(57)【要約】【課題】培地中の微生物を増殖的に培養する微生物の培養方法および装置、ならびにそれを利用する水質検査を行うための方法および装置を提供する。【解決手段】培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養することを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、微生物の培養方法。
【請求項２】
循環流路を循環している微生物懸濁液の所定量を排出し、排出される懸濁液の所定量と同量の培地を補給することにより、循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整し、微生物を増殖的に培養する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
循環流路を循環している微生物懸濁液の所定量を恒常的に排出し、排出される懸濁液の所定量と同量の培地を恒常的に補給することにより、循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を一定に保持しつつ、微生物を増殖的に培養する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
循環が一定方向である、請求項１から３までのいずれか記載の方法。
【請求項５】
循環の方向を所定の時間間隔で逆転させる、請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
ａ）培地中の微生物懸濁液が循環する循環流路、ｂ）循環流路に連結している懸濁液排出口、ｃ）循環流路に連結している培地供給槽を含む、微生物を培養するための装置。
【請求項７】
微生物を増殖的に培養するための、請求項６記載の装置。
【請求項８】
ａ）循環流路中では微生物懸濁液は一定方向、または所定の時間間隔で逆転して流れることができ、
ｂ）懸濁液排出口は、微生物懸濁液の所定量を排出し、
ｃ）培地供給槽は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整する、請求項６または７記載の装置。
【請求項９】
ａ）循環流路中では微生物懸濁液が一定の流速度で流れており、
ｂ）懸濁液排出口は、微生物懸濁液の所定量を恒常的に排出し、
ｃ）培地供給槽は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を恒常的に補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を一定に保持させつつ微生物を培養する、請求項６または７記載の装置。
【請求項１０】
さらに、ｄ）循環流路中の微生物懸濁液の一部を取り出すためのサンプリング口を備えた、請求項６から９までのいずれか記載の装置。
【請求項１１】
検水中の有害物質混入の有無を検出する方法であって、循環流路中を移動している微生物を採取し、採取した微生物に対して検水を負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出することを特徴とする方法。
【請求項１２】
循環流路中を移動している微生物が請求項１から５までのいずれか記載の方法あるいは請求項６から１０までのいずれか記載の装置により培養されている、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ａ）培地中の微生物懸濁液が循環する循環流路、ｂ）循環流路に連結している懸濁液排出口、ｃ）循環流路に連結している培地供給槽、ｄ）循環流路から分岐している、一定量の微生物懸濁液が流れる試験流路、ｅ）試験流路に検水を注入するための検水注入装置、およびｆ）検水が負荷された、試験流路を流れる微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置。
【請求項１４】
ａ）循環流路中では微生物懸濁液が一定方向、または所定の時間間隔で逆転して流れることができ、
ｂ）懸濁液排出口は、微生物懸濁液の所定量を排出し、
ｃ）培地供給槽は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整し、
ｄ）試験流路中では循環流路からの一定量の微生物懸濁液が流れており、
ｅ）検水注入装置は、試験流路中を移動している対数増殖期の微生物に検水を負荷し、
ｆ）微生物応答検出装置は、検水中に有害物質が混入した場合に微生物応答の変化が引き起こされるに充分な移動時間を与える位置に配置されている、請求項１３記載の装置。
【請求項１５】
ａ）循環流路中では微生物懸濁液が一定の流速度で流れており、
ｂ）懸濁液排出口は、微生物懸濁液の所定量を恒常的に排出し、
ｃ）培地供給槽は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を恒常的に補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整し、
ｄ）試験流路中では循環流路からの一定量の微生物懸濁液が一定の流速度で流れており、
ｅ）検水注入装置は、試験流路中を移動している対数増殖期の微生物に検水を負荷し、
ｆ）微生物応答検出装置は、検水中に有害物質が混入した場合に微生物応答の変化が引き起こされるに充分な移動時間を与える位置に配置されている、請求項１３記載の装置。
【請求項１６】
検水注入装置が連結していない点以外は同じ試験流路を対照流路としてさらに含む、請求項１３から１５までのいずれか記載の装置。
【請求項１７】
培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、微生物を対数増殖期に保持させる方法。
【請求項１８】
培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、対数増殖期の微生物を調製する方法。
【請求項１９】
検水中の有害物質混入の有無を検出する方法であって、増殖的に培養している微生物に対して検水を負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出することを特徴とする方法。
【請求項２０】
ａ）増殖的に培養している微生物を供給できる培養機構を有する培養装置、ｂ）該培養装置から微生物を採取するための採取装置、ｃ）採取した微生物に検水を注入するための検水注入装置、およびｆ）検水が負荷された微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置。
【請求項２１】
検水を負荷されていない、増殖的に培養している微生物の微生物応答を検出する手段をさらに含む、請求項２０記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の培養、および水質検査を行うためのバイオアッセイ方法および装置に関する。
【０００２】
【従来の技術および解決課題】
理想的な培養条件下では、微生物、特に細菌は時間に比例してその数を増す。細胞数の変化は増殖曲線で表され、通常、増殖誘導期、対数増殖期および定常期の３期で示される。増殖誘導期は新しい環境に適応して発育を再開するまでの時期、対数増殖期は菌が一定の発育速度で増殖し、菌がもっている増殖能が最高に発揮されている状態の時期、そして定常期は菌の発育が殆ど停止し集団内で死滅していく菌と分裂する菌の数がほぼ同じ割合で全体的に均衡が保たれているようにみえる時期である。
微生物を培養するための方法および装置はこれまで種々報告されているが（特許文献１、２、３）、特定の時期、増殖誘導期の終わりから定常期の初めにかけて細胞が増殖する時期、特に対数増殖期、を保持させつつ培養するものはこれまで知られていない。また、藻類を閉鎖系で培養する装置も知られているが（特許文献４）、この装置も特定の時期に指向しておらず、また専ら培養槽において培養する方式である。
