(57)【要約】【課題】本発明は、自律的に稼働することができる核酸分子を使用した情報処理方法および該方法によって演算を行うための分子コンピュータを提供することを目的とする。【解決手段】上記の課題は、以下の方法により実現される。すなわち、本発明は、分子の化学反応により、引数を受け取り戻り値を返す関数による演算を行う情報処理方法であって、（ａ）分解可能な第１の一本鎖核酸に対応付けて定義された第１の符号化核酸を引数として入力し、（ｂ）前記引数に基づき、演算用核酸の化学反応に対応付けて定義された関数による演算を行い、（ｃ）第２の一本鎖核酸に対応付けて定義された第２の符号化核酸を戻り値として得ることを特徴とする情報処理方法を提供する。また、該方法に基づいて設計された分子コンピュータを提供する。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子の化学反応により、引数を受け取り戻り値を返す関数による演算を行う情報処理方法であって、
（ａ）分解可能な第１の一本鎖核酸に対応付けて定義された第１の符号化核酸を引数として入力し、
（ｂ）前記引数に基づき、演算用核酸の化学反応に対応付けて定義された関数による演算を行い、
（ｃ）第２の一本鎖核酸に対応付けて定義された第２の符号化核酸を戻り値として得ること、
を特徴とする情報処理方法。
【請求項２】
請求項１に記載の情報処理方法であって、前記第２の一本鎖核酸は、分解可能な核酸である方法。
【請求項３】
請求項２に記載の情報処理方法であって、前記（ｃ）で得られた第２の符号化核酸を、さらなる関数における第１の符号化核酸として使用して演算を行い、さらなる第２の符号化核酸を戻り値として得ることを含む情報処理方法。
【請求項４】
請求項２または３に記載の情報処理方法であって、前記関数による演算を複数機能させることにより、戻り値としての第２の符号化核酸を得ることを含む情報処理方法。
【請求項５】
請求項４に記載の情報処理方法を使用して、前記関数、引数および戻り値の組合せにより記述されたプログラムに従って、複数の関数による演算を行うことにより前記プログラムの計算結果を導出する情報処理方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の情報処理方法であって、
前記（ａ）の入力は、前記第１の一本鎖核酸を、前記演算用核酸と適切な酵素を含む反応液中に添加することであり、
前記（ｂ）の演算は、前記演算用核酸と前記適切な酵素と前記第１の一本鎖核酸を化学反応させることであり、
前記（ｃ）の戻り値は、前記化学反応の反応産物として得られること、
を特徴とする情報処理方法。
【請求項７】
請求項６に記載の情報処理方法であって、
前記第１の一本鎖核酸および第２の一本鎖核酸はＲＮＡであり、
前記化学反応は、合成反応、増幅反応、逆転写反応、転写反応、分解反応であり、それぞれＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による合成反応または増幅反応、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による逆転写反応、およびＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による転写反応、およびＲＮａｓｅＨによる分解反応である情報処理方法。
【請求項８】
請求項７に記載の情報処理方法であって、前記演算用核酸は、前記第１の一本鎖核酸に対してプライマーとして作用する配列、プロモータ配列および任意の核酸のプライマーとして作用する配列から選択される一以上の配列を有することを特徴とする情報処理方法。
【請求項９】
請求項８に記載の情報処理方法であって、
前記関数は、配列ａより始まり配列ｂを通過する経路を有するＲＮＡを引数として入力したときに、指定した配列ｘのＲＮＡを戻り値として返す関数であり、
前記演算用核酸は、５’末端方向のプロモータ配列と、その下流にｘの逆相補配列と、その３’末端側にａの相補配列とを有する第１の演算用核酸、並びに配列ｂを有する第２の演算用核酸の２つであり、
前記化学反応は、前記第１の演算用核酸のａの相補配列から前記ＲＮＡの逆転写反応が起こり、次いで、逆転写された一本鎖ＤＮＡに前記第２の演算用核酸の配列ｂが結合して該第２の演算用核酸の３’末端から第２鎖ＤＮＡの合成反応が起こり、次いで、該第２鎖ＤＮＡと前記第１の演算用核酸のプロモータ配列が二本鎖化されることにより、該プロモータ配列の下流に配置された配列ｘの転写反応が起こり、反応産物として配列ｘのＲＮＡ分子が合成される反応である情報処理方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の情報処理方法であって、
前記関数は、配列ａより始まり配列ｂで終結する経路を有するＲＮＡを引数として入力したときに、指定した配列ｘのＲＮＡを戻り値として返す関数であり、
前記演算用核酸は、配列ａを有する第１の演算用核酸、並びに５’末端方向のプロモータ配列と、その下流に配列ｘと、その３’末端側に配列ｂとを有する第２の演算用核酸の２つであり、
前記化学反応は、前記第１の演算用核酸の配列ａから前記ＲＮＡの逆転写反応が起こり、次いで、逆転写された一本鎖ＤＮＡに前記第２の演算用核酸の配列ｂが結合して該一本鎖ＤＮＡの３’末端からさらなる合成反応が起こり、次いで、前記第２の演算用核酸のプロモータ配列が二本鎖化されることにより、該プロモータ配列の下流に配置された配列ｘの転写反応が起こり、反応産物として配列ｘのＲＮＡ分子が合成される反応である情報処理方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の情報処理方法であって、
前記関数は、配列ａより始まり配列ｂを通過するＲＮＡを引数として入力したときに、該ＲＮＡまたは該ＲＮＡに任意の配列が付加されたＲＮＡを戻り値として返す関数であり、
前記演算用核酸は、ａの相補配列と、任意に配列ｑの相補配列とを有する第１の演算用核酸、並びに３’末端方向のプロモータ配列と、任意にその３’末端側に配列ｐと、その３’末端に配列ｂとを有する第２の演算用核酸の２つであり、
前記化学反応は、前記第１の演算用核酸のａの相補配列から前記ＲＮＡの逆転写反応が起こり、次いで、逆転写された一本鎖ＤＮＡに前記第２の演算用核酸の配列ｂが結合して該一本鎖ＤＮＡの３’末端からさらなる合成反応が起こり、次いで、前記第２の演算用核酸のプロモータ配列が二本鎖化されることにより、該プロモータ配列の下流に配置された配列の転写反応が起こり、反応産物として前記ＲＮＡ分子または任意に配列ｐもしくは配列ｑが付加された前記ＲＮＡ分子が合成される反応である情報処理方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の情報処理方法であって、
前記関数は、配列ａより始まり配列ｂを通過する経路を有するＲＮＡを引数として入力したときに、該ＲＮＡの逆相補配列を有するＲＮＡまたは該ＲＮＡの逆相補配列に任意の配列が付加されたＲＮＡを戻り値として返す関数であり、
前記演算用核酸は、３’末端方向のプロモータ配列と、任意にその３’末端側に配列ｐと、その３’末端にａの相補配列とを有する第１の演算用核酸、並びに配列ｂと、任意にその３’末端に配列ｑとを有する第２の演算用核酸の２つであり、
前記化学反応は、前記第１の演算用核酸のａの相補配列から前記ＲＮＡの逆転写反応が起こり、次いで、逆転写された一本鎖ＤＮＡに前記第２の演算用核酸の配列ｂが結合して該第２の演算用核酸の３’末端から合成反応が起こり、次いで、該ＤＮＡと前記第１の演算用核酸のプロモータ配列が二本鎖化されることにより、該プロモータ配列の下流に配置された配列ｘの転写反応が起こり、反応産物として前記ＲＮＡの逆相補配列を有するＲＮＡ分子または任意に配列ｐもしくは配列ｑが付加された前記ＲＮＡの逆相補配列を有するＲＮＡ分子が合成される反応である情報処理方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の情報処理方法であって、
前記関数は、引数としてのＲＮＡを必要とせず、常に配列ｘのＲＮＡを戻り値として返す関数であり、
前記演算用核酸は、３’末端方向のプロモータ配列と、その下流に配列ｘとを有する第１の演算用核酸、および５’末端方向のプロモータ配列と、その下流にｘの相補配列とを有する第２の演算用核酸であり、
前記化学反応は、前記第１の演算用核酸と前記第２の演算用核酸が結合することにより、該プロモータ配列の下流に配置された配列ｘの転写反応が起こり、反応産物として配列ｘのＲＮＡ分子が合成される反応である情報処理方法。
【請求項１４】
前記請求項９〜１３に記載の関数、引数および戻り値の組合せによって記載されたプログラムに従って複数の関数による演算を行うことにより前記プログラムの計算結果を導出する情報処理方法。
【請求項１５】
核酸分子を使用して情報処理を行うためのキットであって、所望の関数による演算を行うための演算用核酸を含むことを特徴とするキット。
【請求項１６】
請求項１５に記載のキットであって、前記演算用核酸は、前記第１の一本鎖核酸に対してプライマーとして作用する配列、プロモータ配列および任意の核酸のプライマーとして作用する配列から選択される一以上の配列を有する核酸であるキット。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のキットであって、さらに適切な反応液と、適切な酵素とを含むことを特徴とするキット。
【請求項１８】
請求項１７に記載のキットであって、前記適切な反応液は、合成反応、増幅反応、逆転写反応、転写反応および分解反応に適したバッファーであり、前記適切な酵素は、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮａｓｅＨであるキット。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の情報処理方法によって演算を行うための分子コンピュータであって、所望の関数による演算を行うための演算用核酸と、適切な反応液と、適切な酵素とを含む容器からなることを特徴とする分子コンピュータ。
【請求項２０】
請求項１９に記載の分子コンピュータであって、前記演算用核酸は、前記第１の一本鎖核酸に対してプライマーとして作用する配列、プロモータ配列および任意の核酸のプライマーとして作用する配列から選択される一以上の配列を有する核酸であり、前記適切な反応液は、合成反応、増幅反応、逆転写反応、転写反応および分解反応に適したバッファーであり、前記適切な酵素は、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮａｓｅＨである分子コンピュータ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
生体分子が持つ性質を利用する非常にユニークな試みとして、ＤＮＡコンピュータが知られている。ＤＮＡコンピュータとは、ＤＮＡの配列上に入力値や計算プログラムなどを人為的に組み込んでやり、そのＤＮＡ分子に対して様々な反応、たとえばＤＮＡ修飾酵素や制限酵素などの酵素反応や核酸同士のハイブリッド形成反応などをうまく組み合わせることによって計算を実行するものである。
【０００２】
ＤＮＡコンピュータの歴史は、１９９４年にＡｄｌｅｍａｎがＤＮＡを使用した実験系で数学的な問題を解くことが可能であると実証したことにより始まった（非特許文献１）。この研究でＡｄｌｅｍａｎは、有向ハミルトン経路問題という数学的な問題を、ＤＮＡ分子などを使用した実験系で解いたのである。またその翌年には、ＬｉｐｔｏｎがＤＮＡコンピュータを使用した充足可能性問題の解法を報告した（非特許文献２）。ＤＮＡコンピュータの計算アルゴリズムはその後にも多くの種類のものが考案され、単一ＤＮＡ分子上での伸長反応を利用した技術（非特許文献３、非特許文献４）や一本鎖ＤＮＡ分子上のヘアピン構造を利用したもの（非特許文献４）、ＤＮＡをメモリーとして利用し固相上で適切な解を探し出す技術や（非特許文献５、非特許文献６）プラスミドへの２本鎖ＤＮＡの挿入・切出しを利用する方法など多様な方法が考えられている。また、その他でもＤＮＡではなくＲＮＡを使用した分子コンピュータや（非特許文献７）、ＤＮＡの自己組織化によるナノ構造を利用した技術（非特許文献８）なども報告されており、ＤＮＡコンピュータが包括する範囲は広がりつつあるといえる。
【０００３】
Ａｄｌｅｍａｎの研究を始めとする従来の多くのＤＮＡコンピュータ技術は、特定配列のＤＮＡ分子などを入力データとして扱い、その後の生物化学的な操作ステップのプロトコルでプログラムを規定している。最近ではロボットを使用した各種反応の自動化技術による大規模計算実現の研究も行なわれている（特許文献１、非特許文献９、非特許文献１０）。これとは異なる方向性として、自律的に動作する分子コンピュータも研究されている。これはプログラムを進める上で反応液に対して外から操作を加える必要がなく、入力データおよび計算プログラムをＤＮＡ分子として反応液中に与えると、一定条件下で自律的に動作して計算結果を出力するものであり、チューリングマシンをモデルに開発された分子コンピュータ技術が発表された（非特許文献１１）。自律的に稼動する分子コンピュータは、生体細胞内など従来のコンピュータでは不可能であった環境で計算を実行するポテンシャルを有することから注目を集めている。
【０００４】
これらＤＮＡコンピュータ研究の目的は、主に大規模な並列計算を実現するということにある。すなわち、試験管の中には非常に多数のＤＮＡ分子が存在可能であり、そのＤＮＡ分子一つ一つに計算の初期値や計算プログラム自身等をあらかじめ組み込んでおき、それらＤＮＡ分子の集合体に対して一斉に計算のプロセスとなる化学反応を行なうことによって、非常に多岐にわたる初期値ないし計算プログラムによる計算を一度に並列して行なうことができるというアイデアである。このように、ＤＮＡコンピュータの系が持つ特長である並列性を利用して並列計算などの数学的計算を効率的に行なう系を開発する目的で研究が行なわれてきた。
【０００５】
生体反応を数学的目的で応用する研究は、そのユニークな発想とポテンシャルから広く関心を集めるものの、具体的な応用技術となると研究は未発達であり、その将来性は未知数であるというのが現状である。特に電気信号による従来型のコンピュータの処理能力は年々拡大しており、これと比べて分子コンピュータが処理能力や正確性などの面で上回ることは非常に困難であると考えられる。従来型のコンピュータとは異なる、分子コンピュータの有用性を発揮できる適応分野が開拓されることが望まれる。そのような中で、最近ではＤＮＡコンピュータを遺伝子の発現解析やＳＮＰｓ解析に役立てようとする研究の動きが出ている（非特許文献１２、非特許文献１３）。これは生体分子を直接入力データとして扱える分子コンピュータ特有の性質を生かした応用分野として有望である。しかしながら生体の解析に応用可能な分子コンピュータとして従来提案されてきたものは自律的に稼動するものではなく、その応用範囲も限られていた。
【０００６】
核酸分子が含有する情報にアクセスする手段として核酸同士のハイブリダイゼーション反応が利用されるが、一度情報にアクセスするとその部位に核酸同士の安定なハイブリッドが形成されることからそのままでは再びアクセスできなくなる。しかしながら、核酸が含有する情報を利用した分子コンピュータを構成する際には繰り返し連鎖的に情報にアクセスできることが望ましい。そのためには、ひとたび二本鎖となってアクセス不能となった核酸分子上の情報を、再びアクセス可能にするプロセスが必要となる。従来の多くのＤＮＡコンピュータは、熱を加えて核酸を変性させることによりこのプロセスを実現している。しかしこの方法では外部からの温度コントロールが必須となり、自律型分子コンピュータは実現しない。自律型分子コンピュータを実現するためには、二本鎖の核酸に閉じ込められた情報を、酵素などの分子反応などを活用することで再びアクセス可能とすることが鍵となる。Ｓｈａｐｉｒｏらの分子コンピュータ  （非特許文献１４）は、制限酵素の切断で二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡの切断面を露出させることにより、自律型分子コンピュータの実現を成功させた例がある。
【０００７】
【従来の技術】
【０００８】
【特許文献１】
特開特開２００２−３１８９９２号公報
【０００９】
【特許文献２】
特開特開２００２−１８１８１３号公報
【００１０】
【非特許文献１】
Ａｄｌｅｍａｎ  ＬＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ．、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、（ＵＳＡ）、１９９４年、２６６（５１８７）巻、ｐ．１０２１−４
【００１１】
【非特許文献２】
Ｌｉｐｔｏｎ  ＲＪ、ＤＮＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｒｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ．、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、（ＵＳＡ）、１９９５年、２６８（５２１０）巻、ｐ．５４２−５
