(57)【要約】      （修正有）【課題】高品質及び高機能性をもつキトサンを含有する水溶性天然フィルム及びその製造方法を提供する。【解決手段】水溶性天然フィルムは、キチン／キトサンをリゾチームで分解処理した後、塩溶液中で超音波処理し、次いでイオン交換処理して製造した水溶性β−グルコサミン繊維素を、免疫タンパク質のγ−グロブリンでナノコーティングして製造した、免疫性の強化された水溶性キトサン２０〜９９．９８重量％；天草、くらげ、わかめ、こんぶ及びこれらの抽出液の中から選ばれる一種またはニ種以上の海藻類０．０１〜７５重量％；及びγ−グロブリン、コール酸、アスタキサンチン、ルチン、レシチン、オオグルマ、セルロース及びコラーゲンの中から選ばれる一種またはニ種以上の機能性成分０．０１〜３０重量％からなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチン／キトサンをリゾチームで分解処理した後、塩溶液中で超音波処理し、次いでイオン交換処理して製造した水溶性β−グルコサミン繊維素を、免疫タンパク質のγ−グロブリンでナノコーティングして製造した、免疫性の強化された水溶性キトサン２０〜９９．９８重量％；
天草、くらげ、わかめ、こんぶ及びこれらの抽出液の中から選ばれる一種または二種以上の海藻類０．０１〜７５重量％；及び
γ−グロブリン、コール酸、アスタキサンチン、ルチン、レシチン、オオグルマ、セルロース及びコラーゲンの中から選ばれる一種または二種以上の機能性成分０．０１〜３０重量％；
からなることを特徴とするキトサン含有水溶性天然フィルム組成物。
【請求項２】
キトサンの分子量が１００００〜１００００００Ｄａである請求項１記載の組成物。
【請求項３】
キトサン含有水溶性天然フィルムを製造する方法であり、
１）キチン／キトサンをリゾチームで分解処理した後、塩溶液中で超音波処理し、次いでイオン交換処理して製造した水溶性β−グルコサミン繊維素を、免疫タンパク質のγ−グロブリンでナノコーティングして免疫性の強化された水溶性キトサンを製造する工程；
２）前記免疫性の強化された水溶性キトサン２０〜９９．９８重量％；天草、くらげ、わかめ、こんぶ及びこれらの抽出液の中から選ばれる一種または二種以上の海藻類０．０１〜７５重量％；及びγ−グロブリン、コール酸、アスタキサンチン、ルチン、レシチン、オオグルマ、セルロース及びコラーゲンの中から選ばれた一種または二種以上の機能性成分０．０１〜３０重量％；からなる構成成分を蒸留水に溶解して０．００１〜７０％濃度のゲルを製造する工程；
３）前記工程２で製造したゲルを粘度１０〜１５０ｃｐｓとなるまで熟成する工程；
４）前記工程３で熟成したゲルをエタノール９５〜９９．９重量％及びグルタルアルデヒド０．１〜５重量％からなる溶液で硬化させる工程；及び
５）前記工程４で硬化したゲルを圧縮成形するか、または生分解性フィルム或いは汎用フィルムの片面または両面にスプレー処理して乾燥させる工程；
からなることを特徴とするキトサン含有水溶性天然フィルムを製造する方法。
【請求項４】
前記請求項１記載のキトサン含有水溶性天然フィルム組成物をフィルムとして成形加工したことを特徴とするキトサン含有口腔清浄剤用水溶性天然フィルム。
【請求項５】
前記請求項１記載のキトサン含有水溶性天然フィルム組成物が生分解性フィルム或いは汎用フィルムの片面または両面に塗布されていることを特徴とする抗菌性包装材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性天然フィルムとその製造方法に関するものであり、さらに詳しくは、キチン／キトサンをリゾチームで分解処理しエタノール洗浄した後、塩（ＮａＣｌ）溶液中で電気調整と超音波分解処理及びイオン交換処理工程を経て水溶性β−グルコサミン繊維素を製造した後、免疫タンパク質（γ−グロブリン）をナノサイズ表面結合させた水溶性キトサンを主原料物質とし、これに海藻類及び機能性成分を含む組成物を蒸留水に溶解し、ゲル化させて製造したキトサン含有水溶性天然フィルムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）は、自然界に存在するアミノ多糖類の一種で、蟹、エビの殻とイカの骨、カビ、キノコ類及び細菌などの微生物の細胞壁に含有されているキチンを脱アセチル化して得られる天然物質であり、毒性がなく、生分解が可能であり、生体親和性を有し、細胞の結合及び生体組織培養、抗菌性、止血作用、生体適合性などの生体学的特徴及びコレステロール低下作用、腸内代謝作用、免疫増強による抗癌作用、肝機能改善及び血糖低下作用、重金属解毒作用などの生理作用をするものとして知られている。
