(57)【要約】【課題】脳の機能を低下させることなくグリオーマの進展防止及び治療を行う方法が求められている。又、グリオーマ細胞に対して分化を誘導するような薬剤はこれまで知られていない。【解決手段】グリオーマ細胞に対し分化誘導作用を有するレクチンを有効成分とするグリオーマ治療剤及びグリオーマ細胞分化誘導剤または増殖抑制剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリオーマ細胞に対し分化誘導作用を有するレクチンまたは抗体を有効成分とするグリオーマ治療剤。
【請求項２】
レクチンがアスパラギン結合型多分岐糖鎖及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの直列の繰り返し構造を有する糖鎖に結合する蛋白質である請求項第１項に記載のグリオーマ治療剤。
【請求項３】
レクチンがＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２）Ｍａｎを含むアスパラギン結合型多分岐糖鎖及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの直列の繰り返し構造を有する糖鎖に結合する蛋白質である請求項第１項に記載のグリオーマ治療剤。
【請求項４】
レクチンがチョウセンアサガオレクチン（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、インゲン豆レクチン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｌｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）又はトマトレクチン（ｔｏｍａｔｏ  ｌｅｃｔｉｎ）のいずれかである請求項第１項に記載のグリオーマ治療剤。
【請求項５】
グリオーマ細胞に対し分化誘導作用を有するレクチンまたは抗体を有効成分とするグリオーマ細胞の分化誘導剤または増殖抑制剤。
【請求項６】
レクチンがアスパラギン結合型多分岐糖鎖及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの直列の繰り返し構造を有する糖鎖に結合する蛋白質である請求項第５項に記載のグリオーマ細胞の分化誘導剤または増殖抑制剤。
【請求項７】
レクチンがＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２）Ｍａｎを含むアスパラギン結合型多分岐糖鎖及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの直列の繰り返し構造を有する糖鎖に結合する蛋白質である請求項第５項に記載のグリオーマ細胞の分化誘導剤または増殖抑制剤。
【請求項８】
レクチンがチョウセンアサガオレクチン（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、インゲン豆レクチン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｌｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）又はトマトレクチン（ｔｏｍａｔｏ  ｌｅｃｔｉｎ）のいずれかである請求項第５項に記載のグリオーマ細胞の分化誘導剤または増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリオーマ（神経膠腫）細胞に対し分化誘導作用を有するレクチンを用いたグリオーマ治療剤及びグリオーマ細胞分化誘導剤または増殖抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
悪性グリオーマは、癌の中でも治療が困難なものの一つであり、近年の外科的治療・放射線治療の技術の進歩にも拘わらず予後はよくない。グリオーマは、一般的に非常に悪性度が高く、神経軸索に沿って広範囲に広がってしまい、更に、グリオーマは周囲の正常組織との間に明確な境界を持たないことが多い。この結果、グリオーマは周囲の脳組織に広範囲に散らばり、外科的切除は不完全に終わることが多い。例え、大脳半球切除術を実施したとしても再発を防げるとは言えない。
【０００３】
又、他の組織の癌であれば外科的療法、放射線療法、化学療法等の治療により癌を取り除き治癒することが可能であるが、脳腫瘍の場合、それらのいずれの療法を適用するにしても、腫瘍を完全に取り除こうとすれば、正常な細胞及び脳自体の機能に多大な損傷を与えることは避けられない。
これらがグリオーマの治癒が極めて困難な理由である（非特許文献１）。そのため、手術のみによる平均生存期間は短く、術後の残存腫瘍に対して補助療法として放射線治療が試みられているが、その効果も一過性であることが多い。又、近年では患者のＱＯＬへの配慮から放射線の治療総投与線量の抑制あるいは照射野の限定縮小等が行われ、放射線治療にも限界があると言われている。更に放射線療法に、ニトロソウレア系薬剤、インターフェロン‐β等の化学療法を加えた集学的治療も試みられているが、決して満足できる結果は得られていない。
