(57)【要約】【課題】３種類以上の標識源を同時に導入でき、且つ検出感度が高く、更に標識源を効率的に核酸類に導入することが可能なポリヌクレオチドの標識化法を提供する。【解決手段】式（１）〜式（４）のいずれかで示される安定同位体を含有する化合物。【化１】2004284965.tif 000033（式中、Ｍは鉄、もしくはニッケルを表し、ｍは２から６の整数を表し、Ｘは水素原子もしくは水酸基を表す）。上記標識化合物を用いた場合には、多種類の標識源を、効率的にポリヌクレオチドに導入することができる。更に、ＤＮＡチップに応用した場合には、微量発現遺伝子の検出ないしは多標識化の新しい機能を付与することができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）〜式（４）のいずれか
【化１】
2004284965.tif 000021
（式中、Ｍは鉄、ルテニウム、コバルトもしくはニッケルを表し、ｍは２から６の整数を表し、Ｘは水素原子もしくは水酸基を表す。）で示される安定同位体を含有する化合物、またはその塩。
【請求項２】
式（１）または式（２）
【化２】
2004284965.tif 000022
（式中、Ｍは鉄であり、ｍは３から５の整数であり、Ｘは水素原子もしくは水酸基を表す。）で示される請求項１記載の安定同位体を含有する化合物またはその塩。
【請求項３】
式（３）または式（４）
【化３】
2004284965.tif 000023
（式中、Ｍは鉄であり、ｍは３から５の整数であり、Ｘは水酸基を表す。）で示される請求項１記載の安定同位体を含有する化合物。
【請求項４】
請求項１から請求項３記載のいずれかで示される化合物を含有する水溶液。
【請求項５】
式（１）〜（４）のいずれかで示される化合物で、リン酸基の対カチオンが、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウムの少なくとも一つから選ばれる請求項１から請求項４いずれか記載の安定同位体を含有する化合物の塩。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載された安定同位体を含有する化合物、その塩、もしくはそれを含有する水溶組成物を、ヌクレオチドの共存下に重合させて得られる、安定同位体を含有する重合体もしくはその重合体の水溶組成物。
【請求項７】
式（１）または式（２）
【化４】
2004284965.tif 000024
（式中、Ｍは鉄、ルテニウム、コバルトもしくはニッケルを表し、ｍは２から６の整数を表し、Ｘは水素原子もしくは水酸基を表す。）で示される安定同位体を含有する化合物、その塩、もしくはそれを含有する水溶液組成物を、２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸、および２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸の４種類のヌクレオチドの共存下に重合させて得られる安定同位体を含有する重合体もしくはその重合体の水溶組成物。
【請求項８】
式（１）〜式（４）のいずれか
【化５】
2004284965.tif 000025
（式中、Ｍは鉄、ルテニウム、コバルトもしくはニッケルを表し、ｍは２から６の整数を表し、Ｘは水素原子もしくは水酸基を表す。）で示される安定同位体を含有する化合物、その塩、もしくはその水溶組成物を、アデノシン−５’−三リン酸、シチジン−５’−三リン酸、グアノシン−５’−三リン酸、およびウリジン−５’−三リン酸の４種類のヌクレオチドの共存下に重合させて得られる安定同位体を含有する重合体もしくはその重合体の水溶組成物。
【請求項９】
式（５）
【化６】
2004284965.tif 000026
（式中、Ａは水素原子もしくは水酸基を表し、Ｂはピリミジン塩基もしくはプリン塩基を表し、Ｒは典型金属元素、遷移金属元素、硫黄原子、ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子、およびフッ素原子から選ばれるいずれかを含有する分子団もしくは水素原子を表し、ｑは１から５０００の整数を表す。）で示される安定同位体を含有する化合物もしくはそれを含有する組成物に対してエネルギーを照射して、該化合物を構成成分に分解・イオン化し、イオン化された構成成分をマススペクトルにより検出することを特徴とする分析方法。
【請求項１０】
式（５）
【化７】
2004284965.tif 000027
（式中、Ａは水素原子もしくは水酸基を表し、Ｂはピリミジン塩基もしくはプリン塩基を表し、Ｒは典型金属元素、遷移金属元素、硫黄原子、ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子、およびフッ素原子から選ばれるいずれかを含有する分子団もしくは水素原子を表し、ｑは１から５０００の整数を表す。）で示される安定同位体を含有する化合物もしくはその構成成分およびそれらを含有する水溶組成物を、質量差の違いから分離するクロマトグラフィーシステムにより、質量別に分離することを特徴とする分析方法。
【請求項１１】
式（６）〜式（９）のいずれかで示される化合物
【化８】
2004284965.tif 000028
（式中、Ｍは鉄、ルテニウム、コバルトもしくはニッケルを表し、ｍは２から６の整数を表し、Ｘは水素原子もしくは水酸基を表し、Ａは水酸基、モノリン酸エステルもしくは、ジリン酸エステルを表す。）、もしくは、それらを含有する水溶組成物。
【請求項１２】
式（６）または式（７）
【化９】
2004284965.tif 000029
（式中、Ｍは鉄を表し、ｍは３から５の整数を表し、Ｘは水素原子もしくは水酸基を表し、Ａは水酸基、モノリン酸エステルもしくは、ジリン酸エステルを表す。）で示される請求項１０記載の化合物、もしくは、それらを含有する水溶組成物。
【請求項１３】
式（８）または式（９）
【化１０】
2004284965.tif 000030
（式中、Ｍは鉄を表し、ｍは３から５の整数を表し、Ｘは水酸基を表し、Ａは水酸基、モノリン酸エステルもしくは、ジリン酸エステルを表す。）で示される請求項１０記載の化合物、もしくは、それらを含有する水溶組成物。
【請求項１４】
式（１０）で示される化合物。
【化１１】
2004284965.tif 000031
（式中、Ｍは鉄、ルテニウム、コバルトもしくはニッケルを表し、ｍは３から５の整数を表し、ｎは１から３の整数を表し、Ｄ−Ｄは炭素炭素二重結合もしくは炭素炭素三重結合を表し、Ｒ’は水素原子、もしくは炭素数１〜４のアルキル基を表す。）
【請求項１５】
