(57)【要約】【課題】自己免疫疾患や移植片拒絶反応の処置には、従来免疫反応全体を抑制する免疫抑制剤が使用されてきた。しかしながら、この方法には免疫低下などの副作用があった。本発明の技術的課題は、目的の抗原に対する免疫反応のみを抑制することである。【解決手段】目的の抗原に特異的なＴ細胞にＦｏｘｐ３タンパク質を発現させることにより、該細胞を制御性Ｔ細胞に変化させる。こうして作成された制御性Ｔ細胞は、哺乳動物の体内に移入されると、目的の抗原に対する反応性Ｔ細胞のみを抑制し、免疫反応の抗原特異的抑制が達成される。【選択図】図４
2004208548.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｏｘｐ３タンパク質を発現している、制御性Ｔ細胞表現型を有する形質転換体。
【請求項２】
Ｆｏｘｐ３タンパク質をコードする核酸配列分子を含むベクター。
【請求項３】
自己免疫疾患の処置に使用する、請求項２に記載の治療用ベクター。
【請求項４】
移植片への免疫反応を抑制するために使用する、請求項２に記載の治療用ベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の形質転換体または請求項２に記載のベクターを含有する医薬組成物。
【請求項６】
ａ）哺乳動物からある抗原に特異的なＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を単離すること、
ｂ）該細胞にＦｏｘｐ３タンパク質を発現させて制御性Ｔ細胞表現型に変化させ請求項１の形質転換体を調製すること、
ｃ）該哺乳動物に該形質転換体を移入すること、
の各段階を含む、該抗原に対する免疫反応を抑制する方法。
【請求項７】
制御性Ｔ細胞を検出するための方法であって、Ｆｏｘｐ３遺伝子またはＦｏｘｐ３タンパク質を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫反応の抑制に関するものである。特に、本発明は、自己免疫疾患および移植片への拒絶反応を抑制するための形質転換体、医薬組成物および方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
自己免疫疾患は、本来非自己抗原とのみ反応すべき免疫系が自己抗原に向かい、自己を攻撃・破壊するに至る疾患である。自己免疫疾患には、橋本病、悪性貧血、グットパスチャー症候群、重症筋無力症、慢性関節リウマチなどがある。これらの疾患の治療には各々適する方法を採用するが、症状が重篤な場合には、メトトレキサート、アザチオプリン、シクロホスファミドなどの免疫抑制剤を使用する。しかし、一般に、これらの薬物は免疫系の機能全体を抑制するので、危険な副作用を引き起こし得る。例えば、日和見感染症が生命を脅かしたり、通常は免疫系により排除される腫瘍が排除されなくなり、癌発症のリスクが高まったりする。そこで、自己抗原特異的に免疫を抑制する方法の開発が求められている。
【０００３】
多くの自己免疫疾患の発症に、自己反応性Ｔ細胞が主役を演じる。自己反応性Ｔ細胞は、自己免疫疾患を発症した個体のみならず、正常個体中にも検出できる。自己免疫疾患の発症に関わる自己反応性Ｔ細胞の産生および活性化の機構は未解明である。正常個体中では、通常、自己反応性Ｔ細胞は何らかの制御を受け、自己免疫疾患が発症することはない。この免疫自己寛容の維持機構として、現在までにいくつかの説が提唱されてきた。例えば、（１）胸腺中で、自己主要組織適合抗原複合体と自己抗原に強く反応するＴ細胞には細胞死が誘導される。この負の選択を免れたＴ細胞は、自己抗原に対する親和性が低いため、自己抗原を無視する。（２）胸腺中あるいは末梢で自己抗原と遭遇した自己反応性Ｔ細胞は不活性化される。さらに、（３）これらの過程を逃れて末梢に放出された自己反応性Ｔ細胞に対して、Ｔ細胞による抑制的制御が働く。近年、このＴ細胞性制御が積極的に免疫自己寛容の成立・維持に関与している可能性、その異常が自己免疫疾患の直接的原因となり得る可能性が指摘され、報告されている（Ｍｏｄｉｇｌｉａｎｉ  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９９６；  １４６：  １５５−７４、Ｆｏｗｅｌｌ  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９９１；  １２３：  ３７−６４、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  Ｓ．  Ｃｅｌｌ  ２０００；  １０１：  ４５５−８、坂口志文、感染・炎症・免疫、２０００年、第３０巻、第４号（非特許文献１））。
【０００４】
胸腺のクローン除去を逃れた自己反応性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（ＴＲ）によって末梢でその活性化と増殖が積極的に抑制され、ＴＲの大部分は常にＣＤ２５（インターロイキン（ＩＬ）−２受容体α鎖）を発現している（Ｓ．  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  Ｃｅｌｌ  １０１，  ４５５  （２０００）、Ｋ．  Ｊ．  Ｍａｌｏｙ，  Ｆ．  Ｐｏｗｒｉｅ，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２，  ８１６  （２００１）、Ａ．  Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １８２，  ８９  （２００１）、Ｅ．  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２，  ３８９  （２００２）．  Ｓ．  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５，  １１５１  （１９９５））。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞の少なくとも一部は、機能的な成熟Ｔ細胞の亜集団として胸腺で産生される（Ｍ．  Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２，  ５３１７  （１９９９）、Ｍ．  Ａｓａｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８４，  ３８７  （１９９６））。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞の減少または機能上の変化は、げっ歯類で自己免疫性甲状腺炎、胃炎およびＩ型糖尿病の発症・進行を導く（Ｓ．  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  （１９９５）（前出）、Ｍ．  Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（前出）、Ｍ．  Ａｓａｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．（前出）、Ｅ．  Ｓｕｒｉ−Ｐａｙｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０，  １２１２  （１９９８））。さらに、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞は、げっ歯類においてアレルギーや炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を防ぎ、環境に存在する無害な外来抗原に対する反応の均衡を維持すると考えられている（Ｒｅａｄｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９２，  ２９５  （２０００），  Ｃｕｒｏｔｔｏ  ｄｅ  Ｌａｆａｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９４，  １３４９  （２００１））。
【０００５】
アレルギーおよびＩＢＤ、そして類似の多臓器自己免疫疾患は、Ｘ連鎖劣性遺伝疾患、ＩＰＥＸ（免疫制御異常、多発性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖症候群）またはＸＬＡＡＤ（Ｘ連鎖自己免疫−アレルギー制御異常症候群）において発症する（Ｒ．  Ｓ．  Ｗｉｌｄｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３９，  ５３７  （２００２））。変異マウスであるｓｃｕｒｆｙもＣＤ４＋Ｔ細胞の無制御な活性化／増殖の結果として、類似のＸ染色体連鎖劣性遺伝自己免疫／炎症疾患に罹患する（Ｖ．  Ｌ．  Ｇｏｄｆｒｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １３８，  １３７９  （１９９１）．  Ｐ．  Ｊ．  Ｂｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５３，  ３７６４  （１９９４）．  Ｌ．  Ｂ．  Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２，  ２５４６  （１９９９））。最近、ＩＰＥＸ／ＸＬＡＡＤ患者またはｓｃｕｒｆｙマウスにおける原因遺伝子として、Ｓｃｕｒｆｉｎと称するフォークヘッド／ウイングドヘリックス型の転写因子をコードするＦｏｘｐ３が同定された（Ｍ．  Ｅ．  Ｂｒｕｎｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２７，  ６８  （２００１）（非特許文献２）、Ｔ．  Ａ．  Ｃｈａｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０６，  Ｒ７５  （２０００）、Ｒ．  Ｓ．  Ｗｉｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２７，  １８  （２００１）（非特許文献３）、Ｃ．  Ｌ．  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２７，  ２０  （２００１）（非特許文献４））。Ｆｏｘｐ３に関して、その発現を調節する化合物のスクリーニング方法および免疫系の調節方法（特許文献１）、並びにその変異の検出方法（特許文献２）が開示されている。我々は、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞の操作により引き起こされる自己免疫および炎症と、Ｆｏｘｐ３の遺伝的欠陥により誘導されるものとの間に免疫学的類似性があることを見出し、制御性Ｔ細胞の発生または機能におけるＦｏｘｐ３の関与に着目した。
【０００６】
【特許文献１】
国際公開第０２／０９０６００号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第０２／１６６５６号パンフレット
【非特許文献１】
坂口志文、「ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞−自己免疫との関連−」、感染・炎症・免疫、医学の門社、２０００年１２月１５日、第３０巻、第４号、ｐ．２０−２６
【非特許文献２】
マリー・イー・ブランコウ（Ｍａｒｙ  Ｅ．  Ｂｒｕｎｋｏｗ）、ほか９名、「ネイチャー・ジェネティックス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、（英国）、２００１年１月、第２７巻、第１号、ｐ．６８−７３
【非特許文献３】
