(57)【要約】【課題】過度の創傷治癒因子を含むことにより線維芽細胞が増殖したり、細胞外マトリックスの過度の生産により瘢痕組織を形成しない、新規な創傷治癒促進剤を提供すること。【解決手段】組換えヒトＶＩＩ型コラーゲンを含有することを特徴とする創傷治癒促進剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えヒトＶＩＩ型コラーゲンを含有する創傷治癒促進剤。
【請求項２】
組換えヒトＶＩＩ型コラーゲンを発現する細胞を含む創傷治癒促進剤。
【請求項３】
前記細胞がＨａＣａＴ細胞である、請求項２に記載の創傷治癒促進剤。
【請求項４】
創傷治癒促進剤を製造する方法であって、組換えヒトＶＩＩ型コラーゲンを発現する細胞をマトリクス上で増殖させることを含む方法。
【請求項５】
前記細胞がＨａＣａＴ細胞である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物適用の創傷・褥創治療剤等として有用な医薬組成物ならびに哺乳動物適用の皮膚外用剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来創傷治療においては、一般的に抗生物質により患部の細菌の増殖を抑制し自然治癒を待つ方法、天然物抽出物により肉芽、表皮形成促進剤を投与する方法、コラーゲン、キチン、キトサンなどの細胞外マトリックスを生着する方法および人工皮膚を生着する方法などが用いられてきた。皮膚のモデルである人工皮膚を例に挙げると、例えば、表皮角化細胞を多層上のシート状に培養したもの（Ｇａｌｌｉｃｏ，Ｇ．Ｇ．，ｅｔａｌ．，  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，  ３１１，  ｐ４４８，  １９８４）、繊維芽細胞をコラーゲンゲル内で培養し、ゲルが収縮した後に、そのゲルの上に表皮角化細胞を播種、培養したもの（米国特許第４，４８５，０９６  号明細書）、やナイロンメッシュに繊維芽細胞を播種、培養してメッシュ空孔が繊維芽細胞の分泌物により埋まった時点でその上に表皮角化細胞を播種、培養したもの（Ｓｌｉｖｋａ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ９６：５４４Ａ，１９９１  ）、あるいはコラーゲンスポンジに繊維芽細胞を播種、培養した後、フィルム状のコラーゲンスポンジを重ね、さらに表皮角化細胞を播種、培養したもの（特開平６−２９２５６８号公報）などがある。
【０００３】
表皮の細胞が産生している細胞増殖因子や、サイトカインなどが創傷治癒に有効であることから、創傷治癒に使用することが報告されている。例えば  線維芽細胞増殖因子ファミリーは、軟組織の増殖および再生に関与する増殖因子の大きなファミリーとして知られ、様々な程度の相同性をタンパク質があり、それらはヘパリンおよび硫酸ヘパリンプロテオグリカン並びにグリコサミノグリカンに結合して、細胞外マトリックス中に強く集中する。これら増殖因子ファミリーの様々なメンバーの発現パターンと組み合わせは、幾つかの発生段階から様々な組織および器官における発現にまで及び、非常に複雑である。
【０００４】
特に表皮がすべて欠損した創傷治癒は、治療が困難で、離開、吻合破壊、および未治癒の創傷といったような合併症を生じ得る。他方、正常な個体においては、創傷治癒は、問題なく完了する。対照的に、損なわれた治癒は、糖尿病、感染、免疫反応、肥満、および栄養失調といったような幾つかの状態と関連している（Ｃｒｕｓｅ，Ｐ．Ｊ．およびＦｏｏｒｄ，Ｒ．，Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１０７：２０６（１９７３）；Ｓｃｈｒｏｃｋ，Ｔ．Ｒ．ら，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．１７７：５１３（１９７３）；Ｐｏｏｌｅ，Ｇ．Ｕ．，Ｊｒ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ９７：６３１（１９８５）；Ｉｒｖｉｎ，Ｇ．Ｌ．ら，Ａｍ  Ｓｕｒｇ．５１：４１８（１９８５））と言われている。
【０００５】
創傷修復は、複雑な細胞間相互作用および生物学的プロセスの結果である。正常な創傷治癒においては、３つの段階が記載されている；急性炎症段階、細胞外マトリックスおよびコラーゲン合成段階、並びに再形成段階（Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｅ．Ｅ．，Ｊｒ．，Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ，第２版，ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８４））である。そのプロセスは、創傷部位でのケラチノサイト、線維芽細胞、および炎症細胞の相互作用を伴う。
【０００６】
細胞外マトリックスには、コンドロイチン４−硫酸及びケラタン硫酸が含まれ、特に真皮−表皮接合部には、コンドロイチン６−硫酸及びヘパラン硫酸が含まれ、これらの物質が真皮と表皮との間の結合に非常に重要であることが知られている。ヒアルロン酸は、主に基底層に存在し、より少量が有棘層（ｓｐｉｎｏｕｓ  ｌａｙｅｒ）に存在する（Ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ，  Ｌ．Ｊ．Ｍ．Ｍｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓｔｅｒｎ，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．（１９９４），  １０２，  ３８５−３８９）といわれている。さらに根本的には基底膜の構造が重要でありＶＩＩ型コラーゲンが基底膜の正常な発達に不可欠である。
【０００７】
