(57)【要約】【課題】新しい抗生物質の開発にとって、魅力的なターゲットとなる酵素を提供すること。【解決手段】リボソーム小サブユニット（３０Ｓ）によって活性化されることを特徴とする、細菌由来のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素に係る。該酵素はさらに、７０Ｓリボソームによっても活性化され、そのうえ、リボソーム大サブユニット（５０Ｓ）によっては活性化されないことを特徴とする。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボソーム小サブユニット（３０Ｓ）によって活性化されることを特徴とする、細菌由来のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素。
【請求項２】
７０Ｓリボソームによっても活性化されることを特徴とする、請求項１記載のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素。
【請求項３】
リボソーム大サブユニット（５０Ｓ）によっては活性化されないことを特徴とする、請求項１または２記載のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素。
【請求項４】
ＹｊｅＱファミリーに属する遺伝子にコードされていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに一項に記載のＧＴＰ加水分解酵素。
【請求項５】
細菌が大腸菌である、請求項１〜４のいずれかに一項に記載のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素。
【請求項６】
以下のポリペプチドから成ることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに一項に記載のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
（ｂ）上記（ａ）のポリペプチドにおいて一つ若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
以下のＤＮＡにコードされていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに一項に記載のＧＴＰ加水分解酵素：
（ａ）配列番号２に示される塩基配列を含むＤＮＡ；又は
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
リボソーム小サブユニット（３０Ｓ）を共存させることによって、細菌由来のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素の活性を増大させる方法。
【請求項９】
細菌が大腸菌である、請求項８に記載の増大方法。
【請求項１０】
ＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素が請求項１〜４のいずれか一項に記載された酵素であることを特徴とする、請求項８又は９に記載の増大方法。
【請求項１１】
ＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素が請求項６に記載された酵素であることを特徴とする、請求項８又は９に記載の増大方法。
【請求項１２】
ＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素が請求項７に記載された酵素であることを特徴とする、請求項８又は９に記載の増大方法。
【請求項１３】
リボソーム小サブユニット（３０Ｓ）のＡ部位周辺に物質を結合させることによって、細菌由来のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素の活性を阻害する方法。
【請求項１４】
リボソーム小サブユニット（３０Ｓ）のＡ部位周辺に結合する物質が抗生物質である、請求項１３記載の阻害方法。
【請求項１５】
抗生物質が、アミノグリコシド系抗生物質、ストレプトマイシン、又はテトラサイクリンであることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
抗生物質が、ネオマイシン、パロモマイシン、カナマイシン及びゲンタマイシンから成る群から選択される、請求項１５記載の阻害方法。
【請求項１７】
リボソーム小サブユニット（３０Ｓ）のＡ部位周辺に結合する物質が農薬である、請求項１３記載の阻害方法。
【請求項１８】
細菌が大腸菌である、請求項１３〜１７のいずれか一項に阻害記載の阻害方法。
【請求項１９】
ＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素が請求項１〜４のいずれか一項に記載された酵素であることを特徴とする、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の阻害方法。
【請求項２０】
ＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素が請求項６に記載された酵素であることを特徴とする、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の阻害方法。
【請求項２１】
ＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素が請求項７に記載された酵素であることを特徴とする、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の阻害方法。
【請求項２２】
請求項１３〜２１のいずれか一項に記載された阻害方法に基づき、細菌由来のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素の活性を阻害する物質を検出する方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の検出方法によって同定される物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リボソーム小サブユニット（３０Ｓ）によって活性化されることを特徴とする、細菌由来のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素、及び、リボソーム小サブユニット（３０Ｓ）を共存させることによって、該酵素の活性を増大させる方法等に関する。更に、本発明は、リボソーム小サブユニット（３０Ｓ）のＡ部位周辺に物質を結合させることによって、細菌由来のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素の活性を阻害する方法、かかる阻害方法に基づき、細菌由来のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素の活性を阻害する物質を検出する方法、及び、該検出方法によって同定される物質等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＹｊｅＱは未知の機能を有するタンパク質を暗号化するオープンリーディングフレームである。ＹｊｅＱは３種のドメイン、すなわち典型的なＯＢフォールド（オリゴマー結合フォールド）を有するＮ−末端ドメイン、ユニークなＧＴＰアーゼモチーフを有する中央のドメインおよび金属イオンを結合することが予想されるＣｘｘｘｘＣｘＨｘｘｘｘｘＣモチーフを有するＣ−末端ドメインに分けられ得る。アミノ酸配列から予想されているように、このタンパク質は弱いＧＴＰ加水分解活性を持つことが報告されている。尚、以下の文献には、ゲノム配列から予想される配列からクローニングして精製したＹｊｅＱ酵素について調べ、それがＧＴＰ分解活性を弱いながらも有していることが記載されている。しかしながらその酵素のＧＴＰ分解活性がリボソームによっていかなる影響を受けるかに関しては何ら教示されていない。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｄｅｎｉｓ  Ｍ．  Ｄａｉｇｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２，  ４１，  １１１０９−１１１１７
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
抗生物質はペニシリン系、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系など多種のものが使われてきたが、新しいものが開発されても数年後には耐性菌が生じてしまい、すぐに有効性を失ってしまうことが大きな社会的問題となっている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ｙｊｅＱタンパク質のＧＴＰ加水分解活性がリボソームの小サブユニットによって有意に増大されることを見出し、それに基づき本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は以下の態様に係る。
本発明は、リボソーム小サブユニット（３０Ｓ）によって活性化されることを特徴とする、細菌由来のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素に係る。本発明酵素は、７０Ｓリボソームによっても活性化され、更に、リボソーム大サブユニット（５０Ｓ）によっては活性化されないことを特徴とする。
