(57)【要約】【課題】血球などの固形成分を含む試料液に対しても、少量の試料で精度の高い測定が可能なバイオセンサを提供する。【解決手段】垂直分離型の試料供給部を有するバイオセンサにおいて、試料供給部が、試料液を通過させてフィルタの一次側端部に試料液を供給する開口部を有し、この開口部の試料供給部側の外周が親水性の材料で構成され、この親水性材料で構成される部分の外周が疎水性材料で構成されている。試料液を点着する際、試料供給部の開口部を覆う位置に充分試料が覆い被さり、開口部を経由してフィルタの一次側端部に浸透する試料液の量が充分になり、その結果、迅速にフィルタに試料液が浸透する。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料供給部、前記試料供給部より供給される試料液に含まれる固形物を濾過するフィルタ、前記フィルタを通過した試料液の一部または全部と化学反応することにより試料液に含まれる特定の物質の一部または全部を物理的または化学的原理に基づく定量方法で定量するための反応試薬層、および検出に供される部位を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、試料液を通過させて前記フィルタの一次側端部に試料液を供給する開口部を有し、この開口部の試料供給部側の外周が親水性の材料で構成され、この親水性材料で構成される部分の外周が疎水性材料で構成されていることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記化学反応が、前記試料液中の特定成分の酸化または還元反応であり、前記の検出に供される部位が、前記酸化または還元反応により生成する、前記試料液中の特定成分由来の物質、または前記反応試薬層中の物質由来の物質、の一部または全部を電気化学的に酸化または還元する電極系である請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記化学反応が、前記試料液中の特定成分の酸化または還元反応であり、前記の検出に供される部位が、前記酸化または還元反応により生成する、前記試料液中の特定成分由来の物質、または前記反応試薬層中の物質由来の物質、の光学的変性を外部より検出することができる構造を有する請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項４】
絶縁性の基板、前記基板上に設けられた作用極と対極を有する電極系、少なくとも酸化還元酵素と電子メディエータを含む反応試薬層、前記電極系と前記反応試薬層とを含み終端部側に空気孔を有する試料液供給路、試料供給部、および前記試料液供給路と試料供給部との間に設けられた固形物を濾過するフィルタを具備し、前記フィルタで固形物を濾過された試料液が毛細管現象によって前記試料液供給路内に吸引されるようにしたバイオセンサであって、前記試料供給部が、試料液を通過させて前記フィルタの一次側端部に試料液を供給する開口部を有し、この開口部の試料供給部側の外周が親水性の材料で構成され、この親水性材料で構成される部分の外周が疎水性材料で構成されていることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項５】
前記試料供給部が、開口部をもつ親水性の表面を有する部材と、この開口部より大きな開口部をもつ疎水性表面を有する部材を張り合わせて形成されている請求項１〜４のいずれかに記載のバイオセンサ
【請求項６】
前記フィルタの二次側端部と前記基板との間に、濾過液が前記試料液供給路に供給されるまでの間貯留される部分を有する請求項４記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記空気孔と前記フィルタの間の前記試料液供給路に、前記電極系が設けられた請求項６記載のバイオセンサ
【請求項８】
前記フィルタの二次側端部と対向する位置に前記電極系が設けられ、前記フィルタの二次側端部と前記電極系が非接触である請求項６記載のバイオセンサ
【請求項９】
前記フィルタが円形である請求項１〜８のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記フィルタが多角形である請求項１〜８のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
