(57)【要約】【課題】本発明は、高コピー数プラスミドベクターの持つ低レベルの継続的な遺伝子発現、それを避ける為に低コピー数プラスミドベクターを使うことで起る発現べクターの不安定化の両方を克服し、かつプロモーターのスイッチを入れる発現開始にウイルス感染ではなく従来のＩＰＴＧ添加法を使える新規なプラスミド、それを用いた遺伝子発現方法などを提供する。【解決手段】本発明は、ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）であって、そのアミノ酸配列の１３番目のアミノ酸がトレオニンに変異し、かつ５６番目のアミノ酸がバリンに変異していることを特徴とする温度感受性複製能及び温度感受性分離能を有するｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体、それをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有してなるプラスミド、当該プラスミドで形質転換された細胞、及び当該細胞を用いた外来遺伝子がコードするタンパク質の製造方法に関する。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）であって、そのアミノ酸配列の１３番目のアミノ酸がトレオニンに変異し、かつ５６番目のアミノ酸がバリンに変異していることを特徴とする温度感受性複製能及び温度感受性分離能を有するｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体。
【請求項２】
ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）であって、そのアミノ酸配列の３番目のアミノ酸がリジンに変異し、１３番目のアミノ酸がトレオニンに変異し、かつ５６番目のアミノ酸がバリンに変異していることを特徴とする温度感受性複製能及び温度感受性分離能を有するｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体。
【請求項３】
ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体が、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載のｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体。
【請求項４】
ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体が、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する請求項１又は２に記載のｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体。
【請求項５】
ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）をコードする遺伝子であって、その翻訳領域の３７番目の塩基がＡ（アデニン）に変異し、かつ１６７番目の塩基がＴ（チミン）に変異していることを特徴とする温度感受性複製能及び温度感受性分離能を有するｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体をコードする遺伝子。
【請求項６】
ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）をコードする遺伝子であって、その翻訳領域の７番目の塩基がＡ（アデニン）に変異し、３７番目の塩基がＡ（アデニン）に変異し、かつ１６７番目の塩基がＴ（チミン）に変異していることを特徴とする温度感受性複製能及び温度感受性分離能を有するｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体をコードする遺伝子。
【請求項７】
ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体をコードする遺伝子の翻訳領域が、配列表の配列番号３に示される塩基配列を有する請求項５に記載のｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体をコードする遺伝子。
【請求項８】
ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体をコードする遺伝子の翻訳領域が、配列表の配列番号４に示される塩基配列を有する請求項５又は６に記載のｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載のｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体をコードする遺伝子を含有してなるプラスミドベクター。
【請求項１０】
プラスミドベクターが、ｌａｃプロモーター、またはｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ　を含むｌａｃプロモーターに由来するプロモーター、あるいは他の任意の発現制御可能なプロモーターを有するものである請求項９に記載のプラスミドベクター。
【請求項１１】
プラスミドベクターが、抗生物質又は抗菌因子に耐性又は免疫性を発現する遺伝子を有するものである請求項９又は１０に記載のプラスミドベクター。
【請求項１２】
薬剤耐性遺伝子の薬剤が、カナマイシン、クロラムフェニコール、アンピシリン、又はテトラサイクリンである請求項１１に記載のプラスミドベクター。
【請求項１３】
プラスミドベクターが、他のプラスミドベクターを挿入可能な制限酵素部位を有している請求項９〜１２のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項１４】
挿入可能な他のプラスミドベクターが、高コピー数のものである請求項１３に記載のプラスミドベクター。
【請求項１５】
高コピー数の挿入可能な他のプラスミドベクターが、ｐＢＲ３２２である請求項１４に記載のプラスミドベクター。
【請求項１６】
プラスミドベクターが、請求項５〜８のいずれかに記載のｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体をコードする遺伝子の下流側にｍＲＮＡの半減期を調整する塩基配列を有している請求項９〜１５のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項１７】
プラスミドベクターが、配列表の配列番号５又は６に示される塩基配列を有する請求項９〜１６のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項１８】
さらに、外来遺伝子が挿入されている請求項９〜１７のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項１９】
外来遺伝子が、発現可能である請求項１８に記載のプラスミドベクター。
【請求項２０】
請求項９〜１９のいずれかに記載のプラスミドベクターで形質転換された細胞。
【請求項２１】
細胞が、腸内細菌類、とくに大腸菌である請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
請求項９〜１９のいずれかに記載のプラスミドの複製及び分離を細胞の培養温度とは異なる温度で行い、細胞の培養温度では独立したプラスミド分子としての複製及び分離が実質的に行われないことを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項２３】
細胞が、腸内細菌類、とくに大腸菌である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載の方法により外来遺伝子がコードするタンパク質を製造する方法。
【請求項２５】
請求項９〜１９のいずれかに記載のプラスミドの複製及び分離のための温度が２８〜３３℃であり、外来遺伝子の発現のための培養温度が３５〜４３℃である請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、温度感受性複製能及び温度感受性分離能を有するｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体、それをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有してなるプラスミド、当該プラスミドで形質転換された細胞、及び当該細胞を用いた外来遺伝子がコードするタンパク質の製造方法に関する。
