(57)【要約】【課題】使用する各蛍光標識の発光スペクトルをより正確に求めることにより、スペクトラルデコンボリューションがより高精度な値を与えるようにして、分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法。【解決手段】複数の波長を選択するステップＳＴ１０２と、分光画像の各画素における複数の波長の分光強度を多次元の分光強度空間に写像するステップＳＴ１０４と、写像の空間分布を用いて基線を設定するステップＳＴ１０５と、基線近傍に写像された画素を選択するステップＳＴ１０６と、選択された画素より得られた分光データから固有スペクトル成分を推定するステップＳＴ１０８と、推定されたスペクトル成分を用いて分光画像をデコンボリューションするステップＳＴ１０９とを含む方法。【選択図】        図８
2004286515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の固有スペクトル成分が混在する分光画像から前記固有スペクトル成分を分離してその存在割合を求める方法において、複数の波長を選択するステップと、前記分光画像の各画素における前記複数の波長の分光強度を多次元の分光強度空間に写像するステップと、前記写像の空間分布を用いて基線を設定するステップと、前記基線近傍に写像された画素を選択するステップと、前記選択された画素より得られた分光データから前記固有スペクトル成分を推定するステップと、前記推定されたスペクトル成分を用いて前記分光画像をデコンボリューションするステップとを含むことを特徴とする分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法。
【請求項２】
前記選択された画素の分光データの平均値を用いて、前記固有スペクトル成分を推定することを特徴とする請求項１記載の分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法。
【請求項３】
前記選択された画素の分光データのモード値を用いて、前記固有スペクトル成分を推定することを特徴とする請求項１記載の分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法。
【請求項４】
前記推定されたスペクトル成分を用いて前記分光画像をデコンボリューションするステップの後に、前記固有スペクトルの推定の初期値を用いて、前記分光画像のブラインドデコンボリューションをするステップを含むことを特徴とする請求項１から３の何れか１項記載の分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法に関し、特に、スペクトラルデコンボリューション法及びスペクトラルブラインドデコンボリューション法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の複数種類のタンパク分子の運動又は相互作用や、遺伝子の発現を観察するために、それぞれのタンパク分子や遺伝子ＲＮＡに、異なる蛍光標識を結合させて、同時に蛍光観察する手法が利用されている。蛍光標識としては、生体に対し毒性の低い、クラゲやサンゴの遺伝子から抽出された蛍光タンパクを用いることが多くなっている。蛍光タンパクには、よく使われるものでＣＦＰ（シアン色発色）、ＧＦＰ（緑色発色）、ＹＦＰ（黄色発色）、ＤｓＲｅｄ（赤色発色）等がある。
【０００３】
ところが、図１２（ａ）にこれら蛍光タンパクの励起波長と励起効率、図１２（ｂ）にこれら蛍光タンパクの発光波長と発光強度を示すように、蛍光タンパクの発光スペクトルはバンド幅が広くて、互いに重なり合っている。そのために、それぞれの蛍光タンパクの発光を、バンドパスフィルタやシャープカットフィルタ等の光学的フィルタのみを用いて完全に分離することはできない。
【０００４】
