(57)【要約】【課題】セルロース分解能を有する新菌株、その利用方法および増殖促進法を提供する【手段】本発明の新菌株は、セルロース分解能を有し、且つ１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が配列番号１記載の配列と９０％以上の相同性を示す且つ／又はセルラーゼ遺伝子の塩基配列が配列番号２記載の配列と８０％以上の相同性を示す、クロストリジウムに属する菌株である。代表的には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２６）が挙げられる。本発明の新菌株を、セルロースを含む有機性廃棄物及び／又は廃水中で、酸発酵及びメタン発酵微生物と共に用いることにより、該有機性廃棄物及び／又は廃水に含まれるセルロースを分解処理してメタンガスとして回収することができる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース分解能を有し、且つ１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１記載の配列と９０％以上の相同性を示す、クロストリジウムに属する新菌株。
【請求項２】
セルラーゼ遺伝子の塩基配列が、配列番号２記載の配列と８０％以上の相同性を示す、請求項１に記載の新菌株。
【請求項３】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２６）である、請求項１又は２に記載の新菌株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の新菌株を用いて、有機性廃棄物及び／又は廃水に含まれるセルロースを分解処理することを特徴とする、有機性廃棄物及び／又は廃水の処理方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の新菌株を、セルロースを含む有機性廃棄物及び／又は廃水中で、酸発酵及びメタン発酵微生物と共に用いることにより、該有機性廃棄物及び／又は廃水に含まれるセルロースを分解処理してメタンガスとして回収することを特徴とするメタン発酵方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の新菌株の培養環境である有機性廃棄物及び／又は廃水を高温度に保つことを特徴とする、請求項５に記載のメタン発酵方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の新菌株の培養環境であるセルロースを含む有機性廃棄物及び／又は廃水を高温度に保つことを特徴とする、新菌株の増殖促進法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の新菌株を含有することを特徴とするセルロース分解除去剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セルロース分解能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属に属する新菌株、それを利用した処理方法、その増殖促進法、およびそれを含むセルロース分解除去剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、人口の増加や生活の高度化に伴って、家庭や様々な産業から排出される廃棄物の量が増加して来ている。なかでも、下水汚泥や生ごみなどの高有機物含有廃棄物については、主に埋め立てや海洋投棄、焼却による処理が行われてきた。しかしながら、日本国内では恒常的な埋め立て地不足に悩まされており、また有機性廃棄物の焼却に関しても、それに伴うダイオキシン類などの発生について問題視されて来ている。さらに、ロンドン条約の改正（岸辺和美、ロンドン条約付属書改正について、バイオサイエンスとインダストリー、１９９４年、Ｖｏｌ．５２，　Ｎｏ．　７）に伴い、下水汚泥や産業廃棄物の海洋投棄や洋上焼却が禁止されることとなった。このような背景から、有機性廃棄物の適切な処理方法の開発は急務であるといえる。
【０００３】
下水余剰汚泥や畜産廃棄物の生物学的な処理・減容化方法として、メタン発酵技術が知られている。この技術では、嫌気的な環境条件下で複数の嫌気性微生物群の連係プレーにより、有機物をエネルギーとしてのメタンガスにまで転換することができる。しかしながら、難分解性の固形性有機物であるセルロースを多く含有する、下水汚泥、生ゴミ、古紙、製紙工場やパルプ工場からの排水のメタン発酵処理では、その加水分解・酸生成反応が律速となっており、３０〜４０日程度の長い処理時間を必要とするうえ、有機物分解率（メタンへの転換率）も、易分解性の廃水などと比較してかなり低い（Ｄｅ　Ｂａｅｒｅ　Ｌ．，　Ａｎａｅｒｏｂｉｃ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｌｉｄ　ｗａｓｔｅ：　ｓｔａｔｅ−ｏｆ−ｔｈｅ−ａｒｔ，　Ｗａｔｅｒ　Ｓｃｉ．　Ｔｅｃｈｎｏｌ．，　２０００；４１（３）：２８３−９０）。すなわちメタン発酵を中心とした高効率な有機性廃棄物の処理技術を確立するためには、高いセルロース分解能を有し、メタン発酵汚泥などのような嫌気的な条件下で生育可能な微生物およびその増殖促進法の開発が待たれている。
