(57)【要約】【課題】本発明は遺伝子導入ベクターからの遺伝子発現をインビボで評価する方法を提供する。【解決手段】蛍光蛋白質を発現する遺伝子導入ベクターを哺乳動物の耳介に投与し、投与個体の耳介における蛍光を体外から検出することにより、インビボ投与した導入遺伝子の発現を非侵襲的に連続測定する方法を開発した。この方法は、遺伝子導入ベクターからの発現持続性および連続投与における発現レベルの変化を簡便に測定することを可能にする。本方法は、新たなインビボ遺伝子導入ベクターの開発、および遺伝子治療におけるベクター投与プロトコルの作成などにおいて有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体に投与した遺伝子導入ベクターからの遺伝子発現を評価する方法であって、
（ａ）蛍光蛋白質をコードするベクターを、哺乳動物の耳介に投与する工程、
（ｂ）耳介における該蛍光蛋白質からの蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｃ）検出された蛍光を該ベクターからの遺伝子発現と関連付ける工程、を含む方法。
【請求項２】
該蛍光蛋白質をコードするベクターまたは他のベクターを該動物に合計２回以上投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
投与した個体から経時的に蛍光を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ベクターがマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該哺乳動物が齧歯目またはウサギ目である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
蛍光蛋白質が緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子導入ベクターからの遺伝子発現をインビボで評価する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子治療は治療効果のある物質を患者自身の細胞で作らせるという新たなドラッグデリバリーの形態である（Ｖｅｒｍａ  ＩＭ，  Ｓｏｍｉａ  Ｎ．  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ−ｐｒｏｍｉｓｅｓ，  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；３８９：２３９−４２；  Ｍｏｒｇａｎ  ＲＡ，  Ｂｌａｅｓｅ  ＲＭ．  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｌｅａｒｎｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐａｓｔ  ｄｅｃａｄｅ．  ＢＭＪ  １９９９；３１９：１３１０）。これまでに、インビボ遺伝子治療のために種々の遺伝子導入ベクターが開発されている。ウイルスの感染性および遺伝子導入能を利用したウイルスベクターは、高い効率での遺伝子導入が見込めるためインビトロおよびインビボの両方において有用性が高い。しかしながら、インビトロ投与とは違いインビボ投与においては、ウイルスに対する免疫反応が誘導され、特に２回目以降の投与において治療が困難になる場合がある（Ｋａｐｌａｎ，  Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｌｕｎｇｆ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎ．  Ｔｈｅｒ．  ８，  ４５−４６；  Ｍｏｒｓｙ，Ｍ．Ａ．  ａｎｄ  Ｃａｓｋｅｙ，Ｔ．  （１９９７）．  Ｓａｆｅ  ｇｅｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｍａｄｅ  ｓｉｍｐｌｅｒ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５，  １７−１７；  Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｏｍｉａ，Ｎ．  （１９９７）．  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  −  ｐｒｏｍｉｓｅｓ，  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，  ２３９−２４２）。
【０００３】
この問題を回避するため、ｎａｋｅｄ  ＤＮＡおよびその他の非ウイルスベクターの開発、およびより長期間遺伝子を発現できる新たなウイルスベクターおよびその投与方法を開発する試みが続けられている。例えば、アデノウイルスベクターの投与においてポリカチオンを用いると、ベクターの効率が上昇することが知られている（Ａｒｃａｓｏｙ，Ｓ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）．  Ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ４，  ３２−３８）。また、ウイルスベクターからＥ２，  Ｅ１ａ，  およびＥ１ｂなどの免疫原性のウイルス蛋白質遺伝子を除去することによって、発現期間が延長された新しいアデノウイルスベクターが開発されている（Ｃｏｕｔｅｌｌｅ，Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）．  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ，  Ｉｎ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ．  Ｄｏｄｇｅ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ｐ．  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｗｉｄｄｉｃｏｍｂｅ，  Ｊ．  Ｈ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）  ｐｐ３３−５４；  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｃｅｌｌ  ６８，  １４３−１５５；  Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｏｍｉａ，Ｎ．  （１９９７）  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  −  ｐｒｏｍｉｓｅｓ，  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，  ２３９−２４２）。
【０００４】
このようなインビボベクターの開発および投与方法の改良には、ベクターをインビボで投与し、その発現を評価する必要がある。しかし、一般に導入遺伝子の発現の検出は煩雑であり、特に発現の経時変化を追うには、しばしば多数の個体を用いなければならない。より効率的なインビボ評価系の確立が重要である。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｖｅｒｍａ，  Ｉ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｏｍｉａ，  Ｎ．  （１９９７）．  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  −  ｐｒｏｍｉｓｅｓ，  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，  ２３９−２４２）。
【非特許文献２】
Ｍｏｒｇａｎ  Ｒ．Ａ．  ａｎｄ  Ｂｌａｅｓｅ  Ｒ．Ｍ．  （１９９９）  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｌｅａｒｎｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐａｓｔ  ｄｅｃａｄｅ．  ＢＭＪ  ３１９，  １３１０
【非特許文献３】
Ｋａｐｌａｎ，  Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｌｕｎｇｆ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎ．  Ｔｈｅｒ．  ８，  ４５−４６
【非特許文献４】
Ｍｏｒｓｙ，Ｍ．Ａ．  ａｎｄ  Ｃａｓｋｅｙ，Ｔ．  （１９９７）．  Ｓａｆｅ  ｇｅｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｍａｄｅ  ｓｉｍｐｌｅｒ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５，  １７−１７
【非特許文献５】
Ａｒｃａｓｏｙ，  Ｓ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）．  Ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ４，  ３２−３８
【非特許文献６】
Ｃｏｕｔｅｌｌｅ，Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）．  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ，  Ｉｎ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ．  Ｄｏｄｇｅ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ｐ．  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｗｉｄｄｉｃｏｍｂｅ，  Ｊ．  Ｈ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）  ｐｐ３３−５４
