(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なセリンプロテアーゼを提供し、降圧剤、血液凝固調節、麻酔剤等に利用する。【解決手段】トガリネズミ（モグラ目モグラ亜目Blarina brevicauda）由来の新規セリンプロテアーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋な形である配列番号２もしくは配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるセリンプロテアーゼ、そのホモローグ、そのフラグメントまたはそのフラグメントのホモローグであるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２もしくは配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載されたポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１もしくは配列番号３で示される塩基配列を有する請求項３記載のｃＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイブリダイズするフラグメント。
【請求項５】
請求項３もしくは請求項４のどちらかの項に記載のｃＤＮＡが組み込まれた複製または発現ベクター。
【請求項６】
請求項５記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なセリンプロテアーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体に存在する内因性タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）は、消化酵素としての作用の他に、血液凝固反応に見られるように様々な生命現象の中で不可逆的な一定方向に向かわせる反応に関わっている。これらプロテアーゼの中には、免疫機能と共に生体防御に関与しているものがあり、侵入する生物、ウイルス、抗原抗体複合体、生物にとって不必要となった或いは有用でないある種の組織タンパク質を分解するのに役立っている。正常な生物ではプロテアーゼの発現は一定量認められ、プロテアーゼインヒビターとの平衡関係で局所的及び一時的にタンパク質分解反応が阻害され、正常な状態では、プロテアーゼ及びプロテアーゼインヒビターは相互に均衡が保たれている。
【０００３】
しかしながら、このプロテアーゼ／プロテアーゼインヒビターの平衡状態が乱れると、肺気腫、血栓、膵炎、関節炎、糸球体腎炎、歯周炎、筋萎縮症、腫瘍侵襲、ウイルス感染等の様々な疾病が発症する（下東康幸、プロテアーゼインヒビターの基礎と応用Ｉ、セリンプロテアーゼインヒビター、治療学、Ｖｏｌ．３２、Ｎｏ．８、１９９８）。また、敗血症、急性白血病においてプロテアーゼ分泌細胞から大量のプロテアーゼの放出が認められることから、これらの疾病でもプロテアーゼ／プロテアーゼインヒビターの平衡関係に異常を来すことが示唆されている。
【０００４】
従って、新規のプロテアーゼは、そのまま医薬品として利用できるほか、該プロテアーゼをコードするＤＮＡのクローニング、さらにプロテアーゼタンパク質生産の手掛りとなり、これらの疾病の予防、治療になくてはならない疾患誘発の指標マーカー等並びにプロテアーゼインヒビターの医薬品開発、トランスジェニック又はノックアウトアニマルによる病態モデル系の確立等に利用することができ、その発見が切望されていた。
【０００５】
セリンプロテアーゼは活性部位にセリン残基のあるプロテアーゼの総称で、代表的なものにトリプシン、キモトリプシン、トロンビン、カリクレイン等がある。本発明の新規セリンプロテアーゼと最も相同性が高かった組織性カリクレインは、ほ乳類の膵臓、顎下腺、腎臓など多くの器官に存在し、基質（キニノーゲン）を切断してキニン類を遊離させることで血圧調整に関与している。ヒト、マウス、ラットを始め多くのほ乳動物において、組織性カリクレインが分離、精製、遺伝子クローニング、リコンビナントによる活性発現など、盛んに研究されている。
【０００６】
トガリネズミはモグラ目（食虫類）モグラ亜目に属するほ乳類である。上述の通り、ほ乳動物由来のプロテアーゼは数多く知られているが、トガリネズミ由来のプロテアーゼに関しては、過去に報告例はない。従って、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含み、セリンプロテアーゼ活性を有するタンパク質の存在も知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、新規なセリンプロテアーゼを提供し、降圧剤、血液凝固調節、麻酔剤等に利用すること，またはプロテアーゼ／プロテアーゼインヒビターの平衡状態による調節が関与する肺気腫、血栓、膵炎、関節炎、糸球体腎炎、歯周炎、筋萎縮症、腫瘍侵襲、ウイルス感染等の様々な疾病の予防・治療に資することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を重ね本発明に想到したものであり、アメリカ合衆国で採集したブラリナトガリネズミ（Ｂｌａｒｉｎａ  ｂｒｅｖｉｃａｕｄａ）から分離した新規タンパク質をブラリナシンと命名し、これが配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含み、セリンプロテアーゼ活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（６）に関する。
【００１０】
（１）実質的に純粋な形である、下記のアミノ酸配列（配列番号２もしくは配列番号４）からなるセリンプロテアーゼ、そのホモローグ、そのフラグメントまたはそのフラグメントのホモローグであるポリペプチド。
配列番号２：
2004357658.tif 000002
配列番号４：
2004357658.tif 000003
【００１１】
（２）配列番号２もしくは配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる請求項１記載のポリペプチド。
