(57)【要約】【課題】  骨・関節炎の予防・治療剤に有用なタンパク質などの提供。【解決手段】  本発明のタンパク質は、例えば骨・関節炎などの診断マーカー等として有用であり、該タンパク質、該タンパク質を用いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物などは、例えば上記疾患の予防・治療剤などの安全な医薬として使用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
【請求項２】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
【請求項３】
配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
【請求項４】
請求項１記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項５】
請求項１記載のタンパク質または請求項４記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項６】
ＤＮＡである請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項８記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１０】
請求項９記載の形質転換体を培養し、請求項１記載のタンパク質または請求項４記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１記載のタンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法。
【請求項１１】
請求項１記載のタンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１２】
請求項５記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項１３】
請求項５記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
【請求項１４】
請求項１記載のタンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
【請求項１５】
請求項１４記載の抗体を含有してなる診断薬。
【請求項１６】
請求項１４記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項１７】
請求項５記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項１９】
請求項１記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項１記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、請求項１記載のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項２１】
請求項５記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２２】
請求項５記載のポリヌクレオチドを含有してなる、請求項１記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項２３】
請求項１４記載の抗体を用いることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の定量方法。
【請求項２４】
骨・関節疾患の予防・治療剤である請求項１２または請求項１６記載の医薬。
【請求項２５】
骨・関節疾患が、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害である請求項２４記載の医薬。
【請求項２６】
骨・関節疾患の診断薬である請求項１３または請求項１５記載の診断薬。
【請求項２７】
骨・関節疾患が、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害である請求項２６記載の診断薬。
【請求項２８】
配列番号：８で表わされる塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有するＤＮＡ。
【請求項２９】
配列番号：８で表わされる塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有するＤＮＡの転写調節領域である請求項２８記載のＤＮＡ。
【請求項３０】
転写調節領域がプロモーター領域である請求項２９記載のＤＮＡ。
【請求項３１】
請求項２８記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項３２】
配列番号：８で表わされる塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有するＤＮＡの転写調節領域の下流にレポーター遺伝子を有するＤＮＡを含有する請求項３１記載の組換えベクター。
【請求項３３】
請求項３２記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項３４】
請求項２８記載のＤＮＡを用いることを特徴とする、配列番号：２で表わされる塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有するＤＮＡの転写調節活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項３５】
請求項３３記載の形質転換体を用いる請求項３４記載のスクリーニング方法。
【請求項３６】
哺乳動物に対して、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩の活性を阻害する化合物もしくはその塩、または該タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩の有効量を投与することを特徴とする、骨・関節疾患の予防・治療法。
【請求項３７】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩の活性を阻害する、または該タンパク質遺伝子の発現を阻害することを特徴とする、骨・関節疾患の予防・治療法。
【請求項３８】
骨・関節疾患の予防・治療剤を製造するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩の活性を阻害する化合物もしくはその塩、または該タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規タンパク質、そのＤＮＡ、該タンパク質の発現または活性を調節する化合物等のスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得られる化合物、該化合物を含有する骨・関節疾患の予防・治療剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
オルファクトメジンドメイン（Conserved Domain Database pfam0219、OLF）は、約250アミノ酸残基からなる、それ自体は機能不明のタンパク質構造単位である。このドメインを含むタンパク質は、分泌型タンパク質（ER局在型も含む）と7回膜貫通型受容体型の二つに分類されている。分泌型タンパクとしてはOlfactomedinが粘液性の細胞外マトリックスの構成成分として最初に単離され、ウシガエルの嗅覚神経上皮細胞で発現していることが報告されている（Yokoe H, Anholt RR、Proc Natl Acad Sci U S A. 90：4655-4659、1993）。その後、ヒトを含む多くの生物種でこのドメインを含むタンパク質や遺伝子が発見されている。ヒト由来の遺伝子としては毛様体で発現しているMyocilin（Kubota、R.ら Genomics 41：360-369、1997）がよく研究されている。MyocilinはTIGRとも呼ばれ、緑内障の原因遺伝子の1つであることが知られている（Stone, EM. ら Science  275：668-70、1997）。GW112（NP_006409）は潰瘍性大腸炎の大腸粘膜の上皮細胞で発現が上昇していることが報告されている（Shinozaki, S.ら Gut 48：623-9、2001）。マウスのPancortin（Nagano, T.ら Brain Res Mol Brain Res 53：13-23 (1998).  Nagano, T.ら, J Neurochem 75, 1-8、2000）は大脳皮質で発現しており、神経分化に必須なタンパク質であると考えられている。ニワトリのNoelin（Barembaum M, ら Nat Cell Biol 2000 219-25）は神経管による神経提（neural crest）細胞の生産を調節していることが報告されている。また、アフリカツメガエルのTiarin（Hiroshi Tsuda ら、Neuron, Vol 33, 515-528, 2002）は神経管の組織形成に関与する分泌因子であると考えられている。このように、これらのオルファクトメジンドメインを有するタンパク質は細胞外に分泌され、神経の組織形成を制御する新しい範疇の生理活性物質と考えられる。一方、Latrophilinはクモの神経毒素であるα-Latrotoxinの受容体であり、Gタンパク質共役型7回膜貫通型受容体であり、マウスでは脳で発現している（Lelianova, V. G., ら. J Biol Chem 272, 21504-8 (1997)。TiarinはLatrophilinのアンタゴニスト作用を有する可溶性受容体とする仮説も提唱されている（Wessely, O and De Robertis, E.M. Neuron, Vol 33, 489-491, 2002）。上記の他にもヒト由来の分泌型オルファクトメジンドメイン含有タンパク質として、GenBankにはHNOEL-iso（GenBank Accession NP_064575）、OLFM1（NP_055094）、OLFM2（NP_477512）、OLFM3（AAK97473）などが登録されている。また受容体型オルファクトメジンドメイン含有タンパク質としては、ヒトでもLatrophilin 1（NP_036434、Lectomedin-1とも呼ばれる）、Lectomedin-2（NP_055736.1）、Lectomedin-3（NP_056051）などが登録されている。この内、ヒトLatrophilin 1遺伝子は乳がんでは変化していることが示されている（White,G.Rら、Oncogene 17 (26), 3513-3519、1998）。
