(57)【要約】【課題】信号読取装置（例えば、生化学反応チップ用信号読取装置）の正確な評価方法の提供を目的とする。【解決手段】信号読取装置の検出感度確認方法であって、信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリに所定濃度の標準物質を導入し、光学系により標準物質を測定可能な状態で前記キャピラリを配置し、光学系により標準物質を測定する方法が提供される。信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリに所定濃度の標準物質を導入し光学系により標準物質を測定するため、信号読み取り装置により読み取られた信号は標準試料の光学軸方向のほぼ全厚から発せられた信号となり、信号読み取り装置の評価が正確になる。【選択図】  図１
2004325396.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生化学反応チップ用信号読取装置の検出感度確認方法であって、
信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリに所定濃度の標準物質を導入し、光学系により標準物質を測定可能な状態で前記キャピラリを配置し、光学系により標準物質を測定する方法。
【請求項２】
請求項１記載の検出感度確認方法であって、前記キャピラリの内径が、前記光学系の被写界深度の２倍以下である方法。
【請求項３】
請求項１記載の検出感度確認方法であって、
前記キャピラリの内径が、光学系の被写界深度以下（但し０は除く）である方法。
【請求項４】
請求項１記載の検出感度確認方法を用いて、測定された測定結果と予め求めた所定濃度の標準物質における測定結果とを比較し、この比較結果に基づいて生化学反応チップ用信号読取装置の調整を行う方法。
【請求項５】
測定容器内の試料を所定箇所に濃縮し、濃縮試料を光学系により測定する装置の検出感度確認方法であって、
光学系の光軸方向における測定容器の厚みより小さい厚みを有する確認容器に所定濃度の標準物質を導入し、
光学系の光軸方向における前記確認容器の厚みが、前記光学系の光軸方向における測定容器の厚みより小さく、かつ、前記光学系により標準物質を測定可能となる状態に前記確認容器を配置し、
光学系により標準物質を測定する方法。
【請求項６】
請求項５記載の検出感度確認方法であって、
光学系の光軸方向における確認容器の厚みが、光学系の被写界深度の２倍以下である方法。
【請求項７】
請求項５記載の検出感度確認方法であって、
光学系の光軸方向における確認容器の厚みが、光学系の被写界深度以下（但し０は除く）である方法。
【請求項８】
請求項５記載の検出感度確認方法であって、
測定された測定結果と、予め求めた所定濃度の標準物質における測定結果とを比較し、この比較結果に基づいて前記装置の調整を行う方法。
【請求項９】
生化学反応チップ用信号読取装置を評価できるシステムであって、
生化学反応チップを保持できる信号読取装置の保持機構と、
保持機構に保持された生化学反応チップを測定できる光学系と、
保持機構に保持された生化学反応チップに配置され、又は、生化学反応チップの保持されていない保持機構に配置された、信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリであって、その内部に所定濃度の標準物質が導入されたキャピラリと、を含むシステム。
【請求項１０】
生化学反応チップ用信号読取装置の検査セットであって、
信号読取装置の保持器具に保持された生化学反応チップに配置でき、又は、生化学反応チップの保持されていない保持器具に配置できる、信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリと、
信号読取装置で測定できる標準物質とを含む検査セット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、信号読取装置の信号検出感度の評価技術に関する。例えば、蛍光分析を利用する化学反応チップの信号を読み取る信号読取装置の信号検出感度の評価技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生化学反応チップとしては、例えば核酸の塩基配列を測定するために、予め設計した塩基配列の１本鎖オリゴヌクレオチドプローブを塩基配列の種類毎に領域を分けて基板上に固定したポリヌクレオチド検出チップが知られている。このポリヌクレオチド検出チップを用いると、測定対象である１本鎖ポリヌクレオチドと１本鎖オリゴヌクレオチドプローブとの相補鎖結合（ハイブリダイゼーション）の有無を検出することができる。主に、これらの機能エレメント（以下「スポット」と称する。）は縦横にアレイ状に配置され、生化学反応チップアレイ、特に核酸の場合にはＤＮＡマイクロアレイと呼ばれている。このような生化学反応チップは、アフィメトリックス社、ナノゲン社、アジレント社など複数の会社において製品化されている。
