(57)【要約】【課題】培養液の状態をモニターし、培養液の交換を適切なタイミングで行うことにより、長期間にわたる観察及び写真（ビデオ）撮影等の記録を可能にする細胞培養チップを提供する。【解決手段】細胞培養チップ１０に、ウェル内の培養液のｐＨや温度等を検出するセンサ１８を設ける。センサ１８としては、それらの他に、ｐＯ２センサ、ＮＯセンサ、ＣＯ２センサ等を使用することができる。例えばｐＨセンサを用いることにより、培養液を交換すべきタイミングを正確に把握できるようになる。【選択図】　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡の試料台に載置可能な大きさの透明の板材から成り、内部にウェルを有するとともに、ウェルへの液体の供給口及び液体の排出口を有する細胞培養チップにおいて、
ウェル内の培養液を検出するセンサを設けたことを特徴とする細胞培養チップ。
【請求項２】
ウェルと液体供給口又は液体排出口との間にチャンネルを有することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養チップ。
【請求項３】
上記センサがｐＨセンサ、ｐＯ２センサ、ＮＯセンサ、ＣＯ２センサ、温度センサのいずれか１つ又は複数の組み合わせであることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養チップ。
【請求項４】
センサに加え、温度調節手段を設けたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養チップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物、医療又はバイオテクノロジーの研究分野において、培養環境を測定し、培養液の交換を適切なタイミングで行うことにより、長期間にわたる顕微鏡観察を可能にする細胞培養チップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、生物、医療又はバイオテクノロジーの研究分野における細胞の培養状態の観察は、主に液体培養により行われている。また、その培養細胞の状態を直接観察するために、顕微鏡の試料台（ステージ）に乗せることができる培養容器（培養チップ）が用いられている（例えば、特許文献１参照）。更に、細胞を長期間培養・観察するために、培養チップに培養液交換手段を設けたものも利用されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００３】
【特許文献１】
特開平１０−２８５７６号公報（［０００６］，図２）
【特許文献２】
特開２００２−１５３２６０号公報（［００１５］，図１）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
培養細胞を維持するためには、温度などの培養環境や、培養細胞の代謝により変化する培養液の状態を常にモニターしなければならない。培養環境が一定に維持されていないと実験の再現性が低くなり、信頼できるデータが得られない。また、培養液内の組成物が枯渇した状態になると培養細胞の分裂速度が低下する。細胞分裂速度が低下した培養細胞は、良好な培養状態における培養細胞に比して培養細胞の代謝能が大きく劣り、研究に適さない。
【０００５】
しかし、顕微鏡の試料台に乗せることができる大きさの細胞培養チップでは、保持できる培養液の量が少なく、培養液内の組成物がすぐに枯渇してしまう。
【０００６】
本発明はこのような課題を解決するために成されたものであり、その目的とするところは、培養液の状態をモニターし、培養液の交換を適切なタイミングで行うことにより、長期間にわたる観察及び写真（ビデオ）撮影等の記録を可能にする細胞培養チップを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために成された本発明は、顕微鏡の試料台に載置可能な大きさの透明の板材から成り、内部にウェルを有するとともに、ウェルへの液体の供給口及び液体の排出口を有する細胞培養チップにおいて、ウェル内の培養液を検出するセンサを設けたことを特徴とする。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に係る細胞培養チップでは、ウェル内の培養液を検出するセンサが設けられているため、ウェル内部での培養液の状態等を検出することができる。
【０００９】
例えば、培養液内の細胞の状態を把握するには、主にその細胞が代謝する物質をモニターすればよい。代謝物質は培養細胞の種類（例えば、植物細胞、動物細胞、菌類など）により異なるが、各種類に応じた代謝物質の存否及び／又は存在量を検出するセンサを用いることにより、各時点における目的とする培養細胞の状態を把握することができる。このようにして検出される培養細胞の状態を、顕微鏡観察の結果（画像、映像等）と照合することにより、その細胞に関する詳しい知見を得ることができる。
【００１０】
