(57)【要約】【課題】薬剤や健康食品などに利用する共役リノール酸の生理機能の強さを調節することのできる手段を提供する。【解決手段】オレイン酸および／またはパルミトオレイン酸を使用する。例えば、オレイン酸および／またはパルミトオレイン酸を共存させることにより、肝臓ガン細胞などのガン細胞に対する１０トランス、１２シス型共役リノール酸による細胞毒性機能を緩和させることができる。この方法は抗ガン剤の開発に活かすことができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オレイン酸および／またはパルミトオレイン酸を使用することを特徴とする共役リノール酸の生理機能を調節する方法。
【請求項２】
共役リノール酸が１０トランス、１２シス型共役リノール酸であり、そのガン細胞に対する細胞毒性機能を緩和することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ガン細胞として肝臓ガン細胞に対する細胞毒性機能を緩和することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新しい薬剤や健康食品等の開発に有用な技術分野に属し、特に、共役リノール酸の生理機能を調節する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
共役リノール酸（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：以下、ＣＬＡと略記することもある）は、共役ジエン構造を有するリノール酸の位置および構造異性体の総称であり、３０種類を超える異性体が知られているが、特に、９シス、１１トランス型共役リノール酸（以下、９ｃ、１１ｔ型ＣＬＡと略記することがある）および１０トランス、１２シス型共役リノール酸（以下、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡと略記することがある）が注目されている。
【０００３】
ＣＬＡはある種の反すう動物の腸内細菌がリノール酸に水素添加を行う際の中間生成物として生合成されることが示され、微量ながら食事からのＣＬＡ供給源として反すう動物由来の乳製品あるいは獣肉類が挙げられている。牛肉中に存在する抗変異原生物質として同定されて以来現在までにＣＬＡは抗ガン作用を中心として、抗血栓形成、抗動脈硬化および抗肥満効果など、多彩な生理機能が報告されている。
【０００４】
食品中に含まれるＣＬＡのほとんどは９ｃ、１１ｔ型ＣＬＡであり、実際にある種の乳ガン細胞に対するＣＬＡの増殖抑制効果は本異性体によることが報告されている（Ｉｐ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （ｓｕｐｐｌ．），  ７４，  １０５０−１０５４  （１９９４）：非特許文献１）。一方、実験に用いられるＣＬＡの多くはリノール酸あるいはリノール酸に富む植物油などのアルカリ異性化処理により合成されたものであり、この製法では９ｃ、１１ｔ型ＣＬＡのみならず１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡも主要成分として生成する。このため多くの実験がこの異性体混合物を用いて行なわれてきたが、近年になってこれらの異性体の分離生成が可能となっている。
【０００５】
共役リノール酸の制ガン機能は、動物実験における発ガン抑制およびガン細胞増殖抑制のみならず、細胞実験においても大腸ガン、乳ガン、悪性黒色腫細胞の増殖を抑制することが報告されている。また、肝臓ガンに対しても増殖抑制効果が認められることが報告されている。本発明者らも活性本体となるＣＬＡ異性体を検討した結果、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡがアポトーシスを介した強い細胞毒性効果を発現することを示した（Ｙａｍａｓａｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １８８，  １７１−１８０  （２００２）：非特許文献２）。１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡのガン細胞に対する毒性効果は、肝臓以外の組織由来のガン細胞においても認められることが報告されつつあり、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡは比較的広範囲の抗ガンスペクトルを有する物質であることが期待される。
【０００６】
以上のように、ＣＬＡは抗ガン作用をはじめとする多彩な生理機能を有することから、抗ガン剤などの薬剤の他、健康食品の含有成分などへの利用が期待されるが、それらの有用性を高めるためには、必要に応じてその生理機能を適度に調節することができるような手段があることが好ましい。例えば、上述したように、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡなどのＣＬＡの抗ガン作用はアポトーシスを介したガン細胞への細胞致死効果に因るものと考えられるが、過度の作用による正常細胞への細胞毒性の発現を起こさないようにしなければならない。
【非特許文献１】Ｉｐ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （ｓｕｐｐｌ．），  ７４，  １０５０−１０５４  （１９９４）
【非特許文献２】Ｙａｍａｓａｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １８８，  １７１−１８０  （２００２）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、共役リノール酸に関しその生理機能のレベル（強さ）を調節することのできる手段を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、オレイン酸やパルミトオレイン酸（パルミトレイン酸）によって上記の目的が達成できることを見出したことに基づくものであり、オレイン酸および／またはパルミトオレイン酸を使用することを特徴とする共役リノール酸の生理機能を調節する方法を提供する。
