(57)【要約】【課題】インテグリン阻害活性、高い構造安定性、及び結合特異性を有するアミノ酸を１個以上挿入、欠失、改変または、化学的に修飾したｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体、化合物を設計、評価、探索、同定する。また、その受容体を探索、同定する。【解決手段】本発明の課題は、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶と、その結晶を用いたＸ線による結晶構造解析によって決定されたｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標により解決される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の結晶。
【請求項２】
トリメスタチンが配列番号：１のアミノ酸配列を有する請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
結晶が単斜晶系で空間群Ｃ２を有する請求項１または２に記載の結晶。
【請求項４】
結晶の単位格子がａ＝４７．５Å、ｂ＝４８．１Å、ｃ＝３７．７Å、β＝１２６．８°である請求項３に記載の結晶。
【請求項５】
トリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の変異体、又はインテグリン阻害活性を有する化合物を、探索、設計、同定または評価するための、あるいは、その受容体を探索または同定するための表１に示したトリメスタチン３次元構造座標。
【請求項６】
請求項５記載の３次元構造座標を示すモデルを初期モデルとして、分子設計手段により、エネルギー的な安定性が向上した構造を有するトリメスタチン変異体を得ることを特徴とするトリメスタチン変異体の構造決定方法。
【請求項７】
請求項５記載の３次元構造座標を示すモデルを初期モデルとして、分子設計手段により、エネルギー的な安定性が向上した構造を有するインテグリン阻害活性を有する化合物を得ることを特徴とするインテグリン阻害活性を有する化合物の構造決定方法。
【請求項８】
（１）トリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の変異体またはインテグリン阻害活性を有する化合物を探索、設計、同定または評価するための、あるいは、その受容体を探索または同定するための請求項５に記載された３次元構造座標；
（２）請求項５に記載された３次元構造座標をモデルとして、分子置換法によって決定されたトリメスタチンの主要部分の主鎖及び、Ｃα炭素の位置との平均二乗偏差が２Å以下である３次元構造座標；及び
（３）請求項５に記載の３次元構造座標を示すモデルを初期モデルとして、分子設計手段により得られた、可能な限りエネルギー的に安定な構造を与える蛋白質または化合物の３次元構造座標；
から選択された全部または一部を格納しているコンピュータ用記憶媒体。
【請求項９】
（１）請求項５に記載の３次元構造座標；（２）請求項５に記載の３次元構造座標をモデルとして、分子置換法によって決定されたトリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の主要部分の主鎖及び、Ｃα炭素の位置との平均二乗偏差が２Å以下である３次元構造座標；（３）請求項５に記載の３次元構造座標であるモデルを初期モデルとして、分子設計手段により、エネルギー的な安定性が向上した構造を有する蛋白質または化合物の３次元構造座標；から選択された全部または一部の配列、あるいは請求項８に記載のコンピュータ記憶媒体から得られた情報に基づいて、アミノ酸を１個以上挿入、欠失、改変または、化学的に修飾することにより、インテグリン阻害活性を有し、高い結合特異性を有する構造を設計する工程を有することを特徴とするｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体またはインテグリン阻害活性を有する化合物を同定、探索、評価または設計、あるいはその受容体を探索または同定する方法。
【請求項１０】
分子置換法を用いた蛋白質結晶構造解析における、請求項５〜９のいずれかに記載の３次元構造座標の全部又は、一部の使用、及び請求項８に記載のコンピュータ記憶媒体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、結晶化されたトリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）蛋白質、そのアミノ酸配列の３次元構造座標及びその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
虚血性心疾患などの動脈硬化性疾患は死亡の原因となり得る病気であり、心筋梗塞における動脈硬化は血小板の凝集が原因となっている。血小板は、止血や血栓症において重要な役割をしており、血管内皮の損傷などでさまざまな生理学的物質によって活性化された結果、血小板糖蛋白質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（αＩＩｂβ３とも呼ばれる）の活性化によってフィブリノーゲンなどに網状に結合し凝集体を形成する（Ｋｌｅｉｍａｎ，  Ｔ．Ａ．等，  Ｗｉｌｅｙ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３，  Ｊｏｈｎ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｓｏｎｓ，  １７８４−１７９８（２００２）：非特許文献１）。
【０００３】
動脈硬化の治療法として、現在行われているのが風船型のカテーテルを閉塞部で膨らませる経皮的冠動脈介入術（ＰＣＩ）やバイパス手術などである。しかし、ＰＣＩの治療後に風船などでつけられた傷によって急性の血栓症や再狭窄が起こるなど問題点があり、現在まで血栓症を防ぐためにアスピリン（抗血小板剤）、ヘパリン（抗凝固剤）が使われてきたが、アスピリンは血小板凝集を弱く阻害するだけであった。それ以外の治療法に、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体であるｃ７Ｅ３（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）があり、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合し凝集を阻害する。臨床検査では従来のアスピリン、ヘパリンに比べて、より優れた成績を上げている。しかし、  ａｂｃｉｘｉｍａｂ  はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ  とフィブリノーゲンの結合部位であるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）には結合せず、立体阻害、コンフォメーションの効果によりレセプターへの分子の接近を阻害している（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｃ．  ，  Ｄｒｕｇｓ  Ｆｕｔ．，  ２０，  ４５７−６３（１９９５）：非特許文献２；Ｇｅｎａｔｔａ，  Ｔ．Ｂ．等，  Ａｎｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ３０，  ２５１−７（１９９６）：非特許文献３；  米国特許第５４４００２０号明細書：特許文献１）。
【０００４】
