(57)【要約】【課題】播種の操作が容易で作業性に優れた細胞培養システムおよび播種方法を提供する。【解決手段】細胞を培養するための培地が充填された細胞培養容器１と、この細胞培養容器１に新鮮な培地を供給するための培地供給管７とを備えるとともに、この培地供給管７の途中に、播種液供給源から供給される所要量の播種液を受け入れて当該播種液を培地供給管７の流路上に供給可能な播種ユニット１０を備える。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養するための培地が充填された細胞培養容器と、この細胞培養容器に新鮮な培地を供給するための培地供給流路とを備えるとともに、この培地供給流路の途中に、播種液供給源から供給される所要量の播種液を受け入れて当該播種液を上記培地供給流路上に供給可能な播種ユニットを備えることを特徴とする細胞培養システム。
【請求項２】
上記播種ユニットは、上記培地供給流路を開通状態とする第１状態と、上記培地供給流路を遮断して上記播種液供給源から播種液を受入可能な第２状態とに可逆的に切換可能な弁体を有し、この弁体には、上記第１状態にて上記培地供給流路の一部区間を構成し上記第２状態にて上記播種液が充填される穴部が設けられていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項３】
上記穴部は、上記細胞培養容器に播種される播種液量に相当する内容積を有することを特徴とする請求項２に記載の細胞培養システム。
【請求項４】
請求項２または３に記載の細胞培養システムを用いた播種方法であって、
上記播種ユニットの上記弁体を上記第１状態にして、上記培地供給流路を介して上記細胞培養容器内に新鮮な培地を供給する培地供給工程と、
この培地供給工程を経て上記細胞培養容器内に新鮮な培地が充填された後、上記弁体を上記第２状態に切り換えて、上記弁体の穴部内に播種液を充填する播種液充填工程と、
上記穴部内に播種液が充填された上記弁体を上記第１状態に復帰させて、上記培地供給流路を介して上記細胞培養容器内に新鮮な培地を供給することにより、上記穴部内の播種液を上記新鮮な培地で押し流して上記細胞培養容器内に投入する播種液投入工程とを有することを特徴とする播種方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、宇宙実験施設等の閉鎖環境において動物細胞等の細胞を培養試験する際に用いて好適な細胞培養システムおよび播種方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
例えば動物細胞等の細胞を培養試験する場合には、フラスコや試験管等の容器に培地を入れ、これに播種液（細胞と培地を混合してなる種液）をピペット等で投入して所定の培養環境下で一定期間保持することによって細胞の培養が行われる。ただし、細胞を培養する容器が密閉容器である場合には、播種液を予め培地で所定倍率に希釈してから注射器等で上記密閉容器内に注入するという方法が採られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
一方、宇宙実験施設等の閉鎖環境において動物細胞等の細胞を培養試験する場合には、限られたスペースの中で効率良く個々の作業を実施する必要がある。ところが、上記従来の培養方法においては、播種の操作が手作業で行われていたために、非常に作業効率が悪く、上記閉鎖環境で細胞を培養するにあたって作業性の面で大きな課題を有していた。特に、細胞の培養に密閉容器を用いる場合には、播種の際に希釈操作が加わることとなるので、作業効率がさらに悪くなるという問題点があった。
【０００４】
本発明は、かかる事情に鑑みてなされたもので、播種の操作が容易で作業性に優れた細胞培養システムおよび播種方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載の本発明に係る細胞培養システムは、細胞を培養するための培地が充填された細胞培養容器と、この細胞培養容器に新鮮な培地を供給するための培地供給流路とを備えるとともに、この培地供給流路の途中に、播種液供給源から供給される所要量の播種液を受け入れて当該播種液を上記培地供給流路上に供給可能な播種ユニットを備えることを特徴とするものである。
【０００６】
この請求項１に記載の本発明に係る細胞培養システムによれば、播種液供給源から播種ユニットに播種液を供給することにより、当該播種液を培地供給流路上に供給することができる。このため、播種ユニットによって培地供給流路上に供給された播種液を新鮮な培地で押し流して細胞培養容器内に投入することができるとともに、上記新鮮な培地で播種液を希釈することができる。
