(57)【要約】【課題】低副作用で、かつ高抗腫瘍作用を有する抗腫瘍医薬組成物を提供する。【解決手段】下記化学式（１）で表されるバニリル脂肪酸アミドを含む、抗腫瘍医薬組成物：【化７】2004182674.tif 000008（式中−ＣＯ−Ｒ基は、炭素原子数１４個〜３２個の飽和脂肪酸残基、又は炭素原子数１４個〜３２個の不飽和脂肪酸残基）。【効果】低副作用で、かつ高抗腫瘍作用、特に抗メラノーマ作用及び抗白血病作用を有し、辛さ、刺激性、及び炎症誘発性などが極めて少ないカプサイシン関連成分のバニリル脂肪酸アミド化合物を含む抗腫瘍医薬組成物が得られた。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（１）で表されるバニリル脂肪酸アミドを含む、抗腫瘍医薬組成物：
【化１】
2004182674.tif 000006
式中−ＣＯ−Ｒ基は、炭素原子数１４個〜３２個の飽和脂肪酸残基、又は炭素原子数１４個〜３２個の不飽和脂肪酸残基である。
【請求項２】
下記化学式（１）で表されるバニリル脂肪酸アミドを含む、抗メラノーマ医薬組成物：
【化２】
2004182674.tif 000007
式中−ＣＯ−Ｒ基は、炭素原子数１４個〜３２個の飽和脂肪酸残基、又は炭素原子数１４個〜３２個の不飽和脂肪酸残基である。
【請求項３】
該−ＣＯ−Ｒ基が、炭素原子数１４個〜３２個の飽和脂肪酸残基からなる群から選ばれたものである、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
該−ＣＯ−Ｒ基が、ミリスチン酸残基（Ｃ１４）、パルミチン酸残基（Ｃ１６）、及びステアリン酸残基（Ｃ１８）からなる群から選ばれたものである、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
該−ＣＯ−Ｒ基が、炭素原子数１４個〜３２個の不飽和脂肪酸残基からなる群から選ばれたものである、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項６】
該−ＣＯ−Ｒ基が、二重結合を１、２又は３個有する炭素原子数１８個の不飽和脂肪酸残基、及び二重結合を４又は５個有する炭素原子数２０個の不飽和脂肪酸残基からなる群から選ばれたものである、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
該−ＣＯ−Ｒ基が、オレイン酸残基（Ｃ１８：１）、リシノール酸残基（Ｃ１８：１）、リノール酸残基（Ｃ１８：２）、リノレン酸残基（Ｃ１８：３）、及びエレオステアリン酸残基（Ｃ１８：３）からなる群から選ばれたものである、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
該−ＣＯ−Ｒ基が、アラキドン酸残基（Ｃ２０：４）及びエイコサペンタエン酸残基（Ｃ２０：５）からなる群から選ばれたものである、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項９】
該−ＣＯ−Ｒ基が、二重結合を４個以上有する炭素原子数２２、２４、２６、２８及び３２個の不飽和脂肪酸残基からなる群から選ばれたものである、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項１０】
該−ＣＯ−Ｒ基が、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸残基（Ｃ２２：６）である、請求項９記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗腫瘍医薬組成物に関する。特に、本発明は、抗メラノーマ、及び抗白血病細胞増殖抑制作用を有する抗腫瘍医薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現在、ガン治療には、外科的療法、放射線療法、化学療法が行われており、該化学療法では、従来より直接腫瘍細胞に作用して腫瘍細胞を死滅させる薬剤を投与する治療法が広く適用されている。この種の療法に使用できる数多くの抗腫瘍剤が知られているが、従来の化学療法に使用する薬剤は、腫瘍細胞を死滅させると共に、正常細胞にも作用するため、癌の治療効果は高いが、副作用が非常に強いという問題があった。
【０００３】
