(57)【要約】【課題】吸着性領域の液流動性を向上させて、バックグラウンドを低減させる。【解決手段】多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの吸着性領域に、リガンドまたはレセプタを結合させる。標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドが添加された、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを、吸着性領域を横切るように強制的に流動させて標識レセプタまたは標識リガンドをリガンドまたはレセプタに特異的に結合させる。続いて、酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を光電的に検出する。【選択図】　　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、標識物質によって標識された標識レセプタまたは標識リガンドが添加されたハイブリダイゼーションバッファを前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記リガンドまたはレセプタに前記標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドを検出するアッセイ法において、
前記ハイブリダイゼーションバッファとして、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いることを特徴とする生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法。
【請求項２】
リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、レセプタまたはリガンドが添加されたハイブリダイゼーションバッファを前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記レセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、該レセプタまたはリガンドを標識物質によって標識された標識体と特異的に結合させ、前記レセプタまたはリガンドを検出するアッセイ法において、
前記ハイブリダイゼーションバッファとして、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いることを特徴とする生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法。
【請求項３】
リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、補助物質が結合された補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドが添加されたハイブリダイゼーションバッファを前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドと特異的に結合させ、前記補助物質に特異的に結合可能な結合可能標識物質を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドと特異的に結合させ、該補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドを検出するアッセイ法において、
前記ハイブリダイゼーションバッファとして、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いることを特徴とする生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レセプタまたはリガンドを検出するアッセイ法に関し、詳しくは多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットを利用して、レセプタまたはリガンドを検出するアッセイ法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、例えば、スライドガラス板やメンブレンフィルタなどを用いたガラスアレイやメンブレンアレイの担体表面上の異なる位置に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成、特性などが既知のリガンドまたはレセプタをスポッター装置を用いて滴下した後、これを固定し、次いで、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質であって、蛍光物質、蛍光色素などの蛍光標識物質によって標識された標識されたレセプタまたはリガンドを、ハイブリダイゼーション等によって吸着性領域に固定されたリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、続いて励起光を照射して、蛍光物質、色素などの標識物質から発せられた蛍光を光電的に検出して、生体由来の物質を解析する解析システムが開発されている。
【０００３】
この解析システムによれば、メンブレンフィルタなどの担体表面上の異なる位置に、数多くのリガンドまたはレセプタのスポットを高密度に形成して、蛍光標識物質によって標識されたレセプタまたはリガンドをハイブリダイズさせること等によって、短時間で生体由来の物質を解析することが可能になるという利点がある。
【０００４】
これらの解析システムにおいても、充分な精度で検出できることはもちろん、検出限界の向上や再現性が要求されている。しかし、上述の蛍光標識物質を利用した解析システムは、検出感度が低いために発現解析に必要な標識レセプタまたは標識リガンドを大量に必要とする。また、ガラスアレイ上に固定化できるリガンドまたはレセプタの量が少ない上、解析操作の工程でアレイ上に固定化されたリガンドまたはレセプタが剥がれ落ちる等の問題がある。
【０００５】
【特許文献１】
特許第２８３７２７６号公報
【０００６】
【非特許文献１】
「ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ｖｏｌ．２１，　ｐ．２５−ｐ．３２（１９９９）
【０００７】
【非特許文献２】
