブは、ライゲーション検出と併せて二次構造破壊という二つの目的のために使用され得る。ライゲーションアッセイは、Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉらに対する、共有に係る米国特許第５，８００，９９４号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。この手順のスキームの提示は、図１０に示される。
【０１０１】
　検出可能な標識は、二目的ハイブリダイゼーションプローブ上に存在し得るか、またはハイブリダイゼーションアッセイの完了時にそのプローブに結合され得る。
【０１０２】
　本発明はまた、標的ヌクレオチド配列の配列の一部に特異的なプローブを含む。好ましいプローブは、特定の対立遺伝子またはＳＮＰに配列特異的であり、個々の特定の遺伝子型を検出するために使用され得る。対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）プローブは、好ましいプローブの一例である。標的ヌクレオチド配列が、本発明の二目的プライマーを使用して増幅される場合、このプライマーのブロッキング配列は、その増幅された標的ヌクレオチド配列（特定の対立遺伝子またはＳＮＰを含む）の二次構造形成領域とハイブリダイズする。このブロッキング配列が標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするので、ＡＳＨプローブは、対立遺伝子またはＳＮＰを含む標的ヌクレオチド配列の領域とハイブリダイズし得、それによって、その対立遺伝子またはＳＮＰの検出が可能になる。
【０１０３】
　新規プローブはさらに、検出可能なプローブとハイブリダイズするように設計された捕捉配列ドメインを含み得る。好ましいＡＳＨプローブは、以下でより詳細に記載される検出手段に結合された固有の配列とハイブリダイズする捕捉配列ドメインとハイブリダイズする配列を含む。
【０１０４】
　本発明のハイブリダイズされたプローブの検出は、当該分野で公知の任意の方法を使用して、行われ得る。例えば、蛍光プローブの存在または蛍光消光における場合は蛍光シグナルの欠失が、使用され得る。別の検出方法において、プローブは、放射性標識で標識され得、そして例えば、閃光を発して検出され得る。好ましい方法において、プローブは、発蛍光団または他の色素に結合され得るか、あるいはこのプローブは、発蛍光団または他の色素で標識される固体基質に結合され得る。好ましい方法において、このプローブは、検出可能な標識で標識されたヌクレオチド配列（例えば、発蛍光団で標識された核酸プローブ）に相補的なヌクレオチド配列を含む。特に好ましい方法において、検出は、ＬｕｍｉｎｅｘＴＭミクロスフェアを使用する多重アッセイにおいて達成される。
【０１０５】
　標識化プローブによって生じるシグナルを増幅することが、望ましくあり得る。このシグナル増幅は、共有に係る米国特許第５，２００，３１４号；同第５，１２４，２４６号；同第５，６２４，８０２号；同第５，７１０，２６４；および同第５，８４９，４８１号（これらは、上記溶液相アッセイにおいて使用するための、巨大な櫛型（ｃｏｍｂ−ｔｙｐｅ）の分枝ポリヌクレオチドマルチマーの調製を記載している）に記載されるような、核酸マルチマーの使用を含み得る。この櫛は、小さいマルチマーが増強するよりも、このアッセイにおいて大きなシグナルの増強を提供する。核酸マルチマーは、分析物核酸またはこの分析物に結合した核酸（分枝または線形）に特異的にハイブリダイズするセグメント、および標識化プローブに特異的にハイブリダイズする二次セグメント反復、を有するように構築された分枝ポリヌクレオチドである。マルチマーを使用するアッセイにおいて、初期工程の後に、標識または増幅プローブセットとの分析物のハイブリダイゼーション、第一容器内へのプローブセットの捕捉、およびこの捕捉したプローブのセグメントにハイブリダイズする固定化核酸を含む別の容器への複合体の移動が続く。次いで、マルチマーは、固定化複合体にハイブリダイズされ、次いで、この標識化プローブは、マルチマー上の二次セグメント反復にハイブリダイズされる。このマルチマーは、標識プローブ結合のための多数の部位を提供するので、そのシグナルは増幅される。
【０１０６】
　本発明のプローブは、検出感度が十分に高い場合、未増幅の標的ヌクレオチド配列とともに使用され得る。例えば、米国特許第５，６２４，８０２号に記載されるように、上記のマルチマーを使用して、標的ヌクレオチド配列に結合されたプローブを検出することにより、この感度は、少数コピーの標的配列を検出するのに十分であり得る。
【０１０７】
　最も好ましい実施形態において、ハイブリダイズされた対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブの検出は、この対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブに共有結合した検出可能な粒子を使用して達成され、ここで、この粒子は、微粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、粒子機能性ビーズ（ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ　ｂｅａｄｓ）などであり得る。特有の捕捉配列を含む対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用することによって、使用はさらに容易になり、これは次いで、ミクロスフェアまたは微粒子に共有結合した相補的な配列とハイブリダイズする。
