(57)【要約】      （修正有）【課題】ウシでは、サルモネラ菌、大腸菌、緑膿菌などの感染がしばしば見られ、飼育農家に大きな被害を与えている。ウシはLPSに対して高い感受性を持っており、このことが経済的損失を大きくする原因の一つになっていると推測される。そこで、ウシのLPS応答に関するを分子機構を解明し、それを防ぐ薬剤のスクリーニング法を提供すること。【解決手段】特定のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするＤＮＡ、並びに、該分子を発現する形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量を測定することを含むＴＬＲ４及びＭＤ−２から成る複合体に対するリガンドのシグナル伝達能のアッセイ方法、及びそれを利用した薬剤のスクリーニング法。【選択図】        図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列から成るＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列から成るＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列に対する相同性が８５％以上であり、且つ、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを含む遺伝子。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む蛋白質：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む蛋白質：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する相同性が７５％以上であるアミノ酸配列からなり、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
組換え蛋白質であることを特徴とする、請求項５又は６記載の蛋白質。
【請求項８】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載の少なくとも一種のＤＮＡ又は請求項４記載の遺伝子を含有する組換え発現ベクター。
【請求項９】
組換えプラスミドベクターである請求項８に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１０】
ＴＬＲ４遺伝子を有する含有する組換え発現ベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
更に、請求項８又は９に記載の発現ベクターによって形質転換された、請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
更に、転写因子活性測定ベクターによって形質転換された、請求項１０又は１１記載の形質転換体。
【請求項１３】
転写因子がＮＦ−κＢ／Ｒｅｌ  ファミリーである、請求項１２記載の形質転換体。
【請求項１４】
転写因子活性測定ベクターがκＢ  配列の制御下にレポーター遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１３記載の形質転換体。
【請求項１５】
レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を使用する、請求項１４記載の形質転換体。
【請求項１６】
形質転換体が哺乳類細胞由来である請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項１７】
哺乳類細胞がＣＤ１４を発現している細胞である、請求項１６に記載の形質転換体。
【請求項１８】
哺乳類細胞がＨＥＫ２９３細胞である請求項１７に記載の形質転換体。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれか一項に記載した形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量をアッセイすることを含む、ＴＬＲ４、又は、ＴＬＲ４及び請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質から成る複合体に対するリガンドによるシグナル伝達能の測定方法。
【請求項２０】
シグナルが、ＴＬＲ４、又は、ＬＴＲ４及び請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質から成る複合体を介して細胞内に伝達されることを特徴とする、請求項１９記載の測定方法。
【請求項２１】
リガンドがエンドトキシンである、請求項１９又は２０記載の測定方法。
【請求項２２】
レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を使用する、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の測定に基づく、ＴＬＲ４、又は、ＴＬＲ４及び請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質から成る複合体に対する作動薬（アゴニスト）又は拮抗薬（アンタゴニスト）のスクリーニング法。
【請求項２４】
（ａ）  被験物質の存在下で、請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質及びＴＬＲ４を細胞表面に発現する細胞を、ＴＬＲ４、又は、ＴＬＲ４及び請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質から成る複合体に対するリガンドで刺激する工程、
（ｂ）所定時間後に細胞を溶解する工程、及び
（ｃ）レポーター遺伝子の発現量をアッセイする工程、及び
（ｄ）  レポーター遺伝子の発現量を減少させる効果を示した被験物質を選択する工程、を含む請求項２３に記載の拮抗薬（アンタゴニスト）のスクリーニング法。
【請求項２５】
リガンドがＬＰＳである、請求項２４に記載のスクリーニング法。
【請求項２６】
（ａ）請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質及びＴＬＲ４を細胞表面に発現する細胞を被験物質で刺激する工程、
（ｂ）所定時間後に細胞を溶解する工程、及び
（ｃ）レポーター遺伝子の発現量をアッセイする工程、及び
（ｄ）  レポーター遺伝子の発現が認められた被験物質を選択する工程、を含む請求項２３に記載の作動薬（アゴニスト）のスクリーニング法。
【請求項２７】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質又はその部分ポリペプチドに対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドトキシン認識に関わる新規な分子及びそれをコードするＤＮＡ、並びに、該分子を発現する形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量を測定することを含むＴＬＲ４及びＭＤ−２から成る複合体に対するリガンドのシグナル伝達能のアッセイ方法、及びそれを利用した薬剤のスクリーニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体は、細菌の侵襲に対し、その障害を防ぐために種々の防御反応を示す。グラム陰性細菌の感染では、発熱、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、血小板数および白血球数の変動、ショックなどの症状が見られる。これらの症状は、細菌の細胞壁成分であるエンドトキシン又はリポ多糖体（ＬＰＳ）の作用により引き起こされることが明らかにされている。ＬＰＳは、これらの障害作用の他に致死毒性を持っており、生体に対して強い有害作用を及ぼす一方で、Ｂ細胞の分裂促進、アジュバント作用、抗腫瘍作用など、生体に有利に働くと考えられる作用も持っており、その生物活性は多種多様である。
【０００３】
ＬＰＳの作用発現の第一段階はＬＰＳとその受容体との結合であり、第二段階は結合後に引き起こされる細胞内情報伝達機構の作動であると考えてよいであろう。このことから、現在ＬＰＳの結合と、それに引き続きおこる細胞内情報伝達系の解析が精力的に進められているが、その全容を明らかにするには至っていない。
【０００４】
最近、生体が微生物を認識する際に、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリーに属する分子がレセプターとして機能していることが明らかにされた（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｎａｔｕｒｅ  （１９９７）  ３８８：  ３９４−３９７）。ヒトやマウスでは既に、ＴＬＲ１〜１０で表される１０種類のファミリーの存在が確認され、これらの分子は、それぞれ異なる菌体成分を認識する（竹田潔、審良静男書、「Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  の特異性とシグナル伝達」、細胞工学Ｖｏ．２１  Ｎｏ．１１，  １３０８−１３１１  （２００２））。
【０００５】
例えば、マウスの１系統であるＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスはＬＰＳ低応答性を示すマウスであることが以前から知られていた。同様なＬＰＳ  低応答性を示すマウスとしてＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＣｒも報告されていたが、近年これらのマウスの原因遺伝子がＴＬＲ（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）４であることが明らかとなり、ＴＬＲ４はＬＰＳの認識に膜レセプターとして関与していることが報告されている（Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （１９９９）  １６２：  ３７４９−３７５２）。又、このＴＬＲ４はＭＤ−２と会合して複合体を形成し、この複合体がＬＰＳの認識そのものに関与することが示されている（若林靖貴、三宅健介書、「生前免疫の分子基盤」、細胞工学Ｖｏ．２１  Ｎｏ．１１，  １３０４−１３０７  （２００２））。
【０００６】
以来、細菌の侵入を認識するレセプターとしてのＴＬＲファミリーが注目されるようになった。細菌性疾患が多発するウシにおいても  ＴＬＲ４とその細胞外修飾因子であるＭＤ−２が存在し、ヒトおよびマウスのＴＬＲ４、ＭＤ−２と高い相同性を示した。ウシのＴＬＲ４の構造解析の結果、細胞外領域にはショウジョウバエにおけるＴｏｌｌや哺乳類におけるＴＬＲファミリーに共通にみられるロイシンリッチリピートモチーフが存在し、細胞内領域にはＩＬ−１レセプターとの相同領域が存在していた。ロイシンリッチリピートモチーフはタンパク質間の相互作用に関わることがしられているモチーフであり、哺乳類ではＴＬＲのほかにＬＰＳと直接結合するＣＤ１４など様々な種類の分子がこのモチーフを有する。このことからウシのＴＬＲ４はロイシンリッチリピートモチーフにより細胞外で標的分子と会合し、ＩＬ−１レセプターと類似した機構で細胞内にシグナルを伝えていると考えられる。
【０００７】
【非特許文献１】
竹田潔、審良静男書、「Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  の特異性とシグナル伝達」、細胞工学Ｖｏ．２１  Ｎｏ．１１，  １３０８−１３１１  （２００２）
【非特許文献２】
Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （１９９９）  １６２：  ３７４９−３７５２
【非特許文献３】
（若林靖貴、三宅健介書、「生前免疫の分子基盤」、細胞工学Ｖｏ．２１  Ｎｏ．１１，  １３０４−１３０７  （２００２）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
一方、ウシでは、サルモネラ菌、大腸菌、緑膿菌などの感染がしばしば見られ、飼育農家に大きな被害を与えている。ウシはＬＰＳに対して高い感受性を持っており、このことが経済的損失を大きくする原因の一つになっていると推測される。しかしながらウシのＬＰＳ応答に関する分子基盤はいまだ明らかにされていないことが多く、その分子機構の解明が待たれているのが現状である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、ウシにおけるＬＰＳの受容機構を解明する目的で、ＬＰＳの結合に密接に関連すると考えられているＴＬＲ４およびその修飾因子であるＭＤ−２に着目し、その構造と機能および特性について、遺伝子レベルで検討した。
【００１０】
その結果、我々は、すでにヒトやマウスでＬＰＳ受容体として確立されているＭＤ‐２とＴＬＲ４について、ウシからｃＤＮＡを分離して塩基配列を決定しアミノ酸配列を確定した結果、Ｇｕｉｏｎａｕｄ（ベルン大学）（Ｗｅｒｌｉｎｇ  Ｄ，  Ｊｕｎｇｉ  ＴＷ．  ＴＯＬＬ−ｌｉｋｅ
ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｖｅｔ  ＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２００３  Ｊａｎ．  １０；９１（１）：１−１２）が報告したものと異なる配列の第二の新型ウシＭＤ−２があることを明らかにした。更に、このｃＤＮＡをレポータ遺伝子とともに人為的に導入した動物細胞がＬＰＳによる刺激を顕著に増強させることを見出し、これら分子が実際にＬＰＳ受容体として機能することを確認した。これにより、新しい検査法を作製した。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は以下の各態様に係るものである。
１．以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチド。
２．以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列から成るＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
３．以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列から成るＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列に対する相同性が８５％以上であり、且つ、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
４．上記１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを含む遺伝子。
５．以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む蛋白質：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチド。
６．以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む蛋白質：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する相同性が７５％以上であるアミノ酸配列からなり、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチド。
７．組換え蛋白質であることを特徴とする、上記５又は６記載の蛋白質。
８．上記１ないし３のいずれか一項に記載の少なくとも一種のＤＮＡ又は上記４記載の遺伝子を含有する組換え発現ベクター。
９．組換えプラスミドベクターである上記８に記載の組換え発現ベクター。
１０．ＴＬＲ４遺伝子を有する含有する組換え発現ベクターによって形質転換された形質転換体。
１１．更に、上記８又は９に記載の発現ベクターによって形質転換された、上記１０記載の形質転換体。
１２．更に、転写因子活性測定ベクターによって形質転換された、上記１０又は１１記載の形質転換体。
１３．転写因子がＮＦ−κＢ／Ｒｅｌ  ファミリーである、上記１２記載の形質転換体。１４．転写因子活性測定ベクターがκＢ  配列の制御下にレポーター遺伝子を含むことを特徴とする、上記１３記載の形質転換体。
１５．レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を使用する、上記１４記載の形質転換体。
１６．形質転換体が哺乳類由来細胞である上記１０〜１５のいずれか一項に記載の形質転換体。
１７．哺乳類細胞がＣＤ１４を発現している細胞である、上記１６に記載の形質転換体。
１８．哺乳類由来細胞がＨＥＫ２９３細胞である上記１７に記載の形質転換体。
１９．上記１２〜１８のいずれか一項に記載した形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量をアッセイすることを含む、ＴＬＲ４、又は、ＴＬＲ４及び請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質から成る複合体に対するリガンドによるシグナル伝達能の測定方法。
２０．シグナルが、ＴＬＲ４、又は、ＬＴＲ４及び請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質から成る複合体を介して細胞内に伝達されることを特徴とする、上記１９記載の測定方法。
２１．リガンドがエンドトキシンである、上記１９又は２０記載の測定方法。
