(57)【要約】【課題】調製が容易であり、かつ従来よりもタンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質合成用酵母抽出液の調製方法、および該酵母抽出液、ならびにこの酵母抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供する。【解決手段】酵母菌体を凍結させた状態で破砕し、その抽出液を得る無細胞タンパク質合成用酵母抽出液の調製方法、および該酵母抽出液、ならびにこの酵母抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母菌体を凍結させた状態で破砕し、その抽出液を得る無細胞系タンパク質合成用酵母抽出液の調製方法。
【請求項２】
酵母菌体を液体窒素によって凍結させるものである、請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
酵母菌体の破砕が、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰すことによって行われるものである、請求項１または２に記載の調製方法。
【請求項４】
酵母菌体からの抽出後、分子量５，０００以下の菌体内成分を除去して濃縮する、請求項１〜３のいずれかに記載の調製方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法で調製された、無細胞系タンパク質合成用酵母抽出液。
【請求項６】
請求項５に記載の酵母抽出液を含有する反応液を用いた無細胞系タンパク質合成方法。
【請求項７】
反応液がｐＨ６．０〜８．０に調整されたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
反応液を透析しながらタンパク質の合成反応を行うものである、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、無細胞系のタンパク質合成に使用できる酵母抽出液およびその調製方法、および当該抽出液を使用した無細胞系でのタンパク質合成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や昆虫細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃え、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系のタンパク質合成に供する細胞破砕液や抽出液として、種々の生物由来のものを使用することが検討され、研究が進められている。この中で、酵母は、大腸菌などの原核生物と同様に容易に培養することができるため、安価にその抽出液を得ることができる。また、酵母は真核生物であるため大腸菌などの抽出液では不可能な糖鎖付加などの翻訳後の修飾反応も行うことができる。このような観点より、酵母由来の無細胞系タンパク質合成用の抽出液の開発が注目されている。
【０００５】
酵母由来の抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法は、Ｇａｓｉｏｒらによって初めて報告された（たとえば、非特許文献１を参照。）。Ｇａｓｉｏｒらの方法では、まず、酵母を培養後、ｇｌｕｓｕｌａｓｅでスフェロプラストを調製した後、０．４ＭＭｇＳＯ４を含むＹＭ−５培地で再度培養を行う。次に、遠心分離で再度菌体を回収し、緩衝液で懸濁後、ダウンスホモジナイザーで細胞を破砕する。続いて、この破砕物を３０，０００×ｇ、さらに１００，０００×ｇで遠心分離する。得られた上清をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５に供してタンパク質含有量の高い画分を集め、これを無細胞系タンパク質合成用の抽出液としている。しかし、このようなＧａｓｉｏｒらの方法は、抽出液の調製が非常に煩雑であり、多大な時間と労力を要するという問題があった。
【０００６】
この問題を解決するため、Ｈｕｓｓａｉｎらは、細胞破砕の方法を変えることで、より簡便な無細胞系タンパク質合成用の抽出液の作製方法を開発した（たとえば、非特許文献２を参照。）。Ｈｕｓｓａｉｎらが提案した方法は、酵母を培養後、集菌して菌体を緩衝液で洗浄、懸濁後、ガラスビーズで細胞の破砕を行い、得られた破砕物を３０，０００×ｇで遠心分離し、得られた上清をＳｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５に供するという非常に簡便な抽出液の作製法であった。
【０００７】
しかし、上記いずれの方法で得られた抽出液であっても、合成できるタンパク質の量は極めて少なく、放射能標識を行ったアミノ酸の取り込みによってのみ、そのタンパク質合成活性を測定できるという程度のものであった。このため、その調製が容易でありかつタンパク質合成量の高い酵母由来抽出液を調製する方法が望まれていた。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００２−２６２８６７号公報
【非特許文献１】
Ｇａｓｉｏｒ，Ｅ．  ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５４，  ３９６５−３９６９，  １９７９
【非特許文献２】
Ｈｕｓｓａｉｎ，  Ｉら、Ｇｅｎｅ，  ４６，  １３−２３，  １９８６
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、調製が容易であり、かつ従来よりもタンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質合成用酵母抽出液の調製方法、および該酵母抽出液、ならびにこの酵母抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）酵母菌体を凍結させた状態で破砕し、その抽出液を得る無細胞系タンパク質合成用酵母抽出液の調製方法。
（２）酵母菌体を液体窒素によって凍結させるものである、上記（１）に記載の調製方法。
（３）酵母菌体の破砕が、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰すことによって行われるものである、上記（１）または（２）に記載の調製方法。
（４）酵母菌体からの抽出後、分子量５，０００以下の菌体内成分を除去して濃縮する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の調製方法。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法で調製された、無細胞系タンパク質合成用酵母抽出液。
（６）上記（５）に記載の酵母抽出液を含有する反応液を用いた無細胞系タンパク質合成方法。
（７）反応液がｐＨ６．０〜８．０に調整されたものである、上記（６）に記載の方法。
（８）反応液を透析しながらタンパク質の合成反応を行うものである、上記（６）に記載の方法。
【００１１】