前記フィルタが、水に難溶性の繊維からなるフィルタであって、外形の塑性変形が可能である請求項１〜１０のいずれかに記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、試料中の特定成分について、迅速、高感度、かつ簡便に定量するためのバイオセンサに関する。
【０００２】
【従来技術】
従来のバイオセンサの一例として、グルコースセンサについて説明する。
代表的なものとして、絶縁性の基板上にスクリーン印刷等の方法により、少なくとも測定極および対極を含む電極系を形成し、この電極系上に、親水性高分子、酸化還元酵素および電子メディエータを含む酵素反応試薬層を形成したものがある。酸化還元酵素にはグルコースオキシダーゼが、また電子メディエータにはフェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体などの金属錯体や有機化合物などがそれぞれ用いられる。酵素反応試薬層には、必要に応じて緩衝剤が加えられる。
【０００３】
このバイオセンサの酵素反応試薬層上に、基質を含む試料液を滴下すると、酵素反応試薬層が溶解して、酵素と基質が反応し、この反応に伴い電子メディエータが還元される。酵素反応終了後、この還元された電子メディエータを電気化学的に酸化する酸化電流値から試料液中の基質濃度を求めることができる。
このタイプのセンサでは、酵素反応の結果生じた電子メディエータの還元体を電極で酸化し、その酸化電流値からグルコース濃度を求めることができる。
このようなバイオセンサは、測定対象物質を基質とする酵素を用いることで、様々な物質に対する測定が原理的には可能である。例えば、酸化還元酵素にコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを用い、更に、コレステロールエステルをコレステロールに変化させるためにコレステロールエステラーゼを用いれば、各種医療機関で診断指針に用いられる血清中のコレステロール値を測定することができる。
【０００４】
コレステロールエステラーゼの酵素反応の進行は非常に遅いので、適切な界面活性剤を添加することにより、コレステロールエステラーゼの活性を向上させ、全体の反応に要する時間を短縮することができる。
しかし、反応系に界面活性剤が含まれることから、界面活性剤が血球に悪影響を及ぼすため、グルコースセンサのように全血そのものを測定することが不可能である。
【０００５】
そこで、血球を濾過した血漿のみを迅速にセンサ内の試料液供給路に供給するために、試料液供給路の開口部付近にフィルタ（血球濾過部）を設ける提案がなされている。
血球分離の方法には、血液をフィルタの一次側端部から滴下して、二次側端部から血漿がにじみ出る水平分離、血液をフィルタの表面に直接滴下して、底面から血漿がにじみ出る垂直分離、血液をフィルタの一次側表面に直接滴下して、二次側端部から血漿がにじみ出る複合分離の３種類がある。従来は、水平分離（特許文献１参照）あるいは複合分離が用いられてきた。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００２−２０２２８３号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
水平分離を用いる場合、フィルタによる濾過距離を長くとることが可能であるが、濾過に長時間を要するという短所がある。また、フィルタへの試料液の浸潤および濾過後の試料液の試料供給路への導出の駆動力を、主に試料供給路側の濡れ性に依拠し、フィルタへの逆流防止のため、試料供給路に濾過試料液が満たされた後にもフィルタの一次側端部に充分量の試料液が残留している必要がある。従って、試料液の量に比して、濾過される試料液の量が比較的少ないという短所がある。換言すると、試料液の必要量が多くなる傾向があるということになる。
【０００８】
複合分離型の場合、フィルタの一次側端部の試料液との接触面積の増加と、一次側端部からの試料液の浸潤方向が重力方向であることによる浸潤性の向上により、水平分離型の上記の短所の改善が期待できる。しかし、複合分離型の場合にも、フィルタによる濾過距離が長いことから、濾過時間は依然、比較的長い。
これに対し、垂直方向に分離可能なフィルタを用いた垂直分離型では、試料量のフィルタへの浸潤に重力の効果を期待できる。また、試料供給部側端部すなわち一次側端部における試料液との接触部分の面積を多くとることができ、更に濾過試料液が漏出する側の端部すなわち二次側端部の面積も多くとることができる。これらの効果により、フィルタの一次側端部への試料供給量に対する濾過試料液量の割合は、水平分離型および複合型と比して大きくなることが期待できる。
