(57)【要約】【課題】生化学的検査に用いられる中性〜弱塩基性のｐＨ領域において多重鎖核酸を高感度かつ簡便に検出できる方法を提供する。【解決手段】多重鎖核酸との相互作用によって実質的な蛍光を発する化合物を多重鎖核酸と接触させることにより多重鎖核酸を光学的に検出する方法であって、該化合物が下記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）（Ｒ１〜Ｒ３は水素原子又は置換基；Ｒ４はアルキル基など；Ｑは酸素原子又はイオウ原子；ｎは０〜３の整数；Ｘは対イオン；ｑは分子の電荷を中和するのに必要な数；Ｒ５、Ｒ７、Ｒ１０、及びＲ１２のうちの少なくとも一つはハメットのσｐ値が−１．５以上０未満の電子供与性の置換基；Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１１は水素原子又は一価の置換基を示す）で表され、（ａ）多重鎖核酸の非存在下においてプロトン化した条件下では水溶液中で実質的に無色かつ無蛍光性の状態で存在することができ、（ｂ）上記（ａ）の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色へと変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する化合物である方法。【化１】2004113145.tif 000012
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重鎖核酸との相互作用によって実質的な蛍光を発する化合物を多重鎖核酸と接触させることにより多重鎖核酸を光学的に検出する方法であって、該化合物が下記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）：
【化１】
2004113145.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を示し、Ｒ１とＲ２及びＲ２とＲ３は互いに結合して環を形成してもよく；Ｒ４はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し；Ｑは酸素原子又はイオウ原子を示し；ｎは０、１、２、又は３の整数を示し；Ｘは対イオンを示し；ｑは分子の電荷を中和するのに必要な数を示し；Ｒ５、Ｒ７、Ｒ１０、及びＲ１２のうちの少なくとも一つはハメットのσｐ値が−１．５以上０未満の電子供与性の置換基を示し、残りの基は水素原子を示し；Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１１はそれぞれ独立に水素原子又は一価の置換基を示すが、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８、Ｒ９とＲ１０、Ｒ１０とＲ１１、及びＲ１１とＲ１２からなる選ばれる１以上の組み合わせに含まれる２つの基は互いに結合して環を形成してもよい）で表される化合物の中から選択され、かつ下記の性質：
（ａ）多重鎖核酸の非存在下において、プロトン化した条件下では水溶液中で実質的に無色かつ無蛍光性の状態で存在することができ、
（ｂ）上記（ａ）の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色へと変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する
を有する化合物である方法。
【請求項２】
ｐＨ６．０〜８．０の溶液中で測定する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該化合物を多重鎖核酸と溶液状態で接触させる工程を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該化合物を固相担体上に固定化された多重鎖核酸と接触させる工程を含む請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な多重鎖核酸の光学的測定法に関する。さらに詳しくは、遺伝子解析分野において有用な蛍光測定法を用いたハイブリッド多重鎖核酸の光学的測定技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、非常に盛んに研究が行われている分野として、核酸の検出方法としての色素の応用がある。電気泳動を利用した核酸の分離の際に、核酸の存在位置を知る目的で利用される臭化エチジウムを初めとして、広範囲な用途に極めて多様な色素が開発されている。例としては、モレキュラー・プローブス社のＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　８ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社刊ＣＤ−ＲＯＭ、２００１年）に詳しく解説されている。また、遺伝的な情報を知る目的、あるいは病理組織の遺伝子発現情報を得るなどの目的で、生体内から抽出した核酸を適当な処理を行い蛍光色素で標識し、これをプローブ核酸とハイブリダイゼーションすることによって対象となる核酸の存在の有無あるいは量を検出する方法が開発されている。
【０００３】
この方法を応用し、一度に多数の遺伝子や遺伝子発現に関する情報を得る手段として、例えばＤＮＡチップやＤＮＡアレイと呼ばれる検出技術（以下、総称して「ＤＮＡアレイ」と呼ぶ）が開発され、大きな注目を集めている。この技術では、固相担体平面上に部分的あるいは全体の配列が既知であり、それぞれ異なった配列を有する多数の核酸を整列して点状に固定し、平面上の位置と核酸の配列を対応づける（「アドレッシング」とも呼ばれる）。この平面上に配列未知の核酸（この核酸は１種でもよいし、２種以上でもよい）を一様に展開し、ハイブリダイゼーション条件にさらす。配列未知の核酸に対して、相補的な配列を有する核酸が固相担体平面上に存在すれば、両者はハイブリッドを形成し、洗浄後も固相平面上に残存することになる。
【０００４】
この時に、ハイブリッドを何らかの方法によって検出することができれば、固相平面上に残存したハイブリッドの位置と対照させることにより未知の核酸の中に検出対象となる配列が存在するか否かの判定、あるいは定量又は配列の特定などが可能になる。生物の遺伝子は２０個以上の塩基配列が相同である確率は極めて低く、従って、前述の固相平面上に固定する核酸の配列として２０塩基以上の適当な配列を選択すると、固定された配列既知の核酸と検出対象遺伝子との間に１対１の関係を持たせることが可能となる。現在、知られているＤＮＡアレイと呼ばれるもののほとんどが以上の原理の上に成り立っており、この原理により１回の処理で多数（固相平面上に固定されている遺伝子に対応した配列を有する核酸の種数）の遺伝子（あるいは発現遺伝子）の有無や量的な情報を得ることを可能になっている。このように、ＤＮＡアレイ技術はアドレッシング技術及び核酸同志の相同性を相関づけるハイブリダイゼーション技術によって支えられている。
【０００５】
上述の技術をもとにして、ゲノム遺伝子を適当な長さに切断してＤＮＡアレイで解析することにより、生体個々の遺伝子情報をえることができる。また、ＰＣＲ等の手法を利用して特定の範囲の配列を対象として増幅を行い、一塩基多型などの生体個々のゲノム情報を知ることができるほか、個体内の組織毎の遺伝子発現状態や、発生段階、発育段階の各時間スケール毎の遺伝子発現状態を知ることも可能である。この方法は一般に遺伝子発現解析と呼ばれており、ゲノムＤＮＡより転写されるｍＲＮＡの種類や量的な情報を知るため、あるいは比較を行う目的で利用されている。
【０００６】
ＤＮＡアレイを用いた解析の対象となるのは主としてゲノムＤＮＡやｍＲＮＡである。前述したようにＤＮＡアレイの手法は相補的な核酸により形成されたハイブリッド多重鎖核酸を検出することが必要であるが、生体内より採取された核酸は微量である上に、検出に適した化学種とは言い難い。このため、現在、検出に最も広く用いられているのは核酸標識法と呼ばれる方法である。この方法については多くの成書や文献に具体的な方法が記載されており、類似した方法も多いが、その標識原理は、検出対象となる核酸の複製を作成する際に、標識されたヌクレオチド三リン酸を複製の原料として用いることによって生成する核酸ポリマー（オリゴマー）に取り込ませて標識することにある。標識の種類としてはＲＩ（放射性同位元素）、蛍光色素などの直接的な標識法や、ビオチン、ジゴキシゲニンなどの間接的な標識法が知られている。ＲＩ標識の場合には放射線の検出、蛍光色素標識の場合には蛍光検出、ビオチンやジゴキシゲニンの場合には蛍光や化学発光などで検出できるように適宜処理を施したのちに検出を行い、それぞれ高感度で検出できるように検出システムが設計される。
【０００７】
