(57)【要約】【課題】  ＨＩＶ群由来レトロウイルスの検出のために有用なＤＮＡを提供する。【解決手段】  European Collection of Animal Cell Cultures（ECACC）にNo．Ｖ ９２０ ９２ ３１８の番号で寄託されたＭＶＰ−５１８０／９１なる呼称を有するレトロウイルスの本質的な形態学的および免疫学的性質を示すＨＩＶグループの免疫不全ウイルスまたはこのウイルスの変異株のＲＮＡまたはその部分に対し相補的であるＤＮＡ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
European Collection of Animal Cell Cultures（ECACC）にNo．Ｖ  ９２０ ９２ ３１８の番号で寄託されたＭＶＰ−５１８０／９１なる呼称を有するＨＩＶおよびその変異株であるＨＩＶグループの免疫不全ウイルスであって、前記変異株が第１表または第３表に示すヌクレオチド配列と一致するまたは当該配列と相同性のある配列を有するものであり、前記相同性がヌクレオチド配列に基づき６６％以上である免疫不全ウイルスのＲＮＡに対し相補的であるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組換えＤＮＡ。
【請求項３】
第１表または第３表に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡを用いるペプチドの製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡを用いる免疫不全の原因となるレトロウイルスの検出方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡを用いる接種素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ群由来の新規レトロウイルスおよびそのウイルスの本質的性質を有する変異株のＲＮＡまたはその部分に対して相補的であるｃＤＮＡに関する。そのレトロウイルスの培養方法も説明される。さらに本発明は、このレトロウイルスの取得のほか、そのウイルス、その部分または抽出物の、医学目的、診断のための、また接種素調製の際における使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
いわゆるＨＩＶ群に属すレトロウイルスはそれに感染した人間に免疫不全またはエイズ（先天性免疫不全症候群）という集合概念で総括される症状を招く。
【０００３】
疫学的研究により、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）がエイズ（先天性免疫不全症候群）症例の圧倒的多数の病因であることが実証されている。１９８３年にある患者から単離され特性評価されたレトロウイルスにＨＩＶ−１という名称が与えられた（Barre-Sinoussi, F. et al., Science 220, 868-871〔1983〕）。ＨＩＶ−１の一変異株がＷＯ ８６／０２３８３に記載されている。
第２のヒト免疫不全ウイルス群は１９８５年に西アフリカで同定され（Clavel, F. et al., Science 233, 343-346〔1986〕）、そしてヒト免疫不全ウイルス・タイプ２（ＨＩＶ−２）と名付けられている（ＥＰ−Ａ−０ ２３９ ４２５）。ＨＩＶ−２レトロウイルスは、明らかにＨＩＶ−１とは区別されるが、なおもサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ−２）と近縁関係をも示す。ＨＩＶ−１と同様、ＨＩＶ−２もエイズ症状を生じる。
免疫不全レトロウイルスのもう一つの変異株がＥＰ−Ａ−０ ３４５ ３７５に記載されており、そこではＨＩＶ−３レトロウイルスと名付けられている（ＡＮＴ ７０）。
【０００４】
Lancet Vol. 340, Sept. 1992, pp. 681-682には免疫不全ウイルスのもう一つの変異株の単離が記載されている。
高い変異性を示すことがヒト免疫不全ウイルスの一特徴であり、これが様々な単離物の比較の可能性を明らかにめんどうにしている。様々なＨＩＶ−１−単離物を比較すると、他のゲノム領域は比較的保存されたままであるのに、いくつかのゲノム領域では高い変異性が認められる（Benn, S. et al. Science 230, 949-951〔1985〕）。本質的により大きい多形態性はＨＩＶ−２についても観察することができた（Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695〔1986〕）。構造的および酵素的に不可欠なタンパク質をコードしているgagおよびpol遺伝子は大きな遺伝安定性を有し；env遺伝子および調節タンパク質をコードする遺伝子（vif、vpr、tat、rev、nef）は高い変異度を示す。さらにＨＩＶ−１に対する抗血清がほんのわずかな配列相同性しかなくても、ＨＩＶ−２のgagおよびpol遺伝子産生物とも交叉反応することも示すことができた。同様に、あまり厳しくない条件を用いなければ両ウイルス間のハイブリダイゼーションはほとんど有意でなかった（Clavel, F. et al., Nature 324, 691-695〔1986〕）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＨＩＶ群由来レトロウイルスが広く伝播していることから、そして感染時点と、病理学的変化の明らかな徴候が認められるまでの時点との間に数年乃至多年（２〜２０年）の間隔があることから、ＨＩＶ群レトロウイルスをできるだけ早くそしてとりわけ確実に測定することは疫学的に極めて重要なことである。これは免疫不全の徴候を示す患者の診断の際だけでなく供血者の検査においても役割を果す。ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２タイプのレトロウイルスまたはそれらの構成部分をヒト血清の検出系に用いた場合、それら血清が由来する患者に免疫不全の徴候が現われているのに、抗体を全く検出できないかあるいは弱い検出しかなされないことがわかっている。本発明によるＨＩＶ群由来レトロウイルスを用いれば一定の場合にそのような検出が可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１９９１年に免疫不全の徴候を示した３４才のカメルーンの女性患者の末梢リンパ球から単離された、以下ＭＶＰ−５１８０／９１と称する新規ヒト免疫不全ウイルスの単離および特性評価を記述する。地理的には、このレトロウイルスは、ＨＩＶ−２およびＨＩＶ−１ウイルス感染の伝播を特色とする西アフリカと、ほぼもっぱらにＨＩＶ−１が伝播している東中央アフリカとの間に位置するアフリカの地域に由来している。さらに本発明の対象は、ＭＶＰ−５１８０／９１と称されるＨＩＶ群の新規レトロウイルスおよびその変異株のほか、それより導かれるＤＮＳ配列およびアミノ酸配列または部分配列、およびこれらを含むテストキットである。レトロウイルスＭＶＰ−５１８０／９１はブダペスト条約の条件に従ってEuropean Collection of Animal Cell Cultures（ECACC）にＶ９２０ ９２ ３１８の番号の下に寄託された。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によるＨＩＶ群由来レトロウイルスを用いれば新しいタイプのＨＩＶを特定化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２と同様に、本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１は次の細胞系統、ＨＵＴ７８、Jurkat−細胞、Ｃ８１６６−細胞およびＭＴ−２−細胞で増殖する。ウイルスの単離および増殖は“Viral Quantitation in HIV Infection（ＨＩＶ感染におけるウイルス定量）、Jean-Marie Andrien編、John Libbey Eurotext発行、1991年"、という本に詳述されている。そこに記述されている操作方法を引用により本出願の開示の一部とする。
