(57)【要約】      （修正有）【課題】アンギオテンシン変換酵素阻害剤として用いることができる５つの新規ペプチドの提供。【解決手段】アンギオテンシン変換酵素阻害剤として用いることができる５つの新規ペプチドを開示する。この発明はアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有する生成物の製造方法も開示し、その方法は次の工程、（ａ）鶏かすの溶液に反応のためのタンパク質ヒドロラーゼを加える、（ｂ）工程（ａ）の反応後、鶏かすと液体とを分離し、分離された液体を収集する、及び（ｃ）工程（ｂ）から得られた液体を乾燥させて生成物を得る、を含む。【選択図】図１
2004182739.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有する新規ペプチドであって、
Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＩＬＰＰ）
であるペプチド。
【請求項２】
アンギオテンシン変換酵素阻害剤として用いられる請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドの製造方法であって、次の工程、
（ａ）鶏かすの溶液に反応のためにタンパク質ヒドロラーゼを加える、
（ｂ）工程（ａ）の反応後、鶏かす及び液体を分離し、分離された液体を収集する、
（ｃ）工程（ｂ）から得られた液体を乾燥して生成物を得る、及び
（ｄ）前記ペプチドを精製する、
を含む方法。
【請求項４】
前記タンパク質ヒドロラーゼがアルカラーゼである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記鶏かすを５０〜７０℃で１〜５時間加水分解する請求項３に記載の方法。
【請求項６】
さらに、鶏かすと液体とを加圧ろ過にかけ、前記分離された液体を濃縮する、工程（ｂ′）を含む請求項３に記載の方法。
【請求項７】
さらに、分子量カット−オフが１０，０００である膜を用いて限外ろ過を行う、工程（ｂ″）を含む請求項３に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドを含む、ＡＣＥの阻害に用いるための医薬。
【請求項９】
請求項１に記載のペプチドを含む、ＡＣＥの阻害に用いるための健康食品。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドを含む、ＡＣＥの阻害に用いるための食品添加剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は主にヒトの血管の内皮細胞、肺、腎臓及び脳に存在する。この酵素は、血管の収縮を引き起こし、血圧を上昇させるために、Ｃ末端から２つのアミノ酸（Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を切断することにより、不活性なアンギオテンシンＩを活性なアンギオテンシンIIに変換し得る。その間に、ＡＣＥは血管の軽減の機能を示すブラジキシンを不活性化し得る。したがって、ＡＣＥは血圧を上昇させることができる。
【０００２】
アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）のＡＣＥへの結合はアンギオテンシンIIの生成及びブラジキニンの不活性化を減少し得る。ＡＣＥＩを食品に加えると、高血圧症状を減少させるのにプラスの効果を引き起こすだろう。現在のところ、多くのペプチドがＡＣＥの阻害についての効果を有することが知られている。それらは異なったアミノ酸配列と長さを有する。ＡＣＥ阻害活性を有するポリペプチドは食品から単離できる。これらの食品は、動物または植物タンパク質、たとえば、カゼイン（丸山及び鈴木、１９８２）、コーンタンパク質（三好他、１９９１）、イワシの肉（松井他、１９９３）及びカツオ（松村他、１９９３）並びに発酵食品、たとえば、酒及びワイン残渣（斎藤他、１９９４）、大豆油（木下他、１９９３）、チーズ（岡本他、１９９５）及び発酵ミルク（中村他、１９９５）等の加水分解物を含む。
【０００３】
