(57)【要約】      （修正有）【課題】試験化学物質のコイエストロジェンレセプターに対する結合強度及び活性化能の評価方法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列を有する遺伝子を導入して取得した形質転換体に産生させた遺伝子発現タンパク質と、リガンドと、試験化学物質とを溶液中で共存させ、前記タンパク質に結合したリガンド量を測定することにより化学物質のエストロジェンレセプターα又はβへの結合強度を評価する方法、及びエストロジェンレセプター結合応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子と、特定の塩基配列からなるエストロジェンレセプター遺伝子とを、エストロジェンレセプター非内在性宿主細胞に導入して取得した形質転換体に試験化学物質を作用させ、宿主細胞が産生したレポータータンパク質量を測定することにより化学物質のエストロジェンレセプターα又はβに対する活性化能を評価する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、３又は５で示される塩基配列を有する遺伝子。
【請求項２】
配列番号５で示される塩基配列からなるエストロジェンレセプターα遺伝子。
【請求項３】
配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
配列番号７又は９で示される塩基配列を有する遺伝子。
【請求項５】
配列番号９で示される塩基配列からなるエストロジェンレセプターβ遺伝子。
【請求項６】
配列番号８又は１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子を含有するベクター。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子の上流に前記遺伝子発現のためのプロモーターを接続したベクター。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項１０】
配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるエストロジェンレセプターα。
【請求項１１】
配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるエストロジェンレセプターβ。
【請求項１２】
配列番号２、４、６、８又は１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１３】
配列番号１、３又は５で示される塩基配列を有する遺伝子を導入して取得した形質転換体に産生させた遺伝子発現タンパク質と、リガンドと、試験化学物質とを溶液中で共存させ、前記タンパク質に結合したリガンド量を測定することにより化学物質のエストロジェンレセプターαへの結合強度を評価する方法。
【請求項１４】
配列番号７又は９で示される塩基配列を有する遺伝子を導入して取得した形質転換体に産生させた遺伝子発現タンパク質と、リガンドと、試験化学物質とを溶液中で共存させ、前記タンパク質に結合したリガンド量を測定することにより化学物質のエストロジェンレセプターβへの結合強度を評価する方法。
【請求項１５】
エストロジェンレセプターα結合応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子と、配列番号５で示される塩基配列からなるエストロジェンレセプターα遺伝子とを、エストロジェンレセプター非内在性宿主細胞に導入して取得した形質転換体に試験化学物質を作用させ、宿主細胞が産生したレポータータンパク質量を測定することにより化学物質のエストロジェンレセプターαに対する活性化能を評価する方法。
【請求項１６】
エストロジェンレセプターβ結合応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子と、配列番号９で示される塩基配列からなるエストロジェンレセプターβ遺伝子とを、エストロジェンレセプター非内在性宿主細胞に導入して取得した形質転換体に試験化学物質を作用させ、宿主細胞が産生したレポータータンパク質量を測定することにより化学物質のエストロジェンレセプターβに対する活性化能を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コイエストロジェンレセプター遺伝子、前記遺伝子を組み込んだベクター、及び前記遺伝子を導入した形質転換体に関する。また、本発明は、前記形質転換体が産生した遺伝子発現タンパク質を用いた化学物質のコイエストロジェンレセプターに対する結合強度及び活性化能を評価する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
環境中に存在する化学物質あるいは化学製品から漏出する化学物質で、生体内においてホルモンに類似した作用を示すものは、いわゆる「環境ホルモン」と呼ばれる。環境ホルモンはヒトや生物の内分泌系に影響を及ぼし、生殖障害等を引き起こすことが明らかになっている。
【０００３】
環境ホルモンは、ホルモンレセプター（エストロジェンレセプター、アンドロジェンレセプター、甲状腺ホルモンレセプター等）に結合してそれらのホルモンの支配下に置かれている遺伝子を転写活性化するホルモン様作用を有している。このホルモン様作用は、環境ホルモンが環境生物の内分泌攪乱を引き起こす主要な作用メカニズムであると考えられている。
【０００４】
