(57)【要約】【課題】Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するヒト転移酵素タンパク質、その遺伝子及びその製造方法、更には、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化を行う方法を提供すること。【解決手段】Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸に特異的に作用するβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するヒト転移酵素タンパク質を用いて、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンを、β１，４ガラクトシル化し、６−Ｏ−硫酸Ｎ−アセチルラクトサミングリカンを形成する。本発明は、また、該転移酵素タンパク質の遺伝子及びその変異体を用いた該転移酵素タンパク質及びそのアミノ酸変異体の製造方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンを、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列又はそのアミノ酸変異配列を有するＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼで作用することを特徴とする、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化方法。
【請求項２】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸変異配列が、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであることを特徴とする請求項１記載のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化方法。
【請求項３】
Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼが、配列表の配列番号１に示されるＤＮＡ配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含むＤＮＡ配列からなる遺伝子を発現させたものであることを特徴とする請求項１記載のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化方法。
【請求項４】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸変異配列が、配列表の配列番号１記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現させたものであることを特徴とする請求項１又は２記載のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化方法。
【請求項５】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸変異配列が、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現させたものであることを特徴とする請求項１又は２記載のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の方法により、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンを、β１，４ガラクトシル化することを特徴とする６−Ｏ−硫酸Ｎ−アセチルラクトサミングリカンの生合成方法。
【請求項７】
６−Ｏ−硫酸Ｎ−アセチルラクトサミングリカンが、スフィンゴシン、ケラタン硫酸、又は６−硫酸化シアリルルイスＸであることを特徴とする請求項６記載の６−Ｏ−硫酸Ｎ−アセチルラクトサミングリカンの生合成方法。
【請求項８】
配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡを含む組換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクター。
【請求項１０】
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクター。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか記載の組換え発現ベクターを動物細胞に導入したことを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を発現する組換え動物細胞。
【請求項１２】
請求項１１記載の発現系を含んでなる組換え動物細胞を培地に培養し、得られる培養物からＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
請求項８〜１０のいずれか記載のＤＮＡを、動物組織細胞に導入し、発現することを特徴とする動物組織細胞の改変方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するヒト転移酵素タンパク質、その製造方法、及び該酵素活性を用いたＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸を含むオリゴ糖鎖は生体内に広く存在しているが、その生理的機能については不明点が多い。しかしながら、近年炎症反応の際に生じる白血球の炎症部位への集合現象において、白血球と血管内皮細胞との結合に６−硫酸化シアリルルイスＸ構造［Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃ］を有する糖タンパク質が深く関与していることが報告されている（J.Biol.Chem.,273,11225-11233,1998）。この糖鎖構造を有する化合物は、炎症反応部位への投与により炎症を軽減する効果を示すことが推測され、医薬品としての応用が期待されている。
【０００３】
このように、Ｇａｌβ１→４（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃ構造は様々な糖タンパク質のＮ結合型及びＯ結合型グリカンにおいて発見されており、直接的に又はより複雑なグリカンの前駆体として生体現象（biological events）に関わっている（Trends Glycosci. Glycotechnol. 9, 379-398, 1997; J. Biol. Chem. 276, 47747-47750, 2001）。Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸は、例えばケラタン硫酸では、Ｄ−ガラクトース又はＤ−ガラクトース６−硫酸とβ１→３結合をして二糖繰返し単位を構成している。また、ヘパリン及びヘパラン硫酸では、Ｌ−イズロン酸又はＤ−グルクロン酸とα１→４結合した形で存在している。これまでの報告では、硫酸化二糖類単位は、これまで種々の組織に由来し、クローン化されているＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ類（ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴｓ）の基質特異性に基づき、非還元末端Ｎ−アセチルグルコサミンの６−Ｏ−硫酸化と、それに続くβ１，４ガラクトシル化により生合成されると考えられてきた（J. Biol. Chem. 276, 47747-47750, 2001; Glycoconjugate J. 10, 226, 1993; Biochem. J. 319, 209-216, 1996; J. Biol. Chem. 272, 29493-29501, 1997; J. Biochem.（Tokyo）125, 245-252, 1999; Arch. Biochem. Biophys. 392, 87-92, 2001; Glycobiology 11, 75-87, 2001; Biochemistry 40, 5382-5391, 2001; J.Biol. Chem. 277, 3979-3984, 2002; Glycobiology 12, 379-388, 2002）。
【０００４】
ガラクトシル化の段階の酵素学的見解は、長い間明らかでなかったが、本発明者らは少量のヒト大腸粘膜から、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸（６ＳＧＮ）−特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β４ＧａＩＴ）を部分的に精製した（FEBS Lett. 440, 307-310, 1998）。本酵素は、受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）基質として非硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基よりもＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸及びＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸を含むオリゴ糖を強く認識するのに対し、ウシ乳汁β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉは逆の特異性を示した。Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧｌｃＮＡｃβ１→配列はＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼにとって不十分な基質であり、受容体認識のためにはＮ−アセチルグルコサミンのＣ−６における硫酸残基が不可欠であることを示唆した。
【０００５】
このようにＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸残基を認識することから、本酵素がケラタン硫酸（ＫＳ）、［（ＳＯ3-→６）Ｇａｌβ１→４（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃβ１→３）］n（Glycobiology 10, 951-958, 2000）及びＬ−セレクチンリガンドとして知られている６−硫酸化シアリルルイスＸ酵素の生合成に関わることが示唆される（J. Biol. Chem. 270, 12035-12047, 1995; J. Biol. Chem. 273,11225-11233, 1998; J. Cell Biol. 145, 899-910, 1999; Immunity 11, 79-89, 1999）。しかしながら、本酵素の分子クローニングは未だ行われていない。
【０００６】
現在までに、７種類のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの遺伝子が存在することが明らかになっている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1573-1577, 1986; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4720-4724, 1986; J. Biol. Chem.263, 10420-10428, 1988; Eur. J. Biochem. 183, 211-217, 1989; J. Biol. Chem. 272, 31979-31991, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 472-477, 1998; Glycobiology 8, 517-526, 1998; J. Biol. Chem. 273, 13570- 13577, 1998; J. Biol. Chem. 273, 29331-29340, 1998; Biochim. Biophys. Acta 1438, 301-304, 1999; J. Biol. Chem. 274, 22915-22918, 1999; J. Biol. Chem. 274, 26165- 26171, 1999）。全てのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼはタイプII膜結合型タンパク質として合成され、ゴルジ体に属する（J. Biol. Chem.
