(57)【要約】【解決手段】コバラミン誘導体及び夾雑物を含む水溶液に、アニオン性界面活性剤及び水溶性有機溶媒を加えた後、酸を加えて相分離せしめ、次いで析出液体相に飽和環状エーテルを加えて逆抽出するコバラミン誘導体の高選択的な分離回収方法。【効果】コバラミン誘導体及び夾雑物を含む水溶液から、簡便で短時間で迅速に高選択的かつ高収率でコバラミン誘導体を濃縮分離することができ、更に簡便な操作で分離回収できる。また、分離に使用したアニオン性界面活性剤は回収し、次の分離回収に再利用することができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コバラミン誘導体及び夾雑物を含む水溶液にアニオン性界面活性剤及び水溶性有機溶媒を加えた後、酸を加えて相分離せしめ、次いで析出液体相に飽和環状エーテルを加えて逆抽出することを特徴とするコバラミン誘導体の分離回収方法。
【請求項２】
逆抽出する際に更に水を加える請求項１記載のコバラミン誘導体の分離回収方法。
【請求項３】
アニオン性界面活性剤が、炭素数６〜１８のフッ素化脂肪酸のアルカリ金属塩又はアンモニウム塩である請求項１又は２記載のコバラミン誘導体の分離回収方法。
【請求項４】
水溶性有機溶媒が、ケトン類である請求項１〜３のいずれか１項記載のコバラミン誘導体の分離回収方法。
【請求項５】
予めコバラミン誘導体をシアノコバラミンに変換してから行う請求項１〜４のいずれか１項記載のコバラミン誘導体の分離回収方法。
【請求項６】
コバラミン誘導体及び夾雑物を含む水溶液にアニオン性界面活性剤及び水溶性有機溶媒を加えた後、酸を加えて相分離せしめ、次いで析出液体相に飽和環状エーテルを加えて逆抽出してコバラミン誘導体を分離し、残余の析出液体相を加熱して水溶性有機溶媒を留去しアニオン性界面活性剤を回収し、該アニオン性界面活性剤を次の分離回収に使用するコバラミン誘導体の分離回収方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コバラミン誘導体及び夾雑物を含む水溶液から、簡便で短時間に均一液液抽出法で、選択的にコバラミン誘導体を分離回収する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）及びその誘導体（以下、合わせてコバラミン誘導体と記載することもある）は、牡蠣、レバー、乳製品等に多く含まれ、その工業的生産のほとんどは発酵法によるバクテリアからの生産である。そのため、コバラミン誘導体は、生体内及び培養液中では、メチルコバラミン、ヒドロキソコバラミン、アデノシルコバラミン、更には、タンパク質が結合した補酵素型コバラミン等様々な化学種として存在している。そして、その多くは反応活性が高く不安定であるため、光分解やコバルトコリノイドの軸配位子交換反応が起こりやすい状態にある。従って、コバラミン誘導体の分離回収は、一般的には最も安定度の大きなシアノコバラミンに転換して抽出し、分離回収を行っている。例えば、カラムクロマトグラフィー、メンブラン分離、ゲルろ過等固／液分配に基づく固相抽出法が一般的である（例えば、特許文献１、２及び非特許文献１、２参照）。
【０００３】
しかしながら、これら固相抽出による抽出、分離回収には、（１）大量のサンプルの処理に時間がかかる、（２）目詰まりを起こしやすい、（３）充填剤の種類やタンパク質の吸着によっては、充填剤がディスポーザブルとなりコストがかかる、（４）固相に吸着させた後ビタミンＢ１２を溶出させる工程が必要である等の問題があった。
【０００４】
その一方で、溶媒抽出法等の液／液分配に基づく分離は、操作の簡便性、操作時間、資源コスト等の点において、非常に優れた点を有しているが、コバラミン誘導体は、化学的性質として高い親水性を有するため（１２．５ｍｇ／Ｈ２Ｏ  ｍＬ［Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，  １２ＴＨ  Ｅｄｉｔｉｏｎ］）、水溶液から有機相への抽出、分離回収は困難であると考えられてきた。
【０００５】
【特許文献１】
特許第３０８５３２０号明細書
【特許文献２】
特開平６−２７９４８４号公報
【非特許文献１】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、（米国）、１９７１年、２４３巻、１号、ｐ．６１−７４
【非特許文献２】
Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｈｅｅｔ  Ｎｏ．２、日本ミリポア株式会社、１９９７年発行
