(57)【要約】      （修正有）【課題】エンテロコッカス属に属する乳酸菌の生理活性を維持する培養方法及びエンテロコッカス属に属する乳酸菌死菌体の製造方法の提供。【解決手段】エンテロコッカス属に属する乳酸菌の培養方法であって、エンテロコッカス属に属する乳酸菌を、(i）ｐＨ：５．５乃至７．５、（ii）攪拌方法：１分間当たり５乃至４０回、（iii）温度条件：摂氏３０乃至４０度、（iv）培養時間：６乃至２４時間、の培養条件下において好気的に培養し、培養液から生菌体を採取する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロコッカス属に属する乳酸菌の培養方法であって、
エンテロコッカス属に属する乳酸菌を
（i）ｐＨ：５．５乃至７．５、
（ii）攪拌方法：１分間当たり５乃至４０回、
（iii）温度条件：摂氏３０乃至４０度、
（iv）培養時間：６乃至２４時間、の培養条件下において好気的に培養し、
培養液から生菌体を採取することにより成るエンテロコッカス属に属する乳酸菌の培養方法。
【請求項２】
前記培養における培地組成は、
（i）グルコース：１乃至４％と、
（ii）酵母エキス：０．３乃至６％と、
（iii）ペプトン：０．１乃至５％と、
（iv）リン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）：１乃至５％と、
を含む請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記エンテロコッカス属に属する乳酸菌は、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エントロコッカス・ボービス、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス、及びエンテロコッカス・イクイヌスより成る群から１種又は２種以上の生菌体である請求項１又は２に記載の培養方法。
【請求項４】
エンテロコッカス属に属する乳酸菌死菌体の製造方法であって、
前記乳酸菌を、
（１）培養条件（i）ｐＨ：５．５乃至７．５、（ii）攪拌方法：１分間当たり５乃至４０回、（iii）温度条件：摂氏３０乃至４０度、（iv）培養時間：６乃至２４時間、において好気的に培養し、
（２）前記生菌体を含有する菌液を生理食塩水で洗浄し、
（３）生理食塩水溶液に懸濁して得られる菌液を、（i）温度８０乃至１２５°Ｃ、（ii）圧力５乃至２５ポンドの環境下に、（iii）５乃至２５分間置くことによるエンテロコッカス属に属する乳酸菌死菌体の製造方法。
【請求項５】
前記（１）の培養における培地組成は、
（i）グルコース：１乃至４％、
（ii）酵母エキス：０．３乃至６％、
（iii）ペプトン：０．１乃至５％、及び
（iv）リン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）：１乃至５％を含む、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記エンテロコッカス属に属する乳酸菌は、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エントロコッカス・ボービス、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス、及びエンテロコッカス・イクイヌスより成る群から１種又は２種以上の生菌体である請求項４又は５に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロコッカス属に属する乳酸菌の培養方法、及びエンテロコッカス属に属する乳酸菌死菌体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年における日本人一人当りの動物性脂肪の消費量増大と食生活の欧米化の進展に伴い、生活習慣病、成人病の一つである高脂血症及びこれによる動脈硬化症疾患者の数が増加している。
【０００３】
このため、現在において多くの種類の高脂血症治療薬が実用に供されている。しかし、これらの疾患抑制に用いられている薬剤は、いずれも服用後の胃の不快感、嘔吐、肝機能異常、急性腎不全、脱力感等の副作用が報告されており、さらに、他の薬剤を投与中の者はその服用を控えなければならない場合もある。
【０００４】
本願の発明者は、新規坑動脈硬化剤の研究の結果、乳酸菌、特にエンテロコッカス属に属する各種微生物の生菌体及び死菌体が、血中コレステロール値及びトリグリセリド値を著しく低下せしめるものであることを発見し、且つ当該微生物の起源が元来人間の体内に存在している腸内細菌であることから、これを服用しても無毒であり、従来の坑動脈硬化剤や高指血症の治療薬のような副作用がないことを知見したのである（例えば、特許文献１）。
【０００５】
