(57)【要約】【課題】  より優れたｓｉＲＮＡｐまたはｄｓＲＮＡを構築しようとする場合に探索すべき標的遺伝子中の配列を規定する。設計したｓｉＲＮＡを呼吸器系およびｉｎ  ｖｉｔｒｏの幹細胞へ直接送達する。【解決手段】  小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）となりうる二本鎖または他の形態のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ前駆体すなわちｓｉＲＮＡｐ）を設計するために標的遺伝子から特別に選択された配列の使用法を、細胞の遺伝子発現を抑制するために実現する。この方法によって、疾患、例えば重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染を予防および治療することができる。この方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて実施することができる。使用可能な小さな干渉ＲＮＡは、通常２３ヌクレオチド以下の配列であるが、標的遺伝子からの配列選択に関する本発明の方法は、どのような長さの二本鎖ＲＮＡにも適用可能である。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
小さい干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）となりうる二本鎖または他の形態のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡおよび他のｓｉＲＮＡ前駆体「ｓｉＲＮＡｐ」）を導入することにより細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
該ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ前駆体（ｓｉＲＮＡｐ）は、ほとんどの場合、標的遺伝子の領域と比較すると同一またはほぼ同一の配列を有する二本鎖構造または一本鎖ヘアピン構造からなり、
本発明により抑制のために選択される領域は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の天然のヘアピン構造または複数の同一もしくは異なるヘアピンｄｓＲＮＡが、少なくとも理論上は、特定の標的遺伝子からｄｅ  ｎｏｖｏで形成されうるように、同一標的遺伝子中に１つまたは複数の相補的もしくはほぼ相補的な別の領域を有する領域になり、
実用的な目的の場合、最良のマッチングは最初の４〜１２ヌクレオチド程度についてのみ見いだされる（マッチングする可能性は前記の数を超えると指数関数的に困難になるためである）場合があり、
前記マッチングは、最初の４〜１２ヌクレオチドから開始するとは限らず、任意の位置から開始して任意の位置で終了してもよく、
本発明により、この概念が、標的遺伝子のサイレンシングを可能にするｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡｐの正しい配列の選択に適用される
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
標的として選択される領域は、ｓｉＲＮＡの機能のために選択される通常１９〜２３ヌクレオチドが完全にマッチング可能な１つまたは複数の相補的な別の領域を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的として選択される領域は、ｓｉＲＮＡの機能のために選択される全１９〜２３ヌクレオチドより少ない任意の数のヌクレオチドがマッチング可能な１つまたは複数の相補的な別の領域を有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標的として選択される領域は、第１番目のヌクレオチドからマッチングが開始可能な（例えば、第１番目から始まる８ヌクレオチドのマッチングは、すなわち１〜８である）１つまたは複数の相補的な別の領域を有する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標的として選択される領域は、任意の位置からマッチングが開始可能な（例えば、マッチングは２〜９、または３〜１１などであってよい）１つまたは複数の相補的な別の領域を有する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的として選択される領域は、１９〜２３ヌクレオチドの同一ストレッチ内に２つ以上の区域のマッチングを有しうる（例えば、マッチングは、２〜９と１１〜２１、または１〜４、６〜１０および１３〜１９などであってよい）１つまたは複数の相補的な別の領域を有する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標的として選択される領域は、元の選択された領域の５’から３’のいずれかの方向から測定する１つまたは複数の相補的な別の領域を有する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標的として選択される領域は、同一遺伝子内に唯一のそのような相補的領域を有する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標的として選択される領域は、同一遺伝子内に２つ以上のそのような相補的領域を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
選択される領域は、複数の標的遺伝子のサイレンシングを実現するために、２つ以上の遺伝子内に１つまたは複数の相補的な領域を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ｓｉＲＮＡとなりうるｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡｐは、２３個以上のヌクレオチドを有すると定義される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡｉを可能にするｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡｐは、２４個以上のヌクレオチドを有する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
