(57)【要約】【課題】各種の細胞株において転写活性を有し、効率よくウイルスを産生することが可能な狂犬病ウイルスのような非分節（−）鎖ＲＮＡウイルス発現ベクター、及びその利用を提供すること。【解決手段】非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡの両端にリボザイムの配列を配置することによって、各種の細胞株においてウイルスの複製を行うことができる発現ベクターを構築することができる。本発明のウイルス発現ベクターには、プロモーターとして、サイトメガロウイルスプロモーターが用いられる。本発明のウイルス発現ベクターは、この発現ベクターに外来遺伝子を組み込んで用いることにより、外来遺伝子の標的細胞での発現を行うベクターとして、及び薬理活性を有するペプチド医薬のデリバリー用の組成物として用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡにリボザイムの配列を配置したことを特徴とする細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
【請求項２】
非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡが、狂犬病ウイルスｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
【請求項３】
狂犬病ウイルスｃＤＮＡが、狂犬病ウイルス  ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株であることを特徴とする請求項２記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
【請求項４】
非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡの完全長ゲノムｃＤＮＡの両端にリボザイム配列を配置したことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
【請求項５】
リボザイムが、改変ハンマーヘッド型リボザイム及び／又は肝炎デルタウイルス型リボザイムであることを特徴とする請求項４記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
【請求項６】
細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性が、細胞内ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写活性であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
【請求項７】
サイトメガロウイルスプロモーターの下流に、非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡの両端にリボザイムの配列を配置した配列を結合したことを特徴とする細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
【請求項８】
非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡの両端にリボザイムの配列を配置した配列が、請求項２〜６のいずれか記載の狂犬病ウイルスｃＤＮＡの両端にリボザイムの配列を配置した配列であることを特徴とする請求項７記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜８記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターに外来遺伝子を組み込んだことを特徴とする細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有する外来遺伝子組換えウイルス発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜９記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターを、真核宿主細胞中に導入し、該真核宿主細胞中で発現させ、該真核宿主細胞中から回収することを特徴とする組換え非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスの回収方法。
【請求項１１】
組換え非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスが、狂犬病ウイルスＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株であることを特徴とする請求項１０記載の組換え非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスの回収方法。
【請求項１２】
真核宿主細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項１０又は１１記載の非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスの回収方法。
【請求項１３】
請求項９記載の外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターを、標的細胞と接触させ、標的細胞中に導入することを特徴とするにより外来遺伝子の標的細胞での発現方法。
【請求項１４】
外来遺伝子が、ワクチン抗原、インターロイキン、酵素、又は生理活性を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１３記載の外来遺伝子の標的細胞での発現方法。
【請求項１５】
外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ請求項９記載の外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターと医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバント及び／又は賦形剤からなる医薬デリバリー用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡの両端にリボザイムの配列を配置した細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター、特に、狂犬病ウイルスｃＤＮＡの両端にリボザイムの配列を配置した細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
有用なタンパク質をコードする遺伝子を、発現ベクターに組み込み、それを宿主細胞に導入して、遺伝子を発現する技術は既に周知のところであり、発現ベクターとして、ウイルスを基にして構築されたベクターも多くのものが知られている。近年は、ウイルスベクターを、外来遺伝子を標的細胞へ挿入するためのキャリヤーとしての利用が開発されており（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３，  ２２２，  １９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １，  ５１，  １９９４）そのためのベクターの改良もなされている（特表平８−５０１４５３号公報、特開平１０−４９７９号公報）。
【０００３】
狂犬病ウイルスをベクターとして用いることも既に周知のところである。狂犬病ウイルスは、非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスであり、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）科リッサウイルス（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）属に属する。モノネガウイルスの完全長ｃＤＮＡからウイルスを回収する方法は、狂犬病ウイルスを用いてＳｃｈｎｅｌｌらにより１９９４年に初めて開発された（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３，  ４１９５−４２０３，  １９９４）。
