(57)【要約】【課題】良好な波面を保ちつつ、かつ第１の光と第２の光とを光軸変動を生じることなく試料に照射でき、常に安定して超解像現象を発現できる顕微鏡を提供する。【解決手段】第１の光源１１からの第１の光と第２の光源１２，１３からの第２の光とを、重ね合わせ光学系１６により一部分重ね合わせて集光光学系３４により試料３５に集光させて、試料３５の光応答を光検出器４０で検出するようにした顕微鏡において、第１の光源１１または第２の光源１２，１３の少なくとも一方からの第１の光または第２の光を、光ファイバ２２，２８およびコリメータレンズ２３，２９を有する光ファイバ光学系１５，２５を経て均一平面波として重ね合わせ光学系１６に導くよう構成する。【選択図】　　　　図２
2004109368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の光源からの第１の光と第２の光源からの第２の光とを、重ね合わせ光学系により一部分重ね合わせて集光光学系により試料に集光させて、上記試料の光応答を光検出器で検出するようにした顕微鏡において、
上記第１の光源または第２の光源の少なくとも一方からの上記第１の光または第２の光を、光ファイバおよびコリメータレンズを有する光ファイバ光学系を経て均一平面波として上記重ね合わせ光学系に導くよう構成したことを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
上記第１の光源または第２の光源の少なくとも一方がパルス光源であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
上記第１の光の波長は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料の上記分子を、基底状態から第１電子励起状態へ遷移させる共鳴吸収波長帯域内にあり、
上記第２の光の波長は、上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い他の電子状態へ遷移させる共鳴吸収波長帯域内にあることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
上記光ファイバ光学系は、上記光ファイバと上記第１の光源または第２の光源との間に配置した空間フィルタを有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項５】
上記光ファイバ光学系は、上記光ファイバと上記重ね合わせ光学系との間に配置した上記第１の光または第２の光を透過する波長分散素子を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の新しい光学顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択し、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図３〜図６を参照して説明する。図３は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図３に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図４に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して図５に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図６に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図４の吸収過程や図６の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図４のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図５のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図５の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合には画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図３に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図７は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、更に波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図７はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図７に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図８は、図７と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図８において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では蛍光自体が完全に抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図８の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
