(57)【要約】【課題】有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４又はＯＡＴＰ−Ｆの発現細胞及びその利用方法の提供。【解決手段】ラット由来の有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４（Ｏａｔｐ１４：Ｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　１４）又はヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆ（ＯＡＴＰ−Ｆ：Ｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｆ）を発現する能力を有する組換え動物細胞、及び当該組換え動物細胞を利用した被検物質の体内動態予測方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラット由来の有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４（Ｏａｔｐ１４：Ｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　１４）を発現する能力を有する組換え動物細胞。
【請求項２】
組換え動物細胞が、ラット由来の有機陰イオントランスポーター１４遺伝子を導入したものである請求項１記載の組換え動物細胞。
【請求項３】
ラット由来の有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４遺伝子が、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるものである請求項２記載の組換え動物細胞。（ａ）　配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）　配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４の生理学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
組換え動物細胞が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９００８として寄託されたものである、請求項１〜３のいずれかに記載の組換え動物細胞。
【請求項５】
ヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆ（ＯＡＴＰ−Ｆ：Ｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｆ）を発現する能力を有する組換え動物細胞。
【請求項６】
前記組換え動物細胞が、ヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆ遺伝子を導入したものである請求項５記載の組換え動物細胞。
【請求項７】
ヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆ遺伝子が、以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡからなるものである請求項６記載の組換え動物細胞。
（ｃ）　配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）　配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆの生理学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項８】
組換え動物細胞が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９００９として寄託されたものである、請求項５〜７のいずれかに記載の組換え動物細胞。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の組換え動物細胞を用いて、被検物質がラット由来有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４又はヒト由来有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆの輸送基質となるか否かを判定する方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の組換え動物細胞を用いて、被検物質の体内動態を予測する方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の組換え動物細胞を使用することを特徴とする、ラット由来の有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４又はヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆによる被検物質の輸送特性を変化させる物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