本発明のｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）変異体は、温度感受性複製能及び温度感受性分離能を有するために、当該変異体の遺伝子を有するプラスミドの複製及び分離（分配）を外来遺伝子の発現のための培養温度とは異なる温度で行わねばならない。したがって、宿主細胞におけるベクターの複製、分離工程と、宿主細胞における外来遺伝子の発現工程を異なる工程として行う。
本発明は組換え遺伝子を用いた効率的な蛋白質の生産方法を提供するものである。さらに詳細には、本発明は細胞毒性を有する蛋白質の新規な工業的な製造方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
組換え遺伝子を用いて産業的に有用な蛋白質、または蛋白質性の医薬品を製造する場合に、宿主細胞の選択には大きく分けて大腸菌などの原核細胞を用いる方法と、酵母菌、動物細胞、植物細胞などの真核細胞を用いる方法がある。これらのどれを選択するかは個々の蛋白質の様々な性質に基づく。一般には、工業的なコストパーフオーマンスが高く、安価に生産、精製できるので大腸菌を用いる方法が望ましい。しかし、産業的、あるいは医学的に有用な蛋白質はヒトなど高等生物の遺伝子に由来することが多く、大腸菌のように分類学的にあまりにも遠縁である生物の細胞にとって異質性が高く、通常使われる高発現系大腸菌のホスト・べクターシステムではしばしば当該蛋白質の細胞毒性が原因で大腸菌の工業的レベルでの大量培養を不可能にしていることが少なくない。一般に、工業的に使用される大腸菌のプラスミドベクターは、細胞内のコピー数が多く、使用される遺伝子発現の制御装置（プロモーター・オペレーター、以下、ＰＯと略す。）における抑制が完全に機能せずにベーサルレベルで意図せぬ発現が見られることが多い。また、このような低レベルでの発現すら宿主細胞にとって無視できないような細胞毒性を有するタンパク質では、大腸菌での工業的生産が不可能になる。このような場合には、増殖中の大腸菌における外来遺伝子の発現を最小限に抑制し、細胞濃度を十分に高めた段階で初めて外来遺伝子の発現が行われるように、発現のスイッチオン、オフを機能的に制御する必要がある。この目的のために、各種発現系のプラスミドベクターが開発されてきているが、それでも細胞毒性が無視できないほどに強い場合は大腸菌での生産が不可能となることがある。
【０００３】
このように、発現させるタンパク質による細胞毒性を回避することが難しい要因のひとつは、発現べクターに乗せた当該遺伝子の発現調節領域（ＰＯ領域）の機能を完全にスイッチオフすることが難しいためである。蛋白質を得る目的の遺伝子発現のためには大腸菌を所定の濃度までに増殖させたあとで、プロモーターのスイッチを入れる必要がある。なぜならば、大腸菌濃度が低い状態で外来遺伝子が発現すれば大腸菌の増殖阻害が生じるために蛋白質の産生効率が低くなるからである。このような制御手段として、例えば、ラクトースプロモータ一・オペレーター（ＰＯｌａｃ）とそのリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩ）を用いる方法がある。この方法は、そのリプレッサー遺伝子をｌａｃＩｑ突然変異により過剰発現させてプロモーターのスイッチを切り、リプレッサーの不活化因子であるＩＰＴＧを培養液に溶解してスイッチを入れる。しかし、ＰＯｌａｃの下流に発現させる遺伝子が乗っているべクターが、細胞あたりのコピー数が高い、いわゆる高コピー数べクターである場合は、過剰発現したリプレッサーでも完全にスイッチをオフにすることは困難であり、低レベルでの発現が持続的に起っていることが普通である。また、一般に発現ベクターで頻用されているｌａｃプロモーターはｌａｃＵＶ５と呼ばれる変異体であり、リプレッサー存在下でも低レベルの発現が進行することが知られている。このような状況下では、低レベルでの発現でも強い細胞毒性を示す蛋白質の場合は、大腸菌の増殖阻害を起こし、組換え蛋白質の工業的生産にとっては致命的であった。また、極端な場合は蛋白質の生産はもちろん、発現ベクターの構築そのものが不可能であった。
【０００４】
このような毒性蛋白質生産の改良法として、ｐＥＴプラスミドベクター系を用いる方法がノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．６０１　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ１　５３７１１、ＵＳＡ）より販売されている。このシステムは発現したい遺伝子のプロモーターとしてＴ７ファージのプロモーターを使用することを特徴としている。通常の大腸菌はＴ７ＲＮＡポリメラーゼをまったく産生しないので、このべクターに毒性の強い遺伝子を乗せても当該遺伝子はまったく発現せず大腸菌は増殖阻害を受けない。従って、当該遺伝子の発現べクターの構築は問題なくできる。しかし、当該遺伝子を発現させるためには、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を発現する、特殊な大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に移さねばならない。この大腸菌株（Ｆ−、ｏｍｐＴ，ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−），　ｇａｌ（ｌｃＩ８５７，　ｉｎｄ１，　Ｓａｍ７，　ｎｉｎ５，　ｌａｃＵＶ５−Ｔ７　ｇｅｎｅ１），　ｄｃｍ（ＤＥ３））は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子がｌａｃＵＶ５プロモーター支配下に大腸菌の染色体ＤＮＡ中に挿入されている。ＩＰＴＧ投与前の増殖中でもｌａｃＵＶ５プロモーター支配下に低レベルのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの産生は避けられず、結果として、高コピー数プラスミドに乗った遺伝子から組換え蛋白質が低レベルで持続的に生産され、その蛋白質の毒性が強ければ増殖阻害が起ることは避けられない。これを避けるために、ノバジェン社は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを産生しない通常の大腸菌を使って発現させる方法も提供しているが、この方法では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをウイルス感染によって供給するために多量のウイルスを使用しなければならず、また大腸菌の細胞濃度を数百分の１以上に低くしなければならないという欠点があり、蛋白質の実用的、工業的な生産には適していないものである。
【０００５】
一方、低コピー数べクターを使うと、抗生物質入りの選択培養でも、通常、細胞分裂に伴うベクターの自然脱落が高頻度に起り、遺伝子の発現効率が極度に低下することになる。
このように、毒性蛋白質を大腸菌で生産するときに、高コピー数のプラスミドベクターでは、その前段階での細胞増殖中に完全な遺伝子発現抑制が出来ないことが問題であり、それを克服するために低コピー数のプラスミドベクターを用いるとべクターの不安定性が問題となる。
本発明者らは、このような問題点を解決するために、温度感受性変異を持つプラスミドを開発してきた（Ｔ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１２７，　１５６１−１５６３　（１９７６）；　Ｔ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１３１（２），　４０５−４１２　（１９７７））。これらの温度感受性プラスミドは、テトラサイクリン耐性ＲプラスミドｐＳＣ１０１をヒドロキシルアミンで突然変異させて得たものであり、次の３種のタイプに分類された。タイプＩのプラスミド（ｐＨＳＧ１、ｐＨＳＧ２、ｐＨＳＧ４、ｐＨＳＧ６、ｐＨＳＧ７、及びｐＨＳＧ１７、以下、上記２つの報告で「ｐＨＳ」と記述されているプラスミドは後に「ｐＨＳＧ」と改名された。Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１９７９，　Ｖｏｌ．　１３９，　ｐ．５９７−６０７）では、その宿主菌を一度４２℃でテトラサイクリンの無い条件で培養した場合には、３０℃に戻しても、４２℃のままでもテトラサイクリン存在下にコロニー形成能を失うものであった。タイプＩＩのプラスミド（ｐＨＳＧ３）では、プレインキュベーションの温度に関係無く、宿主菌はテトラサイクリンを含有する培地で４２℃ではコロニーを形成しないが、３０℃ではコロニー形成能を有するものであった。タイプＩＩＩのプラスミド（ｐＨＳＧ５、ｐＨＳＧ８、及びｐＨＳＧ１６）は、宿主菌を４２℃でテトラサイクリンの無い条件でプレインキュベーションした場合には、３０℃に戻してもテトラサイクリン含有培地で増殖できないが、３０℃でプレインキュベーションした場合には、４２℃でもコロニー形成能を有するものであった。
