(57)【要約】【課題】豚の種別の判別を、簡便、且つ、高精度に行うことが可能な方法及びキットを提供する。【解決手段】被検体豚のＫＩＴ遺伝子中の１又は２以上の多型を検出し、検出される多型又はその組み合わせによって、同被検体豚の種別を判別する方法において、前記多型として、配列番号１に示す塩基配列を基準とするＫＩＴ遺伝子の塩基配列において、１１５９位及び１２０９位に相当する位置のいずれか一方又は両方の位置における多型を検出する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種又は２種以上のキャプチャーオリゴヌクレオチドを含み、これらのキャプチャーオリゴヌクレオチドと被検体豚由来の核酸とのハイブリダイゼーションにより検出される多型又はその組み合わせによって、同被検体豚の種別を判別するためのキットであって、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列を基準とするＫＩＴ遺伝子の塩基配列において、１１５９位及び１２０９位に相当する位置のいずれか一方又は両方の位置における多型を検出し得るオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするキット。
【請求項２】
前記キャブチャーオリゴヌクレオチドは、支持体に固定化されていることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、前記ＫＩＴ遺伝子の塩基配列において、３９８位、５４９位、５９５位、６５９位、８４４位、８８４位、９５９位、１３１３位、１３４２位、１６３２位、１７２４位、１９８６位、２１７９位、２２９５位、２３１３位、２３１４位、２３６０位、２３７７位、２３９１位、２４２９位、２４４９位、２４７０位、２４７２位、２６００位、２６１１位、２６２２位、２６６３位、２６７４位、２６８０位、２７１７位、２８３４位、２８４０位、２８９９位、３０２０位、３０４９位、３２０７位、３２２１位、３２５８位、３２９６位、３３１７位、３３２３位、３３４１位、３３７３位、３３８７位、３４２０位、３４８２位、３５９７位、３６６６位、３７０５位、３７３７位、３７７３位、３８８４位、３８８５位、３８８６位、及び３８８７位から選ばれる１又は２以上の位置の多型を検出し得るオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項１又は２に記載のキット。
【請求項４】
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、メラニン細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子（以下、「ＭＣ１Ｒ遺伝子」という）における１又は２以上の位置における多型を検出し得るオリゴヌクレオチドを含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５】
前記ＭＣ１Ｒ遺伝子における多型が、配列番号２に示す塩基配列において、１５４位、１７６位、２３４位、２４１位、３６１位、３６７位、５９８位、及び６００位から選ばれる位置に相当する位置における多型である請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、多型部位を含む領域の塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有し、１０〜４０塩基長である請求項１〜５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７】
配列番号１に示す塩基配列を基準とするＫＩＴ遺伝子の塩基配列において、１１５９位又は１２０９位に相当する位置における多型をハイブリダイゼーションにより検出し得るオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記多型部位を含む領域の塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有し、１０〜４０塩基長である請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
被検体豚由来の核酸と、請求項１〜６のいずれかに記載のキットに含まれるキャプチャーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを行い、各々のキャプチャーオリゴヌクレオチドについて被検体豚由来の核酸とのハイブリッド形成の有無を検出し、被検体豚の塩基配列中の多型を同定することによって、被検体豚の種別を判別する方法。
【請求項１０】
被検体豚のＫＩＴ遺伝子中の１又は２以上の多型を検出し、検出される多型又はその組み合わせによって、同被検体豚の種別を判別する方法であって、前記多型は、配列番号１に示す塩基配列を基準とするＫＩＴ遺伝子の塩基配列において、１１５９位及び１２０９位に相当する位置のいずれか一方又は両方の位置における多型を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、豚の品種を簡便に判別する方法および、キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現在、豚肉用として飼育されているものは大ヨークシャー種、ランドレース種、デュロック種、バークシャー種、ハンプシャー種、メイシャン種、モンカイ種などと、それらの交雑によるものが主流である。そのなかで、バークシャー種はいわゆる黒豚といわれ、品質の高さから高値で取引されている。
【０００３】
しかし、この高値に便乗して黒豚肉として取引されているものの中にはバークシャー以外の種の混じった豚肉やバークシャー種が全く混じっていない豚肉も出回っている。そこで、平成１１年６月に「食肉小売品質基準」が改正され、バークシャー純粋種以外の肉を黒豚として表示することを禁止した。しかしながらこれは完全に守られているとはいえないのが現状である。
【０００４】
豚の品種を調べる方法として、遺伝子を増幅した後、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：ＲＦＬＰ）により多型解析を行う方法がある（特許文献１）。しかしながら、この方法はＲＦＬＰを用いているため多量のＤＮＡを必要とすること、制限酵素を用いるため操作に熟練を要すること、複数の制限酵素を用いるときは操作が煩雑になること、制限酵素が市販されていない多型部位については調べることができない、白色品種と有色品種を区別できない場合がある等の問題が生じ、高精度且つ多検体を処理することは難しい。
