(57)【要約】【課題】接合する個々の蛋白質の機能を維持したまま、より合目的的な構造を実現する。【解決手段】ヒト蛋白質阻害物質であるヒトＲＮａｓｅ１のループ部位にヒト生理活性物質であるヒトｂＦＧＦを一次配列上挿入し、宿主細胞中で発現させることで、ＲＮａｓｅ１とｂＦＧＦの機能を併せ持つ挿入融合体を作製する。この挿入融合体は、癌細胞等のＦＧＦ受容体を高発現している細胞に対して選択的に細胞障害活性を示す。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト生理活性物質及びヒト蛋白質合成阻害物質のいずれか一方が他方に一次配列上挿入されてなることを特徴とする挿入融合体。
【請求項２】
上記ヒト蛋白質合成阻害物質がリボヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１記載の挿入融合体。
【請求項３】
上記ヒト生理活性物質が上記リボヌクレアーゼのループ部位に相当する配列部分に挿入されていることを特徴とする請求項２記載の挿入融合体。
【請求項４】
上記ループ部位が上記リボヌクレアーゼにおけるリボヌクレアーゼ阻害剤結合部位に対して立体構造上近傍に位置することを特徴とする請求項３記載の挿入融合体。
【請求項５】
上記ヒト生理活性物質が塩基性線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、インターロイキン−２又は抗体であることを特徴とする請求項１記載の挿入融合体。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の挿入融合体を有効成分とすることを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト生理活性物質とヒト蛋白質合成阻害物質との挿入融合体、及びその挿入融合体を有効成分とする医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
固形癌に有効な抗癌剤が少ないことや多剤耐性癌細胞の出現などから、新しい作用機序を持つ抗癌剤の開発が望まれている。さらに、副作用の軽減や効果増強を目指したＤＤＳ（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）の研究も盛んである。しかしながら、未だ満足するものは得られていない。
【０００３】
本件発明者らは、このような状況を打破すべく、リボソームにおける蛋白質合成阻害物質（トキシン）と癌細胞を認識する抗体との接合体（イムノトキシン）を作製し、従来にはない利点を有した治療薬となる可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ  やｉｎ  ｖｉｖｏでの実験系で明らかにしてきた（Ｈｉｒｏｔａ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ４９：  ７１０６−７１０９，  １９８９）。しかしながら、これらのイムノトキシンではトキシンとしてリシン（ｒｉｃｉｎ）、ジェローニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ジフテリアトキシン（ｄｉｐｈｔｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ）などのヒト由来でない異種蛋白質が用いられるため、ヒトに投与すると副作用としてｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｌｅａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  が生じ、しかも免疫源性が強いため、長期にわたる反復投与ができないという問題があった。また、抗体としては、トランスフェリンレセプターのように癌細胞に特異的とはいえず、しかも悪性度とは無関係の抗原を認識するモノクローナル抗体が用いられるため、患者の治療成績向上をあまり期待できないという問題があった。
【０００４】
近年になって、ウシ膵臓由来のリボヌクレアーゼ（以下、適宜「ＲＮａｓｅ」という。）が顕著な抗癌性及び抗ＨＩＶ活性を有することが報告されている（Ｖｅｓｃｉａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ４０：  ３７４０−３７４４，  １９８０；  Ｗｕ，  Ｙ．Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６８：  １０６８６−１０６９３，  １９９３；  Ｎｉｔｔａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５４：  ９２０−９２７，  １９９４；  Ｙｏｕｌｅ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１：  ６０１２−６０１６，  １９９４）。これらの報告は、ウシＲＮａｓｅがヒトに免疫源性を示さない限り、治療目的に使用できる可能性を示唆している。
【０００５】
