(57)【要約】　　【課題】　本発明は、新規の２本鎖リボゾーム不活性化蛋白(ＲＩＰ)ないしその製法および調製物を提供する。　　【解決手段】　ジスルフィド架橋によって結合した、そのうち鎖Ａはリボソーム・リボ核酸のＮ−グルコシダーゼ活性を有し、鎖Ｂはレクチン活性を有する２本の鎖ＡおよびＢより構成され、無細胞系においてリボ核酸と相互作用でき、かつ蛋白生合成の阻害を引き起こすことができる、植物起源の、細胞外領域において２本の鎖を持つ、塩基ニグリン１、エブリン１およびラセモシンｂという新規な非毒性のリボソーム不活性化蛋白（ＲＩＰ）であって；該新規な蛋白は、標的細胞に存在する膜レセプターによって認識され得る担体分子（抗体、ホルモンまたは他の蛋白）に結合しており、そのいくつかのリボソームのリボ核酸の不活性化によって該標的細胞に対する鎖Ａの特異的かつ選択的な作用を可能とし、それに対して細胞外領域において毒性を欠く、該担体分子によって選択されなかった細胞に対する該ＲＩＰの無差別的攻撃を実質的に回避する等を特徴とする該非毒性蛋白、その製法および調製物。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジスルフィド架橋によって結合した、そのうち鎖Ａはリボソーム・リボ核酸のＮ−グルコシダーゼ活性を有し、鎖Ｂはレクチン活性を有する２本の鎖ＡおよびＢより構成され、無細胞系においてリボ核酸と相互作用でき、かつ蛋白生合成の阻害を引き起こすことができる、植物起源の、細胞外領域において２本の鎖を持つ、塩基ニグリン１という非毒性蛋白であって；
　該蛋白は、標的細胞に存在する膜レセプターによって認識され得る担体分子（抗体、ホルモンまたは他の蛋白）に結合しており、そのいくつかのリボソームのリボ核酸の不活性化によって該標的細胞に対する鎖Ａの特異的かつ選択的な作用を可能とし、それに対して細胞外領域において毒性を欠く、該担体分子によって選択されなかった細胞に対する該蛋白の無差別的攻撃を実質的に回避することを特徴し；および
　該蛋白が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定して、還元剤の不存在下で６６０００の相対的分子量を有し、還元剤の存在下で３２０００の鎖Ａの相対的分子量および３４０００の鎖Ｂの相対的分子量を有し、それらの鎖が以下：
　鎖Ａ；ブロックされたアミノ末端のアミノ酸、
　鎖Ｂ；
　Ala Pro Xxx Tyr Pro Thr Xxx Xxx
　１　　　　　　　５
の配列のアミノ末端を有するサムブカス・ニグラ・エル（Sambucus nigra Ｌ)の葉から単離された該非毒性蛋白。
【請求項２】
ジスルフィド架橋によって結合した、そのうち鎖Ａはリボソーム・リボ核酸のＮ−グルコシダーゼ活性を有し、鎖Ｂはレクチン活性を有する２本の鎖ＡおよびＢより構成され、無細胞系においてリボ核酸と相互作用でき、かつ蛋白生合成の阻害を引き起こすことができる、植物起源の塩基ニグリン１という非毒性蛋白であって；該蛋白は、標識細胞に存在する膜レセプターによって認識され得る担体分子（抗体、ホルモンまたは他の蛋白）によって結合されており、そのリボソームのリボ核酸の不活性化によって該標的細胞に対する鎖Ａの特異的かつ選択的な作用を可能とし、それに対して毒性を欠く担体分子によって選択されなかった細胞に対する該蛋白の無差別的攻撃を実質的に回避することを特徴とし、さらに、塩化ナトリウムおよびリン酸一ナトリウムの水性塩基で植物の対応する部分を抽出し、続いて、該抽出物を濃縮し、次いで、イオン交換および／またはアフィニティーおよび分子排除クロマトグラフィー技術によってそれを精製することによるいくつかの最初の工程による、非毒性植物の単離によって得られることを特徴とし；および
　該蛋白が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定して、還元剤の不存在下で６６０００の相対的分子量を有し、還元剤の存在下で３２０００の鎖Ａの相対的分子量および３４０００の鎖Ｂの相対的分子量を有し、それらの鎖が以下：
　鎖Ａ；ブロックされたアミノ末端のアミノ酸、
　鎖Ｂ；
　Ala Pro Xxx Tyr Pro Thr Xxx Xxx
　１　　　　　　　５
の配列のアミノ末端を有するサムブカス・ニグラ・エル（Sambucus nigra Ｌ)の葉から単離された該非毒性蛋白。
【請求項３】
ジスルフィド架橋によって結合した、そのうち鎖Ａはリボソーム・リボ核酸のＮ−グルコシダーゼ活性を有し、鎖Ｂはレクチン活性を有する２本の鎖ＡおよびＢより構成され、無細胞系においてリボ核酸と相互作用でき、かつ蛋白生合成の阻害を引き起こすことができる、植物起源の、細胞外領域において２本の鎖を持つ、エブリン１という非毒性蛋白であって；
　該蛋白は、標的細胞に存在する膜レセプターによって認識され得る担体分子（抗体、ホルモンまたは他の蛋白）に結合しており、そのいくつかのリボソームのリボ核酸の不活性化によって該標的細胞に対する鎖Ａの特異的かつ選択的な作用を可能とし、それに対して細胞外領域において毒性を欠く、該担体分子によって選択されなかった細胞に対する該蛋白の無差別的攻撃を実質的に回避することを特徴し；および 
　該蛋白が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して、還元剤の存在下で２６０００の鎖Ａの相対的分子量および３００００の鎖Ｂの相対的分子量を有し、かつその不存在下で５６０００の相対的分子量を有し、かつアミノ末端における以下のアミノ酸配列：
　鎖Ａ；
　Ile Asp Tyr Pro Ser Val Ser Phe Asn Leu Ala
　１　　　　　　　５　　　　　　　　 １０
　Gly Ala Lys Ser Thr Thr Tyr Arg Asp Phe Leu
　　　　　　  １５　　　　　　　  ２０
　Lys Asn Leu
　　　　　２５
　鎖Ｂ；
　Asp Gly Glu Thr Xxx Ala Ile Pro Ala Pro Phe
　１　　　　　　　５　　　　　　　    １０
　Thr Arg Arg Ile Val Gly Xxx Asp Gly Leu Glu
　　　　　　　１５　　　　　　　　２０
　Val Asp Pro
　　　　 ２５
（ここに、Ｘｘｘはいずれかのアミノ酸を表す）
を有するサムブカス・エブルス・エル（Sambucus ebulus Ｌ)の葉から単離された非毒性蛋白。
【請求項４】
ジスルフィド架橋によって結合した、そのうち鎖Ａはリボソーム・リボ核酸のＮ−グルコシダーゼ活性を有し、鎖Ｂはレクチン活性を有する２本の鎖ＡおよびＢより構成され、無細胞系においてリボ核酸と相互作用でき、かつ蛋白生合成の阻害を引き起こすことができる、植物起源のエブリン１という非毒性蛋白であって；該蛋白は、標識細胞に存在する膜レセプターによって認識され得る担体分子（抗体、ホルモンまたは他の蛋白）によって結合されており、そのリボソームのリボ核酸の不活性化によって該標的細胞に対する鎖Ａの特異的かつ選択的な作用を可能とし、それに対して毒性を欠く担体分子によって選択されなかった細胞に対する該蛋白の無差別的攻撃を実質的に回避することを特徴とし、さらに、塩化ナトリウムおよびリン酸一ナトリウムの水性塩基で植物の対応する部分を抽出し、続いて、該抽出物を濃縮し、次いで、イオン交換および／またはアフィニティーおよび分子排除クロマトグラフィー技術によってそれを精製することによるいくつかの最初の工程による、非毒性植物の単離によって得られることを特徴とし；および
　該蛋白が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して、還元剤の存在下で２６０００の鎖Ａの相対的分子量および３００００の鎖Ｂの相対的分子量を有し、かつその不存在下で５６０００の相対的分子量を有し、かつアミノ末端における以下のアミノ酸配列：
　鎖Ａ；
　Ile Asp Tyr Pro Ser Val Ser Phe Asn Leu Ala
　１　　　　　　　５　　　　　　　　 １０
　Gly Ala Lys Ser Thr Thr Tyr Arg Asp Phe Leu
　　　　　　  １５　　　　　　　  ２０
　Lys Asn Leu
　　　　　２５
　鎖Ｂ；
　Asp Gly Glu Thr Xxx Ala Ile Pro Ala Pro Phe
　１　　　　　　　５　　　　　　　    １０
　Thr Arg Arg Ile Val Gly Xxx Asp Gly Leu Glu
　　　　　　　１５　　　　　　　　２０
　Val Asp Pro
　　　　 ２５
（ここに、Ｘｘｘはいずれかのアミノ酸を表す）
を有するサムブカス・エブルス・エル（Sambucus ebulus Ｌ)の葉から単離された非毒性蛋白。
【請求項５】
ジスルフィド架橋によって結合した、そのうち鎖Ａはリボソーム・リボ核酸のＮ−グルコシダーゼ活性を有し、鎖Ｂはレクチン活性を有する２本の鎖ＡおよびＢより構成され、無細胞系においてリボ核酸と相互作用でき、かつ蛋白生合成の阻害を引き起こすことができる、植物起源の、細胞外領域において２本の鎖を持つ、ラセモシンｂという非毒性蛋白であって；
　該蛋白は、標的細胞に存在する膜レセプターによって認識され得る担体分子（抗体、ホルモンまたは他の蛋白）に結合しており、そのいくつかのリボソームのリボ核酸の不活性化によって該標的細胞に対する鎖Ａの特異的かつ選択的な作用を可能とし、それに対して細胞外領域において毒性を欠く、該担体分子によって選択されなかった細胞に対する該蛋白の無差別的攻撃を実質的に回避することを特徴し； 
　該蛋白が、サムブカス・ラセモサ・エル（Sambucus racemosa Ｌ)の樹皮から単離され、かつ該蛋白が、ポリアクルアミドゲル電気泳動によって測定して、還元剤の不存在下で５８０００の相対的分子量を有し、還元剤の存在下で２７５００の鎖Ａの相対的分子量および２９５００の鎖Ｂの相対的分子量を有し；および
　該蛋白が、以下の操作：
　（ａ）サムブカス・ラセモサ（Sambucus racemosa)の樹皮をＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４の水性溶液で抽出して、ウサギ網状赤血球溶解物において蛋白生合成を阻害でき、かつヒト赤血球細胞凝集素活性を有する粗製蛋白抽出物を得；
　（ｂ）得られたペーストをメッシュを通して濾過し、予め酸性化した濾液を遠心し；
　（ｃ）得られた予め酸性化した流体を高度に架橋性質のマトリックスを有する４０〜１６５μｍのアガロースビーズベースの高速流イオン交換体上のイオン交換クロマトグラフィーに付し、まず、カラムを酢酸ナトリウムで洗浄し、次いで、リン酸一ナトリウムで洗浄し；