【０００５】
また、現在までに、豚の種別の判別の指標となる遺伝子多型が多数報告されている（特許文献１）が、より正確な判別には、新たな多型を見出すことが必要である。特に、従来知られている多型のみでは、黒豚と白豚とを判別できない場合がある。
【０００６】
一方、標識した標的核酸を固相上で捕獲して、その有無や存在比を解析するマイクロアレイ技術が近年開発された。これは、多数の捕獲核酸（キャプチャーオリゴヌクレオチド）を固相上に固定化し、標識した標的核酸を捕獲核酸にハイプリダイズさせて捕獲し、標的核酸の有無や存在比を網羅的に解析する技術である（非特許文献１）。
【０００７】
【特許文献１】
特許第３１１６０４９号公報（特開２０００−３５０５８６号公報）
【非特許文献１】
Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｖｏｌｕｍｅ  ２１，  Ｐ１０−１４
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、豚の種別判別に際し、簡便且つ、多検体処理に適し、１つの検体に対して一度の試験で高精度の判別が可能な方法及びキットを提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために検討を行った結果、幹細胞増殖因子レセプター遺伝子の一種であるＫＩＴ遺伝子中に、豚の種別の判別に好適な新規な多型が存在することを見出した。そして、ＫＩＴ遺伝子の公知の多型、あるいはメラニン細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子（ＭＣ１Ｒ遺伝子）中の多型と組み合わせることにより、被検体豚の種別を高精度に判定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）１種又は２種以上のキャプチャーオリゴヌクレオチドを含み、これらのキャプチャーオリゴヌクレオチドと被検体豚由来の核酸とのハイブリダイゼーションにより検出される多型又はその組み合わせによって、同被検体豚の種別を判別するためのキットであって、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列を基準とするＫＩＴ遺伝子の塩基配列において、１１５９位及び１２０９位に相当する位置のいずれか一方又は両方の位置における多型を検出し得るオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするキット。
（２）前記キャブチャーオリゴヌクレオチドは、支持体に固定化されていることを特徴とする（１）に記載のキット。
（３）前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、前記ＫＩＴ遺伝子の塩基配列において、３９８位、５４９位、５９５位、６５９位、８４４位、８８４位、９５９位、１３１３位、１３４２位、１６３２位、１７２４位、１９８６位、２１７９位、２２９５位、２３１３位、２３１４位、２３６０位、２３７７位、２３９１位、２４２９位、２４４９位、２４７０位、２４７２位、２６００位、２６１１位、２６２２位、２６６３位、２６７４位、２６８０位、２７１７位、２８３４位、２８４０位、２８９９位、３０２０位、３０４９位、３２０７位、３２２１位、３２５８位、３２９６位、３３１７位、３３２３位、３３４１位、３３７３位、３３８７位、３４２０位、３４８２位、３５９７位、３６６６位、３７０５位、３７３７位、３７７３位、３８８４位、３８８５位、３８８６位、及び３８８７位から選ばれる１又は２以上の位置の多型を検出し得るオリゴヌクレオチドをさらに含む（１）又は（２）に記載のキット。
（４）前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、メラニン細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子（以下、「ＭＣ１Ｒ遺伝子」という）における１又は２以上の位置における多型を検出し得るオリゴヌクレオチドを含む（１）〜（３）のいずれかに記載のキット。
（５）前記ＭＣ１Ｒ遺伝子における多型が、配列番号２に示す塩基配列において、１５４位、１７６位、２３４位、２４１位、３６１位、３６７位、５９８位、及び６００位から選ばれる位置に相当する位置における多型である（４）に記載のキット。
（６）前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、多型部位を含む領域の塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有し、１０〜４０塩基長である（１）〜（５）のいずれかに記載のキット。
（７）配列番号１に示す塩基配列を基準とするＫＩＴ遺伝子の塩基配列において、１１５９位又は１２０９位に相当する位置における多型をハイブリダイゼーションにより検出し得るオリゴヌクレオチド。
（８）前記多型部位を含む領域の塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有し、１０〜４０塩基長である（７）に記載のオリゴヌクレオチド。
（９）被検体豚由来の核酸と、（１）〜（６）のいずれかに記載のキットに含まれるキャプチャーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを行い、各々のキャプチャーオリゴヌクレオチドについて被検体豚由来の核酸とのハイブリッド形成の有無を検出し、被検体豚の塩基配列中の多型を同定することによって、被検体豚の種別を判別する方法。
（１０）被検体豚のＫＩＴ遺伝子中の１又は２以上の多型を検出し、検出される多型又はその組み合わせによって、同被検体豚の種別を判別する方法であって、前記多型は、配列番号１に示す塩基配列を基準とするＫＩＴ遺伝子の塩基配列において、１１５９位及び１２０９位に相当する位置のいずれか一方又は両方の位置における多型を含むことを特徴とする方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、被検体豚のＫＩＴ遺伝子中の１又は２以上の多型を検出し、検出される多型又はその組み合わせによって、同被検体豚の種別を判別する方法であって、前記多型は、配列番号１に示す塩基配列を基準とするＫＩＴ遺伝子の塩基配列において、１１５９位及び１２０９位に相当する位置のいずれか一方又は両方の位置における多型を含むことを特徴とする方法である。同方法は、具体的には、例えば固定化核酸を用いたハイブリダーゼーションにより行われる。本発明のキットは、本発明の方法をこのようなハイブリダイゼーションにより行うためのキットであって、前記１１５９位及び１２０９位に相当する位置のいずれか一方又は両方の位置における多型を検出し得るオリゴヌクレオチドを、キャプチャーオリゴヌクレオチドとして含む。前記多型は、本発明者が見出した新規な多型である。
