(57)【要約】【課題】耐熱性で、かつ広い基質特異性を有する糖ヌクレオチド合成酵素を提供し、糖鎖合成の基質となる糖ヌクレオチドを安定的に合成する。【課題解決手段】超好熱古細菌  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  の全ゲノム遺伝子情報から糖ヌクレオチド合成酵素の遺伝子を見出し、該遺伝子を用いて遺伝子工学的手段により、耐熱性で、かつ広い基質特異性を有する糖ヌクレオチド合成酵素を製造するとともに、これを用いて糖ヌクレオチドを安定的に合成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４、５又は６に記載のアミノ酸配列を有するか、あるいは、配列番号４、５又は６に記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ糖ヌクレオチド合成活性を有することを特徴とする、蛋白質。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号７、８又は９に記載の塩基配列を有することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号７、８又は９に記載のＤＮＡ  とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖ヌクレオチド合成活性を有する蛋白質をコードすることを特徴とする、ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２〜４に記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡがベクターに組み込まれていることを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載の組換え体ＤＮＡが宿主細胞に導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物から糖ヌクレオチド合成活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする、糖ヌクレオチド合成活性を有する蛋白質の製造方法。
【請求項８】
糖一リン酸及びヌクレオシド三リン酸に、請求項１に記載の蛋白質を作用させることを特徴とする、糖ヌクレオチドの製造方法。
【請求項９】
糖一リン酸及びヌクレオシド三リン酸に、請求項６に記載の形質転換体の培養液あるいは培養物の処理物を作用させることを特徴とする、糖ヌクレオチドの製造方法。
【請求項１０】
糖一リン酸及びヌクレオシド三リン酸に、請求項３又は４に記載のＤＮＡ  にコードされるタンパク質を作用させることを特徴とする、糖ヌクレオチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、糖ヌクレオチド合成活性を有する耐熱性蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いた糖ヌクレオチド合成活性を有する蛋白質の製造法、および該蛋白質あるいは該形質転換体を用いた糖ヌクレオチドの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖ヌクレオチド（ＴＤＰ−Ｇｌｕｃｏｓｅ）合成活性を有する酵素としては結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（非特許文献１参照）やシュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）  （非特許文献２参照）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）  （非特許文献３参照）由来のＲｍｌＡ  （Ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の詳しい性質がすでに報告されている。ＲｍｌＡはラムノース合成に必須な代謝経路の初発酵素であり、グルコース−１−リン酸とヌクレオシド三リン酸を基質として、ヌクレオシド三リン酸グルコースを生産する。その他にも、ヒトや酵母から糖ヌクレオチドを合成する酵素が見出されているが、その多くが常温生物由来のため室温以上では極めて不安定で、活性は８０℃程度の加熱処理により速やかに失活する。このため、使用時の滅菌等の処理が必要であったり、低温での注意深い保存が必要であった。
【０００３】
【非特許文献１】Ｙｕｆａｎｇ  Ｍａ，  Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ａ．  Ｍｉｌｌｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｔ．  Ｂｅｌｉｓｌｅ，  Ｖａｒａ  Ｖｉｓｓａ，  Ｍａｒｋ  Ｈｏｗｅｌｌ，  Ｋｅｌｌｙ  Ｂｏｗｌｉｎ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ．  Ｓｃｈｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  ＭｃＮｅｉｌ  ”Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｒｈａｍｎｏｓｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ：  ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ“  （１９９７）    Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １４３，  ９３７−９４５．
