(57)【要約】【課題】高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を高濃度に含有する脂肪酸を、短時間に高分解率で、かつ高収率で製造する方法の提供。【解決手段】次の第一工程及び第二工程を含むＰＵＦＡ高含有脂肪酸の製造方法。第一工程：トリグリセリドに作用するリパーゼをＰＵＦＡ含有油脂に作用させて加水分解した後、遊離脂肪酸を分離し、ＰＵＦＡ高含有油脂を得る工程第二工程：第一工程で得られたＰＵＦＡ高含有油脂に対し、トリグリセリドに作用するリパーゼと部分グリセリドリパーゼを同時に作用させて加水分解し、ＰＵＦＡ高含有脂肪酸を得る工程【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の第一工程及び第二工程を含む高度不飽和脂肪酸高含有脂肪酸の製造方法。
第一工程：トリグリセリドに作用するリパーゼを高度不飽和脂肪酸含有油脂に作用させて加水分解した後、遊離脂肪酸を分離し、高度不飽和脂肪酸の比率を高めた油脂を得る工程
第二工程：第一工程で得られた高度不飽和脂肪酸高含有油脂に対し、トリグリセリドに作用するリパーゼと、部分グリセリドリパーゼを同時に作用させて加水分解することにより、高度不飽和脂肪酸を高濃度に含有する脂肪酸を得る工程
【請求項２】
第一工程で用いるリパーゼが、固定化リパーゼである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
第二工程で用いる２種のリパーゼが、固定化リパーゼであるである請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
固定化リパーゼが、脂溶性脂肪酸又はその誘導体で前処理された固定化担体にリパーゼを固定化したものである請求項２又は３記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高度不飽和脂肪酸を高濃度に含有する脂肪酸を、短時間に高分解率で、かつ高収率で製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等の高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生理活性が注目されており、特にＤＨＡは、血小板凝集抑制作用、血中中性脂肪低下作用、血中コレステロール低下作用、制癌作用、脳機能向上効果等を有することが知られている。このため、ＰＵＦＡを豊富に含む油脂の工業的製造法が精力的に研究開発されている。代表的方法として、リパーゼの脂肪酸選択性を利用してＰＵＦＡ以外の脂肪酸を切断することにより、ＰＵＦＡをグリセリド側に濃縮する方法が多数報告されている。
【０００３】
一方、ＰＵＦＡ高含有グリセリドとしてではなく、遊離酸としてのＰＵＦＡ自体又はこれを高濃度に含有する脂肪酸を製造することも、医薬品開発での利用などにおいて重要な意義がある。この場合にも、ＰＵＦＡ含有油脂のリパーゼによる加水分解が行われるが、通常の手段では分解率やＰＵＦＡ濃度の点で限界がある。このため、２種類のリパーゼを利用することにより、高分解率や高ＰＵＦＡ濃度を達成しようとする技術が提案されている。例えば、ＰＵＦＡの加水分解にトリグリセリド位置選択性を有するリパーゼとトリグリセリド位置選択性を有しないリパーゼを併用することにより、その加水分解率を高め、高収率で中和価の高い脂肪酸を得るという方法（特許文献１参照）、ＤＨＡ含有油脂をキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属由来のリパーゼを用いて加水分解することによりＤＨＡ高含有油脂を得た後、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のリパーゼを用いて加水分解し、ＤＨＡを高濃度に含有する脂肪酸を分取するという方法がある（特許文献２参照）。
【０００４】
しかし、特許文献１の方法は、原料油脂のＰＵＦＡ含有量が低く、分解率を高めても脂肪酸中のＰＵＦＡ濃度が低いままであるという問題がある。また、特許文献２の方法は、第２の加水分解の際に使用するリパーゼが、モノグリセリド又はジグリセリドには作用するが、トリグリセリドに作用しない、いわゆる部分グリセリドリパーゼであるため、トリグリセリド上に濃縮されたＤＨＡを利用できず、高い収率が得られないという問題がある。
