(57)【要約】【課題】アグロバクテリウムに感染しにくいユリ等の植物であってもアグロバクテリウム法により遺伝子を高効率で良好に導入できる実用性に秀れた植物細胞への遺伝子導入技術を提供するものである。【解決手段】植物の花器組織若しくは花柄組織から誘導したカルス８にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入するものである。【選択図】        図１
2004187628.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグロバクテリウム法により植物細胞に遺伝子を導入する方法であって、植物の花器組織若しくは花柄組織から誘導したカルスにアグロバクテリウム法で遺伝子を導入することを特徴とする植物細胞への遺伝子導入方法。
【請求項２】
アグロバクテリウム法により植物細胞に遺伝子を導入する方法であって、植物の花糸組織から誘導したカルスにアグロバクテリウム法で遺伝子を導入することを特徴とする植物細胞への遺伝子導入方法。
【請求項３】
アグロバクテリウム法によりユリ属植物の植物細胞に遺伝子を導入する方法であって、ユリ属植物の花器組織若しくは花柄組織から誘導したカルスにアグロバクテリウム法で遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項４】
アグロバクテリウム法によりユリ属植物の植物細胞に遺伝子を導入する方法であって、ユリ属植物の花糸組織から誘導したカルスにアグロバクテリウム法で遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項５】
請求項３，４いずれか１項に記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、カルスにアグロバクテリウム法で遺伝子を導入する際、アンモニウムイオン成分を可及的に除いた共培養培地を用いてカルス及びアグロバクテリウムを共培養することによりカルスに遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項６】
請求項３，４いずれか１項に記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、カルスにアグロバクテリウム法で遺伝子を導入する際、アンモニウムイオン成分を完全に除いた共培養培地を用いてカルス及びアグロバクテリウムを共培養することによりカルスに遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項７】
請求項３，４いずれか１項に記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、カルスにアグロバクテリウム法で遺伝子を導入する際、ＭＳ培地から培地の構成成分である硝酸アンモニウムを可及的に除いた共培養培地を用いてカルス及びアグロバクテリウムを共培養することによりカルスに遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項８】
請求項３，４いずれか１項に記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、カルスにアグロバクテリウム法で遺伝子を導入する際、ＭＳ培地から培地の構成成分である硝酸アンモニウムを完全に除いた共培養培地を用いてカルス及びアグロバクテリウムを共培養することによりカルスに遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項９】
請求項３〜８いずれか１項に記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、カルスにアグロバクテリウム法で遺伝子を導入した後、オーキシン及びサイトカイニンを添加した培養培地を用いて前記アグロバクテリウム法により遺伝子が導入された前記カルスを培養することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項１０】
請求項９記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、添加するオーキシンとサイトカイニンとの重量割合を、８〜１２：１に設定したことを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項１１】
請求項３〜１０いずれか１項に記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面にカルスを当接させて該カルス中の植物細胞の表面に傷を付けた後、該カルスにアグロバクテリウム法で遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物細胞に外来の遺伝子を導入して遺伝子操作をする技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
