(57)【要約】【課題】植物の分裂組織における細胞分裂機構や分裂組織の維持機構に関与する分子を同定し、それを利用して植物の生長を制御することにある。【解決手段】シロイヌナズナＴ−ＤＮＡタグラインを利用して、根端で特異的に発現するシロイヌナズナ遺伝子（ＡｔＧＣＮ２０−３）を同定した。ＡｔＧＣＮ２０−３遺伝子の破壊株の表現型の解析から、この遺伝子が根の伸長に関与していることが判明した。さらに、ＡｔＧＣＮ２０−３と相互作用する蛋白質をコードする遺伝子（ＡｔＧＣＮ１）を同定した。ＡｔＧＣＮ１遺伝子の破壊株の表現型の解析から、この遺伝子も、ＡｔＧＣＮ２０−３遺伝子破壊株と同様に、根の伸長に関与していることが判明した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の根の伸長を誘導する活性を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と結合する活性を有する蛋白質をコードする、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
植物の根の伸長を誘導する活性を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と結合する活性を有する蛋白質をコードする、請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
植物の根の伸長を抑制する活性を有する、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）請求項１または３に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｂ）請求項１または３に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｃ）植物細胞における発現時に、ＲＮＡｉ効果により、請求項１または３に記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｄ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、請求項１または３に記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項８】
請求項１から５のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項７に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡを有効成分として含有する、植物の根の伸長誘導剤。
【請求項１３】
請求項５に記載のＤＮＡを有効成分として含有する、植物の根の伸長抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の根の伸長を制御する活性を有するＤＮＡおよびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シロイヌナズナの全塩基配列が決定され、ゲノム上に約２５，０００の遺伝子が予測されている。これら遺伝子の個々の機能を明らかにするため、大規模な遺伝子挿入ライン（タグライン）から遺伝子破壊株を単離し、その機能を調べることが重要な手法の１つになっている（Ｆｅｌｄｍａｎｎ，  Ｋ．  Ａ．  （１９９１）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １，  ２７３−２８９．）。タグラインはＴ−ＤＮＡあるいはトランスポゾンの挿入により作出されるが、挿入する遺伝子を変えることにより遺伝子破壊以外の効果を期待することも可能である。たとえば、挿入する遺伝子にレポーター遺伝子を用いれば、挿入先の遺伝子破壊を行えるだけでなく、挿入先遺伝子の発現パターンを調べることも可能となる（ジーン・エンハンサートラップ法：Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  ＧｅｎｅｓＤｅｖ．  ９，  １７９７−１８１０．）。このような手法を用いた解析の例として、植物の細胞分裂に関わる遺伝子の単離（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｐ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８，  ８７７−８８０）や、さやの形成に関わる遺伝子の単離（Ｇｕ，  Ｑ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５，  １５０９−１５１７．）があげられる。したがって多数のレポーター遺伝子を挿入したラインを作製し、そこからある器官・組織における遺伝子発現パターンを指標に解析を行うことにより、新規な遺伝子機能の同定が期待できる。
【０００３】
植物は茎頂と根端の分裂組織で細胞分裂を繰り返し新しい器官を生み出していく。この新しい器官が分化することによって植物の基本構造ができあがり、植物生長を維持している。これまでに茎頂分裂組織形成に関わる遺伝子として、ＷＵＳＣＨＥＬ  （ＷＵＳ：  Ｍａｙｅｒ，  Ｋ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｃｅｌｌ  ９５，  ８０５−８１５．），  ＣＵＰ−ＳＨＡＰＥＤ  ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ１，  ２  （ＣＵＣ１，  ２：  Ａｉｄａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９，  ８４１−８５７．，  Ｔａｋａｄａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８，  １１２７−１１３５．），  ＳＨＯＯＴ  ＭＥＲＩＳＴＥＭＬＥＳＳ  （ＳＴＭ：  Ｌｏｎｇ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７９，  ６６−６９．）が、また根端分裂組織で発現する遺伝子としてｒｏｏｔ  ｍｅｒｉｓｔｅｍｌｅｓｓ  １  （ｒｍｌ１：  Ｖｅｒｎｏｕｘ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  １２，  ９７−１１０．），  ｆａｓｃｉａｔａ（Ｋａｙａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｅｌｌ  １０４，  １３１−１４２．）などが単離されている。
