(57)【要約】【課題】滅菌処理により細胞の吸着能力が低下しないような細胞吸着材、およびそれを用いた摘出体液からの細胞の除去方法および摘出体液処理器を提供すること。【解決手段】光活性化合物を水不溶性担体に固定化したことを特徴とする細胞吸着材および該吸着材を摘出体液と接触させて摘出体液から細胞を除去する方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光活性化合物を水不溶性担体に固定化したことを特徴とする細胞吸着材。
【請求項２】
光活性化合物がポルフィリン系化合物である請求項１に記載の細胞吸着材。
【請求項３】
細胞が腫瘍細胞である請求項１または２に記載の細胞吸着材。
【請求項４】
腫瘍細胞が白血病細胞である請求項３に記載の細胞吸着材。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の吸着材と摘出体液を接触させることを特徴とする、摘出体液からの細胞の除去方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の吸着材を収納した吸着材収納部、摘出体液を前記吸着材収納部に流入させるための摘出体液流入口および前記吸着材収納部に流入した摘出体液を前記吸着材収納部外に流出させるための摘出体液流出口からなることを特徴とする摘出体液処理器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は光活性化合物を水不溶性担体に固定化したことを特徴とする細胞吸着材、摘出体液からの細胞の除去方法および摘出体液処理器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
がん等の腫瘍細胞の治療は抗がん剤などの薬物療法が基本になっている。しかしながら、経口或いは非経口的に投与された薬剤は腫瘍細胞のみならず、正常細胞にも供給されるため、有効量の薬剤を腫瘍細胞に供給するには多量の薬剤投与が必要となる。また、腫瘍細胞以外の組織への副作用も懸念される。このような課題を解決するために、選択的な腫瘍細胞凝集剤であるレクチンタンパク質を固定化した白血病細胞吸着材が知られている。上記吸着材を使用した白血病治療は、薬剤耐性や骨髄移植におけるドナー不足の問題等があり、白血病治療に有効な手段となり得る（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】
特開２００１−１５８７４４号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述したレクチンタンパク質を固定化した吸着材の臨床使用においては、問題点がある。すなわち、感染症を防ぐため吸着材の滅菌が必要となるが、上記吸着材はリガンドにレクチンタンパク質を固定化しているため、高圧蒸気滅菌やガンマ線滅菌等の滅菌においてタンパク質の変性が生じ、吸着能が低下するため、実用性に劣るという問題がある。
【０００５】
上記の課題に鑑み、本発明の目的は、滅菌処理により細胞の吸着能力が低下しないような細胞吸着材、それを用いた摘出体液からの細胞の除去方法および摘出体液処理器を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはかかる目的を達成するために鋭意努力した。すなわち、光活性化合物、特にポルフィリン系化合物をリガンドとして用いることに着目し、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）光活性化合物を水不溶性担体に固定化したことを特徴とする細胞吸着材、（２）光活性化合物がポルフィリン系化合物である上記（１）に記載の細胞吸着材、
（３）細胞が腫瘍細胞である上記（１）または（２）に記載の細胞吸着材、
（４）腫瘍細胞が白血病細胞である上記（３）に記載の細胞吸着材、
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の吸着材と摘出体液を接触させることを特徴とする、摘出体液からの細胞の除去方法、および
（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の吸着材を収納した吸着材収納部、摘出体液を前記吸着材収納部に流入させるための摘出体液流入口および前記吸着材収納部に流入した摘出体液を前記吸着材収納部外に流出させるための摘出体液流出口からなることを特徴とする摘出体液処理器。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の好ましい実施の態様を説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。