標的遺伝子は細胞の遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
標的遺伝子は内在性遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
標的遺伝子は導入遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
標的遺伝子は天然あるいは人工の供給源に由来するウイルス遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
細胞はヒトに由来する請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞はその他の任意の動物に由来する請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
細胞は植物に由来する請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ｓｉＲＮＡｐまたはｄｓＲＮＡは、自己相補的である１本の鎖からなる請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ｓｉＲＮＡｐまたはｄｓＲＮＡは、２本の別個の相補鎖からなる請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
生物体から取り出した細胞にＲＮＡを送達し、標的抑制をｅｘ  ｖｉｖｏにおいて実施し、次いで該細胞を同一または異なる生物体に戻して目的とする遺伝子抑制の使用を可能にする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞は第一の生物体に存在し、第二のＲＮＡを含有する生物体を第一の生物体に導入することによりＲＮＡを第一の生物体に導入する請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
細胞中に発現構築物を導入して所望のＲＮＡ二重鎖を産生させる請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
標的細胞は良性または悪性腫瘍細胞であることを特徴とし、生物体におけるその予防および治療である請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子抑制の最終目標は、任意の病原体による感染の予防および治療である請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子抑制の最終目標は、診断目的、キット・アセンブリおよびハイスループット・スクリーニングである請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子抑制の最終目標は、ヒトまたは動物の疾患を治療できるようにｍＲＮＡレベルで標的細胞の発現を妨害するＲＮＡベースの薬物の開発である請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子抑制の最終目標は、これに限定はされないが、炭疽病などの吸入の予防および治療などの、生物化学戦争または生物化学テロリズムとの戦いのためのＲＮＡベースの技術の開発である請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）となりうる二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）による遺伝子特異的抑制に関する。創製されるｄｓＲＮＡの数および配列の選択は、本発明によって示される基準に依存する。さらに、ｓｉＲＮＡとなりうる選択されたｄｓＲＮＡの特別な送達方法により、ＳＡＲＳおよびＨＩＶ感染を予防および治療する際の困難が解決されようとしている。
【背景技術】
【０００２】
ここ数年、ＲＮＡ干渉は、生物学の分野において大きな興奮を引き起こしている。このような干渉の最初の兆候は、生物学者のリッチ・ヨルゲンセン（Ｒｉｃｈ  Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ）が紫色のペチュニアをさらに濃い紫色にしようと試みた１９９０年に明らかとなった。彼は、律速酵素遺伝子の第２のコピーを挿入した。しかし、紫色の代わりに、ペチュニアは白色になることが分かった。彼は、この奇異な効果を「共抑制（ｃｏ‐ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」と呼んだが、その時点では、特定の色を促進する遺伝子を加えたことがかえってその遺伝子の働きを止めてしまう理由を誰も知らなかった。５年後、対照の「センス」ＲＮＡ鎖の一本鎖を用いる実験が、「アンチセンス」鎖よりも目的の遺伝子を抑制するように働いた。１９９８年、アンドルー・ファイア（Ａｎｄｒｅｗ  Ｆｉｒｅ）およびクレイグ・メロー（Ｃｒａｉｇ  Ｍｅｌｌｏ）は、二本鎖ＲＮＡが本当のサイレンシング剤であることを立証することによりこの謎を解決した。彼らは、これを「ＲＮＡ干渉」と呼び、新たな分野が誕生した（非特許文献１）。タスカル（Ｔｕｓｃｈｌ）のグループは、この技法を哺乳類細胞にも広げ、ＲＮＡ干渉すなわちＲＮＡｉを今日のようなものにした（非特許文献２）。
【０００３】
哺乳類では、二本鎖ＲＮＡすなわちｄｓＲＮＡは、主に転写後機構を介して標的ｍＲＮＡを破壊する作用をしており、この配列特異的な標的認識のためのメディエータは、約２１ヌクレオチドの小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなることが現在知られている。これらの小さなｓｉＲＮＡは、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）ＲＮａｓｅ  ＩＩＩが関与する反応により、自然な状態で存在するはるかに長いｄｓＲＮＡから通常は産生される。これらのｓｉＲＮＡが生成された後、該ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる別のリボヌクレアーゼタンパク質によって再び取り込まれる。ＲＩＳＣタンパク質は最終的にｓｉＲＮＡを巻き戻して一本鎖を形成し、これにより導かれてＲＩＳＣ複合体が細胞質の標的ｍＲＮＡを分解する（非特許文献３）。ある生物種では、ｓｉＲＮＡ  ＲＩＳＣ複合体は、クロマチンまたはその遺伝子の遺伝子発現を効率よく変えることができる他の部位を介し、配列特異的ＤＮＡ中に組み入れることができる。また、これらのｓｉＲＮＡが同一または異なる標的の他のＲＮＡと相補的である場合、二次的（ｔｒａｎｓｉｔｉｖｅ）ＲＮＡｉが生じることもある。一部の生物では、ＲＮＡ依存性または指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）が、テンプレートとして標的ｍＲＮＡを用いてｓｉＲＮＡ合成をプライミングすることもある。その場合、標的ＲＮＡは、ＲＩＳＣよりもむしろＤｉｃｅｒ  ＲＮＡ切断によって不活性化される。標的ｍＲＮＡをサイレンシングするｓｉＲＮＡの効果の一部は、たとえごく微量のｄｓＲＮＡによって引き起こされた場合であっても、その生物体全体に増幅および伝播することがある。しかし、このような効果はこれまでに哺乳類では観察されたことはない。
