(57)【要約】【課題】細胞間連絡に関与していることが知られている、ギャップ結合の機能を効率よく抑制し、ギャップ機能の亢進による疾病の病状の悪化防止、改善、治療、及び予防に使用しうる可能性を有する細胞間連絡抑制剤を提供する。【解決手段】ガラクトサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造（いわゆるコンドロイチン骨格）を基本骨格とする「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」を細胞間連絡抑制剤の有効成分として使用する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」を有効成分として含有することを特徴とする細胞間連絡抑制剤。
【請求項２】
細胞間連絡抑制剤が、ギャップ機能の抑制によって作用することを特徴とする請求項１記載の細胞間連絡抑制剤。
【請求項３】
ガラクトサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」の、細胞間連絡の抑制のための使用。
【請求項４】
ガラクトサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」を有効成分として含有することを特徴とする増殖因子安定化剤。
【請求項５】
ガラクトサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」の、増殖因子を安定させるための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定のグリコサミノグリカンを有効成分とする細胞間連絡抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞間のシグナル伝達は、分泌によるシグナル伝達（ホルモンなど）、細胞膜に結合した分子によるシグナル伝達（シナプスなど）、及びギャップ結合（以下ＧＪと略記する）によるシグナル伝達によって主になされている。細胞間のシグナル伝達には、生理活性物質の伝搬や、細胞間の電位の伝達等があり、生体組織の活動に寄与している。その中でも特にＧＪによるシグナル伝達は、細胞同士が微細構造により結合することによってなされるため、最も直接的で確実なシグナル伝達がなされ、特に組織中の細胞の統制において重要な役割を果たしている。
【０００３】
このようなＧＪは細胞膜タンパク質であるコネキシンが６分子結合した細胞微細チャンネル構造（コネクソン）が、隣接する２個の細胞間で会合することにより形成されている。
【０００４】
細胞間のＧＪの働きが健常状態よりも亢進すると、正常な組織の生理活動が妨げられる。このようなＧＪ機能亢進による疾病としては例えば非特許文献１にはてんかん、非特許文献２には血管内再狭窄、非特許文献３には糸球体腎炎、非特許文献４にはパーキンソン病、非特許文献５にはアルツハイマー病、非特許文献６には動脈硬化症等が記載されて知られている。
従って、細胞間連絡を主に担うＧＪの機能を抑制することは、これらの疾病の悪化防止、症状の改善、治療、予防のために役立つと考えられていた。
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｈｕｎｇ．  Ｈｕａ．  Ｈｓｕｅｈ．  Ｔｓａ．  Ｃｈｉｈ．，  ７８（１９９８），  ３１１−３１３
【非特許文献２】Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．（１９９７）  １７，  ３１７４−３１８４
【非特許文献３】Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  １８２（１９９７），  ３７３−３７９
【非特許文献４】Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．，  ４６（１９９６），  ６０６−６１７
【非特許文献５】Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，  ７１７（１９９６），  １７３−１７８
【非特許文献６】Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．，  １５（１９９５），  １２１９−１２２８