【０００９】
本発明の細胞吸着材において、水不溶性担体に固定化される光活性化合物とは、電磁放射線（好ましくは、この放射線は、紫外範囲または可視範囲の波長を有する）に曝されることによって活性化される場合に、例えば腫瘍細胞に細胞障害効果を示す任意の化合物（好ましくは有機化合物）が挙げられる。活性化照射は、分子中の１以上の酸素原子を励起し、１重項酸素状態を形成すると考えられている。励起した１重項酸素は、短時間しか存在しないが、例えば腫瘍細胞の細胞壁を攻撃するには十分な長さであり、これにより腫瘍細胞の壊死が生じる。光活性化合物としては、例えばプソラレン（ＵＶ光によって活性化される）、テキサフリン（可視光によって活性化される）、ポルフィリン系化合物等が挙げられる。これらのなかでも、腫瘍細胞との親和性が高いため、ポルフィリン系化合物が好ましい。
【００１０】
ポルフィリン系化合物としては、ポルフィリン環を有している化合物であれば特に限定されず、該ポルフィリン環の一部が還元または酸化されていてもよく、該ポルフィリン環が置換基を有していてもよく、該ポルフィリン環が金属イオンと錯体を形成していてもよく、また、該ポルフィリン環がアザポルフィリンのように一部置換されていてもよい。ポルフィリン系化合物としては、具体的には、ポルフィリン、アザポルフィリン、フタロシアニン、プロトポルフィリン、ヘマトポルフィリン、ウロポルフィリン、コプロポルフィリン、７−カルボキシポルフィリン、イソコプロポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、メソテトラヒドロキシフェニルクロリン、モノアスパルチルクロリンｅ６、ポルフィマーナトリウム、ベンゾポルフィリン誘導体、クロリン誘導体、イミノクロリンアスパラギン酸誘導体等が挙げられ、これらの化合物は可視光線の照射によって活性化される。
【００１１】
本発明における水不溶性担体には、例えば、ポリアミン、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド等のポリアミン系重合体またはその架橋重合体；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸等の（メタ）アクリル系重合体またはその架橋重合体；ポリ（ｐ−フェニレンエーテルスルホン）等のポリスルホン系重合体またはその架橋重合体；ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−メタクリル酸メチル共重合体等のポリスチレン系重合体またはその架橋重合体；セルロース、セルローストリアセテート等のセルロース系重合体またはその架橋重合体；ポリビニルアルコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ビニルアルコール−メタクリル酸メチル共重合体等のポリビニルアルコール系重合体またはその架橋重合体；アガロース等のアガロース系重合体；キチン、キトサン等のキチン系重合体またはガラス等の無機質担体等が挙げられる。
上記水不溶性担体の形状としては粒子状、繊維状、シート状、中空糸状など任意の形状をとることが出来る。また、上記水不溶性担体は、多孔質のポーラス型又は非多孔質のゲル型のいずれであってもよい。
これらの水不溶性担体は、光活性化合物を、共有結合で担体表面に固定化できるような反応性官能基（例えば、活性ハロゲン基、アミノ基、水酸基、エポキサイド基、カルボキシル基、イソシアン酸基、チオイソシアン酸基、酸無水物基等）を担体の表面に有するものが好ましい。
【００１２】
本発明において「水不溶性担体に固定化」とは、光活性化合物が水不溶性担体表面上に、少なくとも一つ以上のアミド結合、エステル結合、エーテル結合等の共有結合によって、繋がっている状態をいう。
【００１３】
光活性化合物を水不溶性担体に固定化する方法としては、一般にペプチドまたはタンパク質を担体上の固定化する場合に採用される公知の方法に従って行なわれる。その固定化方法としては、例えば、担体が有するアミノ基またはカルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合試薬の存在下で、光活性化合物が有するカルボキシル基またはアミノ基を縮合反応させる方法（縮合法）、担体または光活性化合物が有するカルボキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させることによって、スクシンイミドオキシカルボニル基に変換し、これに光活性化合物または担体が有するアミノ基の部分で反応させる方法（活性エステル法）、担体と光活性化合物をグルタルアルデヒドなどの２個以上の官能基を有する化合物を用いて架橋する方法（担体架橋法）などが挙げられる。