２２．レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を使用する、上記１９〜２１のいずれか一項に記載の測定方法。
２３．上記１９〜２２のいずれか一項に記載の測定に基づく、ＴＬＲ４、又は、ＴＬＲ４及び請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質から成る複合体に対する作動薬（アゴニスト）又は拮抗薬（アンタゴニスト）のスクリーニング法。
２４．（ａ）  被験物質の存在下で、請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質及びＴＬＲ４を細胞表面に発現する細胞をＴＬＲ４、又は、ＴＬＲ４及び請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質から成る複合体に対するリガンドで刺激する工程、
（ｂ）所定時間後に細胞を溶解する工程、及び
（ｃ）レポーター遺伝子の発現量をアッセイする工程、及び
（ｄ）  レポーター遺伝子の発現量を減少させる効果を示した被験物質を選択する工程、を含む上記２３に記載の拮抗薬（アンタゴニスト）のスクリーニング法。
２５．リガンドがＬＰＳである、上記２４に記載のスクリーニング法。
２６．（ａ）請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質及びＴＬＲ４を細胞表面に発現する細胞を被験物質で刺激する工程、
（ｂ）所定時間後に細胞を溶解する工程、及び
（ｃ）レポーター遺伝子の発現量をアッセイする工程、及び
（ｄ）  レポーター遺伝子の発現が認められた被験物質を選択する工程、を含む上記２３に記載の作動薬（アゴニスト）のスクリーニング法。
２７．上記５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質又はその部分ポリペプチドに対する抗体。
【００１２】
【発明の実施の形態】
【００１３】
本発明遺伝子又はＤＮＡ遺伝子は、ウシの細胞におけるエンドトキシン認識に関わる新規なＭＤ−２をコードするものである。これは以下の実施例に示すように、業者に公知の任意の方法によって、例えば、黒毛和種の雄牛等のウシの体組織の一部、例えば、頸静脈由来の末梢血等から採取した血液から全ｍＲＮＡを調製し、更に、公知のヒトおよびマウスのＭＤ−２のｃＤＮＡの塩基配列に基づき作成したプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ，及びＲＡＣＥ法等によって調製することが出来る。
【００１４】
本発明ＤＮＡのクローニングの別の手段としては、本発明ポリペプチドの部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを作成し、適当なライブラリーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明ポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。
ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、上記の  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
本発明ＤＮＡとしては、前述した本発明ポリペプチドをコードする塩基配列から成るものであればいかなるものであってもよい。また、上記のウシ由来の適当な体組織又は細胞に由来するｃＤＮＡライブラリー等から同定・単離されたｃＤＮＡ、又は、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリー作成に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。
【００１５】
或いは、本明細書で開示された配列情報に基づいて、当該技術分野における周知手段を用いた化学合成等によっても調製することが可能である。当業者であれば、特定のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加することも、当該技術分野における周知手段を用いて容易に実施することができる。
【００１６】
本明細書において、本発明のポリペプチド（又は蛋白質）の「エンドトキシン認識活性」とは、該ポリペプチドが直接、又はＴＬＲ４等の他の蛋白質との会合によって形成される複合体を介して間接的に、エンドトキシンと会合し、結合し、或いは認識するか、又はそれらを制御する活性又は機能を意味する。
【００１７】
本発明のＤＮＡは、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチド、をコードするＤＮＡである。
このようなＤＮＡの例として、例えば、配列番号１に示される塩基配列に対する相同性が８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％であり、且つ、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを挙げることが出来る。
【００１８】
上記の配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
【００１９】
更に本発明のＤＮＡは、（ａ）配列番号１に示される塩基配列から成るＤＮＡ、又は、（ｂ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６５℃の１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ナトリウム、０．５Ｍ  リン酸水素ナトリウム（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ  水溶液中でハイブリダイズさせ、６５℃の１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ナトリウム、４０ｍＭ  リン酸水素ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ  水溶液中でメンブレンを洗浄する条件でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ＤＮＡから成るプローブにハイブリダイズする程度の条件である。
【００２０】
本発明の遺伝子又はＤＮＡに、遺伝子組換え操作において当業者に公知である様々な配列、例えば、プロモーター及びエンハンサーなどの調節因子、制限酵素部位、並びに選択マーカー（マーカー酵素等）遺伝子等が適宜結合されたＤＮＡ分子も本発明の範囲である。
【００２１】
本発明は、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチド、を含む蛋白質に係る。従って、このようなポリペプチドの例として、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する相同性が７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは、９５％以上であるアミノ酸配列からなり、エンドトキシン認識活性を有するポリペプチドを挙げることが出来る。
本発明のポリペプチドは、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を発現させることにより、容易に組換え蛋白質として得ることが出来る。
【００２２】
尚、その際に、エンドトキシン認識活性を有するためには、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加される際に、配列番号２で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性として考えられる。又、実質的に同質の生物学的活性の維持のためには、本発明の各ポリペプチドに含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
更に、当該ポリペプチドにおいて、ＴＬＲ４との会合に必須のアミノ酸（例えば、９５番目のリジン）、機能ドメイン、又は、他のＭＤ−２、特にウシのＭＤ−２との共通配列は保存されることが望ましい。
【００２３】
更に、本発明の遺伝子、ＤＮＡ又は上記ＤＮＡ分子を含有する組換え発現ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することが出来る。例えば、（１）本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス等を利用することが出来る。
【００２４】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することが出来る。
【００２５】
