(57)【要約】【課題】不快な副作用を有さず、落屑を促進させ、局所適用に適切な組成物を提供する。【解決手段】皮膚への局所適用に適した生理学的に許容可能な媒体中に、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体と、(ｉｉ)前記ポリペプチドの活性を調節可能な生成物とから選択される少なくとも一の化合物を含有せしめて、組成物とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚への局所適用に適した生理学的に許容可能な媒体中に、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体、及び(ｉｉ)前記ポリペプチドの活性を調節可能な生成物から選択される少なくとも一の化合物を含有せしめてなる組成物。
【請求項２】
アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドが、アスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有するポリペプチド又はその前駆体であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
アスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有する前記ポリペプチドが：
ａ）ヒト由来のポリペプチド又はアスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有する該ポリペプチドの相同体；
ｂ）アスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有する、前記ａ）のポリペプチドの酵素的又はバイオミメティック類似体；
ｃ）前記ａ）のポリペプチドの断片であって、アスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有している断片；
ｄ）ヘテロダイマー又はヘテロテトラマータイプの活性形態である、ａ）、ｂ）又はｃ）のポリペプチド又は酵素的類似体又はポリペプチド断片；
ｅ）一又は複数の修飾を受けた、ａ）、ｂ）又はｃ）のポリペプチド、又は酵素的類似体又はポリペプチド断片；
から選択されることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
アスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有するヒト由来のポリペプチドが、ヒト表皮の角質層から単離され精製されることが可能で、１０〜５０ｋＤ、特に１５〜４８ｋＤ、さらには１５〜２４ｋＤの見かけ分子量を有することを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドが天然由来のポリペプチドであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドが組換えポリペプチドであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドが、組成物の全重量に対して１０−６〜５％、好ましくは組成物の全重量に対して１０−４〜１％、より好ましくは０．００１〜０．１％の量であることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーの前記ポリペプチドの活性を調節可能な生成物が、前記ポリペプチドの活性を刺激可能なアクチベータであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
アクチベータが、組成物の全重量に対して０．０１％〜５０％、好ましくは組成物の全重量に対して０．１〜１％の量であることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体と、(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータとを含有することを特徴とする、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドと、前記ポリペプチドのアクチベータが、互いに接触しないように包装されていることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
β-ヒドロキシ酸；α-ヒドロキシ酸；α-又はβ-ケト酸；尿素；ゲンチシン酸；オリゴフコース；ケイ皮酸；Saphora japonicaの抽出物；レスベラトロール及びその誘導体；グリコシダーゼ類、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）又は他のセリン又はシステインプロテアーゼ類；キレート剤；アミノスルホン酸化合物；糖誘導体；還元剤及びレチノイド類等の、少なくとも一の他の落屑剤をさらに含有していることを特徴とする、請求項８ないし１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドの活性を調節可能な生成物がインヒビターであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
インヒビターが組成物の全重量に対して１０−６〜５％、好ましくは組成物の全重量に対して０．１〜１％の量であることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
保湿剤；色素形成誘発剤；真皮又は表皮の高分子の合成を刺激及び／又はそれらの分解を防止する薬剤；ケラチノサイトの増殖又は分化を刺激する薬剤；リラクシング剤；汚染防止剤及び／又は抗フリーラジカル剤；ＵＶ遮蔽剤；透過剤；瘢痕形成剤；及びそれらの混合物から選択される少なくとも一の化合物をさらに含有していることを特徴とする、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項８ないし１２のいずれか１項に記載の組成物を、皮膚、粘膜及び／又はケラチン繊維に適用することを特徴とする、落屑、及び／又は表皮の細胞再生、及び／又は皮膚への水分補給、及び／又は皮膚における細胞増殖及び／又は分化に関連した皮膚障害に抗することを意図した乾燥肌の美容処理方法。
【請求項１７】
請求項１３又は１４に記載の組成物を、皮膚、粘膜及び／又はケラチン繊維に適用することを特徴とする、皮膚の障壁効果を増大させることを意図した敏感肌及び／又は加齢した皮膚の美容処理方法。
【請求項１８】
落屑疾患、特に角質増殖、乾燥症、魚鱗癬、乾癬又は反応性角化症の処置を意図した製薬用組成物の調製における、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体と、(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータとから選択される少なくとも一の化合物を含有する組成物の使用。
【請求項１９】
瘢痕形成の促進を意図した製薬用組成物の調製における、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体と、(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータとから選択される少なくとも一の化合物を含有する組成物の使用。
【請求項２０】
アトピー性皮膚炎の処置を意図した製薬用組成物の調製における、アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドの少なくとも一のインヒビターを含有する組成物の使用。
【請求項２１】
(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体と(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータとから選択される少なくとも一の化合物の、局所適用される化粧品用組成物における使用であって、該化合物又は該組成物が、落屑、及び／又は皮膚への水分補給、及び／又は皮膚の細胞再生、及び／又は皮膚の細胞増殖及び／又は分化の促進を意図したものである使用。
【請求項２２】
(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体と、(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータとから選択される少なくとも一の化合物の、局所適用される化粧品用組成物における使用であって、該化合物又は該組成物が、化粧品用及び／又は皮膚用組成物のアクチベータの、皮膚への浸透性を容易にすることを意図したものである使用。
【請求項２３】