【０００９】
本発明の方法は、特に好ましい態様として、共役リノール酸が１０トランス、１２シス型共役リノール酸であり、その肝臓ガン細胞およびその他のガン細胞に対する細胞毒性機能を緩和するのに適用される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、既述したようなＣＬＡの各種の生理機能がオレイン酸やパルミトオレイン酸の存在によって変化することに基づくものであり、ＣＬＡがそれぞれの生理機能を発揮する系にオレイン酸および／またはパルミトオレイン酸を添加、使用することによって実施される。
【００１１】
以下、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡのガン細胞（特に肝臓ガン細胞）に対する細胞毒性機能（細胞毒性効果）がオレイン酸および／またはパルミトオレイン酸によって緩和される場合に沿って本発明を説明する。
一般に抗ガン剤の使用において最も問題になる点はその副作用である。前述したように１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡは肝ガン細胞をはじめとするガン細胞に対する細胞毒性機能を有するので抗ガン剤として期待される。このＣＬＡによる細胞毒性の発現はアポトーシスを介した細胞致死効果に因ると想定される。抗ガン剤の副作用の原因として挙げられるのが正常細胞への細胞毒性の発現によるものである。本発明者らはこれまでに１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡは肝臓ガン細胞に対して正常肝細胞に比べると選択毒性があることを示した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １８８，  １７１−１８０  （２００２）：非特許文献２）。しかしながら、高濃度領域での使用は正常肝細胞に対しても毒性効果があることが明らかとなっており、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても増殖の盛んな正常細胞を標的として毒性が発現される可能性が考えられる。
【００１２】
１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡは脂質の一種であるため、腸管吸収により効率的に体内に取り込まれる。１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡは９ｃ、１１ｔ型ＣＬＡに比べると代謝が速く、生体内から消失速度は速いことが明らかとなっているが、それでも、０．５％のＣＬＡ混合物を含む食餌を４週間摂食した際に、肝臓における１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡは検出限界以下レベルとなるまで４週間程度は要することが報告されている（Ｌｉｐｉｄｓ，  ３４，  ２４３−２４８  （１９９９））。通常、抗ガン剤の代謝は極めて速く、投与１日以内にほとんどの薬剤は代謝され、血中から消失する。このため、薬剤という観点からは１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡの代謝は極めて遅く、体内貯留性が高いことが明らかである。このため、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡの細胞毒性発現を目的とする際は、正常細胞への細胞毒性を考慮に入れその作用を十分に制御できる手段が必要であると考えられる。
【００１３】
事実、この点に関して、本発明者は次のことを確認している：ラット肝ガン細胞株（ｄＲＬｈ−８４細胞）を血清（ＦＢＳ）１％存在下、ＤＭＥＭを用いて培養したところ、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡを１０μＭ添加することにより、アポトーシスを介した強い細胞毒性を発現することを示した。この効果は１μＭという低濃度でも有意に認められたが、逆に２５μＭという高濃度では正常肝細胞に対しても毒性効果が認められた。
【００１４】
本発明者は、さらに、その作用機作を検討する過程において、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡは細胞内のオレイン酸およびパルミトオレイン酸レベルを著しく低下させることも見出した。ＣＬＡによって細胞内および組織中のオレイン酸およびパルミトオレイン酸レベルが低下することはこれまでにも報告があり、デルタ９不飽和化酵素の阻害によることで説明できる。しかしながら、これらの現象とＣＬＡのガン細胞に対する毒性発現との関連については全く明らかではなかった。
【００１５】
本発明は、さらに検討を重ねた結果、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡによる肝臓ガン細胞毒性の発現などのＣＬＡによるガン細胞毒性発現は、オレイン酸および／またはパルミトオレイン酸で緩和されることを発現した。以下、このことを具体的に示すため実験例を記す。
なお、実験に用いた材料の入手先や装置のカタログ名（メーカー名）などは下記のとおりである。
ラット肝癌細胞株ｄＲＬｈ−８４細胞：Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  （ＪＣＲＢ）
１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡ：Ｍａｔｒｅｙａ社製
オレイン酸：Ｓｉｇｍａ社製
パルミトオレイン酸：Ｓｉｇｍａ社製
ＤＭＥＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製
生細胞数計測装置：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製