さらに、顕微鏡の超解像性を高めるため、超解像顕微鏡の機能を十分に活かすための蛍光ラベラー分子や、利用する波長λ１および波長λ２の２つの光の試料への照射タイミング等が開示されている（例えば、特許文献３参照）。この先行技術では、少なくとも基底状態を含む３つの量子状態を有し、第１電子励起状態を除く高位のエネルギー状態から基底状態へ脱励起するときの遷移が蛍光による緩和過程よりも熱緩和過程が支配的である各種分子を染色する蛍光ラベラー分子と、生化学的な染色技術を施した生体分子とを化学結合させた試料を、染色する分子を励起する波長λ１の光でＳ１状態に励起し、続いて波長λ２の光により即座に高位の量子準位に励起することで、Ｓ１状態からの蛍光を抑制するようにしている。このように分子の光学的性質を利用して、空間的な蛍光領域を人為的に抑制することで、空間分解能の向上を図ることができる。
【００１８】
このような分子の光学的性質は、量子化学的な立場から説明することができる。すなわち、一般に、分子はそれを構成する各原子がσまたはπ結合によって結ばれている。言い換えると、分子の分子軌道は、σ分子軌道またはπ分子軌道を有していて、これらの分子軌道に存在する電子が各原子を結合する重要な役割を担っている。そのなかでも、σ分子軌道の電子は各原子を強く結合し、分子の骨格である分子内の原子間距離を決めている。これに対して、π分子軌道の電子は各原子の結合にほとんど寄与しないで、むしろ分子全体に極めて弱い力で束縛されている。
【００１９】
多くの場合、σ分子軌道にいる電子を光で励起すると、分子の原子間隔が大きく変化し、分子の解離を含む大きな構造変化が起こる。その結果、原子の運動エネルギーや構造変化のために、光が分子に与えたエネルギーのほとんどが熱エネルギーに変化する。したがって、励起エネルギーは蛍光という光の形態では消費されない。また、分子の構造変化は極めて高速（ピコ秒より短い）に起こるので、その過程で仮に蛍光が起きてもその寿命が極めて短い。
【００２０】
これに対し、π分子軌道の電子は、励起しても分子の構造自体はほとんど変化せず、高位の量子的な離散準位に長時間とどまり、ナノ秒オーダで蛍光を放出して脱励起する性質を有している。
【００２１】
量子化学によれば、分子がπ分子軌道をもつことと、二重結合をもつこととは同等であり、用いる蛍光ラベラー分子には、二重結合を豊富にもつ分子を選定することが必要条件となる。このことは、二重結合をもつ分子でもベンゼンやピラジン等の６員環分子において、Ｓ２励起状態からの蛍光が極めて弱いことが確かめられている（例えば、非特許文献１参照）。
【００２２】
したがって、ベンゼンやピラジン等の６員環分子を含む分子を蛍光ラベラー分子として選定すれば、Ｓ１状態からの蛍光寿命が長く、しかも光励起によりＳ１状態からＳ２状態に励起することで、分子からの蛍光を容易に抑制できるので、超解像性を効果的に利用することができる。すなわち、これら蛍光ラベラー分子により染色して観察を行なえば、高空間分解能で試料の蛍光像を観察することができるのみならず、その分子の側鎖の化学基を調整することにより、生体試料の特定の化学組織のみを選択的に染色できるので、試料の詳細な化学組成までも分析可能となる。
【００２３】
また、一般に、二重共鳴吸収過程は２つ光の波長や偏光状態等が特定の条件を満たすときにのみ起こるので、これを用いることで分子の構造を非常に詳細に知ることができる。すなわち、光の偏光方向と分子の配向方向とは強い相関関係があり、２つ波長の光のそれそれの偏光方向と分子の配向方向とが特定の角度をなすとき、二重共鳴吸収過程が強く起こる。したがって、２つ波長の光を試料に同時に照射して、それぞれの光りの偏光方向を回転することにより、蛍光の消失の程度が変化するので、その様子から観測しようとする組織の空間配向の情報も得ることができる。このことは、２つ光の波長を調整することでも可能である。
【００２４】
以上のように、特許文献３に記載の技術によると、超解像性以外にも、高い分析能力を有していることがわかる。さらに、波長λ１と波長λ２との２つの光の照射タイミングを工夫することで、Ｓ／Ｎを改善し、かつ蛍光抑制を効果的に起こすことができ、超解像性をより効果的に発現することが可能となる。
【００２５】
このような超解像顕微鏡法の具体例として、蛍光ラベラー分子をＳ０状態からＳ１状態へ励起する波長λ１の光（特にレーザ光）をポンプ光とし、Ｓ１状態からＳ２状態へ励起する波長λ２の光をイレース光として、図９に示すように、光源８１からポンプ光を、光源８２からイレース光をそれぞれ放射させ、ポンプ光はダイクロイックミラー８３で反射させた後、輪帯光学系８４により試料８５上に集光させ、イレース光は位相板８６で中空ビーム化した後、ダイクロイックミラー８３を透過させてポンプ光と空間的に重ね合わせて輪帯光学系８４により試料８５上に集光させるようにしたものが提案されている（例えば、特許文献４参照）。
