(57)【要約】【課題】有機溶媒耐性のシクロデキストリン合成酵素を生産する微生物を自然界から分離し、これを提供する。【解決手段】下記の性質を有するシクロデキストリン合成酵素を生産する菌株。（１）分子量が約７０，０００である（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）。（２）デンプンをシクロデキストリンに変換し、主要変換物はβ−シクロデキストリンである。（３）メタノール、エタノール、２−プロパノール、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、シクロヘキサン、及びヘキサン存在下において安定で、かつ顕著な活性の低下が認められない。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質を有するシクロデキストリン合成酵素。
（１）分子量が約７０，０００である（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）。
（２）デンプンをシクロデキストリンに変換し、主要変換物はβ−シクロデキストリンである。
（３）メタノール、エタノール、２−プロパノール、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、シクロヘキサン、及びヘキサン存在下において安定で、かつ顕著な活性の低下が認められない。
【請求項２】
下記の性質を有するシクロデキストリン合成酵素。
（１）分子量が約７０，０００である（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）。
（２）デンプンをシクロデキストリンに変換し、主要変換物はβ−シクロデキストリンである。
（３）メタノール、エタノール、２−プロパノール、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、シクロヘキサン、及びヘキサン存在下において安定で、かつ顕著な活性の低下が認められない。
（４）ｐＨ５．０〜９．０の範囲で活性が認められる。
（５）ｐＨ６〜１０の範囲で安定である。
（６）４〜４５℃の範囲で安定である（ｐＨ７．０、ＣａＣｌ２非存在下）。
（７）至適温度は６０℃付近である（ｐＨ７．０、ＣａＣｌ２非存在下）。
（８）エタノールの添加により、シクロデキストリンの総生産量及びβ−シクロデキストリンの占める割合が増大する。
【請求項３】
有機溶媒耐性シクロデキストリン合成酵素を生産するパエニバチルス・イリノイセンシスＳＴ−１２Ｋ株、及びその変異株。
【請求項４】
請求項３記載の菌株を培地中で培養し、その培養物から請求項１又は２記載のシクロデキストリン合成酵素を採取することを特徴とする請求項１又は２記載シクロデキストリン合成酵素の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機溶媒に対し耐性を持つシクロデキストリン合成酵素（シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、以下「ＣＧＴａｓｅ」という）、及びこの酵素を生産する微生物、並びにこの微生物を用いた前記酵素の生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＣＧＴａｓｅはデンプンから分子内糖転移反応によりシクロデキストリンを生産する酵素である。シクロデキストリンは、６，  ７，  ８個のグルコースがα−１−４結合した環状構造をしている  （α−，β−，γ−シクロデキストリン）。シクロデキストリンは、その環状構造内へ様々な化合物を取り込むことにより、包接化合物を形成するため、食品、医薬、農業、化粧品、香料生産などの分野で利用されている（Ｓｚｅｊｔｌｉ，  Ｊ．  １９９２．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｐｏｌｙｍ．  １２：３７５−３９２．）。
【０００３】
反応液中に有機溶媒を添加することによりＣＧＴａｓｅの生産物選択性  （α−，β−，γ−シクロデキストリンの割合）を改良する試みがなされている（Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ，  Ａ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｂｕｃｋｅ．  ２０００．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ２７：７０４−７０８．、Ｍｏｒｉ，  Ｓ．，  Ｍ．  Ｇｏｔｏ，  Ｔ．  Ｍａｓｅ，  Ａ．  Ｍａｔｓｕｕｒａ，  Ｔ．  Ｏｙａ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｋｉｔａｈａｔａ．  １９９５．  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：１０１２−１０１５．）。バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）  ｓｔｒａｉｎ  ２５１株由来のＣＧＴａｓｅは、有機溶媒を添加しない条件では、１５：６５：２０  （α−：β−：γ−シクロデキストリン）の割合でシクロデキストリンを生産したが、ブタノールを添加することにより、９：８２：９  （α−：β−：γ−シクロデキストリン）の割合でシクロデキストリンを生産した（Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ，  Ａ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｂｕｃｋｅ．  ２０００．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ２７：７０４−７０８．）。また、有機溶媒を添加することによりシクロデキストリン生産の総収量が増加することが報告されている。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）  ｓｐ．  ＢＥ１０１  株由来のＣＧＴａｓｅはエタノールを添加することにより、エタノールを添加しない場合に比べて約２倍のシクロデキストリンを生産した（非特許文献１参照）。また、その他にも、有機溶媒存在下における難水溶性のフラボノイドの糖転移反応にＣＧＴａｓｅは利用されている（Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｓｕｚｕｋｉ．  １９９１．  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５５：１８１−１８７．）。しかし、多くの場合、有機溶媒存在下において酵素は不安定であり、用いる有機溶媒によっては失活することが知られている（Ａｎｔｏｎｉｎｉ，  Ｅ．，  Ｇ．  Ｃａｒｒｅａ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｃｒｅｍｏｎｅｓｉ．  １９８１．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ３：２９１−２９６．、Ｃａｒｒｅａ，  Ｇ．  １９８４．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２：１０２−１０６．）。有機溶媒存在下において高い安定性と活性を示す酵素は有機溶媒存在下における酵素応用に有用である。有機溶媒耐性微生物は有機溶媒存在下において菌体外酵素を生産するため有機溶媒耐性酵素の検索に用いることができる。これまでに、シクロヘキサン耐性微生物から有機溶媒耐性リパーゼが検索されている（Ｏｇｉｎｏ，Ｈ．，  Ｋ．  Ｍｉｙａｍｏｔｏ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｉｓｈｉｋａｗａ．  １９９４．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５８：１４５−１４６．）。また、本発明者は、シクロヘキサン耐性微生物であるバークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）  ｓｔｒａｉｎ  ＳＴ−２００株が生産する有機溶媒耐性、界面活性剤耐性、熱耐性のコレステロールオキシダーゼを報告している（Ｄｏｕｋｙｕ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｒ．  Ａｏｎｏ．  ２００１．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５７：１４６−１５２．）。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｌｅｅ，  Ｙ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｓ．  Ｋｉｍ．  １９９１．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  １３：４９９−５０３．
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
有機溶媒存在下におけるＣＧＴａｓｅによるシクロデキストリンの生産量の向上や生産物選択性を改良する試みが報告されている（Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ，  Ａ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｂｕｃｋｅ．  ２０００．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ２７：７０４−７０８．、非特許文献１、Ｍｏｒｉ，  Ｓ．，  Ｍ．  Ｇｏｔｏ，  Ｔ．  Ｍａｓｅ，  Ａ．  Ｍａｔｓｕｕｒａ，  Ｔ．  Ｏｙａ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｋｉｔａｈａｔａ．  １９９５．    Ｂｉｏｓｃｉ  ＢｉｏｔｅｃｈＢｉｏｃｈｅｍ  ５９：１０１２−１０１５．）。しかし、これらの研究には主に市販の酵素が用いられており、酵素を生産する微生物に着目し、有機溶媒耐性のＣＧＴａｓｅを生産する微生物を検索した報告例はこれまでになかった。
