(57)【要約】【課題】  ＣＦキャリアーのスクリーニング及び検出、ＣＦ診断および治療のための技術を提供すること。【解決手段】  ＣＦキャリアーのスクリーニング及び検出、ＣＦ診断および治療に使用し得るＣＦタンパク質遺伝子をクローニングし、単離精製する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製ＤＮＡ分子であって、
（ａ）以下に示す配列１：
配列１：
【化１】
2004208694.tif 000019
【化２】
2004208694.tif 000020
【化３】
2004208694.tif 000021
【化４】
2004208694.tif 000022
のアミノ酸残基位置１から１４８０までに対応するＤＮＡ配列、
（ｂ）上記配列１のアミノ酸残基位置１から１４８０までの配列を有する正常な嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質（ＣＦＴＲ）をコードするＤＮＡ配列、
（ｃ）上記配列１のアミノ酸残基位置１と１４８０の間にある少なくとも１６個の連続するヌクレオチドからなる一部分のＤＮＡ配列、
（ｄ）少なくとも１６個のヌクレオチドからなり、上記配列１のアミノ酸配列の部分断片をコードするＤＮＡ配列、および
（ｅ）上記配列１のアミノ酸残基位置１と１４８０の間の少なくとも１８個の連続するヌクレオチドによってコードされるエピトープを含む以下の部分：
アミノ酸残基２０４〜２４９の配列、アミノ酸残基３４７〜６９８の配列、アミノ酸残基７１０〜７５７の配列、アミノ酸残基７５８〜７９６の配列、アミノ酸残基１１８８〜１４８０の配列、アミノ酸残基２８〜４５の配列、アミノ酸残基５８〜７５の配列、アミノ酸残基１０４〜１１７の配列、アミノ酸残基１３９〜１５３の配列、アミノ酸残基２７９〜２９４の配列、アミノ酸残基５００〜５１２の配列、アミノ酸残基７２５〜７３９の配列、アミノ酸残基９３３〜９４６の配列またはアミノ酸残基１０６６〜１０８４の配列
をコードするＤＮＡ配列
からなる群より選択されるＤＮＡ配列からなる精製ＤＮＡ分子。
【請求項２】
請求項１の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の精製ＤＮＡ分子であって、更にヒト体細胞内で発現した際に嚢胞性線維症に関連する細胞機能の変化に関係するＤＮＡ配列の変化、欠損または非機能性変異部分を含み、該ＤＮＡの変化、欠損または非機能性変異部分が、前記配列１におけるアミノ酸残基位置５０８のフェニルアラニン残基をコードするヌクレオチドの欠失を含む精製ＤＮＡ分子。
【請求項３】
請求項１または２の（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の部分に記載された配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列を含む精製核酸プローブ。
【請求項４】
該配列がＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＧＴＴおよびその相補体を含む請求項３に記載の核酸プローブ。
【請求項５】
請求項１または２のＤＮＡ分子を含む組換えクローニングベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターで形質転換された宿主。
【請求項７】
請求項１に示す配列１のアミノ酸残基位置１〜１４８０の配列を有し、さらにアミノ酸残基位置５０からのフェニルアラニンの欠失をもたらす三個の塩基対の除去によって特徴付けられる、変異嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質（ＣＦＴＲ）をコードするＤＮＡ配列を有する精製ＤＮＡ分子。
【請求項８】
被検対象の生物学的試料の分析方法であって、
該生物学的試料中の、正常な嚢胞性線維症関連遺伝子（ＣＦ遺伝子）、正常ＣＦ遺伝子産物、変異ＣＦ遺伝子、変異ＣＦ遺伝子産物およびそれらの混合物からなる群から選択した少なくとも一つの存在の有無を検出する工程を有することを特徴とする分析方法。
【請求項９】
生物学的試料が被検対象のゲノムの少なくとも一部を含み、検出工程がハイブリダイゼーションアッセイを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
検出工程がさらに請求項３に記載のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列を含む精製核酸プローブを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該配列が、ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＧＴＴおよびその相補体を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
生物学的試料が被検対象の嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質（ＣＧＴＲタンパク質）を含み、検出工程が免疫学的アッセイを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
免疫学的アッセイに、正常ＣＦＴＲタンパク質に特異的な抗体であり、正常ＣＦＴＲタンパク質に結合し、変異ＣＦＴＲタンパク質には結合しない抗体を用いる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
免疫学的アッセイに、変異ＣＦＴＲタンパク質に特異的な抗体であり、正常ＣＦＴＲタンパク質には結合せず、変異ＣＦＴＲタンパク質には結合する抗体を用いる請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
抗体が少なくとも一つのモノクローナル抗体である請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
抗体が少なくとも一つのモノクローナル抗体である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
被検対象がヒト子宮内胎児である請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
検出工程に、少なくとも一つの追加の請求項４に記載のヌクレオチドプローブが用いられる請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の配列１のＤＮＡの異なるＤＮＡ配列断片またはそのＲＮＡ相同体またはヒトクロモゾーム７の異なるＤＮＡ配列断片からなり、該配列１のＤＮＡ配列のいずれかの側に位置している、二番目のヌクレオチドプローブを検出工程に用いる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
嚢胞性線維症関連遺伝子（ＣＦ遺伝子）中に同定された嚢胞性線維症変異の存在を示す潜在的ＣＦキャリアもしくは患者をスクリーニングする方法において、
（ａ）該潜在的嚢胞性線維症（ＣＦ）キャリアまたは潜在的患者の体細胞からゲノムＤＮＡを単離し、
（ｂ）該ＣＦ遺伝子中のアミノ酸残基位置５０８のフェニルアラニンの欠失による変異にスパンし、該変異を検出することのできるＤＮＡプローブを該単離されたゲノムＤＮＡ上にハイブリダイズさせ、
（ｃ）該ＤＮＡプローブの有無を決定するために該ゲノムＤＮＡを処理し、それによって予め決定されたハイブリダイゼーション方法に従って該嚢胞性線維症変異の有無を示す
過程を含む方法。
【請求項２１】
変異嚢胞性線維症関連遺伝子（ＣＦ遺伝子）としての請求項２の精製ＤＮＡ分子の制限エンドヌクレアーゼでの切断部位の有無を決定することからなる嚢胞性線維症キャリアまたは患者の検出方法。
【請求項２２】
変異嚢胞性線維症関連遺伝子（ＣＦ遺伝子）におけるアミノ酸残基位置５０８のフェニルアラニンの欠失の結果としてのヘテロデュプレックス（heteroduplex）ＰＣＲ産物のポリアクリルアミドゲルにおける移動度の差の決定からなる嚢胞性線維症キャリアの検出法。
【請求項２３】
イムノアッセイによる嚢胞性線維症関連遺伝子（ＣＦ遺伝子）の存在を測定するためのキットであって、
（ａ）ＣＦ遺伝子の遺伝子産物に特異的に結合する抗体、
（ｂ）抗体の遺伝子産物への結合を検出するための試薬手段とを有し、
（ｃ）これら抗体および試薬手段がイムノアッセイを行なうために有効な量で存在するキット。
【請求項２４】
ハイブリダイゼーションによって嚢胞性線維症関連遺伝子（ＣＦ遺伝子）の存在をアッセイするためのキットであって、
（ａ）ＣＦ遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブのＣＦ遺伝子とのハイブリダイゼーションを検出するための試薬手段を有し、
（ｃ）これらプローブ及び試薬手段がハイブリダイゼーションアッセイを行なうために有効な量でそれぞれ存在する
キット。
【請求項２５】
以下のタンパク質：
（１）約１７０,０００ダルトンのペプチド分子量、および細胞膜透過イオンコンダクタンス作用活性を有し、請求項１に記載の配列１におけるアミノ酸残基１〜１４８０のアミノ酸配列を有する精製された正常な嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質、または
（２）上記（１）に記載の正常な嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質の変異体であって、アミノ酸残基位置５０８のフェニルアラニンの欠失を含み、ヒト細胞中での嚢胞性線維形成活性を有する、精製された変異嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質、
に特異的であり、免疫学的に活性な抗−ＣＦＴＲポリクローナルまたはモノクローナル抗体。
【請求項２６】
薬学的に許容できる担体と組み合せて、治療的に有効な量で以下のタンパク質：
（１）約１７０,０００ダルトンのペプチド分子量、および細胞膜透過イオンコンダクタンス作用活性を有し、請求項１に記載の配列１におけるアミノ酸残基１〜１４８０のアミノ酸配列を有する精製された正常な嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質、または
（２）上記（１）に記載の正常な嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質の変異体であって、アミノ酸残基位置５０８のフェニルアラニンの欠失を含み、ヒト細胞中での嚢胞性線維形成活性を有する、精製された変異嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質
を含み、細胞塩素イオン輸送回復による嚢胞性線維患者の治療に使用するための組成物。
【請求項２７】
呼吸器上皮細胞への該組成物の適用を促進するための肺表面活性剤タンパク質を担体が含む請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１のＤＮＡ分子及び該ＤＮＡ分子の嚢胞性線維患者細胞への伝達のための伝達手段を含む嚢胞性線維症の遺伝子治療に有用な組成物。
【請求項２９】
伝達手段が組換えベクターである請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
嚢胞性線維症の徴候を示すトランスジェニックマウス。
【請求項３１】
正常または変異嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質（ＣＦＴＲ）の製造法であって、
（ａ）組換えクローニングベクターでトランスフェクションされた宿主細胞を培地中で正常または変異ＣＦＴＲタンパク質の発現に好ましい条件下で培養し、
（ｂ）発現された正常または変異ＣＦＴＲタンパク質を単離する過程
を有し、
前記組換えクローニングベクターが、
以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるＤＮＡ配列からなる精製ＤＮＡ分子：
