(57)【要約】【課題】脂質セカンドメッセンジャーが生細胞内のどの部位で、いつ、産生されたかを定量的に検出するためのプローブを提供する。【解決手段】脂質セカンドメッセンジャーに特異的に結合するポリぺプチドと、該ポリぺプチドの両末端に、剛直なリンカー配列を介して連結された異なる蛍光波長を有する二つの発色団と、一方の発色団と剛直なリンカー配列を介して連結された膜局在化配列を有することを特徴とする脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブとする。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質セカンドメッセンジャーに特異的に結合するポリぺプチドと、該ポリぺプチドの両末端に、剛直なリンカー配列を介して連結された異なる蛍光波長を有する二つの発色団と、一方の発色団と剛直なリンカー配列を介して連結された膜局在化配列を有することを特徴とする脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ。
【請求項２】
脂質セカンドメッセンジャーに特異的に結合するポリぺプチドは、脂質セカンドメッセンジャー結合タンパク質である請求項１の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ。
【請求項３】
脂質セカンドメッセンジャー結合タンパク質は、ＧＲＰ１のプレクストリン相同ドメインである請求項２の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ。
【請求項４】
発色団は、ポリぺプチドのＮ−末端に連結されたシアン蛍光タンパク質と、Ｃ−末端に連結された黄色蛍光タンパク質である請求項１ないし３のいずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ。
【請求項５】
リンカー配列は、配列番号１の配列の繰り返しからなる剛直なα−ヘリックス状リンカーである請求項１ないし４のいずれかの脂質セカンドメッセンジャー。
【請求項６】
少なくとも１つのリンカー配列は、ジグリシンモチーフを有する請求項１ないし５のいずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ。
【請求項７】
膜局在化配列は、脂質化配列又は膜貫通配列である請求項１ないし６のいずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを脂質セカンドメッセンジャーと共存させ、蛍光波長の変化を測定することを特徴とする脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを脂質セカンドメッセンジャーと共存させる請求項８の脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法。
【請求項１０】
請求項１ないし７のいずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞において脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブと脂質セカンドメッセンジャーを共存させる請求項８の検出および定量方法。
【請求項１１】
脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブは、細胞内で膜に固定化され、該膜において産生される脂質セカンドメッセンジャーを検出・定量する請求項９または１０のいずれかの脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法。
【請求項１２】
請求項１ないし７のいずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって得られる非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項１３】
請求項１２の非ヒト動物またはその子孫動物に検査試料を導入し、該非ヒト動物またはその子孫動物の細胞における脂質セカンドメッセンジャーを定量する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、脂質セカンドメッセンジャーが生細胞内のどこで、いつ、産生されたかを定量的に検出するための脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブとそれを用いた脂質セカンドメッセンジャーの検出・定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
脂質セカンドメッセンジャーの一つであるホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰＩＰ３）は、細胞膜に存在し、細胞内シグナル伝達において重要な役割を果たしている。具体的には、Ａｋｔ、ＰＤＫ１、およびＢｔｋ等の結合タンパク質を活性化し、アポトーシス、糖尿病、癌等に関係する様々な細胞機能を調節することが知られている（非特許文献１〜３）。ＰＩＰ３等の脂質セカンドメッセンジャーは、細胞膜において、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）により触媒されて産生されることが明らかになっており（非特許文献４）、ＰＩ３Ｋが多くの刺激により活性化されることも知られている。しかし、細胞膜のどの部分で、いつ、どのようにしてＰＩＰ３が産生されるのかは明らかになっていない。その大きな原因の一つとして、生細胞におけるＰＩＰ３の空間的および時間的な動態を定量的に分析するための適当な方法がないことが挙げられる。
【０００３】
従来、ＰＩＰ３の変化は、［３２Ｐ］オルトリン酸を用いた細胞の標識により広く測定されてきた。しかし、このような方法では、充分な放射化学的シグナルを得るために数百万個の細胞を粉砕し、分析しなければならないという問題があった。また、最近になって、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と、Ｂｔｋ（非特許文献５）、ＧＲＰ１（非特許文献６）、ＡＲＮＯ（非特許文献７）、またはＡｋｔ（非特許文献８）由来のＰＩＰ３結合ドメインとの融合タンパク質が、細胞膜におけるＰＩＰ３蓄積のための指示薬として作用することが報告され、このような指示薬では細胞質ゾルから細胞膜への該融合タンパク質の転位がＰＩＰ３の蓄積を反映するとされている。しかしながら、このような方法では、細胞の形状変化や細胞膜のラフリングなどの影響を受けやすく、ＰＩＰ３に無関係な対象に応答しやすいという問題があった。さらに、このような蛍光融合タンパク質では、細胞内のどの膜に融合タンパク質が転位するのかを識別することが困難であるという問題もあった。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｃａｎｔｌｅｙ，  Ｌ．  Ｃ．  （２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９６，  １６５５−１６５７．
【非特許文献２】
Ｃｚｅｃｈ，  Ｍ．  Ｐ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ，  １００，  ６０３−６０６．
【非特許文献３】
Ｖａｎｈａｅｓｅｂｒｏｅｃｋ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ａｌｅｓｓｉ，  Ｄ．  Ｒ．  （２０００）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ，  ３４６，  ５６１−５７６．
【非特許文献４】
Ｗｙｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｐ．  ａｎｄ  Ｐｉｒｏｌａ，  Ｌ．  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４３６，  １２７−１５０．
【非特許文献５】
Ｖａｒｎａｉ，  Ｐ．，  Ｒｏｔｈｅｒ，  Ｋ．  Ｉ．  ａｎｄ  Ｂａｌｌａ，  Ｔ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７４，  １０９８３−１０９８９．
【非特許文献６】
Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ，  Ｋ．，  Ｇｕｎｎ−Ｍｏｏｒｅ，  Ｆ．，  Ｔａｖａｒｅ，  Ｊ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｅｎ，  Ｐ．  Ｊ．  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３３５，  １３９−１４６．
【非特許文献７】
Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ，  Ｋ．，  Ｏａｔｅｙ，  Ｐ．  Ｂ．，  Ｔａｖａｒｅ，  Ｊ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｅｎ，  Ｐ．  Ｊ．  （１９９８）  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．，  ８，  ４６３−４６６．
【非特許文献８】
Ｗａｔｔｏｎ，  Ｊ  ａｎｄ  Ｄｏｗｎｗａｒｄ，  Ｊ．  （１９９９）  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．，  ４３３−４３６．
【非特許文献９】
Ｍｉｓｒａ，  Ｓ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｇ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｈｕｒｌｅｙ，  Ｊ．  Ｈ．  （２００１）  Ｃｅｌｌ，  １０７，  ５５９−５６２．
【非特許文献１０】
Ｚｈａｎｇ，  Ｃ．，  Ｋａｚａｎｉｅｔｚ，  Ｍ．  Ｇ．，  Ｂｌｕｍｂｅｒｇ，  Ｐ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｕｒｌｅｙ，  Ｊ．  Ｈ．  （１９９５）  Ｃｅｌｌ，  ８１，  ９１７−９２４．
【非特許文献１１】
Ｍｉｙａｗａｋｉ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．  Ｙ．  （２０００）  Ｍｅｔｈｏｄ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ３２７，  ４７２−５００．
【非特許文献１２】
Ｓａｔｏ，  Ｍ．  ，  Ｈｉｄａ，  Ｎ．，  Ｏｚａｗａ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｕｍｅｚａｗａ，  Ｙ．  （２０００）  Ａｎｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ７２，  ５９１８−５９２４．
【非特許文献１３】
Ｓａｔｏ，  Ｍ．，  Ｏｚａｗａ，  Ｔ．，  Ｉｎｕｋａｉ，  Ｋ．，  Ａｓａｎｏ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｕｍｅｚａｗａ，  Ｙ．  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０，  ２８７−２９４．
【非特許文献１４】
Ｒｅｓｈ，  Ｍ．  Ｄ．  （１９９６）  Ｃｅｌｌ．  Ｓｉｇｎａｌ．，  ８，  ４０３−４１２．
【非特許文献１５】
Ｍｅｒｕｔｋａ，  Ｇ．，  Ｓｈａｌｏｎｇｏ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ，  Ｅ．  （１９９１）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３０，  ４２４５−４２４８．
【非特許文献１６】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７；  ７３８０−７３８４，  １９８０
【非特許文献１７】
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６（２）；  １７８−１８２，  １９９６
【非特許文献１８】
Ｃｈｏｙ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｃｅｌｌ，  ９８，  ６８−８０．
【非特許文献１９】
Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，  Ｊ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ，  １０３，  ２１１−２２５．
【非特許文献２０】
Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ，  Ｋ．，  Ｃｕｎｎ−Ｍｏｏｒｅ，  Ｆ．，  Ｔａｖａｒｅ，  Ｊ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｅｎ，  Ｐ．  Ｊ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  １１２，  １９５７−１９６５．
【非特許文献２１】
Ｖｉｅｒｉａ，  Ａ．  Ｖ．，  Ｌａｍａｚｅ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄ，  Ｓ．  Ｌ．  （１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７４，  ２０８６−２０８９．
【非特許文献２２】
Ｑｕａｌｍａｎｎ，  Ｂ，．  Ｋｅｓｓｅｌｓ，  Ｍ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｙ，  Ｒ．  Ｂ．  （２０００）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １５０，  Ｆ１１１−Ｆ１１６．
【非特許文献２３】
Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ，  Ｊ．  Ｖ．，  Ｂｅａｈａｍ，  Ｐ．  Ｈ．，  Ｓｈｉｆｒｉｎ，  Ｖ．，  Ｊｏｓｔ，  Ｃ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｎｅｅｌ，  Ｂ．  Ｇ．  （１９９２）  Ｃｅｌｌ，  ６８，  ５４５−５６０．
【非特許文献２４】
Ｈａｊ，  Ｆ．  Ｇ．，  Ｖｅｒｖｅｅｒ，  Ｐ．  Ｊ．，  Ｓｑｕｉｒｅ，  Ａ．，  Ｎｅｅｌ，  Ｂ．  Ｇ．  ａｎｄ  Ｂａｓｔｉａｅｎｓ，  Ｐ．  Ｉ．  Ｈ．  （２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９５，  １７０８−１７１１．
【非特許文献２５】
Ｃｅｒｅｓａ，  Ｂ．  Ｃ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄ，  Ｓ．  Ｌ．  （２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １２，  ２０４−２１０．
【非特許文献２６】
Ｌａｖｏｉｅ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７，  ３５４０２−３５４１０．
【０００５】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、ＰＩＰ３に代表される脂質セカンドメッセンジャーが生細胞内のどの部位で、いつ、産生されたかを定量的に検出するためのプローブを提供することを課題としている。また、この出願の発明は、このようなプローブを用いて細胞内脂質セカンドメッセンジャーによるシグナリングに影響を与える物質をスクリーニングする方法や疾病に関連したシグナルの測定による診断方法をも提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、以上のとおりの課題を解決するものとして、第１には、脂質セカンドメッセンジャーに特異的に結合するポリぺプチドと、該ポリぺプチドの両末端に、剛直なリンカー配列を介して連結された異なる蛍光波長を有する二つの発色団と、一方の発色団と剛直なリンカー配列を介して連結された膜局在化配列を有することを特徴とする脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを提要する。
【０００７】
