(57)【要約】【課題】毒性が低く、癌細胞ターゲッティング可能な、トリプシン修飾遺伝子治療用マイクロエマルション及びその新規調製方法を提供する。【解決手段】癌細胞をターゲットとする遺伝子治療用トリプシン修飾マイクロエマルションであって、トリプシン、オレイン酸サクシイミド、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ脂質、コレステロール及びビタミンＥを含むマイクロエマルションであることを特徴とするマイクロエマルション。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプシン、オレイン酸サクシイミド、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ脂質、コレステロール及びビタミンＥを含むマイクロエマルションベクター。
【請求項２】
トリプシン、オレイン酸サクシイミド、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ脂質、コレステロール及びビタミンＥのモル比が、１：８８：６２：２：２：２０である、請求項１記載のマイクロエマルションベクター。
【請求項３】
請求項１〜２いずれか１項記載のマイクロエマルションベクター及び遺伝子を含む、癌遺伝子治療剤。
【請求項４】
請求項１〜２いずれか１項記載のマイクロエマルションベクターを含む、遺伝子導入用キット。
【請求項５】
オレイン酸サクシイミド、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ脂質、コレステロール及びビタミンＥをエタノールに溶解すること、エタノールを除去すること、トリプシンをマイクロエマルションとインキュベーションすることを含む、トリプシン修飾マイクロエマルションの調製方法。
【請求項６】
請求項５記載のトリプシン修飾マイクロエマルションとＤＮＡとを混合すること、及びこの混合物を室温でインキュベートすることを含む、ＤＮＡ内包トリプシン修飾マイクロエマルションの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子治療用マイクロエマルションベクターに関し、更に詳細には、高い遺伝子発現率を示す癌遺伝子治療用ベクター及びその研究用試薬として有用なマイクロエマルションベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ナノパーティクルには、脂質二重層からなるリポソームや、脂質などを界面活性剤として内部に油相を含むエマルションや、固体の粒子などがある。
【０００３】
このように、種々のタイプのナノパーティクルが知られているが、リポソームには、水溶性物質や油溶性物質を取り込ませることができ、エマルションや固体粒子には油溶性物質を油相や固体の部分に取り込ませることができる。ナノパーティクルに内包された薬物、例えば、抗悪性腫瘍剤であるアクラシノンは、マイクロエマルション化することによって静脈内投与が可能になり、体内からの薬物の消失も遅くなるという遊離の薬物とはまったく異なる体内動態を示し、薬物による副作用の軽減、薬物の徐放化などの効果を奏する。
【０００４】
さらに、ナノパーティクルには、下記の利点：
（ａ）ナノパーティクルを構成するオレイン酸は、生体膜の主要構成成分であることから毒性が低い、
（ｂ）投与の目的や方法に合わせて粒子サイズをコントロールすることができる、
（ｃ）ナノパーティクル粒子表面上に導入された官能基を介して酵素、抗原、抗体、糖鎖などをナノパーティクルに導入することができ、標的部位に対するターゲティング（標的指向化）が可能となる
を有し、これらの利点を生かした製剤学的研究が広く行われている
【０００５】
一方、近年、癌等の遺伝子の異常が原因となって起こる病気を、人体に遺伝子を導入することによって、正常な遺伝子と入れ換えたり、正常な作用を有する遺伝子を補って治療する方法、すなわち遺伝子治療法が開発されてきている。遺伝子治療法には、患者の細胞を取り出して、生体外でこれらの細胞に治療遺伝子を導入した後に、生体内に戻すエクソビボ（ｅｘ　ｖｉｖｏ）法と、直接体内に治療遺伝子を投与して、標的細胞（治療を目的とする細胞）に取り込ませるインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）法の２種類がある。エクソビボ法は、遺伝子の導入効率は高いものの、導入遺伝子の発現効率が低く、治療に利用するのには十分な遺伝子導入効率を達成することはできない。また、インビボ法では、生体内に投与した治療遺伝子が、標的細胞に選択的に導入されるように操作することが困難であるという欠点がある。
