(57)【要約】【課題】Ｎ末端が単一のＩＬ−８でしかも高純度品を得るための製造法を提供することにある。【解決手段】カテプシンＬを用いることを特徴とする単一分子種であるＩＬ−８の製造方法【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆体型インターロイキン−８をカテプシンＬで処理することにより成熟型インターロイキン−８を製造することを特徴とする成熟型インターロイキン−８の製造法。
【請求項２】
カテプシンＬがヒト線維芽細胞由来のものである請求項１記載の成熟型インターロイキン−８の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は前駆体型インターロイキン−８から成熟型インターロイキン−８（以下、ＩＬ−８という）を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＬ−８はサイトカインの一種であり、１９８７年に松島らによって単球由来の好中球走化性因子（ＭＤＮＣＦ）として精製され（非特許文献１参照）、その遺伝子もクローニングされている（非特許文献２参照）。ＩＬ−８の前駆体は９９個のアミノ酸より成り、Ｎ末端部位に分泌に必須と考えられるシグナルペプチドを有する。成熟型ＩＬ−８は一般に２８番目のＳｅｒ残基で始まる７２個のアミノ酸の長さをもつものとみなされている。ところが、動物細胞を用いて作られたＩＬ−８を解析した結果、Ｎ末端バリアントが検出されている。Ｎ末端バリアントとしては、７２ＩＬ−８よりもＮ末端に７残基もしくは５残基アミノ酸が付加された７９アミノ酸型ＩＬ−８（７９ＩＬ−８）、７７アミノ酸型ＩＬ−８（７７ＩＬ−８）、また、７２ＩＬ−８のＮ末端から２もしくは３残基のアミノ酸が少なくなっている７０アミノ酸型ＩＬ−８（７０ＩＬ−８）および６９アミノ酸型ＩＬ−８（６９ＩＬ−８）の存在が明らかになっている。
【０００３】
ＩＬ−１、ＬＰＳ（もしくはＴＮＦ刺激したヒト血管内皮細胞（非特許文献３参照）、およびＩＬ−１、ＴＮＦ刺激した皮膚線維芽細胞の産生するＩＬ−８は７７アミノ酸型の割合が高い（非特許文献４参照）。それに対し、ＩＬ−１、ＬＰＳ，ＣｏｎＡ、ＰＨＡ，もしくはＴＮＦ刺激したヒト単球もしくはリンパ球は７７アミノ酸型ＩＬ−８（以下、７７ＩＬ−８という）と７２アミノ酸型ＩＬ−８（以下、７２ＩＬ−８という）の両者を産生する（非特許文献５参照）。また、ＣｏｎＡ刺激したヒト末梢血単核細胞の産生するＩＬ−８は７２アミノ酸型以外に７０アミノ酸型、６９アミノ酸型の存在が報告されている（非特許文献６参照）。つまり産生されたＩＬ−８の多様性は細胞や刺激の種類によって異なることが示されている。
【０００４】
医薬品を目的とした製造においてもＩＬ−８の多様性について次のようなことが知られている。ヒト線維芽細胞をスピナー培養し、ＩＦＮ−βでプライミング、合成核酸ｐｏｌｙ　Ｉ　：　ｐｏｌｙ　Ｃ　で刺激後、培養上清に含まれる５μｇ／ｍｌのＩＬ−８をシリカ担体および陽イオン交換体を用いて精製した結果、得られたＩＬ−８は７２ＩＬ−８、７７ＩＬ−８、および７９ＩＬ−８が検出された（特許文献１参照）。
【０００５】
ＩＬ−８サブタイプの生物活性について、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでウサギ腹膜好中球に対する細胞内Ｃａ２＋の流入で活性を測定した場合、７２ＩＬ−８の方が７７ＩＬ−８より強いＣａ２＋流入活性を示した。ヒト好中球に対する親和性は７２ＩＬ−８の方が７７ＩＬ−８より１０倍強い。このようにｉｎ　ｖｉｔｒｏの生物活性では７７ＩＬ−８と７２ＩＬ−８の生物活性には差異が存在する（非特許文献７参照）。以上の理由より、７７ＩＬ−８を前駆体型インターロイキン−８、７２ＩＬ−８を成熟型インターロイキン−８、７２ＩＬ−８のＮ末端が削られて生成した７０および６９アミノ酸型ＩＬ−８は７２ＩＬ−８の分解物としてとらえられている。従って、ＩＬ−８を医薬品として製造する場合、規格上の理由から高純度の７２ＩＬ−８を得る必要がある。
精製標品中のＩＬ−８のＮ末端バリアントについて詳細に解析した以下の報告がある。
【０００６】
Ｖａｎ　Ｄａｍｍｅ　Ｊ．らはＣｏｎＡもしくはＬＰＳ刺激したヒト末梢血単核白血球培養上清を中性で２時間ケイ酸にバッチ吸着させ５０％エチレングリコール、１．４ＭＮａＣｌ、０．３Ｍグリシン／塩酸緩衝液で回収した。透析後、ヘパリンクロマトもしくはゲルろ過により回収し、さらに透析後ｐＨ４での陽イオン交換クロマトによりＩＬ−８を単離している。得られたＩＬ−８は主に７２ＩＬ−８であるが、その他７７、７９、７１、７０、６９アミノ酸型ＩＬ−８型も検出される。また調整法の相違によりＮ末端バリアントに相違がみられた（非特許文献８参照）。この様な陽イオン交換を主体とする精製方法では個々のバリアントを分離するにはいたっていない。
【０００７】
さらに、陽イオン交換クロマトを用いたＩＬ−８バリアントの分離としてＣ．Ａ．Ｈｅｒｅｒｔらは７７ＩＬ−８と７２ＩＬ−８の分離状態について詳細に報告しているが、電気泳動による分析では明らかに７２ＩＬ−８画分に７７ＩＬ−８が含まれる（非特許文献９参照）。この様に、７７ＩＬ−８と７２ＩＬ−８の混合物より７２ＩＬ−８のみを単離することすなわちバリアントの分離は容易ではない。
【０００８】
