(57)【要約】【課題】  生体試料の活動をインビボで記録するに際し、活動記録をとる特定部位を正確かつ容易に探し当てることができる装置、方法を提供する。【解決手段】  特定部位３ａに蛍光物質を発現させた生体試料３を準備し、生体試料３に光ファイバ７を刺入し、蛍光顕微鏡６の第１光学系９により光ファイバ７を通して生体試料３の内部に励起光４を照射し、その励起光４によって励起され放出された蛍光５を光ファイバ７を通して蛍光顕微鏡６の第２光学系１０によって観測する。光ファイバ７が特定部位３ａあるいはその近傍に刺入された場合には、その特定部位３ａからの蛍光が光ファイバ７を通して蛍光顕微鏡６に導かれ、第２光学系１０の接眼レンズ１６に入射するため、接眼レンズ１６を覗いて蛍光５が観測されるかどうかを調べるだけで、そのとき光ファイバ７が刺入されている部位が特定部位３ａであるかどうかを判断できる。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト由来の生体試料の特定部位に蛍光物質を発現させ、当該非ヒト由来の生体試料に光ファイバを刺入し、蛍光顕微鏡からの励起光を前記光ファイバを通して非ヒト由来の生体試料の内部に照射しつつ、当該励起光によって励起され放出された蛍光を前記光ファイバを通して当該蛍光顕微鏡により観測することにより前記特定部位を検知することを特徴とする非ヒト由来の生体試料の特定部位検出方法。
【請求項２】
非ヒト由来の生体試料の特定部位に蛍光物質を発現させ、当該非ヒト由来の生体試料に光ファイバを刺入し、蛍光顕微鏡からの励起光を前記光ファイバを通して非ヒト由来の生体試料の内部に照射しつつ、当該励起光によって励起され放出された蛍光を前記光ファイバを通して当該蛍光顕微鏡により観測することにより前記特定部位を検知し、当該特定部位あるいはその近傍にプローブを刺入し、当該プローブを介して当該特定部位あるいはその近傍の活動を測定することを特徴とする非ヒト由来の生体試料の生理学的測定方法。
【請求項３】
対物レンズを通して生体試料に励起光を照射しつつ、当該励起光によって励起され放出された蛍光を当該対物レンズでとらえるように構成された蛍光顕微鏡と、生体試料に一端が刺入される光ファイバと、当該光ファイバの他端面を前記対物レンズに臨ませて保持する光ファイバ保持装置とを備えたことを特徴とする生体試料の特定部位検出装置。
【請求項４】
前記光ファイバ保持装置は、前記蛍光顕微鏡のステージに着脱可能に固定されていることを特徴とする請求項３記載の生体試料の特定部位検出装置。
【請求項５】
前記光ファイバ保持装置は、前記蛍光顕微鏡のステージに着脱可能に固定された平板形状の台座と、前記光ファイバの端部を前記ステージに対して垂直に保持すべく当該台座に固定された把持装置とを有することを特徴とする請求項４記載の生体試料の特定部位検出装置。
【請求項６】
蛍光顕微鏡のステージに着脱可能に固定される平板形状の台座と、光ファイバの端部を前記ステージに対して垂直に保持すべく当該台座に固定された把持装置とを備えたことを特徴とする光ファイバ保持装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、生体試料の組織の活動をインビボ（in vivo）すなわち生きたままの状態で生理学的方法により観測し記録するための技術にかかわり、とくに生体試料の観測対象となる特定部位を効率良く検出できるようにするための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体を個体のまま試料とし、外的な刺激などによる生体組織の活動の変化、すなわち生理作用の変化をインビボで記録する方法として、生体試料の特定部位にタングステン電極などのプローブを刺入し、その近傍の神経細胞群の活動電位などを観測する電気生理学的方法が知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、生体組織の活動をインビボで記録する場合、観測対象の神経細胞群が存在する部位を大まかにしか特定できないため、生体試料にプローブを刺入して活動を記録した後、試料切片を作成し、得られた記録結果と試料切片の部位とを照合するといった煩雑な作業が要求される。たとえば、マウスを試料に用い、その脳の特定部位における神経細胞群の活動電位をインビボで記録する場合、経験的に得られているマウスの脳の領域情報に基づいて測定する部位を大まかに特定し、その部位に電極を刺入して神経細胞群の活動電位を記録した後、脳を取り出して切片を作成し、得られた記録結果と脳切片の部位とを照合するといった作業が行われる。
