(57)【要約】【課題】いつ発生するかわからないてんかん性全身痙攣行動を長期間継続観察する、といった非効率的な観察方法を改善し、その改善によって、たとえば、抗てんかん薬の開発に費やされる時間の短縮、開発コストを削減する。【解決手段】音波刺激および機械振動刺激をケージに入れた観察対象動物に与えることで、該動物のてんかん性全身痙攣行動を誘発させる。かかるプライミング条件付けした動物にて、音波刺激および／または機械振動刺激を与える時間のみ、振動記録し行動解析する。【選択図】図１
2004113011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケージに入れた観察対象動物のてんかん性全身痙攣行動を誘発する方法であって、音波刺激および機械振動刺激をケージに入れた観察対象動物に与えることで、該動物のてんかん性全身痙攣行動を誘発することを特徴とした動物のてんかん性全身痙攣行動の誘発方法
【請求項２】
請求項１の観察対象動物に与える刺激にて、音波刺激および機械振動刺激がケージに入れた観察対象動物に同時に与えられる、または、音波刺激および機械振動刺激が交互に与えられる、または、音波刺激および機械振動刺激が間欠的に同時に与えられる、または、音波刺激および機械振動刺激が間欠的に交互に与えられる動物のてんかん性全身痙攣行動の誘発方法
【請求項３】
ケージに入れた観察対象動物のてんかん性全身痙攣行動を記録する装置であって、ケージに入れた観察対象動物に音波刺激および／または機械振動刺激を与える音波発生手段および／または機械振動発生手段、ケージの振動を検出し記録する振動検出記録手段、前記音波発生手段および／または前記機械振動発生手段によってケージに入れた観察対象動物に音波刺激および／または機械振動刺激が与えられる時間に前記振動検出記録手段に記録指令を出す記録制御手段を具備する動物のてんかん性全身痙攣行動を記録する装置
【請求項４】
請求項３の装置にて、音波発生手段および機械振動発生手段を具備し、音波刺激および機械振動刺激がケージに入れた観察対象動物に同時に与えられる、または、音波刺激および機械振動刺激が交互に与えられる、または、音波刺激および機械振動刺激が間欠的に同時に与えられる、または、音波刺激および機械振動刺激が間欠的に交互に与えられる動物のてんかん性全身痙攣行動を記録する装置
【請求項５】
ケージに入れた観察対象動物のてんかん性全身痙攣行動の有無を判定する方法であって、音波刺激および／または機械振動刺激を観察対象動物に与え、前記音波刺激および／または機械振動刺激が観察対象動物に与えられる時間にケージの振動波形を検出し、かつ振動波形を記録し、前記音波刺激、機械振動刺激、および記録されたケージの振動波形に基づいててんかん性全身痙攣行動の有無を判定する動物のてんかん性全身痙攣行動を判定する方法
【請求項６】
ケージに入れた観察対象動物のてんかん性全身痙攣行動の有無を判定する装置であって、音波刺激および／または機械振動刺激を観察対象動物に与える音波発生手段および／または機械振動発生手段、前記音波刺激および／または機械振動刺激が観察対象動物に与えられる時間にケージの振動波形を検出する振動検出手段、前記振動検出手段で検出された振動を記録する手段、前記音波刺激、機械振動刺激、および記録されたケージの振動に基づいててんかん性全身痙攣行動の有無を判定する判定手段を有する動物のてんかん性全身痙攣行動を判定する装置
【請求項７】
請求項６の判定手段が、音波刺激および／または機械振動刺激のパワーと周波数、音波刺激および／または機械振動刺激の時間的持続パターン、記録されたケージの振動のパワーと周波数、記録されたケージの振動の時間的持続パターン基づいててんかん性全身痙攣行動の有無を判定するものである動物のてんかん性全身痙攣行動を判定する装置
【請求項８】
請求項７の判定にて、刺激のパワー、周波数、時間的持続パターン、または、記録された振動のパワー、周波数、時間的持続パターンをウェーブレット解析法によって解析して判定するものである動物のてんかん性全身痙攣行動を判定する装置
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はケージ等に入れた動物のてんかん性全身痙攣行動を誘発する方法、および、かかる動物行動によって生じる振動の波形を記録する装置、動物のてんかん性全身痙攣行動の有無を判定する方法と装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
