(57)【要約】【課題】  解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されているか否かに関わらず、そのＮ末端ペプチドフラグメントを選択的に回収する方法を提供する。【解決手段】 解析すべきタンパク質の、側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基を保護し、側鎖アミノ基が保護されたタンパク質を得る保護工程と、前記保護されたタンパク質を断片化し、解析すべきタンパク質のＮ末端に由来する１種のＮ末端ペプチドフラグメントと、それ以外の１種又は複数種のその他のペプチドフラグメントとを得る断片化工程と、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント及び前記その他のペプチドフラグメントを、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用し、Ｎ末端ペプチドフラグメントを選択的に溶出させる分離工程とを含む、タンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。【選択図】  図１
2004219412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析すべきタンパク質の、側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基を保護し、前記側鎖アミノ基が保護されたタンパク質を得る保護工程（１）と、
前記保護されたタンパク質を断片化し、前記解析すべきタンパク質のＮ末端に由来する１種のＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）以外の１種又は複数種のその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得る断片化工程（２）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）及び前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用し、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を選択的に溶出させる分離工程（３）とを含み、前記分離工程（３）において、
前記その他のペプチドフラグメントを前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させるか、又は、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を前記支持体に結合させ、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を溶出させ、その後、結合させた前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、タンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項２】
解析すべきタンパク質を断片化し、１種のＮ末端ペプチドフラグメント（ａ´）と、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ´）以外の１種又は複数種のその他のペプチドフラグメント（ｂ´）とを得る断片化工程（２´）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ´）及びその他のペプチドフラグメント（ｂ´）の、側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基を保護し、前記側鎖アミノ基が保護されたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、前記側鎖アミノ基が保護されたその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得る保護工程（１´）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）及び前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用し、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を選択的に溶出させる分離工程（３）とを含み、前記分離工程（３）において、
前記その他のペプチドフラグメントを前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させるか、又は、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を前記支持体に結合させ、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を溶出させ、その後、結合させた前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、タンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項３】
解析すべきタンパク質の、側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基をグアニジノ化し、前記側鎖アミノ基がグアニジノ基に変換されたグアニジノ化タンパク質を得るグアニジノ化保護工程（１）と、
前記グアニジノ化タンパク質を断片化し、前記解析すべきタンパク質のＮ末端に由来する１種のＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）以外の１種又は複数種のその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得る断片化工程（２）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）及び前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用し、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を選択的に溶出させる分離工程（３）とを含み、前記分離工程（３）において、
前記その他のペプチドフラグメントを前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させるか、又は、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を前記支持体に結合させ、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を溶出させ、その後、結合させた前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、請求項１に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項４】
解析すべきタンパク質を断片化し、１種のＮ末端ペプチドフラグメント（ａ´）と、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ´）以外の１種又は複数種のその他のペプチドフラグメント（ｂ´）とを得る断片化工程（２´）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ´）及びその他のペプチドフラグメント（ｂ´）の、側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基をグアニジノ化し、前記側鎖アミノ基がグアニジノ基に変換されたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、前記側鎖アミノ基がグアニジノ基に変換されたその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得るグアニジノ化保護工程（１´）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）及び前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用し、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を選択的に溶出させる分離工程（３）とを含み、前記分離工程（３）において、
前記その他のペプチドフラグメントを前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させるか、又は、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を前記支持体に結合させ、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を溶出させ、その後、結合させた前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、請求項２に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項５】
前記解析すべきタンパク質はＮ末端が修飾されたタンパク質であり、前記分離工程（３）において、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、請求項３又は４に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項６】
前記支持体が、アミノ基と化学反応により共有結合を形成することができる分子又は分子の一部を有する、請求項５に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項７】
