(57)【要約】【課題】  コレステロール代謝異常に対して対処療法的な治療ではなく根本的な改善・治療法の開発のために重要となるターゲット蛋白質等を見出し提供し、さらに当該ターゲット蛋白質及びその遺伝子等を利用すること。【解決手段】  正常型肝臓X受容体αによる正常なコレステロール代謝の阻害に関与する新規な肝臓X受容体αのアイソフォームであって、肝臓X受容体α遺伝子のエクソン５にコードされるアミノ酸配列を少なくとも有する肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子及びそれらの利用等が提供可能となった。これにより正常型肝臓X受容体αによる正常なコレステロール代謝の阻害に関与する疾患や異常の予防、治療に有用な方法や薬剤の開発等に応用できる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓X受容体αのアイソフォームであって、肝臓X受容体α遺伝子のエクソン５にコードされるアミノ酸配列を少なくとも有する、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質。
【請求項２】
肝臓X受容体αのアイソフォームであって、肝臓X受容体α遺伝子のイントロン５にコードされるアミノ酸配列が含まれてなる、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質。
【請求項３】
下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して、95％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
【請求項４】
肝臓X受容体αのアイソフォームであって、肝臓X受容体α遺伝子のイントロン６内の一部領域にコードされるアミノ酸配列が含まれてなる、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質。
【請求項５】
下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項４記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質。
（１）配列番号２で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して、95％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
【請求項６】
正常型肝臓X受容体αが有する、リガンドによる転写活性化能と比較して、弱い転写活性化能を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質。
【請求項７】
請求項３記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号３で示される塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項６記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号４で示される塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項1記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の部分ポリペプチドであって、請求項1記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列のうち、正常型肝臓X受容体αには存在しないアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項１２】
下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１１記載のポリペプチド。
（１）配列番号５で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号６で示されるアミノ酸配列
【請求項１３】
請求項１２記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号７で示される塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号８で示される塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は請求項７乃至１０記載のいずれかのポリヌクレオチド、を含有する組換えベクター。
【請求項１７】
請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は請求項７乃至１０記載のいずれかのポリヌクレオチド、が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項１８】
請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は請求項７乃至１０記載のいずれかのポリヌクレオチドを、宿主細胞中で自立複製可能なベクターに導入する工程を有するベクターの製造方法。
【請求項１９】
請求項１７記載の形質転換体を培養して、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生させる工程を有する、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の製造方法。
【請求項２０】
請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は請求項７乃至１０記載のいずれかのポリヌクレオチドを発現する能力を欠損させてなる遺伝子欠損動物。
【請求項２１】
請求項１１乃至１２記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は請求項１３乃至１５記載のいずれかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項２２】
請求項１１乃至１２記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は請求項１３乃至１５記載のいずれかのポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項２３】
肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に被験物質を接触させる工程、当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の変化を測定する工程を有する、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項２４】
肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が、請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質である、請求項２３記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に被験物質を接触させる工程、前記細胞において当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する工程、及び前記産生量に基づき被験物質の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質タンパク質に対する作用性を評価する工程を有する、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項２６】
肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が、請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質である、請求項２５記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、前記肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のリガンドを接触させ、当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第一工程、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、前記肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のリガンド及び被験物質の両者を接触させ、当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第二工程、及び、前記第一工程と前記第二工程とで測定された前記他のタンパク質の産生量の差異に基づき被験物質の前記リガンドに対する拮抗作用性を評価する工程を有する、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項２８】
肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が、請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質である、請求項２７記載のスクリーニング方法。
【請求項２９】
請求項２３乃至２８記載のスクリーニング方法により選択された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質。
【請求項３０】
肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する請求項２９記載の物質に対する拮抗物質。
【請求項３１】
請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を特異的に認識する抗体又は抗体の一部。
【請求項３２】
請求項７乃至１０記載のいずれかのポリヌクレオチドに基づき設計されてなるプライマー。
【請求項３３】
遺伝子治療法のための、請求項１３乃至１５記載のいずれかのポリヌクレオチドが有する塩基配列に対する特異的DNAプローブの使用。
【請求項３４】
遺伝子治療法のための、請求項１３乃至１５記載のいずれかのポリヌクレオチドが有する塩基配列に対する特異的RNAプローブの使用。
【請求項３５】
請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法であって、生体試料中のメッセンジャ−RNA（mRNA）から相補的DNA（cDNA）を合成する第一工程、請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項１１乃至１２記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は請求項１３乃至１５記載のいずれかのポリヌクレオチド、に対応する前記相補的DNA（cDNA）の部分領域を増幅する第二工程、及び増幅された部分領域を検出する第三工程を有する方法。
【請求項３６】
第二工程において、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドから選択される1つ又は複数をプライマーとして用いるPCR法により増幅する、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項１１乃至１２記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は請求項１３乃至１５記載のいずれかのポリヌクレオチドが、配列番号７又は８で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法であって、請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項１１乃至１２記載のいずれかのポリペプチドを特異的に検出することができる抗体を用いた抗原抗体反応に基づき前記肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を検出する工程を有する方法。
【請求項３９】
請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法であって、請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質若しくは請求項１１乃至１２記載のいずれかのポリペプチドを特異的に検出することができる第一抗体をマイクロタイターウェルに結合させる第一工程、生体試料中の請求項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が、マイクロタイターウェル上の前記第一抗体に結合させる第二工程、第二工程後、マイクロタイターウェル内の全ての非結合状態にある生体試料を除去する第三工程、前記肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質における、第一抗体とは異なるエピトープに結合することができる標識された第二抗体を、第一抗体に結合された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に結合させる第四工程、第四工程後、マイクロタイターウェル内の全ての非結合状態にある第二抗体を除去する第五工程、第五工程後、第二抗体の存在有無を当該第二抗体が有する標識を指標にして検出する第六工程を有する方法。
【請求項４０】
コレステロール代謝異常を調べるためのマーカーとしての、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の使用。
【請求項４１】
肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が、請求項２、３、４、５又は６記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質、或いは、肝臓X受容体αのアイソフォームであって、肝臓X受容体α遺伝子のエクソン５にコードされるアミノ酸配列が欠失してなる肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質であることを特徴とする請求項４０記載の使用。
【請求項４２】
ガン細胞の存在を調べるためのマーカーとしての、肝臓X受容体αのアイソフォームであって、肝臓X受容体α遺伝子のエクソン５にコードされるアミノ酸配列が欠失してなる、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の使用。
【請求項４３】
コレステロール代謝異常を調べるためのマーカーとしての、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの使用。
【請求項４４】
肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが、請求項７乃至１０、又は１３乃至１５記載のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項４３記載の使用。
【請求項４５】
