(57)【要約】【課題】精液中のリラキシン様蛋白質濃度を増加させ、雄性動物の生殖能力を高める方法を提供すること。【解決手段】（１）オリゴ糖を主成分とするリラキシン様蛋白質分泌促進剤、（２）オリゴ糖がイソマルトオリゴ糖である（１）のリラキシン様蛋白質分泌促進剤、（３）１又は２のリラキシン様蛋白質分泌促進剤を用いる雄性動物の生殖能力を向上させる方法、（４）雄性動物が雄豚である３の雄性動物の繁殖能力を向上させる方法、（５）１又は２のリラキシン様蛋白質分泌促進剤を含有する飼料、食品又は医薬品、（６）精漿中のリラキシン様蛋白質濃度を測定することを特徴とする精液の正常度の判別法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴ糖を主成分とするリラキシン様蛋白質分泌促進剤。
【請求項２】
オリゴ糖がイソマルトオリゴ糖である請求項１記載のリラキシン様蛋白質分泌促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のリラキシン様蛋白質分泌促進剤を用いることを特徴とする雄性動物の生殖能力を向上させる方法。
【請求項４】
雄性動物が雄豚である請求項３記載の雄性動物の生殖能力を向上させる方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載のリラキシン様蛋白質分泌促進剤を含有する飼料、食品又は医薬品。
【請求項６】
精漿中のリラキシン様蛋白質濃度を測定することを特徴とする精液の正常度の判別法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リラキシン様蛋白質分泌促進剤により雄性動物の生殖能力を向上させる方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
多くの生命体が行なう有性生殖ではオスとメスの２つの性を必要とし、それぞれが提示する配偶子の受精によって新しい世代の生命体を形成していく。言うまでもなく、生殖は生物にとってきわめて重要な生命活動である。
しかし、近年、環境ホルモン汚染などの影響でヒトの精子数減少や魚介類などで生殖能に異変が取りざたされ、生殖を取り巻く環境汚染が社会問題となっている。
【０００３】
そして、牛、豚、鶏などの産業動物では、生産効率を追求するため、狭い畜舎内で集約的に飼育されることが多く、飼育管理、衛生環境面などでの改善が進められてはいるが、いまだ十分とは言えない。このような、家畜に対する様々なストレスは、繁殖成績の悪化を招き、生産効率向上の足かせとなっている。
とりわけ、養豚の分野では、集約的な生産が営まれれている外、更に、安価な畜産物の輸入圧力に加えて、家畜排泄物の規制に伴う糞尿処理の新たな負担など、養豚生産者を取巻く環境は厳しく、生産コストの削減は生産者にとって切実な問題となっている。
【０００４】
生産コストの削減にとって最も重要なことは、効率的な繁殖を行ない、円滑な家畜生産を行なうことである。しかし、産業動物では、汗腺が退化しており、特に、豚などでは厚い皮下脂肪に覆われていることもあり、２５℃を超える暑熱ストレスによって、何らかの繁殖障害が出ると言われている。特に種雄畜の精子数減少や精子の活力低下（運動能の低下）などの精液性状の異常をきたし、しばしば繁殖障害の原因となっている。
このような問題を解決する方法として、例えば、オリゴ糖、特にフラクトオリゴ糖を主成分とする糖類を含有する種豚用飼料を用いることを特徴とする雄豚の生殖能力を向上させる方法が知られているが（例えば、特許文献１参照）、十分であるとは言い難い。
【０００５】
また、体外受精においては、精子の受精能が不十分であるため、運動性を高めるためカフェインやβ−サイクロデキストリンを添加することが知られている。しかしながら、これらの方法では、多精子進入が起こるなど正常な受精卵が得られる確率は低かった。そこで、特定のペプチドを精子に添加して運動性を高めることで受精率を向上させる方法も開発されている。
このような方法としては、例えば、受精前に精巣−特異的インシュリン同族体ペプチドを、精子に添加して運動性を高める方法（例えば、特許文献２参照）やバッファロー血精／血漿由来の精子運動能促進性高分子タンパク質（例えば、特許文献３参照）が知られている。
しかし、これらのペプチドを作るためには、遺伝子組換え技術やタンパク質を得るための生体が不可欠であること、純度を高めるため精製しなければならないこと、また体外受精を行う必要があること等、極めて煩雑でコストの高い方法であった。
【０００６】
リラキシンは、妊娠期の生殖器に見出される妊娠ホルモンの一つである。