植物細胞に外来の遺伝子を導入することによって、交雑育種では付加できない有用な形質を植物に付与することは、今後の農作物の改良と農業の発展に極めて意義がある。
【０００３】
この遺伝子導入法としては、物理的に植物細胞の一部に穴を空け、この穴から植物細胞に遺伝子を導入する物理的方法と、微生物の遺伝子導入能力を利用した生物的方法とがある。物理的方法の代表例としては、微小な金属粒子に外来の遺伝子を付着しておき、この金属粒子を空気銃で植物細胞に打ち込むパーティクルガン法（特表平５−５０８３１６号）、生物的方法の代表例としては、土壌細菌であるアグロバクテリウムの感染作用を利用したアグロバクテリウム法（特許第１６３３５４６号、特開昭６０−７００８０号、特開平６−２０９７７９号）が知られている。
【０００４】
ところで、物理的方法には、遺伝子の断片が過剰に植物細胞に組み込まれ、これにより目的の遺伝子の発現が妨げられてしまうという問題点がある。従って、植物細胞に遺伝子を導入する際には、生物的方法、特にアグロバクテリウム法が採用される場合が多い。
【０００５】
このアグロバクテリウム法について説明する。
【０００６】
先ず、遺伝子導入能力を持つアグロバクテリウムに物理的方法によって目的の遺伝子を導入しておく。
【０００７】
一方、遺伝子を導入したい植物細胞にメス等で傷を付けておく。この傷は植物の細胞壁を損傷させる程度としておく。
【０００８】
続いて、アグロバクテリウムと植物細胞とを一緒に培養する。この際、前記植物細胞の傷にアグロバクテリウムが接近して感染し、該植物細胞の細胞膜を通して内部の染色体に目的の遺伝子が組み込まれる。
【０００９】
これにより、植物細胞の遺伝子に目的の遺伝子を導入することができ、よって、植物の改良（植物の形質転換）が達成される。
【００１０】
しかし、このアグロバクテリウム法であっても、アグロバクテリウムに感染しにくい植物、例えば、ユリ属植物の場合、当然ながら、目的の遺伝子を導入することができないという問題点がある。
【００１１】
また、パーティクルガン法によってユリ属植物に遺伝子を導入することに成功した例が報告されているが（Ｗａｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｍｉｃｒｏｐｕｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇｉｆｌｏｒｕｍ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １７，２６２−２６７）、この報告例は導入効率が悪く、非実用的である（遺伝子導入の成功率は１％。唯、目的通りに遺伝子導入できないことも多く、実質的な成功率は非常に低い。）。
【００１２】
本発明は、上記問題点を解決するもので、アグロバクテリウムに感染しにくい植物であってもアグロバクテリウム法により遺伝子を高効率で良好に導入できる実用性に秀れた植物細胞への遺伝子導入技術を提供するものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
添付図面を参照して本発明の要旨を説明する。
【００１４】
アグロバクテリウム法により植物細胞１に遺伝子を導入する方法であって、植物の花器組織若しくは花柄組織から誘導したカルス８にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入することを特徴とする植物細胞への遺伝子導入方法に係るものである。
【００１５】
また、アグロバクテリウム法により植物細胞１に遺伝子を導入する方法であって、植物の花糸組織から誘導したカルス８にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入することを特徴とする植物細胞への遺伝子導入方法に係るものである。
【００１６】
また、アグロバクテリウム法によりユリ属植物の植物細胞１に遺伝子を導入する方法であって、ユリ属植物の花器組織若しくは花柄組織から誘導したカルス８にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００１７】
また、アグロバクテリウム法によりユリ属植物の植物細胞１に遺伝子を導入する方法であって、ユリ属植物の花糸組織から誘導したカルス８にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００１８】
また、請求項３，４いずれか１項に記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、カルス８にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入する際、アンモニウムイオン成分を可及的に除いた共培養培地12を用いてカルス８及びアグロバクテリウム９を共培養することによりカルス８に遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００１９】