本件発明者らは、各種組織や細胞に広く存在しているヒトＲＮａｓｅにも同様の活性があるか否かを研究し、ＲＮａｓｅによりヒト由来の細胞を死滅させ得ることを見いだした（Ｊｉｎｎｏ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ５８（２１）：  １９０−１９８，  １９９６）。このＲＮａｓｅは、ヒト生理活性物質として元々ヒトに存在している物質であるため免疫源性は極めて弱く、またその生物活性や動態が既に判明しているため、投与に伴う副作用も多くの点で予測可能であるなど、治療薬への応用に優れた利点を有している。そこで、本件発明者らは、このような細胞障害活性を有するＲＮａｓｅと特定の組織や細胞を特異的に認識する物質とを組み合わせることによる、特定組織や細胞に特異的な新規な治療薬の開発を行ってきた。
【０００６】
ここで、一般に増殖因子受容体を過剰発現している癌細胞は悪性度が高く、従来の治療法では治癒させることができず、細胞膜上に発現する増殖因子受容体を分子標的としたターゲット療法が必要である（Ｏｚａｗａ，  Ｓ．，  Ｃａｎｃｅｒ，  ６３：  ２１６９−２１７３，  １９８９；  Ｋｉｔａｚａｗａ，  Ｙ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２：  ９０９−９１４，  １９９６）。近年、本件発明者らは、副作用の軽減や効果増強を目指した抗癌剤として、ヒト上皮増殖因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、適宜「ＥＧＦ受容体」という。）を過剰発現する癌細胞を認識するヒト上皮増殖因子（以下、適宜「ＥＧＦ」という。）とＲＮａｓｅとを３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸−Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）等の架橋試薬を用いて化学的に接合して接合体を作製したところ、ＥＧＦ受容体の発現量に依存した細胞障害活性が認められた（例えば下記特許文献１参照）。
【０００７】
また、本件発明者らは、免疫疾患にも有効な接合体として、インターロイキン−２（以下、「ＩＬ−２」という。）等のＩＬ−２受容体を特異的に認識する因子とＲＮａｓｅとをＳＰＤＰ等の架橋試薬を用いて化学的に接合し、又は両者をコードする遺伝子をプラスミドに組み込むことにより遺伝子工学的に接合して接合体を作製したところ、ＡＴＬ（成人Ｔ細胞白血病）細胞等のＩＬ−２過剰発現細胞に対して、ＩＬ−２受容体の発現量に依存した細胞障害活性が認められた（例えば下記特許文献２参照）。
【０００８】
【特許文献１】
特開平７−３０９７８０号公報
【特許文献２】
特開平９−３２４０００号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記特許文献１、２のように架橋試薬を用いて２種類の蛋白質を化学的に接合する方法では、蛋白質同士の立体配置の制御が困難であり、接合体の均質性、安定性が悪くなる。また、作製時の収量が悪いため、実用には向かないという問題がある。一方、上記特許文献２のように遺伝子融合により接合する場合には、２つの遺伝子の末端同士を接合（直列融合）することになるが、本来的に接合箇所が２箇所しか存在しないため立体配置の選択肢が少なく、その結果、蛋白質間の立体障害により個々の蛋白質の機能が十分に発揮されなくなる場合がある。
【００１０】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、接合する個々の蛋白質の機能を維持したまま、より合目的的な構造を実現するために、ヒト蛋白質合成阻害物質にヒト生理活性物質が挿入された挿入融合体、及びその挿入融合体を有効成分とする医薬組成物を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するために、本発明に係るヒト生理活性物質とヒト蛋白質合成阻害物質との挿入融合体は、ヒト生理活性物質及びヒト蛋白質合成阻害物質のいずれか一方が他方に一次配列上挿入されてなるものである。
【００１２】
ここで、上記ヒト蛋白質合成阻害物質は、例えばリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）である。この場合、ヒト生理活性物質がリボヌクレアーゼのループ部位に相当する配列部分に挿入されているものが好ましく、上記ループ部位が上記リボヌクレアーゼにおけるリボヌクレアーゼ阻害剤結合部位に対して立体構造上近傍に位置するものがより好ましい。
【００１３】
また、上記ヒト生理活性物質は、例えば塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）又は抗体である。
【００１４】
また、本発明に係る医薬組成物は、本発明に係る挿入融合体を有効成分とするものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本実施の形態における挿入融合体は、ヒト生理活性物質及びヒト蛋白質合成阻害物質の何れか一方（被挿入蛋白質）に他方（挿入蛋白質）が一次配列上挿入されたものであり、遺伝子工学的に作製することができる。すなわち、被挿入蛋白質をコードするＤＮＡ配列中に挿入蛋白質をコードするＤＮＡ配列が挿入された遺伝子をプラスミドに組み込み、この挿入融合体を効率的に発現する宿主細胞中で発現させることにより、被挿入蛋白質に挿入蛋白質が遺伝子レベルで挿入された挿入融合体を作製することができる。
【００１６】