【０００４】
二本鎖または他の前駆体に由来するｓｉＲＮＡ二重鎖は、培養細胞における哺乳類遺伝子のサイレンシングに今日広く用いられている。現在、これらの機能性ｓｉＲＮＡの導入
および形成は、トランスフェクション、電気穿孔、プラスミドを用いた発現系およびウイルスを用いた発現系を含む様々な方法によって行われる。
【０００５】
これまで、ｓｉＲＮＡの動物中への直接的な送達は、ほんの数例に限られていた。ＣＭＶプロモーターの制御下でｓｉＲＮＡを発現する組み換えアデノウイルスは、マウスの尾静脈または脳の線条体領域に注入された場合、該マウスの肝臓または脳における標的遺伝子の発現を低下させた。これまで、唯一の真の疾患予防はリーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）によって行われたが、彼らは、マウスの血液量の約半分に相当する３回の大量の高圧注入をマウスに行って、Ｆａｓ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを肝臓内に強制的に送り込んだ（非特許文献４）。約８０％〜９０％の肝細胞がＲＮＡ分子を取り込んだ。翌日、該動物に、Ｆａｓを暴走させて肝不全を引き起こす抗体を投与した。対照マウスの大部分が死亡したが、処置マウスのうち８２％は生存した。
【０００６】
この最初の動物実験の成功は、この技術をヒトの疾患に用いるためのさらなる研究に確実につながるであろう。
【非特許文献１】ガーバー  ケイ．（Ｇａｒｂｅｒ  Ｋ．）「より優れた遮断剤：研究界を感嘆させるＲＮＡ干渉（Ｂｅｔｔｅｒ  ｂｌｏｃｋｅｒ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄａｚｚｌｅｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、２００３年４月２日、第９５巻、第７号、ｐ．５００‐２
【非特許文献２】エルバシル  エス．エム．（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．Ｍ．）、ハーボース  ジェイ．（Ｈａｒｂｏｒｔｈ  Ｊ．）、ウェーバー  ケイ．（Ｗｅｂｅｒ  Ｋ．）、タスカル  ティー．（Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．）、「小さい干渉ＲＮＡを用いた哺乳類体細胞における遺伝子機能の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  第２６巻、ｐ．１９９−２１３
【非特許文献３】ハノン  ジー．ジェイ．（Ｈａｎｎｏｎ  Ｇ．Ｊ．）、「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）」、Ｎａｔｕｒｅ、２００２年７月１１日、第４１８巻、ｐ．２４４‐５１
【非特許文献４】クジン  ジェイ．（Ｃｏｕｚｉｎ  Ｊ．）、「肝臓を救援するＲＮＡｉ（ＲＮＡｉ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ’ｓ  ｒｅｓｃｕｅ）」、ＳｃｉｅｎｃｅＮＯＷ、２００３年、クジン（Ｃｏｕｚｉｎ）、２１０、１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述のように、ＲＩＳＣ  ｓｉＲＮＡ複合体については明確にされていない。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡｐ出発テンプレートとして使用すべき正しい配列を選択する仕事は標準化されていない。実際に、１９〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）のｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡｐという基準に当てはまる可能性のある数百の配列の組合せが存在する。したがって、正しい配列を選ぶ判断を下すことは、不可能ではないにしても困難である。本発明は、より優れたｓｉＲＮＡｐまたはｄｓＲＮＡを構築しようとする場合、探索すべき標的遺伝子中の配列を規定しようとするものである。
【０００８】
一般には白血球を、または具体的にはリンパ球を標的とするある種の疾患に対するｓｉＲＮＡの送達も困難である。本発明において、これらの特別に設計したｓｉＲＮＡを呼吸器系およびｉｎ  ｖｉｔｒｏの幹細胞へ直接送達することは、ＳＡＲＳおよびＨＩＶウイルス感染の治療における困難の一部を回避しうるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記問題点を解決するために、請求項１に記載の発明は、小さい干渉リボ核酸となりうる二本鎖または他の形態のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡおよび他のｓｉＲＮＡ前駆体「ｓｉＲＮＡｐ」）を導入することにより細胞における標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、該ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ前駆体は、ほとんどの場合、標的遺伝子の領域と比較すると同一またはほぼ同一の配列を有する二本鎖構造または一本鎖ヘアピン構造からなり、本発明により抑制のために選択される領域は、二本鎖リボ核酸の天然のヘアピン構造または複数の同一もしくは異なるヘアピンｄｓＲＮＡが、少なくとも理論上は、特定の標的遺伝子からｄｅ  ｎｏｖｏで形成されうるように、同一標的遺伝子中に１つまたは複数の相補的もしくはほぼ相補的な別の領域を有する領域になり、実用的な目的の場合、最良のマッチングは最初の４〜１２ヌクレオチド程度についてのみ見いだされる（マッチングする可能性は前記の数を超えると指数関数的に困難になるためである）場合があり、前記マッチングは、最初の４〜１２ヌクレオチドから開始するとは限らず、任意の位置から開始して任意の位置で終了してもよく、本発明により、この概念が、標的遺伝子のサイレンシングを可能にするｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡｐの正しい配列の選択に適用されることを要旨とする。