【０００４】
セルロース分解微生物の研究は比較的長く、草食動物の管腔（ルーメン）に生息する微生物や（Ｈｕｎｇａｔｅ　Ｒ．Ｅ．，　Ｍｅｔｈａｎｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ−ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｕｍｅｎ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ．　ＥｘｐｅｒｉｅｎｔｉａＳｕｐｐｌ．，　１９８２；４３：１１７−２０）、堆肥や土壌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ，　Ｍｃｂｅｅ　Ｒ．Ｈ．　Ｔｈｅ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ．　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１９５３；５０５−５０６）、コンポスト（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ，　Ｍａｄｄｅｎ　Ｒ．Ｈ．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｔｒａｃｏｒａｒｉｕｍ　ｓｐ．　ｎｏｖ．，　Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ　Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ．　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｓｙｓｔ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１９８３；３３：８３７−８４０、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｊｏｓｕｉ，　Ｓｕｋｈｕｍａｖａｓｉ　Ｊ．，　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｊｏｓｕｉ　ｓｐ．　ｎｏｖ．，　ａ　Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ，　Ｍｏｄｅｒａｔｅ　Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ　Ｓｐｅｃｉｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｔｈａｉ　Ｃｏｍｐｏｓｔ．　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１９８８；３８：１７９−１８２　）、底泥（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ，　Ｊａｎｎａｓｃｈ　Ｈ．Ｗ．，Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ　ｓｐ．　ｎｏｖ．　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ，　ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｕｓ　Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ．　Ａｒｃｈ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　１９８８；１５０：１０３−１０４）、温泉（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　　ｗｉｅｇｅｌｉｉ，　Ｃｏｏｋ　Ｇ．Ｍ．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｎｅｗ　Ｏｂｌｉｇａｔｅｌｙ　Ａｎａｅｒｏｂｉｃ　Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ，　Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｗｉｅｇｅｌｉｉ　ｓｐ．　ｎｏｖ．　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１９９６；４６：１２３−１２７）などから分離された微生物が報告されている。
【０００５】
しかしながら、セルロース含有廃棄物・廃水の処理を目的としたメタン発酵微生物群集において優占的にセルロース分解に寄与する微生物群に関する情報は著しく少なかった。
