(57)【要約】【課題】サンプル中の標的核酸、特に、ウイルスゲノムまたはｍＲＮＡなど、を簡便に定量することが可能な標的核酸の定量方法、それに使用される核酸、プローブ固相化基体およびアッセイキット、並びにそれを利用するウイルス検査方法を提供する。【解決手段】サンプル核酸と、１の標的核酸に含まれる２箇所以上の標的配列のそれぞれに対して一部の配列を除いて相同である配列を含む複数の濃度標準物質とを、前記標的配列とそれに対応する濃度標準物質で同じプライマーセットを用いて競合的に増幅し、それにより得られた増幅産物を配列の種類毎に定量することを具備する標的核酸の定量方法。【選択図】　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル核酸と、１の標的核酸に含まれる２箇所以上の標的配列のそれぞれに対して一部の配列を除いて相同である配列を含む複数の濃度標準物質とを、前記標的配列とそれに対応する濃度標準物質で同じプライマーセットを用いて競合的に増幅し、それにより得られた増幅産物を配列の種類毎に定量することを具備する標的核酸の定量方法。
【請求項２】
（ａ）標的核酸の第１の標的配列に一部を除いて相同な配列を含む第１の濃度の第１の濃度標準物質と、当該標的核酸の第２の標的配列に一部を除いて相同な配列を含む第２の濃度の第２の濃度標準物質と、サンプル中のサンプル核酸とをプライマーについて競合的に増幅させることと、
（ｂ）前記（ａ）の増幅で得られた増幅産物を配列の種類毎に定量することと、（ｃ）前記（ｂ）の定量結果から、第１および第２の濃度標準物質の濃度を基に、当該サンプル中の標的核酸の量を算出することと、
を具備するサンプル核酸に含まれる標的核酸の定量方法。
【請求項３】
前記増幅産物を配列の種類毎に定量することが、前記標的配列および濃度標準物質の少なくとも一部分に相補的なプローブを固相化したプローブ固相化基体に対して前記増幅産物をハイブリダイズさせることにより行われることを特徴とする請求項１または２の何れか１項に記載の標的核酸の定量方法。
【請求項４】
前記標的配列と、それに対応する濃度標準物質は、使用されるプローブに相補的な配列であるプローブ領域を除いて互いに相同であることを特徴とする請求項３に記載の標的核酸の定量方法。
【請求項５】
前記標的核酸が、ウイルスゲノムおよびｍＲＮＡからなる群より選択されることを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載の標的核酸の定量方法。
【請求項６】
前記標的核酸が少なくとも配列番号１に記載の配列または相補鎖を含むＣ型肝炎ウイルスゲノム由来の核酸であり、
第１の濃度標準物質が配列番号２に記載の配列または相補鎖であり、第２の濃度標準物質が配列番号３に記載の配列または相補鎖であり、
前記プライマーが４種類使用され、その４種類のプライマーがそれぞれ配列番号４、配列番号５、配列番号６若しくは配列番号７に記載の何れかの配列または相補鎖を含み、
前記プローブが少なくとも４種類使用され、その４種類のプローブがそれぞれ配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１に記載の何れかの配列または相補鎖を含む
ことを特徴とする請求項４または５の何れか１項に記載の標的核酸の定量方法。
【請求項７】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１に記載の配列、並びにその相補鎖からなる群より選択される配列からなる核酸。
【請求項８】
配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１に記載の配列、並びにその相補鎖からなる群より選択される配列からなる核酸をプローブとして具備するプローブ固相化基体。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸および請求項８に記載のプローブ固相化基体からなる群より少なくとも１選択された構成要素を具備する標的核酸の定量用のアッセイキット。
【請求項１０】
ウイルスに感染した対象より採取したサンプル核酸について、前記標的核酸が前記ウイルスのゲノムであることを特徴とする請求項１から６の何れか１項に記載の定量方法を行うことと、前記ウイルスのゲノムについて遺伝子型を決定することとを具備するウイルス検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的核酸の定量方法、それに使用される核酸、プローブ固相化基体およびアッセイキット、並びにそれを利用するウイルス検査方法に関する。
【０００２】
例えば、本発明は、あるウイルス感染者に抗ウイルス治療を開始する際に、ウイルス血症の程度を知る目的、または治療過程、治療後に治療効果を追跡する目的で、その患者に感染しているウイルスの血液中の濃度を測定する方法に関する。更に、薬剤応答性などを調べる目的で組織中に発現したｍＲＮＡ量を測定する方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
一般的に、血中ウイルス濃度はウイルス血症の程度を示す重要な指標になると言われている。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の場合、血中ウイルス濃度が低い患者は、肝機能を示す数値ＡＳＴ、ＡＬＴの値が低く肝障害が軽微であり、逆に血中ウイルス濃度が高い患者は肝障害が重篤で肝機能が低下している場合が多い。さらに、血中ウイルス濃度は、抗ウイルス治療の効果にも影響しているといわれている。同じＨＣＶの例では、インターフェロン療法が奏効すると言われているが、血中ウイルス量が高い症例では治療効果が得られにくく、ウイルス量が低い患者では高い治療効果が得られる確率が高いという傾向がある。
【０００４】
日本には約２００万人のＨＣＶ感染者がおり、そのうちの約７０％は慢性肝炎を発症している。これらの患者は、１０年から２０年の経過の後に高率に肝癌を発症することがわかっており、慢性肝炎のうちにウイルスを完全に排除しておくことが強く望まれる。先述のインターフェロン療法はウイルスを排除する有効な方法であるとされているが、実際には３割程度の患者でしか著効しないことがわかっている。そのような状況に加えて、インターフェロン療法には重篤な副作用が伴い、しかも治療には多額の費用がかかることなどの問題もある。よって治療開始前にインターフェロン療法の効果をある程度予測し、治療が奏効する可能性のある患者を選び出すことは、患者の負担を軽減するために重要な意味をもつと考えられる。
【０００５】
また、Ｃ型慢性肝炎に対するインターフェロン療法の効果は、主にウイルス側の要因によって規定されている場合が多い。特に影響すると考えられている要因が、ウイルスのタイプ（遺伝子型）とウイルス量である。これら２要因は、互いに関連しており、遺伝子型１ｂではウイルス量が多くなる傾向があり、逆に２ａ、２ｂ型ではウイルス量があまり多くならないという大まかな相関が認められる。また、治療開始後のウイルス量の推移の仕方が、治療効果に反映するとの報告もあり（非特許文献１を参照されたい）、ウイルス量を測定することは治療方針を決定したり治療を進めるにあたって、重要な判断材料となる。
【０００６】
また、組織中に発現したｍＲＮＡ量を測定することは、ある薬剤に対する個体の反応性を見る上で重要な指標になると考えられている。例えば、Ｃ型慢性肝炎に対するインターフェロン療法の効果を考える場合に、治療開始前と開始後の肝組織を採取し、それぞれで発現しているｍＲＮＡの量を数種の遺伝子に対して比較することにより、その個体のインターフェロンに対する反応性を調べることが可能となる。そのためにはまず治療開始前後でいくつかの遺伝子の発現パターンを比較して、インターフェロンの効果の有無を規定するために意味のある遺伝子の発現変化のパターンを特定する。その結果から治療開始前後の特定の遺伝子の発現量の変化を測定することにより、治療効果をあらかじめ予測するという試みがなされている。
【０００７】
従来におけるウイルス量の測定は、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＰＣＲ法（非特許文献２および非特許文献３を参照されたい）やＢｒａｎｃｈｅｄ　ＤＮＡ　ｐｒｏｂｅ　ａｓｓａｙ（バイエル社製）、Ａｍｐｌｉｃｏｒｅ　ｍｏｎｉｔｏｒ法（ロシュダイアグノスティック社製）などが用いられている。例えば、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＰＣＲ法は濃度標準物質を用いた競合的ＰＣＲによってウイルス量を算定するものである。この方法では、検出に電気泳動を用い、その泳動像を読むにはある程度の経験が必要である。また１検体あたり数本のＰＣＲをかけるなど手順が煩雑である。Ｂｒａｎｃｈｅｄ　ＤＮＡ　ｐｒｏｂｅ　ａｓｓａｙを行なうにはＢｒａｎｃｈｅｄ　ＤＮＡ　ｐｒｏｂｅ　を合成する特別な技術が必要となる。Ａｍｐｌｉｃｏｒｅ法では特別な測定用装置が必要となる。組織中のｍＲＮＡ量を測定する従来法は、ノーザンブロッティング法で大まかに見る以外は、特別な装置を必要とするＴａｑＭａｎ法（アプライドバイオシステムズ株式会社製）、各種マイクロアレイを用いる方法などが挙げられる。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｃｈａｙａｍａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．著、Ｖｉｒａｌ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｌｉｖｅｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ．　１９９４、６１７−６２０