変形性関節症は慢性の関節炎を伴う関節疾患で、軟骨の退行変性により、軟骨の破壊と骨や軟骨の増殖性変化を来たす病気である。骨端に骨棘形成するなどの関節の変形も認められる。変形性関節症は年令とともに増加し、60才以上になると膝、肘、股関節、脊椎では、80％以上が変形性関節症の症状を呈すると言われている。変形性関節症の治療は痛みを抑制する対処療法が中心であり、非ステロイド性消炎鎮痛剤や関節に直接注射するヒアルロン酸やステロイド剤などが使用される。進行した場合、関節鏡視下手術や痛みや変形が強い場合、膝や股関節では骨切り術や人工関節置換などの手術の適応となる。しかし、人工関節には寿命があるため55才迄はこの手術を避けることが好ましいと考えられ、関節の退行性変化を抑制する治療法の開発が望まれている。さらに、変形性関節症はX腺撮影などの装置による診断法しかなく、より簡便な診断法の開発も望まれている。
遺伝子発現を網羅的に解析するために、cDNAまたはオリゴヌクレオチドを固定化したマイクロアレイ法が開発され、疾患特異的な遺伝子発現の変化を見出す技術が普及し、その有用性が確認されている。例えば、Affymetrix社のGeneChipシステムはがんなどの疾患の診断や創薬標的遺伝子の発見に多用されつつある。変形性関節症患者の関節で特異的に発現している遺伝子やタンパク質を見出し、そこから変形性関節症の治療薬や診断薬を創出する試みが行われている。例えば、MMP-13などのマトリックスメタロプロテアーゼは変形性関節症の関節で発現が上昇していることが知られており、MMP阻害剤を関節破壊抑制薬として検討されている。
DKFZP586L151は、GenBank Accession No. XP_034000（非特許文献１）として登録されているオルファクトメジンドメイン含有タンパク質であるが、全長配列は報告されていない。またDKFZP586L151と相同性の高い遺伝子がマウスからクローニングされている（非特許文献２ GenBank Accession No. XM_129545）。しかし、オルファクトメジンドメイン含有タンパク質と変形性関節症との関係はこれまで報告さていない。
【非特許文献１】GenBank Accession No. XP_034000
【非特許文献２】GenBank Accession No. XM_129545
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
安全で優れた骨・関節疾患の診断薬及び予防・治療剤が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、変形性関節症軟骨に発現が顕著に増加するオルファクトメジンドメイン含有遺伝子を見出し、この知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（２）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（３）  配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（４）  上記（１）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（５）  上記（１）記載のタンパク質または上記（４）記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（６）  ＤＮＡである上記（５）記載のポリヌクレオチド、
（７）  配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（８）  上記（５）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（９）  上記（８）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１０）  上記（９）記載の形質転換体を培養し、上記（１）記載のタンパク質または上記（４）記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（１１）  上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（１２）  上記（５）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１３）  上記（５）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（１４）  上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（１５）  上記（１４）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（１６）  上記（１４）記載の抗体を含有してなる医薬、
（１７）  上記（５）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、
（１８）  上記（１７）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１９）  上記（１）記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１９ａ）  上記（１９）記載のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩、
（１９ｂ）  上記（１９ａ）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２０）  上記（１）記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、上記（１）記載のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２０ａ）  上記（２０）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩、
（２０ｂ）  上記（２０ａ）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２１）  上記（５）記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２１ａ）  上記（２１）記載のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩、
（２１ｂ）  上記（２１ａ）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２２）  上記（５）記載のポリヌクレオチドを含有してなる、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２２ａ）  上記（２２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩、
（２２ｂ）  上記（２２ａ）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２３）  上記（１４）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質の定量方法、
（２４）  骨・関節疾患の予防・治療剤である上記（１２）または（１６）記載の医薬、
（２４ａ）  骨・関節疾患の予防・治療剤である上記（１９ｂ）、（２０ｂ）、（２１ｂ）または（２２ｂ）記載の医薬、
（２５）  骨・関節疾患が、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害である上記（２４）記載の医薬、
（２６）  骨・関節疾患の診断薬である上記（１３）または（１５）記載の診断薬、
（２７）  骨・関節疾患が、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害である上記（２６）記載の診断薬、
（２８）  配列番号：８で表わされる塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有するＤＮＡ、
（２９）  配列番号：８で表わされる塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有するＤＮＡの転写調節領域である上記（２８）記載のＤＮＡ、
（３０）  転写調節領域がプロモーター領域である上記（２９）記載のＤＮＡ、
（３１）  上記（２８）記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（３２）  配列番号：８で表わされる塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有するＤＮＡの転写調節領域の下流にレポーター遺伝子を有するＤＮＡを含有する上記（３１）記載の組換えベクター、
（３３）  上記（３２）記載の組換えベクターを含有する形質転換体、
（３４）  上記（２８）記載のＤＮＡを用いることを特徴とする、配列番号：２で表わされる塩基配列と同一または実質的に同一の塩基配列を含有するＤＮＡの転写調節活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３４ａ）  上記（３４）記載のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩、