【非特許文献７】
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｃｅｌｌ  ６８，  １４３−１５５
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝子導入ベクターからの遺伝子発現をインビボで評価する方法を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、蛍光蛋白質遺伝子を搭載するベクターを哺乳動物の耳介に投与し、耳介中でベクターから発現した蛍光蛋白質の蛍光を、体外から検出することにより、インビボ投与した遺伝子導入ベクターの遺伝子発現を、極めて簡便に測定できることを見出した。耳介は蛍光蛋白質からの蛍光を検出するのに非常に適しており、投与したベクターから発現された蛍光蛋白質の蛍光を、体外から非侵襲的に検出することが可能であった。この方法は投与動物を殺したり傷つける必要がないため、ベクター投与後の遺伝子発現の変化を同一個体において連続的にモニターすることが可能であった。
【０００８】
本発明者らは、この評価系を用いてベクターの繰り返し投与におけるベクターの発現効率の変化を測定した。すなわち、動物にまずベクターを適当な経路で投与し、数日後に耳介に蛍光蛋白質遺伝子を搭載するベクターを投与してその蛍光を測定した。これにより、２回目の投与におけるベクターからの遺伝子発現のレベルの低下を経時的に測定することができた。
【０００９】
さらに本発明者らは、免疫応答を抑制するように設計した新たな改変ウイルスベクターを構築し、本発明の評価系を用いてこのベクターの発現効率を経時的に評価した。その結果、改変ウイルスベクターは、従来のベクターと比べ発現持続性が上昇していることが確かめられた。このように本発明の方法は、種々の条件において、遺伝子導入ベクターの発現効率をインビボで評価するために極めて有用である。
【００１０】
すなわち本発明は、遺伝子導入ベクターからの遺伝子発現をインビボで評価する方法に関し、より具体的には、
（１）生体に投与した遺伝子導入ベクターからの遺伝子発現を評価する方法であって、
（ａ）蛍光蛋白質をコードするベクターを、哺乳動物の耳介に投与する工程、
（ｂ）耳介における該蛍光蛋白質からの蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｃ）検出された蛍光を該ベクターからの遺伝子発現と関連付ける工程、を含む方法、
（２）該蛍光蛋白質をコードするベクターまたは他のベクターを該動物に合計２回以上投与する、（１）に記載の方法、
（３）投与した個体から経時的に蛍光を検出する、（１）に記載の方法、
（４）ベクターがマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、（１）に記載の方法、
（５）該哺乳動物が齧歯目またはウサギ目である、（１）に記載の方法、
（６）蛍光蛋白質が緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）である、（１）に記載の方法、に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、遺伝子導入ベクターからの遺伝子発現をインビボで評価する方法に関する。本発明において用いる遺伝子導入ベクターは特に制限はなく、例えばプラスミドベクター、その他のｎａｋｅｄ  ＤＮＡ、ウイルスベクター等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、フォウルポックスウイルスベクター、その他の所望のウイルスベクターが例示できる。
【００１２】
これらのウイルスベクターは当業者に周知の方法に従って組み換えウイルスとして調製することができる。例えば、遺伝子治療などに最も普通に利用されるアデノウイルスベクターの作製は、斎藤らの方法および他（Ｍｉｙａｋｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻、１３２０−２４頁；Ｋａｎｅｇａｅら、１９９６、Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｊｐｎ、３８巻、１８２−１８８頁；鐘ヶ江ら、バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法、１９９４、４３−５８頁、羊土社；鐘ヶ江ら、１９９４、細胞工学、１３巻、８号、７５７−７６３頁）に従って製造することができる。また、例えばレトロウイルスベクター（脇本ら、１９９５、蛋白質核酸酵素、４０巻、２５０８−２５１３頁）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（玉寄ら、１９９５、蛋白質核酸酵素、４０巻、２５３２−２５３８頁）なども、公知の方法により調製することができる。哺乳動物に遺伝子導入可能なその他のウイルスベクターを製造するための詳細は、組換えワクシニアウイルスを製造する方法としては、特表平６−５０２０６９、特公平６−９５９３７、特公平６−７１４２９が知られている。組換えパピローマウイルスを製造する方法としては特公平６−３４７２７、特表平６−５０５６２６が知られている。組換えアデノ随伴ウイルスを製造する方法としては、特開平５−３０８９７５が知られている。組換えアデノウイルスを製造する方法としては、特表平６−５０８０３９が知られている。パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、およびセンダイウイルスなどを含むマイナス鎖ＲＮＡウイルスを製造する方法は、以下のような文献に記載されている（Ｈａｓａｎ，  Ｍ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：  ２８１３−２８２０，  １９９７、Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６：  ５７８−５８７；  Ｙｕ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：  ４５７−４６６；  国際公開９７／１６５３９号；  国際公開９７／１６５３８号；  Ｄｕｒｂｉｎ，  Ａ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：  ３２３−３３２；  Ｗｈｅｌａｎ，  Ｓ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：  ８３８８−８３９２；  Ｓｃｈｎｅｌｌ．  Ｍ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：  ４１９５−４２０３；  Ｒａｄｅｃｋｅ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４：  ５７７３−５７８４；  Ｌａｗｓｏｎ，  Ｎ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：  ４４７７−４４８１；  Ｇａｒｃｉｎ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４：  ６０８７−６０９４；  Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：  ５６９−５７９；  Ｂａｒｏｎ，  Ｍ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｔ．，  １９９７，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：  １２６５−１２７１；  Ｂｒｉｄｇｅｎ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ，  Ｒ．  Ｍ．，  １９９６，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：  １５４００−１５４０４）。マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、マイナス鎖（すなわちアンチセンス鎖）ＲＮＡをゲノムに有するウイルスであって、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ，  Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ，  Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ，  および  Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；  Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，  Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ，  および  Ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、フィロウイルス（Ｆｉｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；  Ｉｎｆｕｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  Ａ，  Ｂ，  Ｃ，  および  Ｔｈｏｇｏｔｏ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  等を含む）、ブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；  Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ，  Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ，  Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ，  および  Ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、アレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）などの科に属するウイルスが含まれる。
