(57)【要約】【課題】精製操作が容易であって、かつ収量が高く、安価で効率的に製造できるガン細胞アポトーシス誘導剤を提供する。【解決手段】ＦＥＲＭＰ−１８９４１として寄託されているペニシリウム・エスピーＧＡＬＡ２２によるアラビノオリゴ糖生成酵素を用い、アラビナン含有繊維分を加水分解することで得られた、平均重合度が５以下のアラビノオリゴ糖含有物を成分とする、ガン細胞アポトーシス誘導剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラビノオリゴ糖含有物を成分とする、ガン細胞アポトーシス誘導剤。
【請求項２】
平均重合度が１０以下のアラビノオリゴ糖含有物を成分とする、ガン細胞アポトーシス誘導剤。
【請求項３】
ＦＥＲＭＰ−１８９４１として寄託されているペニシリウム・エスピーＧＡＬＡ２２によるアラビノオリゴ糖生成酵素を用い、アラビナン含有繊維分を加水分解することで得られたアラビノオリゴ糖含有物を成分とする、ガン細胞アポトーシス誘導剤。
【請求項４】
前記アラビナン含有繊維分として、ビート搾汁粕を用いる、請求項３に記載のガン細胞アポトーシス誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
【０００２】
本発明は、ガン細胞アポトーシス誘導剤に関し、詳細には、オリゴ糖含有物を成分とする、ガン細胞アポトーシス誘導剤に関する。
【０００３】
【従来の技術】
【０００４】
従来、オリゴ糖含有物を成分とするガン細胞アポトーシス誘導剤として、特許文献１である特開２００１−８６９９９号公報に記載されているように、海藻の細胞壁により得られたβ−１，３キシランをβ−１，３キシラナーゼで処理する事によりよって得られたβ−１，３キシロオリゴ糖を主成分とするものが知られている。
該ガン細胞アポトーシス誘導剤は、イヅワタ科の藻類であるスリコギヅタ等から、脱イオン水、１％塩酸溶液及び２３％水酸化ナトリウム溶液での洗浄、亜塩素酸ナトリウム溶液による脱色、１０％水酸化ナトリウム溶液による抽出、エタノール沈殿による分別精製処理を行うことで、原料として用いるβ−１，３キシランを得るものであった。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００１−８６９９９号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記β−１，３キシロオリゴ糖を主成分とするガン細胞誘導アポトーシス誘導剤は、原料として用いるβ−１，３キシランを得るために、イヅワタ科の藻類であるスリコギヅタ等から、脱イオン水、１％塩酸溶液及び２３％水酸化ナトリウム溶液での洗浄、亜塩素酸ナトリウム溶液による脱色、１０％水酸化ナトリウム溶液による抽出、エタノール沈殿による分別精製処理、と多段階の処理を行う必要があるため、精製操作が非常に煩雑であり、かつ収量が低いという問題があり、安価で効率的に製造する事は非常に困難であった。
【０００８】
従って、本発明が解決しようとする課題は、精製操作が容易であって、かつ収量が高く、安価で効率的に製造することが可能な、オリゴ糖含有物を成分とする、ガン細胞アポトーシス誘導剤を得ることにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の課題を解決するための手段は、次のとおりである。
第１に、アラビノオリゴ糖含有物を成分とする、ガン細胞アポトーシス誘導剤。
第２に、平均重合度が１０以下のアラビノオリゴ糖含有物を成分とする、ガン細胞アポトーシス誘導剤。
第３に、ＦＥＲＭＰ−１８９４１として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されているペニシリウム・エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＧＡＬＡ２２によるアラビノオリゴ糖生成酵素を用い、アラビナン含有繊維分を加水分解することで得られたアラビノオリゴ糖含有物を成分とする、ガン細胞アポトーシス誘導剤。