特許文献１（特開平５−８７０５２号公報）及び特許文献２（特開平２−１５４６９３号公報）はオリゴペプチドを含有する物質を開示する。非特許文献１（月刊「食品化学（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｎｔｈｌｙ）」１９９０年６月号第８０頁）も、血液中のトリグリセリドの濃度の低下を含む、脂質の代謝に改善された効果を有する特異的なオリゴペプチドを開示する。上記特許及び参考文献に記載されたオリゴペプチドを含有するこれらの物質はタンパク質加水分解物の混合物である。しかしながら、それらは、活性成分の混合物のアミノ酸配列を記載していない。ペプチドを含有する上記物質の純度は比較的低く、医薬として用いることができない。さらに、これらの物質が食品の中に含まれている時、食品に含まれている他のペプチドから定量的に検出するのが非常に困難である。これが、品質管理にいくらかの問題を引き起こすだろう。
【０００４】
特許文献３（特開平６−２９８７９４号公報）は、動物源及び植物源、たとえば、魚肉、豚及び鶏のタンパク質からのＡＣＥＩの製造方法を開示する。この方法はタンパク質ヒドロラーゼ、たとえば、サーモリシン、ペプシンまたはトリプシンを出発物質を分解するのに適切な培地及び適当な条件で利用する。加水分解物を遠心分離、ろ過、濃縮及び樹脂吸収にかけて、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを得る。特許文献４（特開平５−３３１１９２号公報）は、サーモリシンによりカツオブシを加水分解してＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを生成することを開示している。そのペプチドの配列は、Ｈ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−ＯＨである。特許文献５（特開平４−２６４０９８号公報）は、脂肪を含有しない鶏の肉からのＡＣＥ阻害活性を有するペプチドの製造を開示する。そのペプチドの配列はＧｌｎ−Ｌｙｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇである。特許文献６（米国特許第５，８５４，０２９号明細書）は、ＡＣＥ阻害活性を示す、ジペプチド、Ｔｙｒ−Ｐｒｏの製造方法を開示する。この方法においては、Ｔｙｒ−Ｐｒｏを含有するペプチド及び／またはタンパク質培地中でラクトバシラス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属をインキュベートして、多量のＴｙｒ−Ｐｒｏを含有するインキュベート溶液を得る。
【特許文献１】特開平５−８７０５２号公報
【特許文献２】特開平２−１５４６９３号公報
【非特許文献１】月刊「食品化学（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｎｔｈｌｙ）」１９９０年６月号第８０頁
【特許文献３】特開平６−２９８７９４号公報
【特許文献４】特開平５−３３１１９２号公報
【特許文献５】特開平４−２６４０９８号公報
【特許文献６】米国特許第５，８５４，０２９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記先行技術の中では、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを製造するために、動物のタンパク質、たとえば、魚肉、鶏または豚とは異なったヒドロラーゼ、分離及び精製方法を利用する。しかしながら、出発物質のコストはより高価である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願人は、鶏のエキスの製造により生産された廃棄物の加水分解及びさらなるヒドロラーゼを用いる廃棄物混合物の処理は、強力なＡＣＥ阻害活性を有する生成物を得ることができることを見い出した。この方法はコストが低く、鶏のエキスの副生物の価値を改善し得る。
本発明の主な目的は、ＡＣＥ阻害活性を有する新規なペプチドを提供することである。
本発明の他の目的は、ＡＣＥ阻害活性を有する生成物の製造方法を提供することである。この方法はタンパク質ヒドロラーゼを有する鶏かすの、ＡＣＥ阻害活性を有する生成物を得るための処理を含む。この生成物は健康食品に用いることができる。
【０００７】
ＡＣＥ阻害活性を有する本発明のペプチドは次の配列：
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（ＶＬＰ）、
Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（ＩＬＰ）、
