(57)【要約】      （修正有）【課題】特定のアルカリプロテアーゼについて、その分泌能を高める技術を提供する。【解決手段】プレプロ配列を有するアルカリプロテアーゼであって、当該プレプロ配列が、特定のアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有する配列において、当該特定のアミノ酸配列の（ａ）５２位、（ｂ）７５位、（ｃ）１４２位又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基；  （ａ）位置：アスパラギン酸、アルギニン  （ｂ）位置：アラニン、アルギニン  （ｃ）位置：リジンに置換された変異プレプロ配列であり、成熟酵素としては、上記特定のアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ；これをコードする遺伝子。遺伝子を含有するベクター、形質転換体などを提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレプロ配列を有するアルカリプロテアーゼであって、当該プレプロ配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、当該配列番号１の（ａ）５２位、（ｂ）７５位、（ｃ）１４２位又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：アスパラギン酸、アルギニン
（ｂ）位置：アラニン、アルギニン
（ｃ）位置：リジン
に置換された変異プレプロ配列であり、成熟酵素として配列番号２に示すアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ。
【請求項２】
請求項１記載のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載のベクターを含有する形質転換体。
【請求項５】
宿主が微生物である請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項１記載の変異プレプロ配列をコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項５記載の形質転換体を用いることを特徴とする配列番号２に示すアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は洗浄剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼに関する。
【０００２】
【従来技術及び発明が解決しようとする課題】
産業分野で最も生産量の多いアルカリプロテアーゼは衣料用洗剤等の洗浄剤に配合される洗剤用プロテアーゼであり、例えば、アルカラーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、サビナーゼ（登録商標；ノボザイムズ社）、マクサカル（登録商標；ジェネンコア社）、ブラップ（登録商標；ヘンケル社）、及びＫＡＰ（花王）等が知られている。
【０００３】
衣料用洗剤にプロテアーゼを配合する目的は、衣料に付着したタンパク質汚れを分解することであるが、実際の汚れはタンパク質だけでなく皮脂由来の脂質や泥、埃汚れ等、有機物と無機物が入り混じった複数の成分からなる複合汚れであり、このような複合汚れに対する洗浄性の高い洗浄剤が望まれていた。
【０００４】
かかる観点から本発明者らは、高濃度の脂肪酸存在下でも充分なカゼイン分解活性を保持し、タンパク質だけでなく皮脂等の混在する複合汚れに対しても優れた洗浄性を有する分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼを数種見出し、先に特許出願した（例えば、特許文献１参照）。そして、これらのアルカリプロテアーゼ群は、その分子量、一次構造、酵素学的性質、特に非常に強い酸化剤耐性を有する点で、従来から知られているバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼであるズブチリシンとは異なり、新しいズブチリシンサブファミリーに分類することが提唱されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
しかしながら、このようなプロテアーゼであっても、工業的レベルでの生産を考えた場合、その生産量は充分な量とは言えず、培地中に効率良く分泌されるアルカリプロテアーゼが求められていた。
【０００６】
一方、目的のタンパク質（酵素）を多量に分泌させる試みとしては、宿主菌（生産菌）の変異育種による改良、酵素をコードする遺伝子あるいはその制御を行う遺伝子を改変して分泌量を高める方法が知られているが、ズブチリシンについては分泌とフォールディングに重要な働きを担うプレプロ配列を改変し酵素の分泌量を高めるという試みは為されていない。
【０００７】
本発明は特定のアルカリプロテアーゼについて、その分泌能を高める技術を提供することを目的とする。
【０００８】
【特許文献１】
国際公開第９９／１８２１８号パンフレット
【非特許文献１】
Ｓａｅｋｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７９，（２０００），３１３−３１９
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記アルカリプロテアーゼの特性を保持しつつ、効率良く培地中に分泌できる新たな酵素の探索を行ったところ、当該アルカリプロテアーゼのプレプロ配列中の特定位置のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に変異させた場合に、当該アルカリプロテアーゼの生産性を向上できることを見出した。
【００１０】
すなわち本発明は、プレプロ配列を有するアルカリプロテアーゼであって、当該プレプロ配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、当該配列番号１の（ａ）５２位、（ｂ）７５位、（ｃ）１４２位又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：アスパラギン酸、アルギニン