この出願の発明は、第２には、脂質セカンドメッセンジャーに特異的に結合するポリぺプチドが脂質セカンドメッセンジャー結合タンパク質である脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを、また、第３には、脂質セカンドメッセンジャー結合タンパク質がＧＲＰ１のプレクストリン相同ドメインである脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを提供する。
【０００８】
さらに、第４には、この出願の発明は、発色団がポリぺプチドのＮ−末端に連結されたシアン蛍光タンパク質と、Ｃ−末端に連結された黄色蛍光タンパク質である前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを提供する。
【０００９】
この出願の発明は、第５には、リンカー配列が配列番号１の配列の繰り返しからなる剛直なα−ヘリックス状リンカーである前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャーを、第６には、少なくとも１つのリンカー配列がジグリシンモチーフを有する前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを提供する。
【００１０】
また、この出願の発明は、第７には、膜局在化配列が脂質化配列又は膜貫通配列である前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを提供する。
【００１１】
この出願の発明は、さらに、第８には、前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを脂質セカンドメッセンジャーと共存させ、蛍光波長の変化を測定することを特徴とする脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法を提供する。
【００１２】
この出願の発明は、第９には、前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを脂質セカンドメッセンジャーと共存させる脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法を、第１０には、前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞において脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブと脂質セカンドメッセンジャーを共存させる脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法を提供する。
【００１３】
この出願の発明は、さらに、第１１には、前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法において、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブが細胞内で膜に固定化され、該膜において産生される脂質セカンドメッセンジャーを検出・定量する脂質セカンドメッセンジャーの検出および定量方法をも提供する。
【００１４】
この出願の発明は、第１２には、前記いずれかの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって得られる非ヒト動物またはその子孫動物を提供する。
【００１５】
そして、この出願の発明は、第１３には、前記非ヒト動物またはその子孫動物に検査試料を導入し、該非ヒト動物またはその子孫動物の細胞における脂質セカンドメッセンジャーを定量する物質のスクリーニング方法をも提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブは、各々異なる機能を有する３つの部位からなるものである。つまり、この脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブは、選択的に脂質セカンドメッセンジャーを認識する脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位と、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位の脂質セカンドメッセンジャー認識を光学的に信号発信する発色部位と、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを膜に固定化させるための膜固定化部位からなるものである。
【００１７】
図１にこの出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの概略模式図を示した。この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）は、脂質セカンドメッセンジャー（６）と共存したとき、脂質セカンドメッセンジャーと特異的に結合する部位（以下、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位）（２）が脂質セカンドメッセンジャー（６）と結合し、その際に生じる発色部位（３１、３２）の立体配座の変化が、光学的変化（７ａ、７ｂ）として現れるという原理によるものであり、この光学的変化（７ａ、７ｂ）を測定することにより、脂質セカンドメッセンジャー産生の部位や時間を特定し、定量できるものである。
【００１８】
脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（２）は、例えば、種々の脂質セカンドメッセンジャー結合タンパク質等のポリぺプチドである。脂質セカンドメッセンジャー結合タンパク質としては、検出・定量される脂質セカンドメッセンジャー（６）がホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）の場合には、ＧＲＰ１のプレクストリン相同ドメイン（以下ＰＨドメイン）（非特許文献６）、ＡＲＮＯのＰＨドメイン、ＢｔｋのＰＨドメイン等が、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸（ＰＩ（３，４）Ｐ２）の場合には、ＴＡＰＰのＰＨドメイン等が、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰＩ（４，５）Ｐ２）の場合には、ＰＬＣδのＰＨドメイン等が、ホスファチジルイノシトール−３−リン酸（ＰＩ（３）Ｐ）（非特許文献９）の場合には、ｐ４０ｐｈｏｘのＰＸドメインやＥＥＡ１−２ｘのＦＹＶＥドメインが、ジアシルグリセロール（非特許文献１０）の場合には、ＰＫＣのＣ１ドメイン等が好ましく例示される。
【００１９】
もちろん、脂質セカンドメッセンジャー（６）と脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（２）は、脂質セカンドメッセンジャー（６）と特異的に結合するポリぺプチドであれば、これらに限定されず、合成および天然のあらゆるぺプチド鎖を用いることができる。
【００２０】
この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）において、分子認識の結果を光学的変化として発信する部位としては、種々の発色団（３１、３２）が考慮される。このとき、発色団（３１、３２）は、脂質セカンドメッセンジャー（６）と脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（２）の結合により生じる脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）の立体構造の変化に応答して精度高く波長変化を生じなければならない。生化学の分野においては、一般的に種々の蛍光発色団が用いられるが、立体構造の変化に敏速に応答するものとしては、蛍光共鳴エネルギー移動（以下、ＦＲＥＴ）（非特許文献１１〜１３）の生起により色調に変化を来たす発色団がある。
【００２１】
