(57)【要約】【課題】治療方法の開発が遅れている白内障の治療の道を拓くために有用な白内障モデル非ヒト動物や、該非ヒト動物を用いた白内障治療剤のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】ＤＬＡＤ（ＤＮａｓｅ  ＩＩ  ｌｉｋｅ  ａｃｉｄ  ＤＮａｓｅ）ノックアウトマウス等のＤＬＡＤ遺伝子の機能が染色体上で欠損した白内障モデル非ヒト動物（ＤＬＡＤをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＤＬＡＤを発現する機能を失なった非ヒト動物）をターゲティングベクターを用いて作製する。また、この白内障モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物の白内障の程度を評価することにより白内障の予防・治療剤をスクリーニングする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＬＡＤ遺伝子の機能が染色体上で欠損したことを特徴とする白内障モデル非ヒト動物。
【請求項２】
水晶体核にＤＮＡが存在することを特徴とする請求項１記載の白内障モデル非ヒト動物。
【請求項３】
水晶体核に小胞体とミトコンドリアが存在することを特徴とする請求項１又は２記載の白内障モデル非ヒト動物。
【請求項４】
非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の白内障モデル非ヒト動物。
【請求項５】
齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項４記載の白内障モデル非ヒト動物。
【請求項６】
ＤＬＡＤ遺伝子の機能が染色体上で欠損した白内障モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物の白内障の程度を評価することを特徴とする白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＤＬＡＤ遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と野生型非ヒト動物の場合とを比較・評価することを特徴とする請求項６記載の白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
野生型非ヒト動物が、ＤＬＡＤ遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物であることを特徴とする請求項７記載の白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
被検物質を眼球に直接投与することを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載の白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項６〜９のいずれか記載の白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項１０記載の白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項６〜１１のいずれか記載ののスクリーニング方法により得られることを特徴とする白内障の予防・治療剤。
【請求項１３】
検体からＤＬＡＤ遺伝子を抽出し、その遺伝子異常の有無を調べることを特徴とするＤＬＡＤ異常に起因する白内障の診断法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＬＡＤ（ＤＮａｓｅ  ＩＩ  ｌｉｋｅ  ａｃｉｄ  ＤＮａｓｅ）遺伝子の機能が染色体上で欠損した白内障モデル非ヒト動物、及び該白内障モデル非ヒト動物を用いた白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
白内障は、眼球の水晶体（レンズ）が混濁した状態をいい、先天白内障と後天白内障とに分けられる。先天白内障は水晶体表層の混濁と内部の混濁に分けられる。前者には先天偽性白内障、先天被膜白内障、先天皮質白内障、先天冠状白内障、先天極白内障、先天ピラミッド白内障などがある。後者としては、層間白内障、点状白内障、縫合白内障、中心白内障、糸状白内障、環状白内障などがある。後天性混濁としては、老人性、後発、褐色、併発、糖尿病性、外傷性、マッサージ、電撃、放射エネルギーによる、ガラス工、超音波による、薬物による、全身病あるいは栄養障害による各白内障が知られている。薬物による白内障としては、パラジクローベンゼン、タリウム、トリウムゾル、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、マクレラン、ナフタリン、ステロイド、縮瞳薬、トリパラノール、クロルプロマジン、キノリン、ヨード酢酸等によって生じるものがある。これらの薬物の中ではナフタリンによって生ずる白内障が実験動物を用いて良く研究されている。しかしながら、現在まで混濁した白内障を薬物投与によって透明治癒させうる方法は開発されていない。
【０００３】
また、白内障を発症する実験動物として、遺伝性白内障ラットのＳＣＲ（Ｓｈｕｍｉｙａ  Ｃａｔａｒａｃｔ  Ｒａｔ）が知られている。該ＳＣＲは高血圧自然発症ラットに肥満遺伝子を導入したコンジェニック系のＳＨＲ−ｆａを育成中、成熟期に核性白内障をおこす系統から分離育成された。交配実験による遺伝解析の結果、劣性遺伝子（ｃｔｒ１）と致死を伴う優性遺伝子（ｃｔｒ２）とによって白内障を発症するダブルミュータントであり、セグリゲイティング近交系として維持生産された。また、（ＳＣＲ×ＢＮ）Ｆ１をもとにしてＳＣＲへの連続戻し交配を行った、有色コンジェニック系統Ｃ  ＳＣＲ（Ｎ１３〜）が確立されている（例えば、非特許文献１参照。）。その他、白内障発症実験動物として、遺伝性白内障モデルマウス（ＭＩＰｄｅｌ）が知られている。該モデルマウスは水晶体線維細胞特異的蛋白質であるＭＩＰ蛋白質の４アミノ酸が欠損したものである。該マウスを用いた白内障発症機序の解明が進められた結果、ＭＩＰが機能獲得型の遺伝子であることが明らかとなっている。
【０００４】