【００１２】
（３）請求項２に記載されたポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【００１３】
（４）下記の塩基配列（配列番号１もしくは配列番号３）を有する請求項３記載のｃＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイブリダイズするフラグメント。
配列番号１：
2004357658.tif 000004
配列番号３：
2004357658.tif 000005
【００１４】（５）請求項３もしくは請求項４のどちらかの項に記載のｃＤＮＡが組み込まれた複製または発現ベクター。
【００１５】（６）請求項５記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明の実施の形態】
【００１７】
実質的に純粋な形である配列番号２もしくは配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する本発明のセリンプロテアーゼとは、一般に生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば、９５、９８または９９％が配列番号２もしくは配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するセリンプロテアーゼであることを意味する。
【００１８】
配列番号２もしくは配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる本発明のセリンプロテアーゼのホモローグとは、一般に少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのようなホモローグは、以後本発明のセリンプロテアーゼとして記載される。
【００１９】
さらに、配列番号２もしくは配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる本発明のセリンプロテアーゼのフラグメント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。
【００２０】
配列番号１もしくは配列番号３で示される塩基配列を有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするｃＤＮＡとは、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのようなｃＤＮＡは、以後本発明のｃＤＮＡとして記載される。
【００２１】
配列番号１もしくは配列番号３で示される塩基配列を有するｃＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のｃＤＮＡに含まれる。
【００２２】
さらに、本発明には、本発明のｃＤＮＡが組み込まれた複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ｃＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。ベクターは、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において、例えばｃＤＮＡに対応するＲＮＡの製造、宿主細胞の形質転換に用いることができる。
【００２３】
さらに、本発明には、配列番号１もしくは配列番号３で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡを含む本発明のｃＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
【００２４】
（１）の本発明のセリンプロテアーゼとしては、配列番号２もしくは４で示されるアミノ酸配列を有するもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、配列番号２もしくは４中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド等）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅｔは１種類、Ｌｅｕは６種類）あり、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくｃＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
【００２５】
（２）で特定される本発明のｃＤＮＡには、（１）の配列番号２もしくは４で示されるセリンプロテアーゼをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、セリンプロテアーゼの生産性が向上することがある。
（３）で特定されるｃＤＮＡは、（２）で示されるｃＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表わす。（４）に示されるｃＤＮＡは、（３）で特定されるｃＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
【００２６】
本発明の配列番号２もしくは配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるセリンプロテアーゼ、ブラリナシンは、食虫類に属するトガリネズミの顎下腺を摘出し、その生理食塩水など水系溶媒による抽出物を各種分離操作により精製することで得られる。トガリネズミとしては、北米に生息するブラリナトガリネズミの他に、北海道に生息するオオアシトガリネズミ、エゾトガリネズミ、ヒメトガリネズミ等が挙げられる。
【００２７】
本発明の配列番号２もしくは配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるセリンプロテアーゼ、ブラリナシンの分離精製操作としては、硫酸アンモニウムやエタノール等による沈殿法や、限外濃縮、各種のカラムクロマトグラフィーなどが挙げられる。カラムの担体としては、ゲルろ過、イオン交換、疎水性、逆相系のＣ４，Ｃ１８等が用いられる。