そして、これらのなかでプラスミドｐＨＳＧ１は、とくに４２℃でのＤＮＡ複製が完全に抑制されるものであった。例えば、３０℃では完全に安定に複製され、１００％の子孫に伝達されるが、高温（４２℃）では、全く複製できないものであった。
この温度感受性複製（ｔｓ‐Ｒｅｐ）プラスミドは、蛋白質の生産のための細胞培養の至適温度（３７℃付近）ではプラスミドの複製は部分的にしか阻害を受けず不完全な温度感受性を示すものであった。
【０００６】
一方、温度感受性分離（ｔｓ‐Ｓｅｇ）プラスミドでは、分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）という現象が起き、高温でのＤＮＡ複製は可能であるが、増殖した細胞にプラスミドコピーの二つの娘細胞への配分が均等に起こらないということがわかっていた。分離は、プラスミドが宿主細胞の分裂後に娘細胞の一部に分配されず、子孫細胞から次第に失われてゆく現象である。当該プラスミドは、宿主細胞の高温（４０〜４２℃）培養下で、プラスミドの複製により生じた娘プラスミドコピーが、宿主細胞の分裂（増殖）により生じた子孫細胞から高頻度に失われていった。このような分離が生起すると、そのプラスミドにクローニングした外来遺伝子を含有する細胞が培養細胞全体に対して次第に希釈され、培養液あたりのタンパク質の生産性が著しく低下することになる。例えば、前記した温度感受性分離プラスミド（ｔｓ−Ｓｅｇ）の１種であるｐＨＳＧ５は、４３℃で複製できるにもかかわらず、プラスミドを有する細胞が分裂するたびに娘細胞の３５％が当該プラスミドを有さないものであった。また、ｐＨＳＧ５は低温（３０℃）でさえコピー数が低く、ｐＳＣ１０１やｐＨＳＧ１では宿主細胞の染色体あたりのコピー数が５個であるのに対して、ｐＨＳＧ５は１個しかないという結果であった。
そこで、本発明者らは、温度感受性複製プラスミド、温度感受性分離プラスミドの発現ベクターの開発に成功した（Ｔ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ，　２４１，　１８５‐１９１　（２０００））。その結果、ｐＨＳＧ１に由来し、複製についての温度感受性を有するプラスミド（ｔｓ−Ｒｅｐ）ｐＴＨ１８ｃｓ１、ｐＴＨ１９ｃｓ１、ｐＴＨ１８ｋｓ１、及びｐＴＨ１９ｋｓ１を開発し、ｐＨＳＧ５に由来し、分離について温度感受性を有するプラスミド（ｔｓ−Ｓｅｇ）ｐＴＨ１８ｃｓ５、ｐＴＨ１９ｃｓ５、ｐＴＨ１８ｋｓ５、及びｐＴＨ１９ｋｓ５を開発した。そして、複製が温度感受性であるｃｓ１系（クロラムフェニコール耐性）及びｋｓ１系（カナマイシン耐性）のプラスミドはｒｅｐＡ遺伝子のコーディング領域に制限酵素ＭａｅＩＩで切断される塩基配列（ＡＣＧＴ）を一ヶ所余計に（コーディング領域全体で野生型は一ヶ所しか有しないところが二ヶ所ある）有すること、同様に分離が温度感受性であるｃｓ５系及びｋｓ５系のプラスミドではアミノ末端近くのコーディング領域にあるべき制限酵素ＭａｅＩで切断される塩基配列（ＣＴＡＧ）が失われている（コーディング領域全体で野生型は三ヶ所有するところが二ヶ所しかない）ことがわかった。
これらのプラスミドは、複製又は分離がそれぞれ温度感受性であり、温度の制御により複製又は分離のいずれかが制御できるだけである。しかも、抗生物質存在下での相対的コロニー形成能については温度感受性複製プラスミドは４２℃で１０−４程度に低下するものの、蛋白質を生産する培養条件下の温度（３７℃前後）ではほぼ１００％の細胞がコロニーを形成するものであった。一方の温度感受性分離プラスミドは４２℃でさえほぼ１００％の細胞が同条件下でコロニー形成能を保持していた。したがって、これらの発現ベクターは必ずしも実用的なものではなかった。工業的な観点からは、プラスミドとしての複製と分離が３７℃前後でも同時に抑制され、染色体に組込まれた状態でその一部として複製されるプラスミドベクターの開発が望まれていた。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｔ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１２７，　１５６１−１５６３　（１９７６）；
【非特許文献２】
Ｔ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１３１（２），　４０５−４１２　（１９７７）
【非特許文献３】
Ｈａｍｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７１：４６１７−４６２２，　（１９８９）
【非特許文献４】
Ｔ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ，　２４１，　１８５‐１９１　（２０００）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このように、大腸菌を用いた遺伝子組換え技術による蛋白質の工業的な生産においては、従来は（１）宿主菌の培養による発現べクターの複製と子孫細胞への安定な分配を行う「遺伝子増幅工程」と、（２）有用物質を発現させる「遺伝子発現工程」との両工程が同時進行するために、発現系の宿主や産物が劣化するケースが散見され、大腸菌による有用物質の大量生産における大きな障害となっていた。このことは当該蛋白質が宿主菌細胞に何らかの毒性を示す場合は特に深刻であり、大腸菌による組換え蛋白質の生産が実質上不可能であったことも少なくない。このために、大腸菌に毒性を有する蛋白質の生産効率を可能足らしめるホスト・ベクター系の開発が望まれていた。
本発明は、プラスミドの複製及び分離を温度により制御できる新規なプラスミドを提供するものであり、遺伝子組換え技術による有用物質の大量生産を可能とする新規な発現ベクターを提供するものである。
さらに、本発明の目的は、１）高コピー数プラスミドベクターが持つ低レベルの持続的な遺伝子発現、２）それを避ける為に低コピー数プラスミドベクターを使うことで起る発現べクターの不安定化の両方の問題を克服し、かつプロモーターのスイッチを入れる発現開始にウイルス感染ではなく従来のＩＰＴＧ添加法を使える方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記の状況に鑑み、本発明者はラクトースプロモータ一・オペレーター（ＰＯｌａｃ）支配下に組換え蛋白質の遺伝子発現をするプラスミドベクターを特定の条件下で宿主大腸菌の染色体中に挿入し、安定に維持させる温度感受性二重突然変異をＤＮＡ合成開始蛋白質遺伝子（ｒｅｐＡ）中に持つｐＳＣ１０１系プラスミドベクターを構築することに成功した。
即ち、本発明はｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）であって、そのアミノ酸配列の１３番目のアミノ酸であるアラニンがトレオニンに変異し、かつ５６番目のアミノ酸であるアラニンがバリンに変異していることを特徴とする温度感受性複製能及び温度感受性分離能を有するｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体（ＲｅｐＡｓ１ｓ５あるいは単にＲｅｐＡｓｓ）、好ましくは、さらに、そのアミノ酸配列の３番目のアミノ酸であるグルタミン酸もリジンに変異していることを特徴とする温度感受性複製能及び温度感受性分離能を有するｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体（ＲｅｐＡｓ１ｓ５ｈ１４あるいは単にＲｅｐＡｓｓｈ）に関する。より好ましくは、ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子の遺伝子（ｒｅｐＡ）が、配列表の配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列を有するｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体（ＲｅｐＡｓｓ、またはＲｅｐＡｓｓｈ）に関する。
