(57)【要約】【課題】ストークスシフトの小さい蛍光分子を利用して、ホモＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）に基づいた蛍光指示薬を提供し、分子間相互作用の可視化システムを開発すること。【解決手段】分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる標的配列のＮ末端側とＣ末端側に実質的に同一の蛍光特性を有する蛍光分子成分を結合させた蛍光指示薬。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる標的配列のＮ末端側とＣ末端側に実質的に同一の蛍光特性を有する蛍光分子成分を結合させた蛍光指示薬。
【請求項２】
分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる標的配列；
標的配列に共有的に結合したドナー蛍光分子成分；及び、
標的配列に共有的に結合したアクセプター蛍光分子成分；
を含む蛍光指示薬であって；
ドナー蛍光分子とアクセプター蛍光分子が実質的に同一の蛍光特性を有する分子であり、分析物質の結合により標的配列中に立体構造の変化が生じ、次いでドナー分子及びアクセプター分子成分の相対的位置又は方向に変化が生じ、ある偏光特性を有した照射光によって励起した場合に観察される蛍光の偏光特性が照射光のものと異なる傾向が強くなる（偏光解消）、請求項１に記載の蛍光指示薬。
【請求項３】
蛍光分子成分が蛍光蛋白質である、請求項１又は２に記載の蛍光指示薬。
【請求項４】
蛍光分子成分が黄色蛍光蛋白質またはその変異体である、請求項１から３の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項５】
蛍光分子成分が蛍光蛋白質Ｖｅｎｕｓである、請求項１から４の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項６】
蛍光指示薬がさらに標的ペプチド成分とリンカー成分を含み、分析物質の標的配列が標的ペプチド成分を結合するためのペプチド結合ドメインをさらに含み、
リンカー成分が分析物質の標的配列と標的ペプチド成分とを共有的に結合し、標的配列と標的ペプチド成分がアクセプター蛍光分子成分又はドナー蛍光分子成分の何れかに共有的に結合し、
標的配列に結合した分析物質が標的ペプチド成分及びペプチド結合ドメインの相対的位置又は方向の変化を誘導し、次いでドナー分子及びアクセプター分子成分の相対的位置又は方向に変化が生じ、これによりある偏光特性を有した照射光によって励起した場合に観察される蛍光の偏光特性が照射光のものと異なる傾向が強くなる（偏光解消）、請求項１から５の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項７】
標的配列が、カルモジュリン、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼ、ステロイドホルモン受容体、ステロイドホルモン受容体のリガンド結合ドメイン、蛋白質キナーゼＣ、イノシトール−１，４，５−トリホスフェート受容体、又はレコベリンである、請求項１から６の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項８】
分析物質の標的配列がカルモジュリンである、請求項７に記載の蛍光指示薬。
【請求項９】
標的ペプチド成分が、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ（ｓｋＭＬＣＫｐ）、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ（ｓｍＭＬＣＫ）、カルモジュリンキナーゼＩＩ  （ＣａＭＫＩＩ）、カルデスモン、カルスペルミン、ホスホフルクトキナーゼ、カルシネウリン、ホスホリラーゼキナーゼ、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ、５９  Ｋｄａホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、６０  Ｋｄａホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、ニトリックオキシドシンターゼ、Ｉ型アデニリルシクラーゼ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニリルシクラーゼ、ニューロモジュリン、スペクトリン、ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（Ｆ５２）、ｂ−Ａｄｄｕｃｉｎ、ヒートショック蛋白質  ＨＳＰ９０ａ、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープグリコプロテイン１６０（ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０）、  ブラッシュボーダーミオシン重鎖−Ｉ（ＢＢＭＨＢＩ）、希ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、マストパラン、メリチン、グルカゴン、セクレチン、血管作動性腸ペプチド  （ＶＩＰ）、ガストリン阻害ペプチド  （ＧＩＰ）、又はカルモジュリン結合ペプチド−２  （Ｍｏｄｅｌペプチド  ＣＢＰ２）のカルモジュリン結合ドメインである、請求項６に記載の蛍光指示薬。
【請求項１０】
リンカー成分がペプチド成分である、請求項６に記載の蛍光指示薬。
【請求項１１】
リンカー成分が１から３０アミノ酸残基である、請求項１０に記載の蛍光指示薬。
【請求項１２】
分析物質が作用して指示薬の立体構造を変化させる分析物質の標的配列が、酵素により切断されるアミノ酸配列である、請求項１から５の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項１３】
シングルポリペプチドである、請求項１から１２の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項１４】
さらに局在化配列を含む、請求項１から１３の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項１５】
局在化配列が核局在化配列、小胞体局在化配列、ペルオキシソーム局在化配列、ミトコンドリア局在化配列、ゴルジ体局在化配列、又は細胞膜局在化配列である、請求項１から１４の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項１６】
試料中の分析物質を検出又は測定する方法であって、
（１）試料と請求項１から１５の何れかに記載の蛍光指示薬とを接触させる工程；
（２）ドナー成分を励起させる工程；及び
（３）試料中の分析物質の濃度や活性に対応した試料中の蛍光共鳴エネルギー転移の程度を測定する工程；
を含む方法。
【請求項１７】
試料中の蛍光共鳴エネルギー転移の程度を、偏光解消を測定することにより測定する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
蛍光異方性を求めることにより偏光解消を測定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
試料が生細胞であり、接触工程が蛍光指示薬を細胞中に取り込ませることを含む、請求項１６から１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
細胞へ蛍光指示薬を取り込ませる工程が、蛍光指示薬の発現をコードする核酸配列に作動的に連結した発現調節配列を含む発現ベクターを細胞にトランスフェクションすることを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から１５の何れかに記載の蛍光指示薬をコードする核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２１に記載の核酸又は請求項２２に記載の発現ベクターを有する形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）を利用した分子間の相互作用を分析するための蛍光指示薬、並びにその利用に関する。より詳細には、本発明は、実質的に同一の蛍光特性を有する２分子の蛍光分子が標的配列を介して結合した蛍光指示薬と、分析物質とを相互作用させることにより生じるＦＲＥＴを偏光解消に基づいて測定することを特徴とする分子間の相互作用を分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物学的系の蛍光分析法は、他の生物学的手法と比較して非侵襲的に行うことができる点で有利である。蛍光分析法の物理的手法の開発と共に、例えば細胞内での反応のモニターとして用いられる生物学的レポーター構築物が開発されてきた。特に、固有蛍光に補助因子を必要としない蛍光タンパク質を開発できれば、このタンパク質を遺伝子構築物を介して細胞中に導入して、発現させるこにより各種の分析を行うことができる。蛍光蛋白質としては、特にＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）が公知である。Ｍｉｙａｗａｋｉ  他  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８８，  ８８２−８８７には、ＧＦＰに基づいたＣａ２＋感知系が記載されている。
【０００３】
