(57)【要約】【課題】被験者の末梢血白血球における特定の遺伝子群の発現量を測定することにより、簡便に精度よくうつ病の評価を行うこと。【解決手段】被験者の末梢血由来のメッセンジャーＲＮＡより、アポトーシス関連遺伝子、ＡＴＰａｓｅ関連遺伝子、細胞周期関連遺伝子、サイトカイン関連遺伝子、熱ショックタンパク質関連遺伝子、ポリメラーゼ関連遺伝子、ＧＴＰ結合タンパク質関連遺伝子、プロテインキナーゼＣ関連遺伝子、及びミトコンドリアチトクロームＣオキシダーゼ関連遺伝子から選ばれる少なくとも１種類以上の遺伝子の発現量を解析し、前記解析結果を基に被験者のうつ病の病状を評価する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の末梢血由来のメッセンジャーＲＮＡより、アポトーシス関連遺伝子、ＡＴＰａｓｅ関連遺伝子、細胞周期関連遺伝子、サイトカイン関連遺伝子、熱ショックタンパク質関連遺伝子、ポリメラーゼ関連遺伝子、ＧＴＰ結合タンパク質関連遺伝子、プロテインキナーゼＣ関連遺伝子、及びミトコンドリアチトクロームＣオキシダーゼ関連遺伝子から選ばれる少なくとも１種類以上の遺伝子の発現量を解析し、前記解析結果を基に被験者の病状を評価することを特徴とする、うつ病の評価方法。
【請求項２】
被験者の末梢血由来のメッセンジャーＲＮＡより、表１に記載した遺伝子から選ばれる、少なくとも１種類以上の遺伝子の発現量を解析し、前記解析結果を基に被験者の病状を評価することを特徴とする、うつ病の評価方法。
【請求項３】
被験者と健常者の遺伝子の発現パターンを比較解析することにより、被験者の病状を評価することを特徴とする、請求項１又は２に記載のうつ病の評価方法。
【請求項４】
同一被験者の治療前後の遺伝子の発現パターンを比較解析することにより、被験者の病状を評価することを特徴とする、請求項１又は２に記載のうつ病の評価方法。
【請求項５】
ＤＮＡチップを用いて遺伝子の発現量を解析することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のうつ病の評価方法。
【請求項６】
末梢血由来のメッセンジャーＲＮＡが、末梢血白球由来のメッセンジャーＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のうつ病の評価方法。
【請求項７】
表１に記載した遺伝子から選ばれる、少なくとも１種類以上の遺伝子に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するためのプローブを基板上に固定したうつ病評価用固相化試料。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のうつ病の評価方法を利用したうつ病評価システムであって、被験者の遺伝子発現量、年齢及び性別の各データと、あらかじめ取得しておいた健常者の遺伝子発現量、年齢及び性別の各データとを比較解析することを特徴とする、前記システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、うつ病の評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
うつ病は生涯罹患率が１０％前後の頻度の高い疾患であり、その頻度は現代社会のストレスに促進されて今後さらに増加することが予想される。この疾患は、罹患者の精神と身体に著しい苦悩をもたらし、その社会生活に甚大な支障をきたすばかりか、自殺に結びつくことも少なくない重大な疾患である。年間３万人以上にものぼる自殺者の大半はうつ病に罹患していたと推定されている。また、怠学、失職、引きこもりなどの社会的問題やアルコール関連障害などの医学的問題にも深く関連している。この疾患を的確に診断し、すみやかに治療する体制を確立することは、国民生活の向上に必須であり、社会全体の急務である。
【０００３】
うつ病の診断は、しかし決して簡単ではない。うつ病の主症状は、抑うつ気分、意欲低下、興味と喜びの喪失、集中力と注意力の減退、自己評価と自信の低下、罪責感と無価値感、将来への悲観、自殺念慮、睡眠障害、食欲不振などである。これらの症状には特有の特徴があり、誰もが経験する気分の落ち込みとは異なっており、身体疾患罹患時の疲弊感に伴う精神活動低下とも異なっている。うつ病の症状を把握するためには、詳しく病歴を聴取し、心理行動面に表れる症状がいつからどのように出現し、社会生活や家庭生活の上でどのような支障が生じているのかを聞きとり、受診時の患者の態度や会話内容などから、諸症状を確認することが主体となる。家族歴、既往歴、身体的健康状態、生育歴、生活史、性格傾向、病前社会適応状況、きっかけとなった出来事の有無、などは重要な参考事項となる。これらを的確に把握するためには、十分に熟練した精神科専門医による一時間ほどの面接が必要となる。さらに一般的身体状態及び神経学的状態に大きな異常のないことをを確認し、必要に応じて脳波や脳画像検査によって脳器質性疾患を除外して診断に至る。得られた所見を、世界保健機構（ＷＨＯ）やアメリカ精神医学会による診断基準と照合し、診断を確定することが一般的である。
【０００４】
従来の診断方法の大きな問題点は、診断に熟練した技能を要することである。うつ病に関する十分な知識と経験が必要であることはいうまでもないが、うつ病には該当しなくともうつ状態を呈する心理的、精神科的及び身体的状態は数多い。それらとの鑑別診断も必須となる。したがって、診断には十分な研修を積んだ精神科専門医師があたらねばならない。しかし、生涯罹患率が１０％前後というありふれた病気であるうつ病は、プライマリーケア医師を受診することが多い。精神科的な診察に習熟していない一般医師にとって、客観的検査所見のないうつ病の診断は必ずしも容易ではない。また、うつ病は薬物療法をはじめとする身体（脳）に対する治療が必要である医学的疾患であり、臨床心理士などの臨床心理学の専門家や保健婦などの精神保健活動従事者が、単独で診断することは困難である。