【非特許文献２】Ｗｕｌｆ  Ｂｌａｎｋｅｎｆｅｌｄｔ，  Ｍｉｒｙａｍ  Ａｓｕｎｃｉｏｎ，  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓ．  Ｌａｍ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｈ．  Ｎａｉｓｍｉｔｈ  “Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  （ＲｍｌＡ）”  （２０００）  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １９，  ６６５２−６６６３．
【非特許文献３】Ｌｅｎｎａｒｔ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，  Ｒｕｄｏｒｆ  Ｋａｉｓｅｒ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｒ．  Ｒｅｅｖｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｆ  Ａ．  Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＨＰＬＣ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｌｏｎｅｄ  ｒｆｂＡ  ｇｅｎｅ”  （１９９３）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２１１，  ７６３−７７０．
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
糖ヌクレオチドを合成する活性を有する耐熱性酵素が発見されれば、糖鎖合成の基質となる糖ヌクレオチドを安定に合成することが可能となる。また、糖鎖合成の際の基質として必要な様々な種類の糖を基質とし、さらにＵＴＰ・ＧＴＰ等の様々な種類のヌクレオシド三リン酸を基質として、結合反応を触媒出来る酵素が見出されると高価で不安定な多種類の糖ヌクレオチドの合成を可能とする。更にそれらの反応を行う安定な酵素は渇望されていた。
【０００５】
したがって、本発明の課題は、耐熱性を有し、かつ様々な糖、ヌクレオシド三リン酸を基質として、糖ヌクレオチドを合成することが可能な、新規酵素を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、以上のような課題を解決すべく、７５  −  ８０℃で生育する超好熱古細菌  Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ｓｔｒａｉｎ７に着目し、その全ゲノム遺伝子情報から本酵素活性を有すると推測される遺伝子を検索した。さらに、大腸菌を使ってその遺伝子から酵素を生産し、この酵素が高温（８０℃）で安定に存在し、かつ糖ヌクレオチド合成活性を示すことを確認し、さらに、本酵素を用いることにより様々な種類の糖ヌクレオチドを生産することもできることを見いだし、本発明を完成するに至ったものである。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１０）に係るものである。
（１）  配列番号４、５又は６に記載のアミノ酸配列を有するか、あるいは、配列番号４、５又は６に記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ糖ヌクレオチド合成活性を有することを特徴とする、蛋白質。
（２）  上記（１）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３）  配列番号７、８又は９に記載の塩基配列を有することを特徴とするＤＮＡ。
（４）  配列番号７、８又は９に記載のＤＮＡ  とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖ヌクレオチド合成活性を有する蛋白質をコードすることを特徴とする、ＤＮＡ。
（５）    上記（２）〜（４）に記載のＤＮＡから選ばれるＤＮＡがベクターに組み込まれていることを特徴とする組換え体ＤＮＡ。
（６）    上記（５）に記載の組換え体ＤＮＡが宿主細胞に導入されていることを特徴とする形質転換体。
（７）    上記（６）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物から糖ヌクレオチド合成活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする、糖ヌクレオチド合成活性を有する蛋白質の製造方法。
（８）  糖一リン酸及びヌクレオシド三リン酸に、上記（１）に記載の蛋白質を作用させることを特徴とする、糖ヌクレオチドの製造方法。
（９）  糖一リン酸及びヌクレオシド三リン酸に、上記（６）に記載の形質転換体の培養液または培養物の処理物を作用させることを特徴とする、糖ヌクレオチドの製造方法。
