(57)【要約】【課題】高濃度の高度不飽和脂肪酸含有ジグリセリドを効率良く製造する方法を提供すること。【解決手段】高度不飽和脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンとを、固定化部分グリセリドリパーゼの存在下に、反応生成水を反応系外に除去しながら反応させる高度不飽和脂肪酸含有ジグリセリドの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度不飽和脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンとを、固定化部分グリセリドリパーゼの存在下に、反応生成水を反応系外に除去しながら反応させる高度不飽和脂肪酸含有ジグリセリドの製造方法。
【請求項２】
部分グリセリドリパーゼが、至適温度を３０℃以上５０℃未満に有するものである請求項１記載の高度不飽和脂肪酸含有ジグリセリドの製造方法。
【請求項３】
高度不飽和脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンとの反応モル比Ｒ〔Ｒ＝脂肪酸又はその低級アルキルエステル（ｍｏｌ）／グリセリン（ｍｏｌ）〕が、１．５〜２．６である請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
固定化部分グリセリドリパーゼが、脂溶性脂肪酸又はその誘導体で前処理された固定化担体に部分グリセリドリパーゼを固定化したものである請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
ジグリセリド純度〔ジグリセリド／（ジグリセリド＋トリグリセリド）×１００〕が８０重量％以上であるジグリセリドを、６０重量％以上の反応率（反応液中のジグリセリドとトリグリセリドの合計重量百分率）で得るものである請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
反応液の酸価（ＡＶ）が、５０Ｒ−５５＞ＡＶ＞７０Ｒ−１５０（ただし、ＡＶ＞０）を満たす範囲内で、反応を終了させる請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高度不飽和脂肪酸含有ジグリセリドを高濃度に、かつ効率良く製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ジグリセリドは、油脂の可塑性改良用添加剤、食品、医薬品、化粧品等の分野に利用され、最近、ジグリセリドの優れた生理活性に着目した食品が注目されている。一方、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等の高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生理活性も注目されており、特にＤＨＡは、血小板凝集抑制作用、血中中性脂肪低下作用、血中コレステロール低下作用、制癌作用、脳機能向上効果等を有することが知られている。このため、高濃度にＰＵＦＡを含有する油脂の製造法が精力的に研究開発されている。
【０００３】
一般的にＰＵＦＡは天然界においてはトリグリセリドの形で存在しているが、その含有量が低い。ＰＵＦＡを分離・精製する方法としては、クロマトグラフィー法、尿素付加法、ウインタリング法、分子蒸留法、液液分配法、二重結合への付加物による方法、超臨界抽出法、及びこれらを組合わせた方法が知られている。しかしながら、これらの方法においては、いずれも工程が煩雑で効率が悪く、高コストとなってしまう。
【０００４】
そこで簡便かつ高効率に、直接トリグリセリドの形でＰＵＦＡ画分を濃縮する方法として酵素法がある。一般にリパーゼはＰＵＦＡに対する作用が弱いため、この特性を利用し、トリグリセリド中のＰＵＦＡ以外の構成脂肪酸のエステル結合を選択的に加水分解し、除去することでＰＵＦＡ含有トリグリセリドを濃縮できる。例えば、Ｃａｎｄｉｄａ属由来のリパーゼを用いて濃縮する方法が知られている（特許文献１）。
このように、ＰＵＦＡ含有トリグリセリドを濃縮する方法は多数研究されている。
【０００５】
