(57)【要約】【課題】本発明の課題は、抗リン脂質抗体の特異性を検査できると同時に、凝固機能検査に反映うる抗リン脂質抗体の検査方法を提供することである。【解決手段】血液凝固に関与するリン脂質としてホスファチジルセリン（ＰＳ）が凝固活性に大きく影響していること、又ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）が活性型プロテインＣによる抗凝固活性の発現に影響していることから、これら特定のリン脂質の濃度の異なるＡＰＴＴ試薬を組み合わせて血液凝固検査を行うことにより抗リン脂質抗体を特異的に検査できることを見出した。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原性を有する特定のリン脂質の異なる濃度の組成物を組み合わせて用いることを特徴とする抗リン脂質抗体の検査方法。
【請求項２】
抗リン脂質抗体の検査法が血液凝固法である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法に用いる試薬又はキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床検査の分野で用いられ、とりわけ抗リン脂質抗体の検査方法として用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
動脈や静脈の血栓症や習慣性流産をきたす疾患として抗リン脂質症候群Ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＡＰＳ）が知られている。主な抗リン脂質抗体としては、カルジオリピン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンに対する抗体、さらにカルジオリピンに結合したβ２ＧＰ１上に新たに出現した抗原決定基に対して反応する抗体（抗β２ＧＰ１抗体）、ループスアンチコアグラントが知られている。特に若年者の血栓症や習慣性流産では抗リン脂質抗体は重要であり、陽性者では発症予防をはかる必要があることから、ループスアンチコアグラントや抗カルジオリピン抗体などの抗リン脂質抗体の検査は臨床的意義が高いと言われている。ループスアンチコアグラントはＡＰＴＴの延長をもたらすが、臨床的には凝固亢進状態を示し、血栓症をきたす。ループスアンチコアグラントの検査方法は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、カオリン凝固時間、希釈ＡＰＴＴ、希釈ラッセル蛇毒時間、血小板中和試験等を組み合わせて行われている。ＡＰＴＴ延長を認めた検体を、活性化剤とリン脂質から調製されているＡＰＴＴ試薬を、水で希釈してリン脂質濃度を低下させて測定する希釈ＡＰＴＴ法では、リン脂質の濃度は低下するので抗リン脂質抗体により阻害されるリン脂質の効果を検査している。しかしこの方法では、活性化剤の濃度も同時に低下するので、正確な検査ができなかった。そこでリン脂質を含まないで活性化剤のみを含む組成液でＡＰＴＴ試薬を希釈する方法が提案されている。しかし、この場合でも抗リン脂質抗体の特異性を検査することができないといった欠点がある上に、リン脂質濃度全体が下がるため測定値の比較が困難であった。
【０００３】
血小板中和試験では、正常人の血小板濃縮画分を別途調製しそれを検体に添加した場合にＡＰＴＴの延長が改善されるか否かを検査している。この検査では正常人の血小板を別途調製する煩雑な操作が必要であり、簡便な操作法が要望されていた。希釈ラッセル蛇毒試験は凝固時間の延長した検体にリン脂質を添加することにより凝固時間の延長が改善されるか否かを検査している。この場合もリン脂質の成分を特定した組成物を添加するのではなく、単に天然のリン脂質抽出物を添加しているだけである。従って、抗リン脂質抗体の特異性を考慮した検査が要望されている。
【０００４】
米国特許５４７２８５２には、活性化プロテインＣによる抗凝固作用を利用して抗リン脂質抗体を検査する方法が開示されている。この例示では一定濃度のリン脂質を用いて活性化プロテインＣの有無による凝固時間の比較を行い抗リン脂質抗体を検査している。従って、リン脂質濃度による凝固時間を比較する開示はされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、抗リン脂質抗体の特異性を検査できると同時に、凝固機能検査に反映しうる抗リン脂質抗体の検査を提供することである。
【０００６】
【課題を解決する手段】
本発明者らは、血液凝固に関与するリン脂質について詳細に検討したところ、ホスファチジルセリン（ＰＳ）が凝固活性に大きく影響していること、又ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）が活性型プロテインＣによる抗凝固活性の発現に影響していることから、これら特定のリン脂質濃度の異なるＡＰＴＴ試薬を組み合わせて血液凝固検査を行うことにより抗リン脂質抗体を特異的に検査できることを見出し本発明を完成させた。
