(57)【要約】【課題】簡便に特定の抗原に特異的に反応するリンパ球を選択し、この選択された抗原特異的リンパ球から、抗原特異的抗原受容体遺伝子を効率的にクローニングする方法を提供する。クローニングされた抗原特異的免疫グロブリン遺伝子からモノクローナル抗体を製造する方法、及びクローニングされた抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を用いて、遺伝子治療用材料を製造する方法を提供する。【解決手段】ある抗原に特異的に反応するリンパ球（抗原特異的リンパ球）を１個選択し、次いでこの１個の抗原特異的リンパ球から抗原特異的抗原受容体遺伝子をクローニングする方法。抗原特異的リンパ球がＢリンパ球である場合、抗原特異的免疫グロブリン遺伝子がクローニングされ、抗原特異的リンパ球がＴリンパ球である場合、抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子がクローニングされる。クローニングされた抗原特異的免疫グロブリン遺伝子を用いて、モノクローナル抗体を製造する方法。クローニングされた抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を用いて、遺伝子治療用材料を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある抗原に特異的に反応するリンパ球（以下、抗原特異的リンパ球という）を１個選択し、次いでこの１個の抗原特異的リンパ球から抗原特異的抗原受容体遺伝子をクローニングする方法。
【請求項２】
前記１個の抗原特異的リンパ球の選択は、１個の被検体リンパ球が含まれるマイクロウェルを複数有する抗原特異的リンパ球検出用マイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、次いで、抗原に反応したリンパ球を検出し、検出された抗原特異的リンパ球をマイクロウェルから取り出すことにより行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原特異的リンパ球は、頻度が０．１％以下である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗原特異的リンパ球を、細胞溶解剤を用いて溶解し、ＲＴ−ＰＣＲを用いて抗原特異的抗原受容体遺伝子を増幅する請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
ＲＴ−ＰＣＲが、逆転写酵素によるｃＤＮＡ調製の後、抗原受容体遺伝子用のプライマーミックスを用いてＰＣＲを２回行うことにより行う請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗原特異的リンパ球がＢリンパ球またはＴリンパ球である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
抗原特異的抗原受容体遺伝子が、抗原特異的リンパ球がＢリンパ球である場合には免疫グロブリン遺伝子であり、Ｔリンパ球である場合にはＴ細胞受容体遺伝子である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗原特異的リンパ球がＢリンパ球であり、抗原特異的免疫グロブリン遺伝子がクローニングされる請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
抗原特異的リンパ球がＴリンパ球であり、抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子がクローニングされる請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子の増幅を、検出された抗原特異的リンパ球をマイクロウェルから取り出すことなく、マイクロウェル中で行う請求項２〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法によりクローニングされた抗原特異的免疫グロブリン遺伝子を用いて、モノクローナル抗体を製造する方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法によりクローニングされた抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を用いて、遺伝子治療用材料を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原特異的リンパ球抗原受容体遺伝子のクローニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗原特異的リンパ球は図６に示すような９６穴プレートを用いて、1穴あたり約200,000個のリンパ球を加えて３日から１週間、抗原の存在下で培養することにより検出していた（非特許文献１及び２）。
検出方法は
1.細胞の増殖（3H-thymidineの取り込み、生細胞の検出）
2.抗体・サイトカインの産生
を測定することによる。
この方法では、約200,000個というリンパ球集団の中に抗原特異的リンパ球が存在することは確認できた。しかし、リンパ球集団中に存在する個々の抗原特異的リンパ球を同定することはできなかった。
【０００３】
これに対して近年、蛍光色素で標識した抗原分子をリンパ球と混ぜ合わせることにより、抗原特異的リンパ球の抗原受容体に蛍光標識抗原を結合させ、蛍光標識抗原を結合したリンパ球を、フローサイトメータを用いることにより検出する方法が開発され利用されている（非特許文献３）。この方法では抗原に結合するリンパ球を同定することが可能である。さらに抗原に結合するリンパ球を分取することも可能である。
【０００４】
しかしながら、上記検出方法では、分取するためにはセルソーターという高価で複雑な機器が必要である上に、以下の問題も有る。
（１）分取するための機器の条件設定が難しく、細胞を分取するためには機器操作の熟練を要する。
（２）バックグラウンドが高いため抗原特異的リンパ球の頻度が０．１％以下の場合は抗原特異的リンパ球を検出できない。
（３）細胞を分取する効率は低い。
（４）頻度の低い細胞を分取するのに時間がかかる。
（５）抗原が結合することは確認できるが、抗原が結合したリンパ球の反応を解析することは難しい。
【０００５】
別の抗原特異的リンパ球検出法として、磁気ビーズに結合した抗原分子をリンパ球と混ぜ合わせることにより、抗原特異的リンパ球の抗原受容体に磁気ビーズ結合抗原を結合させ、磁石を用いて抗原特異的リンパ球を分取する方法も開発されている（非特許文献４）。
この方法では、複雑な装置は必要とせず、細胞の分取の時間は短時間であり、抗原が結合することも確認できる。しかし、抗原が結合したリンパ球が抗原に反応(細胞内シグナル伝達、RNA合成、タンパク質合成などの細胞の代謝生理反応)するかを解析することはできなかった。また、蛍光色素標識抗原・セルソーターを用いた方法と同様にバックグラウンドが高いため抗原特異的リンパ球の頻度が０．１％以下の場合は抗原特異的リンパ球を検出することが難しかった。
【０００６】
従来の抗原特異的抗体遺伝子のクローニング方法として、以下の方法が知られている。
【０００７】
（１）人の場合、末梢Ｂリンパ球をＥＢウィルスで形質転換させ株化して抗原特異的抗体を産生している細胞をスクリーニングし、得られた抗原特異的リンパ球細胞株から抗体遺伝子をクローニングする方法がある（非特許文献５、６）。この方法の場合、抗原特異的リンパ球細胞株をスクリーニングするのが非効率的であり、かつ細胞培養に１カ月程度かかることから時間がかかり、面倒である。マウスの場合はハイブリドーマを作製することができるが、人の場合は効率のよいハイブリドーマの系は作成されていない。
【０００８】
（２）別の方法として、バクテリオファージを用いて抗原特異的抗体遺伝子をクローニングする方法がある（非特許文献７）。この場合、人のリンパ球よりmRNAを抽出し、免疫グロブリンのＨ鎖とＬ鎖のｃＤＮＡライブラリーをそれぞれ作製し、一つのファージＤＮＡに組み込むことにより、ファージで抗体のＨ鎖とＬ鎖を発現させる。このＨ鎖とＬ鎖の組合せで抗原特異性が決まる。しかし、この系の場合、その組合せはランダムであり、抗原を使ってその抗原に結合する抗体を作っているファージをスクリーニングする。その結果、抗原に結合する抗体を作っているファージが得られれば、抗原特異的抗体遺伝子がクローニングできる。しかし、Ｈ鎖とＬ鎖の組合せはランダムなので抗原特異的抗体遺伝子のスクリーニングは非常に非効率的である。例えば、ある抗原に対する抗体のＨ鎖のｃＤＮＡとＬ鎖のｃＤＮＡがライブラリーの中に１０の４乗分の１の頻度でそれぞれ存在しているとすると、その抗原に結合できるＨ鎖とＬ鎖の組合せは１０の８乗分の１になる。また、この系の場合、得られたＨ鎖とＬ鎖の組合せが、実際にヒトの体の中でつくられているＨ鎖とＬ鎖の組合せと同じであるかどうかも分からない。
【０００９】
【非特許文献１】「リンパ球機能検索法」矢野純一、藤原道夫編著、中外医学社（１９９４年）
【非特許文献２】「免疫実験操作法Ｉ、ＩＩ」右田俊介、紺田進、本庶佑、濱岡利之編集、南江堂（１９９５年）
【非特許文献３】Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, McHeyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, Davis MM. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 274:94-96, 1996
【非特許文献４】Abts H, Emmerich M, Miltenyi S, Radbruch A, Tesch H, CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of Immunological Methods 125:19-28, 1989.
