(57)【要約】【課題】  １つの反応容器内で複数の被測定物質を測定することが可能な特異結合反応測定方法、それに用いる試薬キットおよび特異結合反応測定装置を提供する。【解決手段】  まず、図１に示す工程Ｓｔ１で、被測定物質２の含有量を測定しようとする試料１と、被測定物質２に対して特異的に結合する特異結合物質３が固定化された磁性粒子４とを含む反応系を構築する。次に、図１に示す工程Ｓｔ２で、反応系の光学特性を測定する。このとき、上記工程Ｓｔ１で凝集複合体５が生じる場合には、上記反応系に濁りが生じ、散乱光強度および透過光量などに変化が生じる。従って、散乱光強度または透過光量などを測定することによって、反応系の濁りの程度を見積もることができる。次に、図１に示す工程Ｓｔ３で、被測定物質２と特異結合物質３と磁性粒子４とからなる凝集複合体５と、凝集複合体５を形成していない磁性粒子（不図示）とを磁力を利用して回収し、反応系から除去する。【選択図】  図１
2004177402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の被測定物質の含有量を測定する特異結合反応測定方法であって、
上記試料と、上記被測定物質に対して特異的に結合する特異結合物質が固定化された磁性粒子とを含む反応系を構築する工程（ａ）と、
上記反応系の光学特性を測定する工程（ｂ）と、
上記被測定物質と上記特異結合物質と上記磁性粒子とを含む凝集複合体を、磁力を利用して上記反応系から除去する工程（ｃ）と、
を含む特異結合反応測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の特異結合反応測定方法において、
上記光学特性は、散乱光強度または透過光量である、特異結合反応測定方法。
【請求項３】
請求項１に記載の特異結合反応測定方法において、
上記磁性粒子の直径は、約０．０５〜２μｍの範囲内である、特異結合反応測定方法。
【請求項４】
請求項１に記載の特異結合反応測定方法において、
上記工程（ｃ）で、上記反応系に残存する上記磁性粒子を上記反応系から除去する、特異結合反応測定方法。
【請求項５】
試料中の第１の被測定物質および第２の被測定物質の含有量を測定する特異結合反応測定方法であって、
上記試料と、上記第１の被測定物質に対して特異的に結合する第１の特異結合物質が固定化された磁性粒子とを含む反応系を構築する工程（ａ）と、
上記工程（ａ）の後に、上記反応系の光学特性を測定する工程（ｂ）と、
上記第１の被測定物質と上記第１の特異結合物質と上記磁性粒子とを含む凝集複合体を、磁力を利用して集める工程（ｃ）と、
上記反応系に、上記第２の被測定物質に対して特異的に結合する第２の特異結合物質を添加する工程（ｄ）と、
上記工程（ｄ）の後に、上記反応系の光学特性を測定する工程（ｅ）と、
を含む特異結合反応測定方法。
【請求項６】
請求項５に記載の特異結合反応測定方法において、
上記工程（ｄ）では、反応系がポリエチレングリコールを２〜６重量％含む、特異結合反応測定方法。
【請求項７】
請求項５に記載の特異結合反応測定方法において、
上記第２の特異結合物質は、上記第２の被測定物質に対して特異的に結合する抗原あるいは抗体と、上記抗原あるいは抗体が固定化された非磁性粒子とから構成されている、特異結合反応測定方法。
【請求項８】
請求項７に記載の特異結合反応測定方法において、
上記磁性粒子の直径は、約０．０５〜２μｍの範囲内であり、
上記非磁性粒子の直径は、約０．０５〜２μｍの範囲内である、特異結合反応測定方法。
【請求項９】
請求項５に記載の特異結合反応測定方法において、
上記第１の被測定物質と上記第２の被測定物質との組み合わせは、ヒトヘモグロビンとヒトアルブミンとの組み合わせである、特異結合反応測定方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の特異結合反応測定方法において、
上記工程（ｃ）で、上記反応系に残存する上記磁性粒子を集める、特異結合反応測定方法。
【請求項１１】
試料中のｎ種類（ｎは２以上の整数）の被測定物質の含有量を測定する特異結合反応測定方法であって、
上記試料と、未測定の被測定物質のうちの１種類に対して特異的に結合する特異結合物質が固定化された磁性粒子とを含む反応系を構築する工程（ａ）と、
上記工程（ａ）の後に、上記反応系の光学特性を測定する工程（ｂ）と、
上記１種類の被測定物質と上記特異結合物質と上記磁性粒子とを含む凝集複合体を、磁力を利用して上記反応系から除去する工程（ｃ）と、
上記工程（ｃ）の後に、上記工程（ｂ）が（ｎ−１）回目未満であった場合、再度工程（ａ）に進むように判断する工程（ｄ）と、
上記反応系に、上記反応系に残った１種類の未測定の被測定物質に対して特異的に結合する特異結合物質を添加する工程（ｅ）と、
上記工程（ｅ）の後に、上記反応系の光学特性を測定する工程（ｆ）と、
を含む特異結合反応測定方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の特異結合反応測定方法において、
上記工程（ｃ）で、上記反応系に残存する上記磁性粒子を上記反応系から除去する、特異結合反応測定方法。
【請求項１３】
試料中のｎ種類（ｎは２以上の整数）の被測定物質の含有量を測定する特異結合反応測定方法であって、
上記試料と、未測定の被測定物質のうちの１種類に対して特異的に結合する特異結合物質とを含む反応系を構築する工程（ａ）と、
上記工程（ａ）の後に、上記反応系の光学特性を測定する工程（ｂ）と、
上記１種類の被測定物質と上記特異結合物質とからなる凝集複合体に、結合可能な物質と磁性粒子とを含む磁性複合体を反応系に添加する工程（ｃ）と、
上記磁性複合体が結合した上記凝集複合体を、磁力を利用して上記反応系から除去する工程（ｄ）と、
上記工程（ｄ）の後に、上記工程（ｂ）が（ｎ−１）回目未満であった場合、再度工程（ａ）に進むように判断する工程（ｅ）と、
上記反応系に、上記反応系に残った１種類の未測定の被測定物質に対して特異的に結合する特異結合物質を添加する工程（ｆ）と、
上記工程（ｅ）の後に、上記反応系の光学特性を測定する工程（ｇ）と、
を含む特異結合反応測定方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の特異結合反応測定方法において、
上記工程（ｄ）で、上記凝集複合体に結合していない上記磁性複合体を上記反応系から除去する、特異結合反応測定方法。
【請求項１５】
試料中の第１の被測定物質および第２の被測定物質の含有量を測定するための試薬キットであって、
上記第１の被測定物質に対して特異的に結合する第１の特異結合物質が固定化された磁性粒子と、
上記第２の被測定物質に対して特異的に結合する第２の特異結合物質と、
を含む、試薬キット。
【請求項１６】
請求項１５に記載の試薬キットにおいて、
上記磁性粒子の直径は、約０．０５〜２μｍの範囲内である、試薬キット。
【請求項１７】
請求項１５に記載の試薬キットにおいて、
上記第２の特異結合物質は、上記第２の被測定物質に対して特異的に結合する抗原あるいは抗体と、上記抗原あるいは抗体が固定化された非磁性粒子とから構成されている、試薬キット。
【請求項１８】
試料中のｎ種類（ｎは２以上の整数）の被測定物質の含有量を測定するための試薬キットであって、
上記ｎ種類の被測定物質のうちの１種類の被測定物質に対して特異的に結合する１種類の特異結合物質と、
上記ｎ種類の被測定物質のうちの残りの（ｎ−１）種類の被測定物質に対して特異的に結合する特異結合物質がそれぞれ固定化された（ｎ−１）種類の磁性粒子と、
を含む、試薬キット。
【請求項１９】
試料中のｎ種類（ｎは２以上の整数）の被測定物質の含有量を測定するための試薬キットであって、
上記ｎ種類の被測定物質に対してそれぞれ特異的に結合するｎ種類の特異結合物質と、
上記ｎ種類の被測定物質のうちの（ｎ−１）種類の被測定物質とそれに対応する（ｎ−１）種類の特異結合物質とからなる凝集複合体に結合可能な物質と、上記物質が固定化された磁性粒子とからなる磁性複合体と、
を含む、試薬キット。
【請求項２０】
セルと、
上記セルに向かって光を照射する光源と、
上記反応系からの散乱光または透過光を検出する光検出器と、
上記セル内に磁性粒子が含まれている場合、磁力を利用して、上記セル内から上記磁性粒子を除去する除去手段と、
を備える、特異結合反応測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれている可能性がある被測定物質の含有量を測定することができる特異結合反応測定方法、それに用いる試薬キットおよび特異結合反応測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療分野では、様々な疾患の診断及び病状の経過を調べるために、ヒトの体液中に存在する各疾患に特徴的な蛋白質の含有量を測定することが広く行なわれている。これらの蛋白質の含有量の測定には、標的とする蛋白質を抗原として特異的に認識する抗体と抗原との反応（抗原抗体反応）を利用した免疫反応測定方法が広く用いられている。現在では、免疫反応測定方法にも様々な原理を利用したものが開発されている。
【０００３】
上述の様々な免疫反応測定方法の中でも、試料中の被測定物質の含有量を測定するために、抗原抗体反応によって生じる抗原抗体複合体の凝集体（以下、凝集複合体と称する）を検出する、免疫比朧法（以下、比朧法と略す）、免疫比濁法（以下、比濁法と略す）、スライド凝集法などの測定方法はよく知られたものである。抗原抗体反応では、凝集複合体の生成により反応系に濁りを生じる。凝集複合体の生成により反応系に生じる濁りの程度は、抗原の量及び抗体の量に依存する。このことに基づいて、比朧法および比濁法は、上述の反応系に生じる濁りの程度を光学的に測定し、その測定値から抗原の量または抗体の量を算出する方法である。具体的には、比朧法は、反応系で散乱された光量の変化に基づいて、比濁法は、反応系での散乱により減少した透過光量の変化に基づいて、凝集複合体を測定する方法である。一般的に、上記の２つの測定方法では、同一の反応系を測定で用いることができる。つまり、いずれか一方の測定方法で測定できる反応系は、もう一方の測定方法でも測定することができる。スライド凝集法は、凝集複合体の生成により、反応系中に生じた濁りあるいは凝集塊を、スライドグラス上などで目視などにより判定する方法である。スライド凝集法でも、比朧法、比濁法と同じ反応系を測定で用いることができる。以上に挙げた３つの測定方法は、反応系中に抗原および抗体が一様に分散された状態で測定を行なうものであるため、「均一系の免疫反応測定方法」と総称される。
【０００４】
また、医療分野では、様々な疾患の診断および病状の経過を調べるために、複数種類の被測定物質の含有量の測定が行なわれている。例えば、臨床検査では、腎臓のろ過能力の指標としてヒトの尿中に含まれ得る全タンパク質の含有量を、また、急性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、腎結核、腎梗塞、腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎、前立腺炎などの尿路の炎症、結石症および腫瘍などの指標として、ヒトの尿中に含まれ得る赤血球（ヘモグロビン）の含有量を測定している（例えば、非特許文献１参照）。さらに、下記特許文献１は、複数種類の被測定物質を測定するための均一系の免疫反応測定方法として、被測定物質毎に異なる反応容器を用意し、各被測定物質に対する測定を個別に行なう方法を開示している。
【０００５】
なお、試料中に含まれる被測定物質と、被測定物質に対して特異的に結合する特異結合物質との反応を利用して、試料中の被測定物質の含有量を測定する方法のことを本明細書中では「特異結合反応測定方法」と称する。上述の免疫反応測定方法も、特異結合反応測定方法の１種である。
