(57)【要約】【課題】腫瘍細胞への取り込み効率が高く、安全な天然のポルフィリン化合物であって、吸収極大が７００  ｎｍの長波長側へシフトし、かつ、光照射により、従来のものよりさらに強力な腫瘍細胞傷害性を発揮する化合物を見いだし、これにより、新規かつ有用な生体用光増感剤ないしは腫瘍細胞傷害剤を開発する。【課題解決手段】クロロフィルの代謝産物として各種のポルフィリン誘導体を含有する植物から、光照射により腫瘍細胞を殺傷する２種の化合物を単離し、これら化合物を生体用光増感剤ないしは腫瘍細胞傷害剤とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式Ｉ又は式ＩＩで表される化合物を含有することを特徴とする生体用光増感剤。
【化１】
2004217541.tif 000009
2004217541.tif 000010
【化２】
2004217541.tif 000011
2004217541.tif 000012
【請求項２】
上記構造式Ｉ及び／又は式ＩＩで表される化合物を含む植物の抽出物からなる生体用光増感剤。
【請求項３】
植物がイネ科植物である請求項２に記載の生体用光増感剤。
【請求項４】
イネ科植物がＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属に属する植物である請求項３の生体用光増感剤。
【請求項５】
上記構造式Ｉ又はＩＩで表される化合物を含有することを特徴とする腫瘍細胞殺傷剤。
【請求項６】
上記構造式Ｉ及び／又は式ＩＩで表される化合物を含む植物の抽出物からなる腫瘍細胞殺傷剤。
【請求項７】
植物がイネ科植物である請求項６に記載の腫瘍細胞殺傷剤。
【請求項８】
イネ科植物がＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属に属する植物である請求項７に記載の腫瘍細胞殺傷剤。
【請求項９】
上記構造式Ｉで表される化合物。
【請求項１０】
上記構造式Ｉ又はＩＩで表される化合物を含有する植物から溶媒を用いて抽出することを特徴とする上記構造式Ｉ又はＩＩで表される化合物の製造方法。
【請求項１１】
植物がイネ科植物である請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
イネ科植物が、Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属に属する植物である請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物から抽出した天然のポルフィリン誘導体からなる生体用光増感剤及び腫瘍細胞殺傷剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍の治療法の１つに光力学療法という方法がある（非特許文献１参照）。この方法は、腫瘍細胞に対する選択性を有する光感受性物質を腫瘍細胞に取り込ませ、光を照射して光による化学反応（光反応）を腫瘍細胞内に起こさせることにより、酸素を活性化し、その結果生じる一重項酸素やスーパーオキシドラジカルにより腫瘍細胞を死滅させるものである。類似する放射線治療法に比べて、骨髄等に対する重篤な副作用がほとんどなく、外科的方法のように組織の大部分を取り去るということもないので、腫瘍以外の組織・臓器の機能を保全することも容易になる。従来、光を照射しやすい皮膚ガンや眼底病変の治療にもっぱら用いられてきたが、最近、光源としてのレーザーや導波管（光ファイバー）等ハードウェア面での著しい進歩があいまって、肺ガンや大腸ガン等の臓器ガンにも積極的に応用されている。特に中心性早期肺ガンについては、米国ＮＣＩのプロトコールで治療の第１選択肢となっており、我が国でも本法のみにより８５％以上の治癒率があげられている（非特許文献２参照）。ところで、このような光力学療法にとって重要な要素は、腫瘍細胞に対する選択性を有し、かつ光によって酸素を活性化する仲立ちとなる化合物（光増感剤）である。
【０００３】
この光増感剤として従来用いられてきたものにはヘマトポルフィリン（非特許文献３参照）やピロフェオホーバイドエステル（非特許文献４、５参照）など天然のポルフィリン誘導体やそれをモデルとしたフタロシアニン系色素  （非特許文献６参照）などがあるが、これらの中ではヘマトポルフィリンの加工品であるフォトフリンのみが我が国では治療薬として認可されている。また、これらは、癌細胞に対する親和性を利用して診断剤として使用する試みもなされている。
しかし、癌の光力学療法に用いられている従来の光増感剤、とくにフォトフリンは光の吸収極大が６２５ｎｍと比較的短波長側にあるため、組織浸透性の良い７００ｎｍに近いもしくはそれよりも長い長波長の光による細胞殺傷効果が弱いという問題があった。また、第２世代の光増感剤と期待されているクロリンｅ６誘導体（特許文献１参照）は吸収波長の問題をクリアしているが、ガン細胞への取り込みが必ずしも良いとは言えない（非特許文献７参照）。また、フタロシアニンやローダミンのような合成色素（特許文献２参照）の場合は非選択的毒性と副作用も強いという問題があり、この点からは天然ポルフィリンが優れていると考えられ、またガン細胞への取り込み効率からも、天然のポルフィリン誘導体に新たな期待が高まっている。
【０００４】
【非特許文献１】
