(57)【要約】【課題】細胞に導入した核酸の標的オルガネラ全体おける局在量を正確に定量する方法を提供する。【解決手段】（ａ）標的オルガネラを第一の蛍光色素で染色し、（ｂ）ポリカチオン性物質と第二の蛍光色素で標識した核酸との複合体を細胞に導入し、（ｃ）細胞と交差する平面上に存在する第一の蛍光色素が発する蛍光を検出し、上記平面上における標的オルガネラの存在領域を決定し、（ｄ）上記平面上に存在する第二の蛍光色素が発する蛍光を検出し、標的オルガネラの存在領域のうち、第二の蛍光色素によって染色された領域の面積を算出し、（ｅ）細胞と交差する複数の平面に対して工程（ｃ）及び（ｄ）を行い、（ｆ）複数の平面について算出された第二の蛍光色素による染色領域の面積を総和し、第二の蛍光色素による染色領域の総和面積を指標として、核酸の標的オルガネラにおける局在量を定量する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に導入した核酸の標的オルガネラおける局在量を定量する方法であって、
（ａ）前記標的オルガネラを第一の蛍光色素で染色する工程、
（ｂ）ポリカチオン性物質と第二の蛍光色素で標識した前記核酸との複合体を前記細胞に導入する工程、
（ｃ）前記細胞と交差する平面上に存在する前記第一の蛍光色素が発する蛍光を検出し、前記平面上における前記標的オルガネラの存在領域を決定する工程、
（ｄ）前記平面上に存在する前記第二の蛍光色素が発する蛍光を検出し、前記標的オルガネラの存在領域のうち、前記第二の蛍光色素によって染色された領域の面積を算出する工程、
（ｅ）前記細胞と交差する複数の平面に対して前記工程（ｃ）及び（ｄ）を行う工程、並びに
（ｆ）前記複数の平面について算出された前記第二の蛍光色素による染色領域の面積を総和し、前記第二の蛍光色素による染色領域の総和面積を指標として、前記核酸の前記標的オルガネラにおける局在量を定量する工程を含む前記方法。
【請求項２】
前記第一の蛍光色素又は前記第二の蛍光色素が発する蛍光を共焦点レーザー顕微鏡によって検出する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記複数の平面が、前記細胞内において互いに交差しない平面である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記複数の平面の数が２０以上である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法により、細胞に導入した核酸の異なる複数のオルガネラにおける局在量を定量し、前記核酸の細胞内動態を分析する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞に導入した核酸の標的オルガネラおける局在量を定量する方法、及び当該方法を利用して細胞に導入した核酸の細胞内動態を分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子治療に大きな期待が寄せられており、遺伝子導入技術の重要性が増加している。細胞への遺伝子導入技術は、生化学的又は物理的方法を利用するトランスフェクションと、ウイルスを利用するインフェクションとに大別される。インフェクションによる遺伝子導入は、特定の細胞（ウイルスが感染できる細胞）に対する遺伝子導入効率や遺伝子発現効率は高いものの、トランスフェクションによりも操作が複雑で多大な時間を要し、利用するウイルスによっては安全性が問題となる。このため、現在ではトランスフェクションによる遺伝子導入技術が汎用されており、トランスフェクションによる遺伝子導入技術としては、リン酸カルシウム共沈法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、陽電荷を有するＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、カチオン性脂質との複合体形成法等が知られている。
【０００３】
遺伝子導入技術の評価、開発、改良等にあたっては、遺伝子導入効率や遺伝子発現効率の検討に加え、導入遺伝子の細胞内動態の検討が重要となる。導入遺伝子の細胞内動態を知るためには、導入遺伝子の各種オルガネラにおける局在量の定量が必要であり、導入遺伝子の定量法としては、細胞分画法、共焦点レーザー顕微鏡法（共焦点走査顕微鏡法）等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、細胞分画法は、細胞の破壊が必要となるため、オルガネラ間におけるコンタミネーションが生じ、個々のオルガネラにおける導入遺伝子の局在量を定量することは困難である。また、これまでの共焦点レーザー顕微鏡法は、導入遺伝子を標識する蛍光色素の蛍光強度を二次元的に検出するものであったため、オルガネラの一部分に存在する導入遺伝子を定量することはできたが、個々のオルガネラ全体に存在する導入遺伝子を定量することはできず、さらに蛍光強度の減衰の影響を受けるため正確な定量が困難であった。