【非特許文献５】Roome AJ, Reading CL.  The use of Epstein-Barr virus transformation for the production of human monoclonal antibodies. Exp Biol 43:35-55, 1984
【非特許文献６】Carson DA, Freimark BD. Human lymphocyte hybridomas and monoclonal antibodies. Adv Immunol. 38:275-311, 1986
【非特許文献７】Huston JS, Levinson D, Mudgett-Hunter M, Tai MS, Novotny J, Margolies MN, Ridge RJ, Bruccoleri RE, Haber E, Crea R, et al.  Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli.  Proc Natl Acad Sci U S A. 85:5879-5883, 1988.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、従来の抗原特異的抗体遺伝子のクローニング方法は、非常に効率の悪い方法であった。それでも、頻度が比較的高い抗原特異的リンパ球については、従来の方法でも、相当量の労力を投入すれば、抗原特異的抗体遺伝子をクローニングすることは可能であった。しかし、従来の方法では頻度の低い抗原特異的リンパ球を同定、選別するということは不可能であった。
【００１１】
そこで本発明は、頻度が比較的高い抗原特異的リンパ球は勿論のこと、頻度の低い抗原特異的リンパ球であっても、簡便に特定の抗原に特異的に反応するリンパ球を選択し、この選択された抗原特異的リンパ球から、抗原特異的抗原受容体遺伝子を効率的にクローニングする方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、クローニングされた抗原特異的免疫グロブリン遺伝子からモノクローナル抗体を製造する方法を提供すること、及びクローニングされた抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を用いて、遺伝子治療用材料を製造する方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。
（１）ある抗原に特異的に反応するリンパ球（以下、抗原特異的リンパ球という）を１個選択し、次いでこの１個の抗原特異的リンパ球から抗原特異的抗原受容体遺伝子をクローニングする方法。
（２）前記１個の抗原特異的リンパ球の選択は、１個の被検体リンパ球が含まれるマイクロウェルを複数有する抗原特異的リンパ球検出用マイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、次いで、抗原に反応したリンパ球を検出し、検出された抗原特異的リンパ球をマイクロウェルから取り出すことにより行う（１）に記載の方法。
（３）抗原特異的リンパ球は、頻度が０．１％以下である（１）に記載の方法。
（４）抗原特異的リンパ球を、細胞溶解剤を用いて溶解し、ＲＴ−ＰＣＲを用いて抗原特異的抗原受容体遺伝子を増幅する（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素によるｃＤＮＡ調製の後、抗原受容体遺伝子用のプライマーミックスを用いてＰＣＲを２回行うことにより行う（４）に記載の方法。
（６）抗原特異的リンパ球がＢリンパ球またはＴリンパ球である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）抗原特異的抗原受容体遺伝子が、抗原特異的リンパ球がＢリンパ球である場合には免疫グロブリン遺伝子であり、Ｔリンパ球である場合にはＴ細胞受容体遺伝子である（６）に記載の方法。
（８）抗原特異的リンパ球がＢリンパ球であり、抗原特異的免疫グロブリン遺伝子がクローニングされる（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）抗原特異的リンパ球がＴリンパ球であり、抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子がクローニングされる（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（１０）遺伝子の増幅を、検出された抗原特異的リンパ球をマイクロウェルから取り出すことなく、マイクロウェル中で行う（２）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）（８）に記載の方法によりクローニングされた抗原特異的免疫グロブリン遺伝子を用いて、モノクローナル抗体を製造する方法。
（１２）（９）に記載の方法によりクローニングされた抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を用いて、遺伝子治療用材料を製造する方法。
【発明の効果】
【００１３】
感染症に対しては、病原体特異的リンパ球を検出し、病原体特異的抗体遺伝子をクローニングすることにより、がんに対しては腫瘍特異的リンパ球を検出し、腫瘍特異的抗体遺伝子、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体遺伝子をクローニングすることにより、抗体を用いた抗体療法、また、Ｔ細胞受容体遺伝子を用いた遺伝子治療が可能になると期待される。
【００１４】
自己免疫疾患においては自己反応性リンパ球を検出し、自己抗体、自己抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子をクローニングすることにより、アレルギーにおいてはアレルゲン特異的リンパ球を検出し、IgE遺伝子をクローニングすることにより、正確な病因・病態の把握を行い、病因に対応した治療や治療効果のモニターを行うことができる。
【００１５】
さらに、すべてのリンパ球を対象に網羅的に個人の持つすべての抗体遺伝子やＴ細胞受容体遺伝子をモニターすることにより、和漢薬の免疫機能に対するモニターや病原体に対する免疫応答を予測することによりテーラーメード医療に応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のクローニング方法は、ある抗原に特異的に反応するリンパ球（抗原特異的リンパ球）を１個選択し、次いでこの１個の抗原特異的リンパ球から抗原特異的抗原受容体遺伝子をクローニングする方法である。
本発明のクローニング方法は、抗原特異的リンパ球の頻度が０．１％以下である場合に特に有効である。
しかし、頻度が０．１％を超える場合にも適用できることは勿論である。
抗原特異的リンパ球は、例えば、Ｂリンパ球またはＴリンパ球であることができる。さらに、抗原特異的抗原受容体遺伝子は、抗原特異的リンパ球がＢリンパ球である場合には免疫グロブリン遺伝子であり、Ｔリンパ球である場合にはＴ細胞受容体遺伝子である。
