(57)【要約】  【課題】  蛋白質修飾抑制作用の評価方法、およびその評価方法に基づくスクリーニング方法の提供。【解決手段】  SHR/NDmc-cpラットにおける糖化最終産物(AGEs)の生成レベルを測定する工程を含む、蛋白質修飾抑制作用の評価方法が提供された。この評価方法を利用して、AGEsの生成レベルを抑制する被験物質を選択することにより、AGEsの産生に起因する疾患に対する治療および／または予防に使用し得る化合物をスクリーニングすることができる。【選択図】 なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、蛋白修飾物生成抑制剤の評価方法。
(1)2型糖尿病様症状を呈する前、および／または後のSHR/NDmc-cpラットに被験物質を投与する工程、
(2)SHR/NDmc-cpラットにおける糖化最終産物の生成レベルを測定する工程、および
(3)被験物質が糖化最終産物の生成レベルを抑制する作用を有するとき、当該被験物質が蛋白修飾物生成抑制作用を有すると評価する工程
【請求項２】
次の工程を含む、糖化最終産物の産生に起因する疾患に対する治療および／または予防に使用し得る化合物のスクリーニング方法。
(a)請求項１に記載の方法によって被験物質の蛋白修飾物生成抑制作用を評価する工程、および
(b)対照と比較して蛋白修飾物生成抑制作用が大きい被験物質を選択する工程
【請求項３】
糖化最終産物の産生に起因する疾患が腎疾患である請求項２記載の方法。
【請求項４】
糖化最終産物がペントシジンであり、当該ペントシジンの産生に対する被験物質の抑制効果を検定することを指標とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法により選択することができる化合物を有効成分とする、糖化最終産物の産生に起因する疾患に対する治療および／または予防用薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白修飾物生成抑制剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化反応（グリケーション）とは、ペプチドや蛋白質等のアミノ基と還元糖等のカルボニル基との非酵素的反応から始まる一連の反応（メイラード反応（非特許文献１／Maillard, L. C. ; Compt. Rend. Soc. Biol., 72, 599, 1912））をいう。この反応は、初期段階と後期段階に大別することができる。
【０００３】
初期段階は、糖の濃度と反応時間とに依存する可逆反応である。この段階において、前記アミノ基と前記カルボニル基とが非酵素的に反応してシッフ塩基を生成し、さらにアマドリ転位によりアマドリ化合物を形成する。後期段階では初期段階で生成したアマドリ化合物が非可逆的に脱水、縮合、環状化、酸化、断片化、重合、転位等を受け、最終的に糖化最終産物（AGEs）と呼ばれる蛋白修飾物を形成する。
【０００４】
また糖の自動酸化等によって、３−デオキシグルコソン（以下、「３−ＤＧ」と称する）、グリオキサールおよびメチルグリオキサール（以下、「ＭＧ」と称する）等の反応性の高いジカルボニル化合物が生成する。これらのカルボニル化合物も蛋白質と反応し、多くの場合、蛋白質のリジン残基やアルギニン残基等が修飾されたAGEsを生成する。
【０００５】
また、酸化ストレス下では、生体内に豊富に存在する糖、脂質、アミノ酸等は酸化反応等により、反応性の高いカルボニル化合物へと変化する。その結果生じる、グリオキサール、メチルグリオキサール、アラビノース、グリコールアルデヒドなどの化合物はAGEsの前駆物質となる。更にアスコルビン酸の酸化により生成するデヒドロアスコルビン酸もAGEsの前駆物質となる。これらの前駆物質はいずれもカルボニル基を有しており、蛋白質のアミノ基と非酵素的に反応してシッフ塩基を生成してAGEsを形成する（非特許文献２／Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 55, 389-399, 1999）。
【０００６】
一方、酸化ストレス下では脂質過酸化も進行し、マロンジアルデヒド、ヒドロキシノネナールおよびアクロレインのような、様々なカルボニル化合物が形成される（非特許文献３／Esterbauer, H. et al. ; Free Radic. Biol. Med., 11, 81-128, 非特許文献４／1991、Uchida, K. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 4882-4887, 1998）。これらのカルボニル化合物も蛋白質のアミノ基等と反応し、マロンジアルデヒド修飾リジンやヒドロキシノネナール修飾物等のＡＬＥｓと呼ばれる蛋白修飾物を形成する（非特許文献２／Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 55, 389-399, 1999、非特許文献５／Miyata, T. et al. ; Nephrol. Dial. Transplant., 12, 255-258, 1997、非特許文献６／Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 51, 1170-1181, 1997）。
【０００７】
更に、セリンやスレオニンなどのアミノ酸も酸化によりアクロレイン、グリオキサールなどのカルボニル化合物が生成し、蛋白修飾物を形成する（非特許文献７／Anderson, M. M. et al. ; J. Clin. Invest., 99, 424-432, 1997）。多くのカルボニル化合物は酸化的経路で生成されるが、３−ＤＧのように非酸化的経路を経て生成されるカルボニル化合物も存在する。
【０００８】
公知のAGEs生成経路として、次のような経路が知られている。
１）シッフ塩基、アマドリ化合物から３−ＤＧを経由する経路、
２）シッフ塩基が酸化的にグリコールアルデヒド−アルキルイミンへ変化し、アルドアミンを経てAGEsに至る経路、
３）アルドアミンがグリオキサールモノアルキルイミンを経てAGEsに至る経路、
４）アマドリ化合物から２，３−エンジオールを経て生成されるメチルグリオキサールを中間体とする経路、
５）その他
【０００９】
最近、AGEsの１つであるカルボキシメチルリジンが不飽和脂肪酸の脂質酸化反応の結果生じるグリオキサールによって第３経路を介して生成することが明らかにされた。つまり、糖化・酸化反応と脂質酸化反応が、共通の基盤で起こっていると考えられる。
以上のように、糖、脂質、アミノ酸およびアスコルビン酸から酸化的、非酸化的経路により生成されたカルボニル化合物は、蛋白を非酵素的に修飾して最終的にAGEsやＡＬＥｓ等の蛋白修飾物を形成するに至る。特に、複数の反応経路を経て生成されたカルボニル化合物により蛋白修飾反応が亢進している状態をカルボニル過剰による蛋白修飾、すなわち、カルボニルストレスと呼んでいる。
【００１０】
公知のAGEsとしては、ペントシジン（非特許文献８／Sell, D. R. et al. ; J. Biol. Chem., 264, 21597-21602, 1989）、クロスリン（非特許文献９／Nakamura, K. et al. ; J. Chem. Soc. Chem. Commun., 15, 992-994, 1992、非特許文献１０／Ienaga, K. et al. ; Contrib. Nephrol., 112, 42-51, 1995、非特許文献１１／Hirata, C. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 236, 712-715, 1997）、X1（フルオロリンク）、ピロピリジン（非特許文献１２／Hayase, F. et al. ; Biosci. Biotech. Biochem., 58, 1936-1937, 1994）、ピラリン（非特許文献１３／Njoroge, F. G. et al. ; Carbohyd. Res., 167, 211-220, 1987、非特許文献１４／Hayase, F. et al. ; J. Biol. Chem., 264, 3758-3764, 1989、非特許文献１５／Miyata, S. et al. ; J. Clin. Invest., 89, 1102-1112, 1992）、カルボキシメチルリジン（非特許文献１６／Ahmed, M. U. et al. ; J. Biol. Chem., 261, 4889-4894, 1986）、イミダゾロン化合物（非特許文献１７／Hayase, F, et al. ; Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1407-1411, 1995、非特許文献１８／Uchida, K. et al. ; FEBS Lett., 410, 313-318, 1997）、カルボキシエチルリジン（非特許文献１９／Ahmed, M. U. et al. ; Biochem. J., 324, 565-570, 1997）、メチルグリオキサールダイマー（非特許文献２０／Brinkmann, E. et al. ; J. Chem. Soc. Perkin. Trans., 2, 1-2, 1995、非特許文献２１／Wells-Knecht, K. J. et al. ; Nephrol. Dial. Transplant., 11(Suppul. 5), 41-47, 1996）、グリオキサールダイマー（非特許文献２２／Well-Knecht, K. J. et al. ; J. Org. Chem., 60, 6246-6247, 1995、非特許文献２１／Wells-Knecht, K. J. et al. ; Nephrol. Dial. Transplant., 11(Suppul. 5), 41-47, 1996）、イミダゾリジン（非特許文献２３／Nagaraj, R. H. et al. ; J. Biol. Chem., 271, 19338-19345, 1996）およびアルグピリミジン（非特許文献２４／Shipanova, I. N. et al. ; Arch. Biochem. Biophys., 334, 29-36, 1997）等が知られている。
【００１１】
現在クローニングされているAGEs受容体として、ＲＡＧＥ（非特許文献２５／Neeper, M. et al. ; J. Biol. Chem., 267, 14998-15004, 1992、非特許文献２６／Schmit, A. M. et al. ; J. Biol. Chem., 267, 14987-14997, 1992）、マクロファージスカベンジャー受容体クラスＡ（非特許文献２７／Suzuki, H. et al. ; Nature, 386, 292-295, 1997、非特許文献２８／Komada, T. et al. ; Nature, 343, 531-535, 1990）、ガレクチン３（非特許文献２９／Vlassara, H. et al. ; Molecular Medicine, 1, 634-646, 1995）、ＯＳＴ−４８および８０Ｋ−Ｈ等がある（非特許文献２７／Suzuki, H. et al. ; Nature, 386, 292-295, 1997、非特許文献２９／Vlassara, H. et al. ; Molecular Medicine, 1, 634-646, 1995）。