【特許文献１】特開平５−２０２４号公報
【非特許文献１】金井泉  原著、金井正光  編著、「臨床検査法提要」、改訂第３１版、金原出版株式会社、１９９８年、１５６ページ、１７９−１８０ページ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記従来の方法では、複数種類の被測定物質を測定する際には、被測定物質の数と同じ数の反応容器を用意する必要があり、測定に大量の試料が必要となる。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、１つの反応容器内で複数の被測定物質を測定することが可能な特異結合反応測定方法、それに用いる試薬キットおよび特異結合反応測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の特異結合反応測定方法は、試料中の被測定物質の含有量を測定する特異結合反応測定方法であって、上記試料と、上記被測定物質に対して特異的に結合する特異結合物質が固定化された磁性粒子とを含む反応系を構築する工程（ａ）と、上記反応系の光学特性を測定する工程（ｂ）と、上記被測定物質と上記特異結合物質と上記磁性粒子とを含む凝集複合体を、磁力を利用して上記反応系から除去する工程（ｃ）とを含む。
【０００９】
本発明によれば、測定後の工程（ｃ）で、反応系中に存在していた磁性粒子と、被測定物質と特異結合物質と磁性粒子とを含む凝集複合体とが、磁力を利用することによって反応系から除かれる。特に、本発明では磁力を利用するため、反応系に化学的な影響を全く与えない。このため、測定後の反応系を用いて、試料に含まれる他の成分を、種々の測定方法で測定することが可能である。
【００１０】
また、従来では、２種類の被測定物質を測定する際には、被測定物質の数と同じ数の反応容器を用意する必要がある。しかし、本発明によれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類の被測定物質を測定することができる。従って、測定に必要な試料を非常に少量にすることが可能である。このため、例えば医療分野においては、患者からの試料の採取量を低減することができ、患者への負担を軽減することができる。
【００１１】
上記光学特性は、散乱光強度または透過光量であってもよい。
【００１２】
上記磁性粒子の直径は、約０．０５〜２μｍの範囲内であることが好ましい。
【００１３】
上記工程（ｃ）で、上記反応系に残存する上記磁性粒子を上記反応系から除去してもよい。
【００１４】
本発明の別の特異結合反応測定方法は、試料中の第１の被測定物質および第２の被測定物質の含有量を測定する特異結合反応測定方法であって、上記試料と、上記第１の被測定物質に対して特異的に結合する第１の特異結合物質が固定化された磁性粒子とを含む反応系を構築する工程（ａ）と、上記工程（ａ）の後に、上記反応系の光学特性を測定する工程（ｂ）と、上記第１の被測定物質と上記第１の特異結合物質と上記磁性粒子とを含む凝集複合体を、磁力を利用して集める工程（ｃ）と、上記反応系に、上記第２の被測定物質に対して特異的に結合する第２の特異結合物質を添加する工程（ｄ）と、上記工程（ｄ）の後に、上記反応系の光学特性を測定する工程（ｅ）とを含む。
【００１５】
本発明によれば、第２の被測定物質を測定する際には、反応系中の被測定物質と特異結合物質と磁性粒子とを含む凝集複合体とによる反応系の光学特性の変化が、磁力を利用することによって除かれる。特に、磁力を利用するため、反応系に化学的な影響を全く与えない。このため、本発明の特異結合反応測定方法によれば、第２の被測定物質を測定する際にも、測定値の信頼性が高い。
【００１６】
また、従来では、２種類の被測定物質の含有量を測定する際には、被測定物質の種類と同じ２つの反応容器を用意する必要があるが、本発明によれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類の被測定物質の含有量を測定することができる。従って、測定に必要な試料が非常に少量である。このため、例えば医療分野においては、患者からの試料の採取量を低減することができ、患者への負担を軽減することができる。
【００１７】
上記工程（ｄ）では、反応系がポリエチレングリコールを２〜６重量％含むことが好ましい。
【００１８】
上記第２の特異結合物質は、上記第２の被測定物質に対して特異的に結合する抗原あるいは抗体と、上記抗原あるいは抗体が固定化された非磁性粒子とから構成されていることが好ましい。
【００１９】
上記磁性粒子の直径は、約０．０５〜２μｍの範囲内であり、上記非磁性粒子の直径は、約０．０５〜２μｍの範囲内であることが好ましい。
【００２０】
上記第１の被測定物質と上記第２の被測定物質との組み合わせは、ヒトヘモグロビンとヒトアルブミンとの組み合わせであってもよい。
【００２１】
上記工程（ｃ）で、上記反応系に残存する上記磁性粒子を集めてもよい。
【００２２】
本発明のさらに別の特異結合反応測定方法は、試料中のｎ種類（ｎは２以上の整数）の被測定物質の含有量を測定する特異結合反応測定方法であって、上記試料と、未測定の被測定物質のうちの１種類に対して特異的に結合する特異結合物質が固定化された磁性粒子とを含む反応系を構築する工程（ａ）と、上記工程（ａ）の後に、上記反応系の光学特性を測定する工程（ｂ）と、上記１種類の被測定物質と上記特異結合物質と上記磁性粒子とを含む凝集複合体を、磁力を利用して上記反応系から除去する工程（ｃ）と、上記工程（ｃ）の後に、上記工程（ｂ）が（ｎ−１）回目未満であった場合、再度工程（ａ）に進むように判断する工程（ｄ）と、上記反応系に、上記反応系に残った１種類の未測定の被測定物質に対して特異的に結合する特異結合物質を添加する工程（ｅ）と、上記工程（ｅ）の後に、上記反応系の光学特性を測定する工程（ｆ）とを含む。
【００２３】
本発明によれば、被測定物質と特異結合物質と磁性粒子とを含む凝集複合体が、光学特性の測定の後に磁力を利用することによって除かれる。磁力を利用するため、反応系に化学的な影響を全く与えない。このため、複数の被測定物質を測定する際にも、先に形成された凝集複合体の影響がほとんど排除されるため、光学特性の測定の際に、毎回測定値の信頼性が高い。
【００２４】
特に、従来では、２種類以上の被測定物質の含有量を測定する際には、被測定物質の種類と同じ数の反応容器を用意する必要があるが、本発明によれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類以上の被測定物質の含有量を測定することができる。従って、測定に必要な試料が非常に少量である。このため、例えば医療分野においては、患者からの試料の採取量を低減することができ、患者への負担を軽減することができる。
【００２５】
上記工程（ｃ）で、上記反応系に残存する上記磁性粒子を上記反応系から除去してもよい。
【００２６】
本発明のまたさらに別の特異結合反応測定方法は、試料中のｎ種類（ｎは２以上の整数）の被測定物質の含有量を測定する特異結合反応測定方法であって、上記試料と、未測定の被測定物質のうちの１種類に対して特異的に結合する特異結合物質とを含む反応系を構築する工程（ａ）と、上記工程（ａ）の後に、上記反応系の光学特性を測定する工程（ｂ）と、上記１種類の被測定物質と上記特異結合物質とを含む凝集複合体に、結合可能な物質と磁性粒子とを含む磁性複合体を反応系に添加する工程（ｃ）と、上記磁性複合体が結合した上記凝集複合体を、磁力を利用して上記反応系から除去する工程（ｄ）と、上記工程（ｄ）の後に、上記工程（ｂ）が（ｎ−１）回目未満であった場合、再度工程（ａ）に進むように判断する工程（ｅ）と、上記反応系に、上記反応系に残った１種類の未測定の被測定物質に対して特異的に結合する特異結合物質を添加する工程（ｆ）と、上記工程（ｅ）の後に、上記反応系の光学特性を測定する工程（ｇ）とを含む。
【００２７】
本発明によれば、被測定物質と特異結合物質とを含む凝集複合体が、光学特性の測定の後に磁力を利用することによって除かれる。磁力を利用するため、反応系に化学的な影響を全く与えない。このため、複数の被測定物質を測定する際にも、先に形成された凝集複合体の影響がほとんど排除されるため、光学特性の測定の際に、毎回測定値の信頼性が高い。
【００２８】
特に、従来では、２種類以上の被測定物質の含有量を測定する際には、被測定物質の種類と同じ数の反応容器を用意する必要があるが、本発明によれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類以上の被測定物質の含有量を測定することができる。従って、測定に必要な試料が非常に少量である。このため、例えば医療分野においては、患者からの試料の採取量を低減することができ、患者への負担を軽減することができる。
【００２９】
上記工程（ｄ）で、上記凝集複合体に結合していない上記磁性複合体を上記反応系から除去してもよい。
【００３０】
本発明の試薬キットは、試料中の第１の被測定物質および第２の被測定物質の含有量を測定するための試薬キットであって、上記第１の被測定物質に対して特異的に結合する第１の特異結合物質が固定化された磁性粒子と、上記第２の被測定物質に対して特異的に結合する第２の特異結合物質とを含む。
【００３１】
本発明の試薬キットを特異結合反応測定方法に用いれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類以上の被測定物質の含有量を測定することができる。従って、測定に必要な試料を非常に少量にできる。
【００３２】
上記磁性粒子の直径は、約０．０５〜２μｍの範囲内であることが好ましい。
【００３３】
上記第２の特異結合物質は、上記第２の被測定物質に対して特異的に結合する抗原あるいは抗体と、上記抗原あるいは抗体が固定化された非磁性粒子とから構成されていることが好ましい。
【００３４】
本発明の別の試薬キットは、試料中のｎ種類（ｎは２以上の整数）の被測定物質の含有量を測定するための試薬キットであって、上記ｎ種類の被測定物質のうちの１種類の被測定物質に対して特異的に結合する１種類の特異結合物質と、上記ｎ種類の被測定物質のうちの残りの（ｎ−１）種類の被測定物質に対して特異的に結合する特異結合物質がそれぞれ固定化された（ｎ−１）種類の磁性粒子とを含む。
【００３５】
本発明の試薬キットを特異結合反応測定方法に用いれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類以上の被測定物質の含有量を測定することができる。従って、測定に必要な試料を非常に少量にできる。
【００３６】
本発明のさらに別の試薬キットは、試料中のｎ種類（ｎは２以上の整数）の被測定物質の含有量を測定するための試薬キットであって、上記ｎ種類の被測定物質に対してそれぞれ特異的に結合するｎ種類の特異結合物質と、上記ｎ種類の被測定物質のうちの（ｎ−１）種類の被測定物質とそれに対応する（ｎ−１）種類の特異結合物質とを含む凝集複合体に結合可能な物質と、上記物質が固定化された磁性粒子とを含む磁性複合体とを含む。
【００３７】
本発明の試薬キットを特異結合反応測定方法に用いれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類以上の被測定物質の含有量を測定することができる。従って、測定に必要な試料を非常に少量にできる。
【００３８】
本発明の特異結合反応測定装置は、セルと、上記セルに向かって光を照射する光源と、上記反応系からの散乱光または透過光を検出する光検出器と、上記セル内に磁性粒子が含まれている場合、磁力を利用して、上記セル内から上記磁性粒子を除去する除去手段とを備える。
【００３９】