【０００９】
しかし、垂直方向に分離可能なフィルタを用いた垂直分離型では、フィルタの一次側端部に確実に試料液を浸透させる必要がある。さもないと、一次側端部のみならず、隣接するフィルタ側壁にも試料液が回りこみ、充分な濾過性能が得られなくなる。そこで、確実にフィルタの一次側端部に試料液を導くために、試料供給部とフィルタの一次側端部が接触する位置に設けた開口部を通じて、フィルタの一次側端部に試料液を供給すれば、一次側端部に確実に試料液を供給することができる。この場合、試料供給部の開口部の大きさは、フィルタの試料供給部との接触部より小さいことが求められる。
【００１０】
試料供給部の開口部の大きさは、このような制限のもとに形成される。このため、試料供給部に添加された試料液が、開口部に確実に吸引されない場合がある。具体的には、試料供給部が通常のＰＥＴなどの樹脂材料で構成されている場合、指先等を穿刺して出液させた試料液たる血液を穿刺具の針先で試料供給部に点着する際、試料供給部の開口部が小さく、しかも親水性が弱いことから、血液が試料供給部表面ではじかれて、開口部を覆うように点着できないことがある。また、試料供給部を親水性の強い材料、たとえば表面全体を親水処理した材料で構成した場合、試料液を点着する際、試料液が試料供給部表面にいち早く拡散してしまい、開口部を経由してフィルタの一次側端部に浸透する試料液の量が充分でなくなる場合がある。
【００１１】
本発明は、上記のようなバイオセンサにおける垂直分離型の試料供給部に生じる不都合をなくし、試料液中の固形成分が完全に濾過され、迅速に電極系に達するように改良したバイオセンサを提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため本発明のバイオセンサは、試料供給部、前記試料供給部より供給される試料液に含まれる固形物を濾過するフィルタ、前記フィルタを通過した試料液の一部または全部と化学反応することにより試料液に含まれる特定の物質の一部または全部を物理的または化学的原理に基づく定量方法で定量するための反応試薬層、および検出に供される部位を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、試料液を通過させて前記フィルタの一次側端部に試料液を供給する開口部を有し、この開口部の試料供給部側の外周が親水性の材料で構成され、この親水性材料で構成される部分の外周が疎水性材料で構成されていることを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
上記のように本発明によるバイオセンサは、試料供給部が、試料液を通過させて前記フィルタの一次側端部に試料液を供給する開口部を有し、この開口部の試料供給部側の外周が親水性の材料で構成され、この親水性材料で構成される部分の外周が疎水性材料で構成されている。
【００１４】
本発明の好ましい実施の形態における上記化学反応は、試料液中の特定成分の酸化または還元反応であり、前記の検出に供される部位は、前記酸化または還元反応により生成する、前記試料液中の特定成分由来の物質、または前記反応試薬層中の物質由来の物質、の一部または全部を電気化学的に酸化または還元する電極系である。
【００１５】
前記の化学的原理に基づく定量方法としては、試料液中に含まれる特定成分の酸化還元反応を用いることができる。この場合、最も好適なバイオセンサは、絶縁性の基板、前記基板上に設けられた作用極と対極を有する電極系、少なくとも酸化還元酵素と電子メディエータを含む反応試薬層、前記電極系と前記反応試薬層とを含み、終端部側に空気孔を有する試料液供給路、試料供給部、および前記試料液供給路と試料供給部との間に設けられた、血球等の固形物を濾過するフィルタを具備し、前記フィルタで固形物を濾過された試料液が毛細管現象によって前記試料液供給路内に吸引されるように構成される。
【００１６】
本発明の別の好ましい実施の形態における前記化学反応は、試料液中の特定成分の酸化または還元反応であり、前記の検出に供される部位が、前記酸化または還元反応により生成する、前記試料液中の特定成分由来の物質、または前記反応試薬層中の物質由来の物質、の光学的変性を外部より検出することができる構造を有する。すなわち、反応試薬と試料中の特定物質の化学反応で生じた溶液の吸光度変化などの光学的な変化を外界から検出することが可能なように、光学的変化を伴う化学反応が生じる溶液と外界を隔てる部分の材質の一部または全部が対象となる光学的特性に対して透明であるか、化学反応を生じる溶液の一部が外界に露出しており、前記の溶液と外界を隔てる部分の透明な材料の部分の外界側の少なくとも一部、または前記の外界への溶液の露出部分の少なくとも一部と、外界に配置される光学的検出装置を結ぶ直線上に、フィルタなどの前記光学的特性に対して透明でない物質が配置されていない構造である。
