(57)【要約】【課題】成長が速く、セルロース含量の多い植物を提供すること。【解決手段】植物にキシログルカナーゼ遺伝子を導入することによりキシログルカナーゼを発現させ、植物体中のキシログルカンを分解することにより、成長が促進し、セルロース含量が増加し、強度も高くなるといった多くの利点を有する植物が得られる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシログルカナーゼ遺伝子を導入したトランスジェニック植物。
【請求項２】
野生型の植物に比し、茎又は幹全体に8%以上多くのセルロースを含む請求項1に記載の植物。
【請求項３】
野生型の植物に比し、茎又は幹全体が5%以上大きな比重を有する請求項1に記載の植物。
【請求項４】
野生型の植物に比し、茎又は幹全体が5%以上高いヤング率を有する請求項1に記載の植物。
【請求項５】
野生型の植物に比し、茎又は幹全体の長さが15%以上長い請求項1に記載の植物。
【請求項６】
請求項1に記載の植物から得られる物品。
【請求項７】
植物の成長を促進させるために使用する、キシログルカナーゼ遺伝子が挿入されたプラスミド。
【請求項８】
請求項7に記載のプラスミドを有する宿主細胞。
【請求項９】
（I）キシログルカナーゼ遺伝子をベクターに組み込む工程、（II）（I）で得られたプラスミドを細菌に導入することにより、細菌の形質転換を行う工程、（III）（II）で得られた細菌を植物細胞に接触させることにより、植物細胞のトランスフェクションを行う工程、及び（IV）トランスフェクションされた植物細胞を培養する工程、を含む請求項1に記載の植物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キシログルカナーゼ遺伝子を導入したプラスミド、宿主細胞、トランスジェニック植物、該トランスジェニック植物の作製方法、及び該トランスジェニック植物から得られる物品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、地球上では森林破壊が急速に進んでおり、地球温暖化の問題も深刻化している。植物は、大気中の二酸化炭素を吸収して酸素を供給するという重要な役割を担っている。また、植物、特に樹木は二酸化炭素を吸収するだけでなく、例えば木材、紙パルプ等の資源を供給するという役割も担っている。
【０００３】
そこで、植物をより大きく、より速く、即ち、効率良く育てる技術が強く望まれている（非特許文献1参照）。
【０００４】
最近、植物の成長は吸水力に依存しており、その吸水力は細胞壁のゆるみによってもたらされることが分かってきている。また、その細胞壁の堅さは、キシログルカンがセルロースを架橋することによって与えられることが推測されている（非特許文献2参照）。
【０００５】
しかしながら、キシログルカンが分解されることによって成長が促進された植物はいまだに作られていない。
【０００６】
【非特許文献１】
大宮泰徳，林隆久，「林木バイオテクノロジーの現状」，化学と生物，2002年1月，第40巻，第1号，p.32-37
【０００７】
【非特許文献２】
林隆久，「キシログルカン」，生化学，1997年12月，第69巻，第12号，p.1392-1397
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、植物にキシログルカナーゼ遺伝子を導入することにより、成長が速く、セルロース含量も多く、更に茎の強度も高いといった多くの利点を有する植物を得ることである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、キシログルカナーゼの遺伝子を植物に組み込み、キシログルカナーゼを発現させることにより、野生型の植物に比し、成長が速く、セルロース含量が多く、更に茎等の強度も高い植物を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下の項1〜9に関する。
【００１１】
１．キシログルカナーゼ遺伝子を導入したトランスジェニック植物。
【００１２】
２．野生型の植物に比し、茎又は幹全体に8%以上多くのセルロースを含む上記項1に記載の植物。
【００１３】
３．野生型の植物に比し、茎又は幹全体が5%以上大きな比重を有する上記項1に記載の植物。
【００１４】
