(57)【要約】【課題】アルカリ性条件下で、複素環系化合物または芳香族アミンと強く作用し、かつ耐熱性に優れた新規アルカリラッカーゼ、およびその生産方法を提供すること。【解決手段】以下の特性：（１）分子量：約４２，０００〜４３，０００；（２）至適ｐＨ：約１０；および（３）基質特異性：複素環系化合物または芳香族アミンに強く作用する；を有する、新規アルカリラッカーゼ。フォーマ属に属する糸状菌を培養する工程、および、得られる培養物よりこのアルカリラッカーゼを分離精製する工程を包含する方法。ならびに、このアルカリラッカーゼを生産する糸状菌。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特性：
（１）分子量：約４２，０００〜４３，０００；
（２）至適ｐＨ：約１０；および
（３）基質特異性：複素環系化合物または芳香族アミンに強く作用する；を有する、アルカリラッカーゼ。
【請求項２】
以下の特性：
（４）作用適温の範囲：至適温度は５０℃である；
（５）熱安定性：ｐＨ７．５で３０分間保持した場合に、約６０℃まで安定である；
（６）安定ｐＨ範囲：３０℃で３時間処理する場合において、ｐＨ４．０〜９．０；および
（７）等電点：約３．７；
を有する、請求項１に記載のアルカリラッカーゼ。
【請求項３】
フォーマ（Ｐｈｏｍａ）属に属する糸状菌が生産する、請求項１または２に記載のアルカリラッカーゼ。
【請求項４】
Ｐｈｏｍａ  ｓｐ．Ｍａ２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５２）が生産する、請求項３に記載のアルカリラッカーゼ。
【請求項５】
以下の特性：
（１）分子量：約４２，０００〜４３，０００；
（２）至適ｐＨ：約１０；および
（３）基質特異性：複素環系化合物または芳香族アミンに強く作用する；
を有するアルカリラッカーゼを生産する方法であって、該アルカリラッカーゼを生産するフォーマ属に属する糸状菌を培養する工程、および、培養物より該アルカリラッカーゼを分離精製する工程を包含する、方法。
【請求項６】
前記アルカリラッカーゼが、以下の特性：
（４）作用適温の範囲：至適温度は５０℃である；
（５）熱安定性：ｐＨ７．５で３０分間保持した場合に、約６０℃まで安定である；
（６）安定ｐＨ範囲：３０℃で３時間処理する場合において、ｐＨ４．０〜９．０；および
（７）等電点：約３．７；
を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記糸状菌が、Ｐｈｏｍａ  ｓｐ．Ｍａ２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５２）である、請求項７に記載の方法。
【請求項８】
以下の特性：
（１）分子量：約４２，０００〜４３，０００；
（２）至適ｐＨ：約１０；および
（３）基質特異性：複素環系化合物または芳香族アミンに強く作用する；
を有するアルカリラッカーゼを生産する、糸状菌。
【請求項９】
前記アルカリラッカーゼが、以下の特性：
（４）作用適温の範囲：至適温度は５０℃である；
（５）熱安定性：ｐＨ７．５で３０分間保持した場合に、約６０℃まで安定である；
（６）安定ｐＨ範囲：３０℃で３時間処理する場合において、ｐＨ４．０〜９．０；および
（７）等電点：約３．７；
を有する、請求項８に記載の糸状菌。
【請求項１０】
フォーマ（Ｐｈｏｍａ）属に属する、請求項８または９に記載の糸状菌。
【請求項１１】
前記糸状菌が、Ｐｈｏｍａ  ｓｐ．Ｍａ２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５２）である、請求項１０に記載の糸状菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルカリ性域に至適ｐＨを有し、かつ耐熱性に優れた新規アルカリラッカーゼ、ならびにこのような新規アルカリラッカーゼをフォーマ（Ｐｈｏｍａ）属に属する糸状菌培養物から生産する方法および新規アルカリラッカーゼを生産する糸状菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、芳香族系化合物や複素環系化合物等に対し分子状酸素を用いて酸化する酵素として、ラッカーゼやポリフェノールオキシダーゼ（以下、酸化酵素と略記）が知られている。酸化酵素は、細菌、糸状菌、及び担子菌等の微生物に広く分布する。
【０００３】
また、酸化酵素、特にラッカーゼにより酸化される基質のうち、比較的安定な反応中間体ラジカルとなり得る低分子性化学物質は、ラッカーゼ・メディエーターまたはレドックスメディエーターと呼ばれ、ラッカーゼの酸化を受けることにより、ラッカーゼの酸化反応の増強、或いはラッカーゼの非基質性化学物質の酸化といった現象を引き起こす。例示すれば、ラッカーゼ単独では分解され難い或いは分解され得ない難生分解性有機汚染化学物質群をレドックスメディエーター存在下でラッカーゼが間接的に酸化出来ることが明らかにされている（Ｂｒｅｓｓｌｅｒ  Ｄ．  Ｃ．ら：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ．，２２，１１９〜１２５（２０００）  ；  Ｓｒｅｂｏｔｎｉｋ  Ｅ．ら：Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８１，１７９〜１８８（２０００））。
【０００４】
