(57)【要約】【課題】本発明の課題は、アポトーシス抑制に起因する障害の予防及び／又は治療に有用なアポトーシス誘導剤を提供することである。【解決手段】式Ｉ：【化１】2004231556.tif 000007〔式中、Ｒは、炭素数４〜３０の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基である〕で表される化合物を含む、Ａｋｔ阻害剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2004231556.tif 000005
〔式中、Ｒは、炭素数４〜３０の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基である〕
で表される化合物を含む、Ａｋｔ阻害剤。
【請求項２】
Ｒが、３位にオキソ基を有する炭素数４〜３０の直鎖状又は分枝状のアシル基である、請求項１に記載のＡｋｔ阻害剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＡｋｔ阻害剤を含む、アポトーシス誘導剤。
【請求項４】
式Ｉ：
【化２】
2004231556.tif 000006
〔式中、Ｒは、請求項１と同義である〕
で表される化合物を用いて、細胞におけるアポトーシスを誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キナーゼの１つであるＡｋｔを阻害する化合物、及び該化合物を含むアポトーシス誘導剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）は、Ｋｅｒｒ及びＷｙｌｌｉｅ等によって提唱された生理的な細胞死の過程又は様式であり（非特許文献１及び２参照）、単なる細胞の崩壊現象ではなく、個体の生命を維持するために細胞の遺伝子にプログラムされた能動的な細胞死である。アポトーシスは、発生過程における体の形成だけではなく、成熟個体においても正常な細胞交替、神経系の維持、免疫系の成立など細胞社会の統制を図るために重要な役割を果たしている（非特許文献３及び４参照）。さらにアポトーシスは、基本的な生命現象のみならず、癌、自己免疫疾患、ＡＩＤＳなどのウィルス感染症、アルツハイマー病などの神経変性疾患といった様々な疾病の発症にも密接に関わっていることが明らかになってきている（非特許文献５参照）。
【０００３】
アポトーシスは、生理的及び病理的な条件下で様々なアポトーシス誘導要因によって引き起こされ、アポトーシス細胞に特徴的な形態学的変化と生化学的な変化により定義されている。アポトーシスは、正常な細胞が火傷や打撲といった過激な障害を受けて死に至る受動的な崩壊過程であるネクローシス（壊死）とは区別される。
【０００４】
アポトーシスの誘導には、ホルモンやサイトカインによるシグナル、成長因子の除去などの生物学的要因の他に、放射線や熱といった物理的要因及び薬物などの化学的要因があげられ、そのメカニズムは誘導要因によって様々であり、最終的にＤＮＡの断片化を中心とする共通のプロセスを経て、細胞死が起こる。
【０００５】
アポトーシスは正常な発生・分化に不可欠な生理的細胞死であり、正常な生体組織の細胞回転などにおいて個々の細胞に起こっている。そのため、アポトーシスが過剰に抑制されると多くの機能障害の原因となってくる。
【０００６】
具体的にこれらアポトーシス抑制に起因する障害としては、癌、増殖性皮膚疾患、慢性関節リウマチ、ＨＩＶ感染、肝炎、腎疾患等を挙げることができるが、いずれもまだ有効な治療剤がないのが現状であり、臨床上有用性の高い治療・改善薬が求められていた。
【０００７】
一方、近年、微生物が有する多種多様な認識及び応答機能の１つとして、クオラムセンシングと呼ばれる、周囲の菌体数を感知して応答する機構が知られている。この情報伝達機構にはオートインデューサーと呼ばれる物質が存在し、このオートインデューサーを介して微生物間での情報伝達が行われ、遺伝子の転写活性の促進、病原性の発現、抗生物質産生などの広範囲の生物化学的、生理学的機能の調節が行われている。このクオラムセンシングは、多くのグラム陰性菌で発見され、代表的なオートインデューサーとしてアシル化ホモセリンラクトン類が報告されている。そして、アシル化ホモセリンラクトン類は、微生物の多種多様な活性に関与していることが明らかとなっている。これらの活性としては、植物病原菌であるエルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）及び嚢胞性繊維症の起因菌である緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）における細胞外酵素の産生、及びアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）から植物へのＴｉプラスミドの導入等が知られている。
【０００８】
しかし、アシル化ホモセリンラクトン類が、動物細胞の活性等に影響を及ぼすことに関する知見は極めて乏しく、さらには、細胞のアポトーシスに影響を及ぼすことについては、全く知られていなかった。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２６，２３９−２５７，  １９７２
【非特許文献２】
Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １１１，８５−９４，  １９７３
【非特許文献３】
Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５４，  ６０５−６１２，  １９６６
【非特許文献４】
Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７，  ６６３−６９８，  １９９１
【非特許文献５】
Ｌａｎｃｅｔ  ３４１，  １２５１−１２５４，  １９９３
