(57)【要約】【課題】本発明は、ウイルスの回収率が高く、海水のろ過に用いることにより遺伝子検出ができるだけのマリンビルナウイルス等海水中のウイルスを簡易かつ効果的に回収でき、環境評価や魚病病原体検査に有用なフィルタを安価に提供することを目的とする。本発明のフィルタは、ガラス繊維等よりなるフィルタ基材１に脱脂粉乳の水溶液２を注いでタンパク質をコーティングすることによりろ過時のウイルスの回収率を向上させたものであり、このフィルタを冷凍乾燥させることにより、さらにウイルス回収率を向上させるとともに、保存・取り扱いを容易にしたものである。【解決手段】【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱脂粉乳に含まれるタンパク質を皮膜として有する繊維又は多孔質材よりなるフィルタ。
【請求項２】
脱脂粉乳に含まれるタンパク質を皮膜として有するガラス繊維よりなるフィルタ。
【請求項３】
前記ガラス繊維のメッシュサイズが０．７μｍ程度である請求項２に記載のフィルタ。
【請求項４】
脱脂粉乳の水溶液をガラス繊維中を通過させ、脱脂粉乳に含まれるタンパク質をガラス繊維上に皮膜として設けたフィルタ。
【請求項５】
タンパク質を含む溶液を繊維又は多孔質材よりなるフィルタ基材中を通過させた後に凍結乾燥させて、タンパク質を皮膜として設けたフィルタ。
【請求項６】
脱脂粉乳の水溶液をガラス繊維中を通過させ、このガラス繊維を凍結乾燥させて、脱脂粉乳に含まれるタンパク質をガラス繊維上に皮膜として設けたフィルタ。
【請求項７】
タンパク質を皮膜として有する繊維又は多孔質材よりなるフィルタを凍結乾燥し、４℃以下で保存するフィルタの保存方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は気体または液体を通過させ、その中の含有物を分離するためのフィルタに関するものである。特に、ウイルスを捕捉できるフィルタに関する。
【０００２】
【従来の技術】ウイルスの研究を行うためには、各種の実験・計測に必要な十分な量と濃度のウイルスが必要とされる。たとえば、アクアビルナウイルスは水中に棲息し、魚介類の大量死を発生させる原因となるウイルスであるが、このような水中のウイルスを遺伝子解析等の実験ができる程十分な濃度で回収することは困難であった。従来は、ウイルスを検出するために培養が行われた。また、低レベルのウイルスを検出する方法として、”Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，１９９７，５，ｐ２０５−２０９にポリメラーゼ連鎖反応を用いる技術が記載されている。さらに、特開２００２−４５１７６号公報には検体に粒子を添加し、ウイルスを粒子に吸着させた後、フィルタにより粒子を回収してウイルスを濃縮する方法が記載されている。２００１年度日本海洋学会春季大会講演要旨集には海水をろ過してウイルスを濃縮する本願発明者の試みが記載されている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−４５１７６号公報
【非特許文献１】”Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，１９９７，５，ｐ２０５−２０９
【非特許文献２】鈴木聡、外１名、「第２００１年度日本海洋学会春季大会講演要旨集」、日本海洋学会、２００１年３月２７日、ｐ．２４１
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来の技術のうち、ウイルスを培養する方法は多大な時間と労力を要するものであった。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる技術は有用なものであるが、これを実施するためにはやはり大量の海水からウイルスを濃縮しなければならない。海水からウイルスを濃縮する方法としては限外ろ過法、フィルタ吸着法、エタノール沈殿法などが報告されているが、いずれも時間と労力がかかったり、回収率が低い等の問題を有する。海水をろ過してウイルスを濃縮する場合の回収率を向上させる方法として、ろ過直前にフィルタを牛血清アルブミンでコーティングする試みを本発明者は非特許文献２で提案した。しかしながら、牛血清アルブミンは高価であり、入手しやすいものではなく、また保存等取り扱いも不便である。