【０００５】
そこで、本発明は、細胞に導入した核酸の標的オルガネラ全体おける局在量を正確に定量する方法、及び当該方法を利用して細胞に導入した核酸の細胞内動態を分析する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は以下の方法を提供する。
（１）細胞に導入した核酸の標的オルガネラおける局在量を定量する方法であって、
（ａ）前記標的オルガネラを第一の蛍光色素で染色する工程、
（ｂ）ポリカチオン性物質と第二の蛍光色素で標識した前記核酸との複合体を前記細胞に導入する工程、
（ｃ）前記細胞と交差する平面上に存在する前記第一の蛍光色素が発する蛍光を検出し、前記平面上における前記標的オルガネラの存在領域を決定する工程、
（ｄ）前記平面上に存在する前記第二の蛍光色素が発する蛍光を検出し、前記標的オルガネラの存在領域のうち、前記第二の蛍光色素によって染色された領域の面積を算出する工程、
（ｅ）前記細胞と交差する複数の平面に対して前記工程（ｃ）及び（ｄ）を行う工程、並びに
（ｆ）前記複数の平面について算出された前記第二の蛍光色素による染色領域の面積を総和し、前記第二の蛍光色素による染色領域の総和面積を指標として、前記核酸の前記標的オルガネラにおける局在量を定量する工程を含む前記方法。
【０００７】
（２）前記第一の蛍光色素又は前記第二の蛍光色素が発する蛍光を共焦点レーザー顕微鏡によって検出する前記（１）記載の方法。
（３）前記複数の平面が、前記細胞内において互いに交差しない平面である前記（１）又は（２）記載の方法。
（４）前記複数の平面の数が２０以上である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法により、細胞に導入した核酸の異なる複数のオルガネラにおける局在量を定量し、前記核酸の細胞内動態を分析する方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、「細胞」とは、生物体から分離された状態で存在する細胞を意味し、現に生物体を構成している細胞は含まれない。
本発明で使用する細胞は真核細胞又は原核細胞のいずれであってもよい。また、本発明で使用する細胞が由来する生物種は特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましく、哺乳動物であることがさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。また、本発明で使用する細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等を使用することができる。
【０００９】
本発明において、「核酸」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの他、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸の塩基長は特に限定されるものではなく、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドのいずれであってもよい。また、核酸は一本鎖及び二本鎖のいずれの状態であってもよく、これらの混合状態であってもよい。
【００１０】
本発明において、オルガネラの種類は特に限定されるものではなく、例えば、核、細胞膜、細胞質ゾル、細胞骨格、リソソーム、エンドソーム、小胞体、ゴルジ体、ペルオキシソーム、微小管、ミトコンドリア、葉緑体、液胞、細胞壁等が挙げられる。本発明においては、これらのうち１種類を標的オルガネラとしてもよいし、２種類以上を標的オルガネラとしてもよい。
【００１１】
本発明において、「ポリカチオン性物質」とは、その分子中にカチオン性基を有する物質を意味し、核酸と複合体を形成し得る限り、その種類は特に限定されるものではないが、例えば、カチオン性脂質；カチオン性脂質（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））によって形成されるカチオン性リポソーム；カチオン性基を有する中性リポソーム；カチオン性基を有する高分子ミセル；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体（例えばステアリル化誘導体）；ポリエチレンイミン等のポリカチオン性ポリマー；硫酸プロタミン等が挙げられる。カチオン性物質が有するカチオン性基の数は特に限定されるものではないが、好ましくは２個以上である。カチオン性基は正に荷電し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアニジノ基等が挙げられる。
