(57)【要約】【課題】細菌を容易かつ高精度に識別することが可能なプライマーおよびそのプライマーの塩基配列決定方法を提供することである。【解決手段】大腸菌Ｋ−１２株をプライマーＢ７２を用いてＳＳＣ−ＰＣＲにより増幅し、得られたＤＮＡ断片の１本鎖４０ａおよび４０ｂにより構成される２本鎖４０において、１本鎖４０ａのプライマー１００のすぐ内側に位置する塩基３１ａと、鎖４０ｂの塩基３１ａと対向する位置にある塩基３１ｂとが互いに相補的である場合、塩基配列（５’−ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣ−３’）を有するプライマー１００の３’末端側に塩基３１ａを延長した塩基配列１００ａ（５’−ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣＡ−３’）を大腸菌を識別するためのプライマーとして決定する。【選択図】        図４
2004187560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列決定方法であって、
ｍ個の塩基からなる既存のプライマーを準備し、前記細菌のＤＮＡ断片に対して、熱変性工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行うポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより、前記細菌のＤＮＡ断片を増幅し、５’末端側に既存のプライマーを含む第１の１本鎖ＤＮＡと５’末端側に既存のプライマーを含む第２の１本鎖ＤＮＡとにより構成される２本鎖ＤＮＡを作製するステップと、
前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて前記既存のプライマーを含む５’末端側のｍ個よりも長いｎ個の塩基からなる第１の領域の塩基配列と、前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて３’末端側のｎ個の塩基からなる第２の領域または前記第２の１本鎖ＤＮＡにおいて前記既存のプライマーを含む５’末端側のｎ個の塩基からなる第３の領域の塩基配列との関係に基づいて、前記既存のプライマーの塩基配列を決定するステップとを備え、前記ｍおよびｎは自然数であることを特徴とするプライマーの塩基配列決定方法。
【請求項２】
前記細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列を決定するステップは、
前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて前記既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基と、前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて３’末端側のｍ個の塩基からなる領域の５’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基とが相補的な場合、または、前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて前記既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基と、前記第２の１本鎖ＤＮＡにおいて５’末端のｍ個の塩基からなる領域の３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基とが同一の場合に、前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて前記既存のプライマーの３’末端側に隣接する前記少なくとも１つの塩基を前記既存のプライマーの３’末端に追加することにより得られる塩基配列を前記細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列として決定するステップを含むことを特徴とする請求項１記載のプライマーの塩基配列決定方法。
【請求項３】
前記細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列を決定するステップは、
前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて前記既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基と、前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて３’末端側のｍ個の塩基からなる領域の５’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基とが相補的でない場合、または、前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて前記既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基と、前記第２の１本鎖ＤＮＡにおいて５’末端のｍ個の塩基からなる領域の３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基とが同一でない場合に、前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて前記既存のプライマーの３’末端にイノシンを追加することにより得られる塩基配列を前記細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列として決定するステップを含むことを特徴とする請求項１記載のプライマーの塩基配列決定方法。
【請求項４】
前記細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列を決定するステップは、
前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて前記既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基と、前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて３’末端側のｍ個の塩基からなる領域の５’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基とが相補的でなく、かつ、前記既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基に隣接する第１の塩基と、前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて３’末端側のｍ個の塩基からなる領域の５’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基に隣接する第２の塩基とが相補的な場合、または、前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて前記既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基と、前記第２の１本鎖ＤＮＡにおいて５’末端のｍ個の塩基からなる領域の３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基とが同一でなく、かつ、前記第１の１本鎖ＤＮＡにおける前記第１の塩基と、前記第２の１本鎖ＤＮＡにおいて５’末端のｍ個の塩基からなる領域の３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基に隣接する第３の塩基とが同一である場合に、前記第１の１本鎖ＤＮＡにおいて前記既存のプライマーの３’末端にイノシンおよび前記第１の塩基を順に追加することにより得られる塩基配列を前記細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列として決定するステップを含むことを特徴とする請求項１記載のプライマーの塩基配列決定方法。
【請求項５】
細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列の決定方法であって、
ｍ個の塩基からなる既存のプライマーを準備し、２つの１本鎖により構成される塩基配列が既知である細菌のＤＮＡ断片に対して、熱変性工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行うポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより、前記細菌のＤＮＡ断片を増幅し、５’末端側に既存のプライマーを含む増幅された１本鎖ＤＮＡと細菌の１本鎖ＤＮＡとにより構成される２本鎖ＤＮＡを作製するステップと、
前記増幅された１本鎖ＤＮＡにおいて前記既存のプライマーの塩基配列と、前記細菌の１本鎖ＤＮＡにおいて３’末端側のｍ個の塩基からなる第１の領域との関係、または、前記増幅された１本鎖ＤＮＡにおいて前記既存のプライマーの塩基配列と、前記細菌の１本鎖ＤＮＡにおいて前記第１の領域および５’末端側のｍ個の塩基からなる第２の領域の塩基配列との関係に基づいて、前記既存のプライマーの塩基配列を決定するステップとを備え、前記ｍは自然数であることを特徴とするプライマーの塩基配列決定方法。
【請求項６】
前記細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列を決定するステップは、
前記増幅された１本鎖ＤＮＡの前記既存のプライマーの５’末端の少なくとも１つの塩基と、前記細菌の１本鎖ＤＮＡにおいて前記第１の領域の３’末端の少なくとも１つの塩基とが互いに相補的でない場合に、前記既存のプライマーの５’末端の少なくとも１つの塩基を削除することにより得られる塩基配列を前記細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列として決定するステップを含むことを特徴とする請求項５記載のプライマーの塩基配列決定方法。
【請求項７】
前記細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列を決定するステップは、
前記増幅された１本鎖ＤＮＡの前記既存のプライマーの５’末端からｋ番目の位置の少なくとも１つの塩基と、前記細菌の１本鎖ＤＮＡの３’末端からｋ番目の位置の少なくとも１つの塩基とが互いに相補的でなく、かつ、前記既存のプライマーの５’末端からｋ番目の位置の少なくとも１つの塩基と前記細菌の１本鎖ＤＮＡの５’末端からｋ番目の位置の少なくとも１つの塩基とが互いに相補的である場合に、前記既存のプライマーの５’末端からｋ番目の位置の少なくとも１つの塩基を前記細菌の１本鎖ＤＮＡの５’末端からｋ番目の位置の少なくとも１つの塩基で置換することにより得られる塩基配列を前記細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列として決定するステップを含み、前記ｋは２以上ｍ以下の自然数であることを特徴とする請求項５記載のプライマーの塩基配列決定方法。
【請求項８】
配列番号１７に記載の塩基配列を有することを特徴とするプライマー。
【請求項９】
配列番号１８に記載の塩基配列を有することを特徴とするプライマー。
【請求項１０】
配列番号１９に記載の塩基配列を有することを特徴とするプライマー。
【請求項１１】
配列番号２０に記載の塩基配列を有することを特徴とするプライマー。
【請求項１２】
配列番号２１に記載の塩基配列を有することを特徴とするプライマー。
【請求項１３】
配列番号２２に記載の塩基配列を有することを特徴とするプライマー。
【請求項１４】
配列番号２３に記載の塩基配列を有することを特徴とするプライマー。
【請求項１５】
配列番号２４に記載の塩基配列を有することを特徴とするプライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌識別用のプライマーおよび細菌識別用のプライマーの塩基配列決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細菌の検出および識別の技術は、食品の衛生管理および病気の原因特定のために必要である。従来、細菌の検出および識別は、細菌の培養とその後の生化学的および形態的特徴により行われている。しかしながら、このような細菌の検出および識別の方法では、１週間程時間が必要であり、迅速さが要求される場合、対応できないという欠点がある。
【０００３】
