(57)【要約】【課題】　新形成疾患の診断及び治療のための方法及び組成物、特に、慣用の抗新形成化学療法の典型である非−新形成細胞の不所望の殺生を伴なわずに新形成細胞を選択的に除去する方法についての、本分野における必要性。【解決手段】　細胞集団内で新形成細胞を排除するための方法であって：　感染条件下、（１）機能的腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合することができる発現ウイルス癌タンパク質を欠く組換え体複製欠陥アデノウイルスを、（２）ウイルス癌タンパク質と結合複合体を形成することができる上記機能的腫瘍サプレッサー遺伝子産物を含む非−新形成細胞及び上記機能的腫瘍サプレッサー遺伝子産物を欠く新形成細胞を含んで成る細胞集団に、接触させ、それにより、感染細胞集団を生成する、段階を含んで成る方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬としてデリバリー可能な形態で、機能的腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合することができる発現ウイルス癌タンパク質を欠く組換え体複製欠陥アデノウイルスの治療的有効投与量を含む、新形成疾患の治療のための抗新形成組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、新形成（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）哺乳動物細胞内で複製し、そして／又は後期領域遺伝子を発現することができるが、非−新形成細胞内で本質的に複製できない組換え細胞障害ウイルス（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｖｉｒｕｕｓｅｓ）の組成物、このような組換えウイルスを構築し、そして増殖させるための方法、このような組換えウイルスにより新形成疾患を治療する方法、並びにこのような組換えウイルスを含んで成る治療組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
　（背景）
　正常細胞の増殖は、成長−束縛性の（ｇｒｏｗｔｈ−ｃｏｎｓｔｒａｉｎｉｎｇ）腫瘍−サプレッサー遺伝子と釣り合った成長−促進性のプロト−オンコジーン（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ）により調節されていると考えられている。プロト−オンコジーンの活性を強化する突然変異は、新形成細胞の成長を駆動するオンコジーンを創り出す。反対に、腫瘍サプレッサー遺伝子を失活させる遺伝子病変は、一般的に、その失活した腫瘍サプレッサー対立遺伝子にホモ接合である細胞を導く突然変異（単数又は複数）を通じて、これらの遺伝子により課せられた正常な複製の束縛からその細胞を開放することができる。普通には、活性化されたオンコジーン（すなわち、活性な構造又は調節突然変異を含むプロト−オンコジーン）の形成との組み合わせにおける失活した腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、ｐ５３、ＲＢ、ＤＣＣ、ＮＦ−１）は、本質的に束縛されない成長が可能な新形成細胞（すなわち、形質転換細胞）を産生することができる。
【０００３】
　細胞のオンコジーン形質転換は、細胞の代謝、生理、及び形態における多くの変化を導く。オンコジーンにより形質転換された細胞の１つの特徴的な変化は、細胞−成長調節遺伝子の適正な発現により正常に課せられた細胞増殖及び分化についての束縛に対する応答の損失である。
【０００４】
　様々なタイプの遺伝子変化は全て、細胞−成長調節遺伝子の変更された発現又は働き及び異常成長を導くことができるけれども、１以上の事件が悪性細胞への正常細胞の新形成形質転換を導くために必要であるということが一般的に信じられている（Ｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ　３０４：５９６；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ　ＲＡ（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４９：３７１３）。ほとんどの細胞タイプについて悪性形質転換を導く正確な分子経路及び二次的な変化は、明らかでない。推定の細胞−サイクル制御機能をもち、そして／又は機能転写の複合体の形成に含まれる幾つかのタンパク質、例えば、ｐ５３及びＲＢの変更された発現又は活性が細胞内の増殖制御の損失を導くことができる多数の事件が報告されている（Ｕｌｌｒｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５２５９；Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５３：４９；Ｓａｇｅｒ　Ｒ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５５；Ｌｅｖｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５１：４５３）。
【０００５】
　いくつかのオンコジーンが、特定の癌のかなりのフラクション内に特徴的な活性な突然変異を有していることが見いだされている。例えば、ｒａｓＨ及びｒａｓＫコーディング領域内の特定の突然変異（例えば、コドン１２、コドン１６；Ｐａｒａｄａ　ｅｔ　ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６４９）及びＡＰＣ遺伝子（Ｐｏｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　３５９：２３５）は、培養細胞のオンコジーン形質転換に関係し、そして特定のヒト癌（例えば、結腸腺癌（ｃｏｌｏｎ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膀胱癌、肺癌及び腺癌、悪性肝癌（ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））のかなりのパーセンテージにおいて存在する。これらの発見は、このようなオンコジーンの活性形態（単数又は複数）を特異的に認識する診断及び治療試薬（例えば、ポリヌクレオチド・プローブ及び抗体）の開発を導いた（米国特許第４，７９８，７８７号及び米国特許第４，７６２，７０６号）。
【０００６】
　他のオンコジーン、例えば、ｍｙｃ、ｅｒｂＢ−２、及びｐｉｍ−１　の過剰又は不適当な発現は、そのコーディング領域内の活性突然変異（単数又は複数）の存在を必ずしも必要とせずにオンコジーン形質転換を強化することができるようである。ｅｒｂＢ−２の過剰発現は、胸、胃、及び卵巣の腺癌においてしばしば見いだされ、そしてこれらの細胞タイプにおけるｅｒｂＢ−２レベルは、新形成についての診断マーカーとして役立つことができるかもしれず、そして／又は特異的な腫瘍表現型（例えば、特定の医薬、成長速度、分化状態に対する抵抗性）と相関することができる。
【０００７】
　様々なオンコジーン（米国特許第４，７３６，８６６号及び米国特許第５，０８７，５７１号）又は機能的に破壊された腫瘍サプレッサー遺伝子（Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　３５６：２１５）を宿すトランスジェニッック動物が、発癌物質スクリーニング検定における使用、とりわけ他の潜在的な用途について記載されている。
【０００８】
　形質転換された表現型及び新形成の下にある分子機構のより詳細なモデルの開発におけるこの上記進歩にもかかわらず、慣用の化学療法を超える癌の治療に利用可能な重要な治療方法は、ほとんどもたらされなかった。多くの慣用の化学療法剤は、低い治療指数（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｉｎｄｅｘ）をもち、治療投与量レベルは、毒性を作り出す投与量レベルに又はその付近にある。ほとんどの慣用の化学療法剤の毒性副作用は、不快であり、そして他の副作用の中にあって、致死的な骨髄抑制を導く。
【０００９】
　先天性疾患、例えば、嚢胞性繊維症（ｃｙｓｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を引き起こす欠陥対立遺伝子を矯正し又は補う遺伝子治療を行うための最近のアプローチは、限定された開始の成功の報告をもって達成されている。幾つかの遺伝子治療は、複製−欠陥組換えアデノウイルスを使用してインビボにおける細胞内に欠陥対立遺伝子の機能性コピーを発現することができるポリヌクレオチド配列を形質導入することを含む（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ　６８：１４３）。これらの遺伝子治療法の中の幾つかは、患者から体外移植された単離細胞内にポリヌクレオチドを導入することにおいて有効であるが、インビボにおいて高く有効であることは示されなかった。腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ））及びインターロイキン−２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２（ＩＬ−２））をエンコードするポリヌクレオチドによる体外移植腫瘍細胞のトランスフェクトに頼る癌への治療アプローチが記載されている（Ｐａｒｄｏｌｌ　Ｄ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．４：１１２４）。
【００１０】
　遺伝子治療方法がインビボにおける形質転換細胞内でオンコジーン又は腫瘍サプレッサー遺伝子の欠陥対立遺伝子を矯正するために改良されることが可能であることがいつか証明されることができるであろうが、現在の遺伝子治療の方法は、その場における新形成の実際の遺伝子治療のための十分なパーセンテージの新形成細胞を有効に形質導入し、そして（例えば、相同的組換えにより）正しく標的化することができると報告されていない。癌生物学の性質は、新形成細胞の実質的なフラクション、好ましくは、形質転換された細胞のクローンの子孫の全てが、有効な治療効果について除去されているということを、命令する。その上、現在の遺伝子治療方法は非常に高価であり、患者内への再導入に先立って体外移植された細胞をエクスビボ（ｅｘ　ｖｉｖｏ）において培養することを必要とする。たとえそれらが有効であったとしても、このような方法の広い適用は、極端に高価なものであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
　従って、新形成疾患の診断及び治療のための方法及び組成物、特に、慣用の抗新形成化学療法の典型である非−新形成細胞の不所望の殺生を伴なわずに新形成細胞を選択的に除去する方法についての、本分野における必要性が存在する。本発明は、これらの及び他の必要性を満たす。
【００１２】
　本明細書中に討議する文献は、本出願の出願日の前に単にそれらの開示について提供されている。本明細書中の何も、先の発明によって本発明者らがこのような開示に実際よりも前の日付を付与する資格がないと認めることとして解釈されてはならない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
項目１　細胞集団内で新形成細胞を排除するための方法であって：
　感染条件下、（１）機能的腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合することができる発現ウイルス癌タンパク質を欠く組換え体複製欠陥アデノウイルスを、（２）ウイルス癌タンパク質と結合複合体を形成することができる上記機能的腫瘍サプレッサー遺伝子産物を含む非−新形成細胞及び上記機能的腫瘍サプレッサー遺伝子産物を欠く新形成細胞を含んで成る細胞集団に、接触させ、それにより、感染細胞集団を生成する、
段階を含んで成る方法。
項目２　ウイルス癌タンパク質が、アデノウイルスＥ１ａポリペプチド又はアデノウイルスＥ１ｂポリペプチドである、項目１に記載の方法。
項目３　腫瘍サプレッサー遺伝子産物が、ｐ５３又はＲＢである、項目１に記載の方法。
項目４　新形成細胞が、ｐ５３（−）ＲＢ（−）である、項目１に記載の方法。
項目５　組換え複製欠陥アデノウイルスが、ＲＢに結合することができる　Ｅ１ａポリペプチドをエンコードしておらず、そしてまた、ｐ５３に結合することができるＥ１ｂ　ｐ５５ポリペプチドをエンコードしていない、項目４に記載の方法。
項目６　組換え体複製欠陥アデノウイルスが：Ａｄ５　ＮＴ　ｄｌ　１１１０，Ａｄ５　ｄｌ　１３１２、及びＡｄ２　ｄｌ　１５２０から成る群から選ばれる、項目１に記載の方法。
項目７　新形成細胞及び非−新形成細胞を含んで成る細胞集団が、哺乳動物中に存在し、そして接触段階が、個体に組換え体複製欠陥アデノウイルスを投与することによりインビボにおいて行われる、項目１に記載の方法。
項目８　哺乳動物が、ヒトである、項目７に記載の方法。
項目９　組換え体複製欠陥アデノウイルスが、ｐ５３機能、ＲＢ機能、又はｐ５３機能とＲＢ機能の両方を欠いた新形成細胞内で感染性ビリオンを形成するように複製されることができる、項目１に記載の方法。
項目１０　新形成細胞内で形成された感染性ビリオンが、患者内でインビボにおいて隣接細胞に拡がり、かつ、それに感染することができる、項目９に記載の方法。
