(57)【要約】【課題】心筋領域における血管新生を促進することにより冠状動脈狭窄または閉塞を治療するための新規な方法およびこれに用いるための製剤を提供すること。【解決手段】血管新生因子またはこれをコードする遺伝子およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放性製剤からなる、冠状動脈狭窄または閉塞を治療するための医薬組成物が開示される。血管新生因子としては、例えば、ｂＦＧＦおよびその他のＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、アンギオポイエチン、ＨＩＦ、サイトカイン、ケモカイン、アドレナメジュリン等を用いることができる。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生因子またはこれをコードする遺伝子およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放性製剤からなる、冠状動脈狭窄または閉塞を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
血管新生因子がｂＦＧＦである、請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、冠状動脈狭窄または閉塞治療用の徐放性製剤に関する。より詳細には、本発明は、心臓の栄養動脈である冠状動脈の狭窄あるいは閉塞の治療のための血管新生因子含有徐放性製剤およびその製法、ならびにそれを用いた冠状動脈狭窄または閉塞の新しい治療法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
心臓外科領域においては、冠状動脈の狭窄にて起こる心筋虚血つまり狭心症と、病変進行の結果起こる心筋梗塞は、その早期発見と適切な治療が患者の生命を左右する重篤な疾患である。特に心筋梗塞は日本成人３大死因の一つであり、より効果的な治療の開発は急務である。降圧薬、血管拡張剤等の循環改善剤の投与によりこれらの病気の進展を遅らせることはできても、これはあくまで補助手段に過ぎず、根本治療ではない。狭窄・閉塞した血管に対し直接的な治療方法としては、冠動脈病変部位を機械的に押し広げる内科的カテーテル治療があるが、これには再狭窄の問題が伴うとともに、動脈硬化が強い場合にはその治療に限度がある。この場合残された治療方法は、外科的に血液供給源となる他の血管を病変箇所よりも遠位側に繋ぎ、新たな血液路（バイパス）を作成する冠動脈バイパス手術である。しかし直径が１ｍｍ未満の微少血管には技術的に吻合が困難であり、うまくバイパスしてもその血管径の違いや血流量不足から早期閉塞の運命を辿る。また直径１．５ｍｍまたはそれ以上の血管はバイパス手術の適応であるが、その末梢部や枝血管（とくにそれらの直径が小さいとき）に他の狭窄があると、バイパスの効果は低くなりその開存率も良くない。
【０００３】
狭窄病変を複数の冠状動脈にび漫性に持つ重症の狭心症患者は、現段階では有効な治療方法がない為その予後は非常に不良である。虚血性心機能不全に伴う多臓器不全が併発した場合は致命的である。この危機的状況を打開する目的で、現段階で内科的（ＰＣＩまたはＰＴＣＡ・ステントなどのカテーテルインターベンション）・外科的（ＡＣバイパスまたはＣＡＢＧ、オフポンプＣＡＢＧまたはＯＰＣＡＢなど）治療が適応とならない細血管が灌流する心筋領域に種々の血管新生因子を筋肉注射したり冠動脈内に注入する、あるいはレーザーで心臓外側から小孔を開けることで心筋内の側副血行の発達を促進する治療が開始されはじめているが、依然その効果は十分でない。いずれの方法にしても新生される血管は元来備わっている心筋内の血管の交通を拡充するに過ぎず、これにより増加する血液量は収縮力の低下した心機能を回復するには不十分である。したがって、当該技術分野においては、冠状動脈に十分な血液を供給するための新たな治療法の開発が求められている。
【０００４】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】
ＷＯ９４／２７６３０
【特許文献２】
特開２００１−３１６２８５
【特許文献３】
特開２００２−１４５７９７