ＲＧＤ配列を含むペプチドがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合することにより効果的に、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの接着機能を阻害する。血小板の凝集を阻害する物質としてｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎがあり、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）やＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＫＧＤ）配列を蛇毒由来のｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎの多くは含んでいる（Ｐｌｏｗ，  Ｅ．Ｆ．等，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．，  ８２，  ８０５７−８０６１  （１９８５）：非特許文献４；Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ，  Ｓ．等，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．，  ３１，  ２８９−３００（１９９４）：非特許文献５）。Ｓｉｓｔｒｕｒｕｓ  ｍｉｌａｒｕｓ  ｂａｒｂｏｕｒｉの蛇毒（Ｂａｒｂｏｕｒｉｎ）は、ＫＧＤ配列をもつ７３残基のアミノ酸からなるｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎで、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに特異的で、環状にすると活性が高くなる。このＢａｒｂｏｕｒｉｎに基づいてデザインされたＥｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ（製品名：Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ）が現在市販されている（Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｒ．Ｍ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６８，  １０６６−７３（１９９３）：非特許文献６；  Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｒ．Ｍ．，  Ｄｒｕｇｓ  Ｆｕｔ．，  ２３，  ５８５−５９０（１９９８）：非特許文献７；米国特許第５９６８９０２号明細書：特許文献２）。
【０００５】
インテグリンとｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎの構造的な結合様式を明らかにすることによって、結合特異性及び、高い阻害活性を有する変異体、及び化合物を設計することが可能となる。現在、インテグリンαＶβ３とＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐとの複合体の立体構造が結晶化によるＸ線結晶解析で明らかにされており、ＡｒｇとＡｓｐが異なった方向に結合サイトがあることがわかっている（Ｘｉｏｎｇ，  Ｊ．Ｐ．等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９６，  １５１−１５５（２００２）：非特許文献８）。
【０００６】
また、米国特許第５５８７３６０号公報にはコラーゲンに結合することで血小板凝固を阻害する物質について開示されており、また、米国特許第５４９３０２０には、ペプチドではないαＩＩｂβ３の阻害物質について開示されている。
【０００７】
【特許文献１】
米国特許第５４４００２０号明細書
【特許文献２】
米国特許第５９６８９０２号明細書
【特許文献３】
米国特許第５５８７３６０号明細書
【特許文献４】
米国特許第５４９３０２０号明細書
【特許文献５】
特開平６−３０９３８５号公報
【０００８】
【非特許文献１】
Ｋｌｅｉｍａｎ，  Ｔ．Ａ．等，  Ｗｉｌｅｙ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｓｏｎｓ，  １７８４−１７９８（２００２）
【非特許文献２】
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｃ．  ，  Ｄｒｕｇｓ  Ｆｕｔ．，  ２０，  ４５７−６３（１９９５）
【非特許文献３】
Ｇｅｎａｔｔａ，  Ｔ．Ｂ．等，  Ａｎｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ３０，  ２５１−７（１９９６）
【非特許文献４】
Ｐｌｏｗ，  Ｅ．Ｆ．等，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．，  ８２，  ８０５７−８０６１  （１９８５）
【非特許文献５】
Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ，  Ｓ．等，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．，  ３１，  ２８９−３００（１９９４）
【非特許文献６】
Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｒ．Ｍ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６８，  １０６６−７３（１９９３）
【非特許文献７】
Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｒ．Ｍ．，  Ｄｒｕｇｓ  Ｆｕｔ．，  ２３，  ５８５−５９０（１９９８）
【非特許文献８】
Ｘｉｏｎｇ，  Ｊ．Ｐ．等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９６，  １５１−１５５（２００２）
【非特許文献９】
Ｒａｈｍａｎ，  Ｓ．等，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３３５，  ２４７−２５７（１９９８）
【非特許文献１０】
Ｐｆａｆｆ，  Ｍ．等，Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２，  ４９１−５０１（１９９４）
【非特許文献１１】
Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｃ．等，  Ｂｌｏｏｄ，  ９０，  １５６５−１５７５（１９９７）
【非特許文献１２】
Ｏｋｕｄａ，  Ｄ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １３０，  ４０７−４１５（２００１）
【非特許文献１３】
Ｗｙｃｋｏｆｆ，  Ｈ．Ｗ．等，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）
【非特許文献１４】
Ｗｙｃｋｏｆｆ，  Ｈ．Ｗ．等，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）
【非特許文献１５】
Ｙａｍａｄａ，  Ｍ．等，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２４３，  ３１０−３２６（１９９６）
【非特許文献１６】
Ｇａｂｂ，  Ｈ．Ａ．等，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２７２，  １０６−１２０（１９９７）
【非特許文献１７】
Ｌａｔｔｍａｎ，  Ｅ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ５５−７６（１９８５）
【非特許文献１８】
竹中章郎、勝部幸輝、笹田義夫訳、Ｊ．ドレント著、蛋白質のＸ線結晶解析法、シュプリンガー・フェアラーク東京、２０４−２２４（１９９８）
【非特許文献１９】
ＣＣＰ４（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，  Ｎｕｍｂｅｒ  ４），  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．，Ｄ５０，  ７６０−７６３（１９９４）
【非特許文献２０】
Ｎａｖａｚａ，  Ｊ．，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．，  Ａ５０，  １５７−１６３  （１９９４）