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、ＧＪの機能（ギャップ機能）をはじめとする細胞間連絡を抑制する働きを有し、生体にとって安全性が高い細胞間連絡抑制剤が期待されていたが、そのような物質は未だ見つかっていなかった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題に鑑み、細胞間連絡機能、特にＧＪを介した細胞間連絡（ギャップ機能）を抑制する物質を鋭意探索した。その結果、驚くべきことにガラクトサミン残基とヘキスロン酸残基とからなるコンドロイチン骨格を有する「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」が、ギャップ機能を強く抑制して細胞間連絡を抑制する働きを有することを見い出し、本発明に至った。
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）  ガラクトサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」を有効成分として含有することを特徴とする細胞間連絡抑制剤。
（２）  細胞間連絡抑制剤が、ギャップ機能の抑制によって機能することを特徴とする（１）記載の細胞間連絡抑制剤。
（３）  ガラクトサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」の、細胞間連絡の抑制のための使用。
（４）  ガラクトサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」を有効成分として含有することを特徴とする増殖因子安定化剤。
（５）  ガラクトサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」の、増殖因子を安定させるための使用。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。尚、本明細書中において、細胞間連絡とは、ホルモンや電気刺激、化学物質の拡散による細胞同士の連絡、及び細胞同士のＧＪを介した連絡の双方を含む概念であって、ギャップ機能とは、上記ＧＪによって細胞間連絡を行う機能を表す用語として使用する。
【００１０】
（１）本発明抑制剤
本発明抑制剤はガラクトサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造（これを「コンドロイチン骨格」ともいう）を基本骨格とする「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」を有効成分として含有することを特徴とする細胞間連絡抑制剤である。
【００１１】
本発明抑制剤における「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」は、ガラクトサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする糖鎖である。上記二糖は、ガラクトサミン残基にヘキスロン酸がβ−１，３−結合した構造を有している。ここでヘキスロン酸とは、ヘキソースの６位がカルボキシル基を形成した六炭糖であり、具体的にはグルクロン酸又はイズロン酸を指称する。
【００１２】
一般にコンドロイチン硫酸と呼ばれるグリコサミノグリカンが有するコンドロイチン骨格においては、ガラクトサミン残基の４位、６位、ヘキスロン酸残基の２位又は３位のヒドロキシル基が硫酸エステル化されており、さらにガラクトサミン残基の２位アミノ基はスルファミノ化又はアセチル化されている。本発明抑制剤においても、その有効成分であるグリコサミノグリカンは硫酸基を有している。
【００１３】
上記「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」は、重量平均分子量が５，０００乃至１５０，０００程度であることが好ましく、７，０００乃至１２０，０００であることがより好ましく、１０，０００〜１３０，０００であることが最も好ましい。重量平均分子量は、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．，  ２２０，  １０８−１１２（１９９６）に従って、測定することができる。
【００１４】
本発明抑制剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて隣り合う細胞同士の連絡、特にＧＪを介した細胞間連絡を抑制する細胞間連絡抑制剤である。本発明抑制剤の効果は、例えばＥｎｖｉｒｏｎ．  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２９，２９２３−２９２８（１９９５）に記載された、色素（蛍光色素）移行（Ｓｃｒａｐｅ−ｌｏａｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｙｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＳＬＤＴ）法により、容易に確認することが可能である。
【００１５】