【００１２】
ＲＡＧＥは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞膜貫通型蛋白質である。血管組織においてAGEsがＲＡＧＥに結合すると、細胞内で活性酸素が生成し、p21ras/MAPK経路が活性化される（非特許文献３０／Lander, H. M. et al. ; J. Biol. Chem., 272(28), 17810-17814, 1997）。これにより転写因子NF-κB活性化が誘導され、VCAM-1等の血管障害関連因子の発現が誘導されることが報告されている（非特許文献３１／Chappey, O. et al. ; Eur. J. Clin. Invest., 27, 97-108, 1997、非特許文献３０／Lander, H. M. et al. ; J. Biol. Chem., 272, 17810-17814, 1997）。
【００１３】
また、AGEsはＲＡＧＥを介して、微小血管の内皮細胞の増殖を制御し、恒常性維持に重要な役割を果たしている周皮細胞の増殖を抑制するとともに、毒性効果を発揮することが報告されている（非特許文献３２／Yamagishi, S. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 213, 681-687, 1995）。さらに、AGEsはＲＡＧＥを介して、微小血管の内皮細胞に直接的に作用し血管新生を促進すること、PGI2の産生を阻害して血栓傾向となること（非特許文献３３／Yamagishi, S. et al. ; FEBS Lett., 384, 103-106, 1996）が報告されている。
【００１４】
その他、AGEsやＡＬＥｓ等の生理活性として、メサンギウム細胞の基質産生の亢進、単球遊走能の亢進、マクロファージからの炎症性サイトカインの放出、滑膜細胞のコラゲナーゼ産生促進、破骨細胞の活性化、血管平滑筋の増殖作用、血小板凝集の促進、NO活性とその平滑筋弛緩反応の抑制が報告されている（非特許文献３４／Doi, T. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 2873-2877, 1992、非特許文献３５／Miyata, T. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 9, 1723-1735, 1998、非特許文献３６／Miyata, T. et al. ; J. Clin. Invest., 93, 521-528, 1994、非特許文献３７／Iida, Y. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 1235-1241, 1994、非特許文献３８／Miyata, T. et al. ; J. Clin. Invest., 98, 1088-1094, 1996、非特許文献３９／Satoh, H. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 111-115, 1997、非特許文献４０／Hangaishi, M. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 248, 285-292, 1998、非特許文献４１／Miyata, T. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 8, 260-270, 1997）。
【００１５】
AGEsが関与する疾患として、たとえば次のような疾患が報告されている。
１）糖尿病合併症である腎症（非特許文献４２／Horie, K. et al. ; J. Clin. Invest., 100(12), 2995-3004, 1997、非特許文献４３／Makino, H. et al. ; Kidney Int., 48(2), 517-526, 1995、非特許文献１５／Miyata, S. et al. ; J. Clin. Invest., 89(4), 1102-1112, 1992、非特許文献４４／Niwa, T. et al. ; J. Clin. Invest., 99(6), 1102-1112, 1997）、神経障害（非特許文献４５／Sugimoto, K. et al. ; Diabetologia, 40(12), 1380-1387, 1997）、網膜症（非特許文献４６／Lu, M. et al. ; J. Clin. Invest., 101(6), 1219-1224、非特許文献３２／Yamagishi, S. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 213(2), 681-687, 1995）、および白内障、
【００１６】
２）動脈硬化（非特許文献４７／Park, L. et al. ; Nat. Med., 4(9), 1025-1031, 1998、非特許文献４８／Wang, X. Y. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(13), 7643-7647, 1998、非特許文献４９／Bucala, R. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9441-9445, 1994、非特許文献５０／Kume, S. et al. ; Am. J. Pathol., 147, 654-667, 1995）、
【００１７】
３）透析合併症である透析アミロイドーシス（非特許文献５１／Miyata, T. et al. ; J. Clin. Invest., 92, 1243-1252, 1993、非特許文献３６／Miyata, T. et al. ; J. Clin. Invest., 93, 521-528, 1994、非特許文献５２／Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 49, 538-550, 1996、非特許文献３７／Iida, Y. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 1235-1241, 1994、非特許文献５３／Miyata, T. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 2353-2358, 1996、非特許文献５４／Miyata, T. et al. ; Biochemistry, 33, 12215-12221, 1994）、および腹膜透析患者における腹膜硬化症、
【００１８】
４）中枢神経疾患であるアルツハイマー病（非特許文献５５／Smith, M. A. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(12), 5710-5714, 1994、非特許文献５６／Yan, S. D. et al. ; Nature, 382, 685-691, 1996、非特許文献５７／Kimura, T. et al. ; Neurosci. Lett., 219, 95-98, 1996、非特許文献５８／Horie, K. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 236, 327-332, 1997）、ピック病およびパーキンソン病、
【００１９】
５）リウマチ性関節炎（非特許文献５９／Miyata, T. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 244, 45-49, 1999）、
【００２０】
６）日光弾性線維症、
７）老化、
８）腎不全（非特許文献６０／Makita, Z. et al. ; N. Engl. J. Med., 325, 836-842, 1991、非特許文献５１／Miyata, T. et al. ; J. Clin. Invest., 92, 1243-1252, 1993）等
【００２１】
その他、糖尿病の場合、血管内皮由来の血管拡張がAGEsによって障害されること（非特許文献６１／Bucala, R. et al. ; J. Clin. Invest., 87, 432-438, 1991）、AGEsが腎硬化を促進させること（非特許文献６２／Vlassara, H. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11704-11708, 1994）等が報告されている。
以上のことから、AGEsを初めとする蛋白修飾物は、直接的にまたは受容体を介して生体に悪影響を与えることが明らかとなっている。
【００２２】
一方、腎機能が低下するに従って、血中のAGEsの濃度が上昇することが知られている。腎機能低下により、分子量５kDa以下と考えられるカルボニル化合物は体内に蓄積する。ペントシジンやピラリン等の場合、遊離型も存在するが、血清アルブミン等の蛋白結合型が大部分を占めている（非特許文献６３／Miyata, T. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 7, 1198-1206, 1996、非特許文献６４／Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 54, 1290-1295, 1998、非特許文献６５／Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 51, 880-887, 1997、非特許文献６６／Odani, H. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 224, 237-241, 1996）。
【００２３】
また、血中ペントシジン濃度は糸球体濾過機能の影響を強く受けるという報告がある（非特許文献６７／Sugiyama, S. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 9, 1681-1688, 1998、非特許文献６８／Jadoul, M. et al. ; Kidney Int., 55, 2487-2492, 1999）。この様に、AGEsはその大部分が腎において処理され、健康時には血中濃度は低く保たれている。しかし腎機能が低下するとAGEsが蓄積し尿毒症毒素（uremic toxin）として慢性の生物活性をもたらすようになる。
