(57)【要約】【課題】大麦焼酎蒸留残液から分取したNK細胞を賦活化する作用を有する組成物の製造方法及び賦活化したNK細胞含有組成物の製造方法を提供する。【解決手段】  少なくとも、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る工程、前記液体分を限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付す工程を有し、前記限外濾過による濃縮処理工程では、ウロン酸を実質的に含有せずに、キシロース、アラビノース及びグルコースからなる多糖類を含有し、ナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する濃縮液を得る、前記濃縮液からなるナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する組成物の製造方法、及び前記ナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する組成物で賦活化したナチュラルキラー細胞を含有する賦活化ナチュラルキラー細胞含有組成物の製造方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る固液分離工程、前記液体分を限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付すことにより、ウロン酸を実質的に含有せず、キシロース、アラビノース及びグルコースからなる多糖類を含有し、ナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する濃縮液を得る濃縮処理工程を有することを特徴する前記濃縮液からなるナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する組成物の製造方法。
【請求項２】
前記固液分離工程と前記濃縮処理工程との間にイオン交換処理工程を有し、前記イオン交換処理工程では、前記固液分離工程で得られた前記液体分をイオン交換樹脂を使用するイオン交換処理に付して前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を分取し、前記濃縮処理工程では、前記イオン交換処理工程で分取した前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付すことにより、ナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する濃縮液を得ることを特徴とする請求項１に記載の組成物の製造方法。
【請求項３】
前記固液分離工程と前記濃縮処理工程との間に吸着分離処理工程を有し、前記吸着分離処理工程では、前記固液分離工程で得られた前記液体分を合成吸着剤を使用する吸着分離処理に付して前記合成吸着剤に非吸着の画分を分取し、前記濃縮処理工程では、前記吸着分離処理工程で分取した前記合成吸着剤に非吸着の画分を限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付すことにより、ナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する濃縮液を得ることを特徴とする請求項１に記載の組成物の製造方法。
【請求項４】
前記固液分離工程と前記濃縮処理工程との間に吸着分離処理工程とイオン交換処理工程を有し、前記吸着分離処理工程では、前記固液分離工程で得られた前記液体分を合成吸着剤を使用する吸着分離処理に付して前記合成吸着剤に非吸着の画分を分取し、前記イオン交換処理工程では、前記吸着分離処理工程で分取した前記合成吸着剤に非吸着の画分をイオン交換樹脂を使用するイオン交換処理に付して前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を分取し、前記濃縮処理工程では、前記イオン交換処理工程で分取した前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付すことにより、ナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する濃縮液を得ることを特徴とする請求項１に記載の組成物の製造方法。
【請求項５】
前記濃縮処理工程で得られた前記濃縮液を凍結乾燥する工程を更に有する請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の組成物の製造方法。
【請求項６】
前記イオン交換樹脂が、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、及び陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂を混合した混床イオン交換樹脂からなる群から選ばれるものである請求項２又は請求項4に記載の組成物の製造方法。
【請求項７】
前記合成吸着剤が、芳香族系合成吸着剤又はメタクリル系合成吸着剤である請求項3又は請求項4に記載の組成物の製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載の製造方法で製造された、ウロン酸を実質的に含有せず、キシロース、アラビノース及びグルコースからなる多糖類を含有し、ナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する濃縮液からなる組成物と、ナチュラルキラー細胞を混合して培養することにより前記ナチュラルキラー細胞を賦活化することを特徴とする賦活化したナチュラルキラー細胞含有組成物の製造方法。
【請求項９】
請求項２に記載の製造方法で製造された、ウロン酸を実質的に含有せず、キシロース、アラビノース及びグルコースからなる多糖類を含有し、ナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する濃縮液からなる組成物と、ナチュラルキラー細胞を混合して培養することにより前記ナチュラルキラー細胞を賦活化することを特徴とする賦活化したナチュラルキラー細胞含有組成物の製造方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の製造方法で製造された、ウロン酸を実質的に含有せず、キシロース、アラビノース及びグルコースからなる多糖類を含有し、ナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する濃縮液からなる組成物と、ナチュラルキラー細胞を混合して培養することにより前記ナチュラルキラー細胞を賦活化することを特徴とする賦活化したナチュラルキラー細胞含有組成物の製造方法。
【請求項１１】
請求項４に記載の製造方法で製造された、ウロン酸を実質的に含有せず、キシロース、アラビノース及びグルコースからなる多糖類を含有し、ナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する濃縮液からなる組成物と、ナチュラルキラー細胞を混合して培養することにより前記ナチュラルキラー細胞を賦活化することを特徴とする賦活化したナチュラルキラー細胞含有組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る工程及び、前記液体分を限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付すことにより、ウロン酸を実質的に含有せず、キシロース、アラビノース及びグルコースからなる多糖類を含有し、ナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する濃縮液を得る工程を有することを特徴とする、ナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する前記濃縮液からなる組成物の製造方法、及び、前記ナチュラルキラー細胞を賦活化する作用を有する組成物を使用してナチュラルキラー細胞を賦活化した、賦活化したナチュラルキラー細胞含有組成物の製造方法を包含する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー細胞（以下、NK細胞と呼称する）は、動物（ヒト、マウス、ハムスター、ラット、ニワトリ、ブタなど）のリンパ組織中に見出されている。そうしたNK細胞は、形態学的には、細胞質内にアズール顆粒を含有するやや大型のリンパ球（LGL）で、リンパ球中の数%を占めており、免疫的記憶なしに、ある種の腫瘍細胞（主として造血器系腫瘍）を非特異的に破壊することができることから、腫瘍発生に対する生体の防御機構の一翼を担っていると考えられている。更に、B細胞やT細胞が抗原特異的な獲得免疫を司るのに対して、NK細胞は免疫反応の極く初期に働く抗原非特異的な自然免疫に重要な役割を果たし、B細胞レセプターやT細胞レセプターを有さないにもかかわらず、自己と非自己を正確に識別し、事前の抗原の感作なしにウイルス感染細胞や腫瘍細胞を壊死に至らしめることが知られている。
【０００３】
ところで、近年、がん・糖尿病をはじめとする難病（生活習慣病）の治療などにおいて、合成医薬に依存する治療方法では、克服し難い副作用の問題が往々にしてあることから、そうした合成医薬による副作用のない治療方法として、人間に本来備わっている免疫力（自己治癒力）を天然素材を原料とする薬効食品などを使って増強させる所謂代替医療による治療方法が注目されている。代替医療は患者主体の治療方法であり、副作用の心配が少ないことから、特にアメリカでは、全体の60%の医師が患者に代替医療をすすめ、がん患者の約半数以上が代替医療を行っていることが報告されている。日本国内でも、1998年2月に初めての「代替医療」に関する学術合議が日本国内で開催されたこともあって、代替医療への関心が高まっている。こうしたことから、各種の天然物に由来するNK細胞を賦活化する物質が、免疫力増強物質の一つとして医薬品や薬効食品として徐々に使用されるようになっており、将来的には、その使用は一般に普及するものと思われる。
【０００４】
そうした天然物に由来するNK細胞を賦活化する物質としては、以下に述べるように幾つか知られている。例えば、特許公報第2532899号（以下、当該公報を特許文献１と呼称し、後述の段落番号0010に別途記載する）には、米糠、ふすま、稲わらまたはバガスの植物組織原料をアスペルギルス属またはバシディオマイセトス属である糸状菌の培養液中で資化することを特徴とする免疫賦活作用を有するヘミセルロースの製造方法が記載されている。そして、該製造方法を介して得られる免疫賦活作用を有するヘミセルロースは、主たる構成要素がキシロース及びアラビノースであり、平均分子量が55万又は60万であることが記載されている。
【０００５】
特開平9-23895号公報（以下、当該公報を特許文献２と呼称し、後述の段落番号0010に別途記載する）には、イネ科植物、特に米糠などの植物組織水溶性多糖を調製して水溶性多糖体を得、これとは別に糸状菌の細胞外酵素を調製して酵素複合体を得、前記水溶性多糖体と該酵素複合体とを混合し、所定pHで所定時間反応させることにより得られる免疫力増強物質が、NK細胞を賦活化する作用を有することが記載されている。また、該免疫力増強物質は、平均分子量が60万または65万であり、主たる構成要素がキシロース及びアラビノースであることが記載されている。
