(57)【要約】【課題】ＳＨＰＳ−１を介した細胞応答の機能に作用させることのできるＣＤ４７部分ペプチドと抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体を提供する。【解決手段】ＣＤ４７タンパク質の免疫グロブリン様構造を有する細胞外領域を構成するアミノ酸配列を有し、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質の脱リン酸化基質タンパク質ＳＨＰＳ−１のＮ端免疫グロブリン様構造と特異的に結合するＣＤ４７部分ペプチド。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４７タンパク質の免疫グロブリン様構造を有する細胞外領域を構成するアミノ酸配列を有し、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質の脱リン酸化基質タンパク質ＳＨＰＳ−１のＮ端免疫グロブリン様構造と特異的に結合するＣＤ４７部分ペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号２である請求項１のＣＤ４７部分ペプチド。
【請求項３】
免疫グロブリンＦｃフラグメントを結合した請求項１または２のＣＤ４７部分ペプチド。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列を有する請求項３のＣＤ４７部分ペプチド。
【請求項５】
配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現産物である請求項４のＣＤ４７部分ペプチド。
【請求項６】
配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６のポリヌクレオチドを保有する発現ベクター。
【請求項８】
請求項７の発現ベクターによる形質転換細胞。
【請求項９】
ＳＨ２ドメイン含有タンパク質の脱リン酸化基質タンパク質ＳＨＰＳ−１を特異的に認識し、結合する抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体。
【請求項１０】
請求項９の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【請求項１１】
請求項１から５いずれかのＣＤ４７部分ペプチドと請求項９の抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体の少なくともどちらか一方を有効成分として、薬理成分とともに含有していることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ＣＤ４７部分ペプチドと抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明はＳＨＰＳ−１を介した細胞応答の機能に作用させることのできるＣＤ４７部分ペプチドと抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、細胞の増殖と接着との制御機構には、両者における綿密なクロストークが作用していることが明らかにされてきている。たとえば、外傷等によって皮膚に損傷が生じた場合、皮膚の細胞は傷口を覆うために増殖し始め、細胞同士が接触すると、細胞の増殖は停止する（接触阻止）。また、多くのガン細胞ではこの接触阻止の機構が消失しており、これがガン細胞の無限増殖能や転移能の獲得の原因となっていると考えられている。そのため、細胞の増殖と接着の制御機構の解明は、器官形成等の生命現象を理解する上で重要であり、またガン細胞の転移といった病態を理解する上においても重要である。
【０００３】
また、わが国において、重篤な疾患の原因になることが多い動脈硬化の新たな予防法や治療法の開発は、中・高年者の保健医療において重要な課題となっている。最近、動脈硬化の病巣において、マクロファージを中心とした免疫担当細胞による慢性炎症との関連性が注目されている。したがって、動脈硬化の病態をさらに詳細に理解して、より効果的な治療戦略を研究開発する上で、マクロファージ機能の詳細な制御機構を分子レベルで解明することは大変重要である。
【０００４】
発明者らは、ＳＨ２ドメインを有するチロシンホスファターゼが、増殖因子の刺激によるＲａｓ低分子量Ｇタンパク質の活性化に重要な役割を果たしていることを解明した（非特許文献１）。また、ＳＨＰ−２の脱リン酸化基質タンパク質としてイムノグロブリンスーパーファミリーに属する受容体型のタンパク質ＳＨＰＳ−１（ＳＨ２−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１）（非特許文献２）やドッキングタンパク質Ｇａｂ−１を見出しており、ＳＨＰＳ−１／ＳＨＰ−２系やＧａｂ−１／ＳＨＰ−２系が、細胞外マトリックスへ細胞が接着する際に機能する細胞表面上の受容体分子であるインテグリン系や細胞が互いに接着するのに必要な分子群であるカドヘリン系と相互作用して、Ｒｈｏ低分子量Ｇタンパク質の活性化を介して、細胞運動をも制御することも解明している。
【０００５】
そして、最近、発明者らはＳＨＰＳ−１がその細胞外領域の生理的なリガンドである受容体型の分子ＣＤ４７と相互作用することにより細胞間シグナル伝達系（ＣＤ４７−ＳＨＰＳ−１系）を形成している可能性を示唆する研究結果を得ている（非特許文献３）。また、ＣＤ４７は、血管内皮細胞においても発現しており、従って血管内皮細胞のＣＤ４７がマクロファージ上のＳＨＰＳ−１と相互作用し、マクロファージ機能を負に制御することが考えられる。このＣＤ４７−ＳＨＰＳ−１系の詳細を解明することによって、上記のような「増殖と接着との制御機構」や「マクロファージ機能の制御機構」等の解明に大きく貢献できると考えられ、その結果、たとえばＳＨＰＳ−１を発現しているガン細胞転移の抑制や動脈硬化の予防や治療に貢献することが期待される。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｎｏｇｕｃｈｉ，  Ｔ．，  Ｍａｔｏｚａｋｉ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．：  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １４：  ６６７４−６６８２，  １９９４
