(57)【要約】【課題】ピリドキシン及びその類縁化合物に作用してα−グルコシド化合物を生成する糖転移酵素を提供する。【解決手段】下記の一般式（Ｉ）：【化１】2004357591.tif 000007（式中、Ｒは水素原子、低級アルキル基、低級ヒドロキシアルキル基、カルボキシル基、又はアルデヒド基を示す）で表される化合物に作用して、下記の一般式（ＩＩ）：【化２】2004357591.tif 000008（式中、Ｒは上記と同義である）で表される化合物を生成することができる糖転移酵素であって、例えばベルティシリウム属に属する微生物に由来し、至適ｐＨ：６〜７、至適温度：約６０℃、及び分子量：約１３７，０００を有する糖転移酵素。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
2004357591.tif 000005
（式中、Ｒは水素原子、低級アルキル基、低級ヒドロキシアルキル基、カルボキシル基、又はアルデヒド基を示す）で表される化合物に作用して、下記の一般式（ＩＩ）：
【化２】
2004357591.tif 000006
（式中、Ｒは上記と同義である）で表される化合物を生成することができる糖転移酵素であって、以下の理化学的性質：
至適ｐＨ：６〜７
至適温度：約６０℃
分子量：約１３７，０００
を有する糖転移酵素。
【請求項２】
一般式（Ｉ）で表される化合物の５’位の水酸基を位置選択的に配糖化してα−グルコシド化する作用を有する請求項１に記載の糖転移酵素。
【請求項３】
Ｒがヒドロキシメチル基である請求項１又は２に記載の糖転移酵素。
【請求項４】
下記のいずれかの群：レイフソニア属、パエニバチルス属、シュードノカルディア属、クリプトコッカス属、コリオルス属、ユーロチウム属、フラムリナ属、ガノデルマ属、グリオクラディウム属、ヘリコスティルム属、モルティエレラ属、ピソマイセス属、シゾフィルム属、トラメテス属、又はベルティシリウム属に属する微生物に由来する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の糖転移酵素。
【請求項５】
ベルティシリウム属に属する微生物に由来する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の糖転移酵素。
【請求項６】
請求項１ないし３に記載の糖転移酵素の製造方法であって、請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表される化合物に作用して請求項１に記載の一般式（ＩＩ）で表される化合物を生成することができる糖転移酵素を産生する微生物を培養し、得られた培養物から該糖転移酵素を分離・採取する工程を含む方法。
【請求項７】
該微生物が下記のいずれかの群：レイフソニア属、パエニバチルス属、シュードノカルディア属、クリプトコッカス属、コリオルス属、ユーロチウム属、フラムリナ属、ガノデルマ属、グリオクラディウム属、ヘリコスティルム属、モルティエレラ属、ピソマイセス属、シゾフィルム属、トラメテス属、又はベルティシリウム属に属する微生物である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の一般式（ＩＩ）で表される化合物の製造方法であって、請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表される化合物に請求項１ないし５に記載の糖転移酵素を作用させる工程を含む方法。
【請求項９】
ホウ酸及び／又はホウ酸塩の存在下で糖転移酵素を作用させる請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピリドキシン及びその類縁化合物に作用してα−グルコシド化合物を生成する糖転移酵素に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ピリドキシン（ＰＮ）は、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）とともにビタミンＢ６作用を持つ物質の一つである。細胞に取り込まれたＰＮはリン酸化されてピリドキシン−５’−リン酸（ＰＮＰ）となり、さらに酸化されてピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）に変換され、アミノ酸代謝にあずかる酵素の補酵素として重要な役割を果たしている。
【０００３】
ピリドキシンの塩酸塩（ＰＮ・ＨＣｌ）は、水によく溶けるが、光に対して不安定であり、また、酸味や苦味があるという問題を有している。一方、その配糖体であるピリドキシン−α−グルコシドは、光安定性に優れており［Ｊ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．，  １７，  １２１−１２４（１９７１）］、酸味や苦味がないかあるいは緩和されている。また、経口投与された場合、腸管でそのままの形で吸収され、速やかにピリドキサールリン酸に変換されることが動物実験で確認されており、医薬としての有用性が高い［Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．，  ４２，  ３７７−３８６  （１９９６）］。加えて、ピリドキシン  α−グルコシドは、さまざまな製剤形において安定性が高く（特開２００２−２５５３６８号公報）、またそれを含む外用剤が、肌荒れ改善やヒゲソリ負け防止に有効（特開２００２−２６５３１６号公報）とされている。
【０００４】