このようにラッカーゼが、基質の酸化により生成される反応中間体のラジカル種に起因する多様な化学反応の触媒能力を有することが判明している。それ故、この触媒能力を応用した用途開発が、世界中の研究者達により活発に続けられているが、その用途内容を例示すれば、染色および抜染、洗濯時の色移り防止、パルプおよび繊維の漂白、着色廃液の脱色、難生分解性化合物の分解、有毒性化学物質の解毒、食品の苦渋味の除去、ワインコルク付着カビ臭の消失、ジュースの混濁防止、家畜飼料の体内消化促進、無接着剤木質ボードの製造、フェノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、接着剤の製造、化石燃料の脱硫、発光や発色に基づく臨床分析、バイオセンサー、有機化合物の合成等、多岐にわたる。
【０００５】
しかし、上記の用途開発に当っては作用至適ｐＨがアルカリ性域に存在することが所望されることが多いのにもかかわらず、工業規模で生産され得るほとんどのラッカーゼの作用至適ｐＨが酸性域から弱酸性域にある為、実用化されたものは僅かである。
【０００６】
例えば、毛髪の染色や洗濯時の色移り防止には、アルカリ性域に至適ｐＨを有するラッカーゼを使用することが望ましい。また、クラフトパルプ製造処理におけるリグニン除去においても、アルカリ性域に至適ｐＨを有するラッカーゼを使用することがコスト低減の点で重要とされている。以上のように、ラッカーゼの利用は、アルカリ性域でなされることが多い。
【０００７】
一方、至適ｐＨがアルカリ性域に存在するとされる酸化酵素の生産微生物は幾つか知られ、スティルベラ属、サゲノメラ属、スタキリジウム属（以上、特開平１０−１７４５８３号（特許文献１））、ミロセシウム属（特開２００１−６９９７３号（特許文献２）、国際公開第９７／００９４８号（特許文献３）、特開平１１−２９９４８２号（特許文献４）、特開平１１−２９９４８３号（特許文献５））に属する微生物が知られている。また、動植物由来の至適ｐＨがアルカリ性域に存在するとされる酸化酵素についても報告されているが、それら動植物から大量且つ安価に生産することは困難であり、産業上の利用に供するためには微生物由来の至適ｐＨがアルカリ性域に存在する酸化酵素が望まれる。
【０００８】
現在、上記記載の公知微生物が生産する酸化酵素のうち、最もアルカリ側で作用すると考えられるラッカーゼは、ミロセシウム属由来のものである。しかしながら、特開２００１−６９９７３号（特許文献２）に記載のミロセシウム属由来ラッカーゼの至適ｐＨは、約８．３（ＭＢＴＨとホモバニリルアルコールとの酸化縮合を利用した発色反応系で測定）であり、耐熱性については７０℃、１時間処理で完全失活する。このことは、特開２００１−６９９７３号（特許文献２）に記載のラッカーゼと諸性質的に類似する特開平１１−２９９４８２号（特許文献４）に記載のラッカーゼについても当てはまる（例：７０℃、０．５時間処理で完全失活）。すなわち、これまで、アルカリ性域での高い活性と耐熱性とを兼ね備えるラッカーゼおよびこれを生産する微生物は発見されていない。なお、ここでいう「アルカリ性域」とは、上記発色反応系にて至適ｐＨが９．０以上の範囲を指す。
【０００９】
【特許文献１】
特開平１０−１７４５８３号
【特許文献２】
特開２００１−６９９７３号
【特許文献３】
国際公開第９７／００９４８号
【特許文献４】
特開平１１−２９９４８２号
【特許文献５】
特開平１１−２９９４８３号
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来の課題の解決を意図するものであり、その目的とするところは、アルカリ性域に至適ｐＨを有し、かつアルカリ性条件下で耐熱性に優れた新規アルカリラッカーゼ、その生産方法および生産菌を提供することである。これまで、至適ｐＨをアルカリ性域に有し、かつアルカリ性条件下で耐熱性が高いラッカーゼ、およびこれを生産する微生物は知られていない。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、フォーマ（Ｐｈｏｍａ）属に属する、新たに単離した糸状菌から、新規なアルカリラッカーゼを見いだし、これに基づいて本発明を完成した。
本発明のアルカリラッカーゼは、次の特性を有する：
（１）分子量：約４２，０００〜４３，０００である；
（２）至適ｐＨ：約１０である；および
（３）基質特異性：複素環系化合物または芳香族アミンに強く作用する。
【００１２】
本明細書中で使用する用語「強く作用する」は、ラッカーゼ活性を測定した場合、フェノール系化合物を基質とした場合の酸化反応における活性より約３倍、好ましくは約４倍、より好ましくは約５倍、さらにより好ましくは約８倍、最も好ましくは約１０倍以上高い活性で、複素環系化合物または芳香族アミンの酸化反応を触媒し、分解し得ることを意味する。
【００１３】
好ましくは、上記アルカリラッカーゼは、以下の特性：
（４）作用適温の範囲：至適温度は５０℃である；
（５）熱安定性：ｐＨ７．５で３０分間保持した場合に、約６０℃まで安定である；
（６）安定ｐＨ範囲：３０℃で３時間処理する場合において、ｐＨ４．０〜９．０；および
（７）等電点：約３．７；
を有する。上記アルカリラッカーゼは、好ましくはフォーマ属に属する糸状菌、より好ましくはＰｈｏｍａ  ｓｐ．Ｍａ２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５２）により生産される。
【００１４】
本発明のアルカリラッカーゼを生産する方法は、以下の特性：