細菌の例としては、大腸菌を挙げることが出来る。
【０００７】
本発明酵素の具体例としては、ＹｊｅＱファミリーに属する遺伝子にコードされている酵素を上げることが出来る。
その好適例としては、以下のポリペプチドから成ることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに一項に記載のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
（ｂ）上記（ａ）のポリペプチドにおいて一つ若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素活性を有するポリペプチド、を挙げることが出来る。
別の好適例として、以下のＤＮＡにコードされていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに一項に記載のＧＴＰ加水分解酵素：
（ａ）配列番号２に示される塩基配列を含むＤＮＡ；又は
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、を挙げることが出来る。
【０００８】
さらに、本発明は、リボソーム小サブユニット（３０Ｓ）を共存させることによって、上記に示したいずれかの細菌由来のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素の活性を増大させる方法、に係る。
【０００９】
本発明は又、リボソーム小サブユニット（３０Ｓ）のＡ部位周辺に物質を結合させることによって、上記に示したいずれかの細菌由来のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素の活性を阻害する方法にも係る。このような物質の種類に特に制約はないが、その例として、各種抗生物質、例えば、ストレプトマイシン及びテトラサイクリン、更には、ネオマイシン、パロモマイシン、カナマイシン及びゲンタマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質、を挙げることが出来る。更に、除草剤、殺虫剤及び殺菌剤等の、一般に農薬として当業者に公知の任意の物質を挙げることが出来る。
更に、本発明は、上記阻害方法に基づき、細菌由来のＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素の活性を阻害する物質を検出する方法、及び、かかる検出方法によって同定される物質に係る。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明遺伝子又はＤＮＡは以下の実施例に示すように、大腸菌株由来の遺伝子ライブラリー中から、適当なプライマーを用いるＰＣＲクローニング等の方法によりクローニングし、その塩基配列を決定することによって調製することができる。
【００１１】
更に、本明細書で開示された配列情報に基づいて、当該技術分野における周知手段を用いた化学合成等によっても調製することが可能である。当業者であれば、特定のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加することも、当該技術分野における周知手段を用いて容易に実施することができる。
【００１２】
本明細書において、特定の遺伝子又はＤＮＡとハイブリダイズさせる際のストリンジェントな条件は、当業者が適宜設定することができる。
本発明の遺伝子又はＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ＲＮＡ結合ＧＴＰ加水分解酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの例として、例えば、かかる遺伝子又はＤＮＡと相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であるようなＤＮＡを挙げることができる。
【００１３】
本発明の遺伝子又はＤＮＡに、遺伝子組換え操作において当業者に公知である様々な配列、例えば、プロモーター及びエンハンサーなどの調節因子、制限酵素部位、並びに選択マーカー遺伝子等が適宜結合されたＤＮＡ分子も本発明の範囲である。更に、本発明の遺伝子、ＤＮＡ又は上記ＤＮＡ分子を含有する組換えベクター等の発現ビークル、及び該発現ビークルを含みそれによって形質転換された細菌、真核細胞等の形質転換体も本発明に含まれる。これらのＤＮＡ分子、発現ビークル及び形質転換体は、当該技術分野における公知の手段によって、容易に調製することができる。
