(57)【要約】【課題】様々な種類のｃＤＮＡ断片が混在するｃＤＮＡ断片の群から目的とするｃＤＮＡ断片をより確実に回収することができるＤＮＡ回収法を提供すること。【解決手段】ＤＮＡ回収法は、一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するｃＤＮＡ断片の群について、第１アダプター配列に相補的な配列を有すると共に標識物質を有する第１プライマーと、第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、ＰＣＲ反応を行う第１ＰＣＲ工程を備える。また、第１ＰＣＲ工程で増幅されたｃＤＮＡ断片の群についてゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、電気泳動の結果に基づいて、ゲルから目的のｃＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、当該ｃＤＮＡ断片を回収する回収工程とを備える。【選択図】　　　　図５
2004113108.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するｃＤＮＡ断片の群について、上記第１アダプター配列に相補的な配列を有すると共に標識物質を有する第１プライマーと、上記第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、ＰＣＲ反応を行う第１ＰＣＲ工程と、
上記第１ＰＣＲ工程で増幅されたｃＤＮＡ断片の群についてゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、
上記電気泳動工程の結果に基づいて、ゲルから目的のｃＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、当該ｃＤＮＡ断片を回収する回収工程と、
を備えることを特徴とするＤＮＡ回収法。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡ回収法であって、
前記回収工程で回収したｃＤＮＡ断片について、前記第１アダプター配列に相補的な配列を有する第３プライマーと、前記第２アダプター配列に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、再度ＰＣＲ反応を行う第２ＰＣＲ工程を備える
ことを特徴とするＤＮＡ回収法。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡ回収法であって、
前記第２ＰＣＲ工程において、ＲｅｃＡタンパク質及びこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を反応液に混合して、ＰＣＲを行う
ことを特徴とするＤＮＡ回収法。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のＤＮＡ回収法であって、
前記回収工程後、または、前記第２ＰＣＲ工程を有する場合には第２ＰＣＲ工程後、前記ｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程と、
上記組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程と、
を備えることを特徴とするＤＮＡ回収法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、目的とするＤＮＡ断片を回収する方法に関し、特に、様々な種類のｃＤＮＡ断片が混在するｃＤＮＡ断片の群から目的とするｃＤＮＡ断片を回収するＤＮＡ回収法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、様々なｃＤＮＡ断片が混在するｃＤＮＡ断片の群から、目的とするｃＤＮＡ断片を回収するＤＮＡ回収法が、いくつか知られている。
例えば、平板ゲルを利用して、ｃＤＮＡ断片の群から目的とするｃＤＮＡ断片を回収する方法がある（例えば、非特許文献１参照。）。即ち、ｃＤＮＡ断片の群について、例えばアクリルアミドゲル電気泳動を行う。その後、アクリルアミドゲル中のｃＤＮＡ断片をエチジウムブロミドで染色し、ＵＶトランスイルミネータによりアクリルアミドゲルを照らしてｃＤＮＡ断片を検出する。そして、分画されたｃＤＮＡ断片の群から目的のｃＤＮＡ断片を含むアクリルアミドゲルを切り出し、そのゲルから当該ｃＤＮＡ断片を回収する。
【０００３】
また、例えば、キャピラリー電気泳動を利用して、ｃＤＮＡ断片の群から目的とするｃＤＮＡ断片を回収する方法もある（例えば、特許文献１〜３参照。）。即ち、予め蛍光標識したｃＤＮＡ断片の群をキャピラリーカラムに供試し電気泳動を行う。そして、検出されたピークに基づいて、目的のｃＤＮＡ断片が泳動されて来る時間を推測する。次に、再びキャピラリーカラムで電気泳動を行い、その推定時間をもとに目的のｃＤＮＡ断片を回収する。
【０００４】
【非特許文献１】
Ａ　ｎｅｗ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＤＮＡ．
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　　１９７７，７４：５６０−５６４
【特許文献１】
特開２０００−８８８０３号公報
【特許文献２】
特開平７−１８１１６４号公報
【特許文献３】
特開平６−１３８０３７号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前者の方法では、目的とするｃＤＮＡ断片が少量しか存在しない場合、ゲル電気泳動後、ｃＤＮＡ断片を染色しても、ＵＶトランスイルミネータ下でそれを検出することができないため、目的とするｃＤＮＡ断片を回収できないという問題がある。
一方、後者の方法では、蛍光標識したｃＤＮＡ断片を使用しているので、目的とするｃＤＮＡ断片が少量であっても、これを検出することは可能である。しかしながら、この方法では、ｃＤＮＡ断片を目視しながら回収することができないため、目的のｃＤＮＡ断片がキャピラリーカラムの先端部分に現れる時間を予想して回収する。そのため、回収したｃＤＮＡ断片には、目的とするｃＤＮＡ断片に加え、目的物とほぼ同じくらいの長さのｃＤＮＡ断片が混在する可能性がある。また、サイズ分画能が平板ゲルを使用した場合と比較すると良くないため、回収したｃＤＮＡ断片の中に目的物以外のものが混在したり、また、目的とするｃＤＮＡ断片の回収率の低下を招くこともある。
【０００６】
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、様々な種類のｃＤＮＡ断片が混在するｃＤＮＡ断片の群から目的とするｃＤＮＡ断片をより確実に回収することができるＤＮＡ回収法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段、作用及び効果】
その解決手段は、一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するｃＤＮＡ断片の群について、上記第１アダプター配列に相補的な配列を有すると共に標識物質を有する第１プライマーと、上記第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、ＰＣＲ反応を行う第１ＰＣＲ工程と、上記第１ＰＣＲ工程で増幅されたｃＤＮＡ断片の群についてゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、上記電気泳動工程の結果に基づいて、ゲルから目的のｃＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、当該ｃＤＮＡ断片を回収する回収工程と、を備えることを特徴とするＤＮＡ回収法である。
【０００８】
本発明のＤＮＡ回収法は、両端にアダプター配列を有するｃＤＮＡ断片の群から、目的とするｃＤＮＡ断片を回収する方法である。まず、ｃＤＮＡ断片の一端にある第１アダプター配列に相補的な配列を有すると共に標識物質を有する第１プライマーと、ｃＤＮＡ断片の他端にある第２アダプター配列に相補的な配列を有する第２プライマーとを用いて、ＰＣＲ反応を行う。そして、増幅されたｃＤＮＡ断片の群（ＰＣＲ産物）をゲル電気泳動する。その後、その電気泳動の結果に基づいて、ゲルから目的のｃＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、そこからｃＤＮＡ断片を回収する。