【００１２】
【非特許文献３】
Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｋ，  Ｇｏｕｚｕ  Ｈ，  Ｋｏｍｉｙａ  Ｋ，  Ｋｉｇａ  Ｄ，  Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｓ，  Ｙｏｋｏｍｏｒｉ  Ｔ，  Ｈａｇｉｙａ  Ｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、（ＵＳＡ）、２０００年、２８８（５４６９）巻、ｐ．１２２３−６
【００１３】
【非特許文献４】
ａｋａｍｏｔｏ  Ｋ，  Ｋｉｇａ  Ｄ，  Ｋｏｍｉｙａ  Ｋ，  Ｇｏｕｚｕ  Ｈ，  Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｓ，  Ｉｋｅｄａ  Ｓ，  Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｈ，  Ｈａｇｉｙａ  Ｍ、Ｓｔａｔｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．、“Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ”、１９９９年、５２（１−３）巻、ｐ．８１−９１
【００１４】
【非特許文献５】
Ｌｉｕ  Ｑ，  Ｗａｎｇ  Ｌ，  Ｆｒｕｔｏｓ  ＡＧ，  Ｃｏｎｄｏｎ  ＡＥ，  Ｃｏｒｎ  ＲＭ，  Ｓｍｉｔｈ  ＬＭ
ＤＮＡ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅｓ．、“Ｎａｔｕｒｅ”、（英）、２０００年、４０３（６７６６）巻、ｐ．１７５−９
【００１５】
【非特許文献６】
Ｗａｎｇ  Ｌ，  Ｈａｌｌ  ＪＧ，  Ｌｕ  Ｍ，  Ｌｉｕ  Ｑ，  Ｓｍｉｔｈ  ＬＭ
Ａ  ＤＮＡ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｒｅａｄｏｕｔ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ．、“Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ”、（英）、２００１年、１９（１１）巻、ｐ．１０５３−９
【００１６】
【非特許文献７】
Ｆａｕｌｈａｍｍｅｒ  Ｄ，  Ｃｕｋｒａｓ  ＡＲ，  Ｌｉｐｔｏｎ  ＲＪ，  Ｌａｎｄｗｅｂｅｒ  ＬＦ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ：  ＲＮＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃｈｅｓｓ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ．、“Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ”、（ＵＳＡ）、２０００年、９７（４）巻、ｐ．１３８５−９
【００１７】
【非特許文献８】
Ｍａｏ  Ｃ，  ＬａＢｅａｎ  ＴＨ，  Ｒｅｌｆ  ＪＨ，  Ｓｅｅｍａｎ  ＮＣ、Ｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｔｒｉｐｌｅ−ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．、“Ｎａｔｕｒｅ”（英）、２０００年、４０７（６８０３）巻、ｐ．４９３−６
【００１８】
【非特許文献９】
Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  Ｎ，  Ｋｉｙｏｈａｒａ  Ｈ，  Ｓｕｇｉｍｕｒａ  Ｎ，  Ｋａｒａｋｉ  Ｓ，  Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｔ，  Ｍａｋｉｎｏ  Ｔ，  Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｎ，  Ｓｕｙａｍａ  Ａ、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．、“Ｅｉｇｈｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ＤＮＡ  Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ”、（Ｊａｐａｎ）、２００２年、Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【００１９】
【非特許文献１０】
Ｓｕｙａｍａ  Ａ、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｗｉｔｈ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ．、“Ｅｉｇｈｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ＤＮＡ  Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ”、（Ｊａｐａｎ）、２００２年、Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【００２０】
【非特許文献１１】
Ｂｅｎｅｎｓｏｎ  Ｙ，  Ｐａｚ−Ｅｌｉｚｕｒ  Ｔ，  Ａｄａｒ  Ｒ，  Ｋｅｉｎａｎ  Ｅ，  Ｌｉｖｎｅｈ  Ｚ，  Ｓｈａｐｉｒｏ  Ｅ、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ａｎｄ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｍａｄｅ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．、“Ｎａｔｕｒｅ”、（英）、２００１年、４１４（６８６２）巻、ｐ．４３０−４
【００２１】
【非特許文献１２】
Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｎ，  Ｗａｋｕｉ  Ｍ，  Ｔｏｋｕｎａｇａ  Ｋ，  Ｓｕｙａｍａ  Ａ、Ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．、“Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ”、２００１年、（１２）巻、ｐ．２５９−２６０
【００２２】
【非特許文献１３】
Ｍｉｌｌｓ  ＡＰ  Ｊｒ、Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ．、“Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ”、２００２年、２０（４）巻、ｐ．１３７−４０
【００２３】
【非特許文献１４】
Ｙ．  Ｂｅｎｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ｂｏｔｈ  ｄａｔａ  ａｎｄ  ｆｕｅｌ、“Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．”、２００３年、１００巻、ｐ．２１９１−６
【００２４】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような状況に鑑み、本発明は、自律的に稼働することができる核酸分子を使用した情報処理方法および該方法によって演算を行うための分子コンピュータを提供することを目的とする。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は、たとえば以下の方法により実現される。すなわち、本発明は、分子の化学反応により、引数を受け取り戻り値を返す関数による演算を行う情報処理方法であって、
（ａ）分解可能な第１の一本鎖核酸に対応付けて定義された第１の符号化核酸を引数として入力し、
（ｂ）前記引数に基づき、演算用核酸の化学反応に対応付けて定義された関数による演算を行い、
（ｃ）第２の一本鎖核酸に対応付けて定義された第２の符号化核酸を戻り値として得ること、
を特徴とする情報処理方法を提供する。
【００２６】
また、本発明は、上記情報処理方法であって、第２の一本鎖核酸は、分解可能な核酸である方法を提供する。
【００２７】
さらに、本発明は、上記情報処理方法であって、上記（ｃ）で得られた第２の符号化核酸を、さらなる関数における第１の符号化核酸として使用して演算を行い、さらなる第２の符号化核酸を戻り値として得ることを含む情報処理方法を提供する。
【００２８】
さらに、本発明は、上記情報処理方法であって、関数による演算を複数機能させることにより、戻り値としての第２の符号化核酸を得ることを含む情報処理方法を提供する。
【００２９】
さらに、本発明は、上記情報処理方法を使用して、関数、引数および戻り値の組合せにより記述されたプログラムに従って、複数の関数による演算を行うことによりプログラムの計算結果を導出する情報処理方法を提供する。
【００３０】
さらに、本発明は、上記情報処理方法であって、
（ａ）の入力は、第１の一本鎖核酸を、演算用核酸と適切な酵素を含む反応液中に添加することであり、
（ｂ）の演算は、演算用核酸と適切な酵素と前記第１の一本鎖核酸を化学反応させることであり、
（ｃ）の戻り値は、化学反応の反応産物として得られること、
を特徴とする情報処理方法を提供する。
【００３１】
さらに、本発明は、上記情報処理方法であって、
第１の一本鎖核酸および第２の一本鎖核酸はＲＮＡであり、
化学反応は、合成反応、増幅反応、逆転写反応、転写反応、分解反応であり、それぞれＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による合成反応または増幅反応、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による逆転写反応、およびＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による転写反応、およびＲＮａｓｅＨによる分解反応である情報処理方法を提供する。
【００３２】
さらに、本発明は、上記情報処理方法であって、演算用核酸は、前記第１の一本鎖核酸に対してプライマーとして作用する配列、プロモータ配列および任意の核酸のプライマーとして作用する配列から選択される一以上の配列を有することを特徴とする情報処理方法を提供する。
【００３３】
また、本発明は、上記情報処理を行うためのキットであって、所望の関数による演算を行うための演算用核酸を含むことを特徴とするキットを提供する。
【００３４】
さらに、本発明は、上記キットであって、演算用核酸は、第１の一本鎖核酸に対してプライマーとして作用する配列、プロモータ配列および任意の核酸のプライマーとして作用する配列から選択される一以上の配列を有する核酸であるキットを提供する。
【００３５】
さらに、本発明は、上記キットであって、さらに適切な反応液と、適切な酵素とを含むことを特徴とするキットを提供する。
【００３６】
さらに、本発明は、上記キットであって、前記適切な反応液は、合成反応、増幅反応、逆転写反応、転写反応および分解反応に適したバッファーであり、前記適切な酵素は、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮａｓｅＨであるキットを提供する。
【００３７】
また、本発明は、上記情報処理方法によって演算を行うための分子コンピュータであって、所望の関数による演算を行うための演算用核酸と、適切な反応液と、適切な酵素とを含む容器からなることを特徴とする分子コンピュータを提供する。
【００３８】
さらに、本発明は、上記分子コンピュータであって、演算用核酸は、第１の一本鎖核酸に対してプライマーとして作用する配列、プロモータ配列および任意の核酸のプライマーとして作用する配列から選択される一以上の配列を有する核酸であり、適切な反応液は、合成反応、増幅反応、逆転写反応、転写反応および分解反応に適したバッファーであり、適切な酵素は、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮａｓｅＨである分子コンピュータを提供する。
【００３９】
【発明の実施の形態】
上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、以下の思想に基づいて本発明を完成するに至った。
【００４０】
ＲＮＡゲノムを有するウイルスの一種であるレトロウイルスは、宿主細胞内にてゲノム複製を行なうことが知られている（図１）。ＲＮＡゲノムの複製は、逆転写酵素のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性によりＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写することによって開始する。これは細胞内のｔＲＮＡがゲノム上のｐｒｉｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  （ＰＢＳ）に特異的に結合してプライマーとして働くことによって開始される。ここから逆転写反応が開始され、一度ゲノムの３’末端までｃＤＮＡが合成された後、さらにゲノム５’末端への鎖の転移とそれに続く逆転写反応が行なわれる。その結果、全長ゲノムの第１鎖ｃＤＮＡが形成される（Ｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｉｍｅｒ  ｔＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９７  Ｎｏｖ；７１（１１）：８０８７−９５）。形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのうちのＲＮＡ鎖は逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性により除去される。残された一本鎖ＤＮＡは、さらにＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性により二本鎖ＤＮＡとなり、これがゲノムに組み込まれてプロモータ部位からゲノム配列が転写される。その結果、もとのゲノムと同一の配列を有するゲノムＲＮＡが生成される。なお、細胞内に存在するｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ  （ＬＴＲ）  レトロトランスポゾンなども同等の機構により配列を複製することが知られており、２本鎖ＤＮＡ上の配列を１本鎖ＲＮＡへと転写した後、再び逆転写およびＤＮＡ２本鎖化がなされて複製される（Ｗｉｌｈｅｌｍ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＬＴＲ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２００１  Ａｕｇ；５８（９）：１２４６−６２）。
【００４１】
上記レトロウイルスのゲノム複製は、４つの特徴的な反応により構成されている。第１は、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性による逆転写反応である。第２は、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性によるＤＮＡ２本鎖化反応である。第３は、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性による転写反応である。また、逆転写反応およびＤＮＡ２本鎖化反応の際に、ＲＮａｓｅＨ活性によりＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖が除去されることも完全長ゲノムを複製する上で重要な役割を有する。この４種の反応の組み合わせにより、ゲノム増幅は実現している。このような一連のシステムを一種のコンピュータと捉えると、レトロウイルスは、宿主細胞というハードウェア内における上記４種の反応活性を活用して、自らのゲノムＲＮＡという入力に対して、複製された同一配列のＲＮＡを返すというプログラムを実行していると見なすことができる。
【００４２】
