(57)【要約】【課題】  目的遺伝子の形状、サイズに影響されることなく、迅速、正確、かつ効率良く目的遺伝子を抽出分離することができ、従来の２週間程度のスクリニングを約２４時間で完了することができる、極めて簡便な目的遺伝子の抽出方法を提供する。【解決手段】  本発明の目的遺伝子の抽出方法は、プローブＤＮＡが表面に結合されたプローブＤＮＡ結合粒子と、一方に前記プローブＤＮＡと相補的な配列を有し、もう一方に目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと、抽出すべき目的遺伝子とを含む試料を混合し、前記プローブＤＮＡと前記一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと前記目的遺伝子とをハイブリダイズさせること、を含む。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブＤＮＡが表面に結合されたプローブＤＮＡ結合粒子と、一方に前記プローブＤＮＡと相補的な配列を有し、もう一方に目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと、抽出すべき目的遺伝子とを含む試料を混合し、
前記プローブＤＮＡ結合粒子と前記一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと前記目的遺伝子とをハイブリダイズさせること、を含む、目的遺伝子の抽出方法。
【請求項２】
デオキシシトシン酸（ｄＣ）およびデオキシグアニン酸（ｄＧ）の少なくとも一方が５塩基以上連続した配列を含む５〜８０塩基の配列からなる１本鎖オリゴヌクレオチドが表面に結合され、かつ粒子径が０．１〜１５μｍである、プローブＤＮＡ結合粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的遺伝子およびプローブＤＮＡの双方とハイブリダイズされる一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドを使用する、特定の塩基配列を有する目的遺伝子の抽出方法、ならびに前記方法に用いられるプローブＤＮＡ結合粒子を提供する。本発明は主に、遺伝子クローニング、ｃＤＮＡライブラリーからの目的遺伝子の抽出、分離精製、検出等の用途に適している。
【背景技術】
【０００２】
固相粒子に結合されるプローブＤＮＡと目的遺伝子のハイブリダイゼーションを利用して特定の遺伝子を分離検出する方法が以前から考案されてきた。多くの場合、目的遺伝子と相補的な配列を有するプローブＤＮＡを固相粒子表面に結合させ、目的遺伝子とハイブリダイゼーションを行って目的遺伝子を固相化し、分離、検出する。この方法においては、特異的な配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドの末端のみを効率的に固相粒子表面に固定する必要がある。このため、プローブとなるオリゴヌクレオチドの末端にビオチンを導入し、固相粒子表面にアビジンを共有結合で固相化させ、アビジンとビオチンとの反応を利用してプローブＤＮＡの固相化を図る方法が用いられてきた（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、この方法では、固相粒子表面に結合したプローブＤＮＡと目的遺伝子とを直接ハイブリダイズさせるため、固相粒子のサイズによって捕獲効率が異なるという欠点がある。特にサイズの大きい遺伝子の分離精製には、固相粒子のサイズおよび目的遺伝子の実効サイズに比べて、固相粒子表面に結合したプローブＤＮＡのサイズが無視できなくなるほど小さくなり、抽出効率の低下が免れない。
【０００３】
上述した、固相粒子表面に結合したプローブＤＮＡと目的遺伝子とを直接ハイブリダイズさせる方法の欠点を改良するため、ビオチン化したプローブＤＮＡと目的遺伝子とのハイブリダイゼーションをまず行ってハイブリッド体を作製し、次いでこのハイブリット体を、アビジンを固相化させた固相粒子に結合させ、抽出する方法が開示されている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、この方法も、プローブＤＮＡの固相化にアビジン・ビオチン反応を利用するので、ビオチン化したプローブＤＮＡおよび目的遺伝子のハイブリッド体のサイズが大きい場合、目的遺伝子の抽出効率が著しく低下する問題が依然解決されない。特に標的遺伝子が2本鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡの場合、抽出できないことがある。
【特許文献１】特開昭６０−９３３５５号公報
【非特許文献１】「バイオマグネティック・テクニクス・イン・モレキュラー・バイオロジー（Biomagnetic Techniques in Molecular Biology）」，ダイナル（Dynal）社，１９９５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述したアビジン・ビオチン反応を用いてプローブＤＭＡの固相化を行なう場合、ビオチン標識体のサイズ依存性を排除できない問題がある。また、蛋白質であるアビジンを固相化させた固相粒子の取り扱いも注意を要する。さらに、アビジン・ビオチンの反応条件とハイブリッド体の形成条件とが必ずしも一致しないときには抽出効率が低下したり、ハイブリッド体の崩壊等の問題が生じる場合がある。特に標的遺伝子が2本鎖ＤＮＡ、環状