一方、リラキシン様蛋白質は、リラキシンと相同性のあるペプチドホルモンであり、雄性動物類の精漿中に含まれている。リラキシン様蛋白質は、精子のレセプターに結合してその運動性を高めると考えられている。即ち、射精時に精子の先体に主に結合し，１５０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で精巣上体尾部精子に暴露させると顕著に受精能獲得や先体反応を誘起するとされている（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照）。
このようなリラキシン様蛋白質としては、例えば、ブタ精漿腺から単離された分子量約１３ｋＤａの分泌蛋白質があり、１０頭の種豚について精漿リラキシン様蛋白質濃度を調べた結果、１１７−７００μｇ／ｍｌ（平均３００±１７０μｇ／ｍｌ）であった（例えば、非特許文献３参照）。
【０００７】
【特許文献１】
特開平８−２０５７８９号公報
【特許文献２】
特開２００２−２０４６９８号公報
【特許文献３】
特開平１１−２７９０７５号公報
【非特許文献１】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｖｏｌ．４７、Ｎｏ．４、２００１、１９７−２０４
【非特許文献２】
「２００１年度日本畜産学会第９８回大会講演要旨」、社団法人日本畜産学会、ｐ．１０９
【非特許文献３】
「２００１年第９４回日本繁殖生物学会講演要旨」、日本繁殖生物学会、ｐ．８８
【０００８】
また、最近、顕微鏡での検査では精子数や精子の活力（運動性）は正常であっても、卵子との受精能の低い、低受胎性精液の存在が知られている。この原因は、まだはっきりと解明されていないが、精子核のストレスに対する抵抗性が低いことや精子頭部の首振り振幅幅の小さいことが原因と見られている。
繁殖動物の管理では、精液の性状は熟練を要し手間のかかる顕微鏡観察や、実際に雌性動物で発情の有無を調べたり、超音波検査機器など高価な電子機器が必要とする。ここで雌性動物での判断は、個体の影響が大きいため、受胎率や産子数などで精液に問題があっても発見することは非常に困難があった。
従って、長期に渡って精液性状に異常のある種雄畜を使用することになるため、経済的な損失は大きい。このため、従来の顕微鏡を用いた判定では発見できない種雄畜の精液異常を早期に発見できれば、経済的な損失は最小限で食い止めることが出来る。
以上のことから、雄性動物の生殖能力を向上させる方法の開発が待たれている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、精液中のリラキシン様蛋白質濃度を増加させ、雄性動物の生殖能力を高める方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、リラキシン様蛋白質が精子に運動性を付与する錠分子であると考え、上記の課題を解決するべく鋭意研究を重ねたところ、オリゴ糖とリラキシン様蛋白質の分泌との間には関係があることを知り、更に研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、以下の通りのものである。
１．オリゴ糖を主成分とするリラキシン様蛋白質分泌促進剤。
２．オリゴ糖がイソマルトオリゴ糖である上記１記載のリラキシン様蛋白質分泌促進剤。
３．上記１又は２記載のリラキシン様蛋白質分泌促進剤を用いることを特徴とする雄性動物の生殖能力を向上させる方法。
４．雄性動物が雄豚である上記３記載の雄性動物の生殖能力を向上させる方法。５．上記１又は２記載のリラキシン様蛋白質分泌促進剤を含有する飼料、食品又は医薬品。
６．精漿中のリラキシン様蛋白質濃度を測定することを特徴とする精液の正常度の判別法。
【００１２】
本発明は、オリゴ糖には優れたリラキシン様蛋白質分泌促進作用があるという、本発明により初めて見出された新事実の発見に基づいてなされたものである。本発明によれば、オリゴ糖の作用によりリラキシン様蛋白質の分泌が促進される結果、精液中のリラキシン様蛋白質の濃度低下が防止されるので、牛、豚、鶏などの雄性動物においても暑熱ストレスなどの環境変化による精子活力の低下を引き起こすことがなく、農場成績を向上・安定させるという、格別の効果が達成される。
また、従来の顕微鏡を用いた判定では発見できなかった雄豚等の精液異常を精液中のリラキシン様蛋白質の濃度を測定することにより、早期に発見できるので、経済的な損失は最小限で食い止めることが出来る。
【００１３】
以下、本発明について、更に詳細に説明する。
本発明のオリゴ糖としては、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、ラフイノース、キシロオリゴ糖、ラクチュロース、ラクトスクロース等が挙げられるが、特に、イソマルトース、イソマルトリオース、パノースなど、グルコースがα−１，４結合以外の結合を有するオリゴ糖、例えば、イソマルトオリゴ糖が最適である。