アール・エス・ウィルディン（Ｒ．  Ｓ．  Ｗｉｌｄｉｎ）、ほか１５名、「ネイチャー・ジェネティックス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、（英国）、２００１年１月、第２７巻、第１号、ｐ．１８−２０
【非特許文献４】
シー・エル・ベネット（Ｃ．  Ｌ．  Ｂｅｎｎｅｔｔ）、ほか９名、「ネイチャー・ジェネティックス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、（英国）、２００１年１月、第２７巻、第１号、ｐ．２０−２１
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記したように、自己免疫疾患の処置には抗原特異的な免疫抑制が有効である。本発明の技術的課題は、免疫反応の抗原特異的抑制を可能にすることである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決すべく種々研究を重ねた結果、目的の抗原に特異的なＴ細胞にＦｏｘｐ３タンパク質を発現させると、該細胞が制御性Ｔ細胞に変化すること、そして該制御性Ｔ細胞が該抗原に特異的な反応性Ｔ細胞を抑制することを明らかにし、このメカニズムを利用して、抗原特異的に免疫を抑制する方法を開発した。
【０００９】
即ち、本発明は、Ｆｏｘｐ３タンパク質を発現している、制御性Ｔ細胞表現型を有する形質転換体を提供する。本発明はまた、Ｆｏｘｐ３タンパク質をコードする核酸配列分子を含むベクター、特に自己免疫疾患の処置または移植片に対する免疫反応の抑制用の治療用ベクターを提供する。本発明はさらに、制御性Ｔ細胞表現型を有する形質転換体を含有する医薬組成物も提供する。
【００１０】
また、本発明は、ａ）哺乳動物からある抗原に特異的なＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を単離すること、ｂ）該細胞にＦｏｘｐ３タンパク質を発現させて制御性Ｔ細胞表現型に変化させ本発明の形質転換体を調製すること、ｃ）該哺乳動物に該形質転換体を移入すること、の各段階を含む、該抗原に対する免疫反応を抑制する方法を提供する。さらに、Ｆｏｘｐ３遺伝子またはＦｏｘｐ３タンパク質を使用する、制御性Ｔ細胞を検出するための方法も提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
「Ｆｏｘｐ３」は、Ｘ染色体連鎖劣性遺伝自己免疫／炎症疾患に罹患するマウスの変異株、ｓｃｕｒｆｙにおいて変異が発見された遺伝子であり、Ｘ染色体上にある。マウスＦｏｘｐ３は、Ｓｃｕｒｆｉｎと称する４２９アミノ酸のフォークヘッド／ウイングドヘリックス型の転写因子をコードする（上述）。ヒトにおいても、Ｆｏｘｐ３遺伝子はＸ染色体上に位置し、４３１アミノ酸からなり、マウスＦｏｘｐ３と８６％と高い相同性を示す。Ｆｏｘｐ３ｃＤＮＡの塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２７７９９１およびＡＦ２７７９９２（マウス）、並びにＡＦ２７７９９３（ヒト）として知られている。本発明における「Ｆｏｘｐ３」は、哺乳動物におけるマウスＦｏｘｐ３相同体および類似体を包含し、これらの遺伝暗号縮重体もＦｏｘｐ３に含まれる。ある遺伝子がＦｏｘｐ３相同体または類似体であるか否かは、ＢＬＡＳＴプログラムのような当業者に周知の類似性測定プログラムを使用して推定でき、後述の方法により判定できる。
【００１２】
Ｆｏｘｐ３と類似性が高いと判断された候補Ｆｏｘｐ３遺伝子の中から、本発明で使用し得るＦｏｘｐ３を選択する方法は、次の通りである。ａ）候補Ｆｏｘｐ３遺伝子を、哺乳動物から単離したＣＤ４＋ＣＤ２５−反応性Ｔ細胞に導入し、該遺伝子からタンパク質を発現させる。ｂ）抗原提示細胞および抗ＣＤ３モノクローナル抗体の存在下で、該細胞を新たに単離したＣＤ４＋ＣＤ２５−反応性Ｔ細胞と共に培養する。ｃ）遺伝子導入を実施する場合としない場合で比較し、実施した場合に有意に反応性Ｔ細胞の増殖が抑制されたならば、該候補Ｆｏｘｐ３遺伝子を、本発明のＦｏｘｐ３と判定する。実験条件は、実施例の記載を参酌して当業者が容易に設定できるものである。
【００１３】
本明細書における「Ｆｏｘｐ３タンパク質」は、上記Ｆｏｘｐ３にコードされるタンパク質を意味する。Ｆｏｘｐ３タンパク質のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＧ５３６０５およびＡＡＧ５３６０６（マウス）、並びにＡＡＧ５３６０７（ヒト）として知られている。本発明では、「Ｆｏｘｐ３タンパク質」には、マウスまたはヒトＦｏｘｐ３タンパク質に対して１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または付加を有し、かつマウスまたはヒトＦｏｘｐ３タンパク質と同等の活性を有する変異タンパク質も包含される。
【００１４】
「制御性Ｔ細胞表現型」は、細胞接触が許容される条件でＣＤ４＋ＣＤ２５−の反応性Ｔ細胞と共に培養し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介する刺激を受けると、抗原非特異的に反応性Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン産生を阻害する表現型を意味する。制御性Ｔ細胞表現型を有するＴ細胞を制御性Ｔ細胞と称する。通常、制御性Ｔ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋であり、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、他のＴ細胞のＩＬ−２の転写レベルを直接または間接的に低下させることにより増殖抑制能を発揮する。本発明においては、抗原特異性を示す制御性Ｔ細胞表現型が好ましい。
【００１５】
本発明の「形質転換体」は、外来Ｆｏｘｐ３遺伝子を導入した細胞、好ましくはＴ細胞を意味する。外来遺伝子の導入方法は当分野で既知であり、本発明のベクターを使用して作成し得る。好ましくは、本発明の形質転換体は、抗原特異性を示す制御性Ｔ細胞表現型を有する形質転換体である。
【００１６】
本発明のＦｏｘｐ３をコードする核酸配列を含むベクターを作成するために、哺乳動物Ｔ細胞におけるタンパク質の発現に適するあらゆる発現ベクターを使用できる。そのような発現ベクターの例には、ＭＳＣＶ２．２、ｐｃＤＮＡ３などがある。本発明のベクターを哺乳動物細胞に導入するには、レトロウイルス感染、アデノウイルス感染、レンチウイルス感染およびエレクトロポレーションなどの既知の方法から、適する方法を選択すればよい。
【００１７】
本発明により、自己免疫疾患を処置するための治療用Ｆｏｘｐ３発現ベクターが提供される。本発明における「自己免疫疾患」とは、免疫系が自己成分（共生細菌を含む）または環境から体内に取入れた通常は無害な成分に反応することを原因とする、あらゆる疾患を意味する。このような自己免疫疾患の例には、インシュリン依存性糖尿病、自己免疫性胃炎、炎症性腸疾患、橋本病、悪性貧血、グットパスチャー症候群、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、アレルギー性疾患、多発性硬化症などが挙げられる。
【００１８】
本発明により、移植片に対する免疫反応抑制のための治療用Ｆｏｘｐ３発現ベクターも提供される。現在様々な臓器の移植が行われているが、ドナーとレピシエントが遺伝学的に同一でない限り、レピシエントの免疫系が移植片を非自己成分と認識し攻撃するので、自己免疫疾患と同様に、必要な臓器の機能不全に至る。本発明で提供される移植片に対する免疫反応抑制のためのＦｏｘｐ３発現ベクターを使用すれば、移植片に対する免疫反応を特異的に抑制することが可能である。
【００１９】
上記の自己免疫疾患の処置用のＦｏｘｐ３発現ベクターおよび移植片に対する免疫反応抑制のための治療用Ｆｏｘｐ３発現ベクターにはウイルス型ベクターまたは非ウイルス型ベクターが含まれ、例えば文献記載のＭｉｇＲ１、ＭＦＧ  ｖｅｃｔｏｒなどを利用できる（Ｒｉｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ９２，  ６７３３  （１９９５））。
【００２０】
本発明はさらに、医薬的に許容し得る（即ち、非毒性の、生理的に許容し得る）担体、賦形剤、添加物および／または他の薬剤（免疫抑制剤など）と共に、制御性Ｔ細胞表現型を有する形質転換体、または本発明の治療用ベクターを含有する、医薬組成物も提供する。好ましくは、抗原特異的制御性Ｔ細胞表現型を有する形質転換細胞の養子移入である。
【００２１】
本発明によると、特定の抗原に対する免疫反応を抑制する方法には以下の段階が含まれる：ａ）哺乳動物からある抗原に特異的なＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を単離すること、ｂ）該細胞にＦｏｘｐ３タンパク質を発現させて制御性Ｔ細胞表現型に変化させ本発明の形質転換体を調製すること、ｃ）該哺乳動物に該形質転換体を移入すること。ａ）は、抗原特異的レセプター、ＣＤ４およびＣＤ２５の発現を指標に、フローサイトメトリー、磁気分離などにより達成できる。ｂ）は上記方法により、そしてｃ）はｂ）細胞を上記の医薬組成物に調製し、それを投与することにより達成できる。
【００２２】
特に特定の理論にとらわれるものではないが、上記方法の基礎となるメカニズムは、次の通りであり、本発明の実施例で証明されている。即ち、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３を発現させると、抗原特異性を保持したまま制御性Ｔ細胞に変化する。この制御性Ｔ細胞は、哺乳動物の体内に移入され、抗原提示細胞によりＴＣＲを介して刺激されると、制御性Ｔ細胞と接触する反応性Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン産生を抗原非特異的に抑制する。この抑制に抗原特異性はないが、抗原提示細胞が提示する抗原によって活性化される反応性Ｔ細胞が、近傍の制御性Ｔ細胞によって抑制される。従って、結果的に制御性Ｔ細胞と同じ抗原を認識する反応性Ｔ細胞を抑制することが可能になり、免疫反応の抗原特異的抑制を実行できる。
【００２３】
実施例で証明した通り、Ｆｏｘｐ３は制御性Ｔ細胞において支配的に発現している。従って、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現またはＦｏｘｐ３タンパク質の存在を指標にして、制御性Ｔ細胞を検出することができる。Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現は、マイクロアレイやＤＮＡチップを使用して、あるいはＲＴ−ＰＣＲやノザンブロットなどの方法により検出できる。Ｆｏｘｐ３タンパク質の存在は、Ｆｏｘｐ３特異的抗体を使用してフローサイトメトリー、ウエスタンブロットなどの方法で、あるいはＦｏｘｐ３タンパク質が結合するプロモーター配列を使用して、サウス−ウエスタン法、ゲルシフトおよびフットプリントなどの方法で検出できる。上記の方法は当業者に周知であり、またこれらに限定されるものではなく、他の方法も使用できる。制御性Ｔ細胞の検出方法により、制御性Ｔ細胞が低レベルであると判定された患者に対し、本発明の抑制方法を適用する。
【００２４】
以下の実施例は、本発明を詳細に理解するための例示説明であると共に、本発明の制御性Ｔ細胞が抗原特異的に免疫反応を抑制することを証明するものである。
【００２５】
【実施例】
材料と方法
マウス
ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスは、ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ  （東京、日本）から購入した。ＲＡＧ−２−欠損ＤＯ１１．１０ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｋ．  Ｍ．  Ｍｕｒｐｈｙ，  ｅｔ，  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０，  １７２０  （１９９０））は、我々の動物施設で飼育した。全マウスは６ないし１２週齢で使用し、施設の動物保護ガイドラインに従い、病原体の無い特別な条件で維持した。
