(57)【要約】【課題】従来のメラニン生成抑制剤にみられる上記のような問題を解決できるメラニン生成抑制剤を皮膚外用剤として提供すること。【解決手段】ヒト由来のチロシナーゼに対し、β−アルブチンより強力な阻害効果がある、β−Ａｂ−α−Ｇ１、β−Ａｂ−α−Ｇ２、α−Ａｂ−α−Ｇ１及びα−Ａｂ−α−Ｇ２を各種のメラニン生成抑制剤として提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−ハイドロキシフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド（以下β−アルブチン）のグルコースの４位のＯＨ基にグルコースが１つ以上α−結合している、又は、４−ハイドロキシフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド（以下α−アルブチン）のグルコースの４位のＯＨ基にグルコースが２つ以上α−結合していることを特徴とするα−あるいはβ−アルブチン配糖体。
【請求項２】
α−及びβ−アルブチンに糖供与体の存在下、糖転移酵素又は加水分解酵素を使用した糖転移反応による配糖化あるいは加水分解酵素を使用した縮合反応による配糖化を特徴とするアルブチン配糖体の製造法。
【請求項３】
請求項２に記載の製造法により作成した請求項１に記載のα−あるいはβ−アルブチン配糖体及び請求項２に記載の製造法により作成したα−アルブチンのグルコースの４位のＯＨ基にグルコースが１つα−結合していることを特徴とするアルブチン配糖体。
【請求項４】
請求項１及び３に記載したα−あるいはβ−アルブチン配糖体を１種以上含有する皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、α−及びβ−アルブチン配糖体、その製造法及びそれを含有する皮膚外用剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より皮膚の美白化（皮膚黒化予防）および紫外線に過度に暴露されるために生じるしみ・そばかすならびに肝班などの予防、改善のために各種のメラニン生成抑制剤が用いられてきた。その代表例として、ハイドロキノンのフェノール性ＯＨ基にグルコースがβ−結合したアルブチン（β−アルブチン）が挙げられる。
【０００３】
しかし、β−アルブチンは、チロシナーゼの働きを抑えることでその効果が発揮されるものであるが、特開昭６０−０１６９０６号に記載のように皮膚における分解性が高く、効果の面などでも必ずしも満足できるものではない。
【０００４】
【特許文献１】
特開昭６０−０１６９０６号
【特許文献２】
特開平６−２８４８９６号
【非特許文献１】
Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｖｏｌ．１００Ｂ，Ｎｏ１，１３７−１３９（１９９１）
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、従来のメラニン生成抑制剤にみられる上記のような問題を解決できるメラニン生成抑制剤を皮膚外用剤として提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題を解決すべく、外用剤として安定で、しかも安全性が高く、さらに従来のものより遥かに効果の高い物質を追求して行く中で、次のような知見を得た。
（１）先ず、前記の目的に叶う化合物としてα−アルブチンα−Ｄ−グルコピラノシド（以下α−Ａｂ−α−Ｇ１）及びα−アルブチンα−Ｄ−マルトシド（以下α−Ａｂ−α−Ｇ２）が存在すること。（図１に構造図）同様に、β−アルブチンα−Ｄ−グルコピラノシド（以下β−Ａｂ−α−Ｇ１）及びβ−アルブチンα−Ｄ−マルトシド（以下β−Ａｂ−α−Ｇ２）が存在すること。（図２に構造図）
（２）β−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２がヒト由来のチロシナーゼに対し、β−アルブチンより強力な阻害効果があること。同様に、α−Ａｂ−α−Ｇ１及びα−Ａｂ−α−Ｇ２がヒト由来のチロシナーゼに対し、β−アルブチンより強力な阻害効果があること。
【０００７】本発明の皮膚外用剤は、上記の知見に基づくもので、ヒトのチロシナーゼに対する活性阻害に優れたβ−Ａｂ−α−Ｇ１又はβ−Ａｂ−α−Ｇ２又はα−Ａｂ−α−Ｇ１又はα−Ａｂ−α−Ｇ２を１種以上含有することを特徴とする。
【０００８】α−Ａｂ−α−Ｇ１は特許文献２（ポリフェノール配糖体の製造法）に既出の物質（ハイドロキノン−Ｏ−α−マルトシドとして記述）であるが、この中では実施例で調製された物質としての記述しかなく本特許の主旨であるチロシナーゼの阻害効果に関する記述は一切ない。製造法に関しても本特許においてはα‐アルブチンを受容体として用いているのに対して、特許文献２においてはハイドロキノンを受容体として用い、そこにグルコースを２つ転移させたものとして扱っている。また、製造用酵素についても特許文献２においてはサイクロデキストリン合成能のない糖化型α‐アミラーゼに限定している点で本特許とは明らかに異なる。すなわち、本特許におけるα−Ａｂ−α−Ｇ１は請求項２、３、４においては特許文献２と明確に区別されるものである。