【０００５】
診断に習熟を要するのは、簡便かつ客観的な症状評価方法が存在しないことが大きな要因となっている。現在も、自己記入式の質問紙によるスクリーニング方法もあるが、あくまで主観的に記入されるため、性格要因、環境要因あるいは身体状態不良による気分の落ち込みと本来のうつ病を区別することはできない。医師の用いる症状評価尺度もあり、重症度の判定にはしばしば使用されるが、これも各項目の評価には適切な問診が必要であって、診察に代わる物ではない。
【０００６】
客観的な指標を目指して、これまでにもいくつかの検査方法が試みられている。うつ病は、脳内のモノアミン系の機能的変調があり、その変調は心身相関作用を通して、神経内分泌系、神経免疫系、自律神経系に少なからぬ影響を及ぼしていることが知られている。特に、神経内分泌的な異常のひとつである軽度の副腎皮質ホルモン分泌亢進をデキサメサゾン抑制試験によって的確に把握してうつ病の診断に応用する試みは、１９８０年代以降に精力的に研究されたが、試験薬服用という煩雑さ及び感度や特異性の限界から臨床応用には至らなかった。研究段階では、その他の神経内分泌系、神経免疫系、自律神経系、日内リズムや睡眠構築の異常なども報告されている。最近では、脳血流や脳内モノアミン受容体の変化なども指摘されているが、いずれも感度や再現性に問題が残る。いずれに着目するにしても、限られた因子を測定する方法ではうつ病という複雑な精神疾患を評価することそのものが困難であるとも言える。また、従来の検査は、施行と評価には膨大な時間と労力が必要であり、簡便性という観点をも考慮すると、日常診療への応用はとうてい望むことが出来ないのが現状である。
【０００７】
一方、うつ病の病因としては、これまで、カテコラミン仮説、インドールアミン仮説、ＧＡＢＡ仮説、グルタミン仮説、ドーパミン仮説、神経新生仮説、などが提唱されてきた。これらの仮説に対しては多くの矛盾点が指摘され、現在に至っても結論は得られていない。分子遺伝学的手法による連鎖研究や関連研究、ならびに連鎖解析による染色体の感受性領域の検索もなされているが、うつ病のように、複数の遺伝子の相互作用により素因（生物学的特性）が形成され、さらに、ストレスのような環境因子によって発症する疾患では、病原遺伝子を解析することは極めて困難である。これまでの遺伝子解析から、うつ病に関連する機能的候補遺伝子として、セロトニントランスポーター、セロトニン１Ａ／２Ｃ受容体、ドーパミンＤ２／Ｄ３受容体、ドーパミントランスポーター、チロシン水酸化酵素、トリプトファン水酸化酵素、モノアミン酸化酵素、ＡＴＰａｓｅなどの遺伝子が報告されている。例えば、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅと精神疾患については、うつ病（例えば、非特許文献１参照）や気分変調症（例えば、非特許文献２参照）との関連が指摘されている。また、うつ病治療薬ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅによる症状の改善と赤血球のＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ活性の上昇が相関することも報告されている（例えば、非特許文献３参照）。しかしながら、一方ではこれらに対しては否定的な追試もなされている。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｄｅｐｒｅｓｓ  Ａｎｘｉｅｔｙ  １９９７；５：ｐ５３−６５
【非特許文献２】
Ｊ．  Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０００；１１（４）：ｐ３７５−９４
【非特許文献３】
Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９；４０（３）：１３４−９
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、簡便に数多くの因子を測定することで、精度高くうつ病を評価する方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ストレスが発症に重要な役割を果たすうつ病の病態を客観的に評価するため、検体として容易に得られ、しかも、ストレスに関連する因子の受容体の多くを発現する末梢血白血球に着目した。そして、ストレス応答に関連する１５００遺伝子のｍＲＮＡの発現パターンを網羅的に解析し、パターン化することでうつ病を評価しうる方法を見出し、本発明の完成に至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、被験者の末梢血由来のメッセンジャーＲＮＡより、アポトーシス関連遺伝子、ＡＴＰａｓｅ関連遺伝子、細胞周期関連遺伝子、サイトカイン関連遺伝子、熱ショックタンパク質関連遺伝子、ポリメラーゼ関連遺伝子、ＧＴＰ結合タンパク質関連遺伝子、プロテインキナーゼＣ関連遺伝子、及びミトコンドリアチトクロームＣオキシダーゼ関連遺伝子から選ばれる少なくとも１種類以上の遺伝子の発現量を解析し、前記解析結果を基に被験者の病状を評価することを特徴とする、うつ病の評価方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、被験者の末梢血由来のメッセンジャーＲＮＡより、表１に記載した遺伝子から選ばれる、少なくとも１種類以上の遺伝子の発現量を解析し、前記解析結果を基に被験者の病状を評価することを特徴とする、うつ病の評価方法に関する。
【００１３】
ある態様において、本発明の方法は、被験者と健常者の遺伝子の発現パターンを比較解析することにより、被験者の病状を評価することを特徴とする、うつ病の評価方法である。