単離したセルロース分解菌をメタン発酵などの複数の微生物群が混在する環境に添加することによってセルロースの分解能を高めようという、いわゆるバイオオーグメンテーション技術に関する幾つかの研究例が報告されている。Ｍｌａｄｅｎｏｖｓｋａ　Ｚ．は糞尿のメタン発酵において、そこに含まれるセルロース等の繊維分の分解を促進させるためにセルロース分解菌の投与を行った。しかしながら、系外から投与した分解菌のメタン発酵系内での定着には成功しておらず、セルロース分解能を高めることが出来なかった（Ｍｌａｄｅｎｏｖｓｋａ　Ｚ．，　Ｂｉｏａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ　ｂｉｏｇａｓ　ｒｅａｃｔｏｒ　ｂｙ　ａｎａｅｒｏｂｉｃ　ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃ−ａｎｄ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ，　Ａｎａｅｒｏｂｉｃ　Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，　２００１；１８３−１８８）。この様に、様々な嫌気性微生物群の存在するメタン発酵などの微生物群集において、有用細菌の利用を行う場合には、その汚濁物質に対する分解能の高さのみならず、微生物群集において定着できる能力を有する細菌を選択し、その利用法を開発する必要がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、難分解性の固形性有機物であるセルロースに対し高い分解能を有する嫌気性微生物を選択すること、及びこれを用いて有機性廃棄物や廃水に含まれるセルロースを迅速に分解するための手段を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、セルロース分解メタン発酵微生物群集内で、セルロース分解に伴って菌数の増加する一群の新菌株を見いだし、またそれら菌株の単離と増殖温度特性の調査により、培養環境を高温度に保つことにより本発明の一群の新菌株の増殖が促進されることを見いだし本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、セルロース分解能を有し、且つ１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１記載の配列と９０％以上の相同性を示す、クロストリジウムに属する新菌株群に関する。
更に、本発明の新菌株は、セルラーゼ遺伝子の塩基配列が、配列番号２記載の配列と８０％以上の相同性を示す。本発明の新菌株群のうちの１つは、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２６）である。
【０００８】
本発明の新菌株群において、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の相同性は、他の菌種と区別するためには９０％以上でよいが、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上である。また、そのセルラーゼ遺伝子の相同性は、他の菌種と区別するためには８０％以上でよいが、好ましくは８３％以上で、より好ましくは８５％以上である。
本発明の新菌株は、上記の様にセルロースに対して分解能を持てば良いが、セロビオースに対して分解能を持つことが好ましい。
【０００９】
他の側面において本発明は、上記新菌株群のいずれか、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株を用いて、有機性廃棄物及び／又は廃水に含まれるセルロースを分解処理することを特徴とする、有機性廃棄物及び／又は廃水の処理方法を提供する。
更に本発明は、上記新菌株を、セルロースを含む有機性廃棄物及び／又は廃水中で、酸発酵及びメタン発酵微生物と共に用いることにより、該有機性廃棄物及び／又は廃水に含まれるセルロースを分解処理してメタンガスとして回収することを特徴とするメタン発酵方法を提供する。
更に本発明は、上記新菌株の培養環境である有機性廃棄物及び／又は廃水を高温度に保つことを特徴とするメタン発酵方法を提供する。その培養環境は、好ましくは４５℃〜６５℃、より好ましくは５０〜６０℃になるように制御される。
【００１０】
更なる他の側面において本発明は、上記新菌株の培養環境であるセルロースを含む有機性廃棄物及び／又は廃水を高温度に保つことを特徴とする、新菌株の増殖促進法を提供する。
更なる他の側面において本発明は、上記新菌株を含有することを特徴とするセルロース分解除去剤を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の新菌株群の一例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株を挙げることができる。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株は、以下のようにして単離されたものである。
し尿、浄化槽汚泥、生ゴミを処理しているメタン発酵槽より採取した消化汚泥１００　ｍＬ（乾燥重量約１５ｇ）をセルムバイアル瓶に入れ、セルロースパウダーを１ｇ、アンモニア性窒素（１３０ｍｇ−Ｎ／Ｌ）、リン酸カリウム（５０ｍｇ−Ｐ／Ｌ）、酵母エキス（５０ｍｇ）を加えて、嫌気的条件下（溶存酸素濃度０ｍｇ／Ｌ，　酸化還元電位　−２００ｍＶ以下）、５５℃、ｐＨ７〜７．５で振とう培養した。セルムバイアル瓶内の汚泥中の細菌叢の変化とセルロースの分解状況を解析し、セルロース分解能を有する菌株を発見、単離した。
【００１２】
