(57)【要約】【課題】微量の検体を、できるだけ短時間に効率的に検出することが可能な電気泳動装置および検出法の提供。【解決手段】第１電極、第２電極、半透膜、バイオチップ、検体溶液槽の構成を含み、第１電極、半透膜、バイオチップは順に積層構造を形成しており、バイオチップと第２電極の間には所定の容積を有する検体溶液槽が形成されている電気泳動装置。さらには、第１電極、第２電極、半透膜、バイオチップ、検体溶液槽の構成を含み、半透膜、バイオチップは積層構造を形成しており、第１電極と半透膜の間には所定の容積を有するバッファー溶液槽が形成され、バイオチップと第２電極の間には所定の容積を有する検体溶液槽が形成されている電気泳動装置。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１電極、第２電極、半透膜、バイオチップ、検体溶液槽の構成を含み、第１電極、半透膜、バイオチップは順に積層構造を形成しており、バイオチップと第２電極の間には所定の容積を有する検体溶液槽が形成されている電気泳動装置。
【請求項２】
第１電極、第２電極、半透膜、バイオチップ、検体溶液槽の構成を含み、半透膜、バイオチップは積層構造を形成しており、第１電極と半透膜の間には所定の容積を有するバッファー溶液槽が形成され、バイオチップと第２電極の間には所定の容積を有する検体溶液槽が形成されている電気泳動装置。
【請求項３】
第１電極及び／又は第２電極が、絶縁体に固定されており、該絶縁体が透明材料で構成されている請求項１又は２記載の電気泳動装置。
【請求項４】
第１電極及び／又は第２電極が、それぞれ互いに並列に接続された複数の電極からなる、請求項１又は２記載の電気泳動装置。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の電気泳動装置の検体溶液槽を検体溶液で満たし、第１電極と第２電極の間に、第１電極が正極となるように電圧を印加することを特徴とする生体関連物質の検出方法。
【請求項６】
次いで、第１電極と第２電極の間に、第１電極が負極となるように電圧を印加することを含む請求項５記載の生体関連物質の検出方法。
【請求項７】
請求項５又は６記載の生体関連物質の検出方法において、検体に蛍光分子を結合し、検出光を第１電極又は第２電極の形成する平面を透過させ、バイオチップ表面に直角に照射し、蛍光分子の蛍光を検出することを含む生体関連物質の検出方法。
【請求項８】
生体関連物質が核酸である請求項５〜７のいずれかに記載の生体関連物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸等の生体関連物質を検出するための電気泳動用装置及びそれを用いた生体関連物質の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、病気の診断、原因の解明のために、バイオチップ（ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ等）とよばれる検査ツールが使用され始めており、さまざまな形態のバイオチップが開発されつつある。
【０００３】
バイオチップとして、代表的な製法としては、化学的又は物理的に修飾した基盤上に核酸をスポッティングして固定化する方法（例えば、非特許文献１参照）、シリコン等の基盤の上にフォトグラフィー技術により短鎖の核酸を直接固相合成していく方法が知られている（例えば、特許文献１及び２参照）。また、核酸等の生体関連物質プローブがゲルに固定化されているＤＮＡチップが開発されている（特許文献３及び４参照）。その他、自己アドレス可能な電極上にＤＮＡプローブを固定したチップがある（特許文献５参照）。
【０００４】
核酸検出においては、安価な検出装置を用いて、より微量の検体を、できるだけ短時間に検出することが所望されている中、特許文献３〜５に開示されているバイオチップは、電気泳動法を採用することにより、ゲル中に保持されているプローブと検体とをハイブリダイゼーション操作、ハイブリダイズしなかった不要な検体の洗浄操作及びデハイブリ操作が簡便かつ高速に実施できることが期待される。そのような電気泳動可能なバイオチップとして、特許文献４及び５に核酸検出法および核酸検出装置が開示されている。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，４６７−４７０（１９９５）
