(57)【要約】【課題】生理活性物質の濃度を測定する組織内物質濃度測定装置を提供する。【解決手段】サンプルホルダー２に組織サンプル１をセットし、励起光源３より励起光４を照射する。制御部１２により制御されたスリット５により励起光の波長を選択する。選択された励起光は、組織サンプル１に照射される。組織サンプル１から放射された蛍光６を分光器７により分光した後、増幅器８により増幅して信号処理部９に導入する。測定結果は表示部１０により表示するとともにデータ保存部１１に保存する。装置の動作は制御部１２によって制御される。薬物の最適励起波長および極大発光波長に基づき薬剤の蛍光強度（Ｄ）を測定し、組織の自家蛍光強度（Ａ）を測定する。Ｄ／Ａを表示部１０に表示すると共にデータ保存部１１に保存する。【効果】簡便に組織内の生理活性物質の濃度を測定できる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織内の薬物からの蛍光および前記組織からの自家蛍光を指標として前記薬物の組織内相対濃度を算出する組織内物質濃度測定装置において、連続した複数の波長を発生する光源と、前記薬物および組織に照射する励起光を選択する励起光波長選択手段とを有することを特徴とする組織内物質濃度測定装置。
【請求項２】
請求項１に記載の組織内物質濃度測定装置において、前記薬物からの蛍光強度を前記組織からの自家蛍光強度で割った値を前記薬物の相対濃度として用いることを特徴とする組織内物質濃度測定装置。
【請求項３】
請求項１に記載の組織内物質濃度測定装置において、複数のサンプルホルダーを具備し、同一組織の異なる切片における薬物濃度測定を行い、切片間での薬物濃度のばらつきが大きい場合には再測定するよう構成されたことを特徴とする組織内物質濃度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体組織中の薬物の濃度を測定する組織内物質濃度測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に病気の治療方法として、手術あるいは放射線療法のように侵襲性の高い方法よりも薬剤投与のような低侵襲な方法の方が患者に受け入れらやすく、新薬の開発は常に続けられている。
【０００３】
新規薬剤の開発の初期において、生体に投与後した薬剤のターゲットとなる組織中での濃度と時間との関係を調べることは大変重要である。このような関係を調べる場合には、通常、生体から組織を摘出した後にホモジナイズし、物質を適切な溶媒に抽出した後にクロマトグラフィーにより物質濃度を測定するという手法が用いられている。
【０００４】
薬剤の官能基の一部の原子を放射性同位体に置き換え、生体に投与した後にこの同位体からの放射線量を測定することにより、生体から組織を取りだすことなく直接薬剤の組織内濃度に関する指標を得るという手法も用いられている（非特許文献１を参照）。
【０００５】
（組織中の薬剤の蛍光強度）／（薬剤を含む組織の自己蛍光強度）として定義される蛍光インデックスを用いて組織内の薬剤濃度を求める方式が考案されている。この蛍光インデックスは、光化学治療に用いられるポルフィリン類に関して検討され、上記クロマトグラフィーを用いる手法との相関が良いとの結果が得られている（非特許文献２を参照）。
【０００６】
超音波作用を誘導する薬剤に関する報告がある（特許文献１を参照）。
【０００７】
【特許文献１】
国際出願公開第９８／０１１３１号パンフレット
【非特許文献１】
Ｋ．Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ７９巻，  ｐｐ．８８０−８８４（１９８８）
【非特許文献２】
Ｓ．Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ，  ７巻，  ｐｐ．１８９−１９８（１９９０）
【本発明が解決しようとする課題】
クロマトグラフィーにより物質濃度を測定する手法は広く一般に用いられているが、以下の（１）、（２）の課題がある。（１）抽出およびクロマトグラフィーという二段階の過程を踏むために、結果が得られるまでに時間がかかる。（２）抽出あるいはクロマトグラフィーに用いる溶媒は、調べるべき薬物によりそれぞれ異なることから、新規物質を測定する場合には、測定に先立って溶媒の選定を行う必要がある。
【０００８】
また、非特許文献１の手法に関しても、以下の（１）、（２）の課題がある。（１）薬剤の一部を放射性同位体に変えるために、新規な反応経路を探索する必要がある。（２）測定に専用のシールド室を必要とする。
【０００９】
