(57)【要約】【課題】タンパク質間の新規な相互作用を利用する高脂血症関連技術を提供すること。【解決手段】１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質とオキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）との間の相互作用を利用する高脂血症治療薬のスクリーニング方法、高脂血症治療薬製造のための１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質とオキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）との間の相互作用の使用、１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子からなる高脂血症診断用マーカー、並びに１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子を用いる高脂血症の発症リスク評価方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質とオキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）との間の相互作用を利用することを特徴とする高脂血症治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
高脂血症治療薬製造のための１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質とオキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）との間の相互作用の使用。
【請求項３】
１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子からなる高脂血症診断用マーカー。
【請求項４】
１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子を用いる高脂血症の発症リスク評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質間の新規な相互作用を利用する高脂血症関連技術に関する。より詳しくは、高脂血症治療薬のスクリーニング方法、高脂血症治療薬製造における前記相互作用の使用、高脂血症診断用マーカー、高脂血症の発症リスク評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポスト・シークエンス時代を迎え、大規模な遺伝子機能解析が急務とされている。これまでの遺伝子機能解析は、破壊実験や過剰発現実験が主であった。即ち、ノックアウト、またその逆を行い、その結果生じる細胞の変化である「表現型」から、遺伝子の機能を予測してきた。
【０００３】
また、ポスト・ゲノム・シークエンスの取り組みの一つとして、機能未知の遺伝子の翻訳後産物の立体構造、即ち、タンパク質の立体構造解析から機能を予測する技術が生まれてきた。この構造ゲノム科学と称される技術は、タンパク質の持つ「姿・形」からその機能を同定することを主幹とする技術であるが、タンパク質の立体構造のみからの機能予測は、当該タンパクの機能を直接的に同定するものではないため、必ずしも有効な手段となり得ない場合が多い。
【０００４】
このため、遺伝子機能解析の最も直接的な機能解析法として、遺伝子の翻訳後産物であるタンパク質間の相互作用解析が注目され始めている。機能未知のタンパク質と機能既知であるタンパク質とが、どのような相互作用をしているかを知ることができれば、最も直接的に、詳細な遺伝子機能情報が得られることになるからである。なお、タンパク質間の相互作用とは、タンパク質間の非共有結合、共有結合を含む化学的結合あるいは解離をいう。
【０００５】
ここで、オキシステロール結合タンパク質（ｏｘｙｓｔｅｒｏｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，略称「ＯＳＢＰ」）は、細胞内コレステロール量のダウンレギュレーターとしての活性を持つオキシステロール類（２５−ヒドロキシコレステロール，７−ケトコレステロールなど）と高親和性に結合する細胞内タンパク質として同定された。
【０００６】
このＯＳＢＰは、細胞内コレステロール合成の増加やコレステロールのエステル化の減少をもたらし、また、細胞質及び一部核周辺の小胞に結合して存在しており、細胞にオキシステロールを加えるとゴルジ体への移行が観察される（非特許文献１）。これらの知見から、ＯＳＢＰは、血液中の脂質が異常に多い状態となる「高脂血症」の発症に密接に関与するタンパク質であると考えられている。
【０００７】
また、「１４−３−３タンパク質ファミリー」は、クロイッフェルト−ヤコブ病患者の脳脊髄液に顕著に増加するタンパク質として知られており、また、近年、エイズ脳症患者の脳脊髄液中に１４−３−３抗原が高値に検出されることもわかった（非特許文献２）。このように、１４−３−３タンパク質は、脳の疾患の状態を知るためのマーカーとして有用であることがわかってきているが、いまだその機能には、未知の部分が多い。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｉｓｉａ  Ａｃｔａ  １６３１（２００３）１−１１、Ｍａｒｋｋｕ  Ｌｅｈｔｏ，Ｖｅｓａ  Ｍ．Ｏｌｋｋｏｎｅｎ，「Ｔｈｅ  ＯＳＢＰ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」。
【非特許文献２】
木戸  博ら、エイズ脳症に伴う１４−３−３蛋白質の動態に関する研究、［ｏｎ  ｌｉｎｅ］、［平成１５年３月５日検索］、インターネット、ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｋｅｎｋｙｕ／ｈｉｙｏｒｉｍｉ／２０００ｈｉｙｏｒｉｍｉ／２０．ｈｔｍ
【０００９】
【発明が解決しようする課題】
