(57)【要約】    【課題】  ウイルス感染症の診断、予防および治療における使用に適した組換えウイルスタンパク質を提供する。    【解決手段】  パピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質をコードする野生型ヒトパピローマウイルス１６型(ＨＰＶ１６)Ｌ１立体配座コード配列を組換えベクター中に含む遺伝子構成物であって、前記構成物が、前記パピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質を含むキャプソメア構造の自己組み立てにより天然のパピローマウイルスに対する高力価中和抗体を誘導する立体配座エピトープを有するキャプソメア構造の宿主細胞内での発現を指示することを特徴とする、パピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質をコードする野生型ヒトパピローマウイルス１６型(ＨＰＶ１６)Ｌ１立体配座コード配列を含む遺伝子構成物。    【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質をコードする野生型ヒトパピローマウイルス１６型(ＨＰＶ１６)Ｌ１立体配座コード配列を組換えベクター中に含む遺伝子構成物であって、前記構成物が、前記パピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質を含むキャプソメア構造の自己組み立てにより天然のパピローマウイルスに対する高力価中和抗体を誘導する立体配座エピトープを有するキャプソメア構造の宿主細胞内での発現を指示することを特徴とする、パピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質をコードする野生型ヒトパピローマウイルス１６型(ＨＰＶ１６)Ｌ１立体配座コード配列を含む遺伝子構成物。
【請求項２】
前記Ｌ１キャプシッドタンパクは、配列番号１に示す変異型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列の２０２位に相当する位置に、ヒスチジン残基以外のアミノ酸残基を有する請求項１に記載の構成物。
【請求項３】
前記パピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質は、前記２０２位に相当する位置を除いて、配列番号２に示すアミノ酸配列、又は同アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２に記載の遺伝子構成物。
【請求項４】
前記の組換えベクターが、真核細胞用ベクターであり且つ宿主細胞が真核細胞である、請求項１〜３の何れかに記載の構成物。
【請求項５】
前記の組換えベクターが、昆虫用ベクターであり且つ宿主細胞が昆虫細胞である、請求項４に記載の構成物。
【請求項６】
前記の昆虫用ベクターが、バキュロウイルスベクターである、請求項５に記載の構成物。
【請求項７】
前記のバキュロウイルスベクターが、昆虫宿主細胞の、組換えバキュロウイルスＤＮＡと野生型バキュロウイルスＤＮＡの同時トランスフェクションにより形成される、請求項６に記載の構成物。
【請求項８】
前記の組換えベクターが、酵母細胞用ベクターであり且つ前記の宿主が酵母宿主細胞である、請求項４に記載の構成物。
【請求項９】
前記のキャプソメア構造が、パピローマウイルスＬ２キャプシッドタンパク質の同時発現を必要としない、請求項１〜８の何れかに記載の構成物。
【請求項１０】
前記のキャプソメア構造が、更に、パピローマウイルスＬ２キャプシッドタンパク質を含む、請求項１〜８の何れかに記載の構成物。
【請求項１１】
前記の配列が、前記のパピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質と前記のパピローマウイルスＬ２キャプシッドタンパク質とを二重にコードする、請求項１０に記載の構成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れかに記載の遺伝子構成物を含む真核宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞が昆虫細胞である請求項１２に記載の真核宿主細胞。
【請求項１４】
前記細胞が酵母細胞である請求項１２に記載の真核宿主細胞。
【請求項１５】
天然のパピローマウイルスに対する中和抗体を誘導する立体配座エピトープを有するキャプソメア構造の製造方法であって、該キャプソメア構造の発現を指示する請求項１〜１１の何れかに記載の遺伝子構成物のための条件を準備することを含む当該製造方法。
【請求項１６】
前記のキャプソメア構造を単離するステップを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１の何れかに記載の遺伝子構成物の指示の下に発現された天然のパピローマウイルスに対する中和抗体を誘導する立体配座エピトープを有するキャプソメア構造。
【請求項１８】
パピローマウイルス感染の予防又は治療における利用のための、請求項１７に記載のキャプソメア構造。
【請求項１９】
疫化投与スケジュールに従って投与した場合に少なくとも約１０3
の力価のパピローマウイルス中和抗体を誘導するのに十分な有効な免疫原濃度の請求項１７に記載のキャプソメア構造を含む単位投与量のワクチン。
【請求項２０】
患者におけるパピローマウイルス感染に対する液性免疫を検出する方法であって、下記を含む当該方法：
(ａ)請求項１７に記載のキャプソメア構造の有効な抗体検出量を用意し；
(ｂ)該キャプソメア構造をパピローマウイルス感染について試験すべき患者由来の体液試料と接触させ、該試料中に含まれるパピローマウイルス抗体をそれに結合させて抗原抗体複合体を形成させ；そして
(ｃ)該試料中の該パピローマウイルス抗体の存在を該複合体の形成を測定することにより測定する。
【請求項２１】
パピローマウイルス感染の疑いのある患者からの試料において該ウイルスを検出する方法であって、下記を含む当該方法：
(ａ)有効なパピローマウイルス検出量の請求項１７に記載のキャプソメア構造に対して高めた抗体を用意し；
(ｂ)該試料を該抗体と接触させ、該試料に含まれるパピローマウイルスをそれに結合させて抗原抗体複合体を形成させ；そして
(ｃ)該試料中の該パピローマウイルスの存在を該複合体の形成を測定することにより測定する。
【請求項２２】
患者におけるパピローマウイルス感染を検出するための、即座に使えるようにパッケージされた診断用キットであって、第１のコンパートメントに有効な抗体検出量の請求項１７に記載のキャプソメア構造を含み且つ第２のコンパートメントに該キャプソメア構造と患者から得られた試料中のパピローマウイルス抗体との結合を検出する材料を含む当該キット。
【請求項２３】
患者におけるパピローマウイルス感染を検出するための、即座に使えるようにパッケージされた診断用キットであって、第１のコンパートメントに有効なパピローマウイルス検出量の請求項１７に記載のキャプソメア構造に対して高めた抗体を含み且つ第２のコンパートメントに該抗体と患者から得られた試料中のパピローマウイルスとの結合を検出する材料を含む当該キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換えウイルスタンパク質に関する。特に、本発明はウイルス感染症の診断、予防および治療における使用に適した組換えウイルスタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
パピローマウイルスはヒトを含むさまざまな種の動物の上皮に感染し、一般に感染部位に良性の上皮および腺維上皮腫細胞、すなわちいぼ状組織を誘発する。脊椎動物の種はそれぞれ、はっきりと区別できる一群のパピローマウイルスに感染する。各パピローマウイルス群は、いくつかの型のパピローマウイルスを含む。例えば、６０種類を超える数のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子型が単離されている。パピローマウイルスは上位種に特異的な感染因子である。例えば、ウシパピローマウイルスがヒトなどの異種において乳頭腫を誘発することはできない。また、パピローマウイルスの型も、あるパピローマウイルス型による感染に対する中和免疫性は通常は他の型に対する免疫性を持たせることはないという点で免疫抗原としては極めて特異的であることが分かっている。これらの型が相同種に感染するとしても、である。
