(57)【要約】【課題】ハイスループット分析に適した液体クロマトグラフィーによる分離分取装置を提供する。【解決手段】液体クロマトグラフィーによる分離分取装置であって、移動相の供給手段１０と、一つの前記移動相供給手段に対応する少なくとも２本の分離カラム６、とを備える分離手段と、前記分離カラム６から流出される溶出液を分取する手段３０、とを備えるようにする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーによる分離分取装置であって、
移動相の供給手段と、一つの前記移動相供給手段に対応する少なくとも２本の分離カラム、とを備える分離手段と、
前記分離カラムから流出される溶出液を分取する手段、
とを備える、装置。
【請求項２】
前記分離カラムとして、内径５０μｍ以上１００μｍ以下、長さ５ｃｍ以上２０ｃｍ以下のカラムを使用する、請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記移動相供給手段は、２μＬ／分以上１０μＬ／分以下の流速範囲内で送液能力を有し、前記分離カラムに１０００ｎＬ／ｍｉｎ以下の流速で移動相を供給する、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
前記各分離カラムの前段にはそれぞれプレカラムを備える、請求項１〜３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記分取手段は、前記分離カラムからの溶出液を収容するターゲットを前記分離カラムの装備数に対応して有し、これらのターゲットを移動させることにより、前記分離カラムからの溶出液を順次分取可能に形成されている、請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
前記分取手段は、前記分離カラムにそれぞれ接続され、前記ターゲットを指向する溶出液の流出管の端部を２以上保持する保持体を有し、当該保持体は、保持体下方に突出状に設けられる筒状のターゲッティングガイドを有し、当該ガイド内には、前記各流出管がガイド先端開口からの最大突出長が規制された状態で挿通方向に移動可能に保持されている、請求項５記載の装置。
【請求項７】
前記プレート状保持体は、前記分離カラムの全装備数に対応するターゲッティングガイドを有する、請求項６記載の装置。
【請求項８】
タンパク質の質量分析用試料の調製用である、請求項１〜７のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
マトリックスアシステッドレーザーデソープション型質量分析用であって、当該質量分析用マトリックスを前記流出管内で前記溶出液に供給可能なマトリックス供給手段を備える、請求項８記載の装置。
【請求項１０】
液体クロマトグラフィーによる分離分取方法であって、
移動相の供給手段に対して移動相の流路を分岐して並列して備えられる複数の分離カラムの各カラムに対して被験試料を導入してそれぞれ分離する工程と、
前記各分離カラムから溶出した溶出液をそれぞれ分取する分取工程、
とを備える、方法。
【請求項１１】
前記分離工程及び前記分取工程は、複数の被験試料について同時的に実施する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記分離カラムの前段に連結されるプレカラムに被験試料を吸着させる吸着工程を各分離カラムについて実施し、全分離カラムに対応する当該吸着工程完了後に、全分離カラムについての前記分離工程を開始する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の分離工程及び分取工程を備える、タンパク質の質量分析用試料の調製方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の分離工程及び分取工程を備える、マトリックスアシステッドレーザーデソープション型質量分析用試料の調製方法。
【請求項１５】