【非特許文献２】
Ｆｕｊｉｏｋａ，  Ｙ．，  Ｍａｔｏｚａｋｉ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．：  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １６：  ６８８７−６８９９，  １９９６
【非特許文献３】
Ｙａｍａｏ，  Ｔ．，  Ｎｏｇｕｃｈｉ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．：  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７：  ３９８３３−３９８３９，  ２００２
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＣＤ４７−ＳＨＰＳ−１系が細胞の「増殖と接着との制御機構」や「マクロファージ機能の制御機構」に関与している可能性が示唆され、これらに基づく各疾患の予防や治療に応用することが考えられているとはいえ、ＣＤ４７は、膜貫通型タンパク質であるため、時間的、定量的にリガンドとして作用させるということは困難であり、ＳＨＰＳ−１の機能を制御する有効な方法はなかった。
【０００８】
また、抗ＳＨＰＳ−１抗体の作製においては、その際に免疫源となるＳＨＰＳ−１をコードする塩基配列は本発明者らによってはじめて同定されたもの（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：  ＪＣ５２８７（タンパク質）、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：  Ｅ１５７０３Ａ（核酸）Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２３１：  ６１−６７，  １９９７）であるが、抗体作製までは到らなかった。
【０００９】
そこでこの出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、従来の問題点を解消し、ＳＨＰＳ−１を介した細胞応答の機能に作用させることのできるＣＤ４７部分ペプチドと抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体を提供することを課題としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決する手段として、以下の（１）〜（１１）の発明を提供する。
（１）ＣＤ４７タンパク質の免疫グロブリン様構造を有する細胞外領域を構成するアミノ酸配列を有し、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質の脱リン酸化基質タンパク質ＳＨＰＳ−１のＮ端免疫グロブリン様構造と特異的に結合するＣＤ４７部分ペプチド。
（２）前記アミノ酸配列が、配列番号２である前記発明（１）のＣＤ４７部分ペプチドを提供する。
（３）免疫グロブリンＦｃフラグメントを結合した前記発明（１）または（２）のＣＤ４７部分ペプチドド。
（４）配列番号４のアミノ酸配列を有する前記発明（３）のＣＤ４７部分ペプチドを提供する。
（５）配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現産物である前記発明（４）のＣＤ４７部分ペプチド。
（６）配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（７）前記発明（６）のポリヌクレオチドを保有する発現ベクター。
（８）前記発明（７）の発現ベクターによる形質転換細胞。
（９）ＳＨ２ドメイン含有タンパク質の脱リン酸化基質タンパク質ＳＨＰＳ−１を特異的に認識し、結合する抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体。
（１０）前記発明（９）の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
（１１）前記発明（１）〜（５）いずれかのＣＤ４７部分ペプチドと前記発明（９）の抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体の少なくともどちらか一方を有効成分として、薬理成分とともに含有していることを特徴とする組成物。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。
【００１２】
この出願の発明におけるＣＤ４７タンパク質（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：  ＢＴ００６９７）とは、細胞接着分子であるインテグリンに関連する分子として同定されたため、ＩＡＰ（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ばれ、組織普遍的に発現している５回細胞膜貫通型タンパク質である。図１および図２に例示したとおり、その細胞外領域には１個の免疫グロブリン様構造を保有しており、これがＳＨＰＳ−１のＮ末端側にある免疫グロブリン様構造と結合する。
【００１３】
そして、第１の発明のＣＤ４７部分ペプチドは、ＣＤ４７タンパク質の免疫グロブリン様構造を有する細胞外領域を構成するアミノ酸配列を有し、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質の脱リン酸化基質タンパク質ＳＨＰＳ−１のＮ端免疫グロブリン様構造と特異的に結合するポリペプチドである。第２の発明の配列番号２のアミノ酸配列は、上記のＣＤ４７タンパク質の免疫グロブリン様構造を有する細胞外領域を構成するアミノ酸配列である。このＣＤ４７部分ペプチドは、公知であるＣＤ４７タンパク質（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：  ＢＴ００６９７）の部分配列（第１位−第１４２位アミノ酸）であり、また、ヒト細胞由来のｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、ヒト細胞等から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として公知の方法（たとえば、Ｏｋａｙａｍａ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２；  １６１−１７０，  １９８２等）により合成することができ、市販のｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。
