(57)【要約】【課題】迅速でしかも特別な技術を必要としない簡易な手法により、種々のプロテアーゼにおける動態を網羅的にプロファイリングできる方法を確立する。【解決手段】少なくとも１種のプロテアーゼ、特にカスパーゼの基質となる蛋白質もしくはペプチドが基板の金属薄膜上に固定化されてなるアレイを用いて、固定化された基質が加水分解される様子を、特に表面プラズモン共鳴を利用して検出することを特徴とする方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のプロテアーゼの基質となる蛋白質もしくはペプチドが基板の金属薄膜上に固定化されてなるアレイ。
【請求項２】
各々が別々のプロテアーゼの基質である、少なくとも２種の蛋白質もしくはペプチドが金属薄膜上に固定化されてなる請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
プロテアーゼがカスパーゼである請求項１または２に記載のアレイ。
【請求項４】
前記蛋白質もしくはペプチドのＮ末端及びＣ末端の一方或いは両方にシステイン残基を有している請求項１〜３のいずれかに記載のアレイ。
【請求項５】
前記蛋白質もしくはペプチドがビオチンにより修飾されてなる請求項１〜４のいずれかに記載のアレイ。
【請求項６】
表面プラズモン共鳴を利用してプロテアーゼ活性の解析を行うための請求項１〜５のいずれかに記載のアレイ。
【請求項７】
加水分解された前記アレイ上に固定化ペプチドを表面プラズモン共鳴を利用して検出することを特徴とするプロテアーゼ活性の解析方法。
【請求項８】
加水分解された前記アレイ上に固定化ペプチドを表面プラズモン共鳴イメージング法により検出することを特徴とする請求項７記載のプロテアーゼ活性の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、金属基板上にプロテアーゼの基質となる蛋白質もしくはペプチドが１もしくは複数種固定化されてなるアレイを用いたプロテアーゼ活性の網羅的な解析方法に関する。特に表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲと示すこともある。）による分析技術を用いることにより、迅速で効率的であり、しかも簡便なプロテアーゼ活性の解析を実現することができるものである。より具体的には、ＳＰＲにより解析された物質間の相互作用の様子をモニターした表面プラズモン共鳴イメージング法（以下、ＳＰＲイメージング法と示すこともある。）を応用した新規なプロテアーゼ活性の解析方法である。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアーゼは蛋白質やペプチドにおけるペプチド結合を加水分解する酵素の総称であり、微生物、動物、植物の細胞内外に広く存在している。プロテアーゼは実に多くの種類のものが報告されており、生体内においては様々な生理的意義を有している。なかでも、カスパーゼはアポトーシスのシグナル伝達の基幹となる酵素であり、重要なプロテアーゼの一つである。
【０００３】
アポトーシスＫｅｒｒらによりは提唱された概念であり、個体の生命を維持するために遺伝子により制御された細胞死を意味するものである。これは、個体発生における形態形成や神経系ネットワークの確立だけでなく、成熟個体における細胞交替や内分泌系による恒常性の維持及び免疫系の成立などに重要な役割を果たしている。また、癌、自己免疫疾患、エイズなどのウイルス感染症、アルツハイマー病などの神経変性疾患などの発症に密接に関わっている。アポトーシスの実行過程においては、カスパーゼによる特定蛋白質（ＰＡＲＰ、ＩＣＡＤ、Ａｃｉｎｕｓ等）の限定分解が中心的な役割を果たしている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  第３２６巻、第１〜１６頁（１９９７年））。カスパーゼには、既に多種類のものが報告されており、それらの活性化に関するメカニズムも解明されつつある。これらカスパーゼの活性を網羅的に解析する技術を確立することは、薬剤の開発や診断等の分野において重要な意味を有する。
【０００４】
プロテアーゼ活性の測定は、基質である蛋白質やペプチドの分解を紫外線吸収による定量や、蛍光物質、放射性物質等により標識された基質を用いて遊離される標識物質の量を定量するなどの方法により通常は行われている。しかしながら、こうした手法はプロテオミクス研究などの分野において近年強く求められてきているハイスループット化には到底対応できるものではない。ハイスループット化に対応の可能性あるプロテアーゼアッセイ系としては、表面プラズモン共鳴を用いた手法として、インタクトな基質の質量対切断された基質の質量を検出する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、この方法も別な反応容器内で予め酵素反応させてからＳＰＲ測定に供する方法であり、必ずしもハイスループット化に十分に対応しうるような方法とはいえるものではない。