前記分画工程に先だって、質量分析用マトリックスを前記溶出液に供給する工程を備える、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、カラムクロマトフグラフィーによる成分分離及び分離成分の分取（特に、点状塗布（ブロッティング）して分取する手法）に関し、特に、ハイスループット分析に適した分離および分取技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質の機能解析は創薬研究の第一歩であり、近年、その重要性が増大し、大量の試料を高速処理することが求められてきている。また、タンパク質の機能解析にあたって、その一次構造及び高次構造を知ることは、翻訳後修飾と機能との関係についての知見を得るための重要な要素である。かかる構造解析には、特に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マトリックスアシステッドレーザーデソープションイオン化飛行時間型質量分析装置）などの分析システムが有用である。
【０００３】
ここに、従来、これまで、クロマトグラフィーと分取システムとを連結した技術を提供してきた（特許文献１）。しかしながら、このような技術であっても、１つのクロマトグラフィーシステムによって同時に１つの試料を分離し分取できるに過ぎず、近年のハイスループット分析の要請に応じることは困難であった。また、溶出液の分取形態としては、分取後の同定分析に適した形態であることも処理の効率化においては重要であり、上述のＭＳやＮＭＲを用いて分析するには、点状塗布（ブロッティング）の形態で分取する（ブロッティングする）ことが求められている。
【０００４】
【特許文献１】
特許第２６０３４３４号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明では、したがって、成分分離後の分析システムに、多くの試料を適切な状態で供給できる、すなわち、ハイスループット分析に適したクロマトグラフィーおよび分取システムを提供することをその目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記した課題を解決するため、カラムクロマトグラフィー用の１つの送液ポンプの流路を分岐して並列状に複線化し、分岐した各流路に対して分離カラムをセットすることによるマルチカラムシステム、及び、各カラムから溶出される溶出液を一括して分取する分取（ブロッティング）システムをそれぞれ構築できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００７】
（１）液体クロマトグラフィーによる分離分取装置であって、
移動相の供給手段と、一つの前記移動相供給手段に対応する少なくとも２本の分離カラム、とを備える分離手段と、
前記分離カラムから流出される溶出液を分取する手段、
とを備える、装置。
（２）前記分離カラムとして、内径５０μｍ以上１００μｍ以下、長さ５ｃｍ以上２０ｃｍ以下のカラムを使用する、（１）記載の装置。
（３）前記移動相供給手段は、２μＬ／分以上１０μＬ／分以下の流速範囲内で送液能力を有し、前記分離カラムに１０００ｎＬ／ｍｉｎ以下の流速で移動相を供給する、（１）又は（２）に記載の装置。
（４）前記各分離カラムの前段にはそれぞれプレカラムを備える、（１）〜（３）のいずれかに記載の装置。
（５）前記分取手段は、前記分離カラムからの溶出液を収容するターゲットを前記分離カラムの装備数に対応して有し、これらのターゲットを移動させることにより、前記分離カラムからの溶出液を順次分取可能に形成されている、（１）〜（４）のいずれかに記載の装置。
（６）前記分取手段は、前記分離カラムにそれぞれ接続され、前記ターゲットを指向する溶出液の流出管の端部を２以上支持する支持体を有し、当該保持体は、保持体下方に突出状に設けられる筒状のターゲッティングガイドを有し、当該ガイド内には、前記各流出管がガイド先端開口からの最大突出長が規制された状態で挿通方向に移動可能に保持されている、（５）記載の装置。
（７）前記プレート状保持体は、前記分離カラムの全装備数に対応するターゲッティングガイドを有する、（６）記載の装置。
（８）タンパク質の質量分析用試料の調製用である、（１）〜（７）のいずれかに記載の装置。
