(57)【要約】【課題】ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法の、分離能が低い、最適な温度条件の探索に手間がかかる、という問題点を解決する。【解決手段】多型位置を含む検査領域２０の配列として想定される配列７をアンカー配列として付加したプライマー１０を用いてＰＣＲ反応を行い、配列７の相補配列７’と検査領域２０および２１のハイブリダイゼーションの融解温度の中間の温度でＰＣＲ産物の電気泳動分析を行う。【効果】多型によって異なる融解温度の中間の温度で電気泳動を行うと、ヘアピン状態の有無という大きな立体構造の変化が生じて泳動速度の差が大きくなるため、ＳＳＣＰ分析の分離能を大きく改善でき、多型のタイピングやＬＯＨを用いたがん診断の高精度化などに大きな効果がある。また、融解温度を予測してアンカー配列を設計できるため、温度条件の探索など分離の最適化作業を減らせるだけでなく、自動キャピラリー電気泳動装置に適した温度領域に設計することで、ルーチン検査にも好適となる。【選択図】  図１
2004187545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＤＮＡの一方の鎖における検査領域より３’末端側の配列にハイブリダイズする第１の配列部分と、前記検査領域の配列として想定される配列と同一の配列を持ち、かつ前記第１の配列部分の５’末端側に続く第２の配列部分とを有する第１のプライマーと、前記ＤＮＡの他方の鎖における検査領域より３’末端側の配列にハイブリダイズする第２のプライマーとを使用して、前記ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応により前記検査領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程と、
増幅された前記ＤＮＡ断片を一本鎖化した後に電気泳動分離する工程と
を含むことを特徴とする、核酸配列の検査方法。
【請求項２】
一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの一方の鎖における第１の所定の塩基数からなる検査領域の３’末端から５’→３’方向に第２の所定の塩基数だけ離れた第３の所定の塩基数の配列にハイブリダイズする第１の配列部分と、前記第１の所定の塩基数からなり、前記検査領域の配列として想定される配列と同一の配列を持ち、かつ前記第１の配列部分の５’末端側に続く第２の配列部分とを有する第１のプライマーと、前記検査領域の配列の５’末端から３’→５’方向に第４の所定の塩基数だけ離れた第５の所定の塩基数の配列に相補な配列にハイブリダイズする配列を有し、５’末端が標識された第２のプライマーとを使用して、前記ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応により前記検査領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程と、
増幅された前記ＤＮＡ断片を一本鎖化した後に電気泳動分離する工程と
を含むことを特徴とする、核酸配列の検査方法。
【請求項３】
得られた一本鎖ＤＮＡ断片の３’末端側に形成された、前記第２の配列部分の配列に相補な第３の配列部分の配列と、前記検査領域の配列との自己ハイブリダイゼーションの有無を指標として前記検査領域の配列を同定する工程を更に含む、請求項１または２に記載の核酸配列の検査方法。
【請求項４】
二本鎖ＤＮＡの一方の鎖における検査領域より３’末端側の配列にハイブリダイズする第１の配列部分と、前記検査領域の配列として想定される配列と同一の配列を持ち、かつ前記第１の配列部分の５’末端側に続く第２の配列部分とを有する第１のプライマーと、前記ＤＮＡの他方の鎖における検査領域より３’末端側の配列にハイブリダイズする第２のプライマーとを使用して、前記ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応により前記検査領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程と、
増幅された前記ＤＮＡ断片の自己ハイブリダイゼーションの有無により、前記検査領域の配列を同定する工程と
を含むことを特徴とする、核酸配列の検査方法。
【請求項５】
二本鎖ＤＮＡの一方の鎖における検査領域より３’末端側の配列にハイブリダイズする第１の配列部分と、前記検査領域の配列を検出するための配列を持ち、かつ前記第１の配列部分の５’末端側に続く第２の配列部分とを有する第１のプライマーと、前記ＤＮＡの他方の鎖における検査領域より３’末端側の配列にハイブリダイズする第２のプライマーとを使用して、前記ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応により前記検査領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程と、
増幅された前記ＤＮＡ断片を一本鎖化した後に電気泳動分離する工程と
を含むことを特徴とする、核酸配列の検査方法。
【請求項６】
検査領域が１塩基多型の塩基位置を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸配列の検査方法。
【請求項７】
検査領域の配列が異なる複数のＤＮＡの存在比を、前記複数のＤＮＡから増幅された複数のＤＮＡ断片の泳動ピークの強度比から求めることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸配列の検査方法。
【請求項８】
二本鎖ＤＮＡの一方の鎖における検査領域より３’末端側の配列にハイブリダイズする第１の配列部分と、前記検査領域の配列として想定される配列と同一の配列を持ち、かつ前記第１の配列部分の５’末端側に続く第２の配列部分とを有する第１のプライマーと、前記ＤＮＡの他方の鎖における検査領域より３’末端側の配列にハイブリダイズする第２のプライマーとを使用して、前記ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応により前記検査領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程を含むことを特徴とする、試料調製方法。
【請求項９】
一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの一方の鎖における第１の所定の塩基数からなる検査領域の３’末端から５’→３’方向に第２の所定の塩基数だけ離れた第３の所定の塩基数の配列にハイブリダイズする第１の配列部分と、前記第１の所定の塩基数からなり、前記検査領域の配列として想定される配列と同一の配列を持ち、かつ前記第１の配列部分の５’末端側に続く第２の配列部分とを有する第１のプライマーと、前記検査領域の配列の５’末端から３’→５’方向に第４の所定の塩基数だけ離れた第５の所定の塩基数の配列に相補な配列にハイブリダイズする配列を有する第２のプライマーとを使用して、前記ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応により前記検査領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程を含むことを特徴とする、試料調製方法。