（ｂ）位置：アラニン、アルギニン
（ｃ）位置：リジン
に置換された変異プレプロ配列であり、成熟酵素として配列番号２に示すアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、当該アルカリプロテアーゼをコードする構造遺伝子、該構造遺伝子を含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換体を提供するものである。
【００１１】
また本発明は、上記変異プレプロ配列をコードする遺伝子を提供するものである。
【００１２】
更に本発明は、上記形質転換体を用いることを特徴とする配列番号２に示すアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼの製造法を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のアルカリプロテアーゼにおけるプレプロ配列（「変異プレプロ配列」ともいう）は、配列番号１に示すアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列の（ａ）５２位、（ｂ）７５位、（ｃ）１４２位又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基を（ａ）位置：アスパラギン酸、アルギニン、（ｂ）位置：アラニン、アルギニン、（ｃ）位置：リジン、に置換してなるものである。本発明のプレプロ配列は、野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１４】
ここでプレプロ配列とは、アルカリプロテアーゼの分泌、フォールディングに関与する重要な領域であり、プレ配列はシグナル配列であり、アルカリプロテアーゼ前駆体が細胞膜を通過する際にシグナルペプチダーゼにより切断される。また、プロ配列は、分子内シャペロニンとして作用することが知られており、細胞膜の通過前後においてアルカリプロテアーゼが正確な立体構造をとるために必須の領域である。プロ配列は最終的に成熟型のアルカリプロテアーゼにより切断されさらに小さなペプチドへと分解される。即ち、アルカリプロテアーゼをコードする構造遺伝子から転写、翻訳される産物はプレプロ配列を有するアルカリプロテアーゼ前駆体として細胞内に存在する。従って、本発明のプレプロ配列を有するアルカリプロテアーゼとはアルカリプロテアーゼ前駆体を示すものである。
【００１５】
ここで、変異前のプレプロ配列である配列番号１に示すアミノ酸配列としては、例えばＫＰ４３〔バチルス  エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）由来、国際公開第９９／１８２１８号パンフレット〕のプレプロ配列が挙げられる。
また、配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列としては、好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、更に９８％以上の相同性を有するものが好ましく、更に後記段落〔００２０〕で示す性質を有するプロテアーゼのプレプロ配列であることが好ましい。具体的には、例えばプロテアーゼＫＰ９８６０（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＢ０４６４０３）［バチルス  エスピーＫＳＭ−９８６０（ＦＥＲＭＢＰ−６５３４）由来、国際公開第９９／１８２１８号パンフレット］、プロテアーゼＫＰ９８６５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０８４１５５）［バチルス  エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）由来、特願２００２−２６５３号］のプレプロ配列が挙げられ、その相同性はそれぞれ８６．８％、９７．６％である（図１）。
【００１６】
なお、アミノ酸配列の相同性は、ＧＥＮＥＴＹＸ  ＷＩＮのマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム（ソフトウェア開発）により計算される。
【００１７】
また、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。プレプロ配列のアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各プレプロ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００１８】
すなわち、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より、配列番号１の（ａ）５２位、（ｂ）７５位、（ｃ）１４２位のアミノ酸残基は、それぞれリジン、グルタミン及びグルタミン酸である。その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより特定することができる。例えば、プロテアーゼＫＰ９８６０、プロテアーゼＫＰ９８６５のプレプロ配列においても（ａ）５２位、（ｂ）７５位、（ｃ）１４２位のアミノ酸残基は、それぞれリジン、グルタミン及びグルタミン酸である。
【００１９】
そして、本発明の変異プレプロ配列においては、配列番号１の（ａ）５２位又はその位置に相当する位置のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、アルギニンに置換されるのが好ましく、アルギニンであるのが特に好ましい。（ｂ）７５位又はその位置に相当する位置のアミノ酸残基は、アラニン、アルギニンに置換されるのが好ましく、アルギニンであるのが特に好ましい。（ｃ）１４２位又はその位置に相当する位置のアミノ酸残基は、リジンに置換されるのが特に好ましい。
【００２０】
