(57)【要約】【課題】体内の目的の組織や細胞に薬物等を配送し、かつ生分解性を有する表面被覆化合物およびそれを用いた医療用担体を提供する。【解決手段】下記一般式【化１】2004284991.tif 000006（ここでＲ１は炭素数１〜２３のアルキル基または少なくとも一つの二重結合を有するアルケニル基、Ｒ２は水素または炭素数１〜１８のアルキル基またはアルケニル基、Ｒ３は炭素数１〜１８のアルキレン基、ＡはＯ、Ｓ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＮＲ４、ＮＲ４ＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＮＨのいずれか（ここでＲ４は水素または炭素数１〜１８のアルキル基またはアルケニル基）、Ｘは生体由来物質）で表されることを特徴とするアシルアミド化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
2004284991.tif 000005
（ここでＲ１は炭素数１〜２３のアルキル基または少なくとも一つの二重結合を有するアルケニル基、Ｒ２は水素または炭素数１〜１８のアルキル基またはアルケニル基、Ｒ３は炭素数１〜１８のアルキレン基、ＡはＯ、Ｓ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＳ、ＳＣＯ、ＣＯＮＲ４、ＮＲ４ＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＳ、ＳＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＮＨのいずれか（ここでＲ４は、水素または炭素数１〜１８のアルキル基またはアルケニル基）、Ｘは生体由来物質）で表されるＮ−アシルアミン化合物。
【請求項２】
一般式（１）中のＲ２が水素であることを特徴とする請求項１に記載のＮ−アシルアミン化合物。
【請求項３】
一般式（１）中のＲ１のアルキル基またはアルケニル基が炭素数１２〜２３の直鎖状であることを特徴とする請求項１または２に記載のＮ−アシルアミン化合物。
【請求項４】
一般式（１）中のＲ１がアルケニル基であり、かつ二重結合の数が１〜５であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物。
【請求項５】
一般式（１）中のＲ３が炭素数１〜４のアルキレン基であることを特徴とする請求項４に記載のＮ−アシルアミン化合物。
【請求項６】
一般式（１）中のＸが糖から選ばれることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物。
【請求項７】
一般式（１）中のＸがグルコース、マンノース、マンノース−６−リン酸、フコース、ガラクトース、グルコサミン、ラクトサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、ラクトース、マルトース、イソマルトース、スクロース、セロビオース、トレハロース、ラクトビオン酸、アポＢ、トランスフェリン、タフツシン、免疫グロブリン、葉酸であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物。
【請求項８】
生分解性であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の少なくとも一つのＮ−アシルアミン化合物を、少なくとも表面に有する粒子。
【請求項１０】
該粒子がリポソームであることを特徴とする請求項９に記載の粒子。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の少なくとも一つのＮ−アシルアミン化合物を基材粒子の表面にコーティングしてなることを特徴とする請求項９に記載の粒子。
【請求項１２】
該基材粒子が生分解性材料からなることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の粒子。
【請求項１３】
該粒子のサイズが０．１ｎｍ〜５ｍｍの範囲にあることを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載の粒子。
【請求項１４】
該粒子中に少なくとも生理活性物質、薬剤、遺伝子のいずれか１つを含有してなることを特徴とする請求項９〜１３のいずれかに記載の粒子。
【請求項１５】
該生理活性物質が、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、血管作動性物質から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１４に記載の粒子。
【請求項１６】
該薬剤がステロイド、造影剤、抗癌薬、抗炎症薬、抗アレルギー薬、循環器薬、降圧薬、昇圧薬、抗血小板薬、抗凝固薬、向精神薬、疼痛治療薬、抗生物質、抗ウイルス薬、消化器薬、泌尿器薬、内分泌薬、蛍光試薬から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１４に記載の粒子。
【請求項１７】
該遺伝子がＤＮＡ、ＲＮＡから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１４に記載の粒子。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物と生理活性物質または薬剤を水溶性有機溶媒に溶解した後、水中に滴下し、有機溶媒を除去し、遠心分離または濾過のいずれかで被覆粒子を分離することを特徴とする粒子の製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物と生理活性物質または薬剤を非水溶性有機溶媒に溶解し、水中に滴下した後、有機溶媒を除去し、遠心分離または濾過のいずれかで被覆粒子を分離することを特徴とする粒子の製造方法。
【請求項２０】
粒子の原料物質と生理活性物質または薬剤を非水溶性有機溶媒に溶解した後、請求項１〜８のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物を溶解した水溶液中に滴下し、有機溶媒を除去し、遠心分離または濾過のいずれかで被覆粒子を分離することを特徴とする被覆粒子の製造方法。
【請求項２１】
請求項１〜８のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物と粒子の原料物質と生理活性物質または薬剤を非水溶性有機溶媒に溶解した後、水中に滴下し、有機溶媒を除去し、遠心分離または濾過のいずれかで被覆粒子を分離することを特徴とする被覆粒子の製造方法。
【請求項２２】
超音波処理を行いながら水中に滴下することを特徴とする請求項１８〜２２に記載の粒子の製造方法。
【請求項２３】
攪拌を行いながら水中に滴下することを特徴とする請求項１８〜２３に記載の粒子の製造方法。
【請求項２４】
減圧下で有機溶媒を除去することを特徴とする請求項１８〜２４に記載の粒子の製造方法。
【請求項２５】
請求項１〜８のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物と生理活性物質または薬剤を水溶性有機溶媒に溶解した後、透析チューブに充填し、水に対して透析を行って有機溶媒を除去し、遠心分離または濾過のいずれかで被覆粒子を分離することを特徴とする被覆粒子、リポソーム、ミセルのいずれかの製造方法。
【請求項２６】
請求項１〜８のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物を少なくとも表面に有する医療用器材。
【請求項２７】
該医療用組成物がカテーテルであることを特徴とする請求項２６に記載の医療用器材。
【請求項２８】
該医療用組成物が細胞治療システム器材であることを特徴とする請求項２６に記載の医療用器材。
【請求項２９】
該医療用組成物が検査診断薬用器材であることを特徴とする請求項２６に記載の医療用器材。
【請求項３０】