（１）分子量：約４２，０００〜４３，０００である；
（２）至適ｐＨ：約１０である；および
（３）基質特異性：複素環系化合物または芳香族アミンに強く作用する；
を有するアルカリラッカーゼを生産するフォーマ属に属する糸状菌を培養する工程、および、培養物より該アルカリラッカーゼを分離精製する工程を包含する。
【００１５】
好ましくは、上記アルカリラッカーゼは、以下の特性：
（４）作用適温の範囲：至適温度は５０℃である；
（５）熱安定性：ｐＨ７．５で３０分間保持した場合に、約６０℃まで安定である；
（６）安定ｐＨ範囲：３０℃で３時間処理する場合において、ｐＨ４．０〜９．０；および
（７）等電点：約３．７；
を有する。上記アルカリラッカーゼは、好ましくはフォーマ属に属する糸状菌、より好ましくはＰｈｏｍａ  ｓｐ．Ｍａ２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５２）により生産される。
【００１６】
本発明の糸状菌は、以下の特性：
（１）分子量：約４２，０００〜４３，０００である；
（２）至適ｐＨ：約１０である；および
（３）基質特異性：複素環系化合物または芳香族アミンに強く作用する；
を有するアルカリラッカーゼを生産する。
【００１７】
好ましくは、上記アルカリラッカーゼは、以下の特性：
（４）作用適温の範囲：至適温度は５０℃である；
（５）熱安定性：ｐＨ７．５で３０分間保持した場合に、約６０℃まで安定である；
（６）安定ｐＨ範囲：３０℃で３時間処理する場合において、ｐＨ４．０〜９．０；および
（７）等電点：約３．７；
を有する。上記糸状菌は、フォーマ属に属し、特にＰｈｏｍａ  ｓｐ．Ｍａ２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５２）である。
【００１８】
このことによって上記目的が達成される。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明のアルカリラッカーゼは、代表的には、糸状菌由来のものである。ここでいう「糸状菌由来のアルカリラッカーゼ」には、天然の糸状菌の培養物より調製されるアルカリラッカーゼに限定されず、自体公知の方法（例：紫外線、Ｘ線、γ線等の照射、薬剤処理、薬剤含有培地上での培養、遺伝子操作技術等）により、それらの菌株から誘導される、アルカリラッカーゼ高生産性変異株の培養物から調製される、当該酵素と等しい性質を有する酸化酵素も包含される。好ましくはフォーマ（Ｐｈｏｍａ）属に属する糸状菌由来のもの、特に好ましくはフォーマ（Ｐｈｏｍａ）属  Ｍａ２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５２）由来のものが挙げられる。
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
（１）アルカリラッカーゼ
本発明の代表例であるフォーマ（Ｐｈｏｍａ）属  Ｍａ２株の生産するアルカリラッカーゼは、以下の表１に示す種々の特性を有する。
【００２２】
【表１】
2004208503.tif 000002
【００２３】
本明細書では、「酵素が安定である」とは、ある処理をした場合に、酵素が、約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相対残存活性を有することをいう。
【００２４】
上記特性を有するアルカリラッカーゼは、これまで知られていない。
【００２５】
本発明のアルカリラッカーゼの代表例であるＰｈｏｍａ  ｓｐ．Ｍａ２株由来の酵素は、７〜１１のｐＨ範囲で、好ましくはｐＨ８．３〜１０．６、より好ましくはｐＨ９．０〜１０．０のｐＨ範囲で、複素環系化合物または芳香族アミンの酸化反応を行い得、ｐＨ１０付近に至適ｐＨがあり、アルカリ性域での酸化反応を触媒するという特長を有する（図６）。また、至適温度は約５０℃であり（図４）、さらには、様々な一定温度で３０分間の加熱処理を施した後の活性は、例えば６０℃においてはほぼ９５％の残存活性を示した（図５）。さらには、様々なｐＨのバッファー中で３０℃、３時間の処理を施した後の残存活性は、広範囲のｐＨにおける安定性を示した（図７）。これらの結果は、弱アルカリ性からアルカリ性の範囲のｐＨ域で、中低温の様々な溶液中での酸化反応を保証する。
【００２６】
また、本発明のアルカリラッカーゼは、従来の酸性域に至適反応ｐＨを有する酵素と共に組み合わせて用いることも可能である。つまり、従来知られている酸性域に至適反応ｐＨを有するラッカーゼと本発明のアルカリラッカーゼを組み合わせて用いることで、酸性からアルカリ性の広範囲のｐＨ域においてラッカーゼ反応を行うことが可能となる。このような目的で酵素を混合して用いるとき、酸性域に至適反応ｐＨを有するラッカーゼの活性量と本発明のアルカリラッカーゼの活性量との混合比率は、好ましくは１：２０〜２０：１、より好ましくは１：２〜２：１にして用いることができる。このようにして広範囲のｐＨ域においてラッカーゼ反応を達成するためにも、本発明のアルカリラッカーゼは有用である。
【００２７】
（２）アルカリラッカーゼの起源
本発明の代表例のアルカリラッカーゼは、フォーマ属の糸状菌、特に平成１４年１２月１３日に工業技術院生命工学工業技術研究所（生命研と略称する）に寄託したＰｈｏｍａ  ｓｐ．Ｍａ２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５２）（以下、Ｍａ２株と略称する）により生産される。Ｍａ２株は、発明者が土壌、腐朽物、ならびにその他等からラッカーゼを生産する微生物を広くスクリーニングした結果、新たにマアジの腸内から単離された新菌株である。