ガン細胞の存在を調べるためのマーカーとしての、肝臓X受容体αのアイソフォームであって、肝臓X受容体α遺伝子のエクソン５にコードされるアミノ酸配列が欠失してなる、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓X受容体αのアイソフォームである肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子及びそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは、生体内における重要な脂質であり、様々な脂質の構成成分でもある。コレステロールは、摂食により腸管から吸収されるか、又は肝臓においてアセチル-CoAから生合成される。生合成されたコレステロールは肝臓から排出され、小腸において再吸収され、血液を介して肝臓に輸送され、再利用される。また、肝臓においては、コレステロールの一部は、胆汁酸へと代謝される。生体内におけるコレステロールレベルが何らかの異常により上昇すると、高コレステロール血症に由来する高脂血症やアテローム性動脈硬化症の発症原因となる。これらの高コレステロールに由来する疾患の発症メカニズムについては十分に解明されていない。現在、高コレステロール血症に由来する疾患の治療薬としては、コレステロール合成阻害剤（スタチン系製剤）やフィブラート系薬剤が用いられている。しかし、これらの薬剤による治療は、場合によっては必ずしも充分に満足できるものではない。
コレステロールの再吸収や胆汁酸への変換（コレステロール代謝）はそれぞれの特定のトランスポーター又は酵素により行われている。さらにこれらのタンパク質をコードする遺伝子群の発現調節には核内レセプターの１つである肝臓X受容体が関与していることが知られている。
肝臓X受容体には、これまでに２種類のサブタイプ（肝臓X受容体α、肝臓X受容体β）が存在することが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。肝臓X受容体αは、核内レセプターの1つであるレチノイドX受容体（RXR）とヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子の転写制御領域に結合することにより、標的遺伝子の転写を制御することが知られている。肝臓X受容体以外の核内レセプターにおいても、サブタイプやアイソフォームが見出されており、例えば、RAR、RXR及びPPAＲでは３種類のサブタイプ並びにこれらによりコードされるタンパク質が変化した形のアイソフォームが見い出されている（例えば、非特許文献２参照）。RAR及びPPAＲのアイソフォームは選択的スプライシング及び／又は異なるプロモーターの制御により生じると考えられており、発現の組織特異性や役割が異なることが知られている（例えば、非特許文献３参照）。従って、核内レセプターのサブタイプ及びアイソフォームは、それぞれ異なる機能を有していると考えられる。
【非特許文献１】Peet et al.、 Curr. Opin. Genet. Dev. 8; 571-575、1998
【非特許文献２】Mangelsdorf and Evans、Cell、83: 841-850、1995
【非特許文献３】Takeyama et al.、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 222; 395-400、1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明では、正常型肝臓X受容体αによる正常なコレステロール代謝の阻害に関与する新規な肝臓X受容体αのアイソフォームである肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子及びそれらの利用を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
コレステロールの代謝調節において重要な役割を担っている肝臓X受容体αに関し、正常型肝臓X受容体αによる正常なコレステロール代謝の阻害に関与する新規な肝臓X受容体αのアイソフォームである肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質タンパク質を見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．肝臓X受容体αのアイソフォームであって、肝臓X受容体α遺伝子のエクソン５にコードされるアミノ酸配列を少なくとも有する、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質（以下、本発明スプライシング変異体タンパク質と記すこともある。）；
２．肝臓X受容体αのアイソフォームであって、肝臓X受容体α遺伝子のイントロン５にコードされるアミノ酸配列が含まれてなる、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質（以下、本発明スプライシング変異体タンパク質５Aと記すこともある。）；
３．下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする前項２記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して、95％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
４．肝臓X受容体αのアイソフォームであって、肝臓X受容体α遺伝子のイントロン６内の一部領域にコードされるアミノ酸配列が含まれてなる、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質（以下、本発明スプライシング変異体タンパク質６Aと記すこともある。）；
５．下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする前項４記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質
（１）配列番号２で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して、95％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
６．正常型肝臓X受容体αが有する、リガンドによる転写活性化能と比較して、弱い転写活性化能を有することを特徴とする前項１〜５のいずれかに記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質；
７．前項３記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド；
８．配列番号３で示される塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド；
９．前項６記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド；
１０．配列番号４で示される塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド；
１１．前項1記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の部分ポリペプチドであって、前項1記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列のうち、正常型肝臓X受容体αには存在しないアミノ酸配列からなる、ポリペプチド（以下、本発明ポリペプチドと記すこともある。）；
１２．下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする前項１１記載のポリペプチド
（１）配列番号５で示されるアミノ酸配列
（２）配列番号６で示されるアミノ酸配列
１３．前項１２記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド；
１４．配列番号７で示される塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド；
１５．配列番号８で示される塩基配列、又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列、を有するポリヌクレオチド；
１６．前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は前項７乃至１０記載のいずれかのポリヌクレオチド（以下、総じて本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子と記すこともある。）、を含有する組換えベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある。）；
１７．前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は前項７乃至１０記載のいずれかのポリヌクレオチド、が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
１８．前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は前項７乃至１０記載のいずれかのポリヌクレオチドを、宿主細胞中で自立複製可能なベクターに導入する工程を有するベクターの製造方法（以下、本発明ベクターの製造方法）；
１９．前項１７記載の形質転換体を培養して、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生させる工程を有する、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の製造方法（以下、本発明スプライシング変異体タンパク質の製造方法と記すこともある）；
２０．前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は前項７乃至１０記載のいずれかのポリヌクレオチドを発現する能力を欠損させてなる遺伝子欠損動物；
２１．前項１１乃至１２記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、本発明ポリペプチド遺伝子と記すこともある。）、又は前項１３乃至１５記載のいずれかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクター；
２２．前項１１乃至１２記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は前項１３乃至１５記載のいずれかのポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
２３．肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に被験物質を接触させる工程、当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の変化を測定する工程を有する、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法（以下、本発明スクリーニング方法と記すこともある。）；
２４．肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が、前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質である、前項２３記載のスクリーニング方法；
２５．肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に被験物質を接触させる工程、前記細胞において当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する工程、及び前記産生量に基づき被験物質の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質タンパク質に対する作用性を評価する工程を有する、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法；
２６．肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が、前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質である、前項２５記載のスクリーニング方法；
２７．肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、前記肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のリガンドを接触させ、当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第一工程、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、前記肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のリガンド及び被験物質の両者を接触させ、当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第二工程、及び、前記第一工程と前記第二工程とで測定された前記他のタンパク質の産生量の差異に基づき被験物質の前記リガンドに対する拮抗作用性を評価する工程を有する、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法；
２８．肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が、前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質である、前項２７記載のスクリーニング方法；
２９．前項２３乃至２８記載のスクリーニング方法により選択された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質；
３０．肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する前項２９記載の物質に対する拮抗物質；
３１．前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を特異的に認識する抗体又は抗体の一部；
３２．前項７乃至１０記載のいずれかのポリヌクレオチドに基づき設計されてなるプライマー；
３３．遺伝子治療法のための、前項１３乃至１５記載のいずれかのポリヌクレオチドが有する塩基配列に対する特異的DNAプローブの使用；
３４．遺伝子治療法のための、前項１３乃至１５記載のいずれかのポリヌクレオチドが有する塩基配列に対する特異的RNAプローブの使用；
３５．前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法であって、生体試料中のメッセンジャ−RNA（mRNA）から相補的DNA（cDNA）を合成する第一工程、前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質若しくは前項１１乃至１２記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は前項１３乃至１５記載のいずれかのポリヌクレオチド、に対応する前記相補的DNA（cDNA）の部分領域を増幅する第二工程、及び増幅された部分領域を検出する第三工程を有する方法；
３６．第二工程において、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドから選択される1つ又は複数をプライマーとして用いるPCR法により増幅する、前項３５記載の方法；
３７．前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質若しくは前項１１乃至１２記載のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は前項１３乃至１５記載のいずれかのポリヌクレオチドが、配列番号７又は８で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドである、前項３５記載の方法；
