(57)【要約】【課題】生体内でのＮＯ発生量の制御性や取扱い性に優れる、新たなＮＯドナーを提供する。特にＮＯＳに依存しない代謝活性型のＮＯドナーを提供する。【解決手段】下記式【化１】2004115374.tif 000018［式中、ＡはＮまたはＮ＋−Ｏ−であり、ＢはＡに対してパラ位もしくはメタ位に置換する−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２であるか、またはＡに対してパラ位に置換する−Ｎ＝Ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２である。］で表わされる（Ｎ−ヒドロキシアミジノ）ピリジン誘導体からなる一酸化窒素供与剤。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式
【化１】
2004115374.tif 000015
［式中、ＡはＮまたはＮ＋−Ｏ−であり、ＢはＡに対してパラ位もしくはメタ位に置換する−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２であるか、またはＡに対してパラ位に置換する−Ｎ＝Ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２である。］で表わされる（Ｎ−ヒドロキシアミジノ）ピリジン誘導体からなる一酸化窒素供与剤。
【請求項２】
下記式
【化２】
2004115374.tif 000016
［式中、ＡはＮ＋−Ｏ−であり、ＢはＡに対してパラ位もしくはメタ位に置換する−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２である。］で表わされる（Ｎ−ヒドロキシアミジノ）ピリジン誘導体。
【請求項３】
下記式
【化３】
2004115374.tif 000017
［式中、ＡはＮまたはＮ＋−Ｏ−であり、ＹはＡに対してパラ位もしくはメタ位に置換する−ＣＮであるか、またはＡに対してパラ位に置換する−Ｎ＝Ｎ−ＮＫ−ＣＮである。］で表わされる化合物に，ヒドロキシルアミン（Ｈ２ＮＯＨ）を反応させることからなる請求項１記載の一酸化窒素供与剤の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一酸化窒素供与剤として作用する（Ｎ−ヒドロキシアミジノ）ピリジン誘導体に関する。本発明の化合物は水溶性であり、生体内でヒドロキシルラジカルの酸化力により一酸化窒素を遊離する。
【０００２】
【従来の技術】
一酸化窒素（ＮＯ）は、生体内でＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）によりＬ−アルギニンがＬ−シトルリンへ代謝される際に生成し、生体内で種々の生理活性発現に関与していることが知られている。そして、循環器系疾患、呼吸器系疾患、消化器系疾患、炎症、糖尿病、癌などのさまざまな病態にＮＯが関与しているということが次第に明らかになってくるとともに、ＮＯの生体に対する作用についての研究が盛んに行われるようになった。以上については、例えば、非特許文献１を参照のこと。
【０００３】
【非特許文献１】
谷口直之ら編、イラスト医学とサイエンスシリーズ「ＮＯの生理作用と疾患」、羊土社、１９９９年１２月２０日
【０００４】
ＮＯの生体に対する作用を研究するには、制御された量のＮＯを生体に与え、その有効性や有害性を解析する必要がある。ところが、ＮＯは常温常圧下で酸化され易い不安定な気体であり、これを正確に秤量したり希釈したりするのは困難である。このため、生体内ＮＯ実験用として、常温常圧では安定で希釈や秤量がし易く、生体内への投与に際して必要量のＮＯを発生するＮＯ供与剤（ＮＯドナー）が注目され、各種のものが開発されつつある。それらは、熱や光などの物理化学的作用でＮＯを発生する自発発生型、酸やアルカリの作用により分解してＮＯを発生する化学反応依存型、代謝酵素により分解してＮＯを発生する代謝活性（特にＮＯＳ依存）型、ＮＯＳが関与する生体内のＮＯ産生系に作用するＮＯ発生系活性型などに分類されることがある。以上については、非特許文献２又は３を参照のこと。
【０００５】
【非特許文献２】
日本化学会編、季刊化学総説Ｎｏ．３０「ＮＯ−化学と生物」、学会出版センター、１９９６年、５３〜６２ページ
