(57)【要約】【課題】  乾癬にかかっている患者を治療またはPASIを少なくとも50％低下させるための医薬組成物を提供する。【解決手段】  インターフェロン−γ、インターロイキン−12、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン  CD3又はαＥインテグリン・サブユニットからなる群から選択した抗原と結合する抗体を含むか、インターロイキン−12を中和するモノクローナル抗体を含む医薬組成物。【選択図】      図１
2004231667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾癬にかかっている患者を治療するための医薬組成物であって、インターフェロン-γ、インターロイキン-12、E-セレクチン、P-セレクチン、CD3、又はαEインテグリン・サブユニットからなるグループの中から選択した抗原と結合する抗体を含む前記組成物。
【請求項２】
前記抗体が、ヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗体が、HuZAF5F2、16F2、16G2または20E11抗体であることを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
乾癬にかかっている患者のPASIを少なくとも50％低下させるための医薬組成物であって、インターロイキン-12を中和にするモノクローナル抗体を含む前記医薬組成物。
【請求項５】
前記抗体が、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
乾癬は慢性の皮膚病であり、鱗屑と炎症を特徴とする。アメリカ合衆国では人口の1.5〜2％、すなわち約500万人が乾癬にかかる。あらゆる年齢層の人が乾癬にかかり、男女差もほとんどない。乾癬にかかった人は不快感に悩まされ、関節の動きが制限され、精神的に苦しい。乾癬を発症すると、皮膚のあちこちが厚くなり、赤みを帯び、プラークと呼ばれる銀白色の鱗屑で覆われるようになる。乾癬は、肘、膝、頭皮、背中の下部、顔、手のひら、足の裏に発生することが多い。手や足の爪、口内の柔らかい組織、外陰部もこの疾患にかかることがある。乾癬にかかっている人の約10％は関節に炎症を起こしており、関節リューマチの症状を呈する。
【０００２】
皮膚が傷ついたとき、傷を治す生体プログラムがスタートする。これは再生的成熟としても知られている。傷害性乾癬は、この代替増殖プログラムにおける細胞増殖を特徴とする。乾癬にかかった皮膚は、多くの点で、傷が治るときの皮膚、または感染などの刺激に反応するときの皮膚に似ており、角質細胞において通常の増殖プログラムから再生的成熟へと切り換わる。細胞は、生まれるとほんの2〜4日で表面へと押しやられるが、皮膚はその細胞を十分に早く剥落させてしまうことはできない。過剰な皮膚細胞が積み重なり、高く鱗のように重なった発疹となる。発疹を通常は覆っている（“プラーク”と呼ばれる）白い鱗は、死んだ皮膚細胞からなり、発疹の赤い色は、急速に分裂する皮膚細胞領域に対して血液の供給が増えることによって生じる。
【０００３】
ヒトにおける乾癬の正確な原因はわかっていないが、遺伝的素因によるものと一般には考えられている。最近の研究によれば、乾癬には自己免疫の要素があることが明確になった。ある人が乾癬にかかるかどうかは、その疾患発生の“引き金となる”何かに依存していると考えられている。可能な“引き金因子”の具体例としては、全身感染、皮膚の怪我（ケブナー現象）、予防接種、ある種の薬物治療、筋肉内注射、ステロイドの経口投与治療などが挙げられる。
【０００４】
乾癬による慢性皮膚炎には、表皮角質細胞の過形成と、CD4+記憶T細胞、好中球、マクロファージなどの単核細胞の浸潤が伴う。炎症の描像がこのように複雑であり、その結果としてさまざまな細胞間の複雑な相互関係が生まれるため、この疾患の誘起と進行の裏に隠れているメカニズムを分析することは極めて難しい。
【０００５】
乾癬の原因と治療の研究は、適切なモデル動物がいないために長い間できずに放置されていた。皮膚炎のモデルとなるネズミ類がいくつか最近になって導入されたものの、そのいずれも、この疾患を誘起する第1の原因であることが証明された特異的T細胞の異常を持っていない。ヒトの乾癬に伴う臨床的特徴を有する改良型モデル動物を開発することは、可能な治療法と薬剤をスクリーニングする上で大いに役立つと思われる。
【０００６】
ショーン他（非特許文献１、Nat. Med.、第3巻、183〜188ページ、1997年）は、ナイーブCD4+T細胞を用いてscid/scidマウスを再構成することにより、ネズミ類に乾癬様疾患を発症させた。しかしこのモデルは、ヒトの疾患に特有なある種の組織学的特徴が欠けている一方で、乾癬にかかった患者にはないいくつかの特徴を持っていた（非特許文献２、ニコロフ他、Nat. Med.、第3巻、475〜476ページ、1997年）。他の乾癬モデル・マウスは、やはり免疫不全のマウスを利用している。スガイ他（非特許文献３、J. Dermatol. Sci.、第17巻、85〜92ページ、1998年）は、ヒト乾癬の発疹をSCIDマウスに移植した。ヒトの皮膚移植片は、この実験期間中は全体としてよく維持されたが、乾癬に特有の組織学的、免疫組織化学的な所見は、表皮腫と過角化を除き、乾癬状発疹にリンパ球が浸潤しなくなるにつれて徐々に消えた。ヤマモト他（非特許文献４、J. Dermatol. Sci.、第17巻、8〜14ページ、1998年）は、重症複合免疫不全（SCID）マウスに移植した乾癬の厚い皮膚の下に、ブドウ球菌のエンテロトキシンBで刺激したリンパ球を皮下注射した。
【０００７】
ゴットリーブ他（非特許文献５、Nat. Med.、第1巻、442〜447ページ、1995年）は、ヒト・インターロイキン2（DAB389IL-2）を結合させたジフテリア毒素の断片を用いて患者の治療を行なった。ヒト・インターロイキン2は、活性化されたT細胞を選択的に標的とし、角質細胞は標的としない。彼らは、角質細胞ではなくT細胞がこの疾患を起こす第1の原因であることを示し、有意な臨床上の改善を見た。
【０００８】
サンドバーグ他（非特許文献６、Pathobiology、第65巻（5）、271〜286ページ、1997年）は、薄片状皮膚（fsn）突然変異マウスにおける乾癬状皮膚炎と全身性発疹の発症と進行を記述している。薄片状皮膚（fsn）突然変異マウスは、もともとは血液疾患に伴う乾癬のモデル・マウスとして記述された。しかし、ホモ（fsn/fsn）のマウスは、他にも多くの病変を起こす。
【０００９】
ホン他（非特許文献７、J. Immunol.、第162巻、7480〜7491ページ、1999年）は、改良型の乾癬モデル動物を記述している。この明細書には、実際上この論文を参考として組み込んである。
【非特許文献１】Nat. Med.、第3巻、第183〜188ページ、1997年
【非特許文献２】Nat. Med.、第3巻、第475〜476ページ、1997年
【非特許文献３】J. Dermatol. Sci.、第17巻、第85〜92ページ、1998年
【非特許文献４】J. Dermatol. Sci.、第17巻、第8〜14ページ、1998年
【非特許文献５】Nat. Med.、第1巻、第442〜447ページ、1995年
【非特許文献６】Pathobiology、第65巻（5）、第271〜286ページ、1997年
【非特許文献７】J. Immunol.、第162巻、第7480〜7491ページ、1999年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
乾癬用の、ヒト以外のモデル動物を提供する。この動物は、ヒト乾癬に見られる多くの特徴を有する疾患を発症する。この動物は、生物活性のある乾癬治療用薬剤のテストとスクリーニングに役立つ。免疫能のあるナイーブTリンパ球を、宿主となる免疫不全の動物に移植する。それと同時に、少なくとも1つの炎症促進性サイトカインとポリクローナル活性化剤も移植する。移植されたT細胞は、宿主動物の主要組織適合抗原に対して寛容であるが、1つまたはそれ以上の副組織適合遺伝子座では合わない。移植を受けた動物は慢性皮膚疾患を発症する。その症状としては、ヒト乾癬に見られる組織学的特徴として、例えば網状組織突起、重い表皮腫、Th1細胞の真皮への浸潤などがある。この動物は、特定の病因として要求されている、乾癬状発疹を発症させるTh1刺激サイトカインや細胞を有するモデルとして、また、ヒト乾癬の予防と治療のモデルとして有効である。
別の実施態様では、このモデル動物を用いて乾癬の治療法を発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
その方法には、インターロイキン12（IL-12）またはγインターフェロン（γ-IFN）と結合してそれを無効にするモノクローナル抗体を疾患動物に投与する操作が含まれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ヒト乾癬の組織学的特徴の多くを有するヒト以外のモデル動物を提供する。免疫能が低下した宿主動物に、同じ種または関連した種のドナー動物に由来する精製したCD45Rb+細胞群を注入した。注入する細胞は、CD4+ CD45RbhiT細胞であることが好ましい。なおCD45Rbhiとは、これら細胞がCD45Rbを高レベルで発現していることを意味する。宿主動物とドナー動物は、宿主の主要組織適合抗原に対して寛容である。例えば、これら動物は同じMHCハプロタイプ（MHC適合）であるが、1つまたはそれ以上の副抗原が適合していない。注入した細胞は、IL-12などの炎症促進性サイトカインおよび／またはポリクローナル活性化剤によって刺激する。その前および／その後に、CD45Rb+細胞を宿主動物に移植する。宿主動物は、慢性皮膚疾患を発症する。その症状としては、ヒト乾癬に見られる組織学的特徴、例えば網状組織突起、重い表皮腫、Th1細胞の真皮への浸潤などがある。
【００１３】
この動物は、特定の病因として要求されている、乾癬状発疹を発症させるTh1刺激サイトカインや細胞を有するモデルとして、また、ヒト乾癬の予防と治療のモデルとして有効である。ヒトの疾患のためのより正確なモデルを提供することにより、可能性のある治療法の安全性と効果を、臨床試験を行なう前にモデル動物で評価することができる。疾患動物は、薬剤候補のスクリーニングに加え、病気の発症における“引き金”剤の役割、特異的T細胞の一部やサイトカインの役割、病気関連T細胞が活性化される際の特異的抗原の役割を決定するのにも役立つ。
【００１４】
免疫能が低下した宿主哺乳類の中には移植に適したものや所望の免疫不全を起こしたものが存在している。あるいはそのような宿主哺乳類を作り出すことができる。重要な因子は、免疫能が低下した宿主が、導入したT細胞に対して免疫応答できないことである。特に興味深いのは、免疫グロブリンやT細胞抗原受容体をコードする遺伝子座において生殖系列DNAの再構成ができないという遺伝的欠陥のため、または胸腺の発達における遺伝的欠陥（nu/nu）のために免疫能が低下しているウサギ、アレチネズミ、ハムスター、モルモットなどの小さな哺乳類、中でもマウスやラットといった囓歯類である。
【００１５】
現在利用可能な宿主としては、遺伝子工学を利用した遺伝子破壊によって、RAG-1および／またはRAG-2に伴うリコンビナーゼ機能が欠けたマウス（例えば市販されているTIM（登録商標）RAG-2トランスジェニック）、クラスIおよび／またはクラスIIのMHC抗原が欠けたマウス（例えば市販されているC1DとC2Dのトランスジェニック系列）、またはBcl-2原ガン遺伝子の発現が欠けたマウスが挙げられる。特に興味深いのは、scid遺伝子座にホモの突然変異が生じたために機能的に関連した免疫グロブリンとT細胞受容体の遺伝子が欠けて、重い複合免疫不全を起こすマウスである。scid/scid突然変異が利用可能である。あるいは、scid/scid突然変異をさまざまな遺伝的背景を持つように育てることができる。例えば、CB.17、ICR（異系交配）、C3H、BALB/c、C57BI/6、AKR、BA、B10、129などがある。レシピエントとして役立つ他のマウスとしては、NOD scid/scid、SGB scid/scid、bh/bh、CB17 scid/hr、NIH-3 bg/nu/xid、META nu/nuがある。CD3c遺伝子がホモに破壊されているために機能的なB細胞とT細胞が欠けたトランスジェニック・マウス、ラット、ブタが利用可能である。免疫能が低下したラットとしては、HsdHan:RNU-mu；HsdHan:RNU-mu/+；HsdHan:NZNU-mu；HsdHan:NZNU-mu/+；LEW/HanHsd-mu；LEW/HanHsd-mu/+；WAG/HanHsd-mu；WAG/HanHsd-mu/+が挙げられる。