３８．前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法であって、前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質若しくは前項１１乃至１２記載のいずれかのポリペプチドを特異的に検出することができる抗体を用いた抗原抗体反応に基づき前記肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を検出する工程を有する方法；
３９．前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法であって、前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質若しくは前項１１乃至１２記載のいずれかのポリペプチドを特異的に検出することができる第一抗体をマイクロタイターウェルに結合させる第一工程、生体試料中の前項１乃至６記載のいずれかの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が、マイクロタイターウェル上の前記第一抗体に結合させる第二工程、第二工程後、マイクロタイターウェル内の全ての非結合状態にある生体試料を除去する第三工程、前記肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質における、第一抗体とは異なるエピトープに結合することができる標識された第二抗体を、第一抗体に結合された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に結合させる第四工程、第四工程後、マイクロタイターウェル内の全ての非結合状態にある第二抗体を除去する第五工程、第五工程後、第二抗体の存在有無を当該第二抗体が有する標識を指標にして検出する第六工程を有する方法；
４０．コレステロール代謝異常を調べるためのマーカーとしての、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の使用；
４１．肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が、前項２、３、４、５又は６記載の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質、或いは、肝臓X受容体αのアイソフォームであって、肝臓X受容体α遺伝子のエクソン５にコードされるアミノ酸配列が欠失してなる肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質であることを特徴とする前項４０記載の使用；
４２．ガン細胞の存在を調べるためのマーカーとしての、肝臓X受容体αのアイソフォームであって、肝臓X受容体α遺伝子のエクソン５にコードされるアミノ酸配列が欠失してなる、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の使用；
４３．コレステロール代謝異常を調べるためのマーカーとしての、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの使用；
４４．肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが、前項７乃至１０、又は１３乃至１５記載のポリヌクレオチドであることを特徴とする前項４３記載の使用；
４５．ガン細胞の存在を調べるためのマーカーとしての、肝臓X受容体αのアイソフォームであって、肝臓X受容体α遺伝子のエクソン５にコードされるアミノ酸配列が欠失してなる、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの使用；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、正常型肝臓X受容体αによる正常なコレステロール代謝の阻害に関与する新規な肝臓X受容体αのアイソフォームである肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子及びそれらの利用が提供可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、肝臓X受容体αのアイソフォームである肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子及びそれらの利用に関する。
本発明において単離された3種類の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のうち、1つはイントロン５にコードされるアミノ酸配列が含まれるアイソフォーム（本発明スプライシング変異体タンパク質５Ａ）、他の1つはイントロン６内の一部領域にコードされるアミノ酸配列が含まれるアイソフォーム（本発明スプライシング変異体タンパク質６Ａ）である。これらのアミノ酸配列は新規に見い出された配列である。さらにもう1つはエクソン５にコードされるアミノ酸配列が欠失したアイソフォーム（肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質D5）である。このアイソフォームのアミノ酸配列は公共データベースに既に登録されている配列と同一であった（GenBank Accession No. BC008819）。
本発明スプライシング変異体タンパク質5Aは、正常型肝臓X受容体αのエクソン５にコードされるアミノ酸配列のカルボキシル末端に相当するアミノ酸残基の下流に、イントロン５にコードされるアミノ酸配列が含まれる以外は、正常型と全く同一の塩基配列を有している。また、本発明スプライシング変異体タンパク質6Aは、エクソン６にコードされるアミノ酸配列のカルボキシル末端に相当するアミノ酸残基の下流にイントロン６内の一部領域にコードされるアミノ酸配列が含まれる以外は、正常型と全く同一の塩基配列を有している。尚、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質D5は、エクソン５にコードされるアミノ酸配列が欠失した以外は、正常型と全く同一のアミノ酸配列を有している。
これら３種類の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が有する、肝臓X受容体αのリガンドの１つである22R−オキシコレステロールによる転写活性化能は、正常型肝臓X受容体αが有する当該転写活性化能と比較して極めて弱い又は認められないレベルである。さらに、正常型肝臓X受容体αと上記３種類の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質それぞれを共発現させたところ、正常型肝臓X受容体αのみを発現させたときに見られるリガンド依存的な転写活性化は著しく抑制される。以上の知見から、3種類の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質は、生体内においてドミナントネガティブ的に、正常型肝臓X受容体αによる正常なコレステロール代謝の阻害に関与することが示唆される。
【０００７】
本発明スプライシング変異体タンパク質は、肝臓X受容体αのアイソフォームであって、少なくともエクソン５にコードされるアミノ酸配列を有する。
代表的な例としては、肝臓X受容体α遺伝子のイントロン５にコードされるアミノ酸配列が含まれてなる肝臓X受容体αのアイソフォーム（即ち、本発明スプライシング変異体タンパク質５A）、肝臓X受容体α遺伝子のイントロン６内の一部領域にコードされるアミノ酸配列が含まれてなる肝臓X受容体αのアイソフォーム（即ち、本発明スプライシング変異体タンパク質６A）等をあげることができる。
さらに具体的には、本発明スプライシング変異体タンパク質５Aとして、（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列、（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、又は（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して、95％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を有する肝臓X受容体αアイソフォームがあげられる。また、本発明スプライシング変異体タンパク質６Aとして、（１）配列番号２で示されるアミノ酸配列、（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、又は（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して、95％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を有する肝臓X受容体αアイソフォームがあげられる。
かかる本発明スプライシング変異体タンパク質は、正常型肝臓X受容体αが有する、リガンドによる転写活性化能と比較して、弱い転写活性化能を有する。
【０００８】
ここで「実質的に同一のアミノ酸配列」の定義に関して、一般に生理活性を有するタンパク質のアミノ酸配列が多少変更された場合には、例えば、当該アミノ酸配列中の1又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されるような変更があった場合でも、当該タンパク質の生理活性が維持される場合があることはよく知られた事実であり、従って、本明細書でいう「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、特定のアミノ酸配列（即ち、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列）と実質的に同等の生物活性が保持される限り、当該アミノ酸配列中の1又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたヒト肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質も本発明の範囲に含まれることを意味する。前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個（ここで「数個」とは、２〜約１０個程度である。）、又はそれ以上である。かかる改変の数は、当該タンパク質の生理活性が維持される範囲であればよい。より具体的には、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列中の1個以上20個以下、好ましくは１個以上10個以下、さらに好ましくは１個以上５個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたヒト肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質である。このような変異は、例えば、蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、器官、組織間の差異等により天然に生じる変異であってもよいし、人為的なアミノ酸の変異（例えば、部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって、天然の蛋白質をコードするＤＮＡに変異を導入し発現させることにより作出された蛋白質が有するアミノ酸配列中に存在するアミノ酸の変異）であってもよい。
【０００９】
このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加による変異体タンパク質は、保存的に置換されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。これは特定のアミノ酸残基が物理化学的類似性（例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質）を有する残基によって置換されていてもよいことを意味している。このような保存的置換の非限定的な例には、(1)グリシン、アラニン；(2)バリン、イソロイシン、ロイシン；(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、(4)セリン、スレオニン；(5)リジン、アルギニン；(6)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換のような、脂肪族鎖含有アミノ酸残基の間の置換や極性基の間の置換等が挙げられる。
【００１０】
アミノ酸の欠失、置換若しくは付加による変異体タンパク質は、例えば、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子に公知技術である部位特異的変異導入（例えば、Nelson and McClelland、 Methods Enzymol、 216; 279、 1992等、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.、12、9441-9456、1984）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法）を行うことにより得ることができる。
【００１１】
部位特異的変異導入は、導入したい変異を含む合成プライマーを用いて行うことができる。即ち、プライマーとして前記合成オリゴヌクレオチド及びその塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いて、正常型肝臓X受容体αの遺伝子を含むプラスミドを鋳型として、増幅反応を行う。次に、メチル化感受性制限酵素であるDpn Iで処理することにより、新たに形成された変異を有するDNAのみが残る。この反応液を用いて大腸菌XLI-Blue株を形質転換し、アンピシリン含有LB寒天培地に捲く。37 ℃で一晩培養し、増殖したコロニーからプラスミドを単離する。これにより、変異されたDNAを含むプラスミドを得ることができる。上記方法に基づくキットとしては、例えば、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製）等が販売されており、これらを利用してもよい。目的の変異が導入されたことは、その塩基配列を決定することにより確認できる。
【００１２】
さらにまた、アミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加を行う方法としては、前記の部位特異的変異導入の他にも、遺伝子を変異原で処理する方法又は遺伝子を制限酵素で開裂し、選択した遺伝子断片を除去、付加若しくは置換し、次いで連結する方法等も挙げることができる。
【００１３】
ここで「正常型肝臓X受容体α」とは、同一種の生物由来の当該受容体タンパク質のアミノ酸配列において、天然に最も高頻度に出現するアミノ酸配列からなる肝臓X受容体αを意味する。例えば、ヒト由来正常型肝臓X受容体αとしては、公共データベースに登録されているアミノ酸配列（GenBank Accession No. NM_005693）からなる肝臓X受容体αを挙げることができる。
【００１４】
本発明において「アミノ酸同一性」、「塩基同一性」とは、２つの蛋白質又は２つのＤＮＡ間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の蛋白質又はＤＮＡは、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.、22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、当該同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
【００１５】
本発明における「アミノ酸同一性」はアミノ酸配列基準であって、例えば、約95％以上であることが好ましい。これに対して「塩基同一性」は塩基配列基準であって、例えば、約95％以上であることが好ましい。
【００１６】