【０００７】
本発明は以下の構成からなる。
１、抗原性を有する特定のリン脂質の異なる濃度の組成物を組み合わせて用いることを特徴とする抗リン脂質抗体の検査方法。
２、抗リン脂質抗体の検査法が血液凝固法である上記１に記載の方法。
３、上記１又は２に記載の方法に用いる試薬又はキット。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、抗リン脂質抗体の検査法に関するものであり、とりわけループスアンチコアグラントの検査に適用される凝固検査に応用される。
【０００９】
抗原性の有する特定のリン脂質の例としてＰＳを例に本発明を説明する。ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ＰＥ及びＰＳを適当な組成比で混合したリン脂質混合物とＰＳを除いた組成で調製したリン脂質混合物をそれぞれクロロホルム等の有機溶媒に溶解し、溶媒成分を除去した後、適当な水溶媒を少量加えて、脂質を懸濁させることにより脂質小胞体、いわゆるリポソームを調製することができる。調製したリポソームをさらに超音波処理して微粒子のリポソームを調製することも可能である。調製した各リポソームを適当な緩衝液に懸濁する。一方、ＡＰＴＴ試薬の活性化剤は公知のものを用いることができる。たとえばコロイドシリカ、エラグ酸等を適宜選択してリポソーム溶液と混合することによりＡＰＴＴ試薬を調製することができる。本発明の方法はこのようにして調製したＰＳを含むＡＰＴＴ試薬とＰＳを含まないＡＰＴＴ試薬をそれぞれ単独又は適当な比率で混合して用いるか、予めＰＳの濃度を変化させて調製したリポソームを用いてもよい。
【００１０】
調製したＡＰＴＴ試薬を用いて、血漿検体の凝固時間を測定する。凝固時間の測定方法は、一定量の血漿と調製したＡＰＴＴ試薬をインキュベーションしたのち、塩化カルシウム溶液を添加して凝固を開始させ、塩化カルシウムの添加から凝固が観察されるまでの時間を測定する。このような凝固時間の測定は通常の血液凝固分析装置で測定される。ＰＳ濃度が通常のＡＰＴＴ測定に用いられるものと、それより約５分の１から２０分の１濃度のものを調製し、両試薬で正常検体及び検査検体のＡＰＴＴを測定し、凝固時間の延長度合いを比較検討する。ループスアンチコアグラントの検体では正常検体に比較してＡＰＴＴの延長が認められ、ＰＳ濃度の低い試薬で、より顕著に延長が認められればＰＳに対する抗体の存在が示唆される。
【００１１】
上記の例ではＰＳをターゲットにしたＡＰＴＴ試薬の例を示したが、ＰＥの場合にも同様に試薬を調製することができる。この場合には活性型プロテインＣを添加して、抗凝固活性を検査することが有効である。活性型プロテインＣを添加して前述のごとく正常血漿のＡＰＴＴを測定すると添加しない場合に比べてＡＰＴＴの延長が認められ、その延長度はＰＥ濃度が高い試薬で顕著になる。一方、ループスアンチコアグラントの検体ではＰＥ濃度にあまり依存しないＡＰＴＴを示し、ＰＥ濃度の低い試薬では正常検体よりも短縮したＡＰＴＴが観察されることになる。このように各試薬でのＡＰＴＴを比較することにより抗ＰＥ抗体の存在を検査することが可能である。
【００１２】
非常に複雑で多様な挙動を示すループスアンチコアグラント検体も本発明の方法により検査することにより、特定のリン脂質に対する抗体の存在と凝固機能検査が可能になる。
ＰＳやＰＥのみならず、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール等についても同様に調製できる。本発明は、濃度を変化させるリン脂質は１種類に限られない。例えばＰＳとＰＥの両方を変化させることも可能である。また凝固活性測定試薬はＡＰＴＴに限らずＰＴ試薬でも良い。ＰＴ試薬の場合には遺伝子組換え技術により調製した組織因子をリン脂質と結合させて、ホロ化させる方法がとられる。この場合リン脂質の組成を変化させた試薬を調製し、組み合わせて用いることにより本発明を実施できる。さらに、天然の組織因子を用いる場合には、組織より抽出した組織因子からリン脂質を除いた後、別途リン脂質の組成を変化させたリン脂質組成物を再構成することによっても実施可能である。
【００１３】
本発明で用いるリン脂質の脂肪酸については、特に限定されないが、不飽和脂肪酸を含むもの、さらに酸化されたリン脂質を用いることも可能である。
【００１４】