（３４ｂ）  上記（３４ａ）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（３４ｃ）  骨・関節疾患の予防・治療剤である上記（３４ｂ）記載の医薬、
（３５）  上記（３３）記載の形質転換体を用いる上記（３４）記載のスクリーニング方法、
（３６）  哺乳動物に対して、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩の活性を阻害する化合物もしくはその塩、または該タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩の有効量を投与することを特徴とする、骨・関節疾患の予防・治療法、
（３７）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩の活性を阻害する、または該タンパク質遺伝子の発現を阻害することを特徴とする、骨・関節疾患の予防・治療法、
（３８）  骨・関節疾患の予防・治療剤を製造するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩の活性を阻害する化合物もしくはその塩、または該タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩の使用などに関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のタンパク質またはＤＮＡは、骨・関節炎の診断マーカーとして使用できる。
本発明のタンパク質の活性を調節（好ましくは阻害）する化合物またはその塩、該タンパク質の遺伝子の発現を調節（好ましくは阻害）する化合物またはその塩、該タンパク質に対する中和抗体、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドなどは、例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘等）などの骨・関節炎の予防・治療剤として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上、好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、軟骨細胞の分化調節活性、軟骨細胞への結合活性などがあげられる。実質的に同質とは、それらの性質が生物学的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
軟骨細胞の分化調節活性の測定は、公知の方法に準じて行うことができ、例えば、J Cell Biochem 67, 498-513 (1997)に記載の方法またはそれに準じた方法などに従って測定することができる。例えば、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞の培養上清または細胞抽出物から、公知方法（例、免疫アフィニティーカラム）に従い、本発明のタンパク質を得る。このタンパク質を培養軟骨細胞に添加し、37℃で7日〜21日間培養する。次に上記文献に挙げられた方法に従い軟骨細胞のプロテオグリカン含量またはアルカリ性ホスファターゼ活性を評価することにより、軟骨細胞の分化調節活性を測定する。
軟骨細胞への結合活性の測定は、公知の方法に準じて行うことができる。例えば、本発明のタンパク質を、公知の方法に準じ、例えばD-ビオチノイル-ε-アミノカプロン酸-N-ハイドロキシサクシイミドエステルを用いてビオチン標識する。該標識タンパク質を培養軟骨細胞に添加し、4℃で一時間培養後、細胞をPBSで洗浄する。次に、ストレプトアビジンおよび酵素（例、アルカリ性ホスファターゼ）の複合体を添加し、4℃で一時間培養後、細胞をPBSで洗浄する。最後に該酵素の化学発光基質（例、Disodium 2-chloro-5-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro) tricyclo[3.3.1.1.3,7]decan}-4-yl)-1-phenyl phosphateなど）を添加し、発生する光を測定することにより、本発明のタンパク質の軟骨細胞への結合活性を測定する。
【０００８】
また、本発明のタンパク質としては、例えば、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
【０００９】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート(-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば-OH、-SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などが挙げられる。
【００１０】
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明のタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１〜２９０番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどが挙げられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
【００１１】
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート（-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明のタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
【００１２】
本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１３】
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１４】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１５】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１６】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１７】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１８】
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（i）〜（v）に記載された方法が挙げられる。
（i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年)
（ii）SchroederおよびLuebke、The Peptide, Academic Press, New York (1965年)
（iii）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
（iv）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
（v）矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００１９】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、RT-PCR法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、（i）配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ii）配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
【００２０】
配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning 2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２１】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
【００２２】
本発明のタンパク質、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Molecular Cloning 2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００２３】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２４】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００２５】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,60巻,160(1968)〕，ＪＭ１０３〔Nucleic Acids Research,9巻,309(1981)〕，ＪＡ２２１〔Journal of Molecular Biology,120巻,517(1978)〕，ＨＢ１０１〔Journal of Molecular Biology,41巻,459(1969)〕，Ｃ６００〔Genetics,39巻,440(1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔Gene,24巻,255(1983)〕，２０７−２１〔Journal of Biochemistry,95巻,87(1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