【０００６】
本発明は、このような技術的背景の下になされたものであり、有機溶媒耐性のＣＧＴａｓｅを生産する微生物を自然界から分離し、これを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、関東各地から採取した土壌試料から分離された菌株が、有機溶媒存在下で安定でかつ高い活性を示すＣＧＴａｓｅを生産することを見出し、この知見から本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、下記の性質を有するＣＧＴａｓｅである。
（１）分子量が約７０，０００である（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）。
（２）デンプンをシクロデキストリンに変換し、主要変換物はβ−シクロデキストリンである。
（３）メタノール、エタノール、２−プロパノール、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、シクロヘキサン、及びヘキサン存在下において安定で、かつ顕著な活性の低下が認められない。
【０００９】
また、本発明は、有機溶媒耐性ＣＧＴａｓｅを生産するパエニバチルス・イリノイセンシスＳＴ−１２Ｋ株、及びその変異株である。
【００１０】
更に、本発明は、上記菌株を培地中で培養し、その培養物から上記ＣＧＴａｓｅを採取することを特徴とする上記ＣＧＴａｓｅの生産方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明のＣＧＴａｓｅは、少なくとも、下記の（１）〜（３）の性質を有する。
（１）分子量が約７０，０００である（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）。
（２）デンプンをシクロデキストリンに変換し、主要変換物はβ−シクロデキストリンである。
（３）メタノール、エタノール、２−プロパノール、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、シクロヘキサン、及びヘキサン存在下において安定で、かつ顕著な活性の低下が認められない。
【００１３】
また、好ましくは、本発明のＣＧＴａｓｅは、下記の（４）〜（８）の性質を有する。
（４）ｐＨ５．０〜９．０の範囲で活性が認められる。
（５）ｐＨ６〜１０の範囲で安定である。
（６）４〜４５℃の範囲で安定である（ｐＨ７．０、ＣａＣｌ２非存在下）。
（７）至適温度は６０℃付近である（ｐＨ７．０、ＣａＣｌ２非存在下）。
（８）エタノールの添加により、シクロデキストリンの総生産量及びβ−シクロデキストリンの占める割合が増大する。
【００１４】
上述した性質の中で、「分子量は約７０，０００」とは、通常、分子量が６６，０００〜９７，０００、好ましくは６８，０００〜７４，０００の範囲であることを指す。また、「安定」とは、活性が保持されていることをいい、処理前の活性に比べ、通常、７０％以上、好ましくは、８０％以上の活性が保持されていることをいう。「顕著な活性の低下が認められない」とは、有機溶媒の非存在下における活性に比べ、通常、７０％以上、好ましくは、８０％以上の活性が保持されていることをいう。「活性が認められる」とは、最も高い活性値に比べ、通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の活性が認められることをいう。「至適温度は６０℃付近」とは、酵素の至適温度が、通常、５０〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃の範囲であることを指す。
【００１５】
本発明のＣＧＴａｓｅは、後述するパエニバチルス・イリノイセンシスＳＴ−１２Ｋ株などを培地中で培養し、その培養物からＣＧＴａｓｅを採取することにより得ることができる。培養物から本発明のＣＧＴａｓｅを採取する方法は、常法に従い、硫安塩析、クロマトグラフィーなどを使って行うことができる。
【００１６】
パエニバチルス・イリノイセンシスＳＴ−１２Ｋ株は、土壌中から分離された菌株で、その菌学的性質は実施例２に示すとおりであり、また、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列は、配列番号１に示すとおりである。この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１７７として寄託されている（受託日：平成１４年１２月２６日）。
