(57)【要約】【課題】急性及び慢性の神経損傷に起因する疾患の予防及び／又は治療に用いる神経細胞保護剤を提供する。【解決手段】下記式（１）Ｃ６０（ＯＨ）ｎ        （１）（式中、Ｃ６０はバックミンスターフラーレンを示し、ｎは２〜１２の正数を示す）で表される水酸化フラーレン又はそのプロドラッグを含む神経細胞保護剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2004231595.tif 000003
（式中、Ｃ６０はバックミンスターフラーレンを示し、ｎは２〜１２の正数を示す）
で表される水酸化フラーレン又はそのプロドラッグを含む神経細胞保護剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は水酸化フラーレンを有効成分として含む神経細胞保護剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バックミンスターフラーレンＣ６０は、交互に並ぶ５員環および６員環を有する球状炭素であり、３０個の炭素二重結合は、酸素ラジカルと容易に反応するためフリーラジカル捕捉剤として作用しうる。
しかし、Ｃ６０は、トルエンまたはベンゼンのような芳香族炭化水素系や芳香族ハロゲン化炭化水素系の溶媒にしか溶解性を示さず水やアルコールには全く不溶のため、水溶性のカルボキシフラーレンや水酸化フラーレンの合成およびその用途に関する研究開発が行われている。医薬用途として、例えばＣ６０（Ｃ（ＣＯＯＨ）２）ｎやＣ６０（ＯＨ）  ｎ（ｎ＝１８〜２０）について、グルタミン酸レセプター介在性神経毒性損傷治療剤として検討が行われている（例えば、特許文献１、非特許文献１、非特許文献２参照）。
【０００３】
Ｃ６０（ＯＨ）ｎの別な医薬用途としては、抗ＨＩＶウイルス作用（非特許文献３参照）、細胞分裂抑制作用（非特許文献４参照）などの検討がおこなわれている。それゆえ、更に合成が容易で有効性が優れるフラーレン類が求められている。一方、水酸化フラーレンの製造方法としては、濃いアルカリ性水溶液を用いる方法（例えば、特許文献２参照）と、二酸化窒素を用いる方法（非特許文献５参照）、発煙硫酸を使用する方法（例えば、非特許文献６及び特許文献３参照）などが知られている。
前者の濃いアルカリ性水溶液を用いる方法は、非常に多い数の水酸基の導入が可能な方法として記載されているが、製品が水溶性のため、使用したアルカリ性無機物を中和した後の無機塩と製品の分離が容易に行えないという問題があった。
【０００４】
後者の発煙硫酸を使用する方法は、水酸基の数が１２個前後と前者の方法のものより少ないが、得られた製品は中性で、水に溶けないために製品を分離することが可能という利点がある。この方法では、硫酸の除去が必要となり、具体的には硫酸は水に溶けるので水での洗浄、例えば、製品と水を容器に入れて撹拌し、濾過やデカンテーションで水を除く懸濁洗浄方法や吸引濾過器などに濾紙などを置きその上に製品を敷き、上から水を掛けて洗浄し濾過するふりかけ洗浄方法によって除去することが知られている。
【０００５】
また、この方法が記載されている文献では、硫酸を除去して分離した製品を減圧中、４０℃で加熱乾燥して最終製品を得る旨の記載がなされている。しかしながら、このような方法では、最終生成品中に、３〜５％の水分が含まれていること、また、生成品は親水性の水酸基を有していて、水を非常に吸いやすい性質を有するために、放置すると８〜１０％の水分を吸収してしまうという問題があった。
【０００６】
【特許文献１】
特表２０００−５１４４１２号公報
【非特許文献１】
Ｈ．  Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ  Ｃ６０，  Ｆｕｌｌｅｒｅｎｏｌｓ，  ａｓ  Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ＲｅｃｅｐｔｏｒＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２：  ６００−６０７  （２０００）
【非特許文献２】
Ｌ．  Ｌ．  Ｄｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｕｃｋｍｉｎｓｔｅｒｆｕｌｌｅｒｅｎｏｌ  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ  Ｒｅｄｕｃｅ  Ｅｘｃｉｔｏｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｏｐｏｔｏｔｉｃ  Ｄｅａｔｈ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃｏｒｔｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｎｓ，  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３：  １２９−１３５  （１９９６）
