(57)【要約】【課題】ＬＯＸ−１遺伝子対の発現が不活性化された遺伝子改変動物を得ることができれば、個体レベルでＬＯＸ−１の生理機能を解明することができ、該遺伝子に関連した、動脈硬化等を含む疾患の治療薬等の研究に利用することも可能となる。【解決手段】遺伝子ターゲティング法によりＬＯＸ−１遺伝子欠損マウスを作製した。作製されたＬＯＸ−１遺伝子欠損マウスを用いた解析により、ＬＯＸ−１アンタゴニストは内皮機能が低下している病態の改善に有用であることが明らかとなった。また、原虫の感染においてもＬＯＸ−１が関与していることが明らかとなった。このように、本発明のＬＯＸ−１遺伝子欠損動物は、ＬＯＸ−１の新規機能を明らかにしていくために有用なモデル動物である。また、本発明のＬＯＸ−１遺伝子の機能がノックアウトされたマウスは、動脈硬化の発症、進展、その他未知のＬＯＸ−１遺伝子の役割を探る上で有用なモデルマウスとなる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制されたＥＳ細胞。
【請求項２】
ＬＯＸ−１遺伝子対の一方または両方の遺伝子が欠損されることによりＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制されている、請求項１記載のＥＳ細胞。
【請求項３】
遺伝子の欠損が外来遺伝子の挿入によるものである、請求項１記載のＥＳ細胞。
【請求項４】
ＥＳ細胞がげっ歯類由来の細胞である、請求項１記載のＥＳ細胞。
【請求項５】
ＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物。
【請求項６】
ＬＯＸ−１遺伝子対の一方または両方の遺伝子が欠損されることによりＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制されている、請求項５記載の非ヒト動物。
【請求項７】
遺伝子の欠損が外来遺伝子の挿入によるものである、請求項５記載の非ヒト動物。
【請求項８】
非ヒト動物がげっ歯類である請求項５記載の非ヒト動物。
【請求項９】
以下の工程を含む  ＬＯＸ−１アゴニスト及び／または促進剤のスクリーニング方法、
（１）請求項５〜８のいずれか１項に記載の非ヒト動物に対しバベシア原虫を感染させる工程
（２）（１）の動物に被験物質を投与する工程
（３）原虫による感染症の症状を緩和させる被験物質を選択する工程
【請求項１０】
ＬＯＸ−１アゴニスト及び／若しくは促進剤、または発現促進剤を有効成分とする原虫感染症治療用組成物。
【請求項１１】
ＬＯＸ−１アンタゴニスト及び／若しくは阻害剤、またはＬＯＸ−１発現抑制剤を有効成分とする虚血性疾患、高脂血症、糖尿病及び高血圧病治療用組成物。
【請求項１２】
ＬＯＸ−１アンタゴニスト及び／若しくは阻害剤、またはＬＯＸ−１発現抑制剤を有効成分とする抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＬＯＸ−１遺伝子がノックアウトされた細胞及び動物、並びに、それらの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血管内皮細胞の機能異常は、動脈硬化を含む種々の病態との密接な関係を有する。動脈硬化、高血圧、及び糖尿病のモデル動物、並びに、患者の血管で観察される血管弛緩作用の低下は、血管内皮細胞からの一酸化窒素（ＮＯ）放出の減少が原因であると考えられている。また、動脈硬化巣でよく見られるマクロファージの浸潤には、血管内皮細胞からの遊走因子の分泌、接着因子の発現上昇が関与することが知られている。種々の刺激がこれらの内皮細胞の変化に関与していると考えられるが、酸化された低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ；  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）により上述のような内皮細胞の変化が誘導されることが既に示されており、注目を集めている（Ｏｋａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：  ９５３５−４０；  Ｋａｋｕｔａｎｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：  ３６０−４）。
【０００３】
酸化ＬＤＬ（以下、ｏｘＬＤＬ）受容体（ＬＯＸ−１；  ｌｅｃｔｉｎ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）は、血管内皮細胞におけるｏｘＬＤＬ受容体の一つとしてクローニングされ  （Ｓａｗａｍｕｒａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：  ７３−７）、マクロファージ及び血管内皮細胞に存在することが明らかにされている。ＬＯＸ−１は、血管内皮細胞において、ｏｘＬＤＬ、並びに、高脂血症、高血圧、及び糖尿病等の動脈硬化関連因子により発現が誘導され、動脈硬化巣においてはその発現が亢進していることが示されている。ＬＯＸ−１を介したｏｘＬＤＬの取り込みが内皮細胞死を誘導することは公知の事実である。ヒトＬＯＸ−１遺伝子の構造解析及びＬＯＸ−１の生理的リガンドの同定も既に行われている。また、ｏｘＬＤＬによる内皮細胞におけるＮＯ産生不全が高親和性アルギニン輸送の阻害および活性酸素の産生に起因することが示されている。さらに、ＬＯＸ−１に対する中和抗体を用いた実験から、ＬＯＸ−１アンタゴニストが、動脈硬化等の疾患に有効である可能性も示唆されている。
【０００４】
マクロファージの異物認識・取込みの機構には免疫機構を介した機構、及び介さない機構が知られている。後者の免疫機構を介さない機構は、スカベンジャー機構とも呼ばれ、その代表的な受容体としてＩ型、ＩＩ型クラスＡマクロファージスカベンジャー受容体（ＳＲ−ＡＩ／ＩＩ）が知られている。ＬＯＸ−１もＳＲ−ＡＩ／ＩＩと同じくスカベンジャー受容体ファミリーに属する蛋白質である。ＳＲ−ＡＩ／ＩＩについては、動脈硬化の発症及び進展、病原微生物の感染防御、異物老廃物の除去、原虫感染症に関与していることが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：  ２９２  （１９９７）；Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９１：  １４７  （２０００）；  Ｊ．Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８６：  １４３１  （１９９７）；  Ｊ．  Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．  Ｒｅｓ．  ７：  ８１  （１９９７）；  Ａｍ．  Ｊ．  Ｔｒｏｐ．  Ｍｅｄ．  Ｈｙｇ．  ５９：  ８４３  （１９９８））。従って、ＬＯＸ−１もＳＲ−ＡＩ／ＩＩと同様に、これらの疾患及び感染症に関与している可能性が考えられる。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｓａｗａｍｕｒａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：  ７３−７
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ＬＯＸ−１遺伝子対の発現が不活性化された遺伝子改変動物を得ることができれば、個体レベルでＬＯＸ−１の生理機能を解明することができ、該遺伝子に関連した、動脈硬化等を含む虚血性疾患の治療薬等の研究に利用することも可能となる。また、このようなＬＯＸ−１遺伝子の機能がノックアウトされたマウスは、動脈硬化の発症、進展、その他未知のＬＯＸ−１遺伝子の役割を探る上で有用なモデルマウスとなる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで、ＬＯＸ−１遺伝子の機能を探るために、ＬＯＸ−１遺伝子欠損マウス（以下、ＬＯＸ−１ＫＯマウス）の作製を試みた。様々な検討を行い、本明細書の実施例において示したようにマウスＬＯＸ−１遺伝子をクローニングして相同組換え用のベクターを構築し、該ベクターを用いた相同組換えにより変異ＬＯＸ−１遺伝子を持つＥＳ細胞を樹立し、キメラ胚を作製し、ヘテロ欠損マウスを交配することによりホモ欠損マウスを得ることに成功した。該マウスを使用することにより、以下の機能を確認することができた。
【０００８】
（１）感染における機能
ＬＯＸ−１遺伝子欠損（ＫＯ）マウスに対するＢａｂｅｓｉａ ｒｏｄｈａｉｎｉ感染実験を行った。その結果、Ｂａｂｅｓｉａ ｒｏｄｈａｉｎｉ（１０，０００  ＩＲＢＣ（ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ；感染赤血球））感染後の生存率について、ＫＯマウスと野生型マウスとの間に差は認められなかったが、パラシテミアのより早期且つ急速に上昇する傾向、及びヘマトクリット値の有意な減少がＫＯマウスで観察された。また、ＫＯマウスに対するＢａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ（１×１０７  ＩＲＢＣ）感染においては、野生型マウスでは２峰性のパラシテミアのピークを示すのに対し、ＫＯマウスでは３峰性に推移することが観察された。ヘマトクリット値の推移には野生型マウスとの差は認められなかった。以上、マラリアと同様に赤血球に寄生するバベシア原虫の感染実験により、Ｌｏｘ−１のこの原虫感染症への関与を示唆する成績が得られた。
【０００９】
（２）血管内皮機能
血管収縮物質であるプロスタグランジンＦ（ＰＧＦ）２αとアセチルコリンを用い、本発明のマウスにおいて血管内皮機能評価を行い、ｏｘＬＤＬの内皮機能傷害作用がＬＯＸ−１を介したシグナルに基づくことが明らかとなった。そして、ＬＯＸ−１アンタゴニスト及び／または阻害剤は内皮機能を亢進すると考えられ、ＬＯＸ−１アンタゴニストが内皮機能の低下した病態の改善に有用であることが示された。
【００１０】
（３）炎症における機能
ＬＯＸ−１遺伝子欠損（ＫＯ）マウス及び正常マウスにおけるカラゲニン足浮腫に対する作用を検討し、浮腫率及び病理組織所見から、ＬＯＸ−１遺伝子がノックアウトされたマウスでは正常マウスに比べ炎症反応が抑制されることが示された。
【００１１】
その結果、ＬＯＸ−１アンタゴニスト及び／または阻害剤が虚血性疾患、高脂血症、糖尿病、及び高血圧病を処置するのに有用であること、並びに、ＬＯＸ−１のアゴニスト及び／または促進剤が原虫感染症を処置するのに有用であることが判明した。また、ＬＯＸ−１遺伝子を欠損するトランスジェニック動物を利用することにより、これら有用なアンタゴニスト及び／または阻害剤、並びに、アゴニスト及び／または促進剤をスクリーニングし得ることを思い至り、本発明を完成した。本発明はより詳細には、
［１］ＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制されたＥＳ細胞、
［２］ＬＯＸ−１遺伝子対の一方または両方の遺伝子が欠損されることによりＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制されている、上記［１］記載のＥＳ細胞、
［３］遺伝子の欠損が外来遺伝子の挿入によるものである上記［１］記載のＥＳ細胞、
［４］ＥＳ細胞がげっ歯類由来の細胞である、上記［１］記載のＥＳ細胞、
［５］ＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物、
［６］ＬＯＸ−１遺伝子対の一方または両方の遺伝子が欠損されることによりＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制されている、上記［５］記載の非ヒト動物、
［７］遺伝子の欠損が外来遺伝子の挿入によるものである、上記［５］記載の非ヒト動物、
［８］非ヒト動物がげっ歯類である上記［５］記載の非ヒト動物、
［９］以下の工程を含む  ＬＯＸ−１アゴニスト及び／または促進剤のスクリーニング方法、
（１）上記［５］〜［８］のいずれかに記載の非ヒト動物に対しバベシア原虫を感染させる工程
（２）（１）の動物に被験物質を投与する工程
（３）原虫による感染症の症状を緩和させる被験物質を選択する工程
