(57)【要約】      （修正有）【課題】生体制御機構に作用する新たな薬物の開発に有用な、呼吸器系における疾患に関与する遺伝子及び該遺伝子がコードする蛋白質、および該蛋白質に対する活性調節剤の効率的な評価方法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列からなるＤＮＡ及び該ＤＮＡにコードされるカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質、該ＤＮＡ配列に対するアンチセンス核酸、該蛋白質を利用した該蛋白質のチャネル機能を調節する物質の探索方法、該蛋白質に対する特異抗体。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号：１のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞
【請求項５】
請求項１に記載の蛋白質の発現を抑制するアンチセンス核酸。
【請求項６】
塩基配列が、請求項２に記載のＤＮＡの核酸の全部または一部に相補する配列である、請求項５に記載のアンチセンス核酸。
【請求項７】
請求項１に記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドに対する抗体。
【請求項８】
請求項１に記載の蛋白質あるいは該蛋白質を発現している形質転換細胞と被験物質とを接触させることを特徴とする、該蛋白質のチャネル機能を調節する物質の探索方法。
【請求項９】
請求項３に記載の組換えベクターまたは請求項４に記載の形質転換細胞と被験物質とを接触させることを特徴とする、請求項２に記載のＤＮＡの発現調節作用を示す物質の検索方法。
【請求項１０】
ｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子組換え非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡならびに組換えベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体、該蛋白質に対する特異抗体、該蛋白質の発現を抑制するアンチセンス核酸、及び該蛋白質またはそれをコードするＤＮＡを用いた診断薬、阻害剤、医薬品などのスクリーニング方法、遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞は、細胞膜、核膜その他の生体膜に様々な膜蛋白質を発現させている。これらはきわめて多数の生理活性物質とそれぞれ高度に特異的に対応し、その情報を細胞へと与えることで細胞あるいは生体全体の機能調節の役割を担っている。
【０００３】
この細胞の機能を調節する膜蛋白質として、生体膜においてある物質に対して特異的な通路を、膜を貫通する細孔として形成し、この膜の細孔を介した輸送を行う蛋白質であるチャネル蛋白質が知られている。チャネル蛋白質は、この細孔を開閉させることでそれぞれに特定の物質の移送を調節する。この開閉部分はゲートと呼ばれ、チャネル蛋白質は、このゲート開閉の機構に基づいて、生理活性物質の存在を感受してその開閉が行われるリガンド依存性チャネルと、膜電位に依存する電位依存性チャネルに分けられる。
【０００４】
チャネル蛋白質は、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）などのカチオンの移送に関与し、軸策やシナプス後膜、興奮膜のＮａチャネル、Ｋチャネル、Ｃａチャネルなど、またミトコンドリア内膜においてＡＴＰ産生に関与するプロトン（Ｈ）チャネル（Ｆ０とも呼ばれる）などが知られており、遺伝子、蛋白質、生体膜それぞれのレベルで研究が進められている。
【０００５】
カリウムチャネルは他のイオンチャネルに比べ著しく分子多様性があり、種々の細胞機能に関与している。カリウムチャネル蛋白質で多くのサブタイプが存在することは、各サブタイプが固有の生理的機能を有していることを推認させるものである。
【０００６】
よって新規なカリウムチャネル蛋白質を単離しその機能を特定することは、学術的意義のみならず、かかる機能を応用した医薬開発において重要な要素となり得る。また、このカリウムチャネル蛋白質またはこれをコードする遺伝子を用いて、効率的に医薬候補物質、特に特異的なチャネル機能調節剤を探索、評価することも可能となる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このような背景から、ヒト由来の新たなカリウムチャネル蛋白質及びこれをコードする遺伝子を見出すこと、そして該蛋白質を生産し、該蛋白質の活性を調節する物質を効率的にスクリーニングする方法、活性調節剤、特異的抗体、あるいはアンチセンス核酸の開発が切望されている。
【０００８】
本発明は、新規なカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質、及びそれをコードするＤＮＡを提供することを目的とする。さらに、当該蛋白質に対するチャネル機能調節剤のスクリーニング方法を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ヒト冠動脈内皮細胞から単離された新規な遺伝子（ｔｒａｃｈ３００５２１１とする）、当該遺伝子にコードされるカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質（ＴＲＡＣＨ３００５２１１とする）に関する。また、当該遺伝子を用いて形質転換した宿主細胞、該蛋白質に対する特異抗体、該蛋白質の発現を抑制するアンチセンス核酸、チャネル機能調節剤の探索方法、遺伝子組換え非ヒト動物を提供する。
【００１０】
（核酸）
本発明は、ＴＲＡＣＨ３００５２１１（後に詳しく述べる）をコードする遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１を提供する。遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１とは具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質をコードするＤＮＡのことであり、配列番号１や配列番号３に示すｃＤＮＡのほか該ｃＤＮＡの由来するゲノムＤＮＡも含まれる。該遺伝子は気管から単離同定することができるが、本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブリダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクローニングやホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製されるＤＮＡであってもよい。その形態としてはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。また、本発明のＤＮＡは１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。
【００１１】
ｔｒａｃｈ３００５２１１の塩基配列が提供されれば、これより導かれるＲＮＡの配列や、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡあるいは本発明のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡもまた提供するものと理解すべきである。本明細書中において、「ＤＮＡ」は「ポリヌクレオチド」と同義である。
【００１２】
さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡをも含むものである。
【００１３】
配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対しては、これとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡにコードされる蛋白質がカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質である限り、塩基配列のバリエーションが許容される。例えば、いわゆるコドン縮重による同一アミノ酸残基をコードする複数のコドンの存在や、種々の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が配列番号１または配列番号３に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配列番号１または配列番号３に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
【００１４】