式（１１）または式（１２）で示される化合物。
【化１２】
2004284965.tif 000032
（式中、ｍは３から５の整数を表す。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体関連高分子（例えば、核酸等のポリヌクレオチド）の検出を目的とする標識化合物ないし該高分子の分析方法に関する。より詳しくは、本発明は、標識源として安定同位体元素を用いることを特徴とし、安定同位体元素を分子内に有するヌクレオチド誘導体からなる標識化合物に関する。本発明は、このような該標識化合物に加えて、その重合体およびその中間体をも提供する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸等の生体関連高分子の検出法に関しては、既に多くの研究がなされてきた。これらの検出方法の一つとして、目的対象物質を認識するために、何らかの信号を発する標識源を目的対象物質に導入するという手法が頻繁に用いられるため、それらの標識源または標識方法に関しては、従来より種々の検討がなされている。
【０００３】
ｃＤＮＡ等のポリヌクレオチド類を対象とした標識法を、標識源の種類と標識源の導入方法の２つの側面から分類する。
【０００４】
（表１）
【０００５】
標識源の種類から分類すると主に以下の３つの項目が挙げられる。
【０００６】
１）放射性同位体元素を標識源とし、放射線を検出する方法。
【０００７】
２）蛍光物質を標識源とし、蛍光を検出する方法。蛍光源としてはシアニン系有機色素化合物を使用する技術（米国特許第５２６８４８６（特許文献１）、特許第２８９８２６４号（特許文献２）、特許第２７５７９６５号（特許文献３））、ビオチン等の有機色素化合物を使用する技術（ＷＯ８６０２９２９（特許文献４））等がある。その他には蛍光源として蛍光半導体を用いる技術等が研究されている（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２２，Ｎ０．１６，ｐｐ．３４１８（１９９４））（非特許文献１）。
【０００８】
３）安定同位体元素を標識源として用いる方法。例として米国特許第５７８０２３（特許文献５）、およびＧｅｎｏｍｉｃｓ，ｖｏｌ．９，ｐｐ．５１−５９（１９９１）（非特許文献２）がある。
【０００９】
次に、標識源の導入方法から分類すると以下のＡ）とＢ）の２種類に分類される。
Ａ）ポリヌクレオチド（核酸）に標識化する方法
Ｂ）ヌクレオチドに標識源を結合させた標識化ヌクレオチドを重合して標識化されたポリヌクレオチドを合成する方法。
【００１０】
具体的に例示すると、Ａ）ではｃＤＮＡ等のポリヌクレオチドの５’位末端にアミノ基を有するリンカーを介在させて、そのリンカーのアミノ官能基に標識化反応剤を導入する技術がある。Ｂ）では標識化ヌクレオチドを天然ヌクレオチドとともに酵素等の共存下に重合させて標識化ヌクレオチドを構成成分として含有するポリヌクレオチド類を合成する技術がある。
【００１１】
【表１】
2004284965.tif 000002
【００１２】
【特許文献１】
米国特許第５２６８４８６号
【特許文献２】
特許第２８９８２６４号
【特許文献３】
特許第２７５７９６５号
【特許文献４】
ＷＯ８６０２９２９号
【特許文献５】
米国特許第５７８０２３号
【００１３】
【非特許文献１】
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２２，Ｎ０．１６，ｐｐ．３４１
８（１９９４）
【非特許文献２】
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｖｏｌ．９，ｐｐ．５１−５９（１９９１）
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記した既存技術には以下の課題がある。
【００１５】
すなわち、放射性同位体元素を標識源に用いる技術は、人体への影響が避けられず、その取り扱いには制約がある。また、標識源は単一種の放射線を検出するシステムであり、１回の分析からは１情報しか得られない欠点がある。
【００１６】
蛍光物質を標識源として用いる技術では、一般に、２種類蛍光技術が用いられる。２種類蛍光標識技術とは、２種類の蛍光標識化合物が互いに異なる波長の蛍光を発することにより検出できる仕組みであり、各蛍光化合物が発する蛍光波長の違いを検出機が読みとることにより、検出部分にどのような標識がなされているかを判別する方法である。
【００１７】
従って、多種類の情報を並列に得るシステムを構築するためには、多種類の蛍光標識化合物のそれぞれが、互いに異なる蛍光波長で蛍光を放出し、且つ各波長帯の蛍光強度が同一程度である必要がある。
【００１８】
しかし、現在のところ、上記要件を満足させうる蛍光化合物は多くは存在しないため、２種類の蛍光標識が一般的であり、３種類以上は実用面からするとほぼ不可能に近い。
【００１９】
また、蛍光物質を標識源として用いる技術には感度不足の問題がある。ＤＮＡチップで行われるｃＤＮＡの検出例をもって説明する。
【００２０】
多くの遺伝子の中から疾病等に関連する変異遺伝子を検出する場合、変異遺伝子は発現量がわずかであるために、その検出には高い感度が要求される。しかしながら、現在実用化されている蛍光強度が強いとされるＣｙ３，Ｃｙ５と称される蛍光標識化合物を用いても感度が不足し、変異遺伝子を十分に検出することはできない。
【００２１】
安定同位体元素を標識源に用いる技術には、ｃＤＮＡの５’末端部位の１カ所のみを標識する技術が存在する。しかしながら、このような安定同位体元素標識の技術には、１）標識源の導入量が低い、２）ＤＮＡの標識化は、煩雑な操作と標識化までに時間かかるというの２つの問題点がある。
【００２２】
上記問題１）の導入量の点では、一般的なｃＤＮＡが、５００塩基から２０００塩基のヌクレオチド重合体であるのに対して、上記した安定同位体元素標識の技術ではｃＤＮＡの５’末端部位の１カ所しか安定同位体標識源を導入できないため、ｃＤＮＡ全体に対する標識源の割合は高々０．５％であり、かなり感度の高い検出装置を用いない場合には、微量に存在するｃＤＮＡを検出することはできない。
【００２３】
他方、上記した２）の煩雑な操作等の点では、ｃＤＮＡに安定同位体標識源を連結するためには、ｃＤＮＡの５’末端部位の水酸基に、一旦リンカーとなる物質を作用させ、その後、そのリンカー化合物が有するアミノ基等の結合部分に安定同位体標識源を有する反応剤を作用させ、安定同位体源をｃＤＮＡに（リンカーを介して）連結させる煩雑な工程が通常は必要とされている。
【００２４】