奥仲、加藤、日本外科学会雑誌、第１０３巻、第２号、２５８−２６２頁（２００２年）
【非特許文献２】
古川、加藤、  日本臨床、第６０巻、増刊５、４１４−４１８頁、（２００２年）
【非特許文献３】
Ｐａｓｓ，  ＨＩ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ８５（６），  ４４３  −４５６  （１９９３））
【非特許文献４】
Ｍａｔｒｏｕｌｅ  Ｊ．Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ２０，  ４０７０  −４０８４  （２００１）
【非特許文献５】
Ｈａｊｒｉ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ７５（２），  １４０  −１４８（２００２）
【非特許文献６】
Ｌａｍ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７６  （５０），  ４７３７９  −４７３８６  （２００１）
【非特許文献７】
Ｓｐｉｋｅｓ  Ｊ．Ｄ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂ：  ６，  ２５９  −２７４  （１９９０）
【特許文献１】
特開昭２００１−２３３８７７号公報
【特許文献１】
再表９８／１４４５３号公報
【特許文献２】
特表平１０−５０５３４９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、腫瘍細胞への取り込み効率が高く、安全な天然のポルフィリン化合物であって、吸収極大が７００  ｎｍの長波長側へシフトし、かつ、光照射により、従来のものよりさらに強力な腫瘍細胞傷害性を発揮する化合物を見いだし、これにより、新規かつ有用な生体用光増感剤ないしは腫瘍細胞傷害剤を開発することを課題とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、鋭意研究の結果、本発明者等は、クロロフィルの代謝産物として各種のポルフィリン誘導体を含有する植物において、光増感作用を有し、光の照射により腫瘍細胞を殺傷する成分を検索した結果、植物抽出物中に含まれる、以下の式Ｉ及びＩＩの構造式で表されるポルフィリン誘導体が上記課題の解決に有用であることを見いだし、本発明を完成するに至ったものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１２）からなるものである。
（１）  下記構造式Ｉ又は式ＩＩで表される化合物を含有することを特徴とする生体用光増感剤。
【化１】
2004217541.tif 000002
2004217541.tif 000003
【化２】
2004217541.tif 000004
2004217541.tif 000005
（２）  上記構造式Ｉ及び／又は式ＩＩで表される化合物を含む植物の抽出物からなる生体用光増感剤。
（３）  植物がイネ科植物である（２）に記載の生体用光増感剤。
（４）  イネ科植物が、Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属に属する植物である（３）の生体用光増感剤。
（５）  上記構造式Ｉ又はＩＩで表される化合物を含有することを特徴とする腫瘍細胞殺傷剤。
（６）    上記構造式Ｉ及び／又は式ＩＩで表される化合物を含む植物の抽出物からなる腫瘍細胞殺傷剤。
（７）    植物がイネ科植物である（６）に記載の腫瘍細胞殺傷剤。
（８）  イネ科植物がＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属に属する植物である（７）に記載の腫瘍細胞殺傷剤。
（９）  上記構造式Ｉで表される化合物。
（１０）上記構造式Ｉ又はＩＩで表される化合物を含有する植物から溶媒を用いて抽出することを特徴とする上記構造式Ｉ又はＩＩで表される化合物の製造方法。
（１１）植物がイネ科植物である（１０）に記載の製造方法。
（１２）イネ科植物が、Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属に属する植物である（１１）に記載の方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において使用する上記構造式Ｉ及びＩＩの化合物（以下、前者を化合物１といい、後者を化合物２という。）は、植物から抽出される。抽出原料となる植物としては、例えば、モウソウチク、マダケ等Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属の植物の他、クマザサ等Ｓａｓａ属、イネ等Ｏｒｙｚａ属、トウモロコシ等Ｚｅａ属等のイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ科）の植物が挙げられるが、  特に、モウソウチク、マダケ等Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ属に属する植物が好適である。しかし、本発明の化合物１及び／又は化合物２を含んでいれば他科の植物であっても、もちろん良い。これら植物の植物体のうち、化合物１及び／又は化合物２  を多く含む部位はクロロフィル多く含む部位であり、主として葉、茎等である。これら植物体は本化合物含量が最高の時期に収穫する。すなわち、本化合物が多く含まれる部位、時期等は植物によって異なるが、一般的には、本発明の化合物１及び／又は化合物２の母体であるクロロフィルの代謝が盛んな部位、時期が望ましく、緑葉を収穫することになる。