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、心筋領域における血管新生を促進することにより冠状動脈狭窄または閉塞を治療するための新規な方法およびこれに用いるための製剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ゼラチンハイドロゲルを用いて作製した血管新生因子の徐放性製剤が、心筋梗塞モデルウサギにおいて顕著な治療的効果を有することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、血管新生因子またはこれをコードする遺伝子およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放性製剤からなる、冠状動脈狭窄または閉塞を治療するための医薬組成物を提供する。好ましくは、血管新生因子はｂＦＧＦである。
【０００７】
本発明にしたがって、ｂＦＧＦをゼラチンハイドロゲルに含浸させたシートを心筋虚血部位と多数の分枝を有する胃大網動脈の間に挟み込み徐放させることにより、血管新生効果を得られ、心臓外の血管から新生血管が誘導され、血流が増加して虚血改善が計られる。すなわち、本発明の徐放性製剤を用いることにより、心臓の外部から血管が誘導されるため、上記の細血管に従来の吻合方法（直径１．５ｍｍ以下とくに１ｍｍ以下の血管では成績が極めて悪い）を用いずにバイパスを繋ぐ、いわば”バイオバイパス（Ｂｉｏ−ｂｙｐａｓｓ）”を形成させることが可能となった。本発明は、重症の虚血性心疾患治療剤として特に有用である。
【０００８】
本発明の徐放性製剤は、胃大網動脈（Ｇａｓｔｒｏｅｐｉｐｌｏｉｃ　ａｒｔｅｒｙ）ないし大網（ｇｒｅａｔｅｒ　ｏｍｅｎｔｕｍ）と冠動脈（ｃｏｒｏｎａｒｙ　ａｒｔｅｒｙ）またはその枝あるいは毛細血管とのバイパス（吻合）、左または右内胸動脈（ｌｅｆｔ　ｏｒ　ｒｉｇｈｔ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｔｈｏｒａｃｉｃ　ａｒｔｅｒｙ）と冠動脈またはその枝あるいは毛細血管とのバイパス（吻合）、および、左または右とう骨動脈（ｌｅｆｔ　ｏｒ　ｒｉｇｈｔ　ｒａｄｉａｌ　ａｒｔｅｒｙ）と冠動脈またはその枝あるいは毛細血管とのバイパス（吻合）において用いるのに有用である。
【０００９】
腹腔内で腸管を包み込むように存在する毛細血管の豊富な結合組織である大網は右胃大網動脈を主要栄養動脈としている。この右胃大網動脈は冠動脈バイパス術のグラフト（新しい血液供給路）として汎用されており遠隔期開存率に優れる質の高い血管である。本発明の好ましい態様においては、徐放化した増殖因子を心臓と大網を含んだ右胃大網動脈の間に挟み込むように置き、この主要動脈から心筋へ血管を萌芽するバイオバイパスを形成させる。バイオバイパスによる血流増加は心筋内の側副血行発達のみの血流増加よりも豊富であると考えられ、高い治療効果が期待される。これによりこれまで内科的、外科的に治療不可能とされていた重症虚血心の治療適応が拡大され、心不全や狭心痛に悩まされている患者に大きな福音をもたらす可能性がある。特に、心移植適応患者のなかで虚血性心筋症の患者にも有効である可能性がある。
【００１０】
さらに、本発明にしたがえば、その他の動脈グラフト素材（生体内の血管において最も質の高い内胸動脈や大きな血管径を持つ撓骨動脈など）、さらには組織工学や遺伝子工学により改良された静脈グラフトや各種人工血管において適用することも可能であり、従来の外科治療と組み合わせることで幅広い治療戦略の展開が可能となる。
【００１１】
すなわち、本発明の徐放性製剤は、静脈グラフト（大伏在静脈または小伏在静脈または上腕の静脈ないしそれらを組織工学的・遺伝子工学的に改良したもの）と冠動脈またはその枝あるいは毛細血管とのバイパス（吻合）、人工血管グラフト（ゴアテックス（登録商標）（ＰＴＦＥ）またはダクロンなどと、それらを組織工学的・遺伝子工学的に改良したもの）と冠動脈またはその枝あるいは毛細血管とのバイパス（吻合）、および生物系グラフト（ヒト動脈、静脈、動物由来の動脈、静脈あるいはそれらを脱細胞など組織工学的あるいは遺伝子工学的に改良したもの）と冠動脈またはその枝あるいは毛細血管とのバイパス（吻合）において用いるのにも有用である。
【発明の実施の形態】
【００１２】
本発明において用いることができる血管新生因子の例としては、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：　ｂＦＧＦ）およびその他のＦＧＦ、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）、アンギオポイエチンなどの増殖因子、およびＶＥＧＦの発現を誘導する活性を有する低酸素誘導因子（ＨＩＦ）等、ならびに、血管新生作用をもつサイトカイン、ケモカイン、アドレナメジュリンなどが挙げられる。