【００１０】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、標的として選択される領域は、ｓｉＲＮＡの機能のために選択される通常１９〜２３ヌクレオチドが完全にマッチング可能な１つまたは複数の相補的な別の領域を有することを要旨とする。
【００１１】
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、標的として選択される領域は、ｓｉＲＮＡの機能のために選択される全１９〜２３ヌクレオチドより少ない任意の数のヌクレオチドがマッチング可能な１つまたは複数の相補的な別の領域を有することを要旨とする。
【００１２】
請求項４に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、標的として選択される領域は、第１番目のヌクレオチドからマッチングが開始可能な（例えば、第１番目から始まる８ヌクレオチドのマッチングは、すなわち１〜８である）１つまたは複数の相補的な別の領域を有することを要旨とする。
【００１３】
請求項５に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、標的として選択される領域は、任意の位置からマッチングが開始可能な（例えば、マッチングは２〜９、または３〜１１などであってよい）１つまたは複数の相補的な別の領域を有することを要旨とする。
【００１４】
請求項６に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、標的として選択される領域は、１９〜２３ヌクレオチドの同一ストレッチ内に２つ以上の区域のマッチングを有しうる（例えば、マッチングは、２〜９と１１〜２１、または１〜４、６〜１０および１３〜１９などであってよい）１つまたは複数の相補的な別の領域を有することを要旨とする。
【００１５】
請求項７に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、標的として選択される領域は、元の選択された領域の５’から３’のいずれかの方向から測定する１つまたは複数の相補的な別の領域を有することを要旨とする。
【００１６】
請求項８に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、標的として選択される領域は、同一遺伝子内に唯一のそのような相補的領域を有することを要旨とする。
請求項９に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、標的として選択される領域は、同一遺伝子内に２つ以上のそのような相補的領域を有することを要旨とする。
【００１７】
請求項１０に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、選択される領域は、複数の標的遺伝子のサイレンシングを実現するために、２つ以上の遺伝子内に１つまたは複数
の相補的な領域を有することを要旨とする。
【００１８】
請求項１１に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、ｓｉＲＮＡとなりうるｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡｐは、２３個以上のヌクレオチドを有すると定義されることを要旨とする。
【００１９】
請求項１２に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、ＲＮＡｉを可能にするｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡｐは、２４個以上のヌクレオチドを有することを要旨とする。
請求項１３に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、標的遺伝子は細胞の遺伝子であることを要旨とする。
【００２０】
請求項１４に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、標的遺伝子は内在性遺伝子であることを要旨とする。
請求項１５に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、標的遺伝子は導入遺伝子であることを要旨とする。
【００２１】
請求項１６に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、標的遺伝子は天然あるいは人工の供給源に由来するウイルス遺伝子であることを要旨とする。
請求項１７に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、細胞はヒトに由来することを要旨とする。
【００２２】
請求項１８に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、細胞はその他の任意の動物に由来することを要旨とする。
請求項１９に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、細胞は植物に由来することを要旨とする。
【００２３】
請求項２０に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、ｓｉＲＮＡｐまたはｄｓＲＮＡは、自己相補的である１本の鎖からなることを要旨とする。
請求項２１に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、ｓｉＲＮＡｐまたはｄｓＲＮＡは、２本の別個の相補鎖からなることを要旨とする。
【００２４】
