(57)【要約】【課題】ベンゾチアゾール類に作用し、それを分解する能力を有する新規微生物を土壌等の分離源からスクリーニングし、その微生物を用いてベンゾチアゾール類を温和な条件下で効果的に分解する方法を提供することにある。【解決手段】シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属し、ベンゾチアゾール類を分解する能力を有する微生物、または該微生物が産生する酵素を作用させることにより、ベンゾチアゾール類を分解する方法。【選択図】　図１
2004113104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属し、ベンゾチアゾール類を分解する能力を有する微生物、または該微生物が産生する酵素を作用させることにより、ベンゾチアゾール類を分解する方法。
【請求項２】
ベンゾチアゾール類の分解が、これらを含有する培地中で微生物を培養することによって行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
微生物が休止菌体である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
微生物がシュードモナス属　ＨＫＴ５５４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１２）または該菌株と実質的に同等の菌学的性質を有する菌株である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ベンゾチアゾール類が、ベンゾチアゾール系加硫促進剤である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ベンゾチアゾール類が、ベンゾチアゾール、２−メチルチオベンゾチアゾール、および２−メルカプトベンゾチアゾールから選ばれるいずれか１種または２種以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
シュードモナス属に属する微生物　ＨＫＴ５５４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１２）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シュードモナス属に属する微生物を用いた、ベンゾチアゾール類の分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
古タイヤは、処理が困難でしかもその必要処理量が膨大なことから、不法投棄や野積みが増加し、これが大きな環境問題となっている。天然ゴムをはじめとする高不飽和性ジエン系ゴムは、それ自体は熱可塑性であり、硫黄等の加硫剤と反応させてはじめて自動車用タイヤ等の実用に供しうる性能を発揮する。ゴムと硫黄との反応（加硫反応）を促進させ、製品の物性を向上させるためには、一般に加硫促進剤が必要である。この加硫促進剤としては、２−メルカプトベンゾチアゾール等のベンゾチアゾール系加硫促進剤がもっとも広く使用されている。しかし、加硫促進剤であるベンゾチアゾール類とゴムとの結合能力は低いため、水溶性の高いベンゾチアゾール類は野積みされた古タイヤ等から容易に溶出し、土壌中へと放出される。そして、放出されたベンゾチアゾール類は難分解性であるため、環境中に蓄積され、深刻な環境問題を引き起こす。
【０００３】
一方、ベンゾチアゾール類は殺菌作用を有するため、皮革製品の製造工程における防菌、防黴剤等としても利用されている。このように工業的に使用された後のベンゾチアゾール類は、工業排水中に含まれると活性汚泥処理の障害となる。これに対し、排水処理の前段に希釈槽を設けたり、前処理によりベンゾチアゾール類を除去する方法も提案されている（例えば、非特許文献１および２参照）が、十分な解決法とはなっていない。
【０００４】
ところで、ベンゾチアゾール類の単一の微生物による分解については、グラム陽性細菌であるロドコッカス属細菌によるベンゾチアゾールおよび２−ヒドロキシベンゾチアゾールの分解が報告されている（例えば、非特許文献３参照）。しかしながら、シュードモナス属のようなグラム陰性細菌については、ベンゾチアゾール類を分解する菌株を単離したとの報告は認められない。
【０００５】
グラム陰性菌は、グラム陽性菌とは異なり遺伝子工学的改変が容易なことから、ベンゾチアゾール類を分解可能なグラム陽性菌が単離されれば、これを改変して工業的に利用価値の高い形質転換体や変異株を作製することも可能になる。
【非特許文献１】
Ｔｏｅｌｇｙｅｓｓｙら　Ｊ．Ｒａｄｉｏａｎａｌ．Ｎｕｃｌ．　Ｃｈｅｍ．　１０７，　３１５−３２０　（１９８６）
【非特許文献２】
Ｔａｎａｋａら、工業技術院発酵研究所研究報告　３３，　１９−２９　（１９６８）
【非特許文献３】