他方、河川・湖沼等の環境水および下水、排水中に含まれている化学物質等の水質検査を行う、微生物を指標としているバイオアッセイ装置は、微生物固定膜を利用している（特許文献５、６および７）。しかし、微生物固定膜は微生物の応答が維持できる期間を超えると、微生物固定膜の交換が必要である等、不都合な点が多い。外部環境に最も影響を受けやすいのは細胞周期のすべてのステージの細胞を含む対数増殖期であり、よって対数増殖期の状態を長期に保持できる培養方法は、水質検査のための微生物として有効に機能すると考えられる。
【０００３】
【特許文献１】
特開昭４７−１４３８２
【特許文献２】
特開昭６３−１４１５７６
【特許文献３】
特開平７−８２６０
【特許文献４】
特開平１−２９１７８３
【特許文献５】
特開平７−６３７２５
【特許文献６】
特開平１１−３７９６９
【特許文献７】
特開２０００−２０６０８７
【０００４】
【課題解決手段】
今回、本発明者は、培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ培養すれば、微生物を対数増殖期に保持できることを見出した。そして、この培養方法が、微生物固定膜を用いない、水質検査を行うためのバイオアッセイに応用できることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明は、
（１）  培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、微生物の培養方法；
具体的には、循環流路を循環している微生物懸濁液の所定量を排出し、排出される懸濁液の所定量と同量の培地を補給することにより、循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整し、微生物を増殖的に培養する本発明の方法、あるいは
循環流路を循環している微生物懸濁液の所定量を恒常的に排出し、排出される懸濁液の所定量と同量の培地を恒常的に補給することにより、循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を一定に保持しつつ、微生物を増殖的に培養する、本発明の方法；
さらに具体的には、循環が一定方向または循環の方向を所定の時間間隔で逆転させる本発明の方法；
【０００６】
（２）  ａ）培地中の微生物懸濁液が循環する循環流路、ｂ）循環流路に連結している懸濁液排出口、ｃ）循環流路に連結している培地供給槽を含む、微生物を培養するための装置；好ましくは、微生物を増殖的に培養するための本発明の装置；
具体的には、ａ）循環流路中では微生物懸濁液が一定方向、または所定の時間間隔で逆転して流れることができ、
ｂ）懸濁液排出口は、微生物懸濁液の所定量を排出し、
ｃ）培地供給槽は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整する本発明の装置；
さらに具体的には、ａ）循環流路中では微生物懸濁液が一定の流速度で流れており、
ｂ）懸濁液排出口は、微生物懸濁液の所定量を恒常的に排出し、
ｃ）培地供給槽は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を恒常的に補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を一定に保持させつつ微生物を培養する、本発明の装置；
好ましくは、ｄ）循環流路中の微生物懸濁液の一部を取り出すためのサンプリング口をさらに備えた本発明の装置；
【０００７】
（３）  検水中の有害物質混入の有無を検出する方法であって、循環流路中を移動している微生物を採取し、採取した微生物に対して検水を負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出することを特徴とする方法；
好ましくは、循環流路中を移動している微生物が本発明の方法あるいは本発明の装置により培養されている方法；
【０００８】
（４）  ａ）培地中の微生物懸濁液が循環する循環流路、ｂ）循環流路に連結している懸濁液排出口、ｃ）循環流路に連結している培地供給槽、ｄ）循環流路から分岐している、一定量の微生物懸濁液が流れる試験流路、ｅ）試験流路に検水を注入するための検水注入装置、およびｆ）検水が負荷された、試験流路を流れる微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置；
具体的には、ａ）循環流路中では微生物懸濁液が一定方向、または所定の時間間隔で逆転して流れることができ、
ｂ）懸濁液排出口は、微生物懸濁液の所定量を排出し、
ｃ）培地供給槽は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整し、
ｄ）試験流路中では循環流路からの一定量の微生物懸濁液が流れており、
ｅ）検水注入装置は、試験流路中を移動している対数増殖期の微生物に検水を負荷し、
ｆ）微生物応答検出装置は、検水中に有害物質が混入した場合に微生物応答の変化が引き起こされるに充分な移動時間を与える位置に配置されている、本発明の装置；
さらに具体的には、ａ）循環流路中では微生物懸濁液が一定の流速度で流れており、
ｂ）懸濁液排出口は、微生物懸濁液の所定量を恒常的に排出し、
ｃ）培地供給槽は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を恒常的に補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整し、
ｄ）試験流路中では循環流路からの一定量の微生物懸濁液が一定の流速度で流れており、
ｅ）検水注入装置は、試験流路中を移動している対数増殖期の微生物に検水を負荷し、
ｆ）微生物応答検出装置は、検水中に有害物質が混入した場合に微生物応答の変化が引き起こされるに充分な移動時間を与える位置に配置されている、本発明の装置；
好ましくは、検水注入装置が連結していない点以外は同じ試験流路を対照流路としてさらに含む、本発明の装置；
【０００９】
（５）  培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、微生物を対数増殖期に保持させる方法；
【００１０】
（６）  培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、対数増殖期の微生物を調製する方法；および
【００１１】
（７）  検水中の有害物質混入の有無を検出する方法であって、増殖的に培養している微生物に対して検水を負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出することを特徴とする方法、および
ａ）増殖的に培養している微生物を供給できる培養機構を有する培養装置、ｂ）該培養装置から微生物を採取するための採取装置、ｃ）採取した微生物に検水を注入するための検水注入装置、およびｆ）検水が負荷された微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置；に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
（１）微生物の培養方法
第１の態様として、本発明は、培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、微生物の培養方法に関する。