イソマルトオリゴ糖は、熱や酸に対する安定性が高いため、飼料の加熱処理や酸性剤の添加等による失活が少ないので、イソマルトオリゴ糖からなるリラキシン様蛋白質分泌促進剤は、その使用が制限されない点でも有利である。
【００１４】
受精率の高い精液を繁殖に使用するためには、一定基準のリラキシン様蛋白質濃度を超える精液を使用する必要がある。
その基準は、実際に、リラキシン様蛋白質濃度を測定して、人工授精により、受胎率を測定することができる（補足的なデータとして、運動精子率などの精子の運動性も同時に測定してもよい）。実際に分娩率、出生率で生殖能力を調べる方法もあるが、判定に多大な時間、例えば、妊娠期間は牛で２８０日、豚で１４４日を要する上に、母胎の影響が大きく、Ｎ数を大きくする必要がある。
【００１５】
判断基準は種によって異なり、血統が守られている動物などでも異なる。また、繁殖時期によっても異なる。
豚の場合は、精漿中のリラキシン様蛋白質が２８０μｇ／ｍｌ以上、望ましくは３００μｇ／ｍｌ以上がよい。リラキシン様蛋白質が２４０μｇ／ｍｌ以下の精液は、不良精液と判断し、使用しないのがよい。
【００１６】
本発明のリラキシン様蛋白質分泌促進剤は、オリゴ糖を単独、或いは、他の添加物、例えば、賦形剤、崩壊剤、栄養剤、ハーブ（生薬）等の成分が含まれていてもよい。
賦形剤としては、ケイ酸、ゼオライト、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール等）、澱粉（トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉等）、セルロース誘導体（メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、ゼラチン、トラガントゴム等が、崩壊剤としては、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩等が、栄養剤としては、アミノ酸、ビタミン等が、それぞれ挙げられる。
【００１７】
本発明のリラキシン様蛋白質分泌促進剤は、ヒトや豚、牛、馬、羊、山羊、鶏等の産業動物、また、イヌ、ネコなどの愛玩動物等でその効果が認められ、食品、飼料、医薬品等に添加することにより使用することができる。
本発明のリラキシン様蛋白質分泌促進剤の添加量は、有効成分であるオリゴ糖として、０．０１ｇ〜０．３ｇ／日／体重ｋｇ程度で効果が認められるが、望ましくは０．０２ｇ〜０．２ｇ／日／体重ｋｇが良い。
また、オリゴ糖の機能は主に腸内細菌叢のバランス良化によるところが大きいと考えられるので、本分泌促進剤は継続的に連続して給与することが望ましいが、豚などの夏場対策として季節限定で用いるならば、夏場に入る２〜３ケ月前から給与しても良い。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
１．精漿中のリラキシン様蛋白質濃度の測定
リラキシン様蛋白質濃度の測定は、リラキシン濃度の測定法として確立されている時間分解蛍光免疫測定法に準じて行った（例えば、非特許文献４参照）。
【００１９】
【非特許文献４】
「臨床獣医」臨時増刊号、Ｖｏｌ．２０、Ｎｏ．３、２００２、Ｐ．１５１−１５９
【００２０】
（１）トレーサーの作成
精製したリラキシン様蛋白質を用い、非放射性蛍光物質ユーロピウムで標識した後、ゲル濾過による分画を行い、ユーロピウムで標識されたリラキシン様蛋白質を得る。
【００２１】
（２）リラキシン様蛋白質特異抗体の作成
リラキシン様蛋白質特異抗体はウサギに免疫して作製する。
得られた抗体は、リラキシン様蛋白質とのみクロスリアクションするが、精嚢膿抽出液の中の他の成分とはクロスリアクションしないこと、また、インスリンやＦＳＨともクロスリアクションしないことから、リラキシン様蛋白質に特異的な抗体であることを確認する。
【００２２】
（３）時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲ−ＦＩＡ）
第二抗体を固相化した競合的原理に基づく、時間分解蛍光免疫測定法を用いて、以下の方法により、精漿中のリラキシン様蛋白質濃度を測定した。
第二抗体を固相化したマイクロタイタープレートにサンプルまたはスタンダードと第一抗体を加え、１．５時間インキュベーションする。次いで、トレーサーとしてユーロピウム標識リラキシン様蛋白質を加え、さらに３．５時間、インキュベーションする。インキュベーション終了後、プレートを６回洗浄し反応を停止する。その後、標識リラキシン様蛋白質からユーロピウムイオンが遊離し、高い蛍光を示すキレート化合物を形成させるための増強試薬（Ｎａ  Ｎ３）を添加する。５分間インキュベーションした後、時間分解蛍光装置で蛍光をカウントする。