【００２６】
抗体、試薬および培地
次の試薬を、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ  （サンディエゴ、ＣＡ）から購入した；ＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ２８（３７．５１）、ＩＬ−１０受容体（１Ｂ１．３ａ）の精製ｍＡｂ、抗ＩＬ−４（１１Ｂ１１）、抗ＩＬ−１２（Ｃ１７．８）；ＣＤ４のＦＩＴＣ−結合ｍＡｂ（ＲＭ４−５）；ＣＤ４（Ｈ１２９．１９）、ＣＤ８（５３−６．７）、ＣＤ１９（１Ｄ３）、ＣＤ４５ＲＢ（１６Ａ）、ＣＤ１０３（Ｍ２９０）、ＣＴＬＡ−４（ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１）、ＩＬ−２（ＪＥＳ６−５Ｈ４）、ＩＬ−４（１１Ｂ１１）、ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）のＰＥ結合ｍＡｂ；サイクロム（ＣｙＣｈｒｏｍｅ）結合抗ＣＤ４ｍＡｂ（ＲＭ４−５）；ＣＤ２５（７Ｄ４）およびＣＤ４４（ＩＭ７）のビオチン化ｍＡｂ。
【００２７】
抗ＴＧＦ−β１（９０１６．２）および抗ＴＧＦβ１、β２、β３ｍＡｂ（１Ｄ１１）は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  （ミネアポリス、ＭＮ）から購入した。抗ＧＩＴＲｍＡｂ（ＤＴＡ−１）は、我々の研究室で産生、精製およびビオチン化した。抗ＩＬ−１０受容体およびＴＧＦ−βｍＡｂは、製造者の指示および他のグループの結果（Ｋ．  Ｎａｋａｍｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９４，  ６２９  （２００１）、Ｃ．  Ａ．  Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９６，  ２３７  （２００２））に従って、ＩＬ−１０受容体を阻害するか、またはＴＧＦβを中和するのに十分な濃度である５０または１００μｇ／ｍｌのいずれかで使用した。マウス組換えＩＬ−２（ｒＩＬ−２）は、塩野義製薬株式会社（大阪、日本）から譲渡された。マウスｒＩＬ−４およびｒＩＬ−１２は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  （ロンドン、英国）および  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  から、各々購入した。
【００２８】
Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μＭ２−ＭＥ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した（全て  Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯから購入）。パッケージ細胞株、Ｐｌａｔ−Ｅ（Ｓ．  Ｍｏｒｉｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７，  １０６３  （２０００））は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加したＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）で培養した。
【００２９】
リンパ球の調製、フローサイトメトリーおよび細胞分離
胸腺、脾臓およびリンパ節（鼡径、腋下、上腕、頚部および腸間膜）の器官を、２％ＦＢＳを添加したＨＢＳＳに１００μｍナイロンメッシュを通して押出し、洗浄して、リンパ球懸濁液を調製した。脾臓の赤血球を、ＡＣＫ緩衝液で除去した。
【００３０】
細胞表面染色用に、１０６個の細胞を蛍光またはビオチン化ｍＡｂと共に、４℃で３０分間、次いでビオチン化抗体用の２次試薬としてストレプトアビジン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と共にインキュベートした。死細胞をヨウ化プロピジウム導入で除去し、細胞を  Ｅｐｉｃｓ−ＸＬ  フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、マイアミ、ＦＬ）で分析した。細胞内のＣＴＬＡ−４を検出するために、細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、０．５％サポニンで透過性にし、０．５％サポニンオ存在下で、ＰＥ結合抗ＣＴＬＡ−４またはそのアイソタイプ適合対照ｍＡｂで染色した。
【００３１】
末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団を分離するために、第１に、記載された通り（Ｍ．  Ａｓａｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８４，  ３８７  （１９９６））、パニング法によってＢ細胞、ＣＤ８＋細胞および粘着細胞を除去して、ＣＤ４＋細胞の濃度を高めた。ＣＤ２５＋またはＣＤ２５−ＣＤ４＋ＣＤ８−胸腺細胞を分離するために、抗ＣＤ８ｍＡｂ（クローン３．１５５）およびウサギの補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ホーンビー、カナダ）で処理してＣＤ８＋細胞を除去した。蛍光抗体による染色後、細胞を  Ｅｐｉｃｓ  Ａｌｔｒａ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ  （Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分離した。分離した亜集団の純度は、再分析すると常に＞９８％であった。
【００３２】
ＲＴ−ＰＣＲ
分離した細胞５ｘ１０５個にアイソゲン試薬  （株式会社ニッポンジーン、東京、日本）を使用して１０μｇのグリコーゲンを添加し、細胞の全ＲＮＡを抽出した。最終体積２０μｌで  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  逆転写酵素およびオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマー  （インビトロジェン株式会社、東京、日本）を使用し、ＲＮＡの総量を逆転写した。いくつかの実験では、逆転写の前にＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅＩ（インビトロジェン）でＲＮＡ試料を処理して、混入したゲノムＤＮＡを除去した。
【００３３】
ＨＰＲＴについての準定量的ＰＣＲの後、まず各試料中のｃＤＮＡの相対量を標準化した。反応混合物（４０μｌ）は、業者の緩衝液中に、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭ前方および後方プライマー、並びに１．０Ｕ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ  （Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）  を含有した。ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００（登録商標）Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｅｒ  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、ウォータータウン、ＭＡ）で実施した。ＨＰＲＴの増幅では、ＰＣＲは２．５分間、９４℃の変性段階に続いて、３０秒間９４℃、３０秒間６０℃、３０秒間７２℃の２８サイクルで構成した。Ｆｏｘｐ３では、アニーリング温度が５７℃、サイクル数が３２であることを除き、上記同様に実行した。プライマー配列は、次の通りであった；Ｆｏｘｐ３：５’−ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＡＣＡ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＣＴＡ  Ｇ−３’および５’−ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＡＧ−３’（Ｍ．  Ｅ．  Ｂｒｕｎｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、前出）；ＨＰＲＴ：５’−ＧＴ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＴＧ−３’および５’−ＧＡＡ  ＧＧＧ  ＴＡＧ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＣＴ−３’。
【００３４】
いくつかの実験では、ＡＢＩ／ＰＲＩＳＭ  ７７００  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  フォスターシティ、ＣＡ）を使用して、Ｆｏｘｐ３のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲで定量した。分析は、プライマー、Ｆｏｘｐ３またはＨＰＲＴ特異的内側蛍光  ＴａｑＭａｎ  プローブおよび  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  （株式会社キアゲン、東京、日本）を使用して実施した。ＰＣＲは、０．４μＭプライマーと、０．２μＭ  ＴａｑＭａｎ  プローブを含有し、１０分間、９５℃の変性段階に続いて、１５秒間９５℃、６０秒間６０℃、３０秒間７２℃の４０サイクルで構成した。
【００３５】
プライマーおよび  ＴａｑＭａｎ  プローブの配列は、次の通りであった。Ｆｏｘｐ３プライマー：５’−ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＴ−３’および５’−ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＴＴＧ−３’；Ｆｏｘｐ３プローブ：５’−ＦＡＭ−ＡＴＣ  ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  Ｃ−３’；ＨＰＲＴプライマー：５’−ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＧＴＡ  ＡＴＧ  ＡＴＣ  ＡＧＴ  ＣＡＡ  Ｃ−３’および５’−ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  Ａ−３’；ＨＰＲＴプローブ：５’−ＶＩＣ−ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＴＡ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  Ｃ−３’。混入したゲノムＤＮＡからの増幅を排除するために、これらのプライマーは、イントロン／エクソン境界をわたるように、従ってｃＤＮＡに特異的にアニーリングするように設計した。ＢＡＬＢ／ｃＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞由来ｃＤＮＡの標準曲線を、各試料中のＦｏｘｐ３およびＨＰＲＴのｃＤＮＡ相対量への限界サイクルを較正するのに使用した。各試料中のＦｏｘｐ３ｍＲＮＡ発現を標準化した値を、ＨＰＲＴ相対量で除したＦｏｘｐ３相対量（ｘ１００）として算出した。全サンプルにつき３回実験した。