【非特許文献３】
Ｒ．Ｆ．  Ｓｃｉｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ  Ｆｕｌｌｅｒｅｎｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｋ．Ｍ．  Ｋａｄｉｓｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｓ．  Ｒｕｏｆｆ，  Ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  ｖｏｌ．  ４，  ｐｐ３５７−３６０  （１９９７）
【非特許文献４】
Ｌ−Ｈ．  Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｈｅ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｆ  Ｆｕｌｌｅｒｅｎｏｌ，  Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ  Ｃ６０，  ｏｎ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  １２３：  １０９７−１１０２  （１９９８））
【非特許文献５】
Ｌ．  Ｙ．  Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｏｎｅ−ｆｌａｓｋ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ［６０］  Ｆｕｌｌｅｒｅｎｏｌｓ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５２：  ４９６３−７２  （１９９６）
【特許文献２】
特開平７−４８３０２号公報
【非特許文献６】
Ｌ．  Ｙ．  Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｎｉｔｒｏｎｉｕｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｃ６０  ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １１４：  １０１５７−１０１５７  （１９９２）
【特許文献３】
特開２００２−８０４１４号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記の通り、医薬として実用化しうる合成方法が容易で品質が安定な水酸化フラーレンの製造法やそれを有効成分とするより効果が優れる神経細胞保護剤が求められていた。
本願の出願人は、フラーレンと発煙硫酸とを反応させ、その後加水分解により得られる生成物を、アルカリ性水溶液で洗浄し、次いで加熱乾燥することを特徴とする特定数の水酸基が導入された高品質の水酸化フラーレンの製造方法を先に提案した（特願２００２−３２０１９６号明細書）。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、更に優れた神経細胞保護剤を開発すべく鋭意検討した結果、本願の出願人が先に提案した方法により製造された水酸化フラーレンは、優れた神経細胞保護作用を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
即ち、本発明により、下記式（１）
【０００９】
【化２】
Ｃ６０（ＯＨ）ｎ        （１）
（式中、Ｃ６０はバックミンスターフラーレンを示し、ｎは２〜１２の正数を示す）
で表される水酸化フラーレン又はそのプロドラッグを含む神経細胞保護剤が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で、有効成分として用いられる化合物は、上記式（１）で示される水酸化フラーレン（以下これを「Ｆｕｌｌｅｒｏｌ」と称することがある）である。該化合物におけるバックミンスターフラーレンＣ６０への水酸基（ＯＨ）の導入数ｎは２〜１２の範囲内であり、好ましくは８、１０又は１２であり、更に好ましくは１０である。また当該水酸化フラーレンは、導入された水酸基数が異なるものの混合物であっても良い。この場合、ｎの数は平均値を示し、ｎの平均値としては、８〜１０の範囲内が好ましく、約１０程度がより好ましい。
【００１１】
ここで、本発明において「プロドラッグ」とは、投与後、生体内で分解されて上記式（１）の化合物が放出（生成）され得る式（１）の化合物の誘導体を意味する。具体的には、上記式（１）で表される化合物の低級アルキルエステル、および水溶性置換基（水酸基、アミノ基、カルボン酸基、四級アミノ基など）を有する低級アルキルエステル等が挙げられる。導入されるエステル基の数は、１ｎである。