【００１３】
本発明において血管新生因子として好ましいものはｂＦＧＦである。ｂＦＧＦは、繊維芽細胞（３Ｔ３）の増殖を促進する因子として最初に下垂体および脳から同定された成長因子である（Ｒｉｆｋｉｎ　ａｎｄ　Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ，Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１０９，　１−６，　１９８９）。ｂＦＧＦは、種々の組織および臓器において、血管新生、平滑筋細胞成長、小食治癒、組織修復、造血、神経細胞の分化等の多岐にわたる機能を有することが見いだされている（Ｂｉｋｆａｌｖｉ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ．，１８，　２６−４５，　１９９７）。ｂＦＧＦは、欧米では虚血性心疾患の血管新生療法に臨床治療レベルで使用されており、日本では皮膚科領域では既に皮膚潰瘍治療薬として商品化され、整形外科領域では臨床治験で使用されている。
【００１４】
本発明で使用されるゼラチンは、牛、豚、魚類などを始めとする各種の動物種の皮膚、骨、腱などの身体のあらゆる部位から採取できるコラーゲン、あるいはコラーゲンとして用いられている物質から、アルカリ加水分解、酸加水分解、および酵素分解等の種々の処理によって変性させて得ることができる。遺伝子組換え型コラーゲンの変性体ゼラチンを用いてもよい。ゼラチンの性質は、用いる材料および処理方法により様々であるが、そのいずれの性質をもつゼラチンも本発明においてｂＦＧＦ等の血管新生因子の徐放のためのハイドロゲル材料として利用することができる。
【００１５】
ゼラチンの性質を表す尺度としては、例えば、等電点、分子量、ジータ電位などがある。ジータ電位は、物質（ゼラチン）の静電的な荷電の程度を表す尺度である。本発明において用いるのに特に好ましいゼラチンは、以下の物性：
コラーゲンからのアルカリ加水分解処理によって得られる、酸性ゼラチンであり、
分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの非還元条件下で約１０〜約２０万ダルトンであり、
水溶液中のジータ電位が、約−１５〜約−２０ｍＶ
を有するゼラチンである。また好ましくは、ウシの骨由来のＩ型コラーゲンをアルカリ処理して調製した酸性ゼラチンを用いることができ、新田ゼラチン社の試料等電点（ＩＥＰ）５．０として入手することもできる。なお、酸処理して調製した塩基性ゼラチンは同じく新田ゼラチン社の試料ＩＥＰ９．０として入手することができるが、ジータ電位は以下のように大きく相違する。
酸性ゼラチン　（新田ゼラチン社試料ＩＥＰ５．０）：約−１５〜約−２０ｍＶ
塩基性ゼラチン　（新田ゼラチン社試料ＩＥＰ９．０）：約＋１２〜約＋１５ｍＶ
【００１６】
本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルとは、上記ゼラチンを用いて種々の化学的架橋剤とゼラチン分子間に化学架橋を形成させて得られるハイドロゲルのことである。化学的架橋剤としては、例えばグルタルアルデヒド、例えばＥＤＣ等の水溶性カルボジイミド、例えばプロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、イミダゾール基などの間に化学結合を作る縮合剤を用いることができる。好ましいものは、グルタルアルデヒドである。また、ゼラチンは、熱処理又は紫外線照射によっても化学架橋することもできる。また、これらの架橋処理を組み合わせて用いることもできる。さらに、塩架橋、静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用などを利用した物理架橋によりハイドロゲルを作製することも可能である。
【００１７】
ゼラチンの架橋度は、所望の含水率、すなわちハイドロゲルの生体吸収性のレベルに応じて適宜選択することができる。ゼラチンハイドロゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度の好ましい範囲は、ゼラチン濃度１〜２０ｗ／ｗ％、架橋剤濃度０．０１〜１ｗ／ｗ％である。架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、０〜４０℃、１〜４８時間で行うことができる。一般に、ゼラチンおよび架橋剤の濃度、架橋時間が増大するとともにハイドロゲルの架橋度は増加し、生体吸収性は低くなる。