環境ホルモンが引き起こす内分泌攪乱作用は、女性ホルモン系、男性ホルモン系等への作用がある。特に、近年、河川中のコイの精巣中に卵巣が出現するという現象も起きており、女性ホルモン系への影響を評価する方法の開発は重要な課題となっている。女性ホルモン系への影響を評価する手法としては、化学物質のヒトエストロジェンレセプターに対する結合性を測定する方法、ヒトエストロジェンレセプターを介した遺伝子転写活性化能を測定する方法等のヒト内分泌系への影響を評価する方法が構築されている（例えば、非特許文献１〜３）。化学物質が環境生物あるいは生態系へ与える影響を評価するためには、環境生物由来のエストロジェンレセプターに対する作用を解明する必要がある。
【０００５】
特開２０００−２０１６８８号公報には、環境生物由来のエストロジェンレセプターとしてメダカのエストロジェンレセプターに対する活性化能を評価する方法が記載されている（特許文献１）。
【０００６】
【特許文献１】
特開２０００−２０１６８８号公報（請求項１２）
【非特許文献１】
ナカイ，  エム．  エト  アル．  （１９９９）  バインディング  キャラクタリゼーション  オブ  ジアルキル  フタレート  フォー  ジ  エストロゲン  レセプター，  バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ，  ２５４，  ３１１−３１４．（Ｎａｋａｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｌｋｙｌ  Ｐｈｔｈａｌａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２５４，  ３１１−３１４．）
【非特許文献２】
タビラ，  ワイ．，  エト  アル．  （１９９９）  ストラクチュラル  リクワイアメンツ  オブ  パラ−アルキルフェノールズ  トゥ  バインド  トゥ  エストロゲン  レセプター，  ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー，  ２６２，  ２４０−２４５．（Ｔａｂｉｒａ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐａｒａ−Ａｌｋｙｌｐｈｅｎｏｌｓ  ｔｏ  Ｂｉｎｄ  ｔｏ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２６２，  ２４０−２４５．）
【非特許文献３】
クイパー，  ジー．ジー．ジェイ．エム．，  エト  アル．  （１９９８）  インタラクション  オブ  エストロジェニック  ケミカルス  アンド  ファイトエストロゲンズ  ウィズ  エストロゲン  レセプター  ベータ，  エンドクライノロジー，  １３９，  ４２５２−４２６３．（Ｋｕｉｐｅｒ，  Ｇ．Ｇ．Ｊ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １３９，  ４２５２−４２６３．）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、化学物質が生態系へ与える影響を評価するためにはより多くの環境生物について検討を行う必要があり、特開２０００−２０１６８８号公報記載の方法のみでは未だ不十分である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、環境生物の中でも環境中に広く分布し、既に化学物質の影響が見られるコイに着目し、化学物質が内分泌系へ与える影響を評価する方法について鋭意検討した結果、コイのエストロジェンレセプター遺伝子を取得し、更にこの遺伝子を導入した形質転換体に産生させた遺伝子発現タンパク質を利用することにより化学物質のコイエストロジェンレセプターに対する結合強度及び活性化能を評価できることを見出し本発明を完成するに到った。
【０００９】
即ち、上記課題を解決する本発明は以下に記載するものである。
【００１０】
〔１〕  配列番号１、３又は５で示される塩基配列を有する遺伝子。
【００１１】
〔２〕  配列番号５で示される塩基配列からなるエストロジェンレセプターα遺伝子。
【００１２】
〔３〕  配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１３】
〔４〕  配列番号７又は９で示される塩基配列を有する遺伝子。
【００１４】
〔５〕  配列番号９で示される塩基配列からなるエストロジェンレセプターβ遺伝子。
【００１５】
〔６〕  配列番号８又は１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１６】
〔７〕  〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の遺伝子を含有するベクター。
【００１７】
〔８〕  〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の遺伝子の上流に前記遺伝子発現のためのプロモーターを接続したベクター。
【００１８】
〔９〕  〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【００１９】
〔１０〕  配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるエストロジェンレセプターα。
【００２０】
〔１１〕  配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるエストロジェンレセプターβ。
【００２１】
〔１２〕  配列番号２、４、６、８又は１０で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【００２２】