【０００６】
特開平10-146166号公報（以下、当該公報を特許文献３と呼称し、後述の段落番号0010に別途記載する）には、米を原料とし発酵のみを介して製造される清酒製造において副生する酒粕の水抽出液がNK細胞活性化作用を有することが記載されている。
【０００７】
特開2001-145472号公報（以下、当該公報を特許文献４と呼称し、後述の段落番号0010に別途記載する）には、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分にアルカリを添加してアルカリ可溶性画分を分取し、該アルカリ可溶性画分を酸で中和して中性可溶性画分を得、該中性可溶性画分にエタノールを添加することにより脂肪肝抑制作用を有する組成物を得ることが記載されている。また、特許文献４には、前記組成物は、分子量3000以下を主たる成分として含有し、該組成物が含有するヘミセルロースの主たる構成要素はキシロースであることが記載されている。
特開2001-145498号公報（以下、当該公報を特許文献５と呼称し、後述の段落番号0010に別途記載する）には、Aspergillus属に属する糸状菌を大麦フスマを含まない精麦大麦又は／及び精麦大麦の粉砕物に培養して大麦麹を得、該大麦麹にアルカリを添加してアルカリ可溶性画分を分取し、該アルカリ可溶性画分を酸で中和して中性可溶性画分を得、該中性可溶性画分にエタノールを添加することにより脂肪肝抑制作用を有する組成物を得ることが記載されている。また、特許文献５には、前記組成物は、分子量3000以下を主たる成分として含有し、該組成物が含有するヘミセルロースの主たる構成要素はキシロースであることが記載されている。
【０００８】
特開2002-338475号公報（以下、当該公報を特許文献６と呼称し、後述の段落番号0010に別途記載する）には、トウモロコシ外皮から得られたヘミセルロースの部分分解物を有効成分として含有する抗腫瘍組成物が記載されている。特許文献6には、前記部分分解物は平均分子量が2万乃至20万であり、該部分分解物を投与したcolon26担癌マウスにおいては、NK細胞活性が有意に上昇し、更にサイトカイン（IL-2及びINF-γ）産生能も有意に上昇することが記載されている。また、特許文献６には、前記トウモロコシ外皮から得られたヘミセルロースの部分分解物が「セルエース」の商品名で市販されていることが記載されている。
平成3年3月（社）菓子総合技術センター発行  「農林水産省食品流通局委託事業 No.8 飲食料品用作用性素材有効利用技術シリーズ  水溶性コーンファイバー（アラビノキシラン）」3頁（以下、当該文献を非特許文献１と呼称し、後述の段落番号0010に別途記載する）には、「セルエース」の商品名で市販されているトウモロコシ外皮から得られたヘミセルロースの部分分解物は、アラビノース及びキシロースからなるアラビノキシランを主成分とし、キシロース40.32%、アラビノース27.76%、ウロン酸11.86%、ガラクトース5.91%、及びグルコース2.30%の組成を有するものであることが記載されている。
【０００９】
特開2002-255843号公報（以下、当該公報を特許文献７と呼称し、後述の段落番号0010に別途記載する）には、米糠の水抽出物であって、分子量30000乃至40000程度の画分からなる抽出物を含有してなる免疫賦活用組成物が記載されている。そして、該組成物はマイトジェン活性及び優れたNK細胞の活性化作用を有することが記載されている。
【００１０】
【特許文献１】特許公報第2532899号
【特許文献２】特開平9-23895号公報
【特許文献３】特開平10-146166号公報
【特許文献４】特開2001-145472号公報
【特許文献５】特開2001-145498号公報
【特許文献６】特開2002-338475号公報
【特許文献７】特開2002-255843号公報
【非特許文献１】平成3年3月（社）菓子総合技術センター発行  「農林水産省食品流通局委託事業 No.8 飲食料品用機能性素材有効利用技術シリーズ  水溶性コーンファイバー（アラビノキシラン）」3頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
大麦焼酎蒸留残液が有する生理作用については、上述したように、特許文献４には、大麦および大麦麹を原料に使用し、発酵及び蒸留を介して製造される大麦焼酎の製造において副生する大麦焼酎蒸留残液から脂肪肝抑制作用を有する物質が得られることが記載されている。しかしながら、特許文献４を含めた上述の何れの公知文献にも、前記大麦焼酎蒸留残液がNK細胞に対する賦活化作用を有するか否かについては示唆するところすらない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、大麦焼酎を製造する際に副生される大麦焼酎蒸留残液が大麦由来のものであることから、該大麦焼酎蒸留残液中に含まれる大麦由来の多糖類がNK細胞賦活化作用を有するのではないかと予測して、実験を介して検討を行った。その結果、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分を限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付すことによって、キシロース、アラビノース及びグルコースからなる多糖類を含有する濃縮液が得られ、該濃縮液が、NK細胞を賦活化する顕著な作用を有するものであることを見出した。
大麦焼酎蒸留残液についてのこの発見は、今までに全く例のない新事実であり、大麦焼酎蒸留残液をNK細胞の賦活化に使用できるという大麦焼酎蒸留残液の新規な用途を創出するものである。よって、本発明は、大麦焼酎蒸留残液から、前記NK細胞を賦活化する作用を有する濃縮液からなる組成物（以下、これを「NK細胞賦活化組成物」と呼称する）の製造方法を提供する。本発明は、また、前記NK細胞賦活化組成物を使用して賦活化したNK細胞を含有する賦活化したNK細胞含有組成物の製造方法を提供する。
【００１３】
ところで、NK細胞は細胞表面に受容体を持ち、ウイルス感染細胞や腫瘍細胞等の標的細胞上のリガンドと結合して細胞傷害活性を引き起こすことが知られている。本発明のNK細胞賦活化組成物は、前記NK細胞に作用し、該NK細胞を賦活化せしめるものである。このNK細胞の賦活化機構は非常に複雑であり、具体的に如何なる物質がNK細胞を賦活化させるかは、現在のところ不明である。大麦焼酎蒸留残液より分取した本発明の多糖類を主たる成分として含有する組成物が、このようにNK細胞を顕著に賦活化する作用を有することの発見は、大麦焼酎蒸留残液に係る技術分野では予測すらも全くしなかった事実である。
【００１４】
以下に本発明を完成するにあたり、本発明者らが行った実験について詳述する。本発明は、実験を介して得られた上述の知見に基づいて完成に至ったものである。
本発明者らは、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分には、その主たる成分の１つとして多糖類が含まれていることに鑑み、前記液体分に含まれる多糖類がNK細胞の賦活化に関与しているか否かを明らかにするために実験を介して鋭意検討を行った。即ち、前記液体分に含まれる多糖類以外の成分、即ち、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、有機酸、或いは大麦由来のポリフェノール等を除去することを目的として、種々のイオン交換樹脂を用意し、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得た液体分をそれらイオン交換樹脂を個々に使用するイオン交換処理に付すことにより、それぞれのイオン交換樹脂に非吸着の画分を取得し、得られたイオン交換樹脂に非吸着の画分のそれぞれがNK細胞賦活化作用を有するか否か、またNK細胞賦活化作用を有する場合、そのNK細胞賦活化作用はどの程度のものであるかを明らかにするために以下の実験を行った。
【００１５】
以下の実験1乃至実験14に供する目的で大麦焼酎の製造を行った。原料としては、大麦（70%精白）を用いた。
[麹の製造]
大麦を40重量%吸水させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷し、大麦トンあたり1kgの種麹（白麹菌）を接種し、38℃、RH95%で24時間、32℃、RH92%で20時間保持することにより、大麦麹を製造した。
[蒸麦の製造]
大麦を40重量%吸水させ、40分間蒸した後、40℃まで放冷することにより、蒸麦を製造した。
【００１６】
[大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造]
1次仕込みでは前述の方法で製造した大麦麹（大麦として3トン）に、水3.6キロリットル及び酵母として焼酎酵母の培養菌体1kg（湿重量）を加えて1次もろみを得、得られた1次もろみを5日間の発酵（1段目の発酵）に付した。次いで、2次仕込みでは、上記1段目の発酵を終えた1次もろみに、水11.4キロリットル、前述の方法で製造した蒸麦（大麦として7トン）を加えて11日間の発酵（2段目の発酵）に付した。発酵温度は1次仕込み、2次仕込みとも25℃とした。上記2段目の発酵を終えた2次もろみを常法により単式蒸留に付し、大麦焼酎10キロリットルと大麦焼酎蒸留残液15キロリットルを得た。得られた大麦焼酎蒸留残液を以下の実験1乃至実験14に用いた。
【００１７】
〔実験１〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分1Lを得、得られた液体分1Lを凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物76.5gを得た。
【００１８】
〔実験２〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液から以下に示す方法によりイオン交換樹脂に非吸着の画分を分画した。即ち、前記大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をBrix10に調整後、このBrix10に調整した液体分1Lを、500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライトIRC76（弱酸性陽イオン交換樹脂）を充填したカラムに通して、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、該イオン交換樹脂に非吸着の画分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物71.6gを得た。
【００１９】
〔実験３〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液から以下に示す方法によりイオン交換樹脂に非吸着の画分を分画した。即ち、前記大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をBrix10に調整後、このBrix10に調整した該液体分1Lを、500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライトIRA67（弱酸性陰イオン交換樹脂）を充填したカラムに通して、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られたイオン交換樹脂に非吸着の画分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物82.4gを得た。
