(57)【要約】【課題】増幅産物に関する情報を迅速且つ簡便に得ることが可能な方法を提供する。【解決手段】核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、以下のことを具備する方法；（１）試料標本中の標的塩基配列を増幅するためのプライマーと、少なくとも１種類の塩基が標識物質により標識されたｄＮＴＰｓが存在し、適切な増幅が得られる条件において、標的塩基配列を増幅する工程と、（２）前記（１）の工程と同時またはそれに続いて、前記試料標本について、前記標識物質に由来する検出可能な信号を複数の時点で継時的に検出する工程と、（３）前記（２）の工程により得られた当該信号の変化を基に、前記試料標本に生じた増幅産物に関する情報を得る工程。【選択図】    図１
2004187607.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、以下のことを具備する方法；
（１）試料標本中の標的塩基配列を増幅するためのプライマーと、少なくとも１種類の塩基が標識物質により標識されたｄＮＴＰｓが存在し、適切な増幅が得られる条件において、標的塩基配列を増幅する工程と、
（２）前記（１）の工程と同時またはそれに続いて、前記試料標本について、前記標識物質に由来する検出可能な信号を複数の時点で継時的に検出する工程と、
（３）前記（２）の工程により得られた当該信号の変化を基に、前記試料標本に生じた増幅産物に関する情報を得る工程。
【請求項２】
核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、以下のことを具備する方法；
（１）試料標本中の標的塩基配列を増幅するためのプライマーと、ｄＮＴＰｓが存在し、適切な増幅が得られる条件において、標的塩基配列を増幅する工程と、
（２）前記（１）の工程と同時またはそれに続いて、二本鎖核酸に結合し検出可能な信号を生ずるインターカレーターを前記試料標本に作用させる工程と、
（３）前記（１）および（２）の工程と同時またはそれに続いて、前記インタカレータから生じた信号を複数の時点で継時的に検出する工程と、
（４）前記（３）の工程により得られた当該信号の変化を基に、前記試料標本に生じた増幅産物に関する情報を得る工程。
【請求項３】
核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、以下のことを具備する方法；
（１）試料標本中の標的塩基配列を増幅するためのプライマーと、少なくとも１種類の塩基が標識物質により標識されたｄＮＴＰｓが存在し、適切な増幅が得られる条件において、標的塩基配列を増幅する工程と、
（２）前記（１）の工程と同時またはそれに続いて、二本鎖核酸に結合する検出可能な信号を生ずるインターカレーターを前記試料標本に作用させる工程と、（３）前記（１）および（２）の工程と同時またはそれに続いて、前記（１）の標識物質と前記（２）のインタカレータから生じた信号を複数の時点で継時的に検出する工程と、
（４）前記（３）の工程により得られた当該信号の変化を基に、前記試料標本に生じた増幅産物に関する情報を得る工程。
【請求項４】
請求項１から３の何れか１項に記載の核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、前記標識物質が蛍光物質であり、前記試料標本についての蛍光信号を複数の時点で継時的に検出する工程が、一分子蛍光分析法、蛍光自己相関解析法および蛍光強度分布関数解析法からなる群より選択される手段により行われることを特徴とする核酸の増幅産物に関する情報を得る方法。
【請求項５】
請求項１から４の何れか一項に記載の核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、前記（１）に記載の工程において使用されるプライマーが、複数の標的塩基配列を増幅するために複数種類で使用されることと、前記（４）の工程において得られる情報が前記複数の標的塩基配列に対応する増幅産物のそれぞれについての情報であることを特徴とする核酸の増幅産物に関する情報を得る方法。
【請求項６】
請求項１から５の何れか一項に記載の核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、前記増幅産物に関する情報が、増幅の有無、増幅産物の長さ、存在割合および／または分子数であることを特徴とする核酸の増幅産物に関する情報を得る方法。
【請求項７】
請求項１から６の何れか一項に記載の核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、前記増幅産物に関する情報が、当該増幅の有無に基づいた前記標的塩基配列中の変異の存在に関する情報であることを特徴とする核酸の増幅産物に関する情報を得る方法。
【請求項８】
請求項１および３から６の何れか一項に記載の核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、前記標識物質が当該ｄＮＴＰの塩基の種類毎に異なるように２種類以上で使用されることを特徴とする核酸の増幅産物に関する情報を得る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、任意の核酸増幅の後に得られる反応産物に関する情報を得る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来公知の方法では、任意の核酸増幅の後に得られる反応産物に関する情報を得るために以下のような手段が用いられている。
【０００３】