本発明によれば、本発明の上述の特異結合反応測定方法に非常に適した特異結合反応測定装置が得られる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明により、１つの反応容器内で２種類以上の被測定物質を測定することが可能で、測定に必要な試料を削減することができる特異結合反応測定方法とそれに用いる試薬キットおよび測定装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下の各実施形態では、特異結合反応測定方法の１つである、免疫反応測定方法を図面を用いて説明する。なお、簡単のために、各実施形態に共通する構成要素は、同一の参照符号を付するものとする。
【００４２】
（実施形態１）
図１は、本実施形態の免疫反応測定方法を表すフローチャートである。図２（ａ）〜（ｃ）は、本実施形態の免疫反応測定方法の各工程における反応系を模式的に表す図である。
【００４３】
まず、図１に示す工程Ｓｔ１で、図２（ａ）に示すように、被測定物質２の含有量を測定しようとする試料１と、被測定物質２に対して特異的に結合する特異結合物質３が固定化された磁性粒子４とを含む反応系を構築する。試料１としては、例えば、血液、尿などの体液そのままか、あるいはこれらと緩衝液とを混合したものが挙げられる。なお、被測定物質２が抗原である場合、特異結合物質３は抗体であり、被測定物質２が抗体である場合、特異結合物質３は抗原である。
【００４４】
このことによって、被測定物質２が試料中に含まれているときには、図２（ｂ）に示すように、被測定物質２と特異結合物質３との抗原抗体反応によって、被測定物質２と特異結合物質３と磁性粒子４とからなる凝集複合体５が生じる。被測定物質２が試料中に含まれていないときには、被測定物質２と特異結合物質３との抗原抗体反応による凝集複合体５が生じない。
【００４５】
次に、図１に示す工程Ｓｔ２で、反応系の光学特性を測定する。このとき、上記工程Ｓｔ１で凝集複合体５が生じる場合には、上記反応系に濁りが生じ、散乱光強度および透過光量などに変化が生じる。従って、散乱光強度または透過光量などを測定することによって、反応系の濁りの程度を見積もることができる。ここで測定前の試料１を基準にしながら、上記反応系の光学的変化量、つまり散乱光強度または透過光量の変化量を測定することが好ましい。また、試料１を緩衝液と混合して反応系を構築する場合、緩衝液を基準としてもよい。
【００４６】
次に、図１に示す工程Ｓｔ３で、被測定物質２と特異結合物質３と磁性粒子４とからなる凝集複合体５と、凝集複合体５を形成していない磁性粒子（不図示）とを磁力（具体的には、図２（ｃ）に示すように、磁石６）を利用して回収し、反応系から除去する。
【００４７】
免疫反応測定方法において、凝集複合体の生成により反応系に生じる濁りの程度は、抗原の量および抗体の量に依存する。このことに基づいて、本実施形態によれば、上述の反応系の光学特性を測定し、その測定値から被測定物質２の含有量を算出することができる。
【００４８】
さらに本実施形態によれば、測定後には、反応系中に存在していた磁性粒子と、被測定物質２と特異結合物質３と磁性粒子４とからなる凝集複合体５とが、磁力を利用することによって反応系から除かれる。本実施形態では、磁力を利用するため、反応系に化学的な影響を全く与えない。このため、測定後の反応系を用いて、試料１に含まれる他の成分を、種々の測定方法で測定することが可能である。
【００４９】
また、従来では、２種類の被測定物質を測定する際には、被測定物質の数と同じ数の反応容器を用意する必要があるが、本実施形態によれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類の被測定物質を測定することができる。従って、本実施形態によれば、測定に必要な試料を非常に少量にすることが可能である。このため、例えば医療分野においては、患者からの試料の採取量を低減することができ、患者への負担を軽減することができる。
【００５０】
また、本実施形態で反応系から除去される凝集複合体５と磁性粒子（不図示）とから、ｐＨ３．０以下の酸性条件下で抗原抗体反応を阻害することによって、磁性粒子を、固定化された抗体または抗原が反応性を有する状態で回収し、再利用することもできる。あるいは、強い酸またはアルカリでの処理、界面活性剤による洗浄により、磁性粒子に固定化された抗体または抗原を完全に除去し、その磁性粒子に別の抗体または抗原を固定化することも可能である。
【００５１】
本実施形態の免疫反応測定方法において用いられる磁性粒子４は、反応系において不溶性であることが好ましい。磁性粒子４の具体例としては、フェライト粒子、フェライトコロイド粒子、フェライト含有ラテックス粒子などが挙げられる。このような磁性粒子は、自作することが可能である。特に、菌体内に０．０５〜０．１μｍの磁性粒子を含む磁性細菌を培養して菌数を増加させ、フレンチプレス等により破砕して、菌体内の磁性粒子を磁石で集めて分離して取り出すことによって、ほぼ均一な直径を有する磁性粒子が得られる。磁性細菌を用いて磁性粒子を得る方法は、より詳細には、特開２０００−３４６８４３号公報に記載されている。
【００５２】
磁性細菌から得られる磁性粒子は、脂質二重膜で覆われている。このため、水溶液などでの分散性が良好であり、また、特異結合物質である抗体等の蛋白質を固定化することにも適している。
【００５３】
本実施形態で用いる磁性粒子４の直径は、水溶液中に均一に分散することが容易であるという観点、抗原抗体反応により生じた凝集複合体を定量するための散乱光強度または透過光量の変化量の検出が可能であるという観点から、０．０５〜２μｍであることが好ましい。
【００５４】
本実施形態では、磁性粒子を集めるための磁力の発生に磁石６を挙げているが、この磁石６は、より具体的には永久磁石、電磁石などである。
【００５５】
本実施形態の免疫反応測定方法の反応系には、その用途などに応じて、当該分野で公知である任意の成分を添加してもよい。例えば、被測定物質２および特異結合物質３のそれぞれの自己凝集による非特異的な凝集を低減するために、本実施形態において、反応系にトゥイーン２０、オクチルグルコシド、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スクロースモノラウレートまたはＣＨＡＰＳなどの界面活性剤を付加してもよい。上記界面活性剤の反応系における含有量は、抗原抗体反応の阻害が少ないという観点から、０．３重量％以下であることが好ましく、０．１重量％以下であることがさらに好ましい。
【００５６】
本実施形態の免疫反応測定方法では、工程Ｓｔ２において測定する光学特性として、散乱光強度の変化を測定してもよく（比朧法）、反応系からの透過光量の変化を測定（比濁法）してもよい。
【００５７】
本実施形態では、被測定物質は、特に限定されず、抗原抗体反応を利用して測定できる物質であればよい。例えば、蛋白質、核酸、脂質、細菌、ウィルス、ハプテンなどが挙げられる。特に、本実施形態の免疫反応測定方法および試薬キットは、従来から臨床検査において抗原抗体反応を利用して測定されている測定対象である蛋白質の測定に適している。蛋白質としては、例えば、ＬＨ（黄体形成ホルモン）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ｈＣＧ（絨毛性性腺刺激ホルモン）などのホルモン、各種免疫グロブリンクラスおよびサブクラス、補体成分、各種感染症のマーカー、ＣＲＰ、アルブミン、ヘモグロビン、リウマチ因子、ならびに血液型抗原などが挙げられる。
【００５８】
本実施形態で用いられる抗体は、抗原と特異的に結合することによって、抗原と凝集複合体を形成可能なものであれば、特に限定されない。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤのいずれの抗体クラスであってもよく、これらの混合物であってもよい。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、また、これらの混合物であってもよい。これら中で、ＩｇＧ抗体が非特異的な反応が少なく、また、比較的市販されているものも多く、入手も容易であるため好ましい。また、抗体の由来動物種に関しても、特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、マウス由来の抗体が比較的入手も容易であり、使用例も多いため好ましい。
【００５９】
なお、本実施形態では、特異結合反応測定方法として、抗原抗体反応を利用する免疫反応測定方法を説明したが、抗原抗体反応以外の特異的な結合を生じる反応を利用して凝集複合体を生じさせることによって測定することも可能である。抗原抗体反応以外の特異的な結合を生じる反応を利用する場合、被測定物質と特異結合物質との組み合わせは、例えば、リガンドとレセプターとの組み合わせ、一本鎖ＤＮＡ（被測定物質）と、この一本鎖ＤＮＡに対して相補的な配列を有する種々のＤＮＡ断片（特異結合物質）との組み合わせ、などが挙げられる。
【００６０】
リガンドとレセプターとの組み合わせの例としては、リガンドとなる分子と、その分子に対して複数の結合部位を有するアロステリック蛋白質との組み合わせが挙げられる。リガンドとなる分子内にアロステリック蛋白質と結合する部分が１箇所のみ存在する場合、磁性粒子、非磁性粒子などにリガンドとなる分子を、アロステリック蛋白質と結合する部分以外で固定化すれば、リガンドとなる分子とアロステリック蛋白質との凝集複合体を生じさせることができる。
【００６１】
また、一本鎖ＤＮＡ（被測定物質）と、この一本鎖ＤＮＡに対して相補的な配列を有する種々のＤＮＡ断片（特異結合物質）とを用いる場合、種々のＤＮＡ断片を、一本鎖ＤＮＡに相補的に結合可能な状態で磁性粒子に固定化すればよい。
【００６２】
（実施形態２）
本実施形態では、２種類の被測定物質の含有量を測定することが可能な免疫反応測定方法を図を参照しながら説明する。
【００６３】
図３は、本実施形態の免疫反応測定方法を表すフローチャートである。図４（ａ）および図４（ｂ）は、本実施形態の免疫反応測定方法における反応系を模式的に表す図である。
【００６４】
まず、図３に示す工程Ｓｔ２１で、第１の被測定物質および第２の被測定物質の含有量を測定しようとする試料と、第１の被測定物質に対して特異的に結合する第１の特異結合物質が固定化された磁性粒子とを含む反応系を構築する。試料としては、例えば、血液、尿などの体液そのままか、あるいはこれらと緩衝液とを混合したものが挙げられる。なお、第１の被測定物質が抗原である場合、第１の特異結合物質は抗体であり、第１の被測定物質が抗体である場合、第１の特異結合物質は抗原である。
【００６５】
このことによって、図４（ａ）に示すように、第１の被測定物質２ａが試料中に含まれているときには、第１の被測定物質２ａと第１の特異結合物質３ａとの抗原抗体反応によって、第１の被測定物質２ａと第１の特異結合物質３ａと磁性粒子４ａとからなる凝集複合体５ａが生じる。第１の被測定物質２ａが試料中に含まれていないときには、第１の被測定物質２ａと第１の特異結合物質３ａとの抗原抗体反応による凝集複合体５ａが生じない。
【００６６】
次に、図３に示す工程Ｓｔ２２で、反応系の光学特性を測定する。このとき、上記工程Ｓｔ２１で凝集複合体５ａが生じる場合には、上記反応系に濁りが生じ、散乱光強度および透過光量などに変化が生じる。従って、散乱光強度または透過光量などを測定することによって、反応系の濁りの程度を見積もることができる。ここで測定前の試料を基準にしながら、上記反応系の光学的変化量、つまり散乱光強度または透過光量の変化量を測定することが好ましい。また、試料を緩衝液と混合して反応系を構築する場合、緩衝液を基準としてもよい。
【００６７】