また、本発明の変異プレプロ配列におけるアミノ酸残基の（ａ）〜（ｃ）の選択は、酵素の特性が変化しない限り２個所以上が同時になされていていもよい。２箇所以上が同時になされた場合の具体例としてはＬｙｓ５２（Ａｓｐ／Ａｒｇ）＋Ｇｌｎ７５（Ａｌａ／Ａｒｇ）、Ｌｙｓ５２（Ａｓｐ／Ａｒｇ）＋Ｇｌｕ１４２Ｌｙｓ、Ｌｙｓ５２（Ａｓｐ／Ａｒｇ）＋Ｇｌｕ１４２Ｌｙｓ、Ｇｌｎ７５（Ａｌａ／Ａｒｇ）＋Ｌｙｓ５２（Ａｓｐ／Ａｒｇ）＋Ｇｌｕ１４２Ｌｙｓが挙げられる。好ましい組合せとしては、Ｌｙｓ５２Ａｒｇ＋Ｇｌｎ７５Ａｒｇ、Ｌｙｓ５２Ａｓｐ＋Ｇｌｎ７５Ａｌａ、Ｌｙｓ５２Ａｓｐ＋Ｇｌｕ１４２Ｌｙｓであり、特に好ましくは、Ｌｙｓ５２Ａｒｇ＋Ｇｌｕ１４２Ｌｙｓである。尚、アミノ酸は３文字表記とし、「＋」は１箇所の置換に対し付加された置換を表し、「／」については表記したいずれのアミノ酸を使用しても良いことを示している。
【００２１】
本発明のアルカリプロテアーゼは、プレプロ配列として上記の変異プレプロ配列を有し、成熟酵素として配列番号２に示すアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるものである。
ここで、配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列としては、好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、更に９５％以上の相同性を有するものが好ましく、野生型又は野生型の変異体であってもよい。また、その性質として酸化剤耐性を有し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により認められる分子量が４３，０００±２，０００であるものが好ましく、特にｐＨ８以上のアルカリ性領域で作用する、酸化剤耐性を有する、高濃度の脂肪酸存在下において酵素活性が阻害されない、ゼラチンに対する分解活性が強い、５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存活性を示す、ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で阻害され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００であるものが好ましい。
【００２２】
ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを５０ｍＭ過酸化水素、５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭブリットンロビンソン緩衝液（ｐＨ１０）中で、３０℃、２０分間の放置後の残存活性が少なくとも５０％以上を保持していることをいう。以上の性質を保持していれば野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施したアルカリプロテアーゼであってもよい。
【００２３】
配列番号２で示すアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ（成熟型アルカリプロテアーゼ）としては、例えば、ＫＰ４３〔バチルス  エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）由来、国際公開第９９／１８２１８号パンフレット〕が挙げられ、配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼとしては、例えばプロテアーゼＫＰ９８６０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４６４０３）［バチルス  エスピーＫＳＭ−９８６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３４）由来、国際公開９９／１８２１８号パンフレット］、プロテアーゼ９８６５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０８４１５５）［バチルス  エスピー  ＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９２）由来、特願２００２−００２６５３］、プロテアーゼＥ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４６４０２）［バチルス  Ｎｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９２）由来、特開昭４９−７１１９１］、プロテアーゼＹａ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４６４０４）［バチルス  エスピーＹ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２９）由来、特開昭６１−２８０２６８］、プロテアーゼＳＤ５２１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４６４０５）［バチルス  ＳＤ５２１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１１６２）由来、特開平３−１９１７８１］、プロテアーゼＡ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０４６４０６）［ＮＣＩＢ１２２８９由来、国際公開第８８／０１２９３号パンフレット０１２９３］、プロテアーゼＡ−２［ＮＣＩＢ１２５１３由来、国際公開第９８／５６９２７号パンフレット］や、配列番号２のアミノ酸配列の４６位をロイシンに置換した変異体、５７位をアラニンに置換した変異体、１０３位をアルギニンに置換した変異体、１０７位をリジンに置換した変異体、１２４位をそれぞれリジン及びアラニンに置換した変異体、１３６位をアラニンに置換した変異体、１９３位をアラニンに置換した変異体、１９５位をそれぞれアスパラギン、グルタミン酸、アルギニン、プロリン、スレオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、システイン、アラニン、アスパラギン酸、トリプトファン、グリシン及びフェニルアラニンに置換した変異体、２４７位をそれぞれスレオニン及びアルギニンに置換した変異体、２５７位をバリンに置換した