【００１２】
上記式（１）の化合物は、如何なる方法で製造されたものであっても良い。具体的には、例えば、バックミンスターフラーレンＣ６０と発煙硫酸とを反応させ、その後加水分解して得られる生成物を、アルカリ性水溶液で洗浄し、次いで加熱乾燥することにより製造できる。この方法の詳細は、特願２００２−３２０１９６号明細書に記載されている。
ここで原料となるバックミンスターフラーレンＣ６０は市販されており容易に入手できる。
【００１３】
発煙硫酸は、特に限定されず、市販品されている三酸化硫黄含有量が１０％、３０％及び６０％のものを用いることができるが、３０％及び６０％のものが好ましい。三酸化硫黄含有量が１０％では反応が遅く、また６０％を越えると発煙が激しくなり取り扱いが困難となる。
フラーレンと発煙硫酸との反応は、従来公知の方法が採用でき、具体的には、５０〜６０℃で、５〜７時間、窒素気流下で反応させる。発煙硫酸の容量は、フラーレンの重量の３倍以上で十分だが、反応懸濁液の粘度が高いため十分な撹拌が出来ないので５倍以上が好ましい。１０倍以上あっても反応はこれ以上には進行せず意味をなさないので５倍〜１０倍の範囲が好ましい。
【００１４】
フラーレンと発煙硫酸との反応により硫酸化フラーレンの懸濁液が得られる。この硫酸化フラーレンを加水分解して水酸化フラーレンを合成する。
加水分解の方法は、従来公知の方法が採用できるが、フラーレンと発煙硫酸との反応により得られた懸濁液を、冷却した大量の水に移して希釈する方法が好ましい。懸濁液は、硫酸の濃度が高いため非常に危険であり、また濃度が高いため液の粘度が高く濾別が困難であったり、また分離するのに一般的に使用される濾紙や濾布を化学的に痛めてしまうからであり、例えば、懸濁液の中に水を加えると発熱が激しく、製品上余計な熱を与えてしまうため好ましくない。
【００１５】
この方法により、発煙硫酸に含まれている三酸化硫黄を水と反応させて硫酸にすると同時に、硫酸を希釈して取り扱いやすくできる。
水に移しただけでは硫酸化フラーレンのままであるので、８５〜９０℃で、５〜７時間加熱して硫酸部分を加水分解反応させる。加水分解により得られた生成物は、その後、濾過又は遠心分離により単離して水酸化フラーレンを得る。
【００１６】
得られた生成物が水酸化フラーレンであることは、赤外吸収により水酸基の存在、炭素−水素結合がないこと、及び元素分析で水素と酸素の元素数の値が近いことにより確認することができる。例えば、Ｃ６０を原料とした場合は、マススペクトルで８９０がメインピークであり、これは水酸基が１０個導入された水酸化体の分子量に一致することで判断できる。
【００１７】
濾過又は遠心分離により単離した生成物は、その後、アルカリ性水溶液で洗浄する。洗浄とは、加水分解により得られた生成物を濾過又は遠心分離したものに、アルカリ性水溶液を流す、又はアルカリ性水溶液中に入れて攪拌する方法等が採用できる。この内、濾過又は遠心分離したものにアルカリ性水溶液を流す方法が簡便で好ましい。この際、洗浄後の濾液が、ｐＨ７．０以上まで行うのが好ましい。
【００１８】
また、中和に使用されるアルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム及び水酸化アンモニア化合物の水溶液、アンモニア水やアミン水溶液等が挙げられる。
水酸化アンモニア化合物の具体例としては、水酸化テトラメチルアンモニウム及び水酸化テトラブチルアンモニウム等が挙げられる。また、アミン水溶液の具体例としてはメチルアミン水溶液及びジメチルアミン水溶液を挙げられる。これらの中で、アンモニア水及びアミン水溶液が好ましい。
【００１９】
アルカリ性水溶液で洗浄した後、加熱乾燥する。加熱乾燥は、製品として不要な水を除去するために、乾燥不活性気体の気流下又は真空下で行われる。加熱温度は、５０℃以上、好ましくは５５℃以上で、１００℃以下が好ましい。真空度は３ＫＰａ以下が好ましく、２ＫＰａ以下が更に好ましい。乾燥時間は３０分以上、１２時間以下が好ましく、２時間以上、１０時間以下が更に好ましい。
【００２０】
かくして本発明で有効成分として用いられる水酸化フラーレン、例えばＣ６０（ＯＨ）ｎ（ｎ＝１０又は１２）を得ることができる。本発明で用いるプロドラッグは、例えば該化合物を原料として、それ自体既知の通常用いられる方法、例えば脱水縮合剤によるエステル化法などにより合成することができる。
上記式（１）で表される化合物又はそのプロドラッグは、優れた神経細胞保護作用を有しているので、各種の急性又は慢性の神経損傷に起因する疾患の予防及び／又は治療剤、即ち神経細胞保護剤として用いることができる。ここで、神経損傷に起因する疾患としては、低酸素や虚血による神経損傷、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病等が挙げられる。