［１０］ＬＯＸ−１アゴニスト及び／または促進剤を有効成分とする原虫感染症治療用組成物、
［１１］  ＬＯＸ−１アンタゴニスト及び／若しくは阻害剤、またはＬＯＸ−１発現抑制物質を有効成分とする虚血性疾患、高脂血症、糖尿病及び高血圧病治療用組成物、並びに
［１２］ＬＯＸ−１アンタゴニスト及び／若しくは阻害剤、またはＬＯＸ−１発現抑制物質を有効成分とする抗炎症剤
に関するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子改変ＥＳ細胞及び遺伝子改変動物は、ＬＯＸ−１遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする。ＬＯＸ−１遺伝子は、スカベンジャー受容体の一つとして既にクローニングされている  （Ｓａｗａｍｕｒａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ３８６：  ７３−７）。マウスＬＯＸ−１遺伝子の塩基配列、及びそれにコードされる蛋白質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１及び２として示す。
【００１３】
本発明においてＬＯＸ−１遺伝子の改変の対象となる動物は、特に限定されないが、好ましくはマウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類である。特に、動物モデルとして用いることを考慮する場合には、マウスが好ましい。また、ＬＯＸ−１遺伝子の改変の対象となるＥＳ細胞も特に限定されないが、げっ歯類、中でもマウスに由来するものが好ましい。ＥＳ細胞は、周知の方法により取得し、維持することができる（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｊ．  Ｅｍｂｒｙｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈｏｌ．  ８７：  ２７−４５参照）。
【００１４】
ここで、「ＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制された」とは、ＬＯＸ−１遺伝子対の両方の発現が抑制された完全な抑制（ヌル対立遺伝子）の他、遺伝子対の一方の発現のみが抑制された不完全に抑制された状態を含むものである。本発明においては、ＬＯＸ−１遺伝子の発現が特異的に抑制されていることが好ましい。本発明の遺伝子改変ＥＳ細胞及び動物において、ＬＯＸ−１遺伝子の発現を人為的に抑制する手段としては、ＬＯＸ−１遺伝子を欠損させる方法及びＬＯＸ−１遺伝子の発現制御領域を欠損させる方法を挙げることができる。内在性遺伝子及び発現制御領域の欠損方法としては、遺伝子ターゲティングが考えられるが、好ましくはＬＯＸ−１遺伝子対の一方または両方に外来遺伝子を挿入して遺伝子を不活性化する方法を挙げることができる。
【００１５】
ＬＯＸ−１遺伝子の発現制御領域は、例えば、ＬＯＸ−１の塩基配列を利用してゲノムＤＮＡから公知の方法により得ることができる。Ｓ１マッピングのような転写開始点を特定する方法  （細胞工学  別冊８  新細胞工学プロトコール、東京大学医科学研究所制癌研究部編（１９９３）３６２〜３７４頁、秀潤社）  が利用可能である。一般に遺伝子の発現制御領域は、５’末端の１５〜１００ｂｐ、好ましくは３０〜５０ｂｐをプローブＤＮＡとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、得られたポリヌクレオチドを短縮化または断片化し、レポーター遺伝子を利用してその発現能を調べることにより取得することができる。さらに、Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ．／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ．ｈｔｍｌ；  Ｒｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９９６  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，  Ｈｕｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎ  ｅｄ．，  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）等の遺伝子の発現制御領域を予測するためのプログラム、及び、発現制御領域の活性最小単位を予測するプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｓｃｉ．ｃｂｓ．ｕｍｎ．ｅｄｕ．／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｏｓｃａｎ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｃａｎ．ｈｔｍ）も公知であり、利用することができる。
【００１６】
本発明の遺伝子改変マウスは、例えば、以下のようにして作成することができる。まず、マウスから真正ＬＯＸ−１遺伝子のエクソン部分を含むＤＮＡを単離し、このＤＮＡ断片に適当な遺伝子を挿入し、ターゲティングベクターを構築する。ＤＮＡ断片に挿入する遺伝子としては、例えば、該ベクターの導入を確認することができる、抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）のマーカー遺伝子の使用が考えられる。抗生物質耐性遺伝子を用いた場合には、細胞を抗生物質を含む培地中で培養することにより細胞に該ベクターが導入されたかどうかを確認することができる。ターゲティングベクターは、細胞中に挿入されることにより天然のＬＯＸ−１遺伝子の転写を妨げるか、または、阻止するようにゲノムＤＮＡへと相同組換えにより組込まれる。次に、該ベクターをエレクトポーレション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法等によりＥＳ細胞株に導入し、相同組換えを生じた細胞株を選抜する。さらに効率的な組換え細胞の選抜を行うために、ターゲティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子等を結合させておくことにより、非相同組換えを起こした細胞株を排除することもできる。また、ターゲティングベクターにジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子等を結合させ、非相同組換えを起こした細胞株を排除する方法も知られており、本発明の変異細胞または動物を作製する際に用いることができる。また、ＰＣＲ及びサザンブロットにより相同組換え検定を行い、ＬＯＸ−１遺伝子の遺伝子対の少なくとも一方が不活性化された細胞株を効率的に得ることもできる。
【００１７】
相同組換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組換えの箇所以外における遺伝子挿入による遺伝子破壊の恐れもあるため、複数のクローンを用いてキメラの作製を行うことが好ましい。得られたＥＳ細胞株をマウス胚盤胞にインジェクションしてキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、ＬＯＸ−１遺伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、ＬＯＸ−１遺伝子対の両方を不活性化したマウスを得うることができる。ＥＳ細胞が樹立されているマウス以外の動物においても、同様の手法により、ＬＯＸ−１遺伝子改変細胞及び動物を得ることができる。
【００１８】
また、ＬＯＸ−１遺伝子の遺伝子対の両方が不活性化されたＥＳ細胞株は、以下の方法によっても取得することができる。即ち、遺伝子対の一方を不活性化したＥＳ細胞株を高濃度の抗生物質を含む培地で培養することにより、遺伝子対のもう一方も不活性化された細胞株、つまり、ＬＯＸ−１遺伝子の遺伝子対の両方が不活性化されたＥＳ細胞株を得ることができる。また、遺伝子対の一方を不活性化したＥＳ細胞株を選抜し、この細胞株に再度ターゲティングベクターを導入し、相同組換えを生じた細胞株の選択することによっても、ＬＯＸ−１遺伝子の遺伝子対の両方が不活性化されたＥＳ細胞株を得ることができる。再度の相同組換えを行う場合には、ターゲティングベクターに挿入するマーカー遺伝子を、一回目の相同組換え用と二回目の相同組換え用とで異なるものを使用することが好ましい。
【００１９】
本発明の遺伝子改変動物由来の細胞株を樹立する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、げっ歯類においては、胎仔細胞の初代培養の方法を用いることができる（新生化学実験講座、１８巻、１２５〜１２９頁、東京化学同人；マウス胚の操作マニュアル、２６２〜２６４頁、近代出版等参照）。
【００２０】
本発明のＬＯＸ−１遺伝子欠損マウスを用いた解析により、ＬＯＸ−１の血管内皮機能、原虫感染及び炎症反応との関連が示された（実施例６〜８参照）。従って、ＬＯＸ−１遺伝子欠損動物は、ＬＯＸ−１遺伝子の詳細な機能の解析に利用できるだけではなく、高脂血症、糖尿病、高血圧病、及び虚血性疾患等の血管内皮機能の低下が関与する疾患の発症及び進展、原虫感染、並びに炎症反応等の解明のためのモデル動物として利用することができる。
【００２１】
さらには、感染症に対する治療薬の候補となるＬＯＸ−１アゴニスト及び／または促進剤等のスクリーニングにも利用することができる。即ち、本発明により、本発明のＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物を利用した、ＬＯＸ−１アゴニスト及び／または促進剤のスクリーニング方法が提供される。より詳細には、（１）本発明のＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物に対しバベシア原虫を感染させ、（２）該動物に被験物質を投与し、そして（３）原虫による感染症の症状を緩和させる被験物質を選択することにより、ＬＯＸ−１アゴニスト及び／または促進剤をスクリーニングすることができる。このようにしてスクリーニングされたＬＯＸ−１アゴニスト及び／または促進剤は、原虫感染症治療用組成物として使用することができる。
【００２２】
ＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物に対しバベシア原虫を感染させる方法は特に限定されないが、例えば、実施例７のＡにおいて示すように、感染赤血球を動物に対して摂取する方法を採用することができる。また、本発明における「被験物質」は、どのような化合物であってもよい。例えば、遺伝子ライブラリー、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリー等のライブラリーの物質を挙げることができる。その他、天然物質を被験物質として使用することもできる。天然物質としては、細菌分泌物、微生物、植物及び動物の細胞からの抽出物及びこれらの細胞の培養上清、土壌等を例示することができる。
【００２３】
原虫による感染症の症状を緩和させる被験物質の選択は、これに限定されないが、実施例において示されるように、パラシテミアの傾向またはヘマトクリット値を調べることによって被験物質の能力を検定して行うことができる。本発明により、ＬＯＸ−１遺伝子欠損動物では、野生型の動物と比べてパラシテミアが急速に上昇する傾向、及び、ヘマトクリット値の減少することが明らかにされた。そこで、本発明のＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制された動物におけるパラシテミアの上昇を抑制する効果、またはヘマトクリット値の減少を阻止若しくは緩和する被験物質は、原虫感染症の処置に有用と考えられる。
【００２４】