264, 17615-17618, 1989）。
【０００７】
これらの７つの酵素は基質特異性に関して解析されてきた。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉは可溶化状態でウシ及びヒト乳汁に豊富に存在し、それがコードされたｃＤＮＡが単離された最初のガラクトシルトランスフェラーゼである（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1573-1577, 1986; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4720-4724, 1986; J. Biol. Chem. 263, 10420-10428, 1988; Eur. J. Biochem. 183, 211-217, 1989）。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉは優れた受容体として非還元末端Ｎ−アセチルグルコサミンに作用するが、α−ラクトアルブミンの存在下では該酵素はラクトース合成酵素としてＮ−アセチルグルコサミンよりもグルコサミンに強く作用する（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59, 491-497, 1968; J. Biol. Chem. 245, 5057- 5061, 1970）。該酵素はポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンの反復（repeatig）伸長に関わる（J. Biol. Chem. 274, 9296-9304, 1999）。
【０００８】
β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−II及び−IIIは様々な糖タンパク質及び特定の糖脂質においてＮ−アセチルグルコサミン残基に作用し、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IIはβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉと類似の様式でα−ラクトアルブミンによって影響を受ける（J. Biol. Chem. 272, 31979-31991, 1997）。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−ＩＶはＬｃ3（ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→Ｃｅｒ）（J. Biol. Chem. 273, 29331-29340, 1998）及びＧａｌβ１→３（ＧｌｃＮＡｃβ１→６）ＧａｌＮＡｃ（ｃｏｒｅ２）に作用し、Ｎ−アセチルグルコサミンのＣ−４における後者のガラクトシル化はシアリルルイスＸ構造の形成を導く（J. Biol. Chem. 273, 34843-34849, 1998）。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｖはｃｏｒｅ２及びｃｏｒｅ６（ＧｌｃＮＡｃβ１→６ＧａｌＮＡｃ）に強力な作用を持つことがわかっている（FEBS Lett. 450, 52-56, 1999）。
【０００９】
該酵素はまた、Ｎ結合型４本鎖（tetra-antennary）グリカンのＧｌｃＮＡｃβ１→２（ＧｌｃＮＡｃβ１→６）Ｍａｎα１→６部分も認識し（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 472-477, 1998; Biochem. Biophys. Res. Commun. 265, 434-438, 1999）、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖと協力して腫瘍関連Ｎグリカンを生合成することに関わると示唆された（Biochem. Biophys. Res. Commun. 276, 1019-1023, 2000）。ラクトシルセラミド合成酵素をラット脳から精製し、その分子クローニングを部分的アミノ酸配列に基づいて行った（J. Biol. Chem. 273, 13570-13577, 1998）。該酵素は、ヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−VIの相同分子種である（Glycobiology 8, 517-526, 1998; Biochim. Biophys. Acta 1438, 301-304, 1999）。
【００１０】
β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−VIIは、β−キシロース：β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−（β−Ｘｙｌ：β１，４ＧａｌＴ）であり、ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉと同一である。該酵素は、β１，４ＧａｌＴ、つまりガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉは、様々なグリコサミノグリカンにおける基部配列（proximal seqence）、Ｇａｌβ１→３Ｇａｌβ１→４Ｘｙｌβ１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒの合成に関わる（J. Biol. Chem. 274, 22915-22918, 1999; J. Biol. Chem. 274, 26165-26171, 1999）。これら７つのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの特異性は幅広く研究されてきたが、どの酵素がケラタン硫酸、Ｎ結合型及びＯ結合型グリカンにおけるＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸残基に作用しうるかは不明であったため、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−が新規遺伝子によってコードされるかも不明であった。このような課題はケラタン硫酸及び６−硫酸化シアリルルイスＸを含む６−硫酸−Ｎ−アセチルラクトサミンを含有するグリカンの生物学的役割を研究するために重要であった。
【００１１】
以上のような背景を踏まえ、本発明者は、ブタ大腸粘膜からＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトース転移酵素を精製した（特開２０００−１３９４５６号公報）。この転移酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸又は非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸残基を有するオリゴ糖に、ガラクトース残基をβ１，４結合により導入する。
【００１２】
【特許文献１】
特開２０００−１３９４５６号公報
【非特許文献１】
J. Biol. Chem. 273, 45, 29331-29340, 1998
【非特許文献２】
Glycobiology 8, 5, 517-526, 1998
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するヒト転移酵素タンパク質、その遺伝子及びその製造方法を提供すること、更には、該酵素活性をＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化に用いて６−Ｏ−硫酸Ｎ−アセチルラクトサミングリカンの生合成を行う方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンの生合成に関与する転移酵素について研究する中で、先にブタ大腸粘膜からＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４−ガラクトース転移酵素を精製し、部分的アミノ酸配列を決定した。そして、本発明者はヒトβ１，４−ガラクトース転移酵素−IVに類似の配列を確認した。そこで、本発明者は次に現在までクローニングされている７つのβ１，４−ガラクトース転移酵素の各ｃＤＮＡを単離し、これらのｃＤＮＡを含有する発現ベクターをＣＯＳ−７細胞にそれぞれ導入し、各基質特製を研究するために膜画分を調製した。その結果、本発明者は、７つのβ１，４−ガラクトース転移酵素のうち、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVのみがケラタン硫酸結合オリゴ糖、及び６−スルホシアリルルイスＸの前駆体であるＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸ｃｏｒｅ２に効率的に作用する酵素であることを見い出し、本発明を完成するに至った
【００１５】
すなわち、本発明におけるβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するヒト転移酵素タンパク質は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸に特異的に作用し、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンを、β１，４ガラクトシル化し、６−Ｏ−硫酸Ｎ−アセチルラクトサミングリカンを形成する。本発明は、また、該転移酵素タンパク質の遺伝子及びその変異体を用いた該転移酵素タンパク質及びそのアミノ酸変異体の製造方法を包含する。更に、本発明は、該転移酵素タンパク質を用いてＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化を行い、６−Ｏ−硫酸Ｎ−アセチルラクトサミングリカンの生合成を行う方法を包含する。
【００１６】
すなわち具体的には本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンを、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列又はそのアミノ酸変異配列を有するＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼで作用することを特徴とする、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化方法（請求項１）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸変異配列が、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであることを特徴とする請求項１記載のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化方法（請求項２）や、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼが、配列表の配列番号１に示されるＤＮＡ配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含むＤＮＡ配列からなる遺伝子を発現させたものであることを特徴とする請求項１記載のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化方法（請求項３）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸変異配列が、配列表の配列番号１記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現させたものであることを特徴とする請求項１又は２記載のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化方法（請求項４）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸変異配列が、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現させたものであることを特徴とする請求項１又は２記載のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化方法（請求項５）からなる。