【０００４】
未成熟な正常細胞は、発生の過程を進むにつれ細胞種毎に特殊化が進行し、形態的・機能的にそれぞれの細胞に特徴的な性質を備えていく。この過程を分化と呼ぶ。癌の治療法の１つとして、細胞の有するこの分化能を利用する試みが為されている。即ち、癌細胞を分化誘導することにより、癌細胞を正常化し、癌を治療する方法である。この方法は細胞の持つ分化能を利用するものであることから、従来の細胞毒物質を投与する癌の治療法に比して、正常細胞に対する負荷が少ないと考えられている。そして現在白血病の治療に、レチノイン酸誘導体を分化誘導剤として用いる試みが臨床において為されている。しかしながら、グリオーマにおいては現在グリオーマ細胞を分化誘導する物質は見いだされていない。
【０００５】
発明者等は先に、チョウセンアサガオレクチン（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：以下ＤＳＡという）が、正常未分化なアストログリア細胞の、１）増殖性を低下させ、かつ２）形態を星状の形態にすると共に、３）アストログリア特異的中間径フィラメントの構成成分であるグリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）量を増大させることから、ＤＳＡにより、アストログリア細胞の分化誘導が起きたと見られることを報告した（非特許文献２）。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｐ．  Ｍ．  Ｂｌａｃｋ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３２４，  １５５５  （１９９１）
【非特許文献２】
Ｔ．  Ｓａｓａｋｉ  ＆  Ｔ．  Ｅｎｄｏ，  Ｇｌｉａ，  ３２，  ６０  （２０００）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、グリオーマは脳組織に存在し、治療の極めて困難な癌であることから、脳の機能に悪影響が少なく、かつグリオーマの増殖を抑制する治療剤が求められている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記課題を解決するため鋭意検討の結果、ＤＳＡ等のレクチンがグリオーマの分化を誘導し、異常増殖を抑制することからグリオーマの治療剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
（１）グリオーマ細胞に対し分化誘導作用を有するレクチンまたは抗体を有効成分とするグリオーマ治療剤、
（２）レクチンがアスパラギン結合型多分岐糖鎖及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの直列の繰り返し構造を有する糖鎖に結合する蛋白質である上記第１項に記載のグリオーマ治療剤、
【０００９】
（３）レクチンがＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２）Ｍａｎを含むアスパラギン結合型多分岐糖鎖及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの直列の繰り返し構造を有する糖鎖に結合する蛋白質である上記第１項に記載のグリオーマ治療剤、
（４）レクチンがチョウセンアサガオレクチン（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、インゲン豆レクチン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｌｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）又はトマトレクチン（ｔｏｍａｔｏ  ｌｅｃｔｉｎ）のいずれかである上記第１項に記載のグリオーマ治療剤、
【００１０】
（５）グリオーマ細胞に対し分化誘導作用を有するレクチンまたは抗体を有効成分とするグリオーマ細胞の分化誘導剤または増殖抑制剤、
（６）レクチンがアスパラギン結合型多分岐糖鎖及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの直列の繰り返し構造を有する糖鎖に結合する蛋白質である上記第５項に記載のグリオーマ細胞の分化誘導剤または増殖抑制剤、
（７）レクチンがＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２）Ｍａｎを含むアスパラギン結合型多分岐糖鎖及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの直列の繰り返し構造を有する糖鎖に結合する蛋白質である上記第５項に記載のグリオーマ細胞の分化誘導剤または増殖抑制剤。
