(57)【要約】【課題】本発明は、検出用プローブと被検用の核酸をハイブリダイズさせたときに、塩基対にミスマッチが生じているか否かを簡便な方法で精度よく検出、同定することができる方法を提供する。より詳細には、電気化学的方法によりミスマッチ対の有無を簡便に検出できる方法を提供する。【解決手段】本発明は、電極に固定化された遺伝子検出用プローブと検査対象遺伝子とのハイブリダイゼーション操作を行った後、電極に電位を与え、得られた電荷応答量を測定することからなる検査対象遺伝子と遺伝子検出用プローブとのミスマッチ対を検出する方法に関する。また、本発明は、そのための遺伝子検出用プローブ、それが固定化された電極、当該電極を含むＤＮＡチップ、及びそれを用いた一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための装置に関する。【選択図】      図１
2004357570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極に固定化された遺伝子検出用プローブと検査対象遺伝子とのハイブリダイゼーション操作を行った後、電極に電位を与え、得られた電荷応答量を測定することからなる検査対象遺伝子と遺伝子検出用プローブとのミスマッチ対を検出する方法。
【請求項２】
電極が、ＤＮＡチップ上に設けられている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子検出用プローブが、酸化還元性ユニットを含む直鎖状の核酸からなる遺伝子検出用プローブである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
酸化還元性ユニットが、キノン類、メタロセン類、フラビン類、ポルフィリン類、金属錯体類からなる群から選ばれる核酸へのインターカレーターである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
酸化還元性ユニットが、２本鎖核酸の該当する塩基対間に平衡挿入するものである請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
酸化還元性ユニットが、糖残基の２’位に結合されているものである請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
酸化還元性ユニットを含む直鎖状の核酸からなる遺伝子検出用プローブ。
【請求項８】
遺伝子検出用プローブが、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するためのプローブである請求項７に記載のプローブ。
【請求項９】
酸化還元性ユニットが、キノン類、メタロセン類、フラビン類、ポルフィリン類、金属錯体類からなる群から選ばれる核酸へのインターカレーターである請求項７又は８に記載のプローブ。
【請求項１０】
酸化還元性ユニットが、２本鎖核酸の該当する塩基対間に平衡挿入するものである請求項７〜９のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１１】
酸化還元性ユニットが、糖残基の２’位に結合されているものである請求項７〜１０のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１２】
遺伝子検出用プローブが、金属表面に結合し得るリンカー基を有するものである請求項７〜１１のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１３】
遺伝子検出用プローブが、金属表面に固定化されたものである請求項１２に記載のプローブ。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれかに記載された遺伝子検出用プローブが金属表面に固定化された金属電極。
【請求項１５】
金属電極が、金である請求項１４に記載の電極。
【請求項１６】
請求項７〜１３のいずれかに記載された遺伝子検出用プローブが金属表面に固定化された金属電極を有するＤＮＡチップ。
【請求項１７】
ＤＮＡチップが、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するためのものである請求項１６に記載のチップ。
【請求項１８】
請求項１６に記載されたＤＮＡチップ、電極に電位を与えるための電源装置、電荷応答量を測定するための装置を含んでなる一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための装置。
【請求項１９】