【００１７】
また本発明は、請求項１〜５のいずれか記載の方法により、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンを、β１，４ガラクトシル化することを特徴とする６−Ｏ−硫酸Ｎ−アセチルラクトサミングリカンの生合成方法（請求項６）や、６−Ｏ−硫酸Ｎ−アセチルラクトサミングリカンが、スフィンゴシン、ケラタン硫酸、又は６−硫酸化シアリルルイスＸであることを特徴とする請求項６記載の６−Ｏ−硫酸Ｎ−アセチルラクトサミングリカンの生合成方法（請求項７）からなる。
【００１８】
さらに本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡを含む組換え発現ベクター（請求項８）や、請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクター（請求項９）や、以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクター。(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質（請求項１０）や、請求項８〜１０のいずれか記載の組換え発現ベクターを動物細胞に導入したことを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を発現する組換え動物細胞（請求項１１）や、請求項１１記載の発現系を含んでなる組換え動物細胞を培地に培養し、得られる培養物からＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法（請求項１２）や、請求項８〜１０のいずれか記載のＤＮＡを、動物組織細胞に導入し、発現することを特徴とする動物組織細胞の改変方法（請求項１３）からなる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンを、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列又はそのアミノ酸変異配列を有するＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼで作用させ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化を行う方法よりなる。本発明のβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸変異配列を有する転移酵素としては、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸変異配列が、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである転移酵素が挙げられる。
【００２０】
本発明のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼは、配列表の配列番号１に示されるＤＮＡ配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含むＤＮＡ配列からなる遺伝子を発現させることにより生成することができる。該遺伝子配列情報については、ＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいて、アクセッション番号：ＡＦ０２２３６７（Journal  of  Biological  Chemistry，vol．273，No.45，pp29331-29340，1998）、及びアクセッション番号：ＡＦ０３８６６２（Glycobiology，vol．8，No.５，pp517-526，1998）でアクセスすることができる。
本発明における配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸変異配列を有する転移酵素としては、配列表の配列番号１記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現させたものを挙げることができる。
【００２１】
本発明において、種々のＤＮＡ配列の変異は、周知の遺伝子工学的遺伝子変異手段によって、行うことができる。また、本発明における転移酵素のアミノ酸変異配列を有する酵素は、周知の遺伝子工学的遺伝子変異手段によって、該転移酵素タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を変異させ、該遺伝子を発現させることによって生成することができる。本発明における遺伝子を発現させて、本発明のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を生成するには、該遺伝子を公知の適当な発現ベクターに組込み、該組換え発現ベクターを動物宿主細胞に導入し、培養、発現することにより行うことができる。そのような動物宿主細胞としては、ＣＯＳ−７などを挙げることができる。
【００２２】
なお、上記本発明における転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列において、「塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２３】
本発明のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化方法は、種々のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸構造を有するグリカンのβ１，４ガラクトシル化を行うことができ、例えば、スフィンゴシン、ケラタン硫酸、又は６−硫酸化シアリルルイスＸ等の６−Ｏ−硫酸Ｎ−アセチルラクトサミングリカンの生合成に用いることができる。
本発明におけるＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシル転移酵素は、該遺伝子を動物組織細胞に導入し、発現することによって、動物組織細胞の改変を行うことができる。かかる場合のＤＮＡをヒト組織細胞に導入する方法としては、トランスフェクション法等、公知の適宜の遺伝子導入法を用いることができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［材料及び実験操作］
（材料）
ＵＤＰ−［3Ｈ］ガラクトース(１４００ＧＢｑ／ｍｍｏｌ)をNEN Life Science Products社（Boston, MA）より購入した。アデノシン３'−リン酸塩５'−リン酸硫酸鉛（ＰＡＰＳ）、ＵＤＰ−ガラクトース、ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）−β−Ｄ−キシロース（Ｘｙｌ−Ｏ−ｐＮＰ）及びグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）をSigma Chemical社（St. Louis, MO）より購入した。Ｇａｌβ１→３（ＧｌｃＮＡｃβ１→６）ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−ｐＮＰ（ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ）をフナコシ株式会社より入手した。
【００２５】
ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ（ｂｉＧＰ）をヒドラジン分解−再−Ｎ−アセチル化（Methods Enzymol. 83, 263-268, 1982）、弱酸性加水分解及びストレプトコッカス（streptococcus）６６４６Ｋβ−ガラクトシダーゼ（J. Biochem. 80, 9-17, 1976）（生化学工業株式会社製、Tokyo, Japan）消化により、卵黄シアログリコペプチドから調製した（Biochim. Biophys. Acta1335, 23-32, 1997）。ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ（ＧＬ）をラクト−Ｎ−テトラオース（Methods Enzymol. 28, 262-271, 1972）からＳ．６６４６Ｋβ−ガラクトシダーゼを用いて消化することにより調製した。トウゴマアグルチニン−Ｉ（ＲＣＡ−Ｉ）アガロース（４ｍｇ／ｍｌゲル）をHohnen Oil社（Tokyo, Japan）より購入した。ケラタン硫酸（ナトリウム塩、ウシ角膜）は生化学工業（株）より購入した。
【００２６】
Ｇａｌβ１→４（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌ２Ｌ２）及びＧａｌβ１→４（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃβ１→３（ＳＯ3-→６）Ｇａｌβ１→４（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌ２Ｌ４）は生化学工業（株）のご好意により提供された。ＳＯ3-→６ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃ（ａｇＬ２Ｌ２）及びＳＯ3-→６ＧｌｃＮＡｃβ１→３（ＳＯ3-→６）Ｇａｌβ１→４（ＳＯ3-→６）ＧｌｃＮＡｃ（ａｇＬ２Ｌ４）はＳ．６６４６Ｋβ−ガラクトシダーゼ消化によりＬ２Ｌ２とＬ２Ｌ４からそれぞれ調製した。Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸（６ＳＧＮ）、Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ（ａｇＬＳＴ−ｂ）及びＳＯ3-→６ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３（Ｍａｎα１→６）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４（Ｆｕｃα１→６）ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ−ｂｉＧＰ）を前述の通り調製した（FEBS Lett. 440, 307-310, 1998）。
【００２７】
卵黄レシチンからのＬ−α−ホスファチジン酸、Ｌ−α−ホスファチジルコリン、Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン、及びＬ−α−ホスファチジルエタノールアミン、大豆からのＬ−α−ホスファチジルイノシトール、ウシ脳からのＬ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン及びスフィンゴミエリン、ウシ脳スフィンゴミエリンからのセラミド、ウシ脳セレブロシドからのＤ−スフィゴシン、Ｄ−スフィンゴシン、スフィンゴシン−１−リン酸、及びステアリルアミンから調製されるＮ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−スフィンゴシン、及びＮ−ステアロイル−Ｄ−スフィンゴシンをSigma Chemical社より購入した。オクチルアミンをAldrich Chemical社（Milwaukee WI）より購入した。
