(57)【要約】【課題】低濃度重金属汚染からの重金属の除去について十分に満足できる浄化速度や経済的効率性を発揮できる微生物利用浄化方法を確立すること、特に重金属の再拡散や二次的環境汚染を引き起こさないように重金属を蓄積・回収できるバイオリアクター及び浄化方法を提供する。【手段】重金属微量汚染試料を浄化するための本発明の形質転換微生物は、重金属結合性無機ポリマー合成タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする。より好ましい態様では、前記重金属結合性無機ポリマーがポリリン酸である。さらに重金属膜輸送系タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることが好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重金属結合性無機ポリマー合成タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする、重金属微量汚染試料を浄化するための形質転換微生物。
【請求項２】
前記重金属結合性無機ポリマーがポリリン酸である、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項３】
さらに、重金属膜輸送系タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の形質転換微生物。
【請求項４】
重金属結合性無機ポリマー合成タンパク質をコードする遺伝子及び重金属膜輸送系タンパク質をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたベクターにより形質転換されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【請求項５】
重金属結合性無機ポリマー合成タンパク質をコードする遺伝子及重金属膜輸送系タンパク質をコードする遺伝子びが発現可能に挿入されたベクター。
【請求項６】
さらに、重金属の存在によって前記各遺伝子の発現を誘導するためのプロモーターを含むことを特徴とする、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の形質転換微生物が固定化されていることを特徴とする、重金属微量汚染試料を浄化するための微生物バイオリアクター。
【請求項８】
前記形質転換微生物を固定化しているビーズを充填したカラムであることを特徴とする、請求項７に記載の微生物バイオリアクター。
【請求項９】
下記（ａ）及び（ｂ）の各工程を含む、重金属微量汚染試料の浄化方法：
（ａ）  重金属微量汚染試料を請求項７又は８に記載の微生物バイオリアクター内を経由させ、該試料中の重金属を、前記形質転換微生物内へ取り込ませて重金属結合性無機ポリマーと結合させることによって蓄積させる工程；および
（ｂ）  前記試料の経由後、形質転換微生物内で重金属と結合した重金属結合無機ポリマーが分解されて、該形質転換微生物から重金属が放出される条件を与えることによって、前記微生物バイオリアクターから重金属を回収する工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、重金属結合性無機ポリマー合成タンパク質をコードする遺伝子が導入された重金属微量汚染試料浄化用の形質転換微生物、及びそれを用いた微生物バイオリアクター並びに浄化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、重金属による環境汚染は、従来の高濃度・局所的汚染の段階から、微量長期汚染による人体への影響が問題とされる段階へと進んできている。従来の高濃度・局所的な重金属汚染による環境汚染を防止するための方法として、凝集沈殿法や無機担体吸着法で代表される物理化学的重金属除去法が広く用いられてきた。重金属浄化法として、これまでに用いられる物理化学的処理法は、次のように分類することができる。
１）重金属の無機担体への物理的吸着現象を利用する除去技術（活性炭吸着法）
２）重金属イオンのイオン交換現象を利用する除去技術（キレート樹脂法）
３）重金属との錯体形成・凝集体形成を利用する除去技術（凝集沈殿法）
４）金属表面への重金属置換（アマルガム法）
５）錯体形成とその溶媒抽出法