被検物質が、甲状腺ホルモンＴ４、甲状腺ホルモンＴ３、セリバスタチン、トログリタゾンサルフェイト、エストラジオール−１７β−Ｄ−グルクロナイド、タウロリトコール酸サルフェイト、テストステロン、ジヒドロテストステロン、エストロン、ケトプロフェン、オフラトキシンＡ、Ｅ３０４０グルクロナイド、Ｅ３０４０サルフェイト、ロイシンエンケファリン、コレシストキニン−８及びロイコトリエンＥ４からなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれかに記載の組換え動物細胞を構成要素として含むことを特徴とする、ラット由来の有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４又はヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆによる被検物質の輸送特性を変化させる物質のスクリーニング用キット。
【請求項１４】
被検物質が、甲状腺ホルモンＴ４、甲状腺ホルモンＴ３、セリバスタチン、トログリタゾンサルフェイト、エストラジオール−１７β−Ｄ−グルクロナイド、タウロリトコール酸サルフェイト、テストステロン、ジヒドロテストステロン、エストロン、ケトプロフェン、オフラトキシンＡ、Ｅ３０４０グルクロナイド、Ｅ３０４０サルフェイト、ロイシンエンケファリン、コレシストキニン−８及びロイコトリエンＥ４からなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項１３記載のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラット由来の有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４（Ｏａｔｐ１４：Ｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　１４）又はヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆ（ＯＡＴＰ−Ｆ：Ｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｆ）を発現する能力を有する組換え動物細胞、及び当該組換え動物細胞を利用した被検物質の体内動態予測方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
中枢神経系と循環血とは、血液脳関門と血液脳脊髄液関門により隔てられており、この２つの関門の作用により、脳細胞外液のイオン組成が一定に保たれている。ここで、血液脳関門は、脳実質組織の約２０％を占める脳細胞外液と循環血との間を隔てる関門である。血液脳関門を形成する血管内皮細胞は、他の末梢組織のものとは異なり、内皮細胞間が密接帯（ｔｉｇｈｔ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）により結合されており、更に、窓（ｆｅｎｅｓｔｒａ）と飲小胞（ｐｉｎｏｃｙｔｏｔｉｃ　ｖｅｓｉｃｌｅ）が存在しないという特徴を有している。従って、循環血中のリガンドが、脳細胞外液スペースへ移行するためには、経細胞輸送を介さなければならず、その結果として水溶性の高いあるいは分子量の大きい化合物の中枢移行は妨げられ、関門が形成されている。なお、グルコースやアミノ酸などの栄養物質に対しては、特異的な輸送系が存在している。
【０００３】
中枢神経に対して働くホルモン、ニューロアクティブステロイド（ｎｅｕｒｏａｃｔｉｖｅｓｔｅｒｏｉｄ）あるいは中枢指向型薬物については、細胞間液中濃度がその効果を発揮するために重要な要因である。すでに述べたように、脳細胞間液中濃度は、脳毛細血管内皮細胞を介した取り込み機構・排出機構により制御されている。単純拡散により細胞膜を容易に透過する脂溶性の高い中性・カチオン性薬物の場合は、Ｐ糖タンパク質（Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）による一次性能動輸送により積極的に血中へと排出されるため、実質の脳内移行量は小さい［Ｌｅｅ　Ｇ，　Ｄａｌｌａｓ　Ｓ，　Ｈｏｎｇ　Ｍ，　Ｂｅｎｄａｙａｎ　Ｒ　　Ｄｒｕｇ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ：　ｂｒａｉｎ　ｂａｒｒｉｅｒｓ　ａｎｄ　ｂｒａｉｎ　ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ　ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ．　　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｒｅｖ　５３：５６９−９６（２００１）］。すでに血液脳関門の実体である脳毛細血管内皮細胞にアニオン性薬物対応する排出輸送機構も存在していることが報告され、有機アニオントランスポーターの発現が報告されている。Ｏａｔｐ２（Ｓｌｃ２１ａ５）は脳毛細血管内皮細胞の脳側・血液側の両細胞膜に発現しており、細胞内への取り込み・細胞からの排出の両方向に働きうるトランスポーターである。ステロイドのグルクロン酸抱合体であるエストラジオール−１７β−Ｄ−グルクロナイド（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−１７？−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）を脳内に投与すると、トランスポーターにより脳内から排出されるが、この排出の一部はＯａｔｐ２により説明されることを報告している［Ｓｕｇｉｙａｍａ　Ｄ，　Ｋｕｓｕｈａｒａ　Ｈ，　Ｓｈｉｔａｒａ　Ｙ，Ａｂｅ　Ｔ，　Ｍｅｉｅｒ　ＰＪ，　Ｓｅｋｉｎｅ　Ｔ，　Ｅｎｄｏｕ　Ｈ，　Ｓｕｚｕｋｉ　Ｈ，　Ｓｕｇｉｙａｍａ　Ｙ．　　