【０００９】
【非特許文献２】
Ｋａｎｅｋｏ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．著、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．　３７、１９９２、２７８−２８２
【００１０】
【非特許文献３】
Ｃｈａｙａｍａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．著、Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｒｏｌ．　８、１９９３、Ｓ４０−４４
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上記の状況に鑑み、本発明の課題は、サンプル中の標的核酸、特に、ウイルスゲノムまたはｍＲＮＡなど、を簡便に定量することが可能な標的核酸の定量方法、それに使用される核酸、プローブ固相化基体およびアッセイキット、並びにそれを利用するウイルス検査方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記のような課題は以下のような本発明により達成される。即ち、
（１）サンプル核酸と、１の標的核酸に含まれる２箇所以上の標的配列のそれぞれに対して一部の配列を除いて相同である配列を含む複数の濃度標準物質とを、前記標的配列とそれに対応する濃度標準物質で同じプライマーセットを用いて競合的に増幅し、それにより得られた増幅産物を配列の種類毎に定量することを具備する標的核酸の定量方法：
（２）（ａ）標的核酸の第１の標的配列に一部を除いて相同な配列を含む第１の濃度の第１の濃度標準物質と、当該標的核酸の第２の標的配列に一部を除いて相同な配列を含む第２の濃度の第２の濃度標準物質と、サンプル中のサンプル核酸とをプライマーについて競合的に増幅させることと、
（ｂ）前記（ａ）の増幅で得られた増幅産物を配列の種類毎に定量することと、
（ｃ）前記（ｂ）の定量結果から、第１および第２の濃度標準物質の濃度を基に、当該サンプル中の標的核酸の量を算出することと、
を具備するサンプル核酸に含まれる標的核酸の定量方法：
（３）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１に記載の配列、並びにその相補鎖からなる群より選択される配列からなる核酸：
（４）配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１に記載の配列、並びにその相補鎖からなる群より選択される配列からなる核酸をプローブとして具備するプローブ固相化基体：
（５）前記（３）に記載の核酸および前記（４）に記載のプローブ固相化基体からなる群より少なくとも１選択された構成要素を具備する標的核酸の定量用のアッセイキット：
（６）ウイルスに感染した対象より採取したサンプル核酸について、前記標的核酸が前記ウイルスのゲノムであることを特徴とする前記（１）または（２）の何れか１項に記載の定量方法を行うことと、前記ウイルスのゲノムについて遺伝子型を決定することとを具備するウイルス検査方法
である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
Ｉ．用語の説明
ここで使用される「核酸」の語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、Ｓ−オリゴ、メチルホスホネートオリゴ、ＰＮＡ（即ち、ペプチド核酸）およびＬＮＡ（即ち、ロック核酸）などの何れの核酸類似体など、一般的に、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質を総括的に示す語である。また、そのような核酸は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであって、それらの混合物であってもよい。
【００１４】
ＩＩ．標的核酸の定量方法
以下に、例を用いて本発明の第１の態様を説明する。
【００１５】
１．標的核酸の血中濃度の測定に用いる濃度標準物質の合成
標的核酸の血中濃度の測定するためには、まず、標的核酸の保存性の高い領域を選ぶことが重要である。その領域中に約８０塩基以上の長さからなる領域をなるべく間をあけて２箇所以上選ぶ。この選択された２箇所が標的配列である。図１には、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムにおいて行なった例の５’ＵＴＲに設定した２領域（ａ領域、ｂ領域）の標的配列の位置関係を示す。
【００１６】
このように選んだ２領域（または２以上の領域）の標的配列の内部にそれぞれ２０塩基のプローブ領域（即ち、ｖ配列）を設定する。第１の濃度標準物質である濃度標準物質ａは、プローブ領域に相当する領域を除き、標的核酸のａ領域に相同な配列からなる。濃度標準物質ａは、当該プローブ領域に相当する領域には、故意に変異が組み込まれたｓ配列を有する。即ち、濃度標準物質ａは、ｓ配列以外の部分はウイルスゲノムと同じ配列を持つ核酸である。濃度標準物質ａは、約１００塩基のＤＮＡ鎖などの核酸鎖として合成すればよい。同様に、第２の濃度標準物質である濃度標準物質ｂも合成する。標的配列を３以上選択する場合にも、上記の方法と同様に第ｎの標的配列を選択し、第ｎの濃度標準物質ｎを合成すればよい（ここで、ｎは３以上の整数である）。
【００１７】
ここで、図１に示す配列は、日本人に多い遺伝子型１ｂの典型的な配列を５‘末端から記載した。配列の下にそって「−」で示されている部分に、ａ、ｂの２種類の濃度標準物質を設計した。「−」で示されている部分はウイルスゲノムと同じ配列を持っており、四角で囲まれた部分に集中して変異を導入した。そして、その部分にウイルスゲノム特異的な配列ｖ配列と、変異を導入した濃度標準物質に特異的な配列ｓ配列の２種類のプローブ領域を設計した。このプローブ領域はには、濃度標準物質および標的配列を検出するためのプローブがハイブリダイズし得る。このようなプローブのハイブリダイズは、濃度標準物質および標的配列を配列毎に定量するために利用することが可能である。或いは、プローブ領域の配列の違いを利用して、濃度標準物質と標的配列とを認識してそれ自身公知の方法により定量してもよい。
【００１８】
濃度標準物質に任意に組み込む変異の数は、例えば２０塩基からなるプローブ領域であれば１塩基の違いでも検出可能であるが、２塩基以上組み込むことが望ましい。その場合、変更前のプローブ領域とＴｍ値が変化しないような配列にすることが好ましい。また、変異を組み込む位置は、プローブ領域の末端ではなく中央付近であることが好ましい。
【００１９】
濃度標準物質は、ホスホロアミダイト法により人工的に合成されたものを用いることができる。または、人工的に合成した変異箇所を持つヌクレオチド鎖に対し、その両端の配列を用いてＰＣＲなどによって増幅を行い、そのＰＣＲ産物を濃度標準物質とすることもできる。また、非常にめずらしい配列を一部に持つウイルスを鋳型に増幅したＰＣＲ産物を用いることもでき、その場合は特に変異の集積した箇所をプローブ領域にして、保存性の高い領域を増幅のためのプライマ−領域としてもよい。変異の導入法に関しては以上の方法に限定するものではない。
【００２０】
この濃度標準物質ａ、ｂを、領域別に濃度を変えて調製しておく。Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの定量のための本例においては、標的配列として２領域を選んだ。従って、例えば、第１の濃度標準物質を１０２ｃｏｐｙ／μｌに、第２の濃度標準物質を１０４ｃｏｐｙ／μｌに希釈すればよい。
【００２１】
或いは３領域を選んだ場合には、例えば、第１の濃度標準物質を１０１ｃｏｐｙ／μｌ、第２の濃度標準物質を１０３ｃｏｐｙ／μｌ、第３の濃度標準物質を１０５ｃｏｐｙ／μｌとすればよい。５領域を選んだ場合には、例えば、第１の濃度標準物質を１０１ｃｏｐｙ／μｌ、第２の濃度標準物質を１０２ｃｏｐｙ／μｌ、第３の濃度標準物質を１０３ｃｏｐｙ／μｌ、第４の濃度標準物質を１０４ｃｏｐｙ／μｌ、第５の濃度標準物質を１０５ｃｏｐｙ／μｌとするなど、選択した標的配列の数に応じて段階希釈すればよい。ウイルスの通常の存在量を考えて、もしくは治療上必要な判定のレベルを考慮し、効果的な濃度に設定することが望ましい。
【００２２】
また、上記の例では、その領域中に約８０塩基以上の長さからなる領域をなるべく間をあけて２箇所選んだ例を示したが、これに限定するものではなく、本発明の趣旨に基づいて、実施者が任意にその長さや選択箇所の数を選択することも可能である。
【００２３】
