(57)【要約】      （修正有）【課題】高い結合効率を示す多官能性化合物を提供し、その化合物を用いて、試料中の検体の存在又は量を検出する方法を提供する。【解決手段】目的の検体を含有することが推定される試料を用意し、ヌクレオチド及び非ヌクレオチド単位の両方を有し、少なくとも１つの前記非ヌクレオチド単位が、式、2004325457.tif 000021（式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、−Ｘｒ−Ｙ４−（各ＸはＣ又はＯであり、Ｙ４は結合ボンド、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及び−Ｎ＝Ｎ−のいずれか）、Ｙ１、Ｙ２及びＹ３はＯ又はＳである。）の化合物を含みヌクレオチドモノマー単位に結合している核酸オリゴマーを用意し、試料中に存在する検体とハイブリッド形成させる条件下で試料をオリゴマーにさらす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の検体を含有することが推定される試料を用意すること、
ヌクレオチド及び非ヌクレオチド単位の両方を有し、少なくとも１つの前記非  ヌクレオチド単位が、式、
【化１】
2004325457.tif 000018
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、水素、ブロック基、キャッピング基（ｃａｐｐｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）、標識、連結基、隣接単位に結合する結合ボンド及び式、
【化２】
2004325457.tif 000019
又は
【化３】
2004325457.tif 000020
（式中、Ｘ４はハロゲン又は置換されたアミノであり、Ｘ５はアルキル、アルコキシ、アリールオキシ又はそれらのシアノ誘導体であり、Ｘ６はハロゲン、アミノ又はＯであり、Ｘ７はアルキル、アルコキシもしくはアリールオキシであるか又は、Ｘ６がＯである場合に限ってＨであり得る）
の基からなる群から個々に選ばれ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つは、検出できる標識をさらに含み、
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の各々は、式、
−Ｘｒ−Ｙ４−
（式中、ｒは少なくとも１の整数、各Ｘは個々にＣ又はＯであり、各Ｃは個々に置換された又は非置換であり得て、飽和又は不飽和であり得て、Ｙ４は結合ボンド、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及び−Ｎ＝Ｎ−からなる群から選ばれる）
の化合物から成る群から個々に選ばれ、
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の各々は個々にＯ又はＳである］
の化合物を含み、前記非ヌクレオチド単位が、Ｒ１、Ｒ２もしくはＲ３における結合ボンド又は連結基により、少なくとも１つのヌクレオチドモノマー単位に結合されており、前記検体とハイブリッド形成することができるように配列されている核酸オリゴマーを用意すること、
前記オリゴマーに前記試料中に存在する検体とハイブリッド形成させる時間及び条件下で前記試料を前記オリゴマーにさらすこと並びに
前記試料中の前記検体の存在又は量を検出すること
を含む、試料中の検体の存在又は量を検出する方法。
【請求項２】
前記オリゴマーが、ガラスビーズ、マイクロビーズ、樹脂、ポリスチレン、膜及びマイクロ力価プレートから成る群から選ばれる固体支持体に結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固体支持体が調整された細孔ガラスを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記固体支持体がマイクロ力価プレートを含む、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術的分野】
【０００１】  本発明は、一般的には、試料中の検体の存在又は量を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  研究用途及び臨床診断の両方において、オリゴマー構造を生成するために種々のモノマー単位を結合させることが望ましいと考えられている。そのようなオリゴマー構造の例には、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド等が含まれる。【０００３】  例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡにおける標的ヌクレオチド配列の存在を決定するための公知の技術は、核酸のハイブリッド形成検定を行うことである。そのような検定では、標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部に対して相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチドプローブ、典型的にはオリゴヌクレオチドが選ばれる。典型的には、それによってプローブの存在が容易に検出される手段を提供するためにそのプローブは標識される。【０００４】  ハイブリッド形成条件下で、標識されたプローブを標的ヌクレオチド配列を含むと推測される試料にさらしたときに、標的配列がそのような標識されたプローブとハイブリッド形成される。次に、通常、ハイブリッド形成されたプローブとハイブリッド形成されていないプローブを分離し、試験試料について、ハイブリッド形成された標識されたプローブの存在及び／又は量を決定した後に、試料における標的配列の存在を定性的に又は定量的に決定し得る。【０００５】  標識をヌクレオチドプローブに結合させる先行技術の方法では、一般的に、ヌクレオシドモノマー単位に結合した単一の標識を用いており、次に１つ以上のヌクレオシドモノマー単位をプローブに組み込んでいる。例えば、ビオチン部分を有するｄＵＴＰ及びＵＴＰの類似体が化学的に合成され、ポリヌクレオチドに組み込まれている［文献２４］。そのようなビオチンで標識されたヌクレオチドを生物的又は化学的起源の核酸プローブに組み込み得る。【０００６】  標識をヌクレオチドオリゴマー中のヌクレオチドにランダムに連結させる、ヌクレオチドプローブを標識するための他の方法が提示されている。標識されたプローブ及び標的ヌクレオチド配列の検出性を増大する目的で複数の修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシドモノマー単位をオリゴヌクレオチドに組み込む多くの提案がなされてきた。又、オリゴヌクレオチドプローブ中の１つのモノマー単位に複数の標識を結合させるための手段を提供することが望ましいと考えられてきた。【０００７】  しかし、多くのそのような標識されたヌクレオチドの、プローブにおける使用により、標的ヌクレオチド配列を有する形成させたハイブリッドの安定性が、特に、複数の標識が存在するときに、低減し得ることが示された。ビオチン及びフルオレセイン標識を有する合成のオリゴヌクレオチドと同様に、複数のビオチン部分を有する生物起源の核酸プローブや複数のフルオレセイン標識を有する合成オリゴヌクレオチドについて、そのようなハイブリッドの安定性の低減が示されている。【０００８】  その他に、燐酸エステル基を結合するヌクレオシドの誘導体の、オリゴヌクレオチドへの組み込みの後にその求核部分が標識され得るヌクレオシドの誘導体が開示されている。しかし、ヌクレオシド誘導体に基づいている、そのような化合物は、ヌクレオシド系誘導体についての上記の欠点のいくつかを示すことが予測される。【０００９】  より最近では、リポーター基でオ��ゴヌクレオチドを標識するために、２−アミノ−１，３−プロパンジオール構造が用いられている［文献６］
オリゴヌクレオチドに複数のリポーター分子を組み込むためのいくつかの方法が記載されている［文献１乃至８］。これらは、標識されたホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）又は類似物の線状付加を用いている。合成サイクル当り１つの標識のみを付加するので、組み込まれ得る標識の数は限られている。【００１０】  複数のアミノ基の導入のための他の方法は、ポリリジン−オリゴヌクレオチド結合の使用に関与する［文献９及び１０］。これらの方法は、固相ペプチドとオリゴヌクレオチドの化学的方法とを組み合わせた使用を必要とし、かなり不利である。【００１１】  他の有益な特徴を与えるのと同様に複数の標識を導入する１つの手段として、「枝分れした」ヌクレオチドオリゴマーの製造が提示されている。２つの５′末端を有する「枝分れした」構造を新生オリゴマーに導入するホスホルアミダイトは指数関数的に標識の付加をさせる。「ｎ」の合成サイクルでは、付加される標識の数は２ｎである。いくつかの非ヌクレオシド分枝を与えるホスホルアミダイトは知られている［文献１１乃至１８］。それらの非ヌクレオシドホスホルアミダイトは線状のアクリルアルカントリオールに基づいている。【００１２】  修飾されたデオキシシチジン誘導体系のヌクレオシド分枝を与えるホスホルアミダイトは核酸ハイブリッド形成検定において成功裡に用いられている［文献１１、１９乃至２２］。【００１３】  「分枝を与える」ために用いられる多くのホスホルアミダイトは、最終的な構造に、キラリティーの付加的な中心を導入するという固有の欠点を有する。この欠点は、アキラルな非ヌクレオシドホスホルアミダイトの使用により克服される［文献２３］。この場合、ホスホルアミダイト合成は複数工程法であり、その使用は標準ＤＮＡ合成プロトコルの改変を必要とする。
【背景技術】
【００１４】
【非特許文献１】Ｋ．Ｍｉｓｉｕｒａら、Ｂｉｏｔｉｎｙｌ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｎ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，４３４５（１９９０）．
【非特許文献２】Ｋ．Ｍｉｓｉｕｒａら、Ａ  ｎｅｗ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１０，６７１（１９９１）．
【非特許文献３】Ｋ．Ｍｉｓｉｕｒａ及びＭ．Ｊ  Ｇａｉｔ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ｔｈｅｉｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｎ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．ＥＰＯ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  ＆ｎｕｍ；００５２７１８４／ＥＰ（１９９５）．
【非特許文献４】Ｊ．Ｙ．Ｔａｎｇ及びＳ．Ａｇｒａｗａｌ．Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｎ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，６４６１（１９９０）．
