(57)【要約】【課題】細胞を長期間育成しながら、簡便に、かつ短時間で正確な培養細胞の観測を行う。【解決手段】担体１０１上に配される培養過程の細胞Ｃに光を照射し、細胞から発せられる蛍光を検出する細胞培養検出装置１００であって、担体１０１に沿って平行光を発する光源１０２と、少なくとも平行光の光軸１０３方向に往復移動させられ、該平行光を細胞Ｃに向けて偏向させる照射ヘッド１０４を備え、該照射ヘッド１０４から細胞Ｃに対して平行光からなるスポット光を照射する照射ユニット１０５と、細胞Ｃから発せられた蛍光を検出する検出ユニット１１５とを備える細胞培養検出装置１００を提供する。【選択図】　図２
2004113175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体上に配される培養過程の細胞に光を照射し、細胞から発せられる蛍光を検出する細胞培養検出装置であって、
前記担体に沿って平行光を発する光源と、
少なくとも前記平行光の光軸方向に往復移動させられ、該平行光を細胞に向けて偏向させる照射ヘッドを備え、該照射ヘッドから細胞に対して平行光からなるスポット光を照射する照射ユニットと、
細胞から発せられた蛍光を検出する検出ユニットと
を備える細胞培養検出装置。
【請求項２】
前記光源から発せられる平行光の光軸に直交する方向に前記担体を往復移動させる担体搬送ユニットを備える請求項１に記載の細胞培養検出装置。
【請求項３】
前記照射ユニットが、前記光源から発せられた平行光を集光させる投光レンズと、該投光レンズにより後側焦点位置に集光された光を平行光に変えて細胞に照射する対物レンズとを備える請求項１または請求項２に記載の細胞培養検出装置。
【請求項４】
前記検出ユニットが、細胞から発せられ前記対物レンズを通過させられた蛍光を結像する結像レンズと、該結像レンズの結像位置に設けられた受光ピンホールと、該受光ピンホールを通過した蛍光を検出する光検出器とを備える請求項３に記載の細胞培養検出装置。
【請求項５】
前記投光レンズ、前記対物レンズおよび前記検出ユニットが、前記照射ヘッドに搭載されている請求項３または請求項４に記載の細胞培養検出装置。
【請求項６】
前記投光レンズおよび前記対物レンズが前記照射ヘッドに搭載され、前記検出ユニットが前記照射ヘッドの外部に配置されている請求項３または請求項４に記載の細胞培養検出装置。
【請求項７】
培養液を供給する供給口と、培養液を排出する排出口とを備え、内部に培養液を流通させる培養容器が設けられるとともに、
該培養容器内に前記担体が配置され、
前記培養容器内の少なくとも前記供給口と前記担体との間に、供給された培養液を培養容器内に分散させる整流子部材が配置されている請求項１から請求項６のいずれかに記載の細胞培養検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞を培養しながら培養細胞の反応による情報を検出する装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子解析技術が進み、ヒトを含む多くの生物における遺伝子配列が明らかにされ、解析された遺伝子産物（タンパク質）と疾病の因果関係も少しずつ解明されてきた。今後さらに、各種タンパク質や遺伝子を網羅的に統計的に解析するために、細胞を用いる検査方法および装置が考えられ始められている。ここで、細胞を長期間培養しながら、所定の情報を検出する必要があり、顕微鏡下で細胞を培養する装置として提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】
特開平１０−２８５７６号公報（第２頁，図２等）
【０００４】
この従来の装置は、温度調整器により設定温度に自動制御できる透明発熱プレートを上下に設けるとことにより、温度を自由に制御できる空間を有し、その空間のＣＯ２（二酸化炭素）濃度を調整するための二酸化炭素供給口と排出口を設け、シール用パッキンにより密閉された容器内に湿度を保つための蒸発皿を備えることにより、顕微鏡観察しながら各種の細胞の培養条件を設定できる顕微鏡観察用透明恒温培養容器である。
【０００５】
生物、生殖またはバイオテクノロジーの研究分野において、各種の細胞の培養状態の観察、写真撮影等の記録を行う際に、顕微鏡観察を行いながら温度、ＣＯ２濃度、湿度を自由に制御して培養状態を各種設定し、その経時変化の観察およびその記録が連続的に且つ簡便に行うことができるとされている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、細胞は遺伝子などと異なり、生きている状態での蛍光検出（細胞内でのＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）発現を検出）などが測定手法として多用されている。このため、細胞を培養するための環境条件の管理が、正確な測定結果を得るために重要な項目となる。
【０００７】
