(57)【要約】【課題】本発明は、ＥＳ細胞からの神経細胞の作成するための新規な方法を適用することを目的とする。【解決手段】本発明の方法は、分化しつつあるＥＳ細胞を電気パルス処理することを特徴とする。本発明の方法によって得られた神経細胞は、好ましくは、成長因子の適用を必要とせず、インビボで種々の型のニューロンへ分化する柔軟性を有するものである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化しつつあるＥＳ細胞を電気パルス処理することを含む、インビトロ又はエクスビボでの神経細胞の作成方法。
【請求項２】
電気パルスが、０．０１Ｗないし１０Ｗの電力で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
電気パルスが、０．０５Ｗないし６Ｗの電力で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分化しつつあるＥＳ細胞が、浮遊培養、ストロマ細胞、細胞外マトリックス、分化誘導因子によって、分化誘導されたＥＳ細胞である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
分化しつつあるＥＳ細胞が、浮遊培養によって形成された胚様体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＥＳ細胞がヒトＥＳ細胞である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法によって作成された、神経細胞。
【請求項８】
インビトロ又はエクスビボでの成長因子への暴露に非応答性である、請求項７に記載の神経細胞。
【請求項９】
インビボで、特定の神経細胞に最終分化することが可能である、請求項７又は８に記載の神経細胞。
【請求項１０】
請求項７ないし９のいずれか１項に神経細胞を含む、神経関連疾患又は障害を予防又は診断するための医薬組成物。
【請求項１１】
神経関連疾患又は障害が、脊髄損傷、脳梗塞から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＥＳ細胞の電気パルス処理によって得られた神経細胞、並びに前記神経細胞の作成方法及び応用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞と分化
分化過程の間、分化および細胞パターン形成の調和された組織化が、器官の適切な機能を伝える本来の構築物および最終的には動物の体を構築するために必要とされる。個々の細胞とそれを取り巻く環境（それもまたほとんど細胞と考えられる）との相互作用は、複雑で機能的な構造に組み立てるおよび参加させるために細胞を指示するのに重要である。
【０００３】
細胞は、発生の間に連続的に、分化およびパターン形成のための、種々の型の環境的合図を受ける。これら二つの過程は分離できないものであると同時に、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）培養系での機能的器官の再構成はまだ行われていない。たとえ細胞のパターン形成が培養系において再現が難しいにしても、原則として分化に関する多くの発生の合図がエクスビボ系で研究されている。現在まで、多くの試薬がそのような分化の合図として単離されている、例えば、細胞−細胞相互作用、成長因子（非特許文献１）などである。これらの合図は細胞内のシグナリング経路を活性化し、一連の必然的反応を起こし、最終的には転写修飾を生じて機能的および最終的に分化した細胞を生成させる。全反応を達成させるためには、分化時間枠において、適切な順序でこれらの合図に細胞を暴露させなければならない。
【０００４】
脳神経系は、多彩な個性を持つ神経細胞から構成される。近年の分子遺伝学的・分子発生生物学的研究により種々の神経誘導因子が同定され、未分化外胚葉から神経組織に至る所期神経発生の分子機構が解明されつつある。しかしながら、哺乳類の初期神経発生の分子機構や多彩な成熟神経細胞の個性の決定機構については、まだ不明な点も多い。インビトロ又はインビボで特に哺乳動物の神経発生を再現しうる分化系のモデルが希求される。
【０００５】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）
多能性幹細胞は、発生初期に存在する個体を構成するすべての組織細胞に分化する能力、即ち多能性（ｐｌｕｒｉｏｐｏｔｅｎｃｙ）をもつ幹細胞である。例えば、胎仔は胚盤胞に内部細胞塊（ＩＣＭ：ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）、胚盤葉上層（ｅｐｉｂｌａｓｔ）などに由来する細胞から作られるが、これらは典型的な多能性幹細胞である。ところが、多能性幹細胞は発生の進行に伴い、外胚葉・中胚葉・内胚葉の三胚葉に細胞系譜が分かれ、器官形成が始まる頃には消失してしまうと考えられている。即ち、個体の生涯にわたっての増殖や自己複製は行わない。この点、個体維持のために新たな細胞を供給する元ととなる組織幹細胞と相違する。
【０００６】
このような発生初期のごく限られた間だけ存在する多能性を持つ幹細胞を取り出し、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で培養できるように株化したものが胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）株である。ＥＳ細胞は、初期胚中の多能性幹細胞と同様に個体を構成するすべての細胞に分化する能力を保持したまま事実上無制限に増やすことができる。ＥＳ細胞から必要な機能細胞を分化誘導する方法が確立できれば、治療に必要なだけ機能細胞を供給することが可能になることが期待される。ＥＳ細胞株は、１９８１年にマウスのＩＣＭから初めて樹立された（Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：ｐ．７６３４−７６３８，１９８１；Ｅｖａｎｓ  ＆Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：ｐ．１５４−１５６，１９８１文）。そして、１９９８年以降、いくつかの研究チームがヒト胚盤胞からヒトＥＳ細胞株の樹立に成功している（Ｔｈｏｍｓｏｎ、Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，ｐ．１１４５，１９９８；  Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１３７２６−１３７３１，１９９８；  Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８，ｐ．３９９−４０４，２０００）。これらのＥＳ細胞株は、胚盤胞から分離したＩＣＭをフィーダー細胞上で培養することで樹立されている。
【０００７】
このように、ＥＳ細胞は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）およびエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）おいて、種々の運命で分化する全能性細胞である。ＥＳ細胞をＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）等の分化抑制因子を加えずに高密度になるまで培養したり、培養シャーレに接着しないようにした浮遊培養で形成された細胞塊を形成させるとさまざまな種類の細胞に自然に分化する。特に、浮遊培養で形成された細胞塊は胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ：ＥＢ）と呼ばれ、ＥＳ細胞を試験管内で分化させる際に最も広く用いられる。胚様体は二重の細胞層から成るボールのような構造をもち、外層は近位内胚葉、内層は胚体外胚葉にあたる。２つの胚葉は基底膜によって隔てられている。胚様体の中では中胚様の誘導も起き、心筋細胞や血液細胞、さらには原始的な血管網も発生する。また、胚様体を培養シャーレに付着させてさらに培養を続けるとさまざまな種類の細胞に分化する。この中には、神経細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、脂肪細胞などが含まれる。胚様体形成を経て分化する細胞は体細胞に限らず、最近では生殖細胞系譜への分化も起きることが確認されている。
【０００８】
ＥＳ細胞を試験管内で分化誘導する方法としては、その他にもストロマ細胞と呼ばれる支持細胞層や細胞外マトリックスの上でＥＳ細胞を二次元的に培養する方法もある。ストロマ細胞株や細胞外マトリックスの種類によってＥＳ細胞から分化誘導されやすい細胞系譜が異なるため、この方法は特定の細胞系譜への分化を選択的に誘導するのに適している。
【０００９】
