(57)【要約】【課題】  動物組織由来物質から、比較的低濃度でも高感度で迅速かつ簡便に、病原性プリオン蛋白質を検出できる病原性プリオン蛋白質の検出方法を提供すること。【解決手段】  動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均一化する第１の工程と、前記均一化物を微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて分解処理する第２の工程と、前記第２の工程で分解された均一化物から病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を得る第３の工程とを有する病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮工程を経て、更に、前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を溶剤に溶解して前記濃縮物の溶解物を得る第４の工程と、この溶解物中の前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を吸着面に結合させる第５の工程と、結合された前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を発色させる第６の工程とを行う、病原性プリオン蛋白質の検出方法。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法において、
前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均  一化する第１の工程と、
前記第１の工程で得られた均一化物を、微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて  分解処理する第２の工程と、
前記第２の工程で分解された前記均一化物から病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含  有する濃縮物を得る第３の工程と
を有する前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮工程を経て、更に、
前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を溶剤に溶解して前記濃縮物  の溶解物を得る第４の工程と、
この溶解物中の前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を吸着面に結合させる第５の工  程と、
前記第５の工程において結合された前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を検出する  第６の工程と
を有する、病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項２】
前記動物組織由来物質を中枢神経系組織とし、前記界面活性剤をＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールからなる界面活性剤とする、請求項１に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項３】
前記中枢神経系組織を脳組織とする、請求項２に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項４】
前記動物組織由来物質を細網リンパ系組織とし、前記界面活性剤をｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールからなる非イオン性界面活性剤とする、請求項１に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項５】
前記細網リンパ系組織を脾臓組織とする、請求項４に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項６】
前記第２の工程において、前記分解酵素としてコラーゲン分解酵素及びＤＮＡ分解酵素を用いて前記均一化物を分解し、さらに微生物プロテアーゼを含む蛋白質分解酵素を用いて分解する、請求項１に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項７】
前記微生物プロテアーゼが、プロテイナーゼＫである、請求項１ないし６のいずれか１項に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項８】
前記濃縮工程中に、前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を分解酵素を用いて分解し、次いで分離後に塩析処理を施す工程を更に有する、請求項１に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項９】
前記濃縮工程中に、前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を界面活性剤で洗浄する洗浄工程を更に有する、請求項１に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項１０】
前記界面活性剤をＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネートからなる界面活性剤とする、請求項９に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項１１】
前記第４の工程における前記溶剤がグアニジンチオシアネートを含む溶剤である、請求項１に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項１２】
１〜５モル濃度の前記グアニジンチオシアネートを使用する、請求項１１に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項１３】
前記吸着面を一次抗体で形成し、この一次抗体と前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質との抗原−抗体複合体を前記吸着面に結合させる、請求項１に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項１４】
前記第６の工程において、前記吸着面に結合させた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を酵素標識抗体と発色基質とを用いて発色させ、その発色を検出する、請求項１３に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項１５】
前記第６の工程において、前記吸着面に結合させた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を酵素標識抗体と蛍光基質とを用い、蛍光によって検出する、請求項１３に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項１６】
前記第６の工程において、前記吸着面に結合させた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を酵素標識抗体と発光基質とを用い、発光によって検出する、請求項１３に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
【請求項１７】
動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法の実施に際し、検出されるべき病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を濃縮する方法において、
前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均  一化する第１の工程と、
前記第１の工程で得られた均一化物を、微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて  分解処理する第２の工程と、
前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質  を含有する濃縮物を得る第３の工程と
を有する濃縮方法。
【請求項１８】
界面活性剤がＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項１７に記載の濃縮方法。
【請求項１９】
前記動物組織由来物質を中枢神経系組織とする、請求項１７又は１８に記載の濃縮方法。
【請求項２０】
前記中枢神経系組織を脳組織とする、請求項１９に記載の濃縮方法。
【請求項２１】
前記第２の工程において、前記分解酵素としてコラーゲン分解酵素及びＤＮＡ分解酵素を用いて前記均一化物を分解し、さらに微生物プロテアーゼを含む蛋白質分解酵素を用いて分解する、請求項１７に記載の濃縮方法。
【請求項２２】
前記微生物プロテアーゼが、プロテイナーゼＫである、請求項１７から２１のいずれか１項に記載の濃縮方法。
【請求項２３】
前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて分解し、次いで分離後に塩析処理を施す工程を更に有する、請求項１７に記載の濃縮方法。
【請求項２４】
前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を界面活性剤で洗浄する洗浄工程を更に有する、請求項１７に記載の濃縮方法。
【請求項２５】
動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法の実施に際し、検出されるべき病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を濃縮する方法において、
前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均  一化する第１の工程と、
前記第１の工程で得られた均一化物を、微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて  分解処理する第２の工程と、
前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質  を含有する濃縮物を得る第３の工程と、
前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を  Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネートからなる界  面活性剤で洗浄する洗浄工程と
を有する濃縮方法。
【請求項２６】
前記動物組織由来物質を細網リンパ系組織とする、請求項２５に記載の濃縮方法。
【請求項２７】
前記細網リンパ系組織を脾臓組織とする、請求項２６に記載の濃縮方法。
【請求項２８】
前記第２の工程において、前記分解酵素としてコラーゲン分解酵素及びＤＮＡ分解酵素を用いて前記均一化物を分解し、さらに微生物プロテアーゼを含む蛋白質分解酵素を用いて分解する、請求項２５に記載の濃縮方法。
【請求項２９】
動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法の実施に際し、検出されるべき病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を濃縮するための試薬キットであって、
前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均  一化する第１の工程と、
前記第１の工程で得られた均一化物を、微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて  分解処理する第２の工程と、
前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質  を含有する濃縮物を得る第３の工程と