【非特許文献５】Ｓ．Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ａｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２４，２０７（１９９１）．
【非特許文献６】Ｐ．Ｓ．Ｎｅｌｓｏｎら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ３．Ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ，ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ，２−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ  ｂａｃｋｂｏｎｅ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，６２５３（１９９２）．
【非特許文献７】Ｖ．Ｚｅｃｃｈｉｎｉら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｔｔｏｍｏｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９，２８６（１９９５）．
【非特許文献８】Ａ．Ｇｕｚａｅｖら、Ｎｏｖｅｌ  ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７，２４０（１９９６）．
【非特許文献９】Ａ．Ｙａｍａｎｅら、Ｐｏｌｙ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ．ＰＣＴ  ＰａｔｅｎｔＤｏｃｕｍｅｎｔ  ＆ｎｕｍ；０４８７６３３５（１９８９）．
【非特許文献１０】Ｊ．Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら、Ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｌａｂｅｌｓ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，５０１（１９９０）．
【非特許文献１１】Ｂ．Ｈｅｒｅ’ら、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅａｓｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉ  ｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｌａｂｅｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １０，３６３（１９９１）．
【非特許文献１２】Ｒ．Ｔｅｏｕｌｅら、Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ＥＰＯ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  ＆ｎｕｍ；００４５１２１３／ＥＰ．（１９９４）．
【非特許文献１３】Ｖ．Ａ．Ｋｏｒｓｈｕｎら、Ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏ−ａｎｄ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２４，２６９（１９９１）．
【非特許文献１４】Ｓ．Ｔｅｉｇｅｌｋａｍｐら、Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｐｏｌｙ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｆｏｒｋ−ｓｈａｐｅｄｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１，４６５１（１９９３）．
【非特許文献１５】Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ−−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ．ＣＬＯＮＴＥＣＨｎｉｑｕｅｓ，Ａｐｒｉｌ（１９９３）．
【非特許文献１６】Ｄ．Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ：ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＦＩＳＨａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  Ｉ．Ｏｌｉｇｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２，１（１９９４）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）．
【非特許文献１７】Ｍ．Ｊ．Ｄｅ  Ｖｏｓら、Ｎｅｗ  ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｍｕｌｔｉ−ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｃｏｍｂ−ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｋ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．ＮｕＣｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １３，２２４５（１９９４）．
【非特許文献１８】Ｍ．Ｓ．Ｕｒｄｅａら、Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ｉｎ  ｍａｋｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，３５９，１００，（１９９４）．
【非特許文献１９】Ｔ．Ｈｏｒｎ及びＭ．Ｓ．Ｕｒｄｅａ．Ｆｏｒｋｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｓ  ａｎｄ  ＤＮＡ：ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，６９５９（１９８９）．
【非特許文献２０】Ｃ−Ａ．Ｃｈａｎｇら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ｆｏｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｉｎ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １０，３８９（１９９１）．
【非特許文献２１】Ｍ．Ｓ．Ｕｒｄｅａら、Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｄｉｒｅｃｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２４，１９７（１９９１）．
【非特許文献２２】Ｍ．Ｓ．Ｕｒｄｅａら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ（ＨＢＶ），ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｔｈｅｒｅｆｏｒ．ＰＣＴ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  ＆ｎｕｍ；９０  １３６６７．
【非特許文献２３】Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓら、Ａ  ｎｅｗ  ａｃｈｉｒａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５，１７８５（１９９５）．
【非特許文献２４】Ｐ．Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６３３（１９８１）．
【非特許文献２５】Ｍｅａｎｓ，Ｇ．Ｍ．及びＲ．Ｅ．Ｆｅｅｎｅｙ，″Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ″ＨｏｌｄｅｎＤａｙ  Ｉｎｃ．（１９７１）．
【非特許文献２６】Ｒ．Ｅ．Ｆｅｅｎｅｙ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２９：１４５−１６１（１９８７）．
【非特許文献２７】Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ，″Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ，″Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）．
【非特許文献２８】Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ″Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，″ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８４）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】  高い結合効率を示す多官能性化合物を提供し、その化合物を用いて、試料中の検体の存在又は量を検出する方法を提供することが望ましいと考えられている。【００１６】  又、オリゴペプチドオリゴマーのような非ヌクレオチドオリゴマーにおける使用もできるような化合物を提供することが望ましいと考えられている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】  本発明の試料中の検体の存在又は量を検出する方法において有効に用いられる化合物は、枝分れしたオリゴマーを生成させるためにモノマー単位を結合させることができる、式、
【化１】
2004325457.tif 000002
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、水素、ブロック基、キャッピング基（ｃａｐｐｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）、標識及び式、
【化２】
2004325457.tif 000003
又は
【化３】
2004325457.tif 000004
（式中、Ｘ４はハロゲン又は置換されたアミノであり、Ｘ５はアルキル、アルコキシ、アリールオキシ又はそれらのシアノ誘導体であり、Ｘ６はハロゲン、アミノ又はＯであり、Ｘ７はアルキル、アルコキシもしくはアリールオキシであるか又は、Ｘ６がＯである場合に限ってＨであり得る）
の基からなる群から個々に選ばれ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つは水素でなく、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の各々は、式、
−Ｘｒ−Ｙ４−