【００１１】
本発明において、多型の検出及びその結果に基づく豚の種別の判別は、上記多型に加えて、ＫＩＴ遺伝子の公知の多型と組み合わせて行ってもよい。さらに、これらの多型と、ＭＣ１Ｒ遺伝子中の多型と組み合わせてもよい。
【００１２】
ＫＩＴ遺伝子の多型としては、配列番号１に示す塩基配列を基準とするＫＩＴ遺伝子の塩基配列において、３９８位、５４９位、５９５位、６５９位、８４４位、８８４位、９５９位、１１５９位、１２０９位、１３１３位、１３４２位、１６３２位、１７２４位、１９８６位、２１７９位、２２９５位、２３１３位、２３１４位、２３６０位、２３７７位、２３９１位、２４２９位、２４４９位、２４７０位、２４７２位、２６００位、２６１１位、２６２２位、２６６３位、２６７４位、２６８０位、２７１７位、２８３４位、２８４０位、２８９９位、３０２０位、３０４９位、３２０７位、３２２１位、３２５８位、３２９６位、３３１７位、３３２３位、３３４１位、３３７３位、３３８７位、３４２０位、３４８２位、３５９７位、３６６６位、３７０５位、３７３７位、３７７３位、３８８４位、３８８５位、３８８６位、３８８７位に相当する位置における多型が挙げられる。
【００１３】
また、ＭＣ１Ｒ遺伝子の多型としては、配列番号２に示す塩基配列を基準とするＭＣ１Ｒ遺伝子の塩基配列において、１５４位、１７６位、２３４位、２４１位、３６２位、３６７位、５９８位、および６００位から選ばれる位置に相当する位置における多型が挙げられる。
【００１４】
遺伝子における多型の位置は、その位置よりも上流側における配列中のヌクレオチドの挿入、欠失等によって変化し得る。本発明において、「相当する位置」とは、このように、遺伝子配列中の絶対的位置が変わった場合、配列番号１又は２に示す基準配列中の相対位置を示すものである。
【００１５】
上記多型位置における多型の様式として具体的には、ＫＩＴ遺伝子では３９８位におけるチミンからシトシンへの置換、５４９位におけるアデニンからグアニンへの置換、５９５位におけるアデニンからチミンへの置換、６５９位におけるシトシンからチミンへの置換、８４４位におけるグアニンからアデニンへの置換、８８４位におけるシトシンからアデニンへの置換、９５９位におけるアデニンからグアニンへの置換、１１５９位におけるチミンからシトシンへの置換、１２０９位におけるシトシンからチミンへの置換、１３１３位におけるグアニンからアデニンへの置換、１３４２位におけるグアニンからアデニンへの置換、１６３２位におけるグアニンからアデニンへの置換、１７２４位におけるシトシンからチミンへの置換、１９８６位におけるアデニンからグアニンへの置換、２１７９位におけるシトシンからグアニンへの置換、２２９５位におけるグアニンからアデニンへの置換、２３１３位におけるシトシンからチミンへの置換、２３１４位におけるシトシンからアデニンへの置換、２３６０位におけるシトシンからチミンへの置換、２３７７位におけるシトシンからチミンへの置換、２３９１位におけるグアニンからシトシンへの置換、２４２９位におけるシトシンの欠失、２４４９位におけるグアニンからアデニンへの置換、２４７０位におけるグアニンからアデニンへの置換、２４７２位におけるシトシンからアデニンへの置換、２６００位におけるグアニンからアデニンへの置換、２６１１位におけるアデニンからグアニンへの置換、２６２２位におけるシトシンからチミンへの置換、２６６３位におけるアデニンからグアニンへの置換、２６７４位におけるシトシンからグアニンへの置換、２６８０位におけるチミンからシトシンへの置換、２７１７位におけるシトシンからチミンへの置換、２８３４位におけるアデニンからグアニンへの置換、２８４０位におけるアデニンからチミンへの置換、２８９９位におけるグアニンからアデニンへの置換、３０２０位におけるグアニンからアデニンへの置換、３０４９位におけるシトシンからアデニンへの置換、３２０７位におけるシトシンからチミンへの置換、３２２１位におけるアデニンからシトシンへの置換、３２５８位におけるグアニンからアデニンへの置換、３２９６位におけるチミンからシトシンへの置換、３３１７位におけるチミンからシトシンへの置換、３３２３位におけるチミンからシトシンへの置換、３３４１位におけるグアニンからアデニンへの置換、３３７３位におけるグアニンからチミンへの置換、３３８７位におけるグアニンからアデニンへの置換、３４２０位におけるアデニンからグアニンへの置換、３４８２位におけるグアニンからアデニンへの置換、３５９７位におけるグアニンからチミンへの置換、３６６６位におけるアデニンからグアニンへの置換、３７０５位におけるグアニンからアデニンへの置換、３７３７位におけるアデニンからグアニンへの置換、３７７３位におけるシトシンからチミンへの置換、３８８４位におけるアデニンの欠失、３８８５位におけるグアニンの欠失、３８８６位におけるチミンの欠失、及び３８８７位におけるチミンの欠失が挙げられる。
【００１６】
また、ＭＣ１Ｒ遺伝子では、１５４位におけるグアニンからアデニンへの置換、１７６位におけるチミンからシトシンへの置換、２３４位におけるチミンからシトシンへの置換、２４１位におけるアデニンからグアニンへの置換、３６２位におけるシトシンからチミンへの置換、３６７位におけるシトシンからチミンへの置換、５９８位におけるグアニンからアデニンへの置換、及び６００位におけるグアニンからアデニンへの置換が挙げられる。
【００１７】
本発明において検出する、ＫＩＴ遺伝子の１１５９位及び１２０９位以外の多型の組み合わせとしては、以下の組み合わせが挙げられる。
（１）Ｃ６５９Ｔ、Ｃ２３７７Ｔ
【００１８】
（２）Ｔ３９８Ｃ、Ａ５４９Ｇ、Ｃ６５９Ｔ、Ａ９５９Ｇ、Ｃ１７２４Ｔ、Ａ１９８６Ｇ、Ｃ２１７９Ｇ、Ｃ２３７７Ｔ、Ｇ２３９１Ｃ、Ｃ２４７２Ａ、Ｇ２６００Ａ、Ａ２６１１Ｇ、Ａ２６６３Ｇ、Ｔ２６８０Ｃ、Ａ２８４０Ｔ、Ｇ３０２０Ａ、Ｃ３２０７Ｔ、Ａ３２２１Ｃ、Ｇ３２５８Ａ、Ｔ３２９６Ｃ、Ｔ３３１７Ｃ、Ｔ３３２３Ｃ、Ｇ３３４１Ａ、Ｇ３３８７Ａ、Ｇ３４８２Ａ、Ａ３６６６Ｇ、Ｇ３７０５Ａ
【００１９】