なお、非特許文献９〜２０については後述する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、Ｘ線結晶構造解析により解明されたｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ側の配列はＲＧＤを含む５残基のみであり、これだけでは結合特異性が説明できず、ＲＧＤの前後の配列及びＮ末端配列が、結合特異性や活性に関与していることが生化学的に証明されている（Ｒａｈｍａｎ，  Ｓ．等，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３３５，  ２４７−２５７（１９９８）：非特許文献９；  Ｐｆａｆｆ，Ｍ．等，Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２，  ４９１−５０１（１９９４）：非特許文献１０  ；  Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｃ．等，  Ｂｌｏｏｄ，  ９０，  １５６５−１５７５（１９９７）：非特許文献１１）。
【００１０】
そのため、ｄｉｓｉｎｔｅｇｉｒｎの機能を解明するためにはＲＧＤの前後の配列の構造様式を明らかにする必要がある。また、新たに設計した化合物が、副作用を引き起こしたり、異なる効果を示す可能性があるため、この化合物に結合するかどうかＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ以外の受容体との親和性をも調べる必要がある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記のような問題点を解決するためにトリメレスラス・フラボビリディス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）由来の蛇毒中に含まれるディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）であるトリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）を結晶化し、Ｘ線を用いた構造解析によりＲＧＤ配列の前後を含む配列の３次元構造座標を初めて決定したことにある。この３次元構造座標を用いることにより、動脈硬化等における血栓形成を防ぐための薬剤として有効であるインテグリン阻害剤を設計するにあたり、ＲＧＤ配列以外の部分の情報を用い、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合特異性を有し、阻害活性、及び構造安定性の高いｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体を同定、検索、評価または設計すること、ならびにその受容体を探索または同定することを可能にした。
【００１２】
更に、本発明はｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶を要旨とする。更に、本発明はｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体、インテグリン阻害活性を有する化合物を探索、設計、同定または評価、あるいはその受容体を探索または同定するために使用する表１に示した３次元構造座標を要旨とする。更に、本発明はｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体またはインテグリン阻害活性を有する化合物を探索、設計、同定または評価、あるいはその受容体を探索または同定するために使用する３次元構造座標の全部または、一部を格納しているコンピュータ用記憶媒体と、その使用を要旨とする。
【００１３】
更に、本発明は上記にあるアミノ酸配列、上記に記載の３次元構造座標の全部または一部の配列、上記にあるコンピュータ記憶媒体を使用することを特徴とするインテグリン阻害活性、高い構造安定性及び結合特異性を有する蛋白質または化合物を同定、探索、評価または設計、あるいはその受容体を探索、同定する方法を要旨とする。
【００１４】
すなわち、本発明には以下の各態様が含まれる。
（１）トリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の結晶。
（２）トリメスタチンが配列番号：１のアミノ酸配列を有する上記項目（１）に記載の結晶。
（３）結晶が単斜晶系で空間群Ｃ２を有する上記項目（１）または（２）に記載の結晶。
（４）結晶の単位格子がａ＝４７．５Å、ｂ＝４８．１Å、ｃ＝３７．７Å、β＝１２６．８°である上記項目（３）に記載の結晶。
（５）トリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の変異体、又はインテグリン阻害活性を有する化合物を、探索、設計、同定または評価するための、あるいは、その受容体を探索または同定するための表１に示したトリメスタチン３次元構造座標。
（６）上記項目（５）記載の３次元構造座標を示すモデルを初期モデルとして、分子設計手段により、エネルギー的な安定性が向上した構造を有するトリメスタチン変異体を得ることを特徴とするトリメスタチン変異体の構造決定方法。
（７）上記項目（５）記載の３次元構造座標を示すモデルを初期モデルとして、分子設計手段により、エネルギー的な安定性が向上した構造を有するインテグリン阻害活性を有する化合物を得ることを特徴とするインテグリン阻害活性を有する化合物の構造決定方法。
（８）（Ａ）トリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の変異体またはインテグリン阻害活性を有する化合物を探索、設計、同定または評価するための、あるいは、その受容体を探索または同定するための上記項目（５）に記載された３次元構造座標；
（Ｂ）上記項目（５）に記載された３次元構造座標をモデルとして、分子置換法によって決定されたトリメスタチンの主要部分の主鎖及び、Ｃα炭素の位置との平均二乗偏差が２Å以下である３次元構造座標；及び
（Ｃ）上記項目（５）に記載の３次元構造座標を示すモデルを初期モデルとして、分子設計手段により得られた、可能な限りエネルギー的に安定な構造を与える蛋白質または化合物の３次元構造座標；
から選択された全部または一部を格納しているコンピュータ用記憶媒体。
（９）  （ａ）上記項目（５）に記載の３次元構造座標；（ｂ）上記項目（５）に記載の３次元構造座標をモデルとして、分子置換法によって決定されたトリメスタチン（ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ）の主要部分の主鎖及び、Ｃα炭素の位置との平均二乗偏差が２Å以下である３次元構造座標；（ｃ）上記項目（５）に記載の３次元構造座標であるモデルを初期モデルとして、分子設計手段により、エネルギー的な安定性が向上した構造を有する蛋白質または化合物の３次元構造座標；から選択された全部または一部の配列、あるいは上記項目（８）に記載のコンピュータ記憶媒体から得られた情報に基づいて、アミノ酸を１個以上挿入、欠失、改変または、化学的に修飾することにより、インテグリン阻害活性を有し、高い結合特異性を有する構造を設計する工程を有することを特徴とするｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体またはインテグリン阻害活性を有する化合物を同定、探索、評価または設計、あるいはその受容体を探索または同定する方法。
（１０）  分子置換法を用いた蛋白質結晶構造解析における、上記項目（５）〜（９）のいずれかに記載の３次元構造座標の全部又は、一部の使用、及び上記項目（９）に記載のコンピュータ記憶媒体の使用。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明書において、アミノ酸、ペプチド及び蛋白質の表記には下記に示すＩＵＰＡＣとＩＵＢの生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用されている略語を用いている。また、蛋白質のアミノ酸は左から右の方向でＮ末端からＣ末端方向を表している。
