(57)【要約】【課題】検体測定値の経時的な変動を抑え検体測定値の安定性が飛躍的に向上した免疫測定方法及び免疫測定キットを提供する。【解決手段】被測定物質である抗原又は抗体と、前記被測定物質に対する抗体又は抗原との凝集反応の度合いを検出することにより前記被測定物質を測定する免疫測定方法であって、反応系に抗補体抗体を存在させる免疫測定方法。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定物質である抗原又は抗体と、前記被測定物質に対する抗体又は抗原との凝集反応の度合いを検出することにより前記被測定物質を測定する免疫測定方法であって、反応系に抗補体抗体を存在させることを特徴とする免疫測定方法。
【請求項２】
抗補体抗体は、抗Ｃ３ｃ抗体及び／又は抗Ｃ４ｃ抗体であることを特徴とする請求項１記載の免疫測定方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の免疫測定方法を実施するために用いることを特徴とする免疫測定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体測定値の経時的な変動を抑え検体測定値の安定性に優れた免疫測定方法及び免疫測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
各種生体成分から特定の被測定物質を検出又は定量するため、被測定物質に対する抗原又は抗体との凝集反応を、肉眼にて観察又は光学的に検出する方法が行われている。また、より検出感度を向上するため、被測定物質に対する抗体又は抗原を不溶性担体に担持し、被測定物質との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合いを検出することにより被測定物質を測定する方法が近年広く用いられており、このような測定法としてはラテックス凝集法、赤血球凝集法等がある。
【０００３】
このような方法では試料として血清、血漿、尿、体液、その他の生体成分を用いることが一般的であるが、測定する項目や試料によっては、試料中の被測定物質には変動がないにもかかわらず、被測定物質以外の成分の変動により、採取後経時的に測定値が変動する場合がある。
このような場合には、試料採取後より測定までの時間や保存条件を管理する等の対応がとられているが、非常に煩雑である。
また、測定値が変動する試料では、測定結果に基づいた正確な疾病の診断ができないため、従来より大きな問題となっていた。
各種添加物により、試料中に存在する非特異的反応物質の影響を抑制する方法は従来より提案されているが、試料が本質的にもっている影響因子による経時的な変動を抑えることはできなかった。
【０００４】
特許文献１には、予め検体をヒトリウマチ因子（ＲＦ）の反応部位に結合能を有する動物由来抗体の充分量で前処理して、検体中のヒトＲＦに起因する非特異的反応を減少させる免疫学的検出方法が記載されている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平７−１２８１８号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、検体測定値の経時的な変動を抑え検体測定値の安定性が飛躍的に向上した免疫測定方法及び免疫測定キットを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、被測定物質である抗原又は抗体と、上記被測定物質に対する抗体又は抗原との凝集反応の度合いを検出することにより上記被測定物質を測定する免疫測定方法において、反応系に抗補体抗体を存在させる免疫測定方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明の免疫測定方法は、被測定物質である抗原又は抗体と、上記被測定物質に対する抗体又は抗原との凝集反応の度合いを検出することにより上記被測定物質を測定する方法である。
上記被測定物質としては特に限定されないが、血液中に存在する抗原又は抗体が好ましく、例えば、変性γ−グロブリン、リウマチ因子、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）、抗ＳＬＯ抗体、ペプシノーゲン、抗ペプシノーゲン抗体、カルジオライピン、抗カルジオライピン抗体、インスリン、抗インスリン抗体、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、抗ＣＲＰ抗体、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、抗ＡＦＰ抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、抗ＣＥＡ抗体、ＨＢｓ抗原、抗ＨＢｓ抗体、抗トレポネーマ抗体に対する抗原、ＨＣＶ抗原、フィイブリノーゲン、抗フィブリノーゲン抗体、フィブリン及びフィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）に対する抗体等が挙げられる。
【０００９】
上記被測定物質に対する抗体又は抗原としては、生体由来のもの、遺伝子組換え等の技術を用いて得られたもの、それらの処理物等が用いられる。
上記被測定物質に対する抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであっても好適に用いることができ、また、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’であってもよい。
上記測定対象物に対する抗原としては特に限定されず、抗原能を有する物質以外にハプテンであってもよい。
【００１０】