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｆｆｌｕｘ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｏｆ　１７ｂｅｔａ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−Ｄ−１７ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｂｒａｉｎ　ａｃｒｏｓｓ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ　ｂａｒｒｉｅｒ．　Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｅｘｐ　Ｔｈｅｒ．　２９８：３１６−２２（２００１）］。しかし、全体の排出の約５０〜６０％を説明するべきトランスポーターは同定されていなかった。
【０００４】
ラット脳毛細血管内皮細胞と、肝臓あるいは腎臓とのサブトラクション法を用いて、脳毛細血管内皮細胞に高発現している遺伝子が探索された。その結果見つかってきたものに、Ｏａｔｐ１４が含まれていた［Ｌｉ　ＪＹ，　Ｂｏａｄｏ　ＲＪ，　Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ　ＷＭ　Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ　ｂａｒｒｉｅｒ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ．　Ｊ　Ｃｅｒｅｂ　Ｂｌｏｏｄ　Ｆｌｏｗ　Ｍｅｔａｂ　２１：６１−８（２００１）］。ただし、機能・局在は現在までのところ報告されておらず、その役割については不明であった。Ｏａｔｐ１４は、ＯＡＴＰファミリーのアイソフォームの一つである。他のメンバーとアミノ酸レベルで４０％程度の相同性を示している。データベースを検索したところ、ラットＯａｔｐ１４とアミノ酸レベルで全長に渡って相同性を有しているヒトｏｒｔｈｏｌｏｇ（ＯＡＴＰ−Ｆ；　Ｇｅｎｅ　ｓｙｍｂｏｌ　ＳＬＣ２１Ａ１４）も登録されている［ＮＭ＿０１７４３５；アミノ酸レベルで８４．２％］。しかし、こちらも機能ならびに発現臓器については未報告である。
【０００５】
甲状腺ホルモンや中枢指向型薬物のように循環血から中枢に移行しその効果を発揮する場合、血液脳関門を透過し、脳細胞間液中に到達することが必要である。一方、脳内で生成したニューロアクティブステロイド（ｎｅｕｒｏａｃｔｉｖｅｓｔｅｒｏｉｄ）、　神経伝達物質及びその代謝物は、その不活化のためにもすみやかに排泄されることが必要である。脳細胞間液濃度を制御している脳毛細血管内皮細胞における物質輸送メカニズムを明らかにすることは、中枢作用薬の開発、中枢毒性の回避などに有用であり、また輸送メカニズムの欠陥に伴う病態の原因究明にも有用であり、その分子的実体の解明が待たれていた。
【０００６】
ところで、薬物体内動態の予測、トランスポーター分子を標的とする医薬分子設計、ドラッグデリバリーの開発に有用な情報が提供されつつある。特に、新薬を開発する上で、新薬の体内動態における各トランスポーターを評価することで、新薬と併用される併用薬剤の効力、副作用の増減、かかる併用薬剤及び他の摂取物による新薬の効力、副作用の増減などを予測することができ、新薬の安全性を確認することができるためである。従って、新薬開発などの医薬品分野においては、ヒトにおける有機陰イオントランスポーター及び有機陽イオントランスポーターに関する情報、特にこれら各トランスポーターを区別して測定できる測定技術の開発が要望されている。かかる技術が開発できれば、例えば、新薬の他剤との相互作用、特殊病態時における影響などが容易に把握でき、また新薬の副作用に関する有用な情報を得ることもでき、かくして新薬の安全性を確保することができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ラット由来Ｏａｔｐ１４又はヒト由来のＯＡＴＰ−Ｆを発現する能力を有する組換え動物細胞、及び当該組換え動物細胞を利用した被検物質の体内動態予測方法等を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ラット由来の有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４及びヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆをそれぞれ哺乳動物細胞に発現させることに成功すると共に、当該組換え動物細胞を用いることによって、各トランスポーターの物質輸送特性を測定できることを見出し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１４）である。
【０００９】
（１）　ラット由来の有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４（Ｏａｔｐ１４：Ｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　１４）を発現する能力を有する組換え動物細胞。
（２）　組換え動物細胞が、ラット由来の有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４遺伝子を導入したものである請求項１記載の組換え動物細胞。