【０００３】
キチンは、分子内にアセチルアミノ基を有していて分子間水素結合が非常に固く、化学薬品に対しての耐性が強くて、水と有機溶媒にも溶けないため、繊維、フィルムなどの形態に成形することが難しく、その活用に大きな障害となっている。従って、前述の性質を有するキチンを脱アセチル化して弱酸性液状で水溶性になるキトサンに転換する方法によって得たキトサンは、既存のキトサンよりも優れた物理的特性を有する水溶性キトサンとして産業上利用できる。
【０００４】
キチン及びキトサンは、初期には食品工場の廃水内の有効物質を回収する凝集剤として使用されたが、近年、食品分野、医療医学分野、機能性膜、生物工学分野、化粧品分野、農業分野、化工分野、環境分野などの広範囲の産業分野において幅広く開発され且つ使用されている。一方、世界的に高品質、高機能性の生体臨床医学用キチン、キトサンはその応用範囲が拡大される趨勢にあるにもかかわらず、従来のキチン、キトサンの製造方法は前記要求に十分に対応できないのが実情である。
【０００５】
キチンまたはキトサンを原料物質として使用し、フィルムや繊維などの様々な形態に製造する技術として知られている周知の技術には次のようなものがある。
【０００６】
特許文献１は、キチンからキトサンを製造することができ、該キトサンは酢酸のような有機酸水溶液に溶解されて繊維、フィルムなどに成形することのできる溶液として調製し得ることを開示している。また、特許文献２は、キチンを塩化リチウムを含有するジメチルアセトアミドなどの極性有機溶媒に溶解させてキチン繊維を製造する方法及び酢酸水溶液に溶解させたキトサン溶液から得られるキトサン単繊維について記載している。
【特許文献１】米国特許第３，５３３，９４０号明細書
【特許文献２】米国特許第４，６９９，１３５号明細書
【０００７】
また、特許文献３は、同一システムで短時間内に高収率の獲得が可能な、アシル化度３５〜６５％の高分子量の水溶性アシル化されたキトサンの製造方法を開示しており、そして特許文献４は、キトサンを有機酸水溶液に溶解させたキトサン溶液を使用して不溶性キチン成分のフィルム及び繊維を製造する方法を提示している。
【特許文献３】米国特許第４，９９６，３０７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９００，４７９号明細書
【０００８】
しかしながら、前記のような方法により製造されたフィルム及び繊維は、最終的に製造された製品がすべて有機酸を含む溶液かまたは有機溶媒に溶解されたまま使用されてきた。従って、製造されたフィルムなどは水や水分によって溶解される水溶性をもたないために、その活用度の側面から様々な制限があるという問題点があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は高品質及び高機能性をもつキトサンを含有する水溶性天然フィルム及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の発明者らは、前記のように水溶性をもたないという従来の問題点を解決するために鋭意研究した結果、キチン／キトサンのリゾチームでの分解処理、エタノール洗浄、塩（ＮａＣｌ）溶液中での電気調整と超音波分解処理及びイオン交換処理工程によって、水溶性β−グルコサミン繊維素を製造した後、免疫タンパク質（γ−グロブリン）をナノサイズ表面結合させることにより、従来技術のキトサンの概念とは明確に区別され得る機能特性を付与されたキトサンを作り、該キトサンを主原料として使用し、これに海藻類及び機能性成分を含有させることによって、フィルムマトリックスに弾性が付与されたフィルムの成形を容易にし、そしてその主要構成成分が全て天然成分であるために人体に対しての適合性と摂取時の食感を顕著に改善することができた。
【００１１】