【００２６】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Nature,315巻,592(1985)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69巻,2110(1972)やGene,17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００２７】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Molecular & General Genetics,168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology,194巻,182-187(1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75巻,1929(1978)などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Bio/Technology,6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．263-267(1995)（秀潤社発行）、Virology,52巻,456(1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００２８】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller）， Journal of Experiments in Molecular Genetics,431-433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77巻,4505(1980)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C., Nature,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science,122巻,501(1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology,8巻,396(1959)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔The Journal of the American Medical Association 199巻,519(1967)〕，１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
【００２９】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３０】
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。
【００３１】
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Nature、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【００３２】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３３】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００３４】
本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、（イ）翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（ロ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明のＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
具体的には、配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド（より好ましくは、配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド）が挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド（核酸）は、本発明のタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸を通常指している。タンパク質遺伝子の５'端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００３５】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３'端あるいは５'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３'端あるいは５'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００３６】
以下に、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある）等の用途を説明する。
【００３７】
本発明のタンパク質は、変形性関節症軟骨で発現が増加し、細胞外へ分泌されるので、疾患マーカーとして利用することが出来る。すなわち、変形性関節症軟骨などにおける早期診断、症状の重症度の判定、疾患進行の予測および治療効果判定のためのマーカーとして有用である。よって、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩、本発明の抗体などは、例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘など）などの骨・関節疾患の予防・治療剤として使用することができる。
【００３８】
（１）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は変形性関節症軟骨で発現が増加し、軟骨細胞の分化調節活性、軟骨細胞への結合活性などを有するので、本発明のタンパク質の活性を調節（促進または阻害、好ましくは阻害）する化合物またはその塩は、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘など）などの骨・関節疾患の予防・治療剤として使用することができる。
したがって、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明は、（１）本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性（例、軟骨細胞の分化調節活性、軟骨細胞への結合活性など）を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供する。具体的には、例えば、
（２）（i）本発明のタンパク質の活性（例、軟骨細胞の分化調節活性、軟骨細胞への結合活性など）と、（ii）本発明のタンパク質と試験化合物の混合物の活性（例、軟骨細胞の分化調節活性、軟骨細胞への結合活性など）を比較することを特徴する本発明のタンパク質の活性を調節（促進または阻害）する化合物またはその塩のスクリーニング方法が用いられる。
軟骨細胞の分化調節活性の測定は、公知の方法に準じて行うことができ、例えば、J Cell Biochem 67, 498-513 (1997)に記載の方法またはそれに準じた方法などに従って測定することができる。
例えば、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞の培養上清または細胞抽出物から、公知方法（例、免疫アフィニティーカラム）に従い、本発明のタンパク質を得る。このタンパク質および試験化合物を培養軟骨細胞に添加し、37℃で7日〜21日間培養する。次に上記文献に挙げられた方法に従い軟骨細胞のプロテオグリカン含量またはアルカリ性ホスファターゼ活性を評価することにより、軟骨細胞の分化調節活性を測定する。試験化合物の培養軟骨細胞への添加は、本発明のタンパク質の添加前、同時またはタンパク質添加後のいずれに行ってもよく、本発明のタンパク質の添加前が好ましい。
軟骨細胞への結合活性の測定は、公知の方法に準じて行うことができる。
例えば、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞の培養上清または細胞抽出物から、公知方法（例、免疫アフィニティーカラム）に従い、本発明のタンパク質を得、例えばD-ビオチノイル-ε-アミノカプロン酸-N-ハイドロキシサクシイミドエステルを用いてビオチン標識する。該標識タンパク質および試験化合物を培養軟骨細胞に添加し、4℃で一時間培養後、細胞をPBSで洗浄する。次に、ストレプトアビジンおよび酵素（例、アルカリ性ホスファターゼ）の複合体を添加し、4℃で一時間培養後、細胞をPBSで洗浄する。最後に該酵素の化学発光基質（例、Disodium 2-chloro-5-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro) tricyclo[3.3.1.1.3,7]decan}-4-yl)-1-phenyl phosphateなど）を添加し、発生する光を測定することにより、本発明のタンパク質の軟骨細胞への結合活性を測定する。試験化合物の培養軟骨細胞への添加は、本発明のタンパク質添加前、同時またはタンパク質添加後のいずれに行ってもよく、本発明のタンパク質添加前が好ましい。本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
例えば、上記（ii）の場合における活性が上記（i）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇させる試験化合物を、本発明のタンパク質の活性を促進する化合物として、上記（ii）の場合における活性が上記（i）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上減少させる試験化合物を本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物として選択することができる。
【００３９】