【００１７】
本発明の好ましい実施の形態において、前記試料供給部は、開口部をもつ親水性の表面を有する部材と、この開口部より大きな開口部をもつ疎水性表面を有する部材を張り合わせて形成されている。
【００１８】
本発明の別の好ましい実施の形態において、前記フィルタの二次側端部と前記電極系を有する基板との間に、濾過液が前記試料液供給路に供給されるまでの間貯留される部分を有する。
この場合、前記空気孔と前記フィルタの間の前記試料液供給路に、前記電極系が設けられる。
前記フィルタの二次側端部と対向する位置に前記電極系が設けられ、前記フィルタの二次側端部と前記電極系が非接触である。
好ましいフィルタは、水に難溶性の繊維からなり、外形の塑性変形が可能である。
【００１９】
試料液中の固形成分の分離には垂直分離の方法をとるが、試料液通過用の開口部を有する試料供給部が、固形成分分離用のフィルタの上面を覆う位置に形成されている。この試料供給部に設けられた開口部の周囲を親水性にし、さらにこの親水性部分の外周を疎水性にすることで、供給された試料液が確実に開口部を覆うことができ、その後、迅速に試料液を確実に開口部を通過させて、フィルタの一次側端部に吸収させることができる。この開口部周囲の親水性部分を形成するには、界面活性剤あるいはプラズマ照射などにより親水性を向上させた材料を用いることで実現が可能である。
【００２０】
試料供給部の一部にすり鉢状のくぼみを形成し、その底部に前記開口部を設け、このすり鉢状部分を親水処理することもできる。かわりに、表面を親水処理した部材に開口部を設け、この部材の上部に、より大きな開口部を設けた疎水性の部材を張り合わせて試料供給部を構成することもできる。そのような試料供給部においては、疎水性の部材の開口部の底に、より小さな開口部を有する親水性の部材が位置し、その親水性部材の開口部の縁部に試料液を貯留して、親水性の部材の開口部への試料液の通過を円滑に行わせることができる。
【００２１】
本発明に用いる電子メディエータとしては、フェリシアン化カリウムの他、コレステロールオキシダーゼなどの酸化還元酵素との電子伝達能を有するレドックス化合物から選択することができる。
酸化還元酵素は、測定対象物を基質とする酵素であり、グルコースを測定対象物とするセンサでは、グルコースオキシダーゼを用いる。診断指針に用いられる血清中のコレステロール値を測定するには、コレステロールの酸化反応を触媒する酵素コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼとコレステロールエステルをコレステロールに変化させる過程を触媒する酵素コレステロールエステラーゼを用いる。反応試薬系に界面活性剤を添加することでコレステロールエステラーゼの活性を向上させ、全体の反応に要する時間を短縮することができる。
【００２２】
これらの試薬からなる反応試薬層は、センサ内の電極系上またはその近傍の位置に配置される。本発明によるバイオセンサでは、電極系を設けた電極基板に組み合わされて電極基板との間に電極系に試料液を供給する試料液供給路を形成するカバー部材が用意される。反応試薬層は、前記試料液供給路に露出する部分や試料液供給路の開口部などに設けることができる。いずれの位置であっても、導入された試料液によって反応試薬層が容易に溶解して電極系に到達できることが好ましい。電極を保護し、形成される反応試薬層の剥離を抑制するために、電極上に接して親水性高分子層が形成されることが好ましい。
本発明をコレステロールセンサに用いる場合には、電子メディエータを含む層は、溶解性を高めるために、界面活性剤と分離することが好ましい。また、保存安定性のために、電子メディエータは、コレステロールの酸化反応を触媒する酵素コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼと分離することが好ましい。
【００２３】