また、前記キトサンを含む原料を水に溶解させて一定時間熟成し粘度を付与したフィルム形成材料を製造した後、圧縮成形するか、または疎水性或いは生分解性を有する通常のフィルム表面上にスプレーして、エタノール９５〜９９．９９重量％とグルタルアルデヒド０．０１〜５重量％の混合結晶化溶液中で固形化させる方法を使用する場合、前記のような従来技術での問題点を解決することができるということを明らかにし、本発明を完成した。
【００１２】
本発明は、キチン／キトサンをリゾチームで分解処理した後、塩溶液中で超音波処理し、イオン交換処理して製造した水溶性β−グルコサミン繊維素を、免疫タンパク質のγ−グロブリンでナノコーティングして製造した、免疫性の強化された水溶性キトサン２０〜９９．９８重量％；天草、くらげ、わかめ、こんぶ及びこれらの抽出液の中から選ばれる一種または二種以上の海藻類０．０１〜７５重量％；及びγ−グロブリン、コール酸、アスタキサンチン、ルチン、レシチン、オオグルマ（Ｉｎｕｌａ  ｈｅｌｅｎｉｕｍ  Ｌ）、セルロース及びコラーゲンの中から選ばれる一種または二種以上の機能性成分０．０１〜３０重量％；からなるキトサン含有水溶性天然フィルム組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、キトサン含有水溶性天然フィルムを製造する方法であり、
１）キチン／キトサンをリゾチームで分解処理した後、塩溶液中で超音波処理し、次いでイオン交換処理して製造した水溶性β−グルコサミン繊維素を、免疫タンパク質のγ−グロブリンでナノコーティングして免疫性の強化された水溶性キトサンを製造する工程；
２）前記免疫性の強化された水溶性キトサン２０〜９９．９８重量％；天草、くらげ、わかめ、こんぶ及びこれらの抽出液の中から選ばれる一種または二種以上の海藻類０．０１〜７５重量％；及びγ−グロブリン、コール酸、アスタキサンチン、ルチン、レシチン、オオグルマ、セルロース及びコラーゲンの中から選ばれる一種または二種以上の機能性成分０．０１〜３０重量％；からなる構成成分を蒸留水に溶解して０．００１〜７０％濃度のゲルを製造する工程；
３）前記工程２で製造したゲルを粘度１０〜１５０ｃｐｓとなるまで熟成する工程；
４）前記工程３で熟成したゲルをエタノール９５〜９９．９重量％及びグルタルアルデヒド０．１〜５重量％からなる溶液で硬化させる工程；及び
５）前記工程４で硬化したゲルを圧縮成形するか、または生分解性フィルム或いは汎用フィルムの片面または両面にスプレー処理して乾燥させる工程；からなるキトサン含有水溶性天然フィルムを製造する方法を提供する。
【００１４】
本発明は、水溶性天然フィルムとその製造方法に関するものであり、さらに詳しくは、キチン／キトサンをリゾチームで分解処理しエタノール洗浄した後、塩溶液中で電気調整と超音波分解処理及びイオン交換処理工程を経て水溶性β−グルコサミン繊維素を製造した後、免疫タンパク質（γ−グロブリン）をナノサイズ表面結合させた水溶性キトサンを主原料物質とし、これに海藻類及び機能性成分を含有する組成物を蒸留水に溶解し、ゲル化させて製造した水溶性天然フィルムに関するものである。本発明による水溶性天然フィルムは、従来技術のキトサンを含むフィルムとは違って水溶性が強化されているため、使用された水溶性キトサンの優れた抗菌活性をより多様な分野に適用することができ、特に海藻類と機能性成分を含むことにより、フィルムのマトリックスに弾性を付与しフィルムの成形を容易にして、主要構成成分が全て天然成分からなっているため、人体に対しての適合性と摂取時の食感を改善して、特にフィルム組成物自体を所望の厚さと大きさを有するフィルムとして製造するか、または通常の生分解性樹脂フィルムにコーティング処理させて製造することができ、フィルム状の製品の場合は、携帯が簡便で且つ摂取が容易であるため、速効生口腔清浄剤フィルムに適用可能であり、そして通常のフィルムにコーティングして使用する場合は、食品包装材に適用すると優秀な抗菌活性により食品の腐敗を誘発させる有害菌の生育を効率的に抑制するため、食品を長期間新鮮に保存することができて、また生分解性に優れているため、自然分解性包装材として利用することができ、極めて優れた効果を得ることができる。
【００１５】