例えば、本発明の態様において使用される標的核酸の長さは、少なくとも標的配列として２領域以上を選択でき、各領域の間には約１００塩基以上の塩基が存在していることが好ましい。そのような好ましい標的核酸の長さの例は約３００ｂｐ以上である。しかしながら、これに限定されるものではなく、それよりも短くとも長くとも、上述の本発明の原理に基づき標的核酸の定量方法を実施することが可能であることは当業者によって理解されるであろう。
【００２４】
例えば、本発明の態様において使用される標的配列の長さは、適切なハイブリダイズが得られる条件下において、当該標的核酸に対して相補鎖がハイブリダイズできる範囲の長さであればよい。同様に、本発明の態様において使用される濃度標準物質の長さも、標的配列の長さと同様な基準によって、種々の長さを所望に応じて選択することが可能である。
【００２５】
プローブ領域の長さは、適切なハイブリダイズが得られる条件下において、当該プローブ領域に対して相補鎖がハイブリダイズするために必要なＴｍ値を保てる範囲の長さであればよい。一般的には、例えば、約１５ｍｅｒから約２５ｍｅｒが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２６】
２．標的核酸濃度測定のための競合的ＰＣＲの原理
被検サンプルから精製した標的核酸由来のＤＮＡもしくは逆転写反応後のｃＤＮＡ産物をサンプル核酸として用いる。このサンプル核酸を含むサンプルと、予め濃度を調製した濃度標準物質溶液をそれぞれに同体積持ち込んでＰＣＲ反応を行なう。ここで「被検サンプル」とは、生物からの細胞、組織および体液などであればよい。
【００２７】
例えば、上述のようなウイルス由来の産物を１μｌと、２領域にてそれぞれの濃度に希釈した濃度標準物質ａ、ｂの溶液を１μｌずつ添加して１本のチューブにてＰＣＲ反応を行なう。ＰＣＲは通常の市販の酵素を用い、２０μｌ以上の総量で反応させればよい。反応の総量は、総量に対して持ち込むサンプル、濃度標準物質溶液の体積が多くなれば適宜増加させることができるが、５０μｌを上限とすることが望ましい。
【００２８】
図２に示す模式図は、競合的ＰＣＲの原理を説明するものである。ウイルス量が低値でウイルス量と濃度標準物質ａの濃度がほぼ１：１の場合、大量に持ち込んだ方の濃度標準物質ｂの領域は、ｓ配列を持つ断片のみ選択的に増幅し、低濃度の方の濃度標準物質ａはｓ配列とｖ配列が同程度増幅する。一方のウイルス量が高値でウイルス量と濃度標準物質ｂの濃度がほぼ１：１の場合、大量に持ち込んだほうの濃度標準物質ｂとウイルスゲノムは同程度増幅するが、低濃度の濃度標準物質ａは、ｖ配列のみが選択的に増幅される。この生成量の比較によって、ウイルス量を測定する。以下に、更に具体的な濃度の例を示して説明する。
【００２９】
濃度標準物質のうち、例えば、濃度標準物質ａを１０２ｃｏｐｙ／μｌに、濃度標準物質ｂを１０４ｃｏｐｙ／μｌに希釈して持ちこんだとする。
【００３０】
ウイルス由来の産物３の中にあるＤＮＡもしくはｃＤＮＡが、１０２ｃｏｐｙ／μｌの濃度であった場合、ａ領域ではウイルス由来の産物と濃度標準物質ａ由来の産物１はもともと同量存在したことになるので同等に増える。しかしながら、ｂ領域では濃度標準物質ｂ由来の産物２が大量にあるため、増幅のためのプライマーのほとんどを濃度標準物質ｂ由来の産物２が使用してしまい、ウイルス由来の産物３は増幅することができない（図２）。
【００３１】
逆に、図３に示すように、持ち込まれたウイルス由来の産物３であるＤＮＡもしくはｃＤＮＡが１０４ｃｏｐｙ／μｌであったとすると、ｂ領域ではウイルス由来の産物３と濃度標準物質ｂ由来の産物２はもともと同量存在したことになるので同等に増えるが、ａ領域ではウイルス由来の産物３が大量にあるためプライマーのほとんどを使用してしまい濃度標準物質ａの産物１は増幅することができない（図３）。
【００３２】
また、持ち込まれたウイルス由来の産物３が１０３ｃｏｐｙ／μｌであった場合には、ａ領域ではウイルス由来の産物３が１０倍多くあるためプライマーのほとんどをウイルス由来の産物３が使用してしまい濃度標準物質ａの産物１は増幅することができない。ｂ領域では濃度標準物質ｂ由来の産物２が１０倍多くあるためプライマーのほとんどを濃度標準物質ｂの産物２が使用してしまいウイルス由来の産物３は増幅することができない。或いは、ウイルス由来産物３の中にあるウイルスＤＮＡおよびｃＤＮＡが１０１ｃｏｐｙ／μｌであった場合には、どちらの領域とも濃度標準物質が多く存在するために濃度標準物質の産物１および２が何れも優位に増幅する。また、ウイルス由来の産物３が１０５ｃｏｐｙ／μｌ持ち込まれた場合は、どちらの領域ともウイルス由来の産物３が多く存在するので、ウイルス由来の産物３が、濃度標準物質の産物１および２よりも優位に増幅する。以上の結果をサンプルごとに、由来別で比較を行なうことによって、ウイルスの濃度が測定できる。
【００３３】
ここで使用するフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットは、標的配列毎に同じプライマーセットが使用される。例えば、第１の標的配列であるａ領域に関しては、第１のプライマーセットが使用され、これによりウイルス由来産物のプローブ領域を含む任意の長さの配列と、濃度標準物質ａの全長または一部が増幅可能である。同様に、第２の標的配列であるｂ領域に関しては、第２のプライマーセットが使用され、これによりウイルス由来産物のプローブ領域を含む任意の長さの配列と濃度標準物質ｂの全長または一部が増幅可能である。３以上の標的配列の場合でも同様である。
【００３４】
また、上述ではＰＣＲ法を増幅手段として用いる例を示したが、本発明の態様に従うと、増幅手段はＰＣＲに限定するものではなく、それ自身公知の何れの増幅手段を使用してもよい。即ち、従来公知の何れのプライマー伸長法であれば、本発明の態様において使用することが可能である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（一般的にＰＣＲと称される、以下、ＰＣＲと記す）や逆転写ＰＣＲなどを利用した方法を用いることが可能である。また、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｔｒａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ）、Ｌｉｇａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）、Ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮＮ）、Ｒｏｌｌｉｎｇ　ｃｉｒｃｌｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法等の増幅法も利用可能である。
【００３５】
また、上記において示した各濃度は、例として示したものであるので、所望に応じて実施者が変更することが可能である。
【００３６】
３．マイクロタイタープレート法によるＣ型肝炎ウイルスの定量法の原理
患者サンプルから抽出したウイルスゲノムは、必要に応じてＲＮＡを逆転写反応によってｃＤＮＡ化するなどの処理を行い、得られたサンプル核酸を鋳型として使用する。同様に鋳型として、所望に応じた２種類以上の濃度標準物質（例えば２種）を用意し、これを上述のように濃度を変えて調製する。これらを共存させて競合的ＰＣＲを行う方法である。その時用いるプライマーに対しては、後で検出が可能な標識を付与することが好ましい。標識の種類は特に限定するものではなく、ビオチン等の化学標識および蛍光標識等をそれ自身公知の標識物質を用いてよい。しかしながら、ＤＮＡチップなどの技術によっては、ハイブリダイゼーション時に挿入剤等を持ち込んで、それからのシグナルを検出に利用するような方法を用いる場合にはプライマ−の標識は特に必要ではない。標識物質を用いる手段および挿入剤を用いる手段の何れも本発明の態様において使用することが可能である。
【００３７】
上述の競合的ＰＣＲに続き、検出に用いる基体であるマイクロタイタープレート、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ等にプローブを固相して得たプローブ固相化基体上で、競合的ＰＣＲ産物とプローブとのハイブリダイゼーションを行う。プローブを固相するウェルやスポットの数は、用いた領域の種類に応じた数を用いてもよい。例えば、実施例で行なったＣ型肝炎ウイルスの定量の場合、ａ領域とｂ領域の２領域を標的配列として利用したので、例えば、２つのプローブ領域のそれぞれに付き、ウイルス由来のａ−ｖ配列のためのプローブとｂ−ｖ配列のためのプローブ、変異を組み込んだ濃度標準物質ａおよびｂを検出するためのａ−ｓ配列のためのプローブとｂ−ｓ配列のためのプローブ、合計４つのウェルを使用してよい。図４に４つのウェルを使用した例を示した。プローブ固相化基体１０のそれぞれのウェルには、ａ−ｓ配列４のためのプローブ４’、ｂ−ｓ配列６のためのプローブ６’、ａ−ｖ配列７のためのプローブ７’、およびａ−ｖ配列８のためのプローブ８’が固相化されている。このようなプローブ固相化基体を本発明の態様において使用でき、このようなプローブ固相化基体も本発明の範囲内である。
【００３８】
また、３領域を用いた場合には、それぞれの領域についてｖ配列のためのプローブ、ｓ配列のためのプローブを固相するので、６ウェルが必要とされてよい。