本明細書における「無細胞系タンパク質合成」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系によるタンパク質合成を指すものとする。ここで、本発明の合成方法によって無細胞系で合成される「タンパク質」は、複数のアミノ酸残基から構成される任意の分子量のペプチド、すなわち低分子量のペプチドから高分子量のいずれをも包含するものとする。また本明細書でいう「タンパク質」は、糖鎖修飾されてなる糖タンパク質も含む。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、凍結させた酵母菌体を破砕して酵母菌体からの抽出を行うことによって、無細胞系タンパク質合成用の酵母抽出液を調製する方法である。このような方法によって酵母抽出液を調製することで、非特許文献１に記載の方法と比較して簡便であり、また非特許文献２に記載の方法より緩和な状態で細胞の破砕を行うことができる。
【００１３】
本発明の調製方法では、酵母菌体を凍結させることを要する。酵母菌体は、液体窒素などの不活性ガスを用いて急激に凍結させることが望ましい。菌体を急激に凍結させなかった場合には、タンパク質合成に必要な成分が失活などといった不具合を生じて本発明の上記効果を確実に達成できない虞があるためである。
上記酵母菌体の凍結は、たとえば、上記液体窒素を使用したり、アセトン−ドライアイスを使用したりすることで実現できるが、アセトンなどの有機溶媒を用いるとタンパク質合成に必要な成分が失活する虞があるため、液体窒素を用いて行うのが好ましい。
【００１４】
上記のように酵母の菌体を凍結後、菌体が凍結した状態で細胞の破砕を行う。該酵母菌体の破砕は、凍結した酵母菌体が粉々になれば、いかなる方法を用いてもよい。たとえば、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰す方法、メタルコーンを破砕媒体にマルチビーズショッカー（安井器械株式会社製）を用いて破砕する方法などが例示されるが、より緩和な条件での酵母菌体の破砕が可能であり、酵母菌体より無細胞系タンパク質合成に不要なものまで抽出してしまうことがないため、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰す方法により酵母菌体を破砕することが好ましい。
【００１５】
なお本発明における「酵母」としては、酵母として従来より一般に認知されているものであれば、有胞子酵母、担子菌酵母、不完全酵母のいずれであっても特に制限なく使用することができる。中でも有胞子酵母を使用するのが好ましく、有胞子酵母の中でも分裂酵母を使用するのがさらに好ましく、分裂酵母の中でもＳｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅを使用するのが特に好ましい。
本発明においては、単一種の酵母菌体から抽出を行ってもよいし、複数種の酵母菌体から抽出を行ってもよい。
【００１６】
本発明の方法において、破砕した酵母菌体からの抽出は、上記破砕後の酵母菌体に抽出用液を添加することによって行う。用いる抽出用液は、特に制限されるものではないが、プロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するのが好ましい。プロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液を用いると、酵母由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な分解を防止でき、結果として酵母由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるという利点がある。
【００１７】
上記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、酵母菌体内にはセリンプロテアーゼ活性が強いと推定されることから、セリンプロテアーゼに対して特異性の高いＰＭＳＦを使用するのが好ましい。また、一種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類の混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。
【００１８】
当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、本発明の作用に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００１９】
また本発明に用いる抽出用液は、上記プロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトールおよび緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。
【００２０】
上記カリウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００２１】
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２２】
上記マグネシウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００２３】
当該抽出用液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２４】
上記ジチオトレイトール（以下、「ＤＴＴ」ということがある。）は、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該抽出用液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２５】
上記緩衝剤は、抽出用液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こるｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
緩衝剤は、当該抽出用液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６〜８に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出用液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが特に好ましい。
【００２６】
当該抽出液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２７】
本発明の酵母抽出液の調製方法において、上記破砕後の酵母菌体からの抽出を行ってから無細胞系タンパク質合成用酵母抽出液を得るまでの手順等については特に制限されるものではないが、たとえば、以下の手順により行うことができる。
まず、上記破砕した酵母菌体に抽出用液を添加して得られた酵母抽出物を含有する液状物を、遠心分離にかける。当該遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行い上清を回収し、再度、上記の条件で行えばよい。