また、上記４つの反応を巧みに組み合わせることにより、レトロウイルスの自己ゲノム複製プログラムとは異なったプログラムを実行させることも可能であると考えられる。そこで、本発明は、これら４つの反応によって構成される分子コンピュータの設計を試みた。ここで設計した分子コンピュータは、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅＨ活性を同時に実現する反応液をハードウェアとして使用する。この中に入力データとしてのＲＮＡサンプルを与え、ＲＮＡ分子を引数および戻り値とする「関数」による演算を行う。本発明では、このハードウェア中で動作する基本的な関数として、いくつかの例を定義した。さらに、これらの関数を適宜組み合わせることにより、プログラムを構成することが可能となり、遺伝子発現解析などにも応用できる。このような分子コンピュータは、導入するプログラムにより異なる効果を示すことができる。したがって、プログラム可能な汎用分子コンピュータであるといえる。
【００４３】
また、レトロウイルスのゲノム増幅システムは逆転写反応活性、ＤＮＡ二本鎖化反応活性、転写反応活性およびＲＮａｓｅＨ活性より構成されるが、この機構を自律的な分子コンピュータに応用するにあたり最も特徴的な反応として、転写反応活性とＲＮａｓｅＨ活性を挙げることができる。レトロウイルス型の分子コンピュータでは、二本鎖ＤＮＡ分子から一本鎖ＲＮＡを精製する転写反応活性と、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドからＲＮＡ鎖のみを取り除いて一本鎖ＤＮＡを残すＲＮａｓｅＨ活性とが、分子コンピュータを自律型に稼動させるための鍵となる。
【００４４】
上述の思想から、本発明は、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性などのポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅＨ活性等を有する酵素による分子の化学反応を利用して、自律的な反応の実行を実現し、引数を受け取り戻り値を返す関数による演算を行う情報処理方法を開発した。
【００４５】
ここで、「自律的」な反応とは、分子の化学反応を行う際に、外部から核酸の分離、精製等の操作を行わずに反応産物を得ることができることを意味する。すなわち、外部からの操作を必要とせずに、入力した引数に対する戻り値を出力する関数の演算が可能であることをいう。
【００４６】
また、本明細書において使用する「核酸」とは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡを含む全てのＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ−オリゴ核酸などの人工合成核酸を含む。また、本明細書において「核酸」、「核酸分子」および「分子」とは交換可能に使用され得る。
【００４７】
本明細書において使用される「塩基配列」および「配列」の語は共に、特定の核酸を構成する塩基の並びを示すものである。
【００４８】
以下、図面を参照しながら発明の実施形態を説明する。
【００４９】
本発明の好ましい態様に従うと、核酸を使用した情報処理方法が提供される。本発明は、核酸分子を用いて計算を実施することにより、データの処理や遺伝子解析を自律的に実行可能な方法を開示する。また、核酸分子によりデータやプログラムを表現し、そのプログラムで定義された演算を分子反応に置き換えて自律的な反応の実行を実現する。
【００５０】
まず最初に、本発明の情報処理方法の開発に当たり、実行する演算の内容を分子の化学反応として実行可能なデータ形式に変更しておく。具体的には、分子の化学反応による演算を実施する前に、情報を、予め分子を特定の符号に結びつけた符号化核酸に変換する。そして、その変換規則を使用して演算における変数および定数などのデータを符号化核酸に変換しておく。次いで、これらの符号化核酸による演算処理を行い、符号化核酸による出力を得る。得られた符号化核酸を、予め結びつけた情報に変換することにより、演算が実行される。
【００５１】
本発明の第１の態様の方法について、基本的な処理を図２および３の処理フローに従って説明する。
【００５２】
図２および３は、引数を受け取り戻り値を返す関数による演算を行う情報処理の工程を示す。
【００５３】
（Ｓ１）引数１１の入力を行う工程である。具体的には、分解可能な一本鎖核酸２１に対応付けて定義された符号化核酸を引数として入力する。
【００５４】
（Ｓ２）関数１２による演算を行う工程である。具体的には、引数２１に基づき、演算用核酸の化学反応２２に対応付けて定義された関数１２による演算を行う。「演算用核酸」は、入力した一本鎖核酸２１等と反応し、所定の反応を経て特定の反応産物が産生されるように設計された種々の核酸である。すなわち、関数としての化学反応を進行させるために必要な配列を有する核酸であり、たとえば、プライマーおよびプロモータとして作用する。演算用核酸は複数であってもよく、１つの関数による演算を行うために複数の演算用核酸を使用することができる。
【００５５】
（Ｓ３）関数の戻り値１３を得る工程である。具体的には、一本鎖核酸２３に対応付けて定義された符号化核酸１３を得ることである。
【００５６】
ここで、上記「対応づけて定義された」とは、核酸の化学反応における操作が、情報処理上のどのような操作に該当しているかを表している。すなわち、情報処理上の符号化核酸（引数）１１が、化学反応に使用される分解可能な一本鎖核酸２２に該当し、情報処理上の関数１２による演算が、化学反応における演算用核酸および分解可能な一本鎖核酸などによる化学反応２２に該当し、情報処理上の戻り値１３が、化学反応の反応産物である一本鎖核酸２３に、それぞれ該当することを表している。
【００５７】
また、（Ｓ１）における引数の入力は、必ずしも分解可能な一本鎖核酸２１に対応づけて定義された符号化核酸を引数とする必要はなく、分解可能な一本鎖核酸そのものを直接引数として入力することもできる。この場合、分解可能な一本鎖核酸自体による演算処理を行い、符号化核酸による出力を得る。さらに、（Ｓ３）において得られる関数の戻り値は、第２の一本鎖核酸２３に対応付けて定義された符号化核酸１３を得るだけでなく、第２の一本鎖核酸を直接戻り値として得てもよい。ただし、情報処理方法として関数による演算を行う場合、引数または戻り値のいずれか一方は、予め分子を特定の符号に結びつけた符号化核酸である。
【００５８】
本発明に使用する化学反応の例を図４Ａに示す。
【００５９】
本発明の方法は、「入力」を分解可能な一本鎖核酸（たとえば、ＲＮＡ分子）により与える。情報処理上の「引数の入力」は、分解可能な一本鎖核酸を反応液に添加することに対応する。以下、分解可能な一本鎖核酸としてＲＮＡを使用した場合を例に説明する。
【００６０】
入力したＲＮＡ分子に対する演算用核酸（図４Ａに示したプライマー）が存在すると、逆転写反応が引き起こされて入力が読み取られる。ここで、逆転写反応によって形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖は、ＲＮａｓｅＨ活性によって分解されることとなる。このＲＮａｓｅＨによる分解は、従来の情報処理における入力情報の消去に該当する。
【００６１】
従来のＤＮＡ分子を使用した情報処理方法では、入力したＤＮＡを読み取った後、入力したＤＮＡが分解されずに反応系に残ったままであった。したがって、その後の反応において該ＤＮＡが不要な場合は、該ＤＮＡを除去するために分離操作などの煩雑な操作が必要であった。このような分離操作には、外部からの一連の操作が必要であり、自律的に稼働させることは困難であった。たとえば、分離操作を自動処理するには、ロボットによる分離操作等が必要であった。しかし、分解可能な核酸分子を使用することにより、たとえばＲＮＡ分子であれば、ＲＮａｓｅＨの酵素活性により容易に入力したＲＮＡ分子のみを消去することができ、反応系において自律的に反応を実行できる。本発明では、分解可能な一本鎖核酸としてＲＮＡ分子を使用したが、その他の分解可能な核酸分子を使用することもできる。
【００６２】
本明細書において、「分解可能」とは、所定の反応により「分解可能な一本鎖核酸」のみが分解され、その他の核酸は分解されないことをいう。特に、演算用核酸が分解されないような条件下で「分解可能な一本鎖核酸」のみが選択的に分解されることを意味する。たとえば、「演算用核酸」としてＤＮＡを使用した場合、ＲＮＡは、ＲＮａｓｅＨによって選択的に分解されることから「分解可能」であるといえる。また、「演算用核酸」がＲＮＡである場合に純粋なＤＮＡ分解酵素を用いると、ＤＮＡのみを選択的に分解することができ、このような条件下においてはＤＮＡが「分解可能」な核酸ということになる。すなわち、「分解可能」とは相対的な概念といえる。
【００６３】
「分解可能」な核酸のその他の例として、演算用分子がＤＮＡである場合におけるウラシル含有ＤＮＡ（Ａ  ＲＡＣＨＩＴＴ  ｆｏｒ  ｏｕｒ  ｔｏｏｌｂｏｘ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ａｐｒｉｌ  ２００１  Ｖｏｌｕｍｅ  １９  Ｎｕｍｂｅｒ  ４  ｐｐ  ３１４  −  ３１５、ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ａｐｒｉｌ  ２００１  Ｖｏｌｕｍｅ  １９  Ｎｕｍｂｅｒ  ４  ｐｐ  ３５４  −  ３５９）、および演算用分子がＰｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄである場合におけるＤＮＡやＲＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
また、本発明の方法において、引数として入力する核酸は、一本鎖の核酸である。核酸による情報処理方法では、核酸配列上の情報にアクセスするためにハイブリダイゼーション反応を利用している。したがって、入力に２本鎖ＤＮＡを使用する従来の技術では、該２本鎖ＤＮＡに演算用核酸などをハイブリダイズさせるために、２本鎖ＤＮＡを一本鎖にする反応が必要である。しかし、このような反応は、通常温度の制御が必要であり、外部から一連の操作を行わなければならなかった。このため、上記分離操作と同様に、自律的に反応を実行させることが困難であった。
【００６５】
また、核酸が分解可能でない場合、ハイブリダイズした核酸が二本鎖を形成したままとなるため、一本鎖にするために温度制御等が必要となる。
【００６６】
しかし、本発明の方法では、分解可能な一本鎖核酸を使用するため、該核酸は、ハイブリッドを形成した後に分解される。したがって、自律的な演算が可能となる。すなわち、一定温度のままでも演算用核酸の化学反応を行うことが可能であり、自律的な分解反応が実行される。たとえば、以下の実施例において検討したとおり、５０℃の一定温度において自律的な反応を行うことができる。
【００６７】
一方、ＲＮＡとして入力した情報は、ＲＮａｓｅＨによって分解されて消去されると共に、より安定な核酸分子（たとえばＤＮＡ分子）に逆転写されることにより、より安定な状態で記憶・保存することもできる。また、残された一本鎖ＤＮＡは、さらに別のＲＮＡに対するプライマーとして働く、すなわち、演算用核酸として繰り返し機能することもできる。したがって、該ＤＮＡからさらに伸長反応が進行することも考えられる（図４Ｂ）。本明細書において、図４Ｂのように配列ａのプライマーが１つ以上のＲＮＡ鎖上を逆転写することによって生じた配列を「配列ａで開始したＲＮＡ上の経路」と呼ぶ。得られた一本鎖ＤＮＡは、さらに該一本鎖ＤＮＡに相補的なプライマー（これも演算用核酸の一つである）の存在のもとで二本鎖ＤＮＡとなる。この二本鎖ＤＮＡから転写されたＲＮＡ分子を、関数による演算の出力として得ることができる（図４Ａ）。
【００６８】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼなどの転写酵素の転写活性が誘導されるためには、プロモータ部位が２本鎖ＤＮＡである必要があることが知られている（Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８７  Ｎｏｖ  １１；１５（２１）：８７８３−９８）。本発明では、この性質を利用して出力をコントロールする（図４Ｃ）。たとえば、演算用核酸として使用するプライマー上にプロモータ配列をあらかじめ組み込んでおき、該核酸が一本鎖ＤＮＡのままではプロモータ配列からＲＮＡの転写が生じないが、二本鎖になったときにプロモータ配列が酵素に認識され、転写活性の起点として機能することを利用する。
【００６９】
本発明の情報処理方法は、ＲＮＡによる入力を受け付け、各種反応が生じた結果としてＲＮＡによる出力を返す一連のシステム全体が１つのコンポーネントとなっている。上述したとおり、このようなコンポーネントを、ＲＮＡによる「引数」を受け取りＲＮＡによる「戻り値」を返す「関数」と呼ぶ（図５Ａ）。
【００７０】
本発明の情報処理方法では、戻り値を一本鎖核酸として得ているため、この戻り値に再アクセスすることも容易である。また、各関数は引数および戻り値が同じ分子（共に分解可能な核酸分子であるＲＮＡ）であることから、ある関数の戻り値が他の関数の引数となることが可能である。すなわち、ある関数によって得られた戻り値をさらなる関数の引数として使用し、さらなる戻り値を得ることができる。また、１つの関数における引数は一つとは限られず、複数の引数をとることも可能である。このとき、複数の関数の戻り値を引数として、さらなる戻り値を得る関数を定義することもできる。このような関数を複数組み合わせて、所定の戻り値を得ることもでき、関数、引数および戻り値の組合せにより記述されたプログラムに従って複数の関数による演算を行うことにより、該プログラムの計算結果を戻り値として導出することもできる。
【００７１】
また、上記一連のシステム全体を分子コンピュータであるとすると、所望の関数による演算を行うための演算用核酸、適切な反応液および適切な酵素で構成される反応液は、この関数による演算を実現するためのコンピュータの「ハードウェア」に該当する。ＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）プライマーなどの演算用核酸によって「プログラム」が定義され、実際に引き起こされる反応が決定されることとなる（図５Ｂ）。本発明の情報処理方法を使用することにより、ＲＮＡによる入力を受けてハードウエアとしての反応液中で反応を行い、結果をＲＮＡにより出力することが可能な分子コンピュータ実現される（図５Ｂ）。
【００７２】
（各種基本関数の設計）
次に、上述した関数による演算の具体例を以下に示す。
【００７３】
本発明の情報処理方法で実現される関数は、演算用核酸によって定義される。演算用核酸は、たとえば、一本鎖核酸に対してプライマーとして作用する配列、プロモータ配列および任意の核酸のプライマーとして作用する配列から選択される一以上の配列を有するプライマーであることが好ましい。分解可能な核酸分子としてＲＮＡ分子を引数とする場合、本発明による関数の演算には、この一本鎖ＲＮＡにプライミングしてＤＮＡの伸長反応を引き起して第１鎖ｃＤＮＡを形成させる第１プライマー（Ｐ１）と、第１鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズする第２プライマー（Ｐ２）との２種類の演算用核酸が必要である。これらのプライマー上のいずれかの位置にプロモータ配列を組み込むことにより、そのプライマーが二本鎖ＤＮＡとなったときに転写活性が誘起される。その結果、特定のＲＮＡが出力される。上記関数の例として、プロモータ配列を配置する際の位置および向きにより、たとえば以下に示す４通りの関数が考えられる（図６Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）。また、引数をとらない関数も考えられる（図６Ｅ）。その他、当業者であれば、上記関数に基づいて種々の関数を定義することが可能であろう。
【００７４】
以下、上記５つの関数について詳細に解説する。
【００７５】
基本関数Ａ：  Ｐａｔｈ  （ａ  −＞  ｂ）  ＝＞  Ｘ
配列ａより始まり配列ｂを通過するＲＮＡ上の経路が存在する場合に、指定した配列ＸのＲＮＡを返す関数である。
【００７６】
Ｐ１は、５’末端方向のプロモータ配列と、その下流にＸの逆相補鎖配列と、その３’末端にａの相補鎖配列とを有するプライマーであり、プライマーＰ２の塩基配列は、ｂである（図６Ａ）。このように設計したＰ１、Ｐ２を含む反応液中に配列ａを有するＲＮＡ分子が存在すると、Ｐ１から逆転写反応が起こる。この反応の際に、図４Ｂに示したように複数のＲＮＡ分子上を辿る反応が生じてもよい。具体的には、プライマーより逆転写反応が起こった際に生成された一本鎖ｃＤＮＡの３’末端が他のＲＮＡと結合してプライマーとして働き、再び逆転写反応が開始する場合が含まれる。このとき、逆転写反応が辿った塩基配列  （図４Ｂの場合ａ→ｂ→ｃ→ｄ）を、特に「配列ａより開始したＲＮＡ上の経路」と呼ぶこととする。またその経路を構成するＲＮＡ分子上の配列（この場合ａ→ｂ，  ｂ→ｃ及び  ｃ→ｄ）を「経路素子」と呼ぶ。
【００７７】
次に、Ｐ１からの逆転写反応によって形成された一本鎖ＤＮＡ上に配列Ｂと相補的な配列が存在すると、プライマーＰ２が結合して第２鎖ＤＮＡの合成が開始される。これにより、Ｐ１上のプロモータ配列が二本鎖化されて転写が誘発されて、プロモータの下流に配置された配列ＸのＲＮＡ分子が出力される。すなわち、本反応は、配列ａより開始したＲＮＡ上の経路が配列ｂを通過する場合に配列ＸのＲＮＡを返す関数となる。
