(57)【要約】  【目的】皮膚の老化を防止し、皮膚の健康を図ることで、本来自然に備わる肌美を実現する化粧料を提案する。  【構成】  皮膚有用常在細菌叢の好気性最優勢菌スタフィロコッカス・エピデルミデスの発育を増進する作用と、当該菌体が生産分泌するスーパーオキサイド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）様活性物質を高める作用をもつ、金属イオンであるマンガン、及び、亜鉛、あるいは、それらの塩、例えば、塩化マンガン、及び、酸化亜鉛、あるいは、いずれか一つを微量含有する。  【選択図】図  １【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚有用常在細菌叢の好気性最優勢菌スタフィロコッカス・エピデルミデスの発育を増進する作用と、当該菌体が生産分泌するスーパーオキサイド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）様活性物質を高める為に、マンガンイオン、亜鉛イオンのいずれか一つ又は両方を微量含有することを特徴とする化粧料。
【請求項２】
前記マンガンイオンは、０．１〜１００ｍＭの濃度範囲であり、望ましくは、０．１〜１０ｍＭの濃度範囲を含有する請求項１に記載の化粧料。
【請求項３】
前記亜鉛イオンは、０．０１〜５ｍＭの濃度範囲であり、望ましくは、０．１〜１ｍＭの濃度範囲を含有する請求項１に記載の化粧料。
【請求項４】
前記マンガンイオンが０．００２重量％のマンガンイオンの金属塩である請求項１に記載の化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は本化粧料が、健全な皮膚常在菌叢の維持・増進をはかり、その皮膚常在細菌が分泌するＳＯＤ様活性物質を高めることにより皮膚に大敵である皮膚表面の活性酸素を分解除去し、整肌、皮膚老化防止に役立つ化粧料、皮膚外用剤としての利用が期待される。
【背景技術】
【０００２】
生体にとって有害な活性酸素はＯ2を代謝系に用いる生物に於いて恒常的に産生されるが、活性酸素の一種であるスーパーオキサイドアニオン（Ｏ2-)の不均化反応を触媒するＳＯＤは代表的な抗酸化酵素であり、この酵素活性により細胞はその酸素傷害から守られているといわれる。皮膚の健康科学においても、この活性酸素が太陽光紫外線による皮膚脂質酸化に介在し、皮膚老化の加速、また、肌のトラブルへの関与が注目され、ＳＯＤ活性物質の化粧料、或いは、皮膚外用剤への応用が提案されてきた。（特開平1-96107）  
【０００３】
しかし、動物、あるいは、植物、微生物から精製される天然物由来ＳＯＤ、あるいは、ＤＮＡ組替体由来ＳＯＤは、製造コストの上から、また、製剤の中での保存安定性など品質管理上からも問題を残していた。
【０００４】
最近、皮膚表面に生息する皮膚常在細菌で好気的に生育する菌は、酸素に強く、また、直接太陽の紫外線をうけることから活性酸素に暴露されることが多く高い抗酸化能をもっていることが示唆されている。実際、代表的好気性常在細菌で最優勢菌スタフィロコッカス・エピデルミデスは、その培養液、或いは、その培養菌体破砕物が抗酸化性を示すことから、それらを配合する化粧品、外用剤の提案もなされている。（特開平6-271851）しかし、製剤としての不安定性において問題が残っていた。
【特許文献１】特開平１−９６１０７号公報
【特許文献２】特開平６−２７１８５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のごとく、ＳＯＤあるいは培養抗酸化性物質を化粧料に直接配合すると、臭いや色さらに使用時のＳＯＤ活性の保存安定性など品質管理上の問題解決が課題として残っていた。このようにＳＯＤおよび抗酸化物質の整肌作用に永年注目されてきたにもかかわらず化粧料への配合応用はまだ解決すべき点が多く残されている。本発明は、ＳＯＤ或いはＳＯＤ様活性物質を常に皮膚の上で安定的に発現確保できるよう、直接化粧料に配合するのではなく、健常人の皮膚上に最も多く生育している有用な皮膚常在菌のＳＯＤ活性を効率よく分泌させる作用物質を配合することにより、皮膚の老化防止効果及び整肌作用を示す安価で安全な皮膚抗酸化性化粧料を提供することにある。
【０００６】