（３）　ラット由来の有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４遺伝子が、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるものである上記（２）の組換え動物細胞。
（ａ）　配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）　配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有機陰イオントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（４）　組換え動物細胞が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９００８として寄託されたものである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組換え動物細胞。
【００１０】
（５）　ヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆ（ＯＡＴＰ−Ｆ：Ｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｉｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｆ）を発現する能力を有する組換え動物細胞。
（６）　前記組換え動物細胞が、ヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆ遺伝子を導入したものである上記（５）の組換え動物細胞。
（７）　ヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆ遺伝子が、以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡからなるものである上記（６）の組換え動物細胞。
（ｃ）　配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）　配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有機陰イオントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１１】
（８）　組換え動物細胞が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９００９として寄託されたものである、上記（５）〜（７）のいずれかに記載の組換え動物細胞。
（９）　上記（１）〜（８）のいずれかに記載の組換え動物細胞を用いて、被検物質がラット由来有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４又はヒト由来有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆの輸送基質となるか否かを判定する方法。
（１０）　上記（１）〜（８）のいずれかに記載の組換え動物細胞を用いて、被検物質の体内動態を予測する方法。
（１１）　上記（１）〜（８）のいずれかに記載の組換え動物細胞を使用することを特徴とする、ラット由来の有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４又はヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆによる被検物質の輸送特性を変化させる物質のスクリーニング方法。
【００１２】
（１２）　被検物質が、甲状腺ホルモンＴ４、甲状腺ホルモンＴ３、セリバスタチン、トログリタゾンサルフェイト、エストラジオール−１７β−Ｄ−グルクロナイド、タウロリトコール酸サルフェイト、テストステロン、ジヒドロテストステロン、エストロン、ケトプロフェン、オフラトキシンＡ、Ｅ３０４０グルクロナイド、Ｅ３０４０サルフェイト、ロイシンエンケファリン、コレシストキニン−８及びロイコトリエンＥ４からなる群から選択されるものであることを特徴とする上記（１１）のスクリーニング方法。
（１３）　（１）〜（８）のいずれかに記載の組換え動物細胞を構成要素として含むことを特徴とする、ラット由来の有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４又はヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆによる被検物質の輸送特性を変化させる物質のスクリーニング用キット。
（１４）　被検物質が、甲状腺ホルモンＴ４、甲状腺ホルモンＴ３、セリバスタチン、トログリタゾンサルフェイト、エストラジオール−１７β−Ｄ−グルクロナイド、タウロリトコール酸サルフェイト、テストステロン、ジヒドロテストステロン、エストロン、ケトプロフェン、オフラトキシンＡ、Ｅ３０４０グルクロナイド、Ｅ３０４０サルフェイト、ロイシンエンケファリン、コレシストキニン−８及びロイコトリエンＥ４からなる群から選択されるものであることを特徴とする上記（１３）のスクリーニング用キット。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、ラット由来の有機陰イオントランスポーターＯａｔｐ１４を発現する組換え動物細胞、ヒト由来の有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰ−Ｆを発現する組換え動物細胞及びその利用方法である。ラット由来Ｏａｔｐ１４のアミノ酸配列を配列番号２に、ヒト由来ＯＡＴＰ−Ｆのアミノ酸配列を配列番号４に示した。なお、本発明の組換え動物細胞上に発現する有機陰イオントランスポーターとしては、配列番号２又は４で示されたアミノ酸配列を有するものの他、例えば、配列番号２又は４で示されたアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。アミノ酸の欠失、置換又は付加は、Ｏａｔｐ１４又はＯＡＴＰ−Ｆの生理学的活性（例えば、甲状腺ホルモンＴ４の輸送活性）がそれぞれのタンパク質において失われない程度であればよく、通常１〜約１００アミノ酸、好ましくは１〜約５０アミノ酸である。このようなタンパク質は、配列番号２又は４で示されたアミノ酸配列と通常、８０％以上、好ましくは９０％以上のホモロジーを有する。
