(57)【要約】【目的】高塩濃度において、ＥＤＴＡ・重金属錯体に代表される難生分解性成分に対して活性を示す分解性菌の提供【構成】特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２９として受託されたＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属のａｔｌａｎｔｉｃａ種に属する菌株。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２９として受託されたＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属のａｔｌａｎｔｉｃａ種に属する菌株。
【請求項２】
特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２９として受託されたＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属のａｔｌａｎｔｉｃａ種に属する菌株を含む有機アミノカルボン酸・重金属錯体を分解する生分解剤。
【請求項３】
特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２９として受託されたＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属の種ａｔｌａｎｔｉｃａに属する細菌を有機アミノカルボン酸・重金属錯体を含む被処理物に加え、ｐＨを６〜８に維持して前記有機アミノカルボン酸・重金属錯体を分解処理する方法に用いる前記細菌を含む有機アミノカルボン酸・重金属錯体生分解処理剤。
【請求項４】
有機アミノカルボン酸がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であることを特徴とする請求項２または３に記載の有機アミノカルボン酸・重金属錯体分解処理剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属のａｔｌａｎｔｉｃａ種に属する受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２９として受託された菌株、および前記菌株を含む有機アミノカルボン酸・重金属錯体を含む被処理物、特にＥＤＴＡ・金属錯体を含む被処理物の前記錯体分解処理剤、および前記処理剤による有機アミノカルボン酸・重金属錯体の生物分解処理方法などに関する。
【０００２】
【従来技術】
重金属類含有廃水を物理化学的に廃水処理するのに適した方法として、例えば，廃水を活性炭やイオン交換樹脂などの吸着材に吸着させて重金属を捕集する方法がある。中でも前記イオン交換樹脂においてＥＤＴＡ等のキレート化剤の残基を官能基として有するキレート樹脂は、重金属類を効果的に捕集できることはよく知られている。重金属類を含んだ産業廃水などの場合に、活性汚泥法などの生物的処理法を適用する試みは、重金属類を含んでいるために廃水からの重金属の除去効率が良くなかった。この様な中で、生物的処理を実現するために、有機アミノカルボン酸類が金属と結合した金属錯体に対しても生分解性を維持する生分解性細菌を見出すべき努力が払われ、有機アミノカルボン酸・重金属錯体にアミノカルボン酸分解性の細菌をその生育ｐＨ条件の下で処理すると、錯体のアミノカルボン酸部分が生物的に分解されて重金属類あるいは有価金属類は、水酸化物や酸化物などの形で濃縮分離された状態になり、廃水は無害化されることが見出されている。そして、そこで使用可能な有機アミノカルボン酸類を分解する能力を有する細菌とし、バチルス属に分類される菌株として、バチルス　エディタビダス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｅｄｉｔａｂｉｄｕｓ）　、バチルス　サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）　、バチルス　メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　、バチルス　スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｎａｔｔｏなどを挙げ、これらは、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｅｄｉｔａｂｉｄｕｓ−１（微工研菌寄　第１３４４９号）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＮＲＩＣ　００６８　、Ｂ．　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　ＮＲＩＣ　１００９　、Ｂ．　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ　ＮＲＩＣ　１０１３　などとして容易に入手可能であることなどに言及している（特許文献１）。しかしながら、シュードアルテロモナス属に分類される菌株、例えばシュードアルテロモナス・アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ａｔｌａｎｔｉｃａ：ＩＡＭ　１２９２７）については、有機アミノカルボン酸・重金属錯体の生分解に有効であることについて言及する文献は見当たらない。
【０００３】
【特許文献１】
特開２００２−１９２１８６（２００２年７月１０日公開。）（例えば、〔００２１〕、〔００２２〕）
【０００４】
前記生物処理は、より環境負荷が少なく低コストな方法を実現できる可能性が大きいので、ＥＤＴＡに代表される難生分解性成分についても生物による分解を実現するものとして有効となるものと考えられるが、現在までに報告されているＥＤＴＡに代表される難生分解性のキレート剤の分解微生物は陸上微生物であった。
一方、廃液など被処理物の塩分濃度はかなり高いので、高塩濃度において、ＥＤＴＡ・重金属錯体に代表される難生分解性成分に対して生分解活性を示す分解性菌株が望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、基本的には、高塩濃度において、ＥＤＴＡ・重金属錯体に代表される難生分解性成分に対して活性を示す分解性菌を提供することであり、更に、ＥＤＴＡ・重金属錯体に代表される難生分解性成分に対して活性を示す生分解処理剤、ならびに、生分解処理方法を提供することである。