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、アポトーシス抑制に起因する障害の予防及び／又は治療に有用なアポトーシス誘導剤を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、アシル化ホモセリンラクトン類が、細胞の生存に必須の酵素であるＡｋｔの活性を阻害し、効果的にアポトーシスを誘導することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）式Ｉ：
【化３】
2004231556.tif 000002
〔式中、Ｒは、炭素数４〜３０の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基である〕
で表される化合物を含む、Ａｋｔ阻害剤。
（２）Ｒが、３位にオキソ基を有する炭素数４〜３０の直鎖状又は分枝状のアシル基である、（１）に記載のＡｋｔ阻害剤。
（３）（１）又は（２）に記載のＡｋｔ阻害剤を含む、アポトーシス誘導剤。
（４）式Ｉ：
【化４】
2004231556.tif 000003
〔式中、Ｒは、（１）と同義である〕
で表される化合物を用いて、細胞におけるアポトーシスを誘導する方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明における、式Ｉ：
【化５】
2004231556.tif 000004
で表される化合物をアシル化ホモセリンラクトン類と称する。
【００１４】
式Ｉにおける、Ｒは、炭素数４〜３０、好ましくは８〜２０、より好ましくは１０〜１４の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアシル基であり、置換基としては、ヒドロキシル基、オキソ基、メチル基等が挙げられる。非置換の飽和脂肪族アシル基、及び３位にオキソ基を有する飽和脂肪族アシル基が好ましい。また、直鎖状であることが好ましい。
【００１５】
Ｒの具体例としては、特に限定されないが、例えば、ブチリル基、３−オキソブチリル基、３−ヒドロキシブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、３−オキソバレリル基、イソバレリル基、３−オキソイソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、３−オキソヘキサノイル基、ヘプタノイル基、３−オキソヘプタノイル基、オクタノイル基、３−オキソオクタノイル基、ノナノイル基、３−オキソノナノイル基、デカノイル基、３−オキソデカノイル基、ウンデカノイル基、３−オキソウンデカノイル基、ラウロイル基、３−オキソドデカノイル基、トリデカノイル基、３−オキソトリデカノイル基、テトラデカノイル基、３−オキソテトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、３−オキソペンタデカノイル基、パルミトイル基、３−オキソパルミトイル基、ヘプタデカノイル基、３−オキソヘプタデカノイル基、ステアロイル基、３−オキソステアロイル基、ノナデカノイル基、３−オキソノナデカノイル基、イコサノイル基、３−オキソイコサノイル基、トリアコンタノイル基、３−オキソトリアコンタノイル基、ミリストイル基、３−オキソミリストイル基及びピルボイル基等が挙げられる。
【００１６】
式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類の具体例としては、特に限定されないが、例えば、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソブチリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−ヒドロキシブチリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イソブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−バレリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソバレリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イソバレリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソイソバレリル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ピバロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘプタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソオクタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ノナノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソノナノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−デカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソウンデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−テトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソテトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソペンタデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−パルミトイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソパルミトイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘプタデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ステアロイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソステアロイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ノナデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソノナデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−イコサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソイコサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリアコンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリアコンタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソミリストイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−ピルボイル−Ｌ−ホモセリンラクトン等が挙げられる。
【００１７】
特に、Ｎ−（３−オキソデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソウンデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソトリデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−（３−オキソテトラデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンが好ましい。
【００１８】
本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は、例えば、脂肪族カルボン酸又はそのエステルと環状アミノ酸との間にアミド結合を形成させることによって合成することができる。また、アシル化ホモセリンラクトン類は、例えば、Ｃｈｈａｂｒａ，  Ｓ．  Ｒ．，  Ｐ．  Ｓｔｅａｄ，  Ｎ．  Ｊ．  Ｂａｉｎｔｏｎ，  Ｇ．  Ｐ．  Ｃ．  Ｓａｌｍｏｎｄ，  Ｇ．  Ｓ．  Ａ．  Ｂ．  Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｐ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｗ．  Ｂｙｃｒｏｆｔ，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，  ４６，  ４４１−４５４，  １９９３、Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．，  Ｐ．  Ｊ．  Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．  Ｋｅｒｒ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｅ．  Ｔａｔｅ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２，  ４４６−４４８，  １９９３、Ｓｃｈａｅｆｅｒ  Ａ．Ｌ．，  Ｂ．  Ｌ．  Ｈａｎｚｅｌｋａ，  Ａ．  Ｅｂｅｒｈａｒｄ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｐ．  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７８，  ２８９７−２９０１，  １９９６、Ｇａｏ，  Ｊ．  Ｇ．  ａｎｄ  Ｅ．  Ａ．  Ｍｅｉｇｈｅｎ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７５，  ３８５６−３８６２，  １９９３などに記載された方法によって合成できる。
【００１９】
また、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類は微生物によって生合成されるため、微生物を培養した培養物から当技術分野において通常用いられる方法によって分離精製することもできる。
【００２０】
本発明者らは、アシル化ホモセリンラクトン類と各種動物細胞を反応させ、ウェスタンブロッティング法によって、該細胞におけるＡｋｔ活性を測定したところ、特定のアシル化ホモセリンラクトン類が、Ａｋｔのリン酸化活性を効果的に阻害することを見出した。
【００２１】
本発明において、Ａｋｔは、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシチド３−ＯＨキナーゼ）の下流で活性化するセリン／トレオニンキナーゼであり、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路は、生存シグナル伝達経路の１つとして知られている。また、Ａｋｔが、細胞におけるアポトーシスを阻害する活性を有することも報告されている（特表２００２−５２８３９０）。
【００２２】
本発明において、アポトーシスとは当技術分野で通常用いられる意味を有し、すなわち、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死を意味する。アポトーシスの形態は、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表層微絨毛の消失、クロマチンの凝縮を特徴とする。細胞は萎縮し、細胞の内容物が細胞外に放出されずにマクロファージなどの周囲の細胞にすみやかに取り込まれるので、炎症が引き起こされず、周囲の細胞に影響を与えない。一方、環境の悪化から引き起こされるネクローシス（壊死）は、細胞の内容物が放出される点で大きく異なる。
【００２３】