次に、図３に示す工程Ｓｔ２３で、第１の被測定物質２ａと第１の特異結合物質３ａと磁性粒子４ａとからなる凝集複合体５ａと、凝集複合体５ａを形成していない磁性粒子とを磁力を利用して集める。このとき、凝集複合体５ａおよび磁性粒子を反応系から除去してもよく、また、後述する工程Ｓｔ２５での反応系の光学特性測定を妨げないように、反応系が構築されている反応容器内の一部に集中して配置してもよい。
【００６８】
次に、図３に示す工程Ｓｔ２４で、反応系に、第２の被測定物質に対して特異的に結合する第２の特異結合物質を添加する。例えば、第２の被測定物質が抗原である場合、第２の特異結合物質は抗体であり、第２の被測定物質が抗体である場合、第２の特異結合物質は抗原である。
【００６９】
このことによって、第２の被測定物質が試料中に含まれているときには、図４（ｂ）に示すように、第２の被測定物質２ｂと第２の特異結合物質３ｂとの抗原抗体反応によって、第２の被測定物質２ｂと第２の特異結合物質３ｂとからなる凝集複合体４ｂが生じる。勿論、第２の被測定物質２ｂが試料中に含まれていないときには、第２の被測定物質２ｂと第２の特異結合物質３ｂとの抗原抗体反応による凝集複合体４ｂが生じない。
【００７０】
次に、図３に示す工程Ｓｔ２５で、反応系の光学特性を測定する。このとき、上記工程Ｓｔ２４で凝集複合体４ｂが生じる場合には、上記反応系に濁りが生じ、散乱光強度および透過光量などに変化が生じる。従って、散乱光強度または透過光量などを測定することによって、反応系の濁りの程度を見積もることができる。ここで測定前の試料を基準にしながら、上記反応系の光学的変化量、つまり散乱光強度または透過光量の変化量を測定することが好ましい。また、試料を緩衝液と混合して反応系を構築する場合、緩衝液を基準としてもよい。
【００７１】
特に、上記工程Ｓｔ２３で、図４（ｂ）に示すように、凝集複合体５ａと、凝集複合体５ａを形成していない磁性粒子とが磁力を利用して集められているので、本工程では、反応系の光学特性を測定する際には、凝集複合体４ｂのみによる散乱光強度および透過光量などの変化を測定することができる。
【００７２】
特に、本実施形態によれば、第２の被測定物質２ｂを測定する際には、反応系中に存在していた磁性粒子４ａと、被測定物質２ａと特異結合物質３ａと磁性粒子４ａとからなる凝集複合体５ａとによる反応系の光学特性の変化が、磁力を利用することによって除かれる。磁力を利用するため、反応系に化学的な影響を全く与えない。このため、本実施形態の免疫反応測定方法によれば、第２の被測定物質２ｂを測定する際にも、測定値の信頼性が高い。
【００７３】
従来では、２種類の被測定物質の含有量を測定する際には、被測定物質の種類と同じ２つの反応容器を用意する必要があるが、本実施形態によれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類の被測定物質の含有量を測定することができる。従って、本実施形態によれば、測定に必要な試料が非常に少量である。このため、例えば医療分野においては、患者からの試料の採取量を低減することができ、患者への負担を軽減することができる。
【００７４】
また、本実施形態で反応系から除去される凝集複合体と磁性粒子とから、ｐＨ３．０以下の酸性条件下で抗原抗体反応を阻害することによって、磁性粒子を、固定化された抗体または抗原が反応性を有する状態で回収し、再利用することもできる。あるいは、強い酸またはアルカリでの処理、および界面活性剤による洗浄により、磁性粒子に固定化された抗体または抗原を完全に除去し、その磁性粒子に別の抗体または抗原を固定化することも可能である。
【００７５】
次に、本実施形態の免疫反応測定方法に用いる試薬キットを説明する。図４（ａ）および（ｂ）を参照しながら説明する。
【００７６】
本実施形態の免疫反応測定方法に用いる試薬キットは、第１の被測定物質２ａに対して特異的に結合する第１の特異結合物質３ａが固定化された磁性粒子４ａと、第２の被測定物質２ｂに対して特異的に結合する第２の特異結合物質３ｂとを含む。
【００７７】
なお、第１の被測定物質２ａが抗原である場合、第１の特異結合物質３ａは抗体であり、第１の被測定物質２ａが抗体である場合、第１の特異結合物質３ａは抗原である。また、第２の被測定物質２ｂが抗原である場合、第２の特異結合物質３ｂは抗体であり、第２の被測定物質２ｂが抗体である場合、第２の特異結合物質３ｂは抗原である。
【００７８】
本実施形態の試薬キットを、本実施形態の免疫反応測定方法に用いれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類の被測定物質の含有量を測定することができる。従って、本実施形態の試薬キットを用いれば、測定に必要な試料を非常に少量にできる。
【００７９】
特に、図４（ｂ）に示すように、第２の被測定物質２ｂを測定する際に、反応系中に存在していた磁性粒子４ａと、被測定物質２ａと特異結合物質３ａと磁性粒子４ａとからなる凝集複合体５ａとによる反応系の光学特性の変化が、磁力を利用することによって除かれる。磁力を利用するため、反応系に化学的な影響を全く与えない。このため、本実施形態の免疫反応測定方法によれば、第２の被測定物質２ｂを測定する際にも、測定値の信頼性が高い。
【００８０】
本実施形態の免疫反応測定方法および試薬キットにおいて用いられる磁性粒子４ａは、反応系において不溶性であることが好ましい。磁性粒子４ａの具体例としては、フェライト粒子、フェライトコロイド粒子、フェライト含有ラテックス粒子などが挙げられる。このような磁性粒子は、自作することが可能である。特に、菌体内に０．０５〜０．１μｍの磁性粒子を含む磁性細菌を培養して菌数を増加させ、フレンチプレス等により破砕して、菌体内の磁性粒子を磁石で集めて分離して取り出すことによって、ほぼ均一な直径を有する磁性粒子が得られる。磁性細菌を用いて磁性粒子を得る方法は、より詳細には、特開２０００−３４６８４３号公報に記載されている。
【００８１】
磁性細菌から得られる磁性粒子は、脂質二重膜で覆われている。このため、水溶液などでの分散性が良好であり、また、特異結合物質である抗体等の蛋白質を固定化することにも適している。
【００８２】
本実施形態で用いる磁性粒子４ａの直径は、水溶液中に均一に分散することが容易であるという観点、抗原抗体反応により生じた凝集複合体を定量するための散乱光強度または透過光量の変化量の検出が可能であるという観点から、０．０５〜２μｍであることが好ましい。
【００８３】
本実施形態では、磁性粒子を集めるための磁力の発生に磁石６を挙げているが、この磁石６は、より具体的には永久磁石、電磁石などである。
【００８４】
本実施形態の免疫反応測定方法および試薬キットにおいて、第２の特異結合物質３ｂとしては、例えば抗原あるいは抗体であるが、これに限定されない。特に、第２の特異結合物質３ｂは、第２の被測定物質２ｂと抗原抗体反応を生じる抗原あるいは抗体が固定化された非磁性粒子であることが好ましい。このことによって、第２の被測定物質２ｂの測定の際（すなわち工程Ｓｔ２５）光学特性の変化範囲が、第１の被測定物質２ａの測定の際（すなわち工程Ｓｔ２２）の光学特性の変化範囲と、あまり大きく変化しない。このため、測定に用いる装置の調整が容易となる。また、第２の被測定物質２ｂの抗原抗体反応の進行が、磁力による影響を全く受けないことも好ましい理由である。
【００８５】
非磁性粒子としては、例えば、ガラス粒子、黒鉛粒子、金コロイド粒子、ラテックス粒子などが挙げられる。この中では、安定性が高く、様々な直径を持つ粒子を入手し易いという点でラテックス粒子が好ましく、特にタンパク質の吸着性に優れたポリスチレンラテックス粒子が好ましい。
【００８６】
上述の非磁性粒子には、溶液中に均一に分散することが容易であること、および抗原抗体反応により生じた凝集複合体を定量するための散乱光強度および透過光量の変化量の検出が可能であることが求められる。従って、上述の非磁性粒子の直径は、０．０５〜２μｍであることが好ましく、磁性粒子４ａを用いた場合の測定と光学特性の変化範囲を同等にするという観点から、磁性粒子４ａの直径と同等であればさらに好ましい。
【００８７】
本実施形態の免疫反応測定方法の反応系には、その用途などに応じて、当該分野で公知である任意の成分を添加してもよい。例えば、第２の特異結合物質３ｂが、抗原あるいは抗体が固定化された非磁性粒子でない場合、工程Ｓｔ２４において反応系にポリエチレングリコールを添加してもよい。また、工程Ｓｔ２４において反応系にポリエチレングリコールを添加するために、試薬キットにポリエチレングリコールを付加してもよい。ポリエチレングリコールの含有量は、反応系に対して２〜６重量％であることが好ましく、４重量％であることがさらに好ましい。上記の濃度のポリエチレングリコールが反応系に含まれる場合、第２の被測定物質２ｂおよび第２の特異結合物質３ｂのそれぞれの自己凝集による非特異的な凝集が少なくなり、測定感度が向上する。
【００８８】
また、工程Ｓｔ２２および工程Ｓｔ２５において、第１の被測定物質２ａ、第１の特異結合物質３ａ、第２の被測定物質２ｂおよび第２の特異結合物質３ｂのそれぞれの自己凝集による非特異的な凝集を低減するために、本実施形態において、反応系にトゥイーン２０、オクチルグルコシド、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スクロースモノラウレートまたはＣＨＡＰＳなどの界面活性剤を付加してもよい。上記界面活性剤の反応系における含有量は、抗原抗体反応の阻害が少ないという観点から、０．３重量％以下であることが好ましく、０．１重量％以下であることがさらに好ましい。
【００８９】
本実施形態の免疫反応測定方法では、工程Ｓｔ２２および工程Ｓｔ２５において測定する光学特性として、散乱光強度の変化を測定してもよく（比朧法）、反応系からの透過光量の変化を測定（比濁法）してもよい。
【００９０】
本実施形態では、第１の被測定物質２ａおよび第２の被測定物質２ｂは、特に限定されず、抗原抗体反応を利用して測定できる物質であればよい。例えば、蛋白質、核酸、脂質、細菌、ウィルス、ハプテンなどが挙げられる。特に、本実施形態の免疫反応測定方法および試薬キットは、従来から臨床検査において抗原抗体反応を利用して測定されている測定対象である蛋白質の測定に適している。蛋白質としては、例えば、ＬＨ（黄体形成ホルモン）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ｈＣＧ（絨毛性性腺刺激ホルモン）などのホルモン、各種免疫グロブリンクラスおよびサブクラス、補体成分、各種感染症のマーカー、ＣＲＰ、アルブミン、ヘモグロビン、リウマチ因子、ならびに血液型抗原などが挙げられる。例えば、本実施形態において、第１の被測定物質２ａおよび第２の被測定物質２ｂをそれぞれ、ヒトヘモグロビンおよびヒトアルブミンとすると、腎臓疾患の初期スクリーニングに好適な測定結果を提供できる。これは、尿中のヒトヘモグロビンが急性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、腎結核、腎梗塞、腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎、前立腺炎などの尿路の炎症、結石症および腫瘍などの指標となり、尿中のヒトアルブミンが尿中のタンパク質総量の変化を反映し易いので、腎機能の評価を行なうことができるからである。
【００９１】
本実施形態で用いられる抗体は、抗原と特異的に結合することによって、抗原と凝集複合体を形成可能なものであれば、特に限定されない。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤのいずれの抗体クラスであってもよく、これらの混合物であってもよい。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、また、これらの混合物であってもよい。これら中で、ＩｇＧ抗体が非特異的な反応が少なく、また、比較的市販されているものも多く、入手も容易であるため好ましい。また、抗体の由来動物種に関しても、特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、マウス由来の抗体が比較的入手も容易であり、使用例も多いため好ましい。