しかし、これら標識法に基づくハイブリッドの検出に関しては、主に２つの問題点が指摘されている。１つは標識の際に用いられる核酸を複製する手法、すなわちＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）やＲＴ（逆転写）反応において、オリジナルの核酸混合物の量的な相対関係が複製物に正確には反映されない可能性があることである。もう１つは、ＲＩ標識法を除いて、複製された遺伝子核酸は標識用化合物が結合するために、正確には複製ということができない別の化学種となってしまうことである。この点についての具体的な問題点としては、ハイブリダイゼーションの効率低下（量的低下）、及びプローブ核酸と試料核酸の認識性低下に基づく誤認識（情報の質的低下）があるとされており、標識法の根本的な問題になる可能性がある。
【０００８】
上述のように標識法は本質的な問題を有している。このため、これら問題点の解決可能な方法として、標識を行わずに、すなわち非標識でハイブリッド２本鎖核酸を検出する方法が提案されている。特開平５−１９９８９８号公報には、電極上にハイブリッドを形成させ、電気化学的に活性な化学種で修飾したインターカレーターを用いてハイブリッドの形成を検出する方法が記載されている。この方法によれば、ＤＮＡアレイ法においてハイブリダイゼーションによって形成されたハイブリッド２本鎖を標識することなしに検出することができることから、この方法は標識法が持つ問題を解決可能な方法であると考えられる。もっとも、この方法は検出のための装置の小型化が可能であるなどいくつかの利点はあるものの、電気化学的に検出を行うためにプローブ核酸を電極表面に固定化する必要があり、同時多数の検出を行うためには多数の電極を平面上に作成し、かつそれぞれにプローブ核酸を固定化する必要があり、検出方法として越えるべき障害が多い。また、シグナル／バックグラウンド比においてもハイブリッドと非ハイブリッド（プローブ１本鎖）の識別性が必ずしも十分とは言えず、定量的な検出を行うことは困難である。
【０００９】
他の方法として、多重鎖核酸との相互作用によって蛍光強度が増大する蛍光色素を用いる方法も考えられる。プローブ核酸（１本鎖）との相互作用では蛍光強度が小さく、ハイブリダイゼーションにより形成された多重鎖との相互作用により蛍光強度が著しく増大する色素が存在すれば、標識することなくハイブリッド２本鎖が検出可能になると考えられる。モレキュラー・プローブス社より商品名　ＰｉｃｏＧｒｅｅｎとして市販されている色素は２本鎖核酸が定量できるとされているが、１本鎖核酸が存在した場合にも少なからぬ蛍光を発するため高いシグナル／バックグラウンド比は期待できない。
【００１０】
微量成分検出法では、一般的にプローブは検出対象物に対して過剰に使用されるため、非標識でハイブリッド２本鎖核酸を検出するためには、過剰に存在するプローブ１本鎖核酸とハイブリダイゼーションによって形成された２本鎖核酸を厳密に識別可能な方法が必要となるが、これまでそのようなものは知られていなかった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明者らは既知の方法とはまったく別の発想に基づいた多重鎖核酸の検出方法を開発すべく鋭意研究を行ってきた。特に遺伝子発現解析用蛍光色素とその利用法の開発に取り組んだ結果、多重鎖核酸の検出にあたり、１本鎖核酸のみが存在している状態（多重鎖核酸が存在していない場合）では実質的に無色であり、多重鎖核酸が存在する場合には有色へと変化し、かつ蛍光を発する化合物を提供することに成功した（特願２００２−０３６４７３号明細書）。また、該色素を用いた多重鎖核酸を検出する方法を提供している。
【００１２】
もっとも、この色素は比較的低ｐＨの溶液中において無色化するものであることから、実際の生体条件に近い条件での使用には制限があった。そのような理由から、本発明者らは生化学的検査に用いられる中性〜弱塩基性のｐＨ領域において所望の機能を発現する化合物とそれを用いた多重鎖核酸の検出方法を提供すべく鋭意研究を行なった。
【００１３】
色素の中には溶液状態でプロトン化されることによって実質的に無色化するものが知られている。シアニン色素の中には水溶液中でプロトン化を受けて無色化するものがあり、例えばベンズイミダカルボシアニン色素類にはこのような性質を有するものが多く存在する。この現象はシアニン色素のメチン炭素上にプロトン化が起こった結果として色素共役系が切断され無色化したものと考えられる。この場合、シアニン色素は系のプロトン濃度に依存して本来の色素の状態とプロトン化され無色化した状態の平衡にあるものと考えられる。
【００１４】
そこで、本発明者らは、特願２００２−０３６４７３号明細書に開示された色素化合物の特定の部位に電子供与性の置換基を導入したところ、該化合物が無色化して存在するｐＨ領域がより高ｐＨ側に拡大することを発見した。さらに、該化合物を用いて多重鎖核酸の検出を試みたところ、１本鎖核酸／２本鎖核酸の識別比が顕著に向上することを見出した。これは、上記化合物本来の有色状態とプロトン化された無色状態の平衡が無色側に偏ったことによるものと考えられる。
【００１５】
すなわち、本発明は、多重鎖核酸との相互作用によって実質的な蛍光を発する化合物を多重鎖核酸と接触させることにより多重鎖核酸を光学的に検出する方法であって、該化合物が下記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）：
【化２】
2004113145.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を示し、Ｒ１とＲ２及びＲ２とＲ３は互いに結合して環を形成してもよく；Ｒ４はアルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を示し；Ｑは酸素原子又はイオウ原子を示し；ｎは０、１、２、又は３の整数を示し；Ｘは対イオンを示し；ｑは分子の電荷を中和するのに必要な数を示し；Ｒ５、Ｒ７、Ｒ１０、及びＲ１２のうちの少なくとも一つはハメットのσｐ値が−１．５以上０未満の電子供与性の置換基を示し、残りの基は水素原子を示し；Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１１はそれぞれ独立に水素原子又は一価の置換基を示すが、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８、Ｒ９とＲ１０、Ｒ１０とＲ１１、及びＲ１１とＲ１２からなる選ばれる１以上の組み合わせに含まれる２つの基は互いに結合して環を形成してもよい）で表される化合物の中から選択され、かつ下記の性質：
（ａ）多重鎖核酸の非存在下において、プロトン化した条件下では水溶液中で実質的に無色かつ無蛍光性の状態で存在することができ、
（ｂ）上記（ａ）の条件下において多重鎖核酸を存在させた場合に、多重鎖核酸との相互作用によって実質的に有色へと変化し、かつ該相互作用によって実質的に蛍光性を発現する
を有する化合物である方法を提供するものである。
【００１６】
この発明の好ましい態様によれば、ｐＨ６．０〜８．０の溶液中で測定する工程を含む上記の方法；該化合物を多重鎖核酸と溶液状態で接触させる工程を含む上記の方法；及び該化合物を固相担体上に固定化された多重鎖核酸と接触させる工程を含む上記の方法が提供される。
【００１７】
別の観点からは、本発明により、多重鎖核酸を光学的に測定するための試薬であって、上記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表され、かつ上記の性質（ａ）及び（ｂ）を有する化合物を含む試薬が提供される。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、多重鎖核酸を光学的に測定する方法であって、多重鎖核酸と相互作用可能な化合物を多重鎖核酸と接触させる工程を含み、該化合物が上記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表され、かつ上記の性質（ａ）及び（ｂ）を有することを特徴としている。特願２００２−０３６４７３号の明細書の開示の全てを参照として本明細書の開示に含める。
【００１９】
上記一般式において、Ｑは酸素原子又はイオウ原子を示す。Ｑとしては酸素原子、硫黄原子が好ましく、硫黄原子がより好ましい。
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を表し、Ｒ１とＲ２及びＲ２とＲ３は可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が置換基を表す場合、好ましくはハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基であり、これらの置換基はさらに置換されていてもよい。これらの置換基の総原子数としては１〜５０が好ましく、１〜３５がより好ましく、１〜２５がさらに好ましい。Ｒ１とＲ２及びＲ２とＲ３が互いに結合して形成される環は５〜８員環が好ましく、非芳香族又は芳香族の環のいずれであってもよく、炭素環又はヘテロ環のいずれであってもよい。
【００２０】