また、同一の細菌種でも、毒性を持つ株と持たない株とが存在するため、株の違いまで検出する必要があるが、生化学的および形態的な株間の相違は僅かであり、株の違いまで識別することは困難であった。
【０００４】
近年、リボゾームＲＮＡ（１６Ｓ）をコードする遺伝子の相違から細菌の識別を行う方法が確立され、属までの識別に有効であるが、株間の識別には至っていない（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−０９５４７８号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
一方、ＤＮＡ分析を行うことにより細菌群の情報を得る方法も考えられる。ＤＮＡ分析を行うには分析可能な程度のＤＮＡの量が必要である。ＤＮＡを増幅する方法としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ポリメラーゼ連鎖反応）法が用いられている（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，９６５，１８８号、第５，０３８，８５２号および第５，３３３，６７５号）。このＰＣＲ法は、増幅しようとするＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）の両端の塩基配列に相補な塩基配列を有するプライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、熱変性工程、アニーリング（熱処理）工程および伸長反応工程の３段階からなるサイクルを繰り返すことにより、鋳型ＤＮＡとほぼ同じＤＮＡ断片を増幅することを可能にするものである。このＰＣＲ法を用いると、微量にしか存在しない細菌の１個のＤＮＡ中の所定の断片を例えば１０万〜１００万倍に増幅することができる。
【０００７】
しかしながら、このＰＣＲ法を用いるためには、鋳型ＤＮＡの一領域の少なくとも両端の塩基配列が既知であることが必要である。したがって、従来のＰＣＲ法では、細菌の種類および塩基配列が知られていないと、それらの細菌のＤＮＡ断片を増幅することはできない。
【０００８】
そこで、単一のプライマーで塩基配列の情報なしに一種類のＤＮＡから同時に多数の種類のＤＮＡ断片を増幅するＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）法もしくはＡＰ−ＰＣＲ（Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  Ｐｒｉｍｅｄ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が提案されている。これらの方法では、ＰＣＲの反応時にプライマーのアニーリング温度を下げ、さらに反応液中のマグネシウムイオン濃度を上げることにより、プライマーの結合時の配列特異性を下げる。すると、プライマーはミスマッチを伴って細菌の染色体ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ断片が複製される。
【０００９】
これらのＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ法によれば、増幅しようとするＤＮＡの塩基配列の情報がなくても、単一のプライマーにより何らかのＤＮＡ断片が多量に増幅される。増幅されたＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により分離することによりＤＮＡフィンガープリントが得られる。このＤＮＡフィンガープリントを分析することにより細菌の状態を分析することが可能となる。
【００１０】
その反面、従来のＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ法を複数の細菌から構成される細菌群に適用する場合、増幅されるＤＮＡ断片の種類数が多すぎるために、増幅されたＤＮＡ断片と鋳型となった細菌との対応付けが困難となり、細菌群が形成する生態系を把握することが困難となる。また、増幅されたＤＮＡ断片から細菌群を構成する細菌を識別することはできない。
【００１１】
特に、食品の衛生管理および病気の原因特定のためには、細菌の種間の識別のみならず大腸菌等の株間の識別も行うことが重要である。
【００１２】
そこで、本発明者らは、ＳＳＣ−ＰＣＲ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いた細菌識別方法を開発した。このようなＳＳＣ−ＰＣＲを用いた細菌識別方法によれば、特定のプライマーを用いて大腸菌等の株間の識別を行うことが可能となる。
【００１３】
このような細菌識別方法を行うためには、細菌を容易かつ高精度に識別することが出来るプライマーが必要となる。
【００１４】
本発明の目的は、細菌を容易かつ高精度に識別することができるプライマーおよびそのプライマーの塩基配列決定方法を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段および発明の効果】
本発明者は、細菌を容易かつ高精度に識別することを可能にすべく検討および実験を重ねた結果、特定の細菌の識別に用いられる既存のプライマーを改変することにより、その細菌の識別に用いる新たなプライマーの塩基配列を決定することができることを見い出し、以下の発見を案出した。
【００１６】
第１の発明に係るプライマーの塩基配列決定方法は、細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列決定方法であって、ｍ個の塩基からなる既存のプライマーを準備し、細菌のＤＮＡ断片に対して、熱変性工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行うポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより、細菌のＤＮＡ断片を増幅し、５’末端側に既存のプライマーを含む第１の１本鎖ＤＮＡと５’末端側に既存のプライマーを含む第２の１本鎖ＤＮＡとにより構成される２本鎖ＤＮＡを作製するステップと、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて既存のプライマーを含む５’末端側のｍ個よりも長いｎ個の塩基からなる第１の領域の塩基配列と、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて３’末端側のｎ個の塩基からなる第２の領域または第２の１本鎖ＤＮＡにおいて既存のプライマーを含む５’末端側のｎ個の塩基からなる第３の領域の塩基配列との関係に基づいて、既存のプライマーの塩基配列を決定するステップとを備え、ｍおよびｎは自然数であるものである。
【００１７】
本発明に係るプライマーの塩基配列決定方法によれば、ある特定の細菌の識別に用いられる既存のプライマーを改変することにより、その細菌の識別に用いる新たなプライマーの塩基配列を決定することができる。それにより、ある特定の細菌を識別するために用いることができる種々のプライマーを作製することが可能となる。したがって、ある特定の細菌を識別するために用いることができる種々のプライマーのうち作製が容易なプライマーまたは識別精度の高いプライマーを選択することが可能となる。その結果、細菌を容易かつ高精度に識別することができる。
【００１８】
細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列を決定するステップは、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基と、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて３’末端側のｍ個の塩基からなる領域の５’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基とが相補的な場合、または、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基と、第２の１本鎖ＤＮＡにおいて５’末端のｍ個の塩基からなる領域の３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基とが同一の場合に、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基を既存のプライマーの３’末端に追加することにより得られる塩基配列を細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列として決定するステップを含んでもよい。
【００１９】
この方法により決定された塩基配列を有するプライマーを作製し、ＳＳＣ−ＰＣＲに用いることにより、細菌を高精度かつ安定的に増幅することができ、細菌を容易にかつ高精度に識別することが可能となる。
【００２０】
細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列を決定するステップは、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基と、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて３’末端側のｍ個の塩基からなる領域の５’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基とが相補的でない場合、または、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基と、第２の１本鎖ＤＮＡにおいて５’末端のｍ個の塩基からなる領域の３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基とが同一でない場合に、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて既存のプライマーの３’末端にイノシンを追加することにより得られる塩基配列を細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列として決定するステップを含んでもよい。
【００２１】
この方法により決定された塩基配列を有するプライマーを作製し、ＳＳＣ−ＰＣＲに用いることにより、ミスマッチを伴う細菌の増幅を防止することができ、高精度かつ安定的に細菌を増幅することが可能となる。その結果、細菌を高精度かつ安易に識別することが可能となる。
【００２２】
細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列を決定するステップは、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基と、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて３’末端側のｍ個の塩基からなる領域の５’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基とが相補的でなく、かつ、既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基に隣接する第１の塩基と、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて３’末端側のｍ個の塩基からなる領域の５’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基に隣接する第２の塩基とが相補的な場合、または、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて既存のプライマーの３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基と、第２の１本鎖ＤＮＡにおいて５’末端のｍ個の塩基からなる領域の３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基とが同一でなく、かつ、第１の１本鎖ＤＮＡにおける第１の塩基と、第２の１本鎖ＤＮＡにおいて５’末端のｍ個の塩基からなる領域の３’末端側に隣接する少なくとも１つの塩基に隣接する第３の塩基とが同一である場合に、第１の１本鎖ＤＮＡにおいて既存のプライマーの３’末端にイノシンおよび第１の塩基を順に追加することにより得られる塩基配列を細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列として決定するステップを含んでもよい。
【００２３】
この方法により決定された塩基配列を有するプライマーを作製し、ＳＳＣ−ＰＣＲに用いることにより、ミスマッチを伴う細菌の増幅を防止することができ、高精度かつ安定的に細菌を増幅することが可能となる。その結果、細菌を高精度かつ安易に識別することが可能となる。