【００１４】
また、別な態様において、本発明の方法は、同一被験者の治療前後の遺伝子の発現パターンを比較解析することにより、被験者の病状を評価することを特徴とする、うつ病の評価方法。
【００１５】
本発明の方法において、遺伝子の発現量は、ＤＮＡチップ、ＤＮＡアレイ等の固相化試料、定量的ＰＣＲ法、ノーザンブロット法等、任意の方法を用いて解析されるが、なかでもＤＮＡチップを用いた方法が好ましい。
また、本発明の方法において、末梢血由来のメッセンジャーＲＮＡは、末梢血白球由来のメッセンジャーＲＮＡであることが好ましい。
【００１６】
本発明はまた、表１に記載した遺伝子から選ばれる、少なくとも１種類以上の遺伝子に特異的にハイブリダイズし、該遺伝子を検出するためのプローブを基板上に固定したうつ病評価用固相化試料に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、本発明のうつ病の評価方法を利用したうつ病評価システムを提供する。前記システムは、被験者の遺伝子発現量、年齢及び性別の各データと、あらかじめ取得しておいた健常者の遺伝子発現量、年齢及び性別の各データとを比較解析することによりうつ病の評価を行うことを特徴とする。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について実施例に従って詳細に説明する。
本発明者らは、以下に記載する患者及び健常者より採血し、全血よりＲＮＡを抽出した後ＤＮＡチップを用いて、患者及び健常者発現解析を行った。ＤＮＡチップとは、ガラス等の支持基体上に多数の遺伝子に相当する塩基配列を有するＤＮＡ断片を固定化したものであり、ハイブリダイゼーションにより、サンプル中のＤＮＡあるいはＲＮＡを検出するものである。なお、上記ＤＮＡチップに代えて、検出対象であるＤＮＡ断片が固定化された他の固相化試料、例えば、ＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター等も好適に利用することができる。
【００１９】
対象患者は次の通りである。徳島大学医学部附属病院精神科神経科を平成１３年１１月から平成１４年６月までの間に受診した未治療のうつ病患者のうち、本診断法開発のための研究に参加することについて文書により説明し同意を得たものを対象とした。本研究は徳島大学医学部附属病院倫理委員会の承認を得ている。診断は、ＩＣＤ−１０（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）のうつ病エピソードに合致するものとした。また重篤な身体合併症を有するものや身体疾患治療薬を服用しているものは除外した。午前１０時から午後１時までの空腹時に医師又は看護師が、安静下に肘静脈より採血した。
【００２０】
治療前のサンプルを得た１４名の患者は、男性１１名、女性３名、年齢は２８歳から７０歳まで（平均４６歳）であり、ハミルトン評価尺度得点は１２点から３４点（平均２３．７点）であった。
これらの患者に関しては、ＲＮＡ発現量を、性、年齢のマッチした健常対照者と比較した。健常者の採血は午前１０時から午後１時までの空腹時に行った。
【００２１】
治療後の寛解後のサンプルを得た６名は、男性５名、女性１名、年齢は３１歳から７１歳（平均４９．８歳）であり、ハミルトン評価点は１点から９点（平均５．５点）であった。治療は主として抗うつ薬による薬物療法である。寛解は臨床的綜合判断によるが、通常寛解状態に達しているとみなされるハミルトン評価点７点以下という基準を一例を除いて満たしていた。治療後のサンプルは、治療前サンプルから６８日〜２１１日後（平均１２１日）に採取した。治療後のＲＮＡ発現量は、治療前の同一人物のサンプルと比較した。
【００２２】
治療前のサンプルを得た１４名の患者から５ｃｃ、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社製）を用いて採血し、トータルＲＮＡを抽出した。トータルＲＮＡの収量は、５−１５マイクログラムであった。次に、各患者より抽出したトータルＲＮＡを５マイクログラムずつ取り出し、Ｔ７プロモータ配列を付加したオリゴ（ｄＴ）２４プライマーをアニールさせ、まず、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ合成を行った。次に、このＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを鋳型にして、Ｔ７プロモータ配列を有するＳｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを合成した。最後にＳｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを鋳型にして、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるＲＮＡ合成を行った。合成したＲＮＡ６マイクログラムに対し、ランダムヘキサマーをアニールさせ逆転写酵素反応を行い、Ｃｙ５−ｄＣＴＰを鎖中に取り込ませることで蛍光標識したｃＤＮＡを合成した。これらの患者に対して、性、年齢のマッチした健常対照者１４名から、患者の場合と同様に５ｃｃ採血した後トータルＲＮＡを抽出し、蛍光ラベルとしてＣｙ３を用いた以外は同様の手順でｃＤＮＡを合成した。
治療前後の同一人物のサンプルを比較する場合には、治療後のサンプルをＣｙ５で、治療前のサンプルをＣｙ３でラベルしたｃＤＮＡを合成した。
【００２３】
比較解析を行う２種類のｃＤＮＡを等量混合した後、ＤＮＡチップ（日立製作所社製薬物応答解析用ＤＮＡチップ）にかけてハイブリダイゼーションを６２℃で、１２時間行った。洗浄後スキャナー（ＧＳＩ−Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製ＳｃａｎＡｒｒａｙ  ５０００）により各スポットの蛍光強度を測定し、患者サンプルと健常対照者サンプル、あるいは治療前後の同一人物のサンプル間の各遺伝子における発現量の比を求めた。
