(57)【要約】【課題】ゲルを用いる方法よりも使いやすく、ピラー構造を用いた従来の方法よりも分離能力や解像度の優れたものとする。【解決手段】泳動用流路２は石英ガラス基板に形成され、泳動方向に直交する方向に延びた微細な棒状のピラーが高密度に形成されているピラー領域８と、そのようなピラーの設けられていない領域１０とが泳動用流路２に沿って交互に繰り返し配置されていることによって、ピラーの設けられていない領域１０とピラー領域８との界面が泳動用流路２に沿って複数個形成されている。ピラー領域８には直径が２００ｎｍ、ピッチが４００ｎｍ、高さが５μｍの円柱状で、アスペクト比が２５のピラーを高密度に配置した。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
泳動用流路に、伸びた状態の測定対象生体高分子のみを通過させる隙間をもつ障壁領域と、そのような障壁の設けられていない領域とを泳動用流路に沿って交互に繰り返し配置することにより、障壁のない領域と障壁領域との界面を複数個配置し、
前記泳動用流路の一端側に生体高分子試料を導入し、
前記泳動用流路の両端間に泳動用電圧を印加して前記泳動用流路の一端側から他端側に向かって試料を電気泳動させることにより、前記生体高分子試料をサイズに応じて分離することを特徴とする生体高分子解析方法。
【請求項２】
前記障壁領域は泳動方向に直交する方向に延びた微細な棒状のピラーが高密度に形成されているピラー領域である請求項１に記載の生体高分子解析方法。
【請求項３】
前記ピラー領域におけるピラーは、直径が１〜１０００ｎｍ、ピッチが１〜２０００ｎｍである請求項４に記載の生体高分子解析方法。
【請求項４】
一端側に試料導入部を有し、前記一端側から他端側に向かって試料を電気泳動させるための泳動用電圧が両端間に印加される泳動用流路を備え、
前記泳動用流路には伸びた状態の測定対象生体高分子のみを通過させる隙間をもつ障壁領域と、そのような障壁の設けられていない領域とが前記泳動用流路に沿って交互に繰り返し配置されていることによって、障壁の設けられていない領域と障壁領域との界面が前記泳動用流路に沿って複数個形成されていることを特徴とする生体高分子解析装置。
【請求項５】
前記障壁領域は泳動方向に直交する方向に延びた微細な棒状のピラーが高密度に形成されているピラー領域である請求項４に記載の生体高分子解析装置。
【請求項６】
前記ピラー領域におけるピラーは、直径が１〜１０００ｎｍ、ピッチが１〜２０００ｎｍである請求項５に記載の生体高分子解析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの生体高分子試料をサイズに応じて分離する生体高分子解析方法とその方法の実施に使用する装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡのサイズ分離は、ＤＮＡのシーケンスを決定したり、ＳＮＰｓ（一塩基多型）の検出などによるＤＮＡ診断、ＤＮＡタイピング、ＤＮＡ検定による親子の判別や犯罪の捜査まで広く使われている技術であり、今後ますます増える需要に応えるため、その取り扱いの容易化と高速化は、大きな課題である。
【０００３】
ＤＮＡのサイズ分離には、従来、アガロースやポリアクリルアミドなどのゲルやポリマー中を電気泳動させ、その網目構造に制限を受けながら（ひっかかりながら）移動する速度が、ＤＮＡの大きさに依存することを利用したゲル電気泳動が主流であった。
【０００４】
しかし、一般的に長時間の泳動が必要とされ、また分離するサイズに応じてゲルやポリマーの組成を変える必要があったり、大きなＤＮＡの分離には途方もない時間が必要だったりするため、使いにくいという問題がある。
【０００５】
また、ゲルやポリマーは水分を含むため保存が難しく、その都度作製あるいは充填する必要がある。また体積も大きく、バイオハザード成分を含んだ大量のゲルの廃棄には無毒化の処理も必要であり、この点でも使いにくいものであった。
【０００６】
近年、ゲルの網目構造を、リソグラフィーなどを用いて作製したピラー構造の人工的な構造物に置き換え、サイズ分離を試みる手法がいくつか報告されている（非特許文献１参照。）。ピラー構造とは、泳動方向に直交する方向に延びた微細な棒状のピラーが高密度に形成されている構造である。