【０００９】ここでアルブチン配糖体とは、α−及びβ−アルブチンに糖供与体の存在下、糖転移反応あるいは縮合反応をさせることによって製造されるものの総称であり、詳しくはα−及びβ−アルブチンのグルコースの４位のＯＨ基にグルコースが１つ以上α−結合している物質であるが、結合する物質はグルコースに限定されるものではない。また結合する部位もグルコースの４位に限定されるものではない。
【００１０】このβ−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２、又はα−Ａｂ−α−Ｇ１及びα−Ａｂ−α−Ｇ２は、例えば細菌由来の酵素によるアルブチンの配糖化により得られるもので、この酵素はアミラーゼであり、このアミラーゼは例えば、ＣＧＴａｓｅ（シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ）［ＥＣ　２．４．１．１９］、α−アミラーゼ［ＥＣ　３．２．１．１］、β−アミラーゼ［ＥＣ　３．２．１．２］、グルコアミラーゼ［ＥＣ　３．２．１．３］、α−グルコシダーゼ［ＥＣ　３．２．１．２０］、β−ガラクトシダーゼ［ＥＣ　３．２．１．２３］等である。
【００１１】色素沈着を惹起するメラニンの生成は、チロシナーゼ酵素が最も重要な役割を果たしており、美白剤、しみ・そばかすの予防、肝班の改善を目的とした外用剤の多くは、チロシナーゼを阻害する物質で構成されている。このチロシナーゼの阻害作用の強弱が、これらの目的を達成する度合いと深く関わっており、チロシナーゼ阻害作用の大きい物質ほど、優れた美白効果、しみ・そばかすの予防効果、肝班の改善作用が期待される。
【００１２】ヒトの皮膚の培養細胞からチロシナーゼを精製し、ヒトのチロシナーゼに対するβ−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２の阻害効果を検討したところ、β−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２は、ヒト由来のチロシナーゼに対し、β−アルブチンより高い阻害活性を有するとの知見を得た。
【００１３】この知見に基づき、本発明に係るβ−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２を配合した皮膚外用剤を用いてボランティアによる美白効果（皮膚黒化予防効果）及び肝班改善効果の臨床試験を行ったところ、従来から用いられているメラニン生成抑制剤（β−アルブチン）より優れた効果を得られることができることを確認した。
また、非特許文献１ではブタの皮膚を使用してグルコシダーゼ活性の比較を行った結果、ブタ皮膚ではβ−グルコシダーゼ活性がα−グルコシダーゼ活性より高いことを明らかにしている。このことから考えるとβ−アルブチンのグルコースの４位のＯＨ基にグルコースが１〜２個α結合しているβ−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２は、ハイドロキノンにグルコースがβ−結合したβ−アルブチンより分解されにくいと予想される。すなわち、β−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２は安定性が高く、ハイドロキノンを生成し難いことから、安全性も極めて高いと推定される。
【００１４】このように優れたヒト由来のチロシナーゼ活性阻害作用を有し、ヒトに対する安全性が高く、空気中・水中での熱・酸化に対する安定性が高く、皮膚外用剤中での経時的変質のないβ−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２、又はα−Ａｂ−α−Ｇ１及びα−Ａｂ−α−Ｇ２は、ＣＧＴａｓｅと糖供与体（マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、各種スターチ等のα−１，４結合を持つグルカン）を用い、例えば次のような条件で工業的に量産することができる。
α又はβ−アルブチンが１〜２０重量％、好ましくは１〜１５重量％、デキストリンが１〜５０重量％、好ましくは、１０〜３０重量％となるように、ｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ５〜８の溶媒（燐酸、酢酸等を加えた水溶液）中に溶解し、これを室温〜９０℃、好ましくは３０〜７０℃に加温し、ここに、ＣＧＴａｓｅを１〜１００単位、好ましくは５〜８０単位を加え、上記温度で１〜４８時間、好ましくは５〜２４時間反応させる。