Ｂｅｓｓｅら、Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６７，　１４１２−１４１７　（２００１）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ベンゾチアゾール類に作用し、これを分解する能力を有する新規微生物を土壌等の分離源からスクリーニングし、当該微生物を用いてベンゾチアゾール類を温和な条件下で効果的に分解する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは土壌からのスクリーニングによって採取したシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属　ＨＫＴ５５４株にベンゾチアゾール類を分解する能力があることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（７）に関するものである。
（１）　シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属し、ベンゾチアゾール類を分解する能力を有する微生物、または該微生物が産生する酵素を作用させることにより、ベンゾチアゾール類を分解する方法。
（２）　ベンゾチアゾール類の分解が、これらを含有する培地中で微生物を培養することによって行われる、上記（１）記載の方法。
（３）　微生物が休止菌体である、上記（１）または（２）記載の方法。
（４）　微生物がシュードモナス属　ＨＫＴ５５４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１２）または該菌株と実質的に同等の菌学的性質を有する菌株である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）　ベンゾチアゾール類が、ベンゾチアゾール系加硫促進剤である、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）　ベンゾチアゾール類が、ベンゾチアゾール、２−メチルチオベンゾチアゾール、および２−メルカプトベンゾチアゾールから選ばれるいずれか１種または２種以上である、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（７）　シュードモナス属に属する微生物　ＨＫＴ５５４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１２）。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属し、ベンゾチアゾール類を分解する能力を有する微生物、または該微生物が産生する酵素を作用させることにより、ベンゾチアゾール類を分解する方法に関する。
【００１０】
１．　ベンゾチアゾール類
本発明において、分解対象となるベンゾチアゾール類は、下式（Ｉ）に示されるベンゾチアゾール骨格を有する化合物を意味し、ベンゾチアゾールおよびその誘導体、ならびにこれらの塩類の全てを含むものとする。
【００１１】
【化１】
2004113104.tif 000003
（式中Ｒは、任意の置換基を示す。）
【００１２】
特に、上記ベンゾチアゾール類が加硫促進剤の場合は、Ｒはメルカプト基で、ベンゾチアゾール類は２−メルカプトベンゾチアゾールまたはその誘導体、ならびにこれらの塩類であることが好ましい。例えば、加硫促進剤として利用されているベンゾチアゾール類としては、２−メルカプトベンゾチアゾール（ＭＢＴ）　およびその亜鉛塩、２−メルカプトベンゾチアゾールのシクロヘキシルアミン塩、ジ−２−ベンゾチアゾリルジスルフィド（ＭＢＴＳ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルチオカルバモイルチオ）ベンゾチアゾール、２−（４’−モルホリノジチオ）ベンゾチアゾール、Ｎ−ｔ−ブチル−２−ベンゾチアゾリルスルフェンアミド（ＴＢＢＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ベンゾチアゾリルスルフェンアミド（ＣＢＳ）、Ｎ−オキシジエチレン−２−ベンゾチアゾリルスルフェンアミド（ＭＢＳ）、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−２−ベンゾチアゾリルスルフェンアミド（ＤＣＢＳ）、ならびに２−（２，４−ジニトロ−フェニル）−メルカプトベンゾチアゾール等が挙げられる。
本発明では、後述する実施例において、ベンゾチアゾール、２−メチルチオベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾチアゾールの分解方法を具体的に例示する。
【００１３】
２．　微生物
２．１　微生物の特性