〔１３〕  配列番号１、３又は５で示される塩基配列を有する遺伝子を導入して取得した形質転換体に産生させた遺伝子発現タンパク質と、リガンドと、試験化学物質とを溶液中で共存させ、前記タンパク質に結合したリガンド量を測定することにより化学物質のエストロジェンレセプターαへの結合強度を評価する方法。
【００２３】
〔１４〕  配列番号７又は９で示される塩基配列を有する遺伝子を導入して取得した形質転換体に産生させた遺伝子発現タンパク質と、リガンドと、試験化学物質とを溶液中で共存させ、前記タンパク質に結合したリガンド量を測定することにより化学物質のエストロジェンレセプターβへの結合強度を評価する方法。
【００２４】
〔１５〕  エストロジェンレセプターα結合応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子と、配列番号５で示される塩基配列からなるエストロジェンレセプターα遺伝子とを、エストロジェンレセプター非内在性宿主細胞に導入して取得した形質転換体に試験化学物質を作用させ、宿主細胞が産生したレポータータンパク質量を測定することにより化学物質のエストロジェンレセプターαに対する活性化能を評価する方法。
【００２５】
〔１６〕  エストロジェンレセプターβ結合応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子と、配列番号９で示される塩基配列からなるエストロジェンレセプターβ遺伝子とを、エストロジェンレセプター非内在性宿主細胞に導入して取得した形質転換体に試験化学物質を作用させ、宿主細胞が産生したレポータータンパク質量を測定することにより化学物質のエストロジェンレセプターβに対する活性化能を評価する方法。
【００２６】
【発明の実施の形態】
エストロジェンレセプターにはα体とβ体の異種形態（ｉｓｏｆｏｒｍ）が存在することが知られている。α体とβ体はアミノ酸の配列が異なっており、後述する実施例において取得した配列番号５で表される塩基配列はエストロジェンレセプターα遺伝子の全長を表し、配列番号９で表される塩基配列はエストロジェンレセプターβ遺伝子の全長を表す。配列番号１及び３で表される塩基配列はエストロジェンレセプターα遺伝子の部分配列で、配列番号７で表される塩基配列はエストロジェンレセプターβ遺伝子の部分配列である。配列番号１、３、５、７、９の塩基配列に対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０に示す。
【００２７】
エストロジェンレセプターやアンドロジェンレセプター等のホルモンレセプターは、Ａ〜Ｆドメインで構成されることが知られている。これらのドメインのうち、例えばＥドメインはリガンド結合ドメインである。またＣドメインは、リガンドが結合したエストロジェンレセプターが染色体上の特異的な塩基配列に結合するためのＤＮＡ結合ドメインである。
【００２８】
配列番号２で表されるアミノ酸配列はエストロジェンレセプターαのＥドメインに、配列番号８で表されるアミノ酸配列はエストロジェンレセプターβのＥドメインに相当する。また、配列番号４で表されるアミノ酸配列は、エストロジェンレセプターαのＥドメインとＦドメインとを併せた配列である。
【００２９】
配列番号１、３、５、７又は９で表される塩基配列を有する遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法を用いてプラスミド、ウイルス、ファージベクター等のベクターに挿入することができる。ベクターには必要により導入される宿主細胞において上記遺伝子が発現するためのプロモーターやプロモーターの制御因子を遺伝子の上流に接続する。ベクターは１以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子等を含んでいてもよい。
【００３０】
構築したベクターは常法により宿主細胞に導入して形質転換体を取得することができる。取得した形質転換体の培養を行うことにより、導入した遺伝子が発現したタンパク質を産生させる。
【００３１】
例えば宿主細胞として大腸菌を用いる場合には、遺伝子を適当なプロモーターの下流に接続し、大腸菌内で機能するベクターに挿入して発現ベクターを作製する。プロモーターとしては、ｔａｃプロモーター（アマシャムバイオサイエンス社製）、Ｔ７プロモーター（ノバゲン社製）等を、ベクターとしてはｐＧＥＸ−４Ｔ−１（アマシャムバイオサイエンス社製）、ｐＭＡＬ（ニューイングランドバイオラブズ社製）、ｐＥＴ（ノバゲン社製）等を挙げることができる。また、大腸菌としては例えばＤＨ５α（タカラバイオ社製）、ＨＢ１０１（タカラバイオ社製）などが適用できる。
【００３２】
得られた遺伝子発現タンパク質を用いて競争結合試験を行うことにより化学物質のエストロジェンレセプターに対する結合強度を評価することができる。以下、化学物質のエストロジェンレセプターαへの結合強度を評価する方法につき説明する。
【００３３】
まず、配列番号１で示される塩基配列を有する遺伝子を組み込んだベクターを導入した形質転換体に遺伝子発現タンパク質を産生させる。得られた遺伝子発現タンパク質（エストロジェンレセプターα）と、リガンド（エストロジェン等）と、試験化学物質とを溶液に添加し共存させる。リガンドと化学物質の遺伝子発現タンパク質への競争結合が平衡に達した後、遊離のリガンドを溶液中から取り除き、溶液のリガンド濃度を測定する。試験化学物質の遺伝子発現タンパク質への結合強度が強いほど遊離のリガンド量が多く、測定される溶液中のリガンド濃度は低いものとなる。
【００３４】
