(57)【要約】【課題】Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ属細菌における酸化酵素を合成化学的に利用し、目的物を製造する方法を提供する。【解決手段】Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ属細菌、例えばＪａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓにおける酸化酵素によって、ｉ）原料オレフィンまたはその誘導体から光学活性なエポキシド類を製造する。又はｉｉ）原料単環式もしくは多環式芳香族化合物またはその誘導体から、位置特異的に水酸基が導入されたフェノール類を製造する。又はｉｉｉ）原料インドール又はその誘導体からインドキシル類を製造する。【選択図】    図１
2004357512.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ属細菌の酸化酵素を用いることを特徴とする、エポキシド類、フェノール類、又はインドキシル類の製造方法。
【請求項２】
Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ属細菌がＪａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓであることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
原料がオレフィンまたはその誘導体であり、エポキシド類を製造することを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
光学活性なエポキシド類を製造することを特徴とする、請求項１〜３いずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
原料が単環式もしくは多環式芳香族化合物またはその誘導体であり、フェノール類を製造することを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項６】
位置特異的に水酸基が導入されたフェノール類を製造することを特徴とする、請求項１，２，又は５に記載の製造方法。
【請求項７】
原料がインドール又はその誘導体であり、インドキシル類を製造することを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ属細菌の酸化酵素を利用した酸化物の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ属のグラム陽性細菌であるＪａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓ（例えば非特許文献１参照）はトリクロロエチレンの分解菌として単離され、トリクロロエチレンをはじめとしてシス−１，２−ジクロロエチレン、フェノール、フッ化ビニルなどの環境中の汚染物質を分解するための利用法がこれまで報告されている（例えば特許文献１，２，及び３参照）。
【０００３】
環境中に残存するトリクロロエチレンを生物的に除去する試みは古くからなされており、様々な微生物がそのような活性を持つものとして分離されてきている。それらはトリクロロエチレンを酸化的に分解する代謝を有する好気性菌と還元的に分解する代謝を有する嫌気性菌に大別されるが、前者の生育が速く代謝活性が高いために、より詳細に研究され、また利用されている。前者においてはモノオキシゲナーゼが初発反応に関わるとされているものとジオキシゲナーゼが初発反応に関わるとされているものがあり、後者の例としてはトルエンジオキシゲナーゼを有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｆ１やＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＪＳ１５０を挙げることができる（例えば非特許文献２参照）。
【０００４】
一方、前者すなわちモノオキシゲナーゼが関与している例ははるかに多く、メタンモノオキシゲナーゼを有するＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（例えば非特許文献３参照）、フェノールヒドロキシラーゼあるいはこれに類似した酵素であるトルエンモノオキゲナーゼを有するＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｅ１（例えば特許文献４参照）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  Ｒ５（例えば特許文献４および非特許文献４参照）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４（例えば非特許文献５参照）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＪＭＰ１３４（例えば非特許文献６参照）などが知られている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平９−２０１５８１号公報
【特許文献２】
特開２０００−２１７５６９号公報
【特許文献３】
特開２００２−２６２８６１号公報
【特許文献４】
特開平１１−２４３９５８号公報
【非特許文献１】
Ｉｍａｍｕｒａ  Ｙ．ら：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０００、５０、１８９９−１９０３
【非特許文献２】
Ｌｅａｈｙ  Ｊ．Ｇ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１、６２（３）、８２５−８３３
【非特許文献３】