前記支持体が、ｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）ポリマー樹脂及びアリルアミンポリマー樹脂からなる群から選ばれる、請求項６に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項８】
前記断片化工程（２）又は前記グアニジノ化保護工程（１´）の後、前記分離工程（３）の前に、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）のＮ末端に、特定の分子又は分子の特定の一部と特異的に結合し複合体を形成することができる親和性物質をカップリングさせる工程を含み、かつ、前記支持体が、前記特定の分子からなるリガンド又は前記分子の特定の一部を有するリガンドを固定化したものである、請求項５に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項９】
前記親和性物質が抗原物質であり、かつ、前記リガンドが前記抗原物質に対応する抗体である、請求項８に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項１０】
前記親和性物質がビオチン誘導体であり、かつ、前記リガンドがアビジンである、請求項８に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項１１】
前記解析すべきタンパク質はＮ末端が修飾されていないタンパク質であり、前記グアニジノ化保護工程（１）の後、前記断片化工程（２）の前に、前記解析すべきタンパク質の非修飾Ｎ末端を修飾する工程をさらに含む、請求項３に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項１２】
前記解析すべきタンパク質の非修飾Ｎ末端を、特定の分子又は分子の特定の一部と特異的に結合し複合体を形成することができる親和性物質で修飾する、請求項１１に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項１３】
前記支持体が、前記特定の分子からなるリガンド又は前記分子の特定の一部を有するリガンドを固定化したものであり、前記分離工程（３）において、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を前記支持体に結合させて前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を溶出させ、その後、結合させた前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、請求項１２に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項１４】
前記親和性物質が抗原物質であり、かつ、前記リガンドが前記抗原物質に対応する抗体である、請求項１３に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項１５】
前記親和性物質がビオチン誘導体であり、かつ、前記リガンドがアビジンである、請求項１３に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項１６】
前記支持体が、アミノ基と化学反応により共有結合を形成することができる分子又は分子の一部を有し、前記分離工程（３）において、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、請求項１２に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項１７】
前記支持体が、ｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）ポリマー樹脂及びアリルアミンポリマー樹脂からなる群から選ばれる、請求項１６に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項１８】
前記解析すべきタンパク質の非修飾Ｎ末端を、特定の分子又は分子の特定の一部と特異的に結合し複合体を形成することができる親和性物質以外の化合物で修飾し、前記分離工程（３）において、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、請求項１１に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項１９】
前記支持体が、アミノ基と化学反応により共有結合を形成することができる分子又は分子の一部を有する、請求項１８に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項２０】
前記支持体が、ｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）ポリマー樹脂及びアリルアミンポリマー樹脂からなる群から選ばれる、請求項１９に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項２１】
前記断片化工程（２）の後、前記分離工程（３）の前に、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）のＮ末端に、特定の分子又は分子の特定の一部と特異的に結合し複合体を形成することができる親和性物質をカップリングさせる工程を含み、前記支持体が、前記特定の分子からなるリガンド又は前記分子の特定の一部を有するリガンドを固定化したものである、請求項１８に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項２２】
前記親和性物質が抗原物質であり、前記リガンドが前記抗原物質に対応する抗体である、請求項２１に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【請求項２３】
前記親和性物質がビオチン誘導体であり、前記リガンドがアビジンである、請求項２１に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質のアミノ酸配列の決定の分野において利用できる、タンパク質のＮ末端の回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のアミノ酸配列の決定方法としては、プロテインシーケンサーを用いる方法が挙げられる。プロテインシーケンサーでは、Ｎ末端を標識したタンパク質をエドマン法によってＮ末端から順に１つずつアミノ酸を切り出し、切り出したアミノ酸をより安定な化合物に変換した後、得られた最終生成物をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いてＵＶで検出し、保持時間から順次アミノ酸を決定する。しかし、プロテインシーケンサーには例えば以下のような問題がある。第１に、エドマン法では修飾されたＮ末端で反応が起きないため、直接的にシーケンスできないことである。タンパク質を予め断片化処理することにより間接的にシーケンスすることは可能であるが、この場合は、タンパク質の内部配列は決定できてもＮ末端からの配列を決定することはできない。第２に、エドマン分解の過程で、最終生成物の安定性の低さ等に起因する副反応が、ＨＰＬＣでの解析を困難にすることである。第３に、最終生成物のＵＶの吸光係数が小さく検出感度が低いことである。
【０００３】
近年、質量分析装置の感度及び精度が大きく向上し、ペプチドのタンパク質への帰属や部分アミノ酸配列の決定が、質量分析で得られるデータだけから高能率かつ高い信頼性で可能になった。これに伴い、質量分析を用いる方法がタンパク質の解析法として一般化している。このような方法においては、タンパク質を酵素消化などによりペプチドフラグメントに分解し、得られたペプチドフラグメント群の質量値を測定し、得られたデータをデータベースと照合させ、タンパク質の同定を行う。例えば、ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）法（例えば、Henzel WJ, Billeci TM, Stults JT, Wong SC, Grimley C, and Watanabe C, Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1993, 90, p. 5011-5105、及び、James P, Quadroni M, Carafoli E, and Gonnet G, Biochemical Biophysical Research Communications, 1993, 195, p. 58-64参照）や、ペプチドのアミノ酸配列情報を直接得るためのＭＳ／ＭＳによる解析（例えば、Hunt DF, Yates JR, Shabanowitz J, Winston S, Hauer CH, Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America1986, 83, p. 6233-6237参照）が行われている。しかし、これらの方法では、タンパク質のＮ末端ペプチドフラグメントを他のペプチドフラグメントと区別することはできない。このため、タンパク質の内部配列は決定できてもＮ末端からの配列を決定することはできない。
【０００４】
【非特許文献１】ヘンゼル・ＷＪ（Henzel WJ）、ビレシ・ＴＭ（Billeci TM）、シュタルツ・ＪＴ（Stults JT）、ワン・ＳＣ（Wong SC）、グリムレー・Ｃ（Grimley C）、ワタナベ・Ｃ（Watanabe C）著、「タンパク質配列データベースにおけるペプチドフラグメントの分子量検索による２次元ゲルからのタンパク質の同定（Identifying proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide fragments in protein sequence databases）」、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America）、（米国）、１９９３年、９０巻、ｐ．５０１１−５０１５