さらに、本発明ウイルスはマグネシウム依存性ではあるがマンガン依存性ではない逆転写酵素を有する。このことは、ウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２とのもう一つの一致点である。
【０００９】
本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１ウイルスとレトロウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の相違をよく理解してもらうために、免疫不全の原因となるレトロウイルスの構築をまず簡単に説明する。ウイルスの内部には、ｐ２４（ｐはprotein（タンパク質）のｐである）の呼称を有するサブユニットより組成された円錐状コアにＲＮＡが存在する。この内部コアは、タンパク質ｐ１７で構築されたタンパク質外被（外部コア）で囲まれ、そして宿主細胞に由来する脂質のほかにトランスメンブレン（transmembrane）タンパク質gp４１および外被タンパク質１２０（gp１２０）を含む糖タンパク質外被により囲まれている。このgp１２０は次いで宿主細胞のＣＤ−４−レセプターと結合することができる。
【００１０】
知られている限り、ＨＩＶ−ウイルスのＲＮＡは（簡略化して記述した場合）次の遺伝子領域を示す：両末端にいわゆるロングターミナルリピート、および次の遺伝子領域、すなわちgag、pol、envおよびnef。gag遺伝子はとりわけ中核（コア）−タンパク質であるｐ24およびｐ17をコードし、pol遺伝子はとりわけ逆転写酵素、ＲＮエース（リボヌクレアーゼ）Ｈおよびインテグラーゼをコードし、そしてenvはウイルス外被の糖タンパク質であるgp４１およびgp１２０をコードする。nef遺伝子は調整機能を有するタンパク質をコードする。ＨＩＶ型のレトロウイルスのゲノム配置の概略図を図１に示す。
【００１１】
レトロウイルスＨＩＶ−１とＨＩＶ−２との間の区別は、ウイルス抗原がAbbott社のテストキット（ＨＩＶＡＧ−１ Monoclonal）として商業的に入手されるモノクローナル抗体を用いてテストしそして（ＨＩＶ−１）ｐ２４に指向させることにより可能になる。ウイルス型ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２における逆転写酵素含量が略等しいことは知られている。そこで可溶化されたウイルスの希釈液について抗原抗体反応によって得られる吸光度（Ｅ４９０nm）を逆転写酵素の活性に対してプロットすると大体図２に相当するグラフが得られる。ここでわかることは、ＨＩＶ−１における逆転写酵素含量に比例して使用モノクローナル抗体にはｐ２４に対する極めて高い結合親和性が存在することである。それに対し、ＨＩＶ−２については、モノクローナル抗体をこの場合も逆転写酵素含量に関係させて用いた場合極めてわずかな対ｐ２４結合親和性しか認められない。この測定をＭＶＰ−５１８０／９１について行うとかなり正確にＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の曲線の中間にくる、すなわちモノクローナル抗体の結合親和性はＨＩＶ−１よりも低下している。図２はこれらの事実を図示したものであり、ここでＲＴは逆転写酵素を意味し、そして抗原（Ag）としては、Abbott社より購入されるテストキットに存在するモノクローナル抗体がそれに対して指向するタンパク質ｐ２４が用いられる。
【００１２】
多面的に利用可能な遺伝子工学系はいわゆるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）であり、その場合、この方法の実施に必要な成分は購入することができる。この方法を用いれば、増幅すべき配列のＤＮＡ領域が知られていればＤＮＡ配列を増幅することができる。その際、増幅すべき核酸配列の短い領域に付着する短い相補ＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド＝プライマー）を合成する必要がある。テストの実施には、そのほかにポリメラーゼとヌクレオチドトリホスフェートを含有する反応混合物中でＨＩＶ−核酸をそのプライマーと混合する。重合（ＤＮＡ合成）を一定の時間行った後、核酸鎖を加温により分離させる。冷却後、重合を改めて開示させる。従って本発明によるレトロウイルスにおいてＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルスが問題とされる場合には、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ウイルスの既知配列内で保存されたプライマーを用いて核酸を増幅し得たはずであろう。そのようなプライマーは一部報告されている（pol３およびpol４についてはLaure, F. et al., Lancet ii,（1988）538-541、またはｓｋ３８／３９、ｓｋ６８／６９についてはOu C.Y. et al., Science 239（1988）295-297）。
【００１３】
今般次の配列を示す一定のプライマー対、すなわち
【化１】
2004187686.tif 000002
【００１４】
またはpol３およびpol４と
ＵＮＩ−１：ＧＴＧＣＴ  ＴＣＣＡＣ  ＡＧＧＧＡ  ＴＧＧＡＡ
ＵＮＩ−２：ＡＴＣＡＴ  ＣＣＡＴＧ  ＴＡＴＴＧ  ＡＴＡ
（Donehower L.A. et al.（1990）J. Virol. Methods 28, 33-46）
との組合せを用い、そしてネステッド・プライマー（nested primer）を用いたＰＣＲを行うとＭＶＰ−５１８０／９１−ＤＮＡの弱い増幅物が得られることがわかった。
【００１５】
次のプライマー配列
【化２】
2004187686.tif 000003
を用いると、増幅物は全く得られなかったが、ＨＩＶ−１に比べ弱い増幅物しか得られなかったが、これは場合によっては汚染によるかもしれない。
【００１６】
gag c：TATCA CCTAG AACTT TAAAT GCATG GG
gag d：AGTCC CTGAC ATGCT GTCAT CA
env a：GTGGA GGGGA ATTTT TCTAC TG
env d：CCTGC TGCTC CCAAG AACCC AAGG
を用いるとＨＩＶ−１に比べ弱いが使用ＨＩＶ−２単離物（ＭＶＰ−１１９７１／８７）と同じ強さを示す増幅物が得られた。
【００１７】
広く普及しているＨＩＶ−抗体の検出方法は、いわゆるウエスターンブロット（免疫ブロット）である。その場合、ウイルスタンパク質はゲル電気泳動的に分離された後、膜に移される。その移されたタンパク質を有する膜は次に検査すべき患者の血清を結合させる。ウイルスタンパク質に対する抗体が存在すれば、これはそのタンパク質に結合する。洗浄後はウイルスタンパク質に対する特異的抗体のみが残る。その抗体は次に、呈色反応を触媒する酵素と規則的にカップリングされた抗抗体により視認可能にできる。この方法により、ウイルスタンパク質のバンドを可視化することとができる。
【００１８】
本発明によるウイルスＭＶＰ−５１８０／９１はウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対し、ウェスターンブロットにおいて二つの著しい本質的相違点を示す。ＨＩＶ−１は、タンパク質ｐ２４に対応する強いバンドと、ｐ２３に対応する極めて弱い、しばしばほとんど視認できないバンドを規則的に示す。ＨＩＶ−２はタンパク質ｐ２５に対応する強力なバンドを、そして多くの場合にｐ２３に対応する弱いバンドを示す。これとは対照的に、本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１ウイルスはタンパク質ｐ２４およびｐ２５に相当するほぼ同じ強さの二本のバンドを示す。
【００１９】
もう一つの著しい相違点は逆転写酵素に対応するバンドに存在する。ＨＩＶ−１は逆転写酵素に相当する一本のバンド（ｐ５３）とＲＮエースＨと結合した逆転写酵素に相当する一本のバンド（ｐ６６）を示す。ＨＩＶ−２ではその逆転写酵素はタンパク質ｐ５５に相当し、またそれがＲＮエースＨと結合している場合はタンパク質ｐ６８に相当する。それに対し本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１は、タンパク質ｐ４８のところに逆転写酵素に相当する一本のバンド、およびタンパク質ｐ６０のところにＲＮエースＨと結合した逆転写酵素に相当する一本のバンドを示す。