変異体、３４２位をアラニンに置換した変異体、６６位をアスパラギン酸に置換し且つ２６４位をセリンに置換した二重変異体（特願２０００−３５５１６６号）、配列番号２のアミノ酸配列の８４位をアルギニンに置換した変異体、１０４位をプロリンに置換した変異体、２５６位をそれぞれアラニン及びセリンに置換した変異体、３６９位をアスパラギンに置換した変異体（特開２００２−３０６１７６号公報）、配列番号２のアミノ酸配列の２５１位をそれぞれアスパラギン、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン及びグルタミンに置換した変異体、２５６位をそれぞれセリン、グルタミン、アスパラギン、バリン及びアラニンに置換した変異体（特願平２００１−３２９４７２号）又はこれらとアミノ酸配列において８���％以上、好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼが挙げられる。上記アルカリプロテアーゼの一部についてそのアミノ酸配列を整列させた図を示す（図２ａ及び図２ｂ）。
【００２４】
本発明に用いるアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングはショットガンクローニング法やＰＣＲ法等を用いればよい。また、クローニングされた遺伝子に対して変異を施してもよい。このようにして取得された遺伝子の塩基配列の一例を配列番号３に示した。また、配列番号１に示すプレプロ配列又はこれと８０％以上の相同性を有するプレプロ配列の領域をコードする遺伝子もＰＣＲ法等を用いることでクローニングすることができる。
【００２５】
プレプロ配列をコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われているランダム変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍキット（Ｔａｋａｒａ）等を用いて行うことができる。
【００２６】
得られた変異プレプロ遺伝子を用いた本発明プロテアーゼの生産方法としては、配列番号３で示されるアリカリプロテアーゼのプレプロ配列をコードする遺伝子に変異を施した場合にはそのまま、変異プレプロ遺伝子の下流に配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する成熟酵素をコードする遺伝子を連結する場合には、適当な制限酵素切断部位を部位特異的変異法により付与するか又はリコンビナントＰＣＲ法等を用いることにより構造遺伝子を作製すればよい。さらに当該変異遺伝子をベクターに導入し、当該プラスミドベクターが安定に増幅、保持できる宿主菌を形質転換する、或いは当該変異遺伝子を安定に維持できる宿主菌の染色体ＤＮＡ上に導入させる、等の方法が採用できる。この条件を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、カビ、酵母、放線菌等が挙げられ、これらの菌株を用い、資化性の炭素源、窒素源その他必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すればよい。
【００２７】
斯くして、菌体内において発現される本発明のプレプロ配列を有するアルカリプロテアーゼは、形質転換体からの分泌能が高い。
【００２８】
ここで、「分泌能が高い」とは、例えば変異させる前のアルカリプロテアーゼと同一の条件下において（例えばポリペプトンＳ８％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．３％、マルトース１０％、硫酸マグネシウム７水和物０．０４％、リン酸２水素カリウム０．２％、無水炭酸ナトリウム１．５％、テトラサイクリン３０ｐｐｍから成る培地に植菌し、３０℃、３日間振盪培養する）、生産したアルカリプロテアーゼ変異体について培養上清中のプロテアーゼ活性量、タンパク質量を測定した場合、一定量以上の活性量又はタンパク質量を示すことをいい、例えば親アルカリプロテアーゼの５％以上、望ましくは１０％以上、さらに望ましくは１５％以上の活性量又はタンパク質量の増大が認められることを意味する。特に、比活性等の変化が認められなければ、活性量又はタンパク質量のどちらか一方を測定しても構わない。
【００２９】
成熟酵素は、当該アルカリプロテアーゼからプレプロ配列が切断されて菌体外に分泌生産されるが、斯かる酵素の採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製方法準じて行えばよい。例えば、培養液を遠心分離、又は濾過することで菌体を除き、培養上清液から常法の精製手段により目的酵素を得ることができる。このようにして得られる酵素液は、そのまま用いることもできるが、更に公知の方法により精製、結晶化、粉末化、又は顆粒化することもできる。
【００３０】
斯くして得られたアルカリプロテアーゼは、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、ゼラチン分解力が高い。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認められる分子量が４３，０００±２，０００であり、アルカリ性域で活性を有するという優れた性質を有し、衣料洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤等として使用することができる。
【００３１】
【実施例】
実施例１