【非特許文献２】ジェームズ・Ｐ（James P）、クワドロニー・Ｍ（Quadroni M）、カラフォリ・Ｅ（Carafoli E）、ゴネット・Ｇ（Gonnet G）著、「マスプロファイルフィンガープリンティングによるタンパク質の同定（Protein identification by mass profile finger printing）」バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical Biophysical Research Communications）、（米国）、１９９３年、１９５巻、ｐ．５８−６４
【非特許文献３】フント・ＤＦ（Hunt DF）、イェーツ・ＪＲ（Yates JR）、シャバノヴィッチ・Ｊ（Shabanowitz J）、ウィンストン・Ｓ（Winston S）、ホイヤー・ＣＨ（Hauer CH）著、「タンデムマススペクトロメトリーによるプロテインシーケンス（Protein sequencing by tandem mass spectrometry）」、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America）、（米国）、１９８６年、８３巻、ｐ．６２３３−６２３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、質量分析を用いたタンパク質のＮ末端からの配列決定を行うために、解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されているか否かに関わらず、そのＮ末端ペプチドフラグメントを選択的に回収する方法を提供することにある。
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、解析すべきタンパク質のリジン残基等の側鎖アミノ基をグアニジノ化し、得られたグアニジノ化タンパク質を断片化し、解析すべきタンパク質のＮ末端に由来するＮ末端ペプチドフラグメントとその他のペプチドフラグメントとを、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用して分離を行うことによって上記本目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の発明を含む。
【０００８】
下記＜１＞は、まず保護工程（１）を行い、次に断片化工程（２）を行い、最後に分離工程（３）を行う形態を示す。
【０００９】
＜１＞  解析すべきタンパク質の、側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基を保護し、前記側鎖アミノ基が保護されたタンパク質を得る保護工程（１）と、
前記保護されたタンパク質を断片化し、前記解析すべきタンパク質のＮ末端に由来する１種のＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）以外の１種又は複数種のその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得る断片化工程（２）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）及び前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用し、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を選択的に溶出させる分離工程（３）とを含み、前記分離工程（３）において、
前記その他のペプチドフラグメントを前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させるか、又は、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を前記支持体に結合させ、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を溶出させ、その後、結合させた前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、タンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【００１０】
上記タンパク質は、オリゴペプチド、ポリペプチド等のペプチドを含む意味で用いる。
【００１１】
一方、下記＜２＞は、まず断片化工程（２´）を行い、次に保護工程（１´）を行い、最後に分離工程（３）を行う形態を示す。
【００１２】
＜２＞  解析すべきタンパク質を断片化し、１種のＮ末端ペプチドフラグメント（ａ´）と、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ´）以外の１種又は複数種のその他のペプチドフラグメント（ｂ´）とを得る断片化工程（２´）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ´）及びその他のペプチドフラグメント（ｂ´）の、側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基を保護し、前記側鎖アミノ基が保護されたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、前記側鎖アミノ基が保護されたその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得る保護工程（１´）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）及び前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用し、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を選択的に溶出させる分離工程（３）とを含み、前記分離工程（３）において、
前記その他のペプチドフラグメントを前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させるか、又は、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を前記支持体に結合させ、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を溶出させ、その後、結合させた前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、タンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【００１３】
下記＜３＞〜＜２３＞は、上記＜１＞又は＜２＞における保護工程としてグアニジノ化を行う形態を示す。
【００１４】
＜３＞  解析すべきタンパク質の、側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基をグアニジノ化し、前記側鎖アミノ基がグアニジノ基に変換されたグアニジノ化タンパク質を得るグアニジノ化保護工程（１）と、
前記グアニジノ化タンパク質を断片化し、前記解析すべきタンパク質のＮ末端に由来する１種のＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）以外の１種又は複数種のその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得る断片化工程（２）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）及び前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用し、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を選択的に溶出させる分離工程（３）とを含み、前記分離工程（３）において、
前記その他のペプチドフラグメントを前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させるか、又は、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を前記支持体に結合させ、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を溶出させ、その後、結合させた前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、＜１＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【００１５】
＜４＞  解析すべきタンパク質を断片化し、１種のＮ末端ペプチドフラグメント（ａ´）と、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ´）以外の１種又は複数種のその他のペプチドフラグメント（ｂ´）とを得る断片化工程（２´）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ´）及びその他のペプチドフラグメント（ｂ´）の、側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基をグアニジノ化し、前記側鎖アミノ基がグアニジノ基に変換されたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、前記側鎖アミノ基がグアニジノ基に変換されたその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得るグアニジノ化保護工程（１´）と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）及び前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用し、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を選択的に溶出させる分離工程（３）とを含み、前記分離工程（３）において、
