(57)【要約】【課題】含水物中における物質の凍結濃縮を抑制する方法、生理活性物質の失活を抑制する方法、および成分が均質に拡散した凍結物又は凍結乾燥物を製造する方法を提供すること。【解決手段】水分子及び水分子以外の物質を含む含水物を凍結する際、該含水物に不凍タンパク質を添加する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水分子及び水分子以外の物質を含む含水物を凍結する際における該含水物中における前記物質の凍結濃縮を抑制する方法であって、該含水物に不凍タンパク質を添加することを特徴とする含水物中における物質の凍結濃縮を抑制する方法。
【請求項２】
生理活性物質を含む含水物を凍結する際における該生理活性物質の失活を抑制する方法であって、該含水物に不凍タンパク質を添加することを特徴とする生理活性物質の失活を抑制する方法。
【請求項３】
水分子及び水分子以外の成分を含む含水物を凍結又は凍結乾燥させて、該成分が均質に拡散した凍結物又は凍結乾燥物を製造する方法であって、該水溶液に不凍タンパク質を添加することを特徴とする成分が均質に拡散した凍結物又は凍結乾燥物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、含水物中における物質の凍結濃縮を抑制する方法、生理活性物質の失活を抑制する方法、および成分が均質に拡散した凍結物又は凍結乾燥物を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
水分子及び水分子以外の物質（溶質、混入物、夾雑物など；以下、媒質という）を含む含水物を凍結させると、水分子同士が、媒質を排除しながら結晶化して水分子のみからなる氷結晶を形成する。そのため、凍結時に、含水物中で媒質が不均一に拡散し、この氷結晶以外の場所に追いやられて溜まる現象、すなわち凍結濃縮（ｆｒｅｅｚｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）が発生することが知られている。
従来より、この凍結濃縮は、例えば濃縮果実ジュースを生産する飲料技術や、食品、医療、廃水処理等において利用されている。
【０００３】
凍結濃縮を利用する技術が進む一方、凍結濃縮を抑制する技術は、広範な利用性があるにも関わらず進んでいない。
例えば、細胞を凍結した場合、凍結濃縮に伴う水分子の移動と氷の形成が細胞内に起こるため、細胞の内部構造と内容物は、大きく移動したり、圧迫、損傷を受けてしまう。その結果、凍結した細胞を解凍した後、凍結前の状態を回復することが困難となる。そのため、生体由来の細胞、例えば精子や卵子、血球等を含む血液などを凍結させた際にその細胞が破壊されたり、肉類や野菜類などを凍結させた際にその味が損なわれるといった現象が生じる。同様に、例えば酵素等のタンパク質や各種医薬品等の生理活性物質の水溶液を凍結させた場合、その生理活性が大きく失われてしまう。したがって、凍結濃縮を抑制する技術は非常に重要である。
【０００４】
このような凍結濃縮を抑制する方法は、医療分野において、血液、精子、卵子、組織、臓器等の多くの物質の凍結保存のために望まれている。
また、食品分野においても、食肉、野菜、魚介類、氷菓子、加工食品などを凍結させた場合に、凍結濃縮によってこれらの食品の内部構造が破壊され、各種栄養成分やうまみ成分、添加物等を氷以外の部分に追いやる結果、著しい品質低下が起こることが問題となる。そのため、食品分野においても凍結濃縮を効果的に抑制する方法が望まれている。
また、医薬品や食品の製造において利用されている技術に凍結乾燥技術があるが、この凍結乾燥においても、凍結濃縮を抑制することは重要である。すなわち、凍結濃縮が生じると、医薬品成分や各種うまみ成分が均一に分散せず、製品（凍結乾燥物）の著しい品質低下を引き起こす。