【００１４】
このｃＤＮＡライブラリーから、ＣＤ４７部分ペプチドをクローン化するには、前記のとおりＣＤ４７タンパク質の任意の部分の塩基配列に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用い、公知の方法によってコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行うことによって取得することができる。また、目的とするポリヌクレオチドの両末端にハイブリダイズをするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして、細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法を行うことによって、ＣＤ４７部分ペプチドｃＤＮＡを取得することができる。このｃＤＮＡを適当な制限酵素によってダイジェストすることによって、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（すなわち、配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチド）を調整することができる。
【００１５】
この出願の第３の発明は、ＣＤ４７部分ペプチドと抗体をパパイン等のタンパク質分解酵素で消化させることによって得られる免疫グロブリンＦｃフラグメント（以下、Ｉｇ−Ｆｃとすることがある）とを結合させた融合タンパク質（以下、ＣＤ４７−Ｆｃとすることがある）を提供するものである。第４の発明のＣＤ４７部分ペプチドは、ＣＤ４７部分ペプチドとＩｇ−Ｆｃとの融合タンパク質であるＣＤ４７−Ｆｃをコードするアミノ酸配列である配列番号４のアミノ酸配列を有するものである。第５の発明は、配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現産物である、前記の第４の発明のＣＤ４７部分ペプチドである。また、第６の発明は、この配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供するものである。
【００１６】
なお、この配列番号４のアミノ酸を有するＣＤ４７−Ｆｃを構成しているＣＤ４７部分ペプチドは、第１位−第１４２位のアミノ酸をコードし、Ｉｇ−Ｆｃは、第１４３位−第３７１位のアミノ酸をコードしている。
【００１７】
上記のようにして得られたＣＤ４７−Ｆｃは、可溶性であり、また抗体様で２価の状態であるため、ＳＨＰＳ−１架橋作用が得られ、細胞運動の抑制等の効果を実現するにおいてより好ましい。
【００１８】
さらにまた、二次抗体を添加することによって、ＣＤ４７−Ｆｃあるいは抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体によるＳＨＰＳ−１の集積、架橋効果が増強することによって、ＳＨＰＳ−１の作用を介した抑制効果が増強される。この二次抗体は、一次抗体の抗体種に対するＩｇＧ抗体であり、特に限定されるものではない。たとえば、マウスを免疫して得られた抗体であるならば、抗体がマウスＩｇＧであるため、二次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体を使用する。また、ヒトＦｃフラグメントタンパク質の場合、抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体を用いる。
【００１９】
そして、第７の発明の発現ベクターは、ＣＤ４７部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとＩｇ−Ｆｃをコードするポリヌクレオチドそれぞれを適当な制限酵素で処理およびライゲーションによって連結をし、得られたフラグメント（すなわち、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド）を導入したものである。この発現ベクターを利用して、ＣＤ４７−Ｆｃを発現させてもよい。なお、使用できる発現ベクターとしては、ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２等が例示できる。
【００２０】
もちろん、この出願の発明は、ＣＤ４７部分ペプチドのみの構成（１価）として利用することもでき、また上記Ｉｇ−Ｆｃフラグメントを、他のペプチド（たとえば、Ｈｉｓ−ｔａｇ（ヒスチジン−ｔａｇ）やＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）等）を任意に採択して融合タンパク質としてもよい。
【００２１】
このＣＤ４７−Ｆｃは、第８の発明の形質転換細胞は、上記のとおりの配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを任意の培養細胞に形質転換させたものである。この培養細胞は、ＣＤ４７−Ｆｃを安定発現する形質転換細胞であって、発現ベクターが保有している薬剤耐性遺伝子に合わせた各種薬剤（たとえば、Ｇ４１８等）を含有する細胞培養培地で、選択培養をすることによって樹立されたものである。この形質転換細胞株の細胞上清を回収・精製することによってＣＤ４７−Ｆｃを得ることができる。なお、培養細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞等をはじめとする種々のものが使用でき、特に限定されるものではない。
【００２２】