Ｒ４はアルキル基、アリール基、またはヘテロ環基を示し、これらの置換基はさらに置換されていてもよい。これらの基における総原子数としては４〜８０が好「アルキル基」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はこれらの組み合わせのいずれであってもよい（アルキル部分を有する他の置換基のアルキル部分についても同様である）。「アリール基」としては、単環式又は縮合多環式芳香族炭化水素基が挙げられ、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、アントリル、フェナントリル、アセナフチレニル等のＣ６〜Ｃ１４のアリール基が挙げられる。「ヘテロ環基」としては、例えば、環系を構成する原子（環原子）として、酸素原子、硫黄原子、及び窒素原子等から選択されたヘテロ原子を１個以上含む単環式又は縮合多環式ヘテロアリール環あるいは単環式又は縮合多環式非芳香族ヘテロ環の残基が挙げられる。
【００２１】
ｎは０、１、２、又は３の整数を示し、０、１、２が好ましく、０、１がさらに好ましい。Ｘは対イオンを表し、ｑは分子の電荷を中和するのに必要な数を示す。Ｘは陽イオンでも陰イオンでもよく、陽イオンとしてはナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、テトラアルキルアンモニウムイオン、ピリジニウムイオンなどの有機イオンが挙げられる。陰イオンは無機陰イオン又は有機陰イオンのいずれであってもよく、ハロゲン陰イオン（例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなど）、置換アリールスルホン酸イオン（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、ｐ−クロルベンゼンスルホン酸イオンなど）、アリールジスルホン酸イオン（例えば、１，３−ベンゼンジスルホン酸イオン、１，５−ナフタレンジスルホン酸イオンなど）、アルキル硫酸イオン（例えばメチル硫酸イオンなど）、硫酸イオン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ピクリン酸イオン、酢酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオンなどが挙げられる。また、Ｍは水素イオンであってもよい。対イオンとして好ましくはアルカリ金属イオン、テトラアルキルアンモニウムイオン、ハロゲン陰イオン、置換アリールスルホン酸イオンであり、更に好ましくはアルカリ金属イオン、ハロゲン陰イオン、置換アリールスルホン酸イオンである。
【００２２】
Ｒ５、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１２の少なくとも一つはσｐ値が−１．５以上０未満の電子供与性の置換基を示し、残りの基は水素原子を示す。Ｒ５、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１２のうちの２以上の基が電子供与性基であるときには、それらは同一でも異なっていてもよい。Ｒ５、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１２の全部が電子供与性基であってもよい。該電子供与性基としては、例えば、アルキル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、メルカプト基が好ましく、アルコキシ基、アミノ基、アルキルチオ基がさらに好ましい。これらの置換基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては１〜５０が好ましく、１〜３５がより好ましく、１〜２５がさらに好ましい。ハメットの置換基定数σｐ値については、稲本直樹著「ハメット則−構造と反応性−」（丸善）、「新実験化学講座１４・有機化合物の合成と反応Ｖ」２６０５頁（日本化学会編、丸善）、仲矢忠雄著「理論有機化学解説」２１７頁（東京化学同人）、ケミカル・レビュー（９１巻），１６５〜１９５頁（１９９１年）等の成書に詳しく解説されているので、当業者は適宜の置換基を容易に選択することが可能である。
【００２３】
Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ヘテロ環基、シアノ基、スルホニル基、スルフィニル基、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、メルカプト基を表す。これらの置換基はさらに置換されていてもよく、総原子数としては１〜５０が好ましく、１〜３５がより好ましく、１〜２５がさらに好ましい。Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８、Ｒ９とＲ１０、Ｒ１０とＲ１１、及びＲ１１とＲ１２からなる選ばれる１以上の組み合わせに含まれる２つの基は互いに結合して環を形成してもよい。形成される環としては５〜８員環が好ましく、非芳香族または芳香族の環のいずれであってもよい。また、炭素環であってもヘテロ環であってもよく、芳香族環であることがより好ましい。
【００２４】
以下、本発明の方法に好適に用いられる化合物の具体例を挙げるが、本発明の方法はこれらの化合物を用いる場合に限定されることはない。
【００２５】
【化３】
2004113145.tif 000003
【００２６】
【化４】
2004113145.tif 000004
【００２７】
【化５】
2004113145.tif 000005
【００２８】
【化６】
2004113145.tif 000006
【００２９】
【化７】
2004113145.tif 000007
【００３０】
【化８】
2004113145.tif 000008
【００３１】
本発明の方法に用いられる化合物は、いずれも基本的には以下に示す合成経路によって合成することができる。まず、チアゾロピリジン類Ａをジメチルホルムアミド中、３当量程度のＮ−ブロモメチルフタルイミドと反応させて対応する４級塩Ｂを得る。またレピジン類Ｃをハロゲン化アルキルまたはハロゲン化アリールと反応させることで対応する４級塩Ｄが得られる。ＢとＤをジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミンを加えることで色素Ｅが生成する。色素Ｅを粗精製した後にメタノールに溶解し、室温下でアンモニア水を加えた後に反応液をセファデックスカラムにより精製することで目的物Ｆが得られる。なお、特願２００２−０３６４７３号明細書にも類似構造の化合物の製造方法が詳細に説明されており、当業者は上記明細書に記載された製造方法を適宜参照しつつ、本発明の方法に用いられる化合物を用意に製造することが可能である。
【００３２】
【化９】
2004113145.tif 000009
【００３３】
本明細書において、「無色」とは４００〜１０００ｎｍ（本明細書において「〜」で表される数値範囲は特に言及しない場合には上限及び下限を含む範囲である）における最大分子吸光係数が０〜８０００未満、好ましくは０〜５０００未満であり、最も好ましくは０〜３０００未満である。また、有色とは４００〜１０００ｎｍにおける最大分子吸光係数が２００００以上、好ましくは３００００以上であり、最も好ましくは４００００以上である。無色状態から有色状態への分子吸光係数の変化率としては５倍以上、好ましくは７倍以上、最も好ましくは１０倍以上である。
【００３４】
本明細書において、「相互作用可能」とは、上記化合物と多重鎖核酸とが親和性を有しており、可逆的な結合によりエネルギーの受け渡しなど何らかの物理化学的な相互作用を行うことができることを意味しているが、この用語はいかなる意味においても限定的に解釈してはらなず、最も広義に解釈する必要がある。「プロトン化した条件下では水溶液中で実質的に無色かつ無蛍光性の状態で存在することができる」とは、プロトン化が可能なｐＨや塩濃度などの条件が適宜選択された状態において、化合物が上記に定義された性質を有することを意味しており、その条件下以外における性質はいかなるものであってもよい。当業者は溶液のｐＨや塩濃度を通常の方法で適宜選択することにより、化合物が所望の性質を有するか否かを容易に判定することが可能である。
【００３５】
本明細書において、多重鎖核酸とは核酸が相補的配列に由来する相互作用により集合した状態を指している（相互作用による多重鎖核酸の生成過程を「ハイブリダイゼーション」と呼ぶ場合がある）。多重鎖核酸は二本鎖、三本鎖、又は四本鎖などの状態をとることが知られており、本明細書における多重鎖核酸にはこれらの多重鎖も包含される。核酸としてはＤＮＡ又はＲＮＡのほか、これらの化学修飾体が数多く知られており、さらにＰＮＡと呼ばれるポリペプチド鎖を主鎖に有する核酸類縁体なども知られているが、本明細書における多重鎖核酸にはこれらがすべて包含される。本発明においてより好ましく用いられる核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの化学修飾体であり、二本鎖、三本鎖、又は四本鎖の中では二本鎖が好ましい。プローブ核酸と試料核酸とのハイブリダイゼーションにより生成される多重鎖核酸を本明細書において「ハイブリッド多重鎖核酸」と呼ぶ。