【請求項１０】
二本鎖ＤＮＡの一方の鎖における検査領域より３’末端側の配列にハイブリダイズする第１の配列部分と、前記検査領域の配列として想定される配列と同一の配列を持ち、かつ前記第１の配列部分の５’末端側に続く第２の配列部分とを有する第１のプライマー、及び
前記ＤＮＡの他方の鎖における検査領域より３’末端側の配列にハイブリダイズする第２のプライマー
を含むことを特徴とする、核酸配列の検査のためのキット。
【請求項１１】
一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの一方の鎖における第１の所定の塩基数からなる検査領域の３’末端から５’→３’方向に第２の所定の塩基数だけ離れた第３の所定の塩基数の配列にハイブリダイズする第１の配列部分と、前記第１の所定の塩基数からなり、前記検査領域の配列として想定される配列と同一の配列を持ち、かつ前記第１の配列部分の５’末端側に続く第２の配列部分とを有する第１のプライマー、
前記検査領域の配列の５’末端から３’→５’方向に第４の所定の塩基数だけ離れた第５の所定の塩基数の配列に相補な配列にハイブリダイズする配列を有し、５’末端が標識された第２のプライマー
を含むことを特徴とする、核酸配列の検査のためのキット。
【請求項１２】
増幅されたＤＮＡ断片の３’末端側に形成された、前記第２の配列部分の配列に相補な第３の配列部分の配列と前記検査領域の配列との自己ハイブリダイゼーションの有無を電気泳動で分析するための温度条件のデータを更に含むことを特徴とする、請求項１０または１１に記載のキット。
【請求項１３】
検査領域に含まれる多型または変異を電気泳動で分析するための、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
検査領域における１塩基多型を解析するためのものである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
検査領域の配列が異なる複数のＤＮＡの存在比を解析するためのものである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子における１塩基多型等の多型及び変異の分離検出方法に関する。さらに言えば、ゲル電気泳動法を用いるＤＮＡの一本鎖高次構造多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：  ＳＳＣＰ）解析法の分離能改良法およびその解析法を用いた遺伝子診断法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒトゲノムの解析が急速に進み、ヒトのゲノムには、ほぼ１０００塩基毎に１つの頻度で一塩基レベルの個人差（多型）があることがわかってきた。これをＳｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  （ＳＮＰ）と呼ぶ。この多型は、ゲノム上に高密度に存在するため、ゲノム上での位置を示す詳細な目印となる。例えば、ある病気の疾患集団と正常集団との間で、このゲノム上にマッピングされたＳＮＰの出現頻度の差異を解析することにより、ゲノム上のどの位置にその疾患に関連した遺伝子が配置しているかをつきとめられる。ゲノム上の遺伝子の位置関係が詳細にわかれば、遺伝子間の相互作用などの新しい機能情報の取得につながり、新しい創薬・診断・治療につながる知見が得られるものと期待されている。
【０００３】
また、一塩基レベルの遺伝子多型が検出できるということは、遺伝子配列中の突然変異の検出が可能であることを意味する。発がんや転移のメカニズムに関しては、遺伝子変異の関与が示唆されているため、一塩基の多型や変異の分析技術は、がんを始めとする多くの疾病の診断の基礎技術になると期待される。
【０００４】
このような、一塩基レベルの多型を分析する方法の１つに一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔａｒｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＳＣＰ）法がある。この方法は、Ｍ．Ｏｒｉｔａらによって報告されている（例えば非特許文献１参照）。これは、一本鎖ＤＮＡを非変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した時の泳動速度が、同じ長さのＤＮＡであっても、一塩基の配列の違いによって異なることを利用して、一塩基の多型を分離検出する方法である。一塩基の違いによって一本鎖ＤＮＡがもつ高次構造（立体構造）が異なり、その高次構造の違いが泳動速度の違いを引き起こしていると考えられている。近年では、生体試料から抽出したＤＮＡの標的部分をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ    Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって選択的に増幅して分析するＰＣＲ−ＳＳＣＰ法が広く行われている。
【０００５】
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を利用したがんの診断法の一例として、ヘテロ接合性欠損（Ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ，  ＬＯＨ）という現象に基づくものがある。細胞から抽出したゲノムＤＮＡには、通常は父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子が同数含まれている（ヘテロ接合性）。ところが、がん化した細胞では、特定遺伝子座について欠落や異常な複製が起こっているため、この平衡が失われているという現象  （ＬＯＨ）  がよく見られる。Ｍ．  Ｓｈｉｇｙｏらの報告（例えば非特許文献２参照）によれば、尿中の細胞のＬＯＨと膀胱の悪性腫瘍に高い相関があることが報告されている。
このＬＯＨを測定する際に、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子を区別するマーカーとして一塩基多型を用い、ＳＳＣＰ法によってこの一塩基多型を分離検出する。父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子の存在量の不均衡は、電気泳動によって分離されたこの一塩基多型のピーク強度の比によって定量化される。
【０００６】
一方、従来、ＳＳＣＰ法には平板ゲル電気泳動またはキャピラリーゲル電気泳動が利用されてきた。平板ゲル（スラブゲル）電気泳動装置には、例えば、アマシャム・ファルマシアバイオテク社の製品ＧｅｎｅＰｈｏｒなどがある。平板ゲル電気泳動装置は、装置構成が簡単で価格も安いが、ゲルの作製、泳動槽への設置、試料の導入、ゲルの泳動槽からの取りだし、ゲルの写真撮影等、手作業の工程が多い。そこで、例えば特許文献１に記載のように、自動化に適し、かつ、内径が１００ミクロン以下と細いために電気泳動に伴うジュール熱の放熱が早いキャピラリーゲルを用い、高電圧で高速分析を行うＳＳＣＰ法が提案されている。キャピラリー電気泳動装置には、アプライドバイオシステムズ社の製品ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０のように、分離媒体として流動性ポリマーを用い、測定終了毎にポリマーを自動交換する機能を有していて、多数のサンプルを全自動で連続測定できる装置が、近年急速に普及している。