電荷応答量を測定した情報を処理する装置、処理結果を表示する装置を含む請求項１８に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電極に固定化された遺伝子検出用プローブと検査対象遺伝子とのハイブリダイゼーション操作を行った後、電極に電位を与え、得られた電荷応答量を測定することからなる検査対象遺伝子と遺伝子検出用プローブとのミスマッチ対を検出する方法、より詳細にはヒトなどのゲノムにおける一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための方法に関する。また、本発明は、そのための遺伝子検出用プローブ、それが固定化された電極、当該電極を含むＤＮＡチップ、及びそれを用いた一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムの全塩基配列の解読終了とともに、ゲノム研究の中心は遺伝子の発現機構の解明を目的とした機能ゲノミクスに移行し、塩基配列情報にもとづいた遺伝子診断、遺伝子治療、およびゲノム創薬、さらには、ゲノム塩基配列の個人差（ＳＮＰｓ：一塩基多型）に応じたテーラーメイド医療、への応用が期待されている。例えば、抗癌剤の場合、薬剤の不活性化や活性化にかかわる酵素の遺伝子多型によって、個人個人でこれらの酵素の活性やその産生量に大きな違いの生ずることが報告されている。たとえば、５‐ＦＵ（フルオロウラシル）を不活性化する酵素では個人間の活性の差が１０倍、６‐ＭＰ（メルカプトプリン）やアザチオプリンでは３０倍以上、塩酸イリノテカンでは５０倍以上もの差が遺伝子の差によって生じていると報告されている。ＴＰＭＴ（チオプリンメチルトランスフェラーゼ）の場合、正常な遺伝暗号に対して酵素活性の低下をきたす６種類の遺伝子多型がこれまでに見出されており、副作用を避けるために遺伝子診断（ＳＮＰｓ診断）による投与量の調節が提唱されている。一般に薬剤の濃度は、その代謝酵素の働きが大きく影響し、薬剤代謝酵素遺伝子やトランスポーターやレセプターの遺伝子の違いにより、その効果や副作用に違いが生じることが知られている。
【０００３】
したがって、特定の塩基配列を検出、識別する方法は、これらの目的を達成するうえでの基本技術として重要である。特に、固相表面にあらかじめ塩基配列の分かっているオリゴヌクレオチドを高密度に固定化したＤＮＡチップは、多数の遺伝子を同時並行的に分析することが可能であり、ＤＮＡ塩基配列を調べるツールとして非常に注目されている。しかしながら、現在の蛍光測定を基盤としたＤＮＡチップは、その作製とＤＮＡハイブリダイゼーションの検出に特殊な装置や試薬を必要とし、さらに複雑な操作を必要とすることから、より簡便で効率の良い検出法の開発が期待されている。
近年、ＤＮＡの特定の塩基配列を検出する新しい手法として電気化学応答を基盤とした方法が注目され、様々なアプローチが試みられてきた。ＤＮＡ２本鎖に対して親和性を有するレドックス活性な化学種を利用して、ＤＮＡとの相互作用に起因する電気化学応答をモニターして検出を行う方法が報告されている。竹中らは、ＤＮＡインターカレーターであるフェロセン化ナフタレンジイミドは金電極上に固定化されたＤＮＡ１本鎖と比較してＤＮＡ２本鎖に対して高い親和性を有することを示し、これを利用した電気化学的なＤＮＡハイブリダイゼーションの検出法を報告している（非特許文献１参照）。バートン（Ｂａｒｔｏｎ）らは、ＤＮＡを経由する電子移動を利用したミスマッチ検出のためのプローブとして、ダウノマイシンやメチレンブルーを利用する方法を報告している（非特許文献２参照）。また、別のアプローチとして、レドックス活性分子をオリゴヌクレオチドの特定の部位に共有結合で導入し電気化学フローブとして用いる方法が報告されている（非特許文献３参照）。
【０００４】
このような状況のもと、すでにわれわれは、典型的なレドックス応答分子でなおかつＤＮＡインターカレーターの両者の性質をあわせ持つアントラキノンを特定のＤＮＡ糖部位に導入する一般的かつ効率の良い方法を開発してきた（非特許文献４−５参照）。そして、アントラキノン修飾核酸が、標的ＤＮＡと極めて安定な２重らせんを形成し、これにともなう特異なレドックス変化の観測に成功してきた（非特許文献６−７参照）。また、アントラキノン修飾ＤＮＡをプローブとして用いるＤＮＡセンシング法としてアントラキノン修飾ＤＮＡを表面に固定化した金電極をＤＮＡチップに用いることを計画した（非特許文献８参照）。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｓ．Ｔａｋｅｎａｋａ，  Ｋ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ａＮＡＬ．  Ｃｈｅｍ．，  ７２，  １３３４  （２０００）
【非特許文献２】
Ｅ．Ｍ．Ｂｏｏｎ，  Ｊ．Ｋ．Ｂａｒｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １８，１０９６  （２０００）