を有する濃縮方法を実施するための、
（ａ）界面活性剤を含有する動物組織由来物質の均一化試薬、および
（ｂ）微生物プロテアーゼを含有する分解酵素試薬
を含む組み合わせからなる、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮試薬キット。
【請求項３０】
病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の溶剤を含有する溶解試薬をさらに含む、請求項２９記載のキット。
【請求項３１】
前記界面活性剤が、サーコシル、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項２９または３０記載のキット。
【請求項３２】
前記微生物プロテアーゼが、コラーゲン分解酵素およびプロテイナーゼＫから選択される少なくとも１つの酵素である、請求項２９、３０または３１記載のキット。
【請求項３３】
前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の溶剤が、グアニジンチオシアネートである、請求項３０、３１または３２記載のキット。
【請求項３４】
動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出するための試薬キットであって、
前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均  一化する第１の工程と、
前記第１の工程で得られた均一化物を、微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて  分解処理する第２の工程と、
前記第２の工程で分解された前記均一化物から病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含  有する濃縮物を得る第３の工程と
を有する前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮工程を経て、更に、
前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を溶剤に溶解して前記濃縮物  の溶解物を得る第４の工程と、
この溶解物中の前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を吸着面に結合させる第５の工  程と、
前記第５の工程において結合された前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を検出する  第６の工程と
を有する、病原性プリオン蛋白質の検出方法を実施するための、
（ａ）界面活性剤を含有する動物組織由来物質の均一化試薬、
（ｂ）微生物プロテアーゼを含有する分解酵素試薬、
（ｃ）病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の溶剤を含有する溶解試薬、
（ｄ）プリオン蛋白質由来蛋白質に結合し得る抗体を含有する抗体試薬、および
（ｅ）コントロール試薬
を含む組み合わせからなる、病原性プリオン蛋白質の検出試薬キット。
【請求項３５】
前記界面活性剤が、サーコシル、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項３４記載のキット。
【請求項３６】
前記微生物プロテアーゼが、コラーゲン分解酵素およびプロテイナーゼＫから選択される少なくとも１つの酵素である、請求項３４または３５記載のキット。
【請求項３７】
前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の溶剤が、グアニジンチオシアネートである、請求項３４、３５または３６記載のキット。
【請求項３８】
前記抗体が、酵素標識抗体である、請求項３４、３５、３６または３７記載のキット。
【請求項３９】
酵素標識抗体中の酵素の基質を含有する基質溶液をさらに含む、請求項３８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法、さらに、この検出方法の実施に際し、検出されるべき前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を濃縮する、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮方法、並びにその濃縮又は検出試薬キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プリオン病の１つであるスクレーピーは、羊において約２００年以上前から西ヨーロッパで深刻な病気として知られていた。また、近年、英国でスクレーピー感染羊を未加熱のまま牛飼料として投与し、狂牛病（牛海綿状脳症：ＢＳＥ；Bovine Spongiform Encephalopathy）の大発生を起こした。
【０００３】
また、狂牛病の牛クズ肉を食することと、人プリオン病の１つであるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ； Creutfelt Jakob Disease）の新型のものとの因果関係も指摘されている。即ち、人類にとって重要な動物性蛋白質資源である羊肉やその乳、牛肉や牛乳に関して、危機的な汚染が進行しているといっても過言ではない。
【０００４】
しかしながら、プリオン病は、これまでに報告された伝染性細菌、ウイルス性疾患等とは異なり、その病原性物質が本来生体に存在する蛋白質であること、伝播機能が新しいこと、発病までに比較的長時間を有すること、病原性の失活が困難であることなどから、有効な診断方法及び予防方法の開発が遅れている。
【０００５】
現在行われている最も高感度な病原性プリオン蛋白質（異常プリオン蛋白質）の検出方法として、羊のスクレーピーに関して、発病前の低濃度での病原性プリオン蛋白質を検出するウエスタンブロット法（ＷＢ法；Western Blotting）が開発されている。
【０００６】
しかしこの方法は、病原物質の蓄積部位の相違や、この方法を実施するのに時間がかかることや処理頭数などの関係から、牛に関しての適用は困難である。即ち、迅速な処理は困難である。
【０００７】
上述した方法以外では、病原性プリオン蛋白質に対する抗体を用いた免疫組織染色や病理所見による感染牛の検出法が広く実施されているのが現状である。
【０００８】
しかしながら、これらの方法は、発病後顕著な神経症状を呈したり、死亡した家畜に関し有効なものであり、潜伏期間にある家畜の安全性、言い換えれば、屠蓄場まで、見かけ上、正常な牛についての安全性が確保できなかった。
【０００９】
近年、海外から、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immnosorbent assay）や、尿や血液による診断方法の報告もあるが、その感度や特異性には疑問があった。
【００１０】
即ち、目的とする病原物質に含まれる病原性プリオン蛋白質をその測定試料調製段階で濃縮し、また、ＥＬＩＳＡ法用のマイクロタイタープレートへ効率良く吸着させれば、検出感度を向上させることができるが、これまでの方法では検出感度上の限界があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ：ウェールズ他、１９８７年）は、食事として与えられた肉や骨髄を介してスクレーピーに汚染された羊のくず肉が畜牛の飼料に含まれていたために発生し、その結果新しく感染した畜牛材が再循環した（ウイルスミス他、１９９３年）ことは明らかであった。
【００１２】
その後英国では、ネコ科の動物と同様に数種の捕獲有蹄動物（ワイアット他、１９９１年）が再度、海綿状脳症を発病している。これら全てのケースにおいて、ＢＳＥは汚染された飼料を介して発生したものと考えられる
【００１３】
ウイル他が行った（１９９６年）英国におけるクロイッフェルト−ヤコブ病（ＣＩＪ）の特殊な例に関する報告では、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）又はプリオン病の当グループにおける人間変異体の一つが報告されているが、それによると、ＢＳＥが人間に伝染する可能性（ウイル他、１９９６年）が示唆されている。このため全てのＴＳＥについて、種を越えて発生する（ディリンガー、１９９５年）可能性が一般的に考えられる。
【００１４】
現在の調査最優先事項は、スクレーピーやＢＳＥに感染している動物及び材料を検知し、感染の拡大や食物連鎖システムへの侵入を防ぐ方法を開発することにある。
【００１５】
残念ながら今までのところ、これらの防止方法や管理対策、又スクレーピー及びＢＳＥの撲滅プログラムは、診断の困難さから上手く捗っているとは言えない。
【００１６】
現在使用されている診断方法で最も一般的な方法は、中枢神経系の代表的な海綿変化が顕著に認められる場合に感染と診断する組織病理学的方法（フレイサー、１９７６年）と、プロテイナーゼＫ処理法に対して部分的に耐性を示すほか（ボルトン他、１９８２年；ディリンガー他、１９８３年）、中性界面活性剤により抽出できない（メイヤー他、１９８６年；ボルトン他、１９８７年）と言う特性を有するがために正常なプリオン蛋白質（ＰｒＰｃ）と区別することができるプリオン蛋白質のスクレーピー特殊イソフォーム（ＰｒＰsc）検出方法の二つである。
【００１７】
また、最近になって、羊の生検扁桃組織を使用した免疫組織化学アッセイによる細網リンパ系臓器内のＰｒＰsc検出方法が報告された（シュルーダー他、１９９６年）。しかしながら、牛では、細網リンパ系臓器において異常プリオンの蓄積が顕著でないために、この方法は適さない。
【００１８】
その反面、組織病理学は、潜伏期間中での中枢神経系の病理学的変化が後になって発生するため、前記ＰｒＰsc検出法と比較した場合、実験用のスクレーピー及びＢＳＥの両者（ボルトン他、１９９１年；ジェンドロスカ他、１９９１年）でその使用有効性が低減している。
【００１９】
最近では、プリオン病の重大性が高まってきているため、羊や畜牛を屠殺時に選別するためのより感度の高い診断方法が求められている。
【００２０】
選別方法としてはＥＬＩＳＡ法が適切な方法と言えるが、現在、この方法はＴＳＥの基本的な研究のみで使用されているにすぎない（カスクザック他、１９８７年、サファー他、１９９０年；サーバン他、１９９０年）。これらの研究では、高純度ＰｒＰscのみがマイクロタイタプレートに吸着されているが、診断においては原組織抽出液の使用も必要となる。
【００２１】
上述したように、プリオン病のうち、人類に対して最も大きな脅威となる疾病の１つに牛海綿状脳症（ＢＳＥ）が挙げられる。
【００２２】
この疾病は外来の病原性プリオン蛋白質が引き金となり、家畜体内の中枢神経等に病原性プリオン蛋白質を蓄積し、神経症状を呈して死亡に至る疾病であり、病原性物質としての病原性プリオン蛋白質の蓄積濃度と病気の進行具合とは顕著に比例する。
【００２３】
そのため、罹患後、潜伏期間中には病原性物質の蓄積濃度が低いため、特異的で高感度の検出方法が必要であった。また、全世界で処理される牛の頭数を考慮すれば、測定試料の調製法（即ち、濃縮法）並びに検出法は、簡便性、正確性、迅速性、経済性等が必要であることは言うまでもない。
【００２４】
他方、本疾病は、罹患した牛の中枢神経系臓器を食することによる人間への伝播性が強く示唆されている。これらの問題を解決するためには、広く検疫調査を行い、本疾病に罹った羊や牛などを見出し、食物連鎖の初期の段階での駆除が有効である。
【００２５】
本発明は、上述した従来の実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、動物組織由来物質から、比較的低濃度でも迅速かつ簡便に、そして高感度で組織特異的に病原性プリオン蛋白質を検出できる病原性プリオン蛋白質の検出方法、および、その検出方法の実施に際し、検出されるべき前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を濃縮する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明者は、上述した課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法において、検出対象となる動物組織由来物質の種類に応じて、使用する調製剤（特に界面活性剤）や調製方法、検出方法を適宜選択することによって、前記病原性プリオン蛋白質を比較的低濃度でも迅速かつ簡便に、そして高感度で検出できることを見出した。