【００１４】
また、ラット由来Ｏａｔｐ１４をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に、ヒト由来ＯＡＴＰ−Ｆをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３に示した。本発明の組換え動物細胞の構築に使用できる遺伝子としては、配列番号１又は３で示された塩基配列を有するもののほか、配列番号１又は３で示された塩基配列からなるＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるタンパク質がＯａｔｐ１４又はＯＡＴＰ−Ｆの生理学的活性（例えば、甲状腺ホルモンＴ４の輸送活性）を有するものであればよい。このようなＤＮＡは配列番号１又は３で示された塩基配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。本発明において、ハイストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
【００１５】
ラット由来のＯａｔｐ１４遺伝子又はヒト由来のＯＡＴＰ−Ｆ遺伝子はそれぞれ、ラット又はヒト由来の組織や細胞から調製したｍＲＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことにより得ることができる。例えば、ラットＯａｔｐ１４遺伝子の調製においては、ラット大脳から脳毛細血管を単離し、これからｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を調製する。これからｃＤＮＡを構築し、遺伝子データベースの検索によって得られるラットＯａｔｐ１４遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲを行うことによってラットＯａｔｐ１４遺伝子のｃＤＮＡを得ることができる。なお、本発明において使用できるＯａｔｐ１４のｃＤＮＡは、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計し、それを使用することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法　［Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８１：５６６２（１９８４）］等によって実施できる。
【００１６】
本発明のＯａｔｐ１４発現組換え動物細胞及びＯＡＴＰ−Ｆ発現組換え動物細胞は、先の手順で得られたＯａｔｐ１４又はＯＡＴＰ−ＦをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術によりそれぞれ作製することができる。例えば、Ｏａｔｐ１４をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。なお、Ｏａｔｐ１４を発現する組換え動物細胞（名称：ＨＥＫ−１４−１）は平成１４年９月１１日付で受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９００８として、ＯＡＴＰ−Ｆを発現する組換え動物細胞（名称：ＨＥＫ−５２９−４）は平成１４年９月１１日付で受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９００９として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されている。
【００１７】
例えば、Ｏａｔｐ１４ポリペプチドを哺乳類細胞で発現させる場合には、Ｏａｔｐ１４をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター（例えば、アデノウイルス系ベクター、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１ａプロモーター等）の下流に挿入してＯａｔｐ１４発現用ベクターを構築する。ここで、Ｏａｔｐ１４の発現にはｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の市販のベクターを使用することもできる。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするＯａｔｐ１４ポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、ミドリザル由来ＣＯＳ−７細胞、イヌ由来ＭＤＣＫ細胞、ブタ由来ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、チャイニーズハムスター由来ＣＨＯ細胞、ヒト由来Ｈｅｐ−Ｇ２細胞、ヒト由来Ｃａｃｏ−２細胞、ヒト由来ＨｅＬａ細胞又はヒト由来ＨＥＫ２９３細胞などの細胞株などが挙げられる。