例えば、特開平１１−６９９９８（特許文献１参照）は、従来のＰＣＲ法（即ち、ポリメラーゼ連鎖反応法）、ＮＡＳＢＡ法（即ち、Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）およびＬＡＭＰ法（即ち、Loop-Mediated Isothermal Amplification）などの核酸増幅においては、当該増幅反応時に使用される塩基混合物（ｄＮＴＰ）中に、蛍光標識された塩基を混在させることや、蛍光標識プライマーを用いることが開示されている。それにより増幅された核酸に蛍光標識を取り込ませ、マイクロタイターなどに固相化したＤＮＡプローブ反応させ、蛍光強度を測定する。その結果より、増幅された核酸に関する情報を得る。
【０００４】
特開２０００−１６６５９９（特許文献２参照）では、当該核酸増幅反応時に蛍光標識化プライマーを用い、所望の条件における増幅の後、ＦＣＳを用いて、蛍光標識された核酸を検出する方法が開示されている。
【０００５】
特表２０００−５０８１６８（特許文献３参照）では、固体支持体に結合しているＤＮＡプローブとサンプルＤＮＡを反応させ、その結果生じたハイブリダイゼーションにより固体支持体上に保持された増幅産物を表面プラズモンで測定し、検出する方法が開示されている。
【０００６】
特表２０００−５１３９２１（特許文献４参照）では、当該核酸増幅反応後に得られた反応産物を、マイクロプレートなどに固相化したプローブを反応させ、その後生じたハイブリダイゼーションを２本鎖核酸を認識するインターカレーターを用いて検出する方法が開示されている。
【０００７】
米国特許５５８０７３０（特許文献５参照）では、当該核酸増幅後、得られた反応産物をアガロースゲルで電気泳動して分離し、インターカレーターを添加し、トランスイルミネーター上で増幅された核酸を検出する方法が開示されている。
【０００８】
例えば、従来のＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法およびＬＡＭＰ法などの核酸増幅反応は、増幅された核酸サンプルをアガロースゲル中で電気泳動を行い、大きさによってゲル中で分離した後、インターカレーターを加えて、トランスイルミネーター上で増幅された核酸を検出している。
【０００９】
特開平９−３２９５４９（特許文献６参照）では、核酸増幅反応時にプライマーの種類に応じて、異なった蛍光物質で標識を行ったプライマーを用いることによって、異なった蛍光標識を有する増幅産物を得て、１反応で複数種の遺伝子について１度に増幅し、検出することが可能な方法を開示している。
【００１０】
特許２７９２７５７（特許文献７参照）では、核酸増幅反応時に、使用される塩基混合物（ｄＮＴＰ）の中に蛍光標識された塩基を混在させることによって、増幅産物中に蛍光標識された塩基を複数個取り込ませ、これをマイクロプレートなどに固相化したプローブと反応させ、ゲノムまたは遺伝子内の塩基の変異や、多型を検出する方法を開示している。
【００１１】
Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３４，９５５−９６０、１９９４（非特許文献２参照）は、核酸増幅時に塩基の変異、多型のある部分に特異的に核酸増幅反応を生じるようなプライマーを用いて所望の反応を行った後に、電気泳動し、インターカレーターを加えて増幅の有無を検出し、それによりゲノムまたは遺伝しないの塩基の変異または多型を検出する方法を開示している。
【００１２】
以上のような従来の技術は、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法などの核酸増幅法において、増幅された核酸の検出に固体支持体に固定化固相化したプローブと、サンプル中のＤＮＡを反応させ、ハイブリダイズした後に、それにより固相支持体に保持された増幅産物を表面プラズモン、または洗浄操作後の測定を行っており、プローブや固体支持体に固定する操作も必要である。また、多くの検出法は、ハイブリダイズの後に、洗浄操作が必要である。従来では、ハイブリダイズしにくい標的物質を検出する方法や、例えば、洗浄操作を必要とせず、迅速、且つ簡便な測定方法についての開示はない。
【００１３】
また、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法などの核酸増幅法において、幾つかの公知の方法は、核酸増幅反応時に蛍光標識したプライマーを用いることにより増幅された核酸を蛍光標識している。そのような場合、ＦＣＳで蛍光標識されたＤＮＡを検出する方法では、常に高価な蛍光標識化プライマーを用意する必要がある。
【００１４】
【特許文献１】
特開平１１−６９９９８号公報
【００１５】
【特許文献２】
特開２０００−１６６５９９号公報
【００１６】
【特許文献３】
特表２０００−５０８１６８号公報
【００１７】
【特許文献４】
特表２０００−５１３９２１号公報
【００１８】
【特許文献５】
米国特許５５８０７３０号公報
【００１９】
【特許文献６】
特開平９−３２９５４９号公報
【００２０】
【特許文献７】
特許２７９２７５７号公報
【００２１】
【非特許文献１】
Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３４，ｐ９５５−９６０、１９９４。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、増幅産物に関する情報を迅速且つ簡便に得ることが可能な方法を提供することである。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するための手段は、即ち、以下に示す８態様である。
【００２４】
１．  核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、以下のことを具備する方法；
