(57)【要約】【課題】抗生物質投与の副作用による下痢等の消化管障害の予防及び改善に有効である飼料用添加剤、及びそれを含む飼料を提供する。【解決手段】本発明の飼料用添加剤は、（Ａ）ラクトバチルス・イクイの菌体と、（Ｂ）ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・クリスパータス及びラクトバチルス・ジョンソニーからなる群より選ばれる少なくとも１種の菌体とを含む。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）ラクトバチルス・イクイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｑｕｉ）の菌体と、
（Ｂ）ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）及びラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の菌体と、
を含む飼料用添加剤。
【請求項２】
（Ｃ）セフトリアキソンナトリウム、硫酸カナマイシン、ジヒドロストレプトマイシン、スルファモノメトキシン、バクトラミン、ゲンタマイシン、オフロキサシン、セファロチンナトリウム、アンピシリン、オキシテトラサイクリン塩酸塩及びベンジルペニシリンからなる群より選ばれる少なくとも１種の抗生物質を更に含む請求項１記載の飼料用添加剤。
【請求項３】
前記（Ｃ）抗生物質と組合わせて添加するための請求項１記載の飼料用添加剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載の飼料用添加剤を含む飼料。
【請求項５】
以下の（イ）〜（ニ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のラクトバチルス属に属する菌株：
（イ）ラクトバチルス・サリバリウス  ＹＩＴ０４７９株（寄託番号：ＦＥＲＭＰ−１９３３２号）；
（ロ）ラクトバチルス・ロイテリ  ＹＩＴ０４８０株（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３３号）；
（ハ）ラクトバチルス・クリスパータス  ＹＩＴ０４８１株（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３４号）及び
（ニ）ラクトバチルス・ジョンソニー  ＹＩＴ０４８２株（寄託番号：ＦＥＲＭＰ−１９３３５号）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、馬の飼育管理において、抗生物質投与の副作用による消化管障害を予防及び改善する飼料用添加剤、及びそれを含む飼料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、家畜動物として飼育管理されている代表的なものとしては、牛、豚、馬などが挙げられるが、これらの家畜動物は、飼育環境等の変化によってその発育過程や健康状態に影響を受けやすいため、飼育管理に十分な配慮が必要とされている。例えば、馬の場合には、食事などの飼育環境の変化による種々のストレス状態から誘発される下痢などの身体症状を起こしやすいことが知られている。馬（特に仔馬）は、他の家畜動物に比べて腸内に存在する細菌が少なく、その上、これらの細菌は、飼育環境の変化により極端に減少するため、腸内細菌の生態系を構成する腸内フローラが障害を受け、そのバランスを崩すことにより下痢などの症状を起こす。このような症状は、消化吸収能力の低下、成長阻害及び免疫力の低下等の生理学的機能に悪影響を及ぼすことから、軽種馬生産現場に与える損害は大きい。
【０００３】
近年、馬の飼育管理において、乳酸菌やビフィズス菌に代表される微生物を生菌で含有する飼料が広く利用されている（例えば、特許文献１〜４参照）。これらの飼料は、含有される微生物が馬の腸内に付着することにより、腸内フローラを改善し、発育促進、下痢改善等の生理効果を期待するものである。
しかしながら、これらの飼料を使用しても投与した微生物が馬の腸内に付着及び増殖しないため、下痢などの身体症状の改善効果を十分に発揮できない場合が多く、実際には症状に応じて各種抗生物質を投与しているのが現状である。
【０００４】
投与される抗生物質は、馬の身体症状を効果的に改善するものであるが、同時に馬の腸内に存在する細菌を死滅させる等の影響を与え、逆に下痢症状の悪化等の副作用を引き起こす原因となることが多い。また、これらの抗生物質は、馬の腸内に存在する細菌だけでなく、飼料等により別途投与される有用微生物も死滅させるため、有用微生物を生菌で含有する飼料を馬に投与した場合であっても、投与した微生物の十分な効果を得ることなく、逆に下痢などの消化管障害を引き起こす身体症状の改善効果も低いものであった。