【００２８】
本発明のアルカリラッカーゼ生産菌は、例えば、以下のようにして取得され得る。土壌、腐朽物、海水、淡水、海浜または河原で見られる泡塊、底泥、活性汚泥、魚類内臓などの試料を採取する。採取した試料を、生理食塩水または滅菌水とよく混合した後に静置し、上澄み液を得る。次に上澄み液を２００μＬ採取して染料を含有するアルカリ性の固形培地に塗り広げ、２８℃にて数日間静置培養する。出現した微生物コロニーの周囲に、染料の脱色ハローが観察されるコロニーを、アルカリラッカーゼ生産菌として分離する。
【００２９】
分離されるアルカリラッカーゼ生産菌は、当業者に周知の方法を用いて、生産するアルカリラッカーゼについてさらに詳細に特徴付けられ得る。
【００３０】
本発明者により単離されたＭａ２株の、分類学的性状を表２及び表３示す。表中に記載されるＯＡ〔碾割り燕麦  ６０ｇ、寒天  １２．５ｇ、蒸留水  １Ｌ〕、ＰＤＡ〔馬鈴薯浸出液  ２００ｇ、葡萄糖  ２０ｇ、寒天  １５ｇ、蒸留水  １Ｌ〕、ＭＥＡ〔麦芽エキス  ３０ｇ、寒天  １５ｇ、蒸留水  １Ｌ〕は、培地の種類を表す。Ｍａ２株は、表２及び表３に記載のコロニー性状・分生子形成構造体の形態的特徴から（Ａｒｘ，Ｊ．Ａ．ｖｏｎ（１９７４）  Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  ｆｕｎｇｉ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｕｒｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａ．Ｒ．Ｇａｎｔｎｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  ＫＧ，Ｖａｄｕｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ，３１５頁、Ｄｏｍｓｃｈ，Ｋ．Ｈ．，Ｇａｍｓ，Ｗ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｈ．（１９９３）Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｓｏｉｌ  ｆｕｎｇｉ，第１巻、ＩＨＷ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｅｃｈｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，再版，８６０頁、およびＭａｌｌｏｃｈ，Ｄ．（１９８１）Ｍｏｕｌｄｓ−ｔｈｅｉｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＵＳＡ，９７頁）、Ｐｈｏｍａ属と同定され、Ｐｈｏｍａ  ｓｐ．Ｍａ２と命名された。
【００３１】
【表２】
2004208503.tif 000003
【００３２】
【表３】
2004208503.tif 000004
【００３３】
（３）アルカリラッカーゼを生産させるための培養条件
本発明のアルカリラッカーゼを生産する糸状菌を培養する代表的な条件を説明する。本発明の糸状菌は、液体培養または固体培養のいずれでも、培養され得る。本発明の糸状菌を培養する培地としては、特に限定されず、通常用いられる合成培地や有機炭素源、及び有機窒素源或いは無機窒素源を含む、液体培地または固体培地が使用可能である。炭素源の例としては、本発明の糸状菌が同化し得るものなら何でもよく、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、ソルビトール、糖蜜、澱粉等の糖類、ふすま、みかんパルプなどが単独で、または組み合わせて用いられ得る。窒素源の例としては、おから、アミノ酸、各種ペプトン類、脱脂大豆粉、コーンスティープリカー、尿素、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキスなどの有機窒素源の他、硝石、硝安、硫安等の無機窒素源も、単独で、または組み合わせて使用し得る。必要に応じて、芒硝、瀉痢塩、緑礬、胆礬、皓礬といった硫酸塩、リン酸塩、カリウム、カルシウム、マンガン、コバルト等の無機塩類、ビタミン類、核酸関連化合物類等が添加され得る。また、酵素の生産性を高めるために適切量の生産誘導物質を添加してもよい。これらの培地成分は、本菌の生育を阻害しない濃度であればよく、炭素源は０．１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％、窒素源は０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％である。また、培地のｐＨをアルカリ側にする場合、予め別殺菌しておいた苛性ソーダ、炭酸ソーダ、または重曹を含む溶液の適当量を、殺菌済みの培地に添加することによりｐＨ調整を達し得る。
【００３４】
培地のｐＨを、５．０から１２．０、好ましくは、６．０〜１０．０に調整し、滅菌して使用する。培養温度は、糸状菌類が生育し得る温度であればよく、実用上、１０〜約４０℃、好ましくは２５〜３５℃である。培養は、通常の中温菌の培養に準じ、液体培養にあっては通気培養或いは振盪培養、また固体培養にあっては静置培養により行えばよい。培養の継続時間は、種々の培養条件によって異なるが、目的とするラッカーゼが十分産生する期間であり、通気または振盪培養の場合は、通常２〜７日間が好ましい。