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ＶＬＹ）、
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＶＬＰＰ）及び
Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＩＬＰＰ）
を有する。
【０００８】
これらのペプチドは天然物質から単離及び精製できるかまたは公知の化学合成方法で製造することができる。アミノ酸配列によると、それらは、そのペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を適切なベクターに入れて、クローン化させ、適切な宿主細胞中で発現させることによっても製造することができる。
【０００９】
本発明によると、鶏エキスを製造する過程から生産された廃棄物が出発物質として用いられる。それらは不完全に加水分解された鶏肉及び鶏骨かすである。前記物質に適当な量の水とタンパク質ヒドロラーゼを加えて、適当な反応条件で加水分解する。次いで、加水分解物とかすとを分離し、液体を収集する。得られた液体をさらなるろ過及び濃縮後、乾燥させて、粗生成物を得る。生成物を精製してペプチドを得る。そのペプチドのアミノ酸配列を配列決定機で決定する。そのペプチドを医薬、健康食品として用いることができるか、または食品に添加することができる。
【００１０】
本発明は、さらにＡＣＥ阻害活性を有する生成物の製造方法を開示し、それは次の工程、
（ａ）鶏かすの溶液に反応のためにタンパク質ヒドロラーゼを加える、
（ｂ）工程（ａ）の反応後、鶏かすと液体を分離させ、分離した液体を収集する、及び
（ｃ）工程（ｂ）から得られた液体を乾燥させて生成物を得る、
を含む。
【００１１】
本発明によると、この方法は出発物質として鶏のエキスを製造する方法から生産された廃棄物を利用する。その物質は不完全に加水分解された鶏肉及び鶏の骨かすである。これらの物質は鶏のエキスを製造する工場から得ることができる。その物質に適当な量の水とタンパク質ヒドロラーゼを加える。混合物を適当な反応条件下で反応させる。加水分解物とかすとを分離し、液体を収集する。得られた液体を、生成物を得るために、さらなるろ過及び濃縮後に乾燥させる。生成物をＡＣＥ阻害活性を示すために検出し、生成物は健康食品に広く用いることができるか、または食品添加物として用いることができる。加水分解生成物をさらに精製すると、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドが得られる。このペプチドは医薬として用いることができる。
【００１２】
工程（ａ）のタンパク質ヒドロラーゼは、タンパク質加水分解活性を有するもの、たとえば、サーモリシン、ペプシン、トリプシン、ブロメレイン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）、フレーバ−ザイム（Ｆｌａｖｏｒｚｙｍｅ）またはエスペラーゼ、ならいかなるものでもよく、好ましくはアルカラーゼである。
タンパク質ヒドロラーゼのための加水分解反応の温度及び時間は、選択したヒドロラーゼの種に依存する。たとえば、アルカラーゼを鶏かすの加水分解を進めるのに用いるなら、好ましい温度は約５０〜７０℃で、好ましい反応時間は約１〜５時間である。
【００１３】
加水分解後の加水分解物は、次いで液体とかすに分離する。一般に、分離は、当業者に既知の分離のいかなる操作工程によっても実施することができる。加水分解物を乾燥工程を容易にするために、さらに濃縮して水を除去することができる。たとえば、かすを含有する加水分解物をろ過袋に入れ、ろ液を収集するために遠心分離することができる。ろ液を珪藻土と混合し、加圧ろ過にかけ、そして真空濃縮することができる。
【００１４】
濃縮された加水分解物をさらに限外ろ過にかけて、高分子量の分子を除去することができる。この工程は、１００〜２０，０００の分子量カットオフを有する膜、好ましくは、１０，０００の分子量カットオフを有する膜を用いて膜ろ過を進行させる。
本発明に関係する乾燥工程は、当業者に既知のあらゆる方法、たとえば、凍結乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥機乾燥及び流動床乾燥、特に噴霧乾燥により達成できる。