【００２４】
第２の発明に係るプライマーの塩基配列決定方法は、ｍ個の塩基からなる既存のプライマーを準備し、２つの１本鎖により構成される塩基配列が既知である細菌のＤＮＡ断片に対して、熱変性工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行うポリメラーゼ連鎖反応法を適用することにより、細菌のＤＮＡ断片を増幅し、５’末端側に既存のプライマーを含む増幅された１本鎖ＤＮＡと細菌の１本鎖ＤＮＡとにより構成される２本鎖ＤＮＡを作製するステップと、増幅された１本鎖ＤＮＡにおいて既存のプライマーの塩基配列と、細菌の１本鎖ＤＮＡにおいて３’末端側のｍ個の塩基からなる第１の領域との関係、または、増幅された１本鎖ＤＮＡにおいて既存のプライマーの塩基配列と、細菌の１本鎖ＤＮＡにおいて第１の領域および５’末端側のｍ個の塩基からなる第２の領域の塩基配列との関係に基づいて、既存のプライマーの塩基配列を決定するステップとを備え、ｍは自然数であるものである。
【００２５】
本発明に係るプライマーの塩基配列の決定方法によれば、ある特定の細菌の識別に用いられる既存のプライマーを改変することにより、その細菌の識別に用いる新たなプライマーの塩基配列を決定することができる。それにより、ある特定の細菌を識別するために用いることができる種々のプライマーを作製することが可能となる。したがって、ある特定の細菌を識別するために用いることができる種々のプライマーのうち作製が容易なプライマーまたは識別精度の高いプライマーを選択することが可能となる。その結果、細菌を容易かつ高精度に識別することができる。
【００２６】
細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列を決定するステップは、増幅された１本鎖ＤＮＡの既存のプライマーの５’末端の少なくとも１つの塩基と、細菌の１本鎖ＤＮＡにおいて３’末端の少なくとも１つの塩基とが互いに相補的でない場合に、既存のプライマーの５’末端の少なくとも１つの塩基を削除することにより得られる塩基配列を細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列として決定するステップを含んでもよい。
【００２７】
この方法により決定された塩基配列を有するプライマーを作製し、ＳＳＣ−ＰＣＲに用いることにより、ミスマッチを伴う細菌の増幅を防止することができ、細菌を高精度に識別することができる。
【００２８】
細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列を決定するステップは、増幅された１本鎖ＤＮＡの既存のプライマーの５’末端からｋ番目の位置の少なくとも１つの塩基と、細菌の１本鎖ＤＮＡの３’末端からｋ番目の位置の少なくとも１つの塩基とが互いに相補的でなく、かつ、既存のプライマーの５’末端からｋ番目の位置の少なくとも１つの塩基と細菌の１本鎖ＤＮＡの５’末端からｋ番目の位置の少なくとも１つの塩基とが互いに相補的である場合に、既存のプライマーの５’末端からｋ番目の位置の少なくとも１つの塩基を細菌の１本鎖ＤＮＡの５’末端からｋ番目の位置の少なくとも１つの塩基で置換することにより得られる塩基配列を細菌の識別に用いるプライマーの塩基配列として決定するステップを含み、ｋは２以上ｍ以下の自然数であってもよい。
【００２９】
この方法により決定された塩基配列を有するプライマーを作製し、ＳＳＣ−ＰＣＲに用いることにより、細菌を高精度かつ安定的に増幅することができ、細菌を高精度かつ安易に識別することが可能となる。
【００３０】
第３の発明に係るプライマーは、配列番号１７に記載の塩基配列ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣＡを有するものである。
【００３１】
上記の塩基配列を有するプライマーをＳＳＣ−ＰＣＲに用いることにより、大腸菌および赤痢菌を識別することができる。
【００３２】
第４の発明に係るプライマーは、配列番号１８に記載の塩基配列ＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣを有するものである。
【００３３】
上記の塩基配列を有するプライマーをＳＳＣ−ＰＣＲに用いることにより、大腸菌および赤痢菌を識別することができる。
【００３４】
第５の発明に係るプライマーは、配列番号１９に記載の塩基配列ＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣを有するものである。
【００３５】
上記の塩基配列を有するプライマーをＳＳＣ−ＰＣＲに用いることにより、大腸菌および赤痢菌を識別することができる。
【００３６】
第６の発明に係るプライマーは、配列番号２０に記載の塩基配列ＣＡＡＣＣＧＡＧＣを有するものである。
【００３７】
上記の塩基配列を有するプライマーをＳＳＣ−ＰＣＲに用いることにより、大腸菌および赤痢菌を識別することができる。
【００３８】
第７の発明に係るプライマーは、配列番号２１に記載の塩基配列ＴＴＧＡＧＴＡＧＴＴＧＣＩを有するものである。
【００３９】
上記の塩基配列を有するプライマーをＳＳＣ−ＰＣＲに用いることにより、大腸菌および赤痢菌を識別することができる。
【００４０】
第８の発明に係るプライマーは、配列番号２２に記載の塩基配列ＴＴＧＡＧＴＡＧＴＴＧＣＩＩを有するものである。
【００４１】
上記の塩基配列を有するプライマーをＳＳＣ−ＰＣＲに用いることにより、大腸菌および赤痢菌を識別することができる。
【００４２】
第９の発明に係るプライマーは、配列番号２３に記載の塩基配列ＴＴＧＡＧＴＡＧＴＴＧＣＩＩＩを有するものである。
【００４３】
上記の塩基配列を有するプライマーをＳＳＣ−ＰＣＲに用いることにより、大腸菌および赤痢菌を識別することができる。
【００４４】
第１０の発明に係るプライマーは、配列番号２４に記載の塩基配列ＴＴＧＡＧＴＡＧＴＴＧＣＩＩＩＡを有するものである。
【００４５】
上記の塩基配列を有するプライマーをＳＳＣ−ＰＣＲに用いることにより、大腸菌および赤痢菌を識別することができる。
【００４６】
【発明の実施の形態】
図１は、細菌識別装置を示す図である。
【００４７】
図１に示すように、細菌識別装置は、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１、電気泳動イメージ入力部２、解析用コンピュータ３、データベースの格納部４および結果表示手段５からなる。
【００４８】
ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅解析装置１については後述する。電気泳動イメージ入力部２は、例えばＣＣＤカメラおよびスキャナにより構成される。解析用コンピュータ３は、後述する構成を有するパーソナルコンピュータからなる。データベースの格納部４は、ハードディスク等からなり、結果表示手段５は、ディスプレイ等からなる。
【００４９】
なお、本実施の形態におけるＳＳＣ−ＰＣＲとは、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎのことであり、１種類の細菌から平均１種類のＤＮＡ断片が増幅できるように増幅条件を設定し、特定の塩基配列を有するプライマーを複数用いて未知の塩基配列を有する細菌群または単一の細菌からＤＮＡ断片を連鎖反応的に増幅する反応をいう。ＳＳＣ−ＰＣＲの詳細については後述する。
【００５０】
なお、本実施の形態では、表１に示す予め選定した有効な７種類のプライマーおよび本発明におけるプライマーの塩基配列決定方法により決定した塩基配列を有する表２に示す８種類のプライマーを用いる。なお、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｉはイノシンを示す。
【００５１】
【表１】
2004187560.tif 000003
【００５２】
【表２】
2004187560.tif 000004
【００５３】
表２に示す８種類のプライマーのうち、配列番号１７〜２０のプライマーは、表１に示す配列番号１のプライマーＢ７２を基に本発明におけるプライマー塩基配列決定方法により塩基配列を決定し、作成したものである。また、配列番号２１〜２４のプライマーは、表１に示す配列番号２のプライマーＢ６９を基に本発明におけるプライマーの塩基配列決定方法により塩基配列を決定し、作成したものである。以下に、プライマーの作成方法を示す。
【００５４】
作成するプライマーの塩基配列の基となるプライマーおよび基となるプライマーにより増幅伸長する検体のＤＮＡ断片を用意し、基となるプライマーを用いて検体のＤＮＡ断片をＳＳＣ−ＰＣＲ法により増幅する。
【００５５】
ここで、ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、後述する３段階の工程を繰り返し行い、細菌のＤＮＡ断片に対して特定の塩基配列を有するプライマーを用いることにより分析可能な量のＤＮＡ断片を増幅する。
【００５６】
本実施の形態においては、基となるプライマーとしてプライマーＢ６９またはプライマーＢ７２を用い、検体のＤＮＡ断片として大腸菌Ｋ−１２株を用いる。
【００５７】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いた反応溶液の組成を表３に示す。
【００５８】
【表３】
2004187560.tif 000005
【００５９】
表３において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのＴｒｉｓは、Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの略である。ｄＮＴＰｍｉｘは、ｄＡＴＰ（２−−デオキシアデノシン−５−−三燐酸）、ｄＣＴＰ（２−−デオキシシチジン−５−−三燐酸）、ｄＧＴＰ（２−−デオキシグアノシン−５−−三燐酸）、ｄＴＴＰ（２−−デオキシチミジン−５−−三燐酸）の等濃度混合溶液である。反応溶液量は２０μＬとした。
【００６０】
プライマーＢ６９および大腸菌Ｋ−１２株のＤＮＡ断片を含むＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液ならびにプライマーＢ７２および大腸菌Ｋ−１２株のＤＮＡ断片を含むＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の２種類を調製した。
【００６１】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法の３段階の工程を示す。
（１）熱変性工程
ＤＮＡ（初期時）またはＤＮＡ断片を加熱変性し、１本鎖（ＤＮＡ鎖）にする。
【００６２】
（２）プライマーのアニーリング工程（プライマーの結合工程）
プライマーがＤＮＡ鎖の増幅領域の端に結合するように熱処理を行う。
【００６３】
（３）ポリメラーゼによる伸長反応工程（ポリメラーゼによる複製工程）
プライマーを起点としてポリメラーゼによって相補鎖を合成し、２本鎖化する。
【００６４】
上記（１）〜（３）の工程を１サイクルとしてこのサイクルを繰り返し行う。第１のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で２分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程、および上記反応溶液を例えば７２℃で３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行う。なお、本サイクルの熱変性工程は、長い完全ＤＮＡを１本鎖に完全に分離するために下記サイクルの熱変性工程よりも長めに設定する。
【００６５】
引続き、第２のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程および上記反応溶液を例えば７２℃で３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で例えば３３回繰り返す。
【００６６】
最後に、第３のサイクルとして、上記反応溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記反応溶液を例えば４５℃で２分間保持するプライマーのアニーリング工程および上記反応溶液を７２℃で１０分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で行う。なお、本サイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程は、最後に複製を完全化するために第１および第２のサイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程よりも長めに設定する。