【００２８】
（ブタ大腸粘膜からのＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの精製）
下記の操作を４℃で行った。６Ｋｇのブタ大腸をTokyo Shibaura Zohki株式会社より購入した。粘液層を大腸からかき取り、ＰＢＳを３Ｌ加え、ポッターエルベージェム型ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、その後１，０００×ｇで３０分間遠心した。さらにもう１回抽出を行い、ふたつの上清画分を混合し１００，０００×ｇで１時間超遠心した。沈殿したミクロソームを０．５Ｍ塩化カリウムを用いて１回洗浄し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．２）、１Ｍ  塩化ナトリウム、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2、１％（ｗ／ｖ）  TritonX-100、１ｍＭ  ＤＴＴ（dithiothreiotol）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（phenylmethanesulfonylfluoride）、及び１０％（ｖ／ｖ）  グリセロールを混合して最終容量を１Ｌとしたものを用いて２回抽出し、その後超遠心した。
【００２９】
抽出物を緩衝液Ａ［組成：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）、５ｍＭ  ＭｎＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０％グリセロール］で透析し、ＵＤＰ−ヘキサノールアミン−セファロースカラム（７μｍｏｌ／ｍｌゲル：２×１０ｃｍ、緩衝液Ｂ［組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2、０．１％（ｗ／ｖ）  TritonX-100、１ｍＭ  ＤＴＴ及び１０％グリセロール］で平衡化）に適用した。０．１５Ｍ  塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂで洗浄した後、酵素画分を１Ｍ  塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂで溶出し、緩衝液Ａで透析した。次に、透析液をＵＤＰ−ヘキサノールアミン−セファロースカラム（１．４×６．５ｃｍ、緩衝液Ｂで平衡化）に再適用し、１ｍＭ  ＵＤＰを含む緩衝液Ｂで溶出した。各画分を緩衝液Ａで透析し、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性をアッセイした。酵素画分はasialo-agalact-ovomucin-Sepharose column（６.７ｍｇムチン／ｍｌゲル；１×７．５ｃｍ；緩衝液Ｂで平衡化）に適用した（FEBS Lett. 440, 307-310, 1998）。酵素を直線勾配（linear gradient）の塩化ナトリウム（０〜０．２Ｍ）を含む緩衝液Ｂで溶出し、その後透析した。酵素画分を濃縮し生化学解析に使用した。
【００３０】
（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡのクローニング）
β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−II、−III、−IV、−Ｖ、及び−VIIをコードするｃＤＮＡをSuper Script TMヒト精巣ｃＤＮＡライブラリー（Life Technologies社製）からＰＣＲにより増幅し、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉ及び−VIをコードするｃＤＮＡ（アクセッション番号：ＡＦ０２２３６７、ＡＦ０３８６６２；配列表の配列番号１）をＰＣＲによりヒト大腸悪性腺腫及びマウス脳のQUICK-CloneTM cDNA（CLONTECH社製、Palo Alto, CA）を鋳型としてそれぞれ増幅した。ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りである。
【００３１】
5'- tttggatccTGTAGCCCACACC -3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉ フォワードプライマー：配列番号３）、5'- tttgatatcAGGTCTCTTATCCGTG-3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉ リバースプライマー：配列番号４）、5'- tttggatccGGATGAGCAGACTGCTG -3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−II フォワードプライマー：配列番号５）、5'- tttgatatcGTCCATTAGTGTCAGCC -3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−II リバースプライマー：配列番号６）、5'- tttggatccAGGATGTTGCGGAGGCT -3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−III フォワードプライマー：配列番号７）、5'- tttgatatcGAGGAGTCAGTGTGAAC -3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−III リバースプライマー：配列番号８）、5'- tttggatccACATGGGCTTCAACCTG -3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IV フォワードプライマー：配列番号９）、5'- tttgatatcATCCAGGGTCATGCACC -3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IV リバースプライマー：配列番号１０）、5'- tttggatccTGGCTGCAGCATGC -3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｖフォワードプライマー：配列番号１１）、5'- tttgatatcTCAGTACTCGTTCAC -3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｖ リバースプライマー：配列番号１２）、5'- tttggatccGGAAGATGTCTGTGCTC -3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−VI フォワードプライマー：配列番号１３）、5'- tttgatatcCAGCATTGTGGTCTA -3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−VI リバースプライマー：配列番号１４）、5'- tttggatccGCACGATGTTCCC -3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−VII フォワードプライマー：配列番号１５）、5'- tttgatatcCAGCTCAGCTGAATG -3'（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−VII リバースプライマー：配列番号１６）。
【００３２】
なお、小文字で表記した配列は適切な制限酵素部位を含む。増幅したｃＤＮＡをBamH I及びEco RVで消化し、pcDNA3（Invitrogen社製）のそれぞれの部位間でクローニングした。構築したプラスミドをそれぞれpcDNA3−β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉ、−II、−III、−IV、−Ｖ、−VI、及び−VIIと命名し、これらの配列をApplied Biosystems PRISMR310 Genetic Analyzer（PE Biosystems社製）を用いて確認した。
【００３３】
（ＣＯＳ−７細胞におけるβ１，４−ガラクトース転移酵素の発現）
プラスミド（１μｇ）を３５ｍｍディッシュ上で、説明書に従いLipofectin Reagent（Life Technologies社製）を用いてＣＯＳ−７細胞に導入した。４８時間後、細胞をリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、ディッシュからこすり取り、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）及び０．２５Ｍショ糖に入れ、ホモジナイズした。ホモジネートを１００，０００×ｇで１時間超遠心した。沈殿した粗膜を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）で懸濁し、使用時まで−８０℃で保存した。
【００３４】
（Ｇａｌβ１→３（ＳＯ3-→６ＧｌｃＮＡｃβ１→６）ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−ｐＮＰ（６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ）の合成）
ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰにおけるＮ−アセチルグルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸をＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−スルホ基転移酵素−Ｉを用いて行った（J. Biochem. (Tokyo) 124, 670-678, 1998）。即ち、０．１Ｍ  カコジル酸ナトリウム塩（ｐＨ６．８）、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2、０．１％（ｗ／ｖ）ジギトニン、０．１Ｍフッ素ナトリウム、２ｍＭ  ＮＡ2−ＡＴＰ、０．２ｍＭ  ＰＡＰＳ、０．７５ｍＭ  ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ、及びＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−スルホ基転移酵素−Ｉを発現するＣＯＳ−７細胞から調製した膜画分（Glycobiology 12, 379-388, 2002）（１ｍＭ  ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ及び１７μＭ  ＰＡＰＳを使用したとき比活性は８ｎｍｏｌ／時間であった）を含む２ｍｌの反応混合物を３７℃で２４時間インキュベートし、ろ紙電気泳動を行った。生成物画分を切り出し、水で抽出した。抽出物をSephadex G-25 column（１．４×６８ｃｍ、エタノール：水＝５：９５（ｖ／ｖ）で平衡化し溶出）を用いて精製した。硫酸化したオリゴ糖画分を収集し、濃縮した。最終的に１５０ｎｍｏｌの６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰを得た。
【００３５】
（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性のアッセイ）
