(57)【要約】【課題】蛋白質を容易に大量に産生するために用いることができる高コピー高発現ベクターおよび該ベクターを有する形質転換体を提供すること。【解決手段】目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、該目的遺伝子の発現に必要な配列要素、及び１以上のクローニング部位を含むベクター。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、該目的遺伝子の発現に必要な配列要素、及び１以上のクローニング部位を含むベクター。
【請求項２】
目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素が、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）由来の配列である、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素が、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断した断片である、請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
目的遺伝子の発現に必要な配列要素が、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結部位であり、リボソーム結合部位と転写終結部位との間にクローニング部位が存在する、請求項１から３の何れかに記載のベクター。
【請求項５】
リボソーム結合部位及び転写終結部位がｐＥＴ３ａ由来の配列である、請求項１から４の何れかに記載のベクター。
【請求項６】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位に、リボソーム結合部位（ＳＤ配列）、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位及び転写終結部位を含むｐＥＴ３ａ由来の配列を挿入することによって作製され、少なくとも５’から３’方向にＴ７プロモーター配列、ＳＤ配列、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位および転写終結部位を含む、請求項１から５の何れかに記載のベクター。
【請求項７】
配列番号１に記載の塩基配列を有するベクター。
【請求項８】
請求項１から７の何れかに記載のベクターのクローニング部位に目的遺伝子が挿入されている、組み換えベクター。
【請求項９】
目的遺伝子が薬物代謝に関与する酵素の遺伝子である、請求項８に記載の組み換えベクター。
【請求項１０】
目的遺伝子がＣＹＰ酵素遺伝子である、請求項８又は９に記載の組み換えベクター。
【請求項１１】
目的遺伝子がＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６またはＣＹＰ２Ａ６である、請求項８から１０の何れかに記載の組み換えベクター。
【請求項１２】
目的遺伝子が、ＣＹＰ酵素遺伝子を宿主での発現に最適化して試験管内合成した遺伝子である、請求項１０又は１１に記載の組み換えベクター。
【請求項１３】
目的遺伝子が、Ｎ末端の膜貫通領域を欠失させた遺伝子である、請求項１０から１２の何れかに記載の組み換えベクター。
【請求項１４】
請求項１から７の何れかに記載のベクターのクローニング部位に配列番号２に記載の塩基配列を有する目的遺伝子が挿入されている、組み換えベクター。
【請求項１５】
請求項１から１４の何れかに記載のベクターを有する形質転換体。
【請求項１６】
大腸菌である、請求項１５に記載の形質転換体。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の形質転換体を用いる、蛋白質の製造方法。
【請求項１８】
蛋白質が薬物代謝に関与する酵素である、請求項１７記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１９】
予め薬物代謝に関与する酵素の一塩基多型遺伝子（ＳＮＰ）を有する酵素群を作製し、該酵素群の薬物に対する代謝能力を調べておき、薬物を投与すべき患者の薬物代謝に関与する酵素をコードする遺伝子を調べることにより、患者への薬剤の投与処方を決定する方法。
【請求項２０】
薬物代謝に関与する酵素が肝臓に存在する酵素である、請求項１９記載の薬剤の投与処方を決定する方法。
【請求項２１】
肝臓に存在する酵素がＣＹＰ酵素である、請求項２０に記載の薬剤の投与処方を決定する方法。
【請求項２２】
ＳＮＰを有する酵素群をコードする遺伝子を請求項１から７の何れかに記載のベクターのクローニング部位に挿入した組み換えベクターを有する形質転換体を培養することによりＳＮＰを有する酵素群を作製する、請求項１９から２１の何れかに記載の薬剤の投与処方を決定する方法。
【請求項２３】