(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体と、(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータからと選択される少なくとも一の化合物の、局所適用される化粧品用組成物における使用であって、該化合物又は該組成物が、皮膚への細菌付着に抗することを意図したものである使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚への局所適用に適した生理学的に許容可能な媒体に、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体、及び(ｉｉ)前記ポリペプチドの活性を調節可能な生成物から選択される少なくとも一の化合物を含有せしめてなる組成物；及び特に落屑現象を調節するためのその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
落屑は、皮膚の最上層を構成している表皮が絶えず再生されているという事実に関連した自然現象である。
表皮は複数の細胞層からなり、その最も深い層は未分化細胞からなる基底層である。時間が経過すると、これらの細胞は分化し、表皮表面に移動して種々の層を構成し、落屑により除去される死細胞である角質細胞を表皮表面に形成する。
表面におけるこの細胞の損失は基底層から表皮表面への細胞の移動により補われる：これが皮膚の永続的な再生を構成している。従って、角層（horny layer）を強制的に除去すると再生が促進され、加齢に抗することができる。
【０００３】
同時に、これらの細胞は分化し続け、その最終段階が角質細胞である。実際、それらは表皮の最後の層、つまり角質層（stratum corneum）とも呼ばれる最外層を構成する死細胞である。
【０００４】
皮膚の加齢は、皺や小皺を生じ、皮膚を黄変させて、色素沈着による斑点を伴う皺のある外観を生じ、エラスチンとコラーゲン線維の崩壊を引き起こし、弾性、柔軟性(suppleness)及び堅さ(firmness)の喪失を引き起こす内因性又は外因性の要因の影響の結果生じる。
これらの加齢の徴候のいくつかは、特に内因性又は生理学的加齢、すなわち年齢に関連した「正常な」加齢又は時間生物学的加齢であるのに対し、他のものは外因性の加齢、すなわち一般に環境により引き起こされる加齢に特有である；これはより詳細には太陽、光又は他のあらゆる光線にさらされることによる光加齢に関連している。
【０００５】
皮膚加齢に抗することを意図した、落屑特性を有する種々の薬剤が従来から知られている。
例えば、米国特許第４６０３１４６号には、皮膚加齢に抗するために、化粧品用組成物にレチノイン酸及びその誘導体を使用することが開示されている。
さらに、多くの市販化粧品用組成物から、皮膚加齢を処理するためにα-ヒドロキシ酸、例えば乳酸、グリコール酸又はクエン酸を使用することが教唆されている。
最後に、β-ヒドロキシ酸、特にサリチル酸並びにその誘導体は、落屑特性があることが知られている（国際公開第９３／１０７５６号及び米国特許第４７６７７５０号）。
【０００６】
これら全ての化合物は落屑を促進させることにより皮膚加齢に作用する、すなわち表皮の角質層の表面にある「死」細胞を除去することにより皮膚加齢に作用する。また、この「落屑」特性は、多くの場合は誤ってではあるが、角質溶解性とも呼ばれている。
しかしながら、従来技術の化合物は、使用者にとって不快なチクチク刺すような痛み(prickling)、突張感、熱い感じ(overheating)及び赤み(redness)からなる副作用を有するものであった。
よって、特に皮膚の落屑を促進させるために、皮膚への局所適用に適した組成物に使用可能な、新規で効果的な化合物がなお必要とされている。
【特許文献１】米国特許第４６０３１４６号明細書
【特許文献２】国際公開第９３／１０７５６号パンフレット
【特許文献１】米国特許第４７６７７５０号明細書
【発明の開示】
【０００７】
しかして、本出願人は、驚くべきことに、アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリー(EC 3.5.1.X)に属するアスパルチルグルコサミニダーゼＡＧＡ(EC 3.5.1.26)が表皮の角質層に存在しており、落屑誘発(prodesquamating)活性を有していることを見出した。
しかしながら、アスパルチルグルコサミン尿症(ＡＧＵ)と呼ばれる深刻な遺伝病の原因である、ある種のＡＧＡ変異体の研究では、現在までに、ＡＧＡは主として肝細胞、大脳皮質の錐体細胞、腎臓の近位尿細管細胞において発現し、結合組織においてはその程度が低いことが示されている(Enomaa N.E.ら, (1993),  The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Vol41, No.7, pp981-989；Arvioら, (1999), J Med Genet, 36, 398-404)。ましてや、表皮、特に角質層におけるＡＧＡの発現又は活性、落屑誘発活性については、何も記載されていない。
【０００８】
よって、本発明は、皮膚への局所適用に適した生理学的に許容可能な媒体中に、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体と、(ｉｉ)前記ポリペプチドの活性を調節可能な生成物とから選択される少なくとも一の化合物を含有せしめてなる組成物に関する。
また、落屑の調節、特に促進、及び／又は表皮の細胞再生の調節、及び／又は皮膚への水分補給(hydration)の調節、及び／又は皮膚における細胞増殖及び／又は分化の調節、及び／又は化粧品用及び／又は皮膚用組成物の活性剤の皮膚への浸透の促進、及び／又は細菌付着へ抗するための、前記化合物又は組成物の使用にも関する。
【０００９】
第１の実施態様では、本組成物は、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドの少なくとも一又はその前駆体を活性成分として含有する。
アミダーゼ活性を有する加水分解酵素(EC 3.5.1.X)はペプチド結合以外にも、炭素／窒素結合に作用する。特にアスパルチルグルコサミニダーゼＡＧＡ(EC 3.5.1.26)は、糖ペプチドとヒト糖タンパク質のＮ-アセチルグルコサミン-アスパラギン結合を加水分解するリソソーム酵素である(McGovern MMら, (1983), The journal of biological chemistry, 258, 17, 10743-10747)。
酵素活性を有する加水分解酵素ファミリーの化合物の例としては、一般的な命名法で、化合物群EC 3.5.1.1からEC 3.5.1.89のもの、中でもアスパラギナーゼ、グルタミナーゼ、アミダーゼ、ウレアーゼ、アミノアシラーゼ、アスパルトアシラーゼ、セラミダーゼ、ペプチジル-グルタミナーゼ、ホルムアミダーゼ、ペンタンアミダーゼ、及びアスパルチルグルコサミニダーゼＡＧＡを挙げることができる。
【００１０】
本発明では、アスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有するポリペプチド又はその前駆体が好ましく使用される。
「ポリペプチドの前駆体」なる表現は、転換後に活性形態の酵素に至る、酵素の不活性な、又は「プロ-」形態を意味するものと解される。この転換は、シグナルペプチドの分離と分子内の自己タンパク分解からなり得る。
【００１１】
本発明において、前記アスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有するポリペプチドは：
ａ）ヒト由来のポリペプチド、又はアスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有する前記ポリペプチドの相同体；
ｂ）アスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有し、前記ａ）のポリペプチドの酵素的又はバイオミメティックス類似体；
ｃ）前記ａ）のポリペプチドの断片であって、アスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有している断片；
ｄ）ヘテロダイマー又はヘテロテトラマータイプの活性形態である、ａ）、ｂ）又はｃ）のポリペプチド、又は酵素的類似体又はポリペプチド断片；
ｅ）一又は複数の修飾を受けた、ａ）、ｂ）又はｃ）のポリペプチド、又は酵素的類似体又はポリペプチド断片；
から選択され得る。
【００１２】
アスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有するヒト由来のポリペプチドには、例えばSwissProt受託番号P20933(Fisherら, 1990, FEBS Letter, 269(2), 440-444)に記載されているペプチド配列又はその相同体が含まれる。
