(57)【要約】【課題】免疫グロブリンに対する結合特異性が高く、かつ、滅菌処理時または保存中における結合特性の低下が極めて少ない物質を提供する。【解決手段】下記のアミノ酸配列（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｌｅｕ（Ｉ）（配列中、Ｘ１はＰｒｏ、Ｔｈｒ又はＧｌｎを表し、Ｘ２はＰｒｏ、Ａｌａ又はＩｌｅを表し、Ｘ３はＳｅｒ又はＧｌｙを表す。）Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｘ４−Ｐｒｏ（ＩＩ）（配列中、Ｘ４はＧｌｕ又はＡｒｇを表す。）Ｌｅｕ−Ｘ５−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（ＩＩＩ）（配列中、Ｘ５はＳｅｒ、Ｌｅｕ又はＶａｌを表す。）Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｘ６−Ｘ７−Ａｌａ−Ｘ８−Ｘ９−Ｓｅｒ（ＩＶ）（配列中、Ｘ６は、Ｐｒｏ又はＡｒｇを表し、Ｘ７はＴｈｒ又はＬｙｓを表し、Ｘ８はＨｉｓ又はＬｅｕを表し、Ｘ９はＡｌａ又はＳｅｒを表す。）などで表される免疫グロブリン結合性ペプチド、並びにこれらを利用した免疫グロブリン精製用担体及び免疫グロブリンの精製方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１乃至６２記載のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチド。
【請求項２】
下記のアミノ酸配列（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｌｅｕ（Ｉ）
（配列中、Ｘ１はＰｒｏ、Ｔｈｒ又はＧｌｎを表し、Ｘ２はＰｒｏ、Ａｌａ又はＩｌｅを表し、Ｘ３はＳｅｒ又はＧｌｙを表す。）
Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｘ４−Ｐｒｏ（ＩＩ）
（配列中、Ｘ４はＧｌｕ又はＡｒｇを表す。）
Ｌｅｕ−Ｘ５−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（ＩＩＩ）
（配列中、Ｘ５はＳｅｒ、Ｌｅｕ又はＶａｌを表す。）
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｘ６−Ｘ７−Ａｌａ−Ｘ８−Ｘ９−Ｓｅｒ（ＩＶ）
（配列中、Ｘ６は、Ｐｒｏ又はＡｒｇを表し、Ｘ７はＴｈｒ又はＬｙｓを表し、Ｘ８はＨｉｓ又はＬｅｕを表し、Ｘ９はＡｌａ又はＳｅｒを表す。）
を含む免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載の免疫グロブリン結合性ペプチドを担体に固定してなる免疫グロブリン精製用担体。
【請求項４】
請求項３記載の免疫グロブリン精製用担体と免疫グロブリンを含む試料とを接触させ前記担体と免疫グロブリンを結合させ、その後、前記担体から免疫グロブリンを解離させることを特徴とする免疫グロブリンの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は精製用リガンドとして有用な、免疫グロブリンに対して特異的な結合性を有するペプチドに関する。さらに詳述すると、本発明は免疫グロブリンの一定部分にそれ自体を非共有結合的に結合しうるペプチドに関するものであり、免疫グロブリンの精製リガンド等に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
抗体としても知られる免疫グロブリン（Ｉｇ）は脊椎動物の血漿、リンパ液中に存在する免疫を担う糖タンパク質である。現在まで、免疫グロブリンの五つの主要なクラスがヒトにおいて同定（ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧおよびＩｇＭ）されている。近年、これらの免疫グロブリンは診断及び治療分野で極めて重要な地位を占め、事実、有機低分子化合物、環境汚染物質、生体由来物質の同定、定量化試薬として広く使用され、また、治療上有用な各種生体分子に結合し、その結果生じる生理的変動から、臨床的な効果も確認されている。さらには、免疫グロブリン及び免疫グロブリン複合体が慢性間接リウマチなどの各種自己免疫疾患の原因、進行に密接に関与することが明らかになりつつある。
【０００３】
免疫グロブリンは、動物の血清等からの分離あるいは適当な細胞系の培養後、夾雑物を除く大まかな前処理工程・クロマトグラフィーによる精製操作等を経てその製造が行われている。精製工程においてはその特異的吸着による利便性から、免疫グロブリン結合性タンパク質であるプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＬ、リウマチ因子（土屋尚之、臨床免疫、２３巻、８９６−９０３ページ（１９９１年））などを吸着リガンドとするアフィニティークロマトグラフィーが用いられることがある。なかでも、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡはその吸着特性から免疫グロブリンＩｇＧの分離・精製に広く採用され、臨床応用も可能な精製ＩｇＧを提供している。プロテインＡは分子量約４２ＫＤａのタンパク質で、免疫グロブリンＩｇＧの不変領域（定常領域とも称される）である重鎖のＣＨ２、ＣＨ３ドメインに結合することが知られている（Ｆｏｒｓｇｅｒｅｎ  Ａ．，  Ｓｊｏｅｑｕｉｓｔ  Ｊ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７：８２２−８２７（１９６６））。
