(57)【要約】【課題】歯胚を再生する方法を提供すること、より具体的には、辺縁性歯周炎（歯槽膿漏）やう蝕などの歯科疾患により歯牙を欠損又は損傷した患者を治療することを可能にする歯胚の再生方法を提供すること。【解決手段】歯胚細胞およびこれらの細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも１種類をフィブリンを含む担体と一緒に培養することで歯胚を再生する方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯胚細胞およびこれらの細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも１種類をフィブリンを含む担体と一緒に培養することで歯胚を再生する方法。
【請求項２】
上記少なくとも１種類の細胞は上記担体の上又は中で培養されることを特徴とする請求項１に記載の歯胚を再生する方法。
【請求項３】
上記少なくとも１種類の細胞は、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、歯髄あるいは歯乳頭細胞、歯嚢細胞、又はこれらの前駆細胞であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の歯胚を再生する方法。
【請求項４】
歯胚細胞およびこれらの細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも１種類を培養して増殖させた後に担体上もしくは担体中に播種して培養することを特徴とする歯胚を再生する方法。
【請求項５】
上記担体上で培養した少なくとも１種類の細胞を動物の体内に移植して該動物の体内で歯胚に再生させることを含む請求項１から４の何れかに記載の歯胚を再生する方法。
【請求項６】
上記担体について、形状は再生する歯胚の目的形状でありかつ血行の導入部分を有する担体を用いることを特徴とする請求項１から５の何れかに記載の歯胚を再生する方法。
【請求項７】
請求項１から６の何れかに記載の方法により再生された歯胚。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、歯胚の再生方法に関する。より詳細には、本発明は、歯胚細胞をフィブリンから成る担体上もしくは担体中で培養することにより歯胚を再生する方法に関する。本発明はさらに、上記方法により再生された歯胚を用いて歯科患者を治療する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現代社会は高齢化社会であり、数年後には日本国民人口の約２０％が６５歳以上の高齢者になることが予想されている。これら高齢者の大多数は、何らかの理由により一部又は全部の歯牙を喪失しており、多くの人は可綴式義歯（いわゆる入れ歯）を使用している。従来の義歯は、着脱が必要で装着感もよくないなどの実際的問題のみならず、心理的にも老化の象徴といった印象があり、できれば義歯を使用したくないというのが患者の一般的認識である。さらに、全ての歯牙を喪失した場合に、総義歯を装着すると、その咀嚼能力は通常の天然歯牙の約５分の１となることが知られている。多くの高齢者にとって楽しみの一つである食事が歯の喪失のため苦痛となる場合も少なくない。さらに、脳に対する咀嚼刺激は痴呆防止の効果があり、咀嚼力の低下は痴呆の促進になることが明らかになってきている。
【０００３】
これに対して近年、人工歯根が開発され臨床に応用されている。人工歯根の応用により義歯が固定され、維持がよくなり、咀嚼力も改善される。しかし、審美性、装着感に関しては未だ満足のいくものではない。また、手術が必要であること、一定量の骨が必要であり、全身状態によっても制限されること、さらに多額の費用がかかり、信頼できる医療機関も限られることなどの理由から、未だインプラント義歯は広く普及しているとは言えない。その結果、義歯に不満を感じている患者が少なくないにもかかわらず、インプラント義歯の使用者は義歯使用者のうちの極わずかである。
【０００４】
一方、他家移植による歯牙移植の報告はあるが、移植できる健康な抜去歯牙を確保することは困難であるのみならず、感染症の危険もあり、一般的な治療とはなっていない。義歯に不満を感じながらインプラントに踏み込めないか、あるいは条件的にインプラント治療が困難な多数の患者が存在している。
【０００５】