特に、健康なヒトの皮膚の上で好気性菌として最優勢のものは、スタフィロコッカス・エピデルミデスで1×104個/cm2程度で安定的常在皮膚細菌叢を形成している。このスタフィロコッカス・エピデルミデスは高い抗酸化能により皮膚表面に定着増殖し、ＳＯＤ様活性物質を菌体外に分泌し、その結果紫外線などにより生じた皮膚上のＯ2-を消去して皮膚傷害を防止し、皮膚の健康度を増し、他細菌の感染を防止する役割などを果たしていると考えられている。実際、アトピー性皮膚炎等の傷害をもつ皮膚（荒れた肌）あるいは乾燥した肌では皮膚細菌フローラのバランスが崩れ、スタフィロコッカス・アウレウスやミクロコッカス属に属する有害菌が高い割合で見られる。優勢菌としてのスタフィロコッカス・エピデルミデスは、上記有害菌の増殖を抑制するので、軽度の皮膚傷害はスタフィロコッカス・エピデルミデスを選択的に増殖させることのできる化粧料を提供することによって、病原菌の増殖を抑制し皮膚傷害の改善効果を期待することも可能となる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は上記問題を解決するために鋭意研究を重ね、スタフィロコッカス・エピデルミデスの菌体外ＳＯＤ様比活性を高め、また貧栄養培地においても金属イオンであるマンガンと亜鉛を添加する事により同菌を短時間で増殖させ、長期間菌体外ＳＯＤ様活性物質を維持されることができることを見出し本発明をするに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は皮膚上に常在するスタフィロコッカス・エピデルミデスを短期間で増殖させ、菌体外ＳＯＤ様比活性を高めることのできる物質を配合する化粧料である。また、この化粧料は、皮膚細菌叢の正常化及びその菌体外分泌ＳＯＤ様活性物質の活性を高めることによる整肌を達成する安定性の高い、安全な化粧料である。
本発明をよりよく説明するため、以下に実施例を記述する。
【０００９】
（１）本発明の実効性を証明するため用いる微生物は、以下の実施例に用いられたごとく、健常人の皮膚に生息する代表的皮膚常在菌であるスタフィロコッカス・エピデルミデスであるか、あるいは、皮膚有害菌の代表としてスタフィロコッカス・アウレウス菌である。しかし、本発明を実施するため用いる細菌は、皮膚に存在する細菌として通過性のものも含めていずれの菌種、菌株を問わず用いる事が出来る。
【００１０】
（２）本発明の実効性を証明するため用いた培地は、通常の富栄養培地だけでなく、金属イオン要求性を調べるため最小発育培地も用いた。すなわち、最小発育培地では、エネルギー源としてグルコース及び酵母エキスを添加し、pH調製のため炭酸カルシウムを添加したものを基礎培地とした。細菌の金属要求性は知られているが、あらかじめＳＯＤの活性中心となるマンガンをはじめとする数種類の金属イオンについて基礎培地に添加し、発育阻害の起こらない濃度を検討した。したがって、本発明において用いる最小発育培地は細菌類の生育可能な最少濃度の金属を添加したものと定義される。
【００１１】
（３）本発明の実効性を証明するため用いた細菌の培養法は、上記菌株及び培地を用い、細菌を37℃の好気的条件下でロータリーシェーカー（１２０rpm）で培養した。
【００１２】
（４）本発明の実効性を証明するため用いた試料調製法は、以下の通りである。まず、上記培地で十分に発育した菌を、冷却高速遠心機（佐久間製作所製）で10000rpm、１０分、４℃にて菌体と培養上清に分離。ついで、培養上清のＳＯＤ活性測定にあたり以下のように濃縮した。培養上清に冷アセトンを最終濃度７５％となるよう添加して−２０℃冷凍庫に静置し、形成した沈殿物を冷却遠心分離機によって分離回収し、少量の精製水に溶解し凍結乾燥を行い、アセトン粉末試料を得た。この粉末体を精製水で溶解したものを菌体外分泌性成分試料とした。
【００１３】
（５）本発明の実効性を証明するため用いたＳＯＤ様活性物質の測定として、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）法を用いた。この測定法は数ある測定法の中で比較的簡便で、感度が高く、nｇオーダーまで検出が可能である。キサンチンオキシダーゼによりＯ2-を発生させ、Ｏ2-によるニトロブルーテトラゾリウムの発色度を波長560nmの吸光度で測定するものである。ＳＯＤの存在によりＯ2-が不均化されるとＮＢＴの発色阻害が起こり、この阻害率からＳＯＤ活性が求められる。この方法を用いて菌体外に分泌されるＳＯＤ様活性物質が培養上清試料のアセトン濃縮処理と併せ用いることにより高い感度で測定が可能となった。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。しかし、本発明の範囲は以下の実施例に制限されるものではない。
