(57)【要約】【課題】炎症組織や腫瘍組織等において特異的に発現するテネイシンＣを、非侵襲的に高精度で測定する手段を提供する。【解決手段】アイソトープで標識化したことを特徴とする標識化抗テネイシンＣモノクローナル抗体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アイソトープで標識化したことを特徴とする標識化抗テネイシンＣモノクローナル抗体。
【請求項２】
抗体が、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２  またはＦｖ断片である請求項１の標識化抗テネイシンＣモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、アイソトープ標識化抗テネイシンＣモノクローナル抗体に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、炎症や腫瘍などによる組織再構築に伴って発現するテネイシンＣの非侵襲的測定を可能とし、炎症や腫瘍等の疾患診断に有用な標識化抗テネイシンＣモノクローナル抗体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの心筋炎の原因はウイルス感染である場合が多い（非特許文献１−３）。ウィルス性心筋炎にかかわる心臓の基本的メカニズムは、細胞表面の変化、またはウイルス関連の新規抗原に対する細胞媒介性の免疫学的反応であると考えられている（非特許文献４）。さらに興味深いのは、ウイルス性心筋炎はおそらくはウイルス媒介性の免疫学的心臓障害の結果として、拡張型心筋症（ＤＣＭ）の原因になる点である（非特許文献５−７）。様々な診断方法が開発されているにもかかわらず、心筋炎に対する早期の確定的な診断は、いまだにＤａｌｌａｓ基準（非特許文献８）に従った心内膜心筋の生検標本における炎症性浸出細胞の検出に依存している。しかしながら、この技術は侵襲的であり、サンプル時にエラーを生じる傾向がある（非特許文献９）。このため、心筋症に対して精確かつ非侵襲的な診断を早期に行うための新しい診断技術が待ち望まれている。
【０００３】
テネイシン−Ｃ（ＴＮＣ）は細胞外マトリクス糖タンパクの一種であり、胚形成時に発現するが、正常な成人組織では発現しない（非特許文献１０、１１）。しかしながら創傷治癒、癌浸潤または炎症などの各種の病理学的状態では、ＴＮＣが一時的に再発現する（非特許文献１２）。この出願の発明者らがマウスモデルにおいて最近示した事実では、心筋炎の活性段階期間中には、ＴＮＣが心筋に特異的に発現している。ＴＮＣの免疫反応性は心筋細胞溶解の初期段階に現れ、細胞浸潤と壊死が続く活性段階の期間中残存し、治癒段階では瘢痕組織の形成に伴い消失する（非特許文献１３）。
【０００４】
なお、この出願の発明者は、腫瘍間質において特異的に発現するテネイシンＣスプライシングバリアントを選択的に認識するモノクローナル抗体を既に発明し、特許出願している（特許文献１）。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−２３４９００号公報
【非特許文献】
１．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０００；  ３４３：  １３８８−１３９８．
２．  Ｈｅｒｚ．  ２０００；  ２５：  ２７９−２８５．
３．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０００；  ３４２：  １０７７−１０８４．
４．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  １９８０；  １０１：  ４２７−４８４．
５．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  １９９９；  ９９：  １０９１−１０１０．
６．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  １９８９；  １３：  １２１９−１２３９．
７．  Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．  １９９５；  １６  Ｓｕｐｐｌ．  Ｏ：  １６８−１７２．
８．  Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐａｔｈｏｌ．  １９８６；  １：  ３−１４．
９．  Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ．  １９８９；  １２３５−１２４５．
１０．  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．  ２０００；  ２１８：  ２３５−２５９．
１１．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９３；  ５：  ８６９−８７６．
１２．  Ｃｅｌｌ  １９８６；  ５３：  ３８３−３９０．
１３．  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００２；  １９７（３）：３８８−９４．
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、心筋症に対して精確かつ非侵襲的な診断を早期に行うための新しい診断技術が待望されている。一方、ＴＮＣは心筋炎組織において空間的、時間的に極めて特異的に発現することから、その発現を捉えることによって心筋炎の非侵襲的な診断が可能となることが期待される。またＴＮＣ発現の検出は、癌浸潤等の腫瘍診断にも有効であることが期待される。
【０００７】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、生体内でのＴＮＣ発現を非侵襲的に測定することを可能とする新しい手段を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、アイソトープで標識化したことを特徴とする標識化抗テネイシンＣモノクローナル抗体を提供する。
【０００９】