このように、胚様体（ＥＢ）等の形成を通した誘導により、ＥＳ細胞は胚体外内胚葉、ニューロン、筋肉などのような種々の型の細胞運命をたどる（非特許文献２）。多くの成長因子およびシグナリング経路は分化過程を開始する活性を持ち、細胞分化の方向を調節することになっている（非特許文献３−４）。神経細胞に関してはある種の成長因子を適用することにより、ＥＳ細胞がいくつかの特定のニューロンになる運命に分化すること、およびニューロン組織のいくつかの運命付けられた部分への寄与を示したことがいくつかの報告ですでに示されている（非特許文献５−７）。これらの単一成長因子は、比較的効率のよい様式で分化比の調節を示した。
【００１０】
しかしながら、哺乳類の初期神経発生の分子機構や多彩な成熟神経細胞の個性の決定機構については、まだ不明な点も多い。ＥＳ細胞より神経細胞を再生するために現在知られている方法は成長因子の適用を必要とし、そして使用された成長因子の種類に応じてＥＳ細胞は、ニュロン、グリア、アストロサイト、オリゴデンドライト等の特定の種類の神経細胞に分化する。一方、動物への適用、臨床適用を考慮すると、作成に成長因子の適用を必要とせず、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で種々の型のニューロンへ分化する柔軟性を有する、神経幹細胞に相当する神経細胞の作成が希求される。
【００１１】
イオン平衡又は電気活性と細胞分化
イオン平衡または電気活性はホメオスタシスの一つの無視できない因子であろう。イオンは、神経伝達のような生物学的機能を持っていることが知られている。細胞内および細胞外イオン密度間の平衡は電気的ポテンシャルを生じ、イオン平衡の静止性が細胞の状態を維持している。Ｌｉ＋およびＣａ２＋の濃度はＷｎｔ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ経路に関連したリン酸化カスケードを通して分化運命に影響することが知られている。その上、分化している神経回路においての電気的活性は多くのシナプス連結の機能的および構造的改善を誘導し、活性依存性遺伝子転写応答はネットワーク機能をきわだたせることを可能にする（非特許文献８）。このことは分化過程に対するイオン密度及び電気的活性の重要性を示唆しているが、細胞および細胞外イオン密度に関連し、細胞運命決定についての現象はほとんど報告されていない。
【００１２】
【非特許文献１】
Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｍ．  ＆  Ｇｕｒｇｏｎ，  Ｊ．Ｂ．  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  １８，  ５１５−５３９  （２００２）．
【非特許文献２】
Ｃｏｕｃｏｕｖａｎｉｓ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｇ．Ｒ．  ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｌａｙｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｖｉｃｅｒａｌ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６，  ５３５−５４６  （１９９９）．
【非特許文献３】
Ｌｅｅ，  Ｓ．Ｈ．，  Ｌｕｍｅｌｓｋｙ，  Ｎ．，  Ｓｔｕｄｅｒ，  Ｌ．，  Ａｕｅｒｂａｃｈ，  Ｊ．Ｍ．  ＆  ＭｃＫａｙ  Ｒ．Ｄ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｄ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｈｉｎｄｂｒａｉｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌ．  １８，  ６７５−６７９    （２０００）
【非特許文献４】
Ｌｕｍｅｌｓｋｙ，  Ｎ．，  Ｂｌｏｎｄｅｌ，  Ｏ．，  Ｌａｅｎｇ，  Ｐ．，  Ｖｅｌａｓｃｏ，  Ｉ．，  Ｒａｖｉｎ，  Ｒ．  ＆  ＭｃＫａｙ，  Ｒ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２，  １３８９−１３９４  （２００１）．
【非特許文献５】
Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ，  Ｈ．，  Ｌｉｅｂｅｒａｍ，  Ｉ．  Ｐｏｒｔｅｒ，Ｊ．Ａ．  ａｎｄ  Ｊｅｓｓｅｌｌ，  Ｔ．Ｍ．  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓｉｎｔｏ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｃｅｌｌ  １１０，  ３８５−３９７  （２００２）．
【非特許文献６】
Ｊｏｈｅ，  Ｋ．Ｋ．，  Ｈａｚｅｌ，  Ｔ．Ｇ．，  Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｔ．，  Ｄｕｑｉｃｈ−Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ，  Ｍ．Ｍ．  ＆  Ｍｃｋａｙ  Ｒ．Ｄ．  Ｓｉｎｇｌｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｇｅｎｅｓ．  Ｄｅｖ．  １０，  ３１２９−３１４０  （１９９６）．
【非特許文献７】
Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｈ．，  Ｍｉｓｕｓｅｋｉ，  Ｋ．，  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｓ．，  Ｋａｎｅｋｏ，  Ｓ．，  Ｋｕｗａｎａ，  Ｙ．，  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，  Ｓ．，  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ．  Ｓ．  ＆  Ｓａｓａｉ，  Ｙ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｎｅｕｒｏｎ  ２８，  ３１−４０  （２０００）．
【非特許文献８】
Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．Ｉ．  ＆  Ｐｏｏ，  Ｍ．Ｍ．  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ．  Ｎａｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ４  Ｓｕｐｐｌ．，  １２０７−１２１４  （２００１）．
【非特許文献９】
Ｎａｇａｉ，  Ｔ．，  Ｉｂａｔａ，  Ｋ．，  Ｐａｒｋ，  Ｅ．Ｓ．，  Ｋｕｂｏｔａ，  Ｍ．，  Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，  Ｋ．  ＆  Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａ．  Ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０，  ８７−９０  （２００２）．
【非特許文献１０】
Ｔａｎａｂｅ，  Ｙ．，  Ｗｉｌｌｉａｍ，  Ｃ．  ＆  Ｊｅｓｓｅｌｌ，  Ｔ．Ｍ．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｂｙ  ＭＮＲ２  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ  ９５，  ６７−８０  （１９９８）．
【非特許文献１１】
Ｗｕ，  Ｐ．，  Ｔａｒａｓｅｎｋｏ，  Ｙ．Ｉ．，  Ｇｕ，  Ｙ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｌ．−Ｙ．Ｍ．，  Ｃｏｇｇｅｓｈａｌｌ，  Ｒ．Ｅ．  ＆  Ｙｕ，Ｙ．  Ｒｅｇｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｆｅｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ．  Ｎａｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ５，  １２７１−１２７８  （２００２）．
【非特許文献１２】