【００２６】
この顕微鏡によると、イレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光は抑制されるので、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域（Δ＜０．６１・λ１／ＮＡ、ＮＡは輪帯光学系８４の開口数）に存在する蛍光ラベラー分子のみが観察されることになり、結果的に超解像性が発現することになる。なお、イレース光を中空ビーム化する位相板８６は、例えば、図１０に示すように、光軸に対して点対称な位置で位相差πを与えるように構成したものや、液晶面を用いた液晶空間変調器を用いることができる。
【００２７】
【特許文献１】
特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】
特開２００１−１００１０２号公報
【特許文献３】
特開平１１−９５１２０号公報
【特許文献４】
特開２００１−２７２３４５号公報
【非特許文献１】
Ｍ．Ｆｕｊｉｉ　ｅｔ．ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１７１（１９９０）３４１
【００２８】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、従来提案されている超解像蛍光顕微鏡は、観察性能上の各種機能に優れている。しかし、かかる顕微鏡では、異なる波長の２色のレーザ光源を用いることから、顕微鏡の性能を十分に発揮させるためには、光源の更なる安定性が要求される。すなわち、超解像現象の発現の度合いは、イレース光とポンプ光とが試料上でいかに位置ずれなくオーバーラップして集光するかにかかっている。特に、光源としてパルス発振型レーザを用いる場合には、レーザショット毎にポンプ光の光軸とイレース光の光軸とが独立して変動してしまうと、本来、蛍光を抑制してはいけない領域からの蛍光をも抑制してしまうこととなって、解像度が向上せず、むしろ蛍光強度が低下して画質が悪くなるという弊害が生じることになる。
【００２９】
以下、超解像蛍光顕微鏡を図１１に示すように構成した場合を例にとって説明する。図１１に示す超解像蛍光顕微鏡は、上記の特許文献２に開示されているもので、ローダミン６Ｇで染色された試料１００を観察するものである。この顕微鏡では、モードロック型のＮｄ：ＹＡＧレーザ１０１から出射される波長１０６４ｎｍのレーザ光をベータ硼酸バリウム（ＢＢＯ）結晶からなる波長変換素子１０２により２倍高調波の波長５３２ｎｍのレーザ光に波長変換し、このレーザ光をハーフミラー１０３で透過光と反射光との二光路に分岐して、その透過光をポンプ光としてダイクロイックミラー１０４および１０５を順次透過させた後、対物レンズ１０６により二次元移動ステージ１０７上に載置された試料１００に集光させるようにしている。
【００３０】
また、ハーフミラー１０３での反射光は、反射ミラー１０８で反射させた後、Ｂａ（ＮＯ３）２　結晶からなるラマンシフタ１０９で波長５９９ｎｍのレーザ光に波長変換し、このレーザ光をイレース光として反射ミラー１１０で反射させた後、位相板１１１により中空ビームに整形し、さらにダイクロイックミラー１０４によりポンプ光と同軸上に揃えて、ダイクロイックミラー１０５を経て対物レンズ１０６により試料１００に集光させるようにしている。
【００３１】
一方、試料１００からの蛍光は、対物レンズ１０６を経てダイクロイックミラー１０５で反射させた後、蛍光集光レンズ１１２、シャープカットフィルタ１１３およびピンホール１１４を経てフォトマル１１５で受光するようになっている。なお、試料１００に投射されるポンプ光およびイレース光は、フォトマル１１６で受光され、その出力に基づいてＮｄ：ＹＡＧレーザ１０１から出射されるレーザ光の強度が一定となるように制御されるようになっている。
【００３２】
かかる構成の超解像蛍光顕微鏡においては、特にＮｄ：ＹＡＧレーザ１０１をパルス発振させる場合に、以下のような問題が生じる。
１）パルス発振毎に、レーザ光の光軸が揺らぐ。
２）レーザ光の波面が乱れているため、空間変調による形状整形を前提とするイレース光には適用し難い。
【００３３】
特に、上記１）に関しては、長い光路でレーザ光をガイドすると、空気の揺らぎでもレーザ光の光軸が変動して、集光点における位置安定性が更に悪くなる。このため、最悪の場合、ポンプ光の集光領域とイレース光の集光領域とがオーバーラップせず、超解像の効果が全く現れなくなることがあり得る。
【００３４】
この１）の問題の解決方法として、光ファイバを用いてパルスレーザ光を伝達することが考えられる。しかしながら、パルスレーザの場合には、連続発振型のレーザいわゆるＣＷレーザとは異なり、レーザ光の時間平均の光強度は小さいものの、パルス尖頭値はメガワットにも及ぶことがあるため、光ファイバの入射端面が焼損したり、光ファイバ内で誘導ラマン光が発生したりする等の問題がある。特に、誘導ラマン光が発生すると、その光が試料からの蛍光信号を観測する際のバックグラウンドとなって顕微鏡画像の画質が劣化することになる。
