(57)【要約】      （修正有）【課題】ネコ免疫不全ウィルス(FIV) に対する安全且つ効果的なワクチンの開発に関する。【解決手段】特定のゲノム核酸配列を有するネコ免疫不全ウィルスの新規株(FIV-141）及びそれにより生成されるワクチンに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対応するゲノム核酸配列を有する、実質的に精製されたネコ免疫不全ウィルス−１４１(FIV-141）。
【請求項２】
請求項１記載のウィルスにより感染された宿主細胞。
【請求項３】
請求項２記載の宿主細胞において生成される FIV-141子孫ウィルス。
【請求項４】
FIV-141 に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項１記載のウィルスを動物に感染せしめることを含んで成る方法。
【請求項５】
前記ウィルスが、接種の前に不活性化される請求項４記載の方法。
【請求項６】
FIV-141 に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項２記載の宿主細胞を動物に感染せしめることを含んで成る方法。
【請求項７】
前記細胞が、感染の前に固定される請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記動物から前記抗体を単離することをさらに含んで成る請求項４〜７のいづれか１項記載の方法。
【請求項９】
請求項４〜７のいづれか１項記載の方法により生成される抗体。
【請求項１０】
不活性化されている、請求項１記載の FIV-141ウィルスを含んで成る全ウィルスワクチン。
【請求項１１】
請求項１記載のウィルスにより感染された、固定されている宿主細胞を含んで成る固定された細胞ワクチン。
【請求項１２】
ネコにおいて免疫応答を誘発するための方法であって、請求項１０又は１１記載のワクチンを、FIV-141 による続く感染に対しての保護免疫性を誘発するのに十分な用量で前記ネコに投与することを含んで成る方法。
【請求項１３】
配列番号１に対応する配列を有する実質的に精製された核酸分子。
【請求項１４】
前記核酸がＤＮＡである請求項１３記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１３記載の核酸によりトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１５記載の宿主細胞により生成されるＦＩＶ子孫ウィルス。
【請求項１７】
動物においてＦＩＶ−１４１に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項１３記載の核酸分子を前記動物に注射することを含んで成る方法。
【請求項１８】
動物において抗体の生成を誘発する方法であって、請求項１５記載の宿主細胞を前記動物に注射することを含んで成る方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞が、感染の前に固定される請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記動物から前記抗体を単離することをさらに含んで成る請求項１７〜１９のいづれか１項記載の方法。
【請求項２１】
請求項１７〜１９のいづれか１項記載の方法により生成される抗体。
【請求項２２】
請求項１３記載の核酸によりトランスフェクトされた、固定されている宿主細胞を含んで成る固定された細胞ワクチン。
【請求項２３】
ネコにおいて免疫応答を誘発する方法であって、請求項２２記載のワクチンを、ＦＩＶ−１４１による続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記ネコに投与することを含んで成る方法。
【請求項２４】
宿主細胞中への侵入の後に複製するが、しかし野生型ウィルスに比較して、ネズミＴリンパ球に対して有意に低められた感染性を示す弱毒化されたＦＩＶ−１４１ウィルスであって、ビリオン感染因子 (Vif)、マトリックスタンパク質（MA）、オープンリーディングフレーム２（ORF(2)）、エンベロープ(ENV）、カプシドタンパク質（CA）、ヌクレオカプシドタンパク質（NC）、表面タンパク質（SU）、トランスメンブラン因子（TMf)、トランスメンブランの細胞質ドメイン（CT）、インテグラーゼ（IN）、デオキシウリジントリホスファターゼ（DU）、表面タンパク質のV3及びV4領域（V3／4)、表面タンパク質のV7及びV8領域（V7／8)、並びにＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）から成る群から選択されたFIV-141 ゲノムにおける遺伝子を突然変異誘発することによって生成される弱毒化された FIV-141ウィルス。
【請求項２５】
前記遺伝子が Vif, MA, ORF(２）及び ENVから成る群から選択される請求項２４記載の弱毒化された FIV-141ウィルス。
【請求項２６】
請求項２４記載の弱毒化されたウィルスによりトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２６記載の宿主細胞において生成される弱毒化された FIV-141ウィルス。
【請求項２８】
FIV-141 に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項２４記載の弱毒化された FIV-141ウィルスを動物に感染せしめることを含んで成る方法。
【請求項２９】
前記弱毒化された FIV-141ウィルスが、感染の前に不活性化される請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
FIV-141 に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項２６記載の宿主細胞を動物に感染せしめることを含んで成る方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞が、感染の前に固定される請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記動物から前記抗体を精製することをさらに含んで成る請求項２８〜３１のいづれか１項記載の方法。
【請求項３３】
請求項２８〜３１のいづれか１項記載の方法により生成される抗体。
【請求項３４】
請求項２４又は２５のいづれか１項記載のウィルスを含んで成る弱毒化された全ウィルスワクチン。
【請求項３５】
ネコにおいて免疫応答を誘発する方法であって、請求項３４記載のワクチンを、FIV-141 による続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記ネコに投与することを含んで成る方法。
【請求項３６】
請求項２６記載の宿主細胞を含んで成る弱毒化された宿主細胞ワクチン。
【請求項３７】
請求項２５記載のウィルスにより感染された宿主細胞を含んで成る弱毒化された宿主細胞ワクチン。
【請求項３８】
ネコにおいて免疫応答を誘発する方法であって、請求項３６又は３７のいづれか１項記載のワクチンを、FIV-141 による続く感染に対して保護免疫性を誘発するのに十分な用量で、前記ネコに投与することを含んで成る方法。
【請求項３９】
配列番号１に対応する配列を有するが、しかし Vif, MA, CA, NC, SU, TMf, ORF(2), CT, ENV, Vifn (Vif タンパク質のＮ−末端部分），Vifc（Vif タンパク質のＣ−末端部分），IN, DU, V3／４，V7／８、及びRRE から成る群から選択された遺伝子において突然変異誘発されている実質的に精製された FIV-141核酸分子であって、宿主細胞中への導入後に、複製するウィルスを生成するが、しかし野生型FIV-141 に対して、末梢血液単核細胞（PBMC）において有意に低められた感染性を有するウィルスを生成する核酸分子。
【請求項４０】
前記遺伝子が、MA, Vif, ORF (2)、及びENV から成る群から選択される請求項３９記載の核酸分子。
【請求項４１】
前記核酸がＤＮＡである請求項３９又は４０のいづれか１項記載の核酸分子。
【請求項４２】
請求項３９記載の核酸分子によりトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項４３】
請求項４２記載の宿主細胞により生成されるＦＩＶ子孫ウィルス。
【請求項４４】
動物において FIV-141に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項３９記載の核酸分子を前記動物に注射することを含んで成る方法。
【請求項４５】
動物において FIV-141に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項４２記載の宿主細胞を前記動物に注射することを含んで成る方法。
【請求項４６】
前記宿主細胞が、感染の前に固定される請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記動物から前記抗体を単離することをさらに含んで成る請求項４４〜４６のいづれか１項記載の方法。
【請求項４８】
請求項４４〜４６のいづれか１項記載の方法により生成される抗体。
【請求項４９】
ネコに投与される場合、免疫性を誘発するのに十分な濃度での請求項３９記載の核酸分子を含んで成るワクチン。
【請求項５０】
前記核酸がＤＮＡである請求項４９記載のワクチン。
【請求項５１】
請求項３９記載の核酸分子によりトランスフェクトされた宿主細胞を含んで成るワクチン。
【請求項５２】
前記宿主細胞が固定されている請求項５１記載のワクチン。
【請求項５３】
ネコにおいて免疫応答を誘発する方法であって、請求項４９〜５２のいづれか１項記載のワクチンを、FIV-141 による続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記ネコに投与することを含んで成る方法。
【請求項５４】
宿主細胞において複製するが、しかしその野生型対応物に対して有意に低められた感染性を有する弱毒化されたレンチウィルスを製造するための方法であって、MA, CA, NC, DU, ENV, SU, TMf, CT, V3／4 、V7／8 、Vif, Vifn, Vifc, IN, RRE、及び ORF（２）から成る群から選択された１又は複数の遺伝子を突然変異誘発することを含んで成る方法。
【請求項５５】
前記遺伝子が MA, ORF(2) 及びENV から成る群から選択される請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記レンチウィルスが FIVの株である請求項５４又は５５のいづれか１項記載の方法。
【請求項５７】
請求項５４又は５５のいづれか１項記載の方法により生成される弱毒化されたレンチウィルス。
【請求項５８】
請求項５７記載の弱毒化されたウィルスにより感染された宿主細胞。
【請求項５９】
レンチウィルスに対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項５７記載の弱毒化されたウィルスにより哺乳類を感染せしめることを含んで成る方法。
【請求項６０】
レンチウィルスに対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項５８記載の宿主細胞を哺乳類に感染せしめることを含んで成る方法。
【請求項６１】
前記哺乳類から前記抗体を精製することをさらに含んで成る請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
請求項５９又は６０のいづれか１項記載の方法により生成される抗体。
【請求項６３】
レンチウィルス感染に対して哺乳類を治療する方法であって、請求項６２記載の抗体を、前記感染に関連する１又は複数の症状を減じるのに十分な用量で、前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
【請求項６４】
請求項５４又は５５のいづれか１項記載のウィルスを含んで成る弱毒化された全ウィルスワクチン。
【請求項６５】
哺乳類に免疫応答を誘発する方法であって、請求項６４記載のワクチンを、前記レンチウィルスの少なくとも１つの株による続く感染に対する保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
【請求項６６】
請求項５８記載のレンチウィルスにより感染された宿主細胞を含んで成る弱毒化された宿主細胞ワクチン。
【請求項６７】
哺乳類に免疫応答を誘発する方法であって、請求項６６記載のワクチンを、前記レンチウィルスの少なくとも１つの株による続く感染に対する保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
【請求項６８】
レンチウィルス感染のためのワクチンへの使用のために適切な核酸を製造する方法であって、
ａ）前記レンチウィルスのゲノムＲＮＡを逆転写し；
ｂ）段階ａ）の逆転写されたＲＮＡをクローニングし；
ｃ）段階ｂ）のクローン化された核酸における遺伝子を突然誘発し、ここで前記遺伝子がMA, CA, NC, SU, TMf, ORF(2), CT, ENV, V3／4,  V7／8, Vif, Vifn, Vifc, IN, DU及びRRE から成る群から選択され；そして
ｄ）段階ｃ）の突然変異誘発された核酸をクローニングする；
ことを含んで成る方法。
【請求項６９】
前記突然変異誘発された分子が、宿主細胞中への導入の後複製するが、しかし突然変異誘発されていない野生型核酸から生成されたレンチウィルスに比べて有意に低められた感染性を有する弱毒化されたウィルスを生成する請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記レンチウィルスが FIVの株であり、そして前記弱毒化されたウィルスは複製するが、しかし突然変異されていない野生型核酸から生成されるＦＩＶに比べてネズミＴ−リンパ球において有意に低められた感染性を有する請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記遺伝子が、MA, ORF(2)及び ENV(2) から成る群から選択される請求項６９又は７０のいづれか１項記載の方法。
【請求項７２】
請求項７１記載の核酸分子によりトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項７３】
請求項７２記載の宿主細胞により生成される子孫レンチウィルス。
【請求項７４】
レンチウィルスの少なくとも１つの株に対する抗体の生成を誘発する方法であって、請求項６８記載の核酸分子を動物に注射することを含んで成る方法。
【請求項７５】
請求項７４記載の方法により生成される抗体。
【請求項７６】
請求項６９記載の核酸分子を、哺乳類に投与される場合に免疫性を誘発するのに十分な濃度で含んで成るワクチン。
【請求項７７】
哺乳類において免疫応答を誘発する方法であって、請求項７６記載のワクチンを、前記レンチウィルスによる続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
【請求項７８】
請求項７０記載の核酸分子を、ネコに投与される場合に免疫性を誘発するのに十分な濃度で含んで成るワクチン。
【請求項７９】
ネコにおいて免疫応答を誘発する方法であって、請求項７８記載のワクチンを、ＦＩＶの少なくとも１つの株による続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記ネコに投与することを含んで成る方法。
【請求項８０】
請求項７２記載の宿主細胞を含んで成るワクチン。
【請求項８１】
哺乳類において免疫応答を誘発する方法であって、請求項８０記載のワクチンを、前記レンチウィルスによる続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で、前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
【請求項８２】
前記哺乳類がネコであり、そして前記レンチウィルスがＦＩＶの株であり、そして前記ワクチンが、FIV の少なくとも１つの株による続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で投与される請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
ATCC受託番号VR-2619 を有するネコ免疫不全ウィルスの株、及びそれから調製される子孫ウィルス。
【請求項８４】
pFIV-141-B1 として命名され、そしてATCC受託番号203001を有するプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネコ免疫不全ウィルス(FIV）の新規株、及びこのウィルスの種々の突然変異誘発された形に向けられる。レンチウィルス関連疾病からの動物の保護に使用され得る組成物及び方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
ネコにおけるネコ免疫不全ウィルス(FIV）感染は、ヒトにおけるヒト免疫不全ウィルス−１(HIV-1) 感染により引き起こされる症状に類似する疾病症状をもたらす。疾病の進行は、過渡的急性期 (transient acute phase)（８〜１０週）で開始し、続いて延長された無症候性期（prolonged asymptomatic phase) （数週間〜数年続く）、及び最終症候性期（ferminal symptomatic phase）が続く（Ishidaなど．、1990, Jan. J. Vet. Sci. 52 : 645-648）。血漿におけるウィルス負荷は、感染されたネコにおける疾病段階と相互関連することが示されており、そして促進されたＦＩＶ感染における疾病進行を予測するために使用され得る（ Diehlなど. 、1996, J. Virol. 70 : 2503-2507）。