＜プライミング＞てんかん性全身痙攣（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）のモデル動物としては、非特許文献１に記載されたＮＥＲ（Ｎｏｄａ　ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ　ｒａｔ）が国際的に認められている。一般に、モデル動物等の行動を誘発させることはプライミングと呼ばれ、以下もこの呼称を用いる。ＮＥＲのてんかん性全身痙攣行動のプライミングにて、これを音によって行うことは、非特許文献２に記載されている。しかし、その方法では必ずしもてんかん性全身痙攣行動が発現されない。すなわち再現性がなく、プライミング手法として問題があった。（多くの人が非特許文献２記載の方法を追試したがプライミング成功率はきわめて少なかった）
【０００３】
また、非特許文献３には、音によって誘導されるてんかん性ではない痙攣動作（Ａｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ　ｅｌｉｃｉｔｅｄ　ｂｅｈａｖｉｏｕｒｓ）について記載されている。ただしこれは、てんかん性全身痙攣行動について適用されるものではない。またこの文献では可聴音のみを扱っていて超音波周波数域まで考察されていない。
【０００４】
特許文献１では、ケージ等に入れた動物のてんかん性全身痙攣行動をケージに取り付けた振動センサーで記録し解析する装置が記載されているが、プライミングとの関連の記載はない。
【０００５】
また、特許文献２には通常音源よりも指向性が強い音源となりうる技術が圧力波発生装置（圧力波は音波を含む）として記載されているが、これもプライミングとの関連で応用する記載はない。
【０００６】
特許文献２は、外からの振動や外気圧の影響を受けにくく、広い周波数範囲で安定に超音波などの圧力波を発生することができ、かつ集積回路技術を適用しての製造が容易な圧力波発生装置で、電気的に駆動される発熱体薄膜を熱絶縁上に被者したものである。特許文献２の圧力波発生装置は、発熱体薄膜を電気的に駆動して表面の空気層に超音波周期の温度変化を与え、圧力波を生じさせる。発熱体を薄膜状に形成して表面積を大きくするとともに、発熱体と基板との間に熱伝導率のきわめて小さい多孔質層を大きくし、熱絶縁層を設けて発熱体を基板から熱的に絶縁することにより、発熱体表面の温度変化が大きくなるようにして、超音波発生効率を向上させている。かかる装置は、通常音源よりも指向性が強い音源となりうる。
【０００７】
＜動物の行動観察・解析全般＞てんかん性全身痙攣行動に限らず動物の行動を継続的に観察し、どのような行動をいかなる頻度でいかなる時間に起こしたかを分析することは行動心理学、動物を用いた実験医学の分野では重要な課題である。人間が動物の行動を長期間（数日−１週間程度）継続的に観察することは殆ど不可能であった。この問題を解決するため、赤外線を２次元的に照射して動物の動きによる遮光状態を記録し、コンピュータ処理して行動解析する装置、ビデオカメラで撮影した画像情報をコンピュータ処理して行動解析する装置が開発されている。
【０００８】
動物の行動の観察対象を、てんかん性全身痙攣行動に限定した場合には、特許文献１に記載されているケージに取り付けた振動センサーで記録し解析する装置が効果的であって、上記のような赤外線の遮光では判定ミスが起こること、画像処理方式では高額な設備費を必要とすることで不適切であった。
【０００９】
しかしながら、特許文献１は動物のてんかん性全身痙攣行動の自動記録と行動の有無の解析装置を与えることに限られたものであって、いつ発生するかわからないてんかん性全身痙攣行動を長期間（数日−１週間程度）継続観察する、といった非効率的な観察方法については進歩がない。特に前に述べたプライミングとの関連で行動記録と解析を行うといったアイデアは記載されていない。
【００１０】
【特許文献１】
特開平１０−１９６５８号公報　「動物の行動観察・解析装置」（天野　殖）
【特許文献２】
特開平１１−３００２７４「圧力波発生装置」（科学技術振興事業団）
【非特許文献１】