組織再生は、修復プロセスに関与する細胞の遊走および増殖を調節する、特異的なペプチド因子により制御されるらしい（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６７７２−６７７４（１９８５）；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１６；７４８−７５０（１９８５））。従って、増殖因子は、創傷、熱傷、および他の皮膚障害の処置における有望な療法であり得る（Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．およびＭｏｓｃａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９：１−６（１９８９）；Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．ら，Ｊ．Ｃｅ１ｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：１０３９−１０４５（１９８７）；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｇ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５：３１９−３２６（１９９１））と言われている。
【０００８】
創傷治癒のプロセスは、仮組織の沈着と共に、急性炎症段階の間に開始される。この後、再上皮形成、コラーゲン合成および沈着、線維芽細胞増殖、並びに血管新生が起こり、これらは全て、最終的には、再形成段階を定義する（Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ．Ｆ．，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １３：７０１（１９８５））。これらの事象は、炎症細胞により分泌される増殖因子およびサイトカインによって、または創傷の縁にある細胞によって影響される（Ａｓｓｏｉａｎ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）３０９；８０４（１９８４）；Ｎｅｍｅｔｈ，Ｇ．Ｇ．ら，”Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｗｏｕｎｄ  ａｎｄ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ”，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８），１−１７頁）。ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）（Ａｎｔｉｏｎｉａｄｅｓ，Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５６５（１９９１））、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（Ａｎｔｉｏｎｉａｄｅｓ，Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５６５（１９９１）；Ｓｔａｉａｎｏ−Ｃｏｉｃｏ，Ｌ．ら，Ｊｏｕｒ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：８６５−８７８（１９９３））、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｇｏｌｄｅｎ，Ｍ．Ａ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：４０６（１９９１））、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）（Ｍｅｌｌｉｎ，Ｔ．Ｎ．ら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｎｎａｔｏｌ．１０４：８５０−８５５（１９９５）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）（Ｗｈｉｔｂｙ，Ｄ．Ｊ．およびＦｅｒｇｕｓｏｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４７：２０７（１９９１））、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら，Ｓｕｒｇ．Ｆｏｒｕｍ４２：６４３（１９９１）；Ｔｏｄｄ，Ｒ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８；１３０７（１９９１））、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）（Ｗｏｎｇ，Ｄ．Ｔ．Ｗ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３；６２２（１９８７））、ノイ（ｎｅｕ）分化因子（ｒＮＤＦ）（Ｄａｎｉｌｅｎｋｏ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：８４２−８５１（１９９５））、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、およびインスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）（Ｃｒｏｍａｃｋ，Ｄ．Ｔ．ら，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．４２：６２２（１９８７））を含め、幾つかのポリペプチド増殖因子は、創傷治癒に関与するものとして同定された。皮膚におけるｒＫＧＦ−１は、上皮ケラチノサイト、毛包および脂腺内のケラチノサイトを刺激することが報告された（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｇ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：８３１−８４０（１９９４））。
【０００９】