酵素群の薬物に対する代謝能力の検査をｉｎ  ｖｉｔｒｏ  で行う、請求項１９から２２の何れかに記載の薬剤の投与処方を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、新規な高コピー高発現ベクター、該ベクターを有する形質転換体、及び該形質転換体を用いて酵素等の蛋白質を製造する方法、並びに該酵素を用いて薬剤の投与処方を決定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
米国の統計では、治療薬物による副作用発現患者は毎年２２０万人、副作用により死亡した患者数は１０万人以上、副作用にかかる医療費は７００億ドルにも達すると報告されている。
【０００３】
このように副作用が発生する原因の一つに各個人における薬物代謝能力の違いが挙げられている。このような薬物代謝能力の違いは一塩基多型（ＳＮＰ）の存在によるものであり、薬害を最小限に抑えるためには、個々の患者のゲノム解析から得られる患者の遺伝子情報に基づいたオーダーメード医療の展開が急務の課題となっている。
【０００４】
酵素による薬物代謝機構の解明と遺伝子レベルでのＳＮＰ解析との対応をつけられれば、副作用を低減させる薬物投与設計を可能にするとともに、我国にとって極めて深刻な医療費の高騰という問題を解決する道が開けるであろう。
【０００５】
酵素による薬物代謝機構の解明と遺伝子レベルでのＳＮＰ解析とを対応した報告としては、肝臓に発現し、薬物の代謝に関与する酵素群であるヒトＣＹＰのＳＮＰについて、ＣＤＹＰ２Ｃ９の３５９位にはＩｌｅ（コドン：ＡＴＣ）が存在するが、ＳＮＰによりＬｅｕ（コドン：ＣＴＣ）へ変異したケース（ＣＹＰ２Ｃ９＊３）が白人の６％、黒人の０．５％に認められ、東洋人では２．６％の頻度で出現する。この変異により薬物の代謝速度が低下する結果、常用量の投与により薬が効きすぎる、すなわち副作用が現れることがワルファリンなどで報告されている。（例えばＰｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９６．６．３４１）
【０００６】
しかしながら、ＳＮＰと薬物代謝との相関を調べるためには、ＳＮＰを有する患者に由来する肝細胞を用いるか、数多くのボランティアを対象とした広汎な疫学的調査を調べなければならないのが現状であり、詳細な解析が出来ていない。
【０００７】
ＳＮＰについては製薬会社を含めた世界的規模のコンソーシアムが設立されており、次々と情報が蓄積されている。（例えば  ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ  ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．．ｃｓｈｌ．ｏｒ／  ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．．ｃｓｈｌ．ｏｒ／）しかし、この情報が医療に生かされているとは言えないのが現状である。
【０００８】
薬物の代謝に関与する酵素群のＳＮＰと薬物代謝との関係を求めるにはＳＮＰによる変異を持つ酵素群を大量に産生する必要があるが、これまで酵素等の蛋白質を大量に産生するには、一旦蛋白質をコードする遺伝子をベクターに組み込んだ大腸菌を増殖させて遺伝子のコピーを増幅し、そのようにして増幅した遺伝子を、蛋白質を発現するベクターに組み込んで、そのベクターを大腸菌にトランスフェクトすることにより蛋白質を発現させており、多大な労力がかかっていた。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９６．６．３４１
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決することを目的としている。すなわち本発明の第一の目的は、蛋白質を容易に大量に産生するために用いることができる高コピー高発現ベクターおよび該ベクターを有する形質転換体を提供することにある。本発明の第二の目的は副作用の少ない患者毎の薬物投与処方の設計方法を提供することを目的とする。本発明の他の目的は、患者毎の薬物投与処方の設計を患者の遺伝子に基づき行う方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、遺伝子のコピーと蛋白質の発現とを同時に行うことのできる配列要素を一つのベクター中に組み込むことによって、蛋白質を容易に大量に産生するために用いることができる高コピー高発現ベクターを構築することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明によれば、目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、該目的遺伝子の発現に必要な配列要素、及び１以上のクローニング部位を含むベクターが提供される。
【００１３】