これらの結果から、ＭＶＰ−５１８０／９１の逆転写酵素はＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の逆転写酵素よりも約３〜約７キロダルトン小さい分子量を有すると結論することができる。ＭＶＰ−５１８０の逆転写酵素は従ってＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の逆転写酵素よりも約４,５００〜約５,５００ダルトン小さい分子量を示す。
【００２０】
本発明によるウイルスＭＶＰ−５１８０／９１を用いた場合、抗−env−抗体は免疫不全の徴候を示すドイツの患者の血清中にはほんの弱くに検出され得るにすぎないが、本発明によるウイルスに代えてＨＩＶ−１ウイルスを用いるとそれらの血清が強く反応することが見出された。この強力な検出反応はとりわけｇｐ４１タンパク質に局在した。それらの試験では、一方はドイツの患者に由来し、そして他方は免疫不全の徴候を示すアフリカの患者に由来する血清パネルを対比した。
前述の諸特徴が本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１に相当するようウイルス変異株を特徴付ける。従って、免疫不全徴候を示しそして好ましくはアフリカに由来する人々に由来するヘパリン加供血者血液から免疫不全ウイルスが単離されれば、この方法により本発明によるウイルスまたはその変異株を得ることができる。
【００２１】
前述の性質を示すウイルスが単離されたのでｃＤＮＡのクローニングを次の方法により行うことができる：そのウイルスを相応の量（約１リットル）の培養液から沈殿させ、そしてホスフェート緩衝食塩水にとる。次に（２０％）サッカロース−パッドを通してペレット化を行う。そのウイルスペレットは、２０mMジチオトレイトールおよび０.５％Nonidet ｐ４０中の６Ｍグアニジニウムクロライド中に懸濁することができる。ＣｓＣｌを２Ｍ濃度になるまで添加しそしてその破砕されたウイルスを含有する溶液を塩化セシウムパッドに適用する。次いでウイルスＲＮＡを遠心分離によりペレット化し、溶解し、フェノール抽出し、そしてエタノールおよび塩化リチウムを用いて沈殿させる。オリゴ（Ｔ）−プライマーを用いて第一ｃＤＮＡ鎖の合成をウイルスＲＮＡまたはその一部で行う。逆転写酵素を添加しての合成は購入により入手されるキットを用いて行うことができる。第二鎖の合成にはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖をＲＮエースＨで希釈しそして大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成される。次いでＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ平滑末端を作ることができ、そしてこれを制限切断部位に適したリンカーと結合させる。適切な制限エンドヌクレアーゼによる制限消化の後、ｃＤＮＡ断片をアガロースゲルから単離し、そして予め適切な方法で切断されたベクターに結合する。ｃＤＮＡ−インサートを有するそのベクターを次いでコンピテント大腸菌細胞の形質転換に用いることができる。得られたコロニーを次いで膜に移動し、溶菌させそして変性させ、そして最後にハイブリダイゼーションにより、ジゴキシゲニンまたはビオチンで標識された核酸と結合させる。相当するｃＤＮＡの遺伝子工学的調製後、レトロウイルスに由来する目的とするＤＮＡ断片の単離が可能である。適切な発現ベクター中でこの断片を構築することにより、次いで目的とするタンパク質またはタンパク質断片を発現させ、そして診断テストに適用することができる。
【００２２】
前述の方法とは別の選択肢として、免疫不全ウイルスをＰＣＲ法を用いてクローン化でき、その際前述のプライマーを用いることができる。
様々なウイルス単離物の間の類似性を核酸またはタンパク質配列の相同度により絞り出すことができる。例えば５０％相同性は配列中の１００のヌクレオチド−またはアミノ酸−位のうち５０が一致することを意味している。タンパク質の相同性は配列分析により決定される。相同ＤＮＡ配列はハイブリダイゼーション法によっても調べることができる。
【００２３】
本発明によれば、まず外被タンパク質の一部について配列決定がされたところ、この配列がＨＩＶ型のウイルスの相当する配列に対して比較的わずかな相同性しか示さないことが確認された。特にgp４１領域に関しては、データバンクを利用して行われたＨＩＶ−配列との比較によって高々６６％（核酸配列）の相同性が見出されたにすぎない。
更に、gp４１をコードする領域も配列決定された。この配列を第１表または第３表に示す。
【００２４】
従って本発明の主題は、第１表および／または第３表のヌクレオチド配列に関し、本発明によるＨＩＶウイルス、ＭＶＰ ５１８０／９１に対して６６％以上、好ましくは７５％以上、そして特に好ましくは８５％以上の相同性を示すようなウイルスである。
更に本発明の主題は、少くとも５０、好ましくは１００、ヌクレオチド長の第３表に記載の核酸配列の部分配列に対して６６％以上、好ましくは７５％以上、そして特に好ましくは８５％以上の相同性を示すようなウイルスである。これは、少くとも１６、そして好ましくは３３、のアミノ酸のアミノ酸長に相当する。
【００２５】
本発明によるウイルスはその配列によって従来より知られるウイルスとは区別される。従って本発明の主題は、相同度により相違度を確認した場合に本発明によるウイルスの配列に広範に対応するようなウイルスおよび相当する核酸またはアミノ酸配列である。従って例えば８５％以上の相同性は、１００のヌクレオチドまたはアミノ酸のうち少くとも８５において同じヌクレオチドまたはアミノ酸を示し残りは異なっていてもよいような配列が包含されることを意味する。相同性を確認するにあたって、両配列はできるだけ多くの相互に対応するヌクレオチドまたはアミノ酸が相互に一致するように対応される。
【００２６】
本発明によるウイルスのＤＮＡ配列として記載された（ほぼ）完全な配列を第７表に示す。ここで本発明の主題は第７表による配列を示すウイルス、および第７表の配列に対し高い相同性を示すそれらの変異株、およびそれらより導かれる、診断的に使用できるかまたは接種素として通用できるタンパク質、ポリペプチドおよびオリゴペプチドである。
【００２７】
単離された配列に基づき免疫支配エピトープ（ペプチド）を調製し（konfektioniert）合成することができる。ウイルスの核酸配列がわかっているので当業者はそれよりアミノ酸配列を導くことができる。アミノ酸配列の部分領域を第３表に記述する。従って本発明の主題は、第７表または第４表に開示された情報を用いて調製することができる抗原、すなわちタンパク質、オリゴペプチドまたはポリペプチドでもある。これらの抗原、タンパク質、ポリペプチドおよびオリゴペプチドは、第７表から導き得る、または第３表に記載されているアミノ酸配列を示す。それら抗原またはペプチドは第３表に記載されているかまたは第７表より導き得るアミノ酸配列の比較的短い部分配列を示すことができる。このアミノ酸配列は、少くとも６アミノ酸長、好ましくは少くとも１０アミノ酸長、そして特に好ましくは１５アミノ酸長である。これらのペプチドは組換え法によるだけでなく合成法によって調製することもできる。適当な調製方法の一つはMerrifield型の固相合成である。この方法の更なる記述および他の従来技術として知られる方法は文献、例えばM. Bodansky, et al., Peptide Synthesis, John Weeley & Sons, 第二版，1976にみることができる。
【００２８】
診断テストにおいては、検査すべき人の血清検体をＭＶＰ−５１８０／９１に由来する一以上のタンパク質または糖タンパク質（それらは真核細胞系統において発現させることができる）のタンパク鎖またはその一部と混合する。好ましいテスト方法には免疫蛍光または免疫酵素テスト法（例えばＥＬＩＳＡ、イムノブロット）が包含される。