前記その他のペプチドフラグメントを前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させるか、又は、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を前記支持体に結合させ、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を溶出させ、その後、結合させた前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、＜２＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【００１６】
下記＜５＞〜＜１０＞は、解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されている形態を示す。
【００１７】
＜５＞  前記解析すべきタンパク質はＮ末端が修飾されたタンパク質であり、前記分離工程（３）において、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、＜３＞又は＜４＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
＜６＞   前記支持体が、アミノ基と化学反応により共有結合を形成することができる分子又は分子の一部を有する、＜５＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
＜７＞  前記支持体が、ｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）ポリマー樹脂及びアリルアミンポリマー樹脂からなる群から選ばれる、＜６＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【００１８】
本発明においてＤＩＴＣポリマー樹脂とは、ＤＩＴＣが樹脂に複数固定化されているものである。また、本発明においてアリルアミンポリマー樹脂とは、アリルアミンが樹脂に複数固定化されているものである。
【００１９】
＜８＞  前記断片化工程（２）又は前記グアニジノ化保護工程（１´）の後、前記分離工程（３）の前に、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）のＮ末端に、特定の分子又は分子の特定の一部と特異的に結合し複合体を形成することができる親和性物質をカップリングさせる工程を含み、かつ、前記支持体が、前記特定の分子からなるリガンド又は前記分子の特定の一部を有するリガンドを固定化したものである、＜５＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
＜９＞  前記親和性物質が抗原物質であり、かつ、前記リガンドが前記抗原物質に対応する抗体である、＜８＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【００２０】
＜１０＞  前記親和性物質がビオチン誘導体であり、かつ、前記リガンドがアビジンである、＜８＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【００２１】
下記＜１１＞〜＜２３＞は、解析すべきタンパク質のＮ末端が非修飾である形態を示す。
【００２２】
＜１１＞  前記解析すべきタンパク質はＮ末端が修飾されていないタンパク質であり、前記グアニジノ化保護工程（１）の後、前記断片化工程（２）の前に、前記解析すべきタンパク質の非修飾Ｎ末端を修飾する工程をさらに含む、＜３＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【００２３】
下記＜１２＞〜＜１７＞は、上記＜１１＞において、解析すべきタンパク質の非修飾Ｎ末端を、親和性物質で修飾する形態を示す。
【００２４】
＜１２＞  前記解析すべきタンパク質の非修飾Ｎ末端を、特定の分子又は分子の特定の一部と特異的に結合し複合体を形成することができる親和性物質で修飾する、＜１１＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
＜１３＞  前記支持体が、前記特定の分子からなるリガンド又は前記分子の特定の一部を有するリガンドを固定化したものであり、前記分離工程（３）において、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を前記支持体に結合させて前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を溶出させ、その後、結合させた前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、＜１２＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
＜１４＞  前記親和性物質が抗原物質であり、かつ、前記リガンドが前記抗原物質に対応する抗体である、＜１３＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【００２５】
＜１５＞  前記親和性物質がビオチン誘導体であり、かつ、前記リガンドがアビジンである、＜１３＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【００２６】
＜１６＞  前記支持体が、アミノ基と化学反応により共有結合を形成することができる分子又は分子の一部を有し、前記分離工程（３）において、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、＜１２＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
＜１７＞  前記支持体が、ｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）ポリマー樹脂及びアリルアミンポリマー樹脂からなる群から選ばれる、＜１６＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【００２７】
下記＜１８＞〜＜２３＞は、上記＜１１＞において、解析すべきタンパク質の非修飾Ｎ末端を親和性物質以外の化合物で修飾する形態を示す。
【００２８】
＜１８＞  前記解析すべきタンパク質の非修飾Ｎ末端を、特定の分子又は分子の特定の一部と特異的に結合し複合体を形成することができる親和性物質以外の化合物で修飾し、前記分離工程（３）において、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）を前記支持体に結合させ、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させる、＜１１＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
＜１９＞  前記支持体が、アミノ基と化学反応により共有結合を形成することができる分子又は分子の一部を有する、＜１８＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
＜２０＞  前記支持体が、ｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）ポリマー樹脂及びアリルアミンポリマー樹脂からなる群から選ばれる、＜１９＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【００２９】
＜２１＞  前記断片化工程（２）の後、前記分離工程（３）の前に、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）のＮ末端に、特定の分子又は分子の特定の一部と特異的に結合し複合体を形成することができる親和性物質をカップリングさせる工程を含み、前記支持体が、前記特定の分子からなるリガンド又は前記分子の特定の一部を有するリガンドを固定化したものである、＜１８＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
＜２２＞  前記親和性物質が抗原物質であり、前記リガンドが前記抗原物質に対応する抗体である、＜２１＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【００３０】
＜２３＞  前記親和性物質がビオチン誘導体であり、前記リガンドがアビジンである、＜２１＞に記載のタンパク質のＮ末端フラグメントを選択的に回収する方法。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されているか否かに関わらず、そのＮ末端ペプチドフラグメントを選択的に回収する方法が提供される。この方法を用いると、質量分析を用いたタンパク質のＮ末端からの配列決定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、保護工程と、断片化工程と、分離工程とを含む。本発明においては、まず保護工程（１）を行い、次に断片化工程（２）を行い、最後に分離工程（３）を行う形態と、工程（１）及び（２）を入れ代えた形態、つまり、まず断片化工程（２´）を行い、次に保護工程（１´）を行い、最後に分離工程（３）を行う形態との両方が含まれる。
【００３３】
保護工程（１）においては、解析すべきタンパク質の側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基を保護し、適切に保護されたタンパク質を得る。断片化工程（２）においては、（１）で得られた保護されたタンパク質を分解し、解析すべきタンパク質のＮ末端に由来するＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）とその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得る。
