(57)【要約】    【課題】すべての分子量のヒアルロン酸を簡便かつ精度良く測定し得る抗ヒアルロン酸抗体を提供する。そして、この抗ヒアルロン酸抗体を含む試薬キット、この抗ヒアルロン酸抗体の製造方法及びヒアルロン酸の測定法を提供することである。    【解決手段】抗原を動物に免疫して製造され得る抗ヒアルロン酸抗体において、抗原が２万〜４００万の粘度平均分子量を持ち、かつ固体状の未修飾ヒアルロン酸（ＭＨ）であることを特徴とする抗ヒアルロン酸抗体を用いる。抗ヒアルロン酸抗体がモノクローナル抗体であることが好ましい。また、２万〜４００万の粘度平均分子量を持ち、かつ固体状の未修飾ヒアルロン酸（ＭＨ）を動物に免疫する免疫工程を含むことを特徴とする抗ヒアルロン酸抗体の製造方法を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原を動物に免疫して製造され得る抗ヒアルロン酸抗体において、抗原が２万〜４００万の粘度平均分子量を持ち、かつ固体状の未修飾ヒアルロン酸（ＭＨ）であることを特徴とする抗ヒアルロン酸抗体。
【請求項２】
抗原の粘度平均分子量が１０万〜２００万である請求項１に記載の抗ヒアルロン酸抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である請求項１又は２に記載の抗ヒアルロン酸抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗ヒアルロン酸抗体を含んでなるヒアルロン酸測定用試薬キット。
【請求項５】
さらに配位子を含んでなる請求項４に記載の試薬キット。
【請求項６】
抗ヒアルロン酸抗体及び／又は配位子が標識化合物で標識されてなる請求項５に記載の試薬キット。
【請求項７】
抗ヒアルロン酸抗体及び配位子のうち、いずれか一方が水不溶性担体に結合又は吸着されて構成され、他方が標識化合物で標識されてなる請求項５に記載の試薬キット。
【請求項８】
標識化合物が酵素である請求項６又は７に記載の試薬キット。
【請求項９】
２万〜４００万の粘度平均分子量を持ち、かつ固体状の未修飾ヒアルロン酸（ＭＨ）を動物に免疫する免疫工程を含むことを特徴とする抗ヒアルロン酸抗体の製造法。
【請求項１０】
固体状の未修飾ヒアルロン酸（ＭＨ）を油中水型エマルジョンに混合した状態で動物に免疫する免疫工程を含む請求項９に記載の製造法。
【請求項１１】
請求項４〜８のいずれかに記載のヒアルロン酸測定用試薬キットを用いて、サンドイッチ法によりヒアルロン酸を定量する方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の試薬キットを用いて、化学発光酵素免疫測定法によりヒアルロン酸を定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒアルロン酸抗体、これを含む試薬キット、抗ヒアルロン酸抗体の製造方法及びヒアルロン酸の測定法に関する。より詳しくは臨床検査に最適な抗ヒアルロン酸抗体、これを含む試薬キット、抗ヒアルロン酸抗体の製造方法及びヒアルロン酸の測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定用の抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体としては、低分子量化させたヒアルロン酸ナトリウムにヘモシアニン、ホスハチジルエタノールアミン又はホスファチジルセリンを導入して形成される共有結合体を動物に免疫して得られるモノクロナール抗体が知られている（特許文献１及び２）。また、免疫測定用の蛋白としては、ヒアルロン酸結合性蛋白（プロテオグリカン、リンクプロテイン及びヒアルロネクチン）やＣＤ４４（細胞膜貫通型蛋白質）が知られている（特許文献３及び４）。
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−１５５５６６号公報
【特許文献２】特開平９−１２６００号公報
【特許文献３】特公平６−４１９５２号公報
【特許文献４】特開平９−２２９９３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、低分子量ヒアルロン酸に対するモノクローナル抗体は、生体内に存在する高分子量（特に粘度平均分子量１８万〜４００万）のヒアルロン酸を測定できないという問題がある。また、ヒアルロン酸結合性蛋白質及びＣＤ４４等は、生体内に微量成分として存在するため、生体から採取したサンプルからこれらを抽出・精製してからでないと測定できないという問題がある。すなわち、本発明の目的はすべての分子量のヒアルロン酸を簡便かつ精度良く測定し得る抗ヒアルロン酸抗体、この抗体を含む試薬キット、この抗ヒアルロン酸抗体の製造方法及びヒアルロン酸の測定法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記問題を解決するため鋭意検討した結果、特定の免疫法により製造され得る抗ヒアルロン酸抗体が上記目的を達成し得ることを見いだし、本発明に到達した。すなわち本発明は、抗原を動物に免疫して製造され得る抗ヒアルロン酸抗体において、抗原が２万〜４００万の粘度平均分子量を持ち、かつ固体状の未修飾ヒアルロン酸（ＭＨ）であることを特徴とする抗ヒアルロン酸抗体、この抗体を含む試薬キット及びこのキットを用いるヒアルロン酸を定量する方法である。また、２万〜４００万の粘度平均分子量を持ち、かつ固体状の未修飾ヒアルロン酸（ＭＨ）を動物に免疫する免疫工程を含むことを特徴とする抗ヒアルロン酸抗体の製造方法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の抗ヒアルロン酸抗体は、すべての分子量のヒアルロン酸を簡便かつ精度良く測定し得る。そして、本発明の抗ヒアルロン酸抗体は、競合免疫測定法のみだけでなく、従来実現できなかったサンドイッチ免疫測定法が可能となった。さらに、このヒアルロン酸抗体はヒアルロン酸測定用の試薬キットに最適であり、中でも同一の抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体を含む試薬キット（サンドイッチ測定法用）は、極めて高い感度で定量することができる。従って、本発明の抗ヒアルロン酸抗体を含む試薬キットを用いて測定すると、極めて簡便かつ高精度でヒアルロン酸を定量することができる。そして、本発明の抗ヒアルロン酸抗体の製造方法は、特定の免疫方法による免疫工程を含むことにより上記の簡便かつ精度の高い測定を可能にする抗ヒアルロン酸抗体を容易に調整することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において、ヒアルロン酸とは、特記しない限りヒアルロン酸及びヒアルロン酸塩を意味する。ヒアルロン酸塩としては、アルカリ金属（リチウム、ナトリウム及びカリウム等）塩、アルカリ土類金属（マグネシウム及びカルシウム等）塩及びアンモニウム塩等が含まれ、これらのうちアルカリ金属塩が好ましく、特に好ましくはナトリウム塩であるる。
【０００８】
免疫に用いる抗原の粘度平均分子量は、２万以上が好ましく、さらに好ましくは４万以上、特に好ましくは１０万以上、最も好ましくは１８万以上であり、また４００万以下が好ましく、さらに好ましくは３００万以下、特に好ましくは２５０万以下、最も好ましくは２００万以下である。この範囲であると、すべての分子量のヒアルロン酸に対して反応し得る抗体が得られやすい。なお、粘度平均分子量は、バイオポリマー（Biopolymer）９，７９９（１９７０）に記載の方法に準じて測定される。すなわち、極限粘度を求め、その値を、式［h］＝２．２８×１０-4×Ｍ0.816｛ここで［h］は極限粘度（ｄｌ／ｇ）であり、Ｍは粘度平均分子量である。｝に代入し、粘度平均分子量を求める（以下同じ）。
【０００９】
また、免疫に用いる抗原の形態は液状（溶融状態及び溶解状態を含む）及び個体状（分散状態を含む）のいずれでもよいが、固体状であることが好ましい。固体状であると、すべての分子量のヒアルロン酸に対して反応し得る抗体が得られやすい。ここで、形態とは、１０〜４０℃における物質の状態を意味し、少なくとも免疫開始時の物質自身の状態である。固体の形状及び大きさ等は、免疫操作に支障のない範囲で自由に設定できる。形状としては、粉末状、砂状（粒状）、シート状及び繊維状等が挙げられ、好ましくは砂状である。免疫操作は、通常内径０．４〜１．２ｍｍ程度の注射針を使用するため、大きさとしては、注射針を通過する大きさが好ましく、例えば、内径０．４〜１．２ｍｍ程度の注射針を使用して免疫する場合、使用する注射針の内径に対して１／１０〜１／２の体積平均粒子径が好ましく、さらに好ましくは注射針の内径の１／５〜１／３の体積平均粒子径である。なお、体積平均粒子径は、ＪＩＳ  Ｚ８８２５−１：２００１に記載された測定原理｛光散乱法（２５℃）｝を有するレーザー回折式粒度分布測定装置（例えば、島津製作所製ＳＡＬＤ−１１００型）により求められる。
【００１０】
免疫に用いる抗原としては、以上の特性を持つものであれば限定なく使用でき、市販されているヒアルロン酸（商品名）としては、ヒアルロン酸ナトリウム塩（ブタ皮由来）｛生化学工業（株）製、粘度平均分子量４万〜６万｝、ヒアルロン酸ナトリウム塩（ヒト臍帯由来）｛生化学工業（株）製、粘度平均分子量８０万〜１２０万｝、ヒアルロン酸協和−ＨＰ（微生物由来）｛協和発酵工業（株）製、粘度平均分子量１５０万〜２００万｝、バイオヒアルロン酸ナトリウム（微生物由来）｛（株）資生堂製、粘度平均分子量６０万〜１５０万｝、デンカヒアルロン酸（微生物由来）｛電気化学工業（株）製、粘度平均分子量６０万〜１５０万｝、及びヒアルロン酸ＨＡ−Ｑ（鶏冠由来）｛（株）キューピー製、粘度平均分子量５０万〜１２０万｝等が挙げられる。
【００１１】
この他に、へその緒を原料として、細かく砕いた後蛋白質の大部分をペプシン又はトリプシンで分解して除き、さらに残りをクロロホルム−アミルアルコールと振ってゲルとして除き、次いで、ピリジンの存在下で硫酸アンモニウムで分別沈殿を行い他の多糖類を除く（この他、酢酸ナトリウム、フェノール、トリクロロ酢酸で抽出する方法及びアルコールで沈殿させる方法等がある）。そして、アフィニティークロマトグラフィーやゲルパーミエーションクロマトグラフィー等により、好ましい粘度平均分子量範囲に分画採取することによっても得ることができる。なお、免疫に用いる抗原は、ヘモシアニン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリン等で修飾していない未修飾ヒアルロン酸であることが好ましい。未修飾ヒアルロン酸を用いると、すべての分子量のヒアルロン酸に対して反応し得る抗体が得られやすい。
【００１２】
免疫に使用される動物としては特に制限はなく、従来抗体の作成に使用されているものから適宜選択して用いることができ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ及びウシ等が挙げられる。これらのうち、モノクローナル抗体の調整し易さ等の観点から、マウス及びラットが好ましく、さらに好ましくはマウスである。
【００１３】
通常、抗原を動物に免疫する場合、適当な溶媒（生理食塩水等）に溶解した後、免疫増強剤（コンプリートフロイントアジュバント等）と共に乳化し、動物の皮下や腹腔内等に投与されることが一般的である。しかし、未修飾ヒアルロン酸の場合、この方法ではヒアルロン酸溶液の粘度高いため多量の抗原を免疫できず、少量の抗原では充分な抗体価が得られにくいという問題がある。未修飾ヒアルロン酸を免疫し、効率よく抗ヒアルロン酸抗体を得るためには、免疫増強剤（コンプリートフロイントアジュバント等）及び生理食塩水等を常法により混合・乳化して作成した油中水型エマルションと、固体状の未修飾ヒアルロン酸（ＭＨ）とを混合・分散し、直ちに（約３０分以内が好ましく、さらに好ましくは１５分以内、特に好ましくは５分以内）、動物に投与することが好ましい。このように固体状の未修飾ヒアルロン酸（ＭＨ）を油中水型エマルションに混合した状態で動物に免疫することにより、充分な量の抗原を投与することができ、充分な抗体価を得られやすい。
【００１４】
免疫増強剤及び生理食塩水の使用重量比率（免疫増強剤：生理食塩水）としては通常の免疫の場合と同程度でよく、１：０．６〜１が好ましく、さらに好ましくは１：０．８〜１、特に好ましくは１：１である。また、固体状の未修飾ヒアルロン酸（ＭＨ）の含有量（重量％）は、免疫増強剤及び生理食塩水の合計重量に基づいて、０．０１以上が好ましく、さらに好ましくは０．０５以上、特に好ましくは０．１以上であり、また３０以下が好ましく、さらに好ましくは２０以下、特に好ましくは１０以下である。
【００１５】