請求項２２に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、生物体から取り出した細胞にＲＮＡを送達し、標的抑制をｅｘ  ｖｉｖｏにおいて実施し、次いで該細胞を同一または異なる生物体に戻して目的とする遺伝子抑制の使用を可能にすることを要旨とする。
【００２５】
請求項２３に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、細胞は第一の生物体に存在し、第二のＲＮＡを含有する生物体を第一の生物体に導入することによりＲＮＡを第一の生物体に導入することを要旨とする。
【００２６】
請求項２４に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、細胞中に発現構築物を導入して所望のＲＮＡ二重鎖を産生させることを要旨とする。
請求項２５に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、標的細胞は良性または悪性腫瘍細胞であることを要旨とする。
【００２７】
請求項２６に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、遺伝子抑制の最終目標は、任意の病原体による感染の予防および治療であることを要旨とする。
請求項２７に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、遺伝子抑制の最終目標は、診断目的、キット・アセンブリおよびハイスループット・スクリーニングであることを要旨とする。
【００２８】
請求項２８に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、遺伝子抑制の最終目標は、ヒトまたは動物の疾患を治療できるようにｍＲＮＡレベルで標的細胞の発現を妨害するＲＮＡベースの薬物の開発であることを要旨とする。
【００２９】
請求項２９に記載の発明は、請求項１に記載の方法において、遺伝子抑制の最終目標は、これに限定はされないが、炭疽病などの吸入の予防および治療などの、生物化学戦争または生物化学テロリズムとの戦いのためのＲＮＡベースの技術の開発であることを要旨とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡｐの正しい配列を選択する方法）
標的領域候補は、いくつかのよく知られている基準に基づいて遺伝子配列から選択される。本発明者らは、転写開始部位から少なくとも５０ｂｐ下流を検索し、パターンＡＡ（ｎ１９）ＴＴ（ｎは、任意の塩基である）に当てはまる領域を特定する。しかしながら、これが不可能な場合、完全性が低くなるが他の配列を選択する（例えば、ｎＡ（ｎ１９）Ｔｎ、ｎＡ（ｎ１９）ｎｎ）。配列は、約５０％のＧＣ比を有し、長く連続した反復ヌクレオチド配列を欠いていなければならない。この選択から２１ｎｔのｄｓＲＮＡオリゴが得られるが、この技法を用いて任意の長さのオリゴを作成することができる。
【００３１】
次いで、これらのｓｉＲＮＡ候補を、天然のヘアピン構造または他のｍＲＮＡ折りたたみ二次構造を生成する可能性のある下流または上流の相同領域についてスクリーニングする。最初と最後の２塩基を含む（表１）あるいは除いた（表２）候補領域の５’末端の１０塩基および３’末端の１０塩基を、３’−５’方向に読み取り、同一ｍＲＮＡ上に位置するこれらの領域の相補鎖すべてを同定する。下流塩基対のマッチング数に基づいて元の候補領域をスコア化し、最も相補性の高い配列相同性を有する領域を選択する（表１〜３）。
【００３２】
アンチセンス鎖がこの１９ｂｐの中心領域に相補的となるように、相補的ｄｓＲＮＡオリゴを作製する。各鎖は３’ｄＴｄＴの張り出し（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有し、その双方、または５’ｄＴのみが、標的の対応する５’領域に相補的である。
【００３３】
関連するＢＬＡＳＴデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて候補配列をスクリーニングおよびマッチングし、非特異的な相同性について体系的にチェックし、かつ７５％を超える相同性を有する配列を除外する。ｓｉＲＮＡオリゴを注文し、民間のオリゴヌクレオチド合成会社（プロリゴ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ））またはその他の納入機構を使用して合成する。
【００３４】
【表１】
2004357708.tif 000002
【００３５】
【表２】
2004357708.tif 000003
【００３６】
【表３】
2004357708.tif 000004
（コンピュータ支援による配列選択）
ｓｉＲＮＡ標的領域は、以上の具体的で簡単な基準を認識するようにプログラムされたコンピュータ・ソフトウェアを用いて迅速に同定される。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
））、ＢＬＡＳＴ（全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））、Ｇｅｎｅ−Ｔｏｏｌ  Ｌｉｔｅ（バイオツール社（ＢｉｏＴｏｏｌｓ  Ｉｎｃ．））などの現在利用可能なソフトウェアは、極めて類似した機能を有するが、本発明者らは、短い下流逆転写配列を検索可能なソフトウェア・ツールを未だに発見していない。そのようなソフトウェア・ツールは近い将来に利用可能になると予想される。
【００３７】
２つ以上の領域が、類似のマッチング配列および以下の作業式のセクションで定義されるＲＮＡ優先度指標（ＲＰＩ）を有する場合は、当技術分野で知られている配列比較およびアラインメント・アルゴリズム（グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）およびデベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」、１９９１年、ストックトン出版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）を参照）、ならびに様々なアルゴリズムおよびソフトウェア・パッケージ（例えば、ＧｅｎｅＴｏｏｌ  ｌｉｔｅ）を用いて相同性の異なる度合により起こりそうな結合を計算することによって、さらなる領域選択を支援することが可能である。
【００３８】
（本発明の背後にある作業式）