【０００３】
上記生化学反応チップ用の基板としては、ガラス基板、Ｓｉ基板、プラスチック基板などが用いられている。１つの生化学反応アレイ全体では、スポットは５０μｍ〜５００μｍの間隔でマトリクス状に配列されている。
【０００４】
基板上にオリゴヌクレオチドを固定化する方法として、一般的には、基板上で一層ずつオリゴヌクレオチドを合成させながら固定化する方法と、予め別途合成させておいたオリゴヌクレオチドを基板上に固定化する方法とがある。前者の方法における代表例は、フォトリソグラフィー技術による方法である（例えば、アフィメトリックス社の方法である。非特許文献１参照）。
【０００５】
また、後者の方法にはメカニカルマイクロスポッティング技術がある。ナノゲン社の技術は、チップ基板表面に目的とするオリゴヌクレオチド配列を含んだ溶液を接触させて、オリゴヌクレオチドを固定化したいスポットに正の電圧を印加し、負の電荷を有するオリゴヌクレオチドをスポット上に固定化する電界制御方式技術である（例えば特許文献１参照）。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１号、７６７頁（１９９１年）。
【特許文献１】
特表平９−５０４９１０号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
これらの生化学反応チップの信号読取には、蛍光色素を用いる方式や、インターカレーターを用いて相補鎖結合の蛍光や電位差を読み取る方式、また、相補鎖結合の電気的な抵抗値を直接読み取る方式などがある。これらの中でも、蛍光色素を用いる方式は、直接検体を蛍光色素で標識できる、蛍光波長の異なる蛍光色素を用いることにより多種類の色素を同時に独立に測定できることなどから、最も頻繁に用いられている方式である。
【０００８】
そして、多種類の蛍光色素に対応した読取装置も、アフィメトリックス社やアジレント社から市販されている。これらの読取装置は、原理的には従来の蛍光分析と同様に、励起光源としてのレーザー、蛍光を読み取るための検出器であるＰＭＴ（光電子倍増管）等により構成されている。
【０００９】
従来の蛍光分析では装置の性能指標の１つとしてＳＮ比が用いられてきた。これは、純水に励起光を照射したときのラマン散乱光を信号強度として、またその信号強度の変動を雑音として比を求めるものである。
【００１０】
通常の生化学反応チップの分析技術においては、使用する蛍光色素が固定されており、すなわち励起／検出波長が固定されているため回折格子による分光よりも、むしろ光学フィルタによる分光を採用している場合が多い。この場合には、検出用の光学フィルタは蛍光色素の波長に合わせて設計されており、読取装置が有する励起光の波長からのラマン信号を検出できない場合がほとんどである。従って、ラマン散乱光によるＳＮ比に基づく手法は、装置の性能評価には使えない。色素を固定せず、液体のままにしてチップ上に保持し、測定する方法もあるが、この場合はチップ上の色素を含んだ液体の厚さを制御する必要がある。なぜなら厚さが不定であれば、チップ上での色素の濃度を正確に求めることができないからである。また仮に色素を含んだ液体の厚さを制御できたとしても、結果的に光学系の被写界深度よりも厚い液層を形成した場合は、チップ上に存在する色素の量と光学系が見ている色素の量とが異なるため濃度は正確には求まらない。
【００１１】
また、実際の測定と同様の手法で評価するのであれば、実際は色素が固定されていることから、異なる当該色素を含む濃度系列を作成し検量線を作成し、その検出限界を求めて装置の性能の指標にすることも可能である。メカニカルマイクロスポッティング技術において、固定化したいオリゴヌクレオチドなどを含む液体の体積とその液体のオリゴヌクレオチドの濃度からスポットに固定化されるであろうオリゴヌクレオチドの分子の数を推定できる。しかしながら、蛍光色素は光に反応して容易に劣化してしまう。特に蛍光測定時には強力な励起光を照射するため、蛍光色素の劣化が顕著である。このため、メカニカルマイクロスポッティングによって得られた、基板上の蛍光色素を感度評価の基準として繰返し使用することはできない。また、スポット領域の面積が一定ではないため、データ処理が煩雑になることもある。
【００１２】
さらに、フォトリソグラフィー技術や、電界制御方式技術などを用いると、この方法により分子の数を正確に見積もることはできない。これらの技術を用いて作成された生化学反応チップに固定化された物質の量は、液体温度、ｐＨ、電界強度他、ハイブリダイズの効率、生化学反応チップ中のオリゴヌクレオチドを固定化するための部材とその表面状態、などによって決定される。そしてこれらの要因が固定化に与える効率を定量的に把握することはきわめて難しい。