Ｔｓｕｃｈｉｄａ，  Ｔ．，  Ｅｎｓｉｎｉ，  Ｍ．，  Ｍｏｒｔｏｎ，  Ｓ．Ｂ．，  Ｂａｌｄａｓｓａｒｅ，  Ｍ．，  Ｅｄｌｕｎｄ，  Ｔ．，  Ｊｅｓｓｅｌｌ，  Ｔ．Ｍ．  ＆  Ｐｆａｆｆ，  Ｓ．Ｌ．  Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＬＩＭ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅｓ．  Ｃｅｌｌ  ７９，  ９５７−９７０  （１９９４）．
【非特許文献１３】
Ｒｕｂｉｏ，  Ｆ．Ｊ．，  Ｂｕｅｎｏ，  Ｃ．，  Ｖｉｌｌａ，  Ａ．，  Ｎａｖａｒｒｏ，  Ｂ．  ＆  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓｅｒｒａｎｏ，  Ａ．  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｐｅｒｐｅｔｕａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｇｒａｆｔ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １６，  １−１３  （２０００）．
【非特許文献１４】
Ｂｅａｔｔｉｅ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｂｒｅｓｎａｈａｎ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｋｏｍｏｎ，  Ｊ．，  Ｔｏｖａｒ，  Ｃ．Ａ．，  Ｖａｎ  Ｍｅｔｅｒ，  Ｍ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．Ｋ．，  Ｆａｄｅｎ，  Ａ．Ｉ．，  Ｈｓｕ，  Ｃ．Ｙ．，  Ｎｏｂｌｅ，  Ｌ．Ｊ．，  Ｓａｌｚｍａｎ，  Ｓ．  ＆  Ｙｏｕｎｇ，  Ｗ．  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｐａｉｒ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １４８，４５３−４６３  （１９９７）．
【非特許文献１５】
Ｃａｓｓｉｄｙ，  Ｒ．  ＆  Ｆｒｉｓｅｎ，  Ｊ．，  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．  Ｎａｔｕｒｅ
４１２，  ６９０−６９１  （２００１）．
【非特許文献１６】
Ｋｉｍ，  Ｊ．Ｈ．，  Ａｕｅｒｂａｃｈ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｇｏｍｅｚ，  Ｊ．Ａ．，  Ｖｅｌａｓｃｏ，  Ｉ．，  Ｇａｖｉｎ，  Ｄ．，  Ｌｕｍｅｌｓｋｙ，  Ｎ．，  Ｌｅｅ，  Ｓ．Ｈ．，  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｊ．，  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｒｎａｕｔｅ，  Ｒ．，  Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｋ．  ＆  ＭｃＫａｙ，  Ｒ．  Ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，  ５０−５６  （２００２）．
【非特許文献１７】
Ｊａｎｉｃａｋ，  Ｐ．Ｇ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｇｉｂｂｏｎｓ，  Ｒ．Ｄ．，  Ｅｒｉｃｋｓｅｎ，  Ｓ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｓ．  ＆  Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，  Ｐ．  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＥＣＴ：  ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １４２，  ２９７−３０２  （１９８５）．
【非特許文献１８】
Ｎｉｗａ，  Ｈ．，  Ｙａｍａｍｕｒａ，  Ｋ．  ＆  Ｍｉｙａｚａｋｉ，  Ｊ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｇｅｎｅ  １０８，  １９３−１９９  （１９９１）．
【非特許文献１９】
Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：ｐ．７６３４−７６３８，１９８１
【非特許文献２０】
Ｅｖａｎｓ  ＆  Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：ｐ．１５４−１５６，１９８１
【非特許文献２１】
Ｉａｎｎａｃｏｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．  １６３：ｐ．２８８−２９２，１９９４
【非特許文献２２】
Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．  １２７：ｐ．２２４−２２７，１９８８
【非特許文献２３】
Ｗｈｅｅｌｅｒ，  Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．  ６：ｐ．５６３−５６８，１９９４
【非特許文献２４】
Ｆｉｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．  ６：ｐ．５５３−５６２
【非特許文献２５】
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：ｐ．７８４４−７８４８，１９９５
【非特許文献２６】
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：  １１４５−１１４７，  １９８８
【非特許文献２７】
Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１３７２６−１３７３１，１９９８
【非特許文献２８】
Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８，ｐ．３９９−４０４，２０００
【非特許文献２９】
Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：ｐ．６４−６６，１９９６
【非特許文献３０】
Ｔａｄａ、Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒ．Ｂｉｏｌ．，１１：ｐ．１１５３−１１５８，２００１
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、インビトロ又はエクスビボでの神経細胞の作成方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、分化しつつあるＥＳ細胞を電気パルス処理することを含む。
【００１４】
本発明方法の好ましい一態様では、電気パルスは、０．０１Ｗないし１０Ｗの電力、より好ましくは０．０５Ｗないし６Ｗの電力で行われる。
【００１５】
本発明の好ましい一態様では、分化しつつあるＥＳ細胞は、浮遊培養、ストロマ細胞、細胞外マトリックス、分化誘導因子によって、分化誘導されたＥＳ細胞である。
【００１６】
本発明はまた、本発明の前記方法によって作成された、神経細胞を提供することを目的とする。本発明の神経細胞は、インビトロ又はエクスビボでの成長因子への暴露に非応答性であり、及び／又は、インビボで、特定の神経細胞に最終分化することが可能である。
【００１７】
本発明はさらに、本発明の神経細胞を含む、神経関連疾患又は障害を予防又は診断するための医薬組成物を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、作成に成長因子の適用を必要とせず、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で種々の型のニューロンへ分化する柔軟性を有する、神経細胞を得るために鋭意研究に努めた結果、イオン密度勾配および電気的ホメオスタシスが分化過程、特に分化しつつある細胞の運命決定の調節においても重要であることを発見し、本発明を想到した。分化を開始したＥＳ細胞は、電気パルスによりニューロン細胞への分化に向かう強い傾向が与えられた。生じたニューロン細胞は、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）培養系内では特定の終末分化の徴候を示さなかった。即ち、成長因子によるニューロン運命誘導ＥＳ細胞（非特許文献５−７）と異なり、細胞型特異性決定の“行き先柔軟性”を示し、試験された任意のニューロン組織における任意のニューロン系列を構築する能力を示した。一方、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で種々の型のニューロンへ分化する可能性を持っており、動物の体へ寄与できることが示された。本発明の神経細胞及びその作成方法は、細胞分化および神経発育の基礎をなす新規機構を理解する可能性のみでなく、医薬応用の可能性を開くものである。