本発明の方法で用いられる微生物は、シュードモナス属に属し、ベンゾチアゾール類を分解する能力を有する微生物であれば特に限定されない。そのような微生物としては、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属　ＨＫＴ５５４株、および該菌株と実質的に同等の菌学的性質を有する菌株を挙げることができる。ここで、「実質的に同等の菌学的性質を有する菌株」とは、ＨＫＴ５５４株を起源とし、該菌株と同様にベンゾチアゾール類を分解する能力を有しているが、その起源である菌株とは他の１つ以上の性質において異なっている菌株を意味する。そのような菌株としては、ＨＫＴ５５４株の変異株や形質転換体を挙げることができる。
本明細書中においては、ＨＫＴ５５４株には、このような「それらと実質的に同等の菌学的性質を有する菌株」をも含むものとする。
【００１４】
本発明のシュードモナス属に属する微生物は、一般にロドコッカス属細菌に比べて有機溶媒耐性が高く、したがって、より効率的にベンゾチアゾール類を分解することができる。また、シュードモナス属細菌はグラム陰性菌であり、グラム陽性菌であるロドコッカス属細菌に比べて遺伝子工学的改良が容易であるため、活性の高いプロモーターを導入するなど、分解効率を高めるための種々の改変も可能である。
【００１５】
２．２　シュードモナス属　ＨＫＴ５５４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１２）
次に、本発明で用いられる微生物の好適な例である、シュードモナス属　ＨＫＴ５５４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１２）について説明する。
このシュードモナス属　ＨＫＴ５５４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１２）は、本発明者が日本各地より採取した多種類の土壌をスクリーニングすることによって見出したもので、その菌学的性質は後述する実施例１の表１に記載のとおりである。
【００１６】
なお、ＨＫＴ５５４株は１，２−［ｂ］−ナフトチオフェンの脱硫を指標としたスクリーニングによって得られた菌株のうち、さらなる研究によって、ベンゾチアゾール類の分解能力があることが確かめられた菌株である。
【００１７】
上記ＨＫＴ５５４株の菌学的性質をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ．２（１９８６）およびＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　第９版　（１９９４）と照合し、ＨＫＴ５５４株はシュードモナス属に属するものと同定された。ＨＫＴ５５４株は、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００２年９月１３日付で寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１２を得ている。
また、このＨＫＴ５５４株の１６ＳｒＲＮＡの部分配列（３５２ｂｐ）は、２００２年３月１４日付けで、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ　データベースにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＢ０８１５９２として登録されている。
【００１８】
２．３．　微生物が産生する酵素
本発明の分解方法では、微生物に代えて、該微生物が産生するベンゾチアゾール類分解活性を有する酵素を単離し、この酵素を直接基質に作用させてもよい。そのような酵素は、当該分野で周知の技術を用いて、該微生物あるいは該微生物の培養液から容易に調製することができる。例えば、上記微生物の菌体を含む培養液から、その酵素活性を指標としてクロマトグラフィー等を利用して単離精製することができる。酵素が一旦単離精製されれば、公知の方法にしたがい、該酵素の遺伝子を単離し、これを導入した形質転換体を作製することにより、酵素を大量生産して用いることも可能である。
【００１９】
３．　ベンゾチアゾール類の分解
ベンゾチアゾール類の分解は、以下に記載するような培地にベンゾチアゾール類を添加し、ベンゾチアゾール類を含有する培地中で前記微生物を培養することにより実施することができる。
添加されるベンゾチアゾール類の培地中の濃度は、好ましくは５〜１０，０００ｐｐｍであり、より好ましくは　２５〜２００　ｐｐｍである。
【００２０】
３．１　微生物の培養条件
微生物の培養は、微生物の通常の培養法にしたがって行われる。培養の形態は固体培養でも液体培養でもよいが、液体培養が好ましい。
【００２１】