そこで、スペクトラルデコンボリューションと呼ばれる手法を用いて、観測された測定対象の発光スペクトルをそれぞれの蛍光標識の発光スペクトルに分解することが行われる。特許文献１には、スペクトラルデコンボリューションを用いる場合の手順が簡単に説明されている。その手順は、図１３に示すように、ステップ１で、使用する蛍光標識の発光スペクトルを求め、ステップ２で、各蛍光標識の発光スペクトルを計算機に登録し、ステップ３で、測定対象の発光スペクトルを計測し、ステップ４で、計測した測定対象の発光スペクトルをコンピュータに記録し、ステップ５で、デコンボリューションを用いて測定対象の発光スペクトルを蛍光標識の発光スペクトルに分解し、ステップ６で、各蛍光標識の存在割合を決定する、と言うものである。
【０００５】
測定対象の発光スペクトルを蛍光標識の発光スペクトルに分解するデコンボリューション法の数学的手順は、特許文献２や、非特許文献１、非特許文献２等に具体的に示されている。
【０００６】
ここで、上記ステップ１において、各蛍光標識の発光スペクトルとして実際とは異なる値を用いると、スペクトラルデコンボリューションが誤った結果を与えることになる。したがって、各蛍光標識の発光スペクトルはできるだけ正確に求めておかなければならない。ステップ１において、使用する蛍光標識の発光スペクトルを決定するために、いくつかの方法が用いられている。その１つは、特許文献２に示されているように、使用する蛍光標識の発光スペクトルを、予め単独で計測して、その発光スペクトルを用いる方法である。他の１つは、非特許文献１に示されているように、測定対象の中で各蛍光標識が孤立している領域を観察して手動で選択して、その領域の発光スペクトルの計測値を用いる方法である。他の１つは、使用する蛍光標識のカタログ値を用いる方法である。
【０００７】
ところで、従来のステップ１の方法には、以下に述べる不都合が存在する。すなわち、上述の方法で得られた蛍光標識の発光スペクトルが、測定対象に実際に含まれる蛍光標識の発光スペクトルと異なっているために、スペクトラルデコンボリューションが誤った結果を与える可能性がある。使用する蛍光標識の発光スペクトルを単独で計測した場合、その蛍光標識の周辺の温度、ｐＨ等の環境や励起光のスペクトル、褪色度等が、測定対象に含まれている蛍光標識に対するそれらと異なるために、不正確な発光スペクトルを設定してしまうことがある。また、測定対象中で各蛍光標識が孤立している領域を選択しても、実際には、他の蛍光標識が多少混ざっていたり、測定対象や測定装置の自家蛍光の影響で、蛍光標識の発光スペクトルが正確に求められないことがある。また、領域の選択のし方によっても、正しい発光スペクトルが得られないことがある。蛍光標識のカタログ値を用いる場合も、同様な理由で正しい発光スペクトルが得られないことがある。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許第６，４０３，３３２号明細書
【０００９】
【特許文献２】
米国特許第６，０２５，６０１号明細書
【００１０】
【特許文献３】
米国特許第５，  ７０６，  ４０２号明細書
【００１１】
【非特許文献１】
Ｍ．  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  ｅｔ．  ａｌ．，  ”Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｕｎｍｉｘｉｎｇ  Ａｄｄ  ａ  Ｗｈｏｌｅ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｔｏ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｖｏｌ．３１，  Ｎｏ．６，  ｐｐ．１２７２−１２７８  （２００１）
【００１２】
【非特許文献２】
河田聡，  「イメージングスペクトロスコピーによるパターン分析」，  光学，Ｖｏｌ．１８，  Ｎｏ．１，ｐｐ．