【００２４】
解析の方法は次の通りである。２０組すべてのデータで蛍光強度が５００以上である遺伝子群（６９２個）を選び、遺伝子群をグループ分けするクラスタ解析を行った。解析には、クラスタ間の重み無し平均ユークリッド距離を基にした凝集型クラスタリング法を用いた。
【００２５】
解析結果を図１−図１０に示す。図では、発現比（Ｃｙ５／Ｃｙ３）の対数（底２）を取り、その値を示している。サンプル番号１−１４は、患者（Ｃｙ５）と健常対照者（Ｃｙ３）との比較、サンプル番号１５−２０は、同一人物の治療後（Ｃｙ５）と治療前（Ｃｙ３）との比較である。図１及び図２より、特定の遺伝子群（図１のＴＣＥＢ１ＬからＣＣＲ５、図２のＣＹＰ１Ｂ１からＰＴＰＲＣ）では、健常対象者群に比べて患者群において発現量が減少している（サンプル番号１−１４）と同時に、治療前に比べ治療後発現量が増加している（サンプル番号１５−２０）傾向が顕著に現れていることが分かる。解析結果の表示は、発現比（Ｃｙ５／Ｃｙ３）の対数値を数値段階別等で色分けして表示すると分かりやすい。これらの遺伝子群では、疾患の状態では健常時に比べ発現量が減少しており、治療後疾患の状態が快復すると治療前に比べその発現量が増加している。したがって、これらの遺伝子群はうつ病の評価マーカーとして有用であることが分かった。すなわち、これらの遺伝子群の発現量が健常人あるいは健常時に比べて減少している場合には、うつ状態である可能性が高いものと判断することが出来る。他の遺伝子について見てみると、サンプル番号１−１４と１５−２０で大きく挙動の異なる傾向は観測されなかった。
【００２６】
うつ病の評価マーカーとして選定された遺伝子群を表１に纏めて示す。アポトーシス関連遺伝子、ＡＴＰａｓｅ関連遺伝子、細胞周期関連遺伝子、サイトカイン関連遺伝子、熱ショックタンパク質関連遺伝子、ポリメラーゼ関連遺伝子、ＧＴＰ結合タンパク質関連遺伝子、プロテインキナーゼＣ関連遺伝子、ミトコンドリアのストレス応答性チトクロームＣオキシダーゼ関連遺伝子が多く含まれていることが分かる。したがって、前記カテゴリーに含まれる遺伝子群の発現量を測定することで、うつ病の評価をすることが可能であることが明らかになった。
【００２７】
うつ病のメカニズムに関しては、現在の所不明確ではあるが、評価マーカーとして選ばれた遺伝子群とうつ病との関係については以下のようなことが知られている。
【００２８】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は、レニン・アンギオテンシン系の調節の鍵を握る酵素であり、また、中脳のドーパミンの代謝回転を調節することから、散発性アルツハイマー病の関連候補遺伝子の一つとして  （Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２００１；９（６）：４３７−４４４）、精神疾患との関連が指摘されている。また、統合失調症とＡＣＥ遺伝子の多型解析も行われている（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００１；４４（１）：３１−３５）。
【００２９】
最近、イオンチャンネルの機能障害が関係する病態を“チャンネル病”として捉える概念が提唱されている。イオンチャンネルは神経細胞の活動に最も重要な機能であり、てんかん、失調症、偏頭痛、統合失調症、アルツハイマー病や他の神経変性疾患などとの関連が指摘されている（ＣＮＳ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ  ２００１；７（２）：２１４−２４０）。なかでも、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅと精神疾患については、うつ病（Ｄｅｐｒｅｓｓ  Ａｎｘｉｅｔｙ  １９９７；５：５３−６５）や気分変調症（Ｊ  Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０００；１１（４）：３７５−９４）との関連が指摘されている。例えば、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅのαサブニットＡＴＰ１Ａ３（Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １９９８；４４：４７−５１）とβサブユニットＡＴＰ１Ｂ３  （Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｉａｔｒｙ  １９９５；３７：２３５−２４４）と双極性障害病との関連が報告されている。さらに、うつ病治療薬ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅによる症状の改善と赤血球のＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ活性の上昇が相関することも知られている（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９；４０（３）：１３４−９）。ＡＴＰ１Ｂ３Ｐ１はＡＴＰ１Ｂ３の偽遺伝子で同一のゲノムから転写される。また、ＡＴＰＸは、１９９５年に発見されたＡＴＰａｓｅでＸ染色体に関連した知能発育不全症（ＡＴＲ−Ｘ症候群，  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ症候群，  Ｊｕｂｅｒｇ−Ｍａｒｓｉｄｉ症候群，  Ｓｍｉｔｈ−Ｆｉｎｅｍａｎ−Ｍｙｅｒｓ症候群）との関連が指摘されている。ＡＴＰ２Ｃ１は新規のカルシウムポンプ（Ｐ型Ｃａ輸送ＡＴＰａｓｅ）で、その突然変異はＨａｉｌｅｙ−Ｈａｉｌｅｙ病の原因とされている。本発明者らは、これらのアイソザイムを含めたＡＴＰａｓｅのｍＲＮＡ発現パターンの変化がうつ状態を反映することを初めて実証した。