（３）Ｔ３９８Ｃ、Ａ５４９Ｇ、Ｃ６５９Ｔ、Ｃ８８４Ａ、Ａ９５９Ｇ、Ｇ１３４２Ａ、Ｃ１７２４Ｔ、Ａ１９８６Ｇ、Ｃ２１７９Ｇ、Ｃ２３７７Ｔ、Ｇ２３９１Ｃ、Ｃ２４７２Ａ、Ｇ２６００Ａ、Ａ２６１１Ｇ、Ａ２６６３Ｇ、Ｔ２６８０Ｃ、Ａ２８４０Ｔ、Ｇ３０２０Ａ、Ｃ３２０７Ｔ、Ａ３２２１Ｃ、Ｇ３２５８Ａ、Ｔ３２９６Ｃ、Ｔ３３１７Ｃ、Ｔ３３２３Ｃ、Ｇ３３４１Ａ、Ｇ３３８７Ａ、Ｇ３４８２Ａ、Ａ３６６６Ｇ、Ｇ３７０５Ａ
【００２０】
（４）Ｔ３９８Ｃ、Ａ５４９Ｇ、Ｃ６５９Ｔ、Ａ９５９Ｇ、Ｇ１３１３Ａ、Ｃ１７２４Ｔ、Ａ１９８６Ｇ、Ｃ２１７９Ｇ、Ｃ２３７７Ｔ、Ｃ２４７２Ａ、Ｇ２６００Ａ、Ａ２６１１Ｇ、Ａ２６６３Ｇ、Ｔ２６８０Ｃ、Ａ２８４０Ｔ、Ｇ３０２０Ａ、Ｃ３２０７Ｔ、Ａ３２２１Ｃ、Ｇ３２５８Ａ、Ｔ３２９６Ｃ、Ｔ３３１７Ｃ、Ｔ３３２３Ｃ、Ｇ３３４１Ａ、Ｇ３３８７Ａ、Ｇ３４８２Ａ、Ａ３６６６Ｇ、Ｇ３７０５Ａ
【００２１】
（５）Ｔ３９８Ｃ、Ａ５４９Ｇ、Ｃ６５９Ｔ、Ａ９５９Ｇ、Ｃ１７２４Ｔ、Ａ１９８６Ｇ、Ｃ２１７９Ｇ、Ｃ２３７７Ｔ、Ｃ２４７２Ａ、Ｇ２６００Ａ、Ａ２６１１Ｇ、Ａ２６６３Ｇ、Ｔ２６８０Ｃ、Ａ２８４０Ｔ、Ｇ３０２０Ａ、Ｃ３２０７Ｔ、Ａ３２２１Ｃ、Ｇ３２５８Ａ、Ｔ３２９６Ｃ、Ｔ３３１７Ｃ、Ｔ３３２３Ｃ、Ｇ３３４１Ａ、Ｇ３３８７Ａ、Ｇ３４８２Ａ、Ａ３６６６Ｇ、Ｇ３７０５Ａ
【００２２】
（６）Ｔ３９８Ｃ、Ａ５４９Ｇ、Ｃ６５９Ｔ、Ａ９５９Ｇ、Ｃ１７２４Ｔ、Ａ１９８６Ｇ、Ｃ２１７９Ｇ、Ｃ２３７７Ｔ、Ｃ２４７２Ａ、Ｇ２６００Ａ、Ａ２６１１Ｇ、Ａ２６６３Ｇ、Ｔ２６８０Ｃ、Ａ２８４０Ｔ、Ｇ３０２０Ａ、Ｃ３２０７Ｔ、Ａ３２２１Ｃ、Ｇ３２５８Ａ、Ｔ３２９６Ｃ、Ｔ３３１７Ｃ、Ｔ３３２３Ｃ、Ｇ３３４１Ａ、Ｇ３３８７Ａ、Ｇ３４８２Ａ、Ａ３６６６Ｇ、Ｇ３７０５Ａ、Ａ３８８４Ｄ、Ｇ３８８５Ｄ、Ｔ３８８６Ｄ、Ｔ３８８７Ｄ
【００２３】
（７）Ｔ３９８Ｃ、Ａ５４９Ｇ、Ｃ６５９Ｔ、Ａ９５９Ｇ、Ｃ１７２４Ｔ、Ａ１９８６Ｇ、Ｃ２１７９Ｇ、Ｃ２３７７Ｔ、Ｃ２４７２Ａ、Ｇ２６００Ａ、Ａ２６１１Ｇ、Ａ２６６３Ｇ、Ｔ２６８０Ｃ、Ａ２８４０Ｔ、Ｇ３０２０Ａ、Ｃ３２０７Ｔ、Ａ３２２１Ｃ、Ｇ３２５８Ａ、Ｔ３２９６Ｃ、Ｔ３３１７Ｃ、Ｔ３３２３Ｃ、Ｇ３３４１Ａ、Ｇ３３８７Ａ、Ｇ３４８２Ａ、Ａ３６６６Ｇ、Ｇ３７０５Ａ
【００２４】
（８）Ｔ３９８Ｃ、Ａ５４９Ｇ、Ｃ６５９Ｔ、Ａ９５９Ｇ、Ｃ１７２４Ｔ、Ａ１９８６Ｇ、Ｃ２１７９Ｇ、Ｃ２３７７Ｔ、Ｇ２４７０Ａ、Ｃ２４７２Ａ、Ｇ２６００Ａ、Ａ２６１１Ｇ、Ａ２６６３Ｇ、Ｔ２６８０Ｃ、Ａ２８４０Ｔ、Ｇ２８９９Ａ、Ｇ３０２０Ａ、Ｃ３２０７Ｔ、Ａ３２２１Ｃ、Ｔ３２９６Ｃ、Ｔ３３１７Ｃ、Ｔ３３２３Ｃ、Ｇ３３４１Ａ、Ｇ３３８７Ａ、Ｇ３４８２Ａ、Ａ３６６６Ｇ、Ｇ３７０５Ａ、Ｃ３７７３Ｔ
【００２５】
（９）Ａ５９５Ｔ、Ｃ６５９Ｔ、Ｇ８４４Ａ、Ａ９５９Ｇ、Ｇ１６３２Ａ、Ａ１９８６Ｇ、Ｇ２２９５Ａ、Ｃ２３１３Ｔ、Ｃ２３１４Ａ、Ｃ２３６０Ｔ、Ｃ２４２９Ｄ、Ｇ２４４９Ａ、Ａ２６１１Ｇ、Ｃ２６２２Ｔ、Ａ２６６３Ｇ、Ｃ２６７４Ｇ、Ｔ２６８０Ｃ、Ｃ２７１７Ｔ、Ａ２８３４Ｇ、Ａ２８４０Ｔ、Ｃ３０４９Ａ、Ａ３２２１Ｃ、Ｔ３２９６Ｃ、Ｔ３３１７Ｃ、Ｔ３３２３Ｃ、Ｇ３３７３Ｔ、Ａ３４２０Ｇ、Ｇ３４８２Ａ、Ｇ３５９７Ｔ、Ａ３６６６Ｇ、Ｇ３７０５Ａ、Ａ３７３７Ｇ
（但し、数字は配列番号１における位置を、数字を挟む左右の文字は左の塩基から右の塩基への置換を、Ｄは欠失を、それぞれ示す。）
【００２６】
また、本発明において検出する、ＭＣ１Ｒ遺伝子の多型の組み合わせとしては、以下の組み合わせが挙げられる。
（１０）Ｃ３６７Ｔ
（１１）Ａ２４１Ｇ、Ｃ３６２Ｔ、Ｇ５９８Ａ
（１２）Ｇ１５４Ａ、Ｔ１７６Ｃ、Ｔ２３４Ｃ、Ａ２４１Ｇ、Ｇ６００Ａ
【００２７】
本発明において、豚の種の判定は、上記多型又はその組み合わせを同定することによって行われる。表１に、ＭＣ１Ｒ遺伝子の豚の種別による多型の一覧を示す。また、表２〜３に、ＫＩＴ遺伝子の豚の種別による多型の一覧を示す。例えば表２中に、「白ぶた」が４種記載されているが、これは、４種の白ぶたについて多型の組合せを分類したところ、４種にわかれたことを意味している。また、表１〜３中、「多型個所」は、ＭＣ１Ｒは配列番号２に示す塩基配列を基準とする位置を、ＫＩＴ遺伝子は配列番号１に示す塩基配列を基準とする位置を示す。また、ランドレース種と大ヨークシャー種は共に白色であるため、以下２種をまとめて白色豚とする。
【００２８】
【表１】
2004187528.tif 000002
【００２９】
【表２】
2004187528.tif 000003
【００３０】
【表３】
2004187528.tif 000004
【００３１】
本発明において、好ましくは、上記多型は、それぞれの多型をハイブリダイゼーションにより検出し得るオリゴヌクレオチドを用いて検出される。本発明においては、このようなオリゴヌクレオチドをキャプチャーオリゴヌクレオチドという。キャプチャーオリゴヌクレオチドは、多型部位を含む領域の塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有する。
【００３２】
キャプチャーオリゴヌクレオチドの設計は、それぞれの遺伝子に存在する各々の多型部位を含むように行う。また、１つのキャプチャーオリゴヌクレオチドのなかに２塩基以上のタイプ固有の塩基配列が存在していてもかまわない。
【００３３】
キャプチャーオリゴヌクレオチドの塩基の長さは、１０〜４０塩基が望ましい。これより短いとハイブリダイゼーションの検出が困難になり、長いとタイプ固有の配列によるハイブリダイゼーションの差が少なくなり、タイプの判定が難しくなることがある。ただし、このキャプチャーオリゴヌクレオチドの長さは、主として各塩基の含有率や同一塩基の繰り返しなどの配列の特性に依存する。また、ハイブリダイゼーションを妨げる要因である２次構造的障害がある場合は、遺伝子の多型性に関係しない任意の塩基をスペーサー化合物で置換することによりハイブリダイゼーションにおける結合親和性を緩和したオリゴヌクレオチドを用いることにより、前記障害を回避することもできる。このようなスペーサー化合物としては、いずれの種類の塩基との相補結合性を有しない核酸骨格等が挙げられる。
【００３４】
キャプチャーオリゴヌクレオチドの塩基配列の例を、配列番号３〜１２１に示す。尚、配列番号３〜１２１に示した番号のほか、各塩基配列の５’側もしくは３’側またはその両方において、各々の塩基配列を、ＭＣ１Ｒ遺伝子、ＫＩＴ遺伝子の塩基配列に対応して伸長、または短縮させてもよいが、いずれの場合もキャプチャーオリゴヌクレオチドは１０〜４０塩基の範囲とすることが好ましい。
【００３５】
キャプチャーオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、またはロックド核酸のいずれであってもよい。キャプチャーオリゴヌクレオチドの合成方法は、通常のオリゴヌクレオチドと同様にして、例えば市販のＤＮＡ合成機を用いる方法等によって、行うことができる。
【００３６】
本発明において、設計されたキャプチャーオリゴヌクレオチドは、出願時点までの研究・調査結果を良く反映したものであるが、新しいハプロタイプの塩基配列に関して、この後、追加的な情報が得られた場合には、本出願に記載の方法に基づいて新たなキャプチャーオリゴヌクレオチドが設計されることになる。このようなキャプチャーオリゴヌクレオチドを使用する場合であっても、ＫＩＴ遺伝子の１１５９位及び１２０９位に相当する位置のいずれか一方を検出する限り、本発明に含まれる。
【００３７】
上記のようなキャプチャーオリゴヌクレオチドを用いてハイブリダイゼーションを行う際に、キャプチャーオリゴヌクレオチドと被検体豚に由来する核酸（以下、「核酸プローブ」ともいう）を液中でハイブリダイゼーションさせてもいいし、キャプチャーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブのどちらかを支持体上に固定化してもよい。
【００３８】
固定化を行う場合、このような支持体としては、キャプチャーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブを固定化でき、被検体とのハイブリダイゼーション及び、ハイブリッドの検出に必要な反応工程に耐え得るものであれば特に制限されない。このような支持体の材質として具体的にはプラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック等が挙げられる。
【００３９】
上記プラスチックとして具体的には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビリニデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアクリル樹脂等が挙げられる。
【００４０】
また、無機高分子として具体的には、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及び、グラファイト等が挙げられる。
【００４１】
また、金属として具体的には、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネット等が挙げられる。
【００４２】
また、天然高分子としてはポリアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸及び、それらの誘導体等が挙げられる。
【００４３】
また、セラミックとして具体的にはアパタイト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び、炭化ホウ素等が挙げられる。
【００４４】
本発明においてキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは被検体の固定化に用いる支持体の形状はキャプチャーオリゴヌクレオチドが固定化されれば、特に制限されない。このような支持体の形状として平板、メンブレン、微粒子等が挙げられる。
【００４５】
本発明において上記支持体にキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブを固定化する際、支持体にキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブを直接固定化してもよく、担体を支持体に担持させて、担体を介してキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは被検体を支持体に固定化してもよい。担体としては、担体自体がキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは被検体に結合性を有してもよく、キャプチャーオリゴヌクレオチドまたは被検体に結合性を有するリガンドを介してキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは被検体を固定化できるものであってもよい。ここで、「担持」とは、担体にキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブを固定化する際やキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブ固定化支持体を実際の検出に用いる際等に用いられる水溶性溶剤、有機溶剤等の各種溶剤中で、支持体から上記担体が実質的に脱離しないことを意味する。
【００４６】
本発明に用いられる上記担体は、上記支持体上に担持される限り、単に物理的な接着性を利用して担持されていてもよく、また、化学的に共有結合等を介して担持されていてもよい。また、上記担体は、必要に応じ、支持体上の全面において担持されていても、また、その一部において担持されていてもよい。
【００４７】
担体としては、有機低分子、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、セラミック等が挙げられる。
上記有機低分子として具体的には、カルボジイミド基含有化合物、イソシアネート基含有化合物、窒素イペリット基含有化合物、アルデヒド基含有化合物、アミノ基含有化合物等が挙げられる。
【００４８】
また、プラスチック、無機高分子、金属、セラミックは、前記したものと同様のものを使用することができる。
本発明において特に好ましい担体は、カルボジイミド基含有化合物またはイソシアネート基含有化合物である。
【００４９】
各キャプチャーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブの支持体への供給はキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブの活性が維持されるように、通常、水またはバッファー中に含まれる形で供給される。また、供給の際の温度としては固定化されるキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは被検体の活性が失われないように０℃〜１００℃とすることが望ましい。
【００５０】
また、オリゴヌクレオチドと支持体の接触後に紫外線等の電磁波を照射することによって固定することもできる。さらに、オリゴヌクレオチドとカルボジイミド樹脂、窒素イペリット、ポリアミノ酸、ニトロセルロール等の公知の化合物を化学的に結合又は物理的に結合した状態で、これら混合物と担体を接触させ固定させても良く、また、このとき紫外線等の電磁波を照射して固定しても良い。