単一なＮ末端を有するＩＬ−８を得ようとした場合、一つの方法として酵素による処理が考えられる。７７ＩＬ−８を７２ＩＬ−８にプロセシング（変換）する酵素としては、トロンビン（非特許文献１０参照）、プラスミンン（非特許文献１１参照）が報告されている。またヒト好中球をホモジネートして調製した溶解産物が７７ＩＬ−８を７２ＩＬ−８に変換することも報告されている（非特許文献１２参照）。しかし、医薬品組成物としてＩＬ−８を利用する場合には、トロンビン、もしくはプラスミンなどの外来からの酵素の添加はなるべく避けたい。同じ理由でヒト由来の好中球の溶解産物の添加も適さない。
【０００９】
ヒト線維芽細胞の培養上清中に含まれるＩＬ−８をシリカクロマトグラフィー後、ｐＨ６．０下でインキュベーションすることにより７７ＩＬ−８が７２ＩＬ−８に変換されることを本発明者らが確認している（特許文献２参照）。しかしながら、この変換反応に係わる酵素が同定されていないため、変換反応のコントロールが容易でなく、一定にしかも均一な７２ＩＬ−８を得るためにはなおも課題が残る。従って、単一酵素標品さらに言えばＩＬ−８産生細胞由来である酵素による前駆体型ＩＬ−８の成熟型ＩＬ−８への効率的な変換方法の開発が求められた。
【特許文献１】
特開平５−１７０７９９号公報
【特許文献２】
特開平１１−２２１０９４号公報
【特許文献３】
特開平６−３１９５８２号公報
【非特許文献１】
Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４　９２３３頁　１９８７年
【非特許文献２】
Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７　　１８８３頁　１９８８年
【非特許文献３】
Ｇｒｉｍｂｒｏｎｅ　Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２　２４４頁　１９８９年
【非特許文献４】
Ｓｃｈｒｏｄｅｒ　Ｊ．−Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４　２２２３頁　１９９０年
【非特許文献５】
Ｇｒｅｇｏｒｙ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５１　８８３頁　１９８８年
【非特許文献６】
Ｖａｎ　Ｄｅｍｍｅ　Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０　２１１３頁　１９９０年
【非特許文献７】
Ｎｏｕｒｓｈａｒｇｈ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８　１０６頁　１９９２年
【非特許文献８】
Ｖａｎ　Ｄｅｍｍｅ　Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８１　３３７頁　１９８９年
【非特許文献９】
Ａ．Ｈｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４５　３０３３頁　１９９０年
【非特許文献１０】
Ｈｅｂｅｒｔ　ＣＡ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５　３０３３頁　１９９０年
【非特許文献１１】
Ｎａｋａｇａｗａ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２８２　４１２頁　１９９１年
【非特許文献１２】
Ｐａｄｒｉｎｅｓ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．３５２　２３１頁　１９９４年
【非特許文献１３】
勝沼信彦　細胞内タンパク質分解　東京化学同人　１０−１２　　１９９２
【非特許文献１４】
Ｍａｃｉｅｗｉｃｚら　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｒｅｌａｔ．　Ｒｅｓ．　７　２９５−３０４　１９８７，
【非特許文献１５】
Ｍａｓｏｎら　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ　２５７　１２５−１２９　１９８９
【非特許文献１６】
Ｍａｓｏｎら　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　２４８　４４９−４５４　１９８７
【非特許文献１７】
Ｍａｓｏｎら　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　２４０　３７３−３７７　１９８６
【非特許文献１８】
Ｊｏｓｅｐｈら　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　１５　３１８６　１９８７
【非特許文献１９】
Ｍａｓｏｎら　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　２４８　４４９−４５４　１９８７
【非特許文献２０】
Ｊｏｓｅｐｈら　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　１５　３１８６　１９８７
【非特許文献２１】
Ｊｏｓｅｐｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、８１　１６２１−１６２９　１９８８
