(57)【要約】【課題】目詰りが少なく、多量の試料液量を注入することのできるＬＣ用カラムを提供する【解決手段】充填剤５２を内部に充填した円筒状カラム主体５０と、前記カラム主体の両端に取りつけたエンドフィッティングとからなる液体クロマトグラフ用カラムのエンドフィッティングがその内部の溶離液流路に多孔性フィルタ５６を介装すると共に前記多孔性フィルタの細孔５８内に充填粒子６０を充填した液体クロマトグラフ用カラム。充填粒子の粒径は、カラム主体に充填する充填剤の粒径よりも大きいことが好ましい。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
充填剤を内部に充填した円筒状カラム主体と、前記カラム主体の両端に取りつけたエンドフィッティングとからなる液体クロマトグラフ用カラムにおいて、前記エンドフィッティングがその内部の溶離液流路に多孔性フィルタを介装すると共に前記多孔性フィルタの細孔内に充填粒子を充填してなることを特徴とする液体クロマトグラフ用カラム。
【請求項２】
多孔性フィルタの細孔内に充填する充填粒子の粒径が、カラム主体に充填する充填剤の粒径よりも大きい請求項１に記載の液体クロマトグラフ用カラム。
【請求項３】
充填粒子が逆相クロマトグラフィー用充填剤である請求項１に記載の液体クロマトグラフ用カラム。
【請求項４】
カラム主体が、カラムの入口側から出口側に向けてカラム主体全長の４０％以下に逆相用クロマトグラフィー充填剤を充填した濃縮部と、残りのカラム主体内に前記濃縮部に充填した充填剤よりも単位体積当りの液相量が多い逆相クロマトグラフィー用充填剤を充填してなる分離部とを有する請求項１に記載の液体クロマトグラフ用カラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高速液体クロマトグラフ（ＬＣ）用カラムに関し、特に液体クロマトグラフ−質量分析計（以下ＬＣ／ＭＳ）等に使用して好適な液体クロマトグラフ用カラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、内分泌攪乱物質の調査、研究、医薬品の開発等の、生物関連分野においてＬＣ／ＭＳが急速に普及している。図６は、非特許文献１に記載された従来のＬＣ用カラムの構造例を示すものである。図６中、１００は、カラム主体で、円筒状のステンレススチール製パイプ２中に充填剤４が充填されている。前記カラム主体１００の両端には、エンドフィッティング２００ａ、２００ｂが取りつけられ、これによりカラム主体１００と、入口側キャピラリー６ａ、出口側キャピラリー６ｂとが連結されている。
【０００３】
前記フィッティング２００ａ、２００ｂは、フィッティング部材８ａ、８ｂ内にパイプ２の各端部を挿入し、大径フェラル１０ａ、１０ｂを大径袋ナット１２ａ、１２ｂで締付けることにより、カラム主体１００の両端部とフィッティング部材８ａ、８ｂとを液密に連結させる構造になっている。
【０００４】
同様に、キャピラリー６ａ、６ｂも小径フェラル１４ａ、１４ｂを介して押しねじ１６ａ、１６ｂによりフィッティング部材８ａ、８ｂに液密に連結される。
【０００５】
前記フィッティング部材８ａ、８ｂと、カラム主体１００の両端との間には、多孔性のフィルタ１８ａ、１８ｂが介装されている。
【０００６】
このＬＣカラムを用いて高速液体クロマトグラフ分析を行う場合は、キャピラリー６ａを通って圧送される溶離液はエンドフィッティング内に形成された溶離液流路に介装された前記フィルタ１８ａの多孔を通ってカラム主体１００内に供給され、分析対象の各成分をここで分離しながらカラム主体１００内を通過した後、フィルタ１８ｂに形成された多孔を通ってキャピラリー６ｂに送られる。フィルタ１８ａは、溶離液中に存在する微粒子がカラム主体１００内に流入することを防止する濾材の役割を果す。
【０００７】
