(57)【要約】【課題】種々の配糖体をより高収率で製造する方法を提供する。【解決手段】マルトースホスホリラーゼをリン酸存在下でアルコール性ヒドロキシル基を有する化合物と糖供与体に作用させることにより、１段階目で可逆的にβ−グルコース−１−リン酸を生成し、その後不可逆的にα−アノマー選択的にα−グルコシドを生成する。α−グルコシドがマルトースホスホリラーゼによる分解を受けることもなく、不可逆的であるため、高収率でα−グルコシドを製造することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルトースホスホリラーゼをリン酸存在下でヒドロキシル基を有する化合物と糖供与体に作用させることを特徴とするマルトースホスホリラーゼによる配糖体の製造方法。
【請求項２】
ヒドロキシル基がアルコール性ヒドロキシル基であることを特徴とする請求項１記載のマルトースホスホリラーゼによる配糖体の製造方法。
【請求項３】
α−アノマー選択的であることを特徴とする請求項１又は２記載のマルトースホスホリラーゼによる配糖体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マルトースホスホリラーゼによる配糖体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコシダーゼに分類される酵素には、加水分解のみではなく、転移反応を触媒するものがあり、そのような酵素はオリゴ糖や各種配糖体の製造に用いられている。また、配糖体は自然界に広く存在し各種生理活性を有するものが多いが、有機物質を配糖化することで当該有機物質の溶解性や安定性の向上が期待されることもあって、多くの関連技術が報告されている。例えば、特許文献１、非特許文献１〜３には、マルトースを糖供与体として収率良く配糖体としてのα−グルコシドを合成するXanthomonas campestris由来のα−グルコシダーゼの酵素活性を利用したα−グルコシドの製造方法が開示されている。
【０００３】
しかしながら、グルコシダーゼによる配糖体の製造においては、当該酵素の有する加水分解活性により生成物であるα−グルコシドが分解されて損失を生じるという問題があり、種々の配糖体をより高収率で製造する方法が求められている。
【０００４】
なお、特許文献２（関連文献として非特許文献４）には、シュークロースホスホリラーゼを用いたフェノール配糖体の製造法が開示されている。この製造法によれば、α−アノマー選択的にフェノール配糖体を製造できる。しかしながら、この場合に用いられる糖供与体がシュークロースであって、生成する配糖体がフェノール配糖体に限られるなど適用範囲に限界があった。
【０００５】
また、マルトースホスホリラーゼを用いた配糖体の合成に関し、当該酵素をフェノール化合物に作用させることによりβ−グルコシドを製造する方法が特許文献３に唯一開示されている。マルトースホスホリラーゼはマルトースを加リン酸分解してグルコースとβ−グルコース−１−リン酸を生成する反応を触媒する酵素として知られているが、マルトースホスホリラーゼの反応機構を考えると、この開示された方法ではβ−グルコシドは勿論、配糖体の製造も不可能であることを本発明者らは確認済みである。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００１−４６０９６号公報
【特許文献２】
特開平６−１５３９７６号公報
【特許文献３】
特開平８−１７３１８３号公報
【非特許文献１】
J.Bioci.Bioeng., 89(2), 138-144, (2000)
【非特許文献２】
J.Bioci.Bioeng., 90(6), 625-630, (2000)
【非特許文献３】
J.Bioci.Bioeng., 93(3), 328-330, (2002)
【非特許文献４】
Biosci. Biotech. Biochem., 58(1), 38-42, (1994)
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記問題を解決することであり、種々の配糖体をより高収率で製造する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意研究の結果、マルトースホスホリラーゼをリン酸存在下でアルコール性ヒドロキシル基を有する化合物と糖供与体に作用させると、１段階目で可逆的にβ−グルコース−１−リン酸を生成し、その後不可逆的にα−グルコシドを生成するという新たな活性をマルトースホスホリラーゼに見出し、本発明に想到した。
【０００９】