　（ｄ）該洗浄したカラムを塩化ナトリウムおよびリン酸一ナトリウム溶液で溶出させ、蛋白画分を収集し；
　（ｅ）該蛋白画分を、イオン力グラジエントにて、高度に架橋性質のマトリックスを有し、かつ部分構造−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯ−を有する交換基を含む４０〜１６５μｍのアガロースビーズベースの高速流イオン交換体上のイオン交換クロマトグラフィーに付し、該蛋白を含有する画分を分離し、次いで、膜を用いかつ１０％マクロ溶質濃度までの溶液で高速流速を供する限外濾過撹拌セルでそれらを濃縮し；
　（ｆ）予め濃縮した画分を分子排除クロマトグラフィーに付す；
ことによって得られる該非毒性蛋白。
【請求項６】
ジスルフィド架橋によって結合した、そのうち鎖Ａはリボソーム・リボ核酸のＮ−グルコシダーゼ活性を有し、鎖Ｂはレクチン活性を有する２本の鎖ＡおよびＢより構成され、無細胞系においてリボ核酸と相互作用でき、かつ蛋白生合成の阻害を引き起こすことができる、植物起源のラセモシンｂという非毒性蛋白であって；該蛋白は、標識細胞に存在する膜レセプターによって認識され得る担体分子（抗体、ホルモンまたは他の蛋白）によって結合されており、そのリボソームのリボ核酸の不活性化によって該標的細胞に対する鎖Ａの特異的かつ選択的な作用を可能とし、それに対して毒性を欠く担体分子によって選択されなかった細胞に対する該蛋白の無差別的攻撃を実質的に回避することを特徴とし、さらに、塩化ナトリウムおよびリン酸一ナトリウムの水性塩基で植物の対応する部分を抽出し、続いて、該抽出物を濃縮し、次いで、イオン交換および／またはアフィニティーおよび分子排除クロマトグラフィー技術によってそれを精製することによるいくつかの最初の工程による、非毒性植物の単離によって得られることを特徴とし； 
　該蛋白が、サムブカス・ラセモサ・エル（Sambucus racemosa Ｌ)の樹皮から単離され、かつ該蛋白が、ポリアクルアミドゲル電気泳動によって測定して、還元剤の不存在下で５８０００の相対的分子量を有し、還元剤の存在下で２７５００の鎖Ａの相対的分子量および２９５００の鎖Ｂの相対的分子量を有し；および
　該蛋白が、以下の操作：
　（ａ）サムブカス・ラセモサ（Sambucus racemosa)の樹皮をＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４の水性溶液で抽出して、ウサギ網状赤血球溶解物において蛋白生合成を阻害でき、かつヒト赤血球細胞凝集素活性を有する粗製蛋白抽出物を得；
　（ｂ）得られたペーストをメッシュを通して濾過し、予め酸性化した濾液を遠心し；
　（ｃ）得られた予め酸性化した流体を高度に架橋性質のマトリックスを有する４０〜１６５μｍのアガロースビーズベースの高速流イオン交換体上のイオン交換クロマトグラフィーに付し、まず、カラムを酢酸ナトリウムで洗浄し、次いで、リン酸一ナトリウムで洗浄し；
　（ｄ）該洗浄したカラムを塩化ナトリウムおよびリン酸一ナトリウム溶液で溶出させ、蛋白画分を収集し；
　（ｅ）該蛋白画分を、イオン力グラジエントにて、高度に架橋性質のマトリックスを有し、かつ部分構造−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯ−を有する交換基を含む４０〜１６５μｍのアガロースビーズベースの高速流イオン交換体上のイオン交換クロマトグラフィーに付し、該蛋白を含有する画分を分離し、次いで、膜を用いかつ１０％マクロ溶質濃度までの溶液で高速流速を供する限外濾過撹拌セルでそれらを濃縮し；
　（ｆ）予め濃縮した画分を分子排除クロマトグラフィーに付す；
ことによって得られる該非毒性蛋白。
【請求項７】
請求項１ないし６いずれか１記載の蛋白を含む、トキシンに感受性のリボソームをin vitroにて不活性化するための調製物。
【請求項８】
請求項１ないし６いずれか１記載の蛋白を含む、哺乳動物リボソーム・リボ核酸をin vitroにて不活性化するための調製物。
【請求項９】
請求項１ないし６いずれか１記載の蛋白と他の化学種との複合体を含む、真核生物のin vivo不活性化による蛋白生合成を阻害するための調製物。
【請求項１０】
請求項１ないし６いずれか１記載の蛋白を含む、その遺伝的内容物がリボ核酸であるウイルス（ＲＮＡウイルス）によって引き起こされる病気における、リボ核酸の機能的増殖（in vivoにておよび単離した無傷細胞におけるもの）を阻害するための調製物。
【請求項１１】
単独あるいは他の化学種との複合体の形態のいずれかにて、請求項１ないし６いずれか１記載の蛋白を含む、ヒトおよび実験動物において特異的標的細胞を不活性化するための調製物。
【請求項１２】
該蛋白が、分子クローン化技術によって得られた請求項１ないし６いずれか１記載の蛋白である請求項７ないし１１のいずれか１記載の調製物。
【請求項１３】
該蛋白が、アルキル化および／またはチオール化によって化学的に修飾された請求項１ないし６いずれか１記載の蛋白である請求項７ないし１２のいずれか１記載の調製物
【請求項１４】
請求項１ないし６いずれか１記載の蛋白を含む、可能な癌および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を治療するための調製物。
【請求項１５】
請求項１記載の蛋白を得るための製法であって、該蛋白が、以下の操作：
　（ａ）サムブカス・ニグラ・エル（Sambucus nigra Ｌ）の葉をＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４の水性溶液で抽出して、ウサギ網状赤血球溶解物において蛋白生合成を阻害でき、かつヒト赤血球細胞凝集素活性を有する粗製蛋白抽出物を得；
　（ｂ）得られたペーストをメッシュを通して濾過し、予め酸性化した濾液を遠心し；
　（ｃ）得られた予め酸性化した流体を高度に架橋性質のマトリックスを有する４０〜１６５μｍのアガロースビーズベースの高速流イオン交換体上のイオン交換クロマトグラフィーに付し、まず、カラムを酢酸ナトリウムで洗浄し、次いで、リン酸一ナトリウムで洗浄し；
　（ｄ）該洗浄したカラムを塩化ナトリウムおよびリン酸一ナトリウム溶液で溶出させ、蛋白画分を収集し；
　（ｅ）該蛋白画分を、イオン力グラジエントにて、高度に架橋性質のマトリックスを有し、かつ部分構造−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯ−を有する交換基を含む４０〜１６５μｍのアガロースビーズベースの高速流イオン交換体上のイオン交換クロマトグラフィーに付し、該蛋白を含有する画分を分離し、次いで、膜を用いかつ１０％マクロ溶質濃度までの溶液で高速流速を供する限外濾過撹拌セルでそれらを濃縮し；
　（ｆ）予め濃縮した画分を分子排除クロマトグラフィーに付して、請求項１記載の蛋白を得る；
ことによって得られることを特徴とする該製法。
【請求項１６】
請求項３記載の蛋白を得るための製法であって、該蛋白が、以下の操作：
　（ａ）従前に摩砕したサムブカス・エブルス・エル（Sambucus ebulus Ｌ）の葉をＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４の水性溶液で抽出して、ウサギ網状赤血球溶解物において蛋白生合成を阻害でき、かつヒト赤血球細胞凝集素活性を有する粗製蛋白抽出物を得；
　（ｂ）得られた液状抽出物をメッシュに通して濾過し、濾液を遠心し；
　（ｃ）酸処理した、約６％のアガロース濃度および４０〜２１０μの湿潤状態の粒子サイズを有する球状アガロースゲルビーズを充填し、抽出用緩衝液で平衡化したアフィニティークロマトグラフィーカラムに上清流体を適用し、カラムを抽出用緩衝液で洗浄し；
　（ｄ）該洗浄したカラムをＤ−ガラクトースを含有する抽出用緩衝液で溶出し、蛋白画分を収集し；
　（ｅ）その蛋白画分を遠心し、次いで、それをＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４で平衡化したもう一つの分子排除クロマトグラフィーカラムに適用し、溶出させて、そのうち最後のものが請求項３記載の蛋白である蛋白ピーク物を得る；
ことによって得られることを特徴とする該製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、リボ核酸を不活性化することにより、リボソームが機能するのを触媒的に妨げるリボソーム-不活性化蛋白(ＲＩＰ)の技術分野に関する。
【０００２】
　さらに詳細には、本発明は、癌の治療および後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)に潜在的に用いられる非毒性の新規な２本鎖ＲＩＰに関する。
【背景技術】
【０００３】
　植物界においては、真核生物由来の系で蛋白生合成阻害活性を含有し、蛋白型のものであって、正確な生化学的な解明が待たれているいくつかの種があるが、それはリボソーム-不活性化蛋白(ＲＩＰ)として知られている(ガスペリ-カンパニ(Ｇasperi-Ｃampani)ら、バイオケミカル・ジャーナル(Ｂiochem.Ｊ.)、第１８６巻、４３９-４４１頁(１９８０年);ガスペリ(Ｇasperi)ら、ジャーナル・オブ・ナチュラル・プロダクツ(Ｊ.Ｎat.Ｐrod.)、第４８巻、４４６-４５４(１９８５年);フェレラス(Ｆerreras)ら、セルラー・アンド・モレキュラー・バイオロジー(Ｃell.Ｍol.Ｂiol.)、第３５巻、８９-９５頁(１９８９年);メリノ(Ｍerino)ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・ボタニー(Ｊ.Ｅxp.Ｂot.)、第４１巻、６７-７０頁(１９９０年);ギルベス(Ｇirbes)ら、セルラー・アンド・モレキュラー・バイオロジー(Ｃell.Ｍol.Ｂiol.)、第３８巻:８０３-８１２頁(１９９２年);シトレス(Ｃitores)ら、セルラー・アンド・モレキュラー・バイオロジー(Ｃell.Ｍol.Ｂiol.)、第３９巻、８８５-９９５頁(１９９３年);スチルペ(Ｓtirpe)ら、バイオテクノロジー(Ｂiotechnology)、第１０巻、４０５-４１２頁(１９９２年);シトレス(Ｃitores)ら、エフ・イイ・ビイ・エス・レターズ(ＦＥＢＳ Ｌett.)、３２９巻、５６-６２頁(１９９３年))。これらの蛋白は、１本のポリペプチド鎖(１型)、２本のポリペプチド鎖(２型)または４本のポリペプチド鎖(４型)を有しうる(シトレス(Ｃitores)ら、エフ・イイ・ビイ・エス・レターズ(ＦＥＢＳ Ｌett.)、第３２９巻、５９-６２頁(１９９３年))。１本鎖のポリペプチドの蛋白は、リボソームリボ核酸Ｎ-グルコシダーゼである(スチルペ