ここで、２つのＤＮＡ配列の末端同士を接合（直列融合）すると、本来的に接合箇所が２箇所しか存在しないため立体配置の選択肢が少なく、その結果、蛋白質間の立体障害により個々の蛋白質の機能が十分に発揮されなくなる場合があるが、本実施の形態における挿入融合体のように一方のＤＮＡ配列中に他方のＤＮＡ配列を挿入（挿入融合）することで、立体構造の選択肢が増え、両者の機能が効果的に発揮されるような合目的的な立体構造を実現することができる。
【００１７】
なお、被挿入蛋白質及び挿入蛋白質をコードするＤＮＡは、必ずしも全長でなくてもよく、その機能を発現できる限り、一部が欠失又は置換されたものであっても構わない。また、被挿入蛋白質と挿入蛋白質との接合部にリンカー配列を挿入するようにしても構わない。
【００１８】
被挿入蛋白質としては、例えばヒト蛋白質阻害物質であるヒトＲＮａｓｅを用いることができる。挿入部位としては、被挿入蛋白質のループ部位に相当する配列部分が立体障害を避ける上で好ましい。ヒトＲＮａｓｅを用いる場合、ＲＮａｓｅ活性の強さよりもＲＮａｓｅインヒビターに対する抵抗性の方が実効ＲＮＡ分解能力にとって重要であることが示唆されているため（Ｆｕｔａｍｉ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４０（２５）：  ７５１８−７５２４，  ２００１）、インヒビターの結合部分に近いループ部位に挿入することで、インヒビターに対する耐性を獲得することができる。後述する実施例では、ヒトＲＮａｓｅ１の７つのループ部位のうち、立体構造上、ＲＮａｓｅインヒビターの結合部位に近い３８番、６８番、８９番アミノ酸部分に挿入した。なお、予めヒトＲＮａｓｅのインヒビター結合部分（例えばヒトＲＮａｓｅ１のＮ末端の数アミノ酸）を除く修飾を行っている場合には、任意のループ部分に挿入しても構わない。
【００１９】
一方、挿入蛋白質としては、Ｎ末端とＣ末端との距離が近く、且つ略同方向を向いているものが好ましい。後述する実施例では、挿入蛋白質としてヒト生理活性物質である塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いたが、この他に、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、或いはＩｇＥといった抗体など、標的細胞に合わせて選択可能である。例えばｂＦＧＦを用いた場合、本実施の形態における挿入融合体は、癌細胞のようなＦＧＦ受容体を高発現している細胞に対して選択的に細胞障害活性を発揮する。この細胞障害活性の作用機序は、次のように考えられる。すなわち、先ず生理活性物質であるｂＦＧＦが癌細胞等のＦＧＦ受容体を高発現している細胞を識別し、次いでＦＧＦ受容体と複合体を形成する。そして、その複合体が細胞内に陥入すると同時にｂＦＧＦと接合している蛋白質合成阻害物質であるＲＮａｓｅも細胞内に侵入し、この侵入したＲＮａｓｅがＲＮＡ合成を阻害することで、細胞の増殖を抑制する。
【００２０】
なお、上記の例に限らず、ヒト生理活性物質を被挿入蛋白質として、ヒト蛋白質阻害物質を挿入蛋白質としてそれぞれ用いるようにしてもよいことは勿論である。
【００２１】
この挿入融合体は、薬理的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤等と混合して医薬組成物とすることができる。この医薬組成物は、ペプチド医薬に一般的に用いられている方法、すなわち非経口投与方法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与などによって投与するのが好ましい。経口投与した場合、この医薬組成物は消化管内で分解を受けるため、この投与方法は一般的には効果的でないが、消化管内で分解を受けにくい製剤、例えば活性成分である本実施の形態における挿入融合体をリポソーム内に抱容したマイクロカプセル剤として経口投与することも可能である。また、直腸、鼻内、舌下などの消化管以外の粘膜から吸収させる投与方法も可能である。この場合には、座剤、点鼻スプレー、舌下錠といった形態で投与することができる。
【００２２】
なお、この医薬組成物の投与量は、疾患の種類、患者の年齢、体重、症状の程度及び投与経路などによっても異なるが、一般的に０．１μｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与することができる。０．５μｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与するのが好ましく、１μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重がさらに好ましい。
【００２３】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【００２４】
実施例１
ヒトｂＦＧＦとヒトＲＮａｓｅ１との挿入融合体の作製
実施例１では、ヒトｂＦＧＦとヒトＲＮａｓｅ１との挿入融合体を作製した。ヒトｂＦＧＦの成熟蛋白質の塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。また、ヒトＲＮａｓｅ１の成熟蛋白質の塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００２５】