【非特許文献３】
Ｃ．Ｊ．Ｙｕ，  Ｈ．Ｙｏｗａｎｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２２，  ６７６７  （２０００）
【非特許文献４】
Ｋ．Ｙａｍａｎａ，  Ｙ．Ｎｉｓｈｉｊｉｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  １，  ３１９−３２４（１９９０）
【非特許文献５】
Ｋ．Ｙａｍａｎａ，  Ｔ．Ｍｉｔｓｕｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ７，  ７１５−７２０（１９９６）
【非特許文献６】
Ｋ．Ｙａｍａｎａ，  Ｓ．Ｋｕｍａｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔ．，  １１３２−１１３３（２００１）
【非特許文献７】
Ｓ．Ｋｕｍａｍｏｔｏ，  Ｈ．Ｎａｋａｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ７０，  ７８９−７９４（２００２）
【非特許文献８】
Ｋ．Ｙａｍａｎａ，  Ｓ．Ｋｕｍａｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔ．，  ５０６−５０７（２００２）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、検出用プローブと被検用の核酸をハイブリダイズさせたときに、塩基対にミスマッチが生じているか否かを簡便な方法で精度よく検出、同定することができる方法を提供する。より詳細には、電気化学的方法によりミスマッチを簡便に検出できる方法を提供する。また、本発明は、そのためのプローブ、当該プローブを固定化した電極、プローブを固定化した電極を含むＤＮＡチップ、及びそれらを用いたミスマッチを検出するための装置を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、すでに、レドックス応答分子や蛍光発色団をＤＮＡ中の所定の位置に特異的に導入する一般的かつ簡便な手法を開発するとともに、得られる標識ＤＮＡ誘導体と対象となる遺伝子の複合体形成に伴う特異なレドックス応答や蛍光挙動について基本的な知見を集積してきた。
本発明者らの開発してきた電気化学的特性を有するＤＮＡチップの特徴は、表面構造を制御した基板上にプローブとなる修飾ＤＮＡを比較的高密度に整列固定化することに加えて、ＤＮＡ２重螺旋の特定の塩基対間にインターカレーターとしての性質と電気化学活性の両性質を有するレドックス分子を配置することにある。これらにより初めて、分子サイズで構造を制御した電極表面の作成が可能となり、ＤＮＡ塩基配列やπ電子構造と電子移動反応の関連を明らかにすることが可能であると考えられた。
そして、この手法を応用することにより電気化学的手段によりフルマッチＤＮＡとミスマッチＤＮＡの識別が可能であるか否かを検討してきたところ、この手法を応用することにより、極めて簡便な方法で電極に固定化した検出用プローブと被検用の核酸とのフルマッチとミスマッチとを識別することができることを見出し、簡便な一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出方法を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、電極に固定化された遺伝子検出用プローブと検査対象遺伝子とのハイブリダイゼーション操作を行った後、電極に電位を与え、得られた電荷応答量を測定することからなる検査対象遺伝子と遺伝子検出用プローブとのミスマッチ対を検出する方法に関する。より詳細には、酸化還元性ユニットを含む遺伝子検出用プローブの酸化還元性ユニットが結合した箇所と、電極との間に存在するミスマッチ対を検出する方法に関する。
また、本発明は、酸化還元性ユニットを含む直鎖状の核酸からなる遺伝子検出用プローブ、より詳細には、酸化還元性ユニットを含む直鎖状の核酸からなる一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための遺伝子検出用プローブに関する。
さらに、本発明は、当該遺伝子検出用プローブが金属表面に固定化された金属電極、当該遺伝子検出用プローブが金属表面に固定化された金属電極を有するＤＮＡチップ、及びそれらを用いた一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための装置に関する。
【０００９】