このような細胞間連絡抑制剤は、有効成分である「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」が、生体内に存在するグリコサミノグリカンと同一又は近似した構造を有するため、生体に対し極めて高い安全性を有していると考えられる。従って、本発明抑制剤は、たとえばてんかん、血管内再狭窄、糸球体腎炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び動脈硬化症等の治療薬としての使用可能性を有する。
【００１６】
また更に、本発明抑制剤はその細胞間連絡を抑制する働きを妨げることがない、上記「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」以外の多糖を含んでいても良い。この場合の多糖としては、グリコサミノグリカンが好ましく、特に硫酸基を有しないグリコサミノグリカンが好ましい。そのようなグリコサミノグリカンとしてはヒアルロン酸及びコンドロイチンが例示され、ヒアルロン酸が最も好ましいが、これに限定はされない。
【００１７】
なお、本発明抑制剤は後述の実施例２及び実施例３により細胞からの成長因子分泌を促進すること及び細胞外の成長因子の安定化に寄与することが示唆されたため、下記記載の本発明安定化剤としても使用することが可能である。
【００１８】
（２）本発明安定化剤
本発明安定化剤はガラクトサミン残基とヘキスロン酸残基とからなる二糖の繰り返し構造を基本骨格とする「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」を有効成分として含有することを特徴とする増殖因子安定化剤である。
【００１９】
本発明安定化剤の有効成分としての上記「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」は上記本発明抑制剤に記載したグリコサミノグリカンと同義である。
【００２０】
このようなグリコサミノグリカンは、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて増殖因子を安定化させることができる。  増殖因子の安定化とは、増殖因子の分解を抑制する作用、増殖因子の細胞外への分泌を促進する作用など、細胞外の増殖因子の量の減少を抑制する作用である限りにおいて特に限定はされないが、本発明安定化剤は特に増殖因子の分解を抑制する作用を有していることが好ましい。なお、コンドロイチン硫酸等の本発明の「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」が増殖因子の分解を抑制することはこれまでに知られていなかった。
本発明安定化剤の「増殖因子を安定化させる作用」は、例えば後述の実施例２及び実施例３に従って確認することが可能である。
【００２１】
本発明安定化剤が安定化させる増殖因子は、例えばトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、アンドロゲン誘導性成長因子（ＡＩＧＦ）など）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、脳由来神経増殖因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ミッドカイン（ＭＫ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、ケモカイン（αケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン）、βケモカイン（Ｃ−Ｃケモカイン））、インターロイキン類（ＩＬ−８等）、ビトロネクチン（ＶＮ）、ヘパリン結合性脳細胞増殖因子（ＨＢＢＭ）、及びヘパリン結合性神経増殖因子（ＨＢＮＦ）等が例示され、ＦＧＦがその中でも好ましく、本発明安定化剤が顕著な安定化作用を示すことから特にｂＦＧＦ及びＫＧＦが好ましい。
【００２２】
本発明安定化剤は、上述の増殖因子を含んだ「組成物」としても良い。
但し、本発明安定化剤は上記ような増殖因子を含む「組成物」の態様とせずとも、生体内にはこれらの増殖因子が存在するため、生体内に存在する増殖因子と「硫酸基を有するグリコサミノグリカン」との相互作用によって、生体内に存在する増殖因子の安定化を図り所望の効果を奏することも可能である。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
実施例１
コンドロイチン硫酸が正常ヒト皮膚繊維芽細胞のギャップ機能に及ぼす影響