また、代謝物質が不明又はそれを検出するセンサが存在しない場合でも、ｐＨセンサを用いることにより、培養細胞の状態を検出することができる。すなわち、ほとんど全ての培養細胞において、培養液のｐＨは細胞の状態を表す適切な指標となり得る。そこで、予め培養する細胞の培養環境において、最適なｐＨの範囲を調べ、培養液を交換すべきｐＨの値を定めておく。そうすることにより、培養液の交換するタイミングを、培養液のｐＨをモニターすることにより正確に把握できるようになる。
【００１１】
ｐＨをモニターするセンサは種々挙げることができるが、細胞培養チップに搭載可能な程度に微小なｐＨセンサとして、ＬＡＰＳ型ｐＨセンサ（特開平９−２０３７２２号公報参照）やＩＳＦＥＴ型センサ（特開平９−２０３７２１号公報参照）を挙げることができる。
【００１２】
また、培養液にｐＨの変化により色が変化するフェノールレッド等の色素を添加し、培養中の培養液を分光光学的に測定することにより培養液のｐＨをモニターすることも可能である。
【００１３】
ｐＯ２センサ、ＣＯ２センサは、その増加・減少を測定することにより、培養チップ内での細胞の活動をモニターすることができる。また、その測定結果に応じて、培養チップに供給する培養液中のＯ２、ＣＯ２の量を調節するようにしてもよい。
【００１４】
ＮＯセンサは、培養液内の組成物の中で、植物細胞を培養する際の硝酸態窒素濃度の代謝の指標として有効であるばかりでなく、特定物質による刺激に対する細胞の応答の有効な指標となる。
【００１５】
温度センサは、細胞の培養環境の重要な要素の一つである温度をモニターする。温度センサとしては、小型である点で熱電対を用いるのが望ましい。
【００１６】
温度センサはまた、培養環境としての温度を制御するためのセンサとしても用いることができる。この場合、培養チップ内の培養液の温度を変化させるための手段としては、加熱手段として、温水循環、赤外線ヒーター（赤外線照射）、温風ファン（温風吹き付け）を挙げることができ、冷却手段としては冷水循環を挙げることができる。ペルチェ素子を用いることにより、加温・冷却の両方を行うことができる。
【００１７】
【発明の効果】
本願発明に係る細胞培養チップを使用することにより、長期間に亘る培養環境の維持が可能となり、長期間に亘る細胞の顕微鏡観察が可能となる。これにより、生物、医薬、バイオテクノロジー等の研究において、より信頼性の高いデータを得ることができるようになる。たとえば、これまでには調査できなかった、細胞の特定物質に対する長期間にわたる応答反応や、特定物質が培養細胞に与える一連の挙動等を正確且つ確実に記録することができる。
【００１８】
【実施例１】
本発明の一実施例である細胞培養チップの構成を図１に示す。図１（Ｂ）に示すように、本実施例の細胞培養チップ１０は、ウェル層１１、チャンネル層１２及びセンサ層１３の３層の透明板から成る。これら３層の透明板はオプティカルコンタクトで接着されている。
【００１９】
ウェル層１１には培養細胞を保持するためのウェル１４が、チャンネル層１２にはウェル１４と培養液供給口１６及び排出口１７を接続するチャンネル１５ａ、１５ｂが、そしてセンサ層１３にはウェル１４内の培養液の各種パラメータをモニターするためのセンサ１８と培養液供給口１６及び排出口１７が設けられている。センサ１８の先端はウェル１４内の培養液を検出できる位置に設けられている。なお、センサ１８は、細胞に干渉しないように、その先端がなるべくウェル１４の天井近くとなるように配置することが望ましい。また、細胞との相互作用を経た後の培養液を検出するため、なるべく培養液排出口１７の近くに配置することが望ましい。
【００２０】
本実施例の細胞培養チップ１０を用いて培養細胞の観察を行う際の構成を図２に示す。まず、細胞培養チップ１０の供給口１６又は排出口１７から目的の細胞２０を培養液と共にウェル１４に入れる。細胞を入れた細胞培養チップ１０を顕微鏡のステージ２１に載置し、ホルダ２２により細胞培養チップ１０を固定する。そして、培養液タンク２３からのチューブを細胞培養チップ１０の供給口１６に接続し、排出口１７を排液タンク２５に接続する。培養液タンク２３からのチューブの途上にはペリスタポンプ２４が設けられている。なお、培養液タンク２３とポンプ２４の代わりに、シリンジとシリンジポンプを用いてもよい。細胞培養チップ１０の外部に突出しているセンサ１８の端子に専用の端子ユニット１９を取り付け、モニターシステム２７に接続する。
【００２１】
ウェル１４内の細胞は、顕微鏡ステージ２１の下に配置された対物レンズ２６により観察する。対物レンズ２６で撮影された映像はＣＣＤによりリアルタイムに電気信号に変換され、同様にモニターシステム２７に送られる。
【００２２】
モニターシステム２７は、パーソナルコンピュータを専用のプログラムで動作するようにしたものであり、上記の細胞培養チップ１０のセンサ１８からの検出信号及び観察映像信号を処理する他、培養液ポンプ２４や顕微鏡ステージ２１の移動等も制御するようになっている。
【００２３】
