(57)【要約】      （修正有）【課題】少量のサンプル量で広範囲に液を流すことのできる表面プラズモン共鳴測定用のマイクロ流路を得る【解決手段】センサー表面上の０．２５ｃｍ２以上の面積にサンプル液を供給できる表面プラズモン共鳴測定用マイクロ流路。好ましくは流路の深さが６０μｍ以下であり、表面プラズモン共鳴イメージング用に最適なマイクロ流路である。マイクロ流路の素材はポリジメチルシロキサンが好ましく用いられる。【選択図】図１
2004219369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センサー表面上の０．２５ｃｍ２以上の面積にサンプル液を供給できることが可能な表面プラズモン共鳴測定用マイクロ流路
【請求項２】
流路の深さが６０μｍ以下である請求項１乃至２記載の表面プラズモン共鳴測定用マイクロ流路
【請求項３】
表面プラズモン共鳴が表面プラズモン共鳴イメージングである請求項１または２に記載の表面プラズモン共鳴測定用マイクロ流路
【請求項４】
マイクロ流路の素材がポリジメチルシロキサンであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の表面プラズモン共鳴測定用マイクロ流路。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、広範囲にサンプル液を流すことのできる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用マイクロ流路に関する
【０００２】
【従来の技術】
生体分子の相互作用を観察し、生体分子の機能解析を行う方法の一つとして表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法が注目を浴びている。ＳＰＲ法の利点は、第一に検出に蛍光分子や放射線同位体などのラベル手段が不要なことが挙げられる。ラベルにより生体分子の機能部位が損なわれることがあり、相互作用を測定しても正しい情報を与えているかが問題になる。特にタンパク質の相互作用を解析する場合はラベル不要であるメリットは非常に大きい。
【０００３】
第二にリアルタイムに生体分子の結合、解離を観察できることが挙げられる。
結合・解離の速度に関する情報を得ることで、生体分子の結合の速さも評価することができる。
【０００４】
従来の一般的なＳＰＲ機器は１〜４点で測定できるように設計されている。例えば、シリコンゴムを用いた４流路型のマイクロ流路が開示されている（特許文献１参照）。多数のバルブと組み合わせることで４流路にさまざまな流れのパターンを形成することができる。しかし、センサー表面が接触するシリコンゴムによって４つの区域に分けられており、各々の区域には、表面全体にプローブとなる分子が固定できる。該区域の面積は非常に小さく、５ｍｍ２以下であり、それぞれの区域内の液量は１マイクロリットル前後でよいと推察される。しかし、流路を細かく区域にわける手段は限界があり、多数の生体分子を同時に測定するのは困難である。
【０００５】
ＳＰＲにおいて多点が測定できるように工夫されたものも示されている。先行特許では金属表面に生体分子のアレイを作製する手段と、光をセンサー表面全面に当て、その反射光を撮影し、同時に多点の相互作用を観察する手段が開示されている（特許文献２参照）。しかし、ここに測定対象物質を送液する手段は示されていない。
【０００６】
先行特許において、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いたマイクロウェルアレイが示されている（特許文献３参照）。これは、シリコン上のパターンを転写することで微小な隙間を形成することができる。しかし、ここでは微小な面積を有するウェルが多数並んだ流路をセンサー表面上に形成するものであり、広い面積に送液することはできない。この方法では数十個から数百個のスポットの解析は非常に困難であり、せいぜい１０個前後と推測される。
【０００７】
このように測定対象を含む液が微少量で、ＳＰＲ測定が可能な流路はすでに示されている。しかし、アレイとなったセンサー表面の広い範囲に微少量で送液できる流路、フローセルは全く発明されていないのが現状である。
【０００８】
【特許文献１】
特表平４−５０１４６２号公報
【特許文献２】
米国特許第５６２９２１３号明細書
【特許文献３】
国際公開第０１／３５０８１号パンフレット
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、少量のサンプル量で広範囲に液を流すことのできるＳＰＲ測定用ＰＤＭＳマイクロ流路を得ることにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．センサー表面上の０．２５ｃｍ２以上の面積にサンプル液を供給できることが可能な表面プラズモン共鳴測定用マイクロ流路