【００３９】
ＰＣＲにて増幅した競合的ＰＣＲ産物を、濃度標準物質の数（即ち、標的配列の数）に応じて、ｖ配列とｓ配列のそれぞれのプローブに対してハイブリダイゼーションさせる。競合的ＰＣＲにより増幅され得られた増幅産物が、ｖ配列を持っているのか、ｓ配列を持っているのかにより、ハイブリダイゼーションできるプローブとできないプローブが生じる。従って、あらかじめＰＣＲ産物に標識しておいたビオチンなどの標的物質を検出すれば、両者のハイブリダイゼーションの量を比較することができるので、元の濃度標準物質の濃度からウイルスの定量が可能になる。
【００４０】
例えば、濃度標準物質ａを１０２ｃｏｐｙ／μｌに、濃度標準物質ｂを１０４ｃｏｐｙ／μｌに希釈して持ちこんだとする。ウイルス由来の産物の中にあるＤＮＡもしくはｃＤＮＡが、１０２ｃｏｐｙ／μｌの濃度であった場合には、ａ領域ではウイルス由来の産物と濃度標準物質ａ由来の産物はもともと同量存在したことになるので同等に増えるが、ｂ領域では濃度標準物質ｂ由来の産物が大量にあるため、増幅のためのプライマーのほとんどを濃度標準物質ａ由来の産物が使用してしまい、ウイルス由来の産物は増幅することができない。その場合、ａ領域のウェルもしくはスポットでは、ｖとｓのプローブで同程度の数値を示すが、ｂ領域のウェルもしくはスポットでは、ｖプローブでは数値が上がらずｓプローブのみ数値が上昇している。
【００４１】
逆に、持ち込まれたウイルス由来のＤＮＡもしくはｃＤＮＡが１０４ｃｏｐｙ／μｌであったとすると、ｂ領域ではウイルス由来の産物と濃度標準物質ｂ由来の産物はもともと同量存在したことになるので同等に増えるが、ａ領域ではウイルス由来の産物が大量にあるためプライマーのほとんどを使用してしまい濃度標準物質ａの産物は増幅することができない。その場合、ｂ領域のウェルもしくはスポットでは、ｖとｓのプローブで同程度の数値を示すが、ａ領域のウェルもしくはスポットでは、ｓプローブでは数値が上がらずｖプローブのみ数値が上昇している。
【００４２】
また、持ち込まれたウイルス由来の産物が１０３ｃｏｐｙ／μｌであったとすると、ａ領域ではウイルス由来の産物が１０倍多くあるためプライマーのほとんどをウイルス由来の産物が使用してしまい濃度標準物質の産物は増幅することができない。ｂ領域では濃度標準物質由来の産物が１０倍多くあるためプライマーのほとんどを濃度標準物質が使用してしまいウイルス由来の産物は増幅することができない。その場合は、ａ領域のウェルもしくはスポットでは、ｖプローブがｓプローブよりも低い値を、ｂ領域のウェルもしくはスポットでは、ｖプローブがｓプローブより高い数値を示す。
【００４３】
ウイルス由来産物の中にあるウイルスＤＮＡおよびｃＤＮＡが１０１ｃｏｐｙ／μｌであった場合は、どちらの領域とも濃度標準物質が多く存在するため優位に増幅する。よって、どちらのウェルもしくはスポットでもｓプローブの方が高い値を示す。
【００４４】
ウイルス由来の産物が１０５ｃｏｐｙ／μｌ持ち込まれた場合は、どちらの領域ともウイルス由来の産物が多く存在するため優位に増幅する。そのためどちらのウェルもしくはスポットでもｖプローブの方が高い数値を示す。
【００４５】
以上の方法で、用いた領域でのｖプローブ、ｓプローブでの数値を比較することによって、濃度標準物質のコピー数から、ＰＣＲに持ち込んだサンプル内のＤＮＡ量もしくはｃＤＮＡ量を算定することができる。その後、患者サンプルからＰＣＲに持ち込んだサンプルへの濃縮等を考慮に入れ、血中濃度を算出する。例えば、血清１００μｌを使ってＰＣＲに持ち込む前段階のサンプルが２０μｌ得られたとする。そのうち１μｌを競合的ＰＣＲに用いたとすると、ＰＣＲに持ち込んだ１μｌは血清５μｌ中の存在量に相当することとなる。よって、得られた結果は、血液１ｍｌ中に換算するとき１００倍することが必要である。
【００４６】
このようにマイクロタイタープレートやＤＮＡチップ、または各種マイクロアレイ等の基体上に特定のウイルス特有の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドに代表される１本鎖ＤＮＡを固相したプローブ固相化基体を用いて、それに対して数種類の鋳型を持ち込んで行なったＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションさせることによって、由来別に増幅産物の精製量を測定する本発明の態様によれば、ウイルス性疾患の病態把握や治療の方針の決定に役立つ血中ウイルス量およびｍＲＮＡ量（さらには、後述するように同時にウイルスの遺伝子型）を簡便に測定することが可能である。
【００４７】
また、上記において示した各濃度は、例として示したものであるので、所望に応じて実施者が変更することが可能である。
【００４８】
４．複数の要因を同時に検出する方法。
【００４９】
本発明を利用すれば、一度の検出操作で複数の要因について測定することが可能である。
【００５０】
例えば、同時にウイルスの遺伝子型を調べる場合、ウイルスの遺伝子型を分けることのできる特徴的な領域を選んで、そこにウイルス量のためのプローブを同程度のＴｍ値をもつプローブを設計する。その場合、ウイルス量の測定に用いるゲノム領域と遺伝子型のための領域を離して（約１０００塩基以上）設定しておくと、同じ１本のＰＣＲチューブでウイルス量測定のためのＰＣＲと遺伝子型検出のためのＰＣＲを同時に行なえばよい。
【００５１】
このように感染したウイルスの遺伝子型とウイルス量を一度に測定することにより、個々の患者についてウイルス血症の程度を簡便に測定する方法およびインターフェロン療法の効果が期待できるかどうかをあらかじめ予測する簡便な方法、および薬剤応答性を反映する組織中のｍＲＮＡ量を測定する簡便な方法が提供される。
【００５２】
従来法ではそれぞれの工程で血中ウイルス量しか測定できなかったが、本発明では、ＰＣＲを行なった後に同一の基板上（マイクロタイタープレート、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ等）でウイルス量と遺伝子型が検出可能となり、病態把握や治療法決定に役立つ２つの要因が一度に測定可能となる。さらには、治療効果に影響するヒトゲノムの薬剤応答ＳＮＰｓ等も同時に検出できる可能性もある。
【００５３】
５．マイクロタイタープレートへの核酸の固相化方法の例
本発明に使用され得るプローブ固相化基体は、それ自身公知の何れかの手段により、ガラスまたはプラスチック等の基体に対してプローブ固相化したものであればよい。
【００５４】
例えば、マイクロタイタープレートに高率にＤＮＡ断片を固相することが可能な方法の例を以下に説明する。しかしながら、本発明のプローブ固相化基体の製造方法は、これに限定するものではない。
【００５５】
ここでのマイクロタイタープレートに代表されるプローブを固相する不溶性支持体の素材としては、ポリスチレン、ポリビニール等が好ましい。例えばＥＬＩＳＡ−ＰＬＡＴＥ，　ＭＩＣＲＯＬＯＮ，　９６Ｗ，　ＦＬＡＴ−ＢＯＴＴ，　ＭＥＤＩＵＭ　　ＢＩＮＤＩＮＧ（グライナー社製）が挙げられる。また、ＰＣＲチューブに直接固相することも可能である。さらに、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ等のハイブリダイゼーションを基本に核酸の検出を行なう慣用のほかの方法を利用することもできる。
【００５６】
マイクロタイタープレートにプローブを固相化する方法として、慣用のいくつかの方法を利用することもできるが、本発明では特にいくつかの塩溶液を数段階の濃度調整したうえでプローブを希釈し、被覆溶液としての最適な条件を探し、より効果的にプローブ固相を行なった。ＤＮＡチップやマイクロアレイにプローブを固相する方法に関しても特に規定するものではない。
【００５７】
この被覆用溶液中に、約２０塩基からなるプローブを溶解する。プローブの長さは特に規定するものではない。例えば、プローブを０．４μＭの濃度に溶解し、マイクロタイタープレートに適当量（ウェルの底部を覆い乾燥しない程度）分注して４℃で一晩放置し（または穏やかに振とうの上、室温で１、２時間でもよい）、ツイーン２０を含むＴＢＳ（トリス・バッファード・セリン）緩衝液にてウェルを洗い、プローブの固相の操作とすることができる。固相の条件や洗浄の操作はこれ以降も、記載の溶液に限定されることはなく、慣用のほかの洗浄液を用いることができる。
【００５８】
