(57)【要約】【課題】飼料添加用はもとより、食品、医薬品、化粧品等の分野で広く用いることができる赤色天然色素アスタキサンチンの濃縮体の新規な製造法を提供する。【解決手段】ファフィア属酵母をアセトンで抽出し、抽出液を濃縮して得られる粗色素油に炭化水素系溶剤を加えて晶析させることを特徴とする、アスタキサンチンを高濃度に含むカロテノイド類の製造方法。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファフィア属酵母をアセトンで抽出し、抽出液を濃縮して得られる粗色素油に炭化水素系溶剤を加えて晶析させることを特徴とする、アスタキサンチンを高濃度に含むカロテノイド類の製造方法。
【請求項２】
ファフィア属酵母をアセトンで抽出し、抽出液を水の存在下濃縮して得られる粗色素油に炭化水素系溶剤を加えて晶析させることを特徴とする、アスタキサンチンを高濃度に含むカロテノイド類の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の製造方法で得られた天然赤色色素。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アスタキサンチンを高濃度に含むカロテノイド類の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
カロテノイド化合物は天然色素として飼料添加物として有用であり、中でもカロテノイド類の一種であるアスタキサンチン（Astaxanthin：３,３’−ジヒドロキシ−カロチン−４,４’−ジオン）は魚類、鶏卵の色揚げ剤として広く使われている。また食品添加物としても認められており、油脂加工食品、蛋白質性食品、水性液状食品、健康食品などに幅広く使用されている。さらにフリーラジカルによって誘起される脂質の過酸化に対する抗酸化活性、α−トコフェロールの数百倍に達する一重項酸素消去作用などからその強力な抗酸化作用を生かした化粧品類、医薬品としての用途が期待されている。
【０００３】
アスタキサンチンはサケ、マス、マダイ等の魚類、カニ、エビ、オキアミ等の甲殻類など広く自然界に分布すると共に、細菌アグロバクテリウム・オウランティアク、プレビバクテリウム属に属する細菌類、新規な細菌E-396株、緑藻類ヘマトコッカス・プルビアリス、酵母ファフィア・ロードザイマといった微生物によっても生産されている。アスタキサンチンは化学合成によるものが市販されているが安全面の不安から天然物由来のものが求められており、上記天然資源からの取り出しは重要な課題である。
【０００４】
これら天然資源中のアスタキサンチン含量はもともと微量であり、アスタキサンチンを有効に利用するためにはこれを分離し、かつ濃度を上げる必要があり、そのための方法が数多く報告されている。
【０００５】
甲殻類からアスタキサンチンを分離する方法としては、カニ・エビ・オキアミ殻等を適当な前処理後有機溶剤で抽出するのが一般的であり、例えば、カニ、エビからアスタキサンチンを分離するものとしては、カニ、エビ殻を塩酸浸漬して殻中のカルシウムを除き、次いで水酸化ナトリウム溶液で処理することにより中和と蛋白質除去を行い、さらに該殻を醸造用アルコール：水＝80:20からなる溶媒中に78±5℃で浸漬し、得られた抽出液を減圧濃縮してアスタキサンチンを単離する方法がある。
藻類や酵母などの微生物からアスタキサンチンを得る方法としては、該微生物体の細胞壁を適当な手段で破壊した後、有機溶剤で抽出することが広く行われているが、ヘマトコッカス藻体のシスト細胞を熱アセトン処理し、夾雑物であるクロロフィルを溶出させた後、エタノールでアスタキサンチン類を抽出する方法があり、この方法によれば細胞壁破壊の操作が要らないことも報告されている(例えば、特許文献１参照。)。
【０００６】
また、赤色色素を産出するファフィア属酵母からアスタキサンチンを得る方法としては、当該乾燥菌体をロールミルや振動ボールミル処理する方法、当該菌体にトリコデルマリーセイATCC1361由来の細胞壁分解酵素を作用させる方法などがある。