【００１７】
血液中のリンパ球は1個1個がそれぞれ別々の抗原に反応する。そこで、本発明では、例えば、抗原に特異的に反応したＢリンパ球を検出し、このＢリンパ球から、抗原（病原体）に反応する免疫グロブリン（抗体）遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより増幅できる。同様に、抗原に特異的に反応したＴリンパ球を検出し、このＴリンパ球から、抗原（病原体）に反応するＴ細胞受容体遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより増幅できる。
【００１８】
［抗原特異的リンパ球の選択］
１個の抗原特異的リンパ球の選択は、例えば、マイクロウェルアレイチップを用いた方法により行うことができる。マイクロウェルアレイチップを用いた方法では、例えば、１個の被検体リンパ球が含まれるマイクロウェルを複数有する抗原特異的リンパ球検出用マイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、次いで、抗原に反応したリンパ球を検出し、検出された抗原特異的リンパ球をマイクロウェルから取り出すことにより、１個の抗原特異的リンパ球を得ることができる。この方法について、より具体的に説明する。
【００１９】
（マイクロウェルアレイチップ）
マイクロウェルアレイチップとしては、複数のマイクロウェルを有し、かつ各マイクロウェルが被検体リンパ球を１個含むことができるものを使用することができる。各マイクロウェルが被検体リンパ球を１個含むことで、抗原特異的リンパ球を細胞レベルで特定することが可能になる。即ち、このマイクロウェルアレイチップを用いると、マイクロウェルに含まれる被検体リンパ球が１個であることから、抗原に反応する被検体リンパ球を１個の細胞として特定でき、結果として、抗原特異的リンパ球を１個の細胞として検出できる。そして、検出された１個の抗原特異的リンパ球を取り出して、遺伝子をクローニングする。
【００２０】
但し、同一のマイクロウェルには、リンパ球以外の細胞が被検体リンパ球とともに含まれていても良い。リンパ球以外の細胞であれば、抗原に反応せず、検出されることもないからである。
【００２１】
本発明で使用するマイクロウェルアレイチップは、複数個のマイクロウェルを有し、前記マイクロウェルは、１つのマイクロウェルに１つのリンパ球のみが格納される形状及び寸法を有することが好ましい。
【００２２】
マイクロウェルの形状や寸法には特に制限はないが、マイクロウェルの形状は、例えば、円筒形であることができ、円筒形以外に、直方体、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であることもでき、これらの形状の二つ以上を組み合わせた形状であることもできる。例えば、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であることができる。また、逆円錐形、逆角錐形の場合、底面がマイクロウェルの開口となるが、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状である（その場合、マイクロウェルの底部は平坦になる）こともできる。円筒形、直方体は、マイクロウェルの底部は通常、平坦であるが、曲面（凸面や凹面）とすることもできる。マイクロウェルの底部を曲面とすることができるのは、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合も同様である。
【００２３】
マイクロウェルの形状や寸法は、マイクロウェルに格納されるべきリンパ球の種類（リンパ球の形状や寸法等）を考慮して、１つのマイクロウェルに１つのリンパ球が格納されるように、適宜決定される。
１つのマイクロウェルに１つのリンパ球が格納されるようにするためには、例えば、マイクロウェルの平面形状に内接する最大円の直径が、マイクロウェルに格納しようとするリンパ球の直径の1〜2倍の範囲、好ましくは1.1〜1.9倍の範囲、より好ましくは1.2〜1.8倍の範囲であることが適当である。
また、マイクロウェルの深さは、マイクロウェルに格納しようとするリンパ球の直径の1〜2倍の範囲、好ましくは1.1〜1.9倍の範囲、より好ましくは1.2〜1.8倍の範囲であることが適当である。
【００２４】
マイクロウェルが円筒形の場合、その寸法は、例えば、直径5〜100μｍであることができ、リンパ球がＢリンパ球の場合、好ましくは、直径は5〜15μｍである。また、深さは、例えば、5〜100μｍであることができ、リンパ球がＢリンパ球の場合、好ましくは、深さは5〜40μｍであることができる。但し、マイクロウェルの寸法は、上述のように、マイクロウェルに格納しようとするリンパ球の直径とのマイクロウェルの寸法の好適な比を考慮して適宜決定する。
【００２５】
1つのマイクロウェルアレイチップが有するマイクロウェルの数は、特に制限はないが、抗原特異的リンパ球の頻度が105個に1個から多い場合には約500個であるという観点から、1cm2当たり、例えば、2,000〜1,000,000個の範囲であることができる。
【００２６】
マイクロウェルには、被検体リンパ球は培養液とともに格納されている。培養液としては、例えば、以下のいずれかのものを挙げることができる。
1. 137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1mg/mlグルコース, 1mg/ml BSA, 20mM HEPES (pH7.4)
2. 10% FCS(牛胎仔血清)含有RPMI1640培地
3. 1mg/ml BSA含有RPMI1640培地
4. 10% FCS(牛胎仔血清)含有Dulbecco's MEM培地
5. 1mg/ml BSA含有Dulbecco's MEM培地
【００２７】
被検体リンパ球は血液由来であることができ、例えば、Ｂリンパ球またはＴリンパ球であることができる。それ以外に扁桃腺(リンパ節)、脾臓等のリンパ組織由来リンパ球、がん浸潤リンパ球などの病変部位浸潤リンパ球等を挙げることができる。
【００２８】
（抗原特異的リンパ球の検出方法）
抗原特異的リンパ球の検出方法は、上記マイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、細胞を刺激し、抗原に反応する細胞を検出することを含む。
【００２９】
各マイクロウェルへの抗原の添加は、以下のように行うことができる。
1. ピペットを用いてマイクロウェルアレイチップ全面を覆うように抗原液を添加する。
2. 1ウェルずつ自動スポッターを用いて抗原液を添加する。
【００３０】
この方法により検出される抗原には、特に制限はないが、例えば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、糖鎖または有機化合物等であることができる。また、抗原は、細菌、ウィルス、自己抗原、がん抗原またはアレルゲン等であることができる。
【００３１】