上記のＤＮＡ変異の程度は、配列番号１または配列番号３に記載のＤＮＡ配列と９８％以上、好ましくは９９％以上、更に好ましくは９９．８％以上の同一性を有するものであれば許容範囲内である。ＤＮＡ配列の同一性の判断には、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，Ｖｏｌ．３６；２９０−３００（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２１５；４０３−１０（１９９０））を用いることができる。また、ハイブリダイズする程度としては、ストリンジェントな条件下、例えばＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃａｔ  Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、例えば３２℃、好ましくは３７℃、より好ましくは４２℃のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃａｔ  Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、例えば５０℃、好ましくは６５℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、配列番号１または配列番号３に記載の核酸にハイブリダイズする程度であればよい。
【００１５】
配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡあるいはその部分断片は、本発明の蛋白質が関与する疾患の特異的プローブとして有用であると考えられる。
【００１６】
本発明のＤＮＡは、ＴＲＡＣＨ３００５２１１を大量に生産するために使用することができる。該ＤＮＡはまた、酵素等で標識して、組織における本発明の蛋白質の発現状況を検査するために使用することができる。すなわち、該ＤＮＡをプローブとして使用し、細胞における本発明の蛋白質の発現量をｍＲＮＡ発現量を指標として確認することにより、本発明の蛋白質の製造に適した細胞やその培養条件を決定することができるほか、本発明の蛋白質が関連する疾患の診断を行うことも可能である。
【００１７】
また、本発明のＤＮＡの一部をプライマーとして使用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、シークエンシング等の方法により、核酸配列上の異常あるいは多形を検査・診断することができる。
【００１８】
また、本発明のＤＮＡを生体内の細胞に導入し、本発明の蛋白質の発現または活性が損なわれていることによる疾患の遺伝子治療にも使用する事ができる。
【００１９】
本発明のＤＮＡは、形質転換細胞の調製、さらには該形質転換細胞を用いた組換蛋白質ＴＲＡＣＨ３００５２１１の生産方法、あるいはＴＲＡＣＨ３００５２１１の発現を特異的に抑制する化合物の探索に大いに有用である。
【００２０】
本発明における形質転換細胞は当業者に公知の技術を適用して調製することが可能であり、例えば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々なベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のＤＮＡを組み入れることが可能である。その際、遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１をプロモーターやエンハンサーに代表される発現制御遺伝子の影響下におくことで、遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１の宿主細胞内での発現を任意にコントロールすることが可能である。この手法は、形質転換された宿主細胞を用いた蛋白質ＴＲＡＣＨ３００５２１１の生産において好適に用いられる他、遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１の発現制御機構の研究あるいは該遺伝子の発現を調節し得る物質の探索などにも応用することが可能となる。
【００２１】
例えば、任意の被験物質と遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１の全部または一部を含むベクターで形質転換された細胞とを適当な条件下で接触させることで、被験物質の遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質を探索し、あるいは評価を行うことができる。遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１の一部の例としてはｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡが挙げられる。
【００２２】
また、本発明であるＤＮＡと公知の方法とを組み合わせてマウスまたはその他の適当な動物を基にトランスジェニック動物を調製することが出来る。本発明の遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１を利用すれば、ヒト以外の動物からｔｒａｃｈ３００５２１１に相当する遺伝子を破壊したいわゆるノックアウト動物を作製することも可能である。そのようにして内在性遺伝子が破壊された該動物に本発明のヒトｔｒａｃｈ３００５２１１を導入することにより、ヒトｔｒａｃｈ３００５２１１のみを有するモデル動物を作製することも可能となる。かかるトランスジェニック動物、特に本発明である遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１あるいは蛋白質ＴＲＡＣＨ３００５２１１を大量に発現しているあるいは逆にこれらを欠いた動物を観察すれば、遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１あるいは蛋白質ＴＲＡＣＨ３００５２１１の機能を特定することが可能となる。さらに、このモデル動物は、該導入されたヒトｔｒａｃｈ３００５２１１をターゲットとした薬剤の開発、評価に有用である。
【００２３】
遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１あるいは蛋白質ＴＲＡＣＨ３００５２１１に特異的に作用しあるいは機能を補完する物質等を、生体レベルで調べることが可能となり、この様にして得た物質は、ＴＲＡＣＨ３００５２１１が特異的に機能する生体制御に働く薬物となることが期待される。特に本発明である遺伝子あるいは蛋白質は脳に特異的に発現が観察されることから、上述の形質転換細胞あるいはトランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物等は、本発明の蛋白質が関与する疾患に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
【００２４】
（蛋白質ＴＲＡＣＨ３００５２１１）
ｔｒａｃｈ３００５２１１にコードされる蛋白質は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるＴＲＡＣＨ３００５２１１である。ＴＲＡＣＨ３００５２１１はラットのカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質であるＳｌａｃｋ（Ｊｏｉｎｅｒ  ＷＪら、Ｎａｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、Ｖｏｌ．１、ｐｐ４６２−４６９（１９９８））との間で８０％の相同性を有し、Ｓｌａｃｋと同様カルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質であると推測される。Ｓｌａｃｋは神経系に多く発現している一方で、本発明のＴＲＡＣＨ３００５２１１は気管より単離され肺において強い発現が確認された。ＳｌａｃｋとＴＲＡＣＨ３００５２１１は異なる組織において発現しており、それぞれ異なる役割を果たしているものと推察される。
【００２５】
カルシウム感受性カリウムチャネルは細胞内カルシウム濃度の上昇によって開口する。平滑筋に存在するカルシウム感受性カチオンチャネルが開口すると、細胞膜の過分極により、筋は弛緩する。従って本発明の蛋白質の開口薬は、平滑筋弛緩作用を有すると考えられる。本発明の蛋白質は気管から単離され、肺組織において高い発現が確認されていることから、気管支拡張薬のターゲットとなり得る。
【００２６】
従って、ＴＲＡＣＨ３００５２１１に作用するチャネル機能の調節剤は、新たな作用機序に基づく医薬としての有用性を持つと期待されることから、ＴＲＡＣＨ３００５２１１を用いたチャネル機能調節剤の探索は、医薬開発において重要な意義を有すると期待される。