【０１０８】
　適切な検出可能な微粒子としては、米国特許第６，２６８，２２２号に記載されている微粒子（これは、１ｍｍ未満の直径、好ましくは、約０．１〜１，０００μｍの直径、好ましくは、１〜１００μｍ、より好ましくは、２〜５０μｍ、なおより好ましくは、３〜２５μｍ、そして最も好ましくは、約６〜１２μｍの直径のサイズ範囲を有する粒子を記載している）が挙げられるがこれらに限定されない。微粒子は、好ましくは、ポリマー材料（例えば、ポリスチレン）から作製される。しかしながら、有用なポリマー材料としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：臭素化ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリブタジエン、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリジメチルシロキサン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリビニルアセテート、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリ塩化ビニルベンジル、ポリビニルトルエン、塩化ポリビニリデン、ポリジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレート、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリ（乳酸−ｃｏ−クリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリフォスファーゼン、ポリホスファーゼ（ｐｏｌｙｐｈｏｓｏｐｈａｚｅ）、ポリスルホン、またはそれらの組み合わせ。他のポリマー材料（例えば、炭水化物（例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、タンパク質ポリマー、ポリペプチド））、ならびに寒天、ゲル、真核生物細胞および原核生物細胞、ウイルス、脂質、金属、樹脂、ラテックス、ゴム、シリコーン（例えば、ポリジメチルジフェニルシロキサン）、ガラス、セラミック、木炭、カオリナイト、ベントナイトなどが、同様に使用され得る。これらのポリマーはまた、超常磁性金属酸化物、常磁性金属酸化物、強磁性金属酸化物、反強磁性金属酸化物、または強磁性金属酸化物からなる群より選択される、磁性金属酸化物または磁気的に応答性の金属酸化物を取り込み得る。
【０１０９】
　微粒子はさらに、検出を容易にする蛍光色素または着色色素を含む。好ましくは、このような色素は、疎水性であり、かつこの微粒子を染色し得る。好ましい色素は、シアニン色素である。この色素は、微粒子に共有結合され得るかまたは吸着され得る。さらに、色素の混合物を使用して、特定の適用のためかまたは特定のプローブ配列のための特有の標識を作製し得る。
【０１１０】
　米国特許第６，２６８，２２２号にもまた記載されるように、微粒子は、その表面上に、蛍光染色されたナノ粒子の１つ以上の集団を輸送し得、ここで、所定の集団内の全てのナノ粒子は、同じ濃度の色素で染色される。同じかまたは異なる色の、既知の量のこれらナノ粒子の微粒子への結合により、多色微粒子または多蛍光性（ｍｕｌｔｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）微粒子が生じる。異なる集団のナノ粒子の量および割合を変化させることによって、特有の発光スペクトルを用いて、キャリア粒子の多数の目立たない集団を確立および識別することが可能である。このキャリア微粒子はまた、さらなる色またはシグナルを提供するように染色され得る。このような特有に標識された微粒子は、配列の多重分析に特に有用であり、かつフローサイトメトリを使用して簡便に検出および分析され得る。もちろん、微粒子またはミクロスフェアではなく、ヌクレオチド配列または固体基質に結合する色素の組み合わせの使用は、類似の様式で行われ、微粒子の使用を必要としない。
【０１１１】
　本発明のプライマーおよびプローブはまた、質量分析法を使用して質量タグで標識された配列を検出することによって、検出され得る。例えば、この質量タグに共有結合する特定の配列とハイブリダイズする、特有の捕捉配列が使用され得る。次いで、この質量タグの存在は、特定の捕捉配列の存在、従って、特定の捕捉配列を含むプライマーまたは対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブの存在を示す。質量タグは、ＭｉｒおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ（２０００）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２９〜３６０によって、記載および概説されている。