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2、０．５％（ｗ／ｖ）  TritonX-100、２５０μＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌ、０．３μＭ  ＵＤＰ−［3Ｈ］Ｇａｌ（４．９×１０5ｄｐｍ）、０．５ｍＭ受容体基質、及び適当に希釈した膜画分を含む２０μｌの反応混合物を３７℃で１時間インキュベーションした。精製したブタＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの場合は、０．５％（ｗ／ｖ）  TritonX-100を０．００１％（ｗ／ｖ）  Ｄ−スフィンゴシン及び０．０５％（ｗ／ｖ）  TritonX-100に置換した。ｂｉＧＰ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸、グルコサミン、Ｘｙｌ−Ｏ−ｐＮＰ、ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ、６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ、６Ｓ−ｂｉＧＰ、ケラタン硫酸由来の3Ｈ標識生成物をろ紙電気泳動（ピリジン：酢酸：水＝３：１：３８７、ｐＨ５．４）で精製した。
【００３６】
ａｇＬ２Ｌ２、ａｇＬ２Ｌ４、及びａｇＬＳＴ−ｂの場合は反応混合物を１ｍｌの０．０１Ｎ  ＨＣｌを用いて１００℃で１０分間処理し、１Ｎの水酸化ナトリウムを用いて中和し、濃縮し、ろ紙電気泳動を適用した。酸加水分解は［3Ｈ］ガラクトシル化ａｇＬ２Ｌ２及びａｇＬ２Ｌ４と類似の位置に移動する、余剰のＵＤＰ−［3Ｈ］Ｇａｌの分解に必要であり、ａｇＬＳＴ−ｂの場合においてはシアル酸残基の除去に必要であった。乾燥後、中間基質に関しては、ピリジン：酢酸エチル：酢酸：水＝５：５：１：３の溶媒システムを用いてろ紙上で展開（ペーパークロマトグラフィー）した。ラジオクロマトグラムスキャナーを用いてろ紙の放射能を測定し、3Ｈ標識生成物をＲＣＡ−Ｉ−アガロースカラム（０．７×２．５ｃｍ）を用いて水で抽出した。溶出は、はじめ４ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）／０．１５Ｍ塩化ナトリウムで行い、続いて１０ｍＭラクトースを含む同緩衝液を用いて行った。
【００３７】
結合画分（１０ｍＭラクトースで溶出）若しくは遅延溶出（retarded）画分を収集し放射能を測定した。グルコシルセラミドにおいては、反応混合物を直接ＨＰＴＬＣシリカゲルプレート（Keiselgel 60F254）（Merck社製、Darmstadt, Germany）上で、溶媒システム（クロロホルム／メタノール／０．２％塩化カルシウム、６０：３５：７）を用いて展開させた。乾燥後、プレートの放射能を測定し、3Ｈ標識生成物をクロロホルム／メタノール（１：１）を用いて抽出し算出した。内因性β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の対照として、pcDNA3を導入したＣＯＳ−７細胞（Ｃ−ＭＦ）由来の膜画分を用いた。外因性β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性量を計算するために、Ｃ−ＭＦにおける活性値を同条件下で得た明確な酵素活性値から減算した。本発明が提示する酵素活性値は４つの独立した実験の平均値であった。標準的偏差は全ての場合において５％未満であった。ケラタン硫酸の濃度はガラクトースのｍｏｌ数として表示した。
【００３８】
（タンパク質濃度の測定）
タンパク質濃度をBio-Radプロテインアッセイ色素試薬、及び標準物質としてウシ血清アルブミンを用いて測定した。
【００３９】
（アミノ酸配列解析）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のクーマシーで染色したバンドを切り出し、０．２ｍｇのAchromobacter protease（アクロモバクタープロテアーゼ）Ｉ（ＡＰＩ、Dr. Masaki, Ibaraki Universityより寄贈）（Biochim. Biophys. Acta 660, 44-50, 1981）を用いて、０．１％  ＳＤＳを含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で３７℃、１２時間処理した。ペプチドをゲルから抽出し、モデル１１００（Hewlett Packard社製）液体クロマトグラフィーシステムに連続して接続したＤＥＡＥ−５ＰＷ（２×２０ｍｍ、Tosoh社製、Tokyo）及びMyghtysil RP-18（２×５０ｍｍ、Kanto Chemical社製、Tokyo）カラム上で分離した。
【００４０】
ペプチドを、０．１ｍｌ／分の流速で０〜６０％直線勾配（linear gradient）の溶媒Ｂを使用して溶出した。溶媒Ａとして、０．０９％（ｖ／ｖ）水溶性トリフルオロ酢酸を含む８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを、溶媒Ｂとして、０．０７５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを、それぞれ用いた。モデル１２０Ａ ＰＴＨ解析器（Perkin Elmer社製）及びReflex MALDI-TOF（Bruker-Franzen Analytik社製、Bremen, Germany）上の基質補助レーザー脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption ionization）飛行時間型質量分析法にオンラインで接続した、モデル４７７Ａ自動タンパク質シークエンサー（Applied Biosystems社製）を使用し、基質として２−メルカプトベンゾチアゾル（J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8, 116-124, 1997）を使用する直線モード（in linear mode）で、選択したペプチドをエドマン分解で分析した。
【００４１】
（ノーザンブロット分析）
ヒト複数組織（Multiple Tissue）ノーザンブロット膜（CLONTECH社製、Palo Alto, CA）を説明書の指示に従い使用した。ノーザンブロット膜の各レーンのｍＲＮＡ量をβ−アクチンのｍＲＮＡ発現量で標準化した。説明書の指示に従い、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（NEN Life Science Products社製）を使用してランダムプライムＤＮＡラベリングキット（Roche Diagnostics社製）により、32Ｐ−標識プローブをｃＤＮＡ断片（Bam HI及びEco RV消化によりpcDNA3-β4GalT-IVから切除した）から調製した。膜をExpressHyb溶液（CLONTECH社製）中で６８℃で２時間プレハイブリダイズし、その後32Ｐ−標識プローブを用いて同溶液中において６８℃で１６時間ハイブリダイズした。ノーザンブロット膜を２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳで室温で洗浄し、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５０℃で洗浄した。放射能をＦＬＡ−２０００（富士フィルム社製、Tokyo）を用いて検出した。
【００４２】
［結果と考察］
（ブタ大腸粘膜からのＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの精製及びその活性のための塩基性脂質要求）本発明者らは以前、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼがヒト大腸粘膜に存在することを示した（FEBSLett. 440, 307-310, 1998）。本酵素を精製するため及びその部分的アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを単離するため、本発明者らは酵素資源としてブタ大腸粘膜を用いた。ブタ大腸粘膜もまたＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有していた。該酵素を２次ＵＤＰ−ヘキサノールアミン−セファロースカラムクロマトグラフィーで２３００倍に精製すると、酵素活性が消滅した（図１Ａ及び表１）。
【００４３】
【表１】
2004208506.tif 000002
【００４４】
【表２】
2004208506.tif 000003
【００４５】
高精製状態での活性化にスフィンゴミエリンを必要とするグルクロン酸転移酵素に関し、上記のような酵素作用の損失が今まで報告されてきたので（J. Biol.Chem. 273, 30295-30300, 1998）、本発明者らは酵素反応混合物に様々な脂質化合物を加えることを試みた。表２に示すように、リン脂質とセラミドの大部分には酵素活性を回復する能力がなかったのに対し、Ｄ−スフィンゴシン及びＮ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシンの存在下では活性が現れた。ステアリルアミンもまた活性を回復できたが、オクチルアミンは活性を回復できず、長疎水鎖を持つ塩基性脂質化合物が少なくともインビトロでの酵素活性に不可欠であることを示唆した。最大活性をもたらすＤ−スフィンゴシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン、及びステアリルアミンの最小濃度はそれぞれおよそ１０、２０、及び１０μＭであった（図２）。
【００４６】
アシアロ−アガラクト−オボムチン−セファロースクロマトグラフィー（asialo-agalacto-ovomucin-Sepharose chromatography）の後に、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトース転移酵素を２４，０００倍に精製した（図１Ｂ及び表１）。本発明者らはさらに様々なクロマトグラフィー法により精製を試みたが、どの方法も成功しなかった。最終的な酵素画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により２つの主要（major）なタンパク質（４５Ｋ及び４２Ｋ）及び２つの非主要（minor）なタンパク質（５９Ｋ及び５２Ｋ）を含んでいた（図３）。各タンパク質のバンドをリジン特異的プロテアーゼで消化し、ペプチド断片を逆相ＨＰＬＣで分離しアミノ酸配列を解析した。各バンドの１又は２の断片をアミノ酸配列のために測定し（表３）、該配列をＢＬＡＳＴ検索システムを使用して既知のタンパク質配列と比較した。
【００４７】
【表３】
2004208506.tif 000004
【００４８】
その結果、バンドａはヒトポリペプチドであるＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素−IIの配列と等しい１つの配列を含有していることが明らかになった（J.Biol. Chem. 270, 24156-24165, 1995）。バンドｂはヒトＮ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉの配列と類似する２つの配列を含有した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9948-9952, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 234-238, 1991）。かかる２つの酵素はドナー基質としてＵＤＰ−糖を使用することから、ＵＤＰ−ヘキサノールアミン−セファロースカラムクロマトグラフィー（UTP-hexanolamine-Sepharose column chromatographies）によりＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを用いて精製できる可能性がある。一方、バンドｃ及びｄは、ヒトβ１，４−ガラクトース転移酵素−IVの配列に類似した共通のペプチド配列を含む（Glycobiology 8, 517-526, 1998; J. Biol. Chem. 273, 29331-29340, 1998）。この結果は精製されたＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼがβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVに対応することを示す。