【００２７】
なお、カルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質である限り、配列番号２に示す蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／若しくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。
【００２８】
蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。非荷電極性アミノ酸としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、チロシン（Ｔｙｒ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。塩基性アミノ酸としてはＬｙｓ、Ａｒｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能、本発明においてはカルシウム依存性カチオンチャネル機能、を失わない変異も当業者に多く知られている。さらに、異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されていてもなお本質的な機能を保持している例も多く認められている。
【００２９】
従って、配列番号２に示したアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、その変異蛋白質がカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質であれば、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。ここにいうカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質とは、例えばチャネル蛋白質機能において配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質であるＴＲＡＣＨ３００５２１１と実質的に同質の機能を有するものをいう。従って、チャネル機能が性質的に同質であればよく、チャネル機能の強弱の変動、または糖鎖結合の相違などによる該蛋白質の分子量の量的変化などは許容されると解されるべきである。  このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多型等によって生ずる変異の様に自然界において認められる他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことができる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白質がカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質である限り特に制限はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、より好ましくは１もしくは数個以内である。
【００３０】
上記に述べた蛋白質は、いわゆる当業者における通常の認識の範囲にある塩の形態であっても差し支えないことは言うまでもなく、それ単独の形態のみならず、別種の蛋白質との融合蛋白質を含めた種々の形態に変換された蛋白質も含まれる。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手法による変換が考えられる。用いる宿主によっては発現する蛋白質への糖鎖の付加の有無あるいはその程度に相違が生ずる。かかる場合にあっても、カルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質として機能する限りにおいて、なお本発明であると理解されたい。
【００３１】
本発明の蛋白質またはその部分断片ペプチドは、該蛋白質の活性を調節する物質の探索に使用することが出来る。探索を通じて得られる化合物等は、本発明の蛋白質が関連する疾患対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
【００３２】
（抗体）
本発明はさらにＴＲＡＣＨ３００５２１１に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、上記蛋白質全体あるいはその部分ペプチドを抗原として特異的に認識する抗体であり、モノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構造、物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれに属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリンを例えばペプシンで分解したときのＦ（ａｂ’）２、パパインで分解したときのＦａｂなどのフラグメントであっても、またキメラ抗体、ヒト化抗体やヒト抗体であってもよい。またＴＲＡＣＨ３００５２１１あるいはその部分ペプチドを特異的に認識するのみでなく、ＴＲＡＣＨ３００５２１１の活性を調節する機能を有する抗体も本発明に含まれる。これらの抗体は、ＴＲＡＣＨ３００５２１１の研究的あるいは臨床的な検出、ＴＲＡＣＨ３００５２１１によってもたらされ得る疾患の臨床治療等に有用である。
【００３３】
（アンチセンス核酸）
本発明は、生体内において核酸レベルでのＴＲＡＣＨ３００５２１１生合成を抑制することのできる、いわゆるアンチセンス核酸を提供する。かかるアンチセンス核酸は、ＴＲＡＣＨ３００５２１１をコードするｍＲＮＡを作り出すのに必要なゲノム領域からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担うＤＮＡもしくはＲＮＡに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋白質の発現を調節するものを意味し、遺伝子ＴＲＡＣＨ３００５２１１の核酸配列の全体あるいはいずれかの部分に相補する配列からなるものであってもよい。好ましくは、配列番号１または３に記載の核酸配列に相当あるいは相補する配列から成る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡを含む）である。また、ゲノム領域から転写されるｍＲＮＡがイントロン構造あるいは５’末端や３’末端に非翻訳領域を含む形であるときは、かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相補するアンチセンス核酸も本発明のアンチセンス核酸と同等の機能を有するものとなろう。
【００３４】
本発明のアンチセンス核酸は、ＤＮＡやＲＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮＡあるいはＲＮＡと類似する各種誘導体のすべてを含むものである。例えば、３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合した核酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか１つにおいて置換や修飾が生じた核酸、天然には存在しないような塩基、糖あるいはリン酸を有する核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有する核酸等が挙げられる。これらの核酸は、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも１つが高められた誘導体として好適である。すなわち、ＴＲＡＣＨ３００５２１１の活性発現を抑制し得る機能を有する限り、核酸の形態に制限はない。
【００３５】
また本発明では、一般的には、ステム・ループを形成しているｍＲＮＡのループ部分にハイブリダイズするような塩基配列、すなわちステム・ループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつアンチセンス核酸が好適である。あるいは、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプライス部位に結合するようなアンチセンス核酸、すなわちこれらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸も、一般に高い発現抑制効果が期待できる点で好ましい。
【００３６】
この様なアンチセンス核酸を細胞内に取り込ませ、効率的に作用させるためには、本発明のアンチセンス核酸の鎖長は１５塩基以上３０塩基以下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩基以上２２塩基以下の塩基数からなる塩基配列からなるものが好適である。