【００３６】
Ｔ細胞の活性化および形質分化
レトロウイルス感染用に、１２ウェルプレート（３．０ｍｌ／ウェル）中で、ＡＰＣ（１．０ｘ１０７個／個ウェル）としてのＴ細胞除去とＸ線照射（１８Ｇｙ）したＢＡＬＢ／ｃの脾臓細胞の存在下、分離したＣＤ４＋Ｔ細胞（２．５ｘ１０６個／ウェル）を０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３ｍＡｂおよび１００Ｕ／ｍｌｒＩＬ−２で活性化した。いくつかの実験では、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３を４℃で一夜２４ウェルプレート（０．５ｍｌ／ウェル）にコートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１００Ｕ／ｍｌｒＩＬ−２または２．０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８と共に、Ｔ細胞を加えた（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）。
【００３７】
Ｔｈ１およびＴｈ２分化を誘導するために、２４ウェルプレート（２．０ｍｌ／ウェル）中で、５ｘ１０６個のＡＰＣおよび１００Ｕ／ｍｌｒＩＬ−２の存在下、０．３μＭＯＶＡ３２３−３３９ペプチドにより、ＤＯ１１．１０／ＲＡＧ−２−／−マウスから分離した２．５ｘ１０５ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激した。Ｔｈ１細胞の誘導には、培養に５ｎｇ／ｍｌｒＩＬ−１２および１０μｇ／ｍｌ抗ＩＬ−４ｍＡｂを添加した。Ｔｈ２細胞の誘導には、１０ｎｇ／ｍｌｒＩＬ−４および１０μｇ／ｍｌ抗ＩＬ−１２ｍＡｂを代りに添加した。最初の活性化から７日目までこれらのサイトカインを添加した培地中で細胞を増殖、維持し、次いで５０ｎｇ／ｍｌＰＭＡおよび５００ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）で４時間再刺激した。
【００３８】
レトロウイルスコンストラクトおよび形質転換
マウスＦＯＸＰ３（アミノ酸１−４２９）全長をコードするｃＤＮＡを、ＢＡＬＢ／ｃＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞のｃＤＮＡから、特異的プライマー（５’−ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＧＣＡ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＧＡＣ−３’および５’−ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＣＴ−３’）を使用して増幅し、ＭＳＣＶ２．２由来ベクター、ＭＩＧＲ１（Ｗ．  Ｓ．  Ｐｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ９２，  ３７８０  （１９９８））にクローニングした。フォークヘッドドメインを欠くＦｏｘｐ３ｃＤＮＡ断片（アミノ酸１−３３６）は、プライマー（５’−ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＧＣＡ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＧＡＣ−３’および５’−ＴＣＡ  ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＧＴＡ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＧＴＡ−３’）を使用して同様に増幅し、ＭＩＧＲ１ベクターにクローニングした。パッケージ細胞株、Ｐｌａｔ−Ｅへのトランスフェクションは、記載のように実施した（Ｓ．  Ｍｏｒｉｔａ，  ｅｔ  ａｌ．、前出）。一次Ｔ細胞を上記のように活性化し、１：２体積のウイルス上清と６μｇ／ｍｌの  ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ  （Ｓｉｇｍａ）  を使用して２４時間後に感染させ、３，０００ｒｐｍで６０分間、３２℃で遠心分離した。最初の活性化後７日目から１０日目まで１００Ｕ／ｍｌｒＩＬ−２を添加した培地で細胞を増殖、維持し、ＧＦＰ発現細胞を分離した。
【００３９】
増殖アッセイ
精製したＴ細胞（ウェル当り２．５ｘ１０４個、Ｕ底９６ウェルプレート）を、５ｘ１０４個のＡＰＣと一緒に、０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３ｍＡｂまたは０．１μＭＯＶＡ３２３−３３９ペプチドの存在下で７２時間培養した。３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル；Ｄｕ  Ｐｏｎｔ／ＮＥＮ）  を、培養の最後の６時間にわたって添加した。結果を３回の培養の平均で表し、各実験の平均のＳＤは１５％以内であった。ＡＰＣ単独でのバックグラウンドのカウントは、常に＜２，０００ｃｐｍであった。
【００４０】
ウェル通過実験は、培養に直接添加するか、もしくは  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｉｎｓｅｒｔｓ  （孔サイズ０．４μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、ケンブリッジ、ＭＡ）に添加した２．５ｘ１０５個のＦｏｘｐ３形質転換ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞の存在下または非存在下で、２４ウェルプレート（０．８ｍｌ／ウェル）中で、２．５ｘ１０５個の新鮮なＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞、２．５ｘ１０５個のＡＰＣ、および０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３を用いて実行した。
【００４１】
サイトカインアッセイ
サイトカイン産生を測定するために、５ｘ１０４個の精製したＴ細胞を、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ｍＡｂの存在下で１ｘ１０５個のＡＰＣと一緒に７２時間培養し、７２時間の培養後に培養上清を回収した。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の濃度を、ＥＬＩＳＡ  （ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．、カマリロ、ＣＡ）で測定した。
【００４２】
いくつかの実験では、サイトカイン産生を細胞内の染色で評価した。細胞を１ｘ１０６／ｍｌで再懸濁し、５０ｎｇ／ｍｌＰＭＡおよび５００ｎｇ／ｍｌイオノマイシンで４時間か、または２ｘ１０６／ｍｌＡＰＣの存在下、０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３で２４時間のいずれかで刺激した。細胞回収の２時間前に、ブレフェルジンＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）（１０μｇ／ｍｌ）を添加した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、０．５％サポニンの存在下で、抗サイトカインまたはアイソタイプ適合ｍＡｂで染色した。
【００４３】
組織学
緩衝化した１０％ホルマリン中で大腸と胃を固定し、６μｍのパラフィン包埋切片をヘマトキシリンとエオシンで染色した。大腸炎および胃炎を、公表された基準に従って無作為に等級付けた（Ｍ．  Ａｓａｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．、前出、Ｃ．  Ａｓｓｅｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９０，  ９９５  （１９９９））。
【００４４】
実施例１  ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団は、Ｆｏｘｐ３を発現する
最初に、我々は、正常マウスの胸腺および末端におけるＦｏｘｐ３ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた。胸腺では、ＣＤ４＋ＣＤ８−胸腺細胞の５％を構成するＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＣＤ８−胸腺細胞（Ｍ．  Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、前出）は、ほとんどがＦｏｘｐ３を転写していた。一方、ＣＤ４−ＣＤ８＋および他の未成熟な胸腺細胞の集団は、転写していなかった（図１Ａ）。末梢リンパ組織では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、特異的に遺伝子を転写し、一方ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ１９＋Ｂ細胞は転写しなかった（Ｍ．  Ｅ．  Ｂｒｕｎｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。ＣＤ４＋細胞の中では、正常ナイーブマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞の５−１０％を構成するＣＤ２５＋のサブセットが、主に転写を示した（図１Ｂ）。リアルタイム定量的ＰＣＲ分析により、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞のＦｏｘｐ３ｍＲＮＡレベルは、ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞のものよりも１００倍高いことが解明された（図１Ｃ）。ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞の内では、以前に制御活性を有すると報告されたＣＤ４５ＲＢｌｏｗ集団（Ｌ．  Ａ．  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，  Ｄ．  Ｍａｓｏｎ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５，  ３１０５  （２０００）、Ｏ．  Ａｎｎａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６，  ３００８  （２００１））のみが低レベルで発現した。これらの結果は、胸腺と末梢の両方で、Ｆｏｘｐ３の発現が主にＣＤ２５＋ＣＤ４＋集団に限られていることを示す。
【００４５】
ＩＬ−２または抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の存在下、抗ＣＤ３ｍＡｂによって試験管内で３日間ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞を刺激しても、Ｆｏｘｐ３発現は誘導されなかったので、Ｆｏｘｐ３の発現は、単にＴ細胞活性化によるものではない（図１Ｄ）。ナイーブＴ細胞から調製したエフェクターＴｈ１とＴｈ２細胞は、いずれもＦｏｘｐ３を発現しなかった（図Ｓ１）。さらに、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞を抗ＣＤ３とＩＬ−２で刺激しても、そのＦｏｘｐ３発現は変化しなかった。従って、活性化の方法や状態に関わらず、Ｆｏｘｐ３発現はＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞で安定である。