免疫酵素テスト（ＥＬＩＳＡ）においては、例えばＭＶＰ−５１８０／９１またはその変異株に由来する抗原をミクロタイタープレートの壁面に結合することができる。その際に用いられる用量はテストシステムおよびミクロタイタープレートの操法に本質的に依存する。次いで検査すべき人に由来する血清または血清希釈液をそのミクロタイタープレートの穴に添加する。一定のインキュベーション時間の後、そのプレートを洗浄する。特異免疫複合体は、ヒト免疫グロブリンに特異的に結合しそして予め酵素例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどに結合しておいた抗体により、あるいは酵素標識抗原を用いて検出される。この酵素は無色基質を強く発色した生成物に変えることができ、次いでその色の強さで特異抗−ＨＩＶ−抗体の存在を読み取ることができる。テストシステムにおける本発明ウイルス利用のもう一つの可能性はウェスターンブロットへの利用である。
【００２９】
たとえ、免疫不全疾患に対する接種素の調製が極端に困難であるとわかっても、このウイルスまたはその一部、すなわち免疫支配エピトープおよび細胞性免疫のインデューサー、あるいは遺伝子工学的に調製された抗原は接種素の開発および調製に用いることができる。
【実施例】
【００３０】
実施例１
本発明による免疫不全ウイルスＭＶＰ−５１８０／９１を免疫不全徴候を伴う女性患者の血液から単離した。そのために、ＨＩＶに感染していない供血者の血液からの末梢リンパ球（peripheral blood lymphocytes, PBL）および末梢単核細胞（末梢血リンパ球、PBL）を植物性血球凝集素（フィトヘマグルチニン）で刺激しそして培養液に保った。そのために、１０％牛胎仔血清含有の普通培地ＲＰＭＩ １６４０を用いた。培養条件はLanday A. et al., J. Inf. Dis., 161（1990）pp．706-710、に記載されている。次いで巨細胞（Reisenzellen）の形成を顕微鏡観察した。ＨＩＶウイルスの生産をAbbott社から購入できるテストを用いたｐ２４−抗原の測定により測定した。ウイルス増殖測定のためのもう一つのテストは粒子結合逆転写酵素を用いたテストであった（Eberle J., Seibl R., J. Virol. Methods 40, 1992, pp. 347-356）。すなわち、ウイルス生産を監視するためにウイルス増殖を培養上清中の酵素活性に基づいて週１〜２回測定した。１週間に１回新たな供血者リンパ球を添加した。
【００３１】
ＨＩＶウイルス増殖が確認できた後、ＨＩＶで感染されていない健常供血者の血液からの新鮮末梢リンパ球（ＰＢＬ）を初代培養液上清で感染させた。この段階を反復した後その上清でＨ９またはＨＵＴ７８細胞を感染させた。この方法により免疫不全ウイルスの永続的生産が可能であった。そのウイルスはＥＣＡＣＣにNo．V 920 92 318の番号で寄託された。
【００３２】
実施例２
ＨＩＶ感染の検出には、現在のところいわゆるウェスターンブロットまたはイムノブロットが標準的方法である。J. Virol. Meth. 15 (1987) pp. 11-23にGuertlerらが記載している手順に従って様々な血清を検査した。その際に、ドイツの患者の血清をアフリカの患者から得られた血清と対比させた。その際に得られた結果は次のとおりであった。
ウイルス型：ドイツの患者から単離されたＨＩＶ−１ウイルス
ドイツの血清    強い反応
アフリカの血清  ｇｐ４１と強い反応
ウイルス型：ＭＶＰ−５１８０／９１
ドイツの血清    ｇｐ４１と無反応乃至弱い反応
アフリカの血清  強い反応
【００３３】
前述の結果は、ドイツの患者から単離されたＨＩＶ−１型ウイルスをＨＩＶ−感染の検出に用いる場合、患者が本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１に相当するウイルスに感染しているときは、一義的結果は多分全く得られないことを示している。さらにそれによって、本発明によるウイルスを用いればゲノム全体に関し少くとも約８５％相同性を本発明ウイルスに対して示すようなウイルスを検出できると結論される。
【００３４】
実施例３
実施例２に記載の手順に従ってさらなるウェスターンブロットを行った。その結果を添付した図３に示す。このテストでは、本発明による免疫不全ウイルスＭＶＰ−５１８０／９１のウイルスタンパク質、およびＨＩＶ−１型ウイルス（ＭＶＰ−８９９）のウイルスタンパク質をそれぞれ、ゲル電気泳動分離した後セルロースフィルターに移した。これらフィルター片を様々な患者の血清と共にインキュベートした後特異抗体を呈色反応により視認できるようにした。ＭＶＰ−５１８０の標題のある図の左半分は本発明による免疫不全ウイルスを示す。図の右半分は、ＨＩＶ−１ウイルスに関係する、ドイツの供血者から単離されたウイルス（ＭＶＰ−８９９）を示す。
それら個々のフィルター片を今度は様々な患者の血清と共にインキュベートした。図３からわかるように、それぞれ同じ（ドイツの患者の）血清を各々２つのフィルター片と反応させた。８と２６；９と２７；１０と２８；１１と２９；１３と３０；１３と３１；１４と３２；１５と３３および１６と３４の番号は同じ血清を表示している。１７および１８番のウェスターンブロットでは、アフリカの患者の血清を適用した。右側余白の数値は概ねの分子量を１０００（ＫＤ）単位で記述したものである。
【００３５】
図３は、本発明による免疫不全ウイルスを有するドイツの患者の血清がウェスターンブロットにおいてｇｐ４１とは極めて弱くしか反応しないことを明らかに示している。これに対し、アフリカの患者の血清は本発明による免疫不全ウイルスと極めて強く反応する。従って図３は、本発明による免疫不全ウイルスを用いればＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルスを用いた場合には不確かな、すなわち一義的でない陽性結果しか得られないような免疫不全感染を検出できることを明らかにしている。この検出可能性は遠大な診断上の意義を有し得る。何故ならば、ウェスターンブロットで不確かな結果しか得られない場合は、免疫不全ウイルスによる感染が関係しているかどうかを明確な確実さをもって確認することができないからである。しかしながら本発明による免疫不全ウイルスを用いてかかる不確かな結果が本発明によるタイプのウイルスによる感染と相関させることができるところ、これは診断上大変な進歩である。
【００３６】
実施例４
ＨＩＶ−単離物ＭＶＰ−５１８０／９１のゲノム断片のＤＮＡ単離、増幅および構造的特徴評価
ＭＶＰ−５１８０／９１に感染させたＨＵＴ７８細胞よりのゲノムＤＮＡを標準的方法により単離した。
単離物ＭＶＰ−５１８０／９１のゲノム領域の特徴評価をするためにＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）実験を外被タンパク質領域ｇｐ４１からのプライマー対を用いて行った。そのＰＣＲ実験の実施は次の改変を加えたSaikiら（Saiki et al., Science 239: 487-491, 1988）の方法により行った：ＨＩＶ−特異的ＤＮＡ領域を増幅するために、ＭＶＰ−５１８０／９１に感染させたＨＵＴ７８細胞からの５μｌのゲノムＤＮＡを１００μｌの反応混合物（０.２５mM ｄＮＴＰ、各１μＭのプライマー１およびプライマー２、１０mM Tris ＨＣｌ pH８.３、５０mM ＫＣｌ、１.５mM ＭｇＣｌ2、０.００１％ゼラチン、２.５単位のＴａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer社））にピペットで取り、そして次の温度プログラムに従って増幅した：１．初期変性：３分９５℃、２．増幅：９０秒９４℃、６０秒５６℃、９０秒７２℃（３０サイクル）。
【００３７】
前記ＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定に用いたプライマーはBioresearch社のオリゴヌクレオチド合成装置８７５０で合成された。
プライマー１：ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＡＡＧ ＣＡＣ ＴＡＴ ＧＧ
（ＨＩＶ単離物Ｈ×Ｂ２からの座標（コーディネート）：塩基７７９５−７８１４、プライマーｓｋ６８に相当）
プライマー２：ＧＡＧ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＧＡ ＧＣＡ ＡＣＣ ＣＣ
