(57)【要約】      （修正有）【課題】蛍光または発光強度を増大でき、その結果、蛍光または化学発光検出における検出感度を向上できる蛍光または発光検出用媒体を提供する。【解決手段】水、アルコール等の溶媒を、イオン性液体からなる媒体に代替することで、蛍光または化学発光強度が増大され、高感度の検出が可能となることを見いだした。【効果】イオン性液体を蛍光または発光検出媒体として用いているから、従来用いられていた溶媒に比べ、蛍光または化学発光検出における検出感度を著しく高めることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン性液体からなることを特徴とする蛍光または化学発光検出用媒体。
【請求項２】
前記イオン性液体を構成するカチオンが、アンモニウムカチオンであることを特徴とする請求項１記載の蛍光または化学発光検出用媒体。
【請求項３】
前記アンモニウムカチオンが、脂肪族または脂環式４級アンモニウムイオンであることを特徴とする請求項２記載の蛍光または化学発光検出用媒体。
【請求項４】
前記脂肪族または脂環式４級アンモニウムイオンが、下記一般式（１）で示されるイオンであることを特徴とする請求項３記載の蛍光または化学発光検出用媒体。
【化１】
2004219233.tif 000014
〔式中、Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一もしくは異種の炭素数１〜５のアルキル基、
またはＲ′−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−で表されるアルコキシアルキル基（Ｒ′はメチル基またはエチル基を示し、ｎは１〜４の整数である。）を示し、これらＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のいずれか２個の基が環を形成していても構わない。ただし、Ｒ１〜Ｒ４の内少なくとも１つは上記アルコキシアルキル基である。〕
【請求項５】
前記脂肪族または脂環式４級アンモニウムイオンが、下記一般式（２）で示されるイオンであることを特徴とする請求項４記載の蛍光または化学発光検出用媒体。
【化２】
2004219233.tif 000015
〔式中、Ｒ１〜Ｒ３は互いに同一または異種の炭素数１〜５のアルキル基を示し、これらＲ１、Ｒ２およびＲ３のいずれか２個の基が環を形成していても構わない。
Ｒ′はメチル基またはエチル基を示す。〕
【請求項６】
前記脂肪族または脂環式４級アンモニウムイオンが、下記式（３）で示されるイオンであることを特徴とする請求項５記載の蛍光または化学発光検出用媒体。
【化３】
2004219233.tif 000016
〔式中、Ｍｅはメチル基を、Ｅｔはエチル基を示す。〕
【請求項７】
前記イオン性液体を構成するアニオンが、フッ素原子含有アニオンであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光または化学発光検出用媒体。
【請求項８】
前記フッ素原子含有アニオンが、ＢＦ４−、ＰＦ６−、（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ−、ＣＦ３ＳＯ３−またはＣＦ３ＣＯ２−であることを特徴とする請求項７記載の蛍光または化学発光検出用媒体。
【請求項９】
前記イオン性液体を構成するアニオンが、フッ素原子非含有アニオンであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光または化学発光検出用媒体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛍光または化学発光検出用媒体を溶媒として用いることを特徴とする蛍光または化学発光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光または化学発光検出用媒体および蛍光または化学発光検出方法に関し、さらに詳述すると、イオン性液体からなる蛍光または化学発光検出用媒体およびこれを溶媒として用いた蛍光または化学発光検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、微量成分を検出する方法として、放射性同位体を用いた検出方法が一般的に行われてきたが、この検出方法は、使用する放射性物質の危険性が高く、その取り扱いが煩雑になるとともに、厳重管理が必要である等の問題がある。
このような理由から、近年では、放射性同位体に代わって、蛍光や化学発光を用いた、安全性に優れる高感度検出方法が開発され、これらの方法が利用されている（特許文献１〜３参照）。
【０００３】
ところで、最近の、生化学や分子生物学などの極微量サンプルの分析を行う分野の発展に伴い、より高い感度を有する検出方法が望まれている。