【０００５】
【特許文献１】
特許第２９６８０４８号
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、迅速でしかも特別な技術を必要としない簡易な手法により、種々のプロテアーゼに関する動態を網羅的にプロファイリングできる方法を確立しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、金属をコーティングした基板上にプロテアーゼを認識する蛋白質もしくはペプチドが固定化されてなるアレイを用いること、さらに該アレイ上における物質間の相互作用をＳＰＲにより検出することが、様々なプロテアーゼに関する動態の迅速な解析を行う上で極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．少なくとも１種のプロテアーゼの基質となる蛋白質もしくはペプチドが基板の金属薄膜上に固定化されてなるアレイ。
項２．各々が別々のプロテアーゼの基質である、少なくとも２種の蛋白質もしくはペプチドが金属薄膜上に固定化されてなる項１に記載のアレイ。
項３．プロテアーゼがカスパーゼである項１または２に記載のアレイ。
項４．前記ペプチドのＮ末端及びＣ末端の一方或いは両方にシステイン残基を有している項１〜３のいずれかに記載のアレイ。
項５．前記ペプチドがビオチンにより修飾されてなる請求項１〜４のいずれかに記載のアレイ。
項６．表面プラズモン共鳴を利用してプロテアーゼ活性の解析を行うための項１〜５のいずれかに記載のアレイ。
項７．加水分解された前記アレイ上に固定化ペプチドを表面プラズモン共鳴を利用して検出することを特徴とするプロテアーゼ活性の解析方法。
項８．加水分解された前記アレイ上に固定化ペプチドを表面プラズモン共鳴イメージング法により検出することを特徴とする項７記載のプロテアーゼ活性の解析方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明における基板上において分解された蛋白質もしくはペプチドの検出方法としては、従来からよく知られているような放射性物質、蛍光性物質、化学発光性物質などの標識化合物を利用して行うことも可能である。しかしながら、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、楕円偏光法（以下、エリプソメトリと示す。）、和周波発生（以下、ＳＦＧと示す。）分光測定などの光学的検出方法を適用するのがより好ましい。なかでもＳＰＲは位相差を求める必要がなく、反射光強度を求めるだけで、表面のｎｍオーダーの膜厚変化を求めることができるため特に好ましい。さらにＳＰＲイメージング法は広い範囲の観察が可能であり、アレイフォーマットでの物質相互作用観察が可能であるためさらに好ましい。
【００１０】
蛋白質もしくはペプチドの加水分解は、プロテアーゼを有し得る供試試料を本発明のアレイ上に適用して行うことができる。例えば、適当なバッファー中にプロテアーゼを有し得る供試試料を加え、１０〜４０℃程度の温度で、好ましくは３０〜３７℃の温度で、１０分〜６時間程度、好ましくは３０〜２時間程度反応させることで、ペプチドを加水分解することができる。必要に応じて、加水分解反応溶液中には、塩、糖などの物質を共存させてもよい。動態のプロファイリングの対象となるプロテアーゼとしては、例えばトリプシン、エラスターゼ、ペプシン、キモトリプシン、プラスミン、レニン、ウロキナーゼ、カテプシン、カスパーゼなど種々のものが例示されるが、特に限定されるものではない。
【００１１】
本発明において、蛋白質もしくはペプチドは様々なプロテアーゼの動態を網羅的にプロファイリングすることが目的であるので、１種類の蛋白質もしくはペプチドは１種類のプロテアーゼによってのみ加水分解され、他のプロテアーゼによっては加水分解されないことが好ましい。例えば、カスパーゼ３の基質としては配列番号２のペプチドが例示される。カスパーゼ３を含むプロテアーゼの基質となるペプチド配列は公知であるか、公知の配列に基づき適宜選択することが可能である。本発明のアレイがその動態の把握を必要とする複数のプロテアーゼの種類に対応した種類のペプチドを固定化していれば、１枚のアレイで多種類の及ぶプロテアーゼのプロファイリングをすることができ好ましい。もちろん１つのアレイに１種のみのプロテアーゼに対応するペプチドを固定化し、必要な数のアレイを使用してプロテアーゼのプロファイリングを行ってもよい。
【００１２】