現在までに、歯科に関する再生の研究は、歯周組織の再生に注目が置かれ、骨の再生、歯根膜の再生を中心に研究されてきた。これらの研究の成果として、ＧＴＲ法（Ｇｕｉｄｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ法）が開発された。ＧＴＲ法とは、例えばミリポアフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＦＩＬＴＥＲ，ミリポア社商品名）などの膜によって、歯根面への上皮細胞等の侵入を抑制し、歯根膜細胞の増殖に必要な空間を形成させる方法である  （Ｎｙｍａｎら，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．，９，２９０（１９８２））。ＧＴＲ法は、歯周病に罹患した歯牙周囲に歯槽骨と歯根膜を再生させることを目的とするものであり、軽症例では大きな成果を挙げている。また、近年、歯根膜再生を可能にするタンパク質が開発され、実用化されている。しかしながら、ＧＴＲ法は、歯牙喪失の原因となる高度の歯槽骨の吸収には応用できず、またう蝕による歯牙の破壊を修復することはできない。
【０００６】
上記した問題点を根本的に解決する方策として、歯胚そのものを再生する方法が提案され、検討が行われているが（Ｃ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ    Ｊ．  Ｄｅｎｔ．  Ｒｅｓ．  ８１  （１０），  ６９５−２０００，  ２００２）、未だ小さな組織が形成できたのみで、実際の治療に供することが可能な程の大きさの組織形成はできていなかった。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｎｙｍａｎら，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．，９，２９０（１９８２）
【非特許文献２】
Ｃ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ    Ｊ．  Ｄｅｎｔ．  Ｒｅｓ．  ８１  （１０），  ６９５−２０００，  ２００２
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、歯胚を再生する方法を提供すること、より具体的には、歯槽膿漏やう蝕などの歯科疾患により歯牙を欠損又は損傷した患者を治療することを可能にする歯胚の再生方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、再生した歯胚を用いて歯牙を欠損又は損傷した患者を治療する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、歯胚細胞をフィブリンから成る担体上もしくは担体中で培養することにより、ポリグリコール酸（以下、ＰＧＡと略す）から成る担体を使用した場合と比較して高い細胞接着能および低い細胞毒性、更に高い細胞増殖能が示されること見出し、これにより歯胚細胞から歯胚を効率よく形成できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明によれば、歯胚細胞およびこれらの細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも１種類をフィブリンを含む担体と一緒に培養することで歯胚を再生する方法が提供される。
好ましくは、上記少なくとも１種類の細胞は上記担体の上又は中で培養される。
好ましくは、上記少なくとも１種類の細胞は、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、歯髄あるいは歯乳頭細胞、歯嚢細胞、又はこれらの前駆細胞である。
【００１１】
本発明によればさらに、歯胚細胞およびこれらの細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも１種類を培養して増殖させた後に担体上もしくは担体中に播種して培養することを特徴とする歯胚を再生する方法が提供される。
好ましくは、上記担体上で培養した少なくとも１種類の細胞を動物の体内に移植して該動物の体内で歯胚に再生させる。
好ましくは、上記担体について、形状は再生する歯胚の目的形状でありかつ血行の導入部分を有する担体を用いる。
【００１２】
本発明によればさらに、上記した本発明による歯胚の再生方法により再生された歯胚が提供される。
【００１３】