【００７８】
基本関数Ｂ：  Ｐａｔｈ  （ａ−＃  ｂ  ［；  ｂ’  ；  ｂ’’  …  ］）  ＝＞  Ｘ
配列ａより始まり配列ｂで終結するＲＮＡ上の経路が存在する場合に、指定した配列ＸのＲＮＡを返す関数である。なお、終結条件は、「ｂもしくはｂ’、ｂ’’…」のように、並列的に拡張することもできる。
【００７９】
Ｐ１は、ａの相補鎖配列を有するプライマーであり、Ｐ２は、５’末端方向のプロモータ配列と、その下流に配列Ｘと、その３’末端側に配列ｂとを有するプライマーである（図６Ｂ）。ここに配列ａを有するＲＮＡ分子が入力されると、そこからＲＮＡ上の経路に沿って逆転写反応が起こる。その経路が配列ｂの相補鎖で終結した場合、その末端の配列はＰ２の配列Ｂと結合してプライマーとして機能し、その結果二本鎖となったプロモータ配列の下流に配置された配列Ｘが転写される。なお、Ｐ２上には、プライマーが結合する配列がｂ、ｂ’、ｂ’’…というように複数配置されていてもよい。この場合は、経路の終結条件がｂ、ｂ’、ｂ’’…と並列的に拡張される。また、この関数ではＰ２そのものは伸長反応を起こす必要がない。したがって、Ｐ２の３’末端に特殊な修飾や塩基配列を付加しておくこともできる。
【００８０】
基本関数Ｃ：  Ａｍｐｌｉｆｙ  （ａ  −＃  ｂ  ［−−ａｄｄ５  Ｐ］  ［−−ａｄｄ３  Ｑ］）
配列ａより始まり配列ｂで終結するＲＮＡ上の経路が存在する場合に、その配列のＲＮＡを増幅する関数である。また、増幅配列の３’末端または５’末端に、任意の配列ＰまたはＱが付加されたＲＮＡを増幅するすることもできる。
【００８１】
Ｐ１は、ａの相補鎖配列を有するプライマーであり、Ｐ２は、３’末端方向のプロモータ配列と、３’末端の配列ｂとから構成される（図６Ｄ）。ここに配列ａに相補的な配列を有するＲＮＡ分子が入力されると、ＲＮＡ上の経路に沿って逆転写反応が起こる。この経路がｂの相補鎖配列で終結した場合、その末端配列がＰ２の配列ｂと結合してプライマーとして機能し、その結果二本鎖となったプロモータ配列の下流に配置されたａからｂまでの経路の相補鎖（もとの入力ＲＮＡと同一の鎖）の配列を有するＲＮＡが転写される。さらにこの関数の戻り値は再帰して同一関数の引数となるため、ループを形成して遺伝子配列の増幅を引き起こす。また、必要に応じてＰ１、Ｐ２各プライマーに配列Ｐ、およびＱの相補鎖配列を組み込むことにより、出力されるＲＮＡ分子の５’末端または３’末端に任意の配列ＰまたはＱを付加することができる。
【００８２】
基本関数Ｄ：  ＲｅｖＡｍｐｌｉｆｙ  （ａ  −＞  ｂ  ［−−ａｄｄ５  Ｐ］  ［−−ａｄｄ３  Ｑ］）
配列ａより始まり配列ｂを通過するＲＮＡ上の経路が存在する場合に、その逆相補鎖配列のＲＮＡを増幅する。また、増幅配列の３’末端または５’末端に、任意の配列Ｐ，Ｑを付加することもできる。
【００８３】
Ｐ１は、３’末端方向のプロモータ配列と、３’末端の配列ａ相補鎖とから構成され、Ｐ２は、配列ｂを有する（図６Ｄ）。ここに配列ａを有するＲＮＡが入力されると、ＲＮＡ上の経路に沿って逆転写される。さらにその経路が配列ｂの相補鎖配列を通過すると、Ｐ２が該配列に結合してプライマーとして機能し、ＤＮＡ２本鎖化反応を誘起する。その結果、Ｐ１上のプロモータ配列も二本鎖ＤＮＡとなり、配列ａからｂまでの経路配列（もとの入力ＲＮＡの逆相補鎖配列）のＲＮＡを転写する。なお、出力された逆相補鎖ＲＮＡには、さらにＰ２が結合して逆転写反応が行わる。転写されたＤＮＡには、Ｐ１が結合してＤＮＡ二本鎖化反応が生じ、再び同一のＲＮＡが出力される。この反応は、本関数を実装するプライマーＰ１およびＰ２の役割が入れ替わることにより、もとのプライマーが逆相補鎖ＲＮＡを引数とする基本関数Ｃ：  Ａｍｐｌｉｆｙ  （ｂ  −＃  ａ）として機能すると表現することもできる。この関数も、基本関数Ｃと同様に、出力されるＲＮＡ分子の５’末端または３’末端に任意の配列ＰまたはＱを加えることができる。
【００８４】
基本関数Ｅ：  Ｏｕｔｐｕｔ  （）  ＲＮＡ  Ｘ
引数を必要とせず、常に配列ＸのＲＮＡを出力する。
【００８５】
基本関数Ｅは、引数としてのＲＮＡ分子を必要とせず、常に配列ＸのＲＮＡを転写するように設計してある。この関数は、プロモータ配列とその下流に続く配列Ｘからなる二本鎖のＤＮＡ分子によって実現される。
【００８６】
（基本関数の組み合わせによるプログラム構築）
上記基本関数を組み合わせることにより、高次な関数を構築することことができる。さらに、上記関数、引数および戻り値を組み合わせてプログラムを構築することこともできる。しかし、図５に示したようなプログラムを化学反応により実行する際に、特に演算用核酸の設計に注意する必要がある。上記基本関数Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、最初に逆転写反応を引き起こす演算用核酸をプライマーＰ１とし、続くＤＮＡ二本鎖化反応を引き起こす演算用核酸をプライマーＰ２として分類している。しかし、関数の実体として反応液中に加えられるプライマーは、基本関数ＡとＢとでは同等であり、またＣとＤとで同等である。たとえば、基本関数Ａ  ：  Ｐａｔｈ  （ａ  −＞  ｂ）  ＝＞  Ｘを実装するプライマー・ペアは、プライマーＰ２が第１プライマーとして機能してしまえば、基本関数Ｂ：  ｐａｔｈ  （ｂ  −＃  ａ）  ＝＞  Ｘとして働く。あるいは、プライマーＰ１が第１、第２プライマーとして機能すれば、ｐａｔｈ  （ａ  −＞  ａ）  ＝＞  Ｘなる出力を与えることも考えられる。
【００８７】
あるいは、プライマーがダイマーを形成することでプロモータ配列が二本鎖となり、誤った戻り値を返してしまう可能性も考えられる。さらに複数の関数を単一の反応液中にて同時に実行する場合、相互作用を起こしうるプライマーの組み合わせは、関数の種類に応じて増大し、副反応の可能性がさらに広がる。副反応の影響を受けずに、狙った関数反応を効果的に実行するプログラムを実装するために、プログラムを組む際に副反応が発生し難いと考える関数の組み合わせを使用することや、反応に用いるプライマーの配列を特に注意して設計することなどといった配慮が特に重要である。
【００８８】
たとえば、演算用核酸として、正規直交化配列を含む核酸を使用することができる。「正規直交化配列」における「正規」の語は、複数の配列において熱的性質の正規性を維持すること、即ち、融解温度が一定の範囲内で揃っていることを示す。熱的性質の正規性を維持することによって、たとえば、多くの配列を纏めて使用して反応を行うことが有利に実行される。「正規直交化配列」における「直交化」の語は、配列に直交性を持たせることであり、１つの直交化配列群に含まれる全ての配列は、夫々独立して反応する、すなわち、１つの正規直交化配列群に含まれる配列は、所望の組み合わせ以外の配列間および自己配列内において反応が生じ難いか、または反応が生じない。言い換えれば、１つの直交化配列群に含まれる配列は、配列間でのクロスハイブリダイゼーションや、自己配列内での望まないハイブリダイゼーションが従来よりも生じ難いか、生じない。
【００８９】
上記のような正規直交化配列は、Ｈ．  Ｙｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ａ．  Ｓｕｙａｍａ，  ”Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ３−ＳＡＴ  ｂｙ  ｂｒｅａｄｔｈ  ｆｉｒｓｔ  ｓｅａｒｃｈ”，  ＤＩＭＡＣＳ  Ｖｏｌ．５４  ９−２０（２０００）および特願２００３−１０８１２６に詳細が記載されている。これらの文献に記載の方法を使用して正規直交化配列を設計することができる。簡単には、予め無作為に塩基配列を複数作出することと、それらの融解温度の平均値を求めることと、その平均値の±ｔ℃で制限される閾値を基に候補配列を得ることと、独立して反応する配列であるか否かを指標に得られた候補配列から正規直交化配列群を得ることを具備する方法によって作製することができる。
【００９０】
正規直交化配列である核酸群は、そこに含まれる夫々の塩基配列または核酸の融解温度がほぼ均一であり、互いにクロスハイブリダイゼーションを起こし難く、その自己二次構造が安定ではない。正規直交化配列は、たとえば、以下の実施例にコード配列として示す核酸にも使用することができる。
【００９１】
また、本発明の符号化核酸も、上記正規直交化配列であることが好ましい。しかし、たとえば、細胞から精製した総ＲＮＡなどを直接第１の符号化核酸として使用することもできる。すなわち、予め結びつけた情報を符号化核酸に変換して演算を行うのではなく、得られた核酸（たとえば、総ＲＮＡのような、符号化されていない分解可能な核酸など）自体を情報として、そのまま符号化核酸として使用することもできる。たとえば、以下に示した遺伝子発現解析において本発明の方法を使用する場合などである。また、演算によって得られる第２の符号化核酸にさらなる演算を適用して、符号化していない一本鎖核酸を戻り値として直接得ることもできる。この核酸は、ｍＲＮＡであってもよいし、タンパク質に結合するアプタマー核酸であってもよい。さらに、特定の遺伝子ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡであってもよい。たとえば、以下に示した細胞内分子コンピューティングにおいて本発明の方法を使用する場合などである。
【００９２】
このような場合、入力に使用したＲＮＡは、たとえば以下に示したように、一旦上記正規直交化配列を有する符号化核酸に変換してから、さらなる反応を行うことが好ましい。
【００９３】
（遺伝子発現解析プログラム）
以下に、上記基本関数の組み合わせによるプログラムの一例として、遺伝子発現解析に応用した例について記述する。
【００９４】
（遺伝子のコード化）
ＤＮＡマイクロアレイ等による遺伝子解析において、ハイブリッド形成を的確にコントロールすることを目的として、特定の遺伝子を対応するジップ・コードまたは内部コードに置き換える技術が開発されている（Ｇｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９９  Ｓｅｐ  １７；２９２（２）：２５１−６２、  Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００１  （１２）  ２５９−２６０、Ｗｈａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００１  Ｊｕｎ  １；２９（１１）：Ｅ５４−４）。
【００９５】
本プログラムでは、基本関数Ａ（  ｐａｔｈ  （ａ  −＞  ｂ）  ＝＞  Ｘ  ）を使用する（図７Ａ）。ターゲット遺伝子のＲＮＡを特異的に認識するプライマー・ペア配列として、配列ａおよび配列ｂを使用する。これらの配列を演算用核酸の３’末端に組み込む。また、出力されるＲＮＡの配列Ｘとして、対応させたいコード配列をプロモータの下流に組み込んでプライマーを設計する。このようなプライマー・ペアを使用することにより、ターゲット遺伝子ＲＮＡを入力すると対応するコード配列ＲＮＡに変換される関数を作成することが可能である。また、基本関数Ｃ（Ａｍｐｌｉｆｙ）や基本関数Ｄ（ＲｅｖＡｍｐｌｉｆｙ）を使用することにより、ターゲット遺伝子の部分配列の５’末端または３’末端にラベルのための配列を付加することも可能である。
【００９６】
本プログラムを使用することにより、遺伝子のコード化が自律的な反応条件で実現される。たとえば、ＤＮＡマイクロアレイ等による遺伝子検出に応用することもできる。さらに、コード配列ＲＮＡを他の関数による演算プログラムの入力として使用して、たとえば遺伝子発現解析プログラムを構築することもできる。
【００９７】
（各遺伝子の経路素子への変換と論理演算による遺伝子発現解析）
ここでは、各遺伝子を経路の素子にコード化することにより遺伝子発現解析を行う方法について説明する。図７Ｂに、遺伝子Ａと遺伝子Ｂとが存在する場合に遺伝子Ｘを返すプログラム例を示す。
【００９８】
本プログラムは、遺伝子ＡおよびＢのＲＮＡをコード配列へ変換する関数と、経路を認識して遺伝子Ｘを返す関数よりなる。すなわち、遺伝子ＲＮＡをコード化し、該コード化配列による演算を行なう。第一に、基本関数Ａを使用して、遺伝子Ａが存在する場合にコード配列Ｃｏｄｅ［２，１］を返すというコード化関数を考える。ここで、Ｃｏｄｅ［２，１］は、各々５’末端から３’末端に向かってコード配列Ｃｏｄｅ［２］、Ｃｏｄｅ［１］が並んだ配列を有する。同様に、遺伝子Ｂが存在する場合にＣｏｄｅ［３］、Ｃｏｄｅ［２］を並べた配列を有するＣｏｄｅ［３，２］を返す関数を加える。なお、Ｃｏｄｅ［１］、［２］および［３］は、任意の配列であってよい。しかし、反応液の条件でミス・プライミングなどを起こしにくく、プライミング効率が均一な配列を有することが好ましい。すなわち、上述した正規直交化配列であることが好ましい。
【００９９】
上記関数を組み合わせることにより、遺伝子Ａが存在する場合にのみ経路素子Ｃｏｄｅ［１］→Ｃｏｄｅ［２］が形成され、遺伝子Ｂが存在する場合にのみ経路素子Ｃｏｄｅ［２］→Ｃｏｄｅ［３］が形成される。したがって、遺伝子Ａと遺伝子Ｂの両方が存在している場合に限り、Ｃｏｄｅ［１］より始まりＣｏｄｅ［３］で終結するというＲＮＡ上の経路が形成される（図７Ｂ）。ここで、基本関数Ｂ（もしくは基本関数Ａ）を使用して、該経路が存在する場合にＲＮＡ  Ｘを返す関数をさらに加える。その結果、両遺伝子が存在する場合に限り遺伝子Ｘを返すプログラムが実現する。
【０１００】
本方法の本質は、各遺伝子を、コード配列によって構成された仮想的な経路（この場合１→２→３なる経路）を構成する各経路素子（１→２および２→３）に変換し、その経路の存在を検出することによって遺伝子の解析を行うことである。経路の規模や対応付けを行なう遺伝子の種類を増加させれば、より複雑な演算を行うことができる（図７Ｃ）。あるいは、出力される配列ＸのＲＮＡをさらに別の経路への入力とすることにより、経路を多重に重ねることもできる。
【０１０１】
（ニューラル・ネットワークによる遺伝子発現解析）
論理演算による遺伝子発現解析では、あらかじめ遺伝子の発現パターンが既知である必要がある。また、基本的に遺伝子の有無のみを解析するものであり、濃度の情報を評価できない。ここでは、未知の遺伝子発現パターンについて遺伝子の濃度情報をも評価することができる方法として、本発明の情報処理方法を使用して構築したニューラル・ネットワークの例を示す。
【０１０２】
遺伝子の発現解析において、ＤＮＡコンピュータによって構成されたニューラル・ネットワークを応用するアイデアは以前にもあった（Ｍｉｌｌｓ  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２  Ａｐｒ；２０（４）：１３７−４０）。しかし、従来のアイデアは、中間層を持たない一層の単純パーセプトロンのモデルであり、複雑な解析は原理的に困難であった。さらに、複数ステップの操作が必要とした。一方、本発明の情報処理方法を使用することにより、複雑な解析を実行しうる多層パーセプトロンを自律的に稼動する反応系にて実現することができる（図８Ａ）。
【０１０３】
遺伝子の解析を行なうために、まず遺伝子のコード化を行なう。コード化関数によりＲＮＡ  Ａが存在する場合に、Ｃｏｄｅ［ａ１，ＳＴ］が出力されるようにする。これは経路ＳＴ→ａ１に対応付けられる。ＲＮＡ  Ｂ，Ｃ，Ｄについても同様のコード化関数を設定し、各々経路ＳＴ→ａ２，ａ３，ａ４へと置き換えるようにする。これらのコード化関数により、各遺伝子ＲＮＡの存在に応じてニューラル・ネットワークへの入力が行なわれる。パーセプトロンの中間層を結ぶ経路ユニット：  ａ１→ｂ１，  ａ１→ｂ２，  ａ１→ｂ３，  …，  ｂ４→ｃ４およびｃ１→Ｘ，  ｃ１→Ｙ，  ｃ２→Ｘ，  …，  ｃ４→Ｙは、全て基本関数Ｅ：  Ｏｕｔｐｕｔ（）  を使用して、対応するＲＮＡを出力させることにより形成することができる。さらに、基本関数Ｂを使用して、経路ＳＴ→Ｘの存在に応じてｘを返す関数（  ｐａｔｈ  （  ＳＴ  −＃  Ｘ  ）  ｘ  ）および経路ＳＴ→Ｙの存在に応じてｙを返す関数（  Ｐａｔｈ  （  ＳＴ  −＃  Ｙ  ）  ｙ  ）を導入したプログラムを構築する。その結果、入力ＲＮＡに応じて出力ｘとｙの割合が変化するニューラル・ネットワークが形成される（図８Ａ）。  入力層、中間層および出力層の数は、適宜変更することができる。さらに、各ＲＮＡ経路ユニットの強度は、対応するＯｕｔｐｕｔ（）関数の濃度を調整することによって制御することができる。
【０１０４】