(Ｓtirpe)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎuc.Ａcids Ｒes.)、第１６巻、１３４９-１３５７頁(１９８８年))一方、２本鎖の蛋白は、通常ガラクトース残基およびその誘導体を認識する、リボソームリボ核酸Ｎ-グルコシダーゼ(Ａ鎖)およびレクチン(Ｂ鎖)を有する(スチルペ(Ｓtirpe)ら、バイテクノロジー(Ｂiotechnology)、第１０巻、４０５-４１２頁(１９９２年))。４本鎖蛋白は、２組の(各々の１組が２型分子に相当する)Ａ-Ｂ型二量体により形成されている(シトレス(Ｃitores)ら、エフ・イイ・ビイ・エス・レターズ(ＦＥＢＳ Ｌett.)、第３２９巻、５９-６２頁(１９９３年))。これらの(ＡおよびＢの)蛋白は、２００００および３４０００の間の分子量(Ｍr)を有する。Ａ鎖は、リボ核酸を不活性化させることによりリボソームが機能するのを触媒的に妨げる(ジメネズ(Ｊimenez)およびバズキーズ(Ｖazquez)、アニュアル・レビュー・オブ・マイクロバイオロジー(Ａnnu.Ｒev.Ｍicrobiol.)、第３９巻、６４９-６７２頁(１９８５年);ロバーツ(Ｒoberts)およびセリトレンニコフ(Ｓelitrennikoff)、バイオサイエンス・リポーツ(Ｂiosc.Ｒep.)、第６巻、１９-２９頁(１９８６年);スチルペ(Ｓtirpe)およびバービエリ(Ｂarbieri)、エフ・イイ・ビイ・エス・レターズ(ＦＥＢＳ Ｌett.)、第１９５巻、１-８頁(１９８６年);スチルペ(Ｓtirpe)ら、バイテクノロジー(Ｂiotechnology)、第１０巻、４０５-４１２頁(１９９２年);シトレス(Ｃitores)ら、エフ・イイ・ビイ・エス・レターズ(ＦＥＢＳ Ｌett.)、第３２９巻、５９-６２頁(１９９３年);ギルベス(Ｇirbes)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)、第２６８巻、１８１９５-１８１９９頁(１９９３年);ギルベス(Ｇirbes)ら、(プラント・モレキュラー・バイオロジー(Ｐlant Ｍol.Ｂiol.)、第２２巻、１１８１-１１８６頁(１９９３年))。該不活性化は、リボソームの大きい方のｒＲＮＡのアデノシンを遊離させることからなる(エンドー(Ｅndo)およびツルギ(Ｔsurugi)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)、第２６２巻、８１２８-８１３０頁(１９８７年);スチルペ(Ｓtirpe)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcid Ｒes.)、第１６巻、１３４９-１３５７頁
(１９８８年);ギルベス(Ｇirbes)ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
(Ｊ.Ｂacteriol.)、第１７５巻、６７２１-６７２４頁;イグレシアス(Ｉglesias)ら、エフ・イイ・ビイ・エス・レターズ(ＦＥＢＳ Ｌett.)、第３２５巻、２９１-２９４頁(１９９３年);イグレシアス(Ｉglesias)ら、エフ・イイ・ビイ・エス・レターズ(ＦＥＢＳ Ｌett.)、第３１８巻、１８９-１９２頁(１９９３年))。これらのトキシンを産生する植物におけるこれらの生物学的な役割は、全般的には知られていない(ロバーツ(Ｒoberts)およびセリトンレニコフ(Ｓelitrennikoff)、バイオサイエンス・リポーツ(Ｂiosc.Ｒep.)、第６巻、１９-２９頁(１９８６年))。特に、該トキシンが同じ植物ファミリーに属する場合はそれらがいくつかのＮ-末端アミノ酸配列の相同性を有するにもかかわらず、これらの蛋白は免疫学的にも化学的にも互いに異なっている(モンテキューチ(Ｍontecucchi)ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・プロテイン・リサーチ(Ｉnt.Ｊ.Ｐeptide Ｐrotein Ｒes.)、第３３巻、２６３-２６７頁(１９８９年);アリアス(Ａrias)ら、プランタ(Ｐlanta)、第１８６巻、５３２-５４０頁(１９９２年))。
【０００４】
　癌治療用(ビテッタ(Ｖitetta)およびウア(Ｕhr)、アニュアル・レビュー・
オブ・イムノロジー(Ａnnu.Ｒev.Ｉmmunol.)、第３巻、１９７-２１２頁(１９８５年);フランケル(Ｆrankel)ら、アニュアル・レビュー・オブ・メディシン(Ａnnu.Ｒev.Ｍed.)、第３７巻、１２５-１４２頁(１９８６年);コッペル(Ｋoppel)、バイオコンジュ・ケム(Ｂioconj.Ｃhem.)、第１巻、１３-２３頁(１９９０年);ロード(Ｌord)、プラント・フィジオロジー(Ｐlant Ｐhysiol.)、第８５巻、１-３頁(１９８７年))および後天性免疫不全症候群(チル(Ｔill)ら、サイエンス(Ｓcience)、第２４２巻、１１６６-１１６８頁(１９８８年);ゲーティエ(Ｇhetie)ら、バイオコンジュ・ケム(Ｂioconj.Ｃhem.)、第１巻、２４-３１頁(１９９１年);カーン(Ｋahn)ら、エイズ(ＡＩＤＳ)、第４巻、１１９７-１２０４頁(１９９３年);ビアーズ(Ｂayers)ら、エイズ(ＡＩＤＳ)、第４巻、１１８９-１１９６頁(１９９２年))治療用のイムノトキシンの構築におけるリボソーム-不活性化蛋白の使用について多大な関心が集められている。
【０００５】
　ごく最近には、この(ＲＩＰ)ファミリーのうち少なくとも４つの蛋白が、それ自体で、後天性免疫不全症候群の病因であるＨＩＶ-１ ＲＮＡウイルスを活性化する性質を有することが見い出された(マグラス(ＭcＧrath)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユー・エス・エイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)、第８６巻、２８４４-２８４８頁(１９８９年);リー-ファング(Ｌee-Ｈuang)ら、エフ・イイ・ビイ・エス・レターズ(ＦＥＢＳ Ｌett.)、第２７２巻、１２-１８頁(１９９０年);リー・ファング(Ｌee-Ｈaung)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ))、第８８巻、６５７０-６５７４頁(１９９１年);ザーリング(Ｚerling)ら、ネイチャー(Ｎature)、第３４７巻、９２-９５頁(１９９０年))。
【０００６】
　２型のＲＩＰおよび特にリシンも抗腫瘍活性を示す(バービエリ(Ｂarbieri)およびスチルペ(Ｓtirpe)、キャンサー・サーベイズ(Ｃancer Ｓurv.)、第１巻、４８９-５２０頁(１９８２年))。
【０００７】
　しかしながら、毒性の１本鎖のＲＩＰまたは毒性の２本鎖ＲＩＰの使用は、以下の節に記載するごとく重要な利点を包含する：
【０００８】
　特に、本発明の「非毒性２本鎖ＲＩＰ」の発見に至るまで存在していた２本鎖のＲＩＰは、(スチルペ(Ｓtirpe)ら、(バイオテクノロジー(Ｂiotechnology)、第１０巻、４０５-４１２頁(１９９２年))に改定されている:リシン、アブリン(abrin)、ボルケンシン(volkensin)、ビスクミン(viscumin)およびモデクシン(modeccin)である。この５種の蛋白は、極めて毒性が高いため、イムノトキシンおよび免疫複合体の構築に用いると、その実践的な治療に用いることが大変困難な高い毒性の化学種になりかねない。
【０００９】
　この毒性を減じる１の方法は、これらの蛋白、一般的にはリシンとで形成されたイムノトキシンをラクトースと共に投与し、かくしてイムノトキシン中の(例えば、リシンのような)毒性蛋白部分に起因する非特異的な毒性を減じることである。ラクトースでブロックしたリシンおよび標的細胞の抗原に対する抗体とで形成されたイムノトキシンの毒性は、イムノトキシンの抗体部と抗原との相互作用およびそれに続く該イムノトキシンの該細胞の内部への移動のみに起因する(スプーナー(Ｓpooner)およびロード(Ｌord)、トレンズ・イン・バイオテクノロジー(Ｔrends in Ｂiotechnology)、第８巻、１８９-１９３頁(１９９０年))。
【００１０】
　リシンからの非特異的毒性を評価するために、部位特異的突然変異あるいは該リシンのＡ鎖または他の毒性ＲＩＰのみとでイムノトキシンを形成することによってリシンが一部化学的に活性化されている。これらの全ての別法では、その結果、問題とするリシンまたは毒性ＲＩＰの活性が部分的に喪失されている(ブラットラー(Ｂlattler)ら、キャンサー・セルズ(Ｃancer Ｃells)、第１巻、５０-５５頁(１９８９年))。公表された最も最近の方法は、リシンを修飾する最も良い方法は、完全なＡ-Ｂリシン分子を用いて該リシンのＢ鎖とＤ-ガラクトースとの相互作用を化学的に変化させることである(ランバート(Ｌambert)ら、キャンサー・リサーチ(Ｃancer Ｒesearch)、第５１巻、６２３６-６２４２頁(１９９１年))。しかしながら、該標的細胞の蛋白合成に際しＡ鎖の活性を顕著に減じるため溶液は良くない(ランバート(Ｌambert)ら、キャンサー・リサーチ(Ｃancer Ｒesearch)、第５１巻、６２３６-６２４２頁(１９９１年))。
【００１１】
　１本鎖のＲＩＰに関しては、毒性の２本鎖のＲＩＰよりは毒性が低いとしても、そのうちほとんどは、治療に適した血漿濃度を達するに必要であろう用量では比較的毒性である(スチルペ(Ｓtirpe)ら、バイオテクノロジー(Ｂiotechnology)、第１０巻、４０５-４１２頁(１９９２年))。加えて、２本鎖のものより小さい場合には、それらは流体エンドサイトーシスにより、肝臓または腎臓によってかなり容易に捕捉され得る。一方、１本鎖のＲＩＰは、マクロファージ(バーバリエリ(Ｂarbarieri)およびスチルペ(Ｓtirpe)、キャンサー・サーベイズ(Ｃancer Ｓurveys)、第１巻、４９０-５２０頁(１９８２年))およびトロホブラスト(チャン(Ｃhang)ら、コントラセプション(Ｃontraception)、第１９巻、１７５-１８４頁(１９７９年))に対して毒性である。
【００１２】