さらに、飲食店で用いられる氷（製氷業分野）や、寒冷地で行われる氷祭り、あるいは氷像フェスティバル等においては、赤や青に均質に着色されたディスプレイ用の氷が求められている。しかしながら、均質に着色された氷を製造することは難しく、手間やコストもかかってしまう。そのため、色素等の成分が均質に分散した凍結物等を製造する技術が望まれている。
【０００５】
一方、アイスクリーム等の冷凍食品の品質を向上させる方法の１つとして、不凍タンパク質（Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、以下、ＡＦＰということがある）を用いる方法が提案されている。例えば特許文献１では、天然資源からＡＦＰを回収する方法、及びＡＦＰを含む冷凍食品が開示されている。また、特許文献２では、組み換えＤＮＡ技術により生成された不凍剤ペプチドが開示されており、これをアイスクリームのような食品に適用できるとの報告もある。
【０００６】
【特許文献１】
特表２０００−５１５７５１号公報
【特許文献２】
国際公開（ＷＯ）９０／１３５７１号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ＡＦＰは、凍結温度域において生成する微細な氷結晶（氷核）の表面に特異的に吸着することにより、氷核の成長を阻害するという他に例のない性質を有する生体物質である。しかしながら、ＡＦＰが、これらの内部で発生する凍結濃縮を抑制することについては知られていない。
したがって、本発明の目的は、ＡＦＰを用いた凍結濃縮抑制技術を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、凍結濃縮抑制を検証するための端的なモデル実験系として、色インクを滴下して着色した水を凍結させ、このときに発生するインク成分の凍結濃縮をカメラ撮影により検証する方法を考案した。そして、色インクで着色された水にＡＦＰの凍結乾燥粉末を溶解し、これがインク成分の凍結濃縮を阻害するか否かについて鋭意研究を行ったところ、ＡＦＰの添加により、インク成分の凍結濃縮が著しく軽減され、その結果、全体が均質に着色された着色氷が形成されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、前記課題を解決する本発明の第一の発明は、水分子及び水分子以外の物質を含む含水物を凍結する際における該含水物中における前記物質の凍結濃縮を抑制する方法であって、該含水物に不凍タンパク質を添加することを特徴とする含水物中における物質の凍結濃縮を抑制する方法（以下、凍結濃縮抑制方法ということがある）である。
前記課題を解決する本発明の第二の発明は、生理活性物質を含む含水物を凍結する際における該生理活性物質の失活を抑制する方法であって、該含水物に不凍タンパク質を添加することを特徴とする生理活性物質の失活を抑制する方法（以下、失活抑制方法ということがある）である。なお、本明細書における「生理活性物質」という単語は、全ての「生理的な活性を有する物質」を指し示す。
前記課題を解決する本発明の第三の発明は、水分子及び水分子以外の成分を含む含水物を凍結又は凍結乾燥させて、該成分が均質に拡散した凍結物又は凍結乾燥物を製造する方法であって、該水溶液に不凍タンパク質を添加することを特徴とする成分が均質に拡散した凍結物又は凍結乾燥物を製造する方法（以下、凍結物製造方法ということがある）である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳細に説明する。
≪凍結濃縮抑制方法≫