【００２７】
即ち、本発明は、動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法において、
前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均  一化する第１の工程と、
前記第１の工程で得られた均一化物を、微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて  分解処理する第２の工程と、
前記第２の工程で分解された前記均一化物から病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含  有する濃縮物を得る第３の工程と
を有する前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮工程を経て、更に、
前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を溶剤に溶解して前記濃縮物  の溶解物を得る第４の工程と、
この溶解物中の前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を吸着面に結合させる第５の工  程と、
前記第５の工程において結合された前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を発色させ  る第６の工程と
を有する、病原性プリオン蛋白質の検出方法（以下、本発明の検出方法と称する。）に係るものである。
【００２８】
本発明の検出方法によれば、まず、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮工程において、上述した第１の工程〜第３の工程を有しており、特に、動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いてこれを均一化しているので、前記動物組織由来物質に蓄積される病原性プリオン蛋白質の蓄積濃度が比較的小さくても、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を十分に濃縮させることができる。
【００２９】
さらに、第４の工程から第６の工程を有する免疫測定法、例えば酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法；以下、同様）に基づいてこれを検出しているので、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を特異的に、かつ強固に結合（固定化）させることができ、迅速かつ簡便に、そして高感度でこれを検出することができる。
【００３０】
即ち、本発明の検出方法によれば、例えば牛や羊などをプリオン病（スクレーピーやＢＳＥ）感染初期の段階で診断、選別することが可能となり、また、これを大量かつ迅速に行うことができる。特に、羊ではリンパ節を用いた生検が可能とされているが、本発明によれば、例えば牛に関してもリンパ節を用いた生検が可能になると考えられる。
【００３１】
また、本発明は、動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法の実施に際し、検出されるべき病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を濃縮する方法において、
前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均  一化する第１の工程と、
前記第１の工程で得られた均一化物を、微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて  分解処理する第２の工程と、
前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質  を含有する濃縮物を得る第３の工程と
を有することを特徴とする濃縮方法（以下、本発明の第１の濃縮方法と称する。）を提供するものである。
【００３２】
さらに、本発明は、動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法の実施に際し、検出されるべき病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を濃縮する方法において、
前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均  一化する第１の工程と、
前記第１の工程で得られた均一化物を、微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて  分解処理する第２の工程と、
前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質  を含有する濃縮物を得る第３の工程と、
前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を  Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネートからなる界  面活性剤で洗浄する洗浄工程と
を有することを特徴とする濃縮方法（以下、本発明の第２の濃縮方法と称する。）も提供するものである。
【００３３】
本発明の第１の濃縮方法及び第２の濃縮方法によれば、前記動物組織由来物質に蓄積される病原性プリオン蛋白質の蓄積濃度が比較的小さくても、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を十分に濃縮させることができる。
【００３４】
ここで、前記動物組織由来物質とは、動物の中枢神経系組織、細網リンパ系組織や骨、更には、これらの組織に由来する物質（例えば、食品、移植用硬膜、医療用コラーゲン）なども含むものである（以下、同様）。また、前記病原性プリオン蛋白質とは、プリオン病の原因であると考えられている異常プリオン蛋白質を意味し、前記プリオン病としては、上述したＣＪＤやスクレーピー、ＢＳＥなどが挙げられる。本発明の検出方法、本発明の第１の濃縮方法及び本発明の第２の濃縮方法は、羊のスクレーピーやＢＳＥに限定されず、様々なプリオン病に対処することが可能である。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の検出方法によれば、動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法において、
前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均  一化する第１の工程と、
前記第１の工程で得られた均一化物を微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて分  解処理する第２の工程と、
前記第２の工程で分解された前記均一化物から病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含  有する濃縮物を得る第３の工程と
を有する前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮工程を経て、更に、
前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を溶剤に溶解して前記濃縮物  の溶解物を得る第４の工程と、
この溶解物中の前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を吸着面に結合させる第５の工  程と、
前記第５の工程において結合された前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を検出する  第６の工程と
を有する方法によって前記病原性プリオン蛋白質を検出することを特徴としており、まず、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮工程において、上述した第１の工程〜第３の工程を有しており、特に、動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いてこれを均一化しているので、前記動物組織由来物質に蓄積される病原性プリオン蛋白質の蓄積濃度が比較的小さくても、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を十分に濃縮させることができる。
【００３６】
さらに、第４の工程から第６の工程を有する酵素免疫吸着測定法に基づいてこれを検出しているので、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を特異的に、かつ強固に結合（固定化）させることができ、迅速かつ簡便に、そして高感度でこれを検出することができる。
【００３７】
即ち、本発明の検出方法によれば、例えば牛や羊などをプリオン病（スクレーピーやＢＳＥ）感染初期の段階で診断、選別することが可能となり、また、これを大量かつ迅速に行うことができる。
【００３８】
また、本発明の第１の濃縮方法及び第２の濃縮方法によれば、動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する病原性プリオン蛋白質の検出方法の実施に際し、検出されるべき前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を濃縮する方法において、蓄積濃度が比較的小さくてもこれを十分に濃縮できる有効な濃縮方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
まず、本発明の検出方法について説明する。
【００４０】
本発明の検出方法における第１の工程として、前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて、この動物組織由来物質を均一化する均一化工程を有しているので、前記動物組織由来物質を十分に溶解し、また、その種類に応じた前記界面活性剤の存在下で非特異的物質を可溶化し、病原性プリオン蛋白質を含有する前記動物組織由来物質を十分に均一化することができる。
【００４１】
従って、前記動物組織由来物質における病原性プリオン蛋白質の割合が比較的低濃度であっても、これを良好に均一化することができ、ひいては良好な病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮物を得ることができる。つまり、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を分離、抽出するために有効な均一化物（ホモジネート）を得ることができる。
【００４２】
この第１の工程において、前記動物組織由来物質が中枢神経系組織（例えば、脳組織や脊髄組織など）の場合は、前記界面活性剤をズイッタージェント（Zwittergent）３−１２〔商品名：カルビオケミカル社製：Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート（N-dodecyl-N,N-dimethyl-3-amino-1-propanesulfonate)：分子量３３６．６〕又はトリトン(Triton)Ｘ−１００〔商品名：シグマ社製：ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（t-octylphenoxypolyethoxyethanol）〕からなる界面活性剤とすることが望ましい。なお、前記界面活性剤以外にも、例えばカルビオケミカル社製のズイッタージェント３−０８、３−１０、３−１４、３−１６やノニデットＰ−４０（octylphenoxypolyethoxyethanol）などを使用してもよい。
【００４３】