【００４９】
（ＣＯＳ−７細胞における７つのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現及びその基質特異性）
さらにβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVがＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的であること、及び現在までに同定されている７つのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼのうちで唯一のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼであることを確認するために、本発明者らは７つのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡをそれぞれ含む発現ベクターを調製し、それぞれのベクターを導入したＣＯＳ−７細胞由来の膜画分を用いて該ベクターの基質特異性を解析した。現在までに、７つのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼがヒトゲノムプロジェクトによって供給されたデータベース上で同定されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1573-1577, 1986; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4720-4724, 1986; J. Biol. Chem. 263, 10420-10428, 1988; Eur. J. Biochem. 183,211-217, 1989; J. Biol. Chem. 272, 31979-31991, 1997; Proc. Natl. Acad.Sci. USA 95, 472-477, 1998; Glycobiology 8, 517-526, 1998; J. Biol. Chem. 273, 13570-13577, 1998; J. Biol. Chem. 273, 29331-29340, 1998; Biochim. Biophys. Acta 1438, 301-304, 1999; J. Biol. Chem. 274, 22915-22918,1999; J. Biol. Chem. 274, 26165-26171, 1999）。
【００５０】
空のpcDNA3ベクターを導入したＣＯＳ−７細胞（Ｃ−ＭＦ）由来の膜画分を内因性β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の対照として使用した。Ｃ−ＭＦには、わずかなβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性があった。受容体基質としてｂｉＧＰ、６ＳＧＮ、ａｇＬ２Ｌ２、Ｘｙｌ−Ｏ−ｐＮＰ、ＧＬ、ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ、ＧｌｃＣｅｒ、及び６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰを使用した比活性はそれぞれ０．２０、０．３４、０．４３、０．２０、０．１２、０．４７、０、０．１６ｎｍｏｌ／分／タンパク質（ｍｇ）であった。外因性β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性量を算出するために、Ｃ−ＭＦ由来の値を同条件下で得た明らかな酵素活性から減算した。
【００５１】
β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉ、−II、−III、−IV、−Ｖ、−VI、及び−VIIの比活性はそれぞれ６．６ｎｍｏｌ（受容体としてｂｉＧＰを使用）、３．４ｎｍｏｌ（ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ）、２．６ｎｍｏｌ（ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ）、１．５ｎｍｏｌ（６ＳＧＮ）、１．５ｎｍｏｌ（ＧｌｃＣｅｒ）、０．３２ｎｍｏｌ（ＧｌｃＣｅｒ）、及び３．７ｎｍｏｌ／分／タンパク質（ｍｇ）（Ｘｙｌ−Ｏ−ｐＮＰ）であった。８つの受容体基質に対する７つのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの相対的活性を表４にまとめた。７つのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼのうち、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVだけが、ｂｉＧＰ及びＧＬと比較して、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸を受容体として強く認識し、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVのこの特徴が本発明者らが以前報告したヒト大腸Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの基質特異性（FEBS Lett. 440, 307-310, 1998）に同等であった。
【００５２】
β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVによって合成される［3Ｈ］Ｇａｌβ１→ａｇＬ２Ｌ２及び（［3Ｈ］Ｇａｌβ１→）６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰにおける［3Ｈ］Ｇａｌの連鎖位置（linkage position）はＲＣＡ−Ｉ−アガロースアフィニティークロマトグラフィーによってＧｌｃＮＡｃのＣ−４であることが確認され（図４）、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃに結合する（J.
Biol. Chem. 263, 17482-17489, 1988）。［3Ｈ］Ｇａｌβ１→ａｇＬ２Ｌ２（図４Ｂ、実線）及び（［3Ｈ］Ｇａｌβ１→）６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ（図４Ｃ、実線）は（［3Ｈ］Ｇａｌβ１→）ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰより弱くカラムに結合した（図４Ａ）。この弱い結合が６−Ｏ−硫酸によって引き起こされるかを調べるため、レクチンカラムを用いて、硫酸化生成物を穏やかにメタノリシス（０．０５Ｎ塩酸／メタノール、２５℃で４時間）（J. Biol. Chem. 258, 14144-14147, 1983）処理した。
【００５３】
処理物をカラムに結合し、１０ｍＭ  ラクトースを用いて溶出し（図４Ｂ及びＣ、点線）、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ特異的双球菌β−ガラクトシダーゼを用いた消化により消化物をカラムに流し、硫酸化合物の［3Ｈ］ＧａｌがＧｌｃＮＡｃのＣ−４に結合していることを明らかにした。６ＳＧＮは、０．１又は０．２ｍＭ等のより低い濃度であっても、他のβ１，４−ガラクトース転移酵素にとっては弱い基質であるかあるいは基質とはならず（表４）、かかる低活性又は非活性の原因が高濃度の６ＳＧＮによる抑制効果である可能性を排除した。かかる挙動はいくつかのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼで見受けられた（J. Biol. Chem. 273, 34843-34849, 1998; Cancer Res. 56, 3468-3473, 1996）。以上の結果から、上述の通り、精製したブタＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と一致し、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVが７つのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの中で唯一のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的酵素であることが示された。
【００５４】
【表４】
2004208506.tif 000005
【００５５】
β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IIIはＮ結合型ｂｉＧＰよりＯ結合型ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰを強く認識するが、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉ及び−IIはｂｉＧＰ及びｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ双方を優良な受容体として認識する。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｖはｃｏｒｅ２（FEBS Lett. 450, 52-56, 1999）及びＮ結合型グリカンの特異的分岐構造（Biochem. Biophys. Res. Commun. 265, 434-438, 1999）に作用することが分かっている。本研究において、本発明者らはβ１，４−ガラクトース転移酵素−VIに類似する、グルコシルセラミドに対するβ１，４−ガラクトース転移酵素−Ｖの他の活性を示した。他のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸相同性が３０〜５０％であるのに対し、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｖ及び−VIはアミノ酸相同性が高かった（６８％）（Glycobiology 8, 517-526, 1998）。最近になって、Leeら（J. Biol. Chem. 276, 13924-13934, 2001）はβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−VI欠損ＣＨＯ細胞にラクトシルセラミドを合成する能力があることを報告し、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−VI以外のラクトシルセラミド合成酵素の存在を示唆した。
【００５６】