【００１５】本発明は、上記（００１４）のようにして得られ、かつ優れたヒト由来のチロシナーゼ活性阻害作用を有し、ヒトに対する安全性、空気中・水中での熱・酸化に対する安定性が高く、皮膚外用剤中での経時的変質の少ないという特性を有するβ−Ａｂ−α−Ｇ１又はβ−Ａｂ−α−Ｇ２又はα−Ａｂ−α−Ｇ１又はα−Ａｂ−α−Ｇ２を１種以上含む皮膚外用剤であり、アルブチン配糖体の他に他の美白成分、化粧品、医薬品等に一般に用いられる各種成分、すなわち水性成分、粉末成分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、紫外線吸収剤、色剤、薬剤、香料等を配合することができる。もちろんこれらは本発明の効果を損なわない量的、質的範囲内で使用されなければならない。さらに、剤型としては、軟膏、クリーム、乳液、ローション等を挙げることができる。例えば、洗顔料、化粧水、ジェル、エッセンス、パック・マスク、髭剃り用化粧料、ファンデーション、口紅、医薬品、医薬部外品等に適用可能であるが、これらの剤型の種類は本発明を限定するものではない。
美白効果を上げるためには、他の美白成分（例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸硫酸エステル（塩）、アスコルビン酸リン酸エステル（塩）等のビタミンＣ類、コウジ酸、エラグ酸、α−アルブチン、β−アルブチン等）又は、紫外線吸収剤（例えば、メチルアントラニレート、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレート等のアントラニル酸系紫外線吸収剤、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン等のベンゾフェノン系紫外線吸収剤、ジアニソイルメタン等の長波長紫外線吸収剤、ジベンザラジン等の中波長紫外線吸収剤、Ｎ，Ｎ−ジメチルＰＡＢＡアミルエステル等の安息香酸系紫外線吸収剤、酸化チタン、酸化亜鉛等の紫外線遮断剤等）又は、保湿剤（チロシナーゼ阻害剤の経皮吸収率を上げるため；ポリエチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マルチトール等）等を配合可能である。
本発明の皮膚外用剤におけるβ−Ａｂ−α−Ｇ１又はβ−Ａｂ−α−Ｇ２又はα−Ａｂ−α−Ｇ１又はα−Ａｂ−α−Ｇ２の配合量は、皮膚外用剤全量中、０．０５〜１０重量％程度、好ましくは０．０５〜２重量％程度で美白効果（皮膚黒化予防効果）、しみ・そばかすの予防、肝班の改善などの効果を良好に得ることができるが、この配合量は、本発明を何ら拘束するものではない。
【００１６】
【実施例】
（実施例１）
〔アルブチン配糖体の調製例〕
β−アルブチンを２重量％、マルトオリゴ糖を２０重量％、ＣＧＴａｓｅ　７５単位を２５ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し合計５ｍｌとした後、４０℃で１６時間保持した。この溶液をゲル濾過に供し、アルブチン配糖体の画分を回収、凍結乾燥した。
以上の操作によりβ−Ａｂ−α−Ｇ１の粉末を約２０ｍｇ、β−Ａｂ−α−Ｇ２の粉末を約５ｍｇ得た。高速液体クロマトク゛ラフィーにより純度を測定したところ、どちらも９５％以上であった。
同様に、α−アルブチンを２重量％、マルトオリゴ糖を２０重量％、ＣＧＴａｓｅ　７５単位を２５ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し合計５ｍｌとした後、４０℃で１６時間保持した。この溶液をゲル濾過に供し、アルブチン配糖体の画分を回収、凍結乾燥した。
以上の操作によりα−Ａｂ−α−Ｇ１の粉末を約２０ｍｇ、α−Ａｂ−α−Ｇ２の粉末を約５ｍｇ得た。
高速液体クロマトグラフィーにより純度を測定したところ、どちらも９５％以上であった。
【００１７】
（評価例１）
［β−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２のチロシナーゼ活性阻害効果］
上記実施例１にて調製したβ−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２の試験管内（インビトロ）におけるチロシナーゼ活性阻害効果の評価を、ヒト細胞由来チロシナーゼを用いて行った。
活性阻害の測定は、船山らの方法［Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７（１０）１６６６−１６６９（１９９３）］において、マッシュルーム由来のチロシナーゼを、ヒト由来のそれに置き換えて行い、ポジティブコントロールとしてβ−アルブチン（シグマアルドリッチ社製）を用いて行った。
結果を表１、表２に示す。
【００１８】
【表１】
2004115392.tif 000002
【００１９】
（表１）から明らかなように、本発明に係るβ−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２のヒト由来チロシナーゼに対する阻害活性はＩＣ５０でβ−アルブチンの５倍強の値を示した。