【非特許文献３】
吉村哲彦編、「生体内一酸化窒素（ＮＯ）実験プロトコール」、共立出版、２６〜３３ページ
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のＮＯドナーには、生体内でのＮＯ発生量の制御性や取り扱いやすさといった点では未だ不十分な点も多く、研究試薬や治療薬として新たなＮＯドナーの開発に対する要請は依然として大きい。特に、生体内でのＮＯ発生量の制御性に優れるとされる代謝依存型でこれまでに開発されたものは、ほとんどがＮＯＳの酸化力を利用するＮＯＳ依存型であり、また、従来の多くのＮＯドナーは水に溶けにくいため、塩酸塩や酢酸塩などの酸付加塩の形で使用せざるを得ないという問題がある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記式（１）
【化４】
2004115374.tif 000002
［式中、ＡはＮまたはＮ＋−Ｏ−であり、ＢはＡに対してパラ位もしくはメタ位に置換する−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２であるか、またはＡに対してパラ位に置換する−Ｎ＝Ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２である。］で表わされる（Ｎ−ヒドロキシアミジノ）ピリジン誘導体からなる一酸化窒素供与剤を提供し、前記要請に応えるものである。
【０００８】
上記式（１）の化合物は、そのＮ−ヒドロキシアミジノ基が、活性酸素種であるヒドロキシルラジカルの酸化力を利用してＮＯを遊離する。特に、ＡがＮである化合物は、生体内で有害なヒドロキシルラジカルが発生するときに、これと反応してＮＯを遊離する。一方、ＡがＮ＋−Ｏ―である化合物は、低酸素組織において、還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）による代謝を受けて自らヒドロキシルラジカルを発生し、これにより同一分子内のＮ−ヒドロキシアミジノ基からＮＯを発生する。
【０００９】
上記式（１）の化合物のうち、少なくともＢが−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２であるものは、グアニジン型の構造を含まないため、直接、ＮＯＳに依存することはない。ただし、Ｂが−Ｎ＝Ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２であるものは、グアニジン型の構造を含むためＮＯＳに依存する可能性はある。上記式（１）の化合物は、塩酸塩や酢酸塩の形にしなくても水によく溶けるが、Ｂが−Ｎ＝Ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２であるもの（グアニジン型）は、Ｂが−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２であるもの（アミジン型）に比べてやや水に溶けにくい。
【００１０】
【発明の実施の形態】
（Ａ）化合物の製造
上記式（１）の化合物は下記式（２）
【化５】
2004115374.tif 000003
［式中、ＡはＮまたはＮ＋−Ｏ−であり、ＹはＡに対してパラ位もしくはメタ位に置換する−ＣＮであるか、またはＡに対してパラ位に置換する−Ｎ＝Ｎ−ＮＫ−ＣＮである。］で表わされる化合物に，ヒドロキシルアミン（Ｈ２ＮＯＨ）を反応させることにより、容易に製造することができる。
【００１１】
すなわち、Ｂが−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２である式（１）の化合物を製造するには、Ｙが−ＣＮである式（２）の化合物をメタノールやエタノールなどの不活性溶媒中に溶解して１．２当量の炭酸ナトリウムを共存させ、これに１〜１．２当量のヒドロキシルアミン塩酸塩の粉末を少量ずつ加えて攪拌しながら、６５〜８０℃で３０分間〜５時間反応させればよい。式（１）の化合物は結晶として得られる。下記にその反応式を示す。
【化６】
2004115374.tif 000004
１ａ：Ａ＝Ｎ，Ｂ＝３−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２
