(57)【要約】【課題】            試料溶液中に存在する被検ポリヌクレオチド中の、標的塩基配列の有無、標的塩基配列との違い等の判定を、簡便な操作により迅速かつ信頼性よく行う分析方法を提供すること。【解決手段】        被検ポリヌクレオチド中の、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド(A)の有無、標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド(B)の有無、およびポリヌクレオチド(B)中の標的塩基配列との違いから選ばれる１種以上を判定するポリヌクレオチドの分析方法であって、被検ポリヌクレオチド、測定対象塩基配列と相補的な塩基配列を有する一本鎖のプローブ化合物、及び蛍光性インターカレーターを含有する検体溶液を、全体が同一の一定温度に調節された毛細管状の検出用流路に導入し、蛍光強度を測定する検出工程を有し、蛍光強度の経時変化により上記判定を行うことを特徴とするポリヌクレオチドの分析方法。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検ポリヌクレオチド中の、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）の有無、前記標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（Ｂ）の有無、および前記ポリヌクレオチド（Ｂ）中の前記標的塩基配列との違いから選ばれる１種以上を判定するポリヌクレオチドの分析方法であって、
前記被検ポリヌクレオチド、前記標的塩基配列と実質的に相補的な塩基配列を有する一本鎖のプローブ化合物、及び蛍光性インターカレーターを含有する検体溶液を、全体が同一の一定温度に調節された毛細管状の検出用流路に導入し、前記蛍光性インターカレーターの蛍光強度を測定する検出工程を有し、前記蛍光強度の経時変化により上記判定を行うことを特徴とするポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチド（Ｂ）中の前記標的塩基配列との違いが一塩基の違いである請求項１に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項３】
前記検出工程において前記検出用流路中の一点において経時的に蛍光強度を測定し、該測定した各時点毎の蛍光強度により蛍光強度の経時変化が求められる請求項１に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項４】
前記検出工程において検体溶液を一定の速度で流し、定常状態にある蛍光強度を、前記検出用流路の開始点から流れ方向の異なる距離にある複数の位置において測定し、該測定した各位置を経過時間に換算して、蛍光強度の経時変化が求められる請求項１に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項５】
前記検出工程の前に、前記検出用流路の温度より低い温度で、前記被検ポリヌクレオチドと前記プローブ化合物とのハイブリッドを形成しうる状態とするハイブリッド形成工程を有し、前記検出工程において、前記検出用流路中で前記ハイブリッドの全部または一部が解離しうる状態とする請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項６】
前記ハイブリッド形成工程において、前記検体溶液の温度を、前記ポリヌクレオチド（Ｂ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッドの全量が解離する温度以上であって、前記ポリヌクレオチド（Ａ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッドの全量が解離する温度未満の温度に調整し、
前記検出工程において、検出用流路の温度を、前記ハイブリッド形成工程の温度より高く、かつ、前記ポリヌクレオチド（Ａ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッドの解離する温度以上の温度に調整する請求項５に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項７】
前記ハイブリッド形成工程において、前記検体溶液の温度を、前記ポリヌクレオチド（Ｂ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッドの全量が解離する温度未満の温度に調整し、前記検出工程において、検出用流路の温度を、前記ハイブリッド形成工程の温度より高く、かつ、前記ポリヌクレオチド（Ｂ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッドの解離温度以上であって、前記ポリヌクレオチド（Ａ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッドの解離温度未満である温度に調整する請求項５に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項８】
さらに、前記ハイブリッド形成工程の前に、前記検体溶液を、前記ポリヌクレオチド（Ａ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッドの融解温度以上の温度に調整し、前記検体溶液中に存在する被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物のハイブリッドを解離させて一本鎖とする予備解離工程を有する請求項５〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項９】
前記検出工程において、被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物の少なくとも一部は解離している状態の検体溶液を前記検出用流路に流し、前記検出用流路中で被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物とのハイブリッドを形成しうる状態とする請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項１０】
前記検出工程の前に、前記検体溶液の温度を調節して、前記ポリヌクレオチド（Ａ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッド、及び前記ポリヌクレオチド（Ｂ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッドの少なくとも一部を解離させた状態とする選択的解離工程を有し、前記検出工程において、検出用流路の温度を、前記選択的解離工程の温度未満である温度に調整する請求項９に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項１１】
前記選択的解離工程において、前記検体溶液の温度を、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの全量が解離する温度以上であって、かつ、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの解離温度以上にし、前記検出工程において、検出用流路の温度を、前記ポリヌクレオチド（Ｂ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッドの全量が解離する温度以上であって、前記ポリヌクレオチド（Ａ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッドの全量が解離する温度未満であって、かつ、前記選択的解離工程の温度未満である温度に調整する請求項１０に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項１２】
前記選択的解離工程において、前記検体溶液の温度を、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの解離温度以上、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの解離温度未満の温度にし、前記検出工程において、検出用流路の温度を、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの全量が解離する温度未満であって、かつ、前記選択的解離工程の温度未満の温度に調整する請求項１０に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項１３】
さらに、前記検出工程の前に、前記検体溶液を、前記ポリヌクレオチド（Ａ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッドの融解温度以上の温度に調整し、前記検体溶液中に存在する二本鎖の被検ポリヌクレオチド及び被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物のハイブリッドを解離させて一本鎖とする予備解離工程を有する請求項９に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項１４】
さらに、前記選択的解離工程の前に、前記検体溶液を、前記ポリヌクレオチド（Ａ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッドの融解温度以上の温度に調整し、前記検体溶液中に存在する二本鎖の被検ポリヌクレオチド及び被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物のハイブリッドを解離させて一本鎖とする予備解離工程を有する請求項１０または１２に記載のポリヌクレオチドの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体溶液中に存在する被検ポリヌクレオチドの、標的塩基配列を有するポリヌクレオチドの有無、前記標的塩基配列を有さないポリヌクレオチドの有無、および該標的塩基配列を有さないポリヌクレオチドの前記標的塩基配列との違いから選ばれる１種以上を判定するポリヌクレオチドの分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチドの塩基配列が目的の配列であるか否か、基準とする配列と同一か若しくは異なるか、又は、基準とする配列とどの程度相補性が異なるか等といったポリヌクレオチドの分析方法としては、種々の方法が知られている。
しかし、塩基配列の違いやその長さの差が小さいポリヌクレオチド同士の違いを分析する場合、中でも、置換、挿入、欠失などにより一塩基のみが異なる塩基配列の違いを分析する場合には、既知の分析方法では種々の欠点があり満足できるものではなかった。
【０００３】
例えば、ＤＮＡチップ（例えば、非特許文献１参照。）のように、固相に固定したプローブ化合物であるオリゴヌクレオチドに被検ＤＮＡを選択的にハイブリッド形成させる方法では、一塩基のみ異なるような僅かな塩基配列の違いを十分なコントラストで検出するには数時間以上のインキュベーションを要するといった問題があった。
【０００４】
アフィニティークロマトグラフィー（例えば、非特許文献２参照。）は、標的塩基配列の判定にそれ専用の一本のカラムが必要であり、汎用機とすることができなかった。
【０００５】
また、電気泳動法の一つに、検体溶液にプローブ化合物を添加して電気泳動を行う方法が知られている（例えば、非特許文献３、４参照。）。これによると、プローブ化合物とミスマッチの塩基配列を有するＤＮＡは、特定の条件では立体構造が変化して泳動時間が大きく変化するため、分離、判定できる。これはアフィニティークロマトグラフと異なり、汎用の装置が使用できるが、測定条件が微妙なため条件設定に多数回の測定を要する上、数十分以上の時間を要するといった問題があった。
【０００６】
一方、二本鎖ＤＮＡは、該二本鎖（ハイブリッド）の塩基配列が相補的である場合に比べて、ミスマッチ（非相補的な部位）が有れば解離し易くなることが知られている（例えば、非特許文献５参照。）。従って、二本鎖ＤＮＡの融解温度を調べれば、該ＤＮＡが相補的であるか、塩基配列にミスマッチを有するかが判定できることになる。
しかしながら、例えば分析対象のＤＮＡが変異型であるか野生型であるかという一塩基多型の分析において、試料のＤＮＡが変異型である場合でも、野生型とは塩基配列が異なるものの、それ自身は変異型センス鎖と変異型アンチセンス鎖の相補的な二本鎖であるため、この方法によっては、変異型と野生型を見分けることはできなかった。
【非特許文献１】大野典也，「ニュートン」，１９９９年，７月号，ｐ．６０−６１
【非特許文献２】近藤壽彦，阿部修三，「クロマトグラフィー」，１９９７年，第１８巻，第２号，ｐ．１２２−１２５
【非特許文献３】穴田貴久，前田瑞夫，「バイオサイエンスとインダストリー」，２００１年，第５９巻，第１１号，ｐ．７５１−７５４