【００９２】
なお、本実施形態では、特異結合反応測定方法として、抗原抗体反応を利用する免疫反応測定方法を説明したが、抗原抗体反応以外の特異的な結合を生じる反応を利用して凝集複合体を生じさせることによって測定することも可能である。抗原抗体反応以外の特異的な結合を生じる反応を利用する場合、被測定物質と特異結合物質との組み合わせは、例えば、リガンドとレセプターとの組み合わせ、一本鎖ＤＮＡ（被測定物質）と、この一本鎖ＤＮＡに対して相補的な配列を有する種々のＤＮＡ断片（特異結合物質）との組み合わせ、などが挙げられる。
【００９３】
リガンドとレセプターとの組み合わせの例としては、リガンドとなる分子と、その分子に対して複数の結合部位を有するアロステリック蛋白質との組み合わせが挙げられる。リガンドとなる分子内にアロステリック蛋白質と結合する部分が１箇所のみ存在する場合、磁性粒子、非磁性粒子などにリガンドとなる分子を、アロステリック蛋白質と結合する部分以外で固定化すれば、リガンドとなる分子とアロステリック蛋白質との凝集複合体を生じさせることができる。
【００９４】
また、一本鎖ＤＮＡ（被測定物質）と、この一本鎖ＤＮＡに対して相補的な配列を有する種々のＤＮＡ断片（特異結合物質）とを用いる場合、種々のＤＮＡ断片を、一本鎖ＤＮＡに相補的に結合可能な状態で磁性粒子、非磁性粒子などに固定化すればよい。
【００９５】
（実施形態３）
本実施形態では、上記実施形態２の免疫反応測定方法を、さらに多種類の被測定物質の含有量を測定することができるように拡張した免疫反応測定方法を、図を参照しながら説明する。
【００９６】
図５は、本実施形態の免疫反応測定方法を表すフローチャートである。
【００９７】
まず、図５に示す工程Ｓｔ３１で、ｎ種類（ｎは２以上の整数）の被測定物質の含有量を測定しようとする試料と、未測定の被測定物質のうちの１種類に対して特異的に結合する特異結合物質が固定化された磁性粒子とを含む反応系を構築する。試料としては、例えば、血液、尿などの体液そのままか、あるいはこれらと緩衝液とを混合したものが挙げられる。なお、被測定物質が抗原である場合、特異結合物質は抗体であり、被測定物質が抗体である場合、特異結合物質は抗原である。
【００９８】
このことによって、被測定物質が試料中に含まれているときには、被測定物質と特異結合物質との抗原抗体反応によって、上記実施形態２の図４（ａ）に示す凝集複合体５ａと同等の、被測定物質と特異結合物質と磁性粒子とからなる凝集複合体が生じる。被測定物質が試料中に含まれていないときには、被測定物質と特異結合物質との抗原抗体反応による凝集複合体が生じない。
【００９９】
次に、図５に示す工程Ｓｔ３２で、反応系の光学特性を測定する。このとき、上記工程Ｓｔ３１で凝集複合体が生じる場合には、上記反応系に濁りが生じ、散乱光強度および透過光量などに変化が生じる。従って、散乱光強度または透過光量などを測定することによって、反応系の濁りの程度を見積もることができる。ここで測定前の試料を基準にしながら、上記反応系の光学的変化量、つまり散乱光強度または透過光量の変化量を測定することが好ましい。また、試料を緩衝液と混合して反応系を構築する場合、緩衝液を基準としてもよい。
【０１００】
次に、図５に示す工程Ｓｔ３３で、被測定物質と特異結合物質と磁性粒子とからなる凝集複合体と、凝集複合体を形成していない磁性粒子とを磁力を利用して反応系から除去する。
【０１０１】
次に、図５に示す工程Ｓｔ３４で、上記工程Ｓｔ３２が（ｎ−１）回目であったかを判断する。このとき、上記工程Ｓｔ３２が（ｎ−１）回目であった場合、工程Ｓｔ３５に進む。上記工程Ｓｔ３２が（ｎ−１）回目未満であった場合、再度工程Ｓｔ３１に進む。すなわち、上記工程Ｓｔ３２が（ｎ−１）回目となるまで、工程Ｓｔ３１〜Ｓｔ３３を繰り返す。このことによって、ｎ種類の被測定物質のうち、（ｎ−１）種類の被測定物質が反応系から除去される。
【０１０２】
次に、図５に示す工程Ｓｔ３５で、反応系に残った１種類の未測定の被測定物質に対して特異的に結合する特異結合物質を添加する。このとき、例えば、被測定物質が抗原である場合、特異結合物質は抗体であり、被測定物質が抗体である場合、特異結合物質は抗原である。
【０１０３】
このことによって、被測定物質が試料中に含まれているときには、被測定物質と特異結合物質との抗原抗体反応によって、上記実施形態２の図４（ｂ）に示す凝集複合体４ｂと同等の、被測定物質と特異結合物質とからなる凝集複合体が生じる。勿論、被測定物質が試料中に含まれていないときには、被測定物質と特異結合物質との抗原抗体反応による凝集複合体が生じない。
【０１０４】
次に、図５に示す工程Ｓｔ３６で、反応系の光学特性を測定する。このとき、上記工程Ｓｔ３５で凝集複合体が生じる場合には、上記反応系に濁りが生じ、散乱光強度および透過光量などに変化が生じる。従って、散乱光強度または透過光量などを測定することによって、反応系の濁りの程度を見積もることができる。ここで測定前の試料を基準にしながら、上記反応系の光学的変化量、つまり散乱光強度または透過光量の変化量を測定することが好ましい。また、試料を緩衝液と混合して反応系を構築する場合、緩衝液を基準としてもよい。
【０１０５】
特に、上記工程Ｓｔ３３で、凝集複合体と、凝集複合体を形成していない磁性粒子とが磁力を利用して集められているので、本工程では、反応系の光学特性を測定する際には、凝集複合体のみによる散乱光強度および透過光量などの変化を測定することができる。
【０１０６】
本実施形態によれば、被測定物質と特異結合物質と磁性粒子とからなる凝集複合体が、光学特性の測定の後に磁力を利用することによって除かれる。磁力を利用するため、反応系に化学的な影響を全く与えない。このため、複数の被測定物質を測定する際にも、先に形成された凝集複合体の影響がほとんど排除されるため、光学特性の測定の際に、毎回測定値の信頼性が高い。
【０１０７】
特に、従来では、２種類以上の被測定物質の含有量を測定する際には、被測定物質の種類と同じ数の反応容器を用意する必要があるが、本実施形態によれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類以上の被測定物質の含有量を測定することができる。従って、本実施形態によれば、測定に必要な試料が非常に少量である。このため、例えば医療分野においては、患者からの試料の採取量を低減することができ、患者への負担を軽減することができる。
【０１０８】
また、本実施形態で反応系から除去される凝集複合体と磁性粒子とから、ｐＨ３．０以下の酸性条件下で抗原抗体反応を阻害することによって、磁性粒子を、固定化された抗体または抗原が反応性を有する状態で回収し、再利用することもできる。あるいは、強い酸またはアルカリでの処理、および界面活性剤による洗浄により、磁性粒子に固定化された抗体または抗原を完全に除去し、その磁性粒子に別の抗体または抗原を固定化することも可能である。
【０１０９】
次に、本実施形態の免疫反応測定方法に用いる試薬キットを説明する。
【０１１０】
本実施形態の免疫反応測定方法に用いる試薬キットは、（ｎ−１）種類の被測定物質のそれぞれに対して特異的に結合する特異結合物質が固定化された磁性粒子と、残った１種類の未測定の被測定物質に対して特異的に結合する特異結合物質とを含む。
【０１１１】
本実施形態の試薬キットを、本実施形態の免疫反応測定方法に用いれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類以上の被測定物質の含有量を測定することができる。従って、本実施形態の試薬キットを用いれば、測定に必要な試料を非常に少量にできる。
【０１１２】
本実施形態の免疫反応測定方法および試薬キットにおいて用いられる磁性粒子、および磁性粒子を集めるための磁石６として、上記実施形態２で説明したものと全く同じものを用いることができる。
【０１１３】
また、本実施形態の免疫反応測定方法および試薬キットにおいて、図５に示す工程Ｓｔ３５で添加する特異結合物質としては、反応系に残った１種類の未測定の被測定物質と抗原抗体反応を生じる抗原あるいは抗体が固定化された非磁性粒子であることが好ましい。このことによって、工程Ｓｔ３６での被測定物質の測定における光学特性の変化範囲が、工程Ｓｔ３２での（ｎ−１）種類の被測定物質の測定における光学特性の変化範囲と、あまり大きく変化しない。このため、測定に用いる装置の調整が容易となる。
【０１１４】
非磁性粒子としては、上記実施形態２に述べたものと全く同じものを使用することができる。つまり、上述の非磁性粒子の直径は、０．０５〜２μｍであることが好ましく、上述の磁性粒子の直径と同等であればさらに好ましい。
【０１１５】
本実施形態の免疫反応測定方法の反応系には、その用途などに応じて、当該分野で公知である任意の成分を添加してもよい。例えば、特異結合物質が、抗原あるいは抗体が固定化された非磁性粒子でない場合、工程Ｓｔ３５において反応系にポリエチレングリコールを添加してもよい。また、工程Ｓｔ３５において反応系にポリエチレングリコールを添加するために、試薬キットにポリエチレングリコールを付加してもよい。ポリエチレングリコールの含有量は、反応系に対して２〜６重量％であることが好ましく、４重量％であることがさらに好ましい。上記の濃度のポリエチレングリコールが反応系に含まれる場合、工程Ｓｔ３６において、被測定物質または特異結合物質のそれぞれの自己凝集による非特異的な凝集が少なくなり、測定感度が向上する。
【０１１６】
また、工程Ｓｔ３２および工程Ｓｔ３６において、各被測定物質および各特異結合物質の自己凝集による非特異的な凝集を低減するために、本実施形態において、反応系にトゥイーン２０、オクチルグルコシド、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スクロースモノラウレートまたはＣＨＡＰＳなどの界面活性剤を付加してもよい。上記界面活性剤の反応系における含有量は、抗原抗体反応の阻害が少ないという観点から、０．３重量％以下であることが好ましく、０．１重量％以下であることがさらに好ましい。
【０１１７】
本実施形態の免疫反応測定方法では、工程Ｓｔ３２および工程Ｓｔ３６において測定する光学特性として、散乱光強度の変化を測定してもよく（比朧法）、反応系からの透過光量の変化を測定（比濁法）してもよい。
【０１１８】
本実施形態では、ｎ種類の各被測定物質は、特に限定されず、抗原抗体反応を利用して測定できる物質であればよい。例えば、蛋白質、核酸、脂質、細菌、ウィルス、ハプテンなどが挙げられる。特に、本実施形態の免疫反応測定方法および試薬キットは、従来から臨床検査において抗原抗体反応を利用して測定されている測定対象である蛋白質の測定に適している。蛋白質としては、例えば、ＬＨ（黄体形成ホルモン）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ｈＣＧ（絨毛性性腺刺激ホルモン）などのホルモン、各種免疫グロブリンクラスおよびサブクラス、補体成分、各種感染症のマーカー、ＣＲＰ、アルブミン、ヘモグロビン、リウマチ因子、ならびに血液型抗原などが挙げられる。
【０１１９】