しかしながら、分裂組織における細胞分裂さらには細胞伸長の機構については不明な点が多い。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｆａｇａｒｄ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２，  ２４０９−２４２４．
【非特許文献２】
Ｖａｎ  Ｈｅｎｇｅｌ，  Ａ．  Ｊ．  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｋ，  （２００２）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３２，  １０５−１１３．
【非特許文献３】
Ｇｏｌｄｅｎ，  Ｔ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｐｌｎａｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３０，  ８０８−８２２．
【非特許文献４】
Ｒｅｉｓｅｒ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｃｅｌｌ  ８３，  ７３６−７４２．
【非特許文献５】
Ｂｙｚｏｖａ，  Ｍ．  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １３，  １００２−１０１４．
【非特許文献６】
Ｅｌｌｉｏｔｔ，  Ｒ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８，  １５５−１６８．
【非特許文献７】
Ｓｋｉｎｎｅｒ，  Ｄ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３，  ２７１９−２７３０．
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物の分裂組織における細胞分裂機構や分裂組織の維持機構に関与する分子を同定し、同定された分子を利用して植物の生長を制御することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために、まず、シロイヌナズナＴ−ＤＮＡタグラインを作製し、Ｔ−ＤＮＡ部分に挿入したＧＵＳ遺伝子を指標として、根端で特異的にＧＵＳ遺伝子を発現するラインを同定した。さらに、Ｔ−ＤＮＡに特異的なプライマーを用いたｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ  （ＩＰＣＲ）を行い、このラインに挿入されたＴ−ＤＮＡに隣接するシロイヌナズナ遺伝子を同定した（「ＡｔＧＣＮ２０−３」と銘々した）。この遺伝子をホモで破壊したラインを作製して、その表現型を解析した結果、野生株に比べて根の伸長が著しく抑制されることが判明した。さらに、本発明者は、ＡｔＧＣＮ２０−３と相互作用する蛋白質をコードする遺伝子を同定し（「ＡｔＧＣＮ１」と銘々した）、その遺伝子をホモで破壊したラインを作製して、その表現型を調べたところ、ＡｔＧＣＮ２０−３遺伝子が破壊されたラインと同様に、野生株に比べて根の伸長が著しく抑制されることが判明した。また、このラインでは、地上部がブッシュ状になり、種子は形成されず不稔となった。これら事実から、ＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１は、根端において複合体を形成して根の伸長を制御していること考えられ、また、地上部においては茎頂で発現して形態形成に関与し、さらには生殖過程に重要な役割を果たしていることが示唆された。従って、ＡｔＧＣＮ２０−３やＡｔＧＣＮ１（あるいはシロイヌナズナ以外の植物の対応遺伝子）の発現や機能を制御することにより、植物の根の伸長を増大させることが期待できる。またＡｔＧＣＮ１遺伝子は生殖過程に必要であることから、ＡｔＧＣＮ１遺伝子（あるいはシロイヌナズナ以外の植物の対応遺伝子）の発現や機能を制御することにより、生殖過程を制御することも期待できる。
【０００７】
本発明は、より詳しくは、下記（１）から（１３）に記載された発明に関する。
（１）  植物の根の伸長を誘導する活性を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（２）  配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と結合する活性を有する蛋白質をコードする、（１）に記載のＤＮＡ。
（３）  植物の根の伸長を誘導する活性を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（４）  配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と結合する活性を有する蛋白質をコードする、（３）に記載のＤＮＡ。
（５）  植物の根の伸長を抑制する活性を有する、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）（１）または（３）に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｂ）（１）または（３）に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｃ）植物細胞における発現時に、ＲＮＡｉ効果により、（１）または（３）に記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｄ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、（１）または（３）に記載のＤＮＡの発現を抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（６）  （１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
（７）  （１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