本発明のタンパク質の活性を促進する活性を有する化合物は、本発明のタンパク質の作用を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のタンパク質の活性を阻害する活性を有する化合物は、本発明のタンパク質の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬、例えば軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘など）などの骨・関節疾患の予防・治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物である。該化合物の塩としては、前記した本発明のペプチドの塩と同様のものが用いられる。
【００４０】
さらに、本発明のタンパク質をコードする遺伝子も、変形性関節症軟骨において発現が増加するので、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節（阻害または促進、好ましくは阻害）する化合物またはその塩も、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘など）などの骨・関節疾患の予防・治療剤として使用することができる。
したがって、本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
スクリーニング方法としては、（iii）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（iv）試験化合物の存在下、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、（iii）と（iv）の場合における、前記遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法、例えば、プローブとして配列番号：２もしくは配列番号：４の塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとして配列番号：２もしくは配列番号：４の塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いるＰＣＲ法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、上記（iv）の場合における遺伝子発現量を、上記（iii）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇させる試験化合物を、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進する化合物として、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する化合物として選択することができる。
【００４１】
さらに、本発明は、本発明のタンパク質の遺伝子の転写調節領域の下流（発現制御下）にレポーター遺伝子を連結した組換えＤＮＡで形質転換した形質転換体を、試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合における、それぞれのレポーター活性を測定し、比較することを特徴とする該転写調節活性を調節（促進または阻害）する化合物のスクリーニング方法、およびこの方法のためのスクリーニング用キットも提供する。
本発明のタンパク質の遺伝子の転写調節領域としては、配列番号：８で表される塩基配列と同一または実質的に同一な塩基配列を含有するＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号：８で表される塩基配列と実質的に同一な塩基配列を含有するＤＮＡとしては、ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：８と実質的に同質の転写調節活性（例、プロモーター活性など）を有するＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
また、転写調節領域（例、配列番号：８で表される塩基配列と実質的に同一な塩基配列を含有するＤＮＡ等）としては、配列番号：８で表される塩基配列と実質的に同一な塩基配列に、さらに５’上流のゲノムＤＮＡ配列が付加された配列なども挙げられる（好ましくはプロモーター領域）。付加する塩基配列の塩基数は、例えば約１０Ｋｂ以下、好ましくは約５Ｋｂ以下、さらに好ましくは約２Ｋｂ以下、最も好ましくは約１Ｋｂ以下の配列数が挙げられる。さらに、配列番号：８で表される塩基配列と実質的に同一な塩基配列に、さらに本発明のタンパク質の遺伝子のイントロンの配列が付加された配列なども挙げられる。
レポーター遺伝子としては、例えば、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、成長因子、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、Green fluorescent protein (GFP)、β−ラクタマーゼなどが用いられる。
レポーター遺伝子産物（例、ｍＲＮＡ、タンパク質）の量を公知の方法を用いて測定することによって、レポーター遺伝子産物の量を増加させる試験化合物を本発明のタンパク質の転写調節活性（好ましくはプロモーター活性）を制御（特に促進）する作用を有する化合物、すなわち本発明のタンパク質の発現を促進する活性を有する化合物として選択できる。逆に、レポーター遺伝子産物の量を減少させる試験化合物を本発明のタンパク質の転写調節活性（好ましくはプロモーター活性）を制御（特に阻害）する作用を有する化合物、すなわち本発明のタンパク質の発現を阻害する活性を有する化合物として選択することができる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物である。
形質転換体の培養は、前記の本発明のタンパク質を含有する形質転換体と同様にして行うことができる。レポーター遺伝子のベクター構築やアッセイ法は公知の技術に従うことができる（例、Molecular Biotechnology 13, 29-43, 1999）。
【００４２】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、または本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明のタンパク質の活性を調節（好ましくは阻害）する化合物またはその塩、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の転写調節活性（好ましくはプロモーター活性）を制御する作用を有する化合物またはその塩は、それぞれ、例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘など）などの骨・関節疾患の予防・治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
【００４３】
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated  castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
【００４４】
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、変形性関節症の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、変形性関節症の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを関節内注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４５】
（２）本発明のタンパク質が関与する各種疾病の予防・治療剤
本発明のタンパク質は、軟骨細胞の分化・増殖に寄与するとともに、変形性関節症発症に重要な役割を果たしている。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合あるいは本発明のタンパク質の発現量が減少している場合には、例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘など）などの骨・関節疾患などの種々の疾患が発症する。
したがって、本発明のタンパク質および本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘など）などの骨・関節疾患の予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、生体内において本発明のタンパク質が減少あるいは欠損しているために、軟骨細胞の分化・増殖が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）該タンパク質をコードするＤＮＡをその患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質を発現させることによって、（ロ）細胞に上記ＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質を発現させた後に、その細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のタンパク質をその患者に投与することなどによって、その患者における本発明のタンパク質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）を上記の予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたはその他の温血動物に投与することができる。本発明のポリペプチド（例、ＤＮＡ）は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のタンパク質を上記の予防・治療剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【００４６】