バチルス  エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼ構造遺伝子（配列番号３）の終始コドンまでを含む約２．０ｋｂの範囲に対しランダム変異を与えた。まず、ｐＫＦ１８Ｋ（Ｔａｋａｒａ）のマルチクローニングサイトに導入した上記約２．０ｋｂのＤＮＡを増幅できるＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ−Ｍ（Ｔａｋａｒａ）及びＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ１３−４７（Ｔａｋａｒａ）を用いＰＣＲを行った。反応系は、鋳型ＤＮＡ３０ｎｇ、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰを２０ｎｍｏｌ、適当量の硫酸マンガンとジメチルスルフォキシド、Ｔａｋａｒａ  Ｔａｑ添付反応バッファー１０μＬ、及びＴａｑポリメラーゼ２．５Ｕとした（全量１００μＬ）。ＰＣＲ条件は９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間を１サイクルとし、これを３０サイクル行い、最後は７２℃で１０分間恒温した。ＰＣＲ産物をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  ＰｒｏｄｕｃｔＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  キット（ロッシュ）にて精製し、１００μＬの滅菌水で溶出した。得られた約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ（ロッシュ）により切断した後、同酵素にて処理しておいたｐＫＦ１８ｋを混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  キット  ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）により結合反応を行った。反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、カナマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上にて生育させた。得られた形質転換株をカナマイシン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ培地に植菌し、３０℃で振盪培養した。培養上清について合成基質（Ｇｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ、ペプチド研究所）を用いた活性測定を行い、親アルカリプロテアーゼの活性に比べ活性値の高い培養液を選抜し、少量の菌体並びにＢｃａＢＥＳＴＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ−Ｍ及びＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ１３−４７を用い、上記同条件でＰＣＲを行ない変異遺伝子を増幅した。増幅断片を精製し、適当なプライマーとＢｉｇ  Ｄｙｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  キット（アプライドバイオシステム）を用いて、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７７型（アプライドバイオシステム）にて塩基配列を決定した。
【００３２】
その結果、プロテアーゼ活性が向上した変異体は配列番号１の５２位のリジンがアルギニンに、７５位のグルタミンがアルギニンに、１４２位のグルタミン酸がリジンにそれぞれ置き換わった各変異遺伝子であることが判明し、これにより２〜１０％のプロテアーゼ活性の向上が認められた。次にそれぞれの変異点に関し、他のアミノ酸への置換による効果を調べる目的で変異を行った。変異の手段としては、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ  キット（Ｔａｋａｒａ）を用い、５２位、７５位、１４２位のアミノ酸を任意のアミノ酸に置換した。鋳型プラスミド（ｐＫＦ１８ｋのＢａｍＨＩ、ＸｂａＩサイトにプロテアーゼ構造遺伝子を導入したプラスミド）３０ｎｇ、キット添付セレクションプライマー、プライマー３〜５（配列番号４〜６）を各々２０ｐｍｏｌ及びＴａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑを用いＰＣＲを行った。反応条件は９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。得られたＰＣＲ断片を精製してこれをプライマーとし、鋳型プラスミド３０ｎｇとＬＡ  Ｔａｑを用いて再度ＰＣＲを行った。反応条件は９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で４分間を１サイクルとし、これを３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物を精製し、ライゲーション反応を行った後、大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換した。形質転換株からプラスミドＤＮＡを抽出し、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。この形質転換株をカナマイシン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ培地に植菌し、３０℃で振盪培養した。培養上清について合成基質を用いた活性測定を行い、親アルカリプロテアーゼの活性に比べ活性値の高い培養液を選抜した。菌体を鋳型としてＰＣＲを行うことで変異遺伝子を増幅し、精製後、塩基配列を決定した。その結果、５２位のリジンがアスパラギン酸に置換した変異体、７５位のグルタミンがアラニンに置換した変異体が親アルカリプロテアーゼよりも５％、１０％それぞれ活性値の増加を示すものとして取得された。１４２位についてはリジン以外のアミノ酸には効果が認められなかった。
【００３３】
更に、上記変異部位を組み合わせることにより、プロテアーゼ活性の向上を検討した。５２位の変異部位を含むＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片、１４２位の変異部位を含むＸｈｏＩ−ＡａｔＩＩ断片、成熟酵素をコードする遺伝子を含むＡａｔＩＩ−ＸｂａＩ断片を調製し、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ処理しておいたｐＫＦ１８ｋを混合し、ライゲーション反応を行った。得られたプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、Ｌｙｓ５２Ａｒｇの変異点にさらにＧｌｕ１４２Ｌｙｓの変異が加わった２重変異体を取得した。培養の結果、Ｌｙｓ５２Ａｒｇ＋Ｇｌｕ１４２Ｌｙｓ変異体はＬｙｓ５２Ａｒｇ変異体に比べ１０％の活性増加が認められた。