【００１３】
このように、蛍光分析による従来の生化学反応チップの分析技術においては、生化学反応チップに固定化されたオリゴヌクレオチドの量を見積もることが難しい。これは、必要試料量の掌握、管理および、信号読み取り装置上における検出感度の比較が難しい。
【００１４】
そこで、このような生化学反応チップからの信号を読み取る信号読取装置の性能はより安定に規定し比較するために、生化学反応のプロセスを含むシステムの複数の要因に分析結果が左右されない技術であって、他の装置との比較のみならず、装置単体の実力や安定性を考察する技術が必要とされてきた。検出感度の評価は生化学反応チップを比較する上で重要である。なぜなら、測定対象となる蛍光分子をどれほど光学系の下に準備するかに直結しており、測定の前処理用の試薬の消費量に影響を与えるからである。試薬の消費量は、装置のランニングコストの指標でもあり、大量の試料を測定する場合は無視できない。
本発明は、信号読取装置の正確な評価方法の提供を目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明の一観点によれば、生化学反応チップ用信号読取装置の検出感度確認方法であって、信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリに所定濃度の標準物質を導入し、光学系により標準物質を測定可能な状態で前記キャピラリを配置し、光学系により標準物質を測定する方法が提供される。
【００１６】
信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリに所定濃度の標準物質を導入し光学系により標準物質を測定するため、信号読み取り装置により読み取られた信号は標準試料の光学軸方向のほぼ全厚から発せられた信号となり、信号読み取り装置の評価が正確になる。
【００１７】
本発明の他の観点によれば、測定容器内の試料を所定箇所に濃縮し、濃縮試料を光学系により測定する装置の検出感度確認方法であって、光学系の光軸方向における測定容器の厚みより小さい厚みを有する確認容器に所定濃度の標準物質を導入し、光学系の光軸方向における前記確認容器の厚みが、前記光学系の光軸方向における測定容器の厚みより小さく、かつ、前記光学系により標準物質を測定可能となる状態に前記確認容器を配置し、光学系により標準物質を測定する方法が提供される。
【００１８】
上記の方法によれば、実際の測定対象となる測定容器内の濃縮試料を測定する光学系と同じ光学系を有する装置により確認容器内の標準物質を測定するため、標準物質の測定に基づいて検出感度を精度良く確認することができる。
【００１９】
本発明の別観点によれば、生化学反応チップ用信号読取装置を評価できるシステムであって、生化学反応チップを保持できる信号読取装置の保持機構と、保持機構に保持された生化学反応チップを測定できる光学系と、保持器具に保持された生化学反応チップに配置され、又は、生化学反応チップの保持されていない保持器具に配置された、信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリであって、その内部に所定濃度の標準物質が導入されたキャピラリとを含むシステムが提供される。
【００２０】
上記システムによれば、測定対象である濃縮試料と近い条件で標準物質の測定を行うことが出来るため、生化学反応チップ用信号読取装置を評価精度が高くなる。
【００２１】
本発明のさらに別の観点によれば、生化学反応チップ用信号読取装置の検査セットであって、信号読取装置の保持器具に保持された生化学反応チップに配置でき、又は、生化学反応チップの保持されていない保持器具に配置できる、信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリと、信号読取装置で測定できる標準物質とを含む検査セットが提供される。この検査セットを用いると、標準試料とキャピラリという小型化が可能（持ち運びに便利）な道具を含むセットにより生化学反応チップ用信号読取装置の検査が可能であるため、検査が大がかりにならない。
【００２２】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明に係る方法は、微細なキャピラリ管に例えば蛍光色素を導入し、既存の読取装置を用いて、キャピラリ管中の蛍光色素から発せられる蛍光の信号強度を参照して装置の感度評価を行う方法を含む。
【００２４】