【００６７】
本実施の形態におけるＳＳＣ−ＰＣＲのサイクルを表４に示す。
【００６８】
【表４】
2004187560.tif 000006
【００６９】
ここで、上記第１のサイクル、第２のサイクルの第１回目のサイクル、および第２のサイクルの第２回目のサイクルを図２〜図４を用いて説明する。なお、図は模式的に示しており、ＤＮＡの１本鎖等はプライマーと結合する部分の塩基配列を示している。
【００７０】
図２〜図４では、一例としてＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣの塩基配列（配列番号１）を有するプライマーＢ７２を用いている。なお、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示す。
【００７１】
図２（ａ）に示すように、最初、上記反応溶液中には複数の異なる細菌に含まれていた長いＤＮＡ（完全ＤＮＡ）１１が存在する。ここでは、１個の完全ＤＮＡに着目して説明する。
【００７２】
最初に、図２（ｂ）に示すように、第１のサイクルでは、第２および第３のサイクルの熱変性工程より長い熱変性工程を行うことにより、上記の長いＤＮＡ１１が加熱変性し、２本鎖が互いに離れ、２つの１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｂの状態になる。
【００７３】
次に、図２（ｃ）に示すように、プライマーのアニーリング工程でプライマー２１ａがその塩基配列に適合する各１本鎖１２ａ，１２ｂの適合位置に配置（相補な配列）するように結合する。ここで、適合位置とはプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位置およびプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列と類似の塩基配列の位置である。上記ＳＳＣ−ＰＣＲ法では、プライマーのアニーリング工程のアニール温度を低く設定することにより、プライマーは、その塩基配列と類似の塩基配列を有するＤＮＡ鎖の部分にも結合する。すなわち、プライマーは、その塩基配列に完全に相補な塩基配列を有する１本鎖の位置に結合することができるのみならず、多少のミスマッチを伴って１本鎖に結合することもできる。なお、図２〜図４では、簡単のためにプライマーがその塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位置に結合する場合を図示している。
【００７４】
続いて、図２（ｄ）に示すように、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ａ，１２ｂにそれぞれ沿って１本鎖１２ｃ，１２ｄが伸長して２本鎖化した鎖１３ａ，１３ｂが形成される。
【００７５】
第２のサイクルの１回目のサイクルでは、第１のサイクルで２本鎖化した鎖１３ａ，１３ｂが熱変性工程でそれぞれ１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ａ，１２ｃおよび１本鎖（ＤＮＡ鎖）１２ｂ，１２ｄとなるが、ここでは、鎖１３ａから分かれた１本鎖１２ｃに着目して説明する。
【００７６】
図３に示すように、熱変性工程で分離した１本鎖１２ｃには次のプライマーのアニーリング工程でプライマー２１ｂが適合位置に配置するように結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ｃに沿って１本鎖１２ｅが伸長して２本鎖化した鎖１３ｄとなる。
【００７７】
その後、図４に示すように、第２のサイクルの第２回目のサイクルでは、上記２本鎖化した鎖１３ｄが熱変性工程でそれぞれ１本鎖１２ｃ，１２ｅとなるが、ここでは、鎖１３ｄから分かれた１本鎖１２ｅに着目して説明する。
【００７８】
図４に示すように、熱変性工程で分離した１本鎖１２ｅには、次のプライマーのアニーリング工程で、同様に、プライマー２１ｃが適合位置に配置するように結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖１２ｅに沿って１本鎖１２ｆが伸長して２本鎖化した鎖（ＤＮＡ断片）１３ｅが形成される。
【００７９】
このようにＤＮＡ断片が形成され、このＤＮＡ断片からＤＮＡ断片が形成されるとともに他の同種のＤＮＡからもＤＮＡ断片が形成され、同様の反応が連鎖反応的に続くので、この方法によりＤＮＡ断片が増幅される。
【００８０】
ここで、上記のように、ＤＮＡ断片が増幅する工程において、プライマーはその塩基配列に完全に相補な塩基配列を有する１本鎖の位置に結合するだけでなく、多少のミスマッチを伴って１本鎖に結合するため、増幅された２本鎖化したＤＮＡ断片の塩基配列を分析すると複数のパターンの塩基配列が存在する。
【００８１】
以下、図５〜図９を用いて本発明における第１〜第５のプライマーの塩基配列決定方法を説明する。
【００８２】
なお、以下に示す図５〜図９においては、２本鎖化したＤＮＡ断片の両側の部分の塩基配列のみを示し、中央部の塩基配列の図示を省略している。
【００８３】
図５は、検体のＤＮＡ断片をプライマーを用いてＳＳＣ−ＰＣＲにより増幅した場合の２本鎖化したＤＮＡ断片の塩基配列の第１の例を示す模式図である。
【００８４】
図５に示すように、１本鎖４０ａおよび１本鎖４０ｂにより２本鎖化した鎖４０が構成される。１本鎖４０ａおよび１本鎖４０ｂの５’末端側にはそれぞれプライマー１００が含まれる。
【００８５】
図５の例では、１本鎖４０ａにおいてプライマー１００の３’末端側に隣接する１本鎖４０ａの５’末端から１３番目の塩基３１ａと、１本鎖４０ａの３’末端から１３番目の塩基３１ｂとが互いに相補的である。また、１本鎖４０ａの塩基３１ａと１本鎖４０ｂにおいてプライマー１００のすぐ内側に位置する１本鎖４０ｂの５’末端から１３番目の塩基３１ｃとが同一である。
【００８６】
この場合、第１のプライマーの塩基配列決定方法として、塩基配列（５’−ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣ−３’）を有するプライマー１００の３’末端側に塩基３１ａを延長した塩基配列１００ａ（５’−ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣＡ−３’）を大腸菌を識別するためのプライマーとして決定することができる。
【００８７】
また、図６は、検体のＤＮＡ断片をプライマーを用いてＳＳＣ−ＰＣＲにより増幅した場合の２本鎖化したＤＮＡ断片の塩基配列の第２の例を示す模式図である。
【００８８】
図６に示すように、１本鎖４１ａおよび１本鎖４１ｂにより２本鎖化した鎖４１が構成される。図６の例では、１本鎖４１ａにおいてプライマー１０１の３’末端側に隣接する１本鎖４１ａの５’末端から１３番目の塩基３２ａと、１本鎖４１ａの３’末端から１３番目の塩基３２ｂとが互いに相補的でない。また、１本鎖４１ａの塩基３２ａと１本鎖４１ｂの５’末端から１３番目の塩基３２ｂとが同一でない。この場合、第２のプライマーの塩基配列決定方法として、塩基配列（５’−ＴＴＧＡＧＴＡＧＴＴＧＣ−３’）を有するプライマー１０１の３’末端側に塩基Ｉ（イノシン）を延長した塩基配列１０１ａ（５’−  ＴＴＧＡＧＴＡＧＴＴＧＣＩ−３’）を大腸菌を識別するプライマーとして決定することができる。
【００８９】
図７は、検体のＤＮＡ断片をプライマーを用いてＳＳＣ−ＰＣＲにより増幅した場合の２本鎖化したＤＮＡ断片の塩基配列の第３の例を示す模式図である。
【００９０】
図７に示すように、１本鎖４２ａおよび１本鎖４２ｂにより２本鎖化した鎖４２が構成される。図７の例では、１本鎖４２ａにおいてプライマー１０２の３’末端側に隣接する５’末端から１３番目の塩基３３ａと、１本鎖４２ａの３’末端から１３番目の塩基３３ｂとが相補的でなく、かつ、塩基３３ａおよび塩基３３ｂにそれぞれ隣接する塩基３４ａおよび塩基３４ｂが互いに相補的である。
【００９１】
この場合、塩基配列（５’−ＴＴＧＡＧＴＡＧＴＴＧＣ−３’）を有するプライマー１０２の３’末端にＩ（イノシン）および塩基３４ａを延長した塩基配列１０２ａ（５’−  ＴＴＧＡＧＴＡＧＴＴＧＣＩＡ−３’）を大腸菌を識別するプライマーとして決定することができる。
【００９２】
また、１本鎖４２ａにおいてプライマー１０２の３’末端側に隣接する５’末端から１３番目の塩基３３ａと１本鎖４２ｂにおいてプライマー１０２の３’末端側に隣接する５’末端から１３番目の塩基３３ｃとが同一でなく、かつ塩基３３ａおよび塩基３３ｃにそれぞれ隣接する塩基３４ａおよび塩基３４ｃが互いに同一である場合にも、塩基配列（５’−ＴＴＧＡＧＴＡＧＴＴＧＣ−３’）を有するプライマー１０２の３’末端にＩ（イノシン）および塩基３４ａを延長した塩基配列１０２ａ（５’−  ＴＴＧＡＧＴＡＧＴＴＧＣＩＡ−３’）を大腸菌を識別するプライマーとして決定することができる。
【００９３】
図８は、検体のＤＮＡ断片をプライマーを用いてＳＳＣ−ＰＣＲにより増幅した場合の２本鎖化したＤＮＡ断片の塩基配列の第４の例を示す模式図である。
【００９４】
検体のＤＮＡ断片として用いた２本鎖ＤＮＡが熱変性工程により分離し、図８（ａ）に示す１本鎖７０ａおよび図８（ｂ）に示す１本鎖７０ｂが得られる。
【００９５】
図８（ａ）に示すように、１本鎖７０ａにプライマー１０３が結合し、伸長することにより１本鎖７０ａおよび１本鎖７１ａにより２本鎖化した鎖４３が構成される。図８（ａ）の例では、１本鎖７１ａのプライマー１０３の５’末端の塩基３５ａと、塩基３５ａに対向する位置にある１本鎖７０ａの３’末端の塩基３６ａとが互いに相補的でない。この場合、第４のプライマーの塩基配列決定方法として、塩基配列（５’−ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣ−３’）を有するプライマー１０３の５’末端の塩基３５ａを削除した塩基配列１０３ａ（５’−ＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣ−３’）を大腸菌を識別するためのプライマーとして決定することができる。
【００９６】
同様に、図８（ｂ）に示すように、１本鎖７０ｂにプライマー１０３が結合し、伸長することにより１本鎖７０ｂおよび１本鎖７１ｂにより２本鎖化した鎖４４が構成される。図８（ｂ）の例では、１本鎖７１ｂのプライマー１０３の５’末端の塩基３５ｂと、塩基３５ｂに対向する位置にある１本鎖７０ｂの３’末端の塩基３６ｂとが互いに相補的でない。この場合、第４のプライマーの塩基配列決定方法として、塩基配列（５’−ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣ−３’）を有するプライマー１０３の５’末端の塩基３５ｂを削除した塩基配列１０３ｂ（５’−ＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣ−３’）を大腸菌を識別するためのプライマーとして決定することができる。
【００９７】
なお、第４のプライマーの塩基配列決定方法は、検体として用いるＤＮＡ断片の塩基配列が既知である場合、すなわち、本例においては、１本鎖７０ａおよび１本鎖７０ｂの塩基配列が明らかな場合において適用することができる。
【００９８】
図９は、検体のＤＮＡ断片をプライマーを用いてＳＳＣ−ＰＣＲにより増幅した場合の２本鎖化したＤＮＡ断片の塩基配列の第５の例を示す模式図である。
【００９９】
検体のＤＮＡ断片として用いた２本鎖ＤＮＡが熱変性工程により分離し、図９（ａ）に示す１本鎖７２ａおよび図９（ｂ）に示す１本鎖７２ｂが得られる。
【０１００】
図９（ａ）に示すように、１本鎖７２ａにプライマー１０４が結合し、伸長することにより１本鎖７２ａおよび１本鎖７３ａにより２本鎖化した鎖４５が構成される。図９（ａ）の例では、１本鎖７３ａのプライマー１０４の塩基のうち５’末端からα番目の塩基（本例においては５’末端から６番目の塩基）３７ａと、塩基３７ａに対向する位置にある１本鎖７２ａの３’末端からα番目の塩基（本例においては３’末端から６番目の塩基）３８ａとが互いに相補的でなく、かつ、１本鎖７２ａの塩基３８ａと１本鎖７２ａの５’末端からα番目の塩基（本例においては５’末端から６番目の塩基）３９ａとが互いに相補的である。この場合、第５のプライマーの塩基配列決定方法として、塩基配列（５’−ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣ−３’）を有するプライマー１０４の５’末端からα番目の塩基（本例においては５’末端から６番目の塩基）３７ａを塩基３９ａに置換した塩基配列１０４ａ（５’−  ＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＧＣ−３’）を大腸菌を識別するためのプライマーとして決定することができる。
