(57)【要約】【課題】微生物汚染の確認を効率的かつ正確に行うこと。【解決手段】微生物増殖培地に試料を添加して一定時間培養した後、この培地のＡＴＰ濃度を測定し、この測定結果に基づき試料の微生物汚染を確認する。抽出工程によってＡＴＰを抽出した試料に、発光試薬（ルシフェリン、ルシフェラーゼ、Ｍｇ2+）を添加して、試料中のＡＴＰと発光試薬とを反応させる。次いで、この反応により発生した光を光センサーで一定時間（例えば３０秒間）計測する。そして、この測定結果から得られる発光量に対するＡＴＰ濃度を計量線から読み取り、試料中に含まれる微生物中のＡＴＰ量を測定する。尚、前記ＡＴＰ濃度を測定するにあたり、培地からのＡＴＰ抽出の際、当該培地を超音波処理することで、カビ類を含む微生物の汚染確認がより正確となる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物増殖培地に試料を添加して一定時間培養した後、この培地のＡＴＰ濃度を測定し、この測定結果に基づき試料の微生物汚染を確認することを特徴とする微生物汚染試験方法。
【請求項２】
前記微生物は、大腸菌群、一般細菌またはカビ類であること
を特徴とする請求項１記載の微生物汚染試験方法。
【請求項３】
前記培養の時間は、１５時間以上であること
を特徴とする請求項１または２記載の微生物汚染試験方法。
【請求項４】
前記ＡＴＰ濃度を測定するにあたり、培地からのＡＴＰ抽出の際、当該培地を超音波処理すること
を特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の微生物汚染試験方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＡＴＰ指標を利用した食品の衛生管理に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
食品の検査方法はその大要が食品衛生検査指針として集約され、食品の細菌学的成分規格として、食品別に細菌数及び大腸菌群数が規格化されている。さらに、都道府県で食品項目別に、生菌数、大腸菌群数、腸炎ビブリオ、黄色ブドウ球菌、サルモネラ菌等の細菌数の指導基準を設けて行政指導を行っている。尚、これらの検査法は、いずれも培養法である（例えば非特許文献１参照）。
【０００３】
【非特許文献１】
石関忠一，「医薬品・化粧品の微生物汚染試験法（第２報）」，医薬品研究，１９７３，４（２），１７５
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
検査法が培養法であるため、検査結果がでるまでには数日を要する。また、計数する場合には、大抵の場合、試験者が目視によって細菌のコロニー（集落）を計測するため、正確であると言い難い。
【０００５】
本発明は、かかる事情に鑑みなされたもので、その目的は、微生物汚染の確認を効率的かつ正確に行う微生物汚染試験方法の提供にある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために、本発明は以下のことを特徴とする。
【０００７】
請求項１記載の発明は、微生物汚染試験方法であって、微生物増殖培地に試料を添加して一定時間培養した後、この培地のＡＴＰ濃度を測定し、この測定結果に基づき試料の微生物汚染を確認することを特徴とする。
【０００８】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の微生物汚染試験方法において、前記微生物は、大腸菌群、一般細菌またはカビ類であることを特徴とする。ここで、一般細菌とは、中温性好気性菌を意味する。
【０００９】
請求項３記載の発明は、請求項１または２記載の微生物汚染試験方法において、前記培養の時間は１５時間以上であることを特徴とする。
【００１０】
請求項４記載の発明は、請求項１から３のいずれか１項に記載の微生物汚染試験方法において、前記ＡＴＰ濃度を測定するにあたり、培地からのＡＴＰ抽出の際、当該培地を超音波処理することを特徴とする。
【００１１】