ピリドキシン−α−グルコシドには５’位と４’位の配糖体が存在するが、ピリドキシン−５’−α−グルコシドはホモジェネートされた肝細胞によって速やかにＰＮに加水分解されることから、医薬品や健康食品として有用性が高く、大量生産が望まれるところである。これまで報告されている微生物菌体又はそれより生成した酵素を用いたピリドキシン−５’−α−グルコシドの製造法としては、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属菌体を用いる方法  ［特公昭４６−３３１９８号公報（１９７１）、Ｊ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇｙ  １５，  １４２−１５０  （１９６９）、Ｊ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇｙ  １５，  １６０−１６６  （１９６９）、特公昭４９−１８２３０号公報（１９７４）、及びＪ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇｙ  １５，  １６７−１７３  （１９６９）］、Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ  ＩＦＯ４５７０から精製した酵素を用いる方法［応用糖質科学４３，  ３６９−３７２  （１９９６）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ２８０，  ６６−７１（１９９７）］、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  由来のＣＧＴａｓｅ（シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ）を用いる反応［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ２８０，  ６６−７１（１９９７）］などがあるが、いずれも生成率が低かったり、５’位選択率が低く、生産量において満足のいく結果が得られていない。また、５’位選択率が低い場合は、副生成物のピリドキシン−４’−α−グルコシドの量が多いため、これを除去するためにさらなる精製処理が必要で工程が複雑になり、また、ピリドキシン−４’−α−グルコシドの基質としての再利用が難しくなるなどの問題があった。
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決すべく種々の微生物を対象としてピリドキシンからピリドキシン  α−グルコシドを生成する菌株を広くスクリーニングした結果、細菌又は真菌のなかに所望の糖転移活性を有する微生物を見出した。この微生物を用いると効率的にピリドキシン−５’−α−グルコシドを製造でき、高い５’位選択性が達成できる（非特許文献１）。しかしながら、この刊行物では、この糖転移活性を担うと考えられる酵素は特定されていない。
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｓｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６７，  ｐｐ．５０８−５１６，  ２００３
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｓｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６７，  ｐｐ．４９９−５０７，  ２００３
【非特許文献３】日本農芸化学会２００２年度大会，  大会要旨集，  ｐｐ．１９８
【非特許文献４】日本農芸化学会２００３年度大会，  大会要旨集，  ｐｐ．３６
【０００６】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の課題は、ピリドキシン又はその類縁化合物のα−グルコシドを効率的に製造する手段を提供することにある。より具体的には、ピリドキシン及びその類縁化合物に作用してα−グルコシド化合物を生成する糖転移酵素を提供することが本発明の課題である。本発明者らは鋭意研究を進めた結果、上記の特徴を有する糖転移酵素を分離することに成功した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００７】
すなわち、本発明により、下記の一般式（Ｉ）：
【化３】
2004357591.tif 000002
（式中、Ｒは水素原子、低級アルキル基、低級ヒドロキシアルキル基、カルボキシル基、又はアルデヒド基を示す）で表される化合物に作用して、下記の一般式（ＩＩ）：
【化４】
2004357591.tif 000003
（式中、Ｒは上記と同義である）で表される化合物を生成することができる糖転移酵素であって、以下の理化学的性質：
至適ｐＨ：６〜７
至適温度：約６０℃
分子量：約１３７，０００
を有する糖転移酵素が提供される。
【０００８】
上記の発明の好ましい態様によれば、一般式（Ｉ）で表される化合物の５’位の水酸基を位置選択的に配糖化してα−グルコシド化する作用を有する上記の糖転移酵素；Ｒがヒドロキシメチル基である上記の糖転移酵素；下記のいずれかの群：レイフソニア属、パエニバチルス属、シュードノカルディア属、クリプトコッカス属、コリオルス属、ユーロチウム属、フラムリナ属、ガノデルマ属、グリオクラディウム属、ヘリコスティルム属、モルティエレラ属、ピソマイセス属、シゾフィルム属、トラメテス属、又はベルティシリウム属に属する微生物に由来する上記の糖転移酵素；及び、ベルティシリウム属に属する微生物に由来する上記の糖転移酵素が提供される。
【０００９】
別の観点からは、上記の糖転移酵素の製造方法であって、上記一般式（Ｉ）で表される化合物に作用して上記一般式（ＩＩ）で表される化合物を生成することができる糖転移酵素を産生する微生物を培養し、得られた培養物から該糖転移酵素を分離・採取する工程を含む方法が提供される。この発明の好ましい態様では、該微生物は、下記のいずれかの群：レイフソニア属、パエニバチルス属、シュードノカルディア属、クリプトコッカス属、コリオルス属、ユーロチウム属、フラムリナ属、ガノデルマ属、グリオクラディウム属、ヘリコスティルム属、モルティエレラ属、ピソマイセス属、シゾフィルム属、トラメテス属、又はベルティシリウム属に属する微生物である。
【００１０】
さらに別の観点からは、上記一般式（ＩＩ）で表される化合物の製造方法であって、上記一般式（Ｉ）で表される化合物に上記の糖転移酵素を作用させる工程を含む方法が本発明により提供される。この発明の好ましい態様では、ホウ酸及び／又はホウ酸塩の存在下で糖転移酵素を作用させることにより、５’位のα−グルコシド化の選択性を高めることができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の糖転移酵素は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物に作用して、上記一般式（ＩＩ）を生成することができる糖転移酵素であって、以下の理化学的性質：至適ｐＨ：６〜７、至適温度：約６０℃、分子量：約１３７，０００を有することを特徴としている。