また、請求項３，４いずれか１項に記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、カルス８にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入する際、アンモニウムイオン成分を完全に除いた共培養培地12を用いてカルス８及びアグロバクテリウム９を共培養することによりカルス８に遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２０】
また、請求項３，４いずれか１項に記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、カルス８にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入する際、ＭＳ培地から培地の構成成分である硝酸アンモニウムを可及的に除いた共培養培地12を用いてカルス８及びアグロバクテリウム９を共培養することによりカルス８に遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２１】
また、請求項３，４いずれか１項に記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、カルス８にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入する際、ＭＳ培地から培地の構成成分である硝酸アンモニウムを完全に除いた共培養培地12を用いてカルス８及びアグロバクテリウム９を共培養することによりカルス８に遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２２】
また、請求項３〜８いずれか１項に記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、カルス８にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入した後、オーキシン及びサイトカイニンを添加した培養培地13を用いて前記アグロバクテリウム法により遺伝子が導入された前記カルス８を培養することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２３】
また、請求項９記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、添加するオーキシンとサイトカイニンとの重量割合を、８〜１２：１に設定したことを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２４】
また、請求項３〜１０いずれか１項に記載のユリ属植物への遺伝子導入方法において、鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面２にカルス８を当接させて該カルス８中の植物細胞１の表面に傷７を付けた後、該カルス８にアグロバクテリウム法で遺伝子を導入することを特徴とするユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２５】
【発明の作用及び効果】
本発明は繰り返した実験の結果、得られた効果を請求項としてまとめたものである。
【００２６】
ユリ属植物（Ｌｉｌｉｕｍ）のようにアグロバクテリウムに感染しにくい植物であっても、花器組織や花柄組織から誘導したカルス８には、アグロバクテリウム法によって遺伝子を良好に導入することができた。特に花糸組織から誘導したカルス８の場合、非常に導入効率が高かった。
【００２７】
本発明は上述のようにするから、アグロバクテリウムが感染しにくい植物であってもアグロバクテリウム法により遺伝子を高効率で良好に導入できる実用性に秀れた植物細胞への遺伝子導入技術となる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
図面は本発明の実施例を図示したものであり、以下に説明する。尚、ｐｐｍ及び％は、いずれもｗ／ｖである。
【００２９】
先ず、植物の花器組織若しくは花柄組織を培地14で培養し、該断片からカルス８（植物細胞１の塊）を誘導する。
【００３０】
このカルス８の誘導の際、植物の花器組織中の花糸組織を選択し、該花糸組織からカルス８を誘導すると最も良い。花糸組織の断片を選択した場合、最も良好にカルス８が誘導される。
【００３１】
尚、図１は、花糸組織からカルス８を誘導する場合を図示している。
【００３２】
アグロバクテリウムに感染しにくい植物であるユリ属植物の構造の一例（テッポウユリ）を図２に図示する。符号21は花器（ｆｌｏｗｅｒ  ｏｒｇａｎ）の部分、22は花柄（ｐｅｄｕｎｃｌｅ）、23は花糸（ｆｉｌａｍｅｎｔ）、24は外花被（ｏｕｔｅｒ  ｐｅｒｉａｎｔｈ）、25は内花被（ｉｎｎｅｒ  ｐｅｒｉａｎｔｈ）、26は花柱（ｓｔｙｌｅ）、27は柱頭（ｓｔｉｇｍａ）、28は葯（ａｎｔｈｅｒ）、29は子房（ｏｖａｒｙ）、30は苞（ｂｒａｃｔ）である。
【００３３】