好ましくは、目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）由来の配列であり、さらに好ましくは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断した断片である。
好ましくは、目的遺伝子の発現に必要な配列要素は、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結部位であり、リボソーム結合部位と転写終結部位との間にクローニング部位が存在する。さらに好ましくは、リボソーム結合部位及び転写終結部位はｐＥＴ３ａ由来の配列である。
【００１４】
本発明のベクターは、特に好ましくは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位に、リボソーム結合部位（ＳＤ配列）、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位及び転写終結部位を含むｐＥＴ３ａ由来の配列を挿入することによって作製されるものであり、少なくとも５’から３’方向にＴ７プロモーター配列、ＳＤ配列、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位および転写終結部位を含むものである。本発明のベクターの一例は、配列番号１に記載の塩基配列を有するベクターである。
【００１５】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のベクターのクローニング部位に目的遺伝子が挿入されている、組み換えベクターが提供される。
好ましくは、目的遺伝子は、薬物代謝に関与する酵素の遺伝子であり、さらに好ましくは、ＣＹＰ酵素遺伝子であり、例えば、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６またはＣＹＰ２Ａ６である。
好ましくは、目的遺伝子は、ＣＹＰ酵素遺伝子を宿主での発現に最適化して試験管内合成した遺伝子であり、及び／又はＮ末端の膜貫通領域を欠失させた遺伝子である。特に好ましくは、目的遺伝子は、配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子である。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の何れかのベクターを有する形質転換体が提供される。好ましくは、形質転換体は大腸菌である。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の形質転換体を用いる、蛋白質の製造方法が提供される。好ましくは、製造される蛋白質は薬物代謝に関与する酵素である。
【００１７】
本発明のさらに別の側面によれば、予め薬物代謝に関与する酵素の一塩基多型遺伝子（ＳＮＰ）を有する酵素群を作製し、該酵素群の薬物に対する代謝能力を調べておき、薬物を投与すべき患者の薬物代謝に関与する酵素をコードする遺伝子を調べることにより、患者への薬剤の投与処方を決定する方法が提供される。
【００１８】
好ましくは、薬物代謝に関与する酵素が肝臓に存在する酵素であり、さらに好ましくは肝臓に存在する酵素はＣＹＰ酵素である。
【００１９】
好ましくは、ＳＮＰを有する酵素群をコードする遺伝子を上記した本発明のベクターのクローニング部位に挿入した組み換えベクターを有する形質転換体を培養することによりＳＮＰを有する酵素群を作製することによって、薬剤の投与処方を決定する。好ましくは、酵素群の薬物に対する代謝能力の検査をｉｎ  ｖｉｔｒｏ  で行うことによって、薬剤の投与処方を決定する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明のベクター及びそれを有する形質転換体
本発明のベクターは、目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、該目的遺伝子の発現に必要な配列要素、及び１以上のクローニング部位を含むものであり、目的遺伝子のコピーと発現を同時に行なうことが可能である。本発明のベクターは、コピー用配列要素と発現用配列要素が組込まれている高コピー高発現ベクターである。具体的には、本発明のベクターには、クローニングサイトとともにリボソーム結合部位と転写の終結に必要なターミネータ部位を含むＤＮＡ配列が組込まれている。
【００２１】
本発明のベクターの由来としては、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する細菌プラスミド、酵母プラスミド、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノアソシエーテッドウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター等を挙げることができる。これらのうちでは細菌プラスミドを由来とすることが好ましく、２種類の細菌プラスミドに由来する配列要素（即ち、目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素、及び該目的遺伝子の発現に必要な配列要素）を組み合わせて使用することができる。