【０００５】
このことから、馬の飼育管理上で使用する微生物含有飼料においては、腸内環境を改善する効果を有する乳酸菌やビフィズス菌等の微生物を単に選択するだけでは十分ではなく、馬の消化管上皮への特異的な付着性と増殖活性を示し、馬の腸内環境を改善する優れた効果を有する微生物を選択すること、さらに、馬の身体症状に応じて随時投与する可能性のある各種抗生物質に対して優れた耐性を有する微生物を選択することが必要である。
【０００６】
【特許文献１】
特開昭５９−４６２０８号公報
【特許文献２】
特許第３２２０６９９号公報
【特許文献３】
特表２００１−５１９１４４号公報
【特許文献４】
特開２００２−５８４３２号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、馬の消化管上皮への特異的な付着性及び増殖活性を示すだけでなく、抗生物質に対して優れた耐性を有し、抗生物質投与の副作用による下痢等の消化管障害の予防及び改善に有効である飼料用添加剤、及びそれを含む飼料を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ラクトバチルス属に属する菌種のうち、馬の胃粘膜上皮細胞への優れた付着性及び増殖活性を有する５種類の菌株は、馬（特に仔馬）の下痢予防・改善効果が高く、また、その他の菌に比べ抗生物質に対する耐性に優れていることを見出した。
また、それらのラクトバチルス属に属する５種類の菌株は、優れた抗生物質耐性を示すと共に、同一の属に属するにもかかわらず、それぞれ異なる抗菌スペクトルを有することを知見し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、（Ａ）ラクトバチルス・イクイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｑｕｉ）の菌体と、（Ｂ）ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）及びラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の菌体と、を含む飼料用添加剤を提供するものである。
また、本発明は、（Ｃ）セフトリアキソンナトリウム、硫酸カナマイシン、ジヒドロストレプトマイシン、スルファモノメトキシン、バクトラミン、ゲンタマイシン、オフロキサシン、セファロチンナトリウム、アンピシリン、オキシテトラサイクリン塩酸塩及びベンジルペニシリンからなる群より選ばれる少なくとも１種の抗生物質を更に含む前記飼料用添加剤を提供するものである。
また、本発明は、前記（Ｃ）抗生物質と組合わせて添加するための前記飼料用添加剤を提供するものである。
また、本発明は、前記飼料用添加剤を含む飼料を提供するものである。
また、本発明は、以下の（イ）〜（ニ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のラクトバチルス属に属する菌株：（イ）ラクトバチルス・サリバリウス  ＹＩＴ０４７９株（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３２号）；（ロ）ラクトバチルス・ロイテリ  ＹＩＴ０４８０株（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３３号）；（ハ）ラクトバチルス・クリスパータス  ＹＩＴ０４８１株（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３４号）及び（ニ）ラクトバチルス・ジョンソニー  ＹＩＴ０４８２株（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３５号）を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の飼料用添加剤は、（Ａ）ラクトバチルス・イクイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｑｕｉ）の菌体と、（Ｂ）ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）及びラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の菌体とから構成される。
【００１１】