細胞の回収方法としては、一般的には細胞を培養容器から培地とともに回収し、この細胞を含有した培地を低速遠心で処理をして、沈殿した細胞を適当な緩衝液で懸濁する。緩衝液は、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液等が例示でき、細胞の種類や実験目的に応じて適宜に採択することができる。この細胞懸濁液は、必要に応じてＤＭＳＯや市販の保存液キット（たとえば、ＣｅｌｌｖａｔｉｏｎＴＭ；  Ｃｅｌｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）等のような細胞保存液と混合することによって、液体窒素や−８０℃以下のフリーザーにて長期保存することができる。
【００２３】
また、ＣＤ４７−Ｆｃ等の目的とする発現されたタンパク質の精製方法としては、細胞上清をたとえば、アフィニティーカラム、ゲルろ過法等が採択して精製することができる。特に、この出願の発明のＣＤ４７−Ｆｃの場合、Ｆｃフラグメントとの融合タンパク質としているため、Ｆｃフラグメントと高い結合能を有するＰｒｏｔｅｉｎ−Ａアガロースを使用したアフィニティーカラムを利用することが好ましい。
【００２４】
なお、ＣＤ４７−Ｆｃを構成するＣＤ４７部分ペプチドやＩｇ−Ｆｃの由来は、哺乳類であることが好ましい。たとえば、ヒツジ、ヤギ、ラットやマウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒト等が挙げることができ、特にヒトのガン細胞転移の抑制や動脈硬化の予防・治療等という目的から、ヒトであることがより好ましい。
【００２５】
ＣＤ４７−Ｆｃは、ＳＨＰＳ−１のリガンドの一種としてＳＨＰＳ−１と結合させることができ、この際のＣＤ４７−Ｆｃの使用量や使用時期等を調節することによって、ＳＨＰＳ−１の機能を制御することが実現することができる。このＳＨＰＳ−１は、ＳＨ２ドメインを有しているチロシンホスファターゼＳＨＰ−２の脱リン酸化基質タンパク質として、受容体型のタンパク質であり、細胞外領域に３個の免疫グロブリン様構造を有し、さらにリン酸化を受ける複数のチロシン残基を細胞内領域に保有するタンパク質である。
【００２６】
そして、前記のとおりＣＤ４７−Ｆｃは、ＳＨＰＳ−１のＮ末端側の免疫グロブリン様構造とＣＤ４７細胞外領域の１個の免疫グロブリン様構造とが結合することによって、ＳＨＰＳ−１と相互作用を形成（すなわち、ＣＤ４７−ＳＨＰＳ−１系）していると考えられている。このＣＤ４７−ＳＨＰＳ−１系が、普遍的な細胞運動の負の制御に関与しており、図３に例示したようにＣＤ４７−ＳＨＰＳ−１系はＣＤ４７分子やＳＨＰＳ−１分子をそれぞれ発現する細胞同士の接触により双方向に細胞運動を抑制することが考えられ、ＣＤ４７−ＳＨＰＳ−１系が接触阻止の分子機構に大きく関与していると考えられる。
【００２７】
この出願の第９の発明の抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体とは、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質の脱リン酸化基質タンパク質ＳＨＰＳ−１を特異的に認識し、結合する抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体である。そのため、ＣＤ４７−Ｆｃと同様に、抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体の使用量や使用時期等を調節することによって、ＳＨＰＳ−１の機能を制御することができる。
【００２８】
なお、抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体において、その標的対象となるＳＨＰＳ−１は哺乳類であることが好ましい。たとえば、ヒツジ、ヤギ、ラットやマウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒト等が挙げることができ、特にヒトのガン細胞転移の抑制や動脈硬化の予防・治療等という目的から、ＣＤ４７部分ペプチドと同様にヒトであることがより好ましい。
【００２９】
前記第９の発明の抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体は、定法に従い第１０の発明であるハイブリドーマ細胞株から作製することができる。まず、ペプチドであるＳＨＰＳ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：  ＪＣ５２８７（タンパク質）、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：  Ｅ１５７０３Ａ（核酸）、Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２３１：  ６１−６７，  １９９７等）をＦｃ特異的抗体を用いて免疫沈降法で精製することによってこのＳＨＰＳ−１を取得することができる。また、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）との融合タンパク質として大腸菌や酵母等で産生させることや免疫グロブリンＦｃとの融合タンパク質として産生させてもよい。得られたこのＳＨＰＳ−１を免疫源として被免疫動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ等）に任意の担体（たとえば、ウシ血清アルブミン（ＦＣＳ））とともに投与して、免疫させ、必要に応じて一定期間の後に適宜に追加免疫して、この被免疫動物を充分に感化させる。次に、公知の方法（たとえばポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で細胞融合する方法、電気的刺激による細胞融合する方法等）に従い、被免疫動物から、脾臓やリンパ節から調整したリンパ球等の抗体産生細胞をミエローマ細胞と細胞融合させ、抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体産生のハイブリドーマ細胞株を作製し、その細胞上清を精製することによって取得することができる。（「単クローン抗体」、岩崎辰夫、安東民衛、他著、講談社、１９８７年；Ｓｅｉｆｆｅｒｔ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ  ９４；  ３６３３−３６４３，  １９９９、Ｓｅｉｆｆｅｒｔ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ  ９７；  ２７４１−２７４９，  ２００１等）。