　前記に引用した不都合な点に比して、本発明の非毒性２本鎖ＲＩＰは、驚くべき蛋白合成阻害活性を維持しつつ、自発的には細胞内に入れないという利点を有する。言い換えれば、リシンおよび他の毒性２本鎖ＲＩＰに関して生化学者および分子生物学者が試みた非毒性２本鎖ＲＩＰに関し自然はすでに行っていたのである。従って、それらを多用量で用いても、リシンまたは他の毒性２本鎖ＲＩＰとの複合体が有するような危険は現れない。もう１つのさらなる利点は、非毒性２本鎖ＲＩＰとで形成させたし、イムノトキシンを用いると、ＲＩＰおよび抗体を維持する結合（類）を切断し、それに続いて非毒性ＲＩＰが放出されても、リシンの遊離が起こるのに比して危険がない。
【００１３】
　蛋白が強力な免疫原性物質であるとすると、それでもっていかなるタイプの治療も可能とするためには、一方では最も低い免疫反応性のものを選択し、他方ではトキシンまたはイムノトキシンの毒性部分を患者において中性抗体が発生するものとして置き換えることができるという目的にて、該トキシンの最も広い可能な組合せを有する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
　本発明は、新規の非毒性２本鎖リボゾーム不活性化蛋白(ＲＩＰ)、その製法および調製物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
　まさに標題に示したごとく、本発明は、新規の２本鎖リボゾーム不活性化蛋白(ＲＩＰ)ないしその製法および使用に関する。
【００１６】
　記載の蛋白は新規の蛋白型植物トキシンであり、その物理化学的および生化学的性質に基づくと２型または２本鎖型植物リボゾーム不活性化蛋白(ＲＩＰ)に分類され、１.６ｍｇ/ｋｇ体重の用量で体重３０ｇのスイス・ラット(Ｓwiss rat)に注射しても無毒であることが特徴である。
【００１７】
　前記した先行技術に比する本発明の新規性は、前記したリシン、アブリン、ボケンシン、ビスクミンおよびモデシンの毒性の２本鎖ＲＩＰを得ることに通じる毒性の植物を用いる代わりに、無毒な植物を用いて該２本鎖ＲＩＰを用いる点にある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
　本発明の無毒の新規細胞外蛋白は、２の鎖、言い換えれば、特に哺乳動物リボソーム２８Ｓにリボ核酸Ｎ-グリコシダーゼ活性を有するリボソームリボ核酸Ｎ-グリコシダーゼ活性を有するリボソームＡ鎖と、レクチン活性を有するＢ鎖とがジスルフィド結合により結合したもので；該新規の蛋白は、標的細胞にある膜受容体に認識される(抗体、ホルモンまたは他の蛋白のような)キャリアー分子に結合し、標的細胞の該リボ核酸の不活性化により該標的細胞上における鎖Ａの特異的かつ選択的な作用が可能で、正確にはその細胞外毒性の欠乏に起因する、キャリアー分子により選択されない細胞上の該ＲＩＰの無差別な攻撃を実質的に回避することにより特徴付けられる。
【００１９】
　本発明のかかるよう定義される蛋白は、リボ核酸と触媒的に相互作用することができ、無細胞系の蛋白合成阻害を起こす。それらの阻害活性は、蛋白生合成の非蛋白抗生物質より非常に高い(モレキュラー・メカニズムズ・オブ・プロテイン・バイオシンセシス(Ｍolecular Ｍechanisms of Ｐrotein Ｂiosynthesis)、エイチ、バイスバッハ(Ｈ.Ｗeissbach)およびエス、ペストカ(Ｓ,Ｐestka)編、アカデミック・プレス(Ａcademic Ｐress)中の;ペストカ,エス(Ｐestka,Ｓ)ら(１９７７年)、インヒビターズ・オブ・プロテイン・シンセシス(Ｉnhibitors of protein synthesis)、４６８-５５３頁)。
【００２０】
　加えて、該蛋白は、リボソームリボ核酸(rＲＮＡ)のＮ-グリコシダーゼ活性およびヒト赤血球細胞凝集素能を有する。
【００２１】
　蛋白生合成阻害剤としての強力な能力およびそのリボ核酸に対する効果は、例えばＰＡＰ(ヤマゴボウ抗ウイルス蛋白(pokeweed antiviral protein))で示されるものに匹敵し((アービン(Ｉrvin)、ファーマコル・テル(Ｐharmacol.Ｔer.)、第２１巻、３７１-３８７頁(１９８３年)、ア・プロテイン・ウィズ・アンチ-エイチアイブイ-１・アクティビティー(a protein with anti-ＨＩＶ-1 activity)、ザーリング(Ｚarling)ら、ネイチャー(Ｎature)、第３４７巻、９２-９５頁(１９９０年))、これらの蛋白を極めて有用なものとする。
【００２２】
　本発明の非毒性２本鎖ＲＩＰの最も重要な用途は、：トキシンに感受性のリボソームのイン・ビトロ(in vitro)不活性化剤として、イン・ビトロ哺乳動物リボソームリボ核酸不活性化剤として、イン・ビトロ系における蛋白生合成の阻害剤として、細胞および組織における特異的なレセプターとは対照的にモノクローナル抗体に結合した該細胞および組織における蛋白生合成の阻害剤として、ならびに、ＲＮＡウイルス、特にヒト後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)を引き起こすＨＩＶに対する抗ウイルス剤としてである。
【００２３】
　同様に、真核生物のリボソームのイン・ビボ(in vivo)不活性化による蛋白生合成阻害の目的で、他の化学種との複合体を阻害該蛋白から構築することもできる。これらのラインに沿い、非毒性２本鎖ＲＩＰが試験した系のほとんど全てにおいて完全なリシンよりも無細胞系において高い蛋白合成阻害活性を有し(ギルベス(Ｇirbes)ら、プラント・モレキュラー・バイオロジー(Ｐlant Ｍolecular Ｂiology)、第２２巻、１１８１-１１８６(１９３年))、かつそれらを完全な培養細胞または３０ｇスイス・ラットに１.６ｍｇ/ｋｇ体重の濃度でそれらを投与するのが無毒であれば(ギルベス(Ｇirbes)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊournal of Ｂiological Ｃhemistry)、第２６８巻、１８１９５-１８１９９頁(１９９３年);ギルベス(Ｇirbes)ら、プラント・モレキュラー・バイオロジー(Ｐlant Ｍolecular Ｂiology)、第２２巻、１１８１-１１８６頁(１９９３年))、細胞の内部に適当に輸送されると、リシンのそれよりも効果は大きいであろう。蛋白の細胞内への輸送は、当該細胞表面の特異的な受容体により認識され、内部に取り込まれ得る抗体、ホルモンまたは他の蛋白のごとき適当な担体にそれらを結合させることにより達成される(スチルペ(Ｓtirpe)ら、バイオテクノロジー(Ｂiotechnology)、第１０巻、４０５-４１２頁(１９９２年);バービエリ(Ｂarbieri)およびスチルペ(Ｓtirpe)、キャンサー・サーベイズ(Ｃancer Ｓurveys)、第１巻、４９０-５２０頁(１９８２年))。
【００２４】
　本発明の非毒性２本鎖ＲＩＰは、その遺伝的内容物がリボ核酸であるウイルス(ＲＮＡウイルス)により引き起こされ持続される疾病において、リボ核酸(のイン・ビボ増殖および単離された無傷細胞における)機能を阻害するのに用いることもできる。
【００２５】
　最後に、遊離のまたは他の化学種と結合させた形態の該蛋白は、ヒトおよび実験動物において特異的な標的細胞を不活性化するのに用いることもできる。
【００２６】
　従って、本発明の該非毒性２本鎖ＲＩＰは、癌治療およびＡＩＤＳに潜在的に有用である。
　本発明の該非毒性２本鎖ＲＩＰを得る一般的な工程は、非毒性植物から対応する部分を塩化ナトリウムおよびリン酸一ナトリウムで抽出し、(ｉ)蛋白合成を阻害でき、(ii)ヒト赤血球凝集素能を有する抽出物を得る第一の操作に続き、該抽出物を濃縮し、およびそれをイオン交換および/またはアフィニティーまたは分子排除クロマトグラフィー技術によって精製することを包含する該非毒性植物から該物質を単離することよりなる。
【００２７】
　ところで、本発明の非毒性２本鎖ＲＩＰの一般的範囲内で、２つの型、すなわち、酸性タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰと、塩基性タイプの２本鎖ＲＩＰとを区別できる。従って、同トキシンを単離する工程には、前記の一般的なスキームに従いはするが、該酸性または塩基性の分子に基本的に起因するある種の修飾もある。　前記したことにより、本発明の酸性タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰを得る工程は以下の操作：
　ａ）非毒性植物またはその一部分を選択し；
　ｂ）塩化ナトリウムおよびリン酸一ナトリウムで該植物の蛋白抽出物を得；
　ｃ）かく得られた抽出物から、以下の２つの要件：
　　(ｉ)ウサギ網状赤血球溶解物において蛋白合成を阻害できること；かつ
　　(ii)赤血球凝集素能を有する；
　に沿う抽出物を選択し、
　ｄ）２つの要件に沿う抽出物を、酸処理したセファロース６Ｂ(Ｓepharose 
６Ｂ)上のアフィニティークロマトグラフィーに付して、Ｄ-ガラクトースまたはラクトースで溶出し；
　ｅ）前段階の蛋白ピーク物を分子排除クロマトグラフィーに付し；
　ｆ）レクチンおよび非毒性２本鎖ＲＩＰを含有する蛋白ピーク物を得て；
　ｇ）各々のピークの蛋白合成阻害を分析し；
　ｈ）蛋白合成を阻害するピークを選択する
ことよりなる。
【００２８】
　本発明の該塩基性タイプの２本鎖ＲＩＰを得る工程は、以下の操作：
　ａ）非毒性植物またはその一部分を選択し；
　ｂ）塩化ナトリウムおよびリン酸一ナトリウムで該植物の蛋白抽出物を得て;　ｃ）かく得られた抽出物から、以下の２つの要件：
　　(ｉ)ウサギ網状赤血球溶解物において蛋白合成を阻害できること；および
　　(ii)赤血球凝集素能を有する；
に沿う抽出物を選択し；
　ｄ）該抽出物の塩基性蛋白をＳ-セファロースＦＦ上にイオン交換クロマトグラフィーに付し;次いで、塩化ナトリウムで溶出し；
　ｅ）前段階で得た蛋白ピーク物を透析し；
　ｆ）該透析物をＣＭ-セファロースＦＦ上の第２のイオン交換クロマトグラ
フィーに付し；
　ｇ）蛋白合成を阻害する前段階のピーク物を選択し、次いで、同選択したピーク物をアミコン(ＡＭＩＣＯＮ)で濃縮し;
　ｈ）前段階の生成物をハイ-ロード・スーパーデックス(Ｈi-Ｌoad Ｓuperdex)７５を配したＦＰＬＣ器具上に分子排除クロマトグラフィーに付して塩基性タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰを得る
ことよりなる。
【００２９】
　本発明の非毒性２本鎖ＲＩＰのうち、サムブカス(Ｓambucus)属の植物から単離されたものは特に言及する価値がある。
【００３０】
　さらに詳細には、酸性タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰの中には以下のものが挙げられる：