【００１５】
乾燥後の生成物は健康食品に適用できるか、または食品添加剤として用いることができる。それらをさらに精製して、医薬として用いることができるペプチドを得ることができる。精製工程は、当業者に既知のあらゆる方法、たとえば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーによって達成できる。
本発明の１つの好ましい態様では、得られた生成物をさらに精製して、ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを得る。アミノ酸配列は、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（ＶＬＰ）、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（ＩＬＰ）、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ＶＬＹ）、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＶＬＰＰ）及びＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＩＬＰＰ）と決定される。
【００１６】
ＡＣＥ阻害活性を有する本発明のペプチドは既知の化学合成により製造することができる。たとえば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カーボイミダゾール法、酸化−還元法、ＤＣＣ−活性法〔たとえば、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ及びＬｕｈｋｅ「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ」ｖｏｌ．１（１９９６）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国，ニューヨーク州、または泉谷他「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」丸善株式会社（１９７５）参照〕。これらのペプチド合成法は、固相合成または液相合成のいずれかで実施することができる。側鎖官能基を有するアミノ酸、たとえば、チロシン及びトレオニン、は、好ましくは、それらの側鎖官能基において、既知の保護基、たとえば、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基またはベンジル基等で保護される。保護基は既知の任意の方法で除去できる。
【００１７】
次の例は、本発明の技術内容を具体化するために本発明の可能性の詳細な説明のためであって本発明の範囲を限定するためではない。従来技術の教示に基づいた当業者の本発明に対する任意の変更及び修正は本発明の範囲内である。
【実施例】
【００１８】
例１−加水分解鶏かすからのＡＣＥ阻害活性を有するペプチドの製造
５４kgの鶏の骨、４３．２kgの水、１６２ｇのニュートラーゼ、２７０ｇのプロタメックス（Ｐｒｏｔａｍｅｘ）、１６２ｇのポリリン酸塩及び３２ｇのトコフェロールの混合。混合物を６２℃で２時間加水分解する。７，４８０ｇの骨のかすを加水分解後に得る。加水分解物を遠心分離して１１，０６０ｇのろ液を得る。１１，０６０ｇのろ液を４倍の容積の水（４４，０００ｇ）で希釈し、１１０ｇのアルカラーゼを用いて６５℃で２．５時間再加水分解する。加水分解物を遠心分離して、ろ過かす６，６００ｇを得る。ろ液に１kgの珪藻土を加え、加圧ろ過で処理し、ブリックス２．０を有する再加水分解物を得る。噴霧乾燥を容易にするために、再加水分解物を濃縮し、分子量カットオフ１０，０００の膜を用いて限外ろ過する。本例は、混合物をブリックス１１．８まで濃縮し、次いで噴霧乾燥を進行させる。噴霧乾燥のための加水分解物は４，８５０ｇである。噴霧乾燥後、粉末３９１．４ｇを得る。
【００１９】
例２−ＡＣＥ阻害活性の決定方法
１．鶏の骨の加水分解物の再加水分解
例１から得られた鶏ろ液を２倍の容積の水で希釈し、混合し、５つの群に分割する。加水分解物の質量に基づいて、１％のブロメレイン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）、アルカラーゼ、フレーバーザイム、エスペラーゼ及び水を各群に加える。これらの混合物を６０℃で２．５時間反応させ、次いで、９０℃まで１０分間加熱して、酵素を不活化する。加水分解物を１０，０００ｇで２０分間遠心分離する。上方の溶液をＡＣＥ阻害活性の決定のために収集する。結果を表１に示す。ＩＣ50値はＡＣＥ活性の５０％阻害に対して必要なＡＣＥＩの濃度である。