一方、無血管組織で透明な眼球の水晶体は、水晶体前面の上皮細胞とそれが分化伸張した水晶体線維細胞の一種類の細胞だけで構成されている（例えば、非特許文献２〜４参照。）。増殖能を欠失した水晶体線維細胞への分化は、細胞の形の変化、水晶体に特有なタンパク質であるクリスタリンの発現（例えば、非特許文献５参照。）、並びに核、ミトコンドリア、及び小胞体を含む細胞小器官の分解を伴うことが知られている（例えば、非特許文献６、７参照。）。細胞小器官の喪失は、水晶体の透明度を確実にすると考えられているが、この過程の分子機構は全く解明されていない。
【０００５】
また、マウス組織において発現するＤＮａｓｅとして、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、ＤＬＡＤ、ＣＡＤが知られている。ＤＮＡに特異的に作用し、ホスホジエステル結合を加水分解して３′末端にリン酸基をもつオリゴヌクレオチドを生じるタイプのエンドヌクレアーゼであるＤＮａｓｅ  ＩＩは酸性ＤＮａｓｅであり、リソソーム内に存在し、赤血球前駆細胞から排出された核ＤＮＡの分解、及びマクロファージが貧食した後のアポトーシス細胞のＤＮＡ分解において、重要な役割を果たしている（例えば、非特許文献８〜１０参照。）。また、マウスＤＬＡＤ（例えば、非特許文献１１参照。）は、ヒトではＤＮａｓｅ  ＩＩβと呼ばれ、リソソームの中に存在する酸性ＤＮａｓｅであり（例えば、非特許文献１２参照。）、ＤＬＡＤは、それぞれマウスの肝臓及びヒトの唾液線及び肺で発現することが報告されてきたが、ＤＬＡＤの生理学的な役割は明らかにされていない。また、カスパーゼ活性ＤＮａｓｅであるＣＡＤは、Ｍｇ２＋要求性の中性ＤＮａｓｅであり、アポトーシス細胞の細胞自発的なＤＮＡ分解を引き起こす（例えば、非特許文献１３参照。）。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １２８：  ７７１−７７６，  ２０００
【非特許文献２】
Ｅｙｅ  １３，  ４２５−４３７，  １９９９
【非特許文献３】
Ｅｙｅ  ６，  １１７−１２２，  １９９２
【非特許文献４】
Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １９，  １３４−１５３，  １９８１
【非特許文献５】
Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５７，  ４７９−５０４，  １９８８
【非特許文献６】
Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ．  Ｒｅｓ．  ７４，  １−６，  ２００２
【非特許文献７】
Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３７，  ３７−４９，  １９９７
【非特許文献８】
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２，  １５４６−１５４９，  ２００１
【非特許文献９】
Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．  ９，  ９５６−９６２，  ２００２
【非特許文献１０】
Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４，  １３８−１４４，  ２００３
【非特許文献１１】
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２７，  ４０８３−４０８９，  １９９９
【非特許文献１２】
Ｇｅｎｅ，  ２６９，  ２０５−２１６，  ２００１
【非特許文献１３】
Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒ．  １０，  １４２−１４３，  ２００３
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、治療方法の開発が遅れている白内障の治療の道を拓くために有用な白内障モデル非ヒト動物や、該非ヒト動物を用いた白内障治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
眼球の水晶体細胞は核を持たないため、水晶体細胞の核内ＤＮＡは水晶体細胞形成過程で分解されていると考えられる。本発明者は、ヒト及びネズミ科動物の水晶体細胞に特異的に発現しており、デオキシリボヌクレアーゼＩＩβとも呼ばれているＤＬＡＤを欠損したマウスの生理的機能の解明について鋭意研究を進めた結果、該マウスが、水晶体細胞分化の際にＤＮＡを分解することができず、未分解ＤＮＡは線維細胞に蓄積されることや、水晶体核に白内障を発症し、網膜電図における光に対する反応が大幅に減少することを見い出した。これらの結果から、ＤＬＡＤが水晶体細胞の分化における核ＤＮＡ分解に関与していることを明らかにするとともに、核ＤＮＡが眼球の中に未分解で存在した場合には、水晶体核の光路がブロックされ、白内障を惹起するため、ＤＬＡＤノックアウトマウスがヒト白内障に適したモデル動物となるとの知見を得て、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、ＤＬＡＤ遺伝子の機能が染色体上で欠損したことを特徴とする白内障モデル非ヒト動物（請求項１）や、水晶体核にＤＮＡが存在することを特徴とする請求項１記載の白内障モデル非ヒト動物（請求項２）や、水晶体核に小胞体とミトコンドリアが存在することを特徴とする請求項１又は２記載の白内障モデル非ヒト動物（請求項３）や、非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の白内障モデル非ヒト動物（請求項４）や、齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項４記載の白内障モデル非ヒト動物（請求項５）に関する。
【００１０】