本発明の凍結濃縮抑制方法は、水分子及び水分子以外の物質を含む含水物を凍結する際、該含水物に不凍タンパク質を添加することを特徴とする方法である。
「水分子及び水分子以外の物質を含む含水物」としては特に制限はなく、液体でも、固体であってもよい。例えば、我々の身近なものとしては、溶質と溶媒からなる水溶液、水に溶解しない物質と水との混合液、穀類、麺類、野菜、果実、肉類、魚介類、氷菓子、加工食品、医療品、診断薬、試薬、化粧品、血液、精子、卵子、細胞、組織、臓器などが挙げられる。
本発明において、「タンパク質」とは、アミノ酸が複数個以上ペプチド結合で連結した物質のことである。慣例的に３０残基程度までの小さいタンパク質をペプチドと称して、これをタンパク質と区別する場合があるが、本発明で用いている「不凍タンパク質」という物質名は、不凍能力を有するペプチド及びタンパク質を区別せずに、両方を含むものとする。
【００１１】
ＡＦＰは、魚類等の生体内において、凍結温度域で細胞内に生成する氷結晶の表面に特異的に結合してその成長を食い止め、組織の凍結から身を守る生体防御物質である。ＡＦＰは、約３５年前に南極海に生息するノトセニア科の魚類の血液から初めて発見され、それ以来今日まで、主として北極海、南極海、およびラブラドル湾周辺に生息する魚類について研究がなされてきた。近年、魚類以外にも菌類、昆虫、植物などからもＡＦＰが発見され、それらの構造と機能の解明は現在も世界中で続けられている。
なお、ＡＦＰの不凍能力は、添加された含水物の凝固点をどれだけ降下させることができるか（熱ヒステリシス（℃））によって評価されている。
【００１２】
魚類由来のＡＦＰはその構造によりＩ〜ＩＶ型の４つの型に分類されている。Ｉ型はＡｌａ含有量が高く、ＴｈｒとＡｓｐ残基が等間隔で配置されておりα−ヘリックス構造を形成している。ＩＩ型は高いＣｙｓ含量（８％）を持ち、Ｃ型−レクチンと類似の構造を形成している。ＩＩＩ型はらせん様の球状構造をもつタンパク質である。ＩＶ型はＧｌｎ残基の含有量が高く、α−ヘリックスの束構造を有することが予想されている。
ＡＦＰは、両親媒性を有しており、Ｉ型、ＩＩ型などのタイプによらず、水に対して高濃度で溶解する性質を有している。
【００１３】
本発明において用いられるＡＦＰは、Ｉ〜ＩＶ型のいずれのタイプであってもよいが、入手しやすさ、コスト等の点から、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型のものが好ましく用いられる。
ＡＦＰは、ウシ膵臓アプロチニン（質量平均分子量：Ｍｗ＝６，５００）、ニワトリ卵白リゾチーム（Ｍｗ＝１４，０００）、大豆トリプシンインヒビター（Ｍｗ＝２１，５００）を標準物質としてゲル濾過クロマトグラフィーで測定されるＭｗが１，５００であると細胞への浸透性に優れるため好ましい。
【００１４】
ＡＦＰによる凍結濃縮抑制効果を得るためには、ＡＦＰを、含水物中のＡＦＰ濃度が、含水物の質量に対し、０．０２質量％以上となる量添加することが好ましい。特に、ＡＦＰ濃度が０．０３質量％から０．０５質量％の範囲内であると、最大の凍結濃縮抑制効果が得られると同時に、コストも抑えられるため好ましい。
【００１５】
本発明において、含水物に対するＡＦＰの添加方法は、特に制限はなく、含水物の種類によって適宜、公知の手法を選択して用いることができる。
例えば含水物が液体（水溶液、血液等）である場合は、ＡＦＰの粉末又は水溶液を、そのまま混合すればよい。また、含水物が細胞、組織等である場合は、注射器などを用いてＡＦＰの水溶液を含水物の内部に注入しても良い。また、含水物をＡＦＰの水溶液に浸した後に５０〜２，０００ｋｇ／ｃｍ２に加圧する等の手段により、含水物内部にＡＦＰを浸透させても良い。
【００１６】