【０００７】
このようにして得られたアスタキサンチン含有物には一般になお多くのそれぞれの原料源由来の夾雑物や異臭物質が多量に含まれており、例えば現在市販されているアスタキサンチン含有色素中の純分は数パーセントに過ぎない。魚類、鶏卵の色揚げ用にはこのまま用いられることも多いが、食品、医薬品、化粧品用であればその濃度では使用場面が制限されることも多く、色素濃度をもっと上げることが求められている。夾雑物との分離としては、甲殼類由来のアスタキサンチンの場合、カニ殻のアセトン抽出液の上澄みに当量のエーテル、ヘキサンを加えた後、脱水、濾過、乾燥を経て得られたカロテノイド結晶をベンゼンに溶解し、カラムクロマトグラフィーによりアスタキサンチン部分を分取する方法(例えば、特許文献２参照。)などがある。
【０００８】
藻類由来のアスタキサンチンの場合は、ヘマトコッカスのシスト細胞を熱アセトン処理後、アセトン−メタノール(7:3)混合液で抽出して粗アスタキサンチンを得、これをさらにTLCによりアスタキサンチン部分を分画する方法などが知られている。
【０００９】
ファフィア属酵母由来のアスタキサンチンの場合は、当該菌体をｎ−ヘキサン−エタノール(85：15)の混合溶媒中、圧縮粉砕機で粉砕しつつ抽出し、抽出物を濃縮して得られた油状物質を−50℃で濾過することによりトリグリセリド、ステロール、リン脂質を除き、さらにエタノール中遊離脂肪酸を金属セッケン化して除くことによりアスタキサンチンの濃度を約3倍とし、必要に応じて水蒸気蒸留することにより特異な発酵臭を除いてアスタキサンチン色素油を得る方法(例えば、特許文献３参照。)、同じく乾燥菌体をアセトン中機械粉砕しながら抽出し、抽出液を濃縮後一旦−50℃に冷却して不純物を析出せしめ、これを濾別した後エタノール中硝酸銀を添加することにより更に不純物を除き、最後にエタノールを助溶媒とする超臨界二酸化炭素抽出にかけて高純度アスタキサンチンを得る方法(例えば、特許文献４参照。)、当該破砕菌体を有機溶媒で抽出し、抽出液を濃縮して得られた油状の粗抽出エキスをイオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等の精製手段でアスタキサンチンまたはそのエステルを得る方法(例えば、特許文献５参照。)などがある。ファフィア属酵母は乾燥菌体1g当たり25質量%前後もの油脂分を含むことが知られており、この結果夾雑物は菌自体が産出する油脂分が主となり、このため単なる抽出液の濃縮では取扱い難い、べとついた粘性液となってしまい、このことが数パーセントという低含量と相まって利用場面における著しい制限となっていた。含量を上げるためには油脂分を始めとする多くの夾雑物を除く必要があるが、そのためには上述のような複雑な工程を経るか、あるいはカラムクロマトグラフィーといった非工業的な手段に頼らざるを得ず、取扱いが容易で応用範囲の広い結晶性アスタキサンチンの工業的製法が求められていた。
【００１０】
【特許文献１】
特開平１１−５６３４６号公報
【特許文献２】
特開平１１−４９９７２号公報
【特許文献３】
特開平７−１０１８２７号公報
【特許文献４】
特開平８−１４０６９５号公報
【特許文献５】
特開平１０−２７６７２１号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような問題点を解決するためになされたものであり、飼料添加用はもとより、食品、医薬品、化粧品等の分野で広く用いることができる赤色天然色素アスタキサンチンの濃縮体の新規な製造法を提供するものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、赤色色素を産出するファフィア属酵母からアスタキサンチンの高含量品を効率よく製造するための方法を検討した結果、煩雑な操作を要することなく、アスタキサンチンを高濃度に含むカロテノイド類を結晶で、工業的に得る方法を見い出した。本発明はこの知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は、
