(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ガン作用及び免疫増強作用の両方の作用を併せ持っているトリテルペン化合物を提供すること。【解決手段】南米産薬用植物であるブメリア属植物から抽出、分離された、下記一般式で表されるトリテルペン化合物、及びこのトリテルペン化合物を有効成分として含む抗ガン剤、免疫増強剤、健康食品。2004231559.tif 000009【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１の化学式で表されるトリテルペン化合物及びその薬学的に許容される誘導体。
【化１】
2004231559.tif 000007
【請求項２】
式２の立体構造式で表されるトリテルペン化合物及びその薬学的に許容される誘導体。
【化２】
2004231559.tif 000008
【請求項３】
請求項１または２に記載のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含む抗ガン剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含む白血病治療剤。
【請求項５】
請求項１または２に記載のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含む免疫増強剤。
【請求項６】
請求項１または２に記載のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含むサイトカイン産生促進剤。
【請求項７】
請求項１または２に記載のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含むガン予防剤。
【請求項８】
請求項１または２に記載のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含む健康食品。
【請求項９】
請求項１または２に記載のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を含む動物用飼料。
【請求項１０】
アカテツ（Ｓａｐｏｔａｃｅａｅ）科ブメリア（Ｂｕｍｅｌｉａ）属の植物から得られ、式１または式２で表されるトリテルペン化合物を含む抽出エキス。
【請求項１１】
ブメリア（Ｂｕｍｅｌｉａ）属の植物が、ブメリア  サルトルム（Ｂｕｍｅｌｉａ  ｓａｒｔｏｒｕｍ）である請求項１０記載の抽出エキス。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の抽出エキスを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載の抽出エキスを有効成分として含む健康食品。
【請求項１４】
請求項１０または１１に記載の抽出エキスを有効成分として含む動物用飼料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規トリテルペン化合物に関する。
また、本発明はこの新規トリテルペン化合物を有効成分として含む、ガンの予防用、ガンの治療用、免疫増強用の医薬品、健康食品、動物用飼料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本人の死亡原因として主要なものはガンであり、ガンによる死亡の割合は今後もさらに増加するといわれている。
今日、ガン対策は国民医療上重要かつ緊急の課題であって、各方面からガン対策のアプローチがなされているが、いまだ決定的な解決策は見いだされていない。
薬剤によるガンの治療法として、化学療法と免疫療法が一般的に行われている。
しかしながら、合成化合物からなる抗ガン剤を用いた化学療法においては、一般に抗ガン剤はガン細胞ばかりでなく正常細胞をも攻撃する作用を有するので、重大な副作用を伴うことが多く、治療法としては問題点が少なくない。また、インターフェロンを用いた免疫療法が注目されているが、免疫療法によるガンの治癒率は一般に高いものとはなっていない。
【０００３】
一方、従来より植物体から抽出された天然化合物、特にトリテルペン化合物を有効成分とする抗腫瘍剤（特許文献１）、発癌予防剤（特許文献２）、発癌プロモーター抑制剤（特許文献３）などが数多く知られている。
しかしながら、これらの薬剤はもっぱらガン細胞への作用のみに注目するものであって、正常細胞への作用は不明であり、また、抗ガン作用と免疫増強作用の両方の作用を併せ持つトリテルペン化合物はこれまで知られていない。
【０００４】
【特許文献１】
特開平８−１１９８６６号公報
【特許文献２】
特開平９−２５２３２号公報
【特許文献３】
特開平９−１７６１８４号公報
【非特許文献１】
ブラジル産薬用植物辞典  １９９６年４月２７日  初版発行  著者  橋本梧郎  共著者
毛藤喜重  発行所  （株）アボック社出版局  第１０８０〜１０８１頁
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ガン細胞に対しては増殖を抑制する作用を発揮し、正常細胞に対しては毒性を示さないだけでなく、むしろ増殖を促進する作用を発揮する新規化合物を提供することを課題とする。特に、本発明は、ガン細胞に対しては増殖抑制作用を発揮し、免疫担当細胞に対しては増殖促進作用を発揮する、新規トリテルペン化合物を提供すること、該化合物を含む組成物を提供すること、及び該組成物の用途を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明は下記の事項より構成される。
