(57)【要約】【課題】極微量試料で測定可能なグルコースセンサの高感度化と、試料への試薬の溶解の高速化のバイオセンサを提供する。【解決手段】電気絶縁性の基板１、基板１上に形成された作用極２および対極（図示せず）を主体とする電極系、ＧＯＤを含む領域５とフェリシアン化カリウムを含む領域３からなる試薬部９、および試料供給路７を構成する空間部を有しているバイオセンサにおいて、複数のＧＯＤを含む領域５と複数のフェリシアン化カリウムを含む領域３と被覆部４で前記試薬部９が構成された構造であることを特徴とし、さらにＧＯＤを含む領域５とフェリシアン化カリウムを含む領域３が３次元的に配置されているバイオセンサとなる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも作用極と対極とを有する電極系を設けた絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成された試料供給路と、前記試料供給路内に形成された試薬部とを備えたバイオセンサにおいて、前記試薬部は酵素を含む領域と電子伝達体を含む領域とをそれぞれ複数個有し、前記酵素を含む領域と前記電子伝達体を含む領域との間に被覆部が設けられていることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
試薬部において、複数の酵素を含む領域と電子伝達体を含む領域と被覆部とが基板面に対して平行な方向に形成および基板面に対して垂直な方向に形成されていることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項３】
酵素を含む領域と電子伝達体を含む領域とが交互に形成されていることを特徴とする請求項１または２記載のバイオセンサ。
【請求項４】
試薬層の表面が凹凸構造を有することを特徴とする請求項３記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に含まれる基質を迅速かつ高精度に定量するためのバイオセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
スクロース、グルコースなど糖類の定量分析法として、施光度計法、比色法、還元滴定法および各種クロマトグラフィーを用いた方法等が開発されている。しかし、これらの方法は、いずれも糖類に対する特異性があまり高くないので精度が悪い。これらの方法のうち施光度計法によれば、操作は簡便ではあるが、操作時の温度の影響を大きく受ける。従って、施光度計法は、一般の人々が家庭などで簡易に糖類を定量する方法としては適切でない。
【０００３】
ところで、近年、酵素の有する特異的触媒作用を利用した種々のタイプのバイオセンサが開発されている。
【０００４】
以下に、試料中の基質の定量法の一例としてグルコースの定量法について説明する。電気化学的なグルコースの定量法としては、酵素であるグルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４：以下ＧＯＤと略す）と酸素電極あるいは過酸化水素電極とを使用して行う方法が一般に知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００５】
ＧＯＤは、酸素を電子伝達体として、基質であるβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに選択的に酸化する。酸素の存在下で、ＧＯＤによる酸化反応過程において、酸素が過酸化水素に還元される。酸素電極によって、この酸素の減少量を計測するか、あるいは過酸化水素電極によって過酸化水素の増加量を計測する。酸素の減少量および過酸化水素の増加量は、試料中のグルコースの含有量に比例するので、酸素の減少量または過酸化水素の増加量からグルコースの定量が行われる。
【０００６】
上記方法では、酵素反応の特異性を利用することにより、精度良く試料中のグルコースを定量することができる。しかし、反応過程からも推測できるように、測定結果は試料に含まれる酸素濃度の影響を大きく受ける欠点があり、試料に酸素が存在しない場合は測定が不可能となる。
【０００７】
そこで、酸素を電子伝達体として用いず、フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等の有機化合物や金属錯体を電子伝達体として用いる新しいタイプのグルコースセンサが開発されてきた。
【０００８】
このタイプのセンサでは、酵素反応の結果生じた電子伝達体の還元体を作用極上で酸化することにより、その酸化電流量から試料中に含まれるグルコース濃度が求められる。この際、対極上では、電子伝達体の酸化体が還元され電子伝達体の還元体の生成する反応が進行する。
【０００９】
このような有機化合物や金属錯体を酸素の代わりに電子伝達体として用いることにより、既知量のＧＯＤとそれらの電子伝達体を安定な状態で正確に電極上に担持させて試薬層を形成することが可能となり、試料中の酸素濃度の影響を受けることなく、精度良くグルコースを定量することができる。
【００１０】
またこの場合、酵素および電子伝達体を含有する試薬層を乾燥状態に近い状態で電極系と一体化させることもできるので、この技術に基づいた使い捨て型のグルコースセンサが近年多くの注目を集めている。