本発明のＬＯＸ−１遺伝子の発現が抑制された非ヒト動物を利用したスクリーニング方法により選ばれたアゴニスト及び／または促進剤は、適宜、薬学的に許容される担体、媒体等と組合せて調製することができる。例えば、安定剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、界面活性剤、緩衝剤（クエン酸、リン酸、及びその他の有機酸等）、キレート剤、矯味剤、結合剤、香料、生理食塩水、等張液、賦形剤、防腐剤、溶解補助剤等を配合することができる。また、必要に応じて、その他の物質として、アスパラギン、アルギニン、グリシン、グルタミン、リシン等のアミノ酸、血清アルブミン、ゼラチン、炭水化物、蛋白質、低分子量ポリペプチド、糖アルコール（マンニトール、ソルビトール等）、糖類（多糖及び単糖）、免疫グロブリン等を含んでもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖またはその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムを含むもの）に混和することが好ましく、さらに、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等）等と併用してもよい。
【００２５】
また、必要に応じマイクロカプセルに封入して使用することもできる。マイクロカプセルとしては、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等より構成されるものが公知である。また、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル等を利用したコロイドドラッグデリバリーシステム（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｎｅｃｅ  １６ｔｈ  ｅｄ．，  Ｏｓｌｏ  ｅｄ．  （１９８０）参照）も利用可能である。その他、徐放性薬剤として調製する方法も公知（例えば、Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  １５：  １６７−２７７；  Ｌａｎｇｅｒ  （１９８２）  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．  １２：  ９８−１０５；  Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：  ５４７−５６；  ＵＳ３，７７３，９１９；  ＥＰ５８，４８１；  ＥＰ１３３，９８８等参照）であり、本発明の組成物及び薬剤に適用し得る。また、該アゴニスト及び促進剤が遺伝子によりコードされ得る場合には、該アゴニストまたは促進剤をコードする遺伝子を公知の遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも可能である。
【００２６】
患者への投与は、好ましくは注射や点滴により行われ、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射が挙げられる。その他、鼻腔内、経気管支、筋内、経皮、経口等の経路により投与することも可能である。投与量は、患者の体重及び年齢、処置する疾病の種類及び症状、使用する薬剤の種類及び投与経路等により異なるが、当業者であれば各状況に応じた適当な投与量を適宜選択することができる。
【００２７】
本発明のＬＯＸ−１遺伝子欠損動物を使用した実験により、ＬＯＸ−１の欠損により内皮機能が亢進すること、浮腫及び炎症が抑制されることが判明した。つまり、ＬＯＸ−１の生体内における発現を抑制する物質を得ることができれば、内皮機能の低下が関与する病態の治療薬及び抗炎症剤として有用である。そこで、本発明は、ＬＯＸ−１発現抑制剤のスクリーニング方法を提供するものである。ＬＯＸ−１アンタゴニスト及び／または阻害剤は、（１）ＬＯＸ−１遺伝子の発現制御領域の下流にレポーター遺伝子を連結したベクターを構築し、（２）該ベクターを宿主細胞に導入し、（３）該宿主細胞に被験物質を接触させ、そして（４）レポーター遺伝子の発現を検出することにより選択することができる。
【００２８】
ＬＯＸ−１遺伝子の発現制御領域は、ＬＯＸ−１をコードする遺伝子（例えば、配列番号１に記載の塩基配列）を利用してゲノムＤＮＡから公知の手法によってクローニングしてくることができる。例えば、Ｓ１マッピング法等の転写開始点の特定方法が公知である。また、一般的に、遺伝子の５‘末端の塩基配列をプローブとしてゲノムｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより発現制御領域がクローニングされることが知られている。そして、得られたクローンは１０ｋｂｐ以上に及ぶ５’非翻訳領域を含む場合もあるので、エキソヌクレアーゼ処理等により短縮化または断片化して、所望の部位のみを得ることもできる。短縮化または断片化された断片について発現誘導能の有無、発現の強さ、誘導物質等による制御等について検討し、ＬＯＸ−１遺伝子の発現制御の活性維持に必要とされる最小単位を決定することもできる。
【００２９】
次に、上述のようにして決定されたＬＯＸ−１遺伝子の発現制御領域の下流に作動可能なようにレポーター遺伝子を連結する。レポーター遺伝子は検出可能なポリペプチドをコードする限り特に限定されない。例えば、ルシフェラーゼ、カタラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グリーン蛍光蛋白質等の慣用のレポーター遺伝子を使用することができる。ＬＯＸ−１遺伝子の発現制御領域及びレポーター遺伝子を組み込むベクターは、所望の宿主細胞におけるレポーターの発現を可能にするものであればよく、特に限定されない。プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ等、様々なベクターを利用することができる。ベクターの宿主細胞への導入を確認するために、本発明の発現ベクターは選択可能なマーカー（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等に対する耐性遺伝子）をコードする遺伝子をコードしていてもよい。ベクターへの所望のポリヌクレオチドの導入は、ベクター中の制限酵素部位を利用したリガーゼ反応により容易に行うことができる。
【００３０】
本発明のＬＯＸ−１発現抑制剤のスクリーニングにおいては、構築された発現ベクターは、次に宿主細胞へ導入される。発現ベクターを導入する宿主としては、細菌、真菌類、植物、昆虫、両生類、哺乳類等由来の原核及び真核細胞を挙げることができ、特に限定されない。また、ベクターを宿主細胞へ導入する方法も公知である。例えば、宿主が細菌の場合には、塩化カルシウム法、エレクトポーレション法等によりベクターの導入を行うことができる。その他、電気パルス穿孔法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、リポフェクション、リポフェクタミン、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法等、多様な方法が公知であり、当業者であれば選択した宿主及び発現ベクターの種類に応じ、適切な方法を選択して、実施することができる。
【００３１】
次に、本発明のＬＯＸ−１発現抑制剤のスクリーニングでは、本発明の発現ベクターを含む細胞に対して被験物質を接触させる。ここで、被験物質は特に限定されず、例えば、遺伝子ライブラリー、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリー等のライブラリーの物質、細菌分泌物、微生物、植物及び動物の細胞からの抽出物及びこれらの細胞の培養上清、土壌等の天然物質を示すことができる。
【００３２】
最後に、レポーター遺伝子の発現を、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡまたは翻訳されたポリペプチドにより検出する。ポリペプチドを検出する場合には、抗体等のポリペプチドと結合する物質を用いて検出することもできるが、レポーター蛋白質の活性に基づいて検出することもできる。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ、カタラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等を採用した場合には、各蛋白質の酵素活性に基づいて検出方法が公知である。また、グリーン蛍光蛋白質をレポーター遺伝子として使用した場合には、発現された蛋白質の蛍光を直接観察することによる検出が可能である。レポーター遺伝子発現の検出結果を被験物質を接触させた場合と、接触させなかった場合とで比較し、被験物質との接触によりレポーター遺伝子の発現が抑制される物質をスクリーニングする。
【００３３】
また、本発明のＬＯＸ−１遺伝子欠損動物を使用した実験により、ＬＯＸ−１がバベシア原虫の感染症に関与していることが示唆された。従って、ＬＯＸ−１の生体内における発現を促進する物質を得ることができれば、原虫感染症に対する治療薬あるいは予防薬として有用である。そこで、本発明は、ＬＯＸ−１発現促進剤のスクリーニング方法を提供するものである。このスクリーニング方法は、上記のレポーター系において、レポーター遺伝子発現の検出結果を被験物質を接触させた場合と、接触させなかった場合とで比較し、被験物質との接触によりレポーター遺伝子の発現が促進される物質をスクリーニングすればよい。
【００３４】
また、ＬＯＸ−１のアンタゴニストや阻害剤あるいはアゴニストや促進剤の候補化合物は、ＬＯＸ−１ポリペプチドに結合する化合物を選択することにより得ることもできる。このようなスクリーニングは、ＬＯＸ−１ポリペプチドとこれに結合する化合物を含むと予想される被検試料とを接触せしめ、該ポリペプチドと被検試料との結合活性を検出し、そして本発明のポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する、ことを含む。
【００３５】
スクリーニングに用いられるＬＯＸ−１ポリペプチドは組換えポリペプチドであっても、天然由来のポリペプチドであってもよい。また部分ペプチドであってもよい。また細胞表面に発現させた形態、または膜画分としての形態であってもよい。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製ポリペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。被検試料を接触させるＬＯＸ−１ポリペプチドは、例えば、精製したポリペプチドとして、可溶型ポリペプチドとして、担体に結合させた形態として、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、細胞膜上に発現させた形態として、膜画分として被検試料に接触させることができる。
【００３６】
ＬＯＸ−１ポリペプチドを用いて、これに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、ｐＳＶ２ｎｅｏ，  ｐｃＤＮＡ  Ｉ，  ｐＣＤ８  などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしては  ＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  （Ｒｉｇｂｙ  Ｉｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  （ｅｄ．），  ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｖｏｌ．３．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ｐ．８３−１４１（１９８２）），  ＥＦ−１  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  （Ｋｉｍら  Ｇｅｎｅ  ９１，  ｐ．２１７−２２３  （１９９０）），  ＣＡＧｐｒｏｍｏｔｅｒ  （Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  １０８，  ｐ．１９３−２００  （１９９１）），  ＲＳＶ  ＬＴＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  （Ｃｕｌｌｅｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２，  ｐ．６８４−７０４  （１９８７），  ＳＲα  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  （Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８，  ｐ．４６６  （１９８８）），  ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  （Ｓｅｅｄ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，  ｐ．３３６５−３３６９  （１９８７）），  ＳＶ４０  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  （Ｇｈｅｙｓｅｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １，  ｐ．３８５−３９４  （１９８２）），  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅｐｒｏｍｏｔｅｒ  （Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９，  ｐ．  ９４６  （１９８９）），  ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