（８）  （１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（７）に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
（９）  （８）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
（１０）  （９）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
（１１）  （９）または（１０）に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
（１２）  （１）から（４）のいずれかに記載のＤＮＡを有効成分として含有する、植物の根の伸長誘導剤。
（１３）  （５）に記載のＤＮＡを有効成分として含有する、植物の根の伸長抑制剤。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物の根の伸長を誘導する活性を有する植物由来のタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明者らにより単離されたＡｔＧＣＮ２０−３  ゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ゲノムＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また、ＡｔＧＣＮ１  ゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に、該ゲノムＤＮＡがコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。遺伝子破壊株の表現型の解析と酵母Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ系を利用した相互作用の解析により、ＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１が、根端において複合体を形成して根の伸長を制御していることが判明した。このため、ＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１の遺伝子あるいは他の植物の対応遺伝子を操作することにより、根の伸長を制御することが期待できる。根は水分・養分を吸収し地上部にこれらを供給する重要な器官であるため、根の増大は植物体全体の生育を増大させ、植物の生長量を増大させることにつながると期待できる。生長量が２倍になれば生産量も２倍になることから、今後の食料生産においても有用な技術となると考えられる。一方、根の伸長の抑制は、例えば、雑草などの有害作物の生長を抑制したり、植物体の土壌からの回収（引抜き）を容易にするなどの利点が考えられる。
【０００９】
またＡｔＧＣＮ１遺伝子は、その破壊株の表現型の解析から、地上部においては茎頂で発現して形態形成に関与し、さらには生殖過程に重要な役割を果たしていると考えられる。従って、ＡｔＧＣＮ１遺伝子あるいは他の植物の対応遺伝子の操作により、生殖過程を制御することも期待できる。
【００１０】
本発明において、「植物の根の伸長を誘導する活性」とは、植物内で目的のＤＮＡがコードする蛋白質を発現させた場合に、該蛋白質が植物の根の伸長を誘導する活性を意味する。また、該活性は、植物における目的のＤＮＡの発現や機能を阻害した場合に、該植物の根の伸長が抑制される活性として評価することもできる。植物における目的のＤＮＡの発現や機能の阻害は、例えば、本実施例に記載の遺伝子破壊株の作製や後述するアンチセンス技術の利用により行うことができる。
【００１１】
本発明のＤＮＡの由来する植物および本発明のＤＮＡが導入されることで根の伸長を制御する植物としては、特に制限はない。本実施例において用いたシロイヌナズナの他、例えば、イネ、ダイズ、ユーカリ、ポプラなどが挙げられる。根の伸長を制御するＤＮＡを取得しうる植物および該ＤＮＡを利用して根の伸長を制御しうる植物であれば、本発明を適用可能である。
【００１２】
本発明において、植物の根の伸長を誘導する活性を有する植物由来のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：１または３に記載の塩基配列（それぞれＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１のゲノムＤＮＡ配列）のコード領域を含むＤＮＡや配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列（それぞれＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１のアミノ酸配列）からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００１３】
また、本発明は、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（それぞれＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１）と構造的に類似しており、植物の根の伸長を誘導する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。このようなＤＮＡには、例えば、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アリル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００１４】
本発明者らによって単離されたＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１は、互いに結合する活性を有しており、この結合による複合体の形成により、植物内において機能を発現すると考えられる。従って、ＡｔＧＣＮ２０−３の構造類似体は、好ましくはＡｔＧＣＮ１と結合する活性を有し、また、ＡｔＧＣＮ１の構造類似体は、好ましくはＡｔＧＣＮ２０−３と結合する活性を有する。蛋白質同士の結合活性は、例えば、実施例に記載の酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ系を利用して検出することが可能である。