２．流路の深さが６０μｍ以下である上記記載の表面プラズモン共鳴測定用マイクロ流路
３．表面プラズモン共鳴が表面プラズモン共鳴イメージングである上記に記載の表面プラズモン共鳴測定用マイクロ流路
４．マイクロ流路の素材がポリジメチルシロキサンであることを特徴とする上記に記載の表面プラズモン共鳴測定用マイクロ流路
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明のマイクロ流路に関して詳細に説明する。
マイクロ流路の作成方法としては、所望のマイクロ流路が得られる方法であれば特に限定するものではないが、マイクロ流路に要求される凹凸パターンとは逆の凹凸を持つ型にマクロ流路の素材を接触させて凹凸パターンを写し取る（方法Ａ）か、もしくは素材の前駆体を型に接触させて硬化させることにより凹凸パターンを写し取る（方法Ｂ）ことが好ましい。
【００１２】
上記方法Ａとして用いるマイクロ流路の素材としては熱可塑性のポリマーであることが好ましく、より好ましくは熱可塑性エラストマーである。熱可塑性エラストマーを加熱、流動化させて型に流し込むもしくは押し付けるか、型に接触させた後に加熱し、冷却後に型から剥がすことにより、マイクロ流路が得られる。
方法Ａの中では、気泡が入りにくいと言う点で、前記の方法が好ましい。
【００１３】
熱可塑性エラストマーとしては、ポリオレフィン系、ジエン系、ニトリル系、フッ素系、ポリスチレン系、ポリエステル系、ポリウレタン系、ポリアミド系など、公知の素材が用いられる。
【００１４】
方法Ｂとして用いるマイクロ流路の素材としては、熱可塑性ポリマー、熱硬化性ポリマーいずれの前駆体であっても良く、より好ましくは熱硬化性エラストマーの前駆体であることが好ましい。マイクロ流路の素材の例としては、ポリオレフィン系、ジエン系、ニトリル系、フッ素系、ポリスチレン系、ポリエステル系、ポリウレタン系、ポリアミド系、シリコン系、エポキシ系など、公知の素材が用いられる。これらの前駆体を型に流し込んだ後の硬化方法としては、熱による方法、紫外線や電子線等の放射線による方法、室温近辺でも反応が進むような官能基による方法などが挙げられる。前駆体にはこれらの硬化方法に合わせた官能基を導入する。官能基の例としては、アクリル基やビニル基などの二重結合含有基、イソシアネート基、グリシジル基、アミノ基、カルボキシル基、無水カルボン酸、ヒドロキシ基、シロキシ基など、が挙げられる。
【００１５】
これらの中では、反応の簡便性などの点で、二重結合含有基、イソシアネート基、シロキシ基が好ましく、特にはシロキシ基が好ましい。最も好ましい素材の例としてはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）である。
【００１６】
凹凸を持つ型の製造方法としては、機械的な掘削による方法、レーザー等を用いた掘削による方法、エッチングによる方法、フォトポリマー法（光反応性の化合物を用いて、光により硬化させ未硬化部分を除去するか、光により可溶化させた部分を除去する方法など）が挙げられる。また、エッチングによる方法ではエッチングパターンを描く方法としてフォトポリマー法を用いることも好ましい。
【００１７】
型に用いられる素材としては、金属、セラミック、ガラス、シリコン板、各種樹脂が挙げられ、それぞれの素材に合った加工法を用いることができる。フォトポリマー法でパターンを描きエッチングにより凹凸を設ける方法の場合にはシリコン板を用いることが好ましい。
なお、型からの離型性を向上させるために、シリコン系など離型剤を塗布しても良い。
【００１８】
フォトポリマー法で用いる光反応性樹脂としては、フォトレジスト、モールド剤、接着剤、インキ、印刷製版等に用いられる光反応性樹脂をそのまま用いることができる。
【００１９】
これらの方法としては、様々なパターンが簡便に作製できることから、フォトポリマー法またはフォトポリマー法によりパターンを描きエッチングにより削除する方法が好ましい。
【００２０】
エッチング方法としては、素材にあった公知の方法が用いられるが、シリコン板をエッチングする方法としては、湿式エッチングやプラズマエッチングなど半導体集積回路を作製する際のエッチング技術が好ましく用いられる。
【００２１】
上記技術を説明するための一例を以下に紹介する。