ここで、アラビナン含有繊維分としては、ビート搾汁粕、ビートファイバー、ビートパルプ、リンゴ搾汁粕、リンゴファイバーの他にも、落花生粕、柑橘類の果皮又は果肉、オカラ、ダイズファイバーのいずれか一つ以上のものを使用できる。
第４に、前記アラビナン含有繊維分として、ビート搾汁粕を用いる、上記第３に記載のガン細胞アポトーシス誘導剤。
【００１１】
本発明で使用するアラビノオリゴ糖組成物は、糖の平均重合度が１０以下であることが好ましく、結合様式は特に限定されない。
平均重合度は、全糖量（アラビノース換算）／還元糖量（アラビノース換算）で定義した値であり、全糖量はフェノール・硫酸法で還元糖量はネルソン・ソモギ法で測定することで求められる。
【００１２】
本発明におけるアラビノオリゴ糖とは、アラビノースが１〜１０分子含まれる２〜１０糖からなるオリゴ糖である。その結合様式は、α−１，５結合からなる直鎖状のものに限らず、α−１，２及びα−１，３結合を初めとする各種の分岐構造を有するものも含まれる。これには、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース及びガラクツロン酸のようなアラビノース以外の糖の少なくとも一つが、還元末端や非還元末端、もしくは分子内に結合しているものも含まれる。
【００１３】
また、本発明で使用するアラビノオリゴ糖含有物としては、粉末、液状、結晶あるいは顆粒の何れであっても良い。
【００１４】
【発明の実施の形態】
【００１５】
本発明で使用するアラビノオリゴ糖含有物は、ビート搾汁粕やリンゴ搾汁粕などに、エンドアラビナナーゼやアラビノフラノシダーゼ等の酵素を用いて加水分解処理してオリゴ糖混合物を得、このオリゴ糖混合物からアラビノオリゴ糖を分離回収することにより得ることができる。
その際に用いる酵素剤は、何れのものでも使用できる。
市販酵素を使用する場合には、精製品を入手するのは困難であることから、繊維分解酵素を使用しても良い。
その例としては、アマノエンザイム社製のペクチナーゼＧアマノ（商品名）、新日本化学工業社製のスミチームＡＣ（商品名）等が挙げられる。
【００１６】
酵素によるビート搾汁粕やリンゴ搾汁粕などの加水分解処理は、遊離の酵素を使用しても担体に固定化した酵素を使用しても良い。
また、酵素による加水分解処理は、連続法で行っても、バッチ法で行っても良いし、酵素の種類や起源、酵素の添加量、処理時の温度、ｐＨ、温度等の諸条件を各状況に応じて選んで処理を行うと良い。
【００１７】
上記のようにして得られたオリゴ糖を含有する糖混合物溶液は、常法によって分離される。
即ち、かかる場合に当該分野において通常使用されている周知の手段、例えば濾過、遠心分離、イオン交換または吸着クロマトグラフィー、膜濃縮、膜分離、溶媒抽出、減圧濃縮、結晶化等の操作が必要に応じて適宜組み合わせて用いられる。
一例を挙げれば、糖混合物溶液から濾過、遠心分離等によって繊維分等の残渣を除去し、次いでこの溶液を活性炭で処理して着色物質などを除き、更にイオン交換樹脂により脱塩した後、濃縮してシロップあるいは粉末状にすることができる。
【００１８】
また、ＦＥＲＭＰ−１８９４１として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されているペニシリウム・エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＧＡＬＡ２２によるアラビノオリゴ糖生成酵素を用い、アラビナン含有繊維分を加水分解することで得られる、アラビノオリゴ糖含有物の製造方法について、次に説明する。
【００１９】
まず、ペニシリウム・エスピーＧＡＬＡ２２を培養し、アラビノオリゴ糖生成酵素を調製する。
該菌株の培養は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含む液体培地あるいは固形培地を用いて好気的条件下で実施する。
炭素源としては、ビート搾汁粕やリンゴ搾汁粕などのアラビナン含有繊維分などが使用される。
これら繊維分は、粉砕処理などを実施したものを用いることもできる。
窒素源としては、微生物により利用可能な窒素化合物、例えば酵母エキス、ペプトン、麦芽エキス、コーンスティープリカー等が使用される。