形質転換体に導入した遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列を有しているので、形質転換体が産生した遺伝子発現タンパク質は、リガンド結合ドメインであるＥドメインを有している。このため、このタンパク質のアミノ酸配列はコイの組織から採取した天然由来のエストロジェンレセプターαとは一部異なるが、エストロジェンが特異的に結合する。試験化学物質の女性ホルモン様作用が強いほど遺伝子発現タンパク質への結合強度が強くなり、従ってエストロジェンレセプターαへの結合強度も強くなると類推できる。
【００３５】
このように、宿主細胞に導入するベクターは、少なくともその一部に配列番号１の塩基配列を有する遺伝子を組み込んで配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現させればよいが、配列番号５で示される塩基配列を組み込んでコイの組織から採取したものと同等のエストロジェンレセプターαを産生させてもよい。
【００３６】
リガンドとしては、エストロジェンレセプターαの結合部位（Ｅドメイン）に特異的に結合する化合物であって、溶液中での濃度を高い精度で測定することが可能な化合物であれば制限なく用いることができる。本発明において好ましいリガンドとしては、１７β−エストラジオール等のエストロジェンの水素原子をトリチウムで置換した放射リガンドを挙げることができる。
【００３７】
溶液中に存在する遊離のリガンドを溶液から取り除く方法としては、例えばデキストラン被覆活性炭（ＤＣＣ）を用いる方法を挙げることができる。エストロジェンレセプターに結合したリガンドは、デキストラン被覆活性炭表面のデキストランが障害となって、活性炭に吸着しない。一方、遊離のリガンドはデキストランを通過して活性炭表面に吸着する。このため、遊離のリガンドを溶液から除去するには、溶液にデキストラン被覆活性炭を添加して遊離のリガンドを吸着させた後、濾過、遠心分離等公知の方法を用いてデキストラン被覆活性炭を分離すればよい。
【００３８】
溶液中に添加するリガンド濃度は０．１〜５ｎＭが好ましく、０．２〜２ｎＭがより好ましい。また、溶液中のエストロジェンレセプター濃度は２〜５０ｎＭとすることが好ましい。
【００３９】
試験化学物質のエストロジェンレセプターαに対する結合強度を具体的に評価する方法としては、例えば試験化学物質の濃度を種々変化させた多数の溶液のリガンド濃度を測定し、化学物質が無添加のときにエストロジェンレセプターαに結合するリガンド量の５０％が化学物質に置き換わる化学物質濃度（５０％阻害濃度、又はＩＣ５０）を求める方法がある。ＩＣ５０値は、リガンドの種類や濃度等の試験条件に依存するが、同一条件下においては試験化学物質とエストロジェンレセプターαとの結合の強さに比例する。従って、ＩＣ５０値から試験化学物質のエストロジェンレセプターへの結合強度の相対的な関係を評価できる。
【００４０】
更に、エストロジェンレセプターに対する化学物質の作用を評価する他の方法としてはエストロジェンレセプター発現プラスミドを用いたレポーター遺伝子アッセイにより化学物質の活性化能を評価する方法がある。以下、この方法による化学物質の活性化能を評価する方法につき説明する。
【００４１】
まず、配列番号５で示される塩基配列を組み込んだエストロジェンレセプターα発現プラスミドと、前記プラスミドから発現したエストロジェンレセプターαが結合する結合応答配列を含む転写制御領域の下流にレポーター遺伝子を組み込んだレポータープラスミドの２種のベクターを調整する。
【００４２】
次いで、上記２種のベクターを常法により非内在性エストロジェンレセプター宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。この形質転換体においては、細胞内に導入した受容体発現プラスミドからエストロジェンレセプターαが発現する。この形質転換体に試験化学物質を作用させると、化学物質が細胞中で発現しているエストロジェンレセプターαに特異的な結合性を有しているものであれば、エストロジェンレセプターαのリガンド結合ドメインに結合し、エストロジェンレセプターαの構造変化を惹起する。化学物質が結合して構造変化したエストロジェンレセプターαは、レポータープラスミドの結合応答配列（ホルモン応答エレメント）に結合し、結合応答配列の下流にある遺伝子の転写を促進する。結合応答配列の下流にはレポーター遺伝子が導入されているので、構造変化したエストロジェンレセプターαが結合したレポータープラスミドからはレポーター遺伝子に基づいたレポータータンパク質が発現する。従って、発現したレポータータンパク質の生成量の測定を行えば試験化学物質のエストロジェンレセプターαに対する活性化能を評価することができる。
【００４３】
レポーター遺伝子としては、高感度で検出することができるタンパク質を発現するものであれば制限されないが、例えばルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子等を例示できる。
【００４４】
レポーター遺伝子を組み込んだレポータープラスミドとしては、例えば特開２００３−７９３６８号公報記載のプラスミドを挙げることができる。
【００４５】
以上、エストロジェンレセプターαに対する化学物質の結合強度及び活性化能を評価する方法につき説明したが、同様の操作を行うことによりエストロジェンレセプターβに対する結合強度及び活性化能を評価することが可能である。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００４７】
実施例１（エストロジェンレセプターα遺伝子の取得）