本発明によればさらに、上記した何れかの方法により再生した歯胚を歯牙の欠損又は損傷を有する患者の顎骨に移植することを含む、歯科患者の治療方法が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による歯胚の再生方法は、歯胚細胞をフィブリンから成る担体と一緒に（好ましくは、該担体の上又はその中で）培養することを特徴とするものである。
組織工学による組織再生の成否を決める要因の一つに担体が挙げられる。特に生体に移植後の残存細胞数は重要な要素であり、これには担体の細胞親和性および担体自身の持つ細胞増殖促進効果、分化誘導効果あるいは毒性が影響を与える。従って、担体の選択は、これらの要素を検討の上決定する必要がある。
【００１５】
移植初期における残存細胞数を決定する要因としては、細胞の担体への接着能と、担体の細胞毒性とが考えられる。そこで、本発明では、ＰＧＡメッシュとフィブリンゲルを用いて，培養歯胚細胞播種後の細胞数の変化を比較検討した。その結果、ＰＧＡメッシュを用いた場合と比較してフィブリンゲルを用いた場合の方が、多数の細胞が担体上に維持されることが判明した。
【００１６】
歯胚の再生に用いる担体としては、歯胚の形成に必要とされる時間を耐久することができ、かつその後、速やかに吸収されるものが好ましい。即ち、胃大網又は顎骨内などの生体内において適切な吸収速度と特性を有し、かつ細胞と高い親和性を有する材料から成る担体を使用することが好ましい。フィブリンから成る担体はこれらの条件を満たすものである。
【００１７】
担体は細胞を移植しやすい形状に加工したものが好ましく、板状、球状あるいは中空で一端が開放されており、周囲から血行が導入しやすくなっているものが好ましい。
担体は、目的に適合した形態のものを作製することが好ましい。このためには、目的とする形態をレジンで作製した後に印象材を用いて型を取得する。その後、レジンの型を取り出し、担体を構成する合成材料を流しこむことによって目的の形態を再現することができる。
【００１８】
本発明で用いる歯胚細胞としては、歯胚を構成する細胞あるいはこれらの細胞に分化することができる細胞であれば特にその種類は限定されず、例えば、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、歯髄あるいは歯乳頭細胞、歯嚢細胞、又はこれらの前駆細胞を使用することができる。これらの細胞は、１種類の細胞から成る単一の細胞として培養してもよいし、２種類以上の細胞から成る細胞混合物として培養してもよい。
【００１９】
歯胚細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、豚など）の下顎骨から採取することができる。埋伏歯を無菌的に取り出し、Ｈａｎｋｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）溶液などの適当な保存液で保存する。歯牙の中の石灰化した部分を取り除き，メスにて組織を小片にして、ＨＢＳＳ溶液などを用いて組織を洗浄する。次いで、コラゲナーゼを用いて組織を酵素処理することが好ましい。酵素処理後、ピペッティング操作と遠心操作により細胞を回収することができる。
【００２０】
本発明の方法に従って再生した歯胚は、歯科患者（即ち、歯牙の欠損又は損傷を有する患者）に移植することにより、該患者の治療のために用いられる。この場合、移植に伴う生体適合性などの観点から、再生に用いる歯胚細胞は、該患者に由来する自分の歯胚細胞を用いることが好ましい。歯胚を構成する細胞あるいは歯胚に分化する細胞は、親知らず（智歯）からも採取することができる。
【００２１】
また、歯牙は、発生から成熟するまでに５つの段階を経て形成されることが知られている。第一期は、開始期と呼ばれ、基底膜に上皮組織と間葉組織が誘導される。第二期は、蕾状期と呼ばれエナメル器が作られる。第三期は帽状期と呼ばれ、歯乳頭が形成され、歯胚が形成される。第四期は鐘状期と呼ばれ、歯胚からエナメル質を形成する細胞への分化と歯乳頭から象牙質と歯髄を形成する細胞への分化が開始される。第五期は成熟期と呼ばれ、エナメル質と象牙質と歯髄などの歯牙を構成する組織へと分化する。本発明においては、これらのうちの好適な時期の細胞を採取して用いることができる。また、歯胚が存在していない症例では、歯根より歯髄を摘出して細胞を分離採取することができる。なお、歯牙からの歯髄の摘出は、Ａｂｏｕｔ  Ｉ．，他  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２５８．  ３３−４１，  ２０００に記載の方法に従って行うことができる。