遠心分離後、上清をゲル濾過する。ゲル濾過は、たとえば脱塩カラム  ＰＤ−１０（アマシャム  バイオサイエンス社製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、２０％グリセロールを含む抽出用液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。上記ゲル濾過に用いる緩衝液としては、抽出用液にグリセロールを添加したものを用いるのが好ましい。これにより、タンパク質合成に必須な成分を安定化できるというような利点がある。グリセロールは、通常、５（ｖ／ｖ）％〜４０（ｖ／ｖ）％となるように添加すればよい。
ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
続いて、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム  バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が２０以上、２６０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分をゲル濾過後の濾液より分取し、本発明の酵母抽出液とする。
【００２８】
なお、本発明の調製方法に供する酵母菌体は、培地成分などによるタンパク質合成反応の阻害を防止するため、上記急激な凍結を行う前に、上述した好適な組成の抽出用液にて予め洗浄しておくのが好ましい。抽出用液での洗浄は、酵母菌体に抽出用液を添加し、これを遠心分離（たとえば、４℃、８，０００×ｇ、５分間という条件）することによって行う。
洗浄に用いる抽出用液の量は、培地を完全に洗い流すという理由から、湿重量１ｇの酵母菌体に対し１ｍＬ〜２０ｍＬであるのが好ましく、２ｍＬ〜１５ｍＬであるのがより好ましい。
【００２９】
また本発明の調製方法に供する酵母菌体の量は、特に制限されるものではない。
【００３０】
本発明の方法にて調製された無細胞系タンパク質合成用の抽出液は、好適には、酵母由来の抽出物を、１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ含有することが好ましく、１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有することがより好ましい。酵母由来の抽出物の含有量が１ｍｇ／ｍＬ未満であると、タンパク質合成に必要な成分の濃度が低くなるため、充分な合成量が得られない虞があるためであり、また、酵母由来の抽出物の含有量が２００ｍｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する因子も多く抽出されているので、合成反応時間が著しく短くなる虞があるためである。
該抽出液中の酵母由来の抽出物のタンパク質含有量は、たとえば、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し測定することができる。反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍにおける吸光度を測定するといった手順によって行う。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミンを使用する。
【００３１】
また抽出液中に含有される抽出物が酵母由来のものであるか否かは、たとえば、抽出液に含まれるリボソームＲＮＡの塩基配列を解析することによって判別することができる。
【００３２】
本発明の抽出液は、酵母由来の抽出物をタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ含有するとともに、１ｍＭ〜５００ｍＭの酢酸カリウム、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭのＤＴＴ、１μＭ〜５０ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭ〜２００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。
【００３３】
また、本発明の抽出液は、上記調製方法で得られた後、分子量５，０００以下（好適には、分子量１０，０００以下）の菌体内成分を除去し、濃縮したものであることが好ましい。かかる濃縮を行うことで、タンパク質合成に不必要な成分を除去することができ、必要な成分が濃縮されることで、タンパク質合成の反応速度が向上される。
【００３４】
上記濃縮の方法は、特に制限されず、従来公知の適宜の手法によって行えばよい。濃縮は、濃縮後の抽出液の２８０ｎｍにおける吸光度が好ましくは１０〜１００、より好ましくは２０〜８０となるように行う。濃縮後の抽出液の上記吸光度が１０未満であると、タンパク質合成速度が遅く、結果的に合成量が向上しない傾向にあるためであり、また、上記吸光度が１００を越えると、合成速度は向上されるが、合成反応時間が極めて短縮されるため、この場合も結果として合成量が向上されないという傾向にあるためである。
抽出液の濃縮に用いる手段としては、特に制限されず、従来公知の種々のもの、たとえば、ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−０．５  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ＆ｔｕｂｅ（排除分子量：１０，０００、ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）などを用いることができる。
【００３５】
本発明はまた、上記抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供するものである。かかる合成反応においては、通常、上記抽出液に無細胞系でのタンパク質合成に要する添加物を添加した反応液として調製する。上記添加物に特に制限はなく、無細胞系のタンパク質合成の分野において従来より一般に使用されているものであれば特に制限はない。
なお上記反応液は、本発明の抽出液が１０（ｖ／ｖ）％〜９０（ｖ／ｖ）％、特には２０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好ましい。
すなわち、上記反応液の全体において、酵母菌体由来の抽出物の含有量が、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１８０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、２ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１８０ｍｇ／ｍＬを越えると、目的タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるため好ましくない。
【００３６】
なお、本発明の無細胞系タンパク質合成方法に用いる反応液は、ｐＨが６．０〜８．０に調製されたものであるのが好ましく、６．５〜７．５に調製されたものであるのがより好ましい（従来の一般的な無細胞系タンパク質合成用の反応液のｐＨ：７．４〜７．６）。反応液のｐＨが６．０未満であると、タンパク質合成に必要な成分が変性する虞があるためであり、またｐＨが８．０を越えると、タンパク質合成に必要な成分に好適なｐＨではないことにより、反応速度が遅くなる傾向があるためである。
【００３７】