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２６として寄託されている（寄託日：平成１４日９年１９日）ので、この機関より入手することができる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株以外の本発明の新菌株は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株と同様に消化汚泥などからセルロースに対する分解能を指標として選択することができ、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子及び／又はセルラーゼ遺伝子を解析することによって同定できる。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株の菌学的性質及び分類上の位置は以下の通りである。
【００１３】
（ａ）形態学的性状
菌学的性質については、形態的にはかん菌で、運動性があり、生理学的にはグラム陰性で、至適温度は５５℃、基質特異性は表１に示すとおりであった。
【００１４】
【表１】
2004113067.tif 000002
【００１５】
（ｂ）１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子及びセルラーゼ遺伝子
１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子及びセルラーゼ遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示すとおりである。なお、配列番号３は、配列番号２のセルラーゼ遺伝子によりコードされる推定アミノ酸配列を示す。
【００１６】
（ｃ）分類上の位置
１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の相同性と生化学的分類試験結果から、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株は、バチルス／クロストリジウムグループ、クロストリジウム属に属すものであると同定された。
しかしながら、下記に示されるように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子及びセルラーゼ遺伝子に対して、それぞれ９０％及び８０％以上の相同性を示す菌株は、既存の種に属する菌種としては存在しないことから、既存の種に属さない細菌であると同定した。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と相同性の高い１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子としては、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．，　Ｇｉｓｈ，　Ｗ．，　Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｗ．，　Ｍｙｅｒｓ，　Ｅ．Ｗ．　＆　Ｌｉｐｍａｎ，　Ｄ．Ｊ．　（１９９０）　”Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ．”　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１５：４０３−４１０）による遺伝子データベース上の既知遺伝子との比較と、ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ　（Ｈｉｇｇｉｎｓ，　Ｄ．　Ｇ．，　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，　Ｊ．　Ｄ．　ａｎｄ　Ｇｉｂｓｏｎ，　Ｔ．　Ｊ．　（１９９６）　Ｕｓｉｎｇ　ＣＬＵＳＴＡＬ　ｆｏｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　２６６，　３８３−４０２）による相同性解析により、クロストリジウム　サーモセラム（ＤＳＭ１２３７；　Ｒａｉｎｅｙ，Ｆ．　Ａ．，　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎａｅｒｏｂｉｃ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ：　Ａｉｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１９９３；１７５（１５）４７７２−４７７９）の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、クロストリジウム　アルドリッチの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、アセチビブリオ　セルロリチカス（ＡＴＣＣ３３２８８）の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、バクテロイド　セルロソロヴァンス（ＡＴＣＣ３５６０３）の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子、クロストリジウム　スターコラリウムサブスピーシーズ　レプトスパタムの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を例示することができる。