上記のような特徴から、細胞におけるアポトーシスは、様々な方法で検出することができる。アポトーシスの検出法としては、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡ結合性蛍光色素アミノベンズイミド（ヘキスト３３３４２、３３５８２及び３３３２５８など）などによる染色後に蛍光顕微鏡でクロマチン凝縮を観察する方法、断片化したＤＮＡを遠心などにより抽出分離して比色法などによって定量する方法、断片化したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で「ラダー」として検出する方法、断片化したＤＮＡを組織化学的に検出するＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）法などが挙げられる。
【００２４】
本発明のアポトーシス誘導剤によって、アポトーシスを誘導できる細胞は、特に限定されないが、植物細胞及び動物細胞が挙げられ、動物細胞のアポトーシスを特に効果的に誘導できる。
【００２５】
本発明により、アシル化ホモセリンラクトン類が、癌細胞に対して効果的にＡｋｔの活性を阻害することが明らかとなったことから、アシル化ホモセリンラクトン類を癌細胞におけるＡｋｔ阻害剤として使用できる。さらに、癌細胞にアシル化ホモセリンラクトン類を作用させることによって、癌細胞の細胞生存率の低下及びクロマチンの凝集等が観察されたことから、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類が、癌細胞に対し効果的にアポトーシスを誘導することも明らかとなった。従って、本発明のアシル化ホモセリンラクトン類を、抗癌剤における有効成分として使用できる。
【００２６】
本発明において、Ａｋｔ阻害剤とは、Ａｋｔの活性化、すなわちリン酸化を阻害する薬剤及び活性化Ａｋｔを不活性化する薬剤を意味し、例えば、動物細胞におけるＡｋｔの活性化を阻害する薬剤、Ａｋｔの細胞内における正常な局在化を阻害する薬剤、Ａｋｔを活性化する物質の作用を阻害する薬剤、Ａｋｔ活性化物質を分解する薬剤などが含まれる。
【００２７】
さらに、式Ｉで表されるアシル化ホモセリンラクトン類は、Ｒ基の種類によってＡｋｔ阻害活性が異なることから、Ｒ基を変更及び改変することによって、そのアポトーシス誘導効果を調節することができる。また、異なるＲ基を有する複数種のアシル化ホモセリンラクトン類を組み合わせて使用することにより、Ａｋｔ活性の変化を制御し、薬理効果を調節することも可能であると考えられる。
【００２８】
本発明のアシル化ホモセリンラクトン類を有効成分とするアポトーシス誘導剤によって治療できる疾患としては、特に限定されないが、例えば、卵巣、乳房、膵臓、皮膚、肺、脳、腎臓、肝臓、鼻咽頭腔、中枢神経系、前立腺、大腸、結腸、直腸、子宮頸部及び子宮内膜からなる群より選択される組織中に存在する癌、並びに増殖性皮膚疾患、慢性関節リウマチ、ＨＩＶ感染、肝炎、腎疾患等のアポトーシスの抑制に起因する疾患が挙げられる。特に、大腸癌などの消化器系の癌、皮膚癌の治療において好適に使用される。
【００２９】
本発明のアポトーシス誘導剤において、アシル化ホモセリンラクトン類は、水和物であってもよい。さらに、本発明にかかるアシル化ホモセリンラクトン類は遊離した形態であってもよく、又はその薬理学的に許容される塩であってもよい。塩を形成する場合は、具体的にはアルカリ金属の付加塩、アルカリ土類金属の付加塩、アンモニウム塩、アミンの付加塩等を挙げることができるが、遊離した状態がより好ましい。
【００３０】
次に本発明のアシル化ホモセリンラクトン類の投与剤型としては、例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤などの経口製剤、軟膏、貼付剤等の外用剤、坐剤及び注射用製剤等が挙げられる。製剤化の際には、通常の製剤担体を用いて常法により製造することができる。
【００３１】
すなわち経口製剤を製造するにあたっては、アシル化ホモセリンラクトン類と賦形剤、さらに必要に応じて酸化防止剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。
【００３２】
賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素などが、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミンなどが、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が、滑沢剤としては、例えばタルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が用いられる。これらの錠剤・顆粒剤は、糖衣してもよく、その他必要により適宜コーティングしてもよい。
【００３３】
また注射用製剤を製造する際には、アシル化ホモセリンラクトン類にｐＨ調整剤、溶解剤、等張化剤などと、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤、酸化防止剤などを加えて、常法により製剤化する。
【００３４】
外用剤を製造する際の方法は限定されず、常法により製造することができる。すなわち製剤化にあたり使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能である。
【００３５】
使用する基剤原料として具体的には、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水などの原料が挙げられ、さらに必要に応じ、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料などを添加することができるが、本発明にかかる外用剤の基剤原料はこれらに限定されない。また必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。なお上記基剤原料の添加量は、通常外用剤の製造にあたり設定される濃度になる量である。