１ｂ：Ａ＝Ｎ，Ｂ＝４−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２
１ｃ：Ａ＝Ｎ＋−Ｏ−，Ｂ＝３−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２
１ｄ：Ａ＝Ｎ＋−Ｏ−，Ｂ＝４−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２
２ａ：Ａ＝Ｎ，Ｙ＝３−ＣＮ
２ｂ：Ａ＝Ｎ，Ｙ＝４−ＣＮ
２ｃ：Ａ＝Ｎ＋−Ｏ−，Ｙ＝３−ＣＮ
２ｄ：Ａ＝Ｎ＋−Ｏ−，Ｙ＝４−ＣＮ
【００１２】
また、Ｂが−Ｎ＝Ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２である式（１）の化合物を製造するには、Ｙが式−Ｎ＝Ｎ−ＮＫ−ＣＮである式（２）の化合物を、メタノールやエタノールなどの不活性溶媒中に溶解して、これに１〜１．２当量のヒドロキシルアミン塩酸塩の粉末を少量ずつ加えて攪拌しながら、６５〜８０℃で３０分間ないし１時間反応させればよい。式（１）の化合物は結晶として得られる。下記にその反応式を示す。
【化７】
2004115374.tif 000005
１ｅ：Ａ＝Ｎ，Ｂ＝４−Ｎ＝Ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２
１ｆ：Ａ＝Ｎ＋−Ｏ−，Ｂ＝４−Ｎ＝Ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｎ−ＯＨ）ＮＨ２
２ｅ：Ａ＝Ｎ，Ｙ＝４−Ｎ＝Ｎ−ＮＫ−ＣＮ
２ｆ：Ａ＝Ｎ＋−Ｏ−，Ｙ＝４−Ｎ＝Ｎ−ＮＫ−ＣＮ
【００１３】
なお、Ｙが式−Ｎ＝Ｎ−ＮＫ−ＣＮである式（２）の化合物を製造するには、相当する４−アジドピリジンまたは４−アジドピリジンＮ−オキシドを７０％ジオキサン水溶液中に入れ、これにシアン化カリウムの水溶液を５〜１０℃で添加した後、室温で攪拌しながら３０分間〜１時間反応させればよい。下記にその反応式を示す。
【化８】
2004115374.tif 000006
２ｅ：Ａ＝Ｎ，Ｙ＝　−Ｎ＝Ｎ−ＮＫ−ＣＮ
２ｆ：Ａ＝Ｎ＋−Ｏ−，Ｙ＝　−Ｎ＝Ｎ−ＮＫ−ＣＮ
３ｅ：Ａ＝Ｎ
３ｆ：Ａ＝Ｎ＋−Ｏ−
【００１４】
以上のようにして得られた式（１）の化合物の結晶は、水、メタノール、エタノールなどの不活性溶媒で再結晶操作を行うことにより、より高純度の精製品とすることができる。さらに、所望であれば、生理学的に使用できる酸、たとえば塩酸を常法に従って作用させれば、酸付加塩を得ることもできる。なお、これらの化合物はいずれも水溶性であるが、その中でも、化合物１ａ及び１ｂの水溶性が特に大きく、次いで化合物１ｃ及び１ｄ、さらに化合物１ｅ及び１ｆの順に水溶性は小さくなる。
【００１５】
（Ｂ）ＮＯ発生反応
本発明の化合物はヒドロキシルラジカルを酸化剤としてＮＯを発生する。ヒドロキシルラジカルを人工的に発生させるには、たとえば過酸化水素水と硫酸第一鉄によるフェントン反応による。フェントン反応で生じた一電子酸化剤であるヒドロキシルラジカルが本発明の機能性化合物を三電子酸化することによりＮＯを生成する反応過程を、化合物１ａを例にとって示す。
【化９】
2004115374.tif 000007
【００１６】
上記酸化反応により生成したＮＯを検出するには、図１に示すＮＯ発生検出装置を用いたグリースの方法（たとえば非特許文献４及び非特許文献５を参照）を用いればよい。図１において、装置本体２は気体選択的透過膜（ポリフッ化ビニリデン膜）５で内部が上下二室に分割されており、下室の下半分には本発明の化合物とフェントン試薬を含む反応液３が入っている。フェントン試薬により本発明の化合物から発生するＮＯは、反応液上の空間４を上昇し、気体選択的透過膜５を透過してグリース試薬６中に導かれて発色するので、これを５４６ｎｍで定量する。このときの反応式を下記に示す。なお、装置本体２の下部は恒温槽１内の定温水中に浸漬され、反応液３の温度は一定に保たれている。
【化１０】
2004115374.tif 000008
【００１７】
【非特許文献４】
Ｍ．　Ｔａｎｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．，　４４（１０），　１８４９−１８５２　（１９９６）
【非特許文献５】