顕微鏡下に配置できる培養容器としては、プラスチック製またはガラス製のディッシュやシャーレが一般的であるが、温度・ＣＯ２濃度を管理できないため、長時間の顕微鏡観察では細胞を死滅させてしまうことが多い。
このため、従来技術に示されるような温度およびＣＯ２濃度を管理できる容器が必要となる。
【０００８】
ここで、細胞種類によっては外部環境の変化に対して非常に弱いものも有り、例えば、温度の急激な昇温動作などにより簡単に死滅する場合もある。細胞種類にもよるが、一般に温度では３７±０．５℃、ＣＯ２濃度では３〜８％を一定に維持することが必要となる。また、長期間培養においては、汚染を発生させず細胞培養溶液の半バッチ交換なども重要な培養環境条件の管理項目となる。
【０００９】
以上のような培養機能が付加された培養容器内の細胞の観察を行う場合には、配管等が多数引き出されている培養容器を、例えば、ＸＹ２方向に移動させることもあり、この場合には配管等による負荷抵抗が発生し、観察作業が著しく阻害されることになる。
【００１０】
また、顕微鏡下で細胞を観察する際に、培養容器の観察面の平面度が悪いと、高倍率観察時には焦点ボケとなり、正確な観察・測定が行えない。このため、温度による容器の反り・歪みなどを極力抑えた培養容器であることが望ましい。一方、このような不都合は測定装置側にオートフォーカス機能を設けることによっても解決できるが高価な装置となるという問題がある。
【００１１】
本発明は上記問題点を鑑みてなされたものであって、細胞を長期間育成しながら、簡便に、且つ短時間で正確な培養細胞を検出することのできる培養細胞検出装置を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
第１の発明は、担体上に配される培養過程の細胞に光を照射し、細胞から発せられる蛍光を検出する細胞培養検出装置であって、前記担体に沿って平行光を発する光源と、少なくとも前記平行光の光軸方向に往復移動させられ、該平行光を細胞に向けて偏向させる照射ヘッドを備え、該照射ヘッドから細胞に対して平行光からなるスポット光を照射する照射ユニットと、細胞から発せられた蛍光を検出する検出ユニットとを備える細胞培養検出装置を提供する。
【００１３】
この発明によれば、照射ユニットの作動により、光源から発せられた平行光が照射ヘッドによって偏向され、平行光からなるスポット光として細胞に照射される。そして、スポット光の照射により細胞において発せられた蛍光が検出ユニットによって検出されることにより、細胞の観察が行われる。光源から発せられる光が平行光であるとともに、照射ヘッドの往復移動方向が、その平行光の光軸方向に設定されているので、移動方向のいずれの位置においても照射ヘッドから均一な光スポットを細胞に照射することが可能となる。また、細胞を培養する担体側を移動させるのではなく、照射ヘッドを往復移動させるので、高速に走査させることができる。
【００１４】
第２の発明は、第１の発明に係る細胞培養検出装置において、前記光源から発せられる平行光の光軸に直交する方向に前記担体を往復移動させる担体搬送ユニットを備える細胞培養検出装置を提供する。
この発明によれば、光源から発せられる平行光の光軸方向に往復移動させられる照射ヘッドの動作と、平行光の光軸に直交する方向に担体を往復移動させる担体搬送ユニットの動作とにより、担体上において培養過程にある細胞を２次元的に走査することが可能となる。
【００１５】
第３の発明は、第１または第２の発明に係る細胞培養検出装置において、前記照射ユニットが、前記光源から発せられた平行光を集光させる投光レンズと、該投光レンズにより後側焦点位置に集光された光を平行光に変えて細胞に照射する対物レンズとを備える細胞培養検出装置を提供する。
この発明によれば、光源から発せられた平行光が投光レンズにより集光させられ、対物レンズによって、再度平行光に変換されることにより、光束径の比較的小さい平行光からなるスポット光として、細胞に照射させることが可能となる。細胞に対してスポット状の平行光を照射することにより、焦点深度が深く、温度などの外乱により担体上の測定面が歪んだり反ったりした場合でも、細胞上におけるスポットの光径を変動させないようにすることができる。
【００１６】
第４の発明は、第３の発明に係る細胞培養検出装置において、検出ユニットが、細胞から発せられ前記対物レンズを通過させられた蛍光を結像する結像レンズと、該結像レンズの結像位置に設けられた受光ピンホールと、該受光ピンホールを通過した蛍光を検出する光検出器とを備える細胞培養検出装置を提供する。
この発明によれば、第３の発明において光スポットが細胞に照射されることにより、細胞から発せられる蛍光は、実質的に点光源となるので、焦点深度が深い場合等であっても、光検出器においては、細胞上に焦点を合わせた状態で、十分な蛍光量を正確に捉えることができる。また、受光ピンホールを通過させているため、不要な散乱光などの外乱光が光検出器に入射するのを防止することができ、蛍光量を正確に検出できる。