本実施形態で用いられる抗体は、抗原と特異的に結合することによって、抗原と凝集複合体を形成可能なものであれば、特に限定されない。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤのいずれの抗体クラスであってもよく、これらの混合物であってもよい。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、また、これらの混合物であってもよい。これら中で、ＩｇＧ抗体が非特異的な反応が少なく、また、比較的市販されているものも多く、入手も容易であるため好ましい。また、抗体の由来動物種に関しても、特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、マウス由来の抗体が比較的入手も容易であり、使用例も多いため好ましい。
【０１２０】
なお、本実施形態では、特異結合反応測定方法として、抗原抗体反応を利用する免疫反応測定方法を説明したが、抗原抗体反応以外の特異的な結合を生じる反応を利用して凝集複合体を生じさせることによって測定することも可能である。抗原抗体反応以外の特異的な結合を生じる反応を利用する場合、被測定物質と特異結合物質との組み合わせは、例えば、リガンドとレセプターとの組み合わせ、一本鎖ＤＮＡ（被測定物質）と、この一本鎖ＤＮＡに対して相補的な配列を有する種々のＤＮＡ断片（特異結合物質）との組み合わせ、などが挙げられる。
【０１２１】
リガンドとレセプターとの組み合わせの例としては、リガンドとなる分子と、その分子に対して複数の結合部位を有するアロステリック蛋白質との組み合わせが挙げられる。リガンドとなる分子内にアロステリック蛋白質と結合する部分が１箇所のみ存在する場合、磁性粒子、非磁性粒子などにリガンドとなる分子を、アロステリック蛋白質と結合する部分以外で固定化すれば、リガンドとなる分子とアロステリック蛋白質との凝集複合体を生じさせることができる。
【０１２２】
また、一本鎖ＤＮＡ（被測定物質）と、この一本鎖ＤＮＡに対して相補的な配列を有する種々のＤＮＡ断片（特異結合物質）とを用いる場合、種々のＤＮＡ断片を、一本鎖ＤＮＡに相補的に結合可能な状態で磁性粒子、非磁性粒子などに固定化すればよい。
【０１２３】
（実施形態４）
本実施形態では、多種類の被測定物質の含有量を測定することができる別の免疫反応測定方法を、図を参照しながら説明する。
【０１２４】
図６は、本実施形態の免疫反応測定方法を表すフローチャートである。図７（ａ）および図７（ｂ）は、本実施形態の免疫反応測定方法における反応系を模式的に表す図である。
【０１２５】
まず、図６に示す工程Ｓｔ４１で、ｎ種類（ｎは２以上の整数）の被測定物質の含有量を測定しようとする試料と、未測定の被測定物質のうちの１種類に対して特異的に結合する特異結合物質とを含む反応系を構築する。試料としては、例えば、血液、尿などの体液が挙げられる。なお、被測定物質が抗原である場合、特異結合物質は抗体であり、被測定物質が抗体である場合、特異結合物質は抗原である。
【０１２６】
このことによって、図７（ａ）に示すように、１種類の被測定物質２ａが試料中に含まれているときには、被測定物質２ａと特異結合物質３ａとの抗原抗体反応によって、被測定物質２ａと特異結合物質３ａとからなる凝集複合体５ａが生じる。被測定物質２ａが試料中に含まれていないときには、被測定物質２ａと特異結合物質３ａとの抗原抗体反応による凝集複合体５ａが生じない。
【０１２７】
次に、図６に示す工程Ｓｔ４２で、反応系の光学特性を測定する。このとき、上記工程Ｓｔ４１で凝集複合体が生じる場合には、上記反応系に濁りが生じ、散乱光強度および透過光量などに変化が生じる。従って、散乱光強度または透過光量などを測定することによって、反応系の濁りの程度を見積もることができる。ここで測定前の試料を基準にしながら、上記反応系の光学的変化量、つまり散乱光強度または透過光量の変化量を測定することが好ましい。また、試料を緩衝液と混合して反応系を構築する場合、緩衝液を基準としてもよい。
【０１２８】
次に、図６に示す工程Ｓｔ４３で、上記１種類の被測定物質と特異結合物質とからなる凝集複合体に、結合可能な物質（例えば、凝集複合体に含まれる抗体に結合可能な抗体）と磁性粒子とからなる磁性複合体を反応系に添加する。このことによって、図７（ｂ）に示すように、抗体７と磁性粒子４ｃとからなる磁性複合体８が、凝集複合体５ｃに結合する。
【０１２９】
次に、図６に示す工程Ｓｔ４４で、磁性複合体が結合した凝集複合体と、凝集複合体に結合していない磁性複合体とを磁力を利用して除去する。このことによって、図７（ｂ）に示すように、凝集複合体５ｃが磁性複合体８と共に磁力に引き寄せられて除去され、反応系内に他の被測定物質２ｂが残存する。
【０１３０】
次に、図６に示す工程Ｓｔ４５で、上記工程Ｓｔ４２が（ｎ−１）回目であったかを判断する。このとき、上記工程Ｓｔ４２が（ｎ−１）回目であった場合、工程Ｓｔ４６に進む。上記工程Ｓｔ４２が（ｎ−１）回目未満であった場合、再度工程Ｓｔ４１に進む。すなわち、上記工程Ｓｔ４２が（ｎ−１）回目となるまで、工程Ｓｔ４１〜Ｓｔ４４を繰り返す。このことによって、ｎ種類の被測定物質のうち、（ｎ−１）種類の被測定物質が反応系から除去される。
【０１３１】
次に、図６に示す工程Ｓｔ４６で、反応系に残った１種類の未測定の被測定物質に対して特異的に結合する特異結合物質を添加する。このとき、例えば、被測定物質が抗原である場合、特異結合物質は抗体であり、被測定物質が抗体である場合、特異結合物質は抗原である。
【０１３２】
このことによって、被測定物質が試料中に含まれているときには、被測定物質と特異結合物質との抗原抗体反応によって、上記実施形態２の図４（ｂ）に示す凝集複合体４ｂと同等の、被測定物質と特異結合物質とからなる凝集複合体が生じる。勿論、被測定物質が試料中に含まれていないときには、被測定物質と特異結合物質との抗原抗体反応による凝集複合体が生じない。
【０１３３】
次に、図６に示す工程Ｓｔ４６で、反応系の光学特性を測定する。このとき、上記工程Ｓｔ４５で凝集複合体が生じる場合には、上記反応系に濁りが生じ、散乱光強度および透過光量などに変化が生じる。従って、散乱光強度または透過光量などを測定することによって、反応系の濁りの程度を見積もることができる。ここで測定前の試料を基準にしながら、上記反応系の光学的変化量、つまり散乱光強度または透過光量の変化量を測定することが好ましい。また、試料を緩衝液と混合して反応系を構築する場合、緩衝液を基準としてもよい。
【０１３４】
特に、上記工程Ｓｔ４４で、凝集複合体と、磁性複合体とが磁力を利用して集められているので、本工程では、反応系の光学特性を測定する際には、凝集複合体のみによる散乱光強度および透過光量などの変化を測定することができる。
【０１３５】
本実施形態によれば、被測定物質と特異結合物質とからなる凝集複合体が、光学特性の測定の後に磁力を利用することによって除かれる。磁力を利用するため、反応系に化学的な影響を全く与えない。このため、複数の被測定物質を測定する際にも、先に形成された凝集複合体の影響がほとんど排除されるため、光学特性の測定の際に、毎回測定値の信頼性が高い。
【０１３６】
特に、従来では、２種類以上の被測定物質の含有量を測定する際には、被測定物質の種類と同じ数の反応容器を用意する必要があるが、本実施形態によれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類以上の被測定物質の含有量を測定することができる。従って、本実施形態によれば、測定に必要な試料が非常に少量である。このため、例えば医療分野においては、患者からの試料の採取量を低減することができ、患者への負担を軽減することができる。
【０１３７】
また、本実施形態で反応系から除去される磁性複合体を、ｐＨ３．０以下の酸性条件下で抗原抗体反応を阻害することによって、磁性粒子を、固定化された抗体または抗原が反応性を有する状態で回収し、再利用することもできる。あるいは、強い酸またはアルカリでの処理、および界面活性剤による洗浄により、磁性粒子に固定化された抗体または抗原を完全に除去し、その磁性粒子に別の抗体または抗原を固定化することも可能である。
【０１３８】
次に、本実施形態の免疫反応測定方法に用いる試薬キットを説明する。
【０１３９】
本実施形態の免疫反応測定方法に用いる試薬キットは、ｎ種類の被測定物質のそれぞれに対して特異的に結合する特異結合物質と、（ｎ−１）種類の被測定物質とそれに対応する特異結合物質とからなる凝集複合体のそれぞれに結合可能な物質（例えば、凝集複合体に含まれる抗体に結合可能な２次抗体）と、上記物質が固定化された磁性粒子とからなる磁性複合体と、を含む。
【０１４０】
本実施形態の試薬キットを、本実施形態の免疫反応測定方法に用いれば、反応系を構築することが可能な反応容器が１つ有れば、それを用いて２種類以上の被測定物質の含有量を測定することができる。従って、本実施形態の試薬キットを用いれば、測定に必要な試料を非常に少量にできる。
【０１４１】
本実施形態の免疫反応測定方法および試薬キットにおいて用いられる磁性粒子、および磁性粒子を集めるための磁石６として、上記実施形態２で説明したものと全く同じものを用いることができる。
【０１４２】
本実施形態で用いられる、凝集複合体に対して特異的に結合可能な磁性複合体としては、各凝集複合体の生成に用いた抗体に対して特異的に結合する抗体、凝集複合体の生成に用いた抗体とは違う場所に特異的に結合する抗体、あるいは、凝集複合体の特定の構造に対して特異的に結合する抗体等が磁性粒子に固定化されたものを用いることができる。
【０１４３】
また、本実施形態の免疫反応測定方法および試薬キットにおいて、図６に示す工程Ｓｔ４６で添加する特異結合物質としては、反応系に残った１種類の未測定の被測定物質と抗原抗体反応を生じる抗原あるいは抗体が固定化された非磁性粒子であることが好ましい。このことによって、工程Ｓｔ４７で、被測定物質の測定における光学特性の変化範囲が、工程Ｓｔ４２での（ｎ−１）種類の被測定物質の測定における光学特性の変化範囲と、あまり大きく変化しない。このため、測定に用いる装置の調整が容易となる。
【０１４４】
非磁性粒子としては、上記実施形態２に述べたものと全く同じものを使用することができる。つまり、上述の非磁性粒子の直径は、０．０５〜２μｍであることが好ましく、上述の磁性粒子の直径と同等であればさらに好ましい。
【０１４５】
本実施形態の免疫反応測定方法の反応系には、その用途などに応じて、当該分野で公知である任意の成分を添加してもよい。例えば、特異結合物質が、抗原あるいは抗体が固定化された非磁性粒子でない場合、工程Ｓｔ４６において反応系にポリエチレングリコールを添加してもよい。また、工程Ｓｔ４６において反応系にポリエチレングリコールを添加するために、試薬キットにポリエチレングリコールを付加してもよい。ポリエチレングリコールの含有量は、反応系に対して２〜６重量％であることが好ましく、４重量％であることがさらに好ましい。上記の濃度のポリエチレングリコールが反応系に含まれる場合、工程Ｓｔ４７において、被測定物質または特異結合物質のそれぞれの自己凝集による非特異的な凝集が少なくなり、測定感度が向上する。
【０１４６】
また、工程Ｓｔ４２および工程Ｓｔ４７において、各被測定物質および各特異結合物質の自己凝集による非特異的な凝集を低減するために、本実施形態において、反応系にトゥイーン２０、オクチルグルコシド、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スクロースモノラウレートまたはＣＨＡＰＳなどの界面活性剤を付加してもよい。上記界面活性剤の反応系における含有量は、抗原抗体反応の阻害が少ないという観点から、０．３重量％以下であることが好ましく、０．１重量％以下であることがさらに好ましい。
【０１４７】
本実施形態の免疫反応測定方法では、工程Ｓｔ４２および工程Ｓｔ４７において測定する光学特性として、散乱光強度の変化を測定してもよく（比朧法）、反応系からの透過光量の変化を測定（比濁法）してもよい。
【０１４８】