通常、上記反応液としては、上記抽出液を除く成分として、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するのものを用いる。これにより、短時間で大量のタンパク質の合成が可能であるというような利点をさらに有する無細胞系タンパク質合成用の反応液を実現できる。
【００３８】
当該反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、２０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００３９】
当該反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００４０】
当該反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出用液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００４１】
当該反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜２ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜１ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または２ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００４２】
当該反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００４３】
当該反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、１５ｍＭ〜３５ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１０ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が５０ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００４４】
当該反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００４５】
当該反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を全て含有する。当該アミノ酸成分は、通常、上記２０種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜５００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００４６】
当該反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する酵母菌体由来のＲＮａｓｅによって、本発明の無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜２０Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．２Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが２０Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００４７】
当該反応液中におけるｍＲＮＡにおいては、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、毒性を有するタンパク質をコードするものであってもよいし、また糖タンパク質をコードするものであってもよい。なお用いるｍＲＮＡは、塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならばｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
本発明に用いるｍＲＮＡは、市販のものを適宜用いればよいが、ｐＴＮＴ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）由来の５’−βグロビンリーダー配列の下流に目的タンパク質をコードするＤＮＡの開始コドンが挿入されたベクターを用いて転写反応で得られたｍＲＮＡを用いると、無細胞系での翻訳反応の効率が向上し、結果としてより多くの目的タンパク質を得ることができるため、好ましい。
【００４８】
当該反応液中において、ｍＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを超えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００４９】
当該反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５０】
反応液に含有される緩衝剤としては、上述した本発明の抽出液と同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５１】
また上記反応液は、グリセロールを含有するのがより好ましい。グリセロールを添加すると、タンパク質合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるというような利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。
【００５２】
すなわち、本発明の無細胞系タンパク質合成方法に用いる反応液は、上記抽出液を１０（ｖ／ｖ）％〜９０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、１０ｍＭ〜５００ｍＭの酢酸カリウム、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭのＤＴＴ、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロール、０．０１ｍＭ〜２ｍＭのＡＴＰ、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのクレアチンリン酸、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１μＭ〜１０００μＭのアミノ酸成分、０．１Ｕ／μＬ〜２０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬのｍＲＮＡ、５ｍＭ〜２００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６〜８）を含有するように実現されるのが好ましい。
【００５３】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法は、上記のような本発明の抽出液を用いて、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応に際しては、通常、上記抽出液を含有する反応液を調製して、これを用いて行う。
【００５４】