（１）  ファフィア属酵母をアセトンで抽出し、抽出液を濃縮して得られる粗色素油に炭化水素系溶剤を加えて晶析させることを特徴とする、アスタキサンチンを高濃度に含むカロテノイド類の製造方法、
（２）  ファフィア属酵母をアセトンで抽出し、抽出液を水の存在下濃縮して得られる粗色素油に炭化水素系溶剤を加えて晶析させることを特徴とする、アスタキサンチンを高濃度に含むカロテノイド類の製造方法、及び
（３）  （１）又は（２）項記載の製造方法で得られた天然赤色色素
を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明で原料として用いられるファフィア属酵母(Phaffia rhodozyma)はアスタキサンチンを多く含む赤色色素を生産する微生物として知られている。赤色色素は種々のカロテノイドからなり、全カロテノイドの65〜70質量%がアスタキサンチンを占め、乾燥酵母1g当たりの全カロテノイド量は10mg(1質量%)前後、アスタキサンチン含有量は6〜8mg(O.6〜O.8質量%)である。
【００１４】
抽出に用いられるファフィア属酵母は特に制限はないが、機械的処理(ダイノミル、高圧ホモジナイザー、ボールミル、超音波処理、ジェットミル等)や化学処理(酸もしくはアルカリ等)、あるいは酵素処理(プロテアーセ、グルカナーゼ等)で細胞壁を破壊後、スプレー乾燥、ドラム乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥等の手段により乾燥したものである。
【００１５】
抽出溶剤としてはアセトン、エタノール、n-ヘキサン等が考えられるが、溶解度の点から抽出効率の良いアセトンが好ましい。抽出溶剤量は通常乾燥菌体質量に対して2倍から20倍の量でよい。抽出温度は特に限定されないが室温から沸点までの範囲で加温してもしなくてもよく、抽出時間も1〜数時間（例えば、３時間）の範囲で十分である。
【００１６】
抽出液の菌体との分離は、常法によって行うことができるが、具体的には、濾過分離を挙げることができる。
【００１７】
菌体との分離を行った抽出液は、そのまま濃縮して晶析工程に入ることもできるが、この際水が存在すると濃縮中の不純物の増加を少なくすることができることから、できるだけ水を加えた状態で濃縮することが好ましい。濃縮条件は特に制限されないが、通常液温40℃以下を保って行うのが望ましい。添加する水の量は乾燥菌体質量に対して0.01〜1倍の量でよく、好ましくはO.01〜0.5倍、より好ましくはO.01〜O.2倍である。添加する時期についても特に規定はされず、最初から、もしくは濃縮途中、あるいは濃縮の最後に加えてもよい。
【００１８】
得られた油状濃縮液に炭化水素系溶剤を加えるとアスタキサンチンが晶析してくるが、炭化水素系溶剤の量は乾燥菌体質量に対して通常O.1〜2倍の量でよく、より好ましくは0.2〜1倍である。投入温度については通常その沸点以下、望ましくは30〜50℃であるがこれに限られる訳ではない。炭化水素系溶剤としては特に限定されないが、ペンタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、シクロヘプタン、オクタン、シクロオクタン、ノナン、デカン、メチルシクロヘキサンなどの脂肪族炭化水素系溶剤の他、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレンなどの芳香族炭化水秦系溶剤を挙げることができ、好ましくは脂肪族炭化水素系溶剤である。さらに好ましくは、ペンタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、メチルシクロヘキサンである。以下析出した結晶を濾別することによりアスタキサンチンを高濃度に含むカロテノイド類を得ることができる。