【００１３】
ウイルスベクターは、野生型ウイルスの誘導体であってもよい。誘導体とは、ウイルスの遺伝子導入能を完全には損なわないように、ベクターが搭載するウイルス遺伝子またはウイルス蛋白質を改変したベクターを言う。このような改変は、例えば外来遺伝子発現の向上のため、ベクターの複製能を欠損させるため、あるいは抗原性を減弱化したりするために行い得る（Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：７２６６−７２７２；  Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６：５７８−５８７；  Ｃｕｒｒａｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ０１／０４２７２，  ＥＰ１０６７１７９）。例えばウイルスの複製に必須の遺伝子を欠損させた複製能欠損型ウイルスベクターを用いることができる（国際公開番号  ＷＯ００／７００５５、ＷＯ００／７００７０、ＷＯ０１／１８２２３  参照）。また、所望のエンベロープ蛋白質でシュードタイプ化されたウイルスベクターであってもよい（ＷＯ００／７００５５  および  ＷＯ００／７００７０参照）。
【００１４】
製造したウイルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウイルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーおよび安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウイルスベクター由来の蛋白質の割合が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。例えばパラミクソウイルスの精製方法を例示すれば、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を挙げることができる。
【００１５】
蛍光蛋白質としては典型的には緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；  ＧＦＰ）が用いられる。ＧＦＰはもともとオワンクラゲＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａの発光器官で同定された約２４０個のアミノ酸からなる蛋白質で、紫外線（約３９５  ｎｍ）で励起され緑色蛍光（約５０８  ｎｍ）を発する。ＧＦＰは蛍光強度の改善、温度安定性の上昇、溶解度の増加を目的とし、野生型蛋白質に変異を導入した誘導体（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；  ＥＧＦＰ、およびＶｅｎｕｓなど）が多数存在する（Ｔ．  Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，  ８７−９０  （２００２））。例えばＥＧＦＰとしてはＳ６５Ｔ置換体が知られている。また、ＧＦＰに変異を導入し、それぞれ黄、シアン、および青色に蛍光するＹＦＰ  （ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ  （ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびＢＦＰ  （ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）  が知られている。また、ウミシイタケ  Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  由来のＧＦＰも知られている。本明細書においては、これらの蛋白質を総称してＧＦＰと称す。ＧＦＰとしては、例えば、ＵＳ  ５，８７４，３０４およびＵＳ  ６，０２０，１９２に開示されているヒト化ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＵＳ  ６，０９６，８６５  のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９を持つｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎの変異体、ＵＳ  ５，６２５，０４８のｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎの機能的変異体、ＵＳ  ５，７７７，０７９  のＡｅｑｕｏｒｅａ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ＧＰＰポリペプチドの修飾体、ＵＳ  ６，０６６，４７６の機能的変異蛍光蛋白質、ＵＳ  ６，１９４，５４８  に開示されている蛍光蛋白質、およびＵＳ  ６，３１９，６６９  の機能的変異蛍光蛋白質などのいずれか、またはそれらの機能的変異体を用いてもよい。
【００１６】
また、他の蛍光蛋白質としては、イソギンチャク、スナギンチャク、ハナヅタなどに由来する蛍光蛋白質がマーカー蛋白質として既に使われている。例えば赤色の蛍光を発する蛍光蛋白質として、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｔｒｉａｔａから単離された赤色蛍光蛋白質  ＤｓＲｅｄが知られている。ＤｓＲｅｄにはＳ１９７Ｙ置換された改良型も知られている。これらの蛍光蛋白質をコードする核酸を搭載するベクターを用いて、本発明の方法を実施してもよい。
【００１７】
投与する動物は、耳介を有する所望の哺乳動物であってよいが、好ましくは耳介の厚さが最薄部で３  ｍｍ以下、好ましくは１  ｍｍ以下、より好ましくは０．５  ｍｍ以下である動物が好ましい。また、耳介組織に蛍光を遮断するような過度の色素沈着がなく、外部から蛍光観察がし易いように耳介部に獣毛の薄い部分があることが好ましい。また、皮膚は黒色ではなく、白から黄または褐色であることが好ましい。
【００１８】
具体的には、実験動物として通常使われる所望の非ヒト哺乳動物を用いてよく、例えば齧歯目またはウサギ目の動物が挙げられる。特にラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、モルモット（Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）、スナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）、および  Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  等のＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ属動物などを含む、小型（平均体重約３  ｋｇ以下、好ましくは２．０  ｋｇ以下、より好ましくは１．５  ｋｇ以下、１．０  ｋｇ以下、または０．６  ｋｇ以下）の齧歯目動物またはウサギ目動物が好ましい。最も好ましくは小型齧歯類であり、例えばマウスである。
【００１９】
投与部位は、外耳皮下で軟骨を突き刺さないように、表皮と軟骨の間の皮下に投与することが好ましい。投与は、例えば一箇所または複数箇所に注入により投与することができる。投与量は適宜調節してよいが、ウイルスベクターであれば、例えば一箇所あたり１０６〜１０１３  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｕｎｉｔ、プラスミドおよび他のｎａｋｅｄ  ＤＮＡであれば１μｇ〜１０  ｍｇ程度であってよい。ベクターは、薬学的に許容できる所望の担体により適宜希釈して投与することができる。投与組成物は、例えば、滅菌水、生理食塩水、慣用の緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、安定剤、塩、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、界面活性剤、懸濁剤、等張化剤、または保存剤などを含んでよい。また、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などと組み合わせることもできる。投与はｉｎ  ｖｉｖｏでもｅｘ  ｖｉｖｏでもよい。すなわち、ベクターを直接投与してもよく、あるいは体外で細胞に投与後に、その細胞を耳介に注入してもよい。
【００２０】
耳介における蛍光の検出は、発現させる蛍光蛋白質に応じて実施される。例えば、エーテル麻酔下の動物の耳をガラス版にはさみ、蛍光実体顕微鏡を利用して蛍光を検出することができる。検出された蛍光は、遺伝子導入ベクターからの遺伝子発現を反映する（図２参照）。すなわち、検出される蛍光強度が強いほど、ベクターからの遺伝子発現レベルは高いと判断され、検出される蛍光強度が弱いほど、ベクターからの遺伝子発現レベルは低いと判断される。蛍光強度を定量することにより、遺伝子発現レベルを決定することができる。