上述したように、３種類以上の標識源を同時に導入でき、且つ検出感度が高く、更に標識源を効率的に核酸類に導入することが可能なポリヌクレオチドの標識化法は、これまで存在しなかった。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために発明者らは、鋭意検討した結果、式（１）〜式（４）
【００２６】
【化１３】
2004284965.tif 000003
【００２７】
（式中、Ｍは鉄、ルテニウム、コバルトもしくはニッケルを表し、ｍは２から６の整数を表し、Ｘは水素原子もしくは水酸基を表す。）のいずれかで表される安定同位体元素を含有するヌクレオチド誘導体（標識化合物）およびそれを用いた分析方法を見出した。
【００２８】
当該化合物を用いた分析方法は、安定同位体元素を標識源とするために、従来の蛍光標識、放射性同位体標識にはない、多種類の標識源を保有できる利点がある。
【００２９】
多種類の標識源を利用する場合の考え方を、安定同位体元素として鉄元素を用いた例をもって説明する。この場合には、鉄の同位体種として５４Ｆｅ，５６Ｆｅ，５７Ｆｅ，５７Ｆｅの４種を各々別々にヌクレオチド誘導体に結合させる。各化合物は同一の鉄元素を標識源に用いているが、鉄の原子量が異なるため、（分子量を指標とした場合には）４種類の標識化合物となる。更に別元素を標識源としたヌクレオチド誘導体（標識化合物）と組み合わせて用いた場合には、更に標識源の種類を増やすことができる。
【００３０】
これらの安定同位体標識の考え方では、標識源の質量の違いを認識の指標とする。質量の分布幅は、１から数十万と幅広い領域があるため、検出範囲として使用できる領域が広く、したがって蛍光標識等の従来技術より有利であり、標識種の増加は容易である。
【００３１】
また、本発明は、安定同位体元素を標識源とする従来技術に対しても以下の優位性を有する。
【００３２】
本発明の標識化ヌクレオチドは、安定同位体標識源をヌクレオチドに連結させた化合物である。該化合物存在下に核酸類の合成反応を酵素等の存在下に行えば、標識源を構成成分として組み込んだポリヌクレオチド類を調製でき、しかも該ポリヌクレオチド類は、通常は安定同位体標識源を複数個導入したポリヌクレオチドになる。
【００３３】
従来技術のように単位ポリヌクレオチドに対して一つの標識源しか導入できない場合とは異なり、本発明の上記した態様においては単位ポリヌクレオチド当たりの標識源は増加しており、その増加は検出感度向上に有効である。検出感度の向上は、微量高分子を検出する当該分野では非常に重要である。
【００３４】
また、本発明は標識化ヌクレオチドを合成する操作面においても以下の利点がある。
【００３５】
従来技術では安定同位体標識源の導入前に、ヌクレオチドにリンカーを介在させる工程を必要とした。
【００３６】
これに対して、本発明の標識化ヌクレオチド誘導体を用いあ場合には、リンカー介在化工程が不要であり、効率的に標識化ポリヌクレオチド類を調製できる利点がある。
【００３７】
上述したように、本発明の安定同位体を標識源とするヌクレオチドの提供により、下記の利点を得ることができる。
１）多種類の標識源を利用できる。
２）複数の標識源をポリヌクレオチドに容易に導入できる。
３）従来安定同位体標識法と比べて、標識化ヌクレオチドを効率的に調製できる。
【００３８】
これらの利点は、本発明が臨床現場での疾患判断等に適用される場合に、その有用性がより明確化される（すなわち、より有用性が高い）。上記利点は迅速な疾患原因遺伝子の判定に結びつくため、臨床上の意義は高い。
【００３９】
すなわち、本発明は、
「式（１）〜式（４）のいずれか
【００４０】
【化１４】
2004284965.tif 000004
【００４１】
（式中、Ｍは鉄、ルテニウム、コバルトもしくはニッケルを表し、ｍは２から６の整数を表し、Ｘは水素原子もしくは水酸基を表す。）で示される安定同位体を含有する化合物、もしくは式（１）〜式（４）のいずれかで示される化合物が溶解した水溶組成物。
【００４２】
前記安定同位体を含有する化合物、もしくはその水溶組成物を、ヌクレオチドの共存下に、重合させて得られる安定同位体を含有する重合体、もしくはその重合体の水溶組成物。
【００４３】
式（５）
【化１５】
2004284965.tif 000005
【００４４】
（式中、Ａは水素原子もしくは水酸基を表し、Ｂはピリミジン塩基もしくはプリン塩基を表し、Ｒは典型金属元素、遷移金属元素、硫黄原子、ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子、およびフッ素原子から選ばれるいずれかを含有する分子団、もしくは水素原子を表し、ｑは１から５０００の整数を表す。）で示される安定同位体を含有する化合物もしくはその化合物を含有する組成物に対してエネルギーを照射して、該化合物を構成成分に分解・イオン化し、イオン化した構成成分をマススペクトルにより検出することを特徴とする分析方法。
【００４５】
式（５）
【化１６】
2004284965.tif 000006
【００４６】
（式中、Ａは水素原子もしくは水酸基を表し、Ｂはピリミジン塩基もしくはプリン塩基を表し、Ｒは典型金属元素、遷移金属元素、硫黄原子、ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子、およびフッ素原子から選ばれるいずれかを含有する分子団もしくは水素原子を表し、ｑは１から５０００の整数を表す。）で示される安定同位体を含有する化合物、その構成成分、もしくはそれらの水溶組成物を質量差の違いから分離するクロマトグラフィーシステムにより、質量別に分離することを特徴とする分析方法。
【００４７】
式（６）〜式（９）のいずれかで示される化合物、もしくは式（６）〜式（９）のいずれかで示される化合物が溶解した水溶組成物。
【００４８】
【化１７】
2004284965.tif 000007
【００４９】
（式中、Ｍは鉄、ルテニウム、コバルトもしくはニッケルを表し、ｍは２から６の整数を表し、Ｘは水素原子もしくは水酸基を表し、Ａは水酸基、モノリン酸エステルもしくは、ジリン酸エステルを表す。）
【００５０】
式（１０）で示される化合物。
【化１８】
2004284965.tif 000008
【００５１】
（式中、Ｍは鉄、ルテニウム、コバルトもしくはニッケルを表し、ｍは３から５の整数を表し、ｎは１から３の整数を表し、Ｄ−Ｄは炭素炭素二重結合もしくは炭素炭素三重結合を表し、Ｒ’は水素原子、もしくは炭素数１〜４のアルキル基を表す。）
【００５２】
式（１１）または式（１２）で示される化合物。
【化１９】
2004284965.tif 000009