【００１６】
宿主動物の免疫機能をさらに低下させるには、T細胞の移植前、移植中、または移植後に内在性マクロファージの数を減らすとよい。例えば、リポソームで包み込んだジホスホン酸ジクロロメチレン（Cl2MDP）を投与することによってマクロファージを減らす。
一般に、宿主は、少なくとも年齢が4週のものにする。例えば、約4〜12週のマウスを用いることが多い。哺乳類宿主は、通常の方法で成長させる。哺乳類宿主の免疫能低下の程度に応じ、感染防御の程度を変えるとよい。無菌環境が適切である。感染から防御するため、予防抗生作用を利用することができる。また、帝王切開で取り出した後にノトバイオート環境の中で、宿主となる可能性のある動物を他の動物から隔離してもよかろう。宿主への餌の供給と宿主のメンテナンスは、ほとんどノトバイオート技術に従って行なう。
【００１７】
宿主動物の主要組織適合遺伝子座ハプロタイプは、従来のタイプ決定法、例えば異系交配の動物を用いる方法によって決定するか、またはその動物の遺伝的性質に関してわかっている情報をもとにして決定する。マウスでは、主要組織適合遺伝子座（MHC）の遺伝子の特性は非常によくわかっている。MHC領域は多数の遺伝子からなり、そのうちの少なくとも5つが急性移植拒絶反応と移植片対宿主病に関係している。興味の対象である特異的MHC遺伝子としては、クラスI抗原であるH2-K、H2-D、H2-L；クラスII抗原である、H2-Aa、Ab、B1、Ea、Eb、Eb2、Ob、Pbを含むH2 I領域が挙げられる。既知のほとんどのマウスの系統のハプロタイプに関する特別な情報は、クライン他、Immunogenetics、第17巻（6）、553〜596ページ、1983年で見つけることができる。
【００１８】
免疫機能が低下した宿主動物に、免疫能のあるドナーから単離したCD45Rb+T細胞群を注入する。このT細胞は、同種異系ドナーまたは異種ドナーからのものが可能であり、レシピエントの主要組織適合抗原に対しては寛容であるが、レシピエントの1つまたはそれ以上の副組織適合抗原に対しては免疫応答する。寛容とは、レシピエントからの適切な細胞（例えば放射線を照射したリンパ球）と混合したときに、ドナーのT細胞が、同様にリンパ球を混合してMHC不適合細胞間で反応させた場合よりも実質的に少ししか増殖しなくなる（例えば約10％〜25％未満）ことを意味する。
【００１９】
MHC遺伝子座とは対照的に、多数の副組織適合抗原遺伝子座がゲノム全体にわたって散在している。一般に、副抗原は、自己MHCと関連して細胞表面に細胞タンパク質を提示することによって生まれる。したがって、宿主によって発現され、MHC抗原の文脈で処理されて提示され、宿主とドナーの間で多型となってほとんどすべてのタンパク質は、副組織適合抗原として機能する。いくつかの皮膚抗原が乾癬の引き金となっていることが示唆されている（例えばH-40が、フォーマン他、J. Exp. Med.、第159巻、1724〜1740ページ、1984年に記載されている；他の抗原は、チャン他、P.N.A.S.、第91巻、9282〜9286ページ、1994年、またはメンセン他、J. Immunol.、第155巻、4078〜4083ページ、1995年に記載されている）。本発明の動物は、乾癬の発症に関わる特別な遺伝子座の役割を決定するための貴重なモデルである。スクリーニングでは、興味の対象となる遺伝子座だけで不適合な動物を用い、その違いが疾患を誘発するのに十分であるかどうかを調べる。
【００２０】
T細胞の供給源として適切な多数の動物が存在している。たいていの場合、ドナーとレシピエントは、同じ種にする。しかし、場合によっては異種ドナーを用いてもよい。本発明の一実施態様では、ドナーは同種異系であるが、MHC遺伝子座は適合している。例えば、MHC遺伝子座は同種同系であるが、遺伝的背景は異なる、同種のマウスおよびラットの系統を利用することができる。また、親の系統をドナーとして用いることもできる。その場合、F1動物はレシピエントとなる。例えば、BALB/cドナーをBALB/c×C57bl/6レシピエントに入れる。
【００２１】
別の方法として、キメラ動物をドナー細胞の供給源として用いることもできる。例えば、造血幹細胞（HSC）をレシピエントに移植することによってキメラを作ることができる。この場合、キメラのHSCはレシピエントとは異なる遺伝子型になる。この場合HSCはT細胞に分化し、胸腺で“教育”される。そのため、レシピエントと同じタイプのMHCに制限されることになる。次に、キメラからの細胞を回収し、本発明の方法において使用する。というのも、この細胞は、寛容であり、しかも胸腺と同じタイプのMHCに制限されているからである。当業者であれば、この実施例における胸腺MHCが最終的なレシピエント動物と適合していなくてはならないことが理解できよう。この方法を用いて異種キメラを作り（例えばアメリカ合衆国特許第5,625,127号を参照のこと）、本発明の方法においてヒト細胞を使用できるようにすることもできる。
【００２２】
注入する一群の細胞には、免疫能のあるナイーブT細胞が含まれる。この細胞群にとって適切な1つのマーカーはCD45Rbであり、ナイーブT細胞およびナイーブB細胞で高度に発現する（セラ−ペイジーズ他、Tissue Antigens、第42巻、441ページ、1993年）。CD4+細胞をソーティングすることによってさらに分離することができる。するとヘルパーT細胞が豊富になる。注入する細胞は、CD4+CD45RbhiT細胞であることが好ましい。なおCD45Rbhiは、細胞がCD45Rbを高レベルで発現していることを意味する。
【００２３】
T細胞は、二次免疫器官、例えば脾臓、リンパ節、胸腺などから容易に分離できる。細胞は、末梢血、臍帯血、成分献血産物などからも分離することができる。組織から細胞を分離するため、適切な溶液を用いて脾臓、リンパ節などを分散液にする。一般にこの溶液は平衡塩類溶液であり、この溶液には、ウシ胎仔血清またはそれ以外の天然の因子を、受容可能な低濃度（一般には5〜25mM）の緩衝溶液とともに適宜追加する。適切な緩衝溶液としては、HEPES、リン酸緩衝溶液、乳酸緩衝溶液などが挙げられる。別の方法として、従来法でリンパ球を組織から放出させることもできる。
【００２４】
望む細胞を移植用に分離した後、今度は実質的に純粋な細胞群を得るためにアフィニティ分離を行なう。アフィニティ分離の方法としては、抗体をコーティングした磁性ビーズを用いた磁気的分離、アフィニティ・クロマトグラフィ、モノクローナル抗体に結合させた細胞傷害剤、またはモノクローナル抗体と合わせて用いる細胞傷害剤（例えば、補体と細胞毒素）、プレートなどの固体基質に付着させた抗体を用いた“パンニング”、あるいはその他の適切な方法がある。正確に分離する方法としては、蛍光活性化細胞ソーターがある。この方法の洗練さの程度はさまざまであり、多色チャネル、ローアングルかつ鈍角の光散乱検出チャネル、インピーダンス・チャネルなどがある。生きた細胞は、死んだ細胞と関係する染料（ヨウ化プロピジウム、LDS）を用いて死んだ細胞から分離することができる。選択した細胞の生存能力を過度に阻害するのでなければ、任意の方法を用いることができる。
【００２５】
アフィニティ試薬は、前記の細胞表面分子に対する特異的な受容体またはリガンドにすることができる。抗体試薬に加え、ペプチド-MHC抗原とT細胞受容体のペアを用いることができる。例えば、ペプチド・リガンドと受容体、リガンドと受容体分子などである。抗体とT細胞受容体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよい。また、抗体とT細胞受容体は、トランスジェニック動物、免疫を確立した動物、ヒトまたは動物の不死化したB細胞、抗体またはT細胞受容体をコードするDNAベクターをトランスフェクトした細胞などを用いて産生させることができる。抗体の調製法と、抗体を特異的結合剤として使用する場合の適切な使用法に関する詳細は当業者には周知である。
【００２６】
特に興味深いのは、抗体をアフィニティ試薬として使用することである。抗体は、分離に用いるときには標識と簡単に結合させることができる。あるいは抗体は、その抗体と結合する標識した第2の抗体と合わせて用いることも簡単である。標識としては、直接的な分離を可能にする磁性ビーズ；支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンに結合させることのできるビオチン；蛍光活性化細胞ソーターとともに使用することのできる蛍光色素；特定のタイプの細胞を容易に分離することのできる他の標識が挙げられる。使用可能な蛍光色素としては、フィコエリトリン、アロフィコシアニンなどのフィコビリタンパク質や、フルオレセイン、テキサス・レッドが挙げられる。
【００２７】
抗体をリンパ球分散液に添加し、細胞表面の利用可能な抗原がその抗体と結合するのに十分な時間培養する。通常は、培養時間は少なくとも5分間かつ約30分以内である。反応混合物中の抗体の濃度が十分になるようにして、分離効率が抗体不足によって制限されないようにすることが望ましい。適切な濃度は滴定で決定する。細胞を分離する培地は、その細胞の生存能力が維持される任意の培地にすることができる。好ましい培地は、0.1〜0.5％のBSAを含むリン酸緩衝溶液である。さまざまな培地が市販されており、細胞の性質に応じて使い分けることができる。例えば、ダルベッコの変更イーグル培地（DMEM）、ハンクの基本塩類溶液（HBSS）、ダルベッコのリン酸緩衝溶液（DPBS）、RPMI、アイスコーブ（Iscove's）の培地、5mMのEDTAを含むPBSなどがある。培地には、ウシ胎仔血清、BSA、HSAなどを添加することがしばしばある。
【００２８】
次に、標識した細胞をCD45RbとCD4の発現に関して分離する。分離した細胞を、その細胞の生存能力が維持される任意の適切な培地の中で回収する。通常は、回収チューブの底部に血清をクッションとして置く。さまざまな培地が市販されており、細胞の性質に応じて使い分けることができる。例えば、DMEM、HBSS、DPBS、RPMI、アイスコーブの培地などがある。培地には、ウシ胎仔血清、BSA、HSAなどを添加することがしばしばある。
【００２９】
望むT細胞が非常に豊富になった組成物がこのようにして得られる。このT細胞群は、細胞組成物の約90％またはそれ以上になっていることが好ましく、約95％またはそれ以上になっていることがさらに好ましい。望むT細胞が豊富になった細胞群は、ただちに使用してもよいし、液体窒素温度で凍結して長期間保存しておき、必要なときに溶かしてもよい。凍結した細胞は、通常、10％DMSO、10〜90％FCS、40％RPMI 1640、または他の培地の中で保存する。細胞は、溶かした後、成長因子を用いたり、T細胞の増殖や分化に関係するストロマ細胞を用いたりしてさらに増殖させることもできる。
【００３０】
精製したT細胞群を免疫能が低下したレシピエントに注入する。投与経路としては、全身への注射、例えば静脈内、皮下、腹腔内の注射がある。レシピエント動物がマウスである場合には、注入する細胞の数は、通常、少なくとも約1×105個かつ1×106個を超えない数であり、さらに一般的なのは少なくとも約2×105個であり、好ましくは約3×105個〜4×105個である。レシピエント動物がマウスよりも大きな動物の場合には、細胞数は体の大きさに応じて多くなる。