エリプソメトリは試料に光を照射し、薄膜の表面で反射した光と、薄膜の裏面で反射してきた光の干渉によって生じる偏向状態の変化から、膜厚、屈折率を測定できる。すなわち、ｐ偏光とｓ偏光の光に対する反射率の絶対値の比及び位相変化の比を評価する手段である。なかでも波長を変えながらエリプソメトリを測定する分光エリプソメトリは非常に敏感に表面の膜厚変化が検出できるため好ましい。
【００１３】
ＳＦＧは２次の非線形光学効果の一種であり、周波数の異なる２種類の入射光（周波数ω１  と周波数ω２）が媒質中で混合され、ω１＋ω２、あるいはω１−ω２の光が発生する現象である。特にω１として可視光を用い、ω２として波長可変の赤外光を用いると赤外分光に類似した振動分光を行うことができる。この手法は表面選択性が良いため単分子膜レベルの分子の振動分光が可能であり、非常に敏感な表面解析方法として有用である。
【００１４】
上述したように、特に好ましい１つの実施形態において、本発明はＳＰＲを用いて種々のプロテアーゼ活性を網羅的に解析することが特に好ましい。ＳＰＲは金属に照射する偏光光束によってエバネッセント波が生じて表面ににじみだし、表面波である表面プラズモンを励起し、光のエネルギーを消費して反射光強度を低下させる。反射光強度が著しく低下する共鳴角は金属の表面に形成される層の厚みによって変化する。よって、金属の表面に調べられるべき物質あるいは物質の集合体を固定化し、サンプル中の物質あるいは物質の集合体との相互作用を共鳴角の変化、あるいはある角度での反射光強度の変化で検出可能である。したがって、ＳＰＲはラベルが不要であり、しかもリアルタイム評価が可能な定量法として有用である。
【００１５】
このＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を、画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。図１にその一例を示した。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。
【００１６】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００１７】
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。
【００１８】
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面面積は１０〜１０００ｍｍ２に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。
【００１９】
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラで撮影される。光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。
【００２０】
光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００２１】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。なかでもガラスが特に好ましい。
【００２２】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく、１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎＤは１．５以上であることが好ましい。
【００２３】
金属薄膜を構成する金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、これらを単独であるいは組み合わせて用いてもよいが、なかでも金を用いるのが特に好ましい。金属薄膜の形成方法は特に限定されるものではないが、公知の手法として例えば蒸着法、スパッタ法、イオンコーティング法などが挙げられる。なかでも蒸着による方法が好ましい。また、金属薄膜の厚みは１０〜３０００Å程度が好ましく、１００〜６００Å程度がより好ましい。
【００２４】
本発明の１つの特に好ましい具体例は、金属を蒸着した基板上にプロテアーゼの基質となる蛋白質もしくはペプチドが少なくとも１種、好ましくは複数種の蛋白質もしくはペプチドが固定化されてなるアレイを用い、且つ該アレイに細胞破砕液等のプロテアーゼを含有する溶液を作用させてそれらの相互作用の様子を特にＳＰＲないしはＳＰＲイメージング法により検出することを特徴とする。本発明においてプロテアーゼの基質となる蛋白質もしくはペプチドとは、該プロテアーゼにより加水分解反応を受ける性質を有する蛋白質もしくはペプチドをいうものである。
【００２５】