【０００３】
ヒトでは、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる性器疣贅は性的に伝播する疾病である。性器疣贅はごく普通に起こり、無症状すなわち不顕性のＨＰＶ感染は臨床感染よりもさらに一般的に見られるものである。ヒトにおける良性病変、特にある特定のパピローマウイルス型から生じる良性病変は、進行して悪性に変わる。このため、悪性腫瘍関連パピローマウイルス型の１つによる感染は、世界的に見て女性で２番目に多いガンである子宮頸部ガンの発達における最も危険な要因であると考えられている（ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ，Ｈ．，１９９１；Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ，Ｍ．，１９９２）。子宮頸部ガンでは何種類かのＨＰＶ遺伝子型が発見されたが、ＨＰＶ１６は子宮頸部ガンの５０％から単離される最も一般的な型である。
【０００４】
パピローマ抗原に対する中和抗体の産生についての免疫学的研究から、脊椎動物ではパピローマウイルス感染およびこれらの感染に関連した悪性腫瘍は、免疫処置によって防止可能であるということが分かっている。しかしながら、効果的なパピローマウイルスワクチンの開発はさまざまな困難さが原因で滞っている。
【０００５】
まず、効果的なワクチンの開発には必須であるパピローマウイルスの構造および免疫遺伝学的特徴を特定するために必要な感染性ウイルスの多量のストックをin vivoで生成するのは不可能であった。培養細胞はパピローマウイルスオンコタンパク質およびその他の非構造的タンパク質を発現するが、これらの細胞はin vitroにおいて熱心に研究されてきた。しかしながら、構造的ウイルス蛋白質Ｌ１およびＬ２の発現（およびそれに続く感染性ウイルスのアセンブリ）は、感染した上皮組織の最終的に分化した層においてのみ起こる。従って、ウイルス遺伝子、タンパク質および構造の特徴は、必然的に乳頭腫から採集したウイルスについての研究から集められたものであった。特に、パピローマウイルス構造およびこれに関連した免疫性についてはウシパピローマウイルス系において研究されていた。なぜなら、このウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）いぼ状組織からであれば多量の感染性ウイルス粒子を単離することができるからである。
【０００６】
今日までのパピローマウイルス構造についての研究によって得られた情報から、パピローマウイルスは、全て、保存されたＬ１主要キャプシッドタンパク質およびこれよりは保存されないＬ２副次的キャプシッドタンパク質からなる（Ｂａｋｅｒ，Ｃ．，１９８７）非エンベロープ状態の５０〜６０ｎｍの２０面体構造であることが分かる（Ｃｒａｗｆｏ
ｒｄ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９６３）。これら２つのタンパク質の配列は互いに全く関連がない。キャプシッドにおけるＬ２の機能および位置は明らかになっていない。しかしながら、免疫学的データからＬ２のほとんどはＬ１に対して内部にあるのではないかと思われる。
【０００７】
近年、ＢＰＶ１およびＨＰＶ１ビリオンについての高解像度低温電子顕微鏡解析によって、これら２つのウイルスは、７２個の５量体キャプソメアを持つ極めてよく似た構造を有し、おそらくそれぞれのキャピソメアがＴ＝７対称性のビリオン外被を形成する５個のＬ１分子から構成されていることが分かってきた（Ｂａｋｅｒ，Ｔ．，１９９１）。副次的Ｌ２キャプシッドタンパク質のビリオンにおける位置はまだ特定されておらず、Ｌ２やその他のウイルスタンパク質がキャプシッドアセンブリに必要であるか否かもはっきりしていない。表面上、パピローマウイルス構造は対称性およびキャプソメア数が同一である、ポリオーマ４５ｎｍビリオンの構造に似ている（Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｍ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。しかしながら、ポリオーマウイルスとパピローマウイルス種のキャプソメア内部の接触のシステムは異なっており、ポリオーマウイルスの主要および副次的のキャプシッドタンパク質は遺伝的にＬ１およびＬ２に関連していない。
【０００８】
ウシパピローマウイルスについての研究は、ＢＰＶ用に開発された、定量的な病巣形質転換感染アッセイによって促進されているが、ＨＰＶには利用できない（Ｄｖｏｒｅｔｚｋｙ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）。従って、パピローマウイルスに対する免疫についての理解は、ウシパピローマウイルス系に基づいて導き出されていた。そのままのウシパピローマウイルスを使用しての限られた研究から、分娩時の上皮ＢＰＶ感染を防止するワクチンとして感染性あるいはホルマリン不活性化したＢＰＶウイルスを非皮膚接種するのが効果的であることが分かった（Ｏｌｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９６０；Ｊａｒｒｅｔｔ．，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。残念なことに、他の種に感染するパピローマウイルスに対するワクチンの開発にも、他のウシ型に対するワクチンの開発にでさえも、ＢＰＶビリオンを使用することはできない。なぜなら、これらのウイルスは極めて特異性が高くインタクト（無傷）なウイルス粒子の発癌可能性に関連しているためである。
【０００９】
これらパピローマウイルス免疫性についての研究の有意な結論は、乳頭種ウイルスを中性化する抗体の能力が、型特異的なビリオン表面の立体配座依存的エピトープに対する反応能力に関連しているようである。例えば、感染性ＢＰＶ１ビリオンに対して高められたウサギ抗血清は、Ｃ１２７細胞の病巣形質転換（Ｄｏｒｅｔｚｋｙ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）およびウシ胎児皮膚移植片の形質転換を抑制するが、変性ビリオンに対して高められた抗血清は抑制しない（Ｇｈｉｍ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。
【００１０】
これとは対照的に、細菌で発現させたＢＰＶＬ１およびＬ２（Ｐｉｌａｃｉｎｓｋｉ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８４；Ｊｉｎ．，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８９）と、in vivoで合成されたワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）Ｌ１およびＬ２（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｌｉｎ  Ｙ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）とに対して中和血清が生成されたが、これらの血清はいずれも天然のビリオンの構造的な特徴は有しておらず、力価は小さく、細胞性免疫反応性を検出するためにＥ．ｃｏｌｉにおいて発現された組み換えＨＰＶ  Ｌ１融合ペプチドを使用して成功する例は極めて限られていた（Ｈｏｐｆｌ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。ＢＰＶ系において得られた結果は、マウス異種移植アッセイにおいてＨＰＶ１１感染を中和する単一クローン性の抗体は変性されたＨＰＶ１１ビリオンではなく天然のＨＰＶ１１ビリオンであると認識された（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、ＨＰＶ系において得られた結果と一致している。
【００１１】
パピローマウイルスキャプシッドはin vitroで産生するために単離されている。Ｚｈｏ
ｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ（１９９１）および（１９９２）は、ＨＰＶ  Ｌ１およびＬ２遺伝子と、ＨＰＶ  Ｅ３／Ｅ４遺伝子を組み合わせたＨＰＶ  Ｌ１およびＬ２遺伝子とをワクシニアウイルスベクターにクローニングし、この組み換えワクシニアウイルスでＣＶ−１哺乳類細胞を感染することによってウイルス様の粒子（virus-like particle）を産生した。これらの研究はＺｈｏｕによって解釈され、上皮細胞におけるＨＰＶ１６のＬ１およびＬ２タンパク質の発現はビリオン型の粒子の組立てを可能にするために必要で十分なものであるということが確立された。Ｌ１およびＬ２タンパク質を発現する二重組み換えワクシニアウイルスを感染させた細胞では、ＨＰＶキャプソメアの不完全に組み立てられたアレイであると思われる核中に小さな（４０ｎｍ）ウイルスの粒子認められた。Ｌ１タンパク質のみあるいはＬ２タンパク質のみを発現させても、ウイルス様粒子は産生されなかった。また、Ｌ１およびＬ２遺伝子を含有する単一組み換えワクシニアウイルスを二重に感染させた細胞でも粒子を産生させることはできなかった。中和活性は全く報告されなかった。
【００１２】
Ｇｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）は、哺乳類細胞において、ＨＰＶ１、すなわち主に手足のいぼ状組織に関連した非生殖器型ウイルスからＬ１が発現すると、Ｌ１タンパク質はインタクトなビリオンに認められる立体配座エピトープを含有していたと報告した。Ｇｈｉｍは、粒子が産生されるか否かは特定しておらず、Ｌ１タンパク質が中和抗体を誘導できるか否かについても評価していなかった。もっと最近になって、Ｈａｇａｎｓｅｅ
ｅｔ  ａｌ．（１９９３）は、ヒト細胞においてＨＰＶ１からＬ１が発現されると、Ｌ１は自己組み立てされてウイルス様の粒子になると報告した。中和抗体についての研究は行われなかった。
【００１３】
例えばパルボウイルスなどの他のウイルス系における研究は、キャプシッドアセンブリだけでは免疫原性を持たせることはできないだろうということが分かる。パルボウイルスＶＰ２は、昆虫細胞において発現させるとそれ自体で自己組み立てされるが、ＶＰ１およびＶＰ２の両方を含有する粒子のみが中和抗体を誘導できた（Ｋａｊｉｇａｙａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【００１４】
細胞培養において選択した種および型の更新可能なパピローマウイルス試薬を産生するための方法を開発することには利点がある。また、サブユニットワクチンとして利用可能な立体配座天然ウイルス粒子の特性を付与する免疫を有するこのようなパピローマウイルス試薬を産生することにも利点がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、このような組み換え立体配座パピローマウイルスタンパク質と、その産生および使用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、自己組み立てし、極めて特異的かつ極めて免疫原的な立体配座エピトープを有するキャプソメア構造を形成する組み換えパピローマウイルスキャプシッドタンパク質を提供することによって、パピローマウイルス感染とその良性および悪性の後遺症とを診断および防止することを目的としたものである。従って、本発明によれば、バキュロウイルス転移ベクターに挿入され、そのベクターのプロモーターによって作用的に発現される、パピローマウイルスのＬ１立体配座コード化配列を含む遺伝子構成物が提供される。パピローマウイルスＬ１立体配座コード化配列は、ウシ、サル、ヒトの遺伝子から単離することができる。好ましい実施態様において、パピローマウイルスＬ１立体配座コード化配列は、野生型ＨＰＶ１６遺伝子から単離される。特に好ましい実施態様において、パピローマウイルスＬ１立体配座コード化配列は、配列番号２である。遺伝子構成物は、さらに
パピローマウイルスＬ２コード化配列を有することができる。
【００１７】
本発明の他の態様によれば、本発明による遺伝子構成物によって形質転換された非哺乳類真核性宿主細胞が提供される。
本発明の他の態様によれば、キャプソメア構造またはその一部に組み立てられる、組み換えパピローマウイルスキャプシッドタンパク質を産生するための方法であって、（１）Ｌ１立体配座キャプシッドタンパク質をコード化するパピローマウイルス遺伝子を転移ベクターにクローニングするステップであって、前記遺伝子のオープンリーディングフレームは前記ベクターの制御下にある前記ステップと、（２）組み換えベクターを宿主細胞に転移するステップであって、クローン化したパピローマウイルス遺伝子はパピローマウイルスキャプシッドタンパク質を発現する前記ステップと、（３）宿主細胞からパピローマウイルスキャプシッドタンパク質を含有するキャプソメア構造を単離するステップと、を含む方法が提供される。好ましい実施態様において、クローン化したパピローマウイルス遺伝子は本質的に立体配座Ｌ１コード化配列からなり、発現タンパク質は組み立てられて本質的にＬ１キャプシッドタンパク質からなるキャプソメア構造になる。他の好ましい実施態様において、上述した方法のクローニングするステップは、Ｌ２キャプシッドタンパク質をコード化するパピローマウイルス遺伝子をクローニングすることをさらに含み、それによって前記Ｌ１およびＬ２タンパク質を同時に宿主細胞に発現させる、前記宿主細胞が哺乳類細胞である時に前記転移ベクターはワクシニアウイルスではないという条件で、単離されたキャプソメア構造はＬ１およびＬ２キャプシッドタンパク質を有する。立体配座Ｌ１コード化配列は、ウシ、サル、ヒトパピローマウイルスからクローンすることができる。好ましい実施態様によれば、立体配座Ｌ１コード化配列は野生型ＨＰＶ１６パピローマウイルスからクローニングされる。特に好ましい実施態様において、立体配座Ｌ１コード化配列は配列番号２である。また、好ましい実施態様において、転移ベクターはバキュロウイルスに基づく形質転換ベクターであり、パピローマウイルス遺伝子は昆虫細胞において活性であるプロモーターの制御下にある。従って、この実施態様では、組み換えバキュロウイルスＤＮＡはＳｆ−９昆虫細胞にトランスフェクションされる。
【００１８】
本発明による方法の別の実施態様において、形質転換ベクターは酵母の転移ベクターであり、組み換えベクターは酵母細胞にトランスフェクションされる。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明の方法によって産生される、本質的にパピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質からなるウイルスキャプソメア構造またはその蛋白質が提供される。また、ウイルスキャプソメア構造は本発明の方法により生成される本質的にパピローマウイルスＬ１およびＬ２キャプシッドタンパク質からなるものであってもよい。特に好ましい実施態様において、ウイルスキャプソメア構造は、野生型ウイルスからクローニングされたＨＰＶ１６  Ｌ１ＤＮＡの発現産生物であるパピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質を含む。
【００１９】
本発明によるこのウイルスキャプシッドまたはキャプソメア構造若しくはその一部あるいは断片は、本質的にパピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質からなるものであってもよい。一方、これらのキャプシッドまたはキャプソメア構造若しくはその断片は、本質的に野生型ＨＰＶ１６パピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質からなるものであってもよい。
【００２０】
上述した本発明のいずれかの方法によるウイルスキャプシッド構造は、未変性（天然の）パピローマウイルスに対する中和抗体を誘導可能な免疫原立体配座エピトープを有するキャプシッドタンパク質を含む。キャプシッドタンパク質は、ウシ、サル、ヒトのパピローマウイルスＬ１タンパク質であることができる。好ましい実施態様において、パピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質は、野生型ＨＰＶ１６遺伝子の発現産生物である。特に好ましい実施態様において、ＨＰＶ１６遺伝子は配列番号２の配列を含む。
【００２１】