【００４６】
実施例２  Ｆｏｘｐ３強制発現によるナイーブＴ細胞の制御性Ｔ細胞形質への転換
ナイーブＴ細胞におけるＦｏｘｐ３の強制発現により、これらの細胞を制御性Ｔ細胞形質に転換できるか否かを判定した。Ｆｏｘｐ３およびＧＦＰの両者またはＧＦＰ単独を発現しているバイシストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）レトロウイルスベクター（それぞれＦｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１またはＭＩＧＲ１）を作成した（図２Ａ）。正常ナイーブマウス由来末梢ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞を抗ＣＤ３とＩＬ−２で刺激し、いずれかのレトロウイルスに感染させた。感染の１週間後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激に対する増殖応答、サイトカイン産生、細胞表面分子の発現を調べた。
【００４７】
レトロウイルスによる形質転換により、ＣＤ４＋細胞の３０−６０％がＧＦＰを発現した。抗ＣＤ３でＴＣＲ刺激を与えると、ＭＩＧＲ１感染細胞対照または新たに調製したＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞が活発に増殖したのと対照的に、Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１感染培養由来のＧＦＰ＋細胞は、ほとんど増殖しなかった（図２Ｂ）。さらに、ＩＬ−２、ＩＮＦγ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を大量に分泌したＧＦＰ＋ＭＩＧＲ１感染細胞と比較して、Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１感染ＧＦＰ＋細胞のサイトカイン産生は、検出可能であるが非常に少なかった（図２Ｃ）。これらのＦｏｘｐ３発現細胞は、新たに単離したＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞よりも多量のサイトカインを産生したが（図Ｓ２）、サイトカイン産生細胞は、主としてＧＦＰ（即ち、Ｆｏｘｐ３）の発現レベルが低い細胞に限られた。
【００４８】
自然発生のＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞は、ＣＤ２５、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、糖質コルチコイド依存性腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）およびＣＤ１０３（αＥインテグリン）を特徴的に発現する（Ｓ．  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  （１９９５）（前出）、Ｍ．  Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（前出）、Ｍ．  Ａｓａｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．（前出）、Ｅ．  Ｓｕｒｉ−Ｐａｙｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．（前出）、Ｓ．  Ｒｅａｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９２，  ２９５  （２０００）、Ｔ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９２，  ３０３  （２０００）、Ｂ．  Ｓａｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２，  ４３１  （２０００）、Ｊ．  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３，  １３５  （２００２）、Ｒ．  Ｓ．  ＭｃＨｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６，  ３１１  （２００２）、Ｊ．  Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９９，  １３０３１  （２００２））。レトロウイルス感染のためにＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞を活性化すると、Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１とＭＩＧＲ１感染細胞の両者においてこれらの分子の発現が誘導されるが、前者のＧＦＰ＋細胞は、ＧＦＰ−細胞またはＧＦＰ＋ＭＩＧＲ１感染細胞よりも、ＣＤ２５、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４を高レベルで発現した（図２Ｄおよび表１）。ＧＦＰ＋のＦｏｘｐ３形質転換細胞の中では、ＧＦＰ（即ち、Ｆｏｘｐ３）発現レベルが高いほど、これらの分子の発現が高かった（図２Ｄ）。さらに、Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１感染細胞の中では、ＧＦＰｈｉｇｈ（即ち、Ｆｏｘｐ３ｈｉｇｈ）のみがＣＤ１０３を発現し、ＭＩＧＲ１感染細胞は全く発現しなかった。Ｆｏｘｐ３で形質転換しても、ＣＤ４またはＣＤ４４のいずれの発現レベルも変化しなかったので、これらのＴＲ関連分子のＦｏｘｐ３依存性高発現は特定の遺伝的プログラムによるものであり、単にＦｏｘｐ３によって細胞が過剰に活性化した結果ではない可能性が高い。これらの実験から、我々は、Ｆｏｘｐ３で形質転換すると、ナイーブＴ細胞はＴＣＲ刺激に対して低反応性になり、サイトカイン産生が阻害され、自然発生のＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞の制御機能（Ｔ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０，  １９６９  （１９９８）、Ａ．  Ｍ．  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，  Ｅ．  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８８，  ２８７  （１９９８））と密接に関連する細胞表面分子の発現が上昇すると結論付ける。
【００４９】
表１  Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１またはＭＩＧＲ１で感染させたＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞における様々な細胞表面分子の平均蛍光強度
【表１】
2004208548.tif 000003
【００５０】
実施例３  Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞の抑制活性
Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞の抑制活性を評価した。Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１感染ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３で刺激すると、新たに調製したＣＤ２５−ＣＤ４＋反応性Ｔ細胞の増殖を特異的に低減させた（図３Ａ）。この抑制は、自然のＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞と同様に、反応性集団によるＩＬ−２産生の阻害を伴い（図３Ｂ）、感染集団中ではＧＦＰ（即ち、Ｆｏｘｐ３）発現レベルに比例した（注１および図Ｓ３Ａ）。これらのＧＦＰｈｉｇｈ細胞は、ＣＤ２５−ＣＤ４＋反応性Ｔ細胞のＩＬ−４分泌も抑制した（図Ｓ３Ｂ）。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞は、Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲまたはＭＩＧＲ１のいずれに感染しても、同等の強度の抑制活性を示した（図３Ａ）。
【００５１】
次いで、異所性のＦｏｘｐ３発現により、抗原特異的ナイーブＴ細胞を制御性Ｔ細胞に転換できるか否かを調べるために、我々は、ＲＡＧ欠損ＤＯ１１．１０のＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した（Ｍ．  Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。この動物は、卵白アルブミン（ＯＶＡ）ペプチド特異的なトランスジェニックＴＣＲを発現し、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞に欠損があり、Ｆｏｘｐ３を殆ど発現しない（注２および図Ｓ４）。特異的抗原の非存在下では、これらの動物由来のＴ細胞は、ほぼ全てナイーブ状態にあった。Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲを感染させたトランスジェニックＣＤ４＋細胞は、特異的ＯＶＡペプチドで刺激すると、新たに調製した非感染トランスジェニックＴ細胞の増殖を抑制したが、ＭＩＧＲを感染させたものは抑制しなかった（図３Ｃ）。これらの結果は、総合的に、Ｆｏｘｐ３の異所性発現は、非制御性ナイーブＴ細胞を、おそらくＩＬ−２の阻害を通じて他のＴ細胞の増殖を抑制できる制御性Ｔ細胞表現型に転換するのに十分であることを示す（注３および図Ｓ５）。
【００５２】
Ｆｏｘｐ３形質転換ＣＤ４＋Ｔ細胞は、自然発生ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞と同様の方法で、抑制活性を発揮すると考えられる（注４および図Ｓ６）。第１に、ＢＡＬＢ／ｃＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞由来のＦｏｘｐ３形質転換細胞は、ＯＶＡペプチドで刺激してもＤＯ１１．１０ＴＣＲトランスジェニックＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答を抑制しなかったが、一方抗ＣＤ３によるポリクローナルな刺激は、抑制を誘導した（図３Ｄ）。このことは、Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞は、抑制を発揮するためにＴＣＲを介する刺激を要することを示す（Ｔ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（前出）、Ａ．  Ｍ．  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．（前出））。第２に、Ｆｏｘｐ３感染Ｔ細胞は、細胞接触が許容されれば効果的な抑制を示すが、半透膜で分離されると他のＴ細胞を抑制しなかった（図３Ｅ）。これらの分離されたＦｏｘｐ３感染Ｔ細胞は、おそらくそれらが産生したサイトカインを介して、膜を通してＴ細胞の応答を増強しさえした（図Ｓ２）。さらに、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞で起こるように、ＴＧＦβの中和またはＩＬ−１０受容体の阻害は、単独でも両方でも、抑制を妨げなかった。これらの結果は、Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞によるインビトロでの抑制には、液性因子が介在するのではなく、細胞接触が必要であることを示す（Ｔ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（前出）、Ａ．  Ｍ．  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．（前出））。