この狂犬病ウイルスｃＤＮＡ発現系は、欧州のワクチン株であるＳＡＤ  Ｂ１９株（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７５，４８５−４９９，１９９０）を用いて開発された。この方法は、狂犬病ウイルスの詳細な分子生物学的解析及びワクチン・ベクター開発などの研究を可能にした（特開平８−１６８３８１号公報）。
【０００４】
Ｓｃｈｎｅｌｌらにより、狂犬病ウイルスを用いて完全長ｃＤＮＡからＲＮＡウイルスを回収する方法（リバースジェネティクス）が開発されて以来、別のラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）のリバースジェネティクス（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２，  ４４７７−４４８１，  １９９５、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２，  ８３８８−８３，  １９９５）及びパラミクソウイルスに属する麻疹ウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）のリバースジェネティクス（ＥＮＢＯ  Ｊ．  １４，  ５７７３−５７８４，  １９９５）、呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）のリバースジェネティクス（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２，  １１５６３−１１５６７，  １９９５）、及びセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  Ｖｉｒｕｓ）のリバースジェネティクス（ＥＮＢＯ  Ｊ．  １４，  ６０８７−６０９４，  １９９５、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １，  ５６９−５７９，  １９９６）が基本的に同様の技術を用いて報告されてきた。
【０００５】
狂犬病ウイルスを宿主細胞に感染させた場合に、その感染サイクルの開始のためには、完全長ポジティブセンス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡは、転写後すぐに導入細胞においてキャプシドに包まれる（ｅｎｃａｐｉｄａｔｅｄ）必要がある。従って、該機能を得るために、従来法においては、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ及びＰタンパク質）及びヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質（ヘルパープラスミドとして公知である）をコードするプラスミドを同時に導入することが行われ、結果としてリボヌクレオキャプシドを活性化するという方法が行われた。今まで、完全長アンチゲノムＲＮＡ及び上記３つのウイルスｍＲＮＡの一次転写はＴ７ＲＮＡポリメラーゼの制御下で行われた。３つのグアニジン残基は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに最適の開始配列を形成し、アンチゲノムＲＮＡ転写物の５´末端に付加された。
【０００６】
更に、生産的感染サイクルを開始するためには、一次ウイルスアンチゲノムＲＮＡ転写物の３´末端側の正確な切断が必要とされる。該切断は下記のデルタ肝炎型リボザイム（ＨｄｖＲｚ）転写物の自己切断（ａｕｔｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）によって達成される。従来の方法では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを供給するために、組換えワクシニアウイルス、ｖＴＦ７−３（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３，  ８１２２−８１２６，  １９８６）の感染か、又は恒常的にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞株であるＢＳＲ−Ｔ７／５（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３，  ２５１−２５９，  １９９９）を用いることが必要であった。
【０００７】
このように、従来報告されている狂犬病ウイルスｃＤＮＡの発現系のような、非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡ発現系は、トランスフェクトしたプラスミドをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより転写を行い、（＋）鎖の完全長ゲノムＲＮＡ及びＮ，Ｐ，Ｌ  ｍＲＮＡを同時に発現させることでウイルスの複製を可能にし、組換えウイルスを得るというものであった。従って、該ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡ発現系は、その複製には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する特定の細胞種を用いるか、或いは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスを同時に感染させるか、という制約があった。
【０００８】
一方で、細胞内ポリメラーゼＩ及びＩＩを利用するリバースジェネティクス技術が、分節マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばインフルエンザＡウイルスのために開発された（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６，  ９３４５−９３５０，  １９９９、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３，  ９６７９−９６８２，  １９９９、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７，  ６１０８−６１１３，  ２０００）。該システムは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用せず、インフルエンザリバースジェネティクスを顕著に改良し、構築された。ごく最近になって、ウイルスミニゲノムＲＮＡの正確な末端を作製するために、斬新なｃＤＮＡプラスミドがＭｅｒｃｉｅｒらによって開発された（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６，  ２０２４−２０２７，  ２００２）。該プラスミドはハンマーヘッド型リボザイム（ＨａｍＲｚ）とＨｄｖＲｚ  ｃＤＮＡの間に挟まれるマイナス鎖ミニゲノムｃＤＮＡからなる。
上記のように、ウイルスの両末端の余分なヌクレオチドを切断する技術が開発された。
【０００９】
【特許文献１】
特表平８−５０１４５３号公報
【特許文献２】
特開平１０−４９７９号公報
【非特許文献１】
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３，  ２２２，  １９９５
【非特許文献２】
Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １，  ５１，  １９９４
【非特許文献３】
ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３，  ４１９５−４２０３，  １９９４
【非特許文献４】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３，  ８１２２−８１２６，  １９８６
【非特許文献５】
Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３，  ２５１−２５９，  １９９９
【非特許文献６】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７，  ６１０８−６１１３，  ２０００