図８Ｂに示す方法を使用することにより、ニューラル・ネットワークに対する学習プロセスが実行できる。具体的には、第一に、入力および中間層を結ぶ経路に係る関数とＳＴプライマーとを含む反応液に、入力としてサンプルＡ群およびＢ群のＲＮＡを与えて、ＳＴプライマーの伸長反応を実行させる。各反応液中では、与えられた入力ＲＮＡおよび中間層経路の状況に応じて、ＳＴより開始しＸまたはＹで終結する各経路が逆転写されて、対応するｃＤＮＡが合成される（▲１▼）。ここで、得られたＳＴプライマー伸長産物の末端配列がＸのときと、Ｙのときに分けて経路の解析を行なう。Ａ，  Ｂ群における各中間経路ユニット（ａ１→ｂ１，  ａ１→ｂ２，  …  ）の濃度比較を行なう（▲２▼）。この作業は、たとえば、複合する経路を含んだサンプルを使用して、リアルタイムＰＣＲ法やＤＮＡマイクロアレイ法などによって行なうことが想定される。この結果をもとに、望ましい経路が増強されるようＯｕｔｐｕｔ（）関数の濃度を調製する（▲３▼）。たとえば、Ａ群を出力ｘに、Ｂ群を出力ｙに対応付けたい場合には、Ａ群サンプル−Ｘ終結経路およびＢ群サンプル−Ｙ終結経路と、Ａ群サンプル−Ｙ終結経路およびＢ群サンプル−Ｘ終結経路との比較を行ない、前者に特異的な経路ユニットを増加して後者に特異的な経路を減少させる。このサイクル▲１▼→▲２▼→▲３▼を繰り返すことにより、学習させることができる。
【０１０５】
この分子コンピュータのニューラル・ネットワークによる遺伝子発現解析技術を利用して、新規な遺伝子診断技術を実現することもできる（図８Ｃ）。たとえば、上記反応を行うために必要な演算用核酸を含む反応液を準備する。次いで、反応液に臨床サンプルより得られたＲＮＡを添加して反応を進行させる。所定の遺伝子が所定の組合せで発現している場合に、所定の出力が得られるようにプログラムを構築しておけば、遺伝子がどのようなパターンおよび発現量で発現しているのか容易に解析することができる。
【０１０６】
（関数の拡張）
本発明に使用する関数は、上記５つの関数に限定されない。種々の演算用核酸を使用して、多様な関数を定義することができる。
【０１０７】
たとえば、上記基本関数は、全て、Ｐ１が逆転写反応を引き起こし、そこで形成されたｃＤＮＡにＰ２がハイブリダイズするという構造としているが、Ｐ２をＲＮＡに対するプライマーとして機能させることもできる。このとき、伸長反応に従ってＰ２の３’末端配列が変化している。この変化は、３’末端配列の変化につれて関数の内容が変化しているととらえられる。このような変化を利用することにより、関数の概念を拡張することができる。その他にも、ハードウェアの反応液中で以下に例示するような化学反応を実現することにより、５つの基本関数以外にもプログラムに利用可能な関数の定義を拡張することが可能であろう。
【０１０８】
また、コンピュータとしてプログラムの結果を返すためには、一連の関数反応の結果得られた出力を検出する必要がある。上記基本関数は、全てＲＮＡを戻り値とするため、基本関数のみで構成されたプログラムの最終出力もＲＮＡ分子となる。この出力ＲＮＡは、分子生物学的手法により精製することが可能である。またＲＴ−ＰＣＲやノーザン・ブロット、ＤＮＡマイクロアレイ等などの技術を使えば出力ＲＮＡを検出することも可能である。しかし、本発明の分子コンピュータの特長は、自律的コンピューティングが可能である点であり、結果の検出までのステップを単一反応液内にて同時に行なえればより効果的である。したがって、コンピューティング反応液内で出力されたＲＮＡ分子を直接検出することが望ましい。たとえば、ＲＮＡ分子を直接検出のために、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  （ＦＲＥＴ）技術を応用することができる。ＦＲＥＴ技術は、蛍光を外部から検出して情報を取り出すことが可能であり、非常に有用である。蛍光標識したＤＮＡプローブを用いることにより、ＦＲＥＴ技術をリアルタイムＰＣＲ法などにも応用した例がある（Ｄｉｄｅｎｋｏ，  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  （ＦＲＥＴ）：  ｄｅｓｉｇｎｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００１  Ｎｏｖ；３１（５）：１１０６−１６，  １１１８，  １１２０−１）。たとえば、図９Ａに示すＦＲＥＴプローブを使用すれば、蛍光出力関数として分子コンピュータの出力に応用可能である。Ａｄｊａｃｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｐｒｏｂｅは、特定のターゲット配列が存在する場合に蛍光を返す特性を有するため、そのまま分子コンピュータの出力検出関数として利用することができるであろう（図９Ａ−ａ，  ｂ）。また、Ｈａｉｒｐｉｎ  ｐｒｏｂｅは、ＤＮＡ伸長反応によりプライマーが二本鎖化した際に蛍光を発することから（図９Ａ−ｃ）、基本関数ＡのプライマーＰ１もしくは基本関数ＢのプライマーＰ２の代替としてこの構造のプライマーを使用することにより、該当する経路が存在する場合にのみ蛍光を返す関数を構成することが可能である。
【０１０９】
これらの蛍光出力関数を用いれば、出力の検出までを単一ステップで行なうことが可能な遺伝子診断プログラムなども設計することができる。たとえば、図８Ｃについて、ニューラル・ネットワークによる遺伝子発現解析の結果は、ｘおよびｙの濃度を比較することにより行なわれるが、ｘおよびｙの各々を認識する蛍光プローブを異なる蛍光色素を用いて形成することにより出力の検出が可能となる。  あるいは、「経路ＳＴ→Ｘが存在すればｘを返す関数」などの変わりにヘアピン・プローブを使用した蛍光出力関数「経路ＳＴ→Ｘが存在すれば蛍光を返す関数」などを構築することも考えられる。最終の出力ごとに異なる蛍光を割り当てれば、その蛍光強度を比較することによって出力の検出が可能となる。
【０１１０】
その他の反応として、たとえばＷｈａｒａｍらが２００１年に発表した３−ｗａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  （３ＷＪ）構造を利用したプライマーを使用してもよい（図９Ｂ）。これは、ターゲット配列が存在する場合に、指定した配列のＲＮＡを発現するというプライマーである。ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性とＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性が存在すれば反応が実現することから、本発明の情報処理方法に応用することもできる。特に、遺伝子のコード化反応などに使用することができる。
【０１１１】
また、関数の拡張の例として、ある関数により出力されたＲＮＡを関数による演算に使用することもできる。たとえば、各関数により出力されるＲＮＡ分子自体もプライマーとして機能することができるので、これ自体を関数による演算の演算用核酸として機能させることもできる。
【０１１２】
さらに、リボザイムを分子コンピュータの素子として利用する研究もある（Ｗｉｃｋｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ  Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  Ａｓ  Ｌｏｇｉｃ  Ｇａｔｅｓ．  Ｅｉｇｈｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ＤＮＡ  Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，  ２００２  Ｊｕｎｅ  １０−１３；  Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｊａｐａｎ）。リボザイムは、酵素活性を有するＲＮＡ分子として知られている。このようなリボザイムを使用すれば、関数の出力として生成されたＲＮＡ分子自体がリボザイムとして働き、その出力ＲＮＡが直接新たな関数機能を発揮することができる。本発明の情報処理方法に使用する関数として、このようなリボザイムを使用することもできる。
【０１１３】
以上に例示した基本関数以外の反応を本分子コンピュータのハードウェア中で実行することにより、コンピュータの機能がさらに拡張されるであろう。
【０１１４】
上述したように、レトロウイルスがゲノム増幅に用いる反応活性として重要なＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅＨ活性の４種の反応を組み合わせて、自律的に稼動するプログラム可能な分子コンピュータを実現することができる。
【０１１５】
具体的には、上記情報処理方法によって演算を行うための分子コンピュータとして、所望の関数による演算を行うための演算用核酸と、適切な反応液と、適切な酵素とを含む容器からなることを特徴とする分子コンピュータが提供される。分子コンピュータ上でプログラムを構成する要素となる関数として、便宜上５つの基本関数を定義したが、より一般化すると、プログラムとして分子コンピュータのハードウェア中に加えられるのは３種類のオリゴ核酸、即ち５’方向に配置されたプロモータを含む核酸と、３’方向に配置されたプロモータを含む核酸と、プロモータ配列を含まない核酸である。これらのオリゴ核酸が含まれる反応系に対してＲＮＡによる入力を与えると、オリゴ核酸の伸長反応が適宜進行し、ある点でプロモータ配列が二本鎖ＤＮＡとなるとその下流の配列がＲＮＡとして返されるというシステムであるともいえる。
【０１１６】
一方、分子コンピュータに使用する容器としては、たとえば核酸の反応において通常使用されるサンプルチューブ、試験管、微細流路を使用することができる。また、使用する容器は、単一の容器であればよいが、複数の容器を使用してもよい。
【０１１７】
また、容器として、細胞または組織などを使用すれば、生体細胞内において遺伝子の発現量およびパターンを自律的に検出し、その結果に応じて所望の遺伝子の転写を制御することもできる。したがって、生体細胞内でＲＮＡの出力をコントロールすることが可能であり、新たな細胞コントロール機序を実現することができるであろう。たとえば、特定の発現パターンをもつ細胞のみで特定の遺伝子を発現させることが可能であり、癌細胞などターゲットとした細胞のみで細胞を正常化させるための遺伝子を発現させるにこともできる。このような技術は、遺伝子治療などの技術に応用可能である。
【０１１８】
また、本発明の情報処理方法により情報処理を行うために、必要な演算用核酸をキットとして提供することもできる。該キットには、所望の関数による演算を行うための演算用核酸が含まれる。演算用核酸としては、第１の一本鎖核酸に対してプライマーとして作用する配列、プロモータ配列および任意の核酸のプライマーとして作用する配列から選択される一以上の配列を有する核酸が含まれることが好ましい。
【０１１９】
また、該キットには、演算用核酸だけでなく、適切な反応液と、適切な酵素とが含まれていてもよい。適切な反応液としては、たとえば、合成反応、増幅反応、逆転写反応、転写反応および分解反応に適したバッファーであり、適切な酵素は、たとえば、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮａｓｅＨである。
【０１２０】
上記キットは、たとえば上記（遺伝子発現プログラム）の節に記載したような遺伝子発現解析のためのキットであれば、コード化に必要な演算用核酸、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮａｓｅＨ、並びに適切な反応液として４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴを含む。上記酵素は、予め反応液に添加されていてもよい。該キットは、たとえば５０℃にて全ての酵素を含むバッファー液にＲＮＡサンプルを添加し、よく混ぜた後に、５０℃でインキュベートして使用すればよい。たとえば、試験管１本あたり酵素バッファーを３μｌ添加して反応液の総液量を２５μｌとし、反応時間は３０分である。
【０１２１】
また、プログラムの実行に必要な反応はレトロウイルスやレトロトランスポゾンが生体細胞内にて実際に行なっている反応と本質的に同一であることから、本システムによる分子コンピュータが生体細胞内にて実現する可能性もある。この細胞内分子コンピューティングが実現すると、たとえば生体細胞内での遺伝子発現解析プログラムと蛍光出力関数との組み合わせにより、生きた細胞内の遺伝子発現パターンを外部から非破壊的にモニターする技術にも応用できる。
【０１２２】
あるいは、細胞の活動をコントロールする遺伝子のＲＮＡを出力することにより、遺伝子パターンに応じて細胞の活動をコントロールするプログラムを実現することもできる。たとえば、癌などの疾患マーカー遺伝子を入力とすることで、問題のある細胞内のみで導入した特定遺伝子を発現させるといった遺伝子治療を実現することもできる。
【０１２３】
【発明の効果】
本発明の情報処理方法を使用することにより、プログラム可能な自律型分子コンピュータを作製することができる。このようなコンピュータは、同一ハードウェアを用いて異なるプログラムを実行できる汎用性を有する。特に、今後必要性がますます拡大すると考えられる遺伝子の機能解析に関する研究開発や遺伝子診断などの用途に応用することができる。
【０１２４】
論理演算による遺伝子発現解析またはニューラル・ネットワークによる遺伝子発現解析を実行するプログラムを蛍光出力関数と組み合わせることにより、遺伝子の計測・解析および結果の出力を全て自律的に行なうことが可能となる。また、上記ニューラル・ネットワークによる方法を使用すれば、遺伝子の発現パターンとフェノタイプとの関係が明らかでない場合でも、原理的に遺伝子発現解析が可能である。さらに、遺伝子発現の濃度情報も評価することもできる。
【０１２５】
【実施例】
（材料と方法）
（機器および試薬）
２本鎖ＤＮＡ分子は、ゲル電気泳動を行った後、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）  によって検出した。また、本方法の実施に使用した試薬は、ＤＮＡ  ５００  ＬａｂＣｈｉｐ（Ｒ）  ｋｉｔｓまたはＤＮＡ  ７５００  ＬａｂＣｈｉｐ（Ｒ）  ｋｉｔｓである。リアルタイムＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭクイックシステム３３０  （ロッシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用して行なった。該ＰＣＲのための試薬は、同社より購入したＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ（Ｒ）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用した。試薬の調整および機械の操作方法については、生産者のプロトコルに準じて行なった。
【０１２６】
（遺伝子特異的配列の設計）
ＴＧＴＰ遺伝子およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子を特異的に認識するプライマーは、三島隆らが開発した特異的プライマー設計プログラム（大規模遺伝子発現計測のためのプローブ及びプライマー配列設計法に関する研究、東京大学大学院理学系研究科修士論文  ２００１年度）およびプライマー設計ソフトウェアとして公開されているＰｒｉｍｅｒ３  （Ｒｏｚｅｎ  ａｎｄ  Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ、Ｐｒｉｍｅｒ３  ｏｎ  ｔｈｅ  ＷＷＷ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｕｓｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０００；１３２：３６５−８６）などを使用して設計し、作製したプライマーから適当なものを選んで使用した。使用したＴＧＴＰ遺伝子およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子に特異的な配列を以下にまとめる。（なお、カッコ内の数字は、ＴＧＴＰ，  Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ両遺伝子ＲＮＡ分子上のプライマーの位置を表す。またＳはセンス鎖配列、Ａはアンチセンス鎖配列であることを示す。
【０１２７】
2004357502.tif 000003
必要に応じて、これらの配列の５’末端にプロモータ配列およびコード配列などを追加したものをプライマーＤＮＡとして使用した。なお、原則として３０塩基長未満のプライマーＤＮＡの合成は、プロリゴ・ジャパン株式会社にＥ＠ｓｙ  Ｏｌｉｇｏｓ（Ｒ）として委託合成した。それ以上の長さのプライマーは、ＨＰＬＣ精製品もしくはＰＡＧＥ精製品として株式会社サワディー・テクノロジーに合成依頼した。
【０１２８】
（コード配列の設計）