そこで、高塩濃度において生分解活性を示す菌株は海中から見出されるのではないかと、多くの海域における海水、海水中浮遊物、海中沈殿物などを採取、培養し、前記課題を解決可能な菌株を選別すべく、目的の分解菌の簡便かつ迅速に評価する方法を開発努力と、それを利用した多くの試行錯誤の実験を繰り返し伊豆諸島近海の海中堆積物中からＥＤＴＡ・金属錯体に対して生分解活性を示す菌株を分離することに成功し、前記課題を解決できた。そして、前記菌株がシュードアルテロモナス・アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ａｔｌａｎｔｉｃａ）に分類されＥＤＴＡ・金属錯体を生物分解する新規特性に特徴付けられるものであることを同定し、Ｈ６−２−４と命名し、特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２９として寄託した（平成１４年９月１９日受託）。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１は、特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２９として受託されたＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属のａｔｌａｎｔｉｃａ種に属する菌株である。また、本発明の第２及び第３は、前記特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２９として受託されたＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属のａｔｌａｎｔｉｃａ種に属する菌株を含む有機アミノカルボン酸・重金属錯体を分解する生分解剤、または特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１９０２９として受託されたＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属の種ａｔｌａｎｔｉｃａに属する細菌を有機アミノカルボン酸・重金属錯体を含む被処理物に加え、ｐＨを６〜８に維持して前記有機アミノカルボン酸・重金属錯体を分解処理する方法に用いる前記細菌を含む有機アミノカルボン酸・重金属錯体生分解処理剤である。好ましくは、有機アミノカルボン酸がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であることを特徴とする前記第２または３の有機アミノカルボン酸・重金属錯体分解処理剤である。
【０００７】
【本発明の実施の態様】
本発明をより詳細に説明する。
本発明のＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属ａｔｌａｎｔｉｃａ種に分類されるＨ６−２−４株の特徴；
Ｈ６−２−４株の種の同定
ａ，生理・生化学的性状試験は、“Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｓｍｅｂｅｒｔ，１９８１）”に準ずる。
菌Ｈ６−２−４の特性を表１にまとめた。
【０００８】
【表１】
2004113047.tif 000002
2004113047.tif 000003
【０００９】
菌Ｈ６−２−４の生育及びＦｅ−ＥＤＴＡ分解に対するｐＨの効果を表２に示す。
【００１０】
【表２】
2004113047.tif 000004
【００１１】
登録された既知の菌種のＤＮＡの塩基配列との対比；
菌Ｈ６−２−４の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列と登録された細菌の塩基配列の相同性を比較したところ、表３に記載の６種の細菌の塩基配列と相同性は９９．０％以上であった。この表から１６ＳｒＤＮＡの塩基配列のみでは種の判別は困難であった。標準菌株は東京大学分子細胞研究所（ＬＡＭ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。
ＰＣＲ条件；
プライマー；細菌ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｍｅｒ；
２７Ｆ
１４９２Ｒ
反応液　Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（イタリック）バッファー
プログラム（９４℃６０秒→５８℃２分３０秒→７２℃２分３０秒）×２５サイクル
【００１２】
【表３】
2004113047.tif 000005
【００１３】
登録された既知の菌種のｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列との対比；
菌Ｈ６−２−４のｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列と登録された菌のｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列と対比したところ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ａｔｌａｎｔｉｃａ　と９８．３０％、また、Ｐ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｔｅｔｒａｏｄｏｎｏｎｉｓ　と９７．５４％の相同性が認められた。Ｐ．ｅｓｐｅｊｉａｎａ　との相同性は９１．８７％であった。
標準菌株をＥｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０；Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｉｎｆｅｃ．　Ｄｉｓ．，　９：　２１３−２１７）に従って、ゲノムＤＮＡを抽出した後、このＤＮＡからＹａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５；Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６１：　１１０４−１１０９）の方法に準じ、ｇｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。
ＰＣＲ条件；
プライマー；細菌ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｍｅｒ；
ＵＳ−１Ｓ
ＵＳ−２Ｓｒ
反応液　Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（イタリック）バッファー
プログラム（９４℃６０秒→６０℃６０秒→７２℃２分）×３０サイクル
増幅したＰＣＲ産物を同様に精製し、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３１０　ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒで塩基配列を決定し、データベース中の登録配列との相同性を比較した。相同性試験の結果を表４に示す。
【００１４】
【表４】
2004113047.tif 000006
【００１５】
菌Ｈ６−２−４のＤＮＡのＧ＋Ｃ（Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを意味する）含量の測定；
菌体ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量はＴａｍａｏｋａ　ａｎｄ　Ｋｏｍａｇａｔａ（１９８４；ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２５：　１２５−１２８）の方法に従って解析した。すなわち、ＮｕｃｌｅａｓｅＰ１（ＧＣ含量測定キット：ヤマサ醤油）を用いて精製したゲノムＤＮＡをヌクレオチドに分解し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。ＨＰＬＣの測定条件を以下に示す。また、標準混合物として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒａｉｎ　Ｂ　ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）（Ｇ＋Ｃ含量　５０ｍｏｌ％）を同様に加水分解させたものを用いた。この標準混合物と試料の結果から試料中のＧ＋Ｃ含量を測定した。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件；