８−１４（１９８９）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は従来技術のこのような問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、使用する各蛍光標識の発光スペクトルをより正確に求めることにより、スペクトラルデコンボリューションがより高精度な値を与えるようにして、分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する本発明の分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法は、複数の固有スペクトル成分が混在する分光画像から前記固有スペクトル成分を分離してその存在割合を求める方法において、複数の波長を選択するステップと、前記分光画像の各画素における前記複数の波長の分光強度を多次元の分光強度空間に写像するステップと、前記写像の空間分布を用いて基線を設定するステップと、前記基線近傍に写像された画素を選択するステップと、前記選択された画素より得られた分光データから前記固有スペクトル成分を推定するステップと、前記推定されたスペクトル成分を用いて前記分光画像をデコンボリューションするステップとを含むことを特徴とする。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態については、まず、上記の目的を達成することができる分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法の実施形態と、そのそれぞれの作用効果について説明する。そして、次に、それぞれの実施例を説明することにする。
【００１６】
本発明の分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法は、複数の固有スペクトル成分が混在する分光画像から前記固有スペクトル成分を分離してその存在割合を求める方法において、複数の波長を選択するステップと、前記分光画像の各画素における前記複数の波長の分光強度を多次元の分光強度空間に写像するステップと、前記写像の空間分布を用いて基線を設定するステップと、前記基線近傍に写像された画素を選択するステップと、前記選択された画素より得られた分光データから前記固有スペクトル成分を推定するステップと、前記推定されたスペクトル成分を用いて前記分光画像をデコンボリューションするステップとを含むことことを特徴とする。
【００１７】
本発明においては、分光画像の各画素における複数の波長の分光強度を、多次元の分光強度空間に写像し、その写像の空間分布から基線を設定し、基線近傍に写像された画素を選択することにより、各固有スペクトル成分が単独で存在すると思われる画素を容易かつ高精度に選択することができる。そのことを、使用する蛍光標識がＡ、Ｂの２種類の場合の例を用いて、以下に説明する。
【００１８】
複数の波長を選択するステップにおいては、図１に示すように、使用する２種類の蛍光標識Ａ、Ｂの発光スペクトルそれぞれのピーク近辺で、２つの波長Ｗ１  、Ｗ２  を選択する。Ｗ１  、Ｗ２  は、それぞれの蛍光標識Ａ、Ｂに対して、その波長間の発光強度の強度比ができるだけ大きく、また、２つの蛍光標識Ａ、Ｂでその強度比が逆転するような波長に設定することが好ましい。いま、波長Ｗ１  における蛍光標識Ａ、Ｂの発光強度をそれぞれＳ１Ａ、Ｓ１Ｂとし、波長Ｗ２  における蛍光標識Ａ、Ｂの発光強度をそれぞれＳ２Ａ、Ｓ２Ｂとする。ただし、これらは未知数である。
【００１９】
次に、分光画像の各画素における複数の波長の分光強度を多次元の分光強度空間に写像するステップにおいては、図２に示すように、選択した２つの波長Ｗ１  、Ｗ２  における強度を２つの軸とした分光強度空間上に、分光画像の各画素の強度を写像する。
【００２０】
写像の空間分布を用いて基線を設定するステップにおいては、図２に示すような分光強度空間上で、原点を通り各画素の写像の分布に接して挟み込むような２つの基線Ａ、Ｂを設定する。蛍光標識Ａ又はＢのみが存在する画素があれば、その画素は、基線Ａ又はＢ上に存在する。なぜならば、ある画素に蛍光標識ＡとＢが混在する場合、その画素のＷ１  の強度とＷ２  の強度の比は、必ずＳ１Ａ：Ｓ２ＡとＳ１Ｂ：Ｓ２Ｂの間の数値になり、蛍光標識Ａ又はＢのみが存在する画素において、その強度比がＳ１Ａ：Ｓ２Ａ又はＳ１Ｂ：Ｓ２Ｂとなっているからである。つまり、基線Ａ、Ｂは、強度比がそれぞれＳ１Ａ：Ｓ２Ａ、Ｓ１Ｂ：Ｓ２Ｂの直線を表している。
【００２１】
基線近傍に写像された画素を選択するステップでは、図２に示すように、基線Ａ、Ｂの近傍に選択領域Ａ、Ｂを設定し、その領域中に写像された画素のいくつかを選択する。このとき、選択領域Ａ、Ｂは、基線Ａ、Ｂ近傍で比較強度の強い画素のみを選択するように設定する方が、分光画像計測において生じる様々なノイズの影響を受け難くなり好ましい。