したがって、従来のようにピペット等を用いて手作業で播種操作を行う場合と比べて、作業性を大幅に向上させることができる。また、播種と希釈の両操作を同時に行うことができるので、細胞培養容器が密閉容器であっても、播種液を予め培地で希釈する必要がなく、作業効率が低下することはない。
【０００７】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の細胞培養システムにおいて、上記播種ユニットが、上記培地供給流路を開通状態とする第１状態と、上記培地供給流路を遮断して上記播種液供給源から播種液を受入可能な第２状態とに可逆的に切換可能な弁体を有し、この弁体には、上記第１状態にて上記培地供給流路の一部区間を構成し上記第２状態にて上記播種液が充填される穴部が設けられていることを特徴とするものである。
【０００８】
この請求項２に記載の発明によれば、播種ユニットに、第１状態と第２状態とに可逆的に切換可能な弁体を設けて、この弁体に、第１状態にて培地供給流路の一部区間を構成し第２状態にて播種液が充填される穴部を設けたので、弁体を第１状態にすれば、培地供給流路を介して細胞培養容器内に新鮮な培地を供給することができ、弁体を第２状態に切り換えれば、弁体の穴部内に播種液を充填することができる。また、穴部内に播種液を充填した状態で、弁体を第１状態に切り換えて、培地供給流路を介して細胞培養容器内に新鮮な培地を供給するようにすれば、穴部内の播種液を新鮮な培地で押し流して細胞培養容器内に投入することができる。
【０００９】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の細胞培養システムにおいて、上記穴部が、上記細胞培養容器に播種される播種液量に相当する内容積を有することを特徴とするものである。
【００１０】
この請求項３に記載の発明によれば、穴部の内容積が、細胞培養容器に播種される播種液量に相当する内容積に予め設定されているので、播種液の計量操作が不要となる。また、播種液の希釈割合にバラツキが生じることを防止でき、これにより試験精度を高めることができる。
【００１１】
請求項４に記載の発明は、請求項２または３に記載の細胞培養システムを用いた播種方法であって、上記播種ユニットの上記弁体を上記第１状態にして、上記培地供給流路を介して上記細胞培養容器内に新鮮な培地を供給する培地供給工程と、この培地供給工程を経て上記細胞培養容器内に新鮮な培地が充填された後、上記弁体を上記第２状態に切り換えて、上記弁体の穴部内に播種液を充填する播種液充填工程と、上記穴部内に播種液が充填された上記弁体を上記第１状態に復帰させて、上記培地供給流路を介して上記細胞培養容器内に新鮮な培地を供給することにより、上記穴部内の播種液を上記新鮮な培地で押し流して上記細胞培養容器内に投入する播種液投入工程とを有することを特徴とするものである。
【００１２】
この請求項４に記載の本発明に係る播種方法によれば、弁体の切換操作によって簡単に、所要量の播種液を細胞培養容器内に投入することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
図１および図２は、本発明に係る細胞培養システムの一実施形態を示すものであり、このシステムは、キャニスタと呼ばれるケース内に収納されている。
図１において符号１が細胞培養容器であり、この細胞培養容器１は、上面に開口を有する凹部が設けられた透明な容器本体２と、この容器本体２の上記開口を塞ぐ膜材３とを備えている。膜材３は、シリコンゴム等からなるガス交換膜によって構成され、このガス交換膜の内面側には、培地が充填される培養空間４が形成されている。
【００１４】
この培養空間４は、断面が矩形の細長い線状の空間とされ、その一端側に培地の注入口１Ａが設けられる一方、他端側に排出口１Ｂが設けられている。また、ガス交換膜の外面側には、飽和水蒸気を含んだ空気が環流されており、その環流空気と培養空間４内の培地との間でガス交換が行われるようになっている。
また、培養空間４に面する凹部壁面は、培養細胞の偏在を防止すべく平滑面とされ、その材質としては、培養細胞が接着あるいは忌避しないもの（例えば石英ガラス）が選定されている。さらに、この細胞培養容器１は、オートクレーブ減菌を行うのに十分な耐熱性および耐圧性を備えている。
【００１５】
この細胞培養容器１の近傍には、培養空間４に照明用のレーザ光を照射する平面レーザ５が設置されるとともに、この平面レーザ５のレーザ光が照射された所定領域の画像を撮影するＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）カメラ６が設置されている。このＣＣＤカメラ６で捉えた画像は制御装置（図示省略）に送信される。制御装置は、受信した画像中の細胞数を計数することにより培養空間４における細胞密度を導出する処理を実行する。なお、容器本体２は、前述したように、透明な材質により形成されているので、その内部に設けられた培養空間４をＣＣＤカメラ６や目視により外部から観察することができる。