【０００６】
また、遺伝子治療法においては、治療遺伝子を効率よく標的細胞へ導入するために、アデノウイルスのようなウイルスベクターが用いられるのが一般的である。しかし、ウイルスベクターは、非選択的な遺伝子導入、大量生産の困難性、抗原性、宿主に対する毒性等が問題となり、実用化されているものはない。一方、遺伝子をそのまま生体に投与すると、生体内の核酸分解酵素により遺伝子が分解され、標的細胞に到達することができない。そこで、ウイルスを使用しない遺伝子導入法として、ナノパーティクルを用いた遺伝子治療用ベクターが開発されつつある。
【０００７】
ナノパーティクルベクターは、その表面を修飾することができる。抗原、抗体、糖鎖などをナノパーティクル表面上に導入することができ、これによって、標的部位に対するターゲティング（標的指向化）が可能なったカチオン性ナノパーティクルを用いる遺伝子治療も知られている（特許文献１）。
【０００８】
遺伝子治療用ナノパーティクルベクターとしては、リポソーム、固体粒子、エマルションが知られている。
【０００９】
リポソームや固体粒子のナノパーティクルは、ＤＮＡとの複合体を形成すると、比較的大きなサイズの粒子又は凝集体を形成することが知られている。しかし、癌細胞は、タンパクなどからなる細胞外マトリックス、すなわち結合組織に囲まれていることから、大きなサイズのナノパーティクルは、癌細胞にまで接近することができないという問題を有する。そこで、トリプシンなどのタンパク質分解酵素によって結合組織を分解することによって、血管から漏出後のナノパーティクルとＤＮＡの複合体が、目的とする癌細胞にまでＤＮＡを運搬できるようにする方法が開発されてきている（非特許文献１）。
【００１０】
リポソームや固体粒子は、粒径を小さくするためにＰＥＧ脂質で修飾されている。このため、血中におけるＰＥＧ脂質の離脱が問題となり、これを防止するために、通常コレステロールを高い比率で含有させる必要がある。しかし、このコレステロールには、高濃度では高脂血症になるという問題点がある。
【００１１】
ベクターとしてエマルションを用いると、ＤＮＡとの複合体を形成しても、粒径が大きくならないという利点を有する。しかし、その粒径が５０〜１５０ｎｍというマイクロエマルションを調製することは困難であり、また得られたエマルションも粒径の安定性に欠け、経時的に粒径が大きくなるか又は凝集して塊を形成するという問題がある（非特許文献２）。
【００１２】
本発明者は、上記問題点を解決すべく、鋭意研究した結果、新規調製法であるエタノールインジェクション法により空のナノパーティクルを調製し、次いで遺伝子とインキュベーションし、遺伝子とナノパーティクルとの複合体を調製する方法を開発した。
【００１３】
【特許文献１】
特表平１０−５１２８８２号公報
【非特許文献１】
ワン・ユンピン等（Ｗａｎｇ　Ｊｕｎｐｉｎｇ．　ｅｔ　ａｌ．）著、「腫瘍標的化プロモーターによって制御される自殺遺伝子の担体としてのトリプシン修飾ＰＥＧ化マイクロエマルションの調製及び抗腫瘍効果（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｒｙｐｓｉｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＰＥＧｌａｔｅｄ　ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ　ａｓ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｏｆ　ｓｕｉｃｉｄｅ　ｇｅｎｅｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｂｙ　ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」、日本薬学会第１２２年会講演要旨集、２００２年、日本薬学会第１２２年会組織委員会発行、ｐ．７８
【非特許文献２】
チャン・エッチ等（Ｃｈｕｎｇ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．）著、「薬物又は遺伝子送達システムとしての天然油エマルションの物理的特性及び機能を調節する油成分（Ｏｉｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎａｔｕｒａｌ　ｏｉｌ　ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ　ａｓ　ｄｒｕｇ　ｏｒ　ｇｅｎｅ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ．）」、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ．　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅｌｅａｓｅ）、第７１巻、２００１年、ｐ．３３９−３５０
