(57)【要約】【課題】生体内で細胞や組織に負荷されている圧力や応力を模倣した環境を生体外でつくり、生体細胞又は組織を培養する方法、及びその装置を提供する。【解決手段】生体細胞又は組織の培養に適した環境を提供する培養槽内に、生体細胞又は組織が入った培養容器を設ける。生体細胞又は組織に加えたい水平力と垂直力とから培養容器の回転数と培養容器の水平面に対する設置角度とを算出し、得られた角度で培養容器を傾け、得られた回転数で培養容器を回転しながら培養する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養槽内に設けられた培養容器を回転し、前記培養容器内で培養されている生体細胞又は組織にかかる物理的刺激を、回転数及び／又は回転半径で制御しながら、生体細胞又は組織を培養する生体細胞又は組織の培養方法。
【請求項２】
前記培養容器は少なくとも生体細胞又は組織が培養される平板な底面を備え、該底面を水平面に対して傾けることにより、生体細胞又は組織にかかる力の大きさと方向を制御しながら、生体細胞又は組織を培養する請求項１に記載の生体細胞又は組織の培養方法。
【請求項３】
生体細胞又は組織の培養に適した環境を提供する培養槽と、
前記培養槽内に設けられ生体細胞又は組織を培養する培養容器と、
前記培養容器を保持しながら回転する回転翼と、
前記回転翼の回転数を制御する回転数制御手段及び／又は回転半径を調整する手段とを備えたことを特徴とする生体細胞又は組織の培養装置。
【請求項４】
前記培養容器は、平板な底面を備え、前記回転翼は、該培養容器を水平面に対して任意の角度で保持する手段を更に備えたことを特徴とする請求項３に記載の生体細胞又は組織の培養装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する分野】
【０００１】
本発明は、生体内で細胞や組織に負荷されている圧力や応力を模倣した環境を生体外でつくり、生体細胞又は組織を培養する方法、及びその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の細胞や組織は、異常な圧力（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ）や壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　Ｓｔｒｅｓｓ）等の物理的な刺激を継続して受けると、機能が低下したり変質することが知られている。例えば、多くの緑内障患者には「眼圧の上昇」が認められる。「眼圧の上昇」は、視神経細胞や視神経膠細胞等に影響を与え、視力の低下や喪失、あるいは視野の障害を招いていると考えられている。しかし、眼圧の上昇という物理的な刺激が、どのようなメカニズムで視力や視野などの視機能に影響を与えるのかは明らかになっていない。
【０００３】
物理的な刺激により生体の細胞や組織が変質するメカニズムを解明するには、生体外で（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）細胞や組織に関するデータを収集する、即ち、生体を模倣した環境を生体外につくりだし、生体の細胞や組織をその環境下で培養しながら物理的刺激に対する感知機構を解明する必要がある。
【０００４】
図５は、物理的刺激の一つである圧力を動的に細胞や組織に加えて培養する従来技術における培養装置３０の構成を示したものである。培養槽３１内は、環境コントローラ（図外）により温度、湿度、酸素濃度、炭酸ガス濃度等が制御され、細胞や組織を培養していく上で良好な環境が保持されている。
【０００５】
培養槽３１には培養容器３３が設けられ、細胞や組織はこの中の培養液中で培養される。生体の細胞や組織には外部から空気（５％の二酸化炭素、酸素２０％、窒素７５％）が一定流量で供給される。
【０００６】
培養容器３３の圧力を一定に保つため、培養容器３３は圧力チャンバー３２と連結パイプに３６により接続している。圧力チャンバー３２の圧力は、培養容器３３の圧力と同じであるから、圧力チャンバー３２の圧力を制御することにより培養容器３３の圧力を一定に保持できる。
【０００７】