ＤＮＡの場合、抽出できないことがある。加えて、アビジン蛋白質や、オリゴヌクレオチドのビオチン化がコスト高であることも問題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、プローブＤＮＡが表面に結合されたプローブＤＮＡ結合粒子と、一方に前記
プローブＤＮＡ結合粒子と相補的な配列を有し、もう一方に目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと、抽出すべき目的遺伝子とを含む試料を混合し、前記プローブＤＮＡと前記一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと前記目的遺伝子とをハイブリダイズさせること、を含む目的遺伝子の抽出方法を提供する。
【０００６】
また、本発明は、デオキシシトシン酸（ｄＣ）およびデオキシグアニン酸（ｄＧ）の少なくとも一方が５塩基以上連続した配列を含む５〜８０塩基の配列からなる１本鎖オリゴヌクレオチドが表面に結合され、かつ粒子径が０．１〜１５μｍであるプローブＤＮＡ結合粒子を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明は、遺伝子配列の特異性から目的遺伝子を抽出する方法、および前記方法に用いられるプローブＤＮＡ固定粒子である。本発明においては、目的遺伝子はその由来、形状、サイズ、配列等の制限を受けることなく、迅速、正確、かつ効率良く分離精製が可能である。本発明は特に目的遺伝子が２本鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡの場合にその効果が顕著である。
【０００９】
固相粒子表面に固相化されるプローブＤＮＡと一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドとの結合を強固にするために、本発明に使用する固相化プローブＤＮＡ結合粒子は、少なくともデオキシシトシン酸（ｄＣ）およびデオキシグアニン酸（ｄＧ）の少なくとも一方が５塩基以上連続する配列を含む５〜８０塩基配列を含む１本鎖オリゴヌクレオチドが表面に結合されていることが好ましい。ここで、１本鎖オリゴヌクレオチドは、ｄＣおよびｄＧの少なくとも一方が１０塩基以上連続する配列を含むことがより好ましい。ｄＣおよびｄＧの少なくとも一方が連続する配列が５個未満になると、プローブＤＮＡと一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドとの間に強固な結合が形成されにくいので、好ましくない。また、プローブＤＮＡの全塩基配列が５〜８０塩基からなることが好ましく、１０〜５０塩基であることがより好ましい。プローブＤＮＡの全塩基配列が８０塩基を超えると、プローブＤＮＡの合成効率が低くなり、機能する部分の比率が低くなるので好ましくない。
【００１０】
本発明において、目的遺伝子を効率よく分離するために、共有結合によって固相粒子に結合されたプローブＤＮＡと一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドとの間に２本鎖が形成されるときの融点（Ｔｍ１）と、一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと目的遺伝子との間に２本鎖が形成されるときの融点（Ｔｍ２）の間に、Ｔｍ１≧Ｔｍ２の関係が成立することが好ましい。Ｔｍ１がＴｍ２より低くなると、目的遺伝子と一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド条件の制限があり、目的遺伝子を認識度の低い条件にせざるをえないこともある。この場合、目的遺伝子以外の配列を拾ってしまうおそれがあるので、好ましくない。
【００１１】
具体的には、本発明において固相化されるプローブＤＮＡの塩基配列は、例えばｄＣまたはｄＧが連続５以上、好ましくは１０個続く配列が挙げられる。これらの塩基配列の末端部を特異的に粒子表面に固定するために、固定すべき末端に必要な官能基を修飾してもよい。また、固定化反応の種類にもよるが、必要に応じて塩基中の官能基活性をブロックしてもよい。
【００１２】
本発明のプローブＤＮＡ結合粒子に用いられるプローブＤＮＡは、通常のＤＮＡ合成機で調製することができる。必要に応じて固定すべき末端に共有結合用官能基を導入することができる。例えば、固相粒子表面にカルボキシル基が導入されている場合、プローブＤ
ＮＡの末端にアミノ基を導入すればよい。逆の場合もありうる。また、必要に応じてＳＨ基等を導入してもよい。
【００１３】