細胞の培養は、例えば、リンパ球を培養液に懸濁させ、ウェルに分注後、室温あるいは37℃にて、空気中あるいはＣＯ2インキュベータ内にて培養することで行うことができる。
【００３２】
抗原に反応する細胞の検出は、以下のように行うことができる。
例えば、Ｂリンパ球の抗原受容体（免疫グロブリン）に抗原が結合するとまず細胞内シグナル伝達が起こり、それに続いて細胞増殖、抗体産生が起こる。従って、細胞内シグナル伝達、細胞増殖、抗体産生を種々の方法により検知することにより、抗原に反応する細胞を検出することができる。あるいは、例えば、Tリンパ球の抗原受容体に抗原が結合するとまず細胞内シグナル伝達が起こり、それに続いて細胞増殖、サイトカイン産生が起こる。従って、細胞内シグナル伝達、細胞増殖、サイトカイン産生を種々の方法により検知することにより、抗原に反応する細胞を検出することができる。
【００３３】
細胞内シグナル伝達を検出することによる、抗原に反応する細胞の検出は、例えば、細胞内Ｃａイオンの濃度変化をＣａイオン依存性の蛍光色素を用いることにより行うことができる。
細胞内Ｃａイオン濃度変化は、蛍光色素としてＦｕｒａ−２、Ｆｌｕｏ−３あるいはＦｌｕｏ−４を用い、検出装置として蛍光顕微鏡あるいはマイクロアレイスキャナーを用いる。
【００３４】
具体的には、図１に示すように、Ｂリンパ球にＣａイオン依存性蛍光色素であるＦｕｒａ−２あるいはＦｌｕｏ−３を導入する。次いで抗原でＢリンパ球を刺激すると、細胞内Ｃａイオン濃度が上昇する。その結果、ＣａイオンがＣａイオン依存性蛍光色素に結合し、蛍光強度が増強される。Ｃａイオン濃度が低いと青っぽい色、高いと赤っぽい色で示されている。この方法では、抗原で刺激されることにより細胞内Ｃａイオンが上昇したＢリンパ球（抗原特異的）を、マイクロウェルアレイチップを用いて検出できる。
【００３５】
細胞増殖を検出することによる、抗原に反応する細胞の検出は、例えば、細胞数を、生細胞特異的蛍光色素を用いて計測することによっても行うことができる。この方法は、具体的には、抗原でＢリンパ球を刺激しＣＯ2インキュベータ内にて37℃、3日間培養すると、細胞が増殖する。細胞が増殖後、培養液中にフルオレッセイン・ジアセテート(Fluorescein diacetate(FDA))あるいはカルボキシ・フルオレッセイン・ジアセテート・スクシンイミジル・エステル(Carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester(CFSE))溶液を加える。これらの試薬は生細胞の膜を透過し、細胞内でエステラーゼによって分解され、膜不透過性の蛍光色素を生成する。この蛍光色素の発光は細胞数に比例するためウェル内の生細胞が発光する蛍光強度の和を蛍光顕微鏡あるいはマイクロアレイスキャナーを用いて計測することにより生細胞数を測定する。
【００３６】
抗体産生を計測することによっても、抗原に反応する細胞の検出を行うことができる。抗体産生は抗体を免疫化学的に計測することにより検出できる。
具体的には、抗原でＢリンパ球を刺激しＣＯ2インキュベータ内にて37℃、1週間培養すると、抗体が培養液中に分泌される。培養液中に分泌された抗原特異的抗体をELISA法(酵素標識免疫吸着法)により検出する。
尚、この検出方法では、マイトゲン、レクチン、抗体、サイトカイン、ＰＭＡ、Ｃａイオノフォアを用いても、シグナル伝達、細胞増殖、抗体産生を検出することができる。
【００３７】
以下に、蛍光色素を用いる方法におけるマイクロウェルアレイチップへの細胞の分注、抗原刺激、取り出しまでについて図２に基づいて説明する。
（１）細胞の分注
ウェル１つずつに細胞を入れる。
ウェルに入れる細胞は、末梢血からリンパ球画分を分離後、Ｂリンパ球画分をさらに分離精製して得られる。
次に、Ｆｌｕｏ３/ＡＭ(2μM)溶液に細胞を懸濁させ、室温に30分置き、さらに緩衝液で細胞を洗浄し、細胞内に負荷されなかった色素を除去する。
色素を除去した細胞をマイクロウェルに分注する。
マイクロウェルアレイチップの両側にシールを貼り、その上にカバーグラスを乗せ、緩衝液を満たすことで、乾燥を防ぐ。
【００３８】
（２）蛍光測定
まず、未刺激の細胞の蛍光を測定する。その際の蛍光強度(Ａ)を測定する。
次いで抗原溶液をスライドグラスとカバーグラスの隙間に流し入れ緩衝液と交換し、抗原による刺激を受けた細胞の蛍光を測定する。刺激後１〜２分後の蛍光強度(Ｂ)を測定する。刺激前後の蛍光強度比(Ｂ/Ａ)の高いウェルの細胞を選別する。
【００３９】
（３）抗原刺激に反応した細胞の取り出し
スライドグラスとカバーグラスの隙間に空気を入れると、カバーグラスは容易に剥がれる。抗原刺激により反応した細胞を、未刺激の細胞の蛍光強度と抗原による刺激を受けた細胞の蛍光強度の比(Ｂ/Ａ)により選別し、取り出す。
但し、選別(検出)された抗原特異的リンパ球は、マイクロウェルから取り出すことなく、そのままマイクロウェル中で行う、次の遺伝子増幅に供することもできる。
【００４０】
（遺伝子増幅）
取り出された抗原特異的リンパ球は、細胞溶解剤を用いて溶解した後、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、抗原特異的リンパ球がＢリンパ球であれば抗原特異的免疫グロブリン（抗体）遺伝子がクローニングされ、抗原特異的リンパ球がＴリンパ球であれば抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子がクローニングされる。
細胞溶解剤としては、公知の物をそのまま使用でき、例えば、以下のものを挙げることができる。
1x 1st strand buffer［GIBCO-BRL, SuperScriptIIに添付されている］, 0.2 mM dNTP, 0.25% NP-40, 0.1 mg/mL BSA, 10 mM DTT, Random Primer 0.05 μM, 1U/μL RNasin
【００４１】
Ｂリンパ球における抗原受容体遺伝子は抗体遺伝子と同一のものであり、タンパク質としては免疫グロブリンと呼ばれる。抗原受容体はＢリンパ球の膜表面に存在し（膜型免疫グロブリン）、抗体は普通分泌蛋白（分泌型免疫グロブリン）として産生される。その違いはタンパク質のＣ末端側にある。膜型免疫グロブリンは細胞膜に埋もれる膜ドメインおよび細胞質側につきでる部分を持っている。分泌型免疫グロブリンも同じ遺伝子から産生される。しかし、オルタナティブ・スプライシング（alternative splicing）によりタンパク質のＣ末端側が膜型免疫グロブリンと異なり膜ドメインを持たない。その結果、分泌蛋白として産生される。しかし、この二つの蛋白の抗原結合部位は同一である。したがって、Ｂリンパ球の場合、抗体遺伝子のクローニングと抗原受容体遺伝子のクローニングは同じである。
【００４２】
Ｔリンパ球の場合は、抗原受容体の分泌型というものはない。従って、抗原受容体遺伝子をクローニングすることになる。Ｔリンパ球の場合にはＢリンパ球で設計したプライマーと同じ考え方でプライマーを設計する。これは、Ｔリンパ球の抗原受容体（ＴＣＲ）の遺伝子構成はＢリンパ球の免疫グロブリン遺伝子の遺伝子構成とほとんど同じだからである。そのため、同じ考え方でプライマーを設計することができる。したがって、抗体遺伝子がクローニングできれば、ほとんど同じ方法でＴＣＲ遺伝子もクローニングすることができる。