【００２１】
上記式（１）で表される化合物又はそのプロドラッグは、それ自体を医薬として患者に投与してもよいが、一般には、これらの有効成分の１種または２種以上を含む医薬組成物を製造して患者に投与することが好適である。このような医薬組成物として、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、丸剤、トローチ、舌下剤、又は液剤などの経口投与の製剤、あるいは注射剤、座剤、軟膏、貼付剤などの非経口投与用の製剤を例示することができる。
また式（１）の化合物又はそのプロドラッグが、生理学的に許容される塩又は溶媒和物となりうる場合、これら有効成分は、それらの形態であっても良い。
【００２２】
経口投与用の錠剤又はカプセル剤は、通常は単位投与物として提供され、結合剤、充填剤、希釈剤、打錠剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、香味剤及び湿潤剤のような通常の製剤用担体を添加して製造することができる。錠剤は、この当業界で周知の方法に従って、例えば、腸溶性コーティング剤を用いてコーティングすることができ、例えばセルロース、マンニトール、又はラクトース等の充填剤；澱粉、ポリビニルポリピロリドン、澱粉誘導体、又はナトリウム澱粉グリコラート等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤を用いて製造してもよい。
【００２３】
経口投与用の液剤は、例えば水性又は油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ剤又はエリキシル剤等の他、使用前に水又は適当な媒体により再溶解されうる乾燥製剤として提供される。このような液剤には、通常の添加剤、例えばメチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル又は水素化食用脂肪のような沈殿防止剤、レシチン、ソルビタンモノオレート、アラビアゴムのような乳化剤、アーモンド油、精製ココナッツ油、油状エステル（例えばグリセリンのエステル）、プロピレングリコール、エチルアルコールのような（食用油も包含しうる）非水性媒体、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、エチルエステル、もしくはプロピルエステル、又はソルビン酸のような保存剤及び必要に応じて通常の香味剤又は着色剤を配合することができる。
【００２４】
経口投与剤の製剤は、混合、充填、又は打錠などの当業界で周知の方法により製造することができる。また、反復配合操作を用いて多量の充填剤等を使用した製剤中に有効成分を分布させてもよい。非経口投与用の製剤は、一般には有効成分である化合物と滅菌媒体とを含有する液体担体投与量製剤として提供される。非経口投与用の溶剤は、通常、化合物を媒体に溶解させて滅菌濾過し、次に適当なバイアル又はアンプルに充填して密封することにより製造される。安定性を高めるために組成物を凍結させた後にバイアル中に充填し、水を真空下で除去してもよい。非経口懸濁液は実質的に非経口溶液の場合と同じ方法で製造されるが、有効成分を媒体に懸濁させてエチレンオキシド等により滅菌することにより好適に製造できる。また、有効成分が均一分布となるように必要に応じて界面活性剤、湿潤剤等を添加してもよい。
【００２５】
有効成分である上記式（１）の化合物又はそのプロドラッグの投与量は、治療や予防の目的、患者の症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定すればよいが、通常の場合、成人一日あたり経口投与により０．０５〜３０ｍｇ／ｋｇ程度を投与することができる。このような投与量を１日あたり１〜数回に分けて投与するのが望ましい。
【００２６】
【実施例】
本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
製造例１ 水酸化フラーレンの合成
３０％発煙硫酸（和光純薬製）５ｍＬを、ガラス製５０ｍＬ２口フラスコに入れ乾燥窒素を吹き込みながらＣ６０（フロンティアカーボン（株）社製）１ｇを加え、５時間加熱撹拌した。これを氷冷した脱イオン水２０ｍＬにゆっくり滴下し、濾紙を使って生成物を濾過した。
【００２７】
ガラス製２００ｍＬ４つ口フラスコに、濾紙に残った赤色固体を脱イオン水３０ｍＬを使って移し、５時間加熱攪拌した。室温まで冷却した後濾紙を使って濾過し、さらに脱イオン水３０ｍＬで洗浄し、その後、２．５％アンモニア水で濾液のｐＨが７以上になるまで洗浄した。濾別された固体を真空中（圧力１．５ＫＰａ）４０℃で４時間乾燥し、赤褐色固体（水酸化フラーレン）１．２ｇを得た。