また本発明は、ＤＬＡＤ遺伝子の機能が染色体上で欠損した白内障モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物の白内障の程度を評価することを特徴とする白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項６）や、ＤＬＡＤ遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と野生型非ヒト動物の場合とを比較・評価することを特徴とする請求項６記載の白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項７）や、野生型非ヒト動物が、ＤＬＡＤ遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物であることを特徴とする請求項７記載の白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項８）や、被検物質を眼球に直接投与することを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載の白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項９）や、非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項６〜９のいずれか記載の白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１０）や、齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項１０記載の白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１１）に関する。
【００１１】
さらに本発明は、請求項６〜１１のいずれか記載ののスクリーニング方法により得られることを特徴とする白内障の予防・治療剤（請求項１２）や、検体からＤＬＡＤ遺伝子を抽出し、その遺伝子異常の有無を調べることを特徴とするＤＬＡＤ異常に起因する白内障の診断法（請求項１３）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の白内障モデル非ヒト動物としては、ＤＬＡＤ遺伝子の機能が染色体上で欠損した白内障の症状を呈するモデル動物であれば特に制限されるものではないが、水晶体核にＤＮＡが存在することにより、また、水晶体核に小胞体やミトコンドリアが存在することにより白内障の症状を呈するモデル動物を好適に例示することができる。本発明において、ＤＬＡＤ遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、ＤＬＡＤをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＤＬＡＤを発現する機能を失なった非ヒト動物をいい、上記非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
本発明における野生型の非ヒト動物とは、上記ＤＬＡＤ遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物と同種の動物を意味し、中でも同腹の動物を好適に例示することができる。また上記ＤＬＡＤ遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物としては、メンデルの法則に従い出生してくるものが、ＤＬＡＤ欠損型と同腹の野生型を得ることができ、これらを用いて正確な比較実験をすることができる点で好ましい。そして上記のように、ＤＬＡＤ遺伝子の機能欠損白内障モデル非ヒト動物の好適例としては、ＤＬＡＤノックアウトマウスを、野生型マウスとしては該ノックアウトマウスと同腹の野生型マウスを、それぞれ具体的に挙げることができる。以下、非ヒト動物がマウスの場合を例にとって説明する。
【００１４】
ＤＬＡＤノックアウトマウスの作製法としては、ＤＬＡＤを発現する機能を失ったノックアウトマウスを作製することができる方法であればどのような作製法でもよいが、例えば、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＤＬＡＤ遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＤＬＡＤ遺伝子を、プラスミドベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定し、このクローンのＤＬＡＤ遺伝子の全部又は一部を含むフラグメントをネオマイシン耐性遺伝子カセット等で置換することによって、ターゲットベクターを作製する方法を挙げることができる。
【００１５】
この線状化されたベクターをエレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、Ｇ−４１８などの薬剤に抵抗性の細胞の中から相同的組換えを行ったＥＳ細胞を選択し、その細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウス（ＤＬＡＤ＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスの雌雄を交配させることによって、ＤＬＡＤノックアウトマウス（ＤＬＡＤ−／−）を得ることができる。
【００１６】
本発明の白内障の予防・治療剤のスクリーニング方法としては、本発明のＤＬＡＤ遺伝子の機能が染色体上で欠損した白内障モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物の白内障の程度を評価する方法であれば特に制限されるものではなく、被検物質の投与方法としては、経口投与、静脈内投与、眼球への点滴による直接投与などの方法をを挙げることができる。また、白内障の程度を評価する方法としては、水晶体の混濁の程度を目視により観察評価する方法や、水晶体核のＤＮＡの分解の程度を測定評価する方法や、水晶体核の小胞体やミトコンドリアの消失の程度を測定評価する方法や、網膜電図（ＥＲＧ）における光に対する反応の程度を測定評価する方法などを挙げることができる。網膜電図では、電極によって眼球から取り出された反応信号がその時間経過によって表示されることで評価され、刺激するためには、一回の閃光又は明と暗の連続（フリッカーＥＲＧ）を使用することができ、この場合、網膜面全体の平均値を算出することになる。白内障の程度を評価するに際しては、白内障モデル非ヒト動物と同種の野生型非ヒト動物、中でも白内障モデル非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物と比較評価することが好ましい。
【００１７】