本発明においては、このように収穫した植物体を水または有機溶媒で抽出する。有機溶媒としてはメタノール、エタノール、酢酸エチル、クロロホルム等が用いられる。このような粗抽出物は有毒成分を含まない限りそのまま適宜濃縮、希釈して用いることができるが、活性物質である化合物１または化合物２を精製して用いる方が良い場合には、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー等、公知の手段で精製することができる。
【０００９】
上記方法により精製した化合物１及び２は、水、エタノール等の溶媒に溶解するか、もしくは適当なリン脂質等の界面活性剤を含む水に懸濁して、生体に適用する光増感剤として用いる。
すなわち、本発明の化合物１及び２は、そのＵＶスペクトルにおいて、Ｑバンドの吸収極大がともに６６８ｎｍにあり、従来、光力学療法用の光増感剤として使用されていたフォトフリン（６２５ｎｍ）よりもはるかに長波長域側であり、また、従来、最も長波長域側に吸収極大があるとされるクロリンｅ６（６５４ｎｍ）よりもさらに長波長域側に吸収極大がある。したがって、本発明の化合物１及び２は、これら従来の光力学療法に使用する光増感剤に比べ、より、組織浸透性の高い波長域の光に対しても光増感性を示し、これらの長波長域の光照射により、より深い部位にある癌組織あるいは癌細胞を有効に殺傷できる。特に、本発明の化合物のうち、化合物１は文献未記載の新規化合物であり、光力学療法用光増感剤として極めて顕著な腫瘍細胞殺傷性を有する。
【００１０】
次に、本発明の化合物の使用形態について説明するが、基本的には従来の光力学療法における光増感剤の使用形態と同様である。
本発明の化合物１及び２は、上記溶媒に溶解して静注により生体内に投与され、これら化合物の腫瘍細胞に対する選択的親和性により、これら化合物は腫瘍組織、細胞に集積する。
次いで、腫瘍組織あるいは細胞に対し光照射を行うが、光照射は、腫瘍組織、細胞に対して、光を直接あるいは導波管（光ファイバー）を介して照射する。
使用する光源としては、例えば、白色蛍光灯、半導体レーザ（６７０ｎｍ）、ＹＡＧ−ＯＰＯレーザ（６２０−６７０ｎｍの可変波長）、Ｎｄ／ＹＡＧレーザ、ハロゲンランプ、ダイオードアレイ（ｄｉｏｄｅ  ａｒｒａｙ）及びキセノンアークラプ（Ｘｅｎｏｎ  ａｒｃ  ｌａｍｐ）等が挙げられる。
腫瘍に集積した本発明の化合物１、２は、この光照射により励起されて光化学反応を惹起し、これにより、腫瘍組織内において活性酸素が産生される。活性酸素は、腫瘍細胞に対しネクローシスを生じさせ、また、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を介してカスパーゼ３を活性化させアポトーシスを誘導して、腫瘍を壊死させる。本発明の化合物１及び２を用いた癌細胞の殺傷試験においては、光照射により、癌細胞におけるカスパーゼ活性が増大し、アポトーシスを起こすことが確認されている。
【００１１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【実施例１】竹の葉抽出物の調製
１０月に採取したモウソウチクの葉を２０日間陰干しし、５００ｇの乾燥葉を得た。これを約１０リットルのメタノールに浸漬、ホモジェナイザーで処理し１０日間暗所に放置した。葉を濾過で除いた抽出液をロータリーエバポレーターで濃縮し、１０５ｇの油状残渣を得た。この１０４ｇを１０分の１づつ２００ｍｌの酢酸エチルと混合し３０分攪拌した。静置し、上清をデカンテーションで得た。全部の上清を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、油状残渣２８ｇを得た。
【００１２】
【実施例２】化合物１のクロマトグラフィーによる精製
実施例１で得た酢酸エチル抽出物（油状残渣）のうち５  ｇを取り少量のヘキサンと酢酸エチルの混合液に溶かし、ヘキサンで充填したシリカゲルカラム（１２０  ｃｍ３）の頂部に流し込み吸着させた。ヘキサンと酢酸エチルを５：１、３：１、２：１、１：１で混合した溶液６００  ｍｌづつを流し、溶出液を６０  ｍｌづつ分画した。ヘキサン：酢酸エチル＝３：１の混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この操作を４本のカラムについて繰返し、合計６ｇの濃縮残渣を得た。
上記の濃縮残渣６ｇのうち２ｇをベンゼンで充填したシリカゲルカラム（６０ｃｍ３）の頂部に吸着させ、ベンゼンと酢酸エチルを２０：１、１０：１、８：１、６：１、３：１、１：１で混合した溶液２４０  ｍｌづつを流し、溶出液を３０  ｍｌづつ分画した。１０：１から６：１のベンゼン／酢酸エチル混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この操作を３本のカラムについて繰返し、合計０．８ｇの濃縮残渣を得た。
【００１３】