【０００９】
このような方法によれば、予めゲル電気泳動前にｃＤＮＡ断片の群についてＰＣＲ反応を行うので、ｃＤＮＡ断片の群を多量に増幅することができる。従って、目的とするｃＤＮＡ断片が低濃度であっても、それを大幅に増幅することができ、ゲル電気泳動においてそれを検出することができる。
また、このＰＣＲ反応では、標識物質を有するプライマーを用いているので、ＰＣＲ産物も標識物質を有することになる。従って、ＰＣＲ反応を行っても依然として目的とするｃＤＮＡ断片が比較的少ない場合であっても、電気泳動においてこの標識物質を認識することで、目的とするｃＤＮＡ断片のゲル中の位置を容易に検出することができる。
さらに、ｃＤＮＡ断片の群をゲル電気泳動によって分画するため、例えばキャピラリーカラムによる電気泳動に比べ、サイズ分解能を向上させ、目的とするｃＤＮＡ断片のみをより特異的に回収することができる。
【００１０】
ここで、サンプルとする様々なｃＤＮＡ断片からなるｃＤＮＡ断片の群については、一端に第１アダプター配列を有し他端に第２アダプター配列を有するものであれば、いかなるものであってよい。即ち、ｃＤＮＡ断片の由来は問われず、動植物細胞から抽出したｍＲＮＡから作製したものであっても、ウイルスや微生物から抽出したｍＲＮＡから作製したものであってもよい。また、ｃＤＮＡ断片の群は、抽出に用いた細胞で発現されたほとんどすべての遺伝子が含まれる群であっても、その発現された遺伝子の一部だけが含まれる群であってもよい。また、ｃＤＮＡ断片は、全長ｃＤＮＡの両端にアダプター配列が付いたものでも、全長ｃＤＮＡの一部分をなす断片の両端にアダプター配列が付いたものでもよい。また、第１アダプター配列及び第２アダプター配列は、それぞれいかなる塩基配列からなるものであっても構わないが、ＰＣＲの効率等を考慮して設計されたものであるのが好ましい。即ち、これらのアダプター配列がそれぞれ１５塩基前後であると、安定したＰＣＲ反応を行うことができ、効率よくｃＤＮＡ断片を増幅することができる。
【００１１】
第１プライマーは、第１アダプター配列に相補的な配列を有し、かつ、標識物質を有するものであれば、いかなるものであってもよい。ここでいう相補的な配列とは、第１アダプター配列に対し１００％相補的な配列に限られず、ＰＣＲ反応においてｃＤＮＡ断片を増幅されることができる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第１プライマーは、第１アダプター配列に相補的な配列のみからなるものに限られず、第１アダプター配列に相補的な配列に、さらに他の配列が繋がったものであってもよい。第１プライマーは、第１アダプター配列全体に対応するものに限られず、第１アダプター配列の一部に対応するものでもよい。
【００１２】
また、標識物質は、ゲル電気泳動において検出感度が高いものであれば、いずれのものを使用することもできる。例えば、６−カルボキシフルオレッセイン（以下、ＦＡＭと称す。）、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（以下、ＨＥＸと称す。）、ＮＥＤ（アプライドバイオシステムズジャパン社）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（以下、Ｒｏｘと称す。）等の蛍光物質などを使用することができる。これらの標識物質は、例えば、プライマーＤＮＡの末端（例えば５’末端）に結合させればよい。
【００１３】
第２プライマーは、第２アダプター配列に相補的な配列を有するものであれば、いかなるものであってもよい。ここでいう相補的な配列も、第２アダプター配列に対し１００％相補的な配列に限られず、ＰＣＲ反応においてｃＤＮＡ断片を増幅させることができる程度に実質的に相補的な配列も含まれる。また、第２プライマーについても、第２アダプター配列に相補的な配列のみからなるものに限られず、第２アダプター配列に相補的な配列に、さらに他の配列が繋がったものであってもよい。また、第２プライマーについても、第２アダプター配列全体に対応するものに限られず、第２アダプター配列の一部に対応するものでもよい。さらに、上述の第１プライマーだけでなく、この第２プライマーにも、上述の標識物質が結合されていても構わない。
【００１４】
次に、その他一般にＰＣＲ反応で用いられる種々の試薬について説明する。
ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ反応においてＤＮＡ鎖を変性させる際の高温に短時間加熱されても永久的には不活性化されず、しかも、高温における活性を有するものが好適である。例えば、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、メタノサーマス・フェルビドゥス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｆｅｒｖｉｄｕｓ）、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ．フラブス（Ｔ．ｆｌａｖｕｓ）、Ｔ．ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｔ．ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、Ｔ．ルバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）などの高熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼや、デスルフロコッカス・モビリス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィルクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｌｃｕｍ）、スルホロブス・ソルファタリクス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、Ｓ．アシドカルダリウス（Ｓ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、サーモプラスマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ　ＫＯＤ１株）などの高熱性古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。これらのうち、入手容易性等の理由から、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ、あるいは、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ　ＫＯＤ１株）由来のＤＮＡポリメラーゼを利用するのが好ましい。
【００１５】
さらに、ＰＣＲ反応液には、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅前の活性を阻害するために、ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を混合してもよい。この抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え法により製造された抗体、化学的または組換え法により製造された抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）が挙げられる。これらのうち、モノクローナル抗体を用いるのが特に好ましい。例えば、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼに対する公知のモノクローナル抗体は、約２０℃〜４０℃においてＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を阻害することができると共に、ＰＣＲの熱的サイクルにおける高温によって不活性化される。