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこの課題を解決すべく前駆体型ＩＬ−８のＮ末端アミノ酸５残基を正確に切断する酵素を同定し、前駆体型ＩＬ−８の成熟型ＩＬ−８への変換方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前駆体型ＩＬ−８の成熟型ＩＬ−８の変換反応を触媒する酵素を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は前駆体型インターロイキン−８をカテプシンＬで処理することにより成熟型インターロイキン−８を製造することを特徴とする成熟型インターロイキン−８の製造法である。そして、このカテプシンＬとしてはヒト線維芽細胞由来のカテプシンＬが挙げられる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明によって得られるＩＬ−８は高純度のＮ末端が単一な成熟型ＩＬ−８である。
カテプシンＬはリソソームに局在するシステインプロテアーゼの一種で、主にリソソーム中でタンパク質の分解に係っている（非特許文献１３参照）。これまでのｉｎ　ｖｉｔｒｏの実験から、カテプシンＬがコラーゲンやエラスチンをも基質にしうることが報告された（非特許文献１４、非特許文献１５）。カテプシンＬは細胞内ばかりでなく、細胞外にも成熟型およびプロ体として分泌することが知られているが、細胞外での役割についてそれほど明らかにされていない。恐らく、細胞外マトリックスタンパク質の分解に関与し、病態とも関係があることが考えられている（非特許文献１６参照）。
【００１４】
ヒトカテプシンＬのプレプロ体は、３３３個のアミノ酸残基からなり（分子量３８，０００　Ｄａ）、前駆体（プロ体）はＮ末端１−１７残基が除去されたものである。すなわち、１８−３３３残基を含み（３１６個のアミノ酸残基で分子量３６，０００　Ｄａ）、さらにＮ末端の１８−１１３残基が除去され、成熟型のカテプシンＬが生成する（２２１個のアミノ酸残基で分子量３０，０００　Ｄａ．、非特許文献１７参照）。成熟型のカテプシンＬについては、Ｎ末端アミノ酸が一つ多い２２２個のアミノ酸からなるとの報告もある（非特許文献１８参照）。
【００１５】
ヒトカテプシンＬのプレプロ体のアミノ酸配列を配列番号２に示す。Ｍａｓｏｎら（非特許文献１９参照）が報告している成熟型カテプシンＬのアミノ酸配列を配列番号３に示す。さらに、Ｊｏｓｅｐｈら（非特許文献２０参照）が報告している成熟型カテプシンＬのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００１６】
カテプシンＬの活性を測定する際に使われる合成基質としてベンジルキシカルボニル−アリギニン−２−ナフチルアミドが知られている。この基質はアルギニンのＣ末端で切断されることによって発色される。すなわちカテプシンＬがアルギニンのＣ末端で切断されることは周知の事実である。しかしながら、カテプシンＬは典型的なエンドペプチターゼ活性を有し、特定のアミノ酸を認識して切断する酵素ではない。事実、ミオシンＨ鎖を切断する場合、アルギニン以外でも、リシン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン、チロシンのＣ末端側を切断する。また、７７ＩＬ−８には６つのアルギニン（Ａｒｇ）を有しており、Ａｒｇ５−Ｓｅｒ６のみを特異的に切断することは到底推定できない。
【００１７】
また、これまでカテプシンＬ成分による前駆体型ＩＬ−８の成熟型ＩＬ−８の変換活性についてはまったく知られておらず、本発明によってその活性が初めて明らかにされた。すなわち本発明は、カテプシンＬを用いた前駆体型ＩＬ−８の成熟型ＩＬ−８の製造方法に関する。
【００１８】
本発明によって使用されるカテプシンＬは、ヒト培養細胞の細胞培養によって得ることができるもののほか、すでにそのｃＤＮＡがクローニングされて配列番号５のとおり全塩基配列が決定されているので（非特許文献２１参照）、いわゆる遺伝子組換え技術を応用して組換え型タンパク質として得られたものであってもよい。
【００１９】
ヒト培養細胞は、カテプシンＬを産生する能力を有する各種の正常組織由来細胞、あるいは株化細胞のいずれでも対象となるが、好ましくは線維芽細胞、上皮細胞、白血球が用いられるが、さらに好ましくは線維芽細胞が用いられる。動物細胞の培養方法としては、ＩＬ−１、ＴＮＦなどのサイトカイン類、Ｃｏｎ　Ａ、ＰＨＡなどのレクチン類、ＬＰＳ、あるいは合成核酸などの誘導刺激剤を用いて産生せしめたものが望ましい。特に望ましくは、ヒト細胞の中でも線維芽細胞を合成核酸で刺激したものが良い（特許文献３）。
【００２０】
遺伝子組み替え技術を利用してカテプシンＬを調製する場合には、宿主細胞として、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、マウスＣ１２７細胞などの哺乳類動物細胞、カイコ、夜盗蛾などの昆虫細胞、大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物などを用いることができる。さらにトランスジェニック動物を宿主とする場合には、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシなどを用いることができる。
【００２１】
