(57)【要約】【課題】試料中に含まれるα−トコフェロールとγ−トコフェロールの両者を分離して分析することができるとともに、きわめて短かい時間で多数の試料を効率よく、正確に分析することのできるトコフェロールの迅速分析方法を提供する。【解決手段】試料に炭素数３〜５のアルコールを加えて充分攪拌した後に遠心分離して得られた上澄液を、ＨＰＬＣによりα−トコフェロールとγ−トコフェロールを分離して分析する。アルコールとしてイソプロピルアルコールを使用し、逆相ＨＰＬＣにより分析することが好ましい。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に炭素数３〜５のアルコールを加えて充分攪拌した後に遠心分離して得られた上澄液を、高速液体クロマトグラフィーによりα−トコフェロールとγ−トコフェロールを分離して分析することを特徴とするトコフェロールの迅速分析方法。
【請求項２】
アルコールとしてイソプロピルアルコールを使用することを特徴とする請求項１に記載のトコフェロールの迅速分析方法。
【請求項３】
逆相高速液体クロマトグラフィーにより分析することを特徴とする請求項１又は２に記載のトコフェロールの迅速分析方法。
【請求項４】
オクタデシルシリル又はオクチルシリルが充填されたカラムを使用することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のトコフェロールの迅速分析方法。
【請求項５】
高速液体クロマトグラフィーの溶離液としてメチルアルコール／イソプロピルアルコール／水の混合物を使用することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のトコフェロールの迅速分析方法。
【請求項６】
２９０ｎｍ付近で励起、３３０ｎｍ付近での蛍光を測定することにより分析することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のトコフェロールの迅速分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に含まれるα−トコフェロールとγ−トコフェロールを分離して迅速に分析するトコフェロールの迅速分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビタミンＥは、α−トコフェロールとして知られ、脂質の過酸化を防止する最も大切な抗酸化物質として、老化防止用のサプリメント等に世界中で広く用いられている。このα−トコフェロールは、人体組織中で発生する最も有害な活性酸素・フリーラジカルを抑制する作用を有する。ところが、最近になってα−トコフェロールの異性体であるγ−トコフェロールが、人体組織の炎症反応を抑制することが明らかにされてきた。人体組織中のα−トコフェロールとγ−トコフェロールの量は拮抗的関係にあり、両者のバランスが適正に保たれることが必要である。このバランスが適正に保たれていれば、心筋梗塞等に伴う体内炎症の憎悪化を抑制することができるものと考えられる。
しかし、このような新しい医療を実施するには、人体の状態を時間的遅れのないように管理、フォローすることが不可欠であり、そのためには血中のα−およびγ−トコフェロールの迅速な分析法を確立することが鍵とされていた。
【０００３】
従来、血液等の試料中のトコフェロールを分析する方法としては、例えば、（１）試料に水と、トコールを含むエタノールを加え、よく混和した後に大量のｎ−ヘキサンを加えて密栓し激しく振りまぜた後に遠心分離する（抽出工程）、（２）ｎ−ヘキサン相を採取し、窒素ガスを通じながら溶媒を除去した後に少量のｎ−ヘキサンを加えて分析用サンプルを調製する（サンプル調製工程）、（３）高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と略記する  ）用のカラム（順相カラム）に分析用サンプルを注入し、蛍光を測定して分析する（分析工程）、の３段階からなる方法が知られている。（非特許文献１参照）
【０００４】
【非特許文献１】
「ビタミンＥ−基礎と臨床−」第１４−２１頁、阿部皓一外２名編集、１９８５年８月２０日、医歯薬出版社発行。
【０００５】
しかしながら、上記３段階からなる従来の分析方法では、（２）サンプル調製工程で抽出に使用した溶媒を除去するのに時間がかかるために、（１）〜（３）の全工程に必要な時間は３０〜４５分間となり、多数の試料を迅速に分析することができなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は上記従来技術の問題点を解消して、試料中に含まれるα−トコフェロールとγ−トコフェロールの両者を分離して分析することができるとともに、きわめて短かい時間で多数の試料を効率よく、正確に分析することのできるトコフェロールの迅速分析方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明では、上記課題を解決するために、つぎのような構成を採用する。
１．試料に炭素数３〜５のアルコールを加えて充分攪拌した後に遠心分離して得られた上澄液を、ＨＰＬＣによりα−トコフェロールとγ−トコフェロールを分離して分析することを特徴とするトコフェロールの迅速分析方法。
２．アルコールとしてイソプロピルアルコールを使用することを特徴とする１に記載のトコフェロールの迅速分析方法。
３．逆相ＨＰＬＣにより分析することを特徴とする１又は２に記載のトコフェロールの迅速分析方法。
４．オクタデシルシリル又はオクチルシリルが充填されたカラムを使用することを特徴とする１〜３のいずれかに記載のトコフェロールの迅速分析方法。
５．ＨＰＬＣの溶離液としてメチルアルコール／イソプロピルアルコール／水の混合物を使用することを特徴とする１〜４のいずれかに記載にトコフェロールの迅速分析方法。