【００２０】
〔実験４〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液から以下に示す方法によりイオン交換樹脂に非吸着の画分を分画した。即ち、前記大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をBrix10に調整後、このBrix10に調整した該液体分1Lを、500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライトIR120B（強酸性陽イオン交換樹脂）を充填したカラムに通して、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られたイオン交換樹脂に非吸着の画分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物76.9gを得た。
【００２１】
〔実験５〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液から以下に示す方法によりイオン交換樹脂に非吸着の画分を分画した。即ち、前記大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をBrix10に調整後、このBrix10に調整した液体分1Lを、500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライト200CT（強酸性陽イオン交換樹脂）を充填したカラムに通して、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られたイオン交換樹脂に非吸着の画分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物61.7gを得た。
【００２２】
〔実験６〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液から以下に示す方法によりイオン交換樹脂に非吸着の画分を分画した。即ち、前記大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をBrix10に調整後、このBrix10に調整した液体分1Lを、500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライトIRA402BL（最強塩基性陰イオン交換樹脂）を充填したカラムに通して、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られたイオン交換樹脂に非吸着の画分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物68.3gを得た。
【００２３】
〔実験７〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液から以下に示す方法によりイオン交換樹脂に非吸着の画分を分画した。即ち、前記大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をBrix10に調整後、このBrix10に調整した液体分1Lを、350ml容量のオルガノ（株）製アンバーライトIRC76（弱酸性陽イオン交換樹脂）と150ml容量のオルガノ（株）製アンバーライトIRA67（弱塩基性陰イオン交換樹脂）を混合することにより得た混床イオン交換樹脂を充填したカラムに通して、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られたイオン交換樹脂に非吸着の画分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物57.1gを得た。
【００２４】
[NK細胞活性の測定]
上記実験1乃至実験7で得たそれぞれの凍結乾燥物について、後述の実施例において記載したのと同一の方法によりNK細胞活性（即ち、NK細胞に対する賦活化作用）を測定した。
【００２５】
実験1乃至実験7で得たそれぞれの凍結乾燥物を添加して培養したNK細胞が示すNK細胞活性の測定結果から以下の事実が判明した。即ち、イオン交換樹脂に非吸着の画分を添加しない対照と比較して、前記実験1乃至実験7で得た凍結乾燥物のそれぞれを別々に添加して培養した全てのNK細胞のNK細胞活性が上昇し、K562細胞に対する細胞傷害活性が上昇した。この中で、前記実験5で得たイオン交換樹脂に非吸着の画分の凍結乾燥物を添加して培養したNK細胞が示すNK細胞活性が最も高い値を示した。一方、前記実験1で得た凍結乾燥物を添加して培養したNK細胞が示すNK細胞活性が最も低い値を示した。
【００２６】
次に、本発明者らは、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得られる液体分の主たる成分の１つとして多糖類が含まれていることに鑑み、該液体分に含まれる多糖類がNK細胞の賦活化に関与しているか否かを明らかにするために実験を介して更に検討を行った。即ち、前記液体分に含まれる多糖類以外の成分である、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、有機酸、或いは大麦由来のポリフェノール等を除去することを目的として以下の実験を行った。具体的には、大麦焼酎蒸留残液の液体分に含まれる大麦由来のポリフェノール等を除去することを目的として、大麦焼酎蒸留残液を固液分離することにより得た液体分を合成吸着剤を使用した吸着分離処理に付して合成吸着剤に非吸着の画分を分取し、次に、分取したこの合成吸着剤に非吸着の画分に含まれるアミノ酸、ペプチド、タンパク質及び有機酸を除去することを目的として、該合成吸着剤に非吸着の画分を種々のイオン交換樹脂を使用したイオン交換処理に付すことによってそれらのイオン交換樹脂に非吸着の画分を個々に分取し、得られたイオン交換樹脂に非吸着の画分がNK細胞に対してどのような賦活化作用を有するかを明らかにするために以下の実験を行った。
【００２７】
〔実験８〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物76.5ｇを得た。
【００２８】
〔実験９〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液から以下に示す方法によりイオン交換樹脂に非吸着の画分を分画した。即ち、前記大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をオルガノ（株）製の合成吸着剤アンバーライトXAD-16を充填したカラムに通して吸着分離処理に付すことにより、該カラムの合成吸着剤に対して非吸着性を示す素通り液からなる前記合成吸着剤に非吸着の画分を分取した。得られた前記合成吸着剤に非吸着の画分をBrix10に調整し、このBrix10に調整した前記合成吸着剤に非吸着の画分1Lを、500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライトIRC76（弱酸性陽イオン交換樹脂）を充填したカラムに供し、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られた前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物58.4ｇを得た。
【００２９】
〔実験１０〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液から以下に示す方法によりイオン交換樹脂に非吸着の画分を分画した。即ち、前記大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をオルガノ（株）製の合成吸着剤アンバーライトXAD-16を充填したカラムに通して吸着分離処理に付すことにより、該カラムの合成吸着剤に対して非吸着性を示す素通り液からなる前記合成吸着剤に非吸着の画分を分取した。得られた前記合成吸着剤に非吸着の画分をBrix10に調整し、このBrix10に調整した前記合成吸着剤に非吸着の画分1Lを、500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライトIRA67（弱酸性陰イオン交換樹脂）を充填したカラムに供し、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られた前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物68.7ｇを得た。
【００３０】
〔実験１１〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液から以下に示す方法によりイオン交換樹脂に非吸着の画分を分画した。即ち、前記大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をオルガノ（株）製の合成吸着剤アンバーライトXAD-16を充填したカラムに通して吸着分離処理に付すことにより、該カラムの合成吸着剤に対して非吸着性を示す素通り液からなる前記合成吸着剤に非吸着の画分を分取した。得られた前記合成吸着剤に非吸着の画分をBrix10に調整し、このBrix10に調整した前記合成吸着剤に非吸着の画分1Lを、500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライトIR120B（強酸性陽イオン交換樹脂）を充填したカラムに供し、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られた前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物64.2ｇを得た。
【００３１】
〔実験１２〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液から以下に示す方法によりイオン交換樹脂に非吸着の画分を分画した。即ち、前記大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をオルガノ（株）製の合成吸着剤アンバーライトXAD-16を充填したカラムに通して吸着分離処理に付すことにより、該カラムの合成吸着剤に対して非吸着性を示す素通り液からなる前記合成吸着剤に非吸着の画分を分取した。得られた前記合成吸着剤に非吸着の画分をBrix10に調整し、このBrix10に調整した該合成吸着剤に非吸着の画分1Lを、500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライト200CT（強酸性陽イオン交換樹脂）を充填したカラムに供し、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られた前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物47.2ｇを得た。