無機塩類としては、例えば硫酸マグネシウム、硝酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、水酸化カルシウム等の塩類が使用される。
尚、これらの炭素源、窒素源、無機塩類の他に、更に必要に応じて、糸状菌の生育に必要な各種の有機物、無機物を添加することができる。
上記の培地での培養方法は、固体培養あるいは液体培養の何れを用いても良いが、振盪培養あるいは発酵糟等を用いた通気攪拌培養が望ましい。
培養温度は、生育できる範囲内なら特に限定されないが、３０℃付近が望ましい。
培養ｐＨは、生育できる範囲内なら特に限定されないが、ｐＨ３〜５付近が望ましい。
培養時間は、特に限定されないが、２４〜１６８時間程度が望ましい。
上記のようにして培養した後、培養物中から、目的物であるアラビノオリゴ糖生成酵素を採取及び精製するには、通常使用されている周知の手段、例えば濾過、遠心分離、イオン交換またはゲル濾過クロマトグラフィー、脱塩、膜濃縮、膜分離等の操作を必要に応じて適宜組み合わせて用いることができる。
一例を挙げれば、培養液から濾過、遠心分離等によって菌体を除去し、透析膜による脱塩操作を行なったものを酵素液として用いることができる。
ここで、酵素液は回収し、繰り返し使用することも可能である。
アラビノオリゴ糖の製造は、ビート搾汁粕やリンゴ搾汁粕などのアラビナン含有繊維分に、上記の方法で得られた酵素液を加えることにより糖化を行う。
反応温度は、酵素が失活しない範囲内、即ち２０〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃の範囲がよい。
酵素反応ｐＨは、酵素の至適条件下で反応を行うことが望ましく、ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ４〜７の範囲とする。
反応時間は、使用するアラビナン含有繊維分の組成や形状と酵素添加量に依存するが、通常３〜７２時間に設定するのが作業上好ましい。
反応が進むにつれ、アラビナン含有繊維分が加水分解され、アラビノオリゴ糖が生成、遊離するので、これを反応終了後、常法によって反応液中から分離する。
即ち、かかる場合に当該分野において通常使用されている周知の手段、例えば濾過、遠心分離、イオン交換または吸着クロマトグラフィー、膜濃縮、膜分離、溶媒抽出、減圧濃縮、結晶化等の操作を必要に応じて適宜組み合わせて用いることができる。
一例を挙げれば、反応液から濾過、遠心分離等によって繊維分等の残渣を除去し、次いでこの溶液を活性炭で処理して着色物質などを除き、更にイオン交換樹脂により脱イオンした後、濃縮してシロップあるいは粉末状にすることができる。
【００２０】
本発明で使用するアラビノオリゴ糖は上記方法により製造されたものに限らず、アラビノオリゴ糖で有ればいずれでも使用でき、例えば酵素を用いずに化学的方法に得られたアラビノオリゴ糖も使用することができる。
【００２１】
これらのアラビノオリゴ糖含有物を用いてのアポトーシス誘導の検定は、アラビノオリゴ糖含有物を添加した培養系でのガン細胞（ＨＬ６０ヒト白血病細胞）の増殖性や、該細胞並びに該細胞核の形態変化、及び核ＤＮＡの断片化を観察することによって調べることが可能である。
アラビノオリゴ糖含有物を添加した培養系でのＨＬ６０ヒト白血病細胞の増殖性は、トリパンブルー色素排除能を示す生細胞数を白球計算盤を用いて測定することで、容易に検討できる。
アラビノオリゴ糖含有物の培養系での濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ以上に調製された培養系では、ＨＬ６０細胞の増殖性は明らかにアラビノオリゴ糖含有物を添加しない系に比較して劣ることが判明している。
このアラビノオリゴ糖含有物を含有する細胞系でのＨＬ６０細胞増殖性の低下は、次の試験例１に示すように、顕微鏡及びアガロースゲルによる電気泳動による核ＤＮＡの観察結果から、明らかにアポトーシスによる細胞死によるものであることが判明した。
【００２２】
【実施例１】