しかしながら、サイトカインや細胞増殖因子は、細胞内で複雑な相互ネットワークを形成しているため、患者の創傷治癒促進に必要なサイトカインの組み合わせと濃度は予測できない。また単独のサイトカインや細胞増殖因子を生体に投与することはネットワークのバランスを崩すため予測できない副作用の増大をもたらすため非常に危険である。
【００１０】
これに対して、サイトカインや細胞増殖因子を直接生体に投与するのではなく、これら物質を産生する細胞を利用する方法が報告されている。たとえば、特開平６−１４２１８５には、血管内細胞を増殖させる物質を産生する細胞としてヒト卵巣腫瘍樹立細胞を基材に担持した骨形成促進剤が開示されている。また、創傷治癒に有効な産生物質の一種である細胞成長因子を産生する細胞を組み込んだ形の医療材料が、特開平８−１９８７６３に開示されている。また、特開平１１−２４６４２０には、コラーゲンのマトリックスに血小板が埋入されていることを特徴とする創傷治癒促進剤が開示されている。これは血小板中に含まれる、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）の創傷治癒促進効果によるものである。この方法は創傷治癒超早期での凝固反応には都合がよいが、一般に細毛管が新生して栄養分を運搬する時期、あるいは培養皮膚を使用するような創面では不都合なことが多い。また、創傷治癒後期に血小板の脱顆粒が生じると、過度の創傷治癒因子を含むことにより線維芽細胞の増殖が衰えず、また細胞外マトリックスの生産が分解を極端に上回ることになり、瘢痕組織を形成する結果になるという問題点がある。
【００１１】
ＶＩＩ型コラーゲンは基底膜と真皮とを結合させるアンカリングフィラメントの主成分である。遺伝的にＶＩＩ型コラーゲンの生産が欠損している劣性栄養障害型先天性表皮水疱症では、皮膚が遙かに脆弱であることが知られ、ＶＩＩ型コラーゲンが基底膜の正常な発達に伴っているが重要であることが知られている（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｈ、ｅｔ  ａｌ，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７６：７５３−７６３（１９９７））。また、ＶＩＩ型コラーゲンの合成を促進する物質を含有する化粧品組成物が開示されている（特開平１０−２０３９９２，特表２００１−５０３７５４）。しかしながら、これまで組換えヒトＶＩＩ型コラーゲンを安定して発現することができる宿主細胞系は存在しなかった。
【００１２】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】
特開平１０−２０３９９２
【特許文献２】
特表２００１−５０３７５４
【非特許文献１】
Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｈ、ｅｔ  ａｌ，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７６：７５３−７６３（１９９７）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な創傷治癒促進剤を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、組換えヒトＶＩＩ型コラーゲンを含有する創傷治癒促進剤を提供する。別の観点においては、本発明は、組換えヒトＶＩＩ型コラーゲンを発現する細胞を含む創傷治癒促進剤を提供する。好ましくは前記細胞はＨａＣａＴ細胞である。
【００１５】
本発明はまた、創傷治癒促進剤を製造する方法であって、組換えヒトＶＩＩ型コラーゲンを発現する細胞をマトリクス上で増殖させることを含む方法を提供する。好ましくは、前記細胞はＨａＣａＴ細胞である。
【００１６】
本発明の創傷治癒促進剤を用いて、ＶＩＩ型コラーゲンを直接または間接的にケラチノサイトが傍在する傷面に投与すると、基底膜形成が促進されるため、創傷治癒が促進される。本発明にしたがえば、従前の治療方法が過度の創傷治癒因子を含むことにより線維芽細胞が増殖するという限界、また細胞外マトリックスの生産が分解を極端に上回ることになり、瘢痕組織を形成する結果になるという従来治療法の問題点を克服し、治癒を容易にすることができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
ヒトＶＩＩ型コラーゲンをコードする遺伝子ＣＯ７Ａ１の配列は知られている（（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６９：２０２５６−２０２６２）。この配列に基づいて適当なヒトｃＤＮＡライブラリからヒトＶＩＩ型コラーゲンをコードする遺伝子をクローニングし、これを宿主動物細胞内で作動する適当なベクターに組み込み、適当な宿主細胞に導入して、遺伝子組換え法によりヒトＶＩＩ型コラーゲンを製造する。ヒトＶＩＩ型コラーゲンは、骨形成を誘導する活性を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。宿主細胞としては、線維芽細胞、ケラチノサイト等の細胞株を用いることができるが、特にヒトケラチノサイトＨａＣａＴ細胞が好ましい。
【００１８】
ヒトＶＩＩ型コラーゲンは、上述の形質転換細胞の培養上清から得ることができる。ヒトＶＩＩ型コラーゲンの精製は当該技術分野においてよく知られる各種の蛋白質精製方法にしたがって行うことができる。例えば、硫安沈澱、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、またはこれらの組み合わせを用いて、目的とする蛋白質を精製することができる。ヒトＶＩＩ型コラーゲンのアッセイは、モノクロ−ナル抗体（ＬＨ７．２等）を用いて、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング、免疫沈澱法などにより行うことができる。
【００１９】