４．野生型の植物に比し、茎又は幹全体が5%以上高いヤング率を有する上記項1に記載の植物。
【００１５】
５．野生型の植物に比し、茎又は幹全体の長さが15%以上長い上記項1に記載の植物。
【００１６】
６．上記項1に記載の植物から得られる物品。
【００１７】
７．植物の成長を促進させるために使用する、キシログルカナーゼ遺伝子が挿入されたプラスミド。
【００１８】
８．上記項7に記載のプラスミドを有する宿主細胞。
【００１９】
９．（I）キシログルカナーゼ遺伝子をベクターに組み込む工程、（II）（I）で得られたプラスミドを細菌に導入することにより、細菌の形質転換を行う工程、（III）（II）で得られた細菌を植物細胞に接触させることにより、植物細胞のトランスフェクションを行う工程、及び（IV）トランスフェクションされた植物細胞を培養する工程、を含む上記項1に記載の植物の作製方法。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明で得られるキシログルカナーゼ遺伝子を導入したトランスジェニック植物（以下、「本発明の植物」という。）は、植物体内に発現したキシログルカナーゼが細胞壁に結合しているキシログルカンを分解することにより、野生型の植物に比し成長が促進された植物である。
【００２１】
本発明において成長促進又は成長が促進されたとは、野生型の植物に比し、（イ）茎、幹、枝等の伸長速度が速い、（ロ）茎、幹等の長さや高さが高い、（ハ）茎、幹等の植物中に含まれるセルロースの量も多い、（ニ）比重、ヤング率といった機械的強度も大きい、（ホ）葉が肥大化する、といった特徴の少なくとも1つの特徴を含むことをいう。
【００２２】
例えば、本発明の植物は、野生型の植物に比し、茎又は幹全体に約8%以上、好ましくは約10%以上多くのセルロースを含むことができる。本発明の植物は、野生型の植物に比し、茎又は幹全体が約5%以上、好ましくは約8%以上大きな比重を有することもできる。本発明の植物は、野生型の植物に比し、茎又は幹全体が約5%以上、好ましくは約8%以上高いヤング率を有することもできる。本発明の植物は、野生型の植物に比し、茎又は幹全体の長さが約15%以上、好ましくは約20%以上長くなることもできる。
【００２３】
成長速度、セルロース含量、比重、ヤング率というような植物の性状の比較は、同種の野生型植物と行うことが好ましい。ここで、野生型植物とはキシログルカナーゼ遺伝子を導入していない植物をいう。
【００２４】
また、本発明において植物とは、通常の植物体のみならず、葉、花弁、茎、根、表皮、繊維細胞、枝、果実、種子等の植物体の部分、苗、カルス等も含むものとする。
【００２５】
また、「節間」とは、葉又は枝の生えている部分と、その上又は下の葉又は枝の生えている部分との間の茎又は幹の部分をいう。植物の茎又は幹の（上）先端の葉又は枝の生えている部分から次の（第2の）葉又は枝が生えている部分までの間の茎又は幹の部分を「第1節間」、その第2の葉又は枝が生えている部分から次の（第3の）葉又は枝が生えている部分までの間の茎又は幹の部分ことを「第2節間」といい、以下同様に、根元に向かって節間の数字が増えていくものとする。
【００２６】
茎又は幹全体の長さとは、植物体全体の長さ又は高さから根の部分の長さを除いた部分の長さ又は高さをいう。
【００２７】
本発明におけるキシログルカナーゼとは、キシログルカナーゼ活性を有する酵素（タンパク質）のことであり、キシログルカン特異的エンド-β-1,4-グルカナーゼ（xyloglucan-specific endo-β-1,4-glucanase：XEG）とも呼ばれ、キシログルカンの1,4-β-グルカン骨格を加水分解する酵素をいう。
【００２８】
また、本発明で使用されるキシログルカナーゼの種類、由来等は限定されないが、好ましくは糸状菌であるAspergillus aculeatus由来のものがよい。Aspergillus aculeatusとしては公知の菌を、使用することができ、公知の方法で培養すればよい。
【００２９】
このAspergillus aculeatus由来のキシログルカナーゼのアミノ酸配列を配列番号1に示すが、このアミノ酸配列中の1又は複数、好ましくは1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたものも、キシログルカナーゼ活性を有する限り本発明に含まれる。
【００３０】