【００２０】
２．ＡＣＥＩ活性の決定
（ａ）ＨＨＬ法
この方法はＣｕｓｈｍａｎ及びＣｈｅｕｎｇ「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」２０、１６３７（１９７１）の方法を修正したものである。８０μｌの加水分解物をＨＨＬインキュベート溶液に加える。インキュベート溶液は５mMのＨＨＬ（ヒップリル−ヒスチジル−ロイシン）及び０．１Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液中の０．３Ｍの塩化ナトリウムを含有する。この溶液を３７℃（予備加熱）で５分間インキュベートする。２０μｌの０．１Ｕ／ml  ＡＣＥ溶液を前記溶液に加え、３７℃で３０分間インキュベートする。溶液に１Ｎの塩化水素酸を加える。次いでこの溶液を１．７mlの酢酸エチルで抽出する。次いで、有機部分を真空乾燥にかける。乾燥粉末を１mlの水に再溶解する。吸収値をＵＶ２２８mmで測定する。
【００２１】
鶏の再加水分解物のタンパク質濃度は当業界で既知であるミクロ−ビウレット法により決定される。再加水分解物溶液は別々に５０，１００，２００，３００及び４００容積の上記５つの濃度まで希釈される。回帰曲線を対数関数としてプロットし、ＩＣ50値を対数関数から決定した。
【００２２】
ｂ）シグマキット法
この方法はシグマキットのマニュアルを修正する。０．０５mlの脱イオン水（対照のための）または０．０５mlの試料（試験のため）を１mlの反応溶液（ＡＣＥ基質）に加える。０．０５mlの検量溶液（豚ＡＣＥ）を前記溶液に加える。溶液を３７℃で５分間置く。３４０nmでの吸収値を決定する（この値を初期Ａ値という）。この測定後、この混合物を水浴に置き直す。５分後、吸収値を再び測定する（この値を最終Ａ値という）。得られたこれらの値を次のように計算する。
【００２３】
【数１】
2004182739.tif 000003
【００２４】
【表１】
2004182739.tif 000004
【００２５】
表１に示された結果から、ＡＣＥ阻害活性のＩＣ50値をＨＨＬ法で測定するかあるいはシグマキット法で測定するかのいずれにせよ、再加水分解物の活性のオーダーは同一であることが分かる。アルカラーゼにより製造された再加水分解物生成物は最も顕著な活性を有する。
【００２６】
例３−限外ろ過の方法
さらに、再加水分解物を精製し、噴霧乾燥による生成物の製造を容易にするために、限外ろ過を実施して生成物を濃縮する。選択された限外ろ過膜は、それぞれ、１０，０００及び５００のカットオフ分子量を有するものである。再加水分解物を１０，０００及び５００のカットオフ分子量を有する膜を用いて順にろ過する。透析物のＡＣＥ阻害活性を上記方法で決定する。結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】
2004182739.tif 000005
【００２８】
上表から、１０，０００のカットオフ分子量を有する膜は高分子量を有する物質（すなわち、短い保留時間のもの）を除去できる。５００の分子量カットオフを有する膜を用いる限外ろ過の前後の物質の有意な差を観察する。より低分子量でより純粋な物質が得られる。表２に示されたＩＣ50値との比較で、１０，０００のカットオフ分子量を有する膜を通過する物質はより顕著なＡＣＥ阻害活性を有する。５００のカットオフ分子量を有する膜については、限外ろ過の前後の物質の活性は有意な差はない。したがって、１０，０００の分子量カットオフを有する膜を用いる再加水分解物の処理は、高分子量の物質の部分及び再加水分解物の沈澱を除去し、かつ、再加水分解物のＩＣ50値を効果的に増加し得る。
【００２９】
例４−ペプチドの精製
１ｇの前に噴霧乾燥した粉末を５０mlの水に溶解する。溶液を０．４５μの遠心管でろ過し、精製し、次の工程により特徴づける。
１．サイズ排除カラムを最初の分離段階で用いる。
条件は次のとおりである。
システム：ＡＫＴＡ精製機
分離カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ  １０３０