（１０）  糖一リン酸及びヌクレオシド三リン酸に、上記（３）又は（４）に記載のＤＮＡ  にコードされるタンパク質を作用させることを特徴とする、糖ヌクレオチドの製造方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に、本願発明を具体的に説明する。
本発明で使用した超好熱古細菌は、好酸性好気性超好熱古細菌スルフォロバス、トーコーダイイ（ＪＣＭ登録番号ＪＣＭ１０５４５）である。本超好熱古細菌の全ゲノム情報から本酵素活性を示すと推定した３つの遺伝子領域を、ＰＣＲ反応で増幅・抽出し、蛋白質発現プラスミドｐＥＴ２１ｂに挿入後、そのプラスミドにより形質転換した大腸菌を用いて本酵素の生産をおこなった。生産された酵素は加熱処理およびカラムクロマトグラムで単離精製した。精製された酵素のうちＳＴＲｍｌＡ１は、分子量が約４４，０００のタンパク質で、様々な糖ヌクレオチドを合成する活性を有する酵素であることが判明した。
【０００９】
この酵素の半減期は、５０ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で、８０℃、４０分以上であり、高い耐熱性を示した。
このＳＴＲｍｌＡ１のアミノ酸配列およびその遺伝子ＤＮＡ（ＳＴ０４５２）の塩基配列を、それぞれ配列表の配列番号４及び７に示す。
また、上記残り２つの遺伝子領域（によりコードされる酵素（ＳＴＲｍｌＡ２、    ＳＴＲｍｌＡ３）のアミノ酸配列をそれぞれ同配列番号５、６に示し、これらの遺伝子ＤＮＡ（ＳＴ１９７１、ＳＴ２３５２）の塩基配列をそれぞれ同配列番号８、９に示す。
【００１０】
本発明における酵素は、上記配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列を有するもののみに限定されず、該アミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であっても、このアミノ酸配列を有する蛋白質が、糖ヌクレオチド合成活性を示すものも含む。また、本発明のこれら酵素遺伝子ＤＮＡについても、上記同配列番号７〜９に示す塩基配列を有するもののみに限定されず、上記アミノ酸配列をコードするものを包含する。さらに上記配列番号７〜９のいずれかに示されるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖ヌクレオチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ  も包含する。このストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション溶液１リットル中に５２．５９  ｇ  ＮａＣｌ、２６．４６  ｇ  クエン酸ナトリウム、１  ｇ  フィコール（Ｔｙｐｅ  ４００）、１  ｇ  ポリビニルピロリドン、１  ｇ  ウシ血清アルブミン、５  ｇ  ＳＤＳ、１  ｇ  断片化鮭精子ＤＮＡ、５００  ｍｌ  ホルムアミドを含み、温度４２℃で行う。その後の洗浄は、洗浄用溶液１リットル中に１７．５３  ｇ  ＮａＣｌ、８．８２  ｇ  クエン酸ナトリウム、５  ｇ  ＳＤＳを含み、温度６８℃で行う条件である。
【００１１】
本発明の酵素を得るには、通常の遺伝子工学的手法が適用でき、上記各種酵素遺伝子ＤＮＡを、例えば、ｐＥＴ２１ｂ、ｐＨＹ４８１等の蛋白質発現プラスミドベクター等に挿入して組み換えベクターを作製し、該組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を培地で培養し、培養物、培養処理物あるいはこれら培養物から分離回収された形質転換体から、酵素を常法の蛋白質精製手段により精製し単離する。上記宿主細胞としては、大腸菌・枯草菌等が利用可能である。
【００１２】
本発明においては、さらにこの酵素を用いて、糖ヌクレオチドを合成するが、この合成においては、糖一リン酸とヌクレオシド三リン酸を含有する溶液に、該酵素を添加し、反応温度６０℃〜９５℃で反応させ、糖ヌクレオチドを得る。
糖一リン酸としては、例えば、グルコース−１−フォスフェート、マンノース−１−フォスフェート、フルクトース−１−フォスフェート等の糖―１―リン酸等が挙げられ、ヌクレオシド三リン酸としては、例えばＴＴＰ（チミジントリフォスフェート）、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシントリフォスフェート）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシントリフォスフェート）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジントリフォスフェート）、ＧＴＰ（グアノシントリフォスフェート）、ＵＴＰ（ウリジントリフォスフェート）等が挙げられる。
【００１３】
この反応式として、グルコース−１−フォスフェートとＴＴＰからグルコースヌクレオチドを合成する場合について以下に示す。
【化１】
2004357634.tif 000002
【００１４】
また、この反応においては。上記精製した酵素のみならず、粗酵素であってもよい。例えば、宿主として枯草菌等分泌型の系を用いる場合には、培養液中に本酵素が生成蓄積され、大腸菌等の非分泌型の系を用いる場合には、菌体内に生成されるので、本酵素を含有する培養液あるいはその処理物、もしくは菌体破砕物等の培養処理物を用いて、糖ヌクレオチドを合成してもよい。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明実施例により限定されるものではない。