まず、遺伝子機能解析の最も直接的な機能解析法であるタンパク質間の相互作用解析に基づいて、タンパク質間の全く新規な相互作用の網羅的解析を行うことによって、機能未知のタンパク質と特定の疾病の発現に関与することが知られているタンパク質との間の相互作用を新規に見出すことを課題とする。そして、この相互作用に関する新知見に基づいて、前記疾病向けの医薬のスクリーニング方法、該医薬製造における前記相互作用の使用、さらには、前記疾病の診断用マーカー並びに発症リスク評価方法を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明では、第一に、１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質とオキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）との間の相互作用を利用する高脂血症治療薬のスクリーニング方法を提供する。１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質のアミノ酸配列を添付の「配列番号１〜７」に、オキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）のアミノ酸配列を添付の「配列番号８」にそれぞれ示す。なお、本発明において、１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質は「配列番号１〜７」に示されたアミノ酸配列に示されたタンパク質に狭く限定されるのではなく、オキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）と相互作用する生理的機能を少なくとも備えており、「配列番号１〜７」に示されるアミノ酸配列の一部アミノ酸が欠失、置換、付加あるいは挿入されているタンパク質も含まれる。また、オキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）は、「配列番号８」に示されたアミノ酸配列に示されたタンパク質に狭く限定されるのではなく、１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質と相互作用する生理的機能を少なくとも備えており、「配列番号８」に示されるアミノ酸配列の一部アミノ酸が欠失、置換、付加あるいは挿入されているタンパク質も含まれる。
【００１１】
具体的には、本発明に係るスクリーニング方法によって、対象とするタンパク質間の相互作用の結合特性を変化（阻害又は増進）させ得る化合物のスクリーニングを実施することができる。かかる化合物は、対象とするタンパク質間相互作用が関連する疾病（疾患）に対する治療薬又は予防薬の候補となり得る。
【００１２】
このようなスクリーニングは、上記相互作用を検出するための反応条件に候補化合物を適切な濃度で添加して、相互作用に対する影響を調べる手法を含む。この手法は、従来の酵素標識免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ法）と同様の手法としてスクリーニング可能である。そして９６ウェルプレート上に１４−３−３あるいはＯＳＢＰを結合固定化し、そこにスクリーニング対象分子を添加し、さらにＯＳＢＰ（ＯＳＢＰを固定化した場合は１４−３−３）、標識抗体、基質の順で反応させ、スクリーニング対象物質が存在下でどのくらい１４−３−３とＯＳＢＰとの間の結合が変化するかを調べる。基質の発色が強い方が両者の結合は強いと言うことになる。
【００１３】
なお、薬物のスクリーニングは、ＮＭＲ分光学やＸ線結晶解析や電子顕微鏡等による一分子直接観察によっても可能である。また表面プラズモン共鳴センサ（ＳＰＲ）を用いても効率よくスクリーニング可能で、１４−３−３かＯＳＢＰのいずれかをやはりＳＰＲのセンサーチップ上に固定化し、スクリーニング対象分子を添加したＯＳＢＰ（ＯＳＢＰを固定化した場合は１４−３−３）をセンサーチップ上に送液する。両者の結合は表面プラズモン共鳴によりリアルタイムに結合曲線が観察され、両者の結合が強まれば結合曲線は増高し、弱まれば減弱あるいは消失する。
【００１４】
本発明では、第二に、高脂血症治療薬製造のために、１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質とオキシステロール結合タンパク質（ＯＳＢＰ）との間の相互作用を直接的に又は間接的に使用する手段を提供する。
【００１５】
高脂血症治療薬製造工程の過程において、例えば、前記スクリーニング方法を用いて目的の物質を選別し、この物質を高脂血症治療薬製造に利用することができる。あるいは、高脂血症治療薬の候補となる物質が正しく活性を持っているか否かを品質検査する場合に、前記相互作用を利用することができる。
【００１６】
本発明では、第三に、１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子からなる高脂血症診断用マーカーを提供する。即ち、１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質が、高脂血症に関与することが明らかであるＯＳＢＰと相互作用を示すという、本願発明者らの鋭意研究の結果によって得られた全くの新知見に基づいて、１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子は高脂血症の発症に関与することが判明した。なお、１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子を「配列番号９」〜「配列番号１７」に示す。
【００１７】
このことから、前記タンパク質の発現状態や遺伝子の変異や一塩基多型等を調べることによって、高脂血症の診断に役立てることができる。即ち、１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子は、高脂血症診断用マーカーとなる。
【００１８】
本発明では、第四に、１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子を用いる高脂血症の発症リスク評価方法を提供する。