上記の各界面活性剤を使用することによって、前記脳組織における非特異的物質（正常プリオン蛋白質やその他の蛋白質：以下、同様）を十分に可溶化することができる。特に、前記中枢神経系組織として脳組織を用いることがさらに望ましい。
【００４４】
界面活性剤の選択により検出感度の組織特異性が向上するメカニズムとしては、例えば脳組織では、濃度０．５％、ｐＨ７．５程度のサーコシル〔商品名：シグマ社製（分子式Ｃ15Ｈ25ＮＯ3Ｎａ）〕でもＰｒＰscのロスが少なく、十分非特異的に蛋白質の抽出ができ、これに対してリンパ、脾臓組織などでは、非特異的な夾雑蛋白質の除去が不十分となることがあり、改めて高濃度の前記サーコシルでＰｒＰscを選択的に抽出することが望ましいからであると考えられる。
【００４５】
また、前記動物組織由来物質が細網リンパ系組織（例えば、脾臓やリンパ節、骨髄など）の場合は、前記界面活性剤をｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールからなる非イオン性界面活性剤とすることが望ましい。
【００４６】
上記界面活性剤を使用することによって、前記脾臓組織における非特異的物質を十分に可溶化することができる。特に、前記細網リンパ系組織として脾臓組織を用いることがさらに望ましい。
【００４７】
次に、前記第２の工程として、前記第１の工程で得られた均一化物を微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて分解処理する分解処理工程を有しているので、前記均一化物中の病原性プリオン蛋白質を含む物質（特に、染色体やＤＮＡなど）を十分に分解、消化させて、目的物である病原性プリオン蛋白質を十分に取り出すことができる。
【００４８】
一般に、病原性プリオン蛋白質は、染色体中の遺伝子上にのっていると考えられている。従って、特異的にこの蛋白質を取り出すためには、これを含む蛋白質を分解することが要求される。この第２工程は、非特異的物質を分解すると共に病原性プリオン蛋白質を含む蛋白質を分解する操作である。
【００４９】
ここで、前記分解酵素としてコラーゲン分解酵素（コラゲナーゼ：Collagenase）及びＤＮＡ分解酵素（ＤＮアーゼ：DNase）を用いて前記均一化物を分解し、さらに蛋白質分解酵素（プロテイナーゼ：Proteinase又はプロテアーゼ：Protease）を用いて分解することが望ましい。
【００５０】
次に、前記第３の工程として、前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を得る分離工程を有しているので、上記の第１の工程及び第２の工程で十分に均一化及び分解された前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する物質を効率的に分離することができる。
【００５１】
この分離工程では、例えば、遠心分離（超遠心分離）等の手段を用いて分離、濃縮することができる。
【００５２】
以上が、前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮工程の基本的な構成であるが、本発明の検出方法における濃縮工程では、上述した第１の工程〜第３の工程に加えて、例えば、下記のような工程を付加することが望ましい。
【００５３】
例えば、前記濃縮工程中に、前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて分解し、次いで分離後に塩析処理を施す工程を更に有することが望ましい。
【００５４】
即ち、前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の溶解性を一層向上させるために、例えば、サーコシル（Sarkosyl、商品名：シグマ社製：Ｃ15Ｈ25ＮＯ3Ｎａ）等を使用して溶解処理、分離処理を行い、得られた分離抽出物を例えばＮａＣｌを用いて塩析した後、分離処理を行うことによって、一層濃縮された病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を得ることができる。
【００５５】
また、前記濃縮工程中に、前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を界面活性剤で洗浄する洗浄工程を更に有することが望ましい。
【００５６】
即ち、前記濃縮物（例えばペレット状）の付加的な洗浄工程として、界面活性剤を用いて前記濃縮物を洗浄することによって、前記濃縮物中の不所望の物質（非特異性物質）をさらに多く除去することができる。
【００５７】
ここで、使用する界面活性剤としては、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート（例えばズイッタージェント３−１２，３−０８，３−１０など）からなる界面活性剤が望ましい。
【００５８】
次に、本発明の検出方法に基づく、測定法（第４の工程から第６の工程）について説明する。
【００５９】
ここで、第４から第６工程で行われる測定法として免疫測定法、例えば酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immnosorbentassay)は、酵素抗体法とも呼ばれ、特定の吸着面に抗体を配し、抗原と抗体とを結合せしめて、その複合体を形成し、これを検出する方法である。
【００６０】
まず、前記第４の工程として、前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を溶剤に溶解して前記濃縮物の溶解物を得る工程（溶解工程）を有しているので、次段の吸着工程で吸着面に吸着され易い病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮物を作製することができる。
【００６１】
ここで、前記溶剤としてグアニジンチオシアネート（ＧｄｎＳＣＮ）を使用することが望ましい。
【００６２】
グアニジンチオシアネートは、前記濃縮物を次段での吸着工程で吸着されやすくする作用を有すると考えられる。これは、グアニジンチオシアネートによって抗プリオン蛋白質抗体の免疫反応性が増大するような抗原性サイトが発現することによるものと考えられ、グアニジンチオシアネートでの溶解処理によって、抗原−抗体複合体の強固で特異的な反応を検出することができる。
【００６３】
前記グアニジンチオシアネートは、１〜５モル濃度（Ｍ）のものを使用することが望ましい。この濃度は３〜４モル濃度がさらに望ましい。また、上述したグアニジンチオシアネート中への前記濃縮物の溶解は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ≦５）などをバッファとして行うことが望ましい。
【００６４】
次に、前記第５の工程として、前記溶解物中の前記病原性プリオン蛋白質を吸着面に結合させる工程（結合工程）を有しており、前段で溶解された溶解物中の前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質由来蛋白質を、例えばマイクロタイタープレート（microtiter plate）などに吸着させることができる。従って、抗原−抗体複合体の形成のための強く特異的な反応をこの方法にて検出することができる。
【００６５】
また、前記吸着面を一次抗体で形成し、この一次抗体と前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質との抗原−抗体複合体を前記吸着面に結合させることができる。一般に、ＥＬＩＳＡ法は、測定対象である抗原とその固定化のための抗体とにおける抗原−抗体複合体を生じせしめ、これを例えば酵素標識抗体と基質とを用いる発色法にて検出するものである。
【００６６】
次に、前記第６の工程として、上記第５の工程において結合された前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を酵素標識抗体と発色基質とを反応させて発色させる工程（発色工程）を有しているので、これを比色計や分光光度計などにより容易に検出できる。即ち、その発色度を検出することによって病原性プリオン蛋白質の有無、さらにはその蓄積濃度を調べることができる。
【００６７】
また、発色試薬（発色基質）としては、２，２−アジゾ−ビス（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホネート）等を使用することができる。周知のように、蛍光測定は、酵素標識抗体と蛍光基質とを用いて測定を行うことができる。また、発光測定は、酵素標識抗体と発光基質とを用いて測定を行うことができる。
【００６８】
この発色方法としては、前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質に結合するアビジン（avidin）と、前記化学発光物質に結合するビオチン（biotin）との複合体の形成に基づく発色を観察するアビジン−ビオチン複合体法（ＡＢＣ法）やホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ロバ抗兎免疫グロブリン（horseradish peroxidase-conjugated donky anti-rabbit IgG ）を使用する間接法（ＨＲＰ法）などを使用できる。
【００６９】
この検出方法の概要は、例えば、ウエルに結合されたＰｒＰscがポリクローナル抗体Ｂ１０３と特異的に結合、その抗体をさらに特異的に認識する２次抗体（抗ウサギＩｇＧ）−ビオチン複合体で結合、そこへアジビンを結合、次にホースラディシュベルオキシターゼ（ＨＲＰ）−ビオチンを結合させ、ＨＲＰの基質を反応させ発色させる方法である。
【００７０】
一般に、アビジン−ビオチン複合体法により得られる結果は、間接法よりも再現性が高いが、特に、前記動物組織由来物質として脾臓組織中の病原性プリオン蛋白質を検出する場合、前記アビジン−ビオチン複合体法を用いることが望ましい。
【００７１】
上述したように、本発明の酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）によれば、測定対象である病原性プリオン蛋白質が比較的低濃度であっても、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を強く、特異的に結合させることができ、迅速かつ簡便に前記病原性プリオン蛋白質を検出することができる。
【００７２】
なお、ＥＬＩＳＡ法による検出は、上述したウエスタンブロッティング法（ＷＢ法）に比べて、少なくとも同等の感度を示し、さらに、その測定は実用的かつ迅速である。また、ＥＬＩＳＡ法による検出の利点は、多くのサンプルを１回で分析することができ、潜在的に感染されている動物を大量に診断、選別することができ、感染によるプリオン病（特にＢＳＥ）をコントロールするという広汎な用途に利用することが可能である。
【００７３】
次に、上記した本発明の第１の濃縮方法を説明する。
【００７４】
本発明の第１の濃縮方法によれば、動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法の実施に際し、検出されるべき前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を濃縮する方法において、前記第１の工程として、前記動物組織由来物質の種類に応じたＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール等の界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均一化する均一化工程を有しているので、前記動物組織由来物質を十分に溶解し、また、その種類に応じた界面活性剤として、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールからなる界面活性剤の存在下で非特異的物質を可溶化し、病原性プリオン蛋白質を含有する前記動物組織由来物質を十分に均一化することができる。
【００７５】
