(57)【要約】【課題】沙棘由来でタンパク質非酵素的糖化抑制活性、アルドース還元酵素阻害活性及びフリーラジカル消去活性を示す新規なフラボノイド配糖体及びその用途を提供する。【解決手段】次式：【化１】2004217545.tif 000008（式中、Ｒ１は水素原子又は水酸基を表し、Ｒ２は水素原子又はメトキシ基を表す。）で示されるフラボノイド配糖体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
置換又は非置換のシンナモイル基を糖残基上に有するフラボノイド配糖体。
【請求項２】
沙棘葉部処理物から得られる請求項１に記載のフラボノイド配糖体。
【請求項３】
次式：
【化１】
2004217545.tif 000007
（式中、Ｒ１は水素原子又は水酸基を表し、Ｒ２は水素原子又はメトキシ基を表す。）
で示されるフラボノイド配糖体。
【請求項４】
前記式において、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がメトキシ基である、請求項３に記載のフラボノイド配糖体。
【請求項５】
前記式において、Ｒ１が水酸基であり、Ｒ２がメトキシ基である、請求項３に記載のフラボノイド配糖体。
【請求項６】
前記式において、Ｒ１及びＲ２が水素原子である、請求項３に記載のフラボノイド配糖体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のフラボノイド配糖体を含有するタンパク質非酵素的糖化抑制剤。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のフラボノイド配糖体を含有するアルドース還元酵素阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のフラボノイド配糖体を含有するフリーラジカル消去剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規フラボノイド配糖体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病による高血糖が原因となり、神経障害、白内障、腎障害、網膜症、関節硬化症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性壊疽等の種々の合併症を発症することがある。合併症は主に、患者の血液中のタンパク質が糖と結合する非酵素的糖化が原因とされる血管障害と、糖が代謝されるときに生じるソルビトールの蓄積によって細胞が破壊されることが原因とされる神経障害とに分かれる。特に血管障害は、患者の生命に関わる場合や、長期に亘り患者の生活の質を大きく損なう場合が多いため、その予防・治療は糖尿病又は糖尿病合併症治療上の重要な課題とされ、非酵素的糖化タンパクと疾病との関係が研究されている（例えば非特許文献１〜７参照）。
【０００３】
また、神経障害の原因とされるソルビトールの蓄積は、グルコースの代謝経路であるポリオール経路を介することが知られている（例えば特許文献１参照）。ポリオール経路は、グルコース、ガラクトース等のアルドースがソルビトール、ガラクチトール等のポリオールを介してフルクトース等のケトースに変換される代謝経路であり、この経路の第一段階であるアルドース−ポリオール間の変換を触媒する酵素であるアルドース還元酵素はポリオール経路の律速酵素と考えられている。従ってこのアルドース還元酵素を阻害し、ソルビトールの生産や蓄積を低下させることが、合併症の治療に有効である。
【０００４】
一方、沙棘（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ  ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ）は、主に中国黄河流域及びロシア、中東の乾燥地帯に分布するグミ科の植物であり、その果実や葉は、古くから皮膚潰瘍疾病や、胃、肝臓、呼吸器系慢性疾患の民間薬として利用されており、我が国においても、沙棘の抽出液を原料として利用した浴剤組成物や化粧品に特許が付与されている（例えば特許文献２及び３）。また沙棘の果実は、老化や癌、動脈硬化等の疾病に関与するとされるフリーラジカルを捕捉するフリーラジカル消去活性があるとされ、これらの疾病の予防・治療のための民間薬や化粧品にも利用されている。
【０００５】
沙棘の主な成分として、これまでに多くのフラボノイド配糖体が得られているが、置換又は非置換のシンナモイル基を糖残基上に有するフラボノイド配糖体は知られていない。
【０００６】
【非特許文献１】
「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」、第６７巻、１９７５年、ｐ．１０３
【非特許文献２】
「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２５４巻、１９７９年、ｐ．７０２
【非特許文献３】
「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、米国、第７８巻、１９８２年、ｐ．２３９３
【非特許文献４】
「Ｄｉａｂｅｔｅｓ」、第３１巻、１９８２年、ｐ．２８３
【非特許文献５】