血糖値を測定するバイオセンサでは、試料液が反応試薬層へ導入されるのを容易にするため、電極系上に形成された層などを被覆するように、脂質を含む層を形成する例がある（たとえば特開平２−０６２９５２号公報参照）。本発明によるバイオセンサにおいても、このような脂質を含む層を用いることが可能である。また、反応試薬層の一部を溶解性向上のため、凍結乾燥法により形成することができる。その場合、反応試薬層の形状、形成位置のばらつきを抑制するために、カバー部材の表面が、界面活性剤あるいはプラズマ照射などにより、親水処理されている構成をとることが好ましい。そのような構成の場合、界面活性剤や反応試薬層自身の濡れ性により、試料液が円滑に試料液供給路内に導かれるので、前記の脂質層はなくてもよい。
【００２４】
血糖値を測定するバイオセンサでは、前記のコレステロールセンサなどと違い、反応試薬層を構成する試薬群について、特に分離して形成する必要がないので、全ての試薬群を混合して、１箇所に反応試薬層を形成することができる。
従って、電極基板のフィルタの二次側端部に対向する位置に電極系を形成し、これを覆うように反応試薬層を形成することができる。この場合、濾過された試料液が反応試薬層部分に均一に到達することができるように、電極系の下流側に空気孔を設けることが望ましい。
【００２５】
親水性高分子としては、水溶性セルロース誘導体、特にエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースの他、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、アガロース、ポリアクリル酸およびその塩、デンプンおよびその誘導体、無水マレイン酸の重合体およびその塩、ポリアクリルアミド、メタクリレート樹脂、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレートなどを用いることができる。
界面活性剤には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ポリエチレングリコールモノドデシルエーテル、コール酸ナトリウム、ドデシル−β−マルトシド、ジュークロースモノラウレート、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミドおよびポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルなどから選択することができる。
脂質としては、使用する場合、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質で、両親媒性脂質が好適に用いられる。
酸化電流の測定方法としては、測定極と対極のみの二電極方式と、参照極を加えた三電極方式があり、三電極方式の方がより正確な測定が可能である。
【００２６】
以下、具体的な実施の形態により本発明を詳細に説明する。
図１は、好ましい実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である。
１０は絶縁性樹脂、例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）からなる絶縁性の基板を示す。この基板１０は、その上面にパラジウムがスパッタまたは蒸着されて薄膜１１が形成されている。この薄膜をレーザートリミングすることにより、作用極１２と対極１３からなる電極系を形成している。電極面積は、後述するスペーサ１４に形成されるスリット１７の幅により決定される。
前記基板１に組み合わせるスペーサ１４には、試料液供給路を形成するスリット１７、その両端に形成された、空気孔１５および試料供給部に連通する貫通孔１６が設けられている。
スペーサ１４上にセットされるカバー１８は、貫通孔１６に連通し、それと同じ大きさの貫通孔１９を有するが、空気孔１５は覆わない。
【００２７】
フィルタ保持基板２１は、フィルタ２６より大きな径をもつ貫通孔２２を有する。フィルタ２６の直径は、カバー１８の孔１９のそれより大きい。
試料供給部２３は、すり鉢状に加工された部分の底部に開口部２４が形成されている。このすり鉢状の部分は、界面活性剤の塗布によって親水処理され、親水部２５を形成している。
スペーサ１４の孔１６、カバー１８の孔１９、フィルタ保持基板２１の孔２２および試料供給部２３の開口部２４は、図１に一点鎖線で示すように、中心が一致するように組み合わされる。図１には、スリット１７、孔１５および１６の外周部の投影図を点線で示している。
フィルタ（血球濾過部）２６は、ガラス、紙、あるいはポリエステルの不織繊維布からなり、例えば直径２ｍｍの円形に裁断されたものを用いる。フィルタの厚さは約６００〜１０００μｍである。