【００５１】
本発明においてキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは被検体を支持体に供給する手段は、キャプチャーオリゴヌクレオチドまたは被検体の活性が維持された状態で供給されれば特に制限はされない。このような例としてディスペンサを用いる方法、ピンを用いる方法、インクジェットを用いる方法などが挙げられる。
【００５２】
キャプチャーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブを支持体上へ固定化する際、その形状はハイブリダイゼーションに影響を及ぼさず、また、検出が困難にならなければ特にその形状は制限されない。このような例として円形、四角形等が挙げられる。支持体上へ各キャプチャーオリゴヌクレオチドが固定化される部位のサイズは、径１０μｍ〜１ｃｍが好ましい。これより小さいと検出が困難になり、また、これより大きいと配置されたキャプチャーオリゴヌクレオチド全体の占める面積が大きくなり、操作性が悪くなるという問題が生じることがある。
【００５３】
支持体上への各キャプチャーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブの固定化の際、各オリゴヌクレオチドまたは被検体をそのまま固定化しても良いが、反応性を高めることによって、キャプチャーオリゴヌクレオチドまたは被検体の末端にリンカーを付加し、リンカーと支持体又は担体とを反応させてもよい。そのようなリンカーとしては、アミノ基、またはホモポリマー、例えばチミジン残基のホモポリマー等が挙げられる。
【００５４】
各キャプチャーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブの支持体上への配置は各多型の判定が出来れば特に制限されないが、各多型の判定を容易にするために、多型の判定に用いられるキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは被検体を１区画にまとめるか、あるいは一列に並べるなどして配置することが好ましい。
【００５５】
支持体上へ固定されるキャプチャーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブは、１種であっても、２種以上であってもよい。
【００５６】
キャプチャーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに用いる核酸プローブは、ＭＣ１Ｒ遺伝子及びＫＩＴ遺伝子又はその一部を含む核酸である。核酸プローブは、ハイブリダイゼーションを阻害しないものであれば特に制限されないが、通常、ＤＮＡまたはＲＮＡなどが用いられる。また、核酸プローブの作製方法は、ハイブリダイゼーションを阻害しない方法であれば特に制限されない。具体的には、豚の血液または組織から核酸を抽出し、ＭＣ１Ｒ遺伝子及びＫＩＴ遺伝子の少なくとも多型部位を含む領域を、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法、ｉｎ  ｖｉｒｔｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法等の方法によって増幅又は単離することによって、核酸プローブを調製することができる。核酸の調製は、通常核酸の調製に用いられている方法を採用することができる。例えばＡｎｉｍ．Ｓｃｉ．Ｊ．７１（８）：２２２−２３４，２０００で紹介されている方法が挙げられる。
【００５７】
核酸プローブは、各多型を少なくとも１箇所含むように調製する。また、核酸プローブの作製に用いるＰＣＲプライマーは、各ハプロタイプ固有の配列領域を除き、キャプチャーオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列になるように設計される。なお、ハイブリダイゼーションが可能である限りにおいて、核酸プローブは、キャプチャーオリゴヌクレオチドより長くても短くても良い。また、ＰＣＲ反応の特異性を高めるために、目的とする核酸プローブよりも広い領域を作製する予備的プライマーを用いて初回の作製をおこない、作製された核酸を鋳型として核酸プローブを得るための２次プライマーを用いて核酸増幅をおこなっても良い。多型が離れたところにある場合、各固有領域に応じた核酸プローブを作製することができる。
【００５８】
核酸プローブまたはキャプチャーオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションを検出するために通常標識されている。標識された核酸プローブまたはキャプチャーオリゴヌクレオチドを得る方法は、ハイブリダイゼーションを阻害しない方法であれば特に制限されない。このような方法として、最終的な核酸プローブ作製に用いるプライマーを予め標識しておく方法、核酸プローブ作製中に標識する方法、及び、核酸プローブ作製後に標識する方法、標識したキャプチャーオリゴヌクレオチドを作製する方法等が挙げられる。
【００５９】
プライマーを予め標識しておく方法、標識したキャプチャーオリゴヌクレオチドを作製する方法としては、標識ヌクレオチドを用いてプライマー合成を行う方法などが挙げられる。核酸プローブ作製中に標識する方法として、核酸プローブ作製反応中に標識したヌクレオチドをとりこませる方法などが挙げられる。また、作製反応後に標識する方法としては、特開平１０−２８７８７０号に示される方法で標識する方法などが挙げられる。
【００６０】
核酸プローブまたはキャプチャーオリゴヌクレオチドを標識する物質は、通常のハイブリダイゼーション法に用いられる標識物質を使用することができる。このような標識物質として蛍光物質やハプテンなどが挙げられる。具体的にはフルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド、シアニン系蛍光色素が、ハプテンとしてはビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが挙げられる。
【００６１】
核酸プローブを作製するためのプライマーは、キャプチャーオリゴヌクレオチドと共に、ハプロタイプタイピングキットに含めることができる。
【００６２】
ハイブリダイゼーションは、通常の核酸のハイブリダイゼーションと同様にして行うことができる。以下に具体的な方法を例示する。
ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｃｉｔｒａｔｅ）などの塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミンなどのブロッキング溶液、および反応促進のための添加剤からなる混合液に核酸プローブを加える。プローブが２本鎖の場合は熱などによる変性を行う。支持体上に核酸プローブ溶液を数μＬ滴下した後、数時間加熱操作（通常３０℃〜８０℃）を行い、支持体上に固定化されているキャプチャーオリゴヌクレオチドと核酸プローブでハイブリッドを形成させる。
【００６３】
適当な濃度のＳＳＣ溶液またはテトラメチルアンモニウムクロリド溶液中に支持体を沈め、加熱（通常３７℃〜７０℃）し、特異的なハイブリッドのみを選択的に支持体上に残す。このとき、ＳＤＳなどを加えても良い。
【００６４】
ハイブリッドの検出には核酸プローブに標識されている蛍光物質またはハプテン等を使用する。蛍光物質を使用する場合は、専用の蛍光スキャナーを用いてハイブリダイズした核酸プローブに標識された蛍光を検出する。
【００６５】
ハプテンを使用する場合は、ハプテンを認識するタンパクまたはそれに結合するタンパクと、アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・パーオキシダーゼなどの結合体（酵素コンジュゲート）を含む溶液を支持体上に加え、室温で数１０分間反応させる。なお、このハプテンと酵素コンジュゲートの結合反応を行う前に、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定した領域以外の支持体の領域をカゼインやウシ血清アルブミンなどのタンパクを用いて被覆することによって酵素コンジュゲートと支持体の非特異的吸着を阻止することができる。この処置は、オリゴヌクレオチドを固定した後、支持体上にカゼインなどのタンパクの溶液を加え、室温で数１０分間放置することによって行うことができる。
【００６６】
酵素コンジュゲートと核酸プローブのハプテンとの結合反応後、ハプテンと結合しなかった酵素コンジュゲートを、界面活性剤を含む適当な緩衝液で洗浄することによって、支持体上にはターゲット核酸中のハプテンと結合した酵素コンジュゲートのみが残ることになる。
【００６７】
この後酵素コンジュゲートに結合されたアルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・パーオキシダーゼなどの酵素によって発色し、沈着するような化合物を添加することでハイブリッドを形成している部分だけが可視化される。
【００６８】
ここで用いられる化合物としては、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ｐ−トルイジン塩）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンなどが用いられる。
【００６９】
多型の検出は、得られたハイブリダイゼーションの結果をもとに、キャプチャーオリゴヌクレオチド毎に沈着した色素または蛍光を検出することで行う。具体的には、キャプチャーオリゴヌクレオチド毎の発色量および蛍光強度を、対応するキャプチャーオリゴヌクレオチドと比較し、その量の大きい方をハイブリダイゼーション陽性と判定する。量が同じときは共に陽性と判定する。また、その基準は特に制限されないが、用いる標識物質等によって異なるため、検出系毎に基準をきめることが望ましい。
【００７０】
上記判定を多型部位毎に行い、各々の多型またはその組み合わせがいずれかのタイプと一致したとき、その種の豚であると判定される。豚は２倍体なので交雑種の場合、２種の交雑と判定されることもある。
【００７１】
表４〜６に、配列番号３〜１２１に示す塩基配列を有するキャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化して用いたときの、ハイブリダイゼーションシグナルと豚の種類の対応を示す。ここで表３はＭＣ１Ｒ遺伝子のものを表４はＫＩＴ遺伝子のものを示す。
【００７２】
【表４】
2004187528.tif 000005
【００７３】
【表５】
2004187528.tif 000006
【００７４】
【表６】
2004187528.tif 000007
【００７５】
本発明のキットは、キャプチャーオリゴヌクレオチドを含む。また、本発明のキットは、核酸プローブを作製するためのプライマーまたは標識核酸プローブ、緩衝液、ハプテンを認識する酵素コンジュゲート等のハイブリダイゼーション用の試薬などを含めることができる。
【００７６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００７７】
＜１＞オリゴヌクレオチドの合成
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、オリゴヌクレオチドを合成し、脱保護を施した後、乾燥させた。このオリゴヌクレオチド乾燥体を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液を用いて溶解し、１００ｐｍｏｌ／μＬのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。この合成法は、キャプチャーオリゴヌクレオチド又はプライマーとして使用するいずれのオリゴヌクレオチドに対しても同様である。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号３〜１２５に示す。これらのうち、配列番号３〜１２１がキャプチャーオリゴヌクレオチドであり、配列番号１２２〜１２５がプライマーである。キャプチャーオリゴヌクレオチドについては上記合成機を用いて５’末端にアミノ基を結合させ、プライマーについては５’側にローダミン標識した。
【００７８】
＜２＞支持体へのキャプチャーオリゴヌクレオチドのスポッティング