【００２８】
配列番号１もしくは配列番号３で示される塩基配列を有するｃＤＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。
１）全ＲＮＡ（Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）の抽出：トガリネズミの顎下腺からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ等を用いて全ＲＮＡ  を抽出する。
２）ｃＤＮＡの合成：得られた全ＲＮＡを鋳型にプライマーと逆転写酵素を用いて、ｃＤＮＡを合成する。用いられるプライマーとしては、Ｎ９ランダムプライマーや、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ−ＣＧＣ／ＴＴＶ等が挙げられる。逆転写酵素としては、スーパースクリプトＩＩ（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）、ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＭＭＬＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）等を用いることができる。
【００２９】３）ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーの合成：
セリンプロテアーゼのアクティブサイトをモチーフとしてセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーをそれぞれ化学合成する。センスプライマー、アンチセンスプライマーについては、目的とするアミノ酸をコードするものであれば何でもよいが、ハイブリダイズのし易さを考慮して作成、組み合わせる必要がある。
４）選択的ＰＣＲ：２）で得たｃＤＮＡを鋳型とし、３）で得たプライマーミックスを用いて、ＰＣＲを行なう。ＰＣＲにより、アクティブサイトを有するセリンプロテアーゼの部分配列が増幅される。得られた生成物を電気泳動にかけ、今まで知られているセリンプロテアーゼの長さを勘案してバンドを切り出し、ｃＤＮＡ断片を回収する。
【００３０】５）大腸菌への形質転換：４）で得られたｃＤＮＡ断片をＴベクターに連結し、得られたプラスミドを菌体に形質転換を行なう。好ましい菌体としては、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＨＢ１０９、ＸＬ−１等が挙げられる。菌体を培養し、プラスミドを抽出する。プラスミドを制限酵素（ＥｃｏＲＩ等）で切断し、電気泳動により、バンドを切り出して回収し、インサートを確認する。
６）シーケンシング：５）で得られたクローンについて、公知の方法により、シーケンシングを行ない、それぞれのクローンの配列を決定する。
【００３１】７）５’末端の同定：６）で得られた配列の全長を得るために、５’ＲＡＣＥ法により同定する。例えば、キャップファインダー（ＣＡＰ  ｆｉｎｄｅｒ）変法（Ｃｌｏｎｔｅｃ社）、５’ＲＡＣＥシステム（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）等を用いて、６）で得られた部分配列の５’末端の同定を行なう。そのための鋳型として、ＲＡＣＥ用のｃＤＮＡを作成する。詳しくは、ｉ）  ２）で得られた全ＲＮＡを用いて、プライマーおよび逆転写酵素によりｃＤＮＡを作成する。プライマーとしては、キャップスイッチ（ＣＡＰ  ｓｗｉｔｃｈ）プライマー、オリゴＮｏｔＩ（ｄＴ１８）Ｖプライマー等が用いられる。逆転写酵素は前記と同じものを用いることができる。
ｉｉ）ｉ）で得られたｃＤＮＡを鋳型として、プライマーおよび６）で得られた部分配列の部分をプライマーに用いて、ＰＣＲを行なう。
ｉｉｉ）確かさおよびＰＣＲ生成物の量を増すために、同じプライマーおよび６）で得られた部分配列の別の部分配列を用いてネステッドＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）を行なう。
ｉｖ）このようにして得られたＰＣＲ生成物を電気泳動にかけ、バンドを切り出し、ｃＤＮＡを回収する。
ｖ）  回収されたｃＤＮＡをＴベクターにサブクローニングし、得られたプラスミドを菌体に形質転換し、培養する。菌体よりプラスミドを回収し、制限酵素により切断し、電気泳動により、インサートを確認する。
ｖｉ）クローンのシーケンシングを行ない、５’末端の配列を同定する。
８）Ｎ末端部分の配列の同定の別法：なお、１）で抽出した全ＲＮＡの収量が少ない、もしくは分解している割合が多いために７）の５’ＲＡＣＥ法の適用が困難である場合には、６）の配列と相同性の高い他のセリンプロテアーゼの翻訳開始点周辺の配列をもとに作製したプライマーと、６）で得られた部分配列の部分をプライマーに用いてＰＣＲを行うことで、セリンプロテアーゼのＮ末端部分の配列を決定する。
【００３２】９）３’末端の同定：
３’ＲＡＣＥ法を用いて、６）で得られた配列の３’末端の配列を得る。方法は、５’ＲＡＣＥ法と同様であるが、６）の部分配列については、より下流側の配列を用いる。鋳型は、５’ＲＡＣＥ法で用いたものと同じｃＤＮＡを用いる。
１０）全長の確認：
６）〜９）の操作により得られた全長の配列が、本当に存在することを確認するために、得られた配列の３’末端および５’末端の部分配列を用いて、ＰＣＲを行ない、生成物を電気泳動にかけ、バンドを切り出して回収し、Ｔベクターに接合してプラスミドを得、得られたプラスミドを菌体に形質転換し、菌体を培養後、プラスミドを回収し、シーケンシングを行なう。得られたｃＤＮＡは、公知のシグナルシーケンスの長さおよび配列との比較により、そのものが全長またはほぼ全長であることを確認する。