該医療用組成物がインプラントデバイスであることを特徴とする請求項２６に記載の医療用器材。
【請求項３１】
該医療用組成物が体外循環システムであることを特徴とする請求項２６に記載の医療用器材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性物質、薬剤、遺伝子等を目的の場所まで送達させるためのＮ−アシルアミン化合物およびそれを用いた医療用担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体に投与された薬剤、生理活性物質、遺伝子等を目的の作用部位のみに送達させることは、これらの物質が誘発する副作用を防止する意味においても、また、これらの物質の薬効を上げる意味においても重要な課題である。
【０００３】
この課題を解決する方法の一つは、作用部位の臓器や組織の細胞表面物質と高い親和性のあるリガンドで薬剤等を直接修飾したり、薬剤等をリガンドで修飾されたキャリアに担持させる方法である。リガンドの具体例としては、肝実質細胞に親和性のあるアシアロ糖蛋白やガラクトース、血管内皮細胞と親和性のあるシアリルルイスＸ、癌細胞に親和性にあるトランスフェリン、白血球に親和性のあるＨＩＶウイルス由来ｇｐ１２０、タフトシン、マンノース−６−リン酸が挙げられる。また、キャリアの具体例としては微粒子、リポソームなどが挙げられる。リガンドで修飾された薬剤キャリアについてこれまで多くの研究開発がなされ（例えば非特許文献１参照）、試験管レベルでは単離細胞内に薬剤等を送ることができると報告されている。しかしながら、動物実験で成功している例はきわめて少なく、臨床応用までたどり着いた例はない。生体内においてはこれらの修飾薬剤等が目的の場所にたどり着く前に免疫作用や貪食細胞の食作用によって数を減らしたり、また、たとえ目的の場所に到達できてもリガンドの密度が不十分なために、標的細胞表面の受容体と接触する機会が少なく、接着にまで至らなかった。例えば、ＷｕらはＮ−アセチルガラクトサミンを末端に有するアシアロフェツインをリガンドとして薬物を肝臓に送達するリポソームを調製した（例えば非特許文献２参照）。しかしながら、アシアロフェツインにはタンパク質部分があるため免疫反応を誘発する。また、このリポソームを構成している両親媒性物質を粒子表面に配置させたとしても、表面上で両親媒性物質間の強い相互作用を生み出す化学構造になっていないため表面密度が低くなり細胞に認識されにくい。更に相互作用が弱いと血清中のリポ蛋白質や組織中の脂質との相互作用で両親媒性物質がリポソームから脱離し易いことも細胞との相互作用を低下させる原因となる（例えば非特許文献３参照）。
【０００４】
この問題点を解決するために、小林らはポリスチレンに肝細胞のアシアロ糖蛋白受容体のリガンドであるガラクトースを固定化した化合物（ｐｏｌｙ−（Ｎ−ｐ−ｖｉｎｙｌ  ｂｅｎｚｙｌ−Ｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−［１→４］−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｅ（ＰＶＬＡ））を報告した（例えば非特許文献４参照）。このポリマーは糖の部分が親水性であり、各繰り返し単位ごとに糖があるため、このポリマーで粒子を被覆すると、貪食作用も受けにくく粒子表面のリガンド密度を高くすることができる。渡辺らは、粒子は貪食されることなく肝臓特異的に集積し、ある種の薬剤を担持させて急性肝炎モデル動物に投与すると救命効果が出ることを報告している（例えば非特許文献５参照）。しかしながら、このポリマーは非分解性のポリスチレンを用いているため、分解されずにいつまでも細胞の中に残る。
【０００５】
また、粒子表面に配置が可能と考えられる糖を結合した両親媒性物質が生物分解性界面活性剤として開発されてきた（例えば非特許文献６−９参照）。しかしながら、このような界面活性剤は地球環境中の微生物によって分解される可能性があるというだけで、動物の、とりわけ人間の体内や細胞内で分解するか否かについては不明である。
【０００６】
目的部位に到達し、役目を終えた修飾物質はそのまま体外に排出されるか、分解・代謝を受けるか、吸収されることが望ましい。とりわけリガンドに対する細胞表面受容体がエンドサイトーシスを誘導する場合、あるいは細胞の中で薬剤の効果を発揮させたい場合には、薬剤とともにキャリアが細胞の中に入るため細胞の中の酵素等で分解されることが望ましい。
【０００７】
この問題点を解決する手段として、ポリエステル、ポリアミノ酸、脂質等の生分解性物質をベースにしたリガンド修飾物質あるいはリガンド結合キャリアを用いる方法が数多く報告されてきた（例えば特許文献１−７、非特許文献１０参照）。しかしながら、これらの既存物質の中には、リガンドと生分解性物質との間の結合が非分解性であったり、ポリペプチド構造を有するために免疫反応を誘発したり、表面のリガンド密度を高くするような化学構造上の工夫がなされていなかった。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許第６２１０７１７号明細書
【０００９】
【特許文献２】
米国特許第６４１００５７号明細書
【００１０】
【特許文献３】
米国特許第６２５４８９０号明細書
【００１１】
【特許文献４】
米国特許第６２６７９８７号明細書
【００１２】
【特許文献５】
米国特許第５５４３１５８号明細書
【００１３】
【特許文献６】
特開平１１−２６９０９７号公報（第１−２７頁）
【００１４】
【特許文献７】
特開平５−１９４１９９号公報（第１−９頁）
【００１５】
【非特許文献１】
ヴィヤス・エス・ピーら（Ｖｙａｓ  Ｓ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．）アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）、２０００；４３：１０１−１６４
【００１６】
【非特許文献２】
ウ・ジェーら（Ｗｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．）、ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）．１９９８；２７：７７２−７７８
【００１７】
【非特許文献３】
スパンジャー・エイチ・エイチら（Ｓｐａｎｊｅｒ  Ｈ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．）バイオケミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ）、１９８３；７３４：４０−４７
【００１８】
【非特許文献４】
コバヤシ・ケーら（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．）、ポリマー・ジャーナル（Ｐｏｌｍ  Ｊ）．１９８５；１７：５６７
【００１９】
【非特許文献５】
ワタナベ・ワイら（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・バイオマテリアルサイエンス・ポリマー・エディション（Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ）．２０００；１１：８３３−８４８
【００２０】
【非特許文献６】
シェダーマン・オレら（Ｓｏｄｅｒｍａｎ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．）、カレント・オピニオン・イン・コロイド・アンド・インターフェイス・サイエンス（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ）．    ２０００；４：３９１−４０１
【００２１】
【非特許文献７】
ホームバーグら（Ｈｏｌｍｂｅｒｇ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．）、カレント・オピニオン・イン・コロイド・アンド・インターフェイス・サイエンス（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ）．    ２００１；６：１４８−１５９