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高い遺伝子発現効率を示す、癌遺伝子治療に有用な癌細胞をターゲットとする遺伝子治療用マイクロエマルションベクター、及びその新規調製方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、トリプシン、オレイン酸サクシイミド、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ脂質、コレステロール及びビタミンＥを含むマイクロエマルションベクターを提供する。
【００１６】
また、本発明は、上記マイクロエマルションベクター及び遺伝子を含む、癌遺伝子治療剤及び遺伝子導入用キットも提供する。
【００１７】
また、本発明は、オレイン酸サクシイミド、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ脂質、コレステロール及びビタミンＥをエタノールに溶解すること、エタノールを除去すること、トリプシンをマイクロエマルションとインキュベーションすることを含む、トリプシン修飾マイクロエマルションの調製方法、及びこのトリプシン修飾マイクロエマルションとＤＮＡとを混合すること、及びこの混合物を室温でインキュベートすることを含む、ＤＮＡ内包トリプシン修飾マイクロエマルションの調製方法も提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、トリプシン修飾マイクロエマルションに遺伝子を封入させたマイクロエマルション（以下、遺伝子封入マイクロエマルションという）が、癌細胞への移行性が高く、高い遺伝子導入率と機能発現を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１９】
本発明で遺伝子を封入するとは、遺伝子をマイクロエマルションの内部に取り込んでいる場合のみならず、遺伝子とマイクロエマルションとの単純な複合体の形成をも含む。したがって、マイクロエマルション表面上に遺伝子が付着しているものを含む。
【００２０】
すなわち本発明は、トリプシンによって癌細胞のまわりの結合組織を破壊して遺伝子を癌細胞にまでターゲットとする（癌細胞を標的とする）遺伝子治療用マイクロエマルションに関する。
【００２１】
本発明のトリプシン修飾マイクロエマルション（以下、マイクロエマルションという）は、トリプシン、オレイン酸サクシイミド、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ脂質、コレステロール及びビタミンＥを用いて調製することができる。好ましくは、トリプシン、オレイン酸サクシイミド、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ脂質、コレステロール及びビタミンＥを含むモル比が、１：８８：６２：２：２：２０である。
【００２２】
トリプシンは、細胞間のタンパクを分解するためにマイクロエマルションに共有結合させる。オレイン酸サクシイミドは、マイクロエマルション調製後にトリプシンを結合させるために使うことができる。ＤＣ−Ｃｈｏｌはマイクロエマルションを正電荷にして負電荷のＤＮＡと静電的に結合するために、ジステアロイルフォスファチィジルエタノールアミンポリエチレングリコール誘導体（分子量２０００）（ＰＥＧ脂質）は、粒子径を小さくするための界面活性剤として、さらに細網内皮系にパーティクルが認識されないようにするために、コレステロールはＰＥＧ脂質がパーティクルから引き抜かれないように、ビタミンＥは油相になるように入れられる。ＤＣ−Ｃｈｏｌは、相対的に毒性が低いカチオン性脂質である３−β−Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイルコレステロールである。
【００２３】
トリプシン修飾マイクロエマルションでは、負電荷である遺伝子との静電的相互作用が期待できることから、新規調製法であるエタノールインジェクション法により空のマイクロエマルションを調製し、次いで遺伝子とインキュベーションし、遺伝子とマイクロエマルションとの複合体を調製する。本発明の方法に従って調製されたマイクロエマルションの粒径は、好ましくは１０〜５００ｎｍ、より好ましくは５０〜２５０ｎｍ、最も好ましくは５０〜１５０ｎｍである。
【００２４】