【００１４】
本発明のタンパク質又はポリペプチドは、上記の発現ビークル及び形質転換体等を使用して、当該技術分野における公知手段によって、例えば、形質転換体を培養し、本発明の遺伝子又はＤＮＡを発現させ、それを回収することによって、容易に調製することができる。従って、本発明は、かかる調製方法に係る。
更に、本発明は、かかるタンパク質又はポリペプチドに対するポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体にも係る。かかる抗体は当業者に公知の方法によって作成することができる。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
ベクターｐＧＥＭＥＸ２に大腸菌由来のｙｊｅＱ遺伝子をクローンしたプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を中期対数増殖期まで培養し、終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えさらに３時間培養することで目的タンパク質を大量発現させた後、遠心分離により菌体を回収した。菌体は適量の抽出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．６）、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、１５０ｍＭ  ＫＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１０μｇ／ｍｌ  ＡＢＳＦ、１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、１ｇ／ｍｌ  ａｎｔｉｐａｉｎ）に懸濁し、超音波破砕機で細胞を破砕した。細胞破砕液から遠心分離および超遠心分離により細胞抽出液を得た。
【００１７】
ＤＥＡＥセルロースを担体とした陰イオンカラムクロマトグラフィー（１５０−４００ｍＭの酢酸カリウムの濃度勾配で溶出）およびヘパリンを担体としたアフィニティークロマトグラフィー（２００−８００ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出）を用いて本酵素を分離精製した。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、このタンパク質は約４０ｋＤａのタンパク質であることを確認した。
エドマン分解によるＮ末端のアミノ酸配列の解析により、本酵素は以下のアミノ酸配列を持つことを明らかにした。
【００１８】
配列番号１：
2004208657.tif 000003
【００１９】
更に、大腸菌ゲノムのデータベースに基づき、上記アミノ酸をコードする塩基配列は以下のものであることが明らかとなった。
【００２０】
配列番号２：
2004208657.tif 000004
【００２１】
実施例２
大腸菌ＹｊｅＱはクローン化され、大腸菌細胞中で過剰発現された。
即ち、リボソームは大腸菌抽出液から超遠心分離によって得たものを、リボソーム小サブユニットはさらにそこからショ糖密度勾配遠心によって得たものを使用した。ＧＴＰとＧＤＰの分離はＰＥＩセルロースを用いた薄層クロマトグラフィー（展開溶媒０．７５Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４）を用いて行った。
【００２２】
反応は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、３μＭ  ［α−３２Ｐ］ＧＴＰ、１６０ｎＭ本酵素、５４ｎＭリボソーム小サブユニットまたは大サブユニットを加え、水で４０μｌに調整し、３７℃で行った。１０分後、３０分後に５μｌずつ取り出し、２０ｍＭ  ＥＤＴＡで反応を停止させたものをＰＥＩセルロース（薄層クロマトグラフィー）上にスポットした。それを、０．７５Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４を溶媒として用いて展開することでＧＴＰとＧＤＰを分離し、それぞれをイメージアナライザーを用い定量した。加えたＧＴＰの量に対する生成したＧＤＰの量をもってＧＴＰ加水分解活性とした。
【００２３】