従来の微生物汚染検査法は、培養法に基づくもので、試験者が目視によって細菌のコロニー（集落）を計測するため、正確性に欠けるが、請求項１から４記載の微生物汚染試験方法は、微生物汚染の指標にＡＴＰ濃度を採用しているので、短時間で再現性よく微生物汚染の確認ができる。また、ＡＴＰ濃度測定は、市販の試薬キット及び発光測定装置を用いればよい。したがって、試料の簡易的かつ大量分析が可能となる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、図面に基づき本発明の実施形態について述べる。
【００１３】
図１は本発明の検査プロセスの概略説明図で、図２はＡＴＰ濃度測定の基本原理の概略説明図である。
【００１４】
１．基本原理
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は、生物が生活するために、必要な代謝活性物質で、生きている微生物には必ず存在し、死んでいる微生物には存在しない。しかも、ＡＴＰという物質は、微生物の活性が高いほど多く含まれていることがわかっている。図２に示したように、ＡＴＰは、ルシフェラーゼ（酵素）、酸素、マグネシウムイオンの存在下で、ルシフェリン（発光物質）と反応して光を放出する。この反応において、理論的には、ＡＴＰ１分子に対して光が１個放出される。そして、微生物のＡＴＰ含有量は生物種によりやや異なるが、凡そどのような微生物でも、乾燥重量１ｇ当り１／１０００グラムの割合でＡＴＰをもっていることがわかっている。したがって、光の個数（発光量）を計測すれば、ＡＴＰの個数（濃度）すなわち微生物量（微生物の活性度）を求めることができる。
【００１５】
本発明の検査では、大腸菌類、一般細菌類またはカビ類の汚染確認ができる。これは、食品の検査法はその大要が食品衛生検査指針として集約され、食品の細菌学的成分規格として、食品別に細菌数、大腸菌群数が規格化されていることに基づくものである。尚、一般細菌とは、中温性好気性菌を意味する。
【００１６】
２．検査プロセス
（１）試料調製  乾熱滅菌処理したアルミ管付試験管に、計り採った試料を無菌的に投入する。このとき、試料は滅菌処理蒸留水によって適宜希釈処理される。次に、乾熱滅菌処理した三角フラスコに、オートクレーブで滅菌処理した増殖培地を無菌的に所定量投入する。次いで、この三角フラスコに前記試験管から所定量の試料を無菌的に投入し、試料と培地を攪拌混合する。そして、この三角フラスコを培養器（インキュベータ）に供し、所定の温度のもと、一定時間、静置培養する。尚、増殖培地としては、例えばＳＣＤ培地（ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス培地（大日本製薬製）等がある。また、培養時間は、１５時間以上に設定される。
【００１７】
（２）発光量測定  発光量の測定は、ＡＴＰ抽出工程と発光反応工程とデータ処理工程とを有する（図１参照）。
【００１８】
１）ＡＴＰ抽出工程  微生物（大腸菌類、一般細菌類、カビ類）の体内にはＡＴＰが存在しているため、試料中のＡＴＰ濃度を調べることで、試料の微生物汚染を確認できる。この工程では、ＡＴＰをルシフェリンやルシフェラーゼと反応できるようにするため、試料中からＡＴＰを抽出する。すなわち、採取した試料にトリクロロ酢酸を主成分とした抽出試薬を添加して、ＡＴＰを抽出する。このとき、生物発光反応に及ぼす影響を最小限に抑えるために、希釈液が添加される。前記希釈液としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含むトリス緩衝液等がある。
【００１９】
また、カビ類を含む微生物の汚染を確認する場合は、試料を超音波処理するとよい。カビは通常フロック状態で存在するので、ＡＴＰの抽出効率が悪く、カビの菌体数とＡＴＰ濃度とに相関性が得られない。したがって、試料中のカビの汚染が確認できない場合がある。そこで、ＡＴＰを抽出する前に、試料を一定時間超音波処理することで、カビのフロックは分散されるので、試料のカビの汚染を正確に確認できる。尚、超音波処理時間は、概ね３分とするとよい。
【００２０】
２）発光反応工程  前記抽出工程によってＡＴＰを抽出した試料に、発光試薬（ルシフェリン、ルシフェラーゼ、Ｍｇ2+）を添加して、試料中のＡＴＰと発光試薬とを反応させる。そして、この反応により発生した光を光センサーで一定時間（例えば３０秒間）計測する。光センサーは、光電子増倍管を備えたものを用いる。尚、ＡＴＰ測定試薬キット及び光センサーは、市販のものでよい。例えば、ＡＴＰ測定試薬キットとしては、ルシフェールＡＳ（明電舎製）等がある。また、光センサーとしては、ルミノメータＵＰＤ−４０００（明電舎製）等がある。