本発明は、得られるｓｉＲＮＡの有効性と特異性を共に改善し、加えて、まだ未決定の他の利点を改善することである。ＲＮＡ干渉およびサイレンシングの正確な性質は、いかなる生物、ましてや哺乳類において的確に発現されたことはない。ＲＩＳＣタンパク質および使用されるセンスまたはナンセンスＲＮＡの特定の鎖についての構造および機能は、依然として研究中である。本発明は、所与の標的において利用可能な数百または数千の組合せから、配列の最善の可能な組合せを選択するものである。
【００３９】
できる限り多くのヌクレオチド塩基を一致させて、理想的には５’から３’または３’から５’（５’から５’、３’から３’であってもよい）に相補的な１つまたは複数の下流もしくは上流の領域、ならびに選択されるべき残りの部分を、標準的比較およびアラインメント・アルゴリズムによって選択することは、複数の理論的に重要な目的を実現するはずである。
【００４０】
最初の考え方は、できる限り多くの相補的ヌクレオチド塩基を選択することである。１９ｎｔすべてがマッチングしていることが理想的であろう。それが不可能な場合（おそらくそうである）、最もヌクレオチド塩基がマッチングしている配列を選択する。例えば、１９ｎｔ（他のヌクレオチド長であってもよい）のｄｓＲＮＡ１組については、最も多数のヌクレオチドがマッチングした組を選択する。８個のヌクレオチドがマッチングする組は、６または７個だけが一致する組よりも理論的に優れているであろう。マッチングしたヌクレオチドは、鎖の１番目または３番目のヌクレオチドから始まるべきであるが、これは絶対的必須条件ではない。あるいは、各領域に２以上のマッチング区域が存在することがあり、例えば、マッチングが１〜１２、または２〜７および９〜１４、などによって達成される。
【００４１】
二番目の考え方は、もし存在するならば、ヌクレオチドが同一の組についてできる限り多くの相補的領域を選択することである。例えば、１９ｎｔのｄｓＲＮＡが３組存在し、それらはすべて６ｎｔがマッチングしているとする。そのうち１組はさらに下流または上流にマッチングする余分な６ｎｔの領域を有し、他の２組は、１つの６ｎｔ領域だけがマッチングしている。論理上は、６ｎｔ領域以外に２以上がマッチングした１番目の組を選択することになる。この考え方は、マッチングする２以上の領域を有する組を常に求めることである。領域が大きいほど良い。
【００４２】
より多くの塩基がマッチングするヌクレオチドの組と、より多くの領域がマッチングす
るヌクレオチドの組の２組の間で選択が困難なことがある。現時点では、我々は、少なくとも４から５個のヌクレオチドがマッチングし、かつマッチング領域数が最も多い組を選択する方を選ぶであろう。その背後にある理由は、おそらく、ＲＩＳＣタンパク質が少なくとも４〜５ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡの巻きが解けた区域に作用してサイレンシング状態に導く可能性が高いためである。この場合、マッチング領域が多いほどサイレンシングの確率も多くなる。しかしながら、その後、ＲＩＳＣタンパク質が比較的長鎖のＲＮＡをガイドとして作用することが分かり、マッチングするヌクレオチド数が多いほうが、マッチング領域が多いよりもむしろ好ましい確かな選択であろう。いずれにしても、本発明を使用するという決断は、ｓｉＲＮＡの謎についてより多くが解明され始めていることから、いかにしてｓｉＲＮＡが機能するかが焦点である。
【００４３】
簡便な作業式は以下の通りである：
１．第一優先は、下式のように定義される最高の配列相補指標（Ｓｃ）を求めることである。
【００４４】
Ｓｃ＝Ｍ／Ｒｉｓｃ
式中、Ｓｃは、配列相補指標である。
Ｍは、ＲＩＳＣタンパク質のためにガイド一本鎖ＲＮＡとして動作する必要最小限の長さを超える配列である１つまたは複数のマッチング配列区域の、ヌクレオチドの総数である。例えば、選ばれた領域が３つのマッチング区域を有し、うち２つは、１〜６、８〜１５のように５連続ヌクレオチドを上回り、１つの区域は、１７〜２０のように４連続ヌクレオチドを有するに過ぎず、ＲＩＳＣタンパク質の必要最小限の鎖長が５である場合、最初の２つの区域が計算目的にふさわしいことになる。
【００４５】
Ｍ＝（１〜６）＋（８〜１５）
Ｍ＝６＋８
Ｍ＝１４
Ｒｉｓｃは、この系において動作するヌクレオチドの最低強度長（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｌｅｎｇｔｈ）である。様々な生物種または様々な系、例えばＲｄＲＰで変化する。上記の場合、５に設定する。
【００４６】
Ｓｃ＝１４／５
Ｓｃ＝２．８
２．第二の基準は、ＲＩＳＣタンパク質の最小動作一本鎖長を上回る少なくとも１つの配列区域を有する領域の数を選ぶことである。
【００４７】
Ｎ＝Ｒｉｓｃ要件を上回る少なくとも１つのマッチング区域を有する領域の数
３．この作業式の最終結論は、
ＲＰＩ＝Ｓｃ×Ｎである。
【００４８】
ＲＰＩは、用いるｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡｐを選択するためのＲＮＡ優先度指標であり、指標が高値であればあるほど、優先して選択される。
４．異なるＲＮＡセットが同一または極めてよく似たＲＰＩを有する場合、最良の比較アルゴリズムおよびアラインメント・アルゴリズムを有するＲＮＡセットを選択することになる。
【００４９】
上記の式が、本発明を利用する多くの方法のうちの１つであることは、当業者には明らかであろう。選ばれたｓｉＲＮＡ系の作業範囲に対して釣り合いをとり、より特異的な標的およびより相補的な領域を選択する重要な基準は、当業者が本発明を十二分に使用することを可能にするはずである。
【００５０】
（発明の背後にある理論の要約）