本発明のタンパク質は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明のタンパク質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、変形性関節症の治療目的で本発明のタンパク質を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク質を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、変形性関節症の治療目的で本発明のタンパク質を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該タンパク質を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４７】
（３）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（i）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab')2 、Fab'、あるいはFab画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００４８】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００４９】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質の濃度の増加または減少が検出された場合、例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘など）などの骨・関節疾患である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
【００５０】
（４）遺伝子診断薬
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Genomics,第5巻,874〜879頁(1989年）、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,第86巻,2766〜2770頁(1989年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過多または減少が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘など）などの骨・関節疾患である可能性が高いと診断することができる。
【００５１】
（５）アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘など）などの骨・関節疾患の予防・治療剤として使用することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下または関節腔内等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、変形性関節症の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムなども、本発明の遺伝子の発現を抑制することができ、生体内における本発明のタンパク質または本発明で用いられるＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘など）などの骨・関節疾患の予防・治療剤などとして使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
【００５２】
（６）本発明の抗体を含有する医薬
本発明のタンパク質の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘など）などの骨・関節疾患の予防・治療剤として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、関節内投与）に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の変形性関節症の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、粉末吸入剤により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、関節内投与）に適する剤形として提供される。好ましくは吸入剤として提供される。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００５３】
（７）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００５４】
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（i）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ii）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリホスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
【００５５】
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【００５６】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００５７】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する予防・治療剤、例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘等）などの骨・関節疾患の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００５８】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質または機能不活性型不応症に対する予防・治療剤、例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘等）などの骨・関節疾患の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
（i）組織培養のための細胞源としての使用、
（ii）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
（iii）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（iv）上記（iii）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（v）本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
【００５９】
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００６０】
（８）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００６１】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００６２】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【００６３】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（1〜10000U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常0.001〜0.5％トリプシン／0.1〜5mM ＥＤＴＡ、好ましくは約0.1％トリプシン／1mM ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, Nature第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
【００６４】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
【００６５】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００６６】
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００６７】
例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘等）などの骨・関節疾患に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の関節や軟骨などを経時的に観察し、上記疾患の症状を観察する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の上記疾患症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の変形性関節症患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の変形性関節症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６８】
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリホスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００６９】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現の調節、該タンパク質の機能を調節することができるので、例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症またはスポーツによる関節障害（例、テニス肘など）などの骨・関節疾患の予防・治療剤として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の変形性関節症患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の変形性関節症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのタンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【００７０】