【０００５】
【特許文献１】
特開昭６０−１３０３９６号公報
【特許文献２】
特開平０７−５１０７５号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、高度不飽和脂肪酸を高濃度に含有する脂肪酸を、短時間に高分解率で、かつ高収率で製造する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＰＵＦＡ含有油脂をリパーゼを用いて加水分解し、遊離脂肪酸を分離してＰＵＦＡ高含有油脂を得た後、更に、これを特定の２種のリパーゼを同時に作用させて加水分解することにより、ＰＵＦＡを高濃度に含有する脂肪酸が、極めて効率良く高い収率で得られることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、次の第一工程及び第二工程を含むＰＵＦＡ高含有脂肪酸の製造方法を提供するものである。
【０００９】
第一工程：トリグリセリドに作用するリパーゼをＰＵＦＡ含有油脂に作用させて加水分解した後、遊離脂肪酸を分離し、ＰＵＦＡの比率を高めた油脂を得る工程
【００１０】
第二工程：第一工程で得られたＰＵＦＡ高含有油脂に対し、トリグリセリドに作用するリパーゼと、部分グリセリドリパーゼを同時に作用させて加水分解することにより、ＰＵＦＡを高濃度に含有する脂肪酸を得る工程
【００１１】
なお、本発明でいう高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）とは、二重結合を３個以上有する炭素数２０以上の脂肪酸を意味する。具体的には、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）等が好ましいものとして挙げられる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
〔第一工程〕
本発明方法の第一工程において用いられるリパーゼは、通常市販されているものを使用することができるが、固定化することにより、ＰＵＦＡ含有油脂の濃縮率を更に高めることができ、またリパーゼの使用量を低減することもできる。固定化リパーゼは、以下のようにして製造される。
【００１３】
リパーゼの固定化に使用される固定化用担体は、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体；セルロースパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられ、陰イオン交換樹脂、特に多孔性の陰イオン交換樹脂が好ましい。このような多孔質担体は、大きな表面積を有するため、酵素のより大きな吸着量を得ることができる。樹脂の粒子径は１００〜１０００μｍが好ましく、細孔径は１００〜１５００Åが好ましい。材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられ、特にフェノールホルムアルデヒド系樹脂（例えば、Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａｓｓ社のＤｕｏｌｉｔｅ  Ａ−５６８）が好ましい。
【００１４】
トリグリセリドに作用するリパーゼとしては、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属などが挙げられるが、特にキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属由来のものが好ましい。また用いるリパーゼ量は、担体重量に対して５〜１００％、特に１０〜５０％が望ましい。固定化の際、リパーゼは溶液状態にするが、酵素の変性が起きないような範囲であればよく、緩衝液でｐＨ３〜９に調整して使用することが望ましい。また、固定化時の温度は０〜６０℃、特に５〜４５℃が好ましい。
【００１５】