「バイオインダストリー」Ｖｏｌ．１８，　ｐ．１３−ｐ．１９（２００１）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従来、上記解析システムにおいては、ハイブリダイゼーション等を行う際に、実験者が手作業で、リガンドまたはレセプタが固定されたアレイをハイブリダイゼーションバッグ内に入れ、ハイブリダイゼーションバッグ内に標識レセプタまたは標識リガンドを含む反応溶液を加え、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて標識レセプタまたは標識リガンドを対流あるいは拡散によって移動させて、リガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させるいわゆる振盪方式によって行うのが一般的であった。
【０００９】
しかし、振盪方式の場合、ハイブリダイゼーション反応溶液中の標識レセプタまたは標識リガンドをリガンドまたはレセプタを含む多数のスポット状領域に、効率よく拡散させることは困難であり、リガンドまたはレセプタと標識レセプタまたは標識リガンドとを効率的にハイブリダイズさせることができないという問題がある。ハイブリダイゼーション反応溶液中の標識レセプタまたは標識リガンドをリガンドまたはレセプタを含む多数のスポット状領域に効率的に拡散させることができないと、標識レセプタまたは標識リガンドが結合していない吸着性領域の発光量（ノイズあるいはバックグラウンド）に対する、標識レセプタまたは標識リガンドが結合した量に対応する発光量（信号）の比（Ｓ／Ｎ比）が小さく、吸着性領域に結合する標識レセプタまたは標識リガンドが微量となると検出することが困難になるという問題がある。
【００１０】
標識レセプタまたは標識リガンドを吸着性領域の内部にまで充分に浸透させるためには、反応溶液を強制的に吸着性領域内部に循環させればいいと考えられるが、上述の標識レセプタまたは標識リガンドを含むハイブリダイゼーションバッファを吸着性領域に強制的に流動させると、吸着性領域を循環する標識レセプタまたは標識リガンドを含むハイブリダイゼーションバッファの循環性が落ちてくるという問題がある。吸着性領域の循環性が落ちてくると、その後の洗浄工程で、吸着性領域に非特異的に結合している標識レセプタまたは標識リガンドを充分に洗い落とすことができないために、吸着性領域のバックグラウンドの発光量が上昇し、微量の標識レセプタまたは標識リガンドの検出が困難になる。
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、吸着性領域の流動性を向上させて、バックグラウンドの低減を図ることが可能な生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法を提供することを目的とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、標識物質によって標識された標識レセプタまたは標識リガンドが添加されたハイブリダイゼーションバッファを前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記リガンドまたはレセプタに前記標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドを検出するアッセイ法において、前記ハイブリダイゼーションバッファとして、デンハーツソリューション（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）とサーモンスパームＤＮＡ（Ｓａｌｍｏｎ　Ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ）を含まないハイブリダイゼーションバッファを用いることを特徴とする方法である。
【００１３】
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、レセプタまたはリガンドが添加されたハイブリダイゼーションバッファを前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記レセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、該レセプタまたはリガンドを標識物質によって標識された標識体と特異的に結合させ、前記レセプタまたはリガンドを検出するアッセイ法において、前記ハイブリダイゼーションバッファとして、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いることを特徴とする方法である。
【００１４】
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、補助物質が結合された補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドが添加されたハイブリダイゼーションバッファを前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドと特異的に結合させ、前記補助物質に特異的に結合可能な結合可能標識物質を前記吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドと特異的に結合させ、該補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドを検出するアッセイ法において、前記ハイブリダイゼーションバッファとして、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いることを特徴とする方法である。
【００１５】
【発明の効果】
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法は、標識物質によって標識された標識レセプタまたは標識リガンドが添加されたハイブリダイゼーションバッファ、あるいはレセプタまたはリガンドが添加されたハイブリダイゼーションバッファ、あるいは標識物質によって標識された標識体が添加されたハイブリダイゼーションバッファを吸着性領域を横切るように強制的に流動させる場合において、ハイブリダイゼーションバッファとしてデンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いることとしたので吸着性領域が詰まることがなく、その後の洗浄工程で、吸着性領域に非特異的に結合している標識レセプタまたは標識リガンドを充分に洗い落とすことができる。従って、吸着性領域のバックグラウンドの発光量を低減させて、微量の標識レセプタまたは標識リガンドの検出を可能なものとすることができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。図１は本発明ののアッセイ法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図である。図１に示す生化学解析用ユニット１は、孔３が複数設けられた基板２と、孔３の内部に充填され、多孔性材料が基板２と接着された吸着性領域４とからなる。この吸着性領域４には、構造または特性が既知のリガンドまたはレセプタ５が滴下され、その後の処理により固定化されている。