【００３７】
本発明のアンチセンス核酸の発現抑制効果は、公知の手法、例えば本発明の遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒｉｂｏ  ｍａｘ  ｓｙｓｔｅｍ等）とｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ等）を併用する系のような本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で被験物質を系に添加し、該レポーター遺伝子の発現量を測定することにより評価することができる。
【００３８】
本発明のアンチセンス核酸は、生体内におけるＴＲＡＣＨ３００５２１１の発現を抑制することが出来るので、ＴＲＡＣＨ３００５２１１が関連する疾患の予防・治療剤として有用である。
【００３９】
【発明の実施の最良の形態】
以下に本発明における実施態様を説明するが、遺伝子工学的手法、蛋白質や細胞あるいは動物を用いた生化学的手法、クロマトグラフィーやペプチド合成機などの各種機器の原理や使用法について、特に断らない限りその利用については制限がなく、いわゆる当業者が利用可能な状態にある技術やその原理、使用方法はすべて本発明についても適用可能であって、以下の記載に限定されないと理解されるべきである。
【００４０】
（核酸）
本発明のＤＮＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号１に記載の塩基配列もしくはその一部を有するＤＮＡを３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法で（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２年）行うことができる。イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本発明の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても得る事ができる。ＰＣＲは、配列番号１または３に記載の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライマーを作製し、任意のＤＮＡライブラリーに対し、公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）等を行って、本発明のＤＮＡを得る事もできる。上記各種方法で使用するＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡライブラリーを選択して使用する。当該ＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラリーであれば、いかなるものも使用可能であり、市販のＤＮＡライブラリーを使用したり、本発明のＤＮＡを有する細胞からｃＤＮＡライブラリーを作製するのに適した細胞を選び公知の方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年参照）に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、利用することができる。
【００４１】
また、本明細書に開示された配列を基にホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製することも可能である。
【００４２】
本発明のＤＮＡを含む組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明のＤＮＡの全部または一部に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。一部とは例えば本発明の蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡである。他の塩基配列とは、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。本発明の組換えベクターの好ましい一例は、発現ベクターである。
【００４３】
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明のＤＮＡに付加し、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失させることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、本発明のＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
【００４４】
また本発明のＤＮＡを保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に制限はない。この様に、本発明の遺伝子に対しては、遺伝子工学的手法において通常用いられる様々な要素を付加したもの、あるいは改変したものが挙げられ、それらはここに開示したものが全てではなく、いわゆる当業者が利用可能な要素や手法であれば、特に制限はないと理解されるべきである。
【００４５】
本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。かかる発現系を用いれば、本発明の遺伝子の転写を促進あるいは抑制する物質の探索がより有利に行える。あるいは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモーターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは置き換えて使用することもできる。この場合に使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター、延長因子１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  １α）プロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されない。
【００４６】
ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。
【００４７】
（ｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子組換え非ヒト動物）
本発明は、ｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子組換え非ヒト動物を提供する。ｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子組換え非ヒト動物には、トランスジェニック非ヒト動物およびノックアウト非ヒト動物が含まれる。ｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子組換え非ヒト動物は、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を該動物の染色体上に人為的に組み込むことにより、本発明の蛋白質の発現の程度、発現時期、発現部位等が制御されることを特徴とする。非ヒト動物としては、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ウマ、ニワトリなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。非ヒト動物の中でも非ヒト哺乳動物が好ましい。
【００４８】
本発明の遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１を用いれば、トランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。該トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような定法（例、発生工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィク発行、勝木元也編、野村達次監修、１９８７年）に従って作製することができる。すなわち、本発明の遺伝子または組換えベクターを非ヒト動物の受精卵に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別する。
【００４９】