従って、前記動物組織由来物質における病原性プリオン蛋白質の割合が比較的低濃度であっても、これを良好に均一化することができ、ひいては良好な病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮物を得ることができる。つまり、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を分離、抽出するために有効な均一化物（ホモジネート）を得ることができる。
【００７６】
ここで、前記動物組織由来物質を中枢神経系組織とすることが望ましい。また、前記中枢神経系組織を脳組織とすることがさらに望ましい。
【００７７】
また、第２の工程として、前記第１の工程で得られた均一化物を微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて分解処理する分解処理工程を有しているので、前記均一化物中の病原性プリオン蛋白質を含む物質（特に、染色体）を十分に分解、消化させて、目的物である病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を十分に取り出すことができる。
【００７８】
前記分解酵素として、コラーゲン分解酵素及びＤＮＡ分解酵素を用いて前記均一化物を分解し、さらに微生物プロテアーゼを含む蛋白質分解酵素を用いて分解することが望ましい。
【００７９】
また、前記分解酵素として、前述した微生物プロテアーゼを用いて前記均一化物を分解することもできる。
【００８０】
次に、第３の工程として、前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を得る分離工程を有しているので、上記の第１の工程及び第２の工程で十分に均一化及び分解された前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する物質を効率的に分離することができる。
【００８１】
この分離工程では、例えば、遠心分離（超遠心分離）等の手段を用いて分離、濃縮することができる。
【００８２】
以上が、本発明の第１の濃縮方法の基本的な構成であるが、本発明の第１の濃縮方法では、上述した本発明の検出方法と同様に、前記第１の工程〜第３の工程に加えて、例えば、下記のような工程を付加することが望ましい。
【００８３】
例えば、前記濃縮工程中に、前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて分解し、次いで分離後に塩析処理を施す工程を更に有することが望ましい。
【００８４】
即ち、前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の溶解性を一層向上させるために、例えば、サーコシル等を使用して溶解処理、分離処理を行い、得られた分離抽出物を例えば、ＮａＣｌ等を用いて塩析を行った後、分離処理を行うことによって、一層濃縮された前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物（例えばペレット）を得ることができる。
【００８５】
また、前記濃縮工程中に、前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を界面活性剤で洗浄する洗浄工程を更に有することが望ましい。
【００８６】
即ち、前記濃縮物（例えばペレット状）の付加的な洗浄工程として、前記界面活性剤を用いて前記濃縮物を洗浄することによって、前記濃縮物中の不所望の物質（非特異的物質）をさらに多く除去することができる。前記界面活性剤としては、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート（例えば、前記ズイッタージェント３−１２，３−０８，３−１０など）からなる界面活性剤を使用することが望ましい。
【００８７】
次に、上記した本発明の第２の濃縮方法を説明する。
【００８８】
本発明の第２の濃縮方法によれば、動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法の実施に際し、検出されるべき前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を濃縮する方法において、第１の工程として、前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均一化する均一化工程を有しているので、前記動物組織由来物質を十分に溶解し、また、その種類に応じた前記界面活性剤の存在下で非特異的物質を可溶化し、病原性プリオン蛋白質を含有する前記動物組織由来物質を十分に均一化することができる。
【００８９】
従って、前記動物組織由来物質における病原性プリオン蛋白質の割合が比較的低濃度であっても、これを良好に均一化することができ、ひいては良好な病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮物を得ることができる。つまり、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を分離、抽出するために有効な均一化物を得ることができる。
【００９０】
この第１の工程において、前記動物組織由来物質を細網リンパ系組織とすることが望ましい。特に、前記細網リンパ系組織が脾臓組織である場合は、上述したように、上記界面活性剤を使用することによって、前記脾臓組織における非特異的物質を十分に可溶化することができる。
【００９１】
次に、第２の工程として、前記第１の工程で得られた均一化物を分解酵素を用いて分解処理する分解処理工程を有しているので、前記均一化物中の病原性プリオン蛋白質を含む物質（特に、染色体）を十分に分解、消化させて、目的物である病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を十分に取り出すことができる。
【００９２】
ここで、前記分解酵素としてコラーゲン分解酵素及びＤＮＡ分解酵素を用いて前記均一化物を分解し、さらに微生物プロテアーゼを含む蛋白質分解酵素を用いて分解することが望ましい。
【００９３】
次に、第３の工程として、前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を得る分離工程を有しているので、上記の第１の工程及び第２の工程で十分に均一化及び分解された前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する物質を効率的に分離することができる。
【００９４】
この分離工程では、例えば、遠心分離（超遠心分離）等の手段を用いて分離、濃縮することができる。
【００９５】
次に、洗浄工程として、前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物をＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネートからなる界面活性剤で洗浄する洗浄工程を更に有しているので、前記濃縮物中の不所望の物質（非特異性物質；例えば、正常なプリオン蛋白質や他の蛋白質など）をさらに多く除去することができる。
【００９６】
上述した、本発明の第１の濃縮方法及び第２の濃縮方法によれば、前記動物組織由来物質に蓄積される病原性プリオン蛋白質の蓄積濃度が比較的小さくても、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を十分に濃縮させることができる。なお、上記各濃縮方法で得られた病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物は、後段でＥＬＩＳＡ法に用いてもよいし、また、ＷＢ法や電気泳動法などに用いてもよい。
【実施例】
【００９７】
以下、本発明を具体的な実施例について説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９８】
本実施例は、スクレーピー感染マウスからの粗組織抽出物のＰｒＰsc（病原性プリオン蛋白質：以下、同様）の検出、及び検出されるべきＰｒＰsc由来蛋白質の濃縮を行うものである。
【００９９】
１．本実施例ではSIc/ICRマウスを用いた。このマウスは、オビヒロ種スクレーピーを脳内感染したもの（シナガワ他、１９８５年）であり、明らかにスクレーピーを発症したマウスから脳組織及び脾臓組織を取り出した。
【０１００】
２．脳組織及び脾臓組織からのＰｒＰscの濃縮
サンプルは図１〜図３に示す８種の異なる濃縮法で調製した。すべての８つの方法は、ハサミで細かく切り刻んだ組織サンプルを、分解酵素で消化させたこと（第２の工程）、および、界面活性剤の存在下で、可溶性の非特異的物質を抽出し、遠心分離（第３の工程）する目的のために均一化を行うこと（第１の工程）において共通している。
【０１０１】
以下、ＰｒＰsc由来蛋白質の濃縮方法に関し、方法１〜方法８について図１〜３を参照しながら簡単に説明する。
【０１０２】
方法１
まず、８％ズイッタージェント３−１２（界面活性剤）と、サーコシルと、１００ｍＭ塩化ナトリウム（NaCl）と、５ｍＭ塩化マグネシウム（MgCl2）と５０ｍＭ、ｐＨ＝７．５のトリス−塩酸緩衝液（Tris-HCl）とを加えて、上記脳組織を均一化し、均一化物（ホモジネート）を作製した（第１の工程）。
【０１０３】
次いで、この均一化物を、０．５mg/１００mgコラゲナーゼ〔３，４，２４，３〕（Collagenase）及び４０μg/１００mgのＤＮアーゼ〔３，１，２１，１〕（DNase）を用いて、温度３７℃、４〜１２時間で分解（消化）処理を行い、さらに、５０μg/１００mgのプロテイナーゼ〔３，４，２１，１４〕（Proteinase K）を用い、温度３７℃、０．５〜２時間で分解（消化）処理を行った（第２の工程）。この分解（消化）処理は、前記組織中の病原性プリオン蛋白質以外の測定夾雑物質の酵素分解のために行ったものである。
【０１０４】
次いで、反応を停止した後、回転数15,000rpm、室温で２０分間遠心分離を行った。これを、５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で１０分間加熱溶解させ（第３の工程）、ＰｒＰsc由来蛋白質含有の濃縮物を得た（図１）。
【０１０５】
方法２
まず、方法１と同様に、上記脳組織を均一化し均一化物を作製した（第１の工程）。次いで、前記均一化物を、ブロメリン〔３，４，２２，２３〕（Bromelain）を用いて温度４５℃、０．５〜２時間で分解（消化）した（第２の工程）。
【０１０６】
次いで、反応を停止した後、回転数15,000rpm、室温で２０分間遠心分離を行った。これを、５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で１０分間加熱溶解させ（第３の工程）、ＰｒＰsc由来蛋白質含有の濃縮物を得た（図１）。
【０１０７】
なお、ブロメリンを用いる場合、作用温度４５〜８０℃、作用時間１〜１０時間程度が望ましい。ブロメリンを用いる結果、使用する酵素の種類が１種類となり、また操作が簡便（操作時間の短縮や経費圧縮）になる。なお、測定結果は、３種類の酵素（コラゲナーゼ、ＤＮアナーゼ、プロテイナーゼ）を用いた場合と感度においても遜色のない（同程度）結果であった。
【０１０８】
方法３
組織重量の５〜８倍容量の４％トリトンＸ−１００（非イオン性界面活性剤）と、０．５％サーコシルと、１００ｍＭ塩化ナトリウム（NaCl）と、５ｍＭ塩化マグネシウム（MgCl2）と、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．５のトリス−塩酸緩衝液とを加えて、上記脾臓組織及び脳組織を均一化し均一化物を作製した（第１の工程）。
【０１０９】
次いで、方法１と同様の分解（消化）処理を行った（第２の工程）。さらに方法１と同様の分離処理を行った（第３の工程）。
【０１１０】
次いで、前記分離処理（第３の工程）で得られた沈殿物を６．２５％サーコシル及び１０ｍＭ、ｐＨ＝９．２のトリス−塩酸緩衝液を用いて懸濁化、分解した（分解工程）。
【０１１１】
次いで、これを超音波破砕してから、回転数15,000rpmで遠心分離し、その後、遠心分離で得られた溶液の上澄みに、最終濃度１２％でＮａＣｌを添加、攪拌した（塩析工程）。この後、回転数55,000rpmで超遠心分離し、５％ＳＤＳを用いて加熱溶解し、ＰｒＰsc由来蛋白質含有の濃縮物を得た（図２）。