（８）レクチンがチョウセンアサガオレクチン（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、インゲン豆レクチン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｌｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）又はトマトレクチン（ｔｏｍａｔｏ  ｌｅｃｔｉｎ）のいずれかである上記第５項に記載のグリオーマ細胞の分化誘導剤または増殖抑制剤、
に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のグリオーマ治療剤、グリオーマ細胞の分化誘導剤または増殖抑制剤は、グリオーマ細胞に対し分化誘導作用を有するレクチンまたは抗体を有効成分とする。
レクチンとは動植物中に存在し、糖鎖を特異的に認識・結合する性質を有している糖結合性蛋白質である。本発明に使用するレクチンとしては、グリオーマ細胞に対し分化誘導作用を有していればどんな種類のレクチンであってもよく、特に限定されない。グリオーマ細胞に分化誘導作用を有すとは、レクチンを作用させた時、レクチンが、グリオーマ細胞の１）増殖性を低下させ、かつ２）形態を星状の形態にすると共に、３）該細胞における、アストログリア特異的中間径フィラメントの構成成分であるグリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）量を増大させることである。
【００１２】
レクチンがグリオーマ細胞に対して分化誘導作用を有するか否かは、後記実施例に示すように、グリオーマ細胞に、レクチンを作用させ、グリオーマ細胞を培養し、その増殖性、形態及びＧＦＡＰ生産量を測定若しくは観察することにより、容易に見分けることができる。
本発明に使用されるレクチンとして好ましくは、アスパラギン結合型多分岐糖鎖及び／又はＮ−アセチルラクトサミンの直列の繰り返し構造を有する糖鎖に結合する性質を有するものである。
アスパラギン結合型多分岐糖鎖としては、アスパラギン結合型糖鎖のうち、ＧｌｃＮＡｃβ１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２）Ｍａｎの分岐またはＧｌｃＮＡｃβ１→４（ＧｌｃＮＡｃβ１→２）Ｍａｎの分岐を含むものが好ましい。
【００１３】
アスパラギン結合型多分岐糖鎖として更に好ましくは、上記糖鎖のトップに更Ｇａｌが結合したＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２）Ｍａｎを含むアスパラギン結合型多分岐糖鎖である。Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコース、Ｍａｎはマンノースを表し、例えばＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃはガラクトースの１位とＮ−アセチルグルコースの４位がβ配置のグリコシル結合していることを示している。
【００１４】
Ｎ−アセチルラクトサミンの直列の繰り返し構造を有する糖鎖とは、複数のＮ−アセチルラクトサミンが分岐することなく、結合したものである。
【００１５】
本発明に使用されるレクチンとして具体的には、チョウセンアサガオレクチン（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、インゲン豆レクチン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｌｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）又はトマトレクチン（ｔｏｍａｔｏ  ｌｅｃｔｉｎ）（場合によりＴＬと略す）等が挙げれる。
【００１６】
チョウセンアサガオレクチン（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）としてはシロバナチョウセンアサガオの種に含まれる糖含量の多い蛋白質で、分子量４００００と４６，０００の異なるサブユニットから成る２量体を挙げることができる。これはキチンオリゴ糖とＮ−アセチルラクトサミンに対して親和性を示し、特に３本鎖、４本鎖分岐した複合型糖鎖と結合することが知られている。ＤＡＳは試薬などとして一般に入手可能である。また、例えば次のようにしてチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）  の種子から抽出することもできる。
【００１７】