【００１８】
ゼラチンハイドロゲルの形状は、治療において用いるのに適した物であれば特に制限はないが、例えば、シート状、円柱状、角柱状、ディスク状、ペースト状、球状、粒子状などがある。
【００１９】
円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のゼラチンハイドロゲルは、ゼラチン水溶液に架橋剤水溶液を添加するか、あるいは、架橋剤水溶液にゼラチンを添加し、所望の形状の鋳型に流し込んで、架橋反応させることにより調製することができる。また、成形したゼラチンゲルにそのまま、あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加してもよい。架橋反応を停止させるには、エタノールアミン、グリシン等のアミノ基を有する低分子物質に接触させるか、あるいは、ｐＨ２．５以下の水溶液を添加する。反応に用いられた架橋剤および低分子物質を完全に除去する目的で、得られたゼラチンハイドロゲルは、蒸留水、エタノール、２−プロパノール、アセトン等により洗浄し、製剤調製に供される。
【００２０】
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルは、例えば、三口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例えば、新東科学社製、スリーワンモーター、ＥＹＥＬＡ　ｍｉｎｉＤ．Ｃ．　スターラー等）とテフロン（登録商標）用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装置にゼラチン溶液を入れ、ここにオリーブ油等の油を加えて２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンとし、これに架橋剤水溶液を添加するか、ゼラチン水溶液を予めオリーブ油中にて前乳化（例えば、ボルテックスミキサーＡｄｖａｎｔｅｃ　ＴＭＥ−２１、ホモジナイザー、ｐｏｌｙｔｒｏｎ　ＰＴ１０−３５等を用いて）しておいたものをオリーブ油中に滴下し、微粒子化したＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶液を添加して架橋反応させ、遠心分離によりゼラチンハイドロゲルを回収した後、アセトン、酢酸エチル等で洗浄し、さらに２−プロパノール、エタノール等に浸漬して架橋反応を停止させることにより、調製することができる。得られたゼラチンハイドロゲル粒子は、２−プロパノール、Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水、蒸留水等で順次洗浄し、製剤調製に供される。ゼラチンハイドロゲル粒子が凝集する場合には、例えば、界面活性剤などの添加あるいは超音波処理（冷却下、１分以内程度が好ましい）等を行ってもよい。
【００２１】
得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は、上述の粒子作製時におけるゼラチン濃度、ゼラチン水溶液とオリーブ油との体積比、および撹拌スピードなどにより変化する。一般には粒径は１〜１０００μｍであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けて使用すればよい。さらに、前乳化することによって、粒子サイズが２０μ以下の微粒子状のゼラチンハイドロゲルを得ることができる。
【００２２】
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルを調製する別法として以下の方法も挙げられる。上記の方法と同様の装置にオリーブ油を入れ、２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、ここにゼラチン水溶液を滴下してＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これを冷却後、アセトン、酢酸エチル等を加えて攪拌し、遠心分離により未架橋ゼラチン粒子を回収する。回収したゼラチン粒子を、さらにアセトン、酢酸エチル等、次いで２−プロパノール、エタノール等で洗浄後、乾燥させる。