本発明はまた、上記本発明のスクリーニング方法により得られる白内障の予防・治療剤や、ＤＬＡＤ異常に起因する白内障の診断法に関する。ＤＬＡＤ異常に起因する白内障の診断法としては、検体からＤＬＡＤ遺伝子を抽出し、その塩基配列を調べて、正常なＤＬＡＤ遺伝子と比較して異常の有無を調べる方法を例示することができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００１９】
実施例［方法］
（ＤＬＡＤ遺伝子の遺伝子ターゲット法による欠損）
マウスＤＬＡＤ染色体遺伝子を１２９／ｓｖマウスゲノムライブラリーから単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローンした。エクソン３−４を含む６．１ｋｂのＤＮＡ断片を、ホスホグリセレートキナーゼ１遺伝子プロモーターにより発現する２．１ｋｂのｎｅｏ遺伝子に置換してＤＬＡＤターゲティングベクターを構築した（図２ａ；参考写真２ａ）。ポリオーマウイルスのエンハンサーの下流に配置されたジフテリアトキシンＡフラグメントをコードする１．２ｋｂＤＮＡフラグメントを、負の選択のために、ＤＬＡＤ遺伝子の下流に挿入した。
【００２０】
エレクトロポレーション法により１．０×１０７Ｒ１  ＥＳ細胞を、ターゲティングベクター２５μｇでトランスフェクションした。Ｇ−４１８耐性クローンのなかから、相同的組換えを起こしたクローンをＰＣＲ法によりスクリーニングした。ついで、ＤＬＡＤ欠損対立遺伝子を有するＥＳクローンを、宿主の胚に導入し、キメラマウスを作製し、このキメラマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｓｔ社製）と交配し、ＤＬＡＤ＋／−突然変異マウスを作製した。ＤＬＡＤ−／−マウスは、ＤＬＡＤ＋／−の雌雄を交配することにより作製した。全てのマウスは大阪大学医学部の特定病原体未感染施設に収容し、全ての動物実験は大阪大学医学部動物実験委員会に承認された細則に従って行われた。
【００２１】
（ＰＣＲ法、サザン及びノーザンブロット分析）
ゲノムＤＮＡを、文献（Ｌａｉｒｄ，  Ｐ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｓ．  １９，  ４２９３  （１９９１））記載に準じて、胚組織又は成体のシッポの先から調製した。ＤＬＡＤ遺伝子の遺伝子型を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｉｅｒ  ９７００  ｃｙｃｌｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）及びＴａｑポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用し、ＰＣＲ法により同定した。ＰＣＲには、野生型に特異的センスプライマーとして（５’−ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＣＧＡ  ＣＡＡ  ＴＡＧ  ＧＧＡ−３’；配列番号１）又は突然変異対立遺伝子型に特異的センスプライマーとして（５’−ＧＡＴ  ＴＣＧ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＣＧ−３’；配列番号２；ネオマシン耐性遺伝子の配列）を、共通のアンチセンスプライマー（５’−ＣＴＧ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＡＴＴ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＡＡＧ−３’；配列番号３）と共に使用した。
【００２２】
サザンハイブリダイゼーションでは、ゲノムＤＮＡをＢａｍ  ＨＩで処理し、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）に転写した。ハイブリダイゼーションはＤＬＡＤ遺伝子のエクソン６に位置する０．５ｋｂＤＮＡ断片をプローブとして行った（図２ａ；参考写真２ａ）。ノーザンハイブリダイゼーションのために、全ＲＮＡを０．２２Ｍホルムアルデヒドを含む１．０％アガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。マウスＤＬＡＤ  ｃＤＮＡをプローブとして使用し、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ．ａｌ．  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ２００１））記載されている高ストリンジェント条件下にハイブリダイゼーションを行った。
【００２３】
（マウスＤＬＡＤ  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ法及びリアルタイムＰＣＲ法）
８週齢のマウスの様々な組織、またさまざまな発生段階のマウス胚の水晶体からＲＮＡを調製した。ＲＮＡ（２μｇ）をＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で処理し、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとしてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素を使用して、全量２０μｌにて逆転写した。リアルタイムＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、  各プライマー（０．５μＭ）及び３ｍＭのＭｇＣｌ２を含む反応混合液（２０μｌ）中で、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  社製）を使用して、製造者の指示通りに行った。プライマーとして、ＤＬＡＤには５’−ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＧＡＧ  ＴＡＣ−３’（配列番号４）及び５’−ＴＴＡ  ＧＧＴ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＴＴＧ−３’（配列番号５）を、ＤＮａｓｅＩＩには５’−ＡＡＴ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＧＧＧ  ＡＣ−３’（配列番号６）及び５’−ＡＴＡ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＧＧ−３’（配列番号７）を、ＣＡＤには５’−ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＡＧＴ  Ｇ−３’（配列番号８）及び５’−ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＣＡＧ−３’（配列番号９）をそれぞれ使用した。