またこの標識化抗テネイシンＣモノクローナル抗体は、抗体がＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２  またはＦｖ断片であることを態様の一つとしてもいる。
【００１０】
以下、この発明の実施形態について詳しく説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この発明に使用する抗テネイシンＣモノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作成法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年；  ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”  Ｊａｍｅｓ  Ｗ．  Ｇｏｄｉｎｇ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６等）に従って作成することができる。すなわち、ヒトＴＮＣで免疫した動物（好ましくはマウス）から抗体産生細胞（脾臓、リンパ球）を単離し、この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、限界希釈法等によって目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択すればよい。免疫原としては公知の精製ヒトＴＮＣ（Ａｕｋｈｉｌ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｔｒｉｘ．  １９９０；  １０：  ９８−１１１）を用いることができる。被免疫動物は、ＴＮＣを発現しない動物を使用することが好ましい。このようなＴＮＣ非発現動物としては、文献公知のＴＮＣ−ｎｕｌｌマウス（Ｓａｇａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．  １９９２；  ６：  １８２１−１８３１）等を使用することができる。
【００１２】
この発明の抗体はまた、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２’およびＦｖ断片等の抗体断片であってもよい。このような抗体断片は、パパインまたはペプシン等のペプチダーゼを用いて前記のモノクローナル抗体を分解する公知手段によって得ることができる。またこのような抗体断片をｉｎ  ｖｉｖｏ画像診断等に使用することの利点は米国特許第４，３３１，６４７号等にも記載されている。すなわち、抗体断片は薬物動態が急速であり、免疫原性が少ないため、この発明の標識化抗テネイシンＣモノクローナル抗体として好ましい。
【００１３】
標識として使用するアイソトープとしては、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３１、ヨウ素１３３、臭素７７、テクネチウム９９ｍ、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀１０７、水銀２０３、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、スカンジウム４７、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、銅６７、フッ素１８、イットリウム９０、パラジウム１００、ビスマス２１７およびアンチモン２１１等を例示することができる。これらのアイソトープは、直接的に抗体分子に結合する方法（例えば、米国特許第４，４２４，２００号）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）のようなキレート剤を介して抗体分子に結合させる方法（例えば、米国特許第４，４７９，９３０号）、あるいはクロラミンＴ法（Ｈｕｎｔｅｒ  Ｗ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  Ｆ．Ｃ．  （１９６２）  Ｎａｔｕｒｅ  １９４：４９５）による標識化等の方法で抗体分子に結合することができる。
【００１４】
このようにして作製されたアイソトープ標識化抗テネイシンＣモノクローナル抗体は、炎症や腫瘍等によって組織再構築を起こす病態を有する患者に静脈投与し、例えばシングルフォトン断層装置（ＳＰＥＣＴ）等によって放射活性を画像化することによって、炎症や腫瘍の程度、病変の大きさ、進行状態等を高精度で非侵襲的に診断することが可能となる。
【００１５】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００１６】
【実施例】
１．方法
１−１．ＥＡＭの誘導
４０匹の７週齢Ｌｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ＋  Ｉｎｃ．  Ｊａｐａｎ）を用い、文献（Ｉｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  １９９７；  ９５：  ４８９−４９６）に基づいてＥＡＭ誘導を行った。すなわち、７日間隔で２回にわたり、フロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて、ラットに対して１０ｍｇ／ｍＬのブタ心臓ミオシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）による免疫を行うか、またはＦＣＡのみで免疫を行った（対照ラット）。実験は全て初回免疫の１７日後に実施した。
１−２．抗体とウエスタンブロッティング