本発明のプローブＤＮＡ結合粒子は、１本鎖オリゴヌクレオチドが固相粒子に共有結合されて得られ、かつ粒子径が０．１〜１５μｍであることが好ましく、０．５〜１０μｍであるのがより好ましい。粒子径が０．１μｍ未満になると、固液分離に時間がかかるので、好ましくない。一方、粒子径が１５μmを超えると、一定の固相粒子量を使用したと
きの固相粒子の表面積が少なくなり、同じプローブ量を導入するためにプローブの密度を上げる必要があり、結果的には高密度プローブに由来する立体障害を引き起こす恐れがあるので好ましくない。これにより、粒子のブラウン運動が小さくなり、かつ粒子自重による自然沈降が速くなるので好ましくない。
【００１４】
本発明において使用する固相粒子は、表面の少なくとも一部が合成高分子で被覆されることが好ましい。これは、特にプローブＤＮＡの化学結合に選択性を増やすために必要であるとともに、目的遺伝子以外のＤＮＡ非特異吸着を防ぐに好適である。プローブＤＮＡの固定反応の種類に応じて、固相粒子表面に必要な官能基を重合する際、あるいは後修飾で導入することができる。さらに、必要に応じて固相粒子の内部に少なくとも磁気応答性磁性体、蛍光体、染料、顔料等を１種類以上含芯させてもよい。磁性体を導入すれば、磁気分離が可能であり、作業工程を自動機に代替させることができ、特に大量な作業に好適である。また、蛍光体を固相粒子内に導入できれば、固相粒子自体が標識体となるので、検出するに好適である。また、固相粒子を着色すれば、プローブＤＮＡの種類によって、固相粒子の色分けができる。
【００１５】
本発明の固相粒子（免疫凝集反応用粒子）を構成する有機高分子粒子は、芳香族ビニル化合物、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステルよりなる群から選ばれる一種のモノマーの重合体であり、必要に応じてα，β−不飽和カルボン酸モノマーを共重合することにより、有機高分子粒子の表面にカルボン酸基を導入することができる。
【００１６】
本発明に使用する一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドの塩基配列サイズは特に限定されるものではないが、通常１０〜５００塩基であることが好ましい。１０塩基未満になるとハイブリッド体が形成されにくいので、好ましくない。また、５００塩基を超えると、一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチド本来の機能を満たすためには必要以上に長くなる結果、ハイブリッド反応において立体障害を引き起こす恐れがあるので、好ましくない。この塩基配列は化学合成で調製してもよいが、人工的に酵素反応を利用して調製してもよい。または、天然核酸の少なくとも一部を利用して、人工修飾を加えたものでもよい。なお、相補的な塩基配列を、一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチド内部に形成することを可能な限り避けることは、高効率での抽出を行なうのに有効であることは自明である。
【００１７】
本発明に使用する一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドは、固相粒子に結合されるプローブと相補的な配列を一方に有し、目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列をもう一方に有する。これらの相補的な配列は必ずしも末端に位置する必要はないが、ハイブリッド体形成時の立体障害を最小限にするために、末端近傍に配置されることが好ましい。また、それぞれのハイブリダイゼーション用塩基配列の長さは、プローブＤＮＡの塩基配列、および目的遺伝子の標的部位によって自ずと決定される。具体的には、固相プローブＤＮＡの５’末端側にｄＧが連続して５以上配列する部分を含有する場合、一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドの３’末端側にｄＣが連続して５以上配列することは明らかである。本発明の一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドは通常の化学合成で調製することができる。ハイブリダイズ対象核酸配列の相補鎖を適切な位置に導入することができる。
【００１８】
本発明において、抽出すべき目的遺伝子がその形状、サイズ、存在状況等に関して特に
制限されるものではない。抽出すべき目的遺伝子が１本鎖ＤＮＡであってもよいし、プラスミドのような２本鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、またはスーパーコイル状ＤＮＡであってもよい。
【００１９】
１本鎖ＤＮＡの具体例としては、動物細胞、またはその培養細胞から得られるゲノムＤＮＡ、またはその断片等について１本化処理を施したもの、ｃＤＮＡ，ｃＤＮＡライブラリーを含む試料、ｍＲＮＡ等が挙げられる。また、２本鎖ＤＮＡの具体例としては、プラスミド、環状ＤＮＡ、スーパーコイル状ＤＮＡ、特にｃＤＮＡライブラリーが組み込まれたプラスミドＤＮＡが挙げられる。
【００２０】