【０００７】
【特許文献１】
特開平６−１３８０９０号公報
【非特許文献１】
オリタ（Ｍ．Ｏｒｉｔａ）ら、「プロシーディング  オブ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｕ．Ｓ．Ａ．）」  （米国）  １９８９年、第８６巻  ｐ．２７６６−ｐ．２７７０
【非特許文献２】
シギョウ（Ｍ．  Ｓｈｉｇｙｏ）、「インターナショナル  ジャーナル  オブ  キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）」、（米国）  １９９８年、７８巻  ｐ．４２５−ｐ．４２９
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、ＳＳＣＰ法は一塩基多型を測定するのに簡便で有効な方法であり、さらに、キャピラリー電気泳動装置を用いれば、迅速な自動分析も可能である。しかし、ＳＳＣＰ法はその原理からも示唆されるように、一本鎖ＤＮＡに一塩基多型が存在しても、その高次構造の違いがもたらす泳動速度の違いが、ゲル電気泳動の分離能に比べて小さい場合には分離できない。また、高次構造およびその構造と泳動速度との関係を理論的に予測することは困難であるため、検査の対象となる一塩基多型の１つ１つについて、電気泳動条件を少しずつ変えて測定を繰り返すことによって、分離が得られる条件を探索しなければならなかった。
特にＬＯＨによる遺伝子診断のような場合には、ピーク強度比を正確に求める必要があるため、一塩基多型の２つのピークが重ならないように十分高い分離能を得ることが必要であり、条件検討に大変な手間を要していた。
【０００９】
前出の平板ゲル電気泳動装置ＧｅｎｅＰｈｏｒでは、ＳＳＣＰ法による一塩基多型の分離能は、温度が低くゲル濃度が高い方が良くなる場合が多いことを利用して、１５％濃度で架橋度３％程度の架橋ポリアクリルアミドゲルを用い、温度を５−２０℃程度の範囲に設定し、最適な測定条件を探索するための作業を支援する配慮がなされている。しかし、前出のＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０のような全自動キャピラリー電気泳動装置では、測定が終了する毎にキャピラリーに分離媒体（架橋していないポリアクリルアミドなどからなるポリマー溶液）を詰替えるため、架橋ゲルは使用できない。また、架橋していない場合でも高濃度のポリマー溶液は粘性が高いため、詰替えの際の圧力損失が大きく、詰替えに要する時間も長くなるという不都合を招く。
【００１０】
また、１５℃程度以下の低温では、結露による高電圧のリークや感電を防止するために、装置全体を密閉して内部の湿度を下げるなどの対策が必要になる。前出の平板ゲル電気泳動装置では、泳動とゲルの画像測定は別の装置によって行われ、かつ電気泳動装置は小型であるのであまり問題ではない。しかし、全自動キャピラリー電気泳動装置では、電気泳動とＤＮＡの検出とを同時に行うため、装置が比較的大型である。このため、結露対策が大掛かりにならざるを得なかった。
【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、ＳＳＣＰ法による一塩基多型の分析条件の最適化にかかる手間を軽減することを目的とする。さらに言えば、ルーチン分析や診断用途に適した全自動キャピラリー電気泳動装置において、低温や高濃度のポリマーを用いなくても高い分離が得られるようにＳＳＣＰ法を改良することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記の問題点を解決するために種々検討した結果、一塩基多型の有無によって一本鎖ＤＮＡの高次構造を大きく変化させるような塩基配列をＰＣＲ反応の際に導入し、それによってＳＳＣＰ法の条件検討に要する手間及び分離能を顕著に改善することが可能となった。
【００１３】
すなわち本発明は、検査領域中に存在する一塩基多型等の塩基配列の差異によってＰＣＲ反応で増幅されるＤＮＡ断片の高次構造が変化するように設計したプライマーを用い、検査領域を含むＤＮＡ断片を増幅する工程を含む、核酸配列の検査方法、試料調製方法、及び上記プライマーを含む核酸配列の検査のためのキットを提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の試料調製方法及び検査方法の概要を以下に述べる。
【００１５】
鋳型となるＤＮＡは、例えば、被験者の血液や組織細胞等から抽出したゲノムＤＮＡや、ｍＲＮＡからの逆転写によって得られるｃＤＮＡ等であり、一本鎖ＤＮＡであっても二本鎖ＤＮＡであっても良い。本発明において、このＤＮＡ上にある検査対象となる検査領域は、一塩基多型等の多型部位とそれに隣接する部分からなり、この検査領域の配列を含む領域をＰＣＲ反応で増幅する。ゲノム解析の進展の結果、一塩基多型等の変異に関しては既に情報が蓄積されつつあり、検査領域及びその近辺の配列は予め判明していることが多く、本発明は検査領域の配列が予め想定されていることが前提となる。この際、一方のプライマー（第１のプライマー）には、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの一方の鎖における検査領域より３’末端側の配列にハイブリダイズする配列（第１の配列部分）の他に、この第１の配列部分の５’末端側に続いて、アンカー配列（プライマーの５’末端側に付加してあり、一般的には鋳型ＤＮＡの配列とは相補でない配列）を設け、そのアンカー配列を、前記検査領域の配列として想定される配列と同一の配列にする（第２の配列部分）。他方のプライマー（第２のプライマー）は、上記のプライマーが鋳型とするＤＮＡ鎖の相補鎖（二本鎖ＤＮＡにおける他方の鎖）を鋳型とするが、この相補鎖における検査領域より３’末端側の配列にハイブリダイズする配列を有するように設計し、５’末端を蛍光色素等の標識体で標識する。
【００１６】
別の観点において、第１のプライマーは、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの一方の鎖における第１の所定の塩基数からなる検査領域の３’末端から５’→３’方向に第２の所定の塩基数だけ離れた第３の所定の塩基数の配列にハイブリダイズする第１の配列部分と、前記第１の所定の塩基数からなり、前記検査領域の配列として想定される配列と同一の配列を持ち、かつ前記第１の配列部分の５’末端側に続く第２の配列部分とを有する。第１の所定の塩基数としては、自己ハイブリダイゼーションを生じる配列であることから、特に限定するものではないが、好ましくは７〜１５塩基である。第３の所定の塩基数としては、通常プライマーの配列として用いる範囲であれば良く、特に限定するものではないが、好ましくは１７〜３０塩基である。第２の所定の塩基数としては、自己ハイブリダイゼーションを妨げず、ＰＣＲが好適に行える範囲であれば良く、特に限定するものではないが、好ましくは３０〜１００塩基である。