【非特許文献４】緒方宣邦，野島博，「遺伝子工学キーワードブック」，１９９６年，羊土社，１１０頁「温度勾配ゲル電気泳動法」，３５６頁「変成ゲル電気泳動法」
【非特許文献５】緒方宣邦，野島博，「遺伝子工学キーワードブック」，１９９６年，羊土社，３５５頁「変成」，３５６頁「変成ゲル電気泳動法」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、試料溶液中に存在する被検ポリヌクレオチドが、分析の標的とする塩基配列を有するか否か、および／または、標的塩基配列との違い等の判定を行うためのポリヌクレオチドの分析方法、特に、一塩基のみが異なる塩基配列を判別可能な分析方法であって、汎用の装置を用いて、試薬の選定だけで種々の分析が可能なポリヌクレオチドの分析方法を提供することである。さらに、単純な操作で迅速に、しかも高い信頼性で測定が可能な測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、標的塩基配列と実質的に相補的な塩基配列を有するプローブ化合物、および蛍光性インターカレーターを用い、一定温度に調節された検出用流路において蛍光強度を測定し、蛍光強度の経時変化により判定を行うことにより、上記課題を解決することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、被検ポリヌクレオチド中の、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）の有無、前記標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（Ｂ）の有無、および前記ポリヌクレオチド（Ｂ）中の前記標的塩基配列との違いから選ばれる１種以上を判定するポリヌクレオチドの分析方法であって、被検ポリヌクレオチド、前記測定対象塩基配列と相補的な塩基配列を有する一本鎖のプローブ化合物、及び蛍光性インターカレーターを含有する検体溶液を、全体が同一の一定温度に調節された毛細管状の検出用流路に導入し、前記蛍光性インターカレーターの蛍光強度を測定する検出工程を有し、前記蛍光強度の経時変化により上記判定を行うことを特徴とするポリヌクレオチドの分析方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の分析方法では、試料溶液中に存在する被検ポリヌクレオチドの塩基配列をプローブ化合物を用いて標的塩基配列と比較して、同じか、異なるか又はどの程度異なるかを、特に、一塩基多型の存在の有無やその種類を簡便かつ迅速に分析できる。また、汎用の装置を用いて、試薬、すなわちプローブ化合物と蛍光性インターカレーターとの選定と温度条件の選定だけで異なる塩基配列の分析が可能である。また、蛍光強度の変化が平衡に達した後にその値から判定する方法に比べて、平衡に達するまで測定する必要がないため、短時間に、かつ短い検出用流路を用いて正確に測定可能である。
【００１１】
本発明の分析方法では、検体溶液をあらかじめ所定温度に温度調節された検出用流路に導入してからの蛍光強度の経時変化を測定するため、例えばマイクロウェルなどの貯液槽中で経時的に蛍光を観察する方法に比べて、検出工程の所定温度への急速な温度変化が可能で、かつ検体溶液の温度分布を小さくすることが可能なため、短時間部分の測定精度が向上し、かつ迅速な測定が可能である。
【００１２】
また、経時変化の時間情報を、検出用流路内の位置情報としてとらえることができるため、流速を調節することによって、特に短時間範囲の変化を正確に測定することが可能であり、また、多数の検出用流路を用いて多数同時測定する場合に、各測定部を経時的に追って測定する必要が無いため測定装置やデータ処理が簡単になり、測定装置の小型化、低価格化が可能になる。
【００１３】
また、検出用流路入り口における蛍光強度と検出用流路の任意の位置に於ける蛍光強度を測定し、その差をとって蛍光強度の減少量を算出したり、その比をとって正規化することによって、検体溶液毎に被検ポリヌクレオチドやプローブ化合物の濃度が異なっていてもそれを補正して正確に判定することが出来、また、二本鎖状態の被検ポリヌクレオチドその他の蛍光性の物質が存在しても、それを補正して正確に判定することができる。
【００１４】
また、ハイブリッド形成工程の前に、二本鎖の被検ポリヌクレオチドを一本鎖とする予備解離工程を行うことによって、プローブ化合物と被検ポリヌクレオチドのハイブリッド形成時間が短縮でき、迅速な測定が可能となる。さらに、ハイブリッド形成工程のハイブリッド形成時間を厳密に管理することが可能になり、測定の再現性が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
［検体溶液］
本発明にかかるポリヌクレオチドの分析方法において、測定対象である検体溶液は、被検ポリヌクレオチド、標的塩基配列と実質的に相補的な塩基配列を有する一本鎖のプローブ化合物、および被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物とのハイブリッドにインターカレートして蛍光収率が変化する蛍光性インターカレーターを含有する。
【００１６】
なお、検体溶液は、上記の被検ポリヌクレオチド、プローブ化合物、及び蛍光性インターカレーターの他に、本発明の方法を妨害しない他の成分、例えば、酵素などの蛋白やヌクレオチドモノマー、ＰＣＲ用のプライマーなどを含有していもよい。但し、該プライマーは、プローブ化合物と、本分析を妨害するようなハイブリッド形成をしない塩基配列に設計される必要がある。ここで「本分析を妨害するようなハイブリッド形成をしない塩基配列」とは、検出目的のポリヌクレオチドがプローブ化合物と形成するハイブリッドの相補的な塩基数と同じ数の塩基数の相補鎖を形成しないことをいう。このような塩基配列であれば、ハイブリッド形成しても、検出目的のポリヌクレオチドとは融解温度が異なるため、本分析を妨害しない。
【００１７】
［被検ポリヌクレオチド］
被検ポリヌクレオチドは、本発明に於ける分析対象のポリヌクレオチドであり、分析目的によって種々の場合があり得る。例えば、全ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、制限酵素により切断されたＤＮＡ断片、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などにより増幅された２本鎖又は１本鎖ＤＮＡ断片、ＲＮＡ、これらの置換体や化学修飾体などであり得る。
【００１８】
被検ポリヌクレオチドが対立ポリヌクレオチド（以下、「対立鎖」と称する場合がある。）の双方を含有する場合には、被検ポリヌクレオチドの長さ（塩基数）は、後述のように、プローブ化合物が標的塩基配列と相補的である塩基数より１塩基以上長いことが必要であり、２塩基以上長いことが好ましく、３塩基以上長いことさらに好ましく、４塩基以上長いことが最も好ましい。被検ポリヌクレオチドが対立鎖の一方のみである場合には、上記の限定は不要である。
【００１９】
被検ポリヌクレオチドの長さは、例えば塩基数が数千万であり得るが、分析精度と分析速度を共に高くするために、塩基数２０〜１０００００が好ましく、塩基数３０〜１００００がさらに好ましく、３５〜３０００が最も好ましい。この範囲の下限以上とすることにより、検体溶液を調製する際に、ＰＣＲなどによる増幅の精度が向上するため、本分析方法の精度が向上する。又上記の上限以下とすることによって、ＰＣＲなどによる増幅の速度が向上し、また、ハイブリッド形成や解離の速度が向上するため、本分析方法の速度が向上する。前記検体溶液中に含有される被検ポリヌクレオチドの長さは、制限酵素の選択よって調節でき、また、ＰＣＲなどによってポリヌクレオチドを増幅する場合には、プライマーの設計によって調節できる。
【００２０】
被検ポリヌクレオチドは、対立鎖の一方又は両方であり得る。対立ポリヌクレオチドの両方である場合には、ホモ接合鎖であり得るし、ヘテロ接合鎖であり得る。また、単独の塩基配列のポリヌクレオチド、互いに異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドの混合物、例えば野生型と変異型のポリヌクレオチドの混合物であり得るし、互いに異なる種類のポリヌクレオチドの混合物であり得る。また、異なる長さのポリヌクレオチドの混合物であり得る。勿論、分析結果として検体溶液中に分析目的の塩基配列を有するポリヌクレオチドが含有されないことが判明する場合もあり得る。
【００２１】
被検ポリヌクレオチドの検体溶液中の濃度は任意である。蛍光測定機構の感度に応じて設定できる。蛍光測定機構の感度が高ければ１分子であり得る。ＰＣＲやＬＡＭＰ法などのポリヌクレオチド増幅反応の反応生成溶液をそのまま、或いは２〜１０００倍に希釈して使用することも好ましい。
【００２２】
［標的塩基配列］
標的塩基配列は、分析の基準となる特定の塩基配列である。例えば、一塩基多型の検出を目的とする場合には、変異の生じる部分（ホットスポット）を含む塩基配列部分である。標的塩基配列は、ポリヌクレオチド（Ａ）やポリヌクレオチド（Ｂ）が二本鎖である場合には、対立鎖の一方の配列とするか他方の配列とするか、例えば、センス鎖とするかアンチセンス鎖とするかは任意である。
【００２３】
標的塩基配列の長さは、例えば標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）（以下、単に「ポリヌクレオチド（Ａ）」という。）が１０〜１００塩基（対）である場合には、塩基数６以上であればよい。この長さであれば、ポリヌクレオチド（Ａ）が偶然プローブ化合物に相補的な塩基配列を持つ確率は無視できるほど小さいため、充分な精度と信頼性が得られる。
【００２４】
ポリヌクレオチド（Ａ）の塩基（対）数がそれ以上である場合には、該塩基数に応じて、プローブ化合物の塩基数も増やすことが、選択エラーを防ぐために好ましい。例えば、ポリヌクレオチド（Ａ）の塩基（対）数が１００〜１０００である場合には、１０以上であることが好ましく、ポリヌクレオチド（Ａ）の塩基（対）数が数千以上である場合には、１５以上であることが好ましい。
【００２５】
後述のように、プローブ化合物が標的塩基配列に対して１又は２塩基のミスマッチを有するものである場合には、１５以上であることが好ましく、２０以上であることがさらに好ましく、２３以上であることが最も好ましい。プローブ化合物が標的塩基配列に対して３又は４塩基のミスマッチを有するものである場合には、２５以上であることが好ましく、３０以上であることがさらに好ましく、３３以上であることが最も好ましい。
【００２６】
標的塩基配列の塩基数の上限は任意であり、好ましい上限は標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（Ｂ）（以下、単に「ポリヌクレオチド（Ｂ）」という。）の塩基配列と標的塩基配列との違いの程度や、プローブ化合物へのミスマッチの導入数により異なる。上記配列の違いが大きいほど、それに応じて標的塩基配列の塩基数の上限も大きくてよく、例えば上記上限は１０００であってもよいが、プローブ化合物へミスマッチを導入しない場合には、５０以下であることが好ましく、３０以下であることが最も好ましい。
【００２７】
上記配列の違いが１塩基である場合であって、プローブ化合物が標的塩基配列に対するミスマッチを導入しない場合には、３０以下が好ましく、２５以下がさらに好ましい。プローブ化合物が標的塩基配列に対して１又は２塩基のミスマッチを有するものである場合には、５０以下であることが好ましく、４０以下であることがさらに好ましく、３０以下であることが最も好ましい。プローブ化合物が標的塩基配列に対して３又は４塩基のミスマッチを有するものである場合には、８０以下であることが好ましく、６５以下であることがさらに好ましく、５０以下であることが最も好ましい。この好ましい上限以下とすることで、充分な選択性を維持しつつ分析の迅速化が図れる。
【００２８】
［プローブ化合物］
プローブ化合物は、標的塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、ポリヌクレオチド（Ａ）とハイブリダイゼーションする化合物であれば任意であり、例えば、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、糖部分や燐酸基部分が修飾或いは置換されたオリゴＤＮＡやオリゴＲＮＡ、その他の任意の化合物であり得る。このようなプローブ化合物は、合成可能であるし、また、マイクロアレイ用などとして市販されているものが使用できる。
【００２９】
「実質的に相補的」とは、標的塩基配列の全体に対して少数の非相補的な部分を有してもよいことを意味し、好ましくは、相補的であるか１〜４塩基の非相補的な塩基を有するものである（以下、「（標的塩基配列に）相補的」なことを「（標的塩基配列と）完全マッチ」であると表現する場合がある、また、「（標的塩基配列に相補的な塩基配列に対してＮ個の）塩基の配列が異なる」ことを「（標的塩基配列とＮ個の塩基の）ミスマッチを生じる」と表現する場合がある）。
【００３０】