【００１５】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ  ＆  Ｆｒｉｔｚ  Ｈ−Ｊ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４：  ３５０，  １９８７）が挙げられる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得る。このように、天然型タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても、植物の根の伸長を誘導する活性を有する限りは、本発明のＤＮＡに含まれる。また、たとえ塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わないこと（縮重変異）があるが、このような縮重変異体も本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１６】
ＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１と構造的に類似し、機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＥＭ：  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９８：  ５０３，  １９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ  ＲＫ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：  １３５０，  １９８５、Ｓａｉｋｉ  ＲＫ，ｅｔ  ａｌ：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：  ４８７，  １９８８）を利用する方法が挙げられる。すなわち、ＡｔＧＣＮ２０−３やＡｔＧＣＮ１のゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号：１もしくは３）、または、その一部をプローブとして、また、ＡｔＧＣＮ２０−３やＡｔＧＣＮ１のゲノムＤＮＡの塩基配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、シロイヌナズナや他の植物から、ＡｔＧＣＮ２０−３やＡｔＧＣＮ１をコードするＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得るＡｔＧＣＮ２０−３やＡｔＧＣＮ１の構造的・機能的類似体をコードするＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１７】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できると期待される。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００１８】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，  １９９０、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：  ５８７３，  １９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：  ４０３，  １９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００１９】
本発明のＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段により行うことができる。ゲノムＤＮＡは、例えば、シロイヌナズナ品種からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作製し、これを展開して、本発明のＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで調製できる。また、本発明のＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行って調製することも可能である。ｃＤＮＡは、例えば、シロイヌナズナ品種から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰなどのベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで、またＰＣＲを行うことにより調製できる。
【００２０】
また、本発明は、本発明のＤＮＡによりコードされるタンパク質を提供する。該タンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することができる。組換えタンパク質の製造は、例えば、下記のようにして行なうことができる。まず、ｐＭＡＬ−ｃ２発現ベクター（ＮＥＢ社）のマルチクローニングサイトに対し、予め制限酵素サイトを設けたプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより合成した本発明のＤＮＡをサブクローニングする。この構築物を、定法により、ＢＬ２１（プロテアーゼ欠失株）に形質転換する。これにより得られる形質転換体を用いてタンパク質の誘導を行う。大腸菌は、２ｘＹＴ、０．２％グルコースの培地で３７℃振とう培養する。ＯＤ６００が０．６前後になったところで、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように加え、更に１８℃で２４時間培養する。酵素液の抽出に関しては、培養後、集菌し、これをｓｕｓｐｅｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ８．０，  １０％グリセロール，  ２ｍＭ  ＤＴＴ，  １ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム）に懸濁する。懸濁液を４℃にて３０分放置後、−８０℃にて、凍結するまでインキュベートする。凍結した懸濁液を解凍し、ＳＯＮＩＣＡＴＯＲ（ＨＥＡＴ  ＳＹＳＴＥＭＳ−ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣＳ，ＩＮＣ．ＭＯＤＥＬ  Ｗ−２２５Ｒ）を用いて、ＭＡＸレベルにて、３０秒間、５分のインターバルをおき、２回超音波処理を行う。処理した懸濁液を遠心（１５，０００ｒｐｍ，  ４℃，  ２０分）し、その上清を粗酵素液とすることができる。