【００３１】
細胞の注入前、注入中、および／または注入後、ポリクローナル活性化剤および／または少なくとも1つの炎症促進性サイトカインを用いてT細胞を刺激する。本発明の好ましい一実施態様では、刺激として、レシピエント動物のT細胞にポリクローナル活性化剤と炎症促進性サイトカインの両方を注入する。これらの一方または両方を投与するには、任意の適切な方法による。例えば、静脈内、皮下、腹腔内の注射など全身への注射；パッチまたはインプラント；吸入などの方法がある。一般に、こうした刺激は、細胞を注入してから約1日後に与え、必要に応じて約3日以内にサイトカインを追加する。乾癬のいくつかの側面は細胞のみによって誘起されるが、その症状は、この免疫性刺激を与えることによって顕著に重くなる。
【００３２】
適切な炎症促進性サイトカインとしては、IL-12、IL-2、IL-15、IL-18α、IL-1α、IL-6、VEGF、GM-CSFが挙げられる。サイトカインは、T細胞と同じ種からのものであることが好ましい。しかし、いくつかのサイトカインは十分な交差反応性を有するため、1つの種に由来するタンパク質が他の種に由来する細胞を広く刺激することになる。
【００３３】
特に興味深いのはIL-12である。IL-12の好ましい用量は、レシピエントの体重1gあたり少なくとも0.5ngかつ約2ngを超えない値である。IL-12とその生物活性は、トリンキエリ、Int. Rev. Immunol.、第16巻（3〜4）、365〜396ページ、1998年；ゲイトリー他、Annu. Rev. Immunol.、第16巻、495〜521ページ、1998年に記載されている。IL-12のcDNAクローニングについては、ウルフ他、J. Immun.、第146巻、3074〜3081ページ、1995年に記載されている。IL-18の使用も興味深い。これについては、オカムラ他、Nature、第378巻、88〜91ページ、1995年に記載されている。サイトカインは、公開データベースで利用できる適切な核酸配列を発現させることにより、組み換えの形態で容易に産生させることができる。例えばマウスのIL-18配列は、ジーンバンク昇順番号D49949で見ることができる。サイトカインの用量幅は、一般的な慣例に従って容易に決定される。例えば、効果的な幅を決めるにあたって、10倍増しの用量にする。
【００３４】
本発明の好ましい一実施態様では、炎症促進性サイトカインは、ポリクローナル活性化剤と合わせて投与する。興味深いポリクローナル活性化剤としては、リポ多糖（LPS）などの内毒素；スーパー抗原（外毒素）（ハーマン他、Annu. Rev. Immunol.、第9巻、745〜772ページ、1991年を参照のこと）がある。内毒素が主にマクロファージ上のCD14受容体と相互作用するのに対し、スーパー抗原は選択的にT細胞を活性化する。したがって両方のタイプの細胞が炎症促進性サイトカインの放出を始める。スーパー抗原（SAgs）は主要組織適合複合体（MHC）クラスII分子によって提示され、特異的T細胞受容体のVβドメインを発現する多数のT細胞と相互作用する。SAgsとしては、Misなどの内毒素；SEB、SEAなどの細菌；マウス乳ガンウイルスなどのウイルスが可能である。細菌感染が患者に乾癬を誘発する引き金となりうるのは興味深い。ポリクローナル活性化剤を選択することで、さまざまなスーパー抗原やマイトジェンが本発明のモデル動物における疾患の発症に対して及ぼす効果を評価する手段が提供される。
【００３５】
ポリクローナル活性化剤は、注入したT細胞を活性化するのには十分な用量だが、全身性毒性が見られる用量よりは少ない用量を投与する。さまざまな薬剤の適切な用量は、当業者であれば容易に決定することができる。例えばLPSの場合、用量は、通常、レシピエントの体重1gにつき少なくとも約0.1μgかつ約5μg以下にする。好ましいのは約1μgである。SEB、SEAなどの細菌のスーパー抗原でも同様の用量幅にする。
【００３６】
T細胞、サイトカイン、ポリクローナル活性化剤を投与してから約4週間以内に動物はヒト乾癬に非常に似た疾患を発症する。疾患の程度の評価は、外観と耳の厚さに基づいて行なう。症状としては、1ヶ所以上の紅斑（最初は耳と顔に現われることが一般的である）と；体表面全体の鱗屑がある。重篤な鱗屑は、動物の体表面の約20％以上が鱗屑に覆われた場合と定義する。耳の厚さを測定するには、マイクロメータを用いるなどの一般的な方法による。
【００３７】
さらに詳しい解析を行なうには、さまざまな組織、好ましくは耳、耳たぶ、尾などの組織学的断面を利用するとよい。特別な組織学的特徴としては、表皮腫；単核細胞の浸潤；表皮の厚み増加；大きな血管密度；網状組織突起；表皮と角質細胞の過形成；微小膿瘍；顆粒細胞層の厚み低下；膿胞の形成；顆粒細胞層の破壊が挙げられる。こうした特徴は、文献に詳しく記載されている。例えば、キャロル他、Cell、第83巻、957〜968ページ、1995年；サンドバーグ他、Pathobiology、第65巻、271〜286ページ、1997年；ローン−スミスとニコロフ、J. Clin. Invest.、第98巻、1878〜1887ページ、1996年を参照のこと。
【００３８】
発疹の特徴をよりはっきりとさせるためには、免疫遺伝型解析を行なって、関連するさまざまな抗原決定基を検出するとよい。角質細胞が増殖する程度は、免疫染色法を用いて増殖細胞核抗原（PCNA）を検出することにより、評価することができる。角質細胞の活性を示す他の指標としては、HLA-DR、インテグリン、ケラチン16、インボルクリンの発現がある。存在している免疫細胞のタイプを明らかにするには、さまざまな白血球マーカーに対して免疫組織化学的染色を行なうとよい。乾癬の病理生理学には表皮と真皮の内部のT細胞が関与しており、それに関係する別の付着分子として病巣に隣接する血管においてE-セレクチンが発現したり、全身で血管細胞付着分子-1（VCAM-1）が発現したりしている可能性がある。
【００３９】
ヒトの疾患に特有の特徴は、網状組織突起が異常な形態で存在していることである。これは、本発明の動物でも見られる。表皮と真皮の境界はでこぼこしている。表皮丘診すなわち網状組織突起は、真皮の対応する結合組織のパターンのうちで真皮丘診（これが真皮の丘診層をなしている）と呼ばれるものと適合した皺や溝である。真皮丘診によって生じる表皮からのこうした突起は、断面だと柱状の細胞に見える。
薬剤スクリーニング・アッセイ
本発明の動物は、副組織適合抗原；一部のT細胞群；炎症促進性サイトカイン；ポリクローナル・トリガーなどのさまざまな要素が疾患の誘発において果たしている役割を評価するのに役立つだけでなく、治療用薬剤や薬剤使用法の候補をスクリーニングするのにも役立つ。本発明の動物またはその動物に由来する細胞を用いると、乾癬の進行に影響するリガンドまたは基質を同定することができる。特に興味深いのは、ヒト細胞に対して毒性の低い薬剤のスクリーニング・アッセイである。
【００４０】
この目的で多数のアッセイを利用することができる。例えば、有効性の組織学的解析、投与後に薬剤が局在している場所の決定、インビトロにおける標識したタンパク質−タンパク質結合アッセイ、タンパク質−DNA結合アッセイ、電気泳動モビリティ・シフト・アッセイ、タンパク質の結合に関するイムノアッセイなどがある。どのアッセイを行なうかに応じ、動物全体を用いたり、その動物に由来する細胞、特に皮膚細胞、例えば角質細胞を用いたりする。細胞は、動物から新鮮な状態で分離することもできるし、培養して不死化することもできる。候補となる治療法は新規な方法でもよいし、既存の治療法を改良した方法でもよい。現在用いられている乾癬の治療法としては、以下の方法がある。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
動物の体全体を利用するスクリーニング・アッセイでは、候補となる薬剤または治療法を被験動物に適用する。典型的には、1つのグループの動物を、治療しないネガティブな対照またはプラセボで治療する対照とし、テストするグループを、候補となる治療法で治療する。一般に、異なる用量レベルで複数のアッセイを並行して行ない、さまざまな用量に対する異なる応答を得る。投与する用量と経路は、テストする個々の化合物または治療法に応じて決める。したがって、個々の製剤、候補薬剤の安定性、動物の応答などによって異なることになろう。
【００４３】
解析は、疾患の誘起を予防する効果の確認が目的であり、疾患が誘起される前、すなわちT細胞および／または炎症促進性サイトカインを注入する前に処置を行なう。解析はまた、存在している発疹の軽減を確認することも目的としており、この場合には疾患が最初に見られてから治療を行なう。予防に効果のある治療法は疾患の軽減にも有効であることがしばしばある。
【００４４】
いずれの場合にも、疾患が発症または軽減するのに十分な時間が経過した後、動物に対する治療効果の評価を、目視により、組織学的に、免疫組織学的に、そして治療法の効果を確認するのに適した他の方法で行なう。結果は半定量的または定量的に表現し、結果を統計的に解析するための基礎とする。
“薬剤”という用語は、本明細書では、乾癬症状に作用を与えることのできる任意の分子、例えばタンパク質または薬を指すのに用いる。薬剤または紫外光などを用いた治療法は、本発明の動物、またはその動物に由来する細胞に適用する。サイトカイン特異的な抗体、ポリクローナル活性化剤、T細胞抗原は、特に興味深い薬剤である。本発明の別の側面によれば、薬剤は、例えばリンホカインを無効にしたり、分子の付着を阻止したりするモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００４５】
具体例を挙げるならば、抗体としてはIL-12またはγ-IFNに対して特異的な抗体が挙げられるが、これだけに限られるわけではない。例えば、ヒト化した抗IFN-γ抗体であるHuZAF（1998年12月1に出願され、公に譲渡されたアメリカ合衆国仮特許出願第60/110,523号に記載）；ヒト化した抗E/P-セレクチン抗体であるHuEP5C7（アメリカ合衆国特許第5,622,701号に記載）；ヒト化した抗CD3抗体であるHuM291（PCT公開WO96/26964に記載）が挙げられる。
【００４６】
候補となる他の薬剤としては、多数の化学物質、典型的には有機分子がある。候補となる薬剤は、構造的にタンパク質と相互作用するのに必要な官能基、特に水素結合を含んでいる。典型的には、少なくとも1つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基が含まれているが、少なくとも2つの官能基が含まれていることが好ましい。候補となる薬剤は、1つまたはそれ以上の前記官能基で置換された環式炭素またはヘテロ環式構造、および／または、芳香族構造またはポリ芳香族構造を含んでいることがしばしばある。候補となる薬剤は、生体分子の中からも見つかる。例えば、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体や構造的アナログ、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。
【００４７】
候補となる薬剤は、合成化合物や天然化合物のライブラリーなど、さまざまな供給源から得られる。例えば、多くの方法を利用して、多彩な有機化合物や生体分子のランダムな合成または指向性合成を行なうことができる。ランダム化したオリゴヌクレオチドやオリゴペプチドを発現させることもその中に含まれる。また、細菌、菌類、植物、動物からの抽出物の形態をした天然化合物のライブラリーを利用したり、そうしたライブラリーを簡単に作ったりすることもできる。さらに、天然または合成のライブラリーや化合物は、従来からある化学的、物理的、生化学的な方法で容易に修飾できて、それを利用してコンビナトリアル・ライブラリーを作ることができる。指向性化学的修飾またはランダムな化学的修飾により、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などを既知の薬剤に対して行なうことにより、構造的アナログを生み出すことができる。