【００３６】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の方法の原理は、プロトン化により無色化した色素化合物が多重鎖核酸と相互作用し、多重鎖核酸から受け取った相互作用エネルギーによって本来の色素の状態（色素共役系の回復）へと平衡が移動して有色化すること、及び多重鎖核酸が存在しない場合には実質的に無色の状態が保持されることに基づいている。反応系内に１本鎖核酸が存在しても色素と一本鎖核酸との相互作用エネルギーは小さいために実質的に無色の状態が保持されるが、一方、色素と多重鎖核酸との相互作用は十分に大きく、無色化された色素は多重鎖核酸との相互作用により有色の色素へと変化する。その結果、色素に光吸収が起こり蛍光性を発現させることが可能になる。
【００３７】
本発明の方法の代表的な実施形態としては以下の（１）及び（２）の２つが挙げられる。
（１）溶液中の多重鎖核酸の測定を行う。
（２）ＤＮＡアレイ形態において、固相担体上のハイブリダイゼーションが起こったスポット（遺伝子）の測定を行う。
本明細書において「測定」という用語は、検出及び定量などを含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。上記のうち、溶液中の多重鎖核酸核酸の検出及び定量を行う態様は、単に試料溶液中の多重鎖核酸の測定を行う用途の他に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）で代表される核酸増幅法を用いた試料核酸中の標的核酸配列測定方法としても極めて有効であり、本発明の光学的測定方法を好ましく適用できる。
【００３８】
溶液中の多重鎖核酸を測定する場合に、上記の化合物の好ましい濃度は検出対象の多重鎖核酸の濃度によっても異なるが、通常１×１０−１０モル／Ｌないし１×１０−３モル／Ｌであり、さらに好ましくは１×１０−９モル／Ｌないし１×１０−４モル／Ｌであり、５×１０−８モル／Ｌないし１×１０−５モル／Ｌが最も好ましい。多重鎖核酸と上記化合物を接触させためには、一般的には、試料核酸の溶液と本発明の化合物の溶液を混合すればよいが、試料核酸の溶液に上記化合物を固体として添加してもよいし、他の媒体に本発明の化合物を吸着させて試料核酸溶液に混合してもよい。上記化合物を多重鎖核酸と接触させて光学的な測定を行う際に、検出用セルを光学的測定を行いながら多重鎖核酸と接触させてもよいし、多重鎖核酸と接触させた後に光学的な検出を行ってもよい。好ましくは多重鎖核酸と上記化合物を接触させた後、０．０１秒〜１０００秒の間に検出を行うことが好ましく、０．１秒〜６００秒の間に検出を行うことが好ましい。
【００３９】
測定を行う際の溶液のｐＨは２．０ないし１０．０が好ましく、３．０ないし９．０がより好ましく、４．０ないし８．０が最も好ましい。ｐＨを調節するために、緩衝液を用いることも好ましい。緩衝液としては「蛋白質・酵素の基礎実験法」（堀尾式一編、南江堂（１９９４年刊））などに詳しく記載されているが、フタル酸水素カリウム−塩酸緩衝液、クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、トリエタノールアミン・塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｎ−エチルモルホリン−塩酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ジエタノールアミン−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ブリトン−ロビンソン広域緩衝液、ＧＴＡ広域緩衝液などを好ましく用いることができる。緩衝液の濃度は０．１ｍＭないし５００ｍＭが好ましく、０．５ｍＭないし２００ｍＭがより好ましく、１ｍＭないし５０ｍＭがさらに好ましい。プロトン化により無色化する化合物を測定に用いる場合には、プロトン化が生じるｐＨ以下に調整することが好ましい。測定を行う際の溶液は水溶液が好ましく用いられるが、さらにメタノール、エタノール、エチレングリコール、グリセリン又はジエチレングリコールなどのアルコール類やジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド又はスルホランなどの水混和性溶媒も混合して用いることができる。
【００４０】
光学的測定は蛍光検出法が感度の点で好ましい。通常は蛍光光度計で測定することができ、溶液に励起光を通過させて直角方向から蛍光を測定する方法を用いることが好ましいが、反射光を測定するような方法を用いてもよい。また、試料溶液を固相担体上に展開又はスポットしたのちに、乾燥して、あるいは乾燥せずに蛍光レーザースキャナーやＣＣＤ（電荷結合素子）などで測定する方法を採用してもよい。また、測定は１試料ごとに行ってもよいし、９６穴や３８４穴マイクロプレートなどを用いて多数の試料を同時に測定してもよい。
【００４１】
上記（２）のＤＮＡアレイ形態においては、固相担体上のハイブリダイゼーションが起こったスポット（遺伝子）の測定に本発明の方法を好ましく適用することができる。この場合、プローブ核酸は溶液中に存在していてもよいが、固相担体に固定されている方が好ましい。固相担体としては、その表面に凹凸を有する平面性の低いものであってもよい。固相担体の材質は特に限定されないが、例えば、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース類、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織捕物、不織布、減紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質などを拳げることができる。また、形状としては平板状、球状、ファイバー状、又は棒状等を例示することができるが、特に限定されることはない。固相担体の大きさも特に限定されず、ｎｍオーダーのものからｃｍオーダーのものであってもよい。多孔質物質の細孔の大きさは、２〜１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２〜５００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。平板プレート状の場合、固相担体の厚さは、１００〜２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００４２】
固相担体上へのプローブ核酸の固定化法は、核酸断片の種類及び基板の種類に応じて適当な方法を選択することができる（蛋白質・核酸・酵素，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１３，２００４−２０１１（１９９８））。例えば、核酸断片がｃＤＮＡやＰＣＲ産物の場合には、ＤＮＡの荷電を利用して、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等の陽イオンで表面処理した基板に静電結合させる方法を用いることができる。結合をより強固にするために紫外線を照射する方法も用いることができる。表面処理された基板上に、さらに電荷を有する親水性の高分子物質等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。また、基板によっては、その基板中に親水性の高分子等を含ませることも可能であり、このような処理を施した基板も好ましく用いることができる。表面処理を行うことによって、疎水性、あるいは親水性に乏しい基板と核酸断片との静電的な相互作用を促進することができる。基板としては、表面処理の容易さと解析の容易さのため、スライドガラスを用いることが好ましい。
【００４３】
合成ヌクレオチドを固定する場合には、基板上で直接合成する方法、あるいは予め末端に共有結合のための官能基を導入したオリゴマーを合成し、表面処理した基板に共有結合させる方法を用いることができる。官能基としてはアミノ基、アルデヒド基、メルカプト基、ビオチン等を挙げることができる。特開２００１−２２８１５２号に記載の方法も好ましく用いることができる。基板としては、ガラスやシリコンを用いることが好ましく、ガラスやシリコンの表面処理には公知のシランカップリング剤を用いることが好ましい。基板上に固定される核酸断片は、後述する検出対象の試料核酸断片であってもよい。以下、基板に固定される核酸断片を塩基配列が既知の核酸断片とし、核酸分析素子に接触させる核酸断片を試料核酸断片として説明する。
【００４４】
ＤＮＡ断片の種類は目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅しないものも好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４ｎ（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましい。ＤＮＡ断片は、２〜１００量体であることが好ましく、２０〜８０量体であることが特に好ましい。