リパーゼの固定化後、脂肪酸トリグリセリド又は脂肪酸部分グリセリドと接触させる。固定化リパーゼと接触させる脂肪酸トリグリセリド及び脂肪酸部分グリセリドとしては、菜種油、大豆油、ひまわり油等の植物性の液状油脂、イワシ油、マグロ油、カツオ油等の魚油、鯨油等の海獣油、これらから誘導されるモノグリセリド及びジグリセリド、更にはこれらの混合物、またこれらの油脂から得られるエステル交換油脂等も使用できる。これらは、２種以上併用してもよい。使用される脂肪酸グリセリドの量は、固定化リパーゼとの接触を十分なものとし、かつ過剰量の使用による無駄を回避する観点から、担体重量に対して１００〜３０００％、特に２５０〜２０００％が好ましい。接触方法は、浸漬、攪拌、固定化酵素を充填したカラムにポンプ等で通液する等いずれの方法でもよい。接触温度は５〜４０℃、接触時間は２〜４８時間が好ましい。この接触が終わったところで濾過し、固定化リパーゼを回収する。このような処理により、脂肪酸グリセリドの加水分解が起こるため固定化リパーゼ中の残存水分が消費され、酵素水分量を低減させることができる。これによりリパーゼの構造を維持しうる水分を保持したまま、過剰水分を除去し、リパーゼ近傍が反応に適した状態になるものと考えられる。上記処理は、濾過・回収後の固定化リパーゼの水分量は、担体重量に対して２０〜１００％、特に４０〜７０％の範囲となるように行うのが好ましい。
【００１６】
この固定化リパーゼは、真空又は減圧乾燥を経る通常の調製法により得られた固定化リパーゼと異なり、失活を招くこともないが、油脂の到達分解率の高さは、酵素活性の高さとは無関係であるため、本発明のような高い分解率が得られることは、驚異的である。これにより、魚油自体のようにＰＵＦＡ含有率が低い油脂を原料にした場合であっても、あらかじめウィンタリング等によってある程度ＰＵＦＡ含有率を高める前処理を行わなくても、直接加水分解に付することで、グリセリド中に蓄積されるＰＵＦＡの含有率を、従来不可能であった程度まで高めることができる。
【００１７】
また、固定化リパーゼの活性を高めるために、リパーゼの固定化前にあらかじめ脂溶性脂肪酸又はその誘導体を担体に吸着させる処理を施してもよい。使用する脂溶性脂肪酸としては、炭素数８〜１８の飽和又は不飽和の、直鎖又は分岐鎖の、水酸基が置換していてもよい脂肪酸が挙げられる。具体的には、カプリン酸、ラウリン酸、ミスチリン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、リシノール酸、イソステアリン酸等が挙げられる。またその誘導体としては、これらの脂肪酸と一価又は多価アルコールとのエステル、リン脂質、及びこれらのエステルにエチレンオキサイドを付加した誘導体が挙げられる。具体的には、上記脂肪酸のメチルエステル、エチルエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、それらのエチレンオキサイド付加体、ポリグリセリンエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル等が挙げられる。これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体は、２種以上を併用してもよい。
【００１８】
これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体と担体の接触法としては、水又は有機溶剤中にこれらを直接加えてもよいが、分散性を良くするため、有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散、溶解させた後、水に分散させた担体に加えてもよい。この有機溶剤としては、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等が挙げられる。脂溶性脂肪酸又はその誘導体の使用量は、担体重量に対して１〜５００％、特に１０〜２００％が好ましい。接触温度は０〜１００℃、特に２０〜６０℃が好ましく、接触時間は５分〜５時間程度が好ましい。この処理を終えた担体は、乾燥してもよい。乾燥温度は室温〜１００℃が好ましく、減圧乾燥を行ってもよい。
【００１９】
第一工程においては、ＰＵＦＡ含有油脂にリパーゼ、あるいは前記固定化リパーゼを作用させて加水分解した後、遊離脂肪酸を分離し、ＰＵＦＡ高含有油脂を製造する。反応の具体的態様としては、ＰＵＦＡ含有油脂にリパーゼ、あるいは固定化リパーゼを添加し、更に水を添加して、一定温度で攪拌しながら加水分解反応を行う方法、固定化リパーゼをカラム（固定床）に充填し、そこへＰＵＦＡ含有油脂と水の混合液を通液循環させる方法等がある。
【００２０】