それら１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株との間の相同性は、次の通りであった。
【００１７】
クロストリジウム　サーモセラム：
８８％（１−１６２３ｂｐ）
クロストリジウム　アルドリッチ：
８７％（１−１６２１ｂｐ）
アセチビブリオ　セルロリチカス：
８６％（４−１６０５ｂｐ）
バクテロイド　セルロソロヴァンス：
８５％（４−１６０５ｂｐ）
クロストリジウム　スターコラリウムサブスピーシーズ
のレプトスパタム：　８４％（１−１６２２ｂｐ）
このように、本発明の新菌株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の全長について９０％以上の相同性を示す遺伝子を持つ細菌株についての報告例はない。
【００１８】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株のセルラーゼ遺伝子の塩基配列と相同性の高いセルラーゼ遺伝子は、遺伝子バンクの検索結果とＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗによる相同性解析結果より、クロストリジウム　サーモセラムのｃｂｈＡ遺伝子（Ｚｖｅｒｌｏｖ，　Ｖ．Ｖ．，　Ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍａｌ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ＣｂｈＡ．　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１９９８；１８０（１２）３０９１−３０９９）と、クロストリジウム　サーモセラムのｃｅｌＫ遺伝子（Ｋａｔａｅｖａ，　Ｉ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ＣｅｌＫ，　ａ　ｍａｊｏｒ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ：　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１９９９；１８１（１７）５２８８−５２９５）が挙げられる。それらセルラーゼ遺伝子のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株との間の相同性は、次の通りであった。
【００１９】
クロストリジウム　サーモセラムの
ｃｂｈＡ遺伝子：７９％（１−１１０９ｂｐ）
クロストリジウム　サーモセラムの
ｃｅｌＫ遺伝子：７２％（１−１００９ｂｐ）
このように、本発明の新菌株のセルラーゼ遺伝子と８０％以上の相同性を示す遺伝子を有する細菌種についても現在までに報告されていない。
【００２０】
以上の事実から、本発明の新菌株群は、以下の（１）〜（４）の点で、クロストリジウム属において他の菌種と区別される新菌種に属するものであると考えられる。
（１）１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号１記載の配列と９０％以上の相同性を有する；
（２）セルラーゼ遺伝子の塩基配列が、配列番号２記載の配列と８０％以上の相同性を有する；
（３）セルロース分解能を有する；且つ
（４）セルロースを含む有機性廃棄物及び／又は廃水中、特にメタン発酵汚泥中の酸発酵及びメタン発酵微生物群内での定着及び増殖能を有する。
【００２１】
また、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株の近縁株も幾つか発見されたが、それらの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子及びセルラーゼ遺伝子の塩基配列は、配列番号１及び配列番号２とそれぞれ９０％以上の相同であるか、又は実質的に相同であった。このことから、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株の近縁で上記新菌株群があると見られ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株はその代表株であると考えられる。図５に上記新菌株群の系統学的位置を示す。
【００２２】
（ｄ）培養方法
上記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株に代表される新菌株の培養は、以下のようにして行うことができる。
培地としては、クロストリジウム属細菌に使用される培地であれば、いずれの培地も用いることができるが、表２に示した培地を用いるのが好ましい。培養液は、予め煮沸や窒素ガスでの置換により脱酸素し、キャップ付き試験管などに分注して気相部を窒素ガス置換して完全に嫌気状態とする。培養温度は、５５℃から６０℃が適当であり、ｐＨは中性域に保つことが望ましい。
【００２３】
【表２】
2004113067.tif 000003
2004113067.tif 000004
【００２４】
廃棄物・廃水の処理方法