【００４３】
以下、抗原特異的免疫グロブリン遺伝子の増幅を例にさらに説明する。
取り出された抗原特異的リンパ球を細胞溶解剤で溶解して得られた溶液を用い、逆転写酵素によるｃＤＮＡの調製を行う。次いで、免疫グロブリン遺伝子用のプライマーミックスを用いて２回ＰＣＲすることにより、所望の抗原特異的免疫グロブリン遺伝子を増幅（クローニング）することができる。
【００４４】
逆転写酵素によるｃＤＮＡの調製は、常法（例えば、Sambrook J, Russell DW in Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)）により行うことができる。
本発明では細胞から抽出・精製したＲＮＡを用いてＲＴ反応をするのではなく、細胞溶解液を用いて直接ＲＴ反応を行うことが適当である。
【００４５】
（ＰＣＲ法による抗体遺伝子の増幅）
ＰＣＲ法による抗体遺伝子の増幅では、ＰＣＲ反応を２回実施することにより抗体遺伝子のＶ領域遺伝子を増幅することが適当である。
抗体分子はＨ鎖およびＬ鎖の組合せによりできており、ヒト抗体遺伝子のＨ鎖は生殖細胞系列では約２００種類のV領域遺伝子断片、約２０種類のＤ断片、６種類のＪ断片より構成されており、Ｂリンパ球に分化するときに遺伝子再構成により各々１種類のV断片、Ｄ断片、Ｊ断片が組み合わさることにより（Ｖ/Ｄ/Ｊ再構成）ひとつの抗原結合部位を形成する。Ｌ鎖も同様である。
各Ｂリンパ球は細胞表面に１種類の抗体分子を発現している。抗原特異的Ｂリンパ球より抗原特異的抗体遺伝子を増幅するためにはそれぞれのＶ断片の配列に一致したプライマーを用いる必要がある。
【００４６】
抗体分子はＨ鎖、Ｌ鎖それぞれ２本ずつのペプチド鎖からなり、図３に示す構造図の左側のＶ領域 （Ｈ鎖はＶH領域、Ｌ鎖はＶκあるいはＶλ領域）で抗原と結合する。Ｈ鎖及びＬ鎖のサブファミリーの数を以下の表に示す。
【００４７】
【表１】
2004187676.tif 000002
【００４８】
上記表１に示すように、ヒト抗体遺伝子のＨ鎖のＶ領域は７種類のサブファミリーに分類される。サブファミリー内のＶ断片の配列はよく似ているので共通したプライマーを設定することが可能である。（*ＣH領域にはＣγ１〜４、Ｃμ、 Ｃδ、Ｃα１〜２、Ｃεがあるが、このうち血清中の抗体の主な種類であるIgG, IgMについてプライマーを設計し、ＰＣＲに用いた。Ｃγ１〜４については共通配列１種類を用いているためにＣμと合わせて２種類のプライマーを用いている。**Ｃλ鎖にはＣλ１〜Ｃλ７鎖があるが、プライマーとしては共通配列の１種類を用いている。）
Ｌ鎖のＶ領域およびＣ領域の各サブファミリーについても同様のことが言えるので、各サブファミリー毎にプライマーを設定し、ＰＣＲ反応には、Ｈ鎖あるいはL鎖の全サブファミリーに対するプライマーをミックスしたプライマーミックスを用いる。即ち、プライマーとしては、Ｈ鎖、Ｌ鎖それぞれの全種類のミックスを用いる。
【００４９】
以下のようにＰＣＲ反応を２回行い、抗体遺伝子を増幅する。
Ｈ鎖及びＬ鎖のＶ領域のアミノ酸数が１１０〜１２０前後であることから、Ｖ領域の遺伝子は、約４００ｂｐ程度である。
そこで、図３に示すように、１回目のＰＣＲ反応であるＰＣＲ１では、リーダーシークエンス（Ｌ）からＣ領域のｃＤＮＡが増幅される。
２回目のＰＣＲ反応であるＰＣＲ２では、ＰＣＲ１の内側（Ｖ領域の始まりからＣ領域の始まり）約400 ｂｐ のｃＤＮＡが増幅される。
そして、２回目のＰＣＲ反応で増幅したｃＤＮＡの配列を分析する。
【００５０】
この点に関して、さらに説明する。
本発明において、ＰＣＲ１とＰＣＲ２とでは、異なる配列のプライマーミックスを用いるのは、以下の理由による。ＰＣＲ１ で増幅したものを再度ＰＣＲ２で増幅するが、ＰＣＲ１の産物は特異的なものばかりでなく、非特異的な増幅産物も含まれている。ＰＣＲ２を同じプライマーで増幅すると特異的なＤＮＡ配列も増幅するが、非特異的な配列も増幅してしまう。そこで、ＰＣＲ２ではＰＣＲ１で増幅するＤＮＡ配列でＰＣＲ１のプライマーの位置より少し内側の配列をプライマーに用いる。そうすることで、ＰＣＲ１で増幅した非特異的なＤＮＡ配列は増幅せずに、特異的なＤＮＡ配列を増幅できるようになる。尚、このように、特異的なＤＮＡ配列を増幅するためにプライマーを変えて2回目のＰＣＲ２を行うという以外に、１個のＢリンパ球から抗体遺伝子を増幅する場合、１回のＰＣＲでは増幅が量的に不十分であるという理由からも、ＰＣＲ反応を２回行うことが適当である。
【００５１】
上記方法では、２回目のＰＣＲ反応で増幅したｃＤＮＡの配列を分析するが、その際、１回目のＰＣＲ反応生成物と２回目のＰＣＲ反応生成物とは、分離する必要はない。これは、通常、ＰＣＲ１の産物はＰＣＲ２で増幅した産物に較べると無視できる量だからである。
【００５２】
抗原特異的リンパ球がＴリンパ球である場合には抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子がクローニングされるが、クローニング方法は、上記Ｂリンパ球の場合と同様に行うことができる。Ｔリンパ球の抗原受容体（ＴＣＲ）のサブファミリーを以下の表に示す。
【００５３】
【表２】
2004187676.tif 000003
【００５４】
本発明のクローニング方法では、抗原特異的リンパ球がＢリンパ球である場合、抗原特異的免疫グロブリン（抗体）遺伝子がクローニングされる。そしてクローニングされた遺伝子を用いて、モノクローナル抗体を製造することができる。クローニングされた遺伝子を用いてのモノクローナル抗体の製造は常法により行うことができ、ＰＣＲ法で増幅したＶ領域のｃＤＮＡとＣ領域の遺伝子配列を結合し、発現ベクターを用いて抗体分子を作成する。
【００５５】
モノクローナル抗体の製造は、例えば、Kanda H, Mori K, Koga H, Taniguchi K, Kobayashi H, Sakahara H, Konishi J, Endo K, Watanabe T. Construction and expression of chimeric antibodies by a simple replacement of heavy and light chain V genes into a single cassette vector. 13:359-366, 1994に記載の方法により行うことができる。
【００５６】
尚、本発明の方法においては、抗体分子全体を製造する必要はなく、Ｖ領域が得られれば良い。また、上記ＰＣＲ法で得られる遺伝子配列はＶ領域とＣ領域の一部である。そこで、モノクローナル抗体の製造方法において発現ベクターに導入する遺伝子は、抗体分子（全体）ではなく、Ｖ領域のみまたはＶ領域＋Ｃ領域の一部であってもよい。
【００５７】