【００１７】
上記の観点において、第２のプライマーは、前記検査領域の配列の５’末端から３’→５’方向に第４の所定の塩基数だけ離れた第５の所定の塩基数の配列に相補な配列にハイブリダイズする配列を有し、５’末端が標識されている。第４の所定の塩基数としては、ＰＣＲが好適に行える範囲であれば良く、特に限定するものではないが、好ましくは３０〜１００塩基である。第５の所定の塩基数としては、上記の第３の所定の塩基数と同様、通常プライマーの配列として用いる範囲であれば良く、特に限定するものではないが、好ましくは１７〜３０塩基である。尚、第１のプライマーと第２のプライマーは、当分野において通常行われているように、ＰＣＲ反応の進行条件を考慮して、Ｔｍ値がほぼ等しい値になるように設計する。
【００１８】
これらのプライマーを用い、上記ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応を行うことにより、上記検査領域を含むＤＮＡ断片を増幅することができ、目的の核酸配列の検査方法に必要な試料（増幅されたＤＮＡ断片）が調製される。
【００１９】
増幅されたＤＮＡ断片は二本鎖の状態であり、これを一本鎖ＤＮＡ断片に変性することによって、各ＤＮＡ断片は、その塩基配列に応じて自己ハイブリダイゼーション等を生じ、エネルギー的に安定な高次構造をとるようになる。この場合に、増幅されたＤＮＡ断片は検査領域を含む鋳型ＤＮＡの配列に加えて上記第１のプライマーのアンカー配列に対応する配列をも含んでいる。
【００２０】
従って、一方の鎖の検査領域の配列を含むＤＮＡ断片は、その３’末端側に、検査領域の配列として想定される配列と同一の配列であるアンカー配列に相補の配列（第３の配列部分）が付加されており、検査領域の配列が想定された配列そのものである場合には第３の配列部分の配列と完全に相補となり、自己ハイブリダイゼーションを容易に生じる。検査領域の配列が想定された配列と異なる場合、例えば一塩基多型によって第３の配列部分と一塩基のミスマッチがある場合には、自己ハイブリダイゼーションを生じにくくなる。尚、本発明においては、一塩基のみのミスマッチでも明確に識別できる検査方法を提供するが、一塩基多型以外の多型、例えば複数個の塩基の挿入、欠失、置換等の多型及び変異を検出することもできるものであり、特に一塩基多型のみに限定するものではない。
【００２１】
一方、上記のＤＮＡ断片と対となって増幅されたＤＮＡ断片においては、上記他方の鎖における検査領域の配列（上記一方の鎖における検査領域の配列と相補となる配列）を含み、その５’末端側に、アンカー配列と同一の配列、すなわち上記一方の鎖における検査領域の配列を有しているので、上記と同様に、検査領域の配列が想定された配列そのものである場合には自己ハイブリダイゼーションを容易に生じ、検査領域の配列が想定された配列と異なる場合には、自己ハイブリダイゼーションを生じにくくなる。
【００２２】
検査領域の配列と第３の配列部分の配列が完全に相補的な場合にのみ自己ハイブリダイゼーションを生じ、一塩基ミスマッチの場合に自己ハイブリダイゼーションを生じないようにするためには、具体的には以下のようにすれば良い。
【００２３】
すなわち、検査領域の配列に一塩基の多型が存在すると、一塩基の違いによって融解温度（Ｔｍ）は異なる値となる。したがって、例えば、電気泳動の温度を、完全に相補的な場合のハイブリダイゼーションのＴｍ以下にすると、自己ハイブリダイゼーションを生じてヘアピン型の構造を作ることになる。Ｔｍ以上に温度を上げると、このヘアピン型構造は解離する。一塩基ミスマッチの場合のハイブリダーゼーションのＴｍはこれよりも低い値となる。
【００２４】
アンカー配列を多型の一方の種類の塩基を含む検査領域の配列と完全に一致する（完全マッチ）ように設計した場合、他方の種類の塩基を含む検査領域の配列とは一塩基ミスマッチとなりＴｍは下がる。したがって、電気泳動の温度を、完全マッチのＴｍと一塩基ミスマッチのＴｍとの間、例えば中間の温度に設定すると、完全マッチのＤＮＡはヘアピン構造を取り、一塩基ミスマッチのＤＮＡはヘアピン構造を取らないことになる。Ｔｍ値はハイブリダイゼーションをする塩基配列に応じて変動する値であるが、予め塩基配列が明らかである場合には当業者に公知の手段によって計算することが可能である。
【００２５】
上記のように、増幅されたＤＮＡ断片が検査領域における多型または変異の状態に応じて一本鎖化した場合の高次構造が、適当な温度を設定することによって、上記アンカー配列の存在によって顕著に異なることとなるため、これらを電気泳動で分離し、レーザー励起蛍光検出法を用いることによって、蛍光色素等で標識されている方の一本鎖ＤＮＡを検出することができる。
【００２６】
本方法によると、第１に、ヘアピン型構造とそうでない構造という高次構造の違いが、従来のＳＳＣＰ法における構造変化に比べて大きいため、分離が改善される。このため、粘性の高い高濃度ポリマーや低温を使用しなくても高い分離が得られる。第２に、検査領域の配列のＴｍの値は公知の方法により計算が可能であることから、分離に好適な温度条件を予め推定できるため、ＳＳＣＰ分析の温度条件を最適化するための作業量を軽減できる。第３に、Ｔｍの計算値から予測される分離に最適な温度が、キャピラリー電気泳動装置に適した３０−６０℃程度になるように検査領域の配列を設定できる。加えて、複数の多型部位について、分離に最適な温度がほぼ等しくなるように検査領域の配列を設計することによって、同時に一定の温度条件で複数の多型部位の検査を行うことが可能となる。
【００２７】
本発明の方法は、一塩基多型の存在を容易に検出することができ、予め多型と電気泳動におけるピーク位置との関係を対照データとして得ておけば、検査対象のＤＮＡにおける一塩基多型の型をＤＮＡ断片の泳動ピークの位置から直ちに検出することができる。また、検査領域の配列が異なる複数のＤＮＡが存在する場合に、その存在比をピークの位置及び強度比から算出することができる。
【００２８】
更に本発明により、核酸配列の検査のためのキットが提供される。キットは、上記第１のプライマー及び上記第２のプライマーを含み、必要に応じてＰＣＲ反応に必要なその他の試薬、例えば酵素、ヌクレオチド、バッファー等、及び好適なＰＣＲ反応条件に関するデータ等を含んでいても良い。プライマーそのものの代わりに、プライマーの塩基配列データをキットに含めても良い。その場合には、プライマーを合成する必要があるため、合成のための試薬、プライマーを標識するための蛍光色素等の標識体を含んでいても良い。
【００２９】
キットには更に、一塩基多型等の多型または変異を上記プライマーを用いたＰＣＲ反応によって増幅されるＤＮＡ断片による自己ハイブリダイゼーションの有無を電気泳動で分析するための温度条件のデータを含むものであっても良い。温度条件のデータは、予め検査領域の配列及び想定される多型または変異の型を考慮して、計算値または実測値として提供することができる。
【００３０】