【００１５】
【実施例１】
糖ヌクレオチド合成酵素の製造
（１）菌の培養
好酸性好気性超好熱古細菌スルフォロバス、トーコーダイイＪＣＭ１０５４５は次の方法で培養した。
１．３ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２８ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１．８ｍｇ  のＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、４．５ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、０．２２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｍｇのＶＯＳＯ４・ｘＨ２Ｏ、０．０１ｍｇのＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇの酵母エキスを１Ｌの蒸留水に溶かし、この溶液のｐＨを３．５に１０規定Ｈ２ＳＯ４溶液で調製した。加圧殺菌した後、ＪＣＭ１０５４５を植菌した。この培養液を８０℃で１〜２日培養し、その後遠心分離し集菌した。
【００１６】
（２）染色体ＤＮＡの調製
ＪＣＭ１０５４５の染色体ＤＮＡは以下の方法により調製した。
培養終了後５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により菌体を集菌する。菌体を１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ６．０）溶液で洗浄後、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ−５０  ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ８．５）溶液を加えて細胞を溶解させる。さらに、０．５％  Ｎａ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ、１  ｍｇ／ｍｌ  プロテアーゼＫとなるように各々を加えた後、５０℃で３時間保温する。フェノール処理を３回行った後、溶液を１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ８．０）溶液に対して透析する。３７℃で３０分間のＲＮａｓｅによるＲＮＡの分解後、フェノールクロロフォルム溶液で処理した後、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−１  ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０）で透析を行う。
【００１７】
（３）染色体ＤＮＡを含むショットガンライブラリークローンの作製
実施例２で得られた染色体ＤＮＡを超音波処理することにより断片化した後、アガロースゲル電気泳動により１ｋｂ及び２ｋｂ長のＤＮＡ断片を回収した。この断片をプラスミドベクターｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩ制限酵素部位に挿入したショットガンライブラリーを作製した。各ショットガンクローンの末端塩基配列を、ＡＢＩ社製自動塩基配列読み取り装置３７７を用いて解読していった。各ショットガンクローンから得られた塩基配列を塩基配列自動連結ソフトＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒを用いて連結編集し、本菌の全塩基配列を決定していった。
【００１８】
（４）ＳＴＲｍｌＡ１−３遺伝子の同定
上記手法で決定された好酸性好気性超好熱古細菌スルフォロバス、トーコーダイイのゲノム塩基配列の大型計算機による解析を行い、グルコース１リン酸チミジル酸結合酵素の機能を含むであろうタンパク質をコードする遺伝子（ＳＴ０４５２，  ＳＴ１９７１，  ＳＴ２３５２）を３個同定した。この３個の内、超好熱性古細菌スルフォロバストーコーダイイのＳＴ０４５２遺伝子の開始コドンはＡＴＧで、４０１アミノ酸残基のタンパク質をコードする遺伝子として同定された。
【００１９】
（５）発現プラスミドの構築
構造遺伝子領域の前後に制限酵素（ＮｄｅＩとＸｈｏＩ）サイトを構築する目的でＤＮＡプライマーを合成し、ＰＣＲでその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。その際に合成されるタンパク質のＣ末端にヒスチジン残基をタグとして結合するように合成されるようにする場合とＳＴ０４５２遺伝子がコードするタンパク質のみを合成させるようにする場合とでプライマーの配列が異なる。
【００２０】
Ｕｐｐｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ，
５’−  ＡＴＡＧＣＡＴＡＴＧＡＡＧＧＣＡＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣ  −３’（配列番号１）
（下線部はＮｄｅＩサイトを示す）
Ｌｏｗｅｒ  ｐｒｉｍｅ  １，  ヒスチジン残基を結合させる場合
５’−  ＴＣＡＡＣＴＣＧＡＧＧＡＣＣＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＣＣ−３’（配列番号２）
（下線部はＸｈｏＩサイトを示す）