濃縮残渣０．８ｇのうち０．２ｇをベンゼンで充填したシリカゲルカラム（３０  ｃｍ３）の頂部に吸着させ、ベンゼンと酢酸エチルを１００：１、５０：１、３０：１、２０：１、１０：１、８：１、５：１、１：１で混合した溶液１２０  ｍｌづつを流し、溶出液を２０  ｍｌづつ分画した。３０：１から１０：１のベンゼン／酢酸エチル混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この操作を４回繰返して合計２００ｍｇの濃縮残渣を得た。
濃縮残渣２００ｍｇのうち４０ｍｇを少量のアセトニトリルに溶かし、水とアセトニトリル（２：１）の混液で充填したワコーゲルＬＰ−６０Ｃ１８のカラム（１５  ｃｍ３）の頂部に流し込み、次いで水とアセトニトリルを２：１、１：１、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：２０、１：４０、１：８０、及び０：１００の割合で混合した溶液を３０  ｍｌづつ流し、溶出液を８  ｍｌづつ分画した。１：３から１：５の水／アセトニトリル混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この操作を５回繰返して２０ｍｇの残渣を得た。
【００１４】
この濃縮残渣の半分をヘキサンで充填したシリカゲルカラム（１２  ｃｍ３）の頂部に吸着させ、ヘキサンと酢酸エチルを４：１、３．５：１、３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、及び１：１の割合で混合した溶液２０  ｍｌづつを流し、溶出液を４  ｍｌづつ分画した。２．５：１から１．５：１の混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。残り半分の残渣についても同様に処理し、合わせた濃縮残渣を真空ポンプで乾燥し、４．０ｍｇの化合物１を灰緑色のガム状物として得た。このようにして得られた化合物１はＴＬＣ（シリカゲル６０  Ｆ２５４、０．２５  ｍｍ、ヘキサン／酢酸エチル＝１：１で展開）においてＲｆ  ０．３０の単一スポットを示したことから単一化合物と判断された。
本化合物はＦＡＢ−ＭＳにおいてｍ／ｚ  ６５３とｍ／ｚ  ６７５に顕著なピークを示し、それぞれ［Ｍ＋１］＋、［Ｍ＋Ｎａ］＋ピークと判断された。またＥＳＩ−ＭＳにおいてもｍ／ｚ  ６５３．４に［Ｍ＋１］＋と判断されるピークを示した。ＵＶスペクトルは酢酸エチル中で、３９８、４９６、５２７、６１１、及び６６８ｎｍに吸収極大を示した。モル吸光係数はこの順に１．２５  ｘ  １０５、１．１１  ｘ  １０４、７．９１  ｘ  １０３、５．５４  ｘ  １０３、４．５１  ｘ  １０４であった。このＵＶスペクトルのデータから、本化合物はクロロフィルの関連物と推定されたので、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定し、既知のクロロフィル関連化合物の文献データと比較した。この比較を表１及び表２に示す。
【００１５】
【表１】
表１  １Ｈ−ＮＭＲ（４００／５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）のデータの比較（数字はケミカルシフト、ｐｐｍ）
2004217541.tif 000006
【００１６】
【表２】
表２  １３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）のデータの比較
（数字はケミカルシフト、ｐｐｍ）
2004217541.tif 000007
文献値はＴａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９５，  １０１５−１０１６）による。
＊検出されず。
【００１７】
上表からわかるように、本化合物のＮＭＲスペクトルはＭａら（Ｍａ  Ｌ．  ａｎｄ  Ｄｏｌｐｈｉｎ  Ｄ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ６１，  ２５０１−２５１０  （１９９６））及びＴａｋａｓｈｉｍａら（Ｔａｋａｓｈｉｍａ  Ｈ．，  Ｊｉｎ  Ｓ．，  Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｍ．，  Ａｂｅ  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｍｕｒａｉ  Ａ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １０１５  −１０１６，  １９９５）に記載のある１８−ｃａｒｂｏｘｙ−２０−（１，１−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｏｘｏｅｔｈｙｌ）−８−ｅｔｈｅｎｙｌ−１３−ｅｔｈｙｌ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３，７，１２，１７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２２Ｈ，２４Ｈ−ｐｏｒｐｈｉｎｅ−２−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  δ−ｌａｃｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒのスペクトルによく一致し、ただｄｉｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒでなくｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒである点が異なると結論された。