【００３５】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の主たる目的は、良好な波面を保ちつつ、かつ第１の光と第２の光とを光軸変動を生じることなく試料に照射でき、常に安定して超解像現象を発現できる顕微鏡を提供することにある。
【００３６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する請求項１に係る発明は、第１の光源からの第１の光と第２の光源からの第２の光とを、重ね合わせ光学系により一部分重ね合わせて集光光学系により試料に集光させて、上記試料の光応答を光検出器で検出するようにした顕微鏡において、
上記第１の光源または第２の光源の少なくとも一方からの上記第１の光または第２の光を、光ファイバおよびコリメータレンズを有する光ファイバ光学系を経て均一平面波として上記重ね合わせ光学系に導くよう構成したことを特徴とするものである。
【００３７】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、上記第１の光源または第２の光源の少なくとも一方がパルス光源であることを特徴とするものである。
【００３８】
請求項３に係る発明は、請求項１または２に記載の顕微鏡において、上記第１の光の波長は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料の上記分子を、基底状態から第１電子励起状態へ遷移させる共鳴吸収波長帯域内にあり、
上記第２の光の波長は、上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い他の電子状態へ遷移させる共鳴吸収波長帯域内にあることを特徴とするものである。
【００３９】
請求項４に係る発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の顕微鏡において、上記光ファイバ光学系は、上記光ファイバと上記第１の光源または第２の光源との間に配置した空間フィルタを有することを特徴とするものである。
【００４０】
請求項５に係る発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡において、上記光ファイバ光学系は、上記光ファイバと上記重ね合わせ光学系との間に配置した上記第１の光または第２の光を透過する波長分散素子を有することを特徴とするものである。
【００４１】
先ず、本発明の原理について説明する。例えば、末松・伊賀著：「光ファイバ通信入門」オーム社（１９７９年）にも記載されているように、シングルモード光ファイバに、光ファイバ内で条件を満たす波長の光が入射すると、均一な波面が伝搬して、出射端面から波面が完全に揃った球面波が出射される。したがって、この光を、例えばレンズによりコリメートすれば、波面の均一な平行光を生成でき、また、この波面の揃った平行光を位相板や液晶型の光空間変調器により中空ビーム化すれば、理想的な中空状のイレース光を得ることが可能となる。しかも、このように光ファイバを用いる光学系では、光ファイバの出射端部を機械的に固定すれば、光軸の揺らぎは原理的に生じないという特徴がある。
【００４２】
ところが、レーザ光源から出射される例えばパルス光は、空間モードが非常に悪く、いわゆる波面の揃ったガウシアンプロファイルとはならないと共に、発散角（ダイバージェンス）も種々の角度を持っているため、レンズで集光しても回折限界まで絞り込めないが普通である。例えば、波長６００ｎｍの光に対しては、コア径が５μｍ程度の光ファイバが対応するが、この場合のパルス光の集光径は、光ファイバのコア径よりも遥かに大きくなる。
【００４３】
超解像顕微鏡法では、特に、イレース光の強度が大きい方が好ましいが、勢い光ファイバの出射端面から強度の大きいイレース光を取り出そうとすると、光ファイバの入射端面に入射させるレーザ光も強くする必要がある。この際、臨界角以下の浅い角度で入射端面に集光した光は、微量の減衰はあるものの、ほぼ１００％に近い効率で出射端面から取り出すことができるが、それ以外の光は光ファイバの入射端面で散乱されて光ファイバを透過できない。しかも、この部分には常時強い光が照射されるので、焼けによる損傷が発生して、光ファイバの入射端面全体が焦げてしまう。これは、パルスレーザ光の大半を占める高次のモードが、光ファイバのコア径内に絞りきれなかったのが原因である。
【００４４】
そこで本発明の好適一実施の形態では、空間フィルタを有して光ファイバ光学系を構成し、レーザ光源からのレーザ光を、空間フィルタを介して光ファイバに入射させる。具体的には、図１に示すように、空間フィルタ１を集光レンズ２、ピンホール３、コリメータレンズ４、および集光レンズ５をもって構成し、レーザ光源からのレーザ光を集光レンズ２でピンホール３に集光させ、ピンホール３で回折された光をコリメータレンズ４でコリメートした後、シングルモード光ファイバ６の取り込み立体角と整合させて、集光レンズ５により光ファイバ６の入射端面に再び集光させる。なお、ピンホール３のサイズは、集光レンズ２の焦点距離と入射するレーザ光のビーム径とによって決まる回折限界の大きさを目安に設定する。
【００４５】