【００１７】
基板２の材質としては、生化学解析用ユニット内部での光の散乱を防止するために、光を透過させないか、減衰させる材質が好ましく、金属、セラミックが好ましい。また、孔を開ける加工が容易であるプラスチックを基板として用いる場合は、光をより一層減衰させるために、粒子をプラスチック内部に分散させることが好ましい。
【００１８】
金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルあるいは、ステンレス鋼や黄銅などの合金が好ましくあげられる。セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア、マグネシア、石英などが好ましくあげられる。プラスチックとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ナイロン−６やナイロン−６，６などの脂肪族ポリアミド、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリジフェニルシロキサンなどのケイ素樹脂、ノボラックなどのフェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、酢酸セルロースやニトロセルロースなどのセルロース類、ブタジエン−スチレン共重合体などのコポリマー、さらにはプラスチックをブレンドしたものなどが好ましくあげられる。
【００１９】
基板２に開ける孔３の開口部の面積（サイズ）は、孔３の密度を高めるために、一般には５ｍｍ２　未満であり、好ましくは１ｍｍ２　未満であり、０．３ｍｍ２　未満がより好ましく、さらには０．０１ｍｍ２　未満であることが好ましい。そして、より好ましくは０．００１ｍｍ２　以上であることが好ましい。
【００２０】
孔３のピッチ（隣接する二つの孔の中心から中心までの距離）は０．０５〜３ｍｍの範囲であることが好ましく、孔３の間隔（隣接する二つの孔の端部から端部までの最短距離）は、０．０ｌ〜１．５ｍｍの範囲であることが好ましい。孔３の数（密度）は、一般には１０個／ｃｍ２　以上であり、好ましくは１００個／ｃｍ２　以上、より好ましくは５００個／ｃｍ２　以上、さらには１０００個／ｃｍ２　以上であることが好ましい。そして、好ましくは１０００００個／ｃｍ２　以下、さらには１００００個／ｃｍ２　以下であることが好ましい。なお、必ずしも、孔３は全て図１に示したように等間隔で設けられている必要はなく、幾つかのブロック（単位）に別れてブロック毎に複数の孔が設けられていてもよい。
【００２１】
吸着性領域を形成する多孔性材料としては、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して吸着性領域を形成することもできる。吸着性領域を形成するために使用される多孔性材料は、有機材料、無機材料のいずれでもよく、有機／無機複合体でもよい。
【００２２】
吸着性領域を形成するために使用される有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、活性炭などの炭素多孔質材料あるいはメンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料が好ましく用いられる。メンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料としては、溶媒に溶解可能なポリマーが好ましく用いられる。溶媒に溶解可能なポリマーとしては、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど）、脂肪族ポリアミド類（例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン４，１０など）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素樹脂類（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど）、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体（例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸／ポリリシンポリイオンコンプレックスなど）、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体（混合体）も用いることができる。
【００２３】
また、吸着性領域を形成するための繊維材料としては、特に限定されるものではないが、好ましくは前述したセルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などがあげられる。
【００２４】
吸着性領域を形成するために使用される無機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属（例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど）、金属等の酸化物（例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど）、金属塩（例えば、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムなど）及びこれらの複合体などがあげられる。
【００２５】
基板２に複数の孔３を開ける方法としては、ピンで打ち抜くパンチング、電極に高電圧をパルス状に印加して基板を揮発する放電加工、エッチング、レーザー照射などがあげられる。基板の材料が、金属材料またはプラスチック材料の場合は、基板の表面にコロナ放電またはプラズマ放電を施して接着剤を塗工した後、吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスなどの手段により貼り合わせることで生化学解析用ユニットが作製される。貼り合わせる際に、吸着性領域を形成するための多孔性材料を加熱して軟化すると、孔内部に吸着性領域が容易に形成される。また、基板に吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスする場合には、基板と吸着性領域を形成するための材料を、事前に１枚毎に分割してから間欠的にプレスしてもよいし、基板と吸着性領域を形成するための材料をそれぞれ長尺帯状としたものを２つのロール間に連続搬送してもよい。