【００２１】
検出した蛍光は、コンピュータ上の画像解析などにより蛍光強度を定量化することができる（実施例参照）。具体的には、蛍光画像からＧＦＰの蛍光を示す緑色を、例えばＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて抽出し、その強度および面積については、例えばＮＩＨ  ｉｍａｇｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  ＵＳＡ）を用いて定量化可能である。
【００２２】
本発明の方法は、連続投与または繰り返し投与など、ベクターを複数回投与する際のベクターに対する免疫応答の惹起による感染率の低下を評価するために有用である。繰り返し投与とは、例えば１２時間以上の間隔をあけて２回以上、より特定すれば２０時間以上、あるいは１，  ２，  ３，  ４，  ５，  ６，  ７，  ８，  または９日以上の間隔をあけて２回以上（たとえば２，  ３，  ４，  ５回，  またはそれ以上）ベクターを投与することである。投与の間隔はより長い間隔をあけてもよく、例えば  １０〜３０日、１〜３ヶ月、あるいは数ヶ月間隔であってもよい。それぞれの投与においては、ベクターは同一であっても同一でなくてもよい。典型的には同じウイルスをベースにした（または同じ抗原性を有するウイルス蛋白質を有する）ベクターである。また投与部位は同一部位であっても異なる部位であってもよい。少なくとも一回は、蛍光蛋白質遺伝子を搭載するベクターを耳介に投与する。例えば、蛍光蛋白質遺伝子を搭載しないベクターを耳介に投与１回または複数回投与し、その後に蛍光蛋白質遺伝子を搭載するベクターを同じ耳介に投与すれば、繰り返し投与の特定の回数時における投与ベクターからの遺伝子発現をモニターすることができる。あるいは、蛍光蛋白質遺伝子を搭載するベクターを別の部位（例えば左右のうち一方の耳介またはそれ以外の部位）に投与し、他方の耳介に投与したベクターからの蛍光を測定することもできる（実施例２）。あるいは蛍光蛋白質遺伝子を搭載するベクターを同じ耳介に繰り返し投与すれば、繰り返し投与における遺伝子発現を累積的に評価することもできる。蛍光の検出は、１回またはそれ以上行う。特に本発明は経時的に発現の変化をモニターするのに適している。「経時的に蛍光を検出する」とは、同一個体の耳介における蛍光を、時点の違う少なくとも２回、例えば２，  ３，  ４，  ５，  ６，  またはそれ以上検出することを言う。
【００２３】
本発明の方法は新たなベクター開発、および投与方法の改良において有用である。例えば本発明は、
（ａ）哺乳動物に被検化合物を投与する工程、
（ｂ）蛍光蛋白質をコードするベクターを、該哺乳動物の耳介に投与する工程、
（ｃ）耳介における該蛍光蛋白質からの蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｄ）検出された蛍光と、該被検化合物非投与において検出される蛍光（対照）との違いを、ベクターからの導入遺伝子発現に対する被検化合物の効果に関連付ける工程、
を含む、遺伝子導入ベクターからの遺伝子発現に対する被検化合物の効果を評価する方法に関する。すなわち被検化合物投与下において、被検化合物非投与の場合よりも強い蛍光が検出されれば、その被検化合物はベクターからの導入遺伝子発現を助ける（すなわち発現低下を抑制する）効果があり、逆に被検化合物の投与で蛍光強度が低下すれば、その被検化合物はベクターからの導入遺伝子発現を阻害（すなわち発現低下を促進する）効果があると判断される。蛍光強度を定量することにより、被検化合物の効果を定量化することができる。被検化合物はベクターの投与の前、同時、または後に行ってよい。例えば、ベクターと共に組成物として投与してもよい。被検化合物に制限はなく、低分子化合物、蛋白質、核酸など所望のものを用いることができる。例えば被検化合物として遺伝子を用いる場合は、蛍光蛋白質をコードするベクター中に搭載させることもできる（例えば実施例３における抗ＣＤ２８抗体遺伝子）。対照（被検化合物非投与）に比べ蛍光強度が上昇させる被検化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるベクターの発現を上昇（または発現低下を抑制）する化合物の候補となる。
【００２４】
また、蛍光蛋白質をコードする２つのベクターの遺伝子発現効率の違いを評価することもできる。この方法は、
（ａ）蛍光蛋白質をコードする２種のベクターを、それぞれ、哺乳動物の耳介に投与する工程、
（ｂ）耳介のそれぞれの投与部位における該蛍光蛋白質からの蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｃ）それぞれの投与部位で検出された蛍光の違いを、ベクターからの導入遺伝子発現の違いに関連付ける工程、
を含む方法である。それぞれのベクターは同じ個体に投与しても別の個体に投与してもよい。同じ個体に投与すれば、同一条件で免疫反応が惹起される環境下でのベクター発現効率の違いを評価することができ、別個体に投与すれば、免疫反応の惹起の違いを評価することができる。別個体に投与する場合は、同種で遺伝子背景がほぼ同一であることが好ましい。２つのベクターでプロモーターが違っていたり、あるいは構造上の違いにより発現能にもとから差がある場合は、２つの蛍光強度の差からインビボ投与における発現効率の違いを単純に比較することはできないが、例えば耳介に投与した直後の蛍光強度に対する一定時間経過後の相対蛍光強度を２つのベクターで比較することにより、インビボにおける２つのベクターの導入遺伝子発現の違いを評価することができる（実施例３参照）。相対的に蛍光強度が高いベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるベクター発現効率が上昇した（または発現低下が抑制された）ベクターと判断される。
【００２５】
例えば上記した方法を利用すれば、以下のようなスクリーニングを実施することができる。例えば、本発明の評価方法を用いて、ベクターからの導入遺伝子発現を助ける（発現低下を抑制する）被検化合物をスクリーニングする方法としては、
（ａ）哺乳動物に被検化合物を投与する工程、
（ｂ）蛍光蛋白質をコードするベクターを、該哺乳動物の耳介に投与する工程、
（ｃ）耳介における該蛍光蛋白質からの蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｄ）検出された蛍光レベルが、該被検化合物非投与において検出される蛍光レベル（対照）よりも高くなる化合物を選択する工程、を含む方法が挙げられる。このようなスクリーニング方法は、本発明の評価方法を包含している。
【００２６】
また発現効率の高いベクターをスクリーニングする方法としては、
（ａ）蛍光蛋白質をコードする２つ以上のベクターを、それぞれ哺乳動物の耳介に投与する工程、
（ｂ）投与部位における該蛍光蛋白質からの蛍光を非侵襲的に検出する工程、
（ｃ）検出された蛍光レベルが高いベクターを選択する工程、を含む方法が挙げられる。このようなスクリーニング方法は、本発明の評価方法を包含している。具体的には、例えば（ａ）蛍光蛋白質をコードする２つ以上のベクターを、それぞれ哺乳動物の耳介に投与する工程、（ｂ）投与部位における該蛍光蛋白質からの蛍光を、非侵襲的にそれぞれ２回以上検出する工程、（ｃ）ある時点Ａとそれより後の時点Ｂの蛍光レベルの比（Ｂ／Ａ）を計算し、その値が高いベクターを選択する工程、を含む方法により、発現の持続性が高いベクターを選択することができる。
【００２７】
このようなスクリーニングにより、インビボで長期間発現を持続できる新たなベクター、あるいは、ベクターと共に投与することで持続発現を可能にする薬剤をスクリーニングすることが可能である。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
【００２９】
［実施例１］  遺伝子導入ベクターの耳介投与による非侵襲的ｉｎ  ｖｉｖｏ評価
本実施例では、蛍光蛋白質遺伝子を搭載する遺伝子導入ベクターを耳介に投与し、ベクターからの遺伝子発現をｉｎ  ｖｉｖｏで非侵襲的に検出する方法を例示する。用いられるベクターとしては特に制限はないが、ここではマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターの代表であるセンダイウイルスベクターを用いた。
【００３０】
ＧＦＰ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｕ５５７６２，  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ＡＡＢ０２５７４；  Ｇｅｎｅ，  １９９６，  １７３：３３−８）を有する伝播型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ：５ｘ１０６  ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）（ＷＯ００／７００７０，  ＷＯ０３／０２５５７０）或いはＦ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ：５ｘ１０６  ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）（ＷＯ００／７００７０，  ＷＯ０３／０２５５７０）をマウス耳介に投与した。感染細胞で発現しているＧＦＰ蛋白の蛍光は、非侵襲的に外部から観察可能であった（図１）。非侵襲的であるため、同一個体を利用して経時的にＳｅＶベクター由来蛋白（ＧＦＰ）の発現が観察でき、発現持続性の評価に非常に適している。また、同一個体での経時変化を追えることで、実験に使用する動物個体数を減少させることが可能である。実際の経時変化を観察したところ、ＧＦＰ蛋白の蛍光は投与２日目をピークに投与４日目まで観察可能であるが、投与５日目から６日目にほとんど消失した（図１）。