【００２２】
選択された画素より得られた分光データから固有スペクトル成分を推定するステップでは、選択領域Ａ及びＢの中に写像された画素における分光強度を用いて、蛍光標識Ａ及びＢの発光スペクトルを推定する。基線Ａ及びＢ上に写像された画素には、蛍光標識Ａ及びＢのみが存在するため、その画素の強度分布は、蛍光標識Ａ及びＢの発光スペクトルに非常に近いと考えられるからである。
【００２３】
推定されたスペクトル成分を用いて分光画像をデコンボリューションするステップでは、選択領域Ａ及びＢの中に写像された画素における分光強度を用いて推定された蛍光標識Ａ及びＢの発光スペクトルの推定値を用いて、分光画像のデコンボリューションを行う。
【００２４】
なお、３種類の蛍光標識を用いる場合は、図３に示すように、３つの波長Ｗ１  、Ｗ２  、Ｗ３  を選択し、図４に示すように、３次元の分光強度空間内に各画素の強度を写像する。そして、上で説明したのと同様に、３本の基線Ａ、Ｂ、Ｃを設定し、それぞれの基線近傍に写像された画素を選択して、蛍光標識Ａ、Ｂ、Ｃの発光スペクトルを推定する。さらに多く種類の蛍光標識を用いる場合も、多次元の分光強度空間を用いて同様に行うことができることは、ここに説明するまでもない。
【００２５】
このように、本発明の分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法を用いれば、推定された蛍光標識Ａ、Ｂの発光スペクトルが、実際の発光スペクトルに非常に近いと推定されるため、より高精度なスペクトラルデコンボリューション結果を得ることができるメリットがある。
【００２６】
さらに、本発明の分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法では、基線Ａ、Ｂ上の画素を略機械的に選択することができるので、再現性が良く、信頼のおけるスペクトラルデコンボリューション結果を得ることができるメリットがある。
【００２７】
ここで、スペクトラルデコンボリューションを簡単に説明しておく。測定対象の座標ｘｉ  の各画素における発光スペクトルの波長λｊ  における分光強度Ｉλｊ  ，ｘｉ  （λｊ  、ｘｉ  はＩの下付き文字とする。）を２次元行列［Ｉ］で表し、ｋ番目の固有スペクトル成分の波長λｊ  における分光強度Ｓλｊ  ，ｋ（λｊ  、ｋはＳの下付き文字とする。）を２次元行列［Ｓ］で表し、各画素における各固有スペクトル成分の濃度Ｃｋ，ｘｉ  （ｋ，ｘｉ  はＣの下付き文字とする。）を２次元行列［Ｃ］で表した場合、図５に示すように、次の行列方程式が成立する。なお、図５中の“Ｍ”、“Λ”、“Ｏ”は部分行列である。
【００２８】
［Ｓ］［Ｃ］＝［Ｉ］                                                                  ・・・（１）
（１）式の行列方程式において、［Ｓ］と［Ｉ］は既知であり、［Ｃ］が未知である場合に、［Ｃ］を求める方法をスペクトラルデコンボリューションと呼ぶ。非特許文献２の解説記事に説明してあるように、最小自乗法を用いて、以下の式により［Ｃ］を求めることができる。
【００２９】
［Ｃ］＝（［Ｓ］ｔ  ［Ｓ］）−１［Ｓ］ｔ  ［Ｉ］            ・・・（２）
特に、画素数と固有スペクトル成分の数が等しい場合は、［Ｓ］が正方行列であるため、
［Ｃ］＝［Ｓ］−１［Ｉ］                                ・・・（３）
より［Ｃ］を求めることができる。
【００３０】
本発明の好適１実施形態においては、前記選択された画素の分光データの平均値を用いて、前記固有スペクトル成分を推定することを特徴とする。
【００３１】
本実施形態においては、選択された画素の分光データの平均値をとることにより、各画素の分光データに含まれるランダムノイズの影響を低減させて、精度の良いスペクトラルデコンボリューション結果を得ることができるメリットがある。
【００３２】
本発明の好適１実施形態においては、前記選択された画素の分光データのモード値を用いて、前記固有スペクトル成分を推定することを特徴とする。