本発明者らは、酸化還元性ユニットとしてアントラキノンを有するアントラキノン修飾ＤＮＡを検討してきた。次式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
2004357570.tif 000003
【００１１】
で表される２−メチル−アントラキノン（Ｍｅ−ＡＱ）を用いて、これを核酸の２’位に結合させるために次式（ＩＩ）
【００１２】
【化２】
2004357570.tif 000004
【００１３】
で表されるアントラキノン修飾ウリジンアミダイド（Ｕ（２’ＡＱ）アミダイド）とし、アミダイド試薬を用いて核酸の２’位に結合させて、次式（ＩＩＩ）
【００１４】
【化３】
2004357570.tif 000005
【００１５】
で表されるアントラキノン修飾核酸（ＡＱ−ＯＤＮ）を製造した。そしてこのアントラキノン修飾核酸（ＡＱ−ＯＤＮ）を用いて一連の測定を行い、その電気化学的挙動を比較検討してきた。ここで使用したオリゴヌクレオチドは、
ＡＱ−ＯＤＮ；  ５’−ＡＣＡＵ（２’ＡＱ）ＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴ−３’であり、標的となる核酸としては、
標的核酸；      ３’−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−５’
であった。
これらの試料を用いてサイクリックボルタンメトリーの測定を行ってきた。この結果１本鎖の場合と２本鎖になった場合ではピーク電位差（ΔＥ）及びＥ１／２については相補鎖の濃度依存的な変化を観察できることを見出してきた。
【００１６】
これらの実験では、フルマッチのみを対象としてきたが、ミスマッチがある場合についても電気化学的な測定ができるか否かについてさらに検討した。さらに、電極に固定化させてミスマッチの検出ができるか否かを検討した。
前記したアントラキノン修飾ヌクレオシドアミダイトと市販のチオールモディファイヤーを利用してＤＮＡ自動合成機によりアルカンチオールを末端にもつアントラキノン修飾ＤＮＡ（ＯＤＮ−Ａ）及び（ＯＤＮ−Ｂ）を合成した。目的とする修飾ＤＮＡは、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
【００１７】
ＯＤＮ−Ａ；
ＨＳ−（ＣＨ２）６−５’−ＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＴＵ（２’ＡＱ）ＧＡＴ−３’
ＯＤＮ−Ｂ；
ＨＳ−（ＣＨ２）６−５’−ＡＣＡＵ（２’ＡＱ）ＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴ−３’
このアルカンチオールを末端にもつアントラキノン修飾ＤＮＡを単結晶シリコンウェーハー表面に常法により金を真空蒸着した金電極に固定化した。
被検用の核酸（オリゴヌクレオチド）として次のものを用いた。
＊
３’−ＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−５’
（＊印はミスマッチ部を示す。）
また、対照としてフルマッチする核酸を使用した。
【００１８】
これらの試料を用いてクロノクロノメトリー測定を行った。
ＯＤＮ−Ａ及び被検用の核酸を用いた場合の結果を図１に示し、ＯＤＮ−Ｂ及び被検用の核酸を用いた場合の結果を図２に示す。図１及び図２の上段は、電極に固定化された検出用プローブと被検用の核酸がハイブリダイズしている様子を模式的に示しており、図中の×はミスマッチの箇所を模式的に示しており、細長い丸印はアントラキノンがインターカーレートしている箇所を模式的に示している。図１及び図２の下段は、クロノクロノメトリー測定の結果を示している。縦軸は電荷（μＣ）であり、横軸は積分時間（秒）を示している。各図の上側（Ｆｕｌｌｍａｔｃｈ）はフルマッチの核酸を用いた場合を示し、下側（Ｍｉｓｍａｔｃｈ）はミスマッチの核酸を使用した場合を示す。
ＤＮＡ担持量は、ＯＤＮ−Ｂを使用した場合の方がＯＤＮ−Ａを使用した場合よりも約１．５倍多く電極に担持させた。また、いずれの系においても完全鎖ＤＮＡとミスマッチＤＮＡいずれも同等の固定化量であることをサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）の測定により確認した。
コントロール実験となるＯＤＮ−Ｂを用いた系（図２）では、ミスマッチ部を含むＤＮＡと完全鎖ＤＮＡでクロノクロノメトリー測定により区別されないのに対して、ＯＤＮ−Ａを用いた系（図１）では、クロノクロノメトリー測定によりＤＮＡのミスマッチの検出が可能であることを明らかにしている。
【００１９】
このように、核酸中にインターカーレートしている酸化還元性ユニットと、電極の間にミスマッチが生じた場合には、電荷の移動が急激に減少し、クロノクロノメトリーの測定によりミスマッチが生じていることを高精度で簡便に測定し得ることが明らかにされた。