これにより、本化合物の分子式はＣ３７Ｈ４０Ｎ４Ｏ７となるが、この式量（６５２．７３６）は前述のマススペクトルのデータによく一致する。さらに１Ｈ−ＮＭＲを詳細に解析したところ、２位のプロトンのシグナルが４．０９５  ｐｐｍと４．９９  ｐｐｍに分かれて出現していることを認めた（積分曲線比６．１５：１．０１）。このことはＭａらによって既に指摘されているが、２０１位のヒドロキシル基がセミケタール構造のためにエピメリ化し、２０１−（Ｓ）体（主成分）と２０１−（Ｒ）体（副成分）のジアステレオマー混合物となるためである。従って、本発明の化合物１は上記δ−ｌａｃｔｏｎｅ  ｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒの２０１−（Ｓ）体と２０１−（Ｒ）体が６：１で混ざった混合物と結論される。本化合物１は文献未載の新規化合物である上、上記のＭａらやＴａｋａｓｈｉｍａらのｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒとｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒを含めて、光増感作用による細胞殺傷効果が初めて明らかにされた２０１−ｈｙｄｒｏｘｙｐｕｒｐｕｒｉｎ−７  δ−ｌａｃｔｏｎｅ型ポルフィリン誘導体である。
【００１８】
【実施例３】化合物２のクロマトグラフィーによる精製
実施例１で得られた酢酸エチル抽出物（油状残渣）のうち２ｇを取り少量のヘキサンと酢酸エチルの混合液に溶かし、ヘキサンで充填したシリカゲルカラム（６５  ｃｍ３）の頂部に流し込み吸着させた。ヘキサンと酢酸エチルを８０：１、６０：１、４０：１、２０：１、１０：１、８：１、６：１、４：１、２：１、１：１、１：２、
１：５、１：６、１：５０、及び０：１で混合した溶液１５０  ｍｌづつを流し、溶出液を２０  ｍｌづつ分画した。ヘキサン：酢酸エチル４：１から１：５０の混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この操作を４本のカラムについて行ない、合計３ｇの濃縮残渣を得た。
上記の濃縮残渣３ｇのうち０．５ｇを再度ヘキサンで充填したシリカゲルカラム（３０  ｃｍ３）の頂部に吸着させ、ヘキサンと酢酸エチルを３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、１：１、１：１．５で混合した溶液１２０  ｍｌづつを流し、溶出液を１５  ｍｌづつ分画した。２．５：１から１．５：１のヘキサン／酢酸エチル混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。以上の操作を６回繰返して合計５００ｍｇの濃縮残渣を得た。
【００１９】
この濃縮残渣を分取用ＴＬＣ（シリカゲル、厚さ１ｍｍ、２０  ｘ  ２０  ｃｍ）にアプライし、ヘキサン／酢酸エチル３：１の混液で２回、３：２の混液で３回、１：１の混液で１回、合計６回多重展開した。最終的にＲｆ  ０．６の緑色ゾーンのシリカゲルを掻き取り、酢酸エチルで抽出した。
この抽出物を濃縮して得た８ｍｇの油状残渣をヘキサンで充填したシリカゲルカラム（１０  ｃｍ３）の頂部に流し込み吸着させた。ヘキサンと酢酸エチルを３：１、３：１．５、３：２、及び０：１で混合した溶液３０  ｍｌづつを流し、溶出液を５  ｍｌづつ分画した。ヘキサン：酢酸エチル３：１．５の混合液で溶出したフラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮、真空ポンプで乾燥し、２．０ｍｇの化合物２を灰緑色ガムとして得た。本化合物はＴＬＣ（シリカゲル６０  Ｆ２５４、０．２５  ｍｍ、ヘキサン／酢酸エチル＝３：２で展開）においてＲｆ  ０．５３の単一スポットを示したことから単一化合物と判断された。
【００２０】
本化合物はＦＡＢ−ＭＳにおいてｍ／ｚ  ９０３とｍ／ｚ  ９２５に顕著なピークを示し、それぞれ［Ｍ＋１］＋、［Ｍ＋Ｎａ］＋ピークと判断された。ＵＶスペクトルは酢酸エチル中で前述の化合物１とほぼ同様に、３９８、４９６、５２７、６１１、及び６６８ｎｍに吸収極大を示した。モル吸光係数はこの順に１．１９  ｘ  １０５、１．２１  ｘ  １０４、７．２７  ｘ  １０３、５．０５  ｘ  １０３、４．２９  ｘ  １０４であった。このＵＶスペクトルのデータから、本化合物もクロロフィルの関連物と推定されたので、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定し、既知のクロロフィル関連化合物の文献データ及び前述の化合物１のスペクトルと比較した。この比較を前記表１、及び下記表３に示す。
【００２１】
【表３】
表３  １３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎ−ｄ６）のデータの比較
（数字はケミカルシフト、ｐｐｍ）
2004217541.tif 000008
１８２−（Ｒ）−Ｃｈｌ  ａのデータはＨｙｖａｅｒｉｎｅｎら（Ｍａｇ．Ｒｅｓ．Ｃｈｅｍ．，