【００１２】
本発明において、「第一の蛍光色素」と「第二の蛍光色素」とは異なる蛍光色素である。２種類以上のオルガネラを標的とする場合、第一の蛍光色素として、オルガネラの種類ごとに異なる蛍光色素を選択することができる。また、２種類以上の核酸を使用する場合、第二の蛍光色素として、核酸の種類ごとに異なる蛍光色素を選択することができる。
【００１３】
第一の蛍光色素として使用し得る蛍光色素は、標的オルガネラを染色し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、核の染色についてはＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ等、エンドソーム／リソソームの染色についてはＬｙｏｔｒａｃｋｅｒ、Ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒ等、ミトコンドリアについてはＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ、ＭｉｔｏＲｅｄ等を使用することができる。また、第二の蛍光色素として使用し得る蛍光色素は特に限定されるものではないが、例えば、Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、ＣｙＣｈｒｏｍｅ、ＰｅｒＣＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＰｈａｒＲｅｄ等の他、Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５，Ｃｙ７等のＣｙ系色素、Ａｌｅｘａ−４８８，Ａｌｅｘａ−５３２，Ａｌｅｘａ−５４６，Ａｌｅｘａ−６３３，Ａｌｅｘａ−６８０等のＡｌｅｘａ系色素、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ，ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−等のＢＯＤＩＰＹ系色素、量子ドット等が挙げられる。
【００１４】
本発明において、工程（ａ）及び（ｂ）の前後は特に限定されないが、通常は工程（ａ）の後に工程（ａ）を行う。工程（ｃ）及び（ｄ）は、工程（ａ）及び（ｂ）の後に行う。工程（ｃ）及び（ｄ）の前後は特に限定されないが、通常は工程（ｃ）の後に工程（ｄ）を行う。工程（ｆ）は工程（ｅ）の後に行う。
【００１５】
工程（ａ）において、第一の蛍光色素による標的オルガネラの染色は常法に従って行うことができる。第一の蛍光色素による染色は、標的オルガネラ全体に対して行うことが好ましい。これにより、標的オルガネラ全体における核酸の局在量を定量することができる。
【００１６】
工程（ｂ）において、細胞に導入されるポリカチオン性物質と核酸との複合体複合体の数は特に限定されないが、通常は複数の複合体が細胞に導入される。複数の複合体が細胞に導入される場合、複合体に含まれる核酸量は、いずれの複合体においても均一又はほぼ均一であることが好ましい。複合体に含まれる核酸量がいずれの複合体においても均一又はほぼ均一である場合、第二の蛍光色素による染色領域の単位面積当たりの核酸量が、異なる染色領域間で均一又はほぼ均一となるので、第二の蛍光色素による染色領域の総和面積を指標とした核酸の局在量の定量がより正確なものとなる。
【００１７】
ポリカチオン性物質と核酸との複合体は常法に従って調製することができる。ポリカチオン性物質は正に荷電しており、核酸は負に荷電しているので、両者を混合することにより容易に複合体を調製することができる。核酸含有量が均一又はほぼ均一である複合体を調製するにあたっては、ポリカチオン性物質として、カチオン性脂質（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））によって形成されるカチオン性リポソーム、ポリリジン、ステアリル化ポリリジン、ポリエチレンイミン、硫酸プロタミン等を使用することが好ましい。
ポリカチオン性物質と核酸との複合体は、粒径３０〜３００ｎｍの粒子状であることが好ましい。
【００１８】
工程（ｂ）において、ポリカチオン性物質と核酸との複合体を細胞に導入する方法は特に限定されるものではない。当該複合体はポリカチオン性物質を含んでおり正に荷電しているので、負に荷電した細胞膜表面に静電気的に引き付けられ、エンドサイトーシス等のメカニズムにより細胞内に導入させることができる。エンドサイトーシスを利用する場合には、ポリカチオン性物質と核酸との複合体を細胞に接触させることにより当該複合体を細胞に導入することができる。
【００１９】