【００１６】
また、ＰＣＲ反応は、一般に、４種類のｄＮＴＰ、即ち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの存在化において行う。
さらに、ＰＣＲ反応は、一般に、適当な緩衝剤を含む反応液中で行われる。効率よく核酸を増幅させるためである。緩衝液は、使用するＤＮＡポリメラーゼ等により、反応の最適条件を得るため適宜変更することができる。例えば、ｐＨを適当に調整したトリス系の緩衝液に、塩化カリウムや塩化マグネシウムを加えた緩衝液を利用することができる。
また、ＰＣＲ反応液には、５％〜１０％のＤＭＳＯと１％〜２％のベタインを添加してもよい。鋳型ＤＮＡとなるｃＤＮＡ断片が二字構造を有する場合に産物が増幅されにくいという問題を、最小限に留める効果を有するものである。
【００１７】
電気泳動工程では、アクリルアミドゲル電気泳動やアガロースゲル電気泳動など、公知の平板ゲル電気泳動などにより、ｃＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）を電気泳動し、ｃＤＮＡ断片を分画する。電気泳動には、公知の電気泳動装置を利用すればよい。
【００１８】
回収工程は、電気泳動工程の結果に基づいて、ゲルから目的とするｃＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、そのＤＮＡ断片を回収する工程であれば、いかなる方法を利用することもできる。
即ち、例えば、後述する実施例に示すように、標識物質を検出することができるＤＮＡシークエンサーにｃＤＮＡ断片を供試して電気泳動工程を行い、その解析結果から、回収するｃＤＮＡ断片を決定する。次に、再度同一サンプルを電気泳動して、目的とするｃＤＮＡ断片が検出されたときに、その部分のゲルを切り出し、そこからｃＤＮＡ断片を回収する方法が挙げられる。
また、ゲル電気泳動後、標識物質を検出することができるスキャナー上にゲルを載置し、その解析結果から回収するｃＤＮＡ断片を決定する。そして、その部分のゲルを切り出し、そこからｃＤＮＡ断片を回収する方法が挙げられる。
【００１９】
ところで、両端にアダプター配列を有するｃＤＮＡ断片の群は、例えば、次のようにして作製することができる。
即ち、細胞から抽出したｍＲＮＡから、その５’末端にタグ物質を付加されたｃＤＮＡ断片を合成する工程と、得られたｃＤＮＡ断片を第１制限酵素によって切断する工程と、上記タグ物質に高親和性を有する高親和性物質を結合させることにより、タグ物質を有するｃＤＮＡ断片を回収する工程と、回収されたｃＤＮＡ断片に、上記第１制限酵素の酵素切断部位の配列に相補的な配列を有する第１アダプター配列を結合させる工程と、上記第１アダプター配列を結合させたｃＤＮＡ断片を第２制限酵素によって切断する工程と、上記高親和性物質を結合させて、上記タグ物質を有するｃＤＮＡ断片を除去し、上記タグ物質を有しないｃＤＮＡ断片を回収する工程と、上記タグ物質を有しないｃＤＮＡ断片に、上記第２制限酵素の酵素切断部位の配列に相補的な配列を有する第２アダプター配列を結合させる工程と、を備える方法によって、両端にアダプター配列を有するｃＤＮＡ断片の群を作製することができる。
さらに、このようなｃＤＮＡ断片の群について、上記第１アダプター配列に相補的な配列を有しかつその３’末端に任意の２塩基配列であるＮＮを有するプライマーと、上記第２アダプターの配列に相補的な配列を有しかつその３’末端に任意の２塩基配列であるＮＮを有するプライマーとを用いて、ＰＣＲ反応を行う工程により、上記のｃＤＮＡ断片の群を小規模なｃＤＮＡ断片の群に分類することもできる。
【００２０】
このような方法によってｃＤＮＡ断片の群を作製すれば、発現されたほとんど全ての遺伝子、即ち、公知の遺伝子も未知の遺伝子も同様に、その群の中に含まれるようにすることが可能である。従って、遺伝子解析等において有効に活用することができる。また、解析が容易となるように、ｃＤＮＡ断片の群を複数の小規模な群に分類することができる。
【００２１】
なお、タグ物質とタグ物質に高親和性を有する高親和性物質とは、互いに高親和性をもって特異的に結合することが可能な結合対を構成する物質を示す。タグ物質と高親和性物質の組合せとしては、例えば、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、ＦＩＧＴとＦＩＴＣ抗体、ＤＩＧとアンタイＤＩＧ、プロテインＡとマウスＩｇＧ、ラテックス粒子等が挙げられる。また、各組合せにおいて、いずれをタグ物質として使用しても、いずれを高親和性物質として使用してもよい。
【００２２】
また、制限酵素とは、一般的に、制限エンドヌクレアーゼとも称される酵素であり、特定の配列において二本鎖ＤＮＡを加水分解し切断する酵素である。上記の方法においては、適切な断片を得るために２種類の制限酵素（第１制限酵素及び第２制限酵素）を組み合わせて使用する。使用する制限酵素は、ｃＤＮＡ断片を識別可能な長さを有する断片に切断することが可能なものが好ましい。また、合成されたｃＤＮＡ断片のより多くを、好ましくは、ほとんど全てを切断するような酵素が好ましい。また、制限酵素は、４塩基認識酵素を使用しても６塩基認識酵素を使用してもよいが、特に、上記の理由から、４塩基認識酵素の使用が好ましい。
【００２３】
また、アダプター配列は、ＰＣＲ増幅の際に用いるプライマーを結合させるために用いるものであるが、使用する制限酵素に応じて設計される。即ち、第１制限酵素の酵素切断部位に結合させるための第１アダプター配列は、第１制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有し、また、第２制限酵素の酵素切断部位に結合させるための第２アダプター配列は、第２制限酵素の酵素切断部位に相補的な配列を有する。
【００２４】
また、プライマーセットは、ｃＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅するために使用する１組のプライマーからなる。ここで使用される「任意の２塩基配列であるＮＮ」は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃから任意に選択される配列である。ここで、各任意の配列を２塩基としたのは、当該方法の簡便性と解析精度を考慮した結果である。つまり、各任意の配列を２塩基とすることにより、最大２５６種類のプライマーセットが得られるため、ｃＤＮＡ断片の群を複数の群に分類することができる。なお、この任意の２塩基配列ＮＮを、一方のプライマーまたは両方のプライマーについて３塩基以上とすることも可能である。それによってプライマーの種類が増え、プライマーセットを最大１０２４個や最大４０９６個とすることができる。
【００２５】
さらに、上記のいずれかに記載のＤＮＡ回収法であって、前記回収工程で回収したｃＤＮＡ断片について、前記第１アダプター配列に相補的な配列を有する第３プライマーと、前記第２アダプター配列に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、再度ＰＣＲ反応を行う第２ＰＣＲ工程を備えることを特徴とするＤＮＡ回収法とすると良い。
【００２６】
本発明では、回収工程で回収したｃＤＮＡ断片について、再度ＰＣＲ反応を行う第２ＰＣＲ工程を備える。このため、回収したｃＤＮＡ断片が少量しかなくても、それを大幅に増幅させることができる。
なお、このＰＣＲ工程で使用する第３プライマーは、第１アダプター配列に相補的な配列を有するものであればよく、例えば、上記の第１プライマーを利用しても良いが、このＰＣＲ工程では標識物質は特に要しない。同様に、第４プライマーは、第２アダプター配列に相補的な配列を有するものであればよく、例えば、上記の第２プライマーを利用しても良い。
【００２７】
さらに、上記のＤＮＡ回収法であって、前記第２ＰＣＲ工程において、ＲｅｃＡタンパク質及びこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を反応液に混合して、ＰＣＲを行うことを特徴とするＤＮＡ回収法とすると良い。
【００２８】
