(57)【要約】【課題】従来、光学顕微鏡で試料を観測する場合、合焦点下で観測画像のエッジがシャープになり合焦点からずれた場合エッジがぼやけるという現象に着目しているが、この現象は位相差顕微鏡により試料媒中の粒子体等を観測する場合には、適切にあてはまるものではない。【解決手段】位相差顕微鏡の観測像を画像解析して、観測される個体の像影の大きさおよび像影の個数が最大となる位置を最適フォーカス位置とした。また観測対象の形状に着目したフォーカス制御により特定の観測対象に選択的にフォーカシングする方法を提案した。【選択図】　　　　　図１
2004109305.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
位相差顕微鏡の観測像を画像信号に変換する画像センサと、前記画像信号を解析して前記観測像の形状的特徴を抽出するための画像処理装置と、前記観測像の形状的特徴に応じて位相差顕微鏡の焦点を制御するフォーカス制御装置を備え、該観測像の形状的特徴に応じて位相差顕微鏡の焦点位置を制御するようにしたことを特徴とする位相差顕微鏡フォーカス制御方法および装置。
【請求項２】
観測像として得られた各個体の面積値の総和が最大となるフォーカス位置を最適フォーカス位置とするようにしたこと特徴とする請求項１記載の位相差顕微鏡フォーカス制御方法および装置。
【請求項３】
観測像として得られた各個体の周囲長の総和が最大となるフォーカス位置を最適フォーカス位置とするようにしたことを特徴とする請求項１記載の位相差顕微鏡フォーカス制御方法および装置。
【請求項４】
観測像として得られた各個体の円形度の総和が最大となるフォーカス位置を最適フォーカス位置とするようにしたことを特徴とする請求項１記載の位相差顕微鏡フォーカス制御方法および装置。
【請求項５】
焦点位置が所定のプリセット位置から、観測対象に応じて設定された前記最適フォーカス位置まで自動的に移動するようにしたことを特徴とする請求項１記載の位相差顕微鏡フォーカス制御方法および装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学顕微鏡とくに位相差顕微鏡で試料を観察または画像解析する場合、試料に顕微鏡のフォーカスを合わせる方法及び装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来光学顕微鏡で試料を観察または画像処理する場合のフォーカス制御は、試料台に搭載した試料を光学顕微鏡の対物レンズを介し、結像レンズの結像面位置に配置した画像センサにより映像信号に変換し、この映像信号の微分成分を処理してフォーカス信号としてこのフォーカス信号が最大となる位置を合焦点としている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】
特開平１１−１４２７４２号公報　（第４−５頁。図４）
【０００４】つまり従来の光学顕微鏡のフォーカス制御では、合焦点下での試料の観測画像はエッジがシャープになり、合焦点からずれた場合の試料の観測画像はエッジがぼやけるという現象に着目したものである。このため画像センサより出力される映像信号から微分成分を検出して、微分成分が最大出力となる位置すなわち合焦点位置を求め、次いでその位置に光学系駆動機構を制御するようにしている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術では、光学顕微鏡による試料の観測画像は合焦点下でエッジがシャープになり合焦点からずれた場合エッジがぼやけるという現象に着目しているが、この現象は或る種の光学顕微鏡例えば位相差顕微鏡による試料の観測の場合には、適切にあてはまるものではない。
【０００６】
例えば、位相差顕微鏡により球菌等の粒子体を観測する場合には、図２に示すように対物レンズを徐々に試料に近づけると、先ず合焦点面が球菌等の上端部Ａにあるときは観測像はａのような小円形の像影となり、合焦点面が球菌等の腹部（中央部）Ｂに近づくにつれて徐々に小円形の像影からｂのような大円形の像影へと観測像の大きさが変化する。球菌等が透明または半透明の場合は合焦点面の移動により下端部Ｃでは再びｃのような小円形が観測される。
【０００７】
また、分散媒中に複数の球菌等が浮遊しているような試料を観測する場合には、対物レンズを徐々に試料に近づけると、図３に示すように、分散媒中に浮遊している球菌等がもっとも多いところに合焦点面があるときの像影がもっとも多数個になり、このフォーカス位置の近傍で観測される像影の面積の総和が最大となる。