【００３４】
一方、断片化工程（２´）においては、解析すべきタンパク質を断片化し、Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ´）とその他のペプチドフラグメント（ｂ´）とを得る。保護工程（１´）においては、工程（２´）で得られたペプチドフラグメント（ａ´）及び（ｂ´）の、側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基を保護し、Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）とその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを得る。
さらに、分離工程（３）においては、工程（２）又は工程（１´）で得られたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）とその他のペプチドフラグメント（ｂ）とを、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用し、いずれか一方を支持体に結合させ、いずれか他方を溶出させることにより分離する。
【００３５】
以下、前記保護工程における保護形態の一例として、後述のグアニジノ基を導入するグアニジノ化工程を挙げ、本発明を詳細に説明する。
【００３６】
まず第１に、解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されている場合について説明する。解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されている場合、まずグアニジノ化工程（１Ａ）を行い、次に断片化工程（２Ａ）を行い、最後に分離工程（３Ａ）を行う。また、工程（１Ａ）と工程（２Ａ）とは入れ代わっても良い。つまり、まず断片化工程（２Ａ´）を行い、次にグアニジノ化工程（１Ａ´）を行い、最後に分離工程（３Ａ）を行っても良い。
【００３７】
ここで本発明の方法を表す流れ図を図１に示す。以下、図１に従って各工程を詳細に説明する。
【００３８】
［グアニジノ化工程（１Ａ）］
まず、解析すべきタンパク質の側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基を保護する。側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基としては、ε−アミノ基を有するリジン残基やδーアミノ基を有するオルニチン残基等が挙げられる。これら側鎖アミノ基は一般的に、グアニジノ化反応によって保護される。グアニジノ化反応は、例えばリジン残基をホモアルギニン残基へ、オルニチン残基をアルギニン残基へ変換する。
【００３９】
側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基としてリジンのみを含むタンパク質のモデルを例に挙げ、本工程を次の式１に示す。式中、Ｒ１は、解析すべきタンパク質のＮ末端が有する修飾基を表し、ａ〜ｌは、側鎖アミノ基を有しないアミノ酸残基を表す。
【００４０】
【化１】
2004219412.tif 000003
【００４１】
グアニジノ化反応は式１に示すように、側鎖アミノ基（−ＮＨ２）を、グアニジノ基（−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２）に変換する。グアニジル化試薬としては、Ｏ−メチルイソウレア、Ｓ−メチルイソウレア、１−グアニルー３，５−ジメチルピラゾール等を用いるとよい。実際には、例えば、アンモニア水等の塩基性溶液に解析すべきタンパク質及びグアニジル化試薬を混合して反応を行う。このようにして、側鎖アミノ基がグアニジノ基に変換されたグアニジノ化タンパク質が得られる。
【００４２】
［断片化工程（２Ａ）］
得られたグアニジノ化タンパク質は断片化される。化学的断片化や酵素による消化等を行うと良い。化学的断片化を行う場合、ＢｒＣＮ等を用いると良い。
酵素による消化を行う場合、酵素としてエンドプロテアーゼを用いることができる。本発明においては、解析すべきタンパク質に応じて、質量分析装置で分析が容易な長さのＮ末端ペプチドフラグメントを生成する酵素を選択することが可能である。例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ等が用いられる。この酵素消化は、通常の方法を用いて行う。
【００４３】
本工程は、例えば次の式２で表される。
【００４４】
【化２】
2004219412.tif 000004
【００４５】
式２は、ｅ残基のＣ末端とｈ残基のＣ末端を分解するエンドプロテアーゼを用いた例として示している。断片化によって、グアニジノ化タンパク質は、解析すべきタンパク質の修飾Ｎ末端に由来する目的のＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、その他のペプチドフラグメント（ｂ）とに分解される。式２が示すように、前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）は、ペプチド結合の加水分解によって生じた無置換のアミノ基を有している。
【００４６】
［断片化工程（２Ａ´）］
本工程は、上記断片化工程（２Ａ）と同様の方法で行うことができる。つまり、化学的断片化又は酵素消化によって、Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ´）とその他のペプチドフラグメント（ｂ´）とが得られる。
【００４７】
［グアニジノ化工程（１Ａ´）］
上記断片化工程（２Ａ´）によって得られた各ペプチドフラグメント（ａ´）及び（ｂ´）は、前記グアニジノ化工程（１Ａ）と同様の方法によって側鎖アミノ基がグアニジノ化保護される。このとき、グアニジノ化反応は、側鎖アミノ基だけに選択的に起こり、ペプチドフラグメント（ａ´）及び（ｂ´）の無置換アミノ基では起こらない。このようにして、側鎖アミノ基が適切に保護されたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）及びその他のペプチドフラグメント（ｂ）が得られる。なお本工程では、前記断片化工程（２Ａ´）において酵素Ｌｙｓ−Ｃを用いた場合以外は、前記グアニジノ化工程（１Ａ）及び断片化工程（２Ａ）によって得られたペプチドフラグメントと理論上同じものが得られる。本明細書では、グアニジノ化及び断片化によって生成したペプチドフラグメントをまとめて、Ｎ末端ペプチドフラグメント（ａ）及びその他のペプチドフラグメント（ｂ）として記載する。
【００４８】
［分離工程（３Ａ）］
断片化工程（２Ａ）又はグアニジノ化工程（１Ａ´）で得られた、修飾Ｎ末端を有する目的のペプチドフラグメント（ａ）とアミノ基を有するその他のペプチドフラグメント（ｂ）とは、支持体に対する反応性の差又は親和性の差を利用し、その他のペプチドフラグメント（ｂ）を支持体に結合させ、回収すべきＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）を溶出させることによって分離する。
【００４９】
支持体に対する反応性の差を利用してＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）とその他のフラグメント（ｂ）とを分離する場合、支持体には、その他のフラグメント（ｂ）が有するアミノ基と化学反応することにより共有結合を形成することができる分子又は分子の一部を有しているものを用いると良い。例えば、前記分子を樹脂等の担体に固定化させたもの、前記分子又は分子の一部を有する単量体の重合体等を担体に固定化させたもの、前記重合体そのもの等を支持体として用いることができる。固定化させる担体の材質及び形状は、当業者が適宜定めることができる。また、前記重合体の形状も、当業者が適宜定めることができる。
【００５０】
支持体の具体例としては、ｐ−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）ポリマー樹脂、アリルアミンポリマー樹脂等が挙げられる。これら支持体は、ＤＩＴＣ又はアリルアミンが何らかの樹脂に複数固定化されたものである。
【００５１】
支持体としてＤＩＴＣを樹脂に固定化させたＤＩＴＣポリマー樹脂を用いた例を挙げ、本工程を式３に表す。
【００５２】
【化３】
2004219412.tif 000005
【００５３】
式３が示すように、アミノ基を有する前記その他のペプチドフラグメント（ｂ）が支持体のＤＩＴＣと化学反応により共有結合を形成し、一方、修飾Ｎ末端を有する目的のペプチドフラグメント（ａ）はアミノ基を有しないために支持体のＤＩＴＣと反応することなく溶出する。このようにして、タンパク質のＮ末端に由来するペプチドフラグメントだけを選択的に回収することができる。
【００５４】
前述のように、本工程の支持体は、無置換のアミノ基を結合させる。そのためこれら支持体は、前記その他のペプチドフラグメント等が有するα−アミノ基以外にも側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基が保護されていない場合は、その側鎖アミノ基も結合し得る。そのような場合にはＮ末端ペプチドフラグメントも結合されてしまうため好ましくない。このような理由で、前述のようにグアニジノ化等の保護が予め行われる。
【００５５】
支持体に対する親和性の差を利用してＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）とその他のフラグメント（ｂ）とを分離する場合は、前記断片化工程（２Ａ）の後、前記分離工程（３Ａ）の前に、その他のペプチドフラグメント（ｂ）のＮ末端に親和性物質をカップリングさせる。本明細書において親和性物質とは、特定の分子又は分子の特定の一部と特異的に結合することによって複合体を形成することができる物質をいう。この場合、支持体には前記特定の分子からなるリガンド、又は前記分子の特定の一部を有するリガンドを固定化したものを用いる。