本発明の新菌株を用いたセルロースを含有する廃棄物及び／又は廃水の処理は、典型的には、上記培養条件で培養した本菌株を含む微生物培養液又はその乾燥菌体を、発酵槽（酸発酵槽、メタン発酵槽など）に添加することにより行われる。この際、本発明の菌株の増殖を補助する無機塩類（窒素源、リン源など）、ビタミン、炭素源を同時に添加しても良い。
添加される本菌株の量は、処理対象の廃棄物に含まれるセルロースの量や投入する発酵槽の運転状況などに応じて任意に定めることができるが、典型的には、発酵槽内の最終濃度で１０６〜１０１１ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度である。
【００２５】
上記のように本発明の菌株を添加する必要があるのは、処理対象となる環境中に本菌株が存在しない場合である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株あるいはその近縁株がもともと存在している環境では、本菌株を人為的に添加せずに、既存の本菌株を利用して、そこに含まれるセルロースを分解処理することができる。
そのような土着の本菌株の存在については、本菌株に特有な遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ法を用いた検出により、複数の高温メタン発酵においてその存在を確認することができる。そのような本発明の新菌株がもともと存在する環境あるいは試料としては、メタン発酵槽、酸生成槽、余剰汚泥、ゴミ埋め立て地土壌、堆肥、家畜糞尿、水田土壌、底泥などを例示することができる。
好ましくは、これら処理対象となる環境に下記の培養条件及び／又は後述の増殖促進法を適用することにより、本発明の新菌株を定着且つ増殖させることができる。
【００２６】
好ましい培養環境への調整についての詳細は下記の通りである。
先ず、本発明の新菌株は、嫌気性細菌であり、分子状酸素が存在する環境下では増殖することが出来ないため、分子状酸素が存在する環境で本菌株を使用する場合は、不活性ガス、例えば窒素、ヘリウム、アルゴンあるいは炭酸ガスなどを用いた曝気を行うことにより環境中に存在する酸素の除去を行う。また、硫化ナトリウム、システイン塩酸などの還元剤を添加しても良い。環境中に好気性の微生物が存在する場合は、好気性微生物が利用可能な有機物、例えば生ゴミ、余剰汚泥、し尿、デンプン、グルコースなどを加えることにより、予め環境から酸素を除去しても良い。
【００２７】
また、処理対象となる環境に本菌株の増殖を補助する無機塩類（窒素源、リン源など）、ビタミン、炭素源を同時に添加しても良い。炭素源は添加してもよいが、本発明の増殖促進法においては、主としてセルロースが存在する条件下で微生物を増殖させるためセルロースが炭素源となるので、通常、炭素源の添加の必要はない。炭素源を添加する場合は、セルロース及びその中間代謝基質であるセロビオースを添加するのが好ましい。ただし、中間代謝基質が高濃度に存在すると本菌株によるセルロースの分解を阻害する場合があるので、セルロース存在下でセロビオースの添加を行う場合は、その濃度が高くならないように留意する必要がある。またセルロースを多く含有する紙ゴミや、パルプや紙の製造廃水などを添加しても良い。酵母エキス、ペプトンなどのタンパク質を豊富に含む炭素源を添加しても良いが、また、これら以外の炭素源（例えば、安息香酸、グルタミン酸）であっても構わない。ただし、セルロース、セロビオース以外の上記の炭素源を用いた場合、セルロース分解菌以外の微生物も同時に増殖することが考えられるため、実際の使用に当たってはセルロースあるいはセルロースを多く含む廃棄物を炭素源として用いることが望ましい。
【００２８】
新菌株の増殖促進法
メタン発酵汚泥や余剰汚泥など、本発明の菌株が存在する環境中には本菌株以外の多種多様な微生物が数多く存在している。本菌株をこの様な微生物の群集内で利用する場合、純粋培養系とは異なり、それぞれ異なった基質特異性や機能を持つ微生物群との増殖競合が生じ、必ずしも本菌株の微生物群集内での定着及び増殖を順調になしうるとは限らない。
本発明のクロストリジウム属に属する新菌株は、そのような環境において比較的高温で増殖が促進されることが分かった。
【００２９】
すなわち、本発明の増殖促進法は、上記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株のような新菌株を含む処理対象となる環境を高温に保つことを特徴とするものである。本菌株を含む環境の培養温度は、高温度域、即ち４５℃〜６５℃に維持するのが好ましく、５０〜６０℃になるように制御することがより好ましい。
上記のように培養環境を高温度に維持することにより、中温性細菌の増殖は抑制され、高温性細菌である本発明の菌株の増殖は促進される。また、処理対象となる環境中にセルロースなどの本菌株の増殖基質が十分に存在しない場合は、その培養環境中に増殖基質であるセルロース及びその中間代謝基質であるセロビオースなどを添加することにより、本発明の菌株を優占的に増殖させることもできる。
【００３０】
メタン発酵汚泥など、水素生成酢酸化菌やメタン生成細菌が存在する環境において上記増殖促進法を適用することにより、本発明のセルロース分解菌によるセルロースの分解除去を促進することができる。この場合、セルロースを含む処理対象の環境を高温度に維持する。その好ましい温度条件は上述の通りである。これにより、セルロース類は本発明の菌株の作用により糖、エタノール、脂肪酸、水素へ分解され、そして、それらの産物は、最終的に酸生成細菌及びメタン生成細菌の作用によりメタンガスへ転換され、かくして、効率的にメタンガスを回収することができる。本法によって増殖が促進される菌株として、下記実施例ではＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株を例示しているが、これに限定されるわけではない。