本発明の請求項１記載のマルトースホスホリラーゼによる配糖体の製造方法は、マルトースホスホリラーゼをリン酸存在下でヒドロキシル基を有する化合物と糖供与体に作用させることを特徴とする。
【００１０】
本発明の請求項２記載のマルトースホスホリラーゼによる配糖体の製造方法は、前記請求項１において、ヒドロキシル基がアルコール性ヒドロキシル基であることを特徴とする。
【００１１】
本発明の請求項３記載のマルトースホスホリラーゼによる配糖体の製造方法は、前記請求項１又は２において、α−アノマー選択的であることを特徴とする。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１３】
本発明で用いられるヒドロキシル基を有する化合物には、アルコール性ヒドロキシル基を有する化合物とフェノール性ヒドロキシル基を有する化合物の両方を含む。
【００１４】
本発明で用いられるアルコール性ヒドロキシル基を有する化合物には、エタノール，プロパノール，ブタノール，ペンタノール，ヘキサノール，ヘプタノールなどの鎖式アルコール及びその誘導体，ベンジルアルコール，サリチルアルコールなどの芳香族アルコール及びその誘導体，脂環式アルコール及びその誘導体などが含まれる。
【００１５】
本発明で用いられるフェノール性ヒドロキシル基を有する化合物には、フェノール，ヒドロキノン，カテコール，レゾルシノール，バニリン，カテキン，エピカテキン，ウルシオール，ピロガロール，カプサイシン，ジヒドロカプサイシン及びこれらの誘導体などが含まれる。
【００１６】
本発明で用いられるマルトースホスホリラーゼは、リン酸存在下でマルトースを分解してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸を可逆的に生成する反応を触媒する酵素であって、マルトースホスホリラーゼ活性を有するものであれば、マルトースホスホリラーゼ産生能を有する微生物を栄養培地に接種、培養して該酵素を生産蓄積せしめ、次いでこの培養菌体を含む培養液から常法により分離した粗酵素，精製酵素，ならびに菌体のいずれも用いることができる。また市販製品を用いることもできる。なお、市販製品は、キッコーマン株式会社，シグマ・アルドリッチ社（米国）などから入手可能である。
【００１７】
マルトースホスホリラーゼ産生能を有する微生物としては、例えば、ナイセリア・メニンジチディスなどのナイセリア属，エンテロコッカス・フェーカリスなどのエンテロコッカス属，ラクトバチルス・ブレビス，ラクトバチルス・ファーメンタムなどのラクトバチルス属のほか、ストレプトコッカス属などに属する微生物などが挙げられる。
【００１８】
本発明で用いられるリン酸は、オルトリン酸など、無機リン全般を含み、糖供与体としてはマルトースが用いられる。
【００１９】
本発明を実施するには、まず、基質となるヒドロキシル基を有する化合物，リン酸，マルトースを水に溶解して混合液を調製する。このとき、混合液のｐＨを５〜９、好ましくは６〜８に調整する。なお、上記リン酸の代わりにリン酸緩衝液、たとえばクエン酸―リン酸緩衝液を用いることによってｐＨを調整してもよい。
【００２０】
つぎに、この混合液にマルトースホスホリラーゼを加える。そして、振とうしながら３〜９６時間好ましくは５〜３５時間、２０〜５５℃好ましくは３５〜４５℃で反応させる。反応終了後、煮沸などの方法により反応を停止させ、生成した配糖体は、シリカクロマトグラフィー等による吸着などの常法により単離、精製する。なお、マルトースホスホリラーゼの添加量は、用いる酵素の活性などを考慮して決定すればよいが、反応液１ｍｌあたり０．１〜１００単位程度加えればよい。ここで、１単位はｐＨ７．０，３０℃においてマルトースから１分間に１μｍｏｌのＤ−グルコースを生成する酵素量である。また、反応時間及び温度も上記に限定されるものではなく、用いる酵素に応じた最適な条件とすればよい。
【００２１】
上記の本発明のマルトースホスホリラーゼによる配糖体の製造方法によれば、マルトースホスホリラーゼをリン酸存在下でヒドロキシル基，特にアルコール性ヒドロキシル基を有する化合物と糖供与体に作用させることにより、１段階目で可逆的にβ−グルコース−１−リン酸を生成し、その後不可逆的にα−アノマー選択的にα−グルコシドを生成する。この合成反応は、α−グルコシドがマルトースホスホリラーゼによる分解を受けることもなく、不可逆的であるため、生成物が酵素による分解を受ける従来の方法と比較して、高収率でα−グルコシドを製造することができる。
【００２２】