（式中、ｒは少なくとも１の整数、各Ｘは個々にＣ又はＯであり、各Ｃは個々に置換された又は非置換であり得て、飽和又は不飽和であり得て、Ｙ４は結合ボンド、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及び−Ｎ＝Ｎ−からなる群から選ばれる）
の化合物から成る群から個々に選ばれ、
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の各々は個々にＯ又はＳである］
である。【００１８】  前記化合物の対称の多官能性面によって、従来の自動化合成化学反応及びプロトコルを用いて、複数の標識を又は望ましい官能基をオリゴマーに組み込むために並びに、得られるオリゴマーにおける枝分れパターンを形成するために本化合物は用いられ得る。又、本化合物は、アキラルであり、それらのサイズ及び剛さのために、本化合物は立体障害に関連する困難性を低減させる。【００１９】  又、本発明において、検体の検出におけるそのような化合物の使用を提供する。【００２０】  本発明は、
分岐したオリゴマーを生成させるためにモノマー単位を結合させることができる、式、
【化４】
2004325457.tif 000005
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、水素、ブロック基、キャッピング基（ｃａｐｐｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）、標識及び式、
【化５】
2004325457.tif 000006
又は
【化６】
2004325457.tif 000007
（式中、Ｘ４はハロゲン又は置換されたアミノであり、Ｘ５はアルキル、アルコキシ、アリールオキシ又はそれらのシアノ誘導体であり、Ｘ６はハロゲン、アミノ又はＯであり、Ｘ７はアルキル、アルコキシもしくはアリールオキシであるか又は、Ｘ６がＯである場合に限ってＨであり得る）
の基からなる群から個々に選ばれ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つは水素でなく、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の各々は、式、
−Ｘｒ−Ｙ４−
（式中、ｒは少なくとも１の整数、各Ｘは個々にＣ又はＯであり、各Ｃは個々に置換された又は非置換であり得て、飽和又は不飽和であり得て、Ｙ４は結合ボンド、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及び−Ｎ＝Ｎ−からなる群から選ばれる）
の化合物から成る群から個々に選ばれ、
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の各々は個々にＯ又はＳである］
の化合物を用いて試料中の検体の存在又は量を検定する方法を提供する。【００２１】  本化合物が、ヌクレオチド及びアミノ酸のような生物系における興味がもたれるいずれかのモノマー単位を結合するために容易に適合し得る対称の多官能性連結単位を提供することは容易にわかる。種々の置換基を有していても、本化合物の環状の中央部分は、得られたオリゴマーの枝分れの程度が増加したときに有用であることが証明されている対称の基本的程度を与える。ある態様では、例えば、Ｙ１、Ｙ２及びＹ３が同一の原子であるように選ぶことにより対称度が増大し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が類似の基であるように選ぶか又は少なくとも「ｒ」について同じ値であるように選ぶことにより対称度はさらに増大する。そのような条件下で、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の相対的位置は実質的に交換でき、この特徴を有する各個別の官能基の議論が理解されなくてはならない。【００２２】  又、本化合物の対称性及び多官能性面ゆえに、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の適する選択によりそのような化合物を組み込むオリゴマーは、例えば、モノマー単位の１つ以上の新しい鎖、増大した数の標識又は他の官能性部分、本発明による付加的な化合物等を付加するために用いられ得る枝分れ点を有する。【００２３】  又、本化合物はアキラルであり、従って、その化合物を組み込むオリゴマーは、それによって立体異性にならない。立体異性は、ピークを広くするか又は電気泳動下で別に分割し、従って、ゲル精製及び／又は検出を複雑にするオリゴマーを生成する。【００２４】  それらのサイズと剛性のために、本化合物は、立体障害に関する困難性を低減する。特に、複数の標識のオリゴマーにおいて、又は複雑な枝分れパターンを有するオリゴマーにおいて、立体障害は、合成又はハイブリッド形成の効率を非常に低下させ得て、化合物を非常にコストがかかるものとするか又は非効率的なものとし、従って、複数の標識により達成されることが要求される増幅効果の利益を無効にする。【００２５】  本化合物のこれらの及び他の特徴を以下により詳細に記載する。【００２６】非ヌクレオシド連結基としての化合物の使用
本化合物の有用性は、分岐したオリゴヌクレオチドオリゴマーの合成用の非ヌクレオシド連結基として役立つ能力に言及することにより部分的に記載され得る。しかし、その記載は、他のオリゴマー構造の合成のための本化合物の使用における限定として解釈すべきではない。【００２７】  オリゴヌクレオチドオリゴマーを製造するための非ヌクレオシド単位としての化合物の開示において、下記の用語は、その用語が用いられている内容から、反する意味を有することが明らかでない限り、示された意味を有する。【００２８】  本明細書で用いられているように、用語「ヌクレオチド」は、燐酸エステル基、５炭糖及び窒素含有塩基から成る核酸のサブユニットを意味し、用語「ヌクレオシド」は連結した糖及び塩基から成るサブユニットである。それらの用語は又、そのようなサブユニットの類似体も含むと解釈される。【００２９】  本明細書で用いられているように、用語「ヌクレオチドオリゴマー（又はオリゴマー）」はホスホジエステル結合により連結されたヌクレオチドの鎖又はその類似体を意味する。【００３０】  本明細書で用いられているように、用語「非ヌクレオシドモノマーを含有するヌクレオチドオリゴマー（またはオリゴマー）」は、ホスホジエステル結合により連結された非ヌクレオシドモノマー単位とともにヌクレオシド単位を含むオリゴマーを意味する。【００３１】  そのような状況において、本発明は、ヌクレオシド及び非ヌクレオシド単位を含む主鎖を有する所定の配列のヌクレオチドオリゴマーを製造するために、合成によりヌクレオシドモノマー単位と結合され得る非ヌクレオシド化合物を提供する。上記の第一に提供される式、
【化７】
2004325457.tif 000008
の化合物の、ある態様において、Ｒ１及びＲ２は典型的には、取り除かれて非ヌクレオシドモノマーを含有するヌクレオチドオリゴマーの主鎖構造における他の単位との連結を促進する置換基である。それ自体、Ｒ１及びＲ２は、一般的には、水素、ブロック基及びキャッピング基から成る群から選ばれる。通常、そのようなブロック基は、酸に対して不安定で塩基に対して安定なブロック基であり、そのようなキャッピング基は、アシルキャッピング基である。そのようなブロック基は、本技術分野でよく知られており、例えば、トリフェニルメチル化合物並びに、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基のようなそれらのアルコキシ誘導体を含む。又、別個の脱ブロック処理を必要とするブロック基の使用、例えば、レブリン酸（ＬＥＶ）のエステルのような、酸に対して安定で塩基に対して不安定なブロック基を別に又は酸に対して安定で塩基に対して不安定なブロック基と組み合わせて用いることは、制御された連続した脱ブロックをさせ、分岐したオリゴマーの合成において、より大きな多用性を与える。【００３２】  本発明の１つの態様では、Ｒ１と特定された基は、ヌクレオシドモノマー単位との連結を容易にするための置換基であり、Ｒ２と特定された基は、非ヌクレオシドモノマーを含有するヌクレオチドオリゴマー中に含まれることが望ましい他の官能性部分及び他の官能基との連結を容易にすることを意図する置換基である。そのような基は、通常、標識及び他のリポーター部分を含む。例として、Ｒ１はＤＭＴ又はＬＥＶであることができ、Ｒ２はＤＭＴ、ＬＥＶ又は標識であることができ、最も通常には連結基により結合されている。【００３３】  本化合物の上記の態様において、Ｒ３は、非ヌクレオシドモノマーを含有するヌクレオチドオリゴマーの主鎖構造における他の単位との連結を容易にすることが意図される置換基であるか又は、Ｒ３は固体支持体等への結合ボンドを形成する。典型的には、そのような連結は、自動化ＤＮＡ／ＲＮＡ合成プロトコルのような自動化法により達成される。それ自体Ｒ３は、一般的に、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスファイト、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネート及びホスホロチオエートから成る群から選ばれる。そのような基は本技術分野でよく知られており、例えば、式、
【化８】
2004325457.tif 000009
又は
【化９】
2004325457.tif 000010
（式中、Ｘ４はハロゲン又は置換されたアミノであり、Ｘ５はアルキル、アルコキシ、アリールオキシ又はそれらのシアノ誘導体であり、Ｘ６はハロゲン、アミノ又はＯであり、Ｘ７はアルキル、アルコキシもしくはアリールオキシであるか又は、Ｘ６がＯである場合に限ってＨであり得る）の基を含むか又は、
Ｒ３は、直接又は仲介基を通しての固体支持体への結合ボンドである。通常の核酸合成化学に適応させるために、Ｒ３は通常、ホスホルアミダイト（典型的にはシアノエチル又はＯ−メチル）又はＨ−ホスホネートであるか又は、調整された細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）のような固体支持体に、しばしば長鎖アルキルアミン（ＬＣＡＡ）のような連結部分を経由して、連結される。先に記載したように、高度の対称性を有する化合物の態様において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の相対的な立体的位置は、自由に互換性であると考えるべきである。【００３４】  本化合物のある態様において、Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の各々は、Ｏ及びＳから成る群から個々に選ばれる。そのような基は、主に、その化合物の核の剛性及び対称性を増大するために役立ち、従って、特定の原子又は基の選択は、非常に便宜的な問題である。例えば、Ｙ１、Ｙ２及びＹ３をＯとして選ぶことにより、通常、入手できるシアヌル酸部分は、本発明による化合物を製造するための便利な、高価でない出発物質として役立ち得る。【００３５】  さらに、本化合物において、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３として特定される基は、少なくとも部分的には、モノマー単位として機能するときに非ヌクレオシド化合物中で適切な分子内距離を維持するために役立つ。そのような基は、立体障害により生じる障害を最小にしながら、例えばビオチンのような嵩高な標識部分の使用を可能にする。それ自体、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の各々は、式、