【００２６】
なお、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法においては、上記の材料や方法によって作製した生化学解析用ユニットを使用することも可能であるが、市販されている生化学解析用ユニットを用いてもよく、また多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いることも可能である。
【００２７】
図２は、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの一の実施の形態を示す概略断面図である。リアクタは、反応容器８と溶液循環パイプ１４とポンプ１５とからなり、反応容器８は、生化学解析用ユニット１を保持するとともに液漏れを防止するシール機能を有する生化学解析用ユニット保持部７を有しており、反応容器本体９は、反応容器上半部１０と反応容器下半部１１とからなり、反応容器上半部１０は反応容器本体９に取り外し可能に設けられており、生化学解析用ユニット１は反応容器上半部１０を取り外すことによってセットすることができるように構成されている。
【００２８】
また、図２に示されるように、反応容器下半部１１の底壁には溶液が流通可能な溶液流入口１２が形成され、反応容器上半部１０の頂壁には同様に溶液が流通可能な溶液流出口１３が形成されている。さらに流入口１２および流出口１３には、溶液循環パイプ１４がそれぞれ取り外し可能に取り付けられている。リアクタは、ポンプ１５によって溶液が流入口１２から反応容器本体９に入り、生化学解析用ユニット１を通過した後、流出口１３から出て、溶液循環パイプ１４を通って循環するように構成されている。
【００２９】
図３は、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図である。このリアクタは、図２に示すポンプの代わりにシリンジ２３とピストン２４が設けられているもので、反応溶液が反応容器内で往復流動するように構成したものである。このように、反応溶液の強制的流動は、生化学解析用ユニット１の吸着性領域４を往復流動するものであってもよい。
【００３０】
なお、図２および図３はともに、反応溶液が生化学解析用ユニットを循環するタイプのリアクタを示しているが、反応溶液が生化学解析用ユニットの下から上（あるいは上から下）に通過するのみで、反応溶液が循環しないタイプのリアクタを用いることも可能である。
【００３１】
次に、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法を順を追って説明する。
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに、標識物質によって標識された標識レセプタまたは標識リガンドが添加されたハイブリダイゼーションバッファを吸着性領域を横切るように強制的に流動させて前記リガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、標識レセプタまたは標識リガンドを検出するアッセイ法において、ハイブリダイゼーションバッファとして、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いることを特徴とする。
【００３２】
多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタは、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものである。
【００３３】
標識レセプタまたは標識リガンドは、多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施され、標識物質によって標識されたものである。
【００３４】
標識物質は、標識物質そのものが発光、発色あるいは光を照射することによって蛍光を放出するものであっても、標識物質に何らかの化学物質を接触させて、標識物質によって化学物質が分解あるいは反応する等して発光、発色あるいは蛍光を放出するものであってもよい。前者の標識物質としては、発光物質にアクリジニウムエステル等、発色物質に金コロイド粒子等、蛍光物質にフルオレセイン等を用いることができる。また、後者の標識物質としては、酵素を用いることができ、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。これらの酵素に、化学発光基質あるいは色素基質あるいは蛍光基質を接触させることによってそれぞれ、化学発光、発色、蛍光を放出する。
【００３５】
化学発光基質としては、酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、特に限定するものではないが、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。また、色素基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合にはパラニトロフェノールリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬の組合せ、ジアミノベンチジン、テトラメチルベンチジン、酵素がベータガラクトシダーゼの場合にはパラニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。蛍光基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合４−メチルウンベリフェニルリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には３（４−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸、酵素がベータガラクトシダーゼの場合には、４−メチルウンベリフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。
【００３６】
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法の別の態様としては、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットのリガンドまたはレセプタに、レセプタまたはリガンドが添加されたハイブリダイゼーションバッファを吸着性領域を横切るように強制的に流動させてレセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、レセプタまたはリガンドを標識物質によって標識された標識体と特異的に結合させ、レセプタまたはリガンドを検出するアッセイ法において、ハイブリダイゼーションバッファとして、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いることを特徴とする。