この乾燥ゼラチン粒子を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む架橋剤水溶液に懸濁させ、緩やかに攪拌しながら架橋反応させ、使用した架橋剤に応じて０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１００ｍＭグリシン水溶液又は０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．００４Ｎ　ＨＣ１等にて洗浄し、架橋反応を停止することによりゼラチンハイドロゲル粒子を調製することができる。本法で得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は上記の方法の場合と同様である。
【００２３】
本発明のゼラチンハイドロゲルは適宜、適当な大きさ及び形に切断後凍結乾燥し滅菌して使用することができる。凍結乾燥は、例えば、ゼラチンハイドロゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で３０分以上、又は−８０℃で１時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で１〜３日間乾燥させることにより行うことができる。
【００２４】
以下に、ｂＦＧＦを例として、本発明の血管新生因子含有徐放性製剤の製造方法をおよび使用方法を説明する。ｂＦＧＦ以外の血管新生因子を用いて本発明の徐放性製剤を製造および使用する方法は、本明細書の開示ならびに当該技術分野においてよく知られる技術に基づいて明らかであろう。
【００２５】
本発明で使用されるｂＦＧＦは、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができ、また既に市販されている製品を使用してもよい。ｂＦＧＦの製造法としては、例えば、ｂＦＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該ｂＦＧＦを得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法によりｂＦＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えｂＦＧＦを得ることもできる。（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，　３４２，　４４０（１９８９）、特開平５−１１１３８２号公報、　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　１６３，　９６７（１９８９）などを参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、昆虫、かいこ、または動物細胞などを用いることができる。このようにして得られたｂＦＧＦは、天然型ｂＦＧＦと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。
【００２６】
本発明のｂＦＧＦ含有徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、例えば、上記の凍結乾燥したゼラチンハイドロゲルにｂＦＧＦを滴下して、ハイドロゲル内にｂＦＧＦを含浸させることにより得ることができる。この含浸操作は、通常、４−３７℃で１５分間−１時間、好ましくは４−２５℃で１５−３０分間で終了し、その間にハイドロゲルはｂＦＧＦで膨潤し、ｂＦＧＦがゼラチン分子と相互作用することによってゼラチン分子と複合体を形成し、ゼラチンハイドロゲル内に物理的相互作用によって固定される。ｂＦＧＦとゼラチンとの間の複合体の形成には、両者の間の静電的相互作用だけでなく、疎水結合、水素結合等の他の相互作用も大きく寄与していると考えられる。
【００２７】
ゼラチンに対するｂＦＧＦの重量比は約５倍量以下であることが好ましい。さらに好ましくは、ゼラチンに対してｂＦＧＦは約５〜約１／１０４倍量の重量比である。
【００２８】
本発明のｂＦＧＦ徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、ｂＦＧＦの徐放性効果と安定化効果を持つため、ｂＦＧＦの機能を少量で長時間にわたって発揮し得る。そのため、投与部位においてｂＦＧＦの血管新生促進機能が効果的に発揮されることによりバイオバイパスが形成され、冠状動脈狭窄または閉塞の治療剤として有効に作用することができる。