【００３１】
このＧＦＰ蛍光の変化が、ＳｅＶによる発現のＫｉｎｅｔｉｃｓを定量的に反映しているか否かを判定するために、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を搭載している伝播型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋Ｌｕｃｉ：  Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １８，  ９７０−９７３  （２０００））について同様に耳介投与を行った。まず、投与タイター依存的にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ蛋白の活性の変化が見られることを確認した（図２（Ａ））。次に、耳介内Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ蛋白発現の経時的変化について定量し、投与２日目をピークに投与４日目に少し減少し、投与７日目及び１１日目にほとんどベースラインレベルになることを確認した（図２（Ｂ））。この時、同タイプのＧＦＰ遺伝子搭載ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ）を投与した実験を同時に行い、ＧＦＰ蛍光の経時変化を調べた。ＧＦＰ蛍光の写真（図３（Ａ））から、画像処理ソフトＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）にて緑色蛍光を抽出した後、画像解析ソフトＮＩＨ  ｉｍａｇｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  ＵＳＡ）にて蛍光強度の定量（図３（Ｂ））を行った。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性から求めた経時変化（図２（Ｂ））と蛍光強度から求めた経時変化（図３（Ｂ））に非常に良い相関が見られた。則ち、ＧＦＰ蛍光の変化はＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性の変化に良く一致しており、ＧＦＰ蛍光の強度変化を追うことで、相対的定量性を議論できると判断された。
【００３２】
［実施例２］  ベクターのｉｎ  ｖｉｖｏくり返し投与後の発現評価
本実施例では、ベクターの繰り返し投与後の発現評価という観点からの発現評価方法を例示する。右耳の耳介にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６  ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）を投与し、発現を確認した後に、各種投与時期をずらして、左耳耳介への同じＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６  ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）を投与し、発現の有無を調べた（図４（Ａ））。また、この場合もＧＦＰ蛍光強度を定量化して表した（図４（Ｂ））。右耳耳介感染１日後、及び２日後であれば、左耳耳介での感染及び発現が確認された。しかし、右耳感染４日後であれば、左耳耳介での感染程度がかなり減少し、右耳感染６日後であれば、左耳耳介での感染はほとんど成立しなかった。右耳感染８日後でも、左耳耳介での感染はほとんど成立しなかったが、感染６２日後に僅かな感染が確認された。これらの現象については、ＳｅＶベクターの免疫系への影響を調べる良い材料になるとともに、くり返し投与後の発現を評価する非常に良い実験系になっていると考えられた。
【００３３】
［実施例３］  耳介投与における感染細胞
マウス耳介に投与した場合の感染細胞について調べた。マウス耳介にＳｅＶ１８＋  ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６  ＣＩＵ／５μＬ）を投与し、感染２日後に耳介を切除し、凍結切片を作成し、蛍光顕微鏡下ＧＦＰ蛍光を観察するとともに、抗ＧＦＰ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ，  ＵＳＡ）で染色した。ＧＦＰ蛍光と抗ＧＦＰ抗体での陽性細胞が重なったのは真皮の細胞であった（図５）。他の個体の耳介組織で観察したところ、軟骨膜周辺（図６（Ａ））、軟骨膜に近い真皮（図６（Ｂ））、表皮に近い真皮（図６（Ｃ））等への感染が確認され、表皮及び弾性軟骨への感染はなかった。従って、本投与法にて感染する細胞は、耳介真皮及び軟骨膜（繊維芽細胞含む）であると判断された。
【００３４】
［実施例４］  抗ＣＤ２８抗体遺伝子搭載ＳｅＶのｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現持続性の評価
Ｔ細胞の活性化は抗原提示細胞のＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ（あるいはｃｌａｓｓＩ）／抗原ペプチド複合体とＴ細胞レセプターの反応  （第１シグナル）  及びＣＤ８０（ＣＤ８６）とＣＤ２８等の補助刺激分子の反応  （第２シグナル（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ））  により生じ、その後活性化したＴ細胞はＣＤ８０（ＣＤ８６）とＣＴＬＡ４等の抑制性補助刺激分子の反応により鎮静化される。これらｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌをブロックすることにより末梢で免疫寛容が誘導されることが知られている。例えば、抗ＣＤ２８抗体はＴ細胞上の補助刺激因子であるＣＤ２８の抑制を通して免疫反応を抑制する（Ｙｕ，  Ｘ．Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４（９）  ４５６４−４５６８  （２０００）；  Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，  Ｉ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １３（２）  ５１９−５２７  （２００２））。本発明者らは、抗ＣＤ２８抗体を発現させることにより、遺伝子導入ベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ投与における免疫反応が抑制され、ベクターからの搭載遺伝子産物の長期発現を可能とすることを考えた。そこで、抗ＣＤ２８抗体遺伝子を搭載する遺伝子導入ベクターを構築し、耳介投与法を利用してベクターの発現持続性の評価を行なった。
【００３５】
１．ＣＤ２８に対する一本鎖抗体（αＣＤ２８）遺伝子を搭載したＦ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター（非伝播型）の構築
（ｉ）  遺伝子の全合成
Ｇｒｏｓｓｅ−Ｈｏｖｅｓｔ，  Ｌ．らの報告しているαＣＤ２８遺伝子配列（ＤＤＢＪ  ｄａｔａｂａｓｅ  ＳＹＮ５０７１０７  ）に基づき、αＣＤ２８（ＬＶ鎖及びＨＶ鎖の一本鎖抗体）の遺伝子配列の両端にＸｂａＩ  ｓｉｔｅを設けた配列の全合成を行い、この合成ＸｂａＩ断片（配列番号：１）（この断片をＳＹＮ２０５−１３と呼ぶ。両端の各６塩基はＸｂａＩ部位とした。αＣＤ２８アミノ酸配列は配列番号：２に示した）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクターに導入した（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／αＣＤ２８）。合成に使用したｏｌｉｇｏ  ＤＮＡの配列および名称を以下に示し、その配置を図７に示した。また、ベクター構築の概略図を図８に示した。一方、ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  κ  Ｌ  ｃｈａｉｎのシグナルペプチド（配列番号：４）とＳｅＶのＥＩＳ配列との間にＸｂａＩ  ｓｉｔｅを有し、その両端にＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ  ｓｉｔｅを設けたＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片のＮｈｅＩ  ｓｉｔｅとｐＧＥＭ−４Ｚベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｂａＩ  ｓｉｔｅをライゲーションさせたカセットプラスミド（ｐＧＥＭ−４Ｚｃｓｔ）を構築した（配列番号：３、ＥＩＳ配列を含むＮｏｔＩ断片のみ示した）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／αＣＤ２８のαＣＤ２８遺伝子を含むＸｂａＩ断片をｐＧＥＭ−４ＺｃｓｔベクターのＸｂａＩ  ｓｉｔｅに導入し、上記シグナルペプチドとＳｅＶのＥＩＳ配列を有するαＣＤ２８遺伝子（αＣＤ２８ｃｓｔ遺伝子）を構築した。ここで得られるαＣＤ２８ｃｓｔ遺伝子を含むＮｏｔＩ断片の全長は６の倍数（６ｎ）となるようにデザインしている。
【００３６】
【表１】
合成に使用したｏｌｉｇｏ  ＤＮＡの配列および名称
2004357689.tif 000002
2004357689.tif 000003
【００３７】
（ｉｉ）  αＣＤ２８遺伝子搭載Ｆ欠失型ＳｅＶ  ｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ）の遺伝子構築