本発明のさらに他の態様によれば、免疫治療スケジュールに沿って投与した場合に少なくとも約１０3のパピローマウイルス中和抗体力価を誘導できるだけの効果的な免疫原濃度において、パピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質またはＬ１タンパク質およびＬ２キャプシッドタンパク質の立体配座エピトープを有するペプチドを含む単回量のワクチンが提供される。好ましい実施態様において、ワクチンはＨＰＶ１６キャプシッドタンパク質であるＬ１キャプシッドタンパク質を含む。特に好ましい実施態様において、このワクチンは野生型ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質のＬ１キャプシッドタンパク質を含む。
本発明の方法によれば、野生型ＨＰＶ１６パピローマウイルスゲノムからのＬ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を使用することで、ワクチンの使用に適したスケールでの調製量のウイルス様粒子の産生を特に促進できる。
【００２２】
本発明のさらに他の態様によれば、脊椎動物におけるパピローマウイルス感染を防止または治療するための方法であって、本発明によるパピローマウイルスキャプソメア構造またはその断片を、免疫生成管理に基づいて脊椎動物に投与するステップを含む方法が提供される。好ましい実施態様において、パピローマウイルスキャプソメア構造は野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１キャプシッドタンパク質を含む。
【００２３】
本発明によれば、さらに、脊椎動物においてパピローマウイルス感染を防止または治療するための方法であって、本発明によるパピローマウイルスキャプソメア構造すなわちキャプソメア構造を含むワクチン産生物を、免疫生成管理に基づいて脊椎動物に投与することを含む方法が提供される。好ましい実施態様において、パピローマウイルスワクチンは野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１キャプシッドタンパク質を有する。
【００２４】
また、本発明の範囲内で、パピローマウイルス感染に対して脊椎動物を免疫感作するための方法であって、立体配座パピローマウイルスＬ１コード化配列を有する本発明の組み換え遺伝子構成を脊椎動物に投与し、前記コード化配列が前記脊椎動物の細胞または組織において発現できるようにすることで、パピローマウイルスに対して効果的な中和免疫応答を誘導することを含む方法が提供される。好ましい実施態様において、立体配座パピローマウイルスＬ１コード化配列は、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ１６から誘導される。特に好ましい実施態様において、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ１６は野生型パピローマウイルスである。
【００２５】
本発明のさらに他の態様によれば、脊椎動物におけるパピローマウイルス感染に対するヒトの液性免疫を検出するための方法であって、（ａ）パピローマウイルスキャプソメア構造の少なくとも１つの立体配座エピトープを有するパピローマウイルスキャプシッドタンパク質を抗体検出に有効な量で供給するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のペプチドを、パピローマウイルス感染についての検査対象となる脊椎動物から得られた体液の標本と接触させ、前記標本に含有されるパピローマウイルス抗体がこれに結合して抗原−抗体複合体を形成させるステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の複合体を、検出可能に標識した免疫グロブリン結合試薬と接触させるステップと、（ｅ）前記複合体に結合する標識した免疫グロブリン結合試薬によって前記標本中の抗パピローマウイルス抗体を検出するステップと、を含む方法が提供される。本発明のこの態様の好ましい実施態様において、ペプチドは本質的にパピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質からなる。他の実施態様において、ペプチドは本質的にヒトパピローマウイルスＨＰＶ１６の発現産生物からなる。特に好ましい実施態様において、ペプチドは本質的に野生型ヒトパピローマウイルスＨＰＶ１６遺伝子の発現産生物からなり、例えばこのペプチドは本質的に配列番号２の発現産生物からなる。
【００２６】
本発明のさらに他の態様によれば、パピローマウイルスの感染が疑わしい動物由来の標
本においてパピローマウイルスを検出するための方法であって、前記パピローマウイルスのキャプシッドの立体配座エピトープの１つまたは複数に対する特異性を有する抗体と標本とを接触させるステップであって、抗体は検出可能なシグナルを発生させる標識を有し、あるいは検出可能に標識された試薬に結合されるステップと、抗体をパピローマウイルスに結合できるようにするステップと、検出可能なラベルによって標本中に存在するパピローマウイルスの存在を決定するステップと、を含む方法が提供される。
【００２７】
本発明のさらに他の態様によれば、パピローマウイルスの感染が疑わしい動物におけるパピローマウイルスに対する細胞免疫応答を決定するための方法であって、前記動物の免疫適格細胞と野生型の組み換えパピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質すなわち本発明の結合された組み換えＬ１およびＬ２キャプシッドタンパク質とを接触させるステップと、キャプシッドタンパク質に対する前記細胞の増殖によってパピローマウイルスに対する細胞性免疫を評価するステップとを有する方法が提供される。本発明のこの態様の好ましい実施態様にいおいて、組み換えパピローマウイルスタンパク質を動物の皮膚に導入する。
【００２８】
本発明のさらに別の態様によれば、本質的にパピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質からなるキャプソメア構造またはパピローマウイルスＬ１タンパク質およびＬ２キャプシッドタンパク質を含むキャプソメア構造、またはこれらのキャプソメア構造のいずれかに対する抗体を単体または組み合わせで有し、単一包装のパッケージ容器にパピローマウイルスに対する体液性または細胞性免疫についてのアッセイを実施するための材料と共に備えるパピローマウイルス感染診断キットが提供される。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、組み換え立体配座パピローマウイルスタンパク質と、その産生および使用方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
我々は、ＢＰＶまたはＨＰＶ１６のＬ１主要キャプシッドタンパク質をコード化する遺伝子は、適当な転移ベクターによって宿主細胞に導入された後に、高いレベルでＬ１を発現することができ、また組換えＬ１は自己組み立てされて、そのままのビリオンのキャプシッド構造物に極めてよく似た無核キャプッシド構造物を形成する能力を本質的に有することを発見した。
【００３１】
さらに、本発明の自己組み立てされた組換えＬ１キャプシッドタンパク質は、組換え細菌より抽出したＬ１タンパク質や変性型ビリオンとは異なり、パピローマウイルス感染症から守ることができる多量の中和抗血清を誘導する能力において、インタクトなパピローマウイルス粒子と同じ有効性を有する。本発明におけるキャプシッドタンパク質の高レベルの免疫原性は強い抗体結合性を意味し、それにより、本タンパク質は血清学的スクリーニング検査で立体配座ビリオンエピトープに対する抗体を検出し測定するための感応剤となる。また、この免疫原性により、本発明のキャプッシドタンパク質はパピローマウイルスによる感染症から宿主動物を守る高効果ワクチンまたは中和抗体を誘引する免疫原として使用することもできる。これら見解は最近Ｋｉｒｎｂａｕｅｒらによって報告され(1992)、米国出願番号０７／９４１，３７１の根拠になった。
【００３２】
今回我々は、良性のパピローマウイルス病変より単離された野生型ＨＰＶ１６ゲノムから発現されるキャプシッドタンパク質Ｌ１は、前述のバキュロウイルス系で発現された場合、これまで明らかにされていない効果によって自己組み立てされ、ウシパピローマウイルスＬ１キャプシッドタンパク質が有する効果に匹敵することを明らかにした。
【００３３】
＜１＞ＨＰＶ１６  Ｌ１遺伝子の塩基配列