これらの標的ＤＮＡを含む試料は、通常の核酸抽出方法、例えばフェノールクロロホルム抽出方法より調整することができる。通常、抽出すべき目的遺伝子が２本鎖ＤＮＡである場合は、１本鎖ＤＮＡより高い温度にて一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることが必要である。例えば、抽出すべき目的遺伝子が２本鎖プラスミドである場合、本発明の抽出方法によれば、２本鎖プラスミドの形で抽出することができる。したがって、本発明の抽出方法で回収したＤＮＡがそのまま使用酵素反応、大腸菌等へのインフェクション等の用途に利用できる。
【００２１】
本発明において、プローブＤＮＡ、一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチド、および抽出すべき目的遺伝子のハイブリッド反応の順序は特に制限されるものではなく、目的遺伝子に応じて調整すればよい。つまり、一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと目的遺伝子とのハイブリッド体をまず形成してから、固相プローブＤＮＡとこのハイブリッド体とのハイブリッド複合体を形成させてもよいし、固相プローブＤＮＡと一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドとのハイブリッド体をまず形成させてから、目的遺伝子とこのハイブリッド体とのハイブリッド複合体を形成させてもよい。または、三者を同時に混合して、ハイブリッド複合体を形成させてもよい。これらの具体的な作業順番は、選択された一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドおよび抽出すべき目的遺伝子に応じて選択すればよい。
【００２２】
本発明において、ハイブリッド複合体（複合ハイブリッド）を形成することにより、目的遺伝子が固相粒子（プローブＤＮＡ結合）に固相化され、液体試料から固液分離され、抽出される。簡単な加熱急冷処理により、抽出された目的遺伝子を液相に無傷で再度遊離させることができる。
【００２３】
抽出された目的遺伝子の確認方法が複数あるが、例えば、目的遺伝子が一本鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる以外の位置と相補させ、かつ、蛍光等で標識される検出用プローブとハイブリダイズさせ、固相液相分離による洗浄を行ってから、蛍光強度を測定する方法がある。より高感度、確実な方法として、例えば、抽出した目的遺伝子を含むプラスミドを再び大腸菌内に感染させ、大腸菌を培養してから、コロニーＰＣＲによって目的遺伝子の種類、サイズ等を検証することができる。本発明の抽出方法を用いることにより、従来数日から数週間かかるこのような一連操作を、わずか約２４時間で完了できる。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明の具体的な実施例について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
１．実施例１
１．１．固相粒子
本発明に使用する固相粒子はすべてＪＳＲ社の製品を用いた。粒子径は光動的散乱装置PhotalLPA3100（大塚電子社）、または光回折装置ＳＯＬＤ２０００（島津製作所）を用
いて測定した。また、表面に導入されたカルボキシル基（官能基）の量は、酸アルカリ滴定による伝導度測定（Potentiograph E536 Metrohm, Herisan社）を使用した。表１に、
使用した固相粒子（粒子1〜４）の物性を示す。
【００２６】
【表１】
2004357701.tif 000002
【００２７】
１．２．プローブＤＮＡの調製
次いで、ｄＣが３０個続く配列を通常のアミタイド合成法より調整した。３’末端側にアミノ基を導入できるようにｃ７カラムを使用した。合成方法はメーカーマニュアル（パーキンエルマー（PERKIN  ElUMER）社）に従って実施した。合成したオリゴヌクレオチドをＯＰＣカラムで精製した。このように合成したオリゴヌクレオチドをdC30-Nとした。
【００２８】
（dC30-N）
5'-ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ-ＮＨ２-3'
同様な方法で３’末端にアミノ基を導入しないｄG３０の塩基配列、および５’末端に
蛍光色素ＦＡＭを導入したｄＧ３０の塩基配列を合成した。それぞれdG30、dG30-Fとした。
【００２９】
続いてdC30-N,dG30をそれぞれ10nmol/100μｌとなるように濃度を調製し、それぞれ１
００μｌを取り、0.8ｍｌTE/1.5MNaCl溶液の入ったチューブに入れ、100℃に加熱してか
ら、室温までゆっくり冷やして、ｄＧの３’末端にアミノ基が導入されたｄＧ，ｄＣ２本鎖ＤＮＡ10nmol/mlを調製した。これをdC30-Pとした。260nm吸光度測定から、２本鎖形成されることを確認した。
【００３０】
１．３．プローブＤＮＡの固相化