本発明によれば、第２ＰＣＲ工程において、ＲｅｃＡタンパク質等の相同組み換えタンパク質を反応液に混合してＰＣＲを行い、回収したｃＤＮＡ断片を増幅させる。
このようにＰＣＲを行えば、ｃＤＮＡ断片の収量を減少させることなく、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーがｃＤＮＡ断片の非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
【００２９】
また、本発明では、上記のように特異性が高いため、アニーリング温度等、プライマー伸長反応の温度条件を変えても、回収したｃＤＮＡ断片を特異的に増幅させることができる。即ち、従来のＰＣＲ方法では、アニーリング温度等、プライマー伸長反応の温度を低く設定すると、回収したｃＤＮＡ断片だけでなく、副産物も多量に増幅されることとなるが、本発明によれば、回収したｃＤＮＡ断片をより特異的に増幅させることが可能となる。
これらの結果、目的とするｃＤＮＡ断片をさらに確実に回収することができる。
【００３０】
ここで、上記の相同組み換えタンパク質は、ＲｅｃＡタンパク質、及び、ＲｅｃＡタンパク質を改変したものであって　ＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質、の少なくともいずれかを含むものであれば、いかなるものを用いてもよい。ＲｅｃＡ改変タンパク質としては、例えば、ＲｅｃＡタンパク質をコードする遺伝子から、部位特異的変位誘発等により作出された遺伝子の産物であって、１または数個のアミノ酸が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。また、ＲｅｃＡタンパク質のタンパク質断片であって、タンパク質と類似する機能を有するもの（ＲｅｃＡフラグメント）などであってよい。
【００３１】
また、ＲｅｃＡタンパク質等は、上述したＤＮＡポリメラーゼと同様に、ＰＣＲ反応においてＤＮＡ鎖を変性させる際の高温に短時間加熱されても永久的には不活性化されず、しかも、高温における活性を有するものが好適である。例えば、入手容易性等の理由から、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＲｅｃＡタンパク質を利用するのが好ましい。
【００３２】
なお、上記の相同組み換えタンパク質は、プライマー２０ｐｍｏｌあたり、１ｎｇ〜１０００ｎｇの範囲で混合するのが好ましい。このような範囲でＰＣＲを行えば、より効率よく特異的に、ｃＤＮＡ断片を増幅することができるからである。
【００３３】
さらに、上記のいずれかに記載のＤＮＡ回収法であって、前記回収工程後、または、前記第２ＰＣＲ工程を有する場合にはこの第２ＰＣＲ工程後、前記ｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程と、上記組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程と、を備えることを特徴とするＤＮＡ回収法とすると良い。
【００３４】
本発明のＤＮＡ回収法は、第２ＰＣＲ工程を有しない場合には回収工程後、または、第２ＰＣＲ工程を有する場合には第２ＰＣＲ工程後、目的のｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程を備える。そしてさらに、この組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程を備える。
このように、回収したｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターに連結し、大腸菌に導入しておけば、ｃＤＮＡ断片の構造解析をする場合などに有効である。即ち、形質転換したその大腸菌を培養し、それからｃＤＮＡ断片を有するプラスミドＤＮＡを抽出すれば、これを例えば塩基配列の決定等の構造解析に用いることができる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
（実施例１）
以下、本発明の実施例を、図を参照しつつ説明する。
本実施例においては、まず、特定の細胞において発現された遺伝子を以下のように分類する。まず、抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡ群を合成する。そして、得られたｃＤＮＡ群を適切な２つの制限酵素によって切断し、また、両端にアダプター配列を結合して、識別可能なだけの長さを有しかつ両端にアダプター配列を有するｃＤＮＡ断片の群を作成する。その後、得られたｃＤＮＡ断片の群を、複数種類のプライマーセットを用いて複数の群に分類する。
【００３６】
この分類の手法を図１を参照しつつ説明する。発現されたｍＲＮＡからなる群１から公知の手法によりｃＤＮＡの群２を合成する。これを適切な２つの制限酵素によって切断してｃＤＮＡ断片の群３を得る。そして、このｃＤＮＡ断片の両末端の各２塩基、全４塩基の配列に応じて、即ち、４塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれであるかにより、ｃＤＮＡ断片の群３を分類する。例えば、５’末端の塩基（図１中に黒塗りで示す。）を区別することで、群３を４種類の群４に分類することができる。そして、次の２番目の塩基（図１中に黒塗りで示す。）を区別することで、群４をそれぞれ４種類の群５に分類することができる。さらに、３’末端の２番目の塩基（図１中に黒塗りで示す。）を区別することで、群５をそれぞれ４種類の群６に分類することができる。またさらに、３’末端の塩基（図１中に黒塗りで示す。）を区別することで、群６をそれぞれ４種類の群７に分類することができる。
【００３７】
次に、抽出したｍＲＮＡの群１から複数のｃＤＮＡ断片の群７を調製する手法について、図２を参照しつつ具体的に説明する。図２における各アルファベットは塩基配列を構成する塩基を示すが、Ｎ、Ｍ、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＺは任意の塩基を示し、ＸとＹ及びＷとＺは、互いに相補的に結合する。
【００３８】
まず、試験対象となる特定の細胞から公知の手法によりｍＲＮＡ１１を抽出する。本実施例では、酵母から、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　２．０　ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、総ｍＲＮＡ１１を２０μｇ抽出した。
【００３９】
次に、抽出されたｍＲＮＡ１１の３’末端側のポリＡテイルに相補的なオリゴｄＴプライマーをビオチン（タグ物質）１３で標識化する。そして、これをプライマーとして用いてｃＤＮＡ１２を合成する。具体的には、抽出した２０μｇのｍＲＮＡ１１を、０．８μｌ中で１００ｐｍｏｌｅの５’−ビオチン化オリゴｄＴプライマー（ＢＲＬ社製）と混合し、６５℃で５分間インキュベートした。続いて、それを水冷した後、逆転写バッファー２０．０μｌ中で、最終濃度５ｍＭのＭｇＣｌ２と０．５ｍＭのｄＮＴＰミックス（ＢＲＬ社製）と１０ｍＭのＤＴＴ（ＢＲＬ社製）を４２℃で６０分間インキュベートした。続いて、二本鎖合成バッファー１５０．０μｌ中で最終濃度０．２７ｍＭのｄＮＴＰミックス（ＢＲＬ社製）と１．３３ｍＭのＤＴＴ（ＢＲＬ社製）と２０．０ユニットのＥ．ｃｏｌｉリガーゼ（ＢＲＬ社製）と４０．０ユニットのＥ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ社製）と２．０ユニットのＲＮａｓｅＨ（ＢＲＬ社製）を１６℃で１２０分間インキュベートし、続いて、７０℃で１５分間インキュベートし反応を止めた。
【００４０】
次に、合成されたｃＤＮＡ１２を第１制限酵素を用いて切断する。具体的には、１００μｌ中で最終濃度２０ユニットの制限酵素ＭｓｐＩ（宝酒造社製）と１０μｇのｃＤＮＡ１２とを、３７℃で３６０分間反応させた。なお、ＭｓｐＩは、４塩基認識制限酵素である。その後、エタノールを用いてｃＤＮＡ断片を公知の手法により精製した。
【００４１】
次に、ストレプトアビジン（高親和性物質）１４を用いてビオチン１３を捕捉し、切断されたｃＤＮＡ断片の３’末端側のみを回収する。具体的には、反応液に磁気ビーズに固定したストレプトアビジン１４（ダイナル社製）に対して、ビオチン１３を結合し、産物を得た。