上記蛋白質もしくはペプチドの分子量は特に限定されないが、一般的には１００アミノ酸残基以下のペプチドが用いられる。好ましくは５〜６０アミノ酸残基、より好ましくは１０〜２５アミノ酸残基程度からなるものが用いられる。ペプチドは公知の手法に基づく化学的な合成により得られたペプチドであってもよいし、あるいは遺伝子工学的な手法により生産された蛋白質もしくはペプチドを用いてもよい。また基質の基板への脱着を容易にするために、上記ペプチドの片末端において、ビオチンや、チオール基を有するシステイン残基を付加させたものや、あるいはオリゴヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のような一般的によく用いられるタグを付加させた蛋白質やペプチドを用いるのも有用である。
【００２６】
上記蛋白質もしくはペプチドの金属薄膜への固定化の方法は、特に限定されるものではないが、金属薄膜表面に固定化しやすいような官能基を予め導入しておいて基質ペプチドを固定化処理するのがより好ましい。該官能基としては、アミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、アルデヒド基などが挙げられる。これらの官能基を金属薄膜表面に導入するには、一般的に用いられているアルカンチオールの誘導体を用いるのが好ましい。その際に、Ｊ．Ｍ．ＢｒｏｃｋｍａｎらによりＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  第１２１巻、第８０４４〜８０５１頁（１９９９年）において報告されているような方法に基づいて、アルカンチオール層を介して固定化し、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）によりバックグラウンドを修飾する方法を用いてもよい。また、非特異的な影響をより抑えるために、ＰＥＧの末端に上述のような官能基が導入された誘導体をアルカンチオールに結合させた後に、基質を固定化することも、スペーサー効果を奏する点で有用である。
【００２７】
具体的には、例えば金属薄膜にカルボキシメチルデキストランあるいはカルボキシル基で末端が修飾されたＰＥＧのような水溶性高分子を結合させて表面にカルボキシル基を導入して、ＥＤＣ（１−エチル−３，４−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）のような水溶性カルボジイミドを用いてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）のエステルとして、活性化されたカルボキシル基にペプチドもしくは蛋白質のアミノ基を反応させる方法が挙げられる。あるいは表面をマレイミドにより修飾した後、システインのようなチオール基を含むアミノ酸残基を介して固定化してもよい。この場合のシステイン残基はペプチドの一方の末端に付加されてなるのが好ましい。非特異的な影響を低減させるには、後者のチオール基を介した固定化方法がより好ましいが、特に限定されるものではない。また、基質末端をビオチンにより修飾させた蛋白質もしくはペプチドを用いることも可能である。この場合、基質にアビジンもしくはストレプトアビジンを作用させて、チップ上の基質の分子量を増大させることにより、加水分解される様子をより明瞭にモニターすることができる。
【００２８】
上述したＨｉｓ−ｔａｇやＧＳＴのようなタグを付加した蛋白質もしくはペプチドを固定化する方法も非常に簡便で有用である。この場合には、上述のように金属表面にアルカンチオールを介してアミノ基やカルボキシル基を導入した後に、それぞれＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、グルタチオンを金属薄膜上に導入させておくのがよい。Ｈｉｓ−ｔａｇの場合は、ＮＴＡを導入したアレイを塩化ニッケルにより処理した後で基質を固定化する。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例を挙げることにより、本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００３０】
実施例１：ＳＰＲアレイの作製（１）
まず、金を蒸着させたガラス板（大阪真空工業株式会社製ＬＡＫ−１０；サイズ：１８ｍｍ×１８ｍｍ×１ｍｍ、コート内容：１層目  クロム２０Å、２層目金４５０Å；屈折率１．７２）を、１ｍＭ  ＭＯＡＭ（８−ａｍｉｎｏ−１−ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；同仁化学製）のエタノール溶液２０ｍｌ中に１．５時間浸漬して、金表面上にアミノ基を導入した。このガラス板をエタノール、水の順で洗浄し、乾燥後、４ｍＭ  ｍＰＥＧ−ＳＰＡ（分子量２０００；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ製）溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む）に溶解した。）