ＨＰＶ１６  Ｌ１  ＤＮＡ源は、例えばＺｈｏｕら(1991)が報告した研究で開示された通り、プロトタイプクローン、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｋ０２７１８で、子宮頚部癌より単離されている（Ｓｅｅｄｐｒｆら、1985)。我々は、野生型ＨＰＶ１６ゲノム由来のＬ１は、単一点での突然変異によりプロトタイプゲノムとは異なるが、ＢＰＶ１またはＢＰＶ  Ｌ１／Ｌ２でみられる効果と同様の効果により、自己組み立てされてウイルス様粒子を形成する。プロトタイプＨＰＶゲノム由来のＬ１をＬ２と共に使用した場合に見られる自己組み立てと比較すると、野生型ゲノム由来のＬ１は少なくとも100倍以上の効率で自己組み立てされる。
【００３４】
種々のＨＰＶ１６  Ｌ１発現産物の自己組み立て効率を遺伝子レベルで考察するため、良性病変及び異形成もしくは癌関連病変の両者より単離したＨＰＶ１６  Ｌ１遺伝子のオープンリーディングフレームについて塩基配列を調べた。
分析の結果、プロトタイプ株の報告されているＬ１の塩基配列の内、下記の通り2箇所にエラーが検出された。
【００３５】
(1) ｎｔ６９０２とｎｔ６９０３の間に3つのヌクレオチド(CAT)の挿入がなければならない、これはＬ１タンパク質中にセリンの挿入をもたらす。
【００３６】
(2) 報告されているプロトタイプ塩基配列中には、Ｌ１タンパク質の配列からアスパラギン酸を欠失させる、nt6952-6954からなる3つのヌクレオチドの欠失がなければならないが、nt5637-7155からなるプロトタイプＨＰＶ１６  Ｌ１ゲノムの正確なヌクレオチド配列は配列番号１のヌクレオチド配列で、配列表に掲載されている。
【００３７】
配列番号１中のヌクレオチド塩基の番号付けは、1番から始めており、報告されているＨＰＶ塩基配列のヌクレオチド塩基の番号付けは、nt5638-7156の配列であるが、配列表の1-1518に対応している。従って元の塩基配列中で対応する部位は当業者により容易に同定される。
【００３８】
この他3つのＨＰＶ１６  Ｌ１ゲノム、クローン16PAT及びクローン114/16/2及びクローン114/16/11について塩基配列を調べて、これらの塩基配列を、修正したプロトタイプの配列と比較した。
【００３９】
クローン16PATはUniversity of Rochester School of MedicineのDennis McCance氏より供与されたもので子宮頚部の異形成(前悪性)病変よりクローニングされたものであるが、効率的な自己組み立てを行わないＬ１を発現する。
【００４０】
クローン114/16/2及び114/16/11はハイデルベルク German Cancer Research CenterのMatthias Du"rst氏より供与されたものであるが、非悪性病変よりクローニングされ両者とも効率的に自己組み立てされるＬ１を発現する。
【００４１】
＜２＞異形成、悪性進行癌及び良性病変に関連するＨＰＶ１６  Ｌ１遺伝子の特徴の比較
パピローマウイルス感染異形成病変より単離したクローン16PATと、悪性子宮頚部癌より単離したプロトタイプＨＰＶ１６は両者ともnt6242-6244の位置でヒスチジンをコード化しているのに対し、良性のパピローマウイルス感染病変より単離したクローン2及び11は(他の多くのパピローマウイルスと同様に)同位置でアスパラギン酸をコード化している。
【００４２】
プロトタイプ、悪性関連のＨＰＶ１６種と良性病変由来のＨＰＶ１６種との間にあるこのただ一個のアミノ酸の違いにより、自己組み立ての効率に差が生じているのは明かであ
る。きわめて近縁のＨＰＶタイプの間では、この場所にアスパラギン酸があることが効率的な自己組み立てを得るのに必要で、アスパラギン酸をヒスチジンに置き換えるとキャプシッドタンパク質からこの能力が失われる。悪性関連ウイルスにおいてキャプシッド組み立てが失われることは、中和抗体産生に必要な立体配座エピトープの喪失と関連しており、またこれはパピローマウイルスが免疫制御を逃れるための免疫原性の低下と関係していると思われる。
【００４３】
従って、効率的に自己組み立てされるキャプシッドタンパク質を発現するHPV Ｌ１遺伝子は、(1) パピローマウイルス感染症の良性病変から野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１のオープンリーディングフレームを単離するか、または(2) プロトタイプ塩基配列のnt6242-6244部位でアスパラギン酸をコード化する様に部位特異的突然変異を行うことにより得ることができる。
【００４４】
＜３＞組換えキャプシッドタンパク質
本発明の方法により、任意のパピローマウイルスの組換えキャプシッド粒子も調製することができる。Ｌ１またはＬ２キャプシッドタンパク質のいずれか一方のみ、またはＬ１及びＬ２キャプシッドタンパク質の両者からなる粒子を調製することができる。Ｌ１/Ｌ２キャプシッドタンパク質粒子は天然のパピローマウイルスビリオンの組成とより一層密接に関係するが、おそらくＬ２のほとんどはキャプシッド構造内でＬ１よりも内部にあるため、Ｌ２はＬ１ほど免疫に関して重要とは思われない。Ｌ２が存在しなくてもＬ１は自身で自己組み立てされることが出来るが、自己組み立てされたＬ１/Ｌ２キャプシッドタンパク質粒子はさらに天然のパピローマウイルスビリオンの組成と密接に関係している。従って、Ｌ１のみを含む粒子の方がより単純であり、Ｌ１／Ｌ２を含む粒子の方が一層真正の構造を有していると思われる。自己組み立てされたＬ１及びＬ１／Ｌ２粒子は両者とも高力価の中和抗体を誘導し、従ってワクチン産生に適している。野生型ＨＰＶゲノムにより発現されるＬ１キャプシッドタンパク質を含む粒子は、Ｌ１のみの場合でもＬ１／Ｌ２のいずれの場合でも、特に望ましい。
【００４５】
組換え型Ｌ１またはＬ１／Ｌ２結合キャプシッド粒子の作成はＬ１(またはＬ１及びＬ２)遺伝子を適当なベクターにクローニングしてベクターを形質転換した真核細胞内で両タンパク質に対応する立体配座をコード化する塩基配列を発現させることにより行う。キャプシッド様構造を形成する能力はキャプシッドタンパク質が高力価の中和抗体を産生する能力と密接に関係しており、自己組み立てされて立体配座エピトープを有するキャプシッド構造を形成させる能力を持つキャプシッドタンパク質を産生するためには、実質的に全てのキャプシッドタンパク質をコード化する塩基配列を発現させなければならないと思われる。従って、実質的に全てのキャプシッドタンパク質をコード化する塩基配列がクローニングされる。遺伝子は、真核細胞系で発現されるのが望ましい。昆虫の細胞は望ましい宿主細胞であるが、適当な酵母発現ベクターが使用される場合は酵母細胞も宿主細胞として適切である。同様に適当な哺乳動物発現ベクターを用いて形質転換した哺乳動物細胞も組み立てされたキャプシッドタンパク質を産生するために用いることができるが、哺乳動物培養細胞は非哺乳動物細胞よりも哺乳動物に感染する可能性のある未知のウイルスを有していると思われるため、哺乳動物培養細胞は余り有利ではない。
【００４６】
好ましいプロトコールに従えば、バキュロウイルス系が使用される。クローニングされる遺伝子、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ１）またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ１６）Ｌ１キャプシッドタンパク質またはヒトパピローマウイルスＨＰＶ１６  Ｌ１及びＬ２をコード化する実質的にすべの塩基配列を、フランキングバキュウロウイルス配列を含むバキュロウイルス転移ベクターに挿入して遺伝子構築物を形成し、組換えＤＮＡを野生型バキュロウイルスＤＮＡと共に実施例1記載のSf-9昆虫細胞に同時形質転換させて感染時に挿入遺伝子を大量に発現することの出来る組換えウイルスを作成する。実際のタン
パク質産生は新しい昆虫細胞を組換えバキュロウイルスに感染させることよって行う。従って、Ｌ１キャプシッドタンパク質及びＬ１及びＬ２キャプシッドタンパク質は、実施例2に記載されている通り組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞内で発現される。
【００４７】