【０００３】
構造的に、FIV タンパク質は２種の長い末端反復体（long terminol repeat）（LTR)（ゲノムのいづれかの端で１つの反復体）を含む（ Talbottなど. 、1989, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86 : 5743-5747 ）。３種の大きなオープンリーディングフレーム（Gag)（グループ抗原）； Pol（ポリメラーゼ）；及び ENV（エンベロープ））、及び調節タンパク質をコードする３種の小さなオープンリーディングフレーム（Ｒｅｖ（regulaton of expression of virion)（ビリオンの発現のレギュレーター、すなわちすべてのウィルス転写体に存在する“ＲＲＥ”要素に結合し、そして感染された宿主細胞の細胞質への核からのそれらのトランスロケーションを促進せしめるタンパク質）；Ｖｉｆ(virion infectivify factor）（ビリオン感染性因子）；及びＯＲＦ（２）（オープンリーディングフレーム２））。FIV の Gag前駆体ポリペプチドは、３種の成熟構造タンパク質：マトリックスタンパク質（MA）、カプシドタンパク質（CA）及びヌクレオカプシドタンパク質（NC）にプロセッシングされる。Pol 遺伝子は次の４種の酵素タンパク質：プロテアーゼ（PR）、逆転写酵素（RT）、デオキシウリジントリホスファターゼ（DU）及びインテグラーゼ（IN）、をコードする。
【０００４】
最後に、 ENV駆体ポリペプチドは、次の２種のエンベロープタンパク質：表面タンパク質（SU）及びトランスメンブラン（TM）タンパク質、にプロセッシングされる。
FIV に対する安全且つ効果的なワクチンを開発するいくつかの試みが存在する。 Matteucciは、従来の固定された細胞ワクチンにより接種されたネコが、ワクチン接種の後、中和抗体の見かけ上の不存在にもかかわらず、相同ウィルス（homologous virus）による攻撃から保護されたことを見出した。保護は、短く続き、そして追加免疫することが困難であることが見出された（ Matteucciなど．、1996, J. Virol. 70 : 617-622 ; Matteucciなど. 、1997, J. Virol. 71 : 8308-8376）。これらの結果は、固定された細胞ワクチンの投与の後、保護を観察しなかった Verschourの結果と対比され得る ( Verschourなど．、1995, Vet. Immunol. Immunopathol. 46 : 139-149）。
【０００５】
試験されたもう１つのタイプの従来のワクチンは、全(whole）不活性化された（ateruatert）ＦＩＶウィルスから構成される。Yamamotoは、このタイプのワクチンを投与されたネコの９０％以上が、相同性攻撃（homologous challenge) に対しての実質的に完全な保護及び異種ウィルスに対するわずかな保護を示したことを報告している（Yamamotoなど．、1993, J. Virol. 67 : 601-605）。FIV に対する体液性(humoral）及び細胞性（cellular）免疫性が誘発され、そして高レベルの抗−ENV 、抗−コア及びウィルス中和（VN）抗体が、ワクチン接種されたネコに観察された。対照的に、免疫刺激複合体（immune stimulating complexs)（ISCOMs）中に組込まれた不活性化された(inactivated）全(whole）ＦＩＶによるネコの予防接種は、相同性攻撃から動物を保護するのに失敗した（ Hosieなど. 、1992, Vet. Immunol. Immunopathol. 35 : 191-197）。
【０００６】
ワクチン開発のためのもう１つのアプローチは、組換えコアタンパク質、合成V3タンパク質及び組換え ENVタンパク質を含むサブユニットワクチンの使用を包含した（ Elyarなど．、1997, Vaccine 15 : 1437-1444）。有意なレベルの抗体がそのようなワクチンにより誘発されたが、相同ＦＩＶ攻撃に対してネコを保護し得たことは、同定されなかった（ Huismanなど．、1998, Vaccine 16 : 181-187 ; Flynnなど. 、1997, J. Virol. 71 : 7586-7592 ; Tijhaarなど．、1997, Vaccine 15 : 587-596）。その結果は、サブユニットタイプワクチンを用いてＦＩＶに対する保護免疫を得ることはたぶん困難であることを示唆する。
【０００７】
最近、 Cuisinierは、 FIVのためのＤＮＡワクチンに対して行なわれた試験を報告している（ Cuisinierなど．、1997, Vaccine 15 : 1085-1094）。ネコが、ENV 及び p10を含む、 FIV構造遺伝子を担持するプラスミドによりワクチン接種された。強い体液性免疫応答が観察されたが、すべてのネコは結果的に、相同性攻撃に負けた。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、FIV-141 として本明細書において命名されるネコ免疫不全ウィルスの新規株の単離及び特徴化に一部、基づいている。前記ウィルスの完全なゲノム配列が決定され、そしてそれはすべての他の既知 FIV配列と異なる。FIV-141 をコードするプラスミドは、ATCC No.203001として寄託された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
Ａ． FIV-141ウィルスに基づく組成物及び方法
第１の観点において、本発明は、配列番号１のゲノム配列に対応するゲノム配列を有する、実質的に精製された FIV-141ウィルス、前記ウィルスにより感染された宿主細胞、及び宿主細胞において生成される子孫ウィルスに向けられる。用語“実質的に精製された”とは、FIV-141 がすべての他のウィルス株及び特に、FIV のすべての他の株から分離されていることを意味する。ウィルスを増殖するために使用され得る宿主細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を包含する。子孫ウィルスは、下記に論ぜられるような標準的方法を用いて単離され得る。
【００１０】
FIV-141ウィルス及びそのウィルスにより感染された宿主細胞は、１又は複数の FIV株と選択的に反応する抗体の生成の誘発のために動物に感染せしめるために使用され得る。抗体の“選択的結合”とは、本明細書において使用される場合、いづれかの他ウィルス又は非−FIV タンパク質に対してよりもＦＩＶに対して少なくとも１００倍以上の親和性を有する抗体を意味する。抗体は、この目的のために通常使用されるいづれかの動物（たとえば、マウス、ウサギ、ヤギ又はヒツジ）において生成され得るが、しかし好ましくは、抗体はネコにおいて生成されるであろう。
【００１１】
ウィルスが抗体生成を誘発するために使用される場合、それは、所望には、感染の前に不活性化され得る。不活性化方法は、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、フェノール、ラクトプロピオネート、紫外線、加熱、プソルレン(psorlen）、白金錯体、オゾン又は他の殺ウィルス剤によるウィルスの処理を包含する。FIV-141 を発現する宿主細胞が抗体生成を誘発するために使用される場合、細胞は、感染の前に固定され得る。
【００１２】
典型的には、これは、本明細書に記載されるようなパラホルムアルデヒドにより細胞を処理することを包含するが、しかし他の方法もまた使用され得る。FIV-141 に対して生産される抗体は、それら自体、本発明の範囲内に包含され、そして当業界においてよく知られている技法を用いて精製され得る（たとえば、Harlowなど．、1988, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. を参照のこと）。
【００１３】
もう１つの観点において、本発明は、不活性化された FIV-141ウィルスを含んで成る全(whole）ウィルスワクチンに向けられる。免疫応答は、FIV-141 による続く感染に対して保護免疫を誘発するのに十分な用量で及び十分な期間、このワクチンを投与することによって、ネコにおいて誘発され得る。典型的には、ワクチンは非経口投与され、そして複数回の接種がたとえば２〜８週の間隔で与えられる。本発明はまた、 FIV-141ウィルスにより感染された宿主細胞から構成される、固定された細胞ワクチンも包含する。このワクチンの投与は、全(whole）ウィルスワクチンのために使用されるのと同じ一般的な方法に従うであろう。当業界においてよく知られている標準的方法が、免疫化プロトコールを最適化するために使用され得る。
【００１４】
Ｂ． FIV-141ゲノム核酸に基づく組成物及び方法
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号１の配列に対応する配列を有する、実質的に精製された核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に向けられる。この文脈において使用される場合、“実質的に精製された”とは、所望の生成物が汚染性細胞成分を実質的に有さないことを意味する。“実質的に純粋な”核酸は典型的には、サンプルの少なくとも８５％を構成し、そしてより高い百分率が好ましい。汚染物は、タンパク質、炭水化物又は脂質を包含する。
【００１５】
核酸の純度を決定するための１つの方法は、マトリックス、たとえばポリアクリルアミド又はアガロースにおける調製物の電気泳動による。純度は、染色の後、単一のバンドの出現により明らかにされる。純度を評価するための他の方法は、クロマトグラフィー及び分析遠心分離を包含する。 FIV-141核酸が、宿主細胞をトランスフェクトし、そしてそれにより、子孫ウィルス又はウィルスタンパク質の生成を誘発するために、全(whole）ウィルスの代わりに使用され得る。
【００１６】
本発明はまた、核酸を動物中に直接的に注射し、又は核酸によりトランスフェクトされた宿主細胞を投与することによって、FIV-141 に対する抗体の生成を誘発する方法も包含する。完全ウィルスに関して上記に論ぜられる方法に関しては、宿主細胞が、投与の前に固定され得る。抗体は、動物から精製され得、そして培養培地又は生物学的流体中の FIVの存在を検出するために企画されたアッセイにおいて使用され得る。
【００１７】
FIV-141ゲノムＤＮＡによりトランスフェクトされた宿主細胞はまた、ネコを免疫化するためにワクチンにおいても使用され得る。所望により、そのような細胞は、たとえばホルムアルデヒドのような剤による処理により、ウィルス感染性を低めるために固定され得る。この態様で製造されたワクチンは、ネコにおいて免疫応答を誘発するために使用され得る。ワクチンは、FIV-141 又は所望により、FIV のいくつかの他の株による続く感染に対する保護免疫の誘発のために最適化された標準的免疫化プロトコールを用いて投与され得る。
【００１８】
Ｃ．弱毒化された FIV-141ウィルス及びワクチン
全(whole）ウィルスがワクチンとして動物に投与される前、それは非病原体形に転換されるべきである。上記で論ぜられたように、これは、ウィルスを不活性化し、又は宿主細胞を固定することによって達成され得る。他の方法は、ウィルスを弱毒化された形に形質転換するためにウィルス中への突然変異を導入することを包含する。用語“弱毒化されたウィルス”（atteruated virus）とは、本明細書において使用される場合、その野生型対応物と比較して、実質的に低められた感染性を有するウィルスを意味する。感染性は、下記例のセクションに記載されるように、PBMCにおいて測定され得る。
【００１９】
従って、本発明は、野生型（すなわち突然変異誘発されていない）ウィルスに比べてネコＴリンパ球のための有意に低められた感染性を示す弱毒化された FIV-141ウィルスに向けられる。弱毒化されたウィルスは、Vif, MA, ORF(2), ENV, CA, NC, SU, TMf, CT, IN, DU,  V3／4,  V7／8 及びRRE から成る群から選択された FIV-141ゲノムにおいて１又は複数の遺伝子を突然変異誘発することによって生成される。
【００２０】
それらの遺伝子の個々のための適切な突然変異が本明細書において記載されている。弱毒化されたウィルスの製造に使用され得るいくつかの特定の突然変異の例は、MA del, ENV del,  V3／4 del,  V7／8 del, TMf del, CT del, Vif del, Vifc del, Vifn del, ORF(2) del, CA del, NC del, IN del, DU del, SU del 、及び RRE delを包含する。本発明はまた、弱毒化されたウィルスにより感染された宿主細胞、及びそのような細胞により生成された孫ウィルスを包含する。生成されるとすぐに、弱毒化されたウィルスは、標準的方法を用いて、宿主細胞から精製され得る。
【００２１】
抗体生成は、弱毒化されたウィルスを動物に感染せしめることによって誘発され得、あるいは、感染された宿主細胞が使用され得る。所望により、動物への投与の前に、ウィルスは不活性化され、又は宿主細胞は固定され、そして抗体が標準的方法を用いて動物から精製され得る。
【００２２】
さらに、本発明は、上記に論ぜられる弱毒化された全ウィルス又はそれらのウィルスの１つにより感染された宿主細胞を用いるワクチンを包含する。再び、弱毒化されたウィルスは、不活性化されてもよく、そして宿主細胞は固定されてもよい。そのような処理は、ワクチンがそれら自体、感染を引き起こさないであろう追加の保証を提供することができる。１又は複数の弱毒化された FIV-141ウィルスに基づくワクチンは、ネコにおいて保護免疫性を誘発するために使用され得る。標準的免疫化プロトコールは、 FIV-141による続く攻撃に対する保護免疫性の誘発を最適化するためにワクチンを投与することを包含する。
【００２３】
Ｄ．突然変異誘発された FIV-141ゲノムＤＮＡに基づく組成物及び方法
もう１つの観点において、本発明は、配列番号１に対応する配列を有するが、しかし弱毒化されたウィルスをコードするよう突然変異誘発されている、実質的に精製された FIV-141核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に向けられる。突然変異は、Vif, MA, CA, NC, SU, TMf, ORF(2), CT, ENV, Vifn, Vifc, IN, DU,  V3／4,  V7／8 及びRRE から成る群から選択された１又は複数の遺伝子に対してであるべきであり、そして宿主細胞中への導入の後に、野生型ウィルスに対してネコＴリンパ球（又は他の感受性細胞型）のために有意に低められた感染性を有するウィルスが生産されるような態様で生成されるべきである。
【００２４】
適切な弱毒化されたウィルスを生成するであろういくつかの特定の突然変異の例は、本明細書において記載されており、そして MA del, ENV del, V3／4 del,V7／8 del, TMf del, CT del, Vif del, Vifc del, Vifn del, ORF(2) del, SU del, CA del, NC del, IN del, DU del,及び RRE delを包含する。本発明は、突然変異誘発された核酸によりトランスフェクトされた宿主細胞、及び該宿主細胞により生成された FIV子孫ウィルスを包含する。
【００２５】
上記のようにして突然変異誘発された核酸又は前記核酸によりトランスフェクトされた宿主細胞のいづれかを注射することによって、動物においてＦＩＶに対する抗体の生成を誘発する方法もまた、本発明の範囲内に包含される。所望により、宿主細胞は、投与の前に固定され得る。生成される抗体は、標準的方法を用いて精製され得、そして FIVの存在を検出するよう企画されたアッセイに使用され得る。
【００２６】
突然変異誘発されている核酸、好ましくはＤＮＡは、それがネコへの投与の後に保護免疫性を誘発するのに十分な濃度で存在するワクチンにおいて使用され得る。あるいは、ワクチンは、そのようなＤＮＡによりトランスフェクトされた宿主細胞を含むことができ、そして所望により、宿主細胞は、ウィルスタンパク質が発現された後に固定され得る。ワクチンはネコにおいて免疫応答を誘発するのに十分な用量で且つ十分な期間にわたり投与され得、そして免疫化プロトコールは FIV-141による続く感染に対して保護免疫性を誘発するために最適化され得る。
【００２７】
Ｅ．弱毒化されたレンチウィルスの製造及び使用方法
弱毒化された FIV-141の生成に関して本明細書に開示される方法は、他のＦＩＶ株の弱毒化及び他のタイプのレンチウィルスにも効果的に適用され得る。その突然変異誘発されていない野生型対応物に比べて有意に低められた感染性を有するウィルスは、MA, CA, NC, DU, ENV, SU, TMf, CT, Vif, ORF(2), Vifn, Vifc, IN,  V3／4,  V7／8 、及び RREから成る群から選択された１又は複数の遺伝子を突然変異誘発することによって製造され得る。突然変異は、遺伝子生成物の活性を排除し、又は実質的に低めるよう企画されるべきである。
【００２８】