Ｎｏｄａ　Ａ，　Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ　Ｒ，　Ｍａｉｈａｒａ　Ｔ，　Ｔｏｍｉｚａｗａ　Ｙ，　Ｉｔｏ　Ｙ，　Ｉｎｏｕｅ　Ｍ，　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｋ，　Ａｓａｎｏ　Ｙ，　Ｓａｓａ　Ｍ，　Ｓｅｒｉｋａｗａ　Ｔ．、ＮＥＲ　ｒａｔ　ｓｔｒａｉｎ：　ａ　ｎｅｗ　ｔｙｐｅ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍｏｄｅｌ　ｉｎ　ｅｐｉｌｅｐｓｙ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．、Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ、（１９９８）　ｖｏｌ．３９（１）ｐ−９９−１０７．
【非特許文献２】
Ｉｉｄａ　Ｋ，　Ｓａｓａ　Ｍ，　Ｓｅｒｉｋａｗａ　Ｔ，　Ｎｏｄａ　Ａ，　Ｉｓｈｉｈａｒａ　Ｋ，　Ａｋｉｍｉｔｓｕ　Ｔ，　Ｈａｎａｙａ　Ｒ，　Ａｒｉｔａ　Ｋ，　Ｋｕｒｉｓｕ　Ｋ．、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｎｖｕｌｓｉｖｅ　ｓｅｉｚｕｒｅｓ　ｂｙ　ａｃｏｕｓｔｉｃ　ｐｒｉｍｉｎｇｉｎ　ａ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｅｐｉｌｅｐｓｙ　（Ｎｏｄａ　ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ　ｒａｔ：　ＮＥＲ）、Ｅｐｉｌｅｐｓｙ　Ｒｅｓ．、（１９９８）ｖｏｌ．３０　ｐ−１１５−１２６．
【非特許文献３】
Ｃｏｍｍｉｓｓａｒｉｓ　ＲＬ，　Ｐａｌｍｅｒ　Ａ，　Ｎｅｏｐｈｙｔｏｕ　Ｓ，　Ｇｒａｈａｍ　Ｍ，　Ｂｅｃｋｅｔｔ　Ｓ，　Ｍａｒｓｄｅｎ　ＣＡ．、　　Ａｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ　ｅｌｉｃｉｔｅｄ　ｂｅｈａｖｉｏｕｒｓ　ｉｎ　Ｌｉｓｔｅｒ　ｈｏｏｄｅｄ　ａｎｄ　Ｗｉｓｔａｒ　ｒａｔｓ．、Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｂｅｈａｖ．、　（２０００）ｖｏｌ．６８（４）　ｐ−５２１−３１．
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、いつ発生するかわからないてんかん性全身痙攣行動を長期間（数日−１週間程度）継続観察する、といった非効率的な観察方法ではなく、プライミングされた観察対象動物を用いることで、非効率な観察を改善し、その改善によって、たとえば、抗てんかん薬の開発に費やされる時間の短縮、開発コストの削減することを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、再現性に問題があった従来のプライミング手法を見直し、てんかん性全身痙攣行動を、より確実に誘導するプライミング手法を提案する。これが、第一の発明である（動物のてんかん性全身痙攣行動を誘発する方法）。また、抗てんかん薬の開発などに用いるモデル動物を、従来のように無作為な観察対象動物ではなく、あらかじめプライミングによって、てんかん性全身痙攣行動が条件付けられた観察対象動物を用いる。このプライミングを用いた観察方法が第二の発明である（動物のてんかん性全身痙攣行動の記録装置、動物のてんかん性全身痙攣行動の判定方法および判定装置）。
【００１３】
第一発明は、ケージに入れた観察対象動物のてんかん性全身痙攣行動を誘発する方法であって、音波刺激および機械振動刺激をケージに入れた観察対象動物に与えることで、該動物のてんかん性全身痙攣行動を誘発することを特徴とした動物のてんかん性全身痙攣行動の誘発方法である。従来は音波刺激のみを与えてプライミングしていたため、行動誘発が不確実であった。そこで、音波刺激のみならず機械振動刺激を動物に与え、てんかん性全身痙攣行動を確実に誘発した。
【００１４】
上記の動物のてんかん性全身痙攣行動の誘発する方法にて、音波刺激とは通常のスピーカによって適当な周波数の音を動物に聞かせることである。この音のパワー（音の大きさ）は、たとえば、ラットに可聴音刺激を与える場合には、音源からラットまで２０−３０ｃｍ、音源７２−８５デシベル（７２−８５ｄＢ）が好適である。一方、周波数は動物の個体差があって周波数を特定することはできない。また、音波の周波数であるが、マウス、ラットは可聴音域が広いので、人間の可聴音域はもちろんのこと超音波によるプライミングも効果的である。発明者の行った観察により、２２ー２５ｋＨｚの超音波で行動反応が起こることがわかっている。しかし、その他の周波数でも効果的な領域があると思われる。また、同様にマウス、ラットの可聴音域が人間とは違い、その周波数による刺激の感じ方が違うことから、人間の可聴音と超音波の組み合わせも効果的である。ただし現状では個体差があって、可聴音・超音波の周波数、それらの組み合わせを特定することはできない。