項目１１　組換え体複製欠陥アデノウイルスが、ヒト患者の新形成細胞内での感染性ビリオンの形成について非複製性である、項目１に記載の方法。
項目１２　組換え体複製欠陥アデノウイルスが、Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異体である、項目１に記載の方法。
項目１３　ヒトにおける新形成症状の治療方法であって、機能的腫瘍サプレッサー遺伝子産物を欠く新形成細胞を含んでなる新生物をもつヒト患者に、治療的有効投与量の組換え体複製欠陥アデノウイルスを含んで成る組成物を投与することを含んで成るような方法。
項目１４　腫瘍サプレッサー遺伝子産物が、ｐ５３又はＲＢである、項目１３に記載の方法。
項目１５　腫瘍サプレッサー遺伝子産物が、ｐ５３であり、そして組成物が、Ｅ１ｂ−ｐ５３（−）複製欠陥アデノウイルスである組換え体複製欠陥アデノウイルスを含んで成る、項目１４に記載の方法。
項目１６　腫瘍サプレッサー遺伝子産物が、ＲＢであり、そしてＥ１ａ−ＲＢ（−）複製欠陥アデノウイルスである組換え体複製欠陥アデノウイルスを含んで成る、項目１４に記載の方法。
項目１７　組成物が、Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異複製欠陥アデノウイルスである組換え体複製欠陥アデノウイルスを含んで成る、項目１４に記載の方法。
項目１８　組成物が、Ｅ１ａ−ＲＢ（−）複製欠陥アデノウイルス、Ｅ１ｂ−ｐ５３（−）複製欠陥アデノウイルス、及びＥ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異体複製欠陥アデノウイルスから成る群から選ばれ、そしてさらにウイルス・プロモーターに作用可能な状態で結合された負の選択遺伝子を含んで成る組換え体複製欠陥アデノウイルスを含んで成る、項目１４に記載の方法。
項目１９　ウイルスが、Ａｄ５　ＮＴ　ｄｌ　１１１０，Ａｄ５　ｄｌ　１３１２、及びＡｄ２　ｄｌ１５２０から成る群から選ばれる、項目１８に記載の方法。
項目２０　新形成疾患の治療のための抗新形成組成物であって、Ｅ１ａ−ＲＢ（−）複製欠陥アデノウイルス、Ｅ１ｂ−ｐ５３（−）複製欠陥アデノウイルス、及びＥ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異体複製欠陥アデノウイルスから成る群から選ばれる組換え複製欠陥アデノウイルスの治療的有効投与量を、医薬としてデリバリー可能な形態で含んで成る組成物。
項目２１　ｐ５３及び／又はＲＢを隔離し又は分解する能力を欠いた組換え複製欠陥ウイルスの有効投与量を、新生物をもつ患者に投与することを含んで成る新形成症状の治療方法。
項目２２　ウイルスが、アデノウイルス、乳頭腫ウイルス、及びポリホーマウイルスから成る群から選ばれている、項目２１に記載の方法。
項目２３　ウイルスが、Ｅ６遺伝子又はＥ７遺伝子内に突然変異を含んで成るヒト乳頭腫ウイルスである、項目２２に記載の方法。
【００１４】
　（本発明の要約）
　本発明は、非−新形成細胞内で実質的に複製欠陥であり、そして新形成細胞内で少なくとも部分的な複製表現型を示す組換えアデノウイルスにより新形成細胞を感染させることにより新形成細胞を除去するための幾つかの新規の方法及び組成物を、提供する。新形成と非−新形成細胞内での本発明に係るアデノウイルス構築物の複製表現型における差異は、癌のウイルス−ベースの治療のための生物学的基礎を提供する。アデノウイルス細胞障害効果の発現、及び場合により負の−選択性薬剤遺伝子（例えば、ＨＳＶ　ｔｋ）の発現は、本発明の組換えアデノウイルス構築物により感染された新形成細胞のアデノウイルス複製表現型特性により関連付けられ、これ故、新形成と非−新形成細胞との間を区別し、そして新形成細胞の選択性細胞毒性を提供する。本法は、特にアデノウイルス構築物について詳細に記載されているけれども、本法は、効率的な複製が、非−新形成細胞内に存在するが新形成細胞内では実質的に非存在であり又は非機能性である宿主細胞タンパク質（例えば、ｐ５３、ＲＢ）の結合及び／又は隔離及び／又は失活を必要とするような本質的にいずれかのウイルス・タイプに利用可能であると信じられる。
【００１５】
　アデノウイルスが細胞内で効率的に複製するために、アデノウイルスＥ１ｂ遺伝子生成物、ｐ５５は、宿主細胞のｐ５３タンパク質と複合体を形成し、それにより、ｐ５３を隔離及び／又は失活させ、そしてｐ５３において欠陥のある細胞を作り出す。ｐ５３機能において欠陥にされたこのような細胞は、アデノウイルスの複製を支援することができる。この方法で、野生型アデノウイルスは、ｐ５３を含む細胞内で複製することができる。なぜなら、アデノウイルスｐ５５タンパク質が宿主細胞のｐ５３タンパク質を失活させ、そして／又は隔離するからである。本発明の１つの態様においては、感染された細胞内でｐ５３タンパク質との機能性複合体を実質的に形成することができない突然変異体のｐ５５タンパク質をエンコードしているＥ１ｂ座を含んで成る組換えアデノウイルスが、その組換えアデノウイルスにより感染されることができる新形成細胞を含んで成る個体又は細胞集団に投与される。感染された非−新形成細胞内で効率的にｐ５３タンパク質を隔離する組換えアデノウルスルの実質的な非能力は、導入された組換えアデノウイルスのポリヌクレオチド（単数又は複数）が非−新形成細胞内で複製表現型を発現することができないということをもたらす。反対に、機能性ｐ５３タンパク質を欠いた新形成細胞は、アデノウイルスの細胞障害効果による新形成細胞の除去を導く導入された組換えアデノウイルスによる複製表現型の発現及び／又は複製表現型に結合した負の選択遺伝子の発現を支援する。これらの態様の好ましい変種においては、組換えアデノウイルスは、ｐ５３を実質的に結合することができず、そして場合により機能性ｐ１９タンパク質をも欠くことができる（すなわち、Ｅ１ａポリペプチドの存在中でアデノウイルスの初期領域遺伝子の発現を阻害することができない）突然変異体ｐ５５をエンコードしているＥ１ｂ座を含んで成る。本発明の組換えアデノウイルスは、さらに、強化された細胞障害効果を作り出す突然変異体ｐ１９遺伝子を含んで成ることができ；本分野において公知のこのような突然変異体は、ｐ１９　ｃｙｔ突然変異体遺伝子である。しかしながら、感染の間のウイルスＤＮＡの完全性を維持するために幾つかの突然変異体内で機能性ｐ１９を保持することが好ましくあることができる。
【００１６】
　本発明の他の態様においては、感染された細胞内でＲＢタンパク質との複合体を実質的に形成することができないＥ１ａタンパク質（例えば、ｐ２８９Ｒ又はｐ２４３Ｒ）をエンコードしているＥ１ａ座を含んで成る組換えアデノウイルスが、その組換えアデノウイルスにより感染されることができる新形成細胞を含んで成る個体又は細胞集団に投与される。感染された非−新形成細胞内で効率的にＲＢタンパク質を隔離するその組換えアデノウイルスの実質的な非能力は、その導入された組換えアデノウイルス・ポリヌクレオチド（単数又は複数）が非−新形成細胞内で複製表現型を発現することができないということをもたらす。反対に、機能性ＲＢタンパク質を欠いた新形成細胞は、アデノウイルスの細胞障害効果による新形成細胞の除去を導く導入された組換えアデノウイルスによる複製表現型の発現及び／又は複製表現型に結合した負の選択遺伝子の発現を支援する。これらの態様の好ましい変種においては、組換えアデノウイルスは、ＲＢ（及び／又はその３００ｋＤポリペプチド及び／又はその１０７ｋＤ　ポリペプチド）に結合することができるＣＲ１及び／又はＣＲ２ドメインを欠いているが、アデノウイルスの初期遺伝子のトランス作用（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させることができる機能性ＣＲ３ドメインを含んで成る突然変異体Ｅ１ａタンパク質（例えば、ｐ２８９Ｒ）をエンコードしているＥ１ａ座を含んで成る。これらの態様のさらなる変種は、その組み合えアデノウイルスが、ＲＢに結合し且つこれを失活させるタンパク質を実質的に発現することができず、そして場合により、機能性ｐ１９タンパク質をも含んで成ることができる（すなわち、Ｅ１ａ機能の非存在中でアデノウイルスの初期領域遺伝子の発現を刺激することができる）非機能性Ｅ１ａ座を含んで成るようなものを含む。本発明の組換えアデノウイルスは、強化された細胞障害効果を作り出す突然変異体ｐ１９遺伝子を、さらに含んで成ることができ；本分野において公知のこのような突然変異体は、ｐ１９　ｃｙｔ　突然変異体遺伝子である。
【００１７】
　本発明は、非−新形成細胞内で複製欠陥であるが、機能性ｐ５３及び／又はＲＢを欠いた新形成細胞内で複製表現型を発現することができる新規の組換えアデノウイルス構築物を提供する。新規の組換えアデノウイルス構築物は、Ｅ１ａ及び／又はＥ１ｂ遺伝子領域内に、特に、Ｅ１ｂ　ｐ５５タンパク質をエンコードしている配列並びにＥ１ａ　ｐ２８９Ｒ又はｐ２４３Ｒ　タンパク質のＣＲ１及びＣＲ２ドメイン内に、突然変異、例えば、欠失又は点突然変異を含んで成る。幾つかの態様においては、負の選択遺伝子（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ　ｇｅｎｅ）、例えば、ＨＳＶ　ｔｋ遺伝子が、その負の選択遺伝子が、複製表現型を発現する感染細胞（すなわち、新形成細胞）内で優先的に転写され、そして負の選択剤（例えば、ガンシクロビル、ＦＩＡＵ）の有効投与量の投与によりこのような細胞の負の選択を提供するように、Ｅ１ａ又はＥ１ｂ　突然変異をも含んで成る組換えアデノウイルス構築物内で、初期領域（例えば、Ｅ２、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ）エンハンサー／プロモーター、後期領域遺伝子エンハンサー／プロモーター（例えば、主要後期プロモーター）、あるいはＣＭＶ　エンハンサーを含む初期又は後期領域プロモーター、に作用可能な状態で結合される。負の選択遺伝子は、Ｅ１ａ及び／又はＥ１ｂ構成配列の代わりに挿入されることができ、それぞれ、Ｅ１ａ（−）複製欠陥突然変異体、Ｅ１ｂ（−）複製欠陥突然変異体、又はＥ１ａ／Ｅ１ｂ二重突然変異体を、同時に形成する。
【００１８】
　インビボにおける新形成細胞集団へのデリバリーのための医薬として許容される形態におけるこのような組換えアデノウイルスを含んで成る抗新形成組成物も提供される。
【００１９】
　本発明は、ｐ５３及び／又はＲＢに結合し及び／又はこれを失活するための機能性タンパク質を欠いた、組換えパポバウイルス（ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓｅｓ）、例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ）（例えば、ＢＫ、ＪＣ）及びＳＶ４０をも、提供する。機能性Ｅ６タンパク質の発現を欠いたヒト乳頭腫ウイルス突然変異体は、ｐ５３を効率的に分解する能力を実質的に欠くであろうし、そしてそれ故、十分なレベルの機能性ｐ５３を含む細胞内ではなくｐ５３（−）細胞内で複製表現型を顕出することができるであろう。機能性Ｅ７タンパク質の発現を欠いたヒト乳頭腫ウイルス突然変異体は、ＲＢに効率的に結合する能力を実質的に欠くであろうし、そしてそれ故、十分なレベルの機能性ＲＢを含む細胞内ではなくＲＢ（−）細胞内で複製表現型を顕出することができるであろう。機能性Ｅ６タンパク質と機能性Ｅ７タンパク質の両方の発現を欠いたヒト乳頭腫ウイルス突然変異体は、ＲＢ及びｐ５３に効率的に結合する能力を実質的に欠くであろうし、それ故、十分なレベルの機能性ＲＢ及び／又はｐ５３を含む細胞内ではなくｐ５３（−）ＲＢ（−）細胞内で複製表現型を顕出することができるであろう。
【００２０】
　本発明は、非−新形成細胞集団内での発現と比較したとき、新形成細胞集団内で複製表現型を優先的に発現し、そして／又は細胞障害効果を発現することができる組換えウイルスを患者に投与する段階を含んで成る新形成疾患の新規の治療方法をも提供する。
【発明の効果】
【００２１】
　本発明によって、新形成疾患の診断及び治療のための方法及び組成物、特に、慣用の抗新形成化学療法の典型である非−新形成細胞の不所望の殺生を伴なわずに新形成細胞を選択的に除去する方法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
　（定義）
　特にことわらない限り、本明細書中に使用する全ての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者により一般的に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書中に記載されたものと類似の又は等価な方法及び材料のいずれをも本発明の実施又は試験において使用することができるけれども、その好ましい方法及び材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
【００２３】