これは、完全な遺伝子を欠失するか、又は完全な遺伝子の大きな（たとえば１／４）部分を欠失することによって達成され得る。本発明は、開示される方法を用いて製造された弱毒化されたレンチウィルス、それらのウィルスにより感染された宿主細胞、及び哺乳類中に弱毒化されたウィルスを注射することによって抗体生成を誘発する方法を包含する。抗体は、感染された哺乳類から精製され、そしてイムノアッセイに使用され得る。他方では、精製された抗体、又は弱毒化されたウィルスにより感染された動物に由来する抗体含有血清は、ウィルス感染を治療するために使用され得る。
【００２９】
本明細書において使用される場合、用語“保護免疫（性）の誘発”及び同様の用語は、特定のレンチウィルスに対してワクチン接種された哺乳類を保護するために作用する、抗体もしくは細胞介在免疫応答のいづれか、又は両者を包含する、ワクチン接種に応答してのいづれかの免疫に基く応答(immune-based response）の誘発を包含するよう広く使用される。用語“保護免疫性”、“保護応答”、“保護する”、及び同様の用語は、本明細書において使用される場合、特定のレンチウィルスによる感染に起因する、哺乳類における徴候もしくは症状のいづれかの絶対的保護のみならず、さらに、そのようないづれかの徴候もしくは症状の開始のいづれかの検出できる遅延、特定のレンチウィルスによる感染の程度もしくは速度のいづれかの検出できる低下、又は特定のレンチウィルスによる感染に起因する疾病、又はいづれかの徴候もしくは症状の重症度のいづれかの検出できる低下も意味する。
【００３０】
本発明のワクチン調製物は、哺乳類の感染に関連する１又は複数の臨床学的徴候及びウィルス負荷を減じるのに十分な用量で及び十分な期間にわたり投与されるべきである。レンチウィルスがＦＩＶ株である場合、処理される哺乳類はネコであり、そしてその感染に関連する徴候は、免疫学的異常、たとえば異常に低レベルの CD4+ T −リンパ球、又は異常に高められた数の CD8+ T −リンパ球を包含するであろう。他の臨床学的徴候は典型的には、脱毛症、貧血、慢性鼻炎、結膜炎、下痢、るいそう（emaciation）、腸炎、歯肉炎、血便排泄、神経学的異常性及び皮膚炎を包含するであろう。
【００３１】
弱毒化されたレンチウィルス（たとえば、弱毒化された FIV株）、又はそのようなウィルスにより感染された宿主細胞は、哺乳類（たとえばネコ）に投与される場合、免疫性を誘発するのに十分な濃度でワクチンにおいて使用され得る。次に、少なくとも１つのレンチウィルス株による続く感染に対する保護免疫性を誘発するのに十分な用量で及び十分な期間、そのようなワクチンを投与することによって免疫応答が誘発され得る。
【００３２】
Ｆ．突然変異誘発されたレンチウィルス核酸の製造及び使用方法
本発明はまた、レンチウィルス、たとえば FIV感染に対するワクチンへの使用のために適切な核酸を生成するための方法にも向けられる。これは、レンチウィルスのゲノムＲＮＡを逆転写し；その逆転写物をクローニングし；MA, CA, NC, SU, TMf, ORF(2), CT, ENV, Vif, Vifn, Vifc,  V3／4,  V7／8, IN, DU 、及びRRE から成る群から選択された１又は複数の遺伝子を突然変異誘発し；そして次に、その突然変異誘発された核酸をクローニングする、ことによって達成される。好ましくは、突然変異は、宿主細胞中への導入の後に、突然変異誘発されていない野生型核酸により生成されるレンチウィルスに対して有意に低められた感染性を有する弱毒化されたウィルスが生産されるよう実施されるべきである。FIV の場合、感染性はネコＴ−リンパ球に関して低められるか又は排除されるべきである。
【００３３】
突然変異誘発されたレンチウィルス核酸は、精製され、そして FIV-141について上記に記載されるのと同じ手段で、宿主細胞をトランスフェクトし、子孫ウィルスを生成せしめ、そして抗体を製造するために使用され得る。さらに、核酸、又はその核酸によりトランスフェクトされた宿主細胞が、ワクチン中に導入され、そして哺乳類に保護免疫性を誘発するために使用され得る。好ましくは、核酸は、Ｔ−リンパ球、たとえばＦｅＰ２細胞を包含するネコPBMCにおいて有意に低められた感染性を有する弱毒化された FIV株をコードするであろう。それらの環境下で、免疫応答がネコにおいて誘発されるであろう。
【００３４】
図１：トランスフェクトされた細胞からの FIV生成。クランデル（Crandell）ネコ腎臓（CRFK）細胞を、十分な長さの FIV-141ゲノムを含んで成るプラスミドによりトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞上清液が収穫され、そして酵素イムノアッセイを用いて、FIV p26 カプシドタンパク質の存在についてアッセイされた。
【００３５】
図２：同時培養による FeP2Tリンパ球の感染。CRFK細胞が６個のウェルプレートにおいて増殖され、そして十分な長さの FIV-141ゲノムをコードするプラスミドＤＮＡによりトランスフェクトされた。トランスフェクションの４８時間後、２×１０6 個のFeP2細胞が個々のウェル中に導入された。同時培養の７２時間後、FeP2細胞が分離され、そしてそれらの上清液が ELISAにより FIV p26カプシドタンパク質の存在について試験された。
【００３６】
図３：FeP2細胞の吸着による感染。FeP2細胞が、十分な長さの感染性 FIV-141クローンによりトランスフェクトされたCRFK細胞に由来する、 FIV-141ウィルス含有ならし培地２００μｌに懸濁された。感染の４日後、FeP2細胞上清液が、 p26 ELISAアッセイを用いて、 FIV-141ウィルスの存在について試験された。
【００３７】
図４：欠失クローンによる FIV-141ウィルスタンパク質の発現。 FIV遺伝子又は調節領域を欠失するように突然変異誘発された種々のクローンが製造され、そしてCRFK細胞中にトランスフェクトされた。４８時間後、細胞上清液が ELISAにより FIV p26カプシドタンパク質の存在についてアッセイされた。個々の欠失クローン、及び野生型 FIV-141分子クローンについての結果が示される。
【００３８】
図５〜１０： FIV-141変異体によるFeP2 Tリンパ球の感染。CRFK細胞が６個のウェルプレート上で増殖され、そして次の３種の異なった FIV-141欠失クローン： TMf del, ENV del 又は NC del の１つにより感染された。４８時間後FeP2細胞が個々のウェルに添加され、そしてさらに７２時間、同時培養が維持された。次に、FeP2細胞がCRFK細胞から分離され、そして ELISAアッセイを用いてｐ２６抗原の存在についてアッセイされた。 p26レベルのモニターが、３〜４日ごとに反復され、そして結果が図５に示される。実験が次のものを用いて反復された： Vifn del, Vifc del 及び Vif del（図６）；MA del及び CA del(図７）；V3／4 del,  V7／8 del 及び CT del （図８）；ORF(2) del（図９）；及びDU del, SU del, IN del及びRRE del(図１０）。
【００３９】
本発明の詳細な記載
Ａ． FIV-141の生産、及びこのウィルスをコードするＤＮＡ
本発明は、そのゲノム核酸配列及び生物学的機能に基づいてのすべての類似する株とは区別されるネコ免疫不全ウィルスの新規株（本明細書において“FIV-141 ”と命名される）に向けられる。 FIV-141のゲノムはＲＮＡから成るが、これはＤＮＡ中に逆転写され、そして感染された宿主のゲノム中に組込まれる。ＦＩＶの配列、及びそのような配列の突然変異誘発された形に関する本明細書における言及が、逆転写されたウィルスＲＮＡ配列及びその対応するＤＮＡ自体の両者を包含することが理解されるであろう。
【００４０】
部位特定突然変異誘発のような技法が核酸の構造体中に変動を導入するために使用され得ることは、よく知られている。この方法又はいくつかの類似する方法により導入される FIV-141核酸配列における突然変異は、本発明により包含され、但し得られるウィルスの少なくとも１つの主要生物学的特徴、たとえばその抗原性はそれが由来するウィルスの抗原性と実質的に同じに存続する。好ましい非制限的態様においては、野生型株の感染性に比較して、 FIV-141の感染性を検出できるほどに低める突然変異誘発は、本発明の範囲内である。たとえば、複製するが、しかし非常に低められた感染性を示すウィルスを生成する、ＥＮＶ遺伝子における特定の突然変異が下記に記載されている。本発明は、この突然変異、及び実質的に低められたウィルス感染性をもたらす他の突然変異の両者を包含する。
【００４１】
実験セクションにおいて論ぜられるように、完全な FIV-141ゲノムがクローン化され、そして十分な長さの配列を含むプラスミドが ATCC No.203001 として寄託されている。このプラスミドを単離し、そしてそれを、ウィルス生成を支持することができる宿主細胞中にトランスフェクトするために、標準的方法が使用され得る。
【００４２】
クランデル（Crandell）ネコ腎臓（ＣＲＦＫ）細胞が、この目的のために適切であることが見出されているが、しかし他の細胞型、たとえばネコＴリンパ球細胞が同様に使用され得る。いくつかの場合、ウィルスを発現する宿主細胞は直接的に使用され得、たとえばそれらは収穫され、そして抗体を生成するために、又はワクチンに使用され得る。他方では、前記細胞において生成されるウィルスは、既知の分離技法、たとえばスクロース−グラジエント遠心分離を用いて、高度に精製された形で単離され得る。そのような方法は、野生型ウィルス及びそのウィルスの変異形の両者のために効果的である。
【００４３】
FIV-141ゲノムを得るための他の方法は、配列番号１での配列要素に対応するプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を実施することである。一般的に、プライマーは、約２０〜５０個の長さの塩基であるべきである。完全な FIV-141ゲノムを増幅するための方法が企画され得、又は他方では、前記ゲノムの一部が別々に増幅され、そして次に、十分な長さの配列を形成するために一緒に連結され得る。下記実施例のセクションは、効果的であることが見出されている特定のプライマー及び方法を記載しているが、しかし他の方法も同様に開発され、そして使用され得る。
【００４４】
ウィルスが天然源から単離される場合、ＰＣＲのためのプライマーは、FIV-141 に対してユニークな配列に対応すべきである。そのようなプライマーを用いての好都合な増幅は、感染を担当するウィルスが実際、FIV-141 であることを示すであろう。従って、ＰＣＲは、診断的に、及びウィルスを単離するための方法において使用され得る。
【００４５】
Ｂ．不活性化されたウィルス及び固定された宿主細胞の生成
FIV-141 ウィルスは、適切な宿主及びワクチンにおいて抗体を生成するために使用され得る。いづれの場合においても、動物へのその投与の前にウィルスを不活性化することが通常所望されるであろう。不活性化は、当業界において知られているいづれかの手段により達成され得る。たとえば、ウィルスが精製され、そして次に、０．８％ホルマリン又は１．２５％パラホルムアルデヒド中での約２４時間のインキュベーションにより不活性化される。そのような方法は、野生型又は変異ウィルスのいづれかにより使用され得る。
【００４６】
FIV-141 により又はそのウィルスの突然変異誘発された形により感染された宿主細胞を用いて、抗体がまた生成され、又は免疫化が達成され得る。ウィルス複製を支持することができるいづれかの宿主細胞、たとえば末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）が使用され得る。通常、細胞は、動物への投与の前に固定されるべきである。固定化は、パラホルムアルデヒド（たとえば１．２５％）により３７℃で約２４時間、細胞を処理することによって実施され得る。ウィルスを不活性化するための上記に論ぜられる他の方法はまた、当業界において開示されるいづれか他の方法と同じように、細胞を固定するためにも使用され得る。
【００４７】
Ｃ．弱毒化されたウィルスの生成
上記で論じられたように、ワクチンは、不活性化されたウィルス又は固定された宿主細胞のいづれかを用いて生成され得る。他の方法は、ウィルスゲノム中の１又は複数の遺伝子を突然変異誘発することによって弱毒化されているウィルスを使用する。目的は、ネコに投与される場合、感染性でないウィルスを生成することである。
【００４８】
ウィルス複製の速度は、ウィルスにより細胞（たとえば、PBMC）を感染し、そして次に、時間と共にいかにしてウィルスレベルが変化するかを決定することによって、インビトロで決定され得る。複製は、定量ＰＣＲにより、又はウィルスに対して特異的な酵素（たとえば逆転写酵素）の活性を測定することによって、ＦＩＶに対して特異的な抗原を測定する免疫学的アッセイを用いて追跡され得る。感染性は、ウィルスにネコＴリンパ球（たとえばＦｅＰ２細胞）を暴露し、そして細胞がウィルスを摂取し、そして複製を支持する程度を決定することによって決定され得る（下記例４を参照のこと）。
【００４９】
FIV-141ゲノムにおける突然変異は、部位特定突然変異誘発により行なわれ得る。これを実施するための１つの手段は、正常な遺伝子配列中に変更を導入するプライマーによりウィルス遺伝子を増幅することである。たとえば、ユニーク制限部位がゲノムの選択された領域において導入され得、そして次に、そのような部位間の配列が制限酵素消化により切除され得る。切除の後、残るゲノムＤＮＡの部分が再連結され、そして次に、適切な宿主細胞中に導入され、突然変異誘発されたウィルスが生成され得る、突然変異誘発されたウィルス及び突然変異誘発されたウィルスゲノムの製造及び試験の詳細な記載は、下記例３及び４に提供される。導入されている種々の突然変異の要約が表１及び表２に見出され得る。
【００５０】
【表１】
2004208695.tif 000002
【００５１】
【表２】
2004208695.tif 000003
【００５２】
抗体生成を誘発するために動物への投与のために又はワクチンへの使用のために適切な弱毒化されたウィルスを生成するいくつかの特定の突然変異の例は、MA del, ENV del,  V3／4 del,  V7／8 del, TMf del, CT del, Vif del, Vifc del, Vifn del, ORF(2) del, CA del, NC del, SU del, IN del, DU del 、及び RRE delである。従って、Vif, MA, ORF(2), ENV, Vifn，Vifc, V3／4,  V7／8, TMf, CT, SU, CA, NC, IN, DU又は RRE遺伝子のいづれかにおいて突然変異誘発されたウィルスが弱毒化され、そしてそれらの遺伝子を不活性化する他のヌクレオチド欠失又は変更が、類似する特徴を有するウィルスを生成すべきである。
【００５３】
Ｄ．FIV-141 に対する抗体の生成、及び感染されたネコの処理
FIV-141 に対する抗体は、抗体生成のために典型的に使用される動物、たとえばマウス、ウサギ、等のいづれかにおいて生成され得る。しかしながら、好ましくは、抗体はネコにおいて生成される。野生型ウィルスが抗原として使用される場合、ウィルスは、投与の前に不活性化されるべきである。弱毒化されたウィルス、たとえばそれらの感染性を低め又は排除するために突然変異誘発されたウィルスが使用される場合、宿主細胞の不活性化、又は固定化は必要とされないが、但し、それらの方法は、所望により実施され得る。
【００５４】
ウィルスを含む組成物は、いづれかの経路により動物に投与され得るが、動物は典型的には、筋肉内、皮下又は静脈内注射され得る。一般的に、ウィルス調製物は、アジュバント、たとえば完全又は不完全フロイントアジュバントを含むであろう。注射のための適切な調製法、注射スケジュール、及び同様のことは、当業界においてよく知られており、そして FIV-141及びその変異体のために使用され得る（たとえば、Harlowなど．、1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. ; Klein, 1982, Immunology : The Science of Self-Nonself Discrimination を参照のこと）。モノクローナル抗体もまた使用され得、そして標準的方法を用いて製造され得る（ Kennettなど．、1980, Monoclonal Antibodies and Hybridomas : A New Dimension in Biological Analysis ; Campbell, 1984, "Monoclonal Antibody Technology,", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology) 。
【００５５】
FIV-141 に対する特異性を伴って反応する（すなわち、いづれかの他のウィルスに対してよりも FIV-141に対して少なくとも１００倍以上の親和性を有する）抗体又は抗体フラグメントはまた、いづれかの種々のイムノアッセイにも使用され得る。たとえば、抗体は、“２−部位”又は“サンドイッチ”アッセイとしても知られている、ラジオイムノアッセイ又は免疫計量アッセイにおいて FIV-141を検出するために使用され得る（Chard, 1978, "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques," Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, North Holland Publishing Co. N.Y.を参照のこと) 。
【００５６】