【００１５】
機械振動は、動物を入れたケージを機械的に振動させることである。ここでいう機械振動とは、パルス的なインパクトをケージに与えるものも含ませる。その振動発生手段は、機械的物理量測定装置、機械特性試験機などで公知である。横波振動のみでなく縦波振動でもよいし、もちろん地震波のような縦波・横波の組み合わせでもよい。しかし、この機械振動の振動周波数なども、音刺激と同様の理由から周波数を特定することはできない。
【００１６】
前述のように、プライミングを確実にするために音波刺激と機械振動刺激の組み合わせでプライミングすることが効果的である。ここでいう組み合わせは時間的に同時に音波刺激と機械振動刺激を与えることもさることながら、時間的に交互に、または間欠的に音波刺激と機械振動刺激を与えることも効果的である。すなわち、音波刺激および機械振動刺激がケージに入れた観察対象動物に同時に与えられる、または、音波刺激および機械振動刺激が交互に与えられる、または、音波刺激および機械振動刺激が間欠的に同時に与えられる、または、音波刺激および機械振動刺激が間欠的に交互に与えられる、などのバリエーションから実験的に最適なものを選択すればよい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本案第一発明を実施する装置の例を図１に示す。これは、ケージに入れた観察対象動物のてんかん性全身痙攣行動を記録する装置であって、図中の１はケージに入れた観察対象動物、２はケージ、３は音波発生手段、４は機械振動発生手段である。その他の説明は図中に記載した。すなわち、本案てんかん性全身痙攣行動を記録する装置は、ケージに入れた観察対象動物に音波刺激および／または機械振動刺激を与える音波発生手段および／または機械振動発生手段、ケージの振動を検出し記録する振動検出記録手段、前記音波発生手段および／または前記機械振動発生手段によってケージに入れた観察対象動物に音波刺激および／または機械振動刺激が与えられる時間に前記振動検出記録手段に記録指令を出す記録制御手段を具備する。振動検出記録手段（振動センサー）は上下軸の一次元で振動を検知するもので十分である。これは公知の圧電素子を用いたものでよい。もちろん３軸（３次元）振動を検知するものであってもよい。
【００１８】
ここで、音波刺激および／または機械振動刺激が与えられる時間に前記振動検出記録手段に記録指令を出す、ということが重要であって、これはプライミングを音波刺激および機械振動刺激で十分に行ったことで可能になる。つまり、プライミングによっててんかん性全身痙攣行動誘発の再現性・信頼性が向上したので、動物行動を常時監視することは不要となり、音波刺激および／または機械振動刺激を与えたときだけ記録・解析すればよくなった、と改善された。図２に本案動物のてんかん性全身痙攣行動を判定する方法のフローチャートを示す。この図中に音波刺激および／または機械振動刺激を与えたときだけ記録・解析することを明確に示した。
【００１９】
てんかん性全身痙攣行動にて記録された振動波形の例振動データを図３に示す。これは特許文献１に記載されたものと同様であって、比較例である図４に示す通常の水のみ動作、歩き回り動作とはまったく振動パターンが異なる。この振動データから明らかに、公知の振動解析方法、公知の振動解析ソフトウェアで、てんかん性全身痙攣行動とその他の行動、動作と弁別することは容易であろう。たとえば、データをＡ／Ｄコンバータで１００ｍｓｅｃ（１０Ｈｚ）程度のサンプリングでデジタルデータとして、公知のステップ関数の窓関数（矩形窓）でウェーブレット解析すれば弁別できる。もちろん弁別をシャープにする（てんかん行動の有無を明確にする）ために、１００ｍｓｅｃ（１０Ｈｚ）以下のサンプリング、ステップ関数の以外の窓関数とする改善の余地はある。現在は最適サンプリング、最適ステップ関数の特定はできない。
【００２０】