Ｈ鎖とＬ鎖とは、通常は、別々にクローニングする。この場合、ＲＴまでは１本のチューブで反応を行い、以後のＰＣＲではＨ鎖用とＬ鎖用の２本のチューブを用いる。Ｈ鎖とＬ鎖を１本のチューブで合成できることもあるが、増幅しやすい方が主に増えてしまうということがしばしば起こるので、確実にＨ鎖、L鎖を増幅させるという意味から２本のチューブで別々にＰＣＲを行うことが好ましい。
【００５８】
抗体を得るには、Ｈ鎖とＬ鎖を両方とも発現させる必要が有り、上記発現ベクターにはＨ鎖とＬ鎖の両方を入れておく。
その場合、Ｈ鎖とＬ鎖を別々の発現 ベクターに挿入し、蛋白を発現させる際に、同じ細胞に両方の発現ベクターを同時に導入することにより、１個の細胞でＨ鎖とＬ鎖を発現させるという方法、および、Ｈ鎖とＬ鎖を１つのベクターに同時に挿入した発現ベクターを構築し、それを細胞に導入することにより、H鎖とL鎖を一つの細胞で発現させるという２通りがある。
【００５９】
動物細胞に発現ベクターを導入した場合は、産生された抗体はヒトあるいはほ乳類の体の中で作られる抗体と全く同じものになる。大腸菌で作らせた場合は、アミノ酸の配列は上記のものと全く同じだが、糖鎖が結合していないものが作られる。本発明の方法では、産生された抗体がヒトあるいはほ乳類の体の中で作られる抗体と全く同じものになることから、動物細胞で抗体を産生させることが好ましい。
【００６０】
本発明のクローニング方法は、抗原特異的リンパ球がＴリンパ球である場合、抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子がクローニングされる。クローニングされた抗原特異的受容体遺伝子を用いて、遺伝子治療を行うことができる。例えば、クローニングしたＴ細胞受容体遺伝子をＴリンパ球あるいはＴリンパ球前駆細胞に導入してやることにより、病原体等に特異的なＴ細胞受容体を発現したＴリンパ球を人為的に作り出すことができる。このようにして作り出したＴリンパ球を免疫機能の低下した患者に投与することにより免疫機能を回復させることが可能となる。
【実施例】
【００６１】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
1.Ｂリンパ球の分離
末梢血からFicoll-Paque（Pharmacia, Uppsala, Sweden）を用いてリンパ球画分を分離し、さらにAutoMACS（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を用いてリンパ球画分からＢリンパ球画分をさらに分離精製した。
【００６２】
2.Ｆｌｕｏ３の細胞への導入（図１参照）
2 x 106個のＢリンパ球を2μM Ｆｌｕｏ３/ＡＭ（同仁、熊本）/loading buffer(137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1mg/mLグルコース, 1mg/mL BSA, 20mM HEPES (pH7.4))に懸濁し、室温に30分インキュベーションした。Loading bufferで細胞を洗浄し、細胞内に導入されなかったＦｌｕｏ３/ＡＭを除く。その後細胞をRPMI1640/10% ＦＣＳ溶液に懸濁した。
【００６３】
3.マイクロウェルアレイチップ（図２参照）
マイクロウェルアレイチップはpoly(dimethylsiloxane) (ＰＤＭＳ)を用いて作製されており、直径10μm、深さ32μmのマイクロウェルが2 cm x 2 cmのチップ上に縦・横30μmの間隔（マイクロウェルの中心から中心までの距離は40μm）で配置されている。チップの両側には厚さ1mm幅約1mm長さ2cmのシールを貼った。
【００６４】
4.マイクロアレイスキャナー
本装置は基本的に日立ソフトウェアエンジニアリング（株）（横浜市）のマイクロアレイスキャナー（CRBIO Iie）を用いており、以下の変更を加えている。搭載されているレーザー（Cy3用, 532 nm; Cy5用, 635 nm）のうちの１本を473nmのレーザーと置換してある。
【００６５】
5.マイクロウェルアレイチップを用いた活性化Ｂリンパ球の検出（図２参照）
上記マイクロウェルアレイチップに上記細胞懸濁液を添加し、５分間静置する。マイクロウェルに入らなかった細胞をRPMI1640/10% ＦＣＳ溶液を用いて洗い流した。リンパ球の直径は約8μmであり、使用するマイクロウェルの直径が10μmであるためにひとつのマイクロウェルにはリンパ球は１個入る。カバーグラスを上記シールの上に置き、チップとカバーグラスの間にRPMI1640/10% ＦＣＳ溶液を満たした。このマイクロウェルアレイチップをマイクロアレイスキャナーに挿入し、解像度10μmでスキャンし、データを保存した（抗原刺激前の蛍光のデータ：Ａ）。
【００６６】
次に、チップとカバーグラスの間のRPMI1640/10% ＦＣＳ溶液を除き、そこへRPMI1640/10% ＦＣＳ溶液に溶解させた抗原（10μg/mL）を加える。抗原を加えて1分後にマイクロウェルアレイチップをマイクロアレイスキャナーに挿入し、解像度10μmでスキャンし、データを保存した（抗原刺激後の蛍光のデータ：Ｂ）。
【００６７】
刺激前後の蛍光強度の比(Ｂ/Ａ)を計算し、比の大きいウェルを特定する。このウェルの中に抗原特異的Ｂリンパ球が存在した。
【００６８】
6.マイクロウェルからの細胞の分取。
マイクロマニピュレータを用いてガラスキャピラリーを用いることにより顕微鏡下で細胞を分取した。
【００６９】
7.抗原特異的Ｂリンパ球からの抗体遺伝子のＰＣＲによる増幅（図３参照）
１個の抗原特異的Ｂリンパ球をＰＣＲ用チューブに添加した（5 μL）。細胞に15.15 μLの細胞溶解液（25μLに希釈された時の最終濃度：1x 1st strand buffer［GIBCO-BRL, SuperScriptIIに添付されている］, 0.2 mM dNTP, 0.25% NP-40, 0.1 mg/mL BSA, 10 mM DTT, Random Primer 0.05 μM, 1U/μL RNasin［Promega, Madison, WI］）を加え、そこへ逆転写酵素SuperScriptII（GIBCO-BRL, Rockville, MD）を（4.85μL, 50U）添加し37℃、１時間反応させｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成した。
【００７０】
ＲＴ−ＰＣＲ反応
Cell sol. (1 cell)                       5.0μL
1st strand buffer (5x)                   5.0 
2.5 mM dNTP                              2.0
2.5 % NP-40                              2.5
1 mg/ml BSA                              2.5
0.1M DTT                                 2.5
Random primer (50 pmol/μL)              0.025