上記のミエローマ細胞は、特に制限されるものではなく、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮すると、その選択方法が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｏｒｉｂｏｓｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましく、マウス由来のＸ６３−ＡＧ８（Ｘ６３）、ＮＳ−１Ａｇ４／１（ＮＳ−１）、Ｐ３Ｘ６３−ＡＧ８．ＵＩ（Ｐ３ＵＩ）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０−ＡＧ１４（ＳＰ２／０）、Ｆｏ等が例示できる。
【００３０】
融合細胞と非融合細胞の選択は、たとえば公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法によってできる。この方法は、上記のアミノプテリン存在下で生存することができないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いて融合細胞を作製する場合に有効な方法である。これは、融合細胞および非融合細胞をＨＡＴ培地で培養することによって、アミノプテリンに対する耐性を有する融合細胞のみを選択培養することができる。
【００３１】
目的とするモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、たとえばＥＩＡ（酵素免疫検定法）、ＲＩＡ（放射線免疫測定法）、蛍光抗体法等公知の方法によって行うことができる。
【００３２】
以上のようにして得られたハイブリドーマ細胞株は、ＣＤ４７−Ｆｃ産生細胞株と同様に必要に応じて、ＤＭＳＯや市販の保存液キット（たとえば、ＣｅｌｌｖａｔｉｏｎＴＭ；  Ｃｅｌｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）等のような細胞保存液と混合することによって、液体窒素や−８０℃以下のフリーザーにて長期保存することができる。
【００３３】
さらにまたこの出願の発明は、第１１の発明として、ＣＤ４７部分ペプチドと抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体の少なくともどちらか一方を有効成分として薬理成分とともに含有している組成物として提供されるものである。この組成物は、ガン細胞の転移抑制や動脈硬化の予防・治療等に応用することができる。もちろん、ＣＤ４７部分ペプチドと抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体の２種類を混合させて、薬理成分とともに含有させた組成物としてもよい。
【００３４】
「薬理成分」とは、第１に通常の薬剤製造に用いられる各種の担体を意味する。「担体」は、対象疾患の種類や薬剤の投与形態に応じて広い範囲から適宜選択することができるが、この発明の組成物は、経口的にまたは注射により投与しうる単位服用形態にあることが望ましい。特に、注射による投与の場合には、局所注入、腹腔内投与、選択的静脈内注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注入等を採用することができる。
【００３５】
懸濁剤およびシロップ剤等のような経口液体調整物は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクト−ス等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ごま油、大豆油等の油類、アルキルパラヒドロキシベンゾエート等の防腐剤、ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造することができる。
【００３６】
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクト−ス、グルコース、シュークロース、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギニン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の表面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製剤化することができる。錠剤およびカプセル剤は、投与が容易であるという点において、この発明の組成物における好ましい単位投与形態である。錠剤やカプセル剤を製造する際には、固体の製造担体が用いられる。
【００３７】
また、注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物、各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。また粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調整するようにしてもよい。
【００３８】
薬学的成分の第２は、ＣＤ４７タンパク質および／または抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体を細胞内に導入可能な形態とするための成分である。たとえば、このポリペプチドの構造や機能を変更することなく、かつ薬理学的に許容される溶液にこのポリペプチドを混合して組成物とすることができる。このような組成物は、たとえばマイクロインジェクション法によって細胞内に導入する方法や、脂質を用いた細胞内導入法等によって標的細胞に導入することができる。
【００３９】
以下に実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細、かつ、具体的に説明する。もちろん、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００４０】
【実施例】
（実施例１）細胞運動の抑制効果における検証