したがって、この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）においては、分子認識の結果を光学的変化として発信する部位として、異なる蛍光波長を有する二つの蛍光発色団（３１、３２）を、各々脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（２）の両末端にそれぞれ連結する。このような蛍光発色団としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のブルーシフト変異タンパク質であるシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）や、ＧＦＰのレッドシフト変異タンパク質である黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）が好ましく選択される。このとき、ＣＦＰ（３１）を脂質セカンドメッセンジャーと特異的に結合するポリぺプチドのＮ−末端に、ＹＦＰ（３２）をＣ−末端に連結することにより、それぞれドナーおよびアクセプターとして作用し、ＦＲＥＴを生起する。
【００２２】
また、脂質セカンドメッセンジャー（６）は、形質膜、内膜等の膜（８）で産生されることから、この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）は、末端に脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）を膜に固定化するための膜局在化配列（５）を有する。このような膜局在化配列（５）は、いずれか一方の発色団（３２）に連結されており、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）を膜（８）に固定化させるものである。具体的には、細胞膜に対しては、Ｋ−ＲａｓやＮ−Ｒａｓ等の脂質化配列（非特許文献１４）や膜貫通配列が例示される。もちろん、検出する脂質セカンドメッセンジャー（６）あるいは固定化させたい膜（８）に応じて、膜局在化配列（５）を適宜選択すれば、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）を形質膜や内膜に対してのみならず、核の内膜、あるいはミトコンドリアの外膜等の他の細胞小器官膜に対しても固定化できる。具体的には、小胞体膜やゴルジ体膜に対しては、Ｎ−ＲａｓのＣ１８１Ｓ変異体やＮ−ＲａｓのＣ１８１変異体−ｅＮＯＳ、ミトコンドリア膜に対しては、Ｔｏｍ２０、カベオラに対しては、ｃａｖｅｏｌｉｎ、ラフトに対しては、Ｃｂｐが例示される。さらに、その他の核膜やペルオキシソーム膜などのオルガネラ膜上の脂質セカンドメッセンジャー（６）も、それぞれのオルガネラ膜に局在するタンパク質内の局在化配列を導入すれば固定化できる。
【００２３】
この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）が細胞内に導入されると、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）は、細胞膜（８）に固定化されるが、このとき脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）は二つの発色団（３１、３２）が離れた立体配座をとる（Ａ）。しかし、細胞膜（８）中で脂質セカンドメッセンジャー（６）が産生されると、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（２）がそれを認識し、結合が生じて脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）の立体配座が反転する。これにより二つの発色団（３１、３２）が近接してＦＲＥＴを生起する（Ｂ）。
【００２４】
このような機構によりＦＲＥＴが生起し、脂質セカンドメッセンジャー（６）の検出を光学的変化として発信するためには、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）における異なる蛍光波長を有する二つの蛍光発色団（３１、３２）は、脂質セカンドメッセンジャー（６）非共存下では、立体的に離れた位置にあり、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（２）と脂質セカンドメッセンジャー（６）の結合により敏速に立体配座が反転する必要がある。そのため、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（２）と蛍光発色団（３１、３２）は、剛直なリンカー配列（４１、４２）、例えばＥＡＡＡＲ（配列番号１）の繰り返し配列からなる剛直なα−ヘリックス状リンカー（非特許文献１５）を介して連結していなければならない。
【００２５】
さらに、このような剛直なリンカー配列（４１、４２）において、少なくとも一つは、蝶番のような働きをする柔軟な部位（４３）を有することが望ましい。これにより、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）が細胞膜（８）に固定化された際に、脂質セカンドメッセンジャー（６）非共存下では、二つの発色団（３１、３２）が離れた立体配座をとり、細胞膜（８）中で脂質セカンドメッセンジャー（６）が産生され、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（２）と脂質セカンドメッセンジャー（６）の結合が生じた際には、立体配座が反転して二つの発色団（３１、３２）が近接できるようになる。このように蝶番様の作用を示す柔軟な部位（４３）は、側鎖の小さいアミノ酸数個からなるものであればよく、具体的にはジグリシンモチーフが例示される。
【００２６】
また、この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）において、前記の膜局在化配列（５）と蛍光発色団（３２）についても、同様の剛直なリンカー配列（４４）を介して結合しているものとする。さらに、膜局在化配列（５）は、いずれの発色団（３１、３２）に連結されていてもよいが、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）が細胞膜（８）に固定化された際に、好ましい立体配座をとるためには、前記の蝶番様の柔軟な部位（４３）を有するリンカー配列（４２）によって脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（２）に連結された方の発色団（３２）に連結することが望ましい。
【００２７】
以上のとおりのこの出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）は、脂質セカンドメッセンジャー（６）と共存するとき、脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位（２）と脂質セカンドメッセンジャー（６）の結合が起こり、Ｎ−およびＣ−末端のそれぞれの蛍光発色団（３１、３２）によるＦＲＥＴが生起して、蛍光波長の変化が生じるものである。したがって、この蛍光変化を通常行われる種々の化学的あるいは生化学的分析方法を用いて測定することにより、脂質セカンドメッセンジャー（６）を検出することが可能となるのである。また、蛍光強度と脂質セカンドメッセンジャー（６）の量の関係を予め検量することにより、試料における脂質セカンドメッセンジャーを定量することもできるのである。
【００２８】
この出願の発明では、以上のとおりの脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）と脂質セカンドメッセンジャー（６）を共存させる方法としては、様々な方法が考えられる。例えば、細胞を破壊して、細胞内から脂質セカンドメッセンジャーを溶出させ、その溶液に脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）を添加して、脂質セカンドメッセンジャー（６）と脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）を共存させる方法があげられる。このような方法で脂質セカンドメッセンジャー（６）と脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）を共存させる場合には、予め脂質を供給してリポソーム膜を形成させ、そのリポソーム膜上に脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）を局在化させることにより、脂質セカンドメッセンジャー（６）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出・定量できる。
【００２９】