本発明で使用される水溶性キトサンは、天然生体高分子素材のキチン／キトサンをリゾチームで分解処理、エタノール洗浄、塩溶液中で電気調整と超音波分解処理、イオン交換処理して水溶性β−グルコサミン繊維素を製造した後、免疫タンパク質（γ−グロブリン）をナノサイズ表面結合させて製造したものであって（特許文献５）、従来技術のキトサンの概念とは明確に区別され得る機能的要素を含有する免疫性が強化された水溶性キトサンである。
【特許文献５】大韓民国特許出願第２００１−４０９５５号明細書
【００１６】
本発明で使用される水溶性キトサンは１０００〜１００００００Ｄａの分子量を有する。１０００００〜５０００００Ｄａの分子量を有するキトサンを使用する場合には、製造されたフィルムの抗菌力と物性の側面からより望ましい効果が期待でき、分子量１０００００〜５０００００Ｄａの範囲で分子量別のキトサンの抗菌活性についての研究結果が既に１９９８年フランスのカンヌで開かれた世界化粧品学会で発表された（非特許文献１）、（非特許文献２）。
【非特許文献１】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｓ  ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０ｔｈＣＣ  ｃｏｎｇｒｅｓｓ：Ｃａｎｎｅｓ  Ｆｒａｎｃｅ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １４−１８，１９９８”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ
【非特許文献２】Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔ  ｏｆ  ａｓｉａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｂｅａｕｔｙ（５ｔｈ  ＡＳＣＳ  ２００１）：１−３  Ｍａｒｃｈ，Ｂａｎｇｋｏｋ，Ｔｈａｉｌａｎｄ．”ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｓａn−Ｉｎｕｌａ  Ｈｅｌｅｎｉｕｍ  Ｌ．ｅｘｔｒａｃｔｓ
【００１７】
本発明で使用される免疫性の強化された水溶性キトサンは、分子量範囲が１０００００〜５０００００Ｄａであり、１０〜１５０ｃｐｓ（ブルークフィールド粘度計）程度の高粘度の分布を有するキトサンが使用され、分子量が前記範囲を外れると、口腔に係る細菌と食品に係る細菌に対して高い抗菌活性を期待することができなくなり、そして粘度が前記範囲を外れると、フィルム状として成型する際に基本成形に問題が生じる。
【００１８】
本発明の天然フィルムは、前記の特性を有する、免疫性の強化された水溶性キトサンが２０〜９９．９８重量％含まれ、前記キトサン以外にもマトリックス構成成分として海藻類０．０１〜７５重量％及び機能性成分０．０１〜３０重量％を含んで構成される。
【００１９】
前記海藻類としては、天草、くらげ、わかめ、こんぶ及びこれらの抽出液の中から選ばれる一種または二種以上の混合物が使用される。前記海藻類は、成分自体が人体親和的な天然材料であるため、摂取時人体に有用であり、海藻類の粘液質成分は、取食時キトサンの有する多少粗い質感を緩和して口腔内で柔らかい感触を与える効果を奏すると共に、フィルム形成の際、粘性と弾性を付与してマトリックス形成を容易にする。このような海藻類は、本発明のキトサン含有水溶性天然フィルム組成物に０．０１〜７５重量％を使用するが、使用量が０．０１重量％未満であると前記特性が発現されず、７５重量％を超過すると相対的に免疫性の強化された水溶性キトサンの使用量が少なくなるため、高い抗菌性の発現に問題がある。
【００２０】
前記海藻類以外に使用される構成成分の中で機能性成分としては、アルブミン類としてγ−グロブリン、コール酸、アスタキサンチン、ルチン、レシチン、オオグルマ（Ｉｎｕｌａ  ｈｅｌｅｎｉｕｍ  Ｌ．）、セルロース及びコラーゲンなどの中から選ばれる一種または二種以上の混合物が使用される。前記海藻類と同様に、本発明のキトサン含有水溶性天然フィルム組成物に天然成分である機能性成分が含まれることにより、前記機能性成分の各種機能性をフィルムに付与すると共に、人体との親和性を高めて、しかも本発明の免疫性が強化された水溶性キトサンとの混和性が優れているために相乗効果が期待でき、またフィルム成形の際に、マトリックス形成を容易にする。このような機能性成分は、本発明のキトサン含有水溶性天然フィルムに０．０１〜３０重量％を使用されるが、使用量が０．０１重量％未満であると前記特性が発現されず、３０重量％を超過するとフィルム成形時に問題が生ずる。