なお、本明細書において、「高濃度」とは、結晶中にアスタキサンチンを25質量%以上含む場合を意味し、好ましくは30質量%以上、特に好ましくは40質量%以上である。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって制限されるものではない。
【００２０】
実施例１
ファフィア属酵母の乾燥体180gをアセトン3,600gに懸濁させ、室温下6時間撹拌した。吸引濾過により菌体を除いた後濾液に水45gを加え、常圧にてアセトン抽出液を濃縮した。留出液が出なくなった時点でシクロヘキサン180gを加え、そのまま撹拌冷却した。析出した結晶を集め、シクロヘキサン25gで洗浄、乾燥したところ1.38gの暗赤色結晶が得られた。このものの中の全カロテノイド量は72質量%であり、アスタキサンチン量は39質量%であった。
【００２１】
実施例２
ファフィア酵母の乾燥体180gをアセトン900gに懸濁させ、加熱還流下1時間撹拌した。菌体を吸引濾過により除いた後、濾液を40℃で減圧濃縮した。アセトンの半量留出したところで水36gを加え、残りを同条件下濃縮し、油状濃縮液を得た。さらに、n-ヘキサン36gを加え、そのまま撹拌冷却した。析出した結晶を集め、n−ヘキサン25gで洗浄・乾燥したところ1.78gの暗赤色結晶が得られ、このものの中の全カロテノイド量は70質量%、アスタキサンチン量は40質量%であった。
【００２２】
実施例３
ファフィア属酵母の乾燥体180gをアセトン360gに懸濁させ、室温下2時間撹拌した。実施例1同様に菌体を除いた濾液を30℃で減圧濃縮し、油状濃縮液を得た。該濃縮液に水30gを加えた後50℃に昇温後オクタン150gを加えた。析出した結晶を集め、オクタン25gで洗浄、乾燥したところ1.55gの暗赤色結晶が得られ、このものの中の全カロテノイド量は72質量%、アスタキサンチン量は41質量%であった。
【００２３】
実施例４
ファフィア属酵母の乾燥体180gをアセトン540gに懸濁させ、室温下3時間撹拌した。実施例1同様に菌体を除いた濾液を30℃で減圧濃縮し、油状濃縮液を得た。該濃縮液に水36gを加えた後50℃に昇温後トルエン20gを加えた。氷冷により析出した結晶を集め、n−ヘキサン25gで洗浄、乾燥したところO.96gの暗赤色結晶が得られ、このものの中の全カロテノイド量は73質量%、アスタキサンチン量は36質量%であった。
【００２４】
実施例５
ファフィア属酵母の乾燥体180gをアセトン720gに懸濁させ、室温下3時間撹拌した。吸引濾過により菌体を除いた濾液を30℃で減圧濃縮し、アセトンの約9割が留出した時点で水15gを加えた。残りを濃縮した後、該濃縮液にｎ−ヘキサン72gを加え、次いで析出した結晶を集めてn−ヘキサン25gで洗浄・乾燥した。得られた暗赤色結晶は1.89gであり、このものの中の全カロテノイド量は71質量%、アスタキサンチン量は42質量%であった。
【００２５】
実施例６
ファフィア属酵母の乾燥体180gをアセトン1,800gに懸濁させ、加熱還流下3時間撹拌した。菌体を除いた濾液に水30gを加え、常圧にてアセトン抽出液を濃縮し、油状濃縮液を得た。該濃縮液にn-ヘキサン90gを加え、そのまま撹拌冷却した。析出結晶を集め、n-ヘキサン25gで洗浄した。暗赤色結晶1.05gが得られ、このものの中の全カロテノイド量は71質量%、アスタキサンチン量は35質量%であった。
【００２６】
比較例
ファフィア属酵母の乾燥体180gをアセトン720gに懸濁させ、加熱還流下2時間撹拌した。菌体を吸引濾過により除き、得られた濾液を40℃で乾固するまで減圧濃縮した。残留物を冷却したが暗赤色粘性オイルのままであり、カロテノイドの結晶が析出することはなかった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、煩雑な操作を要することなく、ファフィア属酵母から夾雑物の少ない、アスタキサンチンを高濃度に含む結晶性のカロテノイド類を工業的に得ることができる。