１回当たり投与する未修飾ヒアルロン酸（ＭＨ）の量としては、動物の種類や大きさ等により適宜設定できるが、動物の体重１ｇ当たり２０μｇ以上が好ましく、さらに好ましくは４０μｇ以上、特に好ましくは１００μｇ以上であり、また５ｍｇ以下が好ましく、さらに好ましくは２ｍｇ以下、特に好ましくは１ｍｇ以下である。この範囲であると、充分な抗体価を得られやすい。すなわち好ましい免疫法を例示すれば、体重６０ｇのマウスに免疫する場合、油中水型エマルション０．２ｇと固体状未修飾ヒアルロン酸（ＭＨ）１．２〜３００ｍｇとを混合し、腹腔中に投与する方法等が挙げられる。免疫回数は適宜設定できるが、２週間から１ヶ月の間隔で３回以上免疫することが好ましい。２回目以降の免疫量は通常は１回目と同じでよいが、適宜上記の範囲で増減することができる。
【００１６】
ポリクロナール抗体を得る場合、免疫した後、常法に従って採血を行い、ポリクロナール抗体を得る。例えば免疫動物がウサギの場合、耳外側静脈を切開し血液を採取する。免疫動物がマウスの場合、尾静脈を切開し血液を採取する。いずれの場合も、得られた血液から血清を分離し、硫安塩析、イオン交換カラム等で抗体画分（通常はＩｇＧ画分）を分取することにより、ポリクローナル抗体を得る。得られたポリクロナール抗体の反応性は、例えば、酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assy）で確認できる。すなわち、ヒアルロン酸を結合した不溶性担体に得られたポリクロナール抗体を反応させた後、得られたポリクロナール抗体を認識する抗体と標識物との結合体［例えば、得られた抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体がウサギ抗体の場合、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体（ブタ）等］を反応させ、標識物を検出することにより得られたポリクロナール抗体とヒアルロン酸との反応性を確認できる。この際、不溶性担体に結合するヒアルロン酸の分子量等を変更することにより分子量等の異なるヒアルロン酸に対する反応性を確認できる。
【００１７】
一方、モノクローナル抗体を得る場合、免疫した動物の脾臓を採取し、これから調整される脾臓細胞を用いて常法に従って細胞融合を行い、融合細胞を調整する。そして、これらの中からヒアルロン酸と反応する抗体を産生する細胞を上述の酵素免疫抗体法で選択し、この選択された融合細胞を限界希釈法等でクローニングする。クローニングされた融合細胞をマウス腹腔内又は無血清培地で増殖させ、得られた腹水又は培養液からプロテインＡ等で精製することによりモノクローナル抗体を得る。モノクローナル抗体の反応性も、酵素免疫抗体法で確認できる。
【００１８】
本発明の抗ヒアルロン酸抗体は、以上のようにして製造され得るけれど、この方法に限定されるものではなく、以上の方法をアレンジした方法や全く異なる方法等によっても得ることができる。例えば、脾臓細胞とヒアルロン酸とを接触させて感作した後、細胞融合を行いモノクローナル抗体を作成する方法等が含まれる。本発明の抗ヒアルロン酸抗体としては、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体が含まれるが、ヒアルロン酸の測定用として用いる場合、測定精度の観点から、モノクロナールが好ましい。
【００１９】
本発明の抗ヒアルロン酸抗体は、ヒアルロン酸測定用試薬キットの試薬として最適である。すなわち、本発明の抗ヒアルロン酸抗体を含む試薬キットを用いると、すべての分子量のヒアルロン酸を簡便かつ精度良く測定することができる。測定対象のヒアルロン酸としては、生体中に含まれる全てのヒアルロン酸が対象とでき、皮膚及び関節等の結合組織、肝臓等の臓器、並びに血液等の体液に含有するヒアルロン酸等が含まれる。これらのうち、血液等の体液に含まれるヒアルロン酸に好適であり、さらに血清中のヒアルロン酸に最適である。また、生体中のヒアルロン酸は、種々の分子量で存在することが知られており、本発明の試薬キットは全ての分子量のヒアルロン酸の測定に適用できる。これらの分子量のうち、粘度平均分子量２万以上に対して好適であり、さらに４万以上、特に１０万以上、最も１８万以上に対して適しており、また粘度平均分子量４００万以下に対して好適であり、さらに３００万以下、特に２５０万以下、最も２００万以下に対して適している。この範囲であると、これらのヒアルロン酸に複数個の抗ヒアルロン抗体が結合できるため測定感度及び測定精度が向上しやすい。
【００２０】
本発明の試薬キットには、上記の抗ヒアルロン酸抗体を含めば、試薬の剤型及び試薬キットの構成等に制限はなく、例えば、抗ヒアルロン酸抗体が、不溶性担体及び／又は標識化合物と結合したかたちで試薬キットに含まれてもよく、抗ヒアルロン酸抗体単独で含まれていてもよい。すなわち本発明の試薬キットは、比朧法、ラテックス凝集法及び比濁法等のホモジニアス免疫測定法にも、不溶性担体を用いたヘテロジニアス免疫測定法にも適用できる。これらのうち、測定感度の点で、ヘテロジニアス免疫測定法用の試薬キットが好ましい。
【００２１】
試薬キットには、反応用緩衝液、Ｂ／Ｆ分離用緩衝液及び標準ヒアルロン酸緩衝液等を含むことができる。反応用緩衝液及びＢ／Ｆ分離用緩衝液としては従来免疫測定に使用される緩衝液等が使用でき、蛋白、塩及び／又は界面活性剤等を含有するリン酸緩衝液及びグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液等が使用できる。蛋白としては、アルブミン（牛血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、マウス血清アルブミン、オバルブミン、コナルブミン及びラクトアルブミン等）、抗体（正常ウサギＩｇＧ及び正常マウスＩｇＧ等のヒアルロン酸との結合性がない抗体）及びゼラチン等が挙げられる。塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び臭化リチウム等が挙げられる。界面活性剤としては、ソルビタンラウリン酸モノエステルエチレンオキシド付加物（商品名：ツイーン２０及びツイーン４０、ＩＣＩアメリカ社）等のノニオン界面活性剤等が挙げられる。標準ヒアルロン酸緩衝液は、濃度算出用の検量線を作成するために使用されるものである。そして、既知量のヒアルロン酸を反応用緩衝液及びＢ／Ｆ分離用緩衝液に使用される緩衝液に溶解したものである。
【００２２】
本発明の試薬キットには、抗ヒアルロン酸抗体と共に、配位子を含むことが好ましい。配位子としては、ヒアルロン酸と結合し得る蛋白配位子及びヒアルロン酸そのもの等が使用できる。ヒアルロン酸と結合し得る蛋白配位子としては、本発明の抗ヒアルロン酸抗体、ヒアルロン酸結合性蛋白及びＣＤ４４等が含まれる。ヒアルロン酸結合性蛋白としては、アナリティカルバイオケミストリ（Analytical Biochemistry）109,386-394,(1980)等に記載のプロテオグリカン、リンクプロテイン及びヒアルロネクチン等が挙げられる。ＣＤ４４としては、特許文献４等に記載されている標準型ＣＤ４４（ＣＤ４４Ｈ）、ＣＤ４４変異分子（ＣＤ４４Ｖ）、ＣＤ４４Ｅ及び可溶性ＣＤ４４（ｓＣＤ４４）等が挙げられる。これらの配位子のうち、ヒアルロン酸と結合し得る蛋白配位子（サンドイッチ測定法用試薬キットに対応）が好ましく、さらに好ましくは本発明の抗ヒアルロン酸抗体、特に好ましくは本発明の抗ヒアルロン酸抗体（モノクロナール抗体）である。
【００２３】
配位子がヒアルロン酸と結合し得る蛋白配位子である場合、ヒアルロン酸の測定に際し、［抗ヒアルロン酸抗体−ヒアルロン酸−配位子］のサンドイッチ状複合体を形成し、この複合体を測定することによりヒアルロン酸を定量することができる（サンドイッチ測定法用試薬キット）。そして、この場合、高分子量（粘度平均分子量２万〜４００万）のヒアルロン酸の測定に適しており、さらに粘度平均分子量１０万〜２５０万、特に１８万〜２００万のヒアルロン酸の測定に最適である。
【００２４】
一方、配位子がヒアルロン酸そのものの場合、本発明の抗ヒアルロン酸抗体に対して、このヒアルロン酸が測定されるヒアルロン酸と競合的に反応し、抗ヒアルロン酸抗体と反応した配位子の量を測定することによりヒアルロン酸を定量することができる（競合測定法用試薬キット）。この場合、低分子量（粘度平均分子量２０００〜２万）のヒアルロン酸の測定に好適である。
【００２５】
本発明の試薬キットにおいては、抗ヒアルロン酸抗体又は配位子の少なくとも一つが標識化合物で標識されていることが好ましい。標識化合物としては従来公知のものが使用でき、ラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質及び酵素等が用いられる。アイソトープとしては、125Ｉ等が挙げられ、蛍光物質としてはユーロピウム錯体等が挙げられ、発光物質としてはＮ−メチルアクリジウムエステル等が挙げられ、酵素としては西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。これらの標識化合物のうち、酵素が好ましく、さらに好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼ、特に好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼである。
【００２６】
標識化合物を抗ヒアルロン酸抗体又は配位子に標識する方法は従来公知の方法等が適用でき、「続生化学実験講座５  免疫生化学実験法」（日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年発行、１０２〜１１２頁に記載の方法等が用いられ、例えば、次の（１）〜（４）の方法等が適用できる。
（１）標識化合物がアイソトープの場合、クロラミンＴを酸化剤として用いて放射性ヨウ素を抗ヒアルロン酸抗体又は配位子のチロシン残基に導入する方法。
（２）標識化合物が蛍光物質の場合、フルオレセインイソチオシアネートを緩衝液中で抗ヒアルロン酸抗体又は配位子に反応させ、抗ヒアルロン酸抗体又は配位子のリシン残基に結合させる方法。
（３）標識物質が発光物質の場合、商品名「アクリジニウム誘導体−Ｉ」（同人化学研究所社製）を緩衝液中で抗ヒアルロン酸抗体又は配位子に反応させ、抗ヒアルロン酸抗体又は配位子のアミノ基に結合させる方法。
（４）標識物質が酵素の場合、酵素の持つアミノ基と抗ヒアルロン酸抗体又は配位子の持つチオール基をＮ−スクシンイミジル−６−マレイドヘキサノエート等のニ架橋性試薬で結合する方法。
【００２７】
本発明の試薬キットにおいて、抗ヒアルロン酸抗体又は配位子の一方が水不溶性担体に結合され、他方が標識化合物で標識されていることが好ましい。すなわち、［水不溶性担体−抗ヒアルロン酸抗体−ヒアルロン酸−配位子−標識化合物］若しくは［水不溶性担体−配位子−ヒアルロン酸−抗ヒアルロン酸抗体−標識化合物］（サンドイッチ測定法）又は［水不溶性担体−抗ヒアルロン酸抗体−ヒアルロン酸−標識化合物］（競合測定法）等の複合体を形成するように構成することが好ましい。
【００２８】
水不溶性担体としては、特開平２−２０５７７４号公報に記載の担体等が使用でき、ガラス等の無機物及びポリスチレン等の有機物等が使用できる。水不溶性担体の形状は、使用する目的に合わせて自由に決定でき、真球状や円盤状のビーズ、板状や棒状のスティック、試験管、及び不織布やフィルターのストリップ等が挙げられる。これらのうち、ビーズが好ましく、さらに好ましくは真球状のビーズである。
【００２９】
水不溶性担体の大きさは、使用する目的に合わせて自由に決定でき、直径１０ｍｍ程度の反応容器に投入できる大きさである（試験管を除く。）。ビーズの場合、直径（ｍｍ）は１〜１０が好ましく、さらに好ましくは２〜８、特に好ましくは３〜７である。スティックの場合、長さ（ｍｍ）は２〜１０が好ましく、さらに好ましくは３〜８、特に好ましくは４〜７である。また、スティックの断面積（ｍｍ2）は１〜２５が好ましく、さらに好ましくは２〜１６、特に好ましくは３〜９である。なお、断面積とは、長軸方向に対して垂直に切断した際の切断部分の断面積を意味する。試験管の場合、長さ（ｍｍ）は５〜１００が好ましく、さらに好ましくは８〜８０、特に好ましくは１０〜２０である。また、試験管の内径（ｍｍ）は、５〜２０が好ましく、さらに好ましくは６〜１６、特に好ましくは８〜１２である。ストリップの場合、長さ（ｍｍ）は、５〜１００が好ましく、さらに好ましくは１０〜８０、特に好ましくは１０〜５０である。また、ストリップの幅（ｍｍ）は、１〜２０が好ましく、さらに好ましくは２〜１６、特に好ましくは３〜１０である。
【００３０】
抗ヒアルロン酸抗体又は配位子を水不溶性担体に結合する方法としては、化学的に結合する方法及び物理吸着による方法の従来公知の方法等で行うことができる。化学的に結合する方法としては、水不溶性担体表面に導入されたアミノ基及びスルフヒドリル基等の官能基と、抗ヒアルロン酸抗体又は配位子のアミノ基及びスルフヒドリル基等の官能基とを結合剤（グルタルアルデヒド、サクシンアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロサクシンイミドエステル及びｏ−フェニレンビスマレイミド等）で架橋する方法（米国特許第４２８０９９２号明細書及び同第３６５２７６１号明細書等）等が挙げられる。物理吸着による方法としては、水不溶性担体がポリスチレンの場合、抗ヒアルロン酸抗体又は配位子を０．００１〜０．０４％（Ｗ／Ｖ）含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に水不溶性担体を適当時間浸漬する方法（バイオシム・バイオフィズ・アクタ、２５１巻、４２７頁、１９７１年）等が挙げられる。この方法は、担体がポリスチレン以外の物質、例えばポリプロピレン、シリコン、ガラス及びセルロース等にも適用できる。