【００４５】
ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して行うことが好ましい。点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質であることが好ましい。このような物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド及び低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。ポリマーの分子量は１０３〜１０５の範囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリセリンあるいはエチレングリコールを用いることがさらに好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１〜２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５〜１容量％の範囲にあることが特に好ましい。また、同じ目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相担体を、９０％以上の湿度及び２５〜５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
【００４６】
ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施してもよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００４７】
ＤＮＡ断片は、固相担体表面に対して、１０２〜１０５種類／ｃｍ２の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０−１５モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。ドット間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、１００〜３００μｍの範囲にあることが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好ましく、１ｎＬ〜１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。
【００４８】
上記の工程によって作製されたＤＮＡチップの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡチップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、本発明の原理に基づく非標識核酸の光学的検出法である。
【００４９】
本発明の方法を行うにあたっては、他の核酸標織方法と併用して行うことができる。他の標識法としてはＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、化学発光法等）とが知られているが、本発明の方法はいずれの方法とも併用することができる。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。
【００５０】
試料核酸断片としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。試料がゲノムの場合には、赤血球を除く任意の組織、サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液りンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡの場合には、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。本発明の方法ではｍＲＮＡを直接検出することも可能であるが、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡを用いることもできる。この場合、ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡの量は液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であることが好ましい。なお、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、適切なプライマー存在下で標的領域のＰＣＲを行って得ることもできる。
【００５１】
ハイブリダイゼーションは、試料核酸断片を溶解あるいは分散させた水性液を上記で作製したＤＮＡチップ上に展開することによって行うことが好ましい。展開の量は特に限定されないが、通常は１〜１００μＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、例えば、室温〜７０℃の温度範囲で１〜２０時間の範囲で行うことが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝被、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝被、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。ハイブリダイゼーションと同時に上記化合物をハイブリッド多重鎖核酸と接触させて相互作用させる方法を採用する場合には、上記と同じような方法で洗浄を行ってもよいが、特に洗浄を行わずにそのまま光学的測定を行うことも可能であり、そのような態様は好まし方法である。
【００５２】
ＤＮＡアレイを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、試料核酸断片の使用量が非常に少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮＡ断片の鎖長や試料核酸断片の種類により、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
【００５３】
上記化合物をハイブリッド多重鎖核酸に対して接触させる時の溶媒は特に限定されないが、通常は水又は各種緩衝液のほか、水に混和しうる有機溶媒を適宜用いることができる。水に混和しうる有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、エチレングリコール、グリセリンなどが好ましい。また、水又は緩衝液とこれらの有機溶媒とを混合して用いることも好ましい。本発明の多重鎖核酸の測定において、上記化合物の好ましい濃度は検出対象の多重鎖核酸の濃度によっても異なるが、通常１×１０−１０モル／Ｌ〜１×１０−３モル／Ｌであり、さらに好ましくは１×１０−９モル／Ｌ〜１×１０−４モル／Ｌであり、５×１０−８モル／Ｌ〜５×１０−５モル／Ｌが最も好ましい。
【００５４】
ＤＮＡアレイを用いて上記化合物を多重鎖核酸と接触させる場合には、上記化合物の溶液をアレイ上に展開する方法が最も好ましく用いられるが、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡアレイを上記化合物の溶液に浸漬する方法も好ましく用いることができる。また、上記化合物をハイブリダイゼーション時に存在させる方法も採ることができる。上記化合物を多重鎖核酸と接触させて光学的測定を行う際に、好ましくは多重鎖核酸と接触後、０．０１秒〜１０００秒の間に検出を開始することが好ましく、０．１秒〜６００秒の間に検出を開始することが好ましい。
【００５５】
光学的測定を行うときの上記化合物の溶液のｐＨは２．０〜１０．０が好ましく、３．０〜９．０がより好ましく、４．０〜８．０が最も好ましい。ｐＨを調節するために、緩衝液を用いることも好ましく、緩衝液としては「蛋白質・酵素の基礎実験法」（堀尾式一編、南江堂（１９９４年刊））などに詳しく記載されているが、フタル酸水素カリウム−塩酸緩衝液、クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、トリエタノールアミン・塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｎ−エチルモルホリン−塩酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ジエタノールアミン−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ブリトン−ロビンソン広域緩衝液、ＧＴＡ広域緩衝液などを好ましく用いることができる。緩衝液の濃度は０．１ｍＭないし５００ｍＭが好ましく、０．５ｍＭないし２００ｍＭがより好ましく、１ｍＭないし５０ｍＭがさらに好ましい。