蛍光光度計：島津製作所社製（形式ＲＦ−１０）
共焦点レーザー顕微鏡：Ｏｌｙｍｐｕｓ社製（形式ＧＢ２５０）
【００１６】
実験例１：ガン細胞の生細胞数計測
ラット肝癌細胞株ｄＲＬｈ−８４細胞を５．０×１０４個に調整し、１０ｍｌディッシュでＦＢＳ１０％存在下ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓの改変イーグル培地）で２４時間培養を行なった。その後、ＦＢＳ１％存在下、ＤＭＥＭに１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡを１０μＭ添加した条件で、種々の濃度のオレイン酸およびパルミトオレイン酸添加し培養を行なった。培養は７２時間行ない、トリパンブルー色素排除法によって生細胞数の計測を行なった。
その結果を図１に示す。図に示されるように、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡ処理によって著しく減少した肝臓ガン細胞の生細胞数はオレイン酸およびパルミトオレイン酸添加量依存的に回復した。
【００１７】
実験例２：カスパーゼ活性の測定
アポトーシスの指標として、カスパーゼ３および９活性の測定を行なった。このカスパーゼの測定では実験例１と同様の条件で細胞の培養を行なった後、細胞を回収、溶解し、タンパク量として１００マイクログラムにそれぞれのカスパーゼ基質を添加し、その酵素活性を蛍光光度計を用いて測定した。
アポトーシス細胞の特徴として、ＤＮＡの規則的な断片化が挙げられるが、このようなＤＮＡの切断はＤＮＡエンドヌクレアーゼによるものである。カスパーゼ３はＤＮＡエンドヌクレアーゼを活性化するアポトーシス実行分子として知られており、また、カスパーゼ９はカスパーゼ３活性化因子の１つで、より上流で作用する因子であり、いずれもアポトーシスの際に細胞内で特異的に活性化されるタンパク質分解酵素である。
測定結果を図２に示す。図に示されるように、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡ処理（１０μＭ）によって培養４８時間後、カスパーゼ３および９はいずれも活性化されるが、オレイン酸およびパルミトオレイン酸（１０μＭ）の共存によりこれらの活性化は有意に抑制され、肝臓ガン細胞のアポトーシスが緩和されていることが理解される。
【００１８】
実験例３：アポトーシス細胞の形態観察
実験例１および２と同様の条件で、スライドグラス上で細胞を培養した。培養後の細胞固定には７０％メタノール、５０％エタノールを用い、核の染色にはヨウ化プロピジウムを用い、核の形態観察には共焦点レーザー顕微鏡を用いた。
その結果、図３に示されるように、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡ処理（１０μＭ）によって、培養６０時間後には未処理細胞では認められない、アポトーシス細胞に特徴的な核の凝集および断片化像が顕著に認められた。しかしながら、これらのアポトーシスに特徴的な核形態の異常性はオレイン酸およびパルミトオレイン酸（１０μＭ）の共存によりほとんど認められなくなった。
上記の実験例が示すように、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡ処理によるアポトーシス誘導を介した細胞毒性は等量のオレイン酸およびパルミトオレイン酸のどちらかが存在することで、ほぼ完全に抑制される。また、等量以下のオレイン酸およびパルミトオレイン酸添加によっても濃度依存的に細胞死は抑制される。
【００１９】
以上のように、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡは肝臓ガンのようなガン細胞に対してアポトーシス誘導を介した強い細胞毒性効果を有するが、このような細胞毒性はオレイン酸および／またはパルミトオレイン酸の共存によって著しく緩和される。したがって、オレイン酸やパルミトオレイン酸は１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡの細胞毒性調節剤として働き、１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡによる過剰な細胞毒性の発現調節に有効であるものと思われる。
【００２０】
【発明の効果】
本発明に従えば、オレイン酸および／またはパルミトオレイン酸を使用するという簡単な手段により共役リノール酸の生理機能の強さを調節することができるので、共役リノール酸の生理機能を利用する薬剤や健康食品などの開発に資することができる。
例えば、オレイン酸および／またはパルミトオレイン酸を共存させることにより、肝臓ガン細胞などのガン細胞に対する１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡによる細胞毒性機能を緩和させることができ、この方法は、正常細胞には細胞毒性を起こさず副作用のない抗ガン剤の開発に活かすことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡによる肝臓ガン細胞に対する細胞毒性機能が本発明に従いオレイン酸またはパルミトオレイン酸を共存させることにより緩和されることを示す、生細胞数計測の結果である。
【図２】１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡによる肝臓ガン細胞に対する細胞毒性機能が本発明に従いオレイン酸（ＯＡ）またはパルミトオレイン酸（ＰＯＡ）を共存させることにより緩和されることを示す、カスパーゼ活性の測定の結果である。
【図３】１０ｔ、１２ｃ型ＣＬＡによる肝臓ガン細胞に対する細胞毒性機能が本発明に従いオレイン酸またはパルミトオレイン酸を共存させることにより緩和されることを形態観察により示す、顕微鏡写真である。
【図１】
2004231537.tif 000002
【図２】
2004231537.tif 000003
【図３】
2004231537.tif 000004