【００２２】
目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素としては、例えば、宿主に適合した複製起点及び薬剤耐性遺伝子を含む配列要素が挙げられる。宿主に適合した複製起点としては、例えば、宿主が大腸菌の場合には、ｐＵＣｏｒｉ、ｆ１（＋）ｏｒｉなどが挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子などが挙げられる。
【００２３】
本発明で用いる目的遺伝子の高コピーに必要な配列要素としては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）由来の配列を使用することが好ましく、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断した断片を使用することができる。
【００２４】
目的遺伝子の発現に必要な配列要素が、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結部位であり、リボソーム結合部位と転写終結部位との間にクローニング部位が存在するような配列要素である。プロモーターの種類は、用いる宿主で作動可能なものであれば特に限定されない。細菌細胞で作動可能なプロモーターとしては、大腸菌の  ｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモーター、ファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモーターなどが挙げられる。哺乳動物細胞で作動可能なプロモーターの例としては、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモーターの例としては、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性蛋白プロモーター、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーター等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモーターとしては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーターなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモーターの例としては、ＡＤＨ３プロモーターまたはｔｐｉＡプロモーターなどがある。
【００２５】
リボソーム結合部位としては、ＳＤ配列などが挙げられる。
【００２６】
転写終結部位としては、ポリアデニル化部位などが挙げられる。
【００２７】
本発明では、リボソーム結合部位及び転写終結部位としてプラスミドｐＥＴ３ａ由来の配列を使用することができる。
本発明のベクターの一例としては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位に、リボソーム結合部位（ＳＤ配列）、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位及び転写終結部位を含むｐＥＴ３ａ由来の配列を挿入することによって作製され、少なくとも５’から３’方向にＴ７プロモーター配列、ＳＤ配列、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位および転写終結部位を含むベクターを挙げることができ、さらに具体的には、配列番号１に記載の塩基配列を有するベクターを挙げることができる。
【００２８】
本発明のベクターのクローニング部位に目的遺伝子を挿入することによって、該目的遺伝子を発現させるための組み換え発現ベクターを作製することができる。目的遺伝子の種類は特に限定されないが、発現させたい蛋白質をコードする遺伝子であることが好ましい。目的遺伝子としては、例えば、薬物代謝に関与する酵素の遺伝子を使用することができ、さらに具体的には、ＣＹＰ酵素遺伝子（例えば、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６またはＣＹＰ２Ａ６など）などを使用することができる。
本発明の好ましい態様によれば、目的遺伝子としては、ＣＹＰ酵素遺伝子を宿主での発現に最適化して試験管内合成した遺伝子であって、Ｎ末端の膜貫通領域を欠失させた遺伝子を使用することができる。そのような遺伝子の一例としては、配列番号２に記載の塩基配列を有する目的遺伝子を挙げることができる。
【００２９】
本発明のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることにより形質転換体を作製することができる。本発明で用いることができる宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞等を挙げることができる。本発明では、特に大腸菌を使用することが、増殖が容易であるという観点から好ましい。