このように従来、生体試料の特定部位の活動をインビボで記録する場合、その部位を大まかにしか特定できなかったため、活動を記録した後で生体試料の切片を作成し、記録結果と観測部位との照合を行わなければならなかった。しかも、観測したい部位の記録が必ずしも取れているとは限らないため、満足できる記録結果が得られるまで上記の作業を繰り返す必要があった。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、インビボで生体試料の活動を記録するに際し、活動記録をとる特定部位を正確かつ容易に探し当てることができる特定部位検出装置および特定部位検出方法、活動記録をとる特定部位を正確かつ容易に探し当てて生体試料の活動を測定できる生理学的測定方法などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するために、請求項１記載の発明にかかる特定部位検出方法は、非ヒト由来の生体試料の特定部位に蛍光物質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：Green Fluorescent Protein）等）を発現させ、当該非ヒト由来の生体試料に光ファイバを刺入し、蛍光顕微鏡からの励起光を前記光ファイバを通して非ヒト由来の生体試料の内部に照射しつつ、当該励起光によって励起され放出された蛍光を前記光ファイバを通して当該蛍光顕微鏡により観測することにより前記特定部位を検知することを特徴とする。
また、請求項２記載の発明にかかる生理学的測定方法は、非ヒト由来の生体試料の特定部位に蛍光物質を発現させ、当該非ヒト由来の生体試料に光ファイバを刺入し、蛍光顕微鏡からの励起光を前記光ファイバを通して非ヒト由来の生体試料の内部に照射しつつ、当該励起光によって励起され放出された蛍光を前記光ファイバを通して当該蛍光顕微鏡により観測することにより前記特定部位を検知し、当該特定部位あるいはその近傍にプローブを刺入し、当該プローブを介して当該特定部位あるいはその近傍の活動を測定することを特徴とする。
また請求項３記載の発明にかかる特定部位検出装置は、対物レンズを通して生体試料に励起光を照射しつつ、当該励起光によって励起され放出された蛍光を当該対物レンズでとらえるように構成された蛍光顕微鏡と、生体試料に一端が刺入される光ファイバと、当該光ファイバの他端面を前記対物レンズに臨ませて保持する光ファイバ保持装置とを備えたことを特徴とする。
また請求項４記載の発明にかかる特定部位検出装置は、前記光ファイバ保持装置が、前記蛍光顕微鏡のステージに着脱可能に固定されていることを特徴とする。ここでステージとは、蛍光顕微鏡の対物レンズの下方に位置し、標本などを載置して水平方向あるいはさらに上下方向に移動する載物台のことである。
この特定部位検出装置は、前記蛍光顕微鏡のステージに光ファイバ保持装置を固定して、これに前記光ファイバを保持させれば、請求項３の特定部位検出装置として使用でき、前記蛍光顕微鏡のステージから光ファイバ保持装置を取り外せば、通常の蛍光顕微鏡として使用できる。
【０００５】
また請求項５記載の発明にかかる特定部位検出装置は、前記光ファイバ保持装置は、前記蛍光顕微鏡のステージに着脱可能に固定された平板形状の台座と、前記光ファイバの端部を前記ステージに対して垂直に保持すべく当該台座に固定された把持装置とを有することを特徴とする。
この特定部位検出装置は、前記蛍光顕微鏡のステージに光ファイバ保持装置の台座を固定し、把持装置に前記光ファイバを保持させれば、請求項３の特定部位検出装置として使用でき、前記蛍光顕微鏡のステージから光ファイバ保持装置を取り外せば、通常の蛍光顕微鏡として使用できる。
また請求項６記載の発明にかかる光ファイバ保持装置は、蛍光顕微鏡のステージに着脱可能に固定される平板形状の台座と、光ファイバの端部を前記ステージに対して垂直に保持すべく当該台座に固定された把持装置とを備えたことを特徴とする。
この光ファイバ保持装置によれば、既存の蛍光顕微鏡のステージに台座を固定し、把持装置に前記光ファイバを保持させれば、請求項５の特定部位検出装置として使用できるので、既存の蛍光顕微鏡を利用して、生体試料の特定部位を容易に探し当てることができる。
なお、請求項５、請求項６において、前記台座には、スライドガラスやプレパラートに使用されるガラス板や、プレパラートなどと同等の寸法の金属板や合成樹脂板など、ステージ上に設けられた標本押えなどによって固定できる寸法・形状のものを使用することが望ましい。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は以下のような優れた効果を奏する。