さらに、これらの微生物は種々の生理活性を有するが、その生菌体のみならず所定の条件下において処理された死菌体においても、その生理活性の例として、コレステロール値及びトリグリセリド値を著しく低下せしめる活性を有していることを知見の一例として示したのである。
【特許文献１】特許公報第２７５６７７８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、このようにコレステロール値及びトリグリセリド値を著しく低下させる活性を有するエンテロコッカス属に属する乳酸菌（乳酸球菌）であっても、その培養方法によっては、当該乳酸菌の活性が低下し期待される効果が得られなくなることが判明した。また、エンテロコッカス属に属する乳酸菌死菌体もその生菌体と同様に、コレステロール値及びトリグリセリド値を著しく低下させることが知られているが、その生菌体から死菌体を得る処理の仕方によっては、期待される効果を喪失することが判明した。
【０００７】
本発明は、血中コレステロール及びトリグリセライドを低下させる効果を有するエンテロコッカス属に属する乳酸菌の活性を喪失させることがない培養方法、及びエンテロコッカス属に属する乳酸菌死菌体の製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このため、本願は、エンテロコッカス属に属する乳酸菌の培養方法であって、エンテロコッカス属に属する乳酸菌を、（i）ｐＨ：５．５乃至７．５、（ii）攪拌方法：１分間当たり５乃至４０回、（iii）温度条件：摂氏３０乃至４０度、
（iv）培養時間：６乃至２４時間、の培養条件下において好気的に培養し、培養液から生菌体を採取することにより成るコレステロール及びトリグリセリドを低下させる活性を有するエンテロコッカス属に属する乳酸菌の培養方法を提供するものである。
【０００９】
ここで、前記培養における培地組成は、（i）グルコース：１乃至４％と、（ii）酵母エキス：０．３乃至６％と、（iii）ペプトン：０．１乃至５％と、（iv）リン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）：１乃至５％と、を含むことを特徴とする。
【００１０】
ところで、前記エンテロコッカス属に属する乳酸菌は、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エントロコッカス・ボービス、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス、及びエンテロコッカス・イクイヌスより成る群から１種又は２種以上の生菌体である。
【００１１】
本発明は、さらに、エンテロコッカス属に属する乳酸菌死菌体の製造方法であって、前記乳酸菌を、（１）培養条件（i）ｐＨ：５．５乃至７．５、（ii）攪拌方法：１分間当たり５乃至４０回、（iii）温度条件：摂氏３０乃至４０度、（iv）培養時間：６乃至２４時間、において好気的に培養し、（２）前記生菌体を含有する菌液を生理食塩水で洗浄し、（３）生理食塩水溶液に懸濁して得られる菌液を、（i）温度８０乃至１２５°Ｃ、（ii）圧力５乃至２５ポンドの環境下に、（iii）５乃至２５分間置くことによる、コレステロール及びトリグリセリドを低下させる活性を有するエンテロコッカス属に属する乳酸菌死菌体の製造方法を提供するものである。
【００１２】
ここで、前記（１）の培養における培地組成は、（i）グルコース：１乃至４％、（ii）酵母エキス：０．３乃至６％、（iii）ペプトン：０．１乃至５％、及び（iv）リン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）：１乃至５％を含むことを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明に係るエンテロコッカス属に属する乳酸菌の培養方法及びエンテロコッカス属に属する乳酸菌死菌体の製造方法において使用される微生物の種類、当該微生物の培養方法、培養された微生物の死菌体の製造方法、及びその結果得られた乳酸菌及び乳酸菌死菌体の薬理作用について詳細に説明する。
【００１４】
１．微生物
エンテロコッカス属に属する乳酸菌が使用され、この中で特に、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エントロコッカス・ボービス、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス、及びエンテロコッカス・イクイヌスより成る群から１種又は２種以上の生菌体が好適なものとして例示される。尚、上記エンテロコッカス属に属する乳酸菌は、例えば、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）における寄託番号「ＡＴＣＣ７００８０２」として入手可能である。
【００１５】
２．生菌体製造条件
前記生菌体の培養条件は、以下のとおりである。