このようにすれば、光ファイバ６のコア内に集光した全ての光を取り込んで、球面波として取り出すことが可能となる。しかも、光ファイバ端面の焼けの原因となる余分な光は、空間フィルタ１のピンホール３でカットされるので、測定の最中に光ファイバ６が焦げて使えなくなることもなくなる。したがって、高強度の光ファイバ出射光を取り出すために、レーザ光自体の強度を高くしても、光ファイバ６を焼損することがなくなる。
【００４６】
また、光ファイバ内で発生する誘導ラマン光については、非常に単純なフィルタ光学系を適用することで対処することができる。例えば、上記特許文献４に記載の超解像蛍光顕微鏡では、一般に、試料からの蛍光を検出する検出器の前方にポンプ光およびイレース光の波長成分をカットするノッチフィルタが配置されているので、光ファイバ内で誘導ラマン光が発生する場合には、このノッチフィルタの通過阻止波長帯域内に誘導ラマン光の発光スペクトル帯域が位置するように、ノッチフィルタを構成する。
【００４７】
あるいは、光ファイバの出射端側に、所望の波長のポンプ光またはイレース光を透過する波長分散素子を配置して光ファイバ光学系を構成する。なお、波長分散素子は、狭帯域のバンドパスフィルタ、多層膜を用いた干渉フィルタ、回折格子等を用いることができる。
【００４８】
本発明の好適一実施の形態では、誘導ラマン光をより確実にカットするため、ポンプ光またはイレース光を伝達する光ファイバの出射端面側に、波長分散素子としてポンプ光またはイレース光の波長を中心波長とする狭帯域のバンドパスフィルタを配置して光ファイバ光学系を構成し、光ファイバから出射されてバンドパスフィルタを透過したポンプ光またはイレース光を試料に投射する。さらに、試料からの発光を受光する検出器の前方には、上記のバンドパスフィルタの通過波長帯域よりも広い通過阻止波長帯域を有するノッチフィルタを配置して、このノッチフィルタを透過した光を検出器で受光するようにする。
【００４９】
このようにすれば、光ファイバで発生した誘導ラマン光のみならず、ポンプ光およびイレース光が検出器に入射するのを確実に防止して、試料からの蛍光のみを受光できるので、顕微鏡画像のバックグラウンドを低減することが可能となる。なお、検出器の前方に配置するノッチフィルタは、例えば、直入射設計の誘電体多層膜ミラー等を用いることができる。
【００５０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明による顕微鏡の一実施の形態について、図２を参照して詳細に説明する。
【００５１】
図２は本発明の一実施の形態における顕微鏡の光学系の要部構成を示す図である。本実施の形態の顕微鏡は、レーザ走査型の超解像蛍光顕微鏡で、ローダミン６Ｇで染色された生体試料を観察するものである。
【００５２】
ここで、ローダミン６Ｇは、５３０ｎｍの励起波長帯域で基底状態（Ｓ０）から第１電子励起状態（Ｓ１）への励起による吸収が最大となる。また、第１電子励起状態（Ｓ１）から、よりエネルギー的に高い高位の電子励起状態に励起できる吸収帯が、波長６００〜６５０ｎｍの領域に存在する。
【００５３】
そこで、本実施の形態では、第１の光源としてパルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１を用い、その２倍高調波（５３２ｎｍ）をポンプ光（第１の光）として用いる。また、第２の光源は、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１２とＢａ（ＮＯ３）２結晶からなるラマンシフタ１３とを有し、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１２の２倍高調波をラマンシフタ１３で波長５９９ｎｍのレーザ光に波長変換するように構成して、この波長５９９ｎｍのレーザ光をイレース光（第２の光）として用いる。
【００５４】
なお、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１および１２は、レーザ共振器の設計パラメータの調整により、ＭＨｚオーダの繰り返し周波数で、ピコ秒のレーザパルスを発振することができる。例えば、スイス：Ｔｉｍｅ−Ｂａｎｄｗｉｄｔｈ社製のＧＥ−１００シリーズは、標準仕様で、１００ＭＨｚの繰り返し周波数において、パルス幅：６ｐｓｅｃのパルス光を平均出力５０ｍＷで発振することができる。これは、１パルスの持つエネルギーが、５００ｐＪに対応する。また、共振器を設計変更することで、繰り返し周波数を、２５ＭＨｚ〜１ＧＨｚの間で調整することができる。
【００５５】
パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１からのポンプ光は、ポンプ光用光ファイバ光学系１５を経て重ね合わせ光学系を構成するキューベット型のハーフミラーからなるビームコンバイナ１６に入射させる。ポンプ光用光ファイバ光学系１５は、図１に示した空間フィルタを有する光結合部２１と、偏波面保存シングルモードファイバ２２と、コリメータレンズ２３と、波長分散素子である中心波長５３２ｎｍの狭帯域のバンドパスフィルタ２４とを有して構成し、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１からのポンプ光を、光結合部２１を介して偏波面保存シングルモードファイバ２２のコアに入射させて伝播させ、この偏波面保存シングルモードファイバ２２から出射されるポンプ光を、コリメータレンズ２３により平行光にビーム整形した後、バンドパスフィルタ２４を経てビームコンバイナ１６に入射させる。なお、バンドパスフィルタ２４は、例えば誘電体多層膜により形成された中心波長５３２ｎｍ、通過波長帯域幅１ｎｍの市販のナローバンドフィルタ（例えば、米国Ｂａｒｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ．製）を用いることができる。