「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、米国、第７５巻、１９７８年、ｐ．２９１８
【非特許文献６】
「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、第３７巻、１９８４年、ｐ．８４１
【非特許文献７】
「Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２１巻、１９８４年、ｐ．２
【特許文献１】
特開平９−３０９８４号公報
【特許文献２】
特許第２８１１７１１号公報
【特許文献３】
特許第２５１５５２５号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、沙棘由来でタンパク質非酵素的糖化抑制活性、アルドース還元酵素阻害活性及びフリーラジカル消去活性を示す新規フラボノイド配糖体及びその用途を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）置換又は非置換のシンナモイル基を糖残基上に有するフラボノイド配糖体。
（２）沙棘葉部処理物から得られる前記（１）のフラボノイド配糖体。
（３）次式：
【０００９】
【化２】
2004217545.tif 000002
（式中、Ｒ１は水素原子又は水酸基を表し、Ｒ２は水素原子又はメトキシ基を表す。）
で示されるフラボノイド配糖体。
【００１０】
（４）前記（３）の式において、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がメトキシ基であるフラボノイド配糖体。
（５）前記（３）の式において、Ｒ１が水酸基であり、Ｒ２がメトキシ基であるフラボノイド配糖体。
（６）前記（３）の式において、Ｒ１及びＲ２が水素原子であるフラボノイド配糖体。
（７）前記（１）〜（６）のいずれか１に記載のフラボノイド配糖体を含有するタンパク質非酵素的糖化抑制剤。
（８）前記（１）〜（６）のいずれか１に記載のフラボノイド配糖体を含有するアルドース還元酵素阻害剤。
（９）前記（１）〜（６）のいずれか１に記載のフラボノイド配糖体を含有するフリーラジカル消去剤。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のフラボノイド配糖体は、置換又は非置換のシンナモイル基を糖残基上に有する。ここで、置換シンナモイル基とは、シンナモイル基中のベンゼン環が、メトキシ等の炭素数１〜６のアルコキシ基、水酸基等から選ばれる１〜３個の置換基で置換されたシンナモイル基をいう。また、前記水酸基は、プロドラッグ化等の目的に応じて、エステル化されていてもよい。
【００１２】
本発明のフラボノイド配糖体としては、例えば、次式：
【化３】
2004217545.tif 000003
（式中、Ｒ１は水素原子又は水酸基を表し、Ｒ２は水素原子又はメトキシ基を表す。）
で示されるフラボノイド配糖体が挙げられる。前記式で示されるフラボノイド配糖体としては、例えば、Ｒ１が水素原子でありＲ２がメトキシ基であるフラボノイド配糖体、Ｒ１が水酸基でありＲ２がメトキシ基であるフラボノイド配糖体、又はＲ１及びＲ２が水素原子であるフラボノイド配糖体が挙げられる。
【００１３】
本発明のフラボノイド配糖体は、沙棘由来であり、特に、沙棘の抽出物を処理することにより得ることができ、また、必要に応じて、このようにして得られたフラボノイド配糖体を常法に従ってエステル化等の処理を施すことにより各種誘導体に変換することができる。本発明で用いる沙棘として、従来より民間薬等に使用されているものを使用することができるが、特に、沙棘の葉部を用いることが好ましい。
【００１４】
ここで、沙棘の抽出に用いる抽出溶媒として、水；低級アルコール類、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール；エーテル類、例えばエチルエーテル、ジオキサン；ケトン類、例えばアセトン等が挙げられるが、水、エタノール、又は水−エタノール混合溶媒が好ましい。溶媒は、通常、沙棘１ｋｇ当り抽出溶媒５〜２５Ｌを使用する。
【００１５】
抽出温度は、特に制限はなく、溶媒の融点ないし溶媒の沸点の範囲内であり、超臨界抽出をしてもよい。超臨界抽出は、好ましくは炭酸ガスを主溶媒とし、エントレーナーとしてメタノール、エタノール等のアルコール類を添加して行われる。また、抽出は、通常常圧下で行うが、加圧下又は減圧下で行ってもよい。抽出時間は、抽出温度等により異なり、通常５分間〜１日間である。
【００１６】
このようにして得られた抽出液を、布、ステンレスフィルター、濾紙等で濾過して不純物等を取り除き、濾過後の抽出液に、スプレードライ処理、フリーズドライ処理、超臨界処理等の処理を施す。その後、当該抽出物をイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、透析等の各種精製手段により処理することにより、本発明のフラボノイド配糖体を得ることができる。
【００１７】
このようにして得られたフラボノイド配糖体は、タンパク質非酵素的糖化抑制活性及びアルドース還元酵素阻害活性を有しているため、特に糖尿病及び糖尿病合併症を患っている患者に投与することにより、これらの症状の治療又は予防を図ることができる。
【００１８】