一般的に、ポリペプチド又はペプチド配列の「相同体」なる表現は、同じ種又は異なる種において、ポリペプチド又は決まったポリペプチド配列の、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９５％と同一である任意のポリペプチド又は任意のペプチド配列を意味するものと理解される；ここで異なる種の場合は、「オーソロガスポリペプチド」と称される。
【００１３】
本発明で使用可能なアスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有するポリペプチドとして、例えば真核生物における既知のＡＧＡ配列、特に哺乳動物(マウス、ヒト)、酵母及び植物のＡＧＡ配列のポリペプチド及びそれらのオーソロガス(異なる種において相同なポリペプチド)、特に：
種                                      SwissProt受託番号
−Caenorhabditis elegans                   (Q21697)
(線虫)
−Flavobacterium meningosepticum           (Q47898)
(バクテリア)
−Homo sapiens(ヒト)                    (P20933)
−Mus musculus(マウス)                  (Q64191)
−Sus scrofa(ブタ)                       (P30918)
−Rattus norvegicus(ラット)               (P30919)
−Spodoptera frugiperda(昆虫)              (O02467)
を挙げることができる。
【００１４】
２つのペプチド配列又はアミノ酸配列における「同一性パーセント」なる表現は、最も好ましいアラインメント、すなわち、例えばSmith及びWatermanの局所的ホモロジーアルゴリズム(local homology algorithm)(1981, Ad. App. Math. 2:482)、Neddleman及びWunschの局所的ホモロジーアルゴリズム(1970, J. Mol. Biol. 48:443)、Pearson及びLipmanの類似性検索法(1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444)、これらのアルゴリズムを使用するコンピュータソフトウェアパッケージ(ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ(Wisconsin  Genetics Software Package),  ジェネティクス・コンピュータ・グループ, 575 サイエンスDr. Madison, WIのTFASTA、FASTA、NCBIサイトから入手可能なBLAST N、BLAST P、BESTFIT、GAP)により得られた最適なアラインメントの後に得られる、比較される２つの配列間でアミノ酸残基のパーセントが同一であることを意味するものと理解される。
【００１５】
アスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有する「酵素的又はバイオミメティック類似体」なる表現は、ペプチド結合以外の炭素-窒素結合、特に糖ペプチド及びヒトの糖タンパク質のＮ-アセチルグルコサミン-アスパラギン結合を加水分解可能な任意の分子を意味すると理解される。酵素的類似体又は「シンザイム」の例としては：
−  基質の遷移状態に結合することにより反応を触媒する能力を有する人工酵素；加水分解酵素様酵素としては、例えばシクロデキストリン類、シクロファン類(cyclophanes)、環状ポルフィリン類がある；
−  基質の遷移状態類似体に選択的に結合し(Schultz PGら, 1986, Science, 234, 1570-1573)、以後は抗原として遷移状態の安定した類似体を使用したインビトロにおける免疫化により得ることのできる触媒抗体又は「アブザイム」；
−  Bartel DPら, 1993, Science, 251:1411-1418に記載されているような触媒力を有するＲＮＡ酵素又は「リボザイム」；
を挙げることができる。
【００１６】
「ポリペプチド断片」なる表現は、その大きさが、アスパルチルグルコサミニダーゼ活性及び特異性に必要な、酵素の活性部位を再構築可能にすることで特徴付けられる任意の断片を意味するものと理解される。アミノ酸スレオニン２０６が、ヘテロダイマーへの２つのアルファ及びベータ鎖の組合せ、並びにアスパルチルグルコサミニダーゼの活性にとって必要であることが記述されている。よって、このアミノ酸２０６を保持している、１〜５０ｋＤの大きさを有するポリペプチドが選択される。このポリペプチド断片は常法に従い、タンパク質分解又は合成により得ることができる。
本発明のアスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有する酵素的ポリペプチド又は類似体又はポリペプチド断片は、ヘテロダイマー又はヘテロテトラマーの活性形態又は前駆体の形態であってもよい。
アスパルチルグルコサミニダーゼ前駆体は、酵素の不活性形態に相当し、シグナルペプチドの分離と分子内の自己タンパク分解後に、２４ｋＤ(アルファ)と１８ｋＤ(ベータ)の２つのサブユニットを生じ、ヘテロダイマー又はヘテロテトラマーの形態へのそれらの組合せにより、酵素の活性形態になる(Saarela J., 1998, The Journal of Biochemistry, Vol.273, No.39, 25320-25328)。
【００１７】
本発明においては、一又は複数の修飾を受けた、本発明のアスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有する酵素的ポリペプチド又は類似体又はポリペプチド断片を使用することができる。「修飾」なる表現は、一のアミノ酸又は少ない(reduced)数のアミノ酸の任意の置換、欠失及び／又は挿入、特に修飾がＡＧＡの生物学的活性を有意には損なわない位置での天然のアミノ酸の非天然のアミノ酸又は疑似アミノ酸での置換よるものを意味するものと理解される。また修飾は保存的置換、すなわち同じクラスのアミノ酸との置換、例えば非荷電側鎖を持つアミノ酸(アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン)、塩基性側鎖を持つアミノ酸(リジン、アルギニン及びヒスチジン)、酸性側鎖を持つアミノ酸(アスパラギン酸及びグルタミン酸)；無極性側鎖を持つアミノ酸(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン及びシステイン)の置換にも対応しうる。
【００１８】
好ましくは、アスパルチルグルコサミニダーゼ活性を有するヒト由来のポリペプチドは、ヒトの表皮の角質層から単離され精製されることが可能である；それは１０〜５０ｋＤ、特に１５〜４８ｋＤ、さらには１５〜２４ｋＤの見かけ分子量を有する。それは公知の抽出及び精製方法、特にＥＤＴＡの存在下での抽出、濾過、陽イオンクロマトグラフィー及び活性のアッセイの連続工程を含む、以下の実施例１に記載されたプロトコルに従い得ることができる。
【００１９】
特にＡＧＡ等の、アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーに属するポリペプチドは、天然又は合成、特に組換え由来のものであってよい。
「天然由来」なる表現は、天然由来の組織(皮膚、肝臓等)、特にヒトの表皮の角質層から種々の抽出方法で得られる、種々の濃度の溶液又は純粋な状態のポリペプチドを意味すると理解される。
「合成由来」なる表現は、生成に必要な成分を生物体に導入して、該生物体内に生成されるか、又は化学的に得られる、種々の濃度の溶液又は純粋な状態のポリペプチドを意味すると理解される。
【００２０】
本発明の組成物において、アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドは、組成物の全重量に対して１０−６〜５％、好ましくは組成物の全重量に対して１０−４〜１％、より好ましくは組成物の全重量に対して０．００１〜０．１％の量で一般的に存在する。
【００２１】
第１の変形例では、ＡＧＡポリペプチドは、皮膚に適用されるまで組成物中に非活性な前駆体の形態で保持されており、ｐＨ及びイオン強度の条件は、ＡＧＡの活性化に必要な自己タンパク分解反応に有利なようになされる。ＡＧＡの活性化はｐＨ５〜８で促進されるか、及び／又は誘発されることが知られている。
第２の変形例では、ＡＧＡポリペプチドは、組成物中で、その活性形態で存在しており、その組成物は、前駆体形態を自己タンパク分解するのに必要な要素を既に含んでいる(ｐＨ及びイオン強度の有利な生理学的条件)。ＡＧＡ活性を促進させる前記要素は、ＡＧＡポリペプチドと同じ区画又は別の区画に存在していてもよく、ＡＧＡの活性化は以下に詳細に記載されているようにして(好ましい態様)、前記組成物の適用時まで遅延される。