宿主細胞としては、例えば、当業者に公知のエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；  Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８  新  細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及び  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
このようにして得られた、本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。
【００２６】
上記培養物から本発明ポリペプチド又は蛋白質を分離精製するには、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。
【００２７】
こうして得られた本発明ポリペプチド（蛋白質）は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、トリプシン及びキモトリプシンのような適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。
本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
【００２８】
本発明の抗体は、本発明蛋白質又はその部分ポリペプチドを認識し又はそれらと結合する限り特に制限はなく、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるもの等を含む。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、本発明蛋白質又はその部分ポリペプチドを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００２９】
本発明は、本発明蛋白質であるＭＤ−２遺伝子及び／又はＴＬＲ４遺伝子を含有する組換え発現ベクター、及び、更に転写因子活性測定ベクターによって形質転換された形質転換体に係る。尚、これらの各遺伝子は同じ発現ベクターに含まれていても良いし、夫々異なる発現ベクターに含有されていても良い。
転写因子としては宿主細胞中で発現される任意のものを使用することが出来る。代表的な例として、ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌ  ファミリー及びＩＲＦ３等を挙げることが出来る。
従って、転写因子活性測定ベクターはκＢ  配列等の転写因子の結合配列の制御下にレポーター遺伝子を含むことができる。
レポーター遺伝子としては、当業者に公知の任意の遺伝子、例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を使用することが出来る。
更に、形質転換体を作成する際の宿主細胞に特に制限はないが、例えば、ヒト等の哺乳類細胞由来である細胞、特に、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞を使用することが出来る。
【００３０】
更に、本発明は、上記形質転換体を利用したＴＬＲ４、又はＴＬＲ４及び本発明蛋白質（ＭＤ−２）からなる複合体に対するリガンドによるシグナル伝達能の測定方法に係る。この際、シグナルは、ＴＬＲ４又は該複合体を介して細胞内に伝達されるものと考えられる。この測定方法は、該形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量をアッセイすることを含むものである。
ここで、該リガンドに特に制限はなく、例えば、グラム陰性菌外膜の主要な蛋白質であるエンドトキシン（ＬＰＳ）を挙げることができる。
又、本発明は、このような測定に基づく、ＴＬＲ４又は該複合体に対する作動薬（アゴニスト）又は拮抗薬（アンタゴニスト）のスクリーニング法にも係る。
当業者であれば、このようなスクリーニング方として、適当な工程から成る方法を容易に構成することが出来る。
例えば、（ａ）  被験物質の存在下で、本発明蛋白質及びＴＬＲ４を細胞表面に発現する細胞をＴＬＲ４受容体に対するリガンドで刺激する工程、
（ｂ）所定時間後に細胞を溶解する工程、及び
（ｃ）レポーター遺伝子の発現量をアッセイする工程、及び
（ｄ）  レポーター遺伝子の発現量を減少させる効果を示した被験物質を選択する工程、を含むＴＬＲ４又は該複合体に対する拮抗薬（アンタゴニスト）のスクリーニング法、を挙げることが出来る。
或いは、（ａ）本発明蛋白質及びＴＬＲ４を細胞表面に発現する細胞を被験物質で刺激する工程、
（ｂ）所定時間後に細胞を溶解する工程、及び
（ｃ）レポーター遺伝子の発現量をアッセイする工程、及び
（ｄ）  レポーター遺伝子の発現が認められた被験物質を選択する工程、を含むＴＬＲ４又は該複合体に対する作動薬（アゴニスト）のスクリーニング法を挙げることが出来る。
【００３１】
【実施例】
以下に実施例に即して本発明を詳述するが、これら実施例は本発明の技術的範囲を如何なる意味でも何ら限定するものではない。
【００３２】
尚、以下の実施例において使用する略語の意味は以下のとおりである。
略語一覧
ＬＰＳ：リポ多糖体；
ＴＬＲ４：Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４；
ＭＤ−２：Ｍｙｅｒｏｉｄ  ｄｅｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２；
ｄＮＴＰ：デオキシリボヌクレオシド３リン酸；
ＯＲＦ：Ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｌａｍｅ；
ＧＰＤＨ：Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＤｅＨｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；
ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；
ＲＡＣＥ：Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ；
ＲＴ−ＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＰＣＲ；及び
ｃＤＮＡ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ。
【００３３】
【実施例１】
１、ＲＴ−ＰＣＲ法によるウシのＴＬＲ４とＭＤ−２のｃＤＮＡ増幅
・供試動物
黒毛和種の雄牛の頸静脈より血液を採取した。
・全ＲＮＡの調製
末梢血からの全ＲＮＡ抽出は、市販されている抽出試薬（ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ；  ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、付属の説明書に従い行った。
【００３４】
・逆転写反応によるｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡは、市販の逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；  ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用い、付属の説明書に従って合成した。末梢血から抽出した全ＲＮＡ１μｇに対して１μｌ（２５ｐｍｏｌ／μｌ）のランダムプライマー（Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ；  ＴＯＹＯＢＯ）を加え、Ｈ２Ｏで１２μｌに調整した後、７０℃で１０分間インキュベートして変性させ、氷中に移した。その溶液に、付属の５×Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒを４μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴを２μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（ｄＮＴＰ  ｓｅｔ，  １００ｍＭ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ；  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａを１０ｍＭ  ｅａｃｈに調製したもの）  を１μｌ加え、４２℃で２分間インキュベートした後、１μｌのＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩを加え、４２℃で５０分間逆転写反応を行った。反応終了後７０℃で１５分間加熱することにより酵素を失活させ、ＲＮａｓｅＨ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｈ；  ＴａＫａＲａ）を２ｕｎｉｔ加えてＲＮＡを分解した。これを−２０℃で保存した。