具体的には、例えば、トランスジェニックマウスの場合には、正常Ｃ５７ＢＬａｃＫ／６マウスから取得した前核期受精卵にｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子が発現可能なように構築されたＤＮＡを直接注入する。より具体的には、適切なプロモーターの下流にｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子を接続して導入したコンストラクトを作製し、その後必要であれば原核生物由来の配列を可能な限り除去した直鎖状ＤＮＡを得て、これを前核期受精卵前核に微細なガラス針を用いて直接注入する。
【００５０】
該受精卵を仮親となる別の偽妊娠マウスの子宮に移植する。偽妊娠マウスは一般的にＩＣＲ雌マウスを、精管を切断または結紮した雄マウスと交配して作製する。移植胚由来の仔の組織よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法またはサザンブロッティング法にてｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子の導入の有無を確認しトランスジェニックマウスを得る。
【００５１】
また、ｔｒａｃｈ３００５２１１（またはｔｒａｃｈ３００５２１１のマウス相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、いわゆる「ノックアウトマウス」を作製することができる。本発明における「ノックアウトマウス」とは、本発明のマウス由来の蛋白質をコードする内在性遺伝子がノックアウト（不活性化）されたマウスであり、例えば相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクション法（米国特許第５，４６４，７６４号公報、同５，４８７，９９２号公報、同５，６２７，０５９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９など）を用いて作製することができ、このようなノックアウトマウスも本発明の一態様である。
【００５２】
または、最近中大動物においても核移植によるクローン動物の作出が可能となった。これに伴い本技術を用いたトランスジェニックおよびノックアウト動物の作出も実際に行われるようになった。すなわち体細胞、あるいは生殖系列の細胞に対しｔｒａｃｈ３００５２１１（または各動物におけるｔｒａｃｈ３００５２１１の相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、ＥＳ細胞に対して行うのと同様に相同組換えを行い、得られた細胞から核を得て、その核を用いてクローン動物を得ることができる。該動物はｔｒａｃｈ３００５２１１（または各動物におけるｔｒａｃｈ３００５２１１の相同遺伝子）が失われたノックアウト動物である。または、上述の方法と同様、任意の動物の任意の細胞にｔｒａｃｈ３００５２１１（または各動物におけるｔｒａｃｈ３００５２１１の相同遺伝子）遺伝子を導入し、その核を用いてクローン動物を得る事によりトランスジェニック動物を作製する事も可能である。このようなノックアウト非ヒト動物およびトランスジェニック非ヒト動物はその種に関わらず本発明の一態様である。
【００５３】
（蛋白質）
本発明の蛋白質は、天然に発現している各種臓器から調製することができるが、ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３３Ａ型、アプライドバイオシステムズ  ジャパン株式会社製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。しかしながら、その純度の面から遺伝子工学的な手法による生産ならびに組換え型蛋白質が好ましい。
【００５４】
前項の組換えベクターを用いて形質転換させる宿主細胞には特に制限はなく、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓあるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに代表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、本発明に対しても利用可能である。
【００５５】
本発明の形質転換細胞は、適当な宿主細胞を本発明の組換えベクターにより形質転換させることで得ることができる。前項の組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用いても構わない。
【００５６】
当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するには、上述の形質転換細胞を培養して培養混合物を回収し、当該蛋白質を精製する。形質転換細胞の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換細胞の培養については各種の成書（たとえは、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年、参照）があるので、それらを参考にして行うことができる。
【００５７】
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
【００５８】
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、へキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビン、エンテロカイネースその他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとして蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ましい。
【００５９】
また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。
【００６０】
この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。また、用いる宿主によっては糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認められる。かかる場合にあっても、カルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質として機能する限りにおいて、なお、本発明の思想下にあるというべきである。
【００６１】
本発明の蛋白質は、抗体を作製するための抗原として使用したり、該蛋白質に結合する物質や該蛋白の活性を調節する物質のスクリーニングに使用することができ、有用である。
【００６２】
ＴＲＡＣＨ３００５２１１が形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、適当な緩衝液に懸濁した細胞に対して、例えば超音波処理、凍結融解処理、あるいはリゾチーム処理などを行って細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方法で本発明の蛋白質を含有する膜画分を得、さらに該膜画分を適当な界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を調製する。そして、当該粗溶液から常法により目的蛋白質を単離、精製することができる。
【００６３】
（抗体）
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にして得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説明する。
【００６４】
当該新規抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い、抗血清を得る。抗原として用いる本発明の蛋白質は、それか抗体の作製に使用しうる精製度のものであれはいかなる方法で得られたものであってもよい。本発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原として好適に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプチドが、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよい。免疫する動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用することが好ましい。
【００６５】
ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。
【００６６】
モノクローナル抗体を得るには以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによって得れは良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。