コントロ−ルとして、β−アクチン遺伝子の発現を、プライマー５’−ＴＧＴ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＧＧＧ  ＴＣＡ  Ｇ−３’（配列番号１０）及び５’−ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  Ｃ−３’（配列番号１１）を使用して検出した。特異的ｍＲＮＡのレベルは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  がＰＣＲ蓄積の対数期の上昇期を探知した時点で定量化し、各個別サンプルにおけるβ−アクチンの発現レベルを対照として数値化した。
【００２４】
（ヒトＤＬＡＤ  ｍＲＮＡのＰＣＲ法）
ヒト水晶体細胞は、老人性白内障の患者の前部莢膜から、インフォームドコンセント後に入手した。ヒト水晶体上皮細胞（ＬＥＣ）は、文献（Ｆｌｅｍｉｎｇ，  Ｔ．  Ｐ．  ｅｔ．ａｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  ３９，  １３８７−１３９８  （１９９８））記載に準じて、水晶体上皮細胞から作製し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて維持した。ヒトＨｅＬａ細胞は、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＤ、ＨＬ−６０及びＫＴ−３細胞は、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。全ＲＮＡは、初期水晶体細胞及び細胞株から酸性フェノール−グアニジン−チオシアネート法で調製した。ヒト肝臓及び胸腺からの全ＲＮＡは、それぞれＢｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈａｙｗａｒｄ社製）及びＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌａ  Ａｌｔｏ社製）から購入した。ヒトＤＬＡＤ  ｍＲＮＡを、ヒトＤＬＡＤ  ｍＲＮＡに特異なプライマー（Ｋｒｉｅｓｅｒ，  Ｒ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ２６９，  ２０５−２１６  （２００１））、５’−ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＡ  ＴＡＡ  ＣＴＴ  ＴＣ−３’（配列番号１２）及び５’−ＧＧＴ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＴＣＣ  ＡＧ−３’（配列番号１３）を使用してＲＴ−ＰＣＲ法により、検出した。コントロールとして、ヒトβアクチンｍＲＮＡに対するプライマー（（５’−ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＣＣＣ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＡＣ−３’（配列番号１４）及び５’−ＣＴＴ  ＡＡＴ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  Ｃ−３’（配列番号１５））を使用して、ＲＴ−ＰＣＲ法を行った。
【００２５】
（酸性ＤＮａｓｅの分析）
水晶体を溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのｐＡＰＭＳＦ）中で破砕し、１３，０００ｒｐｍで３０分遠心分離して、細胞核及び大きな細胞の破片を除去した。上澄みを１ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対し透析した。沈殿物を除去した後、上澄みの酸性ＤＮａｓｅ活性を、文献（Ｋａｗａｎｅ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２，  １５４６−１５４９  （２００１））記載に準じて測定した。要約すると、プラスミドＤＮＡ（２．０μｇ）を反応液（１０ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．９））１２０μｌ中でサンプルと混合した。３７℃で３時間インキュベーションした後、混合液をフェノール・クロロホルムで処理し、ＥｔＯＨ沈殿によりＤＮＡを回収した。
【００２６】
（眼球水晶体の組織学的分析及び電子顕微鏡解析）
組織学的解析のために、マウス水晶体を、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）において４％パラホルムアルデヒド／４％スクロースで固定し、パラフィン包埋し、４μｍの切片を作製した。切片は１０分間、１Ｎ  ＨＣｌで６０℃で処理し、フォイルゲン染色のために、シッフ試薬（Ｍｅｒｃｋ社製）で４５分間染色し、光学電子顕微鏡で観察した。ｇｒｐ９４を検出するために、水晶体のパラフィン切片を、一晩４℃でラット抗ｇｒｐ９４モノクローナル抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ  社製）とインキュベートし、次にペルオキシダーゼ共役ウサギ抗ラットＩｇＧ抗体、及びＣｙ３標識チラミドを、ペルオキシダーゼ基質としてインキュベートした。ミトコンドリアＡＴＰシンターゼを検出するために、切片を、一晩４℃で、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサβブユニットに対するウサギ抗体（Ｅｚａｋｉ，  Ｊ．  ｅｔ．ａｌ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ６７，  １６７７−１６８７  （１９９６））とインキュベートし、その後さらに、Ｃｙ３−結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ．社製）とインキュベートした。電子顕微鏡での解析には、６週齢のマウスの水晶体を、４％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で固定した。７．５％ショ糖を含む同緩衝液で洗浄した後、サンプルを４℃で２時間、１％のＯｓＯ４で固定し、Ｅｐｏｎ８１２に包埋した。この水晶体から切片（８０ｎｍ）を、スーパーミクロトーム（Ｎｉｓｓｅｉ社製）で調製し、クエン酸鉛及び酢酸ウラニルで染色し、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７１００電子顕微鏡（日立ハイテクノロジーズ社製）で観察した。