【００５３】
（式中、ｍは３から５の整数を表す。）」である。
【００５４】
【発明の実施の形態】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ本発明を更に具体的に説明する。以下の記載において量比を表す「部」および「％」は、特に断らない限り質量（重量）基準とする。
【００５５】
（安定同位体元素）
本発明において、標識源として使用可能な安定同位体元素は、非放射性の同位体を有する元素である限り、特に制限されない。安定同位体の入手しやすい点からは、金属ではアンチモン、バリウム、カドミウム、カルシウム、セリウム、クロム、銅、ユウロピウム、ガリウム、ゲルマニウム、ハフニウム、インジウム、イリジウム、鉄、鉛、マグネシウム、水銀、モリブデン、ニッケル、オスミウム、パラジウム、白金、カリウム、ルテニウム、セレン、スズ、チタン、亜鉛等を用いることが好ましく、金属以外の元素では、硫黄、ケイ素、ハロゲン系元素等を用いることが好ましい。
【００５６】
（分子集合体）
本発明において使用可能な、安定同位体元素を含有する分子集合体は、上記安定同位体元素を連結した分子団である。安定同位体元素は、共有結合または配位結合により分子集合体と連結されていることが好ましい。
【００５７】
具体例としては、安定同位体元素が金属の場合には、金属と炭素鎖等が直接共有結合した有機金属化合物、または錯体のように金属を分子集合体の配位に関わる部分と配位結合により連結させた化合物等を例示することができる。連結がしやすいという点からは、メタロセン等の有機金属化合物を特に好適に使用することができる。
【００５８】
安定同位体元素が非金属元素の場合には、例えば、分子集合体である化合物に安定同位体元素を共有結合により連結した化合物が、安定同位体元素を含有する分子集合体となったもの（例えば、有機ハロゲン化物、アルキル硫黄）等が例示される。
【００５９】
（鉄元素を用いる態様）
安定同位体元素を含有する分子集合体の製造方法は特に限定されないが、ここでは、１つの好適な態様として、安定同位体元素として鉄を用いる場合を例に説明する。このように安定同位体元素として、鉄元素を用いた場合には、フェロセンなる、特に安定な有機金属を利用できるという利点がある。
【００６０】
鉄元素を含有する分子集合体たるフェロセンは、金属鉄から製造する方法、または塩化鉄（ＩＩ）から製造する方法等複数の方法が知られている。安定同位体別の鉄を用いれば、分子量の異なるフェロセンを製造することができる。また、コバルト、ロジウム、ルテニウム、イリジウム等の遷移金属を安定同位体元素として用いる場合には、ホスフィン類等と配位させることにより安定な錯体として得られる場合が多く、安定同位体別にこれらの金属を用いて錯体を製造することにより、分子量の異なる錯体を製造することができる。
【００６１】
このように化学的に安定なフェロセンや錯体は、安定同位体元素を含有する分子集合体として使用するためには好ましい分子集合体である。
【００６２】
（ヌクレオチド）
前記式（１）〜式（４）のいずれかで示される化合物等の、安定同位体を含有するヌクレオチドとは、上記の安定同位体元素を含有する分子集合体をヌクレオチドに共有結合により連結した化合物、または安定同位体元素をヌクレオチドに直接共有結合により連結した化合物である。
【００６３】
安定同位体を含有する化合物としては、重合体に含有させやすい点からは、式（１）〜式（４）、
【００６４】
【化２０】
2004284965.tif 000010
【００６５】
（式中、Ｍは鉄、ルテニウム、コバルトもしくはニッケルを表し、ｍは２から６の整数を表し、Ｘは水素原子もしくは水酸基を表す。）で示される安定同位体をのいずれかを含有する化合物が好ましい。
【００６６】
更には、化合物の安定性の点からは、式（１）または式（２）
【００６７】
【化２１】
2004284965.tif 000011
【００６８】
（式中、Ｍは鉄であり、ｍは３から５の整数であり、Ｘは水素原子もしくは水酸基を表す。）で示される安定同位体を含有する化合物や、
式（３）または式（４）
【００６９】
【化２２】
2004284965.tif 000012
【００７０】
（式中、Ｍは鉄であり、ｍは３から５の整数であり、Ｘは水酸基を表す。）で示される安定同位体を含有する化合物が特に好ましい。
【００７１】
（連結位置）
安定同位体元素を含有する分子集合体は、ヌクレオチドの任意の位置で連結することができる。合成上または重合体の製造の容易さの点からは、ヌクレオチドを構成する塩基がピリミジン塩基の場合には５位で連結され、塩基がプリン塩基の場合には８位で連結されていることが好ましい。ヌクレオチドへの連結技術は古くから検討され、ピリミジン塩基の場合には５位、およびプリン塩基の場合には８位に連結する技術は、当業者に周知である（このような連結技術の詳細に関しては、例えば「蛋白質  核酸  酵素」ｖｏｌ．１１，ｐｐ．７５０（１９６６）を参照することができる）。
【００７２】
本発明のヌクレオチドとは、プリン塩基もしくはピリミジン塩基が糖にβ−Ｎ−グリコシド結合した骨格を有するヌクレオシドと称される物質の、５’位がリン酸エステル誘導化された化合物である。
【００７３】
かかるヌクレオチドは天然に存在する化合物に限定されるものではなく，ヌクレオシド骨格のいずれかの水素原子が、メチル基、エチル基、アリール基、フッ素原子、塩素原子、もしくはヨウ素原子等により置換された化合物も包含する。更には、前記式（１）〜式（４）のいずれかで示される化合物に加えて、式（６）〜式（９）のいずれかに示される化合物も、Ａが水酸基以外の場合にはリン酸誘導体として包含される。ここに「リン酸誘導体」とは、式（１３）〜式（１５）
【００７４】
【化２３】
2004284965.tif 000013
【００７５】
で示されるモノリン酸、ジリン酸、トリリン酸もしくは、それらの塩である。
【００７６】
（標識源）
式（１）〜式（４）もしくは式（６）〜式（９）のいずれかで示される化合物において、標識源となる安定同位体元素は特に限定されないが、多種類の標識源を保有できる点からは、Ｍで示される化合物が安定同位体であることが好ましい。
【００７７】
例えばＭが鉄である態様においては、５４Ｆｅ，５６Ｆｅ，５７Ｆｅ、５７Ｆｅの４種を各々別々にＭとした式（１）を製造すれば、４種類の分子量の異なる（１）を製造することができる。
【００７８】