【００２２】
【非特許文献８】
ステューベンローチら（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．）、カレント・オピニオン・イン・コロイド・アンド・インターフェイス・サイエンス（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ）．    ２００１；６：１６０−１７０
【００２３】
【非特許文献９】
カワカミ・エスら（Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．）バイオケミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ）、２０００；１５２４：２５８−２５６
【００２４】
【非特許文献１０】
チェネフィア・ピーら（Ｃｈｅｎｅｖｉｅｒ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．）ケミカル・コミュニケーションズ（Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍ）、２００２；２０：２４４６−２４４７
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
生体に投与された薬剤等を目的の作用部位のみに送達させることは、これらの物質が誘発する副作用を防止する意味においても、薬効を上げる意味においても重要である。免疫作用や食作用も回避できるほどの親水性部分を有し、作用部位の細胞表面受容体との接触機会を増すほどのリガンド表面密度を達成できる化学構造を有し、なお且つ細胞内でも分解される安全な表面修飾物質はこれまで実現していない。
【００２６】
そこで、本発明者らはかかる従来技術の問題点に鑑み、種々のリガンド結合化合物を検討した結果、リガンドと脂肪酸をアミン化合物を介して結合して得られる化合物が分解性、高密度構造を有することを見い出し、本発明に到達した。即ち、本発明は、標的部位に薬剤等を送達させるための表面修飾物質とその製造法を提供することを目的とする。
【００２７】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記目的を達成するために、主として下記の構成を有する。
「（１）下記一般式（１）
【００２８】
【化２】
2004284991.tif 000002
【００２９】
（ここでＲ１は炭素数１〜２３のアルキル基または少なくとも一つの二重結合を有するアルケニル基、Ｒ２は水素または炭素数１〜１８のアルキル基またはアルケニル基、Ｒ３は炭素数１〜１８のアルキレン基、ＡはＯ、Ｓ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＳ、ＳＣＯ、ＣＯＮＲ４、ＮＲ４ＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＳ、ＳＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＮＨのいずれか（ここでＲ４は、水素または炭素数１〜１８のアルキル基またはアルケニル基）、Ｘは生体由来物質）で表されるＮ−アシルアミン化合物。
（２）一般式（１）中のＲ２が水素であることを特徴とする（１）に記載のＮ−アシルアミン化合物。
（３）一般式（１）中のＲ１のアルキル基またはアルケニル基が炭素数１２〜２３の直鎖状であることを特徴とする（１）または（２）に記載のＮ−アシルアミン化合物。
（４）一般式（１）中のＲ１がアルケニル基であり、かつ二重結合の数が１〜５であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物。
（５）一般式（１）中のＲ３が炭素数１〜４のアルキレン基であることを特徴とする（４）に記載のＮ−アシルアミン化合物。
（６）一般式（１）中のＸが糖から選ばれることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物。
（７）一般式（１）中のＸがグルコース、マンノース、マンノース−６−リン酸、フコース、ガラクトース、グルコサミン、ラクトサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、ラクトース、マルトース、イソマルトース、スクロース、セロビオース、トレハロース、ラクトビオン酸、アポＢ、トランスフェリン、タフツシン、免疫グロブリン、葉酸であることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物。
（８）生分解性であることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の少なくとも一つのＮ−アシルアミン化合物を、少なくとも表面に有する粒子。
（１０）該粒子がリポソームであることを特徴とする（９）に記載の粒子。
（１１）（１）〜（８）のいずれかに記載の少なくとも一つのＮ−アシルアミン化合物を基材粒子の表面にコーティングしてなることを特徴とする請求項９に記載の粒子。
（１２）該基材粒子が生分解性材料からなることを特徴とする（９）〜（１１）のいずれかに記載の粒子。
（１３）該粒子のサイズが０．１ｎｍ〜５ｍｍの範囲にあることを特徴とする（９）〜（１２）のいずれかに記載の粒子。
（１４）該粒子中に少なくとも生理活性物質、薬剤、遺伝子のいずれか１つを含有してなることを特徴とする（９）〜（１３）のいずれかに記載の粒子。
（１５）該生理活性物質が、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、血管作動性物質から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする（１４）に記載の粒子。
（１６）該薬剤がステロイド、造影剤、抗癌薬、抗炎症薬、抗アレルギー薬、循環器薬、降圧薬、昇圧薬、抗血小板薬、抗凝固薬、向精神薬、疼痛治療薬、抗生物質、抗ウイルス薬、消化器薬、泌尿器薬、内分泌薬、蛍光試薬から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする（１４）に記載の粒子。
（１７）該遺伝子がＤＮＡ、ＲＮＡから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする（１４）に記載の粒子。
（１８）（１）〜（８）のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物と生理活性物質または薬剤を水溶性有機溶媒に溶解した後、水中に滴下し、有機溶媒を除去し、遠心分離または濾過のいずれかで被覆粒子を分離することを特徴とする粒子の製造方法。
（１９）（１）〜（８）のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物と生理活性物質または薬剤を非水溶性有機溶媒に溶解し、水中に滴下した後、有機溶媒を除去し、遠心分離または濾過のいずれかで被覆粒子を分離することを特徴とする粒子の製造方法。
（２０）粒子の原料物質と生理活性物質または薬剤を非水溶性有機溶媒に溶解した後、（１）〜（８）のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物を溶解した水溶液中に滴下し、有機溶媒を除去し、遠心分離または濾過のいずれかで被覆粒子を分離することを特徴とする被覆粒子の製造方法。
（２１）（１）〜（８）のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物と粒子の原料物質と生理活性物質または薬剤を非水溶性有機溶媒に溶解した後、水中に滴下し、有機溶媒を除去し、遠心分離または濾過のいずれかで被覆粒子を分離することを特徴とする被覆粒子の製造方法。