実施例１で調製した、カルボキシル基が導入された各粒子の１重量％分散液１ｍｌをそれぞれ遠心分離処理し、固形物に5mMMES緩衝溶液（ｐＨ＝５．５）を添加して遠心分離処理する操作を３回繰り返すことにより、粒子の洗浄処理を行った。その後、粒子分散液に１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（同仁化学社製）５ｍｇを溶解した５mMMES溶液0.1ｍｌを添加し、40℃で２時間回転攪拌し、さらに前記調製したdC30−P溶液10nmol/mlを100μｌ添加し、室温で１0時間回転攪拌した。続いて、蒸留水で粒子分散液を３回洗浄してから、粒子分散液１ｍｌを100℃に加熱し、次いで0℃氷水で冷やして、直ちに遠心、固液分離を行なうことにより、熱変性で遊離されたｄＧ配列を除去した。この操作を３回繰り返し、遠心分離上澄の吸光度測定から、ｄＧが除去されたことを確認し、ｄＣが３０塩基固定されたプローブＤＮＡ固定粒子の1重量％分散液を得た。
【００３１】
上記プローブＤＮＡ固定粒子の１重量％分散液100μｌと200pmolｄG30-F  溶液100μｌを混合させ、それに2MNaCl溶液200μlを加え、５０℃で１５分インキュベートしてから、遠心で上澄を回収した。上澄の蛍光強度を測定し、粒子分散液に加える前の２００pmolｄG30-F  溶液の蛍光強度との比率から、プローブ粒子にハイブリダイズされたｄＧ成分、
つまり有効に固定化されたdＣ成分を求めた。
【００３２】
また、同様な方法でｄG30を固相した粒子を調製した。各プローブ固相粒子のプローブ
結合量（ｐｍｏｌ／ｍｇ）を表２に示す。
【００３３】
【表２】
2004357701.tif 000003
【００３４】
２．実施例２  アクチン遺伝子の抽出
２．１．一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドの調整
プローブＤＮＡと同様な方法で、下記の一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチド用配列（アクチン−ポリＣ（Actin-polyC））を調製した。
【００３５】
（アクチン−ポリＣ（Actin-polyC）：配列表の配列番号１に相当）
5'-ＧＧＧＣＣＡＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ-3'
【００３６】
２．２．アクチン遺伝子の抽出
上記実施例２で調製した一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチド溶液１０pmol/10ulと、実
施例１で調製したプローブＤＮＡ結合粒子１、２0μlとを70℃で加熱してから、氷冷し、5MnaClを１０μl加え、45℃で１時間インキュベートした。12000rpmで３分遠心し、0.1MNaClで２回洗浄した。続いて、予め95℃で１０分加熱し氷冷したｃＤＮＡライブラリーを
組み込んだプラスミッド（タカラバイオ）１５μg/20μlを全量加えた。55℃で１時間イ
ンキュベートし、0.1mNaClで３回洗浄した。ペレットに25μｌ蒸留水を加え、７０℃で１０分間加熱し、氷冷した。遠心して上澄を回収した。
【００３７】
プローブＤＮＡ結合粒子１〜４、それぞれdG30およびdC30を固定した粒子を用いて同様な実験を行った。
【００３８】
２．３．抽出されたアクチン遺伝子の検証
上記分離精製されたアクチン遺伝子１０μｌを、600nmで吸光度が0.05の大腸菌溶液100μｌに加え、２０分氷冷した後、４２℃で５０秒加熱し、さらに２分氷冷した。上記大腸菌をＳＯＣ培地で37℃で２時間培養し、Ａｒｐ(+)寒天培地で１６時間培養した。続いて
コロニーＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、94℃,で3分、94℃で30秒、56℃で30秒、72℃で30秒で30周期行なった。また、アクチン遺伝子の抽出成績を表３に示す。所要時間は２４時間であった。
【００３９】
（アクチンプライマー１（Actin primer 1）：配列表の配列番号２に相当）
5'-ＴＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＴＡＡＴＣ-3'
（アクチンプライマー２（Actin primer 2）：配列表の配列番号３に相当）
5'-ＧＣＴＧＴＧＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＴＡＧ-3'
【００４０】
【表３】
2004357701.tif 000004
【００４１】
また、ｃＤＮＡプラスミドライブラリーから、アクチン−ポリＣ（Actin-PolyC）ブリ
ッジオリゴヌクレオチドを加えた系（Ａ）、または加えなかった系（Ｂ）において、粒子１（ｄＧ30固定）を用いて、アクチンｃＤＮＡプラスミドを抽出した。抽出したＤＮＡを大腸菌に導入せず、直接上記同様なアクチンプライマーを用い、同様にＰＣＲした結果を図１に示す。他の粒子２〜４からも同様な結果を得た。
【００４２】
図１において、サンプルＡ（図１の左側のバンド）は、アクチン−ポリＣ（Actin-polyC）ブリッジオリゴヌクレオチド存在下で抽出したもの、サンプルBは、アクチン−ポリＣ（Actin-polyC）ブリッジオリゴヌクレオチド非存在下で抽出した結果である。