【００３６】
本発明におけるアポトーシス誘導剤の有効成分であるアシル化ホモセリンラクトン類の臨床投与量は、投与の対象となる動物、症状、重症度、年齢、体重、合併症などによって異なり、また塩の種類・投与経路などによっても異なるが、通常、成人１日あたり１μｇ〜１ｇであり、好ましくは１０μｇ〜２００ｍｇであり、さらに好ましくは２０μｇ〜２０ｍｇである。
【００３７】
本発明のアポトーシス誘導剤の投与対象としては、動物であれば特に限定されないが、哺乳動物、例えば、ウマ、犬、マウス、モルモット、ラット等が挙げられる。特に、ヒトに対して好適に使用される。
【００３８】
【実施例】
以下の実施例において実験材料は、特に他に記載がない限り、以下に記載のものを使用した。
【００３９】
細胞培養に用いたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）はＳＩＧＭＡ社から購入した。Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）の溶媒として用いたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は和光純薬工業株式会社のものを使用した。キナーゼ阻害剤であるＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社から購入した。タンパク質の定量には、ＰＩＥＲＣＥ社のＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用した。抗体については以下の会社のものを使用した。抗−リン酸化−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）  抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−３  抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９（Ｄ３３０）抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰ（Ｄ２１４）抗体、ＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社。ＨＲＰ標識抗−マウスＩｇＧ抗体はＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社。抗−α−チューブリン抗体（Ａｂ−１）はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社。
【００４０】
実施例１  Ａｋｔ活性のウェスタンブロットによる解析
（１）ＣａＣｏ−２細胞におけるアシル化ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の変化
ヒト大腸癌カルチノーマ細胞株ＣａＣｏ−２はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入し、１０％  ＦＣＳ、１％  ＮＥＡＡ、１％  Ｐ／Ｓ（１００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％  ＣＯ２存在下で培養した。
【００４１】
６ｃｍ  ディッシュ（ＮＵＮＣ社）を用いて、１  ディッシュ当たりＣａＣｏ−２細胞を６×１０５個まき、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（−）で２回洗浄後、１％  ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、終濃度１００μＭでホモセリンラクトン塩酸塩、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加し、１０分間反応させた。なお、精製されたアシル化ホモセリンラクトンは、目的とする終濃度の４００倍になるようＤＭＳＯに溶解し、フィルター滅菌（φ０．２２μｍ）を行ったものを使用した。対照として終濃度０．２５  ％のＤＭＳＯを使用した。また、内部標準としてα−チューブリンを用いた。
【００４２】
反応後、冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、−８０℃で凍結させた。氷上で細胞を融解し、溶解バッファー（５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％  グリセリン、１０  ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１００  ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）を２００μｌ加え、スクレーパーで細胞を剥ぎ取った。これを氷上で２０分間静置し、その後１４０００  ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を回収した。回収したタンパク質の濃度を測定し、５０μｇ相当をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後ＰＶＤＦメンブレンにブロットした。リン酸化Ａｋｔを測定する場合は、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含む５％  スキムミルク／Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水でブロッキングを行い、１次抗体にそれぞれ、抗−リン酸化−Ａｋｔ  （Ｓｅｒ４３７）  抗体を、２次抗体にはＨＲＰ標識抗−ウサギＩｇＧ抗体を用いた。内部標準として使用したα−チューブリンは、ブロッキングを５％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳ−Ｔで行い、１次抗体は抗−α−チューブリン（Ａｂ−１）、２次抗体にはＨＲＰ標識抗−マウスＩｇＧ抗体を用いた。