【００２１】
本発明の水溶性キトサンを含む天然フィルムは、従来技術のキトサン含有フィルムと異なり、高分子量でありながら優れた抗菌活性を有する免疫性が強化された水溶性キトサンが原料物質として使用され、しかも本発明で製造される天然フィルムは水溶性の特徴を具備する。
【００２２】
すなわち、本発明で使用される水溶性キトサンは、天然生体高分子素材のキチン／キトサンをリゾチームで分解処理、エタノール洗浄、塩溶液中で電気調整と超音波分解処理、イオン交換処理して水溶性β−グルコサミン繊維素を製造した後、免疫タンパク質（γ−グロブリン）をナノサイズ表面結合させることにより製造された免疫性が強化されたキトサンを使用し、このような特徴を有する水溶性キトサンを使用することによって、従来技術のキトサンフィルムが有する抗菌活性をさらに強化し、且つ製造されたフィルムが優れた水溶性を具備することにその顕著な特徴がある。
【００２３】
前記成分以外にも、必要に応じ、香料０〜１重量％、甘味料、色素０〜１重量％及びその他の添加剤０〜１重量％などの中から選択される成分を含有するフィルムを製造することができ、これは口腔清浄剤用フィルム製造時に適用することができ、また生分解性フィルムや汎用フィルムの片面または両面に塗布して包装材として使用することもできる。
【発明の効果】
【００２４】
以上に説明したように、本発明による水溶性天然フィルムは、従来技術のキトサンを含むフィルムと違って、水に溶解される特性を有するため、使用された水溶性キトサンの優れた抗菌活性をさらに多様な分野に適用することができ、また構成成分として海藻類と機能性成分を含むことにより、キトサンとの混和性を向上させて、フィルムのマトリックスに弾性を付与しフィルムの成形を容易にすると共に、主要構成成分が全て天然成分であるため、人体に対しての適合性と摂取時の食感を改善することができ、さらに、フィルム組成物自体を所望の厚さと大きさを有するフィルムとして製造するか、または通常の生分解性樹脂フィルムにコーティング処理させて製造することができる。
【００２５】
従って、フィルム状の製品の場合は、携帯が簡便で、摂取が容易であると共に、口腔細菌抑制と口臭除去に卓越で、速い速度で発現されるため、速効性フィルム形口腔清浄剤に適用することができる。
【００２６】
また、通常のフィルムに１００〜５００ｐｐｍの濃度でコーティング処理して、果物及び食品の抗菌活性を有する包装材に適用すると、優れた抗菌活性により食品の腐敗を誘発させる有害菌の生育を効率的に抑制することができるため、食品を長期間新鮮に保存することができ、また生分解性に優れているため、自然分解性包装材として利用することができるなど、さらに優れた効果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の天然フィルムを製造する方法を下記に詳細に説明する。
【００２８】
まず、本発明の特徴的な免疫性の強化された水溶性キトサン、海藻類抽出物、機能性成分及びその他の混合添加剤などを定量した後、蒸留水に溶解させてゲルを製造する。この際、ゲルの濃度が０．００１〜７０％となるようにするが、ゲルの濃度が０．００１％未満であるか或いは７０％を超過すると、熟成時に所望の粘度を得ることが難しくなる。前記のような濃度で製造されたゲルを粘度１０〜１５０ｃｐｓとなるように熟成させてフィルムキャスティング（ｆｉｌｍ  ｃａｓｔｉｎｇ）用ゲルを作るが、粘度が１０ｃｐｓ未満であるとフィルム成形が容易にできなくなり、１５０ｃｐｓを超過するとフィルムの弾性が足りなくなってフィルム成形時割れやすくなる。
【００２９】