【０１０１】
同様に、図９（ｂ）に示すように、１本鎖７２ｂにプライマー１０４が結合し、伸長することにより１本鎖７２ｂおよび１本鎖７３ｂにより２本鎖化した鎖４６が構成される。図９（ｂ）の例では、１本鎖７３ｂのプライマー１０４の塩基のうち５’末端からα番目の塩基（本例においては５’末端から６番目の塩基）３７ｂと、塩基３７ｂに対向する位置にある１本鎖７２ｂの３’末端からα番目の塩基（本例においては３’末端から６番目の塩基）３８ｂとが互いに相補的でなく、かつ、１本鎖７２ｂの塩基３８ｂと１本鎖７２ｂの５’末端からα番目の塩基（本例においては５’末端から６番目の塩基）３９ｂとが互いに相補的である。この場合、第５のプライマーの塩基配列決定方法として、塩基配列（５’−ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣ−３’）を有するプライマー１０４の５’末端からα番目の塩基（本例においては５’末端から６番目の塩基）３７ｂを塩基３９ｂに置換した塩基配列１０４ｂ（５’−  ＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＧＣ−３’）を大腸菌を識別するためのプライマーとして決定することができる。
【０１０２】
なお、第５のプライマーの塩基配列決定方法は、検体として用いるＤＮＡ断片の塩基配列が既知である場合、すなわち、本例においては、１本鎖７２ａおよび１本鎖７２ｂの塩基配列が明らかな場合において適用することができる。
【０１０３】
また、第１〜第５のプライマーの塩基配列決定方法のうち複数を組み合わせて、プライマーの塩基配列を決定することも可能である。
【０１０４】
なお、本実施の形態においては、第１のプライマー塩基配列決定方法を用いて表１に示す配列番号１のプライマーＢ７２を基に塩基配列を決定し、表２に示す配列番号１７のプライマーＢ７２−１を作製した。
【０１０５】
また、第２のプライマー塩基配列決定方法を用いて表１に示す配列番号２のプライマーＢ６９を基に塩基配列を決定し、表２に示す配列番号２１〜２３のプライマーＢ６９−１〜Ｂ６９−３を作製した。
【０１０６】
さらに、第３のプライマー塩基配列決定方法を用いて表１に示す配列番号２のプライマーＢ６９を基に塩基配列を決定し、表２に示す配列番号２４のプライマーＢ６９−４を作製した。
【０１０７】
また、第４のプライマー塩基配列決定方法を用いて表１に示す配列番号１のプライマーＢ７２を基に塩基配列を決定し、表２に示す配列番号１８〜２０のプライマーＢ７２−２〜Ｂ７２−４を作製した。
【０１０８】
図１０は、図１の細菌識別装置を用いた細菌識別方法の一例を示すフローチャートである。
【０１０９】
図１０に示すように、まず図１のＳＳＣ−ＰＣＲ増幅装置を用いて、後述のＳＳＣ−ＰＣＲ方により細菌の解析実験を行う（ステップＳ１）。なお、この解析実験においては、単離した単一の細菌をサンプルとして用いてもよく、また、複数の細菌を含む細菌群をサンプルとして用いてもよい。
【０１１０】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法による細菌の解析実験の詳細を図１１に示す。まず、図１１に示すように、細菌のＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応用バッファ溶液、プライマー、耐熱性の好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２および４種の基質となる５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）を所定量ずつ混合し、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する（ステップＳ１−１）。
【０１１１】
なお、複数の細菌を含む細菌群をサンプルとして用いる場合においては、複数の細菌のＤＮＡが混合されたものを用いてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。
【０１１２】
ここで、ＤＮＡポリメラーゼとは、４種の５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質とし、鋳型ＤＮＡに相補な塩基配列を有するＤＮＡ鎖の重合反応を触媒する酵素である。ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の重合の方向性は５’から３’の方向である。また、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼが作用するために不可欠な３’−ＯＨ基を末端に有するＤＮＡ断片（短鎖オリゴヌクレオチド）である。
【０１１３】
なお、後述するようにＳＳＣ−ＰＣＲ法においては増幅確率の異なる複数のプライマーを用いるため、各々のプライマーについてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。本実施の形態においては１５種類のプライマーを用いるので、異なるプライマーを含む１５種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。なお、１５種類のＰＣＲ用反応溶液は全て同時に調製するものとする。
【０１１４】
上記のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製と同時に、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを調製する（ステップＳ１−２）。
【０１１５】
ここで、ポジティブコントロールとは、後述のＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において生じる誤差を除去するためのコントロール実験に用いる試料である。一般に、ＤＮＡ断片の増幅反応における増幅効率は、一連の工程において生じる誤差、例えばＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製時におけるＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム等の濃度の誤差、用いた試薬の活性の度合い、ＤＮＡ断片増幅時における温度の誤差等により影響を受けると考えられる。このような誤差を除去するために、ポジティブコントロールとして、増幅されるＤＮＡ断片の種類が既知で定量可能なＤＮＡ断片を増幅するプライマーと、このプライマーに相補な塩基配列を有する鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液を調製する。ポジティブコントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動法により定量することが可能である。したがって、ポジティブコントロールにおいて増幅されるＤＮＡ断片の量から、ＤＮＡ断片の増幅効率を求めることができる。このようにして求めた増幅効率をもとにして１５種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のＤＮＡ断片の量を補正することにより、ＤＮＡ断片の増幅反応の一連の工程において生じる誤差の影響を除去することが可能となる。その結果、増幅されたＤＮＡ断片の量的な比較が可能となる。
【０１１６】
一方、ネガティブコントロールとは、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象とする細菌群または細菌のものであることを確認するためのコントロール実験に用いる試料である。一般に、細菌は空気中等の様々な場所に存在する。このため、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液の調製時において反応溶液に細菌が混入する可能性がある。細菌が反応溶液に混入した場合、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象とする細菌由来のＤＮＡ断片かあるいは混入した細菌由来のＤＮＡ断片かの判別が不可能となる。そのため、ネガティブコントロールとして、プライマーを含むが鋳型ＤＮＡを含まないＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製する。このネガティブコントロールを用いてＳＳＣ−ＰＣＲおよび電気泳動を行い、ネガティブコントロールの電気泳動像においてはバンドが現れないことを確認する。これにより、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象である細菌群または細菌由来のものであることが確認できる。
【０１１７】
なお、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールに用いるプライマーは、１５種類のプライマーのうちの１つもしくは２つと同じ塩基配列であってもよい。
【０１１８】
上記のようにしてＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を調製した後、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１により、ＤＮＡ断片の増幅反応を行う（ステップＳ１−３）。
【０１１９】
図１２は、ＳＳＣ−ＰＣＲ増幅・解析装置１のＤＮＡ断片増幅装置の例を示す模式図である。図１２のＤＮＡ断片増幅装置は、タイタプレートと呼ばれる支持プレートにより構成される。
【０１２０】
支持プレート５０の上面に複数の孔部５１が形成されている。この場合には、複数の孔部５１にＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液が配置される。また、孔部５１ａには、前述のネガティブコントロールが配置され、孔部５１ｂには、前述のポジティブコントロールが配置される。
【０１２１】
このようなＤＮＡ断片増幅装置により、１５種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールにおいて、以下のようなＳＳＣ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅が同時に行われる。
【０１２２】
ここでのＳＳＣ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅は、前述したプライマーの塩基配列決定方法における熱変性工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程の３段階の工程を繰り返し行うＳＳＣ−ＰＣＲ法と同様である。
【０１２３】
その後、図１１に示すように、ＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを用いて、電気泳動法により、各反応溶液において増幅されたＤＮＡ断片をサイズ（塩基対数）ごとに分画する。このとき、濃度が既知で定量可能なＤＮＡサイズマーカを同時に電気泳動させサイズごとに分画する（ステップＳ１−４）。
【０１２４】
さらに、電気泳動法により得られた電気泳動像を蛍光色素で染色し（ステップＳ１−５）、紫外線照射したときの蛍光像を撮影する（ステップＳ１−６）。撮影には、例えばＣＣＤカメラを用いる。このようにして得られた電気泳動像において、ＤＮＡ断片がバンド（帯）として現れる。
【０１２５】
なお、ここで、ネガティブコントロールの電気泳動像においてバンドが現れない場合、増幅されたＤＮＡ断片が分析対象である細菌または細菌群由来のものであることが確認できる。
【０１２６】
続いて、図１０に示すように、撮影した電気泳動像を電気泳動イメージ入力部２（図１）のスキャナで解析用コンピュータ３（図１）に画像データとして取り込み（ステップＳ２）、画像データに基づいて電気泳動像の各バンドを検出する（ステップＳ３）。
【０１２７】
ところで、ＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅する際において、所定の塩基配列を有する鋳型ＤＮＡの適合位置にプライマーが強く結合して配置する場合は、ＤＮＡ断片の増幅効率が高い。このようなプライマーにより増幅されたＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性の高い明瞭なバンドとして現れる。一方、プライマーと鋳型ＤＮＡの適合位置との結合が弱い場合、鋳型ＤＮＡの適合位置よりも結合が強い他の位置にプライマーが結合する。このように、ＤＮＡ断片の増幅反応においては競争的に反応が進行するため、プライマーと鋳型ＤＮＡとの結合が弱い場合にはＤＮＡ断片の増幅効率が低くなる。このような結合の弱いプライマーにより増幅されるＤＮＡ断片は、電気泳動像において再現性が低く不明瞭バンドとして現れる。上記のような再現性の低いＤＮＡ断片を含むことにより、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータは全体の信頼性が低くなる。