【００２１】
３）データ処理工程  種々の濃度に調製した既知濃度のＡＴＰ溶液（ＡＴＰ標準液）を測定し、標準曲線（検量線）を作成する。そして、試料の測定結果から得られる発光量に対するＡＴＰ濃度を計量線から読み取り、試料中に含まれる微生物中のＡＴＰ量を測定する。これにより、微生物の汚染度が確認できる。
【００２２】
以上述べた実施形態の実施例を以下に示す。
【００２３】
（実施例１）試料中のカビ類汚染の確認
図３は、大腸菌（Escherichia coli 1649T）とＡＴＰ濃度の関係を示した特性図。本実施例では、試料０．２５ｍｌに５％のトリクロロ酢酸を主成分とした抽出試薬０．２５ｍｌを混合し、さらに生物発光反応に及ぼす影響を最小限に抑えるために、希釈液（４×１０-3ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡを含む０．１ｍｏｌ／ｌのトリス緩衝液、ｐＨ７．７５）４．５ｍｌを添加した。発光反応工程では、抽出操作によりＡＴＰを抽出した試料（ＡＴＰ抽出液）５ｍｌから０．５ｍｌを分取して、これに発光試薬（ルシフェリン、ルシフェラーゼ、Ｍｇ2+）０．５ｍｌを添加して、試料中のＡＴＰと発光試薬とを反応させた。
【００２４】
図示された結果から明らかなように、大腸菌数（個／ｍｌ）とＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｌ）の関係は比例関係にあり、試料のＡＴＰ濃度から大腸菌類の汚染を確認することができる。
【００２５】
（実施例２）試料中の一般細類汚染の確認
図４は、Pseudomonas fluorescens IAM12022の菌数（個／ｍｌ）とＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｌ）の関係を示した特性図である。また、図５は、Ｂacillus megaterium IAM1166の菌数（個／ｍｌ）とＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｌ）の関係を示した特性図である。一般細菌は、グラム陰性菌とグラム陽性菌に大別される。ここでは、グラム陰性菌にPseudomonas fluorescens IAM12022、グラム陽性菌にBacillusmegaterium IAM1166を選定したこと以外は、実施例１と同じ測定操作とした。図４及び図５に示された結果から明らかなように、グラム陰性菌及びグラム陽性菌とＡＴＰ濃度との関係が比例関係にあり、試料のＡＴＰ濃度からグラム陰性菌数及びグラム陽性菌数すなわち一般細菌数の汚染を確認することができる。
【００２６】
（実施例３）試料中のカビ類汚染の確認
図６は、カビ（Asperillus oryzae）の菌体数とＡＴＰ濃度の関係を示した特性図である。ここでは、試供菌体にAsperillus oryzaeを選定し、試料に超音波を３分間照射した後、ＡＴＰの抽出したこと以外は、実施例１と同じ測定操作とした。図示された結果から明らかなように、菌体数とＡＴＰ濃度の関係が比例関係にあり、ＡＴＰ濃度からカビ類の汚染を確認することができる。
【００２７】
（実施例４）培養による大腸菌数変化
図７は、培養による大腸菌数の経時的変化を示した特性図である。ここでは、標準大腸菌株（Escherichia coli 1649T）を滅菌済みの生理食塩水で希釈した後、数個／ｍｌ、数十個／ｍｌ、数百個／ｍｌに調製して、それぞれ増殖培地（ＳＣＤ培地（ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス培地，大日本製薬製））で１０時間、２０時間及び４０時間培養した後にＡＴＰ濃度を測定したこと以外は、実施例１と同じ測定操作とした。図示された結果から明らかなように、初期大腸菌数が数個／ｍｌであっても、約１５時間以上培養すれば、大腸菌数は１０9個／ｍｌ程度まで増加し、ＡＴＰ濃度が定量できることがわかる。