本発明スプライシング変異体タンパク質は、ハイブリダイゼーション法やPCR法等により取得することができる。
例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳類等の動物組織又はそれらの動物由来培養細胞から、Sambrook and Russell；モレキュラー クローニング第3版、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（2001年）等に記載される遺伝子工学的方法に準じてRNAを抽出し、一本鎖cDNAを合成する。具体的には、例えば、肝臓等の組織をチオシアン酸グアニジン等のタンパク質変性剤を含む溶液中で破砕し、さらに当該破砕物にクロロホルム等を加えることによりタンパク質を変性させる。変性タンパク質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分からフェノール、クロロホルム等を用いて全RNAを抽出する。尚、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えば、ISOGEN（ニッポンジーン社製）、TRIZOL試薬（インビトロジェン社製）がある。
得られた全RNAを鋳型としてオリゴdTプライマーをmRNAのポリA配列に結合させ、逆転写酵素、例えば、RNaseH- Superscript II Reverse Transcriptase (インビトロジェン社製)及び添付されたバッファーとオリゴdTプライマーとを用いて、42 ℃で1時間反応させ、次いで99 ℃で5分間加熱することにより、逆転写酵素を失活させる。次いで、RNaseHにより、mRNA鎖にニックを入れ、該１本鎖cDNAを鋳型にして大腸菌DNAポリメラーゼIにより2本鎖cDNAを合成する。得られた2本鎖cDNAの末端をT4 DNA ポリメラーゼにより平滑化する。平滑化された2本鎖cDNAをpBluescript II vectorやバクテリオファージ、例えば、λgt11、EMBL3等のベクターにT4リガーゼにより挿入し、cDNAライブラリーを作成する。尚、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えば、cDNA合成システムプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）やTimeSaver cDNA合成キット（アマシャムバイオサイエンス社製）等が挙げられる。このようにして作製されたcDNAライブラリーから、例えば、配列番号３、４、７又は８のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列を有するDNAをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションの条件としては、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするようなものをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J.、 Frisch E. F.、 Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができ、また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×SSC（１．５M  NaCl、０．１５M  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）を含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology、 John Wiley & Sons、 N. Y. (1989)、 6.3.1-6.3.6）や、50%ホルムアミド、6 ×SSC、5 X デンハルト溶液、0.5%(w/v) SDS及び熱変性したサケ精子DNA（100 μg/ml）を含む溶液中に、ランダムプライミング法により[α-32P]dCTPで標識された前記プローブ（10 X 106 cpm/ml）を用いて、42 ℃にて一晩保温してハイブリッドを形成させた後、0.1%(w/v) SDSを含む2×SSC中、室温で10分間洗浄し、さらに0.1%(w/v) SDSを含む0.2×SSC中、55 ℃で10分間２回洗浄するような条件等を挙げることができる。尚、洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×SSCで約５０℃程度の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSCで約５０℃程度までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
次いでX線フィルム（例えば、Hyperfilm-MP；アマシャムバイオサイエンス社製）又はバイオイメージングシステム（BAS-2000；富士フイルム社製）によりシグナルを検出し、プローブと結合する塩基配列を有するベクターを含む組換え体を得ることができる。
【００１７】
PCR法のプライマーを設計する場合には、例えば、配列番号３、４、７又は８のいずれかで示される塩基配列から、例えば、以下の条件を満たすように２つを選定すればよい。
１）プライマーの長さが15塩基から40塩基、好ましくは、20塩基から30塩基。
２）プライマーの中のグアニンとシトシンとの割合が、40%〜60％、好ましくは45％〜55％、より好ましくは50％〜55％。
３）プライマー配列において、アデニン、チミン、グアニン、シトシンの分布が部分的に偏らないこと。例えば、グアニン、シトシンが繰り返すような領域は適切ではない。
４）選定されるプライマーに対応する遺伝子の塩基配列上の距離が、好ましくは100塩基乃至3000塩基、さらに好ましくは、100塩基乃至500塩基。
５）各プライマー自身又は2つのプライマー間に相補的な配列が存在しないこと。
プライマーの塩基配列が選定されれば、市販のＤＮＡ合成機により化学合成すればよい。
例えば、センスプライマーとして配列番号１１、アンチセンスプライマーとして配列番号１２で示される塩基配列を使う組み合わせが挙げられる。PCRの条件としては、例えば、反応液中に、プライマーをそれぞれ200 nMになるように添加し、前記で合成した1本鎖cDNAを鋳型にして、例えば、LA Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）及び当該酵素に添付された反応緩衝液を用いてPCRを行う。かかるPCRとしては、例えば、95 ℃、3分間の熱変性後、94 ℃、 30秒間、55 ℃、 30秒間、72 ℃、1分間を１サイクルとして35サイクル程度行う。ここで、前記のようにして合成されたcDNAの代わりに、クロンテック社製クイッククローンcDNA等の市販の各種動物由来のcDNAを用いてもよい。得られた反応液の一部を、アガロースゲル電気泳動により解析し、目的のバンドを、直接又はゲルから切り出した後、TAクローニングシステムによりpGEM-T Easyベクター（プロメガ社製）にクローニングする。挿入されたDNA断片の塩基配列は、ダイターミネーター法により決定し、確認することができる。
【００１８】
このようにして取得された本発明スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子）を形質転換させる宿主細胞において利用可能なベクターに導入することができる。例えば、宿主細胞中で自立複製可能なベクターであって、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーをもつベクターに、通常の遺伝子工学的手法に準じて組み込むことにより本発明スプライシング変異体タンパク質遺伝子を含むベクターを構築することができる。本発明タンパク質遺伝子を含むベクターとしては、具体的には大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、プラスミドpUC19（宝酒造社製）、pBluescript II（Stratagene社）等を挙げることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合には、プラスミドpACT2（クロンテック社製）、pYES2 (インビトロジェン社製)等を挙げることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合にはpRc/RSV、pRc/CMV (インビトロジェン社)等のプラスミド等を挙げることができる。
【００１９】
本発明タンパク質遺伝子の上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のようなベクターに組み込むことにより、本発明タンパク質遺伝子を宿主細胞で発現させることが可能なベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、本発明タンパク質遺伝子が導入される宿主細胞において、プロモーターの制御下に本発明タンパク質遺伝子が発現されるように、当該プロモーターと本発明タンパク質遺伝子とを結合させることを意味する。使用されるプロモーターは、形質転換する宿主細胞内でプロモーター活性を示すものであって、例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、tacプロモーター、T7プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。宿主細胞が動物細胞である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミアンウイルス(SV40)プロモーター等を挙げることができる。宿主細胞が出芽酵母である場合には、アルコール脱水素酵素 (ADH)1遺伝子プロモーター、ガラクトース代謝酵素(GAL)1遺伝子プロモーター等を挙げることができる。
また、宿主細胞において機能するプロモーターをあらかじめ保有するベクターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーターと本発明タンパク質遺伝子とが機能可能な形で結合するように、当該プロモーターの下流に本発明タンパク質遺伝子を挿入すればよい。例えば、前述のプラスミドpRc/RSV、pRc/CMV等は、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられており、当該クローニング部位に本発明タンパク質遺伝子を挿入し動物細胞へ導入すれば、本発明タンパク質遺伝子を発現させることができる。また前述の出芽酵母用プラスミドpACT2はADH1プロモーターを有しており、当該プラスミド又はその誘導体のADH1プロモーターの下流に本発明タンパク質遺伝子を挿入すれば、本発明タンパク質遺伝子を、例えば、CG1945株(クロンテック社製)等の出芽酵母内で大量発現させることが可能な本発明ベクターが構築できる。
【００２０】
本発明タンパク質遺伝子又は本発明ベクター等を宿主細胞に導入することにより、本発明形質転換体を取得することができる。本発明タンパク質遺伝子又は本発明ベクター等を宿主細胞へ導入する方法としては、形質転換される宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合には、モレキュラー・クローニング第3版（Sambrook and Russell、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、2001年）等に記載される塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることができる。また、哺乳類動物細胞又は昆虫類細胞を宿主細胞とする場合は、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法又はリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法により前記細胞に導入することができる。また、本発明タンパク質遺伝子を、酵母を宿主細胞として発現させてもよい。この場合、好ましくは、出芽酵母（例えば、サッカロミセスセレビシエ）を用いるが、ピキア (Pichia) 等の酵母を用いてもよい。酵母を形質転換する方法としては、例えば、 Itoらの方法（J. Bacteriol. 153; 163-168、 1983）等に記載されている。
バキュロウイルスやワクシニアウイルス等のウイルスに本発明タンパク質遺伝子を組み込むには、使用しようとするウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するトランスファーベクターを用いることができる。このようなトランスファーベクターの具体的例としては、pVL1392、pVL1393（インビトロジェン社製）等のプラスミドを挙げることができる。本発明タンパク質遺伝子を前記のようなトランスファーベクターに挿入し、当該トランスファーベクターとウイルスゲノムとを同時に宿主細胞に導入すると、トランスファーベクターとウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こり、本発明タンパク質遺伝子がゲノム上に組み込まれた組換えウイルスを得ることができる。ウイルスゲノムとしては、バキュロウイルス、アデノウイルス等のゲノムを用いることができる。尚、ウイルスをベクターに用いる場合には、上述のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスDNAを宿主細胞に導入できるほか、組み換えウイルスを直接、宿主細胞へ感染させることによってもウイルスDNAを宿主細胞に導入することができる。
【００２１】
本発明スプライシング変異体タンパク質は、天然に存在する生物体から抽出、精製等の操作により、天然タンパク質として調製することができるし、又は、遺伝子工学的手法を用いて組換えタンパク質として調製することもできる。例えば、ヒトの細胞、組織から粗抽出液を調製し、種々のカラムを使うことにより、精製タンパク質を調製することができる。ここでの細胞としては、本発明スプライシング変異体タンパク質を産生・発現しているものであれば特に限定されず、例えば、肝臓由来細胞、腎臓由来細胞等を用いることができる。また、本発明スプライシング変異体タンパク質の中でヒト以外の生物において産生・発現されているものについては、当該生物から調製することができる。
【００２２】
本発明スプライシング変異体タンパク質を製造するには、上記ようにして本発明タンパク質遺伝子又は本発明ベクター等を適当な宿主細胞に形質転換し、当該形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を培養して、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生させればよい。産生された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を通常の方法に従って回収する。回収された本発明スプライシング変異体タンパク質は、目的に応じて適当な方法により精製される。例えば、本発明形質転換体が微生物である場合には、当該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機塩、無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養される。培養は一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（試験管振とう式培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等）等が可能である。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更できるが、例えば、約15℃〜約40 ℃の培養温度、pHが約6.0〜約8.0の培地において培養するのが一般的である。培養時間は、培養条件によって異なるが、通常、約1時間〜約24時間である。誘導型のプロモーターを用いている場合は、誘導時間は1日以内が望ましく、通常数時間である。