本実施形態では、ｎ種類の各被測定物質は、特に限定されず、抗原抗体反応を利用して測定できる物質であればよい。例えば、蛋白質、核酸、脂質、細菌、ウィルス、ハプテンなどが挙げられる。特に、本実施形態の免疫反応測定方法および試薬キットは、従来から臨床検査において抗原抗体反応を利用して測定されている測定対象である蛋白質の測定に適している。蛋白質としては、例えば、ＬＨ（黄体形成ホルモン）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ｈＣＧ（絨毛性性腺刺激ホルモン）などのホルモン、各種免疫グロブリンクラスおよびサブクラス、補体成分、各種感染症のマーカー、ＣＲＰ、アルブミン、ヘモグロビン、リウマチ因子、ならびに血液型抗原などが挙げられる。
【０１４９】
本実施形態で用いられる抗体は、抗原と特異的に結合することによって、抗原と凝集複合体を形成可能なものであれば、特に限定されない。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤのいずれの抗体クラスであってもよく、これらの混合物であってもよい。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、また、これらの混合物であってもよい。これら中で、ＩｇＧ抗体が非特異的な反応が少なく、また、比較的市販されているものも多く、入手も容易であるため好ましい。また、抗体の由来動物種に関しても、特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、マウス由来の抗体が比較的入手も容易であり、使用例も多いため好ましい。
【０１５０】
なお、本実施形態では、特異結合反応測定方法として、抗原抗体反応を利用する免疫反応測定方法を説明したが、抗原抗体反応以外の特異的な結合を生じる反応を利用して凝集複合体を生じさせることによって測定することも可能である。抗原抗体反応以外の特異的な結合を生じる反応を利用する場合、被測定物質と特異結合物質との組み合わせは、例えば、リガンドとレセプターとの組み合わせ、一本鎖ＤＮＡ（被測定物質）と、この一本鎖ＤＮＡに対して相補的な配列を有する種々のＤＮＡ断片（特異結合物質）との組み合わせ、などが挙げられる。
【０１５１】
リガンドとレセプターとの組み合わせの例としては、リガンドとなる分子と、その分子に対して複数の結合部位を有するアロステリック蛋白質との組み合わせが挙げられる。リガンドとなる分子内にアロステリック蛋白質と結合する部分が１箇所のみ存在する場合、磁性粒子、非磁性粒子などにリガンドとなる分子を、アロステリック蛋白質と結合する部分以外で固定化すれば、リガンドとなる分子とアロステリック蛋白質との凝集複合体を生じさせることができる。
【０１５２】
また、一本鎖ＤＮＡ（被測定物質）と、この一本鎖ＤＮＡに対して相補的な配列を有する種々のＤＮＡ断片（特異結合物質）とを用いる場合、種々のＤＮＡ断片を、一本鎖ＤＮＡに相補的に結合可能な状態で磁性粒子、非磁性粒子などに固定化すればよい。
【０１５３】
（実施形態５）
本実施形態では、上記実施形態１〜４の免疫反応測定方法を行なうための測定装置を、図を参照しながら説明する。
【０１５４】
まず、測定装置１００を図８を参照しながら説明する。図８は、本実施形態の測定装置１００の構成を表す模式図である。
【０１５５】
本実施形態の測定装置１００は、図８に示すように、光源１０１と、セル（反応容器）１０２と、セル１０２を保持するセルホルダ１０３と、セル１０２からの光を検出する光検出器１０４と、除去手段１０８とを備える。
【０１５６】
光源１０１は、出射される光がセル１０２に向かうように配置されている。
【０１５７】
光検出器１０４は、セル１０２内に構築された反応系からの散乱光または透過光を検出する。
【０１５８】
除去手段１０８は、上記実施形態１〜４において、磁力を利用して、反応系内から磁性粒子、磁性複合体および凝集複合体等を収集および除去するためのものである。測定装置１００では、除去手段１０８は、永久磁石１０５と、永久磁石１０５を保護するためのカバー１０６と、永久磁石１０５とカバー１０６とが設けられたアーム１０７とから構成されている。
【０１５９】
ここで、除去手段１０８の動作を図９を参照しながら説明する。図９は、本実施形態の測定装置１００における、セル１０２と除去手段１０８との配置関係を示す図である。
【０１６０】
アーム１０７は、図９に示すように、永久磁石１０５とカバー１０６とを降下させてセル１０２の内部に挿入し、上昇させてセル１０２の内部から引き上げることが可能である。従って、永久磁石１０５とカバー１０６とを反応系内に導入し、反応系内の磁性粒子、磁性複合体および凝集複合体等をカバー１０６の表面に付着させる。次いで、反応系の濁りがほぼ消滅したら、セル１０２内から引き上げる。このことによって、反応系内から磁性粒子、磁性複合体および凝集複合体等を収集および除去することができる。なお、カバー１０６に付着した磁性粒子、磁性複合体および凝集複合体等は、機械的な方法で脱離させればよい。例えば、カバー１０６から永久磁石１０５を引き抜いた後、カバー１０６に付着した回収された磁性粒子を洗浄等することにより除くか、あるいは、カバー１０６をディスポーザブルとしてもよい。なお、永久磁石１０５の代わりに電磁石を用いた場合、電磁石の磁力発生のＯＮ−ＯＦＦによって、磁性粒子の収集および除去を行なえばよい。
【０１６１】
次に、測定装置２００を図１０を参照しながら説明する。図１０は、本実施形態の測定装置２００の構成を表す模式図である。
【０１６２】
本実施形態の測定装置２００は、図１０に示すように、光源２０１と、排出口２０２ａを備えるセル（反応容器）２０２と、セル２０２を保持するセルホルダ２０３と、セル２０２からの光を検出する光検出器２０４と、除去手段２０８とを備える。
【０１６３】
光源２０１は、出射される光がセル２０２に向かうように配置されている。
【０１６４】
光検出器２０４は、セル２０２内に構築された反応系からの散乱光または透過光を検出する。
【０１６５】
除去手段２０８は、上記実施形態１〜４において、磁力を利用して、反応系内から磁性粒子、磁性複合体および凝集複合体等を収集および除去するためのものである。測定装置２００では、除去手段２０８は、電磁石２０５と、セル２０２の排出口２０２ａからの排出物を貯留するための容器２０６と、セル２０２の排出口２０２ａに連結され、開閉可能なバルブ２０７とが設けられている。
【０１６６】
ここで、除去手段２０８の動作を図１１を参照しながら説明する。図１１は、本実施形態の測定装置２００における、セル２０２と除去手段２０８との配置関係を示す図である。
【０１６７】
バルブ２０７は、図１１に示すように、セル２０２の排出口２０２ａに連結される。この状態で電磁石２０５に通電すると、セル２０２内の反応系中の磁性粒子、磁性複合体および凝集複合体等が排出口２０２ａからバルブ２０７を通じて容器２０６に移動する。次いで、反応系の濁りがほぼ消滅したら、バルブ２０７を閉じ、電磁石２０５への通電を止める。このことによって、反応系内から磁性粒子、磁性複合体および凝集複合体等を収集および除去することができる。なお、容器２０６に貯留された磁性粒子、磁性複合体および凝集複合体等は、洗浄して除去してもよい。あるいは、容器２０６をディスポーザブルとしてもよい。
【０１６８】
なお、測定装置２００において、容器２０６に代えて、セル２０２に連結された排出用の配管を設けてもよい。
【０１６９】
また、測定装置２００において、除去手段２０８に代えて、図１２に示す除去手段２０８’を設けてもよい。図１２に示すように、除去手段２０８’は、永久磁石１０５と、永久磁石１０５を保持するアーム１０７と、セル２０２の排出口２０２ａからの排出物を貯留するための容器２０６と、セル２０２の排出口２０２ａに連結され、開閉可能なバルブ２０７とが設けられている。
【０１７０】
アーム１０７は、図１２に示すように、永久磁石１０５を上下させることが可能である。従って、永久磁石１０５を容器２０６に近づけて、反応系内の磁性粒子、磁性複合体および凝集複合体等を容器２０６内に排出させる。次いで、反応系の濁りがほぼ消滅したら、バルブ２０７を閉じ、永久磁石１０５を容器２０６から遠ざける。このことによって、反応系内から磁性粒子、磁性複合体および凝集複合体等を収集および除去することができる。なお、容器２０６に貯留された磁性粒子、磁性複合体および凝集複合体等は、洗浄して除去してもよい。あるいは、容器２０６をディスポーザブルとしてもよい。
【０１７１】
永久磁石１０５を含む除去手段１０８および２０８’を用いる場合には、反応系の光学特性を測定する際には、永久磁石１０５をセル２０２から離れた場所に待機させておき、測定終了後にセル２０２内の磁性粒子、磁性複合体および凝集複合体等を収集および除去できるように、除去手段１０８および２０８’を動作させることが好ましい。
【０１７２】
電磁石２０５を含む除去手段１０８を用いる場合には、電磁石２０５をセル２０２の近くに配置することも可能である。これは、電磁石２０５は、通電していない状態では磁力をほとんど発生しないからである。従って、反応系の光学特性を測定する際には、非通電により磁力を発生させず、測定終了後に通電により磁力を発生させ、セル２０２内の磁性粒子、磁性複合体および凝集複合体等を収集および除去できるように、除去手段１０８および２０８’を動作させることが好ましい。上述のいずれの場合も、反応系の光学特性を測定する際に、磁力による抗原抗体反応への影響を可能な限り低減することができるからである。
【０１７３】
このとき、予め容器２０６内を反応系と同じ緩衝液で満たしておくことが好ましい。このことによって、セル２０２内の反応系の体積の変化を少なくすることができる。また、セル２０２内の反応系の体積の変化が小さくなるため、反応系の光学特性を測定する際にも、測定で追加される試薬の容量だけを考慮すれば良い。従って、光学特性の測定値から被測定物質の濃度を推定することが容易となる。
【実施例】
【０１７４】
以下、本発明の実施例を詳細に説明する。なお、以下に示す実施例は本発明を限定するものではない。
【０１７５】
本実施例では、上記実施形態２における第１の被測定物質をヒトヘモグロビンとし、第２の被測定物質をヒトアルブミンとし、第１の特異結合物質を抗ヒトヘモグロビン抗体とし、第２の特異結合物質を抗ヒトアルブミン抗体とし、第２の特異結合物質を非磁性粒子に固定化しない場合の試薬の構成方法を示す。
【０１７６】
なお、本実施例に示した緩衝液などの調製には、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ＳＰ  ＴＯＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）でろ過した純水を使用した。また、特に記載のない塩、緩衝剤などの試薬は、いずれも和光純薬工業製のものを入手し、ポリエチレングリコール６，０００は１級試薬を、それ以外のものは特級試薬を使用した。
【０１７７】
第１の特異結合物質である抗ヒトヘモグロビン抗体および第２の特異結合物質である抗ヒトアルブミン抗体の調製を、次のようにして行った。
【０１７８】
まず、抗ヒトアルブミン抗体は、ヒトアルブミン（和光純薬工業製）を免疫したウサギより採取した抗血清より、プロテインＡカラムクロマトグラフィーを用いてＩｇＧ分画を精製して調製した。カラムに充填したプロテインＡ固定化ゲルは、アマシャム・ファルマシア製のものを使用した。精製に用いた平衡化緩衝液には、１．５Ｍグリシン、３．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．９の組成のものを使用し、溶出緩衝液には、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ４．０の組成のものを使用した。
【０１７９】