【００１７】
パエニバチルス・イリノイセンシスＳＴ−１２Ｋ株の代わりに、この菌株の変異株を用いることもできる。ここでいう「変異株」とは、パエニバチルス・イリノイセンシスＳＴ−１２Ｋ株に変異を加えた菌株のほか、自然界に存在するパエニバチルス・イリノイセンシスＳＴ−１２Ｋ株と近縁な菌株をいう。有機溶媒耐性ＣＧＴａｓｅを生産する菌株であって、実施例２に示したパエニバチルス・イリノイセンシスＳＴ−１２Ｋ株の菌学的性質と同一の性質を示す菌株、あるいは１６ＳｒＤＮＡの塩基配列においてパエニバチルス・イリノイセンシスＳＴ−１２Ｋ株と高い相同性（全く同一であるか、又は数個程度の違いしかない）を示す菌株は、少なくとも前記した「変異株」に含まれる。
【００１８】
【実施例】
最初に本実施例において使用した実験材料及び方法について説明する。
培地の組成
スクリーニング用培地：１％  馬鈴薯デンプン  （  和光純薬  ）、１％  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  （Ｄｉｆｃｏ社製），  ０．５％  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  （Ｄｉｆｃｏ），  １％  ＮａＣｌ  ，  １０  ｍＭ  ＭｇＳＯ４，  １．５  ％  寒天末
ＬＢＭｇ培地：１％  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，  ０．５％  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ，  １％  ＮａＣｌ
【００１９】
ヘキサン重層下においてＣＧＴａｓｅを生産する微生物の分離
関東各地から収集した土壌試料を生理食塩水に懸濁し、スクリーニング用寒天培地に塗布した。この寒天培地にヘキサンを重層し３０℃で４日間培養した。培養後ヘキサンを除きヨウ素溶液を注いだ。ヨウ素−デンプン反応により、コロニーの周りにハローを形成した微生物を分離した。続いて、単離した菌株を０．２％  可溶性デンプンを含むＬＢＭｇ液体培地で３０℃、１２０  ｒｐｍ、４８時間培養した。培養後、培養液を遠心  （６，０００  ｘ  ｇ，  １５  ｍｉｎ，  ４°Ｃ）  し上清を回収した。上清中の活性を以下に示す２つの方法（ヨウ素法とＤＮＳ法）で測定した。また、デンプン分解産物を以下に説明したＴＬＣ分析によって調べた。その結果、デンプンからシクロデキストリンを生産する微生物を選択した。有機溶媒耐性ＣＧＴａｓｅを選択するために有機溶媒存在下における安定性を調べた。終濃度２０％になるようクロロホルムまたはエタノールを酵素溶液に加え３０℃で１２時間保温した。１００  ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液  （ｐＨ  ７．０）を用いて４倍に酵素液を希釈し残存活性をヨウ素法で測定した。４０℃または５０℃における残存活性をヨウ素法で測定することにより、酵素の耐熱性も同時に調べた。
【００２０】
アミロース−ヨウ素複合体の減少によるデンプン分解活性測定法  （ヨウ素法）
０．５％  デンプン溶液  （１００  ｍＭリン酸緩衝液  ［ｐＨ  ７］、０．５％  デンプン）３００μｌに酵素液２０μｌを加え３０℃で１０分間反応させた。この反応液に５Ｍ  酢酸液０．５ｍｌ加えることで反応を停止した後、０．０２％  Ｉ２−０．２％  ＫＩ  液０．５  ｍｌを加えた。蒸留水３  ｍｌを加え、６６０  ｎｍにおける吸光度を測定した。この方法において１分間に１０％の吸光度を減少させる酵素を１Ｕとした。
【００２１】
還元末端の増加によるデンプン分解活性測定法  （ＤＮＳ法）
３，５−ジニトロサリチル酸  （ＤＮＳ）を用いて還元糖の増加を測定し、デンプン分解活性を求めた。ヨウ素法と同じ反応液を用いて測定した（Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｇ．  Ｌ．  １９５９．  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ３１：４２６−４２８．）。この方法において１分間にグルコース１μｍｏｌ相当の還元末端を生成する酵素を１Ｕとした。
【００２２】
ＳＴ−１２Ｋ株からのＣＧＴａｓｅの精製