【００１９】
神経細胞の作成方法
本発明の神経細胞の作成方法は、分化しつつあるＥＳ細胞を電気パルス処理することを特徴とする。
【００２０】
（１）ＥＳ細胞
本明細書における、「ＥＳ細胞」とは、発生初期に存在する個体を構成するすべての組織細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取り出し、インビトロで培養できるように株化したものを意味する。ＥＳ細胞は、初期胚中の多能性幹細胞と同様に個体を構成するすべての細胞に分化する能力を保持したまま事実上無制限に増やすことができる。
【００２１】
具体的には、ＥＳ細胞はマウスのものが１９８１年に初めて記載された（Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：ｐ．７６３４−７６３８，１９８１；  Ｅｖａｎｓ  ＆  Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：ｐ．１５４−１５６，１９８１）。それらは、例えば、３．５日目の胚の内部細胞塊由来である。ＥＳ細胞は多分化能を有し、すべての組織および細胞タイプを発生させうる。このことは、別の胚盤胞中に注入されたＥＳ細胞が、生殖系を包含するすべての組織の発生に関与でき、そのことによりキメラ動物が得られるという事実により、最もよく示されている。ＥＳ細胞のユニークな特徴は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下においてそれらが多分化能のある段階で維持され、増殖できるという事実である。今日、このことは、ＥＳ細胞の遺伝学的修飾に頻繁に利用されている。その後、これらの処理されたＥＳ細胞の胚盤胞への注入を用いてトランスジェニック動物が得られている。ＥＳ細胞はまた、インビトロでの分化の研究に使用されている。この方法は、インビトロにおける制御された条件下での初期組織の発達に関する研究および実験的処理を可能にする。
【００２２】
ラット（Ｉａｎｎａｃｏｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．  １６３：ｐ．２８８−２９２，１９９４）、ハムスター（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．  １２７：ｐ．２２４−２２７，１９８８）、鳥類、魚類、ブタ（Ｗｈｅｅｌｅｒ，  Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．  ６：ｐ．５６３−５６８，１９９４）、ウシ（Ｆｉｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．  ６：ｐ．５５３−５６２）、ならびに霊長類（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：ｐ．７８４４−７８４８，１９９５）を包含する多種多様な種から多分化能胚性幹細胞が単離されている。胚性ヒト組織からのＥＳ細胞およびＥＳ細胞様幹細胞の単離についてもいくつかの研究チームが、成功している（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：  １１４５−１１４７，  １９８８；  Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１３７２６−１３７３１，１９９８；  Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．，１８，ｐ．３９９−４０４，２０００）。これらのＥＳ細胞株は、胚盤胞から分離したＩＣＭをフィーダー細胞上で培養することで樹立されている。他の最近の研究は、胚および成熟哺乳動物細胞由来の核を脱核卵母細胞中に移植することにより胚および胚性細胞を得ることが可能であることを示している（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：ｐ．６４−６６，１９９６）。
【００２３】
本発明の方法においては、任意の樹立されたＥＳ細胞株を使用可能である。あるいは、本発明の方法によって作成されたＥＳ細胞を個体に適用した場合の免疫拒絶反応を防ぐためには、個体の体細胞を用いてクローン胚を作成しそこからＥＳ細胞株を樹立する方法が有効である。この方法を用いれば個体と同一の遺伝的要素をもったＥＳ細胞を樹立することが可能である。
【００２４】
あるいは、体細胞クローンの作成では卵子に導入された体細胞の核が受精卵の核と同じような状態に変化する、「初期化」と呼ばれる現象が起きると考えられている。卵子のもつこのような活性に類似した活性をＥＳ細胞ももつことが報告されている（Ｔａｄａ、Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒ．Ｂｉｏｌ．，１１：ｐ．１１５３−１１５８，２００１）。つまり、個体の体細胞とＥＳ細胞を融合することで、体細胞をＥＳ細胞のような細胞に変換できることが期待される。ＥＳ細胞はインビトロで遺伝子操作を行うことができるので、ＭＨＣ遺伝子群などの免疫拒絶に関与する因子をあらかじめ操作したＥＳ細胞でこれを行うことで、体細胞クローン胚作成などの手法を用いることなく拒絶反応を回避できることが期待される。
【００２５】
本発明において、「ＥＳ細胞」は好ましくはヒトのＥＳ細胞である、現在、樹立されたヒトＥＳ細胞株は、例えば以下の機関より入手可能である。
【００２６】
【表１】
京都大学再生医科学研究所（日本）
ＢｒｅｓａＧｅｎ．  Ｉｎｃ．（アテネ、ジョージア）
ＣｙＴｈｅｒ，  Ｉｎｃ．（サンディエゴ、カルフォルニア、米国）
ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（メルボルン、オーストラリア）
Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，（カルフォルニア、米国）
Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（スウェーデン）
Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（スウェーデン）
Ｍａｒｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ−Ｍａｒｉａ  Ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ソウル、韓国）
ＭｉｚＭｅｄｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ソウル、韓国）
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｔａｔａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ（インド）
Ｐｏｃｈｏｎ  ＣＨＡ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ソウル、韓国）
Ｒｅｌｉａｎｃｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ムンバイ、インド）
Ｔｅｃｈｎｉｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ハイファ、イスラエル）
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（米国）
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷＡＲＦ）（米国）
【００２７】
本発明の方法において、使用するＥＳ細胞は、「分化しつつある」状態にあることが好ましい。すなわち、本発明の方法では、ＥＳ細胞を電気パルス処理することを特徴とするが、電気パルス処理のみでは神経細胞は作成されない。本発明者は、ＥＳ細胞から最終分化した神経細胞の形成までは以下の三つの段階に分割しうることを明らかにした。第一に、幹細胞未分化状態が“脱”−未分化または不安定化する段階、第二に、細胞運命の方向性が調節される段階、そして第三に、運命付けられた細胞が最終分化状態をとる段階である。本発明の神経細胞の作成方法において、電気パルス処理は第二工程にのみ働くと考えられる。
【００２８】