【００１８】
前記のようにして得られた、本発明のＯａｔｐ１４発現組換え動物細胞及びＯＡＴＰ−Ｆ発現組換え動物細胞について、各種基質の取り込み実験を行い、Ｏａｔｐ１４及びＯＡＴＰ−Ｆの特性、例えば、Ｏａｔｐ１４の物質輸送特性や、Ｏａｔｐ１４及びＯＡＴＰ−Ｆの輸送基質選択性、ｐＨ依存性などをそれぞれ調べることができる。
【００１９】
本発明のＯａｔｐ１４発現細胞は、Ｏａｔｐ１４により輸送される物質（例えば、甲状腺ホルモンＴ４等）の透過効率についての、インビトロでの試験に使用できる。また、Ｏａｔｐ１４が発現している部位（例えば、血液・脳関門など）を効率良く透過する薬物の開発に使用できる。さらに、Ｏａｔｐ１４が発現している部位（例えば、血液・脳関門など）における薬物間相互作用のインビトロでの試験に使用できる。
【００２０】
Ｏａｔｐ１４の活性を抑制することにより、Ｏａｔｐ１４を発現する細胞膜や、Ｏａｔｐ１４が存在すると予想される部位（例えば、血液・脳関門など）における毒物やその他外来性異物の透過を制限することができる。また、本発明のＯａｔｐ１４発現細胞は、Ｏａｔｐ１４により輸送される毒物や外来性異物の、細胞膜通過や、Ｏａｔｐ１４が存在すると予想される部位（例えば、血液・脳関門など）の透過を制限する薬物（Ｏａｔｐ１４の特異的なインヒビター等）の開発に使用できる。
【００２１】
本発明は、Ｏａｔｐ１４発現細胞を用いて、被検物質がＯａｔｐ１４タンパク質の有する物質輸送能力における輸送基質となるか否かを判定する方法及び被検物質の体内動態を予測するための方法を提供するものである。
【００２２】
さらに、本発明は、Ｏａｔｐ１４発現細胞及び／又はＯＡＴＰ−Ｆ発現細胞を主要構成要素とする、Ｏａｔｐ１４及び／又はＯＡＴＰ−Ｆによる被検物質の輸送特性を変化させる物質のスクリーニングキットを提供するものである。その場合には必要に応じて、被検物質（例えば、甲状腺ホルモンＴ４、甲状腺ホルモンＴ３、セリバスタチン、トログリタゾンサルフェイト、エストラジオール−１７β−Ｄ−グルクロナイド、タウロリトコール酸サルフェイト、テストステロン、ジヒドロテストステロン、エストロン、ケトプロフェン、オフラトキシンＡ、Ｅ３０４０グルクロナイド、Ｅ３０４０サルフェイト、ロイシンエンケファリン、コレシストキニン−８及びロイコトリエンＥ４等）、緩衝液等の適当な試薬を適宜選択し、本発明のキットに添付することができる。
【００２３】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕　ラットＯａｔｐ１４のｃＤＮＡ単離とＯａｔｐ１４発現細胞の作製
ラット大脳から脳毛細血管をボアド（Ｂｏａｄｏ）らの方法［Ｂｏａｄｏ　ａｎｄ　Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，　５７：２１３６−２１３９（１９９１）］で単離し、さらにそこからｍＲＮＡを調製し、ＲＴ反応を行うことによりラット脳毛細血管由来ｃＤＮＡを調製した。データベース上に報告されている配列（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ／ＤＤＢＪ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ３０６５４６）を基にｆｏｒｗａｒｄプライマー：５’−ｇｇａａｔｔｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｃａｃｔｔｃａｔｃｃａａａｇａ−３’（配列番号５）とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：５’−ｇｇａｔｔｃｃｔｔａａａｇｔｃｇｇｇｔｃｔｃｃｔｔｇｃ−３’（配列番号６）を作製し、ラット脳毛細血管から得られたｃＤＮＡからＯａｔｐ１４の全長を増幅させた。得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込み、ＥｃｏＲＩを用いてｐｌａｓｍｉｄからＯａｔｐ１４の全長を切り出し、発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み換えた。得られたプラスミドをヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞にリポフェクションし、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８存在下で培養し、Ｏａｔｐ１４発現ＨＥＫ２９３細胞を作製した。
【００２４】
〔実施例２〕　ラットの種々組織におけるＯａｔｐ１４遺伝子の発現（ノザンブロットによる解析）
Ｏａｔｐ１４遺伝子の第１−８０７番目の塩基に相当するｃＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨ１で切り出し、３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしてプローブとして用いた。ラットの各組織から得られたｍＲＮＡを含むｒａｔ　ＭＴＮ　ｂｌｏｔ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に対して、６８℃で３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたＯａｔｐ１４　ｃＤＮＡ断片を含んだハイブリダイゼーション液でハイブリダイゼーションを行い、６５℃で０．１％　ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで洗浄した。脳において２．６ｋｂｐ付近にバンドが検出された。