（ＨＩＶ１単離物Ｈ×Ｂ２からの座標：塩基８００３−８０２２、プライマー env ｂに相当）。
【００３８】
増幅したＤＮＡを３％“Nusieve”アガロースゲル（Biozyme社）で分離し、増幅した断片を切り取りそして等容の緩衝液（１×ＴＢＥ（０.０９Ｍ Trisボレート、０.００２Ｍ ＥＤＴＡ、pH８.０）と混合した。そのＤＮＡ−アガロースゲル混合物を７０℃で１０分間インキュベートし、次いでフェノール抽出した後、そのＤＮＡを水性相から1／10容の３Ｍ ＮａＡｃ（pH５.５）および２容のエタノールを添加することにより−２０℃で１５分間沈殿させ、次いで遠心分離機（Eppendorf社）でペレット化した（１３０００rpm、１０分、４℃）。ペレット化したＤＮＡを乾燥し、水にとり、そして分光光度計（Beckman社）において２６０nmでのＤＮＡ濃度を光度計測定した後、Sanger（F. Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci., 74：5463，1977）の方法により配列決定した。Klenow ＤＮＡポリメラーゼを用いた配列決定に代えてApplied Biosystems社のキット(“Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing”、注文番号（Best.−Nr.）：401150）を用いて配列決定反応を行った。プライマーとしては別々の配列決定反応にプライマー１またはプライマー２（各１μＭ）を適用した。配列決定反応系の分析はＤＮＡ配列決定装置３７３Ａ（Applied Biosystems社）で、装置製造元の指示に従って行われた。
増幅されたＤＮＡ領域のヌクレオチド配列およびそれより導かれたアミノ酸配列を第１表に示す。
【００３９】
【表１】
2004187686.tif 000004
【００４０】
実施例５
確認された第１表記載のヌクレオチド配列の相同配列をＧＥＮＥＢＡＮＫデータバンク（リリース７２、１９９２年６月）でＧＣＧ−コンピュータープログラム（Genetic Computer Group, Inc.社、米国ウイスコンシン州、バージョン７.１、１９９２年３月）を用いて調べた。このデータバンクには１９９２年７月までに知られた、ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離物のヌクレオチド配列のほとんどが含まれている。
【００４１】
第１表のヌクレオチド配列は最良の場合にはチンパンジーからの単離物に対し６６％の相同性を示す。ＨＩＶ１単離物に対して、ＭＶＰ５１８０／９１は調べたＤＮＡ配列において最良の場合に６４％相同である。ＨＩＶ２単離物に対し第１表のＤＮＡは５６％相同である。チンパンジーからの単離物の外には第１表のヌクレオチド配列と霊長類からの単離物（ＳＩＶ：サル免疫不全ウイルス）からのＤＮＡ断片の間の最良の相同性は、単離物ＳＩＶ（アフリカ産オナガザル）ＴＹＯ−１の外被タンパク質の部分領域をコードするＤＮＡ配列に存在する。その相同性は６１.５％である。
【００４２】
実施例６
確認された第１表に記載のアミノ酸配列の相同配列をＳＷＩＳＳＰＲＯＴタンパク質データバンク（リリース２２、１９９２年６月）においてＧＣＧ−コンピュータープログラムを用いて調べた。このデータバンクには１９９２年６月までに知られた、ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離物のタンパク質配列のほとんどが含まれている。
【００４３】
第１表記載のアミノ酸配列は前述のチンパンジーからの単離物の外被タンパク質断片に対し最良の場合６２.５％相同である。ＨＩＶ１−外被タンパク質の下では、第１表のアミノ酸配列との最良の相同性は単離物ＨＩＶ１ Ｍａｌに認められる。その相同性は５９％である。ＨＩＶ２−外被タンパク質に対しては第１表のアミノ酸配列との相同性は最良の場合５２％（単離物ＨＩＶ２ Ｒｏｄ）である。ＨＩＶ１およびＨＩＶ２−単離物も最良の場合対応するタンパク質断片においてわずか６４％が一致するに過ぎないことから、単離物ＭＶＰ−５１８０／９１の場合はＨＩＶ１およびＨＩＶ２とは明らかに構造的に区別され従ってそれらから独立したＨＩＶウイルス群の代表であるＨＩＶ変異株が関係していると思われる。
【００４４】
ＨＩＶ単離物ＭＶＰ−５１８０／９１の増幅されたＤＮＡ領域のアミノ酸配列（第１表）は、ＨＩＶ１の外被タンパク質の免疫診断的に重要な領域（アミノ酸５８４−６１８＊）とオーバーラップする（第２表）(Gnann et al., J. Inf. Dis. 156：261-267, 1987; Norrby et al., Nature, 329：248-250, 1987）。
ＨＩＶ２およびＳＩＶの外被タンパク質の対応するアミノ酸領域も同様に免疫診断的に保存されている（Gnann et al., Science, pp. 1346-1349, 1987）。従ってＨＩＶ１およびＨＩＶ２のこの外被タンパク質領域からのペプチドは多くの商業的に入手し得るＨＩＶ １／２抗体スクリーニングテストに固相抗原として適用される。それによって約９９％の抗ＨＩＶ１および抗ＨＩＶ２陽性血清を捕捉することができる。
【００４５】
ＭＶＰ−５１８０／９１−外被タンパク質のアミノ酸領域（第１表）は、ｇｐ４１の免疫診断的に重要な領域とオーバーラップしていることから、血清診断的に重要であり得る。特に、ＨＩＶ感染した患者の抗血清が商業的に入手される抗体スクリーニングテストのいずれとも陽性に反応しない場合にはそうである。これらの場合には、ＭＶＰ−５１８０／９１と密接な関係にあるウイルスによる感染が存在し得る。
【００４６】
【表２】
2004187686.tif 000005
【００４７】
実施例７
（ｇｐ４１をコードする）ＨＩＶ単離物ＭＶＰ−５１８０／９１のゲノム診断のＤＮＡ単離、増幅および構造的特徴評価
ＭＶＰ−５１８０／９１に感染したＨＵＴ７８細胞からのゲノムＤＮＡを前述の如く単離した。
単離物ＭＶＰ−５１８０／９１のゲノム領域の特徴評価を行うために、外被タンパク質領域ｇｐ４１からのプライマー対を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）実験を行った。ＰＣＲ（Saiki et al., Science 239：487-491, 1988）および逆ＰＣＲ（Triglia et al., Nucl. Asids, Res. 16：8186, 1988）は次の改変を加えて行われた：
【００４８】
１．ＰＣＲ
ＨＩＶ−特異的ＤＮＡ領域を増幅するために、ＭＶＰ−５１８０／９１に感染させたＨＵＴ７８細胞からの５μｌ（２１８μｇ／ml）のゲノムＤＮＡを１００μｌの反応混合物（０.２５mM ｄＮＴＰ、各１μＭのプライマー１６３envおよびプライマーenvend、 １０mM Tris ＨＣｌ（pH８.３)、５０mM ＫＣｌ、１.５mM ＭｇＣｌ2、０.００１％ゼラチン、２.５単位のＴａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer社））にピペットでとりそして次の温度プログラムに従って増殖した：１．初期変性：３分間９５℃、２．増幅：９０秒間９４℃、６０秒間５６℃、９０秒間７２℃（３０サイクル）。
【００４９】
２．ｇｐ４１の５′領域（Ｎ−末端）およびｇｐ１２０の３′配列を“逆ＰＣＲ”により増幅した。そのために、ＭＶＰ−５１８０／９１に感染させたＨＵＴ７８細胞からの１００μｌのゲノムＤＮＡ調製物（２１８μｇ／ml）を１０単位の制限エンドヌクレアーゼSau3aを含む２００μｌの最終容量中３７℃で１時間消化した。そのＤＮＡを次にフェノール処理し、そして酢酸ナトリウム（最終濃度３００mM）および２.５容エタノールを用いて−７０℃で１０分間沈殿させ、エッペンドルフ遠心分離機で遠心分離し、そしてそのペレットを乾燥しそして８９０μｌの蒸留水に再懸濁した。１００μｌのリガーゼ緩衝液（５０mM Tris ＨＣｌ、pH７.８、１０mM ＭｇＣｌ2、１０mM ＤＴＴ、１mM ＡＴＰ、２５μｇ／ml牛血清アルブミン）および１０μｌのＴ４ ＤＮＡ−リガーゼ（Boehringer社、マンハイム）を添加した後、それらＤＮＡ断片を室温で３時間結合し、改めてフェノール処理し、そして前述の如く酢酸ナトリウムおよびエタノールを用いて沈殿させた。遠心分離および乾燥後、そのＤＮＡを４０μｌの蒸留水に再懸濁し、そして１０単位の制限エンドヌクレアーゼSacＩ（Boehringer社、マンハイム）を用いて１時間消化した。次に５μｌのこの混合物を“１．ＰＣＲ”に記載の如くＰＣＲ実験に適用した。プライマー１６３envおよびenvendに代えてプライマー１６８；および１６９；を逆ＰＣＲに用いた。