ＡまたはＡｌａ  ：  アラニン
ＶまたはＶａｌ  ：  バリン
ＬまたはＬｅｕ  ：  ロイシン
ＩまたはＩｌｅ  ：  イソロイシン
ＰまたはＰｒｏ  ：  プロリン
ＦまたはＰｈｅ  ：  フェニルアラニン
ＷまたはＴｒｐ  ：  トリプトファン
ＭまたはＭｅｔ  ：  メチオニン
ＧまたはＧｌｙ  ：  グリシン
ＳまたはＳｅｒ  ：  セリン
ＴまたはＴｈｒ  ：  トレオニン
ＣまたはＣｙｓ  ：  システイン
ＱまたはＧｌｎ  ：  グルタミン
ＮまたはＡｓｎ  ：  アスパラギン
ＹまたはＴｙｒ  ：  チロシン
ＫまたはＬｙｓ  ：  リシン
ＲまたはＡｒｇ  ：  アルギニン
ＨまたはＨｉｓ  ：  ヒスチジン
ＤまたはＡｓｐ  ：  アスパラギン酸
ＥまたはＧｌｕ  ：  グルタミン酸。
【００１６】
１．Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶化
本発明に用いるｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎは、Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ由来の蛇毒中に含まれるｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎである（Ｏｋｕｄａ，  Ｄ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １３０，  ４０７−４１５（２００１）：非特許文献１２）。
【００１７】
蛋白質の３次元構造を解析するために用いられる手法としてＸ線結晶構造解析が多く用いられている。Ｘ線結晶構造解析とは、蛋白質を結晶化し、Ｘ線を当て散乱したＸ線の回折像から蛋白質の３次元構造を解析する方法である。結晶化とは、イオン強度、塩濃度、温度、沈殿剤、ｐＨなど溶解度に関係する物理化学的因子を組み合わせることにより、蛋白質を結晶として析出させる方法である。また、蛋白質の結晶化法として静止バッチ法、自由界面拡散法、微量透析法、蒸気拡散法などがある。結晶化の際には、さまざまな結晶化条件を試してみて、最良な結晶化条件を決定する必要がある（Ｗｙｃｋｏｆｆ，  Ｈ．Ｗ．等，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）  ：非特許文献１３；  Ｗｙｃｋｏｆｆ，  Ｈ．Ｗ．等，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）  ：非特許文献１４）。
【００１８】
本発明で用いるｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶は以下にあるような方法で調整される。まず始めに、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎを高純度に精製する必要があるが、これはカラムクロマトグラフィーなどの方法を単独または、異なる方法を組み合わせることにより行われる。次にｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎを結晶化する方法であるが、これにはバッチ法、蒸気拡散法、微量透析法などを用いることができる。これらの方法を用いて更に、最適な結晶化条件を探す必要がある。ただし、他の方法で同じ結晶が得られることは一般的な事実であるので、同一の結晶学的定数をもつｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶が得られたとしても、それは本発明の範囲内となる。
【００１９】
２．Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造の座標
このようにして得られた配列番号：１に示すｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶をＸ線による結晶構造解析を行い３次元構造座標を明らかにした。Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶は単斜晶系で空間群Ｃ２に属し、ａ＝４７．５Å，  ｂ＝４８．１Å，  Ｃ＝３７．７Å，  β＝１２６．８°の格子定数を持つ。結晶の単位格子の形を図３に示す。この結晶をＸ線結晶構造解析により３次元構造座標を初めて明らかにした。得られた構造座標をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋフォーマットで表１（表１−１〜１−１７）に示す。ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの７０残基のうちＣ末端のＡｓｐ６９とＬｅｕ７０は電子密度地図では見ることができなかった。表１において、左から順に、１列目はこの行が原子座標を示していることを表している。２列目は、その原子の順番を、３列目は原子名を、４列目はアミノ酸名を、５列目は分子鎖の識別記号を、６列目はアミノ酸残基の順番を、７から９列目はÅ単位でＸ、Ｙ、Ｚ軸の原子座標を表しており、１０列目は原子の占有率を、１１列目は温度因子を表している。
【００２０】
【表１】
2004217535.tif 000003
【００２１】
【表２】
2004217535.tif 000004
【００２２】
【表３】
2004217535.tif 000005
【００２３】
【表４】
2004217535.tif 000006
【００２４】
【表５】
2004217535.tif 000007
【００２５】
【表６】
2004217535.tif 000008
【００２６】
【表７】
2004217535.tif 000009
【００２７】
【表８】
2004217535.tif 000010
【００２８】
【表９】
2004217535.tif 000011
【００２９】
【表１０】
2004217535.tif 000012
【００３０】
【表１１】
2004217535.tif 000013
【００３１】
【表１２】
2004217535.tif 000014
【００３２】
【表１３】
2004217535.tif 000015
【００３３】
【表１４】
2004217535.tif 000016
【００３４】
【表１５】
2004217535.tif 000017
【００３５】
【表１６】
2004217535.tif 000018
【００３６】
【表１７】
2004217535.tif 000019
表１の３次元構造座標より得られるｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標のコンピュータグラフィックスによる詳細図を図１に示し、図２に概略図を示す。ペプチド鎖は、６個のジスルフィド結合によって細長く、厳密な形に折りたたまれており、２次構造はおおまかに一連のターンと２個の短い逆平行βシートの部分からなっている。ＲＧＤ配列のＡｒｇ４９とＡｓｐ５１の側鎖は反対の方向を指している。５個のプロリンのうちＰｒｏ９，  Ｐｒｏ１２，  Ｐｒｏ２３はターン構造の２番目の位置にある。インテグリン型受容体によって認識されるＲＧＤ配列はＴｈｒ４３からＣｙｓ５７までの長く不規則な１５残基のヘアピンループの先端にある。逆平行β鎖は一方の鎖のＡｓｐ５５ともう一方の鎖のＣｙｓ４５−Ａｒｇ４６にあるβ隆起のためややねじれている。両鎖は６個の水素結合によって結合されており、その内４個が主鎖間で、１個が主鎖と側鎖間で、１個が側鎖間の水素結合である。ヘアピンループの付け根部分では、２個のジスルフィドブリッジ、Ｃｙｓ３２−Ｃｙｓ５７，  Ｃｙｓ４５−Ｃｙｓ６４が存在する。後者のブリッジによってＣ末端領域が折り返しＲＧＤループに接近する。これによってＴｒｐ６７のインドール環がＰｒｏ５３に疎水的に接触する。もう一つのβシートは分子の中央に位置し、シート内に水素結合を持ち、Ｃｙｓ３２−Ｌｙｓ３９の間にヘアピンループがある。ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎに厳密に保存されているＰｈｅ３８のフェニル環は、Ｇｌｎ２６のメチレン側鎖とＧｌｎ６０−Ｓｅｒ６１の主鎖の間に挿入されている。Ｐｈｅ３８はＮ末とＣ末サブドメインの間の相対的な動きを減少させるために分子の中心で支柱の役割をしていると解せられる。