バンドの検出にはＲｅｎａｉｓｓａｎｃｅＴＭ  ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ２５５８６１  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ（ＮＥＮ社）又は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｌｕｍｉｎｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を使用した。結果を図１に示す。なお以下で言及する図中において、ＨＳＬはホモセリンラクトン塩酸塩を、Ｃ４−ＨＳＬはＮ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトンを、３−ｏｘｏ−Ｃ６−ＨＳＬはＮ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを、３−ｏｘｏ−Ｃ１２−ＨＳＬはＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを意味する。
【００４３】
ＣａＣｏ−２細胞においてＡｋｔは通常リン酸化（活性化）された状態にあるが、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加した場合のみ、Ａｋｔのリン酸化レベルが著しく低下した。すなわち、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンがＡｋｔの活性化を阻害することが明らかとなった。
【００４４】
（２）ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的なＡｋｔ活性の変化
細胞培養後、終濃度０μＭ（０．２５％  ＤＭＳＯ）、１μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソ−ドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加して、１０分間反応させること以外は、（１）と同様にして、Ａｋｔ活性をウェスタンブロットにより解析した（図２）。
【００４５】
図２のバンドの強度をＬＡＳ−１０００により定量、数値化した結果を図３に示す。１０μＭ以上の濃度でＡｋｔのリン酸化レベルが有意に減少した。１０μＭ、３０μＭ、１００μＭではそれぞれ無刺激時の７９％、３１％、１４％にまで活性が低下した。
【００４６】
以上から、ＣａＣｏ−２細胞では、アシル化ホモセリンラクトン１０μＭ以上で、Ａｋｔの活性が有意に阻害されることが明らかとなった。
【００４７】
（３）ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の経時変化
細胞培養後、終濃度３０μＭ及び１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加し、それぞれアシル化ホモセリンラクトンによる刺激時間を０、５、１０、３０、６０分の短いタイムコース（図４）、０、１０分、６０分、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間の長いタイムコース（図５）で行った他は、（１）と同様にして、ウェスタンブロットによりＡｋｔ活性を測定した。３０μＭ刺激時のＡｋｔの活性阻害は５分をピークに６０分まで持続し、２時間で基底レベルに戻った。一方、１００μＭ刺激時のＡｋｔ活性阻害は５分をピークにして６時間まで持続した。
【００４８】
（４）ブタ血管内皮細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の変化
ブタ血管内皮細胞株（ＰＥＣ）を、１０％  ＦＣＳ、１％  ＮＥＡＡ、１％  Ｐ／Ｓ（１００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％  ＣＯ２存在下で培養した。
【００４９】
６ｃｍ  ディッシュ（ＮＵＮＣ社）を用いて、１  ディッシュ当たりＰＥＣ細胞を６×１０５  個まき、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（−）で２回洗浄後、１％  ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、終濃度１００μＭでホモセリンラクトン塩酸塩、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加し、１０分間反応させた。（１）と同様に、ウェスタンブロッティングにより、アシル化ホモセリンラクトン類がＰＥＣ細胞におけるＡｋｔの活性に与える影響を調べた。結果を図６に示す。
【００５０】
ウェスタンブロッティングの結果から、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンが、有意に、ＰＥＣ細胞におけるＡｋｔの活性を低減させることが明らかとなった。
【００５１】
以上の結果は、特定のアシル化ホモセリンラクトン類が、ＰＥＣ細胞におけるアポトーシスを誘導することを示している。
【００５２】
実施例２  Ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ染色による生存率の評価
３．５ｃｍ  ディッシュ（ＮＵＮＣ社）に、ＣａＣｏ−２細胞を２×１０５  個まき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％  ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。各種薬剤  ［終濃度１〜１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを添加し、１２時間培養した。対照として０．２５％  ＤＭＳＯを使用した。その後、上清及びトリプシン−ＥＤＴＡ（ＴＥ）でディッシュから剥がした細胞を、室温、８００  ｒｐｍで５分間遠心後、上清を取り除き、２００μｌのＤＭＥＭにて希釈した。うち５０μｌをエッペンチューブにとり、等量のＴｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ染色液を加え、細胞数を血球計測盤にて測定した。このとき、測定対象とする死細胞数と生細胞数の合計を２００個以上とした。