【０１１２】
　他に示されなければ、本発明の実施は、当該分野の範囲内の分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第３版（２００１）；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ　Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ　＆　Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ　＆　Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ　ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８４）；Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻および第１５５巻（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、およびＷｕ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ、編、１９８７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）。
【０１１３】
　本発明は、その好ましい特定の実施形態とともに記載されているが、上の記載および以下の実施例は、本発明を例示しかつ本発明の範囲に限定されないことが意図されることが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は、本発明に関する当業者に明らかである。
【０１１４】
　上記および下記の両方において、本明細書中で言及される全ての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中で参考として援用される。
【０１１５】
　（実験手順）
　以下の実験手順は、本明細書中に開示されそして特許請求されるハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーをいかに作製しそして使用するのかについて、そしてこの同じハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーを使用する方法をどのように実施するのかについての完全な開示および記載を、当業者に提供するために示される；実施例は、本発明者らが自身の発明であると認識する発明の範囲を制限することを意図されない。数（例えば、量、温度など）に関する精度を保証するように努力がなされたが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。他で示されない限り、部は、重量部であり、温度は、摂氏度（℃）であり、そして圧力は、海面での大気圧またはほぼ大気圧である。
【０１１６】
　以下および本明細書全体を通じてに示される手順において、使用される略語は、以下のような一般的に受け入れられているその略語の意味を有する：
　Ｃ　　　　摂氏または百分度
　ｍＭ　　　ミリモル濃度
　μＭ　　　マイクロモル濃度
　ｐｍｏｌ　ピコモル（１０−１２モル）
　ｍｇ　　　ミリグラム
　μｇ　　　マイクログラム
　ｍＬ　　　ミルリットル
　μＬ　　　マイクロリットル
　μｍ　　　マイクロメートル
　Ｔｍ　　　融解温度
　Ｕ　　　　単位。
【０１１７】
　下記の手順を実施するために、Ｐｒｉｍｅｒ３、ＧＣＧ（登録商標）、ＶＮＴＩ、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）およびＨｙｂｓｉｍｕｌａｔｏｒを含む、種々のソフトウェアが、プライマーの設計およびＴｍの推定のために使用された。Ｈｙｂｓｉｍｕｌａｔｏｒは、Ｔｍの推定のために好ましいソフトウェアであることが見出された。
【実施例】
【０１１８】
　（実施例１：独立したブロッキングプローブを用いる二目的プライマー系と独立したブロッキングプローブを用いない二目的プライマー系との比較）
　以下の手順を、独立したブロッカーを使用する二目的プライマー系と使用しない二目的プライマー系とを比較するために実施した。
【０１１９】
　（ゲノムＤＮＡの抽出）
　ヒトゲノムＤＮＡを、ＱＩＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）によって記載されるようにを使用して、ＥＤＴＡ処理した２００μＬの全血より抽出した。
【０１２０】
　（従来のプライマー配列の調製）
　プライマー配列を、シトクロムｐ４５０　ＣＰＹ２Ｄ６遺伝子（目的の４つのＳＮＰ部位を含むエキソン１、エキソン２、エキソン６およびエキソン９）に対応するＤＮＡの特定の領域を増幅するために設計した。ビオチン化配列もまた、４つのＳＮＰ部位についての対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブとして作用する。