【０００６】
【特許文献１】
米国特許第５，４４５，９３４号明細書
【０００７】
【特許文献２】
米国特許第５，７７４，３０５号明細書
【０００８】
【特許文献３】
特開２０００−２７０８７８号公報
【０００９】
【特許文献４】
特開２０００−６０５５４号公報
【００１０】
【特許文献５】
特表平１０−５０５４９７号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特許文献４に開示された核酸検出法および核酸検出装置においては、試料核酸が電気泳動によりゲルから正極側に流れ出ることから、加えた検体を高い効率でハイブリダイズすることができない。
【００１２】
また、特許文献５に開示されたバイオチップにおいては、試料核酸を電極上に濃縮することから、微量の検体を短時間に検出することができるが、自己アドレス可能な電極パターンの形成が煩雑であるため、装置が高価であり、電極上への核酸の固定化のプロセスが別途必要であるためプロセスが煩雑である。
【００１３】
本発明は、上記課題を解決した電気泳動装置及びそれを用いた検出法を提供する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、特定の構成からなる電気泳動用装置を使用することにより、加えた検体を高い効率で簡便にハイブリダイズすることができることを見いだし、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち、本発明は、第１電極、第２電極、半透膜、バイオチップ、検体溶液槽の構成を含み、第１電極、半透膜、バイオチップは順に積層構造を形成しており、バイオチップと第２電極の間には所定の容積を有する検体溶液槽が形成されている電気泳動装置、である。
【００１６】
また、本発明は、第１電極、第２電極、半透膜、バイオチップ、検体溶液槽の構成を含み、半透膜、バイオチップは積層構造を形成しており、第１電極と半透膜の間には所定の容積を有するバッファー溶液槽が形成され、バイオチップと第２電極の間には所定の容積を有する検体溶液槽が形成されている電気泳動装置、である。
【００１７】
第１電極及び／又は第２電極が、絶縁体に固定されており、該絶縁体が透明材料で構成されていることが好ましい。また、第１電極及び／又は第２電極が、それぞれ互いに並列に接続された複数の電極から構成されていても良い。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【００１９】
図１は本発明の第１の電気泳動装置を示す模式図である。
【００２０】
電気泳動装置は、第１電極１１、半透膜１２、バイオチップ１３、検体溶液槽１５、第２電極１４から構成され、第１電極１１、半透膜１２、及びバイオチップ１３の順に積層されて密着している。バイオチップ１３と第２電極１４の間には、所定の体積を持つ検体溶液槽１５がある。第１電極１１と第２電極１４の間に電源１６により電圧を印加することができる。図中、１７はこれらの要素を保持するための支持体であり、絶縁材料から構成される。
【００２１】
図２は本発明の第２の電気泳動装置を示す模式図である。
【００２２】
電気泳動装置は、第１電極２１、バッファー溶液槽２９、半透膜２２、バイオチップ２３、検体溶液槽２５、第２電極２４から構成され、第１電極２１と半透膜２２の間に所定の体積を持つバッファー溶液槽２９があり、半透膜２２及びバイオチップ２３は順に積層されて密着し、バイオチップ２３と第２電極２４の間に所定の体積を持つ検体溶液槽２５がある。
【００２３】
電源２６により第１電極２１と第２電極２４の間に電圧を印加することができる。図中、２７はこれらの要素を保持するための支持体であり、絶縁材料から構成される。
【００２４】
図２で示した第１電極及び第２電極は、図３〜図５に示す配置となっても構わない。
【００２５】
すなわち、図４の模式図に示すような形状が挙げられる。ここで、第１電極３１および第２電極３４は互いに並列に接続された複数の電極からなり、図４と図５はそれぞれ第１電極および第２電極を垂直に見たときの模式図を示す。第１電極３１および第２電極３４それぞれは互いに並列に接続された４個の電極から構成され、３０は透明な絶縁体である。
【００２６】