このような結果は、ＤＮＡのπ電子構造を介した電子の移動が塩基対のミスマッチにより大きく変化することによるものと考えられる。したがって、遺伝子検出用プローブ中に設けられた酸化還元性ユニットと電極との間にミスマッチが生じた場合には、電子の移動が大きく変化するが（図１参照）、酸化還元性ユニットと電極との間にミスマッチが無い場合には電子の移動の大きな変動は観察されなかった（図２参照）。
この方法は、電極に固定化された検出用プローブを有する電極とクロノクロノメトリーの測定装置さえあれば、ミスマッチの有無を確実に検出することができることを示しており、本発明の方法により一塩基多型（ＳＮＰｓ）の有無を極めて簡便に検出することが可能となる。
【００２０】
本発明の遺伝子検出用プローブとしては、酸化還元性ユニットを有する１本鎖の核酸であり、その長さには特に制限はないが、酸化還元性ユニットを結合することができる少なくとも１個の塩基部分を有し、正常なハイブリダイズができる塩基配列部分を有し、かつミスマッチの可能性のある塩基配列部分を有するものであればよい。このプローブを金属電極に固定化するためのリンカーは、塩基配列の末端部分に有るのがこのましいが、これに限定されるものではない。ミスマッチの可能性のある塩基配列部分は、電極に固定化するためのリンカーを結合した部分と酸化還元性ユニットを有する部分の間となるように設計するのが好ましい。
本発明のこのようなプローブの好ましい長さとしては、例えば、１０〜１００−ｍｅｒ、好ましくは１０〜５０−ｍｅｒ、より好ましくは１０〜２０−ｍｅｒの塩基長を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドはＤＮＡであってもよりし、ＲＮＡであってもよい。また、天然の核酸の塩基と正常にハイブリダイズできるものであるなら、非天然型の核酸であってもよい。
【００２１】
本発明の酸化還元性ユニットとしては、前記で例示してきたアントラキノン誘導体に限定されるものではなく、例えば、＋１．０〜−１．０Ｖの酸化還元電位を有する物質であって、塩基配列の中に比較的安定にインターカーレートできる平面状の分子であって、ミスマッチの存在によりπ電子の電荷移動に変化が生じる物質であれば特に制限はない。さらに、塩基対間に平衡挿入してインターカーレートするものが好ましい。このような酸化還元性ユニットを形成できる物質としては、アントラキノンなどのキノン類、フェロセンなどのメタロセン類、リボフラビンなどのフラビン類、ポルフィリン類、金属錯体類などが挙げられる。本発明の酸化還元性ユニットとしては、これらの物質の１種又は２種以上を用いることができるが、通常は１つの電極に対して１個の酸化還元性ユニットを使用するのが好ましい。
本発明の酸化還元性ユニットを遺伝子検出用プローブに導入する方法も特に制限はないが、核酸の糖鎖部分に導入するのが好ましい。好ましい位置としては糖残基の２’位が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の酸化還元性ユニットは、リンカーとなる基を介して糖残基に結合されるのが好ましい。このようなリンカー基としては、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５程度のアルキレン基が挙げられる。当該アルキレン基は１個以上の炭素原子が硫黄原子、窒素原子、酸素原子などの異種原子で置換されたものであってもよいし、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アミド基などの官能基を形成する原子団となっていてもよい。酸化還元性ユニットに適当なカルボキシル基や水酸基などの官能基を介してリンカーを結合させ、リンカーの他の端を核酸の糖残基に結合させることにより、酸化還元性ユニットを含む核酸を製造することができる。このようにして製造された核酸を市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機により目的の核酸（オリゴヌクレオチド）を製造することができる。製造された合成オリゴヌクレオチドを更に他の核酸と結合させて、より長鎖のオリゴヌクレオチドを製造することもできる。
このようにして得られた遺伝子検出用プローブの電気化学的な特性は、当該プローブに完全にハイブリダイズする相補鎖を用いて検証して確認することもできる。
【００２２】
本発明の遺伝子検出用プローブは、電極、好ましくは金属電極に固定化して使用される。電極へ固定化する方法としては公知の任意な方法を採用することができる。例えば、チオール基のような金属表面に吸着できる官能基を有するリンカー基を結合させることにより金属表面に固定化することができる。リンカー基として使用できる物質としては、炭素数１〜１５、好ましくは３〜１０の直鎖状又は分枝状のメルカプトアルカノールが挙げられる。例えば、６−メルカプトヘキサノール、８−メルカプトオクタノールなどが挙げられる。