【００６７】
また、遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あるいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作製する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて精製することができる。抗体を治療に使用する場合には、免疫原性の点からヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス（例Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、１５；１４６−１５６（１９９７））を免疫することにより調製することができる。また、モノクローナル抗体の超可変領域を用いて遺伝子工学的に調製することもできる（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３；９９−１２１（１９９１））。
【００６８】
（アンチセンス核酸）
アンチセンス核酸は、公知方法で製造することができる（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｔ．ＣｒｏｏＫｅおよびＢｅＲＮＡｌｄ  Ｌｅｂｌｅｕ編、ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ出版、フロリダ、１９９３年）。天然のＤＮＡやＲＮＡであれば、化学合成機を使用して合成したり、ｔｒａｃｈ３００５２１１を鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス核酸を得ることができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘導体の中には化学合成機（たとえばアプライドバイオシステムズ  ジャパン株式会社製、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  Ｍｏｄｅｌ  ８９０９）を使用して合成できるものもある。この場合には、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、アンチセンス核酸を得ることができる。
【００６９】
本発明のＤＮＡやアンチセンス核酸を診断用のプローブとして使用する場合には、それらを公知の方法に従い、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、あるいは発光物質等で標識する。次に、検体からＤＮＡもしくはｍＲＮＡを公知方法で調製し、これを被験物質として、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄して未反応の前記標識プローブを除去する。被験物質中に、遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１もしくはＲＮＡが含まれていれば、当該アンチセンス核酸はそれらと結合する。結合形成の有無は、標識した酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは放射性同位元素等による発光、蛍光、放射能等を指標として知ることができる。
【００７０】
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターを医薬用途に使用する場合には、医薬品として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許容されうる使用方法で使用することが好ましい。
【００７１】
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁して使用してもよいし、リポソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用してもよい。また、必要に応じて、薬理学的に許容され得る補助成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にして使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助成分とは、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、緩衝剤等のことである。
【００７２】
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、上述のような剤型とした場合、患者の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、その投与量を設定して使用することができる。すなわち、病態を改善するのに適した量を、経口投与、あるいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。
【００７３】
（スクリーニング方法）
本発明は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞またはｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子組換え非ヒト動物を用いることを特徴とする、該蛋白質の発現あるいはチャネル機能を調節する物質をスクリーニングする方法に関する。より具体的には、（１）ＴＲＡＣＨ３００５２１１と被験物質とをカチオンの共存下で接触させ、該蛋白質のチャネル機能に与える該候補物質の影響を測定する方法、（２）被験物質の存在下／非存在下における本発明の蛋白質または遺伝子の発現レベルを比較し、本発明の蛋白質の発現を調節する物質をスクリーニングする方法などが挙げられる。（１）の例としては、アフリカツメガエル卵母細胞または哺乳動物由来の細胞系において、ＴＲＡＣＨ３００５２１１を発現している生体膜あるいは細胞を用いたアッセイが考えられる。測定するチャネル機能としては電流または電位変化応答が挙げられる。これらは公知の方法でアッセイが可能である（アフリカツメガエル卵母細胞の場合は，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．８９，  ｐｐ．５５４−５５８，  １９９２を参照。哺乳動物の場合は，Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｖｏｌ．  ２７４，  ｐｐ．  Ｈ１６４３−Ｈ１６５４，  １９９８を参照）。さらに具体的な例としては、実施例３または４に示す方法を挙げることができる。（２）の例としてはｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で該レポーター遺伝子の発現量を被験物質の存在下／非存在下で測定し、被験物質の転写促進活性または転写抑制活性を確認する方法が挙げられる。本発明のスクリーニング方法は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞またはｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子組換え非ヒト動物と被験物質を接触させる工程；被験物質添加群と被験物質無添加群とにおける本発明の蛋白質の活性または本発明のＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを検出する工程；差が認められた被験物質を本発明の蛋白質の活性調節物質または本発明のＤＮＡの発現調節物質として選択する工程を含み得る。また、本発明の蛋白質を発現している形質転換細胞の調製にあたっては、ヒト神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ由来ｍＲＮＡを共導入することが好ましい。本発明の蛋白質の活性を調節する作用を示す物質とは、ＴＲＡＣＨ３００５２１１蛋白質の活性を増強（アゴニスト）あるいは阻害する（アンタゴニスト）作用を有する物質のいずれでも良い。本発明のＤＮＡの発現調節作用を示す物質とは、遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質のいずれでもよいが、好ましくは抑制する作用を有する物質である。被験物質が本発明の蛋白質の活性調節作用または本発明のＤＮＡの発現調節作用を示すかどうかは、蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡ���発現を確認できる系に被験物質を添加した場合と無添加の場合の蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを調べればよい。