Ｌｏｗｅｒ  ｐｒｉｍｅ  ２，  ヒスチジン残基を結合させ無い場合
５’−  ＴＣＡＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＡＣＣＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＣＣ  −３’（配列番号３）
（下線部はＸｈｏＩサイトを示す）
【００２１】
Ｕｐｐｅｒ  ｐｒｉｍｅｒとＬｏｗｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ１或いはＬｏｗｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ２を組み合わせたＰＣＲ反応後、制限酵素（ＮｄｅＩとＸｈｏＩ）で完全分解（３７℃で２時間）した後、その構造遺伝子領域断片を精製した。
制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで切断後精製したｐＥＴ２１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）と上記の構造遺伝子（ＳＴ０４５２）領域断片とをＴ４リガーゼを用いて１６℃、２時間反応させることによって連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製し、塩基配列を確認して発現プラスミド、ｐＥＴ２１ｂ／ＳＴ０４５２−１及びｐＥＴ２１ｂ／ＳＴ０４５２−２を得た。発現プラスミドｐＥＴ２１ｂ／ＳＴ０４５２−１を用いるとＳＴＲｍｌＡ１はＣ末端にヒスチジンタグが付加された融合タンパク質として生産され、発現プラスミドｐＥＴ２１ｂ／ＳＴ０４５２−２を用いるとＳＴＲｍｌＡ１はＣ末端にヒスチジンタグが付加されないタンパク質として生産される。
【００２２】
（６）組換え遺伝子の発現
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＩＬ，、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセルを融解して、二本のファルコンチューブに各々０．１ｍｌづつ移す。その中に上記の２種の発現プラスミド１０ｎｇ分に相当する溶液を別々に加え氷中に３０分間放置した後４２℃でヒートショックを３０秒間行い、そこにＳＯＣ培地０．９ｍｌを加え、３７℃で１時間振とう培養する。その後、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＩＬ／ｐＥＴ２１ｂ／ＳＴ０４５２−１及び形質転換体大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＩＬ／ｐＥＴ２１ｂ／ＳＴ０４５２−２を得た。
【００２３】
当該形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地（２リットル）中で一晩３７℃において培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を１ｍＭになるように加え、さらに３０℃で５時間培養した。培養後遠心分離（６，０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ）により集菌を行った。
【００２４】
（７）ＳＴＲｍｌＡ１酵素の精製
８リットル培養液から集菌した菌体に２倍量の４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１錠のプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ，  Ｒｏｃｈｅ社製）、０．５ｍｇのＤｎａｓｅ  ＲＱ１（プロメガ社製）を加え懸濁液を得た。得られた懸濁液を超音波破砕し、７５℃で１０分保温した後、遠心分離（１１，０００  ｒｐｍ、２０分）により上清液を得た。この上清液を用いＮｉ−カラム（Ｎｏｖａｇｅｎ，    Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｎ  ＆    Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ  ｋｉｔを使用）による親和性クロマトグラムを行った。ここで得られた０．５  Ｍイミダゾール溶出画分（２０ｍｌ）を、再度７５℃で１０分加熱処理し、遠心分離（１１，０００  ｒｐｍ、２０分）により上清液を得た。次にこの上清液を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したＨｉＴｒａｐ  ｐｈｅｎｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）カラムに吸着させ、同緩衝液中のＮａＣｌ濃度を２．５Ｍから１Ｍに低下させることにより、目的タンパク質の溶出を行った。さらに、セントリプレップＹＭ−５０  （アミコン社）で２ｍｌまで濃縮し、これを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌで透析し、精製サンプルとした。
【００２５】
【実施例２】糖ヌクレオチドの合成
（１）糖ヌクレオチド合成反応（糖とヌクレオチド結合反応）