このようにして調製されたカテプシンＬを含む細胞培養上清、虫体抽出液、菌体抽出液、生体体液などを原料として種々のクロマトグラフィーにより、カテプシンＬを精製分離することができる。用いるクロマトフラフィーは、カテプシンＬに親和性を有するものであればいずれでもよいが、例えば、二酸化ケイ素（シリカ）やリン酸カルシウムを吸着素材とするカラム、ヘパリン、色素、レクチン、疎水性のリガンドを固定化したカラム、金属キレートカラム、イオン交換カラム、ゲルろ過カラムなどである。
【００２２】
本発明において用いるカテプシンＬは、通常は該酵素含有溶液として用いるが、その他当該酵素を担体に固定した固定化酵素としても用いることができ、その使用態様を限定するものではない。
【００２３】
カテプシンＬを含有する抽出液を用いて前駆体型ＩＬ−８を成熟型ＩＬ−８に変換する場合、ｐＨ３〜７、好ましくはｐＨ４〜６で行う。変換反応は２〜４０℃で行うことができ、３７℃で行うことがより好ましい。変換反応に要する時間は酵素活性、温度、ｐＨに依存するが、通常カテプシンＬ濃度０．２〜２０μｇ／ｍｌの間で２〜４０℃で、１時間〜１４日間インキュベーションすることで満足する結果が得られる。より好ましくは、ｐＨ４〜６で３７℃で２〜７日間のインキュベーションであるが、これに限定されない。ＩＬ−８溶液はＩＬ−８濃度が１０μｇ／ｍｌ〜５，０００μｇ／ｍｌであるものが用いられるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
本発明でＮ末端の異なるＩＬ−８の定量はトリシンゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ　（トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｓｃｈａｇｇｅｒ，　Ｈ．　Ａｎａｌ．　Ｂｉｃｈｅｍ．　１６６　３６８頁　１９８７年）を行い、クマシーブリリアントブルー染色後、デンシトメータなどを用いて、バンドの濃度を測定する方法，Ｎ末端アミノ酸シークエンサーを用いてアミノ酸含量を測定する方法がある。
【００２５】
本発明ではｐＨ処理してもなお電気泳動による分析でわずかに検出され残存が示された分子量の異なるＩＬ−８をさらに低減化するために、陽イオン交換クロマトが有効である。
【００２６】
７２ＩＬ−８を得る場合わずかに７７ＩＬ−８が含まれる場合には酸性で陽イオン交換体に吸着し，吸着したＩＬ−８が担体より溶出されない濃度のＮａＣｌを含む酸性液で洗浄する。そのまま、中性の溶液で洗浄し、イオン強度の上昇により、ＩＬ−８を担体より溶出させる。ＩＬ−８を吸着した担体を酸性緩衝液で洗浄することによりＩＬ−８の溶出順序は７７ＩＬ−８、続いて７２ＩＬ−８となる。しかもこの順番の方が７２ＩＬ−８を得やすい。ここで用いる陽イオン交換体は、カルボキシル基，スルホン酸基，リン酸基を結合した担体を指し、担体の骨格としてはセルロース，アガロース，デキストランなどを材料とする多糖体、及びポリビニルアルコール，スチレンジビニルベンゼン重合体などの合成高分子系、などいずれでも良い。
【００２７】
このようにして得られたＩＬ−８精製標品は、通常十分に高純度として得られるが、必要に応じてさらに純度を向上させるには、アルキル基（Ｃ１〜Ｃ１８）などを有する担体をカラムに充填した逆相系高速液体クロマトグラフィーを用いることができ、また、後段に陽イオン交換体、シリカ系吸着担体精製法を組み合わせることができる。これは、濃縮を目的とする事もできる。
目的に応じて脱塩を行いたい場合は、脱塩カラムなどの使用も考えられる。
【００２８】
本発明で対象とするＩＬ−８は、次の方法により定量することができる。１次抗体としてヤギ抗ＩＬ−８ポリクローナル抗体、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識したマウス抗ＩＬ−８モノクローナル抗体を組み合わせるサンドイッチ法による酵素免疫測定法により定量した。
【００２９】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
線維芽細胞によるＩＬ−８の産生
２０Ｌのガラス製培養槽を用いて１６Ｌの５％新生子牛血清を含むイーグルＭＥＭ培地中で細胞数がおよそ１０５個／ｍｌになるようにヒト線維芽細胞を培養した［使用したマイクロキャリア：”サイトデックス１”（ファルマシア社），３７℃］。その後、培地を０．１％カルボキシメチルセルロースを含む無血清イーグルＭＥＭ培地１６Ｌに交換し、１００国際単位／ｍｌのヒト天然型インターフェロンβを添加した。翌日さらにポリＩ：ポリＣ　１０ｍｇ／Ｌを添加した。その２時間後、産生培地としての１％メチルセルロースを含むイーグルＭＥＭ培地に置換し、８日間さらに培養を続けた。撹拌を停止してマイクロキャリアを沈降させた後、上清を得た。抗ＩＬ−８抗体を用いた酵素免疫測定法により５μｇ／ｍｌのＩＬ−８の存在が確認された（図１）。図１において、写真は８日目の培養上清を、シリカクロマトグラフィー、逆相−ＨＰＬＣによって精製後、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったものを示す。
【００３０】
実施例２
７７ＩＬ−８および７２ＩＬ−８の精製方法