【００２９】
この徐放のメカニズムは、ｂＦＧＦが、ハイドロゲル内のゼラチンに物理的に固定化されていることに基づく。本発明者らは、これまで、成長因子、サイトカイン、モノカイン、リンホカイン、その他の生理活性物質などの生体吸収性高分子ハイドロゲルを用いた徐放化を試み、これにより他の材料では達成できない生理活性を有した有効成分の徐放化とその徐放期間のコントロールに成功してきた。本発明においては、ｂＦＧＦが同様のメカニズムによってハイドロゲルから徐放されると考えられる。ゼラチンハイドロゲルに固定化された状態では、ｂＦＧＦはハイドロゲルからほとんど放出されない。生体内でハイドロゲルが分解されるにつれて、ゼラチン分子が水可溶性となり、それに伴って、ゼラチン分子に固定化されているｂＦＧＦが放出されるようになる。すなわち、ハイドロゲルの分解によって、ｂＦＧＦの徐放性を制御することができる。ハイドロゲルの分解性は、ハイドロゲル作製時における架橋程度を調節することにより変えることができる。また、ｂＦＧＦがゼラチンと相互作用することによって、これらの生体内での安定性、例えば酵素分解抵抗性などが向上する。
【００３０】
本発明のゼラチンハイドロゲルは、その含水率が徐放性に大きく影響し、好ましい徐放性効果を示す含水率としては約８０〜９９ｗ／ｗ％が挙げられる。さらに好ましいものとしては、約９５〜９８ｗ／ｗ％のものが挙げられる。この架橋度の測定可能な指標に含水率がある。含水率が大きければ架橋度は低くなり、分解されやすくなる。つまり、この含水率の値がｂＦＧＦの徐放（徐々に放出）を左右する。
【００３１】
本発明の徐放性製剤は、血管新生因子をコードする遺伝子を含むものであってもよい。このような遺伝子は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えば、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされる血管新生因子が発現されるように構築されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００３２】
このようなプラスミドは、当該技術分野において入手可能な種々のプラスミドに所望の血管新生因子をコードする遺伝子を適当な制限酵素部位を利用して挿入することによって調製することができる。導入すべき遺伝子の塩基配列を基に合成、半合成の手段により調製することも可能である。
【００３３】
血管新生因子をコードする遺伝子を含有するゼラチンハイドロゲルは、蛋白質である血管新生因子について上述した方法と同様にして作製することができる。例えば、ゼラチンの５〜３０重量％水溶液に直接架橋剤を添加して調製した架橋ゼラチンゲル、あるいは架橋剤水溶液に未架橋ゼラチンゲルを浸漬して調製した架橋ゼラチンゲルを遺伝子を含有する溶液中に直接浸漬するか、あるいは架橋ゼラチンゲルを乾燥した後、それを遺伝子を含有する溶液中で再膨潤させることによって調製することができる。核酸は負に荷電しているため、正に荷電しているゼラチンハイドロゲルを用いることが好ましい。
【００３４】
本発明の徐放性製剤は、冠動脈の近傍に外科手術により留置するか注射により投与することができる。具体的には、胃大網動脈ないし大網と冠動脈との間、左または右内胸動脈と冠動脈との間、左または右とう骨動脈と冠動脈との間等に留置または投与することができる。本発明の徐放性製剤が生体内で徐々に分解するのにともなって血管新生因子が放出され、血管新生因子の作用によりこれらの血管と冠動脈またはその枝あるいは毛細血管との間に新生血管が誘導され、バイオバイパスが形成される。このことにより、虚血心臓への血流が増加し、冠状動脈狭窄または閉塞の有効な治療を達成することができる。
【００３５】
あるいは、静脈グラフト（大伏在静脈または小伏在静脈または上腕の静脈ないしそれらを組織工学的・遺伝子工学的に改良したもの）、人工血管グラフト（ゴアテックス（登録商標）（ＰＴＦＥ）またはダクロンなどと、それらを組織工学的・遺伝子工学的に改良したもの）、および生物系グラフト（ヒト動脈、静脈、動物由来の動脈、静脈あるいはそれらを脱細胞など組織工学的あるいは遺伝子工学的に改良したもの）等を用いて冠動脈バイパス手術を行う際に、本発明の徐放性製剤を病変部位またはその近傍に留置することができる。この場合にも、本発明の徐放性製剤が生体内で徐々に分解するのにともなって血管新生因子が放出され、血管新生因子の作用によりこれらのグラフトと冠動脈またはその枝あるいは毛細血管との間に新生血管が誘導され、バイオバイパスが形成されて血流が増加する。さらに、本発明の徐放性製剤は、人工血管グラフトと細胞移植（心筋細胞、骨格筋芽細胞、骨髄細胞ないし骨髄由来細胞、骨髄単核球細胞、ＥＳ細胞およびそこから分化させた細胞など）を使用したバイパス手術においても有効に用いることができる。