Ｍ．　Ｔａｎｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．，　４５（４），　５９５−５９８　（１９９７）
【００１８】
【実施例】
実施例１（化合物１ａの製造）
３−シアノピリジン２．１ｇをメタノール５０ｍＬに溶解し、これに炭酸ナトリウム２．１ｇを攪拌しながら加えた。この溶液を６５〜７０℃に保ちながら、ヒドロキシルアミン塩酸塩１．４ｇを少量ずつ加えた。その後も攪拌を続けながら、６５〜７０℃で１時間反応させた。反応液を減圧濃縮してメタノールを留去し、残渣に少量の冷水を加えて無機塩類を溶出させた後、残った固形物をメタノールから再結晶させて化合物１ａを得た。得られた化合物１ａの融点、核磁気共鳴スペクトル、及び元素分析値を表１に示す。
【００１９】
実施例２（化合物１ｂの製造）
３−シアノピリジンＮ−オキシド２．４ｇをメタノール５０ｍＬに溶解し、これに炭酸ナトリウム２．１ｇを攪拌しながら加えた。この溶液を６５〜７０℃に保ちながら、ヒドロキシルアミン塩酸塩１．４ｇを少量ずつ加えた。その後も攪拌を続けながら、６５〜７０℃で１時間反応させた。反応液を減圧濃縮してメタノールを留去し、残渣に少量の冷水を加えて無機塩類を溶出させた後、残った固形物をメタノールから再結晶させて化合物１ｂを得た。得られた化合物１ｂの融点、核磁気共鳴スペクトル、及び元素分析値を表１に示す。
【００２０】
実施例３（化合物１ｃの製造）
４−シアノピリジン２．１ｇをメタノール５０ｍＬに溶解し、これに炭酸ナトリウム２．１ｇを攪拌しながら加えた。この溶液を６５〜７０℃に保ちながら、ヒドロキシルアミン塩酸塩１．４ｇを少量ずつ加えた。その後も攪拌を続けながら、６５〜７０℃で１時間反応させた。反応液を減圧濃縮してメタノールを留去し、残渣に少量の冷水を加えて無機塩類を溶出させた後、残った固形物をメタノールから再結晶させて化合物１ｃを得た。得られた化合物１ｃの融点、核磁気共鳴スペクトル、及び元素分析値を表１に示す。
【００２１】
実施例４（化合物１ｄの製造）
４−シアノピリジンＮ−オキシド２．４ｇをメタノール５０ｍＬに溶解し、これに炭酸ナトリウム２．１ｇを攪拌しながら加えた。この溶液を６５〜７０℃に保ちながら、ヒドロキシルアミン塩酸塩１．４ｇを少量ずつ加えた。その後も攪拌を続けながら、６５〜７０℃で１時間反応させた。反応液を減圧濃縮してメタノールを留去し、残渣に少量の冷水を加えて無機塩類を溶出させた後、残った固形物をメタノールから再結晶させて化合物１ｄを得た。得られた化合物１ｄの融点、核磁気共鳴スペクトル、及び元素分析値を表１に示す。
【００２２】
実施例５（化合物１ｅの製造）
（ａ）４−アジドピリジンＮ−オキシド（３ｆ）の合成
４−ニトロピリジンＮ−オキシド１．４ｇとアジ化ナトリウム０．６５ｇを５０％エタノール水溶液に溶解し、水浴上で１０時間還流して反応させた。反応液を減圧濃縮して溶媒を留去した後、残渣を塩化メチレンで抽出した。この塩化メチレン層を無水硫酸ナトリウムで暗所乾燥し、次いで溶媒を留去した後、残留物をエタノールに溶解して４−アジドピリジンＮ−オキシド（３ｆ）を結晶化し、これをさらにエタノールから再結晶させた。収率７４％。ｍｐ１４２〜１４３℃（分解点）。
【００２３】
（ｂ）４−アジドピリジン（３ｅ）の合成
４−アジドピリジンＮ−オキシド（３ｆ）４．７ｇをクロロホルム１５０ｍＬに溶解し、これに三塩化リン１０．０ｇを少量ずつ加えて水浴上で３時間還流した。反応混合物を減圧濃縮した後、残渣を氷水に加え、油状物を塩化メチレンで抽出した。この塩化メチレン層を無水硫酸ナトリウムで暗所乾燥し、次いで溶媒を留去した後、残留物をメタノールと塩酸の混合液で処理して４−アジドピリジン（３ｅ）の塩酸塩とした。これをさらにメタノールから再結晶させた、ｍｐ１３７〜１３９℃（分解点）。
【００２４】
（ｃ）４−（３−シアノ−１−トリアゼノ）ピリジンのカリウム塩（２ｅ）の合成
遊離の４−アジドピリジン（３ｅ）１．２ｇをメタノールに溶解し、これに水２ｍＬにシアン化カリウム０．６５ｇを溶かした溶液を攪拌しながら加え、さらに３０分間水浴上で加熱した。反応液を減圧濃縮した後、残留物をメタノールから再結晶させた。ｍｐ＞３００℃。
【００２５】
（ｄ）４−［３−（Ｎ２−ヒドロキシアミジノ）−１−トリアゼノ］ピリジン（１ｅ）の合成