【０１２１】
【化１】
2004113240.tif 000003
　（シングルプレックス（多重ではない）（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）ＰＣＲ産物またはマルチプレックスＰＣＲ産物の調製）
　２μＬ（５０〜７０ｎｇ）の単離したゲノムＤＮＡを用いて、多重ではない反応または多重反応を実施した。２５μｌの反応容量が、１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ　Ｔａｑ　ＰＣＲ緩衝液、各々２．５ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）；各々０．２μＭの順方向（ビオチン化）プライマーおよび逆方向プライマー、ならびに２．５Ｕ　Ｔｉｔａｎｉｕｍ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。ＰＥ９６００サーモサイクラーを使用した。熱サイクリング条件は、９４℃で２分間、その後に９５℃で３０秒間と６８℃で１分間とを３０サイクル、その後に最終伸長６８℃で５分間であった。
【０１２２】
　（多重作業試薬の調製）
　最終ｐＨ７．５を有する５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（５００ｍＭ　ＬｉＣｌ、１％　ＬＤＳ、１％ウシ血清アルブミン、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０１ｍＭ　ＺｎＣｌ２、防腐剤としての０．５％アジ化ナトリウムおよびＰｒｏｃｌｉｎ−３００（ＨＩＶ３．０　Ｌａｂｅｌ　Ｄｉｌｕｅｎｔ，Ｂａｙｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含む）２５μＬ当たり、４つのＳＮＰ領域についての各々０．１ｐｍｏｌの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）プローブ、および各々２０００個の個別のＬｕｍｉｎｅｘＴＭミクロスフェアを混合することによって、多重作業試薬を調製した。
【０１２３】
　（多重（マルチプレックス）ＰＣＲアッセイ）
　上記に示したＰＣＲ反応の完了後、２５μＬの多重作業試薬（ＡＳＨプローブを含む）を、マルチプレックスＰＣＲ産物を含有する個々のウェルに添加した。このプレートを、Ｍｙｌａｒでシールし、そしてインキュベーションを、ＰＥ９６００サーモサイクラー中で継続した。多重作業試薬を含むこのＰＣＲプレートを、９５℃で１０分間インキュベートして、二本鎖ＤＮＡを解離させ、その後、対立遺伝子ハイブリダイゼーションを達成するために５０℃で３０分間インキュベートした。このプレートを取り出し、そして１００μＬの洗浄緩衝液（ＨＩＶ３．０　Ｗａｓｈ　Ａ，Ｂａｙｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を、各ウェルに添加した。このウェルの内容物を、予め湿らせた９６ウェルのフィルタープレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（登録商標）−ＢＶ１．２μｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ　ＭＡ）に移した。洗浄緩衝液を、穏やかな減圧で吸引し、そして２００μＬの洗浄を繰り返した。ミクロスフェアを、５０μＬのストレプトアビジン−フィコエリトリン（０．０５μｇ／５０μＬ）ＴＴＬ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ　ＬｉＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ８．０））混合液中で再懸濁した。次いで、このプレートを、アルミニウムホイルで被い、そして穏やかに振盪しながら２５℃で１５分間インキュベートした（Ｔｉｔｅｒ　Ｐｌａｔｅシェーカー、Ｌａｂｌｉｎｅ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。上記洗浄工程を繰り返し、そしてミクロスフェアを、８０μＬのＴＴＬ緩衝液中に再懸濁し、そしてＬｕｍｉｎｅｘＴＭ１００で読み取った。ここで、フィコエリトリン（つまり、元々の順方向プライマー）および特定のＡＳＨ各々に特異的なミクロスフェアの存在を検出した。
【０１２４】
　（独立したブロッカー分子の有効性の決定）
　上記の従来のＰＣＲ産物に対する、独立したブロッカー分子の有効性を決定するために、２５μＬの多重作業試薬中１ｐｍｏｌのブロッカーを、従来のシトクロムＰ４５０　ＣＰＹ２Ｄ６エキソン１　ＰＣＲ産物に添加した。図４に示すように、この多重作業試薬にブロッカー分子を添加すると、シグナルが、多重作業試薬にブロッカーを添加しない場合に生成されるシグナルの３０倍に増加した。
【０１２５】
　（二目的プライマー配列の調製）