コイ（メス）の肝膵臓を摘出し、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、ｍＲＮＡを抽出・精製した。得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマーを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（登録商標、インビトロゲン社製）による逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらに、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成した二本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、以下のプライマー対（Ｓ２とＡＳ２、Ｓ２とＡＳ６、Ｓ６とＡＳ６）を用いたＰＣＲ（３０サイクル、９６℃−３０秒、５８℃−３０秒、７５℃−２分）によりＤＮＡフラグメントの増幅を行った。プライマー対の組み合わせは、それぞれ配列番号１、３、５に示す塩基配列からなる遺伝子を得るために用いた。プライマーの塩基配列は、Ｓ２：５’−ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＴＴＧ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＧＣＡ−３’（配列番号１１）、ＡＳ２：５’−ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＡＡＧ−３’（配列番号１２）、ＡＳ６：５’−ＴＣＡ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＧＴＴ  Ｇ−３’（配列番号１３）、Ｓ６：５’−ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＡＣ−３’（配列番号１４）である。
【００４８】
増幅されたＤＮＡフラグメントをｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標、インビトロゲン社製）を用いてサブクローニングし、プラスミドを調製した。ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ（登録商標、インビトロゲン社製）に基づいたプライマーを用い、ダイターミネーター法により塩基配列を決定した。さらに、本遺伝子の内部配列に基づいたプライマーにより塩基配列を決定した。ＤＮＡシーケンサーはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（登録商標、パーキンエルマー社製）を用いた。
【００４９】
実施例２（遺伝子発現用ベクターの構築）
実施例１で得られたコイエストロジェンレセプターα遺伝子のうち、配列番号３で示されるホルモン結合に重要な領域を以下のプライマー対（Ｓ４／ＢとＡＳ６／Ｎ）を用いたＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで消化し、同制限酵素で消化した大腸菌用発現プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−１（アマシャムバイオサイエンス社製）に導入した。Ｓ２／Ｂ：５’−ＡＡＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＴＴＧ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＧＣＡ−３’（配列番号１５）、ＡＳ６／Ｎ：５’−ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＧＧＧ  ＴＧＡ  ＧＡＧ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＴＴＧ−３’（配列番号１６）
実施例３（遺伝子発現タンパク質の調製）
以下の方法を用いて配列番号１で示される遺伝子からのタンパク質発現を行った。実施例２で構築した発現ベクターを大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ社製）に導入し、アンピシリン含有Ｌ−Ｂｒｏｔｈ（２５  ｍＬ）に植菌し、３７℃で終夜培養した。２５０  ｍＬのＬ−Ｂｒｏｔｈに植え換え、３〜８時間培養を行った後に、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドを添加し、目的タンパク質の発現誘導を開始し、２５℃で終夜培養した。遠心分離により大腸菌を集菌し、超音波による破砕を行った。遠心分離による可溶性画分の抽出を行い、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＴ）で平衡化したグルタチオン固定化樹脂を添加し、４℃で３０分ゆるやかに撹拌した。４℃で３，０００回転、１０分間遠心し、上清を除いた。ＰＢＳＴで再懸濁による洗浄を行い、４℃で５，０００回転、１０秒間遠心し、上清を除いた。本洗浄操作を３回繰り返した。１６  ｍＭの還元型グルタチオンを含むトリスバッファー（ｐＨ８．０）を加え、４℃で１０分間撹拌し、発現タンパク質を樹脂から溶出、精製した。
【００５０】
実施例４（遺伝子発現タンパク質のリガンド結合性の測定）
実施例３で調製した遺伝子発現タンパク質（エストロジェンレセプターα）に対してホルモンが特異的に結合できることを確認するために、ホルモン濃度依存的な飽和結合試験を行った。非特異的な結合度は大過剰の１７β−エストラジオール（１  μＭ）を添加して測定した。使用した試薬、機器は以下の通りである。