ＤＡＳの抽出法  ：  チョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）  の種子  （２００  ｇ）を５００  ｍｌのメタノール中で抽出する。  橙色のメタノール溶液はデカンテーションにより捨てる。  これを１時間かけ４回、行う。  その後、残った固形の種子をブフナーロートにかけ、残ったメタノールをろ過し、さらに２５０  ｍｌ  のジクロロメタンで洗い、風乾する。  以後の操作は、４℃で行う．  ポリビニルポリピロリドン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ  ）（１５ｇ）  を乾燥させた種子に加え、その混合物を７００  ｍｌのＰＢＳ（リン酸バッファー生理食塩水）中で一晩、撹拌し、抽出する。  抽出溶液を１１０００  ｘ  ｇ、２０分遠心にかけ、沈査から５００  ｍｌのＰＢＳを用い、同様に抽出する（Ｊａｎｅ  Ｆ．  Ｃｒｏｗｌｅｙ  ａｎｄ  Ｉｒｗｉｎ  Ｊ．  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，  １９８１）。
【００１８】
インゲン豆レクチン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｌｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）は、インゲン豆に含まれる分子量１２６，０００の糖蛋白質である。インゲン豆には非共有結合したサブユニット（ＥとＬが存在する）で構成された４量体のレクチンが５種類存在する（Ｅ４，  Ｅ３Ｌ，  Ｅ２Ｌ２，  ＥＬ３，  Ｌ４）。後記実施例で使用する  Ｌ−ＰＨＡはこのうち、Ｌ４タイプをさす。  これらのレクチンは試薬として一般に入手可能である。
【００１９】
トマトレクチン（ｔｏｍａｔｏ  ｌｅｃｔｉｎ）は、トマトの果実より、精製された分子量７１，０００のタンパク質（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ＤＣ  ：  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｌｅｃｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆｒｕｉｔ  ｊｕｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｍａｔｏ  （Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  １９８０  Ｊａｎ  １；１８５（１）：２６９−７２．）であり、試薬などとして入手可能である。また次のようにして、トマトから抽出することもできる。トマトレクチンの抽出法  ：  １ｋｇの熟したトマトをつぶし、室温（２２℃）で１０００  ｘ  ｇ、１０分遠心にかけ、種や破片を取り除く。  得られた透明なジュースを等量の０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ／０．１  Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ｐＨ  ７．０の溶液を加え、粉末の硫化アンモニウムを５０％飽和まで、ゆっくり加える。  ４℃で一晩静置したのち、４００００  ｘ  ｇ、１時間、遠心にかけ沈殿物を回収する。  ０．９％  ＮａＣｌ  にＮａ２ＨＰＯ４（Ａ液）を加えて、ｐＨ  ７．０にしたものに沈殿物を加え、５  Ｌ  のＡ液に対して４℃で４８時間、透析する。  再溶解しなかったものは、４００００  ｘ  ｇ、３０分間遠心し取り除く。
【００２０】
本発明に使用されるレクチンには、グリオーマに対し分化誘導作用を有している蛋白質であれば、上記レクチンの部分蛋白質も含まれる。
本発明で使用される抗体は、グリオーマ細胞に対して分化誘導作用を有する抗体であればいずれも使用しうる。そのような抗体の例としては上記レクチンが認識する糖鎖全体またはその一部を抗原として得られる抗体が挙げられる。
特定の糖鎖に対する抗体は種々知られており、それらに準じて、上記レクチンが認識する糖鎖全体またはその一部を抗原として用いて、常法により本発明で使用する抗体を得ることができる。
【００２１】
本発明のレクチンを有効成分とするグリオーマ治療剤またはグリオーマ細胞分化誘導剤若しくは増殖抑制剤は、レクチンをそのまままたは適当な医薬用担体と共に製剤し、患者に全身または局所投与してもよい。例えば開頭手術時に直接患部に撒布してもよい。また、場合によりレクチンの一種あるいは二種以上と医薬用担体を含む医薬組成物として又は、レクチンを高分子化合物等に結合した医薬組成物として患者に全身または局所投与してもよい。更に、医薬製剤添加物を併用してもよい。また、グリオーマ細胞分化誘導剤若しくは増殖抑制剤の場合には、患部若しくは取り出されたグリオーマ細胞に直接散布、滴下などの方法で適用してもよい。
【００２２】
本発明の薬剤の投与ルートは特に限定はなく、経口投与または非経口投与例えば血管内投与、患部への直接投与等をすることができる。その投与量は、患者により、又疾患の状態等により適宜調整することができる。例えば局所投与の場合には、局所に一回あたり、レクチンの量が０．１μｇ〜１００ｍｇ程度になるように、一日１ないし数回程度投与すればよい。また、全身投与の場合には、成人あたり、レクチンの量が１０μｇないし１ｇ程度を投与すればよい。