上述した蛍光や化学発光を検出する分析系では、蛍光または発光強度を増大すれば、直ちに検出感度の向上につながることから、できるだけ高い蛍光強度、発光強度が得られる分析系の開発が望まれているが、現在までのところ、この点につき、充分な検討がなされているとはいえない。
【０００４】
【特許文献１】
特開平５−２８４９９９号公報
【特許文献２】
特開平５−２８７２６７号公報
【特許文献３】
特開平８−６２２２０号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、蛍光または発光強度を増大できる結果、蛍光または化学発光検出における検出感度を向上できる蛍光または発光検出用媒体、およびこの媒体を溶媒として用いる蛍光または化学発光検出方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明者らは、上記目的を達成するために、蛍光または発光検出法において、従来、溶媒として一般的に使用されている水、アルコール、その他の極性有機溶剤について鋭意検討を重ねた結果、上記水、アルコール等の溶媒を、イオン性液体からなる媒体に代替することで、蛍光または化学発光強度が増大され、高感度の検出が可能となることを見いだし、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、
１．  イオン性液体からなることを特徴とする蛍光または化学発光検出用媒体、
２．  前記イオン性液体を構成するカチオンが、アンモニウムカチオンであることを特徴とする１の蛍光または化学発光検出用媒体、
３．  前記アンモニウムカチオンが、脂肪族または脂環式４級アンモニウムイオンであることを特徴とする２の蛍光または化学発光検出用媒体、
４．  前記脂肪族または脂環式４級アンモニウムイオンが、下記一般式（１）で示されるイオンであることを特徴とする３の蛍光または化学発光検出用媒体、
【化４】
2004219233.tif 000002
〔式中、Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一もしくは異種の炭素数１〜５のアルキル基、
またはＲ′−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−で表されるアルコキシアルキル基（Ｒ′はメチル基またはエチル基を示し、ｎは１〜４の整数である。）を示し、これらＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のいずれか２個の基が環を形成していても構わない。ただし、Ｒ１〜Ｒ４の内少なくとも１つは上記アルコキシアルキル基である。〕
５．  前記脂肪族または脂環式４級アンモニウムイオンが、下記一般式（２）で示されるイオンであることを特徴とする４の蛍光または化学発光検出用媒体、
【化５】
2004219233.tif 000003
〔式中、Ｒ１〜Ｒ３は互いに同一または異種の炭素数１〜５のアルキル基を示し、これらＲ１、Ｒ２およびＲ３のいずれか２個の基が環を形成していても構わない。
Ｒ′はメチル基またはエチル基を示す。〕
６．  前記脂肪族または脂環式４級アンモニウムイオンが、下記式（３）で示されるイオンであることを特徴とする５の蛍光または化学発光検出用媒体、
【化６】
2004219233.tif 000004
〔式中、Ｍｅはメチル基を、Ｅｔはエチル基を示す。〕
７．  前記イオン性液体を構成するアニオンが、フッ素原子含有アニオンであることを特徴とする１〜６のいずれかの蛍光または化学発光検出用媒体、
８．  前記フッ素原子含有アニオンが、ＢＦ４−、ＰＦ６−、（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ−、ＣＦ３ＳＯ３−、またはＣＦ３ＣＯ２−であることを特徴とする７の蛍光または化学発光検出用媒体、
９．  前記イオン性液体を構成するアニオンが、フッ素原子非含有アニオンであることを特徴とする１〜６のいずれかの蛍光または化学発光検出用媒体、
１０．  １〜９のいずれかの蛍光または化学発光検出用媒体を溶媒として用いることを特徴とする蛍光または化学発光検出方法
を提供する。
【０００８】
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
本発明に係る蛍光または化学発光検出用媒体は、イオン性液体からなることを特徴とするものである。
ここで、イオン性液体とは、液状の塩、特に、常温付近で液体となる塩の総称であり、イオンのみからなる溶媒である。このイオン性液体は、不揮発性の液体であるため、不燃または難燃性であるという特徴を有するとともに、耐熱性が高い、液体温度範囲が広い、化学的に安定である等の特徴を有するものである。
【０００９】