【００３６】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００３７】
実施例１．ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルの作製
１０ｗｔ％濃度の酸性ゼラチンをグルタルアルデヒドにより化学架橋した後、架橋剤を不活性化した。次に蒸留水にて数回洗浄し、架橋含水率９０．３％ゼラチンハイドロゲルを得た。続いて１００μｇのｂＦＧＦを含む０．０５Ｍ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ　７．４，　ＰＢＳ　５００μｌ）を滴下し、ｂＦＧＦ水溶液をゼラチンハイドロゲルへ浸み込ませることによってｂＦＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルを得た。
【００３８】
実施例２．心筋梗塞ウサギモデルの作成および治療
体重２．５−３．５ｋｇの日本白色ウサギを用いて、全身麻酔下に胸骨正中切開で心臓を露出した。抗不整脈剤を投与下に冠動脈の枝（回旋枝）を結紮し、心筋梗塞モデルを作製した。術後心室細動に移行することがあり、約２０分間経過を観察し状態が安定することを待った。
次に、これらの心筋梗塞ウサギモデルに、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルによる治療を施した。
グループＡ（ｎ＝　５）：無処置（心筋梗塞作成のみ）
グループＢ（ｎ＝　１０）：　開腹し採取した大網を含んだ右胃大網動脈を心臓に巻き付ける
グループＣ（ｎ＝　１０）：　シート状のｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルを右胃大網動脈と心臓の間に投与する
ｂＦＧＦの投与は、これを含有させたハイドロゲルシートを細い糸で心臓表面に固定することにより行った。これらの条件下では、ｂＦＧＦは約２週間にわたり局所で徐放される。
【００３９】
実施例３．超音波検査による心臓機能評価
術前、２週目、４週目の超音波検査で心臓機能評価を行った。軽い鎮静下に体表超音波検査を施行した。いずれの群も手術前の心機能は良好であり、差はなかった。２週目、４週目でグループＣにおいて有意に心臓収縮能が良好であり、心機能が保たれていることが判明した。
【００４０】
実施例４．大網動脈造影検査による評価
術後４週目にグループＢ，Ｃについて大網の動脈の造影検査を行った。グループＢ，Ｃのそれぞれ６匹ずつに造影検査を施行した。全身麻酔下に抗凝固を施し再開腹した。大網動脈に２４Ｇカテーテルを挿入した。動物を犠牲死させ、大網と心臓を一塊に取り出した。あらかじめ挿入しておいたカテーテルより造影剤を注入し、これを撮影した後に、現像したフィルムを解析した。
グループＢでは６匹中２匹において大網動脈から冠動脈が描出されたが、その新生血管発育は非常に乏しいものだった。一方グループＣでは６匹全部において冠動脈への交通を認め、新生血管は非常に豊富であり冠動脈との交通を全てに認めた。
【００４１】
実施例５．組織学的検査による評価
４週間の治療期間の後、心臓標本を摘出し、心筋梗塞の範囲を組織学的に検討した。また免疫染色を行い、梗塞境界部位の毛細血管の数を調べ比較検討した。摘出した心臓を冠動脈結紮部位より２ｍｍ心尖部よりで心臓長軸に対して水平断にスライスした。これをマッソン・トリクローム染色し、左心室全体に占める心筋梗塞領域を算出した。
梗塞領域については、グループＣはＡ，Ｂに比べ有意に小さかった。免疫染色（血管壁のαアクチン平滑筋細胞を染色）による細動脈の単位面積当たりの数は、グループＣが他の２群に比較し有意に増加していた。
以上の結果から、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルによる血管新生作用により、心臓外の血管が冠動脈と連結し（バイオバイパス）、虚血心臓の血行改善が得られることで、有意に心機能の悪化を予防し、心筋梗塞領域を縮小させることができた。