【０００３】
前記の如く、重金属の物理化学的除去法に関しては、これまでに多くの特許出願がなされており、例えば特開２００２−２８２８３６号公報（特許文献１）や特開２００２−１９４３２８号公報（特許文献２）では、キレート剤を含む重金属処理剤を用いて土壌あるいは廃棄物、工場排水等に含まれる重金属を除去する方法が検討されている。
【０００４】
しかしながら、これらの物理化学的方法は、高濃度の重金属を含む汚染水や汚染スラッジ、汚染土壌の浄化には有効であったが、環境基準に相当するｐｐｂ〜ｐｐｔレベルの低濃度の重金属を含む汚染水や土壌の処理には適さず、除去限界の改善、除去効率の増大、除去コストの削減等の多くの課題が残されている。すなわち、物理化学的方法で使われる無機物質と重金属との結合アフィニティーが十分高くはなく、低濃度汚染処理に適さないこと、また処理に用いる化学薬品が高価な上にそれによる二次的環境汚染を引きおこす可能性がある。
【０００５】
それに対して、特開２０００−８４５３８号公報（特許文献３）や特開平９−１０８５６８号公報（特許文献４）は、微生物の生産する多糖類や微生物菌体そのものを吸着剤として重金属を除去する方法を開示しており、それによると化学薬品に比べて環境汚染の影響は少ないが、微生物の培養や多糖類の抽出などに要するコストが高く、実用性が低い。
【０００６】
一方、近年、生物機能を利用した重金属除去技術が開発されてきている。それらは、いわゆるバイオレメディエーション技術として、自然界に生存する重金属を吸収し細胞組織に蓄積できる生物、特に植物を利用するもので、ファイトレメディエーション技術と呼ばれている。そのために有用と考えられる植物や関連微生物の探索および育種がなされており、一定程度の重金属汚染の浄化が可能であるとする研究成果が得られつつある。特開２００２−９５４８１号公報（特許文献５）では、カドミウムの高蓄積に関与する遺伝子を植物に導入して、重金属の蓄積量を高めることを検討している。また、特開２００１−２７５６８３号公報（特許文献６）では、チモシンをコードする遺伝子を植物に導入して、鉛の蓄積量を高めることを検討している。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００２−２８２８３６号公報
【特許文献２】
特開２００２−１９４３２８号公報
【特許文献３】
特開２０００−８４５３８号公報
【特許文献４】
特開平９−１０８５６８号公報
【特許文献５】
特開２００２−９５４８１号公報
【特許文献６】
特開２００１−２７５６８３号公報
【０００８】
【発明が解決するための課題】
しかしながら、上記従来の生物を用いた重金属汚染の浄化は、生物の多機能性によって重金属を除去するものであり、重金属の除去機能のみを効果的又は効率的に発揮できるものではない。そのために、浄化速度や経済的効率性を十分に満足できることは期待しがたい。
【０００９】
これまでに水銀化合物の浄化に微生物のもつ水銀代謝能を利用する試みはあるが、実用化されていない。その理由として、微生物の解毒システムをそのままの形で利用すると代謝されて生成した金属水銀が拡散して再び他の地域を汚染するという問題があるからである。
【００１０】
物理化学的方法は、環境基準に相当するｐｐｂ〜ｐｐｔレベルの低濃度の重金属を含む汚染水や土壌の処理には適さず、除去限界の改善、除去効率の増大、除去コストの削減等の多くの課題が残されている。また処理に用いる化学薬品が高価な上にそれによる二次的環境汚染を引きおこす可能性がある。
【００１１】
一方、生物を用いた重金属汚染の浄化は、生物の多機能性によって重金属を除去するものであり、重金属の除去機能のみを特別に発揮できるものではない。そのために、浄化速度や経済的効率性を十分に満足できることは期待しがたい。
【００１２】
上記の各問題点に鑑みると、低濃度重金属汚染からの重金属の除去について十分に満足できる浄化速度や経済的効率性を発揮できる微生物利用浄化方法を確立すること、特に重金属の再拡散や二次的環境汚染を引き起こさないように重金属を蓄積・回収できるバイオリアクター及び浄化方法を提供するという未解決な課題が存在する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、遺伝子工学的手法によって重金属の蓄積・回収に適するのに好ましく改変された形質転換微生物、及びそれを用いた微生物バイオリアクターと浄化方法を見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち、本発明は、重金属結合性無機ポリマー合成タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする、重金属微量汚染試料を浄化するための形質転換微生物を提供する。