また、本発明は、ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡ）をコードする遺伝子（ｒｅｐＡ）であって、その翻訳領域の３７番目の塩基であるグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異し、かつ１６７番目の塩基であるシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変異していることを特徴とする温度感受性複製能及び温度感受性分離能を有するｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体（ＲｅｐＡｓｓ）をコードする遺伝子、好ましくは、さらに、その翻訳領域の７番目の塩基であるグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異していることを特徴とする温度感受性複製能及び温度感受性分離能を有するｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体（ＲｅｐＡｓｓｈ）をコードする遺伝子に関する。より好ましくは、ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体（ＲｅｐＡ
）をコードする遺伝子の翻訳領域が、配列表の配列番号３又は４に示される塩基配列を有するｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体（ＲｅｐＡｓｓまたはＲｅｐＡｓｓｈ）をコードする遺伝子（ｒｅｐＡｓｓまたはｒｅｐＡｓｓｈ）に関する。
【００１０】
また、本発明は、前記したｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体（ＲｅｐＡｓｓまたはＲｅｐＡｓｓｈ）をコードする遺伝子（ｒｅｐＡｓｓまたはｒｅｐＡｓｓｈ）を含有してなるプラスミドベクター、好ましくはラクトースプロモータ一・オペレーター（ＰＯｌａｃ）支配下に組換え蛋白質の遺伝子発現をするプラスミドベクター、より好ましくはｐＳＣ１０１に由来するプラスミドベクター、さらに好ましくはｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体（ＲｅｐＡｓｓまたはＲｅｐＡｓｓｈ）をコードする遺伝子の下流側にｍＲＮＡの半減期を調節する塩基配列を有しているプラスミドベクターに関する。
さらに、本発明は、前記したプラスミドベクターで形質転換された細胞、好ましくは大腸菌に関する。
そして、本発明は、前記したプラスミドの複製及び分離を細胞の培養温度とは異なる温度で行い、細胞の培養温度では当該プラスミドの複製及び分離が実質的に行われないことを特徴とする細胞の培養方法、好ましくはプラスミドとしての複製及び分離のための温度が２８〜３３℃であり、大腸菌染色体に挿入された状態での複製が３５〜４２℃である培養方法に関する。
また、本発明は、外来遺伝子が挿入されている前記したプラスミドベクターで形質転換された細胞を、前記したプラスミドの複製及び分離を細胞の培養温度とは異なる温度で行い、細胞の培養温度（３５〜４２℃）では当該ベクターがプラスミドとして複製及び分離されないことを特徴とする細胞の培養方法により、当該外来遺伝子がコードするタンパク質を製造する方法、好ましくは、前記プラスミドの複製及び分離のための温度が２８〜３３℃であり、外来遺伝子の発現のための培養温度が３５〜４２℃である当該外来遺伝子がコードするタンパク質を製造する方法に関する。
【００１１】
本発明者らは、複製についての温度感受性を有する（ｔｓ−Ｒｅｐ）プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１、ｐＴＨ１９ｃｓ１、ｐＴＨ１８ｋｓ１、及びｐＴＨ１９ｋｓ１を開発し、分離について温度感受性を有する（ｔｓ−Ｓｅｇ）プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ５、ｐＴＨ１９ｃｓ５、ｐＴＨ１８ｋｓ５、及びｐＴＨ１９ｋｓ５を開発してきた（Ｔ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ，　２４１，　１８５‐１９１　（２０００））。
これらのプラスミドは、ＤＮＡ複製に関してはいずれもｐＳＣ１０１プラスミド由来のものであって、複製が温度感受性であるｃｓ１系（クロラムフェニコール耐性）及びｋｓ１系（カナマイシン耐性）のプラスミド、及び、分離が温度感受性であるｃｓ５系（クロラムフェニコール耐性）及びｋｓ５系（カナマイシン耐性）のプラスミドである。
複製についての温度感受性を有するプラスミド（温度感受性複製プラスミド（ｔｓ‐Ｒｅｐ　ベクター）＝　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ‐ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ：ｔｓ−Ｒｅｐ）は、その複製能が温度感受性であり、低温、例えば３０℃で複製可能であるが、高温、例えば４１．５℃では複製ができないものである。また、分離についての温度感受性を有するプラスミド（温度感受性分離プラスミド（ｔｓ−Ｓｅｇ　ベクター）＝ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ‐ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ：ｔｓ−Ｓｅｇ）は、その分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）能が温度感受性であり、３０℃では娘細胞への安定な伝達が可能であるが、４１．５℃では不安定な分離を起こすものである。
しかし、これらのプラスミドは複製又は分離についての温度制御が可能であったが、両方を同一遺伝子に同時に導入した変異体について、それが共存可能か否か、可能であればどのような表現型を示すかについて検討されていなかった。
【００１２】
例えば、複製について温度感受性を有する（ｔｓ−Ｒｅｐ）プラスミド、及び分離について温度感受性を有する（ｔｓ−Ｓｅｇ）プラスミドについての各培養温度における、選択的抗生物質の不存在下での大腸菌の増殖速度を見ると、それぞれ図１のＡ及びＢのようになる。図１のグラフは、縦軸が単位容積辺りの大腸菌の数を対数で示し、横軸は培養時間を示す。丸印（○または●）を付した線は低温（例えば、３０℃）での培養の場合を示し、四角印（□または■）を付した線は高温（例えば、４１．５℃）での培養の場合を示す。それぞれの総細胞数は単位容積辺りで縦軸に示されており、実際の測定は選択的抗生物質を含まない寒天培地に適当に希釈することによって行われる。一方、黒で塗りつぶした印（●または■）は抗生物質を含有する寒天培地を用いて測定した場合を示している。これはプラスミドを含有する細胞数を示している。
複製が温度感受性であるｔｓ−Ｒｅｐプラスミドの場合（図１Ａ）は、低温での培養では菌数は時間と共に半対数的に増加するが、時間Ｔ１で培養温度を高温にシフトした後には総細胞数、プラスミド含有細胞数ともに増加が顕著になる。しかし、時間Ｔ２以降においてはプラスミド含有細胞数は一定となって増加しなくなる（図１Ａの黒四角印（■）を付した線）。これは、高温では温度感受性プラスミドの複製が行われず、大腸菌の増殖に伴ってプラスミドコピーが娘細胞へ分配されるにあたって分離が起こり、細胞あたりに複数個存在するプラスミドコピーが娘細胞に分割（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）され、一定の世代を経て後に細胞あたりのコピー数が１になった時点（Ｔ２）より後には、プラスミドを持たない大腸菌のみが細胞数を増加させる結果になったからである。即ち、プラスミドを含有する細胞は全細胞集団の中で希釈されていくことになる。これに対して、低温での培養では、大腸菌の増殖に伴ってプラスミドも複製され、時間と共に総細胞数（○）と温度感受性プラスミドを有する大腸菌数（●）は一致して増加する。