（ａ）請求項１に記載の配列１のアミノ酸残基位置１から１４８０までに対応するＤＮＡ配列、
（ｂ）上記配列１のアミノ酸残基位置１から１４８０までの配列を有する正常な嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質（ＣＦＴＲ）をコードするＤＮＡ配列、
（ｃ）上記配列１のアミノ酸残基位置１と１４８０の間にある少なくとも１６個の連続するヌクレオチドからなる一部分のＤＮＡ配列、
（ｄ）少なくとも１６個のヌクレオチドからなり、上記配列１のアミノ酸配列の部分断片をコードするＤＮＡ配列および
（ｅ）上記配列１のアミノ酸残基位置１と１４８０の間の少なくとも１８個の連続するヌクレオチドによってコードされるエピトープを含む以下の部分：
アミノ酸残基２０４〜２４９の配列、アミノ酸残基３４７〜６９８の配列、アミノ酸残基７１０〜７５７の配列、アミノ酸残基７５８〜７９６の配列、アミノ酸残基１１８８〜１４８０の配列、アミノ酸残基２８〜４５の配列、アミノ酸残基５８〜７５の配列、アミノ酸残基１０４〜１１７の配列、アミノ酸残基１３９〜１５３の配列、アミノ酸残基２７９〜２９４の配列、アミノ酸残基５００〜５１２の配列、アミノ酸残基７２５〜７３９の配列、アミノ酸残基９３３〜９４６の配列またはアミノ酸残基１０６６〜１０８４の配列
をコードするＤＮＡ配列；及び
（ｆ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の精製ＤＮＡ分子であって、更にヒト体細胞内で発現した際に嚢胞性線維症に関連する細胞機能の変化に関係するＤＮＡ配列の変化、欠損または非機能性変異部分を含み、該ＤＮＡの変化、欠損または非機能性変異部分が、前記配列１におけるアミノ酸残基位置５０８のフェニルアラニン残基をコードするヌクレオチドの欠失を含む精製ＤＮＡ分子；
から選択された精製ＤＮＡ分子を含むことを特徴とする正常または変異ＣＦＴＲタンパク質の製造方法。
【請求項３２】
約１７０，０００ダルトンのペプチド分子量、および細胞膜透過イオンコンダクタンス作用活性を有し、請求項１に記載の配列１におけるアミノ酸残基１〜１４８０のアミノ酸配列を有する精製された正常な嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質。
【請求項３３】
約１７０，０００ダルトンのペプチド分子量、および細胞膜透過イオンコンダクタンス作用活性を有し、請求項１の配列１におけるアミノ酸残基１〜１４８０のアミノ酸配列を有する精製された正常な嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質の変異体であって、
アミノ酸残基位置５０８のフェニルアラニンの欠失を含み、ヒト細胞中での嚢胞性線維形成活性を有する、精製された変異嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質。
【請求項３４】
請求項３１の（ａ）〜（ｆ）から選択されたＤＮＡ配列にコードされ、正常または変異嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質（ＣＦＴＲ）の免疫学的または生物学的活性を示すポリペプチド。
【請求項３５】
請求項３４の正常または変異ＣＦＴＲタンパク質を該タンパク質を含む細胞から単離する方法であって、
（ａ）該正常または変異ＣＦＴＲタンパク質が発現している細胞の選択された細胞膜にあるタンパク質を可溶化して、該ＣＦＴＲタンパク質の溶液を提供し、
（ｂ）基体に固定された該正常または変異ＣＦＴＲタンパク質に対する抗体に、該溶液を接触させて、該溶液から該ＣＦＴＲタンパク質を分離し、
（ｃ）該基体を洗浄して該抗体に結合しなかったタンパク質を除去し、
（ｄ）該抗体から該ＣＦＴＲタンパク質を離して、該ＣＦＴＲタンパク質を単離し、
（ｅ）該ＣＦＴＲタンパク質を精製して、他の残留している哺乳動物性タンパク質を除去する過程を有する正常または変異ＣＦＴＲタンパク質の単離方法。
【請求項３６】
請求項３２または３３に記載の正常または変異ＣＦＴＲタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
【請求項３７】
請求項３１の組換えクローニングベクターを含む異種細胞系を有し、該ベクターが嚢胞性線維症の症候を誘導するものであるヒトを除く動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって支給されたグラントＲ０１ＤＫ３９６９０−０２およびＤＫ３４９４４による政府後援で行われた。政府は、本発明について一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、概して嚢胞性線維症（ＣＦ）遺伝子に関し、さらに詳細には正常および変異ＣＦ遺伝子類に対応するＤＮＡ配列の同定、単離およびクローニング、ならびにそれらの転写体および遺伝子産物類に関する。本発明は、さらに、ＣＦキャリアーのスクリーニングおよび検出方法、ＣＦ診断および出生前ＣＦスクリーニングおよび診断、および前記ＤＮＡＮ タンパク質、および前記タンパク質の代謝機能から誘導した情報を用いる組換え技術および薬物療法を利用した遺伝子治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、コーカサス人種において最もよくみられる重篤な常染色体劣性遺伝的疾患である。それは、北アメリカにおける生存出生２０００人中およそ１人に影響を及ぼす［Ｂｏａｔら、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，第６版、２６４９−２６８０頁、 ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、 ＮＹ（１９８９）］。２０人中およそ１人が本疾患のキャリアーである。本疾患は１９３０年代後半に初めて記載されたが、その根本的欠陥は不明のままである。嚢胞性線維症の主な症状として、慢性肺疾患、膵外分泌不全、および汗電解質レベル上昇が挙げられる。本症状は、外分泌障害である嚢胞性線維症と一致している。最近ＣＦ患者細胞の上皮の先端膜を横断するイオン運搬の解析が進んではいるが、塩素イオン（ｃｈｌｏｒｉｄｅ）チャンネルの異常制御が本疾患の一次欠陥を示すかどうかは明らかでない。本疾患の分子メカニズムの理解が欠如していることを考慮し、したがって、関与遺伝子の直接クローニングによりその染色体位置に基づいて分子欠損の性質を理解する試みが、異なる別の方法として行われた。しかし、本疾患の遺伝的基礎の正確な性質を導くようなまたは嚢胞性線維症遺伝子の同定を可能とするような明確な表現型は皆無である。集団遺伝学データに関連するＣＦ欠陥の性質は、容易には明らかとはならない。本疾患の有病率および臨床的異質性は、２−３の異なるメカニズム；高変異率、ヘテロ接合体の長所、遺伝的変動、複数座、および繁殖代償作用によって説明されてきた。仮説の多くは、根本的欠陥の知識が欠けているために試験することができない。したがって、ＣＦ遺伝子の決定および特性解析のための別の方法では、遺伝子解析によってこの遺伝子の局在を同定する試みを中心とした。ＣＦ遺伝子の抗原性かつタンパク質マーカー類への連結解析が１９５０年代に試みられたが、確たる結果は全く得られなかった［Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら，アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）８：１６２−１７６，（１９５６）；ＳｔｅｉｎｂｅｒｇおよびＭｏｒｔｏｎ、 アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）８：１７７−１８９，（１９５６）；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄら、ジャーナル・オブ・メディカルジェネティックス（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．）７：４１７−４１９，１９７６］。
【０００４】
さらに最近になって、連結解析を促進するためにＲＦＬＰ類を使用することが可能となった。ＣＦ遺伝子へのＲＦＬＰの最初の連結は、１９８５年に記載され［Ｔｓｕｉら、サイエンス Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３０：１０５４−１０５７，１９８５］、その中で連結がＣＦ遺伝子と特性解析されていないマーカーＤＯＣＲＩ−９１７との間に見られた。本関連は、ＣＦに罹患した子供を有する３９０家族の解析で判明した。このことは、染色体局在は立証されなかったが、本疾患遺伝子の局在がヒトゲノムのおよそ１％に、すなわち、３０００万ヌクレオチド塩基対に狭められたことを示唆している。ＤＯＣＲＩ−９１７プローブの染色体局在は、異なるヒト染色体補体を含むげっし類−ヒトハイブリッド細胞株類を用いて立証された。ＤＯＣＲＩ−９１７（およびしたがってＣＦ遺伝子）がヒト染色体７にマップされることが示された。
【０００５】
ＣＦ遺伝子の位置を特定する試みとして、さらに物理的および遺伝的な遺伝子連結研究を行った。Ｚｅｎｇｅｒｌｉｎｇら［アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４０：２２８−２３６（１９８７）］は、ヒト−マウス体細胞ハイブリッドを用いてＣＦ遺伝子とそれに連結していることが公知のマーカー類とのさらに詳細な物理的関係を得たことを記載している。この刊行物は、ＣＦ遺伝子が、染色体７上のバンドｑ２２の遠位部またはｑ３１の近位部のいずれかに帰せられることを示している。Ｒｏｍｍｅｎｓら［アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４３：６４５−６６３，（１９８８）］は、多数の新規７ｑ３１プローブ類の単離について詳細に検討している。概説された本方法により、互いに近接している２個の新規プローブ類、Ｄ７Ｓ１２２およびＤ７Ｓ３４０が単離された。パルスフィールドゲル電気泳動マッピングは、これらの２個のＲＦＬＰマーカー類がＣＦ遺伝子に隣接する２個のマーカー類、ＭＥＴ［Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ Ｓ．，Ｌｅｐｐｅｒｔ Ｍ．ら，ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１８：３８２−３８４，（１９８５）］およびＤ７Ｓ８［Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ、Ｂ．，Ｊ．，Ｓｃａｍｂｌｅｒ，Ｐ．Ｊ．，およびＪ．Ｓｃｈｍｉｄｔｋｅ，ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１８：３８４−３８５，（１９８５）］の間にあり、したがって、ＣＦ遺伝子領域の中にあることを示唆している。これらのマーカー類の発見は、染色体歩行およびジャンピング（ｊｕｍｐｉｎｇ）の出発点を提供する。
【０００６】
Ｅｓｔｉｖｉｌｌｅら、［ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２６：８４０−８４５ （１９８７）］は、候補ｃＤＮＡ遺伝子の位置を調べ部分的に特性解析した。しかし、このことは、ＣＦ遺伝子の正確な位置を教示するものではない。この参考文献はＣｐＧ島の下流にある候補ｃＤＮＡ遺伝子を記載しており、これは、多数の脊椎動物遺伝子類の上流の低メチル化ＧＣヌクレオチド含量の多い領域である。この候補座の染色体位置は、ＸＶ２Ｃ領域として同定されている。この領域は、欧州特許出願８８３０３６４５．１に記載されている。しかし、この実際の領域は、ＣＦ遺伝子を擁していない。
【０００７】