請求項１の特定部位検出方法よれば、非ヒト由来の生体試料の活動をインビボで記録するに際し、非ヒト由来の生体試料に光ファイバを刺入し、当該光ファイバを通して、蛍光を観測する作業を、蛍光顕微鏡を利用して効率良く行うことができるので、活動記録をとる非ヒトに由来する生体試料の特定部位を容易に探し当てることができるようになる。
また、請求項２の生理学的測定方法によれば、非ヒト由来の生体試料の活動をインビボで記録するに際し、非ヒト由来の生体試料に光ファイバを刺入し、当該光ファイバを通して蛍光を観測する作業を、既存の蛍光顕微鏡を利用して効率良く行って、前記特定部位を容易に探し当てることができるので、その特定部位あるいはその近傍にプローブを刺入して測定することにより、非ヒト由来の生体試料のインビボで活動記録作業を容易に実施することができる。
また、請求項３の特定部位検出装置によれば、生体試料の活動をインビボで記録するに際し、生体試料に光ファイバを刺入し、当該光ファイバを通して蛍光を観測する作業を、蛍光顕微鏡を利用して効率良く行うことができるので、活動記録をとる生体試料の特定部位を容易に探し当てることができる。
また、請求項４の特定部位検出装置によれば、蛍光顕微鏡のステージに光ファイバ保持装置を固定して、これに光ファイバを保持させれば、請求項３の特定部位検出装置として使用でき、蛍光顕微鏡のステージから光ファイバ保持装置を取り外せば、通常の蛍光顕微鏡として使用できるので、観察対象や目的に応じた多様な使い方ができる。
また請求項５の特定部位検出装置によれば、蛍光顕微鏡のステージに光ファイバ保持装置の台座を固定し、把持装置に光ファイバを保持させれば、請求項４の特定部位検出装置として使用でき、蛍光顕微鏡のステージから光ファイバ保持装置を取り外せば、通常の蛍光顕微鏡として使用できるので、観察対象や目的に応じた多様な使い方ができる。
また請求項６の光ファイバ保持装置によれば、既存の蛍光顕微鏡のステージに光ファイバ保持装置の台座を固定し、把持装置に光ファイバを保持させれば、請求項３の特定部位検出装置として使用できるので、既存の蛍光顕微鏡を利用して、生体試料の特定部位を容易に探し当てることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下この発明を実施の形態に基づき詳細に説明する。
図１はこの発明にかかる特定部位検出装置の実施の形態の一例を示した概略構成図である。この特定部位検出装置１は、高開口数ｎ（たとえばｎ＝0.7）の対物レンズ２を通して生体試料３に励起光４を照射しつつ、励起光４によって励起され放出された蛍光５を対物レンズ２でとらえるように構成された蛍光顕微鏡６と、生体試料３に一方の端部７ａが刺入される光ファイバ７と、この光ファイバ７の他端面７ｂを対物レンズ２に臨ませて保持する光ファイバ保持装置８とを備えている。
蛍光顕微鏡６は、光ファイバ７を通して生体試料３の内部に励起光４を照射するための第１光学系９と、励起光４によって励起され放出された蛍光５を光ファイバ７を通して観測するための第２光学系１０とを備える。
第１光学系９は、励起光源１１と、この励起光源１１から発せられる励起光４を集光しコリメートするリレーレンズ１２と、リレーレンズ１２からの励起光４を反射させて対物レンズ２側へ導くダイクロイックミラー（二色性ミラー）１３と、ダイクロイックミラー１３からの励起光４を中継して対物レンズ２のほぼ全面に入射させるリレーレンズ１４とを有する。励起光源１１は、生体試料３に着色または遺伝子組み換え技術などにより特異的に発現させた蛍光物質（ＧＦＰなど）を励起させる特定波長の励起光４を発する。この励起光源１１には、ランプまたはレーザ光源が使用される。ダイクロイックミラー１３は、励起光４のみ反射し、それ以外の波長成分の光は透過させる特性をもっている。
第２光学系１０は、対物レンズ２からの光を集光しコリメートするリレーレンズ１４と、リレーレンズ１４からの光を透過させるダイクロイックミラー１３と、ダイクロイックミラー１３からの透過光のうち、生体試料３から発せられた蛍光５のみ透過し、それ以外の波長領域の光は吸収するフィルタ１５と、このフィルタ１５からの透過光（蛍光５）を接眼レンズ１６側と撮像装置１７側の２方向に分岐させるハーフミラー１８とを有する。この例では、フィルタ１５からの透過光は一部ハーフミラー１８で反射されて接眼レンズ１６に入射する。一方ハーフミラー１８を透過した光は、リレーレンズ１９で集光されてＣＣＤなどの撮像装置１７の受光面１７ａに結像される。
