(57)【要約】【課題】免疫組織化学染色に用いる取り扱いが簡便で、かつ抗体の非特異的吸着を抑制することができるブロッキング試薬を提供する。【解決手段】スキムミルクおよび界面活性剤を含むことを特徴とするブロッキング試薬および該試薬を用いる免疫組織化学染色方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スキムミルクおよび界面活性剤を含むことを特徴とする免疫組織化学染色用ブロッキング試薬。
【請求項２】
動物血清を含む請求項１記載の免疫組織化学染色用ブロッキング試薬。
【請求項３】
５％スキムミルクおよび界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１または２記載の試薬。
【請求項４】
１０％動物血清を含むことを特徴とする請求項３記載の試薬。
【請求項５】
リン酸緩衝液に溶解した請求項１〜４のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項６】
界面活性剤がＴｗｅｅｎ２０である請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のブロッキング試薬を用いることを特徴とする、免疫組織化学染色方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫組織化学染色に用いるブロッキング試薬および該試薬を用いる免疫組織化学染色方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫組織化学染色は、組織切片上で抗原抗体反応を利用し特定の抗原を可視化する染色方法であり、生物組織の形態学的研究の有効な手段として汎用されている。
免疫組織化学染色をはじめとする免疫学的測定法には、検出目的である抗原に対する抗体に標識物質を結合させた標識抗体（１次抗体）を直接抗原に反応させた後に可視化する直接法と、抗原に対する抗体（１次抗体）を抗原に反応させた後、当該抗体を認識する抗体に標識物質を結合させた標識抗体（２次抗体）を反応させて可視化する間接法とがあるが、間接法が感度の点で有利である。
【０００３】
免疫組織化学染色では、１次抗体および２次抗体の非特異的反応、すなわち免疫グロブリン自身が有している荷電または物理化学的性状による組織切片中の蛋白質などとの非特異的結合を低下させるためにブロッキングを行うことが重要である。
一般的に、免疫組織化学染色におけるブロッキングには、１〜５％正常動物血清、１〜５％ウシアルブミン（ＢＳＡ）または５〜１０％スキムミルクを単独で使用すること（非特許文献１参照）、Ｔｗｅｅｎ  ２０またはスキムミルクをブロッキング試薬として使用すること（非特許文献２参照）が行われている。しかし、これらの試薬を用いたブロッキングでは、試薬の選択および濃度調整を利用する抗体ごとに実施する必要があり、これらの条件を最適化するために多大な検討を要することから、多くの場合には抗体の非特異的な反応が十分に抑制されていない。このためブロッキング試薬の選択は、一次抗体または二次抗体の至適濃度調整と合わせて、免疫組織化学染色を正確かつ迅速に実施するうえでの問題点となっている。
【０００４】
また、免疫学的測定方法の一つであるＥＬＩＳＡでのブロッキング試薬として、Ｔｗｅｅｎ  ２０およびスキムミルクを含むＰＢＳ溶液を用いること（非特許文献３）、ＥＬＩＳＡに使用するメンブレンを１０％  ＢＳＡでブロッキングした後、さらに１０％  スキムミルク（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むｐＨ  ７．４のＴＢＳ溶液）にてブロッキングすること（非特許文献４）などが知られているが、免疫組織化学染色のブロッキングに用いることは知られていない。
【０００５】
近年、上記問題点を解決する目的で、一部の利用頻度が高い一次抗体を利用する免疫組織化学染色については、至適濃度に希釈された抗体および調製済みの酵素基質等がキット化されたものが利用可能となった（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ，  ＤＡＫＯ他）。これらの使用により、特定の免疫組織化学染色については、操作の相違による染色性のばらつき、非特異的な反応を減弱させることが可能となった。しかしながら、依然として多くの場合ではブロッキング試薬の選択および不充分な非特異的反応の抑制が免疫組織化学染色を正確かつ迅速に実施するうえでの問題点となっている。
【０００６】
【非特許文献１】
「新染色法のすべて」ｐｐ．  ２０６−２０７，  医歯薬出版株式会社，  東京  （１９９９）
【０００７】
【非特許文献２】
病理技術，  ４９，  １２−１５  （１９９４）
【０００８】
【非特許文献３】