【０１２８】
そこで、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により得られたデータの信頼性を向上させるために、解析用コンピュータ３（図１）を用いて、以下のような電気泳動像の画像データの画像補正を行う（ステップＳ４）。
【０１２９】
図１３は画像補正の工程の一例を示すフローチャートである。図１３に示すように、画像データにおいて、ポジティブコントロールのバンドの発光強度と量が既知であるＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度とを比較することにより、ポジティブコントロールにおいて増幅されたＤＮＡ断片を定量する。さらにこの定量した値を用いてＤＮＡ増幅断片増幅反応の増幅効率を求める。この増幅効率に基づいて１５種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のバンドの発光強度を補正する（ステップＳ４−１）。それにより、ＤＮＡ増幅反応時における反応条件等の誤差がＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響が除去される。
【０１３０】
なお、ここでの発光強度とは、発光強度分布におけるピークの高さのことである。
【０１３１】
また、ポジティブコントロールの定量方法としては、ＤＮＡ断片精製後に２６０ｎｍの紫外線吸収量を測定するなどの他の方法を用いることもできる。
【０１３２】
さらに、定量可能なＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度を基準として用い、１５種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液のバンドの発光強度を補正する。このようにして、電気泳動像の画像データの階調補正を行う（ステップＳ４−２）。
【０１３３】
一般に、エチジウムブロマイド染色時の染色度合いおよび写真撮影時の露光の程度によって、得られる電気泳動像の階調に誤差が生じる。しかしながら、濃度が既知のＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づいて電気泳動像の画像データの階調補正を行うことにより、このような誤差を除去することができる。
【０１３４】
続いて、定量可能なＤＮＡサイズマーカのバンドの発光強度に基づいてしきい値を設定し、しきい値未満の発光強度のバンドを削除する（ステップＳ４−３）。これにより、増幅効率が低く再現性の低いバンドを除去することができる。このようにして得られた増幅効率が高く再現性の高いバンドを分析することにより、信頼性の高いデータが得られる。
【０１３５】
図１４は、上記のような画像補正を行った後の電気泳動像の画像データの例を示す図である。図１４において、レーン１は、ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を示している。また、レーン２〜８は、異なる７種類のプライマーにおける電気泳動像を示している。
【０１３６】
続いて、各プライマーにおけるバンドの位置とＤＮＡサイズマーカにおけるバンドの位置とを比較することにより、各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズ（塩基対数）に変換して測定する。さらに、各位置のバンドについて、バンド強度（バンドの発光強度）を測定する。ここでのバンド強度とは、バンドの発光強度分布におけるピークの高さのことである。
【０１３７】
なお、このようなバンド位置およびバンド強度の測定は、解析用コンピュータ３（図１）により行う。
【０１３８】
さらに、解析用コンピュータ３を用いて、上記で得られた各プライマーにおけるバンド位置およびバンド強度のデータをまとめ、バンドデータの一欄を作成する（ステップＳ６）。
【０１３９】
通常、ＳＳＣ−ＰＣＲ法においては、種類の異なる複数のプライマーを用いて複数のＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）を行う。このため、ＳＳＣ−ＰＣＲの結果、各プライマーにつき１つの電気泳動像が得られる。１５種類のプライマーを用いる場合には、１５種類の電気泳動像が得られる。
【０１４０】
ここで、細菌識別装置の解析用コンピュータにおいては、このような複数枚の写真にわたって示された１５種類のプライマーのバンドのデータを集め、１つのデータにまとめることが可能である。それにより、サンプルの細菌に関するＳＳＣ−ＰＣＲのバンドデータの一欄を作成することができる。
【０１４１】
解析用コンピュータにより作成されたバンドデータの一欄には、プライマー名（配列番号）、サイズで表したバンド位置およびバンド強度が記載される。
【０１４２】
上記においては、各プライマーにおけるバンドの位置をバンドサイズで表示する場合について説明したが、バンドの位置をバンドサイズで表示するのではなく、実測した距離に基づいて表示してもよい。この場合、バンドデータの一欄のバンド位置の項目には、例えば実測した距離の比が記載される。
【０１４３】
また、上記においては、バンド強度としてバンドの発光強度分布のピークの高さを測定する場合について説明したが、バンド強度として、バンドの発光強度分布の面積（容量）を測定してもよい。バンドの発光強度分布の面積はバンドに含まれるＤＮＡの含有量に対応するので、発光強度分布の面積をバンド強度として用いる方がより好ましいと考えられる。
【０１４４】
さらに、バンド検出、画像補正およびバンド位置・バンド強度の測定を行う順番は、上記に限定されるものではなく、必要に応じて逆転する場合もある。
【０１４５】
続いて、図１０に示すように、解析用コンピュータ３（図１）を用いて、サンプルの細菌のデータに基づいて、データベースの格納部４（図１）のデータベースに登録されている複数の細菌のＳＳＣ−ＰＣＲのバンドデータをサーチし、サンプルの細菌のバンドデータとデータベースの複数の細菌のバンドデータとを比較する（ステップＳ７）。
【０１４６】
図１に示すように、細菌識別装置のデータベースの格納部４のデータベースには、生化学検査等により同定された複数の細菌の各々に関してＳＳＣ−ＰＣＲのバンドデータを登録する。なお、データベースに登録するバンドデータの構成は、上記において作成したサンプルの細菌のバンドデータの構成と同様である。
【０１４７】
最後に図１０に示すように、結果表示手段５（図１）により検出された細菌の結果を表示する（ステップＳ８）。
【０１４８】
以上のような本発明に係る細菌識別方法によれば、後述するように配列番号１〜１７のプライマーを用いたＳＳＣ−ＰＣＲを行うことにより、大腸菌、赤痢菌、ビブリオ菌、サルモネラ菌、枯草菌等の細菌の種間、株間または血清型間の識別が可能となる。
【０１４９】
さらに、未知の細菌を配列番号１または２のプライマーを用いてＳＳＣ−ＰＣＲにより増幅し、得られたＤＮＡ断片の分析を行うことにより、未知の細菌が大腸菌または赤痢菌であるか否かの識別を行うことが可能となる。
【０１５０】
なお、配列番号１のプライマーの代わりに配列番号１７〜２０のいずれかのプライマーを用いてもよい。
【０１５１】
なお、配列番号２のプライマーの代わりに配列番号２１〜２４のいずれかのプライマーを用いてもよい。
【０１５２】
ここで、この細菌識別方法においては、ＳＳＣ−ＰＣＲによりサンプルの細菌（または細菌群）のＤＮＡ分析を行うので、生化学検査のように細菌を単離および培養する工程が不要となる。このため、短時間でかつ容易に識別および同定を行うことが可能になるとともに、培養が困難な細菌の識別および同定も可能になる。また、ＳＳＣ−ＰＣＲは塩基配列が未知のサンプルに対して行うことが可能であるため、塩基配列の測定を行うことなくサンプルの細菌の識別および同定を行うことができる。
【０１５３】
さらに、この細菌識別方法においては、複数のプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行い、複数のＰＣＲの結果を用いて分析を行うため、諸条件によって個々のＰＣＲが良好に進まない場合においても、個々のＰＣＲの影響は小さい。このため、良好な分析を安定して行うことが可能となる。
【０１５４】
【実施例】
（実施例１）
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の各々についてＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡの分析を行った。
【０１５５】
このＳＳＣ−ＰＣＲ法においては、以下の表５に示す１６種類のプライマー（配列番号１〜１６）を用い、１６種類のプライマーから７種類のプライマーを選定した。
【０１５６】
【表５】
2004187560.tif 000007
【０１５７】
本実施例においては、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００および三洋電機株式会社製ＤＮＡ増幅器ＭＩＲ−Ｄ４０を用いた。
【０１５８】
また、ＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いた反応溶液の組成は表３に示す組成と同様である。
【０１５９】
ここでは、５種類の細菌の各々について、プライマーとして配列番号１〜１６の各プライマーをそれぞれ含む１６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液を同時に調整した。また、配列番号１３または１５のプライマーとこれに対応する塩基配列を有する鋳型ＤＮＡとを含む反応溶液をポジティブコントロールとして、また、配列番号１３または１５のプライマーを含むがＤＮＡを含まない反応溶液をネガティブコントロールとして１６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ用反応溶液と同時に調整した。
【０１６０】
なお、本実施例におけるＳＳＣ−ＰＣＲのサイクルは表４に示すサイクルと同様である。
【０１６１】
次に上記のように調整した１６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ後の反応溶液、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの１０μＬを１％アガロースゲル電気泳動法で分析した。電気泳動条件は、３．６Ｖ／ｃｍ定電圧とした。また、この場合においては、増幅されたＤＮＡ断片のバンドの位置を測定するために、濃度が既知で定量可能なＤＮＡサイズマーカ（ニッポンジーン株式会社製Ｓｍａｒｔ  Ｌａｄｄｅｒ）を反応溶液と同時に電気泳動させた。
【０１６２】
電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド染色し、波長３０２ｎｍ紫外線を照射したときのエチジウムブロマイド蛍光像をポラロイドカメラまたはＣＣＤカメラで撮影した。
【０１６３】
なお、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールおよび１６種類のＳＳＣ−ＰＣＲ反応溶液を電気泳動させる際には、１枚のアガロースゲルにおいて１６種類の試料を同時に電気泳動させ、各アガロースゲルごとに撮影を行った。
このようにして、電気泳動写真を得た。この場合、各アガロースゲルの一端部においては、ＤＮＡサイズマーカを電気泳動させている。
【０１６４】
電気泳動写真をスキャナでコンピュータに取込んだ後、電気泳動像の画像データから、ソフトウェア（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｑｕａｎｎｔｉｆｉｅｒ  １−Ｄ  Ｍａｔｃｈ）を用いて、ＤＮＡサイズマーカのバンド、各プライマーにおけるバンド、ポジティブコントロールにおけるバンドおよびネガティブコントロールにおけるバンドを検出した。
【０１６５】
ここでは、ネガティブコントロールの電気泳動像においてバンドが検出されなかった。このことから、現れたバンドはサンプルとして用いた細菌由来のものであることが確認できた。
【０１６６】