生物学的系の検討（特に、分子間の相互作用の検討など）を目的とするＦＲＥＴに基づく方法の例は、Ｍｉｙａｗａｋｉ  他  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８８，  ８８２−８８７に記載されている。しかしながら、従来の蛍光分子を利用したＦＲＥＴは、何れも異なる色（スペクトル）を有する２種類の蛍光分子を利用するものである。この方法では、一つのＦＲＥＴ観測で、可視領域のかなりの部分を使用することになり、例えば、他の色の蛍光色素の同時観測が制限されるという問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、標的蛋白質と分析物質との相互作用を簡単かつ視覚的に検出することを可能にする蛍光指示薬、並びに該蛍光指示薬の利用方法を提供することを解決すべき課題とした。より詳細には、本発明は、ストークスシフトの小さい蛍光分子を利用して、ホモＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）に基づいた蛍光指示薬を提供し、分子間相互作用の可視化システムを開発することを解決すべき課題とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる分析物質の標的配列のＮ末端側とＣ末端側に実質的に同一の蛍光特性を有する蛍光分子成分を結合させた蛍光指示薬を用いることによって、分析物質を検出及び測定できることを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成したものである。
【０００６】
即ち、本発明によれば、分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる標的配列のＮ末端側とＣ末端側に実質的に同一の蛍光特性を有する蛍光分子成分を結合させた蛍光指示薬が提供される。
【０００７】
本発明によれば、好ましくは、
分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる標的配列；
標的配列に共有的に結合したドナー蛍光分子成分；及び、
標的配列に共有的に結合したアクセプター蛍光分子成分；
を含む蛍光指示薬であって；
ドナー蛍光分子とアクセプター蛍光分子が実質的に同一の蛍光特性を有する分子であり、分析物質の結合により標的配列中に立体構造の変化が生じ、次いでドナー分子及びアクセプター分子成分の相対的位置又は方向に変化が生じ、ある偏光特性を有した照射光によって励起した場合に観察される蛍光の偏光特性が照射光のものと異なる傾向が強くなる（偏光解消）、蛍光指示薬が提供される。
【０００８】
好ましくは、蛍光分子成分は蛍光蛋白質又はその変異体である。
好ましくは、蛍光分子成分は黄色蛍光蛋白質またはその変異体である。
好ましくは、蛍光分子成分は蛍光蛋白質Ｖｅｎｕｓである。
【０００９】
好ましくは、蛍光指示薬がさらに標的ペプチド成分とリンカー成分を含み、分析物質の標的配列が標的ペプチド成分を結合するためのペプチド結合ドメインをさらに含み、
リンカー成分が分析物質の標的配列と標的ペプチド成分とを共有的に結合し、標的配列と標的ペプチド成分がアクセプター蛍光分子成分又はドナー蛍光分子成分の何れかに共有的に結合し、
標的配列に結合した分析物質が標的ペプチド成分及びペプチド結合ドメインの相対的位置又は方向の変化を誘導し、次いでドナー分子及びアクセプター分子成分の相対的位置又は方向に変化が生じ、これによりある偏光特性を有した照射光によって励起した場合に観察される蛍光の偏光特性が照射光のものと異なる傾向が強くなる（偏光解消）、蛍光指示薬が提供される。
【００１０】
好ましくは、標的配列は、カルモジュリン、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼ、ステロイドホルモン受容体、ステロイドホルモン受容体のリガンド結合ドメイン、蛋白質キナーゼＣ、イノシトール−１，４，５−トリホスフェート受容体、又はレコベリンである。
【００１１】
好ましくは、分析物質の標的配列はカルモジュリンである。
好ましくは、標的ペプチド成分は、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ（ｓｋＭＬＣＫｐ）、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ（ｓｍＭＬＣＫ）、カルモジュリンキナーゼＩＩ  （ＣａＭＫＩＩ）、カルデスモン、カルスペルミン、ホスホフルクトキナーゼ、カルシネウリン、ホスホリラーゼキナーゼ、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ、５９  Ｋｄａホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、６０Ｋｄａホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、ニトリックオキシドシンターゼ、Ｉ型アデニリルシクラーゼ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニリルシクラーゼ、ニューロモジュリン、スペクトリン、ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（Ｆ５２）、ｂ−Ａｄｄｕｃｉｎ、ヒートショック蛋白質  ＨＳＰ９０ａ、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープグリコプロテイン１６０（ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０）、  ブラッシュボーダーミオシン重鎖−Ｉ（ＢＢＭＨＢＩ）、希ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、マストパラン、メリチン、グルカゴン、セクレチン、血管作動性腸ペプチド  （ＶＩＰ）、ガストリン阻害ペプチド  （ＧＩＰ）、又はカルモジュリン結合ペプチド−２  （Ｍｏｄｅｌペプチド  ＣＢＰ２）のカルモジュリン結合ドメインである。
【００１２】
好ましくは、リンカー成分はペプチド成分である。
好ましくは、リンカー成分は１から３０アミノ酸残基である。
【００１３】
好ましくは、分析物質が作用して指示薬の立体構造を変化させる分析物質の標的配列は、酵素により切断されるアミノ酸配列である。
好ましくは、本発明の蛍光指示薬は、シングルポリペプチドである。
好ましくは、本発明の蛍光指示薬は、さらに局在化配列を含む。
好ましくは、局在化配列は核局在化配列、小胞体局在化配列、ペルオキシソーム局在化配列、ミトコンドリア局在化配列、ゴルジ体局在化配列、又は細胞膜局在化配列である。
【００１４】
本発明の別の側面によれば、試料中の分析物質を検出又は測定する方法であって、
（１）試料と本発明の蛍光指示薬とを接触させる工程；
（２）ドナー成分を励起させる工程；及び
（３）試料中の分析物質の濃度や活性に対応した試料中の蛍光共鳴エネルギー転移の程度を測定する工程；
を含む方法が提供される。
【００１５】
好ましくは、試料中の蛍光共鳴エネルギー転移の程度を、偏光解消を測定することにより測定する。
好ましくは、蛍光異方性を求めることにより偏光解消を測定する。
好ましくは、試料が生細胞であり、接触工程が蛍光指示薬を細胞中に取り込ませることを含む。
好ましくは、細胞へ蛍光指示薬を取り込ませる工程が、蛍光指示薬の発現をコードする核酸配列に作動的に連結した発現調節配列を含む発現ベクターを細胞にトランスフェクションすることを含む。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の蛍光指示薬をコードする核酸、当該核酸を含む発現ベクター、並びに当該核酸又は発現ベクターを有する形質転換体が提供される。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の蛍光指示薬は、分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる標的配列のＮ末端側とＣ末端側に実質的に同一の蛍光特性を有する蛍光分子成分を結合させたものである。より具体的には、本発明の蛍光指示薬は、分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる標的配列；
標的配列に共有的に結合したドナー蛍光分子成分；及び、
標的配列に共有的に結合したアクセプター蛍光分子成分；
を含むものであり、
ドナー蛍光分子とアクセプター蛍光分子が実質的に同一の蛍光特性を有する分子であり、分析物質の結合により標的配列中に立体構造の変化が生じ、次いでドナー分子及びアクセプター分子成分の相対的位置又は方向に変化が生じ、ある偏光特性を有した照射光によって励起した場合に観察される蛍光の偏光特性が照射光のものと異なる傾向が強くなる（偏光解消）ことを特徴とするものである。
【００１８】
蛍光分子を、垂直方向で偏光した光で励起する場合、蛍光分子の発色団が励起された後、この蛍光分子が回転する前に、蛍光放出が完了するために、通常は、垂直方向に偏光した蛍光が検出される。しかし、この蛍光分子の近くに同じ蛍光分子が存在すると、ＦＲＥＴが生じ、観測される蛍光の偏光解消が生じる。このように同じ蛍光分子の間で起こるＦＲＥＴ（ホモトランスファー）は、偏光解消法で測定することができる。ホモトランスファーＦＲＥＴが実現するためには、蛍光分子の励起と蛍光スペクトルに重なりがあること（ストークスシフトが小さいこと）が必要であり、ＧＦＰ変異体であるＣＦＰ、ＹＦＰ又はＲＦＰなどが適している。
【００１９】
本発明では、標的配列としてプロテアーゼの基質部位又はＣａ２＋によって構造変化を起こすドメインのＮ末端とＣ末端に同じ蛍光分子を結合させたものを作製し、蛍光指示薬を作製した。このような蛍光指示薬を用いることにより、アポトーシスに伴うカスペース３の活性、又は細胞内Ｃａ２＋濃度の変化をモニターすることが可能になる。
【００２０】
本発明における蛍光分子とは、適当な電磁線で励起した際に発光することができる任意の分子を意味する。蛍光分子としては、例えば、蛍光蛋白質を使用することができる。
本発明では、ドナー蛍光分子成分とアクセプター蛍光分子成分は、実質的に同一の蛍光特性を有するものであり、好ましくは、両者は同一の蛍光分である。本発明で用いる蛍光分子は、ＦＲＥＴの効率の点から選択することが好ましく、ＦＲＥＴの効率は本明細書に記載並びに当業者に周知の技術に従って試験することができる。
【００２１】
「共有的に結合」とは、共有結合又は２分子間の他の共有的連結を意味する。共有的な連結としては、２分子を連結するニ価成分が挙げられる。