【００１５】
本発明の形質転換微生物の好ましい態様では、前記重金属結合性無機ポリマーがポリリン酸である。さらに、重金属膜輸送系タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることが好ましい。この場合、重金属結合性無機ポリマー合成タンパク質をコードする遺伝子及び重金属膜輸送系タンパク質をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたベクターにより形質転換されたものであり得る。
【００１６】
また、本発明は、重金属結合性無機ポリマー合成タンパク質をコードする遺伝子及重金属膜輸送系タンパク質をコードする遺伝子びが発現可能に挿入されたベクターを提供する。この場合、さらに、重金属の存在によって前記各遺伝子の発現を誘導するためのプロモーターを含むことが望ましい。
【００１７】
また、本発明は、上記いずれかの形質転換微生物が固定化されていることを特徴とする、重金属微量汚染試料を浄化するための微生物バイオリアクターを提供する。この場合、前記形質転換微生物を固定化しているビーズを充填したカラムであることが好ましい。
【００１８】
また、本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）の各工程を含む、重金属微量汚染試料の浄化方法を提供する。
（ａ）  重金属微量汚染試料を前記いずれかに記載の微生物バイオリアクター内を経由させ、該試料中の重金属を、前記形質転換微生物内へ取り込ませて重金属結合性無機ポリマーと結合させることによって蓄積させる工程；および
（ｂ）  前記試料の経由後、形質転換微生物内で重金属と結合した重金属結合無機ポリマーが分解されて、該形質転換微生物から重金属が放出される条件を与えることによって、前記微生物バイオリアクターから重金属を回収する工程。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の形質転換微生物
本発明の形質転換微生物は、その菌体内においてポリリン酸のような重金属結合性無機ポリマーを生産するための重金属結合性無機ポリマー生合成関連遺伝子が導入された遺伝子組換え微生物（分子育種微生物）である。このような遺伝子組換え微生物では、その微生物内に取り込まれた水銀等の重金属が当該微生物細胞内に既に蓄積しているポリリン酸とキレートを形成して捕捉され、当該重金属の毒性を軽減した形態で蓄積される（図１参照）。
【００２０】
上記ポリリン酸に代表される無機ポリマーは、二価陽イオンなどに対して高い親和性を示し得る一種のキレート剤であり、水銀以外にも、カドミウム、鉛、亜鉛、クロム、砒素などの有害重金属の浄化に利用することができる。
【００２１】
本発明の好ましい態様によれば、上記重金属結合性無機ポリマー合成タンパク質遺伝子の導入に加えて、周囲環境から重金属を微生物細胞内に能動的に取り込ませるための遺伝子による形質転換がなされ、重金属を高度に蓄積可能な微生物として提供されてもよい。そのような重金属蓄積微生物は、上記の組換えＤＮＡ技術によって重金属膜輸送系タンパク質をコードする遺伝子を当該微生物に導入することにより得られる。また別のやり方では、通常の重金属耐性微生物が重金属化合物を細胞外へ排出する生体防御システムを持っているため、それら重金属排出に関与する遺伝子の機能を欠失させることによって高度な重金属蓄積能力が付与された微生物を創出することもできる。
【００２２】
本発明のより好ましい態様では、公知の遺伝子工学手法に基づき、特定の重金属の細胞内蓄積性に寄与する遺伝子群を高レベルで発現できるような発現ベクターを構築し、これを用いて大腸菌を形質転換する。
【００２３】