上記被測定物質に対する抗体又は抗原は、不溶性担体に担持されていてもよい。上記不溶性担体としては特に限定されず、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等からなるラテックス粒子；不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等のその他有機高分子からなる粒子；シリカ、アルミナ等からなる無機粒子；金、チタン、鉄、ニッケル等の金属粉末；赤血球等の生体由来粒子等が挙げられる。なかでもラテックス粒子が好適に用いられる。
上記不溶性担体の粒径としては、０．０５〜５．０μｍの範囲において検出濃度又は測定機器により適宜選択すればよい。
【００１１】
本発明の免疫測定方法は、抗原抗体反応系に抗補体抗体を存在させることを特徴とするものである。
上記補体としては特に限定されず、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７Ｃ８、Ｃ９、及び、それらの分解物が挙げられる。なかでも、Ｃ３ｃや、Ｃ４ｃに対する抗体を反応系に存在させた場合に測定値の安定効果が高く好ましい。
上記抗補体抗体としては、生体由来のもの、遺伝子組換え等の技術を用いて得られたもの、それらの処理物等が用いられる。
上記抗補体抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであっても好適に用いることができ、また、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’であってもよい。
【００１２】
上記抗補体抗体を反応系に存在させる方法としては特に限定されず、例えば、（１）抗補体抗体の溶液を用意して、被測定物質を含む検体に、被測定物質に対する抗体又は抗原を反応させる前に抗補体抗体の溶液を反応させる方法  、（２）被測定物質に対する抗体若しくは抗原の溶液、又は、被測定物質に対する抗体若しくは抗原を不溶性担体に担持する場合には、抗体若しくは抗原が担持された不溶性担体の懸濁液に抗補体抗体を添加する方法等が挙げられる。
【００１３】
上記抗補体抗体の使用量としては、最終的な試薬性能を考慮して決定すればよく特に限定されないが、上記（１）における抗補体抗体の溶液中又は（２）における被測定物質に対する抗体又は抗原の溶液中に、免疫グロブリン濃度として０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬを存在させるのが好ましい。
本発明の免疫測定方法に供する検体としては特に限定されないが、血清、血漿、血液等が好適に用いられる。
【００１４】
抗原抗体反応時には、感度を高めるために、公知の水溶性添加剤を反応系に存在させてもよい。上記水溶性添加剤としては、例えば、ポリエチレングリコ−ル、カルボキシルメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリグリコシルエチルメタクリレート、プルラン、デキストラン等の水溶性高分子等が挙げられる。
【００１５】
抗原抗体反応時には、非特異的反応の抑制、試薬の安定性向上等のために、更に他の添加剤を反応系に存在させてもよい。上記添加剤としては、例えば、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質又はその分解物・変性物；塩化コリン等の第４級アンモニウム塩；ＥＤＴＡ、ポリアニオン；Ｃｌ−、Ｉ−、ＳＣＮ−等のカオトロピックイオン；アミノ酸、界面活性剤等が挙げられる。
【００１６】
反応系のｐＨとしては、５〜１０であることが好ましい。より好ましい下限は６であり、より好ましい上限は９である。反応温度としては、０〜５０℃であることが好ましい。より好ましい下限は２０℃であり、より好ましい上限は４０℃である。反応時間は適宜決定すればよい。
【００１７】
本発明の免疫測定方法を実施するために用いる免疫測定キットもまた、本発明の１つである。
本発明の免疫測定キットは、少なくとも、上記抗補体抗体、及び、上記被測定物質に対する抗体又は抗原を構成成分として含有するものである。
本発明の免疫測定キットは更に、上記水溶性添加剤、その他の添加剤を含有していてもよい。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００１９】
＜実施例１＞フィブリン及びフィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）の測定
（１）緩衝液の調製
５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ６．５）に、１重量％牛血清アルブミン、１重量％ポリエチレングリコール６０００、０．１重量％アジ化ナトリウム及び０．２１ｍｇ／ｍＬの抗ヒトＣ３ｃ補体成分ウサギポリクローナル抗体（ダコジャパン社製、Ａ００６２）を溶解した。
【００２０】
（２）抗ヒトフィブリノーゲン抗体感作ラテックス試薬の調製
抗ヒトフィブリノーゲンヤギポリクローナル抗体を蛋白質濃度として３ｍｇ／ｍＬで５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ６．５）に溶解した液２ｍＬに、平均粒径０．１μｍのポリスチレン系ラテックス（固形分１０重量％、積水化学工業社製）１ｍＬを添加し、３７℃にて６０分間攪拌した。次いで、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという）を２重量％濃度で含有する５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ６．５）３ｍＬをラテックス懸濁液に加え、３７℃にて６０分間攪拌した後、この混合液を遠心分離を行って上清を廃棄し、ポリスチレン系ラテックスに担持されていない抗体を取り除いた。得られた沈殿物に、０．１重量％アジ化ナトリウム及び１重量％ＢＳＡを溶解した５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ６．５）１０ｍＬを加えて再懸濁し、ＦＤＰ測定用試薬を製造した。
【００２１】
（３）試料