【００３３】このようにして得られるｃＤＮＡの塩基配列が一旦確定すると、その後は、化学合成により、あるいは本発明の塩基配列の断片を化学合成し、これをプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明のｃＤＮＡを得ることができる。さらに、本ｃＤＮＡを含有するベクターｃＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とするｃＤＮＡを必要量得ることができる。
【００３４】本発明のポリペプチドを取得する方法としては、（１）生体または培養細胞から精製単離する方法、（２）ペプチド合成する方法、または（３）遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、などが挙げられるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。
【００３５】遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。例えば、大腸菌で発現させる場合には、成熟蛋白部分またはプロフォーム蛋白部分をコードするｃＤＮＡの５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加し、得られたｃＤＮＡを、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。
【００３６】次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体から目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのフュージョン・プロテイン（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を生産することもできる。
【００３７】また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号１もしくは３で示される塩基配列をコードするｃＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、ヒト未分化好酸球白血病ＥＯＬ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
【００３８】
【実施例】
以下に実施例および参考例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００３９】実施例１（ブラリナシンの単離、精製）
以下のブラリナシンの単離、精製に関する操作は、全て低温室あるいはクロマトチャンバー内（摂氏４〜６度）にて行った。
アメリカ合衆国ミシガン州アンナーバー近郊で採集したブラリナトガリネズミ１５頭の顎下腺を摘出し、生理食塩水１０ｍＬと混合した後、ホモジェナイザーペッスルを用いて粉砕した。得られた懸濁液を遠心分離（３０，０００ｒｐｍ×１５分）して上清を回収した後、２回のゲルろ過クロマトグラフィー（アマシャム社、Ｈｉｒｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ２６／６０カラム、生理食塩水、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長：２８０ｎｍ）で分離し、保持時間２０５〜２２０分に見られたピークを回収した。
【００４０】
上記画分を透析チューブに移し、２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中で一昼夜撹拌することで脱塩した。透析チューブから回収したサンプル溶液（全量３５ｍＬ）のうち８ｍＬをイオン交換クロマトグラフィー（アマシャム社、Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  ５／５カラム、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０））、バッファーＢ（２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０））、（Ａ）：（Ｂ）＝１００：０−（４５分）→１００：０−（１５分）→９０：１０−（１５０分）→８０：２０、流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長：２８０ｎｍ）で分離し、保持時間１００〜１１６．７分に見られたピークを回収した。
【００４１】
上記画分（全量５ｍＬ）のうち０．７５ｍＬに、３Ｍ  硫酸アンモニウム１．５ｍＬを加えて混合した後、３０分間静置した。遠心分離（１００，０００ｒｐｍ×１５分）して上清を回収した後、３回の疎水性クロマトグラフィー（アマシャム社、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ＰＣ  １．６／５カラム、溶媒：バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２Ｍ  硫酸アンモニウム（ｐＨ７．０））、バッファーＢ（２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０））、（Ａ）：（Ｂ）＝１００：０−（３０分）→１００：０−（６０分）→０：１００、流速：０．０５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長：２８０ｎｍ）で分離し、保持時間８１〜８７分に見られたピークを回収することで、ブラリナシンを精製した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク量を定量し、約３２μｇと確認した（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）基準）。
【００４２】
なお、得られたブラリナシンを、還元剤（２−メルカプトエタノール）存在下で１２．５％ＳＤＳゲル電気泳動の解析を行ったところ、３２ＫＤａの単一バンドとして検出された（図１）。
【００４３】実施例２（ブラリナシンのアミノ酸配列の決定）
