(57)【要約】      （修正有）【課題】生体内のコレステロールレベルは、複雑なシステムで制御されていることから、食品中のコレステロ−ルを吸着、又は吸収阻害する方法では、生体内のコレステロールの低下は限定的であった。【解決手段】菌体への胆汁酸吸着作用、胆汁酸変換・分解作用（即ち胆汁酸を胆汁酸以外の化合物に変換するか又は分解する作用）に基づき、乳酸菌をスクリーニングし、コレステロール低減に極めて有用な乳酸菌を見出すことに成功した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
供試乳酸菌のコール酸を吸着する能力及びコール酸を変換又は分解する能力を調べ、コール酸を吸着する能力及びコール酸を変換又は／及び分解する能力に優れた株を選択する工程を含む、生体内のコレステロールを低減させる作用を有する乳酸菌のスクリーニング方法。
【請求項２】
ｐＨが６〜８の範囲において、コール酸を吸着する能力及びコール酸を変換又は分解する能力に優れた株を選択する工程を含む、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
供試乳酸菌のコール酸を吸着する能力及びコール酸を変換又は分解する能力を調べ、コール酸を吸着又はコール酸を変換又は分解することにより１５％以上のコール酸を除去することができる株を選択する工程を含む請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１−３いずれか１項記載のスクリーニング方法により選抜された、生体内のコレステロールを低減させる乳酸菌。
【請求項５】
コール酸を吸着する能力及びコール酸を変換又は分解する能力を有する乳酸菌。
【請求項６】
ｐＨ６〜８の範囲内において１５％以上のコール酸を吸着する能力及び／又はコール酸を変換又は分解する能力を有する、請求項４記載のコレステロール低減作用を有するラクトバチルス属菌株。
【請求項７】
ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６７である請求項４記載のコレステロール低減作用を有するラクトバチルス属菌株。
【請求項８】
請求項４−７項いずれか１項記載の乳酸菌を含有する機能性飲食品。
【請求項９】
機能性飲食品が発酵乳製品である請求項８記載の機能性飲食品。
【請求項１０】
請求項４−７いずれか１項記載の乳酸菌を処理したコレステロール低減作用を有する組成物。
【請求項１１】
請求項１−３いずれか１項記載の方法によりスクリーニングされた乳酸菌を含むことを特徴とするコレステロール低減剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内のコレステロール低減作用を有する乳酸菌を含有する食品に係る発明である。
【０００２】
【従来の技術】
現在までに、コレステロールを菌体に吸着する乳酸菌、生体内のコレステロール合成酵素を阻害する乳酸菌の存在が示され、コレステロールの生体内収支に直接的に作用することで生体内コレステロール値を低減させる乳酸菌が報告されている。
【０００３】
例えば、特開２０００−１９７４６９号（下記特許文献１）では、胆汁酸非生成であり且つ胆汁酸の一つであるタウロコール酸を吸着することが認められたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＴＭＣ０４０９をもちいて血清コレステロール低下を狙っている。
【０００４】
また、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．１８，  Ｎｏ．１，  ４３−５０（１９９９）（下記非特許文献１）  では、Ｌ．  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  の分離菌株（Ｌ１）を用い、実際に血中コレステロールを測定し、ヒトの血清中のコレステロール低下作用があることを報告している。
【０００５】