【００２２】
第２の実施態様では、組成物は、活性成分として、(ｉｉ)特にＡＧＡ等の、アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドの活性を調節可能な少なくとも一の生成物を含有する。
「ポリペプチドの活性を調節する」という表現は、該ポリペプチドの発現を調節、及び／又は該ポリペプチドの酵素活性を調節することを意味すると理解される。よって、アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド活性を調節可能な生成物なる表現は、転写、転写後、翻訳又は翻訳後メカニズムを問わず、該ポリペプチドの合成を刺激又は抑制することによるか、又は該ポリペプチドの代謝を刺激又は抑制することによるか、又は該ポリペプチドの本来の活性を刺激又は抑制することにより、該ポリペプチドの量を増加又は減少させることができる任意の成分(要素)を意味すると理解される。
【００２３】
これらの生成物は、前記ポリペプチドの発現性及び／又は活性の変動の測定に基づくスクリーニング方法に従い選択され得る。
当業者によく知られている方法の例としては：
−  White B.A.(1997), Methods on Molecular Biology, Humana Press, Vol67に記載された、定量ＲＴ-ＰＣＲタイプの試験法；
−  Mononen I.T.ら, (1993), Analytical biochemistry, 208, 372-374に記載された、酵素試験法；
−  Kemeny D.M., (1991),  A Practical Guide to ELISA, Pergamon Pressに記載された、特定の抗体を用いるエライザ試験法；
を挙げることができる。
【００２４】
前記ポリペプチドの活性を調節可能な生成物はアクチベータでもインヒビターでもよい。
「アクチベータ」なる表現は、前記ポリペプチドの活性を刺激可能な、例えばＡＧＡポリペプチドをアクチベータに接触させている間の単位時間当たりに消化される基質量の増加度合いにより測定される酵素反応の速度を増加可能な、生成物又は生成物の集合のいずれかを意味すると理解される。
特に、これらの生成物は、酵素の活性化に有利になるように酵素の環境、特にｐＨ及びイオン強度の条件を調節することにより作用可能である。
この接触は、特に角質層に内在性ＡＧＡポリペプチドを含む皮膚の表皮に、アクチベータを含有する組成物を適用する時になされ得る。
【００２５】
アクチベータの例として、すすがれる製品用としては１〜５％の非刺激性濃度でドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、好ましくはすすがれる製品用としては１０〜２５％、手入れのための製品用としては０．００１〜０．１％の非刺激性濃度でラウリルエーテル硫酸ナトリウムを使用することができる。
これらのアクチベータは、一般的に組成物の全重量に対して０．０１％〜５０％、好ましくは組成物の全重量に対して０．１〜１％である。最も高い濃度は、「ピーリング（剥離）」タイプの用途に特に好ましい。他の美容用途に対しては、１０％未満、特に１％未満の割合が、好ましく使用される。
【００２６】
「インヒビター」なる表現は、前記ポリペプチドの活性を阻害可能な生成物、すなわち、例えば生成物がポリペプチドに接触させられている単位時間当たりに消費される基質の量の低減度合いにより測定される、酵素反応の速度を低下可能な生成物を意味すると理解される。特に、これらの生成物は、基質への結合に対して競合するか、又は酵素の活性部位のレベルで作用可能である。
この接触は、特に角質層に内在性ＡＧＡポリペプチドを含む皮膚の表皮に、インヒビターを含有する組成物を適用する時になされ得る。
【００２７】
インヒビターの例としては、ＡＧＡを可逆的に調節するＬ-アスパラギン、及びその類似体５-ジアキソ-４-オキソ-Ｌ-ノルバリンで、ＡＧＡを可逆的に調節するもの(Noronskiら, FEBS Letters, 412, 149-152, 1997)を挙げることができる。また、Ｎ-アセチルシステイン、アスパラギン、アスパルチルアラニン、アスパルチルシクロヘキシルアミン及びｐ-クロロマーキュリ安息香酸を挙げることもできる。
これらのインヒビターは、一般的に組成物の全重量に対して１０−６〜５％、好ましくは組成物の全重量に対して０．１〜１％である。
【００２８】
これらのインヒビターは、角質層の肥厚化の進行を促進することにより、皮膚の障壁効果を増大可能で、よって：
−  光加齢過程に関与している紫外線の有害な影響に抗し；
−  及び／又は時間生物学的加齢の徴候の一つである皮膚の薄層化に抗する；
ことに寄与するために、特に有利である。
インヒビターの使用は、特に、敏感肌及び／又は加齢した皮膚の処置、及び障壁機能疾患に関連したアトピー性皮膚炎(atopic dermatites)の処置に推奨される。
【００２９】
好ましい態様では、本発明の組成物は、特に皮膚への局所適用に適した生理学的に許容可能な媒体に、少なくとも(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドの一つ又はその前駆体と(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータを含有せしめてなる。
このような組合せにより、相加効果によって、前記活性剤(アクチベータ生成物)の活性濃度を低減することができる。よって、ほとんど刺激性がなく、毒性もない組成物が得られ、これらの活性剤(アクチベータ生成物)のみを使用する従来のものよりも効果的である組成物を得ることができる。この組合せは、高い濃度では皮膚に刺激効果を示すおそれのあるＳＤＳのようなアクチベータの場合には特に有利である。
【００３０】
化合物(ｉ)及び(ｉｉ)は、同じ組成物に入れて一緒に投与するか、又は別々の組成物に入れて、同時に又は経時的に間隔をおいて別個に投与してもよい。
有利には、アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドと、該ポリペプチドのアクチベータは、例えば適用時に混合されるか、又は連続してもしくは経時的に間隔をおいて適用されてもよい２つの異なる組成物中に、ＦＲ-２７８０６４５に本出願人が記載したように、互いに接触しないように包装される。
例えば、アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドと該ポリペプチドのアクチベータは、別々の区画又は別々の相に包装される。このような２区画包装具は、例えば仏国特許出願公開第２０４５５５９号、同第２１０５３３２号、同第２２５８３１９号、同第２２９３３７５号、同第２５８６９１３号又は同第２６４３６１５号に記載されている。
【００３１】
さらに、他の組成物に浸漬されたマイクロ顆粒又はマイクロカプセルの形態、及び／又はカプセル化された形態で、組成物の一つを調製することができ、該マイクロ顆粒又はマイクロカプセルは皮膚上で擦り合わされることにより適用時に粉砕され、これによって、前記ポリペプチドのアクチベータとアミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドとの混合が可能になる。
一変形例として、ＡＧＡポリペプチドは、ＡＧＡ前駆体の活性化に必要な成分を含む他の組成物に浸漬されたマイクロ顆粒又はマイクロカプセルに含まれる不活性な前駆体の形態であってよく、この活性化は皮膚に組成物を適用するまで遅延される。
【００３２】
また本発明は、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体と、(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータとから選択される、少なくとも一の化合物を含有する組成物であって、少なくとも一の他の落屑剤をさらに含有していることを特徴とする組成物に関する。
「落屑剤」なる表現は：
−  剥離(exfoliation)を促進することによる落屑；
−  又は角膜デスモソームの分解又は落屑に関連する酵素；
のいずれかに作用可能な任意の化合物を意味すると理解される。