【００１９】
高脂血症にＯＳＢＰを介して関与することがわかった１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質の発現状態を調べたり、該タンパク質のコードする遺伝子の変異や一塩基多型を調べたりすることによって、将来における高脂血症の発症リスク評価を行うことができる。
【００２０】
以上のように、高脂血症の発症に明らかに関与するタンパク質として知られているＯＳＢＰが、１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質と相互作用することが明らかになった結果、本発明は、前記相互作用並びに１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子は、高脂血症向け医薬の創薬技術、診断技術、検査技術、発症リスクの評価技術等に特に役立つという技術的意義を有する。
【００２１】
【実施例】
本願発明者らは、１４−３−３タンパク質ファミリーに属する「配列番号１」に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ３−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ／ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ５−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｂｅｔａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を用いた。この標的となるタンパク質（以下、単に「１４−３−３タンパク質」と称する。）を認識して相互作用を示す「パートナータンパク質」を以下の方法によって、効率的に探索した。なお、前記１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２〜７に示す。
【００２２】
次に、１４−３−３タンパク質を認識して相互作用するパートナータンパク質を以下の具体的方法によって、効率的に探索した。パートナータンパク質を見つけることを目的とする１４−３−３タンパク質の遺伝子（配列番号９）をｃＤＮＡとして準備した。前記１４−３−３タンパク質の遺伝子は、インビトロジェン（株）のＧｅｎｅＳｔｏｒｍから購入し，ＣＭＶプロモーターを有する哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んだ。
【００２３】
これに、タンパク質に構造的、機能的に影響を及ぼさないタグ（エピトープタグ）を選択して融合した。
【００２４】
具体的には、エピトープタグとして「ＦＬＡＧタグ」を選択した．タグの融合はＩｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いた（論文：Ｉｍａｉ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９１，  １９，  ２７８５）。１４−３−３タンパク質のカルボキシル末端にタグが付くように、ｃＤＮＡが組み込まれている発現ベクターに対するＰＣＲプライマーを設計し，増幅し目的のクローンを得た。
【００２５】
続いて、前記タグが融合された１４−３−３タンパク質遺伝子を培養細胞に導入した（トランスフェクト）。遺伝子導入する培養細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞，トランスフェクション試薬はキアゲン（株）のＰｏｌｙＦｅｃｔを用いた．導入の手順は同製品のプロトコールに従った。
【００２６】
前記培養細胞に導入された遺伝子は、前記タグが融合した組み換えタンパク質として細胞内に発現し、該細胞内に存在するパートナータンパク質と相互作用し複合体を形成する。
【００２７】
この複合体は、前記タグが付加されている。このため、前記タグに対する抗体を用いた公知の「免疫沈降法」によって、細胞内から抽出した。
【００２８】
抽出方法は、次の通りである。遺伝子導入した細胞を可溶化バッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌ，５０ｍＭＮａＦ，１ｍＭＮａ３ＶＯ４，１ｍＭＰＭＳＦ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を用いて可溶化した。この可溶化バッファーを加えたのち細胞を掻き取り遠心管に回収し超遠心（５５，０００回転，４℃，２０分）した。
【００２９】
遠心後の細胞抽出液（上清）にＦＬＡＧペプチド抗体を固定化したアガロースビーズ（ＳＩＧＭＡ社から購入）を加え４℃で３時間撹拌した。撹拌後のビーズを遠心（１，０００回転，４℃，１分）して集め可溶化バッファーで洗浄後，ＦＬＡＧペプチドを含むバッファーを加えることによりビーズに結合した１４−３−３タンパク質を溶出し，この１４−３−３タンパク質を含むタンパク質複合体を回収した。
【００３０】
抽出後は、公知のタンデム質量計（ＭＳ／ＭＳ）により、相互作用の相手となるたんぱく質を、「質量タグ法」と称される公知の方法（羊土社「プロテオーム解析法」、磯辺俊明、高橋信弘編、Ｐ１２９〜Ｐ１４２）によって同定した。
【００３１】
具体的には、まず解析前に抽出したサンプルを、特定のアミノ酸を認識し切断する酵素である「トリプシン」あるいは「リジルエンドペプチダーゼ」により消化分解する。なお、本実験では、リジルエンドペプチダーゼを用いた。
【００３２】
具体的には、本実験では、回収されたタンパク質複合体を遠心濃縮後、酵素反応用バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．８）に溶解した。酵素基質比（重量比）が１／１００から１／５０になるようにリジルエンドペプチダーゼを加え３７℃で１２時間反応させ、消化物を得た。
【００３３】
前記消化分解作業後、タンデムマス・スペクトロメトリーを用いて、分解された各ペプチドの質量値と内部アミノ酸配列情報を取得した。