本発明の遺伝子導入に用いられる遺伝子は、ＤＮＡもしくはＲＮＡであることができる。ＤＮＡもしくはＲＮＡは、一本鎖もしくは二本鎖であってよく、その形態は線状、環状等であることができ、１種類以上のＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡを同時に用いることもできる。
【００２５】
マイクロエマルションに封入されたＤＮＡは、ヒト膵臓癌細胞に対して、高い遺伝子導入効率を示し（図１）、かつ、担癌マウスにおいて遺伝子導入後ガンシクロビルを用いた自殺遺伝子治療によって固形癌の縮小が見られたことから、ＤＮＡの癌細胞へのターゲティングには、本発明のトリプシン修飾マイクロエマルションが有効である（図２、３）。したがって、本発明のトリプシン修飾マイクロエマルションを用いると、癌細胞に高い効率で遺伝子を導入することができ、その遺伝子を高い効率で発現させることができる。
【００２６】
本発明のマイクロエマルション中に封入することができる肝疾患治療用遺伝子としては、例えば、自殺遺伝子、α−インターフェロン遺伝子、β−インターフェロン遺伝子、γ−インターフェロン遺伝子、Ｂ型又はＣ型肝炎ウイルスのアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ、α１−アンチトリプシン遺伝子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子、低比重リポプロテイン（ＬＤＬ）遺伝子等が挙げられる。プラスミドＤＮＡ封入マイクロエマルションのＤＮＡ／脂質重量比は、好ましくは１／１０〜１／５００である。
【００２７】
本発明によって得られたトリプシン修飾マイクロエマルションは、そのまま懸濁させるか、又は凍結乾燥若しくはスプレードライによって粉末化したものを水、生理食塩液等で再懸濁させて静脈内投与することができる。こうして、本発明のトリプシン修飾マイクロエマルションは、癌細胞に選択的に到達し、そこで遺伝子が発現することによって癌疾患の遺伝子治療が可能となる。したがって、本発明は、上記マイクロエマルションを含む遺伝子治療剤にも関する。
【００２８】
本発明の遺伝子治療剤の投与経路は、非経口、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻または経肺を用いることができる。投与量は、患者の健康状態、症状の重篤度に依存するが、一日用量０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇであり、毎日又は１〜７回／週で投与することができる。剤形は、好ましくは、水若しくは生理食塩液の懸濁液、又はその凍結乾燥もしくはスプレードライの粉末製剤である。
【００２９】
また、本発明のマイクロエマルションは、培養細胞及び動物を用いる遺伝子導入、遺伝子発現等の研究用試薬としても使用することができる。したがって、本発明は、上記マイクロエマルションを含む遺伝子導入キットにも関する。
【００３０】
本発明のマイクロエマルションベクターを含む遺伝子導入キットは、マイクロエマルションベクター、懸濁用媒体、導入用遺伝子及び容器を含む。好ましくは、マイクロエマルションベクターは、マイクロエマルション懸濁液又は粉末、懸濁用媒体は、水又は５％グルコース溶液、導入用遺伝子は、通常用いられる形態で、そして容器は、バイアル瓶を用いることができる。また上記遺伝子導入キットは、１．バイアル瓶のマイクロエマルションベクター懸濁液または、マイクロエマルションベクター粉末に懸濁用媒体を入れて再懸濁液にしてから一定量をとって、必要時に遺伝子と混ぜて使う、２．マイクロエマルションベクターと遺伝子の複合体懸濁液または、その粉末に懸濁用媒体を入れて再懸濁液にしてから、必要時に一定量をとって使うことができる。
【００３１】
また、本発明は、オレイン酸サクシイミド、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ脂質、コレステロール及びビタミンＥをエタノールに溶かし、エタノールが少量になるまで減圧除去し、この脂質のエタノール溶液に水を加え直ちに混和した後、残留のエタノールを減圧除去する。トリプシンを入れてＰＨを８．５に調整してインキュベーションをして、トリプシン修飾する。これを次に、クリーンベンチ内に、１日置いた後、孔径０．２２μｍの滅菌フィルターに通し、粒子径を揃え、このマイクロエマルションをプラスミドＤＮＡと混合し、室温で１０〜１５分間インキュベートすることによって、プラスミドＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルション複合体を調製する。
【００３２】
【実施例】