【００１３】
また、分離が温度感受性であるｔｓ−Ｓｅｇプラスミドの場合（図１Ｂ）は、低温での培養では全細胞がプラスミド含有細胞として増加するが、時間Ｔ１で培養温度を高温にシフトした後の培養では、一定の時間（Ｔ３−Ｔ１）後に、全生菌数の増加速度は低温時の速度に比べて速くなるのはｔｓ−Ｒｅｐプラスミドの場合と同様であるが、Ｔ３−Ｔ１はＴ２−Ｔ１よりも短く、かつプラスミド含有細胞の増殖速度は遅くなるものの、時間Ｔ３以後においてはｔｓ−Ｓｅｇプラスミドを有する大腸菌細胞数の増加は続く（図１Ｂの黒四角印（■）を付した線）。これは、高温ではｔｓ−Ｓｅｇプラスミドのコピーが世代ごとに一定の割合（３０〜３５％）で娘細胞から失われ、プラスミドを持つ大腸菌（図１Ｂの黒四角印（■）を付した線）の増殖速度を、持たない大腸菌（図１Ｂの四角印（□）を付した線と黒四角印（■）を付した線の差）の増殖速度が上回るからである。結果として、ｔｓ−Ｓｅｇプラスミドを持つ大腸菌もｔｓ−Ｒｅｐプラスミドを持つ大腸菌と同様に高温での増殖中に希釈されていく。
図１Ａにおける時間Ｔ２と時間Ｔ１の差は、温度感受性プラスミドの複製効率が低下し、分離によりｔｓ−Ｒｅｐプラスミドを持たない細胞が出現するに要する時間であり、ｒｅｐＡｓ１の場合は世代数に換算して３．８、ｒｅｐＡｓ１ｈ１４の場合は５．０であった。同様に、図１Ｂにおける時間Ｔ３と時間Ｔ１の差は、分離についての温度感受性プラスミドを持たない大腸菌が出現してくるまでの時間であり、ｒｅｐＡｓ５の場合は世代数に換算して２．１であった。
【００１４】
このような２種類の温度感受性突然変異をｒｅｐＡ遺伝子に同時に導入した場合にどのような挙動を示すかという点について今回検討した結果が、図１Ｃに示されている。
これら２種類の温度感受性突然変異と高コピー数突然変異を同時に有するプラスミドｐＴＨ１４ｋｓｓｈ（３３４３ｂｐ）を本発明のプラスミドの例示として製造した。このプラスミドの配置を図２に示す。また、全塩基配列を配列表の配列番号６）に示す。このプラスミドは、３箇所のアミノ酸置換を有するｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体（ＲｅｐＡｓｓｈ）をコードするｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子の遺伝子（ｒｅｐＡ）を有している。このｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体蛋白質（ＲｅｐＡｓｓｈ）をコードする塩基配列は９４８塩基からなり、その塩基配列は配列表の配列番号４に示されるものである。そして、そのアミノ酸配列は３１６アミノ酸残基からなり、アミノ酸配列は配列表の配列番号２に示される。このｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体（ＲｅｐＡｓｓｈ）と、野生型のｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子（ＲｅｐＡｗｔ）との塩基配列の比較を図３及び図４に示し、アミノ酸配列の比較を図５に示す。このｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体遺伝子（ｒｅｐＡｓｓｈ）のコーディング領域は、図３及び図４に示されるように、７番目の塩基グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しており（この部位の変異をｈ１４変異と言う）、３７番目の塩基であるグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異しており（この部位の変異をｓ５変異と言う）、かつ１６７番目の塩基であるシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変異している（この部位での変異をｓ１変異と言う）。アミノ酸配列では、図５に示されるように、３番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）に置換し、１３番目のアミノ酸であるアラニン（Ａ）がトレオニン（Ｔ）に置換し、５６番目のアミノ酸であるアラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）に置換している。
【００１５】
以下の説明のために、ｒｅｐＡ遺伝子がコードする蛋白質の３１６アミノ酸残基のうち、ｓ１のみが変異した遺伝子を「ｒｅｐＡｓ１」と表記し、以下同様にｓ５のみが変異したものを「ｒｅｐＡｓ５」と表記し、ｈ１４のみが変異したものを「ｒｅｐＡｈ１４」などと表記する。そして、ｓ１とｓ５が変異したものを「ｒｅｐＡｓｓ」と表記し、ｓ１、ｓ５及びｈ１４の３箇所が変異したものを「ｒｅｐＡｓｓｈ」と表記する。また、それぞれの蛋白質は「ＲｅｐＡｓ１」などのように頭文字を大文字にして表記する。
ｒｅｐＡｓ１を持つｐＳＣ１０１系のプラスミドのコピー数は大腸菌宿主細胞の染色体あたりに換算して「５」であり、野生型（ｒｅｐＡｗｔ）と違いはないが、高温でプラスミドの複製が完全に停止する変異体である。ｒｅｐＡｓ５はプラスミドのコピー数を低温で「５」から「１」に減少させ、かつ細胞分裂に際して高温でプラスミドコピーの娘細胞への伝達が不安定になり、世代ごとに娘細胞の３０％がプラスミドを失って、プラスミドフリーになる変異体である。ｒｅｐＡｈ１４は、アンピシリン耐性遺伝子と結合されたｐＳＣ１０１系プラスミドをヒドロキシアミン処理して、その薬剤耐性が約４倍に上昇することで選択したもので、プラスミドコピー数を「５」から「１４」に増加させる変異体である。
【００１６】
これらの三つの変異を同時に持つｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体遺伝子（ｒｅｐＡｓｓｈ）のコーディング領域は、プラスミドｐＴＨ１４ｋｓｓｈ（３３４３ｂｐ）では１８１５番目のアデニン塩基から２７６２番目のシトシン塩基にかけて挿入されている。このプラスミドは、抗生物質のカナマイシンに対する耐性を宿主菌に与えるために耐性遺伝子ａｇｐ５を有している。そして、外来遺伝子挿入のために各種制限酵素（ＮｄｅＩ，　ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳｐｈＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＸｂａＩ，ＢａｍｎＨＩ，ＳｍａＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃＩ，ＥｃｏＲＩ）の単一切断部位が、ｌａｃプロモーター・オペレーター配列（ＰＯｌａｃ）の下流に配置されている。ＮｄｅＩ認識部位（ＣＡＴＡＴＧ）中のＡＴＧはＰＯｌａｃから転写されたｍＲＮＡの翻訳開始部位である。さらに、ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体遺伝子（ｒｅｐＡｓｓｈ）のｍＲＮＡの半減期を調整するための約３００塩基からなる塩基配列が、ｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体（ＲｅｐＡｓｓｈ）をコードする遺伝子の下流側に配置されている。
【００１７】
このプラスミドは、低温（＜３０℃）では低コピー数（≦１／染色体）プラスミドとして大腸菌細胞内で比較的安定に存在するが、高温（≧３７℃）では独立したプラスミド分子としては増殖中の細胞内に維持されないものであった。このプラスミドを有する大腸菌について、その増殖をみると、図１Ｃに示されるようになる。
すなわち、低温では、大腸菌がプラスミドを保持したまま増殖するが、高温ではプラスミドの複製が全く起らず、プラスミドを保持した大腸菌は増殖しない。また、低温でもプラスミドコピー数が宿主染色体あたりに１以下となるために、当該プラスミドを有する大腸菌は培養温度を高温にシフトしたほぼ直後に増加しなくなる。このような挙動は、複製についての温度感受性プラスミドの場合（図１Ａ参照）とよく似ているが、時間Ｔ４と時間Ｔ１との差が極めて短くなり、両者がほぼ同時となる点で異なっている。すなわち、両方の突然変異を同時に導入することにより、温度のシフトアップと殆ど同時に、あるいは極めて短時間内に当該プラスミドを有する大腸菌の増殖が停止されることになる。