また、グリオーマ細胞に直接使用するときは、０．０１マイクロモルないし１００マイクロモル／グリオーマ細胞１×１０４〜６  程度使用すればよい。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
実施例１  ＤＳＡによるグリオーマ細胞に対する増殖抑制作用
ＤＳＡのグリオーマ細胞の増殖に対する作用を確認するため、ＤＳＡ添加培養後のグリオーマ細胞数を調べた。
【００２４】
ｉ）ＤＳＡ１μＭでのグリオーマ細胞の増殖抑制
ラットグリオーマ細胞株Ｃ６細胞を１２穴プレート（Ａｓａｈｉ  Ｔｅｃｈｎｏ  ｇｌａｓｓ製）に、１穴当たり０．５×１０４個となるように撒布し、１０％牛胎児血清（以下ＦＢＳと略す）、０．１ｍｇ／ｍｌのカナマイシン、４ｍｇ／ｍｌのグルコースを加えたＤＭＥＭ培地で、ＤＳＡ無添加群（コントロール群）、ＤＳＡ添加群、最初のみＤＳＡ添加培養後無添加培地切り替え群の三群につき、３７℃、９５％ＣＯ２の条件下で５日間培養した。培養途中４回及び５日の培養終了時の計５回細胞数を測定した。細胞数の測定は、トリプシンおよびＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を用いて、細胞を培養プレートからはがすとともに、該細胞剥離液に細胞を分散させて行った。測定結果は、図１中に平均値±標準偏差で示した。
【００２５】
図１中、三角マーク（△）は、Ｃ６細胞を撒布後、１μＭのＤＳＡを加えた培地で培養した群（ＤＳＡ添加群）を、黒菱形マーク（◆）は、ＤＳＡ非存在下で培養した群（コントロール群）を、黒４角形マーク（■）は、Ｃ６細胞をＤＳＡ添加培地で２４時間培養後、ＤＳＡを含まない培地に切り替えて更に９６時間培養した群を、それぞれ示す。図１中、矢印は、ＤＳＡを含まない培地への交換時期（２４時間後）を示す。
【００２６】
試験開始後１２０時間（５日）では、ＤＳＡを加えなかったコントロール群の細胞数は試験前の２８．９倍に増加したが、ＤＳＡを１μＭ添加した群では細胞数の増加は１．１４倍に過ぎなかった。１μＭのＤＳＡはＣ６細胞の増殖をほぼ完全に抑制した。また、Ｃ６細胞をＤＳＡに接触させた後、ＤＳＡを含まない培地で培養した群（最初のみＤＳＡ添加培養後無添加培地切り替え群）では、ＤＳＡ添加培地での培養中も、また、ＤＳＡを培地から除いた後も、Ｃ６細胞の増殖は抑制されたままであった。従って、ＤＳＡによるＣ６細胞の増殖抑制作用は不可逆的であると考えられた。
【００２７】
ｉｉ）グリオーマ細胞の増殖抑制のＤＳＡ濃度依存性
ラットグリオーマ細胞株Ｃ６細胞を１２穴プレートに、各穴１．０×１０４個となるように撒布し、１０％ＦＢＳを含む培地にて培養を開始する。ＤＳＡは細胞撒布後３時間の時点で図中に示す濃度（０、０．２５、０．５、１．０  各μＭ）となるように培地に加えた。細胞数は、細胞撒布後２４時間の時点で測定した。各ＤＳＡ濃度につき５穴ずつ測定を行い、平均値±標準偏差で細胞数を表した。
結果を図２に示す。ＤＳＡによるＣ６細胞に対する増殖抑制作用の強さは、ＤＳＡ濃度に依存した。
【００２８】
ｉｉｉ）ＤＮＡ合成抑制でのグリオーマ細胞の増殖抑制作用の確認
ＤＳＡによるＣ６グリオーマ細胞の増殖抑制作用をＤＮＡ合成の抑制でも確認した。すなわち、５’−ブロモデオキシウリジン（５’−Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ；以下ＢｒｄＵともいう）の細胞内への取り込み量を常法により測定し、その取り込み量を指標に、ＤＮＡ合成の抑制の度合いを調べた。１μＭのＤＳＡ添加後１２時間の時点でのＣ６細胞のＢｒｄＵの取り込み量はコントロール群の４．３％にすぎなかった。このことはＣ６細胞株のＤＮＡ合成がＤＳＡによって非常に強く抑制されたことを示している。
【００２９】
ｉｖ）ＤＳＡのヒトグリオーマ細胞に対する増殖抑制
ヒトグリオーマ細胞４株（Ｕ２５１（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、ＳＦ−５３９（ｇｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、ＳＮＢ−７５（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、ＳＮＢ−７８（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ））に対する、ＤＳＡの細胞増殖抑制作用を調べた。ヒトグリオーマ細胞の培養は、Ｍｏｎｋｓ等（１９９１年）（Ｊ．  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ｖｏｌ．  ８３：７５７−７６６）及び矢守等（１９９９年）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｖｏｌ．  ５９：４０４２−４０４９）に報告された方法にて行った。