【００１２】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、Ｒは水素原子、低級アルキル基、低級ヒドロキシアルキル基、カルボキシル基、又はアルデヒド基を示す。低級アルキル基としては、例えば、炭素数１から６個程度の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を用いることができ、より具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プルピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、ｎ−ペンチル基、又はｎ−ヘキシル基などを例示することができる。これらのうち、メチル基又はエチル基が好ましく、メチル基がより好ましい。また、低級ヒドロキシアルキル基のアルキル部分も同様である。低級ヒドロキシアルキル基に存在する水酸基の個数は特に限定されないが、好ましくは１個である。低級ヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル基が好ましい。Ｒとしては、ヒドロキシメチル基が最も好ましい。
【００１３】
本発明の糖転移酵素は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物に作用して上記一般式（ＩＩ）で表される化合物を生成することができる糖転移酵素を産生する微生物（以下、「本発明の糖転移酵素の産生菌」と略す場合がある。）を培養した培養物から分離・採取することができる。本発明の糖転移酵素の産生菌の種類は特に限定さず、細菌、放線菌、酵母、カビなどの任意の微生物であってもよい。例えば、本発明の糖転移酵素の生産菌は、レイフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌；シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属に属する放線菌；クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する酵母；コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属、ユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）属、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属、ガノデルマ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）属、グリオクラディウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）属、ヘリコスティルム（Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、ピソマイセス（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ）属、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、ベルティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属するカビから選択することができるが、これらの微生物に限定されることはない。好ましくはベルティシリウム属に属する微生物を用いることができる。
【００１４】
より具体的な微生物種としては、例えば、レイフソニア  アクアティカ（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ  ａｑｕａｔｉｃａ）、パエニバチルス  アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ）、シュードノカルディア  アウトトロフィカ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、クリプトコッカス  アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ）、クリプトコッカス  テレウス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、コリオルス  フィブラ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｆｉｂｕｌａ）、コリオルス  ヒルステュス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、コリオルス  プベセンス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、コリオルス  ユニカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｕｎｉｃｏｌｏｒ）、コリオルス  ベルシカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ユーロチウム  グラブラム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ｇｌａｂｒｕｍ）、フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）、ガノデルマアプラナテュム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｐｐｌａｎａｔｕｍ）、グリオクラディウム  アウレウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）、グリオクラディウム  ビレンス（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｖｉｒｅｎｓ）、ヘリコスティルム  