本発明のキットは、検査領域に含まれる多型または変異を電気泳動で分析するために使用することができ、具体的には、検査領域における１塩基多型の型を解析したり、検査領域の配列が異なる複数のＤＮＡの存在比を解析するために使用することができる。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明の実施例を図１により説明する。本発明による核酸配列の検査方法は、ＤＮＡの抽出、ＰＣＲ反応、ＰＣＲ産物の変性（一本鎖化）、電気泳動分析という４つの工程からなるが、以下工程を追ってその詳細を説明する。
【００３２】
工程１では、ヒトの血液や組織細胞などの生体試料から公知技術によりゲノムＤＮＡを抽出する。図１（ａ）に示すように、ゲノムＤＮＡは、父親由来１と母親由来１１の一対の二本鎖ＤＮＡからなり、その多型部位を２、１２で示す。図１（ａ）では、多型の塩基位置が父親由来のＤＮＡではＡ−Ｔの組に、母親由来のＤＮＡではＧ−Ｃの組になっているものとし、この多型以外の配列の違いはないものとする。また、ゲノムＤＮＡ１、１１において両端の３’または５’の記号は、それぞれのＤＮＡ分子の末端が５’末端、３’末端のいずれであるかを示している。
【００３３】
工程２では、ゲノムＤＮＡ上の検査領域２０、２１を間にはさんだ領域をＰＣＲ反応で増幅する。図１（ｂ）に示すように、ＰＣＲに用いるプライマー組は、蛍光色素８で標識されたプライマー４と、配列７と配列６が５’末端から３’末端に向かってこの順につながった構造のプライマー１０とからなる。プライマー１０の配列７の部分は、ゲノムＤＮＡ１上の多型位置を含む領域（検査領域）２０と同じ配列に設計されている。ＰＣＲにおいて、これらのプライマー４と１０はゲノムＤＮＡ上のあらかじめ決めた配列位置にハイブリダイズして伸長する。プライマー４、１０からの伸長反応によって形成されるＤＮＡ鎖をそれぞれ９，９’で表す。ゲノムＤＮＡ１１上でも同様の伸長反応が起こる。ＰＣＲ反応終了後の生成物を図１（ｃ）に示す。父親由来ゲノムＤＮＡ１を鋳型として生成される二本鎖のＰＣＲ産物１３の蛍光色素８で標識された方の鎖は、プライマー４の配列、ゲノムＤＮＡ１の検査領域２０と同じ配列、プライマー１０の相補配列（配列６の相補配列６’と配列７の相補配列７’からなる）が５’末端側からこの順でつながった構造となり、母親由来ゲノムＤＮＡ１１を鋳型として生成されるＰＣＲ産物２３の蛍光色素８で標識された方の鎖は、プライマー４の配列、ゲノムＤＮＡ１１の検査領域２１と同じ配列、プライマー１０の相補配列（配列６’と配列７’からなる）が５’末端側からこの順でつながった構造となる。
【００３４】
工程３では、ＰＣＲ産物１３、２３を熱あるいはホルムアミドなどの変性剤を使った公知の方法で変性して一本鎖ＤＮＡを得る。
【００３５】
工程４では、工程３で得られた一本鎖ＤＮＡを電気泳動によって検出する。ＤＮＡの検出をレーザー励起蛍光法で行う場合には、図１（ｄ）に示す蛍光色素８が５’末端側に標識された一本鎖ＤＮＡ１４および２４が検出される。一本鎖ＤＮＡ１４はゲノムＤＮＡ１からのＰＣＲ産物であり、多型位置を含む検査領域の配列２０はプライマー１０のアンカー配列部分７の相補配列７’と完全に相補になっている。一方、一本鎖ＤＮＡ２４はゲノムＤＮＡ１１からのＰＣＲ産物であり、多型位置を含む検査領域の配列２１はプライマー１０のアンカー配列部分７の相補配列７’と多型位置においてＣ−Ａのミスマッチになっている。従って、配列２０と配列７’との融解温度（Ｔｍ２）と配列２１と配列７’との融解温度（Ｔｍ１）を比較すると、Ｔｍ２はＴｍ１よりも高くなっている。従って、電気泳動の温度をＴｍ１とＴｍ２の間に設定すれば、図１（ｄ）に示すように、ＤＮＡ１４は自己ハイブリダイゼーションを起こしたヘアピン型になり、ＤＮＡ２４とは大きく異なる立体構造を持つものとなる。このように積極的に構造を変化させることにより、ＳＳＣＰ法の分離能を向上させることができる。
【００３６】
本実施例では、プライマー１０のアンカー部分の配列７は検査領域の配列２０と全く同じ配列であるとしたが、原理的には検査領域の配列２０および検査領域の配列２１でＴｍに十分な差が生ずるものであれば配列７はどのような配列であっても構わない。また、Ｔｍは、キャピラリー電気泳動で分析する場合には、２０−６０℃程度になるように設計するのが好適である。
【００３７】
本実施例を、具体的な鋳型ＤＮＡ配列を用いた実験結果により、さらに詳細に、以下の図２、図３、図４、図５を用いて説明する。
【００３８】
実験の条件を以下１．〜９．に示す。
１．検査対象の多型位置
ＶＡＶ２遺伝子のイントロン領域にある多型であり、ヒト染色体９ｑ３４領域（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  番号：ＡＣ００２１１１、全長３９７０２塩基）の５６８０番目の塩基位置。
【００３９】
２．検査対象の多型の塩基型
ＴまたはＣの一塩基多型である。
【００４０】
３．ＰＣＲプライマー配列
Ｓｈｉｇｙｏらの報告（インターナショナル  ジャーナル  オブ  キャンサー、７８巻４２５頁から４２９頁  １９９８年（Ｍ．  Ｓｈｉｇｙｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ７８，  ｐｐ．  ４２５−４２９  （１９９８））に則って以下の配列を有するプライマーペアをＰＣＲに用いた。以下これらをオリジナルのプライマーと呼ぶ。
・オリジナルフォワードプライマーの配列（図１のプライマー４に対応）：配列番号２
・オリジナルリバースプライマーの配列（図１の配列６に対応）：配列番号３
上記のオリジナルフォワードプライマーとオリジナルリバースプライマーを用いたＰＣＲ反応によりＶＡＶ２遺伝子のイントロン領域（１３８塩基長）が増幅される。この領域のフォワード鎖の配列を配列番号１で示す。配列番号１中にｙの表記で示しているのは、この塩基位置がＴとＣのヘテロ構造であることを示している。
【００４１】
４．アンカー配列
ＶＡＶ２遺伝子のイントロン領域（以下簡単のため単にＶＡＶ２遺伝子領域と呼ぶ）のフォワード鎖を検出する場合には、オリジナルフォワードプライマーの５’末端を蛍光色素（本実験ではＲＯＸを用いた）で標識する。オリジナルリバースプライマーには以下の２種類のアンカー配列を５’側に付加し、２種類のアンカー付加プライマー（図１のプライマー１０に対応）を準備した。
・アンカー配列１（１１塩基長）：配列番号４
・アンカー配列２（１３塩基長）：配列番号５
すなわち、図１の検査領域の配列２０および２１の塩基数として、アンカー配列１を用いる場合は１１塩基、アンカー配列２を用いる場合は１３塩基のように決めたことを示す。また、ここでは、１１塩基および１３塩基の真中（それぞれ６番目および７番目の塩基位置）に多型の塩基位置を配置した。
【００４２】
ＶＡＶ２遺伝子のリバース鎖を検出する場合には、オリジナルリバースプライマーの５’末端に蛍光色素（本実験ではＦＡＭを用いた）を標識する。オリジナルフォワードプライマーには以下のアンカー配列を５’側に付加した。
【００４３】
アンカー配列３（１１塩基長）：配列番号６
すなわち、図１の検査領域の２０、２１の塩基数として１１塩基に決めたことを示す。また、１１塩基の真中（６番目の塩基位置）に多型の塩基位置を配置した。
【００４４】
５．ゲノム溶液の調製
公知の方法（例えば、ＱＩＡ−ｍｉｎｉ  キット；キアゲン社）を用いて全血からゲノムＤＮＡを抽出し、５０μｇ／ｍＬの水溶液に調製した。このゲノムＤＮＡのＶＡＶ２遺伝子の所定の多型部分は、Ｔ−ＡペアとＣ−Ｇペアのヘテロ構造（父母由来の配列が異なる）であることを、ＤＮＡシーケンサで解析して確認した。