前記のように製造されたフィルムキャスティング用ゲルを圧縮成形するか、疎水性ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムまたは生分解性フィルムに前記製造されたフィルムキャスティング用ゲルをスプレーキャスティングした後、エタノール９５〜９９．９９重量％とグルタルアルデヒド０．０１〜５重量％との混合結晶化溶液に通過させて固定化する。前記固定化したフィルムゲルをフィルム製造機に通過させて、マイクロナイフで圧縮成形サイジングして所望の大きさと厚さを有するようにし、ローリングの後エアー熱風乾燥して、目的とする水溶性の天然フィルムを製造する。
【００３０】
前記のように製造された天然フィルムは、口腔用として使用する場合、口腔内で速い速度で溶解され吸収されるため、速効性を期待することができて、フィルム状に製造されるために、携帯と運搬が簡便であるという効果を奏する。また、前記のように製造されたフィルムを食品用包装材に適用する場合、食品の腐敗を誘発させる細菌とカビ類の生育を効果的に阻止することができるため、食品の保存期間を延長できるという優れた効果を奏する。
【実施例】
【００３１】
以下に具体例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら具体例に限定されるものではない。
製造例：水溶性キトサンの製造
【００３２】
特許文献６を基礎として製造した水溶性キトサン（平均分子量構成１０００００〜５０００００）１０００ｇをリゾチームで分解して、塩（ＮａＣｌ）３０％溶液中でｐＨ６〜７に調製し、３時間、４５℃、波長５０〜１００ＫＨｚで段階調整超音波分解処理に付した後に、ＮＨ２鎖の変化及び変性の防止のために８０℃で２時間放置し、次いでイオン交換処理した。この際、カチオン樹脂はＤＩＡＩＯＮ  ＰＫ２２８[三洋社、韓国]を分当たり１５００ｃｃの速度で使用し、アニオン樹脂はＤｕｐｏｎｔ社（米国）のものを分当たり５００ｃｃの速度で使用した。酵素反応時の未反応物質及び不純物、及び残余イオンの除去にカーボンフィルターを使用し、確実な分画分離のために分子量の分散集積効率（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）が１．１〜１．９になるように純度と集積度を高めた。水溶液中でアニオンとカチオンのイオンを確認してみたところ、解離イオンがないということが分かった。
【特許文献６】米国特許第５，７３０，８７６号明細書
【００３３】
分離工程により分散を集積させて、酵素処理後の残余酵素除去及び高分子の分画を行うために、分画分子量１００００００、６０００００、３０００００、２０００００、１０００００を順次に分画並行及び反復して、濾過装置と濾過膜（横×縦：２００ｍｍ×３００ｍｍの平膜）は自己製作して使用し、目的収率９５％（±１０％）で７０〜９９％の純粋集積物を得た。
【００３４】
透過濾液を再び１回以上のイオン交換処理によってカチオン（ＮＨ２）電荷浄化及びアニオン（Ｃｌ−）を導入し、基本水溶性β−グルコサミン繊維素が遊離されるようにして、これにコール酸（ｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）１％製造溶液にコラーゲン１０％を中間触媒として使用して免疫γ−グロブリン０．０１〜１０％をナノ結合及びコーティングして、この水溶液を常温蒸留、予冷を経て冷凍乾燥し、本発明の天然フィルムを製造するための水溶性キトサンを製造した。
実施例１：圧縮成形による水溶性天然フィルムの製造
【００３５】
前記製造例により製造されたキトサン９０重量％、海藻類としてこんぶ抽出液５重量％、機能性成分としてアスタキサンチン５重量％を使用して濃度３％の水溶性ゲルを製造し、４℃で２４時間熟成させて粘度が１００〜１１０ｃｐｓ（ブルークフィールド粘度計）となるようにした後、酒精ベースの硬化溶液（エタノール９９．９重量％及びグルタルアルデヒド０．１重量％の混合溶液）を通過させて硬化させ、フィルム製造機を通過させてマイクロナイフで圧縮成形しローリングした後、８０℃、５０ｒｐｍの速度でエアー熱風乾燥させて、横３ｃｍ、縦２ｃｍ、厚さ０．５ｍｍのフィルム試片を製造し、次の特性を測定した。
実施例２：スプレー法による水溶性天然フィルムの製造
【００３６】