ニグリカンス（Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）、モルテエィレラ  アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、ピソマイセス  アトロ−オリバセウス（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ  ａｔｒｏ−ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、シゾフィルム  コミュネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）、トラメテス  オリエンタリス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ベルティシリウム  アルボ−アトルム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ）、ベルティシリウム  ダーリアエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）、ベルティシリウム  トリコルプス（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｐｕｓ）などを例示することができる。
【００１５】
さらに具体的には、本発明の糖転移酵素の産生菌として、例えば、Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ  ａｑｕａｔｉｃａ  ＩＦＯ  １５７１０、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ  ＩＦＯ  ３３４３、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ  ＩＦＯ  １２７４３、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ  ＩＦＯ  ０３８５、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ  ＩＦＯ  ０７２７、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｆｉｂｕｌａ  ＩＦＯ  ４９４９、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ  ＩＦＯ  ４９１７、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  ９７８２、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｕｎｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ６２６５、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＡＭ  １３０１３、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ｇｌａｂｒｕｍ  ＪＣＭ  １９６７、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ  ＩＦＯ  ８３２９、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｐｐｌａｎａｔｕｍ  ＩＦＯ  ３１１４７、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ  ＩＦＯ  ９０５５、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｖｉｒｅｎｓ    ＩＡＭ  ５０６１、Ｈｅｌｉｃｏｓｔｙｌｕｍ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ  ＩＦＯ  ８０９１、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  ＣＢＳ  ７５４．６８、Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ  ａｔｒｏ−ｏｌｉｖａｃｅｕｓ  ＩＦＯ  ６６５１、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ  ＩＦＯ  ４９２８、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ  ＩＦＯ  ４９２９、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ  ＩＦＯ  ６５０２、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ    ＩＡＭ  ９００６、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ    ＩＡＭ  １３０４２、Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ＩＦＯ  ６４８３、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ  ＩＦＯ  ９４３５、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＩＦＯ  ９７６５、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＩＦＯ  ３１０２４、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＪＣＭ  ９５０９、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＪＣＭ  ９５１０、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｐｕｓ  ＩＦＯ  ３１０２５などの菌株を用いることができる。、上記の菌株はいずれも微生物保存機関から入手可能である。もっとも、本発明の糖転移酵素の産生菌はこれらに限定されることはなく、野生株、変異株、または細胞融合もしくは遺伝子操作などの手法によって誘導される組換え微生物など、いずれの菌株であってもよい。