一方、ＰＵＦＡ含有ジグリセリドの製造法についての例は僅かである。ＰＵＦＡ含有グリセリドの製造法としては、ＰＵＦＡ又はその低級アルコールエステルとグリセリンとを耐熱性リパーゼを用いて反応させる方法が一例であるが（特許文献２）、この方法では、反応温度が５０〜７０℃と酵素反応としてはやや高く、特殊な酵素を使用しており、かつ高濃度にジグリセリドを得ることはできない。また、リパーゼの存在下、ＰＵＦＡ又はそのアルコールエステルに対して過剰量のグリセリンを添加して反応を行うことにより、モノグリセリドとジグリセリドの合計がトリグリセリドより多いＰＵＦＡ含有油脂を製造する方法も知られているが（特許文献３）、この方法では、未反応のグリセリンが大量に残存するため除去工程が必要であり、かつ高濃度にジグリセリドを得ることはできない。
【０００６】
また、エステル化反応によりジグリセリドを合成する場合、原料である脂肪酸又はそのエステルとグリセリンとの仕込み比、反応温度、酵素濃度等によって、高い反応率で高いジグリセリド純度を得るための最適な反応終了点は異なる。特に、反応速度向上のため、グリセリンに対する脂肪酸又はそのエステルの比率を高めた場合、反応時間を長くして反応率を上げるとトリグリセリドが生成してジグリセリド純度が低下するという問題がある。
【０００７】
【特許文献１】
特開昭５８−１６５７９６号公報
【特許文献２】
特開昭６２−９１１８８号公報
【特許文献３】
特開平１０−２６５７９５号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、高濃度のＰＵＦＡ含有ジグリセリドを効率良く製造する方法を提供することにある。
【０００９】
更に、本発明の他の目的は、様々な脂肪酸／グリセリン比、反応温度、酵素濃度の場合に対応でき、特に高い脂肪酸／グリセリン比の場合にも、高い反応率で高濃度のＰＵＦＡ含有ジグリセリドを製造する方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、エステル化反応に用いるリパーゼとして、特許文献１〜３のいずれにおいても対象とされていない部分グリセリドリパーゼを採用し、かつこれを固定化し、反応時に生成する水を反応系外に除去させながらＰＵＦＡ含有脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンを反応させることにより、飛躍的にジグリセリド生成率が高くなり、高濃度のＰＵＦＡ含有ジグリセリドが効率良く得られることを見出した。また本発明者は、反応液の酸価が、原料であるＰＵＦＡ含有脂肪酸又はその低級アルキルエステルとグリセリンとの比率との関係で一定の範囲内となったときに、反応を終了させることにより、できるだけ高い反応率で、高濃度のジグリセリドを製造することが可能となることを見いだした。
【００１１】
すなわち本発明は、ＰＵＦＡ又はその低級アルキルエステルとグリセリンとを、固定化部分グリセリドリパーゼの存在下に、反応生成水を反応系外に除去しながら反応させるＰＵＦＡ含有ジグリセリドの製造方法を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）とは、二重結合を３個以上有する炭素数２０以上の脂肪酸を意味する。具体的には、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）等が好ましいものとして挙げられる。また、イワシ、サバ、マグロなどの魚油や藻類、菌類など天然油脂由来のＰＵＦＡを利用することもできる。またＰＵＦＡとエステルを形成する低級アルコールとしては、炭素数１〜６の低級アルコール類が好ましい。炭素数１〜６の低級アルコールとしては、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノールなどが挙げられる。これらのＰＵＦＡ又はその低級アルキルエステルは、２種以上を併用することもできる。
【００１３】
本発明で使用する部分グリセリドリパーゼは、モノグリセリド及びジグリセリドの部分グリセリドを加水分解するが、トリグリセリドを加水分解しないリパーゼである。