さらに、このフラボノイド配糖体は、フリーラジカル消去活性を有しているため、老化や癌、動脈硬化、脳梗塞等の疾病の予防・治療剤の有効成分として用いることもできる。
【００１９】
患者への投与のために、本発明のフラボノイド配糖体は、公知の医薬用担体と組合せて製剤化することができる。投与形態としては、特に制限はなく、必要に応じ適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤、軟膏剤等の非経口剤として使用される。
【００２０】
本発明のフラボノイド配糖体の投与量は、患者の年令、体重、疾患の程度、投与経路により異なるが、経口投与では、通常１日１０〜３０００ｍｇであり、投与回数は、通常、経口投与では１日１〜３回である。
【００２１】
経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法に従って製造される。
【００２２】
この種の製剤には、適宜前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用することができる。
【００２３】
結合剤の具体例としては、結晶セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルメロースナトリウム、エチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、プルラン、ポリビニルピロリドン、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＲＳ、メタクリル酸コポリマーＬ、メタクリル酸コポリマー、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、アラビアゴム末、寒天、ゼラチン、白色セラック、トラガント、精製白糖、マクロゴールが挙げられる。
【００２４】
崩壊剤の具体例としては、結晶セルロース、メチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、トラガントが挙げられる。
【００２５】
界面活性剤の具体例としては、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴールが挙げられる。
【００２６】
滑沢剤の具体例としては、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、タルク、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類、水素添加植物油、ポリエチレングリコールが挙げられる。
【００２７】
流動性促進剤の具体例としては、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムが挙げられる。
【００２８】
また、本発明のフラボノイド配糖体を液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤に含有して投与する場合には、さらに矯味矯臭剤、着色剤を含有してもよい。
【００２９】
本発明のフラボノイド配糖体は、食品、チューインガム、飲料等に添加して、いわゆる特定保健用食品（例えば、糖尿病・糖尿病合併症予防食品）等とすることもできる。
【００３０】
本発明のフラボノイド配糖体の製造原料である沙棘は現在までに薬、化粧品等に供されており、安全性は確立されている。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）沙棘葉部抽出物のタンパク質非酵素的糖化抑制作用の測定
沙棘葉部抽出物の調製
中国甘粛省より入手した沙棘葉部２ｋｇを粉砕後、超音波条件下、エタノール２３Ｌを用いて３０分間抽出を行った。グラスフィルターにより抽出液をろ過した後、ろ液を減圧濃縮してエタノール抽出物１４３ｇを得た。
【００３３】
このエタノール抽出物１４３ｇを、ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィーに付し、４０％メタノール、６０％メタノール、７０％メタノール、１００％メタノール、アセトンにて順次溶出し画分１〜７に分画した（図１）。
【００３４】
タンパク質非酵素的糖化抑制作用の検討
実施例１で得られた画分１〜７について、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（和光純薬社製０１３−０７４９２）の非酵素的糖化後期反応生成物（ＡＧＥｓ）形成に対する阻害率を測定し、沙棘葉部抽出物のタンパク質非酵素的糖化反応に対する阻害を検討した。
【００３５】
陽性コントロールとしてはクエルセチン（ＳＩＧＭＡ社製Ｑ１２５）を用いて実験を行った。
【００３６】
まず、ＢＳＡをリン酸緩衝液（ＳＩＧＭＡ社製Ｄ−１４０８）にて５０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し，これをＡ液とした。次にＤ（−）リボース（ＳＩＧＭＡ社製Ｒ７５００）をリン酸緩衝液にて０．５Ｍに調製し，これをＢ液とした。このＡ液とＢ液を等量ずつ混和した液（Ｃ液）を調製しておいた。次に９６穴プレートに１０ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭに調製した各サンプル１ｍＬを注入し，それぞれに上記Ｃ液１５０ｍＬを添加した。添加後、直ちに蛍光Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＥＺＳ−ＦＬ（旭テクノグラス社製）を用いて、各反応液の吸光度を励起波長３５５ｎｍ、測定波長４５０ｎｍにて測定し、測定値を０時間反応液の吸光度とした。