１．式１の化学式で表されるトリテルペン化合物及びその薬学的に許容される誘導体。
【化３】
2004231559.tif 000002
２．式２の立体構造式で表されるトリテルペン化合物及びその薬学的に許容される誘導体。
【化４】
2004231559.tif 000003
３．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含む抗ガン剤。
４．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含む白血病治療剤。
５．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含む免疫増強剤。
６．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含むサイトカイン産生促進剤。
７．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含むガン予防剤。
８．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を有効成分として含む健康食品。
９．式１または２のトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体を含む動物用飼料。
１０．アカテツ（Ｓａｐｏｔａｃｅａｅ）科ブメリア（Ｂｕｍｅｌｉａ）属の植物から得られ、式１で表されるトリテルペン化合物または式２で表されるトリテルペン化合物を含む抽出エキス。
１１．ブメリア（Ｂｕｍｅｌｉａ）属の植物が、ブメリア  サルトルム（Ｂｕｍｅｌｉａ  ｓａｒｔｏｒｕｍ）である上記１０に記載の抽出エキス。
１２．上記１０または１１に記載の抽出エキスを有効成分として含む医薬組成物。
１３．上記１０または１１に記載の抽出エキスを有効成分として含む健康食品。
１４．上記１０または１１に記載の抽出エキスを有効成分として含む動物用飼料。
【０００７】
本発明における「誘導体」とは、上記式１または２で表される化合物を基本骨格として、その３位、１３位、及び１８位の３つのケトン基のうちの任意の少なくとも１つが、それぞれ独立にヒドロキシル基（−ＯＨ）、オキシム基（＝Ｎ−ＯＨ）、あるいはヒドラゾノ基（＝Ｎ−ＮＨ２）となっている化合物を意味するものである。
これらの誘導体は、上記式１または２で表される化合物から還元処理やヒドロキシルアミンなどとの反応によって誘導される。
【０００８】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明は、南米産のアカテツ（Ｓａｐｏｔａｃｅａｅ）科植物の一属であるブメリア（Ｂｕｍｅｌｉａ）属の植物から得られる上記式１または２で表される新規トリテルペン化合物に関する。
本発明は、好ましくはブメリア（Ｂｕｍｅｌｉａ）属の植物に分類されるブメリア  サルトルム（Ｂｕｍｅｌｉａ  ｓａｒｔｏｒｕｍ）、特に好ましくはその樹皮、から得られる上記式１または２で表される新規トリテルペン化合物に関する。
【０００９】
アカテツ科の植物は、熱帯に主として広く分布し、約１１６属１１００種のものが知られている（非特許文献１）。
本発明で用いるブメリア属の植物は、熱帯アメリカを中心に分布し、約２５種類が知られており、いずれも木本植物である。
原料として特に好ましい植物であるブメリア  サルトルムは多くブラジルの乾燥地帯に自生している。
このブメリア  サルトルムに近縁の植物であって、原料として好ましい植物として、ブメリア  オブツシフォリア（Ｂｕｍｅｌｉａ  ｏｂｕｔｕｓｉｆｏｒｉａ）、ブメリア  エクセルサ（Ｂｕｍｅｌｉａ  ｅｘｃｅｌｓａ）、ブメリア  ラムノイデス（Ｂｕｍｅｌｉａ  ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ）があり、これらはブラジル、ペルー、ボリビア、パラグアイ、アルゼンチンに分布している。
これら近縁の植物は、ブメリア  サルトルムを含め、高さ５〜１５ｍの高木であり、枝は有毛で棘がある。現地ではクイシャベイラ（ＱＵＩＸＡＢＥＩＲＡ）、コロニーリャ（ＣＯＲＯＮＩＬＨＡ）などと呼ばれ、その樹皮、花は茶剤、煎剤として用いて収斂、強壮、糖尿病、下痢止めなどに効果があるといわれている。
【００１０】
上記式１または２で表されるトリテルペン化合物の単体は、ブメリア属の植物体、好ましくはそれらの樹皮を原料とし、これらの植物体から適宜の溶剤を用いて粗抽出エキスを得て、これを順相・逆相のカラムクロマトグラフイーで分離精製を複数回実施することにより単離することができる。
ブメリア属植物のなかでも、好ましくはブメリア  サルトルム及び上記近縁の植物から、式１または２で表されるトリテルペン化合物を抽出、単離できる。
【００１１】
原料植物体は、抽出処理に先立ち、乾燥、小片化しておくことが好ましい。
抽出溶剤としては、水、メタノールやエタノールなどのアルコール類、エーテル、酢酸エチル、アセトン、クロロホルムなど適宜の溶剤を、単独または混合して用いることができるが、好ましい抽出溶媒はメタノール、エタノールなどのアルコールである。
抽出には、冷浸、温浸、還流冷却下での加熱、超臨界流体抽出など適宜の方法用いることができる。超臨界流体抽出における超臨界流体としては、例えば二酸化炭素、ペンタンを使用できる。抽出は所望により超音波をかけながら行うことができる。抽出は、連続式、バッチ式のいずれでもよく、加圧、常圧または減圧下で実施できる。抽出時間は抽出方法、抽出溶媒の種類などに応じて適宜決定できるが、例えば室温の場合、１時間〜１０日であり、溶媒の沸点付近の温度では１０分〜１０時間である。