【００１４】
本発明の細胞吸着材は、体液中に含まれる細胞を吸着することが出来るが、特に腫瘍細胞や活性化された細胞をより選択的に吸着することが出来る。
【００１５】
上記の腫瘍細胞としては、例えば、白血病細胞あるいは腫瘍組織から血流内に侵入した腫瘍細胞等が挙げられる。なかでも、白血病細胞は、白血病治療の有効な手段として、本発明の細胞吸着材によって吸着除去されることが好ましい。また、腫瘍組織から血流内に侵入した腫瘍細胞を吸着除去することにより、腫瘍の転移を防止することができる。さらには、本発明の細胞吸着材により単離された腫瘍細胞を検査することで白血病等の診断に利用することができる。
【００１６】
上記の活性化された細胞としては、例えば、活性化白血球等が挙げられる。ここで、「活性化白血球」とは、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、重症筋無力症、潰瘍性大腸炎、クローン病等の自己免疫疾患の病因となる細胞であり、例えば、活性化された好中球、リンパ球、単球、マクロファージ等が挙げられる。該細胞を本発明の細胞吸着材で吸着除去することにより、自己免疫疾患の治療効果が期待できる。
【００１７】
上記細胞吸着材の形状としては粒子状、繊維状、シート状、中空糸状など任意の形状を取ることが出来る。また、上記細胞吸着材は、多孔質のポーラス型又は非多孔質のゲル型のいずれであってもよい。
【００１８】
本発明に用いる細胞吸着材は単独で使用してもよく、また２種以上を混合もしくは積層して使用してもよい。また、他の物質（抗がん剤等）を吸着する吸着材と混合もしくは積層して使用してもよい。他の吸着材としては吸着型人工腎臓に用いられる活性炭等を例示することができる。これにより吸着材の相乗効果によるより相乗的な臨床効果が期待できる。例えば、抗がん剤を吸着する活性炭等の吸着材と混合して使用すると、治療に用いられた余剰の抗がん剤を同時に除去できるため、余剰抗がん剤による副作用の低減が期待できる。また、自己抗体と結合するペプチドを固定化した吸着材等の自己抗体吸着材と同時に使用することで、自己免疫疾患の治療に相乗的な効果が期待できる。
【００１９】
本発明で用いられる光活性化合物を固定化した細胞吸着材は滅菌して使用することが好ましく、滅菌方法としてはオートクレーブ滅菌或いはガンマ線滅菌等が適用できる。
【００２０】
本発明における摘出体液とは、血液、血漿、血清、腹水等の生体由来の液状を意味し、本発明においては摘出された体液、特に腫瘍細胞や活性化された細胞を含む体液が処理の対象である。本発明の細胞の除去方法では、これらのいずれも処理することができるが、なかでも血液を処理するのに好適に用いることができる。
【００２１】
本発明の細胞の除去方法における、光活性化合物を固定化した細胞吸着材と摘出体液を接触させる方法としては、種々の方法がある。例えば、吸着材を血液又は血漿の導出入口を有するカラム等に充填し、血液又は血漿を流す方法が挙げられ、他の方法としては、吸着材と血液又は血漿を混合した後、濾過または遠心分離等により吸着材を除去する方法等が挙げられる。
【００２２】
本発明の摘出体液処理器は、上記細胞吸着材を収納した吸着材収納部、細胞を含有する摘出体液を前記吸着材収納部に流入させるための摘出体液流入口および前記吸着材収納部に流入した摘出体液を前記吸着材収納部外に流出させるための摘出体液流出口から成るものである。
【００２３】
本発明の光活性化合物を固定化した細胞吸着材を収納した吸着材収納部の形状は特に限定されないが、例えば、円筒状のカラム、円盤状プレート等が挙げられるが、摘出体液を吸着材と充分に接触させ、細胞を摘出体液から効率的に除去するためには、円筒状のカラムにするのが好ましい。吸着材収納部の容量は、通常１０ｍＬ〜５００ｍＬ、好ましくは３０ｍＬ〜２５０ｍＬである。摘出体液処理器における摘出体液流入口および摘出体液流出口は、吸着材収納部の互いに異なる任意の位置に設けることができるが、吸着材収納部を流れる摘出体液を細胞吸着材と十分な時間接触させることが好ましいことから、例えば、上記円筒状カラムの場合は、その両端にそれぞれ設けることが望ましい。また、本発明の摘出体液処理器の摘出体液流入口および摘出体液流出口には、光活性化合物を固定化した細胞吸着材が通過できないフィルターまたはメッシュを設けてもよい。
【００２４】
本発明の摘出体液処理器を流れる摘出体液の流量は、通常１０ｍＬ／ｍｉｎ〜２００ｍＬ／ｍｉｎであり、摘出体液を吸着材と充分かつ効率的に接触させるためには、５０ｍＬ／ｍｉｎ〜１５０ｍＬ／ｍｉｎとするのが好ましい。
【００２５】