（１）試料標本中の標的塩基配列を増幅するためのプライマーと、少なくとも１種類の塩基が標識物質により標識されたｄＮＴＰｓが存在し、適切な増幅が得られる条件において、標的塩基配列を増幅する工程と、
（２）前記（１）の工程と同時またはそれに続いて、前記試料標本について、前記標識物質に由来する検出可能な信号を複数の時点で継時的に検出する工程と、
（３）前記（２）の工程により得られた当該信号の変化を基に、前記試料標本に生じた増幅産物に関する情報を得る工程。
【００２５】
２．  核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、以下のことを具備する方法；
（１）試料標本中の標的塩基配列を増幅するためのプライマーと、ｄＮＴＰｓが存在し、適切な増幅が得られる条件において、標的塩基配列を増幅する工程と、
（２）前記（１）の工程と同時またはそれに続いて、二本鎖核酸に結合し検出可能な信号を生ずるインターカレーターを前記試料標本に作用させる工程と、
（３）前記（１）および（２）の工程と同時またはそれに続いて、前記インタカレータから生じた信号を複数の時点で継時的に検出する工程と、
（４）前記（３）の工程により得られた当該信号の変化を基に、前記試料標本に生じた増幅産物に関する情報を得る工程。
【００２６】
３．  核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、以下のことを具備する方法；
（１）試料標本中の標的塩基配列を増幅するためのプライマーと、少なくとも１種類の塩基が標識物質により標識されたｄＮＴＰｓが存在し、適切な増幅が得られる条件において、標的塩基配列を増幅する工程と、
（２）前記（１）の工程と同時またはそれに続いて、二本鎖核酸に結合する検出可能な信号を生ずるインターカレーターを前記試料標本に作用させる工程と、
（３）前記（１）および（２）の工程と同時またはそれに続いて、前記（１）の標識物質と前記（２）のインタカレータから生じた信号を複数の時点で継時的に検出する工程と、
（４）前記（３）の工程により得られた当該信号の変化を基に、前記試料標本に生じた増幅産物に関する情報を得る工程。
【００２７】
４．  上記１から３の何れか１項に記載の核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、前記標識物質が蛍光物質であり、前記試料標本についての蛍光信号を複数の時点で継時的に検出する工程が、一分子蛍光分析法、蛍光自己相関解析法および蛍光強度分布関数解析法からなる群より選択される手段により行われることを特徴とする核酸の増幅産物に関する情報を得る方法。
【００２８】
５．  上記１から４の何れか一項に記載の核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、前記（１）に記載の工程において使用されるプライマーが、複数の標的塩基配列を増幅するために複数種類で使用されることと、前記（４）の工程において得られる情報が前記複数の標的塩基配列に対応する増幅産物のそれぞれについての情報であることを特徴とする核酸の増幅産物に関する情報を得る方法。
【００２９】
６．  上記１から５の何れか一項に記載の核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、前記増幅産物に関する情報が、増幅の有無、増幅産物の長さ、存在割合および／または分子数であることを特徴とする核酸の増幅産物に関する情報を得る方法。
【００３０】
７．  上記１から６の何れか一項に記載の核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、前記増幅産物に関する情報が、当該増幅の有無に基づいた前記標的塩基配列中の変異の存在に関する情報であることを特徴とする核酸の増幅産物に関する情報を得る方法。
【００３１】
８．  上記１および３から６の何れか一項に記載の核酸の増幅産物に関する情報を得る方法であって、前記標識物質が当該ｄＮＴＰの塩基の種類毎に異なるように２種類以上で使用されることを特徴とする核酸の増幅産物に関する情報を得る方法。
【００３２】
【発明の実施の形態】
１．実施の形態１
（１）増幅反応
図１を用いて第１の実施の形態である核酸の増幅産物に関する情報を得る方法について説明する。
【００３３】
まず、所望の細胞などのゲノム、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む試料１から試料標本２を作製する。試料１としては、細胞の他にも、哺乳類および微生物を含む生物の何れかに由来する器官、臓器、組織、細胞および体液などを用いてもよく、或いはゲノム、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む何れの試料を用いてもよい。当該試料標本２の作製は、そのような試料１から核酸の抽出および精製などのそれ自身公知の何れかの手段を用いて調製すればよい。
【００３４】
次に、調製された試料標本２について、所望の標的塩基配列を増幅するために予め設計され準備された核酸増幅用プライマー３と、基質としてのヌクレオチド４が存在し、且つ適切な増幅が得られる条件下で増幅反応を行う。このとき使用されるヌクレオチド（ｄＮＴＰとも称す）４は、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンを含むヌクレオチドの混合物であり、そのうちの１以上に対して蛍光物質が付与されており、蛍光標識ヌクレオチド５と非標識ヌクレオチドが混在している。ここでは、１種類に対して蛍光標識された例を示す。
【００３５】
このとき使用される核酸増幅用プライマー３は、標的塩基配列を増幅するものである。当該標的塩基配列は、増幅しようとする配列または検出しようとする配列であればよい。