【００１６】
前記微生物の培養条件は特に限定されず、通常用いられる培養条件を適宜選択できる。培地の種類も特に限定されず、細菌、真菌、又は酵母などの微生物に適した通常の培地で培養を行うことができ、資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要な生育促進物質を適宜含有する培地であれば液体又は固体のいずれでもよく、合成培地又は天然培地のいずれも用いることができる。
【００１７】
炭素源としては、菌体が資化し生育できる炭素化合物であればいずれでも使用可能である。例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、デキストリン、可溶性デンプン、糊化デンプン、ソルビトールなどの糖類、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びその塩類、パラフィンなどの炭化水素類、糖蜜、菜種油などを単独で又は混合して使用することができる。
【００１８】
窒素源としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸、クエン酸などの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆加工品、尿素などの有機窒素源を単独で又は混合して用いることができる。
【００１９】
無機塩類としては、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン、鉄などの硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、硝酸塩、リン酸塩などをそれぞれ単独で又は混合して用いることができる。さらに、ビタミン類などの通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加してもよい。
【００２０】
培養は、振とう培養機又はジャーファーメンターなどを用いて通気条件下で行うことができ、あるいは嫌気的条件下で行うこともできる。培地のｐＨは３〜１０の範囲が好ましく、温度は１０〜５０℃の範囲が好ましく、培養時間は１０〜５００時間が好ましいが、これらの限定されることなく、それぞれの微生物によって適宜決められる。
【００２１】
培養後、培養物を濾過又は遠心分離して菌体を得、その菌体を水または適当な緩衝液でよく洗浄する。洗浄した菌体は適量の緩衝液に懸濁して菌体を粉砕する。
破砕の方法は特に限定されず、例えば、乳鉢、ダイノミル、ベンチプレスなどを用いた破砕、超音波破砕などの機械的破砕法が挙げられる。得られた菌体の破砕液より不溶物を濾過または遠心分離により除去することにより、本発明の糖転移酵素を含む無細胞の抽出液を得ることができる。この抽出液から本発明の糖転移酵素を分離・採取する方法は特に限定されず、通常用いられる酵素の分離及び精製手段を単独で用い、あるいは複数の手段を適宜組み合わせて用いることができる。
【００２２】
例えば、硫酸アンモニウム沈殿などの塩析；セファデックス等によるゲル濾過法；ジエチルアミノエチル基又はカルボキシメチル基等を持つ担体等を用いたイオン交換グロマトグラフィー法；ブチル基、オクチル基、フェニル基等の疎水性基を持つ担体等を用いた疎水性クロマトグラフィー法；色素ゲルクロマトグラフィー法；電気泳動法；透析；限外濾過法；アフィニティークロマトグラフィー法；高速液体クロマトグラフィー法；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー法等の１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２３】
さらに、精製酵素を担体に固定化することにより、固定化酵素を繰り返し使用でき、連続的かつ大量に目的物を製造することができる。酵素の固定化方法は特に限定されず、公知の方法を適宜採用することができる。例えば、共有結合法や吸着法などの担体結合法；架橋法；又は包括法等により固定化できる。また、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート等の縮合剤を必要に応じて用いてもよい。他の固定化法としては、例えば、モノマーを重合反応でゲル化させて行うモノマー法；通常のモノマーよりも大きな分子を重合させるプレポリマー法；ポリマーをゲル化させて行うポリマー法；ポリアクリルアミドを用いた固定化法；アルギン酸、コラーゲン、ゼラチン、寒天、κ−カラギーナン等の天然高分子を用いた固定化法；光硬化性樹脂、ウレタンポリマー等の合成高分子を用いた固定化法などを挙げることができる。
これらの固定化法の２種以上を適宜組み合わせてもよい。固定化酵素をカラムに充填してバイオリアクターとして回分式と同様の反応条件で一カ月から一年間連続通液を行うことにより、目的物を安価に連続的かつ大量に生産することができる。
【００２４】
本発明の糖転移酵素は、上記のようにして本発明の糖転移酵素の産生菌の培養物から分離・採取することができるが、本発明の糖転移酵素をコードする遺伝子を本発明の糖転移酵素の産生菌からクローニングし、この遺伝子を用いて通常の遺伝子組み換えの手法により大腸菌などの汎用の微生物や昆虫細胞などを形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより製造することもできる。上記遺伝子のクローニング方法、形質転換体の製造方法などは当業界で周知かつ慣用の方法である。
【００２５】
本発明の糖転移酵素を用いたα−グルコシド反応における糖の供与体としては、スクロース、デンプン質、ニゲロースなどのグルコースのα１→３結合体、コージビオースなどのグルコースのα１→２結合体、あるいはこれらの混合物などが使用される。デンプン質としては、菌体が作用して分子間グルコシル化を起こしうるデンプン質であれば得に種類は限定されない。例えば、可溶性デンプン、糊化デンプン、アミロース、アミロペクチン、マルトース、デキストリンなどが挙げられる。基質としての一般式（Ｉ）の化合物はその塩を用いてもよく、塩酸塩などが挙げられる。一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、適当な有機溶媒に溶解し反応に供することができる。有機溶媒としては、ヘキサン、酢酸エチル、エーテル、アセトン、エタノールなどを単独で又は組み合わせて、さらには該溶解液を水性溶液として用いることができる。