【００５６】
前記親和性物質と前記リガンドとの組み合わせとして、抗原物質とそれに対応する抗体との組み合わせが挙げられる。ここで抗原物質とは、抗体と結合能を持つ物質であり、ハプテン等の低分子化合物も含む。具体的な組み合わせとしては、抗原としてニトロフェノール誘導体、ラクトシド、フェニルアゾ誘導体及びそれらの錯体、抗体としてそれら抗原を用いて産生する抗体等が挙げられる。
【００５７】
また、前記親和性物質と前記リガンドとの組み合わせとして、ビオチン誘導体とアビジンとの組み合わせを用いることも好ましい。
【００５８】
親和性物質のカップリングは、例えば、抗原物質のカルボキシル基とペプチドフラグメントのアミノ基とを結合させるときは、水溶性カルボジイミド等を架橋剤に用いて行う。抗原物質のアミノ基とペプチドフラグメントのアミノ基とを結合させるときは、グルタルアルデヒドを架橋剤に用いて行う。また、ビオチン誘導体とペプチドフラグメントのアミノ基とを結合させるときは、ビオチン活性エステルをペプチドフラグメントに反応させて行う。
【００５９】
本工程の一例を式４に示す。式中、△は親和性物質を表す。
【００６０】
【化４】
2004219412.tif 000006
【００６１】
式４が示すように、この時、カップリングによる親和性物質の修飾を受けたその他のペプチドフラグメント（ｂ）は支持体に固定化されたリガンドに結合し、抗原抗体複合体やビオチン−アビジン複合体を形成する。その結果、修飾Ｎ末端を有する回収すべきペプチドフラグメント（ａ）は結合することなく溶出する。このようにして、タンパク質のＮ末端に由来するペプチドフラグメントだけを選択的に回収することができる。
【００６２】
第２に、解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されていない場合について以下に説明する。図１に示すように、解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されていない場合、まずグアニジノ化工程（１Ｂ）を行い、次に、解析すべきタンパク質の非修飾Ｎ末端を修飾する。その後は、Ｎ末端の修飾形態により、断片化工程（２Ｂ）及び分離工程（３Ｂ）、又は断片化工程（２Ｃ）及び分離工程（３Ｃ）を行う。式５は、グアニジノ化工程（１Ｂ）から断片化工程（２Ｂ）又は（２Ｃ）までを一例として示す。式中、Ｒ２は、非修飾Ｎ末端の修飾基を表す。
【００６３】
【化５】
2004219412.tif 000007
【００６４】
［グアニジノ化工程（１Ｂ）］
側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基は、グアニジノ化工程（１Ａ）と同様の方法によって保護する。グアニジノ化工程（１Ｂ）において用いるグアニジル化試薬としては、例えばＯ−メチルイソウレアが挙げられる。この工程により、側鎖アミノ基がグアニジノ基に変換されたグアニジノ化タンパク質が得られる。
【００６５】
［Ｎ末端修飾］
断片化の前に、得られたグアニジノ化タンパク質の非修飾Ｎ末端を修飾する。このように修飾することによって、Ｎ末端のアミノ基は後述のタンパク質の断片化によって生じる無置換のアミノ基と区別される。
【００６６】
具体的に非修飾Ｎ末端を修飾する物質としては、前記した親和性物質を用いることができる。例えば抗原物質やビオチン誘導体を用いると良い。ただし、抗原物質としては、後述の断片化工程（２Ｂ）において使用する酵素等に加水分解される構造を有しないハプテン等を用いることが好ましい。これらの親和性物質をグアニジノ化タンパク質にカップリングさせることにより、Ｎ末端が親和性物質で修飾されたグアニジノ化タンパク質が得られる。（断片化工程（２Ｂ）へ進む。）
【００６７】
また、非修飾Ｎ末端を親和性物質以外の適当な化合物を用いて修飾しても良い。このような化合物としては、フェニルイソチオシアネート、フルオレセインイソチオシアネート等が挙げられる。この場合、グアニジノ化タンパク質の非修飾Ｎ末端に前記化合物を付加することにより、非修飾Ｎ末端にフェニルチオカルバミル基、フルオレセインチオカルバミル基等が導入される。これにより、Ｎ末端が適当な置換基で修飾されたグアニジノ化タンパク質が得られる。（断片化工程（２Ｃ）へ進む。）
【００６８】
以下、これら２つの修飾形態を有するそれぞれのグアニジノ化タンパク質の断片化及び分離について説明する。
【００６９】
［断片化工程（２Ｂ）］
まず、Ｎ末端が親和性物質で修飾されたグアニジノ化タンパク質の場合について説明する。
親和性物質によって非修飾Ｎ末端の修飾を受けたグアニジノ化タンパク質は、断片化工程（２Ａ）と同様にして、親和性物質で修飾されたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、無置換アミノ基を有するその他のペプチドフラグメント（ｂ）とに分解される。
【００７０】
［分離工程（２Ｂ）］
断片化された各ペプチドフラグメント（ａ）及び（ｂ）は、支持体との反応性の差又は親和性の差によって分離される。
【００７１】
支持体との反応性の差を利用する場合は、分離工程（３Ａ）で述べたように、ＤＩＴＣポリマー樹脂等、アミノ基と化学反応することにより共有結合を形成することができるものを支持体として用いることができる。従って、前記式３で示したように、アミノ基を有するその他のペプチドフラグメント（ｂ）が共有結合によって支持体に結合し、親和性物質が導入された回収すべきＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）は結合することなく溶出する。このようにして、タンパク質のＮ末端に由来するペプチドフラグメントだけを選択的に回収することができる。
【００７２】
支持体との親和性の差を利用する場合は、分離工程（３Ａ）で述べたように、親和性物質と複合体を形成することができるリガンドを担体に固定化した支持体を用いることができる。例えば、前記Ｎ末端修飾を抗原物質によって行った場合はリガンドとして抗体を選択し、ビオチン誘導体によって行った場合はリガンドとしてアビジンを選択する。このようなリガンドを固定化させた支持体を用いる例を式６に示す。
【００７３】
【化６】
2004219412.tif 000008
【００７４】
まず、親和性物質が導入された回収すべきＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）が特異的に支持体に固定化されたリガンドに結合し、無置換アミノ基を有するその他のペプチドフラグメント（ｂ）は結合することなく溶出する。次に、回収すべきＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）が結合した支持体を良く洗浄し、抗原と抗体との間の結合力を弱めることによって、目的のＮ末端ペプチドフラグメントを溶出させる。これを回収することにより、タンパク質のＮ末端に由来するペプチドフラグメントだけを選択的に回収することができる。
【００７５】
抗原物質と抗体との間の結合力を弱めるためには、例えば、ｐＨを酸性側に変化させたり、塩濃度を上げたりする処理等を行う。
また、ビオチンとアビジンとの結合を弱めるためには、過酸化水素による酸化、塩酸グアニジン処理、アセトニトリル等の有機溶媒の温度を上げる等を行う。
【００７６】
［断片化工程（２Ｃ）］
次に、Ｎ末端が親和性物質以外の適当な置換基で修飾されたグアニジノ化タンパク質の場合について説明する。
【００７７】
非修飾Ｎ末端に親和性物質以外の適当な化合物による修飾を受けたグアニジノ化タンパク質は、断片化工程（２Ａ）と同様にして、前記修飾を受けた回収すべきＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）と、アミノ基を有するその他のペプチドフラグメント（ｂ）とに分解される。
【００７８】
［分離工程（２Ｃ）］
断片化された各ペプチドフラグメント（ａ）及び（ｂ）は、支持体との反応性の差又は親和性の差によって分離される。
【００７９】
支持体との反応性の差を利用する場合は、分離工程（３Ａ）及び分離工程（３Ｂ）で述べたように、ＤＩＴＣポリマー樹脂等、アミノ基と化学反応することにより共有結合を形成することができるものを支持体として用いることができる。従って、前記式３で示したように、アミノ基を有するその他のペプチドフラグメント（ｂ）が共有結合によって支持体に結合させ、親和性物質が導入されたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）は結合することなく溶出する。このようにして、タンパク質のＮ末端に由来するペプチドフラグメントだけを選択的に回収することができる。
【００８０】
支持体に対する親和性の差を利用してＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）とその他のフラグメント（ｂ）とを分離する場合は、前記断片化工程（２Ｃ）の後、前記分離工程（３Ｃ）の前に、その他のペプチドフラグメント（ｂ）のＮ末端に親和性物質をカップリングさせる。この場合、分離工程（３Ａ）で述べたように、支持体には前記親和性物質と特異的に結合することによって複合体を形成することができるリガンドを固定化したものを用いる。前記親和性物質と前記リガンドとの組み合わせも、前述と同様に、抗原物質とそれに対応する抗体との組み合わせ、及びビオチン誘導体とアビジンとの組み合わせが挙げられる。前記式４に示すように、カップリングによる親和性物質の修飾を受けたその他のペプチドフラグメント（ｂ）は、支持体に固定化されたリガンドと結合することにより抗原抗体複合体やビオチン−アビジン複合体を形成する。その結果、Ｎ末端を有する回収すべきペプチドフラグメント（ａ）は結合することなく溶出する。このようにして、タンパク質のＮ末端に由来するペプチドフラグメントだけを選択的に回収することができる。
【００８１】