ブラリナシンのＮ末端アミノ酸配列を決定するため、精製したブラリナシンの溶液２５μＬを遠心操作によりメンブレンフィルターに吸着させた。メンブレンをメタノールで洗浄後、プロテインシーケンサでアミノ酸配列を解析し、ＩＸＧＧＸＥＸＤＸＨＳＸＰＸＸＡＸＬＴＲ（Ｘは不明のアミノ酸残基）と決定した。
【００４４】
精製したブラリナシンではその内部アミノ酸配列の解析を行うには量が十分ではなかったため、顎下腺抽出物を直接電気泳動で分離し、アミノ酸配列の解析に用いた。すなわち、ブラリナトガリネズミ顎下腺の生理食塩水抽出物３／４個体分を２Ｄ−Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｋｉｔ（アマシャム社）により脱塩処理し、二次元電気泳動（一次元目：等電点電気泳動、ｐＩ５−６、二次元目：１２−１４％ＳＤＳゲル電気泳動）を行った。得られた電気泳動の解析を行い、ブラリナシンと同じ等電点、分子サイズ（等電点５．５、分子サイズ３２ｋＤａ）に検出されたスポットをカミソリで切り出した。
【００４５】
上記の方法で得られたゲルを５０％アセトニトリル−０．２Ｍ  炭酸水素アンモニウムバッファーで洗浄した後、減圧下でゲルが半透明になるまで乾燥した。得られたゲルにＭｏｄｉｆｉｅｄ−トリプシン（プロメガ社）の０．６３μＭ水溶液９μＬ、および０．２Ｍ  炭酸水素アンモニウムバッファー１５μＬを順次加え、３７℃で１７時間インキュベートした。上清を回収し、ゲルに０．１％ＴＦＡ−５０％アセトニトリル−０．２Ｍ  炭酸水素アンモニウムバッファー５０μＬを加えて３０分間震盪し、上清を回収した。この操作をもう一度行い、上清を合わせて計約１１０μＬの断片化ペプチドの混合物を回収した。得られた酵素消化物を逆相高速液体クロマトグラフィー（野村化学社、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ  ＡＲ−５カラム、内径１．５ｍｍ×長さ１５ｃｍ）により分離し、１３個の断片化ペプチドを分取した。各々の断片化ペプチドのアミノ酸配列をプロテインシーケンサおよびマス−マススペクトルにより決定した（表１）。
【００４６】
【表１】
2004357658.tif 000006
【００４７】
表１中のアミノ酸残基は一文字標記法で示した。表１に示した断片化ペプチドのアミノ酸配列のホモロジー検索（ＢＬＡＳＴＰ、ＮＣＢＩ）の結果、組織性カリクレイン（ＥＣ  ３．４．２１．３５）と高い相同性を有していることを確認した。
【００４８】実施例３：セリンプロテアーゼ活性中心をコードするｃＤＮＡのスクリーニング
操作１（ランダムプライマーを用いたｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成）：
まず、プラリナトガリネズミの顎下腺（雄１／２  個体分、雌１／２  個体分）からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡ  を抽出し、エタノール沈殿により濃縮した。一本鎖ｃＤＮＡのＮ９ランダムプライマー５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’を合成し、抽出した全ＲＮＡのうち０．６３μｇ、およびＩｍｐｒｏｍーＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社）  を用いてＲＴ  反応を行い、ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  を合成した。
【００４９】操作２（カリクレインの活性中心の保存領域に対するプライマーの合成）：
ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーとして、カリクレインの活性中心の保存領域に対するセンスプライマーＫＬＫ−Ｈｉｓ−１  ：５’−ＧＧＴＫＮＴＣＡＣＲＧＣＹＧＣＹＣＡＹＴＧ−３’（Ｎ：ＡＣＴＧ，  Ｒ：ＡＧ，  Ｙ：ＣＴ，  Ｋ：ＧＴ）およびアンチセンスプライマーＫＬＫ−Ｓｅｒ−１  ：５‘−ＣＣＴＧＡＲＴＣＴＣＣＣＮＹＡＣＡＲＧＴＧＴＣ−３’（Ｎ：ＡＣＴＧ，  Ｒ：ＡＧ，  Ｙ：ＣＴ，  Ｋ：ＧＴ）をそれぞれ化学合成した。選択的ＰＣＲ１０×ＦａｓｔタックＭｇ＋バッファー（Ｆｉｒｓｔ  Ｔａｑ  Ｍｇ＋  Ｂｕｆｆｅｒ，１０μｌ、宝酒造）、２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰミクスチャー（ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ，８μｌ、宝酒造社）、ＦａｓｔＳｔａｒｔタック（ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ、１  μｌ、Ｒｏｃｈｅ社）、上記で合成したセンスプライマー（ＫＬＫ−Ｈｉｓ−１、１μｌ）、アンチセンスプライマー（ＫＬＫ−Ｓｅｒ−１、１μｌ）、およびｄＨ２Ｏ（６９μｌ）を混合し、ＰＣＲミックスを作成した。操作１で得られた２μｌ  のｃＤＮＡ（Ｎ９ランダムプライマー）と１８  μｌ  のＰＣＲミックスを混合し、チューブに分注し、遺伝子増幅ＰＣＲシステム２４００（Ｇｅｎｅ  ａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ２４００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、９５℃で５分おいた後、９５℃で０．５分、６０℃で０．５分、７２℃で０．５分を３５サイクル行った後、７２℃で４分おいた。反応後、各チューブの生成物を２％ＴＡＥアガロースゲルを用いた電気泳動にかけたのち、エチジウムブロマイド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液処理を行ない、バンドを確認したところ、４７０〜４８０ｂｐの単一のものであることを確認し、このバンドを回収した。
【００５０】操作３（オリゴｄＴプライマーを用いたｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成）：