【００４２】
次に、回収されたｃＤＮＡ断片の５’末端側に、第１制限酵素の認識切断部位に相補的な配列を有する第１アダプター配列１５を結合させる。本実施例で使用した第１アダプター配列１５について、図３（ａ）に示す。具体的には、１５μｌのＴ４　ＤＮＡリガーゼバッファー中でＣＧ突出末端（即ち、制限酵素ＭｓｐＩの切断断片部位の相補的配列である）を有する５．０μｇの第１アダプター（ＢＲＬ社製）と、１０ユニットのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社製）を用いてライゲ−ションを行った。
【００４３】
次に、このｃＤＮＡ断片を第２制限酵素を用いて切断する。具体的には、２００μｌ中で最終濃度５０ユニットの制限酵素ＭｓｅＩ（ＮＥＢ社製）とｃＤＮＡ断片とを、３７℃で３６０分間反応させた。なお、このＭｓｅＩも、４塩基認識制限酵素である。その後、エタノールを用いてｃＤＮＡ断片を公知の手法により精製した。
【００４４】
次に、ストレプトアビジン１４を用いてビオチン１３を捕捉し、切断されたｃＤＮＡ断片の３’末端側を除去し、切断されたｃＤＮＡ断片の５’末端側を回収する。
そして、回収されたｃＤＮＡ断片の３’末端側に、第２制限酵素の認識切断部位に相補的な配列を有する第２アダプター配列１６を接合させる。本実施例で使用した第２アダプター配列１６について、図３（ｂ）に示す。具体的には、１０μｌのＴ４　ＤＮＡリガーゼバッファー中でＴＡ突出末端（即ち、制限酵素ＭｓｅＩの切断断片部位の相補的配列である）を有する１０ｐｍｏｌｅの第２アダプター配列（ＢＲＬ社製）と、１０ユニットのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社製）を用いてライゲーションを行った。
以上の処理によって、両末端に既知配列を含むｃＤＮＡ断片１７の群が構築される。
【００４５】
次に、このｃＤＮＡ断片１７の群について、プライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行う。このプライマーセットには、図４（ａ）に示すように、第１アダプター配列に相補的な配列と、増幅させる方向にさらに２塩基の配列（図４中にＮＮで示す。）を有するプライマーと、図４（ｂ）に示すように、第２アダプター配列に相補的な配列と、増幅させる方向にさらに２塩基の配列を有するプライマー（図４中にＮＮで示す。）とを使用する。それぞれのプライマーの増幅される方向に付与した２塩基は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの４種類の塩基からなる全ての組合せによって設計されるので、最大２５６種類のプライマーセットが考えられる。従って、これらのプライマーセットを用いて、ｃＤＮＡ断片１７の群についてＰＣＲを行うことにより、複数種類のｃＤＮＡ断片１８の群に分類すると共に、ＰＣＲ増幅を行うことが可能である。なお、ＰＣＲは、公知の手法により行えばよい。
【００４６】
以上のようにして得た複数種類のｃＤＮＡ断片１８の群は、それぞれ本実施例において、目的とするｃＤＮＡ断片を回収するためのサンプルとして利用することができる。
【００４７】
次に、上述のようにして作成した小規模なｃＤＮＡ断片の群の１つをサンプルとし、以下に示す手法により、目的とするｃＤＮＡ断片を回収する。この手法については、図５を参照しつつ説明する。
なお、本実施例でサンプルとした小規模なｃＤＮＡ断片の群は、オリゴヌクレオチド１からなるプライマーと、オリゴヌクレオチド２からなるプライマーを用いて、分類したものである。
【００４８】
オリゴヌクレオチド１：
５’−ａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇａｃ−３’
オリゴヌクレオチド２：
５’−ａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｔａ−３’
【００４９】
まず、第１ＰＣＲ工程において、作成したｃＤＮＡ断片の群２１について、第１アダプター配列１５に相補的な配列を有し、かつ、標識物質が結合された第１プライマーと、第２アダプター配列１６に相補的な配列を有する第２プラーマーとを用いて、ＰＣＲ反応により増幅させる。
具体的には、第１アダプター配列１５に相補的な配列を有する上記オリゴヌクレオチド１に、蛍光物質である近赤外蛍光色素ＩＲＤ−８００が結合された第１プライマーと、第２アダプター配列１６に相補的な配列を有する上記オリゴヌクレオチド２からなる第２プライマーとを用いて、ＰＣＲ反応を行った。第１，第２プライマーは、それぞれ公知の手法により合成すればよい。
【００５０】
また、ＰＣＲ反応は、パーキンエルマー社製の　ＧｅｎｅＡｍｐ　２４００　を用いて行った。ＰＣＲ条件は、Ｓｔｅｐｄｏｗｎ　ＰＣＲ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６，２０：４７８−４８５を参照されたい。）により行った。使用した酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）は、東洋紡社製の　ＫＯＤ　Ｄａｓｈ酵素である。このＤＮＡポリメラーゼは、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ　ＫＯＤ１株）に由来するものである。反応液の組成は、添付のマニュアルに従った。
【００５１】
次に、電気泳動工程において、増幅したｃＤＮＡ断片の群２２（ＰＣＲ産物）についてゲル電気泳動を行う。
具体的には、増幅したｃＤＮＡ断片の群２２を、蛍光色素の読み取れるＤＮＡシークエンサー（ＬＩ−ＣＯＲ社製ＬＩＣ−４２００Ｌ（Ｓ）−１）に供試し、サイズ分画のためにアクリルアミドゲル電気泳動を行った。アクリルアミドゲル２３の組成は、上記ＤＮＡシークエンサーに付属のマニュアルに従った。
【００５２】
次に、回収工程において、電気泳動工程の結果に基づいて、ゲルから目的のｃＤＮＡ断片２４を含むゲルを切り出し、当該ｃＤＮＡ断片２４を回収する。
具体的には、アクリルアミドゲル電気泳動の解析結果から、抽出するｃＤＮＡ断片２４を決定した。なお、このｃＤＮＡ断片２４は、既知の遺伝子であるＡ遺伝子由来のものであり、長さは２０２ｂｐ（両アダプター配列を含む。）である。そして、再度同一サンプルをアクリルアミドゲル電気泳動し、目的とするｃＤＮＡ断片２４が解析画面上に出現するとすぐに電気泳動を終了して、検出器のレーザーが当たる部分のゲルを切り出した。
そして、切り出したアクリルアミドゲルを、緩衝液中において６５℃で一晩反応させ、アクリルアミドゲルからｃＤＮＡ断片２４を回収した。なお、このｃＤＮＡ断片２４の回収には、Ｏｍｅｇａ　Ｂｉｏ−ｔｅｋ社製のキット（Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｐｏｌｙ−Ｇｅｌ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ）を使用した。
【００５３】
次に、第２ＰＣＲ工程において、回収したｃＤＮＡ断片２４について、第１アダプター配列１５に相補的な配列を有する第３プライマーと、第２アダプター配列１６に相補的な配列を有する第４プライマーとを用いて、再度ＰＣＲ反応を行う。
具体的には、フォワード側には、第１アダプター配列に相補的な配列を有すると共に制限酵素ＮｏｔＩ部位の配列を有する第３プライマーを、リバース側には、第２アダプター配列に相補的な配列を有すると共に制限酵素ＳｐｅＩ部位の配列を有する第４プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。第３プライマーは、オリゴヌクレオチド３からなり、第４プレイマーは、オリゴヌクレオチド４からなる。
【００５４】
オリゴヌクレオチド３：
５’−ｔａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇａｃ−３’
オリゴヌクレオチド４：
５’−ｇａａｃｔａｇｔａａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｔａ−３’