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、１２  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２４  ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１  ｍＭ  ＴＴＰ、１  Ｕのｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅからなる酵素反応液３００μｌ中に実施例１で得られた精製酵素０．０１３５  ｍｇを加えた。この酵素反応液を８０℃で保温することにより、反応させた。５分１０分１５分２０分２５分後に３０μｌ  を分取し、３００  μｌ  の５００  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４溶液に加える事により反応停止させた。
【００２６】
（２）  糖ヌクレオチド合成反応（糖とヌクレオチドの結合反応）の測定
ＨＰＬＣを用いて、反応生成物であるＴＤＰ−Ｇｌｕｃｏｓｅの量を、ヌクレオチド部分の紫外線の吸収を目安に測定した。図１に示すように標準物質であるＴＴＰ及びＴＤＰ−Ｇｌｕｃｏｓｅは、ＨＰＬＣにおいて溶出位置が全く異なる。さらに、図２に示すように標準サンプル添加量を変化させたときの、ピークの面積と標準物質量は正確な比例関係にあり、この検量線を用いることにより反応生成物を定量出来る事が示された。
そこで、上記（１）で反応させたサンプルに関しても、ＨＰＬＣで同様の解析を行った。
【００２７】
【実施例３】酵素の性質
（１）タンパク質化学的性質
当該酵素は上記の精製プロセスで完全に精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量約４４ＫＤａの単一バンドを示した（図３）。当該酵素は４０１アミノ酸残基より構成され（配列番号４）、そのアミノ酸配列から予測される分子量は４４，０００  Ｄａであった。また、結核菌ＲｍｌＡとの相同性は低いが、ヌクレオチド認識に関与するモチーフが保存されていた（図４）。
【００２８】
（２）  糖ヌクレオチド合成活性（糖とヌクレオチドの結合活性）
当該酵素は３７℃においては、図５に有るように糖ヌクレオチド合成活性をほとんど示さないが、８０℃においては高い酵素活性を示した。活性の発現には一度、８０℃２０分間の加熱処理が必須であるが、加熱後であっても３７℃での活性は非常に低い（図６）。
【００２９】
（３）  熱安定性
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、１２  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２４  ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１  ｍＭ  ＴＴＰ、１  Ｕのｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅからなる酵素反応液３００μｌ中に、あらかじめ８０℃で５分１０分２０分３０分４０分６０分９０分１２０分間加熱した実施例１で得られた精製酵素０．０１３５  ｍｇを加えた。この酵素反応液を８０℃で５分間保温することにより、反応させた後に３０μｌ  を分取し、３００  μｌ  の５００  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４溶液に加える事により反応停止させた。反応の進行は、実施例２の（２）に有るようにＨＰＬＣで測定した。その結果、図７に示すように、本酵素は８０℃による９０分間の加熱処理後でも、５０％以上の活性を残すことから非常に安定で耐熱性が高いことが示された。
【００３０】
（４）ｐＨ依存性
１２  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２４  ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１  ｍＭ  ＴＴＰ、１  Ｕのｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅからなる酵素反応液３００μｌ中の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液のｐＨを（ｐＨ  ２）、（ｐＨ  ４）、（ｐＨ  ６）、（ｐＨ  ６．５）、（ｐＨ  ７）、（ｐＨ  ７．５）、（ｐＨ  ８）、（ｐＨ  １０）に変化させた酵素反応液中に、実施例１で得られた精製酵素０．０１３５  ｍｇを加えた。この酵素反応液を８０℃で５分間保温することにより、反応させた後に３０μｌ  を分取し、３００  μｌ  の５００  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４溶液に加える事により反応停止させた。反応の進行は、実施例２の（２）に有るようにＨＰＬＣで測定した。
図８に示すように、本酵素の活性はｐＨ７．５において最も高い活性を示した。
【００３１】
（５）ヌクレオシド３リン酸基質の多様性