カラム：Ｄｏｃｏｓｉｌ　Ｃ２２（４．６φ×２５０ｍｍ）
移動相：０．１Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ未調整）
流速：１ｍＬ／分
検出波長：２６５ｎｍ
【００１６】
菌Ｈ６−２−４のＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は４３．８ｍｏｌ％であり、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属のＤＮＡのＧ＋Ｃ含量が３９〜４５ｍｏｌ％の範囲にあることと（Ｇａｕｔｈｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｓｙｓｔ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　４５：　７５５−７６１）対比すると、菌Ｈ６−２−４はＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属の細菌と確認できた。
【００１７】
菌Ｈ６−２−４と近縁の３種（Ｐ．ａｔｌａｎｔｉｃａ、Ｐ．ｅｓｐｅｊｉａｎａ、Ｐ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｔｅｔｒａｏｄｏｎｏｎｉｓ　）とのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験；菌Ｈ６−２−４と近縁の前記３種について、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを行った。結果は、表５（Ｇ＋Ｃ含量と共に示すと）おりであり、菌Ｈ６−２−４と交雑度が最も高いのはＰ．ａｔｌａｎｔｉｃａで、８９．７％あった。同一種と認める、Ｊｏｎｈｎｓｏｎの提案が７０％以上であるから、菌Ｈ６−２−４はＰ．ａｔｌａｎｔｉｃａ　と考えられた。
【００１８】
【表５】
2004113047.tif 000007
【００１９】
菌Ｈ６−２−４、Ｐ．ａｔｌａｎｔｉｃａおよびＰ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｔｅｔｒａｏｄｏｎｏｎｉｓの糖質および有機酸の資化能の結果を表６および表７に示す。菌Ｈ６−２−４の糖質および有機酸資化能は、Ｄ−リボースと酪酸除き、全てＰ．ａｔｌａｎｔｉｃａと同一の結果であった。
以上のことを総合して、Ｈ６−２−４菌はＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ａｔｌａｎｔｉｃａと判明した。
【００２０】
【表６】
2004113047.tif 000008
【００２１】
【表７】
2004113047.tif 000009
【００２２】
ＩＩ．菌株選別試料の採取；
採取場所；伊豆諸島近海；
北緯３４度４５分８４（Ｌａｔ．　３４。４５’８４　Ｎ）
東経１３９度１９分８３（Ｌｏｎｇ．　１３９。１９’８３　Ｅ）
水深３３７ｍ
ＩＩＩ．生育条件；
ＥＤＴＡ−Ｚ寒天培地の組成
ポリペプトン（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ）（日本製薬）　　　　　　　　　　　５．０ｇ
バクト−イースト抽出物（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）（Ｄｉｆｃｏ）　　１．０ｇ
Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ（Ｄｏｕｊｉｎ）　　　　　　　　　　　　　　１．０ｇ
バクト−寒天（Ｄｉｆｃｏ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５．０ｇ
人工海水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００ｍＬ
ｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７．０
【００２３】
ＩＶ．本発明の菌株を利用した処理方法は、公知の菌株を利用した生分解処理で用いられている技術を採用することができる。例えば、菌株を含む処理剤を、前記菌株が生育できる、ｐＨ、塩濃度、温度などの条件で被処理物と接触させる方法が採用できる。
細菌を固定化して処理する方法としては、担体として、例えば多孔性セラミクス、活性炭、スポンジ、キトサン（粒状）、ひも状担体、プラスチック、ハニカム状担体、波状担体、網状担体、アンスラサイト、砂利、砂、軽石等の１種または２種以上を用い、これに細菌を固定することにより用いることができる。
Ｖ．処理対象としては、ＥＤＴＡ−金属錯体、例えばＣｕ、Ｆｅ（ＩＩＩ）などの重金属との錯体を含む工業、食品などの廃水だけではなく、廃土や沈積土にも適用できる
【００２４】
【実施例】
ここでの説明は、本発明をより理解し易くするだけの目的であり、本発明を限定的に解釈するためのものではない。
実施例１
菌株の分離と培養
１，分離
前記伊豆諸島近海で採取した海底堆積物１ｇを、滅菌天然海水に加え、１０−１〜１０−４に適宜希釈し、前記Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ寒天培地に塗抹し、２７℃において１ヶ月静置培養した。培養後生じたコロニーを無作為的に選び、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ液体培地中で培養を２日間行い、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡが３０％分解されていることを確認した。Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡが分解されイミノ二酢酸とグリシンの生成されていることを確認して、分離菌株がＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡの分解に活性を持つことを確認した。
また、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ含有液に前記分離菌体を添加した場合にも、前記錯体を分解できることを確認した。
【００２５】
種々の金属（Ｍｅ）・ＥＤＴＡ錯体のＨ６−２−４の生分解活性を測定した。結果を表８に示す。Ｃｕ（ＩＩ）・ＥＤＴＡ錯体の分解にも有効であることが確認できた。
【００２６】
【表８】
2004113047.tif 000010
【００２７】
【発明の効果】
以上のように、本発明で提供する菌株Ｈ６−２−４は、活性汚泥の構成菌として有用であることが理解でき、廃水処理、汚染土壌などのバイオレメデーション用の菌株として有用であり、環境浄化が大きな社会問題となっていることから、これらの問題解決するための産業上の利用に貢献できることは明らかである。