これらの結果は、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｖが２次ラクトシルセラミド合成酵素であることを示す。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−VIは精製されラクトシルセラミド合成酵素としてクローニングされてきた（J. Biol. Chem. 273, 13570-13577, 1998）。しかしながらβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｖ及びVIにとってグルコシルセラミドだけでなく、ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰもまた適した受容体であった。これらの活性は疎水性ｐＮＰ部分の存在が原因と考えられる。０．５ｍＭ  グルコシルセラミド／１０ｍＭ  Ｎ−アセチルグルコサミン／１０ｍＭ  Ｎ−アセチルグルコサミンβ−Ｏ−ｐＮＰに対するβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｖ及び−VIの相対的活性は、それぞれ１００：２５：１４７及び１００：＜１：２８６であった。いずれの酵素もＮ−アセチルグルコサミンよりもＮ−アセチルグルコサミンβ−Ｏ−ｐＮＰを強く認識し、この２つの酵素が強く認識するためにはｐＮＰグループが必要であることが示唆された。最近になって、本発明者らはガラクトシルセラミドと同様にｐＮＰ又はベンジルグループ含有基質に選択的に作用する、ガラクトース３−Ｏ−スルホ基転移酵素、Ｇａｌ３ＳＴ−１又はセレブロシドスルホ基転移酵素においても、同様の挙動が観察できることを報告した（Jpn. J. Cancer Res. 93, 507-515, 2002）。
【００５７】
β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVはいくつかのＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸含有オリゴ糖を適切な受容体として認識する（表５）。ケラタン硫酸関連のオリゴ糖であるａｇＬ２Ｌ２及びａｇＬ２Ｌ４はβ１，４−ガラクトース転移酵素−IVに対して適切な基質であった。ＡｇＬ２Ｌ２は他のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼにとっては弱い基質あるいは基質とはならなかった（表４）。ケラタン硫酸はまた、１ｍＭケラタン硫酸に対し０．０４５ｎｍｏｌ／分／タンパク質（ｍｇ）の比活性をもつβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVの基質である。ケラタン硫酸鎖非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基を露出するために、本発明者らはケラタン硫酸を弱酸性加水分解で処理し、ストレプトコッカス６６４６Ｋβ−ガラクトシダーゼで消化し、シアル酸及びガラクトースを取り除いた。アシアロ−アガラクト−ケラタン硫酸に対する酵素活性は非処理のケラタン硫酸の酵素活性より３．３倍高かった。この結果は、β１，４−ガラクトース転移酵素−IVがまたケラタン硫酸長鎖に作用することを示唆している。
【００５８】
ａｇＬＳＴ−ｂはβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVにとって弱い基質であったので、シアル酸をＮ−アセチルグルコサミンＣ６の硫酸と置換することはできない。本基質選択性はヒト大腸Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと同じである（FEBS Lett. 440, 307-310, 1998）。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVはまた６Ｓ−ｂｉＧＰ及び６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰにも効果的に作用する。Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸部分は様々な糖タンパク質においてＮ結合型及びＯ結合型グリカンに存在する（Trends Glycosci. Glycotechnol. 9, 379-398, 1997）。ｃｏｒｅ２グリカン上の６−スルホシアリルルイスＸは、β１→４ガラクトシル化、α２→３シアリル化、及びα１→３フコース化の一連の作用によって６Ｓ−ｃｏｒｅ２から合成され、リンパ節のリンパ球形成初期段階においてＬ−セレクチンリガンド部分として機能する（J. Biol. Chem. 270, 12035-12047, 1995; J. Biol. Chem. 273,11225-11233, 1998; J. Cell Biol. 145, 899-910, 1999; Immunity 11, 79-89, 1999）。
【００５９】
７つのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼのうち６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰを良好な基質として認識する酵素はβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVのみであり（表４）、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVが６−硫酸（スルホ）シアリルルイスＸの合成に関与することを示唆している。
【００６０】
【表５】
2004208506.tif 000006
【００６１】
Ｎ−アセチルグルコサミンに６−Ｏ−硫酸を持つ又は持たないいくつかのグリカンに対するβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVの反応速度解析（kinetic analysis）を表６にまとめた。ＡｇＬ２Ｌ４及び６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰは高濃度のときβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IV活性に対する抑制効果を持っていたので（図５）、これらの基質が低濃度のときに得たデータのみを用いて反応定数を計算した。Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸のミカエリス定数（Ｋｍ）値はＮ−アセチルグルコサミンのミカエリス定数値より低く、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸のミカエリス定数値あたりの最大反応速度はＮ−アセチルグルコサミンの該値より１９００倍も高かった。同様に６Ｓ−ｂｉＧＰ及び６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰのミカエリス定数値あたりの最大反応速度はｂｉＧＰ及びｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰの該値よりそれぞれはるかに高くなった。以上の結果はＮ−アセチルグルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸がβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVの効果的な触媒活性にとって重要であることを示す。
【００６２】
【表６】
2004208506.tif 000007
【００６３】
（様々なヒト組織におけるβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVの発現）
Loら（Glycobiology 8, 517 - 526, 1998）及びSchwientekら（J. Biol. Chem. 273, 29331 - 29340, 1998）はヒト成人及び胎児組織においてβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVの発現特徴を報告したが、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが発現する部位である、大腸又はリンパ節におけるβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVの発現については調べていなかった。発現パターンをより明確にするために、本発明者らは市販のノーザンブロット膜を用いて発現パターンを解析した。図６に示すように、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVの２．４キロベース転写物が広範に発現した。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IV ｍＲＮＡは、腎臓、胎盤、リンパ節、前立腺、胃、甲状腺、舌、及び気管において比較的高発現していた。最近になって、６−スルホシアリルルイスＸ決定因子が大腸粘膜に存在することが分かった（Cancer Res. 60, 1410-1416,2000）。大腸ではβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVは中程度に発現した（図６）。
【００６４】
（全体的考察）
本発明者は本実施例において下記を明らかにした。（１）Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを精製しβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVと同定した。（２）現在までにクローニングされている７つのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの基質特異性を解析し、その中でβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVが唯一のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、いくつかの６−Ｏ−硫酸−Ｎ−アセチルラクトサミングリカンの合成に関わる。（３）ブタβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVは触媒活性のために塩基性脂質（basic lipidous）化合物を、少なくとも高度に精製された状態においては必要とする。
【００６５】
スフィンゴシンはα１→３フコシル基転移酵素（ＦｕｃＴ）、ＧＭ２：β１→３ＧａｌＴ、ＣＭ３：β１→４Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（Indian J. Biochem. Biophys. 27, 386-395, 1990）、及び糖タンパク質スルホ基転移酵素（Arch. Oral Biol. 40, 433-438, 1995）の酵素活性を数倍上昇させ、反対にβ１→３グルクロニル転移酵素の酵素活性を減少させる（Indian J. Biochem. Biophys. 27, 396-401, 1990）と報告されてきた。しかしながら、本発明者の知る限り、塩基性脂質化合物（basic lipidous compound）が糖転移酵素の触媒活性に不可欠であることを示したのは本発明が始めてである。スフィンゴシンはスフィンゴ脂質の新陳代謝の中間体（intermeiate）であり、スフィンゴシン１−リン酸の前駆体であり、２次メッセンジャー分子（J. Biochem. 118, 1091-1103, 1995; Science 274, 1855-1859, 1996; FASEB J. 10, 1388-1397, 1996）であるが、スフィンゴシンは生体細胞中ではかなり低レベルで存在すると考えられてきた。本要求の分子的側面は不明瞭であるが、一説として、精製の過程において、未精製抽出物中の酵素に結合しているある一定の塩基性化合物が、酵素タンパク質から脱離するということがあげられる。本発明者は、本問題の解明に向けて、様々な塩基性化合物に対する組み換えβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVの結合を生化学的に解析している。