　用語”天然の（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｉｎｇ）”とは、本明細書中に使用するとき、対象物に適用するとき、対象物が天然に発見されることができることをいう。例えば、天然の源から単離されることができ、そして実験室内で人により意図的に修飾されていない（ウイルスを含む）生物内に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然である。本明細書中に使用するとき、用語”組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）”は、ポリヌクレオチド構築物（例えば、及びアデノウイルス・ゲノム）が、部分的に、人による意図的な修飾により、生成されていることを示す。
【００２４】
　本明細書中に使用するとき、用語”複製欠陥ウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｖｉｒｕｓ）”とは、ウイルス複製表現型の発現を支援する所定の細胞集団（例えば、ｐ５３及び／又はＲＢ機能を実質的に欠いている細胞）内、並びに非−複製性の非−形質転換細胞に特徴的な正常なｐ５３及びＲＢ機能レベルを含んで成る細胞内で細胞増殖を阻害し、アポプトシスを誘導し、又は複製表現型を発現することが実質的にできない所定の細胞集団内で、細胞増殖を優先的に阻害し又はアポプトシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導するウイルスをいう。典型的には、複製欠陥ウイルスは、正常ＲＢ及び／又はｐ５３機能を含んで成る細胞に対してプラーク形成効率における実質的な減少を示す。
【００２５】
　本明細書中に使用するとき、用語”ｐ５３機能（ｐ５３　ｆｕｎｃｔｉｏｎ）”とは、そのｐ５３ポリペプチドが野生型アデノウイルス２又は５　のＥ１ｂ　ｐ５５タンパク質に結合することができるような、ｐ５３遺伝子によりエンコードされているポリペプチドの本質的に正常なレベル（すなわち、同一の組織学的タイプの非−新形成細胞と比較して）をもつ性質（ｐｒｏｐｅｒｔｙ）をいう。例えば、ｐ５３機能は、ｐ５３の失活（すなわち、突然変異体）形態の産生により又はｐ５３ポリペプチド（単数又は複数）の発現の実質的な減少又は全損失により、失われることができる。また、ｐ５３機能は、野生型ｐ５３タンパク質をエンコードしているｐ５３対立遺伝子を含んで成る新形成細胞内に実質的に非存在であることができ；例えば、ｐ５３座の外側の遺伝子変更、例えば、ｐ５３の異常細胞下プロセシング又は局在化をもたらす突然変異（例えば、その核よりもむしろ細胞質内で優先的にｐ５３の局在化をもたら
す突然変異）は、ｐ５３機能の損失をもたらすことができる。
【００２６】
　本明細書中に使用するとき、用語”ＲＢ機能”とは、そのＲＢポリペプチドが野生型アデノウイルス２又は５　のＥ１ａ　タンパク質に結合することができるような、ＲＢ遺伝子によりエンコードされているポリペプチドの本質的に正常なレベル（すなわち、同一の組織学的タイプの非−新形成細胞と比較して）をもつ性質をいう。例えば、ＲＢ機能は、ＲＢの失活（すなわち、突然変異体）形態の産生により又はＲＢポリペプチド（単数又は複数）の発現の実質的な減少又は全損失により、失われることができる。また、ＲＢ機能は、野生型ＲＢタンパク質をエンコードしているＲＢ対立遺伝子を含んで成る新形成細胞内に実質的に非存在であることができ；例えば、ＲＢ座の外側の遺伝子変更、例えば、ＲＢの異常細胞下プロセシング又は局在化をもたらす突然変異が、ＲＢ機能の損失をもたらすことができる。
【００２７】
　本明細書中に使用するとき、用語”複製表現型（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）”とは、複製欠陥アデノウイルスのようなウイルスにより感染された細胞の１　以上の以下の：（１）後期遺伝子生成物、例えば、キャプシド・タンパク質（例えば、アデノウイルス・ペントン塩基性ポリペプチド）の実質的な発現又はウイルス後期遺伝子プロモーター（単数又は複数）から開始されるＲＮＡ　転写、（２）ウイルス・ゲノムの複製又は複製中間体の形成、（３）ウイルス・キャブシド又は包装されたビリオン粒子のアセンブリー、（４）感染細胞内での細胞障害効果（ＣＰＥ）の出現、（５）ウイルス溶菌サイクルの終了、及び（６）機能性癌タンパク質（単数又は複数）をエンコードしている野生型複製コンピテントＤＮＡウイルスにより感染された非−新形成細胞内でのｐ５３又はＲＢ機能の排除の間に典型的に付随する他の表現型の変更、のような表現型特性をいう。複製表現型は、少なくとも１　の上記列記の表現型特性、好ましくは１以上の上記表現型特性を含んで成る。
【００２８】
　用語”抗新形成複製欠陥ウイルス（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｖｉｒｕｓ）”とは、本明細書中に使用するとき、同一の組織学的細胞タイプの感染非−複製性非−新形成細胞に対して感染新形成細胞の優先的な細胞死により、ヒトにおける新生物の顕出又は進行を阻害する機能的性質をもつ組換えウイルスをいう。
【００２９】
　本明細書中に使用するとき、”新形成細胞（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ）”及び”新形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）”とは、それらが細胞増殖の制御のかなりの損失を特徴とする異常細胞表現型を示すように、比較的自律的な成長を示す細胞をいう。新形成細胞は、活性に複製しているか又は一時的な非−複製休止状態（Ｇ１又はＧ０）にあることができる細胞を含んで成り；同様に、新形成細胞は、よく−分化した表現型、ほとんど−分化していない表現型、両タイプの表現型の混合物をもつ細胞を含んで成ることができる。従って、全ての新形成細胞が、必ずしも、所定の時間点において複製している細胞ではない。新形成細胞として定められたセットは、良性新生物における細胞及び悪性（又は明らかな（ｆｒａｎｋ））新生物から成る。明らかに新形成の細胞は、しばしば、癌（ｃａｎｃｅｒ）といわれ、内胚葉（ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ）又は外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）の組織学的起源の細胞から生じる場合、典型的には、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）といわれ、又は中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ）から誘導された細胞タイプから生じる場合、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）といわれる。
【００３０】
　本明細書中に使用するとき、用語”作用可能な状態で結合された（ｏｐｅｒａｂｌｙ　ｌｉｎｋｅｄ）”とは、機能的な関係におけるポリヌクレオチド要素の結合をいう。核酸は、それが他の核酸配列との機能的な関係に置かれているとき、”作用可能な状態で結合されて”いる。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それがそのコーディング配列の転写に影響を与える場合に、コーディング配列に作用可能な状態で結合されている。作用可能な状態で結合されたとは、結合されているＤＮＡ配列が典型的には隣接し、そして２　つのタンパク質コーディング領域を接続する必要がある場合、隣接し且つ読み取り枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、一般的に、数キロ塩基によりそのプロモーターから隔てられた時に機能し、そしてイントロン配列は様々な長さを有することができるので、幾つかのポリヌクレオチド要素は、作用可能な状態で結合されているが隣接していなくてもよい。
【００３１】
　本明細書中に使用するとき、”生理学的な条件（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）”とは、無傷の哺乳動物細胞内又は生きた哺乳動物の組織空間又は臓器内の条件と実質的に同様なイオン強度、ｐＨ、及び温度をもつ水性環境をいう。典型的には、生理学的条件は、約１５０ｍＭ　ＮａＣｌ（又は場合によりＫＣｌ）、ｐＨ６．５−８．１、及び約２０−４５℃の温度をもつ水性溶液を含んで成る。一般的には、生理学的条件は、生物学的な巨大分子の分子間会合に好適な結合条件である。例えば、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３７℃における生理学的条件が、一般的に、好適である。
【００３２】
　（詳細な説明）
　以下に記載する細胞培養、分子遺伝学、及び分子ウイルス学における、以下に使用する命名法及び実験室手順は、本分野においてよく知られたものであり、そして一般的に使用されている。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、ポリペプチド合成、（複製欠陥ウイルス株をトランス−相補することができる細胞系を含む）ウイルス株の生成及び増殖、細胞培養、等のための標準的な技術が、使用される。一般的な酵素反応及び生成段階が、製造者の仕様書に従って行われる。これらの技術及び手順は、一般的に、本分野における慣用法及び様々な一般的な文献に従って行われる（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｄ　ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ．ｅｄｓ．Ｆｉｅｌｄｓ　ＢＮ　ａｎｄ　Ｋｎｉｐｅ　ＤＭ，（１９９０）Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ（引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）。これらは、本明細書の全体に提供される。この中の手順は、本分野においてよく知られており、そしてその読者の便利のために提供されている。この中に含まれる情報のすべてを、引用により本明細書中に取り込む。
【００３３】
　以下に使用する命名法並びに以下に記載する細胞培養、分子遺伝学、及び分子ウイルス学における実験の手続は、本分野においてよく知られ、かつ、一般的に使用されるものである。標準的な技術は、組換え体核酸法、ポリヌクレオチド合成、ポリペプチド合成、（複製欠陥ウイルス株をトランス相補することができる細胞系を含む）ウイルス株の生成及び増殖、細胞培養、等のために使用される。一般的酵素的な反応及び精製段階を製造者の取扱説明書に従って実施した。これらの技術及び手続は、本分野における慣用法並びに本分野の全体にわたり提供されるさまざまな一般的な文献（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｄ　ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ｆｉｅｌｄｓ　ＢＮ　ａｎｄ　Ｋｎｉｐｅ　ＤＭ，（１９９０）Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）に従って一般的に行なわれる。
【００３４】
　新形成は、変異体遺伝子型及び表現型をもつ新形成細胞の生成を部分的に特徴とする病因症状である。いくつかの腫瘍は、ＲＢ機能を欠いているが　ｐ５３機能を有する細胞の集団を含んで成ることができ；このような細胞はＲＢ（−）と命名される。いくつかの腫瘍細胞は、ｐ５３機能を欠いているがＲＢ機能をもつことができ；このような細胞はｐ５３（−）と命名される。いくつかの腫瘍は、ｐ５３とＲＢの両方を欠く細胞を含んで成ることができ、ｐ５３（−）ＲＢ（−）と命名される。細胞系ＳＡＯＳ２（以下実験の実施例を参照のこと。）は、ｐ５３（−）ＲＢ（−）である新形成細胞型の一例である。また、ｐ５３及びＲＢの本質的に正常なレベルを含んで成る新形成細胞が存在することができ；正常な　ｐ５３及び正常なＲＢの両方をもつこのような細胞は、このような新形成細胞において複製表現型を優位に顕出することができる新新形成ウイルス構築物のための基礎を提供することができる他の癌タンパク質（例えば、ｐ５３又はＲＢ以外の腫瘍サプレッサー遺伝子生産物）を欠くことができる。
【００３５】
　本発明の基礎は、哺乳動物細胞に感染するいくつかのＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス；パポバウイルス、例えばＢＫ及びＪＣ，ＳＶ４０、並びに乳頭腫ウイルス、例えば、ＨＰＶ、等）がそのウイルスの複製サイクルを通しての効率的な発達に本質的であるウイルスのタンパク質をエンコードしているということであり；これらのウイルス・タンパク質のいくつかは細胞タンパク質、例えば、細胞−分裂制御及び／又は効率的なウイルス複製に必要な条件としての、転写複合体の形成に関係するものを隔離する。ｐ５３及びＲＢのような細胞タンパク質に結合し、これを隔離し、又は分解するウイルスタンパク質の非存在中、ウイルス複製は、実質的に阻害される。ｐ５３及び／又はＲＢを隔離し又は分解する能力を欠いた突然変異体ウイルスにより感染された正常な（すなわち、非−新形成の）細胞は、一般的に、その突然変異体ウイルスの複製を支援することができず、これ故に、このような突然変異体ウイルスは、複製欠陥（又は複製欠損）であると考えられる。しかしながら、ｐ５３又はＲＢの隔離又は分解は、機能的なｐ５３又はＲＢを欠いた細胞（このような細胞はそれぞれｐ５３（−）及びＲＢ（−）と命名される。）におけるウイルス複製に必要ではないので、ｐ５３及び／又はＲＢ隔離又は分解について欠損である複製欠陥突然変異体ウイルスが本質的に正常なｐ５３及び／又はＲＢ機能をもつ細胞よりも大きな程度まで、このようなｐ５３（−）又はＲＢ（−）細胞内で複製表現型を発現することができるということが可能である。新形成細胞は、しばしば、ｐ５３機能を欠き（ｐ５３（−）細胞）、ＲＢ機能を欠き（ＲＢ（−）細胞）、又は両方の機能を欠く（ｐ５３（−）ＲＢ（−）細胞）。これ故に、いくつかの複製欠陥ウイルス突然変異体は、新形成細胞において複製表現型を優先的に示すことができる。