但し、プローブ化合物が、標的塩基配列に対して少数の（例えば１〜４塩基の）ミスマッチを生じるものである場合には、該ミスマッチを生じる塩基は、ポリヌクレオチド（Ｂ）が標的塩基配列と異なる部分において、ポリヌクレオチド（Ｂ）と相補的でない塩基とする必要がある。その理由は、プローブ化合物が標的塩基配列に相補手金塩基配列を有する場合のポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）が逆転した場合に相当し、本発明のポリヌクレオチド（Ａ）、ポリヌクレオチド（Ｂ）の定義に反するからである。
【００３１】
例えば、ポリヌクレオチド（Ｂ）が、標的塩基配列中の或るグアニンがチミンに変異した塩基配列を有するとき、標的塩基配列に対してミスマッチとなる塩基が、前記チミンに相補的なアデニンであると、プローブ化合物は該部分でポリヌクレオチド（Ｂ）と相補的ポリヌクレオチド（Ａ）とミスマッチになってしまう。ミスマッチが挿入や欠失による場合も話は同様である。このような、標的塩基配列に対して、実質的に相補的な塩基配列を有するプローブ化合物は、上記ミスマッチの数がいくつであっても、ポリヌクレオチド（Ａ）に対して、ポリヌクレオチド（Ｂ）より強くハイブリダイゼーションする。
【００３２】
プローブ化合物が、標的塩基配列に対して１〜４個のミスマッチを生じるものである場合には、該ミスマッチを生じる塩基は、置換、挿入、欠失のいずれであってもよいが、置換であることが、該ミスマッチを導入する効果が発揮されるため好ましい。また、ポリヌクレオチド（Ｂ）が標的塩基配列と異なる塩基の位置と種類が既知の場合、例えば一塩基多型における野生型と変異型の場合には、プローブ化合物は、前記標的塩基配列内でミスマッチを生じる塩基配列部分を、標的塩基配列の端以外の部分とする。端であってもよいが、本発明においては、説明の煩雑さを避けるため、塩基配列の端にある該１〜４塩基異なる部位を除いた部分を標的塩基配列とする。
【００３３】
上記以外であれば、該１〜４塩基異なる部位は任意であり、ポリヌクレオチド（Ｂ）が標的塩基配列と異なる部位に隣接した塩基（１個目の塩基）であってもよいし、２個目の塩基、３個目の塩基、或いはさらに離れた位置の塩基であってもよい。これらの中で、１〜４個目の塩基であることが好ましく、１個目又は２個目の塩基であることがさらに好ましい。この位置にすることによって、本発明の効果をより発揮できる。
【００３４】
プローブ化合物が、前記標的塩基配列に対して２塩基異なる塩基配列を有する場合にも、該部分の位置は任意であり、ポリヌクレオチド（Ｂ）が標的塩基配列と異なる部位から、若しくは、前記異なる第１の塩基から、１〜４個目の塩基であることが好ましく、１個目又は２個目の塩基であることがさらに好ましい。この位置にすることによって、本発明の効果をより発揮できる。プローブ化合物が、前記標的塩基配列に対して３又は４塩基異なる塩基配列を有する場合も上記と同様であるが、該ミスマッチを生じる塩基が各々１つ置きの塩基であることも好ましい。
【００３５】
プローブ化合物が、標的塩基配列に相補的な塩基配列に対して５個以上の塩基の配列が異なる塩基配列を有していると、標的塩基配列の全長が同じである場合には、解離温度が常温付近以下となりがちであり、室温以下の温度調節が必要となりがちであり、これらの不都合を避けるためには、標的塩基配列の長さやミスマッチの導入位置が限定されたものとなる。
【００３６】
プローブ化合物は、一分子内に標的塩基配列部分を複数有していてもよく、該複数の標的塩基配列部分は同じ標的塩基配列であっても、異なる塩基配列であってもよい。同じである場合は、検出感度を向上させることができるし、異なる場合には、複数の標的塩基配列を同時に測定することができる。
【００３７】
プローブ化合物は上記標的塩基配列以外の部分を有していてよい。この場合には、標的塩基配列と実質的に相補的である塩基配列部分がハイブリダイゼーションに寄与する。但しこの場合、標的塩基配列以外の塩基配列部分は、ポリヌクレオチド（Ｂ）とハイブリッド形成しない必要がある。
【００３８】
プローブ化合物の塩基数の下限は標的塩基配列の塩基数である。プローブ化合物の塩基数の上限は、特に限定する必要はないが、ポリヌクレオチド（Ａ）の塩基数以下であることが好ましく、前記標的塩基配列の塩基数の上限として示した数以下であることが好ましい。
【００３９】
ポリヌクレオチド（Ｂ）は、プローブ化合物と相補的な塩基数がポリヌクレオチド（Ａ）の場合より少ないため、ハイブリッド形成の結合能力は低いが、低温あるいは十分にインキュベートしない短時間条件ではプローブ化合物とハイブリッドを形成する。
【００４０】
プローブ化合物が標的塩基配列と相補的な塩基配列である場合、標的塩基配列を２０〜３０塩基程度にすると温度対解離量の曲線（後述の解離曲線）の傾きは急峻となり、分析の精度と信頼性が向上する。ただし、この場合には解離温度が高くなるため、溶液中の気泡の発生による検出ノイズや、高温下でのデバイスの変形に留意する必要がある。一方、標的塩基配列の長さを短くするにつれ解離温度は低くなるが、温度対解離量の曲線の傾きは徐々に緩慢になるため、分析精度の観点からは標的塩基配列の長さは、上記した長さ以上であることが好ましい。そこで、標的塩基配列を２０〜３０以上に保ち、１〜４のミスマッチを生じうる塩基配列を採用すると、解離温度が低下するにもかかわらず、解離曲線は、標的塩基配列の長さを短くする場合より急峻となるため、１〜４のミスマッチを生じうる塩基配列とすることが好ましい。ミスマッチの導入による融解温度の低下量は、標的塩基配列の長さ、ミスマッチの位置や塩基の種類、溶出液の塩濃度などにもよるが、通常第一のミスマッチ導入により３〜５℃、第二のミスマッチ導入によりさらに３〜１０℃、第三のミスマッチの導入によりさらに３〜１５℃、第四のミスマッチの導入によりさらに３〜１５℃である。
【００４１】
プローブ化合物は、さらに、塩基配列とは無関係な部分を有していてもよい。例えば、該プローブ化合物を固相合成する際に固相に固定するためのアミノ基などの官能基、塩基配列部分と前記固定用官能基の間のスペーサーとなるアルキレン基やポリエチレングリコール基、等を有していてもよい。
【００４２】
プローブ化合物の検体溶液中の濃度は任意であるが、下限は、被検ポリヌクレオチドが対立鎖の双方を含有する場合には、被検ポリヌクレオチド濃度以上とすることが好ましく、３倍以上がさらに好ましく、５倍以上が最も好ましい。前記倍率の上限は、高いことそれ自体による不都合はなく、例えば、被検ポリヌクレオチドが１分子であるような場合には、１０２１倍であってよいが、効果対費用の面から１０００倍以下が好ましく、１００倍以下がさらに好ましい。前記プローブ化合物の濃度の上限は、分析コスト面から１ｍＭ以下が好ましく、０．１ｍＭ以下がさらに好ましい。上記のように検体溶液中のプローブ化合物の濃度をポリヌクレオチドに対して過剰量とすることによって、検出用流路に導入される検体溶液中において、被検ポリヌクレオチド同士がハイブリッド結合した二本鎖ポリヌクレオチド濃度より、プローブ化合物とのハイブリッドの濃度が高くなり、検出感度が高くなると同時に二本鎖ポリヌクレオチドからの蛍光発光が相対的に少なくなり、分析精度が向上する。
【００４３】
本発明に用いるプローブ化合物は互いに相補的な塩基配列を有する対（ポリヌクレオチドで言う対立鎖）の内の一方である。互いに相補的な対の両者を使用すると、それを一本鎖状態と成した混合物として使用しても、後述のハイブリッド形成工程において、プローブ化合物同士がハイブリッド形成してしまい、該ハイブリッドと、プローブ化合物と相補的な塩基配列を持つ被検ポリヌクレオチドとのハイブリッドの区別が付かなくなる。このような対の一方のみのプローブ化合物、例えば一本鎖オリゴＤＮＡは、周知の固相合成法によって合成可能である。
【００４４】
［蛍光性インターカレーター］
前記蛍光性のインターカレーターとは、プローブ化合物とポリヌクレオチドとのハイブリッドや二本鎖ポリヌクレオチドが存在するときと存在しないときで、蛍光収率が変化する化合物である。例えば、プローブ化合物とポリヌクレオチドとのハイブリッドや二本鎖ポリヌクレオチドが存在しないときには無蛍光性であるが、これらの共存下では該ハイブリッドまたは二本鎖の間に入り込み（インターカレーション）蛍光性となる化合物である。このような化合物としては公知慣用のものが使用でき、例えば、エチジウムブロマイドが挙げられる。すなわち、蛍光性インターカレーターを検体溶液に添加することによって、蛍光発光の有無から検体溶液中にプローブ化合物とポリヌクレオチドとの、或いはポリヌクレオチド同士のハイブリッドが存在するかどうかを知ることができ、また蛍光強度からその存在量を知ることができる。前記蛍光性のインターカレーターは、インターカレートしている状態、若しくは、インターカレートしていない状態のいずれかで完全に無蛍光性で有ることが好ましいが、そうでなくてもよい。インターカレートしている状態と、インターカレートしていない状態の蛍光収率の比が１を超える或いは１未満のものであれ使用可能であり、その比が２以上または１／２以下が好ましく、５以上又は１／５以下が更に好ましく、１０以上委又は１／１０以下が最も好ましい。また、インターカレートしている状態での蛍光収率が、インターカレートしていない状態での蛍光収率より高いものが、ポリヌクレオチドの判定が容易であり、好ましい。
【００４５】
蛍光性インターカレーターの検体溶液中の濃度は任意であり、二本鎖ポリヌクレオチドの検出に通常用いられる濃度であればよく、例えばエチジウムブロマイドの場合、０．１〜５μｇ／ｃｍ３の範囲が好ましく使用できる。
【００４６】
［検出用流路］
本発明で用いる毛細管状の検出用流路は、該検出用流路外から蛍光を観察できれば、それが形成された部材の形状は任意であり、チューブ状でもよいし、板状や塊状の部材内部に形成された物でもよいが、板状の部材中に形成されたものであることが好ましい。また、検出用流路は、一つの部材中に後述の予備解離用流路やハイブリッド形成用流路と共に形成されることも好ましく、さらに、ポリヌクレオチドの抽出、濃縮、精製などの前処理を行う機構や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などのポリヌクレオチドを増幅する機構と共に同じ部材中に形成されることも好ましい。また、多検体同時測定を行うために、一つの部材中に複数の検出用流路を有することも好ましい。
【００４７】
検出用流路を構成する部材は、蛍光性インターカレーターの励起と蛍光の観察が可能であれば任意である。好ましく使用できる素材として、ガラス、石英などの結晶、有機重合体（ポリジメチルシロキサンなどの有機含有無機重合体も含む）を例示できる。
【００４８】
検出用流路の断面形状は任意であり、例えば矩形、スリット状、三角形、台形、円、楕円などであり得るが、矩形、台形、またはスリット状であることが、製造、測定が共に容易であり好ましい。本発明に使用する検出用流路は、板状の部材中に形成されており、断面形状が、該部材の幅方向の流路寸法が深さ方向の流路寸法以上であることが、温調精度が向上するため好ましい。
【００４９】
検出用流路の直径は３μｍ〜５００μｍが好ましく、さらに５〜２００μｍであることがより好ましく、１０〜１００μｍであることが最も好ましい。流路径を３μｍより大きくすることによって、圧力損失の増加を防ぎ、検出用流路に検体溶液を流すことが容易となる上、蛍光の検出感度も向上する。一方、流路径を５００μｍ以下とすることによって、前記検体溶液の昇温或いは降温の時間が短縮でき、分析時間の短縮が図れる上、該流路断面積内での温度分布が小さくなり、測定精度が向上する。ただし、検出用流路の断面形状に異方性がある場合、例えば長方形やスリット状の場合には、上記の流路径は短径を言うものとする。
【００５０】
検出用流路を微細な毛細管状の空洞とすることによって、検体溶液を検出用流路に導入した時の温度追従性を非常に高くすることができる。よって、例えばマイクロウェルなどの貯液槽中で経時的に蛍光を観察する方法に比べて、検出工程の後述の第一温度への急速な昇温が可能で、その後も時間遅れのほとんど無い昇温が可能であるため、測定の迅速化が図れる。また、検体溶液の流路断面内での温度分布を小さくすることが可能なため測定精度が向上する。
【００５１】
［蛍光測定］
蛍光測定のための励起方法は任意であり、紫外線や可視光などの光線、エックス線などのエネルギー線などであってもよいが、紫外線や可視光等の光線が簡便であり好ましい。光線の波長は、用いる蛍光性インターカレーターにより選定できる。光源は任意であり、例えばレーザー、発光ダイオード、クセノンランプや水銀灯などの放電管、白熱灯などが使用できる。
蛍光の検出方法も任意であり、例えば、ＣＣＤ、光電増倍管、フォトダイオードなどが例示できる。
【００５２】
［融解温度、解離温度］
本明細書中において、「解離温度」とは、ポリヌクレオチドとプローブ化合物とが形成するハイブリッドを含有する溶液を昇温していったときに、ポリヌクレオチドとプローブ化合物の解離が始まる最低温度をいう。また、二本鎖状態の被検ポリヌクレオチドが一本鎖に解離する場合も同様に、解離が始まる最低温度を解離温度という。「融解温度」とは、ポリヌクレオチドとプローブ化合物とが形成するハイブリッドを含有する溶液を昇温していったときに、ハイブリッドの半量が解離する温度をいう。また、二本鎖状態の被検ポリヌクレオチドが一本鎖に解離する場合も同様に、半量が解離する温度を融解温度という。「ハイブリッドの全量が解離する温度」とは、ポリヌクレオチドとプローブ化合物とが形成するハイブリッドを含有する溶液を昇温していったときに、ハイブリッドの全量が解離する最低温度をいう。