本発明の微生物培養方法は、微生物懸濁液を循環させながら増殖的な培養を行うことを特徴とする。本発明において「増殖的な培養」とは、増殖曲線の対数増殖期を保持しつつ微生物を培養することを意味する。微生物を希釈して試験管内や閉鎖系にて培養し増殖曲線を描くと、まず増殖速度の遅い増殖誘導期が現れ、徐々に増殖速度が速い対数増殖期に入りその速度が最大となる。しかし、細胞数が増え過ぎると増殖速度が低下しはじめ、それ以上細胞数が増加しなくなる増殖曲線の定常期の状態となる。本発明の「増殖的な培養」とは、増殖曲線における定常期の状態でなく、微生物が一定の発育速度で増殖し、微生物がもっている増殖能が最高に発揮されて活発に活動している状態を保持させつつ培養する意味である。
【００１３】
本発明において「循環流路」とは、微生物懸濁液が流れる閉鎖系の流路である。以下に説明する通り、本発明の循環流路は閉鎖系であるが、所定量の懸濁液を排出でき、また所定量の培地を補給できる。よって、本発明における「循環流路」の閉鎖系とは、所定の目的のために微生物を一旦循環流路に供給すれば、その微生物が継代可能な期間は新たに微生物を供給せずに流路を循環させることを意味する。また、培養槽を用いる培養も閉鎖系であるが、本発明の循環流路による培養は流路中で増殖的な培養を行う点で培養槽を用いる培養と異なる。流路中の培養は、簡便な手法・装置により培地を効率的に交換できる点で培養槽培養よりも有利である。また、好気性細菌を培養する場合、好気的培養条件を設定するために培養槽培養では気相と液相を別個に設け、そして振盪させるという煩雑な手法やそのための装置が必要である。しかし、循環流路による培養では循環流路をガス透過性にするという簡便な手法を用いることにより好気的培養が可能である。さらに、循環流路は閉鎖系であるため、培地供給層の設置・交換および当初の液体培地と微生物の供給を無菌的に行うのみで、以降は無菌的な培養が可能となる利点をも有する。ここに、無菌的な培養とは不要な雑菌を伴わない培養を意味する。
循環流路は環状であっても、非環状であってもよい。
【００１４】
本発明の培養方法に適した微生物は、懸濁状態で継代培養が可能な細胞または微生物であれば、特に制限されない。例えば、継代数が多いまたは限りない天然に存在する野生株または野生型株、例えばヒト、マウスその他の哺乳類由来の動物細胞および動物細胞の樹立株；魚類、線虫等の細胞、昆虫細胞、酵母等の真菌細胞；大腸菌等の細菌細胞；ウイルス；原生動物；微小後生動物（線虫、ミジンコ）の何れであってもよい。野生株は天然に存在する組換えを行っていない微生物である。野生型株は注目する遺伝子に手をつけていない微生物である。樹立株は動物細胞で継代培養できるもの、例えばガン細胞などの組換えが施されていないものも含む。なお、本発明においては、循環流路にて培養できる細胞であれば、特別に区別する意味がないため、培養対象である微生物には動物細胞も含まれるものとする。
【００１５】
本発明に用いる培地は、用いる微生物に応じて変動し、微生物が酵母の場合、通常ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）、またはＳＤ培地（ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  （Ｄｉｆｃｏ．０９１９−１５−３））にグルコース、アミノ酸を加えたものを用いる。補給する培地とは、微生物生育に適した栄養分を含み、ｐＨが調整され、必要に応じて滅菌された、または雑菌を含まない培地である。例えば、懸濁液排出口からの廃液を濾過し微生物を除去した後のもの、またｐＨを生育に至適になるよう調整したものを含む。微生物生育に適した培地は例えば、須藤隆一：環境微生物実験法、講談社、１９９９，  ｐｐ２０，  ｐｐ２６２−２７３に詳しい。
【００１６】
本発明の培養方法を行うには、まず微生物を循環流路に供給する。本発明では、循環流路に対し、微生物の一定量を一回で供給する。供給する微生物は、凍結保存したもの、凍結乾燥保存したもの、冷蔵保存したもの、常温のもののいずれでも良い。
【００１７】
本発明の循環流路は閉鎖系であるので、循環させつつ培養を続けると、細胞濃度が高まり増殖曲線の定常期の状態となる。そこで、本発明では好ましくは、循環流路を循環している微生物懸濁液の所定量を排出し、排出される懸濁液の所定量と同量の培地を補給する。それを定期的に行うことにより、循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を一定に保持させる。これが、本発明における「微生物濃度を定期的に調整する」の意である。
【００１８】
「定期的」の頻度ならびに排出する懸濁液の所定量および培地の補給量は、循環流路中の微生物の増加量により決定される。例えば、微生物が２倍になった場合、循環流路中の微生物懸濁液の半量を排出し、これと同量の培地を加える。また、細胞が１０倍になった場合、循環流路中の微生物懸濁液の９／１０を排出し、これと同量の培地を加える。温度、培地等の培養条件が一定なら、微生物種に固有の倍加時間はある程度予測できる。その予測値および、循環流路の長さ、内径、流速から、微生物懸濁液の排出量および培地の供給量が決定できる。例えば、ある微生物の倍加時間が１時間、循環流路の流路長６０ｃｍ、内径１ｍｍ、流速０．０７８５ｍｌ／分である場合、循環流路を１周する間に微生物懸濁液の１／２を排出し、これと等量の培地を供給すればよい。循環している微生物懸濁液における吸光度、酸素消費量等を計測するセンサにより微生物濃度をモニタリングし、その値により排出量および供給量を決定することもできる。
【００１９】
微生物懸濁液の排出と培地の補給とは「恒常的」に行うことができる。ここに、「恒常的」とは、循環流路中を循環している間は絶え間無くの意である。微生物懸濁液の排出と培地の補給を恒常的に行う場合、補給する培地は、懸濁液排出口からの廃液を濾過し微生物を除去した後のものが好ましい。
【００２０】
より具体的には、例えば酵母細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３（ＡＴＣＣ  ２０１２３９）に対し休眠状態の細胞活性を回復させる前培養を行った後、培地で希釈し、ＯＤ６６０＝０．０１にして２５℃で振とう培養すると、２４時間後にはＯＤ６６０＝２．５００になり、細胞数は約２５０倍に増える。このことから、酵母細胞Ｗ３０３の倍加時間は３時間程度であると計算される。よって、微生物としてこの酵母細胞を用いる場合、倍加時間の３時間ごとに細胞懸濁液の１／２が培地と置き換わるように懸濁液の排出と培地の供給とを制御すれば、系内は常に一定の細胞濃度に保たれ、細胞も常に対数増殖期の状態を維持できる。
【００２１】
本発明の方法では、循環流路中の微生物濃度を一定に保持させることが重要であるが、その手段はどんな方法であってもよい。好ましい微生物濃度は、対数増殖を維持する濃度、例えば酵母細胞Ｗ３０３の場合、ＯＤ６６０が０．１−３程度である。一定の細胞濃度に保つためには、常にＯＤ６６０を測定する等、流路中の細胞濃度を監視する。
【００２２】
循環流路中の微生物懸濁液の循環の方向は一定方向であっても、または所定の時間間隔で逆転してもよい。循環流路中の微生物懸濁液は常に流れている必要はなく、断続的に流れを中止させ、次いで所定の時間間隔で順方向、あるいは逆方向に流すことができる。流れを逆転させることにより、流路内に乱流を生じさせ、その乱流の攪拌作用により、細胞の沈殿が防止されるという効果を期待できる。この場合、循環流路は非環状であることができる。微生物懸濁液の循環は必要に応じてポンプを用いる。
【００２３】
循環流路における微生物の循環および／または培養条件は用いる微生物に応じて変動するが、一般には温度が一定であることに加え、細胞が均一に分布するよう攪拌されつつ循環されることが好ましい。それには、流路中に邪魔板を設置し、あるいは流路自体を振動させればよい。温度は微生物の生育に適した温度であり、酵母であれば、２５−３０℃、大腸菌では３０−３７℃、動物細胞では３７℃が好ましい。循環における懸濁液の流速度は流路径によって変動する。