【００１７】
第５の発明は、第３または第４の発明に係る細胞培養検出装置において、前記投光レンズ、前記対物レンズおよび前記検出ユニットが、前記照射ヘッドに搭載されている細胞培養検出装置を提供する。
この発明によれば、光源から発せられた平行光が、照射ヘッドに到達すると、照射ヘッドに搭載されている投光レンズおよび対物レンズを経て担体上の細胞に照射される。そして、細胞において発せられた蛍光が、対物レンズを経て照射ヘッドに搭載されている検出ユニットにおいて検出されることになる。
【００１８】
第６の発明は、第３または第４の発明に係る細胞培養検出装置において、前記投光レンズおよび前記対物レンズが前記照射ヘッドに搭載され、前記検出ユニットが前記照射ヘッドの外部に配置されている細胞培養検出装置を提供する。
この発明によれば、スポット光の照射に必要な投光レンズおよび対物レンズを照射ヘッドに搭載し、蛍光を検出する検出ユニットを照射ヘッドの外部に配置したので、照射ヘッドを軽量化して、高速化を可能にすることができる。
【００１９】
第７の発明は、請求項１から請求項６のいずれかの発明に係る細胞培養検出装置において、培養液を供給する供給口と、培養液を排出する排出口とを備え、内部に培養液を流通させる培養容器が設けられるとともに、該培養容器内に前記担体が配置され、前記培養容器内の少なくとも前記供給口と前記担体との間に、供給された培養液を培養容器内に分散させる整流子部材が配置されている細胞培養検出装置を提供する。
この発明によれば、供給口から培養容器内に供給される培養液が整流子部材を経て担体の近傍に流通させられた後に排出口から培養容器の外部に排出される。整流子部材を経た培養液は培養容器内に分散されるので、培養液の滞留による局所的なｐＨ異常等の発生を阻止することが可能となる。その結果、長期間にわたって細胞を安定的に培養しながら、培養過程で起きる細胞内の挙動を正確且つ経時的に検出することが可能となる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の第１の実施形態に係る細胞培養検出装置について、図１〜図７を参照して説明する。
本実施形態においては、一例として、細胞Ｃをスライドガラス（担体）１０１上にアレイ状に整列配置し、培養された状態で蛍光観察を行う細胞培養検出装置１００について説明する。
【００２１】
本実施形態に係る細胞培養検出装置１００は、図１に示されるように、スライドガラス１０１に沿ってレーザ光（平行光）を発する光源１０２と、該光源１０２からの光軸１０３方向に往復移動可能に設けられた照射ヘッド１０４を備える照射ユニット１０５と、細胞において発せられた蛍光を検出する検出ユニット１１５（図２参照）と、スライドガラス１０１を搭載するステージ１０７と、該ステージ１０７を照射ヘッド１０４の移動方向に直交する方向に往復移動させる担体搬送ユニット１０８とを備えている。スライドガラス１０１は、後述する培養容器内に固定状態に収容されている。
【００２２】
光源１０２は、所定の径の平行光束からなるレーザ光を発生するレーザ光源である。レーザ光の波長は、蛍光色素の励起線に応じて選ばれ、例えば、ＧＦＰのＳ６５Ｔでは励起線は４８９ｎｍである。なお、ＧＦＰは青色光に励起されると緑色光を発する蛍光物質である。
照射ユニット１０５は、照射ヘッド１０４を往復移動させるヘッド駆動機構１０９を備えている。照射ヘッド１０４は、スライドガラス１０１の下面側に配置されていて、該スライドガラス１０１を透過させて該スライドガラス１０１上の細胞Ｃに光を照射することができるようになっている。
【００２３】
ヘッド駆動機構１０９は、光源１０２からの平行光の光軸１０３方向に照射ヘッド１０４のガイドレール穴１１０を貫通する２本のガイドレール１１１と、該ガイドレール１１１に平行に照射ヘッド１０４の両側に配置された磁石ロッド１１２と、該磁石ロッド１１２にそれぞれ外嵌され照射ヘッド１０４に固定されたボイスコイル１１３とから構成されている。前記磁石ロッド１１２は、例えば、ネオジウム類やサマリウムコバルト類の材質からなっており、ボイスコイル１１３との間に所定の間隔をあけるようになっている。ガイドレール１１１は、例えば、ステンレス等の丸棒により構成されている。ガイドレール穴１１０は、ガイドレール１１１を摺動可能に挿入させることで、照射ヘッド１０４の往復直線移動をスムーズに案内することができるようになっている。なお、ガイドレール穴１１０にボールベアリング、含油軸受等を配置して低摺動摩擦となるようにしてもよい。図中符号１１４は、ガイドレール１１１、磁石ロッド１１２およびレーザ光源１０２を固定するフレームを示している。
【００２４】
このように構成することにより、ヘッド駆動機構１０９は、一般的なボイスコイルモータ（ＶＣＭ）によるリニアモータとなり、照射ヘッド１０４をガイドレール１１１に沿って高速に往復移動させることができるようになっている。
【００２５】