本発明では、キシログルカナーゼをコードする遺伝子（DNA）を植物に導入することにより、キシログルカナーゼを発現させ、植物体中のキシログルカンを分解して植物の成長を促進等させる。
【００３１】
ここで、キシログルカナーゼをコードするDNA（以下、「本発明で使用するDNA」という。）とは、キシログルカナーゼ活性を有する酵素をコードする限り限定されない。好ましくは、配列番号2で表される、Aspergillus aculeatus由来のDNAが使用される。本発明においては配列番号2で表されるDNAに限られず、この配列のうち1又は複数、好ましくは1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加されたものであっても、キシログルカナーゼ活性を有する酵素をコードする限り使用できる。
【００３２】
上記の本発明で使用するAspergillus aculeatus由来のDNAは公知の方法により得ることができる。得られたDNAは、例えば、アグロバクテリウム法のような公知の遺伝子工学的手法により植物に導入される。
【００３３】
例えば、本発明で用いるDNAを、pBI 101（クロンテック社製）、pBI 121（クロンテック社製）、PBE2113-GUS（独立法人農業生物資源研究所）のような公知のベクターに組み込み、得られたプラスミドを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることができる。宿主細胞としては、通常の遺伝子工学的手法に用いられている宿主細胞が使用でき、例えば、大腸菌が好適に用いられる。
【００３４】
上記宿主細胞中で増幅されたプラスミドを、例えばエレクトロポレーション法等のような公知の方法により、植物細胞に感染して本発明で用いるDNAを植物細胞に導入することができる細菌に導入することができる。そのような細菌としては、特に限定されないが、好ましくはアグロバクテリウム細菌を使用することができる。アグロバクテリウム細菌の菌株の種類は限定されないが、例えば、LBA4404、GV3101 C58C１等を例示できる。
【００３５】
アグロバクテリウム法のような公知の方法により、本発明で用いるDNAが導入されたアグロバクテリウム細菌を植物細胞切片に接触させ、植物細胞に本発明で用いるDNAを導入することができる（例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 94, 2117-2121；Anal.Biochem., 72, 248-254, 1976等参照。）。
【００３６】
得られた植物細胞切片は、例えば、カナマイシンのような形質転換した植物細胞のスクリーニングのための抗生物質、及びカルベシリン、セフォタキシム、クラホランのようなアグロバクテリウム細菌を殺すための抗生物質といった少なくとも2種以上の抗生物質存在下、ベンジルアデニン（1ppm）及びナフタレン酢酸（0.1ppm）を含むムラシゲ&スクーグのような寒天培地上で、約16〜35℃、好ましくは約18〜32℃、更に好ましくは約20〜30℃で、約10日〜2ヶ月、好ましくは約15日〜2ヶ月、更に好ましくは約1ヶ月培養することができる。
【００３７】
上記のように培養することにより、カルス状の組織とともに芽（シュート）が出現する。これを4μMインドール酪酸を含むムラシゲ&スクーグ培地のような公知の発根培地に移植し、例えば、約1〜20週間、好ましくは約2〜10週間、更に好ましくは約3〜8週間培養することにより植物体にした後、バーミキュライト又は土に移植して育てることにより、本発明の植物を得ることができる。
【００３８】
本発明において、植物の細胞にDNAが組み込まれたことは、酵素の定量（例えば、Anal.Biochem., 28, 50, 50-356, 1956等参照。）、キシログルカナーゼ活性の測定（Plant Physiol., 114, 661-667, 1997）、ウェスタンブロッティング等の公知の方法によって確認できる。これらの方法としても限定されることなく、公知の方法、市販のキット等を用いることにより行うことができる。
【００３９】
本発明で用いるDNAを組み込むことのできる植物としては、何ら限定されず、木本植物であっても草本植物であってもよい。木本植物としては、針葉樹であっても広葉樹であってもよく、草本植物としては、一年草であっても多年草であってもよい。