透析療法によって遊離型のAGEsは除去されるが、蛋白結合型のものや分子内架橋を形成するものは除去することは困難である（非特許文献６９／Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 49, 1304-1313, 1996）。従って、腎不全期間の経過と共に蛋白修飾物の生体内蓄積量は増加する。また生体内で糖が反応する基本的な過程以外に、食品から摂取される遊離型AGEsや、生体内で既に形成されたアマドリ化合物などから形成される活性の強い３−ＤＧ、グリオキサール、ＭＧなどの中間体が次々に蛋白と反応し、AGEsの産生を促進することが認められている。
【００２４】
また、血液は透析膜と接触することによって、補体系や白血球の活性化などの様々な影響を受け、フリーラジカルの産生亢進へとつながる等、透析療法そのものによる酸化の亢進も存在し、AGEs生成の一因となっている。ゆえに、透析療法での対策としては、透析導入の初期からこれらの遊離型物質の除去を図り、結合型のAGEs形成を極力抑制することが重要である。上記のように結合型のAGEsを透析療法によって除去することは困難であるので、透析療法では蛋白修飾物の生成を抑制する薬物の開発が希求されている。
【００２５】
また、腎機能に起因するばかりではなく、腎不全に伴う抗酸化防御機構の低下も蛋白修飾物の蓄積に関与していると考えられる。腎不全患者では、血中還元型グルタチオンに対する酸化型グルタチオンの上昇（非特許文献７０／Canestrari, F. et al. ; Acta Haematol., 91, 187-193, 1994）、グルタチオン依存酵素群の活性低下、保存期腎不全血漿グルタチオンペルオキシダーゼの低下（非特許文献７１／Ueda, Y. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 245, 785-790, 1998）、全血中グルタチオンの低下（非特許文献７０／Canestrari, F. et al. ; Acta Haematol., 91, 187-193, 1994）、ならびに血漿セレン濃度の低下に対する血漿スーパーオキサイドジスムターゼの活性上昇（非特許文献７２／Richard, M. J. et al. ; Nephron, 57, 10-15, 1991）といった抗酸化能の不均衡が示唆されている（非特許文献６８／Jadoul, M. et al. ; Kidney Int., 55, 2487-2492, 1999）。
【００２６】
また、一般に慢性腎不全の患者では、高血糖の有無に関わらず血中や組織中に反応性の高いカルボニル化合物やAGEsが著しく蓄積していることが報告されている（非特許文献６／Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 51, 1170-1181, 1997、非特許文献６３／Miyata, T. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 7, 1198-1206, 1996、非特許文献６４／Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 54, 1290-1295, 1998、非特許文献７３／Miyata, T. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 9, 2349-2356, 1998）。腎不全においては、非酵素的化学反応によりカルボニル化合物が高負荷の状態（カルボニルストレス）となり、蛋白質修飾が亢進される病態が存在しており、糖・脂質からカルボニル化合物が生成され蛋白質を修飾するためであると考えられる（非特許文献２／Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 55, 389-399, 1999）。ゆえに、様々な要因によって生じる蛋白修飾物の生成を抑制することが、組織障害の軽減につながり、AGEs等の蛋白修飾物質が関与する病態を予防および治療することができる。
【００２７】
慢性腎不全患者に行われる透析には、血液透析と腹膜透析がある。腹膜透析の場合、血中の老廃物は腹膜を通して腹膜透析液中に排泄される。高浸透圧の腹膜透析液（グルコース、イコデキストリンまたはアミノ酸等を含有する）は、腎不全患者の血中に蓄積した反応性の高いカルボニル化合物を、腹膜を介して腹腔内の腹膜透析液中に集める作用がある。腎不全患者の血中には、酸化ストレスに伴って、たとえば次のようなカルボニル化合物が蓄積する。
炭水化物に由来するカルボニル化合物（アラビノース、グリオキサール、メチルグリオキサール、３−デオキシグルコゾン）、
アスコルビン酸に由来するカルボニル化合物（デヒドロアスコルビン酸）、
脂質に由来するカルボニル化合物（ヒドロキシノネナール、マロンジアルデヒド、アクロレイン）
【００２８】
また、腹膜透析液の滅菌や保存中に、反応性の高いカルボニル化合物が腹膜透析液中に生成することが知られている（非特許文献７４／Richard, J. U. et al. ; Fund. Appl. Toxic., 4, 843-853, 1984）。腹膜透析液中に生成するカルボニル化合物としては、３−デオキシグルコゾン、５−ヒドロキシメチルフルフラール、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、グリオキサール、メチルグリオキサール、レプリン酸、フルフラール、アラビノース等を示すことができる。
【００２９】
そのため腹膜透析液中の前記カルボニル化合物濃度は上昇し、蛋白修飾物質の生成が亢進する。その結果、腹膜の機能が低下し、除水能の低下や腹膜硬化症への進展に関与すると考えられる（非特許文献７５／Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 58, 425-435, 2000、非特許文献７６／Inagi, R. et al. ; FEBS Lett., 463, 260-264, 1999、非特許文献７７／Combet, S. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 11, 717-728, 2000）。
【００３０】
実際に腹膜透析患者においては、導入されたグルコースによって腹腔内がカルボニルストレス状態となっていることは、内皮および中皮の免疫組織学的検討から証明されている（非特許文献７８／Yamada, K. et al. ; Clin. Nephrol., 42, 354-361, 1994、非特許文献７９／Nakayama, M. et al. ; Kidney Int., 51, 182-186, 1997、非特許文献７５／Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 58, 425-435, 2000、非特許文献７６／Inagi, R. et al. ; FEBS Lett., 463, 260-264, 1999、非特許文献７７／Combet, S. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 11, 717-728, 2000）。この様に、透析患者においてもカルボニル化合物による蛋白修飾物の生成が腹膜の形態学的変化およびこれに伴う機能(除水能)の低下の原因となっていることが推測されており、その改善方法の提供が求められている。
【００３１】
以上の事実と腎不全をはじめとする種々の病態を考え合わせると、カルボニル化合物の蓄積がAGEs産生亢進の原因の１つであると考えられる（非特許文献５／Miyata, T. et al. ; Nephrol. Dial. Transplant., 12, 255-258, 1997、非特許文献６／Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 51, 1170-1181, 1997）。したがって、AGEsの産生を抑制することが、AGEsが関連する病態に対し有効であると考えられる。
【００３２】
代表的なAGEs生成阻害薬としてアミノグアニジンがある。アミノグアニジンはグルコース、シッフ塩基やアマドリ生成物から生成される３−ＤＧなどのジカルボニル化合物と反応してチアゾリンを形成することによってAGEs生成を阻害すると考えられている。糖尿病モデル動物を用いた解析では、糖尿病性腎症（非特許文献８０／Edelstein, D. et al. ; Diabetologia, 35, 96-101, 1992）、網膜症（非特許文献８１／Hammes, H. P. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 11555-11561, 1991）および白内障（非特許文献８２／Matsumoto, K. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 241, 352-354, 1997）の進展を遅延させる効果が確認されている。
【００３３】
他に、この種に属する化合物としてピリドキサミンがある。また、OPB-9195（(±) 2-イソプロピリデンヒドラゾノ-4-オキソ-チアゾリジン-5-イルアセトアニリド）はヒドラジンの窒素原子がカルボニル基と反応して安定な構造を形成し、遊離または蛋白に結合した反応性カルボニルを捕捉することにより（非特許文献８３／Nakamura, S. et al. ; Diabetes, 46, 895-899, 1997）、in vitroでAGEsのみならずＡＬＥｓの生成も抑制する。
【００３４】
メトホルミンやブホルミン等のビグアナイド化合物もカルボニル化合物を捕捉できるため、（非特許文献８４／Beisswenger, P. J. et al. ; Diabetes, 48, 198-202, 1999）AGEs生成阻害薬として利用できる可能性がある。さらに、AGEsの特徴である架橋を切断するタイプのAGEs阻害剤、アマドリ化合物を分解する酵素（amadoriase）等の提案もされている。
【００３５】
一方、カルボニル化合物を消去することにより、AGEsやＡＬＥｓの生成を阻害する可能性も検討されている。カルボニル化合物の消去にはいくつかの酵素や酵素的経路が存在する。例えばアルドース還元酵素、アルデヒドデヒドロゲナーゼやグリオキサラーゼ経路が、酵素的経路として挙げられる（非特許文献８５／Thornalley, P. J. et al. ; Endocrinol. Metab., 3, 149-166, 1996）。還元型グルタチオン（GSH）やNAD(P)Hなどのレドックス制御因子は、これらの経路の活性に重要な因子である。これらの消去系の低下は同時に種々のカルボニル化合物の上昇につながる。メチルグリオキサール、グリオキサールなどのカルボニル化合物はGSHのチオール基と反応し、結果的にグリオキサラーゼにより代謝される。NAD(P)Hはグルタチオン還元酵素を活性化し、GSHレベルを上昇させる。すなわち、細胞内レドックス機構の不均衡によるGSHおよびNAD(P)Hの低下によりカルボニル化合物の消去系が阻害され、AGEsやＡＬＥｓの蓄積につながると考えられる。