【００３１】
セルロース分解除去剤
本発明の新菌株を含有するセルロース分解除去剤は、新菌株の培養物又はその乾燥菌体を含んでなる。必要であれば、菌体をその新菌の生存及び生物活性を維持するために生物学的に許容される公知の増量剤等と混合した組成物として提供してもよい。その形態は液体でも固体でもよく、保存及び運搬等の条件に適したものであればよい。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
【実施例】
〔実施例１〕
発明菌株によるセルロースの分解
発明者らによってメタン発酵汚泥より単離されたクロストリジウム属に属する嫌気性細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株（以下、単に「ＪＣ３株」という）によるセルロースの分解効果を調査するために、セルロースパウダーを用いた回分式の分解実験を行った。
セルロース分解実験には、４５ｍｌ容量のブチルゴムキャップ付き試験管を用いた。炭素源としてセルロースパウダーを８ｇ／Ｌ，　酵母エキスを２ｇ／Ｌ含む嫌気性細菌用の培地（表２）を予め脱酸素し、試験管に１０ｍｌ分注した。その後、スクリューキャップとブチルゴム栓で試験管を密閉した後、試験管の気相部を窒素ガスで置換した。
【００３３】
試験管を高圧滅菌処理後、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株を１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植菌し、５５℃温度条件下、１００ｒｐｍで振とう培養を行った。培養１週間後、ガス発生量（ｍｌ）をシリンジで測定した後、生成ガスの水素含有量（ガスクロマトグラフによる測定）を測定し水素発生量を算定した。培養液５ｍｌを遠心分離し、沈殿物は残存セルロース量の解析に供した。また遠沈上清は、０．２μｍフィルターで濾過し、高速液体クロマトグラフィーによる脂肪酸（乳酸、蟻酸、酢酸、酪酸など）の分析と、有機物濃度（化学的酸素要求量：ＣＯＤ、重クロム酸カリウム法による）の分析に供した。
図１には、試験管内のセルロースと、セルロース分解に伴って生産される中間代謝有機物のＣＯＤをベースとした有機物量のマスバランスを示した。図に示すように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株は、１週間の培養で投入したセルロースの約８０％を分解し、糖、エタノール、脂肪酸、水素に転換した。
【００３４】
〔実施例２〕
発明微生物のセルロースでの生育に及ぼす温度の影響
発明者らによって、メタン発酵汚泥より単離されたクロストリジウム属に属する細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株がセルロースを炭素源として増殖する場合において、その増殖に及ぼす培養温度の影響を調査するために、異なる培養温度条件下でセルロースを炭素源とする分解実験を行った。ＪＣ３株の培養は、セルロースを含む培地（表２）を用いて行った。培養温度は、４５℃、５５℃、６５℃、７５℃の４段階に設定し、分光光度計を用いて６６０ｎｍ波長で吸光度を測定した（培養開始後６日目）。
【００３５】
図２には、各培養温度条件下におけるＪＣ３株のセルロースでの増殖の様子を示した。培養開始時には、予めセルロース培地で前培養した菌液を、０．０１％（ｖ／ｖ）加えた。なお、菌体を含む培地の培養開始前の吸光度（ＯＤ：　ＯＰＴＩＣＡＬ　ＤＥＮＳＩＴＹ）は、約０．１１であった。この値を各サンプルのＯＤ値から差し引いた値を図２にプロットした。図２より、５５℃温度条件下での培養において最もＪＣ３株の増殖が促進され、培地の吸光度は約０．９に達した。４５℃においてもＪＣ３株の増殖が観察され、５５℃培養の約６０％の吸光度を示した。一方、６５℃、７５℃での培養では、顕著な菌体の増殖（吸光度の増加）は、見られなかった。これより、ＪＣ３株の至適増殖温度は、５０℃〜６０℃の範囲であることが分かった。すなわち、本発明の菌株を含む環境を高温度域（５０℃〜６０℃）に維持することにより、クロストリジウム属に属するセルロース分解菌ＪＣ３株のセルロースでの増殖、換言すればセルロースの分解を促進できることが分かった。
【００３６】
〔実施例３〕
セルロース処理メタン発酵汚泥における発明菌株の増殖
本発明のセルロース分解菌ＪＣ３株は、それ単独でもセルロースの分解処理に使用できるが、
酸生成細菌やメタン生成細菌など、種々の微生物が混在するメタン発酵槽汚泥中でも使用することができる。この場合、ＪＣ３株により加水分解・酸生成されたセルロースは、他の細菌群（水素生成酢酸化菌、メタン生成細菌など）の作用により、炭酸ガスとメタンガスにまで転換される。
一般的なメタン発酵汚泥中には、異なった基質特異性や温度依存性を持つ嫌気性細菌群が数多く存在している。本発明菌株をこの様な微生物の群集内で利用する場合、純粋培養系とは異なり、それぞれ異なった基質特異性や機能を持った細菌群の増殖競合が生じ、必ずしも発明菌株の優占的増殖と微生物群集内での定着が行われるとは限らない。