　図１において観察されるように、シトクロムＰ４５０　ＣＰＹ２Ｄ６遺伝子のエキソン１は、そのＳＮＰにて最大量の二次構造を有する。図６中のゲルは、エキソン１が、検出可能なＳＮＰ産物バンドを生成しないことを示す。エキソン１のシグナルを増加させるために、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチドおよび１２ヌクレオチドのブロッキング配列を、以下に示すようなシトクロムＰ４５０　ＣＰＹ２Ｄ６遺伝子のエキソン１のビオチン化順方向プライマーに挿入した；４番目のエキソン１プライマーは、逆方向プライマーを示す。
【０１２６】
【化２】
2004113240.tif 000004
Ｘ：エチレングリコールスペーサー　１８。
【０１２７】
　（二次構造の破壊）
　シトクロムＰ４５０　ＣＰＹ２Ｄエキソン１　ＰＣＲアンプリコン内に形成される二次構造を破壊する際の二目的プライマー分子の有効性を決定するために、上記に示したような８ヌクレオチド、１０ヌクレオチドおよび１２ヌクレオチドのブロッキング配列を有する１ｐｍｏｌ／２５μＬの個々の二目的プライマー分子を、多重作業試薬に添加した。コントロールブロッカー分子を、同濃度で添加した。次いで、上記に示したようなシトクロムＰ４５０　ＳＮＰアッセイを、この二目的プライマーを使用して実施した。図７は、このプロトコルの概略図である。図８に示されるように、ＳＮＰアッセイで検出された正味のシグナルは、このブロッキング配列の長さの増加とともに増加した。対照的に、ブロッカー配列を使用しなかった場合、シグナルがほとんど生成されなかった（図８中「従来の」と示したカラムを参照のこと）。２５ヌクレオチドの外部ブロッカー配列を従来のプライマーとともに使用した場合、ブロッカーを有さないプライマーに対して１５〜２０倍のシグナルの増加が、観察された（図８中「従来の＋ブロッカー」と示したカラムを参照のこと）；しかし、２５ヌクレオチドの外部ブロッカーの有効性は、１２ヌクレオチドブロッカー挿入物を有する二目的プライマーの有効性よりも顕著に低かった；１２ヌクレオチドブロッカー挿入物を有する二目的プライマーは、２５ヌクレオチドの外部ブロッカーに対して正味２倍のシグナル増加を示した。
【０１２８】
　（実施例２：シトクロムＰ４５０　ＣＰＹ２Ｄ６のエキソン１、エキソン２、エキソン６およびエキソン９についての野生型対立遺伝子または変異体対立遺伝子の検出）
　シトクロムＰ４５０　ＣＰＹ２Ｄ６遺伝子のエキソン１、エキソン２、エキソン６およびエキソン９についての野生型対立遺伝子または変異体対立遺伝子を検出するために、上記に示したマルチプレックスＰＣＲアッセイを使用して、この４つのエキソンの各々におけるＳＮＰを検出した。この手順を実施するために、シトクロムＰ４５０　ＣＰＹ２Ｄ６遺伝子のエキソン１、エキソン２、エキソン６およびエキソン９に対応する特定領域を増幅するためのプライマーセットを設計した。生じたアンプリコンを、野生型対立遺伝子に特異的なＡＳＨプローブおよび変異体対立遺伝子に特異的なＡＳＨプローブの直接捕捉を介してハイブリダイズした。適切な場合、二目的プライマーを使用して、二次構造を破壊した。ＡＳＨプローブの各々は、特定色でコードされたＬｕｍｉｎｅｘＴＭミクロスフェア上の標的配列に相補的な、独特な配列ドメインを含んだ。このＡＳＨプローブ上の捕捉配列とＬｕｍｉｎｅｘＴＭミクロスフェアとの間の潜在的な交差反応性を低減させるために、非天然のイソシステイン塩基およびイソグアニン塩基を、ＡＳＨプローブ上の捕捉配列およびＬｕｍｉｎｅｘＴＭミクロスフェアに組み込んだ。この多重アッセイを使用して、変異体対立遺伝子および野生型対立遺伝子は、ＬｕｍｉｎｅｘＴＭミクロスフェアの色に従って容易に同定可能であった。
【０１２９】
　シトクロムＰ４５０　ＣＰＹ２Ｄ６遺伝子のエキソン１、エキソン２、エキソン６およびエキソン９の野生型対立遺伝子（上）および変異体対立遺伝子（下）の各々についてのＡＳＨプローブおよびＴｍを、下記に示す。野生型アンプリコン配列とハイブリダイズするように設計したＡＳＨプローブについてのＴｍは、変異体アンプリコン配列とハイブリダイズするように設計したＡＳＨプローブよりも少なくとも１０℃安定である（すなわち、少なくとも１０℃高い温度で融解する）。これらの融解温度は、１塩基対ミスマッチ配列についての融解温度において予想される差異１０℃と一致する。この規定の下で、変異体アンプリコン配列についての対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブは、この変異体アンプリコン配列が存在する場合に、少なくとも１０℃安定である。
【０１３０】
【化３】
2004113240.tif 000005
2004113240.tif 000006
ここで、Ｊ＝イソグアニンであり、そしてＦ＝イソシトシンである。
【０１３１】
　図２は、マルチプレックスＰＣＲアッセイと、野生型対立遺伝子および変異体対立遺伝子の、それぞれのＬｕｍｉｎｅｘＴＭミクロスフェアへの捕捉との概略図を示す。図７は、ＳＮＰアッセイにおける二目的プライマーの相互作用を図示的に示し；そして、図９は、４人の個々の患者についてのシトクロムＰ４５０　ＣＰＹ２Ｄ２遺伝子のエキソン１、エキソン２、エキソン６およびエキソン９の遺伝子型を検出するためのマルチプレックスＰＣＲアッセイの結果を示す。
【０１３２】