しかし、泳動路に沿ってそのようなピラー構造を配置しただけでは、分離能力や解像度はゲルには及ばない。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｓ．  Ｗ．  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ａ．  Ｍ．  Ｐｅｒｅｚ，  Ａ．  Ｌｏｐｅｚ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｇ．  Ｇｒａｉｇｈｅａｄ，  Ｊ．  Ｖａｃ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  Ｂ  １６（６），  Ｎｏｖ／Ｄｅｃ，  ｐｐ．  ３８３５−３８４０（１９９８）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ゲルやポリマーを用いる方法よりも使いやすく、ピラー構造を用いた従来の方法よりも分離能力や解像度の優れた生体高分子解析方法及び装置を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ピラーのように伸びた状態の測定対象生体高分子のみを通過させる隙間をもつ障壁のない流路を流れているＤＮＡなどの生体高分子が、ピラーのような障壁のある領域に侵入する界面で、侵入速度に大きなサイズ依存性があることを見出した。本発明は、その現象を利用したＤＮＡなど生体高分子のサイズによる分離方法とそれを利用したＤＮＡ解析装置である。
【００１０】
すなわち、本発明による生体高分子解析方法は、泳動用流路に、伸びた状態の測定対象生体高分子のみを通過させる隙間をもつ障壁領域と、そのような障壁の設けられていない領域とを泳動用流路に沿って交互に繰り返し配置することにより、障壁の設けられていない領域と障壁領域との界面を複数個配置し、その泳動用流路の一端側に生体高分子試料を導入し、その泳動用流路の両端間に泳動用電圧を印加して泳動用流路の一端側から他端側に向かって試料を電気泳動させることにより、生体高分子試料をサイズに応じて分離することを特徴とする方法である。
【００１１】
また、本発明の生体高分子解析装置は、一端側に試料導入部を有し、前記一端側から他端側に向かって試料を電気泳動させるための泳動用電圧が両端間に印加される泳動用流路を備え、前記泳動用流路には、伸びた状態の測定対象生体高分子のみを通過させる隙間をもつ障壁領域と、そのような障壁の設けられていない領域とが前記泳動用流路に沿って交互に繰り返し配置されていることによって、障壁の設けられていない領域と障壁領域との界面が前記泳動用流路に沿って複数個形成されていることを特徴とするものである。
【００１２】
そのような障壁領域の一例は、泳動方向に直交する方向に延びた微細な棒状のピラーが高密度に形成されているピラー領域である。ピラー領域におけるピラーは、直径が１〜１０００ｎｍ、ピッチが１〜２０００ｎｍのものが適当である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
図１は一実施例における電気泳動チップの泳動用流路を概略的に示したものである。
この泳動用流路２は、石英ガラス基板に形成された溝と、その上に接合された石英ガラス板により、通路として形成されたものである。泳動用流路２の一端と他端にはそれぞれ上面が開口したリザーバ４，６が設けらけれている。流路２、リザーバ４，６にはバッファ液が充填される。一端側のリザーバ４は試料導入部を兼ねている。リザーバ４，６間には直流電源（図示略）により一端側から他端側に向かって試料を電気泳動させるための泳動用電圧が印加されるようになっている。
【００１４】
泳動用流路２には、泳動方向に直交する方向に延びた微細な棒状のピラーが高密度に形成されている障壁領域としてのピラー領域８と、そのような障壁としてのピラーの設けられていない領域１０とが泳動用流路２に沿って交互に繰り返し配置されていることによって、ピラーの設けられていない領域１０とピラー領域８との界面が泳動用流路２に沿って複数個（この実施例で６個）形成されている。