ＡＦＰを添加する際、含水物のｐＨを、２．０〜１１．０とすることが好ましく、４．０〜８．０とすることがより好ましい。含水物のｐＨをこの範囲内とすると、ＡＦＰの変性による凍結濃縮抑制効果の低下を防ぐことができる。
また、ＡＦＰを添加する際、含水物の温度は、０〜７０℃とすることが好ましく、４〜３０℃とすることがより好ましい。含水物の温度をこの範囲内とすると、ＡＦＰの変性による凍結濃縮抑制効果の低下を防ぐことができる。
【００１７】
本発明において、含水物の凍結は、家庭用又は業務用の冷凍庫、冬期の零度Ｃ以下の野外など、含水物の種類に応じ、一般的に用いられている凍結手段を適宜選択して行うことができる。
含水物を凍結させる温度は、含水物中の水以外の物質の濃度、ＡＦＰの不凍能力、ＡＦＰの添加量等を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは−１０℃以下、より好ましくは−１０〜−８０℃である。凍結温度が低いほど、ＡＦＰの凍結濃縮抑制効果が発揮されやすいため好ましい。
【００１８】
次に、図１を用いて、凍結温度域における水の凍結現象を説明する。
図１の上段はＡＦＰを添加しない場合（ＡＦＰ−）であり、図１の下段はＡＦＰを添加した場合（ＡＦＰ＋）である。
ＡＦＰ−の場合（図１上段）、水を凍結温度域にさらすと（左図）、水分子が互いに結びついてネットワークを形成し、やがて水中に氷核（ｉｃｅ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅまたはｅｍｂｒｙｏ  ｉｃｅ  ｃｒｙｓｔａｌ）と呼ばれる氷結晶が水中に無数に出現して（中央図）各々が結晶成長を起こす。大きくなった氷核同士は、互いに結びついて集合体を形成する（右図）。この結晶成長をした氷核の集合体が一般的に言う「氷」である。
【００１９】
一方、ＡＦＰ＋の場合（図１下段）、ＡＦＰ（図中、○で示す）は、凍結温度域において生成する氷核の単結晶上の氷層平面に対して特異的に結合し、その成長を抑制する（中央図）。その結果、水中に、ＡＦＰにより氷層平面が覆われ、個々に独立した微細な氷核が多数形成される（右図）。
ＡＦＰにより氷層平面が覆われた氷核は、図１のＡ、Ｂで示されるようなバイピラミダル氷結晶、結晶学的には六方両錐体（Ａ）あるいは六方偏四角面体（Ｂ）と呼ばれる氷結晶を生成する場合が多い。
この氷結晶は、長軸（ｃ軸）方向の長さがおよそ５０〜５００μｍの範囲にある微細なものであり、ＡＦＰのタイプや水溶液条件によっては、完全なバイピラミダル氷結晶が生成しないか、あるいは違う形の氷結晶を生成する場合があるが、いずれの場合でも、ＡＦＰの結合が原因となり、多数の微細な氷結晶が形成される。
【００２０】
次に、凍結濃縮のメカニズム、及びＡＦＰによる凍結濃縮抑制のメカニズムを説明する。図２のＡ〜ＣはＡＦＰを添加しない場合（ＡＦＰ−）であり、図２のＤ〜ＦはＡＦＰを添加した場合（ＡＦＰ＋）である。
【００２１】
凍結濃縮は、以下のようなメカニズムによって生じると推測される。すなわち、上述したように、凍結現象が生じる際、水分子は互いに結びついてネットワークを形成する。このとき、水分子は、水分子同士だけで互いに結びつき、より大きなサイズに成長し続けるという性質を有する。そのため、このネットワークが形成される際、水分子以外の物質はことごとく、その種類や量に関わらず、該ネットワーク内から物理的に排除される。その結果、水分子以外の物質が、該ネットワークの形成されていない部位へと移動（不均一拡散）し、凍結濃縮が生じる。