次に、プラリナトガリネズミの顎下腺（雄１／２  個体分、雌３／２  個体分）から操作１と同様に全ＲＮＡ  を抽出し、エタノール沈殿により濃縮した。一本鎖ｃＤＮＡの合成オリゴ（ｄＴ１５）プライマー５‘−ＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’を合成し、抽出した全ＲＮＡ  １μｇ、およびＩｍｐｒｏｍ−ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社）  を用いてＲＴ  反応を行い、ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  を２サンプル合成した。得られた２μｌ  のｃＤＮＡ（オリゴｄＴプライマー）と、操作２で調整した１８μｌ  のＰＣＲミックスを混合し、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、９５℃で５分おいた後、９５℃で０．５分、６０℃で０．５分、７２℃で０．５分を３３サイクル行った後、７２℃で４分おいた。反応後、各チューブの生成物を２％ＴＡＥアガロースゲルを用いた電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処理してバンドを確認したところ、４７０〜４８０ｂｐの単一のものであることを確認し、このバンドを回収した。
【００５１】操作４（ＰＣＲ産物のベクターへの挿入、プラスミドを抽出、およびシーケンシング）：
回収したｃＤＮＡ（５μｌ）をｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  （０．５μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）にＴ４  ＤＮＡ  リガーゼ（１μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて連結した。得られたプラスミドをＤＨ５αｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  （ＴＯＹＯＢＯ社）  に形質転換し、クローンを得た。ホワイトコロニーをランダムに選び、アンピシリン含有のＬＢ培養液（Ｄｉｆｃｏ社）中で、３７℃で一昼夜振とうした。ＡＵＴＯＭＡＴＩＣ  ＤＮＡ  ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ  ＰＩ−５０（ＫＵＲＡＢＯ社）のプラスミド抽出装置を用いて、プラスミドを抽出した。プラスミドをＥｃｏＲＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）を用いて切断し、シーケンシングを行ない、各々の核酸配列を得た。得られた２２クローン中、７クローンがブラリナシンの断片化ペプチドのアミノ酸シーケンスの結果と一致した。いずれも新規な配列であったが、うち１クローンはｍｕｔａｔｉｏｎの頻度が高く、別のサブタイプのものであることが判明した。
【００５２】操作５（３’末端の同定）：
操作３で得られたｃＤＮＡ（オリゴｄＴプライマー）を鋳型として、操作２と同様の方法により、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ−ＣＧＣ／ＴＴＶプライマー：５’−ＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３‘および操作４で得られた配列の部分配列ＫＬＫ−ｇｅｎｅ３：５’−ＧＧＣＡＧＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＴＡＣＡＧＣ−３’（１０  番目のＡはｐｒｉｍｅｒ  ｄｉｍｅｒ  を防止するためにＧをＡに変更）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、９５℃で５分おいた後、９５℃で０．５分、６０℃で０．５分、７２℃で０．７５分を３５サイクル行った後、７２℃で４分おいた。生成物をアガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処理し、予想されるサイズにシングルバンドを確認した。操作４と同様の操作により、ｃＤＮＡを回収し、ｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  にサブクローニングし、ＤＨ５−α−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  に形質転換した。アンピシリン含有のＬＢ培養液中で、３７℃で一昼夜振とうした。プラスミドを抽出後、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて切断し、得られた独立の４クローンについて、操作４と同様の方法によりシーケンシングを行なったところ、いずれのクローンにおいても、操作４で得られた配列の一部と一致した。
【００５３】操作６（３’ＲＡＣＥ  ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）：
操作５で得られたｃＤＮＡ（３’−ＲＡＣＥのＰＣＲ生成物）を鋳型として、操作２と同様の方法により、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ−ＣＧＣ／ＴＴＶプライマー：５’−ＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’および操作４で得られた配列の部分配列ＫＬＫーｇｅｎｅ４  ：５’−ＡＴＧＡＧＴＧＴＴＣＣＣＧＣＴＣＣＣＡＣ−３’を用いてＰＣＲを行なった（３’ＲＡＣＥ  ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）。ＰＣＲは、９５℃で５分おいた後、９５℃で０．５分、６０℃で０．５分、７２℃で０．７５分を２５サイクル行った後、７２℃で４分おいた。生成物をアガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処理し、予想されるサイズにシングルバンドを確認した。操作４と同様の操作により、ｃＤＮＡを回収し、ｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  にサブクローニングし、ＤＨ５−α−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  に形質転換した。アンピシリン含有のＬＢ培養液中で、３７℃で一昼夜振とうした。プラスミドを抽出後、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて切断し、得られた独立の５クローンについて、操作４と同様の方法によりシーケンシングを行なったところ、いずれのクローンにおいても、操作４で得られた配列の一部と一致した。