なお、本発明で言う「歯胚の再生」とは、上記５段階のうちの第二期以降の歯胚を再生することを言う。
【００２２】
細胞の培養は、動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地を用いて、通常の動物細胞の培養条件（例えば、室温から３７℃の温度；５％ＣＯ２インキュベーター内など）の下で行うことができる。
【００２３】
本発明の方法では、分離した歯胚細胞を培養して増殖させた後に、フィブリンから成る担体上もしくは担体中に播種して培養することが好ましい。担体上もしくは担体中に播種する前に培養を行うことにより、担体上で生育するのに十分な数の細胞を取得することが可能になる。分離した歯胚細胞の培養は、上記と同様、通常の動物細胞の培養条件に準じて行うことができる。
【００２４】
フィブリンから成る担体としては、生体組織接着剤等として市販されている血漿分画製剤が使用可能である。フィブリンから成る担体の調製は、通常のフィブリンゲル調製法で行われるが、例えば、フィブリノゲンの溶解液とトロンビンの溶解液の両液を等量混ぜることにより、フィブリンゲルを調製することが可能である。
【００２５】
本発明の方法では、歯胚細胞をフィブリンから成る担体上もしくは担体中で培養した後に、該培養細胞を担体と一緒に移植動物に移植し、該移植動物の体内で歯胚を再生させてもよいし、該培養細胞を担体と一緒に直接患者の顎骨に移植してもよい。あるいはさらに好ましくは、分離した歯胚細胞を培養して増殖させた後にフィブリンから成る担体上もしくは担体中に播種して、または播種後培養し、次いで該培養細胞を担体と一緒に移植動物に移植し、該移植動物の体内で歯胚を再生させることができる。
【００２６】
移植動物の種類は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物であり、例えば、ラット（ヌードラットなど）、ウサギ又はマウスなどのげっ歯類動物を使用することができる。移植の部位としては、歯胚の形成に必要な因子を供給しやすい部位が好ましく、具体的には、血流の豊富な部位が好ましく、例えば、腹腔下の胃大網などが特に好ましい。このような部位に移植することにより、歯胚細胞の成長を促進することができ、歯胚の形成を早めることが可能である。
【００２７】
上記した本発明による歯胚の再生方法により再生した歯胚（歯胚細胞をフィブリンから成る担体上もしくは担体中に播種し培養して得られる歯胚組織、あるいはこの歯胚組織を移植動物に移植し、該移植動物の体内でさらに再生させた歯胚組織のどれでもよい）は、歯牙の欠損又は損傷を有する患者の顎骨に移植することによって、該歯科患者を治療することができる。即ち、本発明による歯胚の再生方法により得られた歯胚を用いる歯科患者の治療方法も本発明の範囲内のものである。歯科患者の顎骨内に移植された後も歯胚の成長を継続させることにより、歯牙を形成させることができる。あるいは歯根までを患者の体外で形成させた後、これを患者の顎骨内に移植し、従来の歯科的な手法により歯冠を形成してもよい。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００２８】
【実施例】
実施例１：フィブリンとコラーゲンコートＰＧＡとの接着性・増殖性の比較
生後６ヶ月の新鮮豚から下顎骨を採取した。実験に使用するまでは４℃の冷蔵庫にて保存し、運搬中は氷上にて保存した。埋伏歯を無菌的に取り出し、Ｈａｎｋｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）溶液にて保存した。歯胚の中の石灰化した部分を取り除き，メスにて組織を約２ｍｍの小片にした。ＨＢＳＳ溶液にて小片にした組織を約５回洗浄した。
２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼをＨＢＳＳ溶液に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を５０分間酵素処理した。
【００２９】
２５ｍｌ用のピペットを用いて１０分間ピペッティングした。２５ｍｌの上澄み液を遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して細胞を回収した。１０％血清入り培地にて３回洗浄した後に遠心することによって細胞を回収した。
【００３０】
回収した細胞を、７５ｍｌのフラスコにて培養した。細胞の培養培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍに１０％牛胎児血清と抗生剤を加えたものを用いた。また、細胞の培養は、３７ｏＣ，５％ＣＯ２という条件下で行った。