典型的な免疫計量アッセイにおいては、多量のラベルされていない抗体が、試験される流体、たとえば血液、リンパ、細胞抽出物、等に不溶性である固体支持体に結合される。固定された抗体への抗原の初期結合の後、多量の検出可能的にラベルされた第２抗体（第１抗体と同じであっても、同じでなくてもよい）が添加され、抗原の検出及び／又は定量化を可能にされる（たとえば、 Kirkhamなど.(ed.), 1970, Radioimmune Assay Methods, pp.199-206, E & S Livingstone, Edinburgh を参照のこと) 。それらのタイプのアッセイの多くの変法が当業界において知られており、そして FIVの検出のために使用され得る。
【００５７】
Ｅ．従来のワクチン及び予防接種方法
異なった FIV株又は密接に関連するウィルスを用いる、ワクチン及び予防接種方法は、多くの著者により論じられて来た（ Elyarなど. 、1997, Vaccine 15 : 1437-1444 ;  Yamamotoなど．、1993, J. Virol. 67 : 601-605 ;  Murphey-Corbなど．、1989, Science 240 : 1293-1297 ;  Jarrettなど. 、1990, AIDS 4 : S163-S165；及び Destrosiersなど．、1989, Proc. Nat‘l Acad. Sci. USA 86 : 6353-6357 ）。FIV-141 の場合、使用され得る次の３種のタイプのワクチンが存在する：不活性化された完全ウィルスワクチン、固定された細胞ワクチン、及び弱毒化されたウィルスワクチン。
【００５８】
典型的には、ワクチンは、約０．５〜５mlの体積に、約１×１０6 〜１×１０8 個のウィルス粒子を含むであろう。配合は、標準的方法、たとえばRemington‘s Pharmaceutical Sciences, 1982, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 16th ed.に記載される方法を用いて行われる。調製物は、キャリヤー及び１又は複数のアジュバントと共に、不活性化されたウィルス、固定された宿主細胞又は弱毒化されたウィルスを含むことができる。ワクチンは一般的に、非経口投与のために企画されているが、但し本発明は他の形の投与と適合できる。最も好ましいワクチンは、ネコに投与される場合、完全に、又は実質的に完全に非感染性である弱毒化されたウィルスを含むであろう。
【００５９】
免疫化方法は典型的には、３〜１０週の間隔により分離されたワクチンによる数回の接種（たとえば、３回の接種）を包含する。接種スケジュール及び免疫化に関連する他のパラメーターを最適化するための方法は、当業界においてよく知られている。
【００６０】
Ｆ．ＤＮＡワクチン
核酸（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）を用いるワクチン及び予防接種方法を記載する文献は、アメリカ特許第 5,703,055号、第 5,580,859号及び第 5,589,466号を包含する。この態様で供給される免疫原は典型的には、体液性及び細胞毒性免疫応答の両者を誘発する。
それらの方法は、弱毒化された FIV-141に対応する核酸をネコに投与するための、FIV に対するワクチンを生成するために利用され得る。
【００６１】
弱毒化された FIV-141ゲノムをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのいづれかがワクチンに使用され得るが、しかしＤＮＡが一般的に好ましいであろう。ＤＮＡは“裸の”形で存在することができ、又はそれは細胞摂取を促進する剤（たとえばリポソーム又はカチオン性脂質）と共に投与され得る。投与の典型的な経路は、約０．１〜５mlのワクチンの筋肉内注射による。ワクチン中の合計ポリヌクレオチドは一般的に、約０．１μｇ／ml〜約５．０mg／mlであるべきである。ポリヌクレオチドは懸濁液、溶液又はエマルジョンの一部として存在することができるが、しかし水性キャリヤーが一般的に好ましい。
【００６２】
ＤＮＡワクチンを用いてのネコの免疫化は、３〜１０週の間隔で分離された、分割された用量の一回の接種又は複数回の接種として実施され得る。所望により、血清が接種された動物から集められ、そして FIV-141又は他の FIV株に対する抗体の存在について試験され得る。
【００６３】
Ｇ．他のレンチウィルスへの方法論の拡張
ワクチンへの使用のために適切な、FIV-141 を弱毒化するための及び突然変異誘発されたウィルス核酸を生成するための上記に論じられる方法は、他の FIV株及び他のタイプのレンチウィルスに拡張され得る。個々の場合、ウィルスゲノムがクローン化され、そして MC, CA, NC, DU, ENV, SU, TMf, CT, ORF(2), Vif, Vifn, Vifc, V3／4,  V7／8, IN 及び RREから成る群から選択された１又は複数の遺伝子において突然変異誘発される。
【００６４】
突然変異は、遺伝子生成物を不活性化するために企画されるべきである。これは通常、完全な遺伝子又は遺伝子の実質的な部分のいづれかを欠失することによって、最とも容易に達成され得る。突然変異を誘発するために使用される特定の方法論は、ウィルスに依存して変化するが、基本的技術は当業界において通常であり、そしてガイドとして本明細書に開示される方法を用いて、当業者により容易に実施され得る。抗体生成、ワクチンの製造及び投与、等は、必要なら、マイナーな調節を行なって、本明細書における FIV-141に関して論ぜられるようにして達成され得る。
【００６５】
さらに、一定のレンチウィルスに対する抗体がウィルスにより感染された動物又はヒトに受動的免疫性を提供するために使用され得る。精製された抗体又は抗体−含有血清のいづれかがこの目的のために使用され得、そして調製物が、ウィルス感染に関連する１又は複数の徴候の改善が観察されるまで、定期的に投与され得る。
【実施例】
【００６６】
例１：感染性 FIVプロウィルスＤＮＡクローンの構成
Ａ．FIV-141 の単離及びクローニング
ウィルス単離
FIV-141 を、FIV-感染されたネコの血漿から単離した。感染された動物からの血漿を特定の病原体フリー（SPF)ネコに投与することによって、ウィルスを増幅した。接種されたネコの感染を、ウィルス単離及び血清転換により確かめた。ネコを１２週間の攻撃の後、安楽死せしめ、組織を集め、そして脾臓を、 FIV-141ゲノムの分子クローニングのためのウィルス源として使用した。ゲノムＤＮＡを、製造業者により提供されるプロトコールに従って、ＤＮＡ拡大キット（Stratagene, La Jolla, CA) を用いて、感染された脾臓から単離した。精製されたゲノムＤＮＡを、１μｇ／mlの濃度でＴＥ緩衝液に溶解し、そして−７０℃で貯蔵した。
【００６７】
FIV-141ゲノムの３種のセグメントのＰＣＲ増幅及びクローニング
３組のオリゴヌクレオチドを、他のＦＩＶ単離物の公開された配列に基づいて企画した（ Talbottなど．、1989, Proc. Nat‘l Acad. Sci. USA 86 : 5743-5747 ; Miyazawaなど．、1991, J. Virol. 65 : 1572-1577 ; Talbottなど．、1990, J. Virol. 64 : 4605-4613）。それらのオリゴヌクレオチドを用いて、ＦＩＶ−１４１ゲノムの３種のセグメントを増幅、ここで１つはゲノムの５′末端で、１つは３′末端で、及び１つは中央に存在する。感染された組織における低コピー数のＦＩＶプロウィルスゲノムのために、２回のＰＣＲ増幅を、個々のセグメントのために半−入れ子セットのプライマー組を用いて実施した。
【００６８】
３種のプライマーを用いて、ヌクレオチド１１８からヌクレオチド６４６まで延びる、 FIV-141プロウィルスゲノムの５′末端からのセグメントをクローン化した。この領域は、５′末端の長い末端反復配列、５′末端の長い末端反復配列とＧａｇオープンリーディングフレームとの間の介在配列、及びＧａｇ遺伝子のＮ−末端部分のほとんどを包含する。プライマーの配列は次の通りであった：プライマー pr-1 (117−CCGCAAAACCACATCCTATGTAAAGCTTGC−146 、配列番号２）並びに２種の逆方向プライマー、pr-2 (646 −CGCCCCTGTCCATTCCCCATGTTGCTGTAG−617 、配列番号３）及び pr-8 (1047 −TTACTGTTTGAATAGGATATGCCTGTGGAG−1018、配列号４）。
【００６９】
最初のＰＣＲ増幅を、プライマーとしてのそれぞれ２００ngの pr-1 及び pr-8 並びに鋳型としての１μｇのゲノムＤＮＡ、並びに０．５単位の Taq DNAポリメラーゼ（Gibco, BRL Gaithersburg, MD ）及び１単位の Pfn DNAポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA）の混合物を用いて実施した。９４℃で１分間の増幅；続いて、９４℃で４５秒間の変性；５２℃で４５秒間のアニーリング；及び７２℃で２分間の延長、を３０回行なった。２回目の増幅を、鋳型として２μｌの第１回目のＰＣＲ生成物と共に、プライマーｐｒ−１及びｐｒ−２を用いて行なった。第１回目の増幅に使用される同じ条件を第２回目にも適用し、但しアニーリングは５５℃の温度で実施された。
【００７０】
３種のオリゴヌクレオチドを用いて、 FIV-141プロウィルスゲノムの３′末端からのセグメントをクローン化した。このセグメントは、３′末端の長い末端反復配列、及び３′末端の長い末端反復体とＥＮＶ遺伝子との間の介在配列のほとんどから成る、ヌクレオチド８８７４〜９３６７を包含する。３種のプライマーの配列は、次の通りである：２つの前方プライマー pr-5 (8793 −GCAATGTGGCATGTCTGAAAAAGAGGAGGA−8822、配列番号５）及び pr-7 (8874 −TCTTCCCTTTGAGGAAGATATGTCATATGAATCC−8907、配列番号６）、及び逆方向プライマー pr-6 (9367 −TCTGTGGGAGCCTCAAGGGAGAACTC−9342、配列番号７）。プライマー pr-5 及び pr-6 を用いて最初の回の増幅を行ない、そして pr-6 及び pr-7 を用いて、第２回目の増幅を行なった。５′末端からのセグメント及び上記 FIV-141の増幅に使用される条件と同じ条件がこの増幅に適用された。
【００７１】
ヌクレオチド５１４７からヌクレオチド５６３１に延長し、そしてIN遺伝子のＣ−末端部分及び Vif遺伝子のＮ−末端部分を包含する、 FIV-141ゲノムの中央部分からのセグメントをクローン化するために、最初の増幅を、前方向プライマー、 pr-3 (4738 −ACAAACAGATAATGGACCAAATTTTAAAAA−4767、配列番号８）及び逆方向プライマー、 pr-10 (5631−TTTCAATATCATCCCACATAAATCCTGT−5604、配列番号９）を用いて実施した。第２回目の増幅を、前方向プライマー、 pr-7 (1547 −TTAAAGGATGAAGAGAAGGGATATTTTCTT−5176、配列番号１０）及び逆方向プライマー、pr-10 を用いて実施した。
【００７２】
第２回目のＰＣＲ増幅の完結の後、生成物を１％アガロースゲルに適用し、そしてすべての３種の領域のための予測されるバンドを、Wizard PCR Prepsキット (Promega, Madison, WI）により増幅した。精製されたＰＣＲフラグメントを、製造業者により推薦される方法に従って、 PCR-Script Amp SK（＋）ベクター（Stratagene, La Jolla, CA）中にクローン化した。挿入体を、制限酵素消化、続くプラスミドＤＮＡの２つの鎖の配列決定により確かめた（Advanced Genetic Analysis Center, St. Paul, MN）。増幅の間、ＤＮＡポリメラーゼにより生成されるＦＩＶ配列における“誤差”を排除するために、３種の独立したＰＣＲ増幅からの３種のクローンを個々の領域について配列決定した。３種の独立したクローンからのコンセンサス配列は、確実な FIV-141配列として見なされた。
【００７３】
５′及び３′末端セグメントからの配列の組合せは、FIV-141 の長い末端反復体がＵ３領域における２０８個の塩基、Ｒ領域における７９個の塩基及びＵ５領域における６７個の塩基を包含する３５４個の塩基から成ることを示唆する。末端の２−塩基の逆方向反復体、TATAボックス、ポリアデニル化シグナル、及び多くの推定上のｃｉｓ−作用性エンハンサー−プロテーター要素は他の FIV単離物に対して完全に保存された。
【００７４】
FIV-141 の完全なプロウィルスゲノムのＰＣＲ増幅及びクローニング
上記の３種のクローン化されたセグメントを用いて得られた配列情報を用いて、２種の断片、すなわち５′側半分及び３′側半分において完全なプロウィルスゲノムを増幅し、そしてクローン化するために使用され得る FIV-141特異的プライマーを企画した。個々の半分を、半−入れ子セットのプライマーによる２回の増幅により増幅した。
【００７５】
FIV-141ゲノムの５′側半分（ヌクレオチド１〜５４６０）を増幅するために、第１回目の増幅を、前方プライマー、pr-11 (1−TGGGAAGATTATTGGGATCCTGAAGAAATA−30、配列番号１１）及び逆方向プライマー pr-10を用いて実施した。Clonetech (Palo Alto, CA）からの Advantage Genomic PCRキットにより提供される増幅プロトコールに従った。手短に言及すれば、ＰＣＲ反応を、１μｌのゲノムＤＮＡ鋳型（１μｇ／μｌ）、１μｌの個々のプライマー（１００ng／μｌ）、５μｌの１０×Ｔｔｈ  ＰＣＲ反応緩衝液、２．２μｌの２５mMのＭｇ（ＯＡｃ）2 、１μｌの５０×ｄＮＴＰ混合物（それぞれ１０mM）、１μｌの５０×Advantage Tth Polymerase混合物、１μｌの Pfnポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）及び３６．８μｌの無菌水を含む合計体積５０μｌにおいて企画した。
【００７６】
反応混合物を９４℃で２分間、加熱し、続いて３０サイクルの増幅を実施した：９４℃で３０秒間及び６８℃で６分間。第２回目の増幅を、鋳型として第１回目のＰＣＲ生成物２μｌ、同じ前方プライマーpr-11 及び逆方向プライマー、pr-12 (5460 − CATATCCTATATAATAATCACGCGTATGAAAGCTCCACCT −5421、配列番号１２）を用いて実施した。２種の半分部分からの十分な長さの FIV-141ゲノムの構成を促進するために、制限酵素部位ＭｌｎＩ（下線が引かれている）を、プライマー１２中に導入した。第１回目の増幅において使用されるのと同じＰＣＲ条件を第２回目に適用し、そして５４６０個の塩基対サイズの増幅フラグメントの生成をもたらした。
【００７７】
FIV-141プロウィルスゲノムの３′側半分をクローン化するために、３種のプライマー、pr-9, pr-13 及び pr-14をまず使用し、増幅を行なった。第１回目のＰＣＲ増幅を、前方プライマー pr-9 及び逆方向プライマー pr-14 (9464−TGCGAGGTCCCTGGCCCGGACTCC−9441、配列番号１３）を用いて実施した。第２回目の増幅を、前方プライマー pr-13（5421− AGGTGGAGCTTTCATACGCGTGATTATTATATAGGATATG −5460、配列番号１４）、及び同じ逆方向プライマーpr-14 を用いて行なった。
【００７８】
プライマーpr-13 を、ゲノムの５′側半分の増幅に使用される pr-12プライマーとオーバーラップするよう企画した。 pr-12プライマーにおけるように、ＭｌｎＩ制限酵素部位（下線が引かれている）を、十分な長さの FIVクローンの構成を促進するために pr-13中に組込んだ。不運なことには、２回目のＰＣＲ増幅の後、特定のＤＮＡバンドは観察されなかった。 FIV-141ゲノムの３′側半分を増幅することの失敗は、たぶん、プライマー pr-14における高いＧＣ含有率及び非常に安定した二次構造体によることが結論づけられた。
【００７９】
従って、新たなプライマー pr-16 (9444−CTCCAGGGATTCGCAGGTAAGAGAAATTA −9416，配列番号１５）を企画した。この配列は、 FIV-141ゲノムにおける最後の塩基の上流の２０個の塩基で終結する。第１回目のＰＣＲ増幅を、前方プライマー pr-9 及び逆方向プライマー pr-16を用いて実施した。この後、前方プライマー pr-13及び再び、逆方向プライマー pr-16を用いて増幅を行なった。予測されるサイズを有するＤＮＡフラグメントを、２回目の増幅の後に得た。
【００８０】
FIV-141ゲノムの５′側半分及び３′側半分のフラグメントを、Wizard PCR Preps DNA精製キット (Promega, Madison, WI）を用いて精製し、そして PCR-Script Amp SK（＋）クローニングベクター（Stratagene, La Jolla, CA）中にクローン化した。３種の独立したＰＣＲ反応からの３種のククローンを、５′側半分及び３′側半分のクローンの個々について配列決定した。プラスミドＤＮＡの両鎖を配列決定し、そして完全なゲノムのための確実なコンセンサス配列を、前記３種の独立したクローンについて得られた結果を比較することによって得た。DNAStar プログラム（DNAStar Inc., Madison, WI ）を用いて、配列アセンブリー、比較及び分析を実施した。
【００８１】
Ｂ．クローン化された FIV-141ウィルスの分子的性決定
完全な FIV-141ゲノムの配列結果及び分析