本発明の実施の形態による生化学反応チップ用信号読取装置の感度評価方法について図面を参照しつつ以下に説明を行う。図１（ａ）は、一般的な明視野蛍光測定光学系を用いた生化学反応チップの信号読取装置の構成例を示す図である。
【００２５】
図１（ａ）に示すように、生化学反応チップの信号読取装置は、励起光源１０１と、ダイクロイックミラー１０２と、対物レンズ（光学系）１０３と、試料１０４と、結像レンズ１０５と、検知器１０６と、を有している。励起光源１０１から発せられた蛍光励起用の光束Ｌは、ダイクロイックミラー１０２に入射する。ダイクロイックミラー１０２の入射励起光源の波長における反射率は高く、ほぼ全ての入射光が反射して生化学反応チップ１０４に向う。その途中で、対物レンズ１０３を通りフローセル１１７（測定容器）内の所定箇所１１９において濃縮された濃縮試料を通り、生化学反応チップ１０４上に到達する。この励起光の作用によって、濃縮試料から発せられた蛍光は、対物レンズ１０３によって捕捉されダイクロイックミラー１０２の方向へ向かう。生化学反応チップ１０４の方向に入射する励起光と、濃縮試料から発せられた蛍光の波長は異なる（蛍光波長が励起光の波長よりも長い）。
【００２６】
ダイクロイックミラー１０２の蛍光波長に対する反射率が低く、透過率が高くなるように設定しておき、試料からの蛍光のほとんどがダイクロイックミラー１０２を通過するようにする。ここでは、励起光の反射率は低く抑えてあるので、励起光はほとんど通過しない。ダイクロイックミラー１０２を通過した蛍光は結像レンズ１０５によって検知器１０６上に結像する。
【００２７】
図１（ｂ）は、生化学反応チップ１０４の構成例を示す図であり、上面図と正面図とが示されている。１つの生化学反応アレイ全体では、図１（ｂ）に示すそれぞれのスポット１０９は、５０μｍ〜５００μｍの間隔でマトリクス状に配列されている。信号読取装置は、この生化学反応チップ上の各スポット１０９からの信号を読み取って区別する必要がある。スポット１０９にマイナスの電界を印加すると、フローセル１１７内の試料が濃縮され所定箇所（スポット１０９の近傍）に集められる。
【００２８】
尚、図１（ａ）及び図１（ｂ）では、励起光源１０１を試料１０４の鉛直方向から入射した明視野光学系を例にして示しているが、蛍光検出のための光学系は、励起光１０１を試料１０４に対し斜め入射させ、励起光の検出器に到達する度合いを低減させた暗視野光学系を採用しても良い。
【００２９】
また、図１（ａ）において、励起光源１０１が試料１０４に到達する際、極めて微小なスポットに結像させてもよい。仮に、微小な空間領域に結像させた場合、検知器１０６の試料側にピンホール１０７を設けることにより、共焦点光学系を形成することができ、試料上の蛍光分析の空間分解及び焦点方向の位置分解能を高めることができる。この場合、光束は相対的に試料上を走査できることが望ましい。走査の方法は、試料又は試料を搭載したステージを走査１０８してもよいし、対物レンズ１０３を走査して光束の試料上への到達位置を移動させても良い。ポリゴンミラーなどを用いて、光束の進行方向を変化させても良い。
【００３０】
励起光としては、微小なスポットを用いずに試料全体を照明するような励起光を用いてもよい。この場合は、検知器としてＣＣＤカメラなどの撮像素子を用いることもできる。試料の全体像を光束の走査なしに取得することができるという利点がある。またピンホール１０７を検知器の試料側に設け、ピンホール位置を走査した場合、励起光は試料全体を照明させかつ、共焦点の光学系を構成することもできる。
【００３１】
図１（ａ）において、レンズシステムを対物レンズ１０３と結像レンズ１０５とで構成したが、これらの各々が複数枚のレンズの組み合わせで構成されていても良い。また対物レンズと結像レンズとが、１本の鏡筒の内部に格納されて１つのレンズシステムを構成していても良い。
【００３２】
しかしながら、上記の蛍光分析による生化学反応チップの分析技術においては、生化学反応チップに固定化されたオリゴヌクレオチドの量を見積もることがきわめて難しい。これは、必要試料量の掌握、管理および、信号読み取り装置上における検出感度の比較が難しいことを意味している。なぜなら、生化学反応チップに固定化された物質の量は、液体温度、ｐＨ、電界強度他、ハイブリダイズの効率、生化学反応チップ中のオリゴヌクレオチドを固定化するための部材とその表面状態、などの様々なパラメータにより決定されるからである。
【００３３】
また、一般的な蛍光分析では、オリゴヌクレオチドを生化学反応チップに固定しなくても、溶液状態のまま複数の濃度系列を作成して検量線方式により検出感度を定義する方法も考えられるが、この場合にも、光学系の被写界深度の影響を考慮しなければならない。例えば、被写界深度５μｍの光学系で、厚さ５００μｍの溶液中の蛍光色素の信号を測定したとしても、約５μｍ厚さ分の蛍光色素からの信号しか検出しないからである。実際に５μｍの厚さのきわめて少ない蛍光分子を検出できるような優れた光学系を用いた場合でも、５００μｍの厚さに含まれた蛍光色素を検出しているように過小評価されてしまう場合がある。