電極としては、前記した遺伝子検出用プローブを表面に固定化できるものであれば特に制限はない。電極の材料としては、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げることができるが、前記した遺伝子検出用プローブを表面に容易に固定化できるものが好ましい。好ましい電極としては、少なくとも表面の一部が金である金属電極が挙げられる。
【００２３】
電極を配置する担体または基板としては、疎水性または低親水性の電気絶縁性の材料を用いることが好ましく、このような材料としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、癖紙、短繊維、メンブレンフィルタ等の多孔質物質などを挙げることができるが、各種ポリマー、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。電気絶縁性の担体または基板の厚さは、特に限定されない。
前記した遺伝子検出用プローブが表面に固定化された電極を担体または基板に複数配置することによりミスマッチの検出用のＤＮＡチップとすることができる。この場合には、各電極は、互いに接しないように、かつ規則的に該担体または基板の上に配置されていることが好ましい。電極を設ける前に、該担体または基板上に、電荷を有する親水性の高分子物質からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって該担体または基板の凹凸を軽減することができる。また、担体または基板の種類によっては、その物質中に電荷を有する親水性の高分子物質を含ませることも可能であり、このような処理を施した担体または基板も好ましく用いることができる。
このようにして製造されたＤＮＡチップを使用することにより、各電極に固定化された遺伝子検出用プローブに対応したミスマッチ（ＳＮＰｓ）を一度に同時に検出可能となる。
【００２４】
本発明は、電極に固定化された遺伝子検出用プローブと検査対象遺伝子とのハイブリダイゼーション操作を行った後、電極に電位を与え、得られた電荷応答量を測定することからなる検査対象遺伝子と遺伝子検出用プローブとのミスマッチ対を簡便かつ高精度で検出する方法を提供するものである。本発明のこのような検出方法は、単一の電極を用いて個別にミスマッチを検出することもできるが、前記したようなＤＮＡチップを用いて、一度に大量のミスマッチを同時に検出することも包含されている。
本発明の検出方法は、電極に固定化された遺伝子検出用プローブと検査対象となる１本鎖の状態の遺伝子（検査対象遺伝子）とを、緩衝液中などでハイブリダイゼーション操作を行い、十分にハイブリダイズさせ、電極に電位を与え、得られた電荷応答量を測定することからなるものである。ハイブリダイゼーションの条件は遺伝子検出用プローブと検査対象遺伝子とが十分にハイブリダイズする条件であればよい。検査対象遺伝子としては、ヒトの遺伝子をはじめ各種の動物や植物、微生物の遺伝子が挙げられる。これらのＤＮＡやＲＮＡを遺伝子検出用プローブの相補鎖として、本発明の検査対象遺伝子とすることができる。
【００２５】
本発明の検出方法としては、電荷応答量を測定できるものであればよく、例えば、クロノクロメトリーのような流れる電流を積算できるものであればよい。測定に当たっては、フルマッチの遺伝子を対照として同時に測定し、フルマッチの遺伝子の測定値と、検査対象遺伝子との測定値とを比較し、両者の差を計測する方法が測定条件の相違に基づく誤差を少なくすることができることから、好ましいが、これに限定されるものではない。図１に示されるように本発明のミスマッチの測定は、積算時間に対応して大きくなることから、予めフルマッチの標準値を設定しておりて、一定の積算時間後に検査対象遺伝子の測定値と比較することにより電荷応答量の相違を測定することもできる。
前記したようなＤＮＡチップを用いて測定した場合には、どの遺伝子検出用プローブが固定化されている電極でミスマッチが生じているかということが、短時間でわかるので、この結果を画像処理して画像により表示することもできる。
したがって、本発明のミスマッチ検出装置は、遺伝子検出用プローブが固定化された電極、電極に電位を与えるための電源装置、電荷応答量を測定するための装置を有するものであるが、遺伝子検出用プローブが固定化された電極として前記してきＤＮＡチップを使用した場合には、さらに電荷応答量を測定した情報を処理する装置、処理結果を表示する装置を含むこともできる。さらに、本発明のミスマッチ検出装置は、ミスマッチの結果として一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出することができるので、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための装置としても使用することができる。