圧力制御部３４には外部から一定の圧力空気（５００Ｋｐａ）が送り込まれている。圧力仕切壁３８の位置は、連結バー３７を通じて受ける圧力と外部からの圧力空気による圧力とがバランスする位置である。このため、圧力チャンバー３２の圧力が低下するとその位置は左方向に動き、連結バー３７が圧力チャンバー３２を押す。これにより、圧力チャンバー３７の圧力が上昇する。逆に圧力チャンバー３２の圧力が上昇すると、連結バー３７が右方向に動き圧力チャンバー３２の圧力を降下させる。このようにして、培養容器３３内の圧力を一定に保持している。
【０００８】
図６は生体の細胞や組織に圧力をかけながら培養する他の従来技術における培養装置の構成を示したものである。この装置はハーバードメディカルスクールの水野秀一他の研究として報告されている（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｓｃｉｅｎｃｅａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃ６（１９９８）３０２−３０６）。また、特開２００１−２３８６６３において図６に示す装置構成で公開されている。
【０００９】
培養装置１００は、培養槽（図外）に収容されており、生体の細胞や組織が培養されていく上で最適な温度、湿度、酸素濃度、炭酸濃度、そして窒素濃度等が維持されている。
【００１０】
培養液槽１０８に貯蓄されている培養液１０９には、外部から酸素、炭酸ガスがフィルターと通気チューブを通して供給される。これにより、培養液１０９には酸素、炭酸ガスが溶け込み、適度な酸素濃度、炭酸ガス濃度が維持される。
【００１１】
ポンプ１０１が運転を開始すると培養液輸送管１０２により培養器１０３に培養液１０９が供給され培養器１０３の圧力が上昇する。設定圧力以上になるとバックプレッシャー・レギュレータ１０４が圧力弁１０５を開いて培養液を培養槽へと排出し、培養器１０３の圧力が低下する。
【００１２】
培養器１０３の圧力は圧力センサー１０７により検知され、圧力モニター１０６により圧力センサー１０７の検出圧力を表示する。ポンプ１０１は、この検出圧力によって制御され、その検出圧力が設定値以上になった場合、ポンプ１０１の運転を停止する。
【００１３】
培養液１０９は培養する生体の細胞又は組織に適した、例えばアミノ酸、糖類等からなる液体であり、生体の細胞又は組織はこの仕組みにより一定の圧力刺激を受けながら培養される。
【００１４】
以上説明したような培養装置により、圧力をかけながら生体外で生体の組織や細胞を培養している。しかし、これらの圧力を負荷しながら、生体の細胞や組織を培養する培養装置の問題点として、培養液に溶け込む酸素、炭酸ガス、および窒素の濃度と、生体の細胞や組織に加える物理的刺激である圧力とを無関係に制御することが難しいという問題がある。これは、液体中に溶け込むガスの量、例えば酸素の量は、酸素分圧に比例して増加してしまうためである。生体の細胞や組織を培養する際に、酸素濃度や炭酸ガス濃度を制御することは、より生体条件に近い環境をつくり、加圧やずれ応力の正確な影響を検討するために非常に重要である。もし、酸素濃度や炭酸ガス濃度などの制御が十分にできない場合、これらが研究結果に影響を及ぼし、正確な圧力増加やずれ応力の生体への影響を検討できないと考えられる。
【００１５】
また、このような培養装置では一定圧力を維持するのに、図５に示す培養装置においては、圧力チャンバー３２、圧力制御部３４等の機構が、また、図６に示す培養装置では、ポンプ１０１、バックプレッシャー・レギュレータ１０４、圧力弁１０５、圧力モニター１０６、圧力センサー１０７等、複雑な制御機構が必要である。
【００１６】
更に、このような装置では一定の圧力を維持できても、圧力の昇降を一定のサイクルで繰り返すことができないという問題がある。これは、▲１▼圧力上昇が、図５に示す培養装置では圧力制御部３４、図６に示す培養装置ではポンプ１０１の能力により決定されること。▲２▼圧力降下が、図５に示す培養装置では圧力制御部３４、図６に示す培養装置では、バックプレッシャー・レギュレータ１０４、圧力弁１０５に依存すること等により、圧力昇降が緩慢にならざるを得ないことがその理由である。
【００１７】