【００５５】
また、このＰＣＲ工程においても、ＰＣＲ反応は、パーキンエルマー社製の　ＧｅｎｅＡｍｐ２４００　を用い、Ｓｔｅｐｄｏｗｎ　ＰＣＲ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６，２０：４７８−４８５を参照されたい。）の条件により行った。使用した酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）は、東洋紡社製の　ＫＯＤ　Ｄａｓｈ　酵素である。反応液の組成は、添付のマニュアルに従った。
【００５６】
次に、連結工程において、第２ＰＣＲ工程で増幅したｃＤＮＡ断片２４の産物をプラスミドベクター２５に連結し、組換え体プラスミド２６を形成する。
具体的には、増幅したｃＤＮＡ断片２４の産物を制限酵素ＮｏｔＩとＳｐｅＩで処理した上で、プラスミドベクター（ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ）２５に連結し、組換え体プラスミド２６を形成した。この連結は、宝酒造社製のライゲーションキットｖｅｒ．２　を使用し、その添付マニュアルに従って行った。
その後、導入工程において、組換え体プラスミド２６を大腸菌に導入する。
具体的には、コンピテントセルとして　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αを使用し、公知の手法により、組換え体プラスミド２６を大腸菌に導入した。
以上のようにすれば、ｃＤＮＡ断片の群２１から目的とするｃＤＮＡ断片２４をより確実に回収することができる。
【００５７】
次に、他の既知の遺伝子（Ｂ遺伝子、Ｃ遺伝子及びＤ遺伝子）由来のｃＤＮＡ断片についても、それぞれ上記の手法により回収した。
各ｃＤＮＡ断片の回収にあたり、サンプルには、上記Ａ遺伝子を回収したｃＤＮＡ断片の群とは、それぞれ異なるｃＤＮＡの群を前述の方法により作成した。
また、サンプルとしたｃＤＮＡ断片の群が異なることに伴い、第１プライマー〜第４プライマーも、その塩基配列が若干異なるものを使用した。
具体的には、Ｂ遺伝子由来のｃＤＮＡ断片の回収には、第１プライマーとしてオリゴヌクレオチド５を、第２プライマーとしてオリゴヌクレオチド６を、第３プライマーとしてオリゴヌクレオチド７を、第４プライマーとしてオリゴヌクレオチド８を使用した。
また、Ｃ遺伝子由来のｃＤＮＡ断片の回収には、第１プライマーとしてオリゴヌクレオチド９を、第２プライマーとしてオリゴヌクレオチド１０を、第３プライマーとしてオリゴヌクレオチド１１を、第４プライマーとしてオリゴヌクレオチド１２を使用した。
また、Ｄ遺伝子由来のｃＤＮＡ断片の回収には、第１プライマーとしてオリゴヌクレオチド１３を、第２プライマーとしてオリゴヌクレオチド１４を、第３プライマーとしてオリゴヌクレオチド１５を、第４プライマーとしてオリゴヌクレオチド１６を使用した。
【００５８】
オリゴヌクレオチド５：
５’−ａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇｔｔ−３’
オリゴヌクレオチド６：
５’−ａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｇｔ−３’
オリゴヌクレオチド７：
５’−ｔａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇｔｔ−３’
オリゴヌクレオチド８：
５’−ｇａａｃｔａｇｔａａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｇｔ−３’
【００５９】
オリゴヌクレオチド９：
５’−ａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇｔｃ−３’
オリゴヌクレオチド１０：
５’−ａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｇｇ−３’
オリゴヌクレオチド１１：
５’−ｔａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇｔｃ−３’
オリゴヌクレオチド１２：
５’−ｇａａｃｔａｇｔａａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｇｇ−３’
【００６０】
オリゴヌクレオチド１３：
５’−ａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇｔａ−３’
オリゴヌクレオチド１４：
５’−ａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｃｇ−３’
オリゴヌクレオチド１５：
５’−ｔａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇｔａ−３’
オリゴヌクレオチド１６：
５’−ｇａａｃｔａｇｔａａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｃｇ−３’
【００６１】
次に、形質転換した大腸菌から、公知の手法により組換え体プラスミドを抽出した。このプラスミドの抽出は、複数個のコロニーについて行った。そして、抽出したそれぞれの組換え体プラスミドについて、組み込まれたｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このような遺伝子解析を、遺伝子Ａ〜遺伝子Ｄ由来の各ｃＤＮＡ断片について同様に行った。その結果を表１に示す。なお、かっこ内の数値は、各ｃＤＮＡ断片の長さ（両アダプター配列を含む。）を表す。
【００６２】
【表１】
2004113108.tif 000003
【００６３】
表１から明らかなように、Ａ遺伝子由来のｃＤＮＡ断片の回収においては、遺伝子解析を行った組換え体プラスミドのうち、約６７％が目的とするｃＤＮＡ断片を含むものであった。また、Ｂ遺伝子由来のｃＤＮＡ断片の回収においては、遺伝子解析を行った組換え体プラスミドのうち、約５７％が目的とするｃＤＮＡ断片を含むものであった。また、Ｃ遺伝子由来のｃＤＮＡ断片の回収においては、遺伝子解析を行った組換え体プラスミドのうち、１００％が目的とするｃＤＮＡ断片を含むものであった。同様に、Ｄ遺伝子由来のｃＤＮＡ断片の回収においては、遺伝子解析を行った組換え体プラスミドのうち、１００％が目的とするｃＤＮＡ断片を含むものであった。
この結果から、本実施例の方法に従ってｃＤＮＡ断片の群から目的とするｃＤＮＡ断片を回収すれば、より確実に目的のｃＤＮＡ断片を回収することができることが判る。
【００６４】
以上で説明したように、本実施例のＤＮＡ回収法によれば、選択したｃＤＮＡ断片の群について予めＰＣＲ反応を行うので、そのｃＤＮＡ断片の群を多量に増幅することができる。従って、目的とするｃＤＮＡ断片が低濃度であっても、それを大幅に増幅することができ、ゲル電気泳動においてそれを検出することができる。
また、このＰＣＲ反応では、標識物質を有するプライマーを用いているので、ＰＣＲ産物も標識物質を含むことになる。従って、目的とするｃＤＮＡ断片が少なかったとしても、電気泳動においてこの標識物質を認識することで、目的とするｃＤＮＡ断片のゲル中の位置を容易に検出することができる。
さらに、ｃＤＮＡ断片の群をゲル電気泳動によって分画するため、例えばキャピラリーカラムによる電気泳動に比べ、サイズ分解能を向上させ、目的とするｃＤＮＡ断片のみをより特異的に回収することができる。
【００６５】
また、第１アダプター配列及び第２アダプター配列は、それぞれ１５塩基前後としてあるので、安定したＰＣＲ反応を行い、効率よくｃＤＮＡ断片を増幅することができる。
また、標識物質として、蛍光物質である近赤外蛍光色素ＩＲＤ−８００を使用しているので、ゲル電気泳動においてｃＤＮＡ断片の検出感度を向上させることできる。
【００６６】
また、本実施例では、回収工程で回収したｃＤＮＡ断片について、再度ＰＣＲ反応を行う第２ＰＣＲ工程を備える。このため、回収したｃＤＮＡ断片が少量しかなくても、それを大幅に増幅させることができる。
【００６７】