「標的配列」とは、分析物質と結合できるアミノ酸配列を意味する。好ましい標的配列は、分析物質と結合すると立体構造が変化する。「標的ペプチド」は標的配列と結合できるペプチドを意味する。標的ペプチドは、標的配列と結合するペプチドの部分配列である。
【００２２】
「分析物質」は、標的配列に結合する溶液中の分子又はイオンを意味し、標的配列の立体構造を変化させるものである。分析物質は標的配列に可逆的に結合しても非可逆的に結合してもよい。
「成分」とは、指示薬の他の基に連結している分子の基を意味する。即ち、「蛍光分子成分」  は、標的配列成分またはリンカー成分に結合している蛍光分子の基である。「標的配列成分」は、蛍光分子成分に結合している標的配列の基である。「標的ペプチド成分」は、標的配列の標的ペプチドの基である。「リンカー成分」は、ドナー及びアクセプター蛍光分子成分の両方に結合している分子リンカーの基を意味する。
【００２３】
「作動的に連結」とは、対象成分が機能するような関係に位置していることを意味する。コード配列に作動的に連結した調節配列は、コード配列の発現が調節配列に適合した条件下で達成されるように連結している。「調節配列」は、それが連結しているコード配列及び非コード配列の発現に必要なポリヌクレオチドを意味する。調節配列としては、プロモーター、リボソーム結合部位、転写終結配列などが挙げられる。調節配列はさらに、リーダー配列及び融合蛋白質の相手側の配列などを含んでいてもよい。
【００２４】
「ポリヌクレオチド」は、長さが少なくとも１０ヌクレオチド以上を意味する。ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はそれらの改変体でもよく、一本鎖でも二本鎖でもよい。
【００２５】
分析物質を検出又は測定するために蛍光共鳴エネルギー転移  （ＦＲＥＴ）を利用する本発明の蛍光指示薬は、ドナー蛍光分子成分とアクセプター蛍光分子成分となる放射及び励起スペクトルを有する２分子の蛍光分子成分を含む。  本発明で用いるドナー蛍光分子成分及びアクセプター蛍光分子成分は、実質的に同一の蛍光特性を有する成分であり、好ましくは同一の成分である。また、アクセプター蛍光分子成分の励起スペクトルがドナー蛍光分子成分の放射スペクトルと重複するように選択する。ドナー及びアクセプター蛍光分子成分（本発明では、これらは実質的に同一の蛍光特性を有する）は、分析物質の結合により立体構造が変化する標的配列成分に結合している。立体構造の変化によりドナー及びアクセプター蛍光分子の相対的位置及び方向が変化し、これにより、偏光解消が生じる。
【００２６】
蛍光分子成分は標的配列成分のアミノ末端及びカルボキシ末端に共有的に結合していることが好ましい。これにより、ドナー蛍光分子成分及びアクセプター蛍光分子成分は、分析物質が結合した際に互いに密接に移動できる。あるいは、ドナー及びアクセプター成分は、分析物質の結合の際に互いに離れるように移動してもよい。一例としては、アクセプター成分は、標的配列成分に結合している標的ペプチド成分に共有的に結合し、標的ペプチド成分はリンカー成分を介して標的配列成分に共有的に結合している。リンカー成分はフレキシブルなもので、標的ペプチド成分が標的配列成分に結合することができる。ドナー成分は、ドナー成分の励起スペクトル内の適当な強さの光によって励起される。ドナー成分は吸収したエネルギーを蛍光として放出する。アクセプター蛍光分子成分が励起状態のドナー成分を消光できる位置に存在する場合、蛍光エネルギーはアクセプター成分に転移されて、蛍光が放出される。
【００２７】
本発明では、１種類の蛍光分子（即ち、実質的に同一の蛍光特性を有する蛍光分子）を用いてＦＲＥＴを起こす（本明細書では、ホモＦＲＥＴとも言う）。ホモＦＲＥＴの観察は、一般的には、蛍光の偏光解消を測定することにより行うことができる。蛍光の偏光解消を起こす要因としては、蛍光の再吸収、ＦＲＥＴ、及び蛍光分子の回転ブラウン運動がある。しかし、一番自由度が高いと考えられる細胞質内環境においてさえ、ＧＦＰなどの蛍光蛋白質の回転緩和時間は３０〜４０ｎｓｅｃと測定されており、これはＧＦＰの蛍光の寿命（３〜４ｎｓｅｃ）と比べて非常に長いため、蛍光分子の発色団自身が偏光を解消するほど高速に回転する可能性は極めて低い。また、ＧＦＰが十分に希釈された条件下または細胞内のように光路長が極めて短い状況下では蛍光の再吸収による影響はまず起きないものと考えられる。従って、蛍光分子からの蛍光に偏光の解消が認められた場合には、ＦＲＥＴが生じたものと結論付けることができる。
【００２８】
偏光の強さは、蛍光の異方性を用いて評価することができる。蛍光の異方性（Ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ；Ａ）は、以下の式により求めることができる。
Ａ＝［Ｉ（平行）−Ｉ（垂直）］／［Ｉ（平行）＋２×Ｉ（垂直）］
式中、Ｉ（平行）は入射光の偏光方向と平行な蛍光成分ベクトルを示し、Ｉ（垂直）は入射光の偏光方向と垂直な蛍光成分ベクトルを示す。
【００２９】
試料中の蛍光は、蛍光偏光度測定装置を用いて測定できる。通常、励起源からの励起線は励起光学系を通過する。励起光学系により励起線は試料を励起する。これに応答して、試料中の蛍光分子は、励起波長とは異なる波長を有する放射線を放出する。次いで、回収光学系が試料からの放射線を回収する。このデバイスには、スキャン中の試料を一定の温度に維持するための温度調節器を有している。一例としては、多軸転換ステージにより、複数の試料を保持するマイクロタイタープレートが移動する。多軸転換ステージ、温度調節器、自動焦点機能、並びに画像化とデータ収集に関連した電子装置は、適当にプログラムされたデジタルコンピューターによって管理されている。
【００３０】
偏光解消によるホモトランスファーＦＲＥＴの検出は、インビトロ（キュベットやプレート内）やインビボ（顕微鏡下、細胞内）で行えるようなシステム（光学系の偏光成分を重視したもの）をセットアップすることができる。
【００３１】
蛍光偏光度の測定は、例えば、蛍光偏光度測定装置ＢＥＡＣＯＮ（ＴＡＫＡＲＡ）などの市販の装置を用いて行うことができる。また、蛍光偏光度の測定方法は当業者に既知であり、例えば、蛋白質・核酸・酵素、４２巻、Ｎｏ．１、ｐ７７−８１（１９９７）などに記載されている。
【００３２】
本発明では任意の蛍光分子を使用できる。例えば、刺胞動物の緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）及びその変異体を使用することができる。変異体としては、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）、赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）または青色蛍光蛋白質  （ＢＦＰ）  などが挙げられる。これらの蛍光蛋白質は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ、ｔｈｅ  ｓｅａ  ｐａｎｓｙ、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、及びＰｈｉａｌｉｄｉｕｍ  ｇｒｅｇａｒｉｕｍなどから得られる（Ｗａｒｄ，  Ｗ．  Ｗ．，  他，  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，  ３５：８０３−８０８  （１９８２）；  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，  Ｌ．  Ｄ．，  他，  Ｃｏｍｐ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ７２Ｂ：７７−８５  （１９８２））。あるいは、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ、Ｃｙなどの低分子有機化合物を使用することができる。
【００３３】
有用な励起及び放射スペクトルを有する各種クラゲ由来蛍光蛋白質は、オワンクラゲ由来の天然ＧＦＰのアミノ酸配列を改変することによって作製されている（Ｐｒａｓｈｅｒ，  Ｄ．  Ｃ．，  他、Ｇｅｎｅ，  １１１：２２９−２３３  （１９９２）；  Ｈｅｉｍ，  Ｒ．，  他，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ９１：１２５０１−０４  （１９９４）；  米国特許出願番号０８／３３７，９１５；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４６９２；及び米国特許出願番号Ｎｏ．  ０８／７０６，４０８）。ＧＦＰのｃＤＮＡは、これら他の蛋白質をコードするｃＤＮＡと連結してもよく、得られる融合体も蛍光で相手の蛋白質の生化学的特徴を保持している場合がある（Ｃｕｂｉｔｔ，  Ａ．  Ｂ．，他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２０：４４８−４５５  （１９９５））。また、変異誘発により励起又は発光波長がシフトしたＧＦＰ変異体が作製されている（Ｈｅｉｍ，  Ｒ．  ＆  Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．  Ｙ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ６：１７８−１８２  （１９９６））。野生型クラゲ由来の蛍光蛋白質のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有する１５０の連続するアミノ酸が含まれていれば、その蛋白質は、クラゲ由来の蛍光蛋白質である。
【００３４】