FIV-141 の完全なプロウィルスゲノムは、９４６４個の塩基を含むことが見出された。前記ゲノムは、典型的なレンチウィルスに構成され、そして５′及び３′側の長い末端反復体；Gag, Pol及び ENV遺伝子を含む３種の大きなオープンリーディングフレーム(ORF）；及び Vif, Rev 及び ORF（２）調節タンパク質を含む３種の小さなオープンリーディングフレームから成る。
【００８２】
長い末端反復体はそれぞれ、 FIV-Petaluma (Olmstedなど．、1989, Proc. Nat‘l Acad. Sci. USA 86 : 2448-2452)及び FIV-USIL (Sodora など. 、1995, AIDS Res. Hum. Retrovirnses 11 : 531-533）単離物と７８．０％及び９３．９％の配列相同性を共有する。Ｇａｇポリタンパク質は、それぞれ FIV-Petaluma 及び FIV-USIL と８８．４％、及び９４．４％のアミノ酸相同性を共有する。
【００８３】
Gag遺伝子は、マトリックス（MA）タンパク質（塩基６２７〜１０３１）、カプシド（CA）タンパク質（塩基１０３２〜１７２４）及びヌクレオカプシト（NC）タンパク質（塩基１７２５〜１９７６）をコードする。Gag 及び Polポリタンパク質は、ヌクレオチド１８８０で始まり、そしてヌクレオチド５２３９で終結する Pol ORFと９７個の塩基でオーバーラップする。ヘプタヌクレオチドフレームシフトシグナル（５′−GGGAAAC −３′）は、前記オーバーラップの３′末端の上流の１００個の塩基部分に位置する。翻訳の間の−１フレームシフトの結果として、 Gag／Pol ポリタンパク質融合が生成される。
【００８４】
FIV-Petaluma 及び FIV-USIL 単離物と比較すれば、FIV-141 の Polポリタンパク質はそれぞれ、８５．７％及び９２．２％のアミノ酸同一性を示す。 Pol遺伝子は、ヌクレオチド１８８０〜１９７８の先導配列；ヌクレオチド１９７９〜２３２６のプロテアーゼ（PR）；ヌクレオチド２３２７〜３９９４の逆転写酵素（RT）；ヌクレオチド３９９５〜４３９３のデオキシウリジントリホスファターゼ（DU）；及びヌクレオチド４３９４〜５２３９のインテグラーゼ（IN）をコードする。
【００８５】
Vif ORF は、 Pol遺伝子と８個の塩基でオーバーラップし、そしてそれぞれ、FIV-Petaluma及びFIV-USIL単離物と８０．２％及び９１．３％のアミノ酸相同性を共有する。直後、 Vif遺伝子は、それぞれ FIV-Petaluma 及び FIV-USIL 単離物と６２％及び９２．４％の配列相同性を明示する、ヌクレオチド５９８８から開始し、そして６２２４で終結するＯＲＦ（２）遺伝子である。
【００８６】
ENVポリタンパク質は、それぞれ、 FIV-Petaluma 及び FIV-USIL との７９．３％及び８８．６％のアミノ酸同一性を共有する。ＥＮＶ遺伝子は、ヌクレオチド６２６２〜８０８８からの表面（ＳＵ）タンパク質；及びヌクレオチド８０８９〜８８２６からのトランスメンブラン（ＴＭ）タンパク質をコードする。
Revタンパク質は、複数スプライシングｍＲＮＡの翻訳に起因する。推定上の Rev遺伝子の第１エキソンは明らかに、ヌクレオチド６２６２で始まり、そしてヌクレオチド６５０５で終結するＥＮＶ遺伝子と初期コドンを共有する。第２のＲｅｖエキソンは、ヌクレオチド８９４７で始まり、３′側の長い末端反復体のＵ３領域中に延び、そしてヌクレオチド９１６１で終結する。
【００８７】
FIV-141 の Revタンパク質は、それぞれ、 FIV-Petaluma 及びFIV-USIL単離物と６７．３％及び８３．９％のアミノ酸相同性を有する。１５１塩基のＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）は、ヌクレオチド８７７５で始まり、そしてヌクレオチド８９２５で終結するＥＮＶ遺伝子と５２個の塩基でオーバーラップする。
ＳＵ糖タンパク質のＶ３領域内の配列比較に基づけば、FIV-141 はタイプＢ単離物である。明らかに、 FIV-141は FIV-USIL 、すなわちもう１つのタイプＢの FIV単離物に最とも密接に関連している。
【００８８】
Ｃ．FIV-141 の十分な長さの分子クローンの構成
十分な長さの FIV-141クローンを構成するために、ゲノムの３′側の極末端での２０個の塩基が３′側半分クローンに付加されるべきであった。さらに、コンセンサス配列を、３種の独立したクローンからの配列を比較することによって同定した。次に、特定部位の突然変異誘発（ＳＤＭ）を用いて、５′及び３′側半分クローンの配列を調整し、十分な長さのウィルスクローンの構成の前、コンセンサスの配列に適合せしめた。
【００８９】
FIV-141 の３′側の極末端で欠失する２０個の塩基の付加
FIV-141 の３′側半分クローンに２０個の塩基を付加するために、長い末端反復体をまず増幅し、そして鋳型として５′側の半分クローン、及び前方プライマー pr-21（５′−TTACAAGAATTCAACTGCAGTGGGAAGATTATTGGGATCCTGAAGAAAT −３′、配列番号１６）及び逆方向プライマー pr-20（５′−TTCAAGGAGCTCTTTTGTCGACAACTGCGAGGTCCCTGGCCC−３′、配列番号１７）を用いて、PCR-Script Amp SK(＋）クローンベクター中にクローン化した。
【００９０】
ＰＣＲフラグメントのクローニングを促進するために、２種の制限酵素部位（下線が引かれている）、すなわちＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを前方プライマーｐｒ−２１中に組込み、そして２種の部位（下線が引かれている）、すなわちＳａｃＩ及びＳａｌＩを逆方向プライマー pr-20中に組込んだ。プライマー中の FIV-141特異的配列は、イタリック体で示されている。得られるクローンを配列決定し、そして PCR-LTRとして命名した。ＳａｃＩ及びＮｈｅＩによる消化により生成される pFIV-LTR の制限フラグメントを、 FIV-141の−３′側半分クローンの１つ中にクローン化した。得られるクローンを、 pFIV ３′-2A-１+ として命名し、そして FIV-141の３′側の極末端での２０個の塩基の存在を、ヌクレオチド配列決定により確かめた。
【００９１】
５′及び３′側の半分クローンにおけるコンセンサス配列の構成
FIV-141 の存在する５′及び３′側半分クローンにおいてコンセンサス配列を確立するために、ＳＤＭを実施した。ゲノムの最初の半分に配列変化を導入するために、５′側半分クローンの１つ（“pFIV５′−Ｄ−11”と称する）を、鋳  として使用した。コンセンサス配列に比較して、pFIV５′−Ｄ−11に合計１５個のヌクレオチド変化が存在した。２種の変化は、５′側非コード領域、Ａ６０２Ｇ及びＡ６１２Ｇに位置し、そしてコード領域における７個のヌクレオチドの変化はサイレント突然変異であった。
【００９２】
コード領域における他の６種の変化は、個々の変化のためにアミノ酸置換をもたらし、３種はＲＴ領域に存在し（ＩからＭへのアミノ酸置換をもたらすＡ２８９０Ｇヌクレオチド変化；ＥからＫへの置換をもたらすＧ３４６１Ａ変化；及びＥからＫへの置換をもたらすＧ３７３７Ａ変化）、１種はＤＵタンパク質に存在し（ＴからＩへの置換をもたらすＣ４３８３Ｔ変化）、そして２種はＩＮタンパク質に存在した（ＩからＭへの置換をもたらすＡ４５７９Ｇ変化；及びＱからＬへの置換をもたらすＡ５００７Ｔ変化）。７個のオリゴヌクレオチドを、非コード領域における２種の変化、及びアミノ酸置換を導びくコード領域における６種の変化をもたらすよう企画した。
【００９３】
オリゴヌクレオチドは次の通りである（ミスマッチは下線が引かれている）：Ａ６０２Ｇ及びＡ６１２Ｇエラーを修復するよう企画されたオリゴｐＦ−１：５′GATTCGTCGGGGGACAGCCAACA AGGTAGGAG A GATTCTACAGCAACATGGGG−３′（配列番号１８）；
Ａ２８９０Ｇエラーを固定するよう企画されたオリゴｐＦ−２：５′−TCAATATATGGATGATATC TATATAGGATCAAATTTAAGTAA −３′（配列番号１９）；
Ｇ３４６１Ａエラーを修復するよう企画されたオリゴｐＦ−３：５′− GTGATATAGCTCTAAGGGCATGTTACAAAATAAGAG AAGAATCCATTATAAGAATAGG−３′（配列番号２０）；
【００９４】
Ｇ３７３７Ａエラーを修復するよう企画されたオリゴｐＦ−４：５′−CGGGCAGATGGCAGGTAATGG AAATAGAAGGAAGTAATCAAAAAGC −３′（配列番号２１）；
Ｃ４３８３Ｔエラーを修復するよう企画されたオリゴｐＦ−５：５′− AGAAAGGGATTTGGGTCAAC TGGAGTCTTTTCTTCATGGGTGGA−３′（配列番号２２）；
Ａ４５７９Ｇエラーを修復するよう企画されたオリゴｐＦ−６：５′− GGGGGACAATTAAAGATTGGACCTGGCATA TGGCAAATGGACTGTACACAC −３′（配列番号２３）；及び
Ａ５００７Ｔエラーを修復するよう企画されたｐＦ−７：５′−GGCTCCTTATGAATTATACATACAACA GGAATCATTAAGAATACAAGAC−３′（配列番号２４）。
【００９５】
ゲノムの３′側半分において配列変化をもたらすために、３′側半分クローン“pFIV３′-2A-１+ ”を、ＳＤＳの実施における鋳型として使用した。pFIV３′-2A-１+ クローンに、コンセンサス配列に比較して、９種の変化が存在した。コード領域における２種のヌクレオチド変化はサンレントであった。他の７種の変化はすべてアミノ酸置換をもたらした：１つはＶｉｆタンパク質に存在し（Ｔ５５０８Ｃ、ＨからＹ）；１つはＯＲＦ（２）領域に存在し（Ａ６０４１Ｔ、ＤからＥ）；３種はＳＵタンパク質に存在し（Ａ６９２２Ｇ、ＶからＩ；Ｇ７００７Ｔ、ＴからＲ；及びＡ７８１４Ｇ、ＳからＮ）；１つはＴＭ領域に存在し（Ａ８４０５Ｔ，ＩからＮ）；そして１つはＲｅｖ領域に存在した（Ａ８９７６Ｇ、ＥからＫ）、７種の突然変異誘発オリゴヌクレオチドが、それらの７種のアミノ酸置換を修復するために企画された：
【００９６】
Ｔ５５０８Ｃエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-８：５′−CAAAATAGTTTAAGATTGT ATGTTTATATAAGCAAT −３′（配列番号２５）；
Ａ６０４１Ｔエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-９：５′−CAGAAAAGTTAGATAGAGA AGCAGCTATTAGATTGTTTAT −３′（配列番号２６）；
Ａ６９２２Ｇエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-10：５′− TAAAAGCAAATGTTAATA TAAGTATACAAGAAGGACCTAC−３′（配列番号２７）；
Ｇ７００７Ｔエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-11：５′−AAAAGCTACAAGGCAATGCAG AAGGGGAAGGATATGGAAG −３′（配列番号２８）；
Ａ７８１４Ｇエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-12：５′− AGAGGACCTTATTGTACAATTTAA TATGACAAAAGCAGTGGAAA−３′（配列番号２９）；
Ａ８４０５Ｔエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-13：５′−CCCTCAATCTGTGGACAATGTATAA CATGACTATAAATCA −３′（配列番号３０）；
Ａ８９７６Ｇエラーを修復するよう企画されたオリゴ pF-14：５′− GACAACGCAGAAGAAGAA AGAAGAAGGCCTTCAAAAAATT−３′（配列番号３１）。
【００９７】
両クローン pFIV ５′−Ｄ−11及び pFIV ３′−2A−１+ のための一本鎖ＤＮＡ鋳型調製物を、製造業者（Promega, Madison, WI）により提供されるプロトコールに実質的に従って製造した。手短に言及すれば、前記２種のクローンのＤＮＡプラスミドを、Ｅ．コリ株ＣＪ２３６中にトランスフェクトした。一本鎖（ＳＳ）ＤＮＡをヘルパーファージＲ４０８を用いて解放し、そしてフェノール／クロロホルム抽出により精製した。精製されたＳＳ  ＤＮＡをＴＥ緩衝液に溶解し、そしてその濃度を、１％アガロースゲル上で鋳型調製物のサンプル２μｌを走行することによって推定した。オリゴヌクレオチドを、製造業者（Gibco BRL, Gaithersburg, MD ）により提供されるプロトコールに従って、リン酸化した。
【００９８】
オリゴヌクレオチドを、合計３０μｌの反応体積において、鋳型にアニーリングした。これは、０．２ｐモルの一本鎖ＤＮＡ鋳型（pFIV５′−Ｄ−11又は pFIV ３′−２−Ａ−１+ ）、４ｐモルの個々のオリゴヌクレオチド（すなわち、 pFIV ５′−Ｄ−11鋳型のために pF-１〜 pF-７、及び pFIV ３′−２−Ａ−１+ 鋳型のためにpF−８〜pF−14）、３μｌのアニーリング緩衝液（０．２Ｍのトリス−ＨＣｌ、pH７．４、２０mMのＭｇＣｌ2 、及び０．５ＭのＮａＣｌ）を含んだ。その混合物を８５℃で５分間インキュベートし、そして次に、約１℃／分の速度で、室温に徐々に冷却した。
【００９９】
相補的ＤＮＡ鎖を合成するために、次の成分をアニーリング混合物に添加した：３μｌの合成緩衝液（４mMの個々のｄＮＴＰ、７．５mMのＡＴＰ、１７５mMのトリス−ＨＣｌ、pH７．４、３７．５mMのＭｇＣｌ2 、２１５mMのＤＴＴ）、３μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（３Ｕ／μｌ）、及び３μｌの希釈されたＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（０．５Ｕ／μｌ）。反応物を３７℃で３時間インキュベートし、続いて、６８℃で１０分間、加熱不活性化した。２μｌのＳＤＭ反応混合物を用いて、Ｅ．コリＤＨα−５コンピテント細胞をトランスフェクトした。
【０１００】
５′側半分クローンpFIV５′−Ｄ−11に関しては、突然変異誘発オリゴヌクレオチドの１つのＰＦ−５の組込みは、ＨｉｎｃII部位の付加をもたらした。ＨｉｎｃIIによる予備スクリーニングは、pFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−４、pFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−22、pFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−28及びpFIV５′−11／Ｍ−52として命名された４種の陽性変異体の同定をもたらした。それらの４種の変異体を完全に配列決定し、他の７種の所望する突然変異の組込みを確かめた。配列決定結果は、４種のクローンのうち３種のクローンがすべての８種の突然変異を含んだことを示した。１つのクローンpFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−28は、突然変異誘発された７種の位置のみを有した。
【０１０１】
クローンpFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52を、５′側半分クローンとして選択し、それを用いて、十分な長さの FIV-141クローンを構成した。３′側半分クローンpFIV３′−２−Ａ−１+ に関しては、ＢｓｐＨＩ消化による予備スクリーニングは、ＢｓｐＨＩ制限部位が突然変異誘発オリゴヌクレオチドｐＦ１３の組込みのために排除されている１０種の変異体を同定した。完全な配列決定は、１０種のクローンのうち８種がすべての７種の所望する位置を含むことを示した。変異体の１つ、すなわち“pFIV３′−２−Ａ−１+ ／Ｍ−21”は、８種の変化のすべてを含み、そして十分な長さの FIV-141クローンを構成する場合の３′側半分クローンとして使用するために選択された。
【０１０２】
十分な長さの FIV-141クローンの構成
十分な長さの FIV-141クローンを構成するために、５′側半分クローン、pFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52に由来する５．５kbのＭｌｕＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、同じ２種の制限酵素により消化された３′側半分クローンpFIV３′−２−Ａ−１+ ／Ｍ−21に連結した。十分な長さの連結生成物を、５′側半分クローンに向けられた前方プライマー、及び３′側半分クローンに向けられた逆方向プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。
【０１０３】
前方プライマーpr９は、配列：５′−（5147）−TTAAAGGATGAAGAGAAGGGATATTTTCTT−（5176）−３′（配列番号１０）を有した。逆方向プライマーpr10は、配列：５′−（5631）−TTTCAATATCATCCCACATAAATCCTGT−（5604）３′（配列番号９）を有した。陽性クローンを、制限消化及び配列決定により確かめた。十分な長さのクローンの１つを、“pFIV−141B−１”と命名し、そしてインビトロ及びインビボの両者での特徴化のために選択した。
【０１０４】
例２：十分な長さの分子クローンが感染性であることの証明
トランスフェクション