【００３６】
　機能的ＲＢ失活タンパク質（例えば、アデノウイルスＥ１ａ，ＨＰＶ　Ｅ７タンパク質）を発現する能力を欠いたウイルス突然変異体は、ＲＢ（−）細胞及びＲＢ（−）ｐ５３（−）細胞内で複製表現型を顕出するであろう。機能的　ｐ５３失活タンパク質（例えば、アデノウイルスＥ１ｂ　ｐ５５，ＨＰＶ　Ｅ６タンパク質）を発現する能力を欠いたウイルス突然変異体は、ｐ５３（−）細胞及びＲＢ（−）ｐ５３（−）細胞内で複製表現型を顕出するであろう。機能的　ｐ５３失活タンパク質（例えば、アデノウイルスＥ１ｂ　ｐ５５，ＨＰＶ　Ｅ６タンパク質）と機能的ＲＢ失活タンパク質（例えば、アデノウイルスＥ１ａ，ＨＰＶ　Ｅ７タンパク質）の両方を発現する能力を欠いたウイルス突然変異体は、ＲＢ（−）ｐ５３（−）細胞内で複製表現型を顕出するであろう。複製表現型の発現に関連する細胞毒性が、それ故に、ＲＢ（−），ｐ５３（−）、又はＲＢ（−）ｐ５３（−）表現型をもつ新形成細胞を優先的に殺生するための基礎として使用されることができる。いくつかの複製性の非−新形成細胞がその細胞分裂サイクルを通じての進行の間にＲＢ（−）表現型、ｐ５３（−）表現型、又はＲＢ（−）ｐ５３（−）表現型を過渡的に示すことができるけれども、本発明に係るウイルス突然変異体は、必らずしも完全に選択的でないにもかかわらず、優先的に、新形成細胞を殺し、それ故に、単独で又は他の治療のモダリティー（様相）との組み合わされて使用されるべき有用な抗新形成療法モダリティーを構築するために、使用されることができる。上記ＨＰＶ　Ｅ７ポリペプチドの３７のアミノ−末端残基内の欠失（又は他の失活突然変異）が、ＲＢ（−）細胞への適用のための好ましいＨＰＶ突然変異体である。なぜなら、これらの残基は、ＲＢ結合のために重要であるからである。
【００３７】
　以下に指示する方法及び組成物は複製欠陥アデノウイルス構築物に関係する方法のために特に記載されているけれども、本発明が、ｐ５３タンパク質又はＲＢタンパク質の分解を隔離し又は強化する癌タンパク質をエンコードしている他の　ＤＮＡウイルス、例えば、複製欠陥乳頭腫ウイルス種（例えば、ＨＰＶ型１６，１８，３３の突然変異体）であって、それぞれｐ５３及び／又はＲＢ機能を実質的に排除するＥ６及び／又はＥ７遺伝子内に突然変異を含むものによって実施されることができると信じられている。アデノウイルス科のメンバー（特にマストアデノウイルス属）に加えて、パポバウイルス科のメンバー、特に乳頭腫ウイルス及びポリオーマウイルスであってｐ５３又はＲＢを隔離し及び／又は失活するウイルス・タンパク質をエンコードしているものが、本発明に係る方法における使用に好適であると信じられている。
【００３８】
　アデノウイルス及びパポバウイルス生物学の一般的な記載については、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ｆｉｅｌｄｓ　ＢＮ　ａｎｄ　Ｋｎｉｐｅ　ＤＭ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．１６５１−１７４０，Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（引用により本明細書中に取り込む）をガンダンスとして参照されることができる。以下の特定の記載は、これに限定されるものではないが、アデノウイルス血清型５及びアデノウイルス血清型２に言及する。他のアデノウイルス血清型も使用されることができると信じられているけれども、アデノウイルス５型は、その　Ｅ１ａウイルス遺伝子領域、及び他のウイルス遺伝子の、ウイルスのポリヌクレオチドのヌクレオチド番号付け慣行及びウイルス−エンコード・ポリペプチドのアミノ酸番号付けのための一般的な引用点を提供する。アデノウイルス２型は、Ｅ１ｂウイルス遺伝子領域、及び他のウイルス遺伝子領域の番号付け慣行のための便利な引用を提供する。当業者は、他のアデノウイルス血清型内の対応の位置を容易に同定するであろうと信じられている。ヒト乳頭腫ウイルスに対する文献は、一般的に、新形成に関連した型（例えば、１６型、１８型、又は３３型）に言及している。但し、非−オンコジーン型も使用されることができる。
【００３９】
　（Ｅ１ａ突然変異体）
　網膜芽腫（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）腫瘍サプレッサー遺伝子（ＲＢ）の遺伝子機能の損失は、さまざまなタイプの腫瘍の病因論に関係している。この腫瘍サプレッサー遺伝子の生産物、ｐＲＢ又はｐ１０５と言われる　１０５キロダルトンのポリペプチドは、細胞分裂サイクル調節性タンパク質である。この　ｐＲＢポリペプチドは、細胞分裂サイクルのＧ１期において細胞を休止させることにより細胞増殖を阻害する。この　ｐＲＢタンパク質も、アデノウイルスＥ１ａ，ＳＶ４０の大きなＴ抗原、及び乳頭腫ウイルスＥ７を含む、いくつかのＤＮＡウイルス癌タンパク質の主要な標的である。これらのウイルス・タンパク質は、ｐＲＢに結合し、そしてこれを失活させ、そして　ｐＲＢを失活させる機能は、ウイルスの複製の容易化において重要である。この　ｐＲＢタンパク質は、アデノウイルスＥ２遺伝子及びいくつかの細胞遺伝子の発現に関連するＥ２Ｆ転写因子と相互作用し、そしてこの転写因子の活性を阻害する（Ｂａｇｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ　６５：１０６３；Ｂａｎｄａｒａ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５１：４９４；Ｃｈｅｌｌａｐｒａｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）　８９：４５４９，（引用により本明細書中に取り込む））。このウイルス癌タンパク質、例えば、アデノウイルスＥ１ａは、Ｅ２Ｆの活性化をもたらす　ｐＲＢ／Ｅ２Ｆ　複合体を破壊する。しかしながら、このＥ２Ｆと複合体化するのに充分に機能的である　ｐＲＢを欠く細胞は、転写活性なＥ２Ｆを所有するために、機能的な癌タンパク質、例えば、Ｅ１ａの存在を必要としないであろう。それ故、ＲＢと複合体を形成する能力を欠いているが他の本質的な複製機能を実質的に保持している複製欠陥アデノウイルス種が、ＲＢ機能において欠陥のある細胞（例えば、実質的に欠失したＲＢ対立遺伝子についてホモ接合又はヘテロ接合である細胞、本質的に非機能的である突然変異体ＲＢタンパク質をエンコードしているＲＢ対立遺伝子を含んで成る細胞、ＲＢタンパク質の機能の欠如をもたらす突然変異を含んで成る細胞）において複製表現型を示すであろうが、非−複製性の非−新形成細胞においては複製表現型を実質的に示さないであろうと、信じられている。このような複製欠陥アデノウイルス種は、本明細書中便利には、Ｅ１ａ−ＲＢ（−）複製欠陥アデノウイルスとして言及される。
【００４０】
　ＲＢ機能を欠く新形成細胞のサブ集団及び本質的に正常なＲＢ機能を発現する非−新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞集団（例えば、混合された細胞カルチャー又はヒト癌患者）は、感染状態（すなわち、その細胞集団のアデノウイルス感染に好適な状態、典型的には、生理学的状態）の下でＥ１ａ−ＲＢ（−）複製欠陥アデノウイルスの感染性投与量を含んで成る組成物により接触されることができる。このような接触は、上記Ｅ１ａ−ＲＢ（−）複製欠陥アデノウイルスによる上記細胞集団の感染をもたらす。この感染は、ＲＢ機能を欠いた新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞のかなりのフラクション中で複製表現型の優位な発現を作り出すが、本質的に正常なＲＢ機能をもつ非−新形成細胞のサブ集団においては複製表現型の実質的な発現を作り出さない。感染されたＲＢ（−）細胞における複製表現型の発現は、例えば細胞病理学上の効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ））、細胞溶解、アポプトシス、等による細胞の死をもたらし、その細胞集団からの新形成ＲＢ（−）細胞の選択的排除をもたらす。
【００４１】
　典型的には、ＲＢ（−）新形成細胞を選択的に殺すのに好適なＥ１ａ−ＲＢ（−）複製欠陥アデノウイルス構築物は、Ｅ１ａポリペプチドがＲＢタンパク質に効率的に結合する能力を失活させる突然変異（例えば、欠失、置換、フレームシフト）を含んで成る。このような失活突然変異は、典型的には、ｐ１０５　ＲＢタンパク質及びｐ１０７タンパク質の結合に関係する、Ｅ１ａ　ＣＲ１ドメイン（Ａｄ５内のアミノ酸３０−８５：ヌクレオチド位置６９７−７９０）及び／又はＣＲ２ドメイン（Ａｄ５内のアミノ酸１２０−１３９；ヌクレオチド位置９２０−９６７）内で生じる。好ましくは、（アミノ酸１５０−１８６にわたる）ＣＲ３ドメインが残り、そして切り詰められたｐ２８９Ｒポリペプチドとして発現され、そしてアデノウイルス初期遺伝子のトランス作用において機能的である。図１は、このＥ１ａ−２８９Ｒポリペプチドのドメイン構造を図示する。
【００４２】
　本発明に係る方法及び組成物中における使用に好適なＥ１ａ−ＲＢ（−）複製欠陥アデノウイルス構築物は、以下の実施例に限定されずに：（１）効率的なＲＢ結合に必要な　ＣＲ１及びＣＲ２ドメイン（アミノ酸２〜１５０　；ヌクレオチド　５６０〜１００９の欠失）を欠いているが、ＣＲ３ドメインを実質的に保持している　Ｅ１ａタンパク質をエンコードしているアデノウイルス血清型５　ＮＴ　ｄｌ　１０１０（Ｗｈｙｔｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ　５６：６７，（引用により本明細書中に取り込む））、並びに（２）野生型アデノウイルス内の　Ｅ１ａ領域の全体をエンコードしているヌクレオチド４４８−１３４９にわたる領域を欠いている欠失ウイルス・ゲノムを含んで成るアデノウイルス血清型５　ｄｌ　３１２（Ｊｏｎｅｓ　Ｎ　ａｎｄ　Ｓｈｅｎｋ　Ｔ（１９７９）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）　７６：３６６５（引用により本明細書中に取り込む））を含む。Ａｄ５　ＮＴ　ｄｌ　１０１０は、好ましいＥ１ａ−ＲＢ（−）複製欠陥アデノウイルスであり、Ｄｒ．Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡから入手可能である。
【００４３】
　Ｅ１ａ−ＲＢ（−）突然変異体の複製を他の方法で支援するであろう新形成細胞における感染性ビリオンの形成を阻害するために、このようなアデノウイルス構築物内に追加の突然変異を取り込むことが好ましいかもしれない。このような追加の失活突然変異は、隣接細胞に拡がり、そしてそれに感染することができる感染性ビリオンを形成する完全なウイルス複製が望ましくない治療的モダリティーにおいて好ましいであろう。これらの充分に失活された突然変異体は、非複製性Ｅ１ａ−ＲＢ（−）突然変異体といわれる。このような非複製性突然変異体は、ｐ５３（−）ＲＢ（−）細胞内でさえ感染性ビリオンの形成を妨ぐ突然変異体を含んで成り；このような突然変異は、典型的には、本質的なビリオン・タンパク質又はプロテアーゼにおける構成的な突然変異である。しかしながら、多くのモダリティーにおいては、突然変異体ウイルスが複製可能であり、そして他の細胞に拡がりそしてそれを感染させることができる突然変異体ウイルス・ゲノムを含む感染性ビリオンを形成し、それにより、突然変異体ウイルスの開始投与量の抗新形成作用を増幅することが望ましい。
【００４４】
　ＲＢに結合する能力を欠く追加の　Ｅ１ａ（−）突然変異体は、典型的には、ＣＲ１及び／又はＣＲ２ドメイン内で、Ｅ１ａポリペプチドをエンコードしているＥ１ａ遺伝子領域内で突然変異を生成させ、その突然変異体Ｅ１ａポリペプチドを発現させ、水性結合条件下、その突然変異体Ｅ１ａポリペプチドをｐ１０５又はＲＢの結合性断片と接触させ、そして本発明における使用に好適な候補Ｅ１ａ（−）突然変異体として、ＲＢに特異的に結合しない突然変異体Ｅ１ａポリペプチドを同定することにより、当業者により生成されることができる。他の検定法は、上記突然変異体Ｅ１ａポリペプチドを水性結合条件下３００ｋＤタンパク質及び／又はｐ１０７タンパク質、又はそれらの結合性断片と接触させ、そして本発明における使用に好適な候補Ｅ１ａ（−）突然変異体として　３００ｋＤ及び／又はｐ１０７ポリペプチドと特異的に結合しない突然変異体Ｅ１ａポリペプチドを同定することを含む。他の結合検定法は、Ｅ１ａ（−）突然変異体タンパク質（又はＥ１ａタンパク質の非存在）が転写因子　Ｅ２Ｆと複合体を形成する能力がないこと、及び／又は生理学的条件下でＲＢ：Ｅ２Ｆ　複合体からＲＢタンパク質を乖離する能力の欠如を測定することを含む（Ｃｈｅｌｌａｐｒａｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）ｏｐ．ｃｉｔ．，（引用により本明細書中に取り込む。））。