【００５４】操作７（異種のカリクレインのシグナルシーケンスを利用したＮ  末端配列の決定）
次に、操作１で得られたｃＤＮＡ（Ｎ９ランダムプライマー）を鋳型として、操作２と同様の方法により、異種のカリクレインのシグナルシーケンスを利用したＮ末端配列の決定を行った。プライマーには異種のカリクレインのシグナルシーケンスを利用したＫＬＫ−ＭＷＦ：５’−ＡＴＧＴＧＧＴＴＣＣＴＧＲＴＹＣＴＧＴＫＣＣＴ−３’（Ｒ：ＡＧ，  Ｙ：ＣＴ，  Ｋ：ＧＴ）、および操作４で得られた配列の部分配列ＫＬＫ−ｇｅｎｅ２：５’−ＧＡＴＣＴＣＧＴＣＧＴＡＧＴＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＣＡ−３’を用いた。ＰＣＲは、９５℃で５分おいた後、９５℃で０．５分、６０℃で０．５分、７２℃で０．７５分を３５サイクル行った後、７２℃で４分おいた。生成物をアガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処理し、予想されるサイズにシングルバンドを確認した。操作４と同様の操作により、ｃＤＮＡを回収し、ｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングし、ＤＨ５−α−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  に形質転換した。アンピシリン含有のＬＢ培養液中で、３７℃で一昼夜振とうした。プラスミドを抽出後、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて切断し、得られた独立の８クローンについて、操作４と同様の方法によりシーケンシングを行なったところ、いずれのクローンにおいても、操作４で得られた配列の一部と一致した。
【００５５】操作８（全長核酸配列の確認）：
操作４〜操作７より得られた、配列の部分配列であるＫＬＫ−ｇｅｎｅ６：５’−ＧＣＡＴＴＴＡＧＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＣＧＡＴ−３’およびヒトカリクレインのＫｏｚａｋ配列をＮ末端側に７塩基付け加えた配列ＫＬＫ−ｇｅｎｅ７  ：５’−ＴＧＴＣＡＣＣＡＴＧＴＡＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴ−３’をプライマーとして用い、操作３で得られたｃＤＮＡ（オリゴｄＴプライマー）を鋳型として、操作２と同様の操作によりＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で５分おいた後、９５℃で０．５分、６５℃で０．５分、７２℃で１．０分を３０サイクル行った後、７２℃で７分おいた。生成物をアガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処理し、予想されるサイズにシングルバンドを確認した。操作４と同様の操作により、ｃＤＮＡを回収し、ｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  にサブクローニングし、ＤＨ５  α  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  に形質転換した。アンピシリン含有のＬＢ培養液中で、３７℃で一昼夜振とうした。プラスミドを抽出後、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて切断し、得られた独立の２０クローンについて、操作４と同様の方法によりシーケンシングを行なった。その結果、９１８ｂｐのｃＤＮＡ配列（配列番号１および３）を決定した。
【００５６】
得られた２０クローンのうち、アミノ酸レベルで配列が異なる２つのタイプの存在を確認した。すなわち、３５８番目がｔあるいはａ（アミノ酸でＬｅｕ叉はＭｅｔ）、３７６番目がｇあるいはｔ（同Ａｓｐ叉はＴｙｒ）、３８６番目がｃあるいはｔ（同Ｓｅｒ叉はＰｈｅ）、３８９番目がｔあるいはｃ（同Ｌｅｕ叉はＰｒｏ）、７７３番目がｃあるいはｔ（同Ｔｈｒ叉はＭｅｔ）の違いが認められた。クローン中に認められた頻度は、前者が２０クローン中１５クローンで、後者が２０クローン中５クローンであった。この２つは同じ遺伝子由来と思われ、ジェノミックＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される際に、この２つのバリエーションが生じるものと考えられる。したがって、ブラリナシンには５か所のアミノ酸が異なるの２つのタイプが存在すると判断した。
【００５７】
また、２種類のクローンのそれぞれに、Ａｌｌｅｌｅ  が３か所認められた（１１７番目がａ叉はｇ、３７２番目がｃ叉はｔ、４５０番目がｔ叉はｃ）。これらはアミノ酸に翻訳される時に変化はなく、また３個体から総ＲＮＡを抽出したことを考慮し、Ａｌｌｅｌｅ  であると判断した。２０クローン中１５クローンで確認された核酸配列を配列番号１に、核酸配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ示す。また、２０クローン中５クローンで確認された核酸配列を配列番号３に、核酸配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。タンパク質のＮ末端部分に関しては、実施例２で示したブラリナシンのＮ末端アミノ酸配列と、核酸の８５番目から翻訳されるアミノ酸の配列が一致したことから、その位置を特定した。さらに、２つの推定アミノ酸配列（配列番号２および４）には、実施例２で明らかにしたブラリナシンの９個の断片化ペプチドのアミノ酸配列（表１）は全て含まれることから、ブラリナシンのアミノ酸配列は両者のうちどちらかであると推定した。