【００５０】
それらプライマー１６３env、１６８；および１６９；は、ＨＩＶ−単離物ＭＶＰ−５１８０のすでに確認されている部分配列から選択した（実施例４）。
ＰＣＲ／逆ＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定に用いられたプライマーはBioresearch社のオリゴヌクレオチド合成装置８７５０で合成したところ、該プライマーは次の配列を示す：
プライマー１６３env： 5′CAG AAT CAG CAA CGC CTA AAC C 3′
プライマーenvend：    5′GCC CTG TCT TAT TCT TCT AGG 3′
（ＨＩＶ１単離物ＢＨ１０での位置：塩基８１２９−８１０９）
プライマー １６８ｉ： 5′GCC TGC AAG CCT TAG AAA CC 3′
プライマー１６９ｉ：  5′GCA CTA TAC CCT TCA GTA CAC TG 3′
【００５１】
増幅されたＤＮＡを３％“Nusieve”−アガロースゲル（Biozyme社）で分離し、増幅された断片を切り取りそして等容の緩衝液（１×ＴＢＥ（０.０９Ｍ Trisボレート、０.００２Ｍ ＥＤＴＡ、pH８.０）と混合した。そのＤＮＡ−アガロースゲル混合物を７０℃で１０分間インキュベーションし次いでフェノール抽出した後、ＤＮＡを水性相から1／10容の３Ｍ ＮａＡｃ、pH５.５および２容のエタノールを用いて−２０℃で１５分間沈殿させ、次いでエッペンドルフ遠心分離機でペレット化した（１３０００rpm、１０分間、４℃）。そのペレット化されたＤＮＡを乾燥し、水にとり、そして分光光度計（Beckman社）により２６０nmでのＤＮＡ濃度を光度計測定した後、Sanger（F. Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci., 74：5463，1977）の方法に従って配列決定した。Klenow ＤＮＡポリメラーゼを用いた配列決定に代えてApplied Biosystems社のキット(“Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing”、注文番号：４０１１５０）を用いて配列決定反応を行った。プライマーとしては別々の配列決定反応にプライマー１６３envまたはプライマーenvend（各１μＭ）を適用した。この逆ＰＣＲ実験で増幅されたＤＮＡをプライマー１６８；および１６９；を用いて配列決定した。配列決定反応の分析はＤＮＡ配列決定装置３７３Ａ（Applied Biosystems社）で装置製造元の指示に従って行われた。
増幅されたＤＮＡ領域のヌクレオチド配列およびそれより導かれたアミノ酸配列を第３表に示す。
【００５２】
【表３】
2004187686.tif 000006
【００５３】
【表４】
2004187686.tif 000007
【００５４】
実施例８
確認された第３表記載のヌクレオチド配列の相同配列をＧＥＮＥＢＡＮＫ−データーバンク（リリース７２、１９９２年６月）においてＧＣＧ−コンピュータープログラム（Genetic Computer Group, Inc.社、米国ウイスコンシン州、バージョン７.１、１９９２年３月）を用いて調べた。このデータバンクには１９９２年７月までに知られた、ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離物のヌクレオチド配列のほとんどが含まれている。
第３表記載のヌクレオチド配列はＨＩＶ１−単離物に対して最良の場合６２％相同性を示す。ＨＩＶ２単離物に対して第５表記載のＤＮＡは５０％相同である。
第３表のヌクレオチド配列から導かれるアミノ酸配列の相同配列をＳＷＩＳＳＰＲＯＴタンパク質データバンク（リリース２２、１９９２年６月）においてＧＣＧ−コンピュータープログラムを用いて調べた。このデータバンクには１９９２年６月までに知られた、ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離物のタンパク質配列のほとんどが含まれている。
【００５５】
第３表記載のアミノ酸配列はチンパンジーからの単離物ＣＩＶ（SIVcpz）の相当する外被タンパク質断片に対し最良の場合５４％相同であり、そしてＨＩＶ１単離物Ｍａｌに対して５４.５％相同である。ＨＩＶ２−外被タンパク質に対する第３表記載のアミノ酸配列の相同性は最良の場合３４％（単離物ＨＩＶ２ Ｄ１９４）である。
それに対し、ＨＩＶ１のｇｐ４１−アミノ酸配列をSWISSRPOT−データバンクに存在するＨＩＶ１ ｇｐ−４１配列と比較すると期待されたとおり最良の場合ほぼ１００％の相同性、そして最悪の場合に７８％の相同性が得られる。
第３表記載の配列領域とＨＩＶ１およびＨＩＶ２の対応する断片との間にこのような明らかな構造的相違があることから、単離物ＭＶＰ−５１８０／９１の場合は、ＨＩＶ１およびＨＩＶ２とは明らかに構造的に区別されるＨＩＶ変異株が関係していると思われる。おそらくＭＶＰ−５１８０／９１はＨＩＶ１およびＨＩＶ２とは区別される特別なＨＩＶウイルス群に帰属すると思われる。
【００５６】
ＨＩＶ１−外被タンパク質領域のアミノ酸５８４−６１８のペプチドは血清診断的に特に重要である（番号付けは次による：Wain Hobson et al., Cell 40：9-17，1985, Gnann et al., J. Inf. Dis. 156：261-267, 1987; Norrby et al., Nature, 329: 248-250, 1987）。ＨＩＶ２およびＳＩＶの外被タンパク質の相当するアミノ酸領域も同じく免疫診断的に保存されている（Gnann et al., Science, pp. 1346-1349, 1987）。従ってＨＩＶ１およびＨＩＶ２のこの外被タンパク質領域からのペプチドは多くの商業的に入手し得るＨＩＶ 1/2抗体スクリーニングテストに固相抗原として適用される。それによって約９９％の抗−ＨＩＶ１および抗−ＨＩＶ２陽性血清を捕捉することができる。
ＭＶＰ−５１８０／９１外被タンパク質の相当するアミノ酸領域（第４表）およびこの単離物のｇｐ４１全体は、ＨＩＶ感染患者の抗血清が商業的に入手される抗体スクリーニングテストにおいてほんの弱くしかあるいはそもそも全く反応しない場合に特に血清診断的に重要であり得る。これらの場合には、ＭＶＰ−５１８０／９１と密接な関係にあるウイルスによる感染が存在し得る。
【００５７】
【表５】
2004187686.tif 000008
【００５８】
ＭＶＰ５１８０に由来する情報を用いて確認されたペプチドは従って次のアミノ酸配列を有する：ＲＬＱＡＬＥＴＬＩＱＮＱＱＲＬＮＬＷＧＣＫＧＫＬＩＣＹＴＳＶＫＷＮＴＳ。
従って本発明の主題は、組換えまたは合成により調製することかでき、そして前述の配列または、少くとも６個の連続するアミノ酸、好ましくは９個そして特に好ましくは１２個の連続するアミノ酸を示す部分配列を示すペプチドである。
【００５９】
実施例９
ＨＩＶ単離物ＭＶＰ５１８０の全ゲノムのクローニング
ａ）  ゲノムライブラリーの調製
ＭＶＰ５１８０感染ＨＵＴ７８細胞由来のゲノムＤＮＡを前述の如く単離した。
３００μｇのこのＤＮＡを７７０μｌの容量として０.２４Ｕの制限酵素Sau3Aと共に４５分間インキュベートした。それによって部分的にのみ切断されたＤＮＡを次いで０.７％アガロース（低融点アガロース、Nusieve）でサイズ分画し、そして１０kbと２１kbの間の断片を切り取った。そのアガロースを７０℃で１０分間溶融し、そして等容の緩衝液（１×ＴＢＥ、０.２Ｍ ＮａＣｌ）と混合した。次いでフェノールで２回、そしてクロロホルムで１回抽出した後、1／10容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（pH５.９）および２.５容のエタノールの添加により−７０℃で１０分間ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを遠心分離し、乾燥しそして１μｇ／μｌ濃度で水に溶解した。