【００３４】
図２は、本実施の形態によるキャピラリの構成を示す図である。図２に示すように、キャピラリの内径を符号１１０で示し、外径を符号１１１で示している。キャピラリの内部は中空である。キャピラリの最表面層は例えばポリイミドなどの保護膜１１２で覆われている。外径１１０は、通常、９０μｍ程度から８５０μｍ程度であり、内径は、２μｍから７００μｍ程度のキャプラリが入手可能である。
【００３５】
このように、キャピラリの外径が１ｍｍ以下であることから、ほぼ全ての生化学反応チップのチップ位置にキャピラリを固定することが可能である。そのまま母材上に固定しても良いし、読取装置内部のほかの部品と干渉する場合は生化学反応チップに溝を掘って、標準試料を導入したキャピラリを埋め込んでも良い。生化学反応チップの母材が金属、ガラス、プラスチックのいずれであっても１ｍｍ程度の溝を母材上に形成することが可能だからである。キャピラリは、粘着テープにより母材に貼り付けて固定しても良いし接着剤による接着して固定しても良い。
【００３６】
図３（ａ）、（ｂ）は、標準試料を導入したキャピラリを生化学反応チップに固定した例を示す図である。図３（ａ）、（ｂ）に示すように、生化学反応チップ１１４が母材１１３に固定されている。尚、生化学反応チップ１１４が母材としての機能（読取装置との固定・位置出し、フローセルなどの流路構成、など）を兼用していても良い。図３（ａ）は、母材１１３に溝１１５を形成し、溝１１５内に標準試料を導入したキャピラリ１１６を固定した例である。溝１１５内にキャピラリ１１６を固定する方法は、母材１１３と生化学反応チップ１１４を組み合わせて信号読取装置にセットし測定する際に信号読取装置側の何らかの部品とキャピラリ１１６とが機械的に干渉してしまう場合に有効な方法である。また、信号読取装置の光学系の焦点において、母材の表面が焦点を合わせるストロークの範囲外にあるような場合、キャピラリを焦点合わせ可能な位置に設置したい場合にも有効である。
【００３７】
特に、干渉する部品が周囲に存在せず、また、焦点合わせの範囲が広い信号読取装置に関して評価を行う場合は、単にキャピラリ１１６を母材１１３またはその同等品に乗せて固定しただけの図３（ｂ）に示す構造でも良い。この構成は、きわめてシンプルな構成である。尚、図３においては、生化学反応チップ１１４が母材１１３と組み合わされている構成について例示したが、母材１１３が存在しない構造の生化学反応チップに応用することも可能である。すなわち、スライドガラス自身に生化学試料をスポッティングして使用し、このスライドガラスそのものを読取装置に搭載して、信号を読み取るような場合である。この場合は、母材が存在しないことになるが、チップであるスライドガラス上にキャピラリを貼り付けるかまたはスライドガラスにキャピラリを設置する溝を掘ってキャピラリを固定することができる。上記キャピラリ方式には、簡便かつ簡素である利点の他に被写界深度の影響を考慮できるという利点がある。すなわち、キャピラリ内に標準試料を導入し標準試料をキャピラリ内に閉じこめることにより、標準試料を光学系の「被写界深度程度」の厚さ方向領域に「局在」させることができる。キャピラリの内径とフローセルの厚みとの関係を図１（ａ）を参照して説明する。図１（ａ）の下の図は、仮想線で示された光学系の光軸方向における確認容器の厚み（この場合は、キャピラリ１１６の内径１１０）が、測定容器（この場合は、フローセル１１７）の厚み１１７ａよりも小さくなる状態を作り出すことができる。
【００３８】
キャピラリ１１６内部の標準試料の濃度と信号読み取り装置の測定値との関係を求めることにより、濃縮された試料の評価を行うことができる。例えば、標準試料の濃度系列を作成し信号読取装置で測定することにより、局在させた分子数を変数とした従来の方法よりも正確な感度評価が可能となる。
【００３９】
次に、実際にキャピラリ１１６内に標準物質を導入する方法について図５を参照して説明する。標準物質は、実際に使用する蛍光色素のみでもよく、これを実際にレポータとして使用するオリゴヌクレオチドを実際に使用する蛍光色素で修飾したものでもよい。これを信号読取時に使用する溶液、例えば燐酸バッファなどで希釈したものを用意し、適当な長さに切断し、かつ、信号読取部のサイズにあわせた部分の被覆１１２を除去したものを準備する。被覆１１２の除去はオゾンによる灰化などでも行うことができるが、炎で簡単に灰化することもできる。この状態のキャピラリ１１６の一端を準備した標準溶液１２０に浸すと、毛細管現象によってキャピラリ１１６の内部は標準溶液１２０により満たされる。この状態を保持し、図３に示すように母材１１３にキャピラリ１１６を固定すればよい。上記の方法を用いると、キャピラリ１１６への標準溶液１２０の導入が非常に簡単なので、標準試料の測定の度に標準試料を導入することも可能である。すなわち、１回だけ使用する感度評価治具を構成することができる。