例えば、β-ヒドロキシ酸、特にサリチル酸及びその誘導体、例えば５-(ｎ-オクタノイル)サリチル酸；α-ヒドロキシ酸、例えばグリコール酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸又はマンデル酸；α-又はβ-ケト酸；尿素；ゲンチシン酸；オリゴフコース；ケイ皮酸；Saphora japonicaの抽出物；レスベラトロール及びその誘導体；グリコシダーゼ類、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）又は他のセリン又はシステインプロテアーゼ類（本出願人によりＦＲ-２７６７８３３に記載されているような、トリプシン又はキモトリプシン様又はシステインプロテアーゼ）；無機塩-キレート剤；ＥＤＴＡ；Ｎ-アシル-Ｎ,Ｎ',Ｎ'-エチレンジアミン三酢酸；アミノスルホン酸化合物、特に(Ｎ-２-ヒドロキシエチルピペラジン-Ｎ-２-エタン)スルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；２-オキソチアゾリジン-４-カルボン酸（プロシステイン）誘導体；グリシンタイプのアルファ-アミノ酸誘導体（例えばＥＰ-０８５２９４９に記載されているもの、及び商品名トリロン(TRILON)ＭでＢＡＳＦ社から市販されているメチルグリシン二酢酸ナトリウム）；カルシウムキレート剤；蜂蜜；糖誘導体、例えばＯ-オクタノイル-６-Ｄ-マルトース及びＮ-アセチルグルコサミン；還元剤、グルタチオン、システイン；又はある種の炭水化物、例えば国際公開第９７／１２５９７号の特許出願に記載されているもの；ジャスモン酸及びその誘導体；レチノイド類、例えばレチノイン酸(all-トランス又は13-シス)及びその誘導体、レチノール(ビタミンＡ)及びそのエステル、例えばパルミチン酸レチノール、酢酸レチノール及びプロピオン酸レチノール及びその塩、又はレチナールを挙げることができる。
【００３３】
例えば、他の落屑剤は、組成物の全重量に対して０．０１〜５０％、好ましくは０．１〜３％の量で、本発明で使用される組成物中に導入され得る。
アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドとのこのような組合せにより、相加効果により、落屑活性を有する他の生成物の活性濃度を低減することができる。よって、ほとんど刺激性がなく、毒性もない組成物が得られ、これらの活性剤のみを使用する従来のものよりも効果的である組成物を得ることができる。
【００３４】
また本発明は、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体と、(ｉｉ)前記ポリペプチドの活性を調節可能な生成物とから選択される少なくとも一の化合物を含有せしめてなる組成物であって、保湿剤；色素形成誘発剤(propigmenting agents)；真皮又は表皮の高分子の合成を刺激及び／又はそれらの分解を防止する薬剤；ケラチノサイトの増殖又は分化を刺激する薬剤；リラクシング剤(relaxing agents)；汚染防止剤及び／又は抗フリーラジカル剤；紫外線遮蔽剤；透過剤(permeating agents)；瘢痕形成剤；及びそれらの混合物から選択される少なくとも一の化合物をさらに含有していることを特徴とする組成物に関する。
本発明の組成物において、保湿剤及び／又はケラチノサイトの増殖を刺激する薬剤及び／又は瘢痕形成剤は、好ましくは(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体及び(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータから選択される化合物と組合せられる。
真皮又は表皮の高分子の合成を刺激及び／又はそれらの分解を防止する薬剤；ケラチノサイトの分化を刺激する薬剤；汚染防止剤及び／又は抗フリーラジカル剤；ＵＶ遮蔽剤；浸透剤；又はそれらの混合物は、本発明の組成物において、好ましくはアミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドのインヒビターと組合せられる。
【００３５】
「保湿剤」なる表現は：
−  角質層の保湿(hydration)を維持するために、障壁機能に作用する化合物、又は閉塞(occlusive)化合物で、セラミド類、スフィンゴイドベースの化合物、レシチン類、グリコスフィンゴ脂質、リン脂質、コレステロール及びその誘導体、フィトステロール類（スティグマステロール、β-シトステロール、キャンペステロール）、必須脂肪酸類、１,２-ジアシルグリセロール、４-クロマノン、五環性トリテルペン類、例えばウルソール酸、ワセリン及びラノリン；
−  角質層の水分含量を直接増加させる化合物、例えば、トレアロース及びその誘導体、ヒアルロン酸及びその誘導体類、グリセロール、ペンタンジオール、ナトリウムピドラート（pidolate）、セリン、キシリトール、乳酸ナトリウム、グリセロールポリアクリラート、エクトイン及びその誘導体、キトサン、オリゴ糖及び多糖類、環状カルボナート類、Ｎ-ラウロイルピロリドンカルボン酸、及びＮ-α-ベンゾイル-Ｌ-アルギニン；
−  あるいは、皮脂腺を活性化する化合物、例えば局部血管拡張による発汗を促進させる化合物、又はコーヒー酸；
を意味すると理解される。
「色素形成誘発剤」としては、マルゼン社(MARUZEN)から市販されているワレモコウ(Sanguisorba officinalis)の抽出物、及びキク(Chrysanthemum morifolium)の抽出物を挙げることができる。
【００３６】
「ケラチノサイトの増殖を刺激する薬剤」には、特にレチノイド類、例えばパルミチン酸レチニルを含む、レチノール及びそのエステル；フロログルシノール；ガッテフォセ社(GATTEFOSSE)から市販されているナッツケーキ(nut cake)の抽出物；及びセダーマ社(SEDERMA)から市販されているSolanum tuberosum抽出物が含まれる。
「ケラチノサイトの分化を刺激する薬剤」には、例えば無機物、例えばカルシウム；フォトプリベンチン(Photopreventine)の商品名でシラブ社(SILAB)から販売されているルピナス抽出物；フィトコヒーシン(Phytocohesine)の商品名でセポルガ社(SEPORGA)から販売されているベータ-シトステリル硫酸ナトリウム；及びフィトビチル(Phytovityl)の商品名でソラビア社(SOLABIA)から販売されているトウモロコシ抽出物が含まれる。
【００３７】
「リラクシング剤」には、特にアルベリン(alverine)及びその塩、マンガン及びその塩；マグネシウム及びその塩；サポゲニン、例えばジオスゲニン及びそれらを含有する天然抽出物(例えば自然薯の抽出物)、及びリポテック社(LIPOTEC)から販売されているヘキサペプタイドアルギレリン(Argireline)及びその塩が含まれる。
「汚染防止剤」なる表現は、コバルト、水銀、カドミウム及び／又はニッケル等の重金属及び／又はベンゾピレン等の単環又は多環式芳香族化合物、オゾンを捕捉可能な任意の化合物を意味すると理解される。
「抗フリーラジカル剤」なる表現は、メラトニン；リグナン類(lignans)；ガンマ-オリザノール(oryzanol)；フィタントリオール；ピドラート類(pidolates)；置換したナフタレノン類；ベンジルシクラノン類(benzylcyclanones)；ベンジリデンショウノウ；グルタチオン；カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ラクトペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ及びキノンレダクターゼ又はそれらの模倣物等のある種の酵素；補酵素Ｑ１０又はユビキノン；バイオフラボノイド類；ビタミンＥ及びその誘導体等のフリーラジカルを捕捉可能な任意の化合物を意味すると理解される。
【００３８】
また本発明の組成物は、有機又は無機化合物の形態の「ＵＶＡ及び／又はＵＢＶ遮蔽剤」をさらに含有してもよく、後者は疎水性にするために、場合によっては被覆されてもよい。