【００２６】
本発明のＤＮＡチップは、実用的な観点からも種々の長所を有している。すなわち、現在用いられている蛍光検出を基盤とするＤＮＡチップは、スタンピング法あるいは光パターニングとＤＮＡ合成の組み合わせ技術で基盤表面にプローブＤＮＡを固定化する方法で作成され、いずれも高価で特殊な装置を必要とするのに対し、本発明のプローブはアルカンチオールの金表面への自己組織化を利用するので単にチオール修飾ＤＮＡプローブ溶液を金電極に侵せきさせるだけでチップの作成が可能である。蛍光ＤＮＡチップでは検出対象となる遺伝子を蛍光標識する必要があるのに対し、本ＤＮＡチップは、電気化学標識したプローブＤＮＡを固定化したものであるため、検出対象ＤＮＡの特別な標識を必要としない。さらに、いままで報告されている電気化学ＤＮＡチップは、ＤＮＡハイブリダイゼーションのモニターとＤＮＡ変異の両方を同時に効率良く検出することが比較的困難であり、いずれの検出にも特別な試薬の添加が必要である。これに対して、本発明のＤＮＡチップは、両者のいずれに対しても有効で、検出の際に特に新たに検出用試薬を加える必要がないことが挙げられる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１  （遺伝子検出用プローブの調製）
アミダイト試薬およびＣＰＧサポートを含むすべてのＤＮＡ合成用試薬は、Ｃｒｕａｃｈｅｍ社のものを使用した。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２‐アントラキノリルメチル）ウリジンホスホアミダイドの合成は、山名らの方法（Ｋ．Ｙａｍａｎａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ７，  ７１５  （１９９６））に準じて行った。
ＤＮＡ合成用のアセトニトリルは水素化カルシウム存在下窒素雰囲気中で蒸留を行い、３Ａモレキュラーシーブ上で保存したものを用いた。塩化メチレンは上記と同様の方法で蒸留し、水素化カルシウム上で保存したものを使用した。精製水（ρ＝１７．５ＭΩｃｍ）は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｅａｓｙ  Ｐｕｒｅによって作製した。その他の試薬は、すべて特級のものを使用した。
オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＮＡ自動合成機（ＡＢＩ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて行った。得られたオリゴヌクレオチドはアンモニア処理による固相担体からの切り出したのち、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。合成したオリゴヌクレオチドは、酵素分解法により塩基組成の分析を行い、目的のオリゴヌクレオチドであることを確認した。
次のＯＤＮ−Ａ及びＯＤＮ−Ｂの２種類のオリゴヌクレオチドを製造した。
ＯＤＮ−Ａ；  ５’−ＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＴＵ（２’ＡＱ）ＧＡＴ−３’
ＯＤＮ−Ｂ；  ５’−ＡＣＡＵ（２’ＡＱ）ＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴ−３’
【００２９】
実施例２  （レドックス修飾ＤＮＡを固定化した金電極の作成）
（１）チオール基を有するアントラキノン修飾ＤＮＡの合成
アルカンチオールを末端にもつアントラキノン修飾ＤＮＡは、実施例１で製造したそれぞれのアントラキノン修飾ヌクレオシドアミダイトと市販のチオールモディファイヤーを利用してＤＮＡ自動合成機により合成した。目的とする修飾ＤＮＡは、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
（２）裸金電極
金電極は、単結晶シリコンウェーハー表面に常法により金を真空蒸着することにより作成した。
（３）修飾ＤＮＡ固定化金電極
前記（２）で作成した金表面を、３０％過酸化水素水−濃硫酸（７：３、体積比）混合溶液で処理したのち、純水およびリン酸緩衝液で洗浄した。金表面（０．０２ｃｍ−２）をチオール基をもつアントラキノン修飾ＤＮＡ（０．１ｍＭ）とメルカプトエタノール（０．５ｍＭ）を含む緩衝溶液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．０１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に１２時間含侵してＤＮＡ固定化金電極を作成した。