【００３４】
酵素消化されたペプチド断片の質量値を用いて、データベース上から候補アミノ酸シークエンスを自動検索して選び出し、かつその配列が各アミノ酸でフラグメント化したときの質量値セットを計算した。
【００３５】
なお、前記データベースは、既に公開されているタンパク質データベースである「ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ」（インターネットアドレス：ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｓｐ＿ｔｒ＿ｎｒｄｂ／ｆａｓｔａ／ｓｐｒｏｔ．ｆａｓ．Ｚ）と核酸データベースである「ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ」（インターネットアドレス：ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／ｍＲＮＡ＿Ｐｒｏｔ／ｈｓ．ｆａａ．ｇｚ）を使用した。
【００３６】
この計算値と実測のフラグメントイオン（ＭＳ／ＭＳスペクトラム）を比較することによって、パートナータンパク質を同定したところ、高脂血症関連疾病に関与することが知られている「ＯＳＢＰ」であることが判明した。
【００３７】
これにより、１４−３−３タンパク質とＯＳＢＰは相互反応を示すことが明らかになった。なお、本解析で検出したＯＳＢＰタンパク質の酵素（リジルエンドペプチダーゼ）による酵素消化ペプチド（２ペプチド）のアミノ酸配列は、次の（１）、（２）の通りである。
【００３８】
（１）
ＮＹＳＤＧＳＥＴＳＳＥＦＳＫ
（Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ）
【００３９】
（２）
ＹＷＳＴＮＡＨＥＩＥＧＴＶＦＤＲＳＧＫ
（Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）
【００４０】
これらのペプチドのアミノ酸配列を基に同定されたＯＳＢＰタンパク質のアミノ酸配列を添付した「配列番号８」に示す。また、該ＯＳＢＰタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を「配列番号１８」〜「配列番号２３」に示す。
【００４１】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、高脂血症の発症に明らかに関与するたんぱく質として知られているＯＳＢＰが、１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質と相互作用することが明らかになった。このため、前記相互作用並びに１４−３−３タンパク質ファミリーに属するタンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子は、高脂血症向け医薬の創薬技術、診断技術、検査技術、発症リスクの評価技術等に特に有用である。
【００４２】
【配列表】
2004325205.tif 000002
2004325205.tif 000003
2004325205.tif 000004
2004325205.tif 000005
2004325205.tif 000006
2004325205.tif 000007
2004325205.tif 000008
2004325205.tif 000009
2004325205.tif 000010
2004325205.tif 000011
2004325205.tif 000012
2004325205.tif 000013
2004325205.tif 000014
2004325205.tif 000015
2004325205.tif 000016
2004325205.tif 000017
2004325205.tif 000018
2004325205.tif 000019
2004325205.tif 000020
2004325205.tif 000021
2004325205.tif 000022
2004325205.tif 000023
2004325205.tif 000024
2004325205.tif 000025
2004325205.tif 000026
2004325205.tif 000027
2004325205.tif 000028
2004325205.tif 000029
2004325205.tif 000030
2004325205.tif 000031
2004325205.tif 000032
2004325205.tif 000033
2004325205.tif 000034
2004325205.tif 000035
2004325205.tif 000036
2004325205.tif 000037
2004325205.tif 000038
2004325205.tif 000039
2004325205.tif 000040
2004325205.tif 000041
2004325205.tif 000042
2004325205.tif 000043
2004325205.tif 000044
2004325205.tif 000045
2004325205.tif 000046
2004325205.tif 000047
2004325205.tif 000048
2004325205.tif 000049
2004325205.tif 000050
2004325205.tif 000051
2004325205.tif 000052
2004325205.tif 000053
2004325205.tif 000054
2004325205.tif 000055
2004325205.tif 000056
2004325205.tif 000057
2004325205.tif 000058
2004325205.tif 000059
2004325205.tif 000060
2004325205.tif 000061
2004325205.tif 000062
2004325205.tif 000063