【００３０】
インターロイキン（ＩＬ）−１，  ６，８などの炎症性サイトカインは、ストレス反応に関与し、中枢にも作用して、傾眠、食欲低下などをきたす。また、Ｃ型肝炎の治療に用いるインターフェロンαの主な副作用としてうつ病状態が発症することが知られている。
【００３１】
本発明者らによるうつ病患者の解析では、サイトカイン受容体（ＣＲＦ２−４；  ＣＲＦＢ４）、ＩＬ−１２β２受容体、ＩＬ−１３受容体第三鎖、１型ＩＬ−１受容体ホモログ（ＩＬ−１Ｒｒｐ）、ＩＬ−２受容体β鎖、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−８、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ４  （ＬＳＩＲＦ／ＩＲＦ４）、インターフェロン誘導蛋白質（ＩＳＧ１５）、インターフェロンγ誘導蛋白質ＩＦＩ１６、インターフェロンα応答遺伝子ＩＦＩ２７、新規インターフェロン応答遺伝子ＩＦＩＴ１とＩＦＩＴ４、インターフェロン誘導性ｍＲＮＡ断片（Ｇ１Ｐ３）、インターフェロンα受容体、インターフェロンγ受容体、新規サイトカイン（ＧＲＯ１，  ＧＲＯ２）、血小板由来ケモカイン（ＳＣＹＢ５）、ＣＣケモカイン受容体（ＣＣＲ５）、Ｔ細胞受容体（ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ８Ｂ１）、ＩｇＥ受容体α鎖などのｍＲＮＡの発現が低下していた。また、サイトカインのシグナル伝達に関与するＩκＢキナーゼ足場蛋白質（ＩＫＢＫＡＰ）、ＪＡＫ１、ＭＡＰキナーゼファミリー（ＭＡＰＫ２ｋ１，  ＭＡＰ３Ｋ１，  ＭＡＰ３Ｋ７，  ＭＡＰ４Ｋ４）などのｍＲＮＡの発現低下が認められた。逆に、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＩＦＩ２７、インターフェロン応答遺伝子（ＩＦＩＴＭ１，  ＩＦＩＴＭ３）、インターフェロンα、ＩＬ−１０受容体サブユニット（ＩＬ１０ＲＢ）、ＮＫ細胞刺激因子（ＩＬ−１２Ｂ）、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ＩＬ−３、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−８、ＩＬ−８α受容体、インターフェロン誘導蛋白質（ＩＳＧ１５，  ＩＳＧ２０，ＭＸ１，  ＭＸ２）、マクロファージ炎症蛋白質  （Ｇ０Ｓ１９−１）  、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＲＡＩＬ受容体３、などのｍＲＮＡの発現が亢進していた。ストレスが発症に起因するうつ病患者では、多くのサイトカイン関連遺伝子の発現変化が認められた。特に、インターフェロン関連遺伝子の発現変化が大きく、インターフェロン治療によるうつ病発症との関連を説明するデータを考えられる。
【００３２】
さらに、１４名のうつ病患者と健常人との比較ならびに病状軽快前後の発現パターンを解析し、うつ病に特徴的な遺伝子発現をクラスター解析で評価すると、ＴＮＦ−α  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ（ＡＤＡＭ１７）、ＩＬ−１６、ＩＬ−１０受容体、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ２、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ５  （ＴＲＡＦ５）、ＩＬ−２受容体β鎖、血小板由来ケモカイン（ＳＣＹＢ５）のｍＲＮＡはうつ病患者で共通して低下し、治療により発現が回復した。また、新しく見い出されたＩＬ−８遺伝子のプロモータのサプレッサーモチーフに結合するＮＦ−ｋａｐｐａＢ抑制転写因子（ＮＲＦ）が共通して低下しており、多くの炎症性サイトカインの発現低下との関連が注目される。さらに、Ｔリンパ球の受容体型ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの代表とされるＣＤ４５のｍＲＮＡもうつ病で低下し、病状の回復とともに発現も回復した。リンパ球の受容体を介する多くの刺激は、受容体ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅとｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの活性のバランスにより、シグナルの強弱が調節されている。このＣＤ４５（ＲＢＢＰ４）ｍＲＮＡの発現低下は免疫機能に少なからず影響を及ぼすと考えられる。また、ＴＧＦ−βやＴｏｌｌ様受容体の下流にあり、これらのレセプターの重要なシグナル伝達分子であるＴＡＫ１（ＭＡＰ３Ｋ７）や、インテグリンα４サブユニット、β１インテグリン（ＩＴＧＢ１）、ＣＤ９の発現もともに低下し、病状軽快とともにｍＲＮＡの発現が回復した。これらの結果から、免疫系細胞の機能調節因子のｍＲＮＡ発現パターンはうつ病の評価に極めて有用と考えられる。
【００３３】