【００３７】
ここで、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体の結晶の構造であっても本発明による結晶構造と実質的に一致するものは本発明の範囲である。また、配列番号：１の配列に対して１つまたは数個のアミノ酸の欠失、置換または付加により得られるｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎと同様のインテグリン阻害活性を有する変異体も本発明の範囲にある。更に、各配列の開始位置及び終了位置も本発明にとって厳密なものでなく、Ｎ末端及びＣ末端に別の蛋白質が付加しているもの、Ｎ末端及びＣ末端に１個以上のアミノ酸残基が付加したものなど、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの分子について実質的な変化をもたらさないものについては本発明に含まれる。また、糖鎖が結合したもの、糖鎖が切断されたものなどについても、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの分子について実質的な変化をもたらさないものについては、本発明の範囲である。実質的に一致するものとは、構造の主要部分の対応する部分の主鎖又はＣα炭素の部分の位置の平均二乗偏差がおよそ２Å以下である構造のことである。なお、表１に示した本発明の３次元構造座標をコンピュータによる計算に用いる場合などで、各原子の相対的な配置を変化させず、３次元空間内で並進、回転、対称などの移動操作の結果として得られる新たな３次元構造座標も本発明の範囲である。
【００３８】
表１の構造座標はｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの構造を表しており、表１の構造からｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎのインテグリンへの結合様式、及び結合特異性を解明でき、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体、及びｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎのように機能する、すなわちディスインテグリンとしての活性を有する化合物を同定、検索、評価または設計、あるいはその受容体を探索または同定することができる。
【００３９】
３．  ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標を利用した分子設計のためのコンピュータの使用
ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶から得られる３次元構造座標を、分子の３次元構造座標を表現することができるコンピュータプログラムが動作するコンピュータまたはそのコンピュータの記憶媒体に入力することで、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造を表現することが可能になる。
【００４０】
コンピュータの記憶媒体としては、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎから得られた構造座標をプログラムに導くことができるものであれば特に限定されない。例えば、メモリ、プロッピーディスク、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープなどである。
【００４１】
本発明におけるｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標を、分子の３次元構造座標を表示することができるコンピュータプログラムが起動するコンピュータに入力し、視覚的及びエネルギー的安定性を検討することで、インテグリン阻害活性を有し、基質特異性、又は構造安定性の高い変異体、及び化合物を設計することが可能になる。
【００４２】
蛋白質分子の３次元構造座標を表示することができる市販のコンピュータプログラムは、好ましくは、分子の３次元構造座標を入力するための入力部、入力された３次元構造座標を用いてコンピュータの画面（ディスプレイ）で蛋白質の立体構造を表現するための表現部、表現された分子内における各原子間の距離や結合角などを測定するための測定部、３次元構造座標を追加または修正するための追加修正部などの各種の部分から構成することができる。更に、分子の座標を元に、分子の構造エネルギーを計算するための分子構造エネルギー計算部、水分子などの溶媒分子を考慮して自由エネルギーを計算するための自由エネルギー計算部などを追加的に有するものであってもよい。なお、分子の３次元構造座標はコンピュータ内の記憶装置に保持し、これを画面表示するようにプログラムを設定してもよい。
【００４３】
例えば、アクセルリス社から販売されているコンピュータプログラムであるＩｎｓｉｇｈｔＩＩやＱＵＡＮＴＡは、このために用いるプログラムの例であるが、これらのプログラムに限定されない。また、プログラムは、シリコングラフィクス社やサンマイクロシステムズ社などから販売されているワークステーションと呼ばれているコンピュータに導入されて使用されるが、これらに限定されない。
【００４４】
Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体の設計方法の一つにコンピュータ又はその記憶媒体に本発明にかかるｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標を記憶させ、それに基づいてｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造を表示させ、視覚的検討によって行う方法がある。まず、コンピュータにｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標を入力し、それに基づいて蛋白質の立体構造を画面に表示させる。そして、この立体構造上で１個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入やアミノ酸の化学的修飾などを行い、その結果からできた化合物の空間的なコンフォメーションをコンピュータ上で表示させ、インテグリン阻害剤としてより適切な構造を探索していく。３次元構造を表記する方法としてクリスタルアイ、立体視、ステレオ対があるが、必ずしも３次元を表記する方法としてこれらに限定されない。
【００４５】
Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体の設計方法は、例えば、
（１）ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標に基づいてコンピュータの画面にｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造を表示させる工程と、
（２）画面に表示されたｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造上で１個以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入、あるいは化学的に親水基、疎水基、ペプチド構造類似化合物による置き換えなどのアミノ酸の化学修飾を行う構造変更工程と、
（３）前記構造変更にともなう空間的なコンフォメーションを画面に表示させる工程と、
（４）前記コンフォメーションを用いてインテグリン阻害剤として機能する構造を検索し、決定する工程と、
を有して構成することができる。
【００４６】
このような処理を行う装置としては、例えば、必要に応じて記憶装置が付加されている演算装置とデータやプログラムに応じて各種の画像を表示し得るディスプレイとを有するコンピュータシステムを主体とし、
（Ａ）ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標に基づいてコンピュータの画面にｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造を表示させる手段と、