ＴＮＣに対するマウスモノクローナル抗体であるクローン４Ｆ１０ＴＴは、ＴＮＣ−ｎｕｌｌマウス（Ｓａｇａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．  １９９２；  ６：  １８２１−１８３１）に対して、文献（Ｉｍａｎａｋａ−Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００２；  １９７（３）：３８８−９４）記載の方法で精製したヒトＴＮＣ（Ａｕｋｈｉｌ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｔｒｉｘ．  １９９０；  １０：  ９８−１１１）を用いて免疫することで作製した。ＴＮＣで免疫したマウスから単離した脾臓細胞を、ＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合させた。免疫グロブリンの精製は、無血清培地中で培養したハイブリドーマ細胞クローン４Ｆ１０ＴＴの培養上清より行った。抗体のＦａｂ’断片の調製は、未処置抗体をペプシン消化した後、メルカプトエタノールでＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド結合を還元することにより行った。
【００１７】
非特異的な対照抗体としては、パラインフルエンザウイルスタイプＩＩ（クローン５３−１、イソタイプ１ｇＧ１ｋ）（三重大学医学部の微生物研究室より供与）のＶタンパク質に対するイソタイプ合致のモノクローナル抗体を、上述の方法で同様に消化してＦａｂ’断片にした。
【００１８】
イムノブロッティングは文献（Ｋａｌｅｍｂｅｙｉ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．  １９９７；４１：  ５６９−５７３）記載の方法で行った。すなわち、２１日目にラットから心臓を摘出し、４ｍＬの緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＰＭＳＦ／１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ  ７．４）中で心筋をホモジナイズした。タンパク質の試料（２０μｇ／レーン）を２−１５％勾配のポリアクリルアミドゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、Ｉｍｏｂｉｌｉｏｎ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）上に電気泳動的に転写した。転写したタンパク質の免疫染色を、４Ｆ１０ＴＴ（１μｇ／ｍＬ）により間接免疫ペルオキシダーゼ法を用いて行った。
１−３．免疫組織化学染色
組織切片に対する免疫染色は、文献（Ｉｍａｎａｋａ−Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｒｓｔ．  ２００１；  ８１：  １０１５−１０２４）に記載の方法で行った。すなわち、最初に一次抗体である４Ｆ１０ＴＴ（１μｇ／ｍＬ）と共に、次にペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（１：５００、ＭＢＬ）と共に切片をインキュベートした。洗浄後、ジアミノベンチジン／Ｈ２Ｏ２溶液を用いて発色した。スライドはヘマトキシリンを用いて軽く対比染色してから顕微鏡観察を行った。
１−４．インジウム−１１１を用いた放射性標識
文献（Ａｒａｎｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．  １９９５；  ２２：  ５５５−５６４；  Ａｒａｎｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  １９９６；３９：  ３４５１−３４６０２）の記載に従い、２種類の抗体の精製Ｆａｂ’断片のチオール基に、１−［４−［（５−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｙｌ］−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＭＣＳ−Ｂｚ−ＥＤＴＡ）のマレイミド基を結合させ、抗体の抗原結合部位から離れた位置に放射性金属キレートを配置した。０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中のＦａｂ’の１ｍＬ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）中に、同緩衝液に溶解した６０μＬのＥＭＣＳ−Ｂｚ−ＥＤＴＡ（５．３ｍｇ／ｍＬ）を添加した。３時間にわたるインキュベーション後、２０μＬのヨードアセトアミド（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、未反応チオール基をマスクした。対応する抗体断片分子あたりの結合ＥＭＣＳ−Ｂｚ−ＥＤＴＡ分子数を測定した（Ａｒａｎｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  １９９６；３９：  ３４５１−３４６０２）。次にＭＥＳ（２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）  ｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）で緩衝した生理食塩水（ｐＨ６．０）を用いて平衡化および流出を行うＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラムクロマトグラフィー（１．８ｃｍ×４０ｃｍ）を用いて、それぞれの複合体の精製を行い、未反応の低分子量化合物を除去した。
【００１９】
精製した複合体を、文献（Ａｒａｎｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  １９９６；３９：  ３４５１−３４６０２）記載の方法に従い、１１１Ｉｎを用いて標識した。１１１Ｉｎ−標識された抗体断片の精製は、０．１Ｍリン酸塩で緩衝した生理食塩水（ｐＨ６．０）で平衡化されたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を用いて、遠心カラム処置により行った。１１１Ｉｎ−標識された抗体断片の放射線化学的純度の測定は、酢酸セルロース電気泳動とゲル濾過ＨＰＬＣにより行った。
１−５．生物学的分布の調査