３３，６４６−６５６（１９９５））による。ただし、表のｎｕｍｂｅｒｉｎｇは
Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔの体系による。
＊検出されず。
【００２２】
これによれば、化合物２は化合物１のエチルエステルがフィチルエステルに置換された構造であることが判明した。これにより、本化合物の分子式はＣ５５Ｈ７４Ｎ４Ｏ７となるが、その式量（９０２．５５５７）は前述のマススペクトルのデータによく一致する。さらに１Ｈ−ＮＭＲを詳細に解析したところ、２位のプロトンのシグナルが４．０６ｐｐｍと４．９６  ｐｐｍに分かれて出現していることを認めた（積分曲線比８．７：１．４）。従って、本発明の化合物２は１８−ｃａｒｂｏｘｙ−２０−（１，１−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｏｘｏｅｔｈｙｌ）−８−ｅｔｈｅｎｙｌ−１３−ｅｔｈｙｌ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３，７，１２，１７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２２Ｈ，２４Ｈ−ｐｏｒｐｈｉｎｅ−２−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄδ−ｌａｃｔｏｎｅ  ｐｈｙｔｙｌ  ｅｓｔｅｒの２０１−（Ｓ）体と２０１−（Ｒ）体が６：１で混合しているジアステレオマー混合物と結論される。なお、Ｇａｎｄｕｌ−Ｒｏｊａｓら（Ｇａｎｄｕｌ−Ｒｏｊａｓ  Ｂ．，  Ｇａｌｌａｒｄｏ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  Ｌ．，  Ｍｉｎｇｕｅｚ−Ｍｏｓｑｕｅｒａ  Ｍ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，  ６２（１０），  １１７２  −１１７７  （１９９９））はオリーブから同じ構造の化合物が得られたと記載しているが、ＵＶとＭＳスペクトルにのみ基づいて判断している。１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲを測定し、構造を厳密に確認した上での報告としては本明細書が初めてである。
【００２３】
【実施例４】
ヒト白血病細胞株Ｕ−９３７を１０％の子牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に１ｘ１０６個／ｍｌの割合で懸濁し、１２−ｗｅｌｌの細胞培養プレート２枚のウェルに０．８ｍｌづつ入れた。サンプルは２０％アセトンを含むエタノールに溶解し、適宜希釈した上で、８μｌづつ上記０．８ｍｌの細胞培養液に添加した。この際、２枚のプレートの両方に同じように添加した。１枚のプレートはサンプル添加後アルミフォイルでくるみ、炭酸ガスインキュベーターに入れた。もう１枚のプレートは５時間インキュベート後、蛍光灯（ＮＥＣ製昼白色、２０型１８Ｗ、ＦＬ２０ＳＳＮ／１８）の１０ｃｍ直下（約２０００ｌｕｘ、０．２４  ｍＷ／ｃｍ２）に１０分置いた後、インキュベータに戻し培養を継続した。６時間後に位相差顕微鏡で細胞を観察し、ネクロシスが見られる場合はトリパンブルー染色で確認した。
【００２４】
結果を図１と図２に示す。図１においてＡはコントロール、ＢとＣには化合物１を１μＭ濃度で添加し、ＤとＥには標準の光増感剤であるＰＰＢＭｅ（ピロフェオフォーバイドメチルエステル，  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．社（ユタ州、Ｕ．Ｓ．Ａ．）製）を１μＭ濃度で添加した。サンプル添加後、ＢとＤは上述のように光を照射し、ＣとＥは光を断って培養した。図１ではＢが位相差顕微鏡下にネクロシスの像を示したので、Ａ〜Ｅの各ウェルをトリパンブルーで染色した。Ｂ（化合物１添加、光照射）のみ、全細胞が青に染まり、ネクロシスを起こしていることがわかる。一方、ＰＰＢＭｅでは光照射しても、ほとんどネクロシスはおきていない（図１のＤ）。図２は位相差顕微鏡写真であり、本図においてＡはコントロール、ＢとＣには化合物１を０．３μＭ濃度で添加し、ＤとＥにはＰＰＢＭｅを０．３μＭ濃度で添加した。サンプル添加後、ＢとＤは上述のように光を照射し、ＣとＥは光を断って培養した。図２Ｂ（０．３μＭの化合物１添加、光照射）では、大部分の細胞が断片化し、アポトーシスが起きていることがわかる。一方、図２Ｄ（０．３μＭ  ＰＰＢＭｅ、光照射）では断片化した細胞はわずかである。いずれも、光照射なし（図１ＣとＥ、図２ＣとＥ）ではアポトーシスは起きず、ネクロシスもほとんど起きていない。このように、本発明の化合物１は１μＭ程度の濃度では光照射によりネクロシスを、また０．３μＭ程度の濃度では光照射によりアポトーシスを誘起し、いずれにおいても標準のＰＰＢＭｅより強い活性を示している。
【００２５】
【実施例５】