【００３５】
（４）培養液からのアルカリラッカーゼの調製
本発明のアルカリラッカーゼは、液体培養の場合、代表的には、菌体外に分泌される。従って、当該酵素を培地中に生産・蓄積せしめた後、下記の方法により培養液からのアルカリラッカーゼの調製を達成し得る。
【００３６】
すなわち、培養停止後、固液分離（例：濾布または濾紙などによる濾過、遠心分離、膜分離等）により菌体等の不溶物を除き、アルカリラッカーゼを含む培養濾液を回収する。次いで、透析、塩析、膜濃縮、各種カラムクロマトグラフィー、等電点沈殿、非水溶媒による沈殿、活性炭による吸着・脱色等といった、一般的に用いられるタンパク質の分別・分離法を、単独使用もしくは併用することにより該培養濾液から本発明のアルカリラッカーゼを調製し得る。例えば、上記で得られた培養濾液を限外濾過、硫安分画後、透析、各種クロマトグラフィーに順次供試することにより、アルカリラッカーゼの高活性画分が調製され得る。
【００３７】
（５）アルカリラッカーゼ活性の測定
本発明において、アルカリラッカーゼ活性は、アルカリラッカーゼが触媒する、ＭＢＴＨ（正式名：３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）と、ホモバニリルアルコールとの酸化縮合による発色反応系において、酵素添加後の５６０ｎｍにおける吸光度の変化を調べることにより測定され得る。
【００３８】
詳細な測定方法は、次の通りである。１．５マイクロモルのホモバニリルアルコールおよび１．０マイクロモルのＭＢＴＨ含む１１５．４ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１０４０μＬを３０℃にて５分間プレインキュベートした後、酵素液１６０μＬを混合・攪拌する。混合・攪拌して３０秒後、測定を開始する。測定開始から３０秒後までの５６０ｎｍにおける吸光度の経時的変化を追跡する。１分間に吸光度を１増加させる酵素活性を１単位（Ｕ；ユニット）としてアルカリラッカーゼの活性値を算出する。
【００３９】
【実施例】
以下の実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、これらはなんら本発明を限定するものではない。
【００４０】
実施例１
（Ｐｈｏｍａ  ｓｐ．Ｍａ２株の培養）
１００ｍＬの培地（５％  グルコース、０．５％  ポリペプトン、０．１％  イーストエキス、０．２％  ＫＨ２ＰＯ４、０．１％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０）を含む５００ｍＬ容丸フラスコに、Ｐｈｏｍａ  ｓｐ．  Ｍａ２株の一白金耳を接種し、３０℃で７日間、振盪培養した。次いで、この培養液１ｍＬを、１００ｍＬの上記培地を含む５００ｍＬ容丸フラスコに植菌し、３０℃で５日間、振盪培養した。
【００４１】
実施例２
（本アルカリラッカーゼの部分精製）
上記実施例で得た培養液に対し遠心分離（１２，０００ｒｐｍ×２０ｍｉｎ；４℃）を行い固液分離後、上清を濾別する。回収した濾液を合わせ培養濾液とした。
【００４２】
培養濾液をＵＦ（限外濾過）膜にて濃縮し、分子量３０，０００以上の画分として濃縮した。ＵＦ濃縮液を苛性ソーダでｐＨ７．０に調整後、硫安塩析（９０％飽和；４℃、一晩静置）を行い、次いで０．７％（Ｗ／Ｖ；Ｖ＝塩析前の液量）に相当する量のセライトを添加し、よく懸濁する。該懸濁液の濾別により、塩析ケーキが得られる。
【００４３】
低温下で塩析ケーキを９０％飽和硫安で数回洗淨した後、適当量の２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、よく攪拌する。この添加・攪拌操作により、塩析ケーキに含まれる塩析タンパク質が溶解されるので、懸濁液を濾過する。得た濾液に対し２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析し、これを透析内液とした。透析内液をＵＦ膜により濃縮し、これを部分精製液とした。
【００４４】
上記各工程における本アルカリラッカーゼの比活性（Ｕ／  ２８０ｎｍでの吸光度）、収率及び精製度を表４に示す。
【００４５】
【表４】
2004208503.tif 000005
【００４６】
実施例３
（単一性の確認）
実施例２に記載の部分精製液の一部を、ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動に供試し、泳動後のゲルに対しＣＢＢ  Ｒ−３５０（製品名：Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｔａｂｌｅｔｓ，ＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−３５０＜アマシャムバイオサイエンス社製；以下、“Ａ．Ｂ．社製”と略記＞）を用いた染色によるタンパク質の検出、およびホモバニリルアルコールおよびＭＢＴＨを用いる上記発色反応系によるアルカリラッカーゼの活性検出を行った
その結果、ｐＨ５以下の酸性側で検出された均一なタンパク質バンドとアルカリラッカーゼ活性バンドとの位置が一致し、実施例１〜２の工程を経て調製した当該部分精製液に一種類のアルカリラッカーゼが含まれることを確認した。
【００４７】
実施例４
（本アルカリラッカーゼの等電点）