例えば、水銀の蓄積・回収に好適な形質転換大腸菌は、他の微生物由来の水銀輸送系タンパク質生合成ないしそれに類した特異的重金属結合タンパク質生合成に関与する遺伝子群から選ばれる少なくとも１種の水銀結合性タンパク質生合成遺伝子、並びにリン酸膜輸送およびポリリン酸生合成に関与する遺伝子群を適切なプラスミドベクターに発現可能に組み込んでクローニングし、これら外来遺伝子を有するプラスミドベクターを大腸菌へ導入することによって得られる。こうして高度な水銀取り込み能力が付与され（即ち、水銀に高度感受性となる）且つ取り込まれた水銀と結合体を形成できるポリリン酸が生産される（即ち、水銀耐性を獲得する）高度な水銀蓄積性の形質転換大腸菌を取得することができる。
【００２４】
以下では、水銀又はカドミウムの除去を対象とした形質転換微生物に関する実施態様を詳細に説明する。
【００２５】
先ず、水銀又はカドミウムに高度感受性細菌株の分子育種は、従来知られている細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属）が所持する水銀還元酵素遺伝子（ｍｅｒＡ）およびＰ型ＡＴＰアーゼドメインを含むカドミウム膜輸送タンパク質（このタンパク質はカドミウムを細胞外にポンプアウトするための細胞膜輸送タンパク質である）の遺伝子（ｃａｄＡ）を当該技術分野の定法である位置指定突然変異により欠失させることにより可能である。
【００２６】
また水銀については、これを細胞内に能動的に取り込む際に機能する水銀イオン膜輸送酵素（対応する遺伝子としてはｍｅｒＴが知られている）及び水銀結合タンパク質（対応する遺伝子としてはｍｅｒＰが知られている）を微生物内へで導入し、水銀イオンの細胞内への能動的取込み能力を増強することができる。
【００２７】
一方、カドミウムの取込みについては、特異的な能動輸送のための膜タンパク質システムとそれに対応する遺伝子は特に存在しないと考えられている。しかしながら、能動輸送システムを持つ水銀の細胞内への取込みとの能力の違いについて比較検討することは可能である。少なくとも後述の実施例３で見られるように重金属結合性無機ポリマー合成遺伝子を導入するだけでも有意なカドミウム耐性を獲得することが分かっている。したがって、カドミウムの特異的能動輸送に寄与する外来遺伝子を導入しなくとも、無機ポリマーの蓄積によって一定のカドミウムの捕捉と回収が可能である。
【００２８】
本発明では、上述の重金属蓄積細菌の分子育種と同時に、取り込んだ重金属を無毒な形態で高度に蓄積可能とするための重金属結合性無機ポリマー合成能力を付与する形質転換を当該微生物に行う。例えば、当該技術分野の定法に従って、大腸菌にポリリン酸合成遺伝子を導入し、その菌体内でポリリン酸を高度に生産及び蓄積可能な形質転換微生物を育種することができる。
【００２９】
微生物におけるポリリン酸の生産及び蓄積能力の形成のためには、例えば、リン酸を特異的に膜輸送するためのＰｓｔオペロンおよびポリリン酸合成酵素（ポリリン酸キナーゼ）をコードする遺伝子（ｐｋｋ）を組み入れた高発現ベクターを作成するとよい。高発現ベクターを利用する好ましい態様では、それら組換え遺伝子の発現を水銀イオンその他の重金属イオンによって発現誘導するのに適したプロモーター及び／又はオペレーターＤＮＡ（例えば、Ｌａｃプロモーター；宝酒造（株）より入手可能）をその遺伝子の上流に配置して、リン酸蓄積遺伝子の発現制御系を構築するとよい。こうして作成された高発現ベクターを微生物に導入して形質転換でき、こうしてポリリン酸高蓄積能を有する細菌および酵母等の微生物を分子育種することができる。
【００３０】
なお上述した遺伝子の中で、典型的な水銀耐性関連遺伝子の単離及び塩基配列はＧｅｎｅ．  Ｎｏ．１８９，  ｐｐ１５１−１５７，  １９９７に記載されており、また典型的なポリリン酸合成遺伝子の単離法及び塩基配列はＧｅｎｅ．  Ｎｏ．１３７，  ｐｐ１３７−２４２，  １９９３に記載されている。したがって、当業者は、従来の遺伝子工学的手法を用いて、それら公知の遺伝子のクローニングしそれを適切な微生物に導入して形質転換株を育種できるし、また関連する遺伝子を欠失させた重金属耐性微生物の突然変異株を取得することもできる。
【００３１】
本発明を適用できる微生物の種類は特に限定されないが、外来遺伝子の導入及び発現のための定法が確立している大腸菌、酵母等の公知の微生物が好ましい。
【００３２】
本発明のバイオリアクターと浄化方法