抽出後、抽出溶媒を常圧または減圧下で留去して除去するか、凍結乾燥して粗抽出エキスを得る。
【００１２】
粗抽出エキスをさらにカラムクロマトグラフィー手段などにより分離精製処理する場合には、分離精製に用いるカラムクロマトグラフイーとしては、ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー及びシリカゲルカラムクロマトグラフィーを挙げることができる。
好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた分離精製法を採用する。
カラムクロマトグラフィーに用いる溶媒は、ベンゼン、酢酸エチル、エタノール、メタノール、アセトン、エーテル、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなど適宜の溶剤を用いることができる。
【００１３】
上記式１または式２で表されるトリテルペン化合物またはその誘導体は、近似の化合物を出発材料とした化学合成法によっても製造することが可能である。
【００１４】
本発明における上記式１であらわされるトリテルペン化合物またはその誘導体は、後述するように、強い抗ガン作用と免疫増強作用の両方の作用を有し、さらにサイトカインの産生促進作用をも有しているので、これらの化合物を有効成分として用いて、ガン治療剤、免疫増強剤、サイトカイン産生促進剤である医薬を製造することができる。
また、この式１であらわされるテルペン化合物またはその誘導体を有効成分として用いて、ガン予防作用、免疫増強作用を有する健康食品、動物用飼料を製造することができる。
【００１５】
この式１であらわされるトリテルペン化合物を含む粗抽出エキス及びこの粗抽出エキスを精製していく途中の工程で得られる抽出エキス（これらを、単に「抽出エキス」ということあり。）には、特に有毒成分は含まれていないのでこの抽出エキスを用いても、式１、２またはその誘導体であらわされるトリテルペン化合物単体を用いる場合と同様の医薬、健康食品、動物飼料を製造することができる。
以下、本発明において、トリテルペン化合物という場合は、とくに単体であると断らない限り、式１または２で表されるトリテルペン化合物またはその誘導体単体だけでなく、それを含む抽出エキスをも意味するものとする。
【００１６】
［有効な投与量及び投与方法］
本発明のトリテルペン化合物はそのまま、あるいは慣用の担体とともに医薬、健康食品、飼料として、動物または人間に投与することができる。
投与形態としては特に限定されないが、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤などの経口剤の製剤、注射剤、経皮吸収剤、ローション、クリーム、軟膏、座剤などの非経口剤の製剤が採用できる。
本発明のトリテルペン化合物を製剤とする場合、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤剤、流動化剤、保存剤、界面活性剤、乳化剤、安定剤、希釈剤、溶解剤、等張化剤、無痛化剤、殺菌剤、防腐剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料などを適宜用いることができる。
人間の健康食品として用いる場合は、本発明のトリテルペン化合物を飲料や食品に添加、配合して用いることができる。
家畜、家禽、養殖魚類などの動物に本発明のトリテルペン化合物を適用する場合は、本発明のトリテルペン化合物を飲料水や飼料に添加、配合して用いることができる。
【００１７】
経口剤としての有効量は、治療か予防かの適用目的の違い、および、適用するヒトや動物の年齢、重量、疾患の程度、などにより異なるが、例えば通常ヒトの成人で本発明のトリテルペン化合物の単体に換算して、１日当たり重量で１０ｍｇ〜５ｇであり、１日数回に分けて適用することができる。
非経口剤として、発ガン予防、治療効果を得るためには、例えば通常成人で本発明のトリテルペン化合物の単体を、１日当たり重量で１ｍｇ〜１０００ｍｇの静脈注射、皮下注射、筋肉注射で適用することができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の詳細を説明する。
【実施例】
以下に実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
［ブメリア属の植物の一種であるブメリア  サルトルムからの式１で表されるトリテルペン化合物の抽出、分離］
ブメリア  サルトルム（Ｂｕｍｅｌｉａ  ｓａｒｔｏｒｕｍ）の乾燥樹皮１Ｋｇを粉砕後、超音波条件下７０％エタノール７Ｌを用いて３０分間抽出を行いガラス濾過器により濾過した。この抽出操作をさらに２回繰り返し、得られた濾液を減圧下で濃縮して粗抽出エキス（１５７．９ｇ）を得た。
【００１９】
（クロマトグラフィーによる粗抽出エキスの精製）
得られた粗抽出エキスをＨＰ−２０カラムクロマトグラフィーに付し、４０％メタノール（Ｆｒ．１）、７０％メタノール（Ｆｒ．２）、１００％メタノール（Ｆｒ．３）、アセトン（Ｆｒ．４）にて順次溶出した。次いで、Ｆｒ．４をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し  クロロホルム：メタノール＝１００：０、５０：１、３０：１、１０：１、９：１、６：４、０：１００  にて順次溶出し、７分画（Ｆｒ．４−１〜Ｆｒ．４−７）した。