ここで、ヒトＲＮａｓｅ１遺伝子をコードするプラスミドｐＢＯ２６ＤＮＡは、文献（Ｓｅｎｏ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＢＲＣ  ２１６，  ４０６−４１３，  １９９５）記載の方法により調製した。また、４番目と１１８番目のアミノ酸残基をＣｙｓ残基に置換し、Ｓ−Ｓ架橋を導入した安定化型ヒトＲＮａｓｅ１変異体（ＣＬ−ＲＮａｓｅ１）遺伝子を含むプラスミドｐＢＯ３８３ＤＮＡは、文献（Ｆｕｔａｍｉ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２８，  ２４５−２５０，  ２０００）記載の方法により調製した。
【００２６】
また、Ｎ末端にＭｅｔ残基を付加した１４７残基型のヒトｂＦＧＦ遺伝子を含むプラスミドｐＢＯ４５ＤＮＡは、文献（Ｆｕｔａｍｉ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  １２，  １０１３−１０１９，  １９９９）記載のものを用いた。さらに、上記ｐＢＯ４５を鋳型として、６９残基目のＣｙｓ残基をＳｅｒ残基に、８７番目のＣｙｓ残基をＳｅｒ残基に、８８番目のＶａｌ残基をＡｌａ残基にそれぞれ置換する部位特異的変異導入を２回施すことにより、安定化型ヒトｂＦＧＦ変異体ｂＦＧＦ（Ｃ６９／Ｓ，Ｃ８７／Ｓ，  Ｖ８８／Ａ）遺伝子をコードするプラスミドｐＢＯ１２６を調製した。
【００２７】
上記４種のプラスミドＤＮＡにおいて、各遺伝子はプラスミドｐＥＴ３ａＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ  社より購入）のバクテリオファージＴ７プロモーター下流に順方向で組込まれている。プラスミドｐＣＲＴＭ２．１ＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  社より購入した。
【００２８】
１）ヒトｂＦＧＦとヒトＲＮａｓｅ１との挿入融合体遺伝子構築
安定化型ヒトｂＦＧＦ変異体遺伝子をコードするプラスミドｐＢＯ１２６を鋳型とし、合成ＤＮＡオリゴマー＃３６８（配列番号５）及び＃３６９（配列番号６）をプライマーとしてＰＣＲ反応を行うことにより、両末端に２アミノ酸残基から成るリンカー部とＳａｃＩＩ制限酵素切断配列とが導入されたｂＦＧＦ変異体の１９残基目から１４６残基目部分（ｂＦＧＦ（１９−１４６））をコードするＤＮＡ断片を増幅させる。この増幅断片をｐＣＲＴＭ２．１ベクターにクローン化した後、制限酵素ＳａｃＩＩでｂＦＧＦ（１９−１４６）  をコードするＤＮＡインサートを切り出す。
【００２９】
同様に、プラスミドｐＢＯ１２６を鋳型とし、合成ＤＮＡオリゴマー＃６３１（配列番号７）及び＃６３２（配列番号８）をプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、両末端に１アミノ酸から成るリンカー部とＳａｃＩＩ制限酵素切断配列とが導入されたｂＦＧＦ変異体の２１残基目から１４４残基目部分（ｂＦＧＦ（２１−１４４））をコードするＤＮＡ断片を増幅させる。この増幅断片をｐＣＲＴＭ２．１ベクターにクローン化した後、制限酵素ＳａｃＩＩでｂＦＧＦ（２１−１４４）  をコードするＤＮＡインサートを切り出す。
【００３０】
次に、ヒトＲＮａｓｅ１遺伝子を含むプラスミドｐＢＯ２６を鋳型とし、合成ＤＮＡオリゴマー＃５１３（配列番号９）及び＃５１４（配列番号１０）をプライマーとした部位特異的変異導入をＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ  社製）を用いて行うことにより、８９残基目に相当する位置に制限酵素ＳａｃＩＩ切断配列が導入されたヒトＲＮａｓｅ１遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを調製する。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩＩで切断した後、上記ｂＦＧＦ（２８−１５５）  ＤＮＡインサートをライゲーションすることで、ＲＮａｓｅ１の８９残基目に相当する位置にｂＦＧＦ（１９−１４６）  が順方向にインフレームで挿入された挿入融合体（ＲＦＮ８９）遺伝子の発現ベクターを調製する。
【００３１】
同様に、プラスミドｐＢＯ３８３を鋳型とし、プライマーとして合成ＤＮＡオリゴマー＃５１３、＃５１４を用いた部位特異的変異導入を行うことにより、８９残基目に相当する位置に制限酵素ＳａｃＩＩ切断配列が導入されたＣＬ−ＲＮａｓｅ１遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを調製する。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩＩで切断した後、上記ｂＦＧＦ（１９−１４６）  ＤＮＡインサートをライゲーションすることで、ＣＬ−ＲＮａｓｅ１の８９残基目に相当する位置にｂＦＧＦ（１９−１４６）  が順方向にインフレームで挿入された挿入融合体（ＣＬ−ＲＦＮ８９）遺伝子の発現ベクターを調製する。
【００３２】
同様に、プラスミドｐＢＯ３８３を鋳型とした部位特異的変異導入法により、ＣＬ−ＲＮａｓｅ１の３８残基目、６８残基目に相当する位置にＳａｃＩＩ切断配列が導入されたＣＬ−ＲＮａｓｅ１遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを各々調製し、導入したＳａｃＩＩ切断部位に上記ｂＦＧＦ（２１−１４４）  ＤＮＡインサートをライゲーションすることで、ＣＬ−ＲＮａｓｅ１の３８、６８残基目にｂＦＧＦ（２１−１４４）  が挿入された挿入融合体（ＣＬ−ＲＦＮ３８、ＣＬ−ＲＦＮ６８）遺伝子の発現ベクターを各々調製する。