本発明の形質転換微生物のバイオリアクターへの利用に際して、当該形質転換微生物重金属を繰り返し利用を可能にするためには、使用した微生物細胞の再利用のための回収と共に微生物細胞内からの重金属の回収が必要となる。この場合、従来において一般に微生物細胞は培養液中で分散して増殖しているためこれらの回収は特別の方法および装置を必要とすることが多かった。他方、それら微生物細胞から回収した重金属は、重金属資源として循環利用することが望まれている。
【００３３】
本発明の形質転換微生物は、好ましいことに、環境試料からの重金属の除去とともにそれら重金属を資源として回収するのに適した包括法などの固定化微生物技術を適用することができる。すなわち、本発明の浄化方法における微生物の固定化技術は、分子育種した微生物の活性安定にも寄与するだけでなく、重金属の回収と再利用を容易になしうるという利点がある。かくして本発明の浄化方法は、重金属の生物による蓄積・除去と回収とを効果的に達成するために遺伝子工学技術と固定化微生物技術のハイブリッド化を画策したものといえる。
【００３４】
本発明の好ましい態様の浄化方法では、重金属吸収能力とポリリン酸合成能の双方を付与した微生物を培養し、それら微生物をゲルによる付着又は包括固定化した形態の固定化微生物にしてバイオリアクターを構成する。
【００３５】
図２は、そのような態様の固定化微生物を適用したカラム式バイオリアクターとその利用プロセスを示している。同図に示す微生物バイオリアクターは、遺伝子工学的手法によって重金属吸収能力とポリリン酸合成能力とが付与された形質転換大腸菌をビーズ上に固定し、それらビーズを通水可能なカラム内に充填したものである。
【００３６】
浄化すべき環境試料（例えば排水）を上記のカラム内へ通水すると、その環境試料中の重金属が固定化されている形質転換大腸菌内に取り込まれ、そこで生産されているポリリン酸と金属キレートを形成し、その菌体内に蓄積されていく。環境試料の通水が完了した後、このカラム内部を大腸菌内に蓄積されたキレートが分解される条件を付与する環境に変化させることで、濃縮した重金属を回収できる。回収のために付与する条件としては、典型的には、嫌気的条件下においてポリリン酸を加水分解する当該微生物の代謝過程を利用することができ、このためカラムに溶存酸素を含まない培養液等を流すなどすればよい。キレートの形態で蓄積されていた重金属は分解されたリン酸と共に細胞外に放出され、こうして重金属の濃縮された分画が得られる。
【００３７】
以上説明した通り、本発明の微生物バイオリアクターは、重金属高度アフィニティー結合細菌と高度蓄積細菌の機能を組合せた微生物を育種し、これを固定化して構築したものであるから、重金属汚染試料から重金属を除去するとともに濃縮して回収でき、さらに再利用可能である。
【００３８】
本発明の実施によって、土壌や環境水などの従来技術では達成不可能であった重金属の微量かつ広域汚染を浄化するのに好都合な産業技術および環境浄化装置が市場に提供される。本発明を利用可能な産業分野としては、少なくとも、重金属汚染土壌洗浄水浄化、廃棄物埋め立て地浸出水浄化、廃棄物焼却処分場排ガス洗浄廃水浄化、石炭灰貯蔵ヤード排水浄化、鉱石・石炭貯蔵ヤード排水浄化、鉱山廃水浄化、重金属含有工業廃水浄化、河川水や農業用水浄化、河川や海域の低質浄化、その他の重金属含有汚泥・廃土壌・排気処を挙げることができる。
【００３９】
【実施例】
実施例１
グラム陰性細菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｋ−６２がプラスミド上にコードしている水銀耐性オペロンの水銀膜輸送系遺伝子と、ポリリン酸合成能力があるグラム陰性細菌Ｋｌｅｂｓｈｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来のポリリン酸合成遺伝子であるｐｐｋとを高発現ベクタープラスミドｐＵＣ１１９に組み込み、新規なプラスミドｐＭＫ２７を得た。このプラスミドｐＭＫ２７を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換することによって新規な形質転換大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＫ２７を得た。組換え大腸菌クローンＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＫ２７はポリリン酸の合成活性を有しており、細胞内に多量のポリリン酸を蓄積することが確かめられた。