【００２８】
このセンサを組み立てるには、基板１０上のスリット１７に対応する部分に、作用極および対極を覆うように反応試薬層２７を形成する。また、カバー１８とスペーサ１４を組み合わせ、スリット１７のところにできる凹部に反応試薬層２８を形成する。そして、基板１０上に、前記のカバー１８とスペーサ１４を組み合わせ、フィルタ保持基板２１およびフィルタ２６、並びに試料供給部２３を順次組み合わせ、フィルタを除き張りあわせる。こうしてセンサが完成すると、図２の縦断面図のような形状になる。
図１では反応試薬層を省いているが、図２には反応試薬層を示している。基板１０の電極系上に反応試薬層２７が形成され、スリット１７のところに形成される試料液供給路の天井に相当するカバー１８の下面側に反応試薬層２８が形成されている。
【００２９】
このセンサを用いて血液中のコレステロールを測定する例を説明する。
まず、試料の血液を試料供給部２３へ供給する。ここに供給された血液は、試料供給部の上部表面が疎水性で、開口部２４の周囲のすり鉢状部分のみ親水処理されているため、親水部２５と開口部２４を覆う位置に収束し、開口部２４からフィルタ２６の一次側端面、すなわち上表面からその内へ浸透する。
【００３０】
フィルタ２６内では、血球の浸透速度は液体成分である血漿より遅いので、血漿がフィルタの二次側の端部から染み出す。そして、この染み出した血漿は、基板１０上に貫通孔１６および１９により形成される凹部に一時的に捕集された後、毛管現象によりスリット１７の部分に形成される試料液供給路の入り口から試料液供給路内に入り、電極系を覆う位置およびその直上のカバー１８の裏面に担持された反応試薬層２７および２８を溶解しながら、電極系近傍からさらに空気孔１５の部分までの試料液供給路全体を満たす。試料液供給路全体が液体で満たされると、フィルタ２６内の液体の流動も停止し、その時点で、血球はフィルタ２６の二次側端部に到達せず、その位置に留め置かれる。したがって、フィルタ２６は、血漿が試料液供給路全体を満たすだけの量が通過してなお血球がフィルタの二次側端部に達しない程度に、血漿と血球との流通抵抗の差があるように設計される。ここに用いるフィルタは、孔径１〜７μｍ程度のデプスフィルタが好適である。
このような血球濾過の過程を経て、血漿により溶解された反応試薬層と血漿中の測定成分、コレステロールセンサであればコレステロール、との化学反応が生じ、一定時間経過後、電極反応により電流値を測定し、血漿中の成分を定量することができる。
【００３１】
図２は、試料液供給路の電極系近傍における反応試薬層の配置の例を示す。基板１０の電極系上には、反応試薬の例えば電子メディエータを含む反応試薬層２７が形成してある。この反応試薬層２７の下層として、電極表面にカルボキシメチルセルロースなどの親水性高分子の層を設けてもよい。また、カバー１８とスペーサ１４を組み合わせたカバー部材の裏面の凹部には、試料液供給路に露出する面に、酸化還元酵素を含む反応試薬層２８が形成されている。
フィルタ保持基板２１の貫通孔２２はフィルタ２６と非接触で、フィルタの膨張を妨げることがないよう設計されているので、溶血するおそれもない。また、貫通孔２２では、フィルタ側面へのフィルタ保持部材などによる接触がないので、毛細管現象によりフィルタ外壁を、濾過されていない血液が回りこむのを防ぐことができる。
図示のような構造のバイオセンサでは、前記試料液供給路の幅が１．５ｍｍ以下、高さが１５０μｍ以下、好ましくは５０〜１００μｍ、長さが４．５ｍｍ以下であることが好ましい。あるいは、前記試料供給路部分の体積が０．０５μｌ以上、１．０１２５μｌ以下であることが好ましい。
【００３２】
前記電極系は、貴金属電極であることが好ましい。理由は２つある。ひとつは、前記試料液供給路の幅が１．５ｍｍ以下のように狭いため、スクリーンを用いた印刷電極では電極面積を決定する精度が劣る。しかし、貴金属電極は、０．１ｍｍ以下の幅でレーザートリミングすることが可能であり、電極面積を決定する精度が高い。また、試料液供給路の高さ、すなわちスペーサ１４の厚みが１５０μｍ以下なので、スクリーン印刷により、抵抗層を設けようとする場合、抵抗層の厚みによる段差が試料の流入性に与える影響が無視できなくなるのである。
【００３３】
試料供給部を変えた別の実施の形態を図３に示す。