また、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．４９，  ｎｏ．２，  Ｐ．３７７−３８１（下記非特許文献２）には、胆汁の存在下で生育しコレステロールの資化能力がある菌株が、高コレステロール飼料を与えられた豚の血清コレステロールの増加を有意に阻害したことが報告されている。更に、特許第２９９２９４５号（下記特許文献２）においては、乳酸菌のコレステロール低下作用は、コレステロールの吸着及び胆汁酸脱抱合活性等によるものと考えられている。胆汁酸脱抱合能は、遊離のコール酸を生じて抱合胆汁酸のコレステロールの吸収能を阻害すると同時に他の栄養素の吸収も阻害し、また脱抱合された胆汁酸が二次胆汁酸と変換されると大腸癌リスクが高くなることから、胆汁酸脱抱合活性を有しないコレステロール低減作用を有する乳酸菌が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】
特開２０００−１９７４６９号公報
【特許文献２】
特許第２９９２９４５号
【非特許文献１】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．１８，  Ｎｏ．１，  ４３−５０  （１９９９）
【非特許文献２】
Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．４９，  ｎｏ．２，  Ｐ．３７７−３８１
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、現在までの乳酸菌による、コレステロールの低減作用は、コレステロールの吸着又はコレステロールの吸収阻害など、体外から生体内へ吸収されるコレステロール量を制御しようとするものであった。
【０００８】
ところが、生体内のコレステロールは、食物由来のコレステロールが消化吸収されたものか、肝臓で生合成されたものであるところ、食物由来のものは、０．３ｇ／Ｄａｙにすぎず、肝臓で生合成されるものが、１．２ｇ／Ｄａｙと８０％を占めており、食品中のコレステロ−ルを吸着、或いは吸収阻害する方法では、コレステロールの大きな低減は見込めない。生体内のコレステロールレベルは実際のところ、非常に複雑なシステムで制御されていることから、コレステロールを乳酸菌等で吸着することによる低下は限定的なものとならざるを得ない。
【０００９】
【課題の解決手段】
本件研究者は、コレステロールの体内への取り込み及び生合成を体系的に検討することで、生体内コレステロール低下に有用な乳酸菌の持つべき特性を特定し、係る特性に基づき、人体由来の乳酸菌を多数スクリーニングすることにより、本件発明を完成させたものである。
【００１０】
生体内コレステロールは、上述したように、食物由来のコレステロールが消化吸収されたものか、肝臓で生合成されたもので、胆汁酸やステロイドホルモン物質等の材料として用いられる。そのため、コレステロールの合成、摂取、分解全てを考慮し、理論的に検討すると、生体内コレステロール量は、（ｉ）コレステロールの消化管からの吸収、（ｉｉ）コレステロールの生合成、（ｉｉｉ）コレステロールから胆汁酸の合成、（ｉｖ）コレステロールのステロイド等への変換、の４つの経路の量により調節されていると考えられる。とすると、生体内コレステロール量は、Ｉ：消化管におけるコレステロールの吸収抑制、ＩＩ：コレステロールの生合成抑制、ＩＩＩ：コレステロールから胆汁酸の合成促進、ＩＶ：コレステロールのステロイド等への変換促進、の４つの作用によって減少させることができるはずである。この４作用の何れかの作用を有する乳酸菌を選択すれば、生体内のコレステロールの低減することができるはずである。
そこで、本件発明者等は、スクリーニング系の構築の現実的な可能性を検討し、特にＩおよびＩＩＩの作用について注目して、スクリーニング方法を開発した。
【００１１】
まず、（Ｉ）乳酸菌が消化管におけるコレステロールの吸収を抑制する作用について、どのような方法により消化管におけるコレステロールの吸収を抑制できるか（作用Ｉ）検討した。