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ          ：セレノシステイン（selenocysteine）
【００７１】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Cl2-Bzl         ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【００７２】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
実施例２で得られた成熟型chondromedinタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有する成熟型chondromedinタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
実施例２で得られたchondromedin前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
実施例２で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
実施例２で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
実施例２で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
実施例３で用いられた塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
実施例４で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
実施例４で用いられたプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
合成ペプチドTr1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５〕
合成ペプチドTr2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実施例６で用いられたアダプターを構成するオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。5'はリン酸化されている。
〔配列番号：１７〕
実施例６で用いられたアダプターを構成するオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。5'はリン酸化されている。
後述の実施例２で得られた大腸菌（Escherichia coli）DH5α/pTB2300は、2002年11月20日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-8240として寄託されている。
【００７３】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、Molecular cloning, 2nd,J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press,1989年に記載されている方法に従った。
実施例１
変形性関節症軟骨（OA軟骨）で発現亢進している遺伝子群を明らかにするため、OA軟骨（膝関節1例、股関節5例）、正常関節軟骨（膝関節1例、股関節1例）、その他22種類の正常組織（各1例）から抽出されたtotal RNA（表１）を材料とし、oligonucleotide microarray (Human Genome U95A; Affymetrix社) を用いて遺伝子発現解析を行った。
実験方法は、Affymetrix社の実験手引き書 (Expression analysis technical manual) に従った。OA軟骨と正常関節軟骨の遺伝子発現プロファイルを比較した結果、DKFZP586L151（GenBank Accession No. XP_034000）遺伝子の発現量は、解析した全ての組織中、OA軟骨において最大であった(表２)。
【００７４】
【表１】
2004187680.tif 000002
【００７５】
【表２】
2004187680.tif 000003
【００７６】
実施例２
DKFZP586L151（GenBank Accession No. XP_034000）遺伝子配列を基にデータベース検索を行ったところ、マウスオルソログと考えられる遺伝子1110018N05Rik（GenBank Accession No. XM_129545）を見出した。この塩基配列を基に、Ensemblのヒト cDNA（Genscan）データベース（http://www.ensembl.org/homo_sapiens/）を検索して、ヒトDKFZP586L151の翻訳開始コドンを含むと考えられる塩基配列（配列番号：５）を見出した。この配列およびDKFZP586L151遺伝子の塩基配列（GenBank Accession No. XP_034000）に基づき、2種の合成プライマー（配列番号：６および配列番号：７）を設計した。このプライマーペアを用い、ヒト各種組織由来cDNA（クロンテック社）を鋳型としてPCRを行った。耐熱性DNAポリメラーゼにはStratagene社から購入したPfuTurboを用いた。反応溶液の組成はPfuTurboの使用説明書に従った。始めに95℃2分の加熱を行い、次に98℃10秒−65℃30秒−72℃3分30秒からなる増幅過程を35サイクル実行、最後に72℃10分のインキュベーションを行った。胎盤、肺、骨格筋、小腸、精巣、子宮、胎児腎臓および胎児肝臓のcDNAから得られた反応液で、予想される約2.3kbpのPCR産物が認められた。これらを混合し、Strataprep PCR purification kit（Stratagene社）を用いてPCR増幅産物を精製した。得られた約2.3kbのDNA断片をpCR-Script cloning kit（Stratagene社）を用いて大腸菌DH5αにクローン化し、そのプラスミドをpTB2300と命名した。得られた大腸菌（Escherichia coli）DH5α/pTB2300からプラスミドDNAを単離し、pTB2300に挿入された約2.3kb のDNA断片を、蛍光Dye-Terminator法によりその塩基配列を決定した。得られた塩基配列において、配列番号：６および配列番号：７で示した2種のプライマー配列間に、配列番号：５およびDKFZP586L151遺伝子の既知塩基配列（GenBank Accession No. XP_034000）を含有するオープンリーディングフレームが見出された。該オープンリーディングフレームの塩基配列を配列番号：４に示す。配列番号：４で表される塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号：３に示す。
配列番号：３で示されるアミノ酸配列は、DKFZP586L151（GenBank Accession No. XP_034000）のアミノ酸配列のＮ末側に314残基伸長したアミノ酸配列であり、マウス1110018N05Rik（GenBank Accession No. XM_129545）とは82％の相同性を有する。
配列番号：４で示される塩基配列は、DKFZP586L151の塩基配列の5’側に826塩基を伸長した塩基配列であり、マウス1110018N05Rikとは86％の相同性を有する。
分泌シグナル予測プログラムであるSignalP（Protein Engineering 12巻, 3-9 頁、1999年）で配列番号：３で表されるアミノ酸配列を解析したところ、N末端の22残基からなるAKPRLLVLYFALIVVPAWVSSは、分泌シグナルペプチドと予測された。配列番号：３で表されるアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列（配列番号：１）を有するタンパク質を、成熟型chondromedinタンパク質と命名した。配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：２に示す。
【００７７】
実施例３
実施例２で得られたchondromedinのcDNA配列を基に、ENSEMBLヒトゲノムデータベース（http://www.ensembl.org/homo_sapiens/）をBLASTサーチした。その結果、cDNAの5’上流を含むゲノム配列を見出した。この配列を第一エキソンとプロモーター領域予測プログラムであるFirstEF（First Exon Finder、Ramana V. ら Nature Genetics 29, 412--417、2001）で解析し、転写制御領域を含むと考えられるゲノム配列（配列番号：８）を見出した。配列番号：８で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列の5’上流域に存在するchondromedinのプロモーター配列である。
配列番号：８で表される塩基配列を、転写因子の結合サイトデータベースであるTRANSFAC（Wingender, Eら Nucleic Acids Res. 29, 281-283. 2001）に対し、転写因子結合サイト予測ソフトであるMatch version 1.5（Goessling, E.ら、Proceedings of the German Conference on Bioinformatics (GCB '01), GBF Braunschweig E. Wingender, R. Hofestaedt, I. Liebich (eds.), 158-161 (2001)）で解析した結果を表３に示す。なお、TRANSFACおよびMatchはhttp://www.biobase.de/で最新版が公開されている。