さらに、本実施例では、第２ＰＣＲ工程後、ｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターに連結し、組換え体プラスミドを形成する連結工程と、さらに、この組換え体プラスミドを大腸菌に導入する導入工程とを備える。このため、ｃＤＮＡ断片の構造解析をする場合などに有効である。即ち、形質転換したその大腸菌を培養し、それからｃＤＮＡ断片を有するプラスミドＤＮＡを抽出すれば、これを容易に構造解析（例えば、塩基配列の決定）に用いることができる。
【００６８】
（実施例２）
次いで、第２の実施例について説明する。なお、上記実施例１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
上記の方法を用いて目的とするｃＤＮＡ断片を回収しても、回収率のやや低いサンプルもあった（表１参照）。これは、目的のｃＤＮＡ断片の量そのものが少ないためである。従って、目的のｃＤＮＡ断片が存在する所のゲルのみを正確に切り出すことができれば、他のｃＤＮＡ断片の混入は少なくなり、目的のｃＤＮＡ断片の回収率も向上するはずである。そこで、目的のｃＤＮＡ断片の回収率の向上させるため、以下の方法を用いて実験を行った。
【００６９】
上記実施例１と同様にして第１ＰＣＲ工程までの作業を行った。
そして、電気泳動工程において、上記実施例１と同様にアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その後は、再度同一サンプルを電気泳動するのではなく、最初に電気泳動を行ったゲルについて、濾紙を使用してゲルをゲル板から剥がした。続いて、濾紙にくっついたゲルを蛍光色素の検出できるスキャナー上に載置し、ゲル全体をイメージ化した。そうすることにより、より低濃度のｃＤＮＡ断片につても、そのｃＤＮＡ断片を含むゲルのみを正確に回収することができた。
回収工程後は、上記実施例１と同様にして、第２ＰＣＲ工程と連結工程と導入工程を行った。
【００７０】
また、上記実施例１と同様に、形質転換した大腸菌から、公知の手法により組換え体プラスミドを抽出し、挿入されたｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このような遺伝子解析を、遺伝子Ｅ由来のｃＤＮＡ断片について同様に行った。
なお、Ｅ遺伝子由来のｃＤＮＡ断片の回収にあたり、サンプルには、上記Ａ〜Ｄ遺伝子を回収したｃＤＮＡ断片の群とは異なるｃＤＮＡの群を前述の方法により作成した。
また、サンプルとしたｃＤＮＡ断片の群が異なることに伴い、第１プライマー〜第４プライマーも、その塩基配列が若干異なるものを使用した。具体的には、第１プライマーとしてオリゴヌクレオチド１７を、第２プライマーとしてオリゴヌクレオチド１８を、第３プライマーとしてオリゴヌクレオチド１９を、第４プライマーとしてオリゴヌクレオチド２０を使用した。
【００７１】
オリゴヌクレオチド１７：
５’−ａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇｔａ−３’
オリゴヌクレオチド１８：
５’−ａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｃｇ−３’
オリゴヌクレオチド１９：
５’−ｔａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇｔａ−３’
オリゴヌクレオチド２０：
５’−ｇａａｃｔａｇｔａａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｃｇ−３’
【００７２】
その結果、比較例として、実施例１と同様にしてＥ遺伝子由来のｃＤＮＡ断片を回収した場合には、遺伝子解析を行った組換え体プラスミドのうち、約８０％が目的とするｃＤＮＡ断片を含むものであった。これに対し、本実施例の方法によりＥ遺伝子由来のｃＤＮＡ断片を回収した場合には、遺伝子解析を行った組換え体プラスミドのうち、約１００％が目的とするｃＤＮＡ断片を含むものであった。
【００７３】
この結果から、本実施例の方法に従ってｃＤＮＡ断片の群から目的とするｃＤＮＡ断片を回収すれば、上記実施例１の方法に比べ、さらに確実に目的のｃＤＮＡ断片を回収することができることが判る。
また、その他、上記実施例１と同様な部分については、同様な効果を奏する。
【００７４】
（実施例３）
次いで、第３の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
実施例１及び実施例２では、既知の遺伝子由来のｃＤＮＡ断片を回収して解析したが、本実施例では、未知の遺伝子由来のｃＤＮＡ断片を回収して解析する。未知の遺伝子由来のｃＤＮＡ断片を解析する場合、回収したｃＤＮＡ断片が目的のものであるか否かを判断するために、２つの方法が考えられる。
【００７５】
即ち、１つは、ｃＤＮＡ断片の群をマーカーと共にゲル電気泳動した場合に目的とするｃＤＮＡ断片の長さとマーカーの長さとが一致するなど、目的のｃＤＮＡ断片の長さが正確に判る場合には、回収して解析したｃＤＮＡ断片の長さから、それが目的のｃＤＮＡ断片か否かを判断する。
【００７６】
具体的には、上記各実施例１，２と同様にして第１ＰＣＲ工程までの作業を行った。その後、増幅されたｃＤＮＡ断片の群について、アクリルアミドゲル電気泳動を行った。そして、分画されたｃＤＮＡ断片のうち、２００ｂｐの長さのマーカーにちょうど一致する２００ｂｐの長さ（両アダプター配列を含む。）のｃＤＮＡ断片に着目し、これを回収の目的とするｃＤＮＡ断片とした。その後、上記実施例１と同様にして、目的のｃＤＮＡ断片を回収した。
回収工程後は、第２ＰＣＲ工程を行った。本実施例では、ＰＣＲ反応液にさらにＥ．ｃｏｌｉのＲｅｃＡタンパク質をプライマー２０ｐｍｏｌあたり、５００ｎｇの割合で混合した。
その後は、上記実施例１，２と同様に、連結工程と導入工程を行った。
なお、第１ＰＣＲ工程に用いた第１プライマーはオリゴヌクレオチド２１からなり、第２プライマーはオリゴヌクレオチド２２からなる。また、第２ＰＣＲ工程に用いた第３プライマーはオリゴヌクレオチド２３からなり、第４プライマーはオリゴヌクレオチド２４からなる。
【００７７】
オリゴヌクレオチド２１：
５’−ａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇｔｔ−３’
オリゴヌクレオチド２２：
５’−ａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｇｔ−３’
オリゴヌクレオチド２３：
５’−ｔａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇｔｔ−３’
オリゴヌクレオチド２４：
５’−ｇａａｃｔａｇｔａａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｇｔ−３’
【００７８】
次に、上記各実施例１，２と同様に、形質転換した大腸菌から、公知の手法により組換え体プラスミドを抽出し、挿入されたｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その結果、塩基配列の長さが２００ｂｐである場合には、目的のｃＤＮＡ断片であると判断し、塩基配列の長さが２００ｂｐでない場合には、目的のｃＤＮＡ断片ではないと判断した。また、比較例として、第２ＰＣＲ工程でＲｅｃＡタンパク質を加えず、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ　Ｄａｓｈ）だけでＰＣＲ反応を行い、その他の工程は上記と同様にした場合も、目的のｃＤＮＡ断片の回収率を調査した。
また、別の比較例として、第２ＰＣＲ工程でＲｅｃＡタンパク質の代わりにＥ．ｃｏｌｉのＳＳＢタンパク質（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を加えてＰＣＲ反応を行い、その他の工程は上記と同様にした場合も、目的のｃＤＮＡ断片の回収率を調査した。
これらの結果を表２に示す。
【００７９】
【表２】
2004113108.tif 000004
【００８０】