【００２３】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
ａ）酵素液の調製
ビート搾汁粕を粉末状に加工したビートファイバー（日本甜菜製糖製）２０．０ｇ、リン酸二水素カリウム３．０ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、コーンスティープリカー０．５ｇからなる培地１リットルを含むジャーファーメンター（サクラ精機製、培養槽容量１．５リットル）に、ペニシリウム・エスピーＧＡＬＡ２２株（ＦＥＲＭＰ−１８９４１）を培養したスラントへ滅菌水５ｍｌと消泡剤を数滴入れ懸濁させものを無菌的に植菌し、温度３０℃、ｐＨ５．０、通気量０．５Ｌ／ｍｉｎ、回転数３００ｒｐｍで７２時間通気撹拌培養した。
培養終了後、遠心分離（５０００Ｇ、１０分）及び孔径０．４５μｍのフィルターにより菌体及び培地残渣を除去した。
続いて、分画分子量１００００の限外濾過膜にて、２０倍量まで濃縮した溶液を酵素液とした。
【００２５】
ｂ）アラビノオリゴ糖溶液の調製
粉砕処理したビート搾汁粕１．４ｋｇを２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）３５リットルに懸濁させた。
これを５０℃まで加温した後、調製した酵素液１リットルを加え、同温度に保って２４時間加水分解を行った。
その後、溶液温度を９０℃に上げ、その温度を３０分間保持し、酵素を失活させた。
これを遠心分離（５０００Ｇ、５分）した後に、孔径０．４５μｍのフィルターで濾過することにより有用糖質を含む溶液を得た。
【００２６】
ｃ）アラビノオリゴ糖溶液の精製
この溶液を活性炭（カルゴン粒状活性炭）４ｋｇを充填したカラム（直径１２ｃｍ、長さ１００ｃｍ）に添加した後、流速１７０ｍｌ／ｍｉｎで蒸留水１００リットル及び５．０％エタノール５０リットルで洗浄することで単糖類を除去した。
次に、１０．０％エタノール５０リットル、２０．０％エタノール５０リットル、３０．０％エタノール５０リットル、５０．０％エタノール５０リットルを順次流しアラビノオリゴ糖画分を得た。
これらを、エバポレーターで１リットルまで濃縮した後、陽イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ８８）８５０ｇと陰イオン交換樹脂（ピュロライトＡ−１０３１２）１５００ｇを充填したカラム（直径６ｃｍ、長さ１００ｃｍ）にアプライした。
流速１５０ｍｌ／ｍｉｎで８０リットルの蒸留水を通液する事で、ガラクツロン酸の除去及び脱塩を行った。
【００２７】
ｄ）ガン細胞アポトーシス誘導剤の調製
ガラクツロン酸の除去及び脱塩を行った画分を、エバポレーターで２００ｍｌまで濃縮した後、凍結乾燥してガン細胞アポトーシス誘導剤としてのアラビノオリゴ糖組成物５２．６ｇを得た。
上記のようにして得られたアラビノオリゴ糖組成物の平均重合度は２．８であった。
【００２８】
【試験例１】
【００２９】
次に、本発明区として上記実施例１で得た平均重合度２．８のアラビノオリゴ糖を成分とするガン細胞アポトーシス誘導剤を使用して、下記の方法によってガン細胞アポトーシス誘導試験を行った。
【００３０】
ここで、ＨＬ６０ヒト白血病細胞は、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより分譲されたものを使用した。
該ＨＬ６０細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２存在下、相対湿度１００％の条件で培養した。
ＨＬ６０細胞を２４穴プレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように播種し、終濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように本発明区のアラビノオリゴ糖の試料を培養液中に添加して２４時間培養した後、トリパンブルー色素排除能を示す生細胞を、血球計算盤を用いてトリパンブルー色素排除能を示す生細胞数を計測した。
【００３１】