【００３７】
次に、この９６穴プレートをモイストチャンバー内にて３７℃で４日間インキュベートした。インキュベート後に生成された蛍光物質の吸光度を励起波長３５５ｎｍ、測定波長４５０ｎｍにて測定し、測定値をサンプルの反応液の吸光度とした。なお、各サンプルは、終濃度６６μＭ、６．６μＭ、０．６μＭとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。
【００３８】
各サンプルの測定値より、下記式を用いて各サンプルのＡＧＥｓ形成に対する阻害率を算出した。
阻害率（％）＝［１−（サンプルの反応液の吸光度−０時間反応液の吸光度）／（コントロール−ブランク）］×１００
式中、コントロールはサンプルを含まないＤＭＳＯのインキュベート後の吸光度であり、ブランクはサンプルを含まないＤＭＳＯの０時間反応時の吸光度である。
【００３９】
各サンプルの阻害率を図２に示す。画分１〜７のいずれも、ＡＧＥｓ形成に対する阻害を示したことから、沙棘葉部の抽出物がタンパク質非酵素的糖化抑制作用を有していることがわかった。
【００４０】
（実施例２）沙棘葉部抽出物のフリーラジカル消去活性の検討
実施例１で得られた画分１〜７について、安定ラジカルである１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌ  Ｈｙｄｒａｚｙｌ（ＤＰＰＨ）を用いて吸光度の変化を測定することにより、沙棘葉部抽出物のフリーラジカル消去活性を検討した。
【００４１】
画分１〜７をサンプルとして用い、ＤＰＰＨとして１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌ  Ｈｙｄｒａｚｙｌ（和光純薬社製０４７−０４０５１）を用いた。
【００４２】
まず、９６穴プレートに、１０ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭに調整した各サンプル１μＬ及びリン酸緩衝液（ＳＩＧＭＡ社製Ｄ−１４０８）１００μＬを注入し、３７℃で５分間インキュベートした後、各画分につき５０μＬのＤＰＰＨ５０μＭ溶液を添加した。反応液を攪拌した後、９６穴プレートを１０分間室温暗所に静置し、Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製Ｍｏｄｅｌ３５５０ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ）を用いて、各反応液の吸光度を５２０ｎｍの波長にて測定した。得られた吸光度より、下記式を用いて各画分のラジカル消去率を算出した。
【００４３】
消去率（％）＝［１−（サンプル−ブランク）／（コントロール−ブランク）］×１００
式中、サンプルは画分１〜７の吸光度、ブランクはＤＰＰＨの添加されていないサンプルとリン酸緩衝液の反応液の吸光度であり、コントロールは沙棘葉部抽出液を含まない溶液（ＤＭＳＯ）の吸光度である。
【００４４】
各サンプルの阻害率を図３に示す。画分１〜７のいずれもラジカル消去活性を示したことから、沙棘葉部の抽出物がフリーラジカル消去活性を有していることがわかった。
【００４５】
（実施例３）化合物Ｉ〜ＶＩＩＩの精製
以下のカラムを用いて、実施例１で得られた画分１〜７をさらに逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐＨＰＬＣ）に付した。
Ａ：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ  ２０Φ  ｘ  ２５０  ｍｍ
Ｂ：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＭＧ  ２０Φ  ｘ  ２５０  ｍｍ
Ｃ：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｐｈ  １０Φ  ｘ  ２５０  ｍｍ
Ｄ：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ  Ｒｐａｑｕｅｏｕｓ  １０Φ  ｘ  ２５０  ｍｍ
Ｅ：Ｋａｓｅｉｓｏｒｂ  ＬＣ  ＯＤＳ−Ｐｈ  １０Φ  ｘ  ２５０  ｍｍ
Ｆ：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＭＧ  １０Φ  ｘ  ２５０  ｍｍ
【００４６】
画分４（３．８ｇ）をｒｐＨＰＬＣ（カラムＢ、５０％メタノール）により画分８〜１１に分画し、画分８（５４８ｍｇ）をさらに、ｒｐＨＰＬＣ（カラムＣ、２２％アセトニトリル）により画分１２〜１６に分画した。画分１３（６２ｍｇ）をｒｐＨＰＬＣ（カラムＤ、２０％アセトニトリル）により精製し、化合物Ｉ（１９ｍｇ）を得た。画分１５（８７ｍｇ）をｒｐＨＰＬＣ（カラムＣ、２１％アセトニトリル）により精製し、化合物ＩＩ（５２ｍｇ）を得た。また、画分１６（５５ｍｇ）をｒｐＨＰＬＣ（カラムＥ、４４％メタノール）により精製し、化合物ＩＩＩ（１２ｍｇ）を得た。さらに、画分１７（８５ｍｇ）をｒｐＨＰＬＣ（カラムＥ、１９％アセトニトリル）により精製し、化合物ＩＶ（１２ｍｇ）を得た。画分９（８３８ｍｇ）をｒｐＨＰＬＣ（カラムＣ、２５％アセトニトリル）により精製し、化合物Ｖ（５９ｍｇ）を得た。画分１０（２４７ｍｇ）をｒｐＨＰＬＣ（カラムＦ、２９％アセトニトリル）及びｒｐＨＰＬＣ（カラムＥ、２３％アセトニトリル）により精製し、化合物ＶＩ（４６ｍｇ）及び化合物ＶＩＩ（２１ｍｇ）を得た。