精製されたＹｊｅＱは既に示されているような非常に弱いＧＴＰ加水分解活性を有している。大腸菌リボソーム画分が反応系に添加された場合、ＧＴＰ加水分解活性は有意に増大した（図１）。面白いことに、ＧＴＰ加水分解活性は７０Ｓリボソームのみならず、小サブユニットによっても増大したが、大サブユニットによって増大しなかった。リボソームを添加すると１／１０００量のＹｊｅＱを用いても同等の活性が得られた。３０Ｓサブユニットが７０Ｓリボソームに代わって使用された場合、同様な活性の増大が見られた。１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡがリボソームに代わって使用された場合、またはリボソームがＲＮａｓｅＡで処理された場合には、ＧＴＰ加水分解活性の増大は観察されず（図１）、これはリボソームのＲＮＡとタンパク質成分の両方を必要とすることを示す。Ｓ１がリボソームから除去された場合、ＧＴＰ加水分解活性の増大が一様に観察された（図１）。
【００２４】
リボソームはそれぞれが１つまたは２つのＲＮＡおよび数十のタンパク質を有する２つのサブユニットからなる巨大分子である。大サブユニットはペプチジルトランスフェラーゼ中心のほかにＧＴＰアーゼ中心と３種の古典的ｔＲＮＡ結合部位を有する。ＩＦ２、ＥＦ−Ｔｕ、ＥＦ−Ｔｓ、ＥＦ−ＧおよびＳｅｌＢなどの真正細菌翻訳プロセスに関与する種々のＧタンパク質が存在する。これらのＧＴＰ加水分解活性は大サブユニットのこのＧＴＰアーゼ中心で全て活性化される。その他、機能はわかっていないが、リボソームと相互作用するＧＴＰアーゼはいくつか存在する。ただし、その中で小サブユニットと相互作用することが示されているものはごくわずかである。例えば、Ｅｒａは小サブユニットと相互作用するＧＴＰ加水分解酵素であるが、ＧＴＰ加水分解活性とリボソームとの関係は未知のままである。我々の知る限りでは、ＹｊｅＱはＧＴＰ加水分解活性がリボソームの小サブユニットによって活性化されることを示す最初の分子である。
【００２５】
実施例３
いくつかの抗生物質はリボソームの小ユニットに結合して翻訳を阻害することが知られている。ここで、リボソームの小サブユニットによるＹｊｅＱのＧＴＰ加水分解活性の増大におけるいくつかの抗生物質、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、ネオマイシン、パロモマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、カスガマイシンおよびクロラムフェニコールの影響を試験した。その結果、図２に示されたように、大サブユニットのペプチジル−トランスフェラーゼ中心に結合するクロラムフェニコールは、ＧＴＰ加水分解活性の増大を阻害しなかった。反対に、ネオマイシン、パロモマイシン、カナマイシンおよびゲンタマイシンなどのアミノグリコシド系抗生物質は有意にリボソーム依存性ＧＴＰ加水分解活性に影響を与えた。これらのアミノグリコシドは特に小サブユニットの解読領域のＡ部位でヘリックス４４に結合して、ミスコーディングを引き起こすことが知られている。５〜５００μＭのこれらのアミノグリコシドを添加すると、リボソーム依存性ＧＴＰアーゼを半分に減少させる結果となった。高濃度（５ｍＭ）のストレプトマイシンまたはテトラサイクリンを添加した場合、リボソーム依存性ＧＴＰアーゼの阻害もまた観察された。ストレプトマイシンはヘリックス４４および小サブユニットのＡ部位に近いＳ１２タンパク質に結合する。テトラサイクリンはＡ部位近くのヘリックス３１および３４間のポケットと主に相互作用して、小サブユニットのＡ部位へのアミノアシルｔＲＮＡの結合を阻害することが知られている。これらの結果は、ＹｊｅＱが小サブユニットの解読領域のＡ部位に近接していることを示す。他方、Ｐ部位特異的抗生物質、カスガマイシンはＹｊｅＱのリボソーム依存性ＧＴＰ加水分解活性に影響しなかった。Ａ部位と小サブユニット頭部間のヘリックス３４の末端でポケットに結合して、ＥＦ−Ｇ依存性転座を阻害するスペクチノマイシンは、同様にＹｊｅＱのリボソーム依存性ＧＴＰ加水分解活性に影響しなかった。
【００２６】
実施例４
次いで、我々はＹｊｅＱとリボソームの間の会合について試験した。ＹｊｅＱとリボソームの混合物をショ糖密度勾配遠心分離によって分画し、複合体形成をＹｊｅＱに対して生じた抗体を使用して評価した。ＹｊｅＱは、グアニンヌクレオチドの非存在下では７０Ｓリボソームまたはそのサブユニットとともに共沈しなかった。また、ＧＴＰまたはＧＤＰの存在下でも同じ結果であった（図３ａ、ｂ）。７０Ｓ、５０Ｓおよび３０Ｓ画分の濃度割合は、ＧＴＰまたはＧＤＰの存否にかかわりなく変化しなかった。反対に、これは非加水分解性ＧＴＰ類似体であるＧＤＰＮＰの存在下に主に小サブユニットとともに共沈した（図３ｃ）。ほとんど全てのリボソームはＧＤＰＮＰの存在下にサブユニットに解離することも見出された。これらの発見は次の考えを強く示唆する。ＹｊｅＱのＧＴＰ体はリボソームの３０Ｓサブユニットに結合して、小サブユニットの構造的変化を誘導し、２つのサブユニット間の会合を一時的にゆるめる。ＧＴＰ加水分解はＹｊｅＱの構造的変化を可能とし、その結果、これはリボソームから解離し、リボソームの２つのサブユニット間の安定な会合を復元する。その結果はまた、限られた画分（例えば、未成熟リボソーム）のみならず、リボソームのほとんど全てがＹｊｅＱの標的になり得ることを示す。