・エストロジェンレセプター：グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合コイエストロジェンレセプターαリガンド結合ドメイン（ＧＳＴ−ｃＥＲ  α−ＬＢＤ）
・標準リガンド：［２，４，６，７，１６，１７−３Ｈ］１７β−エストラジオール（１５５  Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシャムバイオサイエンス社製）０，  １，  ５，  １０，  ５０，  １００  ｎＭ
・非特異的結合測定用リガンド：１７β−エストラジオール（１０  μＭ）（和光純薬工業社製）
・バインディングバッファー（ｐＨ  ７．４）：
１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（シグマ社製）
１  ｍＭ  ＥＤＴＡ（和光純薬工業社製）
１  ｍＭ  ＥＧＴＡ（和光純薬工業社製）
１  ｍＭ  ＮａＶＯ３（和光純薬工業社製）
１０％  グリセロール（和光純薬工業社製）
１０  ｍｇ／ｍＬ  牛血清アルブミン（和光純薬工業社製）
０．５  ｍＭ  ＰＭＳＦ（和光純薬工業社製）
０．２  ｍＭ  ロイペプチン（和光純薬工業社製）
・デキストラン被覆活性炭（ＤＣＣ）懸濁液：０．０４％デキストラン（シグマ社製）、０．４％活性炭（和光純薬工業社製）のバインディングバッファー懸濁液
・液体シンチレーションカウンター：トライカーブＴＲ−３１００（パーキンエルマー社製）
以下の組成で反応溶液を調製した。
2004357558.tif 000002
上記の組成の反応混合液を１時間放置した。１００  μＬのＤＣＣ懸濁液を添加して氷上で１０分間放置した。溶液を濾過してＤＣＣを除去した後、溶液の放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００５１】
実施例５（遺伝子発現タンパク質を用いた競争結合試験）
以下の方法を用いて、実施例３で調製した遺伝子発現タンパク質（エストロジェンレセプターα）に対する試験物質の結合強度を測定した。使用した試薬、機器は以下の通りである。
・エストロジェンレセプター：グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合コイエストロジェンレセプターαリガンド結合ドメイン（ＧＳＴ−ｃＥＲ  α−ＬＢＤ）
・標準リガンド：［２，４，６，７，１６，１７−３Ｈ］１７β−エストラジオール（１５５  Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシャムバイオサイエンス社製）５．０  ｎＭ
・試験物質
エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、１７α−エチニルエストラジオール（ＥＥ２）、フタル酸ジエチルヘキシル（ＤＥＨＰ）、フタル酸ベンジルブチル（ＢＢＰ）、ビスフェノールＡ（ＢＰＡ）、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、ゲニスタイン（ＧＥＮ：以上、和光純薬工業社製）
・バインディングバッファー：１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ７．４（１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、１  ｍＭ  ＥＧＴＡ、  １  ｍＭ  ＮａＶＯ３、１０％  グリセロール、１０  ｍｇ／Ｌ  牛血清アルブミン、０．５  ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．２  ｍＭ  ロイペプチン）
・デキストラン被覆活性炭（ＤＣＣ）懸濁液：０．０４％デキストラン（シグマ社製）、０．４％活性炭（和光純薬工業社製）のバインディングバッファー懸濁液
・試験物質溶液（１  ｘ  １０−４〜１  ｘ  １０−１１  Ｍ、公比１０）
・液体シンチレーションカウンター：トライカーブＴＲ−３１００（パーキンエルマー社製）
以下の組成で反応溶液を調製した。
エストロジェンレセプター                １０  μＬ
標準リガンド（５  ｎＭ）                                      １０  μＬ
試験物質（１０  ｍＭ）                                            １０  μＬ
バインディングバッファー                              ７０  μＬ
計                                                                        １００  μＬ
上記の組成の反応混合溶液を１時間放置した。１００  μＬのＤＣＣ懸濁液を添加して氷上で１０分間放置した。溶液を濾過してＤＣＣを除去した後、溶液の放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００５２】
標準リガンドの受容体結合率Ｂ／Ｂ０（％）は以下の式で表される。
【００５３】
【数１】
2004357558.tif 000003
【００５４】
各化学物質の受容体結合率Ｂ／Ｂ０（％）を化学物質濃度に対してプロットしたグラフを図１に示す。このグラフにおいて受容体結合率Ｂ／Ｂ０（％）は下記式で近似できる。
【００５５】
【数２】
2004357558.tif 000004
【００５６】
ここで、Ｘは溶液中の化学物質濃度（Ｍ）、Ｙは受容体結合率Ｂ／Ｂ０（％）、Ｔｏｐは受容体結合率Ｂ／Ｂ０（％）の頭打ちの数値、Ｂｏｔｔｏｍは受容体結合率Ｂ／Ｂ０（％）の底打ちの数値、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅは化学物質により異なる定数を示す。