RNase Inhibitor ( RNasin 40U/μL)        0.625
Super Script II                          4.85(50U)
Total                                    25.0 μL
37oC    1 h
上記反応により１個のリンパ球のｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製した。
【００７１】
抗体遺伝子の増幅：
ヒト抗体遺伝子のＨ鎖のＶ領域は７種類のサブファミリーに分類される。サブファミリーのＶ断片の配列はよく似ているので共通したプライマーを設定することが可能である。Ｈ鎖およびＬ鎖の各サブファミリーごとにプライマーを設定し、Ｈ鎖あるいはＬ鎖の全サブファミリーに対するプライマーをミックスしたものを用い、以下のようにＰＣＲ反応を２回行い、抗体遺伝子を増幅した。
【００７２】
ＰＣＲ１の反応は、上記ｃＤＮＡ5μLを15μLのPCR mix（最終濃度：1x TAKARA ExTaq buffer, 0.25 mM dNTP, 各サブファミリーに対するPrimer 1  0.5 μM, 0.05U/μL ExTaq［Takara, 京都］）に加え、94℃, 3 min; (94℃, 30 sec; 60℃, 1 min; 72℃, 1 min 30 sec) x 40 cycles; 72℃, 5 min; 10℃, ∞反応させた。
ＰＣＲ １
cDNA（上記RT反応液）                 5.0 μL
10x ExTaq buffer                     2.0
2.5 mM dNTP                          2.0
Primer 1 5' Mix (10 μM each)        1.0
Primer 1 3' Mix (10 μM each)        1.0
H2O                                  7.0
Takara ExTaq (0.5 U/μL)             2.0
Total                                20.0 μL
94 ℃, 3 min.
94 ℃, 30 sec; 60 ℃, 1 min; 72 ℃, 1.5 min.       40 cycles
72 ℃, 5 min.
10 ℃
ＰＣＲ１の反応により免疫グロブリン（抗体）遺伝子のＬｅａｄｅｒ配列から定常部（Ｃ）領域までのＤＮＡ配列を増幅した。
【００７３】
以下に上記反応で用いたプライマー(Ｈ鎖用)の配列を示す。
Primer 1 5' Mix (各10 μM)(V領域用プライマー)
hVH17a.1     atggactgsayytggagvdtc (SEQ ID No=1)
hVH2a.1       tccacrctcctgctrctgac (SEQ ID No=2)
hVH3a.1       gggcygagstggvttttyct (SEQ ID No=3)
hVH4a.1       tcctcctsctggtggcagct (SEQ ID No=4)
hVH5.1       tcaaccgccatcctcgccct (SEQ ID No=5)
hVH6.1       ctccttcctcatcttcctgcc (SEQ ID No=6)
Primer 1 3' Mix (10 μM each) (C領域用プライマー)
hIGHG1-4out   agtccttgaccaggcagccca (SEQ ID No=7)
hIGHMout     attctcacaggagacgagggg (SEQ ID No=8)
【００７４】
以下に上記反応で用いたプライマー(Ｌ鎖用)の配列を示す。
PCR 1
5' primer
hKV12.1    atgaggstcccygctcagctc (SEQ ID No=9)
hKV3.1     ctcttcctcctgctactctggc (SEQ ID No=10)
hKV45.1    ctsttsctytggatctctg (SEQ ID No=11)
hKV6.1     tgggtttctgctgctctggg (SEQ ID No=12)
hKV7.1     atagggtccggggctcctttg (SEQ ID No=13)
hLV12.1    cykctsctcctcactctcctc (SEQ ID No=14)
hLV3.1     ttctcctcctcggcctcctct (SEQ ID No=15)
hLV4.2-2   ccagcytgtgctgactcaatc  (SEQ ID No=16)
hLV789.2   tcycagmctgtgstgacycag (SEQ ID No=17)
hLV6.1     ttttatgctgactcagcccc (SEQ ID No=18)
hLV7.1     ggcctggactcctctctttctg (SEQ ID No=19)
hLV8.1     ggcctggatgatgcttctcctc (SEQ ID No=20)
hLV9.1     tcctctgctcctcaccctcct (SEQ ID No=21)
hLV10.1    cctgggtcatgctcctcctga (SEQ ID No=22)
hLV11.1    gcctgggctccactacttctc (SEQ ID No=23)
3' primer
hIGK1      ctgctcatcagatggcggga (SEQ ID No=24)
hIGL1      gacacacyagtgtggccttgt (SEQ ID No=25)
【００７５】
ＰＣＲ２の反応はＰＣＲ１の反応溶液2μLを18μLのＰＣＲｍｉｘ（最終濃度：1x TAKARA ExTaq buffer, 0.25 mM dNTP, 各サブファミリーに対するPrimer2 0.5μM, ExTaq 0.05U/μL）に加え、94℃, 3 min; (94℃, 30 sec; 60℃, 1 min; 72℃, 1 min 30 sec) x 40 cycles; 72℃, 5 min; 10 ℃, ∞反応させた。
【００７６】
ＰＣＲ ２
PCR 1 sol.                            2.0
10x ExTaq buffer                      2.0
2.5 mM dNTP                           2.0
Primer 2 5' Mix (10 μM each)         1.0
Primer 2 3' Mix (10 μM each)         1.0
H2O                                  10.0
Takara ExTaq (0.5 U/μL)              2.0
Total                                20.0
94 oC, 3 min.