観察された映像は、上記の通りリアルタイムでモニターシステム２７に送られ、そこに接続されたモニタースクリーン２８上に表示される。また、モニターシステム２７におけるスイッチの切り替えにより、センサ１８で検出されたｐＨやｐＯ２等のパラメータの値もモニタースクリーン２８上に表示させることができる。また、これらの検出データや画像は、ＨＤＤ等の記憶装置２９に記録することもできる。
【００２４】
細胞２０の培養条件の変化（劣化）は、センサ１８により検出することができる。例えば、センサ１８の中にｐＨセンサを含めておき、それにより検出される培養液のｐＨが所定の値を超えた場合は、培養液が劣化したと判断することができる。この場合、ポンプ２４を駆動することにより培養液をウェル１４に供給し、古い培養液を排出口１７から押し出すことにより培養液が交換される。
【００２５】
培養液のｐＨは、次のような方法でも検出することができる。培養液の中にフェノールレッド等のｐＨ指示色素を入れ、それを細胞培養チップ１０に供給する。培養細胞の代謝により培養液のｐＨ値が上昇した場合、フェノールレッドが変色する。この色変化を図６に示すように分光光度計６３と光ファイバガイド（６１は送光用、６２は受光用）で特定の波長の吸光度として検出し、吸光度（Ａｂｓ）−ｐＨ変換器６４でｐＨ値に変換する。この値を所定値と比較することにより、培養液の劣化を検出することができる。
【００２６】
このようにして培養及び観察を長期間継続することにより、培養細胞の一連の応答反応を、顕微鏡による映像と培養液組成の変化との両面から観察することができる。
【００２７】
なお、培養温度を一定にするために、顕微鏡ステージ２１又はホルダ２２に温調手段を設けてもよい。そのような温調手段の例を図４及び図５に示す。図４の例では赤外線光源４３を加熱手段として用い、図５の例では細胞培養チップ１０に貼付したシートヒーター５３を加熱手段として用いている。いずれも、センサ１８の中に温度センサ４１、５１を含めておき、それにより検出されるウェル内の培養液の温度をコントローラ４２、５２にフィードバックすることにより温度調節を行う。
【００２８】
【実施例２】
本発明の第２の実施例であるタンデム細胞培養チップを説明する。この細胞培養チップを使用することにより、蛍光標識した物質Ｐに対する培養細胞の応答反応を蛍光顕微鏡を用いて継続的に観察することができる。
【００２９】
図３に示すタンデム細胞培養チップ３０は、１個のチップ内に同一形状のウェル３１ａ、３１ｂを２個並列に設けたものである。各ウェル３１ａ、３１ｂには図１の実施例と同様にチャンネル３２ａ、３２ｂ、供給口３３ａ、３３ｂ、排出口３４ａ、３４ｂ、センサ３５ａ、３５ｂがそれぞれ設けられている。なお、本実施例の細胞培養チップでは各ウェル３１ａ、３１ｂに対して第２供給口３６ａ、３６ｂが設けられている。
【００３０】
本実施例の細胞培養チップ３０では、２個のウェル３１ａ、３１ｂに同じ細胞を入れ、同時に並行して培養を行う。ただし、いずれか一方のウェル（図３では上方の３１ａ）にのみ、供給口３６ａを通じて蛍光標識した物質Ｐを添加して実験区とする。物質Ｐを添加しない方のウェル３１ｂにおける培養細胞は、細胞応答に関する対照区として扱う。
【００３１】
顕微鏡観察は、蛍光標識した物質Ｐを添加した実験区（ウェル３１ａ）に対して行う。蛍光顕微鏡の励起光により、蛍光標識した物質Ｐが励起されるため、その蛍光を観察することにより、物質Ｐの培養細胞に対する挙動を観察することができる。
【００３２】
さらに、蛍光標識した物質Ｐを培養液に添加した実験区（ウェル３１ａ）と添加していない対照区（ウェル３１ｂ）のセンサ３５ａ、３５ｂによる検出データを比較することにより、物質Ｐに対する培養細胞の応答反応を正確に把握することができる。両実験区は同一チップ内で培養しているため、実験区と対照区との間で出たセンサ３５ａ、３５ｂの検出データの差異は、純粋に物質Ｐに対する培養細胞の応答反応による信頼性の高いデータとして扱うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施例である細胞培養チップの平面図（Ａ）及び断面図（Ｂ）。
【図２】第１実施例の細胞培養チップを用いて培養細胞の顕微鏡観察を行う際の概略構成図。
【図３】本発明の第２実施例であるタンデム細胞培養チップの平面図。
【図４】赤外線光源を用いた温調手段の例を示す構成図。
【図５】シートヒーターを用いた温調手段の例を示す構成図。
【図６】フェノールレッドを用いたｐＨ検出の例を示す構成図。
【符号の説明】
１０…細胞培養チップ
１１…ウェル層
１２…チャンネル層
１３…センサ層
１４…ウェル
１５ａ、１５ｂ…チャンネル
１６…培養液供給口
１７…培養液排出口
１８…センサ
１９…センサ用端子ユニット
２０…細胞
２１…顕微鏡ステージ
２２…チップホルダ
２３…培養液タンク
２４…培養液ポンプ
２５…排液タンク
２６…対物レンズ
２７…モニターシステム
２８…モニタースクリーン
２９…記憶装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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