５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液１０μＬに対してマイクロスポッティング溶液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）を１０μＬ混合し、マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．）上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置にシラン化スライドグラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｉｎｄ．  Ｌｔｄ．）を配置し、スポッティングマシンを作動させた。スポッティング終了後、スライドグラスに熱水からの蒸気を数秒間あて、その後紫外線を３０ｍＪ照射した。再度蒸気に数秒間曝露した後、ホットプレート上にスライドグラスを置いて水分を除去した。０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液でスライドグラスをすすいだ後、蒸留水ですすいだ。スライドグラスを３％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），  １００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に室温で３０分間浸し、ブロッキングした。その後室温で乾燥させた後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），  １ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。スライドグラスを再度室温で乾燥させ、使用まで乾燥状態で冷暗所にて保存した。
【００７９】
＜３＞プローブ核酸の調製
豚のＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりプローブ核酸を調製した。
各種の豚から得られた血液５０μＬをマイクロチューブに入れ、これに１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．５％  ＳＤＳ，  ５００μｇ／ｍＬ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを５００μｌ加え混和したのち、３７℃で一晩インキュベートした。フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液を５００μＬ加え、撹拌した後遠心（１２０００ｒｐｍ、１分間）し、水相を回収した。この操作を３回繰り返した。得られた水相にクロロフォルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を５００μＬ加え、撹拌した後遠心（１２０００ｒｐｍ、１分間）し、水相を回収した。この操作を２回繰り返した。得られた水相中のＤＮＡをエタノール沈殿により回収し、乾燥させ後、ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ７．５）に溶解し、ＰＣＲテンプレート溶液とした。
【００８０】
ＰＣＲ反応液の組成は、Ｔａｑポリメレースを１Ｕｎｉｔ、プライマーを各１０ｐｍｏｌ、反応用緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰを各１０ｎｍｏｌ、テンプレートＤＮＡ溶液を０．５μｌ、および滅菌水を加えて総量５０μｌとし、１つのＰＣＲテンプレートについてＭＣ１Ｒ遺伝子を増幅するため（配列番号１２２と１２３のプライマー）とＫＩＴ遺伝子を増幅するため（配列番号１２４と１２５のプライマー）２種類用意する。チューブに入れた溶液をサーマルサイクラーにセットして、９４℃で３分間加熱した後、９４℃：４５秒間、６０℃：６０秒間、７２℃：１分間の反応を３０サイクル行い、その後７２℃：３分間反応させた。
【００８１】
本実施例では、確認試験として、次に記載のアガロースゲルを用いた電気泳動を行ったが、実際の臨床における鑑別の際にはこの操作は必須ではない。ＰＣＲ反応混合物を１μｌ取り、６×泳動色素（３０％グリセロール、０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノール）を１μｌ、蒸留水４μｌと混和した。２％アガロースゲル上で、１００Ｖ、９０分間の条件で泳動させた後、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドを含む蒸留水に３０分間浸し、紫外線照射下でゲルをＣＣＤカメラで撮影した。その結果、所望の増幅断片が得られたことが確認された。
【００８２】
＜４＞ハイブリダイゼーション
＜３＞で作製した全てのプローブ核酸溶液を混ぜ、その後、４μｌ取り、ＡｒｒａｙＩｔ  Ｕｎｉｈｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）１６μｌを加えて混合し、１００℃で１０分間加熱処理を行った後、氷中に５分間浸した。このプローブ核酸溶液を５μｌとり、＜２＞で作製したキャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化したスライドグラスにのせ、その上にカバーグラスをのせた。これを保湿箱に入れ、さらに３７℃に設定した恒温器に入れて１２０分間静置した。スライドグラスを取り出し、すばやく室温下で２×ＳＳＣ，  ０．１％ＳＤＳ溶液（２×ＳＳＣ：０．０３３Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．０３３Ｍクエン酸ナトリウム）に浸してカバーグラスを除去した。スライドグラスを室温下で２×ＳＳＣ，  ０．１％ＳＤＳ溶液に５分間浸す操作を２回行い、３７℃の０．２×ＳＳＣ，  ０．１％ＳＤＳ溶液（０．２×ＳＳＣ：０．００３３Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．００３３Ｍクエン酸ナトリウム）に５分間浸す操作を２回行い、最後に２×ＳＳＣに浸した。
【００８３】
＜５＞蛍光の検出
ハイブリダイゼーションを終えたスライドグラスを２×ＳＳＣから取り出し、遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）にセットし、２０００ｒｐｍで１分間遠心した。次にＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製）にスライドグラスをセットし、蛍光検出を行った。
【００８４】
以上の結果およびＤＮＡシーケンス法によるタイピングとの関係を表７に示した。本発明の方法により、豚の種別判定が可能なことが明らかである。
【００８５】
【表７】
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【００８６】
【発明の効果】
本発明により、豚の種別判定を、効率よく、かつ高精度で行うことができる。
【配列表】
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