−Ｘｒ−Ｙ４−
（他の原子又は原子の基もこの資格において役立ち得るが、式中、ｒは少なくとも１の整数、各Ｘは個々にＣ又はＯであり、各Ｃは個々に置換された又は非置換であり得て、飽和又は不飽和であり得て、Ｙ４は結合ボンド、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及び−Ｎ＝Ｎ−からなる群から選ばれる）
の化合物から成る群から個々に選ばれる。又、上記のように、広範囲の容認できる基が、便利な高価でない出発物質を選ぶ能力を与える。例えば、Ｙ１、Ｙ２及びＹ３がＯである場合、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の各々を（ＣＨ２）２−Ｏとして選ぶことにより、通常、入手できる化学薬品である１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸［例えば、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏ．）（ミズーリー州、セントルイス）から製品番号３０，９００−１として容易に入手できる］が、本発明による化合物を製造するための出発物質として役立つことができる。【００３６】  又、それらの基を伸ばすことが、すなわちｒが３より大きい場合が、ある態様において望ましいときに、この課題を達成するために、高価でなく、容易に入手できる化合物を用いることは、通常便利である。例えば、エチレングリコール系のスペーサー／リンカー、例えば、ポリエレングリコールの使用は、そのような伸長された類似物質の合成をしばしば容易にする。このことにより、−Ｃ２Ｏ−反復単位をもたらし、この基の使用が必要でないことが容易に認識されるが、それは非常に好都合なことである。【００３７】  又、特に、本化合物がダイマー又はオリゴマー構造に組み込まれた場合に、本化合物のＲ１、Ｒ２及びＲ３基は、隣接するモノマー単位（ヌクレオシドもしくは非ヌクレオシド）への又は、ガラスビーズ、例えば調整された細孔ガラス（ＣＰＧ）、マイクロビーズ、樹脂、ポリスチレンのようなポリマー、膜、マイクロ力価プレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）等のような固体支持体への連結基及び／又は結合ボンドを含む。【００３８】非ペプチド連結基としての化合物の使用
本化合物には又、分岐したオリゴペプチドの合成のための非ペプチド連結基としての使用が見出だされた。そのような化合物は、上記の非ヌクレオシド化合物と共通した種々の特徴を有するが、この点に関して効率的に機能するために、この化合物には、特定の修飾が明らかに望ましい。例えば、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３として用いられるブロック基及びキャッピング基は、従来のペプチド合成化学、最も通常には、固相ペプチド合成に適合するように選ばれる。【００３９】  固相ペプチド合成は、不溶性のポリマー支持体に結合したポリペプチド鎖の段階的合成であり、生成物の損失をせずに精製操作を非常に単純にしながら、溶液中で用いられる化学的方法を維持する。合成は、ポリペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端へと進行する。【００４０】  それぞれの連続的なアミノ酸モノマー単位のカルボキシル基は、いくつかの方法の１つにより活性化され、次に、新生鎖のアミノ末端基と結合される。モノマー単位のα−アミノ基は、この部位におけるペプチド結合形成を阻止するために一時的に保護されており、次の合成サイクルの初めに脱保護される。又、アミノ酸モノマー単位における反応性の側基は典型的には、キャッピング基のような永久的な保護基で保護される。ポリペプチドオリゴマーは、望ましいオリゴマーが得られるまで、合成サイクルを繰り返すことにより伸長される。【００４１】  アミノブロック基の特定により、用いられる合成化学的方法並びに側鎖保護基の性質の両方とも決定される。最も通常に用いられるアミノブロック基は、ＦＭＯＣ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）及びｔ−ＢＯＣ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）である。ＦＭＯＣ側鎖保護は、一般的に、ｔｅｒｔ−ブタノールのエステル、エーテル及びウレタン誘導体により与えられ、相当するｔ−ＢＯＣ保護基は、ベンジルアルコールのエステル、エーテル及びウレタン誘導体である。後者は、より大きな酸安定性のために電子吸引ハロゲンの導入により、通常修飾される。シクロペンチル又はシクロヘキシルアルコールのエステル及びエーテル誘導体も用いられる。【００４２】  ＦＭＯＣ保護基は、塩基に対して不安定であり、通常、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンのような塩基で除去される。合成の終りに、側鎖保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理により除去され、トリフルオロ酢酸は又、ポリペプチド鎖と固体支持体との間の結合も切断する。ｔ−ＢＯＣ化学において、酸に対して不安定なｔ−ＢＯＣ保護基は、緩酸、通常、希ＴＦＡを用いて除去される。アミノ酸側鎖を脱保護するのと、固体支持体からポリペプチドを切断するのとの両方に、弗化水素酸（ＨＦ）が用いられる。ｔ−ＢＯＣ化学的方法において用いられる操作よりも緩和であり、ペプチド鎖は各合成サイクルにおいて酸溶液に付さず、最終の脱保護及び切断工程が、ずつと強いＨＦ酸条件でなくＴＦＡで達成できるので、ＦＭＯＣ合成操作が一般的に好ましい。【００４３】  従って、望ましいペプチド合成化学的方法の選択により、適するＲ１、Ｒ２及びＲ３基は当然のこととして選ばれる。同様に、そのような非ペプチド化合物において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、非ヌクレオシド化合物について記載されているような燐酸エステル基であるようには選ばれない。【００４４】多官能性リンカーとしての化合物の使用
非ヌクレオシドモノマーとしての本化合物の記載にもどると、本発明の１つの利点は、信号の増幅をもたらす、オリゴヌクレオチドへのリポーター分子の複数のコピーの組み込みをさせる分岐した核酸構造を合成するために、例えば非ヌクレオシドホスホルアミダイトを提供することである。そのようなホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）は自動化ＤＮＡ／ＲＮＡ合成プロトコルに適合する。【００４５】  図１に示されているように、そして以下に詳細に記載されているように、適する化合物及び適合する合成法の構想の選択により、そのような分岐したオリゴマーは、特に「フオーク」又は「櫛」型構造を与えることができる。【００４６】  例として、上記の１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸に基づいた非ヌクレオシドホスホルアミダイトが提供される。それらのアミダイトは、複数標識されたオリゴヌクレオチドを合成するのに有利に用いられ得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、標的検出用途において信号強度を増大する。【００４７】  構造１に示したように、１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸の一級ヒドロキシル基の２つは、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）エーテル（Ｒ１及びＲ２）として保護され、第三の一級ヒドロキシ基は、標準法を用いてβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（Ｒ３）に変換される。
【化１０】
2004325457.tif 000011
【００４８】                              構造Ｉ
このアミダイト化合物は、２つの実質的に同一のアームを有するので、成長する  ＤＮＡ構造に同一の分枝点（フォーク）を導入するためにＤＮＡ合成中に用いることができる。次に、合成のさらなる伸長は、両方のアームで同時に生じ得る。【００４９】  この化合物により、核酸合成において、複数のサイクルの各々においてフォーク（分枝点）の付加をさせ、２ｎ５′−末端（ｎはアミダイトの付加数に等しい）を有する「分岐した」ＤＮＡ構造をもたらす。このように、この方法では、リポーター分子、例えば、ビオチン、フルオレセイン等が付加できる５′末端における複数のヒドロキシル（又は他の官能）基が与えられる。リポーター分子の付加は、自動合成機で直接又は、オリゴヌクレオチドの切断及び脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）の後の後合成により行われる。【００５０】  構造ＩＩにおいて、一級ヒドロキシル基の１つはＤＭＴエーテル（Ｒ１）として保護されており、１つはレブリン酸エステル（Ｒ２）として保護されており、３番目の１つはＣＥＤ−ホスホルアミダイト（Ｒ３）に変換されている。
【化１１】
2004325457.tif 000012
【００５１】                              構造ＩＩ
ＤＭＴ及びＬＥＶの各々は異なる脱ブロック操作を必要とするので、このアミダイト化合物は、オリゴヌクレオチド鎖において非対称の分枝点を生じさせ、鎖のさらなる合成により「櫛」型構造がもたらされる。【００５２】  構造ＩＩＩにおいては、ヒドロキシル基の１つ（Ｒ２における）はリンカーアーム（Ｘ）を介して官能部分（例えば、アミノ、チオール、ビオチン、フルオレセイン等）に結合し、１つ（Ｒ３における）はホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネートであるか又はＬＣＡＡ−ＣＰＧに結合している（まとめてＲと表わされている）。これらの化合物類には、市販されている他のビオチン又はフルオレセインホスホルアミダイトと類似の一般的用途が見出だされるはずである。
【化１２】
2004325457.tif 000013
【００５３】                              構造ＩＩＩ
構造ＩＶは、構造Ｉの二量体型である。この型においては、２つの同一の枝別れしたサブユニットがともに一般的リンカー部分（Ｘ）を介して連結されている。このタイプのアミダイト化合物の利点は、合成サイクル当りヌクレオチドオリゴマーに４つの同一の分枝点が導入されることである。
【化１３】
2004325457.tif 000014
【００５４】                              構造ＩＶ