工程（ｃ）において、「細胞と交差する平面」は仮想の平面であり、自由に選択することができる。
工程（ｃ）において、細胞と交差する平面上に存在する第一の蛍光色素が発する蛍光を検出する方法は特に限定されるものではないが、例えば、共焦点レーザー顕微鏡を利用して検出することができる。共焦点レーザー顕微鏡を利用する場合、焦点面上に存在する第一の蛍光色素が発する蛍光を検出することができ、共焦点レーザー顕微鏡により得られた二次元像から、焦点面上における標的オルガネラの存在領域を容易に決定することができる。
【００２０】
工程（ｄ）において、細胞と交差する平面上に存在する第二の蛍光色素が発する蛍光を検出する方法は特に限定されるものではないが、例えば、共焦点レーザー顕微鏡を利用して検出することができる。共焦点レーザー顕微鏡を利用する場合、焦点面上に存在する第二の蛍光色素が発する蛍光を検出することができ、共焦点レーザー顕微鏡により得られた二次元像から、標的オルガネラの存在領域のうち、第二の蛍光色素によって染色された領域（第二の蛍光色素による染色領域）の面積を容易に算出することができる。標的オルガネラの存在領域は第一の蛍光色素によって染色されているので、標的オルガネラの存在領域のうち、第二の蛍光色素によって染色された領域は、第一の蛍光色素の蛍光色と第二の蛍光色素の蛍光色との合成蛍光色で染色されている。例えば、第一の蛍光色素の蛍光色が赤色で、第二の蛍光色素の蛍光色が緑色である場合には、両者の合成蛍光色である黄色で染色され、第一の蛍光色素が赤色で、第二の蛍光色素が青色である場合には、両者の合成蛍光色である桃色で染色される。
【００２１】
工程（ｅ）において、複数の平面として、細胞と交差し、かつ細胞内において互いに交差しない複数の平面を選択することが好ましい。同一の第二の蛍光色素による染色領域について重複して面積が算出されることを避けるためである。これにより、工程（ｆ）で算出される第二の蛍光色素による染色領域の総和面積が、標的オルガネラにおける核酸の局在量を正確に反映する。
【００２２】
工程（ｅ）において、細胞と交差し、かつ細胞内において互いに交差しない複数の平面として、例えば、重力方向（すなわち細胞の厚みの方向）に対して垂直な平面を選択することができる。
工程（ｅ）において、複数の平面の数は２以上である限り特に限定されるものではないが、１５以上であることが好ましく、２０以上であることがさらに好ましい。平面の数が多いほど、第二の蛍光色素による染色領域の総和面積を指標として、標的オルガネラにおける核酸の局在量を正確に定量することができる。
【００２３】
工程（ｆ）において算出された第二の蛍光色素による染色領域の総和面積は、標的オルガネラにおける核酸の局在量を正確に反映する。すなわち、第二の蛍光色素で標識した核酸を他の物質と複合体化することなく細胞に導入した場合、異なる核酸に結合している第二の蛍光色素同士が重なり合う可能性があり、その場合には第二の蛍光色素による染色領域の面積は、その領域に含まれる核酸量を正確に反映しない。これに対して、本発明においては、第二の蛍光色素で標識した核酸をポリカチオン性物質と複合体化して細胞に導入するので、第二の蛍光色素で標識した核酸はポリカチオン性物質で囲まれた状態にあり、異なる核酸に結合している第二の蛍光色素の間にはポリカチオン性物質が介在することとなる。これにより、異なる核酸に結合している第二の蛍光色素同士が重なり合うことが防止され、第二の蛍光色素による染色領域の面積は、その領域に含まれる核酸量を正確に反映し、第二の蛍光色素による染色領域の面積が大きいほど、その領域に含まれる核酸量が多く、第二の蛍光色素による染色領域の面積が小さいほど、その領域に含まれる核酸量が少ないということになる。したがって、工程（ｆ）において、第二の蛍光色素による染色領域の総和面積を算出することにより、標的オルガネラ全体における核酸の局在量を正確に定量することができる。
【００２４】
異なる複数のオルガネラについて、第二の蛍光色素による染色領域の総和面積を算出し、異なる複数のオルガネラ間で比較することにより、異なる複数のオルガネラ間における核酸の局在比率を算出することができ、これによって細胞に導入した核酸の細胞内動態を分析することができる。第二の蛍光色素による染色領域の総和面積を、異なる複数のオルガネラ間で比較する際には、工程（ｅ）において選択する複数の平面を同一とすることが好ましい。細胞に導入した核酸の細胞内動態に関する情報は、核酸導入に当たって使用するベクターを開発、最適化等する上で有用である。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
なお、実施例では以下の略語を用いられる。
Ａｍｐ：アンピシリン