照射ヘッド１０４には、図２に示されるように、励起ピンホール１１６と、投光レンズ１１７と、ダイクロイックミラー１１８と、対物レンズ１２２とが搭載されるとともに、結像レンズ１１９と、受光ピンホール１２０と光検出器１２１とを備える検出ユニット１１５が搭載されている。
【００２６】
励起ピンホール１１６は、ピンホールが設けられた板部材からなり、投光レンズ１１７の前側焦点位置に配置され、照射ヘッドに入射されるレーザ光の径を絞るように構成されている。投光レンズ１１７は、励起ピンホール１１６によって絞られたレーザ光を集光させるように構成されている。ダイクロイックミラー１１８は、投光レンズ１１７によるレーザ光の集光途中に設けられ、該レーザ光の光路を略９０°偏向するように構成されている。対物レンズ１２２は、高倍率（例えば、２０倍）の対物レンズ１２２であって、ダイクロイックミラー１１８の反射光路上に配置され、投光レンズ１１７によって後側焦点位置に集光されたレーザ光を細い平行光束、すなわち、平行光からなるスポット光としてスライドガラス１０１に向けて照射するように構成されている。
【００２７】
一方、検出ユニット１１５を構成する結像レンズ１１９、受光ピンホール１２０および光検出器１２１は、ダイクロイックミラー１１８の透過光路上に配置されている。結像レンズ１１９は、ダイクロイックミラー１１８を透過してきた細胞からの蛍光を集光させるように構成されている。受光ピンホール１２０は、結像レンズ１１９の集光位置に配置されたピンホールを備えた板部材である。光検出器１２１は、例えば、フォトマルチプライヤーやアバランシェフォトダイオード等である。
【００２８】
担体搬送ユニット１０８は、スライドガラス１０１を搭載するステージ１０７と、該ステージ１０７を照射ヘッド１０４の移動方向に対して直交する方向に往復移動させるためのステッピングモータ１２３とボールネジ１２４とからなる送り機構１２５とから構成されている。ステージ１０７は、例えば、図１に示す例では、透明な板材により構成されており、図２に示す例では、後述する培養容器の下側のガラス板部材である。ステージ１０７は、上面に搭載したスライドガラス１０１上の細胞Ｃに照射する光を、下方から透過させることができるようになっている。
なお、図１中、符号１２６は、スライドガラス１０１の上方に配置された低倍率対物レンズ（例えば、４倍対物レンズ）を示している。該低倍率対物レンズ１２６は、主として細胞Ｃの実像観察を行うように構成されている。
【００２９】
このように構成された本実施形態に係る細胞培養検出装置１００の作用について以下に説明する。
本実施形態の細胞培養検出装置１００において細胞Ｃの観測を行うには、後述する培養容器内に培養液を流通させて、スライドガラス１０１上の細胞Ｃを培養しつつ、照射ユニット１０５および検出ユニット１１５を作動させる。培養容器の構造および作用については後述することとし、ここでは、スライドガラス１０１上において細胞Ｃが培養されているものとして、その細胞の検出について詳細に述べることにする。
【００３０】
照射ユニット１０５を作動させると、平行光からなるレーザ光がレーザ光源１０２から射出される。レーザ光は、スライドグラス１０１を搭載するステージ１０７の下方において、スライドグラス１０１に平行な光路に沿って照射ヘッド１０４に入射される。照射ヘッド１０４には、レーザ光を入射させる入射穴１２７が設けられている。照射ヘッド１０４は、ヘッド駆動機構１０９により、レーザ光の光路に沿う方向に移動させられるが、レーザ光が平行光により構成されているので、照射ヘッド１０４がいずれの位置に配置されていても、同一の径を有する光束を入射穴１２７から照射ヘッド１０４内に入射させることができる。
【００３１】
入射穴１２７から照射ヘッド１０４内に入射した平行光からなるレーザ光は、励起ピンホール１１６のピンホールを通過させられることにより絞られた後に、投光レンズ１１７を通過させられることにより集光され、ダイクロイックミラー１１８において反射される。そして、レーザ光は、高倍率対物レンズ１２２の後側焦点位置付近において焦点を結んだ後に、高倍率対物レンズ１２２を通過させられることにより、再度平行光としてステージ１０７上のスライドガラス１０１上に配置されている細胞Ｃに照射される。
【００３２】
細胞Ｃに照射されるレーザ光は、充分に細い径のスポット光に構成されている。その光束径は、高倍率対物レンズ１２２の倍率により、任意の大きさに設定できることは言うまでもないが、例えば、細胞Ｃの大きさをφ１０〜２０μｍとすると、それ以下の光束径に設定されることが好ましく、細胞Ｃの大きさの１／１０程度の光束径に設定することがさらに好ましい。これにより、細胞Ｃ内部におけるＧＦＰの発現位置を特定することも可能となる。
【００３３】