本発明で使用する菌株は、５種類すべてラクトバチルス属に属し、いずれも馬の糞便から単離された菌株である。単離は、ラクトバチルス属の選択培地としてＬＢＳ培地を、さらに、非選択培地としてＭＲＳ培地を使用し、それぞれ嫌気条件下、約３７℃で培養することによって行われる。単離された菌株は、形態的性質、培養的性質、生理学的性質又は化学分類学的性質等によって特徴付けられる。上記菌株は、ラクトバチルス属に属する菌種の中でも特に馬の胃粘膜上皮細胞への優れた付着性及び増殖活性を示し、並びに抗生物質に対する優れた耐性を有する菌株である。
【００１２】
（Ａ）ラクトバチルス・イクイの菌株としては、特に、ラクトバチルス・イクイ  ＹＩＴ０４８３株（独立行政法人産業技術総合研究所に寄託、微生物寄託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６７７号」）が特に付着性及び増殖活性に優れている点で好ましい。
【００１３】
また、（Ｂ）ラクトバチルス属の４種類の菌株としては、特に、（イ）ラクトバチルス・サリバリウス  ＹＩＴ０４７９株（独立行政法人産業技術総合研究所に寄託、微生物寄託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３２号」）、（ロ）ラクトバチルス・ロイテリ  ＹＩＴ０４８０株（独立行政法人産業技術総合研究所に寄託、微生物寄託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３３号」）、（ハ）ラクトバチルス・クリスパータス  ＹＩＴ０４８１株（独立行政法人産業技術総合研究所に寄託、微生物寄託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３４号」）及び（ニ）ラクトバチルス・ジョンソニー  ＹＩＴ０４８２株（独立行政法人産業技術総合研究所に寄託、微生物寄託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３５号」）がいずれも抗生物質に対する優れた耐性を有する点で好ましい。
【００１４】
ここで、上記（Ｂ）ラクトバチルス属の４種類の菌株である、（イ）ラクトバチルス・サリバリウス  ＹＩＴ０４７９株、（ロ）ラクトバチルス・ロイテリ  ＹＩＴ０４８０株、（ハ）ラクトバチルス・クリスパータス  ＹＩＴ０４８１株及び（ニ）ラクトバチルス・ジョンソニー  ＹＩＴ０４８２株は、新たに単離された菌株であるので、以下に（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質及び（ｃ）化学分類学的性質等を示す。なお、本発明の（イ）〜（ニ）の４菌株は、それぞれの菌株の（ａ）〜（ｃ）の性質において、有意な差は見られない。
【００１５】
（ａ）形態的性質
本発明の（イ）〜（ニ）の４菌株は、いずれも以下の性質を示す。また、上記（イ）〜（ニ）の４菌株のグラム染色像は、いずれも陽性であった。
（１）細菌の形：桿状
（２）細菌の大きさ：０．６〜０．８×１．３〜３．５μｍ
（３）細菌の多形性：無
（４）運動性：無
（５）胞子：無
グラム染色像によれば、（イ）Ｌ．サリバリウス  ＹＩＴ０４７９株は、大きさが均一の桿菌であり、（ロ）Ｌ．ロイテリ  ＹＩＴ０４８０株は、大きさが均一の短桿菌であり、（ハ）Ｌ．クリスパータス  ＹＩＴ０４８１株及び（ニ）Ｌ．ジョンソニー  ＹＩＴ０４８２株は、大きさが均一の桿菌（やや細い）であることが示される。
【００１６】
（ｂ）培養的性質（生育状態）
（１）本発明の（イ）〜（ニ）の４菌株のＭＲＳ寒天平板培養（３７℃、２日間）による生育状態について以下に示す。
（イ）Ｌ．サリバリウス  ＹＩＴ０４７９株は、直径１ｍｍ程度の白色スムース球形コロニーを生じる。（ロ）Ｌ．ロイテリ  ＹＩＴ０４８０株は、直径２ｍｍ程度の白色スムース球形コロニーを生じる。（ハ）Ｌ．クリスパータス  ＹＩＴ０４８１株は、直径２ｍｍ程度の灰白色ラフフラットコロニーを生じる。（ニ）Ｌ．ジョンソニー  ＹＩＴ０４８２株は、直径１ｍｍ程度の灰白色スムースフラットコロニーを生じる。
（２）本発明の（イ）〜（ニ）の４菌株のＭＲＳ液体培養（３７℃、２４時間）による生育状態については、いずれの菌株にも良好な生育が見られ、静置しておくと沈殿を生じる。
【００１７】
（ｃ）化学分類学的性質
（ＧＣ含量の測定及びＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション）
本発明の（イ）〜（ニ）４菌株のＧＣ含量の測定、及び同４菌株と縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、以下の方法に従って行う。
ＧＣ含量の測定方法は、常法の高速液体クロマトグラフィーを用いたＥｚａｋｉらの方法（文献名：ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ５５，１２７−１３０、１９９０）により行うことができる。測定された本発明の（イ）〜（ニ）４菌株のＧＣ含量は、それぞれ３３〜４１ｍｏｌ％である。