【００４７】
画分５（２４．４ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、クロロホルム：メタノール＝１００：１、２０：１、９：１、クロロホルム：メタノール：水＝８：２：０．１、６：４：０．５、メタノールを用いて順次溶出し、画分１７〜２５に分画した。画分１８（６．１ｇ）をｒｐＨＰＬＣ（カラムＡ、９５％メタノール）により精製し、化合物ＶＩＩＩ（９３７ｍｇ）を得た（以上、図１参照）。
【００４８】
以上の精製により得られた化合物のうち、化合物ＩＩ〜ＩＶは、新規なフラボノイド配糖体であり、化合物Ｉ、Ｖ〜ＶＩＩは、既知のフラボノイド配糖体であった。また、フラボノイド配糖体の他、トリテルペンであるウルソール酸（ＶＩＩＩ）も得られた。以下に化合物Ｉ〜ＶＩＩＩの構造式を示す。
【００４９】
式ＩＩ又はＩＶ（新規化合物）：
【化４】
2004217545.tif 000004
【００５０】
式ＩＩＩ（新規化合物）：
【化５】
2004217545.tif 000005
【００５１】
式Ｉ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩ（既知の化合物）：
【化６】
2004217545.tif 000006
【００５２】
また、化合物ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのそれぞれの物性値は以下の通りであった。
化合物ＩＩ
非晶質粉末
ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＨＲ−ＦＡＢＭＳ  ｍ／ｚ；  ９６１．２６１３［Ｍ−Ｈ］−  （９６１．２６１２  Ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ４４Ｈ４９Ｏ２４）
［α］Ｄ    ６５．０°（ｃ＝１．０，  ＭｅＯＨ）
ＵＶ  λｍａｘ  （ＭｅＯＨ）  ２４５ｎｍ  （ε  １５７００），  ２６８ｎｍ  （ε  １２７００），  ３３２ｎｍ  （ε  １７９００）
１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  δ  ｉｎ  Ｐｙ−ｄ５）；  １．６３  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．１  Ｈｚ，  Ｈ−６’’’’’），  ３．７８  （６Ｈ，  ｓ，  −ＯＣＨ３  ｘ  ２），  ４．９７−５．０６  （２Ｈ，  ｍ，  Ｈ−６’’’），  ５．６４  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  Ｈ−１’’’），  ６．２３  （１Ｈ，  ｂｒ  ｓ，  Ｈ−１’’’’’），  ６．４８  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  １５．５  Ｈｚ，  Ｈ−８’’’’），  ６．５６  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  Ｈ−１’’），  ６．６９  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  Ｈ−６），  ６．８２  （３Ｈ，  ｍ，  Ｈ−８，  ２’’’’，  ６’’’’），  ７．３６  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  Ｈ−３’，  ５’），  ７．７９  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  １５．５  Ｈｚ，  Ｈ−７’’’’），  ８．４８  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  Ｈ−２’，  ６’），  １３．３  （１Ｈ，  ｂｒ  ｓ，  ５−ＯＨ）