ＤＡＰＩ：４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール  ジヒドロクロライド（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
Ｄ’ＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地（ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）
ＦＣＳ：ウシ胎子血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）
ＬＢ：ＬＢ培地
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８：ビスベンズイミド  Ｈ３３２５８  （ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ  Ｈ３３２５８）
ＰＢＳ：リン酸緩衝化生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）
Ｒ８：オクタアルギニン（ｏｃｔａａｒｇｉｎｉｎｅ）
ＳＴＲ８：ステアリルオクタアルギニン（ｓｔｅａｒｙｌ  ｏｃｔａａｒｇｉｎｉｎｅ）
【００２６】
１．共焦点レーザー顕微鏡を用いた３重染色の確立
（１）実験方法
▲１▼プラスミドＤＮＡ（ｐＱＢＩ２５−６３）の調製
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ／ｐＱＢＩ２５−６３をＬＢ  ａｍｐ（７ｍｌ）中に入れ、３７℃で半日振とう培養した。この培養液５ｍｌをＬＢ  ａｍｐ（５００  ｍｌ）中に入れたものを２本調製し、３７℃で一晩振とう培養した。この培養液を４℃，６０００×ｇの条件下で１５分間遠心した後、上清を除き、ＱＩＡＧＥＮ  ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、プロトコールに従い、精製した。精製したプラスミドＤＮＡは２００倍希釈して、ＵＶを測定し、収量を求めた（収量：５２８．６μｇ）。また、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＭｌｕＩ処理による確認も行った。
【００２７】
▲２▼ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の培養
非動化したＦＣＳを１０％加えたＤ’ＭＥＭを培地としてＮＩＨ／３Ｔ３細胞を培養した。
【００２８】
▲３▼プラスミドＤＮＡの蛍光標識
Ｌａｂｅｌ  ＩＴ  ＣＸ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＰａｎＶｅｒａ，  Ｍｅｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｓｉｎｅ）を用いて、プロトコールに従い、プラスミドＤＮＡを蛍光標識した。標識後、エタノール沈殿法によってプラスミドＤＮＡを精製した。
【００２９】
▲４▼トランスフェクション
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。トランスフェクション時には、最も細胞がはがれにくかったディッシュである、Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ  Ｃｅｌｌｗａｒｅ  ３５ｍｍ  Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ−ｂＢｏｔｔｏｍ  Ｄｉｓｈｅｓ（ＦＡＬＣＯＮ社製）を用いた。トランスフェクション２４時間前に２．５×１０５ｃｅｌｌｓを播き、非動化した１０％ＦＣＳを含むＤ’ＭＥＭ中でインキュベートした。トランスフェクション直前にＦＣＳを除いたＤ’ＭＥＭと交換し、ここに蛍光標識をしたプラスミドＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とともに加え、一定時間細胞培養条件でインキュベートした。なお、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅはカチオン性脂質であり、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅよってカチオン性リポソームが形成され、これがプラスミドＤＮＡと複合体を形成する。
【００３０】
▲５▼細胞内オルガネラの染色