【００２７】
実施例５
我々はまた、ゲル易動度シフト分析によって、ＹｊｅＱと３つの異なった種類の小さな安定ＲＮＡ、すなわちｔＲＮＡＡｌａ、５ＳｒＲＮＡおよびｔｍＲＮＡとの結合能力について試験した。ＹｊｅＱはこれらの３種のＲＮＡと低親和性でもって結合した。見かけの解離定数は、３種のＲＮＡ全てにおいて約５μＭであった。配列と構造的変化にもかかわらず、それらの同様なＫｄ値を考慮すれば、特定のヌクレオチド配列はこれらのＲＮＡへの結合に必要ないものと考えられる。親和性はＧＴＰまたはＧＤＰの存否にかかわらず変化しなかった。リボソーム依存性ＧＴＰ加水分解活性は３μＭ（０．０８Ａ２６０単位）ｔＲＮＡＡｌａの添加によって、または０．１１２Ａ２６０単位の粗ＲＮＡ画分によっても影響されなかった。これはＲＮＡ結合性がリボソーム依存性ＧＴＰ加水分解活性に依存しないことを示唆する。
【００２８】
実施例６
細胞中のＹｊｅＱの役割を知るために、我々はＹｊｅＱにおける遺伝子をゲノムから欠失しようと試みた。大腸菌ｙｊｅＱは必須遺伝子として報告されているから、我々は最初、ｙｊｅＱがｐＫＯ３から誘導されたプラスミド上に置かれ、ゲノム上のｙｊｅＱがカナマイシン耐性遺伝子で置換されている細胞を作成した。温度感受性複製開始点を有するこのプラスミドは、もしもｙｊｅＱがこの細胞にとって必須でないなら、４２℃でのインキュベーションによって細胞から欠失され得る。予想外の結果として、この細胞は４２℃で生存していた。細胞中のＹｊｅＱの完全な損失が数セットのプライマーを使用するＰＣＲおよび抗ＹｊｅＱ抗体を使用するウエスタンブロット分析の両方によって確認された。ＹｊｅＱ欠失株は有意にゆっくりと成長することが明らかになった。ｙｊｅＱ欠失株の倍加時間は、野生型のものよりも４７、４２、３７および３０℃で、それぞれ２．５５、２．５、２．５５および２．８倍長かった。ＹｊｅＱの重要性はわずかな程度であるけれども、より低い温度で強化された。ショ糖密度勾配遠心を用いてＹｊｅＱ欠失株から得た細胞抽出液を調べたところ、野生型に比べて明らかに７０Ｓサブユニットが減少しており、代わりに５０Ｓサブユニットと３０Ｓサブユニットが増加していた。このことはＹｊｅＱが５０Ｓサブユニットと３０Ｓサブユニットの会合による７０Ｓサブユニットの形成に関わること、すなわち何らかの形で翻訳のプロセスに関わることを示唆している。ただし、ＹｊｅＱ欠失株からの細胞抽出液は、インビトロでのポリ（Ｕ）依存性ポリ（Ｐｈｅ）合成を野生型からのものと同程度に促進した。この系に、精製したＹｊｅＱを外部から添加したが、その効率を有意に変化させないか、あるいはむしろわずかに減少させた。このことは、ＹｊｅＱが翻訳における通常の伸長過程には関与していないことを示唆する。
【００２９】
実施例７
ＹｊｅＱは小サブユニットのみあるいは７０リボソームのどちらによっても活性化され得る。ＹｊｅＱがいずれの状況を好むかはなお決定されなければならない。解読領域上における高次構造をとったｍＲＮＡは、正常な翻訳において不利であろう。このような状況はより低い温度で生じる傾向が強いようである。いくつかの低温衝撃誘発タンパク質は、１本鎖ＲＮＡ領域に結合して、低温でのＲＮＡの予期されない折りたたみを阻止するか、あるいはときには元にもどす。我々は温度の影響が細胞中のＹｊｅＱの濃度を変化させるかについて試験した。細胞中のＹｊｅＱの濃度は、インキュベーション温度を３７℃から２０℃へシフトした場合にはほとんど変化しなかった。反対に、インキュベーション温度を３７℃から４２℃へシフトした場合、わずかに減少した。典型的なＤＥＡＤ配列を有する低温誘導タンパク質であるＣｓｄＡはｍＲＮＡのシャペロンであると考えられていたが、最近の研究によると、ｅＩＦ４Ａ様タンパク質であるＳｒｍＢおよびＤｂｐＡなどの他のＤＥＡＤタンパク質と同じく、ｍＲＮＡに対してではなくｒＲＮＡに対して作用しリボソーム粒子を形成するという機能を果たしていることが分かってきた。より低温で重要性が増すという実験結果は、ＹｊｅＱがリボソームの翻訳プロセス中に構造化されたｍＲＮＡを不安定にする役割を果たすとの考えを強める。ＹｊｅＱはリボソームの全てに作用しうるので、ｒＲＮＡシャペロンとして作用するとは考えにくい。我々はまた、ＹｊｅＱの欠乏がショ糖密度勾配でのリボソームパターンあるいはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動でのリボソーム画分のタンパク質パターンに有意な変化を生じなかったことを確認した（図４）。
【００３０】