【００１１】
その代表的な例が、使い捨て型のグルコースセンサである。これは測定器に着脱可能に接続されたセンサに試料を導入するだけで容易にグルコース濃度を測定器で測定することができる（例えば、特許文献１参照。）。このような手段はグルコースの定量だけに限らず、試料中に含まれる他の基質の定量にも応用可能である。
【００１２】
図４は従来例のバイオセンサを示す斜視図である。バイオセンサは絶縁性の基板４１と基板４１の上にそれぞれ、電極リード４２、４３、電極系として、作用極４４、対極４５が、絶縁層４６が形成されている。同絶縁層４６は作用極４４の露出部分の面積を一定とし、かつ電極リード４２、４３を部分的に覆っている。図示していないが、作用極４４上に試薬層がある。試薬層は酵素と電子伝達体が混ざった状態で形成されている。さらに、基板４１の上にはスペーサ部材４８がある。スペーサ部材４８には試料供給路５０がある。さらにその上にカバー基板４９がある。なお、カバー基板４９の上には空気孔５１が設けられている。基板４１とスペーサ部材４８とカバー基板４９は一点鎖線で張り合わされる。
【００１３】
【非特許文献１】
鈴木周一編「バイオセンサ」講談社、１９８４年１月１日、全頁
【特許文献１】
特開平３−２０２７６４号公報
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
近年、測定に必要な試料量の更なる微量化と、計測時間の短縮が切望されている。
【００１５】
つまり、更に微量（１μｌ以下）な試料をより短時間で測定が可能なバイオセンサの開発が各方面において求められている。
【００１６】
従来の電気化学グルコースセンサでは、極微量な試料量における測定の場合、試料供給路の体積が減少し、それに応じて計測する電極面積が縮小され、グルコース量測定の感度が低くなる場合があった。また、計測時間の短縮には試料への試薬の溶解を早くすることが求められている。
【００１７】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、好感度でかつ試薬の溶解速度が早いバイオセンサを提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明のバイオセンサは、少なくとも作用極と対極とを有する電極系を設けた絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成された試料供給路と、前記試料供給路内に形成された試薬部とを備えたバイオセンサにおいて、前記試薬部は酵素を含む領域と電子伝達体を含む領域とをそれぞれ複数個有し、前記酵素を含む領域と前記電子伝達体を含む領域との間に被覆部が設けられていることを特徴とする。
【００１９】
ここで、試薬部において、複数の酵素を含む領域と電子伝達体を含む領域と被覆部とが基板面に対して平行な方向に形成および基板面に対して垂直な方向に形成されていることが好ましい。
【００２０】
ここで、酵素を含む領域と電子伝達体を含む領域とが交互に形成されていることを特徴とすることが好ましい。
【００２１】
さらに、試薬層の表面が凹凸構造を有することを特徴とすることが好ましい。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００２３】
（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１におけるバイオセンサの試薬部の断面図である。
【００２４】
作用極２と対極（図示せず）とを有する電極系を設けた絶縁性の基板１と、前記絶縁性基板上に形成された試料供給路７と、前記試料供給路内に形成された試薬部９とを備えたバイオセンサである。
【００２５】
前記試薬部９は酵素としてＧＯＤを含む領域５と電子伝達体としてフェリシアン化カリウムを含む領域３とをそれぞれ複数個有し、前記ＧＯＤを含む領域５と前記フェリシアン化カリウムを含む領域３との間に被覆部４が設けられている。
【００２６】
試薬部９において、ＧＯＤを含む領域５とフェリシアン化カリウムを含む領域３と被覆部４は、基板面１に対して平行に繰り返し形成し、かつ垂直に繰り返し４段積層されている。さらに、ＧＯＤを含む領域５とフェリシアン化カリウムを含む領域３はそれぞれが被覆部４をはさんで交互に形成される。さらに、ＧＯＤ５の表面とフェリシアン化カリウム３の表面と被覆部４にセルロースからなる被覆部材がそれぞれ積層ごとに形成されている。
【００２７】
被覆部４の最上層の上には被覆部４に接触するように界面活性剤層６がある。界面活性剤層６の上には試料供給路７となる空間がある。さらに試料供給路７の上にはカバー８がある。なお、同図では、基板１と試料供給路７とカバー基板８との張り合わせ関係は記載していないが、図４の張り合わせ関係と同様である。
【００２８】
ここで、グルコースのＧＯＤによる反応メカニズムとグルコースセンサのグルコース濃度計測方法を述べる。グルコースがＧＯＤと接触するとＧＯＤによる酸化分解によりグルコン酸と過酸化水素が生成される。前記過酸化水素が水と電子に分解される。前記電子がフェリシアン化カリウムをフェロシアン化カリウムに変換する時に電子のやりとりが行われ、電子が増幅され、その結果を電流値で計測する。