【００３０】
ヒトグリオーマ細胞株を１２穴プレート（Ａｓａｈｉ  Ｔｅｃｈｎｏ  ｇｌａｓｓ製）に、撒布し、５％ＦＢＳ、０．１ｍｇ／ｍｌのカナマイシン、０．５μｇ／ｍｌのファンギゾンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、９５％ＣＯ２の条件下で培養した。
Ｕ２５１株は１穴当たり０．４×１０４個、ＳＦ−５３９、ＳＮＢ−７５及びＳＮＢ−７８の各株は１穴当たり１．０×１０４個になるよう散布した。
各細胞株撒布２４時間後に、ＤＳＡが１μＭとなるように培地に加える。１時間ＤＳＡを加えた培地で培養後、ＤＳＡを含まない培地に交換し、培養を継続する。３６時間培養後、細胞数を測定し、下記に示す数式によって、細胞増殖率を求めた。
細胞増殖率（％）＝１００×｛（Ｔ−Ｔ０）／（Ｃ−Ｔ０）｝
ここでＣはコントロール群の細胞数、ＴはＤＳＡ添加群の細胞数、Ｔ０はＤＳＡ添加直前の細胞数を示す。
また、ラットグリオーマ細胞株Ｃ６についても、培地を上記  ｉ）で使用したと同じ組成の培地を使用した以外は、上記ヒトグリオーマ細胞の場合同様にして、その増殖抑制を調べた。
結果を図３に示す。ラットグリオーマ細胞株Ｃ６がもっとも強く増殖抑制され、４種類のヒトグリオーマ細胞株についても、いずれも増殖が強く抑制された。以上より、グリオーマ細胞株はＤＳＡによって増殖抑制を受けることが示された。
【００３１】
ｖ）  ＤＳＡによるグリオーマ細胞株の形態変化
（１）ＤＳＡによるラットグリオーマ細胞株Ｃ６細胞の形態変化を調べるため、ＤＳＡの有無による形態の違いを顕微鏡を用いて観察した。ＤＳＡを添加していない場合はＣ６細胞は扁平な紡錘状又は多角形の形態を示していたが、ＤＳＡ存在下ではＣ６細胞は星状の形態をとり細長い突起を出すことが観察された。この形状は、高度に分化したａｓｔｒｏｃｙｔｅｓに酷似しており、ＤＳＡがＣ６細胞に対して分化誘導作用を示したと考えられた。
同様にヒト脳腫瘍株４株（Ｕ２５１（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、ＳＦ−５３９（ｇｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、ＳＮＢ−７５（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、ＳＮＢ−７８（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ））のＤＳＡによる形態の変化を観察した。４種類の細胞株はいずれもＤＳＡ添加により、扁平な形状から、突起を伸ばした星状の形態に変化した。この変化した形態は、高度に分化したａｓｔｒｏｃｙｔｅｓの特徴の一つである。
【００３２】
実施例２  ＤＳＡによるグリオーマ細胞株のＧＦＡＰ発現量変化
グリオーマは未分化なほど悪性度が高いと言われており、悪性なほど細胞内のアストログリア特異的中間径フィラメントの構成成分であるグリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）含有量が少ないとされている。成熟したａｓｔｒｏｃｙｔｅでは、非常に多くのＧＦＡＰが発現していることが知られており、悪性度の高いＣ６細胞株ではＧＦＡＰの発現量レベルは非常に低いことが知られている。そこで、Ｃ６細胞株及びヒト脳腫瘍細胞株（Ｕ２５１（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、ＳＦ−５３９（ｇｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、ＳＮＢ−７５（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、ＳＮＢ−７８（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ））にＤＳＡを接触させた場合のＧＦＡＰの発現量を、抗ＧＦＡＰ抗体によるイムノブロッティング法により定量した（図４）。
【００３３】