本願発明は、かかる課題を解決し、簡易で効率的にウイルスを捕捉できるフィルタを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上述の課題を解決するため本発明に係るフィルタは、脱脂粉乳に含まれるタンパク質を皮膜として有する繊維又は多孔質材よりなるものである。フィルタ基材としては綿状のガラス繊維を用いることができる。アクアビルナウイルス等のウイルスの捕捉に有利なように、ガラス繊維のメッシュサイズが０．７μｍ程度であるものを選択することができる。また、本発明に係るフィルタの保存方法は、タンパク質を皮膜として有する繊維又は多孔質材よりなるフィルタを凍結乾燥し、４℃以下で保存するものである。このフィルタの保存方法は、フィルタの保存および取り扱いを容易にするものであり、また、ウイルス回収率を一層向上させるものである。また、本発明に係る別のフィルタはタンパク質を含む溶液を繊維又は多孔質材よりなるフィルタ基材中を通過させた後に凍結乾燥させて、タンパク質を皮膜として設けたものである。タンパク質を含む溶液としては脱脂粉乳の水溶液を、フィルタ基材としてはガラス繊維を選択することができる。
【０００６】
【発明の実施の形態】図１を用いて本発明に係るフィルタの実施の形態を説明する。フィルタ基材１は繊維または多孔質材であり、たとえば綿状のガラス繊維やセルロース混合エステル繊維等が使用できる。ここで、フィルタ基材１の孔径またはメッシュサイズは捕捉対象のウイルスのサイズより大きいほうが好ましい。特に、アクアビルナウイルス等水中のウイルスの濃縮においては０．７μｍ程度のメッシュサイズが好ましい。
【０００７】このフィルタ基材１にタンパク質を含む溶液２を注ぐ。タンパク質を含む溶液２としては脂肪分を含まないタンパク質が好ましく、また表面が酸性であるウイルスを吸着しやすいアルカリ性タンパク質が好ましい。安価かつ入手が容易で、しかも結果が良好な脱脂粉乳が特に適している。タンパク質を含む溶液２を注ぐことによりフィルタ基材１上にタンパク質の膜が形成される。このようにして作られたフィルタはウイルスの捕捉能力の高いものとなる。このフィルタをろ過器に設置し、測定対象のウイルスを含む水を透過させると、ウイルスは高い回収率でフィルタに捕捉される。
【０００８】フィルタ基材１へタンパク質を含む溶液２を注いでタンパク質コーティングを行うのはろ過の直前でもよいが、予めタンパク質コーティングを行ったものを保存し、ろ過時に取り出して使用することも可能である。この場合、タンパク質コーティングしたフィルタを凍結乾燥させ、その後４℃以下の低温で保存する。こうすれば、一度に多数のフィルタをコーティングしておき、一連の比較実験を均質なフィルタを用いて行うことができる。
【０００９】
【実施例】本発明のフィルタの実施例について説明する。フィルタ基材としてメッシュサイズ０．７５μｍのガラス繊維フィルタを用いる。ガラス繊維フィルタの大きさはろ過の目的やろ過器の大きさにあわせて選択するが、ここでは厚さ０．４２ｍｍ程度、直径４７ｍｍ程度とした。ろ過器への着脱が容易になるように保持部材を取り付けカセット状にした。
【００１０】また、脱脂粉乳を水で溶かした溶液を準備した。この脱脂粉乳水溶液をフィルタに注ぎ、ガラス繊維の表面にタンパク質のコーティングがされるよう適量吸収させる。吸着後、軽くリン酸緩衝液等でフィルタを洗浄する。
【００１１】このようにして、タンパク質をコーティングしたフィルタを冷凍乾燥させる。その後、４℃以下の低温化で使用するまで保存する。
【００１２】使用する際にはフィルタを冷蔵庫より取り出し、図２に示すろ過器に設置する。フラスコ４の入り口にカセット状のフィルタ３を装着する。この状態でフィルタの上から液体を注げばろ過することができるが、本例においてはフラスコに枝管５が設けられ、真空ポンプ６に接続されフラスコ内部を減圧できるようにしてある。
【００１３】ろ過する試料溶液はマリンビルナウイルスを含む海水であり、以下の手順で調合した。まず、イーグル最小培地に１％のＬグルタミンと１０％の牛血清を加えた環境下でさけ等の魚類由来培養細胞にマリンビルナウイルスのうちＹ−６という株を感染させて、マリンビルナウイルスを人工的に繁殖させる。このようにして繁殖したマリンビルナウイルスの密度は確立した手法により測定することができる。このウイルスを人工海水で希釈することにより、ウイルス密度が１０００個／ｍｌの標準試料溶液を得た。