実施例1の操作では、BPV1の全Ｌ１遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR; Saikiら、1987)により増幅し、AcMNPV(Autographa californica 核多角体病ウイルス)に基づくバキュロウイルスベクター(Summers. M.ら、1987)内にクローニングした。Ｌ１オープンリーディングフレームをバキュロウイルス ポリヘドリンプロモーターの制御下においた。Ｌ１クローンを野生型(Wt)バキュロウイルスＤＮＡと共にSf-9昆虫細胞(ATCC Accession No. CRL 1711)内に同時形質転換して組換えクローンのプラークを精製した後、高力価の組換えウイルスが生産された。Wt AcMNPVまたはBPV1 L1組換えウイルス(AcBPV-L1)を感染させた細胞の抽出物(実施例2)をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。クーマシーブルー染色後、AcBPV1-L1ウイルスを感染させた培養物の抽出物中に、予想したサイズ55キロダルトンのユニークなタンパク質が検出された。このタンパク質のBPV Ｌ１との同定はBPV Ｌ１特異的モノクローナル抗体(Nakai.Y.ら、1986)を用いたイムノブロットにより確認した。即ち、組換えウイルスによるBPV Ｌ１の発現が感染昆虫細胞溶解物のSDS-PAGE電気泳動によって認められた。
【００４８】
パピローマウイルスＬ１が異種細胞内に過剰発現された場合、自己組み立てされてウイルス様粒子を形成するという仮説を確かめるために、AcBPV-Ｌ１感染細胞の薄切片を電子顕微鏡下で観察してパピローマウイルス様構造物の存在を調べた。ＢＰＶ組換えウイルスを感染させた細胞が選択的に核内に局所化した多くのおよそ50nmの環状構造物を含み、これらの構造物は野生型バキュロウイルス感染細胞からは認められなかった。in vivo パピローマウイルスビリオンの組み立ては核内で起こること、ビリオンの直径は55nmと報告されていることから、これらの結果からＬ１のウイルス様粒子への組み立てが起こったことが示唆された。
【００４９】
宿主細胞内で形成したキャプシッドタンパク質の発現後、実施例4記載の通りウイルス粒子を感染細胞の溶解物から精製した。さらにＬ１タンパク質が自己組み立てされた証拠を得るために、勾配遠心により感染昆虫細胞からウイルス様粒子を単離した。真正のＢＰＶビリオンと比較し、電子顕微鏡により精製組換えＢＰＶ  Ｌ１及びＨＰＶ１６  Ｌ１キャプシッドタンパク質の構成が示された。
【００５０】
高分子量の構造物を、40%ショ糖中の遠心分離によりＬ１組換えまたは野生型感染細胞の溶解物から分離し、沈澱物に対してCsCl密度勾配遠心分離を行った。分画を集めて、イムノブロットによりＢＰＶ  Ｌ１特異性モノクローナル抗体に対する反応性を調べた。
【００５１】
勾配から得たＬ１陽性分画を炭素膜格子に吸着させ、1%酢酸ウラニルで染色して透過型電子顕微鏡で観察した。電子顕微鏡観察では、陽性分画は、たくさんのキャプソメアが規則的に配置されている環状構造を含んでいた。ウイルス様粒子のピークを含むCsCl分画の密度はおよそ1.3mg/mlで、前報の無核ＢＰＶビリオン(Larsen.P.ら、1987)の密度と一致した。もっと小さな環状物及び部分的に組み立てされた構造物も見られたが、多くは直径がおよそ50nmであった。電子顕微鏡では、大きい方の粒子のサイズ、サブユニット構造が感染性ＢＰＶビリオンときわめてよく類似しており、染色と写真撮影を同時に行った。これらの粒子は非感染またはWtAcMNPV感染細胞の調製物中では認められなかった。これらの結果より、BPV Ｌ１は、Ｌ２または他のパピローマウイルスタンパク質非存在下で組み立てされてウイルス様粒子を形成する能力を本質的に有することが示唆された。さらに、分化している上皮または哺乳動物細胞に制限される特異的因子はパピローマウイルスキャプシッドの組み立てに必要ではなかった。
【００５２】
昆虫細胞内での自己組み立て能がパピローマウイルスＬ１の一般的性質であるかどうかを調べるため、ＨＰＶ１６(ヒト性器癌において最も多く検出されるＨＰＶタイプ)のＬ１も、類似の組換えバキュロウイルスにより発現させた。SDS-PAGEにより、予想された58kdのサイズのタンパク質がＨＰＶ１６  Ｌ１組換えウイルスを感染させた昆虫細胞内で大量に発現された。このタンパク質はイムノブロット上でＨＰＶ１６  Ｌ１モノクローナル抗体と強く反応した。このモノクローナル抗体は見かけの分子量がおよそ28kdからおよそ48kdの範囲にある別の5つのバンドをも僅かに染色した。この抗体はBPV Ｌ１とも若干反応し、従ってこの抗体は同イムノブロット上でＢＰＶの55kdのタンパク質を僅かに染色した。CsCl勾配精製後、免疫反応分画を電子顕微鏡で観察し、電子顕微鏡上で本分画に50nmのパピローマウイルス様粒子が含まれていることが認められた。BPV Ｌ１調製物に比べるとヒトの系では、いくらか不完全で小さな組み立て粒子が見られたが、おそらくこれは、発現の量が少ないか、かなりの程度のＨＰＶ１６  Ｌ１の分解(SDS-PAGE上で見られた)のためであり、この結果からＨＰＶ１６のＬ１及びおそらく他のタイプのＬ１タンパク質は組み立てされてビリオンタイプの構造物を形成する能力を本質的に有していることが示唆される。また、実施例に記載の通り、アカゲザルPVの組換えパピローマウイルスキャプシッド粒子の調製も行った。
【００５３】
＜４＞免疫原としての組換え配座キャプシッドタンパク質
異種細胞内で合成された自己組み立て主要キャプシッドタンパク質に基づくサブユニットワクチンはヒトB型肝炎を含む多くの病原ウイルスによる感染の予防に有効であることが明らかにされている(Stevens.C.ら、1987)。非感染性またはホルマリン不活性化ＢＰＶはワクチンとして有効であるがＢＰＶ形質転換細胞は有効ではないことを明らかにする研究により、初期の遺伝子産物よりもウイルスキャプシドタンパク質は免疫応答を誘引することが示唆されている。他の論文のデータからも、細菌から抽出されたＬ１タンパク質は中和抗体の力価が低いにもかかわらず一部免疫応答を誘引することが示唆されている。従って、昆虫細胞内で発現してウイルス様粒子に組み立てられるBPV Ｌ１について家兎中の中和抗体を誘導する能力を調べた。2種類の調製物について試験を行った。それらは、Ｌ１組換えまたは野生型感染Sf-9細胞の全細胞抽出物と種々の遠心分離及び硫安沈澱により単離した部分的精製粒子である。1次接種後、家兎に隔週毎に2回追加接種を行った。
【００５４】
家兎血清を、マウスC127細胞へのＢＰＶの感染を阻害する能力について、標準量のＢＰＶウイルスから誘導されるフォーカス数の減少を測定することにより、調べた。代表的なアッセイを行い、組換えBPV Ｌ１を接種した動物で誘導される中和抗血清の力価を生のＢＰＶビリオン及び変性ＢＰＶビリオンに対する抗血清と比較した。バキュロウイルス由来Ｌ１を接種して作成した免疫血清では、少なくとも1:11,000希釈(力価11,000; 表1)でＢＰＶウイルスの感染性を50%減少させることができたが、同じ家兎の免疫前血清では最も低い希釈試験である1:20の希釈率でもフォーカス形成形質転換を阻害できなかった。粗調製物及び部分精製粒子は高力価中和抗体を含み、最高力価が測定値で290,000であり、共に有効であった。この値は感染性ＢＰＶビリオンに対する陽性コントロール抗血清の中和力価と同じ値であって、これと比較して、細菌で誘導したＬ１を用いた前報の試験での最高力価は36であった(Pilancinski.W.ら、1984)。野生型バキュロウイルス感染細胞からの抽出物を接種した家兎から得た血清では、1:20の希釈率で感染性を阻害することができなかったことから、中和活性はＬ１に特異的であることが示唆された。1%SDS中で煮沸して部分精製Ｌ１粒子を破砕したところ、調製物は中和抗体を誘導する能力を失った(表1)。Ｌ１は自己組み立てされてビリオン様粒子を形成することができ、誘導する中和抗体の力価が少なくとも以前のin vitro産生抗原よりも３桁高いことから組換えＬ１キャプシッドタンパク質は自然に伝染したパピローマウイルスに対して効果的な長期間の抑制効果を誘導する能力を潜在的に有することが示唆される。これらの結果から、昆虫細胞内で組み立てされたＬ１粒子は立体配座依存性の免疫優性エピトープの提示において感染性ウイルスに近い形状になることが明らかである。またこれらの結果から、Ｌ２は高力価の中和抗体
の産生には必要ないことが明かである。細菌により誘導されたＬ１の中和免疫原性が弱いことが報告されたが、これはコンフォメーションが適切ではなく、また組み立てされてビリオン様構造物を形成しないと思われることが原因である。また、Ｌ１の多数の電気泳動的変異体がビリオン内で検出された(Larsen.P.ら、1987)。これら修飾物のいくつかはおそらく細菌により誘導されたＬ１内には存在しないと思われるが、これは中和抗体の産生を促進すると思われる。