【００４０】
尚、室温よりも高い温度環境にさらされている生化学反応チップにおける信号を読み取る場合、又は、励起光の照射によって試料の温度が上昇してしまうような場合には、キャピラリの両端からキャピラリ内部の液体の蒸発が問題となる。このような場合には、キャピラリの両端のうち試料が蒸発しやすい一端または両端を、接着剤などで封入しておいても良い。このような構造にすることで、持ち運びが可能となり、複数回の使用が可能な感度評価治具として用いることも可能である。
【００４１】
使用する蛍光色素に関して、励起光照射による退色の影響が問題となる場合には、キャピラリの一端を標準溶液に浸し他端を減圧して、標準試料をキャピラリ内部で流動させながら感度評価を行うことも可能である。
【００４２】
減圧によって標準試料をキャピラリの内部で流動させる構成例について再び図５を参照して説明する。キャピラリ１１６の一端を標準試料１２０が入っているバイアルに浸す。キャピラリ１１６の他端をシリンジ１２２に接続しておく。シリンジ１２２のピストンを引くことにより、シリンジ１２２の内部は負圧になる。そのため、標準試料１２０はキャピラリ１１６内をシリンジ１２２の方向に向かって移動する。キャピラリ１１６は、励起光を照射する部分１２１の被覆を除去して母材１１３または生化学反応チップ１１４（図３）にセットする。このようにした後、読取装置を用いた標準試料の測定を行う。
【００４３】
もちろん、キャピラリ１１６の一端側に蓄えた標準試料（たとえばシリンジ１２２に蓄えた標準試料）を加圧することによってキャピラリ内部を流動させても良い。上記のように標準試料を流動させる方法を用いると、光に敏感に反応して壊れやすい蛍光色素も標準試料として取り扱うことが可能となる。
【００４４】
本実施の形態による信号読取部に局在した蛍光分子数の決定の手順について図６を参照して説明する。まず、ステップ１３０において、信号読取装置の設計情報から、その検出光学系の被写界深度に近い被写界深度と同等から２倍程度の範囲のキャピラリを調達する。例えば、光学系の開口数（Ｎ．Ａ．）が０．２であり、検出する蛍光波長が６００ｎｍであったとすると、その被写界深度は、以下の式を用いて計算できる。
【００４５】
６００×１０−９／０．２２＝１．５×１０−５＝１５μｍ
ここで、焦点から１５μｍから外れた部分の光は検出されないわけではない。これ以上離れた部分からの光も、結像しているわけではないが検知器に届く。ここでは、被写界深度の約２倍程度の位置からの光も検知器に十分届くとものと仮定する。すなわち、内径約１５μｍから３０μｍ程度のキャピラリを準備すればよい。
【００４６】
次に、ステップ１３１において、使用する蛍光色素が劣化しやすいものであれば、例えば、キャピラリ内を流動させることにより標準試料を移動させるか否かを判断する。例えば、サービスマンが持ち歩いてユーザの装置の評価を行うなどの使用目的や使用環境（状況）に応じて、標準試料を移動させるか否かを決定する。移動させると決定した場合には、ステップ１３２に進み、例えば図５に示すような移動方法を組み込んだキャピラリに加工する。標準試料を移動させない場合には、ステップ１３３に進み、移動手段を組み込まないキャピラリを加工する。
【００４７】
次に、ステップ１３４において、キャピラリ内に濃度が既知の試料を導いたものを測定する。測定により信号とノイズとが十分に区別できれば、さらに濃度の小さい試料を測定し、区別できなければ濃度の大きい試料で再測定を行う。信号とノイズとを区別する方法は、バックグラウンド信号（キャピラリのない領域からの信号）と標準試料からの信号との比、又は、その他、判定者が独自の基準に基づいて区別できるか否かを判定する。
【００４８】
例えば、ステップ１３４の処理を繰り返し、キャピラリ内に導いて検出できる最も小さい濃度を検出限界として導く（ステップ１３５）。この例では、光学系の被写界深度が１５μｍであり、これに合わせて内径１５μｍのキャピラリを使用した。生化学反応チップの１スポットの直径が１００μｍであり、５００μＭの蛍光色素を含んだ溶液が検出限界であったと仮定すると、光学系が観察している空間の体積は、以下の式により求められる。
（７．５×１０−６）２×π×１００×１０−６
＝１．７×１０−１４ｍ３
＝１．７×１０−１４リットル
従って、その中に含まれている蛍光分子数は、
６．０２×１０２３×５００×１０−６×１．７×１０−１４