【００１６】
細胞培養容器１の注入口１Ａには、新鮮な培地を注入するための培地供給管（培地供給流路）７の一端が接続され、この培地供給管７の他端には、新鮮な培地を貯留するための新鮮培地容器８が設けられている。また、培地供給管７の途中には、新鮮培地容器８内の培地を細胞培養容器１に移送するための培地移送ポンプ９が設けられている。
【００１７】
培地移送ポンプ９の吐出側には、播種液供給源（図示省略）から供給される所要量の播種液を受け入れて当該播種液を培地供給管７内に供給可能な播種ユニット１０が設けられ、この播種ユニット１０と細胞培養容器１との間にはバルブ１４が設けられている。播種ユニット１０は、培地移送ポンプ９から細胞培養容器１に至る流路（第１流路）と播種液供給源から廃培地容器１８に至る流路（第２流路）のいずれか一方を開通状態とする流路切換弁であって、各々の流路に対応する４つのポートが設けられた本体１１と、それらポートの中から連通させるポートの組み合わせを選択的に切換可能な弁体１２とを備えて構成されている。すなわち、弁体１２は、その連通孔（穴部）１３を介して上記第１流路を開通状態とする第１状態（図１の状態）と、連通孔１３を介して上記第２流路を開通状態とする第２状態（図２の状態）とに可逆的に回動変換可能な状態で本体１１内に組み込まれている。
【００１８】
なお、連通孔１３は、細胞培養容器１に播種される播種液量（培養空間４の容積×希釈割合）に相当する内容積を有している。このため、例えば弁体１２を上記第２状態にして連通孔１３内に播種液を充填してから、弁体１２を上記第１状態に変換して培地移送ポンプ９を作動させるようにすれば、培地の流れを利用して適量の播種液を細胞培養容器１内に投入することができる。
【００１９】
一方、細胞培養容器１の排出口１Ｂには、途中で第１分岐路１７ａと第２分岐路１７ｂとに２分岐する培地排出管１７が接続され、各分岐路の途中にはそれぞれバルブ１５、１６が設けられている。第１分岐路１７ａには、培養細胞をサンプリングするためのサンプリングユニット２０がアキュムレータ２５を介して接続される一方、第２分岐路１７ｂには、不要となった培地等を回収するための廃培地容器１８が接続されている。
【００２０】
サンプリングユニット２０は、採取した培養細胞を封入するための複数（図示例では９）のサンプリング容器２１と、パージ空気を受けるパージ用容器２２と、アキュムレータ２５から送られる培養細胞の受入先となるサンプリング容器２１を切換操作するための駆動モータ２３とを備えている。各サンプリング容器２１には、サンプリングした培養細胞を化学固定するための試薬（例えば塩化第二水銀など）が予め充填されている。
【００２１】
アキュムレータ２５は、ＰＦＡ（パーフルオロアルコキシ）など酸素透過性のある素材のチューブであって、細胞培養容器１の排出口１Ｂから押し出された培地に含まれる培養細胞を一定期間チューブ内に滞留させて定常状態で維持するためのものである。例えば培養細胞がゾウリムシである場合には、一定期間定常状態（飢餓状態）で維持することによって、オートガミー能を有するゾウリムシにオートガミーを誘導することが可能になる。このアキュムレータ２５内の培養細胞は、空気注入ポンプ１９から供給される空気の圧力によって、サンプリングユニット２０へと送液されるようになっている。なお、そのときの空気圧は、アキュムレータ２５内に培養細胞が残留することを防止し得る圧力に予め設定されている。
【００２２】
また、当該システムが収納されるキャニスタ内には、細胞培養容器１近傍の温度や湿度等を計測する各種センサが設けられるとともに、それらセンサやＣＣＤカメラ６等からの出力に基づいて各種機器（培地移送ポンプ９、サンプリングユニット２０、空気注入ポンプ１９、バルブ１４、１５、１６、ヒータなど）を制御する制御装置が設けられている。
【００２３】
次に、上記細胞培養システムを用いた本発明に係る播種方法の一実施形態について、図３および図４に基づいて説明する。
先ず、制御装置が、図３（ａ）に示すように、播種ユニット１０の弁体１２を第１状態、バルブ１４、１５を開状態、バルブ１６を閉状態として、培地移送ポンプ９を作動させる。その結果、図３（ｂ）に示すように、新鮮培地容器８内の新鮮な培地が培地供給管（培地供給流路）７を介して細胞培養容器１内に送り込まれて、細胞培養容器１内が新鮮な培地で満たされる（培地供給工程）。また、排出口１Ｂより溢れた培地は廃培地容器１８へと導かれる。
【００２４】