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、各種の細胞株において転写活性を有し、効率よくウイルスを産生することが可能な狂犬病ウイルスのような非分節（−）鎖ＲＮＡウイルス発現ベクター、及びその利用を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、狂犬病ウイルスｃＤＮＡのような非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡ発現ベクターの利用に際して、従来のように、その転写複製に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する特定の細胞種を用いなければならないとか、或いは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスを同時に感染させなければならないとかという制約がない発現ベクター、即ち、各種の細胞株において転写活性を有し、複製が可能な発現ベクターの開発について、鋭意研究を行った結果、非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡの両端にリボザイムの配列を配置することによって、従来のような特定の細胞種の使用の限定や、或いは、特定のウイルスの同時感染が必要という制約がなく、細胞内ＲＮＡポリメラーゼＩＩを有する細胞であれば転写が可能であり、したがって、各種の細胞株においてウイルスの複製を行うことができる発現ベクターの構築が可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、具体的には本発明においては、ウイルス完全長ゲノムＲＮＡ転写物の本来の５´及び３´末端を作製するために、非病原性狂犬病ウイルスである、ＨａｍＲｚとＨｄｖＲｚ配列を両端にもつＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株より完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドを構築し、該構築物をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターの下流に配置することによって、該プラスミドの転写が細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩのコントロール下で行われることを見い出し、本発明をなした。本発明の発現ベクターはＴ７ＲＮＡポリメラーゼの補充を必要とせず、かつ、基本的に、ｃＤＮＡプラスミドから組換えウイルスを産生するために組換えワクシニアウイルスに感染せずともすべての細胞株に適用でき、各種の細胞株において狂犬病ウイルスの転写を可能とた。その結果、ウイルスの回収が改善され、効率よくウイルスを産生することを可能とした。
【００１３】
上記のように、本発明の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターには、プロモーターとして、サイトメガロウイルスプロモーターが用いられる。リボザイムとしては、改変ハンマーヘッド型リボザイム及び／又は肝炎デルタウイルス型リボザイムを用いることができる。本発明の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターは、この発現ベクターに外来遺伝子を組み込んで用いることにより、外来遺伝子の標的細胞での発現を行うベクターとして用いることができる。また、該外来遺伝子として薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組込むことにより、医薬のデリバリー用の組成物として利用することができる。
【００１４】
具体的には本発明は、非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡにリボザイムの配列を配置したことを特徴とする細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター（請求項１）や、非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡが、狂犬病ウイルスｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター（請求項２）や、狂犬病ウイルスｃＤＮＡが、狂犬病ウイルス  ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株であることを特徴とする請求項２記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター（請求項３）や、非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡの完全長ゲノムｃＤＮＡの両端にリボザイム配列を配置したことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター（請求項４）や、リボザイムが、改変ハンマーヘッド型リボザイム及び／又は肝炎デルタウイルス型リボザイムであることを特徴とする請求項４記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター（請求項５）や、細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性が、細胞内ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写活性であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター（請求項６）や、サイトメガロウイルスプロモーターの下流に、非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡにリボザイムの配列を配置した配列を結合したことを特徴とする細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター（請求項７）や、非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡにリボザイムの配列を配置した配列が、請求項２〜６のいずれか記載の狂犬病ウイルスｃＤＮＡにリボザイムの配列を配置した配列であることを特徴とする請求項７記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター（請求項８）や、請求項１〜８記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターに外来遺伝子を組み込んだことを特徴とする細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有する外来遺伝子組換えウイルス発現ベクター（請求項９）からなる。
【００１５】
また本発明は、請求項１〜９記載の細胞内ＲＮＡポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターを、真核宿主細胞中に導入し、該真核宿主細胞中で発現させ、該真核宿主細胞中から回収することを特徴とする組換え非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスの回収方法（請求項１０）や、組換え非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスが、狂犬病ウイルスＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株であることを特徴とする請求項１０記載の組換え非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスの回収方法（請求項１１）や、真核宿主細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項１０又は１１記載の非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスの回収方法（請求項１２）からなる。