（２２）超音波処理を行いながら水中に滴下することを特徴とする請求項（１８）〜（２２）に記載の粒子の製造方法。
（２３）攪拌を行いながら水中に滴下することを特徴とする請求項（１８）〜（２３）に記載の粒子の製造方法。
（２４）減圧下で有機溶媒を除去することを特徴とする請求項（１８）〜（２４）に記載の粒子の製造方法。
（２５）（１）〜（８）のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物と生理活性物質または薬剤を水溶性有機溶媒に溶解した後、透析チューブに充填し、水に対して透析を行って有機溶媒を除去し、遠心分離または濾過のいずれかで被覆粒子を分離することを特徴とする被覆粒子、リポソーム、ミセルのいずれかの製造方法。
（２６）（１）〜（８）のいずれかに記載のＮ−アシルアミン化合物を少なくとも表面有する医療用器材。
（２７）該医療用組成物がカテーテルであることを特徴とする（２６）に記載の医療用器材。
（２８）該医療用組成物が細胞治療システム器材であることを特徴とする（２６）に記載の医療用器材。
（２９）該医療用組成物が検査診断薬用器材であることを特徴とする（２６）に記載の医療用器材。
（３０）該医療用組成物がインプラントデバイスであることを特徴とする（２６）に記載の医療用器材。
（３１）該医療用組成物が体外循環システムであることを特徴とする（２６）に記載の医療用器材。」
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
本発明のＮ−アシルアミン化合物は、下記一般式
【００３２】
【化３】
2004284991.tif 000003
【００３３】
（ここでＲ１は炭素数１〜２３のアルキル基または少なくとも一つの二重結合を有するアルケニル基、Ｒ２は水素または炭素数１〜１８のアルキル基またはアルケニル基、Ｒ３は炭素数１〜１８のアルキレン基、ＡはＯ、Ｓ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＳ、ＳＣＯ、ＣＯＮＲ４、ＮＲ４ＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＳ、ＳＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＮＨのいずれか（ここでＲ４は、水素または炭素数１〜１８のアルキル基またはアルケニル基）、Ｘは生体由来物質）で表される。
【００３４】
本発明のＮ−アシルアミン化合物は生体由来の物質からなることを特徴としている。従って、このＮ−アシルアミン化合物の構成要素の構造に関しては、基本的には生体物質由来であればよく、特に限定されるものではない。一般式（１）中のＲ１はこの分子の疎水性部分を形成し、炭素数１〜２４のアルキル基またはアルケニル基が好ましく、枝分かれしていてもよい。生体内に高い割合で存在するという理由で、炭素数１１〜１９が最も好ましく、更に直鎖状であることが好ましい。Ｒ１がアルケニル基の場合には、生体内に高い割合で存在するという理由で、２重結合が１〜５個含まれていることが好ましい。Ｒ２は水素または炭素数１〜１８のアルキル基またはアルケニル基であることが好ましい。Ｒ１とＲ３とを結合する−ＣＯＮＲ２−結合はアミド結合であり、体温付近の温度では酵素が無いと加水分解反応が起こりにくい。この結合が酵素によって加水分解切断されるためには、Ｒ２は水素であることが最も望ましい。また、Ｒ２が水素の場合、アミド結合は互いに水素結合することが知られているので、この分子を基材表面にコーティングすると、基材表面で分子が相互作用し合い高い表面密度が得られる。Ｒ３は炭素数１〜１８の中から自由に選べるが、生体内に高い割合で存在するという理由で、炭素数２〜４のアルキレン基であることが好ましい。Ｘも生体由来物質から成ることを特徴とする物質で、被覆される表面を特徴づけるリガンドとなる。Ｘの具体例としては、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体の一部、受容体、酵素、グルコース、マンノース、マンノース−６−リン酸、ガラクトース、グルコサミン、ラクトサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸などの単糖、ラクトース、マルトース、イソマルトース、スクロース、セロビオース、トレハロース、シアリルルイスＸ、シアリルルイスａなどのオリゴ糖、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、シンデカンなどの多糖等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３５】
特に肝臓あるいは肝実質細胞との親和性を付与するためにこの化合物を用いる場合には、Ｘとしてガラクトース、ガラクトサミン、非還元末端にガラクトースまたはガラクトサミンを有するオリゴ糖または多糖、アポＢが好ましく用いられる。糖鎖は分岐していても良く、分岐鎖のそれぞれの非還元末端にガラクトースまたはガラクトサミンが存在していることが好ましい。
【００３６】
特にマクロファージとの親和性を付与するためにこの化合物を用いる場合には、Ｘとしてガラクトサミン、非還元末端にガラクトサミンを有するオリゴ糖または多糖、アポＢが好ましく用いられる。糖鎖は分岐していても良く、分岐鎖のそれぞれの非還元末端にガラクトサミンが存在していることが好ましい。また、タフツシンも好ましく用いられる。
【００３７】
特にＴ細胞との親和性を付与するためにこの化合物を用いる場合には、ＸとしてがＨＩＶウイルス由来ｇｐ１２０ｇが好ましく用いられる。
【００３８】
特に癌細胞との親和性を付与するためにこの化合物を用いる場合には、Ｘとしてトランスフェリン、ＥＧＦ、タフツシン、葉酸が好ましく用いられる。
【００３９】
一般式１中のＲ１〜Ｒ３とＸの構造を選ぶことによって、Ｎ−アシルアミン化合物の溶媒に対する溶解性も自由に変えることができる。
【００４０】
生体由来物質ＸとＲ３を連結する結合は、Ｘの化学構造や配向性、分解性に応じて自由に選択することができ、生体内で分解されやすいという点で、加水分解を受けやすいエステル結合やウレイド結合、酵素分解を受けやすいペプチド結合に代表されるアミド結合、グルコシド結合、ガラクトシド結合に代表されるエーテル結合やチオエーテル結合が好ましく、すなわちＡの具体例としてはＯ、Ｓ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＳ、ＳＣＯ、ＣＯＮＲ４、ＮＲ４ＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＳ、ＳＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＮＨのいずれか（ここでＲ４は、水素または炭素数１〜１８のアルキル基またはアルケニル基）があげられる。
【００４１】
本発明のＮ−アシルアミン化合物は任意の方法で製造できる。一般式（１）に示されるように−ＣＯＮＲ２−のアミド結合を必須としていることから、本発明のＮ−アシルアミン化合物は、Ｒ１を含むカルボン酸と、Ｒ２及びＲ３を含むアミノ化合物と、生体由来物質Ｘを出発原料とするのが合成しやすさの点で最も好ましい。アミノ化合物は生体由来物質Ｘを結合するという点でアミノ基以外にもう一つの反応性官能基を有していることが好ましい。反応性官能基の具体例として、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、イソシアナート基、グリシジル基などが挙げられる。
【００４２】