このようにして、充分に光束径の小さいレーザ光は、スライドガラス１０１上の細胞Ｃにテレセントリックに照射される。そして、レーザ光を照射されることにより細胞Ｃから発せられた蛍光は、再度高倍率対物レンズ１２２を介してダイクロイックミラー１１８を透過し、結像レンズ１１９によって結像される。結像レンズ１１９のその結像位置には、受光ピンホール１２０が配置されているので、集光された蛍光は、該受光ピンホール１２０のピンホールを通過して、光検出器１２１に入射され検出されることになる。
【００３４】
上記光学系は、小穴直良光学系と類似しているが、励起光をテレセントリック照明とした点に特徴がある。具体的には、平行光を励起ピンホール１１６で整形し、投光レンズ１１７により高倍率対物レンズ１２２の瞳位置に１次ピンホール像として集光させることでスライドガラス１０１へ照射する励起光を一定の断面積を有した平行光とする。このとき、図２に示すように、励起ピンホール１１６で生じた回折光がスライドガラス１０１面上で２次ピンホール像を作る。この２次ピンホール像により、スライドガラス１０１上の細胞Ｃのピント位置を知ることができるため、ピント調整を正確に行うことができる。
【００３５】
また、励起光によって励起されスライドガラス１０１上の細胞Ｃから発せられた蛍光は、第２次の面光束、あるいは、実質的な点光源となり、再び高倍率対物レンズ１２２を通過して、結像レンズ１１９の後側焦点位置で３次ピンホール像を作る。この３次ピンホール像とほぼ等しい大きさのピンホールを有する受光ピンホール１２０を設置することで、励起光が照射されているスライドガラス１０１面以外から発せられた蛍光や外乱光が光検出器１２１に到達することを防止できる。
【００３６】
また、この検出光学系においては、蛍光は面光源（スライドガラス１０１上の細胞Ｃ）から発しているため、一般的な光学顕微鏡と同等の焦点深度となり、共焦点レーザー顕微鏡などと比べ、スライドガラス１０１の歪みや反りの影響で蛍光強度が不均一となることが少ない。
また、通常、励起光がスライドガラス１０１面に平行光として照射される場合、焦点合わせが難しいという問題がある。しかしながら、前述のように、励起ピンホール１１６で生じた回折光がスライドガラス１０１面上で２次ピンホール像を作るので、これにより、高倍率対物レンズ１２２のスライドガラス１０１上の細胞Ｃへの焦点合わせを容易に行うことができる。
【００３７】
そして、３次ピンホール像の大きさよりも受光ピンホール１２０のピンホールの大きさを大きくすると、スライドガラス１０１上の細胞Ｃからの全蛍光量を光検出器１２１で検出することができ、走査しながら測定する際の測光時間を短縮できる。逆に、３次ピンホール像の大きさよりも受光ピンホール１２０のピンホールの大きさを小さくすると、細胞Ｃ内の一部からの蛍光を測定することができるので、順次走査しながら測光することで、細胞Ｃ内の蛍光分布を画像化し、解析することができる。つまり、受光ピンホール１２０のピンホールを数種類用意して、自動的に切り替えることにより、その測定目的に応じて、様々な検出が容易に行える利点がある。
【００３８】
次に、ヘッド駆動機構１０９および担体搬送ユニット１０８の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る細胞培養検出装置１００により培養過程の細胞Ｃの観察を行うには、ヘッド駆動機構１０９を作動させて照射ヘッド１０４を高速に往復移動させるとともに、これに同期して担体搬送ユニット１０８を作動させてスライドガラス１０１を照射ヘッド１０４の移動方向に直交する方向に移動させる。
【００３９】
例えば、ヘッド駆動機構１０９の作動による照射ヘッド１０４の１回の往路走査終了後に、担体搬送ユニット１０８の送り機構１２５を作動させることにより、高倍率対物レンズ１２２から細胞Ｃへ向けて発せられる微小断面のスポット光の光束径を１ピッチとして１ピッチ分だけ、ステージ１０７に送りをかける。次いで、照射ヘッド１０４を１回だけ復路走査した後に、送り機構１２５により、さらに１ピッチ分だけステージ１０７に送りをかける。これらの工程を順次繰り返すことにより、スライドガラス１０１上の細胞Ｃの検出領域を全面にわたって２次元的に走査し、蛍光測定を行うことができることになる。
【００４０】
分解能をより高めるために、スポット光の光束径の１／２の距離を担体搬送ユニット１０８の送り機構１２５の作動により、１ピッチ分として送ることにしてもよい。すなわち、求められる測定分解能に応じて、１ピッチ分の送り量を可変することにしてもよい。
【００４１】
ヘッド駆動機構１０９では、ボイスコイル１１３への電流の向き・大きさを調整することにより、スライドガラス１０１の短辺方向に沿って任意の一定速度（等速度）で、照射ヘッド１０４を往復動作させることができる。ボイスコイル１１３によれば、往復動作時の加減速時間が短時間でよく、長い加減速領域を設ける必要がない。しかしながら、スライドガラス１０１の短辺内で一定速度を維持するために、スライドガラス１０１の短辺の長さよりも長く走査させる必要がある。そして、このようにすることで、蛍光色素に対して、一定速度、つまり一定時間しか励起光を照射しないので、蛍光強度の無意味な退行を防止できるとともに、蛍光強度の走査速度によるムラを低減できるという利点がある。