ＬＣカラムは、一定の期間使用すると、溶離液や試料溶液中に混入している微粒子がＬＣカラム入口側のフィルタ近傍に詰り、その結果ＬＣカラムに送液される溶離液の圧送圧力の上昇、理論段数の低下を来す。
【０００８】
ＬＣ／ＭＳに用いるＬＣカラムは、溶離液流量を小さくするため、通常のＬＣ用カラムの内径（４〜６ｍｍ）と比較して小さいセミミクロカラム（内径が２．１ｍｍや１．５ｍｍ）が通常用いられている。セミミクロカラムは通常のカラムと比較し、カラム断面積が１／５〜１／１０であり、溶離液流量は、通常０．１〜０．２ｍｌ／ｍｉｎ程度である。
【０００９】
従来のセミミクロカラムを用いるＬＣ／ＭＳ分析においては、高感度を得るために試料注入量を５０〜１００μｌとする場合がある。この場合、注入した全試料がカラムに流入する時間は計算上３０〜６０秒になる。従って、５０〜１００μｌの試料をセミミクロカラムに注入する場合は、得られるピークは幅が広がっている。
【００１０】
このように、セミミクロカラムには、試料注入量が小さい問題や、溶離液入口側のフィルタ近傍が溶離液中の微粒子により詰り易く、耐久性に劣る問題がある。
【００１１】
【非特許文献１】
最新高速液体クロマトグラフィー  南原利夫ら、廣川書店、平成３年１１月２５日出版、ｐ．２２８
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、上記問題を解決するため種々検討するうちに、多孔質フィルタの孔内にＬＣカラムに充填する充填剤を圧入すると、溶離液中の微粒子によるフィルタ近傍の詰りを効果的に減少させ得ることを見いだした。更に、カラム主体の溶離液入口側に単位体積当りの液相量の少ない充填剤を、出口側に単位体積当りの液相量が多い充填剤を充填することにより、多量の試料液量を注入できることを見いだした。従って本発明の目的とすることは、目詰りが少なく、多量の試料液量を注入することのできるＬＣ用カラムを提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する本発明は、以下に記載するものである。
【００１４】
〔１〕  充填剤を内部に充填した円筒状カラム主体と、前記カラム主体の両端に取りつけたエンドフィッティングとからなる液体クロマトグラフ用カラムにおいて、前記エンドフィッティングがその内部の溶離液流路に多孔性フィルタを介装すると共に前記多孔性フィルタの細孔内に充填粒子を充填してなることを特徴とする液体クロマトグラフ用カラム。
【００１５】
〔２〕  多孔性フィルタの細孔内に充填する充填粒子の粒径が、カラム主体に充填する充填剤の粒径よりも大きい〔１〕に記載の液体クロマトグラフ用カラム。
【００１６】
〔３〕  充填粒子が逆相クロマトグラフィー用充填剤である〔１〕に記載の液体クロマトグラフ用カラム。
【００１７】
〔４〕  カラム主体が、カラムの入口側から出口側に向けてカラム主体全長の４０％以下に逆相用クロマトグラフィー充填剤を充填した濃縮部と、残りのカラム主体内に前記濃縮部に充填した充填剤よりも単位体積当りの液相量が多い逆相クロマトグラフィー用充填剤を充填してなる分離部とを有する〔１〕に記載の液体クロマトグラフ用カラム。
【００１８】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明の液体クロマトグラフ用カラムのカラム主体の端部側の一例を示す拡大断面図である。
【００１９】
図１において、５０はカラム主体で、その内部に同一種類の充填剤５２が均一に充填されている。カラム主体５０は、ステンレスや、ガラス製の円筒形で、通常の高速液体クロマトグラフ用カラムに使用されているものがそのまま使用できる。これらのカラム主体は、通常内径４〜６ｍｍ、長さ１０〜５０ｃｍ程度のものが多い。また、内径が３〜１ｍｍ、長さ３〜１５ｃｍのセミミクロカラム用のカラム主体も使用できる。
【００２０】
なお、後述するように、カラム主体５０内には、２種類の充填剤をカラム本体５０の長さ方向に沿って２層に積重して充填しても良い。