【００２１】
また、精製タンパク質の調製は、例えば、本発明のＤＮＡがコードするタンパク質をヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合した形態で大腸菌などで発現させ、これをそれぞれニッケルカラム、アミロースカラム、ＧＳＴ−グルタチオンカラムにて精製することにより行なうことができる。さらに、精製後は、必要に応じて、スロンビンやファクターＸａなどの制限プロテアーゼを利用して上記タグを切り離すこともできる。また、天然のタンパク質の場合は、例えば、調製した組み換えタンパク質若しくはその部分ペプチドを適当な免疫動物に免疫することにより調製した抗体を結合したアフィニティーカラムに、本発明のタンパク質を発現しているイネの組織などから調製した抽出液を接触させて、該カラムに結合するタンパク質を精製することにより調製することができる。
【００２２】
また、本発明のＤＮＡは、植物の根の伸長を誘導（あるいは促進）する薬剤として用いることができる。根の伸長が誘導された形質転換植物体を作製するには、上記ＤＮＡを適当なベクターに挿入して、後述する方法で、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させればよい。
【００２３】
本発明のＤＮＡの発現を抑制することにより、植物の根の伸長を抑制することもできる。根の伸長が抑制された形質転換植物体は、例えば上記本発明のＤＮＡの発現を抑制するＤＮＡを適当なベクターに挿入して、後述する方法で、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることによって作製できる。このように、本発明のＤＮＡの発現を抑制するＤＮＡは、植物の根の伸長を抑制する薬剤として利用可能である。
【００２４】
本発明における「ＤＮＡの発現の抑制」には、該ＤＮＡの転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。また、翻訳されたタンパク質が植物細胞内で本来の機能を発揮しないことも含まれる。
【００２５】
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、電気穿孔法で導入したアンチセンスＲＮＡが植物においてアンチセンス効果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された（Ｅｃｋｅｒ  ＪＲ  ＆  Ｄａｖｉｓ  ＲＷ：  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：  ５３７２，  １９８６）。その後、タバコやペチュニアにおいてもアンチセンスＲＮＡの発現により標的遺伝子の発現が低下した例が報告されており（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ＡＲ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｎａｔｕｒｅ  ３３３：  ８６６，  １９８８）、現在では、アンチセンス技術は植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００２６】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上：  新生化学実験講座２  核酸ＩＶ  遺伝子の複製と発現  （日本生化学会編，  東京化学同人）  ｐｐ．３１９−３４７，  １９９３）。
【００２７】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法を用いることで、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換される植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンスＤＮＡの長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００２８】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことを指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ  Ｐに含まれるＭ１  ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子：  蛋白質核酸酵素，  ３５：  ２１９１，  １９９０）。
【００２９】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ：  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２２８：  ２２８，  １９８８）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（ＫｏｉｚｕｍｉＭ，  ｅｔ  ａｌ：  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２３９：  ２８５，  １９８８、小泉誠および大塚栄子：  蛋白質核酸酵素  ３５：  ２１９１，  １９９０、  Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：  ７０５９，  １９８９）。例えば、ＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１をコードするＤＮＡ（配列番号：１または３）中には、標的となり得る部位が複数存在する。
【００３０】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ  ＪＭ：  Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：  ３４９，  １９８６）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｙ  ＆Ｓａｓａｋｉ  Ｎ：  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：  ６７５１，  １９９１、菊池洋：  化学と生物  ３０：  １１２，  １９９２）。