部分グリセリドリパーゼとしては、ラット小腸、ブタ脂肪組織などの動物臓器由来のモノグリセリドリパーゼ又はジグリセリドリパーゼ；バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ｈ−２５７由来モノグリセリドリパーゼ（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２７，  ４１９−４２５，  ２０００）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＬＰ７３１５由来モノグリセリドリパーゼ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ９１（１），  ２７−３２，  ２００１）、ペニシリウム・サイクロピウム由来リパーゼ（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ８７（１），  ２０５−２１１，  １９８０）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）Ｕ−１５０由来リパーゼ（Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ７２（３），  １６２−１６７，  １９９１）等が挙げられる。なかでも、至適温度を３０℃以上５０℃未満、特に３０〜４５℃に有するものが好ましい。
【００１４】
本発明で使用する固定化部分グリセリドリパーゼは、上記部分グリセリドリパーゼが、セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体；セルロースパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等の固定化担体に固定されたものであるが、特にイオン交換樹脂に固定化されたものが好ましい。
【００１５】
イオン交換樹脂としては、多孔性の陰イオン交換樹脂が好ましい。樹脂の粒子径は１００〜１０００μｍが望ましく、細孔径は１００〜１５００Åが望ましい。この細孔が酵素吸着に大きな表面積を与え、より大きな吸着量を得ることができる。樹脂の材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられる。特にフェノールホルムアルデヒド系樹脂（商品名Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ−５６８）が望ましい。
【００１６】
部分グリセリドリパーゼの固定化温度は、酵素の失活の起きない温度であればよく、０〜６０℃、特に５〜４５℃が好ましい。また固定化に用いる酵素水溶液のｐＨは、酵素の変性が起きないような範囲であればよく、ｐＨ３〜９が好ましい。特に至適ｐＨが酸性とされているリパーゼを用いる場合に最大の活性を得るには、ｐＨ４〜６とするのがよい。また酵素水溶液に用いる緩衝液としては、一般的な酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。酵素水溶液中の部分グリセリドリパーゼの濃度は、固定化効率の点から、該酵素の溶解度以下で、かつ十分な濃度であることが望ましい。また必要に応じて不溶部を遠心分離により除去し、上清を使用してもよい。また部分グリセリドリパーゼと固定化担体の使用割合は、固定化担体１重量部に対して、部分グリセリドリパーゼ０．０５〜１０重量部、特に０．１〜５重量部が好ましい。
【００１７】
本発明では、高活性を発現するような吸着状態にするため、固定化の前処理として、固定化担体を脂溶性脂肪酸又はその誘導体で処理することが好ましい。またこれらは単一で用いてもよいが、２種以上を組み合わせることで一層の効果が発揮される。これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体と固定化担体の接触法としては、水又は有機溶剤中にこれらをそのまま加えてもよいが、分散性を良くするため、有機溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散・溶解させた後、水に分散させた固定化担体に加えてもよい。この有機溶剤としては、クロロホルム、ヘキサン、エタノール等が挙げられる。脂溶性脂肪酸又はその誘導体と固定化担体の比率は、固定化担体１重量部（乾燥重量）に対し、脂溶性脂肪酸又はその誘導体０．０１〜５重量部、特に０．１〜２重量部が好ましい。接触温度は、０〜１００℃、特に２０〜６０℃が好ましい。接触時間は、５分〜５時間程度でよい。本処理後濾過して固定化担体を回収するが、この時乾燥してもよい。乾燥温度は室温〜１００℃が良く、減圧乾燥を行ってもよい。
【００１８】
