(57)【要約】【課題】抗原、抗体、酵素、ＤＮＡ等の各種生体関連成分が付着する可能性のある生体試料の分析に使用する器具、例えば核酸試料を取り扱うノズル、ピペット、チップ、ピン等の洗浄を簡便に効果的に行う方法を提供することである。【解決手段】固体、具体的にはノズル、ピペット、チップ、ピン等に付着した生体関連物質は電場の下で移動するので、電位をかけた電解質溶液に洗浄対象物を浸漬させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体成分及び／又は人工的に調製された生体関連成分が付着した固体の洗浄方法であって、該固体を電解質の溶液に浸し、該電解質溶液を通電させ、電位の変位により該付着物質を固体から洗浄容器へ移動させることを特徴とする固体の洗浄方法。
【請求項２】
上記生体成分及び／又は人工的に調製された生体関連成分が付着した固体が、試料及び／または試薬の移動に使用するノズル、ピペット、チップ、ピン又はこれらの同等物である請求項１に記載の洗浄方法。
【請求項３】
上記生体成分及び／又は人工的に調製された生体関連成分が付着した固体が、ＤＮＡチップのプローブ固定のためのピンである請求項１に記載の洗浄方法。
【請求項４】
上記生体成分及び／又は人工的に調製された生体関連成分が、核酸成分を含む請求項１〜３のいずれか１に記載の洗浄方法。
【請求項５】
上記生体成分及び／又は人工的に調製された生体関連成分が、ＤＮＡチップに固定するプローブである請求項４に記載の洗浄方法。
【請求項６】
上記電解質溶液が、電解質であるＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２  、ＬｉＣｌ、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、イオン性の界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドから選択される少なくとも１を含む請求項１〜５のいずれか１に記載の洗浄方法。
【請求項７】
上記電解質溶液に通電する印加電位が、０．１  ｍＶ〜１０００  Ｖである請求項１〜６のいずれか１に記載の洗浄方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１に記載の洗浄方法に使用する洗浄装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は生体試料の分析に使用する器具等の効率的な洗浄方法に関する。特にＤＮＡチップ等の核酸分析において、核酸試料を取り扱うピペット、ノズル、ピン等の洗浄方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査等においては、各種の分析装置を用いることにより、例えば、尿、血清、血漿等の各種体液成分が分析されている。分析方法として通常の生化学的な測定法に限らず、抗原−抗体反応を用いる免疫学的測定法、ＤＮＡプローブを用いる測定法又は電気泳動による測定法のような多種多様の方法が採用される。例えば、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）は、ヒトゲノムシークエンス解明により到来するポストゲノムシークエンス時代において、包括的な遺伝子発現モニタリングやゲノムの変異、多型の検出を可能にする画期的な技術として注目されている。このような技術を利用した分析方法は著しく高感度化されており、それに伴って、特にサンプル分注ノズルや反応容器、ＤＮＡプローブの固定に使用するピン等のように、サンプルや試薬と接する部分の洗浄は重要である。
【０００３】
従来、ノズルやピペット等の洗浄には多くの考案がなされているが、これらは基本的には洗浄水あるいは洗剤を使うことにより、機械的に洗浄効率を上げようとするものが多い（特許文献１、特許文献２）。しかしながら、単に機械的に洗浄効果を高めても限界が有り、これで十分とはいえない。
【０００４】
機械的な洗浄方法のほかに、抗原、抗体、酵素、ＤＮＡ等の各種生体関連成分が付着されている固体対象物表面から、電気的反発力を利用して前記生体関連成分を除去する洗浄方法であって、前記生体関連成分に電荷を与えることと、前記対象物表面には前記電荷とは逆極性の電位を与えることと、前記生体関連成分に与える電荷の極性を少なくとも一回逆転させることとを特徴とする洗浄方法が開示されている（特許文献３、特許文献４）。しかしながら、これらの方法は、ノズルに対して直接電荷を与える技術であり、適用されるノズルの材質には限界がある。
【０００５】
【特許文献１】
特開平１０−６２４３５号公報
【特許文献２】
特開平８−７５７５６号公報
【特許文献３】
特開平５−１０７２５２号公報
【特許文献４】
特開平８−２７１５２２号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、抗原、抗体、酵素、ＤＮＡ等の各種生体関連成分が付着する可能性のある生体試料の分析に使用する器具、例えば核酸試料を取り扱うノズル、ピペット、チップ、ピン等の洗浄を簡便に効果的に行う方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、固体、具体的にはノズル、ピペット、チップ、ピン等に付着した生体関連物質は電場の下で移動することに着目し、電解質の溶液に浸して電位をかけることにより、該付着した生体関連物質は伝導度に応じて固体から分離しうることを見出し本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、