【００２５】
〔実施例３〕　ラット脳、及び脳毛細血管におけるＯａｔｐ１４蛋白の発現（ウェスタンブロットによる解析）
ラットＯａｔｐ１４の７０１−７１６に相当する合成オリゴヌクレオチド：ＣＤＨＧＬＱＰＫＹＷＰＧＫＥＴＲＬ（配列番号７）［Ｎ末端のシステイン残基はＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）とのコンジュゲーションのために導入］に対する特異抗体をアルトマン（Ａｌｔｍａｎ）らの方法に準じて作製した［Ａｌｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８１：２１７６−２１８０（１９８４）］。得られた抗Ｏａｔｐ１４血清（１：１０００）をウェスタンブロットに使用した。ラット脳ホモジネイト（５０μｇ）、ラット脳毛細血管（５０μｇ）、及びＯａｔｐ１４発現ＨＥＫ２９３細胞から調製した膜（１０μｇ）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ　ＰＶＤＶトランスファー膜にブロッティングし、抗Ｏａｔｐ１４血清（１：１０００）で処理した。抗Ｏａｔｐ１４血清により、脳毛細血管及びＯａｔｐ１４発現細胞より調製した細胞膜から約８０ｋＤａのバンドが観察された。これらの結果から、Ｏａｔｐ１４は脳全体ではなく、脳毛細血管内皮細胞に特異的に発現していることが示唆された。
【００２６】
〔実施例４〕　ラット脳、及び脳毛細血管におけるＯａｔｐ１４蛋白の発現（免疫組織化学による解析）
得られた抗Ｏａｔｐ１４血清（１：１００）、及び脳毛細血管内皮細胞の脳側膜に局在していることが知られているＧＬＡＳＴ（Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ／Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）に対する抗ＧＬＡＳＴポリクローナル抗体（１：４０００）を用いて、ラット脳毛細血管に対して、免疫組織化学を行った。Ｏａｔｐ１４とＧＬＡＳＴのシグナルは一致しており、Ｏａｔｐ１４が脳毛細血管内皮細胞の脳側の細胞膜に局在していることが示唆された。
【００２７】
〔実施例５〕　ヒトＯＡＴＰ−ＦのｃＤＮＡ単離とＯＡＴＰ−Ｆ発現細胞の作製
データベース上に報告されている配列（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ／ＤＤＢＪ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ２６０７０４）を基にｆｏｒｗａｒｄプライマー：５’−ｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｃａｃｔｔｃａｔｃｃａａａｇａ−３’（配列番号８）とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：５’−ａａｇｔｔｇａｇｔｔｔｃｃｔｔｇｃｃｔｇ−３’（配列番号９）を作製し、市販されているヒトｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からヒトＯＡＴＰ−ＦのＯＲＦ領域を増幅させた。得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込み、ＥｃｏＲＩを用いてｐｌａｓｍｉｄからＯＡＴＰ−ＦのＯＲＦ領域を切り出し、発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み換えた。得られたプラスミドをヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞にリポフェクションし、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８存在下で培養し、ＯＡＴＰ−Ｆ発現ＨＥＫ２９３細胞を作製した。
【００２８】
〔実施例６〕　Ｏａｔｐ１４及びＯＡＴＰ−Ｆの輸送特性の解析
Ｏａｔｐ１４及びＯＡＴＰ−Ｆの物質輸送特性を解析する目的で、Ｏａｔｐ１４発現細胞及びＯＡＴＰ−Ｆ発現細胞への各種化合物の取り込みを検討した。具体的には、得られたＯａｔｐ１４発現ＨＥＫ２９３細胞及びＯＡＴＰ−Ｆ発現ＨＥＫ２９３細胞をそれぞれ、１２穴プレートに１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで１０％　ＦＢＳ，　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００　Ｕ／ｍｌ），　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００　μｇ／ｍｌ）、Ｇ４１８　ｓｕｌｆａｔｅ　（４００　μｇ／ｍｌ）入りのＤＭＥＭで培養し、２日後にＮａ＋−ｂｕｔｙｒａｔｅ入りメディウムに交換し、その２４時間後に各種取り込み実験を行った。取り込み実験はＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ　ｂｕｆｆｅｒ　（１４２　ｍＭ　ＮａＣｌ，　２３．８　ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，　４．８３　ｍＭ　ＫＣｌ，　０．９６ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，　１．２０　ｍＭ　ＭｇＳＯ４，　１２．