その後のブロッキング、ハイブリダイゼーションの条件は、特に限定するものではなく、慣用されている方法から適宜選択可能である。例えば、ブロッキングは、６ｘＳＳＣ，　０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），　５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，　１００μｇ／ｍｌ　Ｓｈｅａｒｅｄ，　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ｓａｌｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡからなる溶液を各ウェルに分注し、１時間程度室温にて軽く振とうしながらインキュベートすることによって行うことができる。その後ツイーン２０を含むＴＢＳ（トリス・バッファード・セリン）緩衝液にてウェルを洗い、ＰＣＲ産物とのハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは例えば、６ｘＳＳＣ，　０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），　５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，　０．５％　ＳＤＳ，　１００μｇ／ｍｌ　Ｓｈｅａｒｅｄ，　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ｓａｌｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡからなる溶液中に、９８度で２分間処理したＰＣＲ産物（検出可能なラベルをしたもの）を添加して、各ウェルに分注し、２時間程度５０度前後で軽く振とうしながらインキュベートすることによって行うことができる。このときハイブリダイゼーションの温度はプローブのＧＣ含量から計算するＴｍ値を目安に調節する必要がある。添加するＰＣＲ産物の量は、９６穴のプレートであれば１ウェルあたり１０９ｃｏｐｙ以上が望ましいが限定するものではない。
【００５９】
ハイブリダイゼーション後は、ツイーン２０を含む２ｘＳＳＣ緩衝液等の慣用される洗浄液にてウェルを洗い、ハイブリダイゼーションできなかった余分なＤＮＡ断片を除去する。
【００６０】
続いてのハイブリダイゼーションしたＰＣＲ産物に結合しているラベルを検出してハイブリダイゼーションの状態を確認する方法も、慣用されている方法から適宜選択できる。例えばプライマーにビオチンラベルを施した場合には、２５％ＦＣＳを含む１Ｘ　ＴＢＳ緩衝液中に、何らかの標識したストレプトアビジンを最終濃度７．５ｍＵになるように溶解したものでウェルを被覆し、振とうしながら室温で１時間程度インキュベートすることにより、ビオチンに標識を結合させる。標識の種類についても特定しないが、例えばペルオキシダーゼ標識のものであればペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等の市販の試薬を利用することができる。ツイーン２０を含む２ｘＳＳＣ緩衝液にてウェルを洗い、ペルオキシダーゼの発色性基質、例えばＴＭＢ（３，　３’，　５，　５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）−ＥＬＩＺＡ液（ライフテックオリエンタル社製）等を用いて発色させ、吸光度を測定する。
【００６１】
６．プローブ固定化基体
本発明の態様において使用されるプローブ固定化基体は、上述のようなマイクロタイタープレートを利用したものの他に、板状の基体を用いてもよい。そのようなプローブ固定化基体の例を以下に説明する。
【００６２】
（ａ）第１の例
図５に本発明の態様に従い使用され得るプローブ固定化基体の第１の例を模式的に示した。第１の例であるプローブ固定化基体は、基体１６とその表面に存在する１以上の固定化領域１５に夫々１以上で固定化されたプローブ１１から１４を具備する（図５）。
【００６３】
このようなプローブ固定化基体は、例えば、それ自身公知の手段によりシリコン基板などの基体に対してプローブを固定化することにより製造することが可能である。
【００６４】
本発明に従うと、１つの基体に配置する固定化領域１５の数も、そこに固定化されるプローブの数もこれに限定するものではなく、所望に応じて変更してよい。また、複数種類の塩基配列をプローブとして１つの基体に配置してもよい。複数および／または複数種類のプローブの基体への固相パターンは、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このようなプローブ固定化基体は本発明の範囲内である。
【００６５】
（ｂ）第２の例
図６を用いて、本発明の態様において使用され得るプローブ固定化基体の第２の例を説明する。第２例であるプローブ固定化基体は、基体２２に具備された１以上の電極２３に夫々１以上で固定化されたプローブ１７から２０を具備する（図６）。電極２３は、電気的情報を取り出すためのパット２４に接続されている。
【００６６】
このようなプローブ固定化基体は、例えば、それ自身公知の手段によりシリコン基板などの基体に電極を配置し、その電極表面に対してプローブを固定化することにより製造することが可能である。
【００６７】
本態様においては、電極の数を５としたが１つの基体に配置する電極の数はこれに限定するものではない。また、電極の配置パターンも図６に示したものに限定されるものではなく、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。必要に応じて参照電極および対極を設けてもよい。そのようなプローブ固定化基体も本発明の範囲内である。
【００６８】
上記の例に記載するような蛍光検出を行うためのプローブ固定化基体の場合は、上記の何れかの基体に対してプローブを固定化すればよい。また、上記の第１の例に記載するような電気化学的検出を行うためのプローブ固定化基体の場合は、上記の何れかの基体に電気化学的な検出が可能であるように電極を配置し、その電極上にプローブを固定化すればよい。
【００６９】
本発明において使用され得る電極は、特に限定されるものではないが、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、　ＺｎＯ、　ＣｄＳ、　ＴｉＯ２　、ＧａＡｓのような半導体電極、チタン等が挙げられる。これらの電極は導電性高分子によって被覆しても、単分子膜によって被覆してもよく、所望に応じてその他の表面処理剤を処理してもよい。
【００７０】
また、異なる塩基配列を有するプローブは、それぞれ、異なる電極に対して固定化されてもよく、異なる塩基配列を有する複数種類のプローブが混合された状態で１つの電極に対して固定化されてもよい。
【００７１】
（５）検出
本発明に従うプローブ固定化基体を用いる場合、前記基体に固定化されたプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーション反応の結果生じた二本鎖の存在を検知するための手段として、電気化学的方法および蛍光検出法を利用することが可能である。
【００７２】
（ａ）電気化学的検出
電気化学的による二本鎖核酸の検出は、例えば、それ自身公知の二本鎖認識物質を用いて行えばよい。
【００７３】
ここで用いられる二本鎖認識体は特に限定されるものではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。また、その他の公知の何れの二本鎖認識物質も本発明において好ましく使用される。
【００７４】
本発明に従うプローブ固定化基体では、プローブが電極に対して固定化されている。このような電極を用いての二本鎖核酸の検出は他の一般的な電気化学的検出法と同じように、更に対極や参照極を使用してもよい。参照極を配置する場合、例えば、銀／塩化銀電極や水銀／塩化水銀電極などの一般的な参照極を使用してよい。
【００７５】
続いて、適切なハイブリダイゼーションが可能な条件下で反応を行う。そのような適切な条件は、標的配列に含まれる塩基の種類、プローブ固定化基体に具備されるプローブの種類、試料核酸の種類およびそれらの状態などの諸条件に応じて、当業者であれば適宜選択することが可能である。これに限定されるものではないが、例えば以下のような条件下で反応を行ってもよい。
【００７６】
例えば、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに得られた試料核酸を添加し、９０℃以上で熱変性させる。熱変性された試料核酸へのプローブ固定化基体の挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行ってもよい。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。
【００７７】
反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、電極を洗浄する。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。試料核酸中に標的配列を含む標的核酸が存在した場合、プローブとハイブリダイズし、それにより二本鎖核酸が生じる。
【００７８】
続いて、電気化学的手段により、以下のような手順で生じた二本鎖核酸の検出を行う。一般的には、ハイブリダイゼーション反応の後に、基体を洗浄し、電極表面に形成された二本鎖部分に二本鎖認識体を作用させて、それにより生じる信号を電気化学的に測定する。
【００７９】
二本鎖認識体の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で使用する。この際には、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００８０】
例えば、電気化学的な測定は、二本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、二本鎖認識体に由来する反応電流値を測定してよい。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加してもよい。測定の際に、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。例えば、得られた電流値を基に、検量線から標的核酸の濃度を算出してもよい。