本発明の式（１）〜式（４）のいずれかで示される化合物の製造方法は、特に限定されない。例えば、式（６）〜式（９）のいずれかで示される化合物を３リン酸化することにより製造することができる（Ｃｈｅｍ．  Ｐａｐｅｒｓ，  ｖｏｌ．  ５０，ｐｐ．１５１（１９９６））。また、別の製造方法として、式（１）〜式（４）のいずれかで示される化合物は、例えばシチジン５’−３リン酸のように３リン酸結合を有するヌクレオチドを出発原料にして、該３リン酸原料に安定同位体元素を含有する分子集合体を化学反応により導入する方法でも製造することができる。
【００７９】
式（１）〜式（４）もしくは式（６）〜式（９）のいずれかで示される化合物は、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分取法、アルコール沈殿法等、それ自体公知の方法により精製、単離することができる。
【００８０】
（安定同位体を含有する重合体）
本発明において、安定同位体を含有する重合体の製造方法は特に限定されない。広く一般に用いられる点からはＰＣＲ反応を利用して、安定同位体を含有する重合体を製造することが好ましい。
【００８１】
このような具体的な方法の一例を以下に説明する。
【００８２】
通常、ＰＣＲ反応によるｃＤＮＡの製造では、ｃＤＮＡの原料である２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸、および２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸の４種類のヌクレオチドの混合物に、適切な添加物（例えば、塩化マグネシウム）の共存下、酵素により重合反応を進行させて製造する。ここで、上記４種類のヌクレオチドに例えば式（１）で示される化合物を共存させて重合させることにより、２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸として反応する一部が、式（１）で示される化合物に置き換わって反応することにより安定同位体を含有する重合体を製造することができる。
【００８３】
上記例に示すように酵素反応により重合体を製造する場合には、用いるべき酵素が反応を進行させるために適した条件下で重合反応を行うことが好ましい。ただし、用いる酵素やヌクレオチドによりその重合反応条件は種々異なるため、反応温度、反応時間、添加剤等に特に厳密な規定はない。ＰＣＲ反応、ニックトランスレーション法、ランダムプライミング法等の生体関連高分子の製造方法においては、例えばＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ｐｐ．３２２６（１９９４）、または新実験化学講座  ２０巻、ｐｐ．８４７、「ＤＮＡ合成」記載の反応条件が例示される。
【００８４】
また、本発明の重合体は、上記例のＰＣＲ反応等によるｃＤＮＡの製造に制限されることはなく、それ自体公知の化学的な製造方法を用いても製造することができる（このような「化学的な製造方法」の詳細については、例えば新実験化学講座  ２０巻、ｐｐ．７３７、「合成ポリヌクレオチドの調製」を参照することができる）。
【００８５】
本発明において使用すべき重合原料としては、通常、ヌクレオチドを用いることができる。加えて、ＰＮＡ等のヌクレオチドとは構造が異なるが、ヌクレオチドと類似の作用を示す化合物、または重合体に本発明の化合物が取り込まれるものならば任意の重合体に対しても、本発明の化合物は適用できる。
【００８６】
本発明の安定同位体を含有する重合体の分子量は特に規定はないが、ヌクレオチド単位で１０塩基〜５０００塩基の重合体であることが好ましい。
【００８７】
本発明の趣旨に反しない限り、本発明の安定同位体を含有する重合体は種々の形態で存在することができる。本発明の安定同位体を含有する重合体は、例えば単独の重合体として存在してもよく、また、他の化合物もしくは重合体と水素結合等により会合した形状で存在してもよい。本発明は、これら全ての安定同位体を含有する重合体の形態を包含する。
【００８８】
（質量情報の検出方法）
標識源の安定同位体の質量情報を検出する方法はいくつかの種類が存在するが、本発明の化合物に適用すべき検出方法は特に制限されない。
【００８９】
具体的な発明の化合物に適用可能な検出方法の例として、例えば、マススペクトルにより質量を検出する方法が挙げられる。このようなマススペクトルにより質量を検出する装置においては、例えば、本発明の化合物にレーザー等のエネルギーを照射してイオン化すればよい。またはレーザー等のエネルギー照射により本発明の化合物を構成成分に分解・イオン化する。ここで分解とイオン化は同時におこっても良いし、分解した後、その構成成分がイオン化しても良い。これらの方法で生成されたイオンの質量を検出して、安定同位体の質量情報を読み取ることができる。
【００９０】
本発明の化合物をレーザー照射等により分解した構成成分の構造は、特に限定されない。構成成分を原子状態まで分解した原子も分解成分に含まれる。
【００９１】
また、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、または質量差分離クロマトグラフィー等の場合には、本発明の重合体やその構成成分を、各種の混合物の中から分離して検出する方法により、安定同位体の質量情報を得ることができる。上記方法においては、質量情報の検出に重合体の分子量を指標にしても、または重合体をレーザー照射、化学反応等の何らかの方法で構成成分に分解し、その構成成分をクロマトグラフィーにより分離して、分離した構成成分の質量を検出してもよい。
【００９２】
（中間体）
上記したように、本発明の式（１０）〜式（１２）で示される化合物は、式（１）〜式（４）および式（６）〜式（９）で示される化合物を製造するために必要不可欠な重要中間体である。
【００９３】
（化合物の適用法）
本発明の式（１）〜式（４）で示される化合物の適用先は特に制限されないが、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ等の標識化合物であることが好ましい。その適用方法は、例えば既存の蛍光標識ヌクレオチド（アマシャム社：ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ用製品；Ｃｙ３−ｄ−ＵＴＰ等）等の化合物の適用方法と同一である（このような既存の蛍光標識ヌクレオチド適用方の詳細については、例えば、「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）２０００発行を参照することができる）。
【００９４】