　-サムブカス・ニグラ・エル(Ｓambucus nigra Ｌ.)の樹皮から単離されたニグリンｂ(nigrin b)；および
　-サムブカス・エブルス・エル.(Ｓambucus ebulus Ｌ.)の葉から単離されたエブリン１(ebulin １)；塩基性タイプの非毒性２本鎖ＲＩＰには、以下のものが包含される：
　-サムブカス・ニグラ・エル(Ｓambucus nigra Ｌ.)の葉から単離された塩基性ニグリン１；および
　-サムブカス・ラセモサ・エル(Ｓambucus racemosa Ｌ.)の樹皮から単離されたラセモシンｂ(racemosin b)。
【００３１】
　さらに詳細なこれらの各々の蛋白の種類および性質の分析ならびにそれらを得る工程については後記する：
【００３２】
ニグリンｂ
　ニグリンｂは、以下の工程：
　ａ）ＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４の水溶液で予め摩砕したサムバカス・ニグラ・エル(Ｓambucus nigra Ｌ.)の樹皮を抽出し；
　ｂ）得られた液状抽出物をメッシュを通して濾過し、その濾液を遠心し；
　ｃ）上清の流体をアフィニティークロマトグラフィーの工程に付し、クロマトグラフィーカラムに適用して、抽出用緩衝液で該カラムを洗浄し、
　ｄ）Ｄ-ガラクトースを含有する抽出用緩衝液で洗浄した該カラムを溶出し、
該蛋白画分を収集し、
　ｅ)得られた蛋白画分を透析、凍結乾燥し、それをＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４に予め溶解した分子排除クロマトグラフィーに付し、得られた３つの溶出ピークの２番目のものがニグリンｂに相当する；
により特徴付けられる工程手段によりサムブカス・ニグラ・エル(Ｓambucus nigra Ｌ.)の樹皮から単離する。
【００３３】
　この工程手段によりニグリンｂは、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)により測定して最終純度９９％の状態で得られた。
【００３４】
　工程(ｃ)のクロマトグラフィーは、酸、通常０.１Ｎ ＨＣｌで約５０℃にて約３時間処理し、抽出用緩衝液で平衡化する(６％のアガロース・マトリックスよりなる)セファロース(Ｓepharose)６Ｂゲルで主として行う。
【００３５】
　工程(ｅ)のクロマトグラフィーは、(アガロースおよびデキストランよりなる)ハイ-ロード・スーパーデックス(Ｈi-Ｌoad Ｓuperdex)７５ゲルで主として行う。　かく得られたニグリンｂの相対的分子量(Ｍr)は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したところ、還元剤存在下にてＡ鎖につき２６,０００、Ｂ鎖につき３２,０００、その不在下には５８,０００であった。
【００３６】
　ニグリンｂの２本のポリペプチド鎖のアミノ末端のアミノ酸配列は、アリアスらに示されているごとくに決定した(アリアス(Ａrias)ら、プランタ(Ｐlanta)、第１８６巻、５３２-５４０頁(１９９２年)。得られた結果は以下の通りである:　-Ａ鎖：
　　　　　Ｉle Ａsp Ｔyr Ｐro Ｓer Ｖal Ｓer Ｐhe Ａsn Ｌeu
1                   5                       10
Ａsn Ｇly Ａla Ｖal Ｓer Ａla Ｔhr Ｔyr Ａrg Ａsp
15                       20
Ｐhe Ｌeu Ｓer Ａsn
　-Ｂ鎖：
　　　　　Ａsp Ｇly Ｇlu Ｔhr Ｘxx Ｔhr Ｌeu Ｘxx Ｔhr
1
Ｓer Ｐhe Ｔhr Ａrg Ａsn Ｉle Ｖal Ｇly Ａrg
10                       15
Ａsp Ｇly Ｌeu Ｘxx Ｖal Ａsp
20
　　　　　(Ｘxx：いずれのアミノ酸であってもよいことを意味する)
【００３７】
　かく得られ特徴付けられた各々のナルギンｂが、一般的に、前記した性質の各々全てを有すること、ならびに、非毒性２本鎖ＲＩＰへ使用されることが示された。
【００３８】
塩基性ニグリン１
　塩基性ニグリン１は、以下の工程：
　ａ）ＮaＣlおよびＮaＨ２ＰＯ４の水溶液でサムブカス・ニグラ・エル(Ｓambucus nigra Ｌ.)の葉を抽出し；
　ｂ）得られたペーストをメッシュを通して濾過し、予め酸性にした濾液を遠心し；
　ｃ）予め酸性にした得られた流体を、イオン-交換クロマトグラフィーに付し、最初に酢酸ナトリウムで、その後にリン酸一ナトリウムでカラムを洗浄し；
　ｄ）洗浄したカラムを塩化ナトリウムおよびリン酸一ナトリウムの水溶液で溶出して蛋白画分を収集し；
　ｅ）該蛋白画分をリン酸一ナトリウムに対して透析し、それをイオン強度グラジエントにてイオン交換クロマトグラフィーに付し、塩基性ニグリン１を含有する画分を分離すること
により特徴付けられる工程手段によりサムブカス・ニグラ・エル(Ｓumbucus 
nigra Ｌ.)の葉から抽出する。
【００３９】
　かく得られた塩基性ニグリン１の相対分子量(Ｍr)は、ラエムリー(Ｌaemmly)プロセスによるポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したところ、還元剤の不在下にて６６,０００、還元剤の存在下にてＡ鎖につき３２,０００、Ｂ鎖につき３４,０００であった。
【００４０】
　アミノ-末端のアミノ酸配列をアリアス(Ａrias)らにより示されているごとくに決定した(アリアス(Ａrias)ら、プランタ(Ｐlanta)、第１９６巻、５３２-５４０頁(１９９２年))。得られた結果は以下の通りである：
　-Ａ鎖：
　　　　　ブロックされたアミノ末端のアミノ酸
　-Ｂ鎖：
　　　　　Ａla Ｐro Ｘxx Ｔyr Ｐro Ｘxx Ｘxx
　　　　 1                   5
【００４１】
　かく得られ特徴付けられた各々の塩基性ニグリン１は、一般的に、前記した性質の各々全てを有すること、ならびに、非毒性２本鎖ＲＩＰへ使用できることが示された。
【００４２】
エブリン１
　エブリン１は、以下の工程：
　ａ）予め摩砕したサムブカス・エブルス(Ｓambucus ebulus Ｌ.)(葉)をＮaＣlおよびＮａＨ２ＰＯ４の水溶液で抽出し；
　ｂ）得られた液状抽出物をメッシュに通して濾過し、その濾液を遠心し；
　ｃ）その上清をアフィニティークロマトグラフィー工程に付すクロマトグラ
フィーカラムに適用して、該カラムを抽出用緩衝液で洗浄し、
　ｄ）Ｄ-ガラクトースを含有する抽出用緩衝液で、該洗浄したカラムを溶出し、該蛋白画分を収集し；
　ｅ）該蛋白画分を濃縮し、それをＮａＣｌおよびＮａＨ２ＰＯ４で平衡化したカラムの分子排除クロマトグラフィーに付して蛋白溶出ピーク物が得られ、その最後のものがエブリン１に相当する；
により特徴付けられる工程手段によりサムブカス・エブルス・エル(Ｓambucus ebulus Ｌ.)の植物の葉から単離する。
【００４３】
　この工程手段により、エブリン１は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)により測定したところ最終純度９９％の状態で得られた。
【００４４】
　工程(ｃ)のクロマトグラフィーは、酸、通常０.１Ｎ ＨＣｌで約５０℃にて約３時間処理し、抽出用緩衝液で平衡化した(６％のアガロース・マトリックスよりなる)セファロース(Ｓepharose)６Ｂゲルで主として行う。
【００４５】
　工程(ｅ)のクロマトグラフィーは、(アガロースおよびデキストランよりなる)ハイ-ロード・スーパーデックス(Ｈi-Ｌoad Ｓuperdex)７５ゲルで主として行う。　かく得られたエブリン１の相対的分子量(Ｍr)は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したところ、還元剤存在下にてＡ鎖につき２６,０００、Ｂ鎖につき３０,０００、その不在下には５６,０００であった。
【００４６】
　該鎖のアミノ末端のアミノ酸配列は、以下の通りである：
　-Ａ鎖：
　　　　　Ｉle Ａsp Ｔyr Ｐro Ｓer Ｖal Ｐhe Ａsn Ｌeu Ａla
　1                   5                  10
　Ｇly Ａla Ｌys Ｓer Ｔhr Ｔyr Ａrg Ａsp Ｐhe Ｌeu
　              15                  20
　Ｌys Ａsn Ｌeu
　         25
-Ｂ鎖：
　      Ａsp Ｇly Ｇlu Ｔhr Ｘxx Ａla Ｉle Ｐro Ａla Ｐro Ｐhe
　    1                   5                       10
　    Ｔhr Ａrg Ａrg　Ｉle Ｖal Ｇly Ｘxx Ａsp Ｇly Ｌeu Ｇlu
　                                          20
　  Ｖal Ａsp Ｐro
　           25
　　　　　(Ｘxx：いずれのアミノ酸であってもよいことを意味する。)
【００４７】
　かく得られ特徴付けられたエブリン１は、一般的に、前記した性質の各々全てを有すること、ならびに、非毒性２本鎖ＲＩＰへ使用できることが示された。
【００４８】
ラセモシンｂ
　ラセモシンｂは、以下の工程：
　ａ）サムブカス・ラサモサ・エル(Ｓambucus racemosa Ｌ.)の樹皮をＮａＣｌおよびＮａＰＯ４Ｈ２の水溶液で抽出し；
　ｂ）得られたペーストをメッシュに通して濾過し、予め酸性にした濾液を遠心し；
　ｃ）予め酸性にした流体を、イオン交換クロマトグラフィーに付し、最初に酢酸ナトリウム、次いでリン酸一ナトリウムでカラムを洗浄し；
　ｄ）洗浄したカラムを塩化ナトリウムおよびリン酸一ナトリウムの水溶液で溶出し、蛋白画分を収集し；
　ｅ）該蛋白画分をリン酸一ナトリウムに対して透析し、それをイオン強度グラジエントにてイオン交換クロマトグラフィーに付して、ラセモシンｂを含有する画分を分離し；
　ｆ）前記の濃縮した画分を分子排除クロマトグラフィーに付して、ラセモシンｂを得る
により特徴付けられる工程手段によりサムブクス・ラセモサ・エル(Ｓambucus racemosa Ｌ.)の樹皮より単離する。
【００４９】
　かく得られたラセモシンｂの相対的分子量(Ｍr)は、ラエムリ工程(ネイチャー(Ｎature)、第２２７巻、６８０-６８５頁)によるポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られた値で、還元剤の不在下にて５８,０００、還元剤の存在下にてＡ鎖につき２７,５００、Ｂ鎖につき２９,５００であった。