ＣＦ遺伝子同定で大きな問題は、マップ位置の知識によるヒト疾患遺伝子のクローニングにおけるこれまでの全ての成功を非常に促進し細胞学的に検出可能な染色体再配列類または欠失類がないことであった。このような再配列類および欠失類は細胞学的に観察でき、その結果、特定染色体上における物理的位置が特定疾患と相関させられる。さらに、この細胞学的位置は、一般に入手可能なＤＮＡプローブ類および細胞学的に可視可能な染色体中の改変の間の公知の関係に基づき、分子的位置と相関させられる。特定疾患遺伝子の分子的位置の知識によって、特に遺伝子産物が公知でかつこのクローニングされた遺伝子類の発現産物のイムノアッセイによって確認できる時、通常の操作によってこの遺伝子をクローニングしかつ配列決定することができるであろう。
【０００８】
対照的に、先行技術では、嚢胞性線維症の遺伝子の細胞学的位置または遺伝子産物のいずれも公知でなかった。ＣＦ遺伝子に隣接するがその分子的位置を特定することはないマーカー類であるＭＥＴおよびＤ７Ｓ８が最近同定され、本発明者らは、本発明によってＣＦ遺伝子に迫るためにさまざまな新しい手段を開発した。これらの手段に用いられた方法として、隣接マーカー類からの染色体ジャンピング、パルスフィールドゲル電気泳動の使用による定められた物理的領域からのＤＮＡ断片類のクローニング、ＣＦ近傍の低メチル化ＣｐＧ島からのＤＮＡ断片類の単離のために設計された体細胞ハイブリッドおよび分子クローニング技術の併用、染色体微細切断およびクローニング、および７ｑ３１領域からの多数のＤＮＡマーカー類の飽和クローニングが挙げられる。これらの新規手段によって、本発明者らは、先行技術では明確でなくまたは１例では誤りがあった嚢胞性線維症に関与する遺伝子を同定することができた。
【０００９】
これらの遺伝的および分子クローニング手段を応用して、その染色体位置に基づき嚢胞性線維症遺伝子の単離およびｃＤＮＡクローニングが、その方法を示唆するゲノム再配列の恩恵を受けることなく可能となった。ＣＦ遺伝子および遺伝子産物の正常および変異形態の同定によって、核酸プローブ類およびこの遺伝子産物に対する抗体類を用いるＣＦスクリーニングおよび臨床試験の開発が可能となった。欠陥遺伝子産物およびこの遺伝子産物が関与する経路の相互作用によって、正常遺伝子産物補充および遺伝子操作および運搬（デリバリ）による治療がこれで可能となる。
【非特許文献１】Ｂｏａｔら、ＴｈｅＭｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，第６版、２６４９−２６８０頁、 ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、 ＮＹ（１９８９）
【非特許文献２】Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら，アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）８：１６２−１７６，（１９５６）
【非特許文献３】ＳｔｅｉｎｂｅｒｇおよびＭｏｒｔｏｎ、 アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）８：１７７−１８９，（１９５６）
【非特許文献４】Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄら、ジャーナル・オブ・メディカルジェネティックス（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．）７：４１７−４１９，１９７６
【非特許文献５】Ｔｓｕｉら、サイエンス Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３０：１０５４−１０５７，１９８５
【非特許文献６】アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４０：２２８−２３６（１９８７）
【非特許文献７】アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４３：６４５−６６３，（１９８８）
【非特許文献２】Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ Ｓ．，Ｌｅｐｐｅｒｔ Ｍ．ら，ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１８：３８２−３８４，（１９８５）
【非特許文献２】Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ、Ｂ．，Ｊ．，Ｓｃａｍｂｌｅｒ，Ｐ．Ｊ．，およびＪ．Ｓｃｈｍｉｄｔｋｅ，ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１８：３８４−３８５，（１９８５）
【非特許文献１０】ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２６：８４０−８４５ （１９８７）
【特許文献１】欧州特許出願８８３０３６４５．１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
嚢胞性線維症疾患過程に関与する遺伝子は以下で"ＣＦ遺伝子"およびその機能的等価物と称するが、これが同定され、単離され、そして、ｃＤＮＡがクローニングされ、その転写物および遺伝子産物が同定かつ配列決定された。前記遺伝子産物中におけるフェニルアラニン残基の欠失をもたらす３個の塩基対欠損が決定され、ＣＦ罹患患者の約７０％におけるＣＦ遺伝子の変異に対応しており、残りの症例の全部とはいわないまでもほとんどにおいて異なる変異が関与していた。前記遺伝子および遺伝子産物の同定および配列決定により、核酸プローブ類および前記遺伝子産物に対した作成した抗体類を種々のハイブリダイゼーションおよび免疫アッセイに用いて、正常または欠損ＣＦ遺伝子または遺伝子産物のいずれの存在をもスクリーニングしかつ検出できる。このようなスクリーニングおよび診断のためのアッセイキット類も、また、提供できる。さて、遺伝子組換え法を用いて産生を増幅できる前記の正常遺伝子産物またはその機能的等価物を補充することによる患者の治療が、同様に可能となった。さらに、嚢胞性線維症は、前記の遺伝子欠損をインサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）で矯正するかまたは正常遺伝子産物発現が可能なＤＮＡ配列を前記患者の細胞に導入する組換えまたは他のビーイクル類を用いて治癒できまたは管理することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の１面によれば、ＤＮＡ分子は、
（ａ）図１に示したアミノ酸残基１位から１４８０位までのＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列類；
（ｂ）図１によるアミノ酸残基１位から１４８０位までの配列を有する正常ＣＦＴＲポリペプチド類をコードするＤＮＡ配列類；
（ｃ）アミノ酸残基１位から１４８０位までの間の少なくとも１６個の連続ヌクレオチド類を含む下記の図１の配列断片に対応するＤＮＡ配列類；
（ｄ）少なくとも１６個のヌクレオチド類からなりかつ図１のアミノ酸配列の断片をコードするＤＮＡ配列類；および（ｅ）図１の配列中においてアミノ酸残基１位から１４８０位までの間の少なくとも１８個の連続ヌクレオチド類によってコードされるエピトープをコードするＤＮＡ配列類、からなる群から選択されたＤＮＡ配列からなる。
【００１２】
本発明のもうひとつの面によれば、精製された変異ＣＦ遺伝子はある１個のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列からなり、この中で、前記タンパク質は、ヒト体細胞中で発現された時に遺伝的疾患嚢胞性線維症に相関する改変された細胞機能に関連している。
【００１３】
本発明のもうひとつの側面によれば、精製されたＤＮＡ分子は、上記のＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなる。本発明のもうひとつの側面によれば、１個のＤＮＡ分子は、上記のＤＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ分子からなる。本発明のもうひとつの側面によれば、精製された核酸プローブは、群（ａ）から（ｅ）までの上記に記載の選択されたＤＮＡ配列類に対応するＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列からなる。
【００１４】
本発明のもうひとつの側面によれば、ＤＮＡ分子は、下記の図１に示したアミノ酸残基１位から１４８０位までの配列を有する変異ＣＦＴＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からなる。本配列は、さらに、アミノ酸残基５０８位からのフェニルアラニンの欠失をもたらす３個の塩基対変異によって特徴づけられる。
【００１５】
本発明のもうひとつの面によれば、１個のＤＮＡ分子は、（ａ）変異ＤＮＡ配列に対応し、かつ、発現されると変異ＣＦＴＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列類（ｂ）少なくとも２０個のヌクレオチド類を含む変異ＤＮＡ配列類の１個の断片に対応するＤＮＡ配列類；（ｃ）少なくとも２０個のヌクレオチド類からなりかつ変異ＣＦＴＲタンパク質アミノ酸配列の１個の断片をコードするＤＮＡ配列類；および（ｄ）この変異ＤＮＡ配列中の少なくとも１８個の連続ヌクレオチド類によってコードされるエピトープをコードするＤＮＡ配列類、
からなる群から選択された１個のＤＮＡ配列からなる。本発明のもうひとつの面によれば、ＲＮＡ配列からなる精製されたＲＮＡ分子は、変異ＤＮＡ配列に対応する。
【００１６】
本発明のもうひとつの面によれば、正常または変異ＤＮＡおよびその断片類のＤＮＡ配列類からなる組換えクローニングベクターが提供される。本発明の面によれば、前記ベクターが、組換えＤＮＡ分子中において発現制御配列に操作上連結され、その結果、正常ＣＦＴＲタンパク質が発現されるか、または、これとは別に他の選択された変異ＤＮＡ配列によって、変異ＣＦＴＲポリペプチドが発現できる。発現制御配列は、原核または真核細胞類およびそれらのウイルス類およびその組み合わせ類の遺伝子類の発現を制御する配列からなる群から選択される。
【００１７】
本発明のもうひとつの面によれば、正常ＣＦＴＲポリペプチドを産生する方法は、（ａ）培地中でかつ正常ＣＦＴＲポリペプチドの発現に好適な条件下で正常ＤＮＡ配列のための組換えベクターを移入された宿主細胞を培養すること、および（ｂ）前記発現された正常ＣＦＴＲポリペプチドを単離すること、の段階からなる。
【００１８】
本発明のもうひとつの面によれば、変異ＣＦＴＲポリペプチド産生の方法は、（ａ）培地中でかつ変異ＣＦＴＲポリペプチドの発現に好適な条件下で変異ＤＮＡ配列のための組換えベクターを移入された宿主細胞を培養すること、および（ｂ）前記発現された変異ＣＦＴＲポリペプチドを単離すること、の段階からなる。
【００１９】
本発明のもうひとつの面によれば、ヒト細胞膜起源の精製されたタンパク質は、前記タンパク質がヒト細胞膜中に存在する時遺伝的疾患である嚢胞性線維症を起こす細胞機能と関連している変異ＤＮＡ配列によってコードされるアミノ（酸）配列からなる。
【００２０】
本発明のもうひとつの面によれば、前記ＣＦＴＲポリペプチドは、約１７０，０００ダルトンの分子量および上皮細胞膜通過（トランスメンブレン）イオン伝導率に影響を及ぼす活性を特徴とする。
【００２１】
本発明のもうひとつの面によれば、実質的に純粋なＣＦＴＲタンパク質がヒト上皮細胞において発現され、かつ、上皮細胞膜に結合することによって上皮細胞膜中に形成されたチャンネルを介してイオンの動きを修飾することによって、上皮細胞を介してイオン輸送の制御およびコントロールに関与することができることを特徴とする。
【００２２】
本発明のもうひとつの面によれば、ＣＦＴＲタンパク質を単離する工程は、（ａ）末梢タンパク質を上皮細胞膜から抽出し、前記のＣＦＴＲタンパク質を含む必須タンパク質を有する膜物質を提供すること；（ｂ）前記膜物質の前記必須タンパク質類を溶解し、前記必須タンパク質類の溶液を形成すること；（ｃ）前記ＣＦＴＲタンパク質を分離し、哺乳類起源の残りの全ての他のタンパク質類を除去すること、からなる。