一方、香辛料として広く利用されているトウガラシの辛味成分、カプサイシン（８−メチル−Ｎ−バニリル−６−ノネンアミド）は、強い辛味を有し、かつ食欲増進作用、血管拡張・収縮作用、エネルギー代謝亢進作用、生理活性ペプチドの放出亢進作用など、生体に好ましい作用を有することで知られているが、近年、これらの好ましい生理作用に加えて抗腫瘍作用が報告されている（Ｄ．Ｊ．  Ｍｏｒｒｅ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９２，  １８３１−１８３５  （１９９５）、及びＫ．Ｔａｋａｈａｔａ  ｅｔ．  ａｌ，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ６４，  ＰＬ  １６５−１７１  （１９９９））。すなわち、カプサイシンは、ヒト由来のＨｅｌａ細胞（子宮頸部癌細胞）や、ＨＬ−６０細胞（急性前骨髄性白血病細胞）などの各種腫瘍細胞に対し、低濃度で増殖抑制作用があり、また、生き残った細胞の多くに核の分断や凝集などのアポトーシス様の変化を誘導するが、一方、ヒトの乳腺上皮及びラットの肝・腎などの正常細胞には増殖抑制効果がなく、その作用は腫瘍細胞に特異的であることが見出されている（Ｄ．Ｊ．  Ｍｏｒｒｅ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９２，  １８３１−１８３５  （１９９５））。したがって、カプサイシンは、副作用が少なく、かつ有効な抗腫瘍剤として期待されるようになっている。
しかし、カプサイシンには強い辛み、刺激性、及び炎症誘発作用などがあるため使用し難く、また継続的に投与すると身体に負担となるという欠点がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、カプサイシン同様に低い副作用で、かつ高い抗腫瘍作用を有し、かつ強い辛さ、刺激性、及び炎症誘発性などが少ない、カプサイシン関連成分のバニリル脂肪酸アミド化合物を含む抗腫瘍医薬組成物を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、カプサイシンの８−メチル−６−ノネン酸残基を、炭素原子数が１４個以上のアシル基（−ＣＯ−Ｒ基）に置換したバニリル脂肪酸アミドは、カプサイシンの辛み、刺激性などが少なくなること、及びそのバニリルアミン構造にカプサイシンの生理作用発現に必要な生体内レセプターであるバニロイドレセプターに結合するという知見（Ａ．  Ｓｚａｌｌａｓｉ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，  ４７，  １３９９−１４０８  （１９９０））に基づき、研究を行なった。その結果、本発明者は、カプサイシン同様に低い副作用で、かつ抗腫瘍作用、特に高い抗メラノーマ作用及び抗白血病細胞作用を有し、かつ辛さ、刺激性、及び炎症誘発性などが低いカプサイシン関連成分のバニリル脂肪酸アミド化合物が得られるという知見を得て、本発明を完成した。
【０００６】
したがって、本発明は、下記化学式（１）で表されるバニリル脂肪酸アミドを含む、抗腫瘍医薬組成物：
【化３】
2004182674.tif 000002
（式中−ＣＯ−Ｒ基は、炭素原子数１４個〜３２個の飽和脂肪酸残基、又は炭素原子数１４個〜３２個の不飽和脂肪酸残基である。）を提供する。
【０００７】
また、本発明は、下記化学式（１）で表されるバニリル脂肪酸アミドを含む、抗メラノーマ医薬組成物：
【化４】
2004182674.tif 000003
（式中−ＣＯ−Ｒ基は、炭素原子数１４個〜３２個の飽和脂肪酸残基、又は炭素原子数１４個〜３２個の不飽和脂肪酸残基である。）を提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、下記化学式（２）で表されるバニリル脂肪酸アミドを含む、抗メラノーマ医薬組成物を提供する。
【化５】
2004182674.tif 000004
該バニリル脂肪酸アミドは、バニリルアミンと、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６，  ＤＨＡ）とがアミド結合した化合物であり、本発明者によりドヘバニル（Ｄｏｈｅｖａｎｉｌ）と命名されている。