【００２７】
（網膜電図）
網膜電図（ＥＲＧ）を文献（Ｍａｓｕ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ８０，  ７５７−７６５  （１９９５）．）記載に準じて行った。要約すると、マウスを１２時間以上暗順応し、キシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）及びケタミン（５０Ｍｇ／ｍｌ）の混合液（０．０６ｍｌ）を皮下注入して麻酔した。角膜を０．５％オキシブプロカインで麻酔し、瞳孔を０．５％トロピカミド及び０．５％フェニレフリン−ＨＣｌで拡張した。ＥＲＧは塩化銀ワイヤを使用して、片眼の角膜の表面から記録した。光刺激の輝度は、眼球の表面で３．７ｌｏｇ  ｃｄ／ｍ２であり、連続的に光刺激を減少するために、異なったニュートラル・デンシティ・フィルタを使用した。反応は１０，０００の増幅率に拡大した帯域通過周波数を０．０８〜１０００Ｈｚに設定した（日本光電社製）。シングルフラッシュの光刺激を１．８ｌｏｇ  ｃｄ／ｍ２から３．７ｌｏｇｃｄ／ｍ２まで増加し、４段階に分けた。１０の反応をアベレイジャー（日本光電社製）で平均化した。
【００２８】
実施例［結果］
（リアルタイムＰＣＲ法による３種のＤＮａｓｅの発現試験）
水晶体細胞の分化における核ＤＮＡの分解に、ＤＮａｓｅが関与していることを確認するために、本発明者らはまず、様々なマウスの組織における３つのＤＮａｓｅ（ＤＮａｓｅ  ＩＩ、ＤＬＡＤ及びＣＡＤ）の発現を、リアルタイムＰＣＲ法により検討した。図１ａ（参考写真１ａ）に示されているように、ＣＡＤ  ｍＲＮＡは水晶体以外の様々な組織で発現した。ＤＮａｓｅＩＩ  ｍＲＮＡも普遍的に発現したが、水晶体における発現率は低かった。他方、ＤＬＡＤ  ｍＲＮＡは眼球において特異的に高発現していた。マウスの胚形成の初期段階では、全ての水晶体線維細胞は核を保持しているが、この核は胚発生（Ｅ）１６日以降に、欠落する（Ｋｕｗａｂａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ．ａｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  １３，  ９７３−９８１  （１９７４））。これと一致して、ＤＬＡＤ  ｍＲＮＡのレベルは、Ｅ１４．５の水晶体では低かったが、マウスの後期発生段階では、大きく増加した（図１ｂ；参考写真１ｂ）。また、ＤＬＡＤ  ｍＲＮＡを老人性白内障の患者のヒト水晶体細胞で検出した。さらにヒト水晶体から樹立された上皮細胞株は、かなり高い水準のＤＬＡＤ  ｍＲＮＡを発現していた。しかし、他の種類の細胞では、ＤＬＡＤ  ｍＲＮＡの発現は僅かであった（図１ｃ；参考写真１ｃ）。
【００２９】
（ＤＬＡＤ−／−マウスの作製）
ＤＬＡＤの生理的な役割を明らかにするために、ＤＬＡＤ−／−マウスをジーンターゲティング法により作製した。マウスＤＬＡＤ遺伝子は、ゲノムＤＮＡ１５．０ｋｂ以内に６つのエクソンによりコードされている（図２ａ；参考写真２ａ）。エクソン３及び４にコードされている領域は、ＤＮａｓｅ  ＩＩ及びＤＬＡＤ間に保存されており、この領域には酵素活性部位になりうるヒスチジン残基が２こ存在する（Ｓｈｉｏｋａｗａ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７，４０８３−４０８９  （１９９９））。エクソン３及び４をｎｅｏ遺伝子と置換し、ターゲティングベクターを構築し、Ｒ１マウスの胚幹細胞（ＥＳ細胞）内に注入した。変異を有するＥＳクローンをＰＣＲ法により同定し、そのうちの１つの代表的クローンに由来するマウスを詳細に解析した。
【００３０】
ヘテロ接合の雌雄マウスを交配させ、その結果生じた同腹子の尾部ＤＮＡを、Ｂａｍ  Ｈ１で処理した後、サザンハイブリダイゼーションにより分析した（図２ａ；参考写真２ａ）。図２ｂ（参考写真２ｂ）に示されるように、ＤＬＡＤ＋／＋では単一の９．５ｋｂバンドが、ＤＬＡＤ−／−では７．８ｋｂバンドが、ＤＬＡＤ＋／−マウスではその両方が見られた。そのサイズはＤＬＡＤ遺伝子とターゲティングベクターの相同的組換えで想定されたとおりであった。一方、ノーザンハイブリダイゼーションでは１．９ｋｂＤＬＡＤｍＲＮＡがＤＬＡＤ＋／＋マウスの眼球から検出された（図２ｃ；参考写真２ｃ）。このｍＲＮＡのサイズは野生型の肝臓に見られたものと一致した。ＤＬＡＤ−／−の水晶体ではＤＬＡＤｍＲＮＡも発現したが、そのサイズはターゲッティングストラテジーで予想されたとおり、野生型マウスのＤＬＡＤ  ｍＲＮＡより小さかった。ＤＬＡＤｍＲＮＡの欠損を確認するために、水晶体のＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により分析した。図２ｃの右パネルに示されるように、ＤＬＡＤｍＲＮＡのコード配列の全長にわたる一対のプライマーにより、ＤＬＡＤ＋／＋の水晶体からのＲＮＡには１０７３ｂｐバンド、ＤＬＡＤ−／−の水晶体からのＲＮＡには８３８ｂｐバンド、またＤＬＡＤ＋／−の水晶体からのＲＮＡにはその両方が生じた。エクソン４及び６からの配列がプライマーとして使用された場合には、ＤＬＡＤ＋／＋及びＤＬＡＤ＋／−水晶体からのＲＮＡは６３６ｂｐのバンドを生成したが、ＤＬＡＤ−／−水晶体からのＲＮＡではバンドが検出されなかった。これらの結果は、ＤＬＡＤ−／−マウスにおけるＤＬＡＤｍＲＮＡにはエクソン３及び４の配列が欠損していることを示している。ターゲットされたＤＬＡＤ遺伝子のエクソン２からのオープンリーディングフレームは、エクソン５で中断され不完全なたんぱく質が賛成されることとなる。以下に記載するように、ＤＬＡＤ＋／−マウスは野生型マウスと同等の表現系を示し、ＤＬＡＤ＋／−マウスで産生される不完全なタンパク質は野生型ＤＬＡＤたんぱく質に悪影響を与えることはないと考えられる。