【００３７】
これは、検出するレセプタまたはリガンドを、吸着性領域のリガンドまたはレセプタと標識体によって挟み込む、いわゆるサンドイッチ法と呼ばれる手法に適用したものである。ここでいう、レセプタまたはリガンドは、多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質である。
【００３８】
標識物質によって標識された標識体とは、前述の標識物質によって標識され、レセプタまたはリガンドの反応部位に特異的に結合することができる抗原、抗体の他、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものを意味する。
【００３９】
本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法のさらに別の態様としては、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットのリガンドまたはレセプタに、補助物質が結合された補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドが添加されたハイブリダイゼーションバッファを吸着性領域を横切るように強制的に流動させて補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドと特異的に結合させ、補助物質に特異的に結合可能な結合可能標識物質を吸着性領域を横切るように強制的に流動させて補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドと特異的に結合させ、補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドを検出するアッセイ法において、ハイブリダイゼーションバッファとして、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いることを特徴とする。
【００４０】
補助物質は結合可能標識物質が結合する物質であって、ジゴキシゲニン、ビオチン、アビジン、フルオロセインなどの抗原、及びこれらの抗原に対する抗体などを好ましくあげることができる。また、ビオチンに対するアビジンのような生物学的結合パートナーであってもよい。結合可能標識物質は、補助物質に特異的に結合可能であって前述の標識物質によって標識された物質である。
【００４１】
次に、本発明の生化学解析用ユニットを利用したアッセイ法のうち、生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプタを固定し、抗原（補助物質）で標識された抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドをハイブリダイゼーションなどによって、吸着性領域に固定されたリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、続いて、抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドを標識している抗原に対する抗体を、化学発光を生じさせる酵素で標識し（以下、酵素標識抗体という）、この酵素標識抗体を抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドの抗原と特異的に結合させ、さらに酵素標識抗体の酵素と特異的に結合する化学発光基質を接触させて、化学発光基質と酵素との接触によって生ずる可視光波長領域の化学発光を光電的に検出する化学発光法によるアッセイ法を例に、順を追って説明する。
【００４２】
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法では、まず、多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプタを結合させる。
【００４３】
多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタは前述した通りであり、リガンドまたはレセプタは、吸着性領域に滴下した後、紫外線の照射などによって吸着性領域に固定することができる。なお、上述したように、多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いる場合には、この段階は省略される。
【００４４】
次に、抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドを多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタと特異的に結合させた後、生化学解析用ユニットを上記図２または図３等に示す、反応溶液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させることが可能な反応容器に取り付ける。抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドが添加さえたハイブリダイゼーションバッファを吸着性領域を横切るように強制的に流動させて、リガンドまたはレセプタに抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドを特異的に結合させる。
【００４５】
ハイブリダイゼーションバッファは、吸着性領域に抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドが非特異的に結合することを防止する機能を有するものを用いるが、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いる。ハイブリダイゼーションでは、高温で長時間液を流動させることから、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含むハイブリダイゼーションバッファを用いると、しばしば吸着性領域が詰まって液の流動性が低下するが、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いることによって、吸着性領域が詰まることがなく、その後の洗浄工程で、吸着性領域に非特異的に結合している標識レセプタまたは標識リガンドを充分に洗い落とすことができ、吸着性領域のバックグラウンドの発光量を低減させて、微量の抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドの検出を可能なものとすることができる。