【０００４】
しかしながら、異種タンパク質である上記タンパク質等を吸着リガンドとするクロマトグラフィー工程を採る場合、それらの溶出による製造物への混入が危惧され（Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ  ＷＩ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．，  ３：３４７−３５１（１９８４），  Ｍｅｓｓｅｒｓｃｈｍｉｄｔ  ＧＬ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．，  ３：３２５−３２９（１９８４））、溶出リガンドを除去する工程が求められる。また、タンパク質リガンドには滅菌時の安定性に問題があり滅菌方法が限定されること、固定化後の保存安定性に欠ける事などが指摘されている。
【０００５】
このように従来から知られている免疫グロブリン吸着剤は、安全性、安定性などの観点から、診断・治療に用いる免疫グロブリンの精製リガンドとしては必ずしも適切とはいえない。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｇ．  Ｋ．  Ｅｈｒｌｉｃｈ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｂａｉｌｏｎ，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｄｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓａｓ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．，  ４９：４４３−４５４（２００１）．
【０００７】
【非特許文献２】
Ｍａｒｇａｒｅｔａ  Ｋｒｏｏｋ，  Ｋｌａｕｓ  Ｍｏｓｂａｃｈ，  ａｎｄ  Ｏｌｏｆ    Ｒａｍｓｔｒｏｎ，  Ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｆｃ−ｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２２１：１５１−１５７（１９９８）．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、免疫グロブリンに対する結合特異性が高く、かつ、滅菌処理時または保存中における結合特性の低下が極めて少ない、安定性、安全性の高い結合物質を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、アミノ酸残基数１０個程度のペプチドであれば天然高分子タンパク質に比べて生体に対する抗原性が極めて低いこと、及びこのような短いペプチドが熱安定性に代表される高い安定性、特に滅菌処理に対する高い安定性および保存安定性を有していることなどの利点を考慮し、各種免疫グロブリン結合性ペプチドの同定を種々検討した。その結果、ペプチドをファージ表面に提示させたファージディスプレイライブラリー（Ｓｍｉｔｈ  Ｇ．  Ｐ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２８：１３１５−１３１７（１９８５））から、免疫グロブリン結合性を有するペプチド提示ファージクローンを多数単離し、そのアミノ酸配列を決定することに成功し本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、配列番号１乃至６２記載のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチドである。
【００１１】
また、本発明は、下記のアミノ酸配列（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｌｅｕ（Ｉ）
（配列中、Ｘ１はＰｒｏ、Ｔｈｒ又はＧｌｎを表し、Ｘ２はＰｒｏ、Ａｌａ又はＩｌｅを表し、Ｘ３はＳｅｒ又はＧｌｙを表す。）
Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｘ４−Ｐｒｏ（ＩＩ）
（配列中、Ｘ４はＧｌｕ又はＡｒｇを表す。）
Ｌｅｕ−Ｘ５−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（ＩＩＩ）
（配列中、Ｘ５はＳｅｒ、Ｌｅｕ又はＶａｌを表す。）
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｘ６−Ｘ７−Ａｌａ−Ｘ８−Ｘ９−Ｓｅｒ（ＩＶ）
（配列中、Ｘ６は、Ｐｒｏ又はＡｒｇを表し、Ｘ７はＴｈｒ又はＬｙｓを表し、Ｘ８はＨｉｓ又はＬｅｕを表し、Ｘ９はＡｌａ又はＳｅｒを表す。）
を含む免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチドである。
【００１２】
更に、本発明は、上記の免疫グロブリン結合性ペプチドを担体に固定してなる免疫グロブリン精製用担体である。
【００１３】