【００１２】
第一の方法としては、乳酸菌がコレステロールに直接作用して消化管からの吸収を抑制する方法である。具体的には、コレステロール吸着作用又は菌体内へのコレステロール取り込み作用を有する乳酸菌を利用する方法が考えられる。
【００１３】
第二の方法としてはコレステロールの消化管吸収機構を阻害する方法である。胆汁酸であるコール酸と抱合型胆汁酸であるタウロコール酸では、タウロコール酸にはコレステロールの消化管吸収を促進する作用があるが、コール酸はタウロコール酸に比較して、コレステロールの消化管吸収促進作用は低い。そこで、タウロコール酸からコール酸に変換する乳酸菌（脱抱合作用を有する乳酸菌）を利用する方法である。
【００１４】
次に、（ＩＩＩ）乳酸菌がコレステロールからの胆汁酸の合成促進する作用について検討した。胆汁酸は肝臓でタウリンやグリシンで抱合された抱合型胆汁酸として胆汁中に蓄積され、消化管管空内に分泌される。分泌された胆汁酸の８割以上は小腸で再吸収され、約１割程度は大腸で再吸収される。残りの数％は糞便と共に生体外に排出されるか、腸内細菌によって分解される。腸管で再吸収された胆汁酸は肝臓で再び抱合体に変換され、胆汁として消化管の管空内に分泌される。しかし、腸管で再吸収されなかった量の胆汁酸が再分泌に不足するため、この量を補うために肝臓でコレステロールから胆汁酸が合成されるのである。即ち、小腸での胆汁酸再吸収量を少なくすれば、コレステロールからの胆汁酸合成が促進され、結果的に血中コレステロール値が低下すると考えられる。
【００１５】
そこで、乳酸菌が小腸における胆汁酸の再吸収を抑制する作用について、小腸での環境を考慮しながら現実的かつ理論的な作用を考えると、４つの作用が考えられた。
【００１６】
即ち、（イ）胆汁酸脱抱合作用（抱合型よりも脱抱合型胆汁酸が小腸の回腸部分から吸収されにくいため）、（ロ）菌体への胆汁酸吸着作用、（ハ）菌体内への胆汁酸取り込み作用、（ニ）胆汁酸を胆汁酸以外の化合物に変換するか又は分解する作用、の４つの作用である。胆汁酸脱抱合作用（作用（イ））は上述の作用Ｉ（乳酸菌が消化管からのコレステロールの吸収を抑制する作用）と重複する作用である。また、菌体内への胆汁酸取り込み作用（作用（ハ））は菌体外と菌体内ｐＨの差に依存することが報告されている。
【００１７】
そこで、本発明者等は、菌体への胆汁酸吸着作用（作用（ロ））、及び胆汁酸を変換又は分解作用（作用（ニ））に基づき、乳酸菌を選択したところ、コレステロール低減に極めて有用な乳酸菌を見出すことに成功したものである。
【００１８】
更に、好適には、乳酸菌の胆汁酸脱抱合作用（作用（イ））に基づく選抜を上記選抜に組み合わせ、乳酸菌の胆汁酸脱抱合作用（作用（イ））、菌体への胆汁酸吸着作用（作用（ロ））、及び胆汁酸変換・分解作用（作用（ニ））に基づき、乳酸菌を選択することにより、更に優れた、コレステロール低減性に有用な乳酸菌を選抜することができた。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本願発明者は、コレステロール低減作用に優れた乳酸菌をスクリーニングする方法を提供する。
【００２０】
本スクリーニング方法は、（１）対象となる乳酸菌を、当該乳酸菌の菌体を脱抱合型胆汁酸であるコール酸溶液に懸濁し、一定時間後に菌体を除いた上清中のコール酸濃度を調べることで、菌体への胆汁酸吸着作用（作用（ロ））及び胆汁酸変換・分解作用（作用（ニ））を調べ、（２）菌体への胆汁酸の吸着作用及び胆汁酸を変換又は分解する作用に優れた乳酸菌株を選択することにより、コレステロール低減作用に優れた乳酸菌をスクリーニングするものである。
【００２１】
更に好適には、本スクリーニング方法に、抱合型胆汁酸を含む培地で培養後の抱合型胆汁酸の変化を調べることによる乳酸菌の脱抱合作用（作用（イ））を調べる工程を組み合わせても良い。