【００５０】
　かく得られ特徴付けられたラセモシンｂは、一般的に、前記した性質の各々全てを有すること、ならびに、非毒性２本鎖ＲＩＰへ使用できることが示された。
【００５１】
　加えて、以下の実施例の手段により本発明を説明するが、該実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００５２】
　実施例１(ニグリンｂ)
　この実施例は以下の８つの章：
　ａ）サムブカス・ニグラ・エル(Ｓambucus nigra Ｌ.)の樹皮からニグリンｂを得ること；ｂ）見かけ上の分子量を求めること；ｃ）ニグリンｂのポリペプチド鎖のアミノ末端配列；ｄ）ＲＮＡに対するＮ-グルコシダーゼ活性；ｅ）蛋白生合成の阻害；ｆ）ラットにおける毒性；ｇ）赤血球細胞凝集素能；ｈ）免疫学的な関係
に分けられる。
【００５３】
　ａ)ニグリンｂの獲得
　１５.１ｇのサムブカス・ニグラ・エル(Sambucus nigra L.)の樹皮を、２８０ｍＭの塩化ナトリウムおよび５ｍＭのリン酸一ナトリウム塩(ｐＨ７.５）１２１ｍｌと共に４℃において１２時間摩碎した。得られた抽出物をチーズ−クロスを通して濾過して残存する固形物を除去した。液状抽出物をＪＡ−１４ローター（ベックマン(Beckman)Ｊ１遠心機）中１３０００ｒｐｍで４５分間遠心し、上清（１２０.８ｍｌ）を収集した。上清流体を、抽出用緩衝液で平衡化した、酸で処理したセファロース(Sepharose)６Ｂ（５０℃において３時間０.１Ｎ塩酸で処理したセファロース(Sepharose)６Ｂ５０ｍｌ)を充填したクロマトグラフィーのカラムに適用した。次いで、カラムを、２８０ｎｍにおける吸光度がベースラインに達するまで抽出用緩衝液で洗浄した。次いで、２００ｍＭ　Ｄ−ガラクトースを含有する緩衝液を適用した。吸収のピーク（２２.５ｍｌであって０.２４３ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度)を収集し、水に対して透析し、最終的に凍結乾燥して７.２ｍｇの蛋白を得た。５.２ｍｇのこの蛋白調製物を４００ｍＭ塩化ナトリウムおよび５ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ７.５)０.６ｍｌ中に溶解し、各０.３ｍｌの２の分割量をスーパーデックス(Superdex)７５クロマトグラフィーカラムに適用した。０.５ｍｌずつの画分を収集し、３つのピーク物が得られた。２つめのピーク物は電気泳動的に均質なニグリンｂであった。
【００５４】
　ｂ)ニグリンｂの見掛けの分子量の決定
　ラエムリー（Laemmly)プロセス(ネイチャー(Nature)、２２７巻、第６８０頁〜第６８５頁)により、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ドデシル硫酸ナトリウムの存在下１５％アクリルアミドおよび２.７％ビスアクリルアミド、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)によって相対的分子量(Ｍｒ)を測定した。得られたＭｒ値は、還元剤の存在下、Ａ鎖につき２６,０００およびＢ鎖につき３２,０００であって、還元剤不存在下で５８,０００であった。
【００５５】
　ｃ)ニグリンｂのポリペプチド鎖のアミノ末端配列
　ニグリンｂの２つのポリペプチド鎖のアミノ末端配列は、アリアス(Arias)らにより示されているごとく測定した(アリアス(Arias)ら、プランタ(Planta)、第１８６巻、第５３２頁〜第５４０頁〔１９９２年〕)。得られた結果は以下のようである:
　−Ａ鎖:
　Ile Asp Tyr Pro Ser Val Ser Phe Asn Leu
1　      　　　 5　　　　　　　　　 10
Asp Gly Ala Val Ser Ala Thr Tyr Arg Asp
15                   20
Phe Leu Ser Asn
−Ｂ鎖:
Asp Gly Glu Thr Xxx Thr Leu Xxx Thr
1               5 
Ser Phe Thr Arg Asn Ile Val Gly Arg
10                  15
Asp Gly Leu Xxx Val Asp
20
(Xxxはそれがいずれのアミノ酸でもよいことを意味する)
【００５６】
ｄ)ｒＲＮＡに対するＮ−グルコシダーゼ活性
　ニグリンｂのＮ−グルコシダーゼ活性は、ニグリンｂにより脱プリン化されたｒＲＮＡについての酸性培地中におけるアニリンの作用の結果であるｒＲＮＡ断片の放出によって測定した。ｒＲＮＡ断片の放出は、以下に示すように、ウサギ網状赤血球溶解物１００μｌを塩基ニグリンｌとインキュベートすることにより測定した。１００μｌのウサギ網状赤血球溶解物を、３７℃において１５分間、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ　ＫＣｌおよび２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７.８）を含む溶液中０.８μｇとインキュベートした。その後、１０ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下、飽和されたフェノール容量の１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７.８）でこれらの反応混合物からｒＲＮＡを抽出した。フェノールによる抽出はさらに二度行い、最終的に−８０℃において２時間で、３００ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５.２）において二倍エタノール容量によりｒＲＮＡを沈澱させた。次いで、ｒＲＮＡを等容の２Ｍアニリン（ｐＨ５.２）で処理した。アニリンをジエチルエーテルで抽出した（等容で２回）。ｒＲＮＡを、次いで、二倍エタノール容量および３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.２）による沈澱によって沈澱させた。放出された断片の電気泳動分析は以下のように行なった。最終工程で得られたｒＲＮＡ沈澱を水中に再び懸濁させた。電気泳動用緩衝液中の３μｇのｒＲＮＡをポリアクリルアミドゲルディッシュ（サルスチオ(Salustio)およびスタンレー(Stanley)による、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)、第２６５巻、第５８２頁〜第５８８頁〔１９９２年〕に準じて調製した４.８５％アクリルアミドおよび０.１５０％ビス−アクリルアミド)の各々に入れた。電気泳動は１５ｍＡにおいて１００分間、ミニゲル系(マイティー・スモール(Mighty Small)、ホーエーファー(Ｈｏｅｆｅｒ))中で行なった。ゲルの染色は０.５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド中で２０分間行なった。視覚化は３１２ｎｍにおけるＵＶトランスイリュミネーターによって行った。
【００５７】
　ｅ）蛋白生合成の阻害
　ｉｎ　ｖｉｖｏの蛋白生合成阻害実験は、以下の文献に記載された標準的条件において、異なる無細胞系を用いて行った。典型的な実験の結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
2004113252.tif 000002
【００５９】
　ｆ）ラットにおける毒性
　実験は約３０ｇの体重のスイス（Swiss)ラットについて行った。
　体重１ｋｇ当たり１.６ｍｇのニグリンｂを、１５日の期間、死を引き起こさせないように、腹腔組織内に注入した。
【００６０】
　ｇ）赤血球細胞凝集素活性
　赤血球細胞凝集の実験は終体積０.１ｍｌの０.５％赤血球細胞溶液を用い、
９６ディッシュのプレート上で行った。
【００６１】
【表２】
2004113252.tif 000003
【００６２】
　ｈ）免疫学的関係
　ニグリンｂで１.５カ月間免疫したウサギから得られたポリクローナル抗体は、塩基ニグリンｌ、エブリンｌおよびラセモシンｂと反応し、サムブカス
（Sambucus)属の植物から得られたこの蛋白のファミリー間に存在する免疫学的関係についての考えが得られる。
【実施例２】
【００６３】
　実施例２（塩基ニグリンｌ）
　この実施例はａ）サムブカス・ニグラ・エル（Sambucus nigra L.）の葉からの塩基ニグリンｌの獲得；ｂ）見掛けの分子量の測定；ｃ）塩基ニグリンｌのポリペプチド鎖のアミノ末端配列；ｄ）ＲＮＡに対するＮ−グルコシダーゼ活性；ｅ）蛋白生合成の阻害；ｆ）ラットにおける毒性；ｇ）赤血球細胞凝集素活性；ｈ）免疫学的関係；の８つの章に分かれる。
【００６４】
　ａ）塩基リグリンＬの獲得
　５００ｇのサムブカス・ニグラ・エル(Sambucus nigra L.)の葉を、１４０
ｍＭの塩化ナトリウムおよび５ｍＭのリン酸一ナトリウム塩（ｐＨ７.２）４リットルの溶液中で４℃において１２時間抽出した。得られたペーストをチーズ−クロスを通して濾過して残存する固体を除去した。液状抽出物を氷酢酸でｐＨ４に酸性化し、現れた固形物を０℃において、１３０００ｒｐｍで４５分間遠心することによって除去した。流出した流体(約４リットル)を、エス・セファロース・ファースト・フロー(S Sepharose Fast Flow)のイオン交換クロマトグラフィーカラム（１０×５ｃｍのカラム）に付した。平衡化されたカラム溶液は１０ｍＭ酢酸ナトリウム(ｐＨ４.５）であった。酸性化した蛋白流体をカラムに適用した。カラムにより保持されなかった部分を捨てた。次いで、カラムを、２８０ｎｍにおける吸光度が最少値に下がるまで、１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液(ｐＨ４.５）で洗浄した。次いで、カラムを５ｍＭのリン酸一ナトリウム塩溶液（ｐＨ７）で洗浄した。２回の洗浄液を捨てた。最終的に、カラムを１Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍＭのリン酸一ナトリウム塩溶液（ｐＨ７）で洗浄した。流出した蛋白を５ｍＭのリン酸一ナトリウムに対して透析した。次いで、この蛋白調製物を、予めリン酸一ナトリウム（ｐＨ７）で平衡化したシーエム・セファロース・ファースト・フロー（CM Sepharose Fast Flow)(１０.５×２.６ｃｍ）中のイオン力グラジエントにおけるイオン交換クロマトグラフィーに付した。最初に蛋白は固定され、次いで、０.７リットルの５ｍＭリン酸一ナトリウム塩（ｐＨ７）および