ベアシリコンウエハー上に、フォトレジストを塗布し、所望のパターンが得られるように紫外線照射、未硬化部を除去してパターン状のマスクをした後、エッチングを行い、さらにマスクを除去して、シリコン上にフォトレジスト技術により凹凸のあるパターンを形成させる。次いでＰＤＭＳを流し込み、焼成させることで、ゴム状のＰＤＭＳにパターンが転写される。マイクロメートル単位での凹凸を形成させる手段としては非常に汎用性が高い。センサーチップ上に測定対象物質を流すパターンで、シリコンを凸に作製し、ＰＤＭＳに転写すれば、ＰＤＭＳ上に凹になったパターンが形成される。こうしてパターンを形成したＰＤＭＳをセンサーチップに押し付けることでチップ上に微小な空間が生じる。その空間に送液することで、微少量での解析が可能となる。
【００２２】
ＰＤＭＳは自己接着能が高いことも有利な点である。ＳＰＲに用いる平滑な金表面に対して、ＰＤＭＳは接着し、シール材としてはたらく。
本発明でいうＰＭＤＳはＰＤＭＳ単独、もしくはその他の材料が複合されて用いる両方の形態を含む。
【００２３】
また、その他のマイクロ流路を作製する方法の例としては、硬化後ゴム弾性を持つ光硬化性化合物に流路となる部分に光があたらないように紫外線等を照射して硬化させ、未反応の流路部分を除去する方法が挙げられる。この際には、光硬化性化合物は基材上に流路の深さに相当する程度の厚さで薄く積層させることも好ましい。この方法には、感光性のフレキソ印刷製版技術を用いることができる。ここで用いられる基材としては、ＰＥＴなどのフィルム、アルミ、ＳＵＳなどの金属板、ガラスなどのセラミック板、各種樹脂板など挙げられる。
【００２４】
なお、マイクロ流路の素材としては、ＳＰＲ測定の際の測定面である金属との密着性の点から柔軟であることが好ましく、ショアＡ硬度で、好ましくは８０以下、より好ましくは７０以下、さらに好ましくは６０以下である。下限は特に定めるものではないが、取り扱いの面から１０以上であることが好ましい。なお、ショアＡ硬度は２５℃で測定したものである。また、マイクロ流路が積層体である場合には、測定面との接触る部分の素材の硬度とし、マイクロ流路を直接測定できない場合はマイクロ流路の測定方法と類似の方法で硬度測定サンプルを作製してこれを測定する。
【００２５】
本発明のマイクロ流路によって、送液されるセンサー表面上の面積は０．２５ｃｍ２以上が好ましく、より好ましくは０．５０ｃｍ２以上、さらに好ましくは０．７５ｃｍ２以上、特に好ましくは１．００ｃｍ２以上である。上限は特に定めるものではなく測定機によって制限される。ＳＰＲ測定の場合、実用上では上限としては１０ｃｍ２程度である。
【００２６】
本発明のマイクロ流路を用いることで、金属表面上に複数の生体分子を固定化したアレイを用いて、相互作用解析することができるため、広範囲に送液することが好ましい。０．２５ｃｍ２以上であると、アレイ部の面積が十分にとれ、多くの物質を固定化したアレイを用いることができるため好ましい。１．００ｃｍ２以上であるとさらに好ましい。ここでいう面積とはマイクロ流路によってシールされ、センサー表面と測定対象物質を含む液が接触する面積のことを言い、入口から出口までの一つの区域のことを言う。
【００２７】
よって、複数の流路が並列に存在する場合は、個別の流路一つのことをさす。流路の深さは６０μｍ以下が好ましく、３０μｍ以下が特に好ましい。深さは転写対象となるシリコン面のパターンの凸部の高さによって変更することができる。深さが大きいと、分析に必要な液量が増えるため好ましくない。
【００２８】
一つの流路で大きな面積の領域にサンプル液を供給できる本発明により、数十個から数百個のスポットの相互作用を解析することが可能となる。また、従来の複数の流路により、液を供給するタイプでは、それぞれの流路により液の流動速度が異なったり、異物等により一つの流路が詰まったりして、全体で均一な条件での測定が困難であったり、また、それぞれの流路に導くための配管、バルブ等が必要であり、そのために液のロスも多かったが、本発明では、広い面積で均一な条件での測定や、微量での測定を容易に行うことができる。
【００２９】
こうして得られたマイクロ流路はＳＰＲ、特にＳＰＲイメージング法によって相互作用解析に供されるのが好ましい。ＳＰＲイメージング法はスライドの面に光を照射し、その反射像を撮影する手法であり、金属表面上に生体分子を固定化したアレイを用いて測定対象物質との相互作用を解析することができる。
このように本発明のＰＤＭＳマイクロ流路は、微少量のサンプルで、広範囲に送液することができるため、多数のスポットを有するアレイを用いて相互作用解析することを可能とする。
【００３０】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３１】
［実施例１］
図１に示す設計図でＰＤＭＳマイクロ流路を作製した。作製にあたっては、ベアシリコンウエハーを用いて、フォトレジスト−エッチングにより凹凸を持つ型を作製し、この型の上に内直径２０ｍｍの円筒を設け、この中にＰＤＭＳを流し込み、さらに８０℃で３００分間加熱硬化させた（ショアＡ硬度５０）。取り出した後液の流入出孔を開けた。