【００４２】
また、図示していないが、ヘッド駆動機構１０９および担体搬送ユニット１０８の送り機構１２５の一部には光学的または磁気的な位置センサを搭載し、各方向の走査に伴う位置座標を検出して出力できるようにし、各蛍光の発生位置を正確に求めることができる。この蛍光強度発生位置と蛍光強度の値をコンピュータに取り込み、計算処理し、２次元画像としてスライドガラス１０１上の細胞Ｃからの蛍光を表現することは言うまでも無く可能である。また、一つの細胞Ｃに着目した蛍光強度の変化を時間経過と共にグラフ化することも可能である。
【００４３】
つまり、高倍率対物レンズ１２２からレーザ光を細胞Ｃに照射し、そのときの蛍光量を光検出器１２１で随時検出しながら、照射ヘッド１０４を高速に往復移動させて走査し、それと同時に、その照射ヘッド１０４の走査方向に直交する方向にスライドガラス１０１が搬送されるため、結局、スライドガラス１０１全面積を２次元的に走査して、各位置の蛍光量を検出することができる。
【００４４】
また、前述したように、走査系には光学的または磁気的な位置センサも搭載されるため、検出された蛍光量の位置座標も認識することができる。培養されている細胞Ｃは、その活性周期に応じて、形態や蛍光量も変化していく。このため、細胞Ｃから発する蛍光量と、蛍光を発している位置情報と、細胞Ｃを培養する時間との相関関係で、目的とする細胞Ｃ（タンパク質の機能）解析ができるようになる。
【００４５】
この場合には、培養されている細胞Ｃを一定時間ごとに定期的に自動的に走査して、位置情報に対する蛍光量を測定する装置が必要となる。本実施形態に係る細胞培養検出装置１００の光学系の構成によれば、焦点深度が深いので、自動走査する際に焦点を合わせ直すなどの煩雑な作業から解放される。また、ヘッド駆動機構１０９はＶＣＭにより構成されるために、スライドガラス１０１全面を短時間で走査することが可能となり、１枚のスライドガラス１０１の測り始めから測り終わりまでの間にタイムロスが少なく、細胞Ｃの活性周期も正確に把握することができる。
【００４６】
次に、上述したステージ１０７に搭載されるスライドガラス１０１を収容する培養容器１２８について説明する。
この培養容器１２８は、図２および図３に示されるように、スライドガラス１０１を内部に収容可能な表裏貫通穴１２９を有する熱伝導に優れた材質、例えば、ステンレス製またはアルミ製の筐体１３０と、その筐体１３０の表裏貫通穴１２９を塞ぐ光学的に平滑な２枚のガラス板部材１３１と、筐体１３０内部に培養液Ａを供給する培養液供給パイプ１３２と、筐体１３０内部から不要となった培養液Ａを排出する培養液排出パイプ１３３と、筐体１３０への培養液Ａの出入口に設けられた２つの整流子部材１３４とを備えている。
【００４７】
培養容器１２８内のスライドガラス１０１には、細胞Ｃを固定するための高分子材料などの基材が処理形成されている。また、培養容器１２８内はすべて滅菌処理されている。表裏貫通穴１２９を塞ぐガラス板部材１３１は、スライドガラス１０１を内部に固定した後に密閉されるようになっている。このため、図示しないフッ素樹脂（例えば、４フッ化エチレン樹脂）製のパッキン等を培養液Ａの水密を確保するために筐体１３０とガラス板部材１３１との接合部に設置している。これに代えて、シリコーン接着剤により完全に密閉固定してもよい。また、ガラス板部材１３１の内面には、気泡の付着を防ぐために高親水性処理が施されていてもよい。
【００４８】
スライドガラス１０１上に着床・固定した細胞Ｃは、培養液Ａの流れが急激な場合には、脱落・剥離する場合があるが、スライドガラス１０１全域において、常に新鮮な培養液Ａへの交換が必要不可欠である。このため、各パイプ１３２，１３３付近に設置された整流子部材１３４により、培養液Ａの流れを分散し、均一に回収できるようになっている。
【００４９】
すなわち、前記整流子部材１３４は、板材の厚さ方向に複数の貫通穴１３４ａを形成した多孔性の部材により構成されている。培養容器１２８への入口側の整流子部材１３４は、培養液供給パイプ１３２から培養容器１２８内に流れ込む培養液Ａを複数の貫通穴１３４ａに分散させて流通させるようになっている。また、培養容器１２８からの出口側の整流子部材１３４は、培養容器１２８内から培養液排出パイプ１３３を経て一気に流出しようとする培養液Ａを複数の貫通穴１３４ａに分散させて流通させるようになっている。これにより、集中的な流れを分散流に変換し、細胞Ｃが配置されているスライドガラス１０１近傍において、培養容器１２８の横断面積のほぼ全領域で一定の流速および流量で培養液Ａを流動させることができるようなっている。
【００５０】