次いで、制御装置が、培地移送ポンプ９の作動を停止させ、図３（ｃ）に示すように、播種ユニット１０の弁体１２を第２状態に変換する。この状態で、図４（ａ）に示すように、播種液供給源から播種液の供給が行われて、弁体１２の連通孔（穴部）１３内に播種液が充填される（播種液充填工程）。その際に連通孔１３から溢れた播種液は、上記第２流路を通って廃培地容器１８へと導かれる。次いで、制御装置が、図４（ｂ）に示すように、播種ユニット１０の弁体１２を第１状態に復帰させて、培地移送ポンプ９を作動させる。これにより、図４（ｃ）に示すように、新鮮培地容器８内の新鮮な培地が細胞培養容器１内に送り込まれ、この培地の流れに連通孔１３内の播種液が押し流されて、細胞培養容器１内に所要量（連通孔１３の内容積に相当する量）の播種液が投入される。
【００２５】
その後、制御装置が、培地移送ポンプ９の作動を停止させ、バルブ１４、１５を閉状態に変換する。これにより、播種操作が完了となる。
このように、上記播種方法によれば、弁体１２の切換操作によって簡単に、所要量の播種液を細胞培養容器１内に投入することができる。
【００２６】
次に、上記播種操作に続いて行われる培養細胞の希釈・サンプリング操作について具体的に説明する。
制御装置では、ＣＣＤカメラ６から入力した画像に基づいて培養空間４における細胞密度を計測する処理が随時行われ、その計測値が所定値以上となった際に、この希釈・サンプリング操作が開始される。
【００２７】
先ず、制御装置が、図１に示すように、播種ユニット１０の弁体１２を第１状態、バルブ１４、１６を開状態、バルブ１５を閉状態として、培地移送ポンプ９を作動させる。これにより、新鮮培地容器８内の新鮮な培地が注入口１Ａより細胞培養容器１内に順次送り込まれる。この際に、培地の流れが層流（すなわちレイノルズ数が所定値以下）となるように、注入口１Ａより細胞培養容器１内に新鮮な培地が注入されて、その注入量に相当する培地が細胞培養容器１の排出口１Ｂから順次押し出されるので、上記注入量に応じた量の培地（培養細胞を含む希釈前の培地）が新鮮な培地に交換されることとなる。例えば、希釈割合を１／Ｎ（ただし、Ｎ＞１）とする場合には、新鮮な培地の注入により、培養空間４の（Ｎ−１）／Ｎに相当する培地（培養細胞を含む希釈前の培地）が新鮮な培地に交換されたところで、制御装置が、培地移送ポンプ９の作動を停止させ、バルブ１４を閉状態に変換する。これにより、培養空間４内の培養細胞が１／Ｎに希釈される。
【００２８】
一方、排出口１Ｂから押し出された培地（培養細胞を含む希釈前の培地）は、先ず始めにアキュムレータ２５に流入し、その流入量がサンプリングの必要量に達したところで、バルブ１５、１６の切換操作によって、廃培地容器１８へと流入する。
アキュムレータ２５内の培地は、そのままの状態で一定期間維持された後（例えば、培養細胞がゾウリムシである場合には、一定期間定常状態で維持されてオートガミーの誘導が行われた後）、制御装置が空気注入ポンプ１９を作動させることにより、空気圧でサンプリングユニット２０へと送液されて、サンプリング容器２１のいずれかに収納される。サンプリング容器２１に収納された培養細胞は、予め容器内に充填されていた試薬によって化学固定され、その状態で所定期間保存される。これにより、希釈・サンプリング操作が完了となる。
【００２９】
次に、上記構成からなる細胞培養システムを用いて、「単細胞生物であるゾウリムシのクローン寿命の変動を測定する試験」を宇宙実験施設等で行う場合の手順について簡単に説明する。ここでは、ゾウリムシのオートガミー未熟期（自家接合した細胞が次の自家接合能力を獲得するまでの期間）の変動に基づいてクローン寿命の変動を測定する場合を例にとって説明する。
【００３０】
先ず、予めオートガミーが誘導されて定常期にある細胞のみを含む播種液を、前述した播種操作によって、細胞培養容器１内に所要量投入する。ここでは、新鮮な培地が充填された培養空間４に、その２のｎ乗分の１（例えば１／８）に相当する播種液を投入することによって、細胞を２のｎ乗分の１に希釈する。
次いで、一定期間細胞を培養し、図５に示すように、培養した細胞の密度がほぼ希釈前の水準に達して（すなわち、細胞分裂がｎ回行われて）増殖が定常期に入ったことが細胞密度の計測結果により確認されたら、培養を開始してからの経過時間（培養時間）を記録するとともに、前述した手順で希釈・サンプリング操作を行う。ここでは、細胞培養容器１内の培養細胞が２のｎ乗分の１に希釈されるように、新鮮な培地を細胞培養容器１内に注入する。
その後、上記と同様に、ＣＣＤカメラ６による細胞密度の計測結果に基づいて、上記希釈・サンプリング操作を所定回数（ここでは合計９回）繰り返す。
【００３１】