このように、本発明のｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体遺伝子（ｒｅｐＡｓｓｈ）を有するプラスミドは、従来のものに比べて非常に感受性の高い温度特性を有している。この現象を利用することにより、相同組換え機能について野生型（ｒｅｃ＋）であり、かつラクトースプロモーターのリプレッサーを過剰発現するｌａｃＩｑ株に当該プラスミドを導入して高温で寒天培地上で培養し、カナマイシン耐性のコロニーを選択すれば、相同組換えにより染色体に挿入された株が得られる。この場合、当該プラスミドに大腸菌の非必須領域の染色体断片ＤＮＡをあらかじめ組込んでおけば、その領域にプラスミドが挿入されることになる（Ｈａｍｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７１：４６１７−４６２２，　１９８９）。さらに、当該プラスミドのＰＯｌａｃ下流に外来遺伝子のｃＤＮＡを組み込むことにより、その遺伝子をあたかも大腸菌染色体遺伝子であるかのように発現させることができる。この場合、ｌａｃＩｑ遺伝子の存在下であり、当該遺伝子コピーは染色体辺り１コピーしか存在しないので、完全に外来遺伝子の発現を抑制することが可能である。しかも、このプラスミドは大腸菌培養の至適温度である３７℃では複製できない点で、従来の上記Ｈａｍｉｌｔｏｎらが使用したｒｅｐＡｓ１単独変異の温度感受性ベクターとは異なる優れた性質を持つ。このように、当該プラスミドは外来遺伝子の発現ベクターとして極めて有用なものである。特に、細胞毒性の強い蛋白質を発現させるためのホスト・ベクター系として、３７℃で外来遺伝子の発現を押さえながら宿主細胞の増殖が可能であり、細胞毒性の強い蛋白質をコードする遺伝子を有する宿主細胞を大量に、工業的に増殖させることができ、細胞濃度が十分に高くなったのちにＩＰＴＧを加えて初めて外来遺伝子の発現のスィッチを入れることができる。従って、細胞毒性の強い遺伝子の場合でも、低レベルの発現で宿主細胞が死滅する場合であっても、そのような「死滅」を避けることができるので、目的の蛋白質を大量生産することが可能となる。
【００１８】
以上でｒｅｐＡｓｓｈ遺伝子を有するプラスミドを例にして本発明を説明してきた。ここで例示してきたプラスミドｐＴＨ１４ｋｓｓｈは、ｈ１４も変異したｒｅｐＡｓｓｈを用いたものであるが、ｈ１４の変異は本発明においてはプラスミド構築上の便宜的な目的で使われたのであり、発明にとって本質的なものではなく、例示のために存在させたものである。なぜならば、ｓ５変異の低コピー数の性質はｈ１４変異の高コピー数の性質に対して少なくともｃｉｓの関係では優性に発現することが我々の発明の過程で明らかになったからである。要約すれば、ｓ１変異とｓ５変異の二重変異体であることが本発明において重要なことであり、ｈ１４の変異は実験をより容易にするため存在していたにすぎない。
即ち、本発明は、少なくともｓ１及びｓ５変異を有するｒｅｐＡ変異体（ｒｅｐＡｓｓ：例えば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列表の配列番号３で表される塩基配列でコードされる遺伝子）、及び少なくとも当該変異体を含有してなるプラスミド（例えば、配列表の配列番号５）で表される塩基配列を有するプラスミドｐＴＨ１４ｋｓｓ）に関するものである。本発明の他の態様としては、さらにｈ１４変異を有するｒｅｐＡ変異体（ｒｅｐＡｓｓｈ：例えば、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列表の配列番号４で表される塩基配列でコードされる遺伝子）、及び少なくとも当該変異体を含有してなるプラスミド（例えば、配列表の配列番号６で表される塩基配列を有するプラスミドｐＴＨ１４ｋｓｓｈ）に関するものである。
さらに、本発明の他の態様としては、本発明のプラスミドベクターのｌａｃプロモーター・オペレーター配列（ＰＯｌａｃ）下流に外来遺伝子挿入のためにある各種制限酵素による単一切断部位（ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳｐｈＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＸｂａＩ，ＢａｍｎＨＩ，ＳｍａＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃＩ，ＥｃｏＲＩ）の任意の一箇所において、例えばｐＢＲ３２２などの高コピー数プラスミドを挿入し複合プラスミドとしたものが挙げられる。例えば、本発明のプラスミドｐＴＨ１４ｋｓｓｈのＮｄｅＩ認識部位（ＣＡＴＡＴＧ）にｐＢＲ３２２（４３６１ｂｐ）を挿入して、プラスミドｐＴＨ１４ｋｓｓｈとｐＢＲ３２２との複合プラスミドｐＴＨ１４ｋｓｓｈ：ｐＢＲＨ（７７０４ｂｐ）とすることができる。このときｐＢＲ３２２の挿入方向は、いずれの方向からであってもよい。例えばそれぞれのＤＮＡ合成の方向が同じように挿入されたものを「＋」、逆方向のものを「−」とすれば、それぞれｐＴＨ１４ｋｓｓｈ：ｐＢＲＨ＋、ｐＴＨ１４ｋｓｓｈ：ｐＢＲＨ−と表記される。これらは外来遺伝子の発現ベクターを作成するにあたり、ｐＴＨ１４ｋｓｓｈプラスミド部分を切りだして発現ベクターの構築を行うときに便宜を与える。このとき用いるプラスミドはｐＳＣ１０１系のプラスミドでなければ、ｐＢＲ３２２に限定されるものではないが、分子の大きさがｐＴＨ１４ｋｓｓ又はｐＴＨ１４ｋｓｓｈとは電気泳動などの方法で分離可能なほどに大きいことが望ましい。また、同様に、ＮｄｅＩ切断部位やＥｃｏＲＩ切断部位にもｐＢＲ３２２（４３６１ｂｐ）を挿入して複合プラスミドｐＴＨ１４ｋｓｓ：ｐＢＲＮ＋、ｐＴＨ１４ｋｓｓ：ｐＢＲＮ−、ｐＴＨ１４ｋｓｓ：ｐＢＲＥ＋、ｐＴＨ１４ｋｓｓ：ｐＢＲＥ−（いずれも７７０４ｂｐ）とすることもできる。挿入方向が逆になったプラスミドはＰＯｌａｃの下流に挿入する外来遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列中の制限酵素部位によって使い分けるために有用である。
【００１９】
本発明のプラスミドベクターは、低温（＜３０℃）で増殖中は低コピー数プラスミドとして大腸菌細胞内で比較的安定に存在し、一方、高温（＞３７℃）で増殖中は染色体に挿入された状態でしか細胞内に維持されないものである。
本発明のプラスミドベクターは、好ましくは抗生物質又は抗菌因子に耐性又は免疫性を発現する遺伝子、より好ましくは抗生物質の耐性遺伝子を有するものである。配列表に記載した例ではカナマイシン耐性遺伝子を用いた場合を例示してあるが、カナマイシンに限定されるものではなく、クロラムフェニコール、テトラサイクリンなど、他の任意の抗生物質耐性遺伝子であってもよい。
本発明のプラスミドは、低コピー数であるために３０℃での培養であってもＤＮＡの回収率が非常に低い場合がある。このような場合であってもラージスケールの大腸菌培養液から目的のプラスミドＤＮＡを抽出し発現ベクターの構築を行うことはできるがコピー数を増やすための処置を行ってＤＮＡを得るほうが好ましい。便宜上コピー数を増やす方法としては、前記で例示した、高コピー数のプラスミドとの複合プラスミドにする方法がある。
【００２０】
本発明のプラスミドは、外来遺伝子を発現させるためのプロモーターを有するものが好ましい。プロモーターとしては各種のものを使用することができるが、通常用いられるｌａｃＵＶ５プロモーターはリプレッサー存在下でも低レベルでの発現があるので出来れば野生型のｌａｃプロモーターの方がスイッチのオン・オフが容易なので好ましい。しかし、これらに限定されるものではない。
また、本発明のプラスミドベクターは、ｒｅｐＡ遺伝子の下流側にｍＲＮＡの半減期を調整するとされる塩基配列を挿入することができるが、それに制約されるものではない。このような塩基配列として配列表において例示されたような、ｒｅｐＡ遺伝子の持つ本来の配列を利用することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２１】
本発明のｒｅｐＡ変異体遺伝子は、本発明により開示された塩基配列に基づいて各種の方法で製造することができるが、例えば、ｐＳＣ１０１系プラスミドをヒドロキシアミンあるいは、他の変異原で突然変異させることによりｓ１変異又はｓ５変異と同様の効果を持つもの、さらにあるいはそれ以外の変異でｓ１及びｓ５二重変異体と同様に３５℃以上で染色体外でプラスミドとして存在しえないものを得ることが出きる。あるいは、これらのいずれかの変異体を鋳型にして、１塩基が異なるプライマーを用いたＰＣＲ法によりさらにもうひとつの変異を有するｒｅｐＡ変異体遺伝子を製造することができる。ｈ１４変異体も同様な方法により製造することができる。このようにして製造されたＲｅｐＡ変異体の遺伝子（またはｒｅｐＡ変異体遺伝子）を用いて、常法にしたがってプラスミドベクターを構築することができる。