第１電極および第２電極の材料としては、グラファイト、白金、金、金属に金メッキしたもの等が挙げられる。さらに電極は絶縁体に固定され、且つ該絶縁体が透明材料であることが好ましい。そのような例としては、ガラス、ポリエチレンテレフタレートフィルムなどの透明基板に、酸化スズ、ＩＴＯ、金または白金等を主たる構成材料とする薄膜またはその積層体が部分的に形成された透明電極が挙げられる。
【００２７】
第１電極および第２電極の大きさ、形状および配置は、検体溶液槽とバイオチップに均一の電圧を印加することができるものであれば特に限定しないが、例えば、平板上または平板メッシュ状の形態で、バイオチップと平行な位置に配置されていることが好ましい。
【００２８】
本発明において、「半透膜」とは、検体分子は透過せず、溶液中の水や塩類のような低分子は透過するような膜をいう。そのような膜を使用し、バイオチップに積層・密着して配置することにより、検体溶液中の検体がバイオチップを通過して、第１電極への吸着、及び電極反応により変質することを防止することができる。
【００２９】
さらには、検体溶液中の検体がバイオチップ中及び／又はその近傍に濃縮され、微量な検体を効率よくハイブリダイズすることができる。
【００３０】
半透膜としては、使用する検体により適宜選択される。半透膜を透過することのできる分子の大きさは一般にカットオフ分子量とよばれ、数千から数十万のものが市販されている。検出しようとしている検体より小さいカットオフ分子量を示す半透膜を選択すればよい。そのような半透膜としては、ゼラチン膜、アセテート膜、アクリルアミド系やポリビニルアルコール等のハイドロゲル、再生セルロース膜等が挙げられる。機械的強度、取り扱い、入手の容易性等を考慮し、アセテ−ト膜が好ましい。
【００３１】
次に、図６を使用し、本発明の「バイオチップ」に関して説明する。図６はバイオチップの一例を示す模式図である。図中、４１は核酸等の生体関連物質プローブ（以下、プローブ）が固定化されたアクリルアミド、アガロース等の高分子ゲル、４２はゲル４１を保持している中空繊維、４３は中空繊維４２を接着しているマトリックスを表す。
【００３２】
図６では中空繊維の中空部にプローブを固定化したゲルを充填した形態物を例示したが、厚み方向にプローブが固定されたゲルが貫通孔に充填されものであればいずれの形状でも構わない。中空繊維以外のゲルを保持する電気泳動担体としては、例えば、積層された複数のシート状部材やブロック状部材にレーザー等で貫通孔を穿ち、その中にプローブを固定したゲルを注入したのちシート化した電気泳動担体などが挙げられる。
【００３３】
バイオチップの厚みは、数十ミクロンから１ｍｍ程度の範囲である。大きさは、数ミリ角から数センチ角のものが通常、使用される。
【００３４】
本発明において、「検体溶液槽」とは、所定の容積を持つ空間であり、検体溶液が充填される。微量の検体を検出するためには検体溶液が少ないことが好ましい。よって、空間の容積はより微小化することが好ましく、検体溶液槽はバイオチップのプローブが固定された部分にほぼ等しい断面積からなり、検体溶液槽の厚さは、各要素の加工性を考慮し、２５０μｍから３ｍｍ程度の厚さであることが好ましい。溶液槽の形状は特に限定せず任意に選択することができる。
【００３５】
本発明において、「バッファー溶液槽」とは、所定の容積を持つ空間であり、バッファー溶液が充填される。所定の容積を持つバッファー槽を設けることで、バイオチップと第１電極を隔離することができる。バイオチップと第１電極を隔離することにより、バイオチップが電極近傍のｐＨ上昇により劣化したり、反応阻害の影響をうけないようにすることができる。
【００３６】
また、電極近傍で発生する気体によって、バイオチップに印加される電場が不均一になることを防止することができる。バッファー溶液槽の体積及び形状は特に限定されず任意に選択することができる。
【００３７】
バッファー溶液の組成としては、一般的に核酸のハイブリダイズ反応に利用される溶液組成が上げられ、ＴＢＥ溶液やＳＳＣ溶液などが挙げられる。
【００３８】
次に、上記電気泳動装置を使用した検出方法に関して、検体として核酸を含む溶液を使用した場合の検出方法に関して説明する。しかし、核酸の検出には限定されない。
【００３９】
核酸の検出は、電気泳動装置の検体溶液槽に、検体核酸溶液を充填し、第１電極と第２電極の間に、第１電極が正極となるように電圧を印加し、バイオチップ表面およびバイオチップ中に検体を移動、濃縮して、核酸検出プローブと検体を反応させることにより実施される。