本発明に基づく選択の利点は多数ある。ＲＩＳＣタンパク質は、最終的にｄｓＲＮＡを一本鎖に巻き戻すが、そのような鎖上のヌクレオチドの数は変化する可能性があることから、ＲＩＳＣタンパク質を標的遺伝子に導いている特異的ヌクレオチドをできる限り多くの標的に暴露することが重要であろう。標的遺伝子上に２つ以上のマッチングするヌクレオチド領域が存在すれば、このようなサイレンシングの機会は、そのようなプロセスを覆い隠す可能性のある細胞内の宿主その他の要素の中にあっても、増大するはずである。一方、通常は何の機能も果たさないＲＩＳＣタンパク質のセンス・ヌクレオチド鎖は、選択されたマッチング領域を補完することができる。したがって、特別に選択されたｓｉＲＮＡの有効性は、以前に用いられていたランダムな選択方法に比べて少なくとも２倍ある。ｓｉＲＮＡ分子および標的の有効性が２倍以上増加するという事実に加え、本発明により提唱される推論は、哺乳類の系がはるかに複雑な系であることである。実際、サイレンシングが特異的となる前には、一層の確認情報が必要である。ＲＩＳＣタンパク質を伴うｓｉＲＮＡの単一区域によってもたらされている単一標的領域は、理想的な系とは判断できないかもしれない。例えば、本発明が提案する２つ以上の領域によって標的ＲＮＡが同時にサイレンシングされていれば、そのような標的サイレンシング・シグナルは確認される可能性が高い。このより特異的な確認システムは、哺乳類細胞におけるＲＮＡ干渉を長期間有効とし、または他の細胞へ全身に持続的に伝播させるのに先立って極めて重要である。長期間にわたって哺乳類細胞を遺伝的に抑制し、全身の細胞にこのようなサイレンシング効果を獲得させることができるｓｉＲＮＡをトランスフェクションまたは導入する能力は、疾患の予防および治療にとって最も重要である。なぜそうなのかという１つの興味深い知見は、ＲＮＡサイレンシングにおける自然なループＲＮＡの出現である。ヘアピンの形をしたこのループＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを作成し、Ｄｉｃｅｒによって小片に切断され、次いでＲＩＳＣタンパク質によって再構築されて一本鎖のガイドｓｉＲＮＡとなる。ダイサーとＲＩＳＣタンパク質の間には、ＲＮＡ鎖の構造および転移の類似性が示唆されている（ハモンド  エス．エム．（Ｈａｍｍｏｎｄ  Ｓ．Ｍ．）、ベッチャー  エス．（Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ  Ｓ．）、コーディー  エー．エー．（Ｃａｕｄｙ  Ａ．Ａ．）、コバヤシ  アール．（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｒ．）、ハノン  ジー．  ジェイ．（Ｈａｎｎｏｎ  Ｇ．Ｊ．）「Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２、ａ  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ＲＮＡｉ」、ＳｃｉｅｎｃｅＭＡＧ、２００１年、第２９３巻、第５５３２号、ｐ．１１４６）。このような理論は、このシステムが、特異的でなければならない小さな鎖によって働いていることを示している。ループは自然に生じるため、自然の形態の標的遺伝子中に相補的領域が存在しなければならない。この系が、「小さな鎖（ｓｍａｌｌ  ｓｔｒａｎｄ）」理論で働いている場合、最良の確認は、サイレンシングされた２つ以上の領域を備えて、そのような特異的作用が起きることを罹��細胞で確認できることである。この確認が確固としたものであれば、メッセージは持続的で、生物体の他の細胞に伝播するであろう。たとえ仮説に過ぎなくとも、このような理論の正当性を立証する多くの例が自然には存在する。例えば、遺伝子は２組の相補的ヌクレオチドのみから構成され、２組より多くの異なるヌクレオチドにより構成されているのではない。したがって、遺伝子サイレンシングのような明らかに重要な作用が発生しなければならない、または長期にわたって発生しなければならない、または生物体全体に発生しなければならないことを自然が認識するためには、おそらく、唯一の（より特異的かつ複雑であるが）長い組よりむしろ２組以上（より短いが）の指令を介して確認されるべきであろう。したがって、本発明は、上記理論すべてから定式化される。
【００５１】
（トランスフェクション、電気穿孔またはベクター発現系の方法）
ｓｉＲＮＡを介した遺伝子サイレンシングを誘導する様々な方法には、裸の二本鎖ｓｉＲＮＡの導入；二本鎖ヘアピン構造を形成するように作製された一本鎖ＲＮＡの導入；転
写部位または二本鎖ＲＮＡの実体を生み出す他の場所にハイブリダイズする２つの相補ＲＮＡ鎖の合成を誘導するための適切なプロモーター配列を含むＤＮＡプラスミドの導入；二本鎖ＲＮＡの実体を生み出す転写後にハイブリダイズする２つの相補ＲＮＡ鎖を転写できるように構築された組み換えウイルスの導入；転写部位またはその他の場所で相補的二本鎖ＲＮＡの実体の産生を可能にする遺伝要素を含む組み換え細菌の導入、ならびに適切な配列の一本鎖ＲＮＡを生成し、転写時に二本鎖ヘアピンまたは他の二本鎖構造を形成する上記のシステムのいずれかが含まれる。
【００５２】
上記で設定した基準に従い、選択されたｓｉＲＮＡにより株化細胞または他の細胞（幹細胞、リンパ球など）をｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクションする。細胞は、米国特許出願第２００２０１１４７８４号、同第２００２０１７３４７８号、同第２００３００５６２３５号、同第２００２０１３２７８８号に詳述された様々な目的にとって有用である。
【００５３】
株化細胞のトランスフェクションの場合、全部で６０ｐＭのｓｉＲＮＡ（２０μＭ溶液３μｌ）を、３０〜５０％コンフルエンスまで増殖させた２４ウエル・プレートの各ウエルに加える。各ウエルについて、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）血清低減培地（Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ）（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））５０μｌにｓｉＲＮＡを加え、穏やかに混ぜる。別のチューブ内で、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）トランスフェクション試薬（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））３μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）１２μｌと混ぜ、穏やかに混ぜた後、室温で５分間インキュベートする。該チューブの内容物を混合し、室温で２０分間インキュベートしてｓｉＲＮＡ−Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を形成させる。各ウエルに６８μｌを加える。最終的使用法に応じて、プレートを３７℃で様々な時間インキュベートする。それ以上のトランスフェクションが必要な場合、細胞を継代し、７２時間後またはそれを過ぎてから再びトランスフェクションすることができる。
【００５４】
（特殊疾患への送達方法）