【００２８】
（実施例５）培養による一般細菌数変化
図８は、Pseudomonas fluorescens IAM12022の菌体数の経時的変化を示した特性図である。また、図９は、bacillus megaterium IAM1166の菌体数の経時的変化を示した特性図である。ここでは、グラム陰性菌にPseudomonas fluorescens IAM12022、グラム陽性菌にbacillus megaterium IAM1166を選定し、それぞれの細菌を滅菌済みの生理食塩水で希釈した後、数個／ｍｌ、数十個／ｍｌ、数百個／ｍｌに調製し、この各調製液を各増殖培地（ＳＣＤ培地）に添加した後、１０時間、２０時間及び４０時間培養してからＡＴＰ濃度を測定した以外は、実施例１と同じ測定操作とした。図８及び図９の結果から明らかなように、初期の一般細菌数が数個／ｍｌであても、約１５時間以上培養すれば、一般細菌数が１０9個／ｍｌ程度まで増加し、ＡＴＰ濃度が定量できることがわかる。
【００２９】
（実施例６）培養によるカビの菌体数変化
図１０に、カビの菌体数の経時的変化を開示した。ここでは、試供菌体にAsperillus oryzaeを選定し、数個／ｍｌ、数十個／ｍｌ、数百個／ｍｌに調製して、それぞれの細菌を滅菌済みの生理食塩水で希釈した後、この各調製液を各増殖培地（ＳＣＤ培地（ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス培地，大日本製薬製））で１０時間、２０時間及び４０時間培養した後にＡＴＰ濃度を測定したこと以外は、実施例１と同じ測定操作とした。図に示された結果から明らかなように、初期の菌体数が数個／ｍｌであても、約１５時間以上培養すれば、菌体数が１０9個／ｍｌ程度まで増加し、ＡＴＰ濃度が定量できることが確認できる。
【００３０】
（実施例７）カビ菌体中のＡＴＰ測定に及ぼす超音波照射の効果
図１１は、超音波照射時間と増殖培地（ＳＣＤ培地（大日本製薬製））で一定時間培養した後の菌体数との関係（実線）及びＡＴＰ濃度の関係（破線）を示したものである。ここでは、超音波でフロックを分散させた場合のカビ数とＡＴＰ濃度の関係について検討した。試供菌体はAsperillus oryzaeを選定し、培養時間は１７時間とした。図示された結果から明らかなように、３分間程度の超音波照射すれば、カビ菌体のフロックが分散し、ＡＴＰ濃度を正確に測定できることが確認できる。
【００３１】
（実施例８）カビ菌体中のＡＴＰ測定に及ぼす超音波照射の効果
図１２は、超音波照射時間と増殖培地（ＳＣＤ培地（大日本製薬製））で一定時間培養した後の菌体数との関係（実線）及びＡＴＰ濃度の関係（破線）を示したものである。ここでは、試供菌体にAsperillus nigerを選定し、培養時間は１７時間とした。図示された結果から明らかなように、３分間程度の超音波照射すれば、カビ菌体のフロックが分散し、ＡＴＰ濃度を正確に測定できるが確認できる。
【００３２】
（実施例９）香料中の微生物汚染検査
実際の食品中の衛生管理がＡＴＰ指標で可能かどうかを調べるために、１７種類の香料についてＡＴＰ濃度の測定を行った。培養時間は、１日の内で通常、夕方に製品が製造されることが多いと想定されるので、夕方４時から就業時間が開始される翌日の朝９時までの、１７時間とした。以下に実験条件を記載した。
【００３３】
培養時間  １７時間
培    地  増殖培地（ＳＣＤ培地（大日本製薬製））
培    養  ３０℃のもとで静置培養
希釈倍率  試料１ｍｌ／培地５０ｍｌ
１）試料調製  乾熱滅菌処理したアルミ管付試験管に、オートクレーブで滅菌処理した蒸留水を５ｍｌ入れたものを１８本（ブランク１本を含む）用意した。各試験管には、試料名または番号をラベルした。そして、各試料（１７本）を天秤で５ｇ秤量し、それぞれの試験管に入れて、試験管ミキサー（ボルテックスミキサー）で１０秒間程度攪拌した。また、乾熱滅菌処理した１００ｍｌの三角フラスコを１８個用意して、予め調製したオートクレーブで滅菌ずみの増殖培地（ＳＣＤ培地）をそれぞれの三角フラスコに５０ｍｌづつ分取した。そして、各三角フラスコに、試料を１ｍｌづつを入れ、各試料とＳＣＤ培地とを混和した。
【００３４】