　本発明は、標的配列が、標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションを妨害する分子内二次構造を形成し得る場合に、標的ヌクレオチド配列へのプローブのハイブリダイゼーションを向上する方法において使用される、プライマーおよびプローブを提供する。特に、本発明は、標的ヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーを含み、ここで、この標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部が、分子内二次構造を形成し得る。本発明のプライマーは、二次構造を形成しない標的ヌクレオチド配列の一部に相補的なプライマーヌクレオチド配列、および増幅される標的ヌクレオチド配列の二次構造形成領域の少なくとも一部に実質的に相補的なブロッキング配列を含み、ここで、このブロッキング配列は、増幅される標的ヌクレオチド配列の二次構造形成領域の一部にハイブリダイズし、そして二次構造の形成をブロックする。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
　本出願の明細書は、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。
【図１】図１は、チトクロムＰ４５０　ＣＹＰ２Ｄ６のエキソン１、２、６および９（それぞれ、配列番号２４〜２７）の構造の概要を図示し、各ＳＮＰ領域の部分を赤で示す。
【図２】図２は、マルチプレックスモード（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｍｏｄｅ）、およびＬｕｍｉｎｅｘＴＭミクロスフェアを用いる検出において、ＳＮＰを検出するために用いられるプライマーおよびプローブの全体の概略の概要を図示する。
【図３】図３は、チトクロムＰ４５０　ＣＹＰ２Ｄ６のエキソン１（配列番号２４の残基１４２〜１９５）中のＳＮＰを含む干渉する二次構造の概要を図示し、これは、ＳＮＰが、一本鎖ヘアピン（赤で示されるＳＮＰ領域を有する）に関与することを示す。ブロッキングオリゴヌクレオチド（配列番号２８）は、潜在的分子内二次構造に関与するヌクレオチドとハイブリダイズして、この構造の形成を阻害して、その結果、ＳＮＰの検出を可能にする。
【図４】図４は、ブロッキング配列が存在する場合の、チトクロムＰ４５０　ＣＹＰ２Ｄ６のエキソン１中のＳＮＰについての検出シグナル、およびブロッキング配列が存在しない場合の対応する検出シグナルを示す。
【図５】図５は、本発明の二目的プライマーの構造および作用機構の概要を図示する。ブロッカー配列（図において「ブロッカー領域」および「Ｂ」といわれる）、およびプライマー配列（図において「プライマー領域」および「Ｐ」といわれる）は、スペーサー領域「Ｓ」を介して連結される。ここで、任意の塩基「Ｏ」がＳとＰとの間に示される。この任意の塩基は、プライマー配列Ｐに対して５’側の望ましくないプライミングを防ぐ。このプライマー配列は、ＳＮＰ部位（「Ｘ」と表される）を含む標的分子の一方の末端に相補的であり、そしてブロッキング配列は、Ｘに直ぐ隣接する配列Ｂ’に実質的に相補的であり、ここで、Ｂ’は、二目的プライマーの非存在下において、ＳＮＰ部位を相補的な配列から隠す（それにより、ハイブリダイゼーションおよび検出を妨げる）、分子内二次構造を生成する原因である標的分子のセグメントである。標的ヌクレオチド配列の増幅および再アニーリングの後、Ｂは、アンプリコン中のＢ’とハイブリダイズし、望ましくない二次構造の形成をブロックする。ＳＮＰ部位の検出は、標識プローブ（図において「ＡＳＨ標識プローブ」といわれる）を用いて達成される。
【図６】図６は、８、１０、および１２ヌクレオチドのブロッカー配列挿入物を有する二目的プライマーが、全て、予想されたサイズの主要なバンドを生成したことを実証する分析用ゲルを示す。
【図７】図７は、本発明の二目的プライマーを用いるマルチプレックスディファレンシャルハイブリダイゼーションの概要を図示する。
【図８】図８は、８、１０、または１２ヌクレオチドの挿入物を有する本発明の二目的プライマー、従来のプライマー、およびブロッキングオリゴヌクレオチドと組合わせて用いられる従来のプライマーを用いる、チトクロムＰ４５０　ＣＹＰ２Ｄ２遺伝子（ＳＮＰアッセイ）のエキソン１においてＳＮＰを検出するために用いられるマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲアッセイの結果を比較する棒グラフである。
【図９】図９は、４人の個別の患者サンプルに対して行ったマルチプレックスＳＮＰアッセイのチトクロムＰ４５０遺伝子型決定の結果を実証する棒グラフである。
【図１０】図１０は、望ましくない二次構造の形成を防ぎ、そしてまた、ＳＮＰの連結検出を可能にする、二目的プローブの概要を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図６】
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【配列表】
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