以上のようにして、解析すべきタンパク質のＮ末端が修飾されているか否かに関わらず、タンパク質のＮ末端に由来するフラグメント（ａ）だけを選択的に回収する。回収されたＮ末端ペプチドフラグメント（ａ）はＭＳ／ＭＳ等により解析することができる。
【００８２】
一方、その他のペプチドフラグメント（ｂ）は以下のように回収及び解析することができる。つまり、式６のような場合は、その他のペプチドフラグメント（ｂ）が先に溶出するため、支持体の洗浄液を回収する。また、式４のように、その他のペプチドフラグメント（ｂ）が抗原抗体複合体やビオチン−アビジン複合体等として支持体に結合している場合は、支持体との結合を前述の方法によって弱めて回収する。回収されたその他のペプチドフラグメント（ｂ）の混合物は、ＰＭＦ分析やＭＳ／ＭＳ等によって解析することができる。
このようにして、タンパク質のＮ末端からのアミノ酸配列を決定することができる。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明はいかなる意味においてもこれら実施例によって限定されるものではない。以下、特に断りのない限り、「％」は重量％を表す。また、図２〜４のＨＰＬＣクロマトグラムにおいては、横軸に時間（分;min）、縦軸にピーク強度を示し、図５〜１０のＭＡＬＤＩスペクトルにおいては、横軸に 質量／電荷 (Mass/Charge)、縦軸にイオンピークの強度(% Int.)を示す。
【００８４】
［実施例１］
本実施例においては、グアニジノ化工程（１Ａ）−断片化工程（２Ａ）−分離工程（３Ａ）の工程により、Ｎ末端ペプチドフラグメントの回収を行った。
本実施例においてはサンプルとしてニューロテンシンを用いた。ニューロテンシンは、ヒト（Human）、ウシ（Bovine）、イヌ（Canine）等から得ることができるペプチドであるが、本実施例では（株）ペプチド研究所製の合成ニューロテンシン（Pyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu（配列表の配列番号１））を用いた。このペプチドは、Ｎ末端にピログルタミン酸残基（Pyr）を有する。
【００８５】
（グアニジノ化工程（１Ａ））
0.67mMのニューロテンシン30μlと、9Ｎのアンモニア水33μｌと、6ＭのＯ−メチルイソウレア9μlとを混合し、65℃で30分間反応させ、グアニジノ化を行った。図２にグアニジノ化後のニューロテンシンの逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（2 nmol）を示す。図２において、溶出時間約30分のメインピークがグアニジノ化ニューロテンシンであり、直前のマイナーピークが未反応のニューロテンシンであることがＭＡＬＤＩによって確認された。
【００８６】
（断片化工程（２Ａ））
前記メインピークの分画を回収し、さらに逆相ＨＰＬＣで精製し、乾固した。得られた試料に50mMの炭酸水素アンモニウムと5mMの塩化カルシウム水溶液に溶解したトリプシン溶液（0.1μg/μl）30μlとを加え、37℃で一晩放置し、消化を行った。消化後の試料の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを図３に、ＭＡＬＤＩスペクトルを図５に示す。図３で確認された２つのピークは、図５においてPyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg（配列表の配列番号；1072（m/z）（このペプチドは、Ｎ末端にピログルタミン酸残基（Pyr）を有する。）と、Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu（配列表の配列番号３；661（m/z））とに相当する[M+H]+の分子イオンピークとして検出された。
【００８７】
（分離工程（３Ａ））
上記消化された試料3.3μlと、100mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.3）32.7μlと、12.5％トリメチルアミン水溶液4μlと、アセトニトリル4μlとを混合し、ＤＩＴＣポリマー樹脂カラム（CTFF-1 COLUMN(P/N292-02400)、（株）島津製作所製）に注入し、60℃で１時間反応させた。反応後、0.1%トリフルオロ酢酸、２−プロパノール及びアセトニトリルの（4：3：3  v/v/v）混合液300μlで樹脂を洗浄し、洗浄液を回収した。回収した洗浄液を乾固した後、0.1%トリフルオロ酢酸水溶液に再溶解し、逆相ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩにより分析を行った。
【００８８】
図４に逆相ＨＰＬＣクロマトグラム、図６にＭＡＬＤＩスペクトルを示す。図４より、前記図３で得られた２つのピークのうち、溶出時間約22分のピークだけが得られた。このピークは、図６の結果からPyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg（配列表の配列番号２；1072（m/z））に相当する[M+H]+の分子イオンピークとして検出されたため、ニューロテンシンのＮ末端フラグメントのみが選択的に回収されたことが確認された。
【００８９】
［実施例２］
本実施例においては、グアニジノ化工程（１Ｂ）−Ｎ末端修飾工程−断片化工程（２Ｂ）−分離工程（３Ｂ）の工程により、Ｎ末端ペプチドフラグメントの回収を行った。
本実施例においてはサンプルとしてリゾチームLysozyme（EC 3.2.1.17、ニワトリ卵白由来：SIGMA社製）を用いた。Lysozymeを100pmol/μlの濃度になるよう蒸留水に溶解した。溶解されたLysozyme10μlを、直径8mmの円形にカットしたPVDF（ポリビニリデンジフルオリド）膜（日本ジェネティクス社製 ）に滴下し乾燥し、サンプルがアプライされたPVDF膜を得た。
【００９０】
（還元−アルキル化）
サンプルをアプライしたPVDF膜を1.5mlのチューブに入れ、10mM ジチオスレイトールを含む100mM NH4HCO3水溶液と、アセトニトリルとの(8:2 v/v)混合液１mlを加え、56℃で1時間反応させた。反応終了後、上記チューブから加えられた上記混合液を除き、55mM ヨードアセトアミドを含む100mM NH4HCO3水溶液と、アセトニトリルとの(8:2 v/v)混合液１mlをチューブに加え、室温で45分間反応させた。反応終了後、PVDF膜を上記チューブから取り出し、100 mlの蒸留水の入ったビーカに入れ、10分間攪拌してPVDF膜を洗浄した。洗浄後、PVDF膜を乾燥させた。
【００９１】
（グアニジノ化工程（１Ｂ））
上記還元−アルキル化処理して得られたPVDF膜を、別途用意した1.5 mlのチューブに入れ、0.85M ヘミ硫酸O−メチルイソウレアを含む７N アンモニア水と、アセトニトリルとの(8:2 v/v)混合液 1 mlを加え、60℃で30分間反応させた。PVDF膜を上記チューブから取り出し、100 mlの蒸留水の入ったビーカに入れ、10分間攪拌してPVDF膜を洗浄した。洗浄後、PVDF膜を乾燥させた。
【００９２】
（Ｎ末端修飾工程）
１）ビオチニルシステイン酸の合成
スルホスクシンイミドビオチン3.4mgを20μlの蒸留水に溶解したもの、システイン酸1.1mgを15μlの蒸留水に溶解したもの、及び1.65μlのトリエチルアミンを混合し、60℃で30分間反応させた。反応生成物を逆相ＨＰＬＣで精製し、目的のビオチニルシステイン酸をMALDI-TOF MSで確認した。得られたビオチニルシステイン酸の構造式（I）を以下に示す。
【００９３】
【化７】
2004219412.tif 000009
【００９４】
２）Ｎ末端へのカップリング
上記グアニジノ化処理して得られたPVDF膜を、別途用意した1.5 mlのチューブに入れ、2mM ビオチニルシステイン酸（I）、2mM EDC（１−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、及び5mM Sulfo-NHS（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）を含む0.1M MES（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸）緩衝液と、アセトニトリルとの（8:2 v/v）混合液900μlを加え、65℃で１時間反応させた。反応終了後、PVDF膜を上記チューブから取り出し、100 mlの蒸留水の入ったビーカに入れ、10分間攪拌してPVDF膜を洗浄した。洗浄後、PVDF膜を乾燥させた。
【００９５】
（断片化工程（２Ｂ））
上記修飾して得られたPVDF膜を、別途用意した1.5 mlの消化用チューブに入れ、20μgのトリプシンを含む100ｍM NH4HCO3及び5mM CaCl2の混合溶液と、アセトニトリルとの（8:2 v/v）混合液100μlを加え、36℃で一晩消化を行った。
【００９６】
（PVDF膜からの消化ペプチドの抽出）
上記消化終了後、消化用チューブから液部分を取り出して、別途用意した1.5 mlの回収用チューブに回収した。消化用チューブ内に残ったPVDF膜に0.1%TFA（トリフルオロ酢酸）とアセトニトリルとの（4:6 v/v）混合液150μlを加え、60℃で1時間放置した後、攪拌することによりPVDF膜からの消化ペプチドの抽出を行った。得られた抽出溶液を、上記回収用チューブに回収した。消化ペプチドの抽出及び抽出溶液の回収の一連の操作をさらに２回繰り返した。回収液は遠心乾燥を行ない乾固した。得られた乾燥消化ペプチドは、下記分離工程（３Ｂ）の ２）N末端フラグメントの回収 において使用した。
【００９７】
（分離工程（３Ｂ））
１）アビジン樹脂の調製