以下の実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらに何ら限定されるものではない。
【００３３】
実施例１　プラスミドＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルションの調製法
マイクロエマルションの脂質組成としては、トリプシン／オレイン酸サクシイミド／ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ脂質／コレステロール／ビタミンＥ（モル比１：８８：６２：２：２：２０）を用い、プラスミドＤＮＡ（ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子含有プラスミド）を封入させた。プラスミドＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルションは、エタノール注入法により調製した。
【００３４】
まず、オレイン酸サクシイミド、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ脂質、コレステロール及びビタミンＥをエタノールに溶かし、エタノールが少量になるまで減圧除去し、この脂質のエタノール溶液に水を加え直ちに混和した後、残留のエタノールを減圧除去した。トリプシンを入れてＰＨを８．５に調整してインキュベーションをして、トリプシン修飾した。これを次に、クリーンベンチ内に、１日置いた後、孔径０．２２μｍの滅菌フィルターに通し、粒子径を揃え、このマイクロエマルションをプラスミドＤＮＡと混合し、室温で１０〜１５分間インキュベートすることによって、プラスミドＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルション複合体を調製した。調製されたマイクロエマルションの平均粒子サイズをレーザー光散乱機（ＥＬＳ８００、大塚電子、日本）を用いて測定した。平均粒子サイズは、１１３．０±１．３ｎｍ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）であった。
【００３５】
試験例１　ヒト膵臓癌細胞におけるトリプシン修飾マイクロエマルションの遺伝子発現
ヒト膵臓癌細胞を用いて、実施例１で調製したトリプシン修飾マイクロエマルションの遺伝子発現を調べた。ヒト膵臓癌細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ：ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）含有ＲＰＭＩ　１６４０培地（和光純薬）（０．３ｍｇ／ｍｌグルタミン、１０ｎｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液を添加）２ｍｌに播種し（細胞密度：６×１０５細胞／ディッシュ、容器：岩城硝子　３５ｍｍ／組織培養ディッシュ）、３７℃で１日培養した。培養ディッシュの培養液を取り除き、ＤＮＡ封入マイクロエマルションをＤＮＡ２μｇ／２ｍｌになるように１０％ＦＢＳ含有培地で希釈し、そのＤＮＡ封入マイクロエマルション懸濁液を培養ディッシュ内の細胞上に分散させた。培養ディッシュを３７℃で２４時間培養後、培養液を除去し、１０％ＦＢＳ含有培地２ｍｌ／ディッシュを加え、さらに、３７℃で４８時間培養した。その後、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの細胞溶解液（１０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン、ｐＨ７．５，２ｍＭ塩化マグネシウム，５ｍＭβ−メルカプトエタノール）を添加し、−８０℃の冷凍庫で凍結させた。
ＰＢＳの組成は、塩化ナトリウム８．０００ｇ、塩化カリウム０．１９４ｇ、リン酸二ナトリウム２．２９０ｇ、リン酸一カリウム０．１９６ｇ、精製水１０００ｍｌであった。
【００３６】