本発明においては、蛍光または化学発光検出用媒体として、上記性質を有するイオン性液体を用いるものであり、このイオン性液体の種類としては、特に限定されるものではないが、蛍光や化学発光の強度をより一層向上させるという点から、イオン性液体を構成するカチオンが、アンモニウムカチオンであるものが好ましく、特に、脂肪族または脂環式４級アンモニウムイオンをカチオン成分とするものであることが好ましい。
【００１０】
上記脂肪族および脂環式４級アンモニウムイオンとしては、特に限定されるものではなく、トリメチルプロピルアンモニウムイオン、トリメチルヘキシルアンモニウムイオン、テトラペンチルアンモニウムイオンなどが挙げられるが、特に、下記一般式（１）で示されるものを好適に用いることができる。
【００１１】
【化７】
2004219233.tif 000005
〔式中、Ｒ１〜Ｒ４は互いに同一もしくは異種の炭素数１〜５のアルキル基、またはＲ′−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−で表されるアルコキシアルキル基（Ｒ′はメチル基またはエチル基を示し、ｎは１〜４の整数である。）を示し、これらＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のいずれか２個の基が環を形成していても構わない。ただし、Ｒ１〜Ｒ４の内少なくとも１つは上記アルコキシアルキル基である。〕
【００１２】
式（１）において、炭素数１〜５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、２−プロピル基、ブチル基、ペンチル基等が挙げられるが、分子量が大きいほどイオン性液体の粘性が増大する傾向にあり、粘度が高くなると蛍光物質等の溶解が困難になるため、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つはメチル基、エチル基またはプロピル基、特に、メチル基またはエチル基であることが好ましい。
また、Ｒ′−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−で表されるアルコキシアルキル基としては、メトキシまたはエトキシメチル基、メトキシまたはエトキシエチル基、メトキシまたはエトキシプロピル基、メトキシまたはエトキシブチル基が挙げられる。上記ｎは１〜４の整数であるが、イオン性液体形成能が高いことを考慮すると、２〜４が好ましく、特に、ｎ＝２が好ましい。
【００１３】
Ｒ１〜Ｒ４のいずれか２個の基が環を形成しているカチオンとしては、アジリジン環、アゼチジン環、ピロリジン環、ピペリジン環等を有する４級アンモニウムイオンが挙げられる。
上記式（１）で示される４級アンモニウムイオンの中でも、イオン性液体形成能が高く、原料が安価で比較的簡便な方法で合成できることから、下記式（２）で示されるアルコキシエチル基を有する４級アンモニウムイオンが好ましく、特に、下記式（３）で示される４級アンモニウムイオンがより一層好ましい。
【００１４】
【化８】
2004219233.tif 000006
〔式中、Ｒ１〜Ｒ３およびＲ′は、上記と同じ。〕
【００１５】
【化９】
2004219233.tif 000007
〔式中、Ｍｅはメチル基を、Ｅｔはエチル基を示す。〕
【００１６】
上記式（３）で示される４級アンモニウムイオンのように、２−アルコキシエチル基を含有するアンモニウムカチオンは、イオン性液体の性状を示し易く、例えば、下記式（４）〜（６）で示されるものもイオン性液体の性状を示し、これらも本発明の蛍光等の検出用媒体として好適に用いることができる。
【００１７】
【化１０】
2004219233.tif 000008
【００１８】
また、上記イオン性液体を構成するアニオンとしては、特に限定されるものではなく、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＡｓＦ６−、ＳｂＦ６−、ＡｌＣｌ４−、ＨＳＯ４−、ＣｌＯ４−、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＣＯ２−、（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−等のアニオンを用いることができる。
これらのアニオンの中でも、イオン性液体形成能が高いことを考慮すると、フッ素原子含有アニオン、特に、ＢＦ４−、ＰＦ６−、（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＣＯ２−、（ＣＦ３ＳＯ２）３Ｃ−、Ｃ２Ｆ５ＳＯ３−、（Ｃ２Ｆ５ＳＯ２）２Ｎ−、Ｆ・２．３ＨＦ−、ＳｂＦ６−等を用いることが好ましい。
【００１９】
また、非ハロゲン化により環境負荷を低減するという点からは、フッ素原子等のハロゲン原子を含有しないアニオンを用いることが好ましく、この場合、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＳＯ３−、ＣＨ３ＣＯ２−、ＣＨ３ＣＯ２−、（ＣＮ）２Ｎ−、ＮＯ３−等を好適に用いることができる。