【０１１２】
方法４
方法３と、分離処理（第３の工程）までは同様にして、上記脾臓組織及び脳組織の分離を行ったのち、得られた沈殿物（ペレット状）を５％ＳＤＳを用いて加熱溶解し、ＰｒＰsc由来蛋白質含有の濃縮物を得た（図２）。
【０１１３】
方法５
方法３と、分離処理（第３の工程）までは同様にして、上記脾臓組織の分離を行ったのち、得られた沈殿物（ペレット状）を８％ズイッタージェント３−１２（界面活性剤）と、１０ｍＭ、ｐＨ＝７．５のトリス−塩酸緩衝液とを加えて均一化し、均一化物を作製した（洗浄工程）。
【０１１４】
次いで、回転数15,000rpmで遠心分離し、得られた沈殿物（ペレット状）を５％ＳＤＳを用いて加熱溶解し、ＰｒＰsc由来蛋白質含有の濃縮物を得た（図２）。
【０１１５】
方法６
方法３において、その分解処理工程（第２の工程）で、コラゲナーゼ及びＤＮアーゼ、更には、プロテイナーゼを用いて分解（消化）処理を行う代わりに、方法２と同様のブロメリン（Bromelain）を用いて、組織中の病原性プリオン蛋白質以外の測定夾雑物質を酵素分解した以外は方法３と同様にして、ＰｒＰsc由来蛋白質含有の濃縮物を得た（図３）。
【０１１６】
方法７
方法４において、その分解処理工程（第２の工程）で、コラゲナーゼ及びＤＮアーゼ、更には、プロテイナーゼを用いて分解（消化）処理を行う代わりに、方法２と同様のブロメリンを用いて、組織中の病原性プリオン蛋白質以外の測定夾雑物質を酵素分解した以外は方法４と同様にして、ＰｒＰsc含有由来蛋白質の濃縮物を得た（図３）。
【０１１７】
方法８
方法５において、その分解処理工程（第２の工程）で、コラゲナーゼ及びＤＮアーゼ、更には、プロテイナーゼを用いて分解（消化）処理を行う代わりに、方法２と同様のブロメリンを用いて、組織中の病原性プリオン蛋白質以外の測定夾雑物質を酵素分解した以外は方法５と同様にして、ＰｒＰsc含有由来蛋白質の濃縮物を得た（図３）。
【０１１８】
即ち、方法３、方法４及び方法５では、５〜８倍容量の４％(wt/vol)トリトンＸ−１００を均一化バッファに添加し、方法１では、８％(wt/vol)ズイッタージェント３−１２を前記トリトンＸ−１００の代わりに添加した。
【０１１９】
方法５で用いたズイッタージェント３−１２は、不所望な材料（非特異的物質）を更に多く除去するために、第３の工程（回転数15,000rpm）での遠心分離（ＴＬＡ 100.3回転子、オプティマＴＬＸ デスクトップ型超遠心機、ベックマン（Beckman）社製）で得られたペレットの付加的な洗浄工程として用いた。
【０１２０】
方法３では、ＰｒＰsc由来蛋白質の溶解性を上げるため、ＰｒＰsc由来蛋白質を６．２５％（wt/vol）サーコシルによりｐＨ＝９．２（これは従来用いたｐＨよりも高い値である）で抽出した。サーコシル抽出後は、ＰｒＰsc由来蛋白質の溶解性を再び下げるため、１０％（vol/vol）ＨＣｌでｐＨを中性に戻し、次いで１２％（wt/vol）ＮａＣｌによるＰｒＰsc由来蛋白質の塩析と、55,000rpmでの最終遠心分離処理を行い、一層濃縮されたＰｒＰsc由来蛋白質を含有するペレットを得た。このサーコシル抽出とＮａＣｌによるＰｒＰsc由来蛋白質の塩析は、方法４、方法５、方法１では省略し、サンプル調製プロセスを簡略化した。
【０１２１】
３．ウエスタンブロット分析
スクレーピーに感染させたマウスの脳、脾臓をサンプルとした。脳は方法１で脾臓は方法３で調製した。サンプルは２3倍から２11倍希釈した。ＷＢ法に先立ち、各希釈サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（電気泳動）を行い、これをＰＶＤＦ膜に転写した。ブロッキングには、５％のスキムミルクを用い、検出にはＢ１０３ポリクローナル抗体を使用した。ＥＬＣ−Western blot detection system(Amersham社製）で検出した。
【０１２２】
４．ＥＬＩＳＡ法
図４に示すように、マイクロタイタープレートへの適切な吸着条件を調べるために、まず、脳組織及び脾臓組織抽出物を、５％ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム中で１０分間加熱沸騰させ（１）、これを１０倍容量以上の氷冷メタノール中で沈殿させた（２）。この組織抽出物は、通常、１０〜４０mgの原組織を含有していた。但し、前記（数値）は、図４中の（数値）と対応するものである（以下、同様）。
【０１２３】
次いで、遠心分離処理（３）後、得られたペレット状沈殿物を１００μlの異なる濃度（１〜５Ｍ）のグアニジンチオシアネート（グアニジンチオシアン酸エステル：ＧｄｎＳＣＮ）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水：最終ｐＨ≦５)中で超音波溶解させた（４）。ここまでの工程（１）〜（４）は上述した第４の工程に相当するものである。
【０１２４】
また、図５に示すように、溶剤としてＳＤＳを用いた場合の測定を行うために、ＧｄｎＳＣＮの使用に変えて、ペレットを１００μlの異なる濃度（０．１〜４％(vol/vol)）のＳＤＳ、ＰＢＳ（最終ｐＨ≦５）中に溶解させた。
【０１２５】
次いで、それぞれの溶液を、９６穴丸底マキシソープ免疫プレート（商品名：Maxisorp immuno plate：Nunc）上に分布させ、室温で一晩、振揺下で培養した（５）（なお、例えばコーニング社製ＥＬＩＳＡプレート高結合型４３０４５２を用いてもよい）。
【０１２６】
次いで、前記プレートを、ＰＢＳで３回洗浄し（６）、ＰＢＳ−５％脱脂乳中で１時間、３７℃でブロッキング（閉塞状態にすること）を行った（７）。
【０１２７】
次いで、前記プレートを、０．０５％トゥイーン（Tween）２０を含有するＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと称する）で３回洗浄した（８）。
【０１２８】
次いで、兎の抗血清Ｂ−１０３（ホリウチ他、１９９５年）を一次抗体としてＰＢＳの初期容量分を用い、３３％硫酸アンモニウムでの沈殿処理後に、ＰＢＳＴ−０．５％脱脂乳中で2,000倍に希釈した後、ウエル（上記穴：以下、同様）中に１００μl分布させた。前記プレートは、室温で１時間、振揺下で培養し、抗原−抗体反応複合体を形成した（９）。ここで、前記工程（５）〜（９）は、第５の工程に相当する。
【０１２９】
このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、アビジン（Avidin）−ビオチン（Biotin）複合体（ＡＢＣ）法により、下記のようにして顕在化させたところ、上記抗原−抗体複合体が目視状態となった。ただし、ＡＢＣ法用のキットとしてベクタステイン・エリート ＡＢＣキット、ベクターラボラトリーズ製（Vectastain Elite ABC kit, Vector Laboratories）を使用した。
【０１３０】
ビオチン（ビタミンＨ）化した抗ウサギ免疫グロブリン（anti-rabbit IgG）をＰＢＳＴ−０．５％脱脂乳中で1,500倍に希釈し、ウエルを室温、振揺下で１時間、１００μlを培養した（１０）。
【０１３１】
次いで、ＰＢＳＴで４回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した後（１１）、キットの成分Ａ（アビジン）と成分Ｂ（ビオチン）とをそれぞれ、２００倍の希釈率でＰＢＳに添加し、ウエル中に分布させた（１２）。ここで、前記キットとは、上記ＡＢＣ法を実施するための用具や調製剤が組になっているものである。
【０１３２】
次いで、培養及び洗浄を、ビオチン化された抗体（即ち、結合された抗体）に関して行った（１３）。
【０１３３】
発色は、基質溶液〔１００μl/mlの２，２'−アジゾ−ビス（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホネート）:ＡＢＴＳ〕１００μlで培養後、０．０５Ｍクエン酸−リン酸エステルからなる緩衝液中で０．０４％の過酸化水素で室温、１時間、暗中で行った（１４）。
【０１３４】
次いで、マイクロプレートリーダー〔Model 2550, バイオ−ラッドラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）〕で波長４０５ｎｍの発色を確認した（１５）。
【０１３５】
このＡＢＣ法に基づく発色法に代えて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ロバ抗兎ＩｇＧ（horse radish peroxidase-conjugated donky annti-rabbit IgG(アマシャム社製)）１００μlでＰＢＳＴ−０．５％脱脂乳中で８００倍の希釈下でウエルを培養した（１６）。この後、ＰＢＳＴで４回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した（１７）。以下、この方法を間接法と称する。
【０１３６】
また、培養と洗浄とをビオチン化された抗体に対して行った。なお、カットオフラインは、平均光学濃度（ＯＤ）と非感染マウスの組織抽出物でコーティングした、４〜８個の陰性のコントロール群の標準偏差との合計で決定した。
【０１３７】
５．測定結果
(1)適当なコーティング条件の決定
マイクロタイタープレートへの高い吸着率を実現するためには、ＰｒＰsc由来蛋白質を十分に溶解させる必要がある。ここで、ＰｒＰscを溶解させるためにＧｄｎＳＣＮとＳＤＳの有用性を評価した（図５）。
【０１３８】
図５において、マイクロタイタープレートへのＰｒＰsc由来蛋白質吸着に対するＧｄｎＳＣＮ及びＳＤＳの効果を見るために、スクレーピー感染マウスの脳組織（Ａ）及び脾臓組織（Ｂ）からのサンプルを方法１及び方法５によってそれぞれ調製した。各ＳＤＳ及びＧｄｎＳＣＮの各濃度において、脳（Ａ）及び脾臓（Ｂ）の１mg相当量から抽出液を採取し、これをマイクロタイタープレート１枚当たり３つのウエルにコーティングした。
【０１３９】
非感染マウスからの各組織抽出物を調製し、３ＭのＧｄｎＳＣＮ−ＰＢＳに溶解させ、陰性のコントロール群（negative controls(Ctrl.)；コントロール）として用いた。ここでは、２mgの脳等価物（６ウエル分）又は２．５mgの脾臓等価物（４ウエル分）を各ウエルに対して用いた。
【０１４０】
また、図５に平均値及びその標準偏差（Ｓ.Ｄ.）を示した。カットオフラインは、それぞれの平均値に対し３つの標準偏差値（３Ｓ.Ｄ.：以下、同様）を加えることによって決めた。なお、間接法及びＡＢＣ法を脳組織及び脾臓組織についてそれぞれ適用した。なお、前記カオトロピックイオン剤は、疎水性分子の水溶性を増加させ、疎水結合を弱め、膜蛋白質等の抽出に用いられるものであり、例えばＧｄｎＳＣＮが挙げられる。
【０１４１】
ＰＢＳへのＰｒＰsc由来蛋白質の溶解は、カオトロピックイオン（chaotropic）剤又は界面活性剤なしで行うと、マイクロタイタープレートへの吸着が脳組織のものでは幾らか生じるが、脾臓組織のものでは生じなかった（図５(Ａ)、(Ｂ)：０ＭのＧｄｎＳＣＮ）。また、ＳＤＳ濃度が最低濃度（０．１％）であっても、脳組織からＰｒＰsc由来蛋白質の吸着は生じていなかった（図５(Ａ)）。
【０１４２】
これに対して、ＰＢＳ濃度を増やしながらＧｄｎＳＣＮをＰＢＳに添加すると、コーティング効率が向上し、ＧｄｎＳＣＮの濃度が４Ｍの側で脾臓組織のものについてのピークが生じた（図５(Ｂ)）。また、３Ｍ付近のＧｄｎＳＣＮ濃度で、脳組織のものについてはピークを示した（図５(Ａ)）。即ち、溶剤として１〜５Ｍ（特に３〜４Ｍ）のＧｄｎＳＣＮを使用したとき、強く特異的な吸着が見られた。
【０１４３】
ＰＢＳ中でのＧｄｎＳＣＮ濃度が高くなれば、ｐＨ値が低下（≦５）するので、０．０５Ｍの重炭酸ナトリウムのカーボネートバッファ（ｐＨ＝９．６）をＰＢＳに対して定量的に置換することによってＧｄｎＳＣＮとＳＤＳ双方を希釈し、これによって最終ｐＨを８以上に高めた。しかしながら、吸着率は低下する傾向があった（データは示さず）。
【０１４４】
(2) ２つの異なる検出方法：間接法及びＡＢＣ法の比較