１０例のＥＡＭラットと１０例の対照ラットに、３００μＬ生理食塩水に溶解した１００μｇ（３μＣｉ）の１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’を、尾部静脈経由で静注した。３−４匹の動物グループをトレーサー注射後６、２４および４８時間後に安楽死させた。心臓、他の臓器（肺、肝臓、腎臓、脾臓、大脳、足の掌、および後肢の骨格筋）および血液の重量を測定し、次に血液試料の放射活性を測定した。ＥＡＭラットでは肺浸出液のサンプル採取も行った。組織重量のグラムあたり放射活性の注射投与量の比率（％ＩＤ／ｇ）を計算した。放射性トレーサーのＥＡＭ標的特性における用量依存性の変化を評価するため、それぞれ３例のラットのグループに異なる量の１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’（ラットあたり１０、５０または１００μｇ）を投与し、注射６時間後に安楽死させ、心臓や他の器官の放射性トレーサー取り込みを評価した。
【００２０】
またＥＡＭラットにおいて、同量の１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’（ｎ＝３）または１１１Ｉｎ−非特異的Ｆａｂ’（ｎ＝５）を注射し、６時間後の放射活性分布を比較することにより、抗−ＴＮＣ抗体の特異的取り込みの評価を行った。
１−６．組織病理学的および定量的オートラジオグラフィー試験
２種類のグループのＥＡＭラットに、１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’または１１１Ｉｎ−非特異的Ｆａｂ’を等量（２０μＣｉ、５０μｇ）投与した。対照ラットには、同じく等量の１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’を注射した。注射６時間後に心臓を切除して、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ材料（Ｍｉｌｅｓ，  Ｅｌｋｈａｒｔ，  Ｉｎ）中に埋め込んだ。５μｍ厚の切片をスライド上にマウントし、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ−Ｅ）により染色し、病理学的分析を行った。２０μｍ厚の切片をオートラジオグラフィーに曝露した。造影版（ＩＰ）を２４時間曝露し、イメージアナライザ（ＢＡＳ−１８００  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）により分析を行った。それぞれの心筋組織のオートラジオグラフィーの強度は［（ＰＳＬ−ＢＧ）／Ａ］（ＰＳＬ、光刺激蛍光；ＢＧ、背景のＰＳＬ；Ａ、領域［ｍｍ２］）で示した。
１−７．Ｉｎ  ｖｉｖｏ造影
ＥＡＭラットにおける１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’のｉｎ  ｖｉｖｏ造影は、単一フォトン放出コンピュータ化トモグラフィー（ＳＰＥＣＴ）を用いて行った。ＳＰＥＣＴシステムは、１．０ｍｍのピンホールコリメーターを持つ３ヘッドのガンマカメラ（Ｔｏｓｈｉｂａ  ＧＣＡ  ９３００Ａ，Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）により構成されている。２．２ＭＢｑの１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’を静注し、５．５時間後に３７ＭＢｑの９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩを注射した。３０分後に、６０分のデータ取得を１２０秒／ビューにわたり行ったが、この時には段階的回転を４度毎に１２０度以上行い、また複数ピーク取得を行った（９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎの両ピークについて１５％ウインドウ）。データ取得とピクセルサイズ０．６ｍｍのイメージ表示は両方ともマトリックスが１２８ｘ１２８であった。
２．結果
２−１．ＥＡＭ心臓のＴＮＣ発現
心筋のウエスタンブロット分析により、ＥＡＭラットでは、２個の強いバンドが約２７０および２３０ｋＤａの位置に観察されたが（図１、矢印、レーン２）、正常ラットの心筋ではバンドが観察されなかった（レーン１）。ヒトグリオーマＴＮＣでは、３個のバンドが約３００、２４０および２１０ｋＤａの位置に検出された（矢印、レーン３）。
【００２１】
抗原の初回注射から２１−２８日後に、重度の炎症細胞浸出と筋細胞の壊死が心筋全体にわたり確認された（図２ｂ）。間質にはＴＮＣに対する強い免疫染色が見られた。一方、正常な心筋に免疫染色は見られなかった（図２ａ）。
２−２．１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’のｉｎ  ｖｉｖｏにおける生物学的分布
抗体分子に結合しているＥＭＣＳ−Ｂｚ−ＥＤＴＡ基の数は、抗−ＴＮＣ抗体および対照抗体についてそれぞれ１．４および１．６であった。それぞれの抗体断片の分子あたりに見られるヨードアセトアミド添加後の遊離チオール基は０．０５個未満であることが分かった。遠心カラム処理による精製後、１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’と１１１Ｉｎ−非特異的Ｆａｂ’が得られたが、この時の抗−ＴＮＣ抗体と非特異的抗体の放射線化学的純度はそれぞれ９６．９％および９７．６％であった。
【００２２】
１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’の組織取り込みについて、グラム組織あたりの注射投与量の比率として表１にまとめた（％ＩＤ／ｇ）。１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’を用いた場合には、放射活性の循環中からの急速なクリアランスが、ＥＡＭおよび対照ラットの両方で観察された（注射６時間後に＜１％）。全ての時点で腎取り込みが最大であり、脾臓と肝臓が次点、その次に心筋という順であった。しかしながら、対照ラットではＥＡＭラットと比較して、心筋の取り込みが有意に低下していた。ＥＡＭラットの心臓の放射活性は、対照ラットと比べて有意に高値となっており、６、２４および４８時間の時点でそれぞれ７．５４、４．３９および３．５１倍であった。ＥＡＭラットの放射活性の心臓／血液比は対照ラットと比べてかなり増加しており、注射後に徐々に増加した（表１）。心筋取り込みと肺や肝臓などの隣接臓器の取り込みとの比較も表１に示している。放射性トレーサーの心臓／肝臓および心臓／肺の放射能比率が最大になるのは注射後６時間であった。