【００４８】
治療用薬剤は、患者に対してさまざまな方法で投与することができる。例えば、経口で、局所的に、非経口経路として例えば皮下、筋肉内、静脈内に投与する。薬剤は、導入する方法に応じ、さまざまな形態にすることができる。製剤にした医薬組成物に含まれる治療効果のある成分の濃度は、約0.1〜100重量％の範囲で変えることができる。
【００４９】
医薬組成物は、さまざまな形態に調製することができる。例えば、顆粒、タブレット、ピル、座薬、カプセル、分散液、軟膏、ローションなどが可能である。経口利用または局所的利用に適した薬理学的グレードの有機または無機の基剤および／または希釈剤を使用して、治療上有効な化合物を含む組成物を作ることができる。既知の希釈剤としては、水性媒体、植物性または動物性の油や脂肪がある。補助剤として、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変化させる塩類、十分なpH値を確保するための緩衝液、皮膚浸透性向上剤を用いることができる。
IL-12またはγ-インターフェロンを無効にする抗体を用いた治療
本発明の別の実施態様では、リンホカインであるインターロイキン12（IL-12）またはγ-インターフェロン（IFN-γ）の効果を阻止する薬剤を用い、乾癬にかかった患者を治療する。この薬剤は、前記のように小さな分子が可能であるが、タンパク質であることが好ましい。好ましい実施態様では、薬剤は、IL-12またはIFN-γと結合する抗体、特にモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、マウス、ラット、ハムスターなどの適切な任意の種から従来技術で周知の方法を用いて取り出したものが可能である（一般的な文献として、ハーロウとレーン、『抗体、実験室マニュアル』、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、ニューヨーク州、1988年を参照のこと）。抗体は、キメラ抗体（例えばカビリー他、アメリカ合衆国特許第4,816,567号を参照のこと。この明細書には、この特許が参考として実質的に組み込まれている）、またはヒト化した抗体（例えば、クイーン他、アメリカ合衆国特許第5,585,089号を参照のこと。この明細書には、この特許が参考として実質的に組み込まれている）であることが好ましい。なお、ヒト化した抗体とは、ヒト以外の抗体の相補性決定領域（CDR）を、組み換えDNA技術を用いて、本質的にヒトの枠組みの定常領域につなぐことによって形成される抗体のことである。また、抗体は、ヒト抗体でもよい。ヒト抗体を作るには、例えば、トリオーマ技術（例えばアメリカ合衆国特許第4,634,664号を参照のこと）を利用したり、トランスジェニック動物（例えば、ロンバーグ他、WO93/12227と、クチャーラパティ、WO91/10741を参照のこと。この明細書には、それぞれが、参考として実質的に組み込まれている）から作ったり、ファージ提示法（例えば、ダウアー他、WO91/17271、マッカファーティ他、WO92/01047、ウィンター、WO92/20791を参照のこと。この明細書には、それぞれが、参考として実質的に組み込まれている）を利用したりする。
【００５０】
モノクローナル抗体は、対応する抗原に対する結合アフィニティ（会合定数）が少なくとも108M-1であることが好ましい。この値は、109M-1以上になっていることがさらに好ましい。最も好ましいのは、抗体が、IL-12またはIFN-γを無効にする、すなわちIL-12またはIFN-γの1つまたはそれ以上の生物学的機能（例えば細胞の受容体と結合する能力）を阻害することである。無効機能を有する抗体によって阻害される可能性のある他の機能としては、IFN-γに関しては、公に譲渡されたアメリカ合衆国仮特許出願第60/110,523号に例示されており、IL-12に関しては、ゲートリー他、アメリカ合衆国特許第5,780,597号とゲートリー他、WO99/37682（この明細書には、それぞれが、参考として実質的に組み込まれている）に例示されている。具体例を挙げるならば、IL-12の持つIFN-γ誘導機能の阻害である。抗体の濃度を0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、または10μg/mlにすると、それぞれのリンホカインの機能が25％、50％、90％、95％、99％、またはほぼ100％阻害されることが好ましい。特にリンホカインを前記濃度のいずれか、または抗体の濃度の0.005、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、または1.0となるモル濃度で用いる場合にも、リンホカインの機能が阻害されることが好ましい。IFN-γの機能を無効にする抗体の具体例としては、HuZAFまたはヒト化した他のAF2（アメリカ合衆国仮特許出願第60/110,523号に記載）がある。IL-12の機能を無効にする抗体の具体例としては、5F2、16F2、16G2、20E11（ゲートリー他、WO99/37682）のほか、これらのキメラやこれらをヒト化した形態のものがある。好ましい他の抗体は、前記の抗体と同じエピトープ、または前記の抗体と重なったエピトープを備えている。すなわち、好ましい他の抗体は、抗原と結合するために前記の抗体と競合（相互阻害）する。あるいは好ましい他の抗体の中で抗原と同じいくつかのアミノ酸がインビトロでの突然変異誘発によって結合に寄与する。特に好ましい抗IL-12抗体は、p75 IL-12ヘテロ二量体と結合するが、p40などの個々のサブユニットとは結合しない。
【００５１】
また、抗体の代わりに、IL-12またはIFN-γに対する細胞受容体の細胞外部分をヒト免疫グロブリン（例えばIgG1）のFc領域と組み換えによって結合させ、半減期または他の特性を改善することができる。そうした融合タンパク質（“免疫付着因子”）の構成方法に関しては、例えば、アシュケナジー他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第88巻、10535〜10539ページ、1991年と、ムースメイヤー他、J. Interferon Cytokine Res.、第15巻、1111〜1115ページ、1995年を参照のこと（この明細書には、それぞれが、参考として実質的に組み込まれている）。IL-12およびINF-γの受容体は、それぞれ、チュア他、J. Immunol.、第153巻、128〜136ページ、1994年と、プレスキー他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第93巻、14002〜14007ページ、1996年；アゲット他、Cell、第55巻、273〜280ページ、1988年に記載されている（この明細書には、それぞれが、参考として実質的に組み込まれている）。融合タンパク質は、それぞれIL-12またはIFN-γと結合してそれを無効にするので、抗体と似た特性を持つことになる。したがってこの融合タンパク質を乾癬の治療に使える可能性がある。今後は、“抗体”という用語は、このタイプの融合タンパク質も含むものと理解する。
【００５２】
抗体（または融合タンパク質）からなる薬剤は、患者に投与するためには、薬理学的に受容可能な基剤の形にするのが一般的である。さまざまな水性基剤を用いることができる。例えば、注射用の水（WFI）、または、リン酸、クエン酸、酢酸などで緩衝してpHを一般には5.0〜8.0、たいていは6.0〜7.0にし、および／または、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩類を含有させて等張にした水が挙げられる。基剤は、活性タンパク質を保護するため、ヒト血清アルブミン、ポリソルベート80、糖類、またはアミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、グリシンなど）を賦形剤としてさらに含んでいてもよい。これら製剤中の抗体の濃度は約0.01〜100mg/mlという大きな幅があるが、1〜10mg/mlのことが最も多い。製剤にした抗体は、非経口投与に特に適しており、静脈内への点滴、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射により投与することができる。製剤にした抗体は、疾患が生じている部位、例えば乾癬の発疹部に注射することもできる。
【００５３】
薬剤の単位用量中には、疾患を軽減するが容認しがたい副作用を起こすことはないような量（治療上効果的な用量）として、典型的には抗体（または融合タンパク質）を0.01〜100mg含んでいるが、体重1kgまたは単位用量につき0.1〜1mg、または1、2、5〜10mgにすることが最も多い。抗体からなる薬剤は、1回または複数回投与することができる。例えば、疾患の性質と程度に応じて、1日、1週間、1ヶ月に1、2、または3回を、1〜数日、数週間、数ヶ月、数年にわたって、または永久的に投与する。抗体は、1つまたはそれ以上の他の免疫抑制薬の投与または他の治療法を行なった後に、またはそれと同時に投与することがしばしばある。他の免疫抑制薬または他の治療法としては、例えば、コルチコステロイド、シクロスポリン、メトトレキセート、（PUVAを用いた、あるいは用いない）光線療法、または上記の表1に記載した他の方法がある。抗IL-12抗体または抗IFN-γ抗体は、他の抗体と同時に、または他の抗体と組み合わせて使用することもできる。他の抗体としては、例えば、接合分子、またはCD11a、CD40リガンド、IL-8といったリンホカイン、またはこれらの受容体（例えばIL-2受容体）に対する抗体がある。
【００５４】
乾癬の程度は、乾癬領域症状指数（PASI）により（例えば、フライシャー他、J. Dermatol.、第26巻、210〜215ページ、1999年；タニュー他、Arch. Dermatol.、第135巻、519〜524ページ、1999年を参照のこと）、あるいは乾癬の臨床試験を行なっている当業者には周知の内科医全体評価（PGA）などのさまざまな乾癬全体評価スコアにより決定する。IL-12またはIFN-γに対する抗体（例えばヒト化した抗体、またはヒト抗体）を用いた治療により、治療を受けている患者の少なくとも50％、好ましくは60〜70％、または75％又はそれ超において、PASI（またはグローバル評価スコア）が、少なくとも25％または40％、好ましくは50％、あるいは60または70％又はそれ超低下するであろう。また、この治療により、より少数のグループまたは患者において、スコアのより大きな低下が起こるであろう。すなわち患者の少なくとも20％〜25％、好ましくは30％〜40％、または50％又はそれ超において、少なくとも75％、好ましくは80〜90％の治癒、またはほとんど完全な治癒が起こるであろう。スコアのこの低下は、抗体による治療を継続した場合でも停止した場合でも、典型的には少なくとも2ヶ月、好ましくは3ヶ月以上、さらには4〜6ヶ月以上さえも続くであろうが、最も好ましいのは、1年又はそれ超続くことである。典型例では、臨床試験（例えば第I相または第III相の試験）において、IL-12またはIFN-γに対する抗体を用いて治療した患者におけるPASIまたはスコアの改善は、治療を受けていない患者、またはプラセボや他の薬剤で治療を受けた患者からなる対照グループと比較すると、例えばp=0.05または0.01、あるいは0.001のレベルにおいてさえ、統計的に有意となろう。
【００５５】
また、IL-12またはIFN-γに対する抗体は、例えばコルチコステロイド、シクロスポリン、メトトレキセート、（PUVAを用いた、あるいは用いない）光線療法、または上記の表1に記載した他の方法など、他の手段によって寛解がすでに誘導された後に投与することができる。この場合、抗体を用いた治療により、再発するまでの時間（例えばPASIが50％悪化するまでの時間）の中央値は、少なくとも40％、好ましくは50％、さらに好ましくは60〜70％以上、さらには100％（2倍）以上延びるであろう。典型例では、臨床試験（例えば第II相または第III相の試験）において、IL-12またはIFN-γに対する抗体を用いて治療した患者における再発までの時間のこの延長は、治療を受けていない患者、またはプラセボや他の薬剤で治療を受けた患者からなる対照グループと比較すると、例えばp=0.05または0.01、あるいは0.001のレベルにおいてさえ、統計的に有意となろう。