クランダルネコ腎臓（CRFK）細胞を、４０〜６０％の集密性まで、６ウェルプレートにおいて増殖せしめた。トランスフェクションを、Trans IT Polyamina Transfection Reagents (Mirns, Madison, WI）により推薦される基本的プロトコールに従って、２μｇのプラスミドＤＮＡを導入することによって達成した。手短に言及すれば、１０μｌのTrans IT Lt-１（Panvera ）を、１mlのRPMI 1840 培地と共に混合し、そして室温で１５分間インキュベートした。
【０１０５】
２μｇのプラスミドＤＮＡを、前記RPMI／Lt-1溶液に添加し、そして室温でさらに１５分間インキュベートした。培地をウェルから除去し、細胞をＰＢＳにより１度洗浄し、そしてＤＮＡカクテルを細胞単層に添加した。ＣＯ2 インキュベーターにおいて３７℃で４時間インキュベーションの後、ＤＮＡカクテルをウェルから除き、そして３％ウシ血清（ＦＳ）により補充されたＲＰＭＩ１６５０培地２mlを個々のウェルに添加した。２４時間のトランスフェクションの後、細胞上清液を、ＦＩＶ生成、逆転写酵素（ＲＴ）活性及びウィルス感染性についてアッセイした。
【０１０６】
トランスフェクトされたCRFK細胞からの FIV生成
トランスフェクトされたCRFK細胞からの上清液を、トランスフェクションの後、毎日収穫し、そして製造業者により推薦されるプロトコールに従って、FIV Antigen Fest Kit (IDEXX, Portland, ME ）を用いて、FIV カプシド生成についてアッセイした。この酵素イムノアッセイは、 FIV p26カプシドタンパク質の優性グループ関連抗原を検出するよう企画された。 FIV抗原 p26を、２４時間の後−トランスフェクション（PT）で検出し、７２時間のＰＴでピークに達し、そして次に、１１日のＰＴでバックグラウンドレベルに低下した（図１を参照のこと）。
【０１０７】
トランスフェクトされた（CRFK）細胞からのウィルス生成を確かめるために、逆転写酵素（RT）活性アッセイ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN ）を実施し、トランスフェクトされた細胞上清液におけるビリオン−関連ＲＴ活性を検出した。手短に言及すれば、２００μｌの細胞上清液を収穫し、そして微小管において５分間、回転せしめ、細胞及び細胞残骸をペレット化した。上清液を４℃で２０分間、２０，０００ｇで、スウィングバケットローターにおいて遠心分離し、 FIVウィルス粒子をペレット化した。ウィルス粒子ペレットを、キットからの４０μｌの溶解緩衝液に再懸濁し、そして次に、アッセイを製造業者により推薦されるように実施した。トランスフェクトされた細胞からのウィルス生成を、４８時間の後−トランスフェクション（PT）での細胞上清液において示した。
【０１０８】
ＣＲＦＫ細胞の感染
FIV-141野生型ウィルスは、CRFK細胞に感染しない。分子クローンウィルスが類似する挙動を示すかどうかを決定するために、CRFK細胞を６ウェルプレートにおいて増殖せしめ、そしてトランスフェクトされたCRFK細胞からのｐ２６＋ならし培地２００μｌにより接種した。３７℃で２時間のインキュベーションの後、細胞をＰＢＳにより１度洗浄し、そして３％ＦＳにより補充された RPMI 1640培地２mlを個々のウェルに添加した。次に、上清液を、３〜４日の後−トランスフェクションごとに、 FIV p26 ELISAによりウィルス生成についてモニターした。野生型ウィルスと同様に、 FIV-141クローンはCRFK細胞を感染しないことが見出された。
【０１０９】
トランスフェクトされたCRFK細胞による同時培養によるFeP2細胞の感染
CRFK細胞を６ウェルプレートにおいて増殖せしめ、そして上記のようにしてトランスフェクトせしめた。４８時間の後−トランスフェクションで、２×１０6 個のＦｅＰ２細胞を、個々のｐ２６＋トランスフェクトされたウェルに添加した。７２時間の細胞の同時培養の後、FeP2細胞（非付着性）をCRFK細胞（付着性）から分離した。FeP2細胞からの上清液を収穫し、そして３〜４日ごとに、FIV p26 ELISA によりウィルス生成についてモニターした。４日間の同時培養の後、高レベルのウィルス生成がＦｅＰ２細胞上清液に示された（図２を参照のこと）。
【０１１０】
ウィルス力価は、６日の後−トランスフェクションでプラトーに達し、これは、 FIV-141分子クローンウィルスがＦｅＰ２細胞において感染性であることを示唆する。この結果はまた、ＣＲＦＫ細胞の感染がウィルス感染の初期段階で、すなわち細胞中へのウィルスの侵入時点で阻止されることを示唆した。
全体的に、ＣＲＦＫ細胞中へのトランスフェクションに基づいて、 FIV-141分子クローンが細胞中で複製することができ、そしてその細胞から放されるウィルス粒子がＦｅＰ２  Ｔリンパ球に対して感染性であることが結論づけられた。
【０１１１】
吸着によるＦｅＰ２細胞の感染
FeP2細胞（２×１０6 個）を、トランスフェクトされたＣＲＦＫ細胞から得られたＰ２６＋ならし培地２００μｌに懸濁し、そして３７℃で２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳにより洗浄し、熱不活性化された１０％ＦＣＳにより補充されたOpti-MEM培地２mlに懸濁し、そして３７℃でインキュベートした。上清液を収穫し、そして３〜４日ごとに、FIV p26 ELISA によりウィルス生成についてモニターした。
【０１１２】
４日間の後−感染で、感染されたＦｅＰ２細胞からのウィルス開放が、上清液において検出され、そして感染後３週までにピークに達した（図３）。その結果は、FIV-141 によるFeP2細胞の生産的感染が、トランスフェクトされたCRFK細胞による吸着又は同時培養のいづれかを通して達成され得ることを示す。同時培養による感染に比較して、ウィルス感染は、感染が吸着により起こる場合よりも、より一層遅くプラトーに達した（図２及び３）。
【０１１３】
例３：変異体 FIV-141クローン及びワクチンへのそれらの使用
FIV-141ワクチン候補体を開発するために、感染性 FIV-141野生型クローンを用いて、多くの遺伝子−欠失されたクローンを構成した。変異体クローンを製造するための一般的な基準は、次の通りである：
１． FIV-141ゲノム中に導入される欠失又は突然変異は、ウィルス感染性が、クローンがインビトロで培養された細胞中にトランスフェクトされ、又はインビボでネコに投与された後、実質的に低められる（弱毒化される）よう十分に厳密であるべきであり；
【０１１４】
２． FIV-141ゲノム中に導入される欠失又は突然変異は、ウィルスゲノムの複製能力、又は高レベルでウィルスタンパク質を発現する能力を破壊すべきでない。
考慮されるべき他の要因は、遺伝子欠失されたゲノムが宿主染色体中に組込むかどうか、欠損性ウィルス粒子が形成するかどうか、及び発現されるであろうウィルス構造タンパク質のレベルである。それらの考慮に基づいて、多くの遺伝子及び要素が欠失のために標的化された。ウィルスゲノムの複製が保持されたので、 FIV-141のＲＴ遺伝子もＰＲ遺伝子も突然変異誘発されなかった。
【０１１５】
Ａ．Gag 領域における欠失
Gagポリタンパク質は、次の３種のビリオン構造タンパク質を含む：MA，CA及びNC。それらのタンパク質の個々に欠失を有する３種の遺伝子−欠失クローンが構成された。
MA del突然変異
特定部位の突然変異誘発を、鋳型として５′側半分クローンpFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52、及び突然変異誘発プライマー：Mpma-1（５′−AGTAAAGAAATTGACATGGCGATTACTAGTTTAAAAGTTTTTGCAGTGGC−３′、配列番号３２）；及びMpma-2（５′− CCATCTATAAAAGAAAGTGGGACTAGTGAAGAAGGACCTCCACAGGC−３′、配列番号３３）を用いて、ＭＡタンパク質のＣ−末端部分に２つのＳｐｅＩ制限部位を創造するために実施した。
【０１１６】
プライマーにより導入されたＳｐｅＩ部位は、配列において下線が引かれている。ＳＤＭを、５′及び３′側半分クローンにおける推定上のエラーを修復するために、前記で論ぜられたようにして実施した。変異体をＳｐｅＩ制限消化によりスクリーンし、そして陽性クローンを用いて、欠失クローンを構成した。ＳｐｅＩ消化を行ない、ＳｐｅＩフラグメントを開放し、そしてクローンの残る部分を自己連結し、欠失クローンを創造した。それらを、欠失された領域を端に有するプライマー組を用いて、ＰＣＲ増幅によりスクリーンし、そして確認をヌクレオチド配列決定により得た。欠失を有する５′側半分クローンを、３′側半分クローンpFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21に連結し、欠失を有する十分な長さのクローンを生成した。このクローンを FIV-141欠失クローンと命名し、そしてＭＡのＣ−末端で残基８５〜１２５の４１個のアミノ酸に対応する、ヌクレオチド８７９〜ヌクレオチド１００１の１２３個の塩基の欠失を含んだ。
【０１１７】
ＣＡ  ｄｅｌ突然変異
ＳＤＭを、鋳型として５′側半分クローンpFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52、及びプライマーとして、Mpca-1（５′− ATTCAAACAGTAAATGGAGCAACTAGTTATGTAGCCCTTGATCCAAAAATG−３′、配列番号３４）及びMpca-2（５′− ACAGCCTTTTCAGCTAATTTAACTAGTACTGATATGGCTACATTAATTATG−３′、配列番号３５）を用いて、 FIV-141のＣＡ領域に２つのＳｐｅＩ部位を創造するために実施した。ＳｐｅＩ制限フラグメントの欠失の後、５′側半分クローンをpFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21に連結し、遺伝子欠失された十分な長さのクローンを生成した。このクローンは、ＣＡタンパク質のＮ−末端での位置９〜４６の３８個のアミノ酸に対応する、ヌクレオチド１０５６〜１１６９の１１４個の塩基対の欠失を有する。
【０１１８】
ＮＣ  ｄｅｌ突然変異
５′側半分クローンは、それぞれ、ヌクレオチド１６３５及び１８７６でユニークＳｃａＩ及びＳｍａＩ部位を有する。クローンをＳｃａＩ及びＳｍａＩにより消化し、２４２個の塩基対フラグメントを開放した。５′側半分クローンの残る部分を自己−連結し、そして次に、３′側半分クローンに連結し、遺伝子欠失された十分な長さのクローンを生成した。欠失は、CA領域における６３個の塩基（２１個のアミノ酸残基）、CAとNCタンパク質との間の２７個の塩基（９個のアミノ酸残基）、及びNCタンパク質のＮ−末端部分での１５２個の塩基（５１個のアミノ酸残基）から成る。欠失はまた、−１オープンリーディングフレームシフトを引き起こし、そして従って、NCタンパク質のＣ−末端部分はこのクローンにより発現され得ない。
【０１１９】
Ｂ．ENV 領域における欠失
ENV前駆体糖タンパク質を、次の２種の成熟タンパク質中にプロセッシングした：ＳＵ及びＴＭ。６種の欠失クローンを、ＥＮＶ領域において構成した。
ENV del 突然変異
SDM を、鋳型として３′側半分クローンpFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21及び突然変異誘発プライマーとして、 Mpenv-1（５′− ACTATAGTCTATTTACTAACTGGTTACC TGAGATATTTAATAAGCCATAG−３′、配列番号３６）及び Mpenv-2（５′− TACTTATATGCTTGCCTACATTGGGTTACC GTATAAGAAACTGTACTAATAAAA−３′、配列番号３７）を用いて、ＥＮＶ領域において２つのＢｓｔＥII部位を創造するために実施した。
【０１２０】
プライマーにおけるＢｓｔＥII部位は下線が引かれている。ＢｓｔＥIIフラグメントの欠失の後、自己−連結されたクローンを、pFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52に連結した。その得られるクローンは、ＥＮＶタンパク質（残基１０６〜８０６）の中間の７０１個のアミノ酸に対応する、ヌクレオチド６５７７〜８６７９の２１０３個の塩基の欠失を有する。Ｎ−末端の１０５個の残基、Ｒｅｖタンパク質の第１エキソンをオーバーラップする主要部分、及びＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）とオーバーラップするＣ−末端の４５個の残基が、欠失クローンに維持された。
【０１２１】
SU del突然変異
２つのＳｐｅＩ部位を、鋳型として、クローンpFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21、及び突然変異誘発プライマーとして、Mpsu-1（５′−GAGGTATAAAGGTAAACAAAAAACTAGTGCCATTCATATTATGTTAGCCCTTGC−３′、配列番号３８）及びMpsu-2（５′− ACTAACTATAGTCTATTTACTAACAACTAGTTTGAGATATTTAATAAGCCATAGAAAC −３′、配列番号３９）を用いて、ＳＤＭによりＦＩＶ−１４１のＳＵ領域に生成した。ＳｐｅＩフラグメントをＳｐｅＩ消化により欠失し、続いて大きな残るフラグメントを自己連結した。得られるクローンを、pFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52に連結した。このクローンは、SUタンパク質の５０３個のアミノ酸（残基１０６〜８０８）の欠失に対応する、ヌクレオチド６５７７〜８０８５の１５０９個の塩基の欠失を有する。
【０１２２】
V3／4 del 突然変異
ＳＤＭを、ＳＵタンパク質のＶ３及びＶ４領域を端に有する２種のＳｐｈＩ部位を創造するために実施した。クローンpFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21を、鋳型として、及び次の突然変異誘発プライマーを用いた： Mpenv-5（５′− ATACCGAAATGTGGATGGTGGAATCAGGCATGCTATTATAATAATTGTAAATGGGAAGAAGC −３′、配列番号４０）及び Mpenv-6（５′−GCACTATGTACAATTGTTCCTTACAGGCATGCTTCACTATGAAAATAGAGGACCTTAT−３′、配列番号４１）。ＳｐｈＩ部位は下線が引かれている。ＳｐｈＩフラグメントを除去するために消化した後、クローンを自己−連結し、そして次に、pFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52に連結した。クローンは、Ｖ３及びＶ４領域を包含する、SUタンパク質の１４４個のアミノ酸（残基３０６〜５０３）の欠失に対応する、位置７３３９〜７７７０の４３２個の塩基の欠失を含む。
【０１２３】
V7／8 del 突然変異
ＳＤＭを用いて、TMタンパク質のV7及びV8領域を端に有する２種のＳｐｈＩ部位を創造した。これは、鋳型としてpFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21、及び突然変異誘発プライマー Mpenv-7（５′−GAATCAATTCTTTTGTAAGATCGCATGCAATCTGTGGACAATGTATAACATGACTA−３′、配列番号４２）及び Mpenv-8（５′−GGGAAAATTGGGTGGGATGGATAGGTAAGATCGCATGCTATTTAAAAGGACTTCTTGGTAG −３′、配列番号４３）を用いて達成された。
【０１２４】
ＳｐｈＩ部位は下線が引かれている。ＳｐｈＩによる消化は、ヌクレオチド８３８０〜８５９５からの２１６個の塩基の欠失をもたらし、そして続いて、大きなフラグメントに連結した。次に、その得られるクローンを、５′側半分クローンpFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52に連結し、“V7／8 del ”を生成した。これは、V7及びV8の種々の領域を包含する、TMタンパク質の７２個のアミノ酸（残基９８〜１６９）の欠失を含む。
【０１２５】
TMf del 突然変異
FIV-141の３′側半分クローンは、ヌクレオチド８１４５でユニークＡｇｅＩ部位を有する。ＳＤＭを、位置８０７１で第２のＡｇｅＩ部位を創造するために実施した。その３′側半分クローンを鋳型として、及び突然変異誘発プライマーとして Mpenv-3（５′−GGAAGAAGTTATGAGGTATACCGGTAAACAAAAAAGGGCC−３′、配列番号４４）を使用した。２つのＡｇｅＩ部位間の７５−塩基のフラグメントを、制限酵素消化により欠失し、続いて大きな制限フラグメントを自己−連結せしめた。得られるクローンを、５′側半分クローンに連結し、“TMf del ”を生成した。
【０１２６】
これは、SUとTMタンパク質との間の切断連結部に２５個のアミノ酸の欠失を含む。欠失されたアミノ酸は、ＳＵタンパク質の６個のＣ−末端残基（このうち４個は、塩基性であり（Ｋ又はＲのいづれか）、そしてＳＵ／ＴＭ切断部位のプロセッシングのために必要とされる）、及びＴＭタンパク質の融合ペプチドの１９個のＮ−末端残基（ビリオンエンベロップと細胞膜との間の膜融合のために必要とされる）を含む。
【０１２７】
ＣＴ  ｄｅｌ突然変異
ＳＤＭを、鋳型として３′側半分クローンpFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21、及び突然変異誘発プライマーとして Mpenv-4（５′−CTACTTATATGCTTGCCTACATTGGTCGACTGATAGTGAAACTGTACTAATAAAATATTGGG−３′、配列番号４５）を用いて、ＴＭタンパク質の細胞質末端を切断するために実施した。ＳａｌＩ制限部位（下線が引かれている）を、変異体のスクリーニングを促進するために、サイレント突然変異によりオリゴヌクレオチド中に組込んだ。