【００５３】
以下、本明細書中では、上述の温度について説明するために、以下のように温度や温度範囲に符号をつけて説明する。
ＴＬＢ：ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物のハイブリッドの解離温度
ＴＭＢ：ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物のハイブリッドの融解温度
ＴＨＢ：ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物のハイブリッドの全量が解離する温度
ＴＬＡ：ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物のハイブリッドの解離温度
ＴＭＡ：ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物のハイブリッドの融解温度
ＴＨＡ：ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物のハイブリッドの全量が解離する温度
このとき（ＴＬＢ＜ＴＭＢ＜ＴＨＢ）、（ＴＬＡ＜ＴＭＡ＜ＴＨＡ）、（ＴＭＢ＜ＴＭＡ）という関係にある。また、ＴＬＢ、ＴＭＢ、ＴＨＢはそれぞれ、ポリヌクレオチド（Ｂ）の標的塩基配列に対する非相補性が大きいほど低い温度になる関係にある。
【００５４】
準静的な条件、すなわち検体溶液を充分に遅い昇温速度（例えば、毎分１℃）で昇温した時のポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物のハイブリッド（以下、「プローブ化合物／（Ａ）ハイブリッド」ということがある。）、および、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物のハイブリッド（以下、「プローブ化合物／（Ｂ）ハイブリッド」ということがある。）の融解曲線を模式図として図１及び図２に示した。図１および図２において、横軸は被検ポリヌクレオチドを含有する溶液の温度を示し、縦軸はポリヌクレオチドとプローブ化合物とのハイブリッド化率を示す。各図中、破線は、プローブ化合物／（Ａ）ハイブリッドの融解曲線であり、実線は、プローブ化合物／（Ｂ）ハイブリッドの融解曲線である。
【００５５】
図１は、ＴＨＢ≦ＴＬＡ なる関係（以下、「融解曲線が非重畳的」と称する場合がある。）にある場合の解離曲線である。この場合には、次のように温度範囲を命名する。
温度範囲α：溶液の氷結温度〜ＴＬＢ
温度範囲β：ＴＬＢ〜ＴＨＢ
温度範囲δ：ＴＬＡ〜ＴＨＡ
温度範囲ε：ＴＨＢ〜溶液の沸騰温度
【００５６】
また、図２は、ＴＬＡ≦ＴＨＢ なる関係（以下、「融解曲線が重畳的」と称する場合がある。）にある場合である。この場合には、次のように温度範囲を命名する。
温度範囲β’：ＴＬＢ〜ＴＬＡ
温度範囲γ’：ＴＬＡ〜ＴＨＢ
温度範囲δ’：ＴＨＢ〜ＴＨＡ
ただし、図２の重畳的な温度関係の場合において、温度範囲αとεは図１の場合と共通である。
【００５７】
融解温度および解離温度は、プローブ化合物の塩基数、塩基配列のミスマッチの数、プローブ化合物の構成塩基の種類、検体溶液の塩濃度、検体溶液中のＥＤＴＡや有機溶剤などの添加物の濃度などにより変わる。例えば、融解温度は、一般的には５０〜９５℃である。
上記の解離温度、融解温度等は、例えば、いわゆるＤＮＡマイクロアレイを用いて、温度を変化させて洗浄する実験を行い、洗浄温度対ハイブリッド残留量の曲線から求めることができる。
【００５８】
［分析方法］
本発明の分析方法は、被検ポリヌクレオチド中の、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）の有無、前記標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（Ｂ）の有無、および前記ポリヌクレオチド（Ｂ）中の前記標的塩基配列との違いから選ばれる１種以上を判定するポリヌクレオチドの分析方法であって、前記被検ポリヌクレオチド、前記測定対象塩基配列と実質的に相補的な塩基配列を有する一本鎖のプローブ化合物、及び蛍光性インターカレーターを含有する検体溶液を、全体が同一の一定温度に調節された毛細管状の検出用流路に導入し、前記蛍光性インターカレーターの蛍光強度を測定する検出工程を有し、前記蛍光強度の経時変化により上記判定を行うことを特徴とする。
【００５９】
ここで、ポリヌクレオチド（Ｂ）は、標的塩基配列を有さないポリヌクレオチドであれば特に限定されず、標的塩基配列と１塩基以上異なる塩基配列を含むポリヌクレオチドの混合物であってもよい。
【００６０】
また、「ポリヌクレオチド（Ｂ）中の前記標的塩基配列との違いを判定する」とは、被検ポリヌクレオチド中にポリヌクレオチド（Ｂ）が含まれる場合、そのポリヌクレオチド（Ｂ）中の標的塩基配列に対する種々の非相補性、例えば非相補的である塩基の個数はいくつであるか、何種類の非相補鎖を有するポリヌクレオチドの混合物であるか、さらに、非相補的である塩基の種類は何であるか、さらに、非相補的である塩基の種類はＧ又はＣであるかそれともＡ又はＴであるか、標的塩基配列の範囲に複数の既知のホットポイントが有る場合に、変異部分はそのどちらであるか、標的塩基配列の範囲に未知の変異が有るか無いが、標的塩基配列の範囲に未知の変異が有る場合は、標的塩基配列内の大凡の位置等を判定することをいう。但し、これらは、測定による蛍光強度の経時変化の差が十分に大きい場合や、他の因子と重ならない場合などに、判定可能である場合があるのであって、常に判定可能であるとは限らない。
【００６１】
本発明の分析方法によると、上記検体溶液を、全体が同一の一定温度に調節された毛細管状の検出用流路に導入して、該流路において蛍光性インターカレーターの蛍光強度を測定し、該蛍光強度の経時変化により、上記判定を行うことができる。
【００６２】
例えば、ポリヌクレオチド（Ａ）の有無は、検体溶液を、ポリヌクレオチド（Ａ）のみがハイブリッド形成する条件および／またはポリヌクレオチド（Ａ）のみが解離する温度条件（δまたはδ’）を利用して行うことが出来、該温度条件において、前記検出用流路に導入された時点からの蛍光強度の時間変化、又は、前記検出用流路に導入された後の、任意の複数の時刻における蛍光強度の時間変化を測定して、蛍光強度に変化があれば、被検ポリヌクレオチドがポリヌクレオチド（Ａ）を含有していることがわかる。
【００６３】
ポリヌクレオチド（Ｂ）の有無は、検体溶液を、ポリヌクレオチド（Ｂ）のみが解離状態からプローブ化合物とハイブリッド形成する条件および／またはポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物のハイブリッドのみが解離する温度条件（βまたはβ’）を利用して行い、前記検出用流路に導入された時点からの蛍光強度の時間変化、又は、前記検出用流路に導入された後の、任意の複数の時刻における蛍光強度の時間変化を測定して、該温度条件において蛍光強度に変化があれば、被検ポリヌクレオチドがポリヌクレオチド（Ｂ）を含有していることがわかる。
【００６４】
または、ポリヌクレオチド（Ｂ）のみが上記のように変化する温度において、ポリヌクレオチド（Ｂ）の非存在を確認しておき、ポリヌクレオチド（Ａ）及びポリヌクレチド（Ｂ）の両者が変化する温度での測定により、ポリヌクレオチド（Ａ）の存在／非存在を判定することも出来る。
【００６５】
但し、上記のいずれの方法に於いても、ポリヌクレオチド（Ａ）のみ、またはポリヌクレオチド（Ｂ）のみが変化する温度で測定することが好ましいが、ポリヌクレオチド（Ａ）又はポリヌクレオチド（Ｂ）が、相対的に他方より大きく変化する温度への変化だっても、判定を行うことができる。
【００６６】
また、ポリヌクレオチド（Ｂ）中の前記標的塩基配列との違いを判定するには、例えば、以下のように行う。
プローブ化合物として、標的塩基配列に相補的な塩基配列を有するものを使用する場合について説明すると、標的塩基配列と１塩基ミスマッチのポリヌクレオチド（Ｂ）のみがハイブリッド形成する温度条件および／または解離す温度条件を利用し、該温度条件において蛍光強度に変化があれば被検ポリヌクレオチドが、１塩基ミスマッチのポリヌクレオチド（Ｂ）を含有していることがわかる。
【００６７】
また、標的塩基配列と２塩基ミスマッチのポリヌクレオチド（Ｂ）のみがハイブリッド形成する条件および／または解離する温度条件を利用し、該温度条件において蛍光強度に変化があれば被検ポリヌクレオチドが、２塩基ミスマッチのポリヌクレオチド（Ｂ）を含有していることがわかる。
【００６８】
同様にして、蛍光が変化する温度の違いから、非相補的である塩基の種類はＧ又はＣであるかそれともＡ又はＴであるか、標的塩基配列の範囲に複数の既知のホットポイントが有る場合に、変異部分はそのどちらであるか、標的塩基配列の範囲に未知の変異が有るか無いが、標的塩基配列の範囲に未知の変異が有る場合は、標的塩基配列内のどの位置にあるか、などを判定することも出来る場合がある。
【００６９】
本発明の分析方法は、以下のような２種の分析方法とすることができる。
（１）前記被検ポリヌクレオチドと前記プローブ化合物とがハイブリッドを形成しうる状態とする工程（以下、「ハイブリッド形成工程」という。）と、次いで、前記ハイブリッドが解離しうる状態として、検体溶液中の蛍光性インターカレーターの蛍光強度を測定する検出工程（以下、「検出工程（Ｉ）」という。）とを設ける方法（以下、この方法を「分析方法（Ｉ）」という。）
（２）前記ハイブリッド形成工程を設け、該ハイブリッド形成工程が、検体溶液中の蛍光性インターカレーターの蛍光強度を測定する検出工程（以下、この工程を「検出工程（ＩＩ）」という。）である方法（以下、この方法を「分析方法（ＩＩ）」という。）
【００７０】
なお、「ハイブリッドを形成しうる状態とする」とは、被検ポリヌクレオチド中にポリヌクレオチド（Ａ）および／またはポリヌクレオチド（Ｂ）が存在している場合に、ポリヌクレオチド（Ａ）および／またはポリヌクレオチド（Ｂ）がハイブリッドを形成することができる温度に検体溶液を温度調整することをいう。
【００７１】
「ハイブリッドが解離しうる状態とする」とは、被検ポリヌクレオチド中にポリヌクレオチド（Ａ）および／またはポリヌクレオチド（Ｂ）が存在している場合に、ポリヌクレオチド（Ａ）および／またはポリヌクレオチド（Ｂ）がプローブ化合物と形成するハイブリッドが解離することができる温度に検体溶液を温度調整することをいう。
【００７２】
すなわち、分析方法（Ｉ）は、ハイブリッドの解離に基づく蛍光性インターカレーターの蛍光強度低下の有無または低下の程度を検出する方法であり、分析方法（ＩＩ）は、ハイブリッド形成に基づく蛍光性インターカレーターの蛍光強度上昇の有無または上昇の程度を検出する方法である。
【００７３】
これら分析方法（Ｉ）及び（ＩＩ）は、いずれを採用しても構わない。しかしながら、ポリヌクレオチドとプローブ化合物を選択的にハイブリッド形成させるより、非選択的にハイブリッド形成させる方が速く、又、ポリヌクレオチドとプローブ化合物を選択的にハイブリッド形成させるより、選択的に解離させる方が速い。そのため、分析方法（Ｉ）は、ハイブリッド形成工程と検出工程を必要とするが、全体の所要分析時間は分析方法（ＩＩ）より短くすることが可能である。また、分析方法（Ｉ）の方が、分析方法（ＩＩ）よりも再現性が良好である。従って、分析方法（Ｉ）を採用することが好ましい。一方、分析方法（Ｉ）は、ハイブリッド形成工程が不要なため、測定装置を簡略化出来る。
【００７４】
［分析方法（Ｉ）：ハイブリッドの解離に基づく分析］
分析方法（Ｉ）は、ハイブリッド形成工程と、次いで、検出工程（Ｉ）とを有するものである。
［ハイブリッド形成工程］
分析方法（Ｉ）は、ハイブリッド形成工程と、次いで、検出工程（Ｉ）とを有するものである。
［ハイブリッド形成工程］
ハイブリッド形成工程は、被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物とのハイブリッドを形成させ、該ハイブリッドに前記蛍光性インターカレーターをインターカレートさせて、検出工程（Ｉ）にかける検体溶液をあらかじめ蛍光性とする処理を行う工程である。測定の再現性と信頼性を増すために、本工程は温度及び時間を制御された条件で行うことが好ましい。
【００７５】
本ハイブリッド形成工程は、温度の上限が、少なくともポリヌクレオチド（Ａ）がプローブ化合物とハイブリッド形成する条件（ＴＨＡ以下）で行われるが、分析目的や判定論理によっては、ポリヌクレオチド（Ｂ）もプローブ化合物とハイブリッド形成する条件（ＴＨＢ以下）で行われることが好ましい。
【００７６】
例えば、分析目的が、検体溶液中のポリヌクレオチド（Ａ）の有無や存在量のみを検出するものである場合には、ＴＨＡ以下であれば分析可能であり、ＴＭＡ以下が好ましく、ＴＬＡ以下がさらに好ましい。分析目的が一塩基多型（ＳＮＰｓ）の分析であって、被検ポリヌクレオチドの塩基配列がプローブ化合物と相補的であるか、ミスマッチを有するか、ミスマッチを有する場合にはその数は幾つであるか、等を同時に分析するものである場合には、これらの分離判定すべき対象となるポリヌクレオチドの全部をプローブ化合物と非選択的にハイブリッド形成させる条件（α）で処理することが好ましい。