前記製造例により製造したキトサン５０重量％、海藻類として天草抽出液２５重量％、機能性成分としてセルロース２５重量％を使用して濃度３％の水溶性ゲルを製造し、４℃で２４時間熟成させて粘度が８０〜９０ｃｐｓ（ブルークフィールド粘度計）となるようにした後、疎水性ポリエチレンテレフタレートフィルムに０．５〜０．７ｍｍの厚さでスプレーして、酒精ベースの硬化溶液（エタノール９９．９重量％及びグルタルアルデヒド０．１重量％の混合溶液）を通過させて硬化した後、前記実施例１と同様な方法により横５ｃｍ、縦１０ｃｍ、厚さ０．５ｍｍのフィルム試片を製造し、次の特性を測定した。
比較例：従来のキトサンを含有する天然フィルムの製造
【００３７】
キトサン（Ｓｉｇｍａ、脱アセチル化度８５％）を酢酸１％希釈液に溶解させて５％濃度範囲のキトサン溶液を製造した後、前記実施例１と同様なフィルムキャスティング法によりフィルムを製造したが、エタノール９９．９重量％とグルタルアルデヒド０．１重量％からなる硬化溶液で硬化させ、フィルム製造機を通過させて８０℃で熱風乾燥してフィルムを製造した。横３ｃｍ、縦２ｃｍ、厚さ０．５ｍｍのフィルム試片を製造して次の特性を測定したが、ここで製造されたキトサンフィルムは、水に溶解されず、また皮膚刺激が強くて、口腔粘膜損傷の恐れがあるため、食用として使用するのには問題があった。
実験例１：水溶性キトサンの分子量による抗菌活性
【００３８】
前記製造例により製造した水溶性キトサンの分子量による抗菌活性を最少阻止濃度（Ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＭＩＣ）により測定して、その結果を次の表１に示す。
【００３９】
【表１】
2004217933.tif 000002
【００４０】
前記表１に示したように、本発明の天然フィルムの組成物として使用された水溶性キトサンの分子量による抗菌活性度は、分子量が１０００００〜５０００００Ｄａである場合５．８〜２１．０であることが分かる。
実験例２：水溶性キトサン濃度による抗菌活性
【００４１】
前記製造例により製造された水溶性キトサンゲルの濃度による抗菌活性を測定し、その結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
2004217933.tif 000003
【００４３】
一般に、口腔で口内炎、鵞口瘡及び虫歯を誘発させる菌として知られている真菌類のカンディダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）に対しての最少阻止濃度を測定して抗真菌活性（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を調べた。
【００４４】
前記表２から分かるように、水溶性キトサンゲルは、濃度が増加するにつれて抗真菌活性が増加されて、前記結果により、人の口腔細胞へのカンディダアルビカンスの付着を抑制して抗真菌活性を有するということが予想できる。
実験例３：キトサン含有水溶性フィルムの抗菌活性
【００４５】
前記実施例１及び２により製造されたキトサン含有水溶性フィルムの抗菌活性は、四種類のグラム陰性細菌に対して次のような方法により試験した。
【００４６】
寒天培地上に生成された集落数を数えて抗菌活性を測定した。培養された細菌０．５ｍＬ、本発明のフィルムを製造するための組成物を加圧滅菌した溶液０．５ｍＬ、そして０．０５Ｍアセテート緩衝溶液（ｐＨ６．０）を混合して３７℃で１時間攪拌しながら培養した。
【００４７】
対照群としては、本発明のキトサンフィルムを製造するための組成物の代りにアセテート緩衝溶液４．５ｍＬを使用して、１ｍＬの混合溶液は１０倍に希釈した。
【００４８】
前記のような実験群と対照群をトリプシン大豆寒天培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ａｇａｒ，ＴＳＡ，Ｄｉｆｕｃｏ）と共にプラスチックペトリディッシュに分配した後、３７℃培養器で２４時間培養して、生成した集落を計数し次の数式１により抗菌活性度を計算して、その結果は次の表３に示す。
【００４９】
対照群の集落数−実験群の集落数
抗菌活性度（％）＝ ×１００
対照群の集落数
【００５０】
【表３】
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【００５１】