【００２８】
得られた生成物は、赤外吸収スペクトルで３４００ｃｍ−１、１４００ｃｍ−１及び１０４０ｃｍ−１に吸収があることより水酸基の存在が認められた。また、１６３０ｃｍ−１に吸収があることより、炭素炭素二重結合の存在が認められた。更には、３０５０〜２９００ｃｍ−１は、炭素水素結合の吸収が現れる領域であるがこの領域には吸収がなかったことから水素は炭素ではなく酸素と結合していると言え、水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ）が生成していることが判明した。
【００２９】
また、元素分析では、Ｃ：７６．６％、Ｈ：１．３％、Ｏ：２４．８％、Ｎ：０．７６％、Ｓ：０．４４％、であり、炭素を６０とするとＣ：６０、Ｈ１０．７、Ｏ：１５．３、Ｓ：０．１（Ｈ／Ｃ＝１０．７／６０）と算出される。マススペクトルでは、８９０ピークがもっとも強く、これは分子量が水酸化数１０の水酸化フラーレンに相当し、元素分析とマススペクトルの結果が一致しないが、概ね水酸化数（ｎ）は１０と１２の混合物であると考えられる。含水率は、カールフィッシャー試薬測定したところ５．６％であった。
【００３０】
その後、この固体を真空中（圧力１．５ＫＰａ）１００℃で４時間乾燥処理した水酸化フラーレンの含水率は、０．５％で、元素分析のＨ／Ｃは１２．７／６０であり、加熱乾燥後、水素の減量は認められず、水酸化フラーレンが変質していないことが分かった。
また、真空中１００℃で４時間処理した水酸化フラーレンは、１重量％の水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬに対して２００ｍｇ程度の溶解性を有するものであった。
【００３１】
実施例１ 水酸化フラーレンによる細胞毒性試験
１）使用した試液
細胞培養用培地として液体低グルコースＤｕｌｂｅｃｃｏｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に非働化ウシ胎児血清とウマ血清をそれぞれ培地の容量の５％分添加し、さらに硫酸カナマイシンを１００ｍｇ／Ｌとなるように添加したものを使用した。
【００３２】
細胞継代時使用溶液として０．０２％ＥＤＴＡ−ＰＢＳ溶液（ＰＢＳにＥＤＴＡを０．０２％となるように加えて調製）および０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０２％ＥＤＴＡ−ＰＢＳ溶液に粉末トリプシンを０．２５％となるように添加）を用いた。
【００３３】
１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ（ＭＰＰ＋）はＤＭＳＯに溶解し、１００ｍＭストックを調製した。ストックは暗所に−２０℃で保存した。
水酸化フラーレン（Ｆｕｌｌｅｒｏｌ）は、製造例１と同様の方法で合成したものをＤＭＳＯに溶解し、５ｍＭストックを調製した。ストックは暗所に−２０℃で保存した。
【００３４】
ＸＴＴ試液は２，３−Ｂｉｓ［２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏ−５−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ−５−ｃａｒｂｏｘａｎｉｌｉｄｅ  ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔ（ＸＴＴ）１ｍｇ、０．５ｍＭ  ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ（ＰＭＳ）（溶媒はＰＢＳを使用）２０μｌに無血清の液体低グルコースＤＭＥＭ培地を１ｍｌ加えて用時調製した。
【００３５】
２）細胞の培養
培養細胞としてラット副腎由来褐色種細胞（神経細胞）であるＰＣ１２細胞を使用した。
通常、細胞は培養フラスコ（培養面積２５ｃｍ２）で培養し、実験に使用する際はポリスチレン製９６穴マイクロプレート（平底、低蒸発タイプ）で培養した。細胞培養は３７℃、飽湿下、５％ＣＯ２に設定したＣＯ２インキュベーターで行った。
細胞の継代は０．０２％ＥＤＴＡ−ＰＢＳ溶液で洗ったのち、０．２５％トリプシン−ＰＢＳ溶液を用いて細胞を剥離させ、ピペッティングで細胞を分散させた後、培地で適当な濃度に希釈した。
【００３６】
３）細胞毒性試験
水酸化フラーレンのＰＣ１２細胞に対する生存率への影響を、ＸＴＴ法を用いて調べた。このＸＴＴ法は以下の原理に基づいている。ミトコンドリアは、酸化的リン酸化反応によるエネルギー産生の場として重要な役割を担っている。活発に増殖する細胞ではエネルギー産生量が多いが、細胞が破壊されると極端にミトコンドリアの機能が低下することが知られている。一方、ラット肝組織抽出液を用いた電子伝達系の解析からＸＴＴなどのテトラゾリウム塩がミトコンドリア脱水素酵素のよい基質になることが報告された。ＸＴＴは還元されると水溶性ホルマザン色素に変わるため、吸光度を測定することにより生存細胞数を定量することが可能である。よって無処理細胞との比較により、化合物による生細胞の減少、すなわち細胞死の増加が定量できる。この原理を模式的に図１に示す。