生体の細胞や組織に加わる物理的な刺激として、壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　Ｓｔｒｅｓｓ）がある。壁ずり応力が生体の細胞や組織に影響を与えることが、東京大学医学部安藤譲二氏の研究で報告されている（「動脈硬化はどうやって起こるのか」　ずり応力と内皮細胞の遺伝子発現調節　細胞工学（１９９９）１８巻第２号　Ｐａｇｅ１８２−１８７）。
【００１８】
この報告においては、血流の増えた血管は、急性的に拡張し慢性的には血管組織の構造が変化し血管経を大きくする。その原因は、血管の内面を覆う内皮細胞に血流に起因する壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）が、内皮細胞に物理的な刺激を与えているためであるとしている。
【００１９】
図４は血管内皮に壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）がかかったときの平滑筋細胞と内皮細胞状況イメージを示したものである。壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）は、内皮細胞を流れの方向に歪ませる機械的刺激として働く。このような物理的な刺激の一つである機械的刺激が血管経を拡張させる原因ではないかと推定している。しかし、壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）が内皮細胞に加わることにより、どのようなメカニズムにより血管が拡張されるかについては解明されていない。
【００２０】
このため、内皮細胞に壁ずり応力を負荷する装置として、図７に示すような培養装置２００が報告されている。この培養装置２００は、培養液槽２０１、培養液２０２、培養液を送り出すローラポンプ２０４、そして培養器２０３を含んで構成されている。
【００２１】
培養槽２０１に貯留されている培養液２０２は、ローラポンプ２０４により平行平板型チャンバー２０３に供給される。平行平板型チャンバー２０３には内皮細胞が培養されており、内皮細胞の下面を培養液２０２が流れる。培養液２０２が内皮細胞の表面を流れることにより壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）を加えている。
【００２２】
このように壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）を生体外で加えながら内皮細胞を培養するなかで、内皮細胞が放出する物質を特定したり、壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）で働く転写因子を特定する等して、血管拡張のメカニズムを解明しようとしている。
【００２３】
しかし、この培養装置２００は、培養液２０２をロータリーポンプ２０４により常時送り出し、これにより内皮細胞に壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）を生じさせる。このため、一定成分の培養液を安定・継続して培養液槽２０１に補給しなければならない。
【００２４】
また、この培養装置は平行平板型チャンバー２０３に設けた内皮細胞に壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）を発生させるためのローラポンプ２０４が必要であるが、ロータリーポンプ２０４はオイルフリー仕様であったり、滅菌、除菌フィルター等の付属設備を設けたり、あるいは培養液２０２に雑菌や不純物がが混入しないようにすること等が要求される。このため、培養装置２００が高価になったり、メンテナンスに労力や経費がかかるという問題がある。
【００２５】
また、図５、図６、及び図７に示す培養装置のいずれも、圧力と壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）とを同時に負荷しながら生体の細胞や組織を培養することはできないという問題がある。
【００２６】
更に、これらの装置では生体の細胞や組織に加わる圧力を例えば、１ｍｍＨｇ単位で変化させたり、壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）を１００ＰａＮ／ｍ２単位で変化せることは極めて難しいという問題がある。