たとえば、図２Ａ〜Ｃに示すように、赤色のインクを滴下して出来る赤い色水は、図２のＡの模式図で示されるように、微視的には水中において赤色のインク成分（図中、●で示す）が均一に分散したものである。このような色水を入れた容器を冷凍庫内に静置すると、時間経過とともに、冷やされた庫内に接触している容器の底面部分から氷核が発生し、これらが結晶成長して氷となる。このときインク成分は、凍結濃縮効果を受けて一方向に追いやられる（図２Ｂ）。さらに時間が経過してインク成分の凍結濃縮が進むと、巨視的には氷部分と色素部分とが分離した氷が出来上がる（図２Ｃ）。
【００２２】
一方、赤色のインクを滴下した水にＡＦＰを加えたものを用意して（図２Ｄ）、これを上記と同様に冷凍庫内に静置した場合、冷やされた庫内に接触している容器の底面部分から発生する氷核に対してＡＦＰが結合する。
このＡＦＰの結合により、上述したように、氷核が結晶成長抑制を受け、ｃ軸方向に結晶成長して、微細な大きさ（５０〜５００μｍ程度）のバイピラミダル氷結晶などに変形する。このようなバイピラミダル氷結晶は、互いに結びつきにくい性質を有しており、氷結晶間に隙間が形成される。また、バイピラミダル氷結晶とＡＦＰとの結合は、結晶間に存在している自由水のさらなる結合を阻止して氷結晶が大きくなることを抑制すると同時に、色素成分の移動を抑制する。その結果、インク成分は一方向に追いやられることなく氷結晶との混合状態を形成する（図２Ｅ）。
そして、インク成分の不均質拡散が抑制された状態で、色水中の全体にバイピラミダル氷結晶が形成され、最終的に、図２Ｆに示すように、色インク成分と氷結晶とが均一に分散した状態となる。
つまり、含水物の凍結に伴って形成される微細なバイピラミダル氷結晶間の間隙にインク成分が保持されるため、インク成分の不均質拡散が抑制され、凍結濃縮が著しく軽減されると考えられる。
【００２３】
水分子と、水分子以外の物質とを含む含水物は、すべからく上述した図１上段及び図２Ａ〜Ｃの模式図で説明される様式に従い凍結する。すなわち、含水物をマイナス温度下に晒した場合、氷核がこれらの内部において生成し、互いに結びついて氷となり、さらなる成長と結合を繰り返して大きな氷結晶（氷塊）を形成していく。
上述した穀類、麺類、野菜、果実、肉類、魚介類、氷菓子、加工食品、医療品、診断薬、試薬、化粧品、血液、精子、卵子、細胞、組織、臓器などは、それぞれ、多様な内部構造を有しており、水及び水以外の構成物の量や種類も大きく異なっている。しかしながら、凍結濃縮という観点において、これらは本質的には「水分子」と「水分子以外の物質」の２種類から構成される含水物と見なすことができるため、これらの凍結現象も模式的に図１上段及び図２Ａ〜Ｃで表すことができる。この場合、図２中の●は「水分子以外の物質」を表す。
したがって、ＡＦＰが存在している場合には、これらの含水物中に含まれる「水分子以外の物質」は、図２Ｄ〜Ｆに示すように、氷の形成にともなう大きな移動を強制されることがなく、該物質の濃縮によって該物質同士が接近し、互いに圧迫したり損傷を与えたりしにくくなる。その結果として、解凍後も凍結前の状態を維持することができる。
【００２４】
≪失活抑制方法≫
本発明の失活抑制方法は、生理活性物質を含む含水物を凍結する際、該含水物に不凍タンパク質を添加することを特徴とする方法である。
本明細書における「生理活性物質」という単語は、全ての「生理的な活性を有する物質」を指し示すものである。本発明の失活抑制方法が適用される生理活性物質としては、特に、生体に由来する物質、例えば抗生物質、機能性食品添加物、細胞分化誘導物質、機能性脂質（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、低分子化合物、ホルモン、ビタミン、ペプチド、酵素、抗体、タンパク質などが好適である。また、「含水物」としては、当該生理活性物質を含有する水溶液、生体細胞、組織、臓器、血液等の体液、細菌、ウイルス等の微生物などが挙げられる。