【００８１】
また、それ自体公知の電気化学的検出手段、例えば、以下の文献に開示されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．　１９９４，　Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　１９９８）手段なども本発明の方法において好ましく使用できる。当該文献において、橋本らは、ＤＮＡプローブで修飾された金電極と電気化学的に活性な色素を用いる配列特異的遺伝子検出を報告した。色素に由来する陽極の電流は、標的ＤＮＡの濃度に相関する。また、ワンらは、インディケーターフリーの電気化学的なＤＮＡのハイブリダイゼーションを報告した。このバイオセンサーの構成は、カーボンペースト電極へのイノシン置換プローブ（グアニンを含まない）の固定化と、当該標識のグアニン酸化ピークの存在による二重鎖の形成のクロノポテンショメトリック検出を含む。これらの文献に記載される検出手段は好ましく本発明において使用されてよい。
【００８２】
（ｂ）蛍光検出法
蛍光標識物質を用いる方法の場合には、標的核酸を、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５若しくはローダミンなどの蛍光色素などの蛍光学的な活性が得られる物質で標識しておいてもよい。或いは、そのような標識の代わりに前述の物質で標識したセカンドプローブを用いてもよい。また、複数の標識物質を同時に使用してもよい。
【００８３】
幾つかの態様においては、試料から抽出した核酸成分とプローブ固定化チップに固定化されたプローブとのハイブリダイゼーション反応は、例えば、以下のように行う。例えば、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに抽出した核酸成分を添加し、９０℃以上で熱変性させる。プローブ固定化チップの挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行ってよい。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、洗浄を行う。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。
【００８４】
蛍光検出の場合、ハイブリダイゼーション反応の検出は、標識の種類に応じた適宜の検出装置を用いて、試料中の標識された塩基配列又は２次プローブ中の標識を検出することによって行う。標識が蛍光物質の場合には、例えば、蛍光検出器を用いて標識を検出すればよい。
【００８５】
７．アッセイキット
本発明はまた、上述したような何れかの態様に従うプローブ、プローブ固定化基体、プライマー、プライマーを構成する核酸鎖、濃度標準物質および／または後述するようなＣ型肝炎ウイルスゲノムの定量のための核酸を、使用目的に応じて選択し、組み合わせ、適切なアッセイキットとして提供することも可能である。更に、それらに加えて、緩衝液用塩類、その他の必要な試薬、標識物質および／または反応容器などを組み合わせてアッセイキットとして提供されてもよい。
【００８６】
例えば、本発明に従うプライマー、核酸および／またはプローブ固相化基体は、反応容器、緩衝液用塩類および／またはその他の必要な試薬（例えば、ポリメラーゼおよび基質など）と組み合わせてアッセイキットとして提供されてもよい。
【００８７】
８．Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの定量のための核酸
本発明の更なる態様に従うと、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの定量のための核酸が提供される。
【００８８】
例えば、上述した本発明の態様に従って、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの定量のための標的核酸として好ましく使用される配列の１例は、配列番号１に記載の配列またはその相補配列により表される核酸、当該配列を含む核酸、または当該配列の一部の配列である。
【００８９】
例えば、上述した本発明の態様に従って、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの定量のための濃度標準物質として好ましくは使用される配列の１例は、配列番号１および２に記載の配列またはその相補配列により表される核酸、当該配列を含む核酸、または当該配列の一部の配列である。
【００９０】
例えば、上述した本発明の態様に従って、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの定量のためのプライマーは、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７に記載の配列またはその相補配列により表される核酸、当該配列を含む核酸、または当該配列の一部の配列である。特に、配列番号４と配列番号５、および配列番号６と配列番号７を、それぞれフォワードプライマーとリバースプライマーとするプライマーセットとして使用することが好ましい。
【００９１】
例えば、上述した本発明の態様に従って、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムの定量のためのプローブは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１に記載の配列またはその相補配列により表される核酸、当該配列を含む核酸、または当該配列の一部の配列である。
【００９２】
特に、本発明の態様に従って、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムを定量する場合には、以上に示した配列番号１から配列番号１１に記載の配列またはその相補配列により表される核酸を共に使用して実施することが好ましい。しかしながら、本発明は、当然ながらこれに限定するものではない。
【００９３】
【実施例】
１．合成オリゴヌクレオチドを２領域の濃度標準物質として使用したＨＣＶ量測定
１−１．概要
ＨＣＶ量を測定する現行法の一つ、ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＰＣＲ法にて１０７ｃｏｐｙ／ｍｌと測定されたＣ型慢性肝炎患者から採取した血清よりＨＣＶＲＮＡを抽出して、合成オリゴヌクレオチドからなる２領域の濃度標準物質を使用して血中ＨＣＶ量を測定した。検出のための基板にはマイクロタイタープレートを用いた。
【００９４】
１−２．患者検体の採取法
測定すべき患者から末梢血を採血し、ゼリー管等の採血管に採取した。十分に凝固させたのち３０００ｒｐｍ，　１０分間程度の遠心を行い、血球成分を除いて血清を得た。血清は数本の保存用試験管に分注したのち−２０℃以下の冷凍庫内に保存した。
【００９５】
１−３．Ｃ型肝炎ウイルスのゲノム抽出法
ウイルスゲノムの抽出には、１検体あたり血清１００μｌを用いて行った。抽出にはＳｅｐａ−Ｇｅｎｅ−ＲＶ−Ｒ（三光純薬　社製）等のキットを用いた。これにより必要なＨＣＶ　ＲＮＡを含む分画がペレットで得られた。そのペレットを１ｕｎｉｔ／μｌの濃度でＲＮＡｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を含む１ｍＭ　　ＤＴＴ溶液９μｌにて溶解し、逆転写反応に供するＨＣＶ　ＲＮＡサンプルとした。
【００９６】
１−４．Ｃ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡの逆転写反応
逆転写反応は、Ｈｅｘａ−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて、Ｍ−ＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）にて、先ほどのＨＣＶ　ＲＮＡサンプル９μｌを加えた総量２０μｌで４２℃，　３０分間インキュベートして行った。
【００９７】
１−５．ウイルス量を測定するための競合的ＰＣＲ
ＰＣＲはＧｅｎｅＴａｑ（和光純薬社製）を用いて、総量５０μｌで行った。ＰＣＲに用いたプライマーのうちアンチセンス側のプライマ−にはビオチンラベルを施しておいた。増幅のためのｔｅｍｐｌａｔｅとして、先述のウイルスゲノムＲＮＡの逆転写産物を１μｌ、濃度標準物質ａ（ａ領域）の１０４ｃｏｐｙ／μｌの希釈液を１μｌ、濃度標準物質ｂ（ｂ領域）の１０２ｃｏｐｙ／μｌ希釈液を１μｌ、を添加した。ウイルスゲノムＲＮＡの逆転写産物は、１００μｌの血清から得たそのままの濃度のサンプル（血中１０７ｃｏｐｙ／ｍｌからの逆算で、ｃＤＮＡ中１０５ｃｏｐｙ／μｌ）以外に、滅菌蒸留水にて１００倍に希釈したもの、１００００倍に希釈したものを測定した。ＰＣＲ反応液には、ａ、ｂ領域のプライマーを同時にもちこんだ。反応は９４℃で４分間処理した後、９４℃１０秒、６２℃１秒を１サイクルとする反応を３５回繰り返し、最後に７２℃７分の処理を行った。
【００９８】