（９）マトリックスアシステッドレーザーデソープション型質量分析用であって、当該質量分析用マトリックスを前記流出管内で前記溶出液に供給可能なマトリックス供給手段を備える、（８）記載の装置。
（１０）液体クロマトグラフィーによる分離分取方法であって、
移動相の供給手段に対して移動相の流路を分岐して並列して備えられる複数の分離カラムの各カラムに対して被験試料を導入してそれぞれ分離する工程と、
前記各分離カラムから溶出した溶出液をそれぞれ分取する分取工程、
とを備える、方法。
（１１）前記分離工程及び前記分取工程は、複数の被験試料について同時的に実施する、（１０）記載の方法。
（１２）前記分離カラムの前段に連結されるプレカラムに被験試料を吸着させる吸着工程を各分離カラムについて実施し、全分離カラムに対応する当該吸着工程完了後に、全分離カラムについての前記分離工程を開始する、（１１）記載の方法。
（１３）（１０）〜（１２）のいずれかに記載の分離工程及び分取工程を備える、タンパク質の質量分析用試料の調製方法。
（１４）（１０）〜（１２）のいずれかに記載の分離工程及び分取工程を備える、マトリックスアシステッドレーザーデソープション型質量分析用試料の調製方法。
（１５）前記分画工程に先だって、質量分析用マトリックスを前記溶出液に供給する工程を備える、（１４）記載の方法。
【０００８】
本発明によれば、一つの移動相供給手段からの流路を分岐し、並列的に複数本の分離カラムを備えることにより、多数の被験試料を効率的に処理することができるようになる。特に、内径５０μｍ以上１００μｍ以下、長さ５ｃｍ以上２０ｃｍ以下程度のナノカラムに適用することで、少量の被験試料の効率的分析が可能となる。また、分離カラムに１０００ｎＬ／ｍｉｎ以下の移動相速度で移動相を供給する移動相供給手段を備えることにより、分離カラムからの溶出液をナノマイクロリットルのレベルでのブロッティングが可能となる。さらに、分離カラムの前段にプレカラムを備えることにより、当該プレカラムで被験試料を保持あるいは濃縮することができるとともに、複数本の分離カラムへの被験試料の供給タイミングを同期化することができる。これにより、ブロッティング手段を単一化あるいはその個数を低減することができる。また、ブロッティング手段に、前記プレート状保持体を備える場合には、一つのブロッティング手段で複数本の分離カラムからの溶出液を同期的にブロッティングすることが容易になる。
【０００９】
また、本発明の分画方法によれば、多数の被験試料を効率的に分離しかつ、後段での分析用等のために分画することができるようになる。特に、分離工程及びブロッティング工程とをそれぞれ同期的に行うことにより、一層効率的な処理が可能となる。さらに、前記プレカラムに被験試料を吸着させる吸着工程を実施し、全分離カラムに吸着工程を実施後に、一挙に全分離カラムについて分離工程を実施することで、効率的に分離工程と分画工程とを実施できる。
また、本発明装置及び方法の好ましい形態は、タンパク質の質量分析用試料の調製装置あるいは方法に適用する形態であり、また、特にマトリックスアシステッドレーザーデソープション型の質量分析用試料の調製装置及び方法に適用することが好ましい形態である。特に、マトリックスアシステッドレーザーデソープション型の質量分析用試料の調製装置及び方法に適用する場合には、分画に先だって、マトリックスを溶出液に供給する手段あるいは工程を備えることにより、成分分画と分析用試料の調製を同時に実現することができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の分画方法は、液体クロマトグラフィーにおける溶出成分の分画方法であって、移動相の供給手段に対して移動相の流路を分岐して並列して備えられる複数の分離カラムの各カラムに対して被験試料を負荷してそれぞれ分離する工程と、前記各分離カラムから溶出した溶出液をそれぞれブロッティングする分画工程、とを備えることを特徴としている。
また、当該方法を実施するのに適した装置として、本発明は、液体クロマトグラフィーによる分離分画装置であって、移動相の供給手段と、一つの前記移動相供給手段に対応して並列状に装備される少なくとも２本の分離カラムと、前記分離カラムから流出される溶出液をブロッティングする手段、とを備えている。