【００３７】
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法  （Ｃｈｕ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １５，１３１１−１３２６  （１９８７））、リン酸カルシウム法  （Ｃｈｅｎ，  Ｃ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，  Ｈ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７，  ２７４５−２７５２  （１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，  Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２，  ５７０７−５７１７  （１９８４）；  Ｓｕｓｓｍａｎ，  Ｄ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，  Ｇ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４，  １６４２−１６４３  （１９８５））、リポフェクチン法  （Ｄｅｒｉｊａｒｄ，  Ｂ．  Ｃｅｌｌ  ７，  １０２５−１０３７  （１９９４）；  Ｌａｍｂ，  Ｂ．  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５，  ２２−３０  （１９９３）；  Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，  Ｓ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，  ２３０−２３４  （１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
【００３８】
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明のポリペプチドのＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとして本発明のポリペプチドを発現させることができる。用いるエピトープ‐抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学  １３，  ８５−９０  （１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β‐ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。
【００３９】
融合ポリペプチドにすることによりＬＯＸ−１ポリペプチドの性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素  ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７  ｇｅｎｅ１０  タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、ＬＯＸ−１ポリペプチドに結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ‐抗体系として利用できる（実験医学  １３，  ８５−９０  （１９９５））。
【００４０】
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はＬＯＸ−１ポリペプチド、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、ＬＯＸ−１ポリペプチドに対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。ＬＯＸ−１ポリペプチドに対する抗体は、例えば、ＬＯＸ−１ポリペプチドをコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成したＬＯＸ−１ポリペプチドの部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
【００４１】
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ  抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、ＬＯＸ−１ポリペプチドを、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、ＬＯＸ−１ポリペプチドの抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
【００４２】
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｄ．：  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｐｐ．５１１−５５２，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＮｅｗＹｏｒｋ  （１９８８）  ）記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
【００４３】
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的にはＬＯＸ−１ポリペプチドに結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。ポリペプチドの分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のポリペプチドを精製し、その配列を決定することもできる。
【００４４】
また、ＬＯＸ−１ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドに結合するポリペプチドを単離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，  Ｅ．  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  （１９９１）  ６５，  ８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、ＬＯＸ−１ポリペプチドと結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞、組織よりファージベクター（λｇｔ１１，  ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたポリペプチドを固定し、精製して標識したＬＯＸ−１ポリペプチドと上記フィルターとを反応させ、ＬＯＸ−１ポリペプチドと結合したポリペプチドを発現するプラークを標識により検出すればよい。ＬＯＸ−１ポリペプチドを標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、ＬＯＸ−１ポリペプチド又はＬＯＸ−１ポリペプチドに融合したポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
【００４５】
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，  Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．  （１９９４）  １０，  ２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｔｒｅｉｓｍａｎ  Ｒ  （１９９２）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＰ−１，  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ．  Ｃｅｌｌ  ６８，  ５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。
【００４６】
２−ハイブリッドシステムにおいては、ＬＯＸ−１ポリペプチドまたはその部分ペプチドをＳＲＦ  ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、ＬＯＸ−１ポリペプチドと結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内で本発明のポリペプチドと結合するポリペプチドが発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドを得ることができる。これによりＬＯＸ−１ポリペプチドに結合するポリペプチドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
【００４７】
２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
ＬＯＸ−１ポリペプチドと結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、ＬＯＸ−１ポリペプチドをアフィニティーカラムの担体に固定し、ここにＬＯＸ−１ポリペプチドと結合するポリペプチドを発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドに結合したポリペプチドを調製することができる。
【００４８】
得られたポリペプチドは、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００４９】