０.７リットルの３００ｍＭ塩化ナトリウムからなるイオングラジエントを適用した。液速を７ｍｌ／分に調節し、１０.５ｍｌずつの画分を収集した。塩基ニグリンｌを含む画分１５ないし３５を収集した。画分を合し、アミコン（ＡＭＩＣＯＮ)とＹＭ１０膜で１０ｍｌの体積まで濃縮した。濃縮物を０.４Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍＭリン酸一ナトリウムの溶液で平衡化したハイ−ロード・スーパーデックス（Hi-Load Superdex)７５−ＦＰＬＣによる分子排除クロマトグラフィーに付した。クロマトグラフィーを同緩衝液中で行い、塩基ニグリンｌに相当する画分を合した。
【００６５】
　ｂ)ニグリンｌの見掛けの分子量の測定
　ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ドデシル硫酸ナトリウムの存在下、１５％アクリルアミドおよび２.７％ビスアクリルアミド、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)によって相対分子量（Ｍｒ）を測定した。得られたＭｒ値は、還元剤の不存在下において６６,０００であって、還元剤の存在下、Ａ鎖につき３４,０００およびＢ鎖に対し３４,０００であった。
【００６６】
　ｃ)ニグリンポリペプチド鎖のアミノ末端配列
　塩基ニグリンｌの２つのポリペプチド鎖のアミノ末端配列は、アリアス
(Arias)らにより示されているごとくに測定した(アリアス(Arias)ら、プランタ(Planta)、第１８６巻、第５３２頁〜第５４０頁〔１９９２年〕)。得られた結果は以下の通りである:
　−Ａ鎖:ブロックされたアミノ末端のアミノ酸　
　−Ｂ鎖:
Ala Pro Xxx Tyr Pro Thr Xxx Xxx 
1               5 
(Xxxはそれがいずれのアミノ酸でもよいことを意味する)
【００６７】
　ｄ)塩基ニグリンｌのｒＲＮＡに対するＮ−グルコシダーゼ活性
　塩基ニグリンｌのＮ−グルコシダーゼ活性は、塩基ニグリンｌにより脱プリン化されたｒＲＮＡについての酸性培地中のアニリンの作用の結果であるｒＲＮＡ断片の放出によって測定した。ｒＲＮＡ断片の放出は、以下に示すように、ウサギ網状赤血球溶解物を塩基ニグリンｌとインキュベートすることにより測定した。１００μｌのウサギ網状赤血球溶解物を３７℃において１５分間、２ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭＫＣｌおよび２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７.８）を含む溶液中、塩基ニグリンｌ０.５μｇとインキュベートした。その後、１０ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下、飽和されたフェノール容積の１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７.８）でこれらの反応混合物からｒＲＮＡを抽出した。フェノールによる抽出をさらに二度行い、最終的に−８０℃において２時間で、３００ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５.２）において二倍のエタノール容積によりｒＲＮＡを沈澱させた。次いで、ｒＲＮＡを等容の２Ｍアニリン（ｐＨ４.５)で処理した。アニリンをジエチルエーテルで抽出した(等容で２回)。ｒＲＮＡを、次いで、二倍のエタノール容量および３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.２）による沈澱によって沈澱させた。放出された断片の電気泳動分析は以下のように行った。最終工程で得られたｒＲＮＡ沈澱を水中に再び懸濁させた。電気泳動緩衝液中の３μｇのｒＲＮＡをポリアクリルアミドゲルディッシュ(サルスチオ(Salustio)およびスタンレー(Stanley)による、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)、第２６５巻、第５８２頁〜第５８８頁〔１９９２年〕に準じて調製した４.８５％アクリルアミドおよび０.１５０％ビス−アクリルアミド)の各々に入れた。電気泳動は１５ｍＡにおいて１００分間、ミニゲル系（マイティー・スモール(Mighty Small)、ホーエーファー(Hoefer))中で行なった。ゲルの染色は０.５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド中で２０分間行なった。視覚化は３１２ｎｍにおけるＵＶトランスイリュミネーターによって行った。
【００６８】
　ｅ）蛋白生合成の阻害
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏの蛋白生合成阻害実験は、アリアス（Arias)ら、プランタ
(Planta)、第１８６巻、第５３２頁〜第５４０頁［１９９２年］に記載されている標準的条件下、無細胞系のウサギ網状赤血球を用いて行った。典型的な実験の結果を表２に示す。
【００６９】
【表３】
2004113252.tif 000004
【００７０】
　ｇ）赤血球細胞凝集素活性
　赤血球細胞凝集の実験は、終体積０.１ｍｌの０.５％赤血球細胞溶液を用い、９６ディッシュのプレート上で行った。
【００７１】
【表４】
2004113252.tif 000005
【００７２】
　ｈ）免疫学的関係
　塩基ニグリンｌでウサギを１.５カ月間免疫することによって得られたポリクローナル抗体は、ニグリンｂ、エブリンｌおよびラセモシンｂと反応し、サムブカス（Sambucus)属から得られたこの蛋白のファミリー間に存在する免疫学的関係についての考えが得られる。
【実施例３】
【００７３】
　実施例３（エブリンｌ）
　この実施例はａ）サムブカス・エブルス・エル（Sambucus ebulus L.）の葉からのエブリンｌの獲得；ｂ）見掛けの分子量の測定；ｃ）エブリンｌのポリペプチド鎖のアミノ末端配列；ｄ）ＲＮＡに対するＮ−グルコシダーゼ活性；ｅ）蛋白生合成の阻害；ｆ）ラットにおける毒性；ｇ）赤血球細胞凝集素活性；ｈ）免疫学的関係；の８つの章に分かれる。
【００７４】
　ａ）エブリン１の獲得
　サムブカス・エブルス（Sambucus ebulus Ｌ）の葉１００ｇを、２８０ｍＭ塩化ナトリウムおよび５ｍＭリン酸一ナトリウム溶液(ｐＨ７.５）の１０００ｍｌと共に４℃で１２時間摩砕した。得られた抽出物をチーズ−クロスで濾過して残存する固形物を除去した。液状抽出物を、ＪＡ−１４ローター（ベックマン（Beckman)Ｊ２１遠心機）で１３０００ｒｐｍにて遠心し、上清（９９０ｍｌ）を収集した。上清流体を、抽出用緩衝液で平衡化した、酸処理セファロース（Sepharose)６Ｂ（０.１Ｎ塩酸で５０℃にて３時間処理したセファロース６Ｂ　２５０ｍｌ)１９０ｍｌを充填したクロマトグラフィーカラム(９.５×５ｃｍ）に適用した。次いで、該カラムを、２８０ｎｍにおける吸光度がベースラインに落ちるまで抽出用緩衝液で洗浄した。次いで、２００ｍＭ　Ｄ−ガラクトシダーゼを含有する抽出用緩衝溶液を適用した。吸収のピーク物を収集し、アミコン（ＡＭＩＣＯＮ)およびＹＭ１０膜にて７.５ｍｌまで濃縮した。次いで、濃縮した蛋白溶液を、４００ｍＭ　ＮａＣｌおよび５ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７.５）で平衡化したハイ−ロード・スーパーデックス（Hi-Load Superdex）７５カラムに適用した。溶出させて、各々が２０ｍｌのいくつかの蛋白ピーク物が得られ、最後のものが電気泳動的に均質なエブリン1であった（最小Ｍｒピーク）。
【００７５】
　ｂ）見掛けの分子量の測定
　レムリィ（Laemmly)プロセス（ネイチャー（Nature)２２７、６８０−６８５）によって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ドデシル硫酸ナトリウムの存在下における１５.０％アクリルアミドおよび２.７％ビス−アクリルアミド、ＳＤＳ−ＥＤＴＡ）により相対的分子量（Ｍｒ）を測定した。得られたＭｒ値は、還元剤の存在下で、Ａ鎖につき２６０００、Ｂ鎖につき３００００、還元剤の不存在下で５６０００であった。
【００７６】
　ｃ）エブリン１のポリペプチド鎖のアミノ末端配列
　エブリン１の２本のポリペプチドのアミノ末端配列は、アリアス（Arias)ら［アリアス(Arias)ら、プランタ（Planta)１８６、５３２−５４０(１９９２）］に記載されているごとくに測定した。結果は以下の通りである。
【００７７】
　−鎖Ａ：
　Ile Asp Tyr Pro Ser Val Ser Phe Asn Leu Ala
　1　　　　　　　　5　　　　　　　　　10
　Gly Ala Lys Ser Thr Thr Tyr Arg Asp Phe Leu
　　　　　　　15　　　　　　　　　20
　Lys Asn Leu
　　　　　25
　−鎖Ｂ：
　Asp Gly Glu Thr Xxx Ala Ile Pro Ala Pro Phe
　1　　　　　　　　5　　　　　　　　  10
　Thr Arg Arg Ile Val Gly Xxx Asp Gly Leu Glu
　　　　　　　15　　　　　　　　　20
　Val Asp Pro
　　　　　25
　（Ｘｘｘはそれがいずれのアミノ酸であってもよいことを意味する）
【００７８】
　ｄ）エブリン１のｒＲＮＡに対するＮ−グルコシダーゼ活性
　エブリン１の該Ｎ−グルコシダーゼ活性は、エブリン１によって脱プリン化されたｒＲＮＡに対する酸性媒質中におけるアニリンの作用の結果として、