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（アナリティカル  バイオケミストリー），  ２１８（２），４７０−４７３  （１９９４）
【０００９】
【非特許文献４】
Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（アナルス  オブ  クリニカル  バイオケミストリー），  ３４  （２），  １８５−１８９  （１９９７）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、抗体の非特異的な反応を抑制する効果を有し、取り扱いが簡便かつ安価な免疫組織化学染色用のブロッキング試薬および該試薬を用いる免疫組織染色方法を提供する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下の（１）〜（７）に関する。
（１）  スキムミルクおよび界面活性剤を含むことを特徴とする免疫組織化学染色用ブロッキング試薬。
（２）  動物血清を含む上記（１）記載の免疫組織化学染色用ブロッキング試薬。
【００１２】
（３）  ５％スキムミルクおよび界面活性剤を含むことを特徴とする上記（１）または（２）記載の試薬。
（４）  １０％動物血清を含むことを特徴とする上記（３）記載の試薬。
（５）  リン酸緩衝液に溶解した上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の試薬。
【００１３】
（６）  界面活性剤がＴｗｅｅｎ２０である上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の試薬。
（７）  上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載のブロッキング試薬を用いることを特徴とする、免疫組織化学染色方法。
【００１４】
【発明実施の形態】
本発明の免疫組織化学染色に用いるブロッキング試薬としては、スキムミルクおよび界面活性剤を含んでいればいかなるものも包含されるがＴｗｅｅｎ２０が好ましい。また、本発明のブロッキング試薬に、動物血清が含まれていてもよい。
スキムミルクとしては、生化学実験用一般試薬として使用されるスキムミルクであればいかなるものでもよいが、好ましくはノンファットスキムミルクがあげられる。
【００１５】
界面活性剤としては、生化学実験用一般試薬として使用される界面活性剤であればいかなるものでもよい。具体的には、Ｔｗｅｅｎ  ２０、４０、６０、８０、８５などの界面活性剤が挙げられるが、好ましくはＴｗｅｅｎ  ２０が挙げられる。
動物血清としては、ウサギ血清、ヤギ血清、マウス血清、ラット血清など、本発明の免疫組織化学染色方法に適するものであればいかなるものでもよいが、好ましくはウサギ血清、ヤギ血清等があげられる。特に免疫学的測定法で用いられる抗体がモノクローナル抗体の場合には、ヤギ血清が、ポリクローナル抗体の場合には、ウサギ血清が好ましい。
【００１６】
また、ウシ胎児性血清（ＢＳＡ）も動物血清に包含される。
動物血清、スキムミルクおよび界面活性剤を溶解する溶液としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、トリス緩衝液（ＴＢＳ）などがあげられるが、好ましくはＰＢＳがあげられる。
動物血清、スキムミルクおよび界面活性剤の最終濃度としては、それぞれ１〜１０％、１〜１０％、０．０１〜５％があげられるが、好ましくは１０％、５％、１％があげられる。
【００１７】
免疫組織化学染色するための組織片としては、パラフィン切片、凍結切片のいずれでもよく、いかなる組織でも使用することができる。特に、非特異的反応を抑制しにくい複雑な成分から構成される器官・組織のブロッキングに、本発明のブロッキング試薬を用いることは有効である。複雑な成分から構成される器官・組織としては、線維性成分が含まれる組織などが挙げられ、具体的には角化した表皮、口腔粘膜（舌）、食道、膣などがあげられる。
【００１８】
本発明のブロッキング試薬は、凍結に安定である。したがって、大量調製したブロッキング試薬を分注し、凍結保存することができる。また、本発明のブロッキング試薬は、間接法で用いられる１次抗体の結合性に影響を与えないため、１次抗体の希釈溶液としても使用できる。
【００１９】
【実施例】
実施例１．免疫組織化学染色におけるブロッキング試薬の評価
（１）切片の作製
９週齢の雄性マウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ）をエーテル麻酔下で放血致死させ、舌を採取した。
【００２０】