本発明の方法により製造したキトサンの抗菌活性を測定するために使用した微生物はＫＣＴＣ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）及びＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）社から分譲してもらった菌株（大腸菌、大腸菌  Ｏ−１５７，サルモネラ  チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））を使用した。
【００５２】
前記使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、グラム陰性菌の特性を有する菌であり、水質検査時に病原性微生物の汚染程度を表す指標細菌であって、前記菌の生育を阻止することにより有害な病原性微生物の汚染程度を低める効果を奏する。
【００５３】
特に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ−１５７は、グラム陰性の特性を有する菌であって、人体に感染された場合、腸出血を起こす、人体に危害を加える菌である。また、サルモネラ  チフス菌は、グラム陰性の特性を有する菌であって、前記菌の生育を阻害させることにより、敗血症、胃炎などを予防する効果を得ることができる。緑膿菌は、中耳炎の原因となる菌であって、前記菌の生育を阻害させることにより、炎症誘発予防の効果を得ることができる。
【００５４】
従って、前記表３から分かるように、本発明の実施例１及び２により製造されたキトサン含有水溶性フィルムの前記菌に対する阻止効果が、比較例で使用された汎用キトサンより高くて、本発明のキトサン含有水溶性フィルムを適用していない対照群の場合に比べて、著しく優れた抗菌活性を有するということが分かる。
実験例４：キトサン含有水溶性フィルムの最少阻止濃度
【００５５】
実施例１及び２により製造された本発明のキトサン含有水溶性フィルム１ｍＬと比較例により製造された汎用キトサンフィルム１ｍＬを含むトリプシント大豆液状培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ，ＴＳＢ）５ｍＬに各々細菌を接種して、３７℃で１８時間細菌を培養させた後、最少阻止濃度を測定して、その結果を図１に示した。
【００５６】
最少阻止濃度は、肉眼や微細顕微鏡には見えない細胞増殖点での使用された標本（サンプル）の最少濃度として定義する。
【００５７】
本発明の実施例により製造されたキトサン含有水溶性フィルムの最少阻止濃度値は、緑膿菌（０．２５％）の場合を除いては、グラム陰性菌に対して０．０６％以下であった。前記の結果から、対照群の結果である３２％に比べて著しく優れた最少阻止濃度を示すということが確認でき、少ない量でも高い抗菌活性を奏するということが分かる。
実験例５：キトサン含有水溶性フィルム濃度による抗菌活性
【００５８】
大腸菌、フサリウム  ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）及びラクトバシラス  カセイ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）を使用し、前記菌の増殖に対しての本発明のキトサン含有水溶性フィルム濃度による生育抑制効果測定を、分光光度計の６６０ｎｍで培養培地の時間帯別の濁度を測定し、その結果を図２、図３及び図４に各々示した。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の天然フィルムの製造に使用したキトサンのグラム陰性菌に対する最少阻止濃度の測定結果を示したグラフである。
【図２】本発明の天然フィルムの製造に使用したキトサンの濃度による大腸菌に対する増殖抑制効果を示したグラフである。
【図３】本発明の天然フィルムの製造に使用したキトサンの濃度によるフサリウム  ソラニに対する増殖抑制効果を示したグラフである。
【図４】本発明の天然フィルムの製造に使用したキトサンの濃度によるラクトバシラス  カセイ菌に対する増殖抑制効果を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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