【００１４】またフィルタとしては上述のガラス繊維のフィルタ基材を牛血清アルブミンでコーティングしたものも使用した。さらに、比較のためにコーティングをしていないガラス繊維のフィルタも用意した。
【００１５】試料溶液をろ過した後、フィルタからウイルスを回収し、その濃度を測定した。図３にその結果を示す。▲１▼はコーティングをしていないガラス繊維のフィルタのデータであり、▲２▼は牛血清アルブミンでコーティングしたフィルタのデータであり、▲３▼は脱脂粉乳でコーティングしたフィルタのデータである。ガラス繊維のみのフィルタに比べて、牛血清アルブミンでコーティングしたものは回収率が顕著に向上している。脱脂粉乳でコーティングしたものもガラス繊維のみのフィルタに比べて回収率が向上しており、脱脂粉乳が牛血清アルブミンに比べて安価で入手しやすいことを考慮すれば、十分な実用性を有する。さらに、フィルタを凍結乾燥することによって回収率は向上することがわかる。特に、脱脂粉乳でコーティングした後凍結乾燥したものは、牛血清アルブミンでコーティングした後凍結乾燥したものの回収率をも上回り、最も高い回収率を示す。以上より、脱脂粉乳でコーティングしたフィルタのウイルス回収率は高く、さらに凍結乾燥することにより回収率は向上する。なお、凍結乾燥することはウイルス回収率を向上させるだけでなく、コーティング後のフィルタの保存を可能にし、さらに、ろ過ごとにコーティングする必要がなくなる等、本発明のフィルタの取り扱いを容易にする有効な技術である。また、牛血清アルブミンでコーティングしたフィルタも凍結乾燥することにより、ウイルス回収率が向上する。凍結乾燥したフィルタは４℃以下の低温で保存することにより、長期間安定した品質を維持することができる。
【００１６】ろ過する際には真空ポンプを作動させて、フラスコ内を外部に比べて負圧にするが、外部との圧力差を大きくしすぎるとかえってウイルスの回収率は悪くなる。外部より２５ｍｍＨｇ程度低くするとウイルス回収率が最も高くなる。これより負圧が小さいとろ過速度が小さくなりすぎ、ろ過に要する時間が長くなってしまう。
【００１７】メッシュサイズは０．７μｍ程度であることが好ましい。このメッシュサイズはアクアビルナウイルスの大きさに比べてかなり大きいものであるが、このことは、コーティングしていないフィルタではメッシュサイズが小さいほど回収率が高くなることとは全く異なる傾向である。
【００１８】本発明のフィルタは本実施例の用途・形状に限定されるものではない。アクアビルナウイルス以外にもポリオウイルスやインフルエンザウイルス等を効果的に捕捉できるものであり、本発明のフィルタをマスクに設けて、防菌・防ウイルス効果の高いマスクを実現できる。さらに、このマスクをインフルエンザの患者が着用することにより、インフルエンザウイルスが外部へ拡散することを防止することもできる。海水、淡水、汚水、汚泥、空気、血液、尿などの試料を本発明のフィルタでろ過することにより、ウイルス、微生物、花粉、その他の微小物質を効果的に採取でき、各種測定、解析、診断等に適用できるものである。
【００１９】
【発明の効果】本発明に係るフィルタは、フィルタ基材上に脱脂粉乳に含まれるタンパク質がコーティングされており、ウイルス等の微小物質を効果的に捕捉・濃縮することができる。脱脂粉乳を使用するので安価なフィルタを実現できる。また、フィルタを凍結乾燥することにより、本発明のフィルタの回収率をさらに向上させることができるとともに、保存・取り扱いが容易となり、また、フィルタの品質を均一にできるので試料中の病原体の定量的な解析がやりやすくなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のフィルタの製造方法を示す説明図である。
【図２】本発明のフィルタの使用状態を示す正面図である。
【図３】本発明のフィルタを使用したろ過の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
１．フィルタ基材
２．タンパク質を含む溶液
３．フィルタカセット
４．フラスコ
５．枝管
６．真空ポンプ
【図１】
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【図２】
2004113990.tif 000004
【図３】
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