【００２３】
本発明のもうひとつの面によれば、対象がＣＦキャリアーまたはＣＦ患者であるかどうかを決定するために患者をスクリーニングする方法が提供され、本方法は、前記スクリーニングすべき対象の生物試料を提供すること、前記生物試料中において正常ＣＦ遺伝子、正常ＣＦ遺伝子産物類、変異ＣＦ遺伝子、変異ＣＦ遺伝子産物類およびその混合物類からなる群由来の少なくとも１つの構成員の存在を検出するためのアッセイを提供することの段階からなる。本発明のもうひとつの面によれば、ＣＦＴＲポリペプチドに特異的な免疫活性抗ＣＦＴＲポリクローナルまたはモノクローナル抗体が提供される。
【００２４】
本発明のもうひとつの面によれば、イムノアッセイ法によってＣＦ遺伝子の存在をアッセイするキットは、（ａ）ＣＦ遺伝子の遺伝子産物に特異的に結合する抗体；（ｂ）前記遺伝子産物への抗体の結合を検出するための試薬手段；および（ｃ）それぞれ、前記イムノアッセイを実施するために有効な量で存在する抗体および試薬手段からなる。
【００２５】
本発明のもうひとつの面によれば、ハイブリダイゼーション法によってＣＦ遺伝子の存在をアッセイするためのキットは、（ａ）特異的に前記ＣＦ遺伝子に結合するオリゴヌクレオチドプローブ；（ｂ）前記オリゴヌクレオチドプローブの前記ＣＦ遺伝子へのハイブリダイゼーションを検出するための試薬手段；および（ｃ）それぞれ、前記ハイブリダイゼーションアッセイを実施するために有効な量で存在する抗体および試薬手段からなる。本発明のもうひとつの面によれば、患者の嚢胞性線維症を治療するための方法が提供される。本治療は、患者に対して治療有効量の正常ＣＦＴＲタンパク質を投与する段階からなる。本発明のもうひとつの面によれば、嚢胞性線維症の遺伝子治療方法は、正常ＣＦＴＲタンパク質をコードする正常ＤＮＡ配列に対応する配列を含むＤＮＡ分子の運搬（デリバリ）段階からなる。本発明のもうひとつの面によれば、動物は、非相同細胞系からなる。前記細胞系は、この動物における嚢胞性線維症症状を含む変異ＤＮＡ配列に対応する組換えＤＮＡ配列を含む組換えクローニングベクターを含む。本発明のもうひとつの面によれば、トランスジェニックマウスは、嚢胞性線維症症状を呈する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
１．定義
本発明のさまざまな態様のレビューおよび本発明をなすためにかつそれを用いる際に利用したさまざまな要素類および構成の理解を円滑にするために、本発明に使用した以下の用語の定義は、下記のようである：
ＣＦ−嚢胞性線維症
ＣＦキャリアー−外見上健康であるがその染色体がその人の子孫に遺伝することができる変異ＣＦ遺伝子を含有する者。
ＣＦ患者−各染色体上に変異ＣＦ遺伝子を有する者で、それらが嚢胞性線維症の症状を示す者。
ＣＦ遺伝子−その変異形態が本疾患嚢胞性線維症に関連している遺伝子。この定義は、存在する種々の配列多形性を含むものと理解されるが、前記遺伝子配列中でヌクレオチド置換が前記遺伝子産物の必須機能に影響を及ぼさないことを特徴とする。この用語は、元来、単離されたコード配列に関するが、また、隣接制御要素類および／またはイントロン類の一部または全てを含むことができる。
ＣＦ−ＰＩ−嚢胞性線維症膵不全は嚢胞性線維症患者の主要臨床サブグループであり、膵外分泌機能不全を特徴とする。
ＣＦ−ＰＳ−嚢胞性線維症膵良好群（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）は、正常食物消化のための十分な膵外分泌機能を有する嚢胞性線維症患者の臨床サブグループである。
ＣＦＴＲ−嚢胞性線維症膜通過（トランスメンンブレン）伝導率制御タンパク質で、ＣＦ遺伝子によってコードされる。この定義には、ヒトまたは動物起源から単離されたか、組換え有機体によって産生されたか、および化学的または酵素的に合成されたようなタンパク質を含む。この定義は、前記配列中の種々の領域内のアミノ酸置換が前記タンパク質の本来の機能、またはそのヒドロパシープロフィールまたは２次または３次構造に影響を及ぼさないさまざまな多形性形態を含むものと理解される。
ＤＮＡ−標準的命名法を用いて塩基類を同定した。
イントロンを有さないＤＮＡ−内部非コードセグメント類、例えばｃＤＮＡを欠失しているＤＮＡ片。
ＩＲＰ座配列−（プロトオンコジーンｉｎｔ−１関連）ＣＦ遺伝子近傍に局在する遺伝子。
変異ＣＦＴＲ−１次、２次およ３次構造の関連からＣＦＴＲに高度に類似しているタンパク質であるが、少数のアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入の結果、その本来の機能が傷害され、上皮細胞がＣＦＴＲよりもむしろ変異ＣＦＴＲを発現する有機体が嚢胞性線維症の症状を示すようなタンパク質。
ｍＣＦ−ヒトＣＦ遺伝子に同じ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）マウス遺伝子。
ＮＢＦ類−ヌクレオチド（ＡＴＰ）結合折り畳み。
ＯＲＦ−読みとり枠。
ＰＣＲ−ポリメラーゼチェーン反応。
タンパク質−標準的一文字表記命名法を用いてアミノ酸類を記載する。
Ｒ−領域−ＣＦＴＲタンパク質の高度に価電された細胞質領域。
ＲＳＶ−ラウス肉腫ウイルス。
ＳＡＰ−表面活性タンパク質
ＲＦＬＰ−制限酵素断片長多形性。
【００２７】
２．前記ＣＦ遺伝子の単離
染色体歩行、ジャンピングおよびｃＤＮＡハイブリダイゼーションを用いて、５００キロベース対（ｋｂ）以上を擁するＤＮＡ配列類を、嚢胞性線維症（ＣＦ）遺伝子を含有するヒト染色体７の長腕上の領域から単離した。数個の転写配列および保存セグメント類を、本領域で同定した。これらのひとつはＣＦ遺伝子に対応しており、かつ、ゲノムＤＮＡのおよそ２５０ｋｂにまたがる。重複する相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローン類を、嚢胞性線維症遺伝子部分を含有するゲノムＤＮＡセグメントによって上皮細胞ライブラリから単離した。この単離されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、図１に示してある。それぞれの配列類の各列で、下列はヌクレオチド配列の標準命名法によるリストである。それぞれの配列の各列の上列は、それぞれのコドンに対応するアミノ酸の標準一文字表記命名法である。
【００２８】
したがって、本発明は、（ａ）下記の図１に示したアミノ酸残基１位から１４８０位までのＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列類；
（ｂ）下記の図１によるアミノ酸残基１位から１４８０位までの配列を有する正常ＣＦＴＲポリペプチド類をコードするＤＮＡ配列類；
（ｃ）アミノ酸残基１位から１４８０位までの間の少なくとも１６個の連続ヌクレオチド類を含む下記の図１の配列断片に対応するＤＮＡ配列類；
（ｄ）少なくとも１６個のヌクレオチド類からなりかつ下記図１のアミノ酸配列の断片をコードするＤＮＡ配列類；および
（ｅ）下記１図の配列中においてアミノ酸残基１位から１４８０位までの間の少なくとも１８個の連続ヌクレオチド類によってコードされるエピトープをコードするＤＮＡ配列類、
からなる群から選択されたＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子を提供する。
【００２９】
本発明は、また、
（ａ）ヒト上皮細胞中における嚢胞性線維症関連活性を特徴づける変異ＣＦＴＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、または、さらに３個の塩基対変異によりアミノ酸残基５０８位からフェニルアラニン欠失が結果として生じることを特徴とするアミノ酸残基１位から１４８０位までの図１のＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列類；
（ｂ）パラグラフａ）の配列類の断片に対応しかつ少なくとも１６個のヌクレオチド類を含むＤＮＡ配列類；
（ｃ）少なくとも１６個のヌクレオチド類からなりかつパラグラフ（ａ）のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列の断片をコードするＤＮＡ配列類；および（ｄ）パラグラフａ）の配列中の少なくとも１８個の連続ヌクレオチド類によってコードされるエピトープをコードするＤＮＡ配列類、
からなる群から選択されたＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子を提供する。
【００３０】
長さがおよそ６，５００個のヌクレオチド類の転写体は、ＣＦ患者中の罹患組織中で検出可能である。単離されたヌクレオチド配列に基づいて、予測されたタンパク質は、それぞれが膜会合に一致する特性を有する第１領域およびＡＴＰ結合に関与すると確信されている第２領域を有する２つの類似領域からなる。
【００３１】
３ｂｐの欠失は、第１予測ヌクレオチド結合領域（ＣＦ遺伝子産物のアミノ酸５０８位）の中央のフェニルアラニン残基の欠落となり、これは、ＣＦ患者中で検出された。図１の正常ＤＮＡ配列中のこの変異は、嚢胞性線維症患者における変異のおよそ７０％に対応する。推定された疾患遺伝子に緊密に結合したＤＮＡマーカー類に基づいて延長されたハプロタイプデータから、ＣＦ変異遺伝子プールの残りが複数の異なる変異から構成されていることが示唆される。これらの後者の変異対立遺伝子のサブグループ（約８％）が、膵が良好である患者サブグループにおいて残りの膵外分泌機能を付与できる。
【００３２】
２．１ 染色体歩行およびジャンピング
Ｒｏｍｍｅｎｓら、同上のＤ７Ｓ１２２およびＤ７５３４０連結領域を包囲する大量のＤＮＡが、候補遺伝子配列類として検索された。従来の染色体歩行方法に加えて、染色体ジャンピング法をこの検索過程を加速するために採用した。各ジャンピング終端から、新しい両方向性歩行を開始させることができた。しばしば哺乳類ゲノム中で遭遇する"クローニング不可"の領域による連続歩行の停止は、染色体ジャンピングによって回避することができた。
【００３３】
使用した染色体ジャンピングライブラリは、過去に記載されている［Ｃｏｌｌｉｎｓら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３５，１０４６（１９８７）；Ｉａｎｕｚｚｉら、アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４４、６９５（１９８９）］。当初のライブラリは分取用パルスフィールドゲルによって調製し、７０−１３０ｋｂの部分的ＥｃｏＲＩ断片類を含有させることを意図した；このライブラリによるその後の実験から、小断片類が同様に示されることが示唆され、ジャンピングの長さが２５−１１０ｋｂであることが判明した。このライブラリをｓｕｐ宿主ＭＣ１０６１に接種し、標準的手法によってスクリーニングした［Ｍａｎｉａｔｉｓら］。陽性クローンをｐＢＲＡｖａ２３Ａｖａ２中にサブクローニングし、Ｃｏｌｌｉｎｓら、ゲノムアナリシス（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）：ア・プラクティカルアプローチ（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）（ＩＲＬ，ロンドン，１９８８）、７３−９４頁）に記載のようにして、ジャンピング開始および末端をＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩ消化によって同定した。各クローンについて、ジャンピング末端からの断片を調べ、染色体７上におけるその位置を確認した。染色体歩行およびジャンピングによって包含される隣接染色体領域は約２５０ｋｂであった。ジャンピングの方向は、プローブを注意深く選択することによって、ＣｏｌｌｉｎｓらおよびＩａｎｕｚｚｉら、同上によって記載のようにして偏らせた。ＣＦ遺伝子 ｃＤＮＡの使用によって単離された配列類を含む全領域をクローニングし、これは約５００ｋｂである。
【００３４】