実施例１で得た培養上清液中に含まれるＩＬ−８は７７ＩＬ−８と７２ＩＬ−８が４：１で含まれていることが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１）、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ＴＯＦＭＡＦ分析（図２）より明らかとなった。７７ＩＬ−８を得る場合、１６Ｌの培養上清液を１００ｍｌのシリカカラムに加え、１Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液４００ｍｌで順次洗浄を行ってから、２０ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ２）を通じることでＩＬ−８を含む画分を回収した。溶出液に０．１ボリュームの５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を加え中和を行った。これに１／２０容量の酢酸を加え、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｓ（アマシャム・ファルマシアバイオテク社製）を用いた陽イオン交換カラム（内径１１ｍｍ　ｘ　１１０ｍｍ、１１ｍｌベッドボリューム）に適用した。カラムはあらかじめ、５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ４．０で平行化した。適用後、カラムは０．４５Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液で洗い、ＮａＣｌ濃度を０．４５Ｍから０．８Ｍまで上昇させることにより、ＩＬ−８の溶出を行った。溶出したＩＬ−８を２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２で透析後、再度、２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２で平行化した陽イオン交換カラムに適用した。１００〜２５０ｍＭのＮａＣｌグラジエントを用いることにより、ＩＬ−８を溶出した。溶出したＩＬ−８の濃度は２ｍｇ／ｍｌで、約２０％の７２ＩＬ−８が含まれていた。
【００３１】
７２ＩＬ−８のを得るためには、シリカカラムからの７７ＩＬ−８及び７２ＩＬ−８を含む回収液をｐＨ６．０に調整し、３７℃で３日間インキュベーションすることにより、７７ＩＬ−８の７２ＩＬ−８への変換反応を行った。変換により、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析では、７７ＩＬ−８は検出されず、７２ＩＬ−８のみが検出された。以後、７７ＩＬ−８の精製方法と同様に精製を行った。２ｍｇ／ｍｌの濃度の７２ＩＬ−８が得られた。
【００３２】
実施例３
７７ＩＬ−８の７２ＩＬ−８の変換活性の測定方法
適量のサンプルに１／１０量の０．５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０を加え、さらに０．５Ｎ　ＮａＣｌもしくは０．５Ｎ　ＨＣｌを微量添加してｐＨ６．０±０．１に調整した。このサンプル１９０μＬを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに分注し、２μＬの１０％ＮａＮ３を加え、さらに７７ＩＬ−８を２０μｇ加えた。攪拌後、３７℃下でインキュベーションを行った。インキュベーション直前、および直後、反応液３０μＬを取り出し、等量のサンプルバッファー（８％ＳＤＳ、２４％グリセロール、０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ６．８、０．６％ブロモフェノールブルー）を添加して混合し、１６％トリス／トリシンゲルシステム（テフコ社製Ｐｅｐｔｉｄｅ　ＰＡＧＥ　ｍｉｎｉ，トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥと呼ぶ）を用いて電気泳動した。１レーン当たり２０μＬをロードし、泳動終了後クマシー・ブリリアント・ブルーによりゲル中のタンパク質を染色した。７７ＩＬ−８から７２ＩＬ−８へのバンドのシフトより、変換活性をの有無を確認した。
【００３３】
実施例４
変換酵素の精製
線維芽細胞培養上清１６０Ｌを４００ｍｌのシリカカラム（マイクロビーズシリカゲルＭＢ−５Ｄ、富士シリシア化学社製）に適用した後、２０ｍＭＨＣｌで溶出を行い（図３）、直ちに１／１０量の０．５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０を添加して中和した。溶出フラクションの内、ＳＦ−３、４に活性が含まれた（図４）。図４において、変換活性の測定は、３７℃で、０．５時間、２時間インキュベーションしたのち、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥしたものである。このフラクションを、あらかじめ２０ｍＭＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（バイオラッド社製Ｂｉｏ　Ｇｅｌ　ＨＴ，　φ２ｘ６ｃｍ）に適用し、平衡化液でカラムを洗浄後、１００ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液ｐＨ６．０を用いて段階的溶出を行った（図５）。
【００３４】