また、上記形質転換体が哺乳類、昆虫類等の動物細胞である場合には、当該形質転換体は一般の培養細胞における通常の培養に使用される培地を用いて培養することができる。動物細胞の場合には、例えば、終濃度が約5%(v/v)〜約10%(v/v)となるよう牛胎児血清（Fetal Bovine Serum; FBS）を添加した液体培地（インビトロジェン社製等）を用いて37 ℃、5% CO2存在下等の条件で培養すればよい。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えば、0.25%(v/v)程度のトリプシン/PBS溶液を加えて個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し培養を続ける。昆虫類細胞の場合も同様に、例えば、10%(v/v) FBSを含むGrace培地等或いはSF-900（インビトロジェン社製）等の無血清培地を用いて培養温度約25 ℃〜約30 ℃で培養すればよい。また、バキュロウイルス等の組換えウイルスベクターを用いる場合、感染後、72時間以内に細胞を回収するのが望ましい。
本発明形質転換体により産生された本発明スプライシング変異体タンパク質の回収は、適宜、通常の単離、精製の方法を組み合わせて行えばよく、例えば、培養終了後、形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、集められた該細胞を通常のバッファー、例えば、適当なプロテアーゼ阻害剤を含むPBSに懸濁した後、超音波処理、ダウンスホモジナイザー等で破砕し、破砕液を20、000 x gで数十分間から1時間程度遠心分離し、上清画分を回収することにより、目的である本発明スプライシング変異体タンパク質を含む画分を得ることができる。さらに、前記上清画分から通常のタンパク精製技術により各種クロマトグラフィーに供することにより、より精製された目的である本発明スプライシング変異体タンパク質を回収することもできる。尚、本発明スプライシング変異体タンパク質の代わりに本発明ポリペプチドを前述と同様な方法により回収することができる。
【００２３】
このようにして製造された本発明スプライシング変異体タンパク質は、例えば、被験物質と本発明スプライシング変異体タンパク質との結合能や結合量等を評価するためのリガンド・レセプターバインディングアッセイ等に用いることができる。
【００２４】
例えば、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法は、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に被験物質を接触させる工程及び当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の変化を測定する工程を有する。
肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質としては、如何なる肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質であってもよいが、例えば、本発明スプライシング変異体タンパク質を特に適するものとして挙げることができる。
【００２５】
尚、上記方法において、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質と接触させる被験物質の濃度は、通常、約０．１μＭ〜約１０μＭであればよく、１μＭ〜１０μＭが好ましい。肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質と被験物質とを接触させる時間は、通常、１８時間以上６０時間程度であり、好ましくは２４時間から４０時間程度が挙げられる。
【００２６】
本発明スプライシング変異体タンパク質を用いたリガンド・レセプターバインディングアッセイは、当該タンパク質に対する化学物質の結合能の測定や結合量の定量のほか、結合特異性、結合力の分析等が可能な試験方法である。例えば、上述のようにして本発明形質転換体から回収された本発明スプライシング変異体タンパク質に標識されたリガンドが結合している状態において、これに被験物質を共存させると、被験物質と標識リガンドとの競合から、両者の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質への親和性に応じて、標識リガンドが本発明スプライシング変異体タンパク質から遊離し、本発明スプライシング変異体タンパク質に結合した標識リガンドの量が減少し、よって本発明スプライシング変異体タンパク質に結合した標識量が減少する。従って、遊離型の標識リガンドの標識量又は結合型の標識リガンドの標識量をモニターすることにより、被験物質の本発明スプライシング変異体タンパク質への結合能が間接的に分かる。
標識リガンドとしては、例えば、トリチウム標識されたオキシコレステロール等を用いることができる。反応系は大きく3群に分けられる。1つの系は、本発明スプライシング変異体タンパク質に標識リガンドが結合しているところへ溶媒のみが添加される群であり、被験物質の濃度がゼロの系に相当し、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドの本発明スプライシング変異体タンパク質に対する総結合量を示す。もう1つの系は、本発明スプライシング変異体タンパク質に標識リガンドが結合しているところへ、例えば、標識されていないオキシコレステロールが、本発明スプライシング変異体タンパク質を十分飽和し標識リガンドが結合できなくなるだけの濃度（例えば10 μM）となるよう添加された系であり、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドの本発明スプライシング変異体タンパク質に対する非特異的結合量と判断される。従って、本発明スプライシング変異体タンパク質への標識リガンドの特異的結合量は、前者の総結合量から後者の非特異的結合量を引いた値となる。3番目の系は、本発明スプライシング変異体タンパク質に標識リガンドが結合しているところへ、被験物質が、例えば、最終濃度10μM（この濃度は目的により任意に変更する。）となるよう添加された系である。被験物質が本発明スプライシング変異体タンパク質への結合能を有する場合には、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、上記のようにして求めた被験物質の濃度がゼロの時の本発明スプライシング変異体タンパク質への標識リガンドの特異的結合量より小さくなる。このようにしてリガンド・レセプターバインディングアッセイを行うことにより、本発明スプライシング変異体タンパク質に対する被験物質の結合能を調べることができ、被験物質が複数の物質を含む場合にはその中に本発明スプライシング変異体タンパク質に親和性を示す物質が存在するかどうかを調べることもできる。さらに、本発明スプライシング変異体タンパク質に対する被験物質の結合能をより詳細に評価するには、例えば、前記の3番目の系における被験物質の添加濃度を変えて同様にアッセイを行い結合型の標識リガンドの標識量を測定する。当該測定値に基づき、各アッセイにおける結合型と遊離型のリガンド量を算出して、被験物質と本発明スプライシング変異体タンパク質との結合親和性、結合特異性、結合容量等を評価することができる。
【００２７】
また、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が、肝臓X受容体αの結合配列を含む転写制御領域の制御下にある遺伝子の転写を活性化するかどうかの評価は、例えば、肝臓X受容体αの結合配列を含む転写制御領域の下流に連結されてなるレポーター遺伝子を使用して、後述のレポーターアッセイ等の試験方法により評価することができる。肝臓X受容体αは、核内レセプターの1つであるレチノイドX受容体（RXR）とヘテロダイマーを形成し、肝臓X受容体αの結合配列を含む転写制御領域に結合することにより、該転写制御領域の制御下にある遺伝子の転写を制御する。肝臓X受容体αの結合配列としては、”AGGTCA”（又は関連の６ヌクレオチドからなるモチーフ）が同方向に２つ並んだ構造を有するコアモチーフを含む転写調節領域の特定配列（シス配列）をあげることができる。コアモチーフ間のスペーサーはヘテロダイマーの組み合わせにより異なっており、肝臓X受容体とレチノイド受容体とのヘテロダイマーの場合には4 bp（DR4）である（例えば、Lehman et al.、 J. Biol. Chem.、272; 3137-3140、1997参照。）。
【００２８】
既に述べたように、本発明の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子又はそれら部分領域は、当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の機能が直接的又は間接的に関与する病的症状との関連性解明、そして、それら疾患の予防又は治療のための医薬品開発に極めて有用である。そして、上述のようなスクリーニング方法により、選択された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質や、スクリーニング方法により選択された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質に対する拮抗物質を探索し、これら物質を医薬品の候補として提供可能とする。
【００２９】
本発明スクリーニング方法により選抜される物質又は当該物質に対する拮抗物質を有効成分とする薬剤は、その有効量を経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、当該薬剤は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、前記薬剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。前記形態の前記薬剤本脂肪蓄積調節剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
【００３０】
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に本発明スクリーニング方法により選抜される物質又は当該物質に対する拮抗物質を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
【００３１】
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、前記薬剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００３２】
本発明スプライシング変異体タンパク質が直接的又は間接的に関与する病的症状との関連性は、まずリガンドを特定し、次いでリガンドと本発明スプライシング変異体タンパク質とにより転写制御される遺伝子群を特定することによって解明することができる。リガンドの特定は、本発明スプライシング変異体タンパク質又は本発明ポリペプチドに被験物質を接触させることにより、本発明スプライシング変異体タンパク質又は本発明ポリペプチドにより転写制御される遺伝子群の発現レベルの変化を検出することによって行うことができる。
また、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法は、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に被験物質を接触させる工程、当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する工程、及び前記産生量に基づき被験物質の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に対する作用性を評価する工程を有する方法であってもよい。
ここで、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞としては、如何なる肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞であってもよいが、例えば、本発明スプライシング変異体タンパク質を産生する細胞を特に適するものとして挙げることができる。肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞と接触させる被験物質の濃度は、通常、約０．１μＭ〜約１０μＭであればよく、１μＭ〜１０μＭが好ましい。肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常、１８時間以上６０時間程度であり、好ましくは２４時間から４０時間程度が挙げられる。
【００３３】
また、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に作用する物質のスクリーニング方法としては、例えば、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、前記肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のリガンドを接触させ、当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第一工程、本発明スプライシング変異体タンパク質を産生する細胞に、前記肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のリガンド及び被験物質の両者を接触させ、当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質により発現調節を受ける他のタンパク質の産生量を測定する第二工程、及び、前記第一工程と前記第二工程とで測定された前記他のタンパク質の産生量の差異に基づき被験物質の前記リガンドに対する拮抗作用性を評価する工程を有する方法もあげることができる。ここで、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質としては、如何なる肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質であってもよいが、例えば、本発明スプライシング変異体タンパク質を特に適するものとして挙げることができる。肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞と接触させるリガンド又は被験物質の濃度は、通常、約０．１μＭ〜約１０μＭであればよく、１μＭ〜１０μＭが好ましい。肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を産生する細胞とリガンド又は被験物質とを接触させる時間は、通常、１８時間以上６０時間程度であり、好ましくは２４時間から４０時間程度が挙げられる。
さらにまた、一般的に行われているバインディングアッセイ等においては、本発明スプライシング変異体タンパク質又はその断片を用いて行うことができる。また、本発明スプライシング変異体タンパク質と当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が結合する標的遺伝子との発現系を構築し、リガンド添加による標的遺伝子産物であるタンパク質の増加を検出する方法もあげられる。例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチル転移酵素、β−ガラクトシダーゼ等のようなレポータータンパク質を標的遺伝子のプロモーターの制御下で発現するようなレポーター遺伝子を用いることにより、宿主細胞中での標的遺伝子の発現の有無を容易に検出することができる。さらに、本発明スプライシング変異体タンパク質の全長の代わりに、当該タンパク質のリガンド結合領域とDNA結合性タンパク質とのキメラ遺伝子を発現させ、レポーター遺伝子として、DNA結合性タンパク質が結合する塩基配列の下流に最小活性プロモーター及び前述のレポータータンパク質をコードする遺伝子を連結したプラスミドを用いることができる。DNA結合性タンパク質としては、例えば、GAL4、LexA等を用いることができる。本発明スプライシング変異体タンパク質と当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が結合する標的遺伝子との発現系及び当該タンパク質のリガンド結合領域とDNA結合性タンパク質とのキメラ遺伝子を発現させるプラスミドは、通常の遺伝子組換技術により調製することができる。