【００２９】
次にグルコースセンサの作製方法を述べる。説明に際し、図１とともにバイオセンサの概型は図４を用いる。
【００３０】
本発明のグルコースセンサは、以下のような手順で作成した。電気絶縁性の表面をもつ基板１上にパラジウムをスパッタリングし、トリミングにより作用極２、対極（図示せず）を作製した。次に、電気絶縁性の表面をもつカバー基板８には空気孔（図示せず）を形成した。
【００３１】
さらに、基板１上にスペーサ部材（図示せず）を貼付した。このスペーサ部材は、スリット（図示せず）を有しており、作用極２、対極の面積を規定する。酵素であるＧＯＤおよび電子伝達体を含有する水溶液を基板１の作用極２上に滴下した後、乾燥して試薬層９を形成した。
【００３２】
試薬層９は、インクジェットヘッドを用いて微小な滴下をして、同図に示すように、ＧＯＤを含む領域５とフェリシアン化カリウムを含む領域３とを間隔を空けながら順に形成した。セルロースの被覆部４を繰り返し塗布して、３次元的にＧＯＤを含む領域５、フェリシアン化カリウムを含む領域３が接触を低減した状態で積層し、続いて界面活性剤であるレシチンを含有する界面活性剤層６を設けて、形成される。なお、本実施の形態で用いたＧＯＤ、フェリシアン化カリウム、セルロース、レシチンは可溶性のものである。
【００３３】
最後に、基板２、スペーサ部材、カバー基板８を図４に示す一点鎖線の位置で接着することにより、試料供給路７を持つグルコースセンサを作製した。
【００３４】
カバー基板８の空気孔（図示せず）は、この試料供給路７に連通しているので、図示していないが試料供給路の先端（今後試料供給口と称する）に試料を接触させれば、毛管現象により試料は容易に試料供給路７にある試薬層９に達する。
【００３５】
次に、一定量のグルコースを含む溶液を試料としてグルコース濃度の測定を行った。試料を試料供給口（図示せず）から試料供給路７に供給し、一定時間の待機後に、対極（図示せず）を基準にして作用極２に３００ｍＶの電圧を印加した。この電圧印加により、作用極２と対極との間に流れた電流値を測定したところ、試料中のグルコース濃度に比例した電流応答が観察された。
【００３６】
比較例として、従来の技術で示した酵素となるＧＯＤと電子伝達体となるフェリシアン化カリウムの混合した水溶液を滴下して作製した試薬層を持つグルコースセンサについても同様の応答測定を行った。その測定値は本実施の形態では、グルコース濃度１０ｍｇ／ｄｌにおいて５μＡである。なお、従来の技術では３μＡである。
【００３７】
その結果、本実施例、比較例の両センサともに、試料中のグルコース濃度に比例した電流応答が観察されたが、本実施例のバイオセンサの方が、比較例のバイオセンサと比べてより高い応答値が得られた。この高い応答値が得られた理由としては、保存状態の時に３次元的に酵素となるＧＯＤと電子伝達体となるフェリシアン化カリウムの接触確率が低減されることで相互反応が抑制できたことにより、酵素活性の低下が抑制できたことが考えられる。
【００３８】
本実施の形態の酵素が従来例より早く溶解する理由として、以下のことが挙げられる。
【００３９】
１）酵素を細分化し、試料との接触面積が大きくなること。
【００４０】
２）酵素が凹凸となり、試料との接触面積が大きくなること。
【００４１】
３）ＧＯＤのように水に対する溶解性の高い酵素とフェリシアン化カリウムのように水に対する溶解性が低い電子伝達体を物理的に分離し、酵素近傍から試料との親和性の低い電子伝達系を排除する。その結果、酵素が本来の溶解度で溶解することが可能となる。
【００４２】
４）酵素が平面的ではなく、立体的に配置され、液体との接触が大きくなるため。
【００４３】
５）空間的に広い範囲に酵素が配置され、空間的な偏りなく酵素が液体と接し、空間内の濃度分布に偏りがなくなる。
【００４４】
（実施の形態２）
本発明のバイオセンサは試薬部９において、セルロースからなる試薬部９が凹凸構造を有するものである。試薬部９以外のその他の構造は実施の形態１と同様である。
【００４５】
図２は試薬部９が凹凸構造を有するバイオセンサの断面図である。同図に示すように、ＧＯＤを含む領域５とフェリシアン化カリウムを含む領域３との滴下回数を電極２の表面上で２次元的に変えることで、試薬部９の表面に凹凸を形成する。つまり、被覆部４の間隔が実施の形態１より大きくなっている。次にＧＯＤを含む領域５とフェリシアン化カリウムを含む領域３の表面をセルロースで被覆し被覆部４を形成した。被覆部４の上にはレシチンで界面活性剤層６を形成した。
【００４６】
（実施の形態３）
本発明のバイオセンサは試薬部９において、セルロースからなる試薬部９が凹凸構造を有する別の実施の形態を表すものである。試薬部９以外のその他の構造は実施の形態１と同様である。
【００４７】
図３は試薬部９が凹凸構造を有するバイオセンサの断面図である。同図に示すようにＧＯＤを含む領域５とフェリシアン化カリウムを含む領域３の滴下量を電極２の表面上で２次元的に変えることで、試薬部９の表面に凹凸を形成する。同図では、最上層のＧＯＤを含む領域１５の厚さを厚くして段差を設けている。つまり、前出のＧＯＤを含む領域１５の厚さを、実施の形態２よりさらに厚くするとともに、被覆部４の間隔も実施の形態２と同様に大きくなっている。次に最上層のＧＯＤを含む領域１５の表面をセルロースで被覆し被覆部４を形成した。被覆部４の上にはレシチンで界面活性剤層６を形成した。