Ｕ−９３７細胞を１ｘ１０６個／ｍｌの割合で上記培地に懸濁し、１２−ｗｅｌｌの細胞培養プレートの各ウェルに０．８  ｍｌづつ入れた。次いで、本発明の化合物１、化合物２、もしくは標準の光増感剤であるＰＰＢＭｅを１，  ０．１，０．０３または０．０１  ｍＭの濃度で溶かした２０％アセトン／エタノール溶液の８μｌづつを入れ、プレートをゆすってよく混合した。コントロールとしてはサンプルを含まない上記溶媒を８μｌ添加した。各サンプルについてプレートを２枚づつ準備し、１枚は光照射なしでインキュベートし、他の１枚は実施例１の場合と同様に５時間前培養後１０分間蛍光灯直下に置き、光照射後インキュベータに戻し、培養を継続した。７時間後、細胞を遠心分離で集め、氷冷したＰＢＳ（リン酸緩衝化塩溶液）で洗浄した。次いで、公知の方法（Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，  ２５９，  ６４  −７８  （２０００））でアポトーシスの指標となるカスパーゼ−３の活性を測定した。結果を図３に示すが、化合物１は光を当てた場合にのみカスパーゼを活性化しアポトーシスを誘導すること、そしてその活性は同濃度のＰＰＢＭｅと比べて顕著に強く、特に低濃度（０．１μＭ）では４０倍以上強いことがわかる（光照射なしのバックグラウンドを差し引いて比較）。また、化合物２も、化合物１に比べると弱いが、やはり光を当てられるとカスパーゼを活性化することがわかる。（図３のデータは３回の平均値と標準偏差で示されている。）
【００２６】
【実施例６】
ヒト大腸がん細胞株Ｃｏｌｏ３２０ＤＭを１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、３  ｘ１０５個／ｍｌの割合で同培地に懸濁した。これを０．１ｍｌづつ９６−ｗｅｌｌプレートの各ウェルに入れ、３日間培養しウェルの底に張りつかせた。次に、実施例４と同様にして、化合物１を１μＭ（Ｂ、Ｆ）、同０．１μＭ（Ｃ、Ｇ）、ＰＰＢＭｅ１μＭ（Ｄ、Ｈ）、溶媒のみ（Ａ、Ｅ）を添加した。この際、２枚のプレートを用意し、一方のプレートに対してサンプル（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を添加し、他方のプレートにサンプル（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）を添加した。この後、それぞれ６時間前培養後、一方のプレート（サンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）に対し１５分間光照射処理し（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）、他方のプレート（サンプルＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）に対しては光照射せずに、さらに２４時間培養した。次いで、培地をピペットで吸引除去し、４％のホルマリン液（１０％液をＰＢＳで希釈）０．１ｍｌづつを入れ、氷上に１５分放置した。ホルマリン液を除き、氷冷ＰＢＳで１回洗浄後、０．５％のＴｗｅｅｎ２０と０．２％の牛血清アルブミンを含むＰＢＳ０．１ｍｌづつを入れ、室温に１０分放置した。処理液を捨て、ＳＳＣ（Ｘ２）液で洗浄後、ＰＢＳで３回洗浄した。Ｐｒｏｍｅｇａ社のｉｎ  ｓｉｔｕアポトーシス検出キットを用い、ＤＮＡの断片化をＴＵＮＥＬ法で検出した。すなわち、ＤＮＡ断端にＴｄＴ酵素でビオチン結合ヌクレオチドを導入し、そのビオチンにホース・ラディッシュ・ペロキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合したアビジンを結合させ、最後に過酸化水素と色素前駆体をＨＲＰに作用させ発色反応を行い、アポトーシスでＤＮＡが断片化した核を褐色に染色した。結果を図４に示すが、１μＭの化合物１を作用させ、光処理した細胞（Ｂ）はほぼすべてアポトーシスしていることがわかる。同条件下で１μＭのＰＰＢＭｅはＤＮＡの断片化を完全には進行させていない（Ｄ）。さらに、化合物１は０．１μＭの濃度でも光照射でアポトーシスを誘導していた（Ｃ）。以上すべての場合について、光照射がなければ褐色の細胞はほとんど検出されなかった（Ｆ、Ｇ、Ｈ）。このように、化合物１はＣｏｌｏ３２０ＤＭ細胞のアポトーシスを光照射下でＰＰＢＭｅより強く誘導する。
【００２７】
【実施例７】
Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ細胞の懸濁液（３  ｘ  １０５個／ｍｌ）を０．８  ｍｌづつ１２−ｗｅｌｌプレートのウェルに入れ、３日間培養した。次いで、化合物２を１０及び０．１μＭの濃度で、ＰＰＢＭｅを０．１μＭの濃度で、実施例５と同様に上記各ウエルの細胞懸濁液に添加し、前培養、光照射処理し、さらに１８時間培養後、ウェルごとに細胞をスクレーパーで剥がして集めた。氷冷ＰＢＳで洗浄後、前述のようにカスパーゼ−３の活性を測定した。結果を図５に示すが、１０μＭの化合物２は０．１μＭのＰＰＢＭｅより強くカスパーゼを活性化する。（データは２回の平均値と標準偏差で示されている。）
【００２８】
【実施例８】
ヒト大腸がん細胞株ＨＴ−２９を１０％のＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ’５Ａ培地で培養し、実施例７と同様にして、１２−ｗｅｌｌプレートに植え込み、化合物１を１μＭおよび０．１μＭの濃度でそれぞれ添加、前培養、光照射を行った。  この際、化合物１を添加しないものをコントロールとして、同様に前培養、光照射した。２４時間後細胞をスクレーパーで集め、ＰＢＳで洗浄後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００含有０．１Ｍリン酸緩衝液で細胞を破壊しＤＮＡを抽出した。抽出液をＲＮａｓｅとプロティナーゼＫで処理し、寒天ゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを検出した。結果を図６に示す。