【０１２８】
３個のタンデム反復翻訳停止コドン（イタリック形）を、TMタンパク質のトランスメンブラン  ドメインの後のプライマーの右側に組込んだ。その得られるクローンを５′側半分クローンに連結し、“CT del”を生成した。これは、ヌクレオチド８６８６〜８８２３からの１３８−塩基切断（TMタンパク質の細胞質ドメインからの４６個のアミノ酸の切断に対応する）を有する。
【０１２９】
Ｃ．Ｐｏｌ領域における欠失
Ｐｏｌポリタンパク質は、次の４種の酵素タンパク質から成る：ＰＲ，ＲＴ，ＤＵ及びＩＮ。２種の欠失クローンを、Ｐｏｌ領域において構成した。
【０１３０】
ＤＵ  ｄｅｌ突然変異
鋳型として５′側半分クローンpFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52、及び突然変異誘発プライマーとして、Mpdu-1（５′−GATGGTTATAGAAGGTGAAGGAATTACTAGTAAAAGATCAGAAGATGCAGGATATG−３′、配列番号４６）及び Mpdu-2 （５′−GAAATAATAATGGATTCAGAAAGAGGAACTAGTGGATTTGGGTCAACTGGAGTCTTTTC −３′、配列番号４７）を用いて、DU領域に２つのＳｐｅＩ部位を創造するために、ＳＤＭを実施した。プライマーにおけるＳｐｅＩ部位は下線が引かれている。ヌクレオチド４０１９〜４３６３からの３４５個の塩基の欠失を、ＳｐｅＩ消化により達成し、続いて、大きな制限フラグメントの自己連結を行なった。その得られるクローンを、クローンpFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21に連結し、“ＤＵ  ｄｅｌ”を生成した。そのクローンは、完全なＤＵタンパク質のほとんどに対応する１１５個のアミノ酸の欠失を含む。
【０１３１】
ＩＮ  ｄｅｌ突然変異
鋳型として、pFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52、及び突然変異誘発プライマーとして、Mpin-1（５′−CTTCATGGGTGGACAGAATTGAAACTAGTGTATTAAATCATGAAAAATTTCACTCAG −３′、配列番号４８）及びMpin-2（５′−GCAATGGGTGTATTATAAAGATCAGACTAGTAAAAAGTGGAAGGGACCAATGAGAGTAG −３′、配列番号４９）を用いて、２つのＳｐｅＩ部位を、FIV-141 のIN領域に、ＳＤＭにより創造した。プライマー中のＳｐｅＩ部位は下線が引かれている。ＳｐｅＩフラグメントの欠失及び自己連結の後、その得られるクローンを、pFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21に連結し、“IN del”を生成した。これは、完全なＩＮタンパク質のほとんどに対応するヌクレオチド４４１８〜５０３６の６６９個の塩基（ＩＮの残基９〜２３１の２２３個のアミノ酸）の欠失を含む。
【０１３２】
Ｄ．調節遺伝子又は要素における欠失
FIV において固定された３種の調節タンパク質は、 Rev，Vif 及び ORF２である。 Rev−応答要素は、 FIVゲノムの３′末端で報告されている。５個の欠失クローンを、それらの領域において構成した。
【０１３３】
Vifn del突然変異
ユニークＭｌｕＩ部位を、５′側半分クローンpFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52におけるＶｉｆ遺伝子の中央に導入した。鋳型としてpFIV３′−Ｄ−11／Ｍ−52、及び突然変異誘発プライマーとして、 Mpvif-1（５′−AGAAGACTCTTTGCAGTTCTCCAATGAACGCGTTAGAGTGCCATGTTATACATATCG −３′、配列番号５０）を用いて、Ｖｉｆ遺伝子のＮ−末端で第２のＭｌｕＩ部位を創造するために、ＳＤＭを実施した。プライマー中のＭｌｕＩ部位は下線が引かれている。ヌクレオチド５２８６〜５４３５の１５０個の塩基の制限フラグメントを、ＭｌｕＩ消化により欠失し、続いて、大きなフラグメントに自己連結した。得られる欠失クローンをpFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21に連結し、“Ｖｉｆｎ  ｄｅｌ”を生成した。これは、 Vifタンパク質のＮ−末端部分で５０個のアミノ酸（残基１９〜６８）の欠失を含む。
【０１３４】
Vifc del突然変異
３′側半分クローンpFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21は、Ｖｉｆ領域内にユニークＭｌｕＩ部位を有する。鋳型としてpFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21、及び突然変異誘発プライマーとして、 Mpvif-2（５′−CGTGTGGCAAAGAGGCTAAAACGCGTAGAGGCTGTTGTAATCAG−３′、配列番号５１）を用いて、Ｖｉｆタンパク質のＣ−末端で、第２のＭｌｕＩ部位をＳＤＭにより創造した。プライマー中のＭｌｕＩ部位は下線が引かれている。ＭｌｕＩフラグメントの欠失の後、その得られるクローンを５′側半分クローンpFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52に連結し、“Vifc del”を生成した。これは、 Vifタンパク質のＣ−末端部分で、１４６個のアミノ酸（残基６９〜２１４）の欠失に対応する、ヌクレオチド５４３６〜５８７３の４３８個の塩基の欠失を含む。
【０１３５】
Vif del 突然変異
“Vif del ”を構成するために、Vifc delのＸｈｏＩ／ＭｌｕＩ制限フラグメントを、Vifn delの５．３kbのＸｈｏＩ／ＭｌｕＩフラグメントにより置換した。その得られるクローンは、完全な Vifタンパク質のほとんどである１９６個のアミノ酸（残基１９〜２１４）の欠失に対応する、ヌクレオチド５２８６〜５８７３の５８８個の塩基の欠失を含む。
【０１３６】
ORF(2) del突然変異
２つのMluI部位を、ヌクレオチド５９８８及び６２２４（ORF(2)のＮ−及びＣ−末端で）で、ＳＤＭにより創造した。これは、鋳型として、pFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21、及び突然変異誘発プライマーとして、 Mporf-1（５′−GTGGACGGGAGAATTATGAACGCGTGAACTAATCCCACTGTTTAATAAGGTTACAG−３′、配列番号５２）、及び Mporf-2（５′−CTACATTATCCATAAATACTGCCTAGACGCGTTTCTTTTAATATTTCATCTGCAG −３′、配列番号５３）を用いて達成された。プライマー中のＭｌｕＩ部位は、下線が引かれている。
【０１３７】
ＳＤＭにより創造される２つのＭｌｕＩ部位の他に、クローンにおけるヌクレオチド５４３６でＭｌｕＩ部位が存在する。“ORF(2)  del ”を構成するために、５′側半分クローンpFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52からの５．４kbのＭｌｕＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、３′側半分クローンpFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21の大きなＭｌｕＩ／ＸｈｏＩフラグメントに連結した。次に、位置５４３６〜５９８８の５５２個の塩基のＭｌｕＩフラグメントを、その得られるクローンに挿入した。 ORF(2) del は、完全な ORF(2) 遺伝子を包含する、２３７個の塩基の欠失を含む。
【０１３８】
RRE del 突然変異
鋳型として、pFIV３′−2A−１+ ／Ｍ−21、及び突然変異誘発プライマーとして、 Mprre-1（５′−GGCATATCTGAAAAAGAGGAGGAATGAACTAGTATATCAGACCTGTAGAATACA−３′、配列番号５４）及び Mprre-2（５′−GAGGAGGATGTGTCATATGAATCAAATACTAGTCAAAAATAACAGTAAAATCTATATTG −３′、配列番号５５）を用いて、 RRE領域に２つのＳｐｅＩ部位を創造するために、ＳＤＭを実施した。プライマー中のＳｐｅＩ部位は下線が引かれている。ＳｐｅＩフラグメントの欠失を、ＳｐｅＩ消化により達成し、続いて、大きなフラグメントに自己連結した。得られる欠失クローンをpFIV５′−Ｄ−11／Ｍ−52に連結し、“RRE del ”を生成した。これは、ヌクレオチド８８２７〜８９１０の８４個の塩基の欠失を含む。
【０１３９】
例４：FIV-141 遺伝子欠失クローンの特性決定
Ａ．ウィルスタンパク質発現及び／又は欠損ウィルス生成
欠失クローンの個々のプラスミドを、前記のようにして、ＣＲＦＫ細胞中にトランスフェクトした。FIV p26 ELISA アッセイを実施し、トランスフェクトされた細胞上清液におけるウィルスタンパク質発現及び／又はウィルス種子生成を検出した。トランスフェクションの４８時間後で、１３の構造体からのサンプルは、野生型 FIV-141分子クローンに関して観察されるシグナルに相当する強い陽性シグナルを生成することが見出された（図４を参照のこと）。最高レベルのウィルス粒子生成が、ENV del. TMf del, SU del, CT del, V3／4 del 、及びV7／8 del を包含する、 ENV領域における６種の欠失クローンに関して観察された。
【０１４０】
同等レベルのウィルス粒子生成が、Ｖｉｆ領域における３種の欠失クローン（ Vifn del, Vifc del 及び Vif del）、MA del, DU del, IN del、及びORF(2) delを包含する、７種の他の欠失クローンに関して観察された。この結果は、それらの１３のクローンにより担持される欠失がトランスフェクトされた細胞からのウィルス粒子の形成及び開放を妨げないことを示す。比較的弱い陽性シグナルがNC delに関して検出され、これは、この領域における欠失がウィルス粒子アセンブリー又は開放に影響を及ぼすことを示す。
【０１４１】
ウィルス粒子生成は、CA del又は RRE delによりトランスフェクトされた細胞の上清液に検出されなかった。CAタンパク質のＣ−末端における欠失は、ウィルス粒子形成を破壊し、又は p26 ELISAキットに使用されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）により認識されるエピトープの損失をもたらすことができる。予測されるように、ＲＲＥ領域における欠失は、核から細胞質へのスプライスされていないウィルスＲＮＡの輸送の阻止をもたらし、ウィルス構造タンパク質の発現の完全な欠失、又はその劇的な低下のいづれかを導びく。
【０１４２】
Ｂ．ウィルスＲＮＡ発現を検出するためへの細胞内ＲＴ−ＰＣＲ
細胞内RT-PCRを実施し、２種の欠失クローン、CA del及び RRE delにおけるウィルスＲＮＡ発現を検出した。個々のクローンについてのプラスミドＤＮＡを、異なった CRFIC細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、全ＲＮＡを、RNeasyキット（Qiagen, Chatsworth, CA）を用いて、トランスフェクトされた細胞から単離した。そのＲＮＡをDEPC水５０μｌに溶出し、そして個々のＲＮＡサンプル２μｌを、 SuperscriptII（Gibco BRL, Gaithersburg, MD)を用いてｃＤＮＡの第１鎖を合成するために使用した。
【０１４３】
ヌクレオチド２９５６〜３５４２の５８５個の塩基対フラグメントを、前方プライマー、Sp-8（５′−TATTATGGTGGGGATTTGAAAC−３′、配列番号５６）及び逆方向プライマー、Ｓｐ−２０（５′−TAATTAGATTTGATTCCCAGGC−３′、配列番号５７）として用いて、増幅した。個々の反応からのｃＤＮＡ２μｌ、及び対照としての個々の調製物からの全ＲＮＡ２μｌを、ＰＣＲ反応における鋳型として使用した。個々の反応を、ＰＣＲ増幅キット(Gipco BRL, Gaithersburg）を用いて、１００μｌの体積において実施した。反応は次の通りに進行した：９４℃で３０秒間；５５℃で３０秒間；及び７２℃でさらに３０秒間、２５サイクル、個々の反応物１０μｌを、１％アガロースゲル上に負荷した。
【０１４４】
予測されるサイズを有する特定のバンドを、ＣＡ  ｄｅｌ及びＲＲＥ  ｄｅｌクローンについて観察し、これは、ウィルスＲＮＡ発現がそれらのクローンによりトランスフェクトされた細胞において生じたことを示す。その結果は、ＣＡ  ｄｅｌに関しての ELISAによるｐ２６タンパク質発現を検出することの失敗は、たぶん、ウィルス粒子形成の失敗又はｐ２６ ELISAアッセイに使用される抗体により認識されるエピトープの欠失のいづれかによることを示唆する。ＲＲＥ欠失クローンに関しては、ウィルス遺伝子発現が細胞内 RT-PCR により示されたが、しかしｐ２６タンパク質発現は ELISAアッセイを用いて検出されなかった。この矛盾は、 ELISAに比較される場合、RT-PCRアッセイのより高い感度を表わすことができる。
【０１４５】
Ｃ．欠陥ウィルス粒子におけるウィルスゲノム及びRT酵素のカプシド封入
FIV-141 欠失クローンの大部分によるCRFK細胞のトランスフェクションは、欠陥ウィルス粒子の生成及び開放をもたらした。遺伝子欠失されたウィルスゲノム及びＲＴタンパク質がウィルス粒子中にカプシド封入されたかどうかを決定するために、ビリオン関連のRT PCR及びRT活性アッセイを実施した。手短に言及すれば、トランスフェクションの４８時間後、個々のトランスフェクトされたCRFK培養物からの上清液２００μｌを収穫し、微小管において５分間、回転せしめ、細胞及び細胞残骸をペレット化した。
【０１４６】
上清液におけるウィルス粒子を、スウィングバケットローターを用いて、４℃で２０分間、２０，０００ｇで、超遠心分離によりペレット化した。カプシド封入について試験するために、ウィルスペレットを、RNeasyキットからの RLT緩衝液３５０μｌに再懸濁し、そしてウィルスＲＮＡを、製造業者により推薦されるようにして、 DEPC ５０μｌへの溶出により精製した。第１鎖ｃＤＮＡを SuperscriptIIを用いて製造し、そしてＰＣＲ増幅を、Sp-8及び Sp-20プライマー組を用いて、前記のようにして実施した。
【０１４７】
１６個の欠失クローンのうち１４個は、RT-PCR増幅の後、特定のバンドを示し、これは、それらのクローンによるCRFK細胞のトランスフェクションが欠陥ウィルス粒子を生成し、そして遺伝子−欠失されたウィルスゲノムがカプシド封入されたことを示す。それらの１４個のクローンは、 ENV領域からの６個のクローン（ENV del, TMf del, CT del，V3／4 del,及びV7／8 del を包含する）； Vif領域からの３個のクローン（Vifn del, Vifc del及び Vif delを包含する）； Pol領域からの２個のクローン（DU del及びIN delを包含する）；調節遺伝子／要素領域からの２個のクローン（ORF(2) del及び RRE del）；及び Gag領域からの１個のクローン（MA del）から構成された。
【０１４８】
CA delがビリオン−関連 RT-PCR アッセイにおいて負のシグナルを示したことは、p26 ELISA データと一致する。NCタンパク質はビリオン中へのウィルスゲノムのパッケージングのために必要とされ、そして予測されるように、ビリオン−関連遺伝子−欠失ウィルスＲＮＡゲノムは NC del に関して、RT-PCRにより検出されなかった。RRE del に関しては、ビリオン−関連遺伝子−欠失ウィルスＲＮＡは、存在するが、しかしウィルス粒子生成はｐ２６ ELISAアッセイを用いて検出されなかったことを示された。それらの結果の柔値は再び、 ELISAよりもRT-PCRアッセイのより高い感度を示すことができる。
【０１４９】
欠陥ウィルス粒子におけるＲＴ（すなわち逆転写酵素）酵素のカプシド封入を試験するために、ウィルスペレットをRT ELISAキットからの溶解緩衝液４０  ｌに再懸濁し、そしてアッセイを、製造業者により推薦されるようにして、進行せしめた。ビリオン−関連ＲＴ活性が次の１４個の欠失クローンに関して検出されたことは、 p26 ELISAアッセイ及びビリオン−関連ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて得られたデータと一致した：ENV del;SU del；TMf del ; V3／4 del ；V7／8  del；CT del；MA del；DU del；IN del；Vifn del；Vifc del； Vif del；ORF(2) del；及びNC del。ビリオン−関連ＲＴ活性は、ＣＡ又はＲＲＥ欠失クローンにおいては検出されなかった。
【０１５０】
Ｄ．インビトロでの FIV-141遺伝子−欠失クローンの感染性
CRFK細胞を６ウェルプレートにおいて増殖せしめ、そして前記のようにしてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、２×１０6 個の細胞を、個々のウェルに添加した。７２時間の細胞の同時培養の後、FeP2細胞をCRFK細胞から分離し、そしてFeP2細胞培養物からの上清液を収穫し、そして３〜４日ごとに、合計４〜６週間、FIV p26 ELISA アッセイを用いて、ウィルス生成についてモニターした。