又、適する鎖の伸長により、構造１で表わされる本化合物を組み込むオリゴマーは、それらの３′末端において連結された複数のオリゴヌクレオチドを与え、種々の標識方法及びプローブ方法において有用であると証明されることが予測される。【００５５】  本非ヌクレオシド化合物の化学的性質のために、これらの化合物はヌクレオチドオリゴマー配列内の望ましい点に配置され得る。このように、広範囲の性質を、ヌクレオシド及び非ヌクレオシドモノマー単位の両方を含有するオリゴマーに企図することが可能である。そのような性質には、オリゴマー内の望ましい位置における「官能性部分」と本明細書中で名付けられた特異的部分の結合が含まれる。そのような部分には、検出可能な標識（酵素、色原体、蛍光色素、放射性物質、化学的発光体等）、内位添加剤、金属キレート剤、薬物、ホルモン、蛋白質、ペプチド、遊離基発生剤、核酸分解剤（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、蛋白質分解剤、触媒、特異的結合剤（ビオチン、抗原、ヘプテン、抗体、受容体等を含む）並びに他の生物学的関連物質が、生物学的バリヤー（膜のような）を通過するＤＮＡ輸送を変える作用剤及びヌクレオチドオリゴマーの可溶性を変える物質とともに含まれ得る（しかし、これらには限定されない）。このように、そのような標識及び作用剤が、望ましいヌクレオチドに隣接されて配置されることが可能である。【００５６】  本化合物において、化学的コア構造の剛性も又、回転性の自由により「折り重なり」する傾向を最小にし、それにより本発明の化合物の結合効率及び枝分れ能力の両方を実質的に増大させることにより、オリゴマー主鎖構造から離れた連結基及び官能性部分を伸長させる望ましい特徴を与える。【００５７】  オリゴマーにおけるモノマー単位としての化合物の含有の前又は後に、化合物に官能性部分を付加することも当然、本発明の範囲内である。又、官能性部分は、固体支持体への結合としても役立つ。【００５８】  先に記載したように、本非ヌクレオシド化合物は、ヌクレオチドオリゴマーの合成を開始する前又は後に望ましい化学的部分が結合している又は結合され得るリンカー官能基を有する。【００５９】  一般的に、連結部分をリンカーアームに連結する技術は、蛋白質における基における連結標識として知られている技術と類似である。有用な化学反応の例には、活性エステル、活性イミン、アリールフルオライド又はイソチオシアネートとのアルキルアミンの反応並びにマレイミド、ハロアセチル等とのチオールの反応が含まれる［文献２５及び２６］。【００６０】  先に記載したように、本非ヌクレオシド化合物の化学的性質のために、それらの化合物は、ヌクレオチドオリゴマー配列内の望ましい点において配置され得る。このように、広範囲の性質を、ヌクレオシド及び非ヌクレオシドモノマー単位の両方を含有するオリゴマーにデザインすることが可能である。そのような性質には、オリゴマー内の望ましい位置における特異的官能性部分の結合が含まれる。【００６１】  本発明の実施により与えられる他の利点には、例えば、ヌクレオチド親和性支持体を構築するために支持体の化学的部分に官能基結合したリンカーアームを用いることにより固体支持体に特定の配��を固定する能力が含まれる。複数の化学的部分は又、特定のヌクレオチドオリゴマー配列における複数の非ヌクレオシドモノマー単位を介してオリゴマーに組み込まれ得る。【００６２】  ポリヌクレオチドにおいて作用する蛋白質及び酵素を用いることにより変化した活性度を含むことにおいて、天然に生じるポリヌクレオチドとは異なるオリゴマーが提供される。例えば、他の純粋なポリヌクレオチドの３′末端における非ヌクレオシドモノマーの配置は、ヘビの毒液のホスホジエステラーゼによる減成に対する抵抗を付与するか又は選択されたヌクレアーゼのための特異的切断部位を与える。【００６３】  ハイブリッド形成プローブは又、ハイブリッド形成性ヌクレオシドモノマー単位及び非ヌクレオシドモノマー単位を散在させることによっても構築され得る。例えば、ヌクレオシド及び非ヌクレオシドモノマーの混合された合成が行われ、それにより、ヌクレオシドモノマーの所定の配列が合成され、次に１つ以上の非ヌクレオシドモノマー単位の配列が合成され、任意に次にヌクレオシドモノマーの所定の配列の第二のブロックが合成される。【００６４】  本発明は又、１つ以上の塩基対が異なるヌクレオチドオリゴマーを同時に検出する合成プローブを構築する能力を提供する。この能力は、本明細書に記載された非ヌクレオシド化合物を用いることにより達成され、種々の標的ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列に違いが生じる選ばれた部位において非ヌクレオシドモノマー単位を有するプローブ中のヌクレオチドを置換する。【００６５】  本発明の選ばれた態様において、標識したハイブリッド形成プローブが、ヌクレオシドモノマー及び非ヌクレオシドモノマーを含む所定の配列を有するオリゴマーとして構築される。そのような非ヌクレオシドモノマー単位は、ヌクレオチドオリゴマーの選択された領域中に集まり得るか又は配列全体に散在され得る。非ヌクレオシドモノマー単位はハイブリッド形成反応における使用のために化学的に標識され得る。【００６６】  本発明において、現在行われているＤＮＡ／ＲＮＡ合成法を用いて混合されたヌクレオチド、非ヌクレオチドオリゴマーを製造するために段階的形態で添加させるように非ヌクレオシド化合物が提供される。そのような化合物は通常、段階的方法で添加されて、相当するモノマー単位を、固体支持体に共有的に固定化されている増大しているオリゴヌクレオチド鎖に結合する。典型的には、最初のヌクレオチドは、合成の開始前に切断性エステル結合により支持体に結合される。本発明において、非ヌクレオシド化合物は、そのような固体支持体、例えば、調整された細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、樹脂、ポリスチレンのようなポリマー等に都合よく結合した非ヌクレオシド化合物が提供され得る。オリゴヌクレオチド鎖の段階的伸長は、通常、３′から５′方向に行われる。そのような核酸合成法は知られている［文献２７−２８］。【００６７】  合成が完了したときに、オリゴマーは、エステル結合を加水分解することにより支持体から切断され、最初に支持体に結合していたヌクレオチドは、得られたオリゴマーの３′末端になる。従って、本発明は、前記化合物を用いて、試料中の検���の存在又は量を検定する方法を提供する。【００６８】  典型的には、前記化合物は、ヌクレオシドモノマー単位及び非ヌクレオシドモノマー単位のオリゴマーに段階的に含ませるための２つの結合基を有する。最初の結合基は、モノマー単位の成長鎖の末端に効率的に連結することができる性質を有する。二番目の結合基は、混合されたヌクレオシドモノマー及び非ヌクレオシドモノマーの成長鎖を段階的様式でさらに伸長させることができる。このことは、一番目の結合基が連結する間、そのときに実質的に連結しないように二番目の結合基が不活化することを典型的に必要とし、その後に、二番目の結合基が非ヌクレオシドモノマー単位に連結するようにその後に活性され得る。その不活性化は、好ましくは、二番目の結合基における保護基を用いて達成され、次に二番目の結合基を活性化させるために除去され得る。そのような「不活性化」及び「活性化」は、単に反応条件（例えば、ｐＨ、温度、化合物の濃度等）を変えることにより行われ得るということは、そのような技術により二番目の結合基を不活性化及び活性化させるのに適する化学的構造の二番目の結合基とともに本発明の範囲内であると考えられる。そのような結合基は、ヌクレオシドモノマー単位又は非ヌクレオシドモノマー単位のいずれかの隣接結合をさせる。そのような結合基が、標準自動ＤＮＡ合成法に適応できる結合及び脱保護工程により操作することが望ましいと考えられる。【００６９】  そのような方法は典型的には、合成が一方向に生じ、すべての結合切断及び脱保護工程が、オリゴマー主鎖及びその種々の成分に実質的に悪影響を与えない「非有害条件」下で行うことを必要とする。【００７０】  このように、本発明において用いられ化合物を含有するオリゴマーを、ヌクレオシド単位及び非ヌクレオシド単位の両方を含有するオリゴマーの合成におけるそのような化合物を用いる方法とともに提供する。【００７１】  本化合物の使用を容易にするために、オリゴマーを構築することにおける使用のためのキットが提供され、上記の方法の実施を単純にする。そのキットは典型的には、１つ以上の個々の試薬の容器を保持するために適合した受け器並びに、式、
【化１４】
2004325457.tif 000015
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３並びにＹ１、Ｙ２及びＹ３は先に定義された通りである）
による試薬（１）を含有する少なくとも第一の容器
を含む。その試薬は、溶媒及び試薬又は、所定の量まで試薬容器に充填するのに用いられる他の容器からの溶媒が用いられるときに望ましい濃度にするのに適する量の試薬（２）を含む溶液として提供され得る。【００７２】  多くの場合、そのキットは、オリゴマーの合成において用いられる試薬（１）又は目的試薬に含まれる官能性部分の検出に用いられる試薬（２）を含有する少なくとも第二の容器又は、そのような物質の両方を含有する容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ）を含む。そのような試薬は、本技術分野でよく知られており、本明細書中でさらに記載することを必要としない。本発明の一般的な例における特定の実施例を下に記載する。本発明の方法を行うための適切な使用説明書もそのキット中に含まれている。
【実施例】
【００７３】  下記の実施例は、本発明の特定の好ましい態様及び面を示すのに役立つものであり、本発明の範囲を限定するものとしてとらえるべきではない。【００７４】実験
次の実験における開示において、他に示していない限り、すべての重量は、グラム数（ｇ）、ミリグラム数（ｍｇ）、マイクログラム数（μｇ）、ナノグラム数（ｎｇ）又はピコグラム数（ｐｇ）で与えられ、すべての量は、モル数（ｍｏｌ）、ミリモル数（ｍｍｏｌ）、マイクロモル数（μｍｏｌ）、ナノモル数（ｎｍｏｌ）、ピコモル数（ｐｍｏｌ）又はフェムトモル数（ｆｍｏｌ）で与えられ、すべての濃度は、容量％、容量による割合（ｖ：ｖ）、モル濃度（ｍｏｌａｒ）（Ｍ）、ミリモル濃度（ｍＭ）、マイクロモル濃度（μＭ）、ナノモル濃度（ｎＭ）、ピコモル濃度（ｐＭ）、フェムトモル濃度（ｆＭ）又は規定濃度（Ｎ）により与えられ、すべての容量は、リットル数（１）、ミリリットル数（ｍｌ）又はマイクロリットル数（μｌ）で与えられ、線寸法は、ミリメートル（ｍｍ）又はナノメートル（ｎｍ）で与えられる。【００７５】  下記の実施例は、本発明に用いられる化合物の合成並びに、モノマー単位を有する分岐したオリゴマーを生成することにおけるそれらの使用を示す。【００７６】実施例１
本発明に用いられる化合物は、本技術分野でよく知られた化学的合成技術を用いることにより合成されることができる。下記のプロトコルは、本発明の範囲内の選ばれた化合物の合成を示す。【００７７】  化合物１（構造Ｉ）の合成プロトコルを以下に示す。【００７８】工程Ｉ：１，３−ビス−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸の合成