【０００８】
つまり位相差顕微鏡により球菌等の粒子体を観測する場合には、フォーカス制御をおこなうためには観測像のエッジのシャープさに着目するよりはフォーカス位置の変化により観測される像影の大きさあるいは観測される像影の個数が変化するという点に着目するほうが実用的価値が高い。
【０００９】
本発明は、前記の従来の光学顕微鏡のフォーカス制御方法の問題を解決しようとするものであり、特に位相差顕微鏡により球菌等の粒子体を観測する場合に適切な位相差顕微鏡フォーカス制御方法および装置を実現することを目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記目的を達成するために、位相差顕微鏡の観測像を画像信号に変換する画像センサと、画像信号を解析して観測像の形状的特徴を抽出するための画像処理装置と、観測像の形状的特徴に応じて位相差顕微鏡のフォーカスを制御するフォーカス制御装置を備え、観測像の大きさあるいは特定の形状を表す指標が最大となるよう位相差顕微鏡のフォーカス位置を制御するようにしたものである。
【００１１】
第１の具体的解決手段は、前記観測像の形状的特徴量として個々の観測像の像影の面積値を抽出し、この観測像の像影の面積値の総和が最大となるように位相差顕微鏡のフォーカス位置を制御するようにしたものである。
【００１２】
第２の具体的解決手段は、前記観測像の形状的特徴量として個々の観測像の像影の周囲長を抽出し、この観測像の像影の周囲長の総和が最大となるように位相差顕微鏡のフォーカス位置を制御するようにしたものである。
【００１３】
第３の具体的解決手段は、前記観測像の形状的特徴として個々の観測像の像影の円形度を抽出し、この観測像の像影の円形度が最大となるように位相差顕微鏡のフォーカス位置を制御するようにしたものである。
【００１４】
上記第１及び第２の具体的解決手段による作用は、球菌等の粒子体を観測する場合フォーカス位置を移動させると観測像の像影の大きさが変化することに着目したフォーカス位置制御であり、上記第３の具体的解決手段による作用は、観測対象の中で像影が円形となる特定形状の粒子体にフォーカスをあわせることに着目したフォーカス位置制御である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態として一実施例を図１〜図３に基づいて説明する。
【００１６】
発明の実施例を図１に示す。図において１は位相差顕微鏡、２は画像処理装置、３はフォーカス制御装置、４はディスプレイモニタ、１１は試料台、１２は試料、１３は対物レンズ、１４は光学系、１５は画像センサ、１６は光学系駆動機構、３１はフォーカス信号発生部、３２は駆動命令部である。
【００１７】
図１において位相差顕微鏡１の試料台１１に搭載した試料１２の光学像は対物レンズ１３を介して光学系１４により画像センサ１５の位置に結像される。この光学像は光学系１４の結像面位置に配置した画像センサ１５により画像信号に変換されて出力される。この画像信号を画像処理装置２に入れ画像処理する。このとき同時に試料２の光学像はディスプレイモニタ４に映像として表示される。
【００１８】
光学系駆動機構１６は位相差顕微鏡１の光学系１４を上下させ試料１２と対物レンズ１３の距離を変化させてフォーカスを調整する。光学系駆動機構１６を駆動する駆動制御信号はフォーカス制御装置３内の駆動命令部３２により出力される。
【００１９】
画像処理装置２は画像センサ１５から入力される画像信号を受けて入力画像の形状的特徴を抽出するための画像処理を行う。
【００２０】
図２は本発明に用いる形状的特徴の抽出のために用いる画像処理の実施例を示すフロー図である。像影を抽出して面積や周囲長を計算するソフトウアエは広く公知であり、特段の説明は要しない。また像影の円形度の算出としては例えば、「円形度＝面積÷周囲長」と定義してこの式から簡単に求めることができる。
【００２１】
次に、具体例をもって本発明の動作の一実施例を説明する。　まず、前記第１の具体的解決手段に示した観測像の像影の面積値の総和が最大となるようにフォーカス制御する場合について、球菌の観測を例にとって説明する。
【００２２】