染色体歩行およびジャンピング手段の概略を図２に示した。ＣＦ遺伝子エクソン類は、本図においてローマ数字によって示されている。地図上の水平線は、歩行段階を示しており、一方、地図上の弓形はジャンプ段階を示している。本図では６段のそれぞれで左から右へ進行しており、末端の方向は、示してあるように、７ｃａｎおよび７ｑｔｅｒに向かっている。酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＢａｍＨＩ酵素類の制限地図は、実線上に示してあり、全クローン領域を網羅している。垂直線よりもむしろ矢印で示した制限部位は、明確には位置が定められていない部位を示している。他の酵素類のための付加的制限部位を線の下に示してある。クローニングされた領域内のギャップは、||（二本の縦線）によって示されている。これらは、ＣＦ転写体のｃＤＮＡクローン類によって検出される部分にのみ出現する。これらのギャップは、本領域のパルスフィールドマッピングに基づくと、大きいことはありえない。地図上の水平線によって示された歩行クローン類は、各クローンで得られた歩行の進行を示す矢印の方向を有している。コスミドクローン類は、文字ｃによって開始する。他の全てのクローン類は、ファージである。コスミドＣＦ２６はキメラであることが証明された；点線を付けた部分は、もうひとつの染色体上の異なるゲノム断片から由来する。
【００３５】
ローマ数字ＩからＸＸＩＶまでは、ＣＦ遺伝子エクソン類の位置を示している。線の上に示した水平の四角は、本実験の間に使用したプローブ類である。前記プローブ類のうちの３個が、本領域の多形性検出のために先に同定された断片類の独立したサブクローニングを示している：Ｈ２．３ＡはプローブＸＶ２Ｃ（Ｘ．Ｅｓｔｉｖｉｌｌｅら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２６：８４０（１９８７））に対応し、およびプローブＥ４．１はＭｐ６ｄ．９（Ｘ．Ｅｓｔｉｖｉｌｌｅら、アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４４、７０４（１９８９）に対応している。Ｇ−２は、転写された配列を検出するＥ６の小断片である。Ｒ１６１，Ｒ１５９、およびＲ１６０は、ＩＲＰ座配列の部分から構築された合成オリゴヌクレオチドであり［Ｂ．Ｊ．Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔら，ＥＭＢＯ Ｊ、７：１７４３（１９８８）］、この転写体のゲノム地図上における位置を示している。
【００３６】
前記の２個の別々に単離されたＤＮＡマーカー類としてのＤ７Ｓ１２２（ｐＨ１３１）およびＤ７Ｓ３４０（ＴＭ５８）はおよそ１０ｋｂしか離れていないので（図２）、前記歩行およびジャンピングは、本質的に単一点から開始されていた。ＭＥＴおよびＤ７Ｓ８に関する歩行およびジャンピングの方向は、次に、数個の稀にしか切断されない（ＸｈｏＩ、ＮｒｕＩおよびＮｏｔＩに対するそれらのような、図２参照）制限エンドヌクレアーゼ認識部位の交差によっておよびＪ．Ｍ．Ｒｏｍｍｅｎｓら、アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）、印刷中；Ａ．Ｍ．Ｐｏｕｓｔｋａら，ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）２、３３７（１９８８）；Ｍ．Ｌ．Ｄｒｕｍｍら、ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）２、３４６（１９８８）の長い範囲の物理的地図を参考にして確認された。パルスフィールドマッピングデータは、同様に、本発明の発明者らによって同定されたこのＮｏｔＩ部位（図２参照、１１３ｋｂ位）が、ＩＲＰ座に関連した先に見いだされたもの（Ｅｓｔｉｖｉｌｌｅら１９８７、同上）に対応していることを明らかとしていた。その後の遺伝的研究からＣＦがＩＲＰおよびＤ７Ｓ８の間に位置している可能性［Ｍ．Ｆａｒｒａｌｌら、アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４３、４７１（１９８８）、Ｂ．Ｓ．Ｋｅｒｅｎら、アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４４，８２７（１９８９）］が極めて高かったので、歩行およびジャンピング作業をこの区間のクローニングにのみ向けて継続した。しかし、図２に示した他のコード領域は、例えば、Ｇ−２、ＣＦ１４およびＣＦ１６が局在され、さらに、広範囲に研究された。これらのその他の領域のこのような広範囲の研究から、それらが遺伝的データおよび配列解析に基づきＣＦ遺伝子ではないことが明らかとなった。ＣＦ遺伝子の位置およびその特徴についての知識がないので、この推定上の周辺コード領域を広い範囲で時間をかけて検討しても、ＣＦ遺伝子の検索の方向が進展することはなかった。しかし、これらの研究は、ＣＦ遺伝子がそれらの領域内にある可能性を除外するために必要であった。
【００３７】
２８０ｋｂセグメント内の３個の領域が、最初に使用した増幅ゲノムライブラリ中に回収可能でないことが判明した。これらのクローニング可能性が少ない領域はＨ２．３ＡおよびＸ．６ＤＮＡセグメントの近傍に位置しており、それぞれ、図２の７５−１００ｋｂ，２０５−２２５ｋｂおよび２７５−２８５ｋｂ位のコスミドｃＷ４４をちょうど越えたところにあった。Ｈ２．３Ａの近傍の組換えクローン類は極めて不安定であり、細菌培養を数代しか継代しなくてもその後に急激な再配列を起こすことが判明した。結果として生成したギャップを充填するため、不安定配列類の繁殖を可能とすると報告されている［Ａ．Ｒ．Ｗｙｍａｎ、Ｌ．Ｂ．Ｗｏｌｆｅ，Ｄ．Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、プロシーディングズ・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンシズ米国（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８２，２８８０（１９８５）；Ｋ．Ｆ．Ｗｅｒｔｍａｎ，Ａ．Ｒ．Ｗｙｍａｎ，Ｋ．Ｆ．Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、Ｄ．Ｂａｒｋｅｒ、Ｃ．Ｈｅｌｍｓ，Ｗ．Ｈ．Ｐｅｔｒｉ，ジーン（Ｇｅｎｅ）、４９，２６３（１９８６）］特定の宿主−ベクター系を使用して１次歩行ライブラリを構築した。コスミドｃＷ４４近傍の領域は回収されることに変わりはなかったが、Ｘ．６近傍の領域はこれらのライブラリによって救援され成功した。
【００３８】
２．２ ゲノムライブラリの構築
ゲノムライブラリは、Ｍａｎａｔｉｓ（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：ア・ラボラトリマニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載の操作の後に構築され、表１に列挙した。これには、８個のファージ類が含まれており、そのひとつは、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ［Ｆｒｉｔｓｃｈら、セル（Ｃｅｌｌ）、１９：９５９（１９８０）］によって提供された；残りは、本研究の部分としてＭａｎｉａｔｉｓら、同上に記載の操作に従って構築した。下記製造業者によって供与されたベクター腕によって、４個のファージライブラリがλＤＡＳＨ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に入手可能）中にクローニングされ、３個がλＦＩＸ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に入手可能）中にクローニングされた。１個のλＤＡＳＨライブラリは、ヒト染色体７含有ヒト−ハムスターハイブリッド（４ＡＦ／１０２／Ｋ０１５）由来Ｓａｕ３Ａ−部分消化ＤＮＡから構築され、他のライブラリは、ヒト末梢血またはリンパ芽球性ＤＮＡの部分Ｓａｕ３Ａ，総ＢａｍＨＩ、または総ＥｃｏＲＩ消化から構築された。
【００３９】
不安定配列類の損失を避けるため、このファージライブラリの内の５つを組換え−欠失宿主ＤＢ１３１６（ｒｅｃＤ−）、ＣＥＳ２００（ｒｅｃＢＣ−）［Ｗｙｍａｎら、同上、Ｗｅｒｔｍａｎ等、同上、Ｗｙｍａｎ等、同上］；またはＴＡＰ９０［Ｐａｔｔｅｒｓｏｎらヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１５：６２９８（１９８７）］上で繁殖させた。３つのコスミドライブラリを次に構築した。１つでは、ベクターｐＣＶ１０８［Ｌａｕら、プロシーディングズ・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンシズ米国（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８０：５２２５（１９８３）を用いて、部分消化（Ｓａｕ３Ａ）ＤＮＡを４ＡＦ／１０２／Ｋ０１５［Ｒｏｍｍｅｎｓら、［アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４３：４（１９８８）］をクローニングした。第２のコスミドライブラリは、部分消化（ＭｂｏＩ）ヒトリンパ芽球性ＤＮＡを、インターロイキン−２レセプターα鎖のための前記ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモータ駆動ｃＤＮＡ（Ｍ．ＦｏｒｄｉｓおよびＢ．Ｈｏｗａｒｄによって供与された）をｐＷＥ１５の新耐性遺伝子の代わりに挿入することによって調製したベクターｐＷＥ−ＩＬ２Ｒ中にクローニングすることによって、調製した［プロシーディングズ・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンシズ米国（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８４：２１６０（１９８７）］。追加の部分ＭｂｏＩコスミドライブラリは、ＳａｌＩリンカーをｐＷＥ−ＥＬ２ＲのＢａｍＨＩクローニング部位に挿入することによって作製された［Ｍ．Ｄｒｕｍｍ，未公表データ］ベクターｐＷＥ−ＩＬ２−Ｓａｌ中で調製された；これによって、ＳａｌＩおよびＭｂｏＩ末端の連結のために部分充填法を使用でき、タンデム挿入を回避する［Ｚａｂａｒｏｖｓｋｙら、ジーン（Ｇｅｎｅ）４２：１９（１９８６）］。コスミドライブラリは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株ＤＨ１または４９０Ａ中で繁殖させた［Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，Ａ．Ｗｉｎｏｔｏ，Ｋ．Ｍｉｎａｒｄ，Ｌ．Ｈｏｏｄ，セル（Ｃｅｌｌ）２８，４８９（１９８２）］。
【００４０】
【表１】
2004208694.tif 000002
このファージライブラリの３種を増殖させ、そして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＬＥ３９２中で増幅させた。４種のその後のライブラリは、組換え欠損宿主類ＤＢ１３１６（ｒｅｃＤ−）またはＣＥＳ２００（ｒｅｃＢＣ−）［Ｗｙｍａｎ１９８５，同上；Ｗｅｒｔｍａｎ１９８６，同上；およびＷｙｍａｎ１９８６，同上］にまたは１例ではＴＡＰ９０［Ｔ．Ａ．ＰａｔｔｅｒｓｏｎおよびＭ．Ｄｅａｎ，ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１５、６２９８（１９８７）］に接種された。各ファージまたはコスミド挿入物末端近傍の（繰り返し要素類を全く有していない）単一コピーＤＮＡセグメント類を精製し、標準的手法による重複ＤＮＡ断片類を単離するためのライブラリスクリーニングのプローブ類として使用した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、同上）。１−２×１０6ファージクローン類は、適当なインディケータ細菌宿主とともに１５０ｍｍシャーレ ２５−３０個に接種後、３７°Ｃで１０−１６時間インキュベートした。各プレートについて二重"リフト"をニトロセルロースまたはナイロン膜で調製し、記載の条件で予備ハイブリダイズおよびハイブリダイズさせた［Ｒｏｍｍｅｎｓら、１９８８，同上］。