１．生体成分及び／又は人工的に調製された生体関連成分が付着した固体の洗浄方法であって、該固体を電解質の溶液に浸し、該電解質溶液を通電させ、電位の変位により該付着物質を固体から洗浄容器へ移動させることを特徴とする固体の洗浄方法、
２．上記生体成分及び／又は人工的に調製された生体関連成分が付着した固体が、試料及び／または試薬の移動に使用するノズル、ピペット、チップ、ピン又はこれらの同等物である前項１に記載の洗浄方法、
３．上記生体成分及び／又は人工的に調製された生体関連成分が付着した固体が、ＤＮＡチップのプローブ固定のためのピンである前項１に記載の洗浄方法、
４．上記生体成分及び／又は人工的に調製された生体関連成分が、核酸成分を含む前項１〜３のいずれか１に記載の洗浄方法、
５．上記生体成分及び／又は人工的に調製された生体関連成分が、ＤＮＡチップに固定するプローブである前項４に記載の洗浄方法、
６．上記電解質溶液が、電解質であるＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２  、ＬｉＣｌ、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、イオン性の界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドから選択される少なくとも１を含む前項１〜５のいずれか１に記載の洗浄方法、
７．上記電解質溶液に通電する印加電位が、０．１  ｍＶ〜１０００  Ｖである前項１〜６のいずれか１に記載の洗浄方法、
８．前項１〜７のいずれか１に記載の洗浄方法に使用する洗浄装置、からなる。
【０００９】
【発明の実施の態様】
本発明において、「生体成分及び／又は人工的に調製された生体関連成分」とは、例えば尿、血清、血漿等の生体に由来する成分をいい、蛋白質や核酸成分を含み、好ましくはＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸成分をいう。この生体に由来する成分は、生体から採取したものであってもよく、また人工的に既知の方法等により調製されたものであっても良い。好ましくは、ＤＮＡチップなどの技術を用いて微量の生体試料等の分析方法に使用する核酸プローブが挙げられ、この核酸プローブには標識物質などの人為的な物質が含まれていても良い。
【００１０】
本発明において、「生体成分及び／又は人工的に調製された生体関連成分が付着した固体」とは、試料及び／又は試薬の移動に使用するノズル、ピペット、チップ、ピン又はこれらの同等物が挙げられる。試料及び／又は試薬とは、分析を行うためのあらゆる工程で使用されるものを含み、分析時に使用するものに限られるものではない。具体的には、ピペットで試料や試薬をある容器から他の容器に移動させた場合のピペットや、ＤＮＡチップ作製においてプローブを基盤に固定するピンなどが挙げられる。
このような固体の材質は、目的とする物質を移動させることができるものであれば良く特に限定されない。特に本発明の洗浄方法は、上記固体を電解質溶液に浸すものであるから、該電解質溶液に浸した場合にも劣化しないものが好ましい。一方、本発明の洗浄方法は、固体に通電するものではないから、該固体の材質は伝導性を有していてもよく有さなくても良い。このような固体の材質として、具体的にはガラス、ポリカーボネート、ステンレス、ポリプロピレン等が挙げられる。
【００１１】
本発明のより具体的な態様として、ＤＮＡチップが挙げられる。ＤＮＡチップにより、ヒトの遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子構造が明らかにされてきている。ＤＮＡチップは、顕微鏡スライドグラス等の基板上に数千から一万種類以上の異なる種類のＤＮＡ断片をスポットとして整列固定させ、製造する。このＤＮＡチップの製造におけるスポットの形成方法としては、ＱＵＩＬＬ方式、ピン＆リング方式、あるいはスプリングピン方式といった、いわゆるピンによる基板上へのＤＮＡ断片を含んだ試料溶液の供給（打ち込み）を行う方式が広く用いられている。
上記、ＱＵＩＬＬ方式は、ピン先に形成された凹部に試料を貯め、ピン先を基板に接触させることで凹部内の試料を基板上に移して微小スポットを形成する方法であるが、凹部に溜められた試料の洗浄が不完全となってクロスコンタミネーションが起こりやすい等の問題がある。また、ピン＆リング方式は、マイクロプレート中の試料溶液をリングでリザーブした後、溶液がリザーブされたリング内側を貫通するようにしてピン先でリング内の試料を捉え、基板上にスポットを形成していく方法である。
該ＤＮＡチップ用ピンの洗浄は、従来は流水洗浄又は静止水洗浄が主としてなされていたが、本発明の洗浄方法を適用することでより簡便にかつ効果的にピンの洗浄がなされることが期待できる。
【００１２】