金表面に固定化されたオリゴヌクレオチドは次のとおりである。
2004357570.tif 000006
【００３０】
実施例３  （電気化学測定）
電気化学測定（測定機器ＢＡＳ  ＣＶ−５０Ｗ）は、作用電極に修飾金電極、参照電極にＡｇ／ＡｇＣｌ、対象電極に白金線を用いた一般的な３電極方式により、脱気したリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ＝７．０）中室温で行った。
ミスマッチを有するオリゴヌクレオチドとして、
３’−ＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−５’
を使用し、フルマッチのオリゴヌクレオチドとしては、
３’−ＴＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＴＡ−５’
を使用した。
結果を図１及び図２二それぞれ示す。図２では、アントラキノンと金表面に変異が存在しないのに対し、図１ではレドックス中心と電極表面間に変異が存在するよう設定した。
ＤＮＡ担持量は、ＯＤＮ−Ｂの方がＯＤＮ−Ａよりも約１．５倍多いこと、また、いずれの系においても完全鎖ＤＮＡとミスマッチＤＮＡいずれも同等の固定化量であることをＣＶ測定により確認した。
コントロール実験となる図２の系では、変異を含むＤＮＡと完全鎖ＤＮＡでクロノクロノメトリー測定により区別されないのに対して、図１の系では、クロノクロノメトリー測定によりＤＮＡ変異の検出が可能であることが明らかにされている。
【００３１】
【発明の効果】
本発明は、酸化還元性ユニットを含む直鎖状のプローブを遺伝子検出用プローブとして用いた電気化学的な手法による核酸のミスマッチを検出する方法に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子検出用プローブ中の酸化還元性ユニットと電極との間に存在するミスマッチをクロノクロノメトリー測定などの電気化学的な手法により簡便、正確、かつ短時間に検出する方法を提供するものである。本発明の方法は、ミスマッチの検出により、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出方法として特に有用である。
現在用いられている一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出方法としては、インベーダー法などの蛍光の検出に基づくものであり、消光剤や特殊な酵素処理を必要とし極めて煩雑な処理が必要であるが、本発明の方法は、電気化学的に電荷応答を測定するだけであり、極めて簡便である。また、ＤＮＡチップは、スタンピング法あるいは光パターニングとＤＮＡ合成の組み合わせ技術で基板表面にプローブＤＮＡを固定化する方法で作成されいずれも高価で特殊な装置を必要とするのに対し、本発明のＤＮＡチップはアルカンチオールの金表面への自己組織化を利用するので単にチオール修飾ＤＮＡプローブ溶液を金電極に侵せきさせるだけでチップの作成が可能であり、チップの製造面からみても極めて簡便に行うことができる。さらに、本発明の方法は、電荷応答の積算値を測定するものであることから、ミスマッチの有無を極めて正確に判別することができ、測定中にも煩雑な処理を必要としないので極めて短時間で正確な判別が可能となる。
このような本発明の酸化還元性ユニットを含む直鎖状の核酸プローブを利用した電気化学的な遺伝子変異の検出方法は、一塩基多型の検出だけでなく、電気化学式のＤＮＡチップやタンパク質センサー等への応用が可能である。
【００３２】
【配列表】
2004357570.tif 000007
2004357570.tif 000008
2004357570.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】図１の上段は、本発明の電極に固定化された遺伝子検出用プローブと被検用の核酸とがハイブリダイズしている様子を模式的に示すものであり、図１の下段はこれらのクロノクロノメトリー測定による結果を示したものである。この結果、フルマッチとミスマッチでは測定結果が大きく異なることが示された。
【図２】図２の上段は、電極に固定化された遺伝子検出用プローブと被検用の核酸とがハイブリダイズしている様子を模式的に示すものであり、図２の下段はこれらのクロノクロノメトリー測定による結果を示したものである。この結果、フルマッチとミスマッチでは測定結果に大きな差が見出せないことが示された。
【図１】
2004357570.tif 000010
【図２】
2004357570.tif 000011