６．２９０ｎｍ付近で励起、３３０ｎｍ付近での蛍光を測定することにより分析することを特徴とする１〜５のいずれかに記載のトコフェロールの迅速分析方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の迅速分析方法は、（１）血液等の試料に炭素数３〜５のアルコールを加えて充分攪拌した後に遠心分離して得られた上澄液を、（２）ＨＰＬＣにより分析する、２段階の工程からなることを特徴とするものである。すなわち、本発明では、従来の方法のように大量の抽出用溶媒を使用せずに、試料に特定のアルコールを加えて充分攪拌した後に、遠心分離により蛋白等を分離した上澄液から少量の分析用サンプルを採取し、直接ＨＰＬＣにより分析するものである。そして、時間のかかる抽出溶媒の除去工程を省略することにより、全分析工程に必要な時間を３分間程度に大幅に短縮するとともに、α−トコフェロールとγ−トコフェロールを分離し、再現性よく測定することを可能とするものである。
【０００９】
本発明で、血液等の試料に加える炭素数３〜５のアルコールとしては、直鎖状及び分岐状アルコールのいずれをも使用することができ、具体的にはプロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコール、イソアミルアルコールが挙げられる。好ましいアルコールとしては分岐状アルコール、特にイソプロピルアルコールが挙げられる。
アルコールとして、炭素数が上記範囲以外のものを使用した場合には、α−トコフェロールとγ−トコフェロールを分離し、迅速に分析することが困難になる。
【００１０】
アルコールの使用量は、対象とする試料やアルコールの種類に応じて適宜選定するが、例えば、血漿５０μｌに対してイソプロピルアルコール９５０μｌ程度を使用する。
アルコールを加えた試料は、ミキサーを使用して充分攪拌した後に、遠心分離（例えば、１３，０００ｒｐｍ、３分間）により蛋白質等を分離し、この上澄液から２０μｌ程度の分析用サンプルを直接採取し、ＨＰＬＣカラムに注入して分析する。
【００１１】
ＨＰＬＣカラムとしては、オクタデシルシリル、オクチルシリル等を充填した逆相カラムを使用することが好ましい。
ＨＰＬＣの溶離液としては、α−トコフェロールとγ−トコフェロールを分離できるものであれば制限はないが、例えばメチルアルコール／イソプロピルアルコール／水の混合物を使用することが好ましい。また、これらの溶媒の混合比は、重量比で、メチルアルコール０〜６０、イソプルピルアルコール０〜６０、水０〜３０程度とすることが好ましく、必要に応じて濃度勾配を有する溶離液を使用してもよい。溶離液の流量は、例えばカラムの寸法が長さ３．３ｃｍ、径４．６ｍｍの場合には、１．５ｍｌ／ｍｉｎ程度とすることができる。
【００１２】
溶離液中のα−トコフェロールとγ−トコフェロールの量は、通常の蛍光分析法により、例えば２９０ｎｍ励起、３３０ｎｍ発光の蛍光を測定することにより分析することができる。
本発明の迅速分析方法では、（１）分析用サンプルとなる上澄液の調製を１〜３分間程度、（２）ＨＰＬＣによる分析工程を２〜３分間程度、すなわち全工程を３〜６分間程度で行なうことができ、全工程に３０〜４５分間程度を必要とする従来の方法に比較して、大幅に分析時間を短縮し、省力化することができる。また、測定結果の再現性も、本発明の方法では変動係数（測定値の標準偏差を平均値で除した値）が２％台であり、従来の方法の変動係数４〜５％台よりも、大幅に改善されたものとなる。
【００１３】
【実施例】
（実施例１）
内容量１．５ｍｌのポリプロピレンチューブに、分析対象試料として血漿５０μｌを採取し、イソプロピルアルコール９５０μｌを加えてｖｏｒｔｅｘミキサーを使用して１５秒間攪拌した。つぎに、１３，０００ｒｐｍで３分間、遠心分離を行ない、蛋白質等を分離した。
この上澄液２０μｌを分析用サンプルとして採取し、オクタデシルシリル（商品名：ＳＵＰＥＬＣＯＳＩＬ  ＬＣ１８）を充填した長さ３．３ｃｍ、径４．６ｍｍの逆相ＨＰＬＣカラムに注入した。溶離液として、メチルアルコール／イソプロピルアルコール／水＝５０／５０／２０（重量比）の混合溶媒を使用し、流量１．５ｍｌ／ｍｉｎで流出させた溶離液を、２９０ｎｍ励起、３３０ｎｍの蛍光を測定することにより、α−トコフェロールとγ−トコフェロールを分離し、それぞれのピーク面積からその量を分析した。得られたクロマトグラフのチャートを図１に示す。
【００１４】
（実施例２）
本発明のトコフェロールの迅速分析方法の再現性を確認するために、実施例１で調製した分析試料上澄液について、オートサンプラー（ＨＰＬＣ用オートインジェクタ（ＳＩＬ−１０ＡＤ）、島津製作所製）を使用して、実施例１のＨＰＬＣカラムに１００回の注入を行って分析した。試験結果は、α−トコフェロール（α−Ｔｏｃ）とγ−トコフェロール（γ−Ｔｏｃ）のクロマトグラフのピーク面積として図２に示した。
図２によれば、α−トコフェロール、γ−トコフェロールともに、変動係数が２％台と再現性が極めてよい結果が得られた。
【００１５】
【発明の効果】
本発明によれば、試料中に含まれるα−トコフェロールとγ−トコフェロールを分離して定量することが可能となる。また、従来の方法に比較して分析時間を大幅に短縮し、省力化することが可能となり、多数の試料を短時間で再現性よく、正確に分析することができる。本発明は、血液等の体液だけではなく、食品、医薬品等の試料にも適用することができるものであり、極めて実用的価値が高いものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で試料を分析して得られたクロマトグラフのチャートである。
【図２】実施例２で分析したα−トコフェロールとγ−トコフェロールの分析結果である。
【図１】
2004219348.tif 000002
【図２】
2004219348.tif 000003