【００３３】
以上のヒトｂＦＧＦとヒトＲＮａｓｅ１との挿入融合体の名称と構造を以下の表１に示す。
【００３４】
【表１】
2004284977.tif 000003
【００３５】
この挿入融合体（ＲＦＮ８９、ＣＬ−ＲＦＮ８９、ＣＬ−ＲＦＮ３８、ＣＬ−ＲＦＮ６８）遺伝子の発現用ベクタープラスミドＤＮＡを用いて、ヒトｂＦＧＦとヒトＲＮａｓｅ１との挿入融合体を以下の手順により製造した。
【００３６】
２）形質転換
上記の各種挿入融合体発現ベクターで、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（λＤＥ３  ｌｙｓｏｇｅｎｓ）の染色体コピーを含む大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）ｐＬｙＳを形質転換する。得られた形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中、３７℃で、６００ｎｍの吸光度が０．６程度に達するまで培養する。その後、最終濃度０．４ｍＭのイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて発現を誘導し、さらに３時間培養を続ける。
【００３７】
３）発現菌体の溶菌と封入体の単離
遠心分離により菌体を回収し、２．４リットル分の菌体を溶菌用冷緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％スクロース、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）５０ｍｌ中に再懸濁した後、−２０℃で一晩凍結する。３７℃水浴中で迅速に溶解し、さらに１５分間３７℃で保温した後、超音波処理により菌体を破砕する。さらにＤＮａｓｅ１による消化によりＤＮＡを分解した後、遠心分離により沈澱（不溶性画分）を回収する。
【００３８】
その後、沈澱物を洗浄用溶液（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ）に再懸濁して超音波処理した後、遠心分離により不溶性画分を回収する。さらに、沈澱物を超純水に再懸濁して超音波処理した後、遠心分離により不溶性画分を回収することにより、封入体を単離する。
【００３９】
４）封入体の可溶化及びタンパク質の再生（巻き戻し）
得られた封入体画分を２０ｍｌの６Ｍ  塩酸グアニジン、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）溶液中に溶解する。脱気及び窒素置換により空気を除去し、最終濃度０．１Ｍとなるようにβ−メルカプトエタノールを加える。さらに脱気及び窒素置換した後、３７℃で９０分間保温して還元反応を行わせる。
【００４０】
上記反応液を、１リットルの巻き戻し用緩衝液（０．２８Ｍ  塩酸グアニジン、３０％（ｖ／ｖ）  グリセロール、０．３Ｍ  リン酸ナトリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．５ｍＭ  還元型グルタチオン、０．５ｍＭ  酸化型グルタチオン）で約５０倍に希釈し、４℃で２晩以上、タンパク質の再生を行う。
【００４１】
５）再生タンパク質の回収及び最終精製工程
再生タンパク質を含む溶液を超純水で５倍希釈後、ｐＨ５．０に調整する。これを、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換カラム（ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｌ  ６５０Ｃ、東ソー社製）に流し、タンパク質を吸着させ、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液で洗浄した後、０．６Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液で溶出する。
【００４２】
溶出液を超純水で５倍に希釈後、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換カラム（ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｌ  ６５０Ｍ、東ソー社製）に吸着させ、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液で洗浄後、ＮａＣｌ濃度０．２〜０．６Ｍのグラジエントで溶出させる。２８０ｎｍの吸光度のピーク画分を精製タンパク質として回収する。
【００４３】
回収した精製タンパク質を限外ろ過膜（ＭＷＣＯ  １０Ｋ）により濃縮し、緩衝液をリン酸緩衝に置換する。
【００４４】
ＣＬ−ＲＦＮ８９タンパク質精製過程のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）解析の結果を図１に示す。ここで図１において、レーンＭは分子量マーカー、レーン１はＩＰＴＧによる発現誘導後の菌体、レーン２〜４は可溶性画分、レーン５は不溶性画分、レーン６は１回目のＣＭカラムの溶出画分、レーン７は２回目のＣＭカラムの溶出画分をそれぞれ泳動したものである。図１に示すように、ＣＬ−ＲＦＮ８９は分子量約３４ＫＤａのタンパク質であることが確認された。