【００２１】
カラム主体５０に充填する充填剤は、高速液体クロマトグラフィーにおいて使用されている充填剤の何れも使用できる。具体的には、シリカゲル粒子の表面にオクチル基、オクタデシル基等の炭素数３〜２４のアルキル基を化学結合させた逆相型、グリシジルエーテル基等の極性基を化学結合させた順相型、シリカゲルや多孔性樹脂を用いるゲル濾過型等の充填剤が例示される。これらの充填剤は、粒径が１〜２０μｍ程度のものが多い。
【００２２】
前記カラム主体５０の一端５４には、カラム主体５０と略同一直径の円盤状フィルタ５６が載置されている。前記フィルタ５６は、ステンレス、テフロン（登録商標）等の材料で製造された多孔性円盤で、その内部には細孔５８を多数有する。このフィルタは、市販品が特に制限無く使用できる。
【００２３】
前記細孔５８内には、充填粒子６０が多数充填されている。充填粒子は、前記充填剤５２よりも平均粒径が大きいものが好ましく、充填剤５２の平均粒径の２〜５倍程度のものがより好ましい。
【００２４】
充填粒子６０の形状は特に制限が無く、球形、楕円球、特定の形状のない無定型等の何れの形状でも良いが、球形が特に好ましい。充填粒子６０の材質としては、カラムの分離に悪影響を与えることがなければ、何れの材質のものでも使用できる。分離に影響を与えず、入手が容易な点から、シリカが好ましい。シリカをシラン処理した物、又はカラム本体に充填する充填剤であって平均粒径の大きい充填剤を充填粒子として使用する場合は、これらは不活性化処理されているので、特に好ましい。
【００２５】
フィルタ５６の細孔５８内に充填粒子を充填する方法は特に制限がないが、フィルタ５６の溶離液流入側表面から充填粒子をフィルタ５６に擦りつけたり、充填粒子を懸濁させた溶媒を圧送する等の方法により簡単に充填できる。細孔５８の径はフィルタ５６内部で大きく変動しており、２０μｍ以上の細孔径の部分や、数μｍ以下の細孔径の箇所がある。このため、細孔５８内に充填された粒子は、細孔５８内の狭い箇所等で細孔を塞ぎ、内部に保持される。
【００２６】
細孔内は前記充填粒子６０により塞がれるが、カラム本体５０に送られる溶離液は充填粒子６０間や、充填粒子６０と細孔壁との間隙を通過して、自由に細孔内を流れることができる。
【００２７】
本液体クロマトグラフ用カラムは、クロマトグラフ分析中にカラムに溶離液が流入する際、溶離液に分散している不純物粒子（微細なゴミ等であって通常充填粒子よりも粒径が小さい）が細孔壁と充填粒子との間、または充填粒子間で捕集される。このため、不純物粒子はフィルタ５６を通り抜けてカラム本体に流入しにくい。この場合、不純物粒子の捕集はフィルタ５６の細孔５８内の各部分で起るので、長期間にわたりフィルタ５６の全体が不純物粒子により閉塞され難い。
【００２８】
その結果、本カラムは長期間使用しても、不純物粒子によるカラムの目詰りが防止され、目詰りによる溶離液の送液圧力上昇が少ない。
【００２９】
これに対し、従来のカラムは、フィルタの細孔を通過した不純物粒子が、カラム本体に充填した充填剤の表面で全て捕集されるので、比較的短時間にカラムが目詰りする。
【００３０】
図２は、ＬＣ／ＭＳ用カラムとして好適なカラム構成を示す説明図である。ＬＣ／ＭＳに使用されるカラムは、ＭＳに大量の溶離液が流入しないように、汎用カラムよりも小型のセミミクロカラムが一般的である。
【００３１】
この例においては、セミミクロカラム主体７０内に、２種類の充填剤が充填され、濃縮部７２と、分離部７４とが形成されている。尚、このカラム主体７０の両端は、図１を用いて詳述した本発明に係るエンドフィッティング（不図示）が取りつけられている。
【００３２】
前記濃縮部７２はカラムの入口側から出口側に向けて（矢印Ｐ方向）、カラム主体７０の全長（Ａ＋Ｂ）の４０％以下の長さＡで形成されている。
【００３３】
濃縮部７２に充填される充填剤は逆相クロマトグラフィ−用の前記充填剤が充填されている。