【００３６】
また、糖尿病においては、高血糖によりポリオール経路が活性化され、NAD(P)HやGSHが低下し、結果的にカルボニル化合物の消去系が低下することが示唆される。前述したようにGSHなどのチオール濃度の低下がカルボニル化合物消去の低下につながり、結果としてAGEsやＡＬＥｓを形成する原因の１つとなっているとすれば、チオールレベルを上昇させることによりカルボニル化合物を減少できる可能性がある。
【００３７】
そのためには、GSH、システイン、アセチルシステイン等によりチオール基を補充する方法、ビタミンＥやユビキノール等によりGSH需要を低下させる方法、アルドース還元酵素阻害薬等によりポリオール系を阻害する方法が提案されている。さらに、アミノグアニジン、ピリドキサミン、ヒドラジン、ビグアナイド化合物およびＳＨ基含有化合物を用いて、カルボニル化合物をトラップさせる方法も提案されている（特許文献１／WO 00/10606）。
以上詳細に述べたように、AGEsおよびＡＬＥｓの生成を阻害することが、これらに関連する病態を予防または治療できる方法である。
【００３８】
本発明者らは、オルメサルタンをはじめとするビフェニルテトラゾール基を含有する化合物がAGEsの生成を抑制し、AGEsの蓄積に由来する疾患の予防／治療に有用であることを明らかにし、当該化合物が持つラジカル消去作用がAGEsの生成抑制に関与していることを明らかにした（特許文献２／WO 02/083127）。
【００３９】
一方、上記オルメサルタンをはじめとするビフェニルテトラゾール基含有化合物の多くは、アンジオテンシンIIタイプ1受容体拮抗作用を持つ抗高血圧剤として知られており、その血圧降下作用による腎への血流量軽減効果から、糖尿病性腎症の改善などの腎保護剤としても期待されている。
腎障害は慢性化すると、糸球体硬化や間質の繊維化などが起こり、やがては腎不全に至る重篤な経緯をたどる。血圧が腎保護の最大要因であるならば、抗高血圧剤はおしなべて腎保護剤として有用であると言える。しかしながら、薬剤によっては、抗高血圧作用を有しながら、腎保護効果のない化合物があり、血圧と腎保護の関係は必ずしも明らかではなかった。
【００４０】
【非特許文献１】Maillard, L. C. ; Compt. Rend. Soc. Biol., 72, 599, 1912
【非特許文献２】Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 55, 389-399, 1999
【非特許文献３】Esterbauer, H. et al. ; Free Radic. Biol. Med., 11, 81-128,
【非特許文献４】1991、Uchida, K. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 4882-4887, 1998
【非特許文献５】Miyata, T. et al. ; Nephrol. Dial. Transplant., 12, 255-258, 1997
【非特許文献６】Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 51, 1170-1181, 1997
【非特許文献７】Anderson, M. M. et al. ; J. Clin. Invest., 99, 424-432, 1997
【非特許文献８】Sell, D. R. et al. ; J. Biol. Chem., 264, 21597-21602, 1989
【非特許文献９】Nakamura, K. et al. ; J. Chem. Soc. Chem. Commun., 15, 992-994, 1992
【非特許文献１０】Ienaga, K. et al. ; Contrib. Nephrol., 112, 42-51, 1995
【非特許文献１１】Hirata, C. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 236, 712-715, 1997
【非特許文献１２】Hayase, F. et al. ; Biosci. Biotech. Biochem., 58, 1936-1937, 1994
【非特許文献１３】Njoroge, F. G. et al. ; Carbohyd. Res., 167, 211-220, 1987
【非特許文献１４】Hayase, F. et al. ; J. Biol. Chem., 264, 3758-3764, 1989
【非特許文献１５】Miyata, S. et al. ; J. Clin. Invest., 89, 1102-1112, 1992
【非特許文献１６】Ahmed, M. U. et al. ; J. Biol. Chem., 261, 4889-4894, 1986
【非特許文献１７】Hayase, F, et al. ; Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1407-1411, 1995
【非特許文献１８】Uchida, K. et al. ; FEBS Lett., 410, 313-318, 1997
【非特許文献１９】Ahmed, M. U. et al. ; Biochem. J., 324, 565-570, 1997
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【非特許文献２２】Well-Knecht, K. J. et al. ; J. Org. Chem., 60, 6246-6247, 1995
【非特許文献２３】Nagaraj, R. H. et al. ; J. Biol. Chem., 271, 19338-19345, 1996
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【非特許文献２５】Neeper, M. et al. ; J. Biol. Chem., 267, 14998-15004, 1992
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【非特許文献３５】Miyata, T. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 9, 1723-1735, 1998
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【非特許文献３７】Iida, Y. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 1235-1241, 1994
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【非特許文献４０】Hangaishi, M. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 248, 285-292, 1998
【非特許文献４１】Miyata, T. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 8, 260-270, 1997
【非特許文献４２】Horie, K. et al. ; J. Clin. Invest., 100(12), 2995-3004, 1997
【非特許文献４３】Makino, H. et al. ; Kidney Int., 48(2), 517-526, 1995
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【非特許文献４９】Bucala, R. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9441-9445, 1994
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【非特許文献５１】Miyata, T. et al. ; J. Clin. Invest., 92, 1243-1252, 1993
【非特許文献５２】Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 49, 538-550, 1996
【非特許文献５３】Miyata, T. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 2353-2358, 1996
【非特許文献５４】Miyata, T. et al. ; Biochemistry, 33, 12215-12221, 1994
【非特許文献５５】Smith, M. A. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(12), 5710-5714, 1994
【非特許文献５６】Yan, S. D. et al. ; Nature, 382, 685-691, 1996
【非特許文献５７】Kimura, T. et al. ; Neurosci. Lett., 219, 95-98, 1996
【非特許文献５８】Horie, K. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 236, 327-332, 1997
【非特許文献５９】Miyata, T. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 244, 45-49, 1999
【非特許文献６０】Makita, Z. et al. ; N. Engl. J. Med., 325, 836-842, 1991
【非特許文献６１】Bucala, R. et al. ; J. Clin. Invest., 87, 432-438, 1991
【非特許文献６２】Vlassara, H. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11704-11708, 1994
【非特許文献６３】Miyata, T. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 7, 1198-1206, 1996、
【非特許文献６４】Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 54, 1290-1295, 1998
【非特許文献６５】Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 51, 880-887, 1997
【非特許文献６６】Odani, H. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 224, 237-241, 1996