本発明の摘出体液処理器を用いて摘出体液を処理する方法としては、例えば、血液又は血漿の導出入口を有する通常容量が１０〜５００ｍＬの円筒状カラムに、ポルフィリン系化合物を固定化したセルロース樹脂を、例えば注射用蒸留水、生理食塩水等の充填液とともに充填し、高圧蒸気滅菌等により滅菌したものに、血液を２０ｍＬ／ｍｉｎ〜２００ｍＬ／ｍｉｎまたは血漿を１０ｍＬ／ｍｉｎ〜７０ｍＬ／ｍｉｎで流す方法が挙げられる。
【００２６】
本発明によれば、以上述べてきたように、光活性化合物、特にポルフィリン系化合物を水不溶性担体に固定化した細胞吸着材は体液中の腫瘍細胞や活性化された細胞を高い効率かつ特異的に吸着除去し、簡便である。本発明の吸着材は、血液中に腫瘍細胞や活性化された細胞を有する疾患（例えば、白血病、多発性硬化症、慢性関節リューマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、重症筋無力症、潰瘍性大腸炎、クローン病等）に使用可能であり、薬剤投与なく治療が行なえるため副作用が低減でき、かつ滅菌処理に耐えうるため、有効かつ安全、確実に使用できるものである。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明について、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１
５０％ジオキサン／蒸留イオン水（１３ｍＬ）中に、セルロース粒子（チッソ（株）製、ＣＭセルロファイン）（１０ｇ）を懸濁し、得られた懸濁液にＮａＯＨ（２Ｎ，６．５２ｍＬ）、エピクロロヒドリン（２．６ｍＬ）を加え、混合物を４０℃で２時間攪拌した。得られた混合物を蒸留イオン交換水で洗浄し、吸引濾過した。得られた粒子（８ｇ）に２５％アンモニア水（６．７ｍＬ）を加え、混合物を４０℃で２．５時間攪拌し、得られた混合物を蒸留イオン交換水で洗浄した。得られた粒子を無水ジオキサンで十分洗浄後、該粒子（７ｇ）を、下記の式：
【００２９】
【化１】
2004115468.tif 000002
【００３０】
で表されるポルフィリン化合物（以下、ＮＯＥｔともいう）を１．３６μｍｏｌ／ｍＬ濃度で含有するジオキサン溶液（１５．４ｍＬ）中に懸濁し、該懸濁液にＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドを０．５Ｍの濃度で含有するジクロロメタン溶液（５．６ｍＬ）を加え、室温で一晩攪拌した。得られた懸濁液を吸引濾過し、その濾液およびコントロールとしてＮＯＥｔを１．３６μｍｏｌ／ｍＬ濃度で含有するジオキサン溶液（１５．４ｍＬ）とＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドを０．５Ｍの濃度で含有するジクロロメタン溶液（５．６ｍＬ）の混合溶液を室温で一晩攪拌したものを、分光光度計（日立製Ｕ−２００１）により、ＮＯＥｔの吸収波長６７３ｎｍにおける吸光度を測定したところ、それぞれ１１２と３１８であった。次式より固定化率を算出したところ、固定化率は６５％であった。
2004115468.tif 000003
【００３１】
このようにして、ＮＯＥｔが固定化された吸着材を得た。
【００３２】
実施例２、３　比較例１
白血病細胞の一種である急性リンパ性白血病細胞由来のＴ細胞系Ｊｕｒｋａｔ細胞（大日本製薬製）を、「ＲＰＭＩ１６４０＋ＦＢＳ１０％」（大日本製薬製）培地に懸濁し、細胞数が２×１０５個／ｍＬとなるように調整した。次に、このＪｕｒｋａｔ細胞懸濁液（１．５ｍＬ）に、実施例１で作成した吸着材（実施例２）、実施例１で作成した吸着材を１２１℃で２０分高圧蒸気滅菌処理した吸着材（実施例３）およびセルロース粒子（チッソ（株）製、ＣＭセルロファイン）（比較例１）をそれぞれ１５０ｍｇずつ加え、３７℃で１時間反応させた。十分にピペッティングした後の各液の細胞数を測定し、次式より算出した吸着率の結果を表１に示した。
【００３３】
2004115468.tif 000004
【００３４】
【表１】
2004115468.tif 000005
【００３５】
以上の結果をみるように、ポルフィリン系化合物を固定化した吸着材は、滅菌前および滅菌後ともに高い白血病細胞吸着率を示した。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の細胞吸着材によれば、光活性化合物、特にポルフィリン系化合物を固定化することにより、摘出体液中から腫瘍細胞や活性化された細胞を高い効率でかつ特異的に吸着除去することができる。また、光活性化合物は滅菌処理してもレクチンタンパク質のような変性を伴わず、細胞吸着能が損なわれることがないため、安全かつ確実に使用することができる。