【００３４】
分離部７４には、前記濃縮部７２に充填されている充填剤よりも単位体積当りの液相量が多い逆相クロマトグラフィー用充填剤が充填されている。濃縮部７２に充填されている充填剤の単位体積当りの液相量に対する、分離部７４に充填されている充填剤の単位体積当りの液相量の割合は、１．５〜１０倍が好ましく、２〜４倍がより好ましい。液相量の相違は、化学的に同一種類の液層であってその化学結合量が異なる充填剤の組合わせであっても良い。また、シリカ粒子に結合している液層（アルキル基）が異なり、アルキル基の炭素数が異なることにより、結果として液相量が異なる充填剤の組合わせであっても良い。このような例としては、プロピル基やオクチル基をシリカゲルに結合した充填剤を濃縮部に、オクタデシル基を同一のシリカゲルに結合した充填剤を分離部に充填する組合わせがある。
【００３５】
このカラムに１００μｌ程度の大液量の分析試料を注入し、ＬＣ／ＭＳ分析をする場合につき説明する。この場合、有機溶媒濃度が低い溶離液から有機溶媒濃度を連続的に又は段階的に高めていくグラジエント溶出法を用いる。
【００３６】
まず、図２に示す構成のカラム主体を有するカラムに大量の試料を注入すると、溶離液中の有機溶媒濃度が低いので、カラムの濃縮部７２において試料成分が弱く保持される。試料を溶解している試料溶媒は溶離液と共にカラム内をカラム出口側に移動する。これにより、試料成分と、試料を溶解している試料溶媒とが分離される。その後、試料成分はより保持力の強い分離部７４の先端に到達し、この先端で濃縮されピーク幅が狭い状態で保持される。
【００３７】
その後、溶離液の有機溶媒濃度を高める（グラジエント溶出）ことにより、先端に濃縮された試料がカラム内を移動しながら更に各試料成分に分離され、狭いピーク幅を保持した状態でカラム出口側から溶出する。溶出した各試料成分は、ＭＳにより、各成分が検出される。
【００３８】
本発明カラムは、上記グラジエント溶出法を適用することにより、試料を大量に注入した場合もピーク幅を広げることなく高感度分析を可能とする。
【００３９】
【実施例】
実施例１
長さ１５ｃｍ、内径２．１ｍｍのステンレススチール製カラム本体に、表１に示す２種類の充填剤を充填し、濃縮部、分離部を形成した。カラム本体の両端に、充填粒子を擦込んだフィルタをエンドフィッティングで取りつけ、セミミクロカラムを得た（実施カラム１）。
【００４０】
濃縮部長さＡ＝２ｃｍ、分離部長さＢ＝１３ｃｍとした。濃縮部に充填した充填剤は、球状シリカゲル表面にオクチル基を化学結合した粒径５μｍのもので、炭素含有率９質量％のものであった。
【００４１】
分離部に充填した充填剤は、同じ球状シリカゲル表面にオクタデシル基を化学結合させた粒径５μｍのもので、炭素含有率１７質量％のものであった。
【００４２】
フィルタの平均細孔径は２０〜３０μｍ程度であり、細孔に擦込んだ充填粒子は、粒径１０μｍの球状シリカゲル表面にオクタデシル基を化学結合させたもので、炭素含有率は１７質量％であった。
【００４３】
比較例１
実施例１で用いたカラム本体に、実施例１の分離部に充填した充填剤のみを充填した。カラム本体の両端に、充填粒子を擦込んでいないフィルタをエンドフィッティングで取りつけ、セミミクロカラムを得た（比較カラム１）。
【００４４】
なお、実施カラム１の理論段数は１２０００、比較カラム１の理論段数は１２５００であり、大差はなかった。
【００４５】
検討例１
０．４５μｍのフィルタで濾過した緑茶抽出水をＬＣに取りつけた上記実施カラム１、比較カラム１のそれぞれに１００回連続して注入した。
【００４６】
ＬＣ運転条件は、溶離液が水／アセトニトリル（ＡＣＮ）＝４０／６０（容積基準）で、溶離液送液量０．１５ｍｌ／ｍｉｎ、温度４０℃であった。
【００４７】