更に、本発明は、上記スクリーニング方法により得られた、コレステロール低減作用に優れたラクトバチルス属に属する乳酸菌を提供するものである。
【００２２】
上記の乳酸菌の脱抱合作用を調べる目的で乳酸菌を培養する培地に加える抱合型胆汁酸としては、公知の種々の抱合型胆汁酸が用いられるが、特に、タウロコール酸を用いることが好ましい。
【００２３】
脱抱合活性としては、標準的な乳酸菌株に比し、有意に高いことが望ましく、又、小腸内での作用が期待されることから、小腸内のｐＨである中性下で、脱抱合作用を有する物が特に望ましい。
【００２４】
また、乳酸菌の胆汁酸吸着作用及び胆汁酸を変換又は分解する作用を調べるために乳酸菌の菌体を懸濁させる胆汁酸としては、公知の種々の胆汁酸を用いることができるが、特に好適には、コール酸を用いることができる。
【００２５】
胆汁酸の吸着作用及び胆汁酸を変換又は分解する作用としては、好適には、胆汁酸総量に対し１５％程度の胆汁酸を吸着又は胆汁酸を非胆汁酸に変換又は分解することができる能力を有することが望ましい。
【００２６】
又、胆汁酸を吸着する作用及び胆汁酸を変換又は分解する作用は、小腸での吸収を妨げるためのものであるから、小腸内ｐＨでの吸着、変換又は分解する作用が重要であり、ｐＨが中性で、胆汁酸の吸着及び胆汁酸の変換・分解作用があるものが特に望ましい。
【００２７】
更に、スクリーニングの対象の乳酸菌としては、種々の乳酸菌を対象とできるが、例えば、腸内常在菌であるラクトバチルス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、及びストレプトコカッス属、更に、ビフィドバクテリウム属並びに腸内常在菌ではない乳酸菌としてはラクトコッカス属及びストレプトコッカス属に属する菌を挙げることができる。特に好適には、乳酸桿菌（ラクトバチルス）を挙げることができる。
【００２８】
スクリーニング対象としては、ヒト用の飲食品に用いる乳酸菌であるから、好適にはヒトから分離した菌株を用いることができ、具体的には、排泄物からの分離菌株を用いることができる。
【００２９】
本発明は、このようなスクリーニング方法により分離された、コレステロール低減作用を有する乳酸菌を包含する。具体的には、下記に詳述する実施例においてスクリーニングされた、供試菌Ｎｏ．２５菌株は、脱抱合作用を有し、コール酸の吸着・変換分解活性も極めて高く、しかも小腸の管空ｐＨに相当するｐＨ７−８付近で、コール酸を変換又は分解する能力が特に顕著という、コレステロール低減に極めて適した菌株が挙げられる。本菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＯＬＬ  ２７３２）は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに平成１４年１０月１６日付けで、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６７号として寄託されている。
なお本菌株の菌学的性質は下記の通りである。
【００３０】
１．本菌株の生育する培地、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ（ＤＩＦＣＯ，  カタログｎｏ．０８８１−１７−５）
培地組成
Ｂａｃｔｏ  Ｐｒｏｔｅｏｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｎｏ．３  −−−−１０ｇ，      Ｂａｃｔｏ  Ｂｅｅｆ  Ｅｘｔｒａｃｔ  −−−−−１０ｇ，      Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ−−−−−５ｇ，      Ｂａｃｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ−−−−−−−２０ｇ，      Ｔｗｅｅｎ  ８０−−−−−１ｇ，Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ−−−−−２ｇ，        Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ−−−−−２ｇ，        Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ−−−−−０．