本明細書で言う、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）またはそれらの変異体とは、各々公知の緑色蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質だけでなく、それらの変異体の全てを包含する意味である。例えば、緑色蛍光蛋白質遺伝子は単離され配列も決定されている（Ｐｒａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．ら（１９９２），”Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｇｅｎｅ  １１１：２２９−２３３）。その他の蛍光蛋白質又はその変異体のアミノ酸配列も多数報告されており、例えば、Ｒｏｇｅｒ  Ｙ．Ｔｓｉｎ，  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８．  ６７：５０９−４４、並びにその引用文献に記載されている。
緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）またはそれらの変異体としては、例えば、オワンクラゲ（例えば、エクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａ））由来のものを使用できる。
【００３５】
ＧＦＰ、ＹＦＰとそれらの変異体の一例を以下に示す。なお、Ｆ９９Ｓという表示は、９９番目のアミノ酸残基がＦからＳに置換していることを示し、他のアミノ酸置換についても同様の表示に従って示す。
野生型ＧＦＰ；
Ｆ９９Ｓ，Ｍ１５３Ｔ，Ｖ１６３Ａのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｓ６５Ｔのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｆ６４Ｌ，Ｓ６５Ｔのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｓ６５Ｔ，Ｓ７２Ａ，Ｎ１４９Ｋ，Ｍ１５３Ｔ，Ｉ１６７Ｔのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｓ２０２Ｆ，Ｔ２０３Ｉのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｔ２０３Ｉ，Ｓ７２Ａ，Ｙ１４５Ｆのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｆのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＹＦＰ）；
Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｈのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＹＦＰ）；
Ｓ６５Ｇ，Ｖ６８Ｌ，Ｑ６９Ｋ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｙのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＥＹＦＰ−Ｖ６８Ｌ，Ｑ６９Ｋ）；
Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｙのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＥＹＦＰ）；
Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｋ７９Ｒ，Ｔ２０３Ｙのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＹＦＰ）；
【００３６】
本発明ではＧＦＰ変異体であるＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ又はそれらの変異体を使用することが好ましく、例えば、ＹＦＰ変異体であるＶｅｎｕｓを用いることができる。Ｖｅｎｕｓについては、Ｎａｇａｉ，  Ｔ．  他（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ  ２０，  ８７−９０を参照できる。Ｖｅｎｕｓは、ＹＦＰの４６番目のフェニルアラニンをロイシンに置換することにより得られる蛍光蛋白質であり、従来のＧＦＰと比較して、大腸菌内で３０〜１００倍、ほ乳類の細胞内で３〜１００倍の明るさを達成し、通常の装置でも十分検出可能な蛍光を提供することができる。
【００３７】
本発明で使用できる他の蛍光分子としては、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ株Ｙ−１由来の黄色蛍光蛋白質、Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  （ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来蛋白質）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓなどの海洋シアノバクテリア由来のｐｈｙｃｏｂｉｌｉ蛋白質（例えば、フィコエリスリン及びフィコシアニンなど）、又はフィコエリスロビリンで再構築したオート麦由来のオートフィトクロムなどが挙げられる。これらの蛍光蛋白質はＢａｌｄｗｉｎ，  Ｔ．  Ｏ．，  他，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：５５０９−５５１５  （１９９０），  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｂ．  Ｊ．，  他，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２４：６７３−６７７  （１９９４），  及びＷｉｌｂａｎｋｓ，  Ｓ．  Ｍ．，  他，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：１２２６−１２３５  （１９９３），  及びＬｉ  他，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：７９２３−７９３０  （１９９５）などに記載されている。
【００３８】
ドナー及びアクセプター蛍光分子成分間のＦＲＥＴの効率は、２つの蛍光分子が相互作用する能力を調節することによって調節することができる。標的配列成分、標的ペプチド成分及びリンカ成分の性質もＦＲＥＴ及び分析物質に対する指示薬の応答に影響する。通常、大きな立体構造変化が標的配列成分に生じることが望ましい。
【００３９】
標的配列成分は、分析物質の結合に際して立体構造が変化する蛋白質又はその一部である。そのような蛋白質の例としては、カルモジュリン（ＣａＭ）、  ｃＧＭＰ−依存性蛋白質キナーゼ、ステロイドホルモン受容体  （又はそのリガンド結合ドメイン）、プロテインキナーゼＣ、イノシトール−１，４，５−トリホスフェート受容体、又はレコベリンなどが挙げられる（例えば、Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，  Ｊ．  Ａ．  ＆  Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，  Ｂ．  Ｓ．  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５２９−５３６  （１９９６），  及びＡｍｅｓ，  Ｊ．  Ｂ．，  他、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ６：４３２−４３８  （１９９６）を参照）。標的配列成分は好ましくは、分析物質以外に標的ペプチドにも結合する。
【００４０】
標的ペプチド成分は表１の任意のアミノ酸配列またはその一部を含むことができる。但し、標的ペプチドは標的配列成分に結合できなくてはならない。標的ペプチドは、カルモジュリン結合ドメインの部分配列でもよい。表１に挙げた標的ペプチド成分は標的配列成分  ＣａＭによって認識される（例えば、Ｃｒｉｖｉｃｉ，  Ａ．  ＆  Ｉｋｕｒａ，  Ｍ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  ２４：８４−１１６  （１９９５）を参照）。標的ペプチド成分を改変して、分析物質に対する蛍光指示薬の応答を増強してもよい。他の標的配列に対する他の標的ペプチド成分も当業者には既知である。
【００４１】
【表１】
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2004187544.tif 000003
【００４２】
略号の説明
ＡＣ，  アデニリルシクラーゼ；
ＢＢＭＨＣＩ，  ｂｒｕｓｈ−ｂｏｒｄｅｒミオシン重鎖−Ｉ；
ＣａＭＫＩＩ，  カルモジュリンキナーゼＩＩ；
ＣＢＰ２，  カルモジュリン結合ペプチド−２；
ＧＩＰ，  ガストリン阻害ペプチド；
ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０，  ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ糖蛋白質１６０；
ＨＳＰ，  ヒートショック蛋白質；
ＭＡＲＣＫＳ，  ミリストイル化アラニンリッチ  Ｃキナーゼ基質；
ＭＨＣ，  ミオシン重鎖；
ＮＯＳ，  ニトリックオキシドシンターゼ；
ＰＤＥ，  ホスホジエステラーゼ；
ＰＦＫ，  ホスホフルクトキナーゼ
ＰｈＫ，  ホスホリラーゼキナーゼ；
ｓｋ−，  ｓｍＭＬＣＫ，  骨格筋及び平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ；
ＶＩＰ，  血管作動性腸ペプチド
【００４３】
リンカー成分の長さは、ＦＲＥＴ及び、分析物質の結合により立体構造変化の速度及び特異性を最適化するように選択する。リンカー成分は、標的配列成分と標的ペプチド成分とが自由に相互作用して分析物質濃度に応答できるような長さと柔軟さを有することが好ましい。ＦＲＥＴ効果を最適化するために、ドナー及びアクセプター蛍光分子成分の平均距離は、好ましくは約１  ｎｍ  から約１０  ｎｍであり、より好ましくは約１  ｎｍから約６  ｎｍであり、特に好ましくは１  ｎｍから約４  ｎｍである。リンカー分子が短すぎたり堅固すぎると、ドナー及びアクセプター分子成分は容易に一を変えることができない。リンカー成分が長すぎると、標的ペプチド成分は効率的に標的配列成分に結合できない。リンカー成分は好ましくはペプチド成分である。好ましいリンカー成分は、１〜３０アミノ酸残基、好ましくは１〜１５アミノ酸残基のペプチドである。リンカーの一例は、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−  リンカーである。