【００３２】
〔実験１３〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液から以下に示す方法によりイオン交換樹脂に非吸着の画分を分画した。即ち、前記大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をオルガノ（株）製の合成吸着剤アンバーライトXAD-16を充填したカラムに通して吸着分離処理に付すことにより、該カラムの合成吸着剤に対して非吸着性を示す素通り液からなる前記合成吸着剤に非吸着の画分を分取した。得られた前記合成吸着剤に非吸着の画分をBrix10に調整し、このBrix10に調整した前記合成吸着剤に非吸着の画分1Lを、500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライトIRA402BL（最強塩基性陰イオン交換樹脂）を充填したカラムに供し、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られた前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物55.2ｇを得た。
【００３３】
〔実験１４〕
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液から以下に示す方法によりイオン交換樹脂に非吸着の画分を分画した。即ち、前記大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をオルガノ（株）製の合成吸着剤アンバーライトXAD-16を充填したカラムに通して吸着分離処理に付すことにより、該カラムの合成吸着剤に対して非吸着性を示す素通り液からなる前記合成吸着剤に非吸着の画分を分取した。得られた前記合成吸着剤に非吸着の画分をBrix10に調整し、このBrix10に調整した前記合成吸着剤に非吸着の画分1Lを、350ml容量のオルガノ（株）製アンバーライトIRC76（弱酸性陽イオン交換樹脂）と150ml容量のオルガノ（株）製アンバーライトIRA67（弱塩基性陰イオン交換樹脂）を混合することにより得た混床イオン交換樹脂を充填したカラムに供し、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られた前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物47.8ｇを得た。
【００３４】
[NK細胞活性の測定]
実験8乃至実験14で得た凍結乾燥物のそれぞれについて、後述の実施例において記載したのと同一の方法によりNK細胞活性（即ち、NK細胞に対する賦活作用）を測定した。
【００３５】
実験8乃至実験14で得たそれぞれの凍結乾燥物を添加して培養したNK細胞が示すNK細胞活性の測定結果から以下の事実が判明した。即ち、いずれのイオン交換樹脂に非吸着の画分も添加しない対照と比較して、実験8乃至実験14で得た凍結乾燥物のそれぞれを別々に添加して培養した全てのNK細胞のNK細胞活性が上昇し、K562細胞に対する細胞傷害活性が上昇した。この中で、前記実験12で得た凍結乾燥物を添加して培養したNK細胞が示すNK細胞活性が最も高い値を示した。一方、前記実験8で得た凍結乾燥物を添加して培養したNK細胞が示すNK細胞活性が最も低い値を示した。
【００３６】
[多糖類含量の測定]
（多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量の測定）
次に、上記実験1乃至実験14で得たそれぞれの凍結乾燥物について、多糖類含量、及び多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量を以下の方法により測定した。
即ち、前記実験1乃至実験14で得たそれぞれの凍結乾燥物0.05gにイオン交換水1mlを加えて溶解し、これに濃塩酸200μlを加えて、95℃、4時間の条件で加水分解を行い、0.80μmのメンブランフィルターでろ過してろ液を得、得られた濾液を高速液体クロマトグラフに注入して、前記実験1乃至実験14で得たそれぞれの凍結乾燥物に含まれる多糖類の含量、及び多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量を求めた。高速液体クロマトグラフ分析は、Waters製Waters600を用い、検出器に昭和電工株式会社製示差屈折計RI-71を使用し、カラムはBioRad社製Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm)を使用した。カラム温度は60℃とし、移動相には5mM硫酸を用い、流量は0.5ml/min、試料注入量は20μlとした。
【００３７】
実験1乃至実験14で得たそれぞれのイオン交換樹脂に非吸着の画分の多糖類含量の測定結果、並びに、該多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量の測定結果から以下の事実が判明した。即ち、前記実験5及び前記実験12で得た凍結乾燥物の多糖類含量並びに該多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量が、その他の前記実験において得られたそれぞれの凍結乾燥物よりも明らかに高い値を示した。一方、前記実験1及び前記実験8で得た凍結乾燥物の多糖類含量並びに該多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量が、それぞれ最も低い値を示した。
更に、前記実験1乃至実験14で得た凍結乾燥物のそれぞれを別々に添加して培養したNK細胞が示すNK細胞活性は、該凍結乾燥物に含まれる多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量に比例して高まっていることが明らかになった。そして、NK細胞活性と多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量との相関係数は0.918であることが判明した。
【００３８】
以上の結果から、前記実験1乃至実験14で得たそれぞれの凍結乾燥物が有するNK細胞賦活化作用は、該凍結乾燥物に含まれる、アラビノース及びキシロースを主たる構成要素とする多糖類に由来している可能性が極めて高いことが明らかになった。
【００３９】
[分子量分布の測定]
そこで、上記実験1乃至実験14で得たそれぞれの凍結乾燥物に含まれる、アラビノース及びキシロースを主たる構成要素とする多糖類の分子量を明らかにするために、それぞれの凍結乾燥物が有する分子量分布を測定した。
即ち、昭和電工株式会社製のShodex standard P-82（分子量1300乃至1660000）、及びマルトトリオース（分子量504）から成る分子量標準品をそれぞれ別々に0.1mol /L硝酸ナトリウム溶液に溶解して0.05W/V%濃度の標準液を得、該標準液を高速液体クロマトグラフに注入して検量線を作成した。次に、前記実験1乃至実験14で得たそれぞれの凍結乾燥物0.02gを用意し、これに0.1mol/L硝酸ナトリウム溶液10ml を加え、室温で一晩放置した後、孔径0.45μmのメンブランフィルターでろ過してろ液を得、該ろ液を高速液体クロマトグラフに注入して、システムインスツルメンツ株式会社製480データステーションGPCプログラムを用いて分子量分布を求めた。高速液体クロマトグラフ分析は、昭和電工株式会社製Shodex GPC SYSTEM-21 を用い、検出器に昭和電工株式会社製示差屈折計RI-71Sを使用し、カラムは東ソー株式会社製TSKgel GMPWXL(φ7.8mm×300mm)を2本連結して使用した。カラム温度は40℃とし、移動相には0.1mol/L硝酸ナトリウム溶液を用い、流量は1.0ml/min、試料注入量は100μlとした。
【００４０】
上記方法により実験1乃至実験14で得たそれぞれの凍結乾燥物についてそれぞれの分子量分布を測定した結果、該凍結乾燥物に含まれる、多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量が高いほど、3000乃至10万の範囲に分子量分布を有する画分の割合が高まることが判明した。
【００４１】
こうしたことから、本発明者らは、大麦焼酎蒸留残液に含まれる、アラビノース及びキシロースを主たる構成要素とするNK細胞活性化能を有した多糖類は、主として3000乃至10万の範囲の分子量分布を有しているのではないかと推測し、大麦焼酎蒸留残液を限外濾過膜を使用した限外濾過による濃縮処理に付して、大麦焼酎蒸留残液に含まれる分子量3000未満の成分を除去することにより、主として3000乃至10万の範囲の分子量分布を有する多糖類の含量が高まり、その結果として大麦焼酎蒸留残液に含まれるNK細胞活性賦活化に関与する成分の分画精製ができるのではないかと考えて以下の検討を行った。
【００４２】
[限外濾過による濃縮処理による分画精製]
即ち、第一に、上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液液体分1Lを得、得られた大麦焼酎蒸留残液液体分1LをA/G テクノロジー社製の限外濾過膜UFP-30-E-4MA（分画分子量3万）による濃縮処理に付して濃縮液を得、該濃縮液を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物17.1ｇを得た。該凍結乾燥物を粉砕し褐色の組成物を得た。
【００４３】
得られた凍結乾燥物について、上記「多糖類含量の測定」に記載の方法により、多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量を測定した。その結果、多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量は35.7重量%にまで高まっていることが判明した。また、得られた凍結乾燥物について、上記「分子量分布の測定」に記載の方法により分子量分布の測定を行ったところ、該凍結乾燥物の主たる構成分は、3000乃至10万の範囲に分子量分布を有する画分であることが判った。
そこで、後述の実施例に記載の方法により、該凍結乾燥物を添加して培養したNK細胞のNK細胞活性を測定した。その結果、該凍結乾燥物が有するNK細胞賦活化作用は、ポジティブコントロールのIL-2が有するNK細胞賦活化作用と比較すると多少劣りはするものの、NK細胞を優位に賦活化し、この賦活化したNK細胞は、腫瘍細胞等に対して実質的な細胞障害活性を引き起こすことができる程度の優れたものであった。
【００４４】
以上の実験結果から、大麦焼酎蒸留残液の液体分を限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付すことにより分取した濃縮液が有するNK細胞賦活化作用は、該濃縮液に含まれる、アラビノース及びキシロースを主たる構成要素とする多糖類に由来し、こうしたアラビノース及びキシロースを主たる構成要素とする多糖類を著量含有する組成物は、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分を限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付すことにより濃縮液として分取できることが判明した。そして、該濃縮液の凍結乾燥物は、成分分析の結果、多糖類44.0重量%、粗タンパク37.9重量%、有機酸4.3重量%、遊離糖類3.4重量%を含有し、該画分は多糖類を主たる成分として含有することが判った。