【０００８】
光ファイバ保持装置８は、蛍光顕微鏡６のステージ２０上に固定されている。この光ファイバ保持装置８は、図２（Ａ）に示すように、長方形の平板からなる台座２１と、光ファイバ７の端部を保持する把持装置２２とからなる。台座２１には、市販のプレパラートと同寸法の金属板や合成樹脂板が使用される。把持装置２２は、台座２１の上面の中央部に接着あるいはねじ止めなどの方法で固定されている。
把持装置２２は、金属製あるいは合成樹脂で形成された立方体構造の本体２２ａと、本体２２ａの片側側面に設けられた把持機構２３ｂとからなる。把持機構２３ｂは、本体２２ａに接着あるいはねじ止めなどの方法で固定された基板部材２４と、基板部材２４に対しヒンジ部２５を介して台座２１の長手方向（矢印Ａで示す方向）に回動可能に連結された把持板２６とからなる。
把持機構２３ｂの基板部材２４の片側には、図２（Ａ）、（Ｂ）に示すように、光ファイバ７を受け入れるための凹部２７ａを有する支持部２７が上下両端部に突設されている（図２（Ａ）の状態では、下側の支持部２７は把持板２６により隠れている）。そして上下の支持部２７の凹部２７ａに光ファイバ７の端部（生体試料３に刺入する側とは反対側の端部）７ｃを係合させた状態で、把持板２６を支持部２７側に限界まで回動させると、把持板２６と基板部材２４との間に光ファイバ７が挟まれて固定されるようになっている。またこのとき図示しないロック機構が作動して、光ファイバ７を把持した状態のまま把持板２６が固定されるようになっている。
【０００９】
光ファイバ保持装置８は、ステージ２０上に台座２１を下にして載せ、ステージ２０上に設けられた標本押え（一般に、プレパラートなどを上から押える押え部材と、押える力を調節するためのネジとからなる。）によって台座２１を固定することによりステージ２０上に固定される。光ファイバ保持装置８をステージ２０上に固定することにより、光ファイバ７の端部７ｃはステージ２０に対して垂直に保持される。したがって、このとき光ファイバ７の端面７ｂは上方に向けて露出した状態になる。
ステージ２０は、図示しない移動機構を操作することにより前後左右（ｘ軸およびｙ軸方向）および上下（ｚ軸方向）に移動させて位置を調整できるようになっている。したがって、光ファイバ保持装置８をステージ２０上に設置し、これに光ファイバ７を保持させた後、ステージ２０を移動させて位置調整することにより、光ファイバ７の端面７ｂを対物レンズ２の直下に位置決めして、両者の光軸を合わせることができる。そして、その状態で、ステージ２０の高さなどを調整することにより、対物レンズ２の焦点を光ファイバ７の端面７ｂに合わせることができる。
一方、光ファイバ７の生体試料３に刺入される側の端部７ａは、光ファイバ移動機構２８に保持されている。光ファイバ移動機構２８は、光ファイバ７の端部７ａを鉛直方向下方に向けた状態で保持して前後左右（ｘ軸およびｙ軸方向）および上下（ｚ軸方向）に極緻密に移動される移動体２９と、光ファイバ７の端部７ａを生体試料３に刺入する際に、光ファイバ７の端部７ａが曲がらないように支えるべく、移動体２９の下部に固定された金属製（たとえばステンレス鋼製）のサポート管３０とからなる。
【００１０】
以上のように構成された特定部位検出装置１によれば、活動記録をとる特定部位３ａに蛍光物質を発現させた生体試料３を準備し、その生体試料３に光ファイバ７を刺入し、蛍光顕微鏡６の第１光学系９により光ファイバ７を通して生体試料３の内部に励起光４を照射し、その励起光４によって励起され放出された蛍光５を光ファイバ７を通して蛍光顕微鏡６の第２光学系１０によって観測することにより、生体試料３の特定部位３ａを容易に探し当てることができる。すなわち、光ファイバ７が生体試料３の特定部位３ａあるいはその近傍に刺入された場合には、その特定部位３ａからの蛍光が光ファイバ７を通して蛍光顕微鏡６に導かれ、第２光学系１０の接眼レンズ１６に入射するため、接眼レンズ１６を覗いて蛍光５が観測されるかどうかを調べるだけで、そのとき光ファイバ７が刺入されている部位が特定部位３ａであるかどうかを判断することができる。また、蛍光５を撮像装置１７で受光し、その受光信号のデータや、受光画像をモニターに表示すれば、微弱な光でも増幅して検知することができるので、より確実に特定部位３ａを探し当てることができる。また、その際、光ファイバ７の生体試料３に刺入される側の端部７ａを、光ファイバ移動機構２８により移動させることにより、光ファイバ７の刺入位置を微少に変化させていくことができるので、微細な特定部位３ａでも確実に探し当てることができる。