【００５６】
上記化合物をハイブリッド多重鎖核酸に接触させた後は、過剰の化合物を除去するために洗浄を行ってもよい。この場合にはハイブリダイゼーション後の洗浄と同様の操作で行うことができる。また、前述したように、本発明の方法では洗浄を行わなくても光学的検出が可能であり、洗浄操作を省略することも好ましい。
【００５７】
なお、光学的検出は溶液系で多重鎖核酸を検出する場合には、通常の蛍光光度計を用いることもできるが、多数同時検出が可能な点及び感度の点などから蛍光スキャナーを用いて行うことが好ましい。また、蛍光量の測定は、ハイブリダイゼーション後の基板を乾燥させるか、あるいは水性溶媒の存在下に、従来の蛍光レーザースキャナー法によって行ってもよく、あるいは該基板を乾燥させないように基板をカバーガラスで覆い、冷却ＣＣＤ（電荷結合素子）法や蛍光レーザースキャナー法によって行ってもよい。
【００５８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。実施例中の化合物番号（色素番号として表示してある）は上記に好ましい化合物として示した化合物の番号に対応させてある。
【００５９】
［合成例１］色素ＩＩＩ−２の合成：
（ＩＩＩ−２−１）：６−メチル−２−メルカプトチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．）、３７巻、２４８頁（１９９４年）に記載の方法に従って合成した。１０ｇの２−アミノ−３−ブロモ−５−メチルピリジン、Ｎ−メチルピロリドン１２０ｍＬ、キサントゲン酸カリウム１６．７ｇを混合し、１７０℃で３．５時間加熱した。反応液は最初黒色となり、次第に赤褐色となった。反応終了後、室温に冷却し、酢酸で酸性にすると目的物結晶（灰黄色）が得られた。結晶を濾取し、水洗、乾燥を行った。
収量８．７ｇ、収率８９．２％
【００６０】
（ＩＩＩ−２−２）：６−メチル−２−メチルチオチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
合成例（ＩＩＩ−２−１）で合成した６−メチル−２−メルカプトチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン２ｇを１０ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、トリエチルアミン２ｍＬを添加した。次に、ヨウ化メチル１．５ｍＬを添加し、室温で３０分反応した。反応液に水１００ｍＬを添加し、析出した結晶を濾取した。水洗を行い、乾燥して目的物を得た。
収量１．７ｇ、収率７８．９％
【００６１】
（ＩＩＩ−２−３）：臭化　６−メチル−２−メチルチオ−４−フタルイミドメチル−チアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウムの合成
合成例（ＩＩＩ−２−２）で合成した６−メチル−２−メチルチオチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン０．５ｇにＮ−ブロモメチルフタルイミド１．５ｇおよびＤＭＦ３ｍｌを混合し、撹拌しながら１４０℃で５分間加熱した。冷却後、酢酸エチルを添加し、酢酸エチル可溶成分をデカンテーションで除去する操作を３回繰り返して目的物を得た。このものはこれ以上精製することなく次の反応に使用した。
【００６２】
（ＩＩＩ−２−４）：７−メトキシレピジンの合成
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー、６７巻、８６項（１９４５年）に記載の方法に従って合成した。３０．８ｇのｍ−アニシジン、１０８．０ｇの３塩化鉄６水和物、４．０ｇの塩化亜鉛、２００ｍｌのエタノールを混合し、内温が６０℃になるまで加熱攪拌する。６０℃に達したところで１４．０ｇのメチルビニルケトンを３０分以上かけて滴下し、滴下終了後２時間加熱還流する。放冷した後に溶媒を減圧下で留去し、２５％水酸化ナトリウム水溶液を加えてアルカリ性溶液にした。セライトろ過後、酢酸エチルで抽出して得られた有機層をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的を得た。
収量１８．２０ｇ、収率４２％
【００６３】
（ＩＩＩ−２−５）：レピジニウム塩の合成
（ＩＩＩ−２−４）で合成した７−メトキシレピジン５００ｍｇとＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−エトキシカルボニルプロピル−３−ブロモブチルアンモニウムブロミド６００ｍｇおよびＤＭＦ０．５ｍｌを混合し、攪拌しながら１４０℃で３０分間加熱した。放冷後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル可溶成分をデカンテーションで除去する操作を３回繰り返して目的物を得た。この生成物はさらに精製することなく次の反応に用いた。
【００６４】
（ＩＩＩ−２−６）：色素ＩＩＩ−２の合成
合成例（１−４）で合成したレピジニウム塩１００ｍｇと合成例（１−３）で合成した臭化　６−メチル−２−メチルチオ−４−フタルイミドメチル−チアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム２００ｍｇを５ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミン０．３ｍＬを加えて室温で２時間反応した。ついで、５０ｍＬの酢酸エチルを加えて酢酸エチル可溶成分をデカンテーションで除いた。得られた成分をメタノールに溶解し、室温下でアンモニア水を加えて一晩放置した。この反応液をカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０、溶出液：メタノール）で精製し、目的物を得た。
収量１６ｍｇ
【００６５】
例２：色素ＩＩＩ−３の合成：
（ＩＩＩ−３−１）：５，７−ジメトキシレピジンの合成
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー、６７巻、８６項（１９４５年）に記載の方法に従って合成した。１７．２ｇのｍ−アニシジン、４８．０ｇの３塩化鉄６水和物、１．８ｇの塩化亜鉛、１６０ｍｌのエタノールを混合し、内温が６０℃になるまで加熱攪拌した。６０℃に達したところで７．８ｇのメチルビニルケトンを３０分以上かけて滴下し、滴下終了後２時間加熱還流した。放冷した後に溶媒を減圧下で留去し、２５％水酸化ナトリウム水溶液を加えてアルカリ性溶液にした。セライトろ過後、酢酸エチルで抽出して得られた有機層をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して目的を得た。
収量３．９４ｇ、収率１８％
【００６６】
（ＩＩＩ−３−２）：レピジニウム塩の合成
５、７−ジメトキシレピジン５００ｍｇとＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−エトキシカルボニルプロピル−３−ブロモブチルアンモニウム　ブロミド６００ｍｇおよびＤＭＦ０．５ｍｌを混合し、攪拌しながら１４０℃で３０分間加熱した。放冷後、酢酸エチルを加えて酢酸エチル可溶成分をデカンテーションで除去する操作を３回繰り返して目的物を得た。この生成物はさらに精製することなく次の反応に用いた。
【００６７】
（ＩＩＩ−３−３）：色素３の合成
合成例（ＩＩＩ−３−２）で合成したレピジニウム塩１００ｍｇと合成例（ＩＩＩ−２−３）で合成した臭化　６−メチル−２−メチルチオ−４−フタルイミドメチル−チアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム２００ｍｇを５ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミン０．３ｍＬを加えて１００℃で３０分間反応した。放冷後、５０ｍＬの酢酸エチルを加えて酢酸エチル可溶成分をデカンテーションで除いた。得られた成分をメタノールに溶解し、室温下でアンモニア水を加えて一晩放置した。この反応液をカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０、溶出液：メタノール）で精製し、目的物を得た。
収量６ｍｇ
【００６８】
例３：色素ＩＶ−１の合成：
（ＩＶ−１−１）：４−アミノ−３−ブロモピリジンの合成
シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、２１７５項、２０００年の記載に従って合成した。４−アミノピリジン１５．０ｇをアセトニトリル４５０ｍＬに溶解し、Ｎ−ブロモコハク酸イミド２８．４ｇを加え、室温で２４時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより目的物を得た。黄色結晶。
収量２６．５ｇ、収率９５％
【００６９】