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、常法の蛍光標識マイクロプレート法（文献名：Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ３９，２２４−２２９，１９８９）により行うことができる。以下の２０株の基準株（全てラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属）を、本発明の（イ）〜（ニ）４菌株と比較するのに使用する。本発明の（イ）〜（ニ）４菌株の各々は、相同性が認められた基準株により同定される。
【００１８】
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＹＩＴ  ００７０  （ＡＴＴＣ  ４３５６  Ｔ）、Ｌ．ａｇｉｌｉｓ  ＹＩＴ  ０２５３  （ＪＣＭ  １１８７  Ｔ）、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ  ＹＩＴ  ０２１１  （ＪＣＭ  １１２６  Ｔ）、Ｌ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ＹＩＴ  ０２５６  （ＪＣＭ  ５６７０  Ｔ）、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ  ＹＩＴ  ００７６  （ＡＴＴＣ  １４８６９  Ｔ）、Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ  ＹＩＴ  ００７７  （ＡＴＴＣ  ４００５  Ｔ）、Ｌ．ｃａｓｅｉ  ＹＩＴ  ０１８０  （ＡＴＴＣ  ３４４  Ｔ）、Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＹＩＴ  ０２３７（ＪＣＭ  １１６４  Ｔ）、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ  ＹＩＴ  ０２１２  （ＪＣＭ  １１８５  Ｔ）、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＹＩＴ  ００８１  （ＡＴＴＣ  １４９３１  Ｔ）、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ  ＹＩＴ  ０１９２  （ＤＳＭ  ２０２４３  Ｔ）、Ｌ．ｇｒａｍｉｎｉｓ  ＹＩＴ  ０２６０  （ＮＲＩＣ  １７７５  Ｔ）、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＹＩＴ  ０２１９  （ＪＣＭ  ２０１２  Ｔ）、Ｌ．ｍｕｒｉｎｕｓ  ＹＩＴ  ０２３９  （ＪＣＭ  １７１７  Ｔ）、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＹＩＴ  ０１０２  （ＡＴＴＣ  １４９１７  Ｔ）、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ  ＹＩＴ  ０１９７  （ＪＣＭ  １１１２  Ｔ）、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＹＩＴ  ０１０５  （ＡＴＴＣ  ７４６９  Ｔ）、Ｌ．ｒｕｍｉｎｉｓ  ＹＩＴ  ０２２１  （ＪＣＭ  １１５２  Ｔ）、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｌｉｃｉｎｉｕｓ  ＹＩＴ  ００８９  （ＡＴＴＣ  １１７４２  Ｔ）  及び  Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＹＩＴ  ０１０４  （ＡＴＴＣ  １１７４１Ｔ）。
【００１９】
本発明の飼料用添加剤に含まれる菌体は各種抗生物質に対して優れた耐性を有するので、馬の健康管理上必要に応じて、各種抗生物質と混合して混合物として飼料に添加してもよい。また、菌体のみで構成される飼料用添加剤を単独で飼料に添加するだけでなく、各種抗生物質と組合わせて使用してもよい。このように飼料用添加剤は、馬の身体症状にあわせて各種抗生物質を適宜選択し如何なる場合にも組合わせることができるので、馬の健康管理、身体症状の改善に有効である。
【００２０】