移動相：０．５μｌ
溶離液：５％のアルコール水溶液
流量：０．５ml／分
検出器：２１４、２５４及び２８０nmでの検出
結果を図１に示す。
【００３０】
上記の画分を、繰り返し、１０回収集する。収集した溶液をＳｐｅｅｄ  Ｖａｃを用いて凍結乾燥する。画分２，３及び４の総乾燥質量は、それぞれ、０．０５４、０．１４３及び０．０１９mgである。３つの画分を水に２回再溶解し、２つの濃度、１mg／ml及び１０mg／mlに配合する。１mg／ml溶液をＡＣＥ阻害活性の決定のために用いる。１０mg／ml溶液を精製のために用いる。画分２，３及び４（１mg／ml）をシグマキットにより、０％、４６．６９％及び２７．７１％のＡＣＥ阻害活性を有すると決定する。画分３（この後、Ａ３という）を次の精製に進める。
【００３１】
２．ＲＰ１８カラムを第２段階で用いる。条件は次のとおりである。
システム：ＡＫＴＡ精製機
分離カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ  ＰＲ−１８（７μｍ）予備装てんカラムＲＴ２５０−２５
移動相：５０００μｌ
溶離液Ａ１：０．１％のＴＦＡを含有する水
溶離液Ｂ１：０．１％のＴＦＡを含有するメタノール
グラジエント：０．５容積のカラム中で用いる０％のＢ１
３容積のカラム中で用いる０〜１００％のＢ１
１．２容積のカラム中で用いる１００％のＢ１
流量：０．５ml／分
検出器：２１４，２５４及び２８０nmを用いる検出
結果を図２に示す。
【００３２】
図２の結果を５つの画分に分離できる。５つの画分を３回収集し、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃで乾燥する。乾燥固体物質の質量は、それぞれ、０．００８５、０．０２２２、０．０３０３、０．０４３２及び０．０２１４である。前の操作と同様に、５つの画分を１mg／mlの溶液に配合し、ＡＣＥ阻害活性の決定に用いる。１０mg／mlの溶液を精製に用いる。５つの画分のＡＣＥの阻害をシグマキットにより決定する。結果は次のとおりである：
【００３３】
【表３】
2004182739.tif 000006
【００３４】
表３から、画分Ａ３−Ｂ４は最も顕著なＡＣＥ阻害活性を有することが理解できる。したがって、画分Ａ３−Ａ４をさらに精製する。
【００３５】
３．分析クラスのＲＰ１８カラムを第３段階で用いる。
条件は次のとおりである。
システム：ＡＫＴＡ精製機
分離カラム：Ｓｅｐｈａｓｉｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＲＰ−１８（５μｌ）ＳＴ４，６／２５０
移動相：１００μｌ
溶離溶液Ａ１：０．１％のＴＦＡを含有する水
溶離溶液Ｂ１：０．１％のＴＦＡを含有するメタノール
グラジエント：２容積のカラム中で用いる０％のＢ１
１０容積のカラム中で用いる０〜１００％のＢ１
３容積のカラム中で用いる１００％のＢ１
流量：０．６ml／分
検出器：２１４、２５４及び２８０nmを用いる検出
結果を図３に示す。
【００３６】
図３の結果を８つの画分に分離できる。８つの画分を１５回収集し、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃを用いて真空乾燥する。８つの画分をＡＣＥ阻害活性の決定のために１mg／mlの溶液に配合する。１０mg／mlの溶液を精製に用いる。８つの画分のＡＣＥ阻害は次のとおりである。
【００３７】
【表４】
2004182739.tif 000007
【００３８】
表４は画分Ａ３−Ｂ４−Ｃ６が最も顕著なＡＣＥ阻害活性を有することを表わしている。したがって、画分Ａ３−Ｂ４−Ｃ６をさらに精製する。
【００３９】
４．分析クラスのＣ−１８カラムを第４段階に用いる。条件は次のとおりである。
システム：ＡＫＴＡ精製機
分離カラム：Ｓｅｐｈａｓｉｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＲＰ−１８（５μｌ）ＳＴ４．６／２５０
移動相：１００μｌ
溶離液Ａ１：０．１％のＴＦＡを含有する水
溶離液Ｂ１：０．１％のＴＦＡを含有するエチルニトリル
グラジエント：１容積のカラム中で用いる１０％のＢ１
５容積のカラム中で用いる１０〜３０％のＢ１
４容積のカラム中で用いる３０〜６０％のＢ１
２容積のカラム中で用いる６０〜１００％のＢ１
１容積のカラム中で用いる１００％のＢ１