変換活性は２００ｍＭと５００ｍＭＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液ｐＨ６．０（ＨＦ−２，　　ＨＦ−３　　図６）にあった。図６においては、カラム適用液（Ａｐ）、素通り液（ＢＴ）、洗浄液（Ｗ）、溶出フラクション（ＨＦ−１〜３）を２倍（ｘ２）もしくは５倍（ｘ５）に２０ｍＭリン酸緩衝液で希釈後、３７℃で１時間培養しトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったものを示す。ＨＦ−２とＨＦ−３を混合し、４Ｌの２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０で透析後、Ｃｏｎ　Ａセファロースカラム（アマシャム・ファルマシア社製Ｃｏｎ　ＡセファロースＣＬ６Ｂ、φ１．４ｘ１３ｃｍ）に適用した。Ｃｏｎ　Ａセファロースカラムはあらかじめ、０．２Ｍ　ＮａＣｌ，　１ｍＭ　ＭｎＣｌ２，　１ｍＭＣａＣｌ２を含む２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０で平衡化した。適用後、２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０および０．５Ｍ　ＮａＣｌ，　１ｍＭ　ＭｎＣｌ２，　１ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０でカラムを洗浄した。溶出は、０．６Ｍ　α−メチルＤ−マンノシドを含む２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０で行った（図７）。強い変換活性がＣＦ−２に検出された（図８）。図８においては、カラム適用液（Ａｐ）、素通り液（ＢＴ）、洗浄液（Ｗ）、溶出フラクション（ＣＦ−１〜３）を２０倍（ｘ２０）に２０ｍＭリン酸緩衝液で希釈後、３７℃で１時間培養しトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったものを示す。この活性フラクションをセファアクリルＳ−１００（アマシャム・ファルマシア社製、φ２．６ｘ６０ｃｍ）を用いてゲルろ過を行った（図９）。移動相として、０．２Ｍ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０を用いた。ＧＦ−１３、１４に強い変換活性が検出された（図１０，図１１）。なお、図１０においては、カラム適用液（Ａｐ）およびゲルろ過フラクションを５倍希釈し、３７℃で１時間インキュベーションし、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったものを示し、図１１においては、カラム適用液（Ａｐ）およびゲルろ過フラクションを２０倍希釈し、３７℃で１時間インキュベーションし、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったものを示す。このフラクションを２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０で透析し、陰イオン交換クロマトを行った（図１２）。すなわち、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー社製、φ７．５ｍｍｘ７．５ｃｍ）をウォーターズ社製高速液体クロマトグラフィーＷａｔｅｒｓ　６００に取り付けて行った。適用時の流速は０．１ｍｌ／ｍｉｎ、適用後流速を０．５ｍｌ／ｍｉｎに設定し、１８０分間でＮａＣｌ濃度を０．４Ｍまで上昇させてカラムに吸着したタンパク質の溶出を行った。変換活性はＤＦ−１４〜２１まで広範に検出された（図１３）。フラクションのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＵＫ　Ｌａｅｍｍｌｉ　２２７　６８０−６８５　Ｎａｔｕｒｅ　１９７０）を行ったところ、活性フラクションからは３２ｋＤａのバンドが検出された（図１４）。活性フラクションＤＦ−２１を約０．２μｇ用いて１８μｇの７７ＩＬ−８とインキュベーションしたところ、時間に応じて低分子側への経時的なバンドシフトが観察された（図１５）。ＴＯＦＭＡＳ分析から、反応生成物が７２ＩＬ−８であることを確認した（図１７）。
【００３５】
実施例５
変換酵素の同定
変換活性を指標に精製を行い、電気泳動上ほぼ単一バンドのフラクション（ＤＦ−２１）を得ることができたので、Ｎ末端アミノ酸配列分析を行った。分析にはプロテインシーケンサーＧ−１０００Ａ、およびＰＴＨアナライザーを用いて行った。決定したＮ末端の１０アミノ酸配列は、配列番号１のとおりであった。この配列は、ヒトカテプシンＬの配列に完全に一致した（Ｌ．　Ｊｏｓｅｐｈ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１５　３１８６，　１９８７）。この酵素がカテプシンＬであることをさらに実証するために、変換活性を有するフラクション（ＧＦ−１３，１４）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、ウサギ抗ヒトカテプシンＬ抗体（４．５μｇ／ｍｌ、Ａｎｔｈｅｎｓ　Ｒ　ａｎｄ　Ｔ社製、品番１７−０５１８−０１）およびヒツジ抗ヒトカテプシンＬ抗体（４．０μｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製、品番１９１１−０５０７）との反応性を調べた。２次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ（１，０００倍希釈、アマシャム・ファルマシア社製）、ＨＲＰ標識抗ヒツジＩｇＧ（５００倍希釈、ＩＣＮ社製）。抗体と反応させる前に、転写後の膜を５％スキムミルク／ＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、０．５ＭＮａＣｌ）によりブロッティングした。どちらの抗体も３２ｋＤａにバンドが検出された（図１５）。また、ヒト肝由来のカテプシンＬ（Ｃａｌｂｉｏｃｅｍ社製、品番２１９４０２）を１μｇ／０．２ｍｌで７７ＩＬ−８と反応させたところ、インキュベーション時間に応じて７２ＩＬ−８への変換が観察された（図１６）。変換したＩＬ−８が７２ＩＬ−８であることをＴＯＦＭＡＳを用いて確認できた（図１８）。
【００３６】
実施例６
シリカクロマトフラクション中の変換酵素の分析
変換活性は培養上清中には観察されず、培養上清をシリカカラムにかけて回収されてはじめて検出される。シリカクロマトフラフィーにより得られたフラクション（ＳＦ−３，４）に含まれる変換酵素がカテプシンＬであるかを知るために、プロテアーゼ阻害剤を用いた分析を行った。ＳＦ−３，４をｐＨ６．０に調整後、その２００μＬにそれぞれのプロテアーゼ阻害剤を添加し、３７℃で２時間インキュベーションを行った。インキュベーション前後のサンプルをトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析し、７７ＩＬ−８から７２ＩＬ−８への変換活性を算出した。
変換率（％）＝１００ｘ（７７ＩＬ−８のバンドの濃度）／（７７ＩＬ−８のバンドの濃度＋７２ＩＬ−８のバンドの濃度）
用いた阻害剤の濃度と溶媒の以下に示した。
ＡＤＣ：アンチパイン・ヂヒドロクロライド（Ａｎｔｉｐａｉｎ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）５０　ｕｇ／ｍｌ、Ｈ２Ｏ
ベスタチン（Ｂｅｓｔａｔｉｎ）：４０　ｕｇ／ｍｌ　（１３０　ｕＭ）、メタノール
チモスタチン（Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）：　１　ｎｇ／ｍｌ、ＤＭＦ
Ｅ６４：１ｕｇ／ｍｌ、メタノールとＨ２Ｏ（１：１）
ロイペプチン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）：０．５ｕｇ／ｍｌ　（１　ｕＭ）、Ｈ２Ｏ
フォスフォラミドン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ）：１０　ｕｇ／ｍｌ、Ｈ２Ｏ
ペフアブロック（Ｐｅｆａｂｌｏｃ）　ＳＣ：４−［２−アミノエチル］ベンゼンスルフォニル・フロライド、１ｎｇ／ｍｌ、メタノール
ＥＤＴＡ−Ｎａ２：０．２　ｍｇ／ｍｌ、Ｈ２Ｏ
アプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）：１ｕｇ／ｍｌ、Ｈ２Ｏ
３，４−ＤＩ：３，４−ジクロロロイソコウマリン　１０　ｕｇ／ｍｌ、ＤＭＦ
ｐＡ−ＰＭＳＦ：（４−アミノフェニル）−メタンスルフォニルフロライド　１０　ｕｇ／ｍｌ、Ｈ２Ｏ
ＴＬＣＫ：Ｌ−１−クロロ−３−［４−トシルアミド］−７−アミノ−２−ヘプタノン−ＨＣｌ　５０　ｕｇ／ｍｌ、Ｈ２Ｏ
ＴＰＣＫ：Ｌ−１−クロロ−３−［４−トシルアミド］−４−フェニル−２−ブタノン　１００　ｕｇ／ｍｌ、Ｈ２ＯＤＭＦ：ジメチルスルホアミド
ＭｅＯＨ：メタノール
【００３７】
その結果、ＡＤＣ、Ｅ−６４など、システインプロテアーゼを阻害する薬剤により、変換活性は完全に阻害された。しかしながら、セリンプロテアーゼを阻害するペフアブロック　ＳＣ、３，４ＤＩＣ、ｐＡ−ＰＭＳＦ、アプロチニンや、アミノペプチターゼを阻害するベスタチン、メタロプロテアーゼを阻害するフォスフォラミドンでは活性の一部しか阻害しなかった（図１９）。すなわち、シリカクロマトグラフィー回収フラクション中でみられた変換酵素はシステインプロテアーゼであることが示唆され、変換酵素がカテプシンＬであることと一致した。
【００３８】
比較例１
カテプシンＢによる７７ＩＬ−８の消化
実施例４記載のシリカクロマトグラフィーにより得られたフラクション（ＳＦ−３，４）中の変換活性は、システインプロテアーゼであることが示唆された。そこで、同じシステインプロテアーゼであるヒトカテプシンＢの精製標品（シグマ社製カタログ番号Ｃ６２８６）を用いて７７ＩＬ−８が７２ＩＬ−８に変換されるかいなかを調べた。０．１ｕのヒト肝由来のカテプシンＢを１３μｇの７７ＩＬ−８と３７℃下にて最長５日間までインキュベーションし、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって反応性生物を観察した。７７ＩＬ−８のバンドは７７ＩＬ−８と７２ＩＬ−８との間にシフトしたが、７２ＩＬ−８と同じ位置にはバンドは現れなかった。このことから、カテプシンＢは７７ＩＬ−８の７２ＩＬ−８への変換活性を有していないものと考えられた。
【００３９】
【発明の効果】
本発明によりＮ末端が単一でしかも高純度のＩＬ−８を得るための製造法の提供が可能となる。