【００２４】
用いる微生物が嫌気的か好気的かによっても循環条件は変動する。好気的培養が必要な場合は、循環流路の材質としてガス透過性のチューブを用いる、または圧縮空気を混合した培養液をノズルを通して多孔板へ噴出させ，酸素を効率良く溶解させる（登録１１３２６７３）、または流路に通した中空糸によりガス交換するという方法が挙げられる。嫌気的培養が必要な場合は、培地供給槽の培地の酸素を除去し、ガス不透過性チューブを用いる。また、操作全体を嫌気チャンバー内に設置する。
【００２５】
（２）微生物の培養装置
本発明は別の態様として、本発明の培養方法を実施するための装置に関する。詳細には、培地中の微生物懸濁液が循環する循環流路、ｂ）循環流路に連結している懸濁液排出口、ｃ）循環流路に連結している培地供給槽を含む、微生物を培養するための装置、好ましくはｄ）微生物を必要とする場合に循環流路中の微生物懸濁液の一部を取り出すためのサンプリング口をさらに備えた装置である。
【００２６】
「循環流路中では微生物懸濁液は一定方向、または所定の時間間隔で逆転して流れることができる」とは、循環流路中の微生物懸濁液の循環の方向は一定方向であっても、または所定の時間間隔で逆転してもよいことを意味し、ここに、循環流路中の微生物懸濁液は常に流れている必要はなく、断続的に流れを中止させ、次いで所定の時間間隔で順方向、あるいは逆方向に流すことができる。
【００２７】
循環流路の形態は環状であっても、非環状であってもよい。循環流路は通常、管状であるが、形状は何でも構わない。管状の場合、内径は通常、数十μｍ−数ｍｍ、通常は１ｍｍであり、閉鎖系全体の流路長は数ｃｍ−数ｍ、通常は２ｍである。「μＴＡＳ（Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」と呼ばれる数１０−数１００μｍ幅の微小回路にすることも可能である（化学工業  Ｖｏｌ．  ５２，  Ｎｏ．  １１，  ２００１．１１．  ｐ．ｐ１−５１）。
【００２８】
流路は微生物の培養に適した材質であれば何でもよいが、シリコン製、ＰＴＦＥ、ＰＦＡ製が好適に用いられる。また、複数種類の微生物培養を想定し、流路は複数であってもよい。また、用いる微生物種を変える場合を考慮し、循環流路は、流路ごと交換できるような使い捨ての構造をとることが好ましい。
【００２９】
懸濁液排出口には流量を可変できるバルブを付ける。培地供給槽は培地注入口を介して循環流路と連結する。この培地注入口には流量を可変できるバルブを付ける。排出口および注入口のバルブは、微生物種、流路長、流速および温度により予測される微生物の増加率に基づき決定される排出量および供給量を調節・制御するものである。このような調節・制御はバルブを兼ねたコントローラを用いて行うことができる。制御は、循環している微生物懸濁液における吸光度、酸素消費量等を計測するセンサにより微生物濃度をモニタリングし、その値に基づき行うこともできる。ここで用いるバルブは開閉可能で逆流しないものが好ましい。排出および注入は必要に応じてポンプを用いる。
本発明の装置は、微生物を必要とする場合に循環流路中の微生物懸濁液の一部を取り出すためのサンプリング口をさらに備えることができる。
本発明の培養装置における循環流路が環状である装置を図１および図２に示す。
【００３０】
（３）有害物質混入の有無を検出する方法
本発明はさらに別の態様として、検水中の有害物質混入の有無を検出する方法であって、循環流路中を移動している微生物を採取し、採取した微生物に対して検水を負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出することを特徴とする方法に関する。この方法は要するに、循環流路を循環している微生物に対し、水質検査の対象となる検水を加えて生育させ、検水負荷前と負荷後の微生物の応答を測定し比較することにより、検水中の有害物質の有無の検出を行うものである。これにより、微生物固定膜を用いずに水質検査を行うためのバイオアッセイが可能となる。
【００３１】
本発明において「検水」とは、河川・湖沼等の環境水および下水、排水から供給される検体試料水であり、これらは有害物質が混入されていないか、水質検査が常に必要な試料水である。
【００３２】
「検水の負荷」は、循環流路中を移動している微生物を採取し、採取した微生物に対して行う。ここに使用される微生物は本発明の方法または装置により培養されているものが好ましい。本発明では、「検水の負荷」は間欠的であっても連続的であってもよい。間欠的に検水を負荷する場合、検水は異なる場所から採取した試料水であってよく、同じ場所から異なる時間に採取した試料水であってよい。「検水の負荷」を連続的に行う場合、本発明により、検水の経時的な水質検査が可能となる。よって、この態様では、本発明は、検水中の有害物質混入の有無を経時的にモニターする方法であって、循環流路中を移動している微生物を恒常的に採取し、採取した微生物に対して検水を連続的に負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を経時的に検出することを特徴とする方法を提供する。ここに、検水の経時的な水質検査は、任意にモニターしたい時間行うことができる。通常は、数時間から数日、あるいは数ヶ月である。基本的には、モニター時間は、微生物の応答性に依存する。
本発明の検出方法では、微生物応答の測定に用いられた微生物はそのまま排出される。
【００３３】
本発明において「微生物応答」とは、天然に存在する野生株または野生型株の場合、微生物細胞数、生細胞数、呼吸量、ＡＴＰ量等である。また、有害物質の存在下に変動する遺伝子のｍＲＮＡレベルであることができる。ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット法（緒方宣邦、野島博：遺伝子工学キーワードブック  改定第２版、羊土社、２０００，  ｐｐ２９９−３０１）、逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）（中別府雄作、他：細胞工学別冊  Ｔｉｐｓシリーズ  改定ＰＣＲ  Ｔｉｐｓ，  秀潤社、１９９９，  ｐｐ２５−４３）等によって測定できる。
ここに、「有害物質の存在下に変動する遺伝子」は、酵母細胞の場合、公共のデータベース（例えば、ドイツのＭＩＰＳ：Ｍｕｎｉｃｈ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、米国のＳＧＤ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）に開示されている酵母遺伝子の中から適宜選択し、これらはインターネットを介して知ることができる。好ましい遺伝子は、ミトコンドリアタンパク質、遺伝子修復系タンパク質、エネルギー系タンパク質、トランスポート促進タンパク質、ストレスタンパク質、代謝系タンパク質、脱毒性タンパク質および機能未知の遺伝子である。例えば、ＹＬＲ３０３Ｗ、ＹＬＬ０５７Ｃ、ＹＯＲ３８２Ｗ、ＹＣＲ１０２Ｃ、ＹＫＬ０７１Ｗ等である。
【００３４】