【００５６】
本発明は、ここで説明した特定の方法、プロトコル、細胞系、動物の種または属、構造体、薬剤に限定されることはなく、変更が可能であるものと理解する。また、この明細書で用いる用語は特定の実施態様を記述することだけを目的としており、その用語によって本発明の範囲を制限する意図はないものと理解する。なお本発明の範囲は、請求の範囲における用語法によって決まることになる。
【００５７】
この明細書ならびに添付の請求の範囲で使用する単数形には、特別な記載がない限り複数形も含まれることに注意されたい。したがって、例えば“1匹のマウス”には、同様の複数のマウスが含まれ、“サイトカイン”には、1つまたはそれ以上のサイトカインや、当業者に知られているその等価物が含まれる。他のものに関しても同様である。
【００５８】
この明細書で使用している科学技術用語はすべて、特別の記載がない限り、この発明が属する分野の当業者が通常理解しているのと同じ意味で用いる。この明細書で説明したのと似た、または等価な方法、装置、物質を本発明を実践したりテストしたりするのに用いることができるとはいえ、好ましい方法、装置、物質についてこれから説明することにする。
【００５９】
この明細書において言及したすべての出版物は、すべての関連した目的、例えば本発明を記述する際に利用する可能性のある出版物に記述されている細胞系、構造体、方法論を記述し開示するという目的で、参考としてこの明細書に実質的に組み込まれている。すでに引用した出版物およびこの明細書全体の中に登場する出版物は、この出願の出願日前に開示されているというというだけの理由で掲載してある。この明細書のどの部分も、本発明の発明者が、以前になされた発明によるそうした開示に先行する資格がないことを認めていると見なしてはならない。
【００６０】
以下の実施例は、当業者に対し、本発明をなし、かつ利用するための完全な開示と説明を行なうことを目的として記述したものであり、これらの実施例によって本発明の範囲と見なされるものを制限する意図はない。記載した数値（例えば量、温度、濃度など）に関してはできるだけ正確になるよう努力したが、幾分かの実験的誤差やずれは許容されるべきである。特別の記載がない限り、部は重量部を、分子量は平均分子量を、温度は摂氏の温度を、圧力は大気圧またはほぼ大気圧を表わす。
実施例
実施例１
材料と方法
マウス。メスのBALB/cjマウスとBALB/cj-IFN-γ-/-マウス（ドナー・マウス）をジャクソン・ラブズ社（バー・ハーバー、メーン州）から購入した。C.B-17/lcr scid/scidマウスと、C.B-17 scid/beige二重突然変異マウス（レシピエント・マウス）をタコニック社（ジャーマンタウン、ニューヨーク州）から購入した。マウスはすべて、プロテイン・デザイン・ラブズ社において特定の病原体のない環境に収容し、4〜12週の年齢で使用した。歩哨マウスを用いて、MHV、センダイウイルス、PVM、REO3、TMEV、GDVIII、M. プルモニス、パルボウイルスといった病原体をスクリーニングした。マウスをランダム・スクリーニングして、ギョウチュウがいるかどうかを調べた。いかなるときにも、上記のどの病原体も検出されなかった。1つのマイクロアイソレータごとに2〜5匹のマウスを収容した。scid/scidマウスまたはscid/beigeマウスはすべて、クラスIIのフードの下で手袋をして取り扱い、殺菌した食料と水を供給して自由に摂らせ、殺菌したマイクロアイソレータの中で層流テント（バイオクリーン社、メイウッド、ニュージャージー州）の中に保持した。なおマイクロアイソレータは、毎週取り換えた。ドナー・マウスは、従来からある飼育かごに収容した。飼育かごは、毎週取り換えた。
【００６１】
細胞の精製と、scid/scidマウスへの細胞の注入。6〜12週のドナー・マウス（BALB/cjまたはIFN-γ-/--BALB/cj）から脾臓を回収し、脾臓全体を機械的に均質化することによって脾臓細胞を分離した。CD4+ T細胞を正の選択によって選択した。要するに、4〜5匹のドナー・マウスからプールした脾臓細胞の細胞分散液を、磁性ビーズ（DYNABEADS、カタログ#114.05、ダイナル社、レイク・サクセス、ニューヨーク州）でコーティングした抗CD4（L3T4）抗体を用いて4℃にて20〜30分間にわたって培養し、ダイナル磁性粒子濃縮装置（MPC）を用いて磁性細胞ソーティングにより分離した。ダイナル社のDETACHaBEADを用いて細胞−ビーズ複合体から細胞を取り除き、ダイナル社のMPCを用いてビーズから細胞を分離した。その結果得られた、CD4+を豊富に含む細胞群は、90％を超える純度であった。次に、細胞分散液（10×108細胞/ml）をFcブロック（抗CD32、ファーミンジェン社、01241A）（10μg/ml）を用いて培養するとともに、抗CD4-FITC（ファーミンジェン社、9004D）と抗CD45RB-PE（ファーミンジェン社、01145A）（どちらも10μg/ml）で標識する操作を4℃にて30分間行ない、洗浄し、FACSTAR（ベクトン・ディキンソン社、サンノゼ、カリフォルニア州）細胞ソーターを用いてソーティングした。ダブル・ポジティブ細胞（CD4+/CD45Rb+）を回収し、CD45Rbを高レベルで発現した細胞（もっとも明るい45％）を選択した。回収した細胞群は90％を超える純度で、生命力があった。次に細胞を冷たいカリウム緩衝溶液（PBS、シグマ社、D8662）の中で洗浄し、PBSの中に1.5×106細胞 /mlの密度で再度分散させた。4〜6週のC.B-17/lcr scid/scidマウスの尾の静脈内に、3×105個の細胞を、体積にして全部で200μL注入した。
【００６２】
scidマウスにおける乾癬状発疹の誘起と治療。微生物産物とIL-12の効果を研究するため、レシピエント・マウスに対して以下の処置を行なった。対照グループにはCD4+CD45Rbhi分類細胞を注入し、それ以上の処置は行なわなかった。第2のグループには、細胞を移植した1日後、それぞれのマウスの腹腔にサルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis）（シグマ社、L-2012）からのリポ多糖（LPS）を20μg注入した。第3のグループには、1日目と3日目にそれぞれのマウスの腹腔にIl-12（ファーミンジェン社、カリフォルニア州）だけを10ng注入した。最後のグループにはLPSとIl-12を組み合わせて腹腔に注入した。LPSを20μgにし、Il-12の用量は2、10、100ngにした組み合わせについて用量の研究を行なった。LPSとIl-12の注入は、T細胞を移植した1日後に行ない、3日後に追加のIl-12を投与した。追加研究として、LPS（20μg）とIl-12（10ng）を週に1回投与する操作を3週間にわたって行なった。いくつかの実験群には、T細胞を移植した1日後に1回だけ、それぞれのマウスの腹腔にスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（シグマ社、カタログS4881）からのブドウ球菌エンテロトキシンBタンパク質を10μg注入した。
【００６３】
IFN-γの役割を研究するため、BALB/cj-IFN-γ-/-マウス（ジャクソン・ラブズ社）からのT細胞を上に説明したのと同じ方法で分離した。レシピエントのscid/scidマウスにも、20μgのLPSと10ngのIL-12を1日目に、10ngのIL-12を3日目に注入した。さらに、いくつかの実験では、T細胞、B細胞、NK細胞が欠けているscid/beigeマウス（タコニック社）をレシピエント・マウスとして用いてIFN-γ-/-T細胞を移植した。介入研究を行なうため、0.5mgの抗IL-12抗体（クローンC17.8、ファーミンジェン社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を、7日目と35日目にマウスの腹腔内に注入した。対照マウスには、PBSまたはラットのIgG（シグマ社）を同じ日に与えた。
【００６４】
臨床評価。4週〜10週まで、毎週、3人の異なる研究者がマウスの評価を行なった。病気の進行を半定量的に記録するため、外見と耳の厚さをもとにして、0〜4の臨床スコアをつけた。0は皮膚にも耳にも症状が見られない状態。1は、耳または耳たぶに軽度から中度の紅斑があり、耳がわずかに厚くなっている状態（体表の2％未満）。2は、1ヶ所（たいていは耳と顔）に中度から重度の紅斑があり、中度の鱗屑がある状態（体表の2〜10％）。3は、2つまたはそれ以上の部位（耳、顔、胴体）に重度の紅斑があり、重度の鱗屑がある状態（体表の10％を超える）。4は、体全体に非常に重度かつ広範な紅斑があり、重度の鱗屑がある状態（体表の20％を超える）。特別な所見があれば、柔毛、耳の徴候、まぶたの外観、四肢および尾の炎症に注意して記録した。耳の厚さは、バネ式マイクロメータ（オディテスト、ダイヤー社）を改良したものを用いて測定した。あらゆる測定時にはいつも、右の耳と左の耳の両方に関し、同じ箇所で測定を行なった。組織のむくみが最終的な測定に影響しないようにするため、マイクロメータを耳にしばらく固定した。
【００６５】
皮膚組織サンプルの組織学的解析と免疫組織学。細胞を移植してから10〜12週後、マウスの死体解剖を行なった。耳、まぶた、尾からの組織サンプルを回収し、パラホルムアルデヒド溶液の中に固定して、切片の調製と解析をコンパラティヴ・バイオサイエンス社（サニーヴェイル、カリフォルニア州）に依頼した。疾患の程度を記録するため、炎症の程度に応じて0〜4の半定量的な組織学的スコアをつけた。最初の組織学的評価は、外部の独立した病理学者が行なった。その後の研究では、評価を3人の研究者がブラインド・テスト方式で行なった。耳の厚さが25μm以下で他の臨床的徴候が見られないマウスについては切片の解析を行なわず、自動的に組織学的スコアを0にした。0は、炎症の徴候がない状態。1は、炎症部がほんの少しだけで、わずかに表皮腫が見られる状態。2は、単核細胞の浸潤がわずかにあり、表皮がわずかに厚くなり、軽度から中度の表皮腫が見られる状態。3は、単核細胞の浸潤が大量にあり、血管の密度が大きくなっており、表皮が厚くなった状態（表皮腫、網状組織突起、表皮と角質細胞の過形成、小さな膿瘍、顆粒細胞層の厚さ増大）。4は、表皮と真皮に非常に広範な浸潤が起こり、血管の密度が非常に大きくなっており、表皮が極めて厚くなり、膿疱が形成され、顆粒細胞層が破壊されている状態。
【００６６】
組織サンプルを回収し、Tissue Tek OCT化合物の中に埋め、ドライアイスで凍結させて低温にて切片を切り出した。組織の切片（5μm）を100％アセトン中に固定し、PEを結合させたIL-12 mAb（p40/70）（ファーミンジェン社、クローンC17.8）を用いて染色した。蛍光顕微鏡による肉眼での検出に基づき、組織がプラスであるかマイナスであるかを評価した。
【００６７】
皮膚浸潤リンパ球細胞の分離。酵素を用いた消化により、皮膚浸潤リンパ球（SIL）を分離した。要するに、殺菌したかみそりで皮膚、耳、まぶたを細かく切断し、断片を100mmのナイロン製細胞濾過装置（ファルコン社）上でHBSSを用いて洗浄し、表面残留物を取り除いた。Ca/Mg（バイオホワイタッカー社、ウォーカーズヴィル、メリーランド州、10-543F）は含まないが、25mMのHEPES緩衝溶液（バイオホワイタッカー社、17-737E）と10％のFCS（マイクローン・ラブズ社、ローガン、ユタ州、SH30071.03）を追加した25mLの暖かい（37℃）HBSS培地の中で37℃にて20分間にわたって断片を培養し、浸潤細胞を解放した。残った断片をナイロン・メッシュ上で洗浄し、25mMのHEPES緩衝溶液、10％のFCS、400U/mLのDNAアーゼ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ社、インディアナポリス、インディアナ州、104159）、400U/mLのコラゲナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社、1088874）を添加したRPMI1640培地（バイオホワイタッカー社、12-702F）の中に再度分散させ、ロッカー上で37℃にて90分間にわたって培養した。得られた細胞分散液を100μmと40μmのナイロン・メッシュ・フィルターで順番に濾過し、25mMのHEPES緩衝溶液と10％のFCSを追加したRPMI1640の中で2回洗浄した。