【００２２】
本発明のプラスミドベクターは、常法にしたがって外来遺伝子を挿入することができる。また、外来遺伝子が挿入されているプラスミドを本発明のプラスミドに挿入することもできる。外来のＤＮＡは発現させたい遺伝子のＤＮＡだけではなく大腸菌の非必須領域の相同配列を含むものでも構わない。それは発現ベクターの染色体への挿入頻度を上昇させるであろうからである。
本発明のプラスミドベクターは、少なくとも複製について温度感受性変異ｓ１及び分離についての温度感受性変異ｓ５を有する二重変異体のｒｅｐＡ遺伝子を含有していることを特徴とするものであり、複製及び分離が温度感受性であること、結果として染色体外プラスミドとしての大腸菌細胞内での維持が通常の温度（３７℃）以上では不可能になることを特徴とするものである。したがって、その他の点については、通常のプラスミドベクター、好ましくはｐＳＣ１０１系プラスミドベクターと同様に取り扱うことができる。
また、宿主細胞としては大腸菌が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２３】
本発明の温度感受性のプラスミドベクターは、増殖中の大腸菌で、低温（＜３０℃）では染色体外の低コピー数プラスミドとして細胞内で比較的安定に存在し、高温（＞３７℃）ではそうではなく染色体の一部として維持されるものしか複製できない性質のものである。したがって、ｃＤＮＡ断片の上流にＮｄｅＩ切断部位を持ち、下流にＥｃｏＲＩ切断部位を持つコーディング領域を用いて、任意の遺伝子を発現させたい場合は、通常の工程は以下のようになる。
（１）ｐＴＨ１４ｋｓｓｈ：ｐＢＲＮ＋複合プラスミドのＤＮＡを同プラスミドを持つ少量の大腸菌培養液（通常は数ｍｌ）から抽出し、ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断してアガロースゲルで電気泳動する。
（２）ＤＮＡバンドは、それぞれ約３．３ｋｂｐ、２．１ｋｂｐ、１．３ｋｂｐ、７０ｂｐの４種類のサイズのものが得られる。ただし、通常７０ｂｐのサイズのものは肉眼的には観察されない。このうち、３．３ｋｂｐのものがｐＴＨ１４ｋｓｓｈプラスミド本体のものなのでこのバンドを回収し、精製する。
（３）あらかじめ調整したＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ切断断片のｃＤＮＡを上記ＤＮＡと酵素的に結合する。この場合ｃＤＮＡ断片の３’−非翻訳領域の下流に大腸菌染色体の非必須領域に相同性を有する数百ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を挿入しておく。これが染色体への組込み部位を決定する。
（４）（３）で結合したＤＮＡで常法により大腸菌（ｒｅｃ＋、ｌａｃＩｑ株が望ましい）を形質転換し、栄養液体培地を加えて３０℃で２時間以上、振盪培養する。
（５）上記培養液を適当に希釈して、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含む栄養寒天培地二枚づつに撒く。
（６）上記２セットの寒天培地の一方を２８〜３０℃で、他方を４０〜４２℃で１〜２晩インキュベートする。
（７）３０℃でｐＴＨ１４ｋｓｓｈＤＮＡの１μｇ辺りに１０４〜１０７個以上のトランスフォーマントが得られていることを確認して、４２℃ではその数桁以上少ないコロニーが得られたことを確認する。大腸菌の染色体の非必須領域をあらかじめ含めていた外来ＤＮＡを挿入していた場合は、高温でのコロニー形成数は上昇するであろう。
（８）上記の４２℃で得られたコロニーを３７℃で液体培地で培養しシードカルチャーを製造し、常法により液体窒素中で保存する。
（９）上記のシードカルチャーの一部を取りだし、３７℃以上でカナマイシンを含む液体培地で培養し、外来遺伝子ｃＤＮＡからｍＲＮＡが合成されていることを確認し、かつプラスミドＤＮＡが少なくとも数ｍｌの培養液から回収されないことを確認する。
（１０）上記を確認後、同じバッジのシードカルチャーから適度にスケールアップした培養液を同条件下で製造し当該蛋白質が産生されていることを免疫学的、あるいは生化学的方法により確認する。
本発明のプラスミドは低コピー数のプラスミドであるために、場合によっては、プラスミドのコピー数が極端に少なくなる場合があるので、例えば、細胞当たり０．１個以下になる場合もあるので、このような場合に取扱いが困難となったならば、高コピー数になるための処置をすることが好ましい。
【００２４】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１　（プラスミドｐＴＨ１４ｋｓｓｈの構築）
ｐＳＣ１０１プラスミドのｒｅｐＡ遺伝子のｓ１変異とｓ５変異のそれぞれについては、既に報告されたている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ　ａｎｄ　Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１３１，４０５‐４１２，１９７７）。また、ｒｅｐＡｓ１変異体を用いたＤＮＡ合成が温度感受性である、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマインシンの三剤耐性プラスミドベクター、ｐＨＳＧ４１５ｓもすでに報告されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１６，２２７−２３５，１９８１．）。
（１）橋本と関口（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　ａｎｄ　Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１２７：１５６１−１５６３，１９７６）の方法により、ｐＨＳＧ４１５ｓのＤＮＡをヒドロキシアミンによってランダム突然変異を起こす。そのＤＮＡ混合物で大腸菌をトランスフォームして、３０℃で２時間、栄養培地で振盪培養後にアンピシリンを５００μｇ／ｍ加えて、続いて同条件で一晩培養する。翌日、その０．５ｍｌを同様のアンピシリンを含む新鮮栄養培地に移植して、更に５時間培養する。これを５度繰返して、単一コロニーをランダムに５コ選択する。それぞれを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体栄養培地で一晩３０℃で培養する。このときに、対照としてヒドロキシアミン処理していないもとのｐＨＳＧ４１５ｓを持つ大腸菌も同一条件で培養する。翌日、それぞれの培養液を１０−６倍希釈した液を用意して、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌほど含む寒天培地に５０μｌ撒布する。３０℃で二晩培養し、対照のｐＨＳＧ４１５ｓを持つ大腸菌が１００μｇ／ｍｌまでしかコロニーを形成しないのに、他の５サンプルは４００μｇ／ｍｌまで約４００〜５００個のコロニーが形成された。この内の一つからプラスミドＤＮＡを抽出してｐＨＳＧ４１５ｓｈと命名した。
【００２６】
（２）上記のｐＨＳＧ４１５ｓｈのプラスミドからｒｅｐＡ遺伝子を含む、制限酵素ＨａｅＩＩ−Ｎｄｅｌで挟まれるＤＮＡ断片を調整し、カナマイシン耐性遺伝子ａｇｐ５とラクトースプロモーター支配下にＮｄｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳｐｈＩ，ＰｓｔＩ，Ｓａ１Ｉ，ＸｂａＩ，ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃＩ，ＥｃｏＲＩのポリクローニング部位を持つベクターを橋本らの方法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ，２４１：１８５−１９５，２０００）と同様に構築しｐＴＨ１９ｋｓｈと名付けた。
（３）ｐＴＨ１９ｋｓｈにｒｅｐＡｓ５を突然変異を導入すべくＰＣＲプライマーを下記のようにデザインした。
フォワードブライマー（ＵＳ５）
ＡＡＡＴＧＡＡＣＴＡＡＣＧＡＴＴＡＧＴＣＧＣ
これはｓ５変異を導入するためのプライマーで下線の部分が野生型ではＧである。