【００２６】
一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の濃度は特に限定されないが、例えばピリドシキン塩酸塩を用いる場合、０．０１〜１Ｍが好ましい。また、反応温度は１０〜７０℃、ｐＨは３〜１０が好ましく、１〜５００時間反応させるのが好ましい。ｐＨを一定に維持するためには、例えば、リン酸緩衝液などの緩衝液を使用することができる。
【００２７】
反応終了後、適宜の後処理を施すことにより目的物を単離することができる。たとえば、ゲル濾過、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂、シリカゲル、ＯＤＳなどのクロマトグラフィーによって一般式（ＩＩ）で表される化合物を含む画分を集めることができる。また、例えば、煎糖晶出法、冷却析出法、又はエタノールなどによる晶出法などによっても目的物を晶出させることができ、必要によって再結晶を行なって目的物を精製することができる。
【００２８】
また、α−グルコシドの製造にあたり、反応液にホウ酸および／またはホウ酸塩を添加することにより５’位の選択性を高めることができる。ホウ酸塩としては、ナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属との塩などが用いられ、例えば、メタホウ酸ナトリウム、四ホウ酸二ナトリウム、五ホウ酸ナトリウム、六ホウ酸ナトリウム、八ホウ酸ナトリウム、二ホウ酸ナトリウムなどが挙げられる。また、ホウ酸塩緩衝液として用いることもでき、ホウ酸塩緩衝液として用いる場合、ホウ酸、コハク酸などによりｐＨ５〜８付近に調整して用いることができる。  ホウ酸及び／又はホウ酸塩の添加量は特に限定されず、５’選択性を指標として適宜の濃度を選択することが可能であるが、例えば、反応液に対して０．０１〜１Ｍ程度とすればよい。なお、一般式（ＩＩ）で表される化合物の検出及び定量は、例えば、ＨＰＬＣにより行うことができ、目的物の純度はピーク面積比により定量することができる。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：糖転移酵素の精製
Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＪＣＭ  ９５１０を４％可溶性デンプン、１％エスサンミート、０．１％リン酸水素二カリウム、０．０５％塩化カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水塩、０．００１％硫酸第一鉄７水塩、０．１％塩酸ピリドキシンからなる培地１０．４Ｌに接種し、２０℃で８日間培養した。前記培養液を遠心分離機で処理し、湿菌体８００  ｇを得た。この菌体に１０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）を加え、ダイノミルによる破砕を行い、さらに、超音波破砕を行なった。遠心分離により無細胞抽出液３．２  Ｌを得た。この無細胞抽出液に、硫酸アンモニウムを添加した。３０％飽和から８０％飽和にする間に不溶化した部分を集め、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）に溶解し同緩衝液に対して透析を行なった。この酵素液９００  ｍＬをＤＥＡＥ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  カラム（２．５  ｃｍｘ３９  ｃｍ）に負荷し、０．３Ｍの塩化ナトリウムで溶出した。溶出した酵素活性画分を限外ろ過で濃縮し、ヒドロキシアパタイトカラム（２．５  ｃｍｘ１９．５  ｃｍ）に負荷し、リン酸カリウム緩衝液の直線濃度勾配（１０  ｍＭ→４００  ｍＭ）で溶出した。溶出した酵素活性画分（部分精製酵素）をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０に負荷し、１５０  ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０  ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７）で溶出した。精製酵素を含む精製酵素液を得た。このものはネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一のバンドのみを示した。
【００３０】
１）酵素活性
０．３Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）、６％  デキストリン、０．３Ｍピリドキシン塩酸塩を含む溶液２００μＬに、２〜１００倍希釈した酵素液４００μＬを加え、４０℃で２時間保った。反応液をＨＰＬＣで分析してピリドキシン５’−α−グルコシドおよびピリドキシン４’−α−グルコシドの生成率（％）を求めた。下記条件下で１分間に１μｍｏｌのピリドキシン５’−α−グルコシドが生成する酵素活性を１単位（Ｕ）とした。その結果、全活性は１６．８Ｕ、比活性は２４Ｕ／ｍｇであった。
ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８ＭＳ−ＩＩ  （φ４．６×１５０ｍｍ）
カラム温度：３５℃
溶離液：１．０％  メタノール
流速：１．０  ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ３２５ｎｍ
【００３１】
２）分子量
ゲル濾過ＨＰＬＣ（東ソーＴＳＫ−ＧＥＬ  ３０００ＳＷ  ７．５ｍｍ  ｘ  ６００ｍｍ）を用いた分子量測定により、約１３７，０００であった。
３）至適ｐＨ