さらにまた、細胞中で発現されたmRNAから標識化されたDNAを転写させ、得られた標識DNAをDNAライブラリーチップとハイブリダイズさせることにより本発明スプライシング変異体タンパク質により発現制御された遺伝子を特定することもできる。
【００３４】
本発明スプライシング変異体タンパク質が直接的又は間接的に関与する病的症状との関連性は、本発明スプライシング変異体タンパク質を発現する細胞に、アンタゴニスト又はアゴニストを接触させた時の標的遺伝子の発現量と、被験物質を接触させていない前記本発明スプライシング変異体タンパク質発現細胞における標的遺伝子の発現量とを比較することにより、活性化される遺伝子を特定することにより機能の解明が可能である。
【００３５】
本発明スプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法としては、生体試料中のメッセンジャ−RNA（mRNA）から相補的DNA（cDNA）を合成する第一工程、本発明タンパク質遺伝子又は本発明ポリペプチド遺伝子等に対応する前記相補的DNA（cDNA）の部分領域を増幅する第二工程、及び増幅された部分領域を検出する第三工程を有する方法をあげることができる。
【００３６】
本発明タンパク質遺伝子又は本発明ポリペプチド遺伝子等としては、具体的には、配列番号３、４、７又は８で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド等をあげることができる。
【００３７】
また、第二工程において、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドから選択される1つ又は複数をプライマーとして用いるPCR法により増幅するような工程を好ましくあげることもできる。
【００３８】
また、本発明スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド等を発現する能力を欠損させてなる遺伝子欠損動物等の実験動物及びその利用に関しては、本発明スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の機能を有する実験動物由来の内在性スプライシング変異体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を破壊（不活性化）することによりモデル動物を作成し、このモデル動物の物理学的、生物学的、病理学的及び遺伝子的特徴を分析することにより、本発明スプライシング変異体タンパク質の機能と疾病との関連性を解明することも可能となる。
【００３９】
また、前述した内在性肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を破壊（不活性化）されたモデル動物に、本発明のヒト由来遺伝子を導入することにより、本発明のヒト由来遺伝子のみを有するモデル動物を作成し、導入されたヒト由来遺伝子をターゲットとした薬剤（化合物等）を投与することにより、その薬剤の治療学的効果を評価することも可能である。
【００４０】
本発明は、さらに、遺伝子治療法のための、本発明ポリペプチド遺伝子が有する塩基配列に対する特異的DNAプローブの使用や、遺伝子治療法のための、本発明ポリペプチド遺伝子が有する塩基配列に対する特異的RNAプローブの使用も提供する。このような本発明スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列）を有する遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の全部又は一部よりなる、正常型肝臓X受容体αによる正常なコレステロール代謝の阻害に関与する疾患の診断用プローブ及び当該プローブを含有してなる当該障害を伴う疾患の診断薬をも提供するものである。例えば、病理切片に対して本発明タンパク質遺伝子のIn situハイブリダイゼーションを行うことにより、当該障害を伴う疾患の有無や進行具合を検出することができる。
ここで診断用プローブとしては、本発明タンパク質遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ）のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものであれば特に制限されるものではない。当該プローブを診断薬の有効成分とするためには、プローブが分解されないような適当なバッファー類や滅菌水に溶解することが好ましい。また、In situハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、J. Neurobiol. 29、 1-17 (1996)に記載の手法が挙げられる。また、In situ  PCRの方法を利用することも可能である。
前記診断においては、プローブのみならず、本発明スプライシング変異体タンパク質を特異的に認識する抗体（後述参照）を使用することができ、この場合には、免疫染色法により正常型肝臓X受容体αによる正常なコレステロール代謝の阻害に関与する疾患の有無や進行具合を検出することができる（Dev. Biol. 170、 207-222 (1995); J. Neurobiol. 29、 1-17 (1996)参照）。使用される抗体は、例えば、Antibodies; A Laboratory Manual、 Lane、 H、 D. ら編、Cold Spring Harber Lboratory Press 出版New York 1989等に記載の方法により容易に作製される。
【００４１】
本発明タンパク質遺伝子又は本発明ポリペプチド遺伝子は、それ自体、本発明スプライシング変異体タンパク質の機能を遺伝子レベルで制御するアンチセンス医薬品として、遺伝子治療での使用において有用である。例えば、配列番号７又は８に含まれる20塩基以上の塩基配列、好ましくは30塩基前後の塩基配列を用いることができる。
上述のアンチセンス医薬品には、DNAのみならずRNAも含まれる。また、塩基配列は、センス配列でもアンチセンス配列（即ち、センス配列に相補性を有する塩基配列）でも構わない。
【００４２】
ここで「本発明ポリペプチド」、「本発明ポリペプチド遺伝子」とは、前述の如く、本発明スプライシング変異体タンパク質の部分領域（部分ポリペプチド）又はこれに対応する本発明タンパク質遺伝子の部分領域（部分ポリヌクレオチド）であり、正常型肝臓X受容体αには存在しない領域からなるポリペプチド又はこれに対応するポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、少なくとも6個の連続するアミノ酸又は少なくとも１８個の連続する塩基を含むことがよい。
代表的なものとしては、例えば、肝臓X受容体α遺伝子のイントロン５がエクソンとして含まれてなる肝臓X受容体αのアイソフォーム（本発明スプライシング変異体タンパク質５A）のうち、正常型肝臓X受容体αには存在しない領域からなるポリペプチド又はこれに対応するポリヌクレオチドや、肝臓X受容体α遺伝子のイントロン６内の一部領域がエクソンとして含まれてなる肝臓X受容体αのアイソフォーム（本発明スプライシング変異体タンパク質６A）のうち、正常型肝臓X受容体αには存在しない領域からなるポリペプチド又はこれに対応するポリヌクレオチド等をあげることができる。
さらに具体的には、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するもの又はこれに対応する塩基配列（例えば、配列番号７で示される塩基配列）を有するものや、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するもの又はこれに対応する塩基配列（例えば、配列番号８で示される塩基配列）を有するもの等があげられる。
また、上記のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又は上記のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターは、前述の本発明ベクター調製方法に準じて調製すればよい。さらにまた、このようにして調製された組換えベクターを前述の本発明形質転換体調製方法に準じて宿主細胞に導入することにより形質転換体を調製することもできる。
【００４３】
また本発明スプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のうち、配列番号７又は８で示される塩基配列は、プローブ又はプライマーとして本発明スプライシング変異体タンパク質以外のさらなる肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の探索ツールとして利用することが可能である。その長さは少なくとも15個の連続する塩基を含む塩基配列であることが望ましい。プローブは慣用方法により、例えば、放射性同位元素、ジゴキシゲニン、ビオチン、検出可能な酵素等により標識できる。例えば放射能ラベルされたリンを用いる場合、cDNA断片を用いる場合には、ランダムプライミングラベルにより標識し、また、合成プライマーを使用する場合はリン酸化酵素により5'末端標識すると都合がよい。このように標識したプローブをcDNAライブラリーとハイブリダイゼーションしてクローニングを行う。ハイブリダイゼーションは、慣用された方法、条件により行うことができる。例えば、1XSSC、0.5%(w/v) SDS、65 ℃での洗浄である。cDNAライブラリーは、哺乳類を含む動物由来のものであってもよいが、特にヒトの組織・細胞由来のものが望ましい。
【００４４】
また、本発明スプライシング変異体タンパク質を特異的に認識する抗体又は抗体の一部を作製することができる。
配列番号１、２、５又は６で示される本発明スプライシング変異体タンパク質を特異的に認識する抗体は、例えば、前述の遺伝子組換えの常法により得られた本発明スプライシング変異体タンパク質又はその部分領域（ポリペプチド）、或いは配列番号５及び６で示されるペプチド断片を用いて、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ヤギ又はヒツジ等の通常抗体作成に用いられる動物に免疫することにより得ることができる。また、免疫した哺乳動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合することによりモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００４５】
これらの抗体を利用した、本発明スプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法としては、例えば、本発明スプライシング変異体タンパク質若しくは本発明ポリペプチドを特異的に検出することができる抗体を用いた抗原抗体反応に基づき前記肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を検出する工程を有する方法をあげることができる。さらに具体的には、例えば、本発明スプライシング変異体タンパク質若しくは本発明ポリペプチドを特異的に検出することができる第一抗体をマイクロタイターウェルに結合させる第一工程、生体試料中の本発明スプライシング変異体タンパク質が、マイクロタイターウェル上の前記第一抗体に結合させる第二工程、第二工程後、マイクロタイターウェル内の全ての非結合状態にある生体試料を除去する第三工程、前記肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質における、第一抗体とは異なるエピトープに結合することができる標識された第二抗体を、第一抗体に結合された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に結合させる第四工程、第四工程後、マイクロタイターウェル内の全ての非結合状態にある第二抗体を除去する第五工程、第五工程後、第二抗体の存在有無を当該第二抗体が有する標識を指標にして検出する第六工程を有する本発明スプライシング変異体タンパク質の存在有無を検出する方法があげられる。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの特定の実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例１  （肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質遺伝子のクローニング）
市販品として入手できるヒト各組織由来cDNA（クロンテック社製 Multiple Tissue cDNA (MTC) Panels）を鋳型として、ヒト肝臓X受容体α遺伝子のエクソン４からエクソン８までに相当する領域を、プログラム可能なサーマルサイクラーを用いたPCR法により増幅した。プライマーは、ヒト肝臓X受容体α遺伝子の塩基配列（Willy et al.、 Genes Dev. 9: 1033-1045、 1995; GenBank Accession number、 NM_005693）に基づき、エクソン４のセンス鎖の塩基配列を有するプライマー（配列番号９、LXRαF）、及びエクソン８のアンチセンス鎖の塩基配列を有するプライマー（配列番号１０、LXRαR）を設計し、化学合成した。PCR法の反応条件は、下記の通りであった。1.25 unitのEx Taq DNA Polymerase  (宝酒造社製)、200 nmolのセンスプライマーLXRαF（配列番号９）、200 nmolのアンチセンスプライマーLXRαR（配列番号１０）及び鋳型である一本鎖cDNAを含む50 μｌの反応液（MgCl２、デオキシリボヌクレオチド混合液を含む）を準備した。この反応液を、95 ℃で3分間熱変性した後、94 ℃で30秒間、55 ℃で30秒間及び74 ℃で60秒間を1サイクルとして35サイクルの反応に供した。得られたPCR産物を、1%アガロースゲルにて電気泳動し、DNA断片の増幅を確認した後、1 μｌのPCR産物をpGEM-T Easy vector（プロメガ社製）にTAクローニングシステムを用いてライゲーションした。ライゲーションは、用いたキットにより推奨される方法に従って行われた。得られたライゲーション反応液により、大腸菌JM109株のコンピテントセル（宝酒造社製）が、製造者により推奨される方法に従って形質転換された。得られた菌体を、X-gal及びイソプロピルβ-D-ガラクトピラノシド（IPTG）が塗布された、アンピシリンを含むLB寒天培地上にまき、これを37 ℃で一晩培養した。培養後、当該寒天培地上に形成されたアンピシリン耐性白色コロニーをアンピシリンを含む3 mlのLB液体培地に植菌し、これを37℃で一晩培養して増殖させた。増殖された大腸菌から、プラスミドDNAを通常の方法に従い抽出し、単離した。単離されたプラスミドDNAを制限酵素Eco RIにより切断した後、これを1％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、紫外線照射下で、挿入されたDNA断片の大きさを確認した。さらに、挿入されたDNA断片の塩基配列を決定した。このようにして、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質遺伝子がクローニングされた。