以下、図１に例示する本発明の装置２の全体を参照しつつ、本発明の装置及び方法について詳細に説明する。
【００１１】
（液体クロマトグラフィーによる分離手段）
分離手段４としての液体クロマトグラフィーは、分離カラム６ａ〜６ｆ（以下、特にこれらを区別しない場合には、図番を「６」と記載する。）を有し、さらに、当該分離カラム６に液体（移動相）を供給する移動相供給手段１０を備えている。
分離カラム６は、液体クロマトグラフィーに用いられる公知のカラム及び充填担体を用いることができる。すなわち、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等の各種公知の液体クロマトグラフィーに使用される充填担体及びカラムを使用できる。例えば、ＯＤＳ（オクタデシルシリル基）を備えるケイ素化合物を分離用担体とする分離カラム６を用いることができる。
なお、カラムサイズは、特に限定しないが、内径５０μｍ以上１００μｍ以下、長さ５ｃｍ以上２０ｃｍ以下のキャピラリーカラムを使用することができる。当該カラムは、特に、ナノ液体クロマトグラフィー用カラムとして好ましい。
分離カラム６の本数は特に限定しないが、好ましくは、３本以上として、より好ましくは４本以上であり、さらに好ましくは５本以上である。上限は、特に限定しないが、移動相供給手段１０として、２μＬ／分以上１０μＬ／分以下の流速範囲内の送液能力を有するものを使用する場合には、分離カラム６での適正な流速範囲を確保する観点から１０本以下の分離カラム６を使用することが好ましい。
【００１２】
また、本発明装置２及び方法は、流速が１０００μＬ／分以下のマイクロ液体クロマトグラフィー、流速が１０００ｎＬ／分以下のナノ液体クロマトグラフィーに適用することができる。好ましくは、ナノ液体クロマトグラフィーに適用する。ナノＬＣに適用することにより、微量サンプルでかつ微少量でのブロッティングが可能となるからである。また、特に、ナノＬＣは、タンパク質の機能解析等を目的とする質量分析用試料として適切な試料量を供給できるからである。
【００１３】
移動相供給手段１０は、特に限定しないで、従来公知の各種液体クロマトグラフィー用のポンプを用いることができる。特に、ナノＬＣに適用する場合には、キャピラリーカラム用ポンプを用いることが好ましい。送液能力としては、ナノＬＣに適用する場合には、流路を複数本に分岐し並列状に複数本の分離カラム６を装備した場合に、１０００ｎＬ／ｍｉｎ以下の流量となるような送液能力を有することが好ましい。通常、このような流速を達成する移動相供給手段１０としては、２μＬ／分以上１０μＬ／分以下の範囲で送液能力（好ましくは濃度勾配形成能力も有する）を有する移動相供給手段１０を挙げることができる。
【００１４】
本発明は、移動相供給手段１０からの移動相の流路が複数本に分岐し、複数本のカラムが並列的に接続可能となっていることを特徴としている。
移動相供給手段１０からの流路を複数本に分岐するには、例えば、適当な分流器を使用する。最終的に必要する流路数に対応させるために１個あるいは２個以上の分流器を用いることができる。例えば、図１に示すように、最終的に６本の流路に分岐したい場合には、まず、２本の分岐を有する分流器１４ａを使用し、この分流器１４ａで分岐した各流路に対して３方向性の分岐を有する分流器１４ｂを用い、２段階で分岐することが分岐することができる。
なお、カラム６と分流器１４、分流器１４と分流器１４との間は、流速に適合した内径のチューブを用いることが好ましい。なお、ナノＬＣにはフューズドシリカチューブを用いることが好ましい。また、各種チューブと分流器１４や後述するバルブ１２との接続は、チューブとチューブの接続部分を覆うユニオンあるいはチューブと分流器１４との接続部分を構成するコネクター内にチューブを挿通し、当該チューブをユニオンあるいはコネクター内の形状に適合したフェラルとボルトとで固定することにより、デッドボリュームをなしにするかあるいは最小限としてこれらを接続することができる。
【００１５】