【００２７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の課題は、生体の細胞や組織にかかる圧力と壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）とを単独、又は同時に負荷しながら生体の細胞や組織を培養する方法、及び装置を提供することにある。
【００２８】
また、本発明の他の課題は、複雑な機構を持たずに簡単に生体の細胞や組織に圧力や壁ずり応力を所望の単位でかけることができる培養装置を提供すること、及び培養槽内の酸素濃度や炭酸ガス濃度を独立して任意に制御する培養装置を提供することにある。
【００２９】
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、培養槽内に設けられた培養容器を回転し、前記培養容器内に培養されている生体細胞又は組織にかかる物理的刺激を回転数及び／又は回転半径で制御しながら、生体細胞又は組織を培養する。
【００３１】
本明細書において、物理的刺激とは、圧力や応力等の機械的な刺激をいい、物理的刺激は、力のおおきさと方向を持つ。
【００３２】
生体細胞又は組織が培養されている培養容器は、少なくとも底面が平板であり、この底面に生体細胞や組織が培養されている。この底面を水平面に対して傾けることにより、生体細胞又は組織にかかる力及び方向を制御することができる。培養容器の底面の角度を遠心力と重力との合成ベクトルの方向に対し直角になるようにすれば、生体細胞や組織には垂直方向の力のみを加えることができる。また、培養容器の底面を合成ベクトルの方向に対し、適当な角度をつけることにより、垂直方向と水平方向の両成分方向の力を加えることができる。
【００３３】
本発明は、生体細胞又は組織の培養に適した環境を提供する培養槽と、この培養槽内に設けられ生体細胞又は組織を培養する培養容器と、この培養容器を保持しながら回転する回転翼と、この回転翼の回転数を制御する回転数制御手段及び／又は回転半径を調整する手段とを備える。培養容器内の生体細胞又は組織にかかる力を、回転翼の回転スピードと培養器の回転半径で調整する。
【００３４】
前記培養容器は平板な底面を備え、前記回転翼は該培養容器を水平面に対して任意の角度で保持する手段を更に備える。培養器の底面を水平面に対して角度をつけることにより、生体細胞や組織に垂直方向の成分のみを負荷したり、壁ずり応力を含めて負荷させることができる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態について、図１〜図３により説明する。図１は本発明の培養装置１の全体構成図を示したものである。培養装置１は、培養槽１３、加重装置２０、回転コントローラ１１、環境コントローラ１２、空気供給パイプを含んで構成されている。
【００３６】
培養槽１３は、生体の細胞や組織が培養されていく上で最適な温度、湿度、酸素濃度、炭酸濃度、そして窒素濃度等の環境を提供するインキュベータである。培養槽１３には、環境発生装置（図外）により生成された空気が、空気供給パイプ１４により供給される。環境コントローラ１２は、培養槽内の環境（温度、湿度、酸素濃度等）をセンサーにより検出し、環境発生装置（図外）を制御し、培養槽１３の環境が一定になるように制御している。
【００３７】
この培養装置は、生体の細胞又は組織にかかる力の制御を、加重器２０の回転翼２１の回転数と回転半径の調節とで行う。加重器２０の回転数は、回転コントローラ１１により制御される。回転コントローラ１１と加重器２０とは、制御ケーブル１５により接続している。
【００３８】
図２は、加重装置２０の構造を示したものである。加重装置２０は、回転翼２１、培養容器２２、筐体２４、そして回転モータ２３を含んで構成されている。回転翼２１はシャフトを通して回転モータ２３と連結してる。
【００３９】
培養容器２２は、回転翼２１の保持手段により、回転中においても振動等が生じないように固定される。この培養装置は、培養容器２２を水平面に対して傾けて回転翼２１に設置できる構造となっている。
【００４０】