【００４０】
上記大腸菌クローンＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＫ２７と、前記ベクターｐＵＣ１１９によって形質転換した対照大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＵＣ１１９とについて、１６μＭの水銀イオン（Ｈｇ２＋）を含む液体培地中３７℃で２４時間培養した後、それぞれの大腸菌１×１０８細胞当たりに含まれる水銀の量（ｎｍｏｌ）を測定したところ、図３に示したような結果を得た。両者の大腸菌クローンの水銀含有量を比較したところ、ポリリン酸合成遺伝子を含むベクターを持つ大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＫ２７は、ポリリン酸合成遺伝子を含まないベクターを持つ大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＵＣ１１９と比較して約７倍の水銀を蓄積可能であることが分かった。
【００４１】
一方、同一のプラスミドベクターにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｋ−６２がプラスミド上にコードしている水銀耐性オペロンの水銀膜輸送系遺伝子のみを組み入れて新規なプラスミドｐＭＲＤ１４１を得た。これを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換し同様に水銀イオンを含む培地で培養し、大腸菌クローンＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＲＤ１４１を得た。この大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＲＤ１４１は、水銀イオンに対して高度に感受性となることが確かめられた。このことは、ポリリン酸を生産できない大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＲＤ１４１では、水銀イオンを無毒な形態で蓄積できないことを示唆する。
【００４２】
以上のことから、細菌細胞内で生産されたポリリン酸は、細胞膜輸送され細胞内に取り込まれた水銀イオンと結合して水銀イオンによる細胞毒性を大幅に軽減することが確かめられた。また、上記大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＫ２７のように細胞内に大量の水銀を蓄積してもポリリン酸合成能をもつ細菌は水銀の毒性作用を受けることなく生育可能であるため、このような新規な形質転換細菌は、下記実施例４で示すように水銀を生物濃縮して除去することに利用できる。
【００４３】
実施例２
実施例１によって得た組換え大腸菌クローンＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＫ２７を用いて、培地からの水銀除去能力について調べたところ、図４の結果を得た。この大腸菌クローンは、２〜２０ｕＭの低濃度の水銀イオンが存在する場合に液中の水銀イオン残存量がほぼ完全に無くなるまで除去し、１００％近い除去率を示し、微量濃度の水銀の除去にきわめて有効であることが明らかとなった（図４（Ａ）参照）。しかし、液中の初期水銀濃度が４０，  ６０，  ８０ｕＭの高濃度では、水銀残存率がそれぞれ約２５％，  ３０％，  ３５％と高くなり、水銀除去の能力はあるものの高濃度の水銀イオンの除去性能はやや低下することも分かった（図４（Ｂ）参照）。
【００４４】
実施例３
ポリリン酸を高発現させた組換え細菌細胞が水銀以外の重金属の除去に有効か否かを調べるために、実施例１で得た大腸菌クローンＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＫ２７に水銀イオンに替えて塩化カドミウムを添加して培養する実験を行った。この場合には、培地中のカドミウムイオン濃度の現象を測定する代わりに、カドミウムイオンが大腸菌細胞内に生成されたポリリン酸と結合して無毒化されるかどうかを調べることで、間接的にカドミウムの除去能力を評価した。すなわち、取り込まれたカドミウムがポリリン酸に結合すれば、カドミウムイオン濃度は低下しその毒性も低下するので微生物は増殖可能となる。