さらに画分Ｆｒ．４−５を、カラムとしてＳｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ  ＰＥＧＡＳＩＬ  ｓｉｌｉｃａ  ２０ｍｍ×２５０ｍｍ、溶出液としてヘキサン：酢酸エチル＝１０：１  を用いて、順相高速液体クロマトグラフィー（ｎｐ−ＨＰＬＣ）に付して精製し、油状の目的トリテルペン化合物（３ｍｇ）を得た。
【００２０】
（分離されたトリテルペン化合物の物性）
［α］Ｄ２０  ＋１０７．０（ｃ  ０．３，ＭｅＯＨ）
ＨＲ＿ＥＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ４５６．３６０１［Ｍ］＋（組成式  Ｃ３０Ｈ４８Ｏ３）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、δ  ｉｎ  ＣＤＣｌ３）スペクトルと１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、δ  ｉｎ  ＣＤＣｌ３）スペクトルの測定結果を表に示す。
【表１】
2004231559.tif 000004
2004231559.tif 000005
【００２１】
表−１から明らかなように、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルからは、６個の３級メチル基［δ１．１２，１．０７，１．０６，１．０１，０．９５，０．８９（各３Ｈ，ｓ）］と２個の２級メチル基［δ１．０２，０．８９  ０．８７（各３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）］の存在が推定され、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルからは、８個のメチル炭素、１０個のメチレン炭素、４個のメチン炭素、５個の４級炭素、３個のカルボニル炭素（δ２２４．０，２１９．４，２１５．１）に基づくシグナルが観測された。
これらのデータから、単離された化合物が式１で表される新規トリテルペン化合物であることは明らかである。
【００２２】
【実施例２】
［トリテルペン化合物のヒト前骨髄性白血病細胞に対する生物活性］
式１で表されるトリテルペン化合物のヒト前骨髄性白血病細胞に対する生物活性を検討するために細胞増殖抑制試験（阻害率の測定）を次のように行った。
ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）にストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ：明治製菓）とペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ：明治製菓）を添加し、さらに全培地量に対し１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ：ＧＩＢＣＯ社製）を加えた。
この培地にガン細胞の一種であるヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０：大日本製薬）を１．０×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁させ、９６穴のシャーレに（９０μＬずつ）分注した。次に試験試料のＤＭＳＯ溶液１μＬにＲＰＭＩ−１６４０培地を９９μＬ加え、予備希釈した試料を調整し、この希釈試料から１０μＬづつを各ウエルに分注し、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２５％）にて７２時間培養した。
【００２３】
培養後、各ウエルにＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  染色液（ＢＩＯＳＯＲＣＥ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社製）１０μＬを加え、さらに４時間培養した。  培養後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０）を用いて各ウエルの吸光度を測定した。吸光度（Ａ）は、５７０ｎｍおよび５９５ｎｍの２波長で測定した。
同様にして、ブランクの吸光度とコントロールの吸光度を測定した。
ただし、ブランクは細胞、被験試料を加えず培養したウエルにＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  染色液を添加したもの、コントロールは細胞とＤＭＳＯを加え培養したウエルにＡｌａｍａｒＢｌｕｅ  染色液を添加したものである。
阻害率を、以下の計算式により算出したところ、９４．８％であった。
阻害率（％）＝１００［１−｛サンプル（Ａ５７０ｎｍ−Ａ５９５ｎｍ）−ブランク（Ａ５７０ｎｍ−Ａ５９５ｎｍ）｝／｛コントロール（Ａ５７０ｎｍ−Ａ５９５ｎｍ）−ブランク（Ａ５７０ｎｍ−Ａ５９５ｎｍ）｝］式１で表されるトリテルペン化合物は１０μｇ／ｍＬの濃度でヒト前骨髄性白血病細胞に対し、９４．８％の阻害率（細胞増殖抑制活性）を示した。
【００２４】
【実施例３】
［トリテルペン化合物のヒト末梢血単核細胞に対する生物活性］
免疫担当細胞の一種であり、正常細胞としてのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＬ）に対する式１で表されるトリテルペン化合物の示す生物活性を検討するために細胞増殖活性試験を次のように行った。