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、牡蠣抽出液、発酵培地等のコバラミン誘導体及び夾雑物を含む水溶液から、コバラミン誘導体を簡便な操作で短時間に高選択的に高収率で、使用する溶媒量及び排出溶媒量を大幅に低減した均一液液抽出法で分離回収する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、発酵培地、抽出物等多成分を含有するコバラミン誘導体を含む水溶液に、特定の界面活性剤及び水溶性有機溶媒を加えた後、酸を加えると容易に相分離が生じ、析出した液体相から逆抽出することにより、コバラミン誘導体が簡便で短時間で迅速に高選択的かつに高収率で濃縮分離することができ、更に簡便な操作で分離回収できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、コバラミン誘導体及び夾雑物を含む水溶液に、アニオン性界面活性剤及び水溶性有機溶媒を加えた後、酸を加えて相分離せしめ、次いで析出液体相に飽和環状エーテルを加えて逆抽出することを特徴とするコバラミン誘導体の分離回収方法を提供するものである。
更に、残余の析出液体相を加熱して水溶性有機溶媒を留去しアニオン性界面活性剤を回収し、該アニオン性界面活性剤を次の分離回収に使用するコバラミン誘導体の分離回収方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明でコバラミン誘導体とは、シアノコバラミン、ヒドロキソコバラミン、メチルコバラミン、アデノシルコバラミン、タンパク質が結合した補酵素型コバラミン、ハイドロコバラミン、ニトロコバラミン等を総称する。
【００１０】
コバラミン誘導体を分離回収する対象であるコバラミン誘導体及び夾雑物を含む水溶液としては、例えば、レバー、牡蠣等のコバラミン誘導体を含有する天然物からの抽出液、コバラミン誘導体を発酵法で生産したときの培養液、化学反応法で製造したときの反応液等が挙げられる。当該水溶液に含まれる夾雑物としては、ビタミンＢ群、塩基類、アスコルビン酸、アミノ酸類、糖類及び金属イオンの群から選ばれる１種以上が挙げられる。
【００１１】
水溶液中にタンパク質が夾雑する場合は、予めクロロホルム法、膜分離法、塩析法、透析法等によってタンパク質を除去しておくのが好ましい。
【００１２】
該水溶液中にコバラミン誘導体が２種以上が共存する場合は、シアノコバラミンに変換してから分離回収するのが好ましい。またシアノコバラミン以外のコバラミン誘導体を分離回収する場合は、シアノコバラミンに変換してから分離回収をしてもよい。これらの場合、シアン化カリウム等のシアン化合物を用いてシアノコバラミンとしてから分離回収するのが好ましい。
【００１３】
このようにして必要により前処理されたコバラミン誘導体及び夾雑物を含む水溶液に、アニオン性界面活性剤及び水溶性有機溶媒を加える。
【００１４】
アニオン性界面活性剤としては、カルボキシル基、スルホン基、リン酸基等のアニオン基を有するものが好ましく、カルボキシル基を有するものがより好ましい。また、疎水基としては、フッ素原子を有する脂肪族基、例えば、フルオロアルキル基が好ましい。アニオン性界面活性剤の対イオンとしては、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、アンモニウム基等の一価の対イオンが挙げられ、アルカリ金属及びアンモニウム基を対イオンとするのが好ましい。アルカリ金属としてはリチウムが好ましい。
好ましいアニオン性界面活性剤としては、フッ素化脂肪酸塩、特にフッ素化脂肪酸のアルカリ金属塩又はアンモニウム塩が挙げられる。更に、炭素数６〜１８のフッ素化脂肪酸アルカリ金属塩又はアンモニウム塩、特に炭素数６〜１８のペルフルオロアルカン酸のアルカリ金属塩又はアンモニウム塩が好ましい。
【００１５】
アニオン性界面活性剤の水溶液中への添加量は適宜選択されるが、通常は、０．０１〜１ｍｏｌ／Ｌアニオン性界面活性剤水溶液を水溶液１００容量部に対し０．１〜１０容量部、更に０．５〜５容量部加えるのが好ましい。
【００１６】
水溶性有機溶媒としては、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール等のグリコール類；グリセリン、ジグリセリン等のグリセリン類；メチルエチルケトン、アセトン等のケトン類；ジメチルスルホキシド、ジオキサン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。
これらの水溶液有機溶媒の中でケトン類が好ましく、特にアセトンが分離回収の効率の点で好ましい。
【００１７】
水溶性有機溶媒の水溶液中への添加量は適宜選択されるが、通常は、水溶液１００容量部に対し０．１〜１０容量部、更に０．５〜５容量部加えるのが好ましい。
【００１８】
水溶液にアニオン性界面活性剤及び水溶性有機溶媒を加え均一な溶液とした後、更に酸を加えて相分離させる。
酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸；クエン酸、シュウ酸、コハク酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸が挙げられるが、無機酸が好ましい。無機酸の中では、特に塩酸が好ましい。
【００１９】
酸の添加量は、アニオン性界面活性剤が水素付加されて水溶性を失なうのに必要な量であって、通常は、水溶液のｐＨが１以下になる量であるのが好ましい。
【００２０】
水溶液に酸を加えることによって相分離し、液体相が析出する。この相分離を完結させるために、必要により遠心分離等を行ってもよい。
コバラミン誘導体は、相分離して析出した液体相に特異的に選択抽出され、塩酸チアミン、リボフラビンリン酸エステル、ピリドキシン等のビタミンＢ群、アデニン、シトシン等の塩基類、アスコルビン酸、アミノ酸類、グルコース、フラクトース等の糖類、金属イオン等の夾雑物を含む水溶液より高選択的に高倍率に濃縮分離される。
【００２１】
次いで、析出液体相を分取する。析出液体相は、コバラミン誘導体、アニオン性界面活性剤、水溶性有機溶媒及び水からなるが、必要により濃縮を行ってもよい。必要により予め濃縮された析出液体相に、飽和環状エーテルを加えてコバラミン誘導体を逆抽出する。
飽和環状エーテルとしては、４〜７員の飽和環状モノエーテル、例えばテトラヒドロフラン、オキセタン等が挙げられ、特にテトラヒドロフランが好ましい。
飽和環状エーテルの添加量は、該液体相１００容量部に対し、１〜１００容量部、更に５０〜８０容量部が好ましい。また、イオン交換水、蒸留水、精製水等の水を、更に加えてもよい。水の添加量は、該液体相１００容量部に対し、１〜１００容量部、更に１０〜５０容量部が好ましい。飽和環状エーテルと水の混合比率は、飽和環状エーテル：水＝１：９９〜９９：１（容量比）、更に５０：５０〜９５：５であるのが好ましい。
該液体相に飽和環状エーテル及び水を添加した後、必要により撹拌、遠心分離等を行ってもよい。
【００２２】
コバラミン誘導体が分配された水相を分取し、過剰量の飽和環状エーテルを加え、更に冷却静置してコバラミン誘導体を析出させて分離回収する。
【００２３】
コバラミン誘導体が分配された水相を分取した残余の液体相は、例えば６０〜７０℃に加熱することにより水溶性有機溶媒を留去して、使用したアニオン性界面活性剤を回収し、更にコバラミン誘導体の分離回収に再使用することができる。
【００２４】
【実施例】
以下に本発明を実施例に基づいて、更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
金属塩、糖類等の夾雑物を含有する補酵素型ビタミンＢ１２を１０ｍｇ／Ｌ含有する水溶液３０Ｌに、シアン化カリウム１００ｍｇを加え、８０℃、３０分反応させて、補酵素型ビタミンＢ１２を完全にシアノコバラミンに変換させた。次いでクロロホルム１０Ｌを加えて、撹拌静置してクロロホルム相を分離してタンパク質を除去した。
前処理した水溶液に、ペルフルオロオクタン酸リチウム０．１ｍｏｌ／Ｌ水溶液１Ｌ及びアセトン１Ｌを加え、次いで３５重量％塩酸２Ｌを加え、撹拌し相分離させた。１時間静置し相分離を完結させた。このときの水性液相の全量は３４Ｌ、相分離して析出した液体相は３０ｍＬであった。
析出液体相を別容器に分取し、テトラヒドロフラン２５ｍＬ及び蒸留水１０ｍＬを加え、撹拌し逆抽出を行った。水相を分取した後、水相に過剰量のテトラヒドロフランを加え、冷凍庫（−５℃）に一晩静置した後、ろ過、乾燥し、シアノコバラミン１０７ｍｇの結晶を得た。
水相を分取した残余の析出液体相を６０〜７０℃に加熱して水溶性有機溶媒を留去し、ペルフルオロオクタン酸を得た。当該界面活性剤は、コバラミン誘導体の分離回収に再利用できる。
【００２６】
実施例２
実施例１の方法によりシアノコバラミンを逆抽出した後の残余の析出液体相を、常圧下６５℃に加熱して溶媒を留去し、ペルフルオロオクタン酸の結晶４１．２ｇを得た。上記実施例１において使用したペルフルオロオクタン酸溶液中の含有量から換算した該界面活性剤の回収率は９９．５％であった。このペルフルオロオクタン酸の結晶に１．０ｍｏｌ／Ｌ水酸化リチウム水溶液１００ｍＬを加えて溶解し、次いでイオン交換水９００ｍＬを加えて容量を１Ｌに調整した。この溶液を用い、実施例１と同じシアノコバラミンの分離回収を実施した結果、実施例１の場合と同様に、最終的にシアノコバラミンの結晶１０７ｍｇを得た。
【００２７】
【発明の効果】
コバラミン誘導体及び夾雑物を含む水溶液から、簡便で短時間で迅速に高選択的かつ高収率でコバラミン誘導体を濃縮分離することができ、更に簡便な操作で分離回収することができる。
また、分離に使用したアニオン性界面活性剤は回収し、次の分離回収に再利用することができる。