核染色試薬としてＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（ＷＡＫＯ純薬社製）を用いた。ＤＡＰＩは１００μＭとなるように一度滅菌水に溶かし、最終的に５０μＭまでＰＢＳ（−）を用いて希釈し、これを１ｍｌ細胞溶液に加え、５分間細胞培養条件でインキュベートした。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８は１ｍｇ／ｍｌとなるように滅菌水に溶かし、最終的に１００μｇ／ｍｌまでＰＢＳ（−）を用いて希釈し、さらに１０％ＦＣＳを含むＤ’ＭＥＭを用いて２０μｇ／ｍｌに希釈した後、そのうち１ｍｌを細胞に加え、１０分間室温でインキュベートした。
【００３１】
エンドソーム／リソソームの染色試薬としてＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  ＤＮＤ−９９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）及びＬｙｓｏｓｅｎｓｏｒ  ＤＮＤ−１８９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いた。ＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒをＰＢＳ（−）で１０倍に希釈し１０μＭとした。これのうち５ｍｌをＦＣＳ不含の１ｍｌのＤ’ＭＥＭに加え、これを細胞に添加し、３０分間細胞培養条件でインキュベートした。Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒについては、ＦＣＳ不含の１ｍｌのＤ’ＭＥＭに原液のまま１μｌ加え、これを細胞に添加し、細胞倍養条件で３０分間インキュベートした。
【００３２】
▲６▼共焦点レーザー顕微鏡による観察
トランスフェクション後一定時間インキュベートした細胞に前述した方法でＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ又はＬｙｓｏｓｅｎｓｏｒを用いてエンドソーム／リソソームを染色した。染色後Ｄ’ＭＥＭ（＋１０％ＦＣＳ）で細胞を洗浄し、さらに前述した方法でＤＡＰＩ又はＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８を用いて核を染色した。（ここまでのインキュベート時間を０．５，１，１．５，２，２．５，３．５時間の６ポイントに設定した。）Ｄ’ＭＥＭ（＋１０％ＦＣＳ）で細胞を３回洗浄した後、Ｄ’ＭＥＭ（＋１０％ＦＣＳ）を１ｍｌ加え、細胞を固定せずにＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０  共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。ここで、細胞を固定せずに観察した理由は、細胞を固定すると、ＬｙｓｏｓｅｎｓｏｒやＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒがグルタルアルデヒド等の有機化合物を含む固定剤によって細胞質に一様に拡散してしまうためである。拡散の理由は、染色試薬のｐＨ依存性が壊れてしまったためではないかと考えられる。
【００３３】
（２）実験結果
▲１▼ＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒとＬｙｓｏｓｅｎｓｏｒによる染色結果の比較
同時にＬｙｏｔｒａｃｋｅｒとＬｙｓｏｓｅｎｓｏｒを用いてエンドソーム／リソソームを染色したときの様子を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その結果、Ｌｙｏｔｒａｃｋｅｒ、Ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒともにほぼ同様の局在の様子を示すことが確認できた。したがって、これらの試薬がエンドソーム／リソソームを正確に染色していることが明らかとなった。また、共焦点レーザー顕微鏡の画像から、Ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒがよりすべての細胞を均一に染色していることが確認できたため、以後の試験では、Ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒを用いてエンドソーム／リソソームの染色を行うことにした。
【００３４】
▲２▼ＤＡＰＩとＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８による核染色結果
核染色試薬としてＤＡＰＩを選択した場合、Ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒが細胞質に一様に拡散してしまうことが明らかとなった。次に、核染色試薬であるＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８を用いてみたところ、Ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒの細胞質への拡散が観察されなくなった。この原因は、ＬｙｓｏｓｅｎｓｏｒのｐＨ依存性にＤＡＰＩのみが影響を与えたことにあると考えられる。したがって、以後の試験では、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を用いて核の染色を行うことにした。