＝５．１１７×１０６（個）と計算できる（ステップ１３６）。
【００４９】
以上に説明したように、本発明の実施の形態による感度（検出限界）測定方法によれば、微細なキャピラリ内に蛍光色素を封入し、既存の読取装置を用いてキャピラリ中の蛍光色素の信号強度を得ることができる。光学軸の延在する方向に沿って計った標準試料の厚さ（キャピラリの内径）が光学系の被写界深度の２倍程度以下であるため、信号読み取り装置により読み取られた信号は標準試料の全厚みによって発せられた信号となり、標準試料の体積（厚み）と信号量とが対応関係にあり、信号読み取り装置の評価が正確になるという利点がある。この方法において使用される石英のキャピラリは、通常、生化学反応チップの信号読取に用いられる励起波長において蛍光を発しないので、ノイズ源となりにくい。また樹脂中に蛍光色素を封じ込める方法とは異なり、液体試料を極めて簡単にキャピラリ内部に導くことができる。これにより、装置間での信号強度の比較が正確に行えるようになり、また読取原理の異なる読取装置間でも比較が可能になる。また、多くの液中の蛍光色素に対応可能であり、極めて汎用性が高い。サービスマンなどがこれを所持し、移動して測定することも比較的簡単である。
【００５０】
次に、本実施の形態の変形例による感度測定方法について図４を参照して説明する。図４に示すように、本変形例による感度測定方法に用いる装置は、生化学反応チップ１５５と、これと対面して配置されたガラス板１５１と、生化学反応チップ１５５とガラス板１５１との間に、例えば接着剤により接着されたキャピラリ管であって、略平行に配置され略等しい外径ｔを有する２本のキャピラリ１５３ａ、１５３ｂと、を有している。キャピラリ１５３ａ、１５３ｂの外径ｔにより生化学反応チップ１５５とガラス板１５１との向かい合う面間の距離を略ｔに保持するとともに、生化学反応チップ１５５とガラス板１５１及び２本のキャピラリ１５３ａと１５３ｂにより画定される空間内に標準試料を保持することができる。この装置においても、厚さｔは、図１に示すフローセルの厚さ１１７ａよりも薄く、かつ、光学系の被写界深度の２倍程度以下であるのが好ましい。本変形例による感度測定方法においても、光学軸の延在する方向に沿って計った厚さｔが光学系の被写界深度の２倍程度以下であるため、信号読み取り装置により読み取られた信号は標準試料の全厚みｔによって発せられた信号とすることができ、標準試料の体積（厚みｔ）と信号量とが対応関係にある。従って、信号読み取り装置の評価が正確になるという利点がある。
【００５１】
以上に説明したように、図７に示すような生化学反応チップでは、母材１１３または母材１１３と一体化した生化学反応チップ１１４に、厚さ１１８のフローセル１１７を設けた構造において、信号読取時にこのフローセル１１７の内部に液体が満たされている。読み取るべきオリゴヌクレオチドと結合した蛍光色素は、生化学反応チップ１１４表面に固定化されている。すなわち、生化学反応チップ１１４の表面に蛍光色素が局在している。局在している蛍光色素分子の分子数を推定するには、温度、ｐＨ、電界による引き付けの効率などきわめて多くの媒介変数が介在し分子数を推定するのが困難である。
【００５２】
また、図８に示すように、生化学反応チップ１１４に、厚さ１１８のフローセルを設け、濃度が既知の蛍光色素溶液をフローセルに満たして信号読取装置が読み取ったとしても、蛍光信号はその光学系の被写界深度程度の厚さ領域１１９から発せられたものであって、フローセルの厚さ１１８内の全ての蛍光色素からの信号を検出しているわけではない。従って、フローセル内に満たされた溶液中の信号を読取装置により読み取った蛍光分子数は、フローセルの厚さ１１８に基づく体積計算では評価できない。
【００５３】
しかし、上述した感度評価方法によれば、光学軸方向の厚みが光学系の被写界深度の２倍に近い領域に標準試料を閉じ込めることができる。信号読み取り装置により読み取られた信号は標準試料の全厚みによって発せられた信号となり、標準試料の体積（厚み）と信号量とを対応させることができるため、信号読み取り装置の評価が正確になるという利点がある。これにより、装置間の強度の比較が正確に行えるようになり、また原理の異なる読取装置でも比較が可能になる。
【００５４】
（付記）
本発明は以下の付記に記載されている発明の開示を含む。
（付記１）
生化学反応チップ用信号読取装置の検出限界を測定する方法であって、前記生化学反応チップ用信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリを準備する第１ステップと、前記生化学反応チップ用信号読取装置と同じ測定原理を用いて検出する検出対象に関する濃度が既知の標準物質を前記キャピラリ内中に導入し、前記生化学反応チップ用信号読取装置を用いて前記標準物質からの信号を検出する第２ステップと、該第２ステップにより検出された信号と前記標準物質の濃度との関係に基づいて前記検出対象に関する検出限界濃度を求める第３ステップとを含む方法。