【００７７】
ハイブリッド形成の選択性の程度は、後述のように、本工程の温度と時間で調節できる。すなわち、塩基配列のわずかな違いを分析する場合であって、検体溶液がポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の双方を含有しているには、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）をなるべく非選択的に、すなわちなるべく等しい量だけプローブ化合物とハイブリッド形成させることが好ましい。そして、後述の検出工程（Ｉ）において、ポリヌクレオチド（Ｂ）を選択的に解離させ、それを測定する。固定プローブ化合物に対するハイブリッド形成の、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の選択性を小さくするには、例えば、ハイブリッド形成工程の温度をＴＬＢ未満（領域α）とすることや、短時間でハイブリッド形成させる方法で実施できる。
【００７８】
分析方法（Ｉ）におけるハイブリッド形成工程の温度の下限は、検体溶液の氷結温度以上であれば任意であるが、検出を目的とするポリヌクレオチドの解離温度マイナス２０℃以上が好ましく、検出を目的とするポリヌクレオチドの解離温度マイナス１０℃以上がさらに好ましく、検出を目的とするポリヌクレオチドの解離温度マイナス５℃以上が最も好ましい。この温度以上とすることによって、標的塩基配列の一部のみ（例えば半分）でのハイブリッド形成や、標的塩基配列部分とは無関係な部分において標的塩基配列の塩基数より短い塩基数でのハイブリッド形成が生じることを防止でき、従って、引き続く検出工程（Ｉ）においてこれらの解離がノイズとなって、測定の精度と信頼性が低下することを防止できる。さらに、検体溶液中に、検出目的以外のポリヌクレオチドが存在してもその影響を受けにくくすることができる。
以上の観点から、ハイブリッド形成工程の温度は、一般には４０〜６５℃が好ましく、４５〜５５℃がさらに好ましい。
【００７９】
本発明の分析方法（Ｉ）においては、ハイブリッド形成工程において、必ずしも検体溶液中に存在するポリヌクレオチドの全量あるいは大部分をプローブ化合物とハイブリッド形成させる必要はない。引き続く検出工程（Ｉ）の光学的な検出感度を高くすることによって、検体溶液中に存在するポリヌクレオチドの一部をハイブリッド形成させればよい。このため、ハイブリッド形成工程の所要時間を短くでき、分析の迅速化が図れる。
【００８０】
また、本発明の分析方法（Ｉ）においては、ハイブリッド形成工程を上記のようなハイブリッドが形成される条件で行う。従って、検体溶液中に前記ハイブリッド形成可能なポリヌクレオチドが含有されていなくて、結果としてハイブリッドがまったく形成されない場合もある。
【００８１】
ハイブリッド形成工程の処理時間は任意であるが、過剰に短いとハイブリッド形成量が過小となって感度低下を招き、過剰に長いと、分析時間の伸長を招くだけでなく、本工程においてハイブリッド形成の選択性が高まるため、ポリヌクレオチド（Ｂ）の検出感度は低くなりがちである。好適な処理時間は該工程の処理温度と密接な関係があり、高温であるほど短時間にすることが、本工程に於ける選択性の過剰な上昇を防止できるため好ましい。本ハイブリッド形成工程の処理時間は、本工程に処する検体溶液が、予め融解温度以上にまで加熱されるなどして、被検ポリヌクレオチドが一本鎖状態に成っている場合には、好ましくは１秒〜１０分、さらに好ましくは５秒〜５分、さらに好ましくは１０秒〜３分、最も好ましくは１０秒〜１分である。
【００８２】
検体溶液に含有される被検ポリヌクレオチドが二本鎖状態であり、ハイブリッド形成工程の温度が該二本鎖状態の被検ポリヌクレオチドの融解温度未満であっても、ハイブリッドの置換が生じて、被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物とのハイブリッドが生成する。但しこの場合には、ハイブリッド形成工程の処理時間は、好ましくは１０秒〜６０分、さらに好ましくは３０秒〜３０分、最も好ましくは１分〜１０分である。
【００８３】
なお、被検ポリヌクレオチドと、標的塩基配列の違いが大きい場合には、ハイブリッド形成工程において、両者のハイブリッドがほとんど形成されない場合がある。この場合には、該工程において被検ポリヌクレオチド同士の二本鎖形成が優勢となるが、この場合でも、プローブ化合物の設計または選択において、プローブ化合物が標的塩基配列と相補的な塩基数を被検ポリヌクレオチドとの塩基数より少なくして、融解温度に差を設けることによって判定できる。
【００８４】
本発明の分析方法（Ｉ）においては、ハイブリッド形成工程は、検出用流路に導入する前に、独立した容器、例えばエッペンドルフチューブやマイクロウェル内で行ってもよいし、検出用流路の上流側に接続されたハイブリッド形成工程を行う流路（以下、「ハイブリッド形成用流路」という。）中で行い、その後、連続的に検出用流路に導入してもよい。ハイブリッド形成用流路は、流路の断面形状や寸法は検出用流路と異なっていて良く、例えば断面積が検出用流路より大きく、反応槽状であってもよい。また、検体溶液をハイブリッド形成用流路に流す流速や滞留時間も検出用流路における場合と異なっていて良く、一時的に送液を停止して、ハイブリッド形成用流路に一定時間滞留させてもよい。しかしながら、制御の容易さと分析速度の迅速化の面から、直列に接続されたハイブリッド形成用流路と検出用流路とに一定速度で同じ流量の検体溶液を流すことが好ましい。
【００８５】
［検出工程（Ｉ）］
次いで、前記ハイブリッド形成工程を行った検体溶液を、所定の温度に調節された検出用流路に流す。
検出用流路の温度は、前記ハイブリッド形成工程を行う温度より高く、被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物とが形成したハイブリッドが解離しうる温度であれば任意である。分析対象によって、適切な温度とすることが好ましい。
例えば、被検ポリヌクレオチド中のポリヌクレオチド（Ａ）の有無を判定する場合には、ポリヌクレオチド（Ａ）が解離する温度条件（δまたはδ’、ＴＬＡ以上）とすることが好ましく、ポリヌクレオチド（Ａ）の融解温度（ＴＭＡ）以上とすることがさらに好ましく、ポリヌクレオチド（Ａ）の全量が解離する温度（ＴＨＡ）以上とすることが最も好ましい。
【００８６】
また、被検ポリヌクレオチド中のポリヌクレオチド（Ｂ）の有無を判定する場合には、ポリヌクレオチド（Ｂ）のみが解離する温度条件（βまたはβ’、ＴＬＢ以上）とすることが好ましく、ポリヌクレオチド（Ｂ）の融解温度（ＴＭＢ）以上とすることがさらに好ましく、ポリヌクレオチド（Ｂ）の全量が解離する温度（ＴＨＢ）以上とすることが最も好ましい。又この場合、上記範囲であってかつ、ポリヌクレオチド（Ａ）の解離温度（ＴＬＡ）未満とすることが、ポリヌクレオチド（Ｂ）のみが解離し、ポリヌクレオチド（Ａ）の影響を受けないため、高精度の判定ができるため好ましい。
【００８７】
さらに、上記ハイブリッド形成工程および検出工程（Ｉ）における検体溶液を以下のような温度にすることによって、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）の有無、または標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（Ｂ）の有無を分析することが好ましい。
【００８８】
（Ｉａ）ポリヌクレオチド（Ａ）の有無を分析する方法
ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）のいずれか一方又は両方を含有している可能性のある検体溶液について、ポリヌクレオチド（Ａ）の有無を分析する方法について述べる。
本方法は、ハイブリッド形成工程において、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物のハイブリッドを形成させ、かつ、ポリヌクレオチド（Ｂ）はプローブ化合物とハイブリッドを形成させず、検出工程（Ｉ）において、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物を解離させる方法である。すなわち、ハイブリッド形成工程における検体溶液の温度を、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの全量が解離する温度（ＴＨＢ）以上であって、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの全量が解離する温度（ＴＨＡ）未満、好ましくは融解温度（ＴＭＡ）未満、さらに好ましくは解離温度（ＴＬＡ）未満とし、検出工程（Ｉ）における検体溶液の温度を、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドのＴ解離温度（ＬＡ）以上、好ましくは融解温度（ＴＭＡ）以上、さらに好ましくは全量が解離する温度（ＴＨＡ）とする方法（以下、方法（Ｉａ）という。）。
【００８９】
本方法のハイブリッド形成工程の温度を、ＴＭＡ未満、さらにＴＬＡ未満とするとによってハイブリッドの形成量を増加させて感度と信頼性を増すことができる。また、検出工程の温度をＴＭＡ以上、さらにＴＨＡ以上とすることによって、解離量を増加させて、感度と信頼性を増すことができる。
【００９０】
検出用流路の温度の上限は、検体溶液の沸騰、検体溶液に溶存していた気体の析出、溶解物質の分解、部材の熱変形などの不都合が生じる温度未満である。この観点から検出用流路は９０℃以下が好ましく、８５℃以下がさらに好ましく、８０℃以下が最も好ましい。
【００９１】
（Ｉｂ）ポリヌクレオチド（Ｂ）の有無を分析する方法
ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）のいずれか一方又は両方を含有している可能性のある検体溶液について、ポリヌクレオチド（Ｂ）の有無を分析する方法について述べる。
本方法は、ハイブリッド形成工程において、ポリヌクレオチド（Ａ）、ポリヌクレオチド（Ｂ）共にプローブ化合物とハイブリッドを形成させ、検出工程（Ｉ）において、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物のハイブリッドのみを解離させる方法である。すなわち、ハイブリッド形成工程における検体溶液の温度を、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの全量が解離する温度（ＴＨＢ）未満、好ましくは融解温度（ＴＭＢ）未満、さらに好ましくは解離温度（ＴＬＢ）未満とし、検出工程（Ｉ）における検体溶液の温度を、前記ハイブリッド形成工程の温度より高く、かつ、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの解離温度（ＴＬＢ）以上、好ましくは融解温度（ＴＭＢ）以上、さらに好ましくは全量が解離する温度（ＴＨＢ）以上であって、かつ、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの解離温度（ＴＬＡ）未満とする方法（以下、方法（Ｉｂ）という。）。
【００９２】
本方法のハイブリッド形成工程の温度を、ＴＭＢ未満、さらにＴＬＢ未満とするとによってハイブリッドの形成量を増加させて感度と信頼性を増すことができる。また、検出工程の温度をＴＭＢ以上、さらにＴＨＢ以上と」することによって、解離量を増加させて、感度と信頼性を増すことができる。最適な温度は、分析対象の系毎に測定して見いだすことができる。
【００９３】
検出用流路の温度の上限は、検体溶液の沸騰、溶解物質の分解、部材の熱変形などの不都合が生じる温度未満である。この観点から検出用流路は１００℃以下が好ましい。前記温度範囲内であっても、検出用流路の温度が比較的高いと、被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物とのハイブリッドの解離速度が過度に速くなって測定困難となりがちであるうえ、塩基配列の違いに基づく解離状態の差が得にくくなり、分析精度が低下しがちである。一方、該温度が比較的低いと、被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物とのハイブリッドの解離速度が低下し、分析時間の伸長が生じがちであり、また、定常状態に達するために必要な検出用流路の長さが増大する。前述のように、プローブ化合物とポリヌクレオチド（Ｂ）とのハイブリッドの融解温度以上であって、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とのハイブリッド、すなわち相補的な場合の融解温度未満の温度に調節すると、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）との解離状態の差が得やすくなるため好ましい。最適な温度は、分析対象の系毎に測定して見いだすことができる。