本発明で使用する（Ｃ）抗生物質としては、馬の健康管理用に一般的に使用される抗生物質でよく、例えば、仔馬の下痢及び白痢症状等に有用なゲンタマイシン、オキシテトラサイクリン塩酸塩等、肺炎及び関節炎による各種感染症に有用な硫酸カナマイシン、スルファモノメトキシン、バクトラミン、セフトリアキソンナトリウム、セファロチンナトリウム、オフロキサシン、ジヒドロストレプトマイシン等、及び外傷による感染症予防及び輸送熱予防並びに蕁麻疹予防に有用なベンジルペニシリン、アンピシリン等が挙げられる。
【００２１】
上記（Ｃ）抗生物質のうちいずれを使用するかは、選択された（Ｂ）ラクトバチルス属の種類に応じて決定される。例えば、硫酸カナマイシン、スルファモノメトキシン、及びバクトラミン等は、（Ｂ）ラクトバチルス属の４種菌株のいずれに対しても使用することができる。また、オフロキサシンは、（Ｂ）ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・クリスパータス及びラクトバチルス・ジョンソニーに対して使用することができる。さらに、セファロチンナトリウム、オキシテトラサイクリン塩酸塩、ベンジルペニシリン及びアンピシリン等は、（Ｂ）ラクトバチルス・ロイテリに対して使用することができる。
【００２２】
次に、飼料用添加剤の製造方法について示す。
飼料用添加剤は、（Ａ）ラクトバチルス・イクイの菌株と、（Ｂ）ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・クリスパータス及びラクトバチルス・ジョンソニーからなる群より選ばれる少なくとも１種の菌株とをそれぞれ培養し、培養した菌体を回収し、（Ａ）菌体と（Ｂ）菌体とを混合することにより製造される。
上記培養及び回収は通常の方法で行うことができる。使用する培地としては、ラクトバチルス属細菌の増殖可能なＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）培地、ＧＡＭ  ｂｒｏｔｈ（日水社製）培地などが挙げられる。培養条件はいずれの菌株も３７℃で１２〜２０時間である。菌体の回収には通常使用される遠心分離等の手段を用いることができる。得られた飼料用添加剤は、用途に応じて適当な形態にすればよい。
【００２３】
上記製造方法では、菌株によって増殖の程度が異なるため、上記培地以外に、それぞれの菌株に最適な培地を選択して培養することが望ましい。例えば、ラクトバチルス・ロイテリ  ＹＩＴ０４８０株には、ＰＳＹＬ培地［組成：２０％ＰＳＭ＊）５％、ミーストＰ２Ｇ（日本製薬社製）１％、ＣＨ３ＣＯＯＮａ（和光社製）０．３％、（ＮＨ４）２ＳＯ４（和光社製）０．３％、ＫＨ２ＰＯ４（和光社製）１％、Ｋ２ＨＰＯ４（和光社製）０．２％、Ｍｅｔ  ｓｏｌ＊＊）０．５％］が好ましい。
＊）：脱脂粉乳（四つ葉社製）２００ｇ、オリエンターゼ５Ｎ（阪急バイオ社製）４ｇ／１Ｌ
＊＊）：ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １１５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ６．８ｇ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２４ｇ（和光社製）／１Ｌ
【００２４】
また、菌株の増殖性を向上させる手段として、必要に応じて、資化性糖を培地に添加することが望ましい。例えば、ラクトバチルス・イクイ  ＹＩＴ０４８３株及びラクトバチルス・クリスパータス  ＹＩＴ０４８１株には、培地に資化性糖としてラクトースを添加することが好ましい。また、ラクトバチルス・サリバリウス  ＹＩＴ０４７９株及びラクトバチルス・ジョンソニー  ＹＩＴ０４８２株には、培地に資化性糖としてグルコースを添加することが好ましい。
本発明では、使用する培地は上記に限られるものではなく、一般に使用される培地に含まれる組成を適宜組合わせて各菌株に最適な培地を作製したものを用いてもよい。
【００２５】
本発明の飼料用添加剤では、使用する菌体が生菌体であることが望ましく、生菌体であればいかなる状態のものでもよい。例えば、各菌株の培養回収菌体、培養物、凍結乾燥菌体等が挙げられる。なかでも、生菌体の保存性が高い凍結乾燥菌体を使用することが望ましい。なお、死菌体は、馬に投与した時の下痢などの消化管障害の予防及び改善や、早期腸内フローラ形成促進等の生理効果が低いため好ましくない。
【００２６】
本発明の飼料用添加剤は、馬の胃粘膜上皮細胞への優れた付着性及び増殖活性を示し、並びに抗生物質に対する優れた耐性を有する。これにより、この飼料用添加剤は、早期の腸内フローラ形成により下痢等の馬の消化管（特に腸管）障害を早期に予防及び改善すると共に、予防及び改善された馬の消化管内環境が、馬の健康管理上必要に応じて使用される上記（Ｃ）抗生物質の影響を受けることなく良好に維持され、種々のストレスから誘発される馬の身体症状を効果的に改善することができる。さらに、本発明では、特に（Ａ）ラクトバチルス・イクイの菌体と、（Ｂ）ラクトバチルス属の４種類の全ての菌体とを含む飼料用添加剤は、上記のような馬の身体症状の改善効果が顕著であるので好ましい。