１．  各抗体の作製
（ｉ）  抗ＣＤ４７モノクロナール抗体
本実施例で用いる抗ＣＤ４７モノクロナール抗体は、抗ヒトＣＤ４７モノクロナール抗体（ＣＣ２Ｃ６）として作製し、これを利用した。
【００４１】
作製方法は、公知の方法（「単クローン抗体」、岩崎辰夫、安東民衛、他著、講談社、１９８７年；Ｓｅｉｆｆｅｒｔ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ  ９４；  ３６３３−３６４３，  １９９９、Ｓｅｉｆｆｅｒｔ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ  ９７；  ２７４１−２７４９，  ２００１等）で作製・精製した。
【００４２】
具体的には、ＣＤ４７タンパク質を免疫原としてマウスに担体としてウシ血清アルブミン（ＦＣＳ））とともに投与して、免疫させ、必要に応じて一定期間の後に適宜に追加免疫して、マウスを充分に感化させる。このマウスから、脾臓、リンパ節から調整したリンパ球等の抗体産生細胞を公知の方法に従いマウスミエローマ細胞であるＰ３Ｕと細胞融合させ、ＣＤ４７抗体産生ハイブリドーマ細胞株を作製し、その細胞上清を精製することによって得た。
（ｉｉ）  抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体
抗ヒトＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体（ＳＥ１２Ｃ３）は、免疫原としてペプチドであるＳＨＰＳ−１を用いた点以外は、上記（ｉ）と同様の方法で、作製・精製した。
【００４３】
このＳＨＰＳ−１は、Ｆｃ特異的抗体を用いて免疫沈降法で精製することによって取得した。
２．メラノーマ細胞におけるＳＨＰＳ−１およびＣＤ４７の発現確認
メラノーマ細胞としてヒト悪性黒色腫瘍細胞ＷＭ２３９ａ（Ｍ．  Ｈｅｒｌｙｎ  （Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）より提供を受けた）を用いて、ＣＤ４７およびＳＨＰＳ−１の発現を免疫蛍光標識分析法にて確認した。
【００４４】
結果は、図４に示したとおり、ＳＨＰＳ−１およびＣＤ４７いずれにおいても発現していることが確認された。（Ａ）は抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体（ＳＥ１２Ｃ３）を、（Ｂ）は抗ＣＤ４７モノクロナール抗体（ＣＣ２Ｃ６）をそれぞれＷＭ２３９ａとインキュベートした。そして、インキュベート後にＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧポリクロナール抗体の利用とフローサイトメトリーによって検出した（太線）。また、抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体、または抗ＣＤ４７モノクロナール抗体それぞれをノーマルなマウスＩｇＧと置き換えることによって、ネガティブコントロールとした（細線）。
３．ＣＤ４７−Ｆｃの作製
ヒトＣＤ４７のｃＤＮＡは、Ｆ．Ｐ．  Ｌｉｎｄｂｅｒｇ氏（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）からの提供で取得した。
【００４５】
まず、ヒトＩｇＧ１のＦｃタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて公知の方法（Ｌｉｕ，  Ｙ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９０；  ８９５７−８９６１，  １９９３）に従い取得した。このＰＣＲ産物をＳｐｅＩおよびＮｏｔＩとでダイジェストし、このＳｐｅＩおよびＮｏｔＩと相同する部位にｐＥＦｎｅｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ライゲーションし、ｐＥＦｎｅｏＦｃ７６として作製した。
【００４６】
次にヒトＣＤ４７部分ペプチド（１−１４２アミノ酸）をコードするｃＤＮＡは、全長ヒトＣＤ４７タンパク質のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で取得した。その際のセンスプライマーとして、５’−ＴＡＡＴＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＣＧ−３’を、アンチセンスプライマーとしては５’−ＴＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣ−３’を用いた。そして、得られたＰＣＲ産物をＸｂａＩおよびＳｐｅＩでダイジェストし、ｐＥＦｎｅｏＦｃ７６のＳｐｅＩサイトに導入した。得られたこのベクターをＰｓｔＩおよびＮｏｔＩでダイジェストし、これによって得られる断片をｐＴｒａｃｅｒＣＭＶのＰｓｔＩおよびＮｏｔＩサイトと相同する箇所に導入し、プラスミドｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ−ｈＣＤ４７−Ｆｃとした。ＣＨＯ−Ｒａｓ細胞にｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ−ｈＣＤ４７−Ｆｃをトランスフェクトし、Ｚｅｏｃｉｎを用いて定法に従い選択培養を行った。ＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質を発現・分泌する細胞株の判別には、細胞の上清に抗ヒトＩｇＧポリクロナール抗体を用いてイムノブロッティング法によって行った。ＣＤ４７−Ｆｃの精製には、その上清をｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を備えたカラムクロマトグラフィーによって精製した。
４．抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体とＣＤ４７−ＦｃのＷＭ２３９ａに対する作用