所望の分岐数に分岐された流路は、流路切替用バルブ（フローセレクターバルブ）１２ａ〜１２ｆ（以下、特にこれらのバルブを区別しない場合には単に「１２」と記載する。）を介して各分離カラム６ａ〜６ｆに連絡させることができる。複数のポート、すなわち、マルチポートを有するバルブを用いることで、たとえば、図１に示すように、分離カラム６に、オートサンプラー１８からのサンプルローティングのための流路を接続可能となる。また、カラム６ａ〜６ｆの前段に被験試料を吸着保持させるプレカラム１６ａ〜１６ｆ（以下、これらのプレカラムを区別しない場合には、単に「１６」と記載する。）をこのバルブ１２に付随して装備することが可能となる。これにより、バルブ１２の切り換えで、移動相をプレカラム１６を通過しないで分離カラム６に到達する流路系と通過して分離カラム６に到達する流路系とを切り換え可能となる。図１においては、バルブ１２により、移動相がプレカラム１６を通過して分離カラム６に到達する流路系を形成した状態となっている。このプレカラム通過流路系が、プレカラム１６に被験試料を吸着保持させた後に形成されると、プレカラム１６に吸着させた被験試料が移動相によって溶出され分離カラム６に到達されることになる。
【００１６】
このように、本装置２には、プレカラム１６を備えることができるが、プレカラム１６は、分離カラム６の前段に取りつけられ、被験試料を予めプレカラム１６に吸着保持させておくことで、例えば、被験試料を濃縮することもできるし、また、分離カラム６に悪影響のある成分等をプレカラム１６に保持させて精製することもできる。また、本発明のように複数本の分離カラム６を用いる場合には、分離カラム６への流路系をバルブ１２で遮断した後、プレカラム１６に順次被験試料を供給し、最後に被験試料を供給したプレカラム６に被験試料が吸着された後に、同時にバルブ１２を作動させてプレカラム１６から分離カラム６への流路系を開放することにより、同時に各被験試料を複数の分離カラム６へ供給することができる。なお、被験試料の一次保持のためには、プレカラム１６に替えて、被験試料を一時的に貯留しておくことのできるサンプルループを用いることも可能である。
【００１７】
本装置２には、また、上述のように、オートサンプラー（自動サンプル供給装置）１８を装備することができる。オートサンプラー１８は、ＬＣシステムに用いることができる従来公知の各種オートサンプラー１８であれば、特に限定しないで用いることができる。例えば、図１に示すように、オートサンプラー１８は、サンプルローディングポンプ２０、バルブ２２、サンプルループ２４を備えることができる。
オートサンプラー１８と分離カラム６を擁する分離手段とはフローセレクターバルブ２６を介して連絡されている。バルブ２６は、オートサンプラー１８のサンプルループ２４からサンプルローディングポンプ２０によって移動相とともに搬送されてくる被験試料を対応する分離カラム６に分配するように適切な流路系を形成できるように構成されている。
【００１８】
オートサンプラー１８においては、被験試料の導入待機状態にあっては、所定の移動相がサンプルローディングポンプ２０によってサンプルループ２４を回避するように搬送され、バルブ２６、１２を介して、分離系外へ排出されるようになっている。
一方、オートサンプラー１８における被験試料の導入期にあっては、オートサンプラー１８側において上記のような移動相搬送状態下、被験試料の所定量がサンプルバイアルに吸引され、サンプルループ２４に保持され（図１参照）、その後、バルブ２２を切替作動して、サンプルローディングポンプ２０によって搬送される移動相をサンプルループ２４に流出させることにより、サンプルループ２４内に保持されていた被験試料が分離カラム６側へと搬送されるようになっている。
【００１９】
（分取手段）
分離カラム６の溶出末端側には、流出管２８が接続されており、この流出管２８の先端側には、分取手段３０を備えている。流出管２８は、既に述べたように、典型的には、フューズドシリカ製のチューブを用いることができる。ナノＬＣの場合、内径数十μｍ程度（典型的には、内径２０〜３０μｍ程度）とすることができる。