流量：１ml／分
検出器：２１４、２５４及び２８０nmを用いる検出
結果を図３に示す。
【００４０】
図４における５つのより明らかなピークをＡ３−Ｂ４−Ｃ６−Ｄ１〜Ｄ５という。それらの配列を配列決定機で決定する。５つの短鎖ペプチド、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（ＶＬＰ）、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（ＩＬＰ）、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ＶＬＹ）、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＶＬＰＰ）及びＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏが得られる。それらのＡＣＥ阻害活性（ＩＣ50）を決定する。結果を表５に示す。
【００４１】
【表５】
2004182739.tif 000008
【００４２】
例５−動物試験
７週令の２０匹の雄のＳＨＲ／Ｎ（自然の高血圧ラット：岡本−青木ＳＨ／Ｎ）ラットを購入した。ラットをステンレス製のケージの中で粉末餌で飼育した。８週令のラットを１グループ６〜７匹のラット（体重約１５７ｇ）の３つのグループにランダムに分割した。３つのグループを通常の餌（対照）、１％のＡＣＥＩ及び３％のＡＣＥＩで飼育した。これらのラットは食物と水に自由にアクセスできた。ケージを温度２４±１℃、相対湿度５０〜７０％に保った。試験の期間は１７週である。試験の期間中、体重及び血圧を１〜２週毎に記録した。
【００４３】
ラットの収縮期の血圧及び心拍数をプログラムされた電気フィゴマノメーター（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｇｏｍａｎｏｍｅｔｅｒ，ＰＢ９８Ａ，Ｓｏｒｔｒｏｎ）により測定した。結果を図５及び６に示す。
図５はＡＣＥＩを含有する餌で飼育することによる自然高血圧ラットの成長を示す。３グループのラットの体重は時間の増加とともに増加する。３グループの中に有意の差はない。餌の量は有意な差がない（対照のための餌の消化量は１％ＡＣＥＩ及び３％ＡＣＥＩグループは、それぞれ、２０．１±１．５、２０．３±１．７、１９．６±１．３ｇである）。結果はＡＣＥＩ粉末の添加は食欲及び成長のいずれにも影響しないことを示している。
【００４４】
図６は、ＡＣＥＩを含有する餌で飼育することによる自然高血圧ラットの血圧の変化を示す。全体として、自然発生高血圧ラットの血圧は年とともに次第に増加する。ラットをＡＣＥＩで飼育しないなら、血圧は約２００mmHgに増加するとき、安定値に維持し得る。８週間、ＡＣＥＩで飼育したラット（１６週令）の血圧は、わずかに制御されるが、対照の血圧と異ならない。１５週後、ＡＣＥＩで飼育されたラットの血圧は対照の血圧より有意に低い（Ｐ＜０．０５）。１％及び３％のＡＣＥＩで飼育されたラットの血圧は、それぞれ、１４及び２５mmHg低下する。この傾向はラットが２４週令になるまで続く。これは、長期間の再加水分解物の消化は、全く、血圧の低下に生理学的な効能を示すことを示している。投与を増加すればするほど、血圧の低下に有意な効能を示す。ＡＣＥＩでの１週間の飼育の終りに、血圧の低下効能は、さらにある期間なお続くかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】サイズ排除カラムを用いることによる本発明により製造された第１段階のペプチドの単離の結果を示す。
【図２】ＲＰ１８カラムを用いることによる本発明により製造された第２段階のペプチドの精製の結果を示す。
【図３】分析クラスのＣ−１８カラムを用いることによる本発明により製造された第３段階のペプチドの精製の結果を示す。
【図４】やはり、分析クラスのＣ−１８カラムを用いることによる本発明により製造された第４段階のペプチドの精製の結果を示す。
【図５】ＡＣＥＩを含有する餌で飼育された自然高血圧ラットの成長を示す。
【図６】ＡＣＥＩを含有する餌で飼育された自然高血圧ラットの血圧の変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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