【００４０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＦＮ−βプライミング、ｐｏｌｙＩ：ｐｏｌｙＣ刺激後、８日間培養し、培養上清中のＩＬ−８濃度の経日変化を表した図である。
【図２】培養８日目の上清をシリカ担体および逆相−ＨＰＬＣによって精製後、０．１ｕｇをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＡＳによって分子量を分析した図である。
【図３】培養上清をシリカビーズに吸着後、２０ｍＭＨＣｌによって溶出させたときの２８０ｎｍの吸収（Ａ）を連続的にモニタリングした図
【図４】培養上清をシリカビーズに吸着後、２０ｍＭＨＣｌによって溶出させたときの各フラクション（ＳＦ−１〜５）の変換活性をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べた図である。
【図５】シリカクロマトグラフィーの活性フラクション（ＳＦ−３）をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行った。ＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４の段階的溶出を２８０ｎｍで連続的にモニタリングした図。
【図６】シリカクロマトグラフィーの活性フラクション（ＳＦ−３）をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行い、ＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４の段階的溶出の活性測定した図である。
【図７】ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの活性フラクション（ＨＦ−２、３）をＣｏｎ　Ａクロマトグラフィーを行った。０．６ＭαメチルＤマンノシドによる溶出を２８０ｎｍで連続的にモニタリングした図である。
【図８】ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの活性フラクション（ＨＦ−２、３）をＣｏｎ　Ａクロマトグラフィーを行い、０．６ＭαメチルＤマンノシドによる溶出フラクションを活性測定した図である。
【図９】Ｃｏｎ　Ａクロマトグラフィーの活性フラクション（ＣＦ−２）を濃縮後、ゲルろ過を行った時の２８０ｎｍで連続的にモニタリングした図である。
【図１０】Ｃｏｎ　Ａクロマトグラフィーの活性フラクション（ＣＦ−２）を濃縮後、ゲルろ過を行った時の活性測定した図である。
【図１１】Ｃｏｎ　Ａクロマトグラフィーの活性フラクション（ＣＦ−２）を濃縮後、ゲルろ過を行った時の活性測定した図である。
【図１２】ゲルろ過の活性フラクション（ＧＦ−１３、４）の陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、２８０ｎｍで連続的にモニタリングした図である。
【図１３】ゲルろ過の活性フラクション（ＧＦ−１３、４）の陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。適用液（Ａｐ）を２０倍希釈、溶出液（ＤＦ−１０〜２５）を５倍希釈し、３７℃で１３時間インキュベーション後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った図である。
【図１４】ゲルろ過の活性フラクション（ＧＦ−１３、４）の陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、その活性フラクションのトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った図である。
【図１５】ゲルろ過フラクション（ＧＦ−１３、１４）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ブロッティングし、ウサギ抗ヒトカテプシンＬ抗体およびヒツジ抗ヒトカテプシンＬ抗体を用いたウェスタンブロッティング解析を行った図である。
【図１６】陰イオン交換クロマトグラフィーによる溶出フラクション（ＤＦ−２１、０．２μｇ；アミノ酸分析より算出）とヒト肝由来カテプシンＬ（１μｇ）を１８μｇの７７ＩＬ−８と３７℃でインキュベーションした。経時的にサンプリングし、反応生成物をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した図である。
【図１７】図１６のＤＦ−２１から得られた反応生成物をＴＯＦＭＡＳ分析した図である。
【図１８】図１６のヒト肝由来カテプシンＬから得られた反応生成物をＴＯＦＭＡＳ分析した図である。
【図１９】線維芽細胞培養上清のシリカクロマトグラフィによる活性フラクション（図２のＳＦ−３）に、プロテアーゼ阻害剤を添加してインキュベーションした後、変換したＩＬ−８をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察した図である。変換率を数値で表した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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