【００１５】
ピラー領域８には、図２に示されているようなピラーを高密度に配置した。図２の例では、ピラーは直径が２００ｎｍ、ピッチが４００ｎｍ、高さが５μｍの円柱状で、アスペクト比は２５である。しかし、本発明におけるピラーの形状は円柱状に限らず、角柱状であってもよく、サイズもこれに限らない。ピッチはＤＮＡなどの測定対象となる生体高分子が伸びた状態で通過できるように適当に設定することができる。
【００１６】
図１の実施例の装置の寸法を概略的に示す、泳動用流路２は幅が１〜１００μｍ、例えば２５μｍ、長さが０．１〜５００ｍｍ、例えば１０ｍｍ、高さが０．１〜５０μｍ、例えば５μｍであり、ピラー領域８の長さは０．１〜１０ｍｍ、例えば１ｍｍ、ピラー領域８間に挟まれた領域１０の長さは０．１〜１０ｍｍ、例えば１ｍｍである。もちろん、寸法はこれに限られるものではない。
【００１７】
このように、ピラーのある領域８とない領域１０を交互に配置し、ピラーのある領域８で引き伸ばされたＤＮＡなどの生体高分子が、ピラーのない領域１０でもう一度熱的にまるまることにより、次のピラーのあるなし界面でも、再度泳動速度に大きなサイズ依存性が起きることが期待できる。これを繰り返すことにより、総合して泳動時間に大きなサイズ依存性を持たせることができる。
【００１８】
高密度ピラーの形成方法について、以下に記述する。
まず石英ガラス基板に電子ビーム用レジスト層を形成し、電子ビーム露光装置により、所定のパターンに直接描画して露光し、現像してレジストパターンを得る。そのレジストパターンを鋳型にしてニッケル層を電着しニッケルパターンを形成する。次に、そのニッケルパターンをマスクにしてＮＬＤ法により石英ガラス基板をドライエッチングしてピラーを形成する。ＮＬＤエッチングとはプラズマエッチングの一種で、コイルによってチャンバ内に磁気中性線を含む領域を生じさせ、この領域でプラズマを発生させることによって得た、低圧・高密度・低温のプラズマを用いてエッチングを行うものである。微細加工に適し、かつエッチング速度も速いという特長を持つ。
【００１９】
その後、ピラーが形成された石英ガラス板の加工面にリザーバ用貫通穴を形成した石英ガラス板カバーを接合する。接合には、純水によるプリボンド及び熱処理による直接接合を用いた。即ち、親水化処理した石英ガラス基板同士を純水を介して重ね合わせ、荷重（約１．３ＭＰａ）を加えながら乾燥させ、その後１１００℃、酸素雰囲気中での熱処理を行うことにより接合した。
【００２０】
本発明の意義を明確にするために、図３のような１つのピラー領域１８をもつ流路１２を備えた電気泳動チップを作成した。流路１２の幅は２５μｍ、ピラー領域１８の長さは２４ｍｍ、深さは５μｍで、ピラーのサイズとピッチの異なる２種類のチップを製作した。ピラーのそのサイズとピッチは、（サイズ，ピッチ）＝（３００ｎｍ，６００ｎｍ）及び（５００ｎｍ、１０００ｎｍ）である。これらの電気泳動チップをそれぞれマイクロチップ電気泳動装置に装着し、オートサンプラを用いて試料を導入して測定を行なった。
【００２１】
電気泳動速度を測定するために、試料として１６５．６ｋｂｐの塩基長をもつＴ４ＤＮＡ溶液と、４８．５ｋｂｐの塩基長をもつλＤＮＡ溶液を用意し、それぞれをＹＯＹＯ１で着色し、０．５トリス硼酸ＥＤＴＡ緩衝液により試料溶液とした。それらの試料を図３の電気泳動チップに注入し、電気泳動を行なって蛍光顕微鏡を用いてそれぞれのＤＮＡの泳動を観察した。
【００２２】
その結果を図４と図５に示す。図４は直径３００ｎｍ、ピッチ６００ｎｍのピラーをもつピラー領域でＴ４ＤＮＡとλＤＮＡの泳動速度を測定した結果である。泳動電圧が５０〜２００Ｖ／ｃｍの領域において殆ど同一である。
【００２３】
図５は直径５００ｎｍ、ピッチ１０００ｎｍのピラーをもつピラー領域で分離した結果である。図４の結果よりも、両ＤＮＡが分離されていることがわかる。このことからＤＮＡフラグメントの分離にはピラー構造の直径及び／又はパターンの最適化が重要であることが推定される。
しかしながら、このようなピラー領域内での泳動速度に対するＤＮＡのサイズ依存性はさほど大きいとはいえない。
【００２４】