【００２７】
本発明の飼料用添加剤の投与量は、馬一頭に対して１日あたり上記（Ａ）と（Ｂ）との菌体総数として１×１０９個以上、好ましくは１×１０１０個〜５×１０１０個投与することが望ましい。１日の投与量が１×１０９個より少ない場合には、馬の身体症状に十分な改善効果が得られないため好ましくない。さらに、投与する飼料用添加剤における各種菌株の菌体数割合は、該飼料用添加剤に含有させる菌株の組合わせによって任意に調整することが可能であるが、（Ａ）ラクトバチルス・イクイを菌体総数の５％〜２５％、好ましくは１０％〜２０％の範囲で含有させることにより、馬の身体症状改善に顕著な効果を有する。
【００２８】
また、本発明の飼料用添加剤の馬への投与方法は、特に限定されるものではなく、注射器などを用いて直接馬の腸内に投与してもよく、各種糖質、タンパク質、脂質、繊維質、ビタミン類、及びミネラル類などと共に、常法により粉剤、錠剤、顆粒剤、ペレットなどの製剤にして経口投与してもよい。
【００２９】
本発明は、これらの飼料用添加剤と、他の成分、例えば脂質や繊維質等とを含有する飼料を提供する。脂質や繊維質としては、飼料成分として一般的に使用可能なものであればいずれでもよく、例えば、大豆粕、アルファルファミール、及びふすま等が挙げられる。本発明の飼料を馬に投与することにより、消化管障害の予防及び改善され、飼料効率を向上させることができるので軽種馬経営上好ましい。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
＜製造例１＞
（各菌株の菌体の製造）
下記表１に示す組成の培地を、５Ｌコルベンに４．５Ｌずつ作製し、ｐＨを６．８に調整後、高圧加熱殺菌した。次いで、下記表１に示す（Ａ）及び（Ｂ）ラクトバチルス属の５種類の菌株の前培養菌体のクレット値を測定し、クレット３００に希釈した菌液４５０ｍｌを前記培地に植菌し、３７℃、１６時間静置培養して培養液を得た。この培養液を１，５００×Ｇで遠心分離し、５種菌株の菌体をそれぞれ集菌した。各菌株の菌体の４．５Ｌあたりの集菌量（湿重量）は表１の通りである。
【００３２】
【表１】
2004357528.tif 000002
【００３３】
＜実施例１＞
（増殖活性試験及び馬の胃粘膜上皮細胞に対する菌体の付着性試験）
１０％スキムミルク（ＳＭ）、０．１％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ社製）＋１０％スキムミルク（ＹＥ）、０．１％ペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）＋１０％スキムミルク（Ｐ）及び０．１％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ社製）＋０．１％ペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）＋１０％スキムミルク（ＹＰ）の４種類の培地を１１５℃で１５分間高圧加熱滅菌した後、それぞれの培地３ｍｌに前記製造例１で得られた（Ａ）及び（Ｂ）の５種類の菌株の各菌体培養液を３０μｌ（各菌株の菌体数：約３×１０８個／ｍｌ）ずつ接種し、３７℃で２４時間及び４８時間培養した。増殖活性試験は、増殖した菌体により培養液が完全に凝固しているものを○、菌体は僅かに増殖したが培養液が半流動状態のものを△、菌体が増殖せずに培養液が液状のままのものを×とした判断基準に基づいて、判定を行った。
【００３４】
また、前記製造例１で得られた（Ａ）及び（Ｂ）の５種類の菌株の各菌体培養液３ｍｌ（各菌株の菌体数：約３×１０８個／ｍｌ）に馬から採取した胃粘膜上皮組織片１ｃｍ２を入れ、３７℃で振とう培養した後、この胃粘膜上皮組織片を緩衝液（組成：０．８％ＮａＣｌ；０．１２１％Ｋ２ＨＰＯ４；０．０３４％ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．２）で数回洗浄して、実体顕微鏡下で胃粘膜上皮組織片から胃粘膜上皮細胞を掻き取り、ギムザ染色を行った。これを用いて顕微鏡下で一つの胃粘膜上皮細胞に付着した各菌株の菌体数を測定し、付着性を判定した。表２にその結果を示す。
【００３５】
【表２】
2004357528.tif 000003
【００３６】