【００３５】
・プライマーの作製
すでに報告されているヒトおよびマウスＴＬＲ４  ｃＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  番号：ヒトＴＬＲ４  ＮＭ＿００３２６６、マウスＴＬＲ４  ＮＭ＿０２１２９７）を比較し、相同性の高い配列を基にしてｂＴＬＲ４−５’（５’−ＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＴＧＴＧＡ−３’）、ｂＴＬＲ４−３’（５’−ＴＣＣＡＧＴＴＧＡＣＡＣＴＴＡＧＡＧＡＧ−３’）、ｂＴＬＲ４−Ｆ（５’−ＣＴＣＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＴＣＡＣＡＧＡ−３’）、ｂＴＬＲ４−Ｒ（５’−ＴＣＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧ−３’）の４種類のプライマーを作製した。
また、同様にしてウシのＭＤ−２についてもｂＭＤ−２−Ｆ  （５’−ＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＡＴＣＣＧＡＹＧＣ−３’），  ｂＭＤ−２−Ｒ  （５’−ＴＧＷＴＧＴＡＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＣ−３’）の２種類のプライマーを作製した。
・ＰＣＲ法によるウシのＴＬＲ４とＭＤ−２のｃＤＮＡの増幅
ウシの末梢血から抽出した全ＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡを鋳型にしてプライマーを作成した。これを用いて（組み合わせはｂＴＬＲ４  ５’とｂＴＬＲ４  ３’、ｂＴＬＲ４  ＦとｂＴＬＲ４  Ｒ、ｂＭＤ−２  ＦとｂＭＤ−２  Ｒ）、市販のＰＣＲキット（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ；  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｋ．Ｋ）でＰＣＲ法を行った。
【００３６】
ＰＣＲ反応液は以下のように調製した。（５０μｌスケール）
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、１０μＭ  ５’プライマー  ２．５μｌ、１０μＭ  ３’プライマー  ２．５μｌ、及び鋳型ＤＮＡ  １〜２μｌに、Ｈ２Ｏを加えて２５μｌにし、Ｍｉｘ  １を調製した。一方、Ｂｕｆｆｅｒ１  ５μｌ及びＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ０．７５μｌにＨ２Ｏを加えて２５μｌにし、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ２を調製した。その後、４℃でＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  １と２を混合した。
ＰＣＲ法の条件は以下の通りである。
ＢＴＬＲ４  ５’とｂＴＬＲ４  ３’の組み合わせ
▲１▼９４℃  ２  分
▲２▼９４℃  ３０  秒
▲３▼５３℃  ３０  秒
▲４▼７２℃  ２  分
▲２▼〜▲４▼のサイクルを３０回繰り返した。
ｂＴＬＲ４  ＦとｂＴＬＲ４  Ｒの組み合わせ
▲１▼９４℃  ２  分
▲２▼９４℃  ３０  秒
▲３▼５３℃  ３０  秒
▲４▼７２℃  ２  分
▲２▼〜▲４▼のサイクルを３０回繰り返した。
ｂＭＤ−２  ＦとｂＭＤ−２  Ｒの組み合わせ
▲１▼９４℃  ２  分
▲２▼９４℃  ３０  秒
▲３▼５３℃  ３０  秒
▲４▼７２℃  １  分
▲２▼〜▲４▼のサイクルを３０回繰り返した。
【００３７】
・ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）によるウシのＴＬＲ４とＭＤ−２の５’および３’末端の増幅
ウシのＴＬＲ４とＭＤ−２の配列を決定した後、その配列を基にして作製したプライマーは以下の通りである。
ウシのＴＬＲ４  ５’末端増幅用：５’ＧＳＰ１（５’−ＡＡＡＴＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡ−３’）、および５’ｎｅｓｔｅｄ１  （５’−  ＴＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＡ  −３’）、５’ｎｅｓｔｅｄ２  （５’−ＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧ−３’）。
ウシのＴＬＲ４  ３’末端増幅用：３’ＧＳＰ１  （５’−ＣＣＴＴＣＡＣＴＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＴＡ−３’）、３’ＧＳＰ２  （５’−ＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＡＡＴＡＴＣＡ−３’）。
ウシＭＤ−２  ５’末端増幅用：５’ＧＳＰ−１  （５’−ＡＴＡＣＡＡＧＣＴＣＣＴＴＡＴＡＴＣＴＣ−３’）、５’ｎＧＳＰ２  （５’−ＣＴＣＡＧＡＡＣＧＴＡＴＴＧＡＡＡＣＡＧＧ−３’）、および５’ｎｅｓｔｅｄ１  （５’−ＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＡＧＴＣＧＴＡＣＣ−３’）。
ウシＭＤ−２  ３’末端増幅用：３’ｎｅｓｔｅｄ１  （５’−ＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＧＧＡＡＧＣＣＧＴＧ−３’）、３’ｎｅｓｔｅｄ２  （５’−ＴＣＣＡＴＧＡＡＴＴＴＣＣＣＡＴＴＧＣＧ−３’）。
【００３８】
５’ＲＡＣＥは、市販のキット（５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０；  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用い付属の説明書に従い行った。
１）  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成は０．２ｍｌのＰＣＲ用チューブにＧＳＰ１  ２．５ｐｍｏｌ及びサンプルＲＮＡ  ５μｇをとり、Ｈ２Ｏを加えて１５．５μｌにした。
これを７０℃で１０分間インキュベートすることによりＲＮＡを変性させ、氷上で１分間インキュベートし、これに、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２．５μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  Ｍｉｘ  １μｌ及び０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２．５μｌをまぜて、これを４２℃で１分間インキュベートした。
Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩ１μｌを加えて４２℃で５０分間インキュベートした後７０℃で１５分間加熱することによりＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩを失活させた。ＲＮａｓｅ  Ｍｉｘ  １μｌを加えて３７℃で３０分間インキュベートしてｃＤＮＡを得た。これを−２０℃で保存した。
２）  Ｇｌａｓｓ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｉｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡによるＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡの精製
Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを室温にし、あらかじめＨ２Ｏを６５℃に加温しておいた。Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに１２０μｌのＢｉｎｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えた。ｃＤＮＡ／ＮａＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎをＧｌａｓｓ  ｍａｘ  ｓｐｉｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅに移し、室温で１０．０００×ｇ、２０秒間遠心した。