そこで、一般的なメタン発酵汚泥を用いたセルロース分解実験を行い、メタン発酵微生物群集内での土着の発明菌株の増殖の様相を調査した。また、本発明菌株を含む環境を高温度に維持することにより、発明菌株が増殖促進が可能かについても検証を行った。
【００３７】
セルロースのメタン発酵実験は、図３に示したラボスケールのメタン発酵槽を用いて行った。し尿、浄化槽汚泥、生ごみの処理を行っているメタン発酵槽より採取した汚泥１．２Ｌに、表３の無機培地１．２　Ｌとセルロースパウダー４３．２ｇを加え、５９日間、半連続培養を行った。経時的にメタンガスの生成量をモニタリングし、投入セルロースの８５％以上がメタンガスへと転換された時点で、セルロースを含む表３の培地を発酵槽内滞留時間が２５日となる様に半連続投入した。この実験系ではメタン発酵汚泥に存在する土着のＪＣ３株もしくはその近縁株の増殖の様相を調査するため、ＪＣ３株の添加は行わなかった。また、培養温度が発明菌株の増殖に及ぼす影響を調査するために、培養温度は高温（５５℃）と中温（３５℃）に設定した。
【００３８】
【表３】
2004113067.tif 000005
【００３９】
連続培養開始時（０日目）、培養２０日目、培養４１日目、培養終了時（５９日目）に汚泥をサンプリングし、真性細菌の１６Ｓ　ｒＤＮＡを標的にしたＰＣＲ法による遺伝子増幅、増幅した遺伝子混合物のＤＧＧＥ法（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）による分離、分離した微生物遺伝子（ＤＮＡバンド）の遺伝子配列の決定と濃度の測定により、微生物群集内に存在するＪＣ３株の同定と半定量を行った。また、実験開始時と終了時の汚泥については、別途セルロースを単一炭素源としたメタン生成活性（セルロース分解活性）の測定を行った。
図４には、各培養日数でのメタン発酵汚泥の微生物群集の構造をＰＣＲ法およびＤＧＧＥ法により解析した結果を示した。ＤＧＧＥ法では、試料中の微生物群の存在をＤＮＡバンドとして示すことができる。これより、植種汚泥中には存在の認められなかった（ＤＧＧＥ法の検出限界以下）Ｃ１バンドに対応する細菌が、高温培養汚泥では培養２０日目にはバンドとして検出される様になった。また、培養の継続に伴いＣ１バンドに対応する細菌のポピュレーション（存在割合）が増大している（Ｃ１バンドの濃度の上昇）ことが分かる。このＣ１バンドの遺伝子配列を決定したところ、発明株ＪＣ３株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ（ｒＤＮＡ）遺伝子の配列と１００％の相同性（約２００塩基の断片）が得られた。この発明菌株のメタン発酵微生物群集内での優占化により、高温メタン発酵汚泥のセルロースからのメタン生成能は培養開始前の汚泥の５０倍にまで達した。一方中温培養汚泥では、培養後４１日を経た時点でも高温培養汚泥中にみられたＣ１バンド（ＪＣ３株）は検出されず、セルロース分解活性も高温培養汚泥の数分の一程度であった。
【００４０】
以上の結果より、高温度条件下（５５℃）でのメタン発酵汚泥のセルロースを炭素源とした培養により、ＪＣ３株と同一もしくは近縁なセルロース微生物を選択的に増殖促進できることが明らかになった。また、ＪＣ３株に近縁なセルロース分解微生物の高密度集積化を行うことにより、汚泥のセルロース分解能を飛躍的に向上させることが可能であることが分かった。
【００４１】
【発明の効果】
本発明は、セルロース分解能を有する新規な一群の嫌気性微生物を提供する。この微生物により、難分解性有機物であるセルロースを多く含む有機性廃棄物・廃水等を効率的に分解することができる。また、本発明の菌株群をメタン発酵汚泥中で使用することにより、セルロースをエネルギーとしてのメタンガスにまで転換することができる。
本発明の増殖促進法をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．ＪＣ３株のような新菌株に適用することにより、セルロースを含有する廃棄物及び／又は廃水処理において、本菌株の増殖促進、即ちセルロース分解を促進することができる。
【００４２】
【配列表】
2004113067.tif 000006
2004113067.tif 000007
2004113067.tif 000008
2004113067.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明菌株のセルロースの加水分解特性を示す。
【図２】図２は、本発明菌株のセルロースでの生育に及ぼす培養温度の影響を示す。
【図３】図３は、セルロース分解実験に用いたメタン発酵槽の概要を示す。
【図４】図４は、各培養日数でのセルロース分解メタン発酵汚泥の微生物群集の構造をＰＣＲ法およびＤＧＧＥ法により解析した結果を示す。
【図５】図５は、新規セルロース分解菌株群の系統学的位置を示す。
【図１】
2004113067.tif 000010
【図２】
2004113067.tif 000011
【図３】
2004113067.tif 000012
【図４】
2004113067.tif 000013
【図５】
2004113067.tif 000014