【００５６】
このように、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１からのポンプ光を、図１に示した空間フィルタを有する光結合部２１を介して偏波面保存シングルモードファイバ２２に入射させれば、空間フィルタにより球面波成分のみを選別して偏波面保存シングルモードファイバ２２に入射させることができるので、偏波面保存シングルモードファイバ２２からの出射光をコリメータレンズ２３で平行光に変換することにより、均一平面波のポンプ光を得ることができる。また、このコリメータレンズ２３からのポンプ光を、中心波長５３２ｎｍの狭帯域のバンドパスフィルタ２４に入射させれば、偏波面保存シングルモードファイバ２２内で誘導ラマン光が発生しても、これをバンドパスフィルタ２４で通過を阻止でき、所望の波長（５３２ｎｍ）のポンプ光を得ることができる。
【００５７】
一方、ラマンシフタ１３からのイレース光は、イレース光用光ファイバ光学系２５を経て図１０に示したような位相板２６に入射させ、ここで中空ビーム化してビームコンバイナ１６に入射させてポンプ光と同軸上に合成する。イレース光用光ファイバ光学系２５は、ポンプ光用光ファイバ光学系１５と同様に、図１に示した空間フィルタを有する光結合部２７と、偏波面保存シングルモードファイバ２８と、コリメータレンズ２９と、波長分散素子である中心波長５９９ｎｍの狭帯域のバンドパスフィルタ３０とを有して構成し、ラマンシフタ１３からのイレース光を、光結合部２７を介して偏波面保存シングルモードファイバ２８のコアに入射させて伝播させ、この偏波面保存シングルモードファイバ２８から出射されるイレース光を、コリメータレンズ２９により平行光にビーム整形した後、バンドパスフィルタ３０を経て位相板２６に入射させる。なお、バンドパスフィルタ３０は、例えば誘電体多層膜により形成された中心波長５９９ｎｍ、通過波長帯域幅１ｎｍのナローバンドフィルタを用いる。
【００５８】
このように、ラマンシフタ１３からのイレース光を、図１に示した空間フィルタを有する光結合部２７を介して偏波面保存シングルモードファイバ２８に入射させることにより、偏波面保存シングルモードファイバ２８から完全な球面波のイレース光を得ることができ、さらにこの偏波面保存シングルモードファイバ２８からの出射光をコリメータレンズ２９で平行光に変換することにより、均一平面波のイレース光を得ることができる。また、コリメータレンズ２９からのイレース光を、中心波長５９９ｎｍの狭帯域のバンドパスフィルタ３０に入射させることにより、偏波面保存シングルモードファイバ２８内で誘導ラマン光が発生しても、これをバンドパスフィルタ３０で通過を阻止でき、所望の波長（５９９ｎｍ）のイレース光を得ることができる。
【００５９】
ビームコンバイナ１６により同軸上に合成されたポンプ光およびイレース光は、キューベット型のハーフミラーからなるビームセパレータ３１を透過させた後、互いに直交する軸を中心に揺動可能なガルバノミラー３２および３３で順次反射させて対物レンズ３４によりローダミン６Ｇで染色された生体試料３５の表面に集光させ、その集光点をガルバノミラー３２，３３の揺動により移動させて試料面上を２次元走査する。なお、図２では、図面を簡略化するために、ガルバノミラー３２，３３を互いに平行な軸を中心に揺動するように示している。
【００６０】
また、ポンプ光およびイレース光の照射により試料３５から発する蛍光は、対物レンズ３４によりコリメートしたのち、入射光路とは逆の経路を辿って、ガルバノミラー３３および３２を経てビームセパレータ３１に入射させ、該ビームセパレータ３１で反射される蛍光を集光レンズ３６によりピンホール３７に集光させる。
【００６１】
ピンホール３７は、試料３５の蛍光発光点に対して共焦点位置に配置し、このピンホール３７を透過した蛍光を、ポンプ光カットノッチフィルタ３８およびイレース光カットノッチフィルタ３９を透過させて、それぞれポンプ光およびイレース光を除去した後、光検出器である光電子増倍管４０で受光して蛍光出力信号を得、この蛍光出力信号を、顕微鏡を制御する図示しないコンピュータのビデオフレームメモリに格納して、試料３５の蛍光２次元画像を図示しないモニタにリアルタイムで表示する。なお、ガルバノミラー３２，３３は、モニタに表示する蛍光２次元画像のビデオレートに同期して揺動させる。
【００６２】