チューブからＩｎｓｅｒｔ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅを取り、Ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈを別のチューブに移しとっておいた。これに０．４ｍｌのＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒをｓｐｉｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅに入れ室温で１０．０００×ｇ、２０秒間遠心した。この操作を３回繰り返した。室温で１０．０００×ｇ、１分間遠心してＣａｒｔｒｉｄｇｅを乾かした。
Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを新しいサンプルを回収チューブにのせ、５０μｌのＨ２Ｏ（６５℃）を加えて、室温で１０．０００×ｇ、１分間遠心してｃＤＮＡを回収した。
３）  ＴｄＴ  によるｃＤＮＡのｔａｉｌｉｎｇ
ＴｄＴ  によるｃＤＮＡのｔａｉｌｉｎｇを以下の通り行った。
Ｈ２Ｏ  ６．５μｌ、５×Ｔａｉｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、２ｍＭ  ｄＣＴＰ  ２．５μｌ及びＧｌａｓｓ  Ｍａｘ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｃＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅ  １０μｌを混ぜて９４℃で３分間インキュベートした後、氷上に移した。１μｌのＴｄＴを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。６５℃で１０分間インキュベートでＴｄＴを失活させて、これを−２０℃で保存した。
４）  ＰＣＲによるｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡへのｄＣＴＰの付加
ｄＣＴＰの付加反応の条件は以下の通りである。
サーマルサイクラー（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＥＲＳＯＮＡＬ；  ＴａＫａＲａ）を９４℃にしておいた。次に、以下のものを混ぜ、０．５μｌのＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔ／μｌ）を加えて、以下の条件でＰＣＲを行った。
Ｈ２Ｏ  ３１．５μｌ
１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ３μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  １μｌ
ＧＳＰ２（１０μＭ）２μｌ
Ａｂｒｉｄｇｅｄ  Ａｎｃｈｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧｉｉＧＧＧｉｉＧＧＧｉｉ  Ｇ−３’  １０μＭ）２μｌ
ｄＣＴＰ  ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡ  ５μｌ。
ＰＣＲ条件
▲１▼９４℃  ２  分
▲２▼９４℃  ３０  秒
▲３▼５５℃  ３０  秒
▲４▼７２℃  ２  分
▲２▼〜▲４▼のサイクルを３０〜３５回繰り返した。
５）  Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによる増幅
１ｓｔ  ＰＣＲの産物５μｌを４９５μｌのＴＥで希釈し、以下の組成でＰＣＲを行った。
Ｈ２Ｏ  ３３．５μｌ
１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ３μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  １μｌ
ｎｅｓｔｅｄ  ＧＳＰ（１０μＭ）１μｌ
ＡＵＡＰ（５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ−３’  １０μＭ）１μｌ
１ｓｔ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ（１／１００）  ５μｌ。
以上を混ぜ０．５μｌのＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔ／μｌ）を加えてＰＣＲを行った。
【００３９】
３’ＲＡＣＥによる３’末端ｃＤＮＡの増幅は、市販のキット（３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ；  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用い付属の説明書に従い行った。
１）  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成は０．２ｍｌのＰＣＲ用チューブにＫＡＵＡＰ−１８ｄＴ（５’−１８ｄＴ＋ＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＡＣＧＴＡＧＴＡＣ−３’１０μＭ）  １μｌ、サンプルＲＮＡ  ５μｇをとり、Ｈ２Ｏを加えて１２μｌにした。
これを７０℃で１０分間インキュベートすることによりＲＮＡを変性させ、氷上で１分間インキュベートし、これに、５×ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  Ｍｉｘ  １μｌ、及び０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌをまぜ、これを４２℃、１分間インキュベートした。
これにＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩ  １μｌを加えて、４２℃で５０分間インキュベートした後、７０℃で１５分間インキュベートしてＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩを失活させた。
これにＲＮａｓｅ  Ｍｉｘ  １μｌを加えて、３７℃で３０分間インキュベートしてｃＤＮＡを得た。これを−２０℃で保存した。
２）  ｃＤＮＡの増幅
ｃＤＮＡの増幅の条件は以下の通りである。
Ｈ２Ｏ  ３６．５μｌ
１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ３μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  １μｌ
ＧＳＰ１（１０μＭ）２．０μｌ
ＫＡＵＡＰ（５’−  ＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＡＣＧＴＡＧＴＡＣ  −３’１０μＭ）２．０μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔ／μｌ）０．５μｌ
以上を混ぜ２μｌの１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを加えてＰＣＲを行った。
【００４０】
・ｃＤＮＡの電気泳動および検出
０．８％アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ；  ニッポンジーン）で電気泳動した。ゲルの組成は以下の通りである。
アガロース０．８％
臭化エチジウム０．２μｇ／ｍｌ
ＴＡＥ（０．０４Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．０４Ｍ氷酢酸、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ）。
目的のバンドを３４０ｎｍ紫外線下（Ｇｅｌ  ＤｏｃＩＩ；  ＢＩＯ  ＲＡＤ）で観察した。
【００４１】
【実施例２】
２、ウシのＴＬＲ４とＭＤ−２の塩基配列の解析
クローニングしたウシのＴＬＲ４とＭＤ−２のｃＤＮＡを鋳型として、市販のシーケンスキット（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ；  ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してサイクルシーケンス反応を行った（２１）。反応産物をオートシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；  ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて分析し、塩基配列を決定した。
その結果、得られた塩基配列を配列番号１に示し、更に、その塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示した。