正常ヒト皮膚繊維芽細胞（以下「ＮＨＤＦ細胞」とも記載する）は、１０％牛胎児血清（以下「ＦＢＳ」とも記載する：ギブコ社製）及び抗生物質（ペニシリン（１００  ｕｎｉｔ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００  μｇ／ｍｌ））を含むダルベッコの調製イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」とも記載する：ギブコ社製）中で培養した。上記培養液中のＮＨＤＦ細胞は、直径３５ｍｍポリスチレン製の培養皿（ファルコン社製）で、５％ＣＯ２／Ａｉｒ、３７℃条件下で完全なコンフルエント単層を形成するまで培養した。ＣＳ−コート群の培養皿は予め２ｍｇ／ｍｌ濃度のコンドロイチン硫酸Ａ（クジラ軟骨由来：重量平均分子量１６，０００Ｄａ：生化学工業株式会社製）水溶液１ｍｌを添加して４時間保持することにより調製した「ＣＳ−コート処理培養皿」を、使用２４時間前に室温にて無菌気流を用いて乾燥させて使用した。またＣＳ−添加群の培養皿には、「コンドロイチン硫酸をコートしていない培養皿」を使用し、培地に２ｍｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸Ａ水溶液を１ｍｌずつ添加した。対照としてはコンドロイチン硫酸Ａでコートしていない培養皿を用いて、１０％ＦＢＳ（ギブコ社製）及び抗生物質（ペニシリン（１００  ｕｎｉｔ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００  μｇ／ｍｌ））を含むＤＭＥＭで培養した細胞を使用した。
【００２４】
ＮＨＤＦ細胞がコンフルエントとなった培養皿を、リン酸緩衝生理的食塩水（以下「ＰＢＳ」とも記載する）により３回洗浄した後、手術用メスで直線的に切れ目を入れた後、０．１％蛍光色素（ルシフェルイエロー：分子量４５７．２）溶液を５００μｌ添加した。蛍光色素溶液がコンフルエント単層上に存在する状態で、５％  ＣＯ２／Ａｉｒ、３７℃条件下で５分間保温した。この後、蛍光色素溶液を除去し、剥離して遊離した細胞及び過剰な蛍光色素を除去するために、培養皿を５ｍｍｏｌ／ｌのＣａ２＋及び５ｍｍｏｌ／ｌのＭｇ２＋を含むＰＢＳで３回洗浄した。次いで、メスでつけた切れ目からの蛍光色素の移動距離を、Ｓｕｐｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  Ｌａｍｐ  Ｐｏｗｅｒ  Ｓｕｐｐｌｙ  （株式会社ニコン製）を装着したＵＦＸ−ＤＸＩＩ型蛍光顕微鏡（株式会社ニコン製）を用いて、室温条件下にて測定した（図１、図２）。
【００２５】
ＣＳ−コート群における蛍光色素の移動距離は、対照と比較して７２−９８％まで低下していた（図１Ｆ）。一方、ＣＳ−添加群における蛍光色素の移動距離は、対象と比較して約６０％まで低下していた（図１Ｄ）。分析を行なったすべての試料において、蛍光強度はＣＳ−コート群の場合よりもＣＳ−添加群の場合の方が低かった（図１Ｃ、Ｄ）。この結果、コンドロイチン硫酸Ａが強いギャップ機能抑制効果を有することが明かとなった。
【００２６】
コンドロイチン硫酸Ａを重量平均分子量１３，０００Ｄａ及び３４，０００Ｄａのコンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製）に代えて同様の実験を行なった際には、ＣＳ−添加群がコンドロイチン硫酸Ａの場合と同様に強いギャップ機能抑制効果を示した（図２Ｃ（１３）白塗り、Ｃ（３４）白塗り）。
【００２７】
コンドロイチン硫酸Ｂ（鶏冠由来：重量平均分子量３８，０００：生化学工業株式会社製）をコンドロイチン硫酸Ａに代えて使用した場合には、ＣＳ−コート群及びＣＳ−添加群の場合のいずれの場合とも、対象に比較して５％程度低下した蛍光色素の移動率を示した（図２Ｂ（３８））。
【００２８】
各実験群に関しアラマブルー測定法（Ｔｏｘｉｃ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，  ９（１９９５），  ２５７）を用い、コンドロイチン硫酸のＮＨＤＦ細胞に対する細胞障害性を確認したところ、いずれの実験群においても陰性対照と差異は見られず、細胞障害性は認められなかった。
【００２９】
実施例２
ＣＳがＮＨＤＦ細胞の増殖因子産生に及ぼす影響
２００，０００個のＮＨＤＦ  ｃｅｌｌｓを、実施例１と同様にＣＳ−Ａ及びＣＳ−Ｃを使用して調製したＣＳ−コート処理培養皿（直径３５ｍｍ）に播いた。培地は４日間の保温の後に除去し、直ちに−２０℃に貯蔵した。ＮＨＤＦ細胞につきトリプシン処理を施して細胞を剥離させた後、洗浄し、０．５ｍｌのＰＢＳ（５ｍｍｏｌ／ｌのＣａ２＋及び５ｍｍｏｌ／ｌのＭｇ２＋を含む）に懸濁した。次いで、細胞懸濁液を氷冷下で１０秒間×３回超音波処理した。このようにして得た細胞懸濁液も、上記と同様に−２０℃に貯蔵した。細胞表面に結合しているｂＦＧＦ及びＫＧＦの含量、及び培地上澄中に遊離したｂＦＧＦ及びＫＧＦの含量を、市販のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ−ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）により測定した。各場合のタンパク質含量については、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＣＡ）法（Ｊ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．  Ｓｃｉ．  Ｐｏｌｙｍ．  Ｅｄｎ．，  １１（２０００），  ９４７）に従って測定した。
