(57)【要約】【課題】遺伝子組換え酵母を用いる有機酸含量の高い酒類、食品の新規な製造方法を提供する。【解決手段】ＨＡＰ４遺伝子を発現する組換えベクターで形質転換した酵母を用いることを特徴とする有機酸高含有酒類又は食品の製造方法。有機酸の例には、リンゴ酸及び／又はコハク酸がある。また、好ましい酵母の例には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｋ７０１／ｐＡＵＲ　１２３−ＨＡＰ４（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３３）なる清酒酵母がある。【効果】従来の酒類、食品に比べ、酸味が強く、その有機酸組成で嗜好的に好ましいリンゴ酸及び／又はコハク酸含有量が増加した酒類、食品を製造できる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＡＰ４遺伝子を発現する組換えベクターで形質転換した酵母を用いることを特徴とする有機酸高含有酒類又は食品の製造方法。
【請求項２】
有機酸がリンゴ酸及び／又はコハク酸である、請求項１に記載の酒類又は食品の製造方法。
【請求項３】
酵母が清酒酵母である、請求項１又は２に記載の清酒の製造方法。
【請求項４】
清酒酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｋ７０１／ｐＡＵＲ　１２３−ＨＡＰ４（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３３）である請求項３に記載の清酒の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機酸含量の高い酒類又は食品の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【特許文献１】特開平３−１７５９７５号公報
【特許文献２】特開平５−３１７０３６号公報
【特許文献３】特開平６−１２１６７０号公報
【特許文献４】特開２００１−１０３９５８公報
【特許文献５】特開平７−２０３９５１号公報
【特許文献６】特開平１１−４６７５７号公報
【特許文献７】特公昭５３−１９６７８号公報
【特許文献８】特表２００１−５０５７７７公報
【非特許文献１】日本醸造協会誌、第８８巻、第８号、第６４５〜６４７頁（１９９３年）
【非特許文献２】日本醸造協会誌、第９０巻、第１０号、第７５１〜７５８頁（１９９５）
【非特許文献３】２００２年度（平成１４年度）大会講演要旨集、２００２年３月５日、社団法人　日本農芸化学会発行、第５６頁２−６Ａａ１１有機酸を多く生成する酵母について、コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるジメチルサクシネートの感受性酵母（特開平３−１７５９７５号公報）、爽快な酸味を生成する泡なし清酒酵母（特開平５−３１７０３６号公報）、コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるテノイルトリフルオロアセトン又はオキシカルボキシン耐性酵母（特開平６−１２１６７０号公報）、クエン酸シンターゼの阻害剤に耐性を示す酵母（特開２００１−１０３９５８公報）が知られている。また、有機酸及び香気成分を多く生成する酵母について、シクロヘキシミド耐性酵母〔日本醸造協会誌、第８８巻、第８号、第６４５〜６４７頁（１９９３年）〕、メタ亜硫酸カリウムに対して馴養により取得した酵母（特開平７−２０３９５１号公報）、シクロヘキシミド耐性酵母にカプロン酸エチル高生産性を付与した多酸性酵母〔日本醸造協会誌、第９０巻、第１０号、第７５１〜７５８頁（１９９５年）〕、アコニット酸ヒドラターゼの阻害剤感受性、基質感受性酵母（特開平１１−４６７５７号公報）が知られている。
【０００３】
一方、清酒製造工程において汲水の全部あるいは一部に清酒を使用し、清酒醪を十分増殖させた酵母によりアルコール発酵させる清酒醸造法があり、甘口、濃醇な酒質の清酒が得られる（特公昭５３−１９６７８号公報）。この甘口、濃醇な清酒の製造には、甘味とのバランスから多酸性酵母を用いることが良く、有機酸含量が多く、甘味と酸味のバランスが良い酒質の清酒を製造できる酵母が求められている。しかしながら、従来の変異誘発剤で処理した多酸性変異酵母ではそのようなバランスの良い酒質の清酒を得ることは容易ではない。
【０００４】
従来の変異処理法に変わる技術として、遺伝子組換え技術による酵母の育種も行われている。例えば、グルコース存在下で抑制されている酵母の酸化的代謝系を、ＨＡＰ４遺伝子を発現する組換え体を造成することで、その抑制を解除し、バイオマス収量を増大させる技術が開示されている（特表２００１−５０５７７７公報）。しかしながら、この遺伝子組換え酵母がアルコール発酵条件下で特定の有機酸を高生産することは知られていない。
【０００５】