【００６８】
SILに対するインビトロでの刺激とサイトカインの検出。10％のFBS（ハイクローン社）、5×10-5Mの2-メルカプトエタノール（シグマ社）、2mMのグルタミン（ライフ・テクノロジーズ社）、10U/mLのペニシリン/100μgのストレプトマイシン（ライフ・テクノロジーズ社）、15mMのHEPESを追加したRPMI1640完全培地の中に、SILを106/mLの割合で再度分散させた。CD4+をソーティングしたT細胞を2.5×105/mLの割合で再度分散させた。次に、この分散液を1つのウエルにつき200μlの割合で96ウエルの組織培養プレート（ファルコン社、3072）に入れ、αCD3（PDL社、クローン145-2C11）とαCD28（ファーミンジェン社）をそれぞれ1μg/ml用いて48時間培養した。3つの異なる培養ウエルからの上澄み液を回収し、IFN-γ、TNF-α、IL-4が存在しているかどうかをELISAで調べた。ELISAの操作には、96ウエルの平底Immulon 4 plate（ダイナテック・ラブズ社、011-010-3850）を、抗IFN-γ抗体、抗TNF-α抗体、または抗IL-4抗体（すべて、ファーミンジェン社）を炭酸塩緩衝液に2μg/mL溶かした溶液を50μl用いて4℃にて一晩コーティングする操作が含まれる。次にプレートをPBS/トゥイーン（PBSにトゥイーン20が0.05％含まれたもの）で洗浄し、3％のBSA（シグマ社、ウシ・アルブミンA7030）を含む殺菌PBS溶液200μlを用いて37℃にて1時間にわたってブロックした。以下の各ステップの間には、プレートをPBS/トゥイーンで洗浄した。次に、IFN-γ、TNF-α、IL-4の基準サンプルと、上澄み液のサンプルをウエルに添加し、37℃にて2時間にわたって培養した。次に、ビオチンが結合した抗IFN-γ二次抗体、抗TNF-α二次抗体、抗IL-4二次抗体（抗体はすべてファーミンジェン社）を3％のBSA/PBS溶液中に2μg/mLの割合で溶かしてそれぞれのウエルに添加し、37℃にて1時間にわたって培養した。次に、ストレプトアビジンで標識したセイヨウワサビのぺルオキシダーゼ（HRP）（ジャクソン。イムノリサーチ・ラブズ社、016-030-084）を1μg/mLの割合で添加した。次に、O-フェニレンジアミン（シグマ社、4664）を、メーカーのプロトコルに従って基質緩衝液として用いた。次に、モレキュラー・デヴァイシーズ社（サニーヴェイル、カリフォルニア州）のプレート読み取り装置で結果を読み取り、SOFTmax（登録商標）ソフトウエアを用いてデータを解析した。
結果
CD4+/CD45Rbhi T細胞を回復したscid/scidマウスを、LPSと低用量または中用量のIL-12とを用いて処置すると、乾癬の発生が増加し、症状が重くなる；高用量のIL-12はこの疾患が誘導されるのを防ぐ。以前の研究において、副ハプロタイプが適合しないCD4+/CD45Rbhi Balb/c T細胞を回復したscid/scidマウスがときにヒト乾癬に似た慢性皮膚炎を発症することが知られていた。最初の実験において、Balb/c CD4+/CD45Rbhi T細胞だけをC.B-17 scid/scidマウスに移植した場合には、ほんの数匹だけが乾癬を発疹し、しかもこの疾患の発現が比較的軽いことがわかった。この発見は、ショーン他、1997年、前掲文献の観察と整合性がある。細菌のマイトジェンまたは細菌のスーパー抗原が細胞を媒介とした免疫応答の強力なモジュレータであること、またIL-12がさまざまな自己免疫疾患の誘起に重要な役割を果たしていることが知られているため、そうした薬剤を同時投与することがscid/scid移植モデルにおいて乾癬を誘起する効果に影響を及ぼすかどうかを最初に調べた。表2に示したように、C.B-17 scid/scidマウスにBalb/c CD4+/CD45Rbhi T細胞だけを回復した場合には、38％のマウスだけが乾癬の皮膚発疹を起こし、27％のマウスだけが重症になった。LPSだけを投与した場合には、疾患の発生がわずかに増加した（50％）が、発疹の程度は、T細胞だけを移植したマウスにおける発疹と同程度のままであった。同様に、T細胞を移植してから1日後と3日後に中用量（10ng/マウス）のIL-12だけを投与したところ、疾患の発生が明らかに増加した（67％）が、疾患の程度には影響しなかった。
【００６９】
【表２】
2004231667.tif 000004
【００７０】
１  BALB/cjマウスの脾臓から分離したCD4+/CD45Rbhi細胞をscid/scidマウスに移植した後、レシピエント・マウスに以下の処置を施した。PBSグループには、ソーティングした細胞を注入した以外の処置はしなかった。IL-12のグループは、0日目に細胞を注入した後、1日目と3日目に1匹のマウスにつき10ngのIL-12だけを腹腔内に注入した。LPSのグループには、細胞を移植した1日後に、サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis）（シグマ社、L-2012）からのリポ多糖（LPS）を1匹のマウスにつき20μg与えた。LPSを20μgにし、Il-12は低用量（2ng）、中用量（10ng）、高用量（100ng）にした組み合わせについて用量の研究を行なった。LPSとIl-12の注入はT細胞を移植した1日後に行ない、3日後に追加のIl-12を投与した。別の一連の実験では、LPS（20μg）とIl-12（10ng）を週に1回投与する操作を3週間にわたって行なった。他のマウスには、T細胞を移植した1日後に1回だけ、それぞれのマウスにスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（シグマ社、カタログS4881）からのブドウ球菌エンテロトキシンBタンパク質を10μg注入した。
２  疾患の発生件数の欄には、12週間の間に発症したマウスの数を記載してある。発症の基準は、耳の厚さが26μm以上、または臨床スコアが1以上である。正常なscid/scidマウスの耳の厚さは21±1μm（n=10）である。
３  発症したマウスの組織学的スコア1〜4は、耳、皮膚、まぶたの炎症の程度によって判断した。耳の厚さが25μm以下のマウスは、発病していないマウス（発症していない平均の耳の厚さは22±1μm）に分類し、自動的に切片解析の対象からはずした。0は、炎症の徴候がない状態。1は、単核細胞の浸潤が非常に少ない状態。2は、単核細胞の浸潤がわずかにあり、表皮がわずかに厚くなった状態。3は、単核細胞の浸潤が多く、血管の密度が大きく、表皮が厚くなった状態（表皮腫、網状組織突起、表皮と角質細胞の過形成）。4は、表皮と真皮に非常に広範な浸潤が起こり、血管の密度が非常に大きくなっており、表皮が極めて厚くなり、膿疱が形成され、顆粒細胞層が破壊されている状態。対照であるPBSに対するp：LPS+IL-12低用量、p<0.1、LPS+IL-12中用量、p<0.008。統計的解析はスチューデントの両側t検定により行なった。
４  重い疾患の誘起は、平均組織学的スコアが2.5以上および／または平均臨床スコアが3以上のマウスの数をもとに計算した。
５  LPS（20μg）とIl-12（10ng）を1週間に1度の割合で3週間にわたって与えた。
６  ソーティングしていない3×105個のCD4+ T細胞（CD45RbhiとCD45Rblo）をscid/scidマウスに移植した。LPS（20μg）とIl-12（10ng）を1週間に1度の割合で3週間にわたって与えた。
【００７１】
他方、T細胞を移植した1日後に20μgのLPSに加えて1日目と3日目に1ngまたは10ngのIL-12を与えたレシピエント・マウスは、疾患の程度が重くなり、発症数が増加した。特に、LPSに加えて中用量（10ng/マウス）のIL-12を投与した場合には、疾患の発生が73％になり、病気のマウスの平均組織学的スコアは2.25±1.1であった。これは、PBSを投与した場合と比べて有意に大きな数値である（p<0.008）。さらに、IL-12中用量のグループにおける重症マウスの割合も、IL-12低用量のグループ（36％）と比較して多い（42％）。これは、PBSを投与した対照グループ（27％）と比べて有意に大きな数値である。興味深いことに、LPS（20μg/マウス）と高用量のIL-12（100ng/マウス）を同時に投与すると、発症が完全に抑制された（発症0％）。LPSと中用量のIL-12（10ng）を1週間に1回、3週間にわたって同時投与すると発症率が80％（8/10）になり、平均組織学的スコアは2.5±1であった（表2）。このグループのマウスはT細胞を移植してから4週間経ってすぐに発症したため、発症までの期間が短縮されたことはこの特別の誘起プロトコルと関係があると考えた。他方、LPSとIL-12（10ng）を1回だけ投与されたマウスは、T細胞を移植してから平均して6〜8週間後に発症した。また、T細胞だけを移植されたマウスは、T細胞を移植してから平均して8〜10週間後に病気の徴候が現われた。
【００７２】
ソーティングしていないCD4+ T細胞を移植したマウスは、LPS（20μg）とIL-12（10ng）を3回投与した場合でさえ、決して発症しなかった（表2）。これは、投与したLPSとIL-12がナイーブT細胞にだけ作用を及ぼすことができ、微生物因子とIL-12を投与してもCD45Rblo細胞の調節効果を抑えられないことを示唆している。注目すべきは、T細胞を移植しなかったマウス、またはT細胞だけを移植したマウスを、T細胞に加えてLPSとIL-12を与えたマウスと一緒に収容して、他の外来性因子が発症に影響しないようにしたことである。
【００７３】
われわれは、別の一連の実験において、SEBなどの他の微生物産物が同様に発症に影響するかどうかを調べた。表2に示したように、SEBも、T細胞だけを移植した場合よりも高い頻度で発症させ、しかもより重症にすることができた（平均臨床スコア1.5±0.9）。したがって、微生物成分が乾癬状発疹の発現を調節する能力は、LPSだけにあるわけではないことがわかる。
【００７４】
さらに、別の細胞移植実験において、発症したマウスの皮膚の発疹から分離した細胞を移植したscid/scidマウスは、LPSとIL-12を同時に投与しない限りは乾癬を発症しないことがわかった。これは、炎症性の乾癬T細胞だけを移植しても皮膚に慢性の炎症性反応を誘起させるのに十分ではないことを示唆している。
LPSとIL-12で処置したscid/scidマウスの乾癬性皮膚発疹は、ヒトの病状に非常によく似ている。CD4+/CD45Rbhi T細胞に加えてLPSとIL-12を注入したマウスは、T細胞を移植してから4〜8週間経ってすぐに発症した。T細胞を移植してから10週間後にまったく臨床的な発症徴候を示さなかったマウスは、さらに4〜6週間観察を続けても発症しないままだった。そこで、4週目の始めからマウスの観察を開始し、10〜12週のときに対象となるマウスの剖検を行なった。病気の臨床的徴候としては、常に、耳の赤さの増加、耳およびまぶたの皮膚の厚さ増大が挙げられる。何匹かのマウスは、尾に重度の皮膚炎を起こす徴候を示した。より重症のケースでは、皮膚炎が体全体に見られ、鱗屑と抜け毛が増えていた（臨床スコア4）。耳の厚さは、たいていの場合、発症していないマウスにおける基準ラインである21±1.1μmから、病的な26〜50μmまでの範囲にわたっていた。皮膚は、重症になった場合には常に鱗屑ができて潰瘍になり、たいていはプラークのように腫れた。乾癬マウスにおける皮膚炎は、耳のつけ根とまぶたの周辺の軽いもの（臨床スコア1〜2）から、体の75％を超える面積にわたる抜け毛（臨床スコア3〜4）という重症までの幅がある。耳の厚さは重症度および臨床スコアと密接に関係しているため、われわれは、たいていの実験で、耳の厚さの測定値を皮膚炎全般の指標として用いた。