【００３０】
ベクターの宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、弾丸導入、感染等により行うことができる。
【００３１】
本発明の高コピー高発現ベクターを有する形質転換体（好ましくは、大腸菌）を大量に培養することにより目的とする蛋白質（例えば、薬物代謝に関与する酵素）を含む形質転換体を大量に得ることができる。形質転換体として大腸菌を使用する場合、大腸菌の培養は好ましくは３０〜４０℃で、公知の培地、例えばＴＢ培地等を用いて培養することができる。酵素の産生量を増加させるために、酵素の基質、酵素がＣＹＰ２Ｃ９の場合はアミノレブリン酸を培地に添加して培養することが好ましい。
【００３２】
上記した形質転換体を含む培養物から、目的蛋白質（例えば、薬物代謝に関与する酵素）を回収し精製するには、例えばリン酸系緩衝液中でＥＤＴＡ等を配合して菌体を例えば硫酸アンモニウム又はエタノールにより沈殿凝集沈殿させた後に、濾過、あるいは遠心分離して菌体を回収し、次いで緩衝液中で例えば超音波処理等により菌体を破砕し、この破砕物混合液にＥＤＴＡとリン酸カリウムついで遠心して菌体を除去し、上澄みを回収し、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、次いでセファロースクロマトグラフィーにより酵素溶液を通して最終溶出液を透析することにより精製する等の方法を採用することができる。目的の蛋白質は、例えば緩衝液／グリセリン混合液中に濃縮して保存し、以下の試験に供することが好ましい。
【００３３】
（２）患者への薬剤の投与処方の決定
本発明によれば、上記した本発明の高コピー高発現ベクターを有する形質転換体を用いて薬物代謝に関与する酵素の一塩基多型遺伝子（ＳＮＰ）を有する酵素群を作製し、該酵素群の薬物に対する代謝能力を調べておき、薬物を投与すべき患者の薬物代謝に関与する酵素をコードする遺伝子を調べることにより、患者への薬剤の投与処方を決定する方法も提供される。
【００３４】
本発明で対象とする酵素は、薬剤の代謝に関与する酵素である。通常薬剤の代謝に関与する酵素は、肝臓に存在する。このような薬剤代謝に関与している酵素の代表例はＣＹＰ（シトクロムＰ４５０族）であるため、薬剤の代謝に重要な役割を担うＣＹＰ酵素群を対象とすることが好ましい。ＣＹＰ酵素群とその基質となる薬物を列挙すると次のようになる。
【００３５】
【表１】
2004208647.tif 000002
【００３６】
ＣＹＰの中でも、ＣＹＰ２Ｃ９は薬剤代謝に特に係わりのあるシトクロムＰ４５０であり、この酵素を対象とすることが特に好ましい。
【００３７】
本発明の薬剤の投与処方を決定する方法では、まずこのような薬剤代謝に関与する特定の酵素をコードする遺伝子、その部位の遺伝子のＳＮＰ情報に基づき変異（ジェノタイプ）を導入した酵素を調製する。
【００３８】
上記本発明の方法で用いる薬剤代謝に関与している酵素のＳＮＰを大量に製造するには、本発明の高コピー高発現ベクターを有する形質転換体（特に、大腸菌）を用いて以下の方法で産生することが好ましい。
まずアミノ酸配列の報告されている酵素のアミノ酸配列を変えないまま、コドンを用いてＤＮＡの塩基配列を設計する。
次に上記ＤＮＡをＰＣＲ等の手法によりＤＮＡを増幅する。酵素を構成するＤＮＡはコード領域が長いため、制限酵素部位を導入したいくつかのフラグメントに分割してＰＣＲ増幅を行うことが好ましい。
【００３９】
ＰＣＲで増幅したフラグメントを本発明の高コピー高発現ベクターに組み込み、このプラスミドを組み込んだ大腸菌を増殖させてクローニングとコピーを行う。フラグメントは最後に繋ぎ合わせ全長ＤＮＡとする。
【００４０】
上記においては、１つのアミノ酸配列を持つ薬剤代謝酵素の合成方法について述べたが、ＳＮＰについても報告されているＳＮＰ情報に基づき、あるいは様々な薬効を示す患者の薬剤代謝酵素のアミノ酸配列を調べる等により得た情報に基づいて、上記と同様の方法により薬剤代謝酵素の変異体を大量に合成することができる。
【００４１】
以上の方法により合成した薬剤代謝酵素による薬物代謝の確認は、例えば、患者への投与を予定する各種の薬剤と薬剤代謝酵素との結合親和性を紫外可視光線吸収スペクトルから算出することができる。具体的には、例えば、試験管中上記方法で得た薬剤代謝酵素濃縮液を緩衝液で希釈した液を注入する。次に代謝を確認したい薬剤の所定量を予めリン酸緩衝液に分散させた液を注入し、混合した後、恒温条件で一定時間放置する。その後試料液を測定用セルに移し紫外可視光線分光分析器で紫外可視光線スペクトルを測定し、得られたスペクトルの薬剤に由来するピークの高さをブランクのそれと対比することにより薬剤と薬剤代謝酵素との結合親和性を判断することができる。
【００４２】