図３に、注入回数と溶離液圧送用ポンプ圧力との関係を示した。比較カラム１は注入１００回で、圧力が約３倍に上昇した。これに対し、実施カラム１は、殆ど圧力上昇がなかった。これは、実施カラム１の場合、フィルタに充填粒子が充填してあるので、緑茶成分に含まれる微細粒子がフィルタ全体に分散して捕捉されたことによると考えられる。
【００４８】
検討例２
実施カラム１、比較カラム１を用いてＬＣ分析を行い、大量試料注入の際の両カラムの理論段数を比較した。
【００４９】
試料は、種々の比率の水／アセトニトリル混合溶媒にナフタレンを濃度２０ｎｇ／ｍｌになるように溶解した。試料注入量は１００μｌ、カラム温度は４０℃、溶離液流量は０．１５ｍｌ／ｍｉｎであった。溶離条件は、アセトニトリル濃度１０％から６分間かけて直線的にアセトニトリル濃度８０％にし、その後６分間同濃度を保持するものであった。
【００５０】
表１に、結果を示した。実施カラム１の場合、１００μｌの大量注入の場合も、高い理論段数が保持できた。
【００５１】
【表１】
表１
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−：  測定不能
図４に、混合溶媒中のＡＣＮ濃度が８０容量％の試料を注入したときに得られたクロマトグラムを示した。比較カラム１のクロマトグラムにおいては、ナフタレンのピーク形状が変形している。これに対し、実施カラム１のクロマトグラムは鋭いナフタレンピークを示している。
【００５２】
検討例３
分析試料に、ビタミンＡ、ビタミンＡアセテートを用いて検討例２と同様の大量試料注入を行った。試料濃度は１μｇ／ｍｌ−アセトニトリルで、この１００μｌをＬＣに注入した。溶離液流量は０．１５ｍｌ／ｍｉｎで、溶液組成はメタノール８０／水２０（容量基準）から、メタノール１００％まで直線的にメタノール濃度を上昇させた。
【００５３】
得られたクロマトグラムを図５に示した。実施カラム１を用いた場合、得られるピーク形状は鋭い。これに対し、比較カラム１を用いた場合、得られるピークの形状は大きく崩れている。
【００５４】
【発明の効果】
本発明のカラムは、フィッティングに取りつけたフィルタの細孔内に充填粒子を充填しているので、長期間に亘り溶離液中の微粒子に起因する溶離液の送液圧力上昇が小さい。また、カラム主体中に、単位体積当りの液相量の異なる充填剤を２層に分けて充填する場合は、試料の大量注入を行うことができ、このカラムは特にＬＣ／ＭＳ用セミミクロカラムとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の液体クロマトグラフ用カラムのフィルタ部分を示す拡大断面説明図である
【図２】本発明の液体クロマトグラフ用カラムのカラム主体の構成の一例を示す断面図である。
【図３】溶離液の送液圧力と注入回数との関係を示すグラフである。
【図４】大量注入した場合のピークの形状の相違を示すクロマトグラムである。
【図５】大量注入した場合のピークの形状の相違を示すクロマトグラムである。
【図６】従来の液体クロマトグラフ用カラムの構成を示す断面図である。
【符号の説明】
１００    カラム主体
２    パイプ
４    充填剤
２００ａ、２００ｂ    エンドフィッティング
６ａ    入口側キャピラリー
６ｂ    出口側キャピラリー
８ａ、８ｂ    フィッティング部材
１０ａ、１０ｂ    大径フェラル
１２ａ、１２ｂ    大径袋ナット
１４ａ、１４ｂ    小径フェラル
１６ａ、１６ｂ    押しねじ
１８ａ、１８ｂ    フィルタ
５０    カラム主体
５２    充填剤
５４    一端
５６    フィルタ
５８    細孔
６０    充填粒子
７０    セミミクロカラム主体
７２    濃縮部
７４    分離部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2004177180.tif 000007
【図５】
2004177180.tif 000008
【図６】
2004177180.tif 000009