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、１２  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２４  ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１  Ｕのｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ及び１  ｍＭ  ｄＴＴＰまたは１  ｍＭ  ｄＡＴＰ、１  ｍＭ  ｄＧＴＰ、１  ｍＭ  ｄＣＴＰ、１  ｍＭ  ＵＴＰ、１  ｍＭ  ＡＴＰ、１  ｍＭ  ＧＴＰ、１  ｍＭ  ＣＴＰからなる酵素反応液３００μｌ中に実施例１で得られた精製酵素０．０１３５  ｍｇを加えた。この酵素反応液を８０℃で５分間保温することにより、反応させた後に３０μｌ  を分取し、３００  μｌ  の５００  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４溶液に加える事により反応停止させた。反応の進行は、実施例２の（２）に有るようにＨＰＬＣで測定した。結果を表１に示す。表１から明らかなように、本酵素はｄＴＴＰ以外にｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＵＴＰを基質として利用出来ることが示された。
【００３２】
【表１】各種ヌクレオシド３リン酸の基質としての利用性
2004357634.tif 000003
【００３３】
（６）糖１リン酸基質の多様性
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、１２  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１  ｍＭ  ＴＴＰ、１  Ｕのｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ及び２４  ｍＭ  α−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅまたは２４  ｍＭ  Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２４  ｍＭ  α−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２４  ｍＭ  α−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅからなる酵素反応液３００μｌ中に実施例１で得られた精製酵素０．０１３５  ｍｇを加えた。この酵素反応液を８０℃で５分間保温することにより、反応させた後に３０μｌ  を分取し、３００  μｌ  の５００  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４溶液に加える事により反応停止させた。反応の進行は、実施例２の（２）に有るようにＨＰＬＣで測定した。表２に示すように、本酵素はα−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ以外にＤ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ及びα−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅを基質として利用出来ることが示された。
【００３４】
【表２】各糖一リン酸の基質としての利用性
2004357634.tif 000004
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、試験管内での様々な種類の糖ヌクレオチドを合成することが可能で、かつ熱等に安定な新規な糖ヌクレオチド合成酵素が提供できた。その結果、新規な糖ヌクレオチド合成が可能になった。
一方、糖ヌクレオチドは、糖タンパク質、糖脂質、多糖類の糖鎖合成に糖供与体として機能するものであり、これらの糖鎖合成は、癌転移、器官発生あるいは細胞性免疫等に密接に関連するものとして近年注目されており、本発明は、これら研究の発展において、その貢献度は極めて大きい。
【００３６】
【配列表】
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2004357634.tif 000007
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＰＬＣによる、ＴＴＰ、及びＴＴＰとＴＤＰ−Ｇｌｕｃｏｓｅ混合物の分離パターンを測定したグラフである。
【図２】ＨＰＬＣを用いたＴＤＰ−Ｇｌｕｃｏｓｅの検量線を示す図である。
【図３】精製されたＳＴＲｍｌＡ１蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す写真である。
【図４】結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の．ＲｍｌＡ蛋白質と本発明の酵素遺伝子（ＳＴ０４５２，ＳＴ１９７１，ＳＴ２３５２）によりコードされる各蛋白質のアミノ酸配列、及びこれらのタンパク質間で保存された配列モチーフを示す図である。
（なお、数字は、蛋白質アミノ基末端側からの残基数を示す。）
【図５】ＳＴＲｍｌＡ１蛋白質の３７℃における糖ヌクレオチド合成活性を示すグラフである。
【図６】ＳＴＲｍｌＡ１蛋白質の８０℃における糖ヌクレオチド合成活性を示すグラフである。
【図７】ＳＴＲｍｌＡ１蛋白質の８０℃処理における残存活性量を示す図である。
【図８】ＳＴＲｍｌＡ１蛋白質のｐＨの違いによる活性変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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