ＤＮＡの発現レベルとは、ｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子のｍＲＮＡの発現強度、蛋白質の発現強度のいずれにより検出しても良い。また、ｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子またはＴＲＡＣＨ３００５２１１蛋白質自体の発現レベルではなく、代替としてレポーター遺伝子の発現レベルを検出しても良い。レポーターアッセイ系は、試験したい遺伝子の発現制御領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該発現制御領域に作用する物質をスクリーニングするアッセイ系をいう。発現制御領域としては、プロモーター、エンハンサー、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子等を利用することができる。本発明の遺伝子の発現制御領域や５’非翻訳領域は公知の方法で取得することが可能である（新細胞工学実験プロトコール（秀潤社）、１９９３年）。阻害（または抑制）する作用を有する、あるいは増強（または促進）する作用を有するとは、蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルの測定値が、被験物質添加群と、被験物質無添加群との間に差があることをいう。たとえば、下記の式で計算される阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であることをいう。
【００７４】
阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率＝（被験物質無添加群の測定値―被験物質添加群の測定値）の絶対値／無添加群の測定値＊１００
ここで、阻害または増強のどちらの活性であるかについて、および測定値については蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系の種類によって適宜定められる。たとえば、蛋白質の活性を確認できる系が実施例３または４に示す電流測定系の場合には、測定値としては電流値を用いることができ、被験物質添加群の測定値＜被験物質無添加群の測定値となる場合、被験物質にはＴＲＡＣＨ３００５２１１蛋白質活性阻害作用があるといえる。測定系にバックグラウンドやノイズの値が含まれる場合には、そのようなものを差し引いた値を測定値とすることは言うまでもない。
【００７５】
本発明である蛋白質は、気管から単離され肺に強い発現が認められるカルシウム感受性カリウムチャネル蛋白質であることから、上述のスクリーニング方法あるいはトランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物等は、呼吸器系における疾患に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。被験物質としては蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質でも公知物質でもよい。
【００７６】
実施例
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
【００７７】
実施例１  遺伝子ｍｃｄ０５５のクローニング
（１）クローンＣ−ＴＲＡＣＨ３００５２１１の取得
（１−１）ｃＤＮＡライブラリーの作成と全長性の評価
ヒト組織の気管（Ｔｒａｃｈｅａ）より全ＲＮＡとして抽出されたｍＲＮＡを全ＲＮＡの状態で購入した（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  ＃６４０９１−１）。購入したＲＮＡよりオリゴキャプ法［Ｍ．  Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄＳ．  Ｓｕｇａｎｏ，  Ｇｅｎｅ，  １３８：  １７１−１７４  （１９９４）］を改良した方法（ＷＯ  ０１／０４２８６）によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐ  ｌｉｎｋｅｒおよびＯｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒを用いて、ＷＯ  ０１／０４２８６に記載したようにＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理、ＲＮＡライゲーション、第一鎖ｃＤＮＡの合成とＲＮＡの除去を行った。次いで、５’側と３’側のＰＣＲプライマーを用いＰＣＲ  （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖ｃＤＮＡに変換し、ＳｆｉＩで切断した。次いで、３ｋｂ以上に分画したｃＤＮＡ断片をＤｒａＩＩＩで切断したベクターｐＭＥ１８ＳＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ００９８６４，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）にｃＤＮＡの方向性を決めてクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐ  ｌｉｎｋｅｒ、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ、５’側と３’側のＰＣＲプライマーの配列は、ＷＯ  ０１／０４２８６に記載したものを使用した。
【００７８】
これらより得たクローンのプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’端の塩基配列をＤＮＡシーケンシング試薬（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００，  ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）でＤＮＡ塩基配列を解析した。得られたデータをデータベース化した。
【００７９】
オリゴキャップ法を改良した方法で作製したヒト気管（Ｔｒａｃｈｅａ）のｃＤＮＡライブラリーの約３万クローンの５’−末端の全長率を次の方法で求めた。公共データベース中のヒト既知ｍＲＮＡと５’−末端配列が一致する全クローンについて、公共データベース中の既知ｍＲＮＡ配列より長く５’−末端が伸びている場合、または５’−末端は短いが翻訳開始コドンは有している場合を「全長」と判断し、翻訳開始コドンを含んでいない場合を「非全長」と判断した。これをもとに５’−末端の全長率  ［全長クローン数／（全長クローン数＋非全長クローン数）］  を計算した。この結果、５’−末端の全長率は、約９０％であった。この結果より、この方法で取得したヒトｃＤＮＡライブラリーからのクローンの５’−端配列の全長率が非常に高いことが分かった。
【００８０】
（１−２）全長塩基配列解析クローンの選択および全長配列解析
上記のようにして得られたｃＤＮＡクローンの５’末端配列については、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅのｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓの表記があるデータを対象にしたＢＬＡＳＴによる相同性検索を行い、ヒトのｍＲＮＡ配列に同一なものは除いた。次にクラスタリングを行い、相同性９０％以上かつコンセンサス配列が５０塩基対以上の場合、同一グループと見なし、グループを形成させた。グループ内の、より５’−側に長いクローンを選択し、全長塩基配列解析を行うクローンを得た。
【００８１】
全長塩基配列解析に選抜されたクローンについて全長ｃＤＮＡの塩基配列を通常の方法により決定した。全長塩基配列は、両鎖とも部分塩基配列が完全にオーバーラップするように確定した。
そのなかよりＣ−ＴＲＡＣＨ３００５２１１を取得した。
プラスミドＣ−ＴＲＡＣＨ３００５２１１には、配列番号２で表される１０５２個のアミノ酸からなる新規な蛋白質をコードする、配列番号１で表される３１５６塩基の塩基配列からなるオープンリーディングフレームを含む配列番号３で表わされる３４６２塩基対の塩基配列からなるｃＤＮＡが含まれていた。このプラスミドＣ−ＴＲＡＣＨ３００５２１１は、国際微生物寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６６として寄託されている。
【００８２】
（２）ｃＤＮＡクローン塩基配列及びアミノ酸配列の解析