【非特許文献６７】Sugiyama, S. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 9, 1681-1688, 1998
【非特許文献６８】Jadoul, M. et al. ; Kidney Int., 55, 2487-2492, 1999
【非特許文献６９】Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 49, 1304-1313, 1996
【非特許文献７０】Canestrari, F. et al. ; Acta Haematol., 91, 187-193, 1994
【非特許文献７１】Ueda, Y. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 245, 785-790, 1998
【非特許文献７２】Richard, M. J. et al. ; Nephron, 57, 10-15, 1991
【非特許文献７３】Miyata, T. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 9, 2349-2356, 1998
【非特許文献７４】Richard, J. U. et al. ; Fund. Appl. Toxic., 4, 843-853, 1984
【非特許文献７５】Miyata, T. et al. ; Kidney Int., 58, 425-435, 2000
【非特許文献７６】Inagi, R. et al. ; FEBS Lett., 463, 260-264, 1999
【非特許文献７７】Combet, S. et al. ; J. Am. Soc. Nephrol., 11, 717-728, 2000
【非特許文献７８】Yamada, K. et al. ; Clin. Nephrol., 42, 354-361, 1994
【非特許文献７９】Nakayama, M. et al. ; Kidney Int., 51, 182-186, 1997
【非特許文献８０】Edelstein, D. et al. ; Diabetologia, 35, 96-101, 1992）
【非特許文献８１】Hammes, H. P. et al. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 11555-11561, 1991
【非特許文献８２】Matsumoto, K. et al. ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 241, 352-354, 1997
【非特許文献８３】Nakamura, S. et al. ; Diabetes, 46, 895-899, 1997
【非特許文献８４】Beisswenger, P. J. et al. ; Diabetes, 48, 198-202, 1999
【非特許文献８５】Thornalley, P. J. et al. ; Endocrinol. Metab., 3, 149-166, 1996
【特許文献１】WO 00/10606
【特許文献２】WO 02/083127
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４１】
本発明の課題は、蛋白質修飾抑制作用の評価方法の提供である。より具体的には、たとえば生体中において、AGEsの生成を抑制する作用を有し、更に腎機能の保護作用をも評価することができる方法の提供を課題とする。また本発明は、当該評価方法に基づく、AGEsの産生に起因する疾患に対する治療および／または予防に使用し得る化合物のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００４２】
本発明者らは、先に述べたように、オルメサルタンをはじめとするビフェニルテトラゾール基を含有する化合物がAGEsの生成を抑制し、腎疾患などのAGEsの蓄積に由来する疾患の予防／治療に有用であることを明らかにした。そして、さらに、当該抗高血圧剤の腎保護効果の機序をさらに追求する過程で、特定の自然発症高血圧ラットによる実験系を用いることにより、腎障害の発症は、血圧とは関係なく、生体内AGEsの産生の程度に左右されること、AGEsの産生を抑制する化合物は、腎疾患治療薬となり得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００４３】
本発明者らは、自然発症高血圧ラットとして、SHRラット及びSHR/NDmc-cpラットを用いた。SHR/NDmc-cpラットは、肥満・高脂血症・高血圧・高血糖・高インスリン血症を呈し、SHRラット及び正常血圧ラットに比べ、強い蛋白尿と腎障害を示す。しかしながら、血圧はSHRラットの方が高い。このことは、腎障害の発症の原因として、血圧以外の要因が存在することを示している。更に、SHRラットと正常血圧ラットの腎AGEs含量はほぼ等しいにもかかわらず、SHR/NDmc-cpラットは、極めて高いAGEs含量を示した。
これらのことより、生体内のAGEs含量が腎障害の有力な指標となり得ることが明らかとなった。そしてSHR/NDmc-cpラットにおけるAGEsの産生に対する被験物質の抑制効果を指標として、AGEsの産生に起因する疾患に対する治療または予防に使用し得る化合物のスクリーニングが可能であることを見出した。
【００４４】
すなわち本発明は、以下の蛋白質修飾抑制作用の評価方法、およびこの評価方法を利用した糖化最終産物の産生に起因する疾患に対する治療および／または予防に使用し得る化合物のスクリーニング方法に関する。
〔１〕次の工程を含む、蛋白修飾物生成抑制剤の評価方法。
(1)2型糖尿病様症状を呈する前、および／または後のSHR/NDmc-cpラットに被験物質を投与する工程、
(2)SHR/NDmc-cpラットにおける糖化最終産物の生成レベルを測定する工程、および
(3)被験物質が糖化最終産物の生成レベルを抑制する作用を有するとき、当該被験物質が蛋白修飾物生成抑制作用を有すると評価する工程
〔２〕次の工程を含む、糖化最終産物の産生に起因する疾患に対する治療および／または予防に使用し得る化合物のスクリーニング方法。
(a)〔１〕に記載の方法によって被験物質の蛋白修飾物生成抑制作用を評価する工程、および
(b)対照と比較して蛋白修飾物生成抑制作用が大きい被験物質を選択する工程
〔３〕  糖化最終産物の産生に起因する疾患が腎疾患である〔２〕記載の方法。
〔４〕  糖化最終産物がペントシジンであり、当該ペントシジンの産生に対する被験物質の抑制効果を検定することを指標とする、〔１〕または２記載の方法。
〔５〕  〔２〕に記載の方法により選択することができる化合物を有効成分とする、糖化最終産物の産生に起因する疾患に対する治療および／または予防用薬剤組成物。
【発明の効果】
【００４５】
本発明によって、SHR/NDmc-cpラットにおけるAGEsの生成抑制作用の評価方法が提供された。SHR/NDmc-cpラットは、2型糖尿病様症状を呈する。そしてSHR/NDmc-cpラットにAGEs抑制作用を有する化合物を投与することによって、実際に2型糖尿病様症状が軽減されることが本発明者らによって確認された。このことは、SHR/NDmc-cpラットが、糖尿病のようなAGEsの生成が病因の一つとなっている疾患の治療に有用な化合物の作用を評価するためのツールとして有用であることを裏付けている。SHR/NDmc-cpラットの使用によって、生体内において起きている疾患メカニズムに対して、より効果的に作用する化合物の評価が可能となる。
たとえば、単に生体外で高血糖状態を再現することは容易である。しかし実際には、化合物が生体に投与され、生体内で治療効果を発現するまでには、考慮すべきさまざまな条件が存在する。したがって、生体内における治療効果を評価しうる方法は、AGEsによってもたらされる疾患の治療方法の開発において有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本発明は、次の工程を含む、蛋白修飾物生成抑制剤の評価方法に関する。
(1)2型糖尿病様症状を呈する前、および／または後のSHR/NDmc-cpラットに被験物質を投与する工程、
(2)SHR/NDmc-cpラットにおける糖化最終産物の生成レベルを測定する工程、および
(3)被験物質が糖化最終産物の生成レベルを抑制する作用を有するとき、当該被験物質が蛋白修飾物生成抑制作用を有すると評価する工程
【００４７】
本発明に用いるSHR/NDmc-cpラットは、肥満、および本態性高血圧症のモデル動物として広く利用されている実験動物である。日本では「SHR等疾患モデル共同研究会」（京都）で維持されており、日本エスエルシー株式会社（静岡）を通じて入手することができる。更に、高炭水化物飼料を継続して与えることにより、SHR/NDmc-cpラットは、2型糖尿病様症状を呈する。SHR/NDmc-cpラットにおける2型糖尿病様症状は、高インスリン血症、高脂血症、耐糖機能の低下、タンパク尿、および糖尿等の症状となって現れる。
【００４８】
本発明の評価方法において、(1)被験物質は2型糖尿病様症状を呈する前、および／または後のSHR/NDmc-cpラットに投与される。被験物質の投与経路は制限されない。たとえば、経口的に、あるいは非経口的に、被験物質を投与することができる。SHR/NDmc-cpラットが2型糖尿病様症状を呈していることは、高インスリン血症、高脂血症、耐糖機能の低下、タンパク尿、および糖尿などの症状を観察することによって知ることができる。
【００４９】
たとえば、高インスリン血症、高脂血症、耐糖機能の低下、タンパク尿、および糖尿のいずれかの症状を指標として観察し、その症状が見られたときに2型糖尿病症状を呈していることがわかる。尿タンパクあるいは尿糖の検査は、試料の採取が容易である。またいずれの指標も市販の測定用試薬、あるいは尿試験紙を使って簡単に測定することができることから、2型糖尿病症状の好ましい指標である。これらの指標の測定方法は公知である。
【００５０】
本発明において、被験物質は、SHR/NDmc-cpラットが2型糖尿病様症状を呈する前、および／または後に投与することができる。2型糖尿病様症状を呈する前に投与する場合には、被験物質の予防的な作用を評価することができる。一方、発症後の投与によって、治療効果を評価することができる。
【００５１】
本発明の評価方法は、(2)SHR/NDmc-cpラットにおけるAGEsの生成レベルを測定する工程を含む。SHR/NDmc-cpラットにおけるAGEsの生成レベルを測定する方法は任意である。たとえば、SHR/NDmc-cpラットの生体試料を採取し、AGEsの生成レベルを測定することができる。生体試料としては、血液や尿、あるいは任意の組織を用いることができる。
【００５２】
本発明において測定すべきAGEsは制限されない。代表的なAGEsとして、次のような化合物が知られていることは既に述べた。