即ち、それぞれの細胞をＤＳＡ非存在下、又は存在下で２４時間培養する。氷冷したＰＢＳ緩衝液で３回細胞を洗浄後、ｒｕｂｂｅｒ  ｓｃｒａｐｅｒで細胞を培養皿からはがし、ＰＢＳ緩衝液中に集める。遠心して集めた細胞塊を、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルファニル）、１０μＭ  ロイペプチン、１μＭ  アプロチニン、１μＭ  ペプスタチンＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む、１．０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．４の中でホモジナイズする。ホモジナイズして得られた蛋白質のうち、Ｃ６細胞については１０μｇ、他のヒトグリオーマ細胞からはそれぞれ５μｇを、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０年）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ  ２２７：６８０−６８５））の方法に従って、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、ゲル上に展開する。ゲル上に展開された蛋白質を、ＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に電気的に転写する。蛋白が転写されたＰＶＤＦ膜に抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体（ＤＡＣＯ社）を反応させた後、過酸化酵素で標識された抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させ、更に過酸化酵素の基質ＤＡＢ（３，３’ジアミノベンチジン）と反応させる。ＤＡＢ反応物の発色の強さをデンシトメーターで計測し、ＧＦＡＰを定量した。
【００３４】
図４中、レーン１、３、５、７、９はＤＳＡ非存在下での細胞（コントロール群）、レーン２、４、６、８、１０はＤＳＡ存在下での細胞、から得た蛋白質をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇした結果である。又、レーン１、２はＵ２５１；レーン３、４はＳＮＢ−７５；レーン５、６はＳＮＢ−７８；レーン７、８はＳＦ−５３９；レーン９、１０はＣ６細胞からそれぞれ得られた蛋白質のＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ結果である。レーン１１は分子量マーカーを展開した。右欄外にＧＦＡＰの泳動位置と分子量マーカーの分子量を示した。
デンシトメーター（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）での計測結果によると、ＤＳＡによって、Ｃ６細胞株においては１００倍以上、ヒト脳腫瘍細胞株においては１２倍以上のＧＦＡＰが誘導されていた。
【００３５】
分化したａｓｔｒｏｃｙｔｅは、▲１▼星状の形態であること、▲２▼ＧＦＡＰを大量に発現すること、▲３▼増殖を停止すること、により定義される（Ｂｕｔｔ（１９９１年）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｖｏｌ  ６３３：９０−９５；Ｂｏｖｏｌｅｎｔａら（１９８４年）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｖｏｌ  １０２：２４８−２５９）。よって、Ｃ６細胞株及びヒト脳腫瘍株４株は全てＤＳＡにより、分化誘導されたといえる。
【００３６】
実施例３  グリオーマ細胞の増殖抑制作用を持つレクチンの特異性
ＤＳＡはＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２）Ｍａｎを含むアスパラギン結合型多分岐糖鎖及びＮ−アセチルラクトサミンの直列の繰り返し構造を認識する（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｋｏｒｎｆｅｌｄ（１９８４年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ｖｏｌ  ２５９：６２５３−６２６０；Ｙａｍａｓｈｉｔａ等（１９８７年））Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ｖｏｌ  ２６２：１６０２−１６０７）。
【００３７】
レクチンはそれぞれ異なる糖結合特異性を持っているので、各種レクチンを用いてグリオーマの増殖阻害能を調べた。結果は図５に示す。
トマトレクチン（ｔｏｍａｔｏ  ｌｅｃｔｉｎ）（ＴＬ）は３つ以上のＮ−アセチルラクトサミンの直列の繰り返し構造を認識する（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  Ｖｏｌ  ２２０：８４３−８４７；Ｍｅｒｋｌｅ  ａｎｄ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ（１９８７年）。トマトレクチンはＤＳＡと同程度の増殖阻害効果を示した。
Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２）Ｍａｎを含むアスパラギン結合型多分岐糖鎖を認識するＰｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｌｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（Ｌ−ＰＨＡ）（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｋｏｒｎｆｅｌｄ（１９８２年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５９：６２５３−６２６０）は、やや弱いが増殖阻害効果を示した。