５　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　５　ｍＭ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　１．５３　ｍＭ　ＣａＣｌ２，ｐＨ　７．４）で細胞を２回洗浄し、１５分プレインキュベーションした後、［３Ｈ］、［１４Ｃ］、［１２５Ｉ］ラベル化された化合物を含むＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ　ｂｕｆｆｅｒに置換することにより開始し、目的の時間でそれを取り除き、氷冷Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ　ｂｕｆｆｅｒにより洗浄することにより終了した。洗浄後、０．２Ｎ　ＮａｏＨで細胞を溶解し、液体シンチレーションカウンターにより放射活性を測定することによって、Ｏａｔｐ１４及びＯＡＴＰ−Ｆの各化合物の輸送活性を明らかにした。結果を表１に示した。
【表１】
2004113066.tif 000002
【００２９】
Ｏａｔｐ１４及びＯＡＴＰ−Ｆいずれも、甲状腺ホルモンＴ４の輸送活性がもっとも高く、次いで甲状腺ホルモンＴ３及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤のセリバスタチンが良好な輸送基質となることが明らかとなった。さらに、Ｏａｔｐ１４はエストラジオール−１７β−Ｄ−グルクロナイド　（Ｅ２１７βＧ）、潰瘍性大腸炎治療薬として開発されたＥ３０４０のグルクロン酸抱合体・硫酸抱合体、経口糖尿病治療薬トログリタゾンの硫酸抱合体（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ−ｓｕｌｆａｔｅ）が良好な基質となることが明らかとなった。更に輸送活性は低いものの、エストロンサルフェート（ｅｓｔｒｏｎｅ−ｓｕｌｆａｔｅ）、オフラトキシンＡ（ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ　Ａ）、利胆薬である４−メチルウンベリフェロンの硫酸抱合体（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ−ｓｕｌｆａｔｅ）が基質となることがみいだされた。濃度依存性を検討した結果、Ｏａｔｐ１４のＥ２１７βＧに対するＫｍ値は１０．７±１．６　？Ｍ、Ｖｍａｘ値は９３．４７±１０．４　ｐｍｏｌ／分／ｍｇ蛋白質であった。さらに、種々化合物によるＥ２１７βＧのＯａｔｐ１４を介した取り込みに対する阻害効果を検討した結果、プロベネシド、ブロモスルフォフタレイン（ｂｒｏｍｏｓｕｌｆｏｐｈｔａｌｅｉｎ）、２，４−ジニトロフェニルグルタチオン（２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、胆汁酸類、ステロイド類による阻害効果が観察されたが、ｐ−アミノ馬尿酸、アジドデオキシチミジン（ａｚｉｄｏｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、ジデオキシシチジン（ｄｉｄｅｏｘｙｃｉｔｉｄｉｎｅ）、サリチル酸、ロイコトリエンＣ４（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ　Ｃ４）、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、葉酸類、テトラエチルアンモニウム（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、シメチジン（ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ）による阻害効果は観察されなかった。
【００３０】
これらの結果から、Ｏａｔｐ１４は血液脳関門を構成する脳毛細血管内皮細胞の脳側膜に特異的に発現し、ニューロアクティブステロイド（ｎｅｕｒｏａｃｔｉｖｅｓｔｅｒｏｉｄ）、神経ペプチド（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）、コレシストキニン−８（ＣＣＫ−８）、甲状腺ホルモンなどの内因性物質やプラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）、セリバスタチン（ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）、オフラトキシン　Ａ（ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ　Ａ）などの化合物を輸送することが示唆され、Ｏａｔｐ１４は新規薬物の開発段階において中枢作用薬の開発、中枢毒性の回避などに有用であり、甲状腺不全症などの病態の原因究明にも有用であると考えられる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により、ラット由来Ｏａｔｐ１４又はヒト由来のＯＡＴＰ−Ｆを発現する能力を有する組換え動物細胞、及び当該組換え動物細胞を利用した被検物質の体内動態予測方法等が提供される。本発明は、新薬開発などの医薬品分野において、体内動態予測、副作用予測及び安全性予測の技術向上に有用である。
【００３２】
【配列表】
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2004113066.tif 000021
【００３３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