本発明で使用される微生物にはまた、上記天然に存在する細胞の組換え体、即ち形質転換体が含まれる。本発明に用いる形質転換体は、上記「有害物質の存在下に変動する遺伝子」のプロモーターのポリヌクレオチド配列に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結して得られるポリヌクレオチド構築物を含むベクターを上記天然に存在する細胞に導入することにより調製できる。プロモーターにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結する方法は周知である（例えばＲ．Ｗ．オールド、Ｓ．Ｂ．プリムローズ  遺伝子操作の原理  原書第５版，  培風館，  ｐｐ１３８−１６５，  ｐｐ．２３４−２６３，  ２０００を参照）。プロモーターの配列は、例えば酵母の場合、公共のデータベース（ＳＣＰＤ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に開示されている。マーカータンパク質の例としてはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｈｅｉｍ，  Ｒ．，  Ｃｕｂｉｔｔ，  Ａ．  Ｂ．  ａｎｄ  Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．  Ｙ．（１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７３，  ６６３−６６４；Ｈｅｉｍ，  Ｒ．，  Ｐｒａｓｈｅｒ  ＤＣ．  ａｎｄ  Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．  Ｙ．（１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９１，  １２５０１−１２５０４；Ｗａｒｇ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｈａｚｅｒｉｇｇ，  Ｔ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ６３９，  ４００−４０３；Ｙｏｕｖａｎ，  Ｄ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｍｉｃｈｅｌ−Ｂｅｙｅｒｌｅ，  Ｍ．Ｅ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４  １２１９−１２２０；Ｃｈａｌｆｉｅ，  Ｍ．，  Ｔｕ，  Ｙ．，  Ｅｕｓｋｉｒｃｈｅｎ，  Ｇ．，  Ｗａｒｄ，  Ｗ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｐｒａｓｈｅｒ，  Ｄ．Ｃ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３，  ８０２−８０５）、β−ガラクトシダーゼ（Ｃａｎｅｓｔｒｏ  Ｃ，  Ａｌｂａｌａｔ  Ｒ，  Ｅｓｃｒｉｖａ  Ｈ，  Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｄｕａｒｔｅ  Ｒ．  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｍｐｈｉｏｘｕｓ：  ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｄｅｖ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ  ２００１  Ｍａｒ  ２１１（３）：１５４−６）、ルシフェラーゼ（Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２００２  Ｊｕｎ；７６（５−６）：２５７−６１、Ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＵＶ  ｆｉｌｔｅｒｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ａｓｓａｙ．Ｓｃｈｒｅｕｒｓ  Ｒ，  Ｌａｎｓｅｒ  Ｐ，  Ｓｅｉｎｅｎ  Ｗ，  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  Ｂ．）、及びアセチルトランスフェラーゼ（Ｊ  Ｒｅｃｅｐｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ  Ｒｅｓ  ２００１  Ｆｅｂ；２１（１）：７１−８４，  Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．    Ｚｈａｎｇ  Ｓ，  Ｌｕ  Ｊ，  Ｉｙａｍａ  Ｋ，  Ｌｏ  ＳＣ，  Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ．）等が挙げられる。
【００３５】
ベクターの調製は、例えば酵母細胞の場合、酵母において複製可能なプラスミドを選択し、これにマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入し、次いでプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをマーカー遺伝子の上流部分に挿入することにより行うことができる。
形質転換体は周知の手法により調製できる。例えば、酵母細胞を形質転換する方法は、Ｋａｉｓｅｒ  Ｃ，  Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ  Ｓ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ａ：  Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  １９９４  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）  ｐｐ．１３３−１３４，１９９４に記載されている。
【００３６】
形質転換体を用いた場合、本発明に使用される「微生物応答」はマーカータンパク質の発現レベルである。マーカータンパク質の発現レベルは、形質転換体を粉砕しタンパク質抽出液を得、この液中のマーカータンパク質量を測定することにより得られる。例えばマーカータンパク質がＧＦＰの場合、タンパク質抽出液の蛍光量を蛍光分光光度計により計測する。また、マーカータンパク質の発現レベルは、形質転換体を粉砕しなくても直接、蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡による画像処理、フローサイトメトリーによる計測、エバネッセント光による計測、さらに比色計などを用いた検出方法により、細胞の蛍光（ＧＦＰ）もしくはもしくは発色（β−ｇａｌ）を測定できる場合もある。好ましい形質転換体は、酵母遺伝子のプロモーターをマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターによって形質転換されている酵母、または染色体のＯＲＦをマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドで置換するように形質転換されている酵母であり、さらに好ましくは、その酵母遺伝子がミトコンドリアタンパク質、遺伝子修復系タンパク質、エネルギー系タンパク質、トランスポート促進タンパク質、ストレスタンパク質、代謝系タンパク質、脱毒性タンパク質および機能未知の遺伝子のなかから選ばれるものである。
【００３７】
本発明の検出方法では、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出する。検水に有害物質が存在する場合、循環流路から採取された微生物が検水と接触すると、生育阻害、呼吸量低下等の影響を受ける。加えて微生物が組換え体である場合、レポーター遺伝子の発現が起きる。
【００３８】
本発明では上記の通り、微生物は循環流路から採取され、そのまま排出される。そのため、本発明において測定できる「微生物応答」として、酸素消費量等の可逆的な応答のみならず、微生物の死滅を伴う生細胞数および細胞を破壊して測定する細胞内の酵素活性などの不可逆的な応答も利用できる。