また反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３５℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。
【００５５】
また、本発明の無細胞系タンパク質合成方法においては、酵母抽出液を透析しながらタンパク質の合成反応を行うことが好ましい。このように透析を行いながらタンパク質の合成を行うことで、ＡＴＰなどのタンパク質合成に必要なエネルギー源が透析外液から常に供給されるため、タンパク質合成反応時間が延長するというような利点がある。
酵母抽出液を透析しながらタンパク質の合成を行う場合、具体的には、透析膜に収容した反応液を、透析外液を収容した反応槽内に浸して、タンパク質合成反応を行う。
【００５６】
用いる透析膜は特に制限されず、従来公知の種々のものを用いればよいが、分子量３，０００以下、特には分子量１０，０００以下の物質を反応液から透析外液に拡散し得るものであるのが好ましい。このような透析膜としては、たとえば、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（ＰＩＥＲＣＥ社製、排除分子量：１０，０００）などが例示される。
また用いる透析外液としては、上記透析がなされる組成であれば特に制限されるものではない。たとえば、反応液の組成より抽出液、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、クレアチンキナーゼ、ＲＮａｓｅインヒビターを除いたような組成の透析外液を使用することができる。
【００５７】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法にて合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
【００５８】
本発明の無細胞系のタンパク質合成方法にて合成できるタンパク質に特に制限はない。
【００５９】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
参考例１
：酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）菌体の培養
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅをＹＥＰＤ培地（Ｇｌｕｃｏｓｅ：１．０％，ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ：１．０％，  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ：２．０％）６ｍＬを含む太口試験管に植菌し、３０℃、１６時間振盪培養した。これを前培養液とし、０．５μＭチアミンを含むＹＥＰＤ培地２．５Ｌに１０ｍＬ植菌し、３０℃、約１５時間、６６０ｎｍの吸光度が１．０になるまで通気攪拌培養した。培養液を遠心分離（４℃、８，０００×ｇ、５分間）し、菌体を回収した。その結果、２．５Ｌの培養液より約６ｇの湿菌体が得られた。
【００６０】
実施例１
：無細胞系タンパク質合成用酵母抽出液の調製
上記参考例１で得られた酵母菌体を滅菌水で洗浄後、遠心分離（４℃、８，０００×ｇ、５分間）により再度菌体を回収した。菌体湿重量１ｇに対して３ｍＬの下記組成の抽出用液で洗浄した。
〔抽出用液の組成〕
・５０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・２ｍＭ            ＤＴＴ
再度遠心分離（４℃、８，０００×ｇ、５分間）により菌体を回収した。回収した菌体約５ｇを−８０℃で凍結させた乳鉢に移した。これに液体窒素を添加し、乳鉢内で乳棒を用いて激しくすり潰した。すり潰した菌体に、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦを含む抽出用液４．５ｍＬを加え抽出した。抽出後、遠心分離（４℃、３０，０００×ｇ、１０分間）により、菌体残渣を除去し、得られた上清を再度遠心分離（４℃、３０，０００×ｇ、３０分間）した。遠心後の上清２．０ｍＬを２０（ｖ／ｖ）％グリセロールを含む抽出用液で平衡化したＰＤ−１０（アマシャム  バイオサイエンス社製）にアプライし、同抽出用液で溶出した。分画は５００μＬずつ行った。各画分の２８０ｎｍおよび２６０ｎｍの吸光度を測定し、それぞれ２０および３０以上の画分を集め、これを酵母由来の無細胞タンパク質合成用抽出液とした。この操作によって２８０ｎｍと２６０ｎｍの吸光度がそれぞれ２５と４２の抽出液を約１．５ｍＬ得ることができた。
【００６１】
比較例１
：ガラスビーズ法による酵母抽出液の作製
上記参考例１で得られた酵母菌体を滅菌水で洗浄後、遠心分離（４℃、８，０００×ｇ、５分間）により再度菌体を回収した。菌体湿重量１ｇに対して３ｍＬの下記組成の抽出用液で洗浄した。
〔抽出用液の組成〕
・５０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・２ｍＭ            ＤＴＴ
再度遠心分離（４℃、８，０００×ｇ、５分間）により菌体を回収した。回収した菌体５ｇを０．５ｍＭ  ＰＭＳＦを含む抽出用液５ｍＬに懸濁した後、１０ｇのガラスビーズを加えた。これをマルチビーズショッカー（安井器械株式会社製）を用いて、２，５００ｒｐｍ、３０秒、１０サイクルの条件で酵母菌体の破砕を行った。菌体を破砕後、遠心分離（４℃、８，０００×ｇ、５分間）により菌体残渣を除去し、得られた上清を遠心分離（４℃、３０，０００×ｇ、１０分間）し、得られた上清を再度遠心分離（４℃、３０，０００×ｇ、３０分間）した。得られた上清２．０ｍＬを２０％グリセロールを含む抽出用液で平衡化したＰＤ−１０にアプライし、同抽出用液で溶出した。分画は５００μＬずつ行った。各画分の２８０ｎｍおよび２６０ｎｍの吸光度を測定し、それぞれ９０、１５０以上の画分を集め、これを酵母由来の無細胞系タンパク質合成用の抽出液とした。この操作によって、２８０ｎｍと２６０ｎｍの吸光度が、１１０、１８０の抽出液を約１．５ｍＬ得ることができた。
【００６２】
実験例１
：実施例１、比較例１で得られた抽出液を用いた無細胞系でのタンパク質合成
上記実施例１および比較例１で得られた抽出液を用いて、下記に示す組成の反応液を調製した。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  酵母抽出液
・２５ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）
・５０ｍＭ          酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・１ｍＭ            ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％  グリセロール
・０．５ｍＭ        ＡＴＰ
・０．１ｍＭ        ＧＴＰ
・２５ｍＭ          クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ  クレアチンキナーゼ
・４０μＭ          アミノ酸（２０種）
・１Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ（ｙｅａｓｔ由来）