【発明の効果】
【００１４】
本発明による金属イオンの亜鉛とマンガンを適量含有する化粧料を用いることにより、皮膚有用常在細菌叢の健全な育成と菌体からのＳＯＤ様活性物質分泌が促進され、皮膚有害菌の生育阻止、皮膚細胞の活性酸素傷害防止、皮膚細胞老化防止などの効果が期待される。 
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、好ましくは０．１〜１０ｍＭの濃度範囲のマンガンイオン、好ましくは０．１〜１ｍＭの濃度範囲の亜鉛イオンの一方又は両方含有した化粧料により、優良な皮膚常在菌の育成を図り、
【実施例】
【００１６】
実験例１  スタフィロコッカス・エピデルミデスの発育に及ぼす金属イオンの影響について：
一連の実験に用いた基礎培地は、デイビス培地（リン酸水素二ナトリウム１２水和物,  8ｇ;リン酸二水素カリウム,  2ｇ;クエン酸ナトリウム,  0.5ｇ;  硫酸マグネシウム７水和物,  0.1ｇ;  硫酸アンモニア,  1ｇ;  グルコース,0.5ｇ/蒸留水  １リットル (ｐＨ７)）に酵母エキス 0.1％及び炭酸カルシウムを1％添加したものを用いた。接種菌１×１０5個/mlとし、培養は37℃の恒温槽で行った。実験に用いた金属は硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化マンガン、酸化亜鉛、硫酸第一鉄であり、濃度はそれぞれ  100μＭ,1ｍＭ,10ｍＭとし、培養開始前に添加した。24時間の培養後標準寒天プレートに培養液を塗布し定法により生菌数を計測した。その結果を表１に示す。
【表１】
2004217673.tif 000002
表１に示すごとく、塩化マンガン及び硫酸亜鉛、酸化亜鉛、硫酸第一鉄に発育促進効果が見られた。
【００１７】
実験例２  皮膚から分離した菌に対する酸化亜鉛と塩化マンガンの生育促進及び阻害効果について：  
実験例１においてスタフィロコッカス・エピデルミデス培養上清のＳＯＤ様活性物質を測定した結果、硫酸亜鉛及び塩化マンガンを添加した実験群が対照群より高い値を示したため、この２価金属イオンに注目した。このとき硫酸亜鉛に対して化粧品に広く用いられている酸化亜鉛を用い、硫酸第一鉄は酸化して変色し、皮膚に悪影響を及ぼす可能性があるので除外した。したがって酸化亜鉛及び塩化マンガンを添加した培地を用いてスタフィロコッカス・エピデルミデスの増殖曲線を検討した。両金属濃度は100μＭとし、接種菌量は１×１０6個/mｌとした。その結果を図１に示す。
【００１８】
図１に示すごとく、酸化亜鉛及び塩化マンガンとの混合物においてスタフィロコッカス・エピデルミデスの増殖率に顕著な増大が認められた。   
【００１９】
また、スタフィロコッカス・エピデルミデス以外の皮膚常在菌についても同様な実験を行った。代表的なものとしてスタフィロコッカス・アウレウスIDD671株を用いて前述と同様な実験を行い、菌数の変化は波長595nmの吸光度で測定した。結果は図２に示す。
【００２０】
図２に示すごとく、有害病原菌であるスタフィロコッカス・アウレウスは、有用常在細菌スタフィロコッカス・エピデルミデスと異なり、添加された酸化亜鉛、塩化マンガンによって特段の生育促進は認められず、また、阻害も認められなかった。
【００２１】
実験例３  スタフィロコッカス・エピデルミデスの菌体外ＳＯＤ様活性に及ぼす酸化亜鉛、塩化マンガンの影響：  
次に、実験例１で見出された菌体外ＳＯＤ様比活性の酸化亜鉛、塩化マンガンの添加で増加する現象が培養時間と関係あるか以下のごとく調べた。培養は実験例１と同様な条件で行い、ＳＯＤ様活性は時間経過を追って測定した。各実験群につき試料数は３とし、平均値と標準偏差を算出した。以下に実験例３の実験方法についてさらに詳細説明する。
【００２２】
試料調製法：試料の調整は培養は100mlのフラスコに50mlの培養液のスケールで行い、各時間毎に5mlずつサンプリングした。培養液はただちに遠心分離（10,000rpm,4℃,10分）して菌体と上清に分けた。集めた上清を氷冷し、-20℃のアセトンを終濃度75%になるように撹拌しながら添加して氷冷中で2時間放置する。そのあと再び遠心分離（10,000rpm,4℃,10分）して沈澱物を収集した。沈澱物を少量の精製水に溶解し、-80℃で凍結させ凍結乾燥を行い、アセトンを除去する。得られた乾燥粉末を精製水で溶解したものをサンプルとして用い、タンパク定量及びＳＯＤ様活性の測定を行った。
【００２３】