【００３１】
標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたＲＮＡの５’端や３’端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側にシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｔａｉｒａ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ３：  ７３３，  １９９０、Ｄｚｉａｎｏｔｔ  ＡＭ  ＆  Ｂｕｊａｒｓｋｉ  ＪＪ：  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：  ４８２３，  １９８９、Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ  ＣＡ  ＆  Ｃｅｃｈ  ＴＲ：  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：  ３８７５，  １９９１、Ｔａｉｒａ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：  ５１２５，  １９９１）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １８６：  １２７１，  １９９２）。このように、リボザイムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３２】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ（ＲＮＡｉ）によっても行うことができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ＲＮＡｉの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖ＲＮＡが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。ＲＮＡｉは植物においても効果を奏することが知られている（Ｃｈｕａｎｇ  ＣＦ  ＆  Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ  ＥＭ：  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：  ４９８５，  ２０００）。例えば、植物体における本発明のＤＮＡの発現をＲＮＡｉにより抑制するためには、本発明のＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３に記載のＤＮＡ）またはこれと類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを目的の植物へ導入し、得られた植物体から野生型植物体と比較して根の伸長が抑制された植物を選択すればよい。ＲＮＡｉに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
【００３３】
内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するＤＮＡの形質転換によって起こる共抑制によっても達成できる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、少なくともその機構の一部はＲＮＡｉの機構と重複していると考えられている。共抑制は植物においても観察される（Ｓｍｙｔｈ  ＤＲ：  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ７：  Ｒ７９３，  １９９７、Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ  Ｒ：  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ６：  ８１０，  １９９６）。例えば、本発明のＤＮＡの発現が共抑制された植物体を得るためには、本発明のＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３に記載のＤＮＡ）またはこれと類似した配列を有するＤＮＡを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から野生型植物体と比較して根の伸長が抑制された植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
【００３４】
本発明の形質転換植物体は、本発明のＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させることにより製造することができる。本発明において、植物細胞が由来する植物としては、特に制限はない。また、植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。ここで言う「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００３５】
植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。アグロバクテリウム（例えば、ＥＨＡ１０１）を介する方法においては、例えば、超迅速単子葉形質転換法（特許第３１４１０８４号）を用いることが可能である。また、パーティクルガン法においては、例えば、バイオラッド社のものを用いることが可能である。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
【００３６】