希釈した精製酵素液（０．２２  Ｕ／ｍＬ）  ２０μＬ、０．２Ｍピリドキシン塩酸塩０．２Ｍ各ｐＨ緩衝液５０μＬ、６．６７％デキストリン３０μＬを加え、６０℃で１時間保った。ｐＨ緩衝液はｐＨ３〜５は、酢酸緩衝液、ｐＨ５〜８はリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８〜９はトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９〜１１は炭酸ナトリウム緩衝液を用いた。各反応液のピリドキシン５’−α−グルコシドおよびピリドキシン４’−α−グルコシドの生成量をＨＰＬＣで測定した。ピリドキシン５’−α−グルコシド生成の至適ｐＨは約６〜７であった。また、５’位の位置選択性はｐＨ６．４以上で最高値となった（図１）。
４）至適温度：
希釈した精製酵素（０．２２  Ｕ／ｍＬ）３０μｌ、０．３  Ｍピリドキシン塩酸塩０．３  Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）５０μＬ、１０％デキストリン３０μｌ、精製水４０μＬ、各温度で１時間保った。各反応液のピリドキシン５’−α−グルコシドおよびピリドキシン４’−α−グルコシドの生成量をＨＰＬＣで測定した。その結果、ピリドキシン５’−α−グルコシド生成の至適温度は６０℃であった（図２）。
【００３２】
５）  ｐＨ安定性
希釈した精製酵素（０．１７  Ｕ／ｍＬ）    ４０μＬをＮａＯＨとＨＣｌを用いて２から１２の各ｐＨに調整した（総体積８０μＬ）。これを６０℃で０．５時間あるいは２時間加温した。その後、０．３Ｍ  塩酸ピリドキシン６％デキストリン（松谷化学工業製  ＴＫ−１６）、０．４５Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７）  ５０μＬと精製水を加え、総体積を１５０μＬとした。これを６０℃で１時間反応させ、生成したピリドキシンα‐グルコシドをＨＰＬＣで測定した。
加温していない酵素液を用いて反応させた場合の活性を１００とし、各ｐＨで加温後の残存活性を図３に示した。本発明の糖転移酵素は、５．９〜９．３の範囲で２時間以上安定（６０℃）であることが分かった。
【００３３】
６）  温度安定性
希釈した精製酵素（０．２２  Ｕ／ｍＬ）  ３０μＬに０．３Ｍ  リン酸カリウム緩衝液５０μＬを加え、４０℃から７５℃の各温度で０．５時間あるいは２時間加温した。その後０．３Ｍ  塩酸ピリドキシン６％デキストリン（松谷化学工業（株）ＴＫ−１６）、０．３  Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７）５０μＬと精製水を加え、総体積を１５０μＬとした。これを６０℃で１時間反応させ、生成したピリドキシンα‐グルコシドをＨＰＬＣで測定した。本発明の糖転移酵素は、６０℃以下の温度で２時間以上安定であることが分かった。（図４）
【００３４】
例２
例１の方法で得たＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  菌体、無細胞抽出液、糖転移酵素を用いてピリドキシンからピリドキシン５’−α−グルコシドを製造した。０．１２ｍｍｏｌ  塩酸ピリドキシン、２４ｍｇデキストリン（松谷化学工業（株）ＴＫ−１６）を含む１２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７）  １．０ｍＬに、培養液１ｍＬから集菌したＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  菌体（０．１１  Ｕ相当分）、無細胞抽出液（０．１１  Ｕ）、本発明の部分精製酵素（０．１１  Ｕ）のいずれか一つを加え、総体積１．２ｍＬとし、４０℃で２０時間加温した。反応液をＨＰＬＣで分析し、ピリドキシン５’−α−グルコシド（ＰＮ−５’−α−Ｇ）およびピリドキシン４’−α−グルコシド（ＰＮ−４’−α−Ｇ），その他のピリドキシングルコシドの生成率（％）を求めた。５’選択率（％）は下式を使って算出した。
５’選択率（％）＝
（ピリドキシン５’−α−グルコシドの生成率）／（ピリドキシン５’−α−グルコシド生成率とピリドキシン４’−α−グルコシド生成率の和）×１００
結果を表１に示す。菌体、無細胞抽出液、及び本発明の酵素を用いて生成率３２％以上、５’位の位置選択性９０％以上でピリドキシン５’−α−グルコシドが得られたが、特に本発明の精製酵素を用いた場合には、より高い５’位の位置選択性が達成できた。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
例３
例１で得た糖転移酵素を用いてホウ酸塩存在下でピリドキシンからピリドキシン５’−α−グルコシドを製造した。０．１２ｍｍｏｌ  塩酸ピリドキシン、２４ｍｇデキストリン（松谷化学工業（株）ＴＫ−１６）を含む３０ｍＭ  ホウ酸ナトリウム（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１
０Ｈ２Ｏ，  ｐＨ  ７）  １．０ｍＬに、本発明の部分精製酵素（０．１１  Ｕ）を加え、総体積１．２ｍＬとし、４０℃で２０時間加温した。反応液をＨＰＬＣで分析した。ピリドキシン  ５’−α−グルコシドの生成率は１２．１％であったが、５’位の位置選択性は９８．４％と非常に高まった。
【００３７】
【発明の効果】
本発明の糖転移酵素は、例えばピリドキシンからピリドキシン  α−グルコシドを効率的に製造するための酵素として有用である。また、本発明の糖転移酵素は、ホウ酸及び／又はホウ酸塩の存在下で反応を行うことにより５’位の位置選択性が高まるので、例えばピリドキシンからピリドキシン  ５’−α−グルコシドを効率的に製造するための酵素として特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の糖転移酵素の活性とｐＨとの関係を示した図である。
【図２】本発明の糖転移酵素の活性と温度との関係を示した図である。
【図３】本発明の糖転移酵素のｐＨ安定性を示した図である。
【図４】本発明の糖転移酵素の温度安定性を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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