（Ｂ）画面に表示されたｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造上で１個以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入、あるいはアミノ酸の化学修飾を行う構造変更のための手段と、
（Ｃ）前記構造変更にともなう空間的なコンフォメーションを画面に表示させる手段と、
（Ｄ）前記コンフォメーションを用いてインテグリン阻害剤として機能する構造を検索し、決定する手段と、
を少なくとも有するものを挙げることができる。
【００４７】
更に、視覚的な探索をした化合物の構造のエネルギーを計算することでエネルギー的な安定性を求めることができる。エネルギー的な安定性は、結合エネルギー、自由エネルギーで評価できる。エネルギー計算は、分子力場計算を行うコンピュータープログラムを用いることによって行うことができる。例えばＩｎｓｉｇｈｔＩＩのＤＩＳＣＯＶＥＲモジュールなどがあるが、これらに限定されない。また、分子軌道計算によっても、化合物のエネルギー的安定性を求めることができる。分子軌道計算を行うプログラムに、例えば、ＧＡＵＳＩＡＡＮ社のＧＡＵＳＩＡＡＮ  ９８，Ｑ−ｃｈｅｍ，  Ｉｎｃ．のＱ−ｃｈｅｍ、アクセルリス社のＩｎｓｉｇｈｔＩＩのＤＭｏＬモジュール，  ＮＥＣ社のＡＭＯＳＳなどがあるが、これらに限定されない。これらの視覚的、計算化学的手法で変異体を探索していくことで、構造安定性が高い変異体を求めることができる。また、受容体とｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標を用いて、立体構造をコンピュータ上に表示して重ね合わせることによって、視覚的、エネルギー的に安定に受容体と結合とするようにｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎ部分を変異させることで、インテグリン阻害活性及び結合特異性を有する変異体を設計することができる。このときに使用するコンピュータ、コンピュータプログラム、記憶媒体に特に制限はない。
【００４８】
上記の方法（視覚的手法、計算化学的手法、受容体との結合モデルなどの分子設計方法または手段）を組み合わせるか、繰り返し行うことによってもインテグリン阻害活性、高い結合特異性、構造安定性を有するｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体を設計することができる。また、データベースに登録されている蛋白質の３次元立体構造座標を用いて、網羅的にコンピュータでドッキングシミュレーションを行い、上記で設計したｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体に安定的に結合する受容体を探索することができる。ドッキングシミュレーションを行うプログラムとしてＡＤＡＭ（Ｙａｍａｄａ，Ｍ．等，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２４３，  ３１０−３２６（１９９６）：非特許文献１５）やＤＯＣＫ、ＦＴＤＯＣＫ（Ｇａｂｂ，  Ｈ．Ａ．等，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２７２，  １０６−１２０（１９９７）：非特許文献１６）、ＮＥＣ社のＡＭＯＳＳなどがあるが、これらに限定されない。
【００４９】
また、受容体を探索する方法には、リガンドと受容体の３次元構造をコンピュータ上に表示し重ね合わせることにより視覚的に最適な受容体を探索する方法がある。その他にも、エネルギー的に安定に結合する受容体を分子力場計算、あるいは分子軌道計算を用いることによって探索することができる。
【００５０】
また、これらの手法を組み合わせることでも受容体を探索できる。このときに使用するコンピュータ又は、記憶媒体には特に制限はない。
【００５１】
４．インテグリン阻害活性を有する化合物を設計するためのｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標の使用
本発明による表１に示したｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標の全部、又は一部をコンピュータに入力してコンピュータプログラムを用いることにより、特開平６−３０９３８５号公報（特許文献５）に示されたような方法によって、リガンド分子の３次元構造座標から生理活性を有するリガンドの分子構造を決定することができる。リガンド分子の３次元構造座標を用いることによって、活性を有する化合物を設計する方法であれば特にこの方法に制限されない。
【００５２】
また、データベースに登録されている蛋白質の３次元立体構造座標を用いて、網羅的にコンピュータでドッキングシミュレーションを行い、上記で設計した化合物に安定的に結合する受容体を探索することができる。ドッキングシミュレーションを行うプログラムとしてＡＤＡＭやＤＯＣＫ、ＦＴＤＯＣＫ、ＡＭＯＳＳなどがあるが、これらに限定されない。また、受容体を探索する方法には、リガンドと受容体の３次元構造をコンピュータ上に表示し重ね合わせることにより視覚的に最適な受容体を探索する方法がある。その他にも、エネルギー的に安定に結合する受容体を分子力場計算、あるいは分子軌道計算を用いることによって探索することができる。また、これらの手法を組み合わせることでも受容体を探索できる。このときに使用するコンピュータ又は、記憶媒体には特に制限はない。
【００５３】
５．分子置換法によるＸ線結晶解析を行うためのｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの構造座標の使用
本発明による表１に示したｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標のすべて又はその一部を使用することで、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの全部又は一部を含んでいる結晶、又はｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎと有意な相同性を持つアミノ酸配列を持つ蛋白質の結晶などのＸ線結晶解析の方法の一つとして用いられている分子置換法（Ｌａｔｔｍａｎ，  Ｅ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ５５−７６（１９８５）  非特許文献１７；  竹中章郎、勝部幸輝、笹田義夫訳、Ｊ．ドレント著、蛋白質のＸ線結晶解析法、シュプリンガー・フェアラーク東京、２０４−２２４（１９９８）  非特許文献１８）で、構造座標決定の際に重原子同型置換法を用いず、構造座標が未知の蛋白質の結晶のＸ線回折像から得られる構造因子からその構造座標を決定することが可能である。分子置換法を行う時には、分子置換法に用いるプログラムを起動することができるコンピュータを用いる。プログラムは、例えばＡＭｏＲｅ（ＣＣＰ４（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，  Ｎｕｍｂｅｒ  ４），  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．，Ｄ５０，  ７６０−７６３（１９９４）：非特許文献１９；  Ｎａｖａｚａ，  Ｊ．，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．，  Ａ５０，  １５７−１６３  （１９９４）：非特許文献２０）プログラムパッケージに含まれるプログラムなどがあるが、使用するプログラムとしてこのプログラムに限定されない。