【００４０】
例えば、針葉樹としては、エゾマツ、トドマツ、アカマツ、ハレペンシスマツ、ラジアータマツ、ストローブマツ、雑種カラマツ、アメリカカラマツ、ヨーロッパアカマツ、テーダマツ、クロマツ、カラマツ、アカエゾマツ、ヨーロッパカラマツ、リュウキュウマツ、ドイツトウヒ、ツガ、トガサワラ、トウヒ、カナダトウヒ、クロトウヒ、アメリカトガサワラ等のマツ科植物、コウヤマキ、スギ等のスギ科植物、ヒノキ、サワラ等のヒノキ科植物等が例示できる。
【００４１】
広葉樹としては、ユーカリ等のフトモモ科植物、ブナ、クヌギ等のブナ科植物、シナノキ等のシナノキ科植物、ポプラ、ドロノキ等のヤナギ科植物、ハンノキ、カバノキ等のカバノキ科植物、カラムシ等のイラクサ科植物、ツナソ等のシナノキ科植物、コウゾ、カジノキ、クワ等のクワ科植物、ミツマタ、ガンピ等のジンチョウゲ科植物、オヒョウニレ等のニレ科植物、アオギリ等のアオギリ科植物、シュロ、ココヤシ等のヤシ科植物、リントウ、タコノキ等のタコノキ科植物、アケビ等のアケビ科植物、パンヤ、アカシアマンギウム、センゴン等が例示できる。
【００４２】
一年生草本としては、マニラアサ、アサ等のクワ科植物、アマ等のアマ科植物、ワタ、イチビ、ケナフ等のアオイ科植物、サイザル、リュウゼツラン、マオラン、イトラン等のリュウゼツラン科植物等が例示できる。
【００４３】
多年草としては、アナナス等のパイナップル科植物、イ等のイグサ科植物、ゲットウ等のショウガ科植物、アンペライ等のカヤツリグサ科植物、パナマソウ等のパナマソウ科植物、トウ等のヤシ科植物、コリヤナギ等のヤナギ科植物等が例示できる。
【００４４】
また、竹、笹、フェニックスカナリエンシス、コユスカナリエンシス、ワシントニヤヤシ、ドラセナ、ユッカ、ソテツ、デイゴ、ハイビスカス、ブーゲンビリア、ベンジャミン、ゴムノキ等も例示できる。更には、観葉植物、花卉植物等も使用することができる。
【００４５】
好ましくは、ポプラ、クヌギ、アカシアマンギウム、マツ類、センゴン、スギ、ワタ、ユーカリ、ケナフ等が、扱い易さという点で例示できるが、これらに限定されるものではなく、例えば、繊維を得る、パルプを得る、材木として使用する、街路樹として利用する、動物の餌にする、観賞用に用いる等、種々の目的に応じて適宜選択することができる。
【００４６】
本発明の植物におけるセルロース含量、比重、ヤング率を測定する方法は、公知の方法が使用でき、特に限定されない。例えば、セルロース含量はフェノール硫酸法等によって定量できる。比重は、アルキメデスの法則を利用して、茎、幹、木片等の乾燥重量を、茎、幹、木片等を水に沈めた時の重量変化で割ることによりと求めることができる。ヤング率は、市販の自動材料試験機によって自動的に算出することができる。
【００４７】
上記のようにして得られた本発明の植物の成長部位は、細胞壁に結合するキシログルカンが分解されるので、野生型の植物に比し成長速度が速くなる。更に、本発明の植物は、野生型の植物に比しセルロース含量が多く、比重、ヤング率等も高い。
【００４８】
本発明の植物は、速く大きく成長し、しかも葉も厚くなることから、光合成も盛んに行われ、二酸化炭素の吸収量も多くなり、環境汚染の防止、地球温暖化の防止、大気の浄化等において非常に有用な植物であるといえる。
【００４９】
本発明の植物はセルロース含有量も多いことから、1本の植物当たりの採取できる繊維やパルプの量も多くなり、伐採する木の量も減らすことができる。ワタなどの繊維細胞が長くなることによって、繊維の強度が増すことも期待される。
【００５０】
本発明の植物は比重、ヤング率等も高いことから、高い強度を必要とする材木、建材等としても好適に用いることができる。得られる木材はまた、燃料としても用いることができる。植物の成長が速くなるので、再生可能エネルギー資源として計画的に生産できる。
【００５１】
本発明の植物を用いて、公知の方法により、様々な物品を得ることができる。該物品としては、例えば、紙類、ダンボール類等、布類、衣類、柱、梁、窓枠、フローリング、クローゼット、パネル等の建材、ベッド、本棚、食器棚、机、テーブル、椅子等の家具、茶碗、箸、お盆、文房具等の日用品、コンテナー、容器等の収納するために用いるもの、日曜大工の材料又は部品、工芸品又は工芸品のための材料、竹刀、木刀、野球のバット、テニスのラケット、バトミントンのラケット、卓球のラケット、スキーの板、スノーボードの板等のスポーツ用品、ギター、バイオリン、ウクレレ、マンドリン、チェロ、ビオラ、コントラバス、ピアノ等の楽器類等を挙げることができる。