・２０μｇ／ｍＬ    ｍＲＮＡ
ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ルシフェラーゼコントロールＲＮＡ、プロメガ社製）を用いた。また、反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用い、無細胞系タンパク質の合成反応を行った。反応温度は３０℃で行い、反応液量は２５μＬとした。合成されたルシフェラーゼの定量は、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて行った。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメータ（ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
図１は、実施例１および比較例１の酵母抽出液を用いた各反応時間におけるルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図１において縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸は反応時間（ｍｉｎ）を示す。図１において、凍結破砕法で調製した酵母抽出液を用いたタンパク質合成反応は反応開始後３時間まで継続し、６０ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成された。それと比較してガラスビーズ法で調製した酵母抽出液では、合成反応は１時間で停止し、ルシフェラーゼ合成量は１４ｎｇ／ｍＬであった。
【００６３】
実験例２
：濃縮抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成
上記実施例１で作製した抽出液をｕｌｔｒａｆｒｅｅ−０．５  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ＆ｔｕｂｅ（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、排除分子量：１０，０００）によって、段階的に濃縮し、抽出液の２８０ｎｍの吸光度が２２、３７、５０、６２、７４である濃縮抽出液をそれぞれ調製した。濃縮した各抽出液を用いて、上記実験例１と同様の組成の反応液を調製し、実験例１と同様に無細胞タンパク質合成および合成されたルシフェラーゼの定量を行った。
図２は、濃縮抽出液を用いた合成反応開始３時間後のルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図２において縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸は抽出液の２８０ｎｍの吸光度を示す。図２に示すように、抽出液の２８０ｎｍの吸光度を３５〜５０に濃縮した抽出液が最も合成量が高く約１００ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成された。
【００６４】
参考例２
：ｍＲＮＡの作製
（１）ベクターＤＮＡの構築
ｐＧＥＭ−ｌｕｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９７℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行った。エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を精製した後、ＫｐｎＩで消化した。
これとは別に、ｐＴＮＴ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をＫｐｎＩで消化した。これらの反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ  Ｅｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いてＤＮＡ断片を精製した。
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、上記ｐＧＥＭ−ｌｕｃ  Ｖｅｃｔｏｒ由来のＤＮＡ断片と、上記ｐＴＮＴ  Ｖｅｃｔｏｒ由来のＤＮＡ断片とをライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製したプラスミドＤＮＡを、配列表配列番号３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ  ＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシークエンシング反応（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分、３０サイクル）を行った。この反応液をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列解析を行った。ｐＴＮＴ  Ｖｅｃｔｏｒ由来の５’−βグロビンリーダー配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンが挿入されたプラスミドをｐＴＮＴ−Ｌｕｃと命名した。
【００６５】
（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応
上記（１）で作製したｐＴＮＴ−ＬｕｃをＢａｍＨＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。これを鋳型とし、ｉｎｖｉｔｒｏ転写反応を行った。転写反応液としては、以下の組成のものを用いた。
〔転写反応液の組成〕
・８０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・２４ｍＭ          酢酸マグネシウム
・４０ｍＭ          ＤＴＴ
・７．５ｍＭ        ＮＴＰｓ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ）
・２ｍＭ            スペルミジン
・１Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・１Ｕ／μＬ        Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
・５０μｇ／ｍＬ    ｐＴＮＴ−Ｌｕｃ／ＢａｍＨＩ
ＮＴＰｓ（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼ（プロメガ社製）をそれぞれ用いた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。転写反応は３７℃、４時間で行い、反応液量は２０μＬとした。
【００６６】
（３）ｍＲＮＡの精製