【００２３】
【表１】
2004217546.tif 000002
【００２４】
ＥＡＭラットでの１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’の生物学的分布における用量依存的変化から、１０μｇの放射線標識抗体を用いた場合の肝臓と脾臓におけるトレーサーの取り込みは、５０または１００μｇの放射線標識抗体を用いた場合の値を上回ることが示された。１００μｇの抗体を用いた場合の心臓におけるトレーサー取り込みは、１０または５０μｇを用いた場合を下回った。このため、以後の実験ではラットあたり５０μｇの抗体の投与量を用いた。
【００２５】
ＥＡＭラットにおける抗−ＴＮＣ抗体と非特異的抗体の放射活性分布の比較を表２にまとめた。心臓における１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’の注射時には、１１１Ｉｎ−非特異的Ｆａｂ’を用いた場合と比較して非常に高い放射活性が観察された（１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’；２．６０±０．３２に対して１１１Ｉｎ−非特異的Ｆａｂ’；０．３２±０．０６）。１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’の放射活性を１１１Ｉｎ−非特異的Ｆａｂ’の場合と比較すると、腎臓では比較的低く、血液、肝臓および脾臓では比較的高かった。
【００２６】
【表２】
2004217546.tif 000003
【００２７】
２−３．組織病理学的および定量的オートラジオグラフィー試験
オートラジオグラフィーによれば、１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’を投与したＥＡＭラットでは、炎症部位と同じ領域に高い放射活性が観察された（図３、１行目）。１１１Ｉｎ−非特異的Ｆａｂ’を用いたＥＡＭラット（２行目）、および１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’を用いた正常ラット（３行目）には放射活性の蓄積が見られなかった。
【００２８】
各ラット群のそれぞれの心筋組織におけるオートラジオグラフィー強度の比率を、表３にまとめている。元のオートラジオグラフィー画像が非常に小さいため、この分析での対象領域（ＲＯＩｓ）は心臓全体のオートラジオグラムに位置させた。ＥＡＭラット心臓では、１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’の高度蓄積がはっきり現れている。
【００２９】
【表３】
2004217546.tif 000004
【００３０】
２−４．Ｉｎ  ｖｉｖｏ造影
最後に、１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’の造影を用いてｉｎ  ｖｉｖｏの心筋傷害を検出できる可能性について調査を行った。ＳＰＥＣＴ造影によって、１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’の病巣部取り込みがはっきり示された（図４ａ）。９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩの心筋潅流画像処置（図４ｂ）では、１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’の場合を相補する画像が示された（図４ｃ）。
【００３１】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、炎症組織や腫瘍組織等において特異的に発現するテネイシンＣを、非侵襲的に高精度で測定する手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】心筋組織のウエスタンブロット分析の結果である。正常ラット（レーン１）およびミオシン誘導性の自己免疫心筋炎後２１日目のラット（レーン２）の心臓に由来する抽出タンパク質を、ヒトグリオーマ細胞に由来する精製ＴＮＣ（レーン３）と共に電気泳動を行い、マウスモノクローナル抗−ＴＮＣクローンの４Ｆ１０ＴＴを用いて免疫化学的染色を行った。
【図２】ラット心筋組織のＴＮＣに対する、正常（ａ）およびミオシン初回注射後２１日目（ｂ）の切片の免疫染色の結果である。（ａ）のバーは５０μｍ。
【図３】放射性標識したＦａｂ’断片を投与した（１：抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’、２および３：非特異的Ｆａｂ’）３例のラット（１および２：ＥＡＭラット、３：正常ラット）の心臓からの隣接切片のＨ−Ｅ染色（ａ）、図式的（ｂ）およびオートラジオグラフィー（ｃ）。図中の薄灰色領域は、炎症細胞の浸潤と心筋細胞の傷害がが見られる領域を示す。
【図４】ＥＡＭラットにおける１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’および９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩの横断二重同位体トモグラフィー画像である。（ａ）矢印は１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’の病巣部取り込みを示す。（ｂ）９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩ心筋潅流画像。（ｃ）重ね合わせた画像から、１１１Ｉｎ−抗−ＴＮＣ  Ｆａｂ’の病巣部取り込みが心室中隔に検出されていることが示された。Ａ＝上方；Ｌ＝側方；Ｐ＝下方；Ｓ＝心室中隔。
【図１】
2004217546.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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