【００４４】
リンカー成分はフレキシブルなスペーサーアミノ酸配列を含んでもよい。リンカー成分については、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，  Ｊ．  Ｓ．，  他，  ＰＮＡＳ  ８５：５８７９−５８８３  （１９８８），Ｗｈｉｔｌｏｗ，  Ｍ．，  他，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：９８９−９９５  （１９９３），  及びＮｅｗｔｏｎ，  Ｄ．  Ｌ．，  他，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３５：５４５−５５３  （１９９６）などに記載されている。
【００４５】
標的配列は、分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させるものであればよく、例えば、酵素によって認識されて切断される配列でもよい。例えば、標的配列としてプロテアーゼの基質部位を使用することができる。プロテアーゼとしてカスペース３を用いる場合は、標的配列のアミノ酸配列としてＤＥＶＤを使用することができる。
【００４６】
蛍光指示薬には局在化配列が含まれていてもよい。局在化配列により、指示薬は、好適な細胞内小器官標的シグナル又は局在化宿主蛋白質と融合することにより細胞内の特定の部位に運ばれる。局在化配列又はシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを蛍光指示薬をコードするポリヌクレオチドの５’末端に連結又は融合することができ、これによりシグナルペプチドは生じる融合ポリヌクレオチド又はポリペプチドのアミノ末端に位置することができる。
【００４７】
真核細胞の場合、シグナルペプチドは融合ポリペプチドを小胞体を経由して輸送する機能を有すると考えられている。分泌蛋白質は次いでゴルジ体に運ばれ、分泌小胞及び細胞外空間、そして好ましくは外部環境に運ばれる。本発明で使用できるシグナルペプチドは、蛋白質分解酵素認識部位を含むプレプロペプチドでもよい。
【００４８】
局在化配列  は核局在化配列、小胞体局在化配列、ペルオキソーム局在化配列、ミトコンドリア局在化配列、又は局在化蛋白質でもよい。局在化配列は、例えば、”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”，  ３５章、Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （４ｔｈ  ｅｄ．）．  Ｗ．  Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，  １９９５に記載されている標的配列でもよい。局在化配列は、局在化蛋白質でもよい。局在化配列の具体例としては、核を標的とする配列（ＫＫＫＲＫ）  （配列番号３２）、ミトコンドリアを標的とする配列（アミノ末端が  ＭＬＲＴＳＳＬＦＴＲＲＶＱＰＳＬＦＲＮＩＬＲＬＱＳＴ−）  （配列番号３３）、小胞体を標的とする配列（ＫＤＥＬ  （配列番号３４）、Ｃ−末端に）（シグナル配列はＮ末端に存在する）、ペルオキシソームを標的とする配列（ＳＫＦ  （配列番号３５）、Ｃ−末端に）、細胞膜へのプレニレーション又は挿入を標的とする配列  （［ＣａａＸ］  ＣＡＡＸ  （配列番号３６），  ＣＣ  （配列番号３７），  ＣＸＣ  （配列番号３８），  又はＣＣＸＸ  （配列番号３９）  、Ｃ−末端に）、  細胞膜の細胞質側を標的とする配列（ＳＮＡＰ−２５への融合）、又はゴルジ体を標的とする配列（ｆｕｒｉｎへの融合）などが挙げられる。
【００４９】
蛍光指示薬は組み換えＤＮＡ技術により融合蛋白質として製造できる。蛍光蛋白質の組み換え生産は、蛋白質をコードする核酸の発現により行う。蛍光蛋白質をコードする核酸は、当業者に既知の方法で入手できる。例えば、蛋白質をコードする核酸は、オワンクラゲ緑色蛍光蛋白質のＤＮＡ配列に基づいたプライマーを用いてオワンクラゲ由来ｃＤＮＡのＰＣＲによって単離することができる。蛍光蛋白質の各種変異体は、蛍光蛋白質をコードする核酸の部位特異的変異誘発又はランダム変異誘発によって作製することができる。ランダム変異誘発は、０．１  ｍＭ  ＭｎＣｌを用いたりヌクレオチド濃度のバランスを崩してＰＣＲを行うことにより行うことができる
【００５０】
発現ベクターの構築及びトランスフェクションした細胞での遺伝子の発現は、当業者に公知の分子クローニング手法に従って行うことができる。これらの詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  他，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  （１９８９）  、並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  他，  ｅｄｓ．，  （Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ｍｏｓｔ  ｒｅｃｅｎｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）に記載されている。
【００５１】
ポリペプチドの発現をコードする配列で細胞をトランスフェクションするために使用する核酸は一般に、ポリペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した発現調節配列を含む発現ベクターである。ここで言う”ポリペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列”とは、  ｍＲＮＡの転写及び翻訳により、ポリペプチドを産生する配列を言う。例えば、イントロンを含む配列もこれに含まれる。ここで言う”発現調節配列”とは、それが作動的に連結している核酸の発現を調節する核酸配列を言う。発現調節配列が核酸配列の転写及び翻訳を調節および制御する際に、発現調節配列は核酸配列に作動的に連結している。発現調節配列は、好適なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、蛋白質コード遺伝子の前の開始コドン  （即ち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、及び停止コドンなどを含むことができる。
【００５２】
当業者に周知の方法を使用して、蛍光指示薬のコード配列と、適当な転写・翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、インビボ組み換え・遺伝組み換えなどが挙げられる  （例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  他，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９に記載の技術を参照）。組み換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は当業者に周知の慣用技術によって行うことができる。宿主細胞が大腸菌などの原核細胞である場合、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテント細胞は、対数増殖期後に回収し、当業者に周知のＣａＣｌ２法で処理した細胞を用いて作製することができる。あるいは、ＭｇＣｌ２又はＲｂＣｌを使用することもできる。形質転換は、宿主細胞のプロトプラストを作成後、またはエレクトロポレーションにより行うことができる。
【００５３】
宿主細胞が真核細胞である場合、リン酸カルシウム共沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム又はウイルスベクターに封入したプラスミドの挿入などのＤＮＡトランスフェクション法を使用することができる。真核細胞は、本発明の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子などの適当な表現型をコードする外来ＤＮＡ分子とを一緒にトランスフェクションすることができる。サルウイルス４０（ＳＶ４０）又はウシパピローマウイルスなどの真核ウイルスベクターを使用して、真核細胞を一過的に感染または形質転換して蛋白質を発現させることもできる（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｄ．，  １９８２を参照）。好ましくは、真核細胞宿主を宿主細胞として使用する。
【００５４】
微生物又は真核細胞で発現させた本発明のポリペプチドの単離及び精製方法は任意の慣用方法を使用することができ、例えば、プレパラティブクロマトグラフィー分離及び免疫学的分離（モノクローナル又はポリクローナル抗体又は抗原を使用することを含むものなど）などが挙げられる。
【００５５】
蛍光指示薬をコードする配列を発現させるために、各種の宿主／発現ベクター系を使用することができる。例えば、蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌；蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母；蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞、又は蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞；蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；あるいは、蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