培地の栄養源としては通常用いられているものを広く用いることができる。すなわち、炭素源としては、利用可能な炭素化合物であれば特に限定されず、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、コハク酸、クエン酸、酢酸などを使用することができる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であれば特に限定されず、例えば、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物、などの有機栄養物質を使用できる。ベンゾチアゾール類の分解反応に影響を与える可能性のある硫黄化合物を含まない培地で培養することが望ましい場合には、塩化アンモニウムのような無機窒素化合物も使用できる。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン類、などを必要に応じて用いてもよい。
【００２２】
培養は、微生物が生育可能な温度、ｐＨで行われ、使用する微生物の最適培養条件で行うことが好ましい。一般的には、例えば、ｐＨ６〜８、温度２５〜３７℃、好ましくは約３０℃付近にて、振盪または通気条件下で好気的に培養される。
【００２３】
３．２　休止菌体の調整
ベンゾチアゾール類の分解反応に供される微生物はどのような状態のものであってもよいが、休止菌体を用いることが好ましい。休止菌体は、例えば、以下のようにして調製することができる。
【００２４】
まず、新鮮な培地に対し適当量、例えば１〜２％容量の種菌を接種し、ｐＨ６〜８、温度２５〜３７℃、好ましくは約３０℃付近で、１〜２日間往復あるいは回転振とう培養を行う。この際、種菌としては対数増殖期初期から定常期のいずれの状態の菌でも構わないが、対数増殖期後期のものが好適である。また、接種量は必要に応じて増減してもよい。
【００２５】
培地としては、特に限定するものではないが、硫安を添加したＡ培地（Ｉｚｕｍｉ　Ｙ．，Ｏｈｓｈｉｒｏ　Ｔ．，Ｏｇｉｎｏ　Ｈ．，Ｈｉｎｅ　Ｙ．，Ｓｈｉｍａｏ　Ｍ．，　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　２２３−２２６　（１９９４））を用いることが好適である。培養後、菌体を培地から分離集菌し、洗浄することにより休止菌体が得られる。ここで、集菌は、培養菌体が対数増殖期初期から定常期までのいずれの状態にある時に行ってもよいが、対数増殖期中期から後期の状態にある時に行うことが好ましい。また、集菌は、遠心分離の他、濾過、沈降分離等のいかなる方法で行ってもよい。菌体の洗浄には、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等の任意の緩衝液を使用することができ、また、水を用いて洗浄することもできる。
【００２６】
３．３　休止菌体による分解反応
休止菌体による分解反応は、休止菌体を適当な緩衝液に懸濁して調製した菌懸濁液に、基質であるベンゾチアゾール類を添加して培養・増殖させることにより行う。
【００２７】
前記緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等、種々の緩衝液を使用することができる。緩衝液のｐＨは特に限定されないが、ｐＨ６〜８が好適である。また、緩衝液の代わりに、水や培地等を使用することもできる。菌体懸濁液の濃度は、ＯＤ６６０が１〜１００の間が好適であり、必要に応じて増減できる。基質であるベンゾチアゾール類の培地中の濃度は、好ましくは５〜１０，０００ｐｐｍであり、より好ましくは　２５〜２００ｐｐｍであるが、必要に応じて増減できる。反応温度は２５〜３７℃、好ましくは３０℃付近が好適であるが、特に限定されない。また反応時間は、通常１〜５００時間の間で、培地中のベンゾチアゾールの量や用いる微生物の量によって適宜設定すればよい。また、基質を添加する前に反応温度と同じ温度に反応液を予備加熱してから行ってもよい。
以上の分解反応は、休止菌体に代えて、微生物が産生する酵素を用いて同様に行ってもよい。
【００２８】
３．４　分解率および分解産物の同定
前記微生物によるベンゾチアゾール類の分解率は、例えば、高速液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー／質量スペクトル、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー／質量スペクトル分析などを使用して測定することができる。
【００２９】
また、前記微生物によるベンゾチアゾール類の分解産物は、例えば、以下のようにして同定することができる。まず、ベンゾチアゾール類を唯一の硫黄源として含む培地でＨＫＴ５５４株を前項にしたがって培養し、この培養液中から分解産物を抽出する。抽出方法は、公知の方法にしたがい、例えば、培養液を適当なｐＨに調整した後、酢酸エチル等を用いて撹拌抽出する。抽出に使用する溶媒は、酢酸エチルに限定されるものではなく、目的とする反応生成物が抽出できるものであればいずれの溶媒を用いても構わない。抽出溶媒の量は反応液に対して等量程度が好適であるが、必要に応じて増減できる。
【００３０】