加水分解に使用するＰＵＦＡ含有油脂としては、ＤＨＡ等のＰＵＦＡを構成脂肪酸の一部に含んだトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド及びこれらの混合物のいずれでもよい。一般的にはイワシ油、マグロ油、カツオ油等の魚油、鯨油等の海獣油が挙げられる。また市販されているＤＨＡ含有油脂を用いてもよい。
【００２１】
反応に用いるリパーゼ量は、リパーゼの活性を考慮して適宜決定することができるが、分解する油脂重量に対して０．３〜３０％、特に２〜１５％が好ましい。また水の量は、分解する油脂重量に対して、１０〜２００％、特に２０〜１００％が好ましい。水は、蒸留水、イオン交換水、水道水、井戸水等いずれのものでも構わない。必要に応じて、リパーゼの安定性が維持できるようにｐＨ３〜９の緩衝液を用いてもよい。
【００２２】
反応温度は、リパーゼが失活せず、分解により生じた遊離脂肪酸が結晶とならない温度である２０〜７０℃、特に３０〜５０℃が好ましい。また反応は、空気との接触が出来るだけ回避されるように、不活性ガス存在下で行うことが望ましい。
【００２３】
加水分解反応は、以下の式（１）で示される分解率によって管理し、所定の分解率に到達した時点で終了すればよい。分解率の上昇と共に、未分解のグリセリド中に蓄積されるＰＵＦＡの含有率が増大する。
【００２４】
式（１）：  分解率（％）＝反応油の酸価（ＡＶ）／原料油のケン化価（ＳＶ）×１００
【００２５】
以上の分解反応で得られた反応油は、遊離脂肪酸、未分解のモノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドを含んでいる。これらの混合物から遊離脂肪酸を分離することで、ＰＵＦＡ高含有油脂を製造することができる。
【００２６】
〔第二工程〕
第二工程においては、第一工程で得られたＰＵＦＡ高含有油脂に対し、トリグリセリドに作用するリパーゼと部分グリセリドリパーゼの２種のリパーゼを作用させて加水分解を行う。これら２種のリパーゼは、同時にＰＵＦＡ高含有油脂に作用させる必要があり、これにより、ＰＵＦＡ高含有脂肪酸が短時間に高分解率で、かつ高い収率で得られる。
【００２７】
第二工程に使用するトリグリセリドに作用するリパーゼとしては、第一工程に用いたものと同様のものが挙げられる。
【００２８】
第二工程に用いる他のリパーゼである部分グリセリドリパーゼは、モノグリセリド及びジグリセリドの部分グリセリドを加水分解するが、トリグリセリドを加水分解しないリパーゼである。部分グリセリドリパーゼとしては、ラット小腸、ブタ脂肪組織などの動物臓器由来のモノグリセリドリパーゼ又はジグリセリドリパーゼ；バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ｈ−２５７由来モノグリセリドリパーゼ（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２７，  ４１９−４２５，  ２０００）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＬＰ７３１５由来モノグリセリドリパーゼ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ９１（１），  ２７−３２，  ２００１）、ペニシリウム・サイクロピウム由来リパーゼ（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ８７（１），  ２０５−２１１，  １９８０）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）Ｕ−１５０由来リパーゼ（Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ７２（３），  １６２−１６７，  １９９１）等が挙げられ、中でもペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のリパーゼが好ましい。市販品としては、例えば「リパーゼＧ「アマノ」５０」（天野エンザイム社）等がある。
【００２９】
これら２種のリパーゼとして、固定化リパーゼを使用することにより、ＰＵＦＡ高含有油脂の分解率を更に高めることができ、またリパーゼの使用量を低減することもできる。
【００３０】