【００５５】
（付記２）
前記第２ステップを繰り返し、検量線を作成するステップを含むことを特徴とする付記１に記載の方法。
【００５６】
（付記３）
さらに、前記第２のステップで求められた検出された信号と前記標準物質の濃度との関係に基づいて、前記生化学反応チップ用信号読取装置を用いて濃度が未知のサンプルに関する信号を検出し該サンプルの濃度を求めるステップを有することを特徴とする付記１又は２に記載の方法。
【００５７】
（付記４）
前記第２ステップは、前記キャピラリ内で前記標準物質を移動させながら信号を検出するステップを含むことを特徴とする付記１から３までのいずれか１に記載の方法。
【００５８】
（付記５）
生化学反応チップ用信号読取装置を調整する方法であって、前記生化学反応チップ用信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリを準備するステップと、前記生化学反応チップ用信号読取装置と同じ測定原理を用いて検出する検出対象に関する濃度が既知の標準物質を前記キャピラリ内中に導入し前記生化学反応チップ用信号読取装置を用いて前記標準物質からの信号を検出するステップを繰り返すことにより得られた結果と、前記生化学反応チップ用信号読取装置を用いて予め求めておいた前記標準物質から検出された信号と前記標準物質の濃度との関係とを比較することにより、前記生化学反応チップ用信号読取装置の調整を行うステップとを含む方法。
【００５９】
（付記６）
生化学反応チップ用信号読取装置を評価するための装置であって、生化学反応チップと、該生化学チップの一面に取り付けられ、前記生化学反応チップ用信号読取装置の光学系の被写界深度に近い内径を有するキャピラリとを備えた装置。
【００６０】
（付記７）
前記生化学チップの他面に取り付けられた透明な面状の母材を有する付記６に記載の装置。
【００６１】
（付記８）
付記６又は７に記載の装置と、さらに、生化学反応チップ用信号読取装置と同じ測定原理を用いて検出する複数の検出対象を含む標準物質であって、濃度の異なる標準物質を複数の容器にそれぞれ収容した試薬セットとを有する検査セット。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によれば、信号読取装置の信号検出感度を正確に評価できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（ａ）は、本発明の実施の形態に用いる一般的な明視野蛍光測定光学系を用いた生化学反応チップの信号読取装置の構成例を示す図であり、図１ｂ）は、試料（生化学反応チップ）の構成例を示す図であり、上面図と正面図とを示す図である。
【図２】本実施の形態によるキャピラリの構成を示す図である。
【図３】図３（ａ）、（ｂ）は、標準試料を導入したキャピラリを生化学反応チップに固定した例を示す図である。
【図４】本発明の実施の形態の変形例による感度測定装置の構成例について示す図である。
【図５】本実施の形態による方法に用いる構成であって、キャピラリ内に標準物質を導入する様子を示す図である。
【図６】本実施の形態による信号読取部に局在した蛍光分子数の決定の手順を示すフローチャート図である。
【図７】母材または母材と一体化した生化学反応チップに、フローセルを設けた構造例を示す図である。
【図８】生化学反応チップに、ある厚さのフローセルを設け、濃度が既知の蛍光色素溶液をフローセルに満たした構成を示す図である。
【符号の説明】
１０１  蛍光励起光源、１０２  ダイクロイックミラー、１０３  対物レンズ、１０４  試料、１０５  結像レンズ、１０６  検知器、１０７  ピンホール、１０８  試料走査、１０９  試料スポット、１１０  キャピラリの内径、１１１  キャピラリの外形、１１２  キャピラリの被覆、１１３  生化学反応チップの母材、１１４  生化学反応チップ、１１５  溝、１１６  キャピラリ、１１７  生化学反応チップ上のフローセル、１１８  フローセルの厚さ、１１９  光学系の被写界深度。
【図１】
2004325396.tif 000003
【図２】
2004325396.tif 000004
【図３】
2004325396.tif 000005
【図４】
2004325396.tif 000006
【図５】
2004325396.tif 000007
【図６】
2004325396.tif 000008
【図７】
2004325396.tif 000009
【図８】
2004325396.tif 000010