例えば、シロイヌナズナにおいて形質転換植物体を作出する手法については、バキューム法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ，  Ｎ．  ＆  Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，  Ｇ．  （１９９８）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８２，２５９−２６６）・Ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法（Ｃｌｏｕｇｈ，  Ｓ．  Ｊ．  ＆  Ｂｅｎｔ，  Ａ．  Ｆ．  （１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １６，  ７３５−７４３）が、ポプラにおいて形質転換植物体を作出する手法については、アグロバクテリウムを用いる方法（Ｌｅｐｌｅ，  Ｊ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１１，  １３７−１４１）などがあげられる。また、例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ  ＳＫ：  Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ  （Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，  Ｅｄｓ）  ｐｐ．６６−７４，  １９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １００：  １５０３，  １９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：  ９５７，  １９９１）、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ６：  ２７１，  １９９４）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００３７】
ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００３９】
［実施例１］    シロイヌナズナＴ−ＤＮＡタグラインの作製
Ｔ−ＤＮＡタグライン作製のために新たなベクターを構築した。ベクターにはバイナリーベクターであるＴＡＣベクター（Ｌｉｕ，  Ｙ．  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｒｏｔ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６，  ６５３５−６５４０．）を用い、Ｔ−ＤＮＡ部分にはレポーター遺伝子としてＧＵＳ遺伝子、挿入位置近傍遺伝子破壊のためにトランスポゾンＤｓを組み込んだ。またトランスポゾンＤｓの中には、トランスポゾン転移後に働くレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子も組み込んでいる。この新たに構築したベクターをアグロバクテリウムに導入し、バキューム法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ，  Ｎ．  ＆  Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，  Ｇ．  （１９９８）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８２，  ２５９−２６６．）によりシロイヌナズナコロンビア株を形質転換して、５０，０００のＴ−ＤＮＡタグラインを作製した。得られた形質転換体は、ジーントラップ、エンハンサートラップが可能である。
【００４０】
［実施例２］    根端で発現が見られるラインの単離
根端分裂組織で機能する遺伝子を同定するため、作製したライン２０，０００ラインについてＧＵＳ染色を行い、遺伝子の発現パターンを調べた。ラインＮｏ．  ＫＧ１０５７０はＧＵＳの発現が根端で特異的に見られたため、さらに解析を進めた。
【００４１】
［実施例３］    ＧＵＳ遺伝子の発現を制御しているシロイヌナズナ遺伝子の同定
ＧＵＳの発現は、Ｔ−ＤＮＡが挿入された位置に存在するシロイヌナズナタンパク質との融合タンパク質として得られているものである。したがってＴ−ＤＮＡに隣接するシロイヌナズナの遺伝子を解析すれば、ＧＵＳ遺伝子の発現を制御しているシロイヌナズナ遺伝子が同定できることになる。ＫＧ１０５７０ライン（Ｔ２世代）１６個体からＤＮＡを抽出し、このＤＮＡ  を鋳型にＴ−ＤＮＡに特異的なプライマーを用いてｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）を行った。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、Ｔ−ＤＮＡに隣接するシロイヌナズナ遺伝子を決定した。ＫＧ１０５７０においてＧＵＳ遺伝子の発現を制御していたのはＡＢＣタンパク質遺伝子であった。この遺伝子は、酵母がアミノ酸欠乏状態のときに発現する遺伝子の１つＧＣＮ２０  （Ｖａｚｑｕｅｚ  ｄｅ  Ａｌｄａｎａ，  Ｃ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４，  ３１８４−３１９９．）  と相同性を持っていた。そこでこの遺伝子をＡｔＧＣＮ２０−３（Ａｔ１ｇ６４５５０）と名付けた。
【００４２】
［実施例４］    遺伝子破壊株の表現型の解析
ＫＧ１０５７０において、ＧＵＳ遺伝子はＡＢＣタンパク質遺伝子と融合遺伝子を作って発現しているが、同時にＴ−ＤＮＡはこのＡＢＣタンパク質遺伝子を破壊していることになる。ＡｔＧＣＮ２０−３遺伝子がホモで破壊されているラインを単離し、根の伸長速度を野生株（コロンビア）と比較した。その結果ＡｔＧＣＮ２０−３が破壊されているラインは、野生株に比べて根の伸長が著しく抑制されており、ＡｔＧＣＮ２０−３は根の伸長に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。さらにこのことを確かめるために、５０，０００のＴ−ＤＮＡタグラインからＡｔＧＣＮ２０−３の遺伝子破壊株の単離を行った。遺伝子破壊株の単離は、Ｔ−ＤＮＡタグラインから抽出したＤＮＡを適当な数だけプールし、そのＤＮＡプールを鋳型に目的の遺伝子に特異的なプライマーとＴ−ＤＮＡのボーダー配列に特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより、遺伝子断片が増幅されるかどうかで確認できる。このようにしてＴ−ＤＮＡタグラインのスクリーニングを行ったところ、ＡｔＧＣＮ２０−３の遺伝子破壊株としてＫＧ１０５７０の他に３ラインを単離することができた。これらのラインの根の伸長速度を調べたところ、ＫＧ１０５７０と同様野生株に比べて根の伸長が著しく抑制されていることが明らかとなった。