１ｇ，        Ｍａｎｇａｎｅｓｅ  Ｓｕｌｆａｔｅ−−−−−０．０５ｇ，        Ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−−−−−２ｇ
培地の殺菌条件
オートクレーブ  １２１℃  １５分
【００３１】
２．本菌株の特徴
（１）乳酸醗酵型式、ヘテロ
（２）好気的条件での生育、＋
（３）カタラーゼ、−
（４）１５℃での生育、−、４５℃での生育：＋
（５）糖醗酵性試験
Ｇｌｙｃｅｒｏｌ：−、Ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ：−、Ｄ−Ａｌａｂｉｎｏｓｅ：−、Ｌ−Ａｌａｂｉｎｏｓｅ：＋、Ｒｉｂｏｓｅ：＋、Ｄ−Ｘｙｌｏｓｅ：＋、Ｌ−Ｘｙｌｏｓｅ：−、Ａｄｏｎｉｔｏｌ：−、Ｇａｌａｃｔｏｓｅ：＋、Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ：＋、Ｄ−Ｆｒｕｃｔｏｓｅ：＋、Ｄ−Ｍａｎｎｏｓｅ：−、Ｌ−Ｓｏｒｂｏｓｅ：−、Ｒｈａｍｎｏｓｅ：−、
Ｉｎｏｓｉｔｏｌ：−、Ｍａｎｎｉｔｏｌ：−、Ｓｏｒｂｉｔｏｌ：−、Ａｍｙｇｄａｌｉｎｅ：＋、Ａｒｂｕｔｉｎｅ：−、Ｅｓｃｕｌｉｎｅ：＋、Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ：−、Ｍａｌｔｏｓｅ：＋、Ｌａｃｔｏｓｅ：＋、Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ：＋、Ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ：＋、Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ：−、Ｉｎｕｌｉｎｅ：−、Ｍｅｌｅｚｉｔｏｓｅ：−、
Ｄ−Ｒａｆｆｉｎｏｓｅ：＋、Ａｍｉｄｏｎ：−、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ：−、Ｘｙｌｉｔｏｌ：−、Ｄ−Ｔｕｒａｎｏｓｅ：＋、Ｄ−Ｌｙｘｏｓｅ：−
（６）乳酸桿菌である。
（７）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．である。
【００３２】
このようにスクリーニングにより分離された菌は、種々の飲食品に添加することができるほか、コレステロール含有食品を本願発明の乳酸菌で処理すること、又は、コレステロール含有食品を本願発明の乳酸菌で加工するにより、コレステロールを低減させることができる。
【００３３】
例えば、ヨーグルト製品等の乳発酵製品の製造過程において、本願発明にかかる乳酸菌を、単独で又は他の乳酸菌と混合して発酵用乳酸菌として用いることができ、更に発酵過程後に添加することこともできる。
又、保健健康食品として、これら菌体を、飲食し易い形態、例えば、固形、粉末、粒状に加工して、経口により投与するようにすることもできる。
【００３４】
更に、本件発明の乳酸菌は、菌体を通常の加工手段により加工し、菌体抽出物、菌体破砕物などの形態で利用することもできる。
更に、本件発明には、コール酸の吸着能力及びコール酸の変換・分解能力を有する乳酸菌、コール酸吸着能力及びコール酸の変換・分解能力を有するコレステロール低減用乳酸菌、コール酸吸着能力及びコール酸の変換・分解能力を有する、コレステロール低減作用を有する乳酸菌を含むコレステロール低減作用を有する組成物、並びに、コール酸吸着能力及びコール酸の変換・分解能力を有するコレステロールさせる乳酸菌を有効成分として含むコレステロール低減剤が含まれる。
【００３５】