なお、本明細書において「腫瘍」という語は、上皮細胞及び非上皮細胞のいずれかが変異した悪性腫瘍を意味し、造血幹細胞が腫瘍増殖する白血病を含むものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の抗腫瘍医薬組成物の主成分であるバニリル脂肪酸アミドは、前記式（１）に示されるように、下記化学式（３）で表されるバニリルアミンと、炭素原子数１４個〜３２個の飽和脂肪酸、又は炭素原子数１４個〜３２個の不飽和脂肪酸とがアミド結合した化合物である。
【化６】
2004182674.tif 000005
【００１０】
前記飽和脂肪酸は、直鎖飽和脂肪酸、又は飽和分枝脂肪酸のいずれであってもよい。該直鎖飽和脂肪酸の例を挙げると、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）、アラキン酸（Ｃ２０）、ベヘン酸（Ｃ２２）、リグノセリン酸（Ｃ２４）、及びペンタデシリック酸（Ｃ２６）などがあり、好ましくはミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、及びステアリン酸（Ｃ１８）である。また、該分枝飽和脂肪酸の例を挙げると、イソミリスチン酸（Ｃ１４）、イソパルミチン酸（Ｃ１６）、イソステアリン酸（Ｃ１８）、及びイソアラキン酸（Ｃ２０）などがある。
【００１１】
前記不飽和脂肪酸のうち好ましいものは、二重結合を１、２又は３個有する炭素原子数１８個の不飽和脂肪酸、二重結合を４又は５個有する炭素原子数２０個の不飽和脂肪酸、二重結合を４個以上有する炭素原子数２２、２４、２６、２８又は３２個の不飽和脂肪酸である。
該不飽和脂肪酸の具体的な例を挙げると、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リシノール酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、ａｌｐｈａ−又はｂｅｔａ−リノレン酸（Ｃ１８：３）、エレオステアリン酸（Ｃ１８：３）、アラキドン酸（Ｃ２０：４）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５）、及び４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６）などがある。これらのうち好ましいものは、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、ａｌｐｈａ−又はｂｅｔａ−リノレン酸（Ｃ１８：３）、エレオステアリン酸（Ｃ１８：３）、アラキドン酸（Ｃ２０：４）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５）、及び４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６，  ＤＨＡ）である。
【００１２】
本発明で用いるバニリル脂肪酸アミドの製造は、バニリルアミン塩酸塩と脂肪酸塩化物とを反応させて合成する方法、リパーゼの触媒作用によりカプサイシンのアシル基と、所望の脂肪酸又はそのエステルの置換反応を利用する方法（特開平１１−２０６３９６号及び特開２０００−１４３９３号）、及び動植物由来の原料から抽出する方法などで行なうことができる。
【００１３】
該リパーゼの触媒作用を利用する方法を用いる場合、原料の脂肪酸エステルは、アルコール成分がグリセリンである脂肪酸エステル、すなわちグリセリドのモノエステル、ジエステル、トリエステル又はこれらの混合物でもよく、動植物由来の天然油脂を使用することができる。例えば、該天然油脂には、アマニ油、オリーブ油、カカオ油、トウモロコシ油、ゴマ油、ベニバナ油、小麦胚芽油、ヒマシ油、ヤシ油、落花生油、ヒマワリ油、綿実油、大豆油、サメ油などがある。
【００１４】
該方法で用いるバニリルアミンとしては、市販の合成品、トウガラシからの抽出カプサイシン、他のＮ−バニリル脂肪酸アミドの加水分解により得られたものを使用することができる。また、該方法で用いるリパーゼは、グリセリドの加水分解用酵素として市販されているリパーゼ、リパーゼを主成分とする複合酵素製剤、又はリパーゼ産生能を有する微生物の培養液であり、これらを固定化酵素の形態で使用してもよい。
【００１５】
該酵素反応は、無溶媒、又はリパーゼを失活させない疎水性有機溶媒（例えば、ヘキサン）中で行なう。バニリルアミンの反応率を高くするため、バニリルアミンに対して当量比で約３０〜１０００倍の脂肪酸またはそのエステルを存在させるとよい。反応温度、水相のｐＨ等の反応条件は、用いるリパーゼにとって最適な条件に選定すればよいが、一般的な反応温度は５〜８０℃、ｐＨは４〜１１である。生成したＮ−バニリル脂肪酸アミドは、反応系から常法により分離することができる。