【００３９】
循環流路に供給される微生物が凍結保存したもの、凍結乾燥保存したもの、または冷蔵保存したものである場合、微生物は休眠状態にある。よって、本発明では好ましくは、検水を負荷する前に、循環流路から採取される微生物を一定時間循環流路中で増殖培養させ、それにより休眠状態の微生物の活性を回復させる前培養を行い、次いで検水の負荷を行い試験培養する。前培養では、微生物の化学物質感受性を上げるため、可能な限り、細胞周期のすべてのステージの細胞を含む状態である対数増殖期とすることが望ましい。前培養では、循環流路中を循環している微生物を所定量排出し、培地を供給することで希釈培養し、それにより微生物が対数増殖期になるように温度および時間を制御する。具体的には、酵母の場合、前培養の条件は２５−３０℃、２時間から十数時間である。試験培養は、検出すべき微生物の応答により異なるが、数１０分から数時間である。
【００４０】
（４）有害物質混入の有無を検出する装置
本発明はさらに別の態様として、本発明の検出方法を実施するための装置を提供する。詳細には、ａ）培地中の微生物懸濁液が循環する循環流路、ｂ）循環流路に連結している懸濁液排出口、ｃ）循環流路に連結している培地供給槽、ｄ）循環流路から分岐している、一定量の微生物懸濁液が流れる試験流路、ｅ）試験流路に検水を注入するための検水注入装置、およびｆ）検水が負荷された、試験流路を流れる微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置である。この装置では、試験流路に設けたサンプリング口から循環流路中の微生物懸濁液の一部を取り出し、検水を加えてさらに試験培養を行い、検出装置にて細胞応答、例えば、細胞数（吸光度により計測）、プロモーターアッセイの場合は蛍光や発色を計測し、検水の有害物質の有無を検出する。
【００４１】
好ましくは、循環流路（ａ）中では微生物懸濁液が一定の流速度で流れており、懸濁液排出口（ｂ）は、微生物懸濁液の所定量を恒常的に排出させ、培地供給槽（ｃ）は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を恒常的に補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整する。そして、試験流路（ｄ）中では循環流路からの一定量の微生物懸濁液が一定の流速度で流れる。試験流路は循環流路からサンプリング口を介して分岐している。試験流路は通常、管状であるが、形状は何でも構わない。その他の特徴は循環流路と同様である。試験流路全体の長さは微生物応答検出のために充分な微生物移動時間を与える長さであり、通常、数分−数時間である。例えば、微生物応答時間が１時間、流速１ｃｍ／分の場合、長さは６０ｃｍ以上を確保する。
【００４２】
検水注入装置（ｅ）は、試験流路中を移動している対数増殖期の微生物に検水を負荷する。検水の負荷を間欠的に行う場合、検水の１回の負荷量は試験流路の径に依存するが、例えば径が１−３ｍｍであれば、通常、検水０．００１−５ｍｌを負荷する。検水の負荷を連続的に行う場合、検水の試験流路への通水量は、試験流路の径に依存するが、例えば径が１−３ｍｍであれば、通常、検水０．００１−５ｍｌ／分である。
【００４３】
試験流路には、試験培養にとって充分な、即ち検水中に有害物質が混入した場合に微生物応答の変化が引き起こされるに充分な移動時間を与える位置に微生物応答検出装置（ｆ）が配置される。試験培養は、検出すべき微生物の応答により異なるが、数１０分から数時間である。時間に応じて、試験流路の長さを調節する。
本発明の典型的な装置において、循環流路が環状である態様を図３に、循環流路が非環状である態様を図４に示す。
【００４４】
本発明の検出装置は、検水注入装置が連結していない点以外は同じ試験流路を対照流路としてさらに含むことができる。対照流路を備えた本発明の装置を図４に示す。微生物の応答を検出する場合、対照となる状態との差をとることにより、より正確な応答を把握することができる。そこで、検水を加えない対照区として別の試験流路を設け、検出区と同様にモニタリングする。
【００４５】
循環流路を複数用いることで、応答を検出する微生物を複数にすることができる。循環流路各々に、それに連結する懸濁液排出口、培地供給槽、試験流路、検水注入装置および微生物応答検出装置を配する。微生物応答検出装置は１台で必要に応じて循環流路を切り替えて用いることも可能である。このようにして、同一の検水について複数種類の微生物応答を計測し、その応答を比較することによって、検水中の有害物質を推定することが可能となる。例えば、微生物として酵母遺伝子ＹＬＬ０５７Ｃのプロモーターアッセイ細胞および酵母遺伝子ＹＢＲ０７２Ｗのプロモーターアッセイ細胞を循環させたそれぞれ２つの循環流路を用いた場合、検水にペンタクロロフェノールが含まれるとＹＬＬ０５７Ｃ細胞のみが応答し、２−４−ジクロロフェノールまたはｐ−ノニルフェノールが含まれるとＹＢＲ０７２Ｗ細胞のみが応答する。また、亜ヒ酸塩が検水に含まれると、ＹＬＬ０５７Ｃ細胞およびＹＢＲ０７２Ｗ細胞の両方が応答する。
【００４６】
（５）微生物を対数増殖期に保持させる方法
本発明はさらに別の態様として、培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、微生物を対数増殖期に保持させる方法、およびそのための装置に関する。この方法および装置の詳細は、上記した本発明の培養方法および培養装置と同様である。
微生物を対数増殖期に保持させれば、例えばレポーター遺伝子の産物が非常に安定であるレポータージーンアッセイを行う場合、培養時間や保存時間が長いと、遺伝子の誘導以前に高レベルのタンパク質が細胞内に蓄積するという問題がある。本発明の培養方法であれば、静止期（Ｇ０期）、老化、アポトーシスのような細胞の割合が少なく、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の状態の細胞割合が多い微生物懸濁液が常に供給されるため、前培養、本培養というような対数増殖期の細胞を得るための手間、時間を省くことができるので、この点で特に有用である。
【００４７】
（６）対数増殖期の微生物を調製する方法
本発明はさらに別の態様として、培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、対数増殖期の微生物を調製する方法、およびそのための装置に関する。この方法および装置の詳細は、上記した本発明の培養方法および培養装置と同様である。
本発明の調製方法により得られる微生物は対数増殖期の状態にある。
【００４８】
（７）増殖的に培養している微生物を用いる、有害物質混入の有無を検出する方法およびそのための装置
本発明は別の態様として、検水中の有害物質混入の有無を検出する方法であって、増殖的に培養している微生物に対して検水を負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出することを特徴とする方法、およびその方法を実施するための装置に関する。
上記の通り、対数増殖期に保持された微生物は、例えばレポーター遺伝子の産物が非常に安定であるレポータージーンアッセイに使用する場合、定常状態の細胞に比してレポーター遺伝子の発現の割合が低い。有害物質を負荷しない状態で遺伝子発現が高い場合は、有害物質負荷により遺伝子が誘導されても、その違いを検出するのが難しい。さらに、定常状態では有害物質感受性が低いと考えられる。これらのことから、対数増殖期を維持する培養機構を有するバイオアッセイ装置は有用であると考えられる。
【００４９】
対数増殖期を維持する培養機構は、本発明の循環流路を利用する上記方法を実施できる装置などである。
【００５０】