てんかん性全身痙攣行動を判定する方法を実現する装置は、前述の記録装置に、上記の判定手段を付加したものでよい。すなわち、ケージに入れた観察対象動物のてんかん性全身痙攣行動の有無を判定する装置であって、音波刺激および／または機械振動刺激を観察対象動物に与える音波発生手段および／または機械振動発生手段、前記音波刺激および／または機械振動刺激が観察対象動物に与えられる時間にケージの振動波形を検出する振動検出手段、前記振動検出手段で検出された振動を記録する手段、前記音波刺激、機械振動刺激、および記録されたケージの振動に基づいててんかん性全身痙攣行動の有無を判定する判定手段を有する動物のてんかん性全身痙攣行動を判定する装置である。
【００２１】
ここで、判定手段が、音波刺激および／または機械振動刺激のパワーと周波数、音波刺激および／または機械振動刺激の時間的持続パターン、記録されたケージの振動のパワーと周波数、記録されたケージの振動の時間的持続パターン基づいててんかん性全身痙攣行動の有無を判定するものであって、さらに刺激のパワー、周波数、時間的持続パターン、または、記録された振動のパワー、周波数、時間的持続パターンをウェーブレット解析法によって解析して判定するものであれば好適である。
【００２２】
発明者は、以下の知見も得ている。すなわち、観察動物であるＮＥＲ（Ｎｏｄａ　ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ　ｒａｔ）の飼育方法としては生後２１日後、ハンドリング（１　ｔｉｍｅ／ｗｅｅｋ）とともに音を聞かせる、ケージはプラスチックで、とこじきあり、集団飼育（２−３匹／ケージ）の方が発作（てんかん性全身痙攣行動）が起こりやすい。この知見もプライミング条件付けに有効である。
【００２３】
さらに、特許文献２に記載された圧力波発生装置が、通常音源よりも指向性が強い音源となりうる技術であることに注目すれば、この指向性音源を上記の装置に組み込んでさらなる効果がえられる。すなわち、複数の観察対象動物に個別の音刺激を与えられるので、プライミング条件付けの個別化ができる。つまり、指向性が強い音源で動物の聴覚器官（耳）へ個別に固有の周波数の音波ショットが打てるので、その個別化された刺激を与えれば、てんかん性全身痙攣行動の発現がより確実になり好ましい。
【００２４】
図３、図４のデータ例について補足する。この例は、機械振動刺激は用いていない。ケージに入れた観察対象動物にプライミング条件付け期間に音波刺激として、周波数：６−８ＫＨｚ、音圧：７０−８０ｄＢ（音源からラットまで２０−３０ｃｍ）、刺激時間：３０ｓｅｃ、刺激間隔：週２回で聞かせる。プライミング条件付け期間は、２１日（離乳後）から４−１０週間である。このプライミング条件付けを行った動物について採取したデータが図３、図４である。図３のてんかん性全身痙攣行動（てんかん発作）誘発時の条件はプライミングと同様であって、周波数：６−８ＫＨｚ、音圧：７０−８０ｄＢ（音源からラットまで２０−３０ｃｍ）、刺激時間：３０ｓｅｃである。実験において、刺激しても発作が起きない場合は５ｍｉｎ後に再刺激して、最大３回まで刺激を与え、それぞれ刺激後１０分間振動データを自動記録した。前述の通り、行動誘発が不確実であった。そこで、音波刺激のみならず機械振動刺激を動物に与えると同様のデータがより確実に採取された。（データは省略）
【００２５】
【発明の効果】
本発明によって、いつ発生するかわからないてんかん性全身痙攣行動を長期間（数日−１週間程度）継続観察する、といった非効率的な観察方法は不要になる。プライミングされた観察対象動物を用いることで、非効率な観察を改善し、その改善によって、たとえば、抗てんかん薬の開発に費やされる時間の短縮、開発コストの削減される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本案動物のてんかん性全身痙攣行動を記録する装置の例を示す図
【図２】本案動物のてんかん性全身痙攣行動を判定する方法のフローチャート
【図３】てんかん性全身痙攣行動にて記録された振動波形の例を示す図（縦軸相対スケール）
【図４】通常の水のみ動作、歩き回り動作にて記録された振動波形の例を示す図（縦軸スケールは図３と同じ）
【符号の説明】
１　ケージに入れた観察対象動物
２　ケージ
３　音波発生手段
４　機械振動発生手段
【図１】
2004113011.tif 000003
【図２】
2004113011.tif 000004
【図３】
2004113011.tif 000005
【図４】
2004113011.tif 000006