【００５２】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するために実施例を挙げるが、いうまでもなく本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５３】
実施例1：キシログルカーゼ融合DNAの構築
Aspergillus aculeatus菌糸体を液体窒素で凍結させてから磨砕し、GeneEluteMammalian Total RNA miniprepkitのバッファー（シグマ社製）に懸濁させてmRNA調製カラム（シグマ社製）に供した。5mgのmRNA から20単位のSuper Script II逆転写酵素（Gibco BRL, Rockville, USA）及び50ngのoligo-dTプライマー（12〜18ヌクレオチド）を用いて37℃で30分間インキュベーションして合成することにより、キシログルカナーゼのcDNAを得た。このcDNAを解読したところ、配列番号2の配列であることが分かった。
【００５４】
Aspergillus aculeatus キシログルカナーゼ（以下、「AaXEG2」という。）のDNA配列に相補的な、XbaI部位（配列番号3）を含むフォワードプライマー1及び内部SacI部位（配列番号4）を含むリバースプライマー1を用いて、cDNA を鋳型としてPCRによって増幅させた。反応は95℃（45秒）、65℃（45秒）、72℃（２分）で、25サイクル行った。
【００５５】
反応終了後、反応液をアガロース電気泳動にかけ、約700bpのDNA断片をゲルより回収した後、pBluescript II（SK-）に組み込んだ。これを用いて大腸菌（E. coli）を形質転換した。得られた菌体よりプラスミドを抽出した（以下、このプラスミドを「pXEG2」という。）。得られたpXEG2は、配列番号2で表されるAaXEG2遺伝子を含むことを確認した。
【００５６】
Populus albaセルラーゼのシグナルペプチド（Met1〜Leu30）を、BamHI部位（配列番号5）を含むフォワードプライマー2及びXbaI部位（配列番号6）を含むリバースプライマー2を用いたPCRによって、PaPopCel1 cDNA由来のpGEM-Tイージーベクター内でクローンした（Nakamura, S., Mori, H., Sakai, F. & Hayashi, T. Cloning and sequencing of cDNA for poplar endo-1,4-b-glucanase. Plant Cell Physiol. 36, 1229-1235 (1995)）。PopCel1シグナルペプチドのBamHI-XbaI断片を、AaXEG2遺伝子に対するXbaI-SacI断片を含むpBluescriptII（SK-）中に結合させた。
【００５７】
CaMV35Sプロモーター及びE12-Ωエンハンサー配列のコントロール下に、PopCel1シグナルペプチドに対するキメラDNA及びXEG2成熟タンパク質をBamHI及びSacIで切除し、2つのベクターpBE2113-GUSのBamHI-SacI部位に挿入してプラスミド構築物を得た（Mitsuhara, I. et al. Efficient promoter cassettes for enhanced expression of foreign genes in dicotyledonous and monocotyledonous plants. Plant Cell Physiol. 37, 49-59 (1996)）。
【００５８】
実施例2：キシログルカナーゼ遺伝子の植物への導入