【実施例】
（供試菌）
健常人の糞便希釈液を、２％Ｏｘｇａｌｌ添加ＭＲＳ培地で培養した培養液をＬＢＳ平板培地で培養しコロニーを単離する方法、又は糞便希釈液を直接ＬＢＳ平板培地で培養しコロニーを単離する方法により乳酸桿菌（２７菌株）を単離した。上記単離された乳酸桿菌２７株とヨーグルトスターター（３菌株）を供試菌として用いた（表１参照）。  供試菌はヨーグルトスターターと  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉを除いて全て胆汁酸耐性を有する菌株であった。
【００３６】
【表１】
2004208577.tif 000002
【００３７】
供試菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ（ＤＩＦＣＯ）を培地として、３７℃、２４時間培養した。
供試菌の凍結乾燥菌体の調製
供試菌の培養液（４０ｍｌ）を遠心分離（８０００ｇ×１０分）し、沈殿した菌体を回収した。菌体を生理食塩水（４０ｍｌ）で洗浄後、蒸留水（４０ｍｌ）で二回洗浄し、洗浄菌体を凍結乾燥して凍結乾燥菌体を調製した。
【００３８】
（１）  供試菌のコール酸の吸着、変換又は分解作用の検定（コール酸の定量方法）
供試菌によるコール酸濃度低下作用を測定することにより、供試菌によるコール酸の吸着（作用（ロ））及び供試菌によるコール酸の変換・分解作用（作用（ニ））の相加作用の検討した。
【００３９】
まず、ＰＢＳ（ＮａＣｌ  ８ｇ，  ＫＣｌ  ０．２ｇ，  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ２．９ｇ，  ＫＨ２ＰＯ４  ０．２ｇ，  蒸留水  １０００ｍｌ，  ｐＨ７．４）にコール酸ナトリウムを溶解してコール酸溶液を調製した。供試菌の凍結乾燥菌体５ｍｇにコール酸溶液を（０．１ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを添加して３７℃で１時間保持した。コール酸溶液中のコール酸濃度を次のようにして調べた。
【００４０】
試験液０．３ｍｌに塩酸（３Ｎ）０．２ｍｌを添加した後、酢酸エチル１ｍｌでコール酸を２回抽出し、酢酸エチル相を回収した。つづいて、回収したコール酸（酢酸エチル相約２ｍｌ）を遠心濃縮機で乾固し、水酸化ナトリウム水溶液（０．０１Ｎ）０．２ｍｌに溶解した。コール酸を完全に溶解後、硫酸（１６Ｎ）１．２ｍｌ、フルフラール水溶液（１％：ｗ／ｖ）０．２ｍｌを添加し、６５℃で１３分間加熱した。加熱後、混合液を室温まで冷却し、氷酢酸１ｍｌを添加して６６０ｎｍの吸光値を測定した。
【００４１】
結果を図１に示す。図１より、１菌株（Ｎｏ．２５株）のコール酸濃度低下作用が他の株と比較して著しく強かった（低下率４６％：図１）。しかし、ほとんど全ての供試株のコール酸濃度低下作用は認められないか非常に弱い作用であった（低下率は０〜１５％）。
【００４２】
（２）供試菌のタウロコール酸脱抱合作用の検定
供試菌をタウロコール酸（０．２％）添加  ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈに培養し、培養液を遠心分離（４０００ｇ×１０分）した上清の濾過液（０．４５μｍフィルターで濾過）［２μｌ］  をシリカゲルプレート（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０，  Ｍｅｒｃｋ）に５μｌをスポットした。つづいて、シリカゲルプレートを展開溶媒（エタノール：ジエチルエーテル＝  ６：４）で展開し、１０％硫酸−メタノール溶液を噴霧した後に１２０℃で２〜３分加熱して、ＴＬＣ上のタウロコール酸のスポットを確認した。
【００４３】
図１及び２に示されるように、３菌株（Ｎｏ．２，３，２５株）が培養過程で培地中のタウロコール酸をほぼ完全に分解する強い作用を有し、１４菌株がタウロコール酸脱抱合作用を有していた（図２、図３）。以上より、Ｎｏ．２５菌株は、コール酸の吸着、変換、又は分解作用に優れるのみでなく、タウロコール酸の脱抱合作用にも優れていることが見出された。