94 oC, 30 sec; 60  oC, 1 min; 72 oC, 1.5 min.       40 cycles
72 oC, 5 min.
10 oC
ＰＣＲ２の反応によりＰＣＲ１で増幅した免疫グロブリン（抗体）遺伝子の可変部（ＶＨ）領域から定常部領域までのＤＮＡ配列を増幅した。
【００７７】
以下に上記反応で用いたプライマー(Ｈ鎖用)の配列を示す。
Primer2 Mix
Primer 2 5' Mix (10μM each)
hVH17a.2       ggtgcagctkgtrcartctgg (SEQ ID No=26)
hVH2a.2        caccttgarggagtctggtcc (SEQ ID No=27)
hVH3a.2       aggtdcarctgktggagtcyg (SEQ ID No=28)
hVH4a.2       ggtcctgtcycagstgcagct (SEQ ID No=29)
hVH5a.2       gtgcagctggtgcagtctgg (SEQ ID No=30)
hVH6.2       gcagcagtcaggtccaggact (SEQ ID No=31)
Primer 2 3' Mix (10μM each)
hIGHG1-4s     aagacsgatgggcccttggtg (SEQ ID No=32)
hIGHM       aagggttgggcggatgcact (SEQ ID No=33)
【００７８】
以下に上記反応で用いたプライマー(Ｌ鎖用)の配列を示す。
PCR 2
5' primer
hKV1.2     ccagatgacccagtctccatc (SEQ ID No=34)
hKV2.2     ccagtggggatattgtgatgac (SEQ ID No=35)
hKV3.2     cagtctccagccaccctgtct (SEQ ID No=36)
hKV4.2     gtgatgacccagtctccagac (SEQ ID No=37)
hKV 5.2    acactcacgcagtctccagca (SEQ ID No=38)
hKV67.2    ttgtgctgacycagtctccag (SEQ ID No=39)
hLV1.2     agtctgtgctgacgcagccgc (SEQ ID No=40)
hLV23.2    tgactcagccwcyctcmgtgtc (SEQ ID No=41)
hLV4.2-3   caatcatcctctgcmtctgc (SEQ ID No=42)
hLV5.2-2   gactcagccaacctccctctc (SEQ ID No=43)
hLV6.2     gactcagccccactctgtgtc (SEQ ID No=44)
hLV789.2   tcycagmctgtgstgacycag (SEQ ID No=45)
hLV1011.2  tgactcagccmcmctckgtgtc (SEQ ID No=46)
3' primer
hIGK2      gacagatggtgcagccacagt (SEQ ID No=47)
hIGL2      cttgragctcctcagaggaggg (SEQ ID No=48)
【００７９】
ＰＣＲ産物を、アガロースゲルを用いて解析、精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（Novagen, Madison, WI）にクローニングし、抗体遺伝子配列を決定した。既存のデータベースに入っている抗体遺伝子の配列と比較したものを図４及び５に示す。図４はＬ鎖の配列であり、図５はＨ鎖の配列である。各図ともに、上側に示した塩基配列が実際に１個のＢリンパ球からＲＴ−ＰＣＲで増幅し、配列決定した抗体遺伝子の配列であり、下側に示した塩基配列がデータベースに登録されていた既存の配列である。
【００８０】
図４
1st 塩基配列（配列決定した抗体遺伝子）
File Name: L1(SEQ ID No=49)
2nd 塩基配列(既存の配列）
File Name: L33038(SEQ ID No=50)
図５
1st 塩基配列（配列決定した抗体遺伝子）
File Name:  H1(SEQ ID No=51)
2nd 塩基配列(既存の配列）
File Name: AF062204(SEQ ID No=52)
【００８１】
図４及び５中の94 %および98 %は、配列決定した抗体遺伝子と既存の配列との相同性を意味する。相同性の値から、配列決定した抗体遺伝子は既存の配列とは異なる抗原に対応した抗体だと推測された。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】Ｆｌｕｏ３色素の細胞への導入と。抗原特異的リンパ球の検出。
【図２】Ｆｌｕｏ３色素を導入した細胞のマイクロウェルへの分注。
【図３】抗原特異的Ｂリンパ球からの抗体遺伝子のＰＣＲによる増幅。
【図４】実施例において得られた抗体(Ｌ鎖)遺伝子の配列と既存のデータベースに入っている抗体遺伝子の配列との比較を示す。
【図５】実施例において得られた抗体(Ｈ鎖)遺伝子の配列と既存のデータベースに入っている抗体遺伝子の配列との比較を示す。
【図６】従来の抗原特異的リンパ球測定に用いられている９６穴プレート。
【図１】
2004187676.tif 000004
【図２】
2004187676.tif 000005
【図３】
2004187676.tif 000006
【図４】
2004187676.tif 000007
【図５】
2004187676.tif 000008
【図６】
2004187676.tif 000009
【配列表】
2004187676000001.app