【００３３】
本実施形態においては、選択された画素の分光データのモード値（頻度の最も大きな分光データの値）をとることにより、各画素の分光データに含まれるショットキー型ノイズの影響を低減させて、精度の良いスペクトラルデコンボリューション結果を得ることができるメリットがある。
【００３４】
また、本発明の好適１実施形態においては、前記推定されたスペクトル成分を用いて前記分光画像をデコンボリューションするステップの後に、前記固有スペクトルの推定の初期値を用いて、前記分光画像のブラインドデコンボリューションをするステップを含むことを特徴とする。
【００３５】
ブラインドデコンボリューション法は、前出のデコンボリューションと異なり、固有スペクトル成分が未知あるいは未確定の場合に、固有スペクトルも同時に求めることができる。ただし、与える固有スペクトルの推定の初期値によって、計算における収束性や計算時間が影響を受ける。したがって、固有スペクトルの推定の初期値には、できるだけ真の値に近い値を設定することが望ましい。その数学的手順の説明は、特許文献３に具体的に示されている。
【００３６】
本発明においては、分光画像の各画素における複数の波長の分光強度を、多次元の分光強度空間に写像し、その写像の空間分布から基線を設定し、基線近傍に写像された画素を選択し、選択された画素より得られた分光データから固有スペクトル成分の推定の初期値を設定することにより、固有スペクトル成分の推定値の初期値がかなり高い精度で真の固有スペクトル成分に近いため、その後のブラインドデコンボリューションの計算が速く収束し、かつ、より精度の高い計算結果を得ることができるメリットがある。
【００３７】
なお、推定された固有スペクトル成分と、デコンボリューションの計算結果を初期値として、分光画像のブラインドデコンボリューションをするようにしてもよい。
【００３８】
この場合は、計算時間のかかるブラインドデコンボリューションを行う前に、計算時間の比較的かからないデコンボリューションを行って、ブラインドデコンボリューションに対して精度の良い初期値を与えることができるようにしているので、初めからブラインドデコンボリューションを行う場合に比較して、計算にかかる時間を短縮することができるメリットがある。
【００３９】
ここで、スペクトラルブラインドデコンボリューションを簡単に説明しておく。前記の（１）式において、［Ｓ］も［Ｃ］も未知であり［Ｉ］のみが既知である場合に、［Ｓ］と［Ｃ］を同時に求める方法を、スペクトラルブラインドデコンボリューションと呼ぶことにする。スペクトラルブラインドデコンボリューションには、種々手法が提案されているが、ここでは、最も簡単な解法の１つとして、［Ｃ］と［Ｓ］の非負拘束条件を利用した反復計算法を、図６のフローチャートを用いて説明する。
【００４０】
初めに、繰返し補助変数ｎを０に設定する（ステップ３０１）。次に、［Ｃ］と［Ｓ］の推定の初期値［Ｃ０  ］と［Ｓ０  ］を設定する（ステップ３０２）。次に、補助変数ｎを１つ増やす（ステップ３０３）。次に、式（１）からの類推で求まる漸化式、
［Ｃｎ  ］＝（［Ｓｎ−１  ］ｔ  ［Ｓｎ−１  ］）−１［Ｓｎ−１  ］ｔ  ［Ｉ］・・・（４）
を用いて、［Ｃｎ  ］を更新する（ステップ３０４）  。次に、［Ｃ］の非負拘束条件に基づいて、［Ｃｎ  ］の負の要素を全て０に置き換える（ステップ３０５）。次に、式（１）からの類推で求まる漸化式、
［Ｓｎ  ］＝［Ｉ］［Ｃｎ  ］ｔ  （［Ｃｎ  ］［Ｃｎ  ］ｔ  ）−１    ・・・（５）
を用いて、［Ｓｎ  ］を更新する（ステップ３０６）。次に、［Ｓ］の非負拘束条件に基づいて、［Ｓｎ  ］の負の要素を全て０に置き換える（ステップ３０７）。次に、［Ｓｎ  ］を最大値が１となるように正規化する（ステップ３０８）。もし、［Ｃｎ  ］と［Ｃｎ−１  ］の各要素の差の絶対値が、［Ｃｎ  ］の収束判定用係数  ｅｐｓＣよりも小さくなり、かつ［Ｓｎ  ］と［Ｓｎ−１  ］の各要素の差の絶対値が、［Ｓｎ  ］の収束判定用係数  ｅｐｓＳよりも小さくなれば、計算が収束したとして、そこで計算を打ち切り終了する（ステップ３０９）。次に、［Ｃｎ  ］と［Ｃｎ−１  ］の各要素の差の絶対値が［Ｃｎ−１  ］と［Ｃｎ−２  ］の各要素の差の絶対値より小さく、かつ［Ｓｎ  ］と［Ｓｎ−１  ］の各要素の差の絶対値が［Ｓｎ−１  ］と［Ｓｎ−２  ］の各要素の差の絶対値より小さい場合は、計算が収束に向かっていると判断して、ステップ３０３からステップ３０８を繰り返し、そうでなければ、計算が発散したとして、ステップ３０１に戻って、［Ｃ］と［Ｓ］の推定の初期値［Ｃ０  ］と［Ｓ０  ］を再設定して、初めから計算をやり直す（ステップ３１０）。