表２から明らかなように、２００ｂｐのｃＤＮＡ断片の回収においては、解析を行った組換え体プラスミドのうち、約３３．３０％が目的とするｃＤＮＡ断片を含むものであった。これに対し、第２ＰＣＲ工程でＲｅｃＡタンパク質を加えなかった場合には、この回収率が約８．３０％まで低下した。また、第２ＰＣＲ工程でＲｅｃＡタンパク質の代わりにＳＳＢタンパク質を加えた場合には、この回収率が１％以下にまで低下した。
この結果から、第２ＰＣＲ工程においてＲｅｃＡタンパク質を加えることにより、目的とするｃＤＮＡ断片の回収率を大幅に向上させることができることが判る。この理由は、ＲｅｃＡタンパク質を反応液に混合してＰＣＲを行うと、ｃＤＮＡ断片の収量を減少させることなく、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅を低く抑えることができるためであると考えられる。
【００８１】
このように、本実施例では、第２ＰＣＲ工程において、ＲｅｃＡタンパク質を反応液に混合してＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ断片の群を増幅させる。このため、ｃＤＮＡ断片の群の収量を減少させることなく、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーがｃＤＮＡ断片の非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、上記のように特異性が高いため、アニーリング温度等、プライマー伸長反応の温度条件を変えても、ｃＤＮＡ断片の群を特異的に増幅させることができる。即ち、従来のＰＣＲ方法では、アニーリング温度等、プライマー伸長反応の温度を低く設定すると、ｃＤＮＡ断片の群だけでなく、副産物も多量に増幅されることとなるが、本実施例によれば、ｃＤＮＡ断片の群をより特異的に増幅させることが可能となる。
これらの結果、より確実に目的のｃＤＮＡ断片を回収することができる。
【００８２】
さらに、本実施例では、ＲｅｃＡタンパク質を、プライマー２０ｐｍｏｌあたり、１ｎｇ〜１０００ｎｇの範囲で混合しているので、より効率よく特異的に、ｃＤＮＡ断片を増幅することができる。
【００８３】
次に、未知の遺伝子由来のｃＤＮＡ断片を回収して解析するもう一つの方法について説明する。ｃＤＮＡ断片の群をゲル電気泳動しても、目的とするｃＤＮＡ断片の長さが正確には判らない場合には、回収して解析したｃＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて適当な一組のプライマーを作製し、ＲＴ−ＰＣＲにより解析したｃＤＮＡ断片が目的のものであるか否かを判断する。
【００８４】
具体的には、上記各実施例１，２と同様にして第１ＰＣＲ工程までの作業を行った。その後、増幅されたｃＤＮＡ断片の群について、アクリルアミドゲル電気泳動を行った。そして、分画されたｃＤＮＡ断片のうち、約２３０ｂｐの長さ（両アダプター配列を含む。）のｃＤＮＡ断片に着目し、これを回収の目的とするｃＤＮＡ断片とした。その後、上記実施例１と同様にして、目的のｃＤＮＡ断片を回収した。
回収工程後は、第２ＰＣＲ工程を行った。
その後は、上記実施例１，２と同様に、連結工程と導入工程を行った。
なお、第１ＰＣＲ工程に用いた第１プライマーはオリゴヌクレオチド２５からなり、第２プライマーはオリゴヌクレオチド２６からなる。また、第２ＰＣＲ工程に用いた第３プライマーはオリゴヌクレオチド２７からなり、第４プライマーはオリゴヌクレオチド２８からなる。
【００８５】
オリゴヌクレオチド２５：
５’−ａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇｇｔ−３’
オリゴヌクレオチド２６：
５’−ａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｇｔ−３’
オリゴヌクレオチド２７：
５’−ｔａｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｔｃｔｇａｔａｃｇａｃｃｃｇｇｇｔ−３’
オリゴヌクレオチド２８：
５’−ｇａａｃｔａｇｔａａｃｇａｃｔｇｔａｇｔｃｃａａｇｔａａｇｔ−３’
【００８６】
次に、上記各実施例１，２と同様に、形質転換した大腸菌から、公知の手法により組換え体プラスミドを抽出し、挿入されたｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。そして、回収率の高かったｃＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて一組のプライマーを作製した。これらのプライマーは、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０からなる。
【００８７】
オリゴヌクレオチド２９：
５’−ｃｃａｇｃａａｃｃｔａｃａａｃａａｃａ−３’
オリゴヌクレオチド３０：
５’−ｃａａｃｔｇｇｔｇｃａｔｃｇｃｃｔｔｃａｔ−３’
【００８８】
次に、これらのプライマーを用いて、サンプルとした元のｃＤＮＡ断片の群についてＰＣＲ反応を行った。また、比較例として、同一のサンプルについて、ＲｅｃＡタンパク質を加えず、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ　Ｄａｓｈ）だけでＰＣＲ反応を行った。また、別の比較例として、同一のサンプルについて、ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＳＳＢタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行った。続いて、これらの反応物についてゲル電気泳動を行った。その結果を図６に示す。
【００８９】
図６から明らかなように、ＲＴ−ＰＣＲによる抽出断片の確認においても、ＰＣＲ条件により良好な結果が得られる場合と、そうでない場合に分かれた。即ち、レーン２に示すように、ＲｅｃＡタンパク質をＰＣＲ反応液に添加すると、目的のｃＤＮＡ断片が特異的に増幅された。これに対し、レーン１に示すように、ＫＯＤ　Ｄａｓｈ（ＤＮＡポリメラーゼ）のみでＰＣＲ反応を行った場合には、レーン全体がスメア状になり、目的のＤＮＡ断片のみを増幅させることができなかった。また、レーン３に示すように、ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＳＳＢタンパク質を添加した場合には、スメア状になることは改善されたが、エキストラバンドが見られた。このことは目的物以外のＤＮＡ断片の増幅が考えられる。
【００９０】
この結果から、ＲＴ−ＰＣＲによる目的とするｃＤＮＡ断片の確認においても、ＲｅｃＡタンパク質を加えることにより、目的とするｃＤＮＡ断片だけを特異的に増幅させることができることが判る。また、回収したｃＤＮＡ断片の確認にも効果がある。
【００９１】
以上において、本発明の実施の形態を実施例に即して説明したが、本発明は上記各実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることは言うまでもない。
【００９２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１に関し、目的とするｃＤＮＡ断片を回収するためのサンプルとなるｃＤＮＡ断片群の作成方法についての概要を示す説明図である。
【図２】実施例１に関し、目的とするｃＤＮＡ断片を回収するためのサンプルとなるｃＤＮＡ断片群の作成方法についての詳細を示す説明図である。
【図３】実施例１に関し、（ａ）は第１アダプター配列を示す説明図であり、（ｂ）は第２アダプター配列を示す説明図である。
【図４】実施例１に関し、２５６種類のｃＤＮＡ断片群に分類するためのプライマーセットの配列を示す説明図である。
【図５】実施例１に関し、ｃＤＮＡ断片の群から目的とするｃＤＮＡ断片を回収する方法を示す説明図である。
【図６】実施例３に関し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡ断片の群を電気泳動した結果を示す、図面に変わる写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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