Ｂｒｕｓｓｅａｕ  Ｇ．Ａ．ら、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、１９９０、１、１９−２９
【非特許文献４】
Ｔｅｒａｍｏｔｏ  Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９９、２６２、５５２−５５８
【非特許文献５】
Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｍ．Ｓ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１、５７（７）、１９３５−１９４１
【非特許文献６】
Ａｙｏｕｂｉ  Ｐ．とＨａｒｋｅｒ  Ａ．Ｌ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９８、６４（１１）、４３５３−４３５６
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらこれらの微生物はいずれもグラム陰性細菌であり、グラム陽性細菌、とりわけＪａｎｉｂａｃｔｅｒ属細菌においてはトリクロロエチレン分解に関わる酸化酵素はその実態が明らかにされておらず、またそうした酵素を合成化学的に利用する試みもなされていない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ属細菌の酸化酵素を用いることを特徴とする、エポキシド類、フェノール類、またはインドキシル類の製造方法である。以下に本発明を更に詳細に説明する。
【０００８】
本発明において、エポキシド類、フェノール類、またはインドキシル類を製造するための原料としては特に限定されないが、例えばオレフィン又はその誘導体、単環式もしくは多環式芳香族化合物又はその誘導体、さらにインドール又はその誘導体をあげることができる。
【０００９】
例えば原料としてオレフィン又はその誘導体を用いる場合は、その種類は特に限定されず、様々な官能基、例えばハロゲン基、エステル基、又は芳香族性の置換基などを有する置換オレフィンが原料として使用できる。またオレフィンの性状は特に末端オレフィンに限定されるものではなく、内部オレフィン（環状オレフィンを含む）である場合にも適用可能である。本発明では、このようなオレフィン又はその誘導体からエポキシド類を製造することができる。例えばプロピレンを原料とした場合はプロピレンオキサイド、１−ブテンを原料とした場合は１，２−ブチレンオキサイド、１，３−ブタジエンを原料とした場合はブタジエンモノエポキサイド、ブタジエンモノエポキサイドを原料とした場合はブタジエンジエポキサイド、アリルクロライドを原料とした場合はエピクロロヒドリン、シクロヘキセンを原料とした場合はシクロヘキセンオキサイド、メチルアクリレートを原料とした場合はメチルグリシデート、エチルアクリレートを原料とした場合はエチルグリシデート、スチレンを原料とした場合はスチレンオキサイドを、それぞれ主生成物として得ることが可能である。
【００１０】
さらに本法を用いることにより、オレフィン又はその誘導体の酸化によって生じるエポキシド類は、光学異性体のうち（Ｒ）体または（Ｓ）体のいずれかを過剰に得ることが可能である。例えば１−ブテンを原料として酸化を行った場合に得られる生成１，２−ブチレンオキサイド、スチレンを原料として酸化を行った場合に得られる生成スチレンオキサイドはいずれも（Ｒ）体過剰である。また、アリルクロライドを原料として酸化を行った場合に得られる生成エピクロロヒドリンは（Ｓ）体過剰である。
【００１１】
また本発明において、原料として単環式もしくは多環式芳香族化合物又はその誘導体を用いる場合は、その種類は特に限定されず、様々な置換基を有する単環式もしくは多環式芳香族化合物又はその誘導体が原料として使用でき、フェノール類を製造することができる。例えばベンゼンを原料とした場合にはフェノール、トルエンを原料とした場合にはクレゾール、ナフタレンを原料とした場合はナフトールを主生成物として得ることが可能である。また本発明によれば、生成物として得られるフェノール類は、位置特異的に水酸基が導入されたものを得ることができる。例えばトルエンを原料とした場合に生じるクレゾールは、ｏ−位に位置選択的に水酸基が導入された化合物であるｏ−クレゾールを主生成物として得ることができる。また、同様にナフタレンを原料として用いた場合は１−ナフトールを単一生成物として得ることが可能である。
【００１２】
更に本発明において、原料としてインドール又はその誘導体を用いる場合は、その種類は特に限定されず、様々な置換基を有するものが使用でき、インドキシル類を製造することができる。またこのインドキシル類は、反応条件によってはＪａｎｉｂａｃｔｅｒ属細菌の酸化酵素などによる更なる酸化反応により、インジゴなどのインジゴイド色素へと変換させることもできる。
【００１３】
Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ属細菌の酸化酵素の利用形態は、酸化酵素の活性を維持する状態であれば特に限定されることはなく、菌体懸濁液、固定化菌体、菌体抽出物、または化学合成品などのいずれの形態でも利用することができる。本発明による製造方法において、温度は特に限定されないが、好ましくは５〜５０℃、更に好ましくは２０〜４０℃である。時間については特に限定されるものではない。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００１５】
実施例１  Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓの酸化酵素活性検出
Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓはドイツＤＳＭＺより入手した（ＤＳＭ１３９５３）。まず本菌株をＹｅａｇｅｒ  Ｃ．Ｍ．ら：Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９、６５（２）、６３２−６３９に記載のｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（以下ではＢａｓａｌ  Ｓａｌｔｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＢＳＭと呼ぶ）培地に植菌して試験管中で３０℃の振盪培養を行った。次にＢＳＭ培地に０．２％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ、２ｍＭ酢酸ナトリウムを添加した培地に植え継ぎ、対数増殖期の培養物５ｍｌにフェノールを最終濃度２ｍＭとなるように添加してから３時間培養を継続し、これにインドールを最終濃度５μｇ／ｍｌになるように添加した。さらに一晩（１６時間）培養を継続したところ、インドールの酸化物（インジゴイド色素、例えばＧｉｌｌａｍ  Ｅ．Ｍ．Ｊ．ら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００、３９（４５）、１３８１７−１３８２４）に特徴的な青褐色の着色が観察された。
【００１６】
インドールからインドキシル、インジゴなどのインジゴイド色素への変換は、モノオキシゲナーゼあるいはジオキシゲナーゼに属する酸化酵素によって触媒されることから、この着色によってＪａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓがモノオキシゲナーゼあるいはジオキシゲナーゼに属する酸化酵素を有することが明らかになった。またこの着色はフェノールを添加しない場合には観察されず、酸化酵素がフェノールによって誘導されることが示された。
【００１７】
実施例２  Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓによる１−ブテンの酸化反応Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓを培養し、これを用いて１−ブテンを原料とした酸化反応を行った。比較対照として、トリクロロエチレン分解菌であるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４（ＤＳＭ１１７３７）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｅ１（ＭＢＩＣ３８３７）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＪＳ１５０（ＤＳＭ８５３０）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＪＭＰ１３４（ＤＳＭ４０５８）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  Ｒ５（ＭＢＩＣ３７４１）を用いた。
【００１８】
１％トリプトンペプトン、０．５％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、及び０．００５Ｍ  ＮａＯＨからなる培地（ＬＢ培地）に対し、Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓのグリセロールストックを０．１％植菌し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で１５．５時間終夜液体培養を行った。遠心操作により菌体を回収した後、菌体密度がＯＤ６００で０．３から０．４になるようにＢＳＭ培地に懸濁し、フェノールまたはトルエンを最終濃度２ｍＭとなるように添加し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で２時間液体培養を行った。その後フェノールまたはトルエンを先の添加時と同量添加し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で２時間液体培養を行い、遠心操作により菌体を回収した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５で２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、菌体密度がＯＤ６００で５の懸濁液を調製した。
【００１９】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４については２０ｍＭ乳酸を含むＢＳＭ培地に該菌体のグリセロールストックを０．０４％植菌し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で１５．５時間終夜液体培養を行った。次にそのままフェノールまたはトルエンを最終濃度２ｍＭになるように添加し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で２時間液体培養を行った後、再びフェノールまたはトルエンを先の添加時と同量添加し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で２時間液体培養を行い、遠心操作により菌体を回収した。２０ｍＭ乳酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、菌体密度がＯＤ６００で５の懸濁液を調製した。
【００２０】