【００４１】
この反復計算法は、計算が収束すれば妥当な結果を与えるが、初めに与える［Ｃ］と［Ｓ］の推定の初期値［Ｃ０  ］と［Ｓ０  ］が不適当である場合は発散する。また、計算が収束する速度も、［Ｃ０  ］と［Ｓ０  ］により大きく影響を受ける。
【００４２】
したがって、［Ｃ０  ］と［Ｓ０  ］の値はできるだけ真の値に近いものを設定することが、計算効率上好ましい。
【００４３】
以下に、図面を用いて、本発明の分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法の実施例について説明する。
【００４４】
本発明による第１実施例の蛍光顕微鏡の構成は、図７に示すように、光源１と、照明光学系２と、励起フィルタ３と、ダイクロイックミラー４と、対物レンズ５と、阻止フィルタ６と、結像レンズ７と、回転可能で複数の透過波長帯域の異なるフィルタからなるフィルタホイール８と、ＣＣＤカメラ９と、コンピュータ１０と、表示装置１１からなる。光源１は照明光を発生し、照明光学系２は照明光を集光し、励起フィルタ３は照明光から標本の蛍光標識を励起する励起光成分のみを透過し、ダイクロイックミラー４は励起光を反射して対物レンズ５の開口に導き、対物レンズ５は標本面上に励起光を集光する。標本Ｏでは蛍光標識により蛍光が発せられ、対物レンズ５は蛍光を集光し、ダイクロイックミラー４は蛍光を透過し、結像レンズ７は標本Ｏの拡大像をＣＣＤカメラ９の撮像面上に形成する。フィルタホイール８は、電気的に接続されたコンピュータ１０から制御され、ＣＣＤカメラ９で撮像する蛍光画像の波長帯域を選択する。コンピュータ１０は、フィルタホイール８を回転させながら、波長帯域の異なる複数の蛍光画像をＣＣＤカメラ９から取り込み、標本Ｏの分光画像を作成する。さらに、コンピュータ１０は、本発明によるスペクトラルデコンボリューション法に基づいて、標本Ｏ内の各蛍光標識の空間分布を算出し、コンピュータ１０に電気的に接続された表示装置１１にその空間分布を表示する。阻止フィルタ６は、光学系内での反射、散乱による励起光の蛍光画像への混入を防ぐ目的で、ダイクロイックミラー４の後方に挿入されている。
【００４５】
本実施例の分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法の手順は、図８に示すように、フィルタホイール８を回転させながら、波長帯域の異なる複数の蛍光画像をコンピュータ１０に取り込むことにより、標本Ｏの分光画像を作成し（ステップ１０１）、標本Ｏに含まれる蛍光標識の種類の数と同じ波長帯域を選択し（ステップ１０２）、選択した波長帯域を軸にして分光強度空間を作成し（ステップ１０３）、各波長帯域における分光画像各画素の値を分光強度空間にプロットし（ステップ１０４）、分光強度空間における各画素の分布から基線を求め（ステップ１０５）、基線近傍にある画素を選択し（ステップ１０６）、同一の基線上にある選択した画素の分光強度を平均し（ステップ１０７）、各基線上の画素の分光強度の平均値を各蛍光標識の発光スペクトルに設定し（ステップ１０８）、デコンボリューション法を用いて測定対象の発光スペクトルを蛍光標識の発光スペクトルに分解し（ステップ１０９）、各蛍光標識の存在割合を決定し（ステップ１１０）、各蛍光標識の空間分布を表示装置１１に表示する（ステップ１１１）。
【００４６】
このように、本実施例においては、標本Ｏの分光画像から各蛍光標識の発光スペクトルを直接求めることができるので、蛍光標識の発光スペクトルを予め登録しておく必要がない。また、本実施例においては、蛍光標識の発光スペクトルが全く未知の場合においても精度の高いスペクトラルデコンボリューション結果を得ることができる。また、本実施例においては、各蛍光標識の発光スペクトルを機械的に設定することができるので、各蛍光標識が孤立している領域を手動で選択して、その画素の分光強度を各蛍光標識の発光スペクトルに設定する従来の方法と比較して、再現性が高く信頼性の高いスペクトラルデコンボリューション結果を得ることができる。