整流子部材１３４は、例えば、図４に示されるように、約φ０．１ｍｍの貫通穴１３４ａを０．３ｍｍ間隔で格子状に配列し、さらに、約φ０．０３ｍｍの貫通穴１３４ｂをその０．３ｍｍ間隔の中央に形成した２種類の貫通穴１３４ａ，１３４ｂを有するものである。このようにすることで、大きな径の貫通穴１３４ａからの培養液Ａの放出流によって整流子部材１３４の下流側に発生する滞留部分を、小さな径の貫通穴１３４ｂからの放出流により攪拌する作用を発生させることが可能となる。これにより、培養液Ａをよどみなく流通させて確実に交換することが可能となる。
なお、上記整流子部材１３４に代えて、圧力損失は大きくなるが、０．２μｍ程度の径の貫通穴を有するものを採用してもよい。このようにすることで、培養液Ａを経路とする汚染の発生を防止することにも効果が得られる。
【００５１】
培養容器１２８には、温度制御ユニット１３５が取り付けられている。該温度制御ユニット１３５は、培養容器１２８の周囲に温水を流通させる温水流路１３６を形成している。温水流路１３６内に温水Ｗを循環させることにより、培養容器１２８の筐体１３０を介して温水の熱を培養容器１２８内部の培養液Ａに伝達することができるようになっている。このとき、図示しない温度センサ（熱電対・サーミスタ・測温抵抗体など）により、培養容器１２８の温度を３７±０．５℃の範囲に維持するように、温水Ｗの温度および循環流量が制御されるようになっている。その結果、培養容器１２８は、いわばウォーターバスにより加温され、急激な温度変化を生じさせることなく、培養液Ａの温度を一定に維持することができるようになっている。
【００５２】
培養容器１２８の培養液供給パイプ１３２には、図５に示されるように、培養液瓶温度制御部により培養液温度が制御された培養液瓶１３７と、該培養液瓶内１３７の培養液Ａを培養液供給パイプ１３２を介して培養容器内１２８に供給する培養液ポンプ１３８とが取り付けられている。また、温度制御ユニット１３５には、温水瓶温度制御部により温水温度が制御された温水瓶１３９と、該温水瓶１３９内の温水Ｗを温水制御ユニット１３５の温水流路１３６内に供給する温水ポンプ１４０とが取り付けられている。培養液ポンプ１３８および温水ポンプ１４０は、例えばベリスタポンプなどの循環ポンプであり、培養液ポンプ制御部および温水ポンプ制御部によりその間欠動作タイミングおよび流量が制御されるようになっている。
【００５３】
また、培養液瓶１３７内の培養液ＡのＣＯ２濃度は、ＣＯ２濃度制御部により、所定のｐＨ値が維持されるようにＣＯ２の流量および間欠供給タイミングが制御されるようになっている。
前記培養液ポンプ制御部、温水ポンプ制御部およびＣＯ２濃度制御部は、コンピュータに接続され、該コンピュータによって統一的に制御されるようになっている。
なお、細胞Ｃへの滅菌性を確立するため、培養瓶１３７および、培養液ポンプ１３８並びにこれに接続する配管１３２，１３３等も滅菌処理されている。
【００５４】
このように構成された培養容器１２８を備えた本実施形態に係る細胞培養検出装置１００により、細胞Ｃを培養しながら測定を行うには、培養液ポンプ制御部、温水ポンプ制御部およびＣＯ２濃度制御部を作動させて、培養液Ａの温度およびＣＯ２濃度が所定値に維持された後に、測定が開始される。
【００５５】
この場合に、担体搬送ユニット１０８の送り機構１２５（図１参照）が、Ｘ軸走査制御部からの指令により、Ｘ軸方向に１ステップ（測定分解ピッチ）送られる毎に、Ｙ軸走査制御部からの指令により照射ヘッド１０４がＹ軸方向に１回走査し、これがスライドガラス１０１の全面にわたって実施される。平行光束光源制御部により、蛍光色素の励起線に基づいて光源１０２が選択され、細胞Ｃの蛍光量が光検出器１２１（図２参照）において検出される。検出結果は、光検出器演算部において演算された後にコンピュータに送られる。一方、各蛍光量測定時にその座標位置もＸ軸座標検出部とＹ軸座標検出部とからコンピュータに送られる。そして、その結果として、スライドガラス１０１全面の各位置における細胞Ｃからの蛍光量の分布が画像化される。この画像は、低倍率対物レンズ１２６を介して得られＣＣＤカメラ制御部によりコンピュータに送られた実像との合成画像としても表示できる。
【００５６】
また、スライドガラス１０１上の任意の数細胞Ｃだけに着目し、培養を行いながら、該当細胞Ｃ内部の蛍光分布を局所的に長期間測定することもできる。
また、例えば、細胞Ｃを培養しながら、一定時間ごとにスライドガラス１０１全面を測定し、時間経過に対する各細胞Ｃの蛍光量を自動測定することにしてもよい。
【００５７】
このように、培養容器１２８には温度制御関連、ＣＯ２濃度関連および培養液関連の配管・配線が数多く設置され、これらの配管・配線を引きずりながら高速移動させることは困難である。また、培養液Ａ中の細胞Ｃを高速移動させる場合、細胞Ｃの位置がずれるなど、位置情報と蛍光強度の値または量の相関を求める上で問題が発生する場合がある。本実施形態においては、高速で走査する機能を照射ヘッド１０４に担わせることにより、培養容器１２８は、担体搬送ユニット１０８の送り機構１２５により低速走査（間欠駆動走査）させるだけで済む。