つまり、β−アルブチンにグルコースがα−結合することによって阻害活性は上昇する。その際、β−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２の阻害活性に大きな違いがないことからβ−アルブチンに結合するグルコースが３つ以上であってもβ−アルブチンより強い阻害活性を有することは明らかである。
【００２０】
【表２】
2004115392.tif 000003
【００２１】
（表２）から明らかなように、本発明に係るβ−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２のヒト由来チロシナーゼに対する阻害活性はＫｉでβ−アルブチンの４〜５倍の値を示した。
つまり、この例からも上記（００１９）同様にβ−アルブチンにグルコースがα−結合することによって阻害活性は上昇すると言える。
【００２２】
（評価例２）
［α−Ａｂ−α−Ｇ１及びα−Ａｂ−α−Ｇ２のチロシナーゼ活性阻害効果］
α−アルブチンを２重量％、マルトオリゴ糖を２０重量％、ＣＧＴａｓｅ　７５単位を２５ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し合計５ｍｌとした後、４０℃で１６時間保持した。反応液をＨＰＬＣに供したところ、図３のチャートに示す通り、α‐アルブチン、α−Ａｂ−α−Ｇ１、α−Ａｂ−α−Ｇ２、α−Ａｂ−α−Ｇ３、α−Ａｂ−α−Ｇ４、α−Ａｂ−α−Ｇ５の混合液であることが確認された。この混合液を用いて試験管内（インビトロ）におけるチロシナーゼ活性阻害効果の評価を、ヒト細胞由来チロシナーゼを用いて（評価例１）と同様の方法で行った。結果を（表３）に示した。
【００２３】
【表３】
2004115392.tif 000004
【００２４】
（表３）から明らかなようにα−アルフ゛チン配糖体混合液はβ−アルブチンの約２倍の阻害活性を示した。このことから、α−アルブチンにグルコースがα結合したもの（α−Ａｂ−α−Ｇ１、α−Ａｂ−α−Ｇ２、α−Ａｂ−α−Ｇ３、α−Ａｂ−α−Ｇ４、α−Ａｂ−α−Ｇ５）もβ−アルブチンにグルコースがα結合したものと同様にβ−アルブチンより阻害活性が高いと予想される。
【００２５】
（実施例２）
上記の（実施例１）で得たβ−アルブチン配糖体の構造を核磁気共鳴スペクトルにより確認したところ、それぞれβ−Ａｂ−α−Ｇ１及びβ−Ａｂ−α−Ｇ２であった。（表４）に１Ｈ−ＮＭＲの、（表５）に１３Ｃ−ＮＭＲのケミカルシフトを示した。なお、数値は内部標準にＴＳＰ（［２，２，３，３−Ｄ４］ｓｏｄｉｕｍ３−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐａｎａｔｅ）を用いた時の値（ｐｐｍ）で表した。
【００２６】
【表４】
2004115392.tif 000005
【００２７】
【表５】
2004115392.tif 000006
【００２８】
［皮膚外用剤（軟膏およびクリーム）の調製例］
（調製例１）
軟膏について（表６）およびクリームについて（表７）に示す配合割合において、精製水とプロピレングリコールの混液に、上記（実施例１）のアルブチン配糖体の調製例で得られたβ−Ａｂ−α−Ｇ又はβ−Ａｂ−α−Ｇ２又はα−Ａｂ−α−Ｇ１又はα−Ａｂ−α−Ｇ２、パラオキシ安息香酸メチルおよびパラオキシ安息香酸ブチルを加え、８０℃で加熱溶解した。これに、８０℃に加熱し均一に溶解した（表６）および（表７）に示す他の成分の混合体を、少しずつ加え、ホモミキサーで高速乳化した。乳化後、徐々に冷却し、３０℃まで攪拌冷却して、軟膏を調製した。
【００２９】
【表６】
2004115392.tif 000007
【００３０】
【表７】
2004115392.tif 000008
【００３１】
（調製例２）
（表８）に示す配合割合において、精製水にβ−Ａｂ−α−Ｇ１又はβ−Ａｂ−α−Ｇ２又はα−Ａｂ−α−Ｇ１又はα−Ａｂ−α−Ｇ２を添加し、７０℃で溶解し、この温度に保持した。
一方、（表８）に示すローカストビーンガムを除く他の成分を７０℃で混合し、この温度に保持した。この７０℃に保持した他の成分に、上記の７０℃に保持したβ−Ａｂ−α−Ｇ１又はβ−Ａｂ−α−Ｇ２又はα−Ａｂ−α−Ｇ１又はα−Ａｂ−α−Ｇ２と精製水の混合体を加え、充分攪拌した後、５０℃まで冷却し、さらに均質化して３０℃まで冷却した。この３０℃まで冷却したものに、ローカストビーンガムを加え、攪拌し、冷却して、ローションを調製した。
【００３２】
【表８】
2004115392.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】α−アルブチンα−Ｄ−グルコピラノシド及びα−アルブチンα−Ｄ−マルトシドの構造図
【図２】β−アルブチンα−Ｄ−グルコピラノシド及びβ−アルブチンα−Ｄ−マルトシドの構造図
【図３】α−アルブチンに、マルトオリゴ糖をドナーとして、ＣＧＴａｓｅを反応させて得られた反応液のＨＰＬＣチャート（評価例２）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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