【００１６】
本発明のバニリル脂肪酸アミドの投与量は、投与経路、患者の性別、症状、年齢、体重に合わせて適宜変えることになるが、通常、成人一日当り１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、特に２０〜３０ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明の医薬組成物では、有効成分として前記バニリル脂肪酸アミドを単独で、又は他の抗腫瘍剤、その他の所望の薬剤との組み合わせて使用することができる。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、経口投与又は非経口投与することができる。該非経口投与には、点滴、静脈注射、皮下注射、筋肉注射などの注射による投与、軟膏及び経皮剤による経皮的投与、座剤による直腸投与などの形態がある。また、経口投与する場合、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、丸剤、トローチ錠、有効成分持続的開放剤、液剤、懸濁剤などの形態で調剤することができる。該調剤は、製薬分野で用いられている常法により容易に行なうことができる。
【００１８】
本発明の医薬組成物を経口投与形態に調剤する場合、通常の薬剤に汎用されている製剤用成分、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤などの希釈剤、及び賦形剤などを用いることができる。具体的な例を挙げると、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤、水、エタノール、単シロツプ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラツク、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖などの崩壊剤、白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩等の滑沢剤などである。さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などを配合してもよい。
【００１９】
本発明の医薬組成物を経皮剤、例えば、皮膚塗布剤の形態に調剤し、皮膚組織に発生した腫瘍、特にメラノーマの治療に用いることができる。また、本発明で用いるバニリル脂肪酸アミドは鎮痛・鎮痒効果もあるので、該経皮剤は腫瘍、その他の疾患に伴う皮膚の痛み、痒みを止めにも有用である。
本発明の医薬組成物を皮膚塗布剤として調剤する場合、該バニリル脂肪酸アミドカプサイシンは、該皮膚塗布剤に対し、５重量％以上であることが好ましく、２０重量％以下であることが好ましい。
【００２０】
該皮膚塗布剤は、炭素数１〜４の直鎖または分枝鎖のアルキル基を有する１価のアルコールの低級アルコールが含有されていることが好ましく、また、皮膚への密着性を向上させるため被覆剤を加えてもよい。該被覆剤の例を挙げると、酸化亜鉛、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、炭酸マグネシウム、硫酸バリウム、ヒドロキシアパタイト、ケイ酸マグネシウム、マイカ、カオリン、モンモリロナイト、ベントナイト、無水ケイ酸、ステアリン酸亜鉛、シリコーン樹脂、シルクパウダー、ポリエチレン粉末、キチン、キトサン、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、アルギン酸セルロースなどがある。また、必要に応じて、界面活性剤、清涼剤などを加えてもよい。
次に、本発明を実施例等によりさらに詳細に説明する。なお、該実施例等は本発明を説明することを目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲は、本明細書の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【００２１】
【実施例】
〔実施例１〕  Ｎ−バニリル−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエンアミド［ドヘバニル（Ｄｏｈｅｖａｎｉｌ）と記す］の合成例