有機遮蔽剤は、特にアントラニラート類、特にアントラニル酸メンチル；ベンゾフェノン類、特にベンゾフェノン-１、ベンゾフェノン-３、ベンゾフェノン-５、ベンゾフェノン-６、ベンゾフェノン-８、ベンゾフェノン-９、ベンゾフェノン-１２、好ましくはベンゾフェノン-３(オキソベンゾン)、又はベンゾフェノン-４(Ｂ.Ａ.Ｓ.Ｆ.社から入手可能なユビヌル(Uvinul)ＭＳ４０)；ベンジリデンショウノウ類、特に３-ベンジリデンショウノウ、ベンジリデンショウノウスルホン酸、ショウノウベンザルコニウムメト硫酸、ポリアクリルアミドメチルベンジリデンショウノウ、テレフタリリデンジショウノウスルホン酸、好ましくは４-メチルベンジリデンショウノウ(メルク社(Merck)から入手可能なユーソレックス(Eusolex)６３００)、ベンゾイミダゾール類、特にベンゾイミダジラート(ハーマンアンドレイマー社(Haarmann and Reimer)から入手可能なネオ・ヘリオパン(Neo Heliopan)ＡＰ)、又はフェニルベンゾイミダゾールスルホン酸(メルク社から入手可能なユーソレックス２３２)；ベンゾトリアゾール類、特にドロメトリゾールトリシロキサン、又はメチレンビスベンゾトリアゾリルテトラメチルブチルフェノール(チバ社(Ciba)から入手可能なチノソーブ(Tinosorb)Ｍ)；シンナマート類、特にシノキサート、ＤＥＡメトキシシンナマ−ト、メチルケイ皮酸ジイソプロピル、グリセリルエチルヘキサノアートジメトキシシンナマート、メトキシケイ皮酸ジイソプロピル、ケイ皮酸イソアミル、好ましくはエトクリレン(Etocrylene)(Ｂ.Ａ.Ｓ.Ｆ.社から入手可能なユビヌルＮ３５)、メトキシケイ皮酸オクチル(ホフマン・ラ・ロシュ社(Hoffmann La Roche)から入手可能なパルソール(Parsol)ＭＣＸ)、又はオクトクリレン(octocrylene)(Ｂ.Ａ.Ｓ.Ｆ.社から入手可能なユビヌル５３９)；ジベンゾイルメタン類、特にブチルメトキシジベンゾイルメタン(パルソール１７８９)；イミダゾリン類、特にエチルヘキシルジメトキシベンジリデン-ジオキソイミダゾリン；ＰＡＢＡ、特にエチルジヒドロキシプロピルＰＡＢＡ、エチルヘキシルジメチルＰＡＢＡ、グリセリルＰＡＢＡ、ＰＡＢＡ、ＰＥＧ-２５ＰＡＢＡ、好ましくはジエチルヘキシルブタミドトリアゾン(３Ｖ・シグマ社(Sigma)から入手可能なユバソーブ(Uvasorb)ＨＥＢ)、エチルヘキシルトリアゾン(Ｂ.Ａ.Ｓ.Ｆ.社から入手可能なユビヌルＴ１５０)、又はエチルＰＡＢＡ(ベンゾカイン)；サリチラート類、特にジプロピレングリコールサリチラート、エチルヘキシルサリチラート、ホモサラート(homosalate)、又はＴＥＡサリチラート；トリアジン類、特にアニソトリアジン(チバ社から入手可能なチノソーブＳ)；ドロメトリゾールトリシロキサンから選択され得る。
無機遮蔽剤は、好ましくは酸化亜鉛及び／又は二酸化チタンで、好ましくはナノメートルサイズで、アルミナ及び／又はステアリン酸で被覆されていてもよいものからなる。
【００３９】
「浸透促進(pro-penetrating)又は透過(permeating)剤」は、有利には、活性剤の浸透性を強化するために添加され得る。例えば、ビヒクルとして、二成分系(binary systems)(ＵＳ４５３７７７６)又は溶媒、例えばＤＭＳＯ(ＵＳ３５５１５５４)、又はＥＰ０３２１８７０Ｂ１に記載されているような、酸付加塩の形態及び遊離塩基の形態の双方で存在する活性透過剤を挙げることができる。
また「瘢痕形成剤」、すなわち再表皮化(reepidermization)(表皮及び真皮の正常化及び上皮化)の促進、及び／又は外傷の収縮現象を制限することにより、瘢痕形成、特に皮膚の瘢痕形成を促進する薬剤を使用することができる。特にＦＲ２７５３６２７に記載されているレチノイン酸活性のインヒビターを挙げることができる。
【００４０】
本発明で使用される組成物は、化粧品的又は皮膚科学的に許容可能な媒体、すなわち皮膚、爪、粘膜、組織及び毛髪と融和性のある媒体を含有する。本発明の好ましい実施態様において、組成物は使用されるポリペプチドの活性を最適にするｐＨ、好ましくは皮膚に近い、５〜８のｐＨを有する。
公知の方法で、本発明で使用される組成物は、化粧品及び皮膚科学の分野で通常のアジュバント、例えば、親水性又は親油性のゲル化剤、親水性又は親油性の活性剤、防腐剤、酸化防止剤、溶媒、香料、フィラー及び着色物質をさらに含有してもよい。これら種々のアジュバントの量は、考慮される分野において従来より使用されている量、例えば、組成物の全重量に対して０．０１％〜２０％である。もちろん、当業者であれば、本発明の組成物に固有の有利な特性、特に本発明のポリペプチドの酵素活性が、想定される添加により損なわれないか、又は実質的に損なわれないように留意して、任意の添加剤及び／又はそれらの量を選択するであろう。
【００４１】
本発明において使用可能な油としては、鉱物性油(流動パラフィン)、植物性油（カリテ油、スイートアルモンド油）、動物性油、合成油、シリコーン油(シクロメチコーン)及びフッ化油(ペルフルオロポリエーテル)を挙げることができる。また脂質として、脂肪アルコール、脂肪酸(ステアリン酸)、ロウ(パラフィン、カルナウバ、ミツロウ)を使用することもできる。
本発明において使用可能な乳化剤としては、スパン(Span)６０及びトゥイーン(Tween)６０の商品名で、それぞれＩＣＩ社から販売されているステアリン酸ソルビタン、及びポリソルベイト６０を挙げることができる。またエムコール(Emcol)２４９-３Ｋの商品名でウィトコ社(Witco)から販売されているＰＰＧ-３ミリスチルエーテル等の共乳化剤を加えることもできる。
本発明で使用可能な溶媒としては、低級アルコール、特にエタノール及びイソプロパノール、プロピレングリコールを挙げることができる。
【００４２】
親水性のゲル化剤としては、カルボキシビニルポリマー類（カーボマー：carbomer）、アクリルコポリマー類、例えばアクリラート／アクリル酸アルキルのコポリマー類、ポリアクリルアミド類、多糖類、例えばヒドロキシプロピルセルロース、天然ガム類(キサンタン)及びクレー類を挙げることができ；また、親油性のゲル化剤としては、変性クレー類、例えばベントーン類、脂肪酸の金属性ゾル、例えばステアリン酸アルミニウム、疎水性シリカ、ポリエチレン類及びエチルセルロースを挙げることができる。
親水性の活性剤としては、タンパク質又はタンパク質の加水分解物、アミノ酸、ポリオール、尿素、アラントイン、糖類及び糖類誘導体、水溶性ビタミン類、デンプン、細菌又は植物、特にアロエ・ベラからの抽出物を使用することができる。
親油性の活性剤としては、トコフェロール(ビタミンＥ)とその誘導体、必須脂肪酸、セラミド類、精油を使用することができる。
【００４３】
本発明の化粧品用組成物は、水性媒体において不安定な、本発明のアミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド等の酵素型活性剤を含有し、局所経路による投与に適した形態で提供されるのが好ましい。よってポリペプチドは、好ましくは安定した形態で存在する。
組成物は、通常、水性アルコール又は油性溶液、又はローション又はセラム型の分散液、無水又は油性ゲル、ミルク型で、水相に油相を分散させて得られる(Ｏ／Ｗ)又は逆(Ｗ／Ｏ)の液体又は半液体状のコンシステンシーのエマルション、クリーム又はゲル型で、希薄な、半固体状又は固体状のコンシステンシーのエマルション又は懸濁液、マイクロエマルション、又はイオン性及び／又は非イオン性の小胞分散液、マイクロカプセル、又は微小粒子の形態で提供される。これらの組成物は通常の方法を使用して調製される。酵素活性剤を含有する組成物に特に適した好ましい形態は、ＥＰ０７７９０７１に記載されているようなＷ／Ｏ／Ｗ型のものである。
【００４４】
アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドは、マクロカプセル又はＤＥ１８８２４０７２に記載されているように、ポリマー性の支持体に固定された形態であってもよい。特にリポソーム／ニオソーム(niosomes)(区画)又はポリ-ベータ-アラニン(共有結合)の球体を使用することができる。他の溶液は、無水液状媒体にそれらを導入することからなる(米国特許第５３２２６８３号)。ＦＲ２７３７１１５に記載されているような構造化剤とポリオール類、又は水性媒体で該ポリペプチドを安定化するための界面活性剤を使用することもできる。
【００４５】
また組成物は、皮膚、粘膜及び／又はケラチン繊維を手入れするため、又は皮膚をクレンジングするためのローション、クリーム、ミルク、ゲル又はフォーム、マスク、マイクロスフェア又はナノスフェア、又はイオン性脂質(リポソーム)及び／又は非イオン性脂質からなる小胞体分散液の形態で提供され得る。さらに組成物は、クレンジングソープ又はケーキを構成する固形調製物からなるものであってもよい。
【００４６】
本発明の他の主題は、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体、及び(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータから選択される少なくとも一の化合物を含有する組成物を、皮膚、粘膜及び／又はケラチン繊維に適用することを特徴とする、落屑、及び／又は表皮の細胞再生、及び／又は皮膚への水分補給の調節、及び／又は皮膚における細胞増殖及び／又は分化に関連した皮膚疾患に抗することを意図した、乾燥肌の美容処理方法にある。
この方法は、特に：
−  特に角膜デスモソームにおける糖タンパク質の加水分解による落屑の促進；
−  及び／又は、特に低分子量の糖鎖の放出による、表皮の浸透圧状態及び皮膚への水分補給の促進；
−  及び／又は、特に表皮成長因子(ＥＧＦ)又はアンフィレグリン(amphiregulins)等の、表皮成長因子の放出による、皮膚の細胞再生及び／又は細胞増殖及び／又は分化の促進；
を意図している。
【００４７】
また本発明は、アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドの少なくとも一のインヒビターを含有する組成物を、皮膚、粘膜及び／又はケラチン繊維に適用することを特徴とする、皮膚の障壁効果を増大させることを意図した、敏感肌及び／又は加齢した皮膚を美容処理するための方法に関する。