よって、電気パルス処理前、あるいは同時にＥＳ細胞を分化しつつある状態、即ち、脱分化の方向に向かわせる分化誘導のための処理が必要である。ＥＳ細胞をＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）等の分化抑制因子を加えずに高密度になるまで培養したり、培養シャーレに接着しないようにした浮遊培養で形成された細胞塊を形成させるとさまざまな種類の細胞に自然に分化する。特に、浮遊培養で形成された細胞塊は胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄｂｏｄｙ：ＥＢ）と呼ばれ、ＥＳ細胞を試験管内で分化させる際に最も広く用いられる。胚様体は二重の細胞層から成るボールのような構造をもち、外層は近位内胚葉、内層は胚体外胚葉にあたる。２つの胚葉は基底膜によって隔てられている。胚様体の中では中胚様の誘導も起き、心筋細胞や血液細胞、さらには原始的な血管網も発生する。また、胚様体を培養シャーレに付着させてさらに培養を続けるとさまざまな種類の細胞に分化する。
【００２９】
ＥＳ細胞をインビトロで分化誘導する方法としては、浮遊培養による胚様体の作成以外にもストロマ細胞と呼ばれる支持細胞層や細胞外マトリックスの上でＥＳ細胞を二次元的に培養する方法もある。ストロマ細胞とは、種々の分化や増殖を支持する間葉系の細胞である。培養では、骨髄や新生仔頭蓋骨などから樹立された細胞株が用いられることが多い。それ自体が脂肪細胞などに分化する脳録をもつものもある。ストロマ細胞株や細胞外マトリックスの種類によってＥＳ細胞から分化誘導されやすい細胞系譜が異なるため、この方法は特定の細胞系譜への分化を選択的に誘導するのに適している。
【００３０】
あるいは、レチノイン酸等の分化誘導因子を使用することにより、本発明の「分化しつつある」ＥＳ細胞を調製してもよい。
【００３１】
よって、本発明において、「分化しつつあるＥＳ細胞」は、好ましくは浮遊培養、ストロマ細胞、細胞外マトリックス、分化誘導因子によって、分化誘導されたＥＳ細胞である。より好ましくは、浮遊培養によって形成された胚様体（ＥＢ）が使用される。
【００３２】
（２）電気パルス処理
本発明は、分化を開始したＥＳ細胞に電気パルス処理を施すと、ニューロン細胞への分化に向かう強い傾向が与えられる、という発見に基づく。
【００３３】
電気パルスの強度は、電位、周波数、回数の３つの要素の組み合わせで決定される。当業者は、使用するＥＳ細胞の種類、培地の種類、電極の種類等の条件に応じて、電気パルスの強度を適宜調節することが可能である。限定されるわけではないが、本発明方法の好ましい一態様では、電気パルスは、０．０１Ｗないし１０Ｗの電力、より好ましくは０．０５Ｗないし６Ｗの電力（例えば、５Ｖ、０．０１Ａ−１０Ｖ，０．６Ａ）で行われる。最も好ましくは、約５Ｗである。約３０ｍｓ−１００ｍｓ（好ましくは、５０ｍｓ）の電気刺激を約９００ｍｓ−９７０ｍｓ（好ましくは９５０ｍｓ）毎に、３回ないし１０回程度（好ましくは５回）、行う。
【００３４】
本発明において電気パルスは、ワット数が重要であり、例えば３０Ｖ（３０Ｖ、０．２Ａで６Ｗ）等の比較的高い電位でも電流が小さければ可能である。電位は、好ましくは、約５Ｖないし約３０Ｖ、より好ましくは、約５Ｖないし約１０Ｖである。本発明の方法における電気パルス処理の電位は、好ましくは、エレクトロポレーションに使用される電位（一般には、約８０Ｖ−約２０００Ｖ）に比較し、有意に低い電位である。よって、エレクトロポレーションの場合と異なり、細胞膜に孔を形成するほど強くなく、電気パルスによる細胞分化調節効果が膜孔形成によるイオン流出または流入のせいではないと考えられる（実施例１（３））。
【００３５】
電気パルス処理は周知の方法、装置を使用して行うことができる。例えば、エレクトロポレーター（例えば、常磐科学のＣＵＹ２１Ｅ）、微小電極（例えば、ネッパジーンのＣＵＹ４５９Ｇ２０）の装置が使用可能である。電気パルス処理を行ったＥＳ細胞は、プレート上、ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ）等の栄養を含む、ＤＭＥＭ、またはａｌｐｈａ−ＭＥＭ等の合成培地などの培地中で維持してもよい。
【００３６】
神経細胞
本発明はまた、本発明の方法によって得られた神経細胞を提供する。本明細書中で後述する実施例１（３）等に記載したように、本発明の神経細胞は、神経細胞の指標であるＴｕＪ１抗体に対しては陽性を示した。しかしながら、特異的神経細胞型の最終分化指標であるチロシン−ヒドロキシラーゼ、ＧＡＤ６５、Ｉｓｌｅｔ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ７、ＭＮＲ２およびＮｋｘ２．２等はエクスビボ系で検出されなかった。このことは電気パルス処理により得られた神経細胞は、エクスビボ培養系では最終分化に到達できなかったことを示唆する。
【００３７】
即ち、本発明において、分化しつつあるＥＳ細胞の電気パルス処理により、ＥＳ細胞は優先的に神経細胞への分化する方向へ向かうことが明らかにされた。本発明者はＥＳ細胞から最終分化した神経細胞の形成までは以下の三つの段階に分割しうることを示した。第一に、幹細胞未分化状態が“脱”−未分化または不安定化する段階、第二に、細胞運命の方向性が調節される段階、そして第三に、運命付けられた細胞が最終分化状態をとる段階である。本発明の神経細胞の作成方法において、電気パルス処理は好ましくは特に、第二工程にのみ働くと考えられる。
【００３８】
さらに、本発明において作製された神経幹細胞様細胞はエクスビボにおいては、細胞運命決定に影響をもつと考えられているＳｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、ＢＭＰ、ＦＧＦ及びＮｏｇｇｉｎ等の成長因子に対して不感受性を示した（実施例１（５）。その一方、インビボ環境において、種々の最終的分化ニューロン状態をとる能力があることが証明された（実施例２および３）。即ち、本発明の神経細胞は、“最終分化には可塑的”であり、最終分化のためには予定された神経運命をたどるための別の工程（第三工程）を必要とする。それらはニューロンの型を示す特異的ニューロンマーカーのいずれも発現せず、インビボでは任意のニューロン運命をたどる能力を持っている。一方、培養系では成長因子に暴露してもそれらを発現しないことを保っている。
【００３９】
よって、本発明の神経細胞は、好ましくは、インビトロ又はエクスビボでの成長因子への暴露に非応答性である。一方、インビボでは、好ましくは特定の神経細胞に最終分化することが可能である。よって、本発明の神経細胞は、好ましくは、ニュロン、グリア、アストロサイト、オリゴデンドライト等の特定の種類の神経細胞に最終分化し、神経組織を構築することが可能な神経幹細胞様の神経系の細胞である。
【００４０】
本明細書中の実施例３では、電気パルス処理ＥＢがインビボで成体神経組織を形成する能力を持っているかどうかを決定するため、受容体として損傷脊髄マウスを使用し、電気パルス処理ＥＢの計画的注入を実施した。その結果、本発明の電気パルス処理ＥＢはマウスの脊髄神経組織の形成に寄与し、運動機能不全を改善することが明らかになった（図９）。本発明の神経細胞がインビボで成体神経組織を形成する具体的な機構については明らかではないが、脊髄損傷に応答して成体ニューロン幹細胞からグリア細胞が発生できることが知られているので（非特許文献１４）、損傷が注入細胞最終分化を適切な方向を導くのに必要な環境合図を与えた可能性もある。また、損傷に応答した環境変化が、ニューロン幹細胞の増殖および分化を調節できる成長因子およびサイトカインの存在に影響することも知られている（非特許文献６）。これに対し、対照の非処理ＥＢは、移植領域で凝集した細胞塊を形成したのみで、適切な分化経路をとれなかった。
【００４１】
このように、本発明の神経細胞は好ましくは、インビトロ又はエクスビボでの成長因子への暴露に非応答性であり、神経幹細胞に近い状態を維持するが、インビボでは任意のニューロン運命をたどる能力を持っている。
【００４２】
医薬組成物
本発明のＥＳ細胞の作成方法は、従来の成長因子を使用する方法と異なり、環境情況へその態度をさらに調節でき、それらが移植された位置に適した細胞へ分化する、かなり融通性のある、若いまたは“可塑性の”神経系列細胞、即ち神経幹細胞に近い神経細胞をもたらす。よって、本発明の神経細胞は治療的応用が可能である。
【００４３】
実際、本明細書中の実施例３に記載したように、電気パルス処理ＥＢがインビボで成体神経組織を形成する能力を持っているかどうかを決定するため、受容体として損傷脊髄マウスを使用し、電気パルス処理ＥＢの計画的注入を実施した。その結果、本発明の電気パルス処理ＥＢはマウスの脊髄神経組織の形成に寄与し、運動機能不全を改善することが示された。
【００４４】