次に、この１０５２個のアミノ酸配列に対して、局部的な配列の一致を検索した。相同性の検索にはＢＬＡＳＴ  （Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ．，  ３６，  ｐｐ．２９０−３００  （１９９３）；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５，  ｐｐ．４０３−１０（１９９０））を用いた。推定される蛋白質配列を問い合わせ配列としてＧｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）蛋白質データベースに対しＢＬＡＳＴ相同性検索を行った。その結果、全長にわたりＫＩＡＡ１４２２  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ：  ｄｂｊ｜ＢＡＡ９２６６０．１｜）と７０％の同一性、７８％の相同性がみられた。また、ラットＳｌａｃｋ（ＮＰ＿０６８６２５）との間で３２−１０３５アミノ酸残基にわたり７２％の同一性、８０％の相同性がみられた。
【００８３】
（３）ｔｒａｃｈ３００５２１１のゲノム構造
（１）でクローニングしたヒトｔｒａｃｈ３００５２１１のゲノム構造を調べた。すなわち、ｔｒａｃｈ３００５２１１のｃＤＮＡ配列を用い、ｓｉｍ４によってヒトゲノム配列に対してマッピングを行った。その結果、ヒトｔｒａｃｈ３００５２１１遺伝子は第１染色体（ＡＬ１６１７３５）上にマッピングされた。一方、ｔｒａｃｈ３００５２１１と相同性があったＫＩＡＡ１４２２  ｐｒｏｔｅｉｎは第９染色体上にマッピングされた。
【００８４】
実施例２  ＲＴ−ＰＣＲによる発現プロファイル解析
ＲＴ−ＰＣＲによるｔｒａｃｈ５２１１の組織発現プロファイル解析を行った。センスプライマー  Ｆ１（５’−ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＴＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＴＡＣ  ＴＣ−３’）及びアンチセンスプライマーＲ１（５’−ＴＧＣ  ＴＡＡ  ＡＣＡ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＣＡ−３’）を設計し、Ｈｕｍａｎ  ＭＴＣ  ＰａｎｅｌＩ、Ｈｕｍａｎ  ＭＴＣ  ＰａｎｅｌＩＩ（クロンテック社）を鋳型にＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社）用いてＰＣＲ反応を行った。解析した結果、ｔｒａｃｈ５２１１は肺および卵巣で強く発現していた（図１）。
【００８５】
実施例３  ＴＲＡＣＨ３００５２１１を発現した卵母細胞における電気生理学的検討
（１）ＴＲＡＣＨ３００５２１１をコードするｍＲＮＡの調製
ＴＲＡＣＨ３００５２１１をコードするｍＲＮＡを調製するために、以下のプラスミドを構築する。実施例１に記載のＣ−ＴＲＡＣＨ３００５２１１を制限酵素ＸｈｏＩにて消化し、ＴＲＡＣＨ３００５２１１ｃＤＮＡを含む約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を切り出す。次にｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＸｈｏＩサイトにこの断片を挿入し、ＪＭ１０９（タカラバイオサイエンス社）などの大腸菌ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌにｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎし、ｍＲＮＡ調製用のプラスミドｐｃＤＮＡ５２１１を構築することができる。ｍＲＮＡの合成及び精製は以下の方法で行う。ｐｃＤＮＡ５２１１をＢｓｓＨＩＩにて直線化し、フェノール及びクロロホルムにて精製する。次にこの直線化ＤＮＡを鋳型にＴ７プロモーターを利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎを行う。その後、合成産物をフェノール及びクロロホルムにて精製し、電気泳動及び吸光度測定を行い、ＲＮＡの純度と合成量を確認する。また、合成ＲＮＡの安定化の目的で、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｔａｉｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用い、合成ＲＮＡの３’端にｐｏｌｙ（Ａ）を付加する。
【００８６】
（２）卵母細胞の調製
アフリカツメガエル（志木家田科学）から摘出した卵母細胞をコラゲナーゼにて、濾胞を除去し単離する。ＮＤバッファー（９６ｍＭ  ＮａＣｌ、２．０ｍＭ  ＫＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＣ１２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）中で、第５または第６ステージの細胞を選別する。選別後の卵母細胞は一晩、２０℃にてインキュベーションし、ｍＲＮＡをマイクロインジェクシヨンする。インジェクション後の卵母細胞はＮＤバッファー中で、２０℃にてインキュベーションする。
【００８７】
（３）卵母細胞における電流測定
２４時間以上インキュベーションを行い，状態の良い卵母細胞について，  Ｋ電流の測定を行う。細胞外液に以下の組成のバッファーを使用する．組成：８８  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２．４  ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，  １．０  ｍＭ  ＫＣｌ，  １９  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ０．８２  ｍＭ  ＭｇＳＯ４，  ０．３３  ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２，  ０．４１  ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ｐＨ  ７．５．固定膜電位は，−３５から−８０  ｍＶとし、５００  ｍｓの脱分極パルスを１０  ｍＶおきに与える。
【００８８】
実施例４  ＴＲＡＣＨ３００５２１１を発現したＣＨＯ細胞における電気生理学的検討
（１）  ＴＲＡＣＨ３００５２１１をコードする遺伝子の導入
ＣＨＯ細胞を１０％ウシ胎仔血清を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍでガラスカバースリップ上で５０％コンフルエント状態まで培養する．実施例１で得られたＣ−ＴＲＡＣＨ３０５２１１あるいは実施例３で得られたｐｃＤＮＡ５２１１をＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）と添付プロトコールに従い混合し、ＣＨＯ細胞に添加する。
【００８９】
（２）ＣＨＯ細胞における電流測定
２４時間以上インキュベーションを行い，Ｋ電流の測定を行う。バス側には以下の組成のバッファーを使用する．組成：１４０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  １．０  ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ３．０  ｍＭ  ＫＣｌ，  ２９  ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ，  ２５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ  ７．４．ピペット内には以下の組成のバッファーを使用する．組成：３２．５  ｍＭ  ＫＣｌ，  ９７．５  ｍＭ  グルコン酸カリウム，５  ｍＭ  ＥＧＴＡ，  １０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ  ７．２．保持電位は−７０  ｍＶとし，−８０  ｍＶから＋６０  ｍＶまでのパルスを２０  ｍＶおきに与える。
【００９０】
【発明の効果】
本発明のＴＲＡＣＨ３００５２１１は、当該蛋白質のチャネル機構を調節し得る、新たな生体制御機構に作用する薬物の開発に有用である。
【００９１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は、遺伝子ｔｒａｃｈ３００５２１１の生体内での発現分布を示す。縦軸は相対的な発現量を表す。。
【図１】
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