【００４５】
以上の手順で作製された各種挿入融合体の最終精製標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を図２に示す。ここで図２において、レーンＭは分子量マーカー、レーン１はＣＬ−ＲＦＮ３８、レーン２はＣＬ−ＲＦＮ６８、レーン３はＲＦＮ８９、レーン４はＣＬ−ＲＦＮ８９をそれぞれ泳動したものである。
【００４６】
実施例２
挿入融合体のＲＮＡ分解活性
実施例２では、ｂＦＧＦによって一次配列上分断されたＲＮａｓｅ１がＲＮＡ分解活性を保持しているか否かを検証するために、上記実施例１で得られた各種挿入融合体（ＲＦＮ８９、ＣＬ−ＲＦＮ８９、ＣＬ−ＲＦＮ３８、ＣＬ−ＲＦＮ６８）のＲＮａｓｅ１活性を、文献（Ｆｕｔａｍｉ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＢＲＣ，  ２１６，  ４０６−４１３，  １９９５）に記載の方法に準じて測定した。具体的には、０．１％ウシ血清アルブミン水溶液で希釈した各挿入融合体１５μｌを、予め３０℃に保温した基質溶液（０．０６％（ｗ／ｖ）  ｙｅａｓｔ  ＲＮＡ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）１．５ｍｌの入った石英セル（光路長１ｃｍ）に加えて混合し、３０℃における３００ｎｍの吸光度を経時的に測定してＲＮＡの分解を測定した。ｈＲＮａｓｅ１のＲＮＡ分解活性を１００％としたときの各挿入融合体の比活性を図３に示す。
【００４７】
図３に示すように、ＲＦＮ８９、ＣＬ−ＲＦＮ８９、ＣＬ−ＲＦＮ３８、ＣＬ−ＲＦＮ６８のＲＮＡ分解活性は、ｈＲＮａｓｅ１のそれぞれ２１％、１６％、２０％、２１％と、ｂＦＧＦの挿入により低下しているものの依然として活性を保持していた。
【００４８】
実施例３
ＲＮａｓｅインヒビター存在下でのＲＮＡ分解活性
実施例３では、ｂＦＧＦをＲＮａｓｅ１のインヒビター結合部位付近に挿入することによるインヒビター耐性の獲得の有無を検証するために、ＲＮａｓｅインヒビター（ＲＩ）存在下、非存在下におけるＲＮＡ分解活性を測定した。具体的には、４０ｎｇ（１．４ｐｍｏｌ）の各挿入融合体を、胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（和光純薬株式会社製）４０ユニット共存下で、４μｇの大腸菌ＭＲＥ６００由来リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ベーリンガーマンハイム社製）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ジチオスレイトール  １０μｌに加えた。そして、３７℃で１５分インキュベートした後、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、ＲＮＡを検出した。なお、陰性対照としては、ｈＲＮａｓｅ１及びＣＬ−ＲＮａｓｅ１を用いた。結果を図４に示す。ここで図４において、レーンＣはｒＲＮＡ、レーン１はｈＲＮａｓｅ１、レーン２はＲＦＮ８９、レーン３はＣＬ−ＲＦＮ８９、レーン４はＣＬ−ＲＮａｓｅ１、レーン５はＣＬ−ＲＦＮ３８、レーン６はＣＬ−ＲＦＮ６８をそれぞれ泳動したものである。
【００４９】
図４に示すように、陰性対照であるＲＮａｓｅ１及びＣＬ−ＲＮａｓｅ１では、ＲＮａｓｅインヒビターによりＲＮＡ分解活性が阻害されたが、ＲＦＮ８９、ＣＬ−ＲＦＮ８９、ＣＬ−ＲＦＮ３８、ＣＬ−ＲＦＮ６８では、ＲＮａｓｅインヒビター存在下でもＲＮＡ分解活性を発揮し、インヒビター結合部位付近にｂＦＧＦを挿入することでインヒビター耐性を獲得していることが確認された。
【００５０】
実施例４
挿入融合体のトリプシンに対する抵抗性
実施例４では、挿入融合体の安定性を検証するために、トリプシン分解に対する抵抗性を調べた。具体的には、７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で希釈した０．３３ｍｇ／ｍｌの挿入融合体（ＲＦＮ８９、ＣＬ−ＲＦＮ８９）溶液１０μｌに、濃度６．２５〜５０μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシン溶液５μｌを加えて混合し、３７℃で３０分インキュベートした。その後、反応液と当量のサンプルバッファー（２％ＳＤＳ、２％メルカプトエタノール、４０％グリセロール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）を混合して、９８℃で５分間加温することにより、酵素反応を停止させ、１５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色し、タンパク質バンドを検出した結果を図５に示す。ここで図５において、レーンＭは分子量マーカー、レーン１，２，３，４はそれぞれ濃度６．２５μｇ／ｍｌ，１２．５μｇ／ｍｌ，２５μｇ／ｍｌ，５０μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシン溶液５μｌを加えたサンプル、レーン５はＴＰＣＫ−トリプシン溶液を加えなかったサンプルをそれぞれ示す。