従来報告されている治療的適用のほとんどは、例えばパーキンソン病治療の場合のように、適切なニューロン回路形成を必要としていない（非特許文献１５、１６）。本発明の神経細胞は運動機能不全を回復することができ、それらが機能的構成を再構築することを示唆している。電気パルスは精神分裂症またはうつ病のようないくつかの精神疾患の処置に使用されること（非特許文献１７）との関連を考えると興味深い。本発明において、分化を開始したＥＳ細胞は、電気パルスによりニューロン細胞への分化に向かう強い傾向が付与されることが明らかにされたことから、精神病患者に対するこ電気パルス治療方法にニューロン細胞の再生および神経回路の再構築が含まれている可能性も示唆される。
【００４５】
よって、本発明は、本発明の神経細胞を含む、神経関連疾患又は障害を予防又は診断するための医薬組成物を提供する。
【００４６】
本明細書において、「神経関連疾患又は障害」は神経の先天的・後天的変性・損傷等に起因する任意の疾患又は障害を含む。公知の神経関連疾患としては、例えば、脊髄損傷、頭部外傷（頭蓋骨骨折、頭蓋内血腫、脳損傷等）、循環障害（脳虚血、低酸素による脳病変、頭蓋内出血等）、感染症（ウイルス感染症、プリオン病、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症等）、脱髄性疾患（多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎等）、変性疾患（痴呆を主徴とする神経変性疾患、運動と姿勢制御の障害を主徴とする神経変性疾患、運動失調を主徴とする神経変性疾患、常染色体優性遺伝の運動失調症、運動神経系の障害を主徴とする神経変性疾患等）、中毒、放射線障害（中毒による神経障害、放射線障害等）、栄養障害に伴う神経障害（チアミン欠乏症、ペラグラ、亜急性連合性脊髄変性症等）、先天性代謝異常に伴う神経疾患（ミトコンドリアＤＮＡの異常に伴う神経疾患、リソソーム関連酵素の異常に伴う神経疾患、ペルオキシソームの異常に伴う神経疾患、その他の白質ジストロフィー、アミノ酸代謝の異常に伴う神経疾患、微量金属の代謝異常による疾患等）、後天性代謝異常に伴う神経疾患（肝脳疾患、Ｒｅｙｅ症候群、低血糖性脳症、橋中心髄鞘崩壊、透析脳症等）、頭蓋内腫瘍（膠腫、神経採用由来の腫瘍、未分化細胞由来の腫瘍、髄膜の腫瘍、末梢神経の腫瘍、松果体部腫瘍、原発性リンパ腫等）、奇形（神経溝の閉鎖不全による神経管の形成不全、神経管形成以後の発達異常、胚細胞の分化、移動の異常による奇形、周産期の異常に起因する神経障害、大後頭孔周辺と脊髄の奇形、母斑症等）、末梢神経の病変等を含む。
【００４７】
脊髄損傷、脳梗塞等の脳虚血、低酸素による脳病変を含む循環障害等はニューロン・グリア等の神経細胞が関与することが知られている。よって、本発明の医薬組成物は好ましくは、脊髄損傷、脳梗塞から選択される神経関連疾患又は障害を予防又は診断するために使用されうる。
より好ましくは脊髄損傷に使用されうる。
【００４８】
本発明の組成物は、最も好ましくは生体の脊髄又は神経管内への注射投与等により移植することによって神経関連疾患又は障害を予防又は診断しうる。投与の方法は公知の方法に従って行うことができる。移植のために必要な神経細胞の量は、適用する生体の種、年齢、性別、疾患の重度等種々の要因に応じて相違する。一般には、例えばヒトに移植するためには、１０７／ｍｌ程度の濃度の神経細胞を合計約１ｍｌないし約１０ｍｌの量必要であると考えられる。
【００４９】
本発明の組成物を適用しうる生体は特に限定されないが、ＥＳ細胞が樹立されている高等生物が好ましい。例えば、前述したようにＥＳ細胞が樹立されているラット、ハムスター、鳥類、魚類、ブタ、ウシ、ならびにヒトを含む霊長類が含まれれる。
【００５０】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５１】
方法
組織学
以下の抗体を使用し、培養細胞または切片を免疫組織化学のために処理した：抗−ＴｕＪ１マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（１：５００；ＢＡｂＣＯ）；
抗−ＧＦＡＰウサギポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（１：５；ＤＡＫＯ）；抗−ＭＡＧウサギポリクローナル抗体（１：５００；故Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ
Ｍａｔｓｕｄａ博士より）；
抗−ＧＡＤ６５ポリクローナル抗体（１：２００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；
抗−ＴＨ  ｍＡｂ（１：５００；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）；
抗−Ｎｅｓｔｉｎ  ｍＡｂ（１：５００）；
抗−Ｉｓｌｅｔ１  ｍＡｂ（１：４００；ＤＳＨＢ）；
抗−Ｐａｘ６  ｍＡｂ（１：２００；ＤＳＨＢ）；
抗−Ｐａｘ７  ｍＡｂ（１：４００；ＤＳＨＢ）；
抗−ＭＮＲ２  ｍＡｂ（１：４００；ＤＳＨＢ）および
抗−Ｎｋｘ２．２  ｍＡｂ（１：４００；ＤＳＨＢ）。
【００５２】
実施例１  培養における電気パルス処理細胞の細胞運命決定
（１）電気の適用による、分化運命に対する細胞内および細胞外イオン平衡の影響を試験した。先ず、以下の記載するようにＥＢを周知の方法で調製し、その後、ＥＢに電極により電気パルスを与えた。
【００５３】
先ず、ＣＡＧＧＳプロモーター（大阪大学の宮崎純一博士より入手）により誘導されたＶｅｎｕｓ蛋白質（理化学研究所、脳科学研究センターの宮脇敦史博士より入手）を発現したＲ１  ＥＳ細胞（マウントシナイ病院（カナダ、トロント）のＡｎｄｒｅａｓ  Ｎａｇｙ博士より入手）のエレクトロポレーションにより、Ｖｅｎｕｓを発現しているＥＳ細胞を単離した（非特許文献９、１８）。胚様体はＥＳ細胞を付着不能細菌ペトリ皿（Ｎｕｎｃ）中、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで培養することにより作製した。
【００５４】
なお、「Ｖｅｎｕｓ」は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の変異体であるＥＹＦＰのさらなる変異体であり、蛍光標識マーカとして実験等に広く使用されている。ＥＹＦＰは公知の蛍光蛋白質であり、そのアミノ酸配列は登録番号ＡＡＦ６５４５５としてＮＣＢＩに寄託されている。ｖｅｎｕｓは、ＥＹＦＰの配列において以下の５箇所のアミノ酸残基が修飾されており、非常に強い蛍光活性を示す：Ｆ４７Ｌ／Ｆ６５Ｌ／Ｍ１５４Ｔ／Ｖ１６４Ａ／Ｓ１７６Ｇ。
【００５５】
電気パルスはいくつかの電位条件下（０Ｖ、５Ｖ、１０Ｖおよび２０Ｖ）、４ｍｍギャップキュベット中、エレクトロポレーター（ＣＵＹ２１Ｅ；Ｔｏｋｉｗａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行われた。具体的には、５−６Ｗの電気刺激を５０ｍｓ、９５０ｍｓ間隔で５回行った。電気パルス処理ＥＢはポリ−Ｄ−リジン被覆プレート（ＢＤ）上、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ）を含むＤＭＥＭ中で維持した。１０日後、細胞を免疫組織化学的観察のために固定した。
【００５６】
ポリ−Ｄ−リジン被覆プレートで１０日培養後、分化によるそれらの運命を試験するために細胞を固定した。電気パルスの処理を施さない本来のＲ１胚性幹細胞は、使用した分化マーカー（主として筋肉およびニューロン）により示されたように、細胞運命の特定の傾向を示さない（図２ａ）。それに対し、驚くことに、ＥＢがパルス実験にかけられた場合、非パルス処理対照ＥＢと比較して、細胞は強いニューロン分化を示した（図１及び２）。パルス処理群では、ほとんどすべてのコロニーが１０Ｖのパルスでニューロン細胞を含んでいた。一方、非パルス処理対照では１０％未満のコロニーしかＴｕＪ１陽性細胞（即ち、ニューロンになる運命に決定された細胞）を含んでいなかった（図１）。いずれの場合においても、ＴｕＪ１陽性細胞を含む一つのコロニーは、ニューロン分化のための約５００の細胞を含んでいるが、０Ｖと比較して、総計で、１０Ｖ処理ＥＢでは１０倍のニューロン運命出現であった（図１ａ，ｃ）。１０Ｖ処理におけるコロニー内の約半分の細胞が初期の時期に神経運命をとると推量されたけれども、一つのコロニー中でニューロン運命をとっている細胞の正確な比率は正確な様式では計算できなかった。ニューロン運命にある細胞（それは分化の初期で増殖を停止すると推定される）は、同一のコロニー内で１０日間、非特定増殖性細胞と一緒に培養され、従って、これらの増殖性集団の少数が多数をとることができる。
【００５７】
５Ｖの電位では、コロニーの約４０％がＴｕＪ１陽性細胞を含んでいるが、ニューロン細胞の出現総数は、１０Ｖパルス処理ＥＢとほとんど同じであるようである（図１ａ−ｄ）。それは各々のコロニーにおけるニューロン細胞出現が５Ｖでは１０Ｖより２倍高いことを示している。２０Ｖのパルスは細胞に幾分毒性があるようであった。これらの細胞はＴｕＪ１を発現するが、それらの細胞体は奇妙な形態を示し、太い樹状突起を持っていた。