【００５３】
Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的に生存率の有意な低下が認められた。１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンにより、生存率がそれぞれ９０％、５５％、５１％にまで低下した（図７）。この３０μＭ以上の濃度において有意に生存率を低下させるという結果は、ウェスタンブロット解析においてＡｋｔ活性阻害が３０μＭ前後で顕著に見られたこととも一致する。また対照及び０．２５％  ＤＭＳＯ添加時の生存率はともに９４％であり、１μＭ  Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激時の生存率が９４  ％であることからＤＭＳＯの生存率への影響は無視できるものと考えられる。
【００５４】
実施例３  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色によるクロマチン凝縮の観察とアポトーシスの判定実施例２で観察されたＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定すべく、クロマチン染色の蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて形態学的に評価した。
【００５５】
８ウェル培養スライド（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  ｃｅｌｌ  ｗａｒｅ  ｂｉｏｃｏａｔ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ）に、ＣａＣｏ−２細胞を２×１０４個まき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％  ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。３−オキソ−ドデカノイルホモセリンラクトンを各濃度（１〜１００μＭ）にて添加し１２時間培養後、細胞を４％  パラホルムアルデヒド−３％  スクロース／ＰＢＳにて固定し、蛍光色素ヘキスト３３３４２を用いてクロマチン染色を行い、蛍光顕微鏡下で観察した。倍率４００倍にて５視野をランダムに選び、アポトーシス細胞と正常細胞を計数、アポトーシス細胞の割合を算出し、これをｎ＝１として３回以上試行した。
【００５６】
Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン１０μＭ以上の濃度で、クロマチン凝縮を起こしたアポトーシス細胞が観察された。しかし０．２５％  ＤＭＳＯ、１μＭ  Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンでは正常細胞のみが観察された（図８）。クロマチン凝縮が観察されたアポトーシス細胞の計数によりアポトーシスの定量を行った結果を図９に示す。全細胞数に対するアポトーシス細胞の割合は、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンでそれぞれ１５％、３９％、５０％であった。この値は生存低下率とも一致する。したがって、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンによるＣａＣｏ−２の細胞死はアポトーシスによるものと判定された。
【００５７】
実施例４  ＤＮＡ断片化によるアポトーシスの評価
実施例２で観察されたＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定するための別法として、ＤＮＡの断片化を評価した。
【００５８】
ＣａＣｏ−２細胞を５×１０６個／１５  ｃｍ  ディッシュ（ＮＵＮＣ社）にまき、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、１％  ＮＥＡＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養し、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンを１μＭ〜１００μＭの各濃度で添加後１２時間培養した。その後、上清及びＴＥでディッシュから剥がした細胞を、室温、８００  ｒｐｍで５分間遠心し、上清を取り除いた。細胞を３００  μｌのＰＢＳ（−）で懸濁し再度４℃、２５００  ｒｐｍで５分間遠心して上清を取り除いた。細胞を細胞溶解バッファー  ［１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．４）、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ８．０）、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００］  ３００μｌを加えて細胞溶解させ、氷上に１０分置いてＤＮＡ断片を抽出した。これを４℃、１４０００ｒｐｍで、１０分間遠心し、上清にＲＮａｓｅ  Ａを加え、３７℃で１時間温置した。さらにプロテイナーゼＫを加え、５０℃で３０分間温置した。ＤＮＡ断片抽出液をエタノール沈澱によって濃縮し、２％アガロースゲルで電気泳動を行った。ゲルをエチジウムブロミドで染色後、ＵＶトランスイルミネーター下でＤＮＡ断片化を検出した。
【００５９】
それぞれ０μＭ、１μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン存在下で１２時間培養したＣａＣｏ−２細胞において、ＤＮＡラダーを検出したところ、３０μＭ以上の濃度にてラダーが確認された（図１０）。
