(57)【要約】【課題】薄層クロマトグラフィーを行う際に、横方向に拡散しないプレートの開発を課題とする。さらには、ＤＨＡ等の化合物の定量・定性分析に適する方法の開発も課題とする。【解決手段】スリットを有するＴＬＣを用いることにより、横方向の試料拡散を防止することができた。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スリットを有する薄層プレート。
【請求項２】
薄層プレートが濃縮ゾーン付きプレートである請求項１記載の薄層プレート。
【請求項３】
請求項１または２記載のプレートを用いる化合物の分析方法。
【請求項４】
化合物がＤＨＡである請求項３記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、新規の薄層クロマトグラフィー用プレートおよび該プレートを用いた分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シリカゲル等をガラス板、プラスチックシート、アルミシート等に塗布したプレートを用いる薄層クロマトグラフィー（以下単にＴＬＣともいう）は、有機化合物の分析、分離に最も頻繁に利用されている手法の１つである。高価な装置を必要とせず、分離時間も比較的短く、簡便で分離能も高いことから、特に、反応の進行状況の追跡、カラムクロマトグラフィーの溶出成分の検出には欠くことのできない手法となっている。
【０００３】
試料が希薄な場合、あるいはＴＬＣ上で分離スポットが接近した試料の場合等には、濃縮ゾーン付きＴＬＣプレート（以下単に濃縮プレートともいう）が用いられる。濃縮ゾーン付きＴＬＣプレートは、細孔径が大きく吸着活性のないポーラスシリカ等をプレート下部に塗布したものである。濃縮プレートにスポット（塗布）された試料は濃縮ゾーンでは吸着されず、吸着層との境目で線状に濃縮される。濃縮後に展開がはじまるため、試料が希薄な場合、あるいは隣接スポットとの分離が必要な場合等には有用である。しかし、この方法は縦方向にのみ濃縮され、横方向に拡散し、その結果、展開したスポットは帯状となる。この方法は定性的なスポット分離には有効であるが、横方向の拡散を調節できないため、定量ＴＬＣ法に用いるには不適切であった。
【０００４】
一方、ドコサヘキサエン酸（以下ＤＨＡともいう）は、生体内において脳、網膜などの神経関連細胞での含量が高く、精子などの細胞膜リン脂質や母乳中にも含まれている（例えば、非特許文献１参照）。これまでの研究からＤＨＡには、学習能向上作用（記憶力増強作用）、網膜反射能向上作用（視力低下抑制作用）、制癌作用、血中脂質低下作用（コレステロール、中性脂質）、抗血栓作用（血小板凝集抑制作用）、抗アレルギー作用、抗炎症作用、抗糖尿病作用（血糖値低下作用）等の生理活性を有していることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
ＤＨＡが食品に添加された場合、品質の確認等には、ＤＨＡの定量が不可欠である。従来、母乳等のＤＨＡ含量を測定するためには、脂質を抽出した後、ケン化を行って脂肪酸を遊離し、その後メチル化し、ガスクロマトグラフィー（以下ＧＣともいう）等で分析を行うことが必要であった（例えば、非特許文献２参照）。しかし、この定量法はガスクロマトグラフ装置を必要とし、場所を選ばず簡便に行うことはできなかった。
【０００６】
【非特許文献１】
原健次著「生理活性脂質ＥＰＡ・ＤＨＡの生化学と応用」幸書房、１９９６年４月１０日、ｐ．１１１−１１８
【非特許文献２】
日本食品分析センター編「分析実務者が書いた五訂日本食品成分表分析マニュアルの解説」中央法規出版、ｐ．２００−２２７
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
薄層クロマトグラフィーを行う際に、横方向に拡散しないプレートの開発を課題とする。さらには、ＤＨＡ等の化合物の定量・定性分析に適する方法の開発も課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、スリットを有するＴＬＣを用いることにより、横方向の試料拡散を防止できることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
（１）  スリットを有する薄層プレート、
（２）  薄層プレートが濃縮ゾーン付きプレートである（１）の薄層プレート、
（３）  （１）または（２）のプレートを用いる化合物の分析方法、