培地14は、公知の植物培養用の培地、例えば、２ｐｐｍ  オーキシン、０．３％  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含んだＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，１９６２）を採用する。
【００３４】
尚、その他の植物培養用の培地、例えば、ＬＳ培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，１９６５）、Ｂ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇら，１９６８）、Ｒ２培地（Ｏｈｉｒａら，１９７３）、Ｎ６培地（Ｃｈｕら，１９７５）を採用しても良い。
【００３５】
続いて、誘導されたカルス８中の植物細胞１の表面に傷７を付ける。この傷７は、植物細胞１が細胞分裂可能な程度の浅い擦り傷７とする。具体的には、植物細胞１の表面に存在する細胞壁10には傷７が付き、この細胞壁10の内側に存在する細胞膜11には傷７が付かない程度に設定する。
【００３６】
また、植物細胞１の表面に傷７を付ける際には、鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面２にカルス８を擦り付けることで前記植物細胞１の表面に傷７を付ける方法を採用すると良い。
【００３７】
また、植物細胞１の表面に傷７を付ける際には、以下に説明する植物細胞処理装置を使用すると良い（図３〜５参照）。
【００３８】
この植物細胞処理装置は、開口部５を有する容器３の内壁には鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面２が設けられているものである。
【００３９】
容器３は筒状のものが採用されている。
【００４０】
また、容器３の開口部５には、該開口部５を閉塞する蓋体６が螺着脱自在に設けられている。
【００４１】
微細凹凸面２は容器３の内壁に紙ヤスリ４が付設されることで形成されている。
【００４２】
この紙ヤスリ４は、耐水性のものを採用すると良い。また、この紙ヤスリ４は＃１５０乃至８００程度のもの採用すると良い。また、傷７を付けようとする植物細胞１の細胞壁10の厚さに対応して使用する紙ヤスリ４を適宜選択すると良い。
【００４３】
植物細胞１に傷７を付ける際には、前記容器３にカルス８と培養液とを収納し、蓋体６を取り付けた後、震盪することにより、前記微細凹凸面２にカルス８中の植物細胞１を擦り付ける方法を採用すると良い。この方法によれば、培養液の存在により、植物細胞１が微細凹凸面２に強く擦り付けられることがなく、植物細胞１の表面に該植物細胞１が細胞分裂可能な程度の浅い擦り傷７が多数良好に付けられることになる。
【００４４】
また、震盪の際には、試験管ミキサー等の撹拌装置を用いると良い。また、震盪時間は、植物細胞１やカルス８によって適宜設定する。
【００４５】
植物細胞１の表面に傷７を付けた後は、カルス８とアグロバクテリウム９（遺伝子導入されたもの）とを一緒に培養（共培養）して該植物細胞１にアグロバクテリウム９を感染させ、該植物細胞１の染色体に遺伝子を導入する。
【００４６】
共培養の際に使用する培地は、アンモニウムイオン成分を可及的に含まない共培養培地12、例えば、ＭＳ培地から培地の構成成分である硝酸アンモニウム（ＮＨ4ＮＯ3）を可及的に除いた共培養培地12、望ましくは、硝酸アンモニウムを完全に除いた共培養培地12を採用する。共培養培地12中のアンモニウムイオン成分の量が通常量より少ない程、多くの植物細胞１に遺伝子が導入されることを実験により確認している（図６参照）。
【００４７】
また、ＭＳ培地は、例えば、２ｐｐｍ  オーキシン、２０ｐｐｍ  ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ、０．３％  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含むものを採用すると良い。
【００４８】
尚、Ｂ５培地、Ｒ２培地、Ｎ６培地のようにアンモニウムイオン成分が硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）として含まれている場合、該硫酸アンモニウムを除いて採用する。
【００４９】
共培養期間は１週間程度とする。
【００５０】
植物細胞１に遺伝子を導入した後、該植物細胞１（カルス８）を培養して増殖させる。
【００５１】
培養の際に使用する培地は、遺伝子が導入された植物細胞１が選択的に増殖される物質（植物細胞１に導入された選択マーカー遺伝子に対応する適当量の抗生物質。例えば、ハイグロマイシン等。）を含む培養培地13を採用する。また、この培養培地13は、植物の増殖を良好に行う為、０．１ｐｐｍ  オーキシン、０．０１ｐｐｍ  サイトカイニン、３００ｐｐｍ  ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ、０．３％ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含むＭＳ培地を採用する。
【００５２】
オーキシンは、ピクロラム（ｐｉｃｌｏｒａｍ）を採用すると良い。また、サイトカイニンは、ベンジルアデニン（ＢＡ）を採用すると良い。