使用する宿主／ベクター系に応じて、適当な転写及び翻訳要素（例えば、構成的又は誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなど）を発現ベクター中で使用することができる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ，  他，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４，  １９８７を参照）。例えば、細菌系にクローニングする場合、バクテリオファージλ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ  （ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）のｐＬなどの誘導性プロモーターを使用することができる。哺乳動物細胞系にクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、レトロウイルスロングターミナルリピート；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５  Ｋプロモーターなど）を使用することができる。組み換えＤＮＡ又は合成技術で作製したプロモーターを使用して蛍光指示薬をコードする挿入配列を転写させることもできる。
【００５７】
細菌系では、発現する蛍光指示薬の意図する用途に応じて多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、大量の蛍光指示薬を産生させる場合には、容易に精製される融合蛋白質産物の高量の発現を指令するベクターが望ましい。蛍光指示薬の回収を助ける切断部位を含むように加工したものが好ましい。
【００５８】
酵母では、構成的又は誘導性のプロモーターを含む多数のベクターを使用することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ２，  Ｅｄ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  他，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ａｓｓｏｃ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｃｈ．  １３，  １９８８；  Ｇｒａｎｔ，  他．，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｅｄｓ．  Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，  ３１９８７，  Ａｃａｄ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｖｏｌ．  １５３，  ｐｐ．５１６−５４４，  １９８７；  Ｇｌｏｖｅｒ，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｖｏｌ．  ＩＩ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈ．，  Ｄ．Ｃ．，  Ｃｈ．  ３，  １９８６；並びに、Ｂｉｔｔｅｒ，  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｅｄｓ．  Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ，  Ａｃａｄ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｖｏｌ．  １５２，  ｐｐ．  ６７３−６８４，  １９８７；  及び  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，  Ｅｄｓ．  Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  他．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，  １９８２などを参照することができる。ＡＤＨ又はＬＥＵ２などの構成的酵母プロモーターあるいはＧＡＬなどの誘導性プロモーターを使用することができる（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，  Ｃｈ．  ３，  Ｒ．  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  Ｉｎ：  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．１１，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｅｄ．  ＤＭ  Ｇｌｏｖｅｒ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈ．，  Ｄ．Ｃ．，  １９８６）。あるいは、酵母の染色体への外来ＤＮＡの組み込みを促進するベクターを使用することもできる。
【００５９】
植物の発現ベクターを使用する場合、蛍光指示薬をコードする配列の発現は、プロモーターにより促進することができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡ及び１９Ｓ  ＲＮＡプロモーターなどの  ウイルスプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ，  他，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４，１９８４）、又はＴＭＶに対するコート蛋白質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，  他，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：３０７−３１１，  １９８７）を使用できる。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小型サブユニット  （Ｃｏｒｕｚｚｉ，  他，  １９８４，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：１６７１−１６８０；  Ｂｒｏｇｌｉｅ，  他，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３，  １９８４）などの植物プロモーター、又はヒートショックプロモーター（例えば、大豆ｈｓｐ１７．５−Ｅ  又はｈｓｐ１７．３−Ｂ  （Ｇｕｒｌｅｙ，  他，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６：５５９−５６５，  １９８６）など）を使用してもよい。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって植物に導入することができる。これらの技術については、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，  ｐｐ．  ４２１−４６３，  １９８８；及びＧｒｉｅｒｓｏｎ  ＆  Ｃｏｒｅｙ，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２ｄ  Ｅｄ．，  Ｂｌａｃｋｉｅ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｃｈ．  ７−９，  １９８８などに記載されている。
【００６０】
昆虫系を使用して蛍光指示薬を発現することも可能である。例えば、オートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）  をベクターとして使用して外来遺伝子を発現することができる。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  細胞で生育する。蛍光指示薬をコードする配列をこのウイルスの非本質領域（例えば、多角体病遺伝子）中にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーターの制御下に置く。蛍光指示薬をコードする配列を正しく挿入した場合、多角体病遺伝子は不活化し、未閉塞の組み換えウイルスが産生する。これらの組み換えウイルスを使用してＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に感染させ、その細胞内で挿入した遺伝子を発現させることができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ，  他，  Ｊ．  Ｖｉｏｌ．  ４６：５８４，  １９８３；及び米国特許第  ４，２１５，０５１号を参照）。
【００６１】
真核細胞系、好ましくは哺乳動物細胞の発現系を使用することにより、発現した哺乳動物の蛋白質の適切な翻訳後修飾を行うことが可能になる。一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、リン酸化、及び遺伝子産物の分泌のための細胞機構を有する真核細胞を、蛍光指示薬の発現のための宿主細胞として使用することが好ましい。そのような宿主細胞株としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、  ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＥＫ−２９３、並びにＷＩ３８などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