患者の組織または細胞、好ましくは体液を採取し、定法によりそのＤＮＡを例えばシーケンサーを用いて、患者がどのタイプの薬剤代謝酵素を有しているかを確認する。これにより、薬剤投与対象患者の遺伝子情報を採取する。体液としては、血液、唾液または尿が好ましい。特に前述の薬剤代謝酵素をコードしている部位の遺伝子に限定して調べることが好ましい。
【００４３】
患者のＤＮＡの調査により薬剤代謝酵素のタイプが判明したら、予め求めておいたその薬剤代謝酵素の薬剤代謝性能から患者へ該薬剤を投与すべきか否か、投与するとしたら、どの程度にしたら副作用がないか等を判断して処方箋を作成することができる。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４４】
【実施例】
（１）薬剤代謝酵素をコードするＤＮＡの設計
薬剤代謝酵素としてヒトＣＹＰ２Ｃ９を対象とした。ヒトＣＹＰ２Ｃ９のアミノ酸配列は（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ；ＣＰＣ９＿ＨＵＭＡＮ）に報告されている。このアミノ酸の配列を変えないまま、大腸菌において高発現に成功しているコドンを用いてＤＮＡの塩基配列を設計した。ヒトＣＹＰ２Ｃ９のアミノ酸配列（配列番号３）および塩基配列（配列番号２）を図１および図２に示す。ＣＹＰ２Ｃ９は膜タンパク質であり、精製と実験的な取扱いが困難と考えられるので、膜貫通領域と考えられているアミノ末端の２０残基（Ｄ２〜Ｒ２１）を欠損させた。合成するＤＮＡはコード領域が１４１０塩基にわたるため、これを４つのフラグメント（Ａ，Ｂ．Ｃ，Ｄ）に分けて合成を行った。
【００４５】
（２）ＰＣＲ
上記（１）の設計に基づいてＤＮＡオリゴマーを合成した。フラグメントＡを例として各フラグメントの合成法について説明すると、まずＡｆ１、Ａｆ２、Ａｒ１、Ａｒ２を等モルで混合し、１回目のＰＣＲを行った。この溶液を少量とり、ＡＲ、ＡＦを加えて２回目のＰＣＲを行った。
【００４６】
（３）大腸菌を用いた増殖とクローニング
ＰＣＲで増幅したフラグメントＡを、末端に導入した制限酵素部位ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて切りだし、同じ酵素で処理したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）につないだ。宿主となる大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質変換し、アンピシリンを含むＬＢプレートにまいた。３７℃で１晩培養後、大腸菌コロニーをとり、アンピシリンを含むＬＢ培地を用いて液体培養した。菌体回収後、プラスミドを抽出（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）し、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を調べた。予期しない変異が全くなく、期待通りのフラグメントが得られていることを確認した。
【００４７】
同様の方法でフラグメントＢ（ＰＣＲ１回目：Ｂｆ１、Ｂｆ２、Ｂｆ３、Ｂｒ１、Ｂｒ２  、Ｂｒ３、ＰＣＲ    ２回目：ＢＲ、ＢＦ）、フラグメントＣ（ＰＣＲ１回目：Ｃｆ１、Ｃｆ２、Ｃｆ３、Ｃｒ１、Ｃｒ２  、Ｃｒ３、ＰＣＲ  ２回目：ＣＲ、ＣＦ）、フラグメントＤ（ＰＣＲ１回目：Ｄｆ１、Ｄｆ２、Ｄｆ３、Ｄｒ１、Ｄｒ２  、Ｄｒ３、ＰＣＲ    ２回目：ＤＲ、ＤＦ）を合成した。各フラグメント末端の制限酵素部位（フラグメントＢ：ＥｃｏＲＩ、Ｂｇ１ＩＩ、フラグメントＣ：Ｂｇ１ＩＩ、Ｃ１ａＩ、フラグメントＤ：Ｃ１ａＩ、ＢａｍＨＩ）を用いてクローニングした。期待しない変異が入っている部位については、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて修正した。
【００４８】
（４）全長の接続
配列が確認された各フラグメントをつなぎ合わせ、全長ＤＮＡを得た。まずフラグメントＢをＥｃｏＲＩ、Ｂｇ１ＩＩを用いて切りだし、同じ酵素で処理したフラグメントＡを含むプラスミドに入れ込んだ。（フラグメントＡＢ）
また、フラグメントＤをＣ１ａＩ、ＢａｍＨＩを用いて切りだし、同じ酵素で処理したフラグメントＣを含むプラスミドに入れ込んだ。（フラグメントＣＤ）
最後にフラグメントＣＤをＢｇ１ＩＩ、ＳｐｅＩで切りだし、同じ酵素で処理したフラグメントＡＢを含むプラスミドに入れ込んだ。全長ＤＮＡ（フラグメントＡＢＣＤ）の配列はシーケンサーを用いて確認した。
【００４９】
（５）高コピー高発現ベクター
クローニングベクタ−であるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と発現ベクターであるｐＥＴ３ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて新たな高コピー発現ベクターを作成した。