本発明のｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標を使用して分子置換法を適用することができる結晶としては、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの全部又は一部を含んでいる結晶、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎと有意な相同性を持つアミノ酸配列を持つ他の蛋白質から得られた結晶、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎと結合する化合物とｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの複合体、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎとアミノ酸残基において有意な相同性を持つ蛋白質を含むもの、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体及びそれを含むものなどから得られた結晶、また更にそれらの複合体から得られた結晶に適応することができる。有意な相同性とは、一般に、挿入配列を許すアミノ酸配列で２０％以上、好ましくは３０％以上一致している場合のことである。実際に結晶のＸ線回折像から得られた以外の未知物質の結晶において、本発明による表１に示したｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造座標の全部又は一部を用いて分子置換法により構造解析することは、有意な解が得られた場合には本発明の範囲である。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００５５】
実施例１  Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの精製方法
Ｔｒｉｍｅｒｅｓｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓの凍結乾燥した毒は（財）日本蛇族学術研究所（群馬県）から購入した。その粗毒は５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ  ８．０）に溶解し、溶解しなかったものは遠心分離により取り除いた。上清はＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｇを用いた分子ふるいクロマトグラフィーで分画した。分画はヒト血小板のＡＤＰ誘導凝固の阻害活性で分析した。活性のあった分画を集め、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅと逆相ＨＰＬＣの２種類のカラムにかけた。Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの収量は粗毒１  ｇあたり４．２  ｍｇであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの分子量は、還元下、非還元下で８  ｋＤａだった。純度はＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ染色による１６％ポリアクリルアミド電気泳動から推測した。
【００５６】
実施例２  ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶化方法
凍結乾燥したｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの蛋白質サンプルは濃度が３０．０  ｍｇ／ｍｌになるように調製した。結晶化条件はＣｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｋｉｔｓ  １と２（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いたマイクロバッチ法によって探索した。一般的に、０．４  μｌの蛋白質溶液と１．２  μｌのスクリーニング溶媒と混合した。条件は多くの実験によって探索され、単結晶（一片がそれぞれ０．３  ｍｍ）が０．５  μｌの蛋白質溶液を３０％ポリエチレングリコール０．６  μｌと０．１  Ｍ硫酸アンモニウム０．６  μｌとを混合して２９３  Ｋで放置する条件下で得られた。
【００５７】
実施例３  ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの回折実験法
結晶は凍結防止剤（同じ結晶化条件で与えられた２０％エチレングリコール）で浸漬処理後、１００  Ｋの液体窒素気流中で急速冷凍した。完全な１．７  Åデータセットは、Ｐｈｏｔｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｙ（高エネルギー加速器研究機構），ｂｅａｍｌｉｎｅ  ＢＬ６Ａ（λ  ＝  １．００Å）で得られた。すべてのデータセットはＤＰＳ／Ｍｏｓｆｌｍを使って処理した。データ収集と精密化における統計は以下の数値である。分解能の範囲（Å）：３０．０−１．７  （１．７６−１．７０）、精密化における反射数：７，５３８  （７３７）、完全性（％）：９９．８  （１００．０）、Ｒ因子（％）：１８．９  （２２．９）、Ｒｆｒｅｅ因子：２２．９  （２７．８）、但し括弧内は最外角の分解能を示す。
【００５８】
蛋白質中での水素原子以外の原子数：５０７、水分子数：１４７、標準値からの平均２乗偏差値は結合長で０．００４Å、結合角で１．２°、平均の温度因子は２３．２Å２である。
【００５９】
実施例４  ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの構造決定と最精密化法
ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶は単斜晶系で空間群Ｃ２に属し、ａ＝４７．５Å，  ｂ＝４８．１Å，  ｃ＝３７．７Å，  β＝１２６．８°の格子定数を持っていた。その構造は、ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎのＮＭＲ構造（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ  １ｆｖｌ）を使用してＡＭｏＲｅでの分子置換法によって解かれた。最初の試みでは、サーチモデルとして１ｆｖｌの各々の１８分子を使ったものは、多くの探索パラメータを使用したが顕著な解は得られなかった。次に１ｆｖｌ全体（１８分子を平均したもの）を探索モデルとして試した。そのため、一定のＢ因子（２０Å２）を持つ以下の３種の全体モデルが準備された。Ａｌｌ−ａｔｏｍ  ｍｏｄｅｌ（全原子からなるサーチモデル）、ｐｏｌｙ−ＡＧ  ｍｏｄｅｌ（グリシン以外のアミノ酸残基をアラニンに置き換えたサーチモデル）、ｐｏｌｙ−ＳＡＧ  ｍｏｄｅｌ（グリシン、アラニン以外のアミノ酸残基をセリンに置き換えたサーチモデル）。１５．０と３．５Å分解能の間のデータを用いてＡＭｏＲｅ  ｐａｃｋａｇｅによる分子置換を行った。回転関数は明確な解を出すことはできなかった。並進関数はすべての回転関数ピーク値を使って計算され、ａｌｌ−ａｔｏｍ  ｍｏｄｅｌまたはｐｏｌｙ−ＳＡＧ  ｍｏｄｅｌ（ｐｏｌｙ−ＡＧ  ｍｏｄｅｌは全く明確な解が得られなかった）を用いそれぞれ１個の顕著な解が得られた。
【００６０】
この解は結晶内パッキングによって評価された。Ａｌｌ−ａｔｏｍ  ｍｏｄｅｌを使った分子置換の解は、ＣＮＳプログラムを使ったねじれ分子動力学精密化にかけられ、１５．０と１．７Å分解能の間のデータを用いてＲ因子は４４．６％、Ｒｆｒｅｅ因子は４５．７％までそれぞれ向上した。このモデルは自動モデル化プログラムＡＲＰ／ｗＡＲＰの開始モデルとして使われ、２００回の自動モデル化サイクル後、Ｒ因子は１９．２％まで向上した。さらにモデル構築はプログラムＯで行われた。モデルは１．７Åのネイティブデータを用いてＣＮＳで精密化された（統計は実施例４の下部）。ＰＲＯＣＨＥＫによれば精密化モデルの各残基はＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットの許容範囲内であった。
【００６１】
実施例５  インテグリン阻害剤の設計方法