また、この出願の発明では、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）を組み込んだ発現ベクターを個々の培養細胞に導入する方法により、脂質セカンドメッセンジャー（６）と脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）を共存させることができる。発現ベクターとしては、動物細胞発現用のプラスミドベクターが好ましく用いられる。このようなプラスミドベクターを細胞に導入する方法としては、電気穿孔法、リン酸化カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法を採用することができる。このように、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）を組み込んだ発現ベクターを細胞に導入する方法を用いることにより、脂質セカンドメッセンジャー（６）と脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）が細胞内で共存できる。したがって、細胞を破壊することなく、脂質セカンドメッセンジャー（６）の検出および定量をするｉｎ  ｖｉｖｏ法が可能となる。
【００３０】
さらに、この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャーの検出および測定方法では、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞において脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）と脂質セカンドメッセンジャー（６）を共存させることもできる。このとき、細胞内で発現された脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）は、細胞内の任意の膜に固定化され、その膜において産生される脂質セカンドメッセンジャー（６）を検出・定量できるようになる。
【００３１】
この出願の発明では、以上のとおりの各種方法により、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、全細胞において脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）と脂質セカンドメッセンジャー（６）が共存しているトランスジェニック非ヒト動物が得られる。トランスジェニック非ヒト動物は、公知の作成法（例えば、非特許文献１６）に従って作製することができる。このようなトランスジェニック非ヒト動物は、すべての体細胞に脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを保有しているため、例えば、その体内に医薬品や毒物などの検査物質を導入し、細胞および組織における脂質セカンドメッセンジャーの濃度を測定することによって、様々な物質のスクリーニングを行うことができる。
【００３２】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００３３】
【実施例】
〔準備〕
（１）試薬
以下の実施例において、各材料および試薬は次のものを使用した。
【００３４】
合成ＰＩＰ３、Ｌ−α−ホスファチジル−Ｄ−ｍｙｏ−イノシトール−３，４，５−三リン酸（Ｄｉｃ１６）は、和光純薬工業（日本、大阪市）から購入した。
【００３５】
ハムＦ−１２培地、ウシ胎児血清、ハンクス液、およびリポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）２０００試薬は、ライフ・テクノロジーズ（メリーランド州、ロックビル）製のものを用いた。
【００３６】
ダルベッコ変法イーグル培養液およびＰＤＧＦ−ＢＢは、シグマ・ケミカル社（ミズーリ州、セントルイス）から購入した。
【００３７】
抗ＧＦＰ抗体はクロンテック（カリフォルニア州、パロアルト）から購入した。
【００３８】
Ｃｙ５標識抗ウサギＩｇＧ抗体は、Ｊａｃｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ，  Ｉｎｃ．（ペンシルバニア州、ウェストグローブ）から入手した。
【００３９】
ＢＯＮＩＰＹ−セラミドＣ５およびブレフェルジンＡは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．（オレゴン州、ユージーン）から購入した。
【００４０】
ＣＦＰ突然変異は、Ｆ６４Ｌ／Ｓ６５Ｔ／Ｙ６６Ｗ／Ｎ１４６Ｉ／Ｍ１５３Ｔ／Ｖ１６３Ａ／Ｎ２１２Ｋ、ＹＦＰ突然変異は、Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｑ６９Ｋ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙとした。
【００４１】
使用された他の化学物質は、すべて分析試薬等級とした。
（２）プラスミド構築
脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブのｃＤＮＡを構築するべく、ＣＦＰ、リンカー配列（Ｌｎ１およびＬｎ２）を有するＰＨＤ、リンカー配列（Ｌｎ３）と膜局在化配列（ＭＬＳ１）を有するＹＦＰ、リンカー配列（Ｌｎ１およびＬｎ２）を有するＰＨＤ−Ｒ２８４Ｃ（ＰＨＤの８４番目のＲがＣに変換されたもの）、リンカー配列（Ｌｎ３）を有するＹＦＰ（以下ＹＦＰ−Ｌｎ３）、およびリンカー配列（Ｌｎ３）と膜局在化配列（ＭＬＳ２）を有するＹＦＰのフラグメントｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲにより生成した。
【００４２】
各々はｐＢＬｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）へサブクローニングされた。クローニング酵素は、すべて宝酒造（日本、東京都）のものを、製造業者の使用説明書に従って使用した。
【００４３】
ＰＣＲフラグメントは、ＡＢＩ３１０ジェネティック・アナライザーにより配列決定した。
【００４４】
脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブをコードしている各ｃＤＮＡは、哺乳類の発現ベクター、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．、カリフォルニア州、カールズバート）のＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位にサブクローニングされた。
＜実施例１＞  脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの作成
図１に示されるように、ヒトＧＲＰ１（２６１−３８２）由来のＰＨＤのＮ−末端にリンカーＬｎ１（配列番号２）を介して発光オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（例えば、非特許文献１７）の変異タンパク質である、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を、また、Ｃ−末端にリンカーＬｎ２（配列番号３）を介して黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をそれぞれ遺伝子工学的に連結し、さらに、ＹＦＰのＣ−末端にリンカーＬｎ３（配列番号４）を介してＮ−Ｒａｓ（非特許文献１８）のＣＡＡＸボックスモチーフを膜局在化配列ＭＬＳ１（配列番号５）として連結して、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）（以下、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍとする）を作成した。
【００４５】
また、この脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（１）において、ＰＨＤのアミノ酸配列を全長有するもの（図２ａ）の他に、同様の方法により、ＰＨＤの２８４番目のアルギニン残基をシステインに変換し、ＰＩＰ３と結合しないようにしたもの（以下、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍＲ２８４Ｃとする）（図２ｂ）、膜局在化配列ＭＬＳ１を有さないもの（以下、Ｆｌｌｉｐ−ｄｅｌとする）（図２ｃ）、および膜局在化配列をＭＬＳ１からＭＬＳ２（配列番号６）に変換したもの（以下、Ｆｌｌｉｐ−ｅｍとする）（図２ｄ）を作製した。