図３にｐＥＴ３ａのクローニングサイト（Ｎｄｅｌ／ＢａｍＨＩ）周辺の塩基配列を示す。翻訳に必要なリボソーム結合部位（ＳＤ配列）と転写の終結に必要なターミネーター部位を含むプライマー（ＸＥｆ、ＸＥｒ）でＰＣＲすることにより増幅した。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）へのつなぎ換えを行えるように、ｐＥＴ３ａが持っているＥｃｏＲＶの認識配列をＥｃｏＲＩに改変した。このフラグメントをＸｂａＩとＥｃｏＲＩにて消化し、同じ制限酵素にて処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）に挿入した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）の多重クローニングサイト周辺の塩基配列を図４に示す。
【００５０】
ｐＥＴ３ａより増殖したフラグメントをＸｂａＩとＥｃｏＲＩのサイトに組込むことにより、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）のＴ７プロモータ、ｐＥＴ３ａのＳＤ配列、Ｎｄｅｌ、ＢａｍＨＩ、ｐＥＴ３ａのターミネーター部位が連結される。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）のものと合わせて、配列番号１に記載の全長３１４４塩基対の塩基配列を有する新たなベクター（ｐＢＥＸ）を作製した。以下、ベクター（ｐＢＥＸ）の具体的構築方法を説明する。
【００５１】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）  は高コピーベクターとしてクローニングに多用されており、多種の制限酵素切断部位が組み込まれたマルチクローニングサイトを有する（図４）。一方ｐＥＴ系のベクターは蛋白質の誘導・発現に必要なＴ７プロモーター（ＲＮＡポリメラーゼ結合部位）、ＳＤ配列（リボソーム結合部位）、ターミネーター（転写終結部位）を有し、ｐＥＴ３ａではＳＤ配列下流のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩに目的遺伝子をクローニングして蛋白質の高発現を達成する（図３）。しかし、細胞あたりのベクターのコピー数は低い。ｐＢＥＸでは両者の利点を生かして、高コピー発現ベクターとして構築された。
【００５２】
構築法の概略を図５に示す。まず、ｐＥＴ３ａのＸｂａＩ、ＥｃｏＲＶ部位をそれぞれ含むプライマーｐＸＥｆ、ｐＸＥｒ（図３）を設計し、ＰＣＲによって目的配列を増幅した。この際、ｐＸＥｒにはＥｃｏＲＶの代わりにＥｃｏＲＩサイトを組み込んだ。これは、ＥｃｏＲＶは平滑末端を与えるのに対し、ＥｃｏＲＩは粘着末端を与えるため、次のライゲーションが容易になるためである。ＰＣＲによって、ｐＥＴ３ａのＳＤ配列、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩサイト、ターミネーターを含むフラグメントが得られる。これをＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩにて処理し、同じ制限酵素で処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）  にライゲーションした。これをＸＬ−１Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’に形質転換し、ｐＢＥＸを含む菌体を選別し、ストックとした。ｐＢＥＸの配列はＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩの領域の塩基配列をシークエンスすることにより確認した。なお、蛋白質の発現に必要なＴ７プロモーター領域は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）  にもともと備わっている。また、ｐＢＥＸを用いた大量発現には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主とすることが望ましい。
【００５３】
（６）ｐＢＥＸベクターを用いたＣＹＰ２Ｃ９の大量生産
ＣＹＰ２Ｃ９（フラグメントＡＢＣＤ）を組込んだｐＢＥＸを大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）に形質変換し、ＬＢ培地を用いて３７℃、１晩培養後、ＴＢ培地に植菌した。０．５ｍＭアミノレブリン酸を加え、３０℃で４８時間大量培養した。ヘムの合成基質であるアミノレブリン酸を添加することにより、ＣＹＰ２Ｃ９の発現量が大幅に増加した。
【００５４】
ＣＹＰ２Ｃ９を高発現を達成できた理由は以下の３つが考えられる。（１）ｐＢＥＸを用いたこと、（２）ＣＹＰ遺伝子を大腸菌での発現に最適化して試験管内全合成したこと、（３）Ｎ末端の膜貫通領域を欠失させたことである。
【００５５】