【００４５】
このようなことから、本発明者らは、大麦焼酎蒸留残液に含まれる、アラビノース及びキシロースを主たる構成要素とするNK細胞活性化能を有する多糖類の含量をさらに高める目的で、イオン交換処理と限外濾過による濃縮処理の両処理法を併用して、大麦焼酎蒸留残液に含まれるNK細胞活性賦活化に関与する成分の分画精製を検討した。
【００４６】
[イオン交換処理と限外濾過による濃縮処理の併用による分画精製]
即ち、上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」で得た大麦焼酎蒸留残液を、8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をBrix10に調整後、このBrix10に調整した液体分1Lを、500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライト200CT（強酸性陽イオン交換樹脂）を充填したカラムに通して、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られたイオン交換樹脂に非吸着の画分をA/G テクノロジー社製の限外濾過膜UFP-30-E-4MA（分画分子量3万）による濃縮処理に付して濃縮液を得、得られた濃縮液を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物13.8gを得た。該凍結乾燥物を粉砕し褐色の組成物を得た。
【００４７】
得られた凍結乾燥物について、上記「多糖類含量の測定」に記載の方法により、多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量を測定した。その結果、多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量は44.8重量%にまで高まっていることが判明した。また、得られた凍結乾燥物について、上記「分子量分布の測定」に記載の方法により分子量分布の測定を行ったところ、該凍結乾燥物の主たる構成分は、3000乃至10万の範囲に分子量分布を有する画分であることが判った。
そこで、後述の実施例に記載の方法により、該凍結乾燥物を添加して培養したNK細胞のNK細胞活性を測定した。その結果、該凍結乾燥物が有するNK細胞賦活化作用は、イオン交換樹脂による処理を行わなかった場合よりは、ポジティブコントロールのIL-2が有するNK細胞賦活化作用に近接していて、NK細胞を実質的に賦活化し、該賦活化したNK細胞が腫瘍細胞等に対して実質的な細胞障害活性を引き起こすことができる程度の優れたものであった。
【００４８】
以上の実験結果から、大麦焼酎蒸留残液の液体分をイオン交換処理に付し、次いで限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付すことにより分取した濃縮液が有するNK細胞賦活化作用は、該濃縮液に含まれる、アラビノース及びキシロースを主たる構成要素とする多糖類に由来し、こうしたアラビノース及びキシロースを主たる構成要素とする多糖類を著量含有する組成物は、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分をイオン交換樹脂を使用するイオン交換処理に付してイオン交換樹脂に非吸着の画分を得、該イオン交換樹脂に非吸着の画分を限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付すことにより濃縮液として分取できることが判明した。そして、該濃縮液の凍結乾燥物は、成分分析の結果、多糖類60.0重量%、粗タンパク13.9重量%、有機酸4.0重量%、遊離糖類6.4重量%を含有し、該画分は多糖類を主たる成分として含有することが判った。
【００４９】
次に、本発明者らは、大麦焼酎蒸留残液に含まれる、アラビノース及びキシロースを主たる構成要素とするNK細胞活性化能を有する多糖類の含量を更に高める目的で、合成吸着剤を使用する吸着分離処理と限外濾過による濃縮処理の両処理法を併用して、大麦焼酎蒸留残液に含まれるNK細胞活性賦活化に関与する成分の分画精製を検討した。
【００５０】
[吸着分離処理と限外濾過による濃縮処理の併用による分画精製]
即ち、上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をBrix10に調整後、このBrix10に調整した液体分1Lをオルガノ（株）製の合成吸着剤アンバーライトXAD-16を充填したカラムに通して吸着分離処理に付すことにより、該カラムの合成吸着剤に対して非吸着性を示す素通り液からなる前記合成吸着剤に非吸着の画分を得、得られた合成吸着剤に非吸着の画分をA/G テクノロジー社製の限外濾過膜UFP-30-E-4MA（分画分子量3万）による濃縮処理に付して濃縮液を得、該濃縮液を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物18.6gを得た。該凍結乾燥物を粉砕し淡褐色の組成物を得た。
【００５１】
得られた濃縮液の凍結乾燥物について、上記「多糖類含量の測定」に記載の方法により、多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量を測定した。その結果、多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量は37.8重量%にまで高まっていることが判明した。また、得られた凍結乾燥物について、上記「分子量分布の測定」に記載の方法により分子量分布の測定を行ったところ、該凍結乾燥物の主たる構成分は, 3000乃至10万の範囲に分子量分布を有する画分であることが判った。
そこで、後述の実施例に記載の方法により、該凍結乾燥物を添加して培養したNK細胞のNK細胞活性を測定した。その結果、該凍結乾燥物が有するNK細胞賦活化作用は、イオン交換樹脂による処理及び合成吸着剤による処理のいずれも行わなかった場合よりは、ポジティブコントロールのIL-2が有するNK細胞賦活化作用に近接していて、NK細胞を実質的に賦活化し、該賦活化したNK細胞が腫瘍細胞等に対して実質的な細胞障害活性を引き起こすことができる程度の優れたものであった。
【００５２】
以上の実験結果から、大麦焼酎蒸留残液の液体分を合成吸着剤を使用した吸着処理に付し、次いで限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付すことにより分取した濃縮液が有するNK細胞賦活化作用は、該濃縮液に含まれる、アラビノース及びキシロースを主たる構成要素とする多糖類に由来し、こうしたアラビノース及びキシロースを主たる構成要素とする多糖類を著量含有する組成物は、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分を合成吸着剤を使用する吸着分離処理に付して合成吸着剤に非吸着の画分を得、該合成吸着剤に非吸着の画分を限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付すことにより濃縮液として分取できることが判明した。そして、該濃縮液の凍結乾燥物は、成分分析の結果、多糖類45.5重量%、粗タンパク33.0重量%、有機酸4.8重量%、遊離糖類4.1重量%を含有し、該画分は多糖類を主たる成分として含有することが判った。
【００５３】
更に、本発明者らは、大麦焼酎蒸留残液に含まれる、アラビノース及びキシロースを主たる構成要素とするNK細胞活性化能を有する多糖類の含量が、上述したように、イオン交換樹脂によるイオン交換処理と限外濾過による濃縮処理の併用による分画精製、或は、合成吸着剤による吸着分離処理と限外濾過による濃縮処理の併用による分画精製を採用することによって高まることに鑑み、前記多糖類の含量を更に高める目的で、合成吸着剤による吸着分離処理、イオン交換樹脂によるイオン交換処理及び限外濾過による濃縮処理の三者の処理を採用して、大麦焼酎蒸留残液に含まれるNK細胞活性賦活化に関与する成分の分画精製を検討した。
【００５４】
[吸着分離処理、イオン交換処理及び限外濾過による濃縮処理を併用した分画精製]
即ち、上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得られた大麦焼酎蒸留残液を、8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をオルガノ（株）製の合成吸着剤アンバーライトXAD-16を充填したカラムに通して吸着分離処理に付すことにより、該カラムの合成吸着剤に対して非吸着性を示す素通り液からなる前記合成吸着剤に非吸着の画分を分取した。得られた前記合成吸着剤に非吸着の画分をBrix10に調整した後、このBrix10に調整した前記合成吸着剤に非吸着の画分1Lを、500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライト200CT（強酸性陽イオン交換樹脂）を充填したカラムに通し、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られた前記イオン交換樹脂に非吸着の画分をA/G テクノロジー社製の限外濾過膜UFP-30-E-4MA（分画分子量3万）による濃縮処理に付して濃縮液を得、得られた濃縮液を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物10.4ｇを得た。
【００５５】
得られた凍結乾燥物について、上記「多糖類含量の測定」に記載の方法により、多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量を測定した。その結果、多糖類由来のアラビノース及びキシロースの合計含量は47.5重量%にまで高まっていることが判明した。また、得られた凍結乾燥物について、上記「分子量分布の測定」に記載の方法により分子量分布の測定を行ったところ、該凍結乾燥物の主たる構成分は、3000乃至10万の範囲に分子量分布を有する画分であることが判った。
そこで、後述の実施例に記載の方法により、該凍結乾燥物を添加して培養したNK細胞のNK細胞活性を測定した。その結果、該凍結乾燥物が有するNK細胞賦活化作用は、イオン交換樹脂による処理又は合成吸着剤による処理のいずれかを行った場合よりは、ポジティブコントロールのIL-2が有するNK細胞賦活化作用により近接し、NK細胞を実質的に賦活化し、該賦活化したNK細胞が腫瘍細胞等に対して実質的な細胞障害活性を引き起こすことができる程度の優れたものであった。
【００５６】