【００５８】
なお、この場合、厳密に言えば、高倍率対物レンズ１２２からの平行光は培養容器１２８の下面に設けられたガラス板部材１３１を通して、スライドガラス１０１上の細胞Ｃに照射されることになる。また、細胞Ｃの周囲（培養容器１２８内）はすべて培養液Ａで満たされているため、培養容器１２８の上面に設置された低倍率対物レンズ１２６は、上面のガラス板部材１３１および培養液Ａを通して細胞Ｃの蛍光量を測定したり、実像を観察したりすることになる。
【００５９】
したがって、高倍率対物レンズ１２２と低倍率対物レンズ１２６は、各ガラス板部材１３１の厚さ、スライドガラス１０１の厚さおよび培養液Ａの厚さを考慮して設計される。厳密には、胞培養容器１２８内は３７℃近傍の温度に設定されるため、温度による屈折率の変化も考慮すべきである。
また、培養液Ａを均一に交換するためには、図２に示されるように、培養液供給パイプ１３２を培養容器１２８の下面近くに、培養液排出パイプ１３３を培養容器１２８の上面近くに設置することが望ましい。
【００６０】
また、図６に示されるように、高倍率対物レンズ１２２を搭載した照射ヘッド１０４および低倍率対物レンズ１４２を搭載した照射ヘッド１４３を培養容器１２８内のスライドガラス１０１の下面側に２ユニット並列に設置しておくことにより、高倍率測定と低倍率測定を１回の走査で実現することも可能である。この場合、Ｘ軸の走査距離（担体搬送ユニットの送り機構による走査距離）は、上記実施形態の場合の倍になる。
【００６１】
さらには、複数の照射ヘッド１０４，１４３の光源１０２の励起光の波長を各照射ヘッド１０４、１４３ごとに異なる構成にすることにより、ＧＦＰ以外の多種の蛍光色素も一度の走査によって測定することができる。言うまでもないが、照射ヘッド１０４、１４３の数、培養容器１２８の数等は、その都度の目的により増減可能であり、１つや２つに限られるものではない。
【００６２】
また、担体として、スライドガラス１０１を例として示したが、９６穴マイクロプレートや３８４穴マイクロプレートのように、穴内において細胞Ｃを培養し、本実施形態の細胞培養検出装置１００によりマイクロプレートの下側（底面側）において培養細胞Ｃからの蛍光強度を測定することも可能である。この場合、走査ストロークの延長とマイクロプレートの開放穴を塞ぐ蓋やＣＯ２供給箱で覆うなどの構成をとれば数日間の培養は可能である。
【００６３】
また、図７に示されるように、結像レンズ１１９、受光ピンホール１２０および光検出器１２１からなる検出ユニット１１５を照射ヘッド１０４内ではなく、照射ヘッド１０４外の固定部側に配置してもよい。この場合には、照射ヘッド１０４内に全反射ミラー１４４を配置して、細胞Ｃから発せられた蛍光を全て光源１０２側に反射して戻すとともに、その光路の途中にダイクロイックミラー１１８を挿入して、蛍光を分離する。これにより、照射ヘッド１０４に搭載される部品点数が削減されるので、照射ヘッド１０４を軽量化して、より高速に走査することができるという効果がある。
【００６４】
【発明の効果】
この発明によれば、細胞を健全に長期間培養しながら、簡易かつ短時間の内に正確な細胞の観測を行うことができる細胞培養検出装置を提供することができる。したがって、培養条件を変化させながら対象細胞の反応程度をリアルタイムで測定することができる。その結果、対象細胞におけるタンパク質の発現の有無およびその発現量の測定および時間経過に伴う発現量の変化などを正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施形態に係る細胞培養検出装置を示す模式的な斜視図である。
【図２】図１の細胞培養検出装置における光学系を説明する図である。
【図３】図１の細胞培養検出装置に用いられる培養容器を説明する平面図である。
【図４】図３の培養容器に使用される整流子部材を示す斜視図である。
【図５】図１の細胞培養検出装置を組み込んだ培養検出システムを示す模式図である。
【図６】図１の細胞培養検出装置の変形例を示す模式的な斜視図である。
【図７】図１の細胞培養検出装置の光学系の変形例を示す図である。
【符号の説明】
Ａ　培養液
Ｃ　細胞
１００　細胞培養検出装置
１０１　スライドガラス（担体）
１０２　光源
１０３　光軸
１０４　照射ヘッド
１０５　照射ユニット
１０８　担体搬送ユニット
１１５　検出ユニット
１１７　投光レンズ
１１９　結像レンズ
１２０　受光ピンホール
１２１　光検出器
１２２　対物レンズ
１２８　培養容器
１３４　整流子部材
【図１】
2004113175.tif 000003
【図２】
2004113175.tif 000004
【図３】
2004113175.tif 000005
【図４】
2004113175.tif 000006
【図５】
2004113175.tif 000007
【図６】
2004113175.tif 000008
【図７】
2004113175.tif 000009