上面および開口部３４の内壁を親水処理により親水部３５を設けた部材３３と、疎水性素材または表面を疎水性に処理した部材に、開口部３４より大きな開口部３７を設けた基板３６とを張り合わせて試料供給部を形成する。この構成によると、疎水性部材３６の開口部３７の底部に、親水部３５を有する開口部３４およびその縁部が位置する。この親水性の部材によってできた開口部３４の縁部は、疎水性部材３６の開口部３７に供給される試料液を貯留し、親水性の部材の開口部３４からの試料液の通過を円滑に行わせることができる。
上の部材３６のかわりに、スクリーン印刷などで、部材３３の上に疎水性材料を印刷し、同様の形状にすることも可能である。
【００３４】
図４は、さらに別の実施の形態を示す。
本実施の形態は、血糖センサのように、反応試薬層の分離の必要が無い場合に適用される。基板４０に形成される作用極４２および対極４３からなる電極系は、フィルタ５６の直下の位置に形成し、これを覆うように反応試薬層５７および５８を形成する。
基板４０の上には、電極系の面積を規定する孔４６を有する部材４４、孔４６と同じ大きさの孔４９を有する部材４８、フィルタ５６より大きな径の孔５２を有するフィルタ保持基板５１、およびすり鉢状の部分の底に開口部５４を有する試料供給部５３が順次貼りあわされている。試料供給部５３のすり鉢状の部分には、親水処理により親水部５５が形成されている。
先の実施の形態における空気孔およびスリット１７の部分に形成した試料液供給路の代わりに、部材４４の孔４６を外部へ連通させるスリットからなる空気孔４５を設けている。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明する。
《実施例１》
図１および図２の構成を有するコレステロールセンサを作製した。反応試薬層２７には電子メディエータが含まれ、反応試薬層２８にはコレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、および界面活性剤が含まれている。このセンサの作製手順を以下に示す。
まず、基板１０の電極系上に、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩（以下ＣＭＣと略す）の０．５ｗｔ％水溶液を５μｌ滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させることによりＣＭＣ層を形成した。次に、フェリシアン化カリウムを７０ミリモル／ｌ含む水溶液４μｌを前記ＣＭＣ層上に滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させることにより、フェリシアン化カリウムを含む反応試薬層２７を形成した。
【００３６】
ノカルジア由来のコレステロールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．６、以下ＣｈＯＤと略す）とシュードモナス由来のコレステロールエステラーゼ（ＥＣ．３．１．１．１３、以下ＣｈＥと略す）を溶解した水溶液に、界面活性剤であるポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した。この混合液を、スペーサ１４とカバー１８を一体化したもののスリット１７により形成される凹部に０．２μｌ滴下し、液体窒素にて予備凍結後、凍結乾燥機で２時間乾燥（初期温度が−４０℃、終末温度が＋４０℃）させることにより、０．１４ユニットのコレステロールオキシダーゼ、０．３４ユニットのコレステロールエステラーゼ、および０．４ｍｇの界面活性剤を含む反応試薬層２８を形成した。
【００３７】
フィルタは、厚さ約８００μｍのガラス繊維ろ紙で、直径２ｍｍの円形に打ち抜いたものを用いた。フィルタ保持基板２１の孔２２に、カバー１８の孔１９を覆うようにフィルタ２６を設置した。フィルタ保持基板２１の厚みは約８００μｍである。このフィルタ保持基板２１の厚みは、フィルタの厚みとほぼ同じか、それよりやや小さいことが望ましい。
この後、フィルタ保持基板２１の上部に試料供給部２３を設置することにより、図１および図２に示すようなコレステロールセンサを作製した。試料供給部２３を構成する部材は、約０．５ｍｍの厚みのＰＥＴ製である。試料供給部２３の開口部２４の直径は１．６ｍｍである。この開口部は、ＰＥＴ板の所定の部位を切削して形成されたすり鉢状部の底部に形成される。すり鉢状部の上部開口部の直径は３ｍｍである。従って、すり鉢状部の内部の容積は約２μｌであるが、試料液がすり鉢状部の外周部の疎水性部分から弾かれる効果と、試料液の表面張力のため、血液では６μｌ程度を貯留することが可能である。必要に応じて、試料供給部２３を構成する板材の厚み、開口部２４の直径、すり鉢状部の上部開口部の直径を最適化し、容積を調整することができる。ここに示した数値はその一例である。