リパーゼの固定化に使用される固定化用担体は、第一工程で使用する固定化リパーゼと同様のものが好ましく、また、脂溶性脂肪酸又はその誘導体で前処理された固定化担体を使用することが好ましいのも、第一工程の固定化リパーゼと同様である。その他、トリグリセリドに作用するリパーゼの固定化条件は第一工程の固定化リパーゼと同様である。
【００３１】
部分グリセリドリパーゼの固定化温度は、酵素の失活の起きない温度であればよく、０〜６０℃、特に５〜４５℃が好ましい。また固定化に用いる酵素水溶液のｐＨは、酵素の変性が起きないような範囲であればよく、ｐＨ３〜９が好ましい。特に至適ｐＨが酸性とされているリパーゼを用いる場合に最大の活性を得るには、ｐＨ４〜６とするのがよい。また酵素水溶液に用いる緩衝液としては、一般的な酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。酵素水溶液中の部分グリセリドリパーゼの濃度は、固定化効率の点から、該酵素の溶解度以下で、かつ十分な濃度であることが望ましい。また必要に応じて不溶部を遠心分離により除去し、上清を使用してもよい。また部分グリセリドリパーゼと固定化担体の使用割合は、固定化担体１重量部に対して、部分グリセリドリパーゼ０．０５〜１０重量部、特に０．１〜５重量部が好ましい。
【００３２】
また、２種のリパーゼともに、固定化担体に吸着後、第一工程の固定化リパーゼと同様の方法により酵素水分量を低減させることが好ましい。
【００３３】
第二工程の加水分解反応に用いるリパーゼ量は、それらの活性を考慮して適宜決定することができるが、トリグリセリドに作用するリパーゼ、部分グリセリドリパーゼのいずれも、ＰＵＦＡ高含有油脂重量に対して１〜３０％、特に５〜１５％が好ましい。また水の量は、ＰＵＦＡ高含有油脂重量に対して、１０〜２００％、特に２０〜１００％が好ましい。水は、蒸留水、イオン交換水、水道水、井戸水等いずれのものでも構わない。必要に応じて、リパーゼの安定性が維持できるようにｐＨ３〜９の緩衝液を用いてもよい。
【００３４】
反応温度は、リパーゼが失活せず、分解により生じた遊離脂肪酸が結晶とならない温度である２０〜６０℃、特に３０〜５０℃が好ましい。また反応は、空気との接触が出来るだけ回避されるように、不活性ガス存在下で行うことが望ましい。
【００３５】
第二工程の加水分解反応も、前述の式（１）で示される分解率によって管理し、所定の分解率に到達した時点で終了すればよい。分解率の上昇と共に、ＰＵＦＡを高濃度に含有する脂肪酸の生成が増大する。
【００３６】
以上の分解反応で得られた反応油は、ＰＵＦＡ高含有油脂を含む脂肪酸混合物のほか、未分解のグリセリドを含んでいる。これらの混合物から脂肪酸成分を分取することで、ＰＵＦＡ高含有脂肪酸を得ることができる。すなわち、反応混合物からリパーゼ、グリセリン等を含む水相を除去した後、クロマトグラフィー、分子蒸留、液液分配、結晶分別、脱酸法等の公知の分別手段により、遊離脂肪酸画分を分取することにより、ＰＵＦＡ高含有脂肪酸が得られる。
【００３７】
【実施例】
〔固定化酵素製造法〕
Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ−５６８（Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａｓｓ社製）１０ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬ中で１時間攪拌した。その後、１００ｍＬの蒸留水で１時間洗浄し、５００ｍＭのリン緩衝液（ｐＨ７）１００ｍＬで２時間ｐＨの平衡化を行った。その後５０ｍＭのリン緩衝液（ｐＨ７）１００ｍＬで２時間ずつ２回、ｐＨの平衡化を行った。この後濾過を行い担体を回収した後、エタノール５０ｍＬでエタノール置換を３０分間行った。濾過した後、リシノール酸を１０ｇ含むエタノール５０ｍＬを加え３０分間、リシノール酸を担体に吸着させた。この後濾過し、担体を回収した後、５０ｍＭのリン緩衝液（ｐＨ７）５０ｍＬで４回洗浄し、エタノールを除去し、濾過して担体を回収した。その後市販のトリグリセリドに作用するリパーゼ（リパーゼＡＹ「アマノ」３０Ｇ，天野エンザイム社）の１０％溶液２００ｍＬと４時間接触させ、固定化を行った。濾過し、固定化酵素を回収して、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ７）５０ｍＬで洗浄を行い、固定化していない酵素や蛋白を除去した。以上の操作はいずれも２０℃で行った。固定化後の酵素液の残存活性と固定化前の酵素液の活性差より固定化率を求めたところ、９５％であった。その後、菜種油４０ｇを加え、４０℃、２時間攪拌した後、濾過して菜種油と分離し、固定化酵素とした。こうして得られた固定化酵素を、使用前に実際に反応を行う基質であるＰＵＦＡ含有油脂で洗浄した。