（ＩＶ−１−２）：２−メルカプトチアゾロ［５，４−ｃ］ピリジンの合成
ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．）、３７巻、２４８頁（１９９４年）に記載の方法を参考にして合成した。（５−１）で合成した４−アミノ−３−ブロモピリジン２０．０１ｇ、　Ｎ−メチルピロリドン１７０ｍＬ、キサントゲン酸カリウム３７．０６ｇを混合し、１６０℃で５時間加熱した。反応終了後、室温に冷却し、酢酸で酸性にすると目的物結晶（紫色）が得られた。結晶を濾取し、乾燥することで目的物を得た。
収量７．９６ｇ、収率４１％
【００７０】
（ＩＶ−１−３）：２−メチルチオチアゾロ［５，４−ｃ］ピリジンの合成
（ＩＶ−１−２）で合成した２−メルカプトチアゾロ［５，４−ｃ］ピリジン６．０２ｇ、炭酸カリウム４．９７ｇを８０ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し室温で３０分攪拌した。次に、ヨウ化メチル１．０３ｍＬを添加し、室温でさらに３０分反応した。反応液に水１００ｍＬを添加し、析出した結晶を濾取し乾燥することで目的物を得た。
収量３．２１ｇ、収率４９％
【００７１】
（ＩＶ−１−４）：臭化　２−メチルチオ−６−フタルイミドメチル−チアゾロ［５，４−ｃ］ピリジニウムの合成
合成例（ＩＩＩ−２−５）で合成した２−メルカプトチアゾロ［５，４−ｃ］ピリジン０．５ｇにＮ−ブロモメチルフタルイミド１．５ｇおよびＤＭＦ３ｍｌを混合し、撹拌しながら１４０℃で５分間加熱した。冷却後、酢酸エチルを添加し、酢酸エチル可溶成分をデカンテーションで除去する操作を３回繰り返して目的物を得た。このものはこれ以上精製することなく次の反応に使用した。
【００７２】
（ＩＶ−１−５）：色素５の合成
合成例（５−５）で合成したレピジニウム塩１００ｍｇと合成例（５−４）で合成した臭化　２−メチルチオ−６−フタルイミドメチル−チアゾロ［５，４−ｃ］ピリジニウム２００ｍｇを５ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミン０．３ｍＬを加えて室温で２時間反応した。ついで、５０ｍＬの酢酸エチルを加えて酢酸エチル可溶成分をデカンテーションで除く。得られた成分をメタノールに溶解し、室温下でアンモニア水を加えて一晩放置する。この反応液をカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０、溶出液：メタノール）で精製し、目的物を得た。
収量２４ｍｇ
【００７３】
例４：色素ＩＩＩ−４の合成：
（ＩＩＩ−４−１）：５−（２−ベンゾチアゾリル）−２−アミノピリジンの合成ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．）、３９巻、３３７５頁（１９９６年）に記載の方法に従って合成した。６−アミノニコチン酸１０．０７ｇと２−アミノチオフェノール９．６９ｇにポリリン酸約９０ｇを加えて２２０℃で４時間加熱した。冷却後、冷水で冷やした１０％炭酸ナトリウム水溶液３ｌに反応混合物を注ぎ、生じた沈殿を吸引ろ過した。この粗生成物を一度回収し、メタノールで洗浄して吸引ろ過、乾燥することにより目的物を得た。
収量１１．２３ｇ、収率６５％
【００７４】
（ＩＩＩ−４−２）：５−（２−ベンゾチアゾリル）−３−ブロモ−２−アミノピリジンの合成
（ＩＩＩ−４−１）で合成した５−（２−ベンゾチアゾリル）−２−アミノピリジン８１０ｍｇを塩化メチレン１５ｍｌに溶解し、Ｎ−ブロモコハク酸イミド６７０ｍｇを加え、室温で３時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、塩化メチレンで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を減圧濃縮したところ、結晶が析出したのでこれを乾燥し、これ以上精製することなく次の反応に用いた。
【００７５】
（ＩＩＩ−４−３）：６−（２−ベンゾチアゾリル）−２−メルカプトチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．）、３７巻、２４８頁（１９９４年）に記載の方法を参考にして合成した。（ＩＩＩ−４−２）で合成した５−（２−ベンゾチアゾリル）−３−ブロモ−２−アミノピリジン８．０ｇ、　Ｎ−メチルピロリドン８０ｍＬ、キサントゲン酸カリウム８．３８ｇを混合し、１６０℃で４．５時間加熱した。反応液は最初黒色となり、次第に赤褐色となった。反応終了後、室温に冷却し、酢酸で酸性にすると目的物結晶（灰黄色）が得られた。結晶を濾取し、酢酸エチルで洗浄し乾燥することで目的物を得た。
収量４．０７ｇ、収率５２％
【００７６】
（ＩＩＩ−４−４）：６−（２−ベンゾチアゾリル）−２−メチルチオチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
（ＩＩＩ−４−３）で合成した６−（２−ベンゾチアゾリル）−２−メルカプトチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン４．０６ｇを４０ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミン１．８７ｍＬを添加した。次に、ヨウ化メチル０．４ｍＬを添加し、室温で３０分反応した。反応液に水１００ｍＬを添加し、析出した結晶を濾取した。さらに酢酸エチルで洗浄し、乾燥することで目的物を得た。
収量２．２０ｇ、収率５２％
【００７７】
（ＩＩＩ−４−５）：臭化　６−（２−ベンゾチアゾリル）−２−メチルチオ−４−フタルイミドメチル−チアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウムの合成
合成例（ＩＩＩ−４−４）で合成した６−（２−ベンゾチアゾリル）−２−メチルチオチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン０．５ｇにＮ−ブロモメチルフタルイミド１．５ｇおよびＤＭＦ３ｍｌを混合し、撹拌しながら１４０℃で５分間加熱した。冷却後、酢酸エチルを添加し、酢酸エチル可溶成分をデカンテーションで除去する操作を３回繰り返して目的物を得た。このものはこれ以上精製することなく次の反応に使用した。
【００７８】
（ＩＩＩ−４−６）：色素８の合成
合成例（ＩＩＩ−２−５）で合成したレピジニウム塩１００ｍｇと合成例（ＩＩＩ−４−５）で合成した臭化　６−（２−ベンゾチアゾリル）−２−メチルチオ−４−フタルイミドメチル−チアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム２００ｍｇを５ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミン０．３ｍＬを加えて室温で２時間反応した。ついで、５０ｍＬの酢酸エチルを加えて酢酸エチル可溶成分をデカンテーションで除く。得られた成分をメタノールに溶解し、室温下でアンモニア水を加えて一晩放置する。この反応液をカラムクロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０、溶出液：メタノール）で精製し、目的物を得た。
収量９ｍｇ
【００７９】
例５：色素ＩＩＩ−５の合成：
（ＩＩＩ−５−１）２−アミノ−４−（４−メトキシフェニル）−ピリジンの合成２−アミノ−５−ブロモピリジン５．０１ｇ、４−メトキシフェニルホウ酸４．８３ｇ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム１．００ｇ、トルエン５０ｍｌおよび２規定炭酸ナトリウム水溶液２５ｍｌの混合物を窒素雰囲気下、１００℃に加熱して２時間攪拌した。放冷後、反応混合物をセライトでろ過し、酢酸エチルで抽出して有機層を水および飽和食塩水で洗浄した。有機層を減圧下で濃縮し、ヘキサン／酢酸エチルで再結晶することにより目的物を得た。
収量４．７６ｇ、収率８２％
【００８０】
（ＩＩＩ−５−２）２−アミノ−３−ブロモ−４−（４−メトキシフェニル）−ピリジンの合成
（ＩＩＩ−５−１）で合成した２−アミノ−４−（４−メトキシフェニル）−ピリジン４．７６ｇ、Ｎ−ブロモコハク酸イミド４．２３ｇおよびアセトニトリル１００ｍｌを混合し、室温で３０分間攪拌する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより目的物を得た。
収量３．５７ｇ、収率５４％
【００８１】
（ＩＩＩ−５−３）６−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．）、３７巻、２４８頁（１９９４年）に記載の方法を参考にして合成した。（９−２）で合成した２−アミノ−３−ブロモ−４−（４−メトキシフェニル）−ピリジン３．５７ｇ、　Ｎ−メチルピロリドン２０ｍｌ、キサントゲン酸カリウム４．１０ｇを混合し、１６０℃で４．５時間加熱した。反応液は最初黒色となり、次第に赤褐色となった。反応終了後、室温に冷却し、酢酸で酸性にすると目的物結晶（灰黄色）が得られた。結晶を濾取し、酢酸エチルで洗浄し乾燥することで目的物を得た。