【００３５】
２．３重染色画像を用いた定量的評価系の確立
共焦点レーザー顕微鏡を利用して、１つの細胞のＺ軸方向（細胞の厚さの方向）に連続的なｘ−ｙ断面画像を取得し（図１参照）、コンピューター解析ソフトであるアクアコスモスにより定量解析した。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅで標識したプラスミドＤＮＡは、細胞質に存在するときは赤色を呈し、エンドソーム／リソソームに存在するときはＬｙｓｏｓｅｎｓｏｒの緑色と混ざって黄色を呈し、核内に存在するときはＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８の青色と混ざって桃色を呈した。ここで、９０％以上が同一色に染色された領域をプラスミドＤＮＡの存在領域と判断した。各々のオルガネラの存在領域のうち、プラスミドＤＮＡの存在領域を特定し、１つのｘ−ｙ断面画像において各オルガネラに含まれるプラスミドＤＮＡの存在領域の面積を計算し、これを各オルガネラにおけるプラスミドＤＮＡの局在量の指標とした。さらに、各ｘ−ｙ断面画像において各オルガネラに含まれるプラスミドＤＮＡの存在領域の面積を総和し、各オルガネラにおけるプラスミドＤＮＡの存在領域の総和面積の比率を求めることにより、各オルガネラにおけるプラスミドＤＮＡの局在量の比率を求めた。
【００３６】
この際、ｘ−ｙ断面画像数について最適化を行った。ｘ−ｙ断片画像数を３０個に設定し、４つの細胞について、５、１０、１５、２０、２５個のｘ−ｙ断面画像を均等に抽出し、各ｘ−ｙ断面画像から各オルガネラに含まれるプラスミドＤＮＡの存在領域の総和面積を求め、これを指標として、各オルガネラにおけるプラスミドＤＮＡの局在量の比率を求めた。結果を図２に示す
図２に示すように、ｘ−ｙ断面画像数が１５個以上、好ましくは２０個以上であると、各オルガネラにおけるプラスミドＤＮＡの局在量の比率について、測定値が安定することが判明した。すなわち、ｘ−ｙ断面画像数がｘ−ｙ断面画像数が１５個以上、好ましくは２０個以上であると、各オルガネラ全体におけるプラスミドＤＮＡの局在量を正確に定量できることが判明した。
【００３７】
３．本評価系を用いたプラスミドＤＮＡの細胞内動態の時間的追跡
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅによるプラスミドＤＮＡ導入の所定時間後において、各オルガネラへのプラスミドＤＮＡの分布を解析した。各時間において１０個の細胞を解析に用いた。結果を図３に示す。
【００３８】
図３に示すように、すべてのオルガネラにおいて非常に大きなヘテロジェネティが認められることが明らかとなった。この非常に大きなヘテロジェネティの原因の一つとして、トランスフェクションした細胞の細胞周期がそろっていないということが考えられたが、同調細胞を用いた実験においてもヘテロジェネティが認められた（データは示さず）。
【００３９】
プラスミドＤＮＡの核膜透過過程は核膜消失のおこるＭ期に促進されることがこれまで明らかになっているが、図３に示す結果から、エンドサイトーシス過程及びエンドソームから細胞質への移行過程においてもこのような細胞同期依存性があることが示唆される。まず、エンドソーム／ライソソーム及び細胞質への分布を考えると、バラツキは大きいが約８０％の細胞で、エンドソームにおけるプラスミドＤＮＡの存在が認められることから、従来の報告通り、エンドサイトーシスが１つのメジャーな細胞内取り込みメカニズムであると考えられる。一方で、いくつかの細胞においては、３０分、１時間という速い時間で５０〜７０％のプラスミドＤＮＡが細胞質中に存在しており、これらの細胞においてはエンドソーム中への分布がほとんど確認されないことから、これらの細胞ではエンドサイトーシス以外のメカニズムで細胞質に導入される可能性が示唆される。さらに核膜透過に注目すると１．５時間後までは上昇するが、その後減少することから、核内へ取り込まれた後の分解又は核外への排出、核への取り込みクリアランスの低下が示唆される。多くの細胞で３．５時間では核膜付近にプラスミドＤＮＡが存在することからも、核からの排出メカニズムの存在が支持されると考えられる。
【００４０】
４．本評価系によるＲ８とＳＴＲ８を用いたプラスミドＤＮＡの核移行量の比較実験
（１）実験方法
▲１▼トランスフェクション