【００３１】
（ＤＬＡＤ−／−マウスの分析）
ブタの水晶体には、白血球エラスターゼ阻害剤に由来するＬ−ＤＮａｓｅ  ＩＩと呼ばれる酸性ＤＮａｓｅが存在すると報告されている（Ｔｏｒｒｉｇｌｉａ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １８，  ３６１２−３６１９  （１９９８））。マウスの水晶体にＤＬＡＤ以外の酸性ＤＮａｓｅが存在するかどうかを調べるために、また、ＤＬＡＤ−／−マウスにおけるＤＬＡＤの変異を確認するために、水晶体より細胞抽出物を調製し、プラスミドＤＮＡを基質としてＤＮａｓｅ活性を分析した。図２ｄ（参考写真２ｄ）で示されるように、野生型マウスとヘテロ接合型マウスの水晶体抽出物は、ｐＨ５．９においてＤＮａｓｅ活性を示した。他方、ＤＬＡＤ−／−マウスの水晶体抽出物においては、この条件下及びさらなる酸性条件下でほとんどＤＮａｓｅ活性が認められなかった。これらの結果は、ＤＬＡＤがマウスの眼球水晶体において主要な酸性ＤＮａｓｅであり、ＤＬＡＤ−／−対立遺伝子はヌル変異であることを示している。ＤＬＡＤ＋／−の雌雄マウスを交配すると３つの遺伝子型（ＤＬＡＤ＋／＋、ＤＬＡＤ＋／−及びＤＬＡＤ−／−）のマウスがメンデルの法則に従って生まれた。また、ＤＬＡＤ−／−マウスは、白内障以外は発育異常を示さず、通常の繁殖力で繁殖した。
【００３２】
ＤＬＡＤ−／−マウスの眼球は、通常の形態で、ＤＬＡＤ＋／＋マウスの眼球とほぼ同サイズであった。ＤＬＡＤ−／−マウスの水晶体では通常レベルのクリスタリンが確認され、水晶体線維細胞は成熟した細胞へと正常に分化しうると考えられる。水晶体の正中矢状に断片化し、その切片を組織学的に分析したところ、水晶体の前面を覆っている単層の立方形の上皮細胞が見い出される。そして、水晶体の赤道面及び皮質の線維細胞には、フォイルゲンおよびＤＡＰＩで染色される核が存在した（図３ａ；参考写真３ａ）。この領域の細胞は小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，ＥＲ）に存在するタンパク質Ｇｒｐ９４に対する抗体及びミトコンドリアに存在するＡＴＰシンターゼに対する抗体で染色されることから、この領域の線維細胞は小胞体及びミトコンドリアを有していることがわかった。一方、野生型マウス（ＤＬＡＤ＋／−）の水晶体の内側には、核、ＥＲ、ミトコンドリアなどの細胞小器官を欠損した領域（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ−ｆｒｅｅ  ｚｏｎｅ）が存在する。ＤＬＡＤ−／−の水晶体核の繊維細胞には小胞体やミトコンドリアが存在せず、形態学的によく分化しているように思われる。しかし、この一見成熟した線維細胞にもフォイルゲン及びＤＡＰＩ陽性物質が認められた。これらのフォイルゲン陽性さいぼうはどのような年齢（１週齢〜３５週齢）のＤＬＡＤ−／−マウスの核水晶体線維細胞でも確認された。
【００３３】
透過型電子顕微鏡により、成熟した水晶体細胞を分析したところ、成熟したＤＬＡＤ−／−の線維細胞は、確かに小胞体、ミドコンドリアを含んでいなかった（図３ｂ；参考写真３ｂ）。しかし、この細胞にはＤＮＡと考えられる凝縮した物質が見出された。さらに高倍率での分析は、この細胞の中にほどけたＤＮＡと考えられる物質あるいは無形態な物質が認められた。これらの物質は、膜質様組織で囲まれておらず、核膜が破壊されていることを示唆した。次に、ＤＬＡＤ−／−の水晶体の成熟線維細胞で、ＤＮＡが未消化のまま残っていることを確認するために、水晶体を物理的に３つの領域（上皮層、末梢皮質、核）に分け、染色体ＤＮＡを上皮層及び核の細胞から調製した。図３ｃ（参考写真３ｃ）に示されるように、上皮層の細胞は、大量の染色体ＤＮＡを含んでいたが、野生型と同等であるＤＬＡＤ＋／−の水晶体核からの線維細胞には含まれていなかった。反対に、ＤＬＡＤ−／−の眼球においては、かかるＤＮＡは上皮層の細胞だけでなく、水晶体核においても観察された。
【００３４】
ＤＬＡＤ−／−マウスの眼球は、弱いがはっきりとした白内障を発症した（図４ａ；参考写真４ａ）。すなわち、ＤＬＡＤ−／−の水晶体核には、混濁が見え、老齢のマウスにおいてはより顕著となった。線維細胞に残されたＤＮＡの光の伝達に対する効果を検査するために、網膜電図（ＥＲＧ）をＤＬＡＤ＋／−及びＤＬＡＤ−／−マウスで比較した。図４ｂ（参考写真４ｂ）に示されるように、ＥＧＲを暗順応条件の野生型マウスで記録したとき、ａ波及びｂ波で構成される典型的な反応が観察された。ＤＬＡＤ−／−マウスにおいては、光フラッシュに対する反応は著しく低下し、光路がＤＬＡＤ−／−水晶体でブロックされたことを示した。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によると、白内障モデル非ヒト動物を用いた白内障の予防・治療薬のスクリーニング方法を提供することができるので、治療方法の開発が遅れている白内障の治療の道を拓くことができる他、本発明の白内障モデル非ヒト動物を用いて白内障の発症機構を解明することができる。
【００３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】水晶体におけるＤＬＡＤ  ｍＲＮＡの発現。
ａ．マウスの水晶体におけるＤＬＡＤ  ｍＲＮＡの特異的発現。８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの示された組織よりＲＮＡを調製した。ＤＡＬＤ、ＣＡＤ及びＤＮａｓｅ  ＩＩ  ｍＲＮＡを、方法の章に記載されている通りのリアルタイムＰＣＲ法で定量した。ＤＮａｓｅ  のｍＲＮＡは各組織のβ−アクチンｍＲＮＡ量の相対的数値として表されている。
ｂ．マウスの後期発生段階における、水晶体内のＤＬＡＤ遺伝子の発現。示された発生段階のマウスの胚及び新生児の水晶体からＲＮＡを調製した。ＤＬＡＤ  ｍＲＮＡの発現レベルは、リアルタイムＰＣＲ法で同定し、βアクチン  ｍＲＮＡ量の相対的数値として表されている。