【００３８】
又、末端にα２−６結合しているシアル酸（Ｓｉａα２→６）に結合するＳａｍｂｕｃｕｓ  ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＳＳＡ）は、弱い阻害能を示した。
セリン・スレオニン結合型コア１糖鎖構造ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  （Ｇａｌｂ１Ｒ３ＧａｌＮＡｃ）  （Ｂａｋｅｒ  ら、１９８３年）に結合するＤｏｌｉｃｈｏｓ  ｂｉｆｌｏｒｕｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＤＢＡ）、フコースに結合するＬｏｔｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＬＴＡ）は、いずれも増殖阻害能を示さなかった。
なお、上記の各種レクチンのグリオーマ増殖阻害能は下記のようにして調べた。
図５中に示した６種類のレクチン（１μモルの濃度）で、Ｃ６細胞をそれぞれ処理した。即ち、細胞は１２穴プレートに、各穴１．０×１０４個となるように撒布し、３時間後に各種レクチンを加えた。細胞数は撒布から２４時間後に測定した。測定は各々５回行い、平均値±標準偏差で細胞数を図５に示した。
その結果を見ると、レクチン非存在下での細胞数は、２４時間後には散布時の２．６４倍に増加したが、ＤＳＡ、Ｌ−ＰＨＡ、ＴＬ、ＳＳＡ存在下では、それぞれ１．０６倍、１．７１倍、１．０９倍、２．０６倍の増加であった。
【００３９】
これらのことから、ＤＳＡはＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→２）Ｍａｎを含むアスパラギン結合型多分岐糖鎖、Ｎ−アセチルラクトスアミンの直列の繰り返し構造の、両方又はいずれかと結合することで、グリオーマの増殖を阻害していると考えている。
【００４０】
【発明の効果】
細胞分裂と分化の制御は正常な発生と恒常性維持に決定的に重要な点であり、腫瘍形成の過程ではしばしばそれらが破綻している。本発明により、レクチンを用いてグリオーマ細胞を分化誘導し、グリオーマ細胞の増殖抑制を引き起こすことにより、グリオーマの進展を防止、治療することが可能となった。
発生や分化に伴って糖鎖の構造は変化し、それらはよく制御されている。例えば、同じ神経系の細胞である神経細胞とアストログリアではその骨格蛋白質部分は共通の分子を持っているが、その蛋白質に結合している糖鎖構造は全く異なる。アストログリアの癌化したグリオーマ細胞が有するＤＳＡと相互作用する糖鎖は神経細胞にほとんどない。その結果、該糖鎖部分をターゲットとしてグリオーマ細胞の分化誘導を引き起こす薬剤は、神経細胞に対する影響を最小限にすることができる。即ち、本発明のレクチンによるグリオーマ細胞分化誘導作用を利用したグリオーマ治療剤は、正常細胞と癌細胞との選択性に優れ、正常組織に負荷が小さい、副作用の低減された医薬として期待される。又、この分化誘導にはレクチンとの継続的な接触は必要なく、一過性に接触すれば分化誘導は可能であった。これは周囲の正常細胞に対する影響を最小限にするのに効果的である。
これらの特徴は、本発明がこれまでの薬剤に比べ脳腫瘍に対して飛躍的に有用であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＳＡによるラットグリオーマ細胞株Ｃ６細胞の増殖抑制作用を示す。
【図２】ＤＳＡによるラットグリオーマ細胞株Ｃ６細胞に対する増殖抑制作用が、ＤＳＡ濃度依存性であることを示す。
【図３】ＤＳＡのヒトグリオーマ細胞株４種及びＣ６細胞に対する増殖抑制作用を示す。
【図４】抗ＧＦＡＰ抗体を用いたＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ結果によるＧＦＡＰ発現量を示す。
【図５】レクチンのＣ６細胞に対する増殖抑制作用の特異性を示す。
【符号の説明】
図１中、三角マーク（△）は、Ｃ６細胞を撒布後、１μＭのＤＳＡを加えた培地で培養した群（ＤＳＡ添加群）を、黒菱形マーク（◆）は、ＤＳＡ非存在下で培養した群（コントロール群）を、黒４角形マーク（■）は、Ｃ６細胞をＤＳＡ添加培地で２４時間培養後、ＤＳＡを含まない培地に切り替えて更に９６時間培養した群を、それぞれ示す。
図１中、矢印は、ＤＳＡを含まない培地への交換時期（２４時間後）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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