分取手段３０は、多数個の溶出液収容部を備えるターゲット３２と、このターゲット３２を載せるｘ、ｙ及びｚ方向に移動制御可能なテーブル４２とを備えている。ターゲット３２は、各分離カラム６に対して個別に設けることができ、それぞれのターゲット３２は、通常、所定量の溶出液を収容可能な収容部が多数個備えている。ナノＬＣあるいはＭＳ用試料を分離するのにＬＣを利用する場合における分取形態は、点状塗布、いわゆるブロッティングする形態となる。ブロッティングする場合、ターゲット３２は、全体としてプレート状であって、溶出液収容部の形態は特に限定しないが、直径１ｍｍ程度の円形の凹部とすることができる。また、ターゲット３２には、このような凹状の溶出液収容部が数１０個〜数１００個程度形成されている。なお、、ターゲット３２は、単に平面状であってもよい。
【００２０】
テーブル４２は、ターゲット３２を載せた状態で、３軸方向に移動して、分離カラム６から溶出される溶出液を、ターゲット３２上に配列された溶出液収容部に予め順番付けられて分取（ブロット）されるようになっている。このテーブル４２は、全ての分離カラム６に対して個々に設けることもできるが、好ましくは、２以上の分離カラム６、すなわち、２以上のターゲット３２に一つのテーブル４２が対応するものとし、より好ましくは、全ての分離カラム６、すなわち、全てのターゲット３２に対して単一のテーブル４２が対応するものとする。このような対応形態は、全ての分離カラム６において同時期（同期的）にサンプルをローディングして分離を開始する場合において特に有効である。また、複数のターゲット３２に対して単一のテーブル４２で対応することで、省スペースで、しかも、効率的に分取が可能となる。
【００２１】
分離カラム６から溶出される溶出液を正確にブロットするには、流出管２８の先端を正確にターゲット３２の溶液収容部に接触させる必要がある。したがって、同時分析の場合、複数の流出管２８の先端を同時に正確にターゲット３２に接触させないと一括ブロッティングが困難となる。本発明では、同時分析における正確なブロッティングのために、複数の流出管２８の先端側を保持する保持手段５２を用いることができる。この保持手段５２は、複数の流出管２８の先端を複数のターゲット３２に対応すべき適切な間隔を置いて、溶出液のブロッティング時には、必ずターゲットに当接させることができるようになっている。
【００２２】
この保持手段５２は、典型的にはプレート状の支持体５４を有し、支持体５４の所定位置に溶出チューブをおおよそまっすぐの状態で自在に挿通させることができる程度の内径の貫通孔５８を有するスリーブ状のターゲッティングガイド５６を備えている。ターゲッティングガイド５６の先端は、支持体５４の下面よりも下方、すなわち、ターゲット３２側に所定距離突出されている。この突出長は例えば数ｃｍ程度とすることができる。このターゲッティングガイド５６の貫通孔５８に流出管２８を挿入し、その先端がターゲッティングガイド５６先端から所定長さ（最大突出長、例えば１〜２ｍｍ程度）以上に突出しないように、下方への突出を規制するが、上方への移動は規制しない規制部材６２を設ける。当該規制部材６２は例えば、貫通孔５８から上方に突出される流出管２８のいずれかの部位に設けられる貫通孔５８よりも大きな外径を有する抜け止め材とすることができる。このような抜け止め材を配することで、流出管２８は、保持手段５２の下方に所定長を超えて突出されることはなく、突出した流出管２８の先端が例えばターゲット３２に当接した場合には、溶出チューブは上方に移動され、前記所定長よりも短い突出長でターゲッティングガイド５６から突出されることとなる。ターゲッティングガイド５６は、いかなる形態で支持体５４に対して形成されていてもよいが、例えば、支持体５６に形成した雌ねじ部に螺合する雄ねじ部を有するナットとすることができる。螺合により一体化されるターゲッティングガイド５６とすることで、ターゲッティングガイド５６が支持体５４の下面から突出する長さを調節することができるため好ましい。また、ターゲッティングガイド５６は、支持体５４の下面から突出する部分が、先端が先細り状のテーパ状であると、テーブル４２の三次元的移動を妨げることがなく、また、流出管２８の先端から流出する溶出液がスリーブ５６の先端に付着しにくいため都合がよい。
【００２３】