更に、本発明は、上記の免疫グロブリン精製用担体と免疫グロブリンを含む試料とを接触させ前記担体と免疫グロブリンを結合させ、その後、前記担体から免疫グロブリンを解離させることを特徴とする免疫グロブリンの精製方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明のペプチドの第一は、配列番号１乃至６２記載のアミノ酸配列で表される免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチドに関するものである。ここで、「前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチド」とは、配列番号１乃至６２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列で表され、かつ免疫グロブリンと結合し得るペプチドをいう。アミノ酸の欠失、置換若しくは付加の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチド若しくはポリペプチドが、配列番号１乃至６２記載のアミノ酸配列で表されるペプチドと同様に免疫グロブリンに対して結合性を有するペプチドであれば特に制限されない。但し、欠失等させるアミノ酸の個数は、通常５個以内であり、好ましくは３個以内であり、最も好ましくは１個である。アミノ酸の改変は、例えば突然変異や翻訳後修飾などに生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変、変異の原因および手段を問わず、上記特性を有するすべての改変ペプチドを包含する。
【００１６】
上述したペプチドの中、好適なペプチドは、配列番号６、７、１１、２５、３２、３３、３８、４１、４５、４８、５１から５５、５８記載のアミノ酸配列で表されるペプチドであり、より好適なペプチドは、配列番号７，１１，４８，５５記載のアミノ酸配列で表されるペプチドである。
【００１７】
本発明のペプチドの第二は、上記のアミノ酸配列（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）を含む免疫グロブリン結合性ペプチド、又は前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチドに関する。ここで、「前記ペプチドと実質的に同一の免疫グロブリン結合性ペプチド」とは、アミノ酸配列（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ免疫グロブリンと結合し得るペプチドをいう。アミノ酸の欠失、置換若しくは付加の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチド若しくはポリペプチドが、アミノ酸配列（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）を含むペプチドと同様に免疫グロブリンに対して結合性を有するペプチドであれば特に制限されない。但し、欠失等させるアミノ酸の個数は、好ましくは１個である。アミノ酸の改変は、例えば突然変異や翻訳後修飾などに生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変、変異の原因および手段を問わず、上記特性を有するすべての改変ペプチドを包含する。また、「アミノ酸配列（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）を含むペプチド」とは、前記したアミノ酸配列だけからなるペプチドのほか、このようなペプチドのＮ末端又はＣ末端側に複数のアミノ酸が付加したものも含む。付加するアミノ酸の個数は、免疫グロブリンに対する結合性を失わせない範囲であれば特に限定されないが、通常は１０個以内であり、好ましくは５個以内である。
【００１８】
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列は、配列番号１乃至６２記載のアミノ酸配列で表されるペプチドを解析した結果見出されたコンセンサス配列である。コンセンサス配列とは、ある特定のペプチドにおけるアミノ酸配列間に、明らかに関連性が認められる配列部分をいう。コンセンサス配列は、同定されたアミノ酸配列においてその結合に必要不可欠な配列と推測することができる。アミノ酸配列（Ｉ）は、配列番号１１から１３のアミノ酸配列から見出されたコンセンサス配列であり、アミノ酸配列（ＩＩ）は、配列番号４１、４２のアミノ酸配列から見出されたコンセンサス配列であり、アミノ酸配列（ＩＩＩ）は、配列番号４８から５０のアミノ酸配列から見出されたコンセンサス配列であり、アミノ酸配列（ＩＶ）は、配列番号５９、６０のアミノ酸配列から見出されたコンセンサス配列である。
【００１９】
本発明の免疫グロブリン結合性ペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法またはペプチドをコードするＤＮＡを用いて遺伝子操作によって製造することができる。
【００２０】
化学合成方法においては、液相及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させペプチドを延長させるステップワイズ法、アミノ酸数個からなるフラグメントをあらかじめ合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させる方法を含む。
【００２１】
遺伝子組換え法によって生産する場合には、目的とするペプチドのアミノ酸配列をもとにこれをコードするＤＮＡを合成し、ファージあるいはプラスミドベクターに導入する。これを適当な微生物（例えば大腸菌）に組み込んで形質転換体を選抜、取得し、公知の方法によって培養する。また、適切なプラスミドベクターを選びさえすれば、酵母、放線菌、枯草菌なども宿主として容易に利用することができる。
【００２２】
かくして得られる本発明の免疫グロブリンに結合するペプチドは、通常の方法に従って、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲルパーミネーションクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、向流分配等のペプチド科学の分野で汎用されている方法に従って、精製を行うことができる。