上記で構築したＮｏｔＩ断片の遺伝子配列を確認した後、このプラスミドから、同ＮｏｔＩ断片を切り出し、ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を搭載したＦ遺伝子欠失型ＳｅＶ  ｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ）（Ｌｉ，  Ｈ．−Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４（１４）  ６５６４−６５６９  （２０００））の＋１８位（ＮｏｔＩ部位）へ挿入し、ｐＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰを構築した。
【００３８】
（ｉｉｉ）  αＣＤ２８遺伝子搭載Ｆ欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ）の再構成
ウイルスの再構成はＬｉらの報告（Ｌｉ，  Ｈ．−Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４．  ６５６４−６５６９  （２０００），  ＷＯ００／７００７０）に従って行った。Ｆ遺伝子欠失型ウイルスを再構成させるため、Ｆ蛋白のヘルパー細胞を利用した。当該ヘルパー細胞作製にはＣｒｅ／ｌｏｘＰ発現誘導システムを利用している。当該システムはＣｒｅ  ＤＮＡ  リコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ（Ａｒａｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：  １１１５−１１２１  （１９８８））を利用したものであり、同プラスミドのトランスフォーマントにＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウイルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ）をＳａｉｔｏらの方法（Ｓａｉｔｏ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  ２３，  ３８１６−３８２１  （１９９５），  Ａｒａｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２，  １１１５−１１２１  （１９９８））で感染させて挿入遺伝子を発現させた。ＳｅＶ−Ｆ蛋白の場合、Ｆ遺伝子を有する同トランスフォーマント細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７と記載し、ＡｘＣＡＮＣｒｅで誘導後Ｆ蛋白を持続発現している細胞をＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａと記載することにする。
【００３９】
ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰの再構成は、以下のようにして行った。則ち、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を  ５×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで直径１００  ｍｍのシャーレに播き、２４時間培養後、ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７を室温で１時間感染させた（ＭＯＩ＝２）。細胞を血清を含まないＭＥＭで洗浄した後、プラスミドｐＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ，  ｐＧＥＭ／ＮＰ，  ｐＧＥＭ／Ｐ，  ｐＧＥＭ／Ｌ及びｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮをそれぞれ１２μｇ，  ４μｇ，  ２μｇ，  ４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁し、１μｇ  ＤＮＡ／５μＬ相当のＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを入れて混合し、室温で１５分間放置後、最終的に３％  ＦＢＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ３  ｍＬに入れ、細胞に添加して培養した。５時間培養後血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬの  ＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで培養した。２４時間培養後、８．５×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈあたりにＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａを重層し、４０μｇ／ｍＬの  ＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含むＭＥＭで更に２日間３７℃で培養した。これらの細胞を回収し、ペレットを２  ｍＬ／ｄｉｓｈあたりの  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁、凍結融解を３回繰り換えしてＰ０  ｌｙｓａｔｅを調製した。一方で、ＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａを２４  ｗｅｌｌプレートに播き、ほぼコンフルエントの時に３２℃に移し１日間培養した細胞を準備した。この細胞にＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰのＰ０  ｌｙｓａｔｅを各２００μＬ／ｗｅｌｌでトランスフェクションし、４０μｇ／ｍＬの  ＡｒａＣ及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎを含み血清を含まないＭＥＭを用い３２℃で培養した。Ｐ１  培養上清を用いてＰ２以降、６  ｗｅｌｌプレートに播いたＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７／Ａ細胞を用いて、同様の培養をＰ３までくり返した。
Ｐ３の５日目の試料（Ｐ３ｄ５）のウイルス力価は７×１０６  ＣＩＵ／ｍＬであった。
【００４０】
（ｉｖ）  ＲＴ−ＰＣＲによるウイルスゲノムの確認
Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶであるＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰのウイルス溶液（Ｐ３  ｓａｍｐｌｅ）からのウイルスＲＮＡの回収は、ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｂｏｔｈｅｌｌ，  ＷＡ）を利用して行い、ＲＴ−ＰＣＲは１  ｓｔｅｐでＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を利用して行った。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｆ６（５’−ＡＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＡＴＧＧ−３’）／Ｒ１９９（５’−ＧＡＴＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＧＡＣＴ−３’）（それぞれ配列番号：２０および２１）の組み合わせをプライマー対として使用して行った。目的の大きさの遺伝子の増幅が確認され、ウイルス遺伝子上にαＣＤ２８ｃｓｔ遺伝子が搭載されていることが確認された（図９）。
【００４１】
（ｖ）  ＳｅＶ搭載遺伝子に由来する蛋白質発現の確認
６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでｃｏｎｆｌｕｅｎｔになったＬＬＣ−ＭＫ２にＭＯＩ  １で  ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰを感染し、血清を含まないＭＥＭ培地１ｍｌを添加して３７℃（５％  ＣＯ２存在下）で培養した。感染１日後にＭＥＭ培地を交換し、４日後に培養上清を回収して試料とした。ネガティブコントロール（ＮＣ）として、ＧＦＰ遺伝子を搭載したＦ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ）を同条件で感染して、培養上清を回収した。試料は、ＰＡＧＥ  ｐｒｅｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ａｎｄ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、３００μＬの培養上清を４０μＬに濃縮し、これをＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動用の試料としてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇは５μＬ／ｌａｎｅでアプライした。一方、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）染色には、同様の操作で６００μＬの培養上清を４０μＬに濃縮し、これを１０μＬ／ｌａｎｅでアプライして試験を行った。Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇの検出用の抗体にはＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ，  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｌｉｎｋｅｄｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （ｆｒｏｍ  ｓｈｅｅｐ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。結果を図１０に示す。約２９ｋＤａのバンドが検出され、アミノ酸配列から予想される分子量と一致した。