ペントシジン
クロスリン
X1（フルオロリンク）
ピロピリジン
ピラリン
カルボキシメチルリジン
イミダゾロン化合物
カルボキシエチルリジン
メチルグリオキサールダイマー
グリオキサールダイマー
イミダゾリジン
アルグピリミジン
これらのAGEsから選択される少なくともひとつの化合物を測定することによって、AGEsの生成レベルが測定される。本発明における好ましいAGEsはペントシジンである。ペントシジンは、糖尿病患者における主要なAGEsである。したがって、生体内においてペントシジンの生成レベルを低下させる作用を有する化合物は、糖尿病患者におけるAGEsの生成を抑制する化合物として有用である。
【００５３】
AGEsの測定方法は限定されない。たとえばペントシジンは、以下のようにして測定することができる。まず蛋白質を含む試料に１０％トリクロロ酢酸を加え、遠心して蛋白質を沈澱させて回収する。回収した蛋白質を５％トリクロロ酢酸で洗浄し、乾燥させた後、6N-HClを添加して110℃、16時間加水分解し、蛋白質上のペントシジンを遊離させる。蛍光検出器を用いたＨＰＬＣを用い、0.1％トリフルオロ酢酸添加蒸留水／0.08％トリフルオロ酢酸添加80%アセトニトリルを移動相とするグラジエント法（30分間、1.0ml/分）によりペントシジンの生成量（nmol/l）を測定する(Miyata, T. et al.:J.Am.Soc..Nephrol.,7,1198-1206,1996、Miyata, T.et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93, 2353-2358,1996)。
【００５４】
AGEsの測定の結果、その生成レベルが被験物質の投与によって抑制されている場合に、当該被験物質がAGEsの生成を抑制する作用を有することが明らかになる。AGEsの生成レベルを比較すべき対照としては、被験物質を与えないSHR/NDmc-cpラットを用いることができる。あるいは、AGEsの生成抑制作用を有しないことが明らかな化合物を与えたラットを対照とすることもできる。AGEsの生成抑制作用を有しないことが明らかな化合物としては、生理食塩水などがある。
【００５５】
本発明の評価方法においては、AGEsの生成レベルが低いほど、被験物質のAGEsの生成を抑制する作用は大きいと言うことができる。したがって、一定のAGEsの生成抑制作用を有することが確認されている比較化合物を対照として用いることによって、その比較化合物が有している生成抑制作用を比較化合物のそれと比較することもできる。
【００５６】
本発明の評価方法は、スクリーニングに利用することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、AGEsの産生に起因する疾患に対する治療および／または予防に使用し得る化合物のスクリーニング方法に関する。
(a)前記評価方法によって被験物質の蛋白修飾物生成抑制作用を評価する工程、および
(b)対照と比較して蛋白修飾物生成抑制作用が大きい被験物質を選択する工程
【００５７】
生体内において生成されたAGEsが、さまざまな疾患の原因となっている可能性があることは既に述べたとおりである。実際に、人為的に投与されたAGEsが腎機能障害を引き起こすこと、そしてAGEs消去能を有する化合物の投与によってその腎機能障害が軽減されることが報告されている。したがってAGEs生成の抑制作用を指標として選択された化合物は、AGEsによってもたらされる種々の疾患の治療薬として有用である。
【００５８】
AGEsの生成を抑制することが、AGEsによってもたらされる疾患の治療に有用であることは既に明らかにされている。しかし、SHR/NDmc-cpラットのように、実際に生体内にAGEsを蓄積するモデル動物をツールとして利用することにより、より実際の疾患に近い状態で被験物質を評価することができる。たとえばSHR/NDmc-cpラットは、タンパク尿あるいは糖尿などの、2型糖尿病様の症状を呈する。つまりSHR/NDmc-cpラットを用いることによって、実際の糖尿病患者の体内で起きている病的な状態に対する治療効果あるいは予防効果を評価することができる。
【００５９】
本発明のスクリーニングに用いる被験物質としては、例えば、天然または合成化合物、各種有機化合物、天然または合成された糖類、蛋白質、ペプチド、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、あるいは菌体成分などを挙げることができる。この他、テトラゾール基を有する化合物群を被験物質として用いることもできる。テトラゾール基を有する化合物または薬理学的に許容されるそれらの塩が蛋白質修飾生成抑制組成物として有用であることを本発明者らは明らかにしている(WO02/083127)。本発明の評価方法を利用すれば、これらの一群の化合物について、生体内での蛋白質修飾生成抑制作用を評価することができる。その結果、より治療効果の高い化合物をスクリーニングすることができる。
【００６０】
被験物質は、2型糖尿病様症状の発症前および／または発症後のSHR/NDmc-cpラットに投与することができる。しかし、糖尿病症状に起因するAGEsに対してより特異的に作用する化合物を見出すためには、糖尿病症状を呈した後に被験物質を投与するのが好ましい。被験物質の投与のタイミングを変えて、AGEs生成レベルに対する作用を比較することにより、より効果的な投与時期を明らかにすることもできる。
【００６１】
本発明のスクリーニング方法によって選択された被験物質は、更に安全性や安定性などを試験したうえで、AGEsの産生に起因する疾患の治療および／または予防のための医薬組成物の有効成分とすることができる。本発明の医薬組成物は、公知の製剤学的製造法により製剤化して投与することができる。また有効成分である化合物自体を直接投与することもできる。製剤化する場合は、例えば、薬剤として一般的に用いられる媒体または担体と適宜組み合わせて投与することができる。
【００６２】
また、該化合物がDNAによりコードされうるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、鼻腔内投与、気管支内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、患部への直接投与などの方法で行うことができる。投与量は、患者の体重、年齢、健康度、あるいは投与方法などの条件によって変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することができる。
【００６３】
すなわち、たとえばSHR/NDmc-cpラットにおいて、2型糖尿病様症状に対する治療効果を、様々な投与量の間で比較することにより有効濃度が決定される。そして、上記のような各投与ルートによって、腎における投与化合物の濃度がその有効濃度に達するような投与量を経験的に決定する。一般的な投与形態においては、有効成分が全身に分布するものとして、体重１kg当たりの投与量を決定する。実験動物における薬物動態の解析結果に基づいて腎移行性が高いと考えられる化合物であれば、投与量をより低く設定することができる。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、決定された投与量と投与形態とを考慮して、媒体や担体と配合される。必要な投与量を達成することができるように有効成分を配合することは、当業者が通常行っている。本発明による医薬組成物の投与量は、体重1kgあたり通常1μgから10g、より一般的には10μg〜100mgとすることができる。また、注射剤の場合は経口投与の10分の1〜100分の1程度を投与量の目安とすることができる。さらに特殊な製剤設計を施すことにより、投与量を調整することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、適当な担体に保持することによって徐放化製剤とすることもできるが、このような製剤においては、高い血中濃度を維持することができるので、配合量を低く設定することができる。
【実施例】
【００６５】
以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、本発明は該実施例に限定されるものではない。
［実施例１］実験材料および実験方法
降圧薬
降圧薬として、アンジオテンシン受容体拮抗剤(ARB)であるオルメサルタン（三共）、β-ブロッカーであるアテノロール（アストラゼネカ）、およびヒドララジン（シグマ）の３種類を使用した。
動物
自然発症高血圧/NIH-肥満ラットのサブラインである自然発症高血圧肥満ラット（SHR/NDmc-cp (fat/fat)）（SHR等疾患モデル共同研究会（京都）で維持）、自然発症高血圧ラット（SHR）とWistar-Kyotoラット（WKY）は日本エスエルシー株式会社（静岡）から購入した。13週齢のSHR/NDmc-cp (fat/fat)を以下のように、無作為に4群に分けた。
賦形剤投与群（グループ1）：10 匹、
低用量オルメサルタン投与群（1 mg/kg/日）（グループ2）：9 匹、
高用量オルメサルタン投与群（5 mg/kg/日）（グループ3）：10 匹、
ヒドララジン投与群（5mg/kg/日）（グループ4）：9 匹
また13週齢のSHR（高血圧、非糖尿病）を次の2群に分けた。
賦形剤投与群（グループ5）：10 匹、
高用量オルメサルタン投与群（5 mg/kg/日）（グループ6）：10 匹
対照の賦形剤投与WKY群（グループ７）：10 匹
薬剤の投与期間は20週間であった。プロトコールについては、東海大学医学部における実験動物の指針に従った。
【００６６】
血圧の測定、尿採取と採血
心臓収縮期の血圧を、試験開始時、２週間後そして４週間間隔でテイルカフ法により測定した。研究の終了時に、ラットの体重を測定し、24時間の尿採取のために代謝ケージで飼育した。屠殺前に血液を採取した。
【００６７】
血液、尿の生化学的測定
血漿中のグルコース、総コレステロール、トリグリセライド、リン脂質、クレアチニンと尿素窒素（BUN）の測定、及び尿中の蛋白、クレアチニンの濃度については自動分析機（Synchron CX-7、Beckman Coulter Inc製）を用いて測定した。血漿中のインスリン濃度については、市販のキット（森永生化学研究所製）を用いて測定した。
【００６８】
形態的解析
腎組識の切片（厚3-4 μm）については、 過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色し、光学顕微鏡を用いて観察した。糸球体の硬化については、Ueharaら(Uehara Y, et al., Hypertension 24: 770-778, 1994)の方法により、半定量的に評価した。すなわち、それぞれの動物の50個の糸球体を形態学的解析のために無作為に選んだ。糸球体硬化の程度は、総面積に対する糸球体障害部位の%で示し、次の５段階に分類した。
0 ; 障害なし
1+; 1%-25%
2+; 5%-50%
3+; 50%-75%