４−（３−シアノ−１−トリアゼノ）ピリジンのカリウム塩（２ｅ）１８５ｍｇをメタノール１０ｍＬに溶解した。これにヒドロキシルアミン塩酸塩７０ｍｇを攪拌しながら加え、８０℃で２０分間反応させて、４−［３−（Ｎ２−ヒドロキシアミジノ）−１−トリアゼノ］ピリジン（１ｅ）の結晶を得た。これをさらに含水メタノールから再結晶させた。得られた化合物１ｅの融点、核磁気共鳴スペクトル、及び元素分析値を表１に示す。
【００２６】
実施例６（化合物１ｆの製造）
（ａ）４−（３−シアノ−１−トリアゼノ）ピリジンＮ−オキシドのカリウム塩（２ｆ）の合成
４−アジドピリジンＮ−オキシド（３ｆ）１．３６ｇを５０％ジオキサン水溶液に溶解した。これに、５〜１０℃で、水２ｍＬにシアン化カリウム０．６５ｇを溶かした溶液を少量ずつ攪拌しながら加えた後、室温で３０分間放置し、生じた４−（３−シアノ−１−トリアゼノ）ピリジンＮ−オキシドのカリウム塩（２ｆ）の結晶を集めた。これをさらにエタノール水溶液から再結晶させた。ｍｐ２３８〜２４０℃（分解点）。
【００２７】
（ｂ）４−［３−（Ｎ２−ヒドロキシアミジノ）−１−トリアゼノ］ピリジンＮ−オキシド（１ｆ）の合成
４−（３−シアノ−１−トリアゼノ）ピリジンＮ−オキシドのカリウム塩（２ｆ）０．２４ｇをメタノール１０ｍＬに溶解した。これにヒドロキシルアミン塩酸塩７０ｍｇを攪拌しながら加え、８０℃で２０分間反応させて、４−［３−（Ｎ２−ヒドロキシアミジノ）−１−トリアゼノ］ピリジンＮ−オキシド（１ｆ）の結晶を得た。得られた化合物１ｆの融点、核磁気共鳴スペクトル、及び元素分析値を表１に示す。
【００２８】
【表１】
2004115374.tif 000009
【００２９】
実施例７（ＮＯの発生）
水に溶解させた０．０３Ｍの化合物１ａ〜１ｆに０．１Ｍの過酸化水素水を加え、さらに０．１Ｍの硫酸第一鉄を加えて（フェントン反応）一定温度で攪拌しながら、一定時間に発生してくるガス状のＮＯをグリース試薬へ導いて発色させ、これを５４６ｎｍで定量した。結果を表２に示す。
【００３０】
【表２】
2004115374.tif 000010
【００３１】
【発明の効果】
化合物１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ及び１ｆは、ヒドロキシルラジカルと反応してＮＯを遊離するため、ＮＯドナーとして有用である。以下に示すように、これらの化合物のうち、化合物１ａ、１ｂ及び１ｅは生体内で生成した内因性ヒドロキシルラジカルと反応して（すなわち有害なヒドロキシルラジカルを消費して）ＮＯを遊離し、それぞれニコチンアミド、イソニコチンアミド及び４−ヒドロキシピリジンと尿素に代謝される。一方、化合物１ｃ、１ｄ及び１ｆはＮＡＤＰＨのような還元酵素による脱オキシド化反応で自らヒドロキシルラジカルを発生し、これによりヒドロキシアミジノ部位が酸化を受けてＮＯを遊離して、それぞれニコチンアミド、イソニコチンアミド及び４−ヒドロキシピリジンと尿素に代謝されることが予想される。
【化１１】
2004115374.tif 000011
【化１２】
2004115374.tif 000012
【化１３】
2004115374.tif 000013
【化１４】
2004115374.tif 000014
【００３２】
なお、化合物１ｃ及び１ｄを記載した文献は見当たらないが、化合物１ａは非特許文献６、化合物１ｂは非特許文献７、化合物１ｅ及び１ｆは非特許文献８に記載された既知化合物である。
【００３３】
【非特許文献６】
Ｂｅｉｌ．，　２２，　４１　（１９３５）
【非特許文献７】
Ｌ．Ｎ．　Ｋｏｉｋｏｖ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｎｄｅｌｅｅｖ　Ｃｏｍｍｕｎ．，　４，　１６５−１６８　（１９９８）
【非特許文献８】
Ｍ．　Ｔａｎｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．　２７，　１８２４−１８２９　（１９７９）
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＮＯドナーから発生したＮＯを検出する装置の一例を示す。
【符号の説明】
１　恒温槽
２　装置本体
３　反応液
４　空間（反応液より気化したＮＯが上昇する）
５　気体選択的透過膜
６　グリース試薬（呈色試薬、酢酸水溶液）
【図１】
2004115374.tif 000019