バニリルアミンと４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６，  ＤＨＡ）とを下記の手順により反応させ、上記ドヘバニルを合成した。
まず、バニリルアミン塩酸塩（ＡＬＤＲＩＣＨ製）１．２３ｇを４２℃のぬるま湯５ｍｌに溶解し、等モル量の１０％水酸化ナトリウム水溶液（２．６２ｍｌ）を加えて、４０℃で２０分間撹拌した。析出した沈殿を濾別し、冷やした蒸留水で３回洗浄した。濾過残査を１１０℃で３時間減圧下で乾燥し、さらに室温で３０分間真空乾燥して、バニリルアミン０．８０１ｇを得た。
【００２２】
該バニリルアミン０．２３０ｇと４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＯＯＳＡＮ  ＳＥＲＤＡＲＹ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ製）０．５９１ｇとをクロロホルム１３．８ｍｌに溶解した。次いで、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（東京化成製）０．３１０ｇ、ジメチルアミノビリジン（ＤＭＡＰ）（東京化成製）０．０３７ｇ、及びブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）（東京化成製）を極く少量加えて、室温で４２時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、濾過して沈殿を除き、濾液をロータリーエバポレータで約０．５ｍｌまで濃縮した。該濃縮液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル４０ｇ、展開溶媒：ヘキサン／酢酸エチル＝６／４（ｖｏｌ／ｖｏｌ））で分画した。ドヘバニルの画分を集めて、ロータリエバボレータで濃縮乾固し、次いで真空乾燥して、無色ないし淡黄色のアモルファス状固体としてドヘバニル０．３１１ｇを得た。得られたドヘバニルをＮＭＲで分析した結果は下記のとおりであった。
【００２３】
１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝０．９７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，−Ｃ−ＣＨ３），２．１（２Ｈ，ｍ，Ｍｅ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ−），２．２５（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−），２．４（２Ｈ，ｍ，−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−），２．８３（１０Ｈ，ｍ，−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｃ−×５），３．８８（３Ｈ，Ｓ，−ＯＣＨ３），４．３５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，−ＮＨ−ＣＨ２−），５．３７（１２Ｈ，ｍ，−ＣＨ＝ＣＨ−×６），５．６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ，−ＯＨ），６．８２（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ  ｐｒｏｔｏｎ）
【００２４】
〔実施例２〕  Ｎ−バニリルミリスチン酸アミド（Ｃ１４）の合成
特開平第１１−２０６３９６号に開示されているリパーゼのアシル基置換反応を利用してＮ−バニリルミリスチン酸アミド（Ｃ１４）を合成することができる。その手順は、まず、バニリルアミン塩酸塩３７．８ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１０ｍｌに溶解し、そこにノボザイム４３５（ムコル・ミーヘイ由来固定化酵素：ノボルディスク社製）を１０００ｍｇ、ミリスチン酸メチルエステルを５．８０ｇ（２４ｍｍｏｌ）加えて、撹拌しながら７０℃で所定の時間反応させる。
その後、生成したＮ−バニリルミリスチン酸アミドを定量する。用いたバニリルアミンの量を基準とする反応収率は、反応時間２４時間で約３０％、７２時間で約５７％になる。
【００２５】
〔実施例３〕  Ｎ−バニリルオレイン酸アミド（Ｃ１８：１）の合成