【００７５】
他の乾癬様モデル・マウスは、ヒト乾癬に見られる組織学的特徴を持たないという点が批判されてきた。マウスの皮膚構造の差が、この違いの原因であると考えられた。ヒトの場合の主要な特徴である網状組織突起や長く延びた隆起がマウスで見られないのは、マウスでは真皮と表皮の接合部が比較的平坦であることが原因であるとされてきた。病気のマウスのいくつかの部位から皮膚サンプルを採取し、3μmの切片をヘマトキシリンとエオシンで染色して調べることにより、われわれのプロトコルによって発症させた発疹の組織学的解析を行なった。T細胞に加えてLPS（20μg/マウス）とIL-12（10ng/マウス）を注入することによって病気になったマウスの耳、まぶた、尾から採取したサンプルを用意し、われわれとは別の病理学者に組織学的評価と顕微鏡による検査をしてもらった。たいていの発疹には、錯角化と過角化が起こり、幾分かの潰瘍または糜爛と膿疱が生じているという典型的な徴候が見られた。また、角質細胞が増殖して表皮が厚くなり（表皮腫）、皮下組織では網状組織突起が比較的深くまで延びていることがわかった。炎症細胞の浸潤は、主に、リンパ球と、少数の単球、マクロファージ、形質細胞とで構成される単核細胞による。さまざまな数の好中球とそれよりも少数の好酸球も見られた。毛細血管とそれ以外の血管が多数あり、そうした血管には輪郭のある多数の好中球が含まれていて、たいていの場合にリンパ球で囲まれていた。こうした特徴を合わせて考えると、このモデルにおける乾癬状発疹は、ヒトに見られる発疹にほぼ匹敵する。T細胞を移植しなかった正常なscid/scidマウスからの切片を、病気のマウスと同じ年齢のときに採取した。表皮は厚さが細胞1〜2個分であり、真皮はリンパ球をほとんど含んでいない。さらに、血管の密度は疎である。真皮と表皮の接合部は真っ直ぐで、膿瘍を含んでいない。
【００７６】
乾癬マウスの皮膚からのCD4+ T細胞はCD45Rbloであり、高レベルのIFN-γと低レベルのIL-4を産生する。皮膚浸潤リンパ球（SIL）の活性化／サイトカインのプロファイルを比較するため、病気のマウスの皮膚発疹と病気でないマウスから採取したリンパ球を精製した。分離したSILを、抗CD3と抗CD28を用いてインビトロで48時間にわたって刺激し、上澄み液にIFN-γ、TNF-α、IL-4が産生されているかどうかを調べた。T細胞を移植したが病気の臨床的徴候を示さなかったマウスの皮膚から分離したリンパ球は、検出できるレベルでIFN-γまたはIL-4を分泌することはまったくなかった。他方、病気のマウスからの細胞は、非常に高レベルのIFN-γとTNF-α、低レベルのIL-4を発現した（表3）。BALB/cの脾臓からのナイーブCD4+/CD45Rbhiドナー細胞を同じようにして刺激しても、調べたサイトカインはまったく検出できなかった。さらに、病気によって炎症を起こした組織から分離したCD4+細胞の大部分は、CD45Rbloであった。データによれば、scid/scidマウスに移植したナイーブT細胞の大部分は、皮膚のミクロ環境においてTh1様の記憶／エフェクターT細胞に分化していることが示唆される。
【００７７】
【表３】
2004231667.tif 000005
【００７８】
SILまたはCD4+ SITが産生したIFN-γ、IL-4、TNF-αは、材料と方法の項に記載したようにして測定した。数字は、平均と標準偏差を表わす。
１  正常なBALB/cマウスからのCD4+/CD45Rbhiに加えてLPSとIL-12を用いて再構成したことによって発症した5〜10匹のレシピエントscid/scidマウスの乾癬状発疹から採取した2.0×105個の細胞を48時間培養した。数字は、似たような値を示した3回の実験のうちの代表値である。
２  病気の症状を示さなかった8〜10匹のレシピエントscid/scidマウスから採取した2.0×105個の細胞を48時間培養した。数字は、似たような値を示した2回の独立した実験のうちの代表的な一方の値である。
３  BALB/cjマウスの脾臓から分離した細胞をフロー・サイトメトリーによってソーティングした2.0×105個のCD4+/CD45Rbhi細胞を48時間培養した。細胞の純度は90％以上である。
【００７９】
IFN-γが欠損したCD4+/CD45Rbhi T細胞は、scidマウスに乾癬状発疹を起こすことができる。IFN-γが乾癬状発疹を起こすのに主要な役割を演じているかどうかを調べるため、まず最初に、IFN-γが欠損した（IFN-γ-/-）マウスからのナイーブT細胞をC.B-17scid/scidマウスに移植した。興味深いことに、IFN-γが欠けているにもかかわらず、IFN-γ-/-ドナーからのCD4+/CD45Rbhi T細胞は、scid/scidマウスに乾癬状発疹を起こすことができた。病気の発生頻度は対照のマウスと同程度であったが、病気になったIFN-γ-/-T細胞scid/scidマウスの耳の厚さは、平均すると、対照のマウスよりは薄く、また、目および顔の皮膚に発疹が存在していたものの、対照のマウスよりは目立たなかった。病気になったマウスの平均臨床スコアは0.9±1.0であり、重症の乾癬（臨床スコアが3以上）は1例だけであった。さらに、発症の時期は、対照マウス（T細胞の移植後6〜8週間）と比較して遅くなった（T細胞の移植後10〜12週間）。こうした観察結果と整合性のあることだが、特に皮膚における過角化は、IFN-γ-/-T細胞scid/scidマウスでは対照のマウスよりも目立たなかった。
【００８０】
ドナーに由来するIFN-γの産生がないことを、CD4+/CD45Rbhi IFN-γ-/-で再構成した病気のscid/scidマウスの皮膚から分離したリンパ球の上澄み液を抗CD3と抗CD28で48時間刺激した後に調べることによって確認した。ELISAで調べたところ、どのサンプルでもIFN-γは検出レベル以下であった（≦30pg）（表3）。TNF-αも測定したところ、発現が増えていることがわかったが、野生型マウスからのCD4+/CD45Rbhi T細胞で再構成したマウスにおいて観測されるTNF-αのレベルよりも有意に低かった（表3と表4）。
【００８１】
【表４】
2004231667.tif 000006
【００８２】
SILが産生したIFN-γ、IL-4、TNF-αは、材料と方法の項に記載したようにして測定した。数字は、平均と標準偏差を表わす。マウスはすべて、T細胞を移植してから10週間後に殺した。対照グループと治療グループは、4〜5匹のマウスからなる。各グループからのリンパ球をプールしておき、病気の状態に関係なくインビトロで刺激した。
１  CD4+/CD45Rbhiに加えてLPSとIL-12を投与するという再構成によって発症した5〜10匹のscid/scidマウスの乾癬状発疹から分離した細胞。マウスには治療を一切施さなかった。数字は、似たような値を示した3回の実験のうちの代表値である。
２  7日目と35日目の2回にわたり、0.5mgの抗IL-12 mAb（クローン社、C17.8ラットIgG1）を腹腔内に注入するという治療をマウスに対して行なった。マウスは、T細胞を移植してから10週間後に殺した。数字は、似たような値を示した2回の独立した実験のうちの代表的な一方の値である。
３  BALB/cj IFN-γ-/-マウスからのCD4+/CD45Rbhi細胞を用いて再構成したレシピエントscid/scidマウスの乾癬にかかった耳およびまぶたの皮膚から分離した細胞。
【００８３】
宿主のNK細胞が分泌するわずかな量のIFN-γが発症に十分であることを否定するため、IFN-γ-/- T細胞をscid/beigeマウスに注入した。このマウスは、scid突然変異に加えて、beige突然変異も持っている。beige突然変異によって、scid突然変異においてすでに存在しているT細胞とB細胞の欠損に加え、NK細胞の欠損が起こる。CD4+/CD45Rbhi IFN-γ-/- T細胞を注入したscid/beigeマウスは、CD4+/CD45Rbhi IFN-γ-/- T細胞を注入したscid/scidマウスと比べると、耳が同様に顕著に厚くなったが、この場合にも、発症は有意に遅くなり、発症数が減少した（表5）。さらに、耳の厚さと臨床スコアで評価した病気の程度（表5）が軽減した。興味深いことに、単核細胞の浸潤がはなはだしいにもかかわらず、表皮腫は、このマウスのほうが軽度であった。これは、上記の結果と整合している。これらの結果によると、IFN-γは、角質細胞の増殖を制御しているが、乾癬における単核細胞の浸潤／活性化は制御していないことが示唆される。
【００８４】
【表５】
2004231667.tif 000007
【００８５】
１  マウスはすべて、IFN-γ+/+またはIFN-γ-/- CD4+/CD45Rbhi T細胞に加えてLPSとIL-12を用いて再構成した。
２  マウスには、PBSまたは対照用Ab（ラットのIgG1）を注入した。
３  抗体による治療は、材料と方法の項と表3に記載してある。
４  BALB/cj IFN-γ-/-マウスからのCD4+/CD45Rbhi細胞を用いて再構成した、scid/scidマウスとscid/beigeマウス。
５  疾患の発生件数の欄には、10週間の間に発症したマウスの数を記載してある。発症の基準は、耳の厚さが26μm以上、または臨床スコアが1以上である。
６  材料と方法の項に記載したように、グループ内のすべてのマウスについて平均臨床スコア±標準偏差を評価した。IFN-γ+/+/scid/scidに対するp：抗IL-12：p<0.0000001、IFN-γ-/-/scid/scid：p<0.003、IFN-γ-/-/scid/beige：p<0.01。統計的解析はスチューデントの両側t検定により行なった。
７  重い疾患の誘起は、平均組織学的スコアが2.5以上および／または平均臨床スコアが3以上のマウスの数をもとに計算した。
【００８６】
IL-12は乾癬状発疹において高度に発現し、生体内におけるIL-12の無効機能によってTNF-αとIFN-γが下方調節され、疾患の発症を抑制する。次にわれわれは、IL-12に狙いを定めた。というのも、この炎症促進性サイトカインがIFN-γの誘導において重要な役割を演じているからである。免疫組織化学的研究を行なって、炎症を起こしている組織にヘテロ二量体のIL-12が存在していることを検出した。CD4+/CD45Rbhiで処置した病気のマウスの組織にはIL-12（p35/p40、（p70））ヘテロ二量体がかなり大量に存在している。他方、抗IL-12 mAb（0.5mg/マウス）を7日目と35日目に注入した、CD4+/CD45Rbhiで処置したマウスでは、有意に少ない染色しか観察できなかった。
【００８７】
乾癬状発疹の誘起におけるIL-12の役割をさらに調べるため、scid/scidマウスに野生型のCD4+/CD45Rbhi T細胞を注入してから7日目と35日目に、抗IL-12mAb（0.5mg）を投与した。2回投与した抗IL-12mAbは、CD4+/CD45Rbhi T細胞を移植した後に病気を誘起する期間を通じて十分に高いAb力価を維持することが目的である。独立した2回の実験において、抗IL-12mAbで治療したマウス（5匹からなるグループ）は、まったく発症しなかった。10匹のうちの1匹だけが、わずかに毛が抜け、まぶたの周囲に紅斑ができるという目に見える形の軽い乾癬（臨床スコア1）を発症したが、抗IL-12mAbで治療したこのマウスと抗IL-12mAbで治療した他のすべてのマウスは、耳の厚さはまったく増加しなかった。他方、対照用のラットIgG抗体またはPBSで処置した対照のマウスは90％が発症し（10匹のマウスのうち9匹が発症した）、平均臨床スコアは2.4±0.7であった。このグループでは発症率が高くて重症であったことに加え、耳の厚さも時間とともに有意に大きくなった。