なお、本発明は、従来のシュークロースホスホリラーゼを用いたフェノール配糖体の製造法（特許文献２）と比較した場合、糖供与体が異なり、反応メカニズムが異なる上に、上記従来例はフェノール性ヒドロキシル基に糖が結合してできるフェノール配糖体の製造法である点で明確な差異がある。かつ、本発明は、マルトースホスホリラーゼに配糖体合成活性があることを初めて見出したものである。
【００２３】
【実施例】
以下の実施例に基づき、本発明をより具体的に説明する。
【００２４】
［実施例１］  種々の基質に対する配糖化反応の検討
表１に示すそれぞれの基質に対する配糖化反応について検討した。
【００２５】
１０ｍｌ容試験管に、基質を１．８ｍｌ（サリチルアルコールについては２０ｍｇ）、１０ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．２ｍｌ（サリチルアルコールの場合は２．０ｍｌ）、マルトースを１００ｍｍｏｌ加えて混合液を調製した。つぎに、市販のマルトースホスホリラーゼを２０μｌ（１０単位）加え、４０℃に保温し１６０ｒｐｍで振とうしながら、２４時間反応させた。その後、１００℃で５分間煮沸することにより反応を停止させ、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析により、生成物を確認した。なお、マルトースホスホリラーゼは市販のもの（ＭＰａｓｅ１：キッコーマン株式会社製，ＭＰａｓｅ２：シグマ・アルドリッチ社製，ＭＰａｓｅ３：オリエンタル酵母工業株式会社製）を用いて検討を行った。
【００２６】
この結果を表１に示す。表中、「＋」の数が多いほど生成した配糖体の量が多いことを示し、「−」は配糖体の生成が確認されなかったことを示す。この結果より、幅広い種々の基質に対してマルトースホスホリラーゼが作用し、配糖体が生成することが確認された。
【００２７】
【表１】
2004208507.tif 000002
［実施例２］  生成物の確認
実施例１で生成した配糖体について検討を行った。
【００２８】
１０ｍｌ容試験管に、１−ブタノールを１．８ｍｌ、１０ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．２ｍｌ、マルトースを１００ｍｍｏｌ加えて混合液を調製した。つぎに、マルトースホスホリラーゼ（ＭＰａｓｅ１）を２０μｌ（１０単位）加え、４０℃に保温し１６０ｒｐｍで振とうしながら、２４時間反応させた。その後、１００℃で５分間煮沸することにより反応を停止させ、エバポレーションを行い、配糖体を含む反応混合物を得た。
【００２９】
さらに、シリカクロマトグラフィーにより分離・精製した配糖体に１０ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を２．０ｍｌ、上記マルトースホスホリラーゼ２０μｌ（１０単位）若しくは市販のα−グルコシダーゼ１０ｍｇ（１０単位：１単位はｐＨ７．０，３０℃においてマルトースから１分間に１μｍｏｌのＤ−グルコースを生成する酵素量）又はβ−グルコシダーゼ１０ｍｇ（１０単位：１単位はｐＨ７．０，３０℃においてセロビオースから１分間に１μｍｏｌのＤ−グルコースを生成する酵素量）を加え、４０℃に保温し１６０ｒｐｍで振とうしながら、２４時間反応させた。その後、１００℃で５分間煮沸することにより反応を停止させ、得られた反応液をＴＬＣなどにより分析した。その結果、得られた配糖体は精製マルトースホスホリラーゼによって分解はされなかった。また、当該配糖体はα−グルコシダーゼによってのみ加水分解され、β−グルコシダーゼに対しては加水分解されなかった。
【００３０】
したがって、本発明のマルトースホスホリラーゼを用いた配糖体合成は従来報告されているグルコシダーゼのような分解反応を伴うものではなく、また得られた配糖体はα−グルコシドであり、かつマルトースホスホリラーゼによる配糖体の合成反応はα−アノマー選択的に進むことが確認された。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の請求項１記載のマルトースホスホリラーゼによる配糖体の製造方法は、マルトースホスホリラーゼをリン酸存在下でヒドロキシル基を有する化合物と糖供与体に作用させるので、種々の配糖体をより高収率で製造することができる。
【００３２】
本発明の請求項２記載のマルトースホスホリラーゼによる配糖体の製造方法は、前記請求項１において、ヒドロキシル基がアルコール性ヒドロキシル基であるので、アルコール性ヒドロキシル基に糖が結合した種々の配糖体をより高収率で製造することができる。
【００３３】
本発明の請求項３記載のマルトースホスホリラーゼによる配糖体の製造方法は、前記請求項１又は２において、α−アノマー選択的であるので、α−グルコシドを効率的に製造することができる。