以上の操作が完了したら、サンプリングユニット２０の各サンプリング容器２１内で化学固定された細胞を取り出して、各々の大核を顕微鏡下で観察し、その形態変化に基づいてオートガミーの出現頻度を求める。これにより、オートガミーの出現頻度の推移を分裂齢および培養時間の関数として導き出すことができ、これに基づいて、ゾウリムシのクローン寿命の変動を測定することができる。
【００３２】
以上のように、上記構成からなる細胞培養システムによれば、培地供給管７の途中に、播種液供給源から供給される所要量の播種液を受け入れて当該播種液を培地供給管７内に供給可能な播種ユニット１０を設け、この播種ユニット１０に、培地供給管７を開通状態とする第１状態と、培地供給管７を遮断して播種液供給源から播種液を受入可能な第２状態とに可逆的に切換可能な弁体１２を設けて、この弁体１２に、上記第１状態にて培地供給管７の一部区間を構成し上記第２状態にて播種液が充填される連通孔１３を設けたので、弁体１２を上記第１状態にすれば、培地供給管７を介して細胞培養容器１内に新鮮な培地を供給することができ、弁体１２を上記第２状態に切り換えれば、弁体１２の連通孔１３内に播種液を充填することができる。また、連通孔１３内に播種液を充填した状態で、弁体１２を上記第１状態に切り換えて、培地供給管７を介して細胞培養容器１内に新鮮な培地を供給するようにすれば、連通孔１３内の播種液を新鮮な培地で押し流して細胞培養容器１内に投入することができる。
【００３３】
したがって、従来のようにピペット等を用いて手作業で播種操作を行う場合と比べて、作業性を大幅に向上させることができる。また、播種と希釈の両操作を同時に行うことができるので、細胞培養容器１が密閉容器であっても、播種液を予め培地で希釈する必要がなく、作業効率が低下することがない。
さらに、連通孔１３の内容積が、細胞培養容器１に播種される播種液量に相当する内容積に予め設定されているので、播種液の計量操作が不要となる。また、播種液の希釈割合にバラツキが生じることを防止でき、培養試験の精度を高めることができる。
【００３４】
なお、上記実施形態においては、播種ユニット１０の弁体１２の切換制御を制御装置が行う構成としたが、これに限られるものではなく、例えば、当該細胞培養システムの利用者がハンドル操作等によって弁体１２の切換を行うような構成であってもよい。
【００３５】
【発明の効果】
以上説明したように、請求項１に記載の本発明に係る細胞培養システムによれば、播種ユニットによって培地供給流路上に供給された播種液を新鮮な培地で押し流して細胞培養容器内に投入することができるとともに、上記新鮮な培地で播種液を希釈することができる。
したがって、従来のようにピペット等を用いて手作業で播種操作を行う場合と比べて、作業性を大幅に向上させることができる。また、播種と希釈の両操作を同時に行うことができるので、細胞培養容器が密閉容器であっても、播種液を予め培地で希釈する必要がなく、作業効率が低下することはない。
【００３６】
請求項２に記載の発明によれば、弁体を第１状態にすれば、培地供給流路を介して細胞培養容器内に新鮮な培地を供給することができ、弁体を第２状態に切り換えれば、弁体の穴部内に播種液を充填することができる。また、穴部内に播種液を充填した状態で、弁体を第１状態に切り換えて、培地供給流路を介して細胞培養容器内に新鮮な培地を供給するようにすれば、穴部内の播種液を新鮮な培地で押し流して細胞培養容器内に投入することができる。
【００３７】
請求項３に記載の発明によれば、播種液の計量操作が不要となる。また、播種液の希釈割合にバラツキが生じることを防止でき、これにより培養試験の精度を高めることができる。
請求項４に記載の本発明に係る播種方法によれば、弁体の切換操作によって簡単に、所要量の播種液を細胞培養容器内に投入することができる。
したがって、宇宙実験施設等の閉鎖環境で動物細胞等の細胞を培養試験する場合において、本発明に係る細胞培養システムおよび播種方法を好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る細胞培養システムの一実施形態を示す概略構成図である。
【図２】図１の播種ユニットの弁体を第２状態に変換したときの状態を示す図である。
【図３】播種操作の手順を説明する図である。
【図４】図３の続きの手順を説明する図である。
【図５】細胞密度の推移を培養時間の関数として示したグラフである。
【符号の説明】
１    培養細胞容器
７    培地供給管（培地供給流路）
１０  播種ユニット
１２  弁体
１３  連通孔（穴部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2004208665.tif 000006
【図５】
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