【００４１】
プローブは、ランダムプライミング操作［Ａ．Ｐ．ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＢ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、アナリティカルバイオケミストリ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２，６（１９８３）］を用いて比放射能５×１０8ｃｐｍ／μｇを越えるまで32Ｐで標識した。このコスミドライブラリをアンピシリン含有プレート上に塗布し同様にしてスクリーニングした。
【００４２】
高いバックグラウンドシグナルを示すＤＮＡプローブ類は、前記プローブをハイブリダイゼーションバッグに入れる前に沸騰したプローブを２５０μｇ／ｍｌのせん断された変性胎盤ＤＮＡとともに６０分間前アニーリングすることによって、より良好に頻繁に使用できた。
【００４３】
各歩行段階について、クローニングされたＤＮＡ断片の中身は、その染色体位置を確認するための体細胞ハイブリッドパネルによるハイブリダイゼーションによって、そのゲノムとの同一直線性を確認するための制限マッピングおよびサザンブロット解析によって決定した。単離されたゲノムＤＮＡ配列類および重複するｃＤＮＡクローン類を全て組み合わせたクローニングされた領域は、５００ｋｂを越えて伸長していた。染色体歩行およびジャンピング操作によって単離されたＤＮＡセグメント類は、ゲノム配列と同一直線にあることを立証するため、各セグメントを：（ａ）染色体７の局在を確認するためのヒト−げっ歯類ハイブリッド体細胞によるハイブリダイゼーション解析、（ｂ）パルスフィールドゲル電気泳動、および（ｃ）クローニングされたＤＮＡの制限地図とゲノムＤＮＡのそれとの比較、によって調べた。
【００４４】
したがって、単一コピーヒトＤＮＡ配列類は、各組換えファージおよびコスミドクローンから単離され、Ｍａｎｉａｔｉｓら、同上の操作によって行うこれらのハイブリダイゼーション解析のそれぞれにおいてプローブとして使用した。ファージおよびコスミド単離物の大半は正確な歩行およびジャンプクローンを示す一方で、わずかが、クローニングアーティファクトまたはヒトゲノム中の他の領域からの交差ハイブリダイゼーション配列類から、または、前記ライブラリがヒト−ハムスターハイブリッド細胞株から由来する場合ハムスターゲノムから、結果として生成した。正確な位置の確認は、染色体ジャンピングによって単離されたクローン類について特に重要であった。多くのジャンプクローン類を検討し、前記遺伝子から研究の方向をそらすような結論とはならない情報が得られた。
【００４５】
２．３ 制限地図の確認
さらに、重複するクローン類の重複物理地図の確認を、パルスフィールドゲル電気泳動を用いて長い範囲の制限マッピング解析によって得た（Ｊ．Ｍ．Ｒｏｍｍｅｎｓ，アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．印刷中、Ａ．Ｍ．Ｐｏｕｓｔｋａら、１９８８、同上、Ｍ．Ｌ．Ｄｒｕｍｍら、１９８８、同上）。
【００４６】
図３Ａから３Ｅまでは、長い範囲の制限マッピング研究の知見を例示しており、その中で、本領域の概略をパネルＥに示した。ヒト−ハムスター細胞株４ＡＦ／１０２／Ｋ０１５由来ＤＮＡは、酵素（Ａ）ＳａｌＩ、（Ｂ）ＸｈｏＩ、（Ｃ）ＳｆｉＩおよび（Ｄ）ＮａｅＩによって消化され、パルスフィールドゲル電気泳動によって分離され、そして、ゼータプローブ（ＺｅｔａｐｒｏｂｅR）（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））に移した。各酵素について、単一ブロットを連続して図ＡからＤまでのパネル類のそれぞれの下に示したプローブ類とハイブリダイズさせ、前記ブロットをハイブリダイゼーションの間で切断した。図３Ｅの各酵素の記号は：Ａ，ＮａｅＩ；Ｂ，ＢｓｓＨＩＩ；Ｆ，ＳｆｉＩ；Ｌ，ＳａｌＩ；Ｍ，ＭｌｕＩ；Ｎ、ＮｏｔＩ；Ｒ，ＮｒｕＩ；およびＸ，ＸｈｏＩである。Ｃは、ゲルの圧縮ゾーン領域に対応する。ＤＮＡ調製物、制限消化、および交差フィールドゲル電気泳動方法が記載されている（Ｒｏｍｍｅｎｓら、印刷中、同上）。図３のゲル類は、０．５ＸＴＢＥ中を２０時間、７ボルト／ｃｍで走行させ、（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）について１０−４０秒間直線的に傾斜させて切り替え、８ボルト／ｃｍで２０時間、（Ｄ）について５０−１５０秒間直線的に傾斜させて切り替えた。ハイブリダイゼーションパターンの解釈図を各パネルの下に示した。断片長さはキロベースとして、そして、オリゴマーとしたバクテリオファージλＤＮＡおよびサッカロミセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）染色体との比較によって大きさを分類した。
【００４７】
Ｈ４．０，Ｊ４４，ＥＧ１．４は、歩行およびジャンピング実験から生じたゲノムプローブ類である（図２参照）。Ｊ３０は、Ｄ７Ｓ８からの４つの連続ジャンプによって単離された（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８７、同上；Ｉａｎｕｚｚｉら、１９８９，同上；Ｍ．Ｄｅａｎら、公表のために提出）。１０−１，Ｂ．７５，およびＣＥ１．５／１．０は、ＣＦ転写体の異なる領域を包含するｃＤＮＡプローブ類である：１０−１は、エクソン類Ｉ−ＶＩを含有し、Ｂ．７５はエクソン類Ｖ−ＸＩＩを含有し、およびＣＥ１．５／１．０は、エクソン類ＸＩＩ−ＸＸＩＶを含有する。図３Ｅには、全ＭＥＴ−Ｄ７Ｓ８区間の組成地図を示した。四角の領域は、歩行およびジャンピングによってクローニングされたセグメントを示唆しており、そして、斜線を入れた部分は、ＣＦ転写体によって網羅された領域を示唆している。Ｄ７Ｓ２３座に関連したＣｐＧ含量の多い領域（Ｅｓｔｉｖｉｌｌｅら、１９８７，同上）は、カッコに示したＮｏｔＩ部位にある。カッコまたはカギカッコに示したこの部位および他の部位は、４ＡＦ／１０２／Ｋ０１５内で切断せず、しかし、ヒトリンパ芽球性細胞株類で観察された。
【００４８】
２．４ ＣＦ遺伝子の同定
上記で詳細に述べた長い範囲の制限マッピングの知見に基づき、全ＣＦ遺伝子が、３８０ｋｂのＳａｌＩ断片上に含有されることが決定された。パルスフィールドゲル解析から由来する制限部位類の部分重複ゲノムＤＮＡクローン類で同定されたそれらとの配列から、このＣＦ遺伝子の大きさが約２５０ｋｂであることが明らかとなった。クローニングされたＤＮＡ断片類の地図および長い範囲の制限地図の配列に役だった最も情報に富んだ制限酵素は、ＸｈｏＩであった；組換えＤＮＡクローン類によって同定された９個のＸｈｏＩ部位の全てが、ゲノムＤＮＡ中の少なくとも部分切断に感受性であるらしかった（図１および２の地図と比較）。さらに、ＣＦ遺伝子の３'末端由来プローブ類とのハイブリダイゼーション解析では、２個のＳｆｉＩ部位が同定され、予測ＮａｅＩ部位の位置が確認された。これらの知見は、さらに、染色体歩行およびジャンピング操作によって単離されたＤＮＡセグメント類が、真の配列と同一直線にあることを裏付けた。
【００４９】
２．５ 同定の基準
１個以上の下記の基準に基づいた陽性の結果は、クローニングされたＤＮＡセグメントが候補遺伝子配列類を含有できることを示唆していた：（ａ）他種における交差ハイブリダイズ配列類の検出（多くの遺伝子類が進化論的保存を示すので）
（ｂ）脊椎動物遺伝子類の５'末端を頻繁にマークするＣｐＧ島の同定［Ａ．Ｐ．Ｂｉｒｄ，ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２１，２０９（１９８６）；Ｍ．Ｇａｒｄｉｎｅｒ−ＧａｒｄｅｎおよびＭ．Ｆｒｏｍｍｅｒ，ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１９６，２６１（１９８７）］、（ｃ）ＣＦ患者中の罹患組織中での可能なｍＲＮＡ転写体の検索、（ｄ）対応するｃＤＮＡ配列類の単離、（ｅ）クローニングされたＤＮＡセグメント類の直接配列決定による読みとり枠の同定。
【００５０】
種間ハイブリダイゼーションは、ＣＦ１４，Ｅ４．３およびＨ１．６をプローブとして用いたときにヒトおよびウシＤＮＡの間に強い配列保存があることを示しており、その結果は、図４Ａ，４Ｂおよび４Ｃに示してある。
【００５１】
ヒト、ウシ、マウス、ハムスター、およびニワトリゲノムＤＮＡ類は、ＥｃｏＲＩ（Ｒ），ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）、およびＰｓｔＩ（Ｐ）によって消化され、電気泳動させ、そして、ゼータバインド（ＺｅｔａｂｉｎｄR）（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ））にブロットされた。Ｒｏｍｍｅｎｓら、１９８８，同上のハイブリダイゼーション操作を、５５℃、０．２Ｘ ＳＳＣ，および０．１％ＳＤＳによる最大緊縮洗浄とともに用いた。図４のハイブリダイゼーションに使用したプローブ類は：（Ａ）全コスミドＣＦ１４，（Ｂ）Ｅ４．３、（Ｃ）Ｈ１．６を含んでいた。図（Ｄ）の略図において、影を付けた領域は、種間保存領域を示している。
【００５２】
異なるサブセットのバンドがこれらの２つの重複するＤＮＡセグメント類（Ｈ１．６およびＥ４．３）で検出されたという事実は、この保存配列が重複した領域の境界に位置している（図４（Ｄ））ことを示唆していた。これらのＤＮＡセグメント類を用いてさまざまな組織からＲＮＡ転写体を検出するとき、ハイブリダイゼーションシグナルが検出された。交差ハイブリダイズ領域を理解しかつ可能な読みとり枠を同定する試みとして、全Ｈ１．６のＤＮＡ配列類および前記Ｅ４．３断片の部分を決定した。結果は、２種の制限酵素（ＢｓｓＨＩＩおよびＳａｃＩＩ）のためのＣＧ含量の多い配列の長い伸長部はしばしば低メチル化ＣｐＧ島に関連して見られるが、これらを除くと、強い種間ハイブリダイーゼーションシグナル類を容易には説明できない短い読みとり枠しかなかったことを示していた。このＣｐＧ高含量の領域の配列決定によって明らかとなったメチル化状況を調べるために、繊維芽細胞およびリンパ芽球性細胞から調製したゲノムＤＮＡ試料を制限酵素ＨｐａＩＩおよびＭｓｐＩによって消化し、ゲルブロットハイブリダイゼーションによって解析した。酵素ＨｐａＩＩは、第２のシトシンが低メチル化である時にのみＤＮＡ配列５'−ＣＣＧＧ−３'を切断し、一方、ＭｓｐＩは、メチル化の状態に関わらずこの配列を切断する。小さいＤＮＡ断片類は両酵素によって産生され、このＣｐＧ含量の多い領域が実際にはゲノムＤＮＡ中において低メチル化であることを示唆していた。Ｅ４．３セグメント（図６）によるゲルブロットハイブリダイゼーションによって、両酵素によって極めて小さなハイブリダイズ断片類が明らかとなり、低メチル化ＣｐＧ島の存在を示唆していた。
【００５３】
上記の結果は、この座におけるコード領域の存在を示唆している。本領域から種間ハイブリダイゼーションシグナル類を検出するＤＮＡセグメント類（Ｅ４．３およびＨ１．６）をプローブ類として用いて、数組織および細胞タイプから作成したｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。
【００５４】