それぞれの出発原料を結合する順番については特に制限はなく、生体由来物質ＸをＡで表される結合でアミノ化合物に結合した後にカルボン酸と反応させてもよく、初めにカルボン酸とアミノ化合物を結合して中間体アミド化合物を得た後にＸを結合してもよい。アミド結合−ＣＯＮＲ２−を含む中間体アミド化合物は、Ｒ１を含むカルボン酸あるいはその誘導体と、Ｒ２及びＲ３を含むアミノ化合物との反応によって得られる。誘導体とはカルボン酸塩化物、カルボン酸臭化物、カルボン酸ヨウ化物、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カルボン酸塩を指す。中間体アミド化合物は、カルボン酸をジシクロヘキシルカルボジイミドなどのカルボジイミドで活性化してアミノ化合物を添加し、副産物として生成するジシクロヘキシルウレアなどの尿素化合物を除去した後に溶媒を除去することによって得られるほか、カルボジイミドで活性化した後に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドでカルボキシル基を更に活性化してからアミノ化合物を加える方法でも得られる。また、ピリジン、トリエチルアミン、ジメチルアミノピリジンなどの触媒存在下にカルボン酸塩化物あるいはカルボン酸臭化物あるいはカルボン酸ヨウ化物あるいはカルボン酸無水物にアミノ化合物を添加し、触媒の塩を除去した後に溶媒を除去することによっても得られる。更に、カルボン酸エステルにアミノ化合物を添加し、溶媒を除去することによっても得られる。アミノ化合物のアミノ基以外の反応性官能基が、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、カルボベンゾキシ基、ニトロフェニル基、ホルミル基、アシル基、ハロアシル基、ベンゾイル基、トシル基などの保護基によって保護されている場合は、アミド結合反応を終了した後に保護基をはずすことが好ましい。
【００４３】
アミノ化合物あるいは中間体アミド化合物と生体由来物質Ｘを結合する方法は特に限定されず適宜選択できる。
【００４４】
Ｘとして単糖、オリゴ糖、多糖に代表される糖をエーテル結合、チオエーテル結合で結合する場合、一般的に、まず糖の水酸基をアシル基、ハロアシル基、ベンジリデン基、ｉｓｏ−プロピリデン基などで保護する。保護化の反応については畑中らの「糖質の科学と工学」（講談社）に詳細に記載されている。保護・脱保護の容易さから、アセチル基あるいはハロアセチル基が好ましく用いられる。保護した糖をクロロホルム、ジクロロエタンなどの溶媒に溶解し、四塩化すずあるいは三フッ化硼素などのルイス酸触媒存在下に、水酸基あるいはチオール基を有する中間体アミド化合物またはアミノ基を保護された出発原料アミノ化合物を添加して反応させた後、触媒と溶媒を除去して得られる生成物をナトリウムメトキシドなどのルイス塩基で処理して保護基をはずすと糖で修飾されたＮ−アシルアミン化合物を得る。この反応によって得られる糖修飾Ｎ−アシルアミン化合物において、糖は還元末端のアノマー位の炭素で結合している。また、ルイス酸触媒の代わりに臭化水素でアノマー位の炭素を臭素化した後に、過塩素酸銀存在下に中間体アミド化合物またはアミノ基を保護された出発原料アミノ化合物と反応させても同じ糖修飾Ｎ−アシルアミン化合物が得られる。
【００４５】
糖をアミド結合で結合する一般的な方法として、カルボキシル基を有する中間体アミド化合物またはアミノ基を保護された出発原料アミノ化合物をジシクロヘキシルカルボジイミドなどのカルボジイミドで活性化して、ガラクトサミン、キトサンなどのアミノ基を含む糖を添加し、副産物として生成するジシクロヘキシルウレアなどの尿素化合物を除去した後に溶媒を除去することによって得られるほか、カルボジイミドで活性化した後に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドでカルボキシル基を更に活性化してから糖を加える方法でも得られる。グルコン酸、グルクロン酸などのように糖にカルボキシル基が含まれる場合には、水酸基を保護した後、糖をカルボジイミドで活性化して、アミノ基を有する中間体アミド化合物またはアミノ基を保護された出発原料アミノ化合物を添加し、副産物として生成するジシクロヘキシルウレアなどの尿素化合物を除去した後に溶媒を除去することによって得られるほか、カルボジイミドで活性化した後に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドでカルボキシル基を更に活性化してから糖を加える方法でも得られる。
【００４６】
糖をエステル結合またはチオエステル結合で結合する一般的な方法としては、グルコン酸、グルクロン酸などのように糖にカルボキシル基が含まれる場合には、ベンジル基などで水酸基を保護した後、糖を塩化チオニル、三塩化リン、五塩化リンなどで処理してカルボキシル基を塩素化した後、ピリジン、トリエチルアミン、ジメチルアミノピリジンなどの触媒存在下に、水酸基またはチオール基を含む中間体アミド化合物またはアミノ基を保護された出発原料アミノ化合物を添加し、触媒の塩と溶媒を除去することによって得られる。
【００４７】
カルボキシル基を含む中間体アミド化合物またはアミノ基を保護された出発原料アミノ化合物のカルボキシル基を予め酸塩化物、酸臭化物、酸ヨウ化物、酸無水物に変換した化合物を、ピリジン、トリエチルアミン、ジメチルアミノピリジンなどの触媒存在下に糖に添加し、触媒の塩と溶媒を除去することによっても得られる。
【００４８】
Ｘとしてアミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質のフラグメントに代表されるペプチド化合物をアミド結合で結合する場合、一般的に、カルボキシル基を有する中間体アミド化合物またはアミノ基を保護された出発原料アミノ化合物をカルボジイミドで活性化して、アミノ基を含むアミノ酸またはポリペプチドなどを添加し、副産物として生成するジシクロヘキシルウレアなどの尿素化合物を除去した後に溶媒を除去することによって得られるほか、カルボジイミドで活性化した後に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドでカルボキシル基を更に活性化してからペプチド化合物を加える方法でも得られる。この方法を用いるとペプチド化合物のアミノ末端のアミノ基またはリジン残基のアミノ基で結合できる。また、ペプチド化合物をエステル結合またはチオエステル結合で結合する場合、一般的に、カルボキシル基を有する中間体アミド化合物またはアミノ基を保護された出発原料アミノ化合物を塩化チオニル、三塩化リン、五塩化リンなどで処理してカルボキシル基を塩素化した後、ピリジン、トリエチルアミン、ジメチルアミノピリジンなどの触媒存在下に、水酸基またはチオール基を含むアミノ化合物を添加し、触媒の塩と溶媒を除去することによって得られる。この方法を用いるとペプチド化合物のセリン残基またはスレオニン残基の水酸基、システイン残基のチオール基で結合できる。また、カルボキシル基を有するペプチド化合物を塩化チオニル、三塩化リン、五塩化リンなどで処理してカルボキシル基を塩素化した後、ピリジン、トリエチルアミン、ジメチルアミノピリジンなどの触媒存在下に、水酸基またはチオール基を含む中間体アミド化合物またはアミノ基を保護された出発原料アミノ化合物を添加し、触媒の塩と溶媒を除去することによっても得られる。この方法を用いるとペプチド化合物のカルボキシ末端のカルボキシル基、アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基のカルボキシル基で結合できる。
このときペプチド化合物にアミノ基が含まれている場合には、保護基で保護されていることが好ましく、保護基は結合反応終了後はずすことができる。
【００４９】
溶媒、反応温度、反応時間、精製方法は原料や前駆体物質の化学構造や反応の種類によって適宜選択できる。
【００５０】
本発明でいう生分解性とは生体内で分解される性質を意味し、酵素が関与するか否かにかかわらず主として加水分解反応によって分解し、生体適合性のある物質を生成することである。生体適合性のある物質とは、もともと生体内にある物質と化学構造が同じであるか、酵素、免疫、肝機能、腎機能などにより代謝・排泄されうる物質である。本発明のＮ−アシルアミン化合物が分解されて生じた複数の構成物が生体由来の物質であれば、それらは生体適合性物質であり、すなわち、そのＮ−アシルアミン化合物は生分解性である。
【００５１】