【００３８】
このセンサの試料供給部２３に試料液として全血６μｌを導入たところ、試料供給部のすり鉢状部に集積、貯留され、直ちに開口部２４を通じて、フィルタ２６の一次側端部より吸収された。３分後に対極を基準にして作用極にアノード方向へ＋０．２Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。その結果、コレステロール濃度に依存した応答が得られた。
【００３９】
《実施例２》
図３に示す構成のセンサを作製した。部材３３として、表面を界面活性剤の塗布によって親水化した厚み０．１ｍｍのＰＥＴ板を用い、開口部３４の直径を１．６ｍｍとした。部材３６として、厚み０．５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン板を用い、開口部３７の直径を３ｍｍとした。その他の構成は実施例１と同様である。このセンサにより実施例１と同様の応答性を得ることができた。
【００４０】
《実施例３》
血漿中のブドウ糖濃度、すなわち血糖値を測定するセンサの場合、血液中の血球成分を濾過することでより正確な測定が可能である。これに本発明を適用した例を以下に示す。
本実施例では図４に示す構成のセンサを作製した。
本実施例のセンサは、フィルタの配置は実施例１のコレステロールセンサとほぼ同じであるが、反応試薬層の溶解性が良好であるため、反応試薬層を電極基板にのみ形成することで良好な応答が得られる。従って、電極系は、フィルタ下面すなわち二次側端面に対向する位置に設けることができる。この場合、実施例１で設けた試料液供給路とそこに連絡する空気孔は不要であるが、空気孔自体は必要なので、スペーサ４４の孔４６に連結するスリット４５を空気孔として設けてある。
【００４１】
まず、基板４０の電極系上に、ＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を５μｌ滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させることによりＣＭＣ層５７を形成した。次に、２０ミリモル／ｌのフェリシアン化カリウム、および１００ユニット／ｍｌのグルコースオキシダーゼ（アスペルギルス由来、ＥＣ１．１．３．４）を含む水溶液をＣＭＣ層５７上に滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させることにより、フェリシアン化カリウムを含む反応試薬層５８を形成した。
続いて、部材４４、４８、フィルタ保持部材５１、フィルタ５６、および部材５３を順次組み合わせてセンサを作製した。部材５３の作り方は実施例１と同じである。
このセンサを用いて血液中のグルコースを測定したところ、良好な応答性が得られた。
【００４２】
上記実施例では、フィルタの形状について、電極基板への投影面が円形あるいは楕円のもののみを示しているが、これに限られるものではない。多角形でも同様の効果が得られる。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、少量の血液であっても、妨害物質である血球をフィルタにより除去し、血球除去後の血漿を迅速に電極系などの検出に供される部位へ供給することができる。従って、応答特性に優れたバイオセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である。
【図２】同バイオセンサの縦断面図である。
【図３】本発明の別の実施の形態のバイオセンサの縦断面図である。
【図４】本発明のさらに別の実施の形態のバイオセンサの縦断面図である。
【符号の説明】
１０  絶縁性基板
１１  パラジウム薄膜
１２  作用極
１３  対極
１４  スペーサ
１５  空気孔
１６、１９、２２  孔
１７  スリット
１８  カバー
２１  フィルタ保持基板
２２  孔
２３  試料供給部
２４  開口部
２５  親水部
２６  フィルタ
２７、２８  反応試薬層
【図１】
2004325384.tif 000003
【図２】
2004325384.tif 000004
【図３】
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【図４】
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