１３Ｃ−ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  δ  ｉｎ  Ｐｙ−ｄ５）；  １８．７  （Ｃ−６’’’’’），  ５６．３  （−ＯＣＨ３  ｘ  ２），  ６２．３  （Ｃ−６’’），  ６４．３  （Ｃ−６’’’），  ７１．２  （Ｃ−４’’，  ４’’’），  ７１．４  （Ｃ−５’’’’’），  ７１．６  （Ｃ−２’’’’’），  ７２．４  （Ｃ−３’’’’’），  ７３．６  （Ｃ−４’’’’），  ７５．８  （Ｃ−５’’’），  ７６．２  （Ｃ−２’’’），  ７８．２  （Ｃ−３’’’），  ７８．３  （Ｃ−３’’），  ７８．９  （Ｃ−５’’），  ８４．１  （Ｃ−２’’），  ９４．５  （Ｃ−８），  １００．０  （Ｃ−１’’），  １００．１  （Ｃ−１’’’’’），  １００．３  （Ｃ−６），  １０６．１  （Ｃ−１’’’），  １０６．４  （Ｃ−１０），  １０６．６  （Ｃ−６’’’’），  １１５．３  （Ｃ−８’’’’），  １１６．３  （Ｃ−２’，  ５’），  １２２．０  （Ｃ−１’），  １２５．１  （Ｃ−１’’’’），  １３２．１  （Ｃ−２’，  ６’），  １３４．８  （Ｃ−３），  １４０．４  （Ｃ−４’’’’），  １４５．９  （Ｃ−７’’’’），  １４９．９  （Ｃ−２’’’’，  ５’’’’），  １５６．７  （Ｃ−９），  １５７．０  （Ｃ−２），  １６１．８  （Ｃ−４’），  １６２．４  （Ｃ−５），  １６２．６  （Ｃ−７），  １６７．５  （Ｃ−９’’’’），  １７８．９  （Ｃ−４）
【００５３】
化合物ＩＩＩ
非晶質粉末
ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＨＲ−ＦＡＢＭＳ  ｍ／ｚ；  ９３１．２５０５［Ｍ−Ｈ］−  （９６１．２５０７  Ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ４３Ｈ４７Ｏ２３）
［α］Ｄ    ８７．９°（ｃ＝１．０，  ＭｅＯＨ）
ＵＶ  λｍａｘ  （ＭｅＯＨ）  ２４６ｎｍ  （ε  １６９００），  ２６８ｎｍ  （ε  １８１００），  ３２７ｎｍ  （ε  ２１９００）
１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  δ  ｉｎ  Ｐｙ−ｄ５）；  １．６３  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．１  Ｈｚ，  Ｈ−６’’’’’），  ３．７４  （３Ｈ，  ｓ，  −ＯＣＨ３），  ５．００  （２Ｈ，  ｍ，  Ｈ−６’’’），  ５．６４  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，  Ｈ−１’’’），  ６．２１  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  １．２  Ｈｚ，  Ｈ−１’’’’’），  ６．４６  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  １５．５  Ｈｚ，  Ｈ−８’’’’），  ６．５６  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，  Ｈ−１’’），  ６．６９  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  Ｈ−６），  ６．８４  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  Ｈ−８），  ７．００−７．１２  （３Ｈ，  ｍ，  Ｈ−２’’’’，  ５’’’’，  ６’’’’），  ７．３７  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．８  Ｈｚ，  Ｈ−３’，  ５’），  ７．７９  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  １５．５  Ｈｚ，  Ｈ−７’’’’），  ８．４９  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．９  Ｈｚ，  Ｈ−２’，  ６’），  １３．３  （１Ｈ，  ｂｒ  ｓ，  ５−ＯＨ）
１３Ｃ−ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  δ  ｉｎ  Ｐｙ−ｄ５）；  １８．７  （Ｃ−６’’’’’），  ５５．８  （−ＯＣＨ３），  ６２．３  （Ｃ−６’’），  ６４．３  （Ｃ−６’’’），  ７１．２  （Ｃ−４’’，  ４’’’），  ７１．４  （Ｃ−５’’’’’），  ７１．６  （Ｃ−２’’’’’），  ７２．４  （Ｃ−３’’’’’），  ７３．６  （Ｃ−４’’’’’），  ７５．８  （Ｃ−５’’’），  ７６．２  （Ｃ−２’’’），  ７８．２  （Ｃ−３’’’），  ７８．３  （Ｃ−３’’），  ７８．９  （Ｃ−５’’），  ８４．１  （Ｃ−２’’），  ９４．６  （Ｃ−８），  １００．０  （Ｃ−１’’，  １’’’’’），  １００．３  （Ｃ−５，  ６），  １０６．２  （Ｃ−１’’’），  １０６．９  （Ｃ−１０），  １１１．２  （Ｃ−２’’’’），  １１５．０  （Ｃ−８’’’’），  １１６．４  （Ｃ−３’，  ５’），  １１６．６  （Ｃ−５’’’’），  １２２．０  （Ｃ−１’），  １２３．７  （Ｃ−６’’’’），  １２６．４  （Ｃ−１’’’’），  １３２．１  （Ｃ−２’，  ６’），  １３４．８  （Ｃ−３），  １４５．５  （Ｃ−７’’’’），  １４８．８  （Ｃ−３’’’’），  １５０．９  （Ｃ−４’’’’），  １５６．８  （Ｃ−９），  １５７．０  （Ｃ−２），  （Ｃ−５），  １６１．８  （Ｃ−４’），  １６２．６  （Ｃ−７），  １６７．６  （Ｃ−９’’’’），  １７８．９  （Ｃ−４）