収量１．４７ｇ、収率４２％
【００８２】
（ＩＩＩ−５−４）：６−（４−メトキシフェニル）−２−メチルチオチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
（ＩＩＩ−５−３）で合成した６−（４−メトキシフェニル）−２−メルカプトチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン１．４７ｇ、炭酸カリウム７４５ｍｇを２０ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、３０分間室温で攪拌した。次に、ヨウ化メチル０．２ｍＬを添加し、室温で３０分反応した。反応液に水１００ｍＬを添加し、析出した結晶を濾取した。さらに酢酸エチルで洗浄し、乾燥することで目的物を得た。
収量８２０ｍｇ、収率５５％
【００８３】
（ＩＩＩ−５−５）：臭化　６−（４−メトキシフェニル）−２−メチルチオ−４−フタルイミドメチル−チアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウムの合成
合成例（ＩＩＩ−５−４）で合成した６−（４−メトキシフェニル）−２−メチルチオチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン０．５ｇにＮ−ブロモメチルフタルイミド１．５ｇおよびＤＭＦ３ｍｌを混合し、撹拌しながら１４０℃で５分間加熱した。冷却後、酢酸エチルを添加し、酢酸エチル可溶成分をデカンテーションで除去する操作を３回繰り返して目的物を得た。このものはこれ以上精製することなく次の反応に使用した。
【００８４】
（ＩＩＩ−５−６）：色素９の合成
合成例（ＩＩＩ−２−５）で合成したレピジニウム塩１００ｍｇと合成例（ＩＩＩ−５−５）で合成した臭化　６−（４−メトキシフェニル）−２−メチルチオ−４−フタルイミドメチル−チアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム２００ｍｇを５ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミン０．３ｍＬを加えて室温で２時間反応した。ついで、５０ｍＬの酢酸エチルを加えて酢酸エチル可溶成分をデカンテーションで除く。得られた成分をメタノールに溶解し、室温下でアンモニア水を加えて一晩放置する。この反応液をカラムクロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０、溶出液：メタノール）で精製し、目的物を得た。
収量１０ｍｇ
【００８５】
例６：色素ＩＩＩ−８の合成：
（ＩＩＩ−８−１）２−アミノ−４−フェニル−ピリジンの合成
２−アミノ−５−ブロモピリジン５．０１ｇ、４−フェニルホウ酸３．８９ｇ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム１．００ｇ、トルエン５０ｍｌおよび２規定炭酸ナトリウム水溶液２５ｍｌの混合物を窒素雰囲気下、１００℃に加熱して２時間攪拌した。放冷後、反応混合物をセライトでろ過し、酢酸エチルで抽出して有機層を水および飽和食塩水で洗浄した。有機層を減圧下で濃縮し、ヘキサン／酢酸エチルで再結晶することにより目的物を得た。
収量３．３８ｇ、収率６８％
【００８６】
（ＩＩＩ−８−２）２−アミノ−３−ブロモ−４−フェニル−ピリジンの合成
（ＩＩＩ−８−１）で合成した２−アミノ−４−フェニル−ピリジン３．３８ｇ、Ｎ−ブロモコハク酸イミド３．５３ｇおよびアセトニトリル１００ｍｌを混合し、室温で３０分間攪拌する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより目的物を得た。
収量２．５０ｇ、収率５１％
【００８７】
（ＩＩＩ−８−３）６−フェニル−２−メルカプトチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．）、３７巻、２４８頁（１９９４年）に記載の方法を参考にして合成した。（１２−２）で合成した２−アミノ−３−ブロモ−４−フェニル−ピリジン２．５０ｇ、　Ｎ−メチルピロリドン２０ｍｌ、キサントゲン酸カリウム３．２２ｇを混合し、１６０℃で４．５時間加熱した。反応液は最初黒色となり、次第に赤褐色となった。反応終了後、室温に冷却し、酢酸で酸性にすると目的物結晶（灰黄色）が得られた。結晶を濾取し、酢酸エチルで洗浄し乾燥することで目的物を得た。
収量１．５４ｇ、収率６３％
【００８８】
（ＩＩＩ−８−４）：６−フェニル−２−メチルチオチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジンの合成
（ＩＩＩ−８−３）で合成した６−フェニル−２−メルカプトチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン１．５４ｇ、炭酸カリウム８８０ｍｇを２０ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、３０分間室温で攪拌した。次に、ヨウ化メチル０．２ｍＬを添加し、室温で３０分反応した。反応液に水１００ｍＬを添加し、析出した結晶を濾取した。さらに酢酸エチルで洗浄し、乾燥することで目的物を得た。
収量１．０８ｍｇ、収率７０％
【００８９】
（ＩＩＩ−８−５）：臭化　６−フェニル−２−メチルチオ−４−フタルイミドメチル−チアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウムの合成
合成例（ＩＩＩ−８−４）で合成した６−フェニル−２−メチルチオチアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン０．５ｇにＮ−ブロモメチルフタルイミド１．５ｇおよびＤＭＦ３ｍｌを混合し、撹拌しながら１４０℃で５分間加熱した。冷却後、酢酸エチルを添加し、酢酸エチル可溶成分をデカンテーションで除去する操作を３回繰り返して目的物を得た。この生成物はさらに精製することなく次の反応に使用した。
【００９０】
（ＩＩＩ−８−６）：色素９の合成
合成例（ＩＩＩ−２−５）で合成したレピジニウム塩１００ｍｇと合成例（ＩＩＩ−８−５）で合成した臭化　６−フェニル−２−メチルチオ−４−フタルイミドメチル−チアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム２００ｍｇを５ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミン０．３ｍＬを加えて室温で２時間反応した。ついで、５０ｍＬの酢酸エチルを加えて酢酸エチル可溶成分をデカンテーションで除く。得られた成分をメタノールに溶解し、室温下でアンモニア水を加えて一晩放置する。この反応液をカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０、溶出液：メタノール）で精製し、目的物を得た。
収量１０ｍｇ
【００９１】
例７：溶液系での多重鎖核酸の検出
（試料核酸の調製）
２重鎖核酸としてデオキシリボ核酸ナトリウム，繊維状，サケ精巣製（和光純薬工業（株）製）をｐＨ７．５のリン酸緩衝液に溶解し１００μｇ／ｍＬの水溶液を作製した。さらにこれを１００℃で３０分加熱したのちに氷水で急冷し１本鎖のデオキシリボ核酸水溶液を調製した。
【００９２】
（検出用化合物の調整）
表１に示した化合物をｐＨ７．５のリン酸緩衝液に溶解し、３２０ｎｍで吸光度が１．０になるように調整した。比較としてモレキュラー・プローブス社の　ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ　をｐＨ７．５のリン酸緩衝液に溶解し、可視域での光学濃度０．５の溶液を調製した。
（蛍光強度の測定）
２本鎖核酸または１本鎖核酸を１、検出用化合物を１、希釈用緩衝液を８の比で混合した溶液を作製し、蛍光光度計を用いて蛍光強度を測定し、（表１）に示した。蛍光強度はそれぞれの試料について蛍光励起スペクトルを測定し、強度最大となる波長で励起したときの蛍光強度を示した。
【００９３】
【表１】
2004113145.tif 000010
蛍光光度計：ＲＦ−５３００ＰＣ（島津製作所製），バンド幅：３，感度：Ｈｉｇｈ
【００９４】
表１に示した結果より、本発明の方法では弱アルカリ性の条件下で２本鎖核酸が存在する場合には高い蛍光収率（蛍光強度／吸光度）が達成されていることがわかる。さらに１本鎖に比較して２本鎖の存在によって蛍光強度が飛躍的に上昇しており、本発明の方法が中性近くの条件で２本鎖核酸を検出するために極めて優れていることがわかる。
【００９５】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、中性〜弱塩基性のｐＨ領域において多重鎖核酸を極めて高感度かつ選択的に検出することができる。