培養上皮細胞からのｃＤＮＡライブラリは、下記のようにして調製した。ＣＦ患者以外の者およびＣＦ患者から由来する汗腺細胞を、記載のようにして初代継代した［Ｇ．Ｃｏｌｌｉｅら、インビトロセルラー・エンド・デベロップメントバイオロジー（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．）２１，５９２，１９８５］。外側における整流チャンネルの存在は、これらの細胞中で確認された（Ｊ．Ａ．Ｔａｂｃｈａｒａｎｉ，Ｔ．Ｊ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｒ．Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｗ．Ｈａｎｒａｈａｎ，ジャーナル・オブ・メンブレンバイオロジー（Ｊ．Ｍｅｍｂ．Ｂｉｏｌ．）、印刷中）が、しかし、このＣＦ細胞類は、サイクリックＡＭＰによる活性化に無感受性であった（Ｔ．Ｊ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｗ．Ｈａｎｒａｈａｎ，Ｊ．Ａ．Ｔａｂｃｈａｒａｎｉ，Ｍ．ＢｕｃｈｗａｌｄおよびＪ．Ｒ．Ｒｉｏｒｄａｎ，ペディアトリックパルモノロジー（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｐｕｌｍｏｎｏｌｏｇｙ）、補遺２、１００，１９８８）。ＲＮＡは、それらから、Ｊ．Ｍ．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（バイオケミストリ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１８，５２９４，１９７９）の方法によって単離した。ポリＡ＋ＲＮＡが選択され（Ｈ．ＡｖｉｖおよびＰ．Ｌｅｄｅｒ，プロシーディングズ・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンシズ米国（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）６９、１４０８，１９７２）、オリゴ（ｄＴ）１２−１８をプライマーとするｃＤＮＡ合成のための鋳型（テンプレート）として使用した。第２の鎖は、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎによって合成した（ジーン（Ｇｅｎｅ）２５，２６３，１９８３）。これは、ＥｃｏＲＩメチラーゼによってメチル化され、末端は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによって平滑にした。リン酸化されたＥｃｏＲＩリンカー類をこのｃＤＮＡに連結し、ＥｃｏＲＩによって制限した。
【００５５】
過剰のリンカーの除去および部分的サイズ分画は、バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ａ−５０クロマトグラフィによって達成した。このｃＤＮＡ類は、次に市販のλＺＡＰのＥｃｏＲＩ部位に連結した。組換え体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＢ４中に封入され増殖させた。この封入された混合物の部分を増幅し、残りは、増幅前にスクリーニングのために保存した。同一操作を用いて、Ｔ−８４結腸腫瘍細胞株（Ｄｈａｒｍｓａｔｈａｐｈｏｒｏｎ、Ｋら、アメリカンジャーナル・オブ・フィジオロジー（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）２４６，Ｇ２０４，１９８４）の飽和前培養物から単離されたＲＮＡからライブラリを構築した。３つのライブラリの独立した組換え体の数は、非ＣＦ汗腺細胞について２×１０6個、ＣＦ汗腺細胞について４．５×１０6個およびＴ−８４細胞について３．２×１０6個であった。これらのファージ類は、１５ｃｍプレート当たり５０，０００個接種し、プラークリフトは、ナイロン膜（バイオダイン（Ｂｉｏｄｙｎｅ））を用いて作成し、そして、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびプライマーとしてのオリゴヌクレオチド類の無作為混合物を用いて32Ｐで標識したＤＮＡ断片でプロービングした。ハイブリダイゼーション条件は、Ｇ．Ｍ．ＷａｈｌおよびＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１５２，４１５，１９８７）によった。ブルースクリプト（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔR）プラスミド類は、Ｍ１３ヘルパーファージによる切断によってプラーク生成クローン類から救援した。肺および膵ライブラリは、クロンテックラボラトリ社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）から購入し、その報告された大きさは１．４×１０6および１．７×１０6個である独立したクローン類であった。
【００５６】
それぞれが１×１０5−５×１０6個の独立したクローン類を有する７種の異なるライブラリをスクリーニングした後、１個の単一クローン（１０−１として同定）を、非罹患（非ＣＦ）者の培養汗腺上皮細胞類から作成したｃＤＮＡライブラリからＨ１．６によって単離した。
【００５７】
ＤＮＡ配列決定解析は、１０−１が大きさが９２０ｂｐの挿入物および１個の長い潜在的読みとり枠（ＯＲＦ）を含有することを示していた。本配列の１端はＨ１．６と完全な配列同一性を有していたので、ｃＤＮＡクローンがおそらくこの領域から由来していると結論された。しかし、この共通のＤＮＡ配列は１１３ｂｐの長さしかなかった（図１および７を参照）。下記に詳細に記したように、この配列は現実に推定ＣＦ遺伝子の最も５’側のエクソンに対応していた。短い配列の重複はしたがってライブラリスクリーニングにおける弱いハイブリダイゼーションシグナル類およびＲＮＡゲルブロット解析における転写体の検出不能を説明した。さらに、転写単位の方向は、１０−１の推定ＯＲＦによるゲノムＤＮＡ配列の整列を基準として暫定的に立証された。
【００５８】
この対応する転写体は、ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーション実験によって長さがおよそ６５００個のヌクレオチドであると推定されたので、さらに、ｃＤＮＡライブラリスクリーニングがコード領域の残りをクローニングするために必要となった。結腸腫瘍細胞株Ｔ８４から作製されたｃＤＮＡライブラリによるいくつかの連続スクリーニングの結果、正常およびＣＦ汗腺細胞、膵および成人肺、１８個のその他のクローン類が単離された（さらに詳細には下記で検討した、図７）。ＤＮＡ配列解析は、これらのｃＤＮＡクローン類のいずれも観察された転写体の長さに対応していないことを明らかとしているが、しかし、重複領域類に基づいて共通配列を誘導することが可能であった。前記転写体の５'および３'末端に対応する付加的ｃＤＮＡクローン類は、５'および３'プライマー伸長実験から誘導した。これとともに、これらのクローン類は総計で６．１ｋｂにわたりかつ１４８０アミノ酸残基のポリペプチドをコード可能なＯＲＦを含有する。
【００５９】
ここで単離されたｃＤＮＡクローン類のほとんどは図７の制限地図のさまざまな位置における配列挿入物を含有していたことを観察したことは異常であった。本地図は、ＣＦ遺伝子のゲノム構造を詳細に示している。エクソン／イントロン境界が示されており、その中では、単離された全てのｃＤＮＡクローン類が図の上半分に概略示されている。これらの余分な配列類の多くは、ゲノムＤＮＡ配列類との配列で明らかなように、ｃＤＮＡ構築の間に逆転写されたイントロン領域に明確に対応していた。ライブラリスクリーニングで検出されたＣＦ遺伝子の組換えｃＤＮＡクローン類の数はＲＮＡハイブリダイゼーション実験で推定された豊富な転写体から予測されるよりもはるかに少なかったので、異常構造を含有するクローン類が優先して保存され一方適切なクローン類が増殖時に喪失するらしかった。本研究で単離された組換えクローン類の大半が、この解釈と一致するように、使用したベクターに無関係に増殖不良であることが観察された。
【００６０】
ｃＤＮＡの５'および３'末端類を得るために使用した操作は、記載されたものと類似していた（Ｍ．Ｆｒｏｈｍａｎら、プロシーディングズ・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンシズ米国（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８５、８９９８−９００２，１９８８））。５'末端クローン類について、総膵およびＴ８４ポリＡ＋ＲＮＡ試料を、放射性トレーサーを本反応に含めた以外はプライマー伸長反応について記載されたのと同様に、エクソン２に特異的な１個のプライマー（１０ｂ）を使用して逆転写した。１次鎖合成のアガロースビーズカラムから採取した分画を、溶出分画のポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）によってアッセイした。使用したオリゴヌクレオチドは、伸長プライマーのちょうど５'の１０−１配列内部に（ヌクレオチド１４５個離れて）あった。ＰＣＲ産物を生成する最初の分画をプールし、蒸発によって濃縮し、供給者（ＢＲＬラボラトリ（ＢＲＬ Ｌａｂｓ．））が推奨するように末端デオキシヌクオレチジルトランスフェラーゼ（ＢＲＬラボラトリ）およびｄＡＴＰでその後末端につないだ。次に、２次鎖合成を、Ｔａｑポリメラーゼ（シータス（Ｃｅｔｕｓ）社、ＡｍｐｌｉＴａｑR）によって、末端に連結したリンカー配列５'ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣ（Ｔ）12３'を含有するオリゴヌクレオチドを用いて実行した。次に、前記のリンカー配列、およびＥｃｏＲＩ制限部位をその５'末端に有する伸長プライマーのちょうど内側のプライマーを用いる固定（ＰＣＲ）実験による増幅を、行った。酵素類ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩによる制限およびアガロースゲル精製後、サイズ別に選択した産物を標準的操作によって（Ｍａｎｉａｔｉｓら、同上）Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入可能なプラスミドブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＫＳへクローニングした。回収されたクローン類の基本的に全てが３５０個未満ののヌクレオチド類挿入物を含有していた。３'末端クローン類を得るため、プライマー伸長のそれに類似の条件で、先に記載の末端連結リンカーオリゴヌクレオチドを用いて、１次鎖ｃＤＮＡを２μｇのＴ８４ポリＡ＋ＲＮＡの逆転写によって調製した。ＰＣＲによる増幅を前記のリンカーオリゴヌクレオチドおよびクローンＴ１６−４．５の公知の配列類に対応する３つの異なるオリゴヌクレオチド類によって実行した。分取用スケールの反応（２×１００μｌ）を、配列５'ＡＴＧＡＡＧＴＣＣＡＡＧＧＡＴＴＴＡＧ３'を有するこれらのオリゴヌクレオチド類のひとつで行った。
【００６１】
このオリゴヌクレオチドは、Ｔ１６−４．５の公知の配列内部のＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流の約７０個のヌクレオチドである。ＰＣＲ産物のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩによる制限を行い、次に、アガロースゲル精製で１．０−１．４ｋｂのバンドをサイズ選択した。この産物をその後Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入可能なプラスミドブルースクリプトＫＳ中にクローニングした。得られたクローンの約２０％をＴ１６−４．５の３'末端部分にハイブリダイズさせた。これらのクローン類から単離されたプラスミド類の１０／１０が同一制限地図を有しており、その挿入物の大きさは、約１．２ｋｂであった。ＰＣＲ反応の全てを酵素供給業者が示唆した緩衝液中で３０サイクル行った。１０−１クローンの５'末端から１５７ｎｔに位置する伸長プライマーを用いて、推定ＣＦ転写体の開始点を同定した。このプライマーの末端を５０００キューリー／ミリモルでγ［32Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識し、スパンカラムゲルろ過によって精製した。
【００６２】