【００１６】
さらに本発明は、請求項９記載の外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターを、標的細胞と接触させ、標的細胞中に導入することを特徴とするにより外来遺伝子の標的細胞での発現方法（請求項１３）や、外来遺伝子が、ワクチン抗原、インターロイキン、酵素、又は生理活性を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１３記載の外来遺伝子の標的細胞での発現方法（請求項１４）や、外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ請求項９記載の外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターと医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバント及び／又は賦形剤からなる医薬デリバリー用組成物（請求項１５）からなる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、狂犬病ウイルスｃＤＮＡのような非分節（−）鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡの両端にリボザイムの配列を配置することにより、細胞内ＲＮＡポリメラーゼの転写活性を有するウイルス発現ベクターを構築することよりなる。狂犬病ウイルスの場合を例にとって、本発明のウイルス発現ベクターの構築について説明する。
まず、本発明のウイルス発現ベクターの構築に用いる狂犬病ウイルス株としては、ワクチン株として開発されたＳＡＤ  Ｂ１９株やＲＣ−ＨＬ株のような非病原性のウイルス株を用いることができる。しかし、日本においてヒト用ワクチン株として用いられているＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株が特に好ましい。発現ベクターの構築には、狂犬病ウイルス  ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株より、完全長ゲノムｃＤＮＡを作製し、この完全長ゲノムｃＤＮＡの両端に、リボザイムの配列を配置する。該リボザイムとしては、改変ハンマーヘッド型リボザイム及び／又は肝炎デルタウイルス型リボザイムを挙げることができる。
【００１８】
該完全長ゲノムｃＤＮＡとリボザイムの配列からなる構築物を、サイトメガロウイルスプロモーターの下流に、挿入した。このようにして構築した狂犬病ウイルス発現ベクターは、細胞内ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）により転写される。したがって、この狂犬病ウイルス発現ベクターを、ＢＨＫ細胞やＮＡ細胞等の各種哺乳類細胞等に、例えば、リン酸カルシウム法や、ポリアミン法のような方法によりトランスフェクトすることにより、組換えウイルスを複製し、回収することができる。
本発明の発現ベクターに外来遺伝子を組み込んで、ウイルス発現ベクターとして用いることができる。該外来遺伝子としては、ワクチン抗原、インターロイキン、酵素、又は生理活性を有するペプチドをコードする遺伝子等、有用なタンパク質をコードする適宜の遺伝子を挙げることができる。
【００１９】
また、本発明のウイルス発現ベクターは、外来遺伝子の標的細胞での発現に用いることができる。本発明のウイルス発現ベクターに外来遺伝子を組み込んで、標的細胞と接触させ、標的細胞中に導入することにより、外来遺伝子を標的細胞で発現することができる。したがって、本発明のウイルス発現ベクターは、外来遺伝子として薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んで、薬理活性を有するペプチド（医薬）のデリバリーシステムとして用いることができる。そのようなデリバリーシステム用の組成物としては、外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ、外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターと医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバント及び／又は賦形剤等を適宜配合して、医薬デリバリー用組成物として用いることができる。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［材料と方法］
（ウイルス及び細胞）
狂犬病ウイルスの非病原性ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株を用いて完全長ｃＤＮＡ及び各ウイルス遺伝子、Ｎ、Ｐ、Ｇ、及びＬ  ｃＤＮＡｓをｃＤＮＡクローニングした（全塩基配列を配列表の配列番号１に示す。配列表の全塩基配列１１６１５中、Ｎ遺伝子は７１〜１４２３の塩基配列で、Ｐ遺伝子は１５１４〜２４０７の塩基配列で、Ｍ遺伝子は２４９６〜３１０４の塩基配列で、Ｇ遺伝子は３３１８〜４８９２の塩基配列で、Ｌ遺伝子は５１０１〜１１４８４の塩基配列で表示される。また、Ｆ１領域は１〜２３６５の塩基配列で、Ｆ２領域は２３５９〜４９４４の塩基配列で、Ｆ３領域は４９９５〜１０１４６の塩基配列で、Ｆ４領域は１０１４１〜１１６１５の塩基配列で示される。）
Ａ／Ｊマウス由来の神経芽腫ＮＡ細胞及びサルＶｅｒｏ細胞を、熱変性した１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）中で３７℃で培養した。ＢＨＫ−２１細胞、ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞（ＢＨＫ−２１由来の細胞株であり、恒常的にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３，  ２５１−２５９，  １９９９）。）、及びヒト胎児腎細胞２９３Ｔ（複製可能なサルウイルス４０ラージＴ抗原を産生する（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７，  ３７９−３８７，  １９８７）。）を、１０％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中で３７℃で培養した。
【００２１】
（プラスミドの作製）
（１）ｃＤＮＡの作製
ｃＤＮＡを得るために、プロトコールに従いＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ  ｇｅｎｅ社製、Ｊａｐａｎ）を使用して、狂犬病ウイルスＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株に感染したＮＡ細胞から全ＲＮＡを抽出した。逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）反応を、下記のとおり、トリ骨髄芽球症ウイルス（ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ）ＲＴａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製、Ｊａｐａｎ）、及びオリゴｄＴ又は狂犬病ウイルス特異的プライマーを用いて、４２℃で１時間行なった。下記の表１に示した、Ｎ、Ｐ、Ｌ、及びＧ用のプライマーセットと、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製、Ｊａｐａｎ）を用いてＰＣＲにより逆転写産物を増幅した。
【００２２】
【表１】
2004187533.tif 000002
【００２３】
（２）完全長ｃＤＮＡの作製