【００３１】
本発明の試薬キットは、競合測定法及びサンドイッチ測定法によるヒアルロン酸を定量する方法に適しており、特にサンドイッチ測定法によるヒアルロン酸を定量する方法に適している。被測定物であるヒアルロン酸は、標識化合物の量を測定することにより定量することができる。標識化合物の測定は、標識化合物の種類により従来公知の方法等で実施できる。標識化合物が蛍光物質の場合、例えば適当な波長の励起光の照射によって生じる蛍光量を光電子増倍管により定量する。標識化合物が化学発光物質の場合、例えばアクリジニウムエステルではアルカリ溶液を加えることにより生じる発光量を光電子増倍管により定量する。
【００３２】
標識化合物が酵素の場合、適当な基質を反応させることにより酵素活性を吸光度（吸光度測定法）、蛍光量（蛍光量測定法）又は発光量（化学発光量測定法）として測定できる。例えば、酵素がペルオキシダーゼの場合、基質としては２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム（ＡＢＴＳ）（吸光度測定法）及びルミノール／過酸化物（化学発光量測定法）等を選択できる。酵素がアルカリフォスファターゼの場合、基質としてはｐ−ニトロフェニルフォスフェート（吸光度測定法）、４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）（蛍光量測定法）及び３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム（ＡＭＰＰＤ）（化学発光量測定法）等を選択できる。吸光度は分光光度計、蛍光量及び化学発光量は光電子増倍管により定量される。これらのうち、化学発光量測定法が好ましく（すなわち、本発明の試薬キットを用いてヒアルロン酸を定量する方法としては化学発光酵素免疫測定法が好ましい。）、さらに好ましくはペルオキシダーゼとルミノール／過酸化物との組合せ又はアルカリフォスファターゼとＡＭＰＰＤとの組み合わせによる化学発光量測定法である。
【００３３】
ルミノールとしては、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）及びこれらの金属塩等が含まれる。これらの金属塩としては、アルカリ金属（ナトリウム及びカリウム等）塩及びアルカリ土類金属（カルシウム及びマグネシウム等）塩等が使用できる。これらのうち、ルミノール及びルミノールの金属塩が好ましく、さらに好ましくはルミノールの金属塩、特に好ましくはルミノールのナトリウム塩である。過酸化物としては、無機過酸化物及び有機過酸化物のいずれも使用できる。無機過酸化物としては、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過ホウ酸カリウム、過酸化酸、過酸化炭酸、過酸化二炭酸、次亜塩素酸、次亜塩素酸カリウム、亜塩素酸、塩素酸、塩素酸ナトリウム、過塩素酸、過臭素酸、ペルオクソ硫酸及びペルオクソリン酸等が挙げられる。有機過酸化物としては、例えば、過酢酸、過プロピオン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トリエチルアミンオキサイド、メチルジエチルアミンオキサイド及び過酸化フタロイル等が挙げられる。これらのうち、保存安定性等の観点から、無機過酸化物が好ましく、さらに好ましくは過酸化水素である。
【００３４】
本発明の試薬キットを用いたヒアルロン酸の定量する方法（サンドイッチ測定法）の具体例（工程１〜６）を以下に示す。
工程１．検体と、抗ヒアルロン酸抗体の結合した水不溶性担体とを反応させて反応混合物（複合体１を含む）を得る。
工程２．工程１の反応混合物から未反応物を除き（Ｂ／Ｆ分離）、複合体１を得る。
工程３．工程２で得られた複合体１と、標識化合物で標識された配位子（Ｂ）とを反応させて反応混合物（複合体２を含む）を得る。
工程４．工程３反応混合物から未反応物を除き（Ｂ／Ｆ分離）、複合体２を得る。
工程５．複合体２の標識化合物の量を測定する。
工程６．標識化合物の量を用いて、別途作成した検量線からヒアルロン酸の量を算出する。
同様に、配位子（Ｂ）がヒアルロン酸そのものの場合、本発明の試薬キットを用いたヒアルロン酸の定量する方法（競合測定法）の具体例となる。
【００３５】
次に、本発明のホモジニアスな測定に適用した実施形態を例示する。一定量の抗ヒアルロン酸抗体を添加した緩衝液を作成する。抗ヒアルロン酸抗体の添加量は、測定条件及び測定対象であるヒアルロン酸の濃度範囲により種々の値をとり得るが、緩衝液の容量に基づいて通常０．１〜１００ｍｇ／Ｌの濃度である。抗ヒアルロン酸抗体を含む緩衝液の一定量と検体の一定量を混合し反応を行い、比濁法又は比朧法により定量する。比濁法の場合、反応にともない濁度の変化を分光光度計又は光電比色計で計測する。比朧法の場合、ネフェロメーターで反応にともない生じる散乱光の変化を計測する。比濁法及び比朧法ともに測定できる濃度範囲が狭く、通常高濃度（０．２ｍｇ／Ｌ以上）のヒアルロン酸を含む検体に適用される。
【００３６】
比濁法に用いる抗ヒアルロン酸抗体を、ラテックスなどの微粒子に結合した形態で使用することができる。ラテックス粒子と抗ヒアルロン酸抗体の結合は、前記の物理吸着法で行うことができる。ラテックスに結合した抗ヒアルロン酸抗体と検体とを緩衝液中で反応させ、濁度の変化を分光光度計又光電比色計を用いて近赤外線（通常９４０ｎｍ）で計測する。この方法は、ラテックスを用いない比濁法より測定可能な濃度範囲が広くなり、０．１ｍｇ／Ｌ以上の濃度範囲の測定に適用できる。
【００３７】
本発明のヒアルロン酸測定用キットは、すべての分子量のヒアルロン酸を簡便かつ精度良く測定し得るので、疾患診断及び治療効果の判断等に最適である。ヒアルロン酸は生体内において、硝子体、関節液及び皮膚等に広範囲に分布している。肝臓疾患、癌及び関節リウマチ等の疾患においては病変部に存在する高分子量（粘度平均分子量２万〜２００万）のヒアルロン酸が滲出又は分解し、血液及び尿等の体液中のヒアルロン酸量が増加することが知られている［例えば、ヘパトロジー（Hepatology)，５，６３８−６４２,１９８５、肝臓,３２（８），７６７−７７４，１９９１、臨床病理，３６（５），５３６−５４０，１９９１等］。特に血液中の高分子量のヒアルロン酸量は、関節リュウマチ、癌及び肝疾患等の病態と良く相関することが知られている。例えば、慢性関節リュウマチの場合、血清中濃度は、健常人では５０ｎｇ／ｍＬ以下、非活動性の慢性リウマチ患者では５０〜２００ｎｇ／ｍＬ、活動性の慢性リウマチ患者では２００ｎｇ／ｍＬ以上の値をとる。肝疾患の場合もほぼ同様で、健常人では５０ｎｇ／ｍＬ以下、慢性肝炎患者では５０〜２００ｎｇ／ｍＬ、肝硬変患者では２００ｎｇ／ｍＬ以上の値をとる。以上の通り、血液中の高分子量のヒアルロン酸を測定することにより、これらの疾患の診断あるいは治療効果の判断等に適用できる。
【００３８】
従来、高分子ヒアルロン酸の臨床での測定は、ヒアルロン酸結合性蛋白を用いたリガンド測定がほぼ独占的に行われていた。この方法では、試薬製造に際し、生体の軟骨等からヒアルロン酸結合性蛋白を精製することが必要であり、ヒアルロン酸結合性蛋白の品質及び試薬品質の安定化に工夫が必要であった。本発明の抗ヒアルロン酸抗体を使用することにより、ヒアルロン酸の新しい測定法及び安定な品質の試薬キットを提供することが可能となった。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１の作成
１．免疫用抗原の調製
コンプリートフロイントアジュバント（ディフコ社製）１重量部と０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１重量部をホモジナイザーで混合、乳化した。この乳化液１重量部にヒアルロン酸ナトリウム塩（ヒト臍帯由来、粘度平均分子量１００万、砂状粒子）［生化学工業株式会社製］４／１０００重量部を攪拌棒で混合し、免疫用抗原エマルション１とした。なお、免疫用抗原エマルション１を３７℃、静置状態で１時間、８時間又は２４時間放置した後、エマルション１の１ｇに対して１０ｍＬのアセトンを加え、析出したヒアルロン酸の形状を肉眼で観察した。ヒアルロン酸ナトリウム水溶液（上記ヒアルロン酸ナトリウムを脱イオン水１ｍＬ当たり０．１ｍｇ加え溶解したもの）を同様に析出した場合、綿状沈殿が析出するが、本エマルションではいずれの時間でも、綿状沈殿は認められず砂状粒子が確認された。すなわち、ヒアルロン酸ナトリウム塩は乳化液には溶解せず、固体状で存在していることが裏付けられた。ただし、２４時間放置では砂状粒子の表面に僅かに綿状沈殿が確認され、粒子表面が徐々に溶解していることが確認された。
【００４０】
２．マウスへの免疫
免疫抗原エマルション１を得た後、直ちに免疫用抗原エマルション１の０．２ｇ（ヒアルロン酸ナトリウム：０．８ｍｇ）をマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）３頭それぞれの腹腔内に投与した。そして１ヶ月間隔で３回同様に投与した（合計４回投与）。なお、免疫抗原エマルション１は、保存せず、それぞれ免疫直前に調整した。最初の免疫から５ヶ月後にマウスの尾静脈より血液をマウス１匹当たり０．１ｍＬ採取した。３匹の血液を混合（０．３ｍＬ）した後、遠心分離し、０．１５ｍＬの抗血清１を得た。
【００４１】
３．抗ヒアルロン酸抗体の精製
０．１５ｍＬの抗血清１をリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．０１２５Ｍ）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム（体積２ｍＬ）に通し、通過液を精製された抗体を含む画分として分取した。この液を蛋白濃度１０μｇ／ｍＬの濃度となるようリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．０１２５Ｍ）で希釈し、抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１を含む緩衝液を得た。
【００４２】
＜実施例２＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体２の作成
免疫用抗原エマルション１に代えて、乳化液１重量部にヒアルロン酸ナトリウム塩（ヒト臍帯由来）［生化学工業株式会社製］６／１０００重量部を混合した免疫用抗原エマルション２を用いた以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体２を含む緩衝液を得た。実施例１と同様にして免疫用抗原エマルション２中のヒアルロン酸の形状を確認したところ、実施例１と同様の結果であった。
【００４３】
＜実施例３＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体３の作成
免疫用抗原エマルション１に代えて、乳化液１重量部にヒアルロン酸ナトリウム塩（ヒト臍帯由来）［生化学工業株式会社製］１０／１０００重量部を混合した免疫用抗原エマルション３を用いた以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体３を含む緩衝液を得た。実施例１と同様にして免疫用抗原エマルション３中のヒアルロン酸の形状を確認したところ、実施例１と同様の結果であった。
【００４４】
＜実施例４＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体４の作成
免疫用抗原エマルション１に代えて、乳化液１重量部にヒアルロン酸ナトリウム塩（ヒト臍帯由来）［生化学工業株式会社製］２０／１０００重量部を混合した免疫用抗原エマルション４を用いた以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体４を含む緩衝液を得た。実施例１と同様にして免疫用抗原エマルション４中のヒアルロン酸の形状を確認したところ、実施例１と同様の結果であった。
【００４５】
＜比較例１＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体５の作成