【００４６】
反応容器に取り付けた生化学解析用ユニットは、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合しなかった抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドを除去するために、吸着性領域にいわゆる洗浄液を強制的に流動させて洗浄することが好ましい。吸着性領域を洗浄液が強制的に流動するので、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合していない抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドを、効率的に剥離させ、除去することが可能になり、洗浄効率を大幅に向上することができる。
【００４７】
なお、この洗浄工程は、後述する酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように強制的に流動させて抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドと特異的に結合させた後、特異的に結合しなかった酵素標識抗体を除去する場合にも行うことが好ましい。これによって、抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドと特異的に結合していない酵素標識抗体を、効率的に剥離させ、除去することが可能になり、洗浄効率を大幅に向上することができる。
【００４８】
吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプタに特異的に結合した抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドに酵素標識抗体を結合させる前に、酵素標識抗体に対するブロッキングバッファを吸着性領域を横切るように強制的に流動させて吸着性領域をブロッキングすることが好ましい。また、ブロッキングバッファは、吸着性領域の孔径よりも小さい孔径を有するフィルターで濾過して用いることが好ましい。
【００４９】
次に、酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように強制的に流動させて抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドと特異的に結合させる。酵素標識抗体の酵素としては、上記したアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。
【００５０】
続いて、生化学解析用ユニットを反応容器から取り出して、抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させる。化学発光基質と酵素との接触によって各吸着性領域から可視光波長領域の化学発光を生ずるので、これを光電的に検出して生化学解析用画像データを生成すれば、抗原結合レセプタまたは抗原結合リガンドを検出、測定することができる。
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００５１】
【実施例】
（実施例１）
大きさが８０ｍｍ×８０ｍｍ、厚み１００μｍのＳＵＳ３０４シート（基板材料シート）に、孔径０．２ｍｍの開口部が円形の微細孔を、エッチングによって孔ピッチ０．３ｍｍ、孔間隔０．１ｍｍで、１０×１０個を一単位として計６４００個形成した。
【００５２】
次に、ナイロン６（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）１４部、ギ酸６６部、水２０部を均一に溶解して、多孔性の吸着性領域形成材料の溶液を調整した。この溶液を安定した溶液状態で、乾燥膜の厚みが１６０μｍになるように、基板材料シート上にキャスティングコーターにより流延して貫通孔内に溶液を注入した後、ブレードにより基板材料シート表面の余分な溶液を掻き落とした。続いて、直ちに、基板材料シートをギ酸４０％水溶液を満たした凝固槽に浸漬して、貫通孔内の膜内に多数の微細孔を形成した。その後、水洗、乾燥してステンレス障壁と多数孔のポリマー充填領域とからなる生化学解析用ユニットを作製した。
【００５３】
ＴＥバッファに溶解した分子量マーカーｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩ（２５０ｎｌ／μｇ：ロッシュ社製）を５分煮沸後、１分間氷冷しｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを１本鎖とした。これを上記で作製した生化学解析用ユニットの吸着性領域にスポットし、その後紫外線を照射（２５４ｎｍ、３３ｍＪ／ｃｍ２　）して、吸着性領域に１本鎖のｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを固定した。
【００５４】
次にジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識されたｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液（ロッシュ社製）１０ｐｇを熱変性し、ハイブリダイゼーションバッファＡ（０．５ＭＣｈｕｒｃｈリン酸バッファ（０．５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４をＨ３ＰＯ４でｐＨ７．２に調整したもの），１ｍＭ　ＥＤＴＡ，７％ＳＤＳ）５ｍｌに添加した。
【００５５】
上記生化学解析用ユニットを図２に示す反応容器に固定し、６５℃の条件下でプレハイブリダイゼーションバッファ（ハイブリダイゼーションバッファＡと同じ）５ｍｌを１時間循環させた（線速度０．２ｃｍ／ｓｅｃ）。次に、ＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液が添加されたハイブリダイゼーションバッファを６５℃の条件下１８時間循環させてハイブリダイゼーションを行った。１８時間後のハイブリダイゼーションバッファの系内の流速を測定したところ、設定値に対して０．９の流速であった。続いて、洗浄バッファ１（４０ｍＭ　Ｃｈｕｒｃｈリン酸バッファ，１％ＳＤＳ）で５分間２回、洗浄バッファ２（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）で５分間２回循環洗浄した（洗浄バッファ温度はいずれも６５℃）。