【００４８】
実施例２  （肝臓X受容体αのバンドの同定：選択的スプライシング転写物の存在）
配列番号９及び１０で示される肝臓X受容体αに特異的なプライマー（LXRαF及びLXRαR）を用い、かつヒト正常組織又はヒトガン組織由来のcDNA を鋳型に用いてDNA断片の増幅を行った。その結果を図２に示す。矢印により示された506塩基対からなるバンドは、公知である正常型肝臓X受容体α遺伝子に由来する増幅バンドに相当した。これ以外に、PCRの反応条件を変化させても消失しない２種のバンド、即ちより低分子量のバンド及びより高分子量のバンドが存在することが明らかになった（図２参照）。これらのバンドは、肝臓X受容体αの選択的スプライシング転写物が存在する可能性を示唆する。
【００４９】
実施例３  （肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質遺伝子のクロ−ニング）
肝臓X受容体αに関連したPCR産物をクローニングし、その塩基配列を決定した。増幅及びクローニングのためのPCR用プライマーには、実施例１で用いられた、センスプライマー（LXRαF；配列番号９）及びアンチセンスプライマー（LXRαR列番号１０）を用いた。ヒト正常組織及びヒトガン組織由来のcDNAを鋳型として用いてPCRを行い、得られたPCR産物を直接、TAクローニング法によりpGEM-T Easy vector（プロメガ社製）にライゲーションした。実施例１と同様に、挿入されたDNA断片の大きさを確認した後、さらに挿入されたDNA断片の塩基配列を決定した。その結果、ヒト正常組織由来の肝臓X受容体αからエクソン５にコードされるアミノ酸配列が欠失した肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質D5をコードするDNAに加えて、新たに２つの新規な肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質（イントロン５にコードされるアミノ酸配列が挿入された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質及びイントロン６内の一部領域にコードされるアミノ酸配列が挿入された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質）にコードするDNAが存在することが明らかとなった。
【００５０】
実施例４  （イントロン５にコードされるアミノ酸配列が挿入された肝臓X受容体αスプ  ライシング変異体タンパク質の同定）
イントロン５にコードされるアミノ酸配列が挿入された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質をコードする翻訳領域全体を単離するために、新たに翻訳領域全体を増幅できるようなプライマーを設計した。センスプライマーとしてhLXRα(ORF)−F／H(配列番号１１)及びアンチセンスプライマーとしてhLXRα(ORF)−R／B(配列番号１２)を用いかつヒト肝臓由来cDNA（クロンテック社製）を鋳型に用いてPCR法によりＤＮＡ断片の増幅を行った。PCR法の反応条件は、下記の通りであった。1.25 unitのEx Taq DNA Polymerase  (宝酒造社製)、200 nmolのセンスプライマーhLXRα(ORF)−F／H(配列番号１１)、200 nmolのアンチセンスプライマーhLXRα(ORF)−R／B(配列番号１２)及び鋳型である一本鎖cDNA（クロンテック社製の肝臓由来cDNA）を含む50 μｌの反応液（MgCl２、デオキシリボヌクレオチド混合液を含む）を準備した。この反応液を、96 ℃で3分間熱変性した後、96 ℃で30秒間、55 ℃で30秒間及び72 ℃で90秒間を1サイクルとして35サイクルの反応に供した。得られたPCR産物の一部を、臭化エチジウムを含む1%アガロースゲルにて電気泳動し、DNA断片の増幅を確認した後、1 μｌのPCR産物をpGEM-T Easy vector（プロメガ社製）にTAクローニングシステムを用いてライゲーションした。ライゲーションは、用いたキットにより推奨される方法に従って行われた。得られたライゲーション反応液により、大腸菌JM109株のコンピテントセル（宝酒造社製）が、製造者により推奨される方法に従って形質転換された。得られた菌体を、X-gal及びイソプロピルβ-D-ガラクトピラノシド（IPTG）が塗布されたアンピシリンを含むLB寒天培地上にまき、これを37 ℃で一晩培養した。培養後、当該寒天培地上にアンピシリン耐性白色コロニーを形成した形質転換体を用いてコロニーPCRを行うことにより、イントロン５が挿入された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質をコードする翻訳領域全体を含むクローンの検出を行った。コロニーPCR法の反応条件は下記の通りであった。センスプライマーとしてLXRαF(配列番号９)、アンチセンスプライマーとしてイントロン５内の塩基配列に基づき設計された特異的プライマーLXRα５A−R(配列番号１３)を用いた。これら２種のプライマー、Ex Taq DNA Polymerase(宝酒造社製)、及び200 nM デオキシリボヌクレオチド混合液を含む反応液を準備した。これに、プレートから採取されたわずかな量の上記の白色を呈する形質転換体を懸濁した後、この反応液を95 ℃で5分間熱変性した後、94 ℃で30秒間、55 ℃で30秒間及び74 ℃で30秒間を1サイクルとして25サイクルの反応に供した。得られたPCR産物を臭化エチジウムを含むアガロースゲルにて電気泳動し、ＤＮＡ断片の増幅を確認した後、ＤＮＡ断片の増幅が確認された形質転換体からプラスミドを抽出した。当該プラスミド中に挿入されたDNA断片の塩基配列を確認することにより、イントロン５が挿入された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を含む翻訳領域全体を含むクローンを得た。当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質は、正常型肝臓X受容体αに、イントロン５にコードされるアミノ酸配列が挿入されており、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質5Aと命名された。図１は、ヒト正常型肝臓X受容体αをコードする翻訳領域と肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質5Aをコードする翻訳領域との比較を表している。ヒト正常型肝臓X受容体αをコードする翻訳領域と比較して、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質5Aをコードする翻訳領域の相違点は、イントロン５が翻訳領域に含まれる点のみであり、その他の塩基配列には違いは認められなかった。イントロン５がエクソン５と６との間に新たな翻訳領域として挿入されても、挿入される塩基数(配列番号７)が192個(64アミノ酸；配列番号５)、即ち３の倍数であることから、エクソン６以降の読み枠は正常型と全く同じであった。肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質5Aをコードする翻訳領域に由来するアミノ酸配列は、511アミノ酸（1533塩基）からなるタンパク質となる。肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列のうち、イントロン５にコードされるアミノ酸配列（配列番号５）の相同性を、ゲノムデータベース及びタンパク質データベースを用いて検索したところ、30％を超える相同性を有するアミノ酸配列はデータベースに存在しないことが判った。このことから、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の、イントロン５にコードされるアミノ酸配列（配列番号５）は新規であることが確認された。
【００５１】
実施例５  （エクソン６の下流に付加された新規な塩基配列（109塩基）を含む、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質をコードする翻訳領域の同定）
イントロン６内の一部領域が挿入された、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質をコードする翻訳領域全体を単離するために、実施例４と同様に、センスプライマーとしてhLXRα(ORF)−F／H(配列番号１１)及びアンチセンスプライマーとしてhLXRα(ORF)−R／B(配列番号１２)を用い、かつヒト肝臓由来cDNA（クロンテック社製）を鋳型に用いてPCR法によりＤＮＡ断片の増幅を行った。
PCR法の反応条件は、下記の通りであった。LA Taq DNA Polymerase（宝酒造社製）、200 nmolのセンスプライマー、200 nmolのアンチセンスプライマー及び鋳型である一本鎖cDNA（クロンテック社製の肝臓由来cDNA）を含む50 μｌの反応液（MgCl２、デオキシリボヌクレオチド混合液を含む）を準備した。この反応液を、96 ℃で3分間熱変性した後、96 ℃で30秒間、55 ℃で30秒間及び72 ℃で90秒間を1サイクルとして35サイクルの反応に供した。得られたPCR産物の一部を、臭化エチジウムを含むアガロースゲルにて電気泳動し、DNA断片の増幅を確認した後、PCR産物をpGEM-T Easy vector（プロメガ社製）にTAクローニングシステムを用いてライゲーションした。ライゲーションは、用いたキットにより推奨される方法に従って行われた。得られたライゲーション反応液により、大腸菌JM109株のコンピテントセル（宝酒造社製）が、製造者により推奨される方法に従って形質転換された。得られた菌体を、X-gal及びイソプロピルβ-D-ガラクトピラノシド（IPTG）が塗布されたアンピシリンを含むLB寒天培地上にまき、これを37 ℃で一晩培養した。培養後、当該寒天培地上にアンピシリン耐性白色コロニー形成した形質転換体を用いてコロニーPCRを行うことにより、イントロン６が挿入された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質をコードする翻訳領域全体を含むクローンの検出を行った。コロニーPCR法の反応条件は下記の通りであった。センスプライマーとしてLXRαF(配列番号９)、アンチセンスプライマーとしてイントロン６内の塩基配列に基づき設計された特異的プライマーLXRα６A−R(配列番号14)を用いた。これら２種のプライマー、Ex Taq DNA Polymerase(宝酒造社製)、及び200 nM デオキシリボヌクレオチド混合液を含む30μlの反応液を準備した。これに、プレートから採取されたわずかな量の上記の白色を呈する形質転換体を懸濁した後、この反応液を95 ℃で5分間熱変性した後、94 ℃で30秒間、55 ℃で30秒間及び74 ℃で30秒間を1サイクルとして25サイクルの反応に供した。得られたPCR産物を臭化エチジウムを含むアガロースゲルにて電気泳動し、ＤＮＡ断片の増幅を確認した後、ＤＮＡ断片の増幅が確認された形質転換体からプラスミドを抽出した。当該プラスミド中に挿入されたDNA断片の塩基配列を確認することにより、イントロン６内の一部領域が挿入された肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を含む翻訳領域全体を含むクローンを得た。当該肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質は、イントロン６内の一部領域の塩基配列（即ち、エクソン６Aと呼ばれる塩基配列）がエクソン６の下流に挿入された翻訳領域によりコードされることを表すため、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質6Aと命名された。図１は、ヒト正常型肝臓X受容体αをコードする翻訳領域と肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質6Aをコードする翻訳領域との比較を表している。ヒト正常型肝臓X受容体αをコードする翻訳領域と比較して、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質6Aをコードする翻訳領域の相違点は、イントロン６の一部領域が翻訳領域に含まれる点のみであり、その他の塩基配列には違いは認められなかった。イントロン６の塩基配列のうち、109塩基対（配列番号８）からなる領域がエクソン６と７との間に新たな翻訳領域として挿入され���と、途中に新たな停止コドンが出現することから、結局、新たな26アミノ酸（配列番号６）がエクソン６にコードされるアミノ酸配列の下流につながることとなる。つまり、356アミノ酸からなる新たなポリペプチド（配列番号２）が産生される。肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のアミノ酸配列のうち、イントロン６の一部領域にコードされるアミノ酸配列（配列番号６）の相同性を、ゲノムデータベース及びタンパク質データベースを用いて検索したところ、30％を超える相同性を有するアミノ酸配列はデータベースに存在しないことが判った。このことから、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質のイントロン６の一部領域にコードされるアミノ酸配列（配列番号６）は新規であることが確認された。
【００５２】
実施例６  （ヒト組織における３種類の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質遺伝子の転写物の存在） 
本発明により見い出された３つの肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質がヒト正常組織及びヒトガン組織由来のRNA中に存在するのかを確認する。各々の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を特異的に増幅させる、配列番号９、１０、１３及び１４で示されるプライマーを用いかつヒト正常組織及びヒトガン組織由来のcDNAを鋳型に用いてPCRを行った。当該PCRにおいて、プライマーとしてLXRαF（配列番号９）及びLXRαR（配列番号１０）を用いる場合には、正常型肝臓X受容体α由来のＤＮＡ断片の増幅は506塩基対を有するＤＮＡ断片の増幅となり、肝臓X受容体αD5由来のＤＮＡ断片の増幅は416塩基対を有するＤＮＡ断片の増幅となる。一方、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質5Aを特異的に増幅させる配列番号９及び１３で示されるプライマーを用い上記と同様にPCRを行うと、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質5A由来のＤＮＡ断片の増幅は432塩基対を有するＤＮＡ断片の増幅となり、また、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質6Aを特異的に増幅させる配列番号９及び１４で示されるプライマーを用い上記と同様にPCRを行うと、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質6A由来のＤＮＡ断片の増幅は428塩基対を有するＤＮＡ断片の増幅となる。尚、コントロールとして、試薬中のDNA混入をチェックするために、鋳型DNA非存在のPCRを行った。その結果を図2、図3及び図4に示した。
これらの図から明らかなように、
１）正常型肝臓X受容体αはいずれのヒト正常組織及びヒトガン組織において発現していた。
２）肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質5Aは、一部のヒトガン組織において発現していた。