１−６．マイクロタイタープレートへのプローブの固相とハイブリダイゼーション
ＥＬＩＳＡ−ＰＬＡＴＥ，　ＭＩＣＲＯＬＯＮ，　９６Ｗ，　ＦＬＡＴ−ＢＯＴＴ，　ＭＥＤＩＵＭ　ＢＩＮＤＩＮＧ（グライナー社製）に、プローブを０．４μＭになるように３Ｍ炭酸カリウム溶液で調整した被覆液を分注し、４℃で一晩保温した。プローブは１検体につきａ−ｖ、ａ−ｓ、ｂ−ｖ、ｂ−ｓ、の４種類を固相した。
次に、ツイーン２０を含むＴＢＳ緩衝液にてウェルを洗浄し、６ｘＳＳＣ，　０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），　５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，　１００μｇ／ｍｌ　Ｓｈｅａｒｅｄ，　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ｓａｌｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡからなる溶液を各ウェルに１００μｌずつ分注し、１時間程度室温にて軽く振とうしながらインキュベートすることによってブロッキングを行なった。その後ツイーン２０を含むＴＢＳ緩衝液にてウェルを洗い、６ｘＳＳＣ，　０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），　５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，　０．５％　ＳＤＳ，　１００μｇ／ｍｌ　Ｓｈｅａｒｅｄ，　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ｓａｌｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡからなるハイブリダイゼーション溶液を５０μｌずつ分注して、今回のハイブリダイゼーションの温度である５０℃に加温しておいた。ターゲットとなるＰＣＲ産物を９８度で２分間処理し、ただちに氷中に移して１本鎖の状態を維持させておき、ハイブリダイゼーション溶液を分注して加温してあるウェルに添加した。５０度で２時間程度軽く振とうしながらインキュベートすることによってハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後は、ツイーン２０を含む２ｘＳＳＣ緩衝液にてウェルを洗浄した。
【００９９】
１−７．検出法
次に、２５％ＦＣＳを含むＴＢＳ緩衝液中に、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を最終濃度７．５ｍＵになるように溶解したもの５０μｌでウェルを被覆し、振とうしながら室温で１時間程度インキュベートした。さらにツイーン２０を含む２ｘＳＳＣ緩衝液にてウェルを洗い、ＴＭＢ（３，　３’，　５，　５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）−ＥＬＩＺＡ液（ライフテックオリエンタル社製）を５０μｌずづ添加した。十分に発色するまで（約１０分）暗所に静置したのち反応停止液（２Ｎ硫酸）を５０μｌずづ添加して、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定はマルチスキャン　バイクロマティック（ラボシステムズ　ジャパン社製）を用いて行なった。結果の出方は図７から図９に示す通りである。
【０１００】
１−８．結果判定
結果の判定は以下の要領で行なった。ａ領域、ｂ領域共にｖ配列のプローブを固相したウェルでの吸光度が高ければ、ｃＤＮＡ中に１０４ｃｏｐｙ／μｌ以上の濃度でウイルスゲノムが存在していたことになり、血液中に換算すると約１０６ｃｏｐｙ／ｍｌ以上と判定する。ａ領域、ｂ領域共にｓ配列のプローブを固相したウェルでの吸光度が高ければ、ｃＤＮＡ中に１０２ｃｏｐｙ／μｌ以下の濃度でウイルスゲノムが存在していたことになり、血液中に換算すると約１０４ｃｏｐｙ／ｍｌ以下と判定する。ａ領域ではｓ配列の吸光度が高く、ｂ領域ではｖ配列の吸光度が高ければ、ｃＤＮＡ中に１０４ｃｏｐｙ／μｌ以下１０２ｃｏｐｙ／μｌ以上の濃度でウイルスゲノムが存在していたことになり、血液中に換算すると１０６ｃｏｐｙ／μｌ以下１０４ｃｏｐｙ／μｌ以上と判定する。さらに、ａ領域またはｂ領域において、ｖ配列とｓ配列の吸光度がほぼ同じになった場合には、それぞれｃＤＮＡ中に１０４ｃｏｐｙ／μｌ、１０２ｃｏｐｙ／μｌの濃度でウイルスゲノムが存在していたことになり、血液中に換算するとそれぞれ約１０６ｃｏｐｙ／ｍｌ、１０４ｃｏｐｙ／ｍｌと判定する。
【０１０１】
結果は、図７から図９に示す。それぞれのグラフの上部に書かれた濃度は、現行法での測定結果とそこからの希釈倍率を基に予想される被検サンプルのｃＤＮＡ濃度である。希釈しない１０５ｃｏｐｙ／μｌのｃＤＮＡを定量した場合は、ａ領域、ｂ領域ともにｖプローブを固相したウェルの方が高い吸光度を示し、測定したサンプルが１０４ｃｏｐｙ／μｌ以上の濃度であることを示している。次の１００倍希釈の１０３ｃｏｐｙ／μｌのｃＤＮＡを定量した場合は、ａ領域ではｓプローブ、ｂ領域ではｖプローブの方が高い値を示した。これは測定したサンプルが１０４ｃｏｐｙ／μｌ以下で１０２ｃｏｐｙ／μｌ以上の濃度であることを示している。次の１００００倍希釈の１０１ｃｏｐｙ／μｌのｃＤＮＡを定量した場合は、ａ領域、ｂ領域ともｓプローブの方が高い吸光度を示しており、測定したサンプルが１０２ｃｏｐｙ／μｌ以下の濃度であることを示している。よって、本発明を用いることによって、正確にウイルス量の範囲を決定することが可能であることが確認された。
【０１０２】
２．変異を導入した合成ヌクレオチドをＰＣＲにて増幅させた産物を希釈して、２領域の濃度標準物質として使用したＨＣＶ量測定
２−１．概要
ＨＣＶ量を測定する現行法の一つ、Ａｍｐｌｉｃｏｒｅ　ｍｏｎｉｔｏｒ法（ロシュ・ダイアグノスティック株式会社）にて血中ＨＣＶ量を測定されたＣ型慢性肝炎患者２４例から採取した血清よりＨＣＶ　ＲＮＡを抽出して、本発明での定量法と結果を比較した。今回の定量には、合成ヌクレオチドを材料にＰＣＲにて増幅して作成した２本鎖ＤＮＡの濃度標準物質を使用して血中ＨＣＶ量を測定した。
【０１０３】
２−２．患者検体の採取法
測定すべき患者から末梢血を採血し、ゼリー管等の採血管に採取した。十分に凝固させたのち３０００ｒｐｍ，　１０分間程度の遠心を行い、血球成分を除いて血清を得た。血清は数本の保存用試験管に分注したのち−２０℃以下の冷凍庫内に保存した。
【０１０４】
２−３．Ｃ型肝炎ウイルスのゲノム抽出法
ウイルスゲノムの抽出には、１検体あたり血清１００μｌを用いて行った。抽出にはＳｅｐａ−Ｇｅｎｅ−ＲＶ−Ｒ（三光純薬　社製）等のキットを用いた。これにより必要なＨＣＶ　ＲＮＡを含む分画がペレットで得られた。そのペレットを１ｕｎｉｔ／μｌの濃度でＲＮＡｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を含む１ｍＭ　　ＤＴＴ溶液９μｌにて溶解し、逆転写反応に供するＨＣＶ　ＲＮＡサンプルとした。
【０１０５】
２−４．Ｃ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡの逆転写反応
逆転写反応は、Ｈｅｘａ−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて、Ｍ−ＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）にて、先ほどのＨＣＶ　ＲＮＡサンプル９μｌを加えた総量２０μｌで４２℃，　３０分間インキュベートして行った。
【０１０６】
２−５．ウイルス量を測定するためのＰＣＲ
２−５−１．ＰＣＲを用いた濃度標準物質の合成法
濃度標準物質は、合成一本鎖ヌクレオチドでも定量可能であるが、凍結融解を繰り返すうちに濃度が不安定になる可能性がある。そこで、ＰＣＲを用いて合成ヌクレオチドを増幅し、出来上がった２本鎖のＰＣＲ産物を濃度標準物質にした。
【０１０７】
ａ、ｂ領域ともに、合成した１００塩基に対して、末端の配列をそのままもつ２０塩基程度のプライマ−を合成した（ａ−フォワード：５’−ｇａｔｔｇｇｇｇｇｃｇａｃａｃｔｃｃ−３’、ａ−リバース：５’−ｔｇｃａｃｇａｃａｃｔｃａｔａｃｔａａｔ−３’、ｂ−フォワード：５’ｇａｃｔｇｃｔａｇｃｃｇａｇｔａｇｔｇ−３’、ｂ−リバース：５’−ａｔｇｇｔｇｃａｃｇｇｔｃｔａｃｇａｇ−３’）。増幅はＧｅｎｅＴａｑ（和光純薬社製）を用いて、総量５０μｌで行った。反応条件は、９４℃で４分間処理した後、９４℃１０秒、５５℃５秒、７２℃１０秒を１サイクルとする反応を３５回繰り返し、最後に７２℃７分の処理を行った。反応後は反応液の全量をアガロースゲルにて電気泳動し、バンドが一本であることを確認した後切り出した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアガロースゲルからの産物の抽出を行い、ＯＤを測定して産物の濃度を算出し、ａ領域の産物は１０４ｃｏｐｙ／μｌに、ｂ領域の産物は１０２ｃｏｐｙ／μｌに希釈して濃度標準物質とした。
【０１０８】
２−５−２．ウイルス量測定のための競合的ＰＣＲ