さらに、組織内での薬物の濃度を測定する上述の従来技術の手法はいずれも簡便に行うという観点で課題を有している。新規薬剤の基本骨格はほぼ決っており、その基本骨格に様々な官能基を付加して目的に合致した薬剤を開発するといった場合などには、数多い薬物の候補物質について生体組織中での濃度を測定する必要があり、従来技術の手法では非常な労力と時間とを要していた。
【００１０】
生理活性物質の多くは、溶媒中で適切な波長の励起光により、蛍光を生成する。生体組織も溶媒と見なせ、実際に生体組織中において物質が蛍光を発することは広く知られている。この蛍光強度は一定の濃度以下では物質の濃度に比例することから、組織に励起光を照射し、得られる蛍光の強度を測定することにより目的とする物質の相対濃度を知ることが可能である。
【００１１】
しかし、実際には生体組織中に存在する血管などの目的とする組織以外の成分の量、あるいは、表面形態が組織の部位により異なるため、同じ量の組織に励起光を照射しても、実際に光が到達している組織量はサンプル毎に異なる。このため、組織の量の指標として使用できる内部標準が必要となる。このような内部標準として、３５０ｎｍ近辺の波長を励起光に用いた場合に得られる組織の自家蛍光を用いることが考えられる。組織からの自家蛍光はフラビンなどのタンパクにより発生するものと考えられており、タンパクは組織中で、通常数ミリの幅の励起光に比べ十分に均一に存在していることから、励起光の照射された領域に関する指標として用いることが可能であると考えられる。
【００１２】
しかし、蛍光インデックスを用いる非特許文献２の手法は、窒素レーザを光源とすることから、窒素レーザ照射により蛍光を発生する薬剤にしか適用できないという課題があった。一般に、薬剤の蛍光を得るのに必要な波長は薬剤の種類毎に異なり、単波長の光源を用いる場合には、窒素レーザ以外でも同様に適用範囲が狭いという課題があった。
【００１３】
本発明の目的は、簡便に組織内の生理活性物質の濃度を測定する組織内物質濃度測定装置を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明の組織内物質濃度測定装置は、連続した複数の波長の光を照射可能な光源を有し、薬物の種類に応じて励起・蛍光波長を変化させて蛍光インデックスを測定できることを特徴とする。また、複数のサンプルホルダーを装置内に装備し、同一組織の異なる切片における薬物濃度測定を行い、切片間での薬物濃度のばらつきが大きい場合には再測定するよう構成されたことを特徴とする。この構成では、複数の個体のサンプルについての薬物濃度測定を行なうことができる。なお、蛍光インデックスは、非特許文献２と同様に、（組織中の薬剤の蛍光強度）／（薬剤を含む組織の自己蛍光強度）として定義される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、組織内の薬物からの蛍光および組織からの自家蛍光を指標として薬物の組織内相対濃度を算出する組織内物質濃度測定装置に適用される。本発明では、連続した複数の波長を発生する光源を用い、励起光波長選択手段により、薬物および組織に照射する励起光を選択する。薬物からの蛍光強度を組織からの自家蛍光強度で割った値を薬物の相対濃度として用いる。
【００１６】
本発明の好ましい実施の形態について、以下詳細に説明する。以下に本発明の組織内物質濃度測定装置の試験例および実施例を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
（実施例１）：単一サンプルの測定を行う実施例
図１は、本発明の実施例１であり、単一サンプルの測定を行う組織濃度測定装置の構成を示す図である。図１に示すサンプルホルダー２に、大きさ約５ｍｍ×５ｍｍ×２ｍｍの組織サンプル１をセットし、励起光源３より励起光４を照射する。制御部１２により制御されたスリット５により励起光の波長を選択する。励起光波長選択手段（スリット５）により選択された励起光は、組織サンプル１に照射される。組織サンプル１から放射された蛍光６を分光器７により分光した後、増幅器８により増幅して信号処理部９に導入する。測定結果は表示部１０により表示するとともにデータ保存部１１に保存する。以上の装置の動作は制御部１２によって制御される。
【００１７】
図２は、実施例１において、組織サンプル１をサンプルホルダー２にセットした後の処理部１２による処理の流れの例を示す図である。これまでに当該装置で測定したことのない新規な薬物である場合には、薬物の最適励起波長および極大発光波長の測定を行い、測定結果をデータ保存部１１に保存する。この測定が終了した後、あるいは既知の物質について、データ保存部１１に保存された最適励起波長および極大発光波長に基づき薬剤の蛍光強度（Ｄ）を測定する。さらに、組織の自家蛍光強度（Ａ）を測定する。しかる後に（Ｄ）を（Ａ）で割った値（Ｄ／Ａ）を組織インデックスとして表示部１０で表示すると共にデータ保存部１１に保存する。
【００１８】