【００１１】
また、この特定部位検出装置１によれば、光ファイバ７を通して生体試料３の内部に励起光４を照射し、その励起光４によって励起され放出された蛍光５を、光ファイバ７を通して観測する作業を、生理学分野の研究者にとって使い慣れた実験器具である蛍光顕微鏡６を利用して行うことができるので、特定部位３ａを探し当てる作業を極めて効率良く実施できる。
その結果、生体試料３の特定部位３ａあるいはその近傍にプローブなどを刺入してインビボで活動電位を測定するといったことを正確かつ容易に実施することができるようになる。
したがって、従来のような、生体試料にプローブを刺入して活動電位などを記録した後、試料切片を作成し、得られた記録結果と試料切片の部位とを照合するといった煩雑な作業から開放されるため、生体試料のインビボによる研究が飛躍的に促進されることが期待される。たとえば、脳組織の特定領域をＧＦＰで標識したトランスジェニック動物、たとえば特定の脳神経細胞にＧＦＰを発現させたトランスジェニックマウスを用い、インビボで脳組織の活動記録をとるといったことが従来とは比較にならないほど簡便に行えるようになるので、脳機能の解明に大きく貢献できる。
【００１２】
また、この特定部位検出装置１は、蛍光顕微鏡６のステージ２０から光ファイバ保持装置８を取り外せば、通常の蛍光顕微鏡として使用できるので、様々な観察対象や用途に応じて使い分けることができる。
また、光ファイバ保持装置８は、この種の研究分野において広く普及している既成の蛍光顕微鏡に簡単に装着することができるので、光ファイバ保持装置８を既成の蛍光顕微鏡に装着することにより、上記の特定部位検出装置１を実現できる。
なお、上記の実施の形態では、接眼レンズ１６と撮像装置１７とを備えた装置構成を例示したが、接眼レンズ１６と撮像装置１７のどちらか一方のみ備えた構成を採用してもかまわない。
また、光ファイバ移動機構２８は必ずしも装備する必要はなく、光ファイバ７を手作業で生体試料３に刺入するようにしてもよい。
また、たとえば図３に示すように、光ファイバ７の刺入側端部７ａに活動電位を検出するためのプローブ３１を並設し、プローブ３１を光ファイバ７と同時に生体試料３内に刺入するようにしてもよい。また、たとえば図４に示すように、光ファイバ７の刺入側端部７ａの外周面にプローブ電極層３２をコーティングしたものを生体試料３内に刺入するようにしてもよい。これらプローブ３１およびプローブ電極層３１は、信号線３３を介して記録系に接続される。図４の構成の場合、特定部位３ａの検出と活動電位の測定とを同時並行的に実施できるだけでなく、プローブ電極層３２によって光ファイバ７の強度が補強されるので、光ファイバ７の変形が防止される。したがって、特定部位３ａの検出と活動電位の測定を極めて効率良く正確に実施することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施の形態の一例を示す特定部位検出装置の概略構成図である。
【図２】（Ａ）は図１中に示す光ファイバ保持装置の拡大斜視図、（Ｂ）は（Ａ）の要部拡大図である。
【図３】本発明の別の実施の形態を示す特定部位検出装置の要部概略構成図である。
【図４】本発明のさらに別の実施の形態を示す特定部位検出装置の要部概略構成図である。
【符号の説明】
【００１４】
１  特定部位検出装置、２  対物レンズ、３  生体試料、４  励起光、５  蛍光、６  蛍光顕微鏡、７  光ファイバ、７ａ  端部（刺入側端部）、７ｂ  端面（他端面）、７ｃ  端部、８  光ファイバ保持装置、９  第１光学系、１０  第２光学系、１１  励起光源、１２  リレーレンズ、１３  ダイクロイックミラー、１４  リレーレンズ、１５  フィルタ、１６  接眼レンズ、１７  撮像装置、１７ａ  受光面、１８  ハーフミラー、２０  ステージ、２１  台座、２２  把持装置、２３ｂ  把持機構、２５  ヒンジ部、２６  把持板、２７  支持部、２８  光ファイバ移動機構、２９  移動体、３０  サポート管、３１  プローブ、３２  プローブ電極層。
【図１】
2004325461.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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