【００９４】
［検出工程−流速］
検体溶液を流す流速は任意であり、判定論理に応じた流速とすることが出来る。蛍光強度の経時変化を位置情報として測定する場合には、時間と位置の対応が取れる流速であることが好ましい。例えば、一定流速、漸増する流速、漸減する流速、間欠的な流速、階段状の流速などであり得るが、一定流速であることが分析の効率および解析の容易さの観点から好ましい。流速は、再現性良く制御することが好ましい。判定論理にもよるが、流速の再現性は測定の精度と再現性に影響する場合が多い。
【００９５】
また、検出用流路における解離速度が速い系においても、流速を増すことによって、位置の差が拡大されて精度良く検出できると共に、分析速度が向上する。
検出工程が、検出用流路の一点における蛍光強度の時間変化の測定である場合には、例えばパルス状の流速や矩形波状の流速、即ち、例えば一定速度で導入した後に停止する流速とすることが出来る。このとき、検体溶液を検出用流路に導入する速度を速くすることが、短時間部分の測定が正確に行え好ましい。
【００９６】
［検出工程−蛍光測定］
検体溶液は、ハイブリッド形成工程において蛍光性インターカレーターがハイブリッドにインターカレートしたため、検出用流路に導入される時点では、蛍光性、すなわち、励起すると蛍光を発する性質を有するが、検出用流路内で、被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物とのハイブリッドの解離温度以上に昇温されると、ハイブリッドは解離し、蛍光性インターカレーターは無蛍光性となって、検体溶液の蛍光性は該解離量に応じて低下する。従って、検体溶液を励起して蛍光強度を測定することによって、被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物のハイブリッドが解離したことを確認できる。或いは、その温度では解離しないことを確認できる。
【００９７】
蛍光測定は、検出用流路中の任意の点において行うことができるが、蛍光強度の経時変化を測定する方法としては、例えば、代表的には以下のような方法が挙げられる。
（ｉ）検出用流路中の一点において経時的に検体溶液の蛍光強度を測定し、該測定した各時点毎の蛍光強度により蛍光強度の経時変化を求める方法。
（ii）検体溶液を検出用流路に一定速度で流し、定常状態にある蛍光強度を、前記検出用流路の開始点から流れ方向の異なる距離にある複数の位置において測定し、該測定した各位置情報を経過時間ごとの情報に換算して蛍光強度の経時間変化を求める方法。
【００９８】
上記（ｉ）のように、検出用流路内の一点において蛍光強度を測定する場合には、検出用流路内に導入された検体溶液の流れを止めて測定する方法で実施できる。
【００９９】
上記（ii）において、「定常状態」とは、検出用流路の各位置における蛍光強度が時間的に変化しない状態であることをいう。
（ii）のように蛍光測定を検出用流路の流れ方向における複数の位置において測定する場合には、測定箇所は流線方向に連続した範囲を測定してもよいし、複数の代表点を測定してもよい。連続した範囲を測定する場合には、測定点をスキャンしてもよいし、例えばＣＣＤカメラなどにより同時に連続した範囲を測定してもよい。検出用流路が長い場合には、検出用流路を複数回往復するように折り曲げて形成し、該複数の折り曲げた部分や該往復する流路に直交する直線との各交点を測定することも好ましい。
【０１００】
上記（ｉ）および（ii）の方法は、いずれを採用しても蛍光強度の経時変化を適切に求めることができ、目的とする判定を行うために好適に用いられる。これらのうち、（ii）のように検体溶液を一定速度で流しつつ複数の位置において蛍光強度を測定すると、より正確な分析を行うことができるため好ましい。
【０１０１】
勿論、その他の方法も採用できる。その他の方法としては、例えば、上記(ii)の変化形として、流速を変化させ、それぞれの流速に於いて蛍光強度の位置依存性を測定することによって、短時間範囲での時間分解能を上げつつ、長時間範囲の測定も行うことが出来る。
【０１０２】
蛍光強度を測定する際、検体溶液中に二本鎖状態の被検ポリヌクレオチドが存在すれば、該二本鎖にインターカレートした蛍光性インターカレーターの蛍光が残存し、測定の障害となる場合がある。しかしながら、プローブ化合物の濃度を被検ポリヌクレオチドの濃度より十分高くすることによって、二本鎖状態の被検ポリヌクレオチド濃度を測定に差し支えない程度まで減少させることができる。また、プローブ化合物の塩基数を被検ポリヌクレオチドの塩基数より少なくすることによって、二本鎖状態の被検ポリヌクレオチドの融解温度は、本発明の測定条件では差し支えない程度に被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物とのハイブリッドの融解温度より高い温度にすることができる。
【０１０３】
また、蛍光測定は、検出用流路入り口における蛍光強度（時間＝０における蛍光強度）と、検出用流路の他の任意の位置に於ける蛍光強度を測定し、その差をとって蛍光強度の減少量を算出することができる。即ち、蛍光強度の経時変化の基準を、検体溶液が検出用流路に導入された時点とすることで、測定間の比較が容易となる。また、二本鎖状態の被検ポリヌクレオチドに起因する蛍光や、インターカレートしていない蛍光性インターカレーターの蛍光や、その他の蛍光性の物質が混在しても、それを補正して正確に判定することができる。
【０１０４】
また、検出用流路の任意の位置に於ける蛍光強度を、検出用流路入り口における蛍光強度で除して正規化することも好ましい。正規化することで、検体溶液毎に被検ポリヌクレオチドやプローブ化合物の濃度が異なっていても、また、被検ポリヌクレオチドやプローブ化合物のハイブリッド形成率が異なっていても、もそれを補正して正確に判定することができる。
【０１０５】
さらに、蛍光測定は、十分な時間が経過して定常状態になった後の値と、検出用流路のまだ定常状態に成らない任意の位置に於ける蛍光強度を測定し、比較することも好ましい。これにより、二本鎖状態の被検ポリヌクレオチドやその他の蛍光性の物質が混在しても、それによる蛍光を補正して正確に判定することができる。
上記の取り扱いの特長は、前記(i)の方法においても同様である。
【０１０６】
［予備解離工程］
前記ハイブリッド形成工程に先立って、披検ポリヌクレオチドとプローブ化合物のハイブリッド、プローブ化合物同士の会合物、披検ポリヌクレオチドの二本鎖、などを解離させることも好ましい（以下、この工程を「予備解離工程」という。）。室温以下の温度で保管された被検ポリヌクレオチドは、対立鎖の両方を含む場合には二本鎖となっているし、対立鎖の一方しか含まない場合にも、標的塩基配列より短い塩基数、例えば塩基数４〜１０の限定された範囲で自己会合している場合が多い。プローブ化合物についても同様である。
【０１０７】
このような被検ポリヌクレオチドやプローブ化合物を用いると、ハイブリッド形成工程において、これらが解離しつつ、標的塩基配列とのハイブリッドが形成されるため、時間を要する上、未解離のこれらが残存してノイズとなりがちである。予備解離工程を行って被検ポリヌクレオチドなどを一本鎖と成した後に、ハイブリッド形成工程を行うことによって、プローブ化合物と被検ポリヌクレオチドのハイブリッド形成時間が短縮でき、測定の迅速化が図れる。
【０１０８】
予備解離工程は、検出用流路を有するデバイス外、例えばエッペンドルフチューブ内で行ってもよいが、予備解離工程を行うための流路（以下、「予備解離用流路」という。）およびハイブリッド形成用流路は、前記検出用流路と同じ部在中に形成され、直列に接続されていて、予備解離用流路に検体溶液を導入すると、連続的にハイブリッド形成用流路及び検出用流路に流れるように構成することが好ましい。これにより、ハイブリッド形成工程のハイブリッド形成時間を厳密に管理することが可能になり、デバイス外、例えばエッペンドルフチューブから検体溶液を移し替える時間の誤差や、昇降温に要する時間の誤差が低減され、測定の再現性と精度が向上する。
【０１０９】
予備解離用流路は、検体溶液を、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とのハイブリッドの解離温度（ＴＬＡ）以上、好ましくは、該ハイブリッドの融解温度（ＴＭＡ）以上、さらに好ましくは、該ハイブリッドの全量が解離する温度（ＴＨＡ）以上の温度に調節される。
【０１１０】
検体溶液に二本鎖ポリヌクレオチドが含まれる場合には、検体溶液を、二本鎖の被検ポリヌクレオチドの融解温度（これは、通常、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とのハイブリッドや、プローブ化合物同士の会合物や、一本鎖ポリヌクレオチドの自己会合物などの融解温度より高い温度である）以上、好ましくは該二本鎖ポリヌクレオチドの融解温度以上、最も好ましくは二本鎖ポリヌクレオチドの全量が解離する温度以上の温度に調節される。これらの解離温度、融解温度、全量が解離する温度は、公知の方法、例えば、紫外線吸収スペクトルの温度依存性を測定する方法で知ることができる。
【０１１１】
予備解離用流離の温度の上限は、検体溶液の沸騰、溶解物質の分解、部材の熱変形などの不都合が生じない温度であれば任意である。好ましい解離用流路の温度は、被検ポリヌクレオチドやプローブ化合物の塩基数や塩基配列により変わるが、一般的には上記の観点から、７０〜１００℃が好ましく、８０〜１００℃がさらに好ましい。
【０１１２】
ポリヌクレオチドが対立鎖の一方のみであることが判明している場合には、予備解離工程の温度は、二本鎖の場合より低い温度でも十分であり、標的塩基配列の塩基数やプローブ化合物の塩基数に応じて、これらのハイブリッドが解離する温度を選定できる。例えば、６０〜９０℃が好ましく、７０〜８５℃がさらに好ましい。
【０１１３】
予備解離用流路の断面形状や寸法は検出用流路と異なっていて良く、例えば断面積が検出用流路やハイブリッド形成用流路より大きく、反応槽状であってもよい。また、検体溶液を解離用流路に流す流速や滞留時間も検出用流路やハイブリッド形成用流路におけるそれと異なっていて良く、一時的に送液を停止して、解離用流路に一定時間滞留させてもよい。しかしながら、制御の容易さと分析速度の迅速化の面から、前記のように直列に接続された解離用流路、検出用流路、および場合によってはハイブリッド形成用流路に一定速度で同じ流量の検体溶液を流すことが好ましい。
【０１１４】
このように、予備解離用流路を設けることによって、被検ポリヌクレオチドとして二本鎖ポリヌクレオチドを使用しても迅速な分析が可能となる上、予備解離用流路からハイブリッド形成用流路へ入ってからの時間（距離）を正確に制御できるため測定精度や再現性が向上する。
【０１１５】
［分析方法（ＩＩ）：ハイブリッド形成に基づく分析］
分析方法（ＩＩ）は、上記分析方法（Ｉ）におけるハイブリッド形成工程を検出用流路中で行い、ハイブリッド形成工程において、検体溶液中の蛍光性インターカレーターの蛍光強度を測定する分析方法である。すなわち、分析方法（ＩＩ）では、ハイブリッド形成工程が、検出工程(ＩＩ）となる。
【０１１６】
［検出工程（ＩＩ）］
検出工程（ＩＩ）では、被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物のハイブリッドの少なくとも一部を解離させた状態で検出用流路内に導入し、検出用流路を被検ポリヌクレオチドがプローブ化合物とのハイブリッドを形成しうる状態として、該ハイブリッドに蛍光性インターカレーターをインターカレートさせて、その蛍光強度の経時変化を測定する工程である。
本検出工程（ＩＩ）では、検出工程に導入される検体溶液は、被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物の少なくとも一部は解離している状態とする。そのため、検出工程の前にポリヌクレオチド（Ｂ）と前記プローブ化合物とが形成するハイブリッドの少なくとも一部を解離させた状態とする選択的解離工程を行うことが好ましい。本分析の検出用流路が、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の解離温度部に接続されていて、解離状態の試料が検出用流路に導入される場合には、必ずしも独立した該解離工程を行う必要はない。また、前記予備解離工程を行う場合にも必ずしも該解離工程を行う必要はない。該選択的解離工程の温度条件については、分析目的によって異なるため、ここの場合について後述する。選択的解離工程の時間は、後述の解離状態が得られれば任意であし、例えば１秒〜１０分、好ましｋは、５行〜３分とすることが出来る。
【０１１７】
検出用流路内でハイブリッド形成する温度条件や時間条件と形成されるハイブリッドに関しては、分析方法（Ｉ）におけるハイブリッド形成工程において述べた内容と同様である。また、以下、特に言及しない限り温度条件と時間条件以外は、上記検出工程（Ｉ）と同様に検体溶液の蛍光強度の測定を行うことができる。
【０１１８】