【００５８】
興味あることに、筋肉運命の細胞は、５Ｖ処理ではわずかな増加傾向が観察されたものの、出現の有意な増加を示さなかった（図１ｂ，ｄ）。このことは、パルスの効果は分化運命間で明瞭に区別可能であり、細胞の分化がニューロンの方向へ強く調節されたことを示している。
【００５９】
（２）電気パルスそれ自身は分化を開始させる因子ではなく、むしろ、分化開始細胞の方向を調節する因子である。分化過程を開始した細胞へそれが適用された場合にのみ、細胞の運命を調節する効果を持っている。しかしながら、特異的ニューロン細胞型の最終分化指標でありうるチロシン−ヒドロキシラーゼ、ＧＡＤ６５、Ｉｓｌｅｔ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ７、ＭＮＲ２およびＮｋｘ２．２（データは示されていない）のような分化マーカーがこのエクスビボ系では検出されなかったことは注目に値する。これらの観察は、出現したＴｕＪ１陽性細胞がこの培養系では最終分化へ到達できなかったことを示唆している。
【００６０】
（３）運命決定を調節する機構に関し情報を得るため、最初に、トリパンブルー染色を用い、電気パルスによる細胞膜の孔形成を試験した。細胞にトリパンブルーを含む試薬内で電気パルスをかけた。以下の分化実験で使用された条件である５および１０Ｖパルスでは青い染色は観察されなかったが、一方、２０Ｖは細胞の染色を示した（データは示されていない）。これらの実験はエレクトロポレーションの場合（データは示されていない）と異なり、細胞膜に孔を作製するにはあまりにも弱いものであるので、電気パルスによる調節効果が膜孔形成によるイオン流出または流入のせいではないことを示している。
【００６１】
（４）コロニーの形状に関する観察では、細胞の解離もまた重要な因子の一つでありうる。ニューロン細胞を含んでいないコロニーはきっちりした丸い形を持っているが、一方、ＴｕＪ１陽性細胞を含んでいるコロニーはむしろ分散されていた。しかしながら、電気パルスなしの解離されたＥＢはニューロン分化の出現において何の相違も示さないので、解離は重要な要素の一つではあるものの（データは示されていない）、鍵となる因子ではないと結論した。
【００６２】
（５）分化しつつあるＥＳ細胞からのニューロン前駆体細胞形成に関する我々の観察に対応して、成長因子の適用、例えば、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）の存在並びに続いてのＦＧＦ２の排除、がニューロン前駆体細胞の最終分化に必要とされている（非特許文献６）。前述したように、本実施例の分化ニューロン細胞は、運動ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロンのようなニューロン組織の細胞型を示す特定のマーカーを発現しない。これらの結果から、二つの可能性が生じる。第一に、これらのニューロン細胞は我々のマーカーレパートリー以外のニューロン独自性を持っているか、または、それらはむしろ若く順応性のあるニューロン前駆体“可塑性”細胞である。細胞運命決定に影響を持つと通常信じられているＳｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、ＢＭＰ、ＦＧＦおよびＮｏｇｇｉｎのようないくつかの成長因子に対するさらなる暴露は、これらのパルス処理ＥＢに対して何の影響も与えなかった。本実施例の分化ニューロン系において、ニューロン系列細胞は単一の因子の適用により特定の最終分化としての応答は示さなかったが（データは示されていない）、これらの環境因子はインビトロならびにインビボでの最終的分化のために必須な鍵であろう。
【００６３】
実施例２  胚への電気パルス処理ＥＳ細胞のニューロン寄与
（１）実施例１のエクスビボ実験では、生じたニューロン前駆体細胞は成長因子に対して幾分応答性がないように見えたことを示唆した。これらの細胞の生物学的能力を試験するため、処理または非処理ＥＳ細胞を種々の段階のマウス胚へ注入した。
【００６４】
具体的には、１０Ｖパルス処理Ｖｅｎｕｓ陽性胚様体（ＥＢ）をトリプシン−ＥＤＴＡで３分間解離させた。解離細胞はＣ５７ＢＬ／６胚盤胞内へ注入した。生じた胚は免疫組織化学のため、Ｅ１１．５またはＥ１３．５にて、４％ホルムアルデヒドを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で固定した。
【００６５】
１２の胚および１５の胚が、各々、１０Ｖのパルス処理および非処理対照細胞の胚盤胞への注入から回収された。蛍光およびまたＧＦＰ抗体で細胞運命を追跡するため、これらのアッセイではＶｅｎｕｓ（ＥＹＦＰ誘導体）の遍在性発現を持つＥＳ細胞株（非特許文献９）が使用された。
【００６６】
ＬＣＶＬ１０と称される本来のＥＳ細胞株は胚様体および新生児体への等しい寄与を示した。これに対し、驚くことに、電気処理細胞では、１１ｄｐｃ（ｄａｙ  ｐｏｓｔ  ｃｏｉｔｕｍ）の９つ、および１３ｄｐｃの３つの胚が回収され、それらは神経組織内へ取り込まれる明瞭な傾向を示した。５つの胚（１１ｄｐｃからの４つ、および１３ｄｐｃからの１つの胚）はお互いに極めて類似しており、体の背側、即ち中枢神経系（ＣＮＳ）への蛍光細胞の主な寄与（図３）、ならびに末梢神経（ＰＮＳ）を含む他の組織への副次的分布を示している。１１ｄｐｃからの他の２つはＰＮＳでのわずかな寄与を示し、１３ｄｐｃからの１つは強い心臓への寄与ならびに副次的なＰＮＳ寄与を持っていた。
【００６７】
非パルス処理ＥＢが胚盤胞へ注入された場合、１１ｄｐｃの１０、および１３ｄｐｃの５つの胚が回収された。半分以上の場合で胚様体への特有の寄与を示した処理ＥＢの場合と対照的に、非処理ＥＢは胚様体への低い効率での寄与を示した。１１ｄｐｃおよび１３ｄｐｃからの各々の一つの胚は、胚様体のみでなく、本来のＥＳ細胞株で観察されたように、卵黄嚢のような胚様体外での遍在性寄与も示した（図３）。他の２つの標本は胚様体内での特別の寄与なしで、卵黄嚢での強い蛍光を示した。
【００６８】
これらの一連の実験において、パルス処理ＥＢからの細胞は、非パルス処理細胞よりも胚様体、特にニューロン組織へ寄与することに強い傾向を示した。
【００６９】
（２）ＥＳ由来注入細胞の細胞型を明らかにするため、回収された胚を、切片中で方法の欄に記載したいくつかの抗体で染色した。
【００７０】
その結果、横断面内で、ＧＦＰ陽性ＥＳ由来細胞はニューロン組織への明瞭な偏向を示した。ＣＮＳで検出されたこれらの細胞はニューロン同一性を示し、ＧＦＰおよびＴｕＪ１、Ｉｓｌｅｔ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ７およびＭＮＲ２遺伝子産物に対する抗体（非特許文献１０）で同時染色された（図４−５）。これらの結果は、培養系において、Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ等の運動ニューロン分化のための試薬は明瞭な同一性を持つニューロンを誘導することはしなかったが、ニューロン特異性にかかわらず、これらの細胞は少なくとも適切な機能性ニューロンへ分化できることを示唆している。
【００７１】
従って、この方法で産生された細胞は、生きている身体環境内で正常ニューロン細胞へ分化する可能性を持っていることは明らかである。いくつかの胚では、細胞の組み込みが、むしろ運動ニューロンおよび介在ニューロンを含む腹側脊髄への傾向を持っていたが、これらの細胞は背腹軸を横切って基本的にすべての型のニューロン運命をとることができる（図４−５）。これらの細胞はまた、それらの前後方向同一性にかかわらず、前脳、後脳、脳幹または脊髄を構築した（図４−５）。
【００７２】
これらのことを一緒にすると、我々のデータは、電気パルス処理ＥＢは第一にニューロン細胞の初期段階に帰することができることを示唆している。さらに、それらははめ込まれた環境に応じて、任意のニューロン特異性に寄与する可塑性を持っているようであり、部分的に、移植環境に応答してコリン作動性ニューロンを与える神経幹細胞での報告（非特許文献１１）に類似している。
【００７３】
実施例３ 成体ニューロン組織の形成
（１）電気パルス処理ＥＢがニューロン組織内へ寄与する能力を持っているかどうかを決定するため、受容体として成体損傷脊髄を使用し、電気パルス処理ＥＢの計画的注入をさらに実施した（図６）。本発明は、運動機能不全を回復する新たな可能性を生じさせうる。
【００７４】
脊椎損傷マウスを作るため、成体１２９ＳｖＥｖマウスをペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ，ｉｐ．）で麻酔し、Ｔ１３−Ｌ２レベルの脊髄を分銅落下衝撃にかけた。１０日後、衝撃損傷マウスにＶｅｎｕｓ陽性ＥＢの移植を行った。ＥＢはＬ１レベルの損傷脊髄内へ注入した。移植２０日後、切片を免疫組織化学のために処理した。すべてのマウスは研究所ガイドラインに従ってＲＩＫＥＮ−ＢＳＩの動物施設で維持された。