【００５７】
得られたデータからＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒ．  ３（登録商標、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した。結果を表１に示す。
【００５８】
実施例６（遺伝子発現タンパク質を用いたレポーター遺伝子アッセイ）
（１）受容体発現プラスミドの構築
実施例１で取得した遺伝子を鋳型として、以下のプライマー（Ｓ６／Ｅ−ＩとＡＳ６／Ｎ（配列番号１６））を用いて、配列番号５で示されるコイエストロジェンレセプターα全長ｃＤＮＡを単離した後、ＥｃｏＲ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉで消化し、同制限酵素で消化した培養細胞用発現プラスミドｐＳＩ（プロメガ社製）に導入し、発現プラスミドを構築した。Ｓ６／Ｅ−Ｉ：５’−ＡＣＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＡＣ−３’（配列番号１７）
（２）レポータープラスミドの構築
まず、エストロジェン応答配列（ＥＲＥ、配列番号１８）を合成した。市販レポータープラスミド（商品名  ｐＧＬ３−ベーシックベクター、プロメガ社）１μｇを制限酵素Ｋｐｎ  ＩとＳａｃ  Ｉとを用いて切断した後、上記のＥＲＥを組込みＥＲＥ／ｐＧＬ３−ベーシックベクターを作製した。
【００５９】
さらに、プラスミド（ＥＲＥ／ｐＧＬ３−ベーシックベクター）を制限酵素Ｎｃｏ  Ｉと  Ｘｈｏ  Ｉで切断し、ＥＲＥとルシフェラーゼの開始コドンの間にプロモーター（ラットα２ｕ−グロブリンプロモーター領域）ＡＵＧ１００（配列番号１９）を組み込んだ。
【００６０】
上記ＡＵＧ１００を組み込んだＥＲＥ／ｐＧＬ３−ベーシックベクター用いて大腸菌を形質転換した後、コロニーを培地で培養した。プラスミドの精製（ＧＦＸＴＭ  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ、アマシャムバイオサイエンス社製又はプラスミド精製キット、キアゲン社製）を行って、ＥＲＥ−ＡＵＧ１００−Ｌｕｃ＋レポータープラスミドを得た。
【００６１】
得られたＥＲＥ−ＡＵＧ１００−Ｌｕｃ＋レポータープラスミドの女性ホルモン活性を確認するため以下の操作を行った。
【００６２】
（女性ホルモン受容体発現遺伝子及びレポータープラスミドを含む培養細胞の調製）
６０％−８０％  コンフルエントの細胞培養シャーレを準備した［遺伝子導入直前に５ｍＬ  イーグル基礎培地（ＥＭＥＭ）で２回洗浄後、培地を除去しておく］。
【００６３】
女性ホルモン発現プラスミド（ｈＥＲ／ｐＣＩ）２  μｇとＥＲＥ−ＡＵＧ１００−Ｌｕｃ＋レポータープラスミド  ４μｇをＥＭＥＭ  ３００  μＬに加えた後、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ  試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）、６０  μＬを添加し混和後、１５分間放置（Ａ液）した。同時に別の容器にてＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  （ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）  １２  μＬとＥＭＥＭ  ３００  μＬを混和後１５分間放置（Ｂ液）した。
【００６４】
（Ａ液）及び（Ｂ液）を混合後、ＥＭＥＭ  ２．４  ｍＬを加え、約３  ｍＬのＤＮＡ調製液を調製した後、前述の細胞培養シャーレに加え３０分間放置した。次いで２０％牛胎児血清を含むＥＭＥＭ  ３  ｍＬを添加後、一晩培養した。
【００６５】
（女性ホルモンの活性の検出方法）
上記のようにして調製した細胞を１  ｘ  １０５  個／ｍＬ  になるように調製し、マイクロプレートに１００  μＬずつ添加した（１  ｘ  １０４  個／ウエル）。
【００６６】
化学物質として天然型女性ホルモン（１７β−エストラジオール、和光純薬）を、前記プレートに濃度を変えて添加し、ＣＯ２インキュベータ内で２４時間培養した。
【００６７】
インキュベータからプレートを取りだし、培地を捨てた後、リン酸緩衝液（１０  ｍＭ、ｐＨ  ７．２）でプレートを２回洗浄した。その後、細胞溶解剤（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ５Ｘ、プロメガ社）を１５  μＬ添加し、１０分間静置した後、発光基質［ルシフェラーゼ測定用キット、プロメガ（株）製］を加え、化学発光測定装置（ＬＵＭＩ  ｓｔａｒ、ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて化学発光量を測定した。その結果を図２に示す。
【００６８】
（３）プラスミドの大量精製
（１）、（２）で得られたプラスミドでそれぞれ形質転換した大腸菌を大量培養し、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、精製した。精製後、分光光度計を用いて、純度及び濃度を測定した。
【００６９】
（４）培養細胞の形質転換