【００２０】
上記４級アンモニウム塩の一般的な合成法は、次の通りである。まず、３級アミン類と、アルキルハライドまたはジアルキル硫酸等とを混合し、必要に応じて加熱を行うことで４級アンモニウムハライド塩とする。なお、アルコキシエチルハライド、アルコキシメチルハライド等の反応性の低い化合物を用いる場合、オートクレーブ等を用いて加圧下で反応させることが好適である。
このようにして得られた４級アンモニウムハライド塩を、水等の水性媒体中に溶解し、ホウフッ化水素酸や、テトラフルオロリン酸等の必要とするアニオン種を発生させる試薬と反応させてアニオン交換反応を行い、４級アンモニウム塩を得ることができる。
【００２１】
上記イオン性液体の融点は、特に限定されるものではないが、蛍光または化学発光分析を行う際に支障を来さないという点から、５０℃以下、特に２５℃以下であることが好ましい。
なお、本発明の蛍光等の検出用媒体は、それ単独で使用してもよく、従来用いられていた溶媒と混合して用いることもできるが、蛍光等の強度増大効果をより高めるという点から、従来の溶媒と混合して用いる場合でも、溶媒全量に対して検出用媒体を少なくとも１０質量％以上、特に、５０質量％以上で使用することが好ましい。
【００２２】
以上述べたイオン性液体からなる蛍光または化学発光検出用媒体中に、後に詳述する励起状態から基底状態に戻る際に光エネルギーを放出する化合物を溶解させることで、従来の溶媒を用いた場合よりも、蛍光または化学発光の強度を増大させることができる。この場合、その増大の程度は、光エネルギーを放出する物質の種類や比較対照とする溶媒等により変わるため一概にはいえないが、少なくとも同等以上の効果が得られ、通常、１．０５倍以上、特には、２〜１０倍程度の強度増大効果が見られる。
このように、本発明の蛍光または化学発光検出用媒体は、蛍光等の強度増大効果を有しているから、蛍光または化学発光検出分析に使用した場合に、蛍光等の検出感度を向上できるので、微量成分の検出が容易に行えるようになる。
【００２３】
本発明に係る蛍光または化学発光検出方法は、従来公知の蛍光または化学発光検出方法において、励起状態から基底状態に戻る際に光エネルギーを放出する化合物、被測定物である微量成分などを溶解等させるのに用いられていた溶媒として、上述したイオン性液体からなる蛍光または化学発光検出用媒体を用いるものである。
【００２４】
この場合、上記蛍光または化学発光検出用媒体に溶解させて使用することのできる、励起状態から基底状態に戻る際に光エネルギーを放出する化合物としては、特に限定されるものではなく、従来公知の化学発光物質や蛍光物質を用いることができる。
化学発光物質としては、例えば、ビス（２，４−ジニトロフェニル）オキサレート（ＤＮＰＯ），ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキサレート（ＴＣＰＯ）等のシュウ酸ジエステル誘導体、ルミノール，イソルミノール等のルミノール誘導体、４−（２−スクシミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオスルフェート（ＳＰＭＡ）等に代表されるアクリジニウムエステル誘導体などが挙げられる。
【００２５】
蛍光物質としては、例えば、ローダミン誘導体、フルオレセイン誘導体、シアニン誘導体、ピレン誘導体、クマリン誘導体、ペリレン誘導体、ダンシル誘導体、オキサゾール誘導体等が挙げられるが、放出される蛍光の強度や汎用性等を考慮すると、中でもローダミン誘導体、シアニン誘導体が好適である。
【００２６】
なお、本発明の検出方法は、従来用いられていた溶媒を、イオン性液体からなる媒体に代替することに特徴を有しており、測定装置、被測定物および測定試料調製方法等のその他の点においては、従来公知の装置、方法等を適宜採用すればよい。例えば、ＤＮＡやＲＮＡなどのポリヌクレオチドの検出、酵素に代表されるタンパク質の検出、抗原・抗体の検出、その他の生体微量成分の検出、微量有機化合物、微量無機化合物の検出などに好適に利用でき、この場合の測定装置、試料調製法などは、従来の採用されていた方法をそのまま適用することができる。
【００２７】
本発明によれば、イオン性液体からなる媒体を測定用溶媒として用いているから、従来使用されていた蛍光または化学発光検出用媒体と比べ、蛍光強度または発光強度を著しく向上させることができ、感度に優れ、微量成分の分析に非常に有効な蛍光または化学発光検出方法を提供することができる。また、従来有機溶媒を用いていた分析系においては、これをイオン性液体に変更することで、難燃性を高めることができるという利点があり、さらに、金属錯体系の蛍光物質を、その種類によっては、回収し、再利用できる場合もある。
【００２８】
【実施例】