【００３６】
当該増幅反応の結果、試料標本２に標的塩基配列が存在しなければ核酸の増幅が起こらない。その場合、核酸増幅用プライマーと、蛍光標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドと、試料標本が夫々独立してまたは一部結合した状態で存在する。
【００３７】
一方、試料標本２に標的塩基配列が存在する場合、当該増幅反応において増幅が生じる。その結果、蛍光標識ヌクレオチドを取り込んだ増幅産物７が得られる。また、増幅に供されなかった核酸増幅用プライマー３、蛍光標識ヌクレオチド５および非標識ヌクレオチド、並びに試料標本２の一部分が存在してもよい。
【００３８】
反応後の反応系における蛍光信号を観察することにより、増幅産物に関する情報を得ることが可能である。
【００３９】
ここで使用される蛍光物質は、特に限定されるものではない。
【００４０】
例えば、蛍光信号の観察は、以下のように行えばよい。例えば、以上の一連の工程において、核酸増幅反応以前および／または核酸増幅反応中から核酸反応以後に亘り、蛍光物質からの蛍光信号の位置変化を断続的に複数の経過時点で、または継時的に連続して測定すればよい。更に、その結果を基に自己相関関数解析および／またはポアソン分布関数解析を行い、並進拡散時間および／または一分子のブライトネス（即ち、一分子の蛍光強度）と、分子数とを求める。それにより、増幅産物の有無、増幅産物の長さおよび増幅産物の量を求めることが可能である。例えば、標的塩基配列に４種類の塩基が均等に標的塩基配列に存在すると考えた場合には、蛍光標識すべき１種類の塩基の全体の１０分の１だけに標識するならば、約４０塩基に１個の割合で蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれることになる。
【００４１】
このように蛍光標識すべき塩基の種類の選択および標識量、並びに標的塩基配列の選択を組み合わせることにより、増幅産物の長さ、個数および配列などの増幅産物に関する情報を得ることが可能である。
【００４２】
以上のような蛍光信号の位置変化の断続的に複数の経過時点で、または継時的に連続して測定するための手段は、蛍光自己相関解析（即ち、Fluorescence Auto Correlation Spectroscopy：FCS）、蛍光クロス相関分光法（即ち、Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy）、蛍光強度分布関数解析（即ち、Fluorescence Internsity Distribution Analysis：FIDA）および一分析蛍光分析（即ち、Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis：FIMDA）などを使用することが可能である。しかしながら、これに限定するものではなく、蛍光信号の位置変化の断続的に複数の経過時点で、または継時的に連続して測定可能な装置であればよい。なお、ＦＩＤＡおよびＦＩＭＤＡに関する記載は、特表２００１−５０２０６２、特表２００１−５１８３０７、特表２００２−５０５７４２を参考にすればよい。
【００４３】
上述の例では、１種類の標的塩基配列を増幅するための核酸増幅用プライマー３を使用する例を記載したが、本発明の態様に従うと、複数の標的塩基配列を増幅するための核酸増幅用プライマーを同時に使用して増幅反応を行ってもよい。ここでいう「複数の標的塩基配列」とは、異なる遺伝子座または位置に存在する特定の塩基配列と、等しい遺伝子座または位置に存在する特定の塩基配列をその一部に含む塩基配列とを含む。従って、当該複数の核酸増幅用プライマーを用いて所望の増幅反応を行ったときに、その結果として得られると予期される増幅産物は、全ての配列が互いに異なる複数の配列であってもよく、その一部の配列が互いに等しく且つ長さが等しい複数の配列であってもよく、その一部の配列が互いに等しく且つ長さが異なる複数の配列であってもよい。
【００４４】
また、１つの反応において複数の蛍光物質を使用してもよい。例えば、互いに異なる蛍光信号を生ずる蛍光物質を、異なる塩基を有するヌクレオチドに対して標識物質として付与してもよい。このような複数種類の蛍光標識ヌクレオチドを１つの反応において同時に使用してもよい。
【００４５】
（２）蛍光相関分光法
本発明に従って使用される蛍光相関分光法（即ち、ＦＣＳ）は、蛍光で標識した標的分子の媒質中におけるゆらぎ運動を測定し、自己相関関数(Autocorrelation function)を用いることにより、個々の標的分子の微小運動を正確に測定する技術である（参照文献：D.Magde and E.Elson, “Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization”, Biopolymers 1974 13(1) 29-61）。
【００４６】
本発明に従って使用されるＦＣＳは、溶液中の蛍光分子のブラウン運動をレーザー共焦点顕微鏡系により微小領域で捉えることによって、蛍光強度のゆらぎから拡散時間を解析し、物理量（分子の数、大きさ）を測定することにより実行される。このような微小な領域で分子ゆらぎを捕えるＦＣＳによる解析は、高感度、特異的に分子間相互作用を検出する上で有効である。
【００４７】
本発明に従って実行されるＦＣＳによる検出の原理を更に詳しく説明する。ＦＣＳでは、試料中の微小視野領域から発生する蛍光信号を検出解析する。この時、媒質中の蛍光標識した標的分子は常に運動している（即ち、ブラウン運動）。従って、標的分子がこの微小視野領域内に進入する頻度および前記領域内に留まる時間に応じて、検出される蛍光強度が変化する。例えば、核酸の伸長が生じて見かけの分子量が増大すれば、標的分子の運動は遅くなり、見かけの分子数は減少する。その結果、微小視野領域内に入ってくる頻度は低下し、観察される蛍光強度が変化する。このような蛍光強度の変化をモニターすることにより、標的分子の見かけの分子量変化が追跡できる。