細胞運動の測定によって、悪性黒色腫細胞ＷＭ２３９ａに対する作用を検討した。細胞運動の測定には、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  （Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いて、公知の方法で測定した（Ｌｏｎｇｏ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ９８；３７１７−３７２６，  ２００１）。
【００４７】
図５に示したとおり、抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体とＣＤ４７−Ｆｃいずれにおいても、悪性黒色腫細胞ＷＭ２３９ａに対して、細胞運動の抑制効果が確認された。すなわち、ＣＤ４７と結合するＳＨＰＳ−１リガンド（すなわち、抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体とＣＤ４７−Ｆｃ）は、細胞運動を抑制することができ、ガン細胞の転移を抑制することが期待できる。
５．二次抗体の添加による効果
上記４の細胞運動の抑制効果は、二次抗体を添加することによって、図６に示したとおり、細胞運動の抑制が増強されることが確認された。
【００４８】
このことは、融合タンパク質であるＣＤ４７−Ｆｃ、あるいは抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体によるＳＨＰＳ−１の集積、架橋効果が増強し、その結果ＳＨＰＳ−１の作用を介した抑制効果が増強するものと考えられる。
【００４９】
なお、本実施例において二次抗体として、抗マウスＩｇＧを用いた。
６．抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体のＣＨＯ−Ｒａｓ細胞に対する作用
細胞運動の測定によって、Ｈ−Ｒａｓを安定発現しているＣＨＯ−Ｒａｓ細胞（Ｓ．  Ｓｈｉｒａｈａｔａ（Ｋｙｕｓｈｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｆｕｋｕｏｋａ，  Ｊａｐａｎ）より提供を受けた）に対する作用を検討した。細胞運動の測定には、上記４と同様にＴｒａｎｓｗｅｌｌ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  （Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いて、公知の方法で測定した（Ｌｏｎｇｏ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ９８；３７１７−３７２６，  ２００１）。
【００５０】
本実施例では、抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体として抗ヒトＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体（ＳＥ１２Ｃ３）と抗ラットＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体（２Ｆ３４）の２種類を用いて検討した。
【００５１】
図７に示したとおり抗ヒトＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体（ＳＥ１２Ｃ３）と抗ラットＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体（２Ｆ３４）のずれにおいても、ＣＨＯ−Ｒａｓ細胞に対して、細胞運動の抑制効果が確認された。特に、ヒトＳＨＰＳ−１発現細胞に対しては抗ヒトＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体がより効果的に作用し、一方ラットＳＨＰＳ−１発現細胞に対しては、抗ラットＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体が効果的に作用していることが確認された。なお、ノーマルなマウスＩｇＧをコントロールとして用いた。
７．ＣＨＯ−ＩＲ細胞を用いたＳＨＰ−２結合モチーフの必要性の検討
ヒトインシュリン受容体を安定発現しているＣＨＯ−ＩＲ細胞は、ラットＳＨＰＳ−１正常型を保有するＣＨＯ−ＩＲ−ＳＨＰＳ−１−ＷＴ細胞と４つすべてのチロシン残基をフェニルアラニン残基に置換したラットＳＨＰＳ−１変異型を保有するＣＨＯ−ＩＲ−ｒＳＨＰＳ−１−４Ｆ細胞を用いた。また、抗体は、抗ラットＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体（２Ｆ３４）、抗ラットＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体（９Ｆ１０）の２種類を用いた。
【００５２】
結果は、図８に示したとおり、ＣＨＯ−ＩＲ−ｒＳＨＰＳ−１−４Ｆ細胞においてコントロール、抗ラットＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体（２Ｆ３４）、抗ラットＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体（９Ｆ１０）いずれにおいても差異は認められなかった。一方、ＣＨＯ−ＩＲ−ＳＨＰＳ−１−ＷＴ細胞においては、コントロールには効果が認められなかったが、抗ラットＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体（２Ｆ３４）、抗ラットＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体（９Ｆ１０）においては抑制効果が確認された。すなわち、抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体による細胞運動の抑制には、ＳＨＰＳ−１のＳＨＰ−２結合モチーフが必要であることが理解することができる。
（実施例２）  マクロファージ機能における検証
１．ＳＨＰＳ−１遺伝子欠失マウスの末梢血血小板数の変化