【００３７】
水酸化フラーレンの処理濃度は２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭとし、薬物処理時間は４８時間および７２時間とした。
対数増殖期にあるＰＣ１２細胞を４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で５０μｌずつ９６穴マイクロプレートに添加し、ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養した。水酸化フラーレン溶液を各目的濃度の２倍となるように培地に加え、９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ添加した（５０→１００μｌとなるために２倍に希釈され、目的の濃度となる）。ＣＯ２インキュベーターにて４８時間または７２時間培養後、培地交換を行い、さらに２４時間ＣＯ２インキュベーターにて培養した。ＸＴＴ試液を５０μｌずつ加え、ＣＯ２インキュベーターで４時間培養後、直ちにプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度から細胞生存率を以下の式から算出した。
【００３８】
細胞生存率＝（Ｓ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００％
Ｓ＝検体での吸光度
Ｂ＝培地のみでの吸光度
Ｃ＝ｃｏｎｔｒｏｌでの吸光度
その結果を表１に示す。表１から明らかなとおり、４８時間、７２時間ともに水酸化フラーレンの細胞毒性は確認されなかった。この結果は、水酸化フラーレンが神経細胞に対して毒性がないことを示す。
【００３９】
【表１】
2004231595.tif 000002
【００４０】
実施例２ 水酸化フラーレンによるＭＰＰ＋毒性軽減作用
水酸化フラーレンによるＭＰＰ＋毒性への影響を、ＸＴＴ法を用いて調べた。水酸化フラーレン、ＸＴＴ試液およびＰＣ１２細胞は、実施例１と同様に調製したものを用いた。
ＭＰＰ＋の処理濃度は１２５μＭで、これに水酸化フラーレンを加えないもの、５μＭ、２０μＭを添加したものについて細胞生存率を調べた。なお、ＭＰＰ＋と水酸化フラーレンは同時に添加した。
【００４１】
対数増殖期にあるＰＣ１２細胞を４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で５０μｌずつ９６穴マイクロプレートに添加し、ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養した。水酸化フラーレン溶液を培地に加え、９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ添加した。ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養後、培地交換を行い、さらに２４時間ＣＯ２インキュベーターにて培養した。ＸＴＴ試液を５０μｌずつ加え、ＣＯ２インキュベーターで４時間培養後、直ちにプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度から細胞生存率を以下の式から算出した。
【００４２】
（細胞生存率）＝（Ｓ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００
Ｓ＝検体での吸光度
Ｂ＝培地のみでの吸光度
Ｃ＝ｃｏｎｔｒｏｌでの吸光度
その結果を表２に示す。この結果は、Ｃ６０（ＯＨ）ｎが、ＭＰＰ＋が引き起こす神経細胞の毒性を減弱することを示す。
【００４３】
【表２】
Ｃｏｎｔｒｏｌ                          １００
ＭＰＰ＋  １２５μＭ                      １３．３
ＭＰＰ＋  １２５μＭ  ＋  Ｆｕｌｌｅｒｏｌ  ５μＭ      ２６．７
ＭＰＰ＋  １２５μＭ  ＋  Ｆｕｌｌｅｒｏｌ  ２０μＭ      ２９．３
【００４４】
【発明の効果】
本発明の神経細胞保護剤は、優れた神経細胞死の抑制作用を有しており、各種の急性又は慢性の神経損傷に起因する疾患の予防及び／又は治療剤となりうると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＸＴＴ法の原理を模式的に示した図である。
【図１】
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