【００２５】
「生理活性物質を含む含水物」及び「生理活性物質」は、前述した凍結濃縮抑制方法における「含水物」及び「水分子以外の物質」に相当し、ＡＦＰの添加により生理活性物質の凍結濃縮が抑制される。その結果、タンパク質やその他各種細胞を構成する成分（細胞壁、脂質、核酸等）が、圧迫、損傷を受けることがなく、生理活性物質の活性が維持される。
本発明の失活抑制方法を行うための条件、すなわち、生理活性物質を含む含水物に対するＡＦＰの添加量、ＡＦＰを添加する際の該含水物のｐＨ、温度等の条件は、前述した凍結濃縮抑制方法において述べた条件と同様である。
生理活性物質を含む含水物中における生理活性物質の濃度に特に制限はなく、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌである。生理活性物質の濃度がこの範囲内であると、ＡＦＰによる失活抑制効果が高く好ましい。
【００２６】
≪凍結物製造方法≫
本発明の凍結物製造方法は、水分子及び水分子以外の成分を含む含水物を凍結又は凍結乾燥する際、該含水物に不凍タンパク質を添加することを特徴とする方法である。
凍結物としては、アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の氷菓、ディスプレイ用の氷、飲食用の氷（球型氷など）、冷凍肉、冷凍魚、冷凍野菜、冷凍果実、冷凍麺、調理済冷凍食品、凍結臓器、凍結細胞、凍結体液、凍結精子、凍結卵子、凍結試薬、凍結診断薬等が挙げられる。
凍結乾燥物としては、凍結乾燥により製造される医薬品、粉末状のフリーズドライ食品などが挙げられる。
また、水分子以外の成分としては、特に制限はないが、例えば医療分野においては、凍結乾燥により製造される医薬品に含まれる、生理活性を有する又は有さない各種成分などが挙げられる。また、食品分野においては、粉末状又は液状の食品、糖類などの調味料、各種食品添加物などが挙げられる。また、ディスプレイ用の氷等の場合には、顔料や染料等の色素などが挙げられる。
【００２７】
「水分子以外の成分を含む含水物」及び「水分子以外の成分」は、前述した凍結濃縮抑制方法における「含水物」及び「水分子以外の物質」に相当し、ＡＦＰの添加により各種成分の凍結濃縮が抑制される。その結果、色素等の成分が、凍結物又は凍結乾燥物全体に均一に分散した凍結物又は凍結乾燥物を得ることができる。なお、凍結乾燥処理の操作は、従来に行われている周知の方法により行うことができる。
本発明の凍結物製造方法を行うための条件、すなわち、含水物に対するＡＦＰの添加量、ＡＦＰを添加する際の含水物のｐＨ、温度等の条件は、前述した凍結濃縮抑制方法において述べた条件と同様である。
該含水物中における各種成分の濃度に特に制限はなく、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌである。成分濃度がこの範囲内であると、ＡＦＰによる均一分散効果が高く好ましい。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明は特にこれにより限定されるものではない。
「ＡＦＰの調製例１」
以下の条件でナガガジ由来のＩＩＩ型ＡＦＰを調製した。ナガガジ魚体は北海道野付漁業共同組合（北海道野付郡別海町尾岱沼港町１７９−２）より購入した。
はじめに、ナガガジ魚体１匹を水で良く洗い、包丁にて頭部と内臓を除いた。次に、残りの胴体部分（約１２０ｇ）を包丁で５等分し、これに同量（１２０ｍＬ）の０．１Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ＝７．９）を加えたものをジューサーミキサー（Ｔｅｓｃｏｍ社製ＰＡＬＣＯＯＫＩＮ、容量７８０ｍＬ）に入れて約１分間粉砕した。