【００５４】
化合物ＩＶ
非晶質粉末
ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＨＲ−ＦＡＢＭＳ  ｍ／ｚ；  ９７７．２５７０［Ｍ−Ｈ］−  （９６１．２５６１  Ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ４４Ｈ４９Ｏ２５）
［α］Ｄ    １０９．６°（ｃ＝０．５，  Ｈ２Ｏ）
ＵＶ  λｍａｘ  （ＭｅＯＨ）  ２０４ｎｍ  （ε  ５２７００），  ２６２ｎｍ  （ε  ２５２００），  ３４３ｎｍ  （ε  １９２００）
１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  δ  ｉｎ  Ｐｙ−ｄ５）；  １．６３  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．１  Ｈｚ，  Ｈ−６’’’’’），  ３．７８  （３Ｈ，  ｓ，  −ＯＣＨ３），  ５．００−５．１３  （２Ｈ，  ｍ，  Ｈ−６’’’），  ５．６６  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  Ｈ−１’’’），  ６．１９  （１Ｈ，  ｂｒ  ｓ，  Ｈ−１’’’’’），  ６．４８  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  １５．９  Ｈｚ，  Ｈ−８’’’’），  ６．６３（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  Ｈ−１’’），  ６．６７  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  Ｈ−６），  ６．６５  （１Ｈ，  ｄ，Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  Ｈ−８），  ６．８４  （２Ｈ，  ｓ，  Ｈ−２’’’’，  ６’’’’），  ７．４４  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  Ｈ−５’），  ７．７７  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  １５．９  Ｈｚ，  Ｈ−７’’’’），  ８．２４  （２Ｈ，  ｍ，  Ｈ−２’，  ６’），  １３．３  （１Ｈ，  ｂｒ  ｓ，  ５−ＯＨ）
１３Ｃ−ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  δ  ｉｎ  Ｐｙ−ｄ５）；  １８．７  （Ｃ−６’’’’’），  ５６．３  （−ＯＣＨ３  ｘ  ２），  ６２．３  （Ｃ−６’’），  ６４．３  （Ｃ−６’’’），  ７１．２  （Ｃ−４’’，  ４’’’），  ７１．４  （Ｃ−５’’’’’），  ７１．６  （Ｃ−２’’’’’），  ７２．４  （Ｃ−３’’’’’），  ７３．７  （Ｃ−４’’’’’），  ７５．８  （Ｃ−５’’’），  ７６．３  （Ｃ−２’’’），  ７８．２  （Ｃ−３’’），  ７８．３  （Ｃ−３’’’），  ７８．８  （Ｃ−５’’），  ８４．７  （Ｃ−２’’），  ９４．３  （Ｃ−８），  ９９．９  （Ｃ−１’’），  １００．０  （Ｃ−１’’’’’），  １００．２  （Ｃ−６），  １０６．３  （Ｃ−１’’’），  １０６．６  （Ｃ−２’’’’，  ６’’’’），  １０６．９  （Ｃ−１０），  １１５．３  （Ｃ−８’’’’），  １１６．５  （Ｃ−５’），  １１７．５  （Ｃ−２’），  １２３．０（Ｃ−１’），  １２５．２  （Ｃ−１’’’’），  １３５．０  （Ｃ−３），  １３５．５  （Ｃ−６’），  １４０．４  （Ｃ−４’’’’），  １４５．８  （Ｃ−７’’’’），  １４７．０  （Ｃ−３’），  １４９．１  （Ｃ−３’’’’，  ５’’’’），  １５６．７  （Ｃ−９），  １５７．０  （Ｃ−２），  １５０．６  （Ｃ−４’），  １６２．３  （Ｃ−５），  １６２．５  （Ｃ−７），  １６７．５  （Ｃ−９’’’’），  １７８．９  （Ｃ−４）
【００５５】
（実施例４）化合物Ｉ〜ＶＩＩのタンパク質非酵素的糖化抑制作用の検討
化合物Ｉ〜ＶＩＩについて、実施例１と同様の方法により、ＡＧＥｓ形成に対する阻害率を測定し、化合物Ｉ〜ＶＩＩのタンパク質非酵素的糖化反応に対する阻害を検討した。
【００５６】
陽性コントロールとしてはクエルセチン（ＳＩＧＭＡ社製Ｑ１２５）及びケンフェロール（東京化成社）を用いて実験を行い、実施例１で用いた式により各サンプルのＡＧＥｓ形成に対する阻害率を算出した。
【００５７】
各サンプルの阻害率を図４に示す。化合物Ｉ〜ＶＩＩのいずれも、ＡＧＥｓ形成に対する阻害を示した。新規化合物である化合物ＩＩは、特に高い非酵素的糖化抑制作用を示しており、化合物ＩＩＩ及びＩＶは、化合物ＩＩＩよりもやや低いものの、約３０〜４０％の阻害率を示している。