０．２％  可溶性デンプンを含むＬＢＭｇ液体培地８００ｍｌにＳＴ−１２Ｋ株を植菌し、３０℃、１２０  ｒｐｍで１４時間培養した。遠心分離  （６，０００×ｇ、１５分、４℃）  により、培養上清を回収した。この培養上清に硫酸アンモニウムを７０％  飽和量加え、４℃で一晩静置した。沈殿画分を遠心分離  （１５，０００×ｇ、２５分、４℃）  により回収した後、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８）緩衝液を用いて懸濁し、同緩衝液で透析した。続いて、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８）で平衡化したＤＥ５３カラムに透析後のサンプルをアプライした。カラムを同緩衝液で洗浄した後、０から５０  ｍＭ  ＮａＣｌ濃度勾配をかけ吸着タンパク質を溶出し、活性の認められた画分を回収した。３０％飽和硫酸アンモニウム−１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８）で平衡化したブチルトヨパール６５０ＭカラムにＤＥ５３溶出画分をアプライした。硫酸アンモニウム濃度を下げることにより吸着タンパク質を溶出し、活性の認められた画分を回収した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を用いて透析し精製標品とした。
【００２３】
タンパク質濃度の測定
ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を測定した（Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｕ．  Ｋ．  １９７０．Ｎａｔｕｒｅ  ２２４：６８０−６８５．）。
【００２４】
活性染色
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは  Ｌａｅｍｍｌｉ  の方法を改変し、１０％  （ｗｔ／ｖｏｌ）  ポリアクリルアミドゲルに１％  （ｗｔ／ｖｏｌ）  可溶性デンプンを加えた。泳動後ゲルを１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液−２５％  （ｖｏｌ／ｖｏｌ）  イソプロパノール混合液で洗浄した。さらに、１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  （ｐＨ  ８．０）に浸して平衡化後、３０℃で１２時間保温した。ゲルをヨウ素溶液に浸けることにより、ハローを検出した。
【００２５】
薄層クロマトグラフィー  （ＴＬＣ）
０．５％  可溶性デンプンに酵素液を加え反応後、反応液１  μｌをシリカゲルプレート（０．２−ｍｍ  ｔｈｉｃｋ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０，  Ｍｅｒｃｋ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）にスポットした。酢酸：酢酸エチル：水  （２：２：１）  の展開溶媒により上昇法により室温で展開した。グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、α−，β−，γ−シクロデキストリンを標品として用いた。展開後、オルシノール−５０％硫酸溶液をプレート全体に均一に噴霧し、１２０℃で１０分間加熱した。メタノールに１％  ヨウ素を溶解した溶液を噴霧してシクロデキストリンを検出した。
【００２６】
酵素活性と安定性に対するｐＨの影響
酵素活性に対する反応  ｐＨ  の影響を調べために、様々なｐＨ下における酵素活性をヨウ素法により測定した。１００  ｍＭ濃度の  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ−ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液  （ｐＨ  ３．０−５．５）、  ＣＨ３ＣＯＯＨ−ＣＨ３ＣＯＯＮａ緩衝液  （ｐＨ  ４．０−５．５）  、ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液  （ｐＨ  ５．５−７．５）  、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  （ｐＨ  ７．５−９．０）  、Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３緩衝液  （ｐＨ  ９．０−１１．０）  、ＮａＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液  （ｐＨ  １１．０−１３．０）緩衝液を用いてｐＨを調整した。ｐＨ安定性は各ｐＨで３０℃、１時間保温し１００  ｍＭリン酸緩衝液  （ｐＨ  ７）  を用いて希釈後、ヨウ素法により活性測定を行った。
【００２７】
シクロデキストリン量の測定
ＮＨ２−１２５１−Ｎ  （センシュー科学）  カラムを用いてＨＰＬＣ分析を行った。アセトニトリル：水  （６：４，ｖｏｌ／ｖｏｌ）  の溶媒を用いて流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、示差屈折器（ＲＩＤ−３００，  日本分光）により糖の検出を行った。
【００２８】
市販ＣＧＴａｓｅの購入
バチルス・マセランス由来のＣＧＴａｓｅは、天野エンザイム（Ｎａｇｏｙａ，  Ｊａｐａｎ）から購入した。
【００２９】
〔実施例１〕  有機溶媒耐性ＣＧＴａｓｅを生産する微生物の分離