（４）  化合物がＤＨＡである（３）の分析方法、
からなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、スリットを有するＴＬＣに関するものであり、市販している濃縮ゾーン付きＴＬＣプレートの濃縮ゾーン部分にスリットを入れることにより調製することができる。
ＴＬＣプレートは、シリカゲル等をガラス板、プラスチックシート、アルミシート等に塗布したプレートを用いることができる。
【００１１】
プレートの分離ゾーンに塗布される化合物としては、シリカゲル、アルミナ（アルミニウムオキソド）、セルロース、けいそう土が用いられる他、シリカゲル表面のシラノール基に有機部位を化学結合した化学修飾型シリカゲルも用いられており、逆相、ＮＨ２、ＣＮ、ＤＩＯＬタイプが知られており、分析したい試料にあわせ、適宜選択すればよい。
【００１２】
ＴＬＣプレートは前述した通常用いられているものを用いることができるが、縦方向の試料の拡散を防止するため、濃縮ゾーン付きＴＬＣプレートを用いることが望ましい。
【００１３】
スリットは、分析に用いるＴＬＣプレートの大きさや同一のプレートにスポットする試料の数によりその高さや幅を適宜調節することができるが、幅１５ｃｍのＴＬＣプレートを用いた場合は、高さ０．１〜０．９ｍｍ、幅５〜１５ｍｍであることが好ましい。また、スリットとスリットとの間隔は、スリット幅より短いことが好ましく、２〜１０ｍｍであることが好ましい。金属の棒等でＴＬＣプレートをなぞり、プレート上のシリカゲルを削ることによりスリットを付けることが可能である。
【００１４】
展開溶媒は、適切なＲｆ値が得られるよう通常用いられている極性溶媒及び／または非極性溶媒を単独または混合して用いることができるが、液面がスリットより下であることが必要である。
【００１５】
スリット付きＴＬＣ（濃縮ゾーン付き）を用いた場合の拡散防止（横方向）の概念図を図１に示す。試料をスリット上部にスポットし、展開を開始するとスリットの横から上昇する溶媒により、スポットが中心に向かって集約される。小さくなったスポットとして分離層へ到達することにより、横方向への拡散が防止される。
【実施例】
以下、本発明を実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものでない。
【００１６】
［実施例１］スリット付きＴＬＣプレートの製造
Ｍｅｒｃｋ社製濃縮ＴＬＣプレートＨＰＴＬＣ−Ｆｅｒｔｉｇｐｌａｔｔｅｎ  ＲＰ−１８の下端から１ｃｍの位置に幅１０ｍｍ、スリット間隔５ｍｍとなるように、幅０．８ｍｍの金属棒を用いてスリットを入れた（図２Ａ）。
【００１７】
［実施例２］スリット付きＴＬＣプレートを用いたＤＨＡの分析
実施例１で製造したスリット付きＴＬＣプレートを用いて、スリットの上部５ｍｍの中央にｃｉｓ−４，７，１０，１３−１６，１９−Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＨＡ）を１μＬスポットした。風乾後、アセトニトリルを用いて展開した。その後、ヨウ素発色を行った。対照としてスリットを入れないＴＬＣプレートを用いて同様の実験を行った。結果を図２に示す。ＤＨＡを０．１、０．２、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、１μＬをスポットしたところ、スリット付きＴＬＣの場合はスポットの形状が真円に近く、ＤＨＡ濃度が増すとともにスポットの濃度も増した。一方、スリット無しＴＬＣの場合はスポットの形状は帯状となり、ＤＨＡ濃度とスポットの濃度は比例しなかった。スリットなしＴＬＣを研究員１０名に見せ、最も濃いスポットと最も薄いスポットを判定してもらったところ、全員が０．２ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のスポットをそれぞれ最も濃いスポットおよび最も薄いスポットと判定した。一方、スリット付きＴＬＣの場合は、０．２ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のスポットをそれぞれ最も濃いスポットおよび最も薄いスポットと判定したのは１０名中２名であり、残りの８名は０．３ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のスポットをそれぞれ最も濃いスポットおよび最も薄いスポットと判定した。このように、ＴＬＣプレートの濃縮ゾーンにスリットを入れることにより、定量性が増すことが確かめられた。