4+; 75%-100%
動物の糸球体硬化については、糸球体の硬化の程度（0-4+）に、その程度を示す割合（%）を掛けてたものを合計した。
【００６９】
免疫組織染色
AGEの構造体であるペントシジンと脂質の過酸化で生成する4-ヒドロキシノネナール-タンパク質付加物のような酸化的蛋白付加物については、エタノール：アセトンで固定した凍結切片を用いて解析した。アビジン/ビオチンキット（Vector Laboratories製）を使用してバックグラウンドの染色を減らした。第一抗体を添加する前に、内因性のペルオキシダーゼ活性を除くために、PBSに溶解した3%過酸化水素液中、室温で15分間インキュベートした。
【００７０】
切片の免疫染色には、次のウサギ抗ペントシジン抗体、またはマウス抗-4-ヒドロキシノネナールモノクローナル抗体NA59を用い、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)検出系を用いて実施した。免疫していないウサギIgG を対照として使用した。
ウサギ抗ペントシジン抗体(Horie K, et al., Biochem Biophys Res Commun 236: 327-332, 1997)
マウス抗-4-ヒドロキシノネナールモノクローナル抗体NA59 (Miyata T, et al., FEBS Lett 445: 202-206, 1999)（Witztum JL博士から提供を受けた）
【００７１】
AGEの測定
腎臓のペントシジン濃度を測定した。腎臓組織（100mg）を細かく切り刻み、10%のトリクロロ酢酸で洗浄し、減圧下で乾燥した後、窒素下、500μlの6N HCl中、110℃で16時間加水分解した。ペントシジンの測定は、逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で、以前に記載した方法(Miyata T, et al., Proc Natl Acad Sci 93: 2353-2358, 1996)により行った。すなわち、PBSにより希釈した酸加水分解物20 μlをHPLCシステムに注入し、C18逆相カラム（Waters）を用いて分離した。移動相を蛍光検出器（RF-10A、島津）を用いて、励起-吸収波長（335/385nm）で測定した。合成ペントシジンを、標準品として使用した。
【００７２】
in vitroにおける AGE抑制作用
ヒドララジンのAGE生成抑制作用についてはin vitroで測定した。インフォームドコンセントの後、非糖尿病腎不全患者の透析前ヘパリン採血し得られた新鮮なプール血漿（900μl）に8、20、あるいは50mMヒドララジン(DMSO溶液)100μlを添加し、インキュベートした。インキュベーションによるペントシジンの生成については、本発明者らの以前の方法(Miyata T, et al., Proc Natl Acad Sci 93: 2353-2358, 1996)により、HPLC法により測定した。
【００７３】
AGE生成抑制の作用機序、すなわちジカルボニル（グリオキサールとメチルグリオキサール）の捕捉、ピリドキサール5'-リン酸塩の捕捉、糖由来のラジカルとヒドロキシラジカルの消去、遷移金属イオンに対するキレート作用）については、以前に報告した方法(Miyata T, et al., J Am Soc Nephrol, in press.)により検討した。
【００７４】
統計学的解析
全てのデータを平均±SEで示した。他の3つのグループのSHR/NDmc-cp (fat/fat)の賦形剤投与群とSHR/NDmc-cp (fat/fat)の他の群との比較は Dunnett's testにより行った。SHR群とオルメサルタン投与SHR群との検定およびSHR/NDmc-cp (fat/fat)群とSHR群との検定、そして、SHR群とWKY群との検定はStudentsのｔ検定により実施した。組織学的解析については、Steel's test または Wilcoxon's test.により検定した。すべての計算は、SAS software（SAS Institute）を用い実施した。P < 0.05を統計学的に有意であるとした。
【００７５】
［実施例２］体重、血中グルコース及び脂質濃度
投与終了時、SHR（表１）とは対照的に、全てのSHR/NDmc-cp (fat/fat)は肥満となり、高血糖で高インスリン血漿、高脂血症であった。2種類の降圧薬として、レニン-アンジオテンシン系に関与するオルメサルタン（I型アンジオテンシンII受容体拮抗薬（ARB））と、レニン-アンジオテンシン系に関与しないと考えられるヒドララジンを使用した。高用量のオルメサルタン投与群では、賦形剤を投与した対照のSHR/NDmc-cp (fat/fat)群と比較して総コレステロールとリン脂質の血漿レベルを低下させた（P < 0.05）が、SHR/NDmc-cp (fat/fat)群に降圧薬を投与した他の群おいて、グルコース、インスリン、総コレステロール、リン脂質、体重、血漿レベルに関して変化は認められなかった。
【００７６】
【表１】
2004325444.tif 000002
データは平均±SEで示した。
aSHR (賦形剤投与群)に対するStudent's t-testによる検定値がP < 0.01
bSHR/NDmc-cp (fat/fat) (オルメサルタン投与群, 1mg/kg)に対するTukey's testによる検定値がP < 0.05 
cSHR/NDmc-cp (fat/fat) (賦形剤投与群)に対するTukey's testによる検定値がP < 0.05 
dWKY (賦形剤投与群)に対するStudent's t-testによる検定値がP < 0.01
【００７７】
［実施例３］心臓収縮期の血圧
対照のWKYラットと比較して、試験開始時において、全てのSHR（P < 0.01）とSHR/NDmc-cp (fat/fat)ラット（P < 0.01）は高血圧で、前者は後者より血圧は高かった（P < 0.01）。オルメサルタンとヒドララジンは、実験の期間中、有意に収縮期の血圧を低下させた（表２）。SHR/NDmc-cp (fat/fat)において、降圧効果はオルメサルタンの濃度に依存していた。ヒドララジン投与群の収縮期の血圧は、低用量オルメサルタン投与群の血圧とほぼ同様であった。また最後の4週間を除いて高用量オルメサルタン投与群の血圧とほぼ同様であった。高用量オルメサルタンの降圧作用は、SHRとSHR/NDmc-cp (fat/fat)で同様の傾向であった。
【００７８】
【表２】
2004325444.tif 000003
データは平均±SEで示した。
aSHR (賦形剤投与群)に対するStudent's t-testによる検定値がP<0.01
bWKY (賦形剤投与群)に対するStudent's t-testによる検定値がP<0.01
cSHR/NDmc-cp (fat/fat) (賦形剤投与群)に対するTukey's testによる検定値がP<0.05
dSHR/NDmc-cp (fat/fat) (賦形剤投与群)に対するTukey's testによる検定値がP<0.01
eSHR (オルメサルタン投与群, 5mg/kg)に対するStudent's t-testによる検定値がP<0.01
fSHR/NDmc-cp (fat/fat) (オルメサルタン投与群, 1mg/kg)に対するTukey's testによる検定値がP<0.05
【００７９】
［実施例４］タンパク尿と腎機能
試験終了時には、SHR/NDmc-cp (fat/fat)は高度のタンパク尿（表３）を示した。低用量のオルメサルタン、およびヒドララジン投与群では、尿中蛋白の排泄は賦形剤投与群に比較して低かったが、統計学的には有意ではなかった。それとは対照的に、高用量オルメサルタン投与群では蛋白尿の低下は、より著しく、統計学的に有意であった（P < 0.01）。対照のSHR群においては、蛋白尿は穏やかであった。そして、それは高用量オルメサルタンの投与により有意に減少した（P < 0.01）。WKYは蛋白尿を呈さず正常であった。腎機能は、全ての群において正常であった。
【００８０】
【表３】
2004325444.tif 000004
データは平均±SEで示した。
aSHR (賦形剤投与群)に対するStudent's t-testによる検定値がP<0.05
bSHR (賦形剤投与群)に対するStudent's t-testによる検定値がP<0.01
cSHR/NDmc-cp (fat/fat) (賦形剤投与群)に対するTukey's testによる検定値がP<0.01
dWKY (賦形剤投与群)に対するStudent's t-testによる検定値がP<0.01
【００８１】
［実施例５］腎臓の組織学
糸球体障害はSHR/NDmc-cp (fat/fat)ラットにおいて認められた（表４）。投与期間終了時には、SHR/NDmc-cp (fat/fat)において、賦形剤投与群では巣状糸球体硬化症は、著しく上昇した（P < 0.01）（図１Ｃ）。そして、オルメサルタン低用量投与群およびヒドララジン投与群おいてより低値を示したが、統計学的に有意ではなかった。それとは対照的に、高用量のオルメサルタン投与群では有意に低かった（P < 0.01）（図１Ｄ）。巣状糸球体硬化症は、SHR群（図１Ａ）の少数の糸球体だけに存在しており、WKY群（図１Ｂ）には認められなかった。
【００８２】
【表４】
2004325444.tif 000005
データは平均±SEで示した。
aSHR (賦形剤投与群)に対するWilcoxon's testによる検定値がP < 0.01
bSHR/NDmc-cp (fat/fat) (賦形剤投与群)に対するTukey's testによる検定値がP < 0.01
cSHR/NDmc-cp (fat/fat) (ヒドララジン投与群, 5mg/kg)に対するSteel-Dwass testによる検定値がP < 0.05
dWKY (賦形剤投与群)に対するWilcoxon's testによる検定値がP < 0.01
【００８３】
［実施例６］酸化的蛋白修飾とAGEに対する免疫組織染色
酸化的蛋白修飾物で、脂質の過酸化の過程で生成する4-ヒドロキシノネナール-タンパク付加物は、SHR/NDmc-cp（fat/fat）の賦形剤投与群で蓄積が認められたが（図２Ａ）、高用量オルメサルタン投与群においては検出されなかった（図２Ｂ）。低用量のオルメサルタンまたはヒドララジンの投与により、4-ヒドロキシノネナールータンパク付加物の生成抑制作用は認められなかった。対照のWKYあるいはSHRラットでは、4-ヒドロキシノネナール-タンパク付加物は認められなかった。ペントシジンは、SHR/NDmc-cp（fat/fat）賦形剤投与群の尿細管で検出された（図２Ｃ）。またペントシジンは全ての群の糸球体で認められなかった。さらにペントシジンはSHR/NDmc-cp（fat/fat）賦形剤投与群（図２Ｄ）の動脈壁で検出され、高用量オルメサルタンの投与により生成が抑制された（図２Ｅ）。WKYまたはSHRラットの動脈壁では検出されなかった。
【００８４】
［実施例７］腎臓のペントシジン濃度