これらの方法は、これらの組成物を使用する通常の技術に従い、本発明の組成物を適用することからなる。例えば、クリーム、ゲル、セラム、軟膏、ローション、ミルクの皮膚、頭髪、爪及び／又は粘膜への適用である。
【００４８】
また本発明は、落屑疾患、特に角質増殖、乾燥症、魚鱗癬(ichtyosis)、乾癬又は反応性角化症の処置を意図した製薬用組成物の調製における、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体、及び(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータから選択される少なくとも一の化合物を含有する組成物の使用に関する。
さらに本発明は、細胞マトリックスのプロテオグリカン類の分解が、ケラチノサイトによる細胞空間の再コロニー化を誘発するという事実から、瘢痕形成の促進を意図した製薬用組成物の調製における、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体、及び(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータから選択される少なくとも一の化合物を含有する組成物の使用に関する。
さらに、アトピー性皮膚炎の処置を意図した製薬用組成物の調製における、アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチドの少なくとも一のインヒビターを含有する組成物の使用も本発明の範囲内に入る。
【００４９】
また、本発明は、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体、及び(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータから選択される少なくとも一の化合物の局所適用される化粧品用組成物における使用であって、該化合物又は該組成物が、落屑、及び／又は皮膚への水分補給、及び／又は皮膚の細胞再生、及び／又は皮膚の細胞増殖及び／又は分化の促進を意図したものである使用に関する。
さらに、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体、及び(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータから選択される少なくとも一の化合物の局所適用される化粧品用組成物における使用であって、該化合物又は該組成物が、化粧品用及び／又は皮膚用組成物の活性剤の、皮膚への浸透性を容易にすることを意図している使用も本発明の範囲内に入る；ここで落屑は、通常、皮膚を通過する生成物の障害を形成する、角質層の不透過性を低減する効果を有しており；実際に角質層は、一方では病原体及び他の毒性物質の進入、他方では生理液の流出を防止するため、体に必須な障壁という役割を担っている。
【００５０】
またさらに本発明は、(ｉ)アミダーゼ活性を有する加水分解酵素ファミリーのポリペプチド又はその前駆体、及び(ｉｉ)前記ポリペプチドのアクチベータから選択される少なくとも一の化合物の局所適用される化粧品用組成物における使用であって、該化合物又は該組成物が、特に低分子量の糖鎖の放出により、よって角質細胞のレベル、細菌付着の部位及びコロニー化を調節することにより、細菌付着に抗することを意図したものである使用である。
次の部分では、角質層におけるＡＧＡの落屑誘発活性及び存在性を示している。さらに、本発明の範囲を制限することのない、本発明の組成物の調製例も提供する。
【実施例】
【００５１】
実施例１：角質層ＳＣにおけるＡＧＡ活性の存在の証明
ａ）ＳＣからのＡＧＡの精製と同定
ＳＣ抽出物を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ(エチレンジアミンテトラアセタート)及び０．１％のトゥイーン２０を含有するｐＨ４の抽出用バッファーを用いて脚の前側表面を「こする」ことにより得る。一連の濾過の後、抽出物を陽イオンクロマトグラフィーにより分離する；溶離は同じ抽出用バッファーにおいて線形のＮａＣｌ勾配で実施される。
ＡＧＡの精製は、Mononen I.T.ら, 1993, Analytical biochemistry, 208, 372-374により記載された方法に従い、蛍光基質Ｌ-アスパラギン酸-ベータ(７-アミド-４-メチルクマリン)（Ａｓｐ-ＡＭＣ）を用いて、活性をアッセイすることによりモニターする。 各溶離フラクション１０μｌを、０．１Ｍトリス-ＨＣｌバッファー、ｐＨ８に、１ｍＭまで希釈されたＡｓｐ-ＡＭＣ基質１００μｌと共に、３７℃で２４時間インキュベートする。蛍光をBioluminリーダー(励起／発光：３４０／４５０ｎｍ)で定量する。
ついで、ＡＧＡ型の活性を有する全てのフラクション(フラクション１４ないし４３)をプールし、濃縮する。５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．１％のトゥイーン２０を含有するｐＨ７のバッファーを用いた、EconoPac10DGカラム(Bio-Rad)において、バッファーの交換を行う。ゲル濾過型(Ｇ２００)のクロマトグラフィー分離を行い、各フラクションのＡＧＡ活性をＡｓｐ-ＡＭＣ基質でアッセイする。
【００５２】
粗精製されたＡＧＡ抽出物を、高ＡＧＡ活性を有するフラクションをプールすることにより得る(フラクション５７ないし７１)。
ついで濃縮し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分離後に硝酸銀を用いて染色したゲル(１２％ゲル)で分析する。
それぞれ分子量４８、２４、１６及び１５ｋＤａを有する４つの主なバンドが観察された。各バンドを、トリプシン消化の後に、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ型の質量分析法により分析した。ＰＲＯＦＯＵＮＤソフトウェアを使用してＮＣＢＩデータバンクでペプチドマッピングする分析により、ＡＧＡのＡ鎖(２８％の回収率、及び３５％の確率を有する２４ｋＤａのバンド)及びＡＧＡのＢ鎖(それぞれ６４％及び３８％の回収率、及び１００％及び１１％の確率を有する１６及び１５ｋＤａのバンド)の同定に至った。
Ｅｄｍａｎ型の化学的シークエンシングにより、これらの同じバンドに対してＡＧＡの同定を確認した。
特に、角質層から単離されたポリペプチドは、参照番号SwissProt P20933のヒトペプチド配列の、連続したアミノ酸番号１３６-１５０を少なくとも含むペプチド配列を有している。
【００５３】
ｂ）活性形態のＡＧＡの存在
−酵素的研究
特定の基質とインヒビターを使用する酵素的研究により、ＡＧＡが、活性なヘテロダイマー又はヘテロテトラマーの形態で、少なくとも部分的にＳＣに存在することを、さらに証明することができた。ＡＧＡ活性を、種々のＳＣ抽出物においてＡｓｐ-ＡＭＣ基質でアッセイした。ＡＧＡ型活性を、足裏の角質層、Mehulら(2000, The Journal of Biological Chemistry, Vol275, No.17, 12841-12847)により記載された「ラッカーストリッピング(varnish stripping)」法によって得られたアセトンパウダー、及び再構成された皮膚であるエピスキン(Episkin)のタンパク質抽出物において証明した。これらの結果を図１に示す。
さらに、特定のインヒビター、例えば１．２５ｍＭで使用されるＬ-アスパラギンは、ＳＣから精製されたＡＧＡ活性を阻害する。
【００５４】
−発現(ウエスタン)
２つの抗-ヒトＡＧＡウサギ抗体を調製した：それらは、それぞれＡＧＡのアルファ及びベータ鎖において、タンパク質配列の特定のペプチドに対するポリクローナル抗体である。
ＡＧＡの存在は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分離の後、ＰＶＤＦ膜に移動させることにより、種々のＳＣ抽出物について免疫検出により証明された。ＡＧＡを１／１０００に希釈した各抗体で免疫検出し、ペルオキシダーゼに結合させた二次抗ウサギ抗体を、ＥＣＬ化学発光試薬で顕現化するために使用する。
ＡＧＡのアルファ鎖に対する抗体では、エピスキン型のＳＣ抽出物、アセトンパウダー及び足裏の角質層において、４６〜５０ｋＤａの分子量を有するバンドが検出される。また２５ｋＤａの分子量を有するバンドも、アセトンパウダー抽出物において検出される。ＡＧＡのベータ鎖に対する抗体では、約４６〜５０ｋＤａの一組のバンドが検出される。
【００５５】
ｃ）種々のドナーに対する活性のアッセイ
ＡＧＡ活性を、上述したＡｓｐ-ＡＭＣ基質で、３の異なるドナーの前腕、額及び脚における「ブレンダームス(blenderms)」付着型のサンプルから、ＳＣにおいて直接アッセイした。各活性は、各サンプルのタンパク質量に対して正規化される。