【００４０】
バイオチップは半透膜に密着して積層しているため、検体溶液中の核酸は、電圧の印加によりバイオチップ表面のゲル近傍に移動して濃縮される。よって、ゲル中のプローブと高い効率でハイブリダイズすることができる。
【００４１】
また、検体溶液中の核酸は、バイオチップを通過してもバイオチップのゲル近傍にとどまることから、高い電圧を印加して短時間で濃縮することが可能である。
【００４２】
好ましくは、第２の実施形態に示すように、半透膜と第１電極の間にバッファー槽を設けることにより、バイオチップを正極と隔離し、電気泳動に伴う正極近傍の溶液のｐＨ上昇による核酸ハイブリッドのＴｍの低下による解離が回避され、ゲル中のプローブと検体が高い効率でハイブリダイズすることができる。
【００４３】
ハイブリダイズ操作が終了した後、ハイブリダイズしなかった検体成分は、バイオチップをバッファー液等で洗浄することにより、除去することができるが、バイオチップに電圧を印加し、洗浄することもできる。
【００４４】
電圧の印可による洗浄方法は、具体的には、プローブと検体を反応させた後、第１電極が負極となるように電圧を印加して、半透膜に積層されたバイオチップ表面およびバイオチップ中の反応しなかった検体を検体溶液槽に移動させることにより実施することができる。この洗浄方法は、上記の濃縮操作に引き続き実施することができる。
【００４５】
以上に述べた検出法において、検体核酸を公知の方法で蛍光分子により標識しておけば、ハイブリダイズした検体を蛍光検出により検出することができる。ハイブリダイズした検体の検出は、上記洗浄操作の後、電気泳動装置から取り出して実施することができるが、第１電極または第２電極を透明電極で構成するか、あるいは、電極をバイオチップの外側に配置することにより、バイオチップを電気泳動装置から取り出さないで検出操作を行うことができる。
【００４６】
すなわち、検出光を第１電極または第２電極の形成する平面を透過して、バイオチップに照射し、バイオチップ上の検体分子に結合した蛍光分子の蛍光を検出することができる。
【００４７】
第１電極および／または第２電極は、透明電極で構成することができるが、経済性の観点からは、図３〜図５に示すような構成が好ましい。ここで用いられる透明な絶縁体３０は、蛍光検出時のノイズを極小化させる観点より、ガラス、ＰＭＭＡ、ポリスチレンなどから選択することが好ましい。
【００４８】
検出に用いる励起光はレーザー、水銀ランプまたはハロゲンランプ等の光源からフィルターにより濾過した光が用いられる。蛍光は、ＣＣＤ、ホトダイオードなどによって検出することができる。
【００４９】
ハイブリダイズした検体の蛍光検出による検出は、前述の濃縮工程および洗浄工程が終了した後に行ってもよいが、濃縮工程および洗浄工程において断続的に検体分子の蛍光を検出して、バイオチップ上の検体分子の蛍光を経時的に検出することもできる。本方法によれば、最適な濃縮条件／洗浄条件の異なるプローブスポットを同一のバイオチップで同一の実験によって検出することができ、プローブ設計が自由に行える利点がある。
【００５０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００５１】
＜実施例１＞
（１）バイオチップの作製：
板の中央部に直径０．３２ｍｍの孔が０．４２ｍｍ間隔で、格子状に５×５、２５個配置された、厚さ０．１ｍｍの多孔板２枚を用い、その多孔板の全ての孔に、ポリメチルメタクリレート製中空繊維（外径０．２８ｍｍ、内径０．１６ｍｍ、長さ５００ｍｍ）を通過させた。次に、この２枚の多孔板を５０ｍｍの間隔に広げ、その間をカーボンブラックで着色したポリウレタン樹脂で長さ５０ｍｍ、２０ｍｍ角の角柱状に包埋した。両端に樹脂で固定化されない部分を有する中空繊維配列体を得た。２０ｍｍ角の角柱状の中央部２．１ｍｍ角の中に２５本の中空繊維が配列されていた。
【００５２】
得られた中空繊維配列体中の２２本の中空繊維にゲル前駆体溶液のみを充填した。残り３本の中空繊維に４０ベースの核酸プローブＡを含むゲル前駆体溶液を充填し、重合させた。その後、ミクロトームにて、繊維軸と直角方向に、厚さ０．５ｍｍの薄片を切り出し、バイオチップを得た。
【００５３】
（２）検体の検出−１：