以上の実験結果から、大麦焼酎蒸留残液の液体分が有するNK細胞賦活化作用は、該液体分に含まれる、アラビノース及びキシロースを主たる構成要素とする多糖類に由来し、こうしたアラビノース及びキシロースを主たる構成要素とする多糖類を著量含有する組成物は、大麦を原料とする焼酎製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分を合成吸着剤を使用する吸着分離処理に付して合成吸着剤に非吸着の画分を得、該合成吸着剤に非吸着の画分をイオン交換樹脂を使用するイオン交換処理に付してイオン交換樹脂に非吸着の画分を得、該イオン交換樹脂に非吸着の画分を限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付すことにより濃縮液として分取できることが判明した。そして、該濃縮液の凍結乾燥物は、成分分析の結果、多糖類55.3重量%、粗タンパク10.9重量%、有機酸3.3重量%、遊離糖類7.4重量%を含有し、該画分は多糖類を主たる成分として含有することが判った。
【００５７】
ところで、特許文献１に記載のヘミセルロースは、主たる構成要素がキシロース及びアラビノースである点において、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物に類似するところはあるものの、前記ヘミセルロースは平均分子量が55万又は60万であることから本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物とは明らかに異なる別異のものである。
特許文献２に記載の免疫力増強物質は、主たる構成要素がキシロース及びアラビノースである点において、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物に類似するところはあるものの、前記免疫力増強物質は平均分子量が60万又は65万であることから本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物とは明らかに異なる別異のものである。
特許文献３には、米を原料とし発酵のみを介して製造される清酒製造において副生する酒粕の水抽出液がNK細胞活性化作用を有することが記載されている。しかしながら、特許文献３には、前記水抽出液の成分組成については全く記載されておらず、また前記NK細胞活性化作用に関与する成分についても具体的記載はない。
特許文献4及び特許文献5に記載の脂肪肝抑制作用を有する組成物は、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物と同様に大麦焼酎蒸留残液から分取されるものである。しかし特許文献４及び特許文献５に記載の前記組成物が有する主たる成分は分子量3000以下のものであり、当該組成物に含まれるヘミセルロースはキシロースを主たる構成要素とすることから、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物とは明確に区別される別異のものである。
【００５８】
特許文献６に記載の抗腫瘍組成物は、先に述べたように、トウモロコシ外皮から澱粉質及び蛋白質を除去した残部をアルカリ抽出することにより得られるヘミセルロースをキシラナーゼで処理することにより得られる部分分解物を有効成分とするものである。また、非特許文献1には、特許文献６に記載のトウモロコシ外皮から得られたヘミセルロースの部分分解物（商品名セルエース）が、先に述べたように、キシロース、アラビノース、ウロン酸、ガラクトース、及びグルコースを含有するものであることが記載されている。よって、特許文献６と非特許文献１は、同じ「トウモロコシ外皮から得られたヘミセルロースの部分分解物（商品名セルエース）」に係るものである。一方、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物は、前記トウモロコシ外皮とは全く異なる大麦焼酎蒸留残液から得られるものである。即ち、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物は、特許文献６に記載のヘミセルロースの部分分解物の製造方法とは全く異なる製造方法で得られるものである。そして、本発明の製造方法を介して得られるNK細胞を賦活化する作用を有する組成物は、アラビノース、キシロース及びグルコースのみを含有し、特許文献6に記載のヘミセルロースの部分分解物が有するウロン酸を実質的に含有していない。よって、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物は、特許文献6に記載の「トウモロコシ外皮から得られたヘミセルロースの部分分解物（商品名セルエース）」を有効成分とする抗腫瘍組成物から明確に区別される別異のものであることは明白である。
【００５９】
尚、特許文献６には、ヘミセルロースの部分分解物の平均分子量が2万乃至20万であることが記載されているが、当該平均分子量を決定づけるに至った実験データは全く記載されていない。そこで、本発明者らは、特許文献６において、ヘミセルロースの部分分解物が商品名「セルエース」（日本食品化工株式会社製）として市販されていることが記載されていることから、「セルエース」を入手し、上記「分子量分布の測定」に記載の方法により該セルエースの分子量分布を測定した。その結果、該セルエースの分子量分布は、100万以上が1%、30万乃至100万が9%、10万乃至30万が30%、3万乃至10万が30%、1万乃至3万が11%、3000乃至1万が4%、1000乃至3000が2%、1000以下が13%であり、そのクロマトグラムにおいて認められる最も高いピークは分子量10万乃至30万の範囲に存在し、その重量平均分子量(Mw)は15万であることが判明した。
一方、上述したように本発明の製造方法により得られるNK細胞を賦活化する作用を有する組成物の主たる構成分は、3000乃至10万の範囲に分子量分布を有する画分である。この「3000乃至10万の範囲に分子量分布を有する画分」は、前記セルエースの分子量分布の画分とは、明らかに別異のものである。
従って、本発明の製造方法を介して得られるNK細胞を賦活化する作用を有する組成物が有する分子量分布は、「セルエース」、即ち、トウモロコシ外皮から得られたヘミセルロースの部分分解物からなる組成物が有する分子量分布とは全く異なる。また上述したように、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物は、トウモロコシ外皮から得られたヘミセルロースの部分分解物が含有するウロン酸を実質的に含有していない。この点からしても、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物が、特許文献６に記載の「ヘミセルロースの部分分解物」からなる抗腫瘍組成物とは明らかに区別される別異のものであることは明白である。
【００６０】
特許文献7には、米糠の水抽出物であって、分子量3万乃至4万程度の画分からなる抽出物を含有してなる免疫賦活用組成物が、マイトジェン活性及び優れたNK細胞の活性化作用を有することが記載されている。しかしながら、特許文献7には、前記免疫賦活用組成物の成分組成については全く記載されておらず、またその免疫賦活作用に関与する成分についても具体的に記載するところはない。
以上述べたことから明らかなように、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物は、特許文献１乃至７及び非特許文献１に記載された組成物とは明確に区別される明らかに別異のものである。
本発明は以上の実験を介して判明した事実に基づいて完成に至ったものである。
【発明の効果】
【００６１】
本発明によれば、大麦焼酎蒸留残液（大麦を原料とする焼酎製造において副成する大麦焼酎蒸留残液）を固液分離して得られる液体分を出発原料にして、ポジティブコントロールのIL-2が有するNK細胞賦活化作用程ではないにしろ、それに近似若しくは近接して、NK細胞を実質的に賦活化する作用を有する組成物を製造することができ、該組成物は、それにより賦活化したNK細胞が、腫瘍細胞等に対して実質的な細胞障害活性を引き起こす、優れたNK細胞賦活化作用を有する。本発明により製造されるこのNK細胞を賦活化する作用を有する組成物は、医薬用として白血病をはじめとするガンの治療に極めて好適に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
以下に、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物の製造方法について、より詳しく説明する。
本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物の製造方法は、少なくとも、大麦を使用する焼酎の製造において副成する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る工程Ａ及び該液体分を限外濾過膜を使用する限外濾過処理に付して濃縮液を得る工程Ｂ１からなる第１の態様を包含する。
また、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物の製造方法は、大麦を使用する焼酎の製造において副成する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る工程Ａ、前記工程Ａにおいて得られる液体分をイオン交換樹脂を使用するイオン交換処理に付すことにより前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を得る工程Ｃ１、及び前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を限外濾過膜を使用する限外濾過処理に付して濃縮液を得る工程Ｂ２からなる第２の態様を包含する。
更に、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物の製造方法は、大麦を使用する焼酎の製造において副成する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る工程Ａ、該液体分を合成吸着剤を使用する吸着分離処理に付すことにより合成吸着剤に非吸着の画分を得る工程Ｄ、及び前記合成吸着剤に非吸着の画分を限外濾過膜を使用する前記限外濾過処理に付して濃縮液を得る工程Ｂ３からなる第３の態様を包含する。
更に、本発明のNK細胞を賦活化する作用を有する組成物の製造方法は、大麦を使用する焼酎の製造において副成する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る工程Ａ、該液体分を合成吸着剤を使用する吸着分離処理に付すことにより合成吸着剤に非吸着の画分を得る工程Ｄ、前記合成吸着剤に非吸着の画分をイオン交換樹脂を使用するイオン交換処理に付すことによりイオン交換樹脂に非吸着の画分を得る工程Ｃ２、及び前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を限外濾過膜を使用する限外濾過処理に付して濃縮液を得る工程Ｂ２からなる第４の態様を包含する。
以上述べた本発明の製造方法を実施するに際して使用する、大麦を原料とする焼酎の製造において副成する大麦焼酎蒸留残液、及び各工程について詳述する。
【００６３】