【００４７】
本発明による第２実施例のレーザ顕微鏡の構成は、図９に示すように、レーザ光源２１と、コリメートレンズ２２と、ダイクロイックミラー２３、一対のガルバノミラー２４と、対物レンズ２５と、結像レンズ２６と、共焦点ピンホール２７と、回折格子２８と、ラインセンサ２９と、コンピュータ３０と、表示装置３１からなる。レーザ光源２１は励起光を発生し、コリメートレンズ２２は励起光を平行光線にし、ダイクロイックミラー２３は励起光を反射して対物レンズ２５に導き、対物レンズ２５は標本Ｏ上に励起光のスポットを形成する。ダイクロイックミラー２３と対物レンズ２５の間に挿入された一対のガルバノミラー２４は、励起光の光線角度を振ることで、標本Ｏ上の励起光のスポットを２次元的に走査する。標本Ｏ内の蛍光標識に励起光が照射されることにより蛍光が発生し、対物レンズ２５は蛍光を集光し、ガルバノミラー２４は蛍光をダイクロイックミラー２３に導き、ダイクロイックミラー２３は蛍光を透過し、結像レンズ２６は共焦点ピンホール２７上に標本Ｏの拡大像を投影し、共焦点ピンホール２７は標本Ｏの共焦点画像成分を抽出する。共焦点ピンホール２７とラインセンサ２９の中心に焦点位置を持つ曲面形状をしたの回折格子２８は、共焦点ピンホール２７を透過した蛍光の分光強度の像をラインセンサ２９上に投影する。ガルバノミラー２４及びラインセンサ２９と電気的に接続されたコンピュータ３０は、ガルバノミラー２４を走査しながらラインセンサ２９からの信号を入力することにより、共焦点分光蛍光画像を作成する。さらに、コンピュータ３０は本発明によるスペクトラルブラインドデコンボリューション法に基づき、標本Ｏ内における蛍光標識の３次元空間分布を算出し、電気的に接続された表示装置３１にその結果を表示する。
【００４８】
本実施例のスペクトラルブラインドデコンボリューションの手順は、図１０と図１１に示すように、ガルバノミラー２４でスキャンしながらラインセンサ２９からの分光強度信号を入力することにより分光画像を作成し（ステップ２０１）、複数の波長帯域を選択し（ステップ２０２）、選択した波長帯域を軸にして分光強度空間を作成し（ステップ２０３）、各波長帯域における分光画像各画素の値を分光強度空間にプロットし（ステップ２０４）、分光強度空間における各画素の分布から基線を求め（ステップ２０５）、各基線が相互に十分離れているかを判定し（ステップ２０６）、各基線が十分離れていないと判定された場合は、波長帯域の選択が不適切と判断し、ステップ２０２まで戻り、波長帯域の選択をやり直す。各基線が十分離れていると判断されると、基線近傍にある画素を選択し（ステップ２０７）、同一の基線上にある選択した画素の分光強度を平均し（ステップ２０８）、各基線上の画素の分光強度の平均値を各蛍光標識の発光スペクトルに設定し（ステップ２０９）、デコンボリューション法を用いて測定対象の発光スペクトルを蛍光標識の発光スペクトルに分解する（ステップ２１０）。
【００４９】
次いで、ブラインドデコンボリューション法を行うか否かを判断し（ステップ２１１）、行うと判断した場合は、各基線上の画素の分光強度の平均値を各蛍光標識の発光スペクトルの推定の初期値に設定し（ステップ２１２）、ブラインドデコンボリューション法を用いて測定対象の発光スペクトルを蛍光標識の発光スペクトルに分解し（ステップ２１３）、各蛍光標識の存在割合を決定し（ステップ２１４）、各蛍光標識の空間分布を表示装置に表示する（ステップ２１５）。また、ステップ２１１でブラインドデコンボリューション法を行う必要がないと判断された場合は、ステップ２１２とステップ２１３を省略する。
【００５０】
ここで、ステップ２１１でブラインドデコンボリューションを行う判断基準は、ステップ２０７において、基線近傍に余り画素が存在していない場合、又は、標本Ｏの自家蛍光が強い等、選択した画素の分光強度が実際の蛍光標識の発光スペクトルと良い一致を示さないと予想される場合は、ブラインドデコンボリューションを行うことが、計算精度上好ましい。その一方、基線上で選択した画素が、蛍光標識の正しい蛍光スペクトルを与えていると判断される場合は、ブラインドデコンボリューションを省略し、計算時間を短縮することができる。