こうして得たナガガジすり身を濃縮遠心機（ＨＩＴＡＣＨＩ  ｈｉｍａｃ  ＣＦ７Ｄ２）により３，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、上澄み液１５０ｍＬを回収した。これを透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭＷＣＯ：  ３，５００）に入れ、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝３．７）に対して一晩透析をした。
その後に、透析チューブ内容物を濃縮遠心機（ＨＩＴＡＣＨＩ  ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｒ）により１１，０００回転にて３０分間遠心分離し、上澄み液１５０ｍＬを回収した。これを透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ、ＭＷＣＯ：３，５００）に入れ、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ＝７．９）に対して一晩透析をした。
その後に、透析チューブ内容物を濃縮遠心機（ＨＩＴＡＣＨＩ  ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｒ）により１１，０００回転にて３０分間遠心分離し、上澄み液１４０ｍＬを回収した。この液をビーカーに入れ活性炭（ＷＡＫＯ特級０３７−０２１１５）１ｇを加えて５分間攪拌した。これを注射器フィルター（ポアサイズ：０．２μｍ）を用いて濾過したものを凍結乾燥した。
凍結乾燥後の粉末の質量は３３０ｍｇであった。電気泳動の結果から、この乾燥粉末は、約８０％の純度のナガガジ由来のＩＩＩ型ＡＦＰ精製物（以下、精製ＡＦＰ（ＩＩＩ）ということがある）であることが判明した。ＡＦＰの氷結晶成長阻害能力は、共雑タンパク質による影響を受けないため、この純度は必要にして充分と判断した。
この精製実験を平行的に行うことで、５日間で１，１２０ｍｇの同純度の精製ＡＦＰ（ＩＩＩ）を得て、以下の凍結濃縮抑制試験１〜３に用いた。
【００２９】
「凍結濃縮抑制試験１」
プラスチック容器（１０５ｍｍ×２８ｍｍ×２８ｍｍ）を用意してこれに５０ｍＬの水道水を入れた。この水にパイロット社製の赤色インクを１５０μＬ滴下し、良く撹拌して赤い色水を作成した。
この色水に対して何も加えないものをＡ液（ＡＦＰ−）とし、精製ＡＦＰ（ＩＩＩ）の乾燥粉末を１０ｍｇ（０．０２質量％）加えて良く撹拌攪拌したものをＢ液（ＡＦＰ＋）とした。
このＡ液とＢ液をともに家庭用冷凍冷蔵庫の冷凍庫内（−１８℃）に静置し、１晩放置して凍結させた。
【００３０】
こうして作製したＡ液とＢ液の氷の写真を図３に示す。
Ａ液（ＡＦＰ−）については、図２Ａ〜Ｃで示した凍結濃縮メカニズムによって、赤色インク成分が氷の一方向に追いやられて濃縮した結果、氷部分とインク部分とが分離し、周辺部が透明な氷となった（図３Ａ）。
一方、Ｂ液（ＡＦＰ＋）については、全体に赤い色インク成分が分散して赤く着色された氷が得られた（図３Ｂ）。これは、図２Ｄ〜Ｆで表されるメカニズムによって、ＡＦＰが赤色インク成分の凍結濃縮を効果的に抑制した結果であると考えられる。
【００３１】
さらに、精製ＡＦＰ（ＩＩＩ）の濃度を０．０１質量％から０．１質量％まで変化させて、上記と同様の試験を行ったところ、精製ＡＦＰ（ＩＩＩ）の濃度がおよそ０．０３質量％から０．０５質量％のときに、最も均質に赤く着色された氷が得られた。
【００３２】
「凍結濃縮抑制試験２」