長いｃＤＮＡ（ｌｏｎｇｅｒ  ｃＤＮＡ）（Ｌ遺伝子及び完全長ｃＤＮＡ）を得るために、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴａｓｅ及びｅＬＯＮＧａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅は、目的増幅産物１キロベースあたり、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び６８℃で６０秒間の合成というサイクルで３０サイクル行なった。ウイルスＮ、Ｐ、Ｌ、及びＧタンパク質を産生するヘルパープラスミドを作製するために、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイトにＰＣＲ産物を挿入し、それぞれｐＨ−Ｎ、ｐＨ−Ｐ、ｐＨ−Ｌ、及びｐＨ−Ｇを作製した。これらの遺伝子をその後ＣＭＶプロモーター及びＴ７プロモーターの制御下で発現させた。
【００２４】
また、既に、ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株の５つのウイルス遺伝子全て（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、及びＬ）のヌクレオチド配列が報告されている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４１，  ２２９−２４０，  １９９７、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４２，  ７６１−７７１，  １９９８、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４３，  ２５９−２７０，  １９９９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７３，  ４６５−４７７，  １９８９、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４２，  ４８５−４９６，  １９９８）。完全長ｃＤＮＡを合成するために、制限酵素認識部位を利用して、最初に以下の４つのｃＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３及びＦ４）を作製した（図１）。なお、Ｆ１：ＨＳＴ７−５プライマーで増幅されるＬｅａｄｅｒ−ＢｌｐＩ断片、Ｆ２：Ｈ−Ｂｌｐ５プライマーで増幅されるＢｌｐ  Ｉ−Ｘｍａ  Ｉ断片、Ｆ３：Ｈ−Ｂｓｒ５プライマーで増幅されるＢｓｒ  Ｉ−Ｎａｒ  Ｉ断片、及びＦ４：Ｈ−Ｋａｓａｆｘ５プライマーで増幅されるＮａｒ  Ｉ−Ｔｒａｉｌｅｒ断片を表し、作製に用いたプライマーを表２に示した。
【００２５】
【表２】
2004187533.tif 000003
【００２６】
次に、付加ＧＧＧ配列を持つＴ７プロモーター、５’−  ｇｃｇｃｇｃＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ  −３’（ＢｓｓＨ  ＩＩ部位を小文字で示す。配列番号１８）をＦ１  ｃＤＮＡ産物のリーダー領域の前に挿入した。ＨｄｖＲｚ  ｃＤＮＡの配列、５’−  ＧＧＧＴＣＧＧＣＡＴＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣＧＧＴＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＣＡＣＧＴＣＣＡＣＴＣＧＧＡＴＧＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＧＧＣＧｇｇｔａｃｃ  −３’（Ｋｐｎ  Ｉ部位を小文字で示す。Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６１，  ６４１−６７１，１９９２、配列番号１９）をＦ４  ｃＤＮＡ産物のトレーラー領域の後ろに加えた。Ｆ２とＦ３断片間に、本来の偽遺伝子の代わりにウイルス転写性単位及び特異制限酵素部位を含む合成オリゴヌクレオチド配列を、ＸＢＰＮＡ５；５’−  ＣＣＧＧＧＧａａａａａａａＣＴａａｃａＣＣＴＣＴｃｇｔａｃｇＡＴＴｃｔｇｃａｇＴＴＴｇｃｔａｇｃＡＧＧＡＣＣＧ  −３’（ポリ（Ａ）シグナル、転写開始シグナル、ＢｓｉＷ  Ｉ部位、Ｐｓｔ  Ｉ部位、Ｎｈｅ  Ｉ部位の順に小文字で示した。配列番号２０）、及び相補的ＸＢＰＮＡ３；３’−  ＣＣｔｔｔｔｔｔｔＧＡｔｔｇｔＧＧＡＧＡｇｃａｔｇｃＴＡＡｇａｃｇｔｃＡＡＡｃｇａｔｃｇＴＣＣＴＧＧＣＣＡＴＧ  −５’（ポリ（Ａ）シグナル、転写開始シグナル、ＢｓｉＷ  Ｉ部位、Ｐｓｔ  Ｉ部位、Ｎｈｅ  Ｉ部位の順に小文字で示した。配列番号２１）の二本鎖オリゴヌクレオチドとして挿入した。最後に、ＢｓｓＨ  ＩＩ−Ｋｐｎ  Ｉ完全長ｃＤＮＡ断片の１１７３５塩基をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のマルチクローニング部位に挿入し、ｐＨＥＰ−１．０を得た。
【００２７】
完全長プラスミドｐＨＥＰ−１．０においてウイルスリーダー配列に続くＴ７プロモーターと付加ＧＧＧ配列の代わりに、ＣＭＶプロモーターＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）プラスミドの６７０塩基Ｍｌｕ  Ｉ−Ｎｈｅ  Ｉ断片）及びＨａｍＲｂｚ配列ｃＤＮＡ、５’−  ＴＧＴＴＡＡＧＣＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＡＧＴＣａｃｇｃｔｔａａｃａ−３’（ウイルスリーダー配列を小文字で示す。Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４７，  ７４１−７５３，１９９７、配列番号２２）を完全長ｃＤＮＡプラスミドに挿入した（ｐＨＥＰ−２．０を得た）。ｐＨＥＰ−２．０の基幹プラスミドをｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）プラスミドに取り替え、ｐＨＥＰ−３．０を得た。得られた全てのｃＤＮＡに変異が起こっていないかを調べるために配列決定を行った。本研究において構築した組換え型ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株の完全長ｃＤＮＡの配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録した（アクセッションナンバー：ＡＢ０８５８２８、配列番号１）。
【００２８】
（狂犬病ウイルスの産生）
１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ又はＭＥＭ中の６ウェルプレートにおいてＢＳＲ−Ｔ７／５細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＮＡ細胞、２９３Ｔ細胞、及びＶｅｒｏ細胞を一晩培養して８０％の濃度（１ウェルあたり４〜６×１０５）とした。導入前に、古い培地を新鮮な培地に交換した。製造者の手順に従い、完全長プラスミド２．０μｇ、ｐＨ−Ｎ  ０．５μｇ、ｐＨ−Ｐ  ０．２５μｇ、ｐＨ−Ｌ  ０．１μｇ、及びｐＨ−Ｇ  ０．１５μｇを、ＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ−１（Ｐａｎｖｅｒａ社製、Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を用いて細胞に導入した。ｐＨ−Ｇプラスミド（ウイルス糖タンパク質を挿入した）の導入は回収されたウイルスの産生に不可欠ではないが、Ｇタンパク質を供給することにより時にウイルスの産生量を改善する（Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．  ６，  ３７３−３８１，  ２０００）。１６時間から２４時間後に、細胞を一度洗浄した後、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ又はＭＥＭでさらに２〜５日培養を続けた。培養培地をＮＡ細胞に加え、３４℃で３日間インキュベーションした。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識狂犬病ウイルスＮタンパク質特異的抗体（Ｃｅｎｔｃｏｒ  Ｉｎｃ．社製、Ｍａｌｖｅｒｎ，  ＰＡ）を使用して免疫蛍光検査アッセイにより、ＮＡ細胞に回収されたウイルスが存在するかを調べた。回収されたウイルスはその後さらなる実験用ウイルスストックとするため、ＮＡ細胞に感染させ、増幅させた。完全長プラスミドｐＨＥＰ−１．０及びｐＨＥＰ−３．０から産生された回収されたウイルスはそれぞれｒＨＥＰ−１．０とｒＨＥＰ−３．０と表した。