【００４５】
カドミウム除去について得られた結果を図５に示す。同図で明らかなように、ポリリン酸合成能を付与した大腸菌クローンＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＫ２７は、そうでない対照株の大腸菌クローンＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＵＣ１１９および大腸菌クローンＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＲＴ１４のいずれと比較しても、高濃度のカドミウムの存在下で増殖可能であることが分かった。
【００４６】
なお、本実施例は、組換え微生物細胞内で合成されたポリリン酸が水銀以外の重金属イオンと結合してこれを除去できることを示しており、このことは、ポリリン酸は少なくとも２価の重金属イオンの除去に有効であることを示唆する。
【００４７】
実施例４
実施例１に示した大腸菌クローンＸＬ１−Ｂｌｕｅ／ｐＭＫ２７の培養液を４％アルギン酸ナトリウムと混合し、その混合液を０．１Ｍの塩化カルシウム溶液に滴下することによってアルギン酸固定化微生物ビーズを作成した。その固定化ビーズをカラムリアクターに充填し、このビーズ充填カラムにさらに初期濃度１０ｕＭの塩化水銀を含む培地を加えてカラムを満たし、約１日の液滞留時間となる押し出し流れとして水銀を含まない培地を通液した。また、この通液を２４時間おきに初期濃度１０ｕＭの塩化水銀となるように加えた後に繰り返した際のビーズ充填カラム出口からの流出液中に残存する水銀の濃度は、図６に示した通りであった。
【００４８】
この結果から、ポリリン酸合成能力を持つ固定化微生物充填したカラムリアクターは繰り返して水銀を有効に除去することができることが明らかになった。さらに、この水銀を除去蓄積した固定化微生物充填カラムに水銀および溶存酸素を含まない培養液を通水して嫌気性条件を与えたところ、その固定化微生物ビーズからリン酸イオンおよび水銀イオンが溶出した。こうして水銀の蓄積・回収プロセスとして有効に利用できること、および繰り返し水銀除去リアクターとして有用であることが確かめられた。
【００４９】
【発明の効果】
以上詳細に説明した通り、本発明の重金属微量汚染試料を浄化するための形質転換微生物は、重金属結合性無機ポリマー合成タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とするものであるから、また、本発明による重金属微量汚染試料の浄化方法は（ａ）重金属微量汚染試料を前記形質転換微生物のバイオリアクター内を経由させ、該試料中の重金属を、前記形質転換微生物内へ取り込ませて重金属結合性無機ポリマーと結合させることによって蓄積させる工程；および（ｂ）前記試料の経由後、形質転換微生物内で重金属と結合した重金属結合無機ポリマーが分解されて該形質転換微生物から重金属が放出される条件を与えることによって前記バイオリアクターから重金属を回収する工程を含む方法であるから、当該微生物内で生産されている重金属結合性無機ポリマーを介して重金属微量汚染試料（例えば下・廃水や各種有機性汚泥）から重金属を効率的に除去及び蓄積させることができ、従来において効率的な浄化が困難であった重金属微量汚染試料を経済的に浄化できるとともに重金属の濃縮・回収をも可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の形質転換微生物内で生産された重金属結合性無機ポリマーの作用を説明するための模式図である。
【図２】本発明の微生物バイオリアクターとその利用プロセスを説明するための模式図である。
【図３】本実施例に係る大腸菌の水銀蓄積能力を示すグラフである。
【図４】本実施例に係る大腸菌の水銀除去能力を濃度別に示すグラフであり、同図（Ａ）は微量濃度域における除去効果を、同図（Ｂ）は比較的高濃度域における除去効果を示す。
【図５】本実施例に係る大腸菌のカドミウム耐性を示すグラフである。
【図６】本実施例のカラムによる水銀の浄化効果を示す線図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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