次に、抽出物を適当な方法を用いて分離する。分離方法は、分解産物が分離できる方法であればいかなる方法を用いても構わない。分解産物の分析は、液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー／質量スペクトル分析、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー／質量スペクトル分析、ガスクロマトグラフィー／原子発光検出分析、ガスクロマトグラフィー／フーリエ変換赤外分光分析、１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル分析、紫外線吸収スペクトル分析などを使用して行うことができる。また、必要に応じて他の分析方法を併せて利用しても構わない。こうして得られた分析データを解析することによって、ベンゾチアゾール類の分解産物を同定することができる。
【００３１】
４．　ベンゾチアゾール類の分解方法の利用
本発明にかかる、ベンゾチアゾール類の分解方法は、不法投棄や野積みされた古タイヤによって汚染された土壌や、ベンゾチアゾール類を含む工業用排水の処理に利用することができる。
【００３２】
例えば、ベンゾチアゾール類に汚染された土壌に、培養した菌体の懸濁液または凍結乾燥物を直接散布し、定期的に土壌を攪拌したり、培地成分を含む水溶液を散布したりしながら、汚染土壌中のベンゾチアゾール類を微生物によって分解させることができる。この場合、汚染土壌そのものが微生物増殖のための培地となる。同様に、ベンゾチアゾール類を含む工業用排水を、必要ならば適当な処理を施した後、本発明のシュードモナス属細菌、あるいはこれを培養した菌体懸濁液を加えて、工業用排水中のベンゾチアゾール類を分解させることができる。
【００３３】
上記の処理方法は、微生物を用いて行われるため、常温常圧下でベンゾチアゾール類の分解処理を行うことができ、経済的にも、環境的にも優れた方法といえる。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。
〔実施例１〕　脱硫微生物　シュードモナス属　ＨＫＴ５５４株の単離と同定
１．微生物の単離
目的の微生物の分離には、１，２−［ｂ］−ナフトチオフェンを唯一の硫黄源として含むＡＳ培地（Ｔ．　Ｍａｔｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ，　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　５７：　２１２−２１５　（２００１））を使用した。まず、シリコン栓付試験管（容量２７ｍｌ、直径１８ｍｍ×長さ１８０ｍｍ）に培地５ｍｌ、１０ｇ／ｌの１，２−［ｂ］−ナフトチオフェン／ジメチルホルムアミド溶液を０．０１ｍｌ、および日本各地より採集した土壌１スパーテル（約０．５ｇ）を加え、３０℃で一週間振盪培養（振盪速度２４０ｒｐｍ）し集積培養を行った。培地に濁りの認められた試料については、その培養液０．２ｍｌを新鮮な同培地に加え、集積培養を３〜４回繰り返した。これらの集積培養により菌体の増殖が認められた試料について、培養物を生理食塩水にて希釈した。得られた希釈液を、ＮＡＧ培地（Ｄｉｆｃｏ社　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ　２３ｇ／Ｌ，　グルコース　１０ｇ／Ｌ）上に塗布し、３０℃で靜置培養してコロニーを形成させた。形成したコロニーの一部をベンゾチオフェンを含む培地に植菌し、ベンゾチオフェンの分解を調べた。ベンゾチオフェンの分解が認められたコロニーを選択し、前述の一連の操作を２回〜３回繰り返すことにより目的の菌株を単離した。
【００３５】
２．微生物の同定
生育の確認されたサンプルからＨＫＴ５５４を分離し、その菌学的性質を調べたところ、表１のとおりであった。
【００３６】
【表１】
2004113104.tif 000004
【００３７】
上記菌学的性質をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ．２（１９８６）およびＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　第９版（１９９４）と照合し、ＨＫＴ５５４株はシュードモナス属に属するものと同定された。ＨＫＴ５５４株は、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００２年９月１３日付で寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０１２を得ている。
また、ＨＫＴ５５４株の１６ＳｒＲＮＡの部分配列（３５２ｂｐ）は、２００２年３月１４日付けで、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ　データベースに登録番号ＡＢ０８１５９２で登録されている。
【００３８】
〔実施例２〕シュードモナス属　ＨＫＴ５５４株による２−メチルチオベンゾチアゾールの分解
１．試験方法