表２の結果から、本発明で使用する（Ａ）及び（Ｂ）ラクトバチルス属の５種類の菌株の各菌体は、各培地条件において優れた増殖活性を示すと共に、馬の胃粘膜上皮細胞に対しても良好な付着性を示す。また、５種菌株の中でも、（Ａ）Ｌ．イクイ  ＹＩＴ０４８３株が他の（Ｂ）の４種菌株に比べて増殖活性及び馬の胃粘膜上皮細胞への付着性に優れていることが認められた。なお、増殖活性試験において、僅かに増殖したが培養液が半流動状態（△判定）のものはなかった。
【００３７】
＜実施例２＞
（抗生物質耐性試験）
下記表３に示された各抗生物質（１１種類）を１００、１０、１、０．１及び０μｇ／ｍｌの濃度となるようにそれぞれ添加してＭＲＳ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を作製した。次に、製造例１で得られた（Ａ）及び（Ｂ）の５種類の各菌株の菌体培養液を、それぞれの抗生物質含有ＭＲＳ寒天培地に１０μｌずつ接種し（各菌株の菌体数：約１×１０８個／ｍｌ）、嫌気条件下で３７℃、４８時間塗抹培養した。増殖した菌を肉眼で判定し、各抗生物質に対する最小発育濃度（μｇ／ｍｌ）を求めた結果を表３に示す。
【００３８】
【表３】
2004357528.tif 000004
【００３９】
表３の結果から、（Ａ）及び（Ｂ）ラクトバチルス属の５種類の各菌株は、いずれも各種抗生物質、特に硫酸カナマイシン、スルファモノメトキシン、ジヒドロストレプトマイシン、バクトラミンなどに優れた耐性を示した。特に、Ｌ．イクイ株はセフトリアキソンナトリウムに、Ｌ．ジョンソニー株はゲンタマイシンに、Ｌ．ロイテリ株、Ｌ．クリスパータス株及びＬ．ジョンソニー株はオフロキサシンに、それぞれ特異的に優れた耐性を示していた。このように、用いた５種類の各菌株は、同属に属するにもかかわらず、それぞれ異なる抗菌スペクトルを示した。Ｌ．ロイテリ株は５種類の菌株の中でもとりわけ耐性に優れ、特にセファロチンナトリウム、オキシテトラサイクリン塩酸塩及びアンピシリンに対して優れていた。また、このＬ．ロイテリ株は、他の４種類の菌株よりもベンジルペニシリンに対して耐性が強いので、ベンジルペニシリンを使用する場合に特に有用である。
【００４０】
また、（Ａ）Ｌ．イクイ  ＹＩＴ０４８３株と（Ｂ）ラクトバチルス属の４種類の菌株から選ばれる１種以上の菌株とを組合わせた菌体培養液を用いて、抗生物質存在下での増殖活性試験を行った。
【００４１】
（増殖活性試験１）
抗生物質としてオキシテトラサイクリン塩酸塩を１０、５、２及び０μｇ／ｍｌの濃度となるようにそれぞれ添加したＭＲＳ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を作製した。次に、製造例１で得られた（Ａ）Ｌ．イクイ株単独の菌体培養液と、（Ａ）Ｌ．イクイ株及び（Ｂ）Ｌ．ロイテリ株の混合菌体培養液とを、それぞれの抗生物質含有ＭＲＳ寒天培地に１０μｌずつ接種し（各菌体数：約１×１０６個／ｍｌ）、嫌気条件下で３７℃、４８時間塗抹培養した後、菌の増殖活性を肉眼で判定した。
【００４２】
（増殖活性試験２）
抗生物質としてゲンタマイシンを１００、５０、２０及び０μｇ／ｍｌの濃度となるようにそれぞれ添加したＭＲＳ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を作製した。次に、製造例１で得られた（Ａ）Ｌ．イクイ株単独の菌体培養液と、（Ａ）Ｌ．イクイ株及び（Ｂ）Ｌ．ジョンソニー株の混合菌体培養液とを、それぞれの抗生物質含有ＭＲＳ寒天培地に１０μｌずつ接種し（各菌体数：約１×１０６個／ｍｌ）、嫌気条件下で３７℃、４８時間塗抹培養した後、菌の増殖活性を肉眼で判定した。
【００４３】
（増殖活性試験３）
抗生物質としてオフロキサシンを１００、５０、２０及び０μｇ／ｍｌの濃度となるようにそれぞれ添加したＭＲＳ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を作製した。製造例１で得られた（Ａ）Ｌ．イクイ株単独の菌体培養液と、（Ａ）Ｌ．イクイ株及び（Ｂ）Ｌ．ジョンソニー株又は（Ａ）Ｌ．イクイ株及び（Ｂ）Ｌ．クリスパータス株の混合菌体培養液とを、それぞれの抗生物質含有ＭＲＳ寒天培地に１０μｌずつ接種し（各菌体数：約１×１０６個／ｍｌ）、嫌気条件下で３７℃、４８時間塗抹培養した後、菌の増殖活性を肉眼で判定した。
以上の増殖活性試験１〜３の結果を表４−１〜３に示す。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
表４−１〜３の結果から、抗菌スペクトルの異なる（Ａ）ラクトバチルス・イクイ  ＹＩＴ０４８３株と（Ｂ）ラクトバチルス属の４種類の菌株から選ばれる１種以上の菌株とを組合わせた菌体培養液を用いれば、抗生物質存在下でも優れた増殖活性を有することが認められた。