【００４２】
２．抗ＣＤ２８抗体遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶの機能評価
構築した抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ２８ｃｓｔ）遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ）の機能評価の一環として、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現持続性を実施例１に示したマウス耳介投与による評価法にて評価した。この時、抗ＣＤ２８抗体遺伝子を搭載せずＧＦＰ遺伝子を搭載しているＦ遺伝子欠失型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ）をコントロールとして持続性の差を調べた。またこの時、感染初期にはαＣＤ２８ｃｓｔ蛋白の発現はない（非常に少ない）ことからその時期の蛋白の発現を補うことを目的として、αＣＤ２８ｃｓｔ蛋白と同様の機能が期待されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白質を、ＳｅＶ投与当日に投与した系も評価した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白質は市販されており（Ａｎｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）使用可能であるが、今回は既に報告されているものと類似の方法で調製したものを使用した（Ｉｗａｓａｋｉ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７３（３）  ３３４−３４０  （２００２）；  Ｈａｒａｄａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｒｏｌ．  Ｒｅｓ．  ２８（１）  ６９−７４  （２０００）；  Ｉｗａｓａｋｉ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７３（３）  ３３４−３４０  （２００２）；  Ｇｌｙｓｉｎｇ−Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４（１２）  １６４１−１６４５  （１９９７））。
【００４３】
実施例１に示したように、ＧＦＰ遺伝子を有するＳｅＶベクターをマウス耳介に投与すると、感染細胞に発現しているＧＦＰ蛋白の蛍光を非侵襲的に外部から観察可能である。この系を用いることにより、同一個体を利用して経時的にＳｅＶベクター由来発現蛋白（ＧＦＰ）の発現が観察でき、発現持続性の評価に非常に適している。ＧＦＰ遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ：５ｘ１０６  ＣＩＵ／５μＬ）或いはＧＦＰ遺伝子とともに抗ＣＤ２８抗体遺伝子を搭載しているＦ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ：５ｘ１０６  ＣＩＵ／５μＬ）をマウス耳介に投与し、経時的にＧＦＰ蛋白の発現を観察した。更に、両投与群の一部のマウスには、ＳｅＶ感染１時間後及び１０時間後に、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白質を０．５  ｍｇ／ｂｏｄｙで腹腔内に投与した（それぞれｎ＝２）。まず、補助刺激因子抑制を目的とした抗体遺伝子（この場合はαＣＤ２８ｃｓｔ）を搭載したＳｅＶベクターがｉｎ  ｖｉｖｏでも感染することが確認された（図１１）。ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦとはＧＦＰ発現量に差が見られるが、この点については後述する。持続性に関しては、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ投与群で、非常に僅かながら対照に比べＧＦＰ蛋白の発現持続が観察された。則ち、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ投与群では、投与５日後までは明らかなＧＦＰ発現が見られるものの、投与６日後にほとんど見えなくなる様な急激な消失が観察されるのに対して、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ投与群では、その減少が僅かながら緩やかであり、投与６日後でもＧＦＰ蛋白の蛍光が観察された（図１１）。ＳｅＶ感染当日のＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白質の投与効果もはっきりと表れた。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白質を投与することにより、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ投与群、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ投与群ともにＧＦＰ蛋白発現の増強が観察され、更にＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ投与群においては、感染６日後でも比較的はっきりとしたＧＦＰ蛋白の蛍光が観察された（図１２）。ＧＦＰ蛍光の写真から、画像処理ソフトＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）にて緑色蛍光を抽出した後、画像解析ソフトＮＩＨ  ｉｍａｇｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  ＵＳＡ）にて蛍光強度を定量化した結果を図１３に示した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白質を投与した場合のＧＦＰ蛋白発現の増強ととともに、僅かではあるがαＣＤ２８ｃｓｔ遺伝子を搭載することによるＳｅＶ搭載遺伝子由来蛋白（この場合はＧＦＰ）発現持続への効果が確認された。この結果は、補助刺激因子活性を抑制することによるベクターからの遺伝子発現の持続性への効果を表すものであり、当該コンセプトの確かさを意味している。また、ＳｅＶベクターの感染だけでは発現の持続への影響は少なくても、感染初期に同メカニズムを期待する蛋白を同時投与することで、発現の持続を延長し得る可能性を示している。
【００４４】
ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ投与群において、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ投与群よりもＧＦＰ蛋白の蛍光が弱かったことについて、以下ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系で確認を行った。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ或いはＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰをＭＯＩ＝５で感染し、経時的に蛍光顕微鏡下でＧＦＰ蛋白の発現を観察した（図１４）。感染１６時間後ではＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ感染細胞ではＧＦＰが観察されるのに対して、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞では観察されなかった。ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞では、感染２４時間後以降発現したＧＦＰ蛋白の蛍光が観察されるものの、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ感染細胞よりも常に弱く、発現量が低いことが確認された。ＳｅＶにおいてはゲノム搭載遺伝子の発現量の違いについて、極性効果が知られている（Ｇｌａｚｉｅｒ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ２１  （３），  ８６３−８７１  （１９７７）；  Ｈｏｍａｎｎ，  Ｈ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７７  （１），  １３１−１４０  （１９９０））。則ち、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのｒｅｓｔａｒｔ効率が高くないために、ゲノムの３’端に搭載した遺伝子ほど発現量が高く、５’端のものほど発現量は低くなる。実際に同じマーカー遺伝子を様々な位置に搭載することで、極性効果を証明するとともに発現量制御のデザインが示されている（Ｔｏｋｕｓｕｍｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ８６，  ３３−３８  （２００２））。