以下、実施例１の測定装置を用いて、マウスに投与した薬剤の組織内濃度を測定した試験例を示す。薬剤として、特許文献１に記載された手法で調整された色素増感剤であるローズベンガルの脂肪酸エステル（炭素数：１５）を用いた。薬剤の投与ｄｏｓｅを５ｍｇ／ｋｇとし、Ｃｏｌｏｎ２６実験腫瘍を皮下に移植したＣＤＦ１マウスの尾静脈から投与し、３時間後にマウスを安楽死させ、肝臓および腫瘍を摘出しサンプルとした。
【００１９】
図３は、本発明の第１の試験例において、マウス肝臓および腫瘍内における自家蛍光を測定するのに用いる励起・蛍光波長を示す図である。図４は、本発明の第１の試験例において、マウス肝臓および腫瘍内における薬剤蛍光を測定するのに用いる励起・蛍光波長を示す図である。図３、図４に、組織自家蛍光および組織中の薬剤からの蛍光に関して実施例１の測定装置により最適励起波長および極大発光波長を求めるのに用いた２次元蛍光スペクトルを示す。
【００２０】
図３（Ａ）、（Ｂ）、図４（Ａ）、（Ｂ）に示すスペクトルを基にして、肝臓の自家蛍光を３４０ｎｍで励起して４４０ｎｍで蛍光測定を行ない、腫瘍の色素蛍光の自家蛍光を３３５ｎｍで励起して４５０ｎｍで蛍光測定を行ない、肝臓の薬剤蛍光を５２５ｎｍで励起して、５６０ｎｍで蛍光測定を行ない、腫瘍の薬剤蛍光を５２５ｎｍで励起して、５５０ｎｍで蛍光測定を行なうのが、それぞれ適している判断した。図２に示す、薬剤の蛍光強度（Ｄ）および組織の自家蛍光強度（Ａ）をサンプルごとに測定し、蛍光インデックスを算出した。
【００２１】
図５は、本発明の試験例において、マウス肝臓および腫瘍内の薬剤の蛍光強度、組織の自家蛍光強度、蛍光インデックス、および、各強度とインデックスのばらつきを示す図である。図５は、肝臓、腫瘍に関しそれぞれ２匹のマウスについてサンプルを３個づつ調製し、それぞれの蛍光インデックスを測定した結果を示す。図５には、薬剤の蛍光強度（Ｄ）、組織の自家蛍光強度（Ａ）、蛍光インデックス（Ｄ／Ａ）、さらに、それらの平均値および標準偏差を平均値で割った値も示してある。
【００２２】
標準偏差を平均値で割った値は、同一サンプルでの異なる組織片の測定における値のばらつきを示しており、いずれのサンプルにおいても（Ｄ／Ａ）の値は（Ｄ）の値よりも小さいもしくは同等であり、再現性の観点で、（Ｄ／Ａ）の方が（Ｄ）よりも優れている。
【００２３】
さらに、投与ＤＯＳＥを０〜５ｍｇ／ｋｇの間で変化させ、Ｃｏｌｏｎ２６実験腫瘍を皮下に移植したＣＤＦ１マウスの尾静脈から投与し、３時間後にマウスを安楽死させ、肝臓および腫瘍を摘出し、サンプルの蛍光インデックスを測定した。同一サンプルについて、ホモジナイズ後メタノールで薬剤を抽出し、液体クロマトグラフィーにて測定して得られた組織内濃度と比較した。
【００２４】
図６は、本発明の試験例において、マウス肝臓内の薬剤の蛍光インデックスと液体クロマトグラフィーにより求めた濃度との関係を示す図である。図７は、本発明の試験例において、マウス肝臓内の薬剤の蛍光インデックスと液体クロマトグラフィーにより求めた濃度との関係を示す図である。図６、図７から、薬物の組織内濃度と蛍光インデックスとはほぼ比例関係にあり、蛍光インデックスは薬物の組織内濃度の相対濃度の指標として有用であることが明らかである。
（実施例２）：複数サンプルの測定を行う実施例
本発明の実施例２の組織内物質濃度測定装置では、複数のサンプルホルダーを具備し、同一組織の異なる切片における薬物濃度測定を行い、切片間での薬物濃度のばらつきが大きい場合には再測定するよう構成される。
【００２５】
図８は、本発明の実施例２であり、複数サンプルの測定を行う組織濃度測定装置の構成を示す図である。図８に示すサンプルホルダー２−１〜２−４に、大きさ約５ｍｍ×５ｍｍ×２ｍｍの組織サンプル１−１〜１−４をセットする。これらサンプルホルダー２−１〜２−４はステージ１３に保持されており、ステージ１３は制御部１２によりサンプル１−１〜１−４の中の任意のものの測定を行えるよう構成されている。
【００２６】
組織サンプル１−１〜１−４は同じ種類の組織であることが望ましいが、異なる種類のサンプルであっても構わない。励起光源３より励起光４を照射する。制御部１２により制御されたスリット５により励起光の波長を選択する。励起光波長選択手段（スリット５）により選択された励起光は、組織サンプル１に照射される。組織サンプル１から放射された蛍光６を分光器７により分光した後、増幅器８により増幅して信号処理部９に導入する。測定結果は表示部１０により表示するとともにデータ保存部１１に保存する。以上の装置の動作は制御部１２によって制御される。
【００２７】