本実施例では、人為的に作成された「コード配列」を含むオリゴＤＮＡを使用した。ここで、コード配列とは、ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ法による計算（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  Ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ，  ｄｕｍｂｂｅｌｌ，  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＤＮＡ  ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９８  Ｆｅｂ  １７；９５（４）：１４６０−５）により２本鎖ＤＮＡの融解温度が均一に揃えられていること、安定した二次構造やミスハイブリッドの形成を起こしにくいように計算されていること等の特徴を有するように設計された同一塩基長の配列の組を指す（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ  ”Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ３−ＳＡＴ  ｂｙ  ｂｒｅａｄｔｈ  ｆｉｒｓｔ  ｓｅａｒｃｈ．  ＤＩＭＡＣＳ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｉｓｃｒｅｔｅ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０００  ５４：  ９−２２，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）。ここでは、以下に示す５つの２５塩基長の配列を使用した。
【０１２９】
2004357502.tif 000004
（コンピューティング反応に使用したプライマー配列）
コンピューティング反応には、遺伝子特異的配列およびコード配列、Ｔ７プロモータ配列などを組み合わせた特殊なオリゴＤＮＡを使用した。それらの名称、構造および配列を以下に列挙する。（「構造」の項目で、［  ］は遺伝子特異的配列の配列名、＜  ＞はコード配列配列名、｛Ｔ７｝はＴ７プロモータ配列を表す。Ｔｇは６塩基長の配列５’−ＧＧＧＡＧＡ−３’、Ｔｃは９塩基長の配列５’−ＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’のことである。またこれらの頭に｀ａ’が付いているものは逆相補鎖配列を示す。Ｓはその他の配列。
【０１３０】
2004357502.tif 000005
コメント：ＴＧＴＰ−Ｔ２１プライマーの５’末端側と相補的な配列。
【０１３１】
2004357502.tif 000006
コメント：Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ−Ｔ３２プライマーの５’末端側と相補的な配列。
【０１３２】
2004357502.tif 000007
コメント：ＴＧＴＰ遺伝子をインビトロ合成する際に使用したプライマー。３’末端の２０塩基は合成したＴＧＴＰのＲＮＡ分子の５’末端と同一の配列である。
【０１３３】
2004357502.tif 000008
コメント：Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子をインビトロ合成する際に使用したプライマー。３’末端の２０塩基は合成したＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎのＲＮＡ分子の５’末端と同一の配列である。
【０１３４】
2004357502.tif 000009
コメント：Ｃｏｄｅ［１］  配列の５’末端側２０塩基配列で、コンピューティング反応液中でのＴｍ値が４８℃程度となっている。
【０１３５】
2004357502.tif 000010
コメント：ａＣ３−Ｔ４５の５’末端側と相補的な配列。
【０１３６】
2004357502.tif 000011
コメント：ａＣ３−Ｔ４６５の５’末端側と相補的な配列。
【０１３７】
（ＲＮＡサンプルの調整）
コンピューティング反応に使用したＴＧＴＰ遺伝子およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子のＲＮＡ分子、並びにＣｏｄｅ［２，１］およびＣｏｄｅ［３，２］  ＲＮＡ分子は、インビトロ転写法によって調整した。
【０１３８】
ＴＧＴＰ遺伝子およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子は、以下の手順で調製した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ｃ５７／ＢＬ１０マウス由来脾臓細胞を移植することにより移植片対宿主反応（ＧＶＨＲ）を誘発する。Ｃ５７／ＢＬ１０マウス由来脾臓細胞は、東京大学医学部の徳永勝士教授らより譲り受けた。次いで、移植後２日目の肝臓からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製する。なお、このサンプルと同等のものがＴＧＴＰ遺伝子およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子のＲＮＡを含むことは半定量リアルタイムＰＣＲ法により確認されている（Ｗａｋｕｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。次いで、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをテンプレートとして逆転写反応を行い、ＴＧＴＰ遺伝子およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子のｃＤＮＡを作成した。逆転写反応のプライマーとして、ＴＧＴＰ遺伝子についてはＴＧＴＰ−ＰＥを、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子ではＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＰＥを使用した。逆転写反応の反応液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．３）、４ｍＭ  ＤＤＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、８００ｎＭの各プライマーおよび０．３  Ｕｎｉｔｓ／μｌのＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ  （タカラバイオ株式会社）を使用し、これにｔｏｔａｌ  ＲＮＡを加えて反応を行った。なお、反応は、ホット・スタート法で行なった。具体的には、酵素を除く反応液９．５μｌを６５℃で５分間インキュベートした後、５０℃にて酵素を含む３μｌの溶液を加えた。酵素を添加後、５０℃で６０分間インキュベートした後に０．５μｌのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｈ  （２Ｕ／ｌ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、３７℃で２０分間反応した。次いで、得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ反応を個別に行なった。ＴＧＴＰについてはＴＧＴＰ−ＰＥおよびＴＧＴＰ−ＰＴを、ＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎについてはＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＰＥおよびＶｎｃｔ−ＰＴを各々プライマー・ペアとして添加して反応を行った。ここで、ＴＧＴＰ−ＰＴおよびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＰＴプライマーは、遺伝子特異的配列のＴＧＴＰ−ＰＳおよびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＰＳの  ５’末端に、それぞれ６塩基長のクランプ配列（５’−ＧＡＴＧＣＡ−３’（配列番号２６））および２３塩基長のＴ７プロモータ配列（５’−  ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧ  Ａ−３’（配列番号２７））を付加したオリゴＤＮＡである。ＰＣＲ反応にはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  （タカラバイオ株式会社）を使用した。操作は、添付のプロトコル（Ｃｏｏｌ  Ｓｔａｒｔ法）に準じて行なった。簡単には、２５μｌの反応バッファー中に０．８μｌＭの各プライマーＤＮＡと、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、４０  Ｕ／ｍｌの酵素と、１μｌのｃＤＮＡサンプルとを加えて調整した溶液を、９４℃−３０秒、６０℃−９０秒、７２℃−６０秒を３１サイクル繰り返した後、さらに７２℃で１０分間反応させた。なお、この反応により、ＴＧＴＰについては８３１塩基の２本鎖ＤＮＡが得られ、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎについては８４６塩基の２本鎖ＤＮＡが得られるものと期待されるが、実際に得られたＰＣＲ産物を電気泳動により検出したところ、期待される塩基長のシグナルが各々シングル・バンドで確認された（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。
【０１３９】
上記ＰＣＲ反応により得られたＴ７プロモータ配列を含有するＴＧＴＰ、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ両遺伝子の２本鎖ＤＮＡを使用したインビトロ転写を各々行ない、両遺伝子のＲＮＡ分子を作成した。反応は各遺伝子について１００μｌの反応液を４つの試験管に分けて行ない、各々について、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ−（ＨＣｌ）３、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＤＴ、０．４ｍＭ  ＮＴＰｓよりなる反応バッファーに５００Ｕ／ｍｌ  Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１μｌの２本鎖ＤＮＡテンプレートを加えた。３７℃で１時間インキュベートした後に１Ｕ／μｌのＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ  （Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２．５μｌ添加し、さらに３７℃で１５分間インキュベートした。得られた反応物はエタノール沈殿法により精製した。なおエタノール沈殿の際にはＰｅｌｌｅｔ  Ｐａｉｎｔ（Ｒ）  Ｃｏ−Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ  （Ｎｏｖａｇｅｎ）を用い、製品に添付の使用説明に添って実験操作を行なった。得られた沈殿物はＤＥＰＣ処理水に溶解したものを−２０℃で保存して使用した。
【０１４０】
Ｃｏｄｅ［２，１］およびＣｏｄｅ［３，２］  ＲＮＡ分子は、合成委託したオリゴＤＮＡのＴＧＴＰ−Ｔ２１およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ−Ｔ３２を用いてインビトロ合成した。各々について、オリゴＤＮＡの３’末端に相補的な２０塩基長のプライマーとをＰＣＲ反応液に混入し、９４℃で５分インキュベートした後に８０℃にて酵素を含むバッファーを投与、その後６０℃で５分、７２℃で６０分間インキュベートした。ここで得られたＴ７プロモータ配列を含む二本鎖ＤＮＡを使用したインビトロ転写反応によりコードＲＮＡを生成した。なお、転写反応、Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ処理およびエタノール沈殿法の方法は、ＴＧＴＰ遺伝子およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子の場合と同様である。
【０１４１】
（コンピューティング反応）
ＤＮＡプライマーによる各種関数反応を実現するコンピューティング反応は、単一バッファー内にＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を共存させ、同時に活性を持たせることにより実現されるものである。反応液の組成は４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴおよび０．３  Ｕ／μｌ  ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ  （タカラバイオ株式会社）、０．０４  Ｕ／μｌ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  （タカラバイオ株式会社）、３．２  Ｕ／μｌ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴＯＹＯＢＯ）より成る。この反応液に適宜、ＤＮＡプライマーおよびＲＮＡテンプレートを添加する。なお、特に断りがない限り、ＤＮＡプライマーは各々最終濃度１ｎＭで添加している。本反応はホット・スタート法で行ない、酵素を除いた反応液を６５℃で５分間インキュベートした。続いて５０℃にて全ての酵素を含むバッファー液を添加し、よく混ぜた後に、５０℃でインキュベートした。なお特に断りがない限り、試験管１本あたり添加した酵素バッファーは３μｌであり、反応液の総液量を２５μｌとし、反応時間は３０分である。反応後速やかに、転写酵素等の活性を失わせる目的で、８５℃で１０分間インキュベートした。
【０１４２】
（コンピューティン反応後のＲＮＡ産物の検出）
コンピューティング反応後のＲＮＡ生成物は、ＤＮＡを酵素で分解した後に逆転写−ＰＣＲを行なうことで検出した。
【０１４３】
ＤＮＡの酵素分解に先立ち、ＤＮＡに結合することで酵素分解を妨げると考えられるＴａｑポリメラーゼなどの酵素類を除去する目的でカラムによる精製を行なった。コンピューティング反応液にＤＥＰＣ処理水を加えて液量を５０  ｍｌとしたサンプルを、分画分子量１００，０００のカラムＭＩＣＲＯＣＯＮ  ＹＭ−１００  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にのせて、４℃，  １２０００ｒｃｆで１０分間遠心した。カラムを通過した溶液を回収し、さらに、ＭＩＣＲＯＣＯＮ  ＹＭ−１０  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  分画分子量１０，０００）にのせて４℃，  １２０００ＲＣＦで５０分間遠心した後、カラムを新しい試験管に逆さに乗せて４℃，  １２０００ＲＣＦで１０分間遠心し、カラムの上部に残った濃縮液を回収した。
【０１４４】
ＤＮＡの分解は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．４）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび０．１Ｕ／μｌ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ  （Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に上で回収されたサンプルを各々１μｌ添加した１０μｌの反応液中で、室温で１５分間反応させることにより行なった。反応後、２５ｍＭのＥＤＴＡを１μｌ加えた後に６５℃で１０分間インキュベートした。
【０１４５】
逆転写反応は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．３）、４ｍＭ  ＤＤＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓおよび０．３  Ｕｎｉｔｓ／μｌのＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ  （タカラバイオ株式会社）よりなる溶液に、最終濃度６００ｎＭのプライマーＤＮＡと上で得られたＤＮａｓｅ  Ｉ反応物を１μｌ加えた、試験管１本あたり１２．５μｌの反応液中で行なった。なお反応はホット・スタート法で行ない、酵素を除いた組成物よりなる溶液を６５℃で５分間インキュベートした後に、バッファーに酵素を加えた溶液を加えた３μｌの溶液を５０℃にて添加した。その後５０℃で１時間反応させたのち、９４℃で１０分間インキュベートした。
【０１４６】