ＡＦＰが、他のタンパク質に比べて高い凍結濃縮抑制効果を有していることを示すために、一般的なタンパク質であるニワトリ卵白リゾチームとウシ血清アルブミンについて凍結濃縮抑制効果を調べ、ＡＦＰにおける同効果と比較した。
まず、プラスチック容器（６０ｍｍ×６０ｍｍ×５５ｍｍ）を用意し、これに５０ｍＬの水道水を入れた。この水にパイロット社製の赤色インクを５０μＬ滴下し、良く撹拌して赤い色水を作成した。
次に、この赤い色水に対して
Ａ）何も加えないもの
Ｂ）ニワトリ卵白リゾチームの乾燥粉末１６ｍｇを加えたもの
Ｃ）ウシ血清アルブミンの乾燥粉末１６ｍｇを加えたもの
Ｄ）精製ＡＦＰ（ＩＩＩ）の乾燥粉末１６ｍｇ（０．０３％）を加えたもの
の４種類の試料液Ａ〜Ｄを作成した。いずれの試料液も良く撹拌し、家庭用冷凍冷蔵庫の冷凍庫内（−１８℃）に静置し、１晩放置して凍結させた。
図４のＡ〜Ｄは、上記試料液Ａ〜Ｄの氷の写真である。
図４のＡ、Ｂ、Ｃのいずれにおいても、赤色インク成分は氷の内部の特定部分に凍結濃縮された。
一方、図４のＤに見られるように、ＡＦＰを加えた場合については凍結濃縮が著しく軽減され、全体に赤い色インク成分が分散して赤く着色された氷が形成された。
【００３３】
「凍結濃縮抑制試験３」
ＡＦＰの凍結濃縮抑制効果を利用して、赤色だけでなく、黄色および青色に着色された氷を作成した。
まず、プラスチック容器（６０ｍｍ×６０ｍｍ×５５ｍｍ）を用意してこれに５０ｍＬの水道水を入れた。この水にパイロット社製の赤色インクを５０マイクロリットル滴下したものをＡ液（赤）、ペンテル社製の黄色の絵の具０．２ｇを溶解したものをＢ液（黄）、ペンテル社製の青色の絵の具０．２ｇを溶解したものをＣ液（青）とし、これらを良く撹拌した。
次いで、Ａ〜Ｃ液に対して精製ＡＦＰ（ＩＩＩ）の乾燥粉末１６ｍｇ（０．０３質量％）を加えた。いずれも良く撹拌し、家庭用冷凍冷蔵庫の冷凍庫内（−１８℃）に静置し、１晩放置して凍結させた。
図５のＡ〜Ｃは、上記Ａ〜Ｃ液の氷の写真である。このようにして、赤色、黄色、青色に均一に着色された氷が作成できた。
【００３４】
【発明の効果】
上述のように、本発明においては、水分子及び水分子以外の物質を含む含水物を凍結する際に、該含水物に対してＡＦＰを添加することにより、前記物質の凍結濃縮を抑制することができる。したがって、凍結濃縮による品質の低下や内部構造の破壊、生理活性の消失などを著しく軽減することができる。また、全体に均一に着色された氷を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＦＰを添加しない場合（ＡＦＰ−）と添加した場合（ＡＦＰ＋）の両方について、水が凍結する様子を表す模式図である。
【図２】ＡＦＰを添加しない場合（ＡＦＰ−）と添加した場合（ＡＦＰ＋）の各々について、着色水が凍結する様子を表す模式図である。
【図３】凍結濃縮抑制試験１において、精製ＡＦＰ（ＩＩＩ）を添加しない場合（ＡＦＰ−）と添加した場合（ＡＦＰ＋）の各々について、着色水を凍結させて作成した氷の写真である。
【図４】凍結濃縮抑制試験２において、色インクを溶かした水を凍結させた氷の写真を、Ａ．タンパク質を添加しない場合、Ｂ．ニワトリ卵白リゾチームを添加した場合、Ｃ．ウシ血清アルブミンを添加した場合、およびＤ．精製ＡＦＰ（ＩＩＩ）を添加した場合について比較したものである。
【図５】凍結濃縮抑制試験３において、精製ＡＦＰ（ＩＩＩ）が存在する場合（ＡＦＰ＋）について、赤色（Ａ）、黄色（Ｂ）、青色（Ｃ）のインクを溶かした水を凍結させて作成した氷の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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