【００４８】
（３）蛍光相関分析装置
以下、本発明の方法において使用され得る蛍光相関分析装置の例を、図２を参照して説明する。図２に示すように、蛍光相関分光装置は、レーザー光源１１と、前記レーザー光源１１からの光ビームの強度を減弱する光強度調節手段（例えば、ＮＤフィルタなど）１２と、適切な光強度調節手段１２を設定する光減弱選択装置（例えば、ＮＤフィルタチェンジャーなど）１３と前記レーザ光源１１からの光ビームを前記試料に集光し、共焦点領域を形成する光学系１４、１５と、蛍光分子を含有する試料を載せたステージ１６と、前記試料からの蛍光を集光する光学系１７〜２１と、集光した蛍光を検出する光検出器２２と、蛍光強度の変化を記録する蛍光強度記録手段とからなる。このように、蛍光相関分析装置は、共焦点レーザ顕微鏡系を応用したものである。図２において、光源のレーザー１１は、アルゴンレーザー、ヘリウム−ネオンレーザー、クリプトン、ヘリウム−カドミウムなど、何れであってもよい。
【００４９】
図２において、レーザー光源１１からの光ビームを前記試料に集光し、共焦点領域を形成する光学系１４、１５は、例えば、ダイクロイックミラー１４、および対物レンズ１５である。レーザ光源１１からの光ビームは、図２中の矢印で示すような経路で、先ず、蛍光強度調節手段１２の減弱度に従ってその強度が減弱され、次いでダイクロイックミラー１４により入射光に対して９０度のステージ方向に屈折し、対物レンズ１５を通ってステージ１６上の試料標本１０に照射される。このようにして光ビームは、微小な１点で前記試料に集光され共焦点領域が形成される。本発明においてステージ１６の試料標本１０は、核酸を含む溶液である。
【００５０】
図２において、共焦点領域内の蛍光分子から放射された蛍光を集光する光学系１７〜２１は、具体的には、フィルタ１７、チューブレンズ１８を経て、反射鏡１９により屈折し、ピンホール２０に結像した後、レンズ２１を通過して光検出器２２に集光される。
【００５１】
集光された蛍光を検出する光検出器（例えば、アバランシャルフォトダイオードなど）２２は、受容した光信号を電気信号に変換し、蛍光強度記録手段（例えば、コンピュータ）２３に送信する。
【００５２】
蛍光強度の変化を記録する蛍光強度記録手段２３は、伝達された蛍光強度データの記録および／または解析を行う。具体的には、この蛍光強度データの解析により自己相関関数を設定する。蛍光分子（例えば、蛍光標識ヌクレオチド、インターカレーター、蛍光標識物質またはインターカレーターを取り込んだ増幅産物など）の動きによる分子量の増大および分子数の減少、あるいは蛍光分子のＤＮＡ特定領域への結合による分子数の減少などは、自己相関関数の変化により検出することができる。
【００５３】
上述のようなＦＣＳを行うための装置も本発明の範囲に含まれる。
【００５４】
（４）自動検出装置
更に、本発明により、光信号検出装置による増幅産物に関する情報を得ることをコンピュータを用いて管理しながら、２以上の段階的な反応に試料標本および反応液を供する状況において、そこにおいて所望の反応を行うための試料標本、反応液および必要とされる任意の試薬などを反応容器に分注することから、継時的且つ光学的な観察、並びにそれにより得たデータの解析までを自動で行う自動検出装置も提供される。
【００５５】
本発明の態様である自動検出装置において使用される光信号検出装置は、上述した何れの測定すべき分子に対して標識された標識物質の測定データに基づいて、見掛けの分子量が変わらずに当該標識物質が液相中に遊離しているのか、或いは増幅において取り込まれて見掛けの分子量が増加した状態で存在しているのかを、少なくとも判断し得るような測定および解析が行われ得るように構成されていることが重要である。そのような測定装置については、標識物質の分子量の運動力学的な計測を利用するのが好ましく、一例としては、複数の装置、即ち、経過時点での標識物質の位置変化を光学的に測定可能な装置であればよい。なお、本明細書においては、標識物質として蛍光物質を、また、測定方法としてはＦＣＳを用いた例について説明するが、本発明は蛍光物質およびＦＣＳに限定されるものではない。
【００５６】
そのような自動検出装置の例を図３に示す。即ち、そのような装置は、一般的に使用される構成要素（例えば、記憶部およびＲＡＭなど各種メモリ、メモリに収納されたプログラム、キーボードなどの入力部、並びにＣＰＵなどの制御部など）を備えるとともに結果などを表示するためのモニターなどの表示部を具備するコンピュータと、ＦＣＳ測定を行うためのＦＣＳ測定装置３１と、前記ＦＣＳ測定装置３１により得られたデータを解析するための解析装置３３と、反応容器３６に対して流体の添加を行う分注器３５と、反応容器３６内で２以上の反応を順次行うことができ、且つＦＣＳ測定の対象となる試料を維持する反応容器３６、前記反応の温度を制御する温度制御装置３２を具備し、且つそれらの構成要素は互いに接続され、夫々の動作は、予めコンピュータに記憶されたコンピュータにより利用できる種々のプログラムおよびデータなどに従ってコンピュータにより制御される。
【００５７】
ここで、温度制御装置３２は、少なくとも上述した試料標本２と核酸増幅用プライマー３とヌクレオチド４による核酸増幅反応に適切な温度を反応容器３６に対して提供するように制御を行う。特に、最初の反応段階であるハイブリダイゼーション反応および／または核酸の増幅反応が複数の異なる温度によって実行される場合には、温度制御装置３２は、高温への加温と低温への冷却の両方を適宜の時間設定に従って切り替えて実行するように制御される。更にまた、必要に応じて、所定の反応温度に恒温維持するように制御されてもよい。