図９、図１０は、本発明の実施例２において、組織サンプル１−１〜１−４をサンプルホルダー２−１〜２−４にセットした後の、処理部１２による処理の例を示す図である。図９に示すように、まず、セットされたサンプルが同じ種類のサンプルかどうかをユーザに選択を促す。選択の結果に従い、同一組織測定モードあるいは通常モードへ移行する。
【００２８】
まず、図９により、同一組織測定モードについて説明する。これまでに当該装置で測定したことのない新規な薬物である場合には、１−１のサンプルについて薬物の最適励起波長および極大発光波長の測定を行い、結果をデータ保存部１１に保存する。この測定が終了した後、あるいは既知の物質について、データ保存部１１に保存された最適励起波長および極大発光波長に基づき、サンプル１−１の（１）薬剤の蛍光強度（Ｄ）を測定する、さらに、（２）組織の自家蛍光（Ａ）を測定する、しかる後に、（３）（Ｄ）を（Ａ）で割った値を蛍光インデックスとしてデータ保存部１１に保存する。サンプル１−２〜１−４について（１）〜（３）の処理を行う。しかる後に、１−１〜１−４の蛍光インデックスの値を比較し、各値のばらつきがあらかじめ設定された最大誤差よりも大きい場合には、上記（１）〜（３）の操作を繰り返す。再測定でもばらつきがあらかじめ設定された最大誤差よりも大きい場合には、ステージ１３の高さを移動して再測定を行う。結果を表示部１０に表示する。再々測定でもばらつきがあらかじめ設定された最大誤差よりも大きい場合には、表示部に「誤差が範囲以上である」との警告を表示する。
【００２９】
続いて、図１０により、通常モードの説明を行う。組織サンプル１−１〜１−４について、以下の操作を行う。これまでに当該装置で測定したことのない新規な薬物である場合には、薬物の最適励起波長および極大発光波長の測定を行い、結果をデータ保存部１１に保存する。この測定が終了した後、あるいは既知の物質について、データ保存部１１に保存された最適励起波長および極大発光波長に基づき薬剤の蛍光強度（Ｄ）を測定する。さらに、組織の自家蛍光（Ａ）を測定する。しかる後に（Ｄ）を（Ａ）で割った値を蛍光インデックスとしてデータ保存部１１に保存する。実施例２においては、サンプルホルダーが４個の場合を示してあるが、処理の規模に応じてサンプルホルダーの数を変えて操作をおこなってもよい。また、処理部１２による処理は、同一組織測定モードと通常モードとを組み合わせて行うこともできる。
【００３０】
本発明の装置は、窒素レーザで蛍光を得ることが困難な薬剤のスクリーニングなどに使用でき、簡便に組織内の生理活性物質の濃度を測定できる。
【００３１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明による組織内物質濃度測定装置によれば、任意の励起波長あるい蛍光波長を有する薬剤に対して、生体から組織を摘出して蛍光を測定するだけで、簡便に薬物の相対濃度を測定することが可能であり、溶媒に対する性質の不明な未知の薬剤について、抽出やクロマトグラフィーなどの繁雑な操作、あるいは放射性同位体によるラベルといった新たな反応過程を経るのに比べて、時間および労力を低減することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１であり、単一サンプルの測定を行う組織濃度測定装置の構成を示す図。
【図２】本発明の実施例１において、処理部１２による処理の流れの例を示す図である。
【図３】本発明の第１の試験例において、マウス肝臓および腫瘍内における自家蛍光を測定するのに用いる励起・蛍光波長を示す図。
【図４】本発明の第１の試験例において、マウス肝臓および腫瘍内における薬剤蛍光を測定するのに用いる励起・蛍光波長を示す図。
【図５】本発明の試験例において、マウス肝臓および腫瘍内の薬剤の蛍光強度、組織の自家蛍光強度、蛍光インデックス、および、各強度とインデックスのばらつきを示す図。
【図６】本発明の試験例において、マウス肝臓内の薬剤の蛍光インデックスと液体クロマトグラフィーにより求めた濃度との関係を示す図。
【図７】本発明の試験例において、マウス肝臓内の薬剤の蛍光インデックスと液体クロマトグラフィーにより求めた濃度との関係を示す図。
【図８】本発明の実施例２であり、複数サンプルの測定を行う組織濃度測定装置の構成を示す図。
【図９】本発明の実施例２において、処理部１２において行う処理の例を示す図。
【図１０】本発明の実施例２において、処理部１２において行う処理の例を示す図。
【符号の説明】
１…組織サンプル、２…サンプルホルダー、３…励起光源、４…励起光、５…スリット、６…蛍光、７…分光器、８…増幅器、９…信号処理部、１０…表示部、１１…データ保存部、１２…制御部、１３…ステージ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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