プラスミド構築物をAgrobacterium tumefaciens LBA4404（アグロバクテリウム菌）にエレクトロポレーション（400V、330μFの条件で）により導入し（Huekema, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J. & Schilperoort, R.A. A binary plant vector strategy based on separation of vir-and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303, 179-180 (1983)）、室温下で、無菌でフラスコ培養したPopulus alba（ポプラ）の葉を細かく刻んだものに上記アグロバクテリウム菌を接種した（Ebinuma, H., Sugita, K., Matsunaga, E.& Yamakado, M. Selection of marker-free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2117-2121.）。
【００５９】
上記のようにして得られた植物を、グロースチャンバ中で18時間の明期及び6時間の暗期の周期で30日間、27℃で生育させた。その後、鉢植えに植え替えて30日間生育させたものを種々の性状の測定に用いた。
【００６０】
実施例3：アポプラスト、細胞質及び細胞壁結合画分の細分化
実施例2で得られた本発明の植物（trg1〜4）の茎を収穫し、その茎を4cmぐらいの長さにに切り分けた。その切り分けられた茎を脱塩水を用いて湿潤し、440gで15分間遠心分離し、得られた上清をアポプラスト画分（図1の「A」）とした。
【００６１】
その後、上清を取り除いて得られた茎をすり鉢で20mMリン酸ナトリウムバッファー（pH6.2）を用いてホモジェナイズし、細胞壁残渣を上記20mMリン酸ナトリウムバッファー（pH6.2）で3回洗浄した。得られた水溶性成分を細胞質画分（図1の「C」）とした。
【００６２】
また、細胞壁結合画分（図1の「W」）は、1MのNaClを含むバッファーを用いて細胞壁残渣から抽出したものを用いた。
【００６３】
実施例4：キシログルカナーゼのウェスタンブロッティングによる確認
実施例3で得られた各画分におけるタンパク質（キシログルカナーゼ）を、ウェスタンブロッティング（図1上の「→」）及び酵素活性（図1下の棒グラフ）を用いて確認した。
【００６４】
組換えキシログルカナーゼを、成熟キシログルカナーゼの全長cDNAを融合させたpET-32 Xa/LIC発現ベクターとして、E.coli 細胞で発現させた。該組換えタンパク質をプロテアーゼ因子Xaで消化し、ウサギにフロイントアジュバントを用いて注射した。抗血清は20〜50%飽和の硫酸アンモニウムを用いて沈殿させた。このようにして、キシログルカナーゼに対する抗体を作製した。
【００６５】
以下の全ての工程は4℃で行った。0.5MのNaCl を含む2倍量の20mMリン酸ナトリウムバッファー（pH6.2）を用いて、茎を2回ホモジェナイズした。ホモジェネートを遠心分離し、上清中のタンパク質を65%飽和の硫酸アンモニウムで沈殿させることによって濃縮した。得られたタンパク質を、タンパク質アッセイキット（Pierce, Rockford, USA）及びスタンダードとしてウシ血清アルブミンを用いて、ブラッドフォードの方法（Bradford, M.N. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).）で定量した。
【００６６】
ウェスタンブロット解析のために、タンパク質を10% SDS-PAGEを用いて電気泳動し、Hybond-C Extra（Amershem, USA）に転写し、抗体を付着させ、次いでTOYOBO-ABC high-HRP Immunostaining Kit（Toyobo, Tokyo, Japan）を用いて二次抗体を付着させた。結果を図1の上図「→」に示す。
【００６７】
また、図1の左上に、Leaf（葉）、Stem（茎）及びRoot（根）の各部位におけるキシログルカナーゼの発現について調べた結果を示す。これらの各部位は実施例3におけるように各画分に細分化したものではなく、それぞれの部位をホモジェナイズしたもの（各画分全体）を用いた。
【００６８】
これらの結果から、本発明の植物において発現したキシログルカナーゼは、植物の特定の部位に局在するのではなく、全体に存在することがわかった。更に、茎においては、キシログルカナーゼはアポプラスト画分にはほとんど存在せず、細胞質画分及び細胞壁結合性画分に局在していることが分かった。
【００６９】
実施例5：キシログルカナーゼの酵素活性の測定
キシログルカナーゼ活性は、0.1mlの酵素調製物に0.65%（w/v）タマリンドキシログルカンを含む10mMリン酸ナトリウムバッファー（pH6.2）0.9mlを加えて、Cannonセミミクロ粘度計（Cannon Instrument, State College, USA）を用いて35℃で2時間アッセイし、粘度を測定した。