転写反応終了後、上記（２）の反応液２０μＬに１ＵのＲＱ１  ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃、１５分間インキュベートし、鋳型ＤＮＡを消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μＬの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ  Ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム  バイオサイエンス社製）にアプライした。滅菌水４００μＬで溶出を行った。溶出画分を回収し、酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成されたｍＲＮＡの定量は、２６０ｎｍの吸光度を測定して行った。その結果、２０μＬスケールの反応で約６０μｇのｍＲＮＡが合成された。
【００６７】
実験例３
：参考例２で得られたｍＲＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成
上記参考例２で得られたｍＲＮＡを鋳型として用い、また抽出液として実施例１で作製した抽出液を２８０ｎｍの吸光度が３５になるように濃縮したものを用いた以外は、実験例１と同様の組成の反応液を調製し、無細胞系タンパク質合成反応および合成されたルシフェラーゼの定量を行った。
結果、合成反応３時間後のルシフェラーゼ合成量は、コントロールｍＲＮＡ（プロメガ社製）を鋳型にした場合８９ｎｇ／ｍＬであったのに対し、２１８ｎｇ／ｍＬであり、コントロールｍＲＮＡの約２．５倍の合成量が得られた。
【００６８】
実験例４
：無細胞系タンパク質合成における各成分添加量の影響
実施例１と同様の方法で作製した抽出液を２８０ｎｍの吸光度が３５になるよう濃縮したサンプルを用いて、無細胞系タンパク質合成反応における各成分添加量の影響を調べた。その結果得られた最適な反応液組成は、以下のとおりであった。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  酵母抽出液
・２５ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）
・５０ｍＭ          酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・１ｍＭ            ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％  グリセロール
・０．５ｍＭ        ＡＴＰ
・０．１ｍＭ        ＧＴＰ
・２５ｍＭ          クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ  クレアチンキナーゼ
・４０μＭ          アミノ酸（２０種）
・１Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ（ｙｅａｓｔ由来）
・２０μｇ／ｍＬ    ｍＲＮＡ
このような最適組成の反応液を用い、実験例１と同様にルシフェラーゼ合成反応および定量を行った。その結果、合成反応開始後３時間で５８０ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成された。
【００６９】
実験例５
：透析法による無細胞系のタンパク質合成
実施例１と同様の方法で作製した抽出液を２８０ｎｍの吸光度が３５になるように濃縮したサンプルを用い、上記実験例４の組成の反応液を調製して、透析法による無細胞系タンパク質合成を行った。透析膜としては、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（排除分子量：１０，０００、ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、透析外液としては下記組成のものを１．１ｍＬ用いた。
〔透析外液の組成〕
・２５ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）
・５０ｍＭ          酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・１ｍＭ            ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％  グリセロール
・０．５ｍＭ        ＡＴＰ
・０．１ｍＭ        ＧＴＰ
・２５ｍＭ          クレアチンリン酸
・４０μＭ          アミノ酸（２０種）
無細胞系タンパク質合成反応および合成されたルシフェラーゼの定量は実験例１と同様にして行った。
図３は、透析法およびバッチ法（実験例４での結果）による無細胞系タンパク質合成反応での、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量の比較を示すグラフである。図３において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（ｍｉｎ）を示す。図３に示すように、透析法により当該透析を行わない場合の合成量の約１．７倍である１．０μｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成された。
【００７０】
【発明の効果】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、調製が容易であり、かつ従来よりもタンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質合成用抽出液の調製方法、および該抽出液、ならびにこの抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供することができる。
【００７１】
【配列表のフリーテキスト】
配列番号１：
プライマー  Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ
配列番号２：
プライマー  Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ
配列番号３：
プライマー  Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ
【００７２】
【配列表】
2004208640.tif 000002
2004208640.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１および比較例１の酵母抽出液を用いた各反応字時間におけるルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸は反応時間（ｍｉｎ）を示す。
【図２】濃縮抽出液を用いた合成反応開始３時間後のルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）、横軸は抽出液の２８０ｎｍの吸光度を示す。
【図３】透析法およびバッチ法による無細胞系タンパク質合成反応での、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量の比較を示すグラフである。
【図１】
2004208640.tif 000004
【図２】
2004208640.tif 000005
【図３】
2004208640.tif 000006