ポンプ光カットノッチフィルタ３８の通過阻止波長帯域は、ポンプ光用光ファイバ光学系１５におけるバンドパスフィルタ２４の通過波長帯域よりも広くする。同様に、イレース光カットノッチフィルタ３９の通過阻止波長帯域も、イレース光用光ファイバ光学系２５におけるバンドパスフィルタ３０の通過波長帯域よりも広くする。なお、これらポンプ光カットノッチフィルタ３８およびイレース光カットノッチフィルタ３９は、ポンプ光およびイレース光を含む波長帯域の光の通過を阻止する市販の１枚のフィルタ（例えば、米国Ｂａｒｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ．製）をもって構成することもできる。
【００６３】
以上のように、本実施の形態では、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１からのポンプ光を、ポンプ光用光ファイバ光学系１５を経てビームコンバイナ１６に入射させると共に、ラマンシフタ１３からのイレース光を、イレース光用光ファイバ光学系２５を経て位相板２６に入射させ、ここで中空ビーム化してビームコンバイナ１６に入射させてポンプ光と同軸上に合成するようにしたので、ポンプ光およびイレース光を光軸の揺らぎを生じることなく、試料面上でオーバーラップさせることができ、超解像効果を確実に得ることができる。また、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１１や、パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ１２およびラマンシフタ１３を、対物レンズ３４を有する光学ベンチとは別体に配置できるので、顕微鏡設計の自由度を広くできる利点もある。
【００６４】
また、ポンプ光用光ファイバ光学系１５には、偏波面保存シングルモードファイバ２２の入射端面側に空間フィルタを設け、出射端面側にコリメータレンズ２３を設けたので、完全な球面波のポンプ光を取り出して均一平面波に変換することができると共に、光ファイバ端面の焼けの原因となる余分な光をカットすることができる。同様に、イレース光用光ファイバ光学系２５には、偏波面保存シングルモードファイバ２８の入射端面側に空間フィルタを設け、出射端面側にコリメータレンズ２９を設けたので、完全な球面波のイレース光を取り出して均一平面波に変換することができると共に、光ファイバ端面の焼けの原因となる余分な光をカットすることができる。したがって、特にイレース光においては、位相板２６で正確に中空ビーム化することができ、超解像性を確実に発現できると共に、高強度のイレース光を取り出すために、レーザ光自体の強度を高くしても、偏波面保存シングルモードファイバ２８を焼損することがなくなる。
【００６５】
また、ポンプ光用光ファイバ光学系１５には、偏波面保存シングルモードファイバ２２の出射端面側に狭帯域のバンドパスフィルタ２４を設けて所望の波長のポンプ光のみを透過させるようにし、同様に、イレース光用光ファイバ光学系２５には、偏波面保存シングルモードファイバ２８の出射端面側に狭帯域のバンドパスフィルタ３０を設けて所望の波長のイレース光のみを透過させるようにしたので、偏波面保存シングルモードファイバ２２，２８内で誘導ラマン光が発生しても、その通過を確実に阻止することができる。したがって、誘導ラマン光が試料３５からの蛍光信号を観測する際のバックグラウンドとなるのを防止することができる。しかも、本実施の形態では、光電子増倍管４０の前方にバンドパスフィルタ２４の通過波長帯域よりも広い通過阻止波長帯域のポンプ光カットノッチフィルタ３８、およびバンドパスフィルタ３０の通過波長帯域よりも広い通過阻止波長帯域のイレース光カットノッチフィルタ３９を配置しているので、偏波面保存シングルモードファイバ２２，２８で発生した誘導ラマン光のみならず、ポンプ光およびイレース光が光電子増倍管４０に入射するのを確実に防止して、試料３５からの蛍光のみを受光できるので、画質の良好な顕微鏡画像を得ることができる。
【００６６】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、偏波面保存シングルモードファイバ２２や２８内で誘導ラマン光が発生する場合において、その誘導ラマン光の発光スペクトル帯域がポンプ光カットノッチフィルタ３８やイレース光カットノッチフィルタ３９の通過阻止波長帯域内にあるときは、バンドパスフィルタ２４や３０を省略することができる。また、イレース光を中空ビームにビーム整形する位相変調素子は、上述した位相板に限らず、液晶空間光変調器や他の公知の素子を使用することができる。さらに、上記実施の形態では、ポンプ光およびイレース光をパルス光としたが、そのいずれか一方または双方が連続波の場合にも、本発明を有効に適用することができる。
【００６７】
付記項
１．第１の光源からの第１の光と第２の光源からの第２の光とを、重ね合わせ光学系により一部分重ね合わせて集光光学系により試料に集光させて、上記試料の光応答を光検出器で検出するようにした顕微鏡において、
上記第１の光源または第２の光源の少なくとも一方からの上記第１の光または第２の光を、光ファイバおよびコリメータレンズを有する光ファイバ光学系を経て均一平面波として上記重ね合わせ光学系に導くよう構成したことを特徴とする顕微鏡。
２．上記第１の光源または第２の光源の少なくとも一方がパルス光源であることを特徴とする付記項１に記載の顕微鏡。