免疫用抗原エマルション１に代えて、ヒアルロン酸ナトリウム塩（ヒト臍帯由来）［生化学工業株式会社製］の１／１００００重量部を０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１重量部に加え、攪拌して溶解した溶液１重量部とコンプリートフロイントアジュバント１重量部を混合・乳化して調整した免疫用抗原エマルション５を用いた以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体５を含む緩衝液を得た。実施例１と同様にしてエマルション５中のヒアルロン酸の形状を確認したところ、綿状沈殿の析出のみが認められ、ヒアルロン酸ナトリウム塩が乳化液に溶解していたことが裏付けられた。
【００４６】
＜比較例２＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体６の作成
免疫用抗原エマルション１に代えて、ヒアルロン酸ナトリウム塩（ヒト臍帯由来）［生化学工業株式会社製］の２／１００００重量部を０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１重量部に加え、攪拌して溶解した溶液１重量部とコンプリートフロイントアジュバント１重量部を混合・乳化して調整した免疫用抗原エマルション６を用いた以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体６を含む緩衝液を得た。実施例１と同様にしてエマルション６中のヒアルロン酸の形状を確認したところ、綿状沈殿の析出のみが認められ、ヒアルロン酸ナトリウム塩が乳化液に溶解していたことが裏付けられた。
【００４７】
＜比較例３＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体７の作成
特許文献１に記載の実施例と同様の方法で低分子量のヒアルロン酸ナトリウム塩を調製した。すなわち実施例１で用いたヒアルロン酸ナトリウム塩（ヒト臍帯由来、粘度平均分子量１００万）０．１ｇを１０ｍｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解した。続いて終濃度が６０Ｕ／ｍｌとなるように牛睾丸由来のヒアルロニダーゼ（シグマ社製）を加えて、３７℃で一晩消化させた。１００℃で、１０分間加熱して酵素を失活させた後、遠心分離により沈殿を除去した。次に１％（ｗ／ｖ）の濃度となるように酢酸ナトリウム（結晶）を加えてヒアルロン酸ナトリウム溶液を得た後、アセトン沈殿法により低分子量のヒアルロン酸ナトリウムを分別沈殿させた。すなわち、ヒアルロン酸ナトリウム溶液へ撹拌しながらアセトンを徐々に滴下し、沈殿１が生じたところで、沈殿１を遠心分離除去した。沈殿１を除去した上清にさらにアセトンを徐々に滴下し沈殿２を生じさせた。沈殿２の増加が認められなくなるまでアセトンを滴下した後、沈殿２を遠心分離した。沈殿２をアセトン洗浄後、真空乾燥することにより、白色粉末の低分子量のヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。このヒアルロン酸ナトリウム塩の粘度平均分子量は５５００であった。
【００４８】
免疫用抗原エマルション１に代えて、低分子量のヒアルロン酸ナトリウム塩の４／１０００重量部を０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１重量部に溶解した溶液１重量部とコンプリートフロイントアジュバント１重量部を混合・乳化して調整した免疫用抗原エマルション７を用いた以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体７を含む緩衝液を得た。実施例１と同様にしてエマルション７中のヒアルロン酸の形状を確認したところ、綿状沈殿の析出のみが認められ、ヒアルロン酸ナトリウム塩が乳化液に溶解していたことが裏付けられた。
【００４９】
＜比較例４＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体８の作成
特許文献１に記載の実施例と同様の方法で低分子量のヒアルロン酸とヘモシアニンとの結合体を調製した。すなわち、比較例３で得た低分子量のヒアルロン酸・ナトリウム塩１５ｍｇを０．５ｍｌの５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解後、１．０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを加えて室温（２５〜３０℃）で６時間反応させることにより、還元末端のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン構造（ＧｌｃＮＡｃ）を糖アルコールとした。ついで、５０ｍｌのアセトンを加えることにより過剰の水素化ホウ素ナトリウムを室温（１５〜２５℃）で分解させると同時にヒアルロン酸糖アルコールを沈殿させた。このヒアルロン酸糖アルコールを比較例３と同様にしてアセトン沈殿法により分別沈澱させ、白色粉末のヒアルロン酸糖アルコールを得た。
【００５０】
得られたヒアルロン酸糖アルコール１０ｍｇを０．５ｍｌのイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した後、３．０ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを加え０℃で１時間反応させることにより、安定なヒアルロン酸アルデヒドを得た。ヒアルロン酸アルデヒドは、エタノール沈殿法により分別沈澱させた。すなわちヒアルロン酸アルデヒドを含む溶液へ撹拌しながらエタノールを徐々に滴下し、沈殿１が生じたところで、沈殿１を遠心分離除去した。沈殿１を除去した上清にさらにエタノールを徐々に滴下し沈殿２を生じさせた。沈殿２の増加が認められなくなるまでエタノールを滴下した後、沈殿２を遠心分離した。沈殿２をエタノール洗浄後、真空乾燥することにより白色粉末のヒアルロン酸アルデヒドを得た。
【００５１】
上記方法により得られたヒアルロン酸アルデヒド１．０ｍｇ及びヘモシアニン１０ｍｇ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔｓ由来、シグマ社製）を０．４ｍｌの蒸留水に溶解させ、室温（２５〜３０℃）で３０分間撹拌させることによりシッフ塩基を形成させた。続いて、２０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えて室温（２５〜３０℃）で７時間撹拌後、５．０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを加え、一晩２〜１０℃の温度下で撹拌することにより、シッフ塩基を還元した。この反応液へ撹拌しながらアセトンを徐々に滴下し、沈殿１が生じたところで、沈殿１を遠心分離除去した。沈殿除去した上清に、さらにアセトンを徐々に滴下し沈殿２を生じさせた。沈殿２の増加が認められなくなるまでアセトンを滴下した後、沈殿２を遠心分離し、低分子量のヒアルロン酸とヘモシアニンとが化学結合したヘモシアニン結合ヒアルロン酸ナトリウム塩を得た（淡赤色の粉末）。
【００５２】
免疫用抗原エマルション１に代えて、ヘモシアニン結合ヒアルロン酸ナトリウム塩の４／１０００重量部を０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１重量部に加え攪拌して溶解した溶液１重量部とコンプリートフロイントアジュバント１重量部を混合・乳化して調整した免疫用抗原エマルション８を用いた以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体８を含む緩衝液を得た。実施例１と同様にしてエマルション８中のヒアルロン酸の形状を確認したところ、綿状沈殿の析出のみが認められ、ヒアルロン酸ナトリウム塩が乳化液に溶解していたことが裏付けられた。
【００５３】
＜抗体価の評価＞
１）測定用試薬の調製
ヒアルロン酸ナトリウム塩（粘度平均分子量１００万、ヒト臍帯由来、生化学工業株式会社製）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に２０μｇ／ｍＬの濃度に溶解し、この溶液５００ｍＬに直径６．３５ｍｍポリスチレンビーズ（商品名：イムノビーズ、イムノケミカル社製）５００個を浸漬し、２〜１０℃で１０時間放置した。その後、溶液をアスピレーターで吸引除去し、ポリスチレンビーズを０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬して、ヒアルロン酸ナトリウム塩結合ビーズ（Ａ）とした。作成したヒアルロン酸ナトリウム塩結合ビーズ（Ａ）は使用時まで４〜１０℃で保存した。
【００５４】
２）標識抗マウスＩｇＧ抗体液の調製
ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgＧウサギ抗体（ダコ社製、商品コードＰ１６０）を０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で２０００倍に希釈し、標識抗体液とした。使用時まで−２０℃で凍結保存した。
【００５５】
３）発色液の調製
０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）１００ｍＬにｏ−フェニレンジアミン３００ｍｇ及び３０重量％過酸化水素水７０μＬを加え溶解し、発色液を調製した。使用時まで遮光冷蔵保存した（作成当日のみ使用可能）。
【００５６】
４）測定操作
試験管（内径１．２ｃｍ、長さ１０ｃｍ）にヒアルロン酸ナトリウム塩結合ビーズ（Ａ）１個、１重量％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００μＬ及び測定用サンプル（抗ヒアルロン酸抗体を含む緩衝液）５０μＬを加え、３７℃、４時間静置下で反応させた。反応液をアスピレーターで吸引除去し、０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１ｍＬを加えた後、塩化ナトリウム水溶液をアスピレーターで吸引除去することによりビーズを洗浄した。この洗浄操作をさらに２回行った後、標識抗体液３００μＬを加え、３７℃、１時間静置下で反応させた。上述と同様にビーズの洗浄を３回行った後、発色液５００μＬを加え、３７℃、３０分間静置下で反応させた。１．５Ｎ硫酸１ｍＬを加えて反応を停止させ、測定波長４９２ｎｍで吸光度（光路長１０ｍｍ）を測定した。
【００５７】
実施例１〜４及び比較例１〜４で得た抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１〜８をそれぞれ含む緩衝液を測定サンプルとして抗体価を評価し、その結果を表１に示した。尚、測定ブランクは非免疫マウス（正常マウス）から同様に得た抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体を１０μｇ／ｍＬに希釈したものを使用した。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
表１から、実施例１〜４の抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体は、比較例１〜４の抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体より明らかに抗体価（活性）が高いことが判る。
【００６０】
＜実施例５＞抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体の作成
１．ハイブリドーマの作成
実施例４で免疫したマウス３頭から脾臓を摘出し、以下の通り常法に従い抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体を作成した。尚、以下の操作は１匹毎に実施した。脾臓から脾臓細胞を採取し、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した後、脾臓細胞全量を２×１０7個のミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５重量％（培地の重量に対する濃度）のポリエチレングリコール４０００［数平均分子量４０００、（株）ナカライテスクより入手］及び７．５重量％（培地の重量に対する濃度）のジメチルスルフォキシドを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬ中で１分間融合させた。１分後にその細胞懸濁液をＲＰＭＩ１６４０培地５ｍＬで徐々に希釈した。その細胞を遠心分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、１０重量％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地）を２０ｍＬになるように加えて、９６ウエルマイクロプレートに０．２ｍＬずつ分注して２週間培養した後、細胞が増殖したウエル中の培養上清の抗体価を測定した。抗体価の測定は抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体の評価に準じて実施した。尚、測定サンプルとしては培養上清を直接用いた。
【００６１】