また、ポリペプチドに限らず、本発明のポリペプチドに結合する化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）を単離する方法としては、例えば、固定したＬＯＸ−１ポリペプチドに、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、ＬＯＸ−１ポリペプチドに結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ；  Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ；  Ｃｈａｎｇ  Ｒ；  Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ；  Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ；  Ｍｕｌｃａｈｙ  ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＬ；  Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ；ＪｏｌｌｉｆｆｅＬＫ；  Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ．，  Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）  Ｊｕｌ  ２６  １９９６，  ２７３  ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ＧＬ．，  Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  （ＥＮＧＬＡＮＤ）  Ｎｏｖ  ７  １９９６，  ３８４  ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ  ＪＣ  Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  （ＥＮＧＬＡＮＤ）  Ｎｏｖ  ７  １９９６，  ３８４  ｐ１７−９）が当業者に公知である。
【００５０】
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、ＬＯＸ−１ポリペプチドと被検化合物との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることによりＬＯＸ−１ポリペプチドと被検化合物との結合を評価することが可能である。
【００５１】
また、本発明のＬＯＸ−１遺伝子欠損動物を使用した実験により、ＬＯＸ−１の欠損により内皮機能が亢進すること、浮腫及び炎症が抑制されることが判明したことにより、ＬＯＸ−１アンタゴニスト及び／または阻害剤は内皮機能が低下している病態の改善並びに抗炎症剤として有用であることが示された。従って、本発明はＬＯＸ−１アンタゴニスト及び／または阻害剤を有効成分とする内皮機能の低下が関与する病態の治療薬及び抗炎症剤を提供するものである。ＬＯＸ−１アンタゴニスト及び阻害剤としては、例えば、中和抗体を挙げることができる（特開２０００−１０９４３５号公報；国際特許第ＷＯ０１／６４８６２号パンフレット）。
【００５２】
ここで、中和抗体とは、ＬＯＸ−１に特異的に結合し、その活性を消失または減退させる抗体を指す。中和抗体は、ＬＯＸ−１またはその一部を抗原として通常の手法により作製される抗血清、ポリクローナル抗体（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８７）  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２−１１．１３，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ参照）及びモノクローナル抗体（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８７）  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４−１１．１１，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ参照）から選択することができる。また、本発明の中和抗体には、キメラ抗体、一本鎖抗体（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，  Ｖｏ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄ．，  （１９９４）  ２６９〜３１５頁、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ参照）、多特異性抗体（ＬｅＤｏｕｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌｅ．  ７：  ５８−６２；  Ｐａｕｌｕｓ  （１９８５）  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．  Ｍｉｌｌ．  ７８：  １１８−３２；  Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ  （１９８３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：  ５３７−９；  Ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４３：  ９４４−９；ＷＯ９３／１１１６１等参照）、ヒト化抗体（Ｐｒｅｓｔａ  （１９９２）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：  ５９３−６）、ヒト抗体（ＷＯ９２／０３９１８；ＷＯ９４／０２６０２；  Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．１５：  １４６−５６等参照）、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ及びＦｖ等の抗体断片も含まれる。さらに必要に応じポリエチレングリコール等で修飾されていても、検出可能な蛋白質（（β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グリーン蛍光蛋白質、ビオチン等）と融合されていてもよい。上述の修飾された抗体及び抗体断片は、中和抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理し、さらに必要に応じ所望の物質と結合することにより、または、中和抗体をコードする遺伝子を単離し、遺伝子工学的な手法（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ  （１９９０）  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ．参照）により作製することができる。また、必要に応じ上述の抗体は、その他の蛋白質の精製と同様に公知の方法、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ等のアフィニティーカラム、クロマトマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、等の手段により適宜、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ  ｅｄ．  （１９８８）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照）。
【００５３】
内皮機能の低下が関与した疾患としては、高脂血症、糖尿病、高血圧症、及び虚血性疾患等が例示される。虚血性疾患は、例えば、血管損傷、血栓、梗塞、動脈硬化、動脈塞栓、動脈閉塞、動脈瘤等による虚血性疾患を含む。
【００５４】
上述のＬＯＸ−１発現抑制剤、並びに抗体等のＬＯＸ−１のアンタゴニスト及び／または阻害剤は、治療用組成物または抗炎症剤として、適宜、薬学的に許容される担体、媒体等と組合せて調製することができる。例えば、安定剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、界面活性剤、緩衝剤（クエン酸、リン酸、及びその他の有機酸等）、キレート剤、矯味剤、結合剤、香料、生理食塩水、等張液、賦形剤、防腐剤、溶解補助剤等を配合することができる。また、必要に応じて、その他の物質として、アスパラギン、アルギニン、グリシン、グルタミン、リシン等のアミノ酸、血清アルブミン、ゼラチン、炭水化物、蛋白質、低分子量ポリペプチド、糖アルコール（マンニトール、ソルビトール等）、糖類（多糖及び単糖）、免疫グロブリン等を含んでもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖またはその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムを含むもの）に混和することが好ましく、さらに、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等）等と併用してもよい。
【００５５】
また、必要に応じＬＯＸ−１発現抑制剤、並びに抗体等のＬＯＸ−１のアンタゴニスト及び／または阻害剤はマイクロカプセルに封入することができる。マイクロカプセルとしては、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等より構成されるものが公知である。また、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル等を利用したコロイドドラッグデリバリーシステム（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｎｅｃｅ  １６ｔｈ  ｅｄ．，  Ｏｓｌｏ  ｅｄ．  （１９８０）参照）も利用可能である。その他、徐放性薬剤として調製する方法も公知（例えば、Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  １５：  １６７−２７７；  Ｌａｎｇｅｒ  （１９８２）  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．  １２：  ９８−１０５；  Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：  ５４７−５６；  ＵＳ３，７７３，９１９；  ＥＰ５８，４８１；  ＥＰ１３３，９８８等参照）であり、本発明の組成物及び薬剤に適用し得る。また、ＬＯＸ−１に対する抗体をコードする遺伝子を公知の遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも可能である。
【００５６】
患者への投与は、好ましくは注射や点滴により行われ、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射が挙げられる。その他、鼻腔内、経気管支、筋内、経皮、経口等の経路により投与することも可能である。投与量は、患者の体重及び年齢、処置する疾病の種類及び症状、使用する薬剤の種類及び投与経路等により異なるが、当業者であれば各状況に応じた適当な投与量を適宜選択することができる。
【００５７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  ＬＯＸ−１遺伝子の相同組み換え用ベクターの作製
本実施例では、マウスＬＯＸ−１遺伝子の相同組み換え用ベクターを構築するために、まずマウスＬＯＸ−１ゲノム遺伝子のクローニングを行った。このゲノムＤＮＡを用い、Ｍａｎｓｏｕｒらの報告（Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：  ３４８（１９８８））に従ってポジティブ／ネガティブセレクションを行うために、ネオマイシン耐性遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子を挿入した相同組み換え用ベクターを構築した。この際、ネオマイシン耐性遺伝子は、エクソン６の一部、７、８の一部と置き換わるように挿入し、正常なＬＯＸ−１が作製できないようにした。以下具体的に説明する。
【００５８】
Ａ．  マウスＬＯＸ−１遺伝子のクローニング
ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）胎盤のｃＤＮＡライブラリー（Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１０）を作製し、ウシＬＯＸ−１  ｃＤＮＡの全オープンリーディングフレームをプローブとして、プラークハイブリダイゼーションを行った。その結果１５個の陽性クローンが得られた。そのうちクローンＴをシークエンシングし、マウスＬＯＸ−１  ｃＤＮＡの全オープンリーディングフレーム配列を決定した。こうして得られたマウスＬＯＸ−１  ｃＤＮＡの配列を配列番号１に、またそのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