＜実施例２＞  ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞への脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ（ＣＧＹ）の導入
チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）を１０  ％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＨａｍのＦ−１２培養液中、３７℃、５  ％ＣＯ２下で培養した。得られたＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞をガラス底培養皿に塗布し、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００試薬（ライフテクノロジー社製）により３７℃、５  ％ＣＯ２下で２４時間、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍ、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍＲ２８４Ｃ、Ｆｌｌｉｐ−ｄｅｌ、およびＦｌｌｉｐ−ｅｍ発現ベクターをそれぞれ遺伝子導入した。
＜実施例３＞  脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを導入されたＣＨＯ−ＰＤＧＦＲのイメージング
（１）Ｆｌｌｉｐ−ｐｍ
無血清培養液で血清不足にした後、培養液をＨａｎｋの平衡塩類溶液で置換した。
【００４６】
次に、発明者らによりすでに報告されている方法（例えば、非特許文献１２、１３）に基づき、室温下で、カール・ツァイス・アクシオバート１３５顕微鏡上で、ＭｅｔａＦｌｕｏｒ（ユニバーサル・イメージング製）（ペンシルベニア州、ウェスト・チェスター）により制御された冷却ＣＣＤカメラＭｉｃｒｏＭＡＸ（ローパー・サイエンティフィック製）（アリゾナ州、ツーソン）を用いて細胞を撮像した。
【００４７】
蛍光イメージは４８０±１５  ｎｍおよび５３５±１２．５  ｎｍのフィルターを通した４０倍の油浸系対物レンズ（カール・ツァイス製）（ドイツ、イエナ）により検出した。ＹＦＰイメージは、共焦点レーザー走査型顕微鏡ＬＳＭ  ５１０（カール・ツァイス製）により検出された。
【００４８】
図３に、ＣＨＯ細胞におけるＦｌｌｉｐ−ｐｍのの顕微鏡像を示した（ａおよびｃ：垂直方向、ｂ：水平方向）。これよりＦｌｌｉｐ−ｐｍは、主としてＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞の形質膜に局在化することが確認された。
（２）Ｆｌｌｉｐ−ｅｍ
次に図４に、ＣＨＯ細胞におけるＦｌｌｉｐ−ｅｍの顕微鏡像を示した（ａ：抗ＧＦＰ抗体によりＣｙ５を染色、ｂ：ゴルジ体マーカーであるＢＯＤＩＰＹ−セラミドＣ５で染色、ｃ：小胞体マーカーであるブレフェルジンＡで染色、ｄ：ａ〜ｃの重ね合わせ）。
【００４９】
ＭＬＳ１における１８１番目のシステインがセリンで置換された変異体を膜局在化配列として用いたＦｌｌｉｐ−ｅｍでは、蛍光は内膜、すなわち小胞体（ＥＲ）およびゴルジ体に局在していた。
＜実施例４＞  脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの応答性
〔Ｆｌｌｉｐ−ｐｍ発現ＣＨＯ細胞における合成ＰＩＰ３添加〕
実施例１で作成された各脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを、脂質セカンドメッセンジャーＰＩＰ３の合成品（１μＭ）でマイクロインジェクション法により刺激し、デュアルエミッション蛍光顕微鏡で蛍光を測定した。
【００５０】
図５に、ＣＨＯ細胞におけるＦｌｌｉｐ−ｐｍのＦＲＥＴ応答、すなわち、２５℃、４４０±１０  ｎｍで励起させたＣＦＰ（４８０±１５  ｎｍ）の発光強度とＹＦＰ（５３５±１２．５  ｎｍ）の発光強度の比の経時変化を示した。
図５より、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍのＣＦＰ／ＹＦＰ発光比は、合成ＰＩＰ３（１μｌ）の添加により急速に減少し、一定値に達することが確認された。これより、ＣＦＰからＹＦＰへのＦＲＥＴが、ＰＩＰ３に比例して増大することが示された。したがって、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍを用いて形質膜におけるＰＩＰ３の動態を可視化できることが示唆された。
＜実施例５＞  脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの応答性
〔Ｆｌｌｉｐ−ｐｍ発現ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞におけるＰＤＧＦ刺激〕
次に、生理的刺激により産生されたＰＩＰ３に対するＦｌｌｉｐ−ｐｍの応答性を調べた。
【００５１】
まず、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍを、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）を安定に発現するＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞に発現させた。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、形質膜におけるＰＤＧＦＲの二量体化を促進し、それによりＰＤＧＦＲを活性化させ、ＰＤＧＦＲに存在する多数のチロシン残基をリン酸化する。ＰＩ３Ｋは、Ｓｒｃ相同２（ＳＨ２）ドメインを介してこれらのチロシルリン酸化部位に漸化され、それにより活性化される（非特許文献１９）。
【００５２】
ＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）を形質膜にＦｌｌｉｐ−ｐｍを発現している明るい細胞に添加した際の、ＣＦＰ／ＹＦＰ発光比の経時変化を図６および図７に示した。
【００５３】
図６ａより、ＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）の添加により、直ちにＣＦＰ／ＹＦＰ発光比が減少し、３００秒以内に一定に達することが確認された。
【００５４】
一方、ＰＩ３Ｋの特異的阻害剤である、ウォルトマンニン１００  ｎＭを用いて同細胞を前処理し、同様にＰＤＧＦを添加したところ、ＰＤＧＦ刺激に対するＦｌｌｉｐ−ｐｍのＦＲＥＴ応答が完全に消失することが確認された（図６ｂ）。
【００５５】
以上より、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍは、形質膜において生理的に産生されたＰＩＰ３のレベルを検出できることが確認された。
＜比較例１＞  脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの応答性
〔Ｆｌｌｉｐ−ｐｍＲ２８４Ｃ発現ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞におけるＰＤＧＦ刺激〕
実施例４および５と同様の方法により、ＰＨＤがＰＩＰ３と結合しないように突然変異されたＦｌｌｉｐ−ｐｍＲ２８４Ｃの応答性について検討した。
【００５６】
ＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）を、形質膜にＦｌｌｉｐ−ｐｍＲ２８４Ｃ（図２ｂ）を発現した細胞に添加した際の、ＣＦＰ／ＹＦＰ発光比の経時変化を図８ａに示した。
【００５７】
公知文献（非特許文献２０）に記載されるように、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍＲ２８４Ｃは、ＰＤＧＦ刺激に対して応答を示さなかった。これより、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍのＦＲＥＴ応答は、ＰＨＤが膜においてＰＩＰ３を認識したことによることが確認された。
〔Ｆｌｌｉｐ−ｄｅｌ発現ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞におけるＰＤＧＦ刺激〕
さらに、膜局在化配列（ＭＬＳ）が欠失しているＦｌｌｉｐ−ｄｅｌ（図２ｄ）を形質膜に発現した細胞に、ＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）を添加した際のＣＦＰ／ＹＦＰ発光比の経時変化を図８ｂに示した。