凍結後、室温で解凍し、引き続き凍結と解凍を２回繰り返し行ない、細胞を破壊した。解凍後の溶液を１００，０００×ｇ、４℃、３０分間の遠心分離を行ない、上澄みを回収した。その上澄液５０μｌをチミジンキナーゼ反応液５０μｌと混和し、３７℃で９０分間放置した。チミジンキナーゼ反応液は、１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン，ｐＨ７．５　２７０μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム　２０μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン　２０μｌ、１００ｍＭアデノシン三リン酸　２００μｌ、３Ｈ標識アシクロビル（１ｍＣｉ／ｍｌ）５μｌ、１００ｍＭアシクロビル　４μｌ、精製水４８１μｌを混和し調製した。その混合反応液を氷冷し、その１０μｌを　２．３ｃｍ　ＤＥ８１ディスク（Ｗｈａｔｍａｎ）に染み込ませた。それを風乾後、２００ｍｌの４ｍＭ蟻酸アンモニウムにて５分間２回振倒洗浄を行なった。さらに２００ｍｌの７０％エタノールで５分間、２００ｍｌの９９％　エタノールで５分間、順次振倒洗浄し、洗浄後のＤＥ８１ディスクを風乾した。これを５ｍｌシンチレーション液（ＡＱＵＡＳＯＬ−２；Ｐａｃｋａｒｄ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）に浸し、シンチレーションカウンターにて残存する３Ｈ標識アシクロビルの測定を行なった。
【００３７】
その結果、図１に示すように、トリプシン未修飾マイクロエマルションでは、膵臓癌細胞において、遺伝子発現が低かったのに対し、プラスミドＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルションでは、高い効率の遺伝子発現が見られた。したがって、トリプシン修飾マイクロエマルションが、癌細胞に高い効率で遺伝子を導入し、その遺伝子が発現することが明らかとなった。
【００３８】
対照としてプラスミドＤＮＡが封入されたトリプシン未修飾マイクロエマルションを調製した。プラスミドＤＮＡとしては、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子含有プラスミドを用いた。マイクロエマルションの脂質材料としては、トリプシン／オレイン酸サクシイミド／ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ脂質／コレステロール／ビタミンＥ（モル比１：８８：６２：２：２：２０）（モル比）を用いた。マイクロエマルションは、エタノール注入法によって調製した。
【００３９】
実施例２　プラスミドＤＮＡとトリプシン修飾マイクロエマルションとの複合体の調製
オレイン酸サクシイミド、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ脂質、コレステロール及びビタミンＥをエタノールに溶かし、エタノールが少量になるまで減圧除去し、この脂質のエタノール溶液に水を加え直ちに混和した後、残留のエタノールを減圧除去した。トリプシンを入れてＰＨを８．５に調整してインキュベーションをして、トリプシン修飾した。これを、クリーンベンチ内に、１日置いた後、孔径０．２２μｍの滅菌フィルターに通し、粒子径を揃えた。このマイクロエマルションをプラスミドＤＮＡと混合し、室温で１０〜１５分間インキュベートすることによって、プラスミドＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルション複合体を調製した。
【００４０】
試験例２　ヒト膵臓癌細胞におけるトリプシン修飾マイクロエマルションのチミジンキナーゼ遺伝子発現
ヒト膵臓癌細胞を用いて、実施例２で調製したトリプシン修飾マイクロエマルションの遺伝子発現を調べた。ヒト膵臓癌細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ：ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）含有ＲＰＭＩ　１６４０培地（和光純薬）（０．３ｍｇ／ｍｌグルタミン、１０ｎｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ緩衝液を添加）２ｍｌに播種し（細胞密度：６×１０５細胞／ディッシュ、容器：岩城硝子　３５ｍｍ／組織培養ディッシュ）、３７℃で１日培養した。培養ディッシュの培養液を取り除き、ＤＮＡ封入マイクロエマルションをＤＮＡ２μｇ／２ｍｌになるように１０％ＦＢＳ含有培地で希釈し、そのＤＮＡ封入マイクロエマルション懸濁液を培養ディッシュ内の細胞上に分散させた。培養ディッシュを３７℃で２４時間培養後、培養液を除去し、１０％ＦＢＳ含有培地２ｍｌ／ディッシュを加え、さらに、３７℃で４８時間培養した。その後、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの細胞溶解液（１０ｍＭ　トリスヒドロキシメチルアミノメタン，ｐＨ７．５、２ｍＭ　塩化マグネシウム，５ｍＭ　β−メルカプトエタノール）を添加し、−８０℃の冷凍庫で凍結させた。ＰＢＳの組成は、塩化ナトリウム８．０００ｇ、塩化カリウム０．１９４ｇ、リン酸二ナトリウム２．２９０ｇ、リン酸一カリウム０．１９６ｇ、精製水１０００ｍｌであった。