マウスＬＯＸ−１ゲノムＤＮＡは次のようにしてクローニングした。まず、マウスＬＯＸ−１  ｃＤＮＡの全オープンリーディングフレームをプローブとしてプラークハイブリダイゼーション法によりマウス（１２９／ＳＶ）ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｌａｍｂｄａ  ＦＩＸ  ＩＩライブラリーをスクリーニングした。得られた陽性クローンＤから調製したファージＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで切断し得られた３ｋｂｐ、８ｋｂｐ、５ｋｂｐの挿入断片をそれぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）のＳａｃＩサイトにサブクローニングした（クローンＤ３、Ｄ８、Ｄ５）。続いて、クローンＤ３、Ｄ８、Ｄ５の塩基配列のシークエンスを行い、エクソン４がＤ３に、エクソン５から８の前半がＤ８に、エクソン８の後半がＤ５に含まれていることを確認した（エクソン３〜８の塩基配列を各々、配列番号３〜１０に示す）。クローンＤによりカバーされるＬＯＸ−１遺伝子の領域を主要な制限酵素（ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＡｐａＩ、ＨｉｎＤＩＩＩ）で切断し、その制限酵素サイトの位置の地図を作製した（図１）。
【００５９】
Ｂ．  相同組み換え用ベクターの構築
クローンＤ８に含まれるマウスＬＯＸ−１遺伝子断片をＣｌａＩとＡｐａＩで切断し生じた約３．８ｋｂｐの断片をＴ４ポリメラーゼにより平滑末端化し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端化したｐＧＥＭ−ＮｅｏｒのＥｃｏＲＩサイトに組み込んだ（ｐ５ＬＯＸＮｅｏ）。一方、クローンＤ５に含まれるマウスＬＯＸ−１遺伝子断片をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで切断してできる断片のうち約２ｋｂｐのものをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）のＫｐｎＩサイトとＢａｍＨＩサイトの間に組み込んだ。この遺伝子断片をＡｓｐ７１８ＩとＢａｍＨＩにより切り出し、Ｔ４ポリメラーゼにより平滑末端化した後、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端化したｐＭＣ１−ｔｋに組み込んだ（ｐＬＯＸ３ｋｔ）。得られたクローンをＳａｌＩとＸｈｏＩで切断し切り出された断片をｐ５ＬＯＸＮｅｏのＳａｌＩサイトに組み込み、相同組み換え用ベクター（ＬＯＸ−１  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ）を得た。このベクターは以下のような特徴を持つ（図１）。
（ｉ）第６エクソンの後半から第８エクソンの前半に置き換わる形でネオマイシン耐性遺伝子が挿入されている。
（ｉｉ）ネガティブ選択用マーカー遺伝子としてチミジンキナーゼ遺伝子を持つ。（ｉｉｉ）野生型ＬＯＸ−１遺伝子との相同部分は、ネオマイシン耐性遺伝子の上流が約３．８ｋｂ、ネオマイシン耐性遺伝子下流が約２ｋｂである。
【００６０】
［実施例２］  相同組み換えによる変異ＬＯＸ−１遺伝子を持つＥＳ  細胞の樹立
本実施例では、相同組み換え用ベクターを、エレクトロポレーション法により１２９／ＳｖＪマウスより得られたＥＳ細胞  ＲＷ−４に導入し、次いでＧ４１８により選択培養を行った。得られたＧ４１８耐性コロニーについて、サザンブロットにより相同組み換え体の検定を行った。以下、具体的に説明する。
相同組み換え用ベクター（ＬＯＸ−１  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ）ＤＮＡ  ２５−３０μｇをＸｈｏＩで切断することにより線状化し、精製した。このＤＮＡをマウスＥＳ細胞ＲＷ−４、３ｘ１０６  個を含むエレクトロポレーション用緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、０．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）に懸濁し、Ｆｉｅｌｄ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  １８５Ｖ／ｃｍ、Ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  ５００μＦの条件で、遺伝子導入を行った。導入後２４時間から終濃度２００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｉｔｉｃｉｎ）（ＳＩＧＭＡ社  Ｇ−９５１６）で選択培養を行った。ＥＳ細胞の培養には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社  １１９６５−０８４）培養液に終濃度１５％の牛胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社  ＳＨ３００７１）、終濃度２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社  ２５０３０−０８１）、終濃度がそれぞれ１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社  １１１４０−０５０）、終濃度１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社  １５６３０−０８０）、終濃度がそれぞれ１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社  １５１４０−１２２）、終濃度１００μＭのβ−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社  Ｍ−７５２２）、そして終濃度１０００Ｕ／ｍｌのＥＳＧＲＯ（ＬＩＦ）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社  １３２７５−０２９）を添加したものを用いた（以下ＥＳ培地と記す）。
【００６１】
また、ＥＳ細胞用のフィーダー細胞としては、Ｅ１４．５の胚から単離したＭＥＦ（Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞を用い、培養液はＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社  １１９６５−０８４）培養液に終濃度１０％の牛胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社  ＳＨ３００７１）、終濃度２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社  ２５０３０−０８１）、終濃度がそれぞれ１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社  １１１４０−０５０）、終濃度がそれぞれ１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社  １５１４０−１２２）を添加したものを用いた（以下ＭＥＦ培地と記す）。１５０ｃｍ２のフラスコでコンフルエントにまで培養させたＭＥＦ細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／１ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社  ２５３００−０４７）ではがし、４枚の１０ｃｍディッシュ、２枚の２４穴プレート、２枚の６穴プレート、６個の２５ｃｍ２フラスコ、２個の７５ｃｍ２フラスコにそれぞれ至適な濃度で撒きなおした。
【００６２】
遺伝子導入後５日目から、以下のようにして、出現したＧ４１８耐性コロニーを２４穴のプレートに継代した。即ち、Ｐ−２００のピペットマンを用いてＧ４１８耐性コロニーを１５０μｌのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を含む９６穴のマイクロプレートに移し換え、２０分間３７℃のインキュベーター内で処理した後、Ｐ−１０００のピペットマンでピペッティングすることによって単一細胞にした。この細胞懸濁液を２４穴のプレートに移し換え培養を継続した。２日後、２４穴のプレート上の細胞を凍結保存用とＤＮＡ抽出用の２つに分割した。即ち、細胞にトリプシン／ＥＤＴＡを５００μｌ加えて２０分間３７℃のインキュベーター内で処理し、ＥＳ培地を５００μｌ加えてＰ−１０００のピペットマンで静かにピペッティングすることによって単一細胞にした。その後、１ｍｌのＥＳ培地の入った２４穴プレートに細胞懸濁液の半分を移し、元の２４穴プレートにもＥＳ培地を１ｍｌ加えた。さらに２日後、片方の２４穴プレートの培地を抜いてから、ＥＳ培地に終濃度が１０％の牛胎児血清と終濃度が１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ社  Ｄ−５８７９）を添加した凍結用培地を１ｍｌ入れて、シールした後−７０℃で凍結保存した。
【００６３】
相同組み換え体の検定は、サザンブロッティングによって以下の通りに行った。即ち、コンフルエントの状態まで細胞が増殖した２４穴プレートの各ウェルから培地を取り除き、ＰＢＳで洗浄した後溶解バッファー（１％  ＳＤＳ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５）を２５０μｌとプロテイナーゼ  Ｋ（２０ｍｇ／ｍｌ）５μｌを加えてよく振り、５２℃で１−１２時間加温した。溶解したサンプルからフェノール／クロロホルム抽出によりＤＮＡを抽出し、サザンブロッティング用の鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００６４】
サザンブロッティングはネオマイシン耐性遺伝子と置換させることにより欠損させたエクソン５上流のＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩサイトの間の配列およびエクソン８下流のＸｂａＩ−ＡｐａＩサイトの間の配列をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。この結果から相同組み換え体であると考えられたクローンは、調べたＧ４１８耐性クローン３６８個中２個（クローン１１６、クローン２４４）であった。（図２）
【００６５】
サザンブロット解析で相同組み換えが確認されたクローンは、凍結保存してあった９６穴プレートを３７℃に温めることにより融解し、２４穴プレートに継代した。この２４穴プレートを２４時間、３７℃で培養後、ＤＭＳＯと流動パラフィンを除くために培地を交換した。それぞれのクローンが７５〜９０％コンフルエントに達した時点で２４穴から６穴プレートに継代した。さらに、６穴プレートに７５〜９０％コンフルエントまで増殖したものが２穴分得られたところで、１穴分は凍結保存し、残りの１穴分は胚盤胞への注入及びＤＮＡ抽出に使用した。
【００６６】
凍結保存は以下の如く行った。即ち、細胞をＥＳＱ  ＰＢＳで２回リンスした後、０．５ｍｌのＥＳＱ  Ｔｒｙｐｓｉｎ（ＬＥＸＩＣＯＮ社Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｋｉｔ）を加え、３７℃で１５〜２０分間保温しトリプシン処理を行った後、さらに０．５ｍｌのＥＳ細胞培地を加え、３５〜４０回ピペッティングを行いＥＳ細胞の塊を完全に解離させた。この細胞懸濁液を１５ｍｌ遠心チューブに移し、さらに１ｍｌのＥＳ細胞培地でウェルを洗ってチューブに回収した。チューブを１，０００ｒｐｍで７分間遠心し、培地を取り除き  ０．２５ｍｌ  ＥＳ細胞培地に再懸濁し、０．２５ｍｌの２  ｘ凍結培地を加えた。クライオジェニックバイアルにウェルの中身を移し、−８０℃で凍らせ、液体窒素中で保存した。
【００６７】
胚盤胞への注入及びＤＮＡ抽出用の細胞は、  ＥＳ細胞の塊を完全に解離させた後、その四分の一を胚盤胞への注入に用い、残りの細胞の三分の一、及び三分の二をそれぞれゼラチンコートした６０ｍｍディッシュに継代した。前者は細胞がコンフルエントにまで増殖したところでサザンブロット解析用のゲノムＤＮＡを抽出し、後者の細胞はコンフルエントにまで増殖したところで３本に分けて凍結した。