この態様に関連し、本発明は、ａ）増殖的に培養している微生物を供給できる培養機構を有する培養装置、ｂ）該培養装置から微生物を採取するための採取装置、ｃ）採取した微生物に検水を注入するための検水注入装置、およびｆ）検水が負荷された微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置に関する。この装置は、検水を負荷されていない、増殖的に培養している微生物の微生物応答を検出する手段をさらに含むことができる。
【００５１】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例１
酵母細胞の継続的培養
凍結保存した酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３株（ＡＴＣＣ  ２００１２３９）を選択培地（ＳＤ培地：ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  （Ｄｉｆｃｏ．０９１９−１５−３）  ＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル、ロイシン）にて２５℃において振盪培養し、定常状態になるまで時間、増殖させた。培養物に同じ選択培地を加え、ＯＤ６６０が０．５となるように希釈し、そのうち２０ｍｌを容量５０ｍｌのチューブに入れ、２５℃でさらに振盪培養した。倍加時間の３時間ごとに培養液の半分を廃棄して等量の上記選択培地を加え、これを繰り返した。その間、培養液のＯＤ６６０を経時的に計測した。得られた結果を図６に示す。
図６の結果は、倍加時間ごとに細胞懸濁液の１／２を排出し、等量の培地を供給することにより細胞懸濁液の濃度を定期的に調整すれば、細胞濃度を一定に保持できることを示している。
【００５２】
実施例２
生育の計測による毒性物質の検出
凍結保存した酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｗ３０３株  （Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ    ＡＴＣＣ  ２００１２３９）を選択培地（ＳＤ培地：ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  （Ｄｉｆｃｏ．０９１９−１５−３）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル、ロイシン））にて２５℃において振盪培養することにより定常状態になるように増殖させた。
定常状態にある酵母を４℃にて１週間保存し、次いで上記同じ培地で１０倍希釈し、２５℃にて２時間、前培養を行った。その後、被検試料を添加しさらに４時間、２５℃にて培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。６００ｎｍの吸光度を測定することにより、細胞の増殖を計測した。化学物質の添加により、いずれも細胞増殖の阻害が確認された。
【表１】
2004357575.tif 000003
【００５３】
以上の結果より、検水負荷の４時間後における循環流路中の検体の吸光度を測定することにより、検水中の有害物質の有無が検出できることが明らかとなった。
【００５４】
実施例３
レポーター・ジーン・アッセイによる有害物質の検出
１．酵母遺伝子ＹＬＬ０５７Ｃプロモーターアッセイ細胞作成
酵母遺伝子ＹＬＬ０５７Ｃのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチド（配列番号１）をＰＣＲにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアであるＯｌｉｇｏ４．０−Ｓ，ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒＩマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は
ＧＣＴＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＧＧＴＡＴＴＧＡ      （配列番号２）
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
ＡＴＴＴＴＡＡＣＴＧＧＧＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴ          （配列番号３）
とした。ＰＣＲはテンプレートとして酵母の染色体（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ，  Ｃａｔ．４０８０２，Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）を用い試薬は市販のキット（ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；コードＫＯＤ−１０１、Ｔｏｙｏｂｏ）を使用した。
【００５５】
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるＹＥｐ型シャトルベクターであるｐＹＥＳ２（ｐＹＥＳ２，  Ｃａｔ  ｎｏ：Ｖ８２５−２０，  Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ＵＳＡ）（Ｒ．Ｗ．オールド、Ｓ．Ｂ．プリムローズ  遺伝子操作の原理  原書第５版，  培風館，  ｐｐ．２３４−２６３，  ２０００））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号４）はベクターｐＱＢＩ  ６３（Ｃａｔ  ｎｏ．５４−００８２，  和光純薬工業（株））のＧＦＰの部分を用いた。まず、ｐＹＥＳ２の  多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）の中にＧＦＰのオリゴヌクレオチドを挿入したベクターを作成した。その後、ｐＹＥＳ２のＧＡＬ１プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＬＬ０５７Ｃのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドで置換した。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
【００５６】
ベクターで酵母を形質転換する手順を以下に示す。
１）酵母細胞Ｗ３０３を２００ｍｌのＳＤ培地でＯＤ６６０が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのＴＥ−ｂｕｆｆｅｒにけん濁する。
３）２．５Ｍのリチウムアセテイト２５０μＬを添加する。
４）３００μｌずつ分注し１０μｌのプラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）７００μｌの５０％ＰＥＧ４０００を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Ｍソルビト−ルで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
形質転換の確認は選択培地（ＳＤ培地）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
【００５７】
２．酵母遺伝子ＹＢＲ０７２Ｗのプロモーターアッセイ細胞作成
酵母遺伝子ＹＢＲ０７２Ｗのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチド（配列番号７）をＰＣＲにより増幅し、そのためのプライマーとして、アッパープライマー：