まず最初にヘキサンを重層した寒天培地上でデンプンを分解する酵素を生産する微生物を検索した。約４００の土壌試料から、４２５株のデンプン分解菌を単離した。ヨウ素法により酵素活性を測定した結果、４２５株のうち３８株の培養上清中にデンプン分解活性が認められた。また、培養上清中の酵素活性をＤＮＳ法により測定した結果、３８株のうち１２株において培養上清中にＤＮＳ法によるデンプン分解活性が認められなかった。これら１２株による生産物を、薄層クロマトグラフィーにより調べた結果、シクロデキストリンが主要生産物として生産されていることが分かった。これら１２株のうち、ＳＴ−１２Ｋ株の生産するＣＧＴａｓｅは最も高い熱安定性を示した。また、ＳＴ−１２Ｋ株由来の酵素は、他の１１株の生産する酵素に比べて、エタノールやクロロホルム存在下においてより高い安定性を示した。そこで、ＳＴ−１２Ｋ株由来の有機溶媒耐性ＣＧＴａｓｅを解析することにした。
【００３０】
〔実施例２〕  ＳＴ−１２Ｋ株の同定
ＳＴ−１２Ｋ株の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列  （１４８０  ｂｐ、配列番号１に示す。）を決定した結果、パエニバチルス・イリノイセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ）と９９％、パエニバチルス・アミロリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）と９６％、パエニバチルス・ボレアリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ）と９４％の相同性を示した（Ｌａｎｅ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｂ．  Ｐａｃｅ，  Ｇ．  Ｊ．  Ｏｌｓｅｎ，  Ｄ．  Ａ．  Ｓｔａｈｌ，  Ｍ．  Ｌ．  Ｓｏｇｉｎ，  ａｎｄＮ．  Ｒ．  Ｐａｃｅ．  １９８５．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８２：６９５５−６９５９．）。ＳＴ−１２Ｋ株の分類学的諸性質を、既報のパエニバチルス属細菌の同定試験に基づき調べた（Ｓｈｉｄａ，  Ｏ．，  Ｈ．  Ｔａｋａｇｉ，  Ｋ．  Ｋａｄｏｗａｋｉ，  Ｌ．  Ｋ．  Ｎａｌａｍｕｒａ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｋｏｍａｇａｔａ．  １９９７．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ４７：２９９−３０６．）。この結果、本菌は、幅０．８  から  １．０  μｍ、長さ３．０  から４．０  μｍのグラム陽性のかん菌であった。また、本菌は、運動性があり、胞子を形成した。コロニーの形状を観察した結果、扁平状に隆起したコロニーが認められ、コロニー周辺は全縁状、表面は平滑であり、黄色みがかった灰色であった。色素の生産は認められなかった。カタラーゼ活性は陽性であり、オキシダーゼ活性は陰性であった。ゼラチンの分解活性は陽性であった。カゼインの分解活性も弱いが認められた。単一炭素源として酢酸は利用できるが、クエン酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、グルタミン酸の資化能は認められなかった。ＳＴ−１２Ｋ株は４０℃、ｐＨ  ５．７、２％  ＮａＣｌ存在下において生育した。Ｌ−アラビノース、グリセロール、Ｄ−マンノース、ラフィノースから酸の生成が認められたが、ラクトース、Ｌ−ラムノースからは酸の生成は認められなかった。これらの微生物学的性質は、パエニバチルス・イリノイセンシスの性質と一致していた。
【００３１】
ＳＴ−１２Ｋ株の有機溶媒存在下における生育を調べた結果、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のドデカン（ｌｏｇ  Ｐｏｗ  ７．０），  デカン  （ｌｏｇ  Ｐｏｗ  ６．０），  ノナン  （ｌｏｇ  Ｐｏｗ  ５．５），  オクタン  （ｌｏｇ  Ｐｏｗ  ４．９）  ジフェニルエーテル  （ｌｏｇ  Ｐｏｗ４．２）存在下ではＳＴ−１２Ｋ株の生育が認められた。一方、シクロヘキサン  （ｌｏｇ  Ｐｏｗ  ３．４）  または  ｐ−キシレン  （ｌｏｇ  Ｐｏｗ  ３．１）  存在下では生育は認められなかった。
【００３２】
〔実施例３〕  ＳＴ−１２Ｋ株由来のＣＧＴａｓｅの精製
ＳＴ−１２Ｋ株の培養上清から、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  を用いたイオン交換クロマトグラフィーおよびＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  を用いた疎水クロマトグラフィーにより、ＣＧＴａｓｅを精製した  （表１）。