【００６０】
サイズ分画されたＤＮＡの収量は約６０μｇであった。５μｇのこのＤＮＡを１Ｕアルカリ性ホスファターゼと共に相当する緩衝液中、３７℃で２０分間インキュベートした。５′−末端ホスフェート残基を分離することによってサイズ分画されたＤＮＡの過度の多重な挿入を減少させた。そのホスファターゼ処理をフェノール処理により停止し、ＤＮＡを前述の如く沈殿させ、１μｇのベクター（２ ＤＡＳＨ、ＢａｍＨＩ切断Stratagene No.：247611）と、全容量を６μｌとして２Weiss単位のラムダＴ４リガーゼを用いて１５℃で１２時間結合した。結合が行われた後、そのＤＮＡをパッキングキット（Gigapack II Gold, Stratagene No.：247611）を用いて製造元の指示に正しく従ってファージ外被にパッキングした。
【００６１】
ｂ）  ＤＮＡプローブの放射性標識
標識にはBoehringer Mannheim社の“ラムダ・プライムド・ＤＮＡ・ラベリング・キット（Random Primed DNA Labeling Kit）”（No.：713 023）を適用した。実施例３に記載の如くプライマー sk６８およびenvbを用いて得られたＰＣＲ生成物を標識した。１μｇのこのＤＮＡを２×５分間煮沸した後氷水中で冷却することにより変性した。標識のために５０mCi〔α−32Ｐ〕−ｄＣＴＰ（ＮＥＮ，No.：ＮＥＸ−０５３Ｈ）を添加した。その他の添加物質を製造元の指示に従ってピペットで添加した。３７℃で３０分間インキュベーションした後、放射性標識済みのＤＮＡを沈殿させた。
【００６２】
ｃ）  ファージ−ライブラリーのスクリーニング
２００μｌの３０℃で一夜培養した培養液（１０mM ＭｇＳＯ4のほか０.２％マルトースを含有するＬＢ培地中のＳＲＢ（Ｐ２）株〔Stratagene, No.：247611〕）に、１００μｌのＳＭ緩衝液（５.８ｇのＮａＣｌ、２ｇのＭｇＳＯ4、５０mlの１Ｍ Tris、pH７.５、および５mlの２％ゼラチン溶液を１リットルのＨ2Ｏに溶解）中の２００００pfu（プラーク形成単位）のライブラリーを添加し、ファージを２０分間３７℃で細菌に吸着させ、７.５mlの５５℃に冷却したTop−アガロースと混合しそして予め加温した直径１４cmのＬｂ−寒天プレートで分別した。約８時間後にプラークが全面に及んだ。そこでプレートにニトロセルロースフィルターを数分間重ねそして非対称的マーキングを設けた。注意深く取り除いた後そのフィルターを２分間変性し（０.５Ｍ ＮａＯＨ、１.５Ｍ ＮａＣｌ）そして次に５分間中和した（０.５Ｍ Tris、 pH８、１.５Ｍ ＮａＣｌ）。そのフィルターを次に８０℃で６０分間ベーキング後プローブとハイブリダイズさせることができた。
【００６３】
プレハイブリダイゼーションを行うべき、そのフィルターをフィルター１枚あたり１５mlのハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、０.５％ＳＤＳ、５×ＳＳＰＥ、５×Denhardt溶液および０.１mg／mlサケ精子ＤＮＡ）中、４２℃で振盪しながら２〜３時間インキュベートした。〔32Ｐ〕標識ＤＮＡプローブを２〜５分間１００℃で変性し、氷冷し、プレハイブリダイゼーション溶液を添加しそして１２時間４２℃でハイブリダイズした。次にそのフィルターを６０℃で、まず２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで、次に０.２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで洗浄した。そのフィルターを乾燥後、ハイブリダイゼーションシグナルをレントゲンフィルムＸ−ＯＭＡＴTHＡＲ（Kodak社）を用いて検出した。
あるシグナルを帰属させることができたプラークをＳＭ緩衝液で溶出後さらなる希釈段階で分離した。
２×１０6プラークのスクリーニング後、下記のクローンを確認することができた。
【００６４】
ｄ）  ファージＤＮＡの単離およびサブクローニング
ＳＭ緩衝液中のファージ溶出液１０μｌを用いて宿主株ＳＲＢ（Ｐ２）の一夜培養物を、培養物の最初の濃密な増殖の後、約６〜８時間後に溶解（Lyse）が行われるように感染させた。その溶解培養物から、９０００ｇで２回１０分間遠心分離することにより細胞残渣を分離した。次にファージを遠心分離（３５０００ｇ、１時間）によりペレット化し、７００μｌの１０mM ＭｇＳＯ4にとり、そしてタンパク質中間相（インターフェーズ）がもはやみられなくなるまでフェノール処理した。そこでファージＤＮＡを沈殿させ、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、そしてそれによって得られたＥｃｏＲＩ断片をベクターBluescript KS-（Strategene，No.：212208）にサブクローン化した。全部で４つのクローンが得られた：
【００６５】
【表６】
2004187686.tif 000009
【００６６】
不足している塩基７４１６と７６５９の間の断片はプライマー１５７（ＣＣＡ ＴＡＡ ＴＡＴ ＴＣＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＣＴＡ Ｇ)および２２６(ＧＣＴ ＧＡＴ ＴＣＴ ＧＴＡ ＴＡＡ ＧＧＧ）を用いたＰＣＲにより得た。ＤＮＡ鋳型としてはクローンのファージＤＮＡを用いた。ＰＣＲの条件は次のとおりとした：１）初期変性：９４℃、３分間、２）増幅：１.５分間９４℃、１分間５６℃および１分間７２℃（３０サイクル）。
ＤＮＡの配列決定は実施例４に記載の如く行った。全ゲノムからその鎖のほかに対向鎖も配列決定した。すべてのＥｃｏＲＩ切断部位の場合に、クローンのファージＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲによって、サブクローン移行時点で各々単一のＥｃｏＲＩ切断部位が関係していることが確認された。
【００６７】
【表７】
2004187686.tif 000010
ＭｖＰ５１８０／９１の全配列は次の第７表に示されている。
【００６８】
【表８】
2004187686.tif 000011
【００６９】
【表９】
2004187686.tif 000012
【００７０】
【表１０】
2004187686.tif 000013
【００７１】
【表１１】
2004187686.tif 000014
【００７２】
【表１２】
2004187686.tif 000015
【００７３】
【表１３】
2004187686.tif 000016
【００７４】
【表１４】
2004187686.tif 000017
【００７５】
実施例１０
ＭｖＰ５１８０／９１の全配列の他のＨＩＶ１単離物からの区別
以下の配列比較の基礎は、遺伝子バンク・リリース７５（１９９３年２月）、ＥＭＢＬ３３（１９９２年１２月）およびSwissprot ２４（１９９３年１月）といったデータバンクであった。相同性比較はＧＣＧソフトウエア（バージョン７.２、１９９２年１０月、Genetics-Computer Group. ウイスコンシン）を用いて行われた。
【００７６】
まずアミノ酸レベルでＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶの配列をプログラム“Wordsearch”を用いてデータバンクと比較した。５０の最良の相同性をプログラム“Pileup”を用いて各々相互比較した。その結果、ＭｖＰ５１８０／９１がＨＩＶ１系統に属するが極めて早い時期に、それどころか更にチンパンジーウイルスＳＩＶｃｐｚより前に分岐し、ＨＩＶ１の新しい亜科（サブファミリー）を代表していることが明らかにわかる。相同性の数値を得るためにプログラム“Ｇａｐ”を用いてＭｖＰ５１８０を各々最も適切なＨＩＶ１、ＨＩＶ２およびＳＩＶ配列そして更にＳＩＶｃｐｚ配列と比較した。
【００７７】
【表１５】
2004187686.tif 000018
【００７８】
上側の数値は両配列の同一性を、下側は類似性を示す。更に、そのデータバンクを“Wordsearch”および“Gap”を用いてヌクレオチドレベルで徹底的に調べた。各々最良の“符合（matches）”についての相同性値を第９表にまとめる。