【００４５】
　Ｅ１ａ機能を欠いた突然変異体、例えば、Ｅ１ａ−依存性転写調節配列に結合したさまざまなリポーター・ポリペプチドの転写の　Ｅ１ａによるトランス作用の損失、等を測定するための他の機能検定法が使用されるであろう。
【００４６】
　（Ｅ１ｂ突然変異体）
細胞リン脂質　ｐ５３の機能は、その細胞分裂サイクルを通して哺乳動物細胞の進行を阻害することである。野生型アデノウイルスＥ１ｂ　ｐ５５タンパク質は、おそらく不活性形態におけるｐ５３を隔離することにより、ｐ５３をもち、かつ、ｐ５３機能の実質的な失活を作り出す感染細胞においてｐ５３に結合する。機能的な　Ｅ１ｂタンパク質は、機能的ｐ５３を含む細胞における効率的なアデノウイルスの複製に不可欠である。これ故、ｐ５３に結合する能力を実質的に欠くアデノウイルス変異体は、機能的ｐ５３の正常レベルをもつ非−複製性、非−新形成細胞においては複製欠陥である。
【００４７】
　ヒト腫瘍細胞は、突然変異した（例えば、置換、欠失、フレームシフト突然変異した）ｐ５３対立遺伝子についてホモ接合又はヘテロ接合であり、そしてその細胞分裂サイクルの正常な制御に必要なｐ５３機能を欠いている（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５３：４９；Ｌｅｖｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）ｏｐ．ｃｉｔ．，（引用により本明細書中に取り込む））。従って、多くの新形成細胞は、ｐ５３（−）である。なぜなら、それらが、ｐ５３タンパク質の充分なレベルを欠いているか、そして／又は、それらが、実質的なｐ５３機能が不可能であり、そして野生型ｐ５３が存在することができるときでさえ（例えば、機能的マルチマーの形成を阻害することにより）ｐ５３機能を実質的に取り除くことができるｐ５３の突然変異体形態を発現するかのいずれかであるからである。いくつかの新形成細胞は、本質的に野生型のｐ５３タンパク質をエンコードしている対立遺伝子を含んで成るが、ｐ５３機能を実質的に排除する第二の部位突然変異、例えば、その核内よりもむしろ細胞質内に局在化するｐ５３タンパク質をもたらす突然変異を含んで成ることができ；このような第二部位突然変異体も、ｐ５３機能を実質的に欠いている。
【００４８】
　ｐ５３と複合体を形成する能力を欠いているが他の本質的なウイルス複製機能を実質的に保持している複製欠陥アデノウイルス種が、ｐ５３機能において欠陥である細胞（例えば、実質的に欠失したｐ５３対立遺伝子についてホモ接合である細胞、本質的に非機能的である突然変異体ｐ５３タンパク質を含んで成る細胞）の内で複製表現型を示すであろうが、非−複製性の非−新形成の細胞内で複製表現型を実質的に示さないであろうと信じられている。このような複製欠陥アデノウイルス種は、Ｅ１ｂ−ｐ５３（−）複製欠陥アデノウイルスとして適宜本明細書中で言及される。
【００４９】
　ｐ５３機能を欠く新形成細胞のサブ集団及び本質的に正常なｐ５３機能を発現する非−新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞集団（例えば、混合された細胞カルチャー又はヒト癌患者）は、感染条件（すなわち、その細胞集団のアデノウイルス感染に好適な条件、典型的には生理学的条件）の下で　Ｅ１ｂ−ｐ５３（−）複製欠陥アデノウイルスの感染投与量を含んで成る組成物と接触されることができる。このような接触は、上記　Ｅ１ｂ−ｐ５３（−）複製欠陥アデノウイルスによる上記細胞集団の感染をもたらす。この感染は、ｐ５３機能を欠く新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞のかなりのフラクション内で複製表現型の優位な発現を作り出すが、本質的に正常なｐ５３機能をもつ非−新形成細胞のサブ集団内での複製表現型の実質的な発現を作り出さない。感染されたｐ５３（−）細胞内での複製表現型の発現は、例えば、細胞病理学的効果（ＣＰＥ）、細胞溶解、アポプトシス、等による細胞の死をもたらし、その細胞集団からの新形成ｐ５３（−）細胞の選択的排除をもたらす。
【００５０】
　典型的には、ｐ５３（−）新形成細胞の選択的殺生に好適な　Ｅ１ｂ−ｐ５３（−）複製欠陥アデノウイルス構築物は、Ｅ１ｂ・ｐ５５ポリペプチドが効率的にｐ５３タンパク質に結合する能力を失活させる突然変異（例えば、欠失、置換、フレームシフト）を含んで成る。このような失活性突然変異は、典型的には、ｐ５３に結合する　ｐ５５の領域内で生じる。場合により、この突然変異体Ｅ１ｂ領域は、その　Ｅ１ｂ領域の残りによりエンコードされている機能的　ｐ１９タンパク質をエンコードし、そしてこれを発現することができ、そして、それは、Ｅ１ａポリペプチドの非存在中アデノウイルス初期遺伝子のトランス作用において機能的である。
【００５１】
　本発明に係る方法及び組成物における使用に好適なＥ１ｂ−ｐ５３（−）複製欠陥アデノウイルス構築物は、以下の実施例に限定されないが：（１）ｐ５５タンパク質の翻訳の開始のために使用される　ＡＵＧコドンの３アミノ酸下流の終止コドンを生成するヌクレオチド位２０２２におけるＣ〜Ｔ突然変異及びヌクレオチド３３３６において第２の終止コドンを生成する小さなリンカー挿入により置換されたヌクレオチド２４９６〜３３２３間の欠失を含む、アデノウイルス２型ｄｌ　１５２０（Ｂａｒｋｅｒ　ａｎｄ　Ｂｅｒｋ（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５６：１０７，（引用により本明細書中に取り込む）並びに（２）少なくとも２０２２位の突然変異及び／又は２４９６−３３２３　の欠失突然変異、又はその実質的な部分、及びｐ１９　ｃｙｔ突然変異体を産生するための　ｐ１９内の追加の突然変異を含んで成る複合アデノウイルス構築物、を含み；この複合ウイルス構築物は、ｐ５５を欠いており、そして　ｐ１９　ｃｙｔ突然変異の増強された細胞病理学的効果を含んで成る。Ａｄ２　ｄｌ　１５２０は、Ｄｒ．Ａ．Ｂｅｒｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　ａｔ　Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡから入手可能であり、そして　Ｂａｒｋｅｒ　ａｎｄ　Ｂｅｒｋ（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５６：１０７，（引用により本明細書中に取り込む）を含む文献中に記載されている。
【００５２】
　Ｅ１ｂ−ｐ５３（−）突然変異体の複製を他の方法で支援するであろう新形成細胞内での感染性ビリオンの形成を阻害するために上記のようなアデノウイルス構築物中に追加の突然変異を取り込むことが好ましいかもしれない。このような追加の失活突然変異は、隣接細胞に拡がり、そしてそれに感染することができる感染性ビリオンを形成する完全なウイルスの複製が望ましくない治療的モダリティーにおいて好ましいであろう。これらの完全に失活された突然変異体は、非複製性Ｅ１ｂ−ｐ５３（−）突然変異体と言われる。このような非複製性突然変異体は、ｐ５３（−）ＲＢ（−）細胞内においてさえ感染性ビリオンの形成を妨ぐ突然変異を含んで成り；このような突然変異は、典型的には、不可欠なビリオン・タンパク質又はプロテアーゼ内の構成的な突然変異である。
【００５３】
　しかしながら、多くのモダリティーにおいては、その突然変異体ウイルスが複製可能であり、そして他の細胞に拡がり、かつ、感染することができる突然変異体ウイルス・ゲノムを含む感染性ビリオンを形成し、これにより突然変異体ウイルスの開始投与量の抗新形成作用を増幅することが望ましい。
【００５４】
　ｐ５３に結合する能力を欠いている追加のＥ１ｂ（−）突然変異体は、ｐ５５をエンコードしているＥ１ｂ遺伝子領域内に突然変異を生成し、突然変異体ｐ５５ポリペプチドを発現させ、水性結合条件下、突然変異体ｐ５５ポリペプチドをｐ５３又はｐ５３の結合性断片と接触させ、そして本発明における使用に好適な候補Ｅ１ｂ（−）突然変異体としてｐ５３に特異的に結合しない突然変異体Ｅ１ｂポリペプチドを同定することにより、当業者により生成されことができる。
【００５５】
　より典型的には、機能的検定法が候補　Ｅ１ｂ（−）突然変異体を同定するために使用されるであろう。例えば、ｐ５３機能の測定のためのＦｒｉｅｎｄ検定法が、Ｆｒｅｂｏｕｒｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５２：６９７７，（引用により本明細書中に取り込む）中に本質的に記載されているように行なわれるであろう。ｐ５３を失活させる能力を欠いている　Ｅ１ｂ突然変異体は、候補　Ｅ１ｂ（−）複製欠陥突然変異体として同定されるであろう。
【００５６】
　（Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異）
　いくつかのヒト腫瘍細胞は、ｐ５３機能とＲＢ機能の両方を、１又は両方のタンパク質種の突然変異性の失活又は欠失のいずれかにより、欠いている。このような細胞は、ｐ５３（−）ＲＢ（−）細胞と命名されている。
【００５７】
　ｐ５３に結合する能力を欠いており、そしてＲＢに結合する能力も欠いているが、他の不可欠なウイルス複製機能を実質的に保持している複製欠陥アデノウイルス種が、ｐ５３（−）ＲＢ（−）細胞内で複製表現型を優位に示すであろうと信じられている。このような複製欠陥アデノウイルス種は、本明細書中適宜、Ｅ１ａ−ＲＢ（−）／　Ｅ１ｂ−ｐ５３（−）複製欠陥アデノウイルス、又は単に　Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異体と言われる。このようなＥ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異体は、Ｅ１ａ領域内の少なくとも１のＥ１ａ−ＲＢ（−）突然変異及びｐ５５をエンコードしているＥ１ｂ領域内の少なくとも１のＥ１ｂ−ｐ５３（−）突然変異を併合して、Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異体アデノウイルスを形成することにより、当業者により構築されることができる。このような複製欠陥２重突然変異体アデノウイルスは、ｐ５３とＲＢ機能の両方において欠陥があるが非複製性の非−形質転換細胞内で複製表現型を実質に示さないであろうような細胞内で、あるいはｐ５３又はＲＢ機能のいずれかにおいて欠陥であるが両方の機能においては欠陥がないような細胞内で、複製表現型を示すであろう。例えば、Ａｄ２　ｄｌ　４３４突然変異体（Ｇｒｏｄｚｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ　２１：４５４，（引用により本明細書中に取り込む）は、Ｅ１ａ座の欠失及びＥ１ｂ座の部分的欠失を含んで成り、そして機能的Ｅ１ａ及びＥ１ｂ　ｐ５５タンパク質をエンコードする能力を実質的に欠いている。
【００５８】
　ｐ５３及びＲＢ機能を欠いている新形成細胞のサブ集団並びに本質的に正常なｐ５３機能及び／又はＲＢ機能を発現する非−新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞集団（例えば、混合された細胞カルチャー又はヒト癌患者）は、感染条件（すなわち、その細胞集団のアデノウイルス感染に好適な条件、典型的には生理学的条件）下で、複製欠陥　Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異体アデノウイルスの感染投与量を含んで成る組成物と接触されることができる。このような接触は、Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異体複製欠陥アデノウイルスによる上記細胞集団の感染をもたらす。
【００５９】
　この感染は、ｐ５３機能とＲＢ機能の両方を欠いている新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞のかなりのフラクション内で複製表現型の優位な発現を作り出すが、本質的に正常なｐ５３機能及び／又はＲＢ機能をもつ非−新形成細胞のサブ集団内で複製表現型の実質的な発現を作り出さない。
【００６０】
　感染したｐ５３（−）ＲＢ（−）細胞内での複製表現型の発現は、例えば、細胞病理学的効果（ＣＰＥ）、細胞溶解、等による細胞死をもたらし、その細胞集団から新形成ｐ５３（−）ＲＢ（−）細胞の選択的排除をもたらす。
【００６１】
　Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異体の複製を他の方法で支援するであろう新形成細胞内で感染性ビリオンの形成を阻害するために上記のようなアデノウイルス構築物中に追加の突然変異を取り込むことが好ましいかもしれない。このような追加の失活突然変異は、隣接細胞に拡がり、そしてそれに感染することができる感染性ビリオンを形成する完全なウイルス複製が望ましくないような治療のモダリティーにおいて好ましいであろう。これらの完全に失活された突然変異体は、非複製性　Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異体と言われる。このような非複製性突然変異体は、ｐ５３（−）ＲＢ（−）細胞内でさえ感染性ビリオンの形成を妨ぐ突然変異を含んで成り；このような突然変異は、典型的には、不可欠なビリオン・タンパク質又はプロテアーゼ内の構成的な突然変異である。