以下、合成例、実施例および比較例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００２９】
［合成例１］  イオン性液体（７）の合成
【００３０】
【化１１】
2004219233.tif 000009
【００３１】
ジエチルアミン（関東化学（株）製）１００ｍｌと２−メトキシエチルクロライド（関東化学（株）製）８５ｍｌとを混合し、得られた混合溶液をオートクレーブ中に入れ、１００℃で２４時間反応させた。この時、内圧は、０．１２７ＭＰａ（１．３ｋｇｆ／ｃｍ２）であった。２４時間後、析出した結晶と反応液との混合物に水酸化カリウム（片山化学工業（株）製）５６ｇを溶解した水溶液２００ｍｌを加え、２層に別れた有機層を分液ロートで分液した。さらに、塩化メチレン（和光純薬工業（株）製）１００ｍｌを加え抽出する操作を２回行った。
【００３２】
分液した有機層をまとめ、飽和食塩水で洗浄した後、炭酸カリウム（和光純薬工業（株）製）を加えて乾燥し、減圧濾過した。得られた有機層の溶媒をロータリーエバポレーターを用いて留去し、残留分について常圧蒸留を行い、沸点１３５℃付近の留分を１８．９ｇ得た。この化合物が２−メトキシエチルジエチルアミンであることを１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルにより確認した。
【００３３】
得られた２−メトキシエチルジエチルアミン８．２４ｇをテトラヒドロフラン（和光純薬工業（株）製）１０ｍｌに溶解し、氷冷下、ヨウ化メチル（和光純薬工業（株）製）４．０ｍｌを加えた。３０分後、アイスバスを外し、室温にて一晩撹拌した。この反応溶液の溶媒を減圧留去し、得られた固形分をエタノール（和光純薬工業（株）製）−テトラヒドロフラン系で再結晶し、２−メトキシエチルジエチルメチルアンモニウムヨウ素塩を１６ｇ得た。
【００３４】
続いて、２−メトキシエチルジエチルメチルアンモニウムヨウ素塩１０．０ｇをアセトニトリル（関東化学（株）製）５０ｍＬに溶解した。これにトリフルオロメタン酸イミドリチウム（キシダ化学（株）製）９．５ｇを加え、これが完全に溶解した後、さらに１５分間撹拌した。
アセトニトリルを減圧留去し、残留分に水を加え、２層に分離した有機層を分液し、水で５回洗浄し、有機層中の不純物を取り除いた。
洗浄後の有機層を真空ポンプにて減圧にし、水を十分に留去し、室温で液体状のイオン性液体（７）を６．８ｇ得た。
【００３５】
［実施例１］
下記式（８）で示されるローダミン誘導体を、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業（株）製）に１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、これを原液とした。この原液５μｌを蛍光等の検出用媒体である合成例１で得られたイオン性液体（７）２ｍｌに加えて均一の溶液を調製した。得られた溶液について、蛍光分光光度計（Ｆ−３０１０、（株）日立製作所製）を用い、蛍光物質の最大励起波長を求め、その波長での最大蛍光波長および蛍光強度を測定した。測定結果を表１に示す。
【００３６】
【化１２】
2004219233.tif 000010
【００３７】
［比較例１〜３］
イオン性液体（７）に代えて、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業（株）製）、メタノール（片山化学工業（株）製）、蒸留水を媒体として用いた以外は、実施例１と同様にして、最大蛍光波長および蛍光強度を測定した。測定結果を表１に併せて示す。
【００３８】
【表１】
2004219233.tif 000011
【００３９】
［実施例２］
下記式（９）で示されるシアニン誘導体をジメチルスルホキシド（和光純薬工業（株）製）に０．４ｍｇ／ｍｌとなるように溶解して原液を調製した以外は、実施例１と同様にして、最大蛍光波長および蛍光強度を測定した。測定結果を表２に示す。
【００４０】
【化１３】
2004219233.tif 000012
【００４１】
［比較例４〜６］
イオン性液体（７）に代えて、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業（株）製）、メタノール（片山化学工業（株）製）、蒸留水を媒体として用いた以外は、実施例２と同様にして、最大蛍光波長および蛍光強度を測定した。測定結果を表２に併せて示す。
【００４２】
【表２】
2004219233.tif 000013
【００４３】
表１，２に示されるように、イオン性液体（７）からなる溶媒を検出媒体として用いた実施例１，２では、比較例よりも、蛍光強度が著しく増大されていることがわかる。
【００４４】
【発明の効果】
本発明によれば、イオン性液体を蛍光または発光検出用媒体として用いているから、従来用いられていた溶媒に比べ、蛍光または化学発光検出における検出感度を著しく高めることができる。