【００４３】
３．実施例３  ＨＰＲＴ遺伝子の抽出
上記アクチン遺伝子抽出と同様な方法で、ブリッジオリゴヌクレオチドとして、アクチン−ポリＣの代わりにＨＰＲＴ−ポリＣ（HPRT-polyC）を使用した。プローブ粒子１、ｄＧ30固定、ブリッジオリゴヌクレオチドの使用量、使用方法は、アクチン遺伝子抽出時と同様にした。また、ＰＣＲ検出時のプライマーは、下記のものを使用した以外、実施例２と同様な方法を用いた。ＨＰＲＴ遺伝子の抽出成績結果を表４に示す。所要時間は２４時間であった。
一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチド：
（ＨＰＲＴ−ポリＣ（HPRT-polyC）：配列表の配列番号４に相当）
5'-ＧＧＧＴＡＧＧＣＴＧＧＣＣＴＡＴＡＧＧＣＴＣＡＴＡＧＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ-3'
（ＨＰＲＴプライマー１（HPRT primer 1）：配列表の配列番号５に相当）
5'-ＧＡＧＡＧＣＴＴＣＡＧＡＣＴＣＧＴＣＴＡ-3'
【００４４】
【表４】
2004357701.tif 000005
【００４５】
４．比較例１
本試験法の代わりに以下の方法で、コロニーハイブリダイゼーション法を用いてそれぞれアクチン、ＨＰＲＴ遺伝子の抽出を行った。
１）ＣＤＮＡライブラリプラスミド（library plasimid）を、相補（competent）E.Coli 
cells(大腸菌)にトランスフェクション（transfection)した。
２）このトランスフェクトさせたE.Coli cells（大腸菌）を、アンピシリンを含む寒天培地プレートに、１枚当り２０００から５００００個なるように撒いた。同じようにして約１０〜２０枚のプレートを準備した。
３）これらプレートについて、１６〜２４時間後に菌が十分増殖していることを確認した後、ハイブリダイゼーション（hybridization）に使用した。
４）ハイブリダイゼーションでは、まずプレートの形に合わせて切ったニトロセルロースからなるフィルタ膜を、１プレート当り２〜３枚分作製した。したがって、全部で２０〜６０枚のフィルタ膜を作製した。
５）ニトロセルロースからなるフィルタ膜をプレートの菌面に合わせ、ニトロセルロースからなるフィルタ膜に菌を移動（transfer）させることで、レプリカを各プレートに付き２〜３枚作成した。
６）その後、レプリカ膜上の菌を溶解させ、ＤＮＡの変性処理等を行って、コロニーハイブリダイゼーション（Colony hybridization）に用いた。
７）次いで、ラジオアイソトープでラベルした目的遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとして、全部のプレートについて、ハイブリダイゼーションを１昼夜行った。
８）その後、非特異的結合（non-specific binding）を除くためよく洗浄し、乾燥させてから、Ｘ線フィルムに２〜５日ほど感光させた。
９）感光シグナルの部分に相当するレプリカプレート上の菌を採り、１）から８）までの手順で再度ハイブリダイゼーションを繰り返し、シングルポジティブコロニー（single positive colony）を得た。その結果を表５に示す。所要時間は１４日であった。
【００４６】
【表５】
2004357701.tif 000006
【００４７】
５．効果
プローブＤＮＡ固定粒子および一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドを用いた本発明の目的遺伝子の抽出方法によれば、プローブＤＮＡが表面に結合されたプローブＤＮＡ結合粒子と、一方に前記プローブＤＮＡと相補的な配列を有し、もう一方に目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと、抽出すべき目的遺伝子とを含む試料を混合し、
前記プローブＤＮＡと前記一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと前記目的遺伝子とをハイブリダイズさせること、を含むことにより、目的遺伝子の形状、サイズに影響されることなく、迅速、正確、かつ効率良く目的遺伝子を抽出分離することができる。具体的には、従来の２週間程度のスクリニングを約２４時間で完了することができるため、極めて簡便な方法として実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】アクチン遺伝子のＰＣＲ増幅反応結果を示すバンドの写真であり、左側のバンドおよび右側のバンドはそれぞれ、アクチン−ポリＣ（Actin-PolyC）一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドを添加した系および添加しない系での結果を示している。
【図１】
2004357701.tif 000007
【配列表】
2004357701000001.app