【００１８】
［実施例３］牛乳中脂肪酸のエステル化（直接法）
魚油カルシウム塩（ＤＨＡ及びＥＰＡを含有）を混入した飼料を与えた乳牛から得た牛乳を用いた。５０ｍＬのガラスチューブに牛乳１ｍＬ、５ｍＬの０．５Ｍ  ＫＯＨメタノール溶液を入れキャップをし、沸騰水浴中５分間加熱した。次に、５ｍＬの１４％ＢＦ３メタノールコンプレックスメタノール溶液を入れ、さらに、沸騰水浴中で２分間加熱した。その後、室温まで冷却し、５ｍＬの飽和食塩水、１０ｍＬのヘキサンを加え、３００ｒｐｍで５分間抽出を行った。その後、２，５００ｒｐｍ５分の遠心分離を行い、上清を牛乳中脂肪酸のエステル体として得た。
【００１９】
［実施例４］牛乳中脂肪酸のエステル化（従来法）
１０ｍＬのガラスチューブに牛乳０．５ｍＬ、０．１ｍＬ  ２８％ＮＨ４ＯＨ水溶液、０．５ｍＬエタノール、３．５ｍＬジエチルエーテルを加え、３００ｒｐｍで３分間抽出を行った。その後、２，５００ｒｐｍ５分の遠心分離を行った。上清（有機層）を新しい１０ｍＬガラスチューブに移し、溶媒を減圧留去した。これに１ｍＬの０．５Ｍ  ＫＯＨメタノール溶液を入れキャップをし、沸騰水浴中５分間加熱した。次に、１ｍＬの１４％ＢＦ３メタノールコンプレックスメタノール溶液を入れ、さらに、沸騰水浴中で２分間加熱した。その後、室温まで冷却し、１ｍＬの飽和食塩水、２ｍＬのヘキサンを加え、３００ｒｐｍで５分間抽出を行った。その後、２，５００ｒｐｍ５分の遠心分離を行い、上清を牛乳中脂肪酸のエステル体として得た。
【００２０】
［実施例５］スリット付きＴＬＣプレートを用いた牛乳中脂肪酸の分析
下記の８の試料を実施例１で作製したプレートに１μＬづつスポットした。アセトニトリルで１０ｃｍ展開し充分に乾燥させた。下端から４ｃｍの場所でＴＬＣプレートを切断し、その後アセトニトリルで約６ｃｍ展開、さらに乾燥後アセトニトリル／水＝９０／１０で約６ｃｍ展開した（図３）。展開時間は約４０分であった。３回目の展開はアセトニトリルを用いてもほぼ同様の分離結果が得られた。この方法で牛乳中のＤＨＡの分析を行った結果を図４に示す。この結果、通常分離の困難なＥＰＡとＤＨＡが良く分離し、定量が可能であることが示された。
レーン１：実施例３で調製した試料
レーン２：市販牛乳から従来法（実施例４）により脂質を抽出し、ＤＨＡ，ＥＰＡをそれぞれ１００μｇ／ｍＬ添加し、その後ケン化、エステル化を行った試料。
レーン３：市販牛乳から従来法（実施例４）により脂質を抽出し、ＥＰＡを１００μｇ／ｍＬ添加し、その後ケン化、エステル化を行った試料。
レーン４：市販牛乳から従来法（実施例４）により脂質を抽出し、ＤＨＡを１００μｇ／ｍＬ添加し、その後ケン化、エステル化を行った試料。
レーン５：市販牛乳を直接法（実施例３）で調製した試料
レーン６：市販牛乳にＤＨＡ，ＥＰＡをそれぞれ１００，  ５０μｇ／ｍＬ添加し、直接法（実施例３）によりケン化、エステル化を行った試料。
レーン７：市販牛乳にＤＨＡ，ＥＰＡをそれぞれ２００，  １００μｇ／ｍＬ添加し、直接法（実施例３）によりケン化、エステル化を行った試料。
レーン８：市販牛乳にＤＨＡ，ＥＰＡをそれぞれ３００，  １５０μｇ／ｍＬ添加し、直接法（実施例３）によりケン化、エステル化を行った試料。
【００２１】
【発明の効果】
スリットを有するＴＬＣを用いることにより、横方向の試料拡散を防止でき、従来困難だったＤＨＡやＥＰＡを別のスポットとして分離し、分析することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】スリット付きＴＬＣ（濃縮ゾーン付き）を用いた場合の拡散防止（横方向）の概念図を示す。
【図２】スリット付きＴＬＣプレート（Ａ）とスリット無し（市販）ＴＬＣプレート（Ｂ）でのＤＨＡスポットの形状を示す図である。ＤＨＡの濃度は２：０．１ｍｇ／ｍＬ，  ３：０．２ｍｇ／ｍＬ，  ４：０．３ｍｇ／ｍＬである（１はブランク）。Ｉは展開溶媒、ＩＩはスリットの位置をそれぞれ示す。
【図３】スリット付きＴＬＣプレートを用いた牛乳中脂肪酸の分析法を示す。
【図４】スリット付きＴＬＣプレートを用いた牛乳中脂肪酸の分析結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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