【００４８】
実施の形態２、実施の形態３に示すように表面に凹凸形状にすることで、試料を導入した時に接触面積が大きくなり、その結果、試薬の溶解が促進する効果が持たせることができ、高速に計測できる。
【００４９】
以上において、試薬部は基板面に対して平行な方向と垂直な方向に形成したが、平行な方向にのみまたは垂直な方向にのみ形成してもよい。
【００５０】
また、作用極および対極が貴金属からなることが好ましい。このようにすると、電極をより微細に加工することが可能となるため、検体量の削減が可能となる場合がある。
【００５１】
本発明において、基板およびカバー基板としては、表面が電気絶縁性を有し、保存および測定時に充分な剛性を有する材料であれば用いることができる。例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、飽和ポリエステル樹脂等の熱可塑性樹脂、または尿素樹脂、メラニン樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル樹脂等の熱硬化性樹脂があげられる。無機材料では、酸化シリコン膜または窒化シリコン膜が表面に形成したシリコン基板があげられる。以上中でも、コストや電極との密着性の点から、ポリエチレンテレフタレートが好ましい。
【００５２】
作用極としては、電子伝達体を酸化する際にそれ自身が酸化されない導電性材料であれば用いることができる。対極としては、パラジウム、銀、白金、カーボン等の一般的に用いられる導電性材料であれば用いることができる。
【００５３】
酵素としては、試料中に含まれる測定対象の基質に対応したものが用いられる。例えば、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ等があげられる。
【００５４】
電子伝達体としては、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フェロセン誘導体等があげられる。また、酸素を電子伝達体とした場合にも電流応答が得られる。電子伝達体は、これらの一種または二種以上が使用される。
【００５５】
スペーサ部材としては、電気絶縁性を有し、保存および測定時に充分な剛性を有する材料であれば用いることができる。例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、飽和ポリエステル樹脂等の熱可塑性樹脂、または尿素樹脂、メラニン樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル樹脂等の熱硬化性樹脂があげられる。
【００５６】
親水性高分子としては、種々のものを用いることができる。例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、ポリアクリル酸およびその塩、ポリメタアクリル酸およびその塩、スターチおよびその誘導体、無水マレイン酸またはその塩の重合体があげられる。中でも、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースが好ましい。
【００５７】
被覆部は、セルロースとしたが、電子伝達体や酵素と反応しなく、試料が導入されて時に解けるものであればよい。その材料として、ゼラチン、寒天、カラギナンがある。
【００５８】
界面活性剤としてはレシチン以外のものを用いてもよい。また上記実施の形態では積層毎に被覆部を形成したが、これに限定されるものではなく、積層の最上部に被覆部を一層だけ設けてもよい。
【００５９】
また、上記実施の形態では作用極と対極のみの二電極系について述べたが、参照極を加えた三電極系すれば、より正確な測定が可能である。
【００６０】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、極微量試料で測定可能なグルコースセンサの高感度化と、試料への試薬の溶解の高速化されたバイオセンサを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１におけるバイオセンサの試薬部の断面図
【図２】本発明の実施の形態２におけるバイオセンサの試薬部の断面図
【図３】本発明の実施の形態３におけるバイオセンサの試薬部の断面図
【図４】従来のバイオセンサの構成を示す斜射図
【符号の説明】
１  基板
２  作用極
３  フェリシアン化カリウム（電子伝達体）を含む領域
４  被覆部
５，１５  ＧＯＤ（酵素）を含む領域
６  界面活性剤層
７  試料供給路
８  カバー基板
９  試薬部
４１  基板
４２，４３  電極リード
４４  作用極
４５  対極
４６  絶縁層
４８  スペーサ部材
４９  カバー基板
５０  試料供給路
５１  空気孔
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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