【００５８】
一方、最初の反応段階であるハイブリダイゼーション反応および核酸の増幅反応が複数の異なる化学処理液によって実行される場合には、温度制御装置３２は、ハイブリダイゼーション反応と増幅反応など、所望される夫々の反応のそれぞれに適した所定の反応温度に恒温維持するように制御されてよい。それとともに、分注装置３５は、ハイブリダイゼーション反応および増幅反応、並びに所望の反応に必要な化学処理用の液体を、試料標本および／またはコントロール標本の混合液に作用させるよう分注するように制御されてよい。このようにして、２段階以上の異なる反応を含む核酸検査を適当な制御の下に簡便且つ迅速に実行することができる。
【００５９】
例えば、ＦＣＳ測定装置３１は、図２に示したＦＣＳ測定装置であってよく、且つそのステージ１６に温度制御装置３４を備えていてもよい。それによって、そこにおいて実施される増幅反応を行い、所望の時期にＦＣＳ測定を行うことが可能である。または容器３６への分注操作および所望の反応または処理をＦＣＳ測定装置３１の外部で行った後に、当該容器３６をＦＣＳ測定装置３１の測定部に輸送してもよい。このような自動検出装置も本発明の範囲に含まれる。
【００６０】
なお、図３では、当該自動検出装置に１つの分注手段が分注器３５として具備され、それにより各反応成分が分注処理される態様が図示されている。しかしながら、分注器３５として、２つ以上の分注手段が具備されてもよい。例えば、本体用において使用される分注手段は一般的に使用される如何なる分注手段であってよい。例えば、使用される試薬、試料標本２、核酸増幅用プライマー３および系ヌクレオチド４に対して、夫々、別個の分注手段を割り当てれば、コンタミネーションを防止することが可能であるので好ましい。また、分注処理のために、分注器３５を用いて、容器３６において行う２以上の反応に必要な試料標本および反応液並びに各種試薬を含む流体を順次添加することも可能である。
【００６１】
容器３６においては、２以上の反応、例えば、ハイブリダイゼーション反応、およ増幅反応などを、夫々に対して適切な条件（例えば、前述した温度）の下で順次行うことが可能である。
【００６２】
上述では、測定方法としてはＦＣＳを用いた例について説明したが、本発明の趣旨に従い、且つ標識物質とそれを測定するための測定装置を選択すれば、蛍光物質およびＦＣＳに限定されるものではない。例えば、蛍光物質に代わり、放射性同位元素および化学発光物質などの各種標識物質を使用したり、その偏光や共鳴エネルギーの変化を測定し得る標識物質を使用することが可能である。当該装置は、そのような物質に対応する装置を用いればよい。
【００６３】
また、ここで使用される「検出可能な信号」とは、使用する標識物質に応じて得られる検出可能な信号であれば何れの信号であればよく、例えば、光信号、放射性信号など、また、他の種々のエネルギー信号などであればよい。例えば、使用する標識物質が蛍光物質であれば蛍光信号、化学発光物質であれば化学発光信号、放射性同位元素であれば放射性信号などでよく、また、色素、偏光または共鳴エネルギーなどを検出可能な信号として利用してもよい。
【００６４】
本発明の態様に従うと、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法およびＬＡＭＰ法などの核酸増幅法で増幅された核酸の検出法において、核酸増幅時に使用されるヌクレオチド混合物（ｄＮＴＰ）の中に、蛍光標識されたヌクレオチドを混在させる。これによって、増幅された増幅産物である核酸には、蛍光標識された塩基が複数で取り込まれることになる。これによって、１分子当たり１個の蛍光分子しかついていない蛍光標識ヌクレオチドと、核酸増幅反応の増幅によって１分子当たり複数個の蛍光標識塩基が取り込まれて存在する核酸との間には、明らかに１分子当たりの蛍光強度という点で差が生じる。また、取り込まれる蛍光標識ヌクレオチドの量は、増幅された核酸の長さに略比例して多くなり、反応物として得られるものが長い増幅産物であるほど、多くの蛍光分子を含むこととなる。このように状態に応じて相違が存在する物質について、反応中および／または反応後に蛍光標識した構成要素分子の蛍光強度の違い、分布および分子数について追跡すれば、増幅産物に関する必要な情報を得ることが可能となる。
【００６５】
そのような情報を得る手段は、例えば、微小領域内の蛍光分子の蛍光強度を計測し、得られたデータを基に蛍光標識された分子の蛍光強度の分布、数に関連する情報を得ることができるＦＩＤＡであってもよい。または、そのような手段として、例えば、ＦＩＭＤＡを用いてもよい。ＦＩＤＡまたはＦＩＭＤＡを使用すれば、微小領域内の蛍光分子の蛍光強度を計測して得られたデータを基に、蛍光標識された分子の蛍光強度の分布、数に関連する情報を得ることと、微小領域内の蛍光分子の揺らぎを計測して得られたデータを基に、自己相関から、蛍光標識された分子の大きさや数に関する情報を得ることと、これらの両方を行うことが可能であるので好ましい。
【００６６】
これらの手段により、１分子当たりに１個の蛍光分子しか有さない蛍光標識ヌクレオチドと、増幅により複数の蛍光物質を取り込んだ増幅産物とを認識することが可能であり、且つそれぞれの存在分子数を計測することが可能である。これらの結果から、所望の増幅反応後に得られる反応物に関する情報および増幅産物に関する情報を明確に得ることが可能である。また、それによって目的とする標的塩基配列が、試料においてどのように存在しているのかを解析することが可能である。
【００６７】