ＳＨＰＳ−１の細胞内領域を欠失する遺伝子欠失マウス（以下、ＳＨＰＳ−１  ＫＯマウスとすることがある）を公知の方法（たとえば、野村達次  監修、勝木元也  編、発生工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィック、１９８７年、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  ＭＲ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：  １２８８−１２９２，  １９８９等）に従い作製した。
【００５３】
このＳＨＰＳ−１  ＫＯマウスの末梢血を各血球成分特異的抗体を用いたフローサイトメトリー解析したところ、血小板数が野生型と比べ、〜７０％程度減少していた（表１）。
【００５４】
【表１】
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この血小板数の変化は、生後４週から確認され、少なくとも１３週まで継続したことを確認した。
２．血小板数の減少の原因検証
血小板数の減少の原因検証は、ＳＨＰＳ−１  ＫＯマウスより取得した巨核球の増殖能、分化能をｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養検討および抗ガン剤５ＦＵの投与後の血小板数の回復をフローサイトメーターによって行った。
【００５５】
具体的には、大腿骨における巨核球コロニー形成能は、その増殖刺激因子であるＭＧＤＦを投与し反応を検討したが、野生型とＳＨＰＳ−１  ＫＯマウスの間には差異は認められなかった。
【００５６】
一方、血小板の寿命において、抗ガン剤である５−ＦＵ投与による骨髄抑制後の血小板数の回復過程を解析した。その結果、図９（Ａ）に示したとおり、投与１５日後における血小板数は、野生型では１８２±１３．７×１０４／μｌに対して、ＳＨＰＳ−１  ＫＯマウスでは１１７±４１．２×１０４／μｌであり、差が認められた。また図９（Ｂ）では、ビオチン標識した血小板の生体内での半減期を測定したところ、野生型に対してＳＨＰＳ−１  ＫＯマウスが有意に半減期の短縮が確認された。このことは、５ＦＵによる回復障害は認められたが、ビオチン化した血小板の消失速度が亢進した結果が確認されたため、産生過程における障害ではなく、消耗過程における亢進によるものであることを意味することが確認された。
３．ＳＨＰＳ−１  ＫＯマウスにおける血小板数の減少に関与する機序の検証
ＳＨＰＳ−１  ＫＯマウスより腹腔内のマクロファージをチオグリコート腹腔内注入により単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける貪食能を解析した。そして、このマクロファージを用いてマウス赤血球の貪食能を検討したところ、図１０（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）にそれぞれ示したとおり、ＳＨＰＳ−１  ＫＯマウス由来のマクロファージの方が野生型マウス由来のマクロファージと比べて、有意に血小板に対する貪食能の増強が見られた。このことから、血小板数の低下、また血小板の寿命の短縮は、マクロファージの貪食能に起因することが理解できる。すなわち、血小板上のＣＤ４７がマクロファージ上のＳＨＰＳ−１と結合することによって、マクロファージによる血小板の貪食過程を負に制御する。すなわち、ＳＨＰＳ−１のリガンドとなる抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体やＣＤ４７−Ｆｃを作用させることによって、マクロファージの血液凝固等に関与する血小板に対する貪食能が向上し、動脈硬化の治療等にも応用することが可能となる。
【００５７】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、ＳＨＰＳ−１を介した細胞応答の機能に作用させることによって、ガン細胞の転移抑制や動脈硬化の改善等に貢献することのできるＣＤ４７部分ペプチドと抗ＳＨＰＳ−１モノクロナールが提供される。
【００５８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】メラノーマ細胞に発現しているＳＨＰＳ−１にＣＤ４７タンパク質および／または抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体を添加する様子を例示した模式図である。
【図２】細胞膜上に存在する５回膜貫通型ＣＤ４７の細胞外領域をＩｇ−Ｆｃと融合させ、作製したＣＤ４７−Ｆｃを例示した模式図である。
【図３】ＣＤ４７−Ｆｃを添加し、ＣＤ４７−ＳＨＰＳ−１系における細胞運動抑制機構を例示した模式図である。
【図４】メラノーマ細胞（ＷＭ２３９ａ）におけるＳＨＰＳ−１およびＣＤ４７の発現の確認を示した図である。（Ａ）がＳＨＰＳ−１の発現の確認結果を、（Ｂ）がＣＤ４７の発現の確認結果を示している。
【図５】ＣＤ４７−Ｆｃ、抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体による細胞運動に対する抑制効果を示した図である。
【図６】抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体に二次抗体をさらに添加した場合における細胞運動に対する抑制効果を示した図である。
【図７】ＳＨＰＳ−１発現するＣＨＯ−Ｒａｓ細胞における細胞運動の抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体による抑制効果を示した図である。
【図８】ＳＨＰＳ−１発現するＣＨＯ−ＩＲ細胞およびＳＨＰＳ−１発現しない変異型ＣＨＯ−Ｒａｓ細胞それぞれに対する抗ＳＨＰＳ−１モノクロナール抗体の抑制効果を示した図である。
【図９】野生型マウスおよびＳＨＰＳ−１欠失型マウスにおける血小板寿命を示した図である。（Ａ）は抗ガン剤投予後の日数を、（Ｂ）はビオチン標識してその半減期をそれぞれ示している
【図１０】マクロファージの貪食能の亢進を示した図であり、（Ａ）は野生型由来のマクロファージを、（Ｂ）はＳＨＰＳ−１欠失型由来のマクロファージを、（Ｃ）は野生型とＳＨＰＳ−１欠失型とを比較したグラフ図をそれぞれ示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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