ＧＣＡＧＴＣＡＡＣＧＡＧＧＡＧＣＧＡＡＴＣＡＧ      （配列番号５）、
ロウワープライマー：
ＧＴＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＴＴＧ        （配列番号６）、を用いる以外は、上記１．と同様に処理し、目的の形質転換体を作成した。
【００５８】
３．生育の計測による毒性物質の検出
得られた形質転換体を選択培地（ＳＤ培地）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）にて２５℃において振盪培養することにより定常状態になるように増殖させた。
次いで、上記同じ培地で５００倍希釈し、前培養を２５℃にて１５時間行った。その後、被検試料を添加しさらに４時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。サンプルを採取し、フローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。化学物質を負荷しない場合の蛍光強度を予め測定し、その１．５倍以上の蛍光強度を有するものを蛍光検出有りとして＋と表示した。
【００５９】
【表２】
2004357575.tif 000004
【００６０】
表２は、検水にペンタクロロフェノールが含まれるとＹＬＬ０５７Ｃ細胞のみが応答し、２−４−ジクロロフェノールまたはｐ−ノニルフェノールが含まれるとＹＢＲ０７２Ｗ細胞のみが応答し、そして検水に亜ヒ酸塩が含まれると、ＹＬＬ０５７Ｃ細胞およびＹＢＲ０７２Ｗ細胞の両方が応答することを示している。
これにより、複数のプロモーターアッセイ細胞の循環流路を用いることにより、化学物質の推定が可能となることが示された。
【００６１】
実施例４
培養条件がレポーター遺伝子の発現に及ぼす影響
実施例３にて調製した形質転換体を選択培地（ＳＤ培地）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）にて２５℃において振盪培養することにより定常状態になるように増殖させた。
定常状態の形質転換体を上記同じ培地で５００倍希釈し、前培養を２５℃にて１５時間行い対数増殖期とした細胞の蛍光をフローサイトメトリーで計測した。さらに、４８時間培養し定常状態としたものの蛍光を同様に計測した。定常状態の蛍光強度と対数増殖期の蛍光強度の比を求め、蛍光強度比とした。得られた結果を表３に示す。
【００６２】
【表３】
プロモーターアッセイ細胞          蛍光強度比
ＹＬＬ０５７Ｃ                        １．５
ＹＢＲ０７２Ｗ                      ２．３
【００６３】
表３の結果から、対数増殖期のように静止期（Ｇ０期）の細胞の割合が少なく、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の細胞割合が多い状態の方が、定常期のように静止期（Ｇ０期）の細胞が多いものより、レポーター遺伝子の発現の割合が低いことがわかる。有害物質を負荷しない状態でレポーター遺伝子の発現が高い場合は、有害物質負荷によりレポーター遺伝子が誘導されても、その違いを検出するのが難しい。さらに、定常状態では有害物質感受性が低いと考えられる。これらのことから、対数増殖期を維持する培養機構を有するバイオアッセイ装置は有用であると考えられる。
【００６４】
【発明の効果】
本発明の培養方法および培養装置により奏される効果を以下に列挙する。
１．通常、微生物の継代は、培養液を無菌的に培地で希釈する等の煩雑な手作業を伴う。しかし、本発明では、自動的に懸濁液を排出し自動的に培地を供給させることにより自動的な微生物の培養、継代が可能となる。よって、上記のような煩雑手作業が必要なくなる。例えば、再生医療や通常の臨床診断、あるいは研究室や実験室おける培養または継代作業に好適に使用できる。
２．通常の微生物の保存法として凍結もしくは凍結乾燥処理が挙げられる。しかし、これらの処理により致死的な損傷を受け、再調製後の生存率が著しく悪くなるような微生物、例えば動物細胞等は、凍結もしくは凍結乾燥処理が出来ない。そのような微生物では継代培養による維持が必要である。本発明を用いれば、これを簡便に行うことができ、微生物の保存的培養の観点からも本発明は有用である。
【００６５】
本発明の検出方法および検出装置により奏される効果を以下に列挙する。
１．従来の微生物固定膜は他の微生物混入、有害物質による過度な障害により微生物の損傷を受けた場合、微生物固定膜の交換の必要があった。本発明では、循環流路を用いることで微生物が増殖的に培養され、膜交換は不要である。
２．本発明では、循環流路から分岐した試験流路を介して検出装置へ微生物を供給し、その微生物は試験終了後排出される。よって、酸素消費量等の可逆的な微生物応答の測定のみならず、微生物の死滅を伴う生細胞数および細胞を破壊して測定する細胞内の酵素活性などの不可逆的な微生物応答の計測をも用いることができる。また、細胞を膜に固定していない為、個々の細胞をフローサイトメトリーで計測するという方法を用いることも可能となる。
３．微生物を膜に固定する方法では、バイオセンサとしての感受性が高い種類の微生物だとしても、活性を維持し難い種類のものは使用できない。しかし、本発明では、このように比較的短命もしくは脆弱な微生物、例えば血球細胞のような動物細胞の樹立株をも対象微生物として用いることが可能である。
４．  微生物固定膜の場合は繰り返しまたは連続的に膜上の細胞をモニタするので、生細胞数および細胞の活性等の細胞状態をある程度一定に保つ必要がある。しかし、本発明の場合は細胞状態を一定に保つ必要が無いので、細胞数の増加を計測するなどの、微生物応答の測定において極めて標準的な計測法を用いることも可能である。
５．プロモーターアッセイを用いる場合、マーカー蛋白質が細胞内に蓄積されてベースが上がってしまうという問題がある。本発明により、常に対数増殖期の若い細胞の供給が可能となり、このような問題が解決される。
６．レポーター遺伝子の産物が安定であるレポータージーンアッセイを行う場合、培養時間や保存時間が長いと、遺伝子の誘導以前に高レベルのタンパク質が細胞内に蓄積するという問題がある。しかし、本発明のように自動的に継代培養を行う方法であれば、常に短い培養時間の細胞を供給できるため、細胞内蓄積の問題が回避され、さらに前準備の手間、時間を省くことができる。
【００６６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ａ）循環流路、ｂ）懸濁液排出口、ｃ）培地供給槽を含む、微生物を培養するための装置の概念図である。
【図２】コントローラをさらに備えた本発明の培養装置である。
【図３】ａ）環状の循環流路、ｂ）懸濁液排出口、ｃ）培地供給槽、ｄ）試験流路、ｅ）検水注入装置、およびｆ）微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置の概念図である。
【図４】ａ）非環状の循環流路、ｂ）懸濁液排出口、ｃ）培地供給槽、ｄ）試験流路、ｅ）検水注入装置、およびｆ）微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置の概念図である。
【図５】対照流路をさらに備えた本発明の検出装置である。
【図６】酵母Ｗ３０３株の培養液の半分を倍加時間ごとに廃棄し、等量の選択培地を加える操作を繰り返し、得られた培養液のＯＤ６６０の経時的グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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