【００５３】
このオーキシンとサイトカイニンの重量割合は重要であり、１２：１乃至８：１が良いことが実験により確認されている。尚、１０：１が最も良い。
【００５４】
また、オーキシンの量は、最大２ｐｐｍまでとする。サイトカイニンの量は、オーキシンの量により決定する。
【００５５】
ＭＳ培地の代わりに、ＬＳ培地、Ｂ５培地、Ｒ２培地、Ｎ６培地等の他の植物培養用の培地を採用しても良い。
【００５６】
この培養は、約３カ月程度行う。この植物細胞１の増殖によって成長したカルス８からは、芽32が再分化することが可能となる。
【００５７】
芽32が再分化したら、０．３％  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含む培地（例えばＭＳ培地）にカルス８から再分化した芽32を置いて発根を促進し、その後に土壌に植えて植物を成長させる。
【００５８】
以上の方法により、アグロバクテリウム法での遺伝子導入が困難といわれていたユリへの遺伝子導入を実験してみたところ、２００個のカルス８から６個の遺伝子導入されたカルス８が得られた。また、得られたカルス８から良好に発芽及び発根が行われることが確認された。
【００５９】
本実施例は上述のようにするから、ユリ属植物のようにアグロバクテリウム９が感染しにくい植物であってもアグロバクテリウム法により遺伝子を実用上十分な高効率で良好に導入できる実用性に秀れた植物細胞への遺伝子導入技術となる。
【００６０】
以下、本実施例の効果を確認した実験例について説明する。
【００６１】
実験例１：ユリへの遺伝子導入（図１参照）
１．植物細胞処理装置の作製
＃１５０の耐水性紙ヤスリを縦８．５ｃｍ横９ｃｍに切断して円筒状とし、遠沈管（容量５０ｍｌ）の内壁に配設した。
【００６２】
２．導入遺伝子とアグロバクテリウム
遺伝子導入用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子、イントロンを含んだβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ遺伝子（以下、ＧＵＳという）及びハイグロマイシン耐性遺伝子を植物に導入される部位に含むｐＩＧ１２１-Ｈｍを用いた（図７参照）。このベクターを保持するアグロバクテリウム  ツメファンエンス（ＥＨＡ１０１株）を用いて遺伝子操作を行った。
【００６３】
３．花糸からのカルス誘導
開花前のユリ（Ｌｉｌｉｕｍ  ｏｒｉｅｎｔａｌ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｖ．Ａｃａｐｕｌｃｏ）のつぼみより花糸を切り出し、オーキシンとして２ｐｐｍ  ｐｉｃｌｏｒａｍ及び０．３％  Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍを含むＭＳ培地上に置き、カルスを誘導した。
【００６４】
４．カルスの傷つけ
上記３．で誘導したカルス２０個（直径約１ｃｍ）を、２ｐｐｍ  ｐｉｃｌｏｒａｍ、２０ｐｐｍ  ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎ、７００ｐｐｍ  アスパラギン水和物、７００ｐｐｍ  グルタミンを含むＭＳ液体培地（２０ｍｌ）と共に前記１．で作製した植物細胞処理装置に入れ、試験管ミキサーを用いて１０秒間激しく攪拌震盪した。
【００６５】
５．アグロバクテリウムとカルスの共培養
前記４．で傷を付けたカルスを前記２．で得たアグロバクテリウムと混合し、オーキシンとして２ｐｐｍ  ｐｉｃｌｏｒａｍ、２０ｐｐｍ  ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ、０．３％  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含み、硝酸アンモニウムの濃度を、２０ｍＭ、５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、０ｍＭとしたＭＳ培地上に置き、７日間培養した。
【００６６】
６．ＧＵＳ染色
前記５．の共培養後、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．(１９８７）ＧＵＳ-ｆｕｓｉｏｎ：β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅａｓ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．６，３９０１-３９０７）により、カルスの染色を行った。その結果、アグロバクテリウムのユリへの感染に最適な硝酸アンモニウムの濃度は、０ｍＭであることが判明した（下記表１参照）。
【００６７】
【表１】
2004187628.tif 000003
【００６８】
７．遺伝子が導入された細胞の選抜