実施例２に記載の部分精製液の一部を等電点電気泳動（以下、ＩＥＦと略記）に供試した。なおＩＥＦ専用装置としてＲｏｔｏｆｏｒ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、両性担体としてＡｍｐｈｏｌｉｎｅ，ｐｒｅｂｌｅｎｄｅｄ  ｐＨ３．５−９．５（Ａ．Ｂ．社製；以下、“Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ”と略記）を使用した。
【００４８】
先ず、部分精製液を４％、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅを４％含む水溶液５０ｍＬに対して当該電気泳動を行い（初泳動）、アルカリラッカーゼ活性が強く検出された分画液、Ｎｏ．３（ｐＨ４．２）及びＮｏ．４（ｐＨ４．４）を足し合わせて活性画分とした。次に、部分精製液（２ｍＬ）および活性画分（全量）を含有する水溶液約６０ｍＬに対して、ＩＥＦを再度実施した（再泳動）。再泳動により得た分画液について、ｐＨ値および活性値をそれぞれ測定した。その結果を図１に示す。図１からわかるように、本アルカリラッカーゼの等電点は約３．７である。
【００４９】
実施例５
（本アルカリラッカーゼの分子量）
実施例２に記載の部分精製液の一部を、ＧＦＣ（ゲル濾過クロマトグラフィー）カラムに供試し、本アルカリラッカーゼの分子量を測定した。なおＧＦＣカラムとしてＨｉＰｒｅｐ  ２６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲ（Ａ．Ｂ．社製；以下、本カラムと略記）を用いた。
【００５０】
２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ含有；ｐＨ７．５）で予め平衡化しておいた本カラムに部分精製液をアプライした後、平衡化に用いたのと同一の緩衝液を用い流速０．９ｍＬ／ｍｉｎにて溶出を行った。溶出液の分画（０．９８ｍＬ／ｔｕｂｅ）の開始は、通液量が８６ｍＬに達した時点以降とし、その後、得られた分画液について、２８０ｎｍにおける吸光度およびアルカリラッカーゼ活性を測定した。アルカリラッカーゼ活性の測定は、室温（２６℃）で２０分間の上記発色反応後の呈色強度について、以下のように点数評価することによって目視的に行った：無色透明  ０点；非常に薄い紫色  ０．５点；薄い紫色（３段階評価）  １．０点、１．５点、２．０点；紫色（２段階評価）  ２．５点、３．０点；濃い紫色  ３．５点；黒紫色  ４．０点。その結果を、図２に示す。
【００５１】
次いで本カラムでの標準物質の溶出位置に基づいて予め作成しておいた分子量標準曲線（図３）に活性ピークの溶出位置を当てはめ、分子量を算出した。その結果、本アルカリラッカーゼの分子量は約４２〜４３ｋＤａであった。なお標準物質としてブルーデキストラン２０００、ウシ血清アルブミン、鶏卵オボアルブミン、ウシ膵臓キモトリプシノーゲンＡ、ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（以上、Ａ．Ｂ．社製）を用いた。
【００５２】
実施例６
（本アルカリラッカーゼの作用適温範囲および熱安定性）
（１）作用適温の範囲
実施例２で得られた部分精製液の本アルカリラッカーゼの活性を、上記発色反応系において種々の温度条件（３０、４０、４５、５０、６０、７０℃）下で測定した。結果を図４に示す。図中の横軸は反応温度（℃）を表し、縦軸は最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を表す。本アルカリラッカーゼの至適温度は、約５０℃である。
【００５３】
（２）熱安定性
実施例２で得られた部分精製液の本アルカリラッカーゼを、種々の温度条件（０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、８０、９０℃）下にて、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で３０分間インキュベートして前処理をした後、上記発色反応系にて残存活性を測定した。結果を図５に示す。図中の横軸は処理温度（℃）を表し、縦軸は最大活性値を１００とした場合の相対残存活性（％）を表す。本アルカリラッカーゼは、処理温度条件が６５℃の場合において酵素活性の約７３％、７０℃の場合においてその約５６％以上が保持され、安定である。本アルカリラッカーゼは、処理温度条件が６０℃では、酵素活性は約９５％保持される。
【００５４】
実施例７
（本アルカリラッカーゼの至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲）
（１）至適ｐＨ
上記発色反応系にて使用する１００ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）の代わりに、ｐＨ領域に応じ、酢酸ソーダ−塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸カリ緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−食塩−苛性ソーダ緩衝液を用いてｐＨを１．０〜１１．１（１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、７．５、８．３、９．０、１０．０、１０．４、１０．６、１１．０、１２．５）に調整し、実施例２で得られた部分精製液の本アルカリラッカーゼの活性を測定した。結果を図６に示す。図中の横軸は反応ｐＨを表し、縦軸は最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を表す。本アルカリラッカーゼの至適ｐＨは、約１０である。