【００４６】
＜製造例２＞
（凍結乾燥菌体の製造）
製造例１により得られた（Ａ）及び（Ｂ）５種類の菌株の菌体培養液を、それぞれ１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ６．８〜７．０に調整した。次いで、５，０００回転で１０分間遠心して上清を除去後、残った菌体に分散媒（組成：スキムミルク２０％、及びトレハロース２０％水溶液）を８％の割合で添加して均一化した。次いで、−３０℃、３時間の予備凍結の後、常法に従い凍結乾燥処理をした。凍結乾燥後の重量を測定し、等量の乾燥澱粉を加えて４℃で保存した。
【００４７】
＜実施例３＞
（早期腸内フローラ形成促進効果）
出生直後の６頭のサラブレッド種仔馬に、製造例２で得られた凍結乾燥菌体５ｇ（（Ａ）及び（Ｂ）ラクトバチルス属の５種菌株を生菌体総数で３．８×１０１０個／５ｇ含有する）を５％ブドウ糖５０ｍｌに溶解したものを毎日計７回経口投与した。出生後１、２、３、５、７及び１４日毎に直腸便を採取し、希釈液を加えて均一化した後、さらに適宜希釈し、ＬＢＳ寒天培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に接種し、嫌気条件下３７℃で４日間培養し、増殖したコロニー数と希釈率から直腸便の乳酸桿菌数を算出した。コントロールとして、凍結乾燥菌体を投与しない６頭の仔馬からも同様に直腸便の乳酸桿菌数を算出した。なお、表５には、（乳酸桿菌が検出された仔馬数）／（調べた全ての仔馬数）×１００から算出された検出率（％）を示す。
【００４８】
【表５】
2004357528.tif 000006
【００４９】
表５の結果から、投与群では、投与５日目で全ての仔馬の腸内に乳酸桿菌の付着が確認され、コントロール群より２日も早い腸内フローラ形成促進効果が認められた。
【００５０】
＜実施例４＞
（下痢の改善効果  検討１）
上記実施例３と同様の試験を出生直後の仔馬５４頭（コントロール群２７頭、投与群２７頭）において実施し、出生３０日目までの下痢の発生を観察した。下痢は、肉眼的に軟便、軽度下痢（下痢便を排泄するが、回数が少なく肛門附近の付着性が僅かなもの）及び重度下痢（悪臭のある水様性の下痢を何度となく排泄し、肛門から臂部にかけて多量の下痢便を付着しているもの）の３段階として、それぞれの発症率（％）を表６に示す。
【００５１】
【表６】
2004357528.tif 000007
【００５２】
表６の結果から、軟便の発症率は、３週目に投与群で有意に低い値となった。また、軽度下痢、重度下痢の発症率については、３週目以降に投与群で有意に低い傾向が見られ、特に、重度下痢の発症は、投与群では全く見られず、４週目では、治療処置及び抗生物質の投与もしなくても良いほど改善の効果が見られた。
【００５３】
＜実施例５＞
（下痢の改善効果  検討２）
２２頭のサラブレッド種仔馬に、製造例２で得られた凍結乾燥菌体５ｇ（（Ａ）及び（Ｂ）ラクトバチルス属の５種菌株を生菌体総数で１．４×１０１０個／５ｇ含有する）を５％ブドウ糖５０ｍｌに溶解したものを１日目〜７日目の投与期間に、１日当たり計７回経口投与した。０日目（投与なし）から１４日目までの下痢の発生を観察した。コントロールとして、凍結乾燥菌体を投与していない６頭の仔馬についても下痢の発生を観察した。下痢は、肉眼的に軟便、重度下痢（悪臭のある水様性の下痢を何度となく排泄し、肛門から臂部にかけて多量の下痢便を付着しているもの）の２段階とした。軟便の発症率（％）を図１に、重度下痢の発症率（％）を図２にそれぞれ示す。
【００５４】
図１及び図２の結果から、軟便の発症において、投与群ではコントロール群と比較して投与６日目で顕著に減少する傾向が見られた。また、下痢の発症において、コントロール群では発症していた下痢症状が、投与群では投与５日目以降全く確認されなかった。
【００５５】
【発明の効果】
本発明によれば、馬の消化管上皮への特異的な付着性及び増殖活性を示すだけでなく、抗生物質に対して優れた耐性を有し、抗生物質投与の副作用による下痢等の消化管障害の予防及び改善に有効である飼料用添加剤、及びそれを含む飼料が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例５の飼料用添加剤の投与群及びコントロール群おける仔馬の軟便の発症率を示した図である。
【図２】実施例５の飼料用添加剤の投与群及びコントロール群おける仔馬の重度下痢の発症率を示した図である。
【図１】
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【図２】
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