次に、ブランクの吸光度の５倍以上の吸光度を示したウエルを、抗体価の認められたウエルとし、そのウエルの細胞を限界希釈法によりクローン化した。３匹のマウスのうち、２匹から各１つづつのハイブリドーマ、すなわち抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを２つ得た。残り１匹から抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは得られなかった。
【００６２】
２．抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体の精製
２個のハイブリドーマのうち一つを無血清培地（ＡＳＦ培地１０４，味の素株式会社より入手）１Ｌで１週間培養し、培養上清を限外ろ過膜（ウルトラフィルターＵＫ−５０，東洋濾紙製）で１００分の１容量にそれぞれ濃縮した。これらの濃縮液を０．８５重量％塩化ナトリウム含有０．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０を移動相としてゲル濾過カラム（スーパーデックス２００プレップカラム，ファルマシア製）にかけ、各フラクションにそれぞれ分画した。各フラクションの抗体価を測定し、ブランクの吸光度の３倍以上の吸光度を示したフラクションをプールした。尚、抗体価の測定は抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体の評価に準じて実施し、測定には各フラクションを直接用いた。プールしたフラクションを限外ろ過膜（ウルトラフィルターＵＫ−５０，東洋濾紙製）でタンパク濃度１ｍｇ／ｍＬとなるよう濃縮し、抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体ＨＡＳ１の緩衝溶液を得た。また、２個のハイブリドーマのうち他一つについて、同様にして精製して、抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体ＨＡＳ２の緩衝溶液を得た。
【００６３】
３．抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体ＨＡＳ１及びＨＡＳ２の反応性確認
表２に記載のヒアルロン酸を用いて作成したヒアルロン酸結合ビーズを使用した以外、抗ヒアルロン酸ポリクロナールの評価と同様にして、抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体の抗体価を評価した。これらの結果を表２に示す。ただし、測定は抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体を１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０μｇ／ｍＬに希釈したものを用いた。また、対照として免疫していないマウスの血清より精製した抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体を同様に試験した。なお、表２中の粘度平均分子量１８万のヒアルロン酸ナトリウム塩は、ヒアルロン酸ナトリウム塩（粘度平均分子量１００万、ヒト臍帯由来、生化学工業株式会社製）の１ｍｇ／ｍＬ水溶液を超音波分散機（株式会社テラオカ製、型番ＵＨ−５０）で分子量が１８万となるまで超音波処理することにより調製した。
【００６４】
【表２】
2004208693.tif 000003
【００６５】
抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体ＨＡ１及びＨＡ２はいずれも高分子量のヒアルロン酸と結合することが判った。又、低分子量のヒアルロン酸に対しては、高分子量のヒアルロン酸より相対的に結合は弱いが、明らかに結合するることが判った。
【００６６】
＜実施例６＞試薬キット１
次の様にして、抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ１）、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ１）、緩衝溶液（第１液）、酸化剤溶液（第２液）並びに標準ヒアルロン酸ナトリウム塩溶液０，１０，１００及び１０００から構成される試薬キット１を調整した。
【００６７】
１）抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ１）の調製
実施例５で得た抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体ＨＡＳ１の緩衝溶液をｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液にＨＡＳ１の濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように加えた。この溶液５０ｍＬに直径３．２ｍｍのポリスチレンビーズ（イムノケミカル（株）製）２，０００個を加え、４８時間静置させて、ポリスチレンビーズに抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体ＨＡＳ１を物理吸着させた。その後、緩衝溶液をアスピレーターで吸引除去し、５０ｍＬの０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液でビーズを２回洗浄し、抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ１）を調製した。この抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ１）を再度５０ｍＬの０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液に浸漬し、浸漬状態で冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００６８】
２）ペルオキシダーゼ標識体の調製
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡製）にジャーナルオブモレキュラアンドセルイムノロジー（J.Mol.Cell.Immunol）2,191(1986)に記載の方法で、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート｛N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate｝［商品名：ＳＰＤＰ、同仁化学（株）製］を反応させ、メルカプト基を導入した。メルカプト基導入ペルオキシダーゼと抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＨＡＳ１）をジャーナルオブバイオケミストリー（J.Biochem）,92，1413(1982)に記載の方法で、二架橋性試薬Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）サクシニイミド｛N-(4-Maleimidobutyryloxy)succinimide｝［ＧＭＢＳ、同仁化学製］で結合し、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ１）を調製し、冷凍（−３０℃）保存した。
【００６９】
３）緩衝溶液（第１液）の調製
市販ルミノールナトリウム（和光純薬工業（株）製）０．１８ｇと、４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇとを、０．１Ｍ−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１Ｌに溶解して、緩衝溶液（第１液）を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００７０】
４）酸化剤溶液（第２液）の調製
２００μｌの３５重量％過酸化水素水を脱イオン水１リットルに溶解して、酸化剤溶液（第２液）を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００７１】
５）ヒアルロン酸ナトリウム塩標準溶液の調製
ヒアルロン酸・ナトリウム塩（粘度平均分子量１００万、ヒト臍帯由来、生化学工業株式会社製）を０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液に０，１０，１００，１０００ｎｇ／ｍＬの濃度となるようにそれぞれ溶解し、ヒアルロン酸ナトリウム塩標準溶液０，１０，１００，１０００をそれぞれ調製した。
【００７２】
＜実施例７＞試薬キット２
抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体（ＨＡＳ１）に代えて、抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体（ＨＡＳ２）を用いた以外実施例６と同様にして、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ２）を調整した。そして、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ１）をこのペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ２）に代えた以外は実施例６と同様にして試薬キット２を調整した。
【００７３】
＜実施例８＞試薬キット３
抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＨＡＳ１）の代えて、ヒアルロン酸結合性蛋白（ＨＡＢＰ；生化学工業（株）製、プロテオグリカン及びリンクプロティンを含んでいる）を用いた以外は、実施例６と同様にしてペルオキシダーゼ標識ヒアルロン酸結合性蛋白（ＰＨＡＢＰ）を調製した。そして、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ１）をペルオキシダーゼ標識ヒアルロン酸結合性蛋白（ＰＨＡＢＰ）に代えた以外は実施例６と同様にして試薬キット３を調整した。
【００７４】
＜実施例９＞試薬キット４
抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体（ＨＡＳ１）の代えて、抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＨＡＳ２）を使用する以外は実施例６と同様にして抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ２）を調整した。そして、抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ１）を抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ２）に代えた以外は実施例６と同様にして試薬キット４を調整した。
【００７５】
＜実施例１０＞試薬キット５
抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ１）を実施例９と同様にして得た抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ２）に、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ１）を実施例７と同様にして得たペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ２）に代えた以外は実施例６と同様にして試薬キット５を調整した。
【００７６】
＜実施例１１＞試薬キット６
抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ１）を実施例９と同様にして得た抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ２）に、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ１）を実施例８と同様にして得たペルオキシダーゼ標識ヒアルロン酸蛋白（ＰＨＡＢＰ）に代えた以外は実施例６と同様にして試薬キット６を調整した。
【００７７】
＜実施例１２＞試薬キット７
抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体（ＨＡＳ１）の代わりに、ヒアルロン酸結合性蛋白（ＨＡＢＰ；生化学工業（株）製）を使用する以外は実施例６と同様にしてヒアルロン酸結合性蛋白結合ビーズ（ＨＡＢＰＢ）を調整した。抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ１）をヒアルロン酸結合性蛋白結合ビーズ（ＨＡＢＰＢ）に代えた以外は実施例６と同様にして試薬キット７を調整した。
【００７８】
＜実施例１３＞試薬キット８
抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ１）を実施例１２と同様にして得たヒアルロン酸結合性蛋白結合ビーズ（ＨＡＢＰＢ）に、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ１）を実施例７と同様にして得たペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体（ＰＨＡＳ２）に代えた以外は実施例６と同様にして試薬キット８を調整した。
【００７９】
＜比較例５＞試薬キット９
抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ１）を実施例１２と同様にして得たヒアルロン酸結合性蛋白結合ビーズ（ＨＡＢＰＢ）に、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ１）を実施例８と同様にして得たペルオキシダーゼ標識ヒアルロン酸結合性蛋白（ＰＨＡＢＰ）に代えた以外は実施例６と同様にして比較の試薬キット９を調整した。
【００８０】
＜キットによるヒアルロン酸の定量＞
試験管（内径１．０ｃｍ、長さ８．５ｃｍ）中で、ヒアルロン酸ナトリウム塩標準溶液０の５０μＬと、１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液３００μＬと、試薬キット中のビーズ１個とを３７℃で、１時間静置下で反応させた。反応液をアスピレータで除去した後、生理食塩水を加てビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去した。次に、試薬キット中のペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸抗体（又はペルオキシターゼ標識ヒアルロン酸結合性蛋白）を１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で蛋白濃度として１μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、標識体希釈液を調製した。この標識体希釈液３００μＬを、洗浄後のビーズに加え３７℃、１時間静置下で反応させた。反応液をアスピレーターで除去し、生理食塩水を加えビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去した。洗浄後のビーズについて、酵素活性の測定を次の通り行った。
【００８１】
洗浄後のビーズが入った試験管をアロカ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホルダーにセットし、試薬キット中の緩衝溶液（第１液）２００μＬ及び酸化剤溶液（第２液）２００μＬを加え化学発光反応を開始した。
化学発光反応の開始４０秒後から１０秒間の発光量（１０秒間の積算値、酵素活性）を計測した。ヒアルロン酸ナトリウム塩標準溶液１０、１００及び１０００についても同様にして発光量を測定した。実施例６〜１３及び比較例５の試薬キット１〜９について発光量を測定した結果を表３に示す。
【００８２】
【表３】
2004208693.tif 000004
なお、表３中のカッコ内の数値はＳ／Ｎ比（各発光量を0ng/mLの発光量で除した値）である。
【００８３】
本発明の試薬キット１〜８は、比較の試薬キット９よりＳ／Ｎ比が高く、高感度の測定が可能なことが判った。特に同一の抗体を用いたサンドイッチ測定の試薬キット５はきわめて高感度の測定が可能であった。また、表３の結果からビーズ又は標識体にＨＡＢＰを用いた場合、０ｎｇ／ｍＬの発光量が高いことが判る。これは非特異的反応が大きいことを意味している。従って、例えばＨＡＳＢ２とＨＡＢＰＢを競合法に適用した場合、ＨＡＳＢ２では標識ヒアルロン酸（例えば比較例４で作成したヒアルロン酸アルデヒドとペルオキシダーゼを反応させ、結合したもの）の非特異的吸着が少なく、ＨＡＢＰＢでは多いと考えられる。非特異的吸着の多い試薬キットは競合法でも測定感度が低く、非特異的吸着の少ない試薬キットは競合法でも測定感度が高いと考えられるため、本発明の試薬キットは競合法でも高感度な測定が期待できる。
【００８４】
＜実施例１４＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体９の作成
ヒアルロン酸ナトリウム塩（人臍帯由来、粘度平均分子量１００万、砂状粒子）［生化学工業株式会社］をヒアルロン酸ナトリウム塩（微生物由来、粘度平均分子量２００万、砂状粒子）［協和発酵株式会社製］に変更した以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体９を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にして、免疫用抗原エマルションからヒアルロン酸を析出させ、形状を確認したところ、実施例１と同様の結果であった。
【００８５】
＜実施例１５＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１０の作成
ヒアルロン酸ナトリウム塩（人臍帯由来、粘度平均分子量１００万、砂状粒子）［生化学工業株式会社］４／１０００重量部をヒアルロン酸ナトリウム塩（微生物由来、粘度平均分子量２００万、砂状粒子）［協和発酵株式会社製］６／１０００重量部に変更した以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１０を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にして、免疫用抗原エマルションからヒアルロン酸を析出させ、形状を確認したところ、実施例１と同様の結果であった。
【００８６】
＜実施例１６＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１１の作成
ヒアルロン酸ナトリウム塩（人臍帯由来、粘度平均分子量１００万、砂状粒子）［生化学工業株式会社］４／１０００重量部をヒアルロン酸ナトリウム塩（微生物由来、粘度平均分子量２００万、砂状粒子）［協和発酵株式会社製］１０／１０００重量部に変更した以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１１を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にして、免疫用抗原エマルションからヒアルロン酸を析出させ、形状を確認したところ、実施例１と同様の結果であった。
【００８７】
＜実施例１７＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１２の作成
ヒアルロン酸ナトリウム塩（人臍帯由来、粘度平均分子量１００万、砂状粒子）［生化学工業株式会社］４／１０００重量部をヒアルロン酸ナトリウム塩（微生物由来、粘度平均分子量２００万、砂状粒子）［協和発酵株式会社製］２０／１０００重量部に変更した以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１２を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にして、免疫用抗原エマルションからヒアルロン酸を析出させ、形状を確認したところ、実施例１と同様の結果であった。
【００８８】
＜比較例６＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１３の作成
免疫用抗原エマルション１に代えて、ヒアルロン酸ナトリウム塩（微生物由来、粘度平均分子量２００万、砂状粒子）［協和発酵株式会社製］の１／１００００重量部を０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１重量部に加え、攪拌して溶解した溶液１重量部とコンプリートフロイントアジュバント１重量部を混合・乳化して調整した免疫用抗原エマルション１３を用いた以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１３を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にして、エマルション１３中のヒアルロン酸の形状を確認したところ、綿状沈殿の析出のみが認められ、ヒアルロン酸ナトリウム塩が乳化液に溶解していたことが裏付けられた。
【００８９】
＜比較例７＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１４の作成
免疫用抗原エマルション１に代えて、ヒアルロン酸ナトリウム塩（微生物由来、粘度平均分子量２００万、砂状粒子）［協和発酵株式会社製］の２／１００００重量部を０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１重量部に加え、攪拌して溶解した溶液１重量部とコンプリートフロイントアジュバント１重量部を混合・乳化して調整した免疫用抗原エマルション１４を用いた以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１４を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にして、エマルション１４中のヒアルロン酸の形状を確認したところ、綿状沈殿の析出のみが認められ、ヒアルロン酸ナトリウム塩が乳化液に溶解していたことが裏付けられた。
【００９０】
＜抗体価の評価＞
１）測定用試薬の調製
ヒアルロン酸ナトリウム塩（微生物由来、粘度平均分子量２００万、砂状粒子、協和発酵株式会社製）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に２０μｇ／ｍＬの濃度に溶解し、この溶液５００ｍＬに直径６．３５ｍｍポリスチレンビーズ（商品名：イムノビーズ、イムノケミカル社製）５００個を浸漬し、２〜１０℃で１０時間放置した。その後、溶液をアスピレーターで吸引除去し、ポリスチレンビーズを０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬して、ヒアルロン酸ナトリウム塩結合ビーズ（Ｂ）とした。作成したヒアルロン酸ナトリウム塩結合ビーズ（Ｂ）は使用時まで４〜１０℃で保存した。
【００９１】
２）測定操作
試験管（内径１．２ｃｍ、長さ１０ｃｍ）にヒアルロン酸ナトリウム塩結合ビーズ（Ｂ）１個、１重量％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００μＬ及び測定用サンプル（抗ヒアルロン酸抗体を含む緩衝液）５０μＬを加え、３７℃、４時間静置下で反応させた。反応液をアスピレーターで吸引除去し、０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１ｍＬを加えた後、塩化ナトリウム水溶液をアスピレーターで吸引除去することによりビーズを洗浄した。この洗浄操作をさらに２回行った後、標識抗体液３００μＬを加え、３７℃、１時間静置下で反応させた。上述と同様にビーズの洗浄を３回行った後、発色液５００μＬを加え、３７℃、３０分間静置下で反応させた。１．５Ｎ硫酸１ｍＬを加えて反応を停止させ、測定波長４９２ｎｍで吸光度（光路長１０ｍｍ）を測定した。なお、標準抗体液及び発色液は上記と同じものを用いた。
【００９２】
実施例１４〜１７及び比較例６〜７で得た抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体９〜１４をそれぞれ含む緩衝液を測定サンプルとして抗体価を評価し、その結果を表４に示した。尚、測定ブランクは非免疫マウス（正常マウス）から同様に得た抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体を１０μｇ／ｍＬに希釈したものを使用した。
【００９３】
【表４】
2004208693.tif 000005
【００９４】
表４から、実施例１４〜１７の抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体は、比較例６〜７の抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体より明らかに抗体価（活性）が高いことが判る。
【００９５】
＜粘度平均分子量１８万のヒアルロン酸ナトリウム塩の作製＞
ヒアルロン酸ナトリウム塩（粘度平均分子量１００万、ヒト臍帯由来、生化学工業株式会社製）の１ｍｇ／ｍＬ水溶液を超音波分散機（株式会社テラオカ製、型番ＵＨ−５０）で粘度平均分子量が１８万となるまで超音波処理することにより調製した。次に粘度平均分子量が１８万のヒアルロン酸ナトリウム塩の水溶液を凍結乾燥機にて乾燥することにより、固体のヒアルロン酸ナトリウム塩（砂状粒子）を調製した。
【００９６】
＜実施例１８＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１５の作成