得られたｃＤＮＡはリアルタイムＰＣＲ法により定量分析した。生産者のプロトコルに添って調整した２０μｌの反応液に逆転写反応産物を１μｌ加えて、９４℃で１０分間インキュベートした後にＰＣＲ反応を実行した。ＰＣＲ反応は、コード配列および３００塩基長未満の遺伝子配列を増幅する際には９４℃−３秒，  ６０℃−１０秒，  ７２℃−５秒のサイクルを４０回繰り返すものとし、３００塩基長以上の遺伝子配列については９４℃−２５秒，  ６０℃−１０秒，  ７２℃−２５秒のサイクルを４０回繰り返すものとした。なお、濃度の定量解析の際には、最終濃度が０．１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０１ｎＭとなるように調整した一本鎖ＤＮＡを同時に反応させ、ＰＣＲ増幅曲線を機械に付属のソフトウェアを用いて比較することにより行なった。また、ＰＣＲ増幅産物をゲル電気泳動にて検出する際には、ＰＣＲ反応を適当な時点で停止し、その増幅途中の産物をＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて検出、解析した。
【０１４７】
（コンピューティン反応の中間ＤＮＡ産物の検出）
コンピューティング反応の進行を確認するため、反応液中にて生成される一本鎖および二本鎖ＤＮＡよりなる中間産物の検出を行なった。
【０１４８】
逆転写反応により生成される一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡの検出の際には、サンプルを精製後にＰＣＲ反応で増幅することにより行なった。コンピューティング反応液にＤＥＰＣ処理水を加えて液量を５０μｌとしたサンプルを、分画分子量１００，０００のカラムＭＩＣＲＯＣＯＮ  ＹＭ−１００  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にのせて、４℃，  １２０００ｒｃｆで１０分間遠心した。カラムを通過した溶液を回収し、さらに、ＭＩＣＲＯＣＯＮ  ＹＭ−１００  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  分画分子量１０，０００）にのせて４℃，  １２０００ＲＣＦで５０分間遠心した後、カラムを新しい試験管に逆さに乗せて４℃，  １２０００ＲＣＦで１０分間遠心し、カラムの上部に残った濃縮液を回収した。ここで得られた液に対して、適当なプライマーおよびＥｘ  Ｔａｑ（Ｒ）  （タカラバイオ株式会社）をバッファーに添加した反応液中でＰＣＲ反応を行ない、一本鎖ＤＮＡの増幅を行なった。増幅はｃｏｏｌ  ｓｔａｒｔ法で行ない、９４℃−３０秒，  ６０℃−６０秒，  ７２℃−６０秒のサイクル３１回の後に、さらに７２℃で１０分間インキュベートした。得られた増幅産物はゲル電気泳動により検出した。
【０１４９】
ＤＮＡ二本鎖反応により形成される二本鎖ＤＮＡの検出の際には、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるゲル電気泳動を行なった。二本鎖ＤＮＡの塩基長および濃度の計測は、装置のプロトコルに準じて行なった。
【０１５０】
結果
（ハードウェアの開発）
レトロウイルスのゲノム増幅システムにおける反応を模した分子コンピュータを実際に試験管内にて実現するために、第一に分子コンピュータの実現に必要となる化学反応を全て実現する反応液の条件検討を行なった。この反応液は、分子コンピュータを構成するハードウェアとなる重要なものである。
【０１５１】
ここで用いるハードウェアは、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性と、さらにＲＮａｓｅＨ活性とが、一定温度に保たれた単一試験管内にて同時に実現する必要がある。同様な反応液は核酸増幅技術である３ＳＲ  （Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ，  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ａ  ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９０  Ｏｃｔ；８７（１９）：７７９７）において実現されていたので、この反応条件に沿って実験を行なった。しかしながら３ＳＲやこれに類似する技術での反応条件は３７℃から４２℃という、ＰＣＲ反応におけるアニーリング温度などと比較すると低い温度設定となっており、実際にこの条件で実験したところ、逆転写反応およびＤＮＡ二本鎖化反応に用いるプライマーＤＮＡの特異性を確保することが困難であり、特にターゲットが存在しないプライマーがダイマーを形成しやすいほか、非特異的な反応が期待される反応を抑制することが明らかとなった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。
【０１５２】
本分子コンピュータではプライマーＤＮＡによりプログラムを入力するため、このような性質はハードウェアとしては不適当であることから、プライミングの特異性を上げるために反応温度を高く設定することを考えた。３ＳＲでは酵素としてＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅＨ用いるが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼとＲＮａｓｅＨは反応温度を高く設定すると活性を失う。そのため、高い反応温度条件下でＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を示す酵素としてＴｈｅｒｍｏ  Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴＴ７；  ＴＯＹＯＢＯ）を、またＲＮａｓｅＨ活性を示す酵素としてＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＨ  （Ｔｔｈ  ＲＮａｓｅＨ；  ＴＯＹＯＢＯ）を用いて検討を行なった。酵素が活性を持つと確認されている反応温度は、ＡＭＶ逆転写酵素が６５℃以下、ＴＴ７は５０℃以下、Ｔｔｈ  ＲＮａｓｅ  Ｈは９０℃以下であった。いずれも低温度では３７℃程度まで活性が確認されており、ここではより高温での反応条件が望まれたことから、反応条件の検討は５０℃以上にて行なった。
【０１５３】
５０℃から６２℃の各反応温度において、耐熱性酵素を使用した反応条件下で各反応活性のアッセイを行なったところ、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラー活性は５０℃〜５８℃ではほぼ一定しているが（図１０）、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー活性は５０℃より温度が上がるに従って急激に活性が低下することが明らかとなり（図１１）、反応温度を５０℃以上に設定するのは困難であると考えられた。さらにＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性も温度に応じて低下するが、これはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを添加することにより改善されることが実験的に示された（図１２）。ところで、ＡＭＶ逆転写酵素は、一本鎖のＲＮＡ鎖あるいはＤＮＡ鎖を鋳型としたＤＮＡポリメラーゼ活性をもつほか、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドからＲＮＡ鎖を除去するＲＮａｓｅ  Ｈ活性も有することが知られており（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９７２，  Ｃｈａｍｐｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．  １９８４，  Ｖｅｒｍａ  １９７７）、さらにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。これらの酵素を用いる際にはＲＮａｓｅＨは特に無くても反応が進行することが、実験的にも明らかとなった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。
【０１５４】
以上の検討結果をもとに、ハードウェアとしてはＡＭＶ逆転写酵素およびＴＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにより構成される反応液を用い、５０℃の一定温度に保たれた反応条件においてコンピューティング反応を行なうものとした。
【０１５５】
（プライマー伸長反応の特異性評価）
コンピューティング反応では、ＲＮＡおよびＤＮＡを鋳型としたプライマー伸長反応によってデータの入力や演算などを行なう。そのためプライミングの特異性が確保されていることは非常に重要である。ここでは、移植片対宿主反応  （ＧＶＨＲ）が引き起こされる際に遺伝子発現が上昇することが知られているＴＧＴＰ／Ｍｇ２１遺伝子（以下、ＴＧＴＰ遺伝子と表記）およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子について、インビトロ合成した両遺伝子断片をターゲットとして、特異的に設計されたプライマーの逆転写反応におけるプライマー伸長反応の活性および特異性を評価する実験を行なった。
【０１５６】
ＴＧＴＰ−Ｐ１は、ＴＧＴＰ遺伝子を特異的な配列ＴＧＴＰ−Ｐ１を３’末端に持のプライマーである。このプライマーの伸長活性および特異性を評価するために、このプライマーとＴＧＴＰ遺伝子とを混和して１５，３０および４５分間のコンピューティング反応を実行し、さらにそこで形成されたプライマー伸長産物をＰＣＲ反応で増幅（図１３−（ａ））した際の反応生成物をゲル電気泳動で確認したところ、期待される８４２ｂｐの位置にバンドが確認された（図１４，  レーン１〜３）。同様な実験を、ＴＧＴＰ遺伝子の変わりにＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子を用いて行なったところ（図１３−（ｂ））、バンドは確認されなかった。なお、ＰＣＲ反応による増幅の際には、伸長させたプライマーと、鋳型として加えた両ＲＮＡ分子の５’末端を含むプライマー（ＴＧＴＰ−ＰＴおよびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＰＴ）とをプライマー・ペアとして加えた（Ａ）。このため、ミス・プライミングにより伸長して精製されたｃＤＮＡもこの方法で検出されると考えられる。この結果から、プライマーＴＧＴＰ−Ｐ１は、少なくともＴＧＴＰ遺伝子およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子の中においては、ＴＧＴＰ遺伝子上のターゲット部位に特異的に結合して伸長反応を引き起こすことが確認された。
【０１５７】
同等な実験をＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子ＲＮＡに特異的なプライマーであるＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  −Ｐ１を用いて行なったところ、Ｖｉｔｒｏｅｎｃｔｉｎ遺伝子が存在する場合にのみ、期待される７９２ｂｐにピークが認められた（レーン７〜１２）。これより、このプライマーもターゲット部位とのみ特異的にプライミングを起こすことが確認される。ただし一部にスメア状のシグナルも確認されることから、若干非特異的な反応も起きているものと考えられる。
【０１５８】
以上の結果より、ＴＧＴＰ−Ｐ１およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ−Ｐ１プライマーは、本ハードウェア中で特異的プライマーとして利用できることが確認された。また、同等な実験を３７℃の反応条件で行なった際には、プライマー・ダイマーと考えられるバンドや非特異的なスメアが強く検出されていたことから（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）、ここで開発した５０℃の反応条件がより適当であることが改めて示された。
【０１５９】
（コード化関数の実行）
コード化関数とは、特定のＲＮＡ分子が存在する場合に対応するコードＲＮＡを生成するものである。遺伝子発現解析プログラムを実現する際に、まず重要となるのがこのコード化関数の実行である。ここではＴＧＴＰ遺伝子およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子ＲＮＡに対するコード化関数を設計し、それを使用した実験を行なった。
【０１６０】
ＴＧＴＰコード化関数の構造を図２−５Ａに示す。これは基本関数Ａ  （図６Ａ参照）を元として、引数としてＴＧＴＰ遺伝子上の配列のａＴＧＴＰ−Ｓ１  （ＴＧＴＰ−Ｓ１の相補鎖配列）およびＴＧＴＰ−Ｓ２を、戻り値としてＣｏｄｅ［２，１］配列を設定したものとなっている（  Ｐａｔｈ  （  ａＴＧＴＰ−Ｓ１  −＞  ＴＧＴＰ−Ｓ２）  ＝＞  Ｃｏｄｅ［２，１］  ）。すなわち、第１鎖ｃＤＮＡ合成に関わるプライマー（Ｐ１）は配列ＴＧＴＰ−Ｓ１のほかＴ７プロモータ配列およびコード配列を含み、第２鎖ｃＤＮＡ合成に関与するプライマー（Ｐ２）は配列ＴＧＴＰ−Ｓ２よりなる。ＴＧＴＰ遺伝子ＲＮＡが存在するとＰ１が逆転写反応を起こし、さらにＳ２による第２鎖合成反応が起きてＴ７プロモータ配列が二本鎖ＤＮＡとなることによりＣｏｄｅ［２，１］配列ＲＮＡ（Ｃｏｄｅ［２］  とＣｏｄｅ［１］配列とがＴｇ配列を挟んで並んだもの）が転写されるものと期待される。なお、Ｔ７転写酵素の転写開始点はプロモータ配列中にあり、出力されるコードＲＮＡの５’末端にはＴｇ配列（５’−ＧＧＧＡＧＡ−３’）が常に付加されると考えられる。また、Ｐ１の５’末端の配列が一本鎖ＤＮＡの状態だと、出力されたコードＲＮＡが未反応のＰ１と結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成しＲＮａｓｅＨ活性により分解されてしまう可能性が考えられ、また実際にＰ１を一本鎖のままで反応させると出力ＲＮＡが検出されなかったことから（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）、Ｐ１の５’末端配列（コード配列の相補鎖部分およびプロモータ配列の一部）に相補的なオリゴＤＮＡをあらかじめハイブリダイズさせて二本鎖ＤＮＡとしておくことが効果的であると考えられた。
【０１６１】
ここで示したＴＧＴＰ遺伝子コード化関数を実行するため、Ｐ１としてＴＧＴＰ−Ｔ２１およびａＴ２１オリゴＤＮＡのハイブリッドを、Ｐ２としてＴＧＴＰ−Ｓ２を用いてコンピューティング反応液中で実行し、出力されたコード配列Ｃｏｄｅ［２，１］のＲＮＡを定量する実験を行なった（図１６）。コード配列ＲＮＡは、コンピューティング反応産物をＤＮａｓｅＩ処理した後に逆転写反応、リアルタイムＰＣＲ反応することで検出した。ＴＧＴＰを投与した場合（白丸）にはコード配列ＲＮＡの増加が確認されるのに対し、ＴＧＴＰが存在しない場合（斜線丸）では時間を追っても変化が見られなかった。なお、検出反応でのＤＮａｓｅＩ処理が不十分だとＰ１上のコード配列が検出されてしまう可能性も考えられたため逆転写反応時に酵素を添加しない実験も行なったが（白四角および黒四角）、その場合はほとんどコード配列は検出されず、バックグラウンドは十分に低いといえる。以上より、ＴＧＴＰ遺伝子コード化関数が本コンピューティング反応液中で確かに活性を有することが確認された。なお、コード配列ＲＮＡは反応時間４０分程度をピークとしてその後は徐々に減少しているが、その理由としては時間の経過に伴ってＲＮＡ合成反応活性が低下し、ＲＮＡ分解反応がこれを上回ってしまうことが考えられる。ここで入力したＴＧＴＰ遺伝子ＲＮＡの濃度は０．１７ｎＭであり、またこの定量結果をもとにコンピューティング反応液中のコード配列ＲＮＡ産物濃度を計算すると、反応時間３６分産物で１．５８ｎＭとなった。同等な実験を複数回行なったところ（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）、３０分から６０分のコンピューティング反応で、コード配列ＲＮＡの出力はＴＧＴＰ遺伝子の一倍から数十倍程度得られた。
【０１６２】
さらにコード化関数の反応特異性を評価する実験を行なった。ＴＧＴＰ遺伝子コード化関数に対して、ＴＧＴＰ遺伝子ＲＮＡ、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子ＲＮＡおよびネガティブ・コントロールとして同量の水（Ｎ．Ｃ．）を加えて３０分間コンピューティング反応を実行し、その産物として得られたコード配列ＲＮＡの濃度を測定した（図１７Ｃ）。この結果としてはＴＧＴＰ遺伝子サンプルが与えられた時のみコード配列の出力が得られることが期待されるが、ここではＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子を投与した場合でもコード配列のシグナルが認められた。また、同様な実験をＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子コード化関数についても行なったところ、こちらでも特異性は認められなかった（図１７Ｄ）。