アビジン樹脂SoftLinkTM SoftLease Avidin Resin（Promega社製）30μlを1.5 mlのチューブにとり、0.1M リン酸緩衝液（Phosphate buffer）500μlを添加し攪拌した後、遠心分離により樹脂を沈殿させ、上澄を除いた。リン酸緩衝液の添加、攪拌、遠心分離及び上澄除去の一連の操作を３回繰り返し、アビジン樹脂を平衡化した。チューブ内の得られたアビジン樹脂に、5mMのビオチニルシステイン酸（I）を含む0.1M リン酸緩衝液100μlを加え、30分間攪拌し、アビジン樹脂へのビオチニルシステイン酸の吸着を行った。吸着終了後、上澄を除いた。得られた樹脂に、10% 酢酸水溶液 500μlを添加し攪拌し、アビジン樹脂からビオチニルシステイン酸の抽出を行なった。その後、樹脂を沈殿させて上澄を除いた。酢酸水溶液の添加から上澄除去までの一連の操作をさらに２回行った。このような処理を行うことによって、ビオチニルシステイン酸による修飾基を有するＮ末端ペプチドフラグメントのアビジン樹脂への非特異的吸着を防いだ。得られたアビジン樹脂は、0.1M リン酸緩衝液 を用いて上記と同様に平衡化を行った後、調製されたアビジン樹脂とした。
【００９８】
２）N末端フラグメントの回収
上記乾燥消化ペプチドを0.1mM リン酸緩衝液 100μlに再溶解した。溶解した消化ペプチドのうち２μlをZipTipTMC18（MILLIPORE社製）で脱塩を行い、MALDIで分析した。このとき得られたスペクトルを図７に示す。1025.70 (m/z)に検出されているピークが、Ｎ末端ペプチドフラグメント（Bio-cys-Hor-Val-Phe-Gly-Arg：配列番号４：理論値1025.47 (m/z)）に相当する。このＮ末端ペプチドフラグメントは、ビオチニルシステイン酸による修飾基（Bio-cys）とグアニジノ化されたLys残基（Hor）とを有する。Ｎ末端ペプチドフラグメントとともに、その他のトリプシン消化ペプチドに相当するピークも多数検出されている。
【００９９】
一方、溶解した消化ペプチドのうち10μlを上記調製されたアビジン樹脂へアプライした。室温で１時間攪拌し、N-フラグメント（ビオチニルシステイン酸による修飾基を有する）のアビジン樹脂への吸着を行った。吸着終了後、アビジン樹脂を500μlの0.1mM リン酸緩衝液で３回洗浄し、N末端フラグメント以外のペプチドをアビジン樹脂から除去した。10％ 酢酸水溶液 150μlを2回、0.1% TFAとアセトニトリルとの(1:1 v/v)混合液150μlを1回流し、吸着されたN末端フラグメントの溶出を行った。溶出されたN末端フラグメントを、遠心乾燥機で乾固した。乾固したN末端フラグメントは、0.1% TFA水溶液10μlに再溶解し、ZipTipTMC18で脱塩を行った後、MALDIで分析を行った。このとき得られたスペクトルを図８に示す。図８においては、図７で検出されたＮ末端ペプチドフラグメントに相当する、1025.59(m/z)のピークが特異的に検出され、N末端フラグメンントが選択的に回収されたことが確認された。
【０１００】
［実施例３］
本実施例においては、断片化工程（２Ａ´）−グアニジノ化工程（１Ａ´）−分離工程（３Ａ）の工程により、Ｎ末端フラグメントの回収を行った。
本実施例においてはサンプルとしてオブアルブミンovalbumin（SIGMA社製）を用いた。ovalbuminを100pmol/μlの濃度になるよう蒸留水に溶解した。溶解されたovalbumin 10μlを、直径8mmの円形にカットしたPVDF膜（日本ジェネティクス社製 ）に滴下し乾燥し、サンプルがアプライされたPVDF膜を得た。
【０１０１】
（還元−アルキル化）
サンプルをアプライしたPVDF膜を1.5 mlのチューブに入れ、10mM ジチオスレイトールを含む100mM NH4HCO3水溶液と、アセトニトリルとの(8:2 v/v)混合液１mlを加え、56℃で1時間反応させた。反応終了後、上記チューブから加えられた上記混合液を除き、55mM ヨードアセトアミドを含む100mM NH4HCO3水溶液と、アセトニトリルとの(8:2 v/v)混合液１mlをチューブに加え、室温で45分間反応させた。反応終了後、PVDF膜を上記チューブから取り出し、100 mlの蒸留水の入ったビーカに入れ、10分間攪拌してPVDF膜を洗浄した。洗浄後、PVDF膜を乾燥させた。
【０１０２】
（断片化工程（２Ａ´））
上記得られたPVDF膜を、別途用意した1.5 mlの消化用チューブに入れ、20μgのトリプシンを含む100mM NH4HCO3及び5mM CaCl2の混合溶液と、アセトニトリルとの（8:2 v/v）混合液100μlを加え、36℃で一晩消化を行った。
【０１０３】
（PVDF膜からの消化ペプチドの抽出）
上記消化終了後、消化用チューブから液部分を取り出して、別途用意した1.5 mlの回収用チューブに回収した。消化用チューブ内に残ったPVDF膜に0.1%TFA（トリフルオロ酢酸）とアセトニトリルとの（4:6 v/v）混合液150μlを加え、60℃で1時間放置した後、攪拌することによりPVDF膜からの消化ペプチドの抽出を行った。得られた抽出溶液を、上記回収用チューブに回収した。消化ペプチドの抽出及び抽出溶液の回収の一連の操作をさらに２回繰り返した。回収液は遠心乾燥を行ない乾固した。
【０１０４】
（グアニジノ化工程（１Ａ´））
上記得られた乾燥消化ペプチドを、別途用意したグアニジノ化用1.5 mlチューブに入れ、0.85M ヘミ硫酸O−メチルイソウレアを含む7N アンモニア水7μlを加え、60℃で30分間反応させた。10％TFA水溶液10μlをさらにチューブに加えて反応を停止し、遠心乾燥機により得られた反応液を乾固した。得られた乾燥ペプチドは、以下の分離工程（３Ａ）に供された。
【０１０５】
（分離工程（３Ａ））
ＤＩＴＣガラスDITC-Glass（Isothiocyanate glass: SIGMA社製）3mgを500μlのチューブにとった。別途、上記消化及びグアニジノ化によって得られた乾燥ペプチドを7μl蒸留水に溶解した。溶解したペプチドのうち一部はMALDIで分析を行った。このとき得られたスペクトルを図９に示す。1849.81（m/z）に検出されているピークが、N末端ペプチドフラグメント（Ac-Gly-Ser-Ile-Gly-Ala-Ala-Ser-Met-Glu-Phe-Cys(Cam)-Phe-Asp-Val-Phe-Hor：配列番号５：理論値1849.83（m/z））である。このＮ末端ペプチドフラグメントは、アセチル化されたＮ末端のGly残基（Ac-Gly）及びカルバモイルメチル化されたシステイン残基（Cys(Cam)）を有する。Ｎ末端ペプチドフラグメントとともに、多数のその他のペプチドフラグメントのピークも検出されている。
【０１０６】
前記溶解したペプチドの残りに12%トリメチルアミン水溶液7μlを加え、上記DITC-Glassにアプライした。60℃で2時間放置し、その後1時間浸とうして反応させた。反応終了後、0.1%TFA水溶液とアセトニトリルとイソプロパノールとの混合液（42:18:40 v/v/v）100μlを添加して攪拌し、DITC-Glassを沈殿させて上澄を回収用チューブに回収した。混合液の添加から上澄の回収までの一連の操作をさらに２回行い、回収用チューブ内の回収液を遠心乾燥により乾固した。得られた乾燥ペプチドを0.1％TFA水溶液10μlに再溶解し、ZipTipTMC18で脱塩を行った後、MALDIで分析を行った。このとき得られたスペクトルを図１０に示す。図１０においては、図９で検出されたＮ末端ペプチドフラグメントに相当する、1850.04(m/z)のピークが特異的に検出され、N末端フラグメントが選択的に回収されたことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本発明の方法を示す流れ図である。
【図２】実施例１で得られた、グアニジノ化後のニューロテンシンのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】実施例１で得られた、トリプシン消化ペプチドフラグメントのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】実施例１で得られた、ＤＩＴＣポリマー樹脂カラムによる分離における溶出分画のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】実施例１で得られた、トリプシン消化ペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図６】実施例１で得られた、ＤＩＴＣポリマー樹脂による分離における溶出分画のＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図７】実施例２で得られた、トリプシン消化ペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図８】実施例２で得られた、アビジン樹脂による分離における吸着分画のＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図９】実施例３で得られた、トリプシン消化ペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図１０】実施例３で得られた、ＤＩＴＣガラスによる分離における溶出分画のＭＡＬＤＩスペクトルである。
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
配列番号４は、Ｎ末端のアミノ酸残基においてビオチニルシステイン酸を用いたペプチド結合が形成され、かつ、グアニジノ化されている。配列番号５は、Ｎ末端のアミノ酸残基においてアセチル化され、Ｎ末端から１１番目のアミノ酸残基においてカルバモイルメチル化され、かつ、Ｎ末端から１６番目のアミノ酸残基においてグアニジノ化されている。
【図１】
2004219412.tif 000010
【図２】
2004219412.tif 000011
【図３】
2004219412.tif 000012
【図４】
2004219412.tif 000013
【図５】
2004219412.tif 000014
【図６】
2004219412.tif 000015
【図７】
2004219412.tif 000016
【図８】
2004219412.tif 000017
【図９】
2004219412.tif 000018
【図１０】
2004219412.tif 000019
【配列表】
2004219412000001.app