【００５３】
実施例４  Ｆｏｘｐ３発現Ｔ細胞による自己免疫疾患の抑制
Ｔ細胞制御の非存在下で進行する炎症および自己免疫疾患を、Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１感染Ｔ細胞が生体内で抑制できるか否かを調べた。そのために、我々は、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに発症するＩＢＤと自己免疫性胃炎のモデルを使用した。このマウスでは、これらの疾患は、正常ＢＡＬＢ／ｃマウス由来ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞の移入により誘導でき、そしてＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞の共移入により防止できる（Ｓ．  Ｒｅａｄ，  ｅｔ  ａｌ．（前出）、Ｓ．  Ｒｅａｄ，Ｅ．  Ｓｕｒｉ−Ｐａｙｅｒ，  Ｈ．  Ｃａｎｔｏｒ，  Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  １６，  １１５  （２００１））（図４）。ＢＡＬＢ／ｃマウス由来ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋細胞をＦｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１またはＭＩＧＲ１に感染させ、ＧＦＰ＋細胞を新たに調製したＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋細胞と共移入した。ＧＦＰ＋Ｆｏｘｐ３形質転換細胞は、体重減少、下痢並びに大腸炎および胃炎の組織学的進行を、自然発生ＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞と同程度に効果的に阻害した。対照的に、ＧＦＰ単独で形質転換した細胞は、疾患を防止せず、むしろ体重減少と大腸炎の進行を促進した。従って、Ｆｏｘｐ３の形質転換により、ナイーブＴ細胞は、胃の自己抗原に対する免疫応答調節異常に起因する自己免疫性胃炎と、共生細菌に対する免疫応答調節異常に起因するＩＢＤを防止するようになることが示された（注５、Ｍ．  Ｅ．  Ｂｒｕｎｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。
【００５４】
以上の実施例は、Ｆｏｘｐ３が胸腺および末梢で自然に発生するＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ集団において支配的に発現されていること、ナイーブＴ細胞でＦｏｘｐ３を発現させると、これらの細胞がＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞と機能的に類似する制御性Ｔ細胞表現型に転換することを示す。このことは、Ｆｏｘｐ３が、胸腺と末梢における制御性Ｔ細胞の細胞系統決定または発生分化のマスター制御遺伝子であることを示唆する。また、我々の結果は、Ｆｏｘｐ３が自己免疫疾患および免疫病理の防止を担う自然発生ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の特異的マーカーになることを示す。これは、現在使用されている、制御性Ｔ細胞と活性化したエフェクターまたはメモリーＴ細胞との間を完全には区別できない細胞表面分子（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＴＬＡ−４およびＧＩＴＲ）よりも有用なマーカーであると期待される。
【００５５】
Ｆｏｘｐ３の突然変異は、ヒトとマウスの両方で、多臓器の病理を伴う致死的なリンパ球増殖異常を進行させる（Ｒ．  Ｓ．  Ｗｉｌｄｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．（前出）、Ｖ．  Ｌ．  Ｇｏｄｆｒｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．（前出））。Ｆｏｘｐ３は、ヒトでも、主にＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞で発現している。さらに、ｓｃｕｒｆｙマウスの突然変異Ｆｏｘｐ３（Ｍ．  Ｅ．  Ｂｒｕｎｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（前出））と同様にフォークヘッドドメインを欠く突然変異Ｆｏｘｐ３を形質転換しても、ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞に抑制活性を与えなかった（図Ｓ７）。従って、本結果は、Ｆｏｘｐ３の突然変異がＣＤ２５＋ＣＤ４＋集団の発生的または機能的異常を介してこれらの疾患を引き起こす可能性を示す。
【００５６】
また、ナイーブＴ細胞のＦｏｘｐ３形質転換によるＴＲ細胞の発生は、自己免疫／炎症性疾患の処置および移植片寛容における処置に、新しい治療様式を提供し得る。
【００５７】
注１  Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞の抑制活性は、Ｆｏｘｐ３発現レベルに依存する
Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１感染細胞を、ＧＦＰ発現レベルによってＧＦＰｈｉｇｈまたはＧＦＰｌｏｗ細胞に分離し、新たに精製したＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞の増殖抑制活性について比較した。ＧＦＰｈｉｇｈ細胞は抑制活性を示したが、ＧＦＰｌｏｗ細胞は示さなかった（図Ｓ３Ａ）。これらのＧＦＰｈｉｇｈＦｏｘｐ３発現細胞は、ＣＤ２５−ＣＤ４＋反応性Ｔ細胞によるＩＬ−４産生も抑制したが、ＭＩＧＲ１に感染したＧＦＰｈｉｇｈ細胞は抑制しなかった（図Ｓ３Ｂ）。これらの結果は、Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞の抑制活性は、Ｆｏｘｐ３発現レベルに依存することを示す。
【００５８】
注２  ＴＣＲトランスジェニックマウスにおけるＦｏｘｐ３発現
ＤＯ１１．１０ＴＣＲトランスジェニックマウスにはＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞が存在し、その大部分は内在性ＴＣＲα鎖を発現するが、ＲＡＧ−欠損バックグラウンドのトランスジェニックマウスには存在しない（Ｍ．  Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。Ｆｏｘｐ３発現は、ＤＯ１１．１０／ＲＡＧ−２＋／−マウス由来のＣＤ２５＋細胞とＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞の両方で検出されるが、ＢＡＬＢ／ｃマウスと同様に、前者で１００倍高いレベルで発現する（図Ｓ４）。さらに、Ｆｏｘｐ３のｍＲＮＡは、ＤＯ１１．１０／ＲＡＧ−２−／−マウス由来のＣＤ４＋細胞ではほとんど検出されない。これらの結果は、Ｆｏｘｐ３発現が胸腺のＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞選択と密接に関係しているという知見をさらに支持する（Ｍ．  Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、前出、Ｍ．  Ｓ．  Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２，  ３０１  （２００１））。
【００５９】
注３  ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋細胞は、試験管内で抑制活性を示す
Ｆｏｘｐ３ｍＲＮＡをほとんど発現しない（図１Ｃ）ＢＡＬＢ／ｃナイーブ（ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ）ＣＤ４＋細胞でも、Ｆｏｘｐ３で形質転換するとインビトロで新鮮なＢＡＬＢ／ｃＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖抑制活性を示す（図Ｓ５）。ＲＡＧ−２−欠損ＤＯ１１．１０ＴＣＲトランスジェニックマウス由来ナイーブＣＤ４＋細胞が抑制活性を獲得するという知見（図３Ｃ）と共に、この結果は、Ｆｏｘｐ３の形質転換によって、Ｆｏｘｐ３非発現ナイーブＴ細胞を制御性Ｔ細胞に変化させられることを示す。
【００６０】
注４  Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞の低増殖状態に対するＩＬ−２、ＣＤ２８、またはＧＩＴＲ刺激の効果
Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞と自然発生のＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫学的特性を比較するために、我々は、様々な用量のＩＬ−２、抗ＣＤ２８ｍＡｂまたは抗ＧＩＴＲｍＡｂと共に抗ＣＤ３でこの２集団を刺激して、その効果を調べた（図Ｓ６）。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＴＲ細胞と同様に（Ｔ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）、前出、Ａ．  Ｍ．  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．、前出）、抗ＣＤ３で刺激したＦｏｘｐ３形質転換ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞は、用量依存的にＩＬ−２に応答して増殖した。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を引き起こすには不十分なほど低い抗ＣＤ３ｍＡｂ濃度でも、抗ＣＤ２８ｍＡｂの存在下で、Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞は抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８に応答して実質的な増殖を示した。同様に、抗ＧＩＴＲ刺激は、Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞の増殖を引き起こしたが、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は引き起こさなかった。これらの差異は、注１で論じたように、ＴＲと非ＴＲ細胞の両方を含有するＦｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞の不均一性に起因するか、またはＦｏｘｐ３発現細胞が微量ながらも産生するＩＬ−２が抗ＣＤ２８や抗ＧＩＴＲｍＡｂと共同作用してこれら細胞の増殖を促進しているためと考えられる（図Ｓ２）。新たに調製したＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞との共培養でＦｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞自体が急激に増殖するので、これらの刺激がＦｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞による抑制を中和できるか否かは現時点では不明である。