【００７０】
活性の1ユニットは、粘度が0.1%減少するのに必要な酵素の量として定義した（Matsumoto, T., Takeda, T., Sakai, F. & Hayashi, T. A xyloglucan-specific endo-1,4-b-glucanase isolated from auxin-treated pea stems. Plant Physiol. 114, 661-667 (1997)）。結果を図1の下図（棒グラフ）に示す。
【００７１】
この結果から、本発明の植物（trg1〜4）において発現したキシログルカナーゼは、実施例4の結果と同様に、葉（Leaf）、茎（Stem）及び根（Root）の各部位で発現しており、更に、茎においては、細胞質画分「C」及び細胞壁結合性画分「W」に局在していることが分かった。
【００７２】
実施例6：外観観察及び顕微鏡観察
伸長している茎を50%エタノールに浸漬し、マイクロスライサー（DTK-2000, D.S.K., Kyoto, Japan）でセクションを作った。それらをスライドグラス上でサフラニンで染色し、エタノールで脱水し、植物細胞を包埋するためにBiolite（Oken, Tokyo, Japan）を乗せた。
【００７３】
葉を20mMのPIPES（pH7.2）中4%パラホルムアルデヒドで固定した。20mM Tris/HCl（pH7.2）で洗浄した後エタノールを用いて脱水し、LR White resin（LondonResin, Hampshire, England）に固定した。セクションは、ガラスナイフを用いてミクロトーム（RM2145, Leica instrument GmbH, Nussloch, Germany）上で作成した。
【００７４】
それらをスライドグラス上に置き、水で希釈し、40℃のホットプレート上で乾燥させた。次いで、そのセクションをToluidine Blue Oで染色し、50%グリセロールをのせた。サンプルを顕微鏡（AxioPlan, Carl Zeiss, Germany）で観察した結果を図2に示す。
【００７５】
これらの結果から、本発明の植物（trg1〜4）はコントロールの植物（野生型：Control）に比し、成長速度が速いことがわかる（図A）。また、本発明の植物は、コントロールの植物に比し茎の直径も大きく（図B（コントロール）及びC（本発明の植物））、茎の各細胞の大きさも非常に大きくなっており（図D（コントロール）及びE（本発明の植物））、更に葉の厚さも非常に厚くなっていることがわかる（図F（コントロール）及びG（本発明の植物））。
【００７６】
試験例7：細胞壁成分の画分化及び測定
本発明の植物及びコントロールの植物の、第2節間及び第10節間の組織をそれぞれ液体窒素中ですりつぶし、得られた粉末を凍結乾燥させた。サンプルを80%エタノールで連続して3回洗浄し、10mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）で2回洗浄した。
【００７７】
洗浄された凍結乾燥品を0.1M EDTA（pH7.0）で抽出し、更にその液で3回洗浄し、可溶性画分を「ペクチン画分」とした。次いで、0.1% NaBH4含有24% KOHで抽出し、更にその液で3回洗浄し、可溶性画分を「ヘミセルロース画分」とした。不溶性画分を「セルロース画分」とした。その後、不溶性画分を水で洗浄し、氷冷した72%の硫酸で可溶化した。
【００７８】
各画分の全糖は、フェノール硫酸法で測定した（Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A. & Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28, 50-356 (1956)）。即ち、サンプル0.5mlに、フェノール0.5mlと濃硫酸2.5mlを加えて発色させて490 nmで測定した。また、キシログルカンは、メチル化分析により4,6結合のグルコースとして測定した。
【００７９】
表1から、本発明の植物は、細胞壁結合性キシログルカンが分解されている。このことから、キシログルカナーゼ遺伝子を導入した植物において、キシログルカナーゼが発現することによりキシログルカンが分解されたことが分かる。