マイクロチューブに血清不含のＤ’ＭＥＭを１００ｍｌ加えた後、蛍光標識したプラスミドＤＮＡを１ｍｇの加え、よく攪拌した。そこに１００ｍｌの血清不含のＤ’ＭＥＭに溶解した９．５ｍｌのＲ８を加え、よく攪拌し、３０分間室温で放置した。３０分後、血清不含のＤ’ＭＥＭ  ４００ｍｌを加え、よく攪拌し、これを上記と同様にして準備した細胞に添加し、インキュベートした。
ＳＴＲ８に関してもＲ８と同様にして、マイクロチューブに血清不含のＤ’ＭＥＭを１００ｍｌ加えた後、１ｍｇの蛍光標識したプラスミドＤＮＡ加え、よく攪拌した。そこに１００ｍｌの血清不含のＤ’ＭＥＭに溶解した６．３５ｍｌのＳＴＲ８を加え、よく攪拌し、３０分間室温で放置した。３０分後、血清不含のＤ’ＭＥＭ  ４００ｍｌを加え、よく攪拌し、これを上記と同様にして準備した細胞に添加し、インキュベートした。
【００４１】
▲２▼共焦点レーザー顕微鏡による観察
インキュベート時間はトランスフェクション後１時間、３時間とし、以降、上記と同様の方法で観察した。
【００４２】
（２）実験結果
ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ）−１  Ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ４８−６９）における基本的なペプチドは、細胞膜浸透性を持つペプチドで、外来分子（遺伝子，タンパク等）を効率よく細胞内に運ぶキャリアーとして知られている。アルギニン−ｒｉｃｈ  ペプチドもＴａｔ−（４８−６９）と非常によく似た細胞内への導入が観察されることが知られている。本研究で用いたＲ８及びＳＴＲ８はともにアルギニン−ｒｉｃｈ  ペプチドであり、遺伝子キャリアーとして報告されており、特にＳＴＲ８はＲ８に比較して非常に高い発現効率をしめすことが報告されている。それぞれのペプチドとプラスミドＤＮＡとの複合体を調製し、各複合体の細胞内動態を本評価系によって定量解析した。
【００４３】
まず、各複合体の細胞内における局在の様子を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その画像からＲ８とプラスミドＤＮＡとの複合体（以下「Ｒ８複合体」という。）は、１時間及び３時間において細胞内にあまり存在していなかった。細胞内に見られたＲ８複合体は、１時間及び３時間ともにエンドソーム／リソソームに局在している様子が観察された。また１時間及び３時間どちらにおいても核内に存在するＲ８複合体を観察することはできなかった。一方、ＳＴＲ８とプラスミドＤＮＡとの複合体（以下「ＳＴＲ８複合体」）は１時間では細胞膜周辺に凝集している様子や、エンドソームに約半数近くの細胞で局在している様子が観察された。さらに、Ｒ８複合体においては観察できなかった核膜周辺に、ＳＴＲ８複合体の局在している様子を観察できた。３時間においては核内に存在しているＳＴＲ８複合体を観察することができた。
【００４４】
つぎに、より詳細に各複合体の細胞内動態を観察するために、本評価系を用いて５個の細胞について定量解析を行った。解析の結果、１時間，３時間ともにＲ８複合体はエンドソーム／リソソームに９０％以上の細胞で局在しており、このことからエンドサイトーシスによって取り込まれたことが示唆される。また、３時間においてもほとんどがエンドソーム／リソソームに存在することから、細胞質への放出効率が低いことが考えられた。
【００４５】
一方、ＳＴＲ８複合体に関しては１時間において６０％の細胞でエンドソーム／リソソームに存在していることから、やはりエンドサイトーシスによる細胞内への取込が示唆される。さらに３時間においては７０％近くの細胞において細胞質や核膜周辺にＳＴＲ８複合体が局在していること、４０％の細胞で核内移行が観察されたことから、ＳＴＲ８複合体がエンドソームから細胞質に放出され、核膜透過が生じたと考えられる。このことから、ＳＴＲ８の細胞質への放出効率が高いのではないかということが示唆された。
【００４６】
【発明の効果】
本発明により、細胞に導入した核酸の標的オルガネラ全体おける局在量を正確に定量する方法、及び当該方法を利用して細胞に導入した核酸の細胞内動態を分析する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】共焦点レーザー顕微鏡によって得られる、１つの細胞のＺ軸方向（細胞の厚さの方向）に連続的なｘ−ｙ断面画像に関する説明図である。
【図２】ｘ−ｙ断面画像数と、各ｘ−ｙ断面画像数に基づいて算出された各オルガネラにおけるプラスミドＤＮＡの局在量の比率との関係を示す図である。
【図３】プラスミドＤＮＡの細胞内動態の時間的変化を示す図である。
【図１】
2004357641.tif 000002
【図２】
2004357641.tif 000003
【図３】
2004357641.tif 000004