ヒアルロン酸ナトリウム塩（人臍帯由来、粘度平均分子量１００万、砂状粒子）［生化学工業株式会社］を超音波処理したヒアルロン酸ナトリウム塩（粘度平均分子量１８万、砂状粒子）に変更した以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１５を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にして、免疫用抗原エマルションからヒアルロン酸を析出させ、形状を確認したところ、実施例１と同様の結果であった。
【００９７】
＜実施例１９＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１６の作成
ヒアルロン酸ナトリウム塩（人臍帯由来、粘度平均分子量１００万、砂状粒子）［生化学工業株式会社］４／１０００重量部を超音波処理したヒアルロン酸ナトリウム塩（粘度平均分子量１８万）６／１０００重量部に変更した以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１６を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にして、免疫用抗原エマルションからヒアルロン酸を析出させ形状を確認したところ、実施例１と同様の結果であった。
【００９８】
＜実施例２０＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１７の作成
ヒアルロン酸ナトリウム塩（人臍帯由来、粘度平均分子量１００万、砂状粒子）［生化学工業株式会社］４／１０００重量部を超音波処理したヒアルロン酸ナトリウム塩（粘度平均分子量１８万）１０／１０００重量部に変更した以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１７を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にして、免疫用抗原エマルションからヒアルロン酸を析出させ形状を確認したところ、実施例１と同様の結果であった。
【００９９】
＜実施例２１＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１８の作成
ヒアルロン酸ナトリウム塩（人臍帯由来、粘度平均分子量１００万、砂状粒子）［生化学工業株式会社］４／１０００重量部を超音波処理したヒアルロン酸ナトリウム塩（粘度平均分子量１８万）２０／１０００重量部に変更した以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１８を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にして、免疫用抗原エマルションからヒアルロン酸を析出させ形状を確認したところ、実施例１と同様の結果であった。
【０１００】
＜比較例８＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１９の作成
免疫用抗原エマルション１に代えて、超音波処理したヒアルロン酸ナトリウム塩（粘度平均分子量１８万）の１／１００００重量部を０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１重量部に加え、攪拌して溶解した溶液１重量部とコンプリートフロイントアジュバント１重量部を混合・乳化して調整した免疫用抗原エマルション１９を用いた以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１９を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にしてエマルション１９中のヒアルロン酸の形状を確認したところ、綿状沈殿の析出のみが認められ、ヒアルロン酸ナトリウム塩が乳化液に溶解していたことが裏付けられた。
【０１０１】
＜比較例９＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体２０の作成
免疫用抗原エマルション１に代えて、超音波処理したヒアルロン酸ナトリウム塩（粘度平均分子量１８万）の２／１００００重量部を０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１重量部に加え、攪拌して溶解した溶液１重量部とコンプリートフロイントアジュバント１重量部を混合・乳化して調整した免疫用抗原エマルション２０を用いた以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体６を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にしてエマルション２０中のヒアルロン酸の形状を確認したところ、綿状沈殿の析出のみが認められ、ヒアルロン酸ナトリウム塩が乳化液に溶解していたことが裏付けられた。
【０１０２】
＜抗体価の評価＞
１）測定用試薬の調製
超音波処理したヒアルロン酸ナトリウム塩（粘度平均分子量１８万）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に２０μｇ／ｍＬの濃度に溶解し、この溶液５００ｍＬに直径６．３５ｍｍポリスチレンビーズ（商品名：イムノビーズ、イムノケミカル社製）５００個を浸漬し、２〜１０℃で１０時間放置した。その後、溶液をアスピレーターで吸引除去し、ポリスチレンビーズを０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬して、ヒアルロン酸ナトリウム塩結合ビーズ（Ｃ）とした。作成したヒアルロン酸ナトリウム塩結合ビーズ（Ｃ）は使用時まで４〜１０℃で保存した。
【０１０３】
２）測定操作
試験管（内径１．２ｃｍ、長さ１０ｃｍ）にヒアルロン酸ナトリウム塩結合ビーズ（Ｃ）１個、１重量％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００μＬ及び測定用サンプル（抗ヒアルロン酸抗体を含む緩衝液）５０μＬを加え、３７℃、４時間静置下で反応させた。反応液をアスピレーターで吸引除去し、０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１ｍＬを加えた後、塩化ナトリウム水溶液をアスピレーターで吸引除去することによりビーズを洗浄した。この洗浄操作をさらに２回行った後、標識抗体液３００μＬを加え、３７℃、１時間静置下で反応させた。上述と同様にビーズの洗浄を３回行った後、発色液５００μＬを加え、３７℃、３０分間静置下で反応させた。１．５Ｎ硫酸１ｍＬを加えて反応を停止させ、測定波長４９２ｎｍで吸光度（光路長１０ｍｍ）を測定した。
【０１０４】
実施例１８〜２１及び比較例８〜９で得た抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１５〜２０をそれぞれ含む緩衝液を測定サンプルとして抗体価を評価し、その結果を表５に示した。尚、測定ブランクは非免疫マウス（正常マウス）から同様に得た抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体を１０μｇ／ｍＬに希釈したものを使用した。
【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
表５から、実施例１８〜２１の抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体は、比較例８〜９の抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体より明らかに抗体価（活性）が高いことが判る。
【０１０７】
＜実施例２２＞抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体の作成
１．ハイブリドーマの作成
実施例１７で免疫したマウス１頭及び実施例２１で免疫したマウス１頭からそれぞれ脾臓を摘出し、以下の通り常法に従い抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体を作成した。尚、以下の操作は１匹毎に実施した。脾臓から脾臓細胞を採取し、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した後、脾臓細胞全量を２×１０7個のミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５重量％（培地の重量に対する濃度）のポリエチレングリコール４０００［数平均分子量４０００、（株）ナカライテスクより入手］及び７．５重量％（培地の重量に対する濃度）のジメチルスルフォキシドを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬ中で１分間融合させた。１分後にその細胞懸濁液をＲＰＭＩ１６４０培地５ｍＬで徐々に希釈した。その細胞を遠心分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、１０重量％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地）を２０ｍＬになるように加えて、９６ウエルマイクロプレートに０．２ｍＬずつ分注して２週間培養した後、細胞が増殖したウエル中の培養上清の抗体価を測定した。抗体価の測定は抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体の評価に準じて実施した。尚、測定サンプルとしては培養上清を直接用いた。
【０１０８】
次に、ブランクの吸光度の５倍以上の吸光度を示したウエルを、抗体価の認められたウエルとし、そのウエルの細胞を限界希釈法によりクローン化した。実施例１７及び実施例２１で免疫した各マウス１頭から各１つずつのハイブリドーマ（１７及び２１）、すなわち抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（１７及び２１）を２個得た。
【０１０９】
２．抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体の精製
実施例１７で免疫して得られたハイブリドーマ（１７）を無血清培地ＡＳＦ培地１０４，味の素株式会社より入手）１Ｌで１週間培養し、培養上清を限外ろ過膜（ウルトラフィルターＵＫ−５０，東洋濾紙製）で１００分の１容量にそれぞれ濃縮した。これらの濃縮液を０．８５重量％塩化ナトリウム含有０．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０を移動相としてゲル濾過カラム（スーパーデックス２００プレップカラム，ファルマシア製）にかけ、各フラクションにそれぞれ分画した。各フラクションの抗体価を測定し、ブランクの吸光度の３倍以上の吸光度を示したフラクションをプールした。尚、抗体価の測定は抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体の評価に準じて実施し、測定には各フラクションを直接用いた。プールしたフラクションを限外ろ過膜（ウルトラフィルターＵＫ−５０，東洋濾紙製）でタンパク濃度１ｍｇ／ｍＬとなるよう濃縮し、抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体ＨＡＳ３の緩衝溶液を得た。
また、実施例２１で免疫して得られたハイブリドーマ（２１）についても、同様にして精製し、抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体ＨＡＳ４の緩衝液を得た。
【０１１０】
３．抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体ＨＡＳ３、ＨＡＳ４の反応性確認
表５に記載のヒアルロン酸を用いて作成したヒアルロン酸結合ビーズを使用した以外、抗ヒアルロン酸ポリクロナールの評価と同様にして、抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体の抗体価を評価した。これらの結果を表６に示す。ただし、測定は抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体を１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０μｇ／ｍＬに希釈したものを用いた。また、対照として免疫していないマウスの血清より精製した抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体を同様に試験した。
【０１１１】
【表６】
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【０１１２】
抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体ＨＡＳ３及びＨＡＳ４はいずれも高分子量のヒアルロン酸と結合することが判った。又、低分子量のヒアルロン酸に対しては、高分子量のヒアルロン酸より相対的に結合は弱いが、明らかに結合するることが判った。
【０１１３】
＜実施例２３＞試薬キット１０
次の様にして、抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体結合ビーズ（ＨＡＳＢ３）、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ３）、緩衝溶液（第１液）、酸化剤溶液（第２液）並びに標準ヒアルロン酸ナトリウム塩溶液０，１０，１００及び１０００から構成される試薬キットを調整した。
すなわち、抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体（ＨＡＳ１）に代えて、抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体（ＨＡＳ３）を用いた以外実施例６と同様にして、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ３）を調整した。そして、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ１）をこのペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ３）に代えた以外は実施例６と同様にして試薬キット１０を調整した。
【０１１４】
＜実施例２４＞試薬キット１１
抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体（ＨＡＳ１）に代えて、抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体（ＨＡＳ４）を用いた以外実施例６と同様にして、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ４）を調整した。そして、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ１）をこのペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ４）に代えた以外は実施例６と同様にして試薬キット１１を調整した。
【０１１５】
＜キットによるヒアルロン酸の定量＞
実施例６〜１３及び比較例５の試薬キット１〜９についての発光量の測定と同様にして、実施例２３及び２４の試薬キット１０及び１１について発光量を測定し、その結果を表７に示す。
【０１１６】
【表７】
2004208693.tif 000008
なお、表７中のカッコ内の数値はＳ／Ｎ比（各発光量を0ng/mLの発光量で除した値）である。
本発明の試薬キット１０、１１は、比較の試薬キット９よりＳ／Ｎ比が高く、高感度の測定が可能なことが判った。
【０１１７】
＜実施例２５＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体２１の作成
ヒアルロン酸ナトリウム塩（ヒト臍帯由来、粘度平均分子量１００万、砂状粒子）［生化学工業株式会社製］４／１０００重量部を２／１０００重量部に変更した以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体２１を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にして、免疫用抗原エマルションからヒアルロン酸を析出させ形状を確認したところ、実施例１と同様の結果であった。
【０１１８】
＜実施例２６＞抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体２２の作成
ヒアルロン酸ナトリウム塩（ヒト臍帯由来、粘度平均分子量１００万）［生化学工業株式会社製］４／１００重量部を１００／１０００重量部に変更した以外、実施例１と同様にして抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体２２を含む緩衝液を得た。なお、実施例１と同様にして、免疫用抗原エマルションからヒアルロン酸を析出させ形状を確認したところ、実施例１と同様の結果であった。
【０１１９】
＜抗体価の評価＞
実施例１〜４及び比較例１〜４で得た抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体１〜８をそれぞれ含む緩衝液についての抗体価の評価と同様にして、実施例２５又は２６で得た抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体２１又は２２をそれぞれ含む緩衝液を測定サンプルとして抗体価を評価し、その結果を表８に示した。尚、測定ブランクは非免疫マウス（正常マウス）から同様に得た抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体を１０μｇ／ｍＬに希釈したものを使用した。
【０１２０】
【表８】
2004208693.tif 000009
【０１２１】
表８から、実施例２５及び２６の抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体２１及び２２は、比較例１及び２の抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体５及び６より明らかに抗体価（活性）が高いことが判る。
【０１２２】
＜実施例２７＞抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体の作成
１．ハイブリドーマの作成
実施例２５で免疫したマウス１頭及び実施例２６で免疫したマウス１頭からそれぞれ脾臓を摘出し、以下の通り常法に従い抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体を作成した。尚、以下の操作はマウス１匹毎に実施した。脾臓から脾臓細胞を採取し、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した後、脾臓細胞全量を２×１０7個のミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５重量％（培地の重量に対する濃度）のポリエチレングリコール４０００［数平均分子量４０００、（株）ナカライテスクより入手］及び７．５重量％（培地の重量に対する濃度）のジメチルスルフォキシドを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬ中で１分間融合させた。１分後にその細胞懸濁液をＲＰＭＩ１６４０培地５ｍＬで徐々に希釈した。その細胞を遠心分離し、洗浄した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、１０重量％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地）を２０ｍＬになるように加えて、９６ウエルマイクロプレートに０．２ｍＬずつ分注して２週間培養した後、細胞が増殖したウエル中の培養上清の抗体価を測定した。抗体価の測定は抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体の評価に準じて実施した。尚、測定サンプルとしては培養上清を直接用いた。
【０１２３】
次に、ブランクの吸光度の５倍以上の吸光度を示したウエルを、抗体価の認められたウエルとし、そのウエルの細胞を限界希釈法によりクローン化した。実施例２５及び実施例２６で免疫した各マウス１頭から各１つずつのハイブリドーマ（２５及び２６）、すなわち抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（２５及び２６）を２個得た。
【０１２４】
２．抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体の精製
実施例２５で免疫して得られたハイブリドーマ（２５）を無血清培地ＡＳＦ培地１０４，味の素株式会社より入手）１Ｌで１週間培養し、培養上清を限外ろ過膜（ウルトラフィルターＵＫ−５０，東洋濾紙製）で１００分の１容量にそれぞれ濃縮した。これらの濃縮液を０．８５重量％塩化ナトリウム含有０．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０を移動相としてゲル濾過カラム（スーパーデックス２００プレップカラム，ファルマシア製）にかけ、各フラクションにそれぞれ分画した。各フラクションの抗体価を測定し、ブランクの吸光度の３倍以上の吸光度を示したフラクションをプールした。尚、抗体価の測定は抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体の評価に準じて実施し、測定には各フラクションを直接用いた。プールしたフラクションを限外ろ過膜（ウルトラフィルターＵＫ−５０，東洋濾紙製）でタンパク濃度１ｍｇ／ｍＬとなるよう濃縮し、抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体ＨＡＳ５の緩衝溶液を得た。
また、実施例２６で免疫して得られたハイブリドーマ（２６）についても、同様にして精製し、抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体ＨＡＳ６の緩衝液を得た。
【０１２５】
３．抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体ＨＡＳ５、ＨＡＳ６の反応性確認
表５に記載のヒアルロン酸を用いて作成したヒアルロン酸結合ビーズを使用した以外、抗ヒアルロン酸ポリクロナールの評価と同様にして、抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体の抗体価を評価した。これらの結果を表９に示す。ただし、測定は抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体を１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０μｇ／ｍＬに希釈したものを用いた。また、対照として免疫していないマウスの血清より精製した抗ヒアルロン酸ポリクロナール抗体を同様に試験した。
【０１２６】
【表９】
2004208693.tif 000010
【０１２７】
抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体ＨＡＳ５及びＨＡＳ６はいずれも高分子量のヒアルロン酸と結合することが判った。又、低分子量のヒアルロン酸に対しては、高分子量のヒアルロン酸より相対的に結合は弱いが、明らかに結合するることが判った。
【０１２８】
＜実施例２９＞試薬キット１２
抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体（ＨＡＳ１）に代えて、抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体（ＨＡＳ５）を用いた以外実施例６と同様にして、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ５）を調整した。そして、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ１）をこのペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ５）に代えた以外は実施例６と同様にして試薬キット１２を調整した。
【０１２９】
＜実施例３０＞試薬キット１３
抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体（ＨＡＳ１）に代えて、抗ヒアルロン酸モノクロナール抗体（ＨＡＳ６）を用いた以外実施例６と同様にして、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ６）を調整した。そして、ペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ１）をこのペルオキシダーゼ標識抗ヒアルロン酸モノクローナル抗体（ＰＨＡＳ６）に代えた以外は実施例６と同様にして試薬キット１３を調整した。
【０１３０】
＜キットによるヒアルロン酸の定量＞
実施例６〜１３及び比較例５の試薬キット１〜９についての発光量の測定と同様にして、実施例２９及び３０の試薬キット１２及び１３について発光量を測定し、その結果を表１０に示す。
【０１３１】
【表１０】
2004208693.tif 000011
【０１３２】
なお、表１０中のカッコ内の数値はＳ／Ｎ比（各発光量を0ng/mLの発光量で除した値）である。
本発明の試薬キット１２及び１３は、比較の試薬キット９よりＳ／Ｎ比が高く、高感度の測定が可能なことが判った。