流路の深さは２５μｍであり、ＰＤＭＳ全体の厚みは２ｍｍである。この流路では液がアレイ部を曲がりくねった形で接触できるように設計されている。この流路を金を蒸着したガラス板の今上着面と合わせて固定し、さらにシリコンチューブと接続し、さらにＰＥＥＫ製のチューブに接続した。ＳＰＲイメージング機器（ＧＷＣ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社  ＳＰＲｉｍａｇｅｒ）にこの流路をセットし、シングルプランジャーポンプ（フロム社製）を用いて０．０１ｍｌ／ｍｉｎの流速で通液した。
この場合のサンプル液を供給できるセンサー表面の面積は１．２１ｃｍ２であり、内部の体積は３．０２μｌであり、微小量のサンプル液で非常に広い範囲に供給することができる。
通液した場合のＳＰＲイメージング像を図２に示す。このように、非常に広い範囲にサンプルを供給することができる。
【００３２】
［実施例２］
図３に示す設計図で実施例１と同様にしてＰＤＭＳマイクロ流路を作製した。
流路の深さは２５μｍであり、ＰＤＭＳ全体の厚みは３ｍｍである。この流路では液がアレイ部全体をカバーする形で接触できるように設計されている。
この場合のサンプル液を供給できるセンサー表面の面積は１．４３ｃｍ２であり、内部の体積は３．５８μｌである。
【００３３】
［実施例３］
図４に示す設計図で実施例１と同様にしてＰＤＭＳマイクロ流路を作製した。
流路の深さは２５μｍであり、ＰＤＭＳ全体の厚みは２ｍｍである。この流路では実施例１と同様に液がアレイ部を曲がりくねった形で接触できるように設計されている。ただし、流路の幅が狭く設計されており、泡がかまないようになっている。
この場合のサンプル液を供給できるセンサー表面の面積は０．５２ｃｍ２であり、内部の体積は１．２８μｌである。
【００３４】
［実施例５］
感光性樹脂として旭化成株式会社製ＡＰＲ（Ｒ）  ＮＳ−６０を実施例１の型に流し込み、紫外線を照射して硬化後、型から取り外し、液の流入出孔を開け、マイクロ流路を作製した（ショアＡ硬度５０）。
【００３５】
［実施例６］
クレイトンポリマージャパン社製ＫＲＡＴＯＮ（Ｒ）  Ｄ−１１１１（ショアＡ硬度５２）を加熱流動化させ、実施例１で用いた型に流し込み、冷却後型から取り外し、液の流入出孔を開け、マイクロ流路を作製した。（ショアＡ硬度５２）
【００３６】
［実施例７］
セメダイン社製シリコーンシーラント  バスコーク（Ｒ）  を実施例１で用いた型に流し込み、１日間放置後に型から取り外し、液の流入出孔を開け、マイクロ流路を作製した。（ショアＡ硬度５５）
【００３７】
［実施例８］
型としてシリコン板の替わりに東洋紡績株式会社製感光性樹脂凸版  プリンタイト（Ｒ）  ＫＭ−１００ＧＲを用い、他は実施例１と同様にしてマイクロ流路を作製した。型は、流路にあたる部分が透明で、他は黒いネガを樹脂凸版にあてて紫外線照射を行い、水によって未硬化部分を洗い出し除去した後（凹部深さは洗い出し時間により調整）、全面に紫外線を照射して完全硬化させた。なお、マイクロ流路の深さは４５μｍであった。
【００３８】
［実施例９］
感光性樹脂として旭化成株式会社製ＡＰＲ（Ｒ）  Ｆ−３２０を用い、流路にあたる部分が黒く、他は透明なネガ（実施例１のパターン）を用いてＡＰＲ推奨の方法によりネガ、カバーフィルム、感光性樹脂−ベースフィルムの積層体を作製した。この積層体の感光性樹脂部の厚みは３０μｍとなるようにした。得られた積層体のネガ方向のみから紫外線を照射して硬化させた後、現像液で未硬化部分を洗い流し、ベースフィルム上に感光性樹脂で凸部をもつ形状のフィルムが得られた。得られたフィルムのベースフィルム面をアクリル板と張り合わせて不要部分を切り取り、液の流入出孔を開け、マイクロ流路とした（硬化後の感光性樹脂のショアＡ硬度２９）。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により少ないサンプル量で、広い範囲にサンプルを供給することができる表面プラズモン共鳴用マイクロ流路を提供することができ、さらには流路パターンが様々なマイクロ流路を容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で用いたＰＤＭＳマイクロ流路の設計図  単位（ｍｍ）
【図２】図１のＰＤＭＳマイクロ流路に水を通液したときのＳＰＲイメージング像
【図３】実施例２で用いたＰＤＭＳマイクロ流路の設計図  単位（ｍｍ）
【図４】実施例３で用いたＰＤＭＳマイクロ流路の設計図  単位（ｍｍ）
【図１】
2004219369.tif 000003
【図２】
2004219369.tif 000004
【図３】
2004219369.tif 000005
【図４】
2004219369.tif 000006