【００５１】
図５に示すように、ｈＲＮａｓｅ１そのものは高濃度（最終濃度１７μｇ／ｍｌ）のＴＰＣＫ−トリプシン存在下でも殆ど分解されなかったが、挿入融合体ＲＦＮ８９は、最終濃度２μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシンで完全に分解された。一方、ＣＬ−ＲＦＮ８９では、最終濃度４μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシン存在下でも５０％程度残存しており、４番目と１１８番目のアミノ酸残基をシステインに置換してＳ−Ｓ架橋を導入することで、挿入融合体が安定化することが確認された。
【００５２】
実施例５
ＦＧＦ受容体高発現細胞株に対する細胞障害活性
実施例４では、各種挿入融合体の細胞障害活性を検証するために、ＦＧＦ受容体を高発現しているマウス転移性メラノーマ細胞株Ｂ１６／ＢＬ６に対する増殖抑制効果を、文献（Ｆｕｔａｍｉ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  １２，  １０１３−１０１９，  １９９９）記載の方法を用いて測定した。具体的には、９６穴マイクロプレートに３％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１００μｌ中に懸濁したＢ１６／ＢＬ６細胞を５×１０２細胞／穴となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１日培養後、各挿入融合体（ＲＦＮ８９、ＣＬ−ＲＦＮ８９、ＣＬ−ＲＦＮ３８、ＣＬ−ＲＦＮ６８）を１０−８Ｍから１０−６Ｍ濃度となるよう添加してさらに２日培養した。細胞増殖度は、文献（Ｔａｄａ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ９３，  １５−１６５，  １９８６）記載の方法（ＭＴＴ法）により評価した。すなわち、各穴に２０μｌのＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を含むＰＢＳを添加して４時間培養した後、１０％  ＳＤＳ、０．０１Ｍ  ＨＣｌ溶液１００μｌを加えて反応を停止し、１日後に各穴の５７０ｎｍの吸光度を測定した。なお、陰性対照としては、ｈＲＮａｓｅ１、ＣＬ−ＲＮａｓｅ１、ｂＦＧＦの３種類を用いた。結果を図６に示す。
【００５３】
図６に示すように、陰性対照であるｈＲＮａｓｅ１、ＣＬ−ＲＮａｓｅ１、ｂＦＧＦではＢ１６／ＢＬ６細胞に対する増殖抑制効果を発揮しなかったのに対して、挿入融合体では、何れも用量依存的な増殖抑制効果を発揮した。
【００５４】
比較例１
ＦＧＦ受容体低発現細胞株に対する細胞障害活性
比較例として、ＦＧＦ受容体を低発現しているヒト扁平上皮癌細胞株Ａ４３１に対する増殖抑制効果を測定した。具体的には、９６穴マイクロプレートに１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ  １００μｌ中に懸濁したＡ４３１細胞を１×１０４細胞／穴となるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１晩培養後、挿入融合体ＣＬ−ＲＦＮ８９を２μＭ濃度となるよう添加してさらに２４時間培養した。その後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（株式会社同仁化学研究所製）を用いてＷＳＴ−８（２−［２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ］−３−［４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ］−５−［２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）アッセイを行い、細胞増殖を測定した。すなわち、ＷＳＴ−８がミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼによって還元されることによって生成された水溶性ホルマザンを４５０ｎｍの吸光度により測定した。それぞれ４つの穴での測定結果を以下の表２に示す。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
表２に示すように、陰性対照と比較して挿入融合体ＣＬ−ＲＦＮ８９の添加によりＡ４３１細胞の増殖が約１．７％しか抑制されておらず、挿入融合体の細胞障害活性はＦＧＦ受容体の発現量に依存することが確認された。
【００５７】
実施例６
癌細胞を移植したマウスにおける血管新生抑制効果