【００７８】
【表３】
2004187680.tif 000004
基本転写因子であるTFII-Iおよびこれと協同的に作用するUSFの結合部位が見出された。Initiator element（Inr）を介して作動するタイプのプロモーターと考えられる。また、軟骨の分化に関係するSox9、TGF-β受容体スーパーファミリーのシグナル伝達に関与するSMAD-3やSMAD-4などの転写因子の結合サイトが見出された。chondromedinは軟骨細胞分化においてBMP刺激やSox9の発現上昇により産生促進されることが予想された。配列番号：８で表される塩基配列を含む配列をレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなど）の上流に結合し、各種の細胞株（ATDC5、C3H10T1/2など）に導入することにより、本遺伝子の発現調節薬の探索に用いることができる。
【００７９】
実施例４
以下、1110018N05Rik（GenBank Accession No. XM_129545）をマウスchondromedin遺伝子と略記する。
マウス由来の間葉系幹細胞であるC3H10T1/2細胞をBMP-2またはBMP-4で刺激して、in vitroで軟骨分化を誘導させ（Ahrens M, et al., DNA Cell Biol. 12:871-80., 1993）、この過程におけるマウスchondromedin遺伝子の発現変動を以下のように解析した。
大日本製薬から購入したC3H10T1/2細胞（Cancer Res., 33: 3239-3249, 1973）をBMP-4存在下、3、6および13日間培養した。BMP-4の添加前（Day 0）、添加後3日目（Day 3）、6日目（Day 6）および13日目（Day 13）に、細胞をRLT緩衝液（Qiagen 社）で溶解し、QIAshredder（Qiagen 社）処理した後、-80℃で保存した。このサンプルを解凍し、RNeasy mini kit（Qiagen 社）を用いて細胞由来total RNAを調製した。この際、混在する微量のゲノムDNAを除去するために、カラム上でDnase処理を行うオプションプロトコールに従った。
得られたtotal RNAを鋳型として定量的RT-PCRを行い、マウスchondromedin遺伝子の発現量を調べた。Genbank登録の塩基配列XM_129545を基に、マウスchondromedin  mRNAに対するプライマー（配列番号：９および配列番号：１０）を設計して用いた。試薬には、Quanti-Tect SYBR green RT-PCR kit (Qiagen社)を使用し、7700 sequence detection system (Applied Biosystems社) 上で RT-PCRおよびシグナル検出を行った。始めに50℃、30分のインキュベーションを行い、次いで95℃で15分間の加熱を行った後、94℃-15秒、60℃-60秒の増幅過程を40サイクル行った。
次に、マウスβ-actin遺伝子の発現量を調べた。Genbank登録の塩基配列を基に、マウスβ-actin  mRNAに対するプライマー（配列番号：１１および配列番号：１２）およびTaqManプローブ（配列番号：１３）を設計して用いた。第一段階では、SensiScript reverse transpciptrase（Qiagen社）を用いて、前述のC3H10T1/2細胞のtotal RNAからcDNAを合成した。第二段階ではこのcDNAを鋳型とし、試薬にTaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems社) を使用し、7700 sequence detection system (Applied Biosystems社) 上で PCRおよびシグナル検出を行った。始めに95℃で10分間の加熱を行った後、94℃-15秒、60℃-60秒の増幅過程を40サイクル行った。
Day 0、Day 3、Day 6 およびDay 13のサンプルのそれぞれにつき、マウスchondromedin の定量的PCRで得られた蛍光シグナル値を マウス β-actinについて得られた蛍光シグナル値で標準化した。さらにDay 3、Day 6 およびDay 13におけるマウスchondromedinの標準化発現量をDay 0における標準化発現量で割り込んで相対化した。
結果を図１に示す。
これより、マウスchondromedin遺伝子は、マウスC3H10T1/2細胞の軟骨分化に伴い発現上昇することが示された。
【００８０】
実施例５
ヒトchondromedinの部分ペプチドに対するウサギ抗血清の作製
Antibodies A LABORATORY MANUAL（E. Harlow and D. Lane., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1988）に記載の方法などに従い、2種の合成ペプチドTr1（配列番号：１４）およびTr2（配列番号：１５）をFmoc固相合成法を用いて合成した。これらのペプチドにキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）をキャリアータンパク質として結合させた複合体を抗原として、それぞれ別個にウサギを免疫感作した。
初回感作の直前（Day 0）および35日目（Day 35）に部分採血を行った。得られた血清の抗体価を、抗原ペプチドを固相に用いたELISAで測定した結果を図２（抗Tr1抗血清）および図３（抗Tr2抗血清）に示す。いずれの血清についても抗体価の上昇が確認された。最終的に感作後56日目に全採血を行い、抗Tr1抗血清および抗Tr2抗血清を取得した。
【００８１】
実施例６
COS-7細胞を用いたヒトchondromedinタンパク質の一過性発現
（１）発現ベクターの構築
実施例２で得られたプラスミドpTB2300を制限酵素SpeIで切断し、得られた非平滑末端をPfu Turbo DNA ポリメラーゼ（Stratagene社）を用いて平滑化した後、DNAリガーゼを用いてXbaIリンカー（宝酒造）を挿入した。
得られたプラスミドをEcoRIおよびNcoIで切断し、得られた非粘着末端間に2種アダプター〔5'-pAATTCACCGC-3'（配列番号：１６）および5'-pCATGGCGGTG-3'（配列番号：１７）（5'-pは、5'リン酸化を表す）〕をDNAリガーゼの反応により挿入した。
得られたプラスミドをHindIIIおよびXbaIで消化し、ヒトchondromedin遺伝子のオープンリーディングフレームを含む約2.3 kbp のcDNA断片を切り出した。この断片をpcDNA5/TO（Invitrogen社）の HindIIIおよびXbaI 部位の間に挿入してヒトchondromedin発現プラスミドpcDNA5/ TO-hCdmを得た。
（２）COS-7 細胞へのトランスフェクション
COS-7細胞を培養プレートに播種し、約24時間後に、pcDNA5/TO（Invitrogen社）または上記で得られたpcDNA5/TO-hCdm を、Lipofectamine2000試薬（Invitrogen）を用いてトランスフェクションした。3日後に細胞をPBSで洗浄し、スクレイパーを用いて培養プレートから剥がし取った後、遠心回収し-80℃に保存した。
（３）抗ペプチド抗体によるヒトchondromedinタンパク質の検出
上記保存した細胞を、氷上で解凍した後、Laemliのサンプルバッファー（Laemmli, U. K. (1970) Nature 227,680-685）を添加、95℃で5分加熱して、細胞総タンパク質を可溶化した。このサンプルをSDS-PAGEで展開した後、ニトロセルロースフィルター（バイオ・ラド社）にタンパク質を転写、実施例５で得られた抗Tr1抗血清を一次抗体に、抗ウサギIgG-アルカリ性ホスファターゼ複合体(Invitrogen社）を二次抗体に用いて、ウェスタンブロットを行った。その結果、ヒトchondromedinを導入したCOS-7細胞でのみバンドが検出された。
以上の操作は、Antibodies A LABORATORY MANUAL （E. Harlow and D. Lane., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1988）に記載の方法、用いた試薬や材料に添付のプロトコールに従った。
これより、抗Tr1抗血清またはそれに由来する免疫IgGは、ヒトchondromedinの上昇を伴う疾患、例えば変形性関節症などの診断、予防・治療に用いることが出来ることがわかる。またヒトchondromedin発現ベクターは、ヒトchondromedinタンパク質の生産に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】マウスC3H10T1/2細胞の軟骨分化過程におけるマウスchondromedin 遺伝子の発現変動を示す。図中、縦軸は、調べた各時点におけるマウスchondromedin 遺伝子の発現量をDay0における発現量で相対化した値を、横軸は分化培養開始後の日数を示す。
【図２】Tr1を免疫感作したウサギの血清における抗Tr1抗体価の上昇を示す。図中、縦軸は抗体価を、横軸は一次抗体として用いた抗ペプチド血清の希釈倍率を、〇はDay 0に採取した血清、●はDay 35 に採取した血清をそれぞれ示す。
【図３】Tr2を免疫感作したウサギの血清における抗Tr2抗体価の上昇を示す。図中、縦軸は抗体価を、横軸は一次抗体として用いた抗ペプチド血清の希釈倍率を、〇はDay 0に採取した血清、●はDay 35 に採取した血清をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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