１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸［１００ｇ、０．３８モル、アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）］を１．０リットルの無水ピリジン中に溶解した。この溶液に、４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（２６０．６ｇ、０．７７モル）を添加し、その反応混合物をアルゴン下で室温で一晩攪拌した。その反応を、２０ｍｌのメタノールの添加により１時間攪拌して停止させた。蒸発乾固させた後に、その反応混合物を８００ｍｌの塩化メチレン中に溶解し、その有機抽出物を５％ＮａＨＣＯ３水溶液で洗滌（２×３００ｍｌ）し、次に無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。真空下での溶媒の蒸発により、約３８０ｇの粗生成物を得、それを、シリカゲルでのヘキサン：酢酸エチル（１：１、ｖ／ｖ）で溶離させるカラムクロマトグラフィーにより精製し、約１５３ｇを得た。【００７９】工程ＩＩ：ホスホルアミダイト−化合物１の合成
先の工程Ｉで得たビスＤＭＴを標準法を用いて相当するホスホルアミダイトに変換した。従って、４３ｇのビスＤＭＴ化合物（５０ミリモル）を３００ｍｌの無水塩化メチレン中に溶解し、得られた溶液をアルゴン下でジイソプロピルエチルアミン（３２ｍｌ、１８０ミリモル）で処理した。得られた溶液を氷浴を用いて５乃至１０℃に冷却した。１００ｍｌの塩化メチレン中２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（２１．３ｇ、９０ミリモル）の溶液をその反応混合物に滴下して添加し、その反応を室温で一晩進行させた。ＴＬＣ分析（ヘキサン／酢酸エチル７：３、ｖ／ｖ）により、その反応が完了したことが示された。その反応混合物を１．０リットルの塩化メチレンに注ぎ、有機層を５％の炭酸水素ナトリウム溶液で洗滌（２×５００ｍｌ）し、次に無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。回転蒸発による溶媒の除去により、６３ｇの粗生成物が得られ、それをシリカゲルでのヘキサン：酢酸エチル／トリエチルアミン（７０：３０：０．５、ｖ／ｖ／ｖ）で溶離させるカラムクロマトグラフィーにより精製し、３２ｇの純粋な化合物１を得た。【００８０】実施例２
化合物２（構造ＩＩ）の合成プロトコルを以下に示す。【００８１】工程Ｉ：１−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸の合成
１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸のモノＤＭＴ誘導体を下記のように製造した。１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸［２００ｇ、０．７７モル、アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を３．０リットルの無水ピリジン中で室温で３０分間攪拌することにより溶解した。この溶液に、４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（５２ｇ、０．１５モル）の２５０ｍｌ無水ピリジン中溶液を滴下し添加した。その添加は約３時間以内で完了し、その反応混合物をアルゴン下で室温で一晩攪拌した。ＴＬＣ分析（ヘキサン／酢酸エチル１５：８５、ｖ／ｖ）により、その反応が完了したことを示された。次にその粗反応混合物を回転蒸発により蒸発乾固させた。次に、その粗混合物をトルエンで処理（２×２５０ｍｌ）し、次に真空下で蒸発乾固することにより、残存するピリジンを除去した。【００８２】  このように得られた残渣を１．０リットルの塩化メチレン中に懸濁させ、反応していない１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸を濾過により除去した。有機抽出物をとっておき、濾液を１．０リットルの塩化メチレンで２回抽出した。塩化メチレン抽出物を合わせ、真空下で濃縮した。このようにして得た残渣を７００ｍｌの塩化メチレン中に溶解し、５％ＮａＨＣＯ３水溶液で洗滌（２×４００ｍｌ）し、次に無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。真空下での溶媒の蒸発により、約９０ｇの粗生成物を得、それを、シリカゲルでの塩化メチレン中３％メタノールで溶離させるカラムクロマトグラフィーにより精製し、４１．２ｇの純粋な生成物を得た。【００８３】工程ＩＩ：モノレブリン酸エステルの合成
先の工程Ｉで得たモノＤＭＴを下記のようにモノレブリン酸エステルに変換した。１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸のモノＤＭＴ誘導体（２０．０ｇ、３５．５ミリモル）を３５０ｍｌの無水ピリジン中に溶解し、得られた溶液をアルゴン下で攪拌した。この溶液に無水レブリン酸（７．６ｇ、３５．５ミリモル）の５０ｍｌ無水ピリジン中溶液を約３時間にわたり滴下して添加した。その反応を室温で４時間進行させた。その反応混合物のＴＬＣ分析（塩化メチレン中５％のメタノール）により、未反応の出発物質の存在が示された。無水レブリン酸（１．９ｇ、８．９ミリモル）の１０ｍｌピリジン中溶液を滴下して添加し、その反応を一日進行させた。次にその粗反応混合物を回転蒸発により蒸発乾固した。次に、その粗混合物をトルエンで処理（２×２００ｍｌ）し、次に真空下で蒸発乾固することにより、残存するピリジンを除去した。その残渣を５００ｍｌの塩化メチレン中に再溶解させ、その溶液を５％のＮａＨＣＯ３水溶液で洗滌（３×４００ｍｌ）し、次に無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。真空下での溶媒の蒸発により、約２４．２ｇの粗生成物が得られ、それをシリカゲルでの塩化メチレン中１％メタノールで溶離させるカラムクロマトグラフィーにより精製し、６．９ｇの純粋なモノ−レブリン酸エステルを得た。所望の生成物の他に、かなりの量（約５ｇ）のビス−レブリン酸エステルと未反応の出発物質（モノ−ＤＭＴ化合物、４．０ｇ）も単離した。【００８４】工程ＩＩＩ：ホスホルアミダイト化合物２の合成
先の工程ＩＩで得た中間体を標準法を用いて相当するホスホルアミダイトに変換した。１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸（５．０ｇ、７．５６ミリモル）のモノ−ＤＭＴ−モノ−レブリン酸エステルを１５０ｍｌの塩化メチレン中に溶解し、得られた溶液を３．４２ｇの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．５当量、１１．３４ミリモル）と６４６．４ｍｇのジイソプロピルアミン−テトラゾール塩（０．５当量、３．７８ミリモル）で処理した。アルゴン下、室温で２４時間攪拌後、ＴＬＣ分析（塩化メチレン中３％メタノール）によりその反応が完了したことが示された。その反応混合物を２５０ｍｌの塩化メチレンで希釈し、５％の炭酸水素ナトリウム溶液で洗滌（３×３００ｍｌ）し、次に無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。回転蒸発による溶媒の除去により、７．４ｇの粗生成物が得られ、それをシリカゲルでの酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン（３５：６５：０．５、ｖ／ｖ／ｖ）で溶離させるカラムクロマトグラフィーにより精製した。約５．１ｇの純粋な化合物２が粘着性の白色固体として得られた。【００８５】実施例３
化合物３ａ（構造ＩＩＩ、標識＝ビオチン）についての合成プロトコルを下記に及び図２において示す。【００８６】工程Ｉ：１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸のジベンゾエートエステル（ａ）の合成
１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸（１４２ｇ、０．５４ミリモル）の１．０リットル塩化メチレン及び５００ｍｌピリジン中の氷のように冷たい溶液に、１２８ｍｌ（１．０９ミリモル）の塩化ベンゾイルを滴下して添加した。その反応混合物を室温で一晩攪拌し、その後にＴＬＣ分析（塩化メチレン／メタノール、１００：５、ｖ／ｖ）によりその反応が完了したことを示された。２００ｍｌの水の添加、その後の室温での１時間の攪拌によりその反応を停止させた。その反応混合物を真空下で蒸発させ、シロップ状の残渣を得た。その残渣を塩化メチレン中で溶解させ、５％のＮａＨＣＯ３水溶液で洗滌（２×５００ｍｌ）した。その有機溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮し、２５４ｇの粗生成物を得た。この生成物をシリカゲルでの塩化メチレン／メタノール（１００：３、ｖ／ｖ）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物を溶離した（９１ｇの純粋なジベンゾエートａを得た）。この所望の生成物を高減圧により２日間さらに乾燥させた。【００８７】工程ＩＩ：ニトリル（ｂ）の製造
先に得られたジベンゾエートエステル（７６ｇ、１６２ミリモル）を４００ｍｌのアクリロニトリル中に懸濁させ、得られた混合物をアルゴン下、室温で、その溶解が完了するまで攪拌した。この溶液に、水素化ナトリウム（６０％分散体、１．３ｇ、３２ミリモル）を添加し、１０分間攪拌を続けた。その反応混合物は非常に粘性になり、次に攪拌を容易にするために無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、４００ｍｌ）で希釈した。室温で約３時間攪拌後、ＴＬＣ分析（塩化メチレン／メタノール、１００：５、ｖ／ｖ）によりその反応が完了したことが示された。４ｍｌの濃塩酸のゆっくりとした添加、次に３０分間の攪拌により、その反応を停止させた。次にその反応混合物を濃縮してアクリロニトリル及びＴＨＦを除去した。得られた残渣を１．０リットルの塩化メチレン中に溶解させ、５％のＮａＨＣＯ３水溶液で洗滌（２×５００ｍｌ）した。その有機溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮し、８６ｇの粗生成物を得た。この生成物を、シリカゲルでのヘキサン／酢酸エチル（６：４ｖ／ｖ）を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物を溶離した（約４２ｇのｂを得た）。【００８８】工程ＩＩＩ：アミン（ｃ）の製造
先に得られたニトリルｂ（４０．０ｇ、７６．６ミリモル）をメタノール（５００ｍｌ）中に溶解し、塩化コバルト（ＩＩ）・６Ｈ２Ｏ（３６．５ｇ、１５３ミリモル）を添加した。この攪拌し、冷却（氷浴）した溶液に硼水素化ナトリウム（２８．７ｇ、０．７６モル）を数回にわけて添加した。攪拌を１時間続け、次に、濃縮した水酸化アンモニウム溶液（２００ｍｌ）を添加した。その得られた懸濁液を濾過し、濾液を濃縮し、メタノールを除去した。次にその反応混合物を塩化メチレン（１．２リットル）で抽出し、抽出物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次に蒸発させ、アミンｃを油として得た（３０．６ｇ）。アミンｃを、シリカゲルでの、溶離剤として塩化メチレン中５．０乃至８．０％のメタノールを用いる勾配溶離を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。【００８９】工程ＩＶ：ビオチン活性エステルとの反応−（ｄ）の製造