精製は次のようにして行った。カラムに充填したゲル容量の５倍の平衡化緩衝液を流してカラムを平衡化した後、カラム全結合容量の１０〜２０％の抗体を含む抗血清を平衡化緩衝液で容量を２倍に希釈してカラムに流し、血清中の抗体をプロテインＡに結合させた。続いて、平衡化緩衝液をプロテインＡに吸着しない血清成分がカラムより出てこなくなるまで流し、カラムを洗浄した。続いて、カラムに溶出緩衝液を流し、プロテインＡに結合した抗体を溶出した。溶出した抗体分画を分画分子量１万の透析チューブに入れ、約１００倍容量の０．０５Ｍ  ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（Ｄｏｊｉｎ製、以下モプスと略称する）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０４重量％  ＮａＮ3、ｐＨ７．４の組成の緩衝液で数回透析して、緩衝液成分を置換した。続いて、抗体濃度を２８０ｎｍの吸光度測定により推定し、透析で用いたものと同じ緩衝液で調整して抗体濃度を３．０ｍｇ／ｍｌとし、これを抗ヒトアルブミン抗体溶液とした。抗体濃度は、特にこれに限定されるものではない。作製した抗体溶液は室温でも保存することができるが、抗体の変性防止の点からは、より低温保存が好ましく、４℃で保存することがより好ましい。
【０１８０】
抗ヒトヘモグロビン抗体は、ヒトヘモグロビン（ＳＩＧＭＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ−７３７９）を免疫したヤギより採取した抗血清より、プロテインＧカラムクロマトグラフィーを用いてＩｇＧ分画を精製し、磁性粒子に固定化して調製した。ＩｇＧ分画の精製に用いたカラムに充填したプロテインＧ固定化ゲルは、アマシャム・ファルマシア製のものを使用した。精製に用いた平衡化緩衝液には、０．０２Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０の組成のものを使用し、溶出緩衝液には、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７の組成のものを使用した。透析に用いた緩衝液の組成は０．０５Ｍ  モプス、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０４重量％  ＮａＮ3、ｐＨ７．４とした。カラムクロマトグラフィーによる精製操作、及び透析による緩衝液の置換方法については、抗ヒトアルブミン抗体の調製の場合と同様の方法を用いた。
【０１８１】
続いて、抗体濃度を２８０ｎｍの吸光度測定により推定し、透析で用いたものと同じ緩衝液で調整して抗体濃度を３．０ｍｇ／ｍｌとし、これを抗ヒトヘモグロビン抗体の磁性粒子への固定化のための抗ヒトヘモグロビン抗体溶液とした。
【０１８２】
磁性粒子は、調製することも可能であるが、市販されているものを利用することもできる。本実施例では、粒径１〜２μｍの鉄を含有したポリスチレンラテックス粒子であるＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の商品名Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，１−２μ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８１９０）を使用した。磁性粒子への抗体の固定化は次のようにして行った。
【０１８３】
２．５重量％の磁性粒子０．５ｍｌをマイクロチューブに入れ、ここに、０．０５Ｍ  モプス、０．０４重量％  ＮａＮ3、ｐＨ７．４緩衝液を０．５ｍｌ加えて磁性粒子を懸濁し、これを遠心機（トミー精工製、型番ＭＲＸ−１５０）を用いて、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、磁性粒子を沈査させて上清を除いた。
【０１８４】
続いてここに、０．０５Ｍ  モプス、０．０４重量％  ＮａＮ3、ｐＨ７．４の緩衝液を１ｍｌ加えて、磁性粒子を懸濁し、これを１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、磁性粒子を沈査させて上清を除いた。この磁性粒子の懸濁、および遠心による沈査を再度繰り返した。
【０１８５】
さらに、０．９ｍｌの０．０５Ｍ  モプス、０．０４重量％  ＮａＮ3、ｐＨ７．４の緩衝液を加え、磁性粒子を懸濁し、０．１ｍｌの上記で調製した磁性粒子への抗ヒトヘモグロビン抗体溶液を加えた。これを室温下で、ローテーター（ＴＡＩＴＥＣ社製、型番ＲＴ−５０）によって一晩攪拌した。攪拌後、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、再度磁性粒子を沈査させて上清を除いた。ここに組成が、０．０５Ｍ  モプス、１重量％  カゼインナトリウム、０．０４重量％  ＮａＮ3、ｐＨ７．４の緩衝液を加えて、磁性粒子を懸濁し、３０分間ローテーターによって攪拌した。攪拌後、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心して磁性粒子を沈査させた。この磁性粒子の懸濁、及び遠心による沈査を合計３回繰り返し、抗体が固定化されていない磁性粒子表面をブロッキングした。
【０１８６】
さらに、組成が、０．０５Ｍ  モプス、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０４重量％  ＮａＮ3、５体積％グリセロール、ｐＨ７．４の緩衝液を加えて磁性粒子を懸濁した。なお、固定化に使用した抗体濃度および磁性粒子濃度は、上記に限定されるものではない。作製した抗体溶液は室温でも保存することができるが、抗体の変性防止の点からは、より低温保存が好ましく、４℃で保存することがより好ましい。
【０１８７】
また、ヒトヘモグロビンを測定するために、反応系に加える第１の緩衝液として、０．０５Ｍ  モプス、０．０４重量％  ＮａＮ3、ｐＨ７．４の組成のものを調整し、ヒトアルブミンを測定するための反応系に加える第２の緩衝液として、０．０５Ｍ  モプス、８．６重量％  ポリエチレングリコール６，０００、０．０４重量％  ＮａＮ3、ｐＨ７．４の組成のものを調製した。作製した各緩衝液は室温で保存した。
【０１８８】
以上のように構成した抗ヒトヘモグロビン抗体（第１の特異結合物質）が固定化された磁性粒子と、抗ヒトアルブミン抗体（第２の特異結合物質）と、各緩衝液とを組み合わせることにより、免疫反応用試薬を構成することができる。
【０１８９】
上記で構成した試薬の使用方法を以下に示す。まず、２種類の被測定物質（ヒトヘモグロビンおよびヒトアルブミン）を含む試料と、抗ヒトヘモグロビン抗体（第１の特異結合物質）が固定化された磁性粒子と、第１の緩衝液とを混合して反応系を構築した。次に、反応系の光学特性を測定した。測定終了後、ヒトヘモグロビン（第１の被測定物質）と、抗ヒトヘモグロビン抗体（第１の特異結合物質）と磁性粒子とからなる凝集複合体と、凝集複合体を形成していない磁性粒子とを、磁力によって集めて反応系の濁りを消去した。
【０１９０】
続いて、抗ヒトアルブミン抗体（第２の特異結合物質）溶液と第２の緩衝液とを反応系に混合した。この後、反応系の光学特性を測定した。以上の手順により、試料中の被測定物質の濃度を知ることができた。
【０１９１】
なお、本実施例では示さなかったが、抗アルブミン抗体（第２の特異結合物質）をラテックス、金コロイドなどの非磁性粒子に固定化させてもよい。例えば、ラテックス粒子に固定化させる方法は、上記で述べた磁性粒子に用いた方法がそのまま適用できる。
【０１９２】
また、本実施例では抗体が固定化されていない粒子表面をカゼインナトリウムによりブロッキングしたが、ゼラチン、スキムミルクなどでも代用することができる。使用する濃度は、カゼインナトリウムの場合と同様でよい。
【０１９３】
またさらに、本実施例では反応系を構築するために、被測定物質毎に緩衝液を用意したが、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子を添加した１種類の緩衝液によって各々の反応系を構成してもよい。
【０１９４】
さらに、抗体溶液の緩衝剤成分およびｐＨは、抗原と抗体の結合による免疫反応に悪影響を与えなければ、上記組成およびｐＨに限定されるものではない。
【０１９５】
また、赤血球中に含まれるヘモグロビンを取り出すために、例えば塩化カリウムなどの溶血剤を反応系に添加する、あるいは溶血剤を含む溶液を試薬キットに付加してもよい。
【０１９６】
以上、本発明の免疫反応測定方法および試薬キットにより、１つの反応容器内で２種類の被測定物質を測定することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１９７】
本発明の特異結合反応測定方法、それに用いる試薬キットおよび特異結合反応測定装置は、様々な疾患の診断及び病状の経過を調べるために有用である。例えば、本発明の構成を、１つの試料からヒトヘモグロビンとヒトアルブミンとを測定する構成とすれば、腎臓疾患の診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】図１は、本発明の１つの実施形態における免疫反応測定方法を表すフローチャートである。
【図２】図２（ａ）〜（ｃ）は、図１に示す免疫反応測定方法の各工程における反応系を模式的に表す図である。
【図３】図３は、本発明の他の実施形態における免疫反応測定方法を表すフローチャートである。
【図４】図４（ａ）および図４（ｂ）は、図３に示す免疫反応測定方法における反応系を模式的に表す図である。
【図５】図５は、本発明のさらに他の実施形態における免疫反応測定方法を表すフローチャートである。
【図６】図６は、本発明のさらに他の実施形態における免疫反応測定方法を表すフローチャートである。
【図７】図７（ａ）および図７（ｂ）は、図６に示す免疫反応測定方法における反応系を模式的に表す図である。
【図８】図８は、本発明の１つの実施形態における測定装置の構成を表す模式図である。
【図９】図９は、図８の測定装置の一部の配置関係を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明の他の実施形態における測定装置の構成を表す模式図である。
【図１１】図１１は、図１０の測定装置の一部の配置関係を示す図である。
【図１２】図１２は、図１０の測定装置の一部の配置関係を示す図である。
【符号の説明】
【０１９９】
１  試料
２  被測定物質
２ａ  第１の被測定物質
２ｂ  第２の被測定物質
３  特異結合物質
３ａ  第１の特異結合物質
３ｂ  第２の特異結合物質
４、４ａ、４ｃ  磁性粒子
４ｂ、５、５ａ、５ｃ  凝集複合体
６  磁石
７  抗体
８  磁性複合体
１００、２００  測定装置
１０１、２０１  光源
１０２、２０２  セル
１０３、２０３  セルホルダ
１０４、２０４  光検出器
１０５  永久磁石
１０６  カバー
１０７  アーム
１０８、２０８  除去手段
２０２ａ  排出口
２０５  電磁石
２０６  容器
２０７  バルブ
【図１】
2004177402.tif 000003
【図２】
2004177402.tif 000004
【図３】
2004177402.tif 000005
【図４】
2004177402.tif 000006
【図５】
2004177402.tif 000007
【図６】
2004177402.tif 000008
【図７】
2004177402.tif 000009
【図８】
2004177402.tif 000010
【図９】
2004177402.tif 000011
【図１０】
2004177402.tif 000012
【図１１】
2004177402.tif 000013
【図１２】
2004177402.tif 000014