この固定化担体処理に用いられる脂溶性脂肪酸としては、炭素数４〜２４の直鎖又は分岐鎖の、飽和又は不飽和の、水酸基が置換していてもよい脂肪酸が挙げられる。好ましい脂溶性脂肪酸としては、炭素数８〜１８の脂肪酸、例えば、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸等の直鎖飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸、リシノール酸等のヒドロキシ脂肪酸、イソステアリン酸等の分岐脂肪酸が挙げられる。脂溶性脂肪酸誘導体としては、炭素数８〜１８の脂肪酸と水酸基を有する化合物とのエステルが挙げられ、１価アルコールエステル、多価アルコールエステル、リン脂質、あるいはこれらのエステルに更にエチレンオキサイドを付加した誘導体等が例示される。１価アルコールエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル等が、多価アルコールエステルとしては、モノグリセリド、ジグリセリド、及びそれらの誘導体、あるいはポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル等が挙げられる。
これらの脂肪酸及びその誘導体は、いずれも常温で液状であることが工程上望ましい。これらの脂溶性脂肪酸又はその誘導体としては、上記脂肪酸の混合物、例えば大豆脂肪酸などの天然由来の脂肪酸を用いることもできる。
【００１９】
上記固定化部分グリセリドリパーゼの存在下でのＰＵＦＡ又はその低級アルキルエステルとグリセリンとの反応において、両者の反応モル比Ｒ〔Ｒ＝ＰＵＦＡ又はその低級アルキルエステル（ｍｏｌ）／グリセリン（ｍｏｌ）〕は、１．５〜２．６が好ましく、特に１．７〜２．４であるのが好ましい。
【００２０】
本反応は、反応生成水を反応系外に除去しながら行われる。すなわちリパーゼ製剤に含まれる水分を除き、実質的に無水条件下で行われ、エステル化反応により生成した反応生成水は、減圧；ゼオライト、モレキュラーシーブス等の吸収剤の利用；反応槽中への乾燥した不活性ガスの通気等の方法により、系外に除去される。
【００２１】
エステル化反応の反応温度は、原料及び生成物の融点、酵素の熱安定性により変化するが、３０℃以上５０℃未満、特に３０〜４５℃が反応性及びＰＵＦＡの安定性の点で好ましい。
【００２２】
本発明方法によれば、ジグリセリド純度〔ジグリセリド／（ジグリセリド＋トリグリセリド）×１００〕が８０重量％以上、更には８５重量％以上、特に９０重量％以上のジグリセリドを、６０重量％以上、好ましくは６５重量％以上、更に好ましくは７０重量％以上の高い反応率（反応液中のジグリセリドとトリグリセリドの合計重量百分率）で製造することができる。
【００２３】
得られるジグリセリドのジグリセリド純度をより高めるために、反応は、反応液の酸価（ＡＶ）を経時的に測定しながら行い、反応率６０重量％以上、ジグリセリドの濃度８０重量％以上を達成するためには、酸価が、５０Ｒ−５５＞ＡＶ＞７０Ｒ−１５０（ただし、ＡＶ＞０）を満たす範囲内で、反応を終了させることが好ましい。更には、反応率７０重量％以上、ジグリセリド純度８５重量％以上を達成するためには、５０Ｒ−７０＞ＡＶ＞７０Ｒ−１４５（ただし、ＡＶ＞０）、特に反応率８０重量％以上、ジグリセリドの濃度９０重量％以上を達成するためには、５０Ｒ−８０＞ＡＶ＞７０Ｒ−１４０（ただし、ＡＶ＞０）を満たす範囲内で、反応を終了させることが好ましい。
【００２４】
本条件に従うことにより、原料仕込み比、反応温度、酵素濃度等の条件が変わった場合にも、当該変更に影響なく、できるだけ高い反応率で、高濃度のジグリセリドを製造することができる。すなわち、酸価が上記範囲より高い時点で反応を終了させた場合には、ジグリセリド純度は高いが、反応率が低いために生産性が低く、また酸価が上記範囲より低くなってから反応を終了させた場合には、反応液中のトリグリセリドの比率が高くなり、十分なジグリセリド純度が得られないため、いずれも好ましくない。
【００２５】
【実施例】
実施例１
Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ−５６８（Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａｓｓ社，平均粒径４８０μｍ）１０ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬ中で１時間攪拌した。攪拌した後５００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）１００ｍＬで２時間ｐＨの平衡化を行った。その後５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）１００ｍＬで２時間ずつ２回、ｐＨの平衡化を行った。