【０１５１】
１２個の欠失クローンが、モニター期間の間、有意なレベルのｐ２６カプシドタンパク質発現を有さないことが見出された。それらは次のものを包含した： ENV del； TMf del；及びNC del（図５）； Vif領域からの３個の欠失クローン（Vifn del；Vifc del；及び Vif del（図６）；MA及びCA欠失クローン（図７）；V3／4,  V7／8 及びCT欠失クローン（図８）；及び ORF(2) 欠失クローン（図９）。それらの結果は、それらのクローン中に導入される欠失がFeP2細胞におけるウィルスの感染性を完全に破壊することを示す。中位のレベルのウィルス複製が、４種の欠失クローン、たとえばDU del；SU del；IN del；及び RRE delに関して検出された（図１０）。
【０１５２】
Ｅ．結論
ENV del 
ENVタンパク質の中央における７０１個のアミノ酸（残基１０６〜８０６）の欠失を有する ENV欠失クローンは、FeP2細胞を感染する能力を完全に失なった。それにもかかわらず、それは、欠陥ウィルス粒子をアセンブルし、そして開放する能力、ウィルスゲノムをカプシド封入する能力、及びＲＮＡを逆転写する能力を保持した。 ENVタンパク質の一次機能は、感染の初期段階の間、標的細胞中へのウィルス侵入を仲介することである。大部分のＥＮＶタンパク質の欠失は、ウィルス侵入を阻止し、そして従って、ウィルス感染性を阻止する。
【０１５３】
TMf del 
SUタンパク質とTMタンパク質との間の切断連結部に２５個のアミノ酸欠失を含む TMf欠失クローンは、FeP2細胞において非感染性である。この欠失は、 ENV前駆体タンパク質の切断プロセッシングを阻止し、そしてこれは標的細胞に結合し、そしてそれに侵入するウィルス粒子の失敗をもたらすことができる。FIV の ENV糖タンパク質の切断部位の除去が切断されていないＥＮＶ前駆体タンパク質の発現をもたらすことが報告されている。
【０１５４】
しかしながら、発現された組換えタンパク質は、ウェスターンブロット及びラジオイムノ沈殿アッセイを用いて決定される場合、モノクローナル抗体とのその相互作用により明らかなように、その抗原性質を保持する（ Rimmelzwaanなど．、1994，J. Gen. Virol. 75 : 2012-2097)。CRFK細胞中へのトランスフェクションに基づいて、欠失クローンは、野生型 FIV-141クローンに相当するレベルで、欠陥ウィルス粒子を生成する。その欠陥ウィルスゲノム及びＲＴ酵素は欠陥ビリオンにカプシド封入された。
【０１５５】
SU del
SU delは、SUタンパク質の残基１０６〜６０８からの５０３個のアミノ酸の欠失を有した。野生型クローンのウィルス粒子生成レベルにほぼ等しいレベルのウィルス粒子生成を維持することが見出された。遺伝子−欠失されたウィルスゲノム及びRT酵素の両者はカプシド封入された。しかしながら、ENV del と比較すると、SU delによりトランスフェクトされた細胞は、野生型ウィルスよりもかなり低い程度ではあるが、FeP2細胞において感染性であるウィルス粒子を生成した。
【０１５６】
従って、 FIV-141ゲノムからのSUタンパク質の欠失がウィルスを弱毒化すると思われる。ウィルス感染における最初の段階である、細胞受容体への FIV結合は、TMタンパク質に関連する場合、ＳＵタンパク質により仲介されると思われる。変異体ウィルスが標的細胞に結合し、そして侵入する機構は未知である。変異体ウィルスが宿主細胞に侵入するためのもう１つの経路は、欠失クローンに関連する、観察される低い感染性を担当することができる。
【０１５７】
V3／4 del 及びV7／8 del 
SUタンパク質の残基３６０〜５０３からの１４４個のアミノ酸（Ｖ３及びＶ４可変領域を包含する）、及びTMタンパク質の残基９８〜１６９からの７２個のアミノ酸（V7及びV8領域を包含する）を、それぞれV3／4 del 及びV7／8 del において欠失せしめた。CRFK細胞中へのトランスフェクションに基づいて、個々のクローンは、野生型クローンに関して観察されるレベルに類似するレベルで欠陥ウィルスを生成した。
【０１５８】
他の ENV−関連の欠失クローンに関しては、V3／4 del 及びV7／8 del は、それらの遺伝子−欠失されたウィルスゲノム及びＲＴ酵素をビリオン中にカプシド封入した。感染性のアッセイは、SUのV3及びV4領域の欠失、及びTMタンパク質におけるV7及びV8領域の欠失がFeP2細胞におけるウィルス感染性を完全に破壊したことを示した。V3可変領域は、免疫優性ドメインであり、そして複数の機能、たとえばウィルス向性、ウィルス病因及び中和エピトープに包含されることが報告されている。この段階で、ウィルス感染がそれらの２種の欠失クローンにおいて阻止されたことは、現在、明白ではない。
【０１５９】
CT del
FIV のTMタンパク質は比較的長い細胞質末端（４６個の長さのアミノ酸）を有する。CT delクローンにおけるこの末端の切断は、FeP2細胞におけるウィルスの感染性の欠損をもたらした。しかしながら、切断は、ウィルスゲノム及びRTタンパク質のウィルス粒子形成及びカプシド封入に対して効果を有さなかった。ＭＡ及びＴＭ細胞質末端間の特定の機能的相互作用が、FIV 及び HIV-1に関して報告されている。この相互作用は、ビリオン中への ENVタンパク質の組込みのために重要であることが提案されている。CT delにおける細胞質ドメインの切断は、MAタンパク質とTMタンパク質との間の機能的相互作用を排除することができ、それにより、ENV の組込みを阻止する。
【０１６０】
MA del
MA delは、MAタンパク質のＣ−末端で残基８５〜１２５の４１個のアミノ酸欠失を含む。CRFK細胞中へのトランスフェクションに基づいて、クローンは、野生型ＦＩＶ−１４１クローンを用いて生成されるレベルに相当するレベルで欠陥ウィルスを生成した。これは、Ｃ−末端ドメインでの欠失がウィルス粒子アセンブリー及び開放に対して有意な効果を有さないことを示す。遺伝子−欠失されたウィルスゲノム及びRTタンパク質は、欠陥ウィルス粒子にカプシド封入された。それらのウィルス粒子がトランスフェクトされたCRFK細胞から開放される場合、それらはＦｅＰ２細胞に対して非感染性であった。
【０１６１】
CA del
CAタンパク質のＮ−末端での残基９〜４６の３８個のアミノ酸の欠失は、ｐ２６ ELISAアッセイ、ビリオン内RT PCRアッセイ及びRT活性アッセイにおける負のシグナルにより明らかなように、ウィルス粒子形成を破壊した。しかしながら、トランスフェクトされたCRFK細胞からの細胞内RT PCRは、欠失がウィルス RNA発現を阻止しなかったことを示した。従って、トランスフェクトされた細胞の上清液におけるｐ２６タンパク質又は欠陥ウィルス生成を検出することの失敗は、ウィルス粒子アセンブリーにおける阻止のためであって、ウィルスタンパク質発現における阻止のためではない。
【０１６２】
NC del
完全なNCタンパク質は、NC delクローンにおいて欠失された。このクローンによりトランスフェクトされた細胞は、野生型クローンに比較して、有意に低められたレベルで欠陥ウィルスを生成し、これは、欠失がウィルス粒子のアセンブリー又は開放を害したことを示す。HIV-１のNCタンパク質はウィルス−株粒子のアセンブリーのために必要とされないことが報告されている。NCクローンにおける欠失は、欠陥ビリオン中へのRT酵素のパッケージングに影響を及ぼさなかった。予測されるように、ウィルスゲノムは、ウィルス粒子にカプシド封入されなかった。
【０１６３】
Vif del, Vifc del 及び Vifn del 
３種の欠失クローン、すなわち Vifn del, Vifc del 及びVif del を、 Vif遺伝子において構成した。Vifnは、 Vifタンパク質のＮ−末端部分で５０個のアミノ酸の欠失を有した。 Vifc は、そのタンパク質のＣ−末端領域で１４６個のアミノ酸の欠失を有し、そしてVif del はほとんど完全な Vifタンパク質の欠失を有した。すべての３種のクローンは、類似する性質を示した。
【０１６４】
それらの３種のクローンのいづれかによりトランスフェクトされた細胞は、野生型 FIV-141クローンに相当する速度でウィルス粒子を生成した。ウィルスゲノム及びRT酵素の両者は、すべての３種のクローンのためにビリオンにカプシド封入された。前記３種のクローンによりトランスフェクトされたCRFK細胞から開放されるビリオンは、FeP2細胞に対して非感染性であり、このことは、 VifがＴリンパ球におけるウィルス複製のために必要とされることを示す。
【０１６５】
ORF(2) del
ORF(2)の完全なオープンリーディングフレームを、ORF(2)欠失クローンにおいて欠失せしめた。前記クローンによりトランスフェクトされた細胞は、野生型クローンに相当する速度で、ウィルス粒子をアセンブリーし、そして開放した。ウィルスゲノム及びRT酵素の両者はウィルス粒子にパッケージングされるが、クローンはＦｅＰ２細胞において複製することを失敗し、このことは、ORF(2)の遺伝子生成物がそれらの細胞におけるウィルス生成のために必要とされることを示す。
【０１６６】
RRE del 
FIV の RRE配列を含んで成る全１５０個の塩基のうち８４個を、RRE del において欠失せしめた。この欠失は、トランスフェクトされた細胞におけるウィルス構造タンパク質の発現及び生成を害した。トランスフェクトされたＣＲＦＫ細胞の上清液におけるｐ２６生成は検出されなかった。同様に、パッケージされたＲＴ活性は測定されなかった。それらの結果は、 RRE配列が核から細胞の細胞質へのスプライスされていない及び単一スプライスされたウィルスＲＮＡの輸送のために必要とされる提案と良好に一致した。
【０１６７】
しかしながら、ビリオン−関連ウィルスゲノムＲＮＡは、RT PCRにより付与されることが示されており、そして  ウィルス粒子はＦｅＰ２細胞において感染性であるが、但し、野生型 FIV-141クローンに比較して、著しく低められたレベルであった。全体的に考慮すると、それらの結果は、ＲＲＥ配列の欠失がウィルス構造タンパク質の発現を劇的に低めることを示す。しかしながら、欠失は発現を完全には破壊せず、そして微量の感染性ビリオン粒子がトランスフェクトされた細胞により生成されたように見える。
【０１６８】
IN del
ほとんど完全なINタンパク質を、IN delクローンにおいて欠失した。CRFK細胞中へのトランスフェクションに基づいて、クローンは、野生型クローンのレベルに相当するレベルのウィルスタンパク質発現及びウィルス粒子生成を示した。ビリオン−関連RT PCR及びRT活性アッセイは、ウィルスゲノムＲＮＡ及びＲＴ酵素の両者がウィルス粒子中にパッケージされることを示した。
【０１６９】
驚くべきことには、クローンによりトランスフェクトされた細胞から回収されたビリオンは感染性であり、そして野生型ウィルスに比較して低いレベルではあるが、FeP2細胞において複製できた。組込みは、多くのレトロウィルス、たとえば HIV-1の生産性感染のために必要とされる必須段階である。データは、HIV に比較して、FIV のINタンパク質はFeP2細胞におけるウィルスタンパク質発現及びウィルス複製のための必須必要条件ではないことを示唆する。
【０１７０】
DU del
ほとんど完全なDU遺伝子を、DU delクローンにおいて欠失せしめた。この遺伝子の生成物は、ｄＵＴＰをｄＵＭＰに転換する。クローンにおけるDU遺伝子の欠失は、トランスフェクトされたCRFK細胞におけるウィルスタンパク質発現又はウィルス粒子生成に影響を及ぼさなかった。ウィルスゲノム及びＲＴ酵素の両者はカプシド封入され、そしてトランスフェクトされた細胞から生成されるビリオンはFeP2細胞に対して感染性であった。
【０１７１】
しかしながら、欠失クローンは、野生型 FIV-141ウィルスよりも遅い速度で、FeP2において複製した。これは、DU遺伝子がウィルスの最大複製のために必要とされることを示す。このデータは、DU欠失された FIVがＴリンパ球において増殖するその能力を保持する報告と一致する。
【０１７２】
生物学的材料の寄託
次の生物学的材料が、１９９８年７月１日、12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA のAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄託され、そして次の受託番号を割り当てられた：
ATCC受託番号
ウィルス株     FIV-141                VR-2619 
プラスミド     pFIV-141-B1            203001
上記に引用されるすべての特許、特許出願及び出版物は、引用により本明細書に組込まれる。
本発明は、本発明の個々の観点の単一の例示として意図される、記載される特定の態様により、発明の範囲において制限されるものではない。機能的に同等の組成物及び方法は、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】これは、トランスフェクトされた細胞からのＦＩＶ生成を示す。
【図２】これは、同時培養によるFeP2 T−リンパ球の感染を示す。
【図３】これは、吸着によるFeP2細胞の感染を示す。
【図４】これは、欠失クローンによる FIV-141ウィルスタンパク質の発現を示す。
【図５】これは、 FIV-141変異体（TMf del, ENV del及びNC del）による FeP2 Ｔリンパ球の感染を示す。
【図６】これは、 FIV-141変異体（Vifn del, Vifc del、及び Vif del）による FeP2 Ｔリンパ球の感染を示す。
【図７】これは、 FIV-141変異体（MA del及びCA del）による FeP2 Ｔリンパ球の感染を示す。
【図８】これは、 FIV-141変異体（V3／4 del,  V7／8 del 及びCT del）による FeP2 Ｔリンパ球の感染を示す。
【図９】これは、 FIV-141変異体（ORF(2) del）による FeP2 Ｔリン球の感染を示す。
【図１０】これは、 FIV-141変異体（DU del, SU del, IN del及び RRE del）による FeP2 Ｔリンパ球の感染を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月5日(2004.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンとして使用するための弱毒化FIV-141ウイルスであって、当該ウイルスは、宿主に入った後複製するが、野生型FIV-141ウイルスと比較した場合、ネコＴ−リンパ球への有意に低下した感染性を示し、そして当該弱毒化ウイルスはENV遺伝子の欠失変異により生成される、ことを特徴とする弱毒化FIV-141ウイルス。
【請求項２】
請求項１に記載の弱毒化ウイルスが感染した宿主細胞。
【請求項３】
請求項１に記載のウイルス及び医薬として許容されるキャリヤーを含んで成る、弱毒化全ウイルスワクチン。
【請求項４】
ワクチンとして使用するための精製されたFIV-141核酸分子であって、当該核酸分子は、配列番号：１の配列を含んで成るヌクレオチド配列を有するが、当該核酸分子のENV遺伝子が欠失により変異しており、これにより、当該変異した核酸分子が宿主細胞に導入された場合、当該宿主細胞は、野生型FIV-141ウイルス感染に対抗してより高い効力を示す弱毒化ウイルスを生産する、ことを特徴とする核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸分子によりトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項６】
ネコに投与される場合に免疫性を誘導するのに十分な濃度の請求項４に記載の核酸分子、及び医薬として許容されるキャリヤーを含んで成るワクチン。
【請求項７】
ネコにおいてFIV-141に対する抗体の産生を誘導する方法において、
（ａ）実質的に精製されそして不活性化されたFIV-141ウイルス；
（ｂ）前記実質的に精製されそして不活性化されたFIV-141ウイルスにより感染された宿主細胞；
（ｃ）弱毒化FIV-141ウイルス；
（ｄ）弱毒化FIV-141ウイルスにより感染された宿主細胞；
（ｅ）弱毒化FIV-141ウイルスをコードする核酸分子；又は
（ｆ）弱毒化FIV-141ウイルスをコードする核酸分子によりトランスフェクトされた宿主細胞；
をネコに投与することを含んで成る方法。
【請求項８】
ネコからの抗体を精製することを更に含んで成る、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
宿主に入った後複製するが、野生型FIV-141ウイルスと比較した場合、ネコＴリンパ球への有意に低下した感染性を示す弱毒化FIV-141ウイルスの製造方法において、当該野生型ウイルスのENV遺伝子における欠失により変異させることを含んで成る方法。
【請求項１０】
FIV-141ウイルス感染に対するワクチン中での使用のために適当な変異した核酸分子の製造方法において、
（ａ）前記FIV-141ウイルスのゲノムRNAを逆転写し；
（ｂ）前記工程（ａ）逆転写物をクローニングして、クローン化された核酸を生成せしめ；
（ｃ）前記工程（ｂ）の前記クローン化された核酸のENV遺伝子中での欠失による変異を生じさせることにより変異した核酸分子を生成せしめ；そして
（ｄ）前記工程（ｃ）の前記変異した核酸をクローニングする；
ことを含んで成る方法。
【請求項１１】
弱毒化FIV-141ウイルスをコードする変異した核酸分子が、宿主細胞に入った後、複製するがしかし野生型FIV-141に比べてネコＴ−リンパ球に対する有意に低下した感染性を示す弱毒化FIV-141ウイルスを生成する、請求項10に記載の方法。