健常成人男性のボランティアから採取した末梢血から、フィコール・ハイパーク濃度勾配法を用いて１５００ｒｐｍ、３０分遠心することにより、正常細胞の一種であるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＬ）を分離した。生存率はトリパンブルー染色法により算出した（＞９９％）。
ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）にストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ：明治製菓）とペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ：明治製菓）を添加し、さらに全培地量に対し１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ：ＧＩＢＣＯ社製）を加えた。
調整したＰＢＬを１．０×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＲＰＭＩ−１６４０に懸濁させ、９６穴のシャーレに（９０μＬづつ）分注した。次に試験試料のＤＭＳＯ溶液１μＬにＲＰＭＩ−１６４０培地を９９μＬ加え、予備希釈した試料を調整し、この希釈試料から１０μＬづつを各ウエルに分注し、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２５％）にて７２時間培養した。
【００２５】
培養後、各ウエルにＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  染色液（ＢＩＯＳＯＲＣＥ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社製）１０μＬを加え、さらに４時間培養した。  培養後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０）を用いて各ウエルの吸光度を測定した。吸光度（Ａ）は、５７０ｎｍおよび５９５ｎｍの２波長で測定した。
同様にして、ブランクの吸光度とコントロールの吸光度を測定した。
ただし、  ブランクは細胞、被験試料を加えず培養したウエルにＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  染色液を添加したもの、コントロールは細胞とＤＭＳＯを加え培養したウエルにＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  染色液を添加したものである。
増殖率を、以下の計算式により算出したところ、２５．７％であった。
増殖率（％）＝１００［｛サンプル（Ａ５７０ｎｍ−Ａ５９５ｎｍ）−ブランク（Ａ５７０ｎｍ−Ａ５９５ｎｍ）｝
／｛コントロール（Ａ５７０ｎｍ−Ａ５９５ｎｍ）−ブランク（Ａ５７０ｎｍ−Ａ５９５ｎｍ）｝−１］
式１で表されるトリテルペン化合物は１０μｇ／ｍＬの濃度で正常細胞であるヒト末梢血単核細胞に対し、２５．７％の増殖率（細胞増殖活性）を示した。
【００２６】
上記ヒト前骨髄性白血病細胞に対する生物活性及びヒト末梢血単核細胞に対する生物活性の測定結果からみて、式１で表されるトリテルペン化合物は、ガン細胞に対しては増殖を抑制する作用を発揮し、正常細胞に対しては毒性を示さないばかりでなく、むしろ正常な免疫担当細胞に対して増殖を促進する作用を有しているものであるということは明らかである。
【００２７】
【実施例４】
［トリテルペン化合物のサイトカイン産生能の促進作用］
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＬ）のサイトカイン産生能（ｈＩＬ−１０，ｈＩＦＮ−γ）の測定は、ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡ  及びＨｕｍａｎ  ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ、ともに  ＥＮＤＯＤＥＮ社製）を用いて行った。被験試料とともにＰＢＬを７２時間培養し、その培養上澄を一次抗体でプレコートしてある９６穴プレートに加えた後、Ｂｉｏｔｉｎ化二次抗体を添加した。
プレートを洗浄後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  を加えて室温にてインキュベート後に基質を添加し、マイクロプレートリーダーにて吸光度（λ４９０  ｎｍ）を測定した。ＰＢＬに対する各試料のサイトカイン産生量を標準品の検量線より算出した。
【００２８】
結果を表−２に示す。
【表２】
2004231559.tif 000006
表−２から明らかなように、式１で表される化合物は、ＰＢＬに対し１０μｇ／ｍＬの濃度においてｈＩＬ−１０の産生は示さないが、ｈＩＦＮ−γの産生を１５  ｐｇ／ｍＬ促すことが認められた。
【００２９】
【発明の効果】
本発明による式１、２またはその誘導体で表されるトリテルペン化合物は、ガン細胞に対しては強い細胞毒性を示す一方、免疫担当細胞に対しては増殖活性を示し、さらにサイトカインの産生能を促進するという、極めて特異で、有用な性質を有するものである。
したがって、本発明による式１、２で表されるトリテルペン化合物またはその薬学的に許容される誘導体、さらに式１、２で表されるトリテルペン化合物を含有する抽出エキスは、抗ガン剤、免疫増強剤、ガン予防剤などとしての医薬品、健康食品、動物健康飼料の有効成分として用いることができるという優れた効果を有するものである。