アミンｃ（８．０ｇ、１５．２ミリモル）の１００ｍｌの塩化メチレン中溶液に、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（６．５ｇ、１７．５ミリモル）の無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、８０ｍｌ）中溶液を滴下して添加し、次にトリエチルアミン（４．３ｍｌ、３０．５ミリモル）の添加をした。室温で１時間後、ＴＬＣ分析によりその反応が完了したことを示した。その反応混合物を濃縮し、塩化メタレンを除去し、次に、２０ｍｌのメタノール、続いて１０ｍｌの１０％炭酸ナトリウム溶液の添加により反応を停止させた。３０分間攪拌後、その反応混合物を酢酸エチル（８００ｍｌ）で抽出し、有機抽出物をブラインで洗滌（２×３００ｍｌ）し、最後に無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。真空下での溶媒の蒸発により、表記化合物ｄ（１５．７ｇ）を得た。この粗生成物をシリカゲルで塩化メチレン中２．５乃至６．０％のメタノールでの勾配溶離を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製し、約９．２ｇを得た。【００９０】工程Ｖ：ベンゾエートエステルの加水分解−（ｅ）の製造
ｄ（９．０ｇ、１１．３ミリモル）のＤＭＦ（１００ｍｌ）中の氷のように冷たい溶液にナトリウムメトキシドのメタノール中溶液（２５％ｗ／ｖ、９．４ｍｌ、４３．５ミリモル）を滴下して添加した。その反応を０乃至５℃で１時間進行させた。次に、その反応混合物に２８ｇのＤｏｗｅｘ５０Ｘ８−１００樹脂を添加し、続いて１５分間攪拌することにより、その溶液のｐＨを７．０に調整した。その樹脂を濾去し、濾液を蒸発させてＤＭＦを除去した。その残渣を塩化メチレン（１０ｍｌ）中に溶解し、その生成物をヘキサン（５０ｍｌ）から再沈殿させた。乾燥後、約６．７ｇの生成物ｅが得られ、さらに精製をすることなく用いられた。【００９１】工程ＶＩ：ｅのジメトキシトリチル化−（ｆ）の製造
化合物ｅ（６．７ｇ、１１．３ミリモル）を１００ｍｌの無水ピリジン中に溶解し、共沸乾固させた。その残渣を２００ｍｌのピリジン中に溶解させた。この溶液中に、４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（３．８ｇ、１１．３ミリモル）を添加し、その反応混合物をアルゴン下で室温で一晩攪拌した。５ｍｌのメタノールの添加及び１時間の攪拌によりその反応を停止させた。蒸発乾固の後に、その反応混合物を５００ｍｌの塩化メチレン中に溶解し、有機抽出物を５％のＮａＨＣＯ３水溶液で洗滌（２×２００ｍｌ）し、次に無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。真空下での溶媒の蒸発により、約７．３ｇの粗生成物を得、この粗生成物を、シリカゲルでの塩化メチレン／メタノール（１００：４ｖ／ｖ）を用いて溶離させるカラムクロマトグラフィーにより精製した。【００９２】工程ＶＩＩ：ホスホルアミダイト３ａの合成
先の工程ＶＩで得られた中間体を標準法を用いて、相当するホスホルアミダイトに変換した。従って、ｆ（１．３ｇ、１．５ミリモル）を３０ｍｌの塩化メチレン中に溶解し、得られた溶液を０．７４ｍｌの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２．２５ミリモル）と１５０ｍｇのジイソプロピルアミンテトラゾール塩で処理した。室温で１５時間後、１．０ｍｌのメタノールの添加によりその反応を停止させた。その反応混合物を２００ｍｌの塩化メチレン中に注ぎ、有機層を５％の炭酸水素ナトリウム溶液で洗滌（２×８０ｍｌ）し、次に無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。回転蒸発による溶媒の除去により、１．９ｇの粗生成物を得、この粗生成物を、シリカゲルでの塩化メチレン／メタノール／トリエチルアミン（１００：１：１、ｖ／ｖ／ｖ）を用いて溶離させるカラムクロマトグラフィーにより精製した。【００９３】実施例４：分岐したオリゴヌクレオチドプローブ構造の試験
下記の実施例は、本発明の検出方法に用いられるの化合物を用いて構築されたオリゴヌクレオチドプローブの検出を示す。【００９４】  マイクロ力価プレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）検定の実施例において、その検出は、基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いるストレプタビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−アルカリ性ホスファターゼ系を用いて行った。アルカリ性ホスファターゼによる加水分解によりこの基質は４０５ｎｍで検出可能な色原体に変換した。「ドット−ブラット（ｄｏｔ−ｂｌｏｔ）」モデルに従う検定実施例では、化学的発光性基質ＣＤＰＳｔａｒ（登録商標）（マサチュセッツ州、ベッドフォードのＴＲＯＰＩＸ  Ｉｎｃ．）が用いられた。基質の加水分解により発光はＸ線フィルムにおいてとらえられた。【００９５】  実施例として３つの検定フォーマットが用いられた。最初に、ビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）オリゴヌクレオチドプローブは、誘導体化されたマイクロ力価プレートに共有結合された。次にビオチン残渣をストレプタビジン検出系を用いて定量した。それらの実施例により、オリゴマー構造の枝別れ化（分岐）はこみあい効果をもたらし、このことはビオチン残渣の検出を促進しないことを示している。こみあい効果は、ビオチン残渣の結合の前に分枝の長さを増大させることにより、改善された。【００９６】  二番目の組の実施例において、標識されていない鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を、誘導体化されたマイクロ力価プレート上に固定した。ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブを、鋳型にハイブリッド形成し、次に検出した。【００９７】  ３組目の実施例において、標識されていない鋳型をナイロン膜上に固定化した。ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブをハイブリッド形成させ、ハイブリッド形成されたプローブを、化学発光性基質を有するストレプタビジン−アルカリ性ホスファターゼを用いて検出した。【００９８】  下記の物質が検定実施例において用いられた。【００９９】１．１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）
２．ストレプタビジン−アルカリ性ホスファターゼ
３．ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ、アルカリ性ホスファターゼ用発色性基質）
４．ＣＤＰＳｔａｒ（登録商標）（アルカリ性ホスファターゼ用化学的発光性基質）
５．２−アミノ−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ、ｐＮＰＰのための反応緩衝液）
６．アル・コンセンサス・テンプレート［Ａｌｕ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｔｅｍｐｌａｔｅ（Ａｌｕ−０１１  Ａ）］
７．アル・コンセンサス・プローブ（ＡＣＰ）
８．ビオチニル化オリゴヌクレオチド構造（５′→３′）（Ｐ＝ホスフェート）：
ＢＧ１００４：ビオチン−ＡＣＰ−Ｐ
ＢＧ１００５：（２ビオチン）−分岐構造−ＡＣＰ−Ｐ
ＢＧ１００７：（４ビオチン）−分岐構造−ＡＣＰ−Ｐ
ＢＧ１００８：（４ビオチン）−（ｄＴ）３−分岐構造−ＡＣＰ−Ｐ
ＢＧ１００９：（４ビオチン）−（ｄＴ）５−分岐構造−ＡＣＰ−Ｐ
ＢＧ１０１０：（８ビオチン）−分岐構造−ＡＣＰ−Ｐ
ＢＧ１０１１：（１６ビオチン）−分岐構造−ＡＣＰ−Ｐ
ＢＧ１０１６：（４ビオチン）−（スペーサー）３−分岐構造−ＡＣＰ−Ｐ
ＢＧ１０１８：（１６ビオチン）−（スペーサー）３−分岐構造−ＡＣＰ−Ｐ【０１００】複数標識された分岐オリゴヌクレオチドの合成
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）Ｄ−１００ＤＮＡ合成機又はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）Ｄ−３００プラスＤＮＡ合成機を用いて０．２μモル規模でオリゴヌクレオチドを合成した。複数標識されたオリゴマーの構築を、Ａ）非修飾ヌクレオチドの特定配列から成る「ステム」の合成並びにＢ）「ステム」への「複数の分枝（フォーク）」及び複数の修飾基の付加の２工程で行った。ステムの合成を標準ＤＮＡ合成プロトコルを用いて行った。改変は必要なかった。分枝の構築には、ホスホルアミダイトの複数の添加を用いる１．０μモルのＲＮＡ合成プロトコルの使用が関与する。カップリング時間を１０分に長くした。分枝付与ホスホルアミダイト１、スペーサーアミダイト９及びアミノリンカーホスホルアミダイトをすべて０．１５乃至０．２モルの濃度で用いた。それらの条件は、オリゴマーにおける分枝の数が増加するにつれ、立体的こみあいがかなり増大することを考えて選んだ。【０１０１】  さらに、利用可能な反応性部位の数が、分枝付与ホスホルアミダイトの添加に伴い指数関数的に増大する。例えば、０．２μモル規模の合成では４つの対称性分枝付与ホスホルアミダイトの連続的添加により、１６×０．２＝３．２μモルの反応性官能基が生じる。従って、化合物の不十分な配布では、より低いカップリング効率が生じ、従って、より低い収量の生成物が単離される。アミダイト濃度を増加させること、アミダイト配布を増加させること並びにカップリングの待ち時間を延ばすことにより、それらの問題は克服される。ビオチン（又は他の標識分子）の検出系への接近性を増大させるために、市販のスペーサーホスホルアミダイト９を用いた。複数の反応性−級アミノ基をオリゴマープローブの末端に与えるために市販のアミノモディファイヤーホスホルアミダイトを用いる。それらの一級アミノ基は、ビオチン、フルオレセイン又は他の標識分子を後合成的に導入するために用いられる。標識分子の導入は又、標識されたホスホルアミダイト、例えばビオチン又はフルオレセインホスホルアミダイトの使用によりＤＮＡ合成機で直接行われる。合成の後に、分岐されたオリゴヌクレオチドを切断（室温で３０分間）し、標準ＤＮ合成プロトコルを用いて脱保護した（水酸化アンモニウム濃縮溶液中、５５℃で１５時間）。オリゴヌクレオチドを、ＤＭＴ−ＯＮ合成（５′末端ＤＭＴ部位非変換を有するオリゴマー合成）の後に、逆相カートリッジで精製し得る。【０１０２】合成オリゴヌクレオチドのビオチンでの標識
末端アミン基を有するオリゴヌクレオチドを合成した。ビオチンの活性エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ビオチンをジメチルホルムアミド中に１０又は２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。各々の個々の分岐構造について、アミン基のモル濃度は１であると考えられる。例えば、（８ビオチン）標識された構造において、１モルのオリゴヌクレオチドが８モルのアミン基に等価であると考えられる。５ナノモルの合成オリゴヌクレオチドとｐＨ９．０における１０ミリモルの炭酸ナトリウム緩衝液を含有する１００μｌの反応液中で、アミン基に対して２０倍モル過剰のビオチンが用いられる。【０１０３】マイクロ力価プレートへのオリゴヌクレオチドの結合