【００２３】
【実施例１】
有効成分８７．５％イソマルトオリゴ糖を含むシロップ（イソマルト９００：昭和産業株式会社製）６９部に、賦形剤としてケイ酸（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｌｔｄ．製）３１部を噴霧乾燥して、リラキシン様蛋白質分泌促進剤を調整した。
上記のリラキシン様蛋白質分泌促進剤を人工授精用の雄豚に給与し、無添加の対照区と比較しながら、精漿中のリラキシン様蛋白質濃度の経時的な推移を調査した。
【００２４】
（１）試験方法
人工授精用の種雄豚２０頭を１０頭ずつ添加区と対照区に分け、添加区には上記の本発明の分泌促進剤を、イソマルトオリゴ糖として、２５ｇ／日／豚体重約２５０ｋｇ給与し、対照区は無給与とした。試験期間は、雄豚の夏場対策を想定し、４〜１０月までの７ケ月間とした。
【００２５】
（２）調査項目
試験期間中、精液は約１回／週のペースで採取し、顕微鏡で採取精液を観察してその性状を調査するとともに、１回／月のペースで採取精漿中のリラキシン様蛋白質の濃度を測定した。
【００２６】
（３）試験結果
１）精子の性状
対照区では、供試豚１０頭のうち２頭が９月から精液性状に異常が見られ、廃豚となった。これに対して、添加区の供試豚は、試験期間中、精液の性状に異常は見られず良好であった。
【００２７】
２）リラキシン様蛋白質の濃度
濃度の測定結果は、表１に示す。
【００２８】
【表１】
2004284980.tif 000002
数値：平均±標準誤差        単位：μｇ／ｍｌ
【００２９】
表１によると、精漿中のリラキシン様蛋白質の濃度は、試験後半の８月以降、添加区が対照区を上回る数値を示した。
上記の結果から、本分泌促進剤は、雄豚の精漿中のリラキシン様蛋白質濃度を増加させることが解る。
また、上記の試験データについて、元々リラキシン様蛋白質の濃度が低い各豚５頭のデータを示すと、表２の結果となる。
【００３０】
【表２】
2004284980.tif 000003
数値：平均±標準誤差        単位：μｇ／ｍｌ
【００３１】
表２の結果から、添加区では３００μｇ／ｍｌまで回復しており、添加区と対照区を比較すると、特に７〜１０月での差が大きく、本分泌促進剤は、元々リラキシン様蛋白質の濃度が低い豚に特に有効であることが解る。
以上の結果、本発明の分泌促進剤は、雄豚の精漿中のリラキシン様蛋白質濃度を増加させ高めることが確認された。
【００３２】
【実施例２】
１１頭の種豚から精漿を集め、リラキシン様蛋白質濃度を測定した。平均リラキシン様蛋白質濃度は、３００μｇ／ｍｌであった。平均濃度を基準にして高リラキシン様蛋白質濃度区（８頭）と低リラキシン様蛋白質濃度区（３頭）の二つのグループに分けた。高リラキシン様蛋白質濃度区のリラキシン様蛋白質の平均濃度は３４６μｇ／ｍｌであり、低濃度区リラキシン様蛋白質平均濃度は１７４μｇ／ｍｌであった。各濃度区の種豚の精子の性状並びに対外受精率を測定した。結果は、表３に示す。
【００３３】
【表３】
2004284980.tif 000004
ＲＬＰ：リラキシン様蛋白質        数値：平均±標準偏差
【００３４】
表３の結果では、顕微鏡下で評価する運動精子率、生存精子率、未成熟精子率に有意差は見られなかった。
それに対して、実際に、卵子を使用している体外受精率測定では、高リラキシン様蛋白質濃度区と低リラキシン様蛋白質濃度区で、明確な差が認められた。
このように、従来行われていた顕微鏡下で観察する方法による評価では、正常精液の判別が難しく、精漿中のリラキシン様蛋白質濃度を測定することで初めて判別することができることが解った。
【００３５】
以上の実施例１及び実施例２の結果から、オリゴ糖は、リラキシン様蛋白質の分泌を促進させ、雄豚の生殖能力を向上させることが解る。
そして、従来の技術では、精子の運動能で問題のない精液を用いて人工授精しても十分な繁殖成績が得られないことがあったが、精漿中のリラキシン様蛋白質濃度を測定することで、生殖能力の高い精液を判別出来ることが可能となった。
【００３６】
【発明の効果】
（１）本発明によれば、リラキシン様蛋白質の分泌が促進される結果、精漿中のリラキシン様蛋白質の濃度低下が防止されるので、牛、豚、鶏などの雄性動物においても暑熱ストレスなどの環境変化による精子活力の低下を引起こすことがなく、農場成績を向上・安定させるという、格別の効果が達成される。また、イヌ、ネコなどの愛玩動物では、精漿中のリラキシン様蛋白質を増加させ、円滑な繁殖が可能となる。
【００３７】
（２）従来の顕微鏡を用いた判定では発見できなかった雄豚等の精液異常を精漿中のリラキシン様蛋白質の濃度を測定することにより、早期に発見できるので、経済的な損失は最小限で食い止めることが出来る。