次に、放射性標識プライマーをＴ−８４結腸腫瘍細胞から調製した４−５μｇのポリＡ＋ＲＮＡと２ｘ逆転写酵素緩衝液中で２時間、６０°Ｃでアニーリングした。希釈およびＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンシズ社（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．））の添加後、４１°Ｃにおけるインキュベーションを１時間行った。試料を次に０．４ＭＮａＯＨおよび２０ｍＭ ＥＤＴＡに調節し、最終的にＮＨ4ＯＡｃ、ｐＨ４．６で中性とし、フェノール抽出、エタノール沈澱、ホルムアミドによる緩衝液への再溶解、さらに、ポリアクリルアミドシークエンシングゲル上での解析を行った。これらの方法の詳細は、記載されている（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．））１５２，１９８７，Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ，Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ編著，アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、Ｎ．Ｙ．）。
【００６３】
１０−１の５'末端からの１５７ヌクレオチドで開始する伸長オリゴヌクレオチドプライマーを用いるプライマー伸長実験の結果を、図１０のパネルＡに示した。ＨａｅＩＩＩ（ＢＲＬラボラトリ）で消化した末端標識φＸ１７４バクテリオファージをサイズマーカーとして使用する。２個の主要産物が、２１６および１００ヌクレオチドで観察される。１０−１中の１００ヌクレオチドに対応する配列は、極めてＧＣ含量の多い配列（１１／１２）に対応し、これが逆転写酵素停止部位でありうることを示唆していた。５'固定ＰＣＲ結果は、図１０のパネルＢに示してある。左に示した１．４％アガロースゲルをブロットし、ゼータベース（ＺｅｔａｂａｓｅR）膜（バイオラドラボラトリ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ））に移した。放射性標識１０−１とのＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションは、右に示した。５'伸長産物は、１７０−２８０ｎｔまで大きさが変化し、主要産物は約２００ヌクレオチドにあることがわかる。ＰＣＲ対照レーンは、１４５ヌクレオチドの断片を示している。それは、１０−１配列内部の試験オリゴマー類を用いて得られた。示したサイズマーカー類は、サイズ１５４，２２０／２１０，２９８，３４４，３９４ヌクレオチド類（１ｋｂラダー（ｌａｄｄｅｒ）は、ＢＲＬラボラトリから購入した）に対応している。
【００６４】
図１０のパネルＢの下方に示した略図は、図７に示したクローン類ＰＡ３−５およびＴＢ２−７を産生するための増幅およびクローニングのために使用した２重鎖ｃＤＮＡを得るための操作を概略したものである。３'末端を特性解析するための固定ＰＣＲ実験は、パネルＣに示した。図１０Ｃの下方の略図に示したように、互いの相対位置が公知である３個のプライマー類を、逆転写されたＴ８４ＲＮＡによる増幅のために記載のように使用した。これらの産物類は１％アガロースゲル上で分離し、上記に記載のようにナイロン膜上にブロットした。Ｔ１６−４．５クローンの３'部分とのＤＮＡ−ブロットハイブリダイゼーションは、使用した特定オリゴマーおよび転写体の３'末端の間の距離に対応する大きさのバンド類を産生した。レーン１、２ａおよび３内のこれらのバンド類は、図１０のパネルＣの下に概略示してある。レーン３のバンドは、このセグメントのヌクレオチド６０個しか使用しなかったプローブと重複しないので、弱い。同様に略図に示しかつレーン２ｂに示したように、固定ＰＣＲ産物の制限によって産生された産物はクローニングを促進し、図７に示したＴＨＺ−４クローンを産生する。全転写体を網羅するｃＤＮＡ類の部分をプローブとしたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ酵素類によって消化したゲノムＤＮＡのＤＮＡ−ブロットハイブリダイゼーション解析から、本遺伝子がローマ数字ＩからＸＸＩＶまでとして番号を付けた少なくとも２４個のエクソン類を含有することを示唆している（図９参照）。これらは、図７に示した数値１から２４までに対応する。各バンドの大きさは、ｋｂで示してある。図７において、白色の四角は、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングからおよび前記の５'および３'末端をクローニングするために設計された固定ＰＣＲ実験から２２個を越えるクローン類を単離することによって同定された２４個のエクソン類のおよその位置を示している。各エクソンによって検出されたＥｃｏＲＩゲノム断片のｋｂ単位の長さも、また、示した。図７の斜線入り四角は、イントロン配列類の存在を示唆しており、かつ、点線入り四角は、他の配列類を示している。左下に閉鎖四角で示したのは、正常汗腺ライブラリの１０6個のファージ中から最初のｃＤＮＡクローンを検出するために使用したクローンＨ１．６の相対位置である。図４（Ｄ）および７に示したように、このゲノムクローンＨ１．６は、部分的に４．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片と重複する。示したｃＤＮＡクローン類の全てがゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、および／または制限地図上に良好にマッピングされた。このｃＤＮＡ類内部または対応するゲノム断片類中に出現する制限部位類の例を示した。
【００６５】
図９を参照として、ハイブリダイゼーション解析は、プローブ類；すなわち、パネルＡについてｃＤＮＡクローン類、パネルＢについてＴ１６−１（３'部分）、パネルＣについてＴ１６−４．５（中央部分）およびパネルＤについてＴ１６−４．５（３'末端部分）を含む。図９のパネルＡにおいて、ｃＤＮＡプローブ１０−１は、エクソンＩからＶＩまでのゲノムバンド類を検出している。ＮｒｕＩ制限によって作製されたＴ１６−１の３'部分は、パネルＢに示したようにエクソンＩＶからＸＩＩＩまでを検出する。このプローブは、１０−１と部分的に重複する。パネルＣおよびＤは、それぞれ、クローンＴ１６−４．５の中央および３'末端ＥｃｏＲＩ断片類によって検出されるゲノムバンド類を示している。２個のＥｃｏＲＩ部位がｃＤＮＡ配列内部に出現し、エクソンＸＩＩＩおよびＸＩＸを分割する。カッコ内のエクソン類によって示したように、２個のゲノムＥｃｏＲＩバンド類がこれらのエクソン類のそれぞれに対応する。他のゲノム断片類への交差ハイブリダイゼーションが観察された。これらのバンド類はＮによって示され、それらはヒト染色体７を含有するヒト−ハムスターハイブリッド中に出現しないので、染色体７起源のものではない。カギカッコ中のＸＩによって示したパネルＤ中のかすかなバンドは、前記ｃＤＮＡとの内部相同性による配列類の交差ハイブリダイゼーションが原因であると確信されている。
【００６６】
Ｔ−８４結腸腫瘍細胞株由来ＲＮＡのゲルブロットハイブリダイゼーション上で１０−１が強いバンドを検出したので、このｃＤＮＡを用いてその起源から構築されたライブラリをスクリーニングした。１５個の陽性物が得られ、それから、クローン類Ｔ６，Ｔ６／２０，Ｔ１１，Ｔ１６−１およびＴ１３−１が精製されかつ配列決定された。同ライブラリをＴ１６−１の３'末端からのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片０．７５ｋｂで再度スクリーニングして、Ｔ１６−４．５を生成した。Ｔ１６−４．５の３末端からの１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片は、Ｔ８−Ｂ３およびＴ１２ａを生成し、この後者は、ポリアデニル化シグナルおよび末端を有していた。同時に、ヒト肺ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした；ここで接頭辞"ＣＤＬ"によって示したものを含めて多くのクローン類が単離された。膵ライブラリを同様にスクリーニングして、クローンＣＤＰＪ５を生成した。
【００６７】
この転写体コピーをＣＦ患者から得るため、患者１例からの汗腺上皮細胞のｃＤＮＡライブラリを、Ｔ１６−１の３'末端からの０．７５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片によってスクリーニングして、エクソン１を除く全てを包含するクローン類Ｃ１６−１およびＣ１−１／５を単離した。これら２種のクローン類は両方ともエクソン１０中の３ｂｐの欠損を示し、これは、そのエクソンを有する他の全てのクローンに存在していない。肺ライブラリ由来のＣＤＬＳ２６−１およびＴ８４から単離されたＴ６／２０およびＴ１３−１は、部分処理転写体類から誘導した。このことは、ゲノムハイブリダイゼーションによっておよび各クローンのためのエクソン−イントロン境界を横切る配列決定によって確認した。Ｔ１１は、同様に、各末端で付加的配列を有していた。Ｔ１６−４．５は、イントロン配列に対応しないエクソン類１０および１１の間の境界近傍で小さい挿入物を有していた。肺ライブラリからのクローン類ＣＤＬＳ１６Ａ，１１Ａおよび１３Ａは，同様に、未知の起源の外来性配列類を有していた。このクローンＣ１６−１は、また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のγ−トランスポゾンの１部分に対応する短い挿入物を含有していた；この要素は、他のクローン中で検出されなかった。膵ＲＮＡから作製された５'クローン類ＰＡ３−５および固定ＰＣＲ法を用いてＴ８４ＲＮＡから作製されたＴＢ２−７は、図１に示したように５'末端における１個のヌクレオチドの長さにおける差異を除いて同一の配列を有している。Ｔ８４ＲＮＡから得られた３'クローンのＴＨＺ−４は、この領域のゲノム配列に一致する転写体の３'配列を有している。
【００６８】
ＣＦ遺伝子の推定コード領域を示す組み合わせ配列は、重複するｃＤＮＡクローン類から作製された。ｃＤＮＡクローン類のほとんどが明らかに未処理転写体から誘導されたので、この組み合わせ配列の正確さを確認するためにさらに研究を行った。各ｃＤＮＡクローンについて、１個のヒト染色体７を含有するヒト−ハムスター体細胞ハイブリッドによるハイブリダイゼーション解析によっておよびパルスフィールドゲル電気泳動によって染色体７に対する局在を最初に試験した。微細な制限酵素マッピングを各クローンについて同様に行った。重複する領域が明らかにクローン類のほとんどについて同定可能であるので、多くが、独自の制限パターンの領域を含有していた。
【００６９】
さらにこれらのｃＤＮＡクローン類を解析するために、これらをプローブ類としてＥｃｏＲＩ−またはＨｉｎｄＩＩＩで消化したヒトゲノムＤＮＡによるゲルハイブリダイゼーション実験で用いた。図９に示したように、５個乃至６個の異なる制限断片類が、１０−１ｃＤＮＡによって検出でき、かつ、類似数の断片類が他のｃＤＮＡクローン類で検出でき、推定ＣＦ遺伝子のために複数のエクソン類が存在することを示唆している。このハイブリダイゼーション研究は、また、未処理イントロン配列類を有するｃＤＮＡクローン類がゲノムＤＮＡ断片類のサブセットに対して優先的なハイブリダイゼーションを示したので、これらを同定した。確認されたｃＤＮＡクローン類について、それらの対応するゲノムＤＮＡセグメント類が単離されかつエクソン類および／またはエクソン／イントロン境界が配列決定された。図７に示したように、総計２４個のエクソン類が識別された。この情報および物理的マッピング実験の結果に基づいて、遺伝子座が染色体７上で２５０ｋｂに及ぶと推定された。
【００７０】
２．６ 配列
図１は、演繹されたアミノ酸配列とともに、ＣＦＴＲをコードするクローニングされたｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示している。最初の塩基位置は、Ｔｂ２−７よりもヌクレオチド１個だけ長い５'伸長クローンＰＡ３−５中の最初のヌクレオチドに対応する。矢印は、プライマー伸長解析による転写開始部位の位置を示している。ヌクレオチド６１２９の後にポリ（