【００６８】
［実施例３］  組み換えＬＯＸ−１遺伝子を持つＥＳ細胞によるキメラマウスの作製
相同組み換えが確認されたＥＳ  細胞クローンについて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞をホスト胚としてキメラ胚を作製し、それを偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。ホスト胚の採取は、妊娠２日目に、１００μＭ  ＥＤＴＡを添加した  Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地で、卵管と子宮を灌流することによって行った。８細胞期胚または桑実胚を２４時間Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地で培養し、得られた胚盤胞を注入に用いた。注入に用いたＥＳ  細胞は、継代してから２あるいは３日目にＴＥ処理により分散させ、顕微操作に供するまで４℃で静置した。ＥＳ  細胞の注入用ピペットとしては、Ｃｏｏｋ  ＩＶＦ社製のｐｏｌａｒ  ｂｏｄｙ  ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ  ｐｉｐｅｔｔｅ（内径約２０μｍ）を用いた。胚保定用ピペットとしては、外径１ｍｍの微小ガラス管（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）を微小電極作製器（Ｓｕｔｔｅｒ社Ｐ−９８／ＩＶＦ）を用いて細く引き延ばした後、マイクロフォージ（Ｄｅ  Ｆｏｎｂｕｒｕｎ）を用いて外径５０〜１００μｍの部分で切断し、さらに口径を１０〜２０μｍに加工したものを用いた。注入用ピペットと保定用ピペットは、先端から約５ｍｍの部分を約３０度曲げて、マイクロマニピュレーター（ＬＥＩＴＺ）に接続した。顕微操作に用いたチャンバーとしては、穴あきスライドグラスにカバーグラスを蜜蝋で接着したものを用い、その上に約２０μｌの０．３％  ＢＳＡを加えたＨｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ培地のドロップを２個置き、上面を流動パラフィン（ナカライテスク２６１−３７  ＳＰ）で覆った。一方のドロップには、約１００個のＥＳ細胞を入れ、他方には拡張胚盤胞を１０〜１５個入れ、胚１個あたり１０〜１５個のＥＳ  細胞を注入した。顕微操作はすべて、倒立顕微鏡下で行った。操作胚は、１〜２時間の培養後、偽妊娠２日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し、里親に哺育させた。
【００６９】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞４０個に、クローン１１６  ＥＳ細胞を注入した結果、４０個の胚盤胞への注入が成功した（成功率１００％）。この４０個を偽妊娠２日目のＩＣＲ系受容雌の子宮角に移植した結果、１４匹の産仔が得られた。相同組み換え体に由来する部分の毛色は野生色を呈し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスに由来する部分の毛色はブラック色を呈する。得られた産仔のうち、１例が毛色からキメラマウスと判定でき、形態的に雄を示していた。このキメラマウスにおける毛色から判断したＥＳ細胞の寄与率は９５％であった。
【００７０】
［実施例４］  相同組み換え体の生殖系列への伝達の検定
実施例３のキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスと交配させ、ＥＳ細胞由来の産仔が得られるか否かを検定した。キメラマウスの生殖細胞がＥＳ細胞に由来していれば、娩出される産仔の毛色は、野生色を呈し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスの胚盤胞に由来していれば黒色を呈することとなる。交配により野生色のマウスが誕生し、ＥＳ細胞の生殖系列への伝達が確認された。
【００７１】
次に、これらの野生色マウスの尾の一部からＤＮＡを抽出し、サザンブロッティングにより、変異ＬＯＸ−１が伝達されているかを調べた。その結果、クローン１１６ＥＳ細胞由来の産仔において変異ＬＯＸ−１アリルが伝達されていることが確認された。
【００７２】
片側のアリルのＬＯＸ−１遺伝子に変異を持つヘテロ欠損マウス同士の交配により、両側のアリルに変異を持つホモ欠損マウスの作製を行った。野生型、ヘテロ欠損そしてホモ欠損マウスの各遺伝子型の解析には、サザンブロッティングによって行った。野生型アリルの存在が検出でき、変異アリルの存在が検出できないものを野生型マウス、その反対に野生型アリルの存在が検出できず、変異アリルの存在が検出できたものをホモ欠損マウス、そして野生型と変異アリル両方が検出された場合をヘテロ欠損マウスと判定した（図３）。
その結果得られた産仔の各遺伝子型は、野生型：ヘテロ欠損：ホモ欠損マウスの比率は、ほぼメンデルの法則通り１：２：１の割合であった。
【００７３】
［実施例５］  ＬＯＸ−１欠損マウスにおけるＬＯＸ−１の発現解析
ＬＯＸ−１欠損マウスより胸部大動脈を採取し，液体窒素にて凍結後、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ  １２００にてホモジェナイズし、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて  総ＲＮＡを抽出した。野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）も同様の手順で総ＲＮＡを抽出した。逆転写反応はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。逆転写反応のプライマーとしてランダムへキサマーを使用し、胸部大動脈から抽出した総  ＲＮＡ  １ｕｇをテンプレートとしてＳｕｐｅｒｓｃｒｐｔＩＩ  ５０Ｕにて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。
【００７４】
作製した逆転写反応物の５％をＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  ０．５ＵによるＰＣＲに使用した。マウスＬＯＸ−１  ｃＤＮＡ増幅にはセンスプライマー：  ５’−ａｇｇｔｃｃｔｔｇｔｃｃａｃａａｇａｃｔｇｇ−３’（配列番号：１１）、アンチセンスプライマー：  ５’−ａｃｇｃｃｃｃｔｇｇｔｃｔｔａａａｇａａｔｔｇ−３’（配列番号：１２）を用い、９４℃  ４０秒，  ５７℃  １分，  ７２℃  １分の条件で３５サイクル反応を行った。同時にサンプル量補正の内部標準としてＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡのＰＣＲを行った。センスプライマー：  ５’−  ｇａｃｃａｃａｇｔｃｃａｔｇａｃａｔｃａｃｔ  −３’（配列番号：１３）、アンチセンスプライマー：  ５’−  ｔｃｃａｃｃａｃｃｃｔｇｔｔｇｃｔｇｔａｇ  −３’（配列番号：１４）を用い、９４℃  ４０秒，  ６０℃  １分，  ７２℃  １分の条件で２５サイクル反応を行った。増幅産物を、エチジウムブロマイドを含む４％アガロースゲルで電気泳動し、２７３ｂｐのマウスＬＯＸ−１増幅産物及び４５３ｂｐのマウスＧＡＰＤＨ増幅産物をＵＶランプにて可視化し、ＣＣＤカメラにて撮影した。
【００７５】
その結果、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）においては、２７３ｂｐのマウスＬＯＸ−１  ｃＤＮＡ特異的ＰＣＲ産物が確認されたが、ＬＯＸ−１欠損マウスにおいては認められなかった。なお内部標準として用いたＧＡＰＤＨの増幅産物の電気泳動上のバンド強度は、ＬＯＸ−１  ノックアウトマウスと対照マウスを比較したときほぼ同等であった。従って、ＬＯＸ−１欠損マウスで確かにＬＯＸ−１  ｍＲＮＡの発現が消失していることが確認された。（図４）。
【００７６】
［実施例６］    血管内皮細胞依存性弛緩反応の検討
１．  溶液の調整
マウスから取り出した血管は、クレブス溶液（１１８ｍＭ  ＮａＣｌ，  ４．７ｍＭ  ＫＣｌ，  １．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，  １．２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，  ２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，  １０ｍＭグルコース）中で実験を行った。次の組成の高カリウム溶液を調整した：６２．７ｍＭ  ＮａＣｌ，  ６０ｍＭ  ＫＣｌ，  １．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，  １．２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，  ２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，  １０ｍＭ  グルコース。クレブス溶液及び高カリウム溶液は９５％Ｏ２、５％ＣＯ２でバブリングを行った。
【００７７】
２．  血管のリング標本の作製
１０週齢のオスのマウスの胸部を開き、胸部大動脈を心臓ごととりだし、クレブス溶液を入れたシャーレに入れた。顕微鏡下で、組織を引っ張らないように、大動脈を心臓から切り離し、大動脈の周囲についている脂肪組織と結合組織を切り離した。そして大動脈のうち、鎖骨下動脈の分岐部と、肋間動脈の分岐部の間から幅約１ｍｍの大動脈リング標本を取り出し実験に使用した。
【００７８】
３．  実験装置
大動脈リング標本は、５ｍｌのクレブス溶液をいれたチャンバーの中に取り付けられてある２本のフックにかけた。２本のフックのうち１本は装置に固定されており、もう一本は大動脈の収縮、弛緩をフックにかかる圧力として感知し電気信号に変換する等尺性トランスデューサー（ＵＣ−５Ａ  ＵＦＥＲ）につないだ。トランスューサーからの電気信号はアンプ（ＰＡＳ−４０１  Ｓｔａｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ）によって増幅され記録した。記録はＰｏｗｅｒＬａｂ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用した。
【００７９】
Ａ．  内皮依存性弛緩の確認
大動脈リング標本にかかっている２本のフックの間隔を伸ばすことにより、血管に０．５ｇの圧力をかけた。血管に圧力をかけると大動脈は元に戻ろうと弛緩するので、大動脈にかかる圧が０．５ｇで一定となるまで圧をかけ直して静止張力とした。静止張力が安定した後に９０分間静置させてから、チャンバーの溶液を高カリウム溶液に替え高カリウム溶液誘発収縮を起こさせた。この収縮が安定したらチャンバーの溶液をクレブス溶液に戻し血管を静止張力まで弛緩させた。この高カリウム溶液誘発による収縮を３回繰り返し、３０分間静置させてから測定に使用した。マウスの大動脈リング標本の内皮依存性の弛緩を評価するためにまず血管を収縮させた。血管収縮物質としてＰＧＦ２ａ（ＷＡＫＯ）を使用した。収縮物質によって得られた収縮が安定した後、アセチルコリン（オビソート注  第一製薬）により内皮依存性の弛緩をみた。このアセチルコリンによる弛緩が内皮依存性の弛緩かどうかを確かめるために、血管内腔に糸を通すことにより内皮を除去した血管にアセチルコリンを作用させ弛緩が起きないこと、そして内皮を残した血管にＮＯ合成阻害薬であるＬ−ＮＡＭＥ（和光純薬）を作用させてから収縮物質により収縮させ、アセチルコリンによる弛緩が起きないことを確認した。（図５上段）より詳細には、内皮を残  した野生型マウスの大動脈では弛緩が起きるが（図５上段の左）、ＮＯ発生阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥを作用させると弛緩が抑えられ（図５上段の中）、また内皮を除去した血管では弛緩が抑えられた（図５上段の右）。従って、アセチルコリンの投与により血管内皮細胞依存性の弛緩が起きていることが示された。チャート上の数字は投与し作用させたアセチルコリンの濃度を表し、「８」は１０−８Ｍ、「７」は１０−７Ｍとなったことを示す。「８」と「７」の間は３×１０−８Ｍで、「７」の次は３×１０−７Ｍのアセチルコリンを作用させたことを示す。チャート上の略号「ＳＮＡＰ」はＮＯ発生剤Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン（Ｓ−Ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ＤＬ−ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ）、「Ｌ−ＮＡＭＥ」は、ＮＯ発生阻害剤ＮＧ−ニトロ−Ｌアルギニンメチルエステルハイドロクロライド（ＮＧ−Ｎｉｔｒｏ−Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ  Ｍｅｔｈｙｌ  ＥｓｔｅｒＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を示す。