このようにして得られた精製ヒトＶＩＩ型コラーゲンを適当な担体と組み合わせて製剤することにより、本発明の創傷治療剤を製造することができる。本発明の創傷治療剤の剤形としては、特に制限はなく、非経口あるいは局所投与用の剤形とすることができるが、創傷治療という目的から局所投与に適した剤形が望ましい。局所投与に好ましい剤形として外用剤、注射剤等が挙げられ、このうち外用剤としては、軟膏、ゲル、クリーム、乳液、液剤などの塗布剤、テープ剤、パッチ剤などの貼付剤、あるいはスプレー剤、粉剤などの噴霧剤から選択される。また、患部周辺に投与する形態として注射剤が挙げられる。
【００２０】
本発明の創傷治療剤には、さらに医薬的に許容しうる添加物を加えてもよい。そのような医薬添加物の例としては、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天など医薬添加物として許容され得る界面活性剤などがあげられる。
【００２１】
さらに好ましい態様においては、本発明の創傷治療剤は組換えヒトＶＩＩ型コラーゲンを発現する細胞がマトリクス上に培養された培養皮膚の形態で提供される。マトリクスとは、表皮細胞が増殖して培養皮膚を形成するための支持体であり、生体適合性および生分解性を有する各種の材料を用いることができる。例としては、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キチン、キトサン等が挙げられる。マトリクスはシート状でもゲル状でもよく、好ましくは多孔質シート状である。
【００２２】
このマトリクス上に上述の組換えヒトＶＩＩ型コラーゲンを発現する細胞を増殖させる。増殖には表皮細胞を培養するのに適した任意の培地を用いることができ、例えば１０％の牛胎児血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＫＧＭ培地等を用いることができる。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２４】
実施例１  ヒトＶＩＩ型コラーゲンを発現する細胞の培養
表皮細胞のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からヒトＶＩＩ型コラーゲンをコードする遺伝子をクローニングした。不足部分は、５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔａｇｇａｔｇａｃｇｃｔｇｃｇｇｃｔｔｃｔ−３’および５’−ｃｃｃｔｃｔａｇａｃａａｃａｃｔｇａａｃｃｃｔｇｃｃｃａｇ−３を用いて、表皮細胞のｃＤＮＡから増幅した。それらを結合して、全長のｃＤＮＡを作成した。次に、Ｆｌｐ−ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて、ＶＩＩ型コラーゲンの全長のｃＤＮＡをＨａＣａＴ細胞（表皮細胞株）のゲノムに組み込んだ。ＨａＣａＴ細胞は、正常表皮細胞の培養から自然発生した表皮細胞株である（Ｂｏｕｋａｍｐ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｊ．  Ｃｅｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０６，  ７６１−７７１．）。ＶＩＩ型コラーゲンをコードする遺伝子を導入したヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）を、１０％の牛胎児血清、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で３７℃、湿度９８％及び５％  ＣＯ２濃度で培養した。
【００２５】
実施例２  ヒトＶＩＩ型コラーゲンフラグメントについてのウエスタンブロットアッセイ
ＶＩＩ型コラーゲン遺伝子導入ＨａＣａＴ細胞の培養上清をセントリプラス（アミコン社）にて１０倍に濃縮した。そのサンプルに５倍のサンプルバッファーを加え、ＳＤＳ６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。セミドライ型のブロッティング機器（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ社）にて泳動を行い、蛋白をニトロセルロース膜に転写した。転写した膜をスキムミルクにてブロッキングを行い、１００倍希釈のＶＩＩ型コラーゲン抗体（ＬＨ７．２）で処理を行った。次に、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスヒツジ抗体、発色液にて処理して、２９０ｋＤのＶＩＩ型コラーゲンのバンドを確認した。
【００２６】
実施例３  ラット創傷の治癒
ラットを抱水クロラールにて麻酔し、メスにて１ｃｍの潰瘍を作成した。３日おきに、ＶＩＩ型コラーゲンを含む細胞培養液（１０倍濃縮）を外用し、潰瘍の大きさの面積（ｍｍ２）を記録した。結果を図１および表１に示す。
【表１】
2004217587.tif 000002
ＶＩＩ型コラーゲン遺伝子を含まない細胞の上清と比較して、有意に潰瘍の縮小が認められた。
【００２７】
実施例４  人工表皮の作製
組換えヒトＶＩＩ型コラーゲンを発現するＨａＣａＴ細胞を、３５ｍｍプラスチックシャーレ（ファルコン社製）を用い、１０％牛血清含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて培養した。２−３日ごとに培地を交換し、細胞がコンフレントに達したところで継代した。７〜８継代目のものについて、細胞を回収し、細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を同様に３５ｍｍプラスチックシャーレに細胞が０．５〜２ｘ１０４  個／穴になるよう播種し、３７℃、５％ＣＯ２  下で３〜５日間培養し、ＨａＣａＴ細胞シートを作製した。
【配列表】
2004217587.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトＶＩＩ型コラーゲンを用いる潰瘍の治療の結果を示す。
【図１】
2004217587.tif 000004