かかる保持手段５２によれば、図２に示すように、テーブル４２が移動してターゲット３２の溶出液収容部に流出管２８の先端が当接すると、流出管２８はターゲッティングガイド５６の貫通孔５８内を規制部材６２とともに上方に押し上げられる。このとき、流出管２８がターゲッティングガイド５６から突出した状態で溶出液収容部の底部に当接させることにより、溶出液のコンタミネーションを有効に防いで各溶出液を各溶出液収容部に分取あるいはブロッティングすることができる。流出管２８がターゲッティングガイド５６の先端から突出する長さを、テーブル４２あるいは支持体５４のセッティングが水平からはずれ得る範囲を想定して、全ての溶出チューブの先端がスリーブ５４の先端から突出した状態で溶出液収容部の底部に当接するように長さに設定しておくことで、全ての流出管２８について、その先端が溶出液収容部の底部に当接された状態とすることができ、複数個の流出管２８の全てからの溶出液を正確な滴下量でかつコンタミネーションを防止して各収容部にブロットすることができる。
【００２４】
なお、本装置２においては、分離カラム６から溶出される溶出液に他の液体を混合する手段を備えることもできる。当該他の液体は、ターゲット３２の溶出液収容部に供給することもできるが、好ましくは、分離カラム６の末端からターゲット３２に至る流出管２８のいずれかの部位において他の液体を当該溶出チューブ内に供給し混合させることが好ましい。このようなインライン混合は、特に、質量分析用試料調製時など、溶出液の分析に溶出液以外に他の液体（マトリックス）を要する場合において好ましい。具体的には、マトリックスエイドレーザーデソープション型質量分析用の試料調製に適用するのが好ましい。
【００２５】
このようなインライン混合には、例えば、分離カラム６からターゲット３２に至る流出管の途中に分流器７２を設け、この分流器７２の一つのポートに他の液体の供給手段を接続することができる。この結果、分流器７２において溶出液と他の液体とが合流した状態で、ターゲット３２まで搬送されることになる。例えば、図１に示す形態では、マトリクス供給手段７４からの流路は、分流器７６を介して分離カラム６の装備数に応じて分流され、各分離カラム６からの流出管２８に分流器７２を介して合流するようになっている。
【００２６】
なお、ターゲット３２は、次なる分析手段、たとえば、マススペクトルや核磁気共鳴スペクトルなどの同定手段のサンプリング手段あるいは当該同定手段の前処理手段にそのままの状態で適用可能な形態とすることが好ましい。
【００２７】
次に、本発明の方法について説明する。なお、以下の工程は、図１に示す装置２を使用した場合を挙げて説明するが、これらの工程は、図１に示す装置２を適用する場合に限定されるものではない。
（分離工程）
まず、ＬＣ分離系に所定の移動相を流して安定化することができる。移動相は、特に限定しないが、分離工程を通じて一定の溶媒を用いることもできるし、グラジエントをかけることもできる。また、両者を組み合わせること可能である。移動相供給手段１０における流速は、２〜１０μＬ／分とすることができ、例えば、図１に示すように６つに分流した場合、それぞれの分離カラム６においては、１０００ｎＬ／分以下程度のナノＬＣレベルとすることができる。
【００２８】
初期の移動相で十分に分離系（分離カラム６、流路、およびプレカラム１６を含む）を安定化後、分離系に被験試料が導入される。オートサンプラー１８にセットされた被験試料は、逐次バルブ２２を介して吸引され、サンプルループ２４にトラップされるとともに、バルブ２２が切り換えられて分離系側にサンプルローディングポンプ２０により押し出され、次いで、流路切り換えバルブ２６の順次的な出口開閉制御により、所定のプレカラム１６に押し出される。プレカラム１６には、被験試料中の分離成分が吸着保持される。なお、プレカラム１６への被験試料の導入にあっては、バルブ１２は、図１に記載したバルブ１２の制御位置とは異なる制御位置にあり、バルブ２６からの流路とプレカラム１６とが直列状に連絡される。このような被験試料の導入が順次行われて、全被験試料がプレカラム１６に吸着された後、全ての分離カラム６に対して、同じタイミングで被験試料が導入される。
【００２９】