３）肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質6Aは、ヒト循環器系組織において高発現していた。
４）肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質D5は、ヒトガン組織において高レベルに発現していた。
尚、コントロールは常に陰性であった。これらの結果は各々の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が、組織特異的に発現していることを示しており、特異的な発現制御を受けていることが判明した。
【００５３】
実施例７  （肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質発現ベクターの構築）
正常型肝臓X受容体α及び3種類の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質が各々クローニングされたプラスミドを、製造者により推奨された方法に従って、制限酵素Hind III及びBamH Iで切断した。当該酵素による処理液をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルからインサートDNAに相当するＤＮＡ断片を回収した。回収されたＤＮＡ断片は、あらかじめHind III及びBamH Iで切断しておいたpFLAG-CMV2(シグマ)にクローニングした。Hind III及びBamIH Iで切断しておいたpFLAG-CMV2（約300 ng）と上記のインサートDNA（約500 ng）とを混合した後、これにT4リガーゼを添加し、当該混合物を16 ℃で30分間のライゲーションを行った。ライゲーションは、用いたキットにより推奨される方法に従って行われた。得られたライゲーション反応液により、大腸菌JM109株のコンピテントセル（宝酒造社製）が、製造者により推奨される方法に従って形質転換された。得られた菌体を、X-gal及びイソプロピルβ-D-ガラクトピラノシド（IPTG）が塗布されたアンピシリンを含むLB寒天培地上にまき、これを37 ℃で一晩培養した。培養後、当該寒天培地上に形成されたアンピシリン耐性白色コロニーからプラスミドDNAを調製した。さらに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列を、前述のダイレクトシークエンスで得られた塩基配列と比較して、翻訳領域の塩基配列が完全に一致していることが確認されたプラスミドを選択し、各々のプラスミドをpCMV2-hLXRαWT、pCMV2-hLXRα5A、pCMV2-hLXRα6A、pCMV2-hLXRαD5と命名した。
【００５４】
実施例８  （肝臓X受容体αの結合配列を有するルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むプラスミドの作製）
マウスメタロチオネインI遺伝子のTATAボックス近傍の塩基配列とリーダー配列に由来する塩基配列からなる２本のオリゴヌクレオチド、即ち、配列番号１５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをアニーリングさせて2本鎖ＤＮＡとし、これにT４ポリヌクレオチドキナーゼを作用させて、その両末端をリン酸化した（以下、当該ＤＮＡをTATA DNAと記す）。一方、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpGL3-Basicベクター（プロメガ社製）を制限酵素Bgl II及びHind IIIで消化した後、これに細菌由来アルカリフォスファターゼ (BAP)を加えて65℃で1時間保温した。次いで、当該保温液を低融点アガロース（Agarose L；ニッポンジーン社製）を用いた電気泳動に供した後、検出されたバンド部分のゲルからＤＮＡ断片を回収した。回収された約100 ngのＤＮＡ断片と、約１μｇの前記のTATA  DNAとを混合し、T4リガーゼで結合させることによりプラスミドpGL3-TATAを作製した。
肝臓X受容体αの結合配列（LXRE）を含むヒトチトクロームP450ファミリーのコレステロール 7α-ヒドロキシラーゼ（CYP7A1）遺伝子上流の塩基配列（配列番号１７）からなるオリゴヌクレオチド及び当該塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号１８）を合成し、これらをアニーリングさせて2本鎖DNA（以下、LXRE DNAと記す。）とした後、これにT4リガーゼを作用させることにより、LXRE DNAをタンデムに結合させた。得られたＤＮＡ断片にT4ポリヌクレオチドキナーゼを作用させてその両末端をリン酸化することにより、リン酸化タンデム結合型DNA断片を得た。
次に、pGL3-TATAを制限酵素Mlu Iで消化した後、大腸菌由来アルカリホスファターゼを加えて65 ℃で1時間保温した。当該保温液を低融点アガロースゲル電気泳動に供した後、検出されたバンド部分のゲルからDNA断片を回収した。回収された約100 ngのＤＮＡと、約１μｇの上記のリン酸化タンデム結合型DNA断片とを混合した後、これにT4リガーゼを添加し、当該混合物を16℃で30分間のライゲーションを行った。ライゲーションは、用いたキットにより推奨される方法に従って行われた。得られたライゲーション反応液により、大腸菌DH5αコンピテントセル（宝酒造社製）が、製造者により推奨される方法に従って形質転換された。得られた菌体を、X-gal及びイソプロピルβ-D-ガラクトピラノシド（IPTG）が塗布されたアンピシリンを含むLB寒天培地上にまき、これを37 ℃で一晩培養した。培養後、当該寒天培地上に形成されたアンピシリン耐性白色コロニーからプラスミドDNAを調製した。さらに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列から、pGL3-TATAのMluI部位にLXRE DNAがタンデムに4つ結合されてなるDNA断片を有するプラスミドを選択し、これをプラスミドpGL3-TATA-LXREx4と命名した。
【００５５】
実施例９  （一過性発現系におけるレポーターアッセイによる肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の機能評価）
ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞株（ATCC; CRL-1573）を、チャコールデキストランにより低分子物質を除去した牛胎児血清(FBS) 10%と抗生物質としてペニシリン（100 unit/ml）とストレプトマイシン（100 μg/ml）とを含み、フェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において5％ CO2存在下37 ℃にて継代培養した。継代培養されたHEK293細胞株を10cm細胞培養用ディッシュに約2 X 106個になるように捲いた。これを37 ℃で1日間培養した後、当該細胞に、Effectene（キアゲン社製）を用いて当該キットが推奨する方法に従って、各々1 μgの正常型肝臓X受容体α及びヒト肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質発現プラスミドとレポータープラスミドpGL3-TATA LXRE x4とを導入した。これを37 ℃で24時間培養した後、当該細胞をピペッティングにより回収した。回収された細胞を均一懸濁した後、これを96穴プレートに播種した。さらに、当該プレートにエタノールで溶解しておいた各種の化合物が添加された。これを37 ℃でさらに約2日間培養した後、当該プレートに5倍に希釈された細胞溶解剤PGC50（ニッポンジーン社製）を50 μl／wellずつ加えて、時々軽くゆすりながら室温で30分間放置することにより、細胞を溶解させた。このようにして調製された細胞溶解液を10 μlずつ96穴白色サンプルプレート（ベルトールド社製）に採取し、ルミノメーターLB96p（ベルトールド社製）で50 μl/wellずつ酵素基質液PGL100（ニッポンジーン社製）を添加し、直ちに発光量を5秒間測定した。
正常型肝臓X受容体α又は肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質に対する各種肝臓X受容体αリガンド(アゴニスト)の測定結果をそれぞれ図５及び６に示した。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、正常型肝臓X受容体αによる正常なコレステロール代謝の阻害に関与する新規な肝臓X受容体αのアイソフォームである肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質、その遺伝子及びそれらの利用が提供可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、正常型肝臓X受容体α遺伝子と3種類の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質遺伝子の構造ドメインを図式的に示した図である。翻訳領域は黒色で示した。
【図２】図２は、ヒト正常組織又はヒトガン組織由来のcDNAを鋳型に用いかつ肝臓X受容体αに特異的なプライマー（LXRαF及びLXRαR）を用いて行ったPCRにより増幅されたPCR産物の一部を、臭化エチジウムを含む1%アガロースゲル電気泳動に供し、電気泳動後、紫外線照射下で増幅シグナルを可視化した結果を示した図である。
【図３】図３は、ヒト正常組織又はヒトガン組織由来のcDNAを鋳型に用いかつ3種類の各々の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質を特異的に増幅するプライマーセットを用いて行ったPCRにより増幅されたPCR産物を示した図である。上段の図は、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質5Aを特異的に増幅するように設計された、配列番号９及び１３で示されるプライマーを用いて行ったPCRにより増幅されたPCR産物を示したものである。hLXRα5Aに由来するPCR産物は432塩基対を有するDNA断片である。下段の図は、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質6Aを特異的に増幅するように設計された、配列番号９及び１４で示されるプライマーを用いて行ったPCRにより増幅されたPCR産物を示したものである。肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質6Aに由来するPCR産物は429塩基対を有するDNA断片である。各々のPCR反応により得られたPCR産物は、TAクローニング後、その塩基配列の決定を行い、目的物が増幅されていることを確認した。
【図４】図４は、正常型肝臓X受容体α及び3種類の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質の循環器系組織における発現を調べた結果を示した図である。上段の図は、正常型肝臓X受容体α及び肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質D5の発現を調べた一例である。肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質D5に由来するPCR産物は416塩基対を有するDNA断片である。中段の図は、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質5Aを特異的に増幅するように設計された、配列番号９及び１３で示されるプライマーを用いて行ったPCRにより増幅されたPCR産物を示したものである。hLXRα5Aに由来するPCR産物は432塩基対を有するDNA断片である。下段の図は、肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質6Aを特異的に増幅するように設計された配列番号９及び１４で示されるプライマーを用いて行ったPCRにより増幅されたPCR産物を示したものである。肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質６Aに由来するPCR産物は429塩基対を有するDNA断片である。各々のPCR反応により得られたPCR産物は、TAクローニング後、その塩基配列の決定を行い、目的物が増幅されていることを確認した。
【図５】図５は、HEK293細胞における一過性発現系におけるレポーターアッセイによる肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質（D5,5A及び6A）の機能評価の結果を示した図である。TATA-LXREx４-luciferaseベクターと3種類の各々の肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質発現ベクターとをHEK293細胞に導入し、各種肝臓X受容体αリガンドを加えた時の転写活性化能を測定した結果を示している。無処理区は白色で表し、1 μg/mlの 22R-ヒドロキシコレステロール処理区は黒色で表し、1 μg/mlの 25-ヒドロキシコレステロール処理区は灰色で表した。また、各々の試験区では1 μM の9-cis レチノイン酸を含む。溶媒のみ添加した対照区（コントロール）におけるルシフェラーゼ活性の値を100%として、各試験区におけるルシフェラーゼ活性の値を相対値として示した。WTは正常型肝臓X受容体αを意味している。
【図６】図６は、HEK293細胞において、正常型肝臓X受容体α（LXRαWT）発現ベクターと肝臓X受容体αスプライシング変異体タンパク質（LXRαD5、LXRα5A、LXRα6A）発現ベクターとを共存させた時の転写活性化能を測定した結果を示した図である。無処理区は白色で表し、1 μg/mlの 22R-ヒドロキシコレステロール処理区は黒色で表し、1 μg/mlの 25-ヒドロキシコレステロール処理区は灰色で表した。また、各々の試験区では1 μMの 9-cis レチノイン酸を含む。溶媒のみ添加した対照区（コントロール）におけるルシフェラーゼ活性の値を100%として、各試験区におけるルシフェラーゼ活性の値を相対値として示した。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
配列番号９
ＰＣＲのためのデサインされたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
ＰＣＲのためのデサインされたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのためのデサインされたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのためのデサインされたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのためのデサインされたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
プロモーターＤＮＡを合成するためのデサインされたオリゴヌクレオチド
配列番号１６
プロモーターＤＮＡを合成するためのデサインされたオリゴヌクレオチド
配列番号１７
肝臓Ｘ受容体結合エレメントを合成するためのデサインされたオリゴヌクレオチド
配列番号１８
肝臓Ｘ受容体結合エレメントを合成するためのデサインされたオリゴヌクレオチド
【図１】
2004357705.tif 000002
【図２】
2004357705.tif 000003
【図３】
2004357705.tif 000004
【図４】
2004357705.tif 000005
【図５】
2004357705.tif 000006
【図６】
2004357705.tif 000007
【配列表】
2004357705000001.app