種々の環境ストレスで誘導され、細胞のストレス応答と耐性能の獲得に寄与する熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）ファミリーも、うつ病患者の白血球で比較的大きな変動が認められた。ＭＨＣ関連ＨＳＰ７０−１（ＨＳＰＡ１Ａ）、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ６、ＨＳＰＢ１、ＨＳＰＣＡのｍＲＮＡ発現の亢進を認めた。しかしながら、うつ病患者の全般的な特徴として、本来ストレスで発現が亢進すべき熱ショック転写因子（ＨＳＦ２）、ＤｎａＪホモログ（ＨＳＪ２）、ＨＳＰ１０５Ｂ、ＨＳＣ７０（ＨＳＰＡ１０）、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  ＨＳＰ７０（ＨＳＰＡ４）、ミトコンドリアＨＳＰ７５（ＨＳＰＡ９Ｂ）、ＨＳＰ２７−１（ＨＳＰＢ１）、ＨＳＰ９０α（ＨＳＰＣＡ）、ＨＳＰ９０β（ＨＳＰＣＢ）、シャペロニンＨＳＰ６０（ＨＳＰＤ１）、シャペロニン１０  （ＨＳＰＥ１）など多くの熱ショック蛋白質の発現が逆に低下していることを見いだした。このことは正常なストレス耐性能の獲得機構の異常が病態を反映していると考えられる。特に、シャペロニンＨＳＰ６０（ＨＳＰＤ１）、構成的に発現しているＨＳＰ７０（ＨＳＰＡ１０）、及びＨＳＰＡ４はうつ病患者に共通して低下が見られ、病状の軽快とともに発現が上昇する。これらのＨＳＰファミリーはうつ病の診断に有力な遺伝子群であると考えられる。さらに、熱ショック蛋白質以外のストレス関連遺伝子の発現変化が認められた。低酸素ストレス応答の鍵を握る転写因子である低酸素誘導因子（ＨＩＦ１）や浸透圧ストレス応答に関連しグルココルチコイド応答キナーゼ（ＳＧＫ）もうつ病患者で共通してｍＲＮＡの発現が認められ、さらに、グルココルチコイド受容体αの発現低下も見られた。これらのｍＲＮＡも病状回復にあわせて発現が回復した。これらの結果から、うつ病患者では、全般的に環境適応応答が低下しており、基本的な細胞活動の低下を生じていると考えられる。
【００３４】
今回、うつ病との関連は明らかにされていないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのサブユニットや結合蛋白質遺伝子のｍＲＮＡの発現低下が共通に認められ、また、病状の軽快に伴いそれらの発現が回復している。１４０  ｋＤａのＲＮＡ  ポリメラーゼＩＩサブユニット蛋白質遺伝子（ＰＯＬＲ２Ｂ）、ＲＮＡ  ポリメラーゼＩＩ転写伸張因子Ｂ（ＳＩＩＩ）ポリペプチド１（ＴＣＥＢ１）、ＲＮＡ  ポリメラーゼＩＩ転写伸張因子Ｂ（ＳＩＩＩ）ポリペプチド１ホモログ（ＴＣＥＢ１Ｌ）  、ＲＮＡ  ポリメラーゼＩＩ  ＴＡＴＡボックス結合蛋白質関連因子ＡＦ２Ｂ）、ｐｏｌｙ（Ａ）  ポリメラーゼ、βＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター新規アイソザイム（ＳＬＣ３５Ａ１）、ポリメラーゼγ２アクセサリーサブユニット（ＰＯＬＧ２）などのポリメラーゼ関連遺伝子群の発現はうつ病の病状を反映した。
【００３５】
最近、モノアミンをはじめとする神経伝達物質の代謝やそれぞれの受容体そのものにうつ病との関連を求めようとする以外に、受容体以降のシグナル伝達や転写因子を介した遺伝子発現の経路にその原因を探る研究が注目されている。モノアミン受容体は７回膜貫通型の受容体でＧ蛋白質とカップリングし、イノシトールリン酸回路やｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  （ＰＫＣ）の活性化を引き起こす。また、ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰの上昇とｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｎｅ  Ａ（ＰＫＡ）の経路も活性化する。さらに、これらのシグナル伝達経路により活性化される転写因子とその遺伝子産物にも焦点が当てられ、これらの経路の包括的な機能障害との関連を見出そうとしている。事実、双極性障害病患者の気分安定剤として効果が実証されているリチウム製剤は、Ｇ蛋白質、イノシトールリン酸回路、ＰＫＣ、ＰＫＡ、ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ３−ｂｅｔａ、Ａｋｔカスケードなどのシグナル伝達経路に働いて、その効果を発揮することが報告されている（Ｂｒ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２００１；４１：ｓｕｐｐｌ  １２８−１３３）。
【００３６】
このような報告を裏付けるような結果が、うつ病の病状と関連する遺伝子群の中に認められた。シグナル伝達因子として、ＰＫＣη（ＰＲＫＣＨ）、ＰＫＣｎｕ（ＰＲＫＣＮ）、及びＰＫＣβ１アイソザイム、ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｄｉｔｅ  ３’−ｋｉｎａｓｅ  αサブユニット（ＰＩＫ３ＣＡ）のｍＲＮＡの低下が認められた。また、リチウムは、ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ３を不活性化して、Ｗｎｔシグナルを増強するが、うつ病患者では、このＷｎｔシグナル経路に属する結合組織増殖因子関連蛋白質ＷＩＳＰ−３、βカテニン（ＣＴＮＮＢ１）、転写因子Ｅ２Ａ（ＴＣＦ３）、カルモジュリン依存性カルシニューリンＡγなどの低下が認められ、病状の軽快に伴い発現が回復した。また、ＧＴＰ結合蛋白質であるＲＡＢ１１Ａ、ＲＡＢ４、ＲＡＢ７Ｌ１のｍＲＮＡ発現低下ならびにＧＴＰａｓｅ活性化蛋白質ｒａｓｐ２１ｍＲＮＡの発現低下が認められ、治療による回復が認められた。
【００３７】