タンパク定量法：タンパク質の定量にはLowry法を用いた。タンパク質を10〜100μｇを含む試料 0.4 mｌを試験管にとり、アルカリ銅溶液（1％硫酸銅1mlと2％ロッシェル塩1mlの混合液を2％炭酸ナトリウム, 0.1Ｎ 水酸化ナトリウム 100 mlに添加したもの）を2 ml添加して撹拌し、室温で10分間放置する。その後直ちに1Ｎフェノール試薬を0.2 ml添加撹拌した後、室温で30分間放置する。30分後に 750 nm で比色定量した。牛血清アルブミン(ＢＳＡ、SIGMA社製)を標準液とした。
【００２４】
ＳＯＤ様活性物質の測定法：試験管に試料を50 μｌをとり  ＸＯＤ（キサンチンオキシダーゼ）液（ＸＯＤを0.5Ｍ硫酸アンモニウム,ＥＤＴＡ-２Ｎａ 1 mＭ溶液に溶解して-20℃に保存しておき、使用直前に溶解し、1分あたりのＯＤ560nmの変化が0.0185になるように希釈したもの）を50μｌ添加し、撹拌せずに25℃水浴下に10分間おく。25℃に加温しておいたＡ液（0.1 mＭ キサンチン、 0.025  mＭ ニトロブルーテトラゾリウム、 0.1 mＭ ＥＤＴＡ-２Ｎa、50 mＭ 炭酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ10.2)）を2.85 mｌ添加後、直ちに撹拌し、25℃水浴下で5分間おいた後、塩化銅溶液（0.2％ ＣｕＣｌ2・Ｈ2Ｏ）を50μl添加して撹拌し、560nmで比色定量する。対照には試料の代わりに精製水を添加し、ブランクは試料及びＸＯＤ液を除いた0.2Ｍ硫酸アンモニウム溶液のみで測定した。ＳＯＤ活性は吸光度変化が50％阻害されるときを1単位（Ｕ）と定義し、以下の計算式によって算出した。
SOD (U/ml)=[(対照ＯＤ - フ゛ランクＯＤ)/(試料ＯＤ - フ゛ランクＯＤ)-1]×20
【００２５】
その結果を表２に示す。
【表２】
2004217673.tif 000003
【００２６】
表２のごとく、酸化亜鉛及び塩化マンガンを単独あるいは混合し添加すると、培養初期において顕著な菌体外ＳＯＤ比活性の増大が認められる結果を得た。
【００２７】
実施例１  皮膚刺激性テスト（安全性について）：
以上の結果にもとずいて、マンガン及び亜鉛を配合した化粧料の刺激性テストを行った。  化粧料の配合例として以下（表３）の溶液を濾紙に20μl浸み込ませ、成人男子（ｎ=1）の前腕内側部皮膚上にテープで閉鎖貼布し、24時間後の皮膚刺激性について観察を行い、表４に示す結果を得た。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
サンプル番号１，２は、マンガンと亜鉛の配合剤及び炭酸カルシウムの刺激性について調べるため、サンプル番号３は対照として作成した。肉眼による判定は、赤斑の観察及び刺激性は全く認められず安全性になんら問題はなかった。
【００３０】
【表４】
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【００３１】
次に、この発明にかかる化粧料の処方例を例示する。配合割合はすべて重量％で示す。なお、この発明は以下の処方例にかかる化粧料になんら限定されないのは言うまでもない。
【００３２】
実施例２  化粧水の組成                        
【表５】
2004217673.tif 000006
【００３３】
実施例３  カラミンローションの組成            
【表６】
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【００３４】
実施例４  スキンローションの組成              
【表７】
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【００３５】
実施例５  スキンクリームの組成                
【表８】
2004217673.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】スタフィロコッカス・エピデルミデスの発育に及ぼす金属イオンの影響を示す図である。
【図２】スタフィロコッカス・アウレウスに対する酸化亜鉛と塩化マンガンの生育促進及び阻害効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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