なお、この場合においては行っていないが、次のような画像補正の工程をさらに行ってもよい。画像補正として、ポジティブコントロールのバンドの発光強度をもとにして他のバンドの発光強度を補正することが考えられる。例えば測定したポジティブコントロールのバンドの発光強度が７０％であった場合、このバンドの発光強度が１００％になるように補正するとともに、他のバンドの発光強度も同様の割合で補正する。これにより、ＤＮＡ断片増幅反応時における反応条件等の誤差がＤＮＡ断片の増幅効率に与える影響を除去することができる。
【０１６７】
また、各々の電気泳動像の画像データにおいて測定により求めたＤＮＡサイズマーカの１０００ｂｐのバンド発光強度が１００％になるような割合で補正するとともに、他のバンドの発光強度についても同様の割合で補正を行うことも考えられる。このように画像データの階調の補正を行うことにより、各々の画像データにおける階調の誤差を除去することができる。
【０１６８】
さらに、測定により求めたＤＮＡサイズマーカの２００ｂｐのバンドの発光強度の２分の１の発光強度をしきい値として定め、各プライマーにおけるバンドのうち発光強度がしきい値よりも小さなバンドを削除することも考えられる。このようにして発光強度が小さなバンドを削除することにより、ＳＳＣ−ＰＣＲにおいて再現性の低いバンドを削除することができる。それにより、ＳＳＣ−ＰＣＲにおける再現性の向上が図られ、得られたデータの信頼性を向上させることができる。
【０１６９】
図１５にＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を示す。図１５に示すように、上記で用いたＤＮＡサイズマーカは、電気泳動によりバンドサイズ（塩基対の数）の異なる１４本のバンドに分離される。この１４本のバンドのサイズは、大きいものから１００００、８０００、６０００、５０００、４０００、３０００、２５００、２０００、１５００、１０００，８００、６００、４００および２００ｂｐである。１４本のバンド間の間隔は均一ではなく、サイズが大きいバンド程、バンド間の間隔が小さくなる。
【０１７０】
次に、上記のようにして得られたＤＮＡサイズマーカのバンド位置（基準値）に基づいて、５種類の細菌の各々について、１６種類のプライマーの各々におけるバンドの位置およびバンド強度を測定した。さらに、測定により得られたデータをまとめ、細菌ごとにバンドデータの一覧を作成した。この場合においては、バンドの発光分布のピーク高さをバンド強度とした。
【０１７１】
なお、前述のようにこの場合においては、電気泳動像の画像データの各バンドについてポジティブコントロールのバンドの発光強度をもとにして他のバンドの発光強度を補正することは行わず、また、ＤＮＡサイズマーカの発光強度による階調補正は行わず、また、発光強度がしきい値より小さいバンドの削除を行わなかった。
【０１７２】
なお、このようなバンド位置およびバンド強度の測定には、前述のソフトウェア（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ  １−Ｄ  Ｍａｔｃｈ）を用いた。
【０１７３】
１６種類のプライマーの各々についての画像データのバンド位置およびバンド強度のデータを複数の細菌の種間および株間で比較することにより、細菌の種間または株間での識別が可能な７種類のプライマーを選定した。
【０１７４】
図１６（ａ）〜（ｇ）および図１７（ｈ）〜（ｍ）に大腸菌の１３種類の株の電気泳動像を示す。図１６および図１７において、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の後に付した１〜１３の番号は、大腸菌の異なる株を示すために用いている。
【０１７５】
図１８（ａ）〜（ｄ）に４種類の赤痢菌の電気泳動像を示す。図１８において、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の後のｓｏｎｎｅｉ、ｆｌｅｘｎｅｒｉ、ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅおよびｂｏｙｄｉｉは、異なる種を表している。
【０１７６】
図１９（ａ）〜（ｄ）に４種類のビブリオ菌の電気泳動像を示す。図１９において、ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ）の後のｃｈｏｌｅｒａｅ  ０１、ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｎｏｎ−０１、ｍｉｍｉｃｕｓおよびｐａｒａｈａｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓは、異なる種を表している。
【０１７７】
図２０（ａ），（ｂ）に２種類のサルモネラ菌の電気泳動像を示す。図２０において、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の後のｅｎｔｅｒｔｉｄｉｓおよびＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、異なる血清型を表している。
【０１７８】
図２１（ａ）〜（ｅ）に枯草菌の異なる５種類の株の電気泳動像を示す。図２１において、枯草菌（Ｂａｃｉｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の後に付した番号は、枯草菌の異なる株を示すために用いている。
【０１７９】
図１６〜図２１において、レーン１はＤＮＡサイズマーカの電気泳動像であり、レーン２〜８は、それぞれ配列番号３、５、６、２、１、４および７のプライマーを用いた場合の電気泳動像である。
【０１８０】
図１６および図１７に示すように、同じ大腸菌であっても株が異なれば電気泳動像のバンドパターンが異なっている。したがって、配列番号１〜７の７種類のプライマーを用いることにより、大腸菌の株間の識別が可能となる。
【０１８１】
図１８に示すように、赤痢菌の種が異なれば、電気泳動像のバンドパターンが異なっている。したがって、赤痢菌の種間の識別が可能となる。
【０１８２】
図１９に示すように、ビブリオ菌の種が異なれば、電気泳動像のバンドパターンが異なっている。したがって、ビブリオ菌の種間の識別が可能となる。
【０１８３】
図２０に示すように、サルモネラ菌の血清型が異なれば、電気泳動像のバンドパターンが異なっている。したがって、サルモネラ菌の血清型間の識別が可能となる。
【０１８４】
図２１に示すように、枯草菌の株が異なれば、電気泳動像のバンドパターンが異なっている。したがって、枯草菌の株間の識別が可能となる。
【０１８５】
また、大腸菌および赤痢菌を配列番号１のプライマーＢ７２を用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行うことにより得られた電気泳動像のバンドパターンが同じである。
【０１８６】
さらに、大腸菌および赤痢菌を配列番号２のプライマーＢ６９を用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行うことにより得られた電気泳動像のバンドパターンが同じである。
【０１８７】
したがって、未知の細菌をプライマーＢ７２およびプライマーＢ６９を用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行うことにより得られたバンドパターンを分析することにより、未知の細菌が大腸菌または赤痢菌の１種であるか否かを判定することが可能となる。
【０１８８】
また、配列番号１のプライマーＢ７２を用いた場合のレーン６の電気泳動像のバンドパターンおよび配列番号４のプライマーＣ６５を用いた場合のレーン７の電気泳動像のバンドパターンの違いから、大腸菌と赤痢菌とを識別することが可能となる。
【０１８９】
以上の結果から配列番号１〜７のプライマーを用いたＳＳＣ−ＰＣＲ法により、大腸菌の株間の識別、赤痢菌の種間の識別、ビブリオ菌の種間の識別、サルモネラ菌の血清型間の識別および枯草菌の株間の識別が可能になるとともに、大腸菌と赤痢菌との識別も可能になることがわかる。
【０１９０】
また、プライマーＢ０６またはプライマーＢ７２を用いたＳＳＣ−ＰＣＲ法により大腸菌又は赤痢菌であるか否かを識別することが可能となる。
【０１９１】
本実施例では、配列番号１または２のプライマーを用いたＳＳＣ−ＰＣＲ法により大腸菌および赤痢菌の識別が可能であることを示したが、第１〜第４のプライマーの塩基配列決定方法を用いて決定された塩基配列を有する配列番号１７〜２４のいずれかのプライマーを用いたＳＳＣ−ＰＣＲ法においても同様に大腸菌および赤痢菌の識別が可能である。
【０１９２】
さらに、第１〜第５の塩基配列決定方法を用いて決定された他の塩基配列を有するプライマーを用いたＳＳＣ−ＰＣＲ法においても同様に細菌の識別が可能である。
【０１９３】
（実施例２）
大腸菌Ｋ−１２株を良好に識別するプライマーの塩基配列を決定した。
【０１９４】
まず、表１に示す配列番号１のプライマーＢ７２を用いて大腸菌Ｋ−１２株のＤＮＡ断片をＳＳＣ−ＰＣＲ法により増幅した。
【０１９５】
本実施例においても実施例１と同様に、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００および三洋電機株式会社製ＤＮＡ増幅器ＭＩＲ−Ｄ４０を用いた。
【０１９６】
また、ＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いた反応溶液の組成は表３に示す組成と同様である。
【０１９７】
なお、本実施例におけるＳＳＣ−ＰＣＲのサイクルについても表４に示すサイクルと同様である。
【０１９８】
図２２は大腸菌Ｋ−１２株を表１に示す配列番号１のプライマーＢ７２を用いて、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により増幅し得られた電気泳動像を示す。図２２に示すように、１２００〜１５００ｂｐのエリアＡ１に強いバンド、２５００〜２８００ｂｐのエリアＡ２に複数の弱いバンドが確認できた。
【０１９９】
電気泳動法に用いたゲルからエリアＡ１とエリアＡ２を切り出して、各エリアに含まれるＤＮＡ断片をＤＮＡ断片抽出用カラム（キアゲン  ＱＩＡｕｉｃｋ  （登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を使用して抽出した。
【０２００】
クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ    ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ）を用いて、抽出したＤＮＡ断片をベクター（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ    ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ）にクローニングし、大腸菌へ形質転換した。
【０２０１】
続いて、大腸菌を液体培養し、ベクターをプラスミドＤＮＡ抽出キット（キアゲン  ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）で抽出した。
【０２０２】
抽出したベクターを鋳型ＤＮＡとし、シークエンス用プライマーとしてＭ１３  Ｆｏｒｗａｒｄ（−２０）  ＰｒｉｍｅｒおよびＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒを用いてサイクルシークエンス法によりシークエンス反応を行い、シークエンサ（ＰＥ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）  Ｍｏｄｅｌ  ３３７）により塩基配列の分析を行った。
【０２０３】
表６に上記の操作により得られた図２２に示すエリアＡ１におけるＰＣＲ産物の塩基配列を示す（配列番号２５）。
【０２０４】
【表６】
2004187560.tif 000008
【０２０５】
表６に示すように、得られた塩基配列は５’末端側に表１に示す配列番号１のプライマーＢ７２の塩基配列を含み、３’末端側にはプライマーＢ７２の塩基配列に対して相補な塩基配列を含む。３’末端側の１２ｂｐの塩基配列がプライマーの結合部位となる。また、表６の塩基配列のうち５’末端側の１２ｂｐの塩基配列と３’末端側の１２ｂｐの塩基配列との間が増幅部位である。
【０２０６】
Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ（遺伝子銀行）データベースにおいて、表６に示した配列番号２５の塩基配列の増幅部位に一致する塩基配列を検索した結果、表７に示すアクセッションナンバーＡＥ０００１９２の塩基配列が見い出された（配列番号２６）。表７に示した塩基配列は大腸菌のＤＮＡの中に存在する。
【０２０７】
【表７】
2004187560.tif 000009