【００８０】
また、第2節間を用いた結果を表1に、第10節間を用いた結果を表2に示す。これらの結果から、本発明の植物（trg1〜4）は、コントロールの植物に比し、第2節間において約5%以上、第10節間において約12%以上セルロースの含量が増加していることが分かった。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
【表２】
2004187618.tif 000004
【００８３】
実施例8：比重の測定
本発明の植物及びコントロール植物における第10節間の組織の表面にグリースを添付し、ワイヤにつるした状態で上皿天秤の上に載せてある水浴に入れた。乾燥重量を増加した水の量に基づく質量で割って算出した。結果を表2にあわせて示す（「比重」）。
【００８４】
この結果から、本発明の植物は、コントロールの植物に比し、第10節間において、約6%以上比重も増加することが分かった。
【００８５】
実施例9：種々の節間の機械的特徴の測定
本発明の植物及びコントロールの植物の茎を、23℃で10mMのMES/KOHバッファー（pH6.2）に浸漬した。5mmスパン当たり0.5g/分の負荷をかけて測定した。張力を茎の縦方向に負荷し、ヤング率は自動材料試験器（Tensilon/UTM-4L, Toyo Measuring Instruments, Yokohama, Japan）を用いて測定した。また、各節間の長さをノギスを用いて測定した。結果を合わせて表3に示す。
【００８６】
【表３】
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【００８７】
この結果から、本発明の植物は、全節間においてコントロールの植物に比し、伸長が促進されていることがわかる。更に、第4節間においては40%を超える伸長速度の上昇が見えられた。即ち、本発明の植物は、コントロールの植物に比し、非常に成長速度が速いことが分かった。
【００８８】
また、ヤング率においても、本発明の植物は、測定可能な第4節間以下では、コントロールの植物に比し10%以上の増加が見られた。この結果から、本願発明の植物は、コントロールの植物に比し、機械的な強度も増加していることが分かった。即ち、本発明の植物は、単に高さが高くなるのではなく、伸長の促進と共に、機械的強度も強度も強くなることが分かった。
【００８９】
【発明の効果】
キシログルカナーゼ遺伝子を導入した本発明の植物は、野生型の植物に比し伸長速度が速く、セルロース含量、ヤング率、更には比重も大きくなる。即ち、植物1本あたりのセルロース含量が多いことから、繊維、パルプ等が多く採取でき、工業上の利用価値も非常に高い。更に、ヤング率も高いことから、硬度を必要とする建材などの材料としても好適に使用できる。
【００９０】
また、本発明の植物の葉も肥大化しており、本発明の植物のセルロース含量も増加していることからも、光合成が活発に行われていることがわかり、本発明の植物は地球温暖化の防止にも役立ち、地球環境に非常に優しい植物である。
【００９１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】上図は、ポプラにおけるAaXEG2遺伝子産物の局在性をウェスタンブロットによって示す。「A」はアポプラスト画分を示し、「C」は細胞質画分を示し、「W」は細胞壁結合性画分を示す。矢印は24kDaの遺伝子産物を示す。下図は、上図の各画分に対応した画分におけるキシログルカナーゼ活性を示す。
【図２】茎及び葉の細胞の成長におけるAaXEG2 形質転換体の効果を示す図である。図Aはコントロール及び形質転換植物（trg1〜trg4）（30日目の植物体）を示し、図Bはコントロールの第2節間の横断面を示し、図Cはtrg1の第2節間の横断面を示す（バー＝1mm）。図Dはコントロールの第2節間の縦断面図を示し、図Eはtrg1の第2節間の縦断面図を示す（バー＝10μm）。図Fはコントロールの第10の葉の断面図を示し、図Gはtrg1の第10の葉の断面図を示す（バー＝100μm）。
【図１】
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【図２】
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