しかしながら、本発明の化合物は該既存標識ヌクレオチドにはない利点（すなわち、標識数が多い等の利点）を有するため、その適用範囲は既存標識ヌクレオチドの適用できる範囲に制限されることはなく、更にはＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイに制限されるものではない。本発明の化合物は、例えば、ＲＮＡチップ等にも適用することができる。
【００９５】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【００９６】
【実施例】
（使用した試薬等）
以下の実施例および比較例においては、溶媒は特に断らない限り、市販品をそのまま用いた。ただし、乾燥ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）は、市販の脱水規格のＤＭＦにモレキュラーシーブ３Ａ（和光純薬工業（株）社製、市販のＤＭＦ５００ｍｌに対して、３０ｇ程度）を添加して、一晩以上静置する乾燥操作を行った。シクロペンタジエンは反応使用前にジシクロペンタジエンを公知の方法（例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｖｏｌｕｍｅｓ，４，２３８（１９６３）を参照）熱分解して単量化したものを用いた。
【００９７】
ｄ−ＡＴＰ，ｄ−ＴＴＰ，ｄ−ＧＴＰ，ｄ−ＣＴＰの略号は、各々２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸、２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸、２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸を表する。
【００９８】
実施例１：フェロセン（５６Ｆｅ成分）
５６ＦｅＣｌ２（２５０ｍｍｏｌ）（日本酸素（株）製品）を１００ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（東京化成製）に添加した。ＴＨＦを減圧下にて留去して乾固し、内容物を乾燥した。反応容器を氷冷し、４０ｍｌのシクロペンタジエンと１００ｍｌのジエチルアミン（東京化成製）を添加し、室温で終夜激しく攪拌した。過剰のアミンを減圧下に留去し、残査を沸騰石油エーテルにより抽出した。有機層をろ過した後、溶媒を留去することにより、目的物を含有する粗体を得た。
【００９９】
得られた粗体をｎ−ペンタン（東京化成製）から再結晶して、３４ｇの表題化合物を得た。融点は１７３℃であり、文献値と一致した。
【０１００】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．１５（１０Ｈ，Ｓ）
同様にして他質量の同位体の塩化鉄（日本酸素（株）製）を使用することにより、５４Ｆｅ，５７Ｆｅからなるフェロセンを各々調製した。
【０１０１】
実施例２  化合物（１６）（５６Ｆｅ成分）
【０１０２】
【化２４】
2004284965.tif 000014
【０１０３】
１．５ｇの塩化アルミニウム（和光純薬製）を２００ｍｌのジクロロメタン（東京化成製）にけん濁した。他方、実施例１で得られたフェロセン２３ｇと、７．０７ｇのグルタル酸無水物（東京化成製）の１００ｍｌのジクロロメタン溶液を、上記のけん濁に室温で３０分かけて滴下した。滴下後、室温で５時間攪拌した後に、氷水に反応液を添加した。ジクロロメタンにより抽出し、次いで炭酸ナトリウム水溶液（５％水溶液）で水層に逆抽出した。その後、ジクロロメタンを添加し、塩酸を滴下することで、再度有機層に抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにより乾燥（室温、約１時間）後、ろ過し、溶媒を留去して１５．９ｇの表題化合物（１６）を得た。
【０１０４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．８（２Ｈ，ｍ），４．５（２Ｈ，ｍ），４．２（５Ｈ，ｓ），２．８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝  ），２．４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝  ），２．０（２Ｈ，ｍ）
【０１０５】
実施例３  化合物（１７）（５６Ｆｅ成分）
【０１０６】
【化２５】
2004284965.tif 000015
【０１０７】
１．０２ｇの実施例２で得られた化合物（１６）を、氷酢酸（東京化成製）５０ｍｌに溶解し、１．０１ｇの酸化白金（エヌイーケムキャット製）を添加した。系内を水素で置換して、常圧、室温で１７時間攪拌した。触媒をろ過して除去し、ろ液を濃縮することにより、表題化合物（１７）を９６０ｍｇ得た。
【０１０８】
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：２９３４，１７１１，１４３１，１４０９，１３１４，１２５８，１２１５，１１０３
【０１０９】
実施例４  化合物（１８）（５６Ｆｅ成分）
【０１１０】
【化２６】
2004284965.tif 000016
【０１１１】
実施例３で得られた化合物（１７）８００ｍｇを、８ｍｌのアセトニトリル（東京化成製）、０．２５ｍｌのピリジン（東京化成製）、１２ｍｌのジオキサン（東京化成製）の混合液に添加し、８００ｍｇのジスクシンイミドジカーボネート（東京化成製）を添加した。室温で３．５時間攪拌後、８００ｍｇのジスクシンイミドジカーボネートを再度添加し、室温で２時間攪拌した。減圧下に溶媒を留去して、残さにジエチルエーテルと０．１Ｎ塩酸を添加して抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにより乾燥（室温、１時間）し、ろ過し、濃縮し、表題化合物（１８）を７４８ｍｇ得た。冷凍庫中で静置すると結晶化した。
【０１１２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．４−４．１（９Ｈ，ｍ），２．９（４Ｈ，ｂｒｓ），２．６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６）
【０１１３】
実施例５  化合物（１９）（５６Ｆｅ成分）
【０１１４】
【化２７】
2004284965.tif 000017
【０１１５】
実施例４で得られた化合物（１８）の３１６ｍｇを８０ｍｌのＤＭＦに溶解し、室温で攪拌しながら、１２０ｍｌのプロパルギルアミンを滴下した。滴下後は室温下に４５分攪拌し、その後水と酢酸エチルにより抽出した。有機層を減圧下に濃縮し、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し（展開液：酢酸エチル・シクロヘキサン）、表題化合物（１９）を１９８ｍｇ黄色固体として得た。