増殖因子関連では、ＴＧＦ−βに関連して、ＴＧＦ−β受容体α、ＴＧＦ−β誘導性クローン２２ホモログ（ＴＳＣ２２）、前述のＴＧＦ−βシグナル伝達分子ＴＡＫ１のｍＲＮＡ、ＥＧＦ受容体ファミリーの一つであるＥＲＢＢ４、インスリンシグナル伝達分子ＩＲＳ４などのｍＲＮＡの発現はうつ病の病状を反映した。その他、ガン抑制遺伝子であるＲｂ関連蛋白質ＲＢＢＰ７、増殖抑制因子ＩＮＧ１、ＰＴＥＮ、ＳＴ１３、また、ガン遺伝子であるＲＵＮＸ１、ＫＲＡＳ２、ＭＹＣＬ１、ＢＭＩ１など、これらのｍＲＮＡが共通してうつ病患者で発現が低下し、病状軽快とともに発現が回復した。さらに、これらの増殖に関連した遺伝子の発現状況を反映して、細胞周期に関連するＣＤＣ２７、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫ７、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＧ１、ＰＣＮＡのｍＲＮＡ発現が共通して低下し、ＤＮＡ複製に関与するトポイソメラーゼＩＩβとトポイソメラーゼＩＩ結合蛋白質（ＴＯＰＢＰ１）のｍＲＮＡ発現低下が認められ全般的な増殖能低下を疑わせる所見がうつ病患者の白血球に認められた。また、これらの遺伝子の発現も病状回復とともに回復した。逆に、ＤＮＡ修復酵素ＭＳＨ６、増殖停止に関連するＧＡＤＤ４５Ａやアポトーシスシグナル分子であるＤＡＰ３、ＡＰＩ１、カスパーゼ１０のｍＲＮＡの発現低下もうつ病患者の病状と関連した。これらの増殖に関連した遺伝子の変化を総合すると、うつ病患者の白血球では細胞回転が全般的に低下していると推察される。
【００３８】
その他のカテゴリーに属する遺伝子として、ユビキチン様蛋白質（ＵＢＬ１）、ダイオキシン誘導性Ｐ４５０（ＣＹＰ１Ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１０などの遺伝子、また、白血球抗原としてＰＴＰＲＣ、ＬｅｗｉｓＸ抗原の合成に関連するＣＨＳＴ２に加え、ＡＲＮＴＬやＥＬＦ２といった転写因子の発現もうつ病の病状を反映したが、これらの意味については現時点では不明である。
【００３９】
本発明は、上記実験結果に基づき完成されたものである。本発明の概念図を図１１に示す。本発明では、被験者の抹消血を採取しＲＮＡを抽出して、その発現プロファイルを調べることで被験者のうつ病を評価するものである。採取する血液量は２−５ｃｃ程度で十分に評価できる。
【００４０】
本発明で用いられる、遺伝子の発現量を調べる方法は、ＤＮＡチップに限られるものではなく、定量的ＰＣＲ法、ノーザンブロット法等も使用できる事は明白である。
【００４１】
被験者より取得したＲＮＡサンプルと、健常者由来のＲＮＡサンプルとを互いに発光波長の異なる蛍光色素でラベルした後、同一のうつ病評価用ＤＮＡチップにかけて競合ハイブリダイゼーションを行い、各プローブにおける両サンプルの発現強度を評価して、被験者のうつ病の状態を評価することができる。また、一定のＲＮＡサンプル、たとえば市販のユニバーサルＲＮＡサンプルをコントロールサンプルとし、被験者サンプルとコントロールサンプルの発現比較解析と、健常者サンプルとコントロールサンプルとの発現比較解析を個別に行い、両者の発現データを照らし合わせて解析することで、被験者のうつ病の状態を評価することもできる。健常者と被験者のサンプルあるいはその発現データを比較する場合には、年齢、性別を合わせることが好ましい。健常者の発現データを年齢、性別に分けてデータベースとして蓄えておき、被験者の発現データをそれらと年齢、性を合わせた健常者のデータと比較解析することで、被験者のうつ病の状態を評価することが好ましい。データの解析方法としては、クラスタリングに限定されるものではなく、サポートベクターマシン等の機械学習のアルゴリズムも使用できる。とくに、うつ病患者及び健常者の発現データをコンピューターにあらかじめ学習させておき、被験者の発現データがうつ病患者と健常者のどちらの発現パターンに近いかをコンピューターに判断させ、それによって被験者のうつ病の状態を評価する方法が好ましい。上記うつ病の評価システムの概念図を図１２に示す。
【００４２】
本発明は、末梢血中のＲＮＡ発現量を一括定量することによってうつ病に特有の所見を得ることでうつ病を評価する方法を提供するものであり、うつ病の診療に画期的な向上をもたらすものである。
【００４３】
本発明の方法は、患者の特別な協力を必要とせず、通常の採血による５ｃｃの血液をもとに解析可能であり、非侵襲的、簡便かつ日常的に行うことのできる評価方法である。数多くのＲＮＡ発現量から生体機能を多面的に把握する本法は、従来の限られた因子を測定する方法に比べ、うつ病のように心と身体にまたがる複雑な精神疾患の評価方法として原理的にも適切である。
【００４４】
本発明の方法による結果の判定は簡単明瞭であり、うつ病の客観的な指標としてプライマリーケア医師が容易に使用でき、診断の確立や治療の導入にきわめて有用となる。また、職場、学校及び地域の検診時や人間ドック等で、集団の中からハイリスクグループを簡便かつ高精度に、しかも安価に選び出すことにより、うつ病の早期発見が可能となり、予防医学的見地から国民のこころの健康の向上にも大きく寄与することができる。
【００４５】
本法の有用性はプライマリーケアと検診に限らない。精神科専門医師にとっても、うつ病発症に関わる心理社会環境因子の検索、病態の評価、診断、及び治療評価、予後判定に応用することができ、精神医学の分野でも革命的な検査技術となる。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４７】
（実施例１）