【００５５】
ここで開示された高力価の中和抗血清を誘導する組換えＬ１(またはＬ２)パピローマウイルスキャプシッドタンパク質は伝染性乳頭腫症に対する予防のためのワクチンとしての使用するのに適した能力を有している。危険な状態にある集団で、免疫処置により恩恵を受けることの出来る集団の例は乳頭腫疣贅の恐れのあるウシの群、非生殖器型のＨＰＶ感染に対する全てのヒト、及び生殖器型ＨＰＶの感染に対する性的活動性のあるヒトである。
【００５６】
治療目的のワクチン処理は、通常Ｌ１(及びＬ２)キャプシッドタンパク質を発現する生産的パピローマウイルス病変に対して有用であり得る。このような病変は疣贅または咽頭乳頭腫症などの良性感染症に最も発症しやすい。新生児の咽頭乳頭腫症は通常、ちつ分泌物内に感染性のパピローマウイルスが存在する産道内を幼児が通過する際に伝染する。パピローマウイルスに対する感染症の妊娠婦人への治療目的のワクチン処理により、胎盤関門を通過し、胎児の循環系に入ってこの種のパピローマウイルス感染症に対する幼児への予防的受動免疫を行う能力を有する中和IgG抗体を誘導することができる。さらにちつ液や乳汁に分泌される母性IgAにより幼児保護機構が供給される。Jarrett(1991)はＢＰＶ誘導性疣贅の治療時に働くＬ２の何等かの有効性を示した。一般に悪性腫瘍はＬ１またはＬ２を発現せず、子宮頚部癌などの状態における組換えＬ１またはＬ２でのワクチン処理の有効性については明らかにされていない。
【００５７】
良性及び悪性パピローマウイルス疾患に対する保護免疫は組換えＬ１キャプシッドタンパク質の有効量をパピローマウイルス感染症の恐れのある個体に投与することによって誘導される。
【００５８】
キャプシドタンパク質を含むワクチンは、従来の免疫処置プロトコルに従って、非経口的あるいは局所的に直接投与される。もう一つの実施態様では、立体配座をコードするＬ１の塩基配列を転移ベクター、例えば(軽度の一過性感染を引き起こす)セムリキ森林ウイルスベクターにクローニングされ、組換えウイルスは、受容体の細胞または組織内に導入され、そこで免疫化キャプシッドタンパク質が発現される。ワクシニアウイルスもまた遺伝子ビヒクルとして使用できる。
【００５９】
＜５＞血清学的スクリーニング剤としての組換え形成キャプシッドタンパク質
パピローマウイルスビリオンタンパク質に対するヒト免疫応答に関する公知の血清検査では、原則として細菌で誘導したＬ１およびＬ２キャプシッドタンパク質を利用しており、その結果は他のＨＰＶ感染症の測定（Ｊｅｎｉｓｏｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０）とはあまりよい相関関係にはない。上記のＢＰＶパピローマウイルス免疫検査により、細菌より抽出されたパピローマウイルスビリオンタンパク質は、タイプ特異的で多くの中和抗体により認識される立体配座依存性エピトープを提示しないことが示唆されている。主に線状エピトープを認識するこのようなアッセイと比較すると、自己組み立てされるＬ１粒子を用いた血清検査は、ヒトの集団において抗ＨＰＶビリオン免疫性の程度をさらに正確に測定すると思われる。従ってここに開示された組換えＬ１キャプシドタンパク質は立体配座エピトープを提示しており、いくつかのタイプの結合アッセイにおいてパピローマウイルスに対する中和抗体を与える免疫性を検出するための特異性の高い診断薬として使用できる。その操作方法は、一般に抗原抗体対中のキャプシッドタンパク質と特異的に結
合する体液中の抗体を検出する手段を提供する固相あるいは液相アッセイとして行われる。循環抗体を評価するための当業者間で公知の手順の例として、二重抗体ラジオイムノアッセイおよび酵素イムノアッセイなどの液相アッセイや、ストリップラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティングおよびＧａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第４，５２０，１１３号酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｓｋｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，０３９，６０７号に開示されているｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃアッセイなどが挙げられる。抗体の検出用として好ましいＥＬＩＳＡ法は、Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．著、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８，ｐｐ．５６３〜５７８に開示されているようなものである。
【００６０】
ここに開示の組換えＬ１またはＬ１／Ｌ２キャプシッドタンパク質を使用し、例えばＢｒａｄｌｅｙ，Ｌ．，１９８０に開示の抗原誘導Ｔ細胞増殖応答や、特にＳｔａｒｌｉｎｇに付与された米国特許第５，０８１，０２９ウイルス抗原に対する細胞応答などのin vivo あるいはin vitroのアッセイによってパピローマウイルスに対する細胞性免疫を測定することもできる。パピローマウイルスに対する細胞性免疫は、Ｓｔｉｔｅｓ，Ｄ．，１９８０に開示されているような従来のin vivo遅延型過敏性反応皮膚試験や、組換えＨＰＶ  Ｌ１融合タンパク質の皮内注射によるＨｏｐｆｌ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１に開示されている好ましい方法によっても特定することができる。
また、本発明のキャプシッドタンパク質を免疫原として使用し、周知の方法によって多クローン性あるいは単一クローン性抗体を得ることもできる。これらのパピローマウイルス特異抗体は、特に抗体のクラスや種に特異的な第２の標識抗体と組み合わせて、免疫組織化学などの様々な周知のアッセイ手順に基づいて、体の組織や体液の標本中におけるキャプシッドタンパク質の存在の検出に診断的に利用することもできる。
【実施例】
【００６１】
後述の遺伝子操作は、本発明による遺伝子調節ユニットの要素の調製に対する一般的な用途について述べたものである。上述したように、場合によっては上述の範囲内に含まれる各組換え分子にこの手順を利用できないこともある。このような状態が起こる状況は、当業者らによって簡単に知ることができる。このような場合はいずれも、例えば適当な代替制限酵素の選択、他の周知の試薬への変更、反応条件の日常的な修正など、当業者間で周知の修正法によって操作を成功させる。一方、ここに開示の他の手順や周知の手順なども、本発明の対応の組換え分子の調製に適用することもできる。どの調製方法でも、開始物質は周知のものであるか、あるいは周知の開始物質から簡単に調製可能なものである。後述の実施例において、特に記載のない限りは温度はいずれも摂氏であり、部およびパーセントは重量部および重量パーセントを意味する。
【００６２】
さらに労力を要せず、当業者は、上述の開示内容を使用して、本発明を最大限に利用することができる。従って、以下の好ましい実施例は単に一例にすぎず、開示内容の残りの部分を限定するものではない。
【００６３】
＜１＞実施例１
ＢＰＶ１  ＤＮＡのクローニングしたプロトタイプ（Ｃｈｅｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８２），ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｓｓｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ０２３４６またはＨＰＶ１６  ＤＮＡ（Ｓｅｅｄｏｒｆ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８５）ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｎｏ．Ｋ０２７１８、あるいは野生型ＨＰＶ１６  ＤＮＡ（配列番号２）をテンプレートとして使用して、完全長のＬ１あるいはＬ１およびＬ２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＰＣＲによって増幅した。単一の制限部位をオリゴヌクレオチドプライマーに組み込んだ（各配列において、６番目〜１１のヌクレオチド）。