ミリスチン酸メチルエステルと同じモル数のオレイン酸メチルを使用した他は、実施例２と同様にして合成を行う。その結果、用いたバニリルアミンの量を基準とする反応収率は、反応時間７２時間で約４４％になる。
【００２６】
〔実施例４〕  Ｎ−バニリルリノール酸アミド（Ｃ１８：２）の合成
ミリスチン酸メチルエステルと同じモル数のリノール酸メチルを使用した他は、実施例２と同様にして合成を行う。その結果、用いたバニリルアミンの量を基準とする反応収率は、反応時間７２時間で約３９％になる。
【００２７】
〔実施例５〕  本発明で用いるバニリル脂肪酸アミドの抗メラノーマ作用
本発明の医薬組成物の抗メラノーマ作用を調べるため、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を用いて、実施例１のドヘバニルとカプサイシンの効果を比較した。
（１）細胞及び培養条件
比較に用いたＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞は、マウス由来悪性黒色腫細胞である。該メラノーマ細胞を、１０％牛胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．２）中で、３７℃及び５％ＣＯ２条件下で培養した。該細胞が７０％〜８０％コンフルエントに達した後、付着性であるためトリプシン−ＥＤＴＡで処理して細胞を剥がし、継代を行った。
【００２８】
（２）  細胞形態の観察
該細胞形態については、光学顕微鏡観察及び蛍光顕微鏡観察を行なった。
該光学顕微鏡観察は、マルチプレートに細胞を播き、所定時間培養後、ニコンのＴＭＳを用いて観察し、撮影することにより行った。
蛍光顕微鏡観察は、所定時間薬剤処理したＢ１６Ｆ１０細胞懸濁液（１×１０６個）をＰＢＳ（−）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した後、該細胞固定液を、ＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞をＰＢＳ（−）２０μｌで懸濁し、スライドガラス上で細胞懸濁液５μｌに、蛍光指示薬（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（１ｍＭ））２μｌの割合で混合し、カバーガラスをかけ、蛍光顕微鏡下（Ｕ領域）で観察、写真撮影することにより行った。
【００２９】
（３）  細胞数測定
細胞を回収し懸濁した後、懸濁液を取り、同量のトリパンブルー染色液を加えて十分に懸濁し、該懸濁液を血球計算盤（ビュルケルチュルク血球計算盤；日本臨床器械工業株式会社）を用いて位相差顕微鏡下で細胞数を測定した。
（４）細胞内メラニン定量
細胞を回収しＰＢＳ（−）２００μｌに懸濁後、エタノール／エーテル１ｍｌを添加し１５分静置させてから遠心分離を行ない、得られたペレットを１０％ＤＭＳＯ−１Ｎ  ＮａＯＨ溶液  １ｍｌに懸濁した後、８０℃で１５分間インキュベートし、上清の吸光度を４７５ｎｍの波長域で測定した。該メラニン量は予め測定しておいた所定のメラノーマ細胞数当たりの吸光度をコントロールを１００として相対値で示した。
【００３０】
（５）官能試験による相対辛味度の決定
カプサイシンとドヘバニルの相対辛味度を、アルコール溶液をカバーガラスに一滴落とし、アルコールを蒸発させてから舌で検知できる最小量から求めた。その結果、カプサイシンを１とするとドヘバニルは１０−５ であり、ドヘバニルの辛み、刺激性は極めて小さかった。
（比較実験）
カプサイシンが該メラノーマ細胞の増殖に及ぼす影響を調べるため、メラノーマ細胞を培養しているＤＭＥＭ培地に対し、カプサイシンをそれぞれ１０μＭ、３０μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び３００μＭ添加し４８時間培養した後、細胞数を測定した。４８時間培養した結果、コントロールに対してカプサイシンは濃度依存的に細胞の増殖を抑制することが観察された。次いで、ドヘバニルの該メラノーマ細胞に対する影響を調べるため、カプサイシンをドヘバニルに置き換えて、カプサイシンの影響測定と同様に、それぞれ１０μＭ、３０μＭ、５０μＭ、及び１００μＭの濃度で培養を行なった。
【００３１】