そこで、図６に示されるように、ピラーのない領域２０からピラーのある領域１８に入る界面をまたいだＤＮＡの平均速度を測定した。その結果を図７に示す。図７はピラーのない領域２０からピラーのある領域１８に入る界面を通過する時のＤＮＡの平均速度を示したものである。この場合は、７０Ｖ／ｃｍという低い泳動電圧でもλＤＮＡの電気泳動速度はＴ４ＤＮＡのほぼ２倍の大きさであり、Ｔ４ＤＮＡとλＤＮＡの泳動速度に大きなサイズ依存がみられる。
【００２５】
すなわち、ピラーのないところでは熱運動で丸まった形で泳動しているＤＮＡが、ピラー領域に入るときに、引き伸ばされ、ピラー領域内部では直線状に伸びた形で泳動している。この界面で、丸まった形から、直線状に伸びるのに必要な時間に関して大きなサイズ依存性があるものと考えられる。ピラー領域に入ったあとは、図４や図５に示したように、大きなサイズ依存性なく泳動するものと考えられる。
【００２６】
実施例では、試料としてＤＮＡを例に説明を行ってきたが、同様に電気泳動による分離を行っているたんぱく質やＲＮＡ（リボ核酸）のような生体高分子にも適用できる。
また、実施例では、障壁としてリソグラフィーとエッチングにより作製したピラーを用いたが、同様にＤＮＡの動きを制限し直線状に引き伸ばす物体を障壁として繰り返し配置することにより同様の効果が期待できる。そのような障壁となる物体として、光硬化多孔質樹脂、光硬化ゲル、ビーズなどが挙げられる。
【００２７】
【発明の効果】
本発明では、泳動用流路に、伸びた状態の測定対象生体高分子のみを通過させる隙間をもつ障壁領域と、そのような障壁の設けられていない領域とを泳動用流路に沿って交互に繰り返し配置することにより、障壁のない領域と障壁領域との界面を複数個配置して生体高分子試料を電気泳動分離させるようにしたので、生体高分子試料のサイズによって分離できるようになる。このサイズ依存性は、単位分離媒体長さ当りで比較すると、けた違いに大きく、トータルとしてより短い分離チャネルで、従来のゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動と同等の分離性能を得ることができる。これは、装置の小型化、高集積化だけではなく、短い泳動距離でよいことを意味しており、ひいては短い泳動時間でよく、けた違いの高速化につながる。これは、増大するＤＮＡ解析需要にとって計り知れない利点である。
また、本発明の装置は、チップ化した際には、他の微小流体デバイスと同時に、１プロセスで作製することができ、ゲルを埋め込んだり、後で注入したりするものに比べて、容易に作製、利用できる。
また、本質的に形状加工だけなので、マイクロ精密プリンティングや、一回のドライエッチングなどにより、大量生産可能である。
さらに、乾燥状態で保存できるため、取り扱いが楽であり、また試料や廃棄物も少量である。
したがって、専門的オペレータや廃棄施設を持った研究所や大病院のみならず、診療所、専門外の研究機関でも容易に利用でき、ＤＮＡ解析の応用範囲を大きく広げると期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】一実施例の電気泳動チップの泳動用流路を概略的に示す平面図である。
【図２】一実施例におけるピラー構造を示す画像である。
【図３】比較のために製作した電気泳動チップの泳動用流路を概略的に示す平面図である。
【図４】図３の電気泳動チップの一例を用いたＤＮＡの泳動速度測定結果を示すグラフである。
【図５】図３の電気泳動チップの他の例を用いたＤＮＡの泳動速度の測定結果を示すグラフである。
【図６】ピラーのない領域からピラーのある領域に入る界面をまたいだＤＮＡの移動を模式的に示す平面図である。
【図７】ピラーのない領域からピラーのある領域に入る界面をまたいだＤＮＡの平均速度の測定結果を示すグラフである。
【符号の説明】
２      泳動用流路
４，６      リザーバ
８      ピラー領域
１０      ピラーのない領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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