本発明のＮ−アシルアミン化合物は表面修飾分子として、少なくとも表面に存在する形態に加工して好ましく用いられる。表面に存在する形態に加工するためには、本発明のＮ−アシルアミン化合物を基材粒子の表面にコーティングして用いてもよく、リポソームまたはミセル、すなわちＮ−アシルアミン化合物自体で粒子形成して用いてもよい。この場合、使用するＮ−アシルアミン化合物の種類は、目的に応じて適宜調節でき限定されない。１種類のＮ−アシルアミン化合物のみを用いてもよいし、複数のＮ−アシルアミン化合物を混合して用いてもよい。ここでいうリポソームとは、Ｎ−アシルアミン化合物がＲ１の部分で会合して二重膜を形成し、その二重膜が球状になった組成物である。また、ミセルとはＮ−アシルアミン化合物がＲ１の部分で会合してコアを形成し、Ｘが表面に分布した球状の組成物である。
【００５２】
この場合に、リポソームまたはミセルや粒子の形状は特に限定されるものではない。大きさについては特に限定されず、目的に合った大きさを選択できる。細胞の間隙のサイズは組織によって異なり、細胞が取り込めるサイズも細胞により様々である。サイズが大きすぎると組織や細胞内に取り込めなくなり、一方、サイズが小さすぎると目的以外の組織や細胞にも取り込まれやすくなる。また、組織や細胞の表面に粒子を吸着させる目的のためには、組織や細胞に取り込まれないサイズがよい。平均粒径として０．１ｎｍ〜５ｍｍが好ましい。組織や細胞に取り込ませる目的の場合には、０．１ｎｍ〜５００μｍが好ましく、特に肝臓や肝実質細胞に取り込ませる目的の場合には１０ｎｍ〜５００ｎｍがより好ましい。粒子の平均粒径は走査型電子顕微鏡Ｓ−２４００（日立社製）を用いて複数の粒子の粒径を測定し、その平均値を算出することによって得られる。またレーザー散乱型粒度分布計（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ  ＡＳＶＲ／Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ−ＨＲＡ（９３２０−Ｘ１００））を用いると直接平均粒径を知ることができる。
【００５３】
本発明のＮ−アシルアミン化合物を基材粒子の表面にコーティングして用いる場合、粒子を構成する基材は特に限定されないが、酵素、免疫、肝機能、腎機能などにより分解・代謝・排泄される物質からなることが好ましい。このような物質の具体例としては、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリビニルアルコール、セルロース、アガロース、デンプン、アルギン酸、キチン、キトサン、およびこれらの物質の誘導体、共重合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細胞に取り込ませる目的で使用する場合には生分解性であることが好ましく、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトンおよびこれらの共重合体が好ましく用いられる。粒子基材の生分解性の測定には公知の方法を用いることができる。例えば、材料を水または塩溶液に適当な固液比で浸漬し、適当な温度で適当な期間振とうまたは攪拌する方法や、生体内に近い条件で測定する場合には生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水に浸漬して３７℃で振とうまたは攪拌する方法が好ましく用いられる。材料の乾燥重量、体積、平均分子量、外観などを天秤、ゲル浸透クロマトグラフィー、走査型電子顕微鏡などを用いて測定し、経時変化を調べることによって生分解性能を評価する。
【００５４】
本発明のＮ−アシルアミン化合物の粒子表面上における密度は、高すぎるとリガンドの配向が損なわれるだけでなく、立体的な障害が生じ、細胞上に存在するレセプターによって認識されにくくなる。一方、低すぎるとリガンドとレセプターの接触機会が減少するため細胞によって認識されにくくなる。したがって、粒子表面の表面密度としては、１〜１０００ｎｍ２に１分子が好ましい。
【００５５】
本発明のＮ−アシルアミン化合物をリポソームとして、あるいは基材粒子の表面にコーティングして用いる場合には、リポソームあるいは基材粒子の中に生理活性物質、薬剤、遺伝子が単独であるいは複数含まれていてもよい。生理活性物質とは、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦなどの増殖因子、ＩＮＦ、ＴＧＦ、インターロイキンなどのサイトカイン、ホルモンなどが挙げられる。また、ワクチンとして用いられる死菌、毒素、糖鎖、ペプチド類などの抗原も含まれる。薬剤とは、造影剤、抗癌薬、抗炎症薬、抗アレルギー薬、循環器薬、降圧薬、昇圧薬、抗血小板薬、抗凝固薬、向精神薬、疼痛治療薬、抗生物質、消化器薬、泌尿器薬、内分泌薬、蛍光試薬などが挙げられる。遺伝子は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ，ＲＮＡなどが挙げられる。特に肝臓や肝細胞を標的とする場合には、リバビリン、ラミブシン、インターフェロンなどの抗ウイルス剤、シクロスポリンなどの抗炎症剤、シスプラチン、カルボプラチン、５−Ｆｕ、マイトマイシン、シクロフォスファミド、メトトレキセートなどの抗癌剤、イオパミドール、イオヘキソールなどのＸ線造影用造影剤、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ−ＨＳＡ、６７Ｇａ、３Ｈ、２４Ｎａ、８６Ｒｂ、８７ｍＳｒ、１８Ｆ−ＦＤＧなどのシンチグラフィー用造影剤、Ｇｄ化合物、Ｆｅ化合物、Ｍｎ化合物などの核磁気共鳴用造影剤、ポリデキストロース、オクタフルオロプロパンなどの超音波造影剤、フィブラートなどの高脂血症薬、ＨＧＦなどの増殖因子、エンドスタチン、アンギオスタチンなどの血管新生阻害因子などが好ましく用いられる。
【００５６】
本発明におけるＮ−アシルアミン化合物によって被覆された粒子の調製方法は特に限定されないが、よく知られたスプレー法、エマルジョン法が好ましく用いられる。本発明でいう水溶性溶媒とは、メタノール、エタノール、アセトン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡｃなど水に溶解しやすい溶媒であり、非水溶性溶媒とは、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、酢酸エチルなどの水に不溶な溶媒を指す。
【００５７】
エマルジョン法では、粒子基材をクロロホルム、塩化メチレンなどの非水溶性溶媒に溶解し、本発明のＮ−アシルアミン化合物を溶解した水中に滴下し、攪拌して有機溶媒を蒸発させる。本発明のＮ−アシルアミン化合物の濃度、粒子基材の濃度、攪拌回転数、温度、圧力を適当に選ぶことによって、粒子のサイズを適宜変えられる。攪拌後、蒸留水で洗浄し、遠心分離または濾過により被覆粒子を水から分離して被覆粒子を得る。粒子基材濃度は、高すぎると溶液の操作性が悪いだけでなく、基材粒子溶液がＮ−アシルアミン化合物水溶液中で分散せず、低すぎると得られる粒子が少なく効率が悪いので、０．００１〜３０ｗ／ｖ％が好ましく、更に０．０１〜２０ｗ／ｖ％が特に好ましい。攪拌速度は速すぎると粒径にばらつきが生じ、遅すぎると細かい粒子が得られないので、１００〜１０００回転／分が好ましく、更には１００〜４００回転／分が特に好ましい。温度条件は、粒子基材を溶解する溶媒に依存し、高すぎると溶媒がすぐに蒸発するため細かい粒子が得られにくいほかエマルジョンの分散性が悪くなり、低すぎると溶媒が蒸発せずに粒子調製に時間がかかるので、０℃〜溶媒の沸点が好ましい。溶媒の蒸発を促進するために、減圧で操作することもでき、このときの圧力は１気圧以下であることが好ましい。例えば、粒子基材を０．０１〜２０ｗ／ｖ％の濃度になるようにクロロホルム、塩化メチレンなどの非水溶性溶媒に溶解し、粒子基材溶液の１〜１０００倍容の、本発明のＮ−アシルアミン化合物を０．０１〜１０％の濃度になるように溶解した水中に滴下し、１００〜４００回転／分の速度で適温で攪拌し、遠心分離または濾過により被覆粒子を水から分離することによって、Ｎ−アシルアミン化合物の表面密度が１〜１０００ｎｍ２／１分子で平均粒径が０．１ｎｍ〜５ｍｍの、Ｎ−アシルアミン化合物でコーティングされた粒子が得られる。