【００８８】
抗IL-12抗体を注入したマウスの耳と皮膚において、浸潤リンパ球がサイトカインを産生しているかどうかを調べた。抗IL-12抗体で治療したマウスの皮膚にはほとんどリンパ球が存在していないとはいえ、IFN-γ、IL-4、TNF-αが分離されたので、これらのサイトカインが産生されているかどうかを調べた。対照のマウスから得た上澄み液におけるサイトカインの産生と比べると、治療したマウスから分離した細胞の上澄み液の中にはほんのわずかの量のIFN-γ、IL-4、TNF-αしか検出されなかった（表4）。
【００８９】
上記の結果は、抗IL-12mAbで治療したマウスから得た組織病理学的切片の解析によって裏づけられる。7日目と35日目に0.5mgの抗IL-12mAbで治療したマウスには、重い炎症、表皮腫、または過角化の徴候は見られなかった。したがって、抗IL-12抗体の投与により、おそらくIFN-γとTNF-αの両方の産生が下方調節されて角質細胞の過剰な増殖と単核細胞の浸潤が抑制され、乾癬状発疹が予防されるように思われる。
考察
上記のデータは、免疫調節に関わる刺激（この場合には微生物の抗原と炎症促進性サイトカインIL-12）が、CD4+/CD45Rbhi T細胞を移植した新規開発モデル動物においてT細胞が乾癬を誘起する能力に対していかに影響を与えるかを示している。C.B-17 scidマウスでは、LPSとIL-12（1ngと10ng）も同時に投与すると、乾癬の発症が早くなり、発症件数も増えた。さらに、処置したマウスにおいて観察された発疹は、より重症になってもいた。追加実験では、SEBも同時に投与すると、やはり発症件数と発現が有意に増大した。こうした知見は、乾癬状発疹が出現する前に細菌またはウイルスに感染することが重要であることを示唆している。特に注目すべきなのは、本発明の誘起方法によって発生する皮膚の発疹が、ヒト乾癬状発疹の特徴を備えていてヒトの乾癬状発疹に驚くほど似ているために、ほとんど同じ臨床的、組織学的特徴を示すことである。肉眼で見て明らかな鱗屑と皮膚厚の増大は、顕著な過角化、錯角化、表皮腫が原因で起こった。ミクロに見ると、網状組織突起、潰瘍、膿疱や、重症であることが多い表皮過形成も報告されている。浸潤する炎症性細胞は主に単核細胞であり、リンパ球と、それよりも少数の単球、マクロファージ、形質細胞とで構成されていた。さらに、乾癬状発疹から分離したCD4+T細胞の大部分は、CD45Rbを低レベルで発現した。これは、ヒトに関する最近の研究で見つかった、乾癬のプラークから分離されたT細胞が記憶表現型を示すという事実と整合性がある。この研究でヒト組織との類似性が観察されたが、それと同時にいくつかの違いも存在している。最も注目すべきは、ヒトでは乾癬のプラークの表皮にCD8+T細胞が存在しているのに、それが存在していないことである。しかしこれまでのところ、乾癬の病理生理学におけるCD8+T細胞の主要な役割は明らかになっておらず、CD8+T細胞ではなくCD4+T細胞を標的として初期に成功した治療法は、この疾患の主役がCD4+T細胞であると見なした方法である。
【００９０】
LPS、IL-12、及びSEBが疾患促進効果を有することの原因として、いくつかのメカニズムが考えられる。第1に、これらの免疫調節物質は、ナイーブTh0細胞がTh1細胞に分化して増殖するのを助けている可能性がある。最近の研究によれば、LPSなどの微生物産物が、ネズミの皮膚由来の樹状細胞が産生するTNF-α、IL-6、IL-12を直接刺激している可能性のあることがわかった（ただしIL-12は、TNF-αやIL-6よりも刺激の受け方が少ない）。したがってそういった微生物産物が、自己反応性T細胞の炎症促進条件を決めている可能性がある。scidマウスに移植された後のCD45Rbhi T細胞は、自己免疫エフェクター細胞に成長するためには、IL-12に依存した追加のシグナルを必要とする。
【００９１】
LPS、IL-12、及びSEBは、マクロファージに対する免疫刺激効果とTh1エフェクター細胞を成長させる効果を持つことに加え、レシピエント・マウスにおいて白血球の通行を調節して、Th1エフェクター細胞を皮膚に局在させている可能性がある。LPSは、直接的にと、IL-1、TNF-α、及びIFN-γの産生を誘導する能力を通じての両方により、内皮細胞がE-セレクチン、ICAM-1、VCAM-1といった接着分子を発現するのを刺激して白血球の増加を促進する。白血球の接着および移動に対して及ぼすこれらサイトカインの炎症促進効果もよく知られている。
【００９２】
IFN-γとIL-12は、免疫調節に関わる非常に重要な2つのサイトカインであり、自己免疫疾患において重要な役割を果たしていることが知られている。IL-12は、主としてNK細胞とT細胞を活性化し、IFN-γのほうは、主としてマクロファージを活性化して組織細胞上のクラスIIの分子の上方調節を誘導する。乾癬において自己免疫エフェクター細胞を誘導するのにIFN-γが決定的に重要であると考えられていたとしても不思議はない。しかし上記のデータは、IFN-γが疾患のプロセスにのみ関与している可能性を示している。IFN-γは、おそらくは角質細胞の増殖を促進することによって疾患の程度を重くしているが、明らかに、乾癬にかかった皮膚の病原性炎症性T細胞を誘導したり維持したりすることはない。このことは、IFN-γ-/-ドナーT細胞を注入したマウスの発疹から採取して観察した組織では、scid/scidマウスまたはscid/beigeマウスと比べると、炎症の徴候はわずかに少ないか同程度であるが、過角化または表皮腫は明らかに減少していたという事実によって裏づけられる。さらに、耳の厚さと肉眼での観察により測定するこの疾患の臨床スコアでは、対照のマウスと比べると軽度であると診断されたが、病気の発現度は極めて似通っていた。これと同じ状況は、IFN-γ-/-T細胞をT細胞、B細胞、NK細胞が欠損したscid/beigeマウスに移植したときにも見られた。
【００９３】
これらの結果は、IFN-γが、角質細胞の異常増殖を誘導する際の重要な補因子であることを示している。
宿主由来のIFN-γがないことは、IFN-γ-/-T細胞を注入したマウスの炎症性発疹から分離して抗CD3と抗CD28によって刺激した全細胞を測定することによって確認した。予想通り、検出可能なレベルのIFN-γは存在していなかった。したがって、皮膚のNK細胞などのT細胞以外の細胞からIFN-γが分泌されている可能性が排除される。
【００９４】
IFN-γとは異なり、scid/scidマウスにおいて慢性の乾癬状発疹が発症するにはIL-12が不可欠であることが、これらの研究におけるいくつかの観察結果から明らかになった。第1に、ドナーのT細胞を移植した後に中用量または低用量のIL-12（1ng/マウスと10ng/マウス）を投与すると、発症件数が増加し、より重症になった。さらに、炎症を起こした組織をその場で染色したところ、ヘテロ二量体のIL-12（p70）が大量に存在していることが明らかになった。それに対して炎症を起こしていない対照の組織には、染色されたIL-12はまったく存在していなかった。最も重要なのは、T細胞を移植してから7日後に生体内でmAbをIL-12（p70）ヘテロ二量体と反応させてIL-12を無効にすると、発症を完全に阻止できたことである。これらの研究によりわかった興味深い1つの事実は、IL-12を大量に投与すると（100ng/マウス）、発症が促進されるのではなく抑制されたことである。
【００９５】
まとめると、この研究において記述した慢性皮膚疾患には、ヒト乾癬にのみ通常は観察される特徴、例えば網状組織突起、重度の表皮腫、Th1細胞の真皮への浸潤が含まれていた。LPSとIL-12を生体内に投与することにより、臨床上の異常、組織病理学的異常が大きく増えた。これは、この疾患の発症に感染性媒体が重要な役割を果たしていることを示している。さらに、乾癬状発疹の誘導はIL-12に依存しており、IFN-γとは無関係であることを、初めて証明した。これらの結果から、乾癬状発疹の発症にはTh1を刺激するサイトカインや細胞が特別に必要であることがわかると同時に、ヒト乾癬の予防と治療についての見通しを得ることもできる。
実施例２
IL-12に対する抗体を用いた治療法が進行中および末期の乾癬に対してどのような効果を及ぼすかをマウスで試験した。この疾患は、実施例1に記載した方法で発症させた。すなわち、scid/scidマウスに3×105個のCD4+CD45Rbhi細胞を移植した後、LPSとIL-12を注入した。抗IL-12抗体を用いた治療では、マウス1匹につき、1回の用量として、常に1mgとした。4回の独立した実験の結果を図1に示す。最初の実験では（治療しないマウス5匹、治療したマウス2匹）、9週と10週（すなわち、乾癬の症状が現われてから約5週間後）に抗IL-12抗体をマウスに注入し、組織を調べるために14週の時点でマウスを殺した。治療しないマウスでは平均臨床スコアが2.5であり、中程度から重い症状であることを示しているのに対し、治療したマウスは平均臨床スコアがたった0.25であり、ほとんど症状が見られないことを示している。したがって、抗IL-12抗体を2回注入したことで、発症した乾癬の症状が大いに緩和された。
【００９６】
第2の実験では、マウスのグループを3つにした。治療しないグループ、アイソタイプは適合しているがIL-12と結合しない対照の抗体で治療したグループ、抗IL-12抗体で治療したグループである（各グループともマウスは4匹）。治療は9週と10週に行ない、12週に組織のサンプルを採取した。この実験でも、治療しないグループと治療を行なった対照グループではかなりの乾癬症状が見られたのに対し、抗IL-12抗体で治療したグループの症状ははるかに軽いものであった。第3の実験では、治療しないマウス（5匹）と、9週と10週に抗IL-12抗体で治療したマウス（6匹）に分けた。組織のサンプルを採取するため、治療したマウスの半数は前の実験と同様に12週に殺し、残りの半数は17週に殺した。治療したマウスはやはり臨床スコアが劇的に低下していた。このスコアは、治療を止めてから7週間後の17週にもほぼ維持されていた。
【００９７】
最後に、第4の実験（抗IL-12抗体で治療したグループ、アイソタイプが適合した対照の抗体で治療したグループは、ともに4匹）では、乾癬の症状が現われてから約10週間経過した14週まで治療を行なわなかった。そのため、症状が非常によく確立していた（耳の厚さが40μmを超える）。治療は14週から17週にかけて毎週行なった。症状が非常によく確立しているにもかかわらず、抗IL-12抗体による治療は、症状を軽減する劇的な効果があった（平均臨床スコアが0.25になった）。この結果は、図2に示したように、毎週測定した耳の厚さと、それとは独立に測定した重症度によって確認された。
【００９８】
これらの実験結果を総合すると、治療しないマウスと対照の治療を行なったマウスを殺したときの平均臨床スコアが2.53であったのに対し、抗IL-12抗体で治療したマウスは、平均臨床スコアがたった0.65であった。これは統計的に極めて有意な結果である（スチューデントの両側t検定によるとp=1.7×10-9）。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】IL-12に対する抗体を用いて乾癬マウスを治療した結果を示すグラフである。棒グラフのかたまりの1つ1つが、1つの実験に対応している。それぞれの棒グラフは組織学的スコアの平均を表わしており、その数値を棒の上方に示す。a-IL-12は、抗IL-12を意味する。
【図２】14週〜18週における病気の程度を、耳の厚さを測定した平均値として示したグラフである。このグラフでは、抗IL-12抗体で治療したマウスと、アイソタイプが適合した対照の抗体（アイソタイプと表記）で治療したマウスを比較して示してある。
【図１】
2004231667.tif 000008
【図２】
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