【００２９】
（ウイルスの検定）
ウイルスの力価を決定するため、９６ウェルプレート中で、ＮＡ細胞の単層を文献記載の方法（Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｔａｎｄ．  ５７，  １９９−２１１，  １９８４）に従いウイルス懸濁液の１０倍に段階希釈したウイルス懸濁液で感染させ３４℃でインキュベートした。感染後４８時間で、細胞を８０％のアセトンで固定し、ＦＩＴＣ標識した狂犬病ウイルスＮタンパク質特異的抗体で染色した。感染巣（ｆｏｃｉ）を蛍光顕微鏡下で数え、１ｍＬあたりの感染形成ユニット（ｆｆｕ／ｍｌ）として計算した。検定は全て３回行ない、平均値をウイルス力価として用いた。
【００３０】
［発現ベクターの構築及び各種細胞株での転写・複製］
（ウイルスベクターとしての完全長ｃＤＮＡプラスミドの構築）
狂犬病ウイルスＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ（Ｋｙｏｔｏ）株のＮ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、及びＬの５つのウイルス遺伝子すべてのヌクレオチド配列はすでに文献に記載されている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４１，  ２２９−２４０，  １９９７、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４２，  ７６１−７７１，  １９９８、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４３，  ２５９−２７０，  １９９９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７３，  ４６５−４７７，  １９８９、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４２，  ４８５−４９６，  １９９８）。本研究においては、ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ（Ｔｏｋｙｏ）株をｃＤＮＡクローニング用に使用した。これら２つの株は同じ起源に由来するが、３０年以上別々に継代し維持されてきた。ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ（Ｋｙｏｔｏ）株と比較すると、ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ（Ｔｏｋｙｏ）株のｃＤＮＡ配列においては、コード領域で、変異アミノ酸（ａｌｔｅｒｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）となる数個の変異がサイレント変異と同様に示された（表３）。このｃＤＮＡ配列の差異はゲノム配列自体又はｃＤＮＡのクローニング工程により引き起こされた。
【００３１】
【表３】
2004187533.tif 000004
【００３２】
まず最初に、本発明者らは、最初に構築したプラスミドを使用して回収実験を行ったが、該プラスミドからは回収したウイルスを回収することはできなかった。ヘルパープラスミドｃＤＮＡｓと完全長プラスミドｃＤＮＡ間の異なるアミノ酸をＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ（Ｋｙｏｔｏ）株の該当アミノ酸に置換した。アミノ酸を置換することによりこれらｃＤＮＡプラスミドから狂犬病ウイルスを回収することが可能となった。以上の結果からＰタンパク質の８１及び８２番目のアミノ酸、及びＬタンパク質の１７１、６６８、及び１４７８番目ののアミノ酸は、正常なタンパク質の折りたたみと共にウイルスポリメラーゼの機能及び／又は複製に不可欠であることを示す。３つのアミノ酸（Ｐタンパク質の１７４番目、Ｇタンパク質の１４番目、Ｌタンパク質の２１２７番目のアミノ酸）のみが２つの実験株の間で異なった。
【００３３】
完全長ｃＤＮＡの合成過程で、Ｔ７又はＣＭＶプロモーター配列及びリボザイム配列を加えた（材料と方法の図１を参照のこと）。狂犬病ウイルスゲノムはＧとＬ遺伝子の間に４００塩基長の非翻訳偽遺伝子（ｕｎｔｒａｎｌａｔｅｄ  ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ）を持つ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３，  ３９１４−３９１８，  １９８６）。偽遺伝子配列は細胞培養においてウイルスの蔓延、病原性、または伝播には関与せず（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３，  ４１９５−４２０３，  １９９４、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．  ４，  １１５−１１９，  １９９８）、従ってウイルスベクターとして感染性組換えウイルスゲノムを操作するのに適した領域である。偽遺伝子はＳｃｈｎｅｌｌら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０，  ２３１８−２３２３，  １９９６）の考えに基づき合成のオリゴヌクレオチド断片と置換された。該合成オリゴヌクレオチド断片においては、外来遺伝子の挿入をする目的で、転写開始シグナルとポリＡシグナル、及び特異的制限酵素部位を設けた。従来の方法（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３，  ４１９５−４２０３，  １９９４）と同様に、ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞中のｐＨＥＰ−１．０プラスミドにおけるアンチゲノムＲＮＡの初期転写はＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって引き起こされ、アンチゲノムＲＮＡの５´末端に付加的なＧＧＧヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
一方、ｐＨＥＰ−３．０プラスミドにおけるアンチゲノムＲＮＡの初期転写は細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって引き起こされる。ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞において、ウイルスリーダー領域に先行するハンマーヘッドリボザイムが最初に転写され、ウイルスＲＮＡは正確な５´末端となる。ウイルストレーラー領域に続くデルタ肝炎ウイルスリボザイムは抗ゲノムウイルスＲＮＡの正確な３´末端を合成する。該プラスミドから産生された組換えウイルスゲノム構造物は、アンチゲノム５´末端の３連Ｇ（グアニン）ヌクレオチドの付加を除いて、同一である。
【００３５】
（各種細胞株における狂犬病ウイルスの複製・回収）
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを供給するため、恒常的にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＳＲ−Ｔ７／５細胞株を使用した。複製された狂犬病ウイルスはＢＳＲ−Ｔ７／５細胞株においてのみ、プラスミドから回収された。ｐＨＥＰ−３．０で感染されると、ウイルス完全長ＲＮＡは細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩの制御下で転写される。ヘルパープラスミドは、ＣＭＶプロモーターとＴ７プロモーターの制御下でＮ、Ｐ、Ｌ、及びＧタンパク質を発現する。ウイルスＲＮＡの正しい５´末端及び３´末端は、その近接するリボザイムによってもたらされる自己分解的開裂（ａｕｔｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）により産生される。このメカニズムは、理論的にはどの細胞株でも起こる。従って、ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞と同様にＢＨＫ−２１細胞、ＮＡ細胞、及び２９３Ｔ細胞におけるｐＨＥＰ−３．０からウイルスを回収した（表４）。興味深いことに、Ｖｅｒｏ細胞がｐＨＥＰ−３．０に感染したとき、組み換えウイルスは検出されなかった。