【００２３】
本発明のペプチドは、免疫グロブリンを特異的に認識して結合するアミノ酸配列を有するものであり、適当な担体に結合することで免疫グロブリン精製用担体として用いることができる。担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、セルロース、キトサン、セファロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、エチレン・酢酸ビニル共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの有機担体、さらにはこれらの組み合わせによて得られる複合担体などが挙げられる。さらに担体表面には、リガンドの固定化反応に用い得る官能着が存在することが好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、エポキシ基、アミド基、ハロゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基などが挙げられる。
【００２４】
上記担体へのペプチドの固定化においては、ペプチドの立体障害を小さくすることにより吸着効率を向上させ、さらに非特異的吸着を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが好ましい。親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などで置換した適当な有機分子であればよい。また、これらペプチドおよびスペーサーとして用いられる有機分子は比較的安定で低分子の物質であり、例えば、酵素、抗体のようなタンパク質を固定化する場合と比較して、その固定化反応条件には制約が少ない。従って、固定化方法は特に限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
〔実施例１〕  免疫グロブリン不変領域に結合するファージの選択的濃縮
ヒト免疫グロブリン不変領域（ＩＣＮファルマシューティカル社製、カタログ番号５５９１１）をリン酸緩衝液ＰＢＳ（和光純薬社製）に１０  μｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解させ、この溶液を市販のイムノチューブ（ヌンク社製）に１．０  ｍｌ加え、一晩放置しヒト免疫グロブリン不変領域を固定化した。翌日、チューブの溶液を除去した後、５％  ＢＳＡ（大日本製薬社製）を含むＰＢＳを２．０  ｍｌ加え、室温で２時間放置し、ブロッキングした。ブロッキング後、イムノチューブに４×１０１０  個相当分のファージ（ニューイングランドバイオラボ社製、Ｐｈａｇｅ−Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｋｉｄ：Ｐｈ．Ｄ−１２）を加え、室温で１時間放置した。溶液を除去後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄することにより結合し得なかったファージを除去した。次に、該チューブに溶出液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と５％ＢＳＡを含むＰＢＳに終濃度５０μｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリン不変領域を加えたもの）を加え、ヒト免疫グロブリン不変領域に特異的に吸着したファージを遊離させた。これを常法により大腸菌に感染させ、ファージを増殖させ、次のラウンドのスクリーニング用ファージディスプレイライブラリーとした。
【００２７】
前記の操作を１ラウンドとして、４ラウンド繰り返しヒト免疫グロブリン結合性ファージを選択的に濃縮した。
【００２８】
〔実施例２〕  免疫グロブリン不変領域に結合するファージのスクリーニング
４ラウンド目で溶出されたファージをシングルクローンに調製し、免疫グロブリン不変領域に対する結合性を評価した。調製は、溶出されたファージを適当に希釈し、対数増殖期の大腸菌ＥＲ２７３８（ニューイングランドバイオラボ社製）を含む、溶解後のソフトアガー（１％トリプトン、０．５％イーストイクストラクト、０．５％ＮａＣｌ、０．１％ＭｇＣｌ２／６Ｈ２Ｏ、０．７％アガロース）に添加し、これをＸ−Ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、和光純薬社製）、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、和光純薬社製）を含むＬＢ（１％  トリプトン、０．５％  イーストイクストラクト、０．５％  ＮａＣｌ）プレートにまき、３７℃で一晩培養することで行った。次いで、プレート上のシングルファージクローン（合計１９２個）をピックアップし、対数増殖期の大腸菌ＥＲ２７３８を含む５００μｌのＬＢ液体培地に接種し３７℃で４．５時間、激しく攪拌しながら培養した。得られた培養液を遠心分離（１０，０００  ｇ×２０ｍｉｎ）し、培養上清中に含まれるファージを結合活性評価に供した。
【００２９】