ウシのＴＬＲ４のｃＤＮＡは、２５２６ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にコードされる推定８４１個のアミノ酸で構成されていた（図１）。また、ウシのＭＤ−２のｃＤＮＡは、４８３ｂｐのＯＲＦにコードされる推定１６０個のアミノ酸で構成されていた（図２及び図３）。ＴＬＲ４の配列は既にデータベースに登録されていたもの（ＡＦ３１０９５２）と一致したが、ＭＤ−２の配列はデータベースに既に記載されたＭＤ−２（ＡＦ３６８４１８）とアミノ酸配列レベルで約３０％異なっていた。これより、他の動物種ではそれぞれ１種類のＭＤ−２しか報告されていないが、ウシでは２種類存在することが示された。
【実施例３】
３、ノーザンブロット解析
・ｃＤＮＡプローブの調製
ウシのＴＬＲ４およびＭＤ−２のｃＤＮＡ全長をＧｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩＩ  （ＢＩＯ  １０１，  ＵＳＡ）  で精製したものを鋳型にして、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ  （ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，  ＵＳＡ）  により、付属の説明書に従って、［α−３２Ｐ］  Ｄｅｏｘｙ  ＣＴＰ  （３７０ｋＢｑ／μｌ；  Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）で標識した。
ＧＰＤＨプローブは、ウシＤＮＡを鋳型にして５’−ＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’と５’−ＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’をプライマーとしたＰＣＲによって増幅したＤＮＡ断片を、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩＩによって精製し、上述のように［α−３２Ｐ］  Ｄｅｏｘｙ  ＣＴＰで標識した。
・ＲＮＡの調製および電気泳動
ＲＮＡ５μｇにＲＮＡ泳動用バッファー  （１０×）  ２．５μｌ、ホルムアルデヒド  （和光純薬，  日本）  ４μｌ、ホルムアミド  （ｎａｋａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，  日本）  １２．５μｌ、蒸留水適量を加えて２５μｌとし、６５℃で１５分間加熱後、氷水で急冷して、ＲＮＡを変性させた。このＲＮＡ溶液に、ＤＮＡ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ２．５μｌ、臭化エチジウム  （和光純薬，  日本）を終濃度４０μｇ／ｍｌになるように加え、ＲＮＡ泳動用バッファー  （１×）  と１８％  ホルムアルデヒドを含む１％  アガロースゲル中で、ＲＮＡ泳動用バッファー  （１×）  を電極槽液として、５０Ｖ、５〜６時間電気泳動した。
・ナイロンメンブレンへのトランスファー
泳動終了後、ゲルを蒸留水に浸して１５分間、２回振盪し、さらにＳＳＣ  （１０×）  に浸して３０分間振盪した。ゲルをＳＳＣ  （１０×）  に浸したスポンジ、ワットマン３ＭＭ濾紙  （Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．，  ＵＫ）  の上に乗せ、さらにその上にナイロンメンブレンフィルター  （ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ；  ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ，  ＵＳＡ）  、ワットマン３ＭＭ濾紙、ペーパータオルの順に乗せて、一晩静置することにより、ゲル中のＲＮＡをナイロンメンブレンに移行させた。フィルターをＳＳＣ  （２×）  で軽く洗浄後、紫外線照射によりＲＮＡを固定させた。
・ハイブリダイゼーションおよび検出
作製したフィルターをハイブリダイゼーションバッファーに浸し、６２℃で３〜４時間プレハイブリダイゼーションした後、前述の方法にて３２Ｐで標識したウシＴＬＲ４プローブ、またはＧＰＤＨプローブを加え、さらに５５℃〜６２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。反応後、フィルターをＳＳＣ（２×）および１％ＳＤＳを含む溶液とＳＳＣ（０．５×）および０．１％ＳＤＳを含む溶液で洗浄した。このフィルターを、増感紙  （ＢｉｏＭａｘ  ＴｒａｎＳｃｒｅｅｎ−ＨＥ；  Ｋｏｄａｋ，  ＵＳＡ）  を用いてＸ線フィルム（ＢｉｏＭａｘ  ＭＳ  Ｆｉｌｍ；  Ｋｏｄａｋ，  ＵＳＡ）  に−８０℃で３日〜１週間露光し、フィルムを現像した。以上の結果、ＴＬＲ４とＭＤ−２の両者の発現が確認された。また、ＴＬＲ４の発現においては高濃度ＬＰＳで刺激した場合、若干の発現の減少が見られた。（図４）
【００４２】
【実施例４】
４、ウシのＴＬＲ４のＭＤ−２の存在下でのＬＰＳシグナル伝達能の検討
・ウシＴＬＲ４とＭＤ−２の強制発現ベクターの作製
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙに使用するウシＴＬＲ４とＭＤ−２の強制発現ベクターを作製するために、ウシのＴＬＲ４とＭＤ−２のタンパク質全長をコードする塩基配列を以下のようなプライマーを用いて増幅した。
ウシＴＬＲ４を増幅する組み合わせ：
ｂＴＬＲ４−５’ＦＬ  （５’−ＴＧＣＣＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＣＧＴＧ−３’）とｂＴＬＲ４−３’ＦＬ（５’−ＡＧＡＡＧＣＡＣＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＴＣ−３’）
ウシＭＤ−２を増幅する組み合わせ：
ｂＭＤ−２  ５’ＦＬ（５’−ＧＴＴＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＧＡＡＴＣＡＴ−３’）とｂＭＤ−２  ３’ＦＬ  （５’−ＴＴＡＴＴＣＴＡＡＴＴＧＡＡＡＴＣＡＧＧ−３’）。
上記の組み合わせでウシ末梢血ｔｏｔａｌ  ＲＮＡより合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法に供した。ＰＣＲ法の条件は以下の通りである。
ウシＴＬＲ４の場合
▲１▼９４℃  ２  分
▲２▼９４℃  １  分
▲３▼５３℃  １  分
▲４▼７２℃  ３  分。
▲２▼〜▲４▼のサイクルを３０回繰り返した。
ウシＭＤ−２の場合
▲１▼９４℃  ２  分
▲２▼９４℃  １  分
▲３▼５３℃  １  分
▲４▼７２℃  １  分。
▲２▼〜▲４▼のサイクルを３０回繰り返した。
以上のＰＣＲで得られた産物を電気泳動により精製し、塩基配列を確認後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＶｅｃｔｏｒにＴＡクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｎｏｔ１  で切断した。
制限酵素反応液の組成
Ｈ２Ｏ  ６μｌ、１０倍濃縮  ｂｕｆｆｅｒ  １μｌ、１０倍ＢＳＡ  ｂｕｆｆｅｒ  １μｌ、プラスミドＤＮＡ  １μｌ  （４００ｎｇ）、及びＮｏｔ１  １μｌから成る混合物を３７℃で２時間インキュベートした後、さらに６８℃で２０分間インキュベートすることにより酵素を失活させ、前述の方法に従い目的のバンドを精製した。同様に哺乳類用強制発現ベクターであるｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  をＮｏｔ１で切断後、アルカリフォスファターゼ処理し、精製したＴＬＲ４あるいはＭＤ−２をコードするＤＮＡ断片をライゲーションした。すなわち、５×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌ、ウシＴＬＲ４／ＭＤ−２断片３μｌ、ｐＣＤＮＡ３  Ｖｅｃｔｏｒ  １μｌ、Ｈ２Ｏ  ３μｌ、及びＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  １μｌを混和し、１６℃にて一晩インキュベートしライゲーションした。得られたプラスミドＤＮＡをベクター上のＴ７  プライマー（５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’）とｂＴＬＲ４  ３’ＦＬあるいはｂＭＤ−２  ３’ＦＬを用いてインサートチェックを行うことによりインサートの向きが正常であることを確認し、強制発現ベクターとした。
【００４３】
・ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）の培養
ＨＥＫ２９３細胞（東北大学加齢医学研究所より購入）の培養に用いた培地の組成は以下の通りである（５００ｍｌの場合）。
ＭＥＭ（日水）  ４３０ｍｌ  （ろ過滅菌済）
１００倍濃縮Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎ  （日水）  ５ｍｌ  （ろ過滅菌済）
１００倍濃縮ＮＥＡＡ  （ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ：  ＧｉｂｃｏＢＲＬ）  ５ｍｌ。
これらにオートクレーブ処理済の８％重炭酸ナトリウムを適量加え、ＰＨを７．２になるように調整した。その後、非働化ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ、Ｌｏｔ：１２８Ｈ８４８２）を５０ｍｌ加えた。これらを用い、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。細胞は５日おきにトリプシン処理により遊離させ、４分の１に希釈して継代した。
【００４４】
・ＨＥＫ２９３細胞へのＤＮＡの導入
ＨＥＫ２９３細胞を１２穴プレートにて１穴あたり３×１０５個加え、一晩インキュベート後、遺伝子導入の約１時間前に培地交換した。この時の添加培地量は０．５ｍｌとした。遺伝子導入にはＦｕＧＥＮＥ６  （Ｒｏｃｈｅ）  によるリポフェクション法を用いた。ＦｕＧＥＮＥ６の希釈には血清無添加ＲＰＭＩ培地  （ＧｉｂｃｏＢＲＬ）  を用いた。１穴あたりの組成を以下に示す。
１．ＲＰＭＩ培地  ２０μｌ
２．ＦｕＧＥＮＥ６  １μｌ
３．ＤＮＡ      ２２０ｎｇ
用いたＤＮＡの組み合わせは以下の通りである。
ａ：  空ベクター  １００ｎｇ
κＢ活性測定ベクター  １００ｎｇ
導入効率測定ベクター２０ｎｇ
ｂ：  ＴＬＲ４強制発現ベクター５０ｎｇ
空ベクター  ５０ｎｇ
κＢ活性測定ベクター  １００ｎｇ
導入効率測定ベクター２０ｎｇ
ｃ：  ＭＤ−２強制発現ベクター５０ｎｇ
空ベクター  ５０ｎｇ
κＢ活性測定ベクター  １００ｎｇ
導入効率測定ベクター２０ｎｇ
ｂ：  ＴＬＲ４強制発現ベクター５０ｎｇ
ＭＤ−２強制発現ベクター５０ｎｇ
κＢ活性測定ベクター  １００ｎｇ
導入効率測定ベクター２０ｎｇ
【００４５】
空ベクターには、ウシＴＬＲ４およびＭＤ−２導入前のｐＣＤＮＡ３ベクターを用いた。κＢ活性測定ベクターとしては、転写因子ＮＦ−κＢの活性に比例してホタルルシフェラーゼが合成されるκＢ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｖｅｃｔｏｒ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）  を用いた。導入効率測定ベクターとしては、遺伝子の細胞への導入量に比例してウミシイタケルシフェラーゼが合成されるｐＲＬ−ｔｋ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。まず１に２を加え２０分室温でインキュベートした。次にＤＮＡを加えさらに２０分間室温でインキュベート後、準備した細胞に加えた。６〜８時間後、培地を交換しさらに１８時間培養後ＬＰＳ刺激を行った。
【００４６】
・細胞の溶解と回収
既存の培地を除去後ＰＢＳで一度軽く細胞を洗浄し、次に１×Ｐａｓｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）  を１ウェルあたり５０μｌ加えた。この状態で室温で数分間インキュベートすることで細胞を溶解させた後、これらを回収しＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙに供した。
【００４７】
・Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性の測定
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性はＴＲ−７１７  （ＰＥＲＫＩＮ  ＥＲＭＥＲ）を用いて測定した。測定方法はＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）の法に準じた。すなわち９６穴プレートを用いてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ  ２５μｌに対して細胞溶解液５μｌを加え、ピペッテイングし、速やかに２５℃にてホタルルシフェラーゼの発光度を１０秒間測定した。次にＳｔｏｐ  ａｎｄ  ｇｌｏｗ  ｒｅａｇｅｎｔを２５μｌ加え、ピペッテイングし、速やかに２５℃にてウミシイタケルシフェラーゼの発光度を１０秒間測定した。遺伝子導入を行わない細胞の発光度をバックグラウンドとして各サンプルの数値より差し引いた後、ホタルルシフェラーゼの値をウミシイタケルシフェラーゼの値で割り、各サンプルの相対ＮＦ−κＢ活性値とした。
その結果、ＨＥＫ２９３細胞においてウシのＴＬＲ４とＭＤ−２をそれぞれ単独にあるいは同時に強制発現させ、ＬＰＳで刺激した時の核内転写因子であるＮＦ−κＢの活性化状態を測定した。その結果、ウシのＴＬＲ４とＭＤ−２の共存下でＮＦ−κＢの顕著な活性化が見られた。また、ＴＬＲ４単独でもわずかなＮＦ−κＢの活性化が見られた。（図５）
【００４８】
ＨＥＫ２９３細胞を用いたウシの  ＴＬＲ４およびＭＤ−２の強制発現実験から、ウシの  ＴＬＲ４はＭＤ−２との共存下でＬＰＳ刺激を細胞内へ伝達することが示された。また、ヒトやマウスではＴＬＲ４とＭＤ−２は複合体を形成することによりＬＰＳのシグナル伝達に関わることが報告されており、ウシのＴＬＲ４およびＭＤ−２のｍＲＮＡは末梢血で共に強い発現が見られたことからウシの生体内で実際に、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体はレセプターとしてＬＰＳシグナルを細胞内に伝えていることが明らかとなった。また、末梢血で高濃度のＬＰＳ刺激を行った場合、ＴＬＲ４の発現量の減少が見られた。このことは白血球系細胞のＬＰＳ応答の減弱を意味し、ウシにおいてＴＬＲ４の発現量の調節により過度のＬＰＳに対する生体反応を緩和する機構が存在することが示唆された。
【００４９】
ＬＰＳおよびその構造類似物質に対する反応は動物種によってことなり、その種特異性はＭＤ−２の構造の違いに依存することが、ヒトとマウスでの研究にもとづき報告された。ウシＭＤ−２の配列とヒトやマウスのものとの違いは、これらの動物種間でのＬＰＳ反応性の違いと密接に関わっていると考えられる。また、本研究で分離されたＭＤ−２の配列はデータベースで報告されたものと異なっていた。これより、他の動物種ではそれぞれ１種類のＭＤ−２しか報告されていないが、ウシでは２種類存在することが示された。ウシＭＤ−２が２種類存在することは、ウシでは個体によりＬＰＳ反応性がことなる結果につながる可能性がある。特に、ウシでＬＰＳ受容体に対する作動薬（アゴニスト）や拮抗薬（アンタゴニスト）を開発するために本知見は重要である。
本研究では、ＬＰＳシグナル伝達メカニズムについてＴＬＲ４とその修飾因子ＭＤ−２に着目した。しかし実際に生体内で行われているＬＰＳ認識にはこれらに加え多くの分子が関与する複雑なプロセスであり、さらなる病原体認識機構の分子基盤の解明は非常に重要な課題である。
【００５０】
【発明の効果】
本発明者はヒトやマウスでＬＰＳレセプターとして見い出されたＴＬＲ４に着目し、ウシのＴＬＲ４とその修飾因子ＭＤ−２の同定と分子レベルでの機能解析を行った。その結果、新型ウシＭＤ‐２をコードする遺伝子を見いだし、それに基づき、ＴＬＲ４のレベルでウシに特有なＬＰＳ認識機構が存在することを示した。また、ＴＬＲ４の発現量の調整によるＬＰＳシグナルを緩和する機構が存在することを示した。
これらの知見に基づき、これらの遺伝子を導入した細胞によるＬＰＳ受容体を介した薬物のスクリーニング方法等の開発に成功した。
【００５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ウシ由来のＴＬＲ４のアミノ酸配列と他種由来のＴＬＲ４との比較を示す。
【図２】本発明のウシ由来のＭＤ−２の塩基配列及び推定一次構造（アミノ酸配列）、並びに、他種由来のＭＤ−２との比較を示す。
【図３】本発明のウシ由来のＭＤ−２の推定一次構造（アミノ酸配列）と既報のＭＤ−２（ＡＦ３６８４１８）のそれとの比較を示す。、
【図４】ウシ末梢血におけるＴＬＲ４及びＭＤ−２の発現の結果を示す電気泳動の写真である。
【図５】ウシのＴＬＲ４及びＭＤ−２の強制発現によるＨＥＫ２９３細胞のＬＰＳ応答能の変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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