【０１１６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ８．３（１Ｈ，ｂｒｓ），４．２−４．０（９Ｈ，ｍ），３．８（２Ｈ，ｍ），３．１（１Ｈ，ｂｒｓ），２．３−２．０（４Ｈ，ｍ），１．６−１．４（４Ｈ，ｍ）
【０１１７】
１３Ｃ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ１７２，８８，８０，７３，６８，６７，６６，３５，３０，２８，２７，２５
【０１１８】
実施例６  化合物（２０）（５６Ｆｅ成分）
【０１１９】
【化２８】
2004284965.tif 000018
【０１２０】
プロパルギルアミンの替わりにアリルアミンを用いた以外は実施例５と同様にして、表題化合物（２０）を黄色固体として得た。
【０１２１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ５．８（１Ｈ，ｍ），５．４（１Ｈ，ｂｒｓ），５．３（２Ｈ，ｍ），４．２−４．０（９Ｈ，ｍ），３．８（２Ｈ，ｍ），２．４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５），１．８−１．４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５）
【０１２２】
実施例７  化合物（２１）（５６Ｆｅを成分とする場合）
【０１２３】
【化２９】
2004284965.tif 000019
【０１２４】
１００ｍｇの５−ヨード  −２’−デオキシシチジン（アルドリッチ製）、１０．８ｍｇのヨウ化銅を乾燥した容器内に添加し、１．４ｍｌの乾燥ＤＭＦを添加し、系内をアルゴン雰囲気に置換した。
【０１２５】
別の乾燥した容器に、実施例５で得られた化合物（１９）の１８７ｍｇ、５７ｍｇのトリエチルアミンを１．０ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解した溶液をアルゴン下に調製した。このようにして得られた溶液を、上記で得られた５−ヨード  −２’−デオキシシチジンの溶液に添加し、約５０ｍｇのテトラ（トリフェニルホスフィン）パラジウム（関東化学製）を添加し、室温で１時間攪拌した。反応液に１．５ｍｌのジクロロメタンと１．５ｍｌのメタノールおよび、１．５ｍｌの希薄（濃度５％）重炭酸ナトリウム水溶液を添加し、減圧下に濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して１１０ｍｇの表題化合物（２１）を黄色固体として得た。
【０１２６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ８．３（１Ｈ，ｂｒｓ），８．２（１Ｈ，Ｓ），７．７（１Ｈ，ｂｒｓ），６．８（１Ｈ，ｂｒｓ），２．２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．５），５．２（１Ｈ，ｂｒｓ），５．０（１Ｈ，ｂｒｓ），４．２−４．１１（９Ｈ，ｍ），４．１０−３．９（２Ｈ，ｍ），３．７（１Ｈ，ｍ），３．６−３．５（２Ｈ，ｍ），２．３−１．９（４Ｈ，ｍ），１．６−１．４（４Ｈ，ｍ）
【０１２７】
１３Ｃ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ１７３，１６４，１５４，１４３，９２，８９，８７，８５，７４，７０，６８，６７，６６，６１，４１，３５，３０，２９，２８，２５
【０１２８】
ＭＳ（ＥＳＩ法）：５４８（Ｍ＋Ｈ）＋（マイクロマス社製のＬＣＴ質量分析計を使用）
２次元解析：日本電子社製のＮＭＲ装置ＪＵＭ−ＡＬ４００を用いて、Ｈ−Ｃ，Ｈ−Ｈ相関２次元スペクトルを測定し、構造確認を行った。
【０１２９】
実施例８  化合物（２）（５６Ｆｅを成分とする場合）
文献（Ｃｈｅｍ．  Ｐａｐｅｒｓ，  ｖｏｌ  ５０，ｐｐ．１５１（１９９６））記載の方法に従い、実施例７で得られた化合物（２１）の５’位を３リン酸誘導体化した。オキシ塩化リンは反応直前にアルゴン雰囲気下に蒸留したものを用いた。ビス（トリブチルアンモニウム）ピロホスフェートは上記文献記載の方法に従い、ピロリン酸ナトリウム（シグマ製）から調製し、ＤＭＦ溶液化してアルゴン下に冷蔵庫内で保管したものを用いた。
【０１３０】
乾燥容器に実施例７で得られた化合物（２１）９１ｍｇを添加し、次いで２．０ｍｌのトリメトキシリン酸（東京化成製）を加えて溶液とし、系内をアルゴン置換した。上記の化合物（２１）溶液を−１０℃に冷却し、２０μＬのオキシ塩化リン（アルドリッチ製）を添加した。−１０℃で０．５時間攪拌するが、ＨＰＬＣ分析により化合物（２１）の残存が確認されたため、更に−１０℃で、２０μＬのオキシ塩化リンを添加した。添加後は−１０℃で０．５時間、次いで０℃で０．５時間攪拌した。ＨＰＬＣ分析によりほぼ全量の化合物（２１）の消費が確認された。反応液は緑色を呈した。
【０１３１】
別の乾燥容器にアルゴン雰囲気下、−１０℃に冷却した、２ｍｌのビス（トリブチルアンモニウム）ピロホスフェートのＤＭＦ溶液（１Ｍ）に、上記で得たモノリン酸化反応液をゆっくり（約５分かけて）滴下し、滴下後は−１０℃で０．５時間、次いで０℃で１時間攪拌した。ＨＰＬＣ分析によりモノリン酸化合物に相当するピークの消失と新規ピークの出現を確認した。反応液は緑色から黄色に変色した。
【０１３２】
このようにして得られた反応液を、あらかじめ０℃に冷却しておいた、水（４ｍｌ）とトリエチルアミン（２６０μＬ）（東京化成製）の混合液に添加して、０℃で１５分攪拌し、２０℃以下で減圧下に１／５程度の容量まで濃縮した。０．１Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液により前処理したＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（アマシャム製、前処理前ゲル）を用いてイオン交換精製した。得られた濃縮液をこのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５に充填した後、展開する重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液を０．１Ｍから１Ｍまで徐々に高めて溶出させた。
【０１３３】