【００３４】
実施例２
以上のように取得された各変異プレプロ配列は、ＫＰ４３プロテアーゼを親アルカリプロテアーゼとした場合は、上記の様に活性増加に効果のあることが明らかになった。そこで既に分泌能力や比活性の向上している変異アルカリプロテアーゼ（配列番号２においてＰｈｅ４６Ｌｅｕ／Ｔｈｒ６５Ｐｒｏ／Ｔｙｒ１９５Ｇｌｙ／Ｖａｌ２７３Ｉｌｅ／Ｔｈｒ３５９Ｓｅｒ／Ａｓｐ３６９Ａｓｎ／Ｓｅｒ３８７Ａｌａに置換されたアルカリプロテアーゼＫＰ４３Ｈ）に対し、本発明のプレプロ配列が効果を示すか否かの検討を加えた。
【００３５】
各変異プレプロ配列をコードする遺伝子断片をｐＫＦ１８ｋよりＢａｍＨＩとＡａｔＩＩにて切りだし、同様にＡａｔＩＩとＸｂａＩにより切り出されたＫＰ４３Ｈをコードする遺伝子をリガーゼにより結合させた（ＡａｔＩＩサイトはコードされるアミノ酸を変化させることなく部位特異的に塩基を置換して新たに作製した）。取得したプラスミドを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。各プラスミドを抽出した後、ＢａｍＨＩとＸｂａＩにより切断した。得られた断片を予め同酵素にて処理しておいたｐＨＡ６４に導入し、ＳＳＨ−１０（島津製作所）及びジーンパルサーキュベット（バイオラッド）を用いたエレクトロポレーション法によりバチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＫＰ４３株を形質転換した。スキムミルク含有アルカリ寒天培地［スキムミルク（ディフコ）１％（ｗ／ｖ）、バクトトリプトン（ディフコ）１％、酵母エキス（ディフコ）０．５％、塩化ナトリウム０．５％、寒天１．５％、無水炭酸ナトリウム０．０５％、テトラサイクリン１５ｐｐｍ］上に生育してきた形質転換株のスキムミルク溶解斑の形成状況により、プロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。プロテアーゼ遺伝子がｐＨＡ６４に挿入されたプラスミドを保持している形質転換株を選抜し、以後の培養に供した。
【００３６】
各形質転換株について単集落分離、ハロー形成の確認を行い、試験管中の５ｍＬ種母培地［ポリペプトンＳ（日本製薬）６．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％、マルトース１．０％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％、リン酸２水素カリウム０．１％、無水炭酸ナトリウム０．３％、テトラサイクリン３０ｐｐｍ］に植菌し、３０℃、３２０ｒｐｍで一晩前培養した。この種母培養液を５００ｍＬ容坂口フラスコ中の２０ｍＬ主培地［ポリペプトンＳ８％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．３％、マルトース１０％、硫酸マグネシウム７水和物０．０４％、リン酸２水素カリウム０．２％、無水炭酸ナトリウム１．５％、テトラサイクリン３０ｐｐｍ］に１％植菌（ｖ／ｖ）し、３０℃、１２１ｒｐｍで３日間培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清中のプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活性はカゼイン法により、タンパク質量はプロテインアッセイキット（和光純薬）を用いて測定した。その結果、変異プレプロ配列を有するアルカリプロテアーゼＫＰ４３Ｈの培養活性はコントロール（アルカリプロテアーゼＫＰ４３Ｈ遺伝子を有する形質転換株を同条件で培養したもの）のそれに比べ５〜２５％向上した（表１）。また、選抜された形質転換株からプラスミドを回収し、塩基配列を決定し、目的の変異体であることを確認した。
【００３７】
上記変異部位により得られるアルカリプロテアーゼは、形質転換株での酵素の分泌を向上させる以外は親アルカリプロテアーゼの特性、すなわち、酸化剤耐性を有し、ゼラチンに対し高い分解活性を示し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより認められる分子量が４３，０００±２，０００であり、アルカリ性域で活性を有する性質を保持していることを確認した。
【００３８】
［プロテアーゼ活性測定法−合成基質法］
合成基質（Ｇｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ：ＡＡＰＬ）を用いた酵素活性は、９６穴アッセイプレート（イワキ）内に１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）４８．５μＬ、１００ｍＭ  ＡＡＰＬ  １．５μＬからなる反応液に適当に希釈した酵素液又は培養液を５０μＬ加え、ｉＥＭＳリーダーＭＳ（ＬＡＢＳＹＳＴＥＭＳ）を使用し３０℃で１５分間反応を行った。遊離されるパラニトロアニリンを４１４ｎｍの吸光度を測定した。酵素１ｕｎｉｔは、上記反応条件下において１分間に０．００１の吸光度を上昇させる量とした。
【００３９】
［プロテアーゼ活性測定法−カゼイン法］
カゼイン１％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）１．０ｍＬを３０℃で５分間保温した後、０．１ｍＬの酵素溶液を加え、１５分間反応を行う。反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３３Ｍ酢酸）を２．０ｍＬ加え、室温で３０分間放置した後、濾過を行い、濾液中の酸可溶性タンパク質をＬｏｗｒｙらの方法の変法により定量した。すなわち、０．５ｍＬの濾液にアルカリ性銅溶液（１％酒石酸ナトリウム・カリウム：１％硫酸銅・５水和物：２％炭酸ナトリウム・０．１Ｎ水酸化ナトリウム＝１：１：１００）を２．５ｍＬ加え、室温で１０分間放置後、フェノール溶液［フェノール試薬（関東化学）を蒸留水にて２倍希釈したもの］を０．２５ｍＬ添加し、３０℃で３０分間保温した。その後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。プロテアーゼ１単位（１ＰＵ）は、上記反応条件で１分間に１ｍｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離させるのに必要な酵素量とした。