先に、本発明者らは、従来の変異処理法によりリンゴ酸、コハク酸を高生成するクエン酸シンターゼの阻害剤に耐性を示す酵母として得られた２０Ｇ−Ｒ３９株の遺伝的特徴を明らかにするため、マイクロアレイ解析を行い、２０Ｇ−Ｒ３９株の有機酸高生産には、ＨＡＰ４遺伝子の発現が深く関わっているという知見を得ている〔２００２年度（平成１４年度）大会講演要旨集、２００２年３月５日、社団法人　日本農芸化学会発行、第５６頁２−６Ａａ１１〕。しかしながら酒類、食品の製造方法の製造において、遺伝子組換え酵母を用いて特定の有機酸を高生産させる検討は行われていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記した従来技術にかんがみ、遺伝子組換え酵母を用いる有機酸含量の高い酒類、食品の新規な製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、ＨＡＰ４遺伝子を発現するベクターで形質転換した酵母を用いることを特徴とする有機酸高含有酒類又は食品の製造方法に関する。本発明の第２の発明は、有機酸がリンゴ酸及び／又はコハク酸である第１の発明に関する。また、本発明の第３の発明は、酵母が清酒酵母である第１又は第２の発明に関する。
【０００８】
本発明者らは、有機酸を高生産し、その酸組成にも特徴を有する酵母の取得を目的に、ＴＣＡサイクルに関与する酵素群の発現を促進する制御遺伝子であるＨＡＰ４遺伝子を高発現させれば有機酸を高生産するのではないかと考えた。本発明においては、ＴＣＡサイクルの働きを促進する遺伝子の一つであるＨＡＰ４遺伝子〔ジーンズ　アンド　デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ）、第３巻、第１１６６〜１１７８頁（１９８９年）〕を清酒酵母協会７０１号酵母（以降、Ｋ７０１と略す）からクローニングし、これを元株のＫ７０１に導入して、ＹＰＤ培地での培養試験を行って、ＨＡＰ４遺伝子を高発現させたところ、有機酸含量が高いことを見出した。更に、該ＨＡＰ４遺伝子高発現株を用いて清酒小仕込試験を実施し、有機酸を高生産することを認めた。更に、成分分析及び官能検査により、爽快で口当りの良い従来にない酸味のバランスの良い清酒が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明において、有機酸高含有酒類及び食品とは、少なくともリンゴ酸及び／又はコハク酸濃度が、対照よりも高い酒類及び食品のことをいい、更に好ましくは、該有機酸濃度が対照の少なくとも２倍である酒類及び食品のことをいう。本発明の酒類及び食品に限定はないが、酒類としては、清酒、焼酎、ビール、ワイン等を例示できる。また、食品としては、パン類、醤油等を例示することができる。
【００１０】
本発明において、形質転換に使用する酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する醸造用酵母（清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母又はパン酵母等）が好ましい。遺伝子クローニング方法としては、酵母において公知の遺伝子クローニング方法、例えばＰＣＲ法を用いて目的遺伝子を増幅させる方法、ショットガンクローニングを行う方法等を適宜選択して用いればよく、有効な遺伝子クローニング方法としてはＰＣＲ法が好ましい。
【００１１】
本発明に使用するＨＡＰ４遺伝子の塩基配列は、例えばＳＧＤ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｄａｔａｂｅｓｅ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ／）に記載されているので、この配列に基づいてＰＣＲプライマーを設計し、酵母のゲノムＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲを行うことにより、目的遺伝子を得ることができる。これを発現ベクターに接続して、酵母に導入することができる。
【００１２】
酵母にＨＡＰ４遺伝子を導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型、単コピー型、染色体組込み型のいずれも利用可能である。特に、オーレオバシジン耐性をマーカーにもつｐＡＵＲ１０１やｐＡＵＲ１２３〔タカラバイオ（株）製〕などが使いやすい。この他、形質転換の際に用いる選択マーカーとして、アミノ酸などの栄養要求マーカーや薬剤に対する耐性マーカーなども利用可能である。
【００１３】
実験例１
（形質転換株の作製法）
ＨＡＰ４遺伝子の高発現株を得るために二段階のクローニング実験を実施した。
▲１▼ｐＡＵＲ１０１ベクターへのクローニング
ＨＡＰ４遺伝子の上流１１５４ｂｐ、ＨＡＰ４遺伝子のコード領域１６６５ｂｐ及びＨＡＰ４遺伝子の下流４５１ｂｐを含むＰＣＲ産物を得るために、配列番号１及び２で示されるプライマーを設計した。
2004113004.tif 000002
プライマー設計のためのソフトウエアは、インターネットを利用し、ＳＧＤ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｄａｔａｂｅｓｅ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ／）に添付のものを使用した。
Ｋ７０１からゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号１及び２で示されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりＤＮＡ増幅を実施し、ＰＣＲ産物をｐＡＵＲ１０１ベクターのＳｍａＩサイトにクローニングした。
▲２▼ｐＡＵＲ１２３ベクターへのクローニング