【００５５】
（２）安定ｐＨ範囲
実施例２で得られた部分精製液の本アルカリラッカーゼのｐＨを、種々の緩衝液にて１．０〜１２．５（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２．５）に調整し、３０℃で３時間インキュベートしてｐＨ処理液を得た。次いで、ｐＨ処理液各々について上記発色系にて残存活性を調べた。結果を図７に示す。図中の横軸は処理ｐＨを表し、縦軸は最大活性値を１００とした場合の相対残存活性（％）を表す。本アルカリラッカーゼの安定ｐＨ範囲は、４．０〜９．０である。
【００５６】
実施例８
（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｕｃｃａｒｉａ由来アルカリラッカーゼとの比較：至適ｐＨ）
実施例７（１）に記載の方法において、部分精製液の替わりにＭｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｕｃｃａｒｉａ  ２４Ｇ−４株（以下、２４Ｇ−４株と略称する）由来アルカリラッカーゼの部分精製液を用い、当該酵素の至適ｐＨを上記発色反応系の改変方法（反応液中のエタノール終濃度：１．５％）にて調べた。結果を図８に示す。図中の横軸は反応ｐＨを表し、縦軸は最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を表す。上記反応条件下での、２４Ｇ−４株由来アルカリラッカーゼの至適ｐＨは、約８．５である。
【００５７】
実施例７（１）に記載の方法において、部分精製液の替わりに２４Ｇ−４株由来アルカリラッカーゼの部分精製液を用いて、上記発色反応系にて使用する１００ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液のｐＨ値を８．０〜８．９（８．０、８．３、８．５、８．７、８．９）に調整した条件で、当該酵素の至適ｐＨを調べた。結果を図９に示す。図中の横軸は反応ｐＨを表し、縦軸は最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を表す。２４Ｇ−４株由来アルカリラッカーゼの上記発色反応系での至適ｐＨは、約８．３である。
【００５８】
実施例９
（アルカリラッカーゼの基質特異性▲１▼：ｐ−フェニレンジアミンに対する酸素消費量）
実施例２に記載の部分精製液をアルカリラッカーゼ粗酵素液として用い、ｐ−フェニレンジアミンを基質として供試し、基質の酸化に伴う酸素消費性をクラーク型酸素電極により電気信号に変換する酸素電極法を用いて調べた。詳細には、粗酵素液（０．８４Ｕ）を含む、１０１ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）  １４８５μＬを、３０℃で１０分間、空気で平衡化した。次いで、ｐ−フェニレンジアミン溶液  １５μＬ（基質含量：１．５μｍｏｌ）を添加することにより反応を開始し、酸素消費量を測定した。ブランク値は、部分精製液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に替えることにより調べられた。その結果、０．０１１ｍＶ／１０ｍｉｎの電圧変化があることを確認した。
【００５９】
実施例１０
（アルカリラッカーゼの基質特異性▲２▼：各基質に対する酸素消費活性）
実施例２に記載の部分精製液をアルカリラッカーゼ粗酵素液として用い、基質特異性を調べた。詳細には、７．５μｍｏｌの基質を含む、２３１ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−食塩−苛性ソーダ緩衝液（ｐＨ１０．０）  １３００μＬを、５０℃で１０分間、空気で平衡化した。次いで、粗酵素液２００μＬ（酵素含量：０．０８Ｕ）を添加することにより反応を開始し、酸素消費量を測定した。基質として、フェノール系化合物類（シリンガ酸、ホモバニリルアルコール）、芳香族アミン系化合物類（ｐ−フェニレンジアミン、バニリルアミン）、複素環系化合物類（ＭＢＴＨ、４−アミノアンチピリン、ＡＢＴＳ（正式名：２，２‘−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））、その他（アスコルビン酸）を用いた。ブランク値は、部分精製液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に替えることにより調べられた。その結果を表５に示す。表５から、部分精製アルカリラッカーゼは、フェノール系化合物より複素環系化合物及び芳香族アミン系化合物類に強く作用することが判る。
【００６０】
【表５】
2004208503.tif 000006
【００６１】
実施例１１
（アルカリラッカーゼの基質特異性▲３▼：各基質に対する酸化呈色性）