【００４０】
【表１】
2004187669.tif 000002
【００４１】
実施例２
（１）洗剤の調製
撹拌翼を有した１ｍ３の混合槽に水４６５ｋｇを加え、水温が５５℃に達した後に４０％（ｗ／ｖ）ポリアクリル酸ナトリウム水溶液１３５ｋｇを添加した。１５分間撹拌した後に、炭酸ナトリウム１２０ｋｇ、硫酸ナトリウム６０ｋｇ、亜硫酸ナトリウム９ｋｇ、蛍光染料３ｋｇを添加した。更に１５分間撹拌した後に、ゼオライト３００ｋｇを添加し、３０分間撹拌して均質なスラリーを得た（スラリー中の水分は５０質量％）。このスラリーを噴霧乾燥塔の塔頂付近に設置した圧力噴霧ノズルから噴霧することでベース顆粒を得た（噴霧乾燥塔に供給する高温ガスは塔下部より温度が２２５℃で供給し、塔頂より１０５℃で排出）。
【００４２】
次にレディゲミキサー（松阪技研（株）製、容量２０Ｌ、ジャケット付）に上記ベース顆粒１００質量部を投入し、主軸（１５０ｒｐｍ）の攪拌下、非イオン性界面活性剤２０質量部、直鎖アルキル（炭素数１０〜１３）ベンゼンスルホン酸ナトリウム２２質量部、脂肪酸（炭素数１４〜１８）ナトリウム４質量部、ポリエチレングリコール２質量部、水４質量部の混合液を３分間で投入し、その後５分間攪拌を行った。更にこのミキサーに結晶性ケイ酸ナトリウム２０質量部とゼオライト１０質量部を投入し、表面被覆を行い洗剤ベースを得た。
洗剤ベース９９質量％に本発明プロテアーゼ粒子０．５質量％、及び香料０．５質量％を混合して最終粒状洗剤Ａを得た。
【００４３】
（２）使用した原料
非イオン性界面活性剤：エチレンオキサイド平均付加モル数が８．５のエマルゲン１０８ＫＭ（花王（株）製）
ポリアクリル酸ナトリウム水溶液：平均分子量１００００（特公平２−２４２８３号公報の実施例に記載の方法に従って製造した）
炭酸ナトリウム：デンス灰（セントラル硝子（株）製）
ゼオライト：平均粒径が３．５μｍのゼオライト４Ａ型（東ソー（株）製）
ポリエチレングリコール：Ｋ−ＰＥＧ６０００（平均分子量８５００，花王（株）製）
結晶性ケイ酸ナトリウム：粉末ＳＫＳ−６（ヘキストトクヤマ（株）製）
本発明プロテアーゼ粒子：表１記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品から特開昭６２−２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき調製した造粒物（６ＰＵ／ｇ）
蛍光染料：チノパールＣＢＳ−Ｘ（チバガイギー社製）
【００４４】
実施例３
（１）洗剤の調製
まず固形分５０質量％のスラリーを熱風温度２５０℃で噴霧乾燥し、ポリアクリル酸ナトリウム（質量平均分子量１００００）７質量％、炭酸ナトリウム２６質量％、硫酸ナトリウム２０質量％、塩化ナトリウム６質量％、蛍光染料０．５質量％、ゼオライト４０質量％、水０．５質量％のベース顆粒を得た。
次にレディゲミキサー（松阪技研（株）製、容量２０Ｌ、ジャケット付）に上記ベース顆粒１００質量部を投入し、主軸（１５０ｒｐｍ）の攪拌下、非イオン性界面活性剤２０質量部、直鎖アルキル（炭素数１０〜１３）ベンゼンスルホン酸ナトリウム２２質量部、脂肪酸（炭素数１４〜１８）ナトリウム４質量部、ポリエチレングリコール２質量部、水４質量部の混合液を３分間で投入し、その後５分間攪拌を行った。更にこのミキサーに結晶性ケイ酸ナトリウム２０質量部とゼオライト１０質量部を投入し、表面被覆を行い洗剤ベースを得た。
洗剤ベース９５質量％に漂白剤粒子２．８質量％、漂白活性剤粒子１．２質量％、本発明プロテアーゼ粒子０．５質量％、及び香料０．５質量％を混合して最終粒状洗剤Ｂを得た。
【００４５】
（２）使用した原料
非イオン性界面活性剤：エチレンオキサイド平均付加モル数が８．５のエマルゲン１０８ＫＭ（花王（株）製）
ポリアクリル酸ナトリウム水溶液：平均分子量１００００（特公平２−２４２８３号公報の実施例に記載の方法に従って製造した）
炭酸ナトリウム：デンス灰（セントラル硝子（株）製）
ゼオライト：平均粒径が３．５μｍのゼオライト４Ａ型（東ソー（株）製）
ポリエチレングリコール：Ｋ−ＰＥＧ６０００（平均分子量８５００，花王（株）製）
結晶性ケイ酸ナトリウム：ＳＫＳ−６（ヘキストトクヤマ（株）製）
本発明プロテアーゼ粒子：表１記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品から特開昭６２−２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき調製した造粒物（６ＰＵ／ｇ）
蛍光染料：チノパールＣＢＳ−Ｘ（チバガイギー社製）
漂白剤粒子：炭酸ナトリウム・過酸化水素付加物（特開２０００−２５６６９９号公報の段落〔００１９〕記載の漂白剤粒子と同様にして得た）
漂白活性剤粒子：ラウロイルオキシベンゼンスルホン酸ナトリウムの造粒物（特開２０００−２５６６９９号公報の段落〔００１８〕記載の漂白活性剤粒子と同様にして得た）
【００４６】
実施例４
表２に示す液体洗浄剤組成物（洗剤Ｃ、及び洗剤Ｄ）を調製した。
【００４７】
【表２】
2004187669.tif 000003
【００４８】
１）炭素数１２〜１４の２級アルコール由来のアルキル基を有するポリオキシエチレン（平均７モル付加）アルキルエーテル（ソフタノール７０、日本触媒化学工業製）
２）炭素数１２〜１４の２級アルコール由来のアルキル基を有するポリオキシエチレン（平均１２モル付加）アルキルエーテル（ソフタノール１２０、日本触媒化学工業製）
３）炭素数１０〜１４の直鎖第１級アルコールにＥＯを平均５モル、ＰＯを平均２モル、ＥＯを平均３モルの順にブロック付加させたもの
４）ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ＥＯを平均８モル付加させたもの