分離カラム６への被験試料の導入は、バルブ１２の切り換えによって達成される。図１には、バルブ１２の切り換えにより、分離カラム６とプレカラム１６とが直列に接続された状態が記載されている。この状態にバルブ１２が切り換えされると、プレカラム１６に吸着保持された被験成分が分離カラム１６に導入される。本発明方法によれば、一つの移動相供給手段１０を用いてその流路を分岐することで一度に複数本の分離カラム６を用いて同時分析が可能となっている。このため、被験試料中の成分の分離とブロッティングとの高速処理化が可能となっている。従来、一つの移動相供給手段１０に対して、複数個の分離カラム６を並列的に接続することは行われていなかった。なお、移動相にグラジエントをかける場合には、適時グラジエントを形成する送液状態が形成される。各分離カラム６には、毎分ナノリットルレベルの流速で移動相が送液され、被験成分が分離され、分離カラム６から各成分が順次溶出される。
【００３０】
（分取工程）
各分離カラム６から溶出された溶出液は、流出管２８を通過し、分取手段３０のテーブル４２上のターゲット３２の溶出液収容凹部に順次分取（ブロッティング）されるようになっている。ブロッティングは、所定時間間隔でテーブル４２が移動して、流出管２８の先端に次の溶出液収容凹部を位置させることにより行われる。流速５００ｎＬ／分の場合、３０秒間、一つの溶出液収容凹部に位置させることにより、約２５０ｎＬがブロットされることになる。
【００３１】
各流出管２８の先端が保持手段５２に保持されている場合には、一つの移動可能なテーブル４２によって、全分離カラム６からの溶出液をブロットすることが可能となる。また、テーブル４２やターゲット３２の水平性が完全に確保されていない場合であっても、ターゲッティングガイド５６によって流出管２８がガイドされているため、撓むことなく、その先端が溶出液収容凹部の底部あるいはその近傍に到達され、正確に所定量が収容凹部にブロットされるとともに、コンタミネーションも防止され、結果として、確実に溶出液をブロットし、後段での分析に適した試料分取が可能となる。
【００３２】
特に、マトリックスアシステッドレーザーデソープション型質量分析用の試料調製をブロッティング工程と同時に実現することができる。この場合には、分離カラム６から流出する溶出液がターゲット３２に到達するのに先だって溶出液にマトリックスが混合されることが好ましい。このためには、図１に示すマトリックス供給手段７４によりマトリックスを供給する。なお、マトリックス以外であっても、後段での同定分析に必要な試薬あるいはその他の液体も、このマトリックスと同様に溶出液に混合することができる。
【００３３】
以上のようにして、本発明における分離工程及び分取工程を実施することができる。本発明によれば、一つの移動相供給手段１０を用いて複数本の分離カラム６で複数の分離工程を実施可能であり、特に、複数の分離カラム６に対して同時期に被験試料を導入して同時分析が可能である。一つの移動相供給手段１０を用いるため、移動相にグラジエントをかける場合など、同時分析に都合がよい。また、本発明によれば、単一のブロッティング手段により複数本の分離カラム６からの溶出液についてブロッティング工程を実施することができる。特に、複数本の分離カラム６に対して同時に被験試料を導入した場合には、各分離カラム６からの溶出成分をそれぞれ同時的にブロッティングすることができることにより、各分離カラム６の多数個の溶出画分は、それぞれ他の分離カラム６からの多数個の溶出液画分と同じ溶出条件（保持時間、移動相のグラジエント等）とすることができる。これにより、各溶出画分についての後段での同定分析において溶出成分の同定や構造分析を容易にすることができる。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によれば、ハイスループット分析に適した液体クロマトグラフィーによる分離分取装置および方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の分離分取装置の全体の概略を示す図である。
【図２】分離カラムからの流出管を保持する保持手段を示す図である。
【符号の説明】
２  装置
６  分離カラム
１０  移動相供給手段
１６  プレカラム
１８  オートサンプラー
２８  流出管
３０  分取手段
【図１】
2004325168.tif 000003
【図２】
2004325168.tif 000004