前記５．の共培養後、３００ｐｐｍ  ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ、５０ｐｐｍハイグロマイシン、０．３％  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含み、オーキシンとしてｐｉｃｌｏｒａｍ  ２ｐｐｍ、あるいは、オーキシンとしてｐｉｃｌｏｒａｍ  ０．１ｐｐｍ、サイトカイニンとしてＢＡ  ０．０１ｐｐｍを加えたＭＳ培地上で、カルスを３ヶ月培養した。その結果、オーキシンとしてｐｉｃｌｏｒａｍ  ０．１ｐｐｍ、サイトカイニンとしてＢＡ  ０．０１ｐｐｍ加えた培地を用いた場合に遺伝子が導入された芽が６個体得られた（下記表２参照）。
【００６９】
【表２】
2004187628.tif 000004
【００７０】
８．植物体の再生
前記７．で選抜されてきた芽を切り取り、０．３％  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含むＭＳ培地上に置くことによって発根を促し、ユリの植物体を得た。得られたユリは良好に生育した。
【００７１】
比較例：従来法によるユリへの遺伝子導入（図８参照）
一般的に植物の遺伝子導入を行う場合と同様、ユリのリン片（図中符号20）からカルスを誘導して遺伝子操作を行った。
【００７２】
また、植物細胞に傷を付ける方法は、メスで傷を付ける方法を採用した。
【００７３】
また、カルスとアグロバクテリウムとを共培養する際の培地（図中符号14）は、硝酸アンモニウムを通常通り含むＭＳ培地を採用した。
【００７４】
また、遺伝子導入されたカルスを培養する際の培地（図中符号15）は、オーキシン及びサイトカイニンを含まない培地を採用した。
【００７５】
比較例では、遺伝子導入されなかった。
【００７６】
実験例２：カルスの由来による影響
実験例１の３．と同様の方法により、ユリの各部位からカルスの誘導及び増殖を行った。結果を下記表３に示す。一般に行われているリン片からでは、カルスの増殖量は少なく、花器組織及び花柄組織からカルスを誘導した方が増殖量が多いことが確認された。
【００７７】
【表３】
2004187628.tif 000005
【００７８】
従って、カルスの増殖量が多いことから、花器組織及び花柄組織からカルスを誘導し、遺伝子導入を行った方が良いと思われた。
【００７９】
尚、花糸を用いた場合が、最も増殖量が多かった。
【００８０】
実験例３：アンモニウムイオン成分及び硝酸イオン成分の影響
実験例１及び図６から、アグロバクテリウムを感染させる際、硝酸アンモニウムが少ない方が良いことは確認されたが、硝酸アンモニウムの内のアンモニウムイオン成分が少なければ良いのか、硝酸イオン成分が少なければ良いのかは不明であった。そこで、ＭＳ培地に依然として残っている硝酸カリウム（ＫＮＯ3）の量を減らし、実験例１と同様に遺伝子導入を試みた。
【００８１】
遺伝子導入の成否は、実験例１と同様、ブルースポットによって確認した。
【００８２】
硝酸アンモニウムと硝酸カリウムの双方の量を少なくした場合、実験例１と同様の結果が得られた。一方、硝酸カリウムだけを少なくした場合、カルスが青に変色せず、遺伝子の導入は成功しなかった。
【００８３】
従って、アグロバクテリウムの感染には、硝酸イオン成分の影響はなく、アンモニウムイオン成分が該感染を阻害することが確認された。
【００８４】
以上の各実験例によれば、本実施例を採用することにより、これまでアグロバクテリウム法での遺伝子導入が困難であったユリ属植物であっても遺伝子導入を高効率で良好に行うことができ、植物の形質転換体を作出できることが確認された。
【００８５】
従って、本実施例によれば、これまでよりも多くの植物に外来の遺伝子を導入し、これにより交雑育種では得られない新規な有用形態（新規花色や耐病性等）を付与することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施例の説明工程図である。
【図２】本実施例のユリの構造の説明図である。
【図３】本実施例の植物細胞の説明図である。
【図４】本実施例の植物細胞処理装置の説明側断面図である。
【図５】本実施例の植物細胞処理装置の説明平断面図である。
【図６】本実施例の共存培地に含まれるＮＨ4ＮＯ3の量とアグロバクテリウム９の感染効率との関係を示すグラフである。
【図７】ｐＩＧ１２１−Ｈｍのマップである。
【図８】従来のアグロバクテリウム法の説明工程図である。
【符号の説明】
１  植物細胞
２  微細凹凸面
７  傷
８  カルス
９  アグロバクテリウム
12  共培養培地
13  培養培地
【図１】
2004187628.tif 000006
【図２】
2004187628.tif 000007
【図３】
2004187628.tif 000008
【図４】
2004187628.tif 000009
【図５】
2004187628.tif 000010
【図６】
2004187628.tif 000011
【図７】
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【図８】
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