先述の舌を約５ｍｍ角の大きさに切り出し、アルミ箔で作製した鋳型に入れ約１ｃｍの高さになるようＯ．Ｃ．Ｔコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｒ），  Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．製）に包埋し、ドライアイスを用い凍結凍結ブロックを作製した。当該凍結ブロックをクリオスタットで約６μｍの切片に薄切しシランコーティングスライドガラス（ＤＡＫＯ製）に貼付した。
【００２１】
（２）切片の染色
切片を冷アセトン（和光純薬工業株式会社製）で１０分間固定し室温で風乾した。切片をＰＢＳ（ＯＸＯＩＤ製）に３分間浸漬しＯ．Ｃ．Ｔコンパウンドを除去し、内因性ペルオキシダーゼを阻害する目的で０．３％Ｈ２Ｏ２（和光純薬株式会社製）／５０％メタノール（和光純薬工業株式会社製）／ＰＢＳを調製し、１０分間浸漬した。切片をＰＢＳで５分間、３回洗浄し、ブロッキング試薬１［スキムミルク（和光純薬工業株式会社製）とＴｗｅｅｎ２０（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．製）とをＰＢＳに溶解し、最終濃度を５％スキムミルクおよび１％Ｔｗｅｅｎ  ２０としたもの］、ブロッキング試薬２［ヤギ血清（株式会社ニチレイ製）、スキムミルクおよびＴｗｅｅｎ２０をＰＢＳに溶解し、最終濃度を１０％ヤギ血清、５％スキムミルクおよび１％Ｔｗｅｅｎ  ２０としたもの］をそれぞれ３０分間反応させた。反応終了後、切片は洗浄することなくそれぞれのブロッキング試薬で２．５  μｇ／ｍＬに希釈した１次抗体を添加し、室温で約２時間反応した。１次抗体としては、末梢神経を反応部位（抗原）とするマウスＩｇＧ抗体を用いた。切片をＰＢＳで５分間、３回洗浄し、１％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ製）／ＰＢＳで２００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ製）と３０分間反応した。切片をＰＢＳで５分間、３回洗浄し、１５  ｍｇ／１００ｍＬ  ＰＢＳの３，３’−ジアミノベンチジン四塩酸塩（和光純薬工業株式会社製、以下：ＤＡＢ溶液）で２分間反応後、５０  μＬの３０％Ｈ２Ｏ２を添加し約５分間発色反応を行った。
【００２２】
さらに、流水で水洗し、ヘマトキシリン（Ｍｅｒｃｋ製）で常法に従って核染色を行い、上昇エタノール（武藤化学株式会社製）系列で脱水、キシレン（和光純薬工業株式会社製）で透徹後、封入剤（Ｍｅｒｃｋ製）を用いて封入した。試薬調製に使用した水は、すべてイオン交換水を使用した。なお、本発明のブロッキング試薬の効果を客観的に判断するため、ブロッキング未実施（ＮＴ）、１０％ヤギ血清（ＮＧＳ）、５％スキムミルク（ＳＭ）、１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＷ）、および１０％ＢＳＡ（ＢＳＡ）をそれぞれ単独で用いた場合を比較対照とした。
【００２３】
（３）染色切片の評価
オリンパス社製画像解析装置  （ＣＯＬＯＲ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＡＮＡＬＹＺＥＲ  ＳＰ５００Ｆ，  ＯＬＹＭＰＵＳ）  を使用し、染色結果の数値化（０から２５５段階の数値範囲でより低い値ほど染色の程度が強いことを示す）を実施した。数値化の対象として、標的部位である末梢神経組織および非特異的反応発生部位について各々３箇所を任意に選択し、平均値を算出した。ブロッキングの効果は、非特異的反応部位での値と標的部位での値との差で示した。すなわち、値が大きいほど、非特異的反応部位での染色程度は弱く、かつ標的部位での染色程度は強いことを示す。
【００２４】
上記の結果を図１に示す。
本発明のブロッキング試薬１およびブロッキング試薬２では、その他の比較対象に比べて明らかな高値を示した。従って、本発明によるブロッキング試薬は、免疫組織化学染色において優れたブロッキング効果を有することが示された。
【００２５】
【発明の効果】
本発明により、非特異反応を抑制する効果を有し、取り扱いが簡便かつ安価な免疫組織染色用ブロッキング試薬および該試薬を用いる免疫組織化学染色方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】は、各種ブロッキング試薬を用いたときの染色切片の非特異的反応部位と標的部位とでのそれぞれの染色程度の数値の差を示したグラフである。図中、ＳＭ＋ＴＷはブロッキング試薬１、ＮＧＳ＋ＳＭ＋ＴＷはブロッキング試薬２、ＮＴはブロッキング未実施、ＮＧＳは１０％ヤギ血清、ＳＭは５％スキムミルク、ＴＷは１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＢＳＡは１０％ＢＳＡをブロッキング試薬として用いた結果をそれぞれ示す。
【図１】
2004219111.tif 000002