【０１６３】
（複数ＲＮＡ分子にまたがる経路の逆転写反応と演算反応）
本分子コンピュータ上で論理演算やニューラル・ネットワークによる遺伝子発現解析プログラムなどを実行する際には、複数のＲＮＡ分子で構成される経路を逆転写する反応が必須となる。複数のＲＮＡで構成される経路の逆転写反応とは、プライマーが第１のＲＮＡ分子にプライミングして逆転写反応を起こし、そこで形成されたｃＤＮＡの３’末端がさらに第２のＲＮＡ分子にプライミングする、というプロセスであり、この実行にはＲＮａｓｅＨ活性による第１のＲＮＡ分子の除去が重要となる。
【０１６４】
ここでは、図１８に示すようにインビトロ合成したＣｏｄｅ［２，１］およびＣｏｄｅ［３，２］  ＲＮＡ分子、およびＣｏｄｅ［１］配列と相補的な２０／ａＣｏｄｅ［１］プライマーを用いることで、２つのＲＮＡ分子にまたがるＣｏｄｅ［１］→Ｃｏｄｅ［２］  →Ｃｏｄｅ［３］なるＲＮＡ上の経路を逆転写する反応の評価を行なった。コンピューティング反応液に２０／ａＣｏｄｅ［１］プライマーとＲＮＡサンプルを投与して０分、１５分および３０分間反応させ、形成されたｃＤＮＡ産物をＰＣＲ増幅してゲル電気泳動にて確認したところ、Ｃｏｄｅ［２，１］およびＣｏｄｅ［３，２］  ＲＮＡ分子を投与して１５分以上反応させた場合に、期待されるｃＤＮＡの形成が確認された（図１９）。
【０１６５】
複数のＲＮＡ分子上をたどる逆転写反応が実現することが確認されたことから、この経路を引数とする関数として基本関数Ｂより「Ｐａｔｈ  （  Ｃｏｄｅ［１］  −＃  Ｃｏｄｅ［３］  ）  ＝＞  Ｃｏｄｅ［４，５］」なる関数を構築した  （図２０）。この関数は、ＴＧＴＰ遺伝子を引数としてＣｏｄｅ［２，１］を返す関数、およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子を引数としてＣｏｄｅ［３，２］を返す関数と組み合わせることにより、ＴＧＴＰ遺伝子とＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子が共に存在する場合にのみＣｏｄｅ［４，５］を返す、「ＴＧＴＰ  ∧  Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ⇒  ｃｏｄｅ［４，５］」なる論理演算プログラムが実現することが期待された（図７参照）。ここでは図１９の実験で使用したＲＮＡサンプルを用いて、Ｃｏｄｅ［２，１］およびＣｏｄｅ［３，２］  ＲＮＡ分子が共に存在する場合にのみＣｏｄｅ［１］で開始しＣｏｄｅ［３］で終結する経路が実現されてＣｏｄｅ［４，５］  ＲＮＡ分子を返す反応を評価する実験を行なった。関数には、Ｐ１に図１９の実験と同様に２０／ａＣｏｄｅ［１］を、Ｐ２にはａＣ３−Ｔ４５とａＴ４５とをハイブリダイズさせたものを使用した。その結果、Ｃｏｄｅ［２，１］、Ｃｏｄｅ［３，２］  ＲＮＡ分子を両方投与した場合においてもＣｏｄｅ［４，５］の有意な発現は認められなかった（図２１）。コード配列ＲＮＡ分子と２０／ａＣｏｄｅ［１］プライマーの代わりにＣｏｄｅ［３］の相補鎖配列オリゴＤＮＡを直接投入する実験を別途行なったところＣｏｄｅ［４，５］の発現が認められたことから（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）、反応効率や特異性に問題があったものと考えられる。
【０１６６】
（センス鎖ＲＮＡ増幅関数の実行）
基本関数Ｃ：  Ａｍｐｌｉｆｙ  （ａ  −＃  ｂ）  を用いて、ＴＧＴＰ遺伝子の配列を増幅する関数を設計し、実験により反応の確認を行なった。
【０１６７】
ＴＧＴＰ−ＰＴはＴＧＴＰ遺伝子ＲＮＡをインビトロ合成した際に使用したプライマーであるためこのプライマーの３’末端に配置された配列ＴＧＴＰ−ＰＳはＴＧＴＰ遺伝子ＲＮＡの５’末端と同一であり、さらにその５’末端側にＴ７プロモータ配列を含む。また、ＴＧＴＰ−ＡＲプライマーは、インビトロ合成ＴＧＴＰ遺伝子ＲＮＡの５３８塩基より始まる２６塩基長の部分の逆相補鎖配列よりなる。これらＴＧＴＰ−ＰＴおよびＴＧＴＰ−ＡＲ両プライマーを組み合わせると「Ａｍｐｌｉｆｙ  （ａＴＧＴＰ−ＡＲ  −＃  ＴＧＴＰ−ＰＳ）」なる、ＴＧＴＰ遺伝子を引数とする遺伝子増幅関数が構成され、これにＴＧＴＰ遺伝子ＲＮＡが渡されると配列ＴＧＴＰ−ＰＳおよびＴＧＴＰ−ＡＲで囲まれた部分のセンス鎖ＲＮＡ配列が増幅されると期待された（図２２）。
【０１６８】
このＴＧＴＰ遺伝子センス鎖ＲＮＡ増幅関数に対して、インビトロ合成したＴＧＴＰ遺伝子あるいはＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子を与えた場合と同量の水を与えた場合（Ｎ．Ｃ．）について０，  １５および３０分のコンピューティング反応を実行し、そのＲＮＡ産物を検出する実験を行なった。検出は、コンピューティング反応産物をＤＮａｓｅＩ処理することでプライマーＤＮＡや反応中間体ＤＮＡを除去した後に、ＴＧＴＰ−ＡＲプライマーを使用した逆転写反応とそれに続くＴＧＴＰ−ＡＲ，  ＴＧＴＰ−ＰＴ両プライマーを使用したＰＣＲ反応で増幅し、ゲル電気泳動することにより行なった（図２３，  レーンＭ：マーカー）。この方法により、ＴＧＴＰ−ＡＲおよびＴＧＴＰ−ＰＴの非特異的な反応により生成されたＲＮＡ分子も検出されると考えられた。ＴＧＴＰ遺伝子ＲＮＡの増幅産物が存在する場合はこのＲＴ−ＰＣＲにより５９２塩基長の二本鎖ＤＮＡが検出されると期待されるが、そのバンドは反応時間に従って増加しており、Ａの反応でターゲットとしたＲＮＡ分子が増幅されていることが確認された（レーン１〜３）。ただしポジティブ・コントロール（レーンＰ）と比較すると５９２ｂｐのバンドの下にスメア状のシグナルが検出されていることから、若干ではあるが非特異的な反応も起きている可能性もある。またＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子ＲＮＡを加えた場合や（図２３レーン４〜６）、等量の水のみを与えた場合（Ｎ．Ｃ．；図２３レーン７〜９）については、全くシグナルが検出されていない。１００ｂｐ未満に見られるスメア状のシグナルはＰＣＲ反応時にサンプルの変わりに等量の水を加えた場合（レーンＮ）にも認められていることから、ＰＣＲ反応において形成されたプライマー・ダイマーであると考えられる。
【０１６９】
考察
レトロウイルスのゲノム増幅反応を模した分子コンピュータをｉｎ  ｖｉｔｒｏの反応系で実装する目的で研究を行なった。この分子コンピュータのハードウェアとしては、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性と、さらにＲＮａｓｅＨ活性とが共存することが必要であり、さらに正確にコンピューティング反応が実行されるために各反応について特異性が十分に確保されていることが必須となった。ここではその条件を満たす反応条件を新規に開発し、これをハードウェアとして採用して実験を行なった。
【０１７０】
このハードウェアを用いて遺伝子コード化反応を行なったところ、単一温度条件下で３０〜４０分程度という短時間反応させることで、確かにコード配列ＲＮＡの生成が確認された。これは非常に簡便な遺伝子コード化技術として遺伝子発現計測への活用が考えられるほか、遺伝子発現解析などさらに高次な分子コンピュータのプログラムへの入力として利用できると考えられた。ＴＧＴＰ遺伝子およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子のコード化関数で使用した第一プライマー（Ｐ１）の遺伝子特異的配列部位は、いずれも図２−４でプライマー伸長の特異性を確認したものであることから、そのプライミングのターゲット特異性に問題があるとは考えにくい。さらにＡｍｐｌｉｆｙ関数でもターゲット特異性に問題は見られなかった。遺伝子コード化反応について十分な特異性が得られない理由としては、プライマー・ダイマーの形成や遺伝子ＲＮＡとの非特異的な反応が影響している可能性が高いと考えられる。ここで使用したコード化関数は、プロモータ部位が二本鎖化されるとターゲット遺伝子を認識した場合と同一のコード配列ＲＮＡを出力してしまうため、何らかの非特異的反応によりＰ１上のプロモータ配列が二本鎖化されると、本来の出力と区別できないＲＮＡを誤って転写してしまう可能性が内在するのである。
【０１７１】
そこで、両コード化関数のプライマーおよび遺伝子ＲＮＡが形成するハイブリッドの構造および安定性を計算したところ、両コード化関数のＰ１について、プロモータＰ２および遺伝子ＲＮＡがＰ１のプロモータ配列と安定なハイブリッドを形成したり、遺伝子ＲＮＡ断片が非特異的プライマーとして機能したりする可能性が示された（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。コード化関数で用いるプライマーは、ターゲット特異的配列にＴ７プロモータ配列を加えた長い一本鎖ＤＮＡ部分が含まれるため非特異的なハイブリッドが起こりやすい上に、プライマー・ダイマーなどの形成によりプモータ配列が二本鎖化されると誤ってコード配列ＲＮＡを出力してしまうため、配列の設計には特に注意を払う必要があると考えられる。さらに、ここで報告したレトロウイルス型分子コンピュータに用いる関数は添加されるオリゴＤＮＡで定義されるもので、同一反応液中に複数のプライマーを添加することにより原理的に複数の関数を同時に実行することが可能となる。これにより遺伝子の発現解析などより複雑なプログラムが実現しうるが、同一反応液中に多数の関数を共存させると反応液中に加えるオリゴＤＮＡの種類もそれに応じて増大し、非特異的な反応の問題はさらに大きくなる。そのため、高度なプログラムを構築する際には適切な核酸の配列設計する技術の開発が望ましい。たとえば、上述した正規直交化配列とすることが好ましい。
【０１７２】
本研究により、レトロウイルス型分子コンピュータを実装するために必要となる反応がｉｎ  ｖｉｔｒｏにて実現しうることが示された。さらに、本研究でターゲットとしたＴＧＴＰ遺伝子およびＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子は、移植手術後に移植片対宿主反応（ＧＶＨＲ）の遺伝子診断を行なうためのマーカー遺伝子として利用が期待されるものである。今回はこれらの遺伝子を引数とするコード化関数と、その出力を受け取って演算関数を実行する関数で構成される遺伝子発現解析プログラムを設計し、さらにこの反応の一部が確かに実行されることが実験的に示された。この分子コンピュータのシステムを用いることにより、単一試験管内で一定温度条件下での反応を実行させる操作を行なうだけで、試験管内の各分子が自律的に複数遺伝子の発現パターンを解析してその結果を出力する技術が確立されると期待され、簡便で正確な遺伝子診断技術としての応用が期待される。さらに将来的には、生体細胞内にて同様の分子コンピュータ・システムを実行するための研究へと発展することも期待され、本研究成果により分子コンピュータ研究に新たな方向性が示されたといえる。
【０１７３】
（複数の関数の多層化）
本分子コンピュータでは、ある関数の戻り値を他の関数の引数とすることが考えられる。ここでは、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子が存在する場合にＣｏｄｅ［３，２］配列ＲＮＡを出力するコード化関数と、その関数の戻り値が存在する場合にＣｏｄｅ［４，６，５］配列ＲＮＡを出力する関数とにより構成されるプログラムが、単一のコンピューティング反応液中にて動作することを確認する実験を行なった。ここでの反応の概略を図２４に示す。本実験では、このプログラムに対する入力としてＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子を加えた場合（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ＋）と、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子は加えずに同量の水のみを加えた場合（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  −）とについてコンピューティング反応を実行し、結果として得られたＲＮＡ産物を検出した。検出は、Ｃｏｄｅ［４，６，５］配列を、Ｃｏｄｅ［４］  ，Ｃｏｄｅ［５］に対するプライマーペアを用いたリアルタイムＰＣＲ法により行なった。その結果を図２５に示す。ＲＮＡ産物検出時において、逆転写反応時に通常濃度の酵素を添加したサンプル（ＲＴ＋；白棒）と、酵素は添加しなかったサンプル（ＲＴ−；黒棒）とに分けて実験したところ、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ＲＮＡを入力として与えた場合ではＲＴ＋のサンプルはＲＴ−と比較して非常に高いレベルで出力が検出されたが（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ＋）、入力を与えなかった場合にはＲＴ＋とＲＴ−とではほとんど出力のレベルに変化はなかった（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  −）。ここでＲＴ−サンプルより得られた出力は実験上のバックグラウンドであり、ＲＴ＋とＲＴ−とにおける検出結果の差が出力として得られたＲＮＡ分子の量を反映するものと考えられる。また、上の反応産物について、図２４に示すプログラムの中間産物であるＣｏｄｅ［３，２］ＲＮＡについても同様に検出反応を行なったところ、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎを与えたときに確かにＣｏｄｅ［３，２］の濃度も上昇していることが確かめられた（図２６，白棒：ＲＮＡ＋，黒棒：ＲＮＡ−）。
【０１７４】
以上の結果から、図２４に示した２種類の関数よりなるプログラムは確かに実行され、複数の関数を単一のコンピューティン反応液中にて組み合わせて実行することが可能であることが示された。関数を多層に重ねることにより複雑なプログラムが実現することも考えられることから、このように関数の戻り値が実際に他の関数の引数となることは重要である。
【０１７５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】レトロウイルスのゲノム複製サイクルと示す模式図。
【図２】本発明の方法の基本的な処理を示す処理フロー図。
【図３】本発明の方法の基本的な処理を示す処理フロー図。
【図４】分子コンピュータに使用する反応を示す模式図。
【図５】本発明の情報処理方法の概念図。
【図６】各種基本関数の模式図。
【図７】遺伝子のコード化と論理演算による遺伝子解析方法を示す模式図。
【図８】ニューラル・ネットワークによる遺伝子解析方法の概略図。
【図９】ＦＲＥＴによる検出のための演算用核酸を示す図。
【図１０】高温反応条件におけるＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定結果を示す図。
【図１１】高温反応条件におけるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性の測定結果を示す図。
【図１２】高温反応条件におけるＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定結果を示す図。
【図１３】本発明の方法において使用したＴＧＴＰ−Ｐ１プライマーの概略図。
【図１４】ＴＧＴＰ−Ｐ１プライマーを使用した伸長の活性と特異性を示す電気泳動写真。
【図１５】ＴＧＴＰ遺伝子の発現を検出するための遺伝子のコード化関数を示す概略図。
【図１６】ＴＧＴＰ遺伝子の発現を検出するための関数による演算の出力結果を示す図。
【図１７】ＴＧＴＰ遺伝子の発現を検出するための関数による演算の出力結果を示す図。
【図１８】複数のＲＮＡ分子にまたがる経路の逆転写反応に使用した符号化核酸の概略図。
【図１９】複数のＲＮＡ分子にまたがる経路の逆転写反応の反応産物を示す電気泳動写真。
【図２０】論理演算反応のための演算用核酸の概略図。
【図２１】論理演算反応の結果を示す図。
【図２２】ＴＧＴＰ遺伝子のセンス鎖ＲＮＡを増幅するためのＡｍｐｌｉｆｙ関数に使用する演算用核酸を示す図。
【図２３】ＴＧＴＰ遺伝子のセンス鎖ＲＮＡを増幅するためのＡｍｐｌｉｆｙ関数による演算結果を示す電気泳動写真。
【図２４】関数を多層に重ねた場合の反応の一例を示す図。
【図２５】反応産物中のＣｏｄｅ［４，５，６］ＲＮＡの検出結果を示す図。
【図２６】反応産物中のＣｏｄｅ［３，２］ＲＮＡの検出結果を示す図。
【符号の説明】
１１  引数
１２  関数
１３  戻り値
２１  第１の一本鎖核酸
２２  化学反応
２３  第２の一本鎖核酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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