血清検体３例を用いた。試料の測定は、血清採取直後（０時間）、３時間後、６時間後の計３回行った。
【００２２】
（４）検体の測定
本実施例のＦＤＰ測定試薬は、上記（１）の緩衝液からなる第１試薬及び上記（２）のラテックス試薬からなる第２試薬から構成される２液系の試薬とした。
測定用の標準液としては、５０μｇ／ｍＬに希釈したヒトフィブリノーゲン液（カビ社製）を生理食塩水にて希釈して０、６．３、１２．５、２５、５０μｇ／ｍＬのものを調製した。
標準液各５μＬに、各々上記（１）項の緩衝液（第１試薬）１５０μＬを混和し、３７℃で適時保持した後、上記（２）のラテックス試薬（第２試薬）１５０μＬを添加撹拌し、この後、約８０秒から３００秒間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定には日立自動分析装置７１５０形を使用した。
試料である血清検体についても、上記標準液と同様に操作して吸光度変化量を求め、標準液より得られた検量線より試料中のＦＤＰ濃度を求めた。
【００２３】
＜実施例２＞
緩衝液の調製において、抗ヒトＣ３ｃ補体成分ウサギポリクローナル抗体を、０．８ｍｇ／ｍＬ抗ヒトＣ４ｃ補体成分ウサギポリクローナル抗体（ダコジャパン社製、Ａ００６５）に変えた以外は実施例１と同様に操作し、試料中のＦＤＰ濃度を求めた。
【００２４】
＜比較例１＞
緩衝液の調製において、抗ヒトＣ３ｃ補体成分ウサギポリクローナル抗体を添加しなかったこと以外は実施例１と同様に操作し、試料中のＦＤＰ濃度を求めた。実施例１、２及び比較例１の結果を表１及び表２に示した。
【００２５】
【表１】
2004325414.tif 000002
【００２６】
【表２】
2004325414.tif 000003
【００２７】
表１及び表２に示された結果から明らかなように、抗補体抗体を加えた実施例１及び実施例２では、無添加の比較例１と比べ、ＦＤＰ測定値の変動が顕著に抑えられていた。
【００２８】
＜実施例３＞ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の測定
（１）緩衝液の調製
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に、１重量％牛血清アルブミン、１重量％プルラン、０．１重量％アジ化ナトリウム及び０．５ｍｇ／ｍＬの抗ヒトＣ３ｃ補体成分ウサギポリクローナル抗体（ダコジャパン社製、Ａ００６２）を溶解した。
【００２９】
（２）抗ヒトα−フェトプロテイン抗体感作ラテックス試薬の調製
抗ヒトα−フェトプロテインモノクローナル抗体を蛋白質濃度として５０μｇ／ｍＬで５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した液４ｍＬに、平均粒径０．３μｍのポリスチレン系ラテックス（固形分１０重量％、積水化学工業社製）１ｍＬを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２．５％に希釈したもの１ｍＬを加え、２５℃にて６０分間攪拌した。次いで、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという）を１重量％濃度で含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍＬをラテックス懸濁液に加え、２５℃にて１２０分間攪拌した後、この混合液に対し遠心分離を行って上清を廃棄し、ポリスチレン系ラテックスに担持されていない抗体を取り除いた。得られた沈殿物に、０．１重量％アジ化ナトリウム及び１重量％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２０ｍＬを加えて再懸濁し、ＡＦＰ測定用試薬を製造した。
【００３０】
（３）試料
血清検体３例を用いた。試料の測定は、血清採取直後（０時間）、３時間後、６時間後の計３回行った。
【００３１】
（４）検体の測定
本実施例のＡＦＰ測定試薬は、上記（１）の緩衝液からなる第１試薬及び上記（２）のラテックス試薬からなる第２試薬から構成される２液系の試薬とした。
測定用の標準液としては、ＡＦＰ標準品（ダコジャパン社製）１１０μｇ／ｍＬを生理食塩水にて希釈して、０、５、２０、１００、５００、２０００ｎｇ／ｍＬのものを調製した。
標準液各２０μＬに、各々上記（１）項の緩衝液（第１試薬）２１０μＬを混和し、３７℃で適時保持した後、上記（２）のラテックス試薬（第２試薬）３０μＬを添加撹拌し、この後、約８０秒から３００秒間の波長５７０ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定には日立自動分析装置７１５０形を使用した。
試料である血清検体についても、上記標準液と同様に操作して吸光度変化量を求め、標準液より得られた検量線より試料中のＡＦＰ濃度を求めた。
【００３２】
＜実施例４＞
緩衝液の調製において、抗ヒトＣ３ｃ補体成分ウサギポリクローナル抗体を、２ｍｇ／ｍＬ抗ヒトＣ４ｃ補体成分ウサギポリクローナル抗体（ダコジャパン社製、Ａ００６５）に変えた以外は実施例３と同様に操作し、試料中のＡＦＰ濃度を求めた。
【００３３】
＜比較例２＞
緩衝液の調製において、抗ヒトＣ３ｃ補体成分ウサギポリクローナル抗体を添加しなかった以外は実施例３と同様に操作し、試料中のＦＤＰ濃度を求めた。
実施例３、４及び比較例２の結果を表３及び表４に示した。
【００３４】
【表３】
2004325414.tif 000004
【００３５】
【表４】
2004325414.tif 000005
【００３６】
表３及び表４に示した結果から明らかなように、ＦＤＰ同様ＡＦＰ測定試薬でも、抗補体抗体を加えた実施例３及び実施例４では、無添加の比較例２と比べ、ＡＦＰ測定値の変動が顕著に抑えられていた。
【００３７】
【発明の効果】
本発明は、上述の構成よりなるので、抗原抗体反応系に抗補体抗体を存在させることにより、検体測定値の経時的な変動が抑制され検体測定値の安定性が飛躍的に向上した。