本発明において使用する大麦焼酎蒸留残液は、代表的には、大麦又は精白大麦を原料として大麦麹及び蒸麦を製造し、得られた大麦麹及び蒸麦中に含まれるでんぷんを該大麦麹の麹により糖化し、それらを酵母によるアルコール発酵に付して焼酎熟成もろみを得、得られた焼酎熟成もろみを減圧蒸留または常圧蒸留等の単式蒸留装置を用いて蒸留する際に蒸留残渣として副生するもの、即ち、大麦焼酎の蒸留残液を意味する。
【００６４】
本発明において、大麦焼酎蒸留残液を得るに際して、大麦焼酎の製造に用いる大麦麹は、通常の大麦焼酎製造において行われている製麹条件で製造すればよく、用いる麹菌株としては、一般的に大麦焼酎製造で使用する白麹菌（Aspergillus kawachii）が好ましい。或いは泡盛製造で使用する黒麹菌（Aspergillus awamori）及び清酒製造等で使用する黄麹(Aspergillus oryzae）などのAspergillus属の菌株を用いることもできる。また大麦焼酎の製造に用いる酵母は、一般的に焼酎製造の際に使用する各種の焼酎醸造用酵母を使用することができる。
【００６５】
本発明において、大麦焼酎の製造における蒸留工程で得られた大麦焼酎蒸留残液を固液分離して液体分を得る工程Ａは、大麦焼酎蒸留残液から原料大麦、あるいは大麦麹由来の水不溶性の発酵残渣等のSS分を除去することを目的として行うものである。この工程Ａにおける当該固液分離は、スクリュープレス方式やローラープレス方式の固液分離方法によるか、或いはろ過圧搾式の固液分離機を用いて予備分離を行い、次いで遠心分離機、ケイソウ土ろ過装置、セラミックろ過装置、或いはろ過圧搾機等を用いて本発明により実施できる本固液分離処理を行う。
【００６６】
前記工程Ａで得られる液体分を限外濾過膜を使用する限外濾過処理に付して濃縮液を得る工程Ｂ１、前記工程Ｃ１及び前記工程Ｃ２で得られるイオン交換樹脂に非吸着の画分を限外濾過膜を使用する限外濾過による濃縮処理に付す工程Ｂ２、並びに、前記工程Ｄで得られる合成吸着剤に非吸着の画分を限外濾過膜を使用する限外濾過処理に付して濃縮液を得る工程Ｂ３においては、NK細胞賦活化作用に関与する成分である、アラビノース及びキシロースを主たる構成要素とする分子量3000以上の多糖類を含有する画分を限外濾過膜を用いて分離濃縮することを目的として行うものである。工程Ｂ１乃至Ｂ３で使用する限外濾過膜としては、いかなる膜材質及び膜モジュール型式のものであっても使用することができ、分画分子量は、好ましくは3000以上、特に好ましくは1万乃至5万のものを使用することができる。更に、限外ろ過の濃縮倍率を、好ましくは2倍以上、特に好ましくは5倍以上にすることによって、アラビノース及びキシロースからなる多糖類を著量含有する本発明の製造方法により得られるNK細胞を賦活化する作用を有する組成物を得ることができる。
【００６７】
工程Ａにおいて得られる液体分をイオン交換樹脂を使用するイオン交換処理に付してイオン交換樹脂に非吸着の画分を得る工程Ｃ１、及び工程Ｄにおいて得られる合成吸着剤に非吸着の画分をイオン交換樹脂を使用するイオン交換処理に付して前記イオン交換樹脂に非吸着の画分を得る工程Ｃ２においては、前記液体分及び前記合成吸着剤に非吸着の画分に含まれる上述した多糖類以外の成分、即ち、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、有機酸、或いは大麦由来のポリフェノール等を、イオン交換樹脂を用いて除去することを目的として行うものである。工程Ｃ１及び工程Ｃ２で使用するイオン交換樹脂としては、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、或いは両者を混合した混床イオン交換樹脂を使用することができる。陽イオン交換樹脂の場合、強酸性陽イオン交換樹脂及び弱酸性陽イオン交換樹脂のいずれであっても使用することができ、陰イオン交換樹脂の場合、強塩基性陰イオン交換樹脂及び弱塩基性陰イオン交換樹脂のいずれであっても使用することができる。また混床イオン交換樹脂の場合には、上述した陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂を自由に組み合わせて所定の割合で混合して使用することができる。こうしたイオン交換樹脂の好適な具体例としては、オルガノ（株）製のアンバーライト200CT及びアンバーライトIR120B等の強酸性陽イオン交換樹脂、アンバーライトIRC76等の弱酸性陽イオン交換樹脂、アンバーライトIRA402BL等の最強塩基性陰イオン交換樹脂、アンバーライトIRA67等の弱塩基性陰イオン交換樹脂、或いは、前記弱酸性陽イオン交換樹脂と前記弱塩基性陰イオン交換樹脂の両者を所定の割合で混合することにより得られる混床型イオン交換樹脂等を用いることができる。これらのうち、上記液体分又は上記合成吸着剤に非吸着の画分に含まれているアミノ酸やペプチド等を除去する観点においては、前記弱酸性陽イオン交換樹脂アンバーライトIRC76と前記弱塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライトIRA67の両者を所定の割合で混合することにより得られる混床型イオン交換樹脂、或いは、強酸性陽イオン交換樹脂アンバーライト200CTを使用することが特に好ましい。
【００６８】
工程Ａで得られる液体分を合成吸着剤を使用する吸着分離処理に付すことにより前記合成吸着剤に非吸着の画分を得る工程Ｄは、大麦焼酎蒸留残液の液体分に含まれているポリフェノール等の成分を除去することを目的として行うものである。当該工程Ｄで使用する合成吸着剤としては、芳香族系、芳香族系修飾型、或いはメタクリル系の合成吸着剤を用いることができる。工程Ｄで使用する合成吸着剤の好適な具体例としては、オルガノ（株）製のアンバーライトXAD-4、アンバーライトXAD-16、アンバーライトXAD-1180及びアンバーライトXAD-2000、三菱化学（株）製のセパビーズSP850及びダイヤイオンHP20等の芳香族系（又はスチレン系とも言う）合成吸着剤、オルガノ（株）製のアンバーライトXAD-7及び三菱化学（株）製のダイヤイオンHP2MG等のメタクリル系（又はアクリル系とも言う）合成吸着剤を挙げることができる。これらの他、場合によっては三菱化学（株）製のセパピーズSP207等の芳香族系修飾型合成吸着剤を用いることができる。
【００６９】
本発明の製造方法により、このようにして得られるNK細胞を賦活化する作用を有する組成物は、後述の実施例における試験例の結果から明らかなように、そのまま経口的に投与する場合は勿論のこと、該組成物を生理的食塩水等の適当な担体に分散せしめ、静脈注射により患者に投与することによっても所望のNK細胞賦活効果を得ることができる。また、本発明は、前記NK細胞を賦活化する作用を有する組成物で賦活化したNK細胞を含有する組成物（以下、賦活化したNK細胞含有組成物と呼称する）を提供する。該賦活化したNK細胞含有組成物は、白血病等の罹患者から血液を採血し、得られた血液をNK細胞等の免疫細胞からなるリンパ球と血清に分離し、該リンパ球に前記NK細胞を賦活化する作用を有する組成物を混合して所定期間の培養に付すことにより得られるものであって、このようにして得られる賦活化したNK細胞含有組成物は、洗浄後、点滴用生理食塩水に浮遊させ、点滴により静脈から投与することができる。この賦活化したNK細胞含有組成物はK562細胞を壊死する作用を有する。従って、該賦活化したNK細胞含有組成物は、骨髄性白血病の治療薬剤として使用することができる。
【００７０】
〔実施例〕
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００７１】
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液液体分1Lを得、得られた大麦焼酎蒸留残液液体分1LをA/G テクノロジー社製の限外濾過膜UFP-30-E-4MA（分画分子量3万）による濃縮処理に付して濃縮液を得、該濃縮液を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物17.1ｇを得た。該凍結乾燥物を粉砕し褐色の組成物を得た。
【実施例２】
【００７２】
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をBrix10に調整後、このBrix10に調整した液体分1Lを500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライト200CT（強酸性陽イオン交換樹脂）を充填したカラムに通して、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られたイオン交換樹脂に非吸着の画分をA/G テクノロジー社製の限外濾過膜UFP-30-E-4MA（分画分子量3万）による濃縮処理に付して濃縮液を得、該濃縮液を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物13.8gを得た。該凍結乾燥物を粉砕し褐色の組成物を得た。
【実施例３】
【００７３】
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をBrix10に調整後、このBrix10に調整した液体分1Lをオルガノ（株）製の合成吸着剤アンバーライトXAD-16を充填したカラムに通して吸着分離処理に付すことにより、該カラムの合成吸着剤に対して非吸着性を示す素通り液からなる合成吸着剤に非吸着の画分を得、得られた前記合成吸着剤に非吸着の画分をA/G テクノロジー社製の限外濾過膜UFP-30-E-4MA（分画分子量3万）による濃縮処理に付して濃縮液を得、該濃縮液を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物18.6gを得た。該凍結乾燥物を粉砕し淡褐色の組成物を得た。
【実施例４】
【００７４】
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液の液体分を得、得られた液体分をオルガノ（株）製の合成吸着剤アンバーライトXAD-16を充填したカラムに通して吸着分離処理に付すことにより、該カラムの合成吸着剤に対して非吸着性を示す素通り液からなる合成吸着剤に非吸着の画分を分取した。得られた合成吸着剤に非吸着の画分をBrix10に調整し、このBrix10に調整した該合成吸着剤に非吸着の画分1Lを、500ml容量のオルガノ（株）製アンバーライト200CT（強酸性陽イオン交換樹脂）を充填したカラムに供し、イオン交換樹脂に非吸着の画分を得、得られたイオン交換樹脂に非吸着の画分をA/G テクノロジー社製の限外濾過膜UFP-30-E-4MA（分画分子量3万）による濃縮処理に付して濃縮液を得、該濃縮液を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物10.4gを得た。該凍結乾燥物を粉砕し淡褐色の組成物を得た。
【比較例１】
【００７５】
上記「大麦焼酎及び大麦焼酎蒸留残液の製造」において得た大麦焼酎蒸留残液を8000rpm、10minの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸留残液液体分1Lを得、得られた大麦焼酎蒸留残液液体分を凍結乾燥に付すことにより凍結乾燥物76.5ｇを得た。該凍結乾燥物を粉砕し褐色の組成物を得た。
【試験例１】
【００７６】