間接法とＡＢＣ法とを感度及び特異性について比較した。図６は、抗原−抗体複合体の検出に関するＡＢＣ法と間接法との比較を示す。
【０１４５】
スクレーピー感染マウスの脳組織のサンプル（Ａ）を方法１で調製し、引き続いて、３ＭのＧｄｎＳＣＮ中へ順次２倍ずつ希釈した。脾臓組織（Ｂ）については、方法３を適用し、４ＭのＧｄｎＳＣＮを用いた。２つの測定方法は、２つの検出方法における平均値を求めた。陰性のコントロール群（コントロール）についても示した。標準偏差（Ｓ.Ｄ.）は小さすぎて図示していない。カットオフラインはそれぞれに対して３Ｓ.Ｄ.を加えて決めた。脾臓組織の測定におけるカットオフラインは４０mgの脾臓等価物（即ち、４０mgの脾臓に相当する量：以下、同様）からなる陰性のコントロール群のデータに基づいて決めた。
【０１４６】
この測定結果によれば、脳組織についてはＡＢＣ法の方がわずかに優れている（図６(Ａ)）が、ＡＢＣ法は脾臓組織について明らかに好ましいことが分かった（図６(Ｂ)）。脾臓組織に関して、ＡＢＣ法は、間接法に比べて少なくとも２倍の感度を示した。また、一般に、ＡＢＣ法により得られる結果は、間接法よりも再現性が高いことが分かった（データは図示せず）。従って、最終的な測定（図８のＥＬＩＳＡ法とＷＢ法との比較）では、脾臓組織及び脳組織に対し、ＡＢＣ法を適用した。
【０１４７】
(3) 適切なサンプル調製法（濃縮法）の確立
ＥＬＩＳＡ法については方法３を用いた。このサンプル調製（濃縮）法は公知のウエスタンブロット法（グレイスウォール他、１９９６年）用のサンプル調製法である。ここで、サーコシル抽出及びＮａＣｌによるＰｒＰsc由来蛋白質の塩析は、方法４、方法５、方法１では省略した。
【０１４８】
そして、抽出によるＰｒＰsc由来蛋白質の分離に代えて、８％（wt/vol）ズイッタージェント３−１２を用いてサンプルからＰｒＰc（正常なプリオン蛋白質）及び他の蛋白質を十分に除去した。前記ズイッタージェント３−１２は、トリトンＸ−１００よりも有効な洗浄剤であることが分かった。それ故、前者を方法１の均一化バッファにおいてトリトンＸ−１００に代えて用いた。
【０１４９】
脾臓組織については、コラゲナーゼによる消化は、４％（wt/vol）トリトンＸ−１００と０．５％（wt/vol）サーコシルとを用いて行った（方法３、方法４及び方法５）。そして方法５においては、より非特異的な物質を除去する目的で、40,000rpmの遠心力下で得られたペレット（濃縮物）を８％（wt/vol）ズイッタージェント３−１２及び０．５％（wt/vol）サーコシルで更に抽出した。
【０１５０】
(3-1) 脳組織について
図７は、脳組織及び脾臓組織の適切なサンプル調製法を示すものである。図７（Ａ）、（Ｂ）とも、繰り返し行った測定結果である。
【０１５１】
脳組織抽出物は、方法４、方法３、方法１で調製（濃縮）し、３ＭのＧｄｎＳＣＮ−ＰＢＳ中で２倍ずつ溶解、希釈化した。ここで、プレートを調べるのに間接法を用いた。陰性のコントロール群（コントロール）として、８個のウエルをそれぞれ、非感染マウスの２０mgの脳組織等価物から方法１で得られた抽出物でコーティングした。カットオフ値は、３Ｓ.Ｄ.を加えた平均値とした。
【０１５２】
脾臓組織抽出物は、方法４、方法３、方法５で調製（濃縮）し、４ＭのＧｄｎＳＣＮ−ＰＢＳ中で４倍ずつ溶解、希釈化した。ここで、プレートを調べるのにＡＢＣ法を用いた。陰性のコントロール群（コントロール）として、各方法において５個のウエルを非感染マウスの４０mgの脾臓組織等価物からの抽出物でコーティングした。平均値を示したが、Ｓ.Ｄ.は小さすぎて示していない。○と□で表した曲線に対し、コントロールはゼロに近く、カットオフ値はｙ軸上の０．１Ｕであったが、これは脾臓組織で繰り返し得られた値におおよそ対応している（図６及び図８）。
【０１５３】
図７（Ａ）によれば、均一化バッファ（方法１）におけるズイッタージェント−サーコシルの組み合わせによって、７．８μgの脳組織と同量においてもＰｒＰscの検出を可能としたことが分かる。
【０１５４】
また、トリトン−サーコシルの組み合わせ（方法４）で得られた感度を方法１のものと比べた。方法４は方法１よりもやや感度が劣るが、十分に実用的なものである。但し、方法３では、１２５μg以上の脳等価物でしかＰｒＰscが検出されなかった。このように、サーコシル及びＮａＣｌによるＰｒＰsc由来蛋白質の付加的な抽出は、ＥＬＩＳＡ法による高感度抽出には至らないことが分かる。
【０１５５】
方法１は、高感度に加えて、比較サンプル（図７(Ａ)）の継続して弱い非特異的反応も明らかにした。従って、方法１は、脳組織のサンプル調製には最も適した方法と考えられた。
【０１５６】
(3-2) 脾臓組織について
方法４で得られた陰性のコントロール群のウエルは、完全に正のシグナルを示す非特異反応を呈した（図７(Ｂ)）。従って、この方法は、脾臓組織の調製には不適当であることが分かった。陰性のコントロール群に基づいて方法３及び方法５における感度のあるカットオフラインを確立することは、陰性のコントロール群の非常に弱い反応のために可能ではなかった。
【０１５７】
従って、図６（Ｂ）及び図８（Ｃ）の結果を含め、脾臓組織について繰り返して確立した値を考慮しながら、カットオフラインをｙ軸の０．１Ｕとした。これによって、方法３と方法５について類似したＰｒＰscの検出にとって効果的な反応が実現された（図７(Ｂ)）。但し、方法５は、大量の組織等価物について方法３の感度には及ばなかったし、繰り返しの測定により、方法３の感度のほぼ２倍の感度を示した（データは示さず）が、これはサーコシル抽出及びＮａＣｌによるＰｒＰsc由来蛋白質の塩析について検討する必要がある。
【０１５８】
図７（Ｂ）に示したすべての方法の結果を比較すると、脾臓組織についての感度及び特異性を向上させるためには、ズイッタージェント３−１２を含む洗浄剤の組み合わせで非特異的蛋白を十分に除去すること、或いは、抽出物及び塩析によってＰｒＰsc由来蛋白質を分離することが、効果的で必要な工程であることが分かる。
【０１５９】
(4) ウエスタンブロット法とＥＬＩＳＡ法の感度の比較
脳組織又は脾臓組織から抽出されたＰｒＰscを検出するための診断方法として、ＥＬＩＳＡ法の有用性は、ＥＬＩＳＡ法とウエスタンブロット（ＷＢ）法の感度比較で確かめられた。
【０１６０】
感染病状の発現前段階での動物の診断法に類似した比較であって、ＰｒＰscのごく少量が潜伏している組織サンプルの比較を行うために、非感染マウスの組織均一化物で希釈されたスクレーピー感染マウスからの組織均一化物を処理した。
【０１６１】
図８は、ＥＬＩＳＡ法とウエスタンブロット法との感度比較を示している。すべての結果は各測定のデータである。脳組織についての結果は、図８（Ａ）（ＥＬＩＳＡ法）、図８（Ｂ）（ＷＢ法）に示し、脾臓組織についての結果は、図８（Ｃ）（ＥＬＩＳＡ法）、図８（Ｄ）（ＷＢ法）に示す。
【０１６２】
(4-0) ＥＬＩＳＡ法及びＷＢ法のサンプル調製：
脳組織は方法１で、脾臓組織は方法３で調製した。スクレーピー感染マウスから得られた組織均一化物を、非感染マウスの対応する組織の２０mg等価物からのホモジネート中で順次２倍ずつ希釈した。２3倍（即ち、２．５mg/２０mgに等しい組織等価物全量に対するスクレーピー組織等価物の割合）から２11倍（９．８μg/２０mg）への希釈工程の結果を示す。
【０１６３】
ＥＬＩＳＡ法（図８(Ａ)、図８(Ｃ)）；マイクロタイタープレートへの吸着に関し、各希釈工程のサンプルは２０mgの組織等価物からの抽出物からなり、脳組織及び脾臓組織についてそれぞれ３Ｍ及び４ＭのＧｄｎＳＣＮ−ＰＢＳに溶解した。両組織とも、マイクロタイタープレートの５個のウエルを非感染マウスからの２０mg当量の抽出物でコーティングし、ＥＬＩＳＡ法の陰性のコントロール群（コントロール）とした。これらを図示したが、標準偏差（Ｓ.Ｄ.）は小さすぎて図示していない。また、カットオフラインは各平均値に３Ｓ.Ｄ.を加えた値に相当している。
【０１６４】
ＷＢ法（図８(Ｂ)、図８(Ｄ)）；各希釈工程について、組み合わせ総量が２０mgの組織から採取した抽出物を使用して１レーン当たりの負荷を行った。薄膜はフィルムに１５時間露出させた。
【０１６５】
(4-1) 脳組織
ＥＬＩＳＡ法は、２8倍の希釈工程の場合に明らかに積極的な反応が生じることを示し、２9倍の希釈工程においてもカットオフライン以上となることが分かった。このことは、スクレーピー感染マウスからの脳組織が全ホモジネート量の１/５１２にすぎない場合（これは脳等価物２０mgの全量中の３９μgに相当する。）でも、ＰｒＰscを検出できることを意味する（図８(A) ）。
【０１６６】
一方、ＷＢ法は、薄膜を１５時間露出させた後に、２8倍の希釈工程（これは１/２５６の比率、即ち、２０mgの脳組織全量中の７８μgのスクレーピー脳に相当する。）で非常に弱いバンドを示すに過ぎなかった（図８(Ｂ)）。
【０１６７】
この結果、ＥＬＩＳＡ法はＷＢ法と少なくとも同等の感度を示していることがわかる。
【０１６８】
(4-2) 脾臓組織
ＥＬＩＳＡ法は、２6倍の希釈工程の場合に明らかに積極的な反応が生じることを示し、スクレーピー感染マウスの脾臓組織が全量の１/６４にすぎない（即ち、２０mgの脾臓等価物の全量中の３１２．５μgに相当する。）場合でも、ＰｒＰscが抽出物中に検出されたことを示す（図８(Ｃ)）。
【０１６９】
ＷＢ法は、１５時間の露出後に、２5倍以下の希釈（これは、スクレーピー感染マウスの組織の１/３２、即ち、２０mgの脾臓組織等価物全量中の６２５μgに相当する。）で、２４．５kDa、２１kDa、１７kDaのＰｒＰsc特有のバンドを示した（図８(Ｄ)）。
【０１７０】
従って、脾臓組織についても、ＥＬＩＳＡ法の感度はＷＢ法の感度以上に相当するものであることが分かる。
【０１７１】
ここで、脾臓組織に関しＥＬＩＳＡ法による積極的な結果を得るのに求められる組織等価物は、脳組織に関して求められる組織等価物より８倍多いだけであった。
【０１７２】
６．評価
マウスのスクレーピーは感染後１週間目にＷＢ法で診断され（グレイスウォール他、１９９６年）、レイスとエルンスト（１９９２年）は感染後２週間目にＰｒＰscのデノボ合成を検出した。羊のスクレーピーもＷＢ法によって感染初期段階で診断された（イケガミ他、１９９１年；ムラマツ他、１９９３年）。
【０１７３】
これらの結果を組織病理学（Histopathology）（レイス他、１９９２年)、電子顕微鏡法（ルーベンシュタイン他、１９９１年）、又は免疫組織化学法（シュルーダー他、１９９６年）による羊の扁桃腺中のＰｒＰscの予備臨床についての新しい報告の如き他の方法で得られた結果と比較すると、ＷＢ法はスクレーピーの初期での最も高感度な方法の１つであり、面倒なバイオアッセイ（bio assay）を省略できる。
【０１７４】
また、腸壁（腹膜）内面の感染後１週間目に、マウスからの脾臓中のＰｒＰscの検出が十分な組織均一化物によって実現され、ホモジネートのコラゲナーゼ消化によって行われた（グレイスウォール他、１９９６年）。これによって、本発明者によるＷＢ法の感度が他の報告（ルーベンシュタイン他、１９９１年；レイス及びエルンスト、１９９２年）で述べられているマウス脾臓からのＰｒＰscの検出結果と少なくとも一致していることが分かった。
【０１７５】
本発明者は、ＷＢ法と感度が少なくとも同等であり、容易かつ短時間に検出可能なＥＬＩＳＡ法を脳組織及び脾臓組織に適用した。
【０１７６】
スクレーピー診断にＥＬＩＳＡ法を開発する上での大きな障害は、ＰｒＰscが容易に沈積状態に凝集することであった（メイヤー他、１９８６年）。スクレーピー感染組織のギ酸又はＳＤＳでの予備処理（カスクサック他、１９８７年）、更に、純粋なＰｒＰscのＧｄｎＳＣＮでの変性（これはマイクロタイタープレートへの吸着後に行われた；サーバン他、１９９０年）が報告されており、これは、抗ＰｒＰ抗体の免疫反応性を増大させる。また、マイクロタイタープレートへのＢＳＡ牛胎児血清）の吸着がグアニジンの存在下で向上することが報告された（ズー他、１９９３年）。グアニジンはおそらく、抗原性サイトが生じることによって次々と耐プリオン蛋白質抗体の免疫反応性を増大させるＰｒＰscの展開を促進させるものと考えられる。
【０１７７】
これらの観察及び考察に基づいて、本発明者は、ＰｒＰsc含有物質を直接溶解させるために1Ｍ〜５Ｍ（特に３Ｍ及び４Ｍ）のＧｄｎＳＣＮを用い、この濃度でのＧｄｎＳＣＮの存在下でマイクロタイタープレートへのＰｒＰscの吸着に成功した。