３０代、４０代及び５０代の男女各々２名の健常人（総数１２名）から各々５ｃｃ採血し、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社製）を用いて採取し、トータルＲＮＡを抽出した。トータルＲＮＡの収量は、５−１５マイクログラムであった。次に、各健常人より抽出したトータルＲＮＡを５マイクログラムずつ取り出し、これらを混合した。混合したトータルＲＮＡ５マイクログラムに対して、Ｔ７プロモータ配列を付加したオリゴ（ｄＴ）２４プライマーをアニールさせ、まず、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ合成を行った。次に、このＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを鋳型にして、Ｔ７プロモータ配列を有するＳｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを合成した。最後にＳｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを鋳型にして、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるＲＮＡ合成を行った。合成したＲＮＡ６マイクログラムに対し、ランダムヘキサマーをアニールさせ逆転写酵素反応を行い、Ｃｙ３−ｄＣＴＰを鎖中に取り込ませることで蛍光標識したｃＤＮＡを合成し、共通のコントロールサンプルとした。
【００４８】
対象患者は次の通りである。診断は、ＩＣＤ−１０（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）のうつ病エピソードに合致するものとした。また重篤な身体合併症を有するものや身体疾患治療薬を服用しているものは除外した。治療前のサンプルを得た６名の患者は、男性３名、女性３名、年齢は３８歳から５５歳まで（平均４４歳）であり、ハミルトン評価尺度得点は１７点から３１点（平均２５．２点）であった。患者から各々５ｃｃ採血し、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社製）を用いて採取し、トータルＲＮＡを抽出した。トータルＲＮＡの収量は、５−１０マイクログラムであった。次に、各患者より抽出したトータルＲＮＡ５マイクログラムに対して、Ｔ７プロモータ配列を付加したオリゴ（ｄＴ）２４プライマーをアニールさせ、まず、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ合成を行った。次に、このＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを鋳型にして、Ｔ７プロモータ配列を有するＳｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを合成した。最後にＳｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡを鋳型にして、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるＲＮＡ合成を行った。ＲＮＡ６マイクログラムに対し、ランダムヘキサマーをアニールさせ逆転写酵素反応を行い、Ｃｙ５−ｄＣＴＰを鎖中に取り込ませることで蛍光標識したｃＤＮＡを合成した。
対照群として３０代、４０代及び５０代の男女各々１名の健常人（総数６名）から採血し、前記患者サンプルと同様にＣｙ５−ｃＤＮＡを合成した。
【００４９】
それぞれの被検者サンプルから作製したＣｙ５−ｃＤＮＡと、共通コントロールサンプルのＣｙ３−ｃＤＮＡを６マイクログラムずつ等量混合した後、ＤＮＡチップ（日立製作所社製薬物応答解析用ＤＮＡチップ）にかけハイブリダイゼーションを６２℃のもと１２時間行った。洗浄後スキャナー（ＧＳＩ−Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製ＳｃａｎＡｒｒａｙ  ５０００）により各スポットの蛍光強度を測定し、数値化ソフトウエア（ＧＳＩ−Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ）を用いて各遺伝子におけるコントロールサンプルと各被検者サンプルとの発現強度比を求めた。
【００５０】
すべてのデータで蛍光強度が５００以上である遺伝子群を評価マーカーとして選定した。選定した評価マーカー遺伝子群（表１）について、その発現強度比を表２に纏めて示す。表２から明らかなように、うつ病患者群では、健常対象者群に比べ評価マーカー遺伝子群の発現量が顕著に低下していることが分かる。
以上のように、特定遺伝子群の発現解析によるうつ病の評価は、臨床所見による結果と非常によい一致を示し、本発明の有効性が非常に高い事が示された。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
【表２】
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【００５３】
【発明の効果】
本発明は、うつ病の患者の末梢血白血球における遺伝子発現を解析した実験結果をもとに完成されたものであって、本発明の評価方法を用いることで、簡便に精度良くうつ病を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、各サンプルにおける遺伝子発現解析の結果を示す。
【図２】図２は、各サンプルにおける遺伝子発現解析の結果を示す。
【図３】図３は、各サンプルにおける遺伝子発現解析の結果を示す。
【図４】図４は、各サンプルにおける遺伝子発現解析の結果を示す。
【図５】図５は、各サンプルにおける遺伝子発現解析の結果を示す。
【図６】図６は、各サンプルにおける遺伝子発現解析の結果を示す。
【図７】図７は、各サンプルにおける遺伝子発現解析の結果を示す。
【図８】図８は、各サンプルにおける遺伝子発現解析の結果を示す。
【図９】図９は、各サンプルにおける遺伝子発現解析の結果を示す。
【図１０】図１０は、各サンプルにおける遺伝子発現解析の結果を示す。
【図１１】図１１は、本発明のうつ病評価方法の概念図である。
【図１２】図１２は、本発明のうつ病評価システムの概念図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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