５００μｌを載せて室温で１．５時間静置させた。このガラス板をエタノール、水の順で洗浄し、乾燥後、上記ガラス板の上にフォトマスクを載せて固定し、紫外線照射（ウシオ電機製Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｏｄｕｌｅｘ    ＳＸ−ＵＩ５００Ｈを使用；５００ワット）を２時間行った。フォトマスクは一辺５００μｍの正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されているものを用いた。紫外線照射終了後エタノールによりガラス板を洗浄して、さらに１ｍＭ  ＭＨＡ（７−ｃａｒｂｏｘｙ−１−ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ；同仁化学製）のエタノール溶液２０ｍｌ中に１．５時間浸漬して、アレイ表面にカルボキシル基を導入した。
【００３１】
上記の処理を施されたガラス板上に、０．２Ｍ  ＥＤＣ／０．０５Ｍ  ＮＨＳ溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む）に溶解した。）２００μｌを載せて室温で２時間静置させて、表面を活性化させた後、エタノール、水の順で洗浄して乾燥を行い、上記ガラス板上に形成されたフォトパターン上に１０ｎｌずつ基質溶液をスポットした。スポットに用いた基質は、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む）に溶解した。スポッティングに際してはニチリョー製ＤＮＡ−ＧＲを用いた。基質としては、抗ＫＯＤ抗体（１ｍｇ／ｍｌ）、ヤギＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；１００μｇ／ｍｌ）、配列表・配列番号１（ＰＫＡの基質となる。）及び配列番号２（カスパーゼ３の基質となる。）に示されるアミノ酸配列からなる合成ペプチド（いずれも１００μｇ／ｍｌ）を用いた。おのおのの基質の固定化パターンは図２に示した通りで行った。このように基質溶液がスポットされたガラス板をウェットな環境下において室温で１６時間静置して反応させた。こうしてプロテアーゼ基質が固定化されたアレイを調製した。
【００３２】
実施例２：ＳＰＲ解析（１）
実施例１において調製したペプチドアレイを水、エタノールで洗浄して乾燥後、ＳＰＲ装置（ＧＷＣ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．製ＳＰＲｉｍａｇｅｒ）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーとしては、ＰＢＳ（−）を用いた。ランニングバッファーの送液は、プランンジャーポンプ（フロム製Ｍｏｄｅｌ−０２１）を用いた。温度は３０℃に設定して行った。基質の加水分解反応においては、市販のトリプシン（ナカライテスク製）を用いた。上記ランニングバッファーにより２．５μｇ／ｍｌに調製した溶液を循環させながら反応を行った。この際におけるＳＰＲシグナルの経時変化の様子を図３に示した。抗ＫＯＤ抗体及びヤギＩｇＧに関しては、トリプシンの作用による分解反応が進行することによりチップ上における質量が徐々に減少するため、ＳＰＲシグナルも経時的に減少していく様子が確認されている。
【００３３】
図４に、上記結果に関してＳＰＲイメージングを行った結果を示した。実施例２におけるＳＰＲ解析に際して、ＣＣＤカメラによる画像の取り込みを５秒ごとに行い、トリプシン反応後４０００秒における時点で取り込まれた画像から、反応開始時点での画像を、画像演算処理ソフトウエアＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．製）を用いて引き算処理を行った結果である。抗ＫＯＤ抗体及びヤギＩｇＧのスポットにおいて抗体が分解された様子が確認される。
【００３４】
実施例３：ＳＰＲアレイの作製（２）
まず、金を蒸着させたガラス板（大阪真空工業株式会社製ＬＡＫ−１０；サイズ：１８ｍｍ×１８ｍｍ×１ｍｍ、コート内容：１層目  クロム２０Å、２層目金４５０Å；屈折率１．７２）を、１ｍＭ濃度のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＳＨ−５０Ｈ（日本油脂製）のエタノール溶液２０ｍｌ中に２時間浸漬させた。このガラス板をエタノール、水の順で洗浄し、乾燥後、上記ガラス板の上にフォトマスクを載せて固定し、実施例１の場合と同様に紫外線照射を２時間行った。フォトマスクは一辺５００μｍの正方形の穴が１６個有し（４個×４個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。紫外線照射終了後エタノールによりガラス板を洗浄して、さらに１ｍＭ  ＭＯＡＭのエタノール溶液２０ｍｌ中に１．５時間浸漬して、アレイ表面にアミノ基を導入した。