【００３０】
その結果、ＣＳ−コート群の細胞抽出物中のｂＦＧＦ含量は、総じて対照に比較して低かった（図３）。これらｂＦＧＦ含量の低下パターンは、図２に示した蛍光色素の移動パターンと良く似ていた（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １５３（１９９２），１９６）。培養液中のｂＦＧＦ含量は、およそ細胞抽出物中のｂＦＧＦ含量の０．１％程度のレベルであった。ＣＳ−コート群における培養液中のｂＦＧＦ含量は、対照に比較して１．５〜２．０倍という高い値を示した（図４）。
【００３１】
ＣＳ−コート群における細胞抽出物中のＫＧＦ含量は、対照と同レベルであった（図５）。培養液中のＫＧＦ含量は、何れのコンドロイチン硫酸を使用した場合、対照と比較して約３倍に上昇していた（図６）。
このことから、コンドロイチン硫酸Ａ及びＣは、細胞から培地への成長因子分泌を促進する働きがあることが示唆された。
【００３２】
実施例３
ＣＳが細胞外の増殖因子の安定性に及ぼす影響
増殖因子の安定性に及ぼすコンドロイチン硫酸の影響は、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中、ｂＦＧＦ又はＫＧＦの存在下で検討した。すなわち、２ｍｇのコンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ（クジラ軟骨由来：重量平均分子量１６，０００Ｄａ：生化学工業株式会社製）又はコンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟骨由来：重量平均分子量３４，０００Ｄａ：生化学工業株式会社製）でコートした直径３５ｍｍの培養皿を用い、３７℃で培地中の成長因子の安定性を測定した。ｂＦＧＦは１６０ｐｇ／ｍｌ、ＫＧＦは５００ｐｇ／ｍｌで添加した。４日間の保温後のｂＦＧＦ及びＫＧＦの濃度を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ−ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を用いて測定した。なお、この検出キットを用いた場合のｂＦＧＦの検出限界は、通常３ｐｇ／ｍｌである。対照としてはコンドロイチン硫酸を添加しない実験群を使用した。
【００３３】
その結果、ｂＦＧＦは、いずれのコンドロイチン硫酸の存在下においても対照の約２倍の安定性が観察された（図７黒塗り）。さらに、ＫＧＦの場合には、いずれのコンドロイチン硫酸の存在下においても対照の約３倍の安定性が観察された（図７斜線）。これらの結果から、コンドロイチン硫酸は細胞外マトリックス中に存在する増殖因子の安定化に関与していることが示唆された。
【００３４】
【発明の効果】
本発明により、コンドロイチン硫酸を有効成分として含むギャップ機能抑制剤及び成長因子安定化剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】コンドロイチン硫酸Ａの添加及びコートした培養皿におけるギャップ機能抑制効果を示す図。
【図２】種々のコンドロイチン硫酸の添加及びコートした培養皿におけるギャップ機能抑制効果を示す図。白塗りのバーはＣＳ−コート群を示し、黒塗りのバーはＣＳ−添加群を示す。＊は確度９９．５％、＊＊は確度９９．８％を示す。
【図３】細胞内貯留性ｂＦＧＦ量のコンドロイチン硫酸Ａ及びＣによる影響を示す図。
【図４】細胞外分泌性ｂＦＧＦ量のコンドロイチン硫酸Ａ及びＣによる影響を示す図。
【図５】細胞内貯留性ＫＧＦ量のコンドロイチン硫酸Ａ及びＣによる影響を示す図。
【図６】細胞外分泌性ＫＧＦ量のコンドロイチン硫酸Ａ及びＣによる影響を示す図。
【図７】細胞外ｂＦＧＦ及びＫＧＦの安定性に及ぼすコンドロイチン硫酸Ａ及びＣによる影響を示す図。黒塗りのバーはｂＦＧＦの安定性を示し、斜線のバーはＫＧＦの安定性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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