【００３６】
【表４】
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【００３７】
回収されたウイルスがｃＤＮＡプラスミドに由来することを確認するために、回収されたウイルスに感染した細胞からのＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより解析した。本来の野生型ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株、及び回収されたウイルスからのＰＴ−ＰＣＲ産物の偽遺伝子領域（ＧとＬ遺伝子間）をアガロースゲル電気泳動法により調べた（図２）。本来のＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株から１６９６塩基長のＲＴ−ＰＣＲ産物を産生する偽遺伝子を取り除き、付加的な転写単位（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｕｎｉｔ）及び制限酵素部位と置換したところ、回収されたウイルスから１３８７塩基長の産物が産生された（図２Ｂ）。組換えウイルスｒＨＥＰ−１．０及びｒＨＥＰ−３．０のＲＴ−ＰＣＲ産物はＰｓｔ  Ｉ消化後に２個の断片ができたが、野生型ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株からのＲＴ−ＰＣＲ産物は影響を受けなかった（図２Ｃ）。増幅された断片の配列解析により、実際に回収したウイルスがｃＤＮＡプラスミドに由来することが確認された。
ｐＨＥＰ−１．０及びｐＨＥＰ−３．０からのウイルス回収効率を比較するため、本発明者らは増幅過程を経ずにＢＳＲ−Ｔ７／５細胞、ＢＨＫ−２１細胞、及びＮＡ細胞においてしたウイルス量を測定した（表５）。
【００３８】
【表５】
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【００３９】
ｐＨＥＰ−１．０からのウイルスの回収は、ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞にトランスフェクトしたもののみウイルスが回収され、感染した細胞のすべてのウェルからは回収されず、低効率であった。ＮＡ細胞でのウイルスの増幅が、高濃度の回収ウイルスを得るのに必要であることが明らかになった。一方、ｐＨＥＰ−３．０を導入すると、ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞、ＢＨＫ−２１細胞、及びＮＡ細胞株のすべてにおいてウイルスを産生した。  ほとんどすべてのウェルにおいて、高濃度の回収ウイルスが増幅過程を必要とせずに得られた（表５）。ウイルス回収のための導入条件を最適化するため、本発明者らはヘルパープラスミドと完全長プラスミドを異なった量と比率で各細胞株に導入した。
【００４０】
本発明者らは最適の導入状態が２．０μｇの完全長プラスミド、０．５μｇのｐＨ−Ｎ、０．２５μｇのｐＨ−Ｐ、０．１μｇのｐＨ−Ｌ、及び０．１５μｇのｐＨ−Ｇであるという結論に達した。しかしながら、ウイルスの力価は最適のトランスフエクション条件下でも１×１０２から２×１０７ｆｆｕ／ｍｌの間で異なり、回収効率は多くの因子によって影響されることを示した。例えば、導入するプラスミドの量を２倍量変化させても回収効率を低減させることない。２つの要因によって変えることができる。導入したＮＡ細胞５×１０５から最大で４×１０７ｆｆｕが回収された。以上の結果は、従来のＴ７ポリメラーゼによるシステムと比べて、本新規ＣＭＶプロモーターシステムが狂犬病ウイルスを効率よく回収できることを示す。
【００４１】
［実施例の結果］
本発明は、狂犬病ウイルスをｃＤＮＡプラスミドから作製する方法に関するものであり、ＳＡＤ−Ｂ１９株（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３，  ４１９５−４２０３，  １９９４）及びＲＣ−ＨＬ株（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５，  ９１２１−９１２８，  ２００１）に続く。本発明者は、２つの異なる完全長構築プラスミド、すなわちｐＨＥＰ−１．０及びｐＨＥＰ−３を使用してｃＤＮＡプラスミドから狂犬病ウイルスＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株を回収することについて述べてきた。ｐＨＥＰ−１．０は従来の方法と同様にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを利用する。新規リバースジェネティクスシステム（ｐＨＥＰ−３．０）は、細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩを利用し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを必要とせず、原則としてどの細胞株においても、ｃＤＮＡプラスミドからウイルスを産生することができる。この新規システムにより、ウイルスの回収効率が著しく高められると共に、組み換えウイルスの作製がはるかに容易となった。
【００４２】
それでもやはり、ウイルス回収効率は使用した細胞株により異なった。回収効率は導入細胞における多くの因子に依存する。つまりｃＤＮＡプラスミド導入効率、ＣＭＶプロモーター活性、リボザイムの開裂活性、ウイルスｍＲＮＡとゲノムＲＮＡの転写及び複製の比率と割合、ウイルスタンパク質の翻訳、ウイルスタンパク質の産生及びウイルス粒子の増殖等の因子である。本研究において他の細胞株がウイルス粒子を産生した条件下でもＶｅｒｏ細胞においては組み換えウイルスの産生が検出されなかった。ｃＤＮＡのＶｅｒｏ細胞への導入は、明らかに低効率であった。実際には、Ｖｅｒｏ細胞培養液における、Ｎタンパク質発現量は他の細胞株における発現量の１０分の１以下であった。従って、本研究で決定した最適の導入条件は、Ｖｅｒｏ細胞に適さないように思われる。ヘルパープラスミドに対する完全長プラスミド比率の最適化と同様に、Ｎ、Ｐ、及びＬタンパク質を挿入したヘルパープラスミドの比率と量の最適化が個々の細胞株に必要であることが示唆された。回収するウイルスの産生量は同じ導入条件で同じ細胞株からでさえ異なっており（表５）、導入細胞の生理的条件がまた、ウイルス産出率において非常に重要な要素であることを示す。
【００４３】
成体マウスに対する固定毒株狂犬病ウイルス株の病原性は、糖タンパク質の３３３位にあるアルギニン又はリジンにより決まることが報告されている（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０，  ７０−７４，  １９８３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７２，  ２０６−２１２，  １９８９）。リバースジェネティクスの技法を用いて又はモノクロナール抗体を用いた変異体（ｅｓｃａｐｅ  ｍｕｔａｎｔ）の作製によって、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ又はＧｌｕとワクチン株中のＡｒｇを置き換えることで、病原性を減少することがわかっている（Ｖａｃｃｉｎｅ  １９，  ３５４３−３５５１，  ２００１、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １，  ３１７−３２０，  １９９３）。この部位のアミノ酸置換はウイルスの病原性に影響を与えるが、その減弱の程度は個々の固定毒株において異なる。
【００４４】
ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株は非常に弱毒化している株であり、成体マウスに脳内接種をしてもマウスは死なない。ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株はもともとＧタンパク質の３３３位アミノ酸がグルタミンである、自然に選択された唯一の非病原性株である。この３３３位のグルタミンをアルギニンに置換することにより、ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙの病原性がどれほど回復するかという疑問は未だ解決されていない。ワクチン株であるＲＣ−ＨＬとその親株である西ヶ原株間での病原性の違いはＧタンパク質の３３３位のアミノ酸によるものではないことがわかっている（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５，  ９１２１−９１２８，  ２００１）。従って、他の部位がＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株の病原性の減弱の原因である可能性を除去できない。本研究で開発した非病原性ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株を使用するシステムにより、分子レベルでの狂犬病ウイルスの病原性の更なる解析が可能である。本新規システムより、実験の特定目的に応じて適当な細胞株の選択が可能である。又、本新規システムは他のモノネガウイルスにも適用できるシステムである。
【００４５】
［図面の説明］
図１：本発明の実施例において、狂犬病ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株、ｐＨＥＰ−１．０及びｐＨＥＰ−３．０の完全長ｃＤＮＡプラスミドの模式図を示す図である。なお、図中の記号は、完全長ｃＤＮＡ構築のために用いたＲＴ−ＰＣＲ産物（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、及びＦ４）及び制限酵素部位（ＢｓｓＨ  ＩＩ、Ｂｌｐ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、ＢｓｒＧ  Ｉ、Ｎａｒ  Ｉ、及びＫｐｎ  Ｉ）を示す（比率は一定でない）。また、Ｔ７：Ｔ７プロモーター、ＣＭＶ：ＣＭＶプロモーター、Ｒｂｚ：ハンマーヘッド型リボザイム又はデルタ肝炎型リボザイム配列ｃＤＮＡ、ＢＰＮ（制限酵素部位を含むウイルス転写単位付加部位）：ＢｓｉＷ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、及びＮｈｅ  Ｉ部位をそれぞれ示す。完全長ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ又はｐＣＤＮＡ３．１／Ｚｅｏのマルチクローニングサイトに挿入した。
【００４６】
図２：本発明の実施例において、産生されたウイルスｒＨＥＰ−１．０及びｒＨＥＰ−３．０がｃＤＮＡプラスミド由来であることを示す図である。なお、図中のＡは、野生型ＨＥＰ−ｆｌｕｒｙ（ｗＨＥＰ）株及び産生された組換えウイルス（ｒＨＥＰ−１．０及びｒＨＥＰ−３．０）のＧとＬ遺伝子間のＲＴ−ＰＣＲの模式図。ｗＨＥＰのΨ領域（Ｇ遺伝子の終止コドンの後からポリＡシグナルまでの位置、４６４ｂｐ）は材料と方法で記載したようにウイルス転写単位付加部位及び制限酵素部位（１５５ｂｐ）に置換した。ウイルスに感染したＮＡ細胞から全ＲＮＡを抽出し、プライマーＣ５−ｂ２（Ｇ遺伝子の５’−  ＧＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡ  −３’：配列番号２３）及びＨＬ６０３−３（Ｌ遺伝子の３’−  ＡＧＡＴＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＴ  −５’：配列番号２４）を用いて、ゲノム狂犬病ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅した。また図中のＢは、ｗＨＥＰ、ｒＨＥＰ−１．０及びｒＨＥＰ−３．０のＲＴ−ＰＣＲ産物（それぞれ１６９６、１３８７、及び１３８７塩基長）を１％アガロースゲルで電気泳動した結果を示す図である。さらに図中のＣは、Ｂで示したｃＤＮＡ断片を制限酵素Ｐｓｔ  Ｉで切断し、Ｂと同様に１％アガロースゲルで電気泳動した結果を示す図である。なお、Ｍ：分子サイズマーカー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｚｅｍａｒｋｅｒ）、Ｗ：ｗＨＥＰ、１：ｒＨＥＰ−１．０、２：ｒＨＥＰ−３．０をそれぞれ表す。
【００４７】
【発明の効果】
本発明で構築したウイルス発現ベクターは、細胞内ＲＮＡ転写活性を有し、その細胞内での発現・複製にあたって、従来の狂犬病ウイルスベクターのように、Ｔ７ＲＮＡフアージプロモーターを持った細胞種に限定されるとか、又は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスの感染を同時に行うことを必要とするとかの、制約を解消することができた。したがって、本発明のウイルス発現ベクターは、ＮＡ細胞やＢＨＫ細胞等の各種の哺乳類細胞から、ウイルスの複製、回収が可能となった。即ち、従来法と同じＴ７プロモーターを利用するプラスミドｐＨＥＰ−１．０を用いた場合、ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞からのみウイルスの複製・回収がおこる。本発明のプラスミドｐＨＥＰ−３．０を用いた場合、ＢＳＲ−Ｔ７／５細胞だけでなく、ＢＨＫ−２１、ＮＡ、２９３Ｔ細胞でも複製・回収が可能となる。そして、その効率を調べてみると、従来法においてはウイルスの回収を確認するためにはもう一回ウイルスの増幅が必要であるが、本方法においてはその様な増幅はほとんど必要ではなく、プラスミドをトランスフェクトした細胞の上清に多量のウイルスが産生していることが確認された。
【００４８】
本発明のリボザイムの配列及びＣＭＶプロモーターによる転写系を利用した狂犬病ウイルスの新規ｃＤＮＡウイルス発現系は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを利用する従来法より簡便かつ高効率な組換えウイルスの回収が可能となり、又ワクチニアウイルスを感染させることなくＮＡ細胞、ＢＨＫ細胞など各種哺乳類細胞からウイルス回収が可能となった。本発明のベクターを用いることで二次感染欠損ウイルス、複製欠損ウイルスの作製及び有用なワクチン・ベクターの開発、更には、狂犬病ウイルスの分子病理の解析がより容易に行えることとなった。
本発明のウイルス発現ベクターは、外来遺伝子を組込んで、該外来遺伝子を標的細胞へ送達（デリバリー）することが可能であり、また、外来遺伝子として薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組込んで、医薬デリバリー用の組成物として用いることができる。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において、狂犬病ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株、ｐＨＥＰ−１．０及びｐＨＥＰ−３．０の完全長ｃＤＮＡプラスミドの模式図を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、産生されたウイルスｒＨＥＰ−１．０及びｒＨＥＰ−３．０の確認したことを示す図である。なお、図中のＡは、野生型ＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ（ｗＨＥＰ）株及び産生された組み換えウイルス（ｒＨＥＰ−１．０及びｒＨＥＰ−３．０）のＧとＬ遺伝子間のＲＴ−ＰＣＲ模式図。また図中のＢは、ｗＨＥＰ、ｒＨＥＰ−１．０及びｒＨＥＰ−３．０のＲＴ−ＰＣＲ産物（それぞれ１６９６、１３８７、及び１３８７塩基長）を１％アガロースゲルで電気泳動した結果を示す図である。さらに図中のＣは、Ｂで示したｃＤＮＡ断片を制限酵素Ｐｓｔ  Ｉで切断し、Ｂと同様に１％アガロースゲルで電気泳動した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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