【０１７８】
ＥＬＩＳＡ法で分析可能な組織等価量の限界、即ち、感度の向上が見込めない限界値は、４０mg付近（データは図示せず）にある。
【０１７９】
ＥＬＩＳＡ法の利点は、多くのサンプルを１回で分析できるため、潜在的に感染された動物を大量に診断、選別することによって、感染による病気をコントロールするという広汎な用途に導けることである。
【０１８０】
ＰｒＰscの検出を経てＴＳＥ（伝播性海綿状脳症:Transmissible Spongiform Encephalopathies）を実際に診断する方法に対する障害は、血液又はその成分を未だ診断に使用しにくいことにある。ＰｒＰscは脳又はリンパ腺組織から抽出されるべきものであるから、サンプル調製は最も時間を要するファクタである。脳組織について適用される方法（方法１）はかなり簡単な方法であり、高感度化に導くものである。但し、方法１は、脾臓組織には十分ではない。これに関して、サーコシルによるＰｒＰscの抽出及びこれに続くＮａＣｌによる塩析（方法３）によって、感度が向上し、非特異性シグナルが減少する。
【０１８１】
この方法は、時間がかかるが、ごく少量のＰｒＰscを検査するのに有用である。一方、ＰｒＰscの抽出及び塩析を省略し、サンプル調製（濃縮）を方法５で行うと、ＥＬＩＳＡ法の感度が約２倍低下するが、なおも、ＷＢ法と同等であった（データは示さず）。このことと、方法５が方法３よりも短時間で行える事実とから、方法５は診断にとって実用可能であると考えられる。
【０１８２】
本実施例を行うなかで見出されたＷＢ法における０．６mgの脾臓組織のＰｒＰsc検出限界は、公知の０．３mgの検出限界（グレイスウォール他、１９９６年）とほぼ同等であった。この場合、最終的な組織抽出物はＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファによって希釈しているが、通常の組織ホモジネートを希釈剤として用いて、最初の抽出工程後に順次希釈を行っているため、ＰｒＰsc検出条件はあまり有利ではなかった。ＥＬＩＳＡ法について報告されている極限の検出限界はより困難な条件を考慮して見出されるべきである。
【０１８３】
脳組織についての結果を脾臓組織のそれと比較すると（図６、図７及び図８）、脳組織中のＰｒＰsc量は脾臓組織中のＰｒＰsc量の８〜３０倍であるものと考えられる。異なるマウス適用のＴＳＥは脾臓組織に含まれるＰｒＰscで変化することを考慮しても、ルーベンシュタイン等（１９９３年）によってスクレーピー感染マウスで発見された５００倍よりもかなり少なく、また、感染の終わりの段階でＣＪＤ（Creutfelt Jakob disease）感染マウスにおいてサカグチ等（１９９３年）によって発見された５０倍以上よりも少ない。ラズメザス等（１９９６年）のみが最近、マウスモデルに関する約３０倍の差を報告した。
【０１８４】
本発明者は、ＰｒＰsc由来蛋白質回収を高効率に行うことが改善されたサンプル調製で実現することを考慮している。そして、マウス脾臓中のＰｒＰsc量はこれまで考えられていたものより多いように思われる。
【０１８５】
予備臨床に関するリンパ腺組織の潜在力に着目して、ヴァン・クーレン等（１９９６年）は免疫組織化学法によってＰｒＰsc量を幾つかの上記組織について調べた。この研究によれば、扁桃腺、脾臓及び腸間リンパ節はこの順に、予備臨床の最も好適な組織である。本発明者は、実験的モデル（イケガミ他、１９９１年）及び天然の羊スクレーピー（ムラマツ他、１９９３年）の双方について、スクレーピーの予備臨床段階での生検表面リンパ節に含まれるＰｒＰscを検出したことを報告した。しかし、ＰｒＰsc量と各組織の得られ易さとを考えると、シュルーダー等（１９９６年）において提案されているように、扁桃腺の生検及び検査は、生前試験（antemortem test）としてより適していると思える。
【０１８６】
上述した実施例から、脳及び脾臓組織からのＰｒＰsc検出のために、ＡＢＣ法と共にＥＬＩＳＡ法を使用する方法は、少なくともＷＢ法と同等の感度が得られると結論づけられる。また、このＥＬＩＳＡ法を羊のスクレーピーや牛のＢＳＥの診断に適用すれば、現行のＷＢ法に比べて、より実用的な、速い診断ができると思われる。しかしながら、検査方法として適当なものにするためには、ＰｒＰscの抽出に要する手間をより簡便にする必要がある。
【０１８７】
原組織抽出物やＧｄｎＳＣＮ溶解物に含まれるＰｒＰsc由来蛋白質をマイクロタイタープレートに容易に吸着できることは、より高感度にＰｒＰscの検出を可能にする上で基本事項と考えられる。発色ＥＬＩＳＡ法はＷＢ法に比べてわずかに高感度であるが、蛍光物質や化学発光物質のような試薬を使用することで、さらに感度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】本実施例における病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮方法の概要を示すフロー図である。
【図２】同、他の濃縮方法の概要を示すフロー図である。
【図３】同、他の濃縮方法の概要を示すフロー図である。
【図４】同、病原性プリオン蛋白質の検出に用いる酵素免疫吸着測定法の概要を示すフロー図である。
【図５】同、酵素免疫吸着測定法における吸着の前段階で使用する溶剤の種類及び濃度による病原性プリオン蛋白質の検出能の変化を示すグラフである（脳組織(Ａ)、脾臓組織(Ｂ)）。
【図６】同、発色法による検出能を示すグラフである（脳組織(Ａ)、脾臓組織(Ｂ)）。
【図７】同、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮方法による検出能を示すグラフである（脳組織(Ａ)、脾臓組織(Ｂ)）。
【図８】同、酵素免疫吸着測定法における検出能を示すグラフ（脳組織(Ａ)、脾臓組織(Ｃ)）、及びＷＢ法における検出能を示す図（脳組織(Ｂ)、脾臓組織(Ｄ)）である。
【図１】
2004325463.tif 000003
【図２】
2004325463.tif 000004
【図３】
2004325463.tif 000005
【図４】
2004325463.tif 000006
【図５】
2004325463.tif 000007
【図６】
2004325463.tif 000008
【図７】
2004325463.tif 000009
【図８】
2004325463.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月6日(2004.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法の実施に際し、検出されるべき病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を濃縮する方法において、
前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均  一化する第１の工程と、
前記第１の工程で得られた均一化物を、微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて  分解処理する第２の工程と、
前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質  を含有する濃縮物を得る第３の工程と
を有する濃縮方法。
【請求項２】
界面活性剤がＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項１に記載の濃縮方法。
【請求項３】
前記動物組織由来物質を中枢神経系組織とする、請求項１又は２に記載の濃縮方法。
【請求項４】
前記中枢神経系組織を脳組織とする、請求項３に記載の濃縮方法。
【請求項５】
前記第２の工程において、前記分解酵素としてコラーゲン分解酵素及びＤＮＡ分解酵素を用いて前記均一化物を分解し、さらに微生物プロテアーゼを含む蛋白質分解酵素を用いて分解する、請求項１に記載の濃縮方法。
【請求項６】
前記微生物プロテアーゼが、プロテイナーゼＫである、請求項１から５のいずれか１項に記載の濃縮方法。
【請求項７】
前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて分解し、次いで分離後に塩析処理を施す工程を更に有する、請求項１に記載の濃縮方法。
【請求項８】
前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を界面活性剤で洗浄する洗浄工程を更に有する、請求項１に記載の濃縮方法。
【請求項９】
動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法の実施に際し、検出されるべき病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を濃縮する方法において、
前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均  一化する第１の工程と、
前記第１の工程で得られた均一化物を、微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて  分解処理する第２の工程と、
前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質  を含有する濃縮物を得る第３の工程と、
前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を含有する濃縮物を  Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネートからなる界  面活性剤で洗浄する洗浄工程と
を有する濃縮方法。
【請求項１０】
前記動物組織由来物質を細網リンパ系組織とする、請求項８または９に記載の濃縮方法。
【請求項１１】
前記細網リンパ系組織を脾臓組織とする、請求項１０に記載の濃縮方法。
【請求項１２】
前記第２の工程において、前記分解酵素としてコラーゲン分解酵素及びＤＮＡ分解酵素を用いて前記均一化物を分解し、さらに微生物プロテアーゼを含む蛋白質分解酵素を用いて分解する、請求項９に記載の濃縮方法。
【請求項１３】
動物組織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する方法の実施に際し、検出されるべき病原性プリオン蛋白質由来蛋白質を濃縮するための試薬キットであって、
前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いて前記動物組織由来物質を均  一化する第１の工程と、
前記第１の工程で得られた均一化物を、微生物プロテアーゼを含む分解酵素を用いて  分解処理する第２の工程と、
前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質  を含有する濃縮物を得る第３の工程と
を有する濃縮方法を実施するための、
（ａ）界面活性剤を含有する動物組織由来物質の均一化試薬、および
（ｂ）微生物プロテアーゼを含有する分解酵素試薬
を含む組み合わせからなる、病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の濃縮試薬キット。
【請求項１４】
病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の溶剤を含有する溶解試薬をさらに含む、請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
前記界面活性剤が、サーコシル、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである、請求項１３または１４記載のキット。
【請求項１６】
前記微生物プロテアーゼが、コラーゲン分解酵素およびプロテイナーゼＫから選択される少なくとも１つの酵素である、請求項１３、１４または１５記載のキット。
【請求項１７】
前記病原性プリオン蛋白質由来蛋白質の溶剤が、グアニジンチオシアネートである、請求項１４、１５または１６記載のキット。