まず、試料台１１に試料１２を配置し、対物レンズ１３の位置をプリセット位置に設定する。このプリセット位置は例えば試料台１１と対物レンズ１３の間の距離を最適フォーカス位置より大きい値に予め設定しておく。次に光学系駆動機構１６を作動させて対物レンズ１３を試料１２の方に徐々に下降させる。このとき同時に画像センサ１５からの画像信号を画像処理装置２により処理して観測像の形状的特徴として観測像の像影の面積の総和を抽出してこの値をフォーカス制御装置３に送るようにする。フォーカス制御装置３内のフォーカス信号発生部３１は観測像の像影の面積の総和に対応したフォーカス信号を発生してこれを駆動命令部３２に送る。駆動命令部３２は送られてきたフォーカス信号と過去のフォーカス信号の大小を比較して最適フォーカス制御に必要な駆動制御信号を発生して光学系駆動機構１６に送出する。光学系駆動機構１６は送出された駆動制御信号に応じて光学系を駆動し対物レンズの位置を上下に移動させる。
【００２３】
このようにすれば、当初プリセット位置から下降した対物レンズが試料１２に近づくにつれて、観測像の像影の面積値の総和が徐々に大きくなり面積値の総和が最大になったあと同値は減少をはじめる。フォーカス制御装置３はこの面積値の総和の増加と減少の変化をとらえて面積値の総和が最大となった位置を最適フォーカス位置として、そこに対物レンズ１３が停止するよう光学系駆動機構１６に駆動制御信号を出す。
【００２４】
以上のようにして、前記第１の具体的解決手段に示した観測像の像影の面積値の総和が最大となるようにフォーカス制御される。
【００２５】
次に、前記第２の具体的解決手段として、観測像の像影の周囲長の総和が最大となるようにフォーカス位置を制御する場合について説明する。
【００２６】
前期第２の具体的解決手段においては、上記第１の具体的解決手段が観測像の像影の面積値に着目したのに対して像影の周囲長に着目するという点が異なるだけで、いずれも観測される像影の大きさおよび個数が最大となるようにフォーカス位置を制御するという目的は同一である。従って、その動作の説明は面積値を周囲長におきかえるだけで容易に理解できる。
【００２７】
次に、前記第３の具体的解決手段として、観測像の像影の円形度を抽出し、この観測像の像影の円形度の総和が最大となるように位相差顕微鏡のフォーカス位置を制御する場合について説明する。
【００２８】
位相差顕微鏡により試料媒中の粒子体を観測する場合、観測対象以外に形状や大きさの異なる他の物体やごみなどの夾雑物が混在する場合がある。この場合夾雑物に対してフォーカス制御が作動することを防ぐために、本解決手段が適用される。前述のように、観測像の形状的特徴として観測像の像影の円形度を抽出しこの円形度の総和が最大となるように位相差顕微鏡のフォーカス位置を制御すれば、円形度が大きい球菌等の観測対象がもっとも多く観測される位置にフォーカス位置が移動し、球菌等の粒子体を選択的に観測するのに適したフォーカス制御が行われる。
【００２９】
以上の実施例では主として球菌等の粒子体を観測対象とする場合について説明したが、本発明による形状的特徴に応じて焦点位置を制御するようにした位相差顕微鏡フォーカス制御方法においては、他の形状特徴をフォーカス制御の指標に用いることにより、糸状菌等の他の形状特徴を持つ観測対象に対しても効果的なフォーカス制御ができることはいうまでもない。例えば糸状菌に対しては、形状特徴として前記の円形度を表す指標の逆数「１／円形度＝周囲長÷面積」が最大となるようフォーカス制御すればよい。
【００３０】
【発明の効果】
このように本発明によれば、位相差顕微鏡で粒子体等を観察または画像解析する場合、試料媒の上下位置の中で観測対象となる粒子体がもっとも多く出現し、かつ個々の粒子体の像影が平均的に合焦点状態となる位置を最適位置とするフォーカス制御が可能となる。
【００３１】
さらに本発明によれば、試料媒の中で特定の形状の観測対象に選択的にフォーカスを合わせるようなフォーカス制御が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例を示す位相差顕微鏡装置フォーカス制御装置の構成図
【図２】本発明の作用を説明するための参考図
【図３】本発明の作用を説明するための参考図
【図４】画像処理の実施例
【符号の説明】
１　位相差顕微鏡
１１　試料台
１２　試料
１３　対物レンズ
１４　光学系
１５　画像センサ
１６　光学系駆動機構
２　画像処理装置
３　フォーカス制御装置
３１　フォーカス信号発生部
３２　駆動命令部
４　ディスプレイモニタ
【図１】
2004109305.tif 000003
【図２】
2004109305.tif 000004
【図３】
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【図４】
2004109305.tif 000006