【００３１】
７５ｃｍ２フラスコにて培養した細胞は、コンフルエントになる前に、トリプシン処理し、フラスコから剥離した後、ＰＧＡメッシュ担体（体積密度５０％  〜６０  ％，厚さ２ｍｍ、  Ａｌｂａｎｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、又はフィブリンゲル（化学及血清療法研究所製  ボルヒール。フィブリノゲンの溶解液とトロンビンの溶解液の両液を等量混ぜることにより、フィブリンゲルを調製）担体に播種した。細胞懸濁液の密度は５．０×１０４個／ｍｌに調整し、１ｍｌを１個の担体に播種した。
【００３２】
播種後の細胞の培養培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍに１０％牛胎児血清と抗生剤を加えたものを用いた。また、細胞の培養は、３７ｏＣ，５％ＣＯ２という条件下で行った。播種後経時的に接着細胞数を測定した。結果を図１に示す。
【００３３】
図１の結果から、培養２４時間後の初期の段階において、ＰＧＡメッシュ群と比較して、フィブリンゲル上での細胞数が多いことが分かる。更に時間が経過するごとに、接着している細胞数に顕著な差が現れる。この結果は、フィブリンが歯胚細胞に対するより高い細胞接着能、低い細胞毒性、更に高い細胞増殖能を示したものと考えられる。この結果より、歯胚再生において培養および分離歯胚細胞の担体としてフィブリンがＰＧＡより有利であることが判明した。
【００３４】
実施例２：ｉｎ  ｖｉｖｏでの担体評価
実施例１の方法にてブタ歯胚細胞を単離した後、１．５×１０７個／１００μｌの細胞懸濁液を調整しＰＧＡメッシュ群に細胞を播種した。一方、フィブリンゲルには、ＰＧＡと同じく実施例１の方法にてブタ歯胚細胞を単離した後、フィブリノゲンの溶解した液にて細胞懸濁液を１．５×１０７個／５０μｌに調整し、トロンビンが溶解した液を５０μｌ混ぜることにより、細胞をフィブリンゲルの中に閉じ込めた。細胞を播種した担体は、静置培養を２４時間行った。細胞の培養培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍに１０％牛胎児血清と抗生剤を加えたものを用いた。また、細胞の培養は、３７ｏＣ，５％ＣＯ２という条件下で行った。
【００３５】
移植動物としては、ＫＳＮ／ｓｌｃヌードマウスを用いた。ヌードマウスの表皮を切開した後、筋層と表皮を剥離し、その空いたスペースにＰＧＡメッシュ及びフィブリンゲルを移植し、移植後４週にて担体を取り出した。取り出した組織の直径は、約８ｍｍであり、以前の報告（Ｃ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ    Ｊ．  Ｄｅｎｔ．  Ｒｅｓ．  ８１  （１０）  ２００２）記載の移殖後２５週時の直径２ｍｍよりも顕著に大きくなった（図２）。また、この組織にヘマトキシリン・エオジン染色を施した所、硬組織の存在も確認され、歯胚再生の速度も速くなったことが確認された（図３）。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の方法を利用して、移植動物の体内または培地上で象牙質、歯乳頭、エナメル髄などの歯胚構造を形成してから、あるいは歯胚構造を形成するように分化誘導された細胞塊を担体とともに科患者の顎骨内に移植することにより、歯根または歯牙を再生させることができる。この結果、歯牙を欠損した患者の咀嚼能力の回復に極めて有効な治療となる。また、審美的な回復も見込まれ、患者のＱｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ（ＱＯＬ）の向上に大きく貢献する。また、本発明の方法では、増殖、転写因子など生理活性物質を用いることにより再生に要する期間を短縮し、あるいは分化誘導を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１２穴プレート中の担体に各５×１０４個歯胚細胞を播種し、各担体における細胞の接着性・増殖性を測定した結果を示す。
【図２】図２は、ヌードマウス皮下に移植後、４週にて取り出した移植体を示す。
【図３】図３は、図２の移植体の組織像（ヘマトキシリン・エオジン染色）を示す。
【図１】
2004357567.tif 000002
【図２】
2004357567.tif 000003
【図３】
2004357567.tif 000004