【００８０】
Ｂ．  野生型マウスとＬＯＸ−１遺伝子欠損マウスの内皮依存性
野生型マウスとＬＯＸ−１遺伝子欠損マウスの内皮依存性の弛緩の比較は、上記のとおり最初に静止張力をかけ、高カリウム溶液による収縮を３回行い、３０分間静置させてから行った。まずＰＧＦ２ａにより血管を収縮させてから、アセチルコリンにより内皮からのＮＯの放出による弛緩を血管にかかる張力の変化として測定、比較した。その後チャンバー内のクレブス溶液を数回交替することによりチャンバー内の薬物を洗い流し、３０分間安定させた。その後ｏｘＬＤＬを加え、収縮物質により収縮させてアセチルコリンにより、ｏｘＬＤＬを作用させた状態での内皮依存性の弛緩を測定、比較した。（図５中段、下段）
【００８１】
その結果、ｏｘＬＤＬを作用させる前後でアセチルコリンによる内皮依存性弛緩を比較すると、ｏｘＬＤＬ作用後に野生型マウスでは弛緩が減弱したが、ノックアウトマウスにおいては前後で差が見られなかった。（ＷＴ；図５中段、ＫＯ；図５下段）。ｏｘＬＤＬを作用させた後でのアセチルコリンによる弛緩の程度を野生型及びノックアウトマウスで各々定量すると、ＰＧＦ２ａによる収縮を０、ベースラインを１００として、アセチルコリン濃度が、１０−８Ｍでは各々１．５０±０．９４と７．６２±４．３３、３×１０−８Ｍでは１．６７±０．７１と３２．７６±５．７７、１０−７Ｍでは１８．３５±３．２７と５３．９０±２．６５、３×１０−７Ｍの時に３７．７４±３．３５と６８．４１±３．７８であり、野生型マウスとノックアウトマウスのアセチルコリンによる弛緩に有意差が見られた。
【００８２】
［実施例７］  原虫感染におけるＬｏｘ−１欠損の影響
Ａ．  Ｂａｂｅｓｉａ  ｒｏｄｈａｉｎｉ及びＢａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉの維持
Ｂａｂｅｓｉａ  ｒｏｄｈａｉｎｉ及びＢａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉは、ＩＣＲマウスにおいて血液継代（ｂｌｏｏｄｐａｓｓａｇｅ）により維持した。最初に、凍結溶解感染赤血球（ｆｒｏｚｅｎ−ｔｈａｗｅｄ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ；  ＩＲＢＣ）をマウス腹腔内に接種した。パラシテミアの割合は、ギムザ染色した血液塗沫標本中のＩＲＢＣ数により決定した。５０％パラシテミアに達した後、マウスを殺し、血液を回収した。
【００８３】
Ｂ．  Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ感染
８週齢のＬｏｘ−１ノックアウト雌マウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス、各群４匹ずつに、１×１０７ＩＲＢＣを腹膜内接種した。各群についてさらに３匹ずつを非感染コントロールとして用いた。パラシテミアの割合、体重、及びヘマトクリットを集めた。パラシテミアの割合は、ギムザ染色した尾の血液標本中のＩＲＢＣ数により決定した。ヘマトクリットはマイクロヘマトクリット法により測定した。パラシテミアの割合については、毎日、決定を行い、ヘマトクリットは感染後、２日毎に測定した。その結果、Ｌｏｘ−１欠損マウスに対するＢａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ  （１  ｘ  １０７  ＩＲＢＣ）の感染においては、野生型マウスでは２峰性のパラシテミアのピークを示すのに対し、Ｌｏｘ−１欠損マウスでは３峰性に推移することが観察された。尚、  ヘマトクリット値の推移には野生型マウスとの差を認められなかった。（図６）
【００８４】
Ｃ．  Ｂａｂｅｓｉａ  ｒｏｄｏｈａｉｎｉ感染
８週齢のＬｏｘ−１ノックアウト雌およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス、各群６匹ずつに１  ｘ  １０４ＩＲＢＣを腹腔内接種し、Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉの場合と同様にパラシテミアおよびヘマトク  リット値を測定した。その結果、Ｌｏｘ−１欠損マウスに対するＢａｂｅｓｉａ  ｒｏｄｈａｉｎｉ（１０，０００  ＩＲＢＣ）感染後の生存率には野生型マウスとの間に差は認められなかったが、パラシテミアのより早期かつ急速に上昇する傾向およびヘマトクリット値の有意な減少が観察された。（図７）
【００８５】
以上のように、マラリアと同様に赤血球に寄生するバベシア原虫の感染実験において、Ｌｏｘ−１のこの原虫感染症への関与を示唆する成績が得られた。Ｌｏｘ−１は老化赤血球をリガンドとすることが知られているが、バベシア感染赤血球に対する機能の詳細は不明である。
【００８６】
［実施例８］  カラゲニン足浮腫に対する受容体反応の検討
実験には、６〜８週齢のＬｏｘ−１ノックアウト雄マウス及び正常マウスを用いた。動物は、室温２０〜２６℃、湿度４０〜７０％、１日１２時間照明（７：００〜１９：００）の飼育室に収容し、市販の固型飼料（Ｆ−２，船橋農場）及び水道水を自由に摂取させて飼育した。なお、動物は３日以上予備飼育した後、一般状態の良好なものをカラゲニン足浮腫法に供した。
【００８７】
一晩絶食させたマウス（体重１４．０〜２０．０ｇ）を１群８匹用い、生理食塩水（大塚製薬工場）に溶解した０．０５ｍＬの１％λ−カラゲニン（Ｌｏｔ  Ｎｏ．  Ｐ−１３，逗子化学）を右側後肢足蹠皮下に注射した。その０．５、１及び３時間後に足容積を測定し、起炎剤投与前の値から浮腫率（％）を算出した（表１、図８）。
【００８８】
【表１】
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【００８９】
成績は平均値±標準誤差で示す。カラゲニン足浮腫法の場合、正常マウス群及びノックアウトマウス群の２群間検定はＢａｒｔｌｅｔｔ（またはＦ検定）による等分散性の検定を行い、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行った。その結果、正常マウスにおけるカラゲニン注射０．５、１及び３時間後の浮腫率はそれぞれ４５．６±６．４、４４．０±７．７及び６４．６±５．７％であった。一方、ノックアウトマウスにおける浮腫率はそれぞれ１３．８±３．４、２８．８±４．８及び４８．１±５．０％と正常マウスに比べ低く、特にカラゲニン注射０．５及び３時間後においては浮腫率の有意な低下が観察された。
【００９０】
また、３時間後の足容積測定後に動物を頚椎脱臼により屠殺し、起炎剤投与足の足根部を１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。固定後、ギ酸脱灰を行い、定法に従ってヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色標本を作製し、病理組織学的検査を実施した（表２，図９）。
【００９１】
【表２】マウス足根部皮下の病理組織学的所見
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変化程度；−：変化なし、＋：軽度、＋＋：中程度、＋＋＋：高度
【００９２】
その結果、正常マウスに共通した所見として、足根部の皮下組織及び筋層において中等度の浮腫並びに炎症性細胞浸潤がやや広範囲に亘って観察され、さらに出血も散見された。一方、ノックアウトマウスにおいても正常マウスと同質の変が観察されたが、特に皮下組織及び筋層における浮腫並びに炎症性細胞浸潤の程度は正常マウスに比べ軽減しており、８例中７例における炎症反応は何れも軽度なものであった。
以上、ノックアウトマウス及び正常マウスにおけるカラゲニン足浮腫に対する作用を検討した結果、浮腫率及び病理組織所見から見て、ノックアウトマウスでは正常マウスに比べ炎症反応の抑制が示唆された。
【００９３】
【発明の効果】
今回作製されたＬＯＸ−１遺伝子欠損マウスを用いた解析により、ＬＯＸ−１アンタゴニストは内皮機能が低下している病態の改善に有用であることが明らかとなった。また、原虫の感染においてもＬＯＸ−１が関与していることが明らかとなった。さらに、ＬＯＸ−１遺伝子欠損マウスでは炎症反応の抑制作用が認められ、ＬＯＸ−１の炎症反応との関連が示唆された。このように、本発明のＬＯＸ−１遺伝子欠損動物は、ＬＯＸ−１の新規機能を明らかにしていくために有用なモデル動物である。また、本発明のＬＯＸ−１遺伝子の機能がノックアウトされたマウスは、動脈硬化の発症、進展、その他未知のＬＯＸ−１遺伝子の役割を探る上で有用なモデルマウスとなる。
【００９４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】上より、クローンＤに含まれるマウスＬＯＸ−１遺伝子の制限酵素サイト、相同組換え用ベクターの構造、相同組み換え後のマウスＬＯＸ−１遺伝子の構造、相同組み換え体解析のためのサザンブロット用プローブをそれぞれ示す図である。
【図２】図１のプローブのうち５’上流側の配列を有するプローブ、および３’下流側の配列を有するプローブを用いたＥＳ細胞ゲノムＤＮＡ断片のサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図３】マウスゲノムＤＮＡ断片の図１のプローブのうち５’上流側の配列を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図４】マウスＬＯＸ−１  ｃＤＮＡ及びマウスＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物の電気泳動結果を示す図である。
【図５】ｏｘＬＤＬによる血管内皮細胞依存性弛緩反応の減弱を野生型マウス及びＬＯＸ−１遺伝子欠損マウスで比較した結果を示す図である。
【図６】Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ感染後のパラシテミアを野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）及びＬＯＸ−１遺伝子欠損マウス（ＬＯＸ−１  ＫＯ）で比較した結果を示す図である。
【図７】Ｂａｂｅｓｉａ  ｒｏｄｈａｉｎｉ感染後のパラシテミアを野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）及びＬＯＸ−１遺伝子欠損マウス（ＬＯＸ−１  ＫＯ）で比較した結果を示す図である。
【図８】カラゲニン処理後の足容積を野生型マウス（ＷＴ）及びＬＯＸ−１遺伝子欠損マウス（ＫＯ）で比較した結果を示す図である。
【図９】野生型マウス（１〜３）及びＬＯＸ−１遺伝子欠損マウス（４〜６）のカラゲニン処置足根部の組織写真を示す。１及び４：×５０、２及び５は各々１及び４を拡大した写真（×１２５）、３及び６は各々写真２及び５を拡大した写真（×２５０）である。▲は炎症性細胞浸潤、矢印は浮腫を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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