３．上記第１の光の波長は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料の上記分子を、基底状態から第１電子励起状態へ遷移させる共鳴吸収波長帯域内にあり、
上記第２の光の波長は、上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い他の電子状態へ遷移させる共鳴吸収波長帯域内にあることを特徴とする付記項１または２に記載の顕微鏡。
４．上記光ファイバ光学系は、上記光ファイバと上記第１の光源または第２の光源との間に配置した空間フィルタを有することを特徴とする付記項１〜３のいずれか一項に記載の顕微鏡。
５．上記光ファイバ光学系は、上記光ファイバと上記重ね合わせ光学系との間に配置した上記第１の光または第２の光を透過する波長分散素子を有することを特徴とする付記項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
６．上記光検出器の前方に、上記試料の光応答による発光を通過させ、上記第１の光または第２の光の通過を阻止するノッチフィルタを配置したことを特徴とする付記項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
７．上記光ファイバ光学系は、上記光ファイバと上記重ね合わせ光学系との間に配置した上記第１の光または第２の光を透過する波長分散素子を有し、上記光検出器の前方には、上記試料の光応答による発光を通過させ、上記第１の光または第２の光の通過を阻止するノッチフィルタを配置し、かつ上記ノッチフィルタの通過阻止波長帯域を上記波長分散素子の通過波長帯域よりも広くしたことを特徴とする付記項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
８．上記波長分散素子は、バンドパスフィルタからなることを特徴とする付記項５または７に記載の顕微鏡。
９．上記ノッチフィルタは、多層膜波長分散素子からなることを特徴とする付記項６または７に記載の顕微鏡。
１０．上記ノッチフィルタは、直入射型の多層膜反射鏡からなることを特徴とする付記項６または７に記載の顕微鏡。
【００６８】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、第１の光源からの第１の光または第２の光源からの第２の光の少なくとも一方を、光ファイバおよびコリメータレンズを有する光ファイバ光学系を経て均一平面波とし、これら第１の光および第２の光を重ね合わせ光学系により一部分重ね合わせて集光光学系により試料に集光させて、試料の光応答を光検出器で検出するようにしたので、良好な波面を保ちつつ、かつ第１の光と第２の光とを光軸変動を生じることなく試料に照射でき、常に安定して超解像現象を発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の原理を説明するための図である。
【図２】本発明の一実施の形態における顕微鏡の光学系の要部構成を示す図である。
【図３】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図４】図３の分子の第１電子励起状態を示す概念図である。
【図５】同じく、第２電子励起状態を示す概念図である。
【図６】同じく、第２電子励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図７】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図８】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図９】従来の超解像顕微鏡の一例の構成を示す図である。
【図１０】図９に示す位相板の構成を示す平面図である。
【図１１】従来の超解像顕微鏡の他の例の構成を示す図である。
【符号の説明】
１　空間フィルタ
２　集光レンズ
３　ピンホール
４　コリメータレンズ
５　集光レンズ
６　シングルモード光ファイバ
１１，１２　パルスＮｄ：ＹＡＧレーザ
１３　ラマンシフタ
１５　ポンプ光用光ファイバ光学系
１６　ビームコンバイナ
２１，２７　光結合部
２２，２８　偏波面保存シングルモードファイバ
２３，２９　コリメータレンズ
２４，３０　バンドパスフィルタ
２５　イレース光用光ファイバ光学系
２６　位相板
３１　ビームセパレータ
３２，３３　ガルバノミラー
３４　対物レンズ
３５　試料
３６　集光レンズ
３７　ピンホール
３８　ポンプ光カットノッチフィルタ
３９　イレース光カットノッチフィルタ
４０　光電子増倍管
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004109368.tif 000009
【図８】
2004109368.tif 000010
【図９】
2004109368.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
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