【００４４】
（３）  供試菌として、コール酸濃度低下作用の高かったＮｏ．２５菌株を用い、Ｎｏ．２５菌株のコール酸吸着作用、及びコール酸変換又は分解作用を、区別して検定した。
Ｎｏ．２５菌株の凍結乾燥菌体２４ｍｇにコール酸溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ：リン酸緩衝液ｐＨ７．４）２．４ｍｌを添加した後、コール酸と凍結乾燥菌体の混合液を６つに分注した（各０．４ｍｌ）。分注した混合液を０〜１２０分間、３７℃で保持し、混合液を遠心分離した上清０．３ｍｌに含まれるコール酸濃度を定量した。コール酸溶液に菌体を添加した直後（０分後）に低下する混合液中コール酸濃度の低下率を供試菌体のコール酸吸着作用の強さの指標とし、３７℃保持時間中に低下する混合液中コール酸濃度の低下率を供試菌体のコール酸変換・分解作用の強さの指標とした。
【００４５】
結果は、図４に示されるとおり、凍結乾燥菌体をコール酸溶液（１００μｇ／ｍｌ）に添加した直後（混合時間０分）の混合液中コール酸濃度は約８０μｇ／ｍｌであり、コール酸濃度は約２０％程度低下しており、Ｎｏ．２５株がコール酸吸着作用したものと認められる。さらに、３７℃で１２０分間保持することで混合液中コール酸濃度は更に約２０％程度低下（初濃度と比較すると４０％以上のコール酸濃度低下率を示した）しており、これはＮｏ．２５株がコール酸変換・分解作用したものと認められる。これから、Ｎｏ．２５株はコール酸吸着作用とコール酸変換・分解作用の両作用を有しているものと考えられる。
【００４６】
（４）  次に、ｐＨがＮｏ．２５菌株のコール酸吸着作用および変換又は分解作用に及ぼす影響を検定した。
Ｎｏ．２５菌株の凍結乾燥菌体６ｍｇとコール酸水溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌ、緩衝液（ｐＨ３〜９）０．３ｍｌ、蒸留水０．２ｍｌを混合した直後及び３７℃で１時間保持後に、遠心分離（８０００ｇ×１０分）した上清中のコール酸濃度を上記（２）と同様に定量し結果を図５及び６に示した。試験に用いた緩衝液はＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ３〜７）、  ０．２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７〜９）または０．２Ｍ炭酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜９）である。コール酸溶液に菌体を添加した直後（０分後）に低下する混合液中コール酸濃度の低下率からＮｏ．２５菌株のコール酸吸着作用の強さが検定できる。３７℃で１時間保持中に低下する混合液中コール酸濃度の低下率からＮｏ．２５菌株のコール酸変換・分解作用の強さを検定できる。
【００４７】
（供試菌のコール酸吸着作用）
図５に示されるように、凍結乾燥菌体をコール酸溶液（１００μｇ／ｍｌ）に添加した直後（混合時間０分）の混合液中コール酸濃度は、ｐＨ３で５８．４μｇ／ｍｌ、ｐＨ５で７６．４μｇ／ｍｌ、ｐＨ７で８３．１μｇ／ｍｌ、ｐＨ９で１０１．８μｇ／ｍｌであり、コール酸濃度低下率は図５に示す結果であった。即ち、Ｎｏ．２５株のコール酸吸着作用は酸性で高く、アルカリ性で低くなっている。
【００４８】
（供試菌のコール酸変換分解作用）
図６に示されるように、３７℃で１時間保持中に低下したコール酸濃度は、ＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液およびトリス緩衝液中では、ｐＨ３で１１．２μｇ／ｍｌ、ｐＨ５で２．２μｇ／ｍｌ、ｐＨ７で３４．４μｇ／ｍｌ、ｐＨ９で９．０μｇ／ｍｌであり、コール酸濃度低下率はｐＨ７付近で最大であった。また、ｐＨ６〜９の炭酸−リン酸緩衝液中でも、コール酸濃度低下率はｐＨ７〜８で最大であった（図７）。即ち、Ｎｏ．２５株のコール酸変換又は分解作用はｐＨ７〜８で最も強かった。