【００５８】
Ｆｌｌｉｐ−ｄｅｌは、ＰＤＧＦ刺激に対し何ら応答を示さなかった。
【００５９】
これより、ＭＬＳが、脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを細胞膜に固定化させるためだけでなく、膜における脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの反転型構造変化を生起する上でも重要な役割を果たしていることが示された。
＜実施例６＞  脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの応答性
〔Ｆｌｌｉｐ−ｅｍ発現ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞におけるＰＤＧＦ刺激〕
次に、実施例３（２）において、内膜内に局在化されることが確認されたＦｌｌｉｐ−ｅｍを用いて、内膜、すなわち小胞体およびゴルジ体におけるＰＩＰ３動態を可視化した。
【００６０】
まず、実施例２と同様の方法により、Ｆｌｌｉｐ−ｅｍをＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞に発現した。次に実施例５と同様の方法により細胞をＰＤＧＦで刺激し、ＣＦＰ／ＹＦＰ発光比の経時変化を測定した。結果を図９および図１０に示した。
【００６１】
Ｆｌｌｉｐ−ｅｍの、ＣＦＰ／ＹＦＰ発光比はＰＤＧＦ刺激により直ちには変化しなかった（図１０ａ）。一方、形質膜におけるＦｌｌｉｐ−ｐｍは直ちに応答を示した（図１０ｂ）。しかし、１００〜１５０秒後では、Ｆｌｌｉｐ−ｅｍの内膜におけるＣＦＰ／ＹＦＰ発光比は減少し、５００秒以内に一定値に達することが確認された（図３ａ）。
【００６２】
これより、ＰＤＧＦ刺激により、形質膜のみならず、内膜においてもＰＩＰ３が増加することが示された。また、内膜におけるＰＩＰ３の増加が、形質膜におけるそれよりも２〜３倍大きいことが明らかになった。
【００６３】
なお、本発明者らは、他のペプチドリガンド、インスリン、および上皮増殖因子を用いた場合にも、同様に形質膜および内膜におけるＰＩＰ３の増加が誘導されることを確認している。
＜実施例７＞
そこで、刺激に際する内膜での実質的なＰＩＰ３の増加が形質膜でのそれと、どのような点で異なるのか、その機構を解明することを検討した。
【００６４】
内膜におけるＰＩＰ３増加の分子機構を調べるため、リジン４４がアラニンで置換されたｄｙｎａｍｉｎのドミナントネガティブな変異体（ＤｙｎＫ４４Ａ）（非特許文献２１）の、ＰＩＰ３増加に対する影響を検討した。
【００６５】
Ｄｙｎａｍｉｎはグアノシントリホスファターゼ（ＧＴＰａｓｅ）であり、ＰＤＧＦＲを含む受容体チロシンキナーゼのクラスリン介在性エンドサイトーシスを調節する（非特許文献２２）が、ＤｙｎＫ４４ＡはＧＴＰａｓｅ活性を欠いており、ＰＤＧＦＲのクラスリン介在性エンドサイトーシスを阻害する。
【００６６】
アデノウイルスを介在した遺伝子移入により、ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞においてＤｙｎＫ４４Ａを発現した後、ＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）により刺激した後、内膜におけるＣＦＰ／ＹＦＰの経時変化を測定し、図１１に示した。内膜において生起するＦＲＥＴは、完全に失われていた。一方、形質膜では、ＤｙｎＫ４４Ａの存在下でも、ＤｙｎＫ４４Ａの非存在下と同様にＰＤＧＦ刺激によりＦｌｌｉｐ−ｐｍのＦＲＥＴ応答が直ちに観察された（図１２）。
【００６７】
以上より、内膜では、ＤｙｎＫ４４Ａの過剰発現により、ＰＤＦＧ刺激によるＰＩＰ３増加が完全に阻害されたのに対し、形質膜においては、影響がなかったことが示された。
【００６８】
他のペプチドリガンド、インスリン、および上皮増殖因子による内膜内のＰＩＰ３の増加もまた、ＤｙｎＫ４４Ａの過剰発現によりの過剰発現により阻害されたことから、クラスリン介在性エンドサイトーシスが、内膜における遅延性のＰＩＰ３増加を引き起こすことが明らかになった。
＜実施例８＞
そこで、どのようにしてエンドサイトーシスが内膜におけるＰＩＰ３増加を引き起こすのかについて検討した。
【００６９】
内膜におけるＰＩＰ３動態を詳細に調べるため、アデノウイルスを介在した遺伝子移入により、タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）をＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞において過剰発現させた。
【００７０】
ＰＴＰ１Ｂは、主にＥＲの細胞質側の表面上に局在化されることが知られている（非特許文献２３）。また、最近になって、ＰＤＧＦＲを含む受容体チロシンキナーゼがリガンドによる刺激を受けた場合、細胞表面で活性化された受容体がエンドサイトーシスにより内部移動した後、ＥＲの細胞質側の表面においてＰＴＰ１Ｂにより脱リン酸化され、不活性化されることが報告されている（非特許文献２４）。
【００７１】
筆者らは、過剰発現されたＰＴＰ１Ｂが、エンドサイトーシスされたＰＤＧＦＲを選択的に脱リン酸化すること、および形質膜におけるＰＤＧＦＲには影響を及ぼすことなく、ＥＲの細胞質側の表面でのＰＤＧＦＲによるＰＩ３Ｋの補充および活性化を阻害することを期待した。
【００７２】
ＰＴＰ１ＢをＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞に過剰発現させ、Ｆｌｌｉｐ−ｅｍを用いてＰＤＧＦ刺激後の内膜におけるＣＹＰ／ＹＦＰ発光強度比の経時変化を測定し、図１３に示した。ＰＤＧＦ刺激によるＰＩＰ３の増加は、完全に失われていた。
【００７３】
一方、形質膜では、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍを用いて検出されたＰＤＧＦ刺激によるＰＩＰ３の増加は、ＰＴＰ１Ｂの過剰発現により影響されなかった（図１４）。これは、形質膜にはＰＴＰ１Ｂが存在しないためと考えられる。
【００７４】
以上より、ＰＩＰ３量の増加は、クラスリン被覆エンドサイトーシス小胞体により、活性化されたＰＤＧＦＲが内膜に内部移動され、それによりＰＩ３Ｋが活性化し、ＰＩＰ３が内膜で産生されたことによると示唆された。したがって、形質膜において産生されたＰＩＰ３の、エンドサイトーシス小胞体による内膜への流入は無視できる程度であり、むしろ、内膜において観察されるＰＩＰ３は内膜においてｉｎ  ｓｉｔｕで産生されていることが示された。
【００７５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても高い精度で、簡便に、脂質セカンドメッセンジャーを検出・定量することを可能とする脂質セカンドメッセンジャープローブと、それを用いた脂質セカンドメッセンジャーの検出・定量方法が提供される。この発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブは、遺伝的にコードされた蛍光プローブであり、あらゆる脂質セカンドメッセンジャーに対して適応性を示す。
【００７６】
したがって、この発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを用いることにより、脂質セカンドメッセンジャーの単一生細胞における動態を可視化できるだけでなく、各種の外的刺激による脂質セカンドメッセンジャーの増加が、形質膜、内膜のいずれにおいて大きいのかや、脂質セカンドメッセンジャーの増加がどのような機構により生じるものなのかについても明らかにできる。
【００７７】
受容体エンドサイトーシスは、受容体の活性化を弱める作用だけでなく、下流でのシグナリングを調整する作用も有すると考えられてきた（非特許文献２１、２５、２６）が、これまでは、生細胞のどの部位において、いかにして、いつ、受容体エンドサイトーシスが起こり、シグナル経路が誘発されるのかについては明らかにされていなかった。この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブは、脂質セカンドメッセンジャー産生の機構、タイミング、および部位に関する広範な知見を得る上で非常に有用性が高いといえる。
【００７８】