ｒＲＮＡ断片の放出として測定した。ｒＲＮＡ断片の放出は、後記するごとく、ウサギ網状赤血球溶解物１００μｌをエブリン１と共にインキュベートすることによって測定した。ウサギ網状赤血球溶解物１００μｌを、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ　ＫＣｌおよび２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）を含有する溶液中、エブリン１の６.８μｇと共に３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、ｒＲＮＡを、１０ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）の飽和フェノール容量で、これらの反応混合物から抽出した。フェノール抽出をさらに２回行い、最後に、−８０℃にて、２倍エタノール容量の３００ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５.２）でｒＲＮＡを２時間で沈殿させた。次いで、該ｒＲＮＡを１倍容量の２Ｍアニリン（ｐＨ４.５）で処理した。該アニリンをジエチルエーテル（１倍容量、２回）で抽出した。次いで、該ｒＲＮＡを、２倍エタノール容量および３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.２）で沈殿させた。遊離した断片の電気泳動分析を以下のごとくに行った。最後の工程で得られたｒＲＮＡ沈殿物を水に再懸濁させた。電気泳動緩衝液中のｒＲＮＡ３μｇを、ポリアクリルアミドゲル・ディッシュ（サルスチオ（Salustio)およびスタンレイ（Stanley)［ジャーナル・オブ・バイオケミカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.)２６５、５８２−５８８、１９９０］に準じて調製した４.８５％アクリルアミドおよび０.１５０％ビス−アクリルアミド）の各々に入れた。ミニゲル系（マイティ・スモール・ヘーファー（Mighty Small, Hoefer)にて、１５ｍＡにて電気泳動を１００分間行った。ゲルの染色は、エチジウムブロマイド０.５μｇ／ｍｌで２０分間行った。可視化は、３１２ｎｍにおけるＵＶランプ・トランスイリュミネーターで行った。
【００７９】
　ｅ）蛋白生合成の阻害
　in vitro蛋白生合成の阻害実験は、文献に記載された標準的条件にて、異なる無細胞系を用いて行った。典型的な実験の結果を以下の表３に示す。
【００８０】
【表５】
2004113252.tif 000006
【００８１】
　ＩＣ５０は、各無細胞系の標準的な条件における蛋白生合成の５０％阻害を引き起こす蛋白濃度を示す。実験は、文献に示された条件で行った。
【００８２】
　ｆ）ラットにおける毒性
　実験は、約３０ｇの体重のストス(Swiss)ラットで行った。
　体重１ｋｇ当たりエブリン１の１.６ｍｇを、いずれの死滅も引き起こすことなく、１５日間、腹腔内注射した。
【００８３】
　ｇ）赤血球細胞凝集活性
　赤血球細胞凝集実験は、最終容量０.１ｍｌにて、０.５％赤血球細胞溶液を用い、９６ディッシュのプレートにて行った。
【００８４】
　合計ヒト赤血球細胞凝集（１ｍｌ当たりのｍｇの蛋白）　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　血液型　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　Ａ　　　　Ｂ　　　　　ＡＢ　　　　　Ｏ
　エブリン１　　　　０.０５　０.０２５　０.０１２５　０.０１２５　
【００８５】
　ｈ）免疫学的関係
　ウサギを１.５月間エブリン１で免疫することによって得られたポリクローナル抗体を、ニグリン（Nigrin)ｂ、塩基ニグリン（Nigrin)ｂおよびラセモシン（Racemosin)ｂと反応し、サムブカス（Sambucus)属の得られた蛋白のこのファミリーの間に存在する免疫学的関係の考えが得られた。
【実施例４】
【００８６】
　実施例４（ラセモシン（Racemosin)ｂ）
　本実施例は７つの章：
　ａ）サムブカス・ラセモサ・エル（Sambucus racemosa Ｌ）の樹皮からのラセモシンｂの獲得；ｂ）見掛けの分子量の測定；ｃ）ＲＮＡに対するＮ−グルコシダーゼ活性；ｄ）蛋白生合成の阻害；ｅ）ラットにおける毒性；ｆ）赤血球細胞凝集素活性；ｇ）免疫学的関係：
に分けられる。
【００８７】
　ａ）ラセモシンｂの獲得
　サムブカス・ラセモサ・エル（Sambucus racemosa Ｌ）の樹皮２５０gを、４℃にて、１４０ｍＭ塩化ナトリウムおよび５ｍＭリン酸一ナトリウムの溶液（ｐＨ７.２）の２リットルで１２時間抽出した。得られた抽出分をチーズ−クロスで濾過して残存する固形物を除去した。液状抽出物を氷酢酸でｐＨ４に酸性化し、出現した固形物を１３０００ｒｐｍにおける０℃での４５分間の遠心によって除去した。溶出した流体（ほぼ２リットル）をＳ　セファロース・ファースト・フロウ（Sepharose Fast Flow)（８.４×５ｃｍのカラム）におけるイオン交換クロマトグラフィーに付した。平衡化したカラム溶液は１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.５）であった。酸性化した蛋白流体を該カラムに適用した。該カラムによって保持されなかった分を捨てた。次いで、該カラムを、２８０ｎｍにおける吸光度が最小値に減少するまで、１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４.５）で洗浄した。次いで、該カラムを５ｍＭリン酸一ナトリウム溶液（ｐＨ７.）で洗浄した。２回の洗液を捨てた。最後に、該カラムを１Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍＭリン酸一ナトリウム溶液（ｐＨ７.）で溶出した。溶出した蛋白を５ｍＭリン酸一ナトリウム（ｐＨ７.）に対して透析した。この蛋白調製物を、次いで、リン酸一ントリウム(ｐＨ１.）で予め平衡化したＣＭ−セファロース・ファースト・フロウ（カラム４.７×２.６ｃｍ）におけるイオン力グラジエントにてのイオン交換クロマトグラフィーに付した。最初に蛋白が固定され、次いで、５ｍＭリン酸一ナトリウム溶液（ｐＨ７）の０.７リットルおよび３００ｍＭ塩化ナトリウム溶液の０.７リットルよりなるイオングラジエントを流した。液速を１分間当たり７ｍｌに調整し、１０.５ｍｌずつの画分を収集した。ラセモシンｂを含有する画分４ないし１５を収集した。該画分を合し、ＡＭＩＣＯおよびＹＭ膜にて１０ｍｌの容量に濃縮した。次いで、濃縮物を、０.４ｍＭ塩化ナトリウムおよび５ｍＭリン酸一ナトリウム溶液（ｐＨ７.）で予め平衡化したハイ−ロード・スーパーデックス（Hi-Load Superdex)７５−ＦＰＬＣを用いる分子排除クロマトグラフィーに付した。該クロマトグラフィーを同緩衝液にて行い、純粋なラセモシンｂに対応する画分を合した。
【００８８】
　ｂ）見掛けの分子量の測定
　レムリィ（Laemmly)プロセス（ネイチャー（Nature)２２７、６８０−６８５）によって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ドデシル硫酸ナトリウムの存在下における１５％アリクリルアミドおよび２.７％ビス−アクリルアミド、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって相対的分子量(Ｍｒ)を測定した。得られた該Ｍｒ値は還元剤の不存在下では５８０００であって、還元剤の存在下では、Ａ鎖につき２７５００、Ｂ鎖につき２９５００であった。
【００８９】
　ｃ）ラセモシンｂのｒＲＮＡに対するＮ−グルコシダーゼ活性
　ラセモシンｂによって脱プリン化されたｒＲＮＡについての酸性培地中におけるアニリンの作用の結果として、ラセモシンｂのＮ−グルコシダーゼ活性を、ｒＲＮＡ断片の放出として測定した。ｒＲＮＡ断片の放出は、後記するごとく、ウサギ網状赤血球溶解物１００μｌをラセモシンｂと共にインキュベートすることによって測定した。ウサギ網状赤血球溶解物１００μｌを、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ ＫＣｌおよび２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）を含有する溶液中にて、ラセモシンｂの０.５μｇと共に３７℃にて１５分間インキュベートした。その後、ＥＤＴＡの存在下にて、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）のフェノール容量でこれらの反応物混合物からｒＲＮＡを抽出した。フェノール抽出をさらに２回行い、最後に、３００ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５.２）における２倍エタノール容量にて、−８０℃で２時間、ｒＲＮＡを沈殿させた。次いで、ｒＲＮＡを１倍容量の２Ｍアニリン（ｐＨ４.５）で処理した。アニリンをジエチルエーテル（１倍容量で２回）で抽出した。しかる後、２倍エタノール容量および３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.２）での沈殿によってｒＲＮＡを沈殿させた。遊離した断片の電気泳動分析は以下のごとくに行った。最後の工程で得られたｒＲＮＡ沈殿物を水に再懸濁させた。電気泳動緩衝液中のｒＲＮＡ３μｇを、サルスチオ（Salustio)およびスタンレイ（Stanley)（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.)２６５、５８２−５８８（１９９０））に準じて調製したポリアクリルアミドゲル・ディッシュ（４.８５％アクリルアミドおよび０.１５０％ビス−アクリルアミド）の各々に入れた。ゲルの染色は、０.５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドで２０分間行った。可視化は３１２ｎｍにおけるＵＶランプトランスイリュミネーターで行った。
【００９０】
　ｄ）蛋白生合成の阻害
　in vitro蛋白生合成阻害実験は、アリアス（Arias)ら［プランタ（Planta)
１８６、５３２−５４０、１９９０］に記載されている標準条件にて、無細胞系ウサギ網状赤血球溶解物を用いて行った。結果を表４に示す。
【００９１】
【表６】
2004113252.tif 000007
【００９２】
　ｅ）ラットにおける毒性
　実験は、約３０ｇの体重のSwissラットで行った。
　体重１ｋｇ当たりラセモシンｂ　１.６ｍｇを、いずれの死滅も起こさせることなく、１５日の期間腹腔内注射した。
【００９３】
　ｆ）赤血球細胞凝集素活性
　赤血球細胞凝集実験は、最終容量０.１ｍｌにて０.５％赤血球細胞溶液を用いて、９６ディッシュのプレートで行った。
【００９４】
　合計ヒト赤血球細胞凝集（ｍｌ当たりのｍｇの蛋白）　　
　　　　　　　　　　　　　　血　液　型　　　　　　　　
　　　　　　　　　　Ａ　　　Ｂ　　　ＡＢ　　　Ｏ　　　
　ラセモシンｂ　　６.８　　３.４　　３.４　　５.４　　
【００９５】
　ｇ）免疫学的関係
　ウサギをエルビン(Ebulin) １およびニグリン（Nigrin)ｂに対して１.５月間免疫することによって得られたポリクローナル抗体をラセモシンｂと反応させ、サムブカス(Sambucus)属の植物で得られたこのファミリーの蛋白の間に存在する免疫学的関係の考えが得られた。