免疫組織染色では、検出限界以上のAGEによるタンパク修飾を検出可能であるが、感度が低く、正確な定量は困難である。そこで、腎臓中のペントシジン濃度をHPLCにより化学的に測定した（表５）。腎臓のペントシジン（pmol/mg蛋白）は、賦形剤投与したSHR/NDmc-cp (fat/fat)群では、SHR群およびWKY群よりも高値を示した（P < 0.01）。腎臓のペントシジンはSHR/NDmc-cp (fat/fat)の賦形剤投与群と比較して、オルメサルタン、ヒドララジン投与群において減少した。高用量のオルメサルタン投与群（P < 0.01）およびヒドララジン投与群（P < 0.05）では統計学的に有意であった。
SHR/NDmc-cp (fat/fat)ラットでは、腎臓のペントシジン濃度は、尿中蛋白と有意な相関が認められた（y = 0.22x + 34.11、n = 38、r2 = 0.462、P < 0.001）（図３Ａ）。収縮期の血圧と尿中蛋白との相関はy = 1.28x + 20.77、n = 38、r2 = 0.126、P < 0.05（図３Ｂ）、収縮期の血圧と腎臓のペントシジン濃度の相関はy = 0.51x + 6.25、n = 38、r2 = 0.173、P < 0.05（図３Ｃ）であり、いずれも有意な相関が認められた。
【００８５】
【表５】
2004325444.tif 000006
データは平均±SEで示した。
aSHR (賦形剤投与群)に対するStudent's t-testによる検定値がP < 0.01 
bWKYに対するStudent's t-testによる検定値がP<0.01
cSHR/NDmc-cp(fat/fat) (賦形剤投与群)に対するTukey's testによる検定値がP<0.05 
dSHR/NDmc-cp(fat/fat) (賦形剤投与群)に対するTukey's testによる検定値がP<0.01
【００８６】
［実施例８］in vitroにおけるAGE抑制作用
本発明者らが以前にオルメサルタン等のin vitroの作用機序を検討したように（Miyata T, et al., J Am Soc Nephrol, in press.）、ヒドララジンの作用機序をin vitroで検討した。非糖尿病の透析患者血漿におけるin vitroでのペントシジン生成（図４Ａ）とNε-カルボキシメチルリジン（CML）（図４Ｂ）は、ヒドララジンにより濃度依存的に阻害された（ペントシジンとCMLのIC50は、0.52mM および0.77mM）。非腎不全の糖尿病患者血漿や糖尿病の透析患者血漿、あるいは、0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）中10mMアラビノース存在下、ウシ血清アルブミンをインキュベートした時においても、同様のAGE生成に対する阻害効果が認められた（データは示していない）。
【００８７】
さらに、ヒドララジンのAGE生成抑制効果の作用機序を検討した。ヒドララジンはアミノグアニジンと同様、グリオキサールやメチルグリオキサールなどのAGEの前駆体となるRCO（図４Ｃ）やピリドキサール5’-リン酸（図４Ｄ）を効果的に捕捉したが、この現象は、オルメサルタン（Miyata T, et al., J Am Soc Nephrol, in press.）の場合とは対照的であった。ヒドララジンは、酸化に対しても軽減化作用を有する。オルメサルタンと同様、ヒドララジンはカーボンセンターラジカル消去作用が認められたが、このことはアミノグアニジンとは対照的であった（図４Ｅ）。さらに、ヒドララジンには、ヒドロキシルラジカルの消去作用が認められたが（図４Ｆ）、アミノグアニジンの場合、消去作用はわずかであった。また、ヒドララジンは、銅イオンに対してキレート作用があり、フェントン反応を抑えることにより、アスコルビン酸の自動酸化を抑制した（IC50=1.3mM）。
【００８８】
［実施例９］β-ブロッカーによるAGE抑制作用
β-ブロッカーは、オルメサルタンのようなアンジオテンシン受容体拮抗剤や
ヒドララジンと同様に血圧降下作用を有しているが、タンパク尿の抑制作用はほとんど認められない。そこで、代表的なβ-ブロッカーであるアテノロールを用い、実施例８と同様に操作して、尿タンパク、血圧、およびペントシジン含量を検討した。
SHR/NDmc-cp(fat/fat)ラットにおいて、アテノロールはオルメサルタンと同程度の血圧低下作用を示したが（図５）、タンパク尿の抑制効果は認められない（図６）。また、非糖尿病の透析患者血漿におけるin vitroでのペントシジン生成に対しても効果は認められなかった（図７）。
【００８９】
［実施例１０］カルシウム拮抗剤によるAGE抑制作用
カルシウム拮抗剤もβ-ブロッカーと同様に、オルメサルタンのようなアンジオテンシン受容体拮抗剤やヒドララジンと同様に血圧降下作用を有しているが、タンパク尿の抑制作用はほとんど認められない。そこで、代表的なカルシウム拮抗剤であるニフェジピンを用い、実施例８および９と同様に操作して、血圧および尿タンパクを検討した。
SHR/NDmc-cp(fat/fat)ラットにおいて、投与14週後、ニフェジピン（50mg/kg）投与群はオルメサルタン（5mg/kg）投与群と同程度の有意な血圧低下作用を示したが（図８）、タンパク尿の抑制効果は認められなかった（図９）。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
β-ブロッカーやカルシウム拮抗剤はオルメサルタンと同様に血圧降下作用を有する。しかし、in vitroでAGE（ペントシジン）抑制効果のないアテノロールにタンパク尿抑制効果は認められなかった。一方、AGE（ペントシジン）生成を抑制するオルメサルタンはタンパク尿を抑制した。また、カルシウム拮抗剤であるニフェジピンにおいても、血圧は有意に低下したが、タンパク尿の抑制作用はほとんど認められなかった。このことは、血圧以外の要因による腎保護作用の存在を強く示唆するものである。そして、非レニン-アンジオテンシン系抗高血圧剤であるヒドララジン（in vitroでAGE抑制作用を有する）がタンパク尿を低下させたことと併せて、腎保護作用にAGEが深く関与していることが明らかになった。したがって、SHR/NDmc-cp(fat/fat)ラットを用いたAGE生成抑制作用の評価方法は、腎疾患分野をはじめとする創薬手段として有効に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】典型的な糸球体障害の写真（２００倍）を示す。A；SHRラットにおける少数の糸球体に観察された糸球体の硬化を示す。矢印は、代表的な硬化を示す。B；対照のWKYラットの糸球体を示す。C；SHR/NDmc-cp (fat/fat)ラットにおけるより高度な糸球体硬化を示す。D；SHR/NDmc-cp (fat/fat)ラットの高用量オルメサルタン投与群における糸球体障害の軽減化を示す。
【図２】脂質の過酸化で生成する4-ヒドロキシノネナール蛋白付加物（A, B）と、AGEであるペントシジン（C〜E）の免疫染色の写真（２００倍）を示す。A；SHR/NDmc-cp (fat/fat)ラットの賦形剤投与群の糸球体における、4-ヒドロキシノネナール蛋白付加物の蓄積を示す。B；SHR/NDmc-cp (fat/fat)ラットの高用量オルメサルタン投与群において4-ヒドロキシノネナール蛋白付加物は認められなかったことを示す写真。C；SHR/NDmc-cp (fat/fat)ラットの賦形剤投与群の尿細管におけるペントシジンの蓄積を示す写真。D；SHR/NDmc-cp(fat/fat)ラットの動脈壁におけるペントシジンの蓄積を示す写真。E；SHR/NDmc-cp (fat/fat)ラットの高用量オルメサルタン投与群においてペントシジンは認められなかったことを示す写真。
【図３】SHR/NDmc-cp (fat/fat)ラットの賦形剤投与群及び降圧薬投与群における、A；尿中タンパクと腎臓中のペントシジン濃度の相関、B；収縮期の血圧と蛋白尿との相関、C；収縮期の血圧と腎臓中のペントシジン濃度の相関を示すグラフ。
【図４】ヒドララジンがin vitroにおいてAGEsの生成を抑制することを示すグラフ。薬剤がない対照を100%とした。結果を平均±SEで示した。  A；非糖尿透析患者血漿をインキュベートした場合のヒドララジンによるペントシジンの生成抑制作用を示す。B；非糖尿透析患者血漿をインキュベートした場合のヒドララジンによるCMLの生成抑制作用を示す。C；ヒドララジンによるジカルボニル化合物の捕捉を示す。D；ヒドララジンによるピリドキサール5'-リン酸（PLP）の捕捉を示す。E；ヒドララジンによるリボース由来カーボンセンタードラジカルの消去作用を示す。縦軸は、キレックス（金属イオンに対するキレート剤）存在下、種々の薬剤の濃度におけるN-t-butyl-a-phenylnitrone (PBN) とリボース由来カーボンセンタードラジカルの付加物の相対的ESR強度を示す。F；ヒドララジンによるヒドロキシルラジカルの消去作用を示す。縦軸は、5,5'-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide（DMPO）OHの相対的ESRのシグナルの高さを示す。
【図５】アテノロールをラットに投与したときの血圧低下作用を示すグラフ。図中、縦軸は収縮期の血圧(mmHg)、横軸は薬剤投与後の期間（週）を示す。黒丸：陰性対象、黒菱形：アテノロール（βブロッカー）、黒四角：オルメサルタン(ARB)、黒三角：WKY（対照）
【図６】アテノロールをラットに投与したときのタンパク尿に対する影響を示すグラフ。図中、縦軸は尿タンパク排泄量(mg/kg/day)、横軸は薬剤投与後の期間（週）を示す。黒丸：陰性対象、黒菱形：アテノロール（βブロッカー）、黒四角：オルメサルタン(ARB)、黒三角：WKY（対照）
【図７】アテノロールのin vitroでのAGEs生成に対する効果を示すグラフ。縦軸は、ペントシジン生成量(nmol/mL)を、横軸は薬剤の種類を示す。各薬剤のカラムは、左から順に薬剤濃度0.8mM、2.0mM、および5.0mMの結果を示す。
【図８】ニフェジピンをラットに投与したときの血圧低下作用を示すグラフ。図中、縦軸は収縮期の血圧（mmHg）を示す。ND：無処置SHR/NDmc-cp(fat/fat)ラット群、Nif：ニフェジピン（50mg/kg）投与群、CS-866：オルメサルタン（5mg/kg）投与群、WKY：対照WKYラット群。
【図９】ニフェジピンをラットに投与したときのタンパク尿に対する影響を示すグラフ。図中、縦軸はタンパク尿（mg/day）を示す。ND：無処置SHR/NDmc-cp(fat/fat)ラット群、Nif：ニフェジピン（50mg/kg）投与群、CS-866：オルメサルタン（5mg/kg）投与群、WKY：対照WKYラット群。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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