この操作は、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎらにより記載されている（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：１３８、１９９１年）。二級アミンを含有する誘導体化マイクロ力価プレートを用いた。オリゴヌクレオチドの末端ホスフェート基の二級アミンとの縮合を、０．２ＭのＥＤＣ、０．０１Ｍの１−メチルイミダゾールを含有するｐＨ７．０緩衝液中で５０℃において５時間行った。ビオチニル化オリゴヌクレオチドをプレートにカップリングしたとき、その濃度は、０．５乃至１０フェムトモル／μｌの間であった。鋳型のＡｌｕ−０１１Ａが用いられたとき、鋳型の最低濃度は０．１フェムトモル／μｌであった。【０１０４】鋳型ＤＮＡのナイロン膜への固定化
適する濃度（１ピコモル／μ１乃至１フェムトモル／μｌの範囲）の１μｌの鋳型Ａｌｕ−０１１Ａを正に荷電したナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−ＮＴＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）上に点在させた。空気乾燥後、ＤＮＡを短波ＵＶ光（２５４ｎｍ）に１０分間さらすことにより、その膜に架橋結合させた。【０１０５】オリゴヌクレオチドプローブへの固定化鋳型のハイブリッド形成
マイクロ力価プレート検定−マイクロ力価プレート検定の実施例では、プローブは、ハイブリッド形成緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のツイーン２０、５０％のホルムアミド及び１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含有する、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの燐酸ナトリウムｐＨ７．０緩衝液）中で２５ピコモル／ｍｌの濃度で用いた。１００μｌのハイブリッド形成緩衝液をマイクロ力価プレートの各ウエルに加えた。ハイブリッド形成を４２℃で５時間行った。【０１０６】ドット・ブロット検定−固定化鋳型への標識されたプローブのハイブリッド形成並びにその後の化学発光性検出をＵＬＴＲＡＬＵＭＥ（登録商標）ＧＥＮＥＢＬＯＴＴＭ検出キット［カタログ番号Ｄ２０１−ＧＤ、バイオジェネックス（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）、カリフォルニア州９４５８３、サン・ラモン（ＳａｎＲａｍｏｎ）］を用いて行った。すべての緩衝液及び洗滌溶液は、キットの使用説明書に記載されたように用いた。【０１０７】  固定化鋳型を含有する膜を約５ｍｌの２×ＳＳＰＥ緩衝液（０．３ＭのＮａＣｌ、０．０２Ｍの第二燐酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で１乃至２分、予め湿らせた。次にその膜を滅菌したプラスチック管に挿入した。次に目的の標識したプローブ（ＢＧ１００４及びＢＧ１０１８）をハイブリッド形成緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のツイーン−２０、５０％のホルムアミド及び１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含有する、０．１５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を用いて適する濃度（２．５ピコモル／ｍｌ）に希釈した。次に希釈されたプローブ溶液（５００μｌ）をその膜を含有する管に付加し、その管を４２℃に維持したハイブリッド形成オーブン内に入れた。適切な混合を確保するために回転機を取り付けた膜を含有する管でハイブリッド形成を４２℃で１時間行った。ハイブリッド形成後、その膜を洗滌トレイに移した。次にその膜を室温で、約５ｍｌのＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（カゼイン及び０．５％のＳＤＳとともに０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含有する）中で５分間ずつ３回洗滌した。洗滌は、穏やかな攪拌をしながら行い、各洗滌の後に化合物を除去した。【０１０８】ビオチン残渣の検出
ストレプタビジン−アルカリ性ホスファターゼ抱合体を支持体結合ビオチニル化プローブとともに室温において２０分間インキュベーションをした。【０１０９】  発色性検出では、基質ｐＮＰＰを０．１８ＭのＡＭＰＤ中に１ｍｇ／ｍｌで溶解した。１００μｌの基質をアルカリ性ホスファターゼ−ストレプタビジン−ビオチニル化プローブの複合体とともにインキュベーションした。着色した生成物Ｐ−ニトロフェノールの吸収をマイクロ力価プレートリーダーにおいて４０５ｎｍで測定した。【０１１０】  膜検定の場合において、ハイブリッド形成及び洗滌が完了した後に、膜を１×Ｌａｂｅｌ（２００Ｘ標識ストックから調製され、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃで希釈された、アルカリ性ホスファターゼで抱合されたストレプタビジン）とともに室温で２０分間、インキュベーションした。次に膜を、約１０ｍｌのＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ中で穏やかに攪拌しながら室温で各々５分間ずつ２回洗滌した。次にその膜を、約１０ｍｌの１×ＵｌｔｒａＬｕｍｅ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ中で穏やかに攪拌しながら５分間インキュベーションした。化学発光性検出では、アルカリ性ホスファターゼ−ストレプタビジン−ビオチニル化プローブ−鋳型の複合体を帯持している膜を、２つの透明のプラスチックシートの間の基質、ＣＤＰＳｔａｒ（登録商標）とともにインキュベーションし、その膜をＸ線フィルムにさらした。その膜を現像フォルダーの中に入れ、化学発光性基質（２００乃至３００μｌのＵｌｔｒａＬｉｍｅ（登録商標）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を付加した。次にその現像フォルダーをＸ線フィルム（ＫＯＤＡＫ  Ｘ−Ｏｍａｔ  ＡＲ、Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔａｌｏｇ  番号Ｆ−５５１３）に約３０乃至６０分間さらし、生じた点の強度を視覚で比較した。【０１１１】実施例４Ａ
ビオチニル化オリゴヌクレオチドを誘導体化マイクロ力価プレートに結合させ、先に記載したように、ストレプタビジン−アルカリ性ホスファターゼ法により検出した。代表的なデーターを表１に示す。【０１１２】
【表１】
2004325457.tif 000016
【０１１３】  示されているように、（１６ビオチン）オリゴヌクレオチドは（１ビオチン）オリゴヌクレオチドよりも１ｌｏｇ多い信号を生じた。それらのデーターを又、図３においてグラフで表わした。【０１１４】実施例４Ｂ
マイクロ力価検定：鋳型Ａｌｕ−０１１  Ａを、０．１乃至１０フェトムモル／μｌで変わる濃度で、マイクロ力価プレート上に固定した。オリゴヌクレオチドプローブの均一の濃度（２５ピコモル／ｍｌ）を鋳型にハイブリッド形成した。そのデーターを表２に表わし、８０分間のデーターを図４にグラフで表わした。【０１１５】
【表２】
2004325457.tif 000017
【０１１６】  その結果をＯＤ４０ｎｍ＝０．５の信号強度において検出された鋳型の量として計算した（図４を参照）。１ビオチンオリゴヌクレオチドＢＧ１００４を用いたとき、この量は９．８フェムトモル／μｌであり、（１６ビオチン）オリゴヌクレオチドＢＧ１０１８が用いられたとき、０．８フェムトモル／μｌの鋳型が検出された。（１６ビオチン）オリゴヌクレオチドは、１ビオチンオリゴヌクレオチドよりも１ｌｏｇ多い感受性であった。【０１１７】実施例４Ｃ
膜検定：鋳型Ａｌｕ−０１１  Ａをナイロン膜上に１ピコモルから１フェムトモルに低減する量で固定化した。膜を２．５ピコモル／ｍｌのオリゴヌクレオチドプローブＢＧ１００４又はＢＧ１０１８とハイブリッド形成した。【０１１８】  （１６ビオチン）プローブＢＧ１０１８は５フェムトモルの鋳型を検出できるが、１ビオチンプローブＢＧ１００４の場合では、同じ信号強度は約１００フェムトモルの鋳型を必要であるようであった。【０１１９】  先に述べた検出実施例からのデーターは、複数標識されたプローブは、単一標識されたプローブよりも１０乃至２０倍、感受性が強いことを示した。より高度な構造、すなわち、プローブにおける、より多くの標識の組み込みは、対応する、より高い信号強度をもたらす。【０１２０】  本明細書中で引用されているすべての刊行物及び特許出願を、それらが引用により援用されていることを特に個々に示しているごとく、引用により援用する。【０１２１】  前記発明を、明確化及び理解の目的のために、例示及び実施例によっていくらか詳細に記載したが、その開示に照らして、請求の範囲の精神及び範囲から逸脱することなく、ある変更及び改変がなされ得ることが、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のある面による分岐したオリゴマーの製造のための選ばれた概略図である。図１Ａは、例えば複数の標識を含有するための「フォーク（ｆｏｒｋ）」構造の製造の概要を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のある面による分岐したオリゴマーの製造のための選ばれた概略図である。図１Ｂは、例えば複数の標識を含有するための「櫛（ｃｏｍｂ）」構造の製造の概要を示している。
【図２】図２は、標識（Ｒ）がビオチンである本発明の選ばれた試薬の合成の概略図である。
【図３Ａ】図３は、単一対複数の標識を含有する本発明によるオリゴヌクレオチドプローブの相対的検出能力の図であり、図３Ａは、プローブ当り１（ＢＧ１００４）標識と８（ＢＧ１０１０）標識とを比較した図である。
【図３Ｂ】図３は、単一対複数の標識を含有する本発明によるオリゴヌクレオチドプローブの相対的検出能力の図であり、図３Ｂは、プローブ当り１（ＢＧ１００４）標識と１６（ＢＧ１０１８）標識とを比較した図である。
【図３Ｃ】図３は、単一対複数の標識を含有する本発明によるオリゴヌクレオチドプローブの相対的検出能力の図であり、図３Ｃは、プローブ（スペーサーなし）当り１（ＢＧ１００４）標識と４（ＢＧ１００７）標識及び１６（ＢＧ１０１１）標識とを並びにプローブ（スペーサーを有する）当り４（ＢＧ１０１６）標識及び１６（ＢＧ１０１８）標識とを比較した図である。
【図４】図４は、本発明により製造された分岐したプローブ［プローブ当り１（ＢＧ１００４）標識対１６（ＢＧ１０１８）標識］を用いる標的核酸配列の濃度の低減の検出を図で示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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