目的とする化合物（２）を含有するフラクションは０．８Ｍ付近で溶出したフラクションに溶出された。該フラクション部分は、ＵＶ検出によるＨＰＬＣ分析スペクトル上は特に他の不純物を含有することなく、ほぼ単一ピークとして得られた。該フラクション部分を濃縮することにより、表題化合物（２）を１０４ｍｇ得た。
【０１３４】
表題化合物をＩＣＰ発光分析法（セイコーインスツルミンツ社製、ＳＰＳ４０００装置）により分析すると鉄の存在が確認された。
【０１３５】
３１Ｐ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：−１２．１（ｄ，Ｊ＝２１Ｈｚ）  ，−２５．８（ｂｒｓ）  ，  −１１．９（ｄ，Ｊ＝２１Ｈｚ）
【０１３６】
上記３１Ｐ−ＮＭＲ分析（日本電子社、ＮＭＲ装置ＪＵＭ−ＡＬ４００）により、３リン酸に特有のケミカルシフトが検出された。
【０１３７】
【表２】
2004284965.tif 000020
【０１３８】
実施例９  化合物（１）（５６Ｆｅを成分とする場合）
文献（Ｐｒｏｃ，  Ｎａｔｌ，  Ａｃａｄ，  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ，ｖｏｌ７８，ｐｐ．６６３３（１９８１））記載の方法に従い、７０ｍｇの５−（１−アリルアミノ）２’−デオキシシチジン３リン酸を２’−デオキシシチジン３リン酸（シグマ製）を出発原料として合成した。
【０１３９】
６８ｍｇの５−（１−アリルアミノ）２’−デオキシシチジン３リン酸を１．２ｍｌの０．１Ｍ  四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．５）に溶解させ、黄色溶液とした。
【０１４０】
別容器に調製した２．６ｍｇの化合物（１８）を１．２ｍｌのＤＭＦに溶解した溶液を、先の黄色溶液（５−（１−アリルアミノ）２’−デオキシシチジン３リン酸溶液）に室温下に約１０分かけて滴下した。反応液ははじめけん濁した状態であったが、攪拌によりほぼ均一化した。室温で１．５時間静置した後に、２０℃以下で濃縮して溶媒を留去して反応液の容量を約１／５まで濃縮した。０．１Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（ナカライテスク製）により前処理したＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（アマシャム製）を用いてイオン交換精製した。先の濃縮液をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５に充填した後、展開する重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液を０．１Ｍから１Ｍまで徐々に高めて展開した。目的とする化合物（１）を含有するフラクションは０．７Ｍ付近で溶出したフラクションに溶出された。フラクションを濃縮することにより、化合物（１）を１．５ｍｇ得た。
【０１４１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ８．２（１Ｈ，ｂｒｓ），６．３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６），６．０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４）  ，５．４（１Ｈ，ｂｒｓ），４．５（１Ｈ，ｂｒｓ），  ４．２−４．０（９Ｈ，ｍ），３．８−３．５（２Ｈ，ｍ），２．７−２．０（６Ｈ，ｍ），１．８−１．４（４Ｈ，ｍ）
表題化合物をＩＣＰ発光分析法により分析すると鉄の存在が確認された。
【０１４２】
実施例１０  ＰＣＲ反応による、化合物（２）共存下のｃＤＮＡの合成
各成分の濃度が１０ｍＭのｄ−ＡＴＰ，ｄ−ＴＴＰ，ｄ−ＧＴＰ，ｄ−ＣＴＰ（アマシャム、宝酒造製）の混合水溶液を調製した。一方、ｄ−ＡＴＰ，ｄ−ＴＴＰ，ｄ−ＧＴＰの各濃度が１０ｍＭであり、且つｄ−ＣＴＰに対してモル比で２４％，３０％，３６％，１００％の割合で化合物（２）を含有し、ｄ−ＣＴＰと化合物（２）を合わせた濃度が１０ｍＭとなる溶液を調製した。すなわち、ｄ−ＣＴＰに対して化合物（２）を０％〜１００％の割合で置換したもの（ｄ−ＣＴＰと化合物（２）を合わせて１０ｍＭ）、および１０ｍＭのｄ−ＡＴＰ，ｄ−ＴＴＰ，ｄ−ＧＴＰの３種が混合した溶液を調製した（５種類）。
【０１４３】
上記溶液に対して、以下の条件でＰＣＲ反応を行い、化合物（２）がｃＤＮＡに取り込まれることを電気泳動によるｃＤＮＡバンドの移動度から確認した。
【０１４４】
反応条件
鋳型ＤＮＡ：  ｈ  ＩＦＮα
プライマー：ｈ  ＩＦＮα５’−ＢａｍＨＩ，  ｈ  ＩＦＮα３’−ＳａｃＩ
添加剤  ：ＭｇＣｌ２、ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造製）
酵素    ：ＬＡ−Ｔａｑ
【０１４５】
電気泳動図を図１に示す。
【０１４６】
図１に示す電気泳動結果からわかるように、ｄ−ＣＴＰに対して化合物（２）の含有量の増加に比例して、バンド移動度の違いを確認できた。この結果は生成したｃＤＮＡの分子量が増加したためであり、ｄ−ＣＴＰよりも分子量が大きい化合物（２）がｃＤＮＡに取り込まれた結果である。しかも、化合物（２）の取り込まれた量は、化合物（２）の添加量の増加に比例して増加していることがバンド移動度の違いから示された。
【０１４７】
ｄ−ＣＴＰの全量を化合物（２）に置き換えた場合には、ｃＤＮＡの生成が確認されなかったが、この現象は本発明の化合物に特有な現象ではなく、従来技術である蛍光標識化合物の場合にも確認されている（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｐｐ．３２２６（１９９４））。
【０１４８】
【発明の効果】
上述したように本発明によれば、安定同位体を標識源とする式（１）〜式（４）のいずれかで示される化合物が提供される。このような化合物を用いることより、従来の標識化合物では実現できなかった下記の利点が得られる。
１）多種類の標識源が利用できる；
２）複数の標識源をポリヌクレオチドに導入できる；
３）従来の安定同位体標識法よりも標識化ポリヌクレオチドを効率的に調製できる。
本発明を診断薬等として利用して臨床現場における疾患判断等に適用する場合には、これらの利点に基づき疾患原因遺伝子の迅速な判定が可能となるため、その有用性は特に顕著となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の安定同位体を含有する重合体の生成を示す電気泳動図である。
【図１】
2004284965.tif 000034