【００６２】
　しかしながら、多くのモダリティーにおいては、その突然変異体ウイルスが複製可能であり、そして他の細胞に拡がり、そしてそれを感染させることができる突然変異体ウイルス・ゲノムを含む感染性ビリオンを形成し、これにより突然変異体ウイルスの開始投与量の抗新形成作用を増幅することが望ましい。
【００６３】
　（負の選択のウイルス構築物）
　感染細胞内のアデノウイルス複製表現型の発現は、一般的に、細胞溶解、細胞病理学的効果（ＣＰＥ）、アポプトシス、又は他の細胞死の機構により、ウイルス−誘導細胞毒性と相関するけれども、抗新形成治療のために使用されるべき組換え体アデノウイルスの細胞毒性を増大させることがしばしば好ましくあることができる。このような増大は、典型的には、複製表現型を発現する細胞内で正の転写調節を示すアデノウイルスのプロモーターに作用可能な状態で結合された組換え体アデノウイルス内に負の選択遺伝子を含む形態を呈することができる。例えば、ＨＳＶ　ｔｋ遺伝子カセットは、複製欠陥アデノウイルスのＥ３プロモーター、例えば、Ａｄ５　ＮＴ　ｄｌ　１１１０の直下流に作用可能な状態で結合されることができる。しばしば、この負の選択カセットに適合するようにアデノウイルス・ゲノムの（すなわち、ウイルス複製及びパッケージングのための）非必須部分を欠失させることが望ましく；従って、このＥ３遺伝子領域の実質的な部分が欠失され、そして負の選択カセット、例えば、Ｅ２プロモーター（及びエンハンサー）又は他の好適なプロモーター／エンハンサーに作用可能な状態で結合されたＨＳＶ　ｔｋ遺伝子により置換されることができる。あるいは、負の選択遺伝子は、アデノウイルス後期領域プロモーターに作用可能な状態で結合されて、後期遺伝子プロモーターの転写を特徴とする複製表現型を発現する細胞内でその負の選択遺伝子産物の効率的な発現を許容することができる。
【００６４】
　インビボにおいて感染性ビリオンを形成するウイルス複製が望ましくない態様のためには、非複製性であるアデノウイルス複製欠陥構築物が使用される。このような非複製性突然変異体は、Ｅ１ａ（−）及び／又はＥ１ｂ（−）突然変異を含んで成り、そして好適な新形成細胞（例えば、ｐ５３（−）細胞、ＲＢ（−）細胞、又はｐ５３（−）ＲＢ（−）細胞）内での複製表現型の生成に必要な遺伝子機能の全てを含んで成るが、感染性ビリオンの形成に、例えば、構造コート・タンパク質、プロテアーゼ、等に、必要な少なくとも１の必須遺伝子機能を欠失している。あるいは、このウイルスにより誘発された顕出免疫応答が、そのウイルスの感染性ビリオンを中和し、そしてその拡がりを緩和することができる。Ｅ１ａ及び／又はＥ１ｂ突然変異に加えて相補性トランス−作用機能を欠いている非複製性突然変異体は、その欠失されたトランス−作用性の機能（単数又は複数）を提供することができる相補性ヘルパー・ウイルス又はヘルパー細胞系と共に増殖されることができる。例えば、トランスにおいて　Ｅ１ａと　Ｅ１ｂ機能を提供する２９３細胞系（ＡＴＣＣ　＃　ＣＲＬ　１５７３；Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，（引用により本明細書中に取り込む）は、トランスにおける追加の機能、例えば、ビリオン・コート・タンパク質等を提供するために修飾されることができ、ウイルス株を開発するために“非複製性”突然変異体の増殖を許容する。細胞内でのＨＳＶ
ｔｋ遺伝子の発現は、その細胞が負の選択剤、例えば、ガンシクロビル又はＦＩＡＵに晒されない場合には、その細胞に直接的には毒性でない。負の選択遺伝子が実質的に発現されるような複製表現型を発現する感染細胞は、その負の選択剤（例えば、ガンシクロビル）が、そのｔｋ遺伝子を発現する感染細胞が選択的に排除されるであろう時に、有効な選択的投与量において投与されるまで、本質的に全く追加の細胞毒性を作り出さない；従って、負の選択は、増強された細胞病理学的殺生のために、及び／又は複製表現型を示す細胞を殺すことによりさらなるウイルス複製を静める（ｄａｍｐ　ｏｕｔ）ために使用されることができる。さらに、この負の選択剤の投与量及び／又は投与スケジュールを調整することにより、この負の選択遺伝子を発現する感染細胞集団の部分的排除のみを作り出すことが可能である。一般的に、ガンシクロビルの投与量は、標準的投与量−応答曲線を作成し、そして感染した新形成細胞の排除の所望のレベルが観察される投与レベルを測定することにより換算される。動物へのガンシクロビル（ＧＡＮＣ）の投与に関する情報は、パッケージ挿入物からヒト処方箋を含む本技術分野におけるさまざまな源において入手可能である。細胞培養において使用されるとき、ガンシクロビルの選択濃度は、典型的には、０．０５μＭ〜５０μＭのレンジ内、典型的には、約１μＭのレンジにあり、約　０．２μＭがインビトロ適用において使用され、そして約１−５μＭがインビボ適用において投与される（典型的には、水溶液中　１２５ｍｓ／ｍｌのガンシクロビルをロードされた浸透ポンプからの連続輸注により約２４時間にわたり投与される）。インビボにおける投与のための投与量スケジュールは、７日間にわたり静脈中に与えられた５ｍｇ／ｋｇ体重Ｂ．Ｉ．Ｄ．の投与量においてガンシクロビルを含んで成ることができる。
【００６５】
　負の選択遺伝子は、Ｅ１ａ−ＲＢ（−）複製欠陥アデノウイルス構築物、Ｅ１ｂａ−ｐ５３（−）複製欠陥アデノウイルス構築物、Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異体複製欠陥ウイルス構築物、等の中に取り込まれることができる。
【００６６】
　好ましい態様は、ｔｋ発現カセットを作るためのポリアデニレーション部位を含む、Ａｄ５　ＮＴ　ｄｌ　１１１０のＥ２プロモーター又は他のプロモーター及び／又はエンハンサー（例えば、大きな後期プロモーター、Ｅ１ａプロモーター／エンハンサー、Ｅ１ｂプロモーター／エンハンサー）に作用可能な状態で結合されたＨＳＶ　ｔｋ遺伝子カセット（Ｚｊｉｌｓｔｒａ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５；Ｍａｎｓｏｕｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３６：３４８；Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４５：１２３４；Ａｄａｉｒ　ｅｔ　ａｌ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８６：４５７４；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８８，（引用により本明細書中に取り込む）である。このｔｋ発現カセット（又は他の負の選択発現カセット）は、例えば、そのＥ３遺伝子の実質的な欠失のための代わりとして、アデノウイルスのゲノム内に挿入される。他の負の選択遺伝子及び複製欠陥アデノウイルス構築物は、当業者に自明であろう。Ｅ２プロモーターに作用可能な状態で結合された負の選択遺伝子は、Ｅ１ａ（−）複製−欠陥アデノウイルス突然変異体内への取り込みのための特に好ましい態様であると信じられている。なぜなら、そのＥ２プロモーターが、多数のＥ２Ｆ部位を含むからである。一方、ＲＢ（−）とｐ５３（−）ＲＢ（−）は、ＲＢ機能を欠き、そしておそらくＥ２プロモーターからのより効率的な転写を示すであろう。
【００６７】
　（診断及びインビトロにおける用途）
　本発明に係る複製欠陥アデノウイルスは、ｐ５３及び／又はＲＢ機能を欠く細胞の存在を検出するために使用されることができる。例えば、ｐ５３及び／又はＲＢを欠く新形成細胞のサブ集団を含んで成る細胞サンプルが、好適な複製欠陥アデノウイルス種により感染される。好適なインキュベーション期間の後、複製表現型（例えば、Ｔｒｙｐａｎブルーを排除する能力の損失、ビリオン形成、ウイルスＤＮＡ内への３Ｈ−チミジンの取り込み）を発現する細胞サンプル中の細胞を、その細胞サンプル中の複製性及び／又は新形成性細胞の数又は比率の測定を提供するために定量することができる。このような方法は、体外移植細胞サンプル（例えば、リンパ球白血病のための化学療法を経験する患者からのリンパ球サンプル）に基づき、患者内の化学療法後に、新形成を診断し、そして／又は腫瘍細胞負荷を評価するために使用されることができる。
【００６８】
　他の診断用途及び変法は自明である；例えば、リポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）を、複製欠陥アデノウイルス内の負の選択遺伝子と置換することができ；形質転換された細胞は、リポーター遺伝子の発現により（例えば、細胞サンプル又は形質転換検定法において）等級付けし、これを、細胞内でのｐ５３及び／又はＲＢの欠如を示す複製表現型の発現と関連付ける。
【００６９】
　（治療法）
　新形成疾患の治療は、Ｅ１ａ−ＲＢ（−）複製欠陥アデノウイルス、Ｅ１ｂ−ｐ５３（−）複製欠陥アデノウイルス、Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異体、及び負の選択遺伝子をさらに含んで成る複製欠陥アデノウイルスを含む、本発明の複製欠陥アデノウイルスを含んで成る組成物を患者に投与することにより与えられることができる。
【００７０】
　ｐ５３及び／又はＲＢ機能を欠いた細胞を含んで成るさまざまなヒト新形成が、複製欠陥アデノウイルス構築物により治療されることができる。例えば、これらに限定されないが、気管支癌腫、鼻咽腔癌腫、喉頭癌腫、小細胞及び非−小細胞肺癌腫、肺腺癌、肝癌、膵臓癌腫、膀胱癌腫、大腸癌腫、胸癌腫、子宮癌腫、卵巣癌腫、又はリンパ球白血病をもつヒト患者又は非ヒト哺乳動物を、適当な複製欠陥アデノウイルスの有効抗新形成投与量を投与することにより治療することができる。感染性アデノウイルス粒子の懸濁液を、静脈内、腹膜内、筋中、皮下、及び表在局所的に含むさまざまな経路をもって新形成組織に適用することができる。１ｍｌ当り約１０３〜１０１２以上のビリオン粒子を含むアデノウイルス懸濁液を、（例えば、気管支癌腫、小細胞肺癌腫、非−小細胞肺癌腫、肺腺癌、又は喉頭癌を治療するための肺デリバリーのために）ミストとして吸入させ、又は、腫瘍（例えば、気管支癌腫、鼻咽腔癌腫、喉頭癌腫、子宮癌腫）を治療するために腫瘍部位に直接的に綿棒で塗ることができ、又は輸注により（例えば、卵巣癌の治療のためには腹膜腔中に、肝癌又は他の非−肝臓一次腫瘍のためには門脈中に）、あるいは腫瘍塊（例えば、胸腫瘍）内への直接的注入、浣腸（例えば、結腸癌）、又はカテーテル（例えば、膀胱癌）を含む他の好適な経路により、投与することができる。
【００７１】
　候補抗新形成アデノウイルス突然変異体を、新形成細胞の等価な移植片を宿す未処理マウスと比較して、ｐ５３及び／又はＲＢ機能を欠いた新形成細胞の移植片を宿すｎｕ／ｎｕマウスにおける腫瘍形成又は新形成細胞負荷を減少させるそれらの能力により、さらに評価することができる。
【００７２】
　抗新形成複製欠陥アデノウイルス突然変異体を、新形成疾患をもつ患者への治療的及び診断的投与のために配合することができる。治療的又は予防的用途のために、抗新形成複製欠陥アデノウイルス変異体の１以上の種の薬理学的有効投与量を含む滅菌組成物を、新形成症状の治療のために、ヒト患者又は獣医学的非ヒト患者に投与する。一般的には、本組成物は、水性懸濁液中に約　１０３〜１０１５以上のアデノウイルス粒子を含んで成るであろう。医薬として許容される担体又は賦形剤が、このような滅菌組成物中でしばしば使用される。さまざまな水溶液、例えば、水、緩衝液、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、等を使用することができる。これらの溶液は、無菌であり、そして所望のアデノウイルス・ビリオン以外の粒状物を一般的に含まない。これらの組成物は、生理学的な条件に近づけるのに必要な医薬として許容される補助的物質、例えばｐＨ調整及び緩衝化剤、毒性調整剤、等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、等を含むことができる。アデノウイルスによる細胞の感染を増強する賦形剤を含むことができる。
【００７３】
　複製欠陥ウイルスは、リポソーム又は免疫リポソーム・デリバリーにより新形成細胞にデリバリーされることができる；このようなデリバリーは、新形成細胞集団上に存在する細胞表面特性（例えば、免疫リポソーム内の免疫グロブリンに結合する細胞表面タンパク質の存在）に基づいて、新形成細胞に対して選択的に標的化されることができる。典型的には、ビリオンを含む水性懸濁液は、リポソーム又は免疫リポソーム内に包み込まれる。例えば、複製欠陥アデノウイルス・ビリオンの懸濁液は、常法により免疫リポソームを形成するためにミセル内に包み込まれる（米国特許第５，０４３，１６４号、米国特許第４，９５７，７３５号、米国特許第４，９２５，６６１号；Ｃｏｎｎｏｒ　ａｎｄ　Ｈｕａｎｇ（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：５８２；Ｌａｓｉｃ　ＤＤ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　３５５：２７９；　Ｎｏｖｅｌ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ｅｄｓ．Ｐｒｅｓｃｏｔｔ　ＬＦ　ａｎｄ　ＮｉｍｍｏＷＳ：Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ｒｅｄｄｙ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５８５；（引用により本明細書中に取り込む））。個体の癌細胞上に存在する癌細胞抗原（例えば、ＣＡＬＬＡ，ＣＥＡ）に特異的に結合する抗体を含んで成る免疫リポソームを、これらの細胞に対してビリオンを標的化するために使用することができる。