本発明は血小板中和試験の代用としても用いられる。すなわち、通常のＡＰＴＴ測定で延長を認めた検体に、血小板中和試験では正常人の血小板を加えて、ＡＰＴＴの延長が改善されるか否かを測定している。本発明の方法では、例えばＰＳの濃度を通常又はそれ以上に含むリン脂質組成物を血小板の代わりに添加してＡＰＴＴを測定し、ＡＰＴＴの延長が改善されるか否かを検査する。従来の正常血小板を添加する方法に比べて血小板の調製が不要になり簡単に検査が可能になる。またあらかじめ、通常のＡＰＴＴ試薬よりも２倍程度高濃度にＰＳを含むＡＰＴＴ試薬を調製しておき、通常のＡＰＴＴ試薬で測定した凝固時間と高濃度ＰＳ試薬での凝固時間を比較することにより高リン脂質抗体を検査することが可能になる。
【００１５】
本発明はさらに、希釈蛇毒試験にも用いられる。希釈蛇毒試験では蛇毒により凝固第Ｘ因子が活性化され、活性化凝固第Ｘ因子とリン脂質、凝固第Ｖ因子によりプロトロンビンが活性化されトロンビンが生成し、凝固が進む。このとき抗リン脂質抗体があると凝固時間の延長が観察される。リン脂質を添加すると凝固時間の延長が改善されることを観察して抗リン脂質抗体の検査を行っている。従来の方法ではリン脂質の組成を特定していないため感度が低いが、本発明では、特定のリン脂質、例えばＰＳの濃度を高めたリン脂質組成物或いはＰＳ単独で検体に添加することにより、抗ＰＳ抗体を吸収することにより、感度よく検査できる。
【００１６】
【実施例】
本発明の実施例を以下に示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
ホスファチジルコリンヂオレイル（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミンジオレイル（ＰＥ）及びホスファチジルセリンジオレイル（ＰＳ）の各１ｍｇ／ｍＬクロロホルム溶液を調製し、ＰＣ／ＰＥ／ＰＳ＝１／１／１の比率で組み合わせたリン脂質組成溶液の１００μＬをガラス製の小試験管に分注し窒素気流中で乾燥後、１００μＬの水と直径約２ｍｍのガラス玉を加えてリン脂質を懸濁させリポソームを調製した。調製したリポソームはさらに１５ＫＨｚで５分間超音波処理して、ユニラメラリポソーム（ＵＬＬ）を調製した。ＰＳを含まないリン試薬用の脂質としてＰＣ／ＰＥ／ＰＳ＝１／１／０（ＰＳの代わりに溶媒のみを入れて濃度を調整）の比率で組み合わせたリン脂質組成溶液を調製して同様にＵＬＬを調製した。市販のエラグ酸０．０２５ｇを０．００１Ｍ水酸化ナトリウム液１Ｌで溶解した。これに５０μｍｏｌ／Ｌになるように硫酸銅を混合し、さらに、この溶液にＴｒｉｓを０．２２ｇ、ＨＥＰＥＳを１．４５ｇ溶解させてエラグ酸溶液とした。調製した各ＵＬＬ懸濁液をエラグ酸溶液で１００倍希釈し、ＡＰＴＴ試薬を調製した（高ＰＳ試薬及び無ＰＳ試薬）。高ＰＳ試薬を無ＰＳ試薬で１０倍希釈したものをＰＳ低濃度ＡＰＴＴ試薬（低ＰＳ試薬）として調製した。調製した３種類の試薬で正常血漿及び抗リン脂質抗体陽性の血漿のＡＰＴＴをそれぞれ測定した。その結果を表１に示した。
【００１７】
【表１】
2004109034.tif 000002
【００１８】
以上の結果、低ＰＳ試薬では抗リン脂質抗体陽性血漿のＡＰＴＴが極度な延長を示し、
これらの検体には抗ＰＳ抗体の存在が強く示唆され、本発明の有用性が示された。
【００１９】
【実施例２】
実施例１のＰＳの代わりにＰＥ濃度を変化させ、ＰＳとＰＣ濃度を一定にした試薬を調製して、同様に正常血漿及び抗リン脂質抗体陽性の血漿のＡＰＴＴをそれぞれ測定した。その結果を表２に示した。
【００２０】
【表２】
2004109034.tif 000003
【００２１】
以上の結果これらの検体では、抗リン脂質抗体陽性血漿のＡＰＴＴが正常血漿のＡＰＴＴよりも有意に延長しているが、ＰＥ濃度に依存したＡＰＴＴの変動は認められないことから、ＰＥは直接的にＡＰＴＴ測定に影響しないことがわかった。
【００２２】
【実施例３】
蛇毒、商品名プロタックで活性化したプロテインＣを、検体に添加して３分間放置した後、実施例２で用いた試薬でＡＰＴＴを測定した。その結果を表３に示した。
【００２３】
【表３】
2004109034.tif 000004
【００２４】
以上の結果、抗リン脂質抗体陽性血漿では高ＰＥ試薬で正常血漿に比べて顕著にＡＰＴＴの短縮を認め、抗ＰＥ抗体によりＰＥの作用が減じられることによる活性化プロテインＣの抗凝固作用が低下することが確かめられ、本発明の有用性が確かめられた。
【００２５】
【実施例４】
実施例１で調製したＰＣ／ＰＥ／ＰＳ＝１／１／１のリポソームで調製したＡＰＴＴ試薬で測定し、正常検体及びＡＰＴＴの延長を認めた抗リン脂質抗体陽性血漿について、ＰＣ／ＰＥ／ＰＳ＝１／１／２のリポソーム及び正常ヒト血小板をそれぞれ添加してＡＰＴＴを測定した。その結果を表４に示した。
【００２６】
【表４】
2004109034.tif 000005
【００２７】
以上結果、本発明の方法は血小板中和試験の血小板に代用して用いることが可能であることが判った。
【００２８】
【発明の効果】
本発明により、抗リン脂質抗体を特異的に感度よく検査することができ、ループスアンチコアグラントの成因を検査する上においても有用である。