【００４１】
凍結後、室温で解凍し、引き続き凍結と解凍を２回繰り返し行ない、細胞を破壊した。解凍後の溶液を１００，０００×ｇ、４℃、３０分間の遠心分離を行ない、上澄みを回収した。その上澄液５０μｌをチミジンキナーゼ反応液５０μｌと混和し、３７℃で９０分間放置した。チミジンキナーゼ反応液は、１Ｍ　トリスヒドロキシメチルアミノメタン，ｐＨ７．５，２７０μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム２０μｌ、１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン２０μｌ、１００ｍＭアデノシン三リン酸２００μｌ、３Ｈ標識アシクロビル（１ｍＣｉ／ｍｌ）５μｌ、１００ｍＭアシクロビル４μｌ、精製水４８１μｌを混和し調製した。
【００４２】
その混合反応液を氷冷し、その１０μｌを２．３ｃｍ　ＤＥ８１　ディスク（Ｗｈａｔｍａｎ）に染み込ませた。それを風乾後、２００ｍｌの４ｍＭ蟻酸アンモニウムにて５分間２回振倒洗浄を行なった。さらに２００ｍｌの７０％エタノールで５分間、２００ｍｌの９９％　エタノールで５分間、順次振倒洗浄し、洗浄後のＤＥ８１ディスクを風乾した。これを５ｍｌシンチレーション液（ＡＱＵＡＳＯＬ−２；Ｐａｃｋａｒｄ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）に浸し、シンチレーションカウンターにて残存する３Ｈ標識アシクロビルの測定を行なった。
【００４３】
その結果、図１に示すように、ヒト膵臓癌細胞において、ＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルション複合体では、トリプシン未修飾マイクロエマルションに比べ、高い遺伝子発現が見られた。また、通常、マイクロエマルションは血清存在下で不安定となり、遺伝子導入率が低くなるが、ＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルション複合体は、血清（ＦＢＳ）含有の場合でも、高い遺伝子発現率を示した。したがって、トリプシン修飾マイクロエマルションが、癌細胞に高い効率で遺伝子を導入し、その遺伝子が発現することが明らかとなった。
【００４４】
試験例３　ヒト膵臓固形担癌マウスへの局所投与によるＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルション複合体の遺伝子発現による治療効果
実施例３で調製したプラスミドＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルション複合体の懸濁液とガンシクロビルを担癌マウスの腫瘍内に２日おきに２回注射し、投与後１日目と６日目の腫瘍サイズを測定して遺伝子発現を調べた。その結果、図２、３に示すように、コントロールのＰＢＳでは、腫瘍が大きくなったが、プラスミドＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルション複合体では、固形癌の萎縮が見られた。このことから、ＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルションの腫瘍内注射により、遺伝子を導入し、高い効率で発現させることができることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドＤＮＡ封入トリプシン修飾と未修飾マイクロエマルションによって導入された遺伝子のヒト膵臓癌培養細胞における高い遺伝子発現を示す図である。各比は、マイクロエマルションとＤＮＡとの荷電比である。
【図２】プラスミドＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルションの腫瘍内投与によって導入された遺伝子のヒト膵臓癌担癌マウスの腫瘍において高い遺伝子発現を示す図である。
プラスミドＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルション複合体の懸濁液とガンシクロビルを１０マイクロｇ／腫瘍で担癌マウスの腫瘍内に２日おきに２回注射し。投与後１日目と６日目の腫瘍サイズを測定して遺伝子発現を調べた。
【図３】その結果、図３に示すように、コントロールのＰＢＳでは、腫瘍が大きくなったが、プラスミドＤＮＡ封入トリプシン修飾マイクロエマルション複合体によっては、固形癌の萎縮が見られた。
【図１】
2004113154.tif 000002
【図２】
2004113154.tif 000003
【図３】
2004113154.tif 000004