競合的ＰＣＲはＧｅｎｅＴａｑ（和光純薬社製）を用いて、総量５０μｌで行った。ＰＣＲに用いたプライマーにはビオチンラベルを施しておいた。増幅のためのｔｅｍｐｌａｔｅとして、先述のウイルスゲノムＲＮＡの逆転写産物を１μｌ、濃度標準物質ａ（ａ領域）の１０４ｃｏｐｙ／μｌの希釈液を１μｌ、濃度標準物質ｂ（ｂ領域）の１０２ｃｏｐｙ／μｌ希釈液を１μｌ添加した。ＰＣＲ反応液には、ａ領域のプライマーとｂ領域のプライマーを同時に持ち込んだ。反応は９４℃で４分間処理した後、９４℃１０秒、６２℃１秒を１サイクルとする反応を３５回繰り返し、最後に７２℃７分の処理を行った。
【０１０９】
２−６．マイクロタイタープレートへのプローブの固相とハイブリダイゼーション
ＥＬＩＳＡ−ＰＬＡＴＥ，　ＭＩＣＲＯＬＯＮ，　９６Ｗ，　ＦＬＡＴ−ＢＯＴＴ，　ＭＥＤＩＵＭ　ＢＩＮＤＩＮＧ（グライナー社製）に、プローブを０．４μＭになるように３Ｍ炭酸カリウム溶液で調製した被覆液を分注し、４℃で一晩保温した。プローブは１検体につきａ−ｖ、ａ−ｓ、ｂ−ｖ、ｂ−ｓの４種類を使用した。
【０１１０】
次に、ツイーン２０を含むＴＢＳ緩衝液にてウェルを洗浄し、６ｘＳＳＣ，　０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），　５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，　１００μｇ／ｍｌ　Ｓｈｅａｒｅｄ，　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ｓａｌｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡからなる溶液を各ウェルに１００μｌずつ分注し、１時間程度室温にて軽く振とうしながらインキュベートすることによってブロッキングを行なった。その後ツイーン２０を含むＴＢＳ緩衝液にてウェルを洗い、６ｘＳＳＣ，　０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），　５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，　０．５％　ＳＤＳ，　１００μｇ／ｍｌ　Ｓｈｅａｒｅｄ，　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ｓａｌｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡからなるハイブリダイゼーション溶液を５０μｌずつ分注して、今回のハイブリダイゼーションの温度である５０℃に加温しておいた。ターゲットとなるＰＣＲ産物を９８度で２分間処理し、ただちに氷中に移して１本鎖の状態を維持させておき、ハイブリダイゼーション溶液を分注して加温してあるウェルに添加した。５０度で２時間程度軽く振とうしながらインキュベートすることによってハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後は、ツイーン２０を含む２ｘＳＳＣ緩衝液にてウェルを洗浄した。
【０１１１】
２−７．検出法
次に、２５％ＦＣＳを含むＴＢＳ緩衝液中に、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を最終濃度７．５ｍＵになるように溶解したもの５０μｌでウェルを被覆し、振とうしながら室温で１時間程度インキュベートした。さらにツイーン２０を含む２ｘＳＳＣ緩衝液にてウェルを洗い、ＴＭＢ（３，　３’，　５，　５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）−ＥＬＩＺＡ液（ライフテックオリエンタル社製）を５０μｌずづ添加した。十分に発色するまで（約１０分）暗所に静置したのち反応停止液（２Ｎ硫酸）を５０μｌずづ添加して、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定はマルチスキャン　バイクロマティック（ラボシステムズ　ジャパン社製）を用いて行なった。
【０１１２】
結果の判定は以下の要領で行なった。ａ領域、ｂ領域共にｖ配列のプローブを固相したウェルでの吸光度が高ければ、ｃＤＮＡ中に１０４ｃｏｐｙ／μｌ以上の濃度でウイルスゲノムが存在していたことになり、血液中に換算すると約１０６ｃｏｐｙ／ｍｌ以上と判定する。ａ領域、ｂ領域共にｓ配列のプローブを固相したウェルでの吸光度が高ければ、ｃＤＮＡ中に１０２ｃｏｐｙ／μｌ以下の濃度でウイルスゲノムが存在していたことになり、血液中に換算すると約１０４ｃｏｐｙ／ｍｌ以下と判定する。ａ領域ではｓ配列の吸光度が高く、ｂ領域ではｖ配列の吸光度が高ければ、ｃＤＮＡ中に１０４ｃｏｐｙ／μｌ以下１０２ｃｏｐｙ／μｌ以上の濃度でウイルスゲノムが存在していたことになり、血液中に換算すると１０６ｃｏｐｙ／μｌ以下１０４ｃｏｐｙ／μｌ以上と判定する。さらに、ａ領域またはｂ領域において、ｖ配列とｓ配列の吸光度がほぼ同じになった場合には、それぞれｃＤＮＡ中に１０４ｃｏｐｙ／μｌ、１０２ｃｏｐｙ／μｌの濃度でウイルスゲノムが存在していたことになり、血液中に換算するとそれぞれ約１０６ｃｏｐｙ／ｍｌ、１０４ｃｏｐｙ／ｍｌと判定する。
【０１１３】
２−８．結果
測定結果を図１０に示す。図１０は、Ｃ型肝炎ウイルスのウイルス量測定に関するグラフである。各グラフの上部に測定に用いたサンプルのｃＤＮＡ１μｌにおけるコピー数を示している。従来法のＡｍｐｌｉｃｏｒｅ　ｍｏｎｉｔｏｒ法（図１０中比較例と記す）で２００ＩＵ／ｍｌ以下の数値を示す検体は、本発明の方法に従うと、１０４ｃｏｐｙ／ｍｌかそれ以下に定量された。Ａｍｐｌｉｃｏｒｅ　ｍｏｎｉｔｏｒ法で２００ＩＵ／ｍｌから１０００ＩＵ／ｍｌの間の数値を示す検体は、本発明の方法に従うと１０４ｃｏｐｙ／ｍｌ以上１０６ｃｏｐｙ／ｍｌ未満の値に定量された。Ａｍｐｌｉｃｏｒｅ　ｍｏｎｉｔｏｒ法で１０００ＩＵ／ｍｌ以上の数値を示す検体は、本発明の方法に従うと１０６ｃｏｐｙ／ｍｌ以上の値にそれぞれ判定されることがわかった。一部の結果、乖離例については、別の定量法であるＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＰＣＲ法を用いて確認を行なった。Ａｍｐｌｉｃｏｒｅ　ｍｏｎｉｔｏｒ法で１７０ＩＵ／ｍｌという比較的低値を示しているにもかかわらず、本発明では１０４ｃｏｐｙ／ｍｌ以上１０６ｃｏｐｙ／ｍｌ未満と判定されている２例（症例Ｎｏ．６、１８）は、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＰＣＲ法にて測定するとそれぞれ１０５ｃｏｐｙ／ｍｌ、１０５．５ｃｏｐｙ／ｍｌという定量結果になり、本発明での定量結果と同様の結果を示した。逆にＡｍｐｌｉｃｏｒｅ　ｍｏｎｉｔｏｒ法で１５００ＩＵ／ｍｌという高値を示しているにもかかわらず、本発明では１０４ｃｏｐｙ／ｍｌ以上１０６ｃｏｐｙ／ｍｌ未満と中程度に判別されている症例（症例Ｎｏ．２３）は、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＰＣＲ法にて測定すると１０５ｃｏｐｙ／ｍｌという定量結果になり、本発明での定量結果と同様の結果を示した。このように、従来法に比して本発明は、簡便なだけではなくより正確な定量結果が得られることがわかった。
【０１１４】
また、臨床的にはウイルス量低値例にインターフェロン治療が奏効することがわかっている。ウイルス量を絶対値で表示しなくとも、インターフェロンが効くといわれているウイルス量の範囲に含まれているか含まれていないかだけを判定するだけでも十分である。その意味では、今回の濃度標準物質の設定を下げ、インターフェロン治療の効果を左右するポイント（ほぼ１０１ｃｏｐｙ／μｌ　ｉｎ　ｃＤＮＡ程度）に設定したごく単純な傾向をみる測定系としても、十分治療に役立つと思われる。
【０１１５】
【発明の効果】
以上のような本発明により、サンプル中の標的核酸、特に、ウイルスゲノムまたはｍＲＮＡなど、を簡便に定量することが可能な標的核酸の定量方法、それに使用される核酸、プローブ固相化基体およびアッセイキット、並びにそれを利用するウイルス検査方法が提供された。
【０１１６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｃ型肝炎ウイルスのウイルス量を測定するために用いたゲノム配列の一部を示す図。
【図２】競合的ＰＣＲの原理を示す図。
【図３】競合的ＰＣＲの原理を示す図。
【図４】本発明の態様であるプローブ固相化基体の例を示す図。
【図５】本発明の態様であるプローブ固相化基体の例を示す図。
【図６】本発明の態様であるプローブ固相化基体の例を示す図。
【図７】Ｃ型肝炎ウイルスのウイルス量測定に関するグラフを示す。
【図８】Ｃ型肝炎ウイルスのウイルス量測定に関するグラフを示す。
【図９】Ｃ型肝炎ウイルスのウイルス量測定に関するグラフを示す。
【図１０】Ｃ型肝炎ウイルスを測定する現行法の一つ、Ａｍｐｌｉｃｏｒｅ　ｍｏｎｉｔｏｒ法での結果と本発明の方法での結果を比較して示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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