本発明において、電解質溶液とは、電気伝導性をもつ溶液をいう。電解質は溶液中でイオンに解離し、電場がかけられるとこのイオンが電荷を運ぶ。本発明の電解質溶液として、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２  、ＬｉＣｌ、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドのような電解質を含む溶液を用いることができる。また、リン酸２水素ナトリウム−リン酸水素２ナトリウム緩衝液、リン酸２水素カリウム−リン酸水素２カリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、イミダゾール−ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＢｉｓＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＭＯＰＯＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＢＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液等を用いることができる。
本発明の洗浄方法を効果的に行うために、該電解溶液に通常使用される界面活性剤、具体的にはイオン性の界面活性剤などを混入して使用することもできる。
【００１３】
本発明の洗浄方法において使用する印加電位の大きさは、０．１  ｍＶ〜１０００  Ｖ、好ましくは１  Ｖ〜５００  Ｖ、より好ましくは２０  Ｖ〜５０  Ｖの範囲で選択することができる。通電は、洗浄対象物の浸漬の前後何れであっても良い。また電流は直流又は交流であっても良い。
通電のために使用する電極として使用可能なものは、例えばニクロム線、銅線などである。
【００１４】
本発明の洗浄方法に使用する水槽の大きさや材質は、上記目的に適合しうるものであれば良いが、特に通電することにより発熱する場合があることや、洗浄により除去された物質が、洗浄の対象となる固体に再付着しない条件を選定することが必要である。このような条件の水槽としては、特に材質はガラス、ポリカーボネート等であることが好ましい。
【００１５】
【実施例】
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１６】
（実施例１）
（ＤＮＡチップのプローブ固定のためのスリットピン洗浄方法）
水槽（高さ５０  ｍｍ、幅５０  ｍｍ×１００  ｍｍ）に、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａ  を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを２００  ｍｌ加えたものを洗浄用の水槽とした。
本発明の洗浄方法に用いる洗浄装置を図１に示した。該装置の水槽に、図１に示すようにニクロム線である電極を挿入した。
電極を挿入した水槽に印加電位として５０  Ｖの通電を行った。
【００１７】
（実験例１）
１）洗浄物（ＤＮＡチップのプローブ固定のためのスリットピン）
Ｃｙ５標識した５’端チオール化オリゴヌクレオチド溶液に、ＤＮＡチップのプローブ固定のためのスリットピンを１秒間浸潤させ、該ピン先を表面にマレイミド基を導入したガラス基板に０．５秒間接着することにより、Ｃｙ５標識オリゴヌクレオチドをガラス基板上に固定化した。
ガラス基板上に固定化作業を行った後の上記スリットピンを洗浄物とした。
２）洗浄方法
上記１のスリットピンのピン先を、▲１▼蒸留水を含む静止水槽に５秒間浸漬する方法、▲２▼流水（蒸留水）に５秒間浸漬する方法、▲３▼実施例１に記載の電位をかけた水槽に２秒間浸漬する方法、▲４▼実施例１に記載の電位をかけた水槽に５秒間浸漬する方法で各々１〜３回洗浄した。
３）洗浄効果の確認
各洗浄した上記スリットピンのピン先を再びガラス基板上に接着させ、ピン先に残存するオリゴヌクレオチド量をガラス基板上に固定化された標識物質から得られる蛍光強度を指標として検出した。
４）結果
その結果を図２および図３に示した。図１は、ガラス基板の蛍光スキャンイメージである。静止洗浄、流水洗浄では洗浄を重ねても蛍光シグナルが検出され、ピン先へのオリゴヌクレオチドの残存が認められた。これに対し、本発明の洗浄方法では、洗浄回数が１回であっても蛍光シグナルは検出されなかった。これより、本発明の洗浄方法は効率的にピン先の洗浄が可能であることが明らかとなった。図３は、各洗浄方法で洗浄した後の蛍光強度の推移を示したものである。この結果からも、本発明の洗浄方法が効果的であることが確認された。
【００１８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の洗浄方法により、各種生体関連成分が付着する可能性のある生体試料の分析に使用する器具、例えば核酸試料を取り扱うノズル、ピペット、チップ、ピン等の洗浄を簡便に効果的に行うことができる。とりわけ、ＤＮＡチップのプローブ固定のためのスリットピンのように微量の核酸試料を取り扱う器具の洗浄に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の洗浄方法の概略を示す図である。（実施例１）
【図２】ガラス基板の蛍光スキャンイメージを示す図である。（実験例１）
【図３】各洗浄方法で洗浄した後の蛍光強度の推移を示す図である。（実験例１）
【符号の説明】
●  静止水洗浄（図２）
■  流水洗浄（図２）
▲  本発明の洗浄方法による洗浄（５秒）（図２）
◆  本発明の洗浄方法による洗浄（２秒）（図２）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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