【００７５】
（２）図９に示した足跡からも理解されるように、処理ＥＢを受けた損傷マウスのすべてが、運動機能の回復を示し、２０日以内に正常に歩くことができるようになった（図９ａ）一方、非処理対照は足を引きずったままであり、回復を示さなかった（図９ｂ）。
【００７６】
（３）注射２０日後に、移植した受容体脊髄のニューロンマーカー発現を分析した（図７−８）。ニューロン前駆体を同定するためのいくつかのマーカーを使用することにより、ＧＦＰ抗体により検出されたこれらのＶｅｎｕｓ発現細胞は、神経膠線維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）陽性アストロサイト、ミエリン付随糖蛋白質（ＭＡＧ）陽性オリゴデンドロサイトならびにＴｕＪ１陽性ニューロンを伴うことができることが示された（図７ａ−ｏ）。本実施例ではさらに、脊髄運動ニューロンのマーカーとして知られているＩｓｌｅｔ１（非特許文献１２）も検出した（図８ａ−ｄ）。このように、電気パルス処理ＥＢは脊髄組織にかなりよく寄与した。
【００７７】
（４）これに対し、非パルス処理ＥＢは移植領域で凝集した細胞塊を形成した。これらのＶｅｎｕｓ陽性細胞塊はＴｕＪ１、ＧＦＡＰおよびＭＡＧのいずれも発現せず、ニューロン組織から排除されているようにさえ思えた（図１０）。また、リン酸化ヒストンＨ３は、これらの細胞塊では検出されず、これらの細胞は増殖を停止していることを示唆している（データは示されていない）。神経幹細胞および胚性幹細胞の移植実験のほとんどにおいて、それらの細胞はほとんどグリアになる運命で分化し、非常に少しの割合の細胞がニューロン系列に寄与することが報告されている（非特許文献１３）。
【００７８】
これらの発見は、ＥＢは電気パルスへの暴露によりニューロン前駆細胞へ特徴付けられるようであり、これらの電気パルス処理ＥＢは移植領域により供給される環境因子に応答して、少なくとも運動ニューロンへの最終分化をとることができることを示している。
【００７９】
実施例４  微小電極を用いたＥＳ細胞の神経分化
微小電極（ネッパジーンのＣＵＹ４５９Ｇ２０）を用いて、ＥＢを処理し、実施例１と同様に細胞運命決定を調べた。Ｒ１  ＥＳ細胞（マウントシナイ病院、Ａｎｄｒｅａｓ  Ｎａｇｙ博士より入手）を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で細胞非付着性ペトリディッシュで培養しＥＢを作製した。それらのＥＢは、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地、またはＨａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍで電気パルスをかけた。電気パルスの強度は３０Ｖ、０．２Ａ（６Ｗ）であった。その後付着性ディッシュにおいて細胞を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地、またはＨａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍで培養した。その結果、ＥＢの神経分化が観察された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、培養系における、分化しているＥＳ細胞に対する電気パルスの影響を示す。図１ａ及びｂは各々、ニューロン同一性（ａ）および筋肉マーカーを発現している（ｂ）細胞を含んでいるコロニーの出現割合を示す。図１ｃ及びｄは各々、ニューロンマーカー（ｃ）および筋肉マーカー（ｄ）陽性の一つのコロニー中における細胞数を示す。
【図２】図２は、培養系における、分化しているＥＳ細胞に対する電気パルスの影響を示す。
図２ａ−ｃは、非パルス処理対照胚様体（ＥＢ）の様相を示す。少数のものがＴｕＪ１陽性細胞の含有を示しているが（図２ｃ）、大多数のコロニーはＴｕＪ１陽性細胞を含んでいない（図２ａ）。図２ａに示されたＥＢの核染色は細胞の密度を伝えている。図２ｄ−ｈは、電気パルス処理ＥＢの様相を示す。５Ｖ（図２ｄ）、１０Ｖ（図２ｅ）および２０Ｖ（図２ｆ）で処理されたＥＢにおける抗−ＴｕＪ１に対する免疫染色が示されている。図２ｇは、１０Ｖ処理ＥＢのＴｕＪ１抗体染色のより大きな倍率である。図２ｈは、１０Ｖ処理ＥＢの抗−α−アクチン染色を示す。図２ｉは、核染色は細胞の存在を示す。図２ｊは図２ｈに示された１０Ｖ処理ＥＢの抗−ＴｕＪ１染色はＥＳ細胞のニューロン分化の徴候がないことを示している。核染色はヨウ化プロピオジウムにより実施された。
縮尺線は１ｍｍ（ａ−ｃ）、１００ｍｍ（ｄ−ｆ、ｈ）、５００ｍｍ（ｇ）および２００ｍｍ（ｉ、ｊ）を示している。
【図３】図３は、Ｖｅｎｕｓ陽性ＥＳ細胞に対する受容体胚の全組織標本像を示す。１１ｄｐｃ胚は上段パネルに示されており、１３ｄｐｃ胚は下段である。両方のパネルにおいて、胚盤胞段階で、左側のものは電気処理ＥＳ細胞を受けており、右側のものは非処理ＥＳ細胞の受容体であった。左のものは両方とも体の背側（神経系）での蛍光分布の明瞭な傾向を持っており、一方、右側の胚はむしろ蛍光細胞の遍在的分布を示した。
【図４】図４は、マウス胚内の電気処理ＥＳ細胞の分布を示す。
中枢神経系における蛍光ＥＳ細胞の細胞型を試験するため、１１ｄｐｃ胚を切片標本にした。脳（ａ−ｃ）および脊髄（ｄ−ｇ）ニューロン中へのＥＳ細胞の取り込みが示されている。緑色蛍光はＶｅｎｕｓを発現している抗ＧＦＰ陽性細胞を示しており（ａ、ｃ、ｄ、ｇ）、赤は分化したニューロン同定のためのＴｕＪ１陽性細胞であり（ｂ、ｅ、ｇ）、および青は細胞の存在を示しているＴｏｐｒｏ３による核染色である（ｆ、ｇ）。縮尺線は５００μｍ（ａ−ｃ）及び２５０μｍ（ｄ−ｇ）を示している。
【図５】図５は、マウス胚内の電気処理ＥＳ細胞の分布を示す。
中枢神経系における蛍光ＥＳ細胞の細胞型を試験するため、１１ｄｐｃ胚を切片標本にした。脊髄（ａ−ｏ）ニューロン中へのＥＳ細胞の取り込みが示されている。緑色蛍光はＶｅｎｕｓを発現している抗ＧＦＰ陽性細胞を示しており（ａ、ｃ）、赤は分化したニューロン同定のためのＴｕＪ１陽性細胞であり（ｂ、ｃ）青は細胞の存在を示しているＴｏｐｒｏ３による核染色である（ｃ）。
ｄ−ｏ、ＥＳ細胞が運動ニューロン、介在ニューロンまたはそれらの前駆体を含む、種々の型のニューロンへ分化したことを示す、寄与ＥＳ細胞特異性の詳細な分析を示しているパネル。緑のシグナルは同様にＧＦＰ陽性細胞を示している。赤いシグナルはＰａｘ６（ｅ、ｆ）、Ｐａｘ７（ｈ、ｉ）、ＭＮＲ２（ｋ、ｌ）およびＬｉｍ３（ｎ、ｏ）を示している。
縮尺線は１００μｍ（ａ−ｃ）および１００μｍ（ｄ−ｏ）を示している。
【図６】図６は、衝撃損傷プロトコールのスキームを示す。椎骨の剥奪後、Ｔ１３−ｌ２に対応する脊髄を分銅落下衝撃損傷にかけた。この処置をして１０日後、処理および非処理ＥＳ細胞を注入した。
【図７】図７は、成体損傷脊髄におけるＥＳ細胞の寄与を示す。切片はＥＳ細胞がＴｕＪ１陽性ニューロン細胞（ａ−ｅ）、ＧＦＡＰ陽性グリア細胞（ｆ−ｊ）、ＭＡＧ陽性オリゴデンドロサイト（ｋ−ｏ）へ分化したことを示している。
ａ、ｆ、ｋ、ヘマトキシリン−エオシン染色。すべてのパネルの緑色シグナルはＧＦＰであり、赤色シグナルはＴｕＪ１（ｂ、ｃ、ｅ）、ＧＦＡＰ（ｇ、ｈ、ｊ）及びＭＡＧ（ｌ、ｍ、ｏ）に対する抗体染色を示している。
縮尺線は５００ｍｍ（ａ、ｆ、ｋ）、２００ｍｍ（ｂ、ｇ、ｌ）、２０ｍｍ（ｃ−ｅ、ｈ−ｊ、ｍ−ｏ）を示している。ｂ、ｇ及びｌに示されている白い矩形は、各々ｃ−ｅ、ｈ−ｊ及びｍ−ｏのより大きな倍率においての領域を示している。
【図８】図８は、成体損傷脊髄におけるＥＳ細胞の寄与、特に、Ｉｓｌｅｔ−１陽性運動ニューロンへ分化したＥＳ由来細胞を示す。すべてのパネルの緑色シグナルはＧＦＰであり、赤色シグナルはＩｓｌｅｔ−１（ａ、ｃ、ｄ）に対する抗体染色を示している。縮尺線は４００ｍｍ（ａ−ｃ）及び５０ｍｍ（ｄ）を示している。ｃに示されている白い矩形はｄのより大きな倍率においての領域を示している。
【図９】図９は、成体損傷脊髄におけるＥＳ細胞の寄与、特に、電気処理ＥＳ細胞のマウスにおける運動機能障害の回復効果を示す。図９のマウスの足跡に示されるように、電気処理ＥＳ細胞の受容体マウスは運動機能障害を回復し、正常移動活性を示したが（ａ）、一方、非処理ＥＢが注入された対照マウスは回復の徴候を示さなかった（ｂ）。
【図１０】図１０は、非パルス処理ＥＢは細胞塊を作り、脊髄組織へ寄与するために分散しなかった、ことを示す。ａ、ヘマトキシリン−エオシン染色。すべてのパネルの緑色シグナルはＧＦＰであり、赤色シグナルはＴｕＪ１（ｂ）、ＧＦＡＰ（ｃ）及びＭＡＧ（ｄ）に対する抗体染色を示している。縮尺線は２００ｍｍを示している（ａ−ｄ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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