リボソーム依存性ＧＴＰ加水分解活性は、リボソームのｍＲＮＡの入口付近に結合された化学薬品によって有意に影響されるが、Ｐ部位特異的抗生物質によって、またはｍＲＮＡの出口周辺に位置するＳ１のリボソームからの除去によって影響されない。サブユニット相互作用を失うことに付随するＧＴＰ加水分解活性は、入ってくる高次構造をとったｍＲＮＡを分離して、Ａ部位中に適当に導入することに関与していると仮定することが合理的である。ＲＮＡ結合に対する低親和性かつ幅広い特異性はこの考えを支持する。高度に特定化された情報はときには高次構造をとったｍＲＮＡにプログラムされており、そこではリボソームジャンプまたは特定状況のＵＧＡコドンでのセレノシステイン挿入などの特殊な翻訳が行われる。
また、ＹｊｅＱはリーダー配列のないｍＲＮＡからの開始などのある特定の翻訳開始プロセスにおいて必要とされる。小サブユニットのＡ部位もまた、この開始プロセスにおいてＩＦ１によって占められる。ＹｊｅＱのＮ−末端ＯＢフォールドのアミノ酸配列はＩＦ１のものに類似している。これはＡ部位への結合部位である。ＩＦ１と違って、ＹｊｅＱはＧＴＰアーゼドメインならびに第２のＲＮＡ結合に関与すると推定される金属結合様モチーフを有する。ＹｊｅＱが解読領域中に特定ｍＲＮＡを適切に配置するように作用すると仮定するなら、このようなｍＲＮＡは高親和性を有するＧＴＰ型のＹｊｅＱに優先的に結合するであろう。
ＹｊｅＱは原核細胞界に広く分布する。その相同性はまた、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）中に見出されるが、酵母や動物中には見出されない。ＹｊｅＱは細胞には重要であるが、必須ではない。これは翻訳メカニズム中に新規な洞察をもたらすであろう新規な翻訳因子に分類されるであろう。
【００３１】
【発明の効果】
本発明は、細菌におけるこれまでに知られていない全く新しい反応を示したものである。報告されているゲノム配列から判断すると、本酵素は全ての細菌がもっている。また、大腸菌ではこの遺伝子を欠失させると生育は著しく阻害される。従って、本反応は新しい抗生物質及び農薬等の開発にとって魅力的なターゲットとなる。なお、本酵素は原核生物および一部の植物にのみ存在するので、副作用の少ない抗生物質の開発が期待できる。
【００３２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本酵素のみ、あるいは本酵素にリボソーム大サブユニットを加えても、ＧＴＰ加水分解活性を示さないが、リボソーム小サブユニットを加えるとＧＴＰ加水分解活性を示すことを示す。すなわち、本酵素は大腸菌リボソーム小サブユニットに依存してＧＴＰ加水分解活性（ＧＴＰ→ＧＤＰ＋Ｐｉ）を持つ酵素である。
【図２】図２は、リボソームの小サブユニットによるＹｊｅＱのＧＴＰ加水分解活性の増大におけるいくつかの抗生物質の影響を示す。
【図３】図３は、リボソーム（７２．２Ａ２６０単位）を８０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１５０ｍＭ塩化アンモニウム、７ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭ（ａ）ＧＴＰ、（ｂ）ＧＤＰまたは（ｃ）ＧＤＰＮＰを含む１００μｌ溶液中で３７℃にて５μＭのＹｊｅＱとともにインキュベートした。１０分間のインキュベーション後に、反応混合物を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび３００ｍＭ塩化カリウムを含む５〜２０％（ｗ／ｖ）ショ糖密度勾配上に載置し、４℃にて７時間、ヒタチ（Ｈｉｔａｃｈｉ）Ｐ２８Ｓローターを使用して２５，０００ｒｐｍで遠心分離した。各画分のタンパク質を１／３容量の１００％トリクロロ酢酸でもって沈殿させた。電気泳動後、ＳＤＳ含有１２％ポリアクリルアミドゲルをニトロセルロース膜上に電気ブロットし、次いで、精製ＹｊｅＱに対する抗体を使用して探索した。抗体は西洋ワサビパーオキシダーゼ共役第２抗体を結合した後、ＥＣＬプラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の化学発光によって可視化した。
【図４】図４は、ＹｊｅＱ欠失株と野生型株から調製した細胞抽出液をそれぞれショ糖密度勾配遠心で分画し、リボソームのパターンを比較した。各温度において、ＹｊｅＱ欠失株では７０Ｓサブユニットが少なくなっており、代わりに５０Ｓサブユニットと３０Ｓサブユニットが多くなっている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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