また、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｅ１、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＪＳ１５０、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＪＭＰ１３４、及びＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  Ｒ５については、２０ｍＭ乳酸を含むＢＳＭ培地にそれぞれの菌体のグリセロールストックを０．１％植菌し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で２０時間終夜液体培養を行った。次にそのままフェノールを最終濃度２ｍＭとなるように添加し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で２時間液体培養を行った後、再びフェノールを先の添加時と同量添加し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で２時間液体培養を行い、遠心操作により菌体を回収した。その後、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｅ１は２０ｍＭ乳酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＪＳ１５０、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＪＭＰ１３４、及びＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  Ｒ５は２０ｍＭ乳酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５でそれぞれ２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、菌体密度がＯＤ６００で５の懸濁液を調製した。
【００２１】
次に１２５ｍｌ容量のバイアルを所定本数分用意し、テフロン（登録商標）コートブチルゴムセプタムで密閉しアルミシールを施した後、８％１−ブテン、９２％窒素の組成のガスで置換を行った。各々のバイアルにガスタイトシリンジを用いて酸素２０ｍｌおよび菌体密度がＯＤ６００で５の懸濁液をそれぞれ１５ｍｌ添加した（１−ブテン仕込み量０．４２ｍｍｏｌ、全て反応したと仮定すると１，２−ブチレンオキサイド生成量は２７．７ｍＭとなる条件）。各バイアルは水平に寝かせた状態で、３０℃で２８０回／分で振とうし、ガスタイトシリンジを用いて０，１，２，１６時間経過後に１ｍｌずつサンプリングを行い、採取した菌体液は８ｍｌ容の栓つき試験管中、即座に酢酸エチル１ｍｌと混合し密閉した。栓つき試験管を水平に寝かせた状態で室温で２８０回／分で５分振とうし、有機相と水相を遠心分離した後、有機相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００２２】
ガスクロマトグラフＨＰ５８９０（ヒューレットパッカード社製）にてキャピラリカラムＨＰ−５（ヒューレットパッカード社製）を用い、酢酸エチル中の生成１，２−ブチレンオキサイドを定量した結果を図１に示す。図中、縦軸は生成した１，２−ブチレンオキサイドの量（ｍＭ）を、横軸は１−ブテンとの反応時間（ｈ）を示す。図中、菌体の名称の後につけた（Ｔ）の記号はトルエンで誘導したことを、（Ｐ）の記号はフェノールで誘導したことをそれぞれ示す。フェノールを用いて誘導を行ったＪａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓは１６時間の反応で１７ｍＭの１，２−ブチレンオキサイドを生じ、他の菌株と比べて１，２−ブチレンオキサイドの生成量が高いことがわかった。
【００２３】
また同ガスクロマトグラフにてキラル分析用キャピラリカラムであるＣＨＩＲＡＬＤＥＸ  Ｇ−ＴＡ（ＡＳＴＥＣ社製）を用いて生成１，２−ブチレンオキサイドの光学純度を分析した結果を図２に示す。図中、縦軸は光学異性体比（Ｒ）／（Ｓ）を、横軸は反応時間（ｈ）を示す。図中、菌体の名称の後につけた（Ｔ）の記号はトルエンで誘導したことを、（Ｐ）の記号はフェノールで誘導したことをそれぞれ示す。なお、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．ＪＳ１５０を用いた場合の反応１時間と２時間のデータについては１，２−ブチレンオキサイド濃度が低いために測定できず、プロットしていない。Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓによる生成１，２−ブチレンオキサイドの光学異性体比は（Ｒ）：（Ｓ）＝３．９〜４．１：１であり、他の菌株と比べ生成した１，２−ブチレンオキサイドの光学純度が高いことが明らかとなった。以上からＪａｎｉｂａｃｔｅｒｂｒｅｖｉｓが１−ブテンを酸化して１，２−ブチレンオキサイドを生じ、（Ｒ）体過剰の１，２−ブチレンオキサイドの生産に有効であることが示された。
【００２４】
実施例３  Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓによるプロピレン、１，３−ブタジエン、ブタジエンモノエポキサイド、メチルアクリレート、エチルアクリレートの酸化反応
Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓを用いてプロピレン、１，３−ブタジエン、ブタジエンモノエポキサイド、メチルアクリレート、エチルアクリレートを原料とした酸化反応を行った。１．６％トリプトンペプトン、１％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ、及び０．００５Ｍ  ＮａＯＨからなる培地（２×ＹＴ培地）に対し、Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓのグリセロールストックを０．１％植菌し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で２３．５時間終夜液体培養を行った。遠心操作により菌体を回収した後、菌体密度がＯＤ６００で２．０になるようにＢＳＭ培地に懸濁し、フェノールを最終濃度２ｍＭになるように添加し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で２時間液体培養を行った。その後フェノールを先の添加時と同量添加し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で２時間液体培養を行い、遠心操作により菌体を回収した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５で２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、菌体密度がＯＤ６００で１０および５の懸濁液を調製した。
【００２５】
プロピレンを原料とした反応については、１２５ｍｌ容量のバイアルにＯＤ６００が５になるように調製した菌体懸濁液を１５ｍｌ添加し、テフロン（登録商標）コートブチルゴムセプタムで密閉しアルミシールを施した後、ガスタイトシリンジを用いてプロピレンガスを９ｍｌ添加した（プロピレン仕込み量０．３７ｍｍｏｌ、全て反応したと仮定するとプロピレンオキサイド生成量は２５．０ｍＭとなる条件）。１，３−ブタジエンを原料とした反応については、１２５ｍｌ容量のバイアルをテフロン（登録商標）コートブチルゴムセプタムで密閉しアルミシールを施した後、８％１，３−ブタジエン、９２％窒素の組成のガスで置換を行った。その後、ガスタイトシリンジを用いて酸素２０ｍｌおよび菌体密度がＯＤ６００で５の懸濁液を１５ｍｌ添加した（１，３−ブタジエン仕込み量０．４２ｍｍｏｌ、全て反応したと仮定するとブタジエンモノエポキサイド生成量は２７．７ｍＭとなる条件）。
【００２６】
また、原料がブタジエンモノエポキサイド、メチルアクリレート、エチルアクリレートの場合については、原料濃度２０ｍＭの２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５溶液を調製し、この原料溶液１０ｍｌとＯＤ６００が１０になるように調製した菌体懸濁液１０ｍｌを１２５ｍｌ容量のバイアル中混合し総量２０ｍｌとした後、テフロン（登録商標）コートブチルゴムセプタムで密閉しアルミシールで封印した（ブタジエンモノエポキサイド、メチルアクリレート、エチルアクリレート仕込み濃度は全て１０ｍＭ）。
【００２７】
各バイアルは水平に寝かせた状態で、３０℃で２８０回／分で振とうし、ガスタイトシリンジを用いて経時的に１ｍｌずつサンプリングを行った。プロピレンを反応させた菌体液は酢酸エチル１ｍｌと、１，３−ブタジエン、ブタジエンモノエポキサイド、メチルアクリレート、エチルアクリレートを反応させた菌体液はジエチルエーテル１ｍｌと、それぞれ８ｍｌ容の栓つき試験管中で混合し、塩化ナトリウム０．５ｇを加えて密閉した。栓つき試験管は水平に寝かせた状態で室温で２８０回／分で３０分間振とうして塩化ナトリウムを水相に飽和させた後、有機相と水相を遠心分離し、有機相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００２８】
ガスクロマトグラフＨＰ５８９０にてキャピラリカラムＨＰ−５を用いて定量した、原料がプロピレンの場合の生成プロピレンオキサイド濃度、原料が１，３−ブタジエンの場合の生成ブタジエンモノエポキサイド濃度、原料がブタジエンモノエポキサイドの場合の生成ブタジエンジエポキサイド濃度について、反応０，１，２，１６．５時間経過後の結果を図３に示す。図中、縦軸は生成物の濃度、横軸は反応時間を示す。また、メチルアクリレート、エチルアクリレートが原料の場合については、ガスクロマトグラフＨＰ５８９０にてキャピラリカラムＨＰ−５を用いて測定した、原料メチルアクリレートと生成メチルグリシデートおよび原料エチルアクリレートと生成エチルグリシデートのＧＣ  ａｒｅａ値の０，１，２時間経過後の変化を図４に示す。図中、縦軸はＧＣ  ａｒｅａ値を、横軸は反応時間を示す。それぞれ原料であるメチルアクリレート、及びエチルアクリレートのＧＣ  ａｒｅａ値の減少とともに酸化生成物であるメチルグリシデートおよびエチルグリシデートのＧＣ  ａｒｅａ値の増大が認められた。
【００２９】
以上の結果からＪａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓの酸化酵素によりプロピレン、１，３−ブタジエン、ブタジエンモノエポキサイド中の末端オレフィンのエポキシ化反応が進行し、それぞれプロピレンオキサイド、ブタジエンモノエポキサイド、ブタジエンジエポキサイドが生成することが示された。またカルボン酸メチル基、カルボン酸エチル基などのエステル基を有するメチルアクリレート、エチルアクリレートを原料とした反応においても同様にエポキシ化反応が進行し、それぞれメチルグリシデートおよびエチルグリシデートが生成することが示された。
【００３０】
実施例４  Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓによるアリルクロライド、スチレン、シクロヘキセン、トルエン、ナフタレンの酸化反応
Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓを用いてアリルクロライド、スチレン、シクロヘキセン、トルエン、ナフタレンを原料とした酸化反応を行った。１．６％トリプトンペプトン、１％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ、及び０．００５Ｍ  ＮａＯＨからなる培地（２×ＹＴ培地）に対し、Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓのグリセロールストックを０．１％植菌し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で２３時間終夜液体培養を行った。遠心操作により菌体を回収した後、菌体密度がＯＤ６００で８．５になるようにＢＳＭ培地に懸濁し、フェノールを最終濃度２ｍＭになるように添加し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で２時間液体培養を行った。その後フェノールを先の添加時と同量添加し、３０℃で攪拌速度１８０ｒｐｍでの攪拌下で２時間液体培養を行い、遠心操作により菌体を回収した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５で２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、菌体密度がＯＤ６００で１０の懸濁液を調製した。
【００３１】
１２５ｍｌ容量のバイアルにＯＤ６００が１０になるように調製した菌体懸濁液を１８ｍｌ添加し、アリルクロライドは４００ｍＭエタノール溶液、スチレン、シクロヘキセン、トルエンは２００ｍＭエタノール溶液、ナフタレンは６０ｍＭエタノール溶液をそれぞれ４５０μｌ加え、テフロン（登録商標）コートブチルゴムセプタムで密閉しアルミシールで封印した（仕込み濃度はそれぞれアリルクロライド１０ｍＭ、スチレン５ｍＭ、シクロヘキセン５ｍＭ、トルエン５ｍＭ、ナフタレン１．５ｍＭの条件）。各バイアルは水平に寝かせた状態で、３０℃で２８０回／分で振とうし、ガスタイトシリンジを用いて０，１，２時間経過後に１ｍｌずつサンプリングを行った。サンプリングした菌体液は全て内部標準として１．５ｍＭ  ｎ−オクタンを添加した酢酸エチル１ｍｌとそれぞれ８ｍｌ容の栓つき試験管中で混合し、塩化ナトリウム０．５ｇを加えて密閉した。栓つき試験管は水平に寝かせた状態で室温で２８０回／分で３０分間振とうして塩化ナトリウムを水相に飽和させた後、有機相と水相を遠心分離し、有機相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００３２】
ガスクロマトグラフＨＰ５８９０でのキャピラリカラムＨＰ−５を用いた分析の結果、アリルクロライドからはエピクロロヒドリン、スチレンからはスチレンオキサイド、シクロヘキセンからはシクロヘキセンオキサイド、トルエンからはｏ−体を主生成物とするクレゾール、ナフタレンからは１−ナフトールが生成していることが明らかとなった。また、ガスクロマトグラフＨＰ５８９０にてキラル分析用キャピラリカラムＣＨＩＲＡＬＤＥＸ  Ｇ−ＴＡを用いて生成エポキサイドの光学純度分析を行った結果、原料がアリルクロライドの場合の生成エピクロロヒドリンの光学異性体比は（Ｒ）：（Ｓ）＝１：６．７、原料がスチレンの場合の生成スチレンオキサドの光学異性体比は（Ｒ）：（Ｓ）＝２．２：１であった。また同カラムにて原料がトルエンの場合の生成クレゾールの分析を行ったところ、ｏ−：ｍ−：ｐ−＝４８：３：１であり、ｏ−位に位置選択的に水酸基が導入された化合物であるｏ−クレゾールが９２％以上の比率で生成していることが明らかとなった。
【００３３】
ＨＰ５８９０にてキャピラリカラムＨＰ−５を用いて定量した、原料がアリルクロライドの場合の生成エピクロロヒドリン濃度、原料がスチレンの場合の生成スチレンオキサイド濃度、原料がシクロヘキセンの場合の生成シクロヘキセンオキサイド濃度、原料がトルエンの場合の生成ｏ−クレゾール濃度、原料がナフタレンの場合の生成１−ナフトール濃度を図５に示す。図中、縦軸は各物質の濃度（ｍＭ）、横軸は反応時間（ｈ）を示す。
【００３４】
以上の結果からＪａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓの酸化酵素によりアリルクロライドからは（Ｓ）体過剰のエピクロロヒドリン、スチレンからは（Ｒ）体過剰のスチレンオキサイド、シクロヘキセンからはシクロヘキセンオキサイドを生じ、ハロゲン基や芳香族性の置換基を有するオレフィンや環状の内部オレフィンのエポキシ化が進行することが明らかとなった。また、ナフタレンからは１−ナフトール、トルエンからはｏ−クレゾールが生じることから、芳香族化合物の位置特異的な水酸化反応が進行していることが示された。
【００３５】
【発明の効果】
以上の説明のように、本発明によりＪａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｂｒｅｖｉｓの酸化酵素を利用して酸化物の製造を行うことができ、特にオレフィン又はその誘導体の光学選択的エポキシ化、芳香族化合物又はその誘導体への位置選択的なフェノール性水酸基の導入、更にはインドール又はその誘導体のインドキシル類への変換が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２で行なった１−ブテンの酸化反応における、生成１，２−ブチレンオキサイド濃度を示したグラフである。
【図２】実施例２で行なった酸化反応における、生成１，２−ブチレンオキサイドの光学異性体の（Ｒ）／（Ｓ）比を示したグラフである。
【図３】実施例３で行なった酸化反応における、各生成物の濃度を示したグラフである。
【図４】実施例３で行なった酸化反応における、原料および酸化生成物のＧＣａｒｅａの変化を示したグラフである。
【図５】実施例４で行なった酸化反応における、各生成物の濃度を示したグラフである。
【図１】
2004357512.tif 000003
【図２】
2004357512.tif 000004
【図３】
2004357512.tif 000005
【図４】
2004357512.tif 000006
【図５】
2004357512.tif 000007