【００７４】
　本抗新形成複製欠陥アデノウイルスを含む組成物又はそれらのカクテルを、新形成疾患の予防的及び／又は治療的処置のために投与することができる。治療的用途においては、組成物を、その症状及びその合併症を治癒し又は少なくとも部分的に休止させるのに充分な量において、特定の新形成疾患を既に患った患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、“治療的有効投与量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｄｏｓｅ）”又は“有効投与量（ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ　ｄｏｓｅ）”と定義される。この用途のために有効な量は、その症状の重度、その患者の一般的な状態、及び投与の経路に依存するであろう。
【００７５】
　予防的な適用においては、抗新形成複製欠陥アデノウイルスを含む組成物又はそのカクテルは、新形成の再発に対する患者の抵抗性を強化し又は緩解時間を遅延化するために、現在は新形成疾患状態にはない患者に投与される。このような量は、“予防的有効投与量（ｐｒｏｐｈｙｔａｃｔｉｃａｌｌｙ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｄｏｓｅ）”であると定義される。この用途においては、適正な量は、再び、その患者の健康及び免疫の一般的レベルに依存する。
【００７６】
　これらの組成物の単一又は多数の投与は、その治療内科医により選択される投与量レベル及びパターンにより行なわれることができる。いずれの事件においても、医薬配合物は、患者を有効に治療するのに充分な量の本発明に係る抗新形成複製欠陥アデノウイルスを提供すべきである。
【００７７】
　本発明に係る抗新形成複製欠陥アデノウイルス治療は、他の抗新形成プロトコール、例えば、慣用の化学療法と組み合わされることができる。
【００７８】
　（突然変異体アデノウイルスの増殖）
　本発明に係るアデノウイルス突然変異体（例えば、Ｅ１ａ−ＲＢ（−）複製欠陥アデノウイルス、Ｅ１ｂ−ｐ５３（−）複製欠陥アデノウイルス、及びＥ１ａ／Ｅ１ｂ　２重突然変異体）は、典型的には、感染性突然変異体ビリオンの複製及び形成を支援するためにトランスにおいて、それぞれ、Ｅ１ａ機能、Ｅ１ｂ機能、又は両Ｅ１ａ及びＥ１ｂ機能を提供することができる細胞系（例えば、２９３細胞系ＡＴＣＣ　＃　ＣＲＬ　１５７３，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）内でウイルス株として増殖される。
【００７９】
　以下の実施例を、限定ではなく実施例として提供する。変法及び他の態様は、当業者に自明であろう。
【実施例】
【００８０】
　（実験的実施例）
　以下の実験的実施例は、ｐ５３及び／又はＲｂ機能を欠いた新形成細胞に複製−欠陥組換えアデノウイルス調製物を投与することが新形成細胞を効率的に殺すことができるということを立証する。また、本実施例は、ｐ５３及びＲｂ機能を含む非−新形成細胞が複製−欠陥組換えアデノウイルス調製物による殺生に対し比較的抵抗性であるということを示す。それ故、以下に示すデータは、複製−欠陥組換えアデノウイルスが新形成細胞を選択的に殺すために使用されることができるという実験的証明を提供する。この選択的殺生は、突然変異体アデノウイルスが新形成細胞内で複製表現型を誘導するが、非−新形成細胞内で複製表現型（又は関連の細胞病理学的効果）を実質的に誘導しない差異的能力を発揮することにより提供される。対照の非−新形成細胞及びさまざまな新形成細胞型を提案する細胞系を、ＤＭＥＭ（高グルコース）中集密において又はその付近で６−ウェル培養皿内にプレートし、そして標準的な培養条件下３７℃、５％　ＣＯ２においてインキュベートした。細胞をプレートして５×１０５細胞／ウェルの密度においてスクリーンした。テストした新形成細胞系は：ヒト１次骨肉腫から得られたＳＡＯＳ−２（ＡＴＣＣ　ＨＴＢ８５）；ヒト骨肉腫から得られたＵ−２ＯＳ（ＡＴＣＣ　ＨＴＢ９６）；膵臓又は腸内に起源をもつヒト転移性腺癌腫から得られたＨＳ７００Ｔ（ＡＴＣＣ　ＨＴＢ１４７）；形質転換されたヒト胎児腎臓、２９３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５７３）；及びヒト大腸腺癌腫から得られたＤＬＤ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２２１）であった。これらの細胞系のそれぞれは、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能である。対照の非−新形成細胞は、ＩＭＲ９０（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ１８６）及びＷＩ−３８（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ７５）、両方２倍体ヒト肺繊維芽細胞系であった。
【００８１】
　これらの細胞カルチャーを、順番に、平行して、野生型アデノウイルス２型、並びに複製−欠陥組換え体アデノウイルス突然変異体ｄｌ　１１０１０，ｄｌ　４３４及びｄｌ　１５２０により感染させた。余った培養皿を、細胞をカウントする目的のためにプレートした。これらの細胞は、上記ウイルス感染のために使用した細胞の同一懸濁液から生じたものであった。細胞を、所望の感染的重度（ＭＯＩ）のためにその細胞カルチャーに添加すべきウイルス・プラーク−形成単位（ＰＦＵ）の数を決定するためにカウントした。上記野生型アデノウイルス２型及び上記突然変異体アデノウイルスを、０．１，１．０，１０、及び１００のＭＯＩｓにおいて上記平行細胞カルチャーに添加した。ＰＢＳ中に懸濁されたウイルスを、１ｍｌの容量において上記細胞ウェルに添加した。接種された培養皿を、接種直後及び３７℃、５％　ＣＯ２において約１時間の吸収時間を通じての半分あたりでＸ−軸及びＹ−軸の両方においてロックした。
【００８２】
　１時間の吸収期間の後、高グルコース及び２％ウシ胎児血清を含む２ｍｌのＤＭＥＭを添加し、そしてそのカルチャーを、標準的な培養条件下３７℃、５％　ＣＯ２においてインキュベートした。
【００８３】
　感染後の各時間において、図２（ａ−ｉ）を参照のこと、細胞カルチャーを、ウイルス調製物による細胞殺生の効果を測定するために２０％メタノール中　０．５％クリスタル・バイオレットにより染色した。死んだ細胞を脱着し、そしてウェルから濯ぎ出し、一方、生きた細胞は、ウェル内に残り、そして上記染料により染色された。これらの効果は、上記複製−欠陥組換えアデノウイルス調製物が、非−新形成細胞に対して新形成細胞を優先的に殺すこと、並びに野生型アデノウイルス２型が新形成細胞と非−新形成細胞の両方をほとんど等しく良好に殺すことを示している。これらの結果は、ｄｌ　１１０１０突然変異体が新形成細胞の殺生において特に有効であり、そして　ｄｌ
１５２０突然変異体及びｄｌ　４３４突然変異体も有効であるということを立証した。これらの結果の例を図２ａ−ｉ中に示す。これらは、野生型アデノウイルス２型、突然変異体；ｄｌ　１０１０（Ｅ１Ａ（−）），ｄｌ　１５２０（Ｅ１Ｂ（−））、又はｄｌ　４３４による感染後の各時間において得られた染色された細胞ウェルの写真である。図２ａは、ウイルスの非存在中、細胞カルチャーのそれぞれが集密まで成長し、そして培養ウェルに付着したことを示している。図２ｂ−ｃは、野生型アデノウイルス２型が、少なくともいくつかの細胞がそれぞれのウェル内で染色され、変動した効力及び不完全性を伴うけれども、各培養ウェル内で細胞を殺すことができたということを示している。ＷＩ−３８及びＳＡＯＳ−２系が、アデノウイルス感染のための良好な宿主ではないこと、並びにＩＭＲ９０（図３ａ−ｃ）がヒト２倍体繊維芽細胞のための代替対照細胞系として役立つということが注目される。図２ｄ−ｅは、ｄｌ　１０１０突然変異体が、感染−抵抗性ＳＡＯＳ−２以外のすべての新形成細胞系を効率的に殺すことができたということを示している。ｄｌ　１０１０は、感染１２日後までに、２９３，Ｕ２ＯＳ，ＨＳ７００Ｔ、及びＤＬＤ−１系を殺し、そして２倍体ヒト肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８）を実質的に殺さなかった。図２ｆ−ｇは、ｄｌ　１５２０突然変異体が、感染１４−２０日後までに５の新形成細胞系の中の３（２９３，ＨＳ７００Ｔ、及びＤＬＤ−１）を効率的に殺すことができたが、２倍体トヒ肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８）を実質的に殺さなかったということを示している。ｄｌ　１５２０は、Ｅ１Ｂ（−）突然変異体であり、そして細胞系ＵＳＯＳはこのような　Ｅ１Ｂ（−）突然変異体ウイルスが複製することを許容せず、これは、予測されるように、突然変異体組換え−欠陥アデノウイルスによる感染についての各形質転換細胞系の特異性を示している。図２ｈ−ｉは、ｄｌ　４３４突然変異体（２重−突然変異体：Ｅ１Ａ（−）Ｅ１Ｂ（−））が感染の１４−２０日後までに５新形成細胞系の中の３（２９３，ＨＳ７００Ｔ、及びＤＬＤ−１）を効率的に殺すことができ、そして２倍体ヒト肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８）を実質的に殺さなかったことを示している。ＤＬＤ−１及びＵ２ＯＳ系は、ｄｌ　４３４の複製についての部分的に抵抗性の表現型を示した。
【００８４】
　図３（ａ−ｃ）は、ＩＭＲ９０ヒト２倍体肺繊維芽細胞が野生型Ａｄ２，ｄｌ　１０１０、及びｄｌ　１５２０により差別的に殺されたことを示している。２９３細胞系は、陽性対照として役立つ。図３（ａ）は野生型　Ａｄ２が１０又は１００の　ＭＯＩにおいてＩＭＲ９０細胞を効率的に殺したことを示している。図３（ｂ）は、たとえ、ｄｌ　１０１０が図２（ｄ−ｅ）中に示すように、新形成細胞系２９３，Ｕ２ＯＳ，ＨＳ７００Ｔ、及びＤＬＤ−１を殺したとしても、ｄｌ　１０１０が、テストした最高　ＭＯＩにおいて　ＩＭＲ９０細胞内で複製することができなかったことを示している。図３（ｃ）は、ｄｌ　１５２０ウイルスが　１００の　ＭＯＩにおいてのみ　ＩＭＲ９０細胞を効率的に殺すことができたことを示しており；この高いウイルス投与量において、複製よりもむしろウイルス過負荷の結果として細胞が死ぬ可能性を除外することができない。
【００８５】
　従って、図２（ａ−ｉ）及び３（ａ−ｃ）中に示すデータは、複製−欠陥組換え体アデノウイルス突然変異体が、予測されるように、ｐ５３及び／又はＲｂ機能を欠く新形成細胞を選択的に殺すために使用されることができるということを示している。
【００８６】
　本発明を、理解の明瞭さの目的をもって説明によりいくぶん詳細に記載してきたけれども、特定の変更及び修正がクレームの範囲内で行われることができるということは自明であろう。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、アデノウイルスＥ１ａ−２８９Ｒポリペプチドのドメイン構造及びタンパク質−タンパク質相互作用の略図を示す。
【図２Ａ】図２（ａ−ｉ）は、野生型アデノウイルスと組換え−欠陥の組換えアデノウイルス突然変異体により新形成形質転換されたヒト細胞系と正常ヒト細胞系の感染を示す。図示された各細胞系は、偽−感染、図２（ａ）；又は野生型アデノウイルス２による１．０のＭＯＩにおける感染、図２（ｂ−ｃ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１０１０、図２（ｄ−ｅ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１５２０、図２（ｆ−ｇ）；又は突然変異体誘導体ｄｌ　４３４、図２（ｈ−ｉ）であった。図２（ａ）は、偽−感染９日後の結果を示す。残りのパネルは、以下の感染後期間からの結果を示す：図２（ｂ）、４日間；図２（ｃ）、７日間；図２（ｄ）、８日間；図２（ｅ）、１２日間；図２（ｆ）、１４日間；図２（ｇ）、２０日間；図２（ｈ）、６日間；図２（ｉ）、１４日間。（上記の）感染後の各日に、細胞をＰＢＳにより洗浄して死細胞を除去し、そしてその残りの細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。ＰＢＳ　単独により感染された各細胞系疑似物が、生存力についての対照として含まれた。