また、部分グリセリドリパーゼを固定化する場合には、上記リン緩衝液（ｐＨ７）の代わりに酢酸緩衝液（ｐＨ５）を用い、同様に担体の前処理を行った。処理後、市販の部分グリセリドリパーゼ（リパーゼＧ「アマノ」５０，天野エンザイム社）の１０％溶液と２時間接触させ、固定化を行った。洗浄後、大豆脂肪酸４０ｇを加え、４０℃下で減圧脱水を行った。その後、濾過して大豆脂肪酸と分離し、固定化酵素とした。こうして得られた固定化酵素を、使用前に実際に反応を行う基質であるＰＵＦＡ含有油脂で洗浄した。
【００３８】
〔第一工程〕
洗浄した固定化リパーゼＡＹ（トリグリセリドに作用するリパーゼ）５ｇ（乾燥重量）を１００ｍＬ容の四つ口フラスコに秤量した。そこへマグロ脱酸油（ＤＨＡ含有率２２％）５０ｇと蒸留水３０ｇを添加し、窒素気流下で攪拌しながら４０℃で７８時間、反応を行った。反応液を遠心分離（５，０００×ｇ，３０分）し、油相部の酸価（ＡＶ）を測定し、式（１）より分解率を算出した。分解率は７３％であった。その後、油相部を分子蒸留して遊離脂肪酸を分離し、ＰＵＦＡ高含有油脂を得た。ＧＣで脂肪酸分析を行ったところＤＨＡ含有率は４６％であり、ＰＵＦＡの比率が高められていた。
【００３９】
実施例１
トリグリセリドに作用するリパーゼ（リパーゼＡＹ「アマノ」３０Ｇ，天野エンザイム社）と部分グリセリドリパーゼ（リパーゼＧ「アマノ」５０，天野エンザイム社）各２ｇを１００ｍＬ容の四つ口フラスコに秤量した。そこへ第一工程で得られたＰＵＦＡ高含有油脂（ＤＨＡ含有率４６％）５０ｇと蒸留水３０ｇを添加し、窒素気流下で攪拌しながら４０℃で７１時間、反応を行った。その後、反応液を遠心分離（１，０００×ｇ，５分）し、油相部をＴＬＣプレートに展開（展開溶媒：クロロホルム／アセトン／メタノール＝９３．５／４．５／２．０ｖｏｌ％）して各グリセリドに分画、酢酸エチルで溶離させ、脱溶剤後、ＧＣで脂肪酸組成分析を行った。結果を表１に示す。
到達分解率は８１．３％と高く、脂肪酸中のＤＨＡ含有率も４５％と高かった。
【００４０】
実施例２
洗浄した固定化リパーゼＡＹ（トリグリセリドに作用するリパーゼ）と洗浄した固定化リパーゼＧ（部分グリセリドリパーゼ）各５ｇ（乾燥重量）を１００ｍＬ容の四つ口フラスコに秤量した。そこへ第一工程で得られたＰＵＦＡ高含有油脂（ＤＨＡ含有率４６％）５０ｇと蒸留水３０ｇを添加し、窒素気流下で攪拌しながら４０℃で６８時間、反応を行った。
到達分解率は９０．１％と高く、脂肪酸中のＤＨＡ含有率も４６％と高かった。
【００４１】
比較例１
トリグリセリドに作用するリパーゼ（リパーゼＡＹ）２ｇを１００ｍＬ容の四つ口フラスコに秤量した。そこへ第一工程で得られたＰＵＦＡ高含有油脂（ＤＨＡ含有率４６％）５０ｇと蒸留水３０ｇを添加し、攪拌しながら４０℃で７１時間、反応を行った。
到達分解率は４４．２％と低く、高分解率を達成できなかった。
【００４２】
比較例２
部分グリセリドリパーゼ（リパーゼＧ）２ｇを１００ｍＬ容の四つ口フラスコに秤量した。そこへ第一工程で得られたＰＵＦＡ高含有油脂（ＤＨＡ含有率４６％）５０ｇと蒸留水３０ｇを添加し、窒素気流下で攪拌しながら４０℃で７１時間、反応を行った。
到達分解率は２４．３％と低く、高分解率を達成できなかった。
【００４３】
比較例３
トリグリセリドに作用するリパーゼ（リパーゼＡＹ）２ｇを１００ｍＬ容の四つ口フラスコに秤量した。そこへ第一工程で得られたＰＵＦＡ高含有油脂（ＤＨＡ含有率４６％）５０ｇと蒸留水３０ｇを添加し、窒素気流下で攪拌しながら４０℃で４７時間、反応を行った。その後、部分グリセリドリパーゼ（リパーゼＧ）を２ｇ添加し、さらに２４時間（計７１時間）反応を行った。
到達分解率は７３．９％と低く、高分解率を達成できなかった。
【００４４】
【表１】
2004208546.tif 000002
【００４５】
【発明の効果】
本発明の製造方法によれば、ＰＵＦＡを高濃度に含有する脂肪酸が、極めて効率よく高い収率で得られる。