【００５８】
また、本発明のＮ−アシルアミン化合物と粒子基材を濃度がそれぞれ０．０１〜１０％、０．００１〜１０％になるようにクロロホルム、塩化メチレンなどの非水溶性溶媒に溶解し、その溶液を粒子基材溶液の１０〜１０００倍容の水中に滴下して、好ましくは１００〜１０００回転／分、更に好ましくは１００〜４００回転／分の速度で適温で攪拌し、遠心分離または濾過により被覆粒子を水から分離することによっても被覆粒子が得られる。
【００５９】
超音波で処理しながら攪拌してもよく、攪拌せずに超音波処理のみ行うのでもよい。例えば、ＵＳ−５０プローブ型超音波装置（Ｎｉｓｓｅｉ）を用いる場合は、出力が低すぎると水中で粒子基材溶液が分散せず、高すぎると平均粒径が小さくなるため、１０〜１００Ｗの出力が好ましい。
【００６０】
また、本発明のＮ−アシルアミン化合物と粒子基材とを、好ましくは０．００１〜３０ｗ／ｖ％の濃度でＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、エタノール、アセトンなどの水溶性溶媒に溶解した後に溶液を透析チューブに入れて水中で透析した後、透析チューブ内の懸濁液を遠心分離または濾過により被覆粒子を水から分離することによってＮ−アシルアミン化合物の表面密度が１〜１０００ｎｍ２／１分子で平均粒径が０．１ｎｍ〜５ｍｍの被覆粒子を得る。
【００６１】
リポソームまたはミセルを調製する場合には、本発明のＮ−アシルアミン化合物を好ましくは０．００１〜３０ｗ／ｖ％の濃度で直接水に溶解してもよいし、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、エタノール、アセトンなど水溶性溶媒に好ましくは０．００１〜３０ｗ／ｖ％の濃度で溶解した後に粒子基材溶液の１〜１０００倍容の水中に滴下してもよい。好ましくは水中に滴下した後に超音波処理することによって粒径のそろったリポソームまたはミセルが得られる。遠心分離または濾過により被覆粒子を水から分離することによってリポソームまたはミセルが得られる。
【００６２】
生理活性物質や薬剤を粒子やリポソームまたはミセルに担持させたい場合には、粒子基材の溶液中に生理活性物質や薬剤あるいはそれらの溶液を共存させて後に上記の操作を行う。生理活性物質や薬剤の粒子中における濃度は、仕込み濃度等を適宜選択することができ、使用目的の濃度に合わせて変えることができる。例えばエマルジョン法では、生理活性物質や薬剤が疎水性の場合には、粒子基材と薬剤をクロロホルム、塩化メチレンなどの非水溶性溶媒に溶解・混合し、本発明のＮ−アシルアミン化合物を０．０１〜１０％の濃度になるように溶解した水中に滴下し、１００〜４００回転／分の速度で適温で攪拌することによって得られる。生理活性物質や薬剤が親水性の場合には、薬剤の水溶液と、粒子基材をクロロホルム、塩化メチレンなどの非水溶性溶媒に溶解した溶液とを攪拌・混合してエマルジョンを調製し、そのエマルジョンを本発明のＮ−アシルアミン化合物を０．０１〜１０％の濃度になるように溶解した水中に滴下し、１００〜４００回転／分の速度で適温で攪拌することによって得られる。生理活性物質や薬剤の濃度は、目的の薬効を発揮するために必要な濃度に自由に調節できる。また、エマルジョンを作成する場合、ポリエチレングリコールやポリビニルアルコールなどの分散剤を用いてもよい。構造によっては、Ｎ−アシルアミン化合物自身が分散剤の役目を果たすことがあるのでポリエチレングリコールなどの分散剤の代わりに、または分散剤と共にＮ−アシルアミン化合物をエマルジョン調製時に使用してもよい。生理活性物質や薬剤を含有させる際にもＮ−アシルアミン化合物の濃度、粒子基材の濃度、攪拌回転数、温度を適当に選ぶことによって、粒子のサイズを適宜変えられる。攪拌後、蒸留水で洗浄した後、遠心分離または濾過により被覆粒子を水から分離することによって粒子を得る。粒子基材濃度は、高すぎると溶液の操作性が悪いだけでなく、基材粒子溶液がＮ−アシルアミン化合物水溶液中で分散せず、低すぎると得られる粒子が少なく効率が悪いので、０．００１〜３０ｗ／ｖ％が好ましく、更に０．０１〜２０ｗ／ｖ％が特に好ましい。攪拌速度は速すぎると粒径にばらつきが生じ、遅すぎると細かい粒子が得られないので、１００〜１０００回転／分が好ましく、更には１００〜４００回転／分が特に好ましい。温度条件は、粒子基材を溶解する溶媒に依存し、高すぎると溶媒がすぐに蒸発するため細かい粒子が得られにくいほかエマルジョンの分散性が悪くなり、低すぎると溶媒が蒸発せずに粒子調製に時間がかかるので、０℃〜溶媒の沸点が好ましい。
【００６３】
生理活性物質や薬剤を含有したリポソームまたはミセルを調製する場合には、本発明のＮ−アシルアミン化合物を好ましくは０．００１〜３０ｗ／ｖ％の濃度でＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、エタノール、アセトンなど水溶性溶媒に溶解し、薬剤を添加し混合した後に粒子基材溶液の１〜１０００倍容の水中に滴下してもよい。好ましくは水中に滴下した後に超音波処理することによって粒径のそろったリポソームまたはミセルが得られる。
【００６４】
本発明における医療用器材とは病気を診断、治療、予防するために用いる器材であり、具体的には生理活性物質、薬物、遺伝子等を含有したキャリアやベクター、ワクチンなどのドラッグデリバリーシステム、カテーテル類、人工血管や人工骨頭のようなインプラントデバイス、人工心肺、人工透析器のような血液回路、吸着材のような体外循環システム用基材、マイクロプレートや粒子などの検査診断薬用基材、細胞足場材や細胞キャリアなどの細胞治療・再生医療システム用基材、クロマトグラフィー担体などを指すがこれに限定されるものではない。
【００６５】
これらの医療用器材の表面にＮ−アシルアミン化合物を配設することによって、生体適合性が著しく向上する。例えば、カテーテル、血液回路は血液と接触することによって血小板や凝固カスケードが活性化し血栓を形成するが、例えば抗血栓性物質であるヘパリンを結合したＮ−アシルアミン化合物を表面に被覆することによってこのような基材表面での血栓形成反応を抑えることができる。また、インプラントデバイスや細胞治療・再生医療システム用基材では、基材表面が異物反応、炎症反応を誘発する、例えばアルギニン−グリシン−アスパラギン酸のアミノ酸配列を含むペプチドやコンドロイチン硫酸を結合したＮ−アシルアミン化合物を表面に被覆することによって、目的部位の組織や細胞との親和性、接着性が向上する。また、検査診断薬や体外循環治療においては、定量したい物質、体外に除去したい物質と相互作用する物質を結合したＮ−アシルアミン化合物を粒子や繊維にコーティングすることによって、それらの物質を定量、除去できる。
【００６６】
これらの医療用器材表面にＮ−アシルアミン化合物を付与する方法は特に限定されず、Ｎ−アシルアミン化合物の溶液に医療器材を浸漬した後、乾燥して溶媒を除去することによって得ることもできるし、また、医療用器材の原料とＮ−アシルアミン化合物を混合した後に成型することもできる。
【００６７】
以下に実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものでない。
【００６８】
【実施例】
＜合成例１＞
Ｄ−乳糖２０ｇをピリジン３２０ｍｌに懸濁後、氷浴中で攪拌しながら無水酢酸３２０ｍｌを滴下した。３日間室温で攪拌後、反応溶液を７００ｍｌの水中に投入した。沈殿を濾別した後、ｐＨ７になるまで水洗した。減圧で乾燥後、産物２６ｇをジエチルエーテル７０ｍｌと酢酸エチル２０ｍｌの混合溶媒に溶解し、硫酸ナトリウムを加えて攪拌後、硫酸ナトリウムを濾別し、溶媒を減圧除去してアセチル化乳糖２７ｇを得た。
【００６９】
リノール酸１０ｇとＮ−ヒドロキシスクシンイミド４．９ｇをジクロロメタンに溶解した後、ジシクロヘキシルカルボジイミド８．８ｇと触媒量のピリジンを添加して室温で３日間攪拌した。ジシクロヘキシルウレアを濾別したのち、溶媒を減圧除去して活性化リノール酸１７ｇを得た。全量を再度ジクロロメタンに溶解した後、２−アミノエタノール  ３ｍｌを添加し、室温で２日間攪拌した。沈殿を濾別した後、溶媒を減圧除去し、得られた産物を水洗・乾燥してリノール酸アミドを得た。