【００４５】
６．ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応キット（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｔｓｐ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の標準プロトコールに従って、所定の反応バッファー溶液中のｄＮＴＰ濃度を０．２ｍＭ，  ＭｇＣｌ２  濃度を１．５ｍＭに調整した。ゲノムＤＮＡ量５０‐１００ｎｇ、酵素量０．６Ｕ、プライマー量５‐３０ｐｍｏｌを用いて、反応液全量１５μＬでＰＣＲ反応を行った。反応容器は２００μＬのＰＣＲ反応用チューブで、サーマルサイクラーにはＵｎｏ−ＴｈｅｒｍｏＢｌｏｃｋ  （Ｂｉｏｍｅｔｒａ社）を用いた。
【００４６】
温度条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒のサイクルを３０回行い、最後に７２℃１０分間の最終伸長反応を行った。上記で５５℃のアニ−ル温度は、プライマーの配列に応じて、５５〜６１℃の範囲で、所望以外のＤＮＡが増幅されないように適宜選択した。
【００４７】
７．電気泳動装置
分析装置には、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた。キャピラリーは内径５０μｍ、外径３５０μｍ、長さ４７ｃｍである。このとき、試料の注入端から検出点（レーザーの照射点）までの距離は３６ｃｍであった。キャピラリー温度は３０℃から６０℃の範囲で設定した。試料溶液からのＤＮＡ注入は電界注入法によって行い、具体的には、１５ｋＶの電圧を５秒間印加した。電気泳動は１５ｋＶの電圧を印加しておこなった。
【００４８】
８．電気泳動試薬
電気泳動用のバッファーには、１×ＴＢＥ、１０％グリセロールを用いた。分離媒体であるポリマーには非変性ポリマーであるＧｅｎｅｓｃａｎ（アプライド・バイオシステムズ社）を用いた。Ｇｅｎｅｓｃａｎは重量比７％濃度で供給されているが、電気泳動用バッファーと同じ１×ＴＢＥ、１０％グリセロール溶液中でポリマー濃度が重量比で６％になるように調製した。
【００４９】
９．分析する試料溶液の調製
ＰＣＲ反応溶液を精製キット（ＱＩＡ‐ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット；キアゲン社）を用いてプライマー除去と脱塩を行い、５０μＬの滅菌純水で溶出した。ついで、この溶液を水で１０倍程度に希釈した後、その希釈液１μＬと脱イオン化したホルムアミド１０μＬとを混合し、９４℃で５分間加熱してＰＣＲ産物を熱変成（一本鎖化）した後、自然空冷して試料溶液とした。尚、上記において水による希釈の倍率は、測定装置ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０において適切な信号強度が得られるように適宜調整した。
【００５０】
以上１．〜９．に記載した条件で得られた結果の一例を図２に示す。
図２（ａ）は、蛍光色素（ＲＯＸ）で標識したオリジナルフォワードプライマーとオリジナルリバースプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、３６℃でＳＳＣＰ分析をした例である。横軸は泳動時間、縦軸は蛍光強度を表す。蛍光色素はフォワードプライマーに標識されているので、検出されているのはフォワード鎖である。試料に用いたゲノムＤＮＡが一塩基多型位置においてＴ／Ｃヘテロ構造であることに対応して、２つのピークが検出されている。
【００５１】
図２（ｂ）は、オリジナルリバースプライマーにアンカー配列１（１１塩基長）を付加したプライマーと蛍光色素（ＲＯＸ）で標識したオリジナルフォワードプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、４６℃でＳＳＣＰ分析をした例である。蛍光色素はフォワードプライマーに標識されているので、検出されているのはフォワード鎖である。試料に用いたゲノムＤＮＡが一塩基多型位置においてＴ／Ｃヘテロ構造であることに対応して、２つのピークが検出されている。泳動時間が短いほうのピーク３２がＴ、長いほうのピーク３３がＣの配列を持つものであることを、Ｔホモ構造およびＣホモ構造である別の二種類のゲノムＤＮＡを用いて検証している。図２（ａ）との比較からわかるように、オリジナルリバースプライマーにアンカー配列１を付加することにより、格段によい分離が得られた。
【００５２】
図２（ｃ）は、オリジナルリバースプライマーにアンカー配列２（１３塩基長）を付加したプライマーと蛍光色素（ＲＯＸ）で標識したオリジナルフォワードプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、４９℃でＳＳＣＰ分析をした例である。図２（ｂ）の場合と同様に、泳動時間が短いほうのピーク３４がＴ、長いほうのピーク３５がＣの配列を持つものであることを、Ｔホモ構造およびＣホモ構造である別の二種類のゲノムＤＮＡを用いて検証している。アンカー配列２を付加した場合にもアンカー配列１を付加した場合には若干及ばないものの、オリジナルプライマーと比べた場合には、やはり格段によい分離が得られた。
【００５３】
図３を用いて分離能ＲＳの定義を説明する。２つのピークの泳動時間差をＴとし、それぞれのピークの半値幅の時間をΔＴ１、ΔＴ２とした場合、ＲＳ＝√（２ｌｎ２）・［Ｔ／（ΔＴ１＋ΔＴ２）］で表される。ここでｌｎは自然対数をあらわす。
【００５４】
図４に電気泳動の温度を変化させて分離能ＲＳを測定した結果を示す。曲線３６，３７，３８は、それぞれ、図２（ａ）（ｂ）（ｃ）の実験結果を得るのに用いたプライマーの組み合わせを用い、電気泳動の温度を変化させて分離能ＲＳを測定した結果を示している。オリジナルのプライマー配列を用いた場合（曲線３６）に比べ、リバースプライマーにアンカー配列１（配列番号４）を導入した場合（曲線３８）、アンカー配列２（配列番号５）を導入した場合（曲線３７）では、分離の最高値は５〜６倍向上した。最高の分離能が得られた温度は、オリジナルプライマーでは３６℃、アンカー配列１を導入した場合には４９℃、アンカー配列２を導入した場合は４６℃であった。
【００５５】
図５には、同じくＶＡＶ２遺伝子を用い、リバース鎖を検出した結果を示す。
図５（ａ）はオリジナルプライマーの組を用いた場合、図５（ｂ）はアンカー配列３（配列番号６）をオリジナルフォワードプライマーの５’末端側に付加したプライマーを用いた場合である。図５（ｃ）には図４と同じように、分離能の温度依存性を示した。この場合には、オリジナルプライマーでは分離できなかった（図５（ａ）のピーク３９）ヘテロ構造が、図５（ｂ）のピーク４０、４１で示すように、アンカー配列の導入で明確に分離できた。このときの温度は３９℃であった。一塩基多型は泳動時間が短いほうのピーク４０がＡ、長いほうのピーク３３がＧであるであることを、フォワード鎖がＴホモ構造およびＣホモ構造（リバース鎖では、それぞれＡホモ、Ｇホモ）である別の二種類のゲノムＤＮＡを用いて検証している。図５（ｃ）で示すように、最高分離能が得られる温度は３９℃であった。