【００６１】
注５  Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞による疾患の防止は、抑制によるのか、または競合によるのか。
Ｔ細胞制御を説明するのに、Ｓｔｏｃｋｉｎｇｅｒ  と共同研究者は、ＴＲ細胞による抑制よりも、むしろＭＨＣリガンドおよび／またはサイトカインなどに対するＴ細胞間の競合が、病原性Ｔ細胞のクローン増殖を制限して免疫病理を防止するという説を最近提唱した（Ｂ．  Ｓｔｏｃｋｉｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２，  ７５７  （２００１））。このモデルに基づけば、Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞がＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋細胞を競合阻害してＩＢＤおよび自己免疫性胃炎を阻害するとも考えられる。しかしながら、可能性は低いと考えられる。なぜならば、我々は病原性のＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋細胞をＦｏｘｐ３で形質転換したからであり、そして最も重要なことには、ＧＦＰ単独で形質転換した同数の細胞を移植すると疾患の進行を防止できず、むしろ悪化させたからである。
【００６２】
注６  Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞の抗原特異性
本実験では、正常ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＳＣＩＤマウスにおいて細菌の抗原または胃の自己抗原を各々認識して反応し、大腸炎および胃炎を引き起こした。これらのＴ細胞は、Ｆｏｘｐ３の遺伝子導入により制御性Ｔ細胞に変化し、かつ、抗体で刺激すると抑制を示した（図３Ｄ）。これらの知見は、Ｆｏｘｐ３形質転換ＴＲ細胞は、エフェクターＴ細胞のように、細菌の抗原および胃の自己抗原に対する特異性を十分に有し、抗原特異的様式で活性化されて抑制を発揮することを総合的に意味する。
【００６３】
図の説明
図１  胸腺および末梢のＣＤ４＋Ｔ細胞小集団におけるＦｏｘｐ３の発現
（Ａ）ＢＡＬＢ／ｃ胸腺細胞を、ＣＤ４−ＣＤ８−（ＤＮ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋（ＤＰ）、ＣＤ４−８＋（ＣＤ８）またはＣＤ４＋８−（ＣＤ４）細胞に分離した（左）。ＣＤ４＋８−胸腺細胞を、さらにＣＤ２５＋またはＣＤ２５−細胞に分離した（右）。各集団由来のｃＤＮＡに対し、Ｆｏｘｐ３またはＨＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ）特異的プライマーを用いて非飽和ＰＣＲを行った。
（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃ由来ＬＮおよび脾臓細胞を、示した区画に分離し、非飽和ＲＴ−ＰＣＲ分析を実行した。ＣＤ４＋細胞を、さらにＣＤ２５＋またはＣＤ２５−細胞に分離した。
【００６４】
（Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットにおける相対的Ｆｏｘｐ３ｍＲＮＡレベルの定量。Ｆｏｘｐ３またはＨＰＲＴ特異的プライマーおよび内側蛍光プローブを使用して、ｃＤＮＡ試料をリアルタイム定量ＰＣＲ分析にかけた（Ｏ．  Ａｎｎａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。
（Ｄ）ＩＬ−２（丸）または抗ＣＤ２８ｍＡｂ（四角形）の存在下、プレートに固相化した抗ＣＤ３ｍＡｂで、ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞（白い記号）またはＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞（黒い記号）を０−７２時間活性化し、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによりＦｏｘｐ３発現を経時的に評価した。
【００６５】
図２  ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞へのレトロウイルス形質転換
（Ａ）Ｆｏｘｐ３ｃＤＮＡをＭＩＧＲＩレトロウイルスベクターに挿入した。このベクターは、インターナルリボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を使用して、同時に２つのｃＤＮＡ、即ちＦｏｘｐ３とＧＦＰを発現する。
（Ｂ）新たに単離したＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞およびＧＦＰ＋のＦｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１−またはＭＩＧＲ１−感染ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞の、抗ＣＤ３刺激による増殖応答。
【００６６】
（Ｃ）ＧＦＰ＋のＦｏｘｐ３／ＭＩＧＲＩ−またはＭＩＧＲＩ−感染ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞を抗ＣＤ３で刺激して培養した培養上清における、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４またはＩＬ−１０の濃度。
（Ｄ）ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞由来のＦｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１−またはＭＩＧＲ１−感染Ｔ細胞を、ＣＤ２５、ＧＩＴＲ、ＣＤ１０３、ＣＤ４、ＣＤ４４または無関係な抗原（対照）のＰＥ標識ｍＡＢで染色し、同時にＧＦＰを検出した。細胞内ＣＴＬＡ−４分子を、ＰＥ標識抗ＣＴＬＡ−４またはアイソタイプ適合ｍＡＢで検出した。
【００６７】
図３  Ｆｏｘｐ３形質転換ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の抑制活性
（Ａ）ＢＡＬＢ／ｃＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞（左）またはＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞（右）に、Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１（黒丸）またはＭＩＧＲ１（白丸）の何れかを感染させ、ＧＦＰ＋細胞の数に勾配をつけ、２．５ｘ１０４個の新たに調製したＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞と、抗ＣＤ３および５．０ｘ１０４個の抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共に、７２時間培養した。新たに調製したＣＤ２５−ＣＤ２５＋細胞も、アッセイに含めた（白い四角形）。
【００６８】
（Ｂ）新たに調製したＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞のみ、または同数のＧＦＰ＋のＦｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１−（＋Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１）感染ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞、ＭＩＧＲ１−感染ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞（＋ＭＩＧＲ１）または新たに単離したＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞（＋ＣＤ２５＋）と混合したものを、抗ＣＤ３で刺激し、培養上清中のＩＬ−２濃度を測定した。
【００６９】
（Ｃ）Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１（黒丸）またはＭＩＧＲ１（白丸）を感染させたＤＯ１１．１０／ＲＡＧ−２−／−ＣＤ４＋細胞由来のＧＦＰ＋細胞を、ＯＶＡペプチドおよび４．０ｘ１０４個のＡＰＣの存在下、新たに調製した２．０ｘ１０４個のＤＯ１１．１０ＣＤ４＋細胞と共に培養した。
【００７０】
（Ｄ）ＢＡＬＢ／ｃＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞を、Ｆｏｘｐ３（黒丸）またはＧＦＰ単独（白丸）で形質転換し、ＧＦＰについて分離した。示した数のＧＦＰ＋細胞を、２．５ｘ１０４個のＤＯ１１．１０ＴＣＲ形質転換ＣＤ４＋細胞と混合し、特異的ＯＶＡペプチド（左）または抗ＣＤ３（右）のいずれかで刺激した。
【００７１】
（Ｅ）ＢＡＬＢ／ｃＣＤ２５−ＣＤ４＋由来のＧＦＰ＋のＦｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１−感染Ｔ細胞と、同数の新たに調製したＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞を、半透膜で分離するか、または分離しないで培養し、抗ＣＤ３および両側のＡＰＣで刺激した（左）。抗ＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）ｍＡｂ、抗ＴＧＦ−βｍＡｂ、またはこれら２種類の混合物を、新たに調製したＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞の単独の培養（白バー）か、またはＧＦＰ＋のＦｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１−感染ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞（灰色バー）または新たに調製したＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞（黒バー）の存在下の培養に添加した（右）。
【００７２】
図４  Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞によるＩＢＤおよび自己免疫性胃炎の予防
（Ａ）Ｃ．Ｂ−１７ｓｃｉｄマウスに、４ｘ１０５個の新鮮なＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋細胞を単独で（ｎ＝６）（白丸）か、またはＦｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１（ｎ＝７）（黒丸）もしくはＭＩＧＲ１（ｎ＝５）（白丸）に感染したＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋細胞由来のＧＦＰ＋分離細胞１．２ｘ１０６個と共に移植した。体重を開始時体重のパーセントとして表した（平均±ＳＤ）。＊Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  試験によってＦｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１対他の２グループがｐ＜０．０１。