分析方法（ＩＩ）では、検出用流路の温度は、少なくともポリヌクレオチド（Ａ）がプローブ化合物とハイブリッド形成する温度、即ち、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とのハイブリッドの全量が解離する温度未満（ＴＨＡ未満）、好ましくはＴＭＡ以下、更に好ましくはＴＬＡ以下であり、分析目的がポリヌクレオチド（Ｂ）の分析である場合や判定論理によっては、ポリヌクレオチド（Ｂ）がプローブ化合物とハイブリッド形成する温度、即ち、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物とのハイブリッドの全量が解離する温度未満（ＴＨＢ未満））であることが好ましく、ＴＭＢ以下が更に好ましく、ＴＬＢ以下がさらに好ましい。これらの温度の中で、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とのハイブリッド、又はポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物とのハイブリッドの解離量の差が大きくなる温度が好ましい。
【０１１９】
例えば、被検ポリヌクレオチド中のポリヌクレオチド（Ａ）の有無を判定する場合には、ポリヌクレオチド（Ａ）のみがハイブリッド形成する温度条件（γ、δ、またはδ’）とすることが好ましい。また、被検ポリヌクレオチド中のポリヌクレオチド（Ｂ）の有無を判定する場合には、ポリヌクレオチド（Ｂ）がハイブリッド形成する温度条件（α、β、β’またはγ’）とすることが好ましい。
【０１２０】
さらに、検出工程（ＩＩ）における検体溶液を以下のような温度にすることによって、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）の有無、または標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（Ｂ）の有無を分析することが好ましい。
【０１２１】
（ＩＩａ）ポリヌクレオチド（Ａ）の有無を分析する方法。
検出工程(ＩＩ)の前に選択的解離工程を設け、該選択的解離工程の温度を、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの全量が解離する温度以上であって、かつ、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とのハイブリッドの解離温度（ＴＬＡ）以上、好ましくは融解温度（ＴＭＡ）以上、最も好ましくは全量が解離する温度（領域ε）に調節する、そして、検出工程（ＩＩ）における検体溶液の温度を、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの全量が解離する温度（ＴＨＢ）以上であって、前記選択的解離工程の温度未満の未満とする方法（以下、方法（ＩＩａ）という。）。
【０１２２】
本方法(ＩＩａ)に於いては、検出工程(ＩＩ)に流入する検体溶液中では、ポリヌクレオチド（Ａ）もポリヌクレオチド（Ａ）も、ポリヌクレオチド（Ｂ）もプローブ化合物とハイブリッドを形成せず、解離した状態として存在するが、検出用流路の温度が、ポリヌクレオチド（Ｂ）はプローブ化合物とハイブリッドを形成しない温度であるため、ポリヌクレオチド（Ｂ）に由来する蛍光は、検出工程(ＩＩ)において検出されず、ポリヌクレオチド（Ａ）に由来する蛍光強度のみが経時的に増加する。従って、検出工程(ＩＩ)の任意の時刻（例えば検出用流路への流入時刻）又は位置（例えば検出用流路の入り口）の蛍光強度強度を基準として、任意の時刻或いは位置における蛍光強度との差を取ることで、ポリヌクレオチド（Ａ）の有無と存在量を検出できる。
【０１２３】
（ＩＩｂ）ポリヌクレオチド（Ｂ）のみを分析する方法
検出工程（ＩＩ）の前に、例えば選択的解離工程を設て、該選択的解離工程の温度を、検体溶液を、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの解離温度（ＴＬＡ）未満、であって、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの解離温度（ＴＬＢ）以上、好ましくは融解温度（ＴＭＢ）以上、さらに好ましくは全量が解離する温度（ＴＨＢ）以上である温度に調整して、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とのハイブリッドを形成させ、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物とのハイブリッドは融解解離させた状態とする。次いで、検出工程（ＩＩ）における検体溶液の温度を、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブ化合物とが形成するハイブリッドの全量が解離する温度（ＴＨＢ）未満、好ましくは融解温度（ＴＭＢ）未満、さらに好ましくは解離温度（ＴＬＢ）未満であって、かつ、前記選択的解離工程の温度未満の温度とする方法（以下、方法（ＩＩｂ）という。）。
【０１２４】
本方法(ＩＩｂ)に於いては、検出工程(ＩＩ)に流入する検体溶液中では、ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブ化合物とのハイブリッドが既に形成されているため、ポリヌクレオチド（Ａ）に由来する蛍光は、検出工程(ＩＩ)において変化せず、ポリヌクレオチド（Ｂ）に由来する蛍光強度のみが経時的に増加する。従って、検出工程(ＩＩ)の任意の時刻（例えば検出用流路への流入時刻）又は位置（例えば検出用流路の入り口）の蛍光強度強度を基準として、任意の時刻或いは位置における蛍光強度との差を取ることで、ポリヌクレオチド（Ｂ）の有無と存在量を検出できる。
【０１２５】
分析方法（ＩＩ）においても、分析方法（Ｉ）の場合と同様に、被検ポリヌクレオチドとプローブ化合物とのハイブリッドを形成させるよりも前に、予備解離工程を設けることが好ましい。このとき、選択的ハイブリッド形成工程の前に、予備解離工程を設けることが好ましい。方法(ＩＩａ)において、選択的ハイブリッド形成工程の温度が十分高く、予備解離工程の温度と同じである場合には、予備解離工程は不要である。
【０１２６】
［判定論理］
本発明に於いて、蛍光強度の測定結果から、被検ポリヌクレオチド中のポリヌクレオチド（Ａ）の有無、ポリヌクレオチド（Ｂ）の有無、およびポリヌクレオチド（Ｂ）中の標的塩基配列との違いから選ばれる１種以上を判定する方法と判定論理は、分析目的や用いる検体溶液の成分によって適切に選択できる。例を示せば、以下のようにして、種々の場合について判定または決定できる。
【０１２７】
［１］変異型ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド（Ａ）として、変異型ポリヌクレオチドの有無を判定する場合
分析方法（Ｉ）を用いて、検体溶液中に含有される被検ＤＮＡ（被検ポリヌクレオチド）が変異型であるかどうかという一塩基多型の検出を目的とする分析においては、該一塩基多型の変異型ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド（Ａ）とする方法で分析できる。この場合、プローブ化合物として変異型ＤＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖に実質的に相補的な配列のオリゴＤＮＡを用い、ハイブリッド形成工程においてこれらのハイブリッドを形成させ、その後、検出工程（Ｉ）において検出用流路に検体溶液を流す。
【０１２８】
ここで、ハイブリッド形成工程の温度を、野生型ポリヌクレオチド［ポリヌクレオチド（Ｂ）］がプローブ化合物とハイブリッド形成しないが、変異型ポリヌクレオチド［ポリヌクレオチド（Ａ）］がプローブ化合物とハイブリッド形成する温度に設定し、検出用流路の温度を、変異型のポリヌクレオチドがプローブ化合物と形成するハイブリッドが解離する温度に設定すると、検出用流路に一定速度で導入された検体溶液の蛍光強度が、下流方向にに進むに従い減少すれば、検体溶液中に変異型ポリヌクレオチドが存在すると判定でき、減少しなければ存在しないと判定できる。
【０１２９】
なお、このとき、検体溶液中に野生型と変異型以外の第３のポリヌクレオチド、すなわち全く異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドの二本鎖が存在すると、該第３のポリヌクレオチドは、前記ハイブリッド形成工程においてプローブ化合物とはハイブリッドを形成しないが、対立鎖同士で二本鎖を形成する場合がある。しかし、この場合には、検出用流路の温度を、該二本鎖が解離しない温度とすれば、該二本鎖に起因する蛍光は経時変化しないため、判別できる。
【０１３０】
より具体的に、第一実施形態として、図１に示すように、解離曲線が非重畳的である場合に、被検ポリヌクレオチドに、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）が含まれるか否かを分析方法（Ｉ）を用いて分析する場合を説明する。まず、分析対象である被検ポリヌクレオチド、標的塩基配列と実質的に相補的な塩基配列を有する一本鎖のプローブ化合物、および蛍光性インターカレーターを含有する検体溶液を準備する。次いで、この検体溶液をハイブリッド形成工程に付す。ハイブリッド形成工程の検体溶液の温度は、上述の温度範囲γ内のいずれかの温度とする。検体溶液の温度を温度範囲γ内とすることによって、検体溶液中のポリヌクレオチド（Ａ）は、プローブ化合物とハイブリッドを形成しうるが、ポリヌクレオチド（Ｂ）は、プローブ化合物とハイブリッドを形成せず、融解したままの状態となる。そして、プローブ化合物／（Ａ）ハイブリッドの形成が略定常状態に達し、蛍光性インターカレーターがハイブリッドにインターカレートした段階で蛍光強度を測定する。
【０１３１】
次いで、検体溶液を検出用流路に流し、検出工程（Ｉ）に付す。検出工程（Ｉ）の検体溶液の温度は、ＴＬＡ以上（すなわち、温度範囲δまたはε）、好ましくはＴＭＡ以上のいずれかの温度とする。検体溶液の温度を温度範囲δまたはε内とすることによって、検体溶液中のプローブ化合物／（Ａ）ハイブリッドが解離すると、検体溶液の蛍光強度が減弱するし、ＴＭＡ以上とすることによって、蛍光強度の減弱がより明確になり信頼性が増す。検体溶液の流路区を一定とし、検出用流路の流れ方向に沿って蛍光強度の位置依存性を測定する。
【０１３２】
蛍光強度が下流に向かって減少している場合は、被検ポリヌクレオチド中にポリヌクレオチド（Ａ）［変異型ポリヌクレオチド］が含有されていると判定される。或いは、減衰曲線の傾きが一定以上であれば、被検ポリヌクレオチド中にポリヌクレオチド（Ａ）が含有されていると判定される。
【０１３３】
また、下記のようなデータ処理によって、より正確に判定することが出来る。即ち、検出用流路の入り口からの距離（ｘ）に於ける蛍光強度［ＩＦ（ｘ）］を検出用流路入り口に於ける蛍光強度［ＩＦ（０）］で除して正規化した値から判定することが好ましい。或いはまた、得られた距離（ｘ）対蛍光強度［ＩＦ（ｘ）］の曲線の減少速度即ち傾きから判定するっことも出来る。
【０１３４】
より正確に判定するには、各位置（ｘ）での蛍光強度［ＩＦ（ｘ）］から、十分下流側の定常状態となった部分での蛍光強度［ＩＦ（∞）］を差し引き、且つ、検出用流路入り口に於ける蛍光強度［ＩＦ（０）］で除して正規化した曲線で判定することが好ましい。このように正規化した蛍光強度を対数軸とする片対数グラフの一定時間後の減少量や曲線の傾きの大小から判定することも好ましい。判定は、別途作製しておいた検量線と比較することにより行ことが好ましい。或いは、比較対象として検量線を用いずに、検出用流路に平行な比較用検出用流路を作製しておき、ここに既知の試料を導入して、蛍光強度の位置依存性を互いに比較して判定しても良い。
【０１３５】
次に、本発明の第二実施形態として、図２に示すように、解離曲線が重畳的である場合に、被検ポリヌクレオチドに、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）が含まれるか否かを分析方法（Ｉ）を用いて分析する場合を説明する。この場合は、ハイブリッド形成工程の温度を温度範囲δ’内のいずれかの温度とし、検体溶液中のポリヌクレオチド（Ａ）の少なくとも一部はプローブ化合物とハイブリッドを形成するが、ポリヌクレオチド（Ｂ）はプローブ化合物とハイブリッドを形成しない状態とする。次いで、検出工程（Ｉ）の温度を、ハイブリッド形成工程の温度より高く、かつ温度範囲δ’またはε内のいずれかの温度に設定して、検体溶液中のプローブ化合物／（Ａ）ハイブリッドが解離しうる状態とする。
【０１３６】
その他は第一実施形態と同様にすることにより、蛍光強度の減少している場合は、被検ポリヌクレオチド中にポリヌクレオチド（Ａ）が含有されていると判定することができる。好ましいデータ処理に関しては第一実施提要と同様である。
【０１３７】
［２］変異型ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド（Ｂ）として変異型ポリヌクレオチドの有無を判定する場合