【００５６】
以下の表１には、上述の実験結果から得られた最高分離を与える温度の実測値と、アンカー配列のハイブリダイゼーションの融解温度の計算値から得られた最高分離を与える温度の計算値とを示す。
【００５７】
表１
最高の分離を与える泳動温度の計算値と実測値、および多型によるヘアピン構造の融解温度の計算値の差と分離能の実測値
【表１】
2004187545.tif 000003
【００５８】
ここで、融解温度の計算には、一塩基ミスマッチを考慮に入れたＮｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法に基づく熱力学パラメータを用いたが、特に限定するものではない。Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法の詳細は主に、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ他による文献：プロシーディング  オブ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  ＵＳＡ  第９５巻  １４６０頁から１４６５頁  １９９８年（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  Ｖｏｌ．  ９５，  ｐｐ．１４６０〜１４６５，  （１９９８））、およびＰｅｙｒｅｔ他による文献：バイオケミストリー  第３８巻  １２号  ３４６８頁から３４７７頁  １９９９年（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．  ３８，Ｎｏ．  １２，  ｐｐ．３４６８〜３４７７，  （１９９９））に開示されている。最高分離を与える温度は、完全マッチと一塩基ミスマッチのＴｍの平均値とした。
【００５９】
表１に示すように、最高分離を与える温度の計算結果と実験結果とは、約７℃以内でほぼ一致している。この結果は、従来のＳＳＣＰ法では予測不可能であった分離最適温度を、本実施例においては、ある程度あらかじめ予測できることを示している。このため、計算結果に従って電気泳動の温度を設定しても、ある程度の分離が得られる。また、実験的に最高分離が得られるような泳動温度を探索する場合にも、少ない実験量で最適の値を容易に得ることができる。さらに、最高分離が得られる温度をキャピラリー電気泳動装置で設定しやすい温度条件に設定できるように、アンカー配列を適宜設計することもできる。
【００６０】
さらに表１には、一塩基多型によるアンカー配列の融解温度の違い（差）の計算値と、最高分離能の実測値を示した。融解温度差の計算値の大小関係と、最高分離能の実測値の大小関係は一致している。すなわち、一塩基多型による融解温度の計算値の差が最も大きくなるようにアンカー配列を設計することによって、高い分離能が得られる。
【００６１】
図６には、以上に説明してきた結果を踏まえた、本発明のプライマー設計の工程をフローチャートで示す。
【００６２】
検査対象ＤＮＡの塩基配列および検査する多型の塩基位置と塩基種のデータセット３０１を用い、工程３０２では、まず公知の技術を用いて、ＰＣＲプライマーの配列の内の、検査対象のＤＮＡにハイブリダイズする部分（図１に４および６で示した部分であり、オリジナルプライマーと呼ぶ）の塩基配列を設計する。
設計に当たっては、公知の技術により、１７ないし３０塩基長程度で、一組のプライマーの融解温度がほぼ等しい値になるように、また、プライマーの自己ハイブリダイゼーションや３’末端側でのプライマー同士のハイブリダイゼーションなど、ＰＣＲを阻害する要因を除くように考慮する。さらに、ＰＣＲ増幅産物の長さは、従来のＳＳＣＰ法で良く用いられている塩基長数十から３００塩基長程度になるようにする。このようにして複数組のオリジナルプライマー組の候補を設計しておく。尚、プライマーの設計には、市販のソフトウェアを用いることができる。工程３０３では、設計した候補の内、一組のオリジナルプライマーを選び、オリゴヌクレオチドを合成する。次いで工程３０４では、合成したオリジナルプライマーペアを用いてＰＣＲ反応を行い、単一長さの特異的な増幅が良好に起こるか否かを、アガロース電気泳動などの適当な公知技術を用いて検定する。
増幅が良好であれば、そのプライマーペアを選定して工程３０５に進む。増幅が悪い場合は、工程３０２で設計した別のオリジナルプライマーペアを用いて工程３０３と３０４を行う。この過程を繰り返してオリジナルプライマーペアを決定する。
【００６３】
尚、過去の文献等で、検査対象の多型部位を含む領域を特異的に増幅できることが実験的に検証されているプライマー配列が報告されている場合には、工程３０３においてその配列をオリジナルプライマー配列に用いることもできる。
【００６４】
一方、工程３０６では、データセット３０１を用いて、アンカー配列を設計する。できるだけ高い分離能を得るためには、アンカー配列が多型部位を含む領域と特異的にハイブリダイズし、かつ多型部位の塩基が異なることによる融解温度の差が最も大きくなるようにする。さらに、キャピラリー電気泳動に適した測定条件にするために、融解温度の計算値が３０℃から６０℃位になるように、またアンカー配列の長さをおおよそ７−１５塩基長程度にする。より単純には、アンカー配列は、多型部位を含む７から１５塩基長程度の範囲の配列で、多型部位に相当する塩基位置を除いて鋳型ＤＮＡと完全に同じ配列とする。アンカー配列が短すぎると類似配列の出現率が高くなり、長すぎるとＴｍ値が高くなりすぎて好ましくない場合がある。アンカー配列内の多型部位に相当する位置とその塩基種類は、多型による融解温度の計算値の差が最も大きくなるようにする。この考え方で、複数のアンカー配列候補を設計する工程が３０６である。
【００６５】
工程３０７では、工程３０６で設計したアンカー配列候補のうち、１つを選ぶ。工程３０５では、工程３０４で選択したオリジナルプライマー組の片方に工程３０７で選んだアンカー配列を付加したプライマーを合成する。
【００６６】
次いで、工程３０８では、アンカー配列を付加したプライマーともう一方のオリジナルプライマーを用いて、再びＰＣＲ反応を行い、特異的増幅の良否をチェックする。増幅が好ましい時は、次の工程３０９に進み、好ましくないときは、工程３０３に戻って別のオリジナルプライマーペアを選択し、再び工程をやりなおす。
【００６７】
工程３０９では、電気泳動分析により、多型の分離能を検定する。この工程において、全自動キャピラリー電気泳動装置を用いる場合には、アンカー配列を付加していないオリジナルプライマーに蛍光標識を行い、ＰＣＲ増幅を行ってから測定する。電気泳動の温度は、アンカー配列の融解温度から計算される値を初期値として、１０℃程度の範囲で前後数点の測定を行えば、最適値を得ることができる。分離が良好な場合は、この工程３０９で用いたプライマー組と泳動温度の条件が、確立されたプライマーと分析条件３１０となる。分離が悪い場合には、工程３０７に戻り、別のアンカー配列候補を用いて工程３０５からやりなおす。
【００６８】
上述のような一連の工程を経て、検査対象の多型部位について実験的にも保証されたプライマーと分析条件を得ることができる。