５）ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ＥＯを平均１１．５モル付加させたもの
６）ナローレンジポリオキシエチレンアルキル（ｓｅｃ−Ｃ１２／Ｃ１３）エーテル
７）炭素数１０〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
８）アミド／エーテル変性シリコーンポリマー（東レ・ダウコーニングシリコーン（株）製、ＢＹ１６−９０６）
９）特開平１０−６０４７６号公報の１１頁６行〜１３行記載の方法で合成したフェノキシポリエチレングリコール、アクリル酸、マレイン酸共重合体（質量平均分子量１００００、固形分５１．２％）
１０）ペンテン／マレイン酸（５０／５０モル比）コポリマーのナトリウム塩（質量平均分子量７０００）
１１）表１記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品（１５ＰＵ／ｇ）
【００４９】
実施例５
下記の表３に示す組成のうち、過炭酸ナトリウムと炭酸ナトリウム（デンス灰）を攪拌混合しながら、ポリアクリル酸ナトリウム４０％水溶液、及び直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、又は非イオン性界面活性剤、又はラウロイルオキシベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加した。次いで特開昭６２−２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき調製した本発明プロテアーゼ粒子を添加し、全体的に均一になる程度攪拌することにより、漂白剤を調製した。
【００５０】
【表３】
2004187669.tif 000004
【００５１】
１）粒経５００〜７００μｍ
２）炭素数１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
３）ポリオキシエチレンアルキルエーテル（アルキル基の炭素数１２〜１４、ＥＯ平均付加モル数１２）
４）平均分子量８，０００
５）表１記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品から特開昭６２−２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき調製した造粒物（６ＰＵ／ｇ）
【００５２】
実施例６
下記の表４に示す全自動食器洗浄機用洗浄剤組成物（洗剤Ｇ、及びＨ）を調製した。
【００５３】
【表４】
2004187669.tif 000005
【００５４】
１）ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（平均分子量２，０００）
２）炭素数１２〜１４のｓｅｃ−アルコールのエチレンオキサイド７モル、及びプロピレンオキサイド８．５モル付加物
３）ＪＩＳ  ２号珪酸ナトリウム
４）アクリル酸−マレイン酸共重合体
５）デュラミル６０Ｔ（ＴＭ）（ノボザイムズ社製）
６）表１記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品から特開昭６２−２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき調製した造粒物（６ＰＵ／ｇ）
【００５５】
実施例７
下記の表５に示す各成分を用い、硬質表面用洗浄剤組成物（洗剤Ｊ）を得た。
【００５６】
【表５】
2004187669.tif 000006
【００５７】
１）ポリオキシエチレン（ＥＯＰ＝４）アルキル（Ｃ１２）エーテル硫酸エステルナトリウム
２）ポリオキシエチレン（ＥＯＰ＝８）アルキル（Ｃ１２）エーテル
３）アルキル（Ｃ１２）ポリグルコシド（縮合度１．３）
４）モノ長鎖第３級アルキル（Ｃ１２）ジメチルアミンオキシド
５）アルキル（Ｃ１２）ヒドロキシジメチルスルホベタイン
６）分子量１００００
７）表１記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品（１５ＰＵ／ｍＬ）
【００５８】
実施例８
前記洗剤Ａ（実施例２参照）を用いて下記表６記載の粒状洗剤を得た。
【００５９】
【表６】
2004187669.tif 000007
【００６０】
１）表１記載の本発明アルカリプロテアーゼの各精製標品から特開昭６２−２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき調製した造粒物（６ＰＵ／ｇ）
２）特開平５−２５４９２号公報に記載のプロテアーゼＫ−１６を特開昭６２−２５７９９０号公報の実施例１に記載の方法に基づき、５ＰＵ／ｇとしたもの
３）ＫＡＣ−５００（花王（株）製）
４）リポラーゼ１００Ｔ（ＴＭ）（ノボザイムズ社製）
【００６１】
【発明の効果】
本発明によれば、分泌能が向上したアルカリプロテアーゼを得ることができ、特に高濃度の脂肪酸存在下でも活性を有し、蛋白質の他に皮脂等が混在する複合汚れに対しても優れた洗浄性を有するアルカリプロテアーゼを効率良く生産できる。
【００６２】
2004187669.tif 000008
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【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるプレプロ配列と８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列からなるプレプロ配列を整列させた図である。
【図２ａ】図２ａは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するプロテアーゼを整列させた図である。
【図２ｂ】図２ｂは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するプロテアーゼを整列させた図であり、図２ａに続く図である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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