【００７９】
【表１６】
2004187686.tif 000019
【００８０】
実施例１１
ＨＩＶ５１８０単離物のｇａｇ遺伝子のＰＣＲ増幅、クローニングおよび配列決定の概要説明
ウイルス増幅の過程で生じる自然突然変異を明示するためにウイルスゲノムの一部をＰＣＲ法によりクローン化しそしてそのように得られたＤＮＡ配列を第７表による配列と比較した。
ｇａｇ配列をＭｖＰ５１８０ゲノムの左端のＬＴＲ（“ロング・ターミナル・リピート”、ＬＴＲ１プライマー）からpol（ポリメラーゼ遺伝子、pol １３.５；プライマー）まで内部をオーバーラップさせながらクローン化した。クローニング手法は図４に概略図で示されている。
それらＰＣＲ反応は、ＨＩＶ−１コンセンサス配列から導かれた配列を有する下記のＤＮＡプライマーを用いて行われた。配列決定はジデオキシ連鎖中断法を用いて行われた。
ＭｖＰ５１８０ｇａｇ遺伝子をコードする配列は、ヌクレオチド８１７（ＡＴＧ開始コドンのＡ）からヌクレオチド２３００（最後のコドンのＡ）まで延びる。
【００８１】
LTR1：     5′-CTA GCA GTG GCG CCC GAA CAG G -3′
gag3.5：   5′-AAT GAG GAA GCU GCA GAU TGG GA -3′ (U＝A／T)
gag3.5i：  5′-TCC CAU TCT GCU GCT TCC TCA TT -3′(U＝A／T)
gag5：     5′-CCA AGG GGA AGT GAC ATA GCA GGA AC -3′
gag959：   5′-CGT TGT TCA GAA TTC AAA CCC -3′
gag11i：   5′-TCC CTA AAA AAT TAG CCT GTC -3′
pol3.5i：  5′ -AAA CCT CCA ATT CCC CCT A -3′
【００８２】
ＰＣＲ法により得られたＤＮＡ配列を第７表に示されたＤＮＡ配列と対比した。両ＤＮＡ配列の比較を図５〜７に示す。その際、同じウイルスを問題としているのにヌクレオチドが約２％相互に違っていることが確認された。図５〜７において各々上列は第７表に示されているＤＮＡ配列を表わし、そして下列はＰＣＲ法で得られたＤＮＡ配列を表わしている。
更に、ＰＣＲ法により調査されたタンパク質ｇａｇのアミノ酸配列を第７表から導かれる相当するタンパク質のアミノ酸配列と対比した。その際約２.２％のアミノ酸相違が認められた。その比較を図８に示すが、図において下列は各々ＰＣＲ法により得られた配列から導かれたアミノ酸配列を表わす。
【００８３】
実施例１２
本発明によるウイルスＭｖＰ５１８０の配列をＨＩＶ１およびＨＩＶ２と、そして知られている限りＡＮＴ−７０（ＷＯ８９／１２０９４）の配列と比較した。
その際に次の結果が得られた：
【表１７】
2004187686.tif 000020
【００８４】
前記の表において、“ＨＩＶ−１”はＨＩＶ−１ウイルスのコンセンサス配列を意味し；“ＨＩＶ−２”はＨＩＶ−２ウイルスのコンセンサス配列を意味し；ＡＮＴ−７０はＷＯ８９／１２０９４より知られたＨＩＶ−３と表示されるウイルスの部分配列を意味する。
【００８５】
従って本発明の主題は、遺伝子座（Genort）に関し第７表に示された配列に対し、％値で表わした場合、高々第１１表に記載の割合が異なるような相同性を示すウイルス、ＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびそれらの部分配列である。
【００８６】
【表１８】
2004187686.tif 000021
【００８７】
第１１表に記載の％単位の相同性値は、第７表による配列を別のウイルスの配列と比較した場合に高々前述の％値に相当する配列割合だけ異なっていてもよいことを意味している。
【００８８】
実施例１３
Ｖ３−ループ／Ｖ３−シュラウフェ（Schlaufe）
このシュラウフェはＨＩＶにおける主に中和性の領域であり、そしてその領域の免疫特異性を示したものが図９に要約してある。これはPeter Nara（1990）の研究によるエイズからのコピーである。次にＶ３−シュラウフェをアミノ酸レベルで記述し、そしてIIIＢウイルス（現在のＬＡＩ）および最初のＨＩＶ−２単離物（ＲＯＤ）と比較した。シスチン架橋の個々のアミノ酸は保存されている。ＨＩＶ−１のクローンはＧＰＧＲまたはＧＰＧＱであり、そしてＨＩＶ−２のクローンはＧＨＶＦであるのに対し、ＭｖＰ５１８０／９１のクローンはアミノ酸ＧＰＭＲから形成されている。メチオニンを用いたモチーフはこれまで報告されてなく、ＭｖＰ５１８０／９１の個性を強めている。
【００８９】
ウイルスの核酸配列を調べた後、そのＶ３−ループ領域を適切なプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。その際に、突然変異、特にメチオニンコドン（ＡＴＧ）からロイシンコドン（ＣＴＧ）への変化をみることができた。
【００９０】
次いでクローン化された核酸から導かれたアミノ酸配列とＰＣＲ法を用いた増幅により得られた配列とを比較した：
ＭｖＰ５１８０（クローン化）：
ＣＩＲＥＧＩＡＥＶＱＤＩＹＴＧＰＭＲＷＲＳＭＴＬＫＲＳＮＮＴＳＰＲＳＲＶＡＹＣ
【００９１】
ＭｖＰ５１８０（ＰＣＲ法）：
ＣＩＲＥＧＩＡＥＶＱＤＬＨＴＧＰＬＲＷＲＳＭＴＬＫＫＳＳＮＳＨＴＱＰＲＳＫＶＡＹＣ
【００９２】
実施例１４
本発明によるウイルスＭｖＰ５１８０またはそれにより導かれる抗原を用いれば、通常のＨＩＶ−１＋２スクリーニングテストを用いたのでは把握できないような血清もＨＩＶ−１として陽性に検出できることを示すために、カメルーンからの患者の様々な血清を検査した。
【００９３】
カメルーンでの研究において１５６の抗−ＨＩＶ−１−陽性血清が検査された。二つのこれらの血清において、相当な、診断上重要な相違が認められた。次の第１２表に吸光度測定値を記す。ＣＡＭ−ＡまたはＣＡＭ−Ｂは異なる患者の血清を表わしている。
【００９４】
【表１９】
2004187686.tif 000022
【００９５】
両テストのカットオフ値は０.３００であった。
カメルーンからの４７の抗−ＨＩＶ−１陽性血清を用いたもう一つの研究において二つの血清が特に目立った。そのうちの一つ（９３−１０００）はわずかに症候を示す患者、もう一つ（９３−１００１）はエイズ病患者に由来する。次の第１３表において、両ＥＩＡテストの吸光度値を相互に比較する：
【００９６】
【表２０】
2004187686.tif 000023
【００９７】
この場合にもカットオフ値は０.３であった。患者９３−１００１の吸光度値は、通常のＨＩＶ−１＋ＨＩＶ−２ ＥＩＡでは失敗し得るのに対し本発明による抗原を適用することにより明瞭な検出が可能であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ＨＩＶ型レトロウイルスのゲノム配置概略図。
【図２】ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＭＶＰ−５１８０ウイルスの希釈液について市販テストキットを用いた抗原抗体反応により得られる吸光度と逆転写酵素活性の関係図。
【図３】ＭＶＰ−５１８０およびＭＶＰ−８９９ウイルスのウェスターンブロット図。
【図４】ＨＩＶ５１８０の遺伝子のＰＣＲ増幅、クローニングおよび配列決定の手法図。
【図５】ＰＣＲ法により得られたＭＶＰ−５１８０のＤＮＡ配列と第７表に示されたＤＮＡ配列の比較図。
【図６】ＰＣＲ法により得られたＭＶＰ−５１８０のＤＮＡ配列と第７表に示されたＤＮＡ配列の図５に続く比較図。
【図７】ＰＣＲ法により得られたＭＶＰ−５１８０のＤＮＡ配列と第７表に示されたＤＮＡ配列の図６に続く比較図。
【図８】ｇａｇタンパク質の比較図（一つは第７表に従って（各々上列）、一つはＰＣＲ法で（各々下列）確認）。
【図９】ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）、ＨＩＶ５１８０およびＨＩＶ−２（ＲＯＤ）のＶ３−シュラウフェを示す図。
【図１】
2004187686.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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