【０２０８】
表６に示す配列番号２５の塩基配列と表７に示す配列番号２６の塩基配列とを比較すると、表６に示す配列番号２５において、プライマーＢ７２の３’末端側に隣接する（５’末端から１３番目）塩基Ｔ（チミン）と、３’末端から１３番目の塩基Ｃ（シトシン）とが互いに相補的でないことがわかった。表７に示す配列番号２６においても、５’末端から２３番目の塩基Ｔ（チミン）と、３’末端から２２番目の塩基がＣ（シトシン）とが互いに相補的でないことがわかった。
【０２０９】
続いて、図２２に示すエリアＡ２における塩基配列を表８に示す（配列番号２７）。
【０２１０】
【表８】
2004187560.tif 000010
【０２１１】
表８に示すように、得られた塩基配列は５’末端側に表１に示す配列番号１のプライマーＢ７２の塩基配列を含み、３’末端側にはプライマーＢ７２の塩基配列に対して相補な塩基配列を含む。３’末端側の１２ｂｐの塩基配列がプライマーの結合部位となる。また、表８の塩基配列のうち５’末端側の１２ｂｐの塩基配列と３’末端側の１２ｂｐの塩基配列との間が増幅部位である。
【０２１２】
Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ（遺伝子銀行）データベースにおいて、表８に示した配列番号２７の塩基配列の増幅部位に一致する塩基配列を検索した結果、表９に示すアクセッションナンバーＡＥ０００４３１の塩基配列が見い出された（配列番号２８）。表９に示した塩基配列は大腸菌のＤＮＡの中に存在する。
【０２１３】
【表９】
2004187560.tif 000011
【０２１４】
表８に示す配列番号２７の塩基配列と表９に示す配列番号２８の塩基配列とを比較すると、表８に示す配列番号２７において、プライマーＢ７２の３’末端側に隣接する（５’末端から１３番目）塩基Ａ（アデニン）と、３’末端から１３番目の塩基がＴ（チミン）とが互いに相補的であることがわかった。表９に示す配列番号２８においても、５’末端から２３番目の塩基Ａ（アデニン）と、３’末端から２３番目の塩基がＴ（チミン）とが互いに相補的であることがわかった。
【０２１５】
以上の結果から、大腸菌Ｋ−１２株を良好に識別できるプライマーとして、塩基配列（５’−ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣ−３’）を有するプライマーＢ７２の塩基配列の３’末端側にＡ（アデニン）を延長した塩基配列（５’−ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣＡ−３’）を有するプライマーＢ７２−１を作製した。
【０２１６】
次に、プライマーＢ７２および上記プライマーＢ７２−１を用いて、大腸菌Ｋ−１２株をＳＳＣ−ＰＣＲ法により増幅し、それから得られる電気泳動像の比較を行った。
【０２１７】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いた反応溶液の組成は表３に示す組成と同様である。
また、本実施例におけるＳＳＣ−ＰＣＲのサイクルについても表４に示すサイクルと同様である。
【０２１８】
プライマーＢ７２およびプライマーＢ７２−１を用いて、大腸菌株Ｋ−１２株をＳＳＣ−ＰＣＲ法により増幅し得られた電気泳動像を図２３（ａ）に示す。
【０２１９】
図２３（ａ）に示すように、レーン１はプライマーＢ７２を用いて、大腸菌Ｋ−１２株を増幅し得られた電気泳動像である。また、レーン２はプライマーＢ７２−１を用いて、大腸菌Ｋ−１２株を増幅し得られた電気泳動像である。
【０２２０】
レーン１に示す電気泳動像においては、１２４５ｂｐのバンドは強く現れ、２５００〜２８００ｂｐ近傍にはバンドは確認できなかった。２５００〜２８００ｂｐ近傍については、複数回の実験の中で、バンドが現れる場合と現れない場合とがあった。この理由として、大腸菌Ｋ−１２株のＤＮＡ断片のＳＳＣ−ＰＣＲ法による増幅は、反応溶液および電気泳動等の状態の影響を受け易いことが考えられる。
【０２２１】
これに対し、レーン２に示す電気泳動像においては、２７４３ｂｐのバンドが強く現れ、他に３本のバンドが確認できた。これは、大腸菌Ｋ−１２株のプライマーＢ７２−１の塩基配列と完全に相補でない他の部位においてもＤＮＡ断片の増幅が行われたことによる。
【０２２２】
なお、図２３（ａ）に示すレーン１の電気泳動像における１２４５ｂｐのバンドをより見やすくするために、レーン１ではレーン２の５倍量であるＳＳＣ−ＰＣＲ産物１０μＬで電気泳動を行った。
【０２２３】
図２３（ａ）に示すレーン２の電気泳動像のバンドパターンを１つにするため、新たに設定したＳＳＣ−ＰＣＲのサイクルを表１０に示す。
【０２２４】
【表１０】
2004187560.tif 000012
【０２２５】
表１０に示すＳＳＣ−ＰＣＲのサイクルのアニール温度は、表４に示すＳＳＣ−ＰＣＲのサイクルのアニール温度より１０℃高くなっており５５℃である。
【０２２６】
表１０に示すＳＳＣ−ＰＣＲのサイクルに基づき、プライマーＢ７２およびプライマーＢ７２−１を用いて、大腸菌Ｋ−１２株をＳＳＣ−ＰＣＲ法により増幅した。
【０２２７】
ＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いた反応溶液の組成は表３に示す組成と同様である。
プライマーＢ７２およびプライマーＢ７２−１を用いて、大腸菌株Ｋ−１２株をＳＳＣ−ＰＣＲ法により増幅し得られた電気泳動像を図２３（ｂ）に示す。
【０２２８】
図２３（ｂ）に示すように、レーン３はプライマーＢ７２を用いて、大腸菌Ｋ−１２株を増幅し得られた電気泳動像である。また、レーン４はプライマーＢ７２−１を用いて、大腸菌Ｋ−１２株を増幅し得られた電気泳動像である。
【０２２９】
レーン３に示す電気泳動像においては、１２４５ｂｐのバンドは現れなかった。この原因として、プライマーのアニーリング工程におけるアニール温度が高いため、プライマーＢ７２が大腸菌Ｋ−１２株のＤＮＡ断片に結合できなくなったことが考えられる。また、レーン３に示す電気泳動像の他の部位においてもバンドは確認できなかった。
【０２３０】
これに対し、レーン４に示す電気泳動像においては、２７４３ｂｐのバンドのみが明瞭に現れ、他に３本のバンドが確認できなくなった。これは、アニール温度を高くしたことで、プライマーＢ７２−１とミスマッチの少ない２７４３ｂｐのＤＮＡ領域のみが増幅でき、プライマーＢ７２−１とミスマッチの多い他のＤＮＡ領域は増幅されなかったためである。
【０２３１】
なお、図２３（ｂ）に示すレーン３においては、バンドが現れないことを確認し易くするために、レーン４の５倍量であるＳＳＣ−ＰＣＲ産物１０μＬで電気泳動を行った。
【０２３２】
一般的に、ＳＳＣ−ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅するときに、プライマーのアニーリング工程におけるアニール温度を高く設定することにより、プライマーの鋳型ＤＮＡへの結合の選択性を厳しくできることが知られている。
【０２３３】
本実施例においては、図２３（ｂ）に示すように、プライマーのアニーリング工程におけるアニール温度を高く設定することにより、プライマーＢ７２では電気泳動像の中にバンドは現れないが、プライマーＢ７２−１を用いることで、電気泳動像の中にバンドが現れた。
【０２３４】
したがって、表２に示す配列番号１７のプライマーＢ７２−１の方が表１に示す配列番号１のプライマーＢ７２よりも大腸菌Ｋ−１２株をより高い識別能力で検出することが可能なＳＳＣ−ＰＣＲ法用のプライマーであることがわかった。
【０２３５】
【配列表】
2004187560.tif 000013
2004187560.tif 000014
2004187560.tif 000015
2004187560.tif 000016
2004187560.tif 000017
2004187560.tif 000018
2004187560.tif 000019
2004187560.tif 000020
2004187560.tif 000021
2004187560.tif 000022
2004187560.tif 000023
2004187560.tif 000024
2004187560.tif 000025
2004187560.tif 000026
2004187560.tif 000027
2004187560.tif 000028
2004187560.tif 000029
【図面の簡単な説明】
【図１】細菌識別装置を示す図である。
【図２】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第１のサイクル中の課程を示す模式図である。
【図３】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの１回目のサイクル中の課程を示す模式図である。
【図４】ＳＳＣ−ＰＣＲ法における第２のサイクルの２回目のサイクル中の課程を示す模式図である。
【図５】ＳＳＣ−ＰＣＲにより増幅された２本鎖化したＤＮＡ断片の塩基配列の第１の例を示す模式図である。
【図６】ＳＳＣ−ＰＣＲにより増幅された２本鎖化したＤＮＡ断片の塩基配列の第２の例を示す模式図である。
【図７】ＳＳＣ−ＰＣＲにより増幅された２本鎖化したＤＮＡ断片の塩基配列の第３の例を示す模式図である。
【図８】ＳＳＣ−ＰＣＲにより増幅された２本鎖化したＤＮＡ断片の塩基配列の第４の例を示す模式図である。
【図９】ＳＳＣ−ＰＣＲにより増幅された２本鎖化したＤＮＡ断片の塩基配列の第５の例を示す模式図である。
【図１０】細菌識別方法の一例を示すフローチャートである。
【図１１】細菌識別方法に用いるＳＳＣ−ＰＣＲ法の一例を示すフローチャートである。
【図１２】図１０のＳＳＣ−ＰＣＲ法に用いるＤＮＡ断片増幅装置の例を示す模式図である。
【図１３】細菌識別方法に用いる画像処理法の一例を示すフローチャートである。
【図１４】図１３の画像処理法を用いて処理を行った電気泳動像の画像データである。
【図１５】ＤＮＡサイズマーカの電気泳動像を示す図である。
【図１６】大腸菌の電気泳動を示す図である。
【図１７】大腸菌の電気泳動像を示す図である。
【図１８】赤痢菌の電気泳動像を示す図である。
【図１９】ビブリオ菌の電気泳動像を示す図である。
【図２０】サルモネラ菌の電気泳動像を示す図である。
【図２１】枯草菌の電気泳動像を示す図である。
【図２２】大腸菌Ｋ−１２株をプライマーＢ７２を用いて、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により増幅し得られた電気泳動像を示す図である。
【図２３】大腸菌Ｋ−１２株をプライマーＢ７２およびプライマーＢ７２−１を用いて、ＳＳＣ−ＰＣＲ法により増幅し得られた電気泳動像を示す図である。
【符号の説明】
２１ａ，２１ｂ，２１ｃ  プライマー
３１ａ，３１ｂ，３２ａ，３２ｂ，３３ａ，３３ｂ，３４ａ，３４ｂ，３５ａ，３５ｂ，３６ａ，３６ｂ，３７ａ，３７ｂ，３８ａ，３８ｂ，３９ａ，３９ｂ
塩基
４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６  ２本鎖化した鎖
４０ａ，４０ｂ，４１ａ，４１ｂ，４２ａ，４２ｂ，７０ａ，７０ｂ，７１ａ，７１ｂ，７２ａ，７２ｂ，７３ａ，７３ｂ  １本鎖
１００，１０１，１０２，１０３，１０４，  プライマー
【図１】
2004187560.tif 000030
【図２】
2004187560.tif 000031
【図３】
2004187560.tif 000032
【図４】
2004187560.tif 000033
【図５】
2004187560.tif 000034
【図６】
2004187560.tif 000035
【図７】
2004187560.tif 000036
【図８】
2004187560.tif 000037
【図９】
2004187560.tif 000038
【図１０】
2004187560.tif 000039
【図１１】
2004187560.tif 000040
【図１２】
2004187560.tif 000041
【図１３】
2004187560.tif 000042
【図１４】
2004187560.tif 000043
【図１５】
2004187560.tif 000044
【図１６】
2004187560.tif 000045
【図１７】
2004187560.tif 000046
【図１８】
2004187560.tif 000047
【図１９】
2004187560.tif 000048
【図２０】
2004187560.tif 000049
【図２１】
2004187560.tif 000050
【図２２】
2004187560.tif 000051
【図２３】
2004187560.tif 000052