結合活性は、市販の９６穴マイクロタイタープレートの左半分に免疫グロブリン不変領域（１０μｇ／ｍｌ）を固定化し、右半分には対照としてＰＢＳのみを添加したプレートを準備することで行った。ブロッキングは５％ＢＳＡを含むＰＢＳで行った。このプレートに、先に得られた培養上清（ファージ溶液）を１００μｌずつ免疫グロブリン固定化ウェルと対照ウェルに添加した。３７℃で１．５時間反応後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、その後、ＨＲＰで標識された抗Ｍ１３抗体を加えた。３７℃で１．５時間反応後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、２０００倍希釈のＨＲＰ用の発色試薬ＡＢＴＳ（フナコシ社製）を加え吸光度（４０５ｎｍ）を求めた。ファージクローンの結合性は免疫グロブリン不変領域固定化ウェルの吸光度と対照ウェルの吸光度の差を以って評価した。結果の一部を図１に示す。
【００３０】
〔実施例３〕  免疫グロブリン結合性ファージが提示しているペプチドのアミノ酸配列の決定
【００３１】
実施例２において吸光度差が０．３以上の９０個のファージを選び、常法に従い、これらのファージからＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ファージが呈示しているポリペプチドのアミノ酸配列を決定した。塩基配列は、配列表配列番号６３のプライマー（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’）を使用し、チェーンターミネーター法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  アプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  アプライドバイオシステム社製）にて解析することにより決定した。なお、９０個のファージクローンを解析した結果、同一のアミノ酸配列を示したクローンがあった。重複するペプチドを除いたアミノ酸配列６２種類を配列表配列番号１から６２に示す。
【００３２】
〔実施例４〕  免疫グロブリン不変領域に結合するファージの反応性（１）
免疫グロブリン不変領域タンパク質（ＩｇＧ−Ｆｃ）を濃度１００μｇ／ｍｌから連続的に希釈し、それぞれの濃度の免疫グロブリン不変領域溶液１００μｌを９６穴マイクロタイタープレートのウェルに添加し、免疫グロブリン不変領域タンパク質をプレートに固定した（４℃、１６時間）。次に、５％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキング後（３７℃、２時間）、各ウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。ここに、ファージのタイターを算出して、ファージ粒子濃度を１．０×１０１２個／ｍｌに調製したファージ溶液１００μｌを添加、反応させた（３７℃、１．５時間）。評価対象のファージは、実施例２の結果から、高結合性の４個のファージを選別した（配列番号７，１１、４８、５５のペプチドを提示するファージ）。反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、２０００倍希釈のＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体を１００μｌ添加し反応させた（３７℃、１．５時間）。次いで、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ用の発色試薬で発色させ吸光度を測定した。結果を図２に示す。
【００３３】
〔実施例５〕  免疫グロブリン不変領域に結合するファージの反応性（２）
免疫グロブリンタンパク質（ＩｇＧ）（ＩＣＮファルマシューティカル社製、カタログ番号５５９０８）を濃度１００μｇ／ｍｌから連続的に希釈し、それぞれの濃度の免疫グロブリン溶液１００μｌを９６穴マイクロタイタープレートのウェルに添加し、免疫グロブリンをプレートに固定した（４℃、１６時間）。
【００３４】
次に、５％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキング後（３７℃、２時間）、各ウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。ここに、ファージのタイターを算出して、ファージ粒子濃度を１．０×１０１２個／ｍｌに調製したファージ溶液１００μｌを添加、反応させた（３７℃、１．５時間）。評価対象のファージは、実施例２の結果から、高結合性の４個のファージを選別した（配列番号７、１１、４８、５５のペプチドを提示するファージ）。反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ標識の抗Ｍ１３抗体を１００μｌ添加し反応させた（３７℃、１．５時間）。次いで、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、２０００倍希釈のＨＲＰ用の発色試薬で発色させ吸光度を測定した。結果を図３に示す。
【００３５】
【発明の効果】
本発明のペプチドは、免疫グロブリンに対する結合特異性が高く、かつ、滅菌処理時または保存中における結合特性の低下が極めて少ないため、免疫グロブリン用の精製リガンド等として有用である。
【００３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】免疫グロブリン不変領域結合性ファージのスクリーニング結果を示す図である。
【図２】単離したファージの免疫グロブリン不変領域に対する結合性を示す図である。
【図３】単離したファージの免疫グロブリンに対する結合性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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