また、本発明の態様において、標的塩基配列を、ゲノムおよび遺伝子内の変異や多型の存在する部位、または存在すると予測される部位とし、例えば、そのような部位がその塩基配列中に含まれるように核酸増幅用プライマーを設計することによって、即ち、変異および／または多型部位に特徴的な３’末端を有する核酸増幅用プライマーを使用することによって、当該増幅反応後に増幅の有無を検出することにより、試料に関する変異および多型の解析を行うことが可能である。即ち、増幅された核酸が検出されるか、検出されないかの違いによって、目的の変異または多型部位のタイピングや、変異の有無の検出を行うことが可能である。
【００６８】
また、本発明の態様に従えば、複数の標的塩基配列に対応する複数の核酸増幅用プライマーを使用することにより、複数の標的塩基配列に関する増幅産物に関する情報を一度に得ることが可能である。即ち、上述したように、取り込まれる蛍光標識ヌクレオチドの量は、増幅された核酸の長さに略比例して多くなり、反応物として得られるものが長い増幅産物であるほど多くの蛍光分子を含むこととなるので、１分子がどれくらいの明るさを持っているか、即ち、１分子当たりにどれくらいの蛍光物質が取り込まれているかを検出することこによって、複数集類の増幅産物が同時に存在していても、複数の増幅産物が存在するか否か、複数存在するならばそれらはどの位の割合で存在するか、夫々の長さはどれくらいなのかを推定することが可能である。それにより、複数の標的塩基配列に対応する増幅産物に関する情報、即ち、増幅された核酸分子の長さ、存在割合および分子数を定量的に得ることが可能である。また、それによって目的とする標的塩基配列が、試料においてどのように存在しているのかを解析することが可能であり、従って、所望の複数のゲノムおよび遺伝子領域に関する情報を一度に簡便に得ることが可能である。
【００６９】
更に、本発明に従うと、洗浄操作の必要のないホモジニアスな系で測定を行うことが可能であり、測定時間も数秒単位と非常に短い。また、測定時の容器に関しても、蛍光検出のための面が光透過性であれば、測定に影響がないために、容器全体の形状に制限がない。従って、多くの検体を扱うのに便利なマイクロプレートなどを使用することが可能であるので、多量のサンプルを容易に処理することが可能である。また、核酸増幅のための反応系を提供するための装置と、ＦＣＳ、ＦＩＤＡまたはＦＩＭＤＡなどの測定用の装置とを連絡することによって、連続的にサンプルを処理測定することが可能である。このような本発明に従う装置によって、試薬や試料標本などの移動を自動化可能であり、様々な形態の反応容器が使用でき、且つホモジニアスな系で、継時的または連続的に、大量のサンプルを迅速且つ簡便に解析することが可能である。
【００７０】
２．実施の形態２
本発明に従う増幅反応は、以下のように行うことも可能である。図４を用いて第２の実施の形態である増幅産物に関する情報を得る方法について説明する。
【００７１】
まず、所望の細胞などのゲノム、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む試料１から試料標本２を作製する。
【００７２】
次に、製作された試料標本２について、所望の標的塩基配列を増幅するために予め設計され準備された核酸増幅用プライマー３と、基質としてのヌクレオチド４が存在し、且つ適切な増幅が得られる条件下で増幅反応を行う。更に、増幅反応前、反応中または反応後に、インターカレーター試薬８を当該増幅反応系に添加する。
【００７３】
このとき使用されるインターカレーター試薬８は、二本鎖の核酸に対して取り込まれ得る物質であればよいが、特に、これらに限定されるものではない。
【００７４】
当該増幅反応の結果、試料標本２に標的塩基配列が存在しなければ核酸の増幅が起こらない。その場合、核酸増幅用プライマー３と、ヌクレオチド４と、試料標本２と、インターカレーター試薬８は、夫々独立してまたは一部結合した状態で存在する。
【００７５】
一方、試料標本２に標的塩基配列が存在する場合、当該増幅反応において増幅が生じる。その結果、インターカレーター試薬８を取り込んだ増幅産物９が得られる。このとき、増幅に供されなかった核酸増幅用プライマー３、ヌクレオチド４、試料標本２およびインターカレーター試薬８の一部分が独立して存在していてもよい。
【００７６】
更に、反応後の反応系における蛍光信号を観察することにより、増幅産物に関する情報を得ることが可能である。
【００７７】
例えば、蛍光信号の観察は、以下のように行えばよい。例えば、以上の一連の工程において、核酸増幅反応以前および／または核酸増幅反応中から核酸反応以後に亘り、蛍光物質からの蛍光信号の位置変化を断続的に複数の経過時点で、または継時的に連続して測定すればよい。更に、その結果を基に自己相関関数解析および／またはポアソン分布関数解析を行い、並進拡散時間および／または一分子のブライトネス（即ち、一分子の蛍光強度）と、分子数とを求める。それにより、増幅産物の有無、増幅産物の長さおよび増幅産物の量などの増幅産物に関する情報を得ることが可能である。
【００７８】
また、ここに記載した実施の形態２は、上述した実施の形態１と同様に変更してもよい。また、実施の形態１において記載した装置を用いて実施することが可能である。更に、当該実施の形態２の方法を実施の形態１の方法と組み合わせて実施してもよい。
【００７９】
本発明の態様に従うと、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法およびＬＡＭＰ法などの核酸増幅法で増幅された核酸の検出法において、核酸増幅後の増幅産物に対して、二本鎖の核酸にインターカレートされると蛍光を発するような物質を加えることにより、増幅により生じた二本鎖を選択的に、且つその増幅産物の構成に応じて標識することが可能である。また、取り込まれる蛍光標識ヌクレオチドの量は、増幅された核酸の長さに略比例して多くなり、反応物として得られるものが長い増幅産物であるほど多くの蛍光分子を含むこととなる。このように状態に応じて相違が存在する物質を、反応中および／または反応後に蛍光標識した構成要素分子の蛍光強度の違い、分布および分子数について追跡すれば、増幅産物に関する必要な情報を得ることが可能となる。