【００５６】
ブロッキングバッファ（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ　ａｎｄ　Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ　に記載のもの）をＰＥＳ製孔径０．２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎ社製）にて濾過し、濾過したブロッキングバッファを室温で１０分間循環した後、５０分間循環を停止した。
【００５７】
次に、アルカリホスファターゼ標識ＤＩＧ抗体をあらかじめ、孔径０．２２μｍのウルトラフリー（ミリポア社製）にて濾過し、濃度が１／１００００となるように、ＰＥＳ製孔径０．２μｍのフィルター（Ｎａｌｇｅｎ社製）にて濾過したブロッキングバッファで希釈し、これを室温で１分間循環した後、６０分間停止した。
【００５８】
続いて、ケミルミ洗浄液（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ　ａｎｄ　Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ　に記載のもの）を１５分間室温で循環させた。これを３回繰り返し、ディテクションバッファ（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ　ａｎｄ　Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ　に記載のもの）でｐＨ調整した後、化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＣＤＰ−ｓｔａｒ，ｒｅａｄ　ｔｏ　ｕｓｅ）を含む溶液と１時間接触させて、生化学解析用ユニットの吸着性領域から放出される化学発光を冷却ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ１０００：富士写真フィルム社製）によって光電的に検出した。
【００５９】
（実施例２〜４）
プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファの温度を表１に記載した通りに調整した以外は、実施例１と同様にして化学発光を検出した。
【００６０】
（比較例１〜４）
プレハイブリダイゼーションバッファおよびハイブリダイゼーションバッファに、ハイブリダイゼーションバッファＢ（６×ＳＳＣ，０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ，５×ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，０．５％ＳＤＳ，１００μｇＳｈｅａｒｄ，Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ｓａｌｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ）を用い、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファの温度を表１に記載した通りに調整した以外は、実施例１と同様にして化学発光を検出した。
【００６１】
実施例１〜４と比較例１〜４のプレハイブリダイゼーションバッファ、ハイブリダイゼーションバッファおよび洗浄バッファの設定温度、ハイブリダイゼーション時の設定流速／ハイブリダイゼーション１８時間後の系内（循環しているパイプ部分）の流速の比、さらにバックグラウンドの発光量を表１に示す。なお、比較例２および３では、ハイブリダイゼーションの段階で反応液が循環しなくなり、その後の工程に進むことができなかったために、バックグラウンドの発光量が測定できなかった。
【００６２】
【表１】
2004109081.tif 000002
【００６３】
表１から明らかなように、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いた実施例１〜４では、設定の流速と、１８時間循環させた後の系内のハイブリダイゼーションバッファの流速が殆ど変化せず、流動性が維持されているため、その後の洗浄工程で、吸着性領域に非特異的に結合している標識レセプタまたは標識リガンドを充分に洗い落とすことができた。この結果、吸着性領域のバックグラウンドの発光量を低減させることができた。一方で、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含むハイブリダイゼーションバッファを用いた比較例１および比較例４では、１８時間循環させた後の系内のハイブリダイゼーションバッファの流速が設定の流速の半分以下となり、バックグラウンドは、デンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いた実施例１〜４の約５倍も高いものとなった。
【００６４】
以上のように、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法は、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドが添加されたハイブリダイゼーションバッファを吸着性領域を横切るように強制的に流動させて標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる場合に、ハイブリダイゼーションバッファとしてデンハーツソリューションとサーモンスパームＤＮＡを含まないハイブリダイゼーションバッファを用いることとしたので吸着性領域が詰まることがなく、その後の洗浄工程で、吸着性領域に非特異的に結合している標識レセプタまたは標識リガンドを充分に洗い落とすことができ、吸着性領域のバックグラウンドの発光量を低減させることができた。従って、これにより、微量の標識レセプタまたは標識リガンドの検出を可能なものとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図
【図２】本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの実施の形態を示す概略断面図
【図３】本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図
【符号の説明】
１　　生化学解析用ユニット
２　　基板
３　　孔
４　　吸着性領域
５　　リガンドまたはレセプタ
【図１】
2004109081.tif 000003
【図２】
2004109081.tif 000004
【図３】
2004109081.tif 000005