実施例２に記載の部分精製液をアルカリラッカーゼ粗酵素液として用い、本アルカリラッカーゼが触媒する基質酸化に伴う呈色反応について吸収スペクトルの経時的変化を調べた（スキャニング法適用）。詳細には、１．２μｍｏｌの基質を含む、１１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ  グリシン−食塩−苛性ソーダ緩衝液（ｐＨ１０．０）１０８０μＬをキュベット内に入れ、５０℃で５分間、予温を行った後、粗酵素液１２０μＬ（酵素含量：０．０４Ｕ）を添加し、よく攪拌する。粗酵素液添加３０秒後にベースライン補正をしてから、１回目のスキャニングを開始した（粗酵素液添加２分後）。２回目以降のスキャニングは、１回目のスキャニングの開始から４分間隔（すなわち、粗酵素液添加６、１０、１４、１８、２２、２６、３０分後）で行った。ブランクのスペクトルは、上記条件において部分精製液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に替えることにより調べられた。基質として、ハイドロキノン、ホモバニリルアルコール、メタネフリン、ｐ−アミノフェノール、バニリルアミン、ｐ−フェニレンジアミン、ＭＢＴＨ、３−アミノ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾールを用いた。なお、スキャニングの条件は、走査波長域を２００〜７００ｎｍ、走査波長間隔を５ｎｍ、走査時間を約４０秒とした。
【００６２】
結果は、上記被検基質に対する各々の吸収スペクトルの経時的変化について各基質ごとに全て重ね合わせた形で示した（図１０〜１７）。いずれの図も一番下のスペクトルグラフから順に、１回目〜最終回目のグラフに相当する。これらの図から、一部を除いて経時的に吸収値が上がっていき基質の酸化呈色反応が進行していることが分かると同時に、部分精製アルカリラッカーゼは、フェノール系化合物類より複素環系化合物類及び芳香族アミン系化合物類に強く作用することが示唆される。
【００６３】
【発明の効果】
本発明によれば、アルカリ性域に至適ｐＨを有し、かつアルカリ性条件下で耐熱性に優れた新規アルカリラッカーゼ、ならびにその生産方法および生産菌が提供される。本発明のアルカリラッカーゼは、従来のアルカリラッカーゼに較べてより高いアルカリ性域に至適ｐＨを有し、且つアルカリ性条件下で耐熱性に優れているため、洗剤及び染毛剤の製造、パルプ製造処理工程等に有用である。本発明のアルカリラッカーゼは、糸状菌の培養によって生産されるため、安価に大量にアルカリラッカーゼを提供することが出来、工業用途または試薬に広く利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のアルカリラッカーゼの等電点電気泳動の結果を示すグラフを示す図である。
【図２】図２は、ゲル濾過クロマトグラフィーによる本発明のアルカリラッカーゼ溶出の結果を示すグラフを示す図である。
【図３】図３は、ゲル濾過クロマトグラフィーによる本発明のアルカリラッカーゼの溶出ピークに基づいて算出された、本発明のアルカリラッカーゼの分子量を示すグラフを示す図である。
【図４】図４は、本発明のアルカリラッカーゼの至適温度を示すグラフを示す図である。
【図５】図５は、本発明のアルカリラッカーゼの熱安定性を示すグラフを示す図である。
【図６】図６は、本発明のアルカリラッカーゼの至適ｐＨを示すグラフを示す図である。
【図７】図７は、本発明のアルカリラッカーゼのｐＨ安定性を示すグラフを示す図である。
【図８】図８は、従来のＭｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｕｃｃａｒｉａ  ２４Ｇ−４株由来アルカリラッカーゼの至適ｐＨを示すグラフを示す図である。
【図９】図９は、ｐＨ８．０〜９．０にて測定した、従来のＭｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｕｃｃａｒｉａ  ２４Ｇ−４株由来アルカリラッカーゼの至適ｐＨを示すグラフを示す図である。
【図１０】図１０は、本発明のアルカリラッカーゼのハイドロキノンに対する酸化呈色についての、吸収スペクトルの経時的変化を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明のアルカリラッカーゼのホモバニルアルコールに対する酸化呈色についての、吸収スペクトルの経時的変化を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明のアルカリラッカーゼのメタネフリンに対する酸化呈色についての、吸収スペクトルの経時的変化を示す図である。
【図１３】図１３は、本発明のアルカリラッカーゼのｐ−アミノフェノールに対する酸化呈色についての、吸収スペクトルの経時的変化を示す図である。
【図１４】図１４は、本発明のアルカリラッカーゼのバニリルアミンに対する酸化呈色についての、吸収スペクトルの経時的変化を示す図である。
【図１５】図１５は、本発明のアルカリラッカーゼのｐ−フェニレンジアミンに対する酸化呈色についての、吸収スペクトルの経時的変化を示す図である。
【図１６】図１０は、本発明のアルカリラッカーゼのＭＢＴＨに対する酸化呈色についての、吸収スペクトルの経時的変化を示す図である。
【図１７】図１０は、本発明のアルカリラッカーゼの３−アミノ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾールに対する酸化呈色についての、吸収スペクトルの経時的変化を示す図である。
【図１】
2004208503.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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