【００３５】
上記の処理を施されたガラス板上に、１０ｍｇ／ｍｌ濃度のＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（分子量３４００；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ製）溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む）に溶解した。）２００μｌを載せて室温で２時間静置させることによりマレイミド表面を形成させた。このガラス板をエタノール、水の順で洗浄して乾燥を行い、上記ガラス板上に形成されたフォトパターン上に０．１μｌずつ基質溶液をマニュアルでスポットした。スポットに用いた基質は、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む）に溶解した。基質としては、配列表・配列番号１（ＰＫＡの基質となる。）及び配列番号２（カスパーゼ３の基質となる。）に示されるアミノ酸配列からなる合成ペプチド（いずれも１００μｇ／ｍｌ）であり、いずれもこの配列の末端にビオチンで修飾されたものを用いた。図５に示すようなパターンで各々の基質をスポットした。基質溶液がスポットされたガラス板をウェットな環境下において室温で１６時間静置して反応させた。こうしてプロテアーゼ基質が固定化されたアレイを調製した。
【００３６】
実施例４：ＳＰＲ解析（２）
実施例３において調製したペプチドアレイを水、エタノールで洗浄して乾燥後、ＳＰＲ装置（ＧＷＣ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．製ＳＰＲｉｍａｇｅｒ）にセッティングして解析を行った。ランニングバッファーとしては、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４；１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）を用いた。ランニングバッファーの送液は、実施例２の場合と同様のプランンジャーポンプを用いた。温度は３７℃に設定して行った。まず、ストレプトアビジン溶液（０．１μｇ／ｍｌ；上記ランニングバッファーにより調製）を送液することにより、基質に結合しているビオチンに作用させた。その後、カスパーゼ３として市販のＡｃｔｉｖｅ  Ｃａｓｐａｓｅ３／ＣＰＰ３２（ＭＢＬ製）を用いて、上記ランニングバッファーにより１００倍に希釈したＣＰＰ３２溶液（約２０Ｕ／ｍｌ）を循環させながら加水分解反応を行った。この際におけるＳＰＲシグナルの経時変化の様子を図６に示した。カスパーゼ３基質においてのみ、ＣＰＰ３２の作用によるＳＰＲシグナルの低下が確認されている。
【００３７】
【発明の効果】
上述したように、本発明の方法により、特殊な技術を要することもなく、また特にＳＰＲを用いた場合には、蛍光性物質、放射性物質等の標識を用いる必要もなく、非常に簡便で迅速に様々なプロテアーゼ動態の解析を行うことが可能となった。本発明を利用することにより、多種類のプロテアーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能が未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテアーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。
【００３８】
【配列表】
2004357642.tif 000002
2004357642.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において用いられる表面プラズモン共鳴イメージング装置の一例を示す図である。
【図２】実施例１において、アレイ上に複数種の基質を固定化したパターンを示す図である。
【図３】実施例２において、ＳＰＲ解析を行った結果である。
【図４】実施例２において、ＳＰＲイメージングを行った結果である。
【図５】実施例３において、アレイ上に複数種の基質を固定化したパターンを示す図である。
【図６】実施例４において、ＳＰＲ解析を行った結果である。
【図１】
2004357642.tif 000004
【図２】
2004357642.tif 000005
【図３】
2004357642.tif 000006
【図４】
2004357642.tif 000007
【図５】
2004357642.tif 000008
【図６】
2004357642.tif 000009