【００７０】
アセチル化乳糖２ｇとリノール酸アミド３．８ｇをジクロロエタン７０ｍｌに溶解した後、合成ゼオライト粉末２ｇを添加し、窒素ガス雰囲気化に７０℃で攪拌した。三フッ化硼素のジエチルエーテル溶液１ｍｌを添加した後、同条件で５時間攪拌した。ハイフロ・スーパーセルで固相を濾別し、溶媒を減圧除去した。エーテルに溶解後、２−プロパノール中に投与して再沈し沈殿を濾別し減圧乾燥してアセチル化乳糖−リノール酸アミド複合体を得た。
【００７１】
アセチル化乳糖−リノール酸アミド複合体２ｇをメタノール２００ｍｌに溶解した後、ナトリウムメトキシド６００ｍｇを添加して、室温で６時間攪拌した。陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ）３５ｇ加えて攪拌したのち、樹脂を濾別して、溶媒を減圧除去して乳糖−リノール酸アミド複合体１．６ｇを得た。
【００７２】
＜比較例１＞
ポリ乳酸（和光純薬；平均分子量５０００）０．６ｇをジクロロメタン６ｍｌに溶解したポリ乳酸溶液を、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（ナカライテスク；重合度５００）０．３３ｇを溶解した水溶液４００ｍｌに滴下し、室温で８時間攪拌してポリ乳酸粒子を得た。
【００７３】
ポリ乳酸粒子に１ｍｇ／ｍｌのＰＶＬＡ（生化学工業；平均分子量：５００００）のＰＢＳ溶液、またはＰＢＳをそれぞれ添加し、室温で１時間５０分静置した。ＰＢＳ０．５ｍｌで粒子を洗浄した後、０．１ｍｇ／ｍｌＦＩＴＣ標識ＲＣＡ１２０（ホーネンコーポレーション）のＰＢＳ溶液０．２ｍｌを添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ０．５ｍｌで粒子を洗浄した後、走査型レーザー生物顕微鏡（ＦＬＯＶＩＥＷ；オリンパス）にて粒子表面の蛍光を観察した。レーザー顕微鏡の設定条件は下記の通りであった。
【００７４】
2004284991.tif 000004
その結果、ｐｏｌｙ−（Ｎ−ｐ−ｖｉｎｙｌ  ｂｅｎｚｙｌ−Ｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−［１→４］−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｅ（ＰＶＬＡ）修飾粒子の表面には蛍光が観察されたが、ＰＶＬＡ修飾されていない粒子の表面には蛍光が観察されなかった（図１）。
【００７５】
＜実施例１＞
ポリ乳酸粒子に乳糖−リノール酸アミド複合体のＰＢＳ溶液を添加し、室温で１時間５０分静置した。ＰＢＳ０．５ｍｌで粒子を洗浄した後、０．１ｍｇ／ｍｌＦＩＴＣ標識ＲＣＡ１２０（ホーネンコーポレーション）のＰＢＳ溶液０．２ｍｌを添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ０．５ｍｌで粒子を洗浄した後、走査型レーザー生物顕微鏡（ＦＬＯＶＩＥＷ；オリンパス）にて比較例１記載の設定条件で粒子表面の蛍光を観察した結果、粒子表面に比較例１のＰＶＬＡ修飾粒子と同程度の蛍光が観察された（図１）。
【００７６】
＜比較例２＞
ポリ乳酸（和光純薬；分子量２００００）１０ｍｇをジクロロメタン０．１ｍｌに溶解したポリ乳酸溶液を、ＰＶＬＡ（生化学工業）またはＰＶＡ（ナカライテスク；重合度５００）０．５ｍｇを溶解した水溶液０．５ｍｌにパスツールピペットで１滴滴下し、室温で１日攪拌して乳糖被覆ポリ乳酸粒子を得た。
【００７７】
ポリ乳酸粒子をＰＢＳ０．５ｍｌで洗浄した後、０．１ｍｇ／ｍｌＦＩＴＣ標識ＲＣＡ１２０（ホーネンコーポレーション）のＰＢＳ溶液０．２ｍｌを添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ０．５ｍｌで粒子を洗浄した後、比較例１記載の設定条件で走査型レーザー生物顕微鏡（ＦＬＯＶＩＥＷ；オリンパス）にて粒子表面の蛍光を観察した結果、蛍光が観察された（図２）。蛍光発色部分中の任意の３平面の平均蛍光強度は、ＰＶＬＡで被覆した粒子は４０７３±２１、ＰＶＡで被覆した粒子は１５７±４であった。
【００７８】
＜実施例２＞
ポリ乳酸（和光純薬；分子量２００００）１０ｍｇをジクロロメタン０．１ｍｌに溶解したポリ乳酸溶液を、乳糖−リノール酸アミド複合体１ｍｇを溶解した水溶液０．５ｍｌにパスツールピペットで数滴滴下し、室温で１日間攪拌して乳糖被覆ポリ乳酸粒子を得た。
【００７９】
ポリ乳酸粒子をＰＢＳ０．５ｍｌで洗浄した後、０．１ｍｇ／ｍｌＦＩＴＣ標識ＲＣＡ１２０（ホーネンコーポレーション）のＰＢＳ溶液０．２ｍｌを添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ０．５ｍｌで粒子を洗浄した後、比較例１記載の設定条件で走査型レーザー生物顕微鏡（ＦＬＯＶＩＥＷ；オリンパス）にて粒子表面の蛍光を観察した結果、粒子表面に比較例２のＰＶＬＡ修飾粒子と同程度の蛍光が観察された（図２）。蛍光発色部分中の任意の３平面の平均蛍光強度は３９４１±５６であった。
【００８０】
＜比較例３＞
細胞を低温でホモジュナイザーで処理し、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した後、超遠心して不溶物を除去して得られた細胞抽出液を調製した。
【００８１】
５ｍｇのＰＶＬＡを０．１ｍｌのメタノールに溶解し、１０μｇ／ｍｌのフルオレセイン２０μｌを添加した後、この溶液を０．９ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に添加した。細胞抽出液を添加し、３７℃で２４時間振とうした。反応液を透析膜に入れて蒸留水に対して透析した。チューブ内の液を凍結乾燥後、高速液体クロマトグラフィーで分子量解析を行った結果、細胞抽出液処理前後でＰＶＬＡの分子量は約５００００で変化がなく細胞内酵素によって分解されなかった。
【００８２】
＜実施例３＞
細胞を低温でホモジュナイザーで処理し、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した後、超遠心して不溶物を除去して得られた細胞抽出液を調製した。
【００８３】
５ｍｇの乳糖−リノール酸アミド複合体を０．１ｍｌのメタノールに溶解し、１０μｇ／ｍｌのフルオレセイン２０μｌを添加した後、この溶液を０．９ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に添加した。細胞抽出液を添加し、３７℃で蛍光強度の時間的変化を蛍光分光光度計（Ｆ−２０００；日立製作所）を用いて下記の条件で測定した。
【００８４】
励起波長：４９０ｎｍ
スキャン速度：６０ｎｍ／分
レスポンス：２秒
バンドパス：励起側１０ｎｍ、蛍光側１０ｎｍ
光電子倍増管：４００Ｖ
蛍光強度が時間と共に１６０８→６→３０と変化し、リノール酸アミドおよびリノール酸にフルオレセインを添加した場合と同等レベルになり、細胞内酵素によって乳糖−リノール酸アミド複合体が分解されることが証明された。
【００８５】
【発明の効果】
本発明の表面被覆化合物は体内で分解するため、本化合物で被覆することによって、目的の組織や細胞に安全に薬物等を配送できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例のＰＶＬＡおよび乳糖−リノール酸複合体で被覆した粒子のレーザー顕微鏡写真である。
【図２】実施例のＰＶＬＡおよび乳糖−リノール酸複合体で被覆した粒子のレーザー顕微鏡写真である。
【図３】実施例の乳糖−リノール酸複合体にフルオレセインと細胞抽出液を添加した場合の蛍光変化である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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