この後濾過を行い担体を回収した後、エタノール５０ｍＬでエタノール置換を３０分間行った。濾過した後、リシノール酸を１０ｇ含むエタノール５０ｍＬを加え３０分間、リシノール酸を担体に吸着させた。この後濾過し、担体を回収した後、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）５０ｍＬで４回洗浄し、エタノールを除去し、濾過して担体を回収した。その後市販の部分グリセリドリパーゼ（リパーゼＧ「アマノ」５０，天野エンザイム社）２０ｇを５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）１８０ｍＬに溶解した酵素液と２時間接触させ、固定化を行った。濾過し、固定化酵素を回収して、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）５０ｍＬで洗浄を行い、固定化していない酵素や蛋白を除去した。以上の操作はいずれも２０℃で行った。固定化後の酵素液の残存活性と固定化前の酵素液の活性差より固定化率を求めたところ、９５％であった。その後、実際に反応を行う基質である大豆脂肪酸４０ｇを加え、４０℃下で減圧脱水を行った。その後、濾過して大豆脂肪酸と分離し、固定化酵素とした。
こうして得られた固定化酵素を実際に反応を行う基質であるＰＵＦＡ含有脂肪酸（ＤＨＡ含有率４４重量％）で洗浄した。洗浄した固定化酵素２０ｇ（乾燥重量８ｇ）を２００ｍＬ容の四つ口フラスコに秤量した。そこへＰＵＦＡ含有脂肪酸（ＤＨＡ含有率４４重量％）とグリセリン８０ｇ（モル比で脂肪酸／グリセリン＝２．３０）を添加し、４０℃、減圧下で、反応液の酸価を経時的に測定しながら、エステル化反応を４５時間行った。このときの反応液の酸価は２７．８であった。反応液をＨＰＬＣで分析し、グリセリド組成及び未反応物の分析を行った。また反応液をＴＬＣプレートに展開（展開溶媒：クロロホルム／アセトン／メタノール＝９３．５／４．５／２．０容量％）して各グリセリドに分画、酢酸エチルで溶離させ、脱溶剤後、ＧＣで脂肪酸組成分析を行った。結果を表１に示す。反応率は７４．２重量％であり、ＤＧ濃度は８５．３重量％と高濃度であった。また、ＤＧ中のＤＨＡ含有率も４４重量％と高かった。
【００２６】
実施例２
実施例１で得られた洗浄済みの固定化酵素２０ｇ（乾燥重量８ｇ）を２００ｍＬ容の四つ口フラスコに秤量した。そこへＰＵＦＡ含有脂肪酸（ＤＨＡ含有率４４重量％）とグリセリン８０ｇ（モル比で脂肪酸／グリセリン＝１．８７）を添加し、４０℃、減圧下で、反応液の酸価を経時的に測定しながら、エステル化反応を１６５時間行った。このときの反応液の酸価は３．６であった。反応液の分析を実施例１と同様に行った結果、反応率は８３．８重量％、ＤＧ濃度は８８．３重量％と高濃度であった。また、ＤＧ中のＤＨＡ含有率も３７重量％と高かった。
【００２７】
比較例１
市販の固定化酵素である１，３位選択性リパーゼ：Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  ＲＭ  ＩＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）４ｇを２００ｍＬ容の四つ口フラスコに秤量した。そこへＰＵＦＡ含有脂肪酸（ＤＨＡ含有率４４重量％）とグリセリン８０ｇ（モル比で脂肪酸／グリセリン＝２．３６）を添加し、５０℃、減圧下で、反応液の酸価を経時的に測定しながら、エステル化反応を４８時間行った。このときの反応液の酸価は４５．２であった。反応液の分析を実施例１と同様に行った結果、反応率は５７．１重量％、ＤＧ濃度は６５．８重量％と低く、高濃度にＤＧを製造できなかった。
【００２８】
比較例２
実施例１で得られた洗浄済みの固定化酵素２０ｇ（乾燥重量８ｇ）を２００ｍＬ容の四つ口フラスコに秤量した。そこへＰＵＦＡ含有脂肪酸（ＤＨＡ含有率４４重量％）とグリセリン８０ｇ（モル比で脂肪酸／グリセリン＝２．６６）を添加し、４０℃、減圧下で、反応液の酸価を経時的に測定しながら、エステル化反応を１８時間行った。このときの反応液の酸価は３０．６であった。反応液の分析を実施例１と同様に行った結果、反応率は７７．２重量％、ＤＧ濃度は６６．２重量％と低く、高濃度にＤＧを製造できなかった。
【００２９】
【表１】
2004208539.tif 000002
【００３０】
【発明の効果】
本発明の製造方法によれば、高濃度のＰＵＦＡ含有ジグリセリドが効率良く得られる。