硫酸アンモニウム　５００　ｍｇ／ｌ、グルコース１０　ｇ／１を含むＡ培地（Ｉｚｕｍｉ　Ｙら、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　２２３−２２６　（１９９４））２　ｍｌに、２−メチルチオベンゾチアゾール（東京化成社製）を０．１　ｍＭ添加し、１白菌耳量のシュードモナス属　ＨＫＴ５５４株を植菌し、３０℃で７２時間培養した。得られた培養液の６６０　ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６６０）を測定したところ、１．１５であった。
【００３９】
培養後の液を７０００　ｒｐｍ　１０分の条件で遠心分離により菌体を除去した後、得られた上清を高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて、カラムＮｏｖａ−Ｐａｋ　Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社）、溶出液　０．１％　トリフルオロ酢酸水溶液：メタノール＝３０：７０、溶出液流速　１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２５４ｎｍで分析した。
【００４０】
２．結果
培養開始時に保持時間６．７分の位置に検出された２−メルカプトベンゾチアゾールは消失していた。培養と並行して同一時間、同一温度で振とうした、微生物を植菌しないベンゾチアゾール含有培地を分析した場合の２−メチルチオベンゾチアゾール濃度は０．１　ｍＭであった。以上の結果から、ＨＫＴ５５４株は２−メチルチオベンゾチアゾールを分解することが確認された。
【００４１】
〔実施例３〕シュードモナス属　ＨＫＴ５５４株によるベンゾチアゾールおよび２−メルカプトベンゾチアゾールの分解
１．試験方法
２−メチルチオベンゾチアゾールの代わりにベンゾチアゾールまたは２−メルカプトベンゾチアゾールを添加する以外は実施例２と同様の方法で、ＨＫＴ５５４株の培養を行い、培養後の液を同様にＨＰＬＣで分析した。
【００４２】
２．結果
結果を表２に示す。その結果、０．１　ｍＭ添加されたベンゾチアゾールは培養後完全に分解され、同様に０．１　ｍＭ添加された２−メルカプトベンゾチアゾールは、残存濃度０．０８６ｍＭと、ほぼ完全に分解された。以上の結果から、ＨＫＴ５５４株はベンゾチアゾールおよび２−メルカプトベンゾチアゾールを分解することが確認された。
【００４３】
【表２】
2004113104.tif 000005
【００４４】
〔実施例３〕　休止菌体によるベンゾチアゾール類の分解方法
１．試験方法
硫酸アンモニウム　５００　ｍｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／１を含むＡ培地（Ｉｚｕｍｉ　Ｙら、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　２２３−２２６　（１９９４））１００ｍｌに、１白菌耳量のシュードモナス属　ＨＫＴ５５４株を植菌し、３０℃で７２時間培養した。
【００４５】
得られた培養液を４℃、１０，０００　ｒｐｍ，５　ｍｉｎ　の条件で遠心分離し、沈殿を滅菌水およびｐＨ　７．０の１／１５Ｍ　リン酸緩衝液にて各１回洗浄した後、同緩衝液に懸濁して反応用菌体（休止菌体）とした。この反応用菌体の測定波長６６０　ｎｍでの濁度は１０であった。
【００４６】
分解反応は、反応用菌体２　ｍｌの入った２０　ｍｌ容の試験管にベンゾチアゾール、２−メチルチオベンゾチアゾール、または２−メルカプトベンゾチアゾールを最終濃度０．１　ｍＭ、グルコースを１０ｇ／ｌになるように加え、３０℃にて往復振とうすることにより行った。
【００４７】
残存ベンゾチアゾール類の測定は、一定時間反応後の反応液を１５０００　ｒｐｍ，　２　ｍｉｎの条件で遠心分離し、得られる上清を実施例２と同様の方法で高速液体クロマトグラフィーにより定量することにより行った。なお、ベンゾチアゾール類の水中での自発的分解量は、各種ベンゾチアゾール０．１ｍＭを分解反応と同じ緩衝液に溶解したものを用いて同様の反応を行って測定した。
【００４８】
２．結果
上記分解反応における残存ベンゾチアゾール量の経時変化を図１に示す。その結果、いずれのベンゾチアゾール類も、ＨＫＴ５５４株の反応用菌体（休止菌体）により分解され、２０−１２０時間後には８０％以上が消失することが確認された。
【００４９】
【発明の効果】
本発明によれば、難分解性のベンゾチアゾール類を温和な条件下で効果的に分解することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＨＫＴ５５４菌体によるベンゾチアゾール類分解反応における、残存ベンゾチアゾール類の経時変化を示すグラフである。
図中、○：ベンゾチアゾール（菌体添加）、●：ベンゾチアゾール（菌体無添加）、△：２−メチルチオベンゾチアゾール（菌体添加）、▲：２−メチルチオベンゾチアゾール（菌体無添加）、□：２−メルカプトベンゾチアゾール（菌体添加）、■：２−メルカプトベンゾチアゾール（菌体無添加）を示す。
【図１】
2004113104.tif 000006