前記実施例1乃至実施例4及び比較例1で得た組成物がNK細胞に対する賦活化作用を有するものであるか否かを明らかにするために以下の試験例1を行った。
即ち、ヒト健常人からヘパリン加末梢血を採取して生理食塩液を用いて2倍に希釈し、希釈した血液をリンホセパールＩ（（株）免疫生物研究所製）に重層し、室温で、1500rpm、30分間の遠心分離に付した後、ピペットを用いて血漿を除去することにより末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cells:PBMC )画分を得た。次に、得られたPBMC画分をStemSep(ベリタス社製)に付すことによりNK細胞画分を得、得られたNK細胞画分を5%CO2雰囲気下、37℃で培養し、NK細胞培養液を得た。得られたNK細胞培養液を1000rpm、5分間の遠心分離に付しNK細胞を捕集した。それぞれの捕集したNK細胞の細胞数を10%FCS添加RPMI-1640培地を用いて1×106個/mlに調整してNK細胞懸濁液を得た。一方、継代培養に付すことにより得たK562細胞（慢性骨髄性白血病細胞）の培養液を遠心分離に付してK562細胞を分取し、PBS(Phosphate-buffered saline)で2回洗浄し、次いで10%FCS添加RPMI-1640培地で更に洗浄してK562細胞からなる標的細胞を得た。
次に、5つの前記NK細胞懸濁液100μlのそれぞれに対して、前記実施例1乃至実施例4及び比較例1で得たそれぞれの凍結乾燥物の濃度を前記10%FCS添加RPMI-1640培地を用いて1mg/mlに調製した溶液をそれぞれ11μlずつ添加し、5%CO2雰囲気下、37℃で72時間培養してNK細胞培養液を得た。また、コントロールとして別のNK細胞懸濁液100μlに対して、前記10%FCS添加RPMI-1640培地11μlを添加したものについても同様の処理に付した。更に、ポジティブコントロールとして更に別のNK細胞懸濁液100μlに対して、IL-2の濃度を前記10%FCS添加RPMI-1640培地を用いて1mg/mlに調製した溶液をそれぞれ11μl添加したものについても同様の処理に付した。
このようにして得たそれぞれのNK細胞培養液を、1000rpm、5分間の遠心分離に付し細胞を捕集した。それぞれの捕集したＮＫ細胞の細胞数を10%FCS添加RPMI-1640培地を用いて1×106個/mlに調整して効果細胞を得た。
次に、至適濃度に調整した前記標的細胞を96穴V底プレートに100μlづつ分注し、これに前記効果細胞を100μlづつ別々に混合した。前記効果細胞と前記標的細胞を混合したプレートは、800rpm、2分間の遠心分離に付し、5%CO2雰囲気下、37℃で4時間培養後、各培養液100μlをそれぞれ採取し、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assayキット（プロメガ社製）を用いてATP量を測定し、下記の計算式によりK562細胞の生存率を調べ、各サンプルのNK細胞活性化能の指標とした。
K562細胞生存率(%)＝{（[各サンプルで処理したNK細胞＋K562細胞]の発光量)−（NK細胞のみの発光量）}／(PBSで処理したK562細胞の発光量)×100
【評価１】
【００７７】
K562細胞に対するNK細胞活性の測定結果を表1に示す。表１に示す結果から以下の事実が判明した。即ち、比較例1で得た組成物の所定量を添加して培養に付すことにより得たNK細胞は、該所定量のIL-2を添加して培養に付すことにより得たNK細胞よりも明らかに低いNK細胞活性を示した。一方、実施例１乃至実施例４で得た組成物の所定量を添加して培養に付すことにより得たNK細胞は、ポジティブコントロールのIL-2が有するNK細胞賦活化作用と同等とは云えないまでも、NK細胞を実質的に賦活化し、該賦活化したNK細胞が腫瘍細胞等に対して実質的な細胞障害活性を引き起こすことができる程度の優れたNK細胞活性を示すことが判明した。
【試験例２】
【００７８】
ところで、悪性腫瘍等の罹患者においては、NK細胞の活性が低下しているため、該NK細胞によってもたらされる腫瘍細胞に対する細胞傷害活性も著しく低い。そこで、上記イオン交換樹脂に非吸着の画分によるNK細胞賦活化と、それによってもたらされる腫瘍細胞に対する細胞傷害活性をより実際的に評価する目的で以下の試験を行った。
【００７９】
即ち、ヒト健常人からヘパリン加末梢血を採取して生理食塩液を用いて2倍に希釈し、希釈した血液をリンホセパールＩ（（株）免疫生物研究所製）に重層し、室温で、1500rpm、30分間の遠心分離に付した後、ピペットを用いて血漿を除去することにより末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cells:PBMC )画分を得た。次に、得られたPBMC画分をStemSep(ベリタス社製)に付すことによりNK細胞画分を得、得られたNK細胞画分を5%CO2雰囲気下、37℃で培養し、NK細胞培養液を得た。得られたNK細胞培養液を1000rpm、5分間の遠心分離に付しNK細胞を捕集した。それぞれの捕集したNK細胞の細胞数を10%FCS添加RPMI-1640培地を用いて1×106個/mlに調整してNK細胞懸濁液を得た。一方、継代培養に付すことにより得たK562細胞（慢性骨髄性白血病細胞）の培養液を遠心分離に付してK562細胞を分取し、PBS(Phosphate-buffered saline)で2回洗浄し、次いで10%FCS添加RPMI-1640培地で更に洗浄してK562細胞からなる標的細胞を得た。
次に、前記NK細胞懸濁液を96穴V底プレートに100μlづつ分注し、これに至適濃度に調整した前記標的細胞を100μlづつ添加し、次いで、実施例１乃至実施例４及び比較例１で得たそれぞれの凍結乾燥物の濃度を前記10%FCS添加RPMI-1640培地を用いて1mg/mlに調製した溶液をそれぞれ22μlずつ添加し、5%CO2雰囲気下、37℃で4時間培養した。これとは別に、コントロールとして、別のNK細胞懸濁液100μlに対して、至適濃度に調整した前記標的細胞100μlを添加し、次いで、前記10%FCS添加RPMI-1640培地22μlを添加したものについても同様の処理に付した。更に、ポジティブコントロールとして、更に別のNK細胞懸濁液100μlに対して、至適濃度に調整した前記標的細胞100μlを添加し、次いで、前記10%FCS添加RPMI-1640培地を用いて1mg/mlの濃度に調製したIL-2水溶液を22μl添加したものについても同様の処理に付した。次に各培養液100μlをそれぞれ採取し、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assayキット（プロメガ社製）を用いてATP量を測定し、下記の計算式によりK562細胞の生存率を調べ、該K562細胞生存率を細胞傷害活性の指標とした。
K562細胞生存率(%)＝{（[各サンプルで処理したNK細胞＋K562細胞]の発光量)−（NK細胞のみの発光量）}／(PBSで処理したK562細胞の発光量)×100
【評価２】
【００８０】
NK細胞とK562細胞の混合物に実施例１乃至実施例４及び比較例１で得た凍結乾燥物を添加した場合の細胞傷害活性の測定結果を表2に示す。表2に示す結果から以下の事実が判明した。即ち、NK細胞とK562細胞の混合物に比較例1で得た凍結乾燥物を前記所定量にて添加した場合には、該混合物に前記所定量のIL-2を添加した場合よりも明らかに低い細胞傷害活性を示した。一方、NK細胞とK562細胞の混合物に実施例１乃至実施例４で得た凍結乾燥物の前記所定量を添加した場合には、該混合物に前記所定量のIL-2を添加した場合の細胞傷害活性と同等とは云えないまでも、NK細胞を実質的に賦活化し、該賦活化したNK細胞は腫瘍細胞に作用して実質的な細胞傷害活性を引き起こすことが判明した。また、表２に示す結果から明らかなように、実施例１乃至実施例４で得た凍結乾燥物は直接的に腫瘍細胞に作用して実質的な細胞傷害活性を引き起こすことが判明した。
即ち、実施例１乃至実施例４の凍結乾燥物を、NK細胞とK562細胞の混合物に添加した場合には、NK細胞を著しく賦活化するだけでなく、該K562細胞の増殖をも抑制することから、優れた白血病治療効果を奏することが明らかになった。
【試験例３】
【００８１】
実施例1乃至実施例4で得た凍結乾燥物が有するin vivoにおけるNK細胞賦活化作用を明らかにするために以下の試験を行った。即ち、C57BL/6マウス（♂、3週齢、1群10匹）に、本発明の製造方法により得られるNK細胞を賦活化する作用を有する組成物を含まない食餌（対照群）と、上記実施例1乃至実施例4で得た凍結乾燥物をそれぞれ別々に1.0%含む食餌（試験群）を摂取させ、5週間後に各群のマウスから脾臓を摘出し、細胞数を計測すると共にNK細胞活性を以下のように測定した。
即ち、脾細胞をC-RPMI培地に浮遊させ、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗マウスIL-2β受容体抗体とフィコエリトリン（PE）結合抗マウスCD3抗体にて細胞標識し、フローサイトメーターにてNK細胞分画を測定し、CD3-IL-2β+分画をNK細胞と同定した。
マウスリンパ腫細胞株YAC-1を51CrO4を用いて標識して標的細胞とし、脾細胞：標的細胞＝100:1の割合で6時間混合浮遊させ、その上澄み液中の51Crの放射活性をγ-シンチレーションカウンターで測定し、NK細胞活性(%)を以下の式から算出した。
NK細胞活性（%）=［（実験遊離-自然遊離）/(最大遊離-自然遊離)］×100
【評価３】
【００８２】
脾細胞数、NK細胞分画および脾細胞由来NK細胞活性の測定結果を表３に示す。表３に示す結果から以下の事実が判明した。即ち、実施例１乃至実施例４で得た凍結乾燥物をそれぞれ別々に1.0%含む食餌を摂取したそれぞれの試験群の脾細胞由来NK細胞活性は、対照群と比較して、それぞれ有意に増加していることが判明した。一方、脾細胞数、及びNK細胞分画に関しては、各試験群及び対照群の間で相互に有意差は認めなかった。これらの結果から、本発明の製造方法により得られるNK細胞を賦活化する作用を有する組成物は、in vivoにおいてもNK細胞を賦活化することが明白となった。
【００８３】
以上の試験例１乃至試験例３の結果から明らかなように、大麦焼酎蒸留残液を本発明の製造方法に付すことによって得られる、アラビノース及びキシロースからなる多糖類を主たる成分とするNK細胞を賦活化する作用を有する組成物は、極めて優れたNK細胞賦活化作用を有することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の製造方法により得られるNK細胞を賦活化する作用を有する組成物は、NK細胞を実質的に賦活化し、該賦活化したNK細胞は、腫瘍細胞等に対して実質的な細胞障害活性を引き起こす優れたNK細胞賦活化作用を有するので、白血病をはじめとするガンの治療に極めて好適である。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
【表２】
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【００８７】
【表３】
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