（i）培養組成の水素イオン指数（ｐＨ）：５．５乃至７．５の範囲とする。
（ii）攪拌方法：１分間に５回乃至４０回ゆるやかに攪拌する。
（iii）培養時間：６乃至２４時間の範囲とする。
（iv）培地組成：グルコース；１乃至４％、酵母エキス；０．３乃至６％、ペプトン；０．１乃至５％、リン酸ニカリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）；１乃至５％、を含み、
（v）温度：３０乃至４５℃の温度環境下において、
（vi）好気的に培養するが特に酸素の付加は必要ない、ものとする。
【００１６】
３．死菌体製造条件
上記２の生菌体製造条件に基づいて得られた生菌体培養液を、さらに生理食塩水で１乃至２回程度洗浄した後、生理食塩水溶液に懸濁して得られる菌液を、以下の条件下において加熱／圧力処理を行う。
（i）温度：８０乃至１２５°Ｃ
（ii）圧力：５乃至２５ポンド
（iii）時間：５乃至２５分
上記条件による加熱／高圧処理により前記微生物の活性ある死菌体を得ることができる。
【００１７】
４．薬理作用
後記各実験例に示す通り、本発明による死菌体製造方法により、乳酸菌特にエンテロコッカス属の微生物が、血中コレステロール及びトリグリセリド値を極めて効果的に低下せしめるものであることを示した。
【００１８】
（１）実験例１
上記１に示したエンテロコッカス属に属する各種微生物の生菌体と加熱、加圧処理菌体をマウス（雄１８週令、平均体重２０ｇ：各群１０匹）に４週間生菌体１０10個／日、死菌体１０10個／日相当量を、経口的に連日投与し、血清中のコレステロールの低下率を測定した。当該実験の結果を表１に示す。
【００１９】
【表１】
2004357703.tif 000002
【００２０】
（２）実験例２
上記実験例１と同様にしてエンテロコッカス属各種微生物の生菌体を加熱、加圧処理死菌体を通常ラット（雄１８週令、平均体重２５０ｇ：各群７匹）４週間、生菌体１０10個／日、死菌体１０10個／日相当量を経口的に連日、投与し血清中のコレステロールの低下率を測定した。当該実験の結果を表２に示す。
【００２１】
【表２】
2004357703.tif 000003
【００２２】
（３）実験例３
上記した生菌体調整例及び死菌体調整例に従って調整されたエンテロコッカス属各種、微生物の生菌体と加熱、加圧処理死菌体を通常マウス（１８週令、平均体重２０ｇ：各群１０匹）に４週間、生菌体１０10個／日、死菌体１０10個／日相当量を経口的に連日投与し、血清中のトリグリセリドの各低下率を測定した。当該実験の結果を表３に示す。
【００２３】
【表３】
2004357703.tif 000004
【００２４】
（４）実験例４
上記実験例３と同様にして調整したエンテロコッカス属各種微生物の生菌体と加熱、加圧処理死菌体を通常ラット（雄１８週令、平均体重２５０ｇ：各群７匹）に４週間、生菌体１０10個／日、死菌体１０10個／日相当量を経口的に連日投与し血清中のトリグリセリドの低下率を測定した。当該実験の結果を表４に示す。
【００２５】
【表４】
2004357703.tif 000005
【００２６】
（５）エンテロコッカス属に属する微生物の安全性について
急性毒性試験において経口で可能な限りの量のエンテロコッカス・フェカリス・Ｋ−２３加熱、加圧処理菌体をラット（雄１８週令、平均体重２５０ｇ：１群１０匹）に経口投与したが（５６００ｍｇ／ｋｇ体重）何ら異常が認められず、経口投与においては事実上、無毒性であった。また腹腔内（マウス雄１８週令、体重２０ｇ：各群１０匹）投与でも８０２ｍｇ／ｋｇ体重と高値であった。
当該安全性に関する実験の結果を表５に示す。
【００２７】
【表５】
2004357703.tif 000006
【００２８】
上記したとおり、本発明のエンテロコッカス属に属する乳酸菌の培養方法においては、エンテロコッカス属に属する乳酸菌を、（i）ｐＨ：５．５乃至７．５、（ii）攪拌方法：１分間当たり５乃至４０回、（iii）温度条件：摂氏３０乃至４０度、（iv）培養時間：６乃至２４時間、の培養条件下において好気的に培養し、培養液から生菌体を採取する。
【００２９】
また、上記のように培養された生菌体を培養し、前記生菌体を含有する菌液を生理食塩水で洗浄し、生理食塩水溶液に懸濁して得られる菌液を、（i）温度８０乃至１２５°Ｃ、（ii）圧力５乃至２５ポンドの環境下に、（iii）５乃至２５分間置くことによって当該乳酸菌の死菌体を得る。
【００３０】
これによって、本発明は、血中コレステロール及びトリグリセライドを低下させる効果を有するエンテロコッカス属に属する乳酸菌の培養方法及びその死菌体の製造方法を確立したのである。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、エンテロコッカス属に属する乳酸菌の生理活性を維持する培養方法及びエンテロコッカス属に属する乳酸菌死菌体の製造方法を提供するものであり、産業上の利用可能性を有する。