【００８０】
そのような情報を得る手段は、例えば、微小領域内の蛍光分子の蛍光強度を計測し、得られたデータを基に蛍光標識された分子の蛍光強度の分布、数に関連する情報を得ることができるＦＩＤＡであってもよい。また、そのような手段は、例えば、ＦＩＭＤＡであってもよい。ＦＩＤＡまたはＦＩＭＤＡを使用すれば、微小領域内の蛍光分子の蛍光強度を計測して得られたデータを基に、蛍光標識された分子の蛍光強度の分布、数に関連する情報を得ることと、微小領域内の蛍光分子の揺らぎを計測して得られたデータの自己相関から蛍光標識された分子の大きさや数に関する情報を得ることと、これらの両方を行うことが可能であるので好ましい。
【００８１】
増幅により生じた二本鎖によって取り込まれた蛍光物質の有無、または量および分布により、増幅産物の有無や長さおよび配列などを導き出することが可能である。即ち、本発明に従うと、所望の増幅反応後に得られる反応物に関する情報および増幅産物に関する情報を明確に得ることが可能である。また、それによって目的とする標的塩基配列が、試料においてどのように存在しているのかを解析することが可能である。
【００８２】
また、本発明の態様において、標的塩基配列を、ゲノムおよび遺伝子内の変異や多型の存在する部位、または存在すると予測される部位とし、且つそのような部位がその塩基配列中に含まれるように核酸増幅用プライマーを設計することによって、即ち、変異および／または多型部位に特徴的な３’末端を有する核酸増幅用プライマーを使用することによって、当該増幅反応後に増幅の有無を検出することにより、試料に関する変異および多型の解析を行うことが可能である。即ち、増幅された核酸が検出されるか、検出されないかの違いによって、目的の変異または多型部位のタイピングや、変異の有無の検出を行うことが可能である。
【００８３】
また、本発明の態様に従えば、複数の標的塩基配列に対応する複数の核酸増幅用プライマーを使用することにより、複数の標的塩基配列に関する増幅産物に関する情報を一度に得ることが可能である。即ち、上述したように、取り込まれるインタカレータの量は、増幅された核酸の長さに略比例して多くなり、反応物として得られるものが長い増幅産物であるほど多くの蛍光分子を含むこととなるので、１分子がどれくらいの明るさを持っているか、即ち、１分子当たりにどれくらいのインターカレーターが取り込まれているかを検出することこによって、複数集類の増幅産物が同時に存在していても、複数の増幅産物が存在するか否か、複数存在するならばそれらはどの位の割合で存在するか、夫々の長さはどれくらいなのかを推定することが可能である。それにより、複数の標的塩基配列に対応する増幅産物に関する情報、即ち、増幅された核酸分子の長さ、存在割合および分子数を定量的に得ることが可能である。また、それによって目的とする標的塩基配列が、試料においてどのように存在しているのかを解析することが可能であり、従って、所望の複数のゲノムおよび遺伝子領域に関する情報を一度に簡便に得ることが可能である。
【００８４】
更に、本発明に従うと、洗浄操作の必要のないホモジニアスな系で測定を行うことが可能であり、測定時間も数秒単位と非常に短い。また、測定時の容器に関しても、蛍光検出のための面が光透過性であれば、測定に影響がないために、容器全体の形状に制限がない。従って、多くの検体を扱うのに便利なマイクロプレートなどを使用することが可能であるので、多量のサンプルを容易に処理することが可能である。また、核酸増幅のための反応系を提供するための装置と、ＦＣＳ、ＦＩＤＡまたはＦＩＭＤＡなどの測定用の装置とを連絡することによって、連続的にサンプルを処理測定することが可能である。このような本発明に従う装置によって、試薬や試料標本などの移動を自動化可能であり、様々な形態の反応容器が使用でき、且つホモジニアスな系で、継時的または連続的に、大量のサンプルを迅速且つ簡便に解析することが可能である。
【００８５】
【発明の効果】
以上のような本発明により、増幅産物に関する情報を迅速且つ簡便に得ることが可能な方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１である核酸の増幅産物に関する情報を得る方法を示すスキーム。
【図２】本発明に従う装置の１例を示す模式図。
【図３】本発明に従う装置の１例を示す模式図。
【図４】本発明の実施の形態２である核酸の増幅産物に関する情報を得る方法を示すスキーム。
【符号の説明】
１．試料    ２．試料標本    ３．核酸増幅用プライマー    ４．ヌクレオチド５．蛍光標識ヌクレオチド    ６．蛍光物質    ７．増幅産物    ８．インターカレーター    ９．増幅産物    １０．試料標本    １１．レーザー光源  １２．光強度調節手段    １３．光減衰選択装置    １４．ダイクロイックミラー    １５．対物レンズ    １６．ステージ    １７．フィルター    １８．チューブレンズ    １９．反射鏡    ２０．ピンホール    ２１．レンズ    ２２．光検出器    ２３．蛍光強度記録手段    ２４．蛍光強度減衰率検出手段  ３１．ＦＣＳ測定装置    ３２．温度制御装置    ３３．解析装置    ３４．温度制御装置    ３５．分注器    ３６．容器
【図１】
2004187607.tif 000003
【図２】
2004187607.tif 000004
【図３】
2004187607.tif 000005
【図４】
2004187607.tif 000006