対照試験として、アラビノオリゴ糖以外の糖質（アラビノース、ガラクツロン酸、グルコース、セロビオース、α−１，４キシロオリゴ糖、アラビナン）でも、本発明区と同様の条件及び手順で試験を行った。
【００３２】
その結果を、各糖質におけるガン細胞の生存率を示すグラフとして、図１に示す。
該図１に示すように、本発明区のアラビノオリゴ糖は、添加２４時間後のＨＬ６０細胞の生細胞数が約４５％と、対照区の糖質と比べて最も強く抑制する。
【００３３】
そこで、本発明区のアラビノオリゴ糖のＨＬ６０細胞増殖抑制効果を明らかにするため、各濃度のアラビノオリゴ糖の試料添加後、６〜４８時間のＨＬ６０細胞の生細胞数を計測した。
その結果を、ＨＬ６０生細胞数の測定結果を示すグラフとして、図２に示す。該図２に示すように、アラビノオリゴ糖は０．５ｍｇ／ｍｌの濃度から明らかにＨＬ６０生細胞の増殖を抑制する。
【００３４】
次に、ＨＬ６０細胞の増殖抑制がアポトーシスに基づく細胞死であるかを検定するため、アポトーシスに特異的なＤＮＡの断片化を観察した。
まず、細胞を２０μｌの溶解液［５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ］に溶解し、１μｌのＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ溶解液）（ＳＩＧＭＡ）を加えて、５０℃で３０分間インキュベートした。
その後、さらに１μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（１０ｍｇ／ｍｌ溶解液）（ＳＩＧＭＡ）を加えて、５０℃で６０分間インキュベートした。
この細胞溶解液を、０．５μｌ／ｍｌのｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ（和光純薬）を含んだ２％アガロースゲルで電気泳動し、ＵＶイルミネーター上でＤＮＡの断片化を観察した。
図３に、アガロース電気泳動の結果を示す写真を示す。
図３において、レーン左から、１番目はマーカー、２番目は無添加の対照区を示し、３〜６番目は本発明区のアラビノオリゴ糖添加区で、３番目はアラビノオリゴ糖０．５ｍｇ／ｍｌ添加区、４番目はアラビノオリゴ糖１．０ｍｇ／ｍｌ添加区、５番目はアラビノオリゴ糖５．０ｍｇ／ｍｌ添加区、６番目はアラビノオリゴ糖１０．０ｍｇ／ｍｌ添加区を示す。
該図３に示すように、アラビノオリゴ糖は、０．５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＨＬ６０細胞に、アポトーシスに特徴的なヌクレオソーム単位でのＤＮＡの断片化を誘導した。
【００３５】
また、本発明区としてアラビノオリゴ糖５．０ｍｇ／ｍｌ添加区と、無添加の対照区とについて、ＨＬ６０細胞の核ＤＮＡをヘキスト３３２５８（和光純薬）で蛍光染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
図４に、対照区の蛍光顕微鏡によるＨＬ６０細胞の観察結果を示す写真を示す。
また、図５に、発明区の蛍光顕微鏡によるＨＬ６０細胞の観察結果を示す写真を示す。
該図５に示すように、アラビノオリゴ糖添加により、アポトーシスに特徴的な核の凝縮及び断片化を観察した。
【００３６】
【発明の効果】
【００３７】
本発明のガン細胞アポトーシス誘導剤は、精製操作が容易であって、かつ収量が高く、安価で効率的に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】各糖質におけるガン細胞の生存率を示すグラフ
【図２】ＨＬ６０生細胞数の測定結果を示すグラフ
【図３】アガロース電気泳動の結果を示す写真
【図４】対照区の蛍光顕微鏡によるＨＬ６０細胞の観察結果を示す写真
【図５】発明区の蛍光顕微鏡によるＨＬ６０細胞の観察結果を示す写真
【図１】
2004182628.tif 000002
【図２】
2004182628.tif 000003
【図３】
2004182628.tif 000004
【図４】
2004182628.tif 000005
【図５】
2004182628.tif 000006