リバースブライマー（ｌａｃＦＷ）
ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ
これはＰＣＲ反応のためにデザインされたｒｅｐＡ遺伝子に関してリバースプライマーである。
常法によりこれらのブライマーを用いてＤＮＡを増幅させ、目的のプラスミドの構築を試みた。このＰＣＲ混合物ＤＮＡを用いて大腸菌（ＴＯＰ１０）をトランスフオームして得られたカナマイシン耐性のコロニーは低温で２日培養しても、実体顕微鏡またはルーペで確認出きる程度のもの（直径０．１〜０．２ｍｍ）しか観察されず、正常なサイズ（＞１ｍｍ）のものは得られなかった。また、そのまま３０℃で４晩ほど放置してもコロニーの大きさに変化はなかった。
これは、ｓ１変異とｓ５変異を共存させたｒｅｐＡ遺伝子は、ＲｅｐＡ蛋白質がこれらの二重温度感受性変異を持つことにより非常に不安定、または不活性になり、その結果、カナマイシンの存在する培地で宿主菌が致死的になったと示唆された。
【００２７】
実施例２　（プラスミドｐＴＨ１４ｋｓｓｈの構築）
実施例１に記載したｐＴＨ１９ｋｓｈのｒｅｐＡ遺伝子はコーディング領域の下流にある単一のＮｄｅＩサイトから３’領域にかけて約３００ｂｐが欠失したものである。このために、転写産物であるｒｅｐＡのｍＲＮＡが不安定になっていて、その結果ＲｅｐＡ蛋白質の活性が量的に減少したためにＤＮＡ合成開始活性を十分に示すことができなかった可能性があるので、この領域を回復させてｓ１変異とｓ５変異が同一遺伝子に同居できるか否かを検証した。ｐＨＳＧ４１５ｓｈのＮｄｅＩ部位を切断後にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化して再結合させ、ＡｓｅＩ−ＡｆｌＩＩＩ　断片として切りだし、ｐＴＨ１９ｋｓ１のｒｅｐＡ遺伝子中のＡｆｌＩＩＩ　部位とＰＯｌａｃ上流末端のＡｓｅＩ部位に結合し、ｐＴＨ１４ｋｓｈを得た。ｐＴＨ１４ｋｓｈのＤＮＡを実施例１の（２）と同様にして、Ｓ５変異を導入し、３０℃でトランスフォームするとカナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含む寒天培地上で数百のコロニーを得た。得られたコロニーは３０℃で二晩培養後に約１．５ｍｍと約２．０ｍｍの直径のものが約半々の比で得られた。それぞれの代表的な５つづつのコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し以下のプライマー（Ｕ１５４５およびＬ２０３８）
Ｕ１５４５プライマー
５’−ＧＡＧＴＴＡＴＡＣＡＣＡＧＧＧＣＴＧＧＧ−３’
Ｌ２０３８プライマー
５’−ＡＧＴＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＴＣＴＣ−３‘
を用いてＰＣＲ増幅を行って、ＤＮＡ塩基配列を決定し、ｓ１、ｓ５、ｈ１４の変異が導入されているかどうかを確認した。小さいほうのコロニーから得られたＤＮＡにはｓ１、ｓ５、ｈ１４の全ての変異が存在していたが、大きいほうのコロニーから得られたＤＮＡにはｓ１、ｈ１４変異のみが存在し、ｓ５変異は導入されていなかった。このことはｒｅｐＡ遺伝子の３’−領域が回復すると、ＲｅｐＡｓｓｈ蛋白質はＲｅｐＡｓｈ蛋白質に比べて比活性の低下があるにもかかわらず、選択薬剤であるカナマイシン存在下に宿主菌の増殖を可能とする程度にはプラスミドの複製、分配の機能が働くことを示唆していた。
【００２８】
得られたプラスミドの特性を検討した結果を、野生型、ｓ１変異型、ｓ５変異型と比較して次ぎの表１に示す。
【表１】
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【００２９】
表１中の「ＡＡ３」はＮ末端から３番目のアミノ酸、「ＡＡ１３」はＮ末端から１３番目のアミノ酸、「ＡＡ５６」はＮ末端から５６番目のアミノ酸を示す。「ＤＮＡ複製効率」ｋは、式
ｋ＝２・ｅｘｐ［ｌｎ（ｂｎ／ｃｎ）／（Ｎ−ｎ）］−１
で与えられるものであり（各パラメーターについてはＨａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ，　２４１，Ｐ１８５−１９１を参照）、表中の数値は高温（４２℃）での低温（３０℃）に対する相対的ＤＮＡ複製効率として表したものである。図１におけるプラスミドを含む宿主菌の増殖速度について、高温側の直線の傾きを低温側の直線の傾きで割った値に相当する。「コロニー形成能」は、プラスミド保持菌が４２℃で形成するコロニー数を、３０℃で形成するコロニー数で割った値である。「コピー数」は、低温（３０℃）での宿主細胞の染色体数当たりのプラスミドのコピー数である。下線で示したプラスミドはｒｅｐＡ遺伝子のｍＲＮＡの半減期を調節すると推量される３’−非翻訳領域を欠失している。括弧で示されたｐＴＨ１９ｋｓｓｈは３０℃でもカナマイシン耐性菌の増殖はほとんど見られなかった。
【００３０】
【発明の効果】
本発明のプラスミドベクターは、鋭敏な温度感受性を有し、培養温度の変更操作により、（１）宿主菌が４２℃において増殖中にプラスミド複製が起らないので選択薬剤下に宿主菌細胞が増殖せず、カナマイシン耐性コロニーを形成した大腸菌宿主細胞がプラスミドを染色体に組み込んだものしか存在しえないこと、（２）その様な大腸菌ではそのプラスミドに乗っていたラクトースプロモーターは染色体遺伝子のｌａｃＩｑによって完全に抑制されること、（３）また、一旦組み込まれたプラスミドは３７℃以上の培養条件では染色体よりきりだされることなく染色体ＤＮＡの一部として安定に子孫細胞に伝達されること、（４）十分に増殖した細胞培養液にＩＰＴＧを加えることによりラクトースプロモーターのスィッチを入れることにより、宿主細胞に毒性を示す蛋白質の工業的生産を効率的に行うことができる。宿主に用いる大腸菌としてはｒｅｃＡ＋、ｏｍｐＴ−、ｌａｃＩｑ、ΔｌａｃＵ１６９の遺伝子型を持っていることが望ましい。それぞれの遺伝子は、プラスミドの染色体への組込み、組換え蛋白質の分解酵素、ラクトースプロモーターのスイッチオフ、ＩＰＴＧ添加時に組換え蛋白質遺伝子のラクトースプロモーター以外に、野生型大腸菌が持っているｄｅ　ｎｏｖｏのｌａｃプロモーターがスイッチオンされることの防止のために有用である。これらの工程により、細胞にとって細胞毒性の強い物質を発現させることが可能となり、大腸菌のような原核細胞による遺伝子組換えタンパク質の工業的な生産を可能とするものである。
【００３１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、複製についての温度感受性プラスミドｐＴＨ１９ｋｓ１ｈ１４（図１Ａ）、分離についての温度感受性プラスミドｐＴＨ１９ｋｓ５（図１Ｂ）、及び本発明のプラスミドｐＴＨ１４ｋｓｓｈ（図１Ｃ）を含有する細胞の、低温（３０℃）（図１中の丸印及び黒丸印を付した線）及び高温（４１．５℃）（図１中の四角印及び黒四角印を付した線）での増殖速度をグラフ化したものである。図１のそれぞれの縦軸は菌数／ｍｌの対数、横軸は培養時間（時間）を示す。○、３０℃での総細胞数；●、３０℃でのカナマイシン耐性細胞数；□、４２℃での総細胞数；■、４２℃でのカナマイシン耐性細胞数
【図２】図２は、本発明のプラスミドベクターの例を示す。ｓ１、ｓ５及びｈ１４は本発明の変異部位を示し、ｐＢＲ３２２挿入箇所の例が示されている。→、←はｐＢＲ３２２のＤＮＡ複製の方向であり、ｐＴＨ１４ｋｓｓｈと同方向の場合を＋、逆向きの場合を−としている。
【図３】図３は、図２に例示した本発明のプラスミドベクターにおけるｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体（ｒｅｐＡｓｓｈ）の塩基配列と、野生型（ｒｅｐＡｗｔ）の塩基配列の比較を示したものである。塩基の７番目、３７番目及び１６７番目に変異があることを示す。
【図４】図４は、図３の続きの塩基配列の比較を示す。
【図５】図５は、図２に例示した本発明のプラスミドベクターにおけるｐＳＣ１０１ＤＮＡ複製開始因子変異体蛋白質（ＲｅｐＡｓｓｈ）のアミノ酸配列と、野生型蛋白質（ＲｅｐＡｗｔ）のアミノ酸配列の比較を示したものである。アミノ酸の３番目、１３番目及び５６番目に置換があることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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