組み換えウイルス又はウイルス要素を利用して発現を指令する哺乳動物細胞系を構築することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用する場合、蛍光指示薬をコードする配列をアデノウイルス転写／翻訳調節複合体（例えば、後期プロモーター及び３つのリーダー配列など）に連結することができる。このキメラ遺伝子をインビトロ又はインビボ組み換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非本質領域（例えば、Ｅ１又はＥ３領域）への挿入により感染宿主で生存可能で蛍光指示薬を発現することができる組み換えウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：  ３６５５−３６５９，  １９８４を参照）。あるいは、ワクシニアウイルス７．５  Ｋ  プロモーターを使用することができる（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔ，  他，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ，７９：  ７４１５−７４１９，  １９８２；  Ｍａｃｋｅｔｔ，  他，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４９：  ８５７−８６４，  １９８４；  Ｐａｎｉｃａｌｉ，  他，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７９：  ４９２７−４９３１，  １９８２を参照）。染色体外要素として複製する能力を有するウシパピローマウイルスに基づくベクターを使用することも可能である  （Ｓａｒｖｅｒ，  他，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １：  ４８６，  １９８１）。このＤＮＡをマウス細胞に導入した直後に、プラスミドは細胞当たり約１００〜２００コピー複製する。挿入したｃＤＮＡの転写には、プラスミドが宿主の染色体に組み込まれることは必要ではなく、これにより高レベルの発現が生み出される。これらのベクターは、ｎｅｏ遺伝子などの選択マーカーをプラスミド中に含めることによって安定した発現のために使用することができる。あるいは、レトロウイルスゲノムを改変して、宿主細胞内での蛍光指示薬遺伝子の発現を誘導及び指令することができるベクターとして使用することができる（Ｃｏｎｅ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：６３４９−６３５３，  １９８４）。高レベルの発現は、メタロチオニンＩＩＡプロモーター及びヒートショックプロモーターなどの誘導性プロモーターを使用することによって達成することができる。
【００６３】
組み換え蛋白質の長期間の高収量の生産のためには、安定な発現が好ましい。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用する代わりに、宿主細胞は、適当な発現調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニレーション部位など）および選択マーカーで調節された蛍光指示薬ｃＤＮＡで形質転換することができる。組み換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞が染色体にプラスミドを安定に組み込み、成長してコロニーを形成し、これをクローニングして細胞株として樹立することができる。例えば、外来ＤＮＡの導入後、組み換え細胞を富裕培地で１〜２日間増殖させ、その後に選択培地に切り替えることができる。多数の選択系を使用することができるが、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，  他，  Ｃｅｌｌ，  １１：  ２２３，  １９７７）、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ４８：２０２６，  １９６２）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，  他，  Ｃｅｌｌ，  ２２：  ８１７，  １９８０）  遺伝子をそれぞれ、ｔｋ−，  ｈｇｐｒｔ−  又はａｐｒｔ細胞で使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を、メソトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，  他，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：  ３５６７，  １９８０；  Ｏ’Ｈａｒｅ，  他，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８：  １５２７，  １９８１）、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ  （Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７８：  ２０７２，  １９８１）、アミノグルコシドＧ−４１８  に対する耐性を付与するｎｅｏ  （Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，  他，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  １５０：１，  １９８１）、及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ  （Ｓａｎｔｅｒｒｅ，  他，  Ｇｅｎｅ，  ３０：  １４７，  １９８４）遺伝子の選択の基礎として使用することができる。
【００６４】
近年、さらに別の選択遺伝子が報告されている。例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを使用することを可能にするｔｒｐＢ、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを使用することを可能にするｈｉｓＤ  （Ｈａｒｔｍａｎ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：８０４７，  １９８８）、並びに、オルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチンに対する耐性を付与するＯＤＣ  （ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）  （ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ  Ｌ．，  Ｉｎ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ｅｄ．，  １９８７）などが挙げられる。
【００６５】
本発明の蛍光指示薬ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、適当な宿主細胞にＤＮＡ導入することによりインビトロで発現することができる。即ち、本発明の組み換え蛍光蛋白質は、大腸菌などの原核細胞、又は酵母や哺乳動物細胞などの真核細胞において核酸を発現することによって作製することができる。
【００６６】
構築物は、蛍光指示薬の単離を簡単にするためのタグを含んでいてもよい。例えば、６個のヒスチジン残基からなるポリヒスチジンタグを蛍光蛋白質のアミノ末端に付加することができる。ポリヒスチジンタグにより、ニッケルキレートクロマトグラフィーにより一回の操作で蛋白質を簡単に単離することが可能になる。
【００６７】
好ましくは、本発明の蛍光指示薬は、組み換えＤＮＡ技術で作製した融合蛋白質である。  ここで、シングルポリペプチドは、ドナー成分、ペプチドリンカー成分及びアクセプター成分を含む。ドナー成分は、ポリペプチド中のアクセプター成分に対してアミノ末端側に位置することができる。そのような融合蛋白質は通常以下のような構造を有する：  （アミノ末端）  ドナー蛍光分子成分―ペプチドリンカー成分−アクセプター蛍光分子成分  （カルボキシ末端）。あるいは、ドナー成分は、融合蛋白質中のアクセプター成分に対してカルボキシ末端に位置してもよい。そのような融合蛋白質は通常以下の構造を有する：（アミノ末端）アクセプター蛍光分子成分−ペプチドリンカー成分−ドナー蛍光分子成分  （カルボキシ末端）。さらに、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端に付加的なアミノ酸配列（例えば、ポリヒスチジンタグなど）を含む融合蛋白質も本発明に包含される。
【００６８】
組み換え核酸によってコードされる蛍光指示薬は、ドナー蛍光分子成分、アクセプター蛍光分子成分及びペプチドリンカー成分の発現をコードする配列を含む。各構成要素は、融合蛋白質への発現により、ドナー成分が励起する際にドナー及びアクセプター成分がＦＲＥＴを示すように選択される。組み換え核酸は、組み換え核酸に作動的に連結した発現調節配列を含む発現ベクター内に組み込むことができる。発現ベクターは、適当なプロモーター、複製配列、マーカーなどを含むことによって原核細胞または真核細胞で機能するように構成することができる。
【００６９】
発現ベクターは、組み換え核酸の発現のために宿主細胞にトランスフェクションすることができる。宿主細胞は、蛍光指示薬融合蛋白質を精製するために高レベルの発現のために選択することができる。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）はこの目的に有用である。あるいは、宿主細胞は、その他の原核細胞でも真核細胞でもよい。リンカーペプチドは、プロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列を含むように選択することができる。細胞は培養細胞でもインビボの細胞でもよい。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００７０】
【実施例】
（１）Ｗ−ｃａｍｅｌｅｏｎの遺伝子構築