３のドナーの結果には、ＡＧＡがＳＣサンプルにおいて直接アッセイ及び検出可能で、我々の実験条件下では、ドナー又はサンプル領域において、活性に大きな差異がないことが示されている。
【００５６】
実施例２：ＡＧＡの落屑誘発効果の証明
Mehul Bら(2000, The Journal of Biological Chemistry, Vol.275, No.17, 12841-12847)により記載された「ラッカーストリッピング」法により得られたＳＣアセトンパウダーを、アセトンパウダー１ｍｇ当たり１００μｌのインキュベーション液の割合で、５ｍＭのＬ-アスパラギンの存在下又は非存在下で、粗精製されたＡＧＡ抽出物と共にインキュベートする。攪拌しつつ、８時間、０．１Ｍトリス-ＨＣｌバッファー、ｐＨ８で、３７℃にてインキュベートする。テストｔ０は対照：バッファー単独としてなされる。
ついで、各サンプルの可溶性タンパク質を変性条件下(ＳＤＳ、ＤＴＴ及び沸騰)で抽出する。全タンパク質量をブラッドフォード(Bradford)法に従ってアッセイし、濃度をＬａｅｍｍｌｉ抽出バッファー中で０．６ｍｇ／ｍｌで並べる。
ついで、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分離を行った後、ミリポア社(Millipore)から市販されているＰＶＤＦ膜上に移動させる。 角質デスモシンを、Serre G.ら(1991, J. Invest. Dermatol., 97, 1061-1072)に記載され、１／１２５００に希釈されたモノクローナル抗体G3619で免疫検出する。ペルオキシダーゼに結合させた抗マウス二次抗体を、ブロットの顕現化のために、アマシャム・バイオサイエンス社(Amersham Biosciences)から販売されているＥＣＬ化学発光試薬と同様に使用する。
ついで、ケラチンの量に対して角質デスモシンの量を正規化するために、各ブロットを０．０３％をアミドブラック液(シグマ社(SIGMA))で染色する。
【００５７】
図２は、８時間、アセトンパウダーと共に種々の量の粗精製ＡＧＡをインキュベートした後の、角質デスモシンシグナルの変動を提供する。
ＡＧＡ量の増加に伴い、インキュベート後では、角質デスモシン量の減少が観察された。
５ｍＭのＬ-アスパラギンが存在すると、ＡＧＡが１０μｌである条件で、この効果が阻害される。
よって、これらの結果より、角質細胞の除去を介するＡＧＡの落屑促進効果を証明することができる。
【００５８】
実施例３：化粧品用組成物における使用−処方物の例
組成物１：顔用ミルク
流動パラフィン                                                ７．０ｇ
ＡＧＡ                                                        ０．００１ｇ
モノステアリン酸グリセリル、ポリエチレ
ングリコールステアラート(１００ＥＯ)                          ３．０ｇ
カルボキシビニルポリマー                                      ０．４ｇ
ステアリルアルコール                                          ０．７ｇ
大豆タンパク質                                                ３．０ｇ
ＮａＯＨ                                                      ０．４ｇ
防腐剤                                                            適量
水                                              全体を１００ｇにする量
この組成物は、良好な化粧品特性を有する顔用ミルクの形態で提供され、滑らかで、快適な使用感を有するものであった。組成物のｐＨは約６である。
【００５９】
組成物２：ローション
ＡＧＡ                                                        ０．０１ｇ
２-エチルヘキシルパルミタート                               １０．０ｇ
シクロペンタジメチルシロキサン                              ２０．０ｇ
ブチレングリコール                                            ５．０ｇ
防腐剤                                                            適量
水                                              全体を１００ｇにする量
界面活性剤を含有しないこのローションは、皮膚の落屑を促進させた。
【００６０】
組成物３：ミルク
パルミチン酸オクチル                                        ３５．０ｇ
グリセリン                                                    ２．０ｇ
ＡＧＡ                                                        ０．１ｇ
Ｃ10-Ｃ30アクリラート／アルキルアクリ                        
ラートの架橋したポリマー                                      ０．１ｇ
トリエタノールアミン                                          ０．１ｇ
小麦アミノ酸                                                  １．０ｇ
ビタミンＣ前駆体(生物変換分子)                              ０．５ｇ
防腐剤                                                            適量
水                                              全体を１００ｇにする量
得られたミルクは、良好な化粧品特性を有するものであった。
【００６１】
組成物４：顔用ゲル
グルセリン                                                  １０．０ｇ
ココアンホ二酢酸二ナトリウム                                  １．０ｇ
Ｌ-アスパラギン(ＡＧＡインヒビター)                           ０．１ｇ
防腐剤                                                            適量
水                                              全体を１００ｇにする量
得られたゲルは良好な化粧品特性を有するものであった。
【００６２】
組成物５：水ベースのクレンジング用ゲル
ブチレングリコール                                            ７．０ｇ
ラウロイルサルコシン酸ナトリウム                              ４．０ｇ
アミダーゼ(アミダーゼ活性を有する加水
分解酵素ファミリー)                                           ０．１ｇ
トリエタノールアミン                                          ０．８ｇ
カーボマー                                                    ０．５ｇ
防腐剤                                                            適量
水                                              全体を１００ｇにする量
得られたゲルは良好な化粧品特性を有するものであった。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】再構成された皮膚であるエピスキン、アセトンパウダー又は足裏の角質層における、Ａｓｐ-ＡＭＣ基質でのＡＧＡの活性のアッセイ結果を示すヒストグラムである。
【図２】８時間、アセトンパウダーと共に種々の量の粗精製ＡＧＡをインキュベートした後の、角質デスモシンシグナルの変動で、対照のインキュベート用バッファーのものを引いた変動を示すヒストグラムである。
【図１】
2004217662.tif 000002
【図２】
2004217662.tif 000003