また、この出願の発明の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブを用いることにより、今後さらに、例えば、細胞内の異なる膜において産生される同一の脂質セカンドメッセンジャー（例えばＰＩＰ３）が、その結合タンパク質の種類に応じて、異なる下流シグナルを調節し、遺伝子発現、細胞代謝、および細胞骨格の調節等の、個別の細胞機能を最終的に引き出していることなども明らかにされるものと期待される。
【００７９】
【配列表】
2004325253.tif 000003
2004325253.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の脂質セカンドメッセンジャー可視化プローブの構成を例示した概略摸式図である。
【図２】この発明の実施例において、作製された各種の脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブの構成を示した概略模式図である。（ａ：Ｆｌｌｉｐ−ｐｍ、ｂ：Ｆｌｌｉｐ−ｐｍＲ２８４Ｃ、ｃ：Ｆｌｌｉｐ−ｄｅｌ、ｄ：Ｆｌｌｉｐ−ｅｍ）
【図３】この発明の実施例において、ＣＨＯ細胞に局在化されたＦｌｌｉｐ−ｐｍの蛍光顕微鏡像を示した図である。（ａおよびｃ：垂直方向、ｂ：水平方向）
【図４】この発明の実施例において、ＣＨＯ細胞に局在化されたＦｌｌｉｐ−ｅｍの共焦点レーザー走査型顕微鏡像を示した図である。（ａ：抗ＧＦＰ抗体によりＣｙ５を染色、ｂ：ゴルジ体マーカーであるＢＯＤＩＰＹ−セラミドＣ５で染色、ｃ：小胞体マーカーであるブレフェルジンＡで染色、ｄ：ａ〜ｃの重ね合わせ）
【図５】この発明の実施例において、ＣＨＯ細胞におけるＦｌｌｉｐ−ｐｍのＦＲＥＴ応答（２５℃、４４０±１０  ｎｍで励起させたＣＦＰ（４８０±１５  ｎｍ）度とＹＦＰ（５３５±１２．５  ｎｍ）の発光強度の比）の経時変化を示した図である。（矢印：合成ＰＩＰ３（１μｌ）添加）
【図６】この発明の実施例において、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍ発現ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞にＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）を添加した際の、ＣＦＰ／ＹＦＰ発光比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：ＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）添加、ａ：ＰＤＧＦ添加、ｂ：Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ処理後ＰＤＧＦ添加）
【図７】この発明の実施例において、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍ発現ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞にＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）を添加した際の、添加後の経過時間毎の蛍光顕微鏡写真を示した図である。（ａ：０秒、ｂ：１００秒、ｃ：３００秒、ｄ：５００秒）
【図８】この発明の実施例において、Ｆｌｌｉｐ−ｐｍＲ２８４Ｃ発現ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞およびＦｌｌｉｐ−ｄｅｌ発現ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞にＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）を添加した際の、ＣＦＰ／ＹＦＰ発光比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：ＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）添加、ａ：Ｆｌｌｉｐ−ｐｍＲ２８４Ｃ、ｂ：Ｆｌｌｉｐ−ｄｅｌ）
【図９】この発明の実施例において、Ｆｌｌｉｐ−ｅｍ発現ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞にＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）を添加した際の、添加後の経過時間毎の蛍光顕微鏡写真（２５℃）を示した図である。（ａ：０秒、ｂ：１２０秒、ｃ：３００秒、ｄ：６００秒）
【図１０】この発明の実施例において、Ｆｌｌｉｐ−ｅｍ発現ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞およびＦｌｌｉｐ−ｐｍ発現ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞にＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）を添加した際の、ＣＦＰ／ＹＦＰ発光比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：ＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）添加、ａ：Ｆｌｌｉｐ−ｅｍ、ｂ：Ｆｌｌｉｐ−ｐｍ）
【図１１】この発明の実施例において、ＤｙｎＫ４４Ａ発現ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞をＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）により刺激した際の、内膜におけるＣＦＰ／ＹＦＰ発光比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：ＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）添加、ａ：ＤｙｎＫ４４Ａ発現なし（小胞体刺激）、ｂ：ＤｙｎＫ４４Ａ発現（ＰＤＧＦ刺激）、ｃ：ＤｙｎＫ４４Ａ発現なし（ＰＤＧＦ刺激））
【図１２】この発明の実施例において、ＤｙｎＫ４４Ａ発現ＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞をＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）により刺激した際の、形質膜におけるＣＦＰ／ＹＦＰ発光比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：ＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）添加、ａ：ＤｙｎＫ４４Ａ発現、ｂ：ＤｙｎＫ４４Ａ発現なし）
【図１３】この発明の実施例において、Ｆｌｌｉｐ−ｅｍを用いてＰＴＰ１Ｂを過剰発現させたＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞にＰＤＧＦを添加した際の内膜におけるＣＹＰ／ＹＦＰ発光強度比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：ＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）添加、ａ：ＰＴＰ１Ｂ過剰発現、ｂ：ＰＴＰ１Ｂ過剰発現なし）
【図１４】この発明の実施例において、Ｆｌｌｉｐ−ｅｍを用いてＰＴＰ１Ｂを過剰発現させたＣＨＯ−ＰＤＧＦＲ細胞にＰＤＧＦを添加した際の形質膜におけるＣＹＰ／ＹＦＰ発光強度比の経時変化を示した図である。（矢印／波線：ＰＤＧＦ（５０  ｎｇ／ｍＬ）添加、ａ：ＰＴＰ１Ｂ過剰発現、ｂ：ＰＴＰ１Ｂ過剰発現なし）
【符号の説明】
Ａ    脂質セカンドメッセンジャー非共存下
Ｂ    脂質セカンドメッセンジャー共存下
１    脂質セカンドメッセンジャー検出・定量用プローブ
２    脂質セカンドメッセンジャー特異結合部位
３１  発色団（ＣＦＰ）
３２  発色団（ＹＦＰ）
４１  剛直なリンカー配列
４２  剛直なリンカー配列
４３  柔軟な部位
４４  剛直なリンカー配列
５    膜局在化配列
６    脂質セカンドメッセンジャー
７ａ  脂質セカンドメッセンジャー非共存下の発光
７ｂ  脂質セカンドメッセンジャー共存下の発光
８    膜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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