その結果、図１及び図２に示されているように、ドヘバニルは、カプサイシンと同様に濃度依存的に細胞の増殖を抑制するが、その抑制度は明らかにドヘバニルが強い。特に、濃度５０μＭでは、カプサイシンでは細胞数がコントロールの約６０％なのに対し、ドヘバニルでは約１０％と低く、濃度１００μＭでは、カプサイシンでは細胞数がコントロールの約５０％なのに対し、ドヘバニルでは細胞数が０％、すなわち生存率が０になっている。したがって、ドヘバニルはカプサイシンよりもメラノーマ細胞に対しかなり強い細胞増殖抑制効果を有しているのが判る。
【００３２】
力プサイシン濃度３００μＭと、ドヘバニル５０μＭの存在下で処理したメラノーマ細胞の細胞形態及びその様子を位相差顕微鏡で観察した。その結果、高濃度のカプサイシンで処理したメラノーマ細胞と比べて、より低濃度のドヘバニル処理で処理したほうが、培養容器に付着している細胞が顕著に減少していることが示された。
カプサイシン、及びドヘバニルによる細胞の死がアポトーシスであるか否かを調べるため、染色体に特異的に結合するＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて蛍光顕微鏡による核の形態観察を行った。その結果、コントロールと比較してカプサイシン、ドヘバニルのそれぞれの濃度処理において、アポトーシスした細胞に特徴的なクロマチンの凝縮、核の形態の乱れが観察された。このようにカプサイシン及びドヘバニルとも、メラノーマ細胞にアポトーシスを誘導し、特にドヘバニルは強いアポトーシス誘導をすることは明かである。
【００３３】
このように、カプサイシンと比べ、本発明の医薬組成物で用いるドヘバニルは、辛み、及び刺激性が著しく弱く、かつアポトーシスを誘導してメラノーマ細胞の増殖を強く阻害することが判った。
〔実施例６〕  本発明で用いるバニリル脂肪酸アミドの抗腫瘍作用
カプサイシンとドヘバニルとの抗腫瘍作用を比較するため、ヒト子宮頸部癌由来のＨｅＬａ細胞を腫瘍細胞とし、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を正常細胞として実験を行なった。
実験に用いたこれらの細胞は、５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０倍地（ｐＨ７．２）中で、３７℃及び５％ＣＯ２条件下で培養した。カプサイシン及びドヘバニルをそれぞれ１０μＭ、３０μＭ、５０μＭ、及び１００μＭの濃度で加え、各細胞の培養を行なった。該比較実験において、細胞増殖能はＷＳＴ−１法、及び上清中へのＬＤＨ活性放出を指標に測定した。
【００３４】
その結果、図３から明らかなようにＨｅＬａ細胞には、カプサイシン及びドヘバニル双方とも、濃度依存的に細胞増殖を抑制するが、その作用はドヘバニルのほうが強く、特に濃度１００μＭになると、カプサイシンでは生存率が５０％近いのに対し、ドヘバニルでは生存率が０％になる。一方、図４から明らかなように、カプサイシン及びドヘバニルとも３０μＭまではＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対してほとんど影響を与えない。したがって、カプサイシンと比べ、ドヘバニルは辛み、刺激性が著しく低く、同時により高い抗腫瘍効果を有し、かつ正常細胞には影響が少ないことが判る。
【００３５】
なお、カスパーゼ３活性測定によると、カプサイシン及びドヘバニルともアポトーシスによる細胞死を誘導とすると考えられる。
なお、本実施例のＷＳＴ−１法とは、ミトコンドリアの還元酵素活性を利用して、フォルマザンを還元させ、その発色を吸光度で測定する方法を言い、細胞が死ぬとミトコンドリアの当該活性が失われるので該吸光度は細胞増殖の指標となる。
また、ＬＤＨ活性放出とは、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）が細胞死に伴う細胞膜破壊で細胞外に放出され、細胞外でＬＤＨ活性が生じることをいい、該活性の測定値は細胞死の程度の指標となる。
【００３６】
〔実施例７〕  本発明で用いるバニリル脂肪酸アミドの抗白血病細胞作用
カプサイシンとドヘバニルとの抗白血病細胞作用を比較するため、ヒト急性白血病細胞Ｕ９３７を用いて実験を行なった。該Ｕ９３７細胞を、５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０倍地（ｐＨ７．２）中で、３７℃及び５％ＣＯ２条件下で培養した。カプサイシン及びドヘバニルをそれぞれ１０μＭ、３０μＭ、５０μＭ、及び１００μＭの濃度で加え培養を行なった。該比較実験において、細胞増殖能はトリパンブルー細胞分染法による測定値を指標に検討した。