この特別に設計したｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡｐの送達方法には、当業者に広く知られているすべての形態が含まれる。
【００５５】
ＲＮＡは、細胞中に直接細胞内導入することができる。また、ＲＮＡは、呼吸器系、胸腔または間質性空間などの、生物体に属する空洞中に送達することができる。また、静脈内、動脈内、または筋肉内など様々な形態の注射によって生物体の循環中にＲＮＡを導入することもできる。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、歯根、および脳脊髄液はすべて、この特別に設計したＲＮＡを導入することができる部位である。ＲＮＡを経口的に導入することも、生物体に直接浴させることによって導入することもできる。植物に噴霧してもよい。一次もしくは標的生物体の遺伝子組み換えにより、または一次もしくは標的生物体中でこのＲＮＡが発現するように遺伝子組み換えされた別の生物体または媒体を導入することにより、ＲＮＡを発現させることができる。また、組み換え構築物からこの特別に設計したＲＮＡを発現するトランスジェニック生物体を、接合体、胚性幹細胞、または適切な生物体に由来する別の多能性細胞中に該構築物を導入することによって作成することもできる。
【００５６】
この特別に設計したＲＮＡを導入する物理的方法には、ＲＮＡを含有する溶液の注入、またはＲＮＡで覆われているもしくはＲＮＡを含有する小粒子による照射、ＲＮＡ溶液中への細胞もしくは生物体の浸漬、またはＲＮＡの存在下での細胞膜の電気穿孔が含まれる。当技術分野で知られている他の一般的方法には、脂質を介した担体輸送および化学物質を介した輸送系の使用も含まれる。また、ウイルス構築物をウイルス粒子中に詰め込んで生物体の細胞中に導入すれば、特別に設計したＲＮＡを生じる発現行為の効率的導入を行
うことができる。また、この特別に設計したＲＮＡを、細胞によるＲＮＡの取り込みを高める、二重鎖のアニーリングを促進する、鎖を安定化する、および標的遺伝子の抑制を高めると思われる成分と一緒に導入してもよい。
【００５７】
また、本発明には、ＳＡＲＳウイルスからなどの肺感染または他の感染用のワクチンとしての機能を果たすと思われる送達方法が含まれる。ＲＮＡは、噴霧器などの広く用いられる技法によってヒトの上部および下部呼吸器系に導入される。呼吸器系の細胞および呼吸器系内に存在する免疫細胞中にこのＲＮＡによる遺伝子抑制を組み入れると、特定の感染性疾患の予防が可能となり、それによってワクチンが作製される。
【００５８】
また、本発明には、ＲＮＡをｅｘ  ｖｉｖｏにおいて幹細胞または免疫機能細胞中に導入する送達方法も含まれる。遺伝子抑制用のＲＮＡを組み入れた後、疾患の予防および治療のために、もとの生物体またはヒトに該細胞を導入する。細胞は、生物体内に広がって分化する可能性があるが、決してその生物体の遺伝子発現に変化をもたらすことはできない。ＨＩＶ感染の治療は、上記の送達方法をどのようにして使用し得るかの最も重要な１例である。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
（使用の分野）
本発明および遺伝子抑制のために選択された特別なＲＮＡは、疾患の治療および予防に用いることができる。１例は、このＲＮＡを用い、癌細胞または腫瘍内に導入し、それによって癌表現型の開始または維持に必要な遺伝子の遺伝子発現を抑制することである。また、発癌遺伝子または良性の表現型から癌性の表現型への形質転換に必要な遺伝子を選択的に阻害することにより、このＲＮＡを癌の予防に適用することも可能である。この治療は、ほとんどすべてのタイプの癌において、単独使用でも、または化学療法、放射線療法および手術などの他の治療様式と併用することも可能であろう。
【００６０】
本発明は、任意の病原体に由来する遺伝子を標的とすることも可能である。例えば、この遺伝子は、宿主の免疫抑制を直接引き起こすものでも、または病原体の複製、伝染および感染の拡大に重要なものでもよい。その場合、ＲＮＡを、感染している可能性のある免疫細胞または幹細胞などの細胞内にｅｘ  ｖｉｖｏで導入し、次いで、病原体を予防または治療するため、もとの宿主に再導入することが可能である。あるいは、危険にさらされている細胞に対して様々な方法により、例えばＳＡＲＳ患者の呼吸器系に噴霧器により、ＲＮＡを送達することが可能である。まだ生きている呼吸器細胞によるＳＡＲＳウイルス・ゲノムの抑制は、ウイルスのそれ以上の拡大を予防し、治療目的を達成することができるはずである。
【００６１】
本発明は、いかなるタイプの標的遺伝子およびヌクレオチド配列にも限定されない。以下に例示の目的で、標的遺伝子となる可能性のある種類を列挙する：発生遺伝子、発癌遺伝子、癌抑制遺伝子、酵素遺伝子など。
【００６２】
また、本発明は、気候障害、昆虫の来襲、病原体感染、および熟成特性に感受性の低い植物を生産するための方法としても適用し得ると考えられる。実際、農業地域において有用な可能性のある１つまたは複数のいかなる遺伝子も、このような特別に選択されたＲＮＡの１つまたは複数の潜在的標的と考えられる。
【００６３】
また、機能が今まで知られていなかった標的遺伝子の活性を抑制するＲＮＡの使用を含む本発明を用いて、生物体における遺伝子機能を同定し得ると考えられる。逆に、本発明を用い、ある機能既知の遺伝子のノック・ダウンの生物体に対する影響を検討することも可能と考えられる。本発明は、薬剤開発のための潜在的標的の決定、ならびに発生および
老化を担うシグナル伝達経路の決定などに使用し得ると考えられる。本発明を使用して感染および癌以外の様々な疾患の予防および治療方法を開発し得ることが予想される。
【００６４】
また、本発明を、様々な診断方法および遺伝子マッピング研究で使用し得ると考えられる。ハイスループット・スクリーニングに使用し得ると考えられる。キットの成分として使用し得ると考えられる。このようなキットには、キットの使用者に本発明を実施させるための使用説明書を含めてもよい。
【００６５】
標準的かつ実際的と思われる方法および実施形態を用いて本発明について記載してきたが、当然のことながら、本発明は開示された方法および実施形態に限定や制限はされない。逆に、添付する特許請求の範囲の思想および範囲内にある様々な変更形態ならびに類似の配置および方法論を包含することが意図されている。
【００６６】
記載の発明における変形形態が、本発明の新規な態様を逸脱していないことは当業者にとって明らかであり、そのような変形形態は、本発明の範囲内にあることを意図している。