２）発光量測定  次に、前記の各三角フラスコを３０℃のもと１７時間静置培養した後、ＡＴＰ測定試薬キット（ルシフェールＡＳ（明電舎製））を使用して、生物発光・化学発光測定装置（ルミノメータＵＰＤ−４０００（明電舎製））で３０分間の発光量を計測した。
【００３５】
図１３は、一般生菌数とＡＴＰ濃度の関係を示したものである。特に、１７種類の香料について、一般細菌数、大腸菌群数及びカビ菌体数を手分析で測定した結果のうち、一般細菌数と、一般細菌、大腸菌群及びカビ類の合計に含まれるＡＴＰ濃度の関係を示したものである。
【００３６】
１７種類の香料について、一般細菌数、大腸菌群数及びカビ菌体数を手分析で測定した結果、一般細菌数は５種類が０個／ｍｌで、残り１２種類が４０〜６２００個／ｍｌであった。大腸菌群数は１７種類全てが０個／ｍｌであった。また、カビ菌体数は１５種類が０個／ｍｌで、残り２種類がそれぞれ１０個／ｍｌと１３個／ｍｌであった。
【００３７】
図１３に示された結果から明らかなように、ＡＴＰ濃度が１．０×１０-9ｍｏｌ／ｌ以下であれば、一般細菌数、大腸菌群数及びカビ菌体数のいずれも存在しないと判断できることが確認できる。
【００３８】
以上のように、従来の培養法では、測定結果がでるまでに、一般細菌数と大腸菌群数は２日間、カビ菌体数は５日間を要したが、本発明の微生物汚染試験法によると、ＡＴＰを指標とすることにより、２０時間程度の短時間で微生物汚染の確認が可能となる。したがって、ＡＴＰ指標が食品等の衛生管理に適用できると考えられる。
【００３９】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明は以下の効果を奏する。
【００４０】
従来の微生物汚染試験方法では、測定結果がでるまでに、一般細菌数と大腸菌群数が２日間、カビ数が５日間要していたが、本発明の微生物汚染試験方法は、ＡＴＰ指標を採用しているので、２０時間程度の短時間で食品の微生物汚染の確認ができる。
【００４１】
また、培養法は操作が煩雑であり試料の大量分析が困難であるが、本発明は、市販の試薬キット及び発光測定装置を用いればよいので、試料の簡易的かつ大量分析が可能となる。
【００４２】
従来の微生物汚染検査法は、培養法に基づくもので、試験者が目視によって細菌のコロニー（集落）を計測するため、正確性に欠けるが、本発明は再現性よくＡＴＰを測定することができる。
【００４３】
このように、本発明によれば微生物の汚染度を効率的かつ正確に把握できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の検査プロセスの概略説明図。
【図２】ＡＴＰ濃度測定の基本原理の概略説明図。
【図３】大腸菌（Escherichia coli 1649T）とＡＴＰ濃度の関係を示した特性図。
【図４】細菌（Pseudomonas fluorescens IAM12022）の菌数（個／ｍｌ）とＡＴＰＰ濃度（ｍｏｌ／ｌ）の関係を示した特性図。
【図５】細菌（Bacillus megaterium IAM1166）の菌数（個／ｍｌ）とＡＴＰ濃度（ｍｏｌ／ｌ）の関係を示した特性図。
【図６】カビ（Asperillus oryzae）の菌体数とＡＴＰ濃度の関係を示した特性図。
【図７】培養による大腸菌数の経時的変化を示した特性図。
【図８】細菌（Pseudomonas fluorescens IAM12022）の菌体数の経時的変化を示した特性図。
【図９】細菌（Bacillus megaterium IAM1166）の菌体数の経時的変化を示した特性図。
【図１０】菌体数の経時的変化を示した特性図。
【図１１】超音波照射時間と増殖培地で１７時間培養した後のカビ（Asperillus oryzae）菌体数との関係（実線）及びＡＴＰ濃度の関係（破線）を示した特性図。
【図１２】超音波照射時間と増殖培地で１７時間培養した後のカビ（Asperillus niger）菌体数との関係（実線）及びＡＴＰ濃度の関係（破線）を示した特性図。
【図１３】香料中の一般生菌数とＡＴＰ濃度の関係を示した特性図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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