培養条件を最適化した結果、大腸菌１Ｌ培養あたり最大８００  ｎｍｏｌのＣＹＰが発現していることがわかった。また、同様の方法でＣＹＰ２Ｃ１９の調製にも成功し、同程度の発現量を得ている。なお、ＣＹＰの定量は、他の文献と同じくＣＯ結合型と還元型の差スペクトルから行った。
【００５６】
なお、本発明の比較例として、以下のような発現例が報告されている。
（ｉ）  ＣＹＰ２Ｃ１０のＮ末端アミノ酸を改変して大腸菌にて発現させた結果、発現量は最大で２０  ｎｍｏｌ／Ｌ  ｃｕｌｔｕｒｅであった。ただしＣＹＰ２Ｃ９は発現しなかった（Ｓｎｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３０６，  ４４３−４５０  （１９９３））。
（ｉｉ）  ＣＹＰ２Ｃ９をＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓにて発現させた結果、発現量は最大で２５０  ｎｍｏｌ／Ｌ  ｃｕｌｔｕｒｅであった（Ｈａｉｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３３３，  ４４４−４５８  （１９９６））。
（ｉｉｉ）  ＣＹＰ２Ｃ９のＮ末端アミノ酸７残基を改変して大腸菌にて発現させた結果、発現量は最大で５００  ｎｍｏｌ／Ｌ  ｃｕｌｔｕｒｅであった（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３２３，  ８７−９６  （１９９５））。
【００５７】
（７）ＣＹＰ２Ｃ９の精製
遠心分離により菌体を回収後、１００ｍＭトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液にて菌体を懸濁し、更に０．２ｍｇ／ｍＬ  リゾチームを加えた。３０分撹拌後、遠心分離により沈殿を回収し、これを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、６０ｍＭ酢酸カリウム緩衝液にて懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。
【００５８】
破砕した菌体に０．３％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０溶液を加え、×３７０００ｇで６０分遠心分離して上澄液を回収した。これをヒドロキシアパタイトカラム、次いでオクチルセファロースカラムによりＣＹＰ２Ｃ９を精製した。最終溶出液を０．５Ｍ  リン酸カリウム（ｐＨ７．４）、２０％グリセロール溶液中で透析し、試料を濃縮保存した。
【００５９】
（８）タンパク質の確認
最終製品をＳＤＳポリアクリルアマイド電気泳動し、予想される分子量約５２ｋＤの単一バンドを検出した。またＮ末端アミノ酸分析を行い、予想されるＣＹＰ２Ｃ９と同一であることを確認した。さらに、一酸化炭素結合型の紫外可視吸収スペクトルを測定したところ、４５０ｎｍ付近に吸収極大が観測された。変性ＣＹＰではこの極大が４２０ｎｍに現れることから、精製標品は変性していないことがわかった。
【００６０】
（９）薬物の結合性
上記で述べた方法にしたがって、ＣＹＰ２Ｃ９で代謝されることがわかっているいくつかの薬物の解離定数を算出した。イブプロフェンでは約４００μＭ、ジクロフェナクでは約１５μＭ、トルブタミドでは約３００μＭ、ワルファリンでは約２５μＭ、フェニトインでは約３０μＭという値を得た。
【００６１】
【発明の効果】
本発明の高コピー高発現ベクターを有する形質転換体を培養することにより、蛋白質を容易に大量に産生することができる。また、本発明の方法によれば、予めＳＮＰを患者のＤＮＡを調べることで、その配合量や最適薬剤等の処方を調整することができるため、従来は遺伝薬理学的・疫学的解析を待たねば結論がでなかった代謝効果のスクリーニングができるため、副作用が少なく薬効が最適の処方を短時間で、明確に決定することができる。
【００６２】
【配列表】
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【００６４】
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【００６５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトＣＹＰ２Ｃ９のアミノ酸配列および塩基配列（前半）を示す。
【図２】図２は、ヒトＣＹＰ２Ｃ９のアミノ酸配列および塩基配列（後半）を示す。
【図３】図３は、ｐＥＴ３ａのクローニングサイト（Ｎｄｅｌ／ＢａｍＨＩ）周辺の塩基配列を示す。
【図４】図４は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）の多重クローニングサイト周辺の塩基配列を示す。
【図５】図５は、本発明のベクターｐＢＥＸの構築法の概要を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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