【００４３】
［実施例５］  酵母ＧＣＮ２０と相互作用する酵母ＧＣＮ１のシロイヌナズナオルソログの解析
酵母はアミノ酸欠乏状態において、ＧＣＮ４という転写因子の翻訳を調節することにより、通常は合成を行わないアミノ酸の合成を開始する（Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｐ．  Ｐ．  ＆  Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ，  Ａ．  Ｇ．  （１９８６）  Ｃｅｌｌ  ４５，  ２０１−２０７．）。ＧＣＮ２０はＧＣＮ１というタンパク質（Ｍａｒｔｏｎ，  Ｍ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３，  ３５４１−３５５６．）と複合体を作り、ＧＣＮ２というタンパク質リン酸化酵素を活性化することにより、ｅＩＦ２αという翻訳開始因子の５１番目のセリン残基をリン酸化する（Ｄｅｖｅｒ，  Ｔ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｃｅｌｌ  ６８，  ５８５−５９６．）。このリン酸化されたｅＩＦ２αは、翻訳開始に必要な３量体複合体（ｅＩＦ２・ＧＴＰ・Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔ）への結合から阻害因子であるｅＩＦ２Ｂへと結合を変換する。ｅＩＦ２αがｅＩＦ２Ｂと結合すると翻訳開始に必要な３量体複合体が減少し、多くのタンパク質の翻訳が阻害される。ＧＣＮ４遺伝子は開始メチオニンの前に短いＯＲＦが４つ存在し、通常３量体複合体が多く存在するときは、ｕＯＲＦ１の翻訳後３量体複合体は解離するがリボゾームはさらにｍＲＮＡをスキャンし、３量体複合体がすぐに結合してｕＯＲＦ４の翻訳を行う。ｕＯＲＦ４の翻訳後はリボゾームがＧＣＮ４ｍＲＮＡから解離し、ＧＣＮ４ｍＲＮＡの翻訳はおこらない。しかし３量体複合体の量が少ない場合、ｕＯＲＦ１の翻訳後３量体複合体の解離に続いてリボゾームはｍＲＮＡをスキャンするが、ｕＯＲＦ４の翻訳までに３量体複合体が供給されず、さらにｍＲＮＡをスキャンする。３量体複合体はリボゾームがＧＣＮ４ｍＲＮＡの開始メチオニンに達するまでに供給され、ＧＣＮ４ｍＲＮＡの翻訳が行われる。このＧＣＮ４ｍＲＮＡの翻訳にともない、アミノ酸合成系の遺伝子の転写がおこり、酵母はアミノ酸合成を開始する。以上のことからＧＣＮ２０はＧＣＮ１と複合体を形成し、機能していることがわかる。そこでシロイヌナズナにおいてもＧＣＮ２０とＧＣＮ１が複合体を形成し機能しているかどうか興味がもたれた。
【００４４】
シロイヌナズナのゲノム上にＧＣＮ１のオルソログが存在するかどうか検索したところ、１コピー存在することが明らかとなった。この遺伝子をＡｔＧＣＮ１（Ａｔ１ｇ６４７９０）と名付けた。次にこの遺伝子の破壊株を単離するためＴ−ＤＮＡタグラインのスクリーニングを行い、８ラインの遺伝子破壊株を単離した。これらのラインの中には、ＧＣＮ１とＧＵＳとの融合タンパク質を発現しているラインが含まれている可能性があるため、ＧＵＳ染色によるＧＵＳの発現を調べた。その結果、ＫＧ４０９２２がＧＵＳを発現しているラインとして単離された。ＫＧ４０９２２のＧＵＳの発現は、根端、茎頂、雌ずいで見られ、ＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１の根における発現パターンは一致していることがわかった。このことはＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１が複合体を作っていることを示唆するものである。ＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１が複合体を作っていることを確かめるため、酵母Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法により解析を行った。その結果ＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１は酵母内で特異的に結合することが明らかとなった。このことはＡｔＧＣＮ２０−３とＡｔＧＣＮ１が複合体を作っていることを強く示唆する結果である。さらにＡｔＧＣＮ１遺伝子破壊株の表現型を調べたところ、Ｎ末端側にＴ−ＤＮＡが挿入された３ラインで変化が見られた。ＡｔＧＣＮ１遺伝子がホモで壊れたラインは、野生株に比べて根の伸長が著しく抑制されていることがわかった。さらに地上部はブッシュ状になり、種子は形成されず不稔となった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により植物の根の伸長を制御する機能を有する遺伝子が提供された。これら遺伝子を操作することにより、根の伸長を制御することができるため、例えば、有用農作物の生育を増大させ、その生産量の向上を図ること可能である。従って、本発明は、今後の食料生産においても有用な技術となると考えられる。また、本発明の遺伝子は生殖過程への関与も示唆され、その操作により、生殖過程を制御することも期待できる。
【００４６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】発芽後２０日目の植物体を示す写真である。Ａ：  野生株、Ｂ：  ＡｔＧＣＮ２０−３遺伝子破壊株
【図２】発芽後２０日目の植物体を示す写真である。Ａ：  野生株またはヘテロ接合体、    Ｂ：  ＡｔＧＣＮ１遺伝子破壊株
【図３】野生株とＡｔＧＣＮ１遺伝子破壊株の形態を示す写真である。Ａ：  野生株、Ｂ：  ＡｔＧＣＮ１遺伝子破壊株
【図１】
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【図２】
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【図３】
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