ｐＲＳＥＴＢ／Ｖｅｎｕｓ（Ｎａｇａｉ，  Ｔ．  他（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ  ２０，  ８７−９０）を鋳型に、５’−ａｔｔｇｇａｔｃｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇ−３’（配列番号４０）、５’−ｃａｔｇｃａｔｇｃｇｇｇｃｇｇｃｇｇｔｃａｃｇａａｃｔｃ−３’（配列番号４１）をプライマーに用いてＰＣＲを行ない、ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断した。ｐＲＳＥＴＢ／ＹＣ２．１２（Ｎａｇａｉ，  Ｔ．  他（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ  ２０，  ８７−９０）をＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断することによりＥＣＦＰ遺伝子を取り除き、そこに上記の制限酵素処理済ＰＣＲ産物をライゲーションさせ、Ｗ−ｃａｍｅｌｅｏｎタンパク質を大腸菌内で発現させることが出来るｐＲＳＥＴＢ／Ｗ−ｃａｍｅｌｅｏｎを得た。Ｗ−ｃａｍｅｌｅｏｎの構造を図１（下段）に示す。
【００７１】
（２）Ｗ−ＳＣＡＴの遺伝子構築
ｐＲＳＥＴＢ／Ｖｅｎｕｓ（Ｎａｇａｉ，  Ｔ．  他（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ  ２０，  ８７−９０）を鋳型に、５’−ｇｃｔｇｇｔａｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇ−３’（配列番号４２）、５’−ｇｃａｇａａｔｔｃｔｃａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃｃ−３’（配列番号４３）をプライマーに用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩで切断後、ｐＲＳＥＴＢの同制限酵素サイトにライゲーションすることにより、ｐＲＳＥＴＢ／Ｖｅｎｕｓ−ＫＥを得た。ｐＲＳＥＴＢ／Ｖｅｎｕｓ（Ｎａｇａｉ，  Ｔ．  他（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ  ２０，  ８７−９０）を鋳型に、５’−ａｔｔｇｇａｔｃｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇ−３’（配列番号４４）、５’−ｇｃｔｇｇｔａｃｃａｔｃｇａｃｃｔｃａｔｃａｇｔｇａｔｃｃｃｇｇｃｇｇｃｇｇｔｃａｃｇａａ−３’（配列番号４５）をプライマーに用いてＰＣＲを行ない、ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切断した。この制限酵素処理済ＰＣＲ産物をｐＲＳＥＴＢ／Ｖｅｎｕｓ−ＫＥのＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩサイトにライゲーションすることによりＷ−ＳＣＡＴタンパク質を大腸菌内で発現させることが出来るｐＲＳＥＴＢ／Ｗ−ＳＣＡＴを得た。Ｗ−ＳＣＡＴの構造を図１（上段）に示す。
【００７２】
（３）タンパク質の発現、精製
ｐＲＳＥＴＢ／Ｗ−ｃａｍｅｌｅｏｎまたはｐＲＳＥＴＢ／Ｗ−ＳＣＡＴを用いて大腸菌を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で３７℃、１５時間培養した。シングルコロニーをピックアップし、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２０ｍｌのＬＢ培地が入った試験管に稙菌し、２００ｒｐｍ、室温で４日間培養した。培養後遠心分離により大腸菌を回収し１０ｍｌのＰＢＳ（−）に溶解した。フレンチプレスを用いて菌体を破砕後、遠心分離により不溶性画分を取り除いた。上清に８００μｌのＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ  （ＱＩＡＧＥＮ）を加え、室温にて１時間転倒混和後、添付プロトコールに従って、タンパク質を精製した。
【００７３】
（４）蛍光異方性の測定
上記で得られたＷ−ｃａｍｅｌｅｏｎ溶液を１ｍｌの測定溶液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），  １００μＭＥＧＴＡまたは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），  １００μＭ  ＥＧＴＡ，  １ｍＭ  ＣａＣｌ２）に溶解した。希釈率は１万分の１とした。上記で得られたＷ−ＳＣＡＴ溶液を１０培希釈したもの２μｌとａｃｔｉｖｅｃａｓｐａｓｅ３  （ＣＰＰ３２，  ＭＢＬ）  １Ｕｎｉｔを反応用緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），  １００ｍＭ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １０ｍＭ  ＤＴＴ，  １０％  ｓｕｃｒｏｓｅ）に加え２０μｌとし、３７℃で２時間反応させた。Ａｃｔｉｖｅ  ｃａｓｐａｓｅ３を加えないものを対照に用いた。反応後１ｍｌＰＢＳ（−）を加えた。上記それぞれのタンパク質の蛍光異方性をＢｅａｃｏｎ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて測定した。測定の結果を以下の表２に示す。以下の結果から、本発明の蛍光指示薬であるＷ−ｃａｍｅｌｅｏｎおよびＷ−ＳＣＡＴを用いることによって、試料中の分析物質を検出・測定できることが分かる。
【００７４】
【表２】
2004187544.tif 000004
【００７５】
【発明の効果】
本発明によれば、リガンドに誘導された立体構造変化をＦＲＥＴによりモニターすることができる。本発明の蛍光指示薬は、細胞又は生体への遺伝子導入によりｉｎｓｉｔｕで作製することができるため、大量の可溶性組み換え蛋白質を発現及び精製し、それをインビトロで精製及び標識し、細胞にマイクロインジェクションで戻す必要がない。また、本発明の蛍光指示薬は、細胞構造を標的とすることができる。
【００７６】
さらに、従来のＦＲＥＴを利用した各種蛍光指示薬は異なる色（スペクトル）を有する蛍光物質を利用している方法では、１つのＦＲＥＴ観測で広範囲の波長域を使用するため、他色の蛍光色素との同時観察が制限される。それに対し本発明では原理上１色しか用いないため、ＦＲＥＴ観測に用いる波長域を狭小化でき、従って多色のイメージングに適する。例えば、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰそれぞれを基に蛍光異方性解消によるＦＲＥＴイメージングを行なえば、１つの細胞の中で３つの事象を同時にモニターすることが可能となる。
【００７７】
【配列表】
2004187544.tif 000005
【００７９】
2004187544.tif 000006
【００８０】
2004187544.tif 000007
【００８１】
2004187544.tif 000008
【００８２】
2004187544.tif 000009
【００８３】
2004187544.tif 000010
【００８４】
2004187544.tif 000011
【００８５】
2004187544.tif 000012
【００８６】
2004187544.tif 000013
【００８７】
2004187544.tif 000014
【００８８】
2004187544.tif 000015
【００８９】
2004187544.tif 000016
【００９０】
2004187544.tif 000017
【００９１】
2004187544.tif 000018
【００９２】
2004187544.tif 000019
【００９３】
2004187544.tif 000020
【００９４】
2004187544.tif 000021
【００９５】
2004187544.tif 000022
【００９６】
2004187544.tif 000023
【００９７】
2004187544.tif 000024
【００９８】
2004187544.tif 000025
【００９９】
2004187544.tif 000026
【０１００】
2004187544.tif 000027
【０１０１】
2004187544.tif 000028
【０１０２】
2004187544.tif 000029
【０１０３】
2004187544.tif 000030
【０１０４】
2004187544.tif 000031
【０１０５】
2004187544.tif 000032
【０１０６】
2004187544.tif 000033
【０１０７】
2004187544.tif 000034
【０１０８】
2004187544.tif 000035
【０１０９】
2004187544.tif 000036
【０１１０】
2004187544.tif 000037
【０１１１】
2004187544.tif 000038
【０１１２】
2004187544.tif 000039
【０１１３】
2004187544.tif 000040
【０１１４】
2004187544.tif 000041
【０１１５】
2004187544.tif 000042
【０１１６】
2004187544.tif 000043
【０１１７】
2004187544.tif 000044
【０１１８】
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【０１１９】
2004187544.tif 000046
【０１２０】
2004187544.tif 000047
【０１２１】
2004187544.tif 000048
【０１２２】
2004187544.tif 000049
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の蛍光指示薬であるＷ−ｃａｍｅｌｅｏｎ及びＷ−ＳＣＡＴの構造を示す。
【図１】
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