ｃ．ヒト水晶体細胞におけるＤＬＡＤ  ｍＲＮＡの発現。老人性白内障の２人の患者の水晶体細胞のＲＮＡ、ヒト胸腺及び肝臓からのＲＮＡ、さまざまなヒト細胞株からのＲＮＡを、ヒトＤＬＡＤ及びβ−アクチン  ｍＲＮＡに特異なプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲ法で分析した。
検査したヒト株細胞は、次の通りである：ＬＥＣ、水晶体上皮細胞；Ｈｅｌａ、腺ガンから作製した上皮株細胞；ＫＴ−３及びＪｕｒｋａｔ、Ｔ細胞リンパ腫細胞株；ＨＬ−６０、前骨髄球性白血病細胞株
ヒトＤＬＡＤ  ｍＲＮＡに想定されたサイズのバンド（４７１ｂｐ）は、矢印で示す。マーカーＤＮＡの細部は、ｂｐで示す。
【図２】相同的組換えによるＤＬＡＤ遺伝子の遺伝子ターゲット法による欠損
ａ．ターゲティングストラテジー。内在性ＤＬＡＤ遺伝子座（上の棒線）、ターゲット構築（真中の棒線）、標的ＤＬＡＤ遺伝子座（下の棒線）を図式で示した。ＤＬＡＤ遺伝子の６つのエクソン（コード領域）を黒のボックスで表し、番号をつけた。制限酵素Ｂａｍ  ＨＩ（Ｂ）及びＳｍａ  Ｉ（Ｓ）の認識部位を示した。それぞれ正の選択、負の選択に使用した、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）及びジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴＡ）をコードするＤＮＡフラグメントを示した。サザンハイブリダイゼーションに使用されたプローブを、下の棒線の下に、塗りつぶしたボックスで示した。ｃのＲＴ−ＰＣＲ法に使用したプライマーを、上の棒線の上に矢印で示した。プローブによって検出された、Ｂａｍ  ＨＩで処理した断片を示した。下のスケールバーは１ｋｂを表す。
ｂ．ＤＬＡＤ＋／−ヘテロ接合型の雌雄を交配して作製した仔から単離した尾部ＤＮＡをターゲットの図に示されたプローブを使用してサザンブロット分析した。相同的組換えにより、ＤＬＡＤ遺伝子座には、ｎｅｏ遺伝子が挿入されＢａｍ  ＨＩ消化により単一の９．５ｋｂバンドから７．８ｋｂバンドに移動する。マーカーＤＮＡのサイズは、左側にｋｂで示した。
ｃ．ノーザンハイブリダイゼーション及びＲＴ−ＰＣＲ法。左のパネルには、６週齢のＤＬＡＤ＋／＋、ＤＬＡＤ＋／−、ＤＬＡＤ−／−マウスの眼球水晶体からの全ＲＮＡ（列毎に１０μｇ）及び野生型マウスの肝臓からのポリ（Ａ）ｍＲＮＡ（列毎に２μｇ）を、ＤＬＡＤ  ｃＤＮＡをプローブとして、ノーザンハイブリダイゼーションにより分析した。マーカーＲＮＡのサイズは、左側にｋｂで示した。下のパネルでは、コントロールとしてフィルターを、ＥＦ−１αｃＤＮＡをプローブとして分析した。右のパネルでは、６週齢のＤＬＡＤ＋／＋、ＤＬＡＤ＋／−、ＤＬＡＤ−／−マウスの眼球水晶体からの全ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ法により分析した。分析には、マウスＤＬＡＤ遺伝子のエクソン１及び６（エクソン１−６）に位置するプライマー、又はエクソン４及び６（エクソン４−６）に位置するプライマーを使用した。ＲＴ−ＰＣＲ法に同量のＲＮＡが使用されていることを確認するために、コントロールとしてβ−アクチンｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法で分析した。
ｄ．水晶体における酸性ＤＮａｓｅ活性。プラスミドＤＮＡを、酸性条件下で、ＤＬＡＤ＋／＋、ＤＬＡＤ＋／−又はＤＬＡＤ−／−眼球からの細胞抽出物の量（１５、４５、１３５μｇ）を増加させてインキュベートし、１．５％アガロースゲルで電気泳動により分析した。Ｃ列は、プラスミドＤＮＡを、細胞抽出物なしで、インキュベート処理したものである。列Ｉ及びＩＩでは、１．５ｎｇのウシ膵臓由来のＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）及び３．８ｎｇのブタ脾臓由来のＤＮａｓｅ  ＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）のＤＮａｓｅ活性を上記の通り分析した。マーカーＤＮＡのサイズはｂｐで示されている。
【図３】ＤＬＡＤ−／−水晶体線維細胞の核ＤＮＡの非破壊
ａ．眼球水晶体の組織学的分析。６週齢のＤＬＡＤ＋／−及びＤＬＡＤ−／−マウスの眼球水晶体はパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。正中矢状水晶体切片（４μｍ）はＤＮＡ用フォイルゲンで染色した（左パネル）。真中と右のパネルでは、水晶体切片をｇｒｐ９４に対する抗体又はミトコンドリアＡＴＰシンターゼβサブユニットに対する抗体でそれぞれ染色し（赤）、次にＤＡＰＩ染色を行った（青）。Ｅｐ：上皮組織、ＯＺＦ：細胞小器官がない領域。ＡＳ：前部縫合。ＰＳ：後部縫合。１００μｍのスケールバーを各パネルの右角に示した。
ｂ．ＤＬＡＤ−／−水晶体線維細胞の透過型電子顕微鏡写真。６週齢のＤＬＡＤ−／−マウスの水晶体線維細胞を透過型電子顕微鏡で分析した。凝縮体から拡散しているほどけたＤＮＡと考えられる物質を、矢頭で示している。右角のスケールバーは、２μｍ又は５００ｎｍを表している。
ｃ．ＤＬＡＤ−／−水晶体核内ＤＮＡ。上皮単層（Ｅｐ）を、１５週齢のＤＬＡＤ＋／−及びＤＬＡＤ−／−マウスの水晶体から静かに剥がした。次に水晶体を末梢皮質及び核に分割した。上皮層（Ｅｐ）と核（Ｎｕｃ）の細胞を、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）１００ｍＭ中で懸濁した。５５℃で４．５時間インキュベーションした後、混合液をフェノール／クロロフォルムで処理し、ＤＮＡをＥｔＯＨ沈殿で回収した。ついで、ＤＮＡを０．８％アガロースゲルで電気泳動することにより分析した。
【図４】ＤＬＡＤ−／−マウスの白内障の進行
ａ．ＤＬＡＤ−／−マウスの核白内障。６及び２６週齢のＤＬＡＤ＋／−、ＤＬＡＤ−／−マウスの眼球を撮影した。
ｂ．網膜電図。照度を増した刺激を拡散するのに応じた網膜電図を１１週齢のＤＬＡＤ＋／−、ＤＬＡＤ−／−マウスで記録した。左側の数字はログユニットの中性濃度（ＮＤ）膜の数値を示している。動物の角膜の表面に対する最高輝度は３．７ｌｏｇ  ｃｄ／ｍ２であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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