図２に生体の細胞又は組織にかかる重力と細胞又は組織が回転することにより発生する遠心力との合成ベクトルを示す。例えば、この合成ベクトルに対して培養容器２２の底面を直角に設置すれば、培養容器２２内の生体細胞又は組織には垂直方向の力のみが加わる。
【００４１】
この培養装置を用いて、例えば、視神経細胞、視神経膠細胞の培養をする場合について説明する。健常者の眼圧（正常眼圧）は大気圧より１０ｍｍＨｇから２０ｍｍＨｇ高い範囲にある。しかし、緑内障患者の眼圧は、２０ｍｍＨｇから６０ｍｍＨｇ程度の範囲にある。また、眼球内においては視神経細胞や視神経膠細胞には垂直方向の力のみが加わっている。
【００４２】
この培養装置で視神経細胞に２０ｍｍＨｇから６０ｍｍＨｇの力を加えるには、培養器２２の回転半径を１１０ｍｍ、培養容器の重量を１０ｇ、回転数１５ｒｐｍとした場合、次のようになる。なお、培養容器の重量とは、培養容器自体の重さと培養液の重さ、そして培養する生体細胞又は組織の重さとを加算したものである。向心力（遠心力）Ｆは、Ｆ＝Ｆ’＝（Ｗ／Ｇ）＊Ａ＝（Ｗ／Ｇ）＊Ｒ＊ｗ＾２＝（Ｗ／Ｇ）＊（Ｖ＾２／Ｒ）、ここで、Ｆ：向心力〔ｋｇｆ〕、Ｆ’：遠心力〔ｋｇｆ〕、Ａ：向心力加速度〔ｍ／ｓ２〕、Ｒ：回転半径〔ｍ〕、Ｗ：物体の重さ〔ｋｇｆ〕、ｗ：角速度〔ｒａｄ／ｓｅｃ〕、Ｇ：重力の加速度〔ｍ／ｓｅｃ２〕、Ｖ：スピード〔ｍ／ｓｅｃ〕であるから、Ｆ＝（０．０１／９．８）×（（（２π×０．１１×１５／６０）＾２）／０．１１）＝０．０００２８ｋｇｆ
【００４３】
重力が１０ｇｆ、遠心力が０．２８ｇｆであるから、培養器を鉛直方向に対してθ＝Ｔａｎ−１（０．２８／１０）傾けて設置すればよい。
【００４４】
合成ベクトルに対して培養容器の底面を直角より大きく傾けることにより、培養容器２２の生体細胞又は組織には、その角度に応じた垂直力と水平力とがかかる。例えば、壁ずり応力が血管の内皮細胞に与える影響を観察したい場合には、培養容器２２の底面を水平に設置し回転させれば良い。
【００４５】
このように生体の細胞や組織に加わる力のコントロールは、培養容器２２の回転数又は回転半径と、培養容器２２を水平面に対して傾けることによりできる。
【００４６】
図３は、加重器２０を上から見た場合の平面図である。回転翼２１は、左右に培養器２２を保持するためのコの字型の切り欠き部を備える。この切り欠き部に培養容器２２を設置する。培養容器２２と回転翼２１とは、切り欠き部の端部において縦方向に調節可能なボルトにより固着されている。例えば、回転中心から近い側のボルトを長くし、遠い側のボルトを短くして培養容器２２を回転翼２１に設置することで、培養容器２２を水平面に対して傾けて設置することができる。
【００４７】
【発明の効果】
以上説明したとおり、本発明によれば、生体の細胞や組織にかかる圧力と壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）とを単一の装置により単独、又は同時に負荷しながら細胞等を培養することができる。また、本発明によれば、複雑な機構を持たずに簡単に細胞等に圧力や壁ずり応力をかける培養装置をつくることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】加重培養装置の構成を示した図。
【図２】加重器の構成を示した図。
【図３】加重器を上から見た場合の平面図。
【図４】細胞に壁ずり応力がかかった場合のイメージ図。
【図５】従来の圧力をかけながら細胞を培養する培養装置の構成を示した図。
【図６】従来の圧力をかけながら細胞を培養する他の培養装置の構成を示した図。
【図７】従来の壁ずり応力（Ｓｈｅａｒ　ｓｔｒｅｓｓ）をかけながら細胞を培養する培養装置の構成を示した図。
【符号の説明】
１　加重培養装置
１１　回転コントローラ
１２　環境コントローラ
１３　培養槽
１４　空調用パイプ
１５　制御ケーブル
２０　加重装置
２１　回転翼
２２　培養容器
２３　回転モータ
【図１】
2004113222.tif 000002
【図２】
2004113222.tif 000003
【図３】
2004113222.tif 000004
【図４】
2004113222.tif 000005
【図５】
2004113222.tif 000006
【図６】
2004113222.tif 000007
【図７】
2004113222.tif 000008