インテグリン阻害剤の設計は図４の流れ図に従って設計できる。この流れ図では、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの３次元構造をコンピュータに入力し、視覚的、エネルギー的に受容体との結合能を評価していき、分子置換や化学的修飾を繰り返し行うことにより、最適なインテグリン阻害剤を設計する。
【００６２】
実施例６  副作用を防ぐためにインテグリンαＶβ３とｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの相互作用を減少させる方法
ＴｒｉｍｅｓｔａｔｉｎとαＶβ３（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ  ＩＬ５Ｇ）の間のドッキングシミュレーションはＦＴＤＯＣＫと分子シミュレーションパッケージＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ  ２０００（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を使用して行った。Ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎは移動する分子とし、一方でＭＩＤＡＳ部位を含むαＶ（残基：Ａ１−Ａ４３８）とβ３（残基：Ｂ１１１−Ｂ３５１）のパートナードメインは静止する分子として使用した。計算では、１方向に２１４グリッド単位  （グリッド点間隔：  ０．７０  Å）をとった空間中で並進、回転走査するために使用し、ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙとｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｆｉｌｔｅｒで制限した。経験的スコアリングは残基−残基間ポテンシャルを使用して行った。適切な複合体モデルを選択するために、ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎのＡｒｇ４９とαＶドメインのＡｓｐ１５０の間を４．５  Åに距離を制限すると、最良のスコアを持つ良い候補モデルが得られた。モデルのエネルギー最小値化は最大の各原子間に働く力が１０−４  ｋｃａｌ／ｍｏｌ・Åに至るまでＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのＤＩＳＣＯＶＥＲモジュール内のＣＶＦＦ力場を使用して行った。計算は１．０の誘電率を使用して真空中で行った。主鎖原子の座標は固定し、側鎖原子は構造の変形を避けるために最初のモデルに拘束した。省略したｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎのＣ末端残基Ａｓｐ６９、Ｉｌｅ７０は最後に付け加えた。
【００６３】
αＶβ３とｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎとの間で相互作用しているアミノ酸残基のコンピュータグラフィックスによる詳細図を図５に示し、図６に模式図を表している。ＲＧＤ配列にあるＡｒｇ４９のグアニジン基とＡｓｐ５１のカルボキシル基の位置は、αＶβ３に結合した環状ペンタペプチドリガンドのそれらの位置と良く一致している。従って、Ａｒｇ４９はプロペラドメインのＡｓｐ１５０、Ａｓｐ２１８との間に塩橋を、Ｔｈｒ２１２との間に水素結合を形成しており、Ａｓｐ５１はβＡドメインのＭＩＤＡＳ（ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｓｉｔｅ）でＭｎ２＋に直接結合している。中央の残基のＧｌｙ５０はαＶβ３と相互作用していない。しかし、環状ペンタペプチドＧｌｙ残基はαＶといくつか疎水相互作用をしている。この違いは明らかに主鎖のコンフォメーションの違いからきている。環状ペンタペプチドの残りの２個の残基はαＶβ３に面していなく、相互作用していない。しかしながら、天然のｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎリガンドの場合には、他の結合サイトがこのモデルで見つけられた。１）ＲＧＤ配列の隣のＰｈｅ５２はプロペラドメインのＴｙｒ１７８とβ３ドメインのＴｙｒ１６６と疎水作用をしている。環状ペンタペプチドはこの位置にＰｈｅを含んでいる。しかし環状化によるコンフォメーションの制約のためとＤ−アミノ酸（Ｄ−Ｐｈｅ）のため、側鎖は違った方向を指している。２）Ｐｒｏ５３はβ３ドメインのＡｓｐ１７９とＡｓｐ２１４と相互作用している。３）Ａｒｇ６６のグアニジニウム基はプロペラドメインのＡｓｐ１４８へ塩橋を形成し、さらにＡｓｐ１５０へも塩橋を形成している。４）Ｔｒｐ６７はプロペラドメインのＡｓｐ１４８、β３ドメインのＴｙｒ１６６、Ａｓｐ１７９と相互作用している。５）Ａｓｎ６８の側鎖はプロペラドメインのＴｈｒ１１６、Ｌｙｓ１１９、Ｇｌｕ１２１、Ａｓｐ１４８と水素結合している。６）Ａｓｐ６９の主鎖はプロペラドメインのＬｙｓ１１９と水素結合している。
【００６４】
上記の相互作用している残基を図７の流れ図のように視覚的、エネルギー的に安定的に結合しないように（しかし、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとの結合は保つ）分子置換、及び化学的修飾を行うことで、副作用を防ぐためにαＶβ３との結合を弱め、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと強く結合するようにｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの変異体を設計することができる。
【００６５】
【配列表】
2004217535.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【図１】ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの立体構造を主鎖リボン図により表した立体構造図である。Ｃ末端の２個の残基は省略した。ＲＧＤ配列にはラベルがあり、側鎖はボールアンドスティック図で示してある。６個のジスルフィド結合はボールアンドスティック図で示してある。図はＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（Ｋｒａｕｌｉｓ，  Ｊ．，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，  ２４，  ９４６−９５０（１９９３））とＲＡＳＴＥＲ３Ｄ（Ｍｅｒｉｔｔ  Ｅ．Ａ．等，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２７７，  ５０５−５２４（１９９７））を使用して作成した。
【図２】ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの構造の概略図である。
【図３】ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎの結晶の単位格子を表した図である。
【図４】インテグリン阻害剤の設計方法のフローチャートである。
【図５】相互作用部位の拡大した立体図。相互作用している残基はラベルを付けたボールアンドスティック図で示してある。図はＭＯＬＳＣＲＩＰＴを使用して作成した。
【図６】ｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎとαＶβＩＩＩの間のアミノ酸残基の相互作用を結線で示した図である。
【図７】副作用を防ぐためにαＶβ３にｔｒｉｍｅｓｔａｔｉｎが結合しないようにする方法のフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2004217535.tif 000025
【図６】
2004217535.tif 000026
【図７】
2004217535.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成15年6月9日(2003.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2004217535.tif 000028