【００６４】
ＢＰＶ１−Ｌ１プライマー
（配列番号３）
5'-CCGCTGAATTCAATATGGCGTTGTGGCAACAAGGCCAGAAGCTGTAT-3'
（センス）
（配列番号４）
5'-GCGGTGGTACCGTGCAGTTGACTTACCTTCTGTTTTACATTTACAGA-3'
（アンチセンス）
【００６５】
ＨＰＶ１６−Ｌ１プライマー
（配列番号５）
5'-CCGCTAGATCTAATATGTCTCTTTGGCTGCCTAGTGAGGCC-3'
（センス）
（配列番号６）
5'-GCGGTAGATCTACACTAATTCAACATACATACAATACTTACAGC-3'
（アンチセンス）
【００６６】
Ｌ１コード化配列は、ＢＰＶ１については第１メチオニンコドン（１５〜１７番目の塩基）、ＨＰＶ１６については第２メチオニンコドンで開始する。ＢＰＶ１−Ｌ１を５´−ＥｃｏＲＩ〜３´−ＫｐｎＩ断片として、ＨＰＶ１６−Ｌ１を５´−ＢｇｌＩＩ〜３´−ＢｇｌＩＩ断片として、ＡｃＭＮＰＶベースのバキュロウイルス転移ベクターｐＥＶｍｏｄ（Ｗａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１）のポリヘドリン遺伝子プロモーターの多重クローニング部位の下流にクローニングし、ＡｃＭＮＰＶ／Ｌ１接合部を通る配列決定によって確認した。ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）（Ｈａｒｔｉｇ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１）を使用して、２μｇの量のＣｓＣｌ精製組換えプラスミドを１μｇの野生型ＡｃＭＮＰＶ  ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共にＳｆ−９細胞（ＡＴＣＣ）に同時トランスフェクションし、組換えバキュロウイルスを上述したようにプラーク精製した（Ｓｕｍｍｅｒｓ．，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。
【００６７】
＜実施例２＞
昆虫細胞中でのＬ１タンパク質またはＬ１／Ｌ２タンパク質の発現
ｗｔ  ＡｃＭＮＰＶ（ｗｔ）またはＡｃＢＰＶ−Ｌ１（Ｂ−Ｌ１）、ＡｃＨＰＶ１６−Ｌ１（１６−Ｌ１）またはＡｃＨＰＶ１６−Ｌ１（１６−Ｌ１）およびＡｃＨＰＶ１６−Ｌ２（１６−Ｌ２）組換えウイルスによって、Ｓｆ−９細胞を疑似感染（疑似）させるかあるいは１０の感染多重度で感染させた。７２時間後、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液において煮沸することによって細胞を溶解し、１０％ゲル内でライゼートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。タンパク質を０．２５％クーマシーブルーで染色するか、免疫ブロッティングしてＢＰＶ  Ｌ１ｍＡｂ  ＡＵ−１（Ｎａｋａｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８６）またはＨＰＶ１６  Ｌ１  ｍＡｂ  ＣＡＭＶＩＲ−１（ＭｃＬｅａｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、125Ｉ標識Ｆａｂ抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でプローブした。Ｐは、ポリヘドリンタンパク質を示す。抗ＢＰＶ  Ｌ１ｍＡｂは予測した５５ｋｄのタンパク質を認識した。抗ＨＰＶ  １６Ｌ１ｍＡｂは予測した５８ｋｄのタンパク質を強く染色すると共に、上述したように分子量がこれよりも小さい５つのバンドも淡く染色した。また、上述したように、この抗ＨＰＶ１６  Ｌ１は、ＢＰＶ  Ｌ１タンパク質と若干交差反応した。
【００６８】
＜実施例３＞
抗血清の製造
家兎に対し、凍結／溶解を１サイクル行い２０×ダウンス ホモジェナイズ処理をすることにより調製した全細胞Ｓｆ−９溶解物（３×１０7 細胞)(家兎＃１，２および８）、
または分画遠心分離および３５％硫安沈澱により部分精製したＬ１タンパク質２００μｇ（＃３、４、６および７）を、完全フロイントアジュバント中に添加したものを皮下より注入して免疫し、次に不完全フロイントアジュバント中に同様の調製物を添加したものを用いて２週間間隔で２回追加免疫を行った。
【００６９】
＜実施例４＞
粒子の精製及び透過型電子顕微鏡による解析
Ｓｆ−９細胞（２×１０6 ／ｍｌ）５００ｍｌにＡｃＢＰＶ−Ｌ１またはＡｃＨＰＶ１６−Ｌ１またはＡｃＨＰＶ１６−Ｌ１／Ｌ２（１６−Ｌ１／Ｌ２）組換え体バキュロウイルスを感染させた。７２時間後、回収した細胞をＰＢＳ中で６０秒間超音波処理した。低速清澄化後、溶解物を４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ショ糖／ＰＢＳクッションで、１１０，０００ｇで２．５時間遠心分離を行った（ＳＷ−２８）。再懸濁したペレットを１４１，０００ｇ、室温で２０時間、１０〜４０％（ｗｔ／ｗｔ）ＣｓＣｌ／ＰＢＳ勾配中で平衡になるまで遠心分離を行った。分画を底から回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った。免疫反応性分画をＰＢＳに対して透析し、セントリコン３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）限外濾過により濃縮し、（ＨＰＶ１６−Ｌ１の場合)エアーヒュージ（Ｂｅｃｋｍａｎ）でＡ−１００ローター中で１０分間３０ｐｓｉで遠心分離してペレットを形成させた。ＢＰＶ１ビリオンを記述通り(Cowsert,L.ら、1987)ウシ疣贅(A.B.Jenson氏より供与)より精製した。精製した粒子をカーボンコートＴＥＭグリットに吸着させ、１％酢酸ウラニルで染色してフィリップ電子顕微鏡ＥＭ４００Ｔにより倍率３６，０００倍で観察した。電子顕微鏡観察により結果が得られ、上記で考察したとおりである。
【００７０】
＜実施例５＞
ＢＰＶ１中和アッセイ
第２追加免疫３週間後に得られた血清の系列希釈物を約５００フォーカス形成単位のＢＰＶ１ウイルスと共に３０分間インキュベートし、ウイルスをＣ１２７細胞に１時間吸着させて、これらの細胞を３週間培養した(Dvoretzky,I.ら、1980)。フォーカスを０．５％メチレンブルー／０．２５％カルボルフクシン／メタノール液で染色した。結果は、フォーカスの数を評価して得た。考察は以下に行う。抗−ＡｃＢＰＶ−Ｌ１は家兎＃１より得られ、抗−ｗｔ  ＡｃＭＮＰＶは家兎＃８より得られた（表１）。１：４００に希釈した前免疫血清を標準として使用した。抗−ＡｃＢＰＶ−Ｌ１は希釈率１：４００または１：６００で実質的にフォーカスを消失したが、抗ｗｔ  ＡｃＭＮＰＶは希釈率１：４００または１：６００でフォーカスの数が上昇したように思われた。１：００希釈時の「ｎｒｓ」と表記した正常家兎血清のネガティブコントロールを抗ＢＰＶ−１ビリオンの標準として使用したところ、抗ＢＰＶ−１ビリオンは希釈率１：４００または１：６００で実質的にフォーカスを消失したと思われた。抗ＢＰＶ−１ビリオンは以前の研究(Nakai,Y.ら、1986)で、野生のＢＰＶビリオンに対して励起された。最後に、ダコは変性ＢＰＶビリオンに対して励起された市販の家兎抗血清(Dako Corp.,Santa Barbara, California)である。この血清は、見かけ上抗体を含まないコントロールよりも大量のフォーカスを発生させた。ネガティブコントロールとして、ウイルスを含まない検査では、実質的にフォーカスを発生しなかった。
【００７１】
＜実施例６＞
ＢＰＶ１に対する血清中和力価
実施例５と同様にしてアッセイを行った。家兎＃１、２および８に粗全細胞Ｓｆ−９溶解物を接種し、家兎＃３、４、６および７には部分精製したＬ１タンパク質（表１）を接種した。家兎＃６および７を、１％ＳＤＳ中で煮沸変性させたＬ１タンパク質調製物で免疫した。各家兎とも、２回目の追加免疫後３〜６週間後に少なくとも２回採血して検査を行ったところ、同一の抗体力価であることが認められた。各家兎の免疫前血清の力価は、２０より小さく、最も低い希釈率で検査した。
【００７２】
【表１】
2004208696.tif 000002
【００７３】
＜参考文献＞
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