【００６９】
本発明のプライマー設計の一連のプロセスについて、別の実施例を図７に示す。検査対象ＤＮＡの塩基配列および検査する多型の塩基位置と塩基種のデータセット３０１を用い、オリジナルプライマーの設計工程３０２とアンカー配列の設計工程３０６により、プライマーペアの候補とそれを用いる場合の推奨ＰＣＲ条件と電気泳動条件の一覧表３１１を得ることができる。一覧表３１１から選択したプライマーペアを工程３１２において合成し、工程３１３でＰＣＲ反応と電気泳動分析を行い、多型の分離を検証する。良好な分離が得られた場合、プライマーと分析条件３１０を確定する。良好でない場合には、工程３１２に戻り、別のプライマーを合成するところからやりなおす。本実施例においては、単純なフローチャートであるため、候補となるプライマーペアを複数一度に評価するのには都合がよい。
【００７０】
図８と図９には、上記図６と図７で示したプライマーと分析条件の確立を行うサービスビジネスの実施例を示す。
【００７１】
図９では、検査会社は、図６および図７で示したデータセット３０１を設計会社に提示する。設計会社は、図６または図７に示したようなフローチャートに従って、プライマーと分析条件を確立し、試薬としてのプライマーと測定条件を記載したドキュメントを含む検査キット３１４を提供し対価を得る。検査会社は、被験者から血液や組織などの生体試料３１５を受け取り、その分析結果３１６を報告して対価を得る。本実施例では、検査会社においては、自社で多くの時間と人手をかけなくても、所定の多型に関する検査キットを入手できる効果があり、設計会社においては、従来のＳＳＣＰ法に比べて分析に最適な条件の予測性がよい本発明によって、キットを確立するのに必要な時間と労力を短縮でき、低価格でサービスを提供できるメリットがある。
【００７２】
図９では、本発明に基づくサービスビジネスの別の実施例を示す。本実施例では、図８で説明した実施例と同様に、検査対象の多型を含むＤＮＡの配列と多型の配列情報（データセット３０１）に基づいてプライマー配列を設計して、プライマー組の配列のいくつかの候補をリストアップ（プライマー組の配列一覧表３２３）し、それに推奨する分析条件（条件のデータ３２４）を添付する。実験に基づく検証は行わない。実験条件の決定は検査会社が行う。検査会社は設計結果に基づいて実験を行い、最終的なプライマーの選定と分析条件を確立する。そして確立した分析条件を用いて被験者から提供を受けた生体試料３１５に対する分析結果３１６を報告する。検査会社は被験者から検査費用を受け取り、設計会社には設計費用を支払う。
【００７３】
この実施例においては、設計会社と検査会社の間には、試料やプライマーなどの物のやり取りはなく、データのやりとりだけなので、設計会社にとっては、インターネット上のホームページによってサービスを提供する形態も可能となる。
このため、低価格のサービスが提供できる。本発明においては、従来の技術と異なり、分離に最適な条件が予測可能なため、実験による保証はないものの、ユーザに推奨条件を提示することは可能である。実験設備やノウハウの十分に整った検査会社などの依頼者に対しては、低価格で設計結果のみを提供できる効果がある。
【００７４】
【発明の効果】
本発明によれば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法に用いるＰＣＲプライマーに、検査領域の配列として想定される配列と同一の配列をアンカー配列として付加することにより、電気泳動測定時にヘアピン状態を起こさせる。ヘアピン状態の融解温度が一塩基の違いによって異なることを利用して、その中間の温度で電気泳動を行うことにより、ＳＳＣＰ法による一塩基多型の分離能を著しく改善することができる。また、分離に最適な温度を予測することが可能となり、従来のＳＳＣＰ法で必須であった分析条件の最適化に要する手間を大きく低減できる。また、最高の分離を与える電気泳動温度がキャピラリー電気泳動装置に適した温度範囲に入るように、アンカー配列を設計することができる。このため、遺伝子診断の自動化・高精度化に大きな効果がある。さらに、本発明によって、一塩基多型を分離分析するための推奨の実験条件を添付した形で、ＰＣＲプライマーの配列あるいは合成したＰＣＲプライマーを提供するサービスビジネスが実現できる。
【００７５】
【配列表】
2004187545.tif 000004
2004187545.tif 000005
2004187545.tif 000006
【００７６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２：合成ポリヌクレオチド
配列番号３：合成ポリヌクレオチド
配列番号４：合成ポリヌクレオチド
配列番号５：合成ポリヌクレオチド
配列番号６：合成ポリヌクレオチド
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の原理を工程に沿って示す。
【図２】本発明の原理に基づく電気泳動測定結果の一例を示す。
（ａ）従来のＳＳＣＰ法でフォワード鎖を検出して得られた電気泳動スペクトル
（ｂ）本発明でアンカー配列として配列番号４の配列からなるポリヌクレオチドを用いフォワード鎖を検出して得られた電気泳動スペクトル
（ｃ）本発明でアンカー配列として配列番号５の配列からなるポリヌクレオチドを用いフォワード鎖を検出して得られた電気泳動スペクトル
【図３】分離能の定義の説明図を示す。
【図４】図２（ａ）（ｂ）（ｃ）で示したそれぞれの場合について、分離能と温度との関係を測定した結果を示す。
【図５】（ａ）従来のＳＳＣＰ法でリバース鎖を検出して得られた電気泳動スペクトルを示す。
（ｂ）本発明でアンカー配列として配列番号６の配列からなるポリヌクレオチドを用いリバース鎖を検出して得られた電気泳動スペクトルを示す。
（ｃ）（ａ）（ｂ）それぞれの場合で、分離能の電気泳動温度に対する依存性を示す。
【図６】本発明のＰＣＲプライマーの設計手順のフローチャートを示す。
【図７】本発明のＰＣＲプライマーの別の設計手順のフローチャートを示す。
【図８】図６及び図７で示した設計フローの全部または一部を実施する設計会社を含むビジネスモデルの一実施例を示す。
【図９】図６及び図７で示した設計フローの一部を実施する設計会社を含むビジネスモデルの別の実施例を示す。
【符号の説明】
１．ゲノムＤＮＡ（父由来）
１１．ゲノムＤＮＡ（母由来）
２，１２．多型部位
４，１０．プライマー
８．蛍光色素
２０、２１．検査領域の配列
２０’、２１’．検査領域の配列
２０、２１の相補配列
７、７’．アンカー配列およびその相補配列
１３、２３．ＰＣＲ産物
１４、２４．一本鎖化したＰＣＲ産物のうち、蛍光色素８で標識されている鎖
３１５．生体試料（血液、組織など）
３１６．検査結果を記載した書類
３０１．検査対象の多型部位を含む領域のＤＮＡ配列及び多型の位置と塩基種からなるデータ。
３１４．プライマー及び反応・測定条件が記載された書類を含む検査キット
３２３．プライマー配列
３２４．推奨する反応・測定条件が記載された書類
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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