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標、インビトロゲン社製）を用いて培養細胞の形質転換を行った。本操作はメーカーのプロトコールに従って行った。無血清培地で希釈したそれぞれ３  μｇのレポーター及びレセプター発現プラスミド溶液にＰＬＵＳ試薬１０  μＬを混合し、室温で１５分間放置した。さらに、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（登録商標、インビトロゲン社製）１５  μＬを添加し１５分放置した。５  ｘ  １０５  個／ディッシュとなるように播種し、一晩培養した細胞に、上述のプラスミド溶液を添加し、ＣＯ２インキュベータで培養した。３〜４．５時間後に血清培地に交換し、一晩培養した。
【００７０】
（５）試験物質の曝露
受容体発現プラスミド及びレポータープラスミドを導入した培養細胞ＨｅＬａ（ヒト子宮頸ガン由来）を、９６穴マイクロプレートに入れて１  ｘ  １０−５〜１  ｘ  １０−１１  Ｍ（公比１０、７濃度区）の試験物質を曝露した。試験物質は、実施例５で用いたものと同様とした。
【００７１】
（６）ルシフェラーゼアッセイ
（５）で化学物質を曝露した培養細胞を終夜放置後、細胞溶解剤Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社製）を用いて細胞を溶解し、細胞内に発現されているルシフェラーゼの酵素活性をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社製）用いて測定した。同時測定した溶媒対照区のルシフェラーゼの酵素活性を１としたときの各化学物質の転写活性化倍率を化学物質濃度に対してプロットしたグラフを図３に示す。
【００７２】
図３より、解析プログラムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒ．  ３（登録商標、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いてＥＣ５０を算出した。ＥＣ５０は、化学物質濃度に対する酵素活性が一定に達したときの値の５０％値を得るために必要な化学物質濃度を表し、化学物質のエストロジェンレセプターに対する活性化能を表すパラメータとなる。各化学物質のＥＣ５０値を表１に示す。
【００７３】
【表１】
2004357558.tif 000005
【００７４】
実施例７
実施例１と同様の操作を行ってエストロジェンレセプターβ遺伝子（配列番号７、９）を取得した。配列番号７又は９に示す遺伝子を導入したベクターを用いた以外は実施例２〜５と同様にして競争結合試験を行った。
【００７５】
配列番号７及び９に示す塩基配列の遺伝子発現タンパク質に対する各化学物質の受容体結合率Ｂ／Ｂ０（％）を化学物質濃度に対してプロットしたグラフを図４、５（配列番号７）及び図６、７（配列番号９）に、ＩＣ５０値を表２に示す。
【００７６】
更に、配列番号９に示す遺伝子を鋳型とした以外は実施例６と同様にしてレポーター遺伝子アッセイを行った。各化学物質の転写活性化倍率を化学物質濃度に対してプロットしたグラフを図８に、ＥＣ５０値を表２に示す。
【００７７】
本実施例において使用した試験物質は以下のとおりである。
エストラジオール（Ｅ２）、クメストロール（ｃｏｕｍｅｓｔｒｏｌ）、ゲニスタイン（ＧＥＮ）、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、エストロン（Ｅ１）、ノニルフェノール（ＮＰ）  、４−ｎ−ノニルフェノール  （ｎ−ＮＰ）、４−ｔ−オクチルフェノール  （ｔ−ＯＰ：以上、和光純薬工業社製）
【００７８】
【表２】
2004357558.tif 000006
【００７９】
【発明の効果】
本発明によれば、化学物質のエストロジェンレセプターに対する結合強度及び活性化能を簡便に測定することができる。従って、本発明は、コイの女性ホルモン系に影響を及ぼす環境ホルモンのプレスクリーニング法として有用である。
【００８０】
【配列表】
2004357558.tif 000007
2004357558.tif 000008
2004357558.tif 000009
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例５における試験化学物質の濃度とリガンドの受容体結合率の関係を示すグラフである。
【図２】実施例６で調製したレポータープラスミドのエストロゲン濃度に対する転写活性化倍率を示すグラフである。
【図３】実施例６における試験化学物質の濃度とルシフェラーゼ遺伝子の転写活性化倍率の関係を示すグラフである。
【図４】実施例７における試験化学物質の濃度と配列番号７で示す塩基配列の遺伝子発現タンパク質に対するリガンドの結合率の関係を示すグラフである。
【図５】実施例７における試験化学物質の濃度と配列番号７で示す塩基配列の遺伝子発現タンパク質に対するリガンドの結合率の関係を示すグラフである。
【図６】実施例７における試験化学物質の濃度と配列番号９で示す塩基配列の遺伝子発現タンパク質に対するリガンドの結合率の関係を示すグラフである。
【図７】実施例７における試験化学物質の濃度と配列番号９で示す塩基配列の遺伝子発現タンパク質に対するリガンドの結合率の関係を示すグラフである。
【図８】実施例７における試験化学物質の濃度とルシフェラーゼ遺伝子の転写活性化倍率の関係を示すグラフである。
【図１】
2004357558.tif 000035
【図２】
2004357558.tif 000036
【図３】
2004357558.tif 000037
【図４】
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【図５】
2004357558.tif 000039
【図６】
2004357558.tif 000040
【図７】
2004357558.tif 000041
【図８】
2004357558.tif 000042