【００６０】
実施例５  ｃａｓｐａｓｅ活性の測定
ｃａｓｐａｓｅ（ｃａｓｐａｓｅ−３、ｃａｓｐａｓｅ−９）、ＰＡＲＰ（ｐｏｌｙ−ＡＤＰ  ｒｉｂｏｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の活性を、ウェスタンブロット解析により抗−活性型（Ｃｌａｖｅｄ型）ｃａｓｐａｓｅ抗体すなわち、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−３抗体、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９抗体（Ｄ３３０）、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰ  抗体  （Ｄ２１４）をそれぞれ用いて、実施例１と同様に測定した。
【００６１】
培養したＣａＣｏ−２細胞に、終濃度３０μＭ、１００μＭのＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンをそれぞれ添加し、経時的に０時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間培養後のｃａｓｐａｓｅ−３、ｃａｓｐａｓｅ−９、ＰＡＲＰ活性をウェスタンブロットにより解析した。結果を図１１に示す。３０μＭでは活性型ｃａｓｐａｓｅ−３は刺激１時間後から検出され、その活性が４時間まで持続したのに対し、１００μＭでは活性が刺激６時間後をピークにして１０時間まで持続した。各メンブレンをリプローブしてＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰを検出した。ｃａｓｐａｓｅ−９活性は３０μＭ刺激では１、２、４時間で活性が強く、微弱な活性が８時間まで持続したのに対し、１００μＭ刺激では強い活性が８時間まで持続した。Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰに関してもＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ−９と同様の挙動を示した。
【００６２】
次に、Ｎ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンとの３時間の反応を、０、１、１０、３０、１００μＭの各濃度にて行い、ｃａｓｐａｓｅ、ＰＡＲＰ活性を測定した。図１２に示すように、３０μＭ、１００μＭの濃度においてのみＣｌｅａｖｅｄ型ｃａｓｐａｓｅ、Ｃｌｅａｖｅｄ型ＰＡＲＰが検出された。この結果はウェスタンブロット解析によるＡｋｔ活性阻害、生存率低下やアポトーシス細胞出現が３０μＭ以上で顕著に起こったこととも一致した。
【００６３】
【発明の効果】
本発明により、細胞におけるアポトーシスを効果的に誘導することができ、アポトーシス抑制に起因する障害の予防及び／又は治療に対する有用な手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣａＣｏ−２細胞におけるＤＭＳＯ、ホモセリンラクトン塩酸塩、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の変化を表す図である。
【図２】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン濃度依存的なＡｋｔ活性の変化を表す図である。
【図３】図２のリン酸化Ａｋｔのバンドの強度をＬＡＳ−１０００により定量、数値化した結果を表す図である。
【図４】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の経時変化を表す図である。
【図５】ＣａＣｏ−２細胞におけるＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の経時変化を表す図である。
【図６】ブタ血管内皮細胞におけるＤＭＳＯ、ホモセリンラクトン塩酸塩、Ｎ−ブチリル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−（３−オキソドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン刺激によるＡｋｔ活性の変化を表す図である。
【図７】アシル化ホモセリンラクトン存在下における細胞生存率をＴｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ染色によって評価した結果である。
【図８】アシル化ホモセリンラクトン存在下における細胞のアポトーシスをＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色によるクロマチン凝縮で判定した結果である。
【図９】クロマチン凝縮が観察されたアポトーシス細胞の計数によりアポトーシスの定量を行った結果である。
【図１０】ＣａＣｏ−２の細胞死がアポトーシス又はネクローシスであるかを判定するために、ＤＮＡの断片化を評価した結果である。
【図１１】アシル化ホモセリンラクトン存在下におけるｃａｓｐａｓｅ活性の培養時間依存性を、ウェスタンブロットによって測定した結果である。
【図１２】ｃａｓｐａｓｅ活性のアシル化ホモセリンラクトン濃度依存性を、ウェスタンブロットによって測定した結果である。
【図１】
2004231556.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2004231556.tif 000015
【図９】
2004231556.tif 000016
【図１０】
2004231556.tif 000017
【図１１】
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【図１２】
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