【００７３】
（Ｂ）各グループおよび未処理ＳＣＩＤマウス（無し）の大腸と胃の組織病理。
（Ｃ）大腸炎（左）と胃炎（右）を組織病理学的にスコア付けした。ＭＩＧＲ１−感染細胞を共移植したグループのマウス２匹と、ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋細胞を単独で移植したグループのマウス１匹は、組織学的試験の前に衰弱死した。
【００７４】
図Ｓ１  Ｔｈ１およびＴｈ２エフェクター細胞におけるＦｏｘｐ３の発現
ＩＬ−１２と抗ＩＬ−４ｍＡｂ（Ｔｈ１発生用）またはＩＬ−４と抗ＩＬ−１２（Ｔｈ２発生用）の存在下で、Ｆｏｘｐ３ｍＲＮＡをほとんど発現しない（注２および図Ｓ４も参照されたい）ＤＯ１１．１０ＴＣＲトランスジェニックＲＡＧ−２−／−マウス（ＤＯ．ＲＡＧ−）由来ＣＤ４＋Ｔ細胞を、特異的ＯＶＡペプチドで活性化して、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を得た。最初の刺激から７日後に、細胞をＰＭＡ＋イオノマイシンで４時間再刺激し、細胞内の染色によってＩＦＮ−γとＩＬ−４の産生を評価した。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞中のＩＦＮ−γ分泌細胞の割合は、各々７７％および＜１％であり、一方Ｔｈ１およびＴｈ２細胞中のＩＬ−４産生細胞の割合は、各々＜１％および５７％であった。ＰＭＡ／イオノマイシンで再刺激するか、または刺激しないで、これらのＴｈ１およびＴｈ２細胞から、そして新たに単離したＤＯ．ＲＡＧ−ＣＤ４＋細胞、ＢＡＬＢ／ｃＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞およびＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞から、ｃＤＮＡを調製した。Ｆｏｘｐ３とＨＰＲＴについてリアルタイム定量的ＰＣＲ分析を実行し、相対的Ｆｏｘｐ３ｍＲＮＡレベルを測定した。
【００７５】
図Ｓ２  Ｆｏｘｐ３−形質転換Ｔ細胞によるサイトカイン産生
（Ａ）ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞をＦｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１またはＭＩＧＲ１に感染させ、ＧＦＰ＋細胞を分離した。ＧＦＰ＋細胞をＡＰＣの存在下で２４時間抗ＣＤ３で再刺激し、ＰＥ−結合抗サイトカインまたはアイソタイプ適合ｍＡｂで細胞内染色して、サイトカイン産生を評価した。
（Ｂ）感染させたＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞から、ＧＦＰ発現が最大または最小の３０％の細胞を選別し、ＧＦＰｈｉｇｈまたはＧＦＰｌｏｗ集団に分離した。これらの細胞並びに新たに単離したＣＤ２５＋ＣＤ４＋およびＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞を６０時間（Ａ）と同様に刺激し、培養上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡで評価した。
【００７６】
図Ｓ３  Ｆｏｘｐ３形質転換ＣＤ４＋Ｔ細胞における抑制活性のＦｏｘｐ３発現依存性
（Ａ）ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞をＦｏｘｐ３で形質転換し、ＧＦＰ発現が最大または最小の３０％の細胞を選別し、ＧＦＰｈｉｇｈまたはＧＦＰｌｏｗ集団に分離した。新たに単離したＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞を、同数の分離したＧＦＰ＋細胞の存在下または非存在下で、抗ＣＤ３とＡＰＣで刺激し、それらの増殖応答を調べた。
（Ｂ）同数のＧＦＰｈｉｇｈＦｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１−もしくはＭＩＧＲ１−感染細胞または新たに調製したＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞の存在下または非存在下で、新たに単離したＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞を抗ＣＤ３で刺激し、培養上清中のＩＬ−４濃度を測定した。
【００７７】
図Ｓ４  ＴＣＲトランスジェニックＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３発現
ＤＯ１１．１０ＴＣＲトランスジェニックＲＡＧ−２−／−（ＤＯ．ＲＡＧ−）もしくは＋／−（ＤＯ．ＲＡＧ＋）、またはＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＣＤ２５＋またはＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞で、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。以前に報告されたように、ＤＯ．ＲＡＧ−マウスにはＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞がほとんど存在しないことに注意されたい（Ｍ．  Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。
【００７８】
図Ｓ５  Ｆｏｘｐ３形質転換による末梢ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞における抑制活性の誘導
ＢＡＬＢ／ｃマウスから精製した末梢ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｆｏｘｐ３（黒い記号）またはＧＦＰ単独（白い記号）で形質転換し、ＧＦＰ＋細胞を分離した。各集団から分離した、示した数のＧＦＰ＋細胞を、抗ＣＤ３と５．０ｘ１０４個のＡＰＣのみで（菱形）、またはそれに加えて２．５ｘ１０４個の新たに単離したＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞の存在下で（丸）刺激した。
【００７９】
図Ｓ６  Ｆｏｘｐ３−形質転換Ｔ細胞の低増殖状態に対するＩＬ−２、抗ＣＤ２８または抗ＧＩＴＲｍＡｂの効果
新たに単離したＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞（黒丸）、ＧＦＰ＋のＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞由来Ｆｏｘｐ３／ＭＩＧＲ１−感染細胞（黒い四角形）、新たに精製したＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞（白い四角形）、同数のＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞とＧＦＰ＋のＦｏｘｐ３−形質転換細胞の混合物（黒い三角形）、または同数のＤ２５−ＣＤ４＋細胞とＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞の混合物（白い三角形）を、抗ＣＤ３で刺激し、培養に様々な量のＩＬ−２、抗ＣＤ２８または抗ＧＩＴＲｍＡｂを添加した。
【００８０】
図Ｓ７  フォークヘッドドメインを欠く変異体Ｆｏｘｐ３は、ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞に抑制活性を与えられない
（Ａ）ｓｃｕｒｆｙマウスにおける変異体Ｆｏｘｐ３に類似する、フォークヘッド（ＦＫＨ）ドメインを欠く変異体Ｆｏｘｐ３コンストラクト（ΔＦＫＨ）の模式図。上図は、アミノ酸１−４４３からなる野生型Ｆｏｘｐ３（ＷＴ）を表す。核移行シグナル（ＮＬＳ）はＦＫＨドメインの内側に位置し、黒い四角形で示す。以前の研究によって、ＦＫＨドメインがＦＯＸＰ３タンパク質の核移行とＤＮＡ結合に必要であると示された（Ｌ．  Ａ．  Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ３７６７２  （２００１））。
【００８１】
（Ｂ）ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞をＷＴ（黒丸）、ΔＦＫＨ（白い四角形）、またはＧＦＰ単独（白丸）のいずれかをコードするレトロウイルスに感染させ、ＧＦＰ発現について分離した。示した数の分離したＧＦＰ＋細胞の存在下または非存在下で、ＣＤ２５−ＣＤ４＋細胞（１．２ｘ１０４個）を抗ＣＤ３および２．４ｘ１０４個のＡＰＣで刺激した。［３Ｈ］チミジン取込みを培養３日目で測定した。
【００８２】
【発明の効果】
本発明により、免疫反応を抗原特異的に抑制することが可能となる。このことは、自己成分に対する免疫系の過剰反応に起因する自己免疫疾患の処置や、移植片への免疫系の攻撃を防止するのに有用である。これらに対して従来使用されてきた免疫抑制剤が、免疫反応全体を低下させ、感染症のリスクを高める等の副作用を伴うのに比較して、本発明は、過剰反応している所望の免疫反応のみを選択的に抑制できるので、はるかに有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、胸腺および末梢のＣＤ４＋Ｔ細胞小集団におけるＦｏｘｐ３の発現を示す。
【図２】図２は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞へのレトロウイルス形質転換を示す。
【図３】図３は、Ｆｏｘｐ３形質転換ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の抑制活性を示す。
【図４】図４は、Ｆｏｘｐ３形質転換Ｔ細胞によるＩＢＤおよび自己免疫性胃炎の予防を示す。
【図５】図Ｓ１は、Ｔｈ１およびＴｈ２エフェクター細胞におけるＦｏｘｐ３の発現を示す。
【図６】図Ｓ２は、Ｆｏｘｐ３−形質転換Ｔ細胞によるサイトカイン産生を示す。
【図７】図Ｓ３は、Ｆｏｘｐ３形質転換ＣＤ４＋Ｔ細胞における抑制活性のＦｏｘｐ３発現依存性を示す。
【図８】図Ｓ４は、ＴＣＲトランスジェニックＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３発現を示す。
【図９】図Ｓ５は、Ｆｏｘｐ３形質転換による末梢ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞における抑制活性の誘導を示す。
【図１０】図Ｓ６は、Ｆｏｘｐ３−形質転換Ｔ細胞の低増殖状態に対するＩＬ−２、抗ＣＤ２８または抗ＧＩＴＲｍＡｂの効果を示す。
【図１１】図Ｓ７は、フォークヘッドドメインを欠く変異体Ｆｏｘｐ３は、ＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞に抑制活性を与えられないことを示す。
【図１】
2004208548.tif 000004
【図２】
2004208548.tif 000005
【図３】
2004208548.tif 000006
【図４】
2004208548.tif 000007
【図５】
2004208548.tif 000008
【図６】
2004208548.tif 000009
【図７】
2004208548.tif 000010
【図８】
2004208548.tif 000011
【図９】
2004208548.tif 000012
【図１０】
2004208548.tif 000013
【図１１】
2004208548.tif 000014