【００３３】
【表１】
2004208637.tif 000002
【００３４】
本酵素は、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ＤＥ５２  カラム  に吸着し、塩化ナトリウム濃度が１５  ｍＭのときに溶出した。また、Ｂｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ  カラム  に吸着し、飽和硫安濃度  １０％  から  ０％  にかけて溶出した。この結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  で単一なバンドを示すＣＧＴａｓｅ精製標品を取得することができた。比活性は、１，２００  Ｕ／ｍｇ  であった。ＳＴ−１２Ｋ株由来のＣＧＴａｓｅの分子量は、おおよそ  ７０，０００  であった。
【００３５】
図１に各精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図中のＡはＣｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  （ＣＢＢ）で染色しており、Ｂは２％ヨウ素−２％ヨウ化カリウム溶液で染色している。また、レーン１、２、３は、それぞれ７０％飽和硫安沈殿画分、ＤＥ５３カラム溶出画分、ブチルトヨパール６５０Ｍカラム溶出画分を試料（１ＵのＣＧＴａｓｅに相当する量）としており、レーンＭは分子量マーカーを泳動させている。
【００３６】
〔実施例４〕  ＳＴ−１２Ｋ株由来のＣＧＴａｓｅの活性、安定性に対するｐＨ、温度の影響
精製した酵素標品を用いて、ＣＧＴａｓｅの活性、安定性に対するｐＨ、温度の影響を調べた。
【００３７】
図２Ａに、様々な温度における酵素活性をヨウ素法により測定した結果を示す。また、図２Ｂに、１００  ｍＭ  リン酸緩衝液  （ｐＨ  ７．０）  中、様々な温度で３０分間保温した後の残存活性をヨウ素法により測定した結果を示す。図中の（○）はＣａＣｌ２無添加での測定値、（●）は  ５  ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下での測定値を示す。これらの図に示すように、本酵素の至適温度（ｐＨ  ７．０）は６０℃で、４℃から４５℃までの温度範囲で安定であった。５  ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加することにより、至適温度は６５℃となった。また、５  ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下では６０℃および７０℃においても８５％および４０％の活性を維持しており、温度安定性の向上が認められた。
【００３８】
一方ｐＨに関して、本酵素は、ｐＨ  ５．０から９．０までのｐＨ範囲で活性が認められ、特にｐＨ  ５．０から８．０の範囲で高い活性を示した。３０℃で１時間処理することにより、ｐＨ安定性を調べた結果、ｐＨ  ６から１０までの範囲で本酵素は安定であった。
【００３９】
〔実施例５〕  ＳＴ−１２Ｋ株由来のＣＧＴａｓｅによるシクロデキストリンの生産
１％  （ｗｔ／ｖｏｌ）  可溶性デンプン溶液を用いてＳＴ−１２Ｋ株由来のＣＧＴａｓｅによるシクロデキストリンの生成をＨＰＬＣにより調べた。実験は、エタノールを含まない反応液〔１％  可溶性デンプン−１００  ｍＭ  リン酸緩衝液  （ｐＨ  ７．０）から成る反応液  ３００μｌ〕とエタノールを含む反応液〔１％  可溶性デンプン−１００  ｍＭ  リン酸緩衝液  （ｐＨ  ７．０）−１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）  エタノールから成る反応液３００μｌ〕の２種類を調製し、これに酵素溶液  （２０  Ｕ／ｍｌ）    ３０μｌを添加して、３０℃で保温して行った。エタノール不在下及び存在下で変換されたデンプンの割合をそれぞれ図３Ａ及び図３Ｂに示す。図中の（○）はα−シクロデキストリン、（●）はβ−シクロデキストリン、（▲）はγ−シクロデキストリン、（□）はシクロデキストリン総量をそれぞれ示す。
【００４０】
これらの図に示すように、いずれの条件でも主要変換物としてβ−シクロデキストリンが生成した。エタノール不在下においては、２４時間後、シクロデキストリンの総生産量は３．２６  ｍｇ／ｍｌ（初期添加デンプン量の３３％）であった。このときのα−，β−，γ−シクロデキストリンの割合は、２４：６９：７であった。また、１０％  （ｖｏｌ／ｖｏｌ）  エタノールを添加することにより、シクロデキストリンの生産量は４．５２  ｍｇ／ｍｌ  （初期添加デンプン量の４５％）にまで向上した。このときのα−，β−，γ−シクロデキストリンの割合は、１２：８２：６であった。
【００４１】