【００５８】
本発明の推定アミノ酸配列（配列番号２および４）は、共にシグナルペプチド（Ｔｙｒ−２８〜Ａｒｇ−１）を含む全長２８０アミノ酸からなっており、セリンプロテアーゼのプロファイル（活性中心、Ｈｉｓ４４、Ａｓｐ１０９、Ｓｅｒ２０４）を有していた。また、組織性カリクレインやトリプシンなど、分泌型セリンプロテアーゼに共通する、１０個のシステイン残基（７、２８、４４、１４１、１６４、１７５、１８９、２００、２１０、２２５番目）が保存されていた。
【００５９】実施例４（ペプチド分解活性）
５０ｍＭ、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中で、実施例１で精製したブラリナシンの添加量を変化させて、最終濃度１００μＭにて、トリプシン型のセリンプロテアーゼが特異的に切断する人工基質、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ペプチド研）の分解反応を測定した。測定系の全体量は５００μｌとし、３７℃で水晶キュベット中に維持して反応させることで、分解生成物である７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の生成量をモニターした。蛍光の測定は、日立蛍光光度計Ｍｏｄｅｌ  ６５０−１０ＭＳ型装置にて、励起波長３７０ｎｍ、螢光波長４６０ｎｍにて行った。なお、１ｕｎｉｔは、１分間に１μｍｏｌｅのＡＭＣを遊離させるプロテアーゼの強さとした。その結果、図２に示すように、ブラリナシンの添加量に比例した活性が検出され、本発明のブラリナシンは確かにセリンプロテアーゼ活性を有することが確認された。
【００６０】（至適ｐＨ）
バッファーのｐＨを５．５から１０．０の範囲で０．５ずつ変化させて、ペプチド分解活性を比較した。ｐＨ５．５から７．５には５種類の５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０と８．５には２種類の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、およびｐＨ９．０から１０．０には３種類の  ５０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨバッファーを用い、ブラリナシンのＰｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡの分解反応を、上記方法に準じて測定した。その結果、図３に示すように、ｐＨ９．５において最も高い分解活性がみられたが、ｐＨ８．５においても極大値を示したことから、ブラリナシンの至適ｐＨを８．５と判断した。
【００６１】（基質特異性）
５０ｍＭ、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中での、ブラリナシンの２７種類の基質に対する分解活性を、上述の方法に準じて測定した。その結果を表２に示す。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
表２において、「活性」とはそれぞれの基質に対するブラリナシンの分解活性を、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（コントロール、Ｎｏ．１）に対する酵素活性を１００とした時の相対値で示した。表２に示すように、トリプシン型のセリンプロテアーゼが特異的に切断する人工基質、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ（Ｎｏ．１８）に対して、特に強力な分解活性がみられた。
【００６４】
【発明の効果】
本発明のブラリナシンは新規セリンプロテアーゼであり、そのまま降圧剤、血液凝固調節、麻酔剤等の医薬品として利用できるほか、該当プロテアーゼをコードするＤＮＡのクローニングや、プロテアーゼタンパク質生産の手掛りとなると期待される。また、プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビターの平衡状態による調節が関与する様々な疾病の予防、治療に必要な疾患誘発の指標マーカーやプロテアーゼインヒビター等の医薬品開発、トランスジェニック又はノックアウト動物による病態モデル系の確立等に利用できると期待される。
【００６５】
本発明のセリンプロテアーゼを用いることにより、本発明のポリペプチドと結合する蛋白（受容体）の精製、あるいは遺伝子クローニングをすることができる。また本発明のセリンプロテアーゼのアゴニスト、アンタゴニストの検索に用いることもできる。
【００６６】
本発明のｃＤＮＡは、多大な有用性が期待される本発明セリンプロテアーゼを生産する際の重要かつ必須の鋳型として利用できる。また、本発明のｃＤＮＡをプローブとしてジェノミック（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡを分離できる。同様にして、本発明ｃＤＮＡと相同性の高いトガリネズミの関連ポリペプチドの遺伝子、またトガリネズミ以外の生物種においても本発明セリンプロテアーゼと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ブラリナシンのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図２】ブラリナシンの酵素活性試験（濃度依存性）を示すグラフである。
【図３】ブラリナシンの酵素活性試験（ｐＨ依存性）を示すグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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