【図２Ｂ】図２（ａ−ｉ）は、野生型アデノウイルスと組換え−欠陥の組換えアデノウイルス突然変異体により新形成形質転換されたヒト細胞系と正常ヒト細胞系の感染を示す。図示された各細胞系は、偽−感染、図２（ａ）；又は野生型アデノウイルス２による１．０のＭＯＩにおける感染、図２（ｂ−ｃ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１０１０、図２（ｄ−ｅ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１５２０、図２（ｆ−ｇ）；又は突然変異体誘導体ｄｌ　４３４、図２（ｈ−ｉ）であった。図２（ａ）は、偽−感染９日後の結果を示す。残りのパネルは、以下の感染後期間からの結果を示す：図２（ｂ）、４日間；図２（ｃ）、７日間；図２（ｄ）、８日間；図２（ｅ）、１２日間；図２（ｆ）、１４日間；図２（ｇ）、２０日間；図２（ｈ）、６日間；図２（ｉ）、１４日間。（上記の）感染後の各日に、細胞をＰＢＳにより洗浄して死細胞を除去し、そしてその残りの細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。ＰＢＳ　単独により感染された各細胞系疑似物が、生存力についての対照として含まれた。
【図２Ｃ】図２（ａ−ｉ）は、野生型アデノウイルスと組換え−欠陥の組換えアデノウイルス突然変異体により新形成形質転換されたヒト細胞系と正常ヒト細胞系の感染を示す。図示された各細胞系は、偽−感染、図２（ａ）；又は野生型アデノウイルス２による１．０のＭＯＩにおける感染、図２（ｂ−ｃ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１０１０、図２（ｄ−ｅ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１５２０、図２（ｆ−ｇ）；又は突然変異体誘導体ｄｌ　４３４、図２（ｈ−ｉ）であった。図２（ａ）は、偽−感染９日後の結果を示す。残りのパネルは、以下の感染後期間からの結果を示す：図２（ｂ）、４日間；図２（ｃ）、７日間；図２（ｄ）、８日間；図２（ｅ）、１２日間；図２（ｆ）、１４日間；図２（ｇ）、２０日間；図２（ｈ）、６日間；図２（ｉ）、１４日間。（上記の）感染後の各日に、細胞をＰＢＳにより洗浄して死細胞を除去し、そしてその残りの細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。ＰＢＳ　単独により感染された各細胞系疑似物が、生存力についての対照として含まれた。
【図２Ｄ】図２（ａ−ｉ）は、野生型アデノウイルスと組換え−欠陥の組換えアデノウイルス突然変異体により新形成形質転換されたヒト細胞系と正常ヒト細胞系の感染を示す。図示された各細胞系は、偽−感染、図２（ａ）；又は野生型アデノウイルス２による１．０のＭＯＩにおける感染、図２（ｂ−ｃ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１０１０、図２（ｄ−ｅ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１５２０、図２（ｆ−ｇ）；又は突然変異体誘導体ｄｌ　４３４、図２（ｈ−ｉ）であった。図２（ａ）は、偽−感染９日後の結果を示す。残りのパネルは、以下の感染後期間からの結果を示す：図２（ｂ）、４日間；図２（ｃ）、７日間；図２（ｄ）、８日間；図２（ｅ）、１２日間；図２（ｆ）、１４日間；図２（ｇ）、２０日間；図２（ｈ）、６日間；図２（ｉ）、１４日間。（上記の）感染後の各日に、細胞をＰＢＳにより洗浄して死細胞を除去し、そしてその残りの細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。ＰＢＳ　単独により感染された各細胞系疑似物が、生存力についての対照として含まれた。
【図２Ｅ】図２（ａ−ｉ）は、野生型アデノウイルスと組換え−欠陥の組換えアデノウイルス突然変異体により新形成形質転換されたヒト細胞系と正常ヒト細胞系の感染を示す。図示された各細胞系は、偽−感染、図２（ａ）；又は野生型アデノウイルス２による１．０のＭＯＩにおける感染、図２（ｂ−ｃ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１０１０、図２（ｄ−ｅ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１５２０、図２（ｆ−ｇ）；又は突然変異体誘導体ｄｌ　４３４、図２（ｈ−ｉ）であった。図２（ａ）は、偽−感染９日後の結果を示す。残りのパネルは、以下の感染後期間からの結果を示す：図２（ｂ）、４日間；図２（ｃ）、７日間；図２（ｄ）、８日間；図２（ｅ）、１２日間；図２（ｆ）、１４日間；図２（ｇ）、２０日間；図２（ｈ）、６日間；図２（ｉ）、１４日間。（上記の）感染後の各日に、細胞をＰＢＳにより洗浄して死細胞を除去し、そしてその残りの細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。ＰＢＳ　単独により感染された各細胞系疑似物が、生存力についての対照として含まれた。
【図２Ｆ】図２（ａ−ｉ）は、野生型アデノウイルスと組換え−欠陥の組換えアデノウイルス突然変異体により新形成形質転換されたヒト細胞系と正常ヒト細胞系の感染を示す。図示された各細胞系は、偽−感染、図２（ａ）；又は野生型アデノウイルス２による１．０のＭＯＩにおける感染、図２（ｂ−ｃ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１０１０、図２（ｄ−ｅ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１５２０、図２（ｆ−ｇ）；又は突然変異体誘導体ｄｌ　４３４、図２（ｈ−ｉ）であった。図２（ａ）は、偽−感染９日後の結果を示す。残りのパネルは、以下の感染後期間からの結果を示す：図２（ｂ）、４日間；図２（ｃ）、７日間；図２（ｄ）、８日間；図２（ｅ）、１２日間；図２（ｆ）、１４日間；図２（ｇ）、２０日間；図２（ｈ）、６日間；図２（ｉ）、１４日間。（上記の）感染後の各日に、細胞をＰＢＳにより洗浄して死細胞を除去し、そしてその残りの細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。ＰＢＳ　単独により感染された各細胞系疑似物が、生存力についての対照として含まれた。
【図２Ｇ】図２（ａ−ｉ）は、野生型アデノウイルスと組換え−欠陥の組換えアデノウイルス突然変異体により新形成形質転換されたヒト細胞系と正常ヒト細胞系の感染を示す。図示された各細胞系は、偽−感染、図２（ａ）；又は野生型アデノウイルス２による１．０のＭＯＩにおける感染、図２（ｂ−ｃ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１０１０、図２（ｄ−ｅ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１５２０、図２（ｆ−ｇ）；又は突然変異体誘導体ｄｌ　４３４、図２（ｈ−ｉ）であった。図２（ａ）は、偽−感染９日後の結果を示す。残りのパネルは、以下の感染後期間からの結果を示す：図２（ｂ）、４日間；図２（ｃ）、７日間；図２（ｄ）、８日間；図２（ｅ）、１２日間；図２（ｆ）、１４日間；図２（ｇ）、２０日間；図２（ｈ）、６日間；図２（ｉ）、１４日間。（上記の）感染後の各日に、細胞をＰＢＳにより洗浄して死細胞を除去し、そしてその残りの細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。ＰＢＳ　単独により感染された各細胞系疑似物が、生存力についての対照として含まれた。
【図２Ｈ】図２（ａ−ｉ）は、野生型アデノウイルスと組換え−欠陥の組換えアデノウイルス突然変異体により新形成形質転換されたヒト細胞系と正常ヒト細胞系の感染を示す。図示された各細胞系は、偽−感染、図２（ａ）；又は野生型アデノウイルス２による１．０のＭＯＩにおける感染、図２（ｂ−ｃ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１０１０、図２（ｄ−ｅ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１５２０、図２（ｆ−ｇ）；又は突然変異体誘導体ｄｌ　４３４、図２（ｈ−ｉ）であった。図２（ａ）は、偽−感染９日後の結果を示す。残りのパネルは、以下の感染後期間からの結果を示す：図２（ｂ）、４日間；図２（ｃ）、７日間；図２（ｄ）、８日間；図２（ｅ）、１２日間；図２（ｆ）、１４日間；図２（ｇ）、２０日間；図２（ｈ）、６日間；図２（ｉ）、１４日間。（上記の）感染後の各日に、細胞をＰＢＳにより洗浄して死細胞を除去し、そしてその残りの細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。ＰＢＳ単独により感染された各細胞系疑似物が、生存力についての対照として含まれた。
【図２Ｉ】図２（ａ−ｉ）は、野生型アデノウイルスと組換え−欠陥の組換えアデノウイルス突然変異体により新形成形質転換されたヒト細胞系と正常ヒト細胞系の感染を示す。図示された各細胞系は、偽−感染、図２（ａ）；又は野生型アデノウイルス２による１．０のＭＯＩにおける感染、図２（ｂ−ｃ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１０１０、図２（ｄ−ｅ）；突然変異体誘導体ｄｌ　１５２０、図２（ｆ−ｇ）；又は突然変異体誘導体ｄｌ　４３４、図２（ｈ−ｉ）であった。図２（ａ）は、偽−感染９日後の結果を示す。残りのパネルは、以下の感染後期間からの結果を示す：図２（ｂ）、４日間；図２（ｃ）、７日間；図２（ｄ）、８日間；図２（ｅ）、１２日間；図２（ｆ）、１４日間；図２（ｇ）、２０日間；図２（ｈ）、６日間；図２（ｉ）、１４日間。（上記の）感染後の各日に、細胞をＰＢＳにより洗浄して死細胞を除去し、そしてその残りの細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。ＰＢＳ　単独により感染された各細胞系疑似物が、生存力についての対照として含まれた。
【図３Ａ】図３（ａ−ｃ）は、野生型及び突然変異体アデノウイルスによる正常ヒト肺２倍体繊維芽細胞系ＩＭＲ９０（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１８６）の感染を示す。ＩＭＲ９０細胞は、０．１、１．０、１０、及び１００　に一致するＭＯＩｓにおいて示されたウイルスにより感染された。感染後の所定の日に、細胞をＰＢＳにより洗浄し、そして細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。それぞれの６−ウェル皿の中の１のウェルを、ウイルス感染についての陽性対照として役立つ２９３細胞により接種した。図３（ａ）は、感染後９日目に野生型Ａｄ２により感染された細胞を示す。図３（ｂ）は、感染後９日目にｄｌ　１０１０により感染された細胞を示す。図３（ｃ）は、感染後９日目にｄｌ　１５２０により感染された細胞を示す。
【図３Ｂ】図３（ａ−ｃ）は、野生型及び突然変異体アデノウイルスによる正常ヒト肺２倍体繊維芽細胞系ＩＭＲ９０（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１８６）の感染を示す。ＩＭＲ９０細胞は、０．１、１．０、１０、及び１００　に一致するＭＯＩｓにおいて示されたウイルスにより感染された。感染後の所定の日に、細胞をＰＢＳにより洗浄し、そして細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。それぞれの６−ウェル皿の中の１のウェルを、ウイルス感染についての陽性対照として役立つ２９３細胞により接種した。図３（ａ）は、感染後９日目に野生型Ａｄ２により感染された細胞を示す。図３（ｂ）は、感染後９日目にｄｌ　１０１０により感染された細胞を示す。図３（ｃ）は、感染後９日目にｄｌ　１５２０により感染された細胞を示す。
【図３Ｃ】図３（ａ−ｃ）は、野生型及び突然変異体アデノウイルスによる正常ヒト肺２倍体繊維芽細胞系ＩＭＲ９０（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１８６）の感染を示す。ＩＭＲ９０細胞は、０．１、１．０、１０、及び１００　に一致するＭＯＩｓにおいて示されたウイルスにより感染された。感染後の所定の日に、細胞をＰＢＳにより洗浄し、そして細胞をクリスタル・バイオレットにより染色した。それぞれの６−ウェル皿の中の１のウェルを、ウイルス感染についての陽性対照として役立つ２９３細胞により接種した。図３（ａ）は、感染後９日目に野生型Ａｄ２により感染された細胞を示す。図３（ｂ）は、感染後９日目にｄｌ　１０１０により感染された細胞を示す。図３（ｃ）は、感染後９日目にｄｌ　１５２０により感染された細胞を示す。
【図１】
2004115543.tif 000002
【図２Ａ】
2004115543.tif 000003
【図２Ｂ】
2004115543.tif 000004
【図２Ｃ】
2004115543.tif 000005
【図２Ｄ】
2004115543.tif 000006
【図２Ｅ】
2004115543.tif 000007
【図２Ｆ】
2004115543.tif 000008
【図２Ｇ】
2004115543.tif 000009
【図２Ｈ】
2004115543.tif 000010
【図２Ｉ】
2004115543.tif 000011
【図３Ａ】
2004115543.tif 000012
【図３Ｂ】
2004115543.tif 000013
【図３Ｃ】
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