【００５８】
この結果より、新規化合物ＩＩ〜ＩＶを含む化合物Ｉ〜ＶＩＩがタンパク質非酵素的糖化抑制作用を有していることがわかった。
【００５９】
（実施例５）  アルドース還元酵素阻害活性の検討
化合物ＩＩ及びＩＩＩについて、アルドース還元酵素阻害活性を検討した。アルドース還元酵素として組換え体ヒト筋肉由来アルドースレダクターゼ（和光純薬社製、試薬生化学用５４７−００５８１）を用いて、１ｍＭのＤＬ−グリセルアルデヒド（ＳＩＧＭＡ社製Ｇ５００１）と、０．１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有した０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）との反応液（全量２００μＬ）中で、β−ＮＡＤＰＨ（ＳＩＧＭＡ社製Ｎ１６３０）から生成されるＮＡＤＰの吸光度を測定し、化合物ＩＩ及びＩＩＩのアルドース還元酵素に対する阻害を検討した。
【００６０】
陽性コントロールとしてはクエルセチン（ＳＩＧＭＡ社製、Ｑ１２５）及びケンフェロール（東京化成社）を用いて実験を行った。
【００６１】
まず、９６穴プレートを用いて、１０ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭに調整した各サンプル１μＬ及び３％組換え体ヒト筋肉由来アルドースレダクターゼ溶液（サンプル溶解溶液：ＤＭＳＯ）２０μＬを注入し、各反応液を３７℃で５分間インキュベートした後、それぞれに１ｍＭのＤＬ−グリセルアルデヒド・ＮＡＤＰＨ溶液３０μＬを添加した。各反応液を再び３７℃で２０分間インキュベートした後、０．５Ｍ  ＨＣｌを３０μＬ添加して酵素反応を停止させた。反応停止後の各反応液に、５００ｍＬの６ＭＮａＯＨ中に３４０ｍｇ（１０ｍＭ相当）のイミダゾールを含む溶液を０．１ｍＬ添加し、６０℃で１０分間インキュベートした後、各反応液の吸光度を励起波長３６０ｎｍ、測定波長４５０ｎｍにて測定し、生成されたＮＡＤＰ量を決定した。測定には、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。なお、各サンプルは、終濃度６６μＭ、６．６μＭ、０．６μＭとなるようにＤＭＳＯに溶解した。
【００６２】
各サンプルの測定値より、下記式を用いて各サンプルのアルドース還元酵素阻害率を算出した。
阻害率（％）＝［１−（サンプルの反応液の吸光度−ブランク）／（コントロール−ブランク）］×１００
式中、コントロールはサンプルを含まないＤＭＳＯのインキュベート後の吸光度であり、ブランクは酵素をあらかじめ反応停止させてインキュベートしたサンプルを含むＤＭＳＯの吸光度である。
【００６３】
各サンプルの阻害率を図５に示す。化合物ＩＩ及びＩＩＩはいずれも高いアルドース還元酵素阻害を示している。
【００６４】
この結果より、新規化合物ＩＩ及びＩＩＩがアルドース還元酵素阻害活性を有していることがわかった。なお、化合物ＩＩ又はＩＩＩと類似の構造を有する化合物ＩＶもアルドース還元酵素阻害活性を有すると考えられる。
【００６５】
（実施例６）化合物Ｉ〜ＶＩＩのラジカル消去活性の検討
化合物Ｉ〜ＶＩＩについて、実施例２と同様の方法により、フリーラジカル消去活性を検討した。
【００６６】
陽性コントロールとしてはクエルセチン（ＳＩＧＭＡ社製Ｑ１２５）及びケンフェロール（東京化成社）を用いて実験を行い、実施例２で用いた式により各サンプルのラジカル消去率を算出した。
【００６７】
各サンプルの消去率を図６に示す。新規化合物ＩＩ〜ＩＶを含む化合物Ｉ〜ＶＩＩのいずれも、ラジカル消去率を示した。この結果より、化合物Ｉ〜ＶＩＩがラジカル消去活性を有していることがわかった。新規化合物ＩＩ及びＩＩＩはいずれも高いフリーラジカル消去活性を示しており、化合物ＩＶはそれよりやや低いものの、４０％を超える消去率を示している。
【００６８】
この結果より、新規化合物ＩＩ〜ＩＶを含む化合物Ｉ〜ＶＩＩがフリーラジカル消去活性を有していることがわかった。
【００６９】
【発明の効果】
本発明のフラボノイド配糖体は、タンパク質非酵素的糖化抑制作用を促進し、またアルドース還元酵素を阻害するため、糖尿病又は糖尿病合併症の予防・治療に有効である。
【００７０】
本発明のフラボノイド配糖体はまた、フリーラジカル消去活性を有しているため、老化や癌、動脈硬化、脳梗塞等の疾病の予防・治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、沙棘抽出物の画分を示す。
【図２】図２は、ＡＧＥｓ形成に対する画分１〜７の阻害率を示す。
【図３】図３は、画分１〜７のＤＰＰＨラジカル消去率を示す。
【図４】図４は、ＡＧＥｓ形成に対する化合物Ｉ〜ＶＩＩの阻害率を示す。
【図５】図５は、化合物ＩＩ及びＩＩＩ、クエルセチン、ケンフェロールのアルドース還元酵素の阻害率を示す。
【図６】図６は、化合物Ｉ〜ＶＩＩのＤＰＰＨラジカル消去率を示す。
【図１】
2004217545.tif 000009
【図２】
2004217545.tif 000010
【図３】
2004217545.tif 000011
【図４】
2004217545.tif 000012
【図５】
2004217545.tif 000013
【図６】
2004217545.tif 000014