実施例６では、挿入融合体のｉｎ  ｖｉｖｏ  における効果を検証するために、Ａ４３１細胞を移植したマウスにおける血管新生抑制効果を文献（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ４９，  ６７２７−６７３０，  １９８０）記載の方法に準じてマウス背部皮下法（Ｍｏｕｓｅ  ｄｏｒｓａｌ  ａｉｒ  ｓａｃ  ａｓｓａｙ）により観察した。具体的には、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅリング（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の両側を孔径０．４５μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタで覆い、得られたＭｉｌｌｉｐｏｒｅチャンバーを０．１５ｍｌのＰＢＳに懸濁した１．５×１０６個のＡ４３１細胞と１μＭ又は２μＭの濃度の挿入融合体ＣＬ−ＲＦＮ８９とで満たした。なお、陽性対照としてはＡ４３１細胞のみのチャンバーを用い、陰性対照としてはＰＢＳのみのチャンバーを用いた。これらのチャンバーを、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、メス６週齢）の背部に予め適量の空気を注入して形成された気嚢（ａｉｒ  ｓａｃ）内部に移植し、５日後にチャンバを皮下組織から除去した。血管新生作用は、解剖顕微鏡写真により、チャンバーに接触していた領域に新たに形成された３ｍｍ以上の長さの血管を数えることにより評価した。
【００５８】
ＰＢＳのみのチャンバー、Ａ４３１細胞のみのチャンバー、Ａ４３１細胞及び２μＭ  ＣＬ−ＲＦＮ８９のチャンバーを移植した場合の解剖顕微鏡写真をそれぞれ図７（ａ）、（ｂ）、（ｃ）  に示す。図７に示すように、Ａ４３１細胞のみのチャンバーを移植した場合（図７（ｂ））には、図中矢印で示す位置に新生血管特有のジグザグ状の血管が確認されるが、Ａ４３１細胞及び２μＭ  ＣＬ−ＲＦＮ８９のチャンバーを移植した場合（図７（ｃ））には、ＰＢＳのみのチャンバーを移植した場合（図７（ａ））と同様に、新生血管は確認されない。
【００５９】
ＰＢＳのみのチャンバーを移植したマウス６匹、Ａ４３１細胞のみのチャンバーを移植したマウス６匹、Ａ４３１細胞及び２μＭ  ＣＬ−ＲＦＮ８９のチャンバーを移植したマウス５匹について新生血管数を計数した結果を図８に示す。なお、図８において血管新生インデックスとは、観察された新生血管数を表す。但し、インデックス５とは新生血管が５以上観察された場合を表す。図８に示すように、Ａ４３１細胞及び２μＭ  ＣＬ−ＲＦＮ８９のチャンバーを移植した場合には、Ａ４３１細胞のみのチャンバーを移植した場合と比較して、新生血管の数が有意に減少している。
【００６０】
このように、本実施の形態における挿入融合体によれば、ヒト生理活性物質及びヒト蛋白質合成阻害物質の何れか一方に他方を一次配列上挿入することで、立体構造の選択肢が増え、両者の機能が効果的に発揮されるような合目的的な立体構造を実現することができる。
【００６１】
また、標的細胞に合わせてヒト生理活性物質の種類を変えることで標的細胞に特異的な挿入融合体を作製することができ、種々の治療薬に応用可能である。特に、この挿入融合体は、ヒト由来の蛋白質のみから構成されているため副作用の心配も極めて低いと考えられ、長期投与が可能となる。
【００６２】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明に係るヒト生理活性物質とヒトリボヌクレアーゼとの挿入融合体によれば、ヒト生理活性物質及びヒト蛋白質合成阻害物質の機能が効果的に発揮されるような合目的的な立体構造を実現することができ、種々の治療薬に応用可能である。特に、この挿入融合体は、ヒト由来の蛋白質のみから構成されているため副作用の心配も極めて低いと考えられ、長期投与が可能となる。
【００６３】
【配列表】
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【配列表フリーテキスト】
配列番号５：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号６：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号７：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号８：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号９：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号１０：人工的に合成されたプライマー配列
【図面の簡単な説明】
【図１】挿入融合体ＣＬ−ＲＦＮ８９の精製過程におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。
【図２】各種挿入融合体の最終精製標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。
【図３】各種挿入融合体のＲＮＡ分解活性を示す図である。
【図４】ＲＮａｓｅインヒビター存在下における挿入融合体ＣＬ−ＲＦＮ８９のＲＮＡ分解活性を示す図である。
【図５】挿入融合体ＲＦＮ８９及びＣＬ−ＲＦＮ８９のトリプシンに対する安定性を示す図である。
【図６】各種挿入融合体のＦＧＦ受容体高発現細胞株に対する細胞障害活性を示す図である。
【図７】癌細胞を移植したマウスにおける挿入融合体の血管新生抑制効果を示す解剖顕微鏡写真である。
【図８】癌細胞を移植したマウスにおける挿入融合体の血管新生抑制効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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