シクロデキストリンの生産量と産物の選択性に対するエタノール濃度の影響を調べた。即ち０〜５０％エタノールを含む反応液〔１％  可溶性デンプン−１００  ｍＭ  リン酸緩衝液  （ｐＨ  ７．０）−０％から５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）  エタノールから成る反応液３００μｌ〕に酵素溶液（２０  Ｕ／ｍｌ）３０μｌを添加して、３０℃で保温し、その後、生成するα−，β−，γ−シクロデキストリンの量を調べた。この結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
2004208637.tif 000003
【００４３】
エタノール濃度が１０％および２０％のときに、シクロデキストリンの生産量は、初期添加デンプン量に対して、４５％および４６％となり、その他のエタノール濃度に比べて高い生産量であった。β−シクロデキストリンの選択性は１０％  エタノール存在下の場合に、８２％となり、最も高かった。
【００４４】
〔実施例６〕  ＳＴ−１２Ｋ株由来のＣＧＴａｓｅの活性、安定性に対する有機溶媒の影響
ＳＴ−１２Ｋ株由来のＣＧＴａｓｅ及び市販のバチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）由来のＣＧＴａｓｅの安定性に対する有機溶媒の影響を調べた。
【００４５】
各有機溶媒  （７５μｌ）  を  ＣＧＴａｓｅ溶液  （０．２  Ｕ／ｍｌ  ｉｎ  １００  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ［ｐＨ  ７．０］  ）    ３００μｌに添加し、３０℃で１２時間反応させた後、溶液をリン酸ナトリウム緩衝液を用いて４倍希釈して、ヨウ素法により活性を測定した。この結果を表３に示す。
【００４６】
【表３】
2004208637.tif 000004
【００４７】
バチルス・マセランス由来のＣＧＴａｓｅは、これまでに非常によく研究されているＣＧＴａｓｅの一つである（Ｔｏｎｋｏｖａ，  Ａ．  １９９８．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：６７８−６８６．）。ｌｏｇ  Ｐｏｗ  値が２以下の高い極性の有機溶媒が酵素を失活させることが知られている（Ｌａａｎｅ，  Ｃ．，  Ｓ．  Ｂｏｅｒｅｎ，  Ｋ．  Ｖｏｓ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｖｅｅｇａｒ．  １９８７．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．  ３０：８１−８７．）が、ＳＴ−１２Ｋ株由来およびバチルス・マセランス由来のＣＧＴａｓｅは、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ベンゼン、トルエン、ｐ−キシレン、シクロヘキサン、ヘキサンなど様々な有機溶媒存在下において安定であった。しかし、クロロホルム存在下  （３０℃、１２時間後）  では、溶媒無添加の活性を１００％とした場合、２５％から５０％程度活性の低下が認められた。
【００４８】
続いて、有機溶媒存在下における活性を調べた。
【００４９】
各有機溶媒  （７５μｌ）  を  ０．５％  可溶性デンプンを含むＣＧＴａｓｅ溶液  （０．２  Ｕ／ｍｌ  ｉｎ１００  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ［ｐＨ  ７．０］  ）    ３００μｌに添加し、ヨウ素法により活性を測定した。この結果を表４に示す。
【００５０】
【表４】
2004208637.tif 000005
【００５１】
バチルス・マセランス由来のＣＧＴａｓｅは、メタノール、エタノール、２−プロパノール、クロロホルム存在下では、１５％から６５％まで活性が低下していた。一方、ＳＴ−１２Ｋ株由来のＣＧＴａｓｅを用いた場合には、これらの溶媒存在下においても顕著な活性の低下は認められなかった。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により、酵素活性を低下させることなく、有機溶媒存在下でシクロデキストリン合成酵素反応を行うことができるようになる。これにより、シクロデキストリンの生産量の増大やシクロデキストリンの選択性の改良を図ることができる。
【００５３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＧＴａｓｅの精製画分を試料としたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図。
【図２】ＣＧＴａｓｅの活性及び安定性と温度との関係を示す図。
【図３】ＣＧＴａｓｅによる各種シクロデキストリンの生成量を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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