【００４９】
（コール酸変換又は分解作用の確認）
また、コール酸の濃度低下がコール酸の変換又は分解により生じていることを確認するため、コール酸変換・分解作用の最も強いｐＨの緩衝液の試験液をＴＬＣで分析した。具体的には試験液を遠心分離した上清のフィルター（０．４５μｍ）濾過液（１０μｌ）をシリカゲルプレート（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０，  Ｍｅｒｃｋ）にスポッとした。つづいて、シリカゲルプレートを展開溶媒（クロロホルム：メタノール：酢酸  ＝  ８０：１６：３）で展開し、１０％硫酸−メタノール溶液を噴霧した後に１２０℃で２〜３分加熱して、コール酸のスポットの変化を確認し、結果を図８に示した。
【００５０】
図８に示されるように、ｐＨ７付近で１時間保持した試験液のＴＬＣの分析では、ＴＬＣ上にコール酸のスポット以外のスポットが確認された。即ち、Ｎｏ．２５株はコール酸からコール酸以外の物質を産生し、コール酸を変換又は分解していることが確認された。
【００５１】
（５）温度がＮｏ．２５菌株のコール酸変換又は分解作用に及ぼす影響を調べた。
Ｎｏ．２５菌株の凍結乾燥菌体６ｍｇとコール酸水溶液（０．６ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌ、リン酸−Ｎａ緩衝液（ｐＨ７）０．３ｍｌ、蒸留水０．２ｍｌを混合した直後および３０、４０、５０、６０、７０℃で１時間保持後、遠心分離（８０００ｇ×１０分）した上清中のコール酸濃度を定量した。
【００５２】
Ｎｏ．２５株の凍結乾燥菌体を試験に供試した。凍結乾燥菌体をコール酸溶液（１００μｇ／ｍｌ）に添加し、様々な温度で１時間保持した後の混合液中コール酸濃度を調べた結果、５０℃で１時間保持した試験液のコール酸濃度が最小値を示し、そのコール酸消失率は約６５％であった（図９）。即ち、Ｎｏ．２５株のコール酸変換・分解作用は５０℃で最大活性を示した。
【００５３】
【発明の効果】
本願発明は、コレステロール低減作用を有する乳酸菌を含有した飲食品を提供するものであり、コレステロールの過剰摂取の防止に役立つだけではなく、高脂血症患者用飲食品としても極めて優れている。
【図面の簡単な説明】
【図１】供試菌のコール酸濃度低下作用
【図２】供試菌の胆汁酸脱抱合作用      １〜１４および３０：表１の菌株Ｎｏ．
ＣＡ：コール酸、ＴＣＡ：タウロコール酸      Ｃ：コントロール
【図３】供試菌の胆汁酸脱抱合作用  １５〜２９：表１の菌株Ｎｏ．
ＣＡ：コール酸、ＴＣＡ：タウロコール酸、Ｃ：コントロール
【図４】Ｎｏ．２５菌体とコール酸溶液の混合時間がコール酸濃度に及ぼす影響
【図５】Ｎｏ．２５株の菌体にコール酸溶液を添加した直後のコール酸濃度低下率（コール酸吸着作用）に及ぼすｐＨの影響
【図６】Ｎｏ．２５株の菌体とコール酸溶液を混合後、３７℃で１時間保持中に低下する混合液中コール酸濃度（コール酸変換・分解作用）に及ぼすｐＨの影響
【図７】Ｎｏ．２５株の菌体とコール酸溶液を混合後、３７℃で１時間保持中に低下する混合液中コール酸濃度（コール酸変換・分解作用）に及ぼすｐＨの影響
【図８】Ｎｏ．２５菌体とコール酸をＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液（ｐＨ７）で３７℃保持した混合液のＴＬＣ  左図：スポットを○で表示したＴＬＣ、右図：○を表示しないＴＬＣ
【図９】Ｎｏ．２５株の菌体とコール酸溶液を混合後、１時間保持中に低下する混合液中コール酸濃度（コール酸変換・分解作用）に及ぼす温度の影響
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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