得られたバイオチップを図２に示すように組み立てて、電気泳動装置を得た。ここで、バイオチップは周囲をトリミングして１０ｍｍ角とした。半透膜はスぺクトロポア社製  カットオフ分子量３５００を、電極はステンレス製の板に金メッキ処理をしたものを用いた。空間２５、２９の厚みは何れも１ｍｍとした。空間２９には０．５×ＴＢ、３０ｍＭ  ＮａＣｌを１００μｌ充填した。空間２５には、プローブＡと相補的に結合する４０ベースのＣｙ５染料で標識された核酸検体ａの１００ｆｍｏｌとプローブＡと相補的に結合しない４０ベースのＣｙ３染料で標識された核酸検体ｂの１００ｆｍｏｌを０．５×ＴＢ、３０ｍＭＮａＣｌ溶液１００μｌに溶解して充填した。
【００５４】
次に、第１電極を正極に、第２電極を負極になるように電源２６により電圧を印加し、検体を濃縮してハイブリダイズさせた。このときの印加電圧は３Ｖ、時間は１０分であった。電気泳動終了後、バイオチップを電気泳動装置から取り外し、２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ溶液１０ｍｌで２０分間洗浄し、更に同溶液で２０分間洗浄し、最後に２×ＳＳＣで２０分間洗浄した。温度は何れも４５℃であった。洗浄操作後、バイオチップを取り出し蛍光顕微鏡で観察した。
【００５５】
その結果、バイオチップのプローブＡが固定化されている３ヶ所のスポットのみＣｙ５染料が発する蛍光を検出することができた。Ｃｙ３染料が発する蛍光は、何れのスポットからも検出されなかった。
【００５６】
＜実施例２＞
実施例１で得られたバイオチップを図３に示すように組み立てて電気泳動装置を得た。ただしここで、空間３５の厚みは１ｍｍ、空間３９の厚みは２０ｍｍとした。ここで、第１電極３１、第２電極３４は何れも０．５ｍｍφの白金線を用い、ＰＭＭＡ板３０に埋め込んで空間３５および３９に満たされる溶液と接触させた。それ以外は実施例１と同様にして、電気泳動による濃縮とハイブリダイズ、電気泳動による洗浄を行った。次に、空間３５の検体溶液を０．５×ＴＢ、３０ｍＭ  ＮａＣｌ水溶液に置換したのちＰＭＭＡ板３０を通してバイオチップを蛍光顕微鏡で観察した。
【００５７】
その結果、バイオチップのプローブＡが固定化されている３ヶ所のスポットのみＣｙ５染料が発する蛍光を検出することができた。Ｃｙ３染料が発する蛍光は、何れのスポットからも検出されなかった。
【００５８】
＜比較例１＞
電気泳動による濃縮とハイブリダイズを行う代わりに、電圧を印加しないで１０分間静置する以外は実施例２とすべて同様にハイブリダイズおよび電気泳動による洗浄を行い、実施例と同様にバイオチップを蛍光顕微鏡で観察した。
【００５９】
その結果、バイオチップのプローブＡが固定化されている３ヶ所のスポットのみＣｙ５染料が発する蛍光を検出することができたが、その蛍光強度は実施例１、実施例２に比較して著しく低かった。以上の結果を表１に示す。
【００６０】
＜表１＞
2004219103.tif 000003
【００６１】
【発明の効果】
安価な検出装置を用いて、より微量の検体を、できるだけ短時間に効率よく検出することが可能な電気泳動装置および核酸等の生体関連物質の検出法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】電気泳動装置の模式図である。
【図２】電気泳動装置の模式図である。
【図３】電気泳動装置の模式図である。
【図４】図３の電極の配置を示す模式図である。
【図５】図３の電極の配置を示す模式図である。
【図６】バイオチップ表面の模式図である。
【符号の説明】
１１、２１、３１・・・・・・第１電極
１２、２２、３２・・・・・・半透膜
１３、１３、３３・・・・・・バイオチップ
１４、２４、３４・・・・・・第２電極
１５、２５、３５・・・・・・検体溶液槽
２９、３９・・・・・・バッファー溶液槽
４１・・・・・・生体関連物質が固定化されたゲル
４２・・・・・・ゲルを保持している中空繊維
４３・・・・・・中空繊維を接着しているマトリックス
１７、２７、３７・・・・・・支持体
３０・・・・・・・・・透明絶縁体
１６、２６、３６・・・・・・電源
【図１】
2004219103.tif 000004
【図２】
2004219103.tif 000005
【図３】
2004219103.tif 000006
【図４】
2004219103.tif 000007
【図５】
2004219103.tif 000008
【図６】
2004219103.tif 000009