【００５１】
このように、本実施例においては、基線の空間的な離れ方を判断基準にして波長帯域の選択の適切性を判断するようにしたため、より信頼度のおける各蛍光標識の発光スペクトルの設定が可能となる。さらに、本実施例においては、ブラインドデコンボリューションを行うことができるので、設定した各蛍光標識の発光スペクトルがノイズ等の影響を受けて不正確である場合にも、高精度な計算結果を得ることができる。さらに、本実施例においては、デコンボリューションを行った後にブラインドデコンボリューションを行うか選択することができるので、必要のない場合は、時間のかかるブラインドデコンボリューションの計算を省略して、効率良く計算結果を得ることができる。
【００５２】
以上、本発明の分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法を実施例に基づいて説明してきたが、本発明はこれら実施例に限定されず種々の変形が可能である。
【００５３】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明の分光画像から複数の固有スペクトル成分の存在割合を求める方法を用いると、推定された蛍光標識の発光スペクトルが実際の発光スペクトルに非常に近いと推定されるため、より高精度なスペクトラルデコンボリューション結果を得ることができるメリットがある。さらに、本発明においては、基線上の画素を略機械的に選択することができるので、再現性が良く、信頼のおけるスペクトラルデコンボリューション結果を得ることができるメリットがある。さらに、スペクトラルブラインドデコンボリューション法を用いる場合は、固有スペクトル成分の推定値の初期値がかなり高い精度で真の固有スペクトル成分に近いために、その後のブラインドデコンボリューションの計算が速く収束し、かつ、より精度の高い計算結果を得ることができるメリットがある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において２種類の蛍光標識を用いる場合に２つの波長を選択する方法を説明するための図である。
【図２】分光強度空間における各画素の強度の写像を説明するための図である。
【図３】３種類の蛍光標識を用いる場合に３つの波長を選択する方法を説明するための図である。
【図４】３種類の蛍光標識を用いる場合の分光強度空間を示す図である。
【図５】スペクトラルデコンボリューションを表す式（１）を示す図である。
【図６】スペクトラルブラインドデコンボリューションに用いる反復計算法を説明するためのフローチャートである。
【図７】本発明による第１実施例の蛍光顕微鏡の構成を示す図である。
【図８】本発明による第１実施例の方法の手順を示すフローチャートである。
【図９】本発明による第２実施例のレーザ顕微鏡の構成を示す図である。
【図１０】本発明による第２実施例の方法の手順を示すフローチャートの前半部である。
【図１１】本発明による第２実施例の方法の手順を示すフローチャートの後半部である。
【図１２】代表的な蛍光タンパクの励起波長と励起効率、発光波長と発光強度を示す図である。
【図１３】従来のスペクトラルデコンボリューションを用いる場合の手順を示すフローチャートである。
【符号の説明】
Ｏ…標本
１…光源
２…照明光学系
３…励起フィルタ
４…ダイクロイックミラー
５…対物レンズ
６…阻止フィルタ
７…結像レンズ
８…フィルタホイール
９…ＣＣＤカメラ
１０…コンピュータ
１１…表示装置
２１…レーザ光源
２２…コリメートレンズ
２３…ダイクロイックミラー
２４…一対のガルバノミラー
２５…対物レンズ
２６…結像レンズ
２７…共焦点ピンホール
２８…回折格子
２９…ラインセンサ
３０…コンピュータ
３１…表示装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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