【００６６】
ケラタン硫酸はポリ−６−Ｏ−硫酸化ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンである（Glycobiology 10, 951-958, 2000）。ケラタン硫酸合成に関わる糖転移酵素（glycotransferase）及びスルホ基転移酵素が報告されてきた。５つのＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−スルホ基転移酵素の遺伝子が今までに同定されており、全ての酵素が非還元末端Ｎ−アセチルグルコサミンに作用するが、ガラクトースβ１→４Ｎ−アセチルグルコサミン等の内部Ｎ−アセチルグルコサミンには作用しない。最近になってAkamaら（J. Biol. Chem. 276, 16271-16278, 2001）が、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−スルホ基転移酵素−５（ＣＧｎ６ＳＴ）がケラタン硫酸合成に関与することを示した。Fukutaら（J. Biol. Chem. 272, 32321-32328, 1997）は、ガラクトース６−Ｏ−スルホ基転移酵素（Ｇａｌ６ＳＴ）を同定したが、該酵素はジ−Ｎ−アセチルラクトサミン鎖中の内部ガラクトース残基を認識し（prefer to）、（Glycobiology 10, 203-211, 2000）、ガラクトースの６−Ｏ−硫酸はケラタン硫酸合成の後半の過程であることを示唆した。
【００６７】
今までクローニングされている６つのβ１，３Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（β３ＧｎＴｓ）のうち、β１，３Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−２がｐ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース（p-lacto-N-neohexaose）に対する強い酵素活性を持ち（J. Biol. Chem. 276, 3498-3507, 2001）、該酵素がケラタン硫酸基幹構造の伸長に関与する候補である可能性を示唆したが、β１，３Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−IIが、ケラタン硫酸伸長に対するβ１，３Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を持つという証拠はない。本研究において、本発明者らは７つのβ１，４−ガラクトース転移酵素のうち、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVのみがケラタン硫酸関連グリカン、ａｇＬ２Ｌ２及びａｇＬ２Ｌ４に作用することを明らかにした。以上の結果から、ケラタン硫酸は、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−５、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IV、β３ＧｎＴ、及びその後のＧａｌ６ＳＴの４種の酵素の一連の作用により合成されると考えられる（図７Ａ）。
【００６８】
一方、６−スルホシアリルルイスＸはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ、β１，４−ガラクトース転移酵素、α２，３シアリル転移酵素（ＳｉａＴ）、及びα１，３ＦｕｃＴの一連の反応により合成される。リンパ節では、本構造がＯ結合型ｃｏｒｅ２（J. Biol. Chem. 270, 12035-12047, 1995）又は伸長したｃｏｒｅ１（Cell 105, 957-969, 2001）においてβ１，６分鎖をもつＧｌｃＮＡｃに結合すること、及びＧｌｃＮａｃ６−Ｏ−硫酸がＧｌｃＮａｃ６ＳＴ−２によって行われることが明らかになっている。しかしながら、Uchimuraら（J. Biol. Chem. 277, 3979-3984, 2002）は、ＧｌｃＮａｃ６ＳＴ−１が６−スルホシアリルルイスＸの合成を誘導することを明らかにした。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVが７つのβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼのうち６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰに作用する唯一の酵素であるという本発明者の結果に基づき、次のガラクトシル化はβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVによって触媒されると考えられる。
【００６９】
Ujitaら（J. Biol. Chem. 273, 34843-34849, 1998）はβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ〜Ｖのうち、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVが非硫酸化ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰに効率的に作用することを報告した。本研究において、本発明者らは６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰがｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰよりもβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVに対して適切な基質であることを示した。以上の結果から、６−スルホシアリルルイスＸの生合成過程をまとめ、図７Ｂに示した。
β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ−IVは図６に示すようにリンパ節を含む様々なヒト組織で発現する。従って、６−Ｏ−硫酸−Ｎ−アセチルラクトサミン構造が広範に見られることが明らかになった。
【００７０】
実際、この硫酸化グリカン部分は、オボムチン（Glycoconjugate J. 4, 329-337, 1987）、数種の培養細胞由来の糖タンパク質（J. Biol. Chem. 263, 8897-8903, 1988）、チログロブリン（J. Biol. Chem. 266, 4237-4243, 1991）、透明帯糖タンパク質（Eur. J. Biochem. 209, 883-894, 1992; Eur. J. Biochem. 221, 491-512, 1994）、ヒト免疫不全ウイルス１型のｇｐ１２０（J. Virol. 67, 943-952, 1993）、呼吸器粘膜（J. Biol. Chem. 269, 18794-18813, 1994; Carbohydr. Res. 295, 157-177, 1996）癌胎児性抗原（Glycobiology 5, 105-115, 1995）、卵表層胞局在主要糖タンパク質（hyosophorin）（Eur. J. Biochem. 238, 357-367, 1996）、及び粘液ムチン（oviducal mutin）（Eur. J. Biochem. 266, 370-382, 1999）を含む様々な糖タンパク質に存在することがわかっている。本研究において同定したＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトース転移酵素−IVはこれらの硫酸化部位の生物学的役割の解明に役立つと考えられる。
【００７１】
【発明の効果】
本発明においては、ヒト Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ硫酸特異的β１，４ガラクトシルトランスフエラーゼの遺伝子をクローニングし、該転移酵素を同定した。該遺伝子やガラクトシルトランスフェラーゼを用いることにより、スフィンゴシンやケラタン硫酸又は６−硫酸化シアリルルイスＸのような６−Ｏ−硫酸Ｎ−アセチルラクトサミングリカンの生合成に置けるβ１，４ガラクトシル化を行うことが可能となった。６−Ｏ−硫酸Ｎ−アセチルラクトサミングリカンの構造を有するグリカンは、生体物質として重要な機能を有しており、該物質の生合成が容易になることは、該物質の機能の解明とともに、医薬品等の開発に貢献しうるものである。
【００７２】
【配列表】
2004208506.tif 000008
2004208506.tif 000009
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において、図１Ａは、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトース転移酵素−IV作用（●）を、実験方法に記載のとおり、０．００１％のＤ−スフィンゴシンの非存在下（上）又は存在下（下）において解析した結果を示す図である。またＢは、Ａで得た酵素画分をアシアロ−アガラクト−オボムチン−セファロースカラムクロマトグラフィーを行った後、酵素活性を０．００１％のＤ−スフィンゴシンの存在下で解析した結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例における、Ｄ−スフィンゴシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン、及びステアリルアミンの、精製したＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−硫酸特異的β１，４−ガラクトース転移酵素に対する影響を示す図である。
【図３】本発明の実施例における、アシアロ−アガラクト−オボムチン−セファロースカラムクロマトグラフィーから得た酵素画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例における、反応生成物、［3Ｈ］Ｇａｌ→ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ（Ａ）、［3Ｈ］Ｇａｌ→ａｇＬ２Ｌ２（Ｂ、実線）、及び（［3Ｈ］Ｇａｌ→）６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ（Ｃ、実線）のＲＣＡ−Ｉ−アガロースカラムクロマトグラフィーの結果を示す図である。なお、Ａの結果を、Ｂ及びＣ中に点線で示している。
【図５】本発明の実施例における、受容体基質の様々な濃度における酵素活性を測定した結果を示す図である。なお、使用した受容体基質をそれぞれ、６ＳＧＮ（●）、ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ（○）、６Ｓ−ｃｏｒｅ２−Ｏ−ｐＮＰ（▲）、及びａｇＬ２Ｌ４（△）で示している。
【図６】本発明の実施例における、β１，４−ガラクトース転移酵素−IV遺伝子の組織分布を示す図である。
【図７】本発明により、ケラタン硫酸が、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−５、β１，４−ガラクトース転移酵素、α２，３シアリル転移酵素（ＳｉａＴ）、及びα１，３ＦｕｃＴによる一連の反応により合成されることをまとめた図である。また、Ｂは、本発明から考えられる６−スルホシアリルルイスＸの生合成スキームを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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