ＨＡＰ４遺伝子のコード領域のみが増幅されるように、配列番号３及び４で示されるプライマーを設計した。
2004113004.tif 000003
▲１▼で得たクローン化ＤＮＡをテンプレートにし、配列番号３及び４をプライマーにして、再度ＰＣＲを実施し、ＨＡＰ４遺伝子のコード領域（１６６５ｂｐ）のみを増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＡＵＲ１２３ベクターのＳｍａＩサ
イトにクローニングし、エレクトロポレーションによりＫ７０１に導入した。０．５μｇ／ｍｌオーレオバシジンＡを含むＹＰＤ寒天培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）で、３０℃、３日間培養し、得られた単コロニーを同じ組成のＹＰＤ培地で再度培養し、生育してきたものを形質転換株として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｋ７０１／ｐＡＵＲ１２３−ＨＡＰ４と命名した（以下、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓをＳ．と略記する）。
（ＹＰＤ培地でのＨＡＰ４遺伝子の発現及び有機酸生成試験）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｋ７０１／ｐＡＵＲ１２３−ＨＡＰ４をＹＰＤ培地で、３０℃、一晩、振とう培養した。この前培溶液０．２ｍｌを１０ｍｌのＹＰＤ培地に加え、更に３０℃で振とう培養した。菌体をＯＤ６６０＝１．０まで増殖させ、菌体からＲＮＡを抽出して、ノーザンブロットを行ったところ、ＨＡＰ４遺伝子の発現量が、対照と比べて約３．７倍と高発現が確認された。
また、一晩振とう培養した前培養液０．２ｍｌを１０ｍｌのＹＰＤ１５培地（ＹＰＤ培地のグルコース濃度を１５％に変更）に加え、１５℃で１０日間静置培養した。培養終了液を遠心分離し、上清部分の有機酸組成を分析した。結果を表１に示す。
【００１４】
【表１】
2004113004.tif 000004
【００１５】
この結果、ｐＡＵＲ１２３ベクターにＨＡＰ４遺伝子をつないだプラスミドを含む形質転換株は、宿主Ｋ７０１（対照株）やベクターのみを含むＫ７０１（比較株）に比べて、爽快な酸味を呈するリンゴ酸及び旨味を呈するコハク酸が多く、各々対照株の１．６倍及び１．７倍高生産であった。
【００１６】
本発明の酒類及び食品の製造方法は、ＨＡＰ４遺伝子を高発現し、有機酸を高生産するサッカロミセス・セレビシエに属する酵母を用いることを特徴とし、製造方法は特に限定されるものではなく、一般的な製造方法を適宜用いることができる。
本発明のＨＡＰ４遺伝子を高発現する酵母を用いて清酒、焼酎、ワイン、ビールの各酒類、又はパン等の食品を製造すれば、爽快な口当りの良い酸味が向上した製品を製造することができる。これらの清酒、焼酎、ワイン、ビール又はパン等の原料は特に限定するものではなく、一般的な原料を適宜用いることができる。
かくして、本発明により、宿主であるＫ７０１株のＨＡＰ４遺伝子を高発現させることにより、有機酸高含有酒類及び食品の製造方法が提供される。
なお、以上の特徴をもつＨＡＰ４遺伝子高発現の代表株は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｋ７０１／ｐＡＵＲ１２３−ＨＡＰ４と命名、表示され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３３として寄託されている。
【００１７】
【実施例】
次に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
本発明の酵母及びＫ７０１を用いて、表２に示す仕込配合で清酒を製造した。
【００１９】
【表２】
2004113004.tif 000005
【００２０】
掛米は精白歩合７５％の白米を使用し、麹は精米歩合７５％の白米を使用して製造した。酵母はＹＰＤ５培地（ＹＰＤ培地のグルコース濃度を５％に変更）２．５ｍｌの一夜振とう培養菌体を加えた。発酵温度は１５℃一定とし、仕込み後１３日目で上槽した。上槽液の分析結果を表３に示す。
【００２１】
【表３】
2004113004.tif 000006
【００２２】
官能検査は３点法（１：良、２：普通、３：悪）で行い、パネラー１０名の平均値で示した。
この結果、ＨＡＰ４遺伝子を含む形質転換株は、宿主Ｋ７０１（対照株）やベクターのみを含むＫ７０１（比較株）に比べて、酸度が高く、爽快な酸味を呈するリンゴ酸及び旨味を呈するコハク酸が各々対照株の２．３倍及び２．１倍高生産であり、有機酸のバランスがとれていた。官能的にも、形質転換株はほどよい甘味と酸味を有するという評価が得られた。すなわち、甘味と酸味のバランスのとれた、しかも旨味を有する従来にない濃醇な酒質を有する清酒となった。
【００２３】
【発明の効果】
本発明により、有機酸、詳細にはリンゴ酸及び／又はコハク酸を高生産する新規酵母を取得することができ、この酵母を使用することにより、従来の酒類、食品に比べ、酸味が強く、その有機酸組成で嗜好的に好ましいリンゴ酸及び／　又はコハク酸含有量が増加した酒類、食品を製造できる。特に、濃醇でかつ甘味と酸味のバランスの良い酒質の清酒が製造できる。
【００２４】
【配列表】
2004113004.tif 000007