図６中、レーン１は分子量マーカー、レーン２はコントロール、レーン３は化合物１を１μＭ濃度で添加したもの、レーン４は化合物１を０．１μＭ濃度で添加したものをそれぞれ示す。
これによれば、化合物１を加え光照射した細胞では小サイズのＤＮＡ断片が増加し、アポトーシスが進行していることが確認された。
【００２９】
【実施例９】
ヒト肉腫細胞株ＨＴ−１０８０を１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養し、２  ｘ  １０５個／ｍｌの懸濁液とし、０．１ｍｌづつ９６−ｗｅｌｌプレートに撒き込んだ。実施例４と同様に化合物１を１μＭ濃度で添加、前培養、光照射を行い、１６時間培養後、４％ホルマリンで固定し、Ｓｙｔｏｘ（１０μＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）で細胞核を染色し、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図７に示す。なお、図中Ａは、コントロール（化合物１無添加）。Ｂは化合物１（１μＭ）を添加し、光照射した場合、Ｃは化合物１（１μＭ）を添加し、遮光して培養した場合をそれぞれ示す。Ｂに示されるように、化合物１を添加して光照射した場合にのみ核が凝集、断片化しており、アポトーシスが誘導されたことが確認された。
【００３０】
【実施例１０】
ＨＴ−１０８０細胞を１  ｘ  １０６個づつ１ｍｌの培地と共に１２−ｗｅｌｌプレートに植え込み、実施例１で得た竹の葉のメタノール抽出物（粗抽出物）を１、０．１及び０．０１μｇ／ｍｌの濃度で添加し、光照射処理、１８時間培養後、実施例７と同様に細胞を集め、カスパーゼ−３の活性を測定した。図８に示すように、粗抽出物も光照射でＨＴ−１０８０細胞のカスパーゼを活性化した。（データは３回の平均値と標準偏差で示されている。）
【００３１】
【発明の効果】
本発明のポルフィリン誘導体のＵＶスペクトルは、Ｑバンドの吸収極大が６６８ｎｍにあり、従来用いられてきたポルフィリン系光増感剤のフォトフリン（６２５  ｎｍ）やクロリンｅ６  （６５４  ｎｍ）などより長波長側にシフトしている。また、実際の腫瘍細胞傷害性試験においても、ヒト白血病細胞や大腸ガン細胞について同一の条件で薬剤処理、光照射を行なった場合、本発明の化合物１は従来用いられてきたピロフェオホーバイドより強力な細胞傷害性を示した。すなわち、本発明は、従来の光力学療法用光増感性ポルフィリン誘導体よりも強力なガン細胞傷害性を示す新しい天然由来ポルフィリン誘導体を提供するものである。
【００３２】
【図面の簡単な説明】
【図１】化合物１（Ｂ，  Ｃ）又はＰＰＢＭｅ  （Ｄ，  Ｅ）を１μＭの濃度で添加したＵ−９３７細胞をＦＬ２０ＳＳＮ／１８蛍光灯で１０分間光照射し（Ｂ、Ｄ）または照射せずに（Ｃ，  Ｅ）６時間インキュベート後、トリパンブルーで染色した顕微鏡写真である。
【図２】化合物１（Ｂ，  Ｃ）又はＰＰＢＭｅ  （Ｄ，  Ｅ）を０．３μＭの濃度で添加したＵ−９３７細胞を図１と同様に光照射し（Ｂ、Ｄ）または照射せずに（Ｃ，  Ｅ）インキュベート後、位相差顕微鏡で観察した写真である。
【図３】化合物１と化合物２及びＰＰＢＭｅを１０，  １，  ０．３  又は０．１μＭ濃度でＵ−９３７細胞に添加し、光照射せずに（黒いバー）またはＦＬ２０ＳＳＮ／１８蛍光灯で光照射し（斜線のバー）、７時間インキュベート後のカスパーゼ−３の活性を示すグラフである。
【図４】化合物１［１μＭ（Ｂ、Ｆ）及び０．１μＭ（Ｃ、Ｇ）］、ＰＰＢＭｅ  ［１μＭ（Ｄ、Ｈ）］、またはこれらを含まない溶媒のみ（Ａ、Ｅ）をＣｏｌｏ３２０ＤＭ細胞に添加し、蛍光灯で光照射し（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）または照射せずに（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）インキュベート後、ＤＮＡの断端をＴＵＮＥＬ法でラベルし、ＨＲＰ反応（褐色に呈色）で検出した顕微鏡写真である。
【図５】化合物２を１０及び１μＭ、ＰＰＢＭｅを０．１μＭの濃度でＣｏｌｏ３２０ＤＭ細胞に添加し、６時間前培養後蛍光灯で光照射し、さらに１８時間インキュベート後のカスパーゼ−３の活性を示すグラフである。
【図６】化合物１添加下に光照射されたＨＴ−２９細胞のＤＮＡの電気泳動写真である。
【図７】ＨＴ−１０８０細胞に化合物１を添加し、光照射することによりアポトーシスの特徴である細胞核の凝縮と断片化が起きることを示す蛍光顕微鏡写真である。
【図８】竹の葉粗抽出物と光照射によるＨＴ−１０８０細胞のカスパーゼ−３活性化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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