【００３７】
その結果、図５から明らかなように該Ｕ９３７細胞には、カプサイシン及びドヘバニル双方とも、濃度依存的に細胞増殖を抑制するが、その作用はドヘバニルのほうが強く、特に濃度１００μＭになると、カプサイシンでは生存率が５０％近いのに対し、ドヘバニルでは生存率が０％になる。したがって、カプサイシンと比べ、ドヘバニルは辛み、刺激性が著しく低く、同時により高い抗白血病細胞増殖抑制効果を有することが判る。また、カスパーゼ３活性測定によると、カプサイシン及びドヘバニルともアポトーシスによる細胞死を誘導すると考えられる。
【００３８】
なお、本発明のトリパンブルー分染法とは、トリパンブルーがタンパク質と結合して青色を呈する性質、及び細胞が死ぬと該トリパンブルーを通さない細胞膜の機能が失われ、該トリパンブルーが細胞内に進入するという性質を利用した方法であって、死んだ細胞はトリパンブルーで青く染まるので、染まった細胞を顕微鏡下で数えることでその生存率を測定することができる。
【００３９】
〔実施例８〕  ドヘバニルの構成要素となっている各化合物のＢ１６メラノーマ細胞に対する影響
検討する各化合物の濃度を１００μＭとし、４８時間処理、培養した他は実施例５と同じ方法で、ドヘバニルの構成要素となっている各化合物のＢ１６メラノーマ細胞に対する影響を検討した。すなわち、カプサイシン、ドヘバニル、バニリルアミン、ＤＨＡで単独添加処理した場合と、ＤＨＡと、カプサイシン又はバニリルアミンとを同時添加して処理をした場合を比較して、各化合物の細胞増殖ヘの影響を調べた。図６に示すように、ＤＨＡと、カプサイシン又はバニリルアミンとを同時添加して処理した場合は、ドヘバニルのような顕著な細胞増殖抑制はみらなかった。したがって、ドヘバニルの効果は、カプサイシン又はバニリルアミンとＤＨＡとの単なる相加効果によるものではないことが示された。
【００４０】
【発明の効果】
本発明は、抗腫瘍性、特に抗メラノーマ及び抗白血病作用を有する抗腫瘍医薬組成物を提供する。特に本発明は、カプサイシン同様、正常細胞に対する副作用が小さく、かつ高い抗腫瘍作用、特に抗メラノーマ及び抗白血病作用を有し、さらにカプサイシンのような辛さ、刺激性、及び炎症誘発性が極めて少ない抗腫瘍医薬組成物を提供する。
なお、本発明のバニリル脂肪酸アミドの関連化合物であるカプサイシンは、ＩｎＶｉｔｒｏとＩｎ  Ｖｉｖｏともに抗腫瘍作用があり、それぞれのデータ間に相関関係があることが報告されている（Ｅｕｒ  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ．  １９９６  Ｏｃｔ．；  ３２Ａ（１１）：１９９５−２００３）。
一方、本発明のバニリル脂肪酸アミド及びカプサイシンはともにアポトーシスを誘導して腫瘍細胞の増殖抑制効果を発揮すること、及び生体内レセプターであるバニロイドレセプターに結合するバニリルアミン構造を有する（Ａ．  Ｓｚａｌｌａｓｉ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，  ４７，  １３９９−１４０８  （１９９０））。この点を考慮すると、本明細書は、Ｉｎ  Ｖｉｖｏデータは記載していないが、当業者であれば本発明の医薬組成物は、Ｉｎ  Ｖｉｖｏにおいても効果を発揮することが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に対するカプサイシンの影響を示すグラフである。
【図２】図２は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に対するドヘバニルの影響を示すグラフである。
【図３】図３は、ＨｅＬａ細胞に対する、カプサイシン及びドヘバニルの影響を示すグラフである。
【図４】図４は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対する、カプサイシン及びドヘバニルの影響を示すグラフである。
【図５】図５は、急性白血病細胞Ｕ９３７に対するカプサイシン及びドヘバニルの影響を示すグラフである。
【図６】図６は、ドヘバニルの構成要素となっている各化合物のＢ１６メラノーマ細胞に対する影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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