検体溶液中に含有される被検ＤＮＡ（被検ポリヌクレオチド）が野生型であるか変異型であるかという一塩基多型の検出を目的とする分析において、プローブ化合物として野生型ＤＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖に実質的に相補的な配列のオリゴＤＮＡを用い、野生型ＤＮＡをポリヌクレオチド（Ａ）、変異型ＤＮＡをポリヌクレオチド（Ｂ）とする。
ハイブリッド形成工程においてこれら両者をプローブ化合物とハイブリッド形成させ、検出工程（Ｉ）において、検出用流路に検体溶液を一定速度で流す。
【０１３８】
ここで、ハイブリッド形成工程の温度を、野生型および変異型ポリヌクレオチドがプローブ化合物とハイブリッド形成する温度に設定し、検出用流路の温度を、変異型ポリヌクレオチドがプローブ化合物と形成するハイブリッドは解離するが、野生型ポリヌクレオチドがプローブ化合物と形成するハイブリッドは解離しない温度に設定すると、検出用流路に導入された検体溶液の蛍光強度が、検出用流路の下流側ほど減少していれば、検体溶液中に変異型ポリヌクレオチドが存在すると判定できる。
【０１３９】
より具体的に、第三実施形態として、図１に示すように、解離曲線が非重畳的である場合に、被検ポリヌクレオチドに、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ｂ）が含まれるか否かを分析する場合を説明する。
まず、第一実施形態と同様にして検体溶液をハイブリッド形成工程に付す。ハイブリッド形成工程の検体溶液の温度は、上述の温度範囲α内のいずれかの温度とする。検体溶液の温度を温度範囲α内とすることによって、検体溶液中のポリヌクレオチド（Ａ）および（Ｂ）は、プローブ化合物とハイブリッドを形成しうる状態となる。
【０１４０】
次いで、第一実施形態と同様に検出工程（Ｉ）に付すが、このときの検体溶液の温度は、温度範囲βまたはγ内のいずれかの温度、好ましくはＴＭＢ〜ＴＬＡの範囲のいずれかの温度とする。検体溶液の温度を温度範囲βまたはγ内とすることによって、検体溶液中のプローブ化合物／（Ｂ）ハイブリッドが解離し、検出用流路の下流側へ行くほど検体溶液の蛍光強度が減弱するし、ＴＭＢ〜ＴＬＡの範囲とすることによって、蛍光強度の減弱がより明確になり信頼性が増す。しかし、この温度範囲では、プローブ化合物／（Ａ）ハイブリッドは解離しないため、該ハイブリッドに起因する蛍光強度は変化しない。
【０１４１】
そして、第一実施形態と同様にして蛍光強度を測定する。得られた蛍光強度対位置の曲線が減少して入れば、被検ポリヌクレオチド中にポリヌクレオチド（Ｂ）が含有されていると判定することができる。より正確に判定するためのデータ処理については第一実施態様の場合と同様である。
【０１４２】
次に、本発明の第四実施形態として、図２に示すように、解離曲線が重畳的である場合に、被検ポリヌクレオチドに、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ｂ）が含まれるか否かを分析する場合を説明する。
この場合は、ハイブリッド形成工程の温度を温度範囲αまたはβ’内のいずれかの温度とすると、検体溶液中のポリヌクレオチド（Ａ）および（Ｂ）は、プローブ化合物とハイブリッドを形成しうる状態となる。次いで、検出工程（Ｉ）の温度を、ハイブリッド形成工程の温度より高く、かつ温度範囲β’内のいずれかの温度に設定することによって、検体溶液中のプローブ化合物／（Ｂ）ハイブリッドが解離すると、検体溶液の蛍光強度が減弱する。しかし、プローブ化合物／（Ａ）ハイブリッドは解離しない。
そして、第一実施形態と同様にして蛍光強度を測定する。蛍光強度が減少している場合は、被検ポリヌクレオチド中にポリヌクレオチド（Ｂ）が含有されていると判定することができる。
【０１４３】
［３］多塩基置換を分析する場合
一塩基多型でなく、多塩基置換を分析する場合には、一塩基置換、二塩基置換、三塩基置換それぞれの解離温度、融解温度等を基にハイブリッド形成工程および検出工程の温度設定を適宜行うことによって、上述［２］の例と同様に、検体溶液中のポリヌクレオチドを判定できる。
【実施例】
【０１４４】
以下本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、「部」及び「％」は、特に断りがない限り、各々「質量％」、「質量部」を表す。
（実施例１）
【０１４５】
〔組成物（Ｘ１）〕
検出用流体デバイスの製造例で使用する紫外線硬化性の組成物（Ｘ１）の調製方法を示す。
重合性化合物として、平均分子量約２０００の大日本インキ化学工業株式会社製３官能ウレタンアクリレートオリゴマー「ユニディックＶ−４２６３」６０部、第一工業製薬株式会社製ヘキサンジオールジアクリレート「ニューフロンティアＨＤＤＡ」４０部、光重合開始剤としてチバスペシャルテッィケミカルズ社製１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」５部、及び重合遅延剤として関東化学株式会社製２，４−ジフェニル−４−メチル−１−ペンテン０．５部を混合して、組成物（Ｘ１）を調製する。
【０１４６】
〔組成物（Ｘ２）〕
検出用流体デバイスの製造例で使用する紫外線硬化性の組成物（Ｘ２）の調製方法を示す。
重合性化合物として、上記「ユニディックＶ−４２６３」８０部、上記「ニューフロンティアＨＤＤＡ」２０部、光重合開始剤として上記「イルガキュアー１８４」」５部、を混合して、組成物（Ｘ２）を調製する。
【０１４７】
〔紫外線の照射〕
製造例に於ける紫外線照射は、２００Ｗメタルハライドランプを光源とするウシオ電機株式会社製のマルチライト２００型露光装置用光源ユニットを用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が１００ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を、特に指定が無い限り室温、窒素雰囲気中で照射する。
【０１４８】
〔検出用マイクロ流体デバイス〕
図３、図４は、本発明の分離方法に好適に用いられる検出用流体デバイスの一例を示したもので、図３は平面模式図、図４は、図３のＡ部に於ける断面模式図である。
図３、図４に示すように、本実施例の検出用流体デバイスは、板状の支持体１上に、第一樹脂層２、及び第二樹脂層３が順に積層され、これらが固着一体化されて概略構成されており、全体の外形は長さ９５ｍｍ、幅３０ｍｍ、厚さ約１．１５ｍｍの板状とされる。なお、外形は例えば使用する光学的測定装置や温調ブロックに合わせて設計すれば良く、任意である。
【０１４９】
支持体１としては、アクリル板、ポリスチレン板、ポリカーボネート板、硝子板等を用いることができるが、検出用流体デバイスにおいては透明なアクリル板が使用されている。
第一樹脂層２は、上述の組成物（Ｘ１）を硬化させた層である。この第一樹脂層２には、該層の表面から裏面に貫通する線状の欠損部４が形成され、該欠損部４は、第一樹脂層２が支持体１と第二樹脂層３で表裏から挟持接着されることによって、毛細管状の流路４となっている。この流路４は、直列に連結された、予備解離工程用流路４ａ、ハイブリッド形成工程用流路４ｂ、及び検出用流路４ｃを構成している。予備解離工程用流路４ａは後述の第一温調ブロック１１が接する範囲、、ハイブリッド形成工程用流路４ｂは後述の第二温調ブロック１２が接する範囲、及び、検出用流路４ｃは後述の第三温調ブロック１３が接触する範囲の流路とされる。流路長は、予備解離工程用流路４ａが約４０ｍｍ、ハイブリッド形成工程用流路４ｂが約８０ｍｍ、検出用流路４ｃが約３０ｍｍであり、これらの流路はいずれも幅が５００μｍ、高さが５０μｍである。
【０１５０】
第二樹脂層３は、組成物（Ｘ２）を硬化させたものであり、その厚さは約１００μｍである。
第二樹脂層３には、層の表面から裏面に貫通する孔である流入口６および流出口７が形成されている。流入口６は、第一樹脂層２の予備解離工程用流路４ａの上流端に連通している。流出口７は、第一樹脂層２の検出用流路４ｃの下流端に連通している。
また、流路４は、支持体１側から第二樹脂層３側まで透明であり、流路４のどの位置も、外部から蛍光測定が可能となっている。
【０１５１】
以下、この検出用流体デバイスの製造方法について説明する。
〔工程１：第一樹脂層２の形成〕
厚さ１ｍｍのアクリル板製支持体１の上に、スピンコーターを用いて組成物（Ｘ１）を塗工して未硬化塗膜を形成し、該未硬化塗膜の流路４と成すべき部分以外の部分にフォトマスクを通して紫外線を１０秒間照射して未硬化塗膜を半硬化させて、第一樹脂層２と成す。次いで、非照射部分の未硬化の組成物（Ｘ１）をエタノールで洗浄除去して、流路４となるべき第一樹脂層２の欠損部４を形成する
【０１５２】
〔工程２：第二樹脂層の固着〕
二村化学株式会社製二軸延伸ポリプロピレンフィルム「ＯＰＰフィルム」上に組成物（Ｘ２）を、バーコーターを用いて塗工し、全面に紫外線を３秒間照射して半硬化させて、カバー層となる第二樹脂層３と成し、上記工程２で作製した部材の第一樹脂層２の上に貼り合わせ、紫外線を４０秒照射して、第一樹脂層２、第二樹脂層３共に完全に硬化させたのち、ＯＰＰフィルムを剥がして、第一樹脂層２の欠損部が流路４となされた検出用流体デバイス前駆体を形成する。
【０１５３】
〔流入口、流出口の形成〕
検出用流体デバイス前駆体の流路４の両端部の位置に於いて、ドリルを用いて第二樹脂層３に直径０．５ｍｍの孔６、７を穿って流路４に連結した流入口６と流出口７を形成し、該流入口６と流出口７には塩化ビニルチューブを接着して接続部８、９を形成し、検出用流体デバイスを製造した。
【０１５４】
〔ポリヌクレオチドの検出試験〕
予備解離工程用流路４ａ、ハイブリッド形成工程用流路４ｂ、及び検出用流路４ｃ部分の上面に、それぞれ、９５℃に調節された第一温調ブロック１１、５０℃に調節された第二温調ブロック１２、及び、８０℃に調節された第三温調ブロック１３を、薄く塗布したシリコンオイルを介して接触させ、それぞれの流路を温調する。なお、第三温調ブロックの温度は、分析目的に応じて変更するか、異なる温度に調節された幾つかの第三温調ブロックを用意しておき、適宜乗せ替える。。
プローブ化合物として長さ２０塩基のオリゴＤＮＡを５μＭ、被検ポリヌクレオチドとして長さ６５塩基の二本鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）０．３μＭ、蛍光性インターかレーターとしてエチジウムブロマイドの０．５μｇ／ｃｍ３を含有する緩衝液溶液を調製し、シリンジポンプ（図示せず）を用いて、導入口６から流路４に、例えば毎分１μｌの一定流速（流路４内の流速約４０ｍｍ／分）で導入すると、該検体溶液は、予備解離工程用流路４ａ、ハイブリッド形成工程用流路４ｂを経て、導入部４ｄから検出用流路４ｃに入り、流出口９から流出する。
検出用マイクロ流体デバイスの下面から、ＣＣＤカメラ付き落射型蛍光実体顕微鏡２１で、検出用流路４ｃの全体または一部の蛍光強度を観察し、画像解析ソフト（例えば（株）プラネトロン社の「イメージプロプラス」）を用いて、検出用流路４ｃの導入部４ｄから一定間隔で蛍光強度を計測する。そして、流速から計算される位置と時間の関係から、一定時間毎の蛍光強度が得られる。
得られた蛍光強度の経時変化データを用い、上記の判定論理に従って判定する。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
本発明のポリヌクレオチドの分析方法は、種々の用途目的に使用できる。例えば、農林水産業などに於ける種の改良などを目的としたＤＮＡやＲＮＡの塩基配列と機能との関係解明のための使用、感染症の原因微生物の分析、疾患に掛かりやすい遺伝的因子の保有の分析、患者の薬物感受性の分析、ガンであるか否かあるいはガンの種類の分析、または生体移植適合性の分析などの医療用途での使用、同一人判定、親子判定、男女判定などの法務鑑定での使用、生物学的あるいは考古学的研究での使用、農作物において特定種であるか否か又はあるいは遺伝子組み換え作物であるか否かの分析のための使用などを挙げることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】非重畳的な場合の、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の解離曲線を示した模式図である。
【図２】重畳的な場合の、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の解離曲線を示した模式図である。
【図３】本発明の実施例で用いられる検出用流体デバイスの平面模式図である。
【図４】本発明の実施例で用いられる検出用流体デバイスの図３におけるＡ部における断面模式図である。
【符号の説明】
【０１５７】
１・・・・支持体
２・・・・第一樹脂層
３・・・・第二樹脂層
４・・・・流路（欠損部）
４ａ・・・予備解離工程用流路
４ｂ・・・ハイブリッド形成工程用流路
４ｃ・・・検出用流路
４ｄ・・・検出用流路の導入部
６・・・・流入口
７・・・・流出口
８，９・・・接続口
１１・・・第一温調ブロック
１２・・・第二温調ブロック
１３・・・第三温調ブロック
２１・・・落射型蛍光顕微鏡
【図１】
2004187678.tif 000003
【図２】
2004187678.tif 000004
【図３】
2004187678.tif 000005
【図４】
2004187678.tif 000006