今回検出に利用しているＧＦＰ遺伝子は、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦでは３’端に、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰでは欠失しているＦ遺伝子の位置に搭載しており、ＧＦＰ蛋白量はＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦで高く、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰでは相対的に低くなるデザインになっている。但し、他のＳｅＶ蛋白は両ベクターで同様に（同量程度）発現していると予想されることから、免疫原性の原因となる蛋白は同量程度で、検出蛋白（ＧＦＰ）のみＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞で少なくなっていると考えられる。以上のことを考慮すると、耳介投与系において、ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ投与群で確認された僅かながらの遺伝子発現の延長に関して、実際にはＧＦＰ観察で予想されるよりも更に延長効果があることが示唆される。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、インビボ投与した遺伝子導入ベクターからの遺伝子発現を非侵襲的に評価する方法が提供された。本方法により、インビボ投与したベクターの発現持続性および繰り返し投与における遺伝子発現レベルの変化を極めて簡便に測定することが可能となる。本方法は、新たなインビボ遺伝子導入ベクターの開発、および遺伝子治療における発現レベルのモニタリングや投与プロトコルの作成などにおいて有用である。
【００４６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＦＰ遺伝子搭載ＳｅＶベクターマウス耳介投与後のＧＦＰ由来蛍光の経時変化を示す図である。ＧＦＰ遺伝子を有する伝播型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ：５ｘ１０６  ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）或いはＦ遺伝子欠失型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ：５ｘ１０６  ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）をマウス耳介に投与し、ＧＦＰ蛋白の蛍光を外部から経時的に観察した。
【図２】耳介投与法の定量性評価を示す図である。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  遺伝子搭載  ＳｅＶ  ベクターでの評価：（Ａ）  投与タイター依存性。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を搭載している伝播型ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋Ｌｕｃｉ）の投与タイターを変えてマウス耳介に投与し（５ｘ１０４，  ５ｘ１０５，  ５ｘ１０６  ＣＩＵ／５μＬ）、投与２日後に耳介を切除後、組織をホモジナイズし、  Ｌｅｃｉｆｅｒａｓｅ活性を調べた  （ｎ＝３）。投与タイター依存的なＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性の変化が見られた。（Ｂ）  経時変化。ＳｅＶ１８＋Ｌｕｃｉ（５ｘ１０６  ＣＩＵ／５μＬ）をマウス耳介に投与し、経時的にそれぞれの耳介を切除後、組織をホモジナイズし、  Ｌｅｃｉｆｅｒａｓｅ活性を調べた  （ｎ＝３）。
【図３】耳介投与法の定量性評価を示す図である。ＧＦＰ遺伝子搭載  ＳｅＶ  ベクターでの評価：ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ（５ｘ１０６  ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）をマウス耳介に投与し、ＧＦＰ蛋白の蛍光を外部から経時的に観察した  （ｎ＝４）。（Ａ）  ＧＦＰ蛍光写真を示す。（Ｂ）  ＧＦＰ蛍光強度の定量化。画像処理ソフトＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにて緑色蛍光を抽出した後、画像解析ソフトＮＩＨ  ｉｍａｇｅにて蛍光強度の定量を行った。
【図４】繰り返し投与での評価法という観点からの耳介投与法の有用性を示す図である。マウス右耳の耳介にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６  ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）を投与し（一回目投与）、次に投与１，  ２，  ４，  ６，  ８，  ２８，  ６２日後に、左耳耳介へＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６  ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）を投与した（二回目投与）。それぞれの投与後、経時的にＧＦＰ蛍光の強度変化を調べた。（Ａ）  ＧＦＰ蛍光写真を示す。（Ｂ）  ＧＦＰ蛍光強度の定量化。
【図５】耳介投与法による感染細胞の同定を示す図である。マウス耳介にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６  ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）を投与し、感染２日後に耳介を切除し、凍結切片を作成、蛍光顕微鏡下ＧＦＰ蛍光を観察した  （Ａ）。同連続切片を抗ＧＦＰ抗体で染色した  （Ｃ）。（Ｂ）  はこれらの重ね合わせを示す。
【図６】耳介投与法による感染細胞の同定を示す図である。マウス耳介にＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ（５ｘ１０６  ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬ）を投与し、感染２日後に耳介を切除し、凍結切片を作成、蛍光顕微鏡下ＧＦＰ蛍光を観察した（図５とは別の個体）。
【図７】抗ＣＤ２８抗体遺伝子断片（ＳＹＮ２０５−１３）の合成に使用したｏｌｉｇｏ  ＤＮＡの配置を示す図である。
【図８】抗ＣＤ２８抗体遺伝子を搭載するＳｅＶベクターｃＤＮＡ構築の概略を示す図である。
【図９】抗ＣＤ２８抗体遺伝子を搭載するＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ）のＲＴ−ＰＣＲによるウイルスゲノムの確認を示す図である。
【図１０】αＣＤ２８遺伝子を搭載するＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ）からの抗体の発現を示す図である。
【図１１】抗ＣＤ２８抗体（αＣＤ２８ｃｓｔ）ＧＦＰ遺伝子搭載ＳｅＶベクター（ＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰ）のマウス耳介投与後のＧＦＰ由来蛍光の経時変化を示す図である。５ｘ１０６  ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬをマウス耳介に投与し、ＧＦＰ蛋白の蛍光を外部から経時的に観察した。ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ投与群との比較を行った。
【図１２】感染初期のＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白投与を併用した場合のＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰのマウス耳介投与後のＧＦＰ由来蛍光の経時変化を示す図である。５ｘ１０６  ＧＦＰ−ＣＩＵ／５μＬをマウス耳介に投与し、投与１時間後及び１０時間後にＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白を０．５  ｍｇ／ｂｏｄｙで腹腔内に投与し、ＧＦＰ蛋白の蛍光を外部から経時的に観察した。同じ処理をしたＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ投与群との比較を行った。
【図１３】ＧＦＰ蛍光強度の定量化を示す図である。図１１及び図１２の蛍光写真を基に、画像処理ソフトＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにて緑色蛍光を抽出した後、画像解析ソフトＮＩＨ
ｉｍａｇｅにて蛍光強度の定量を行った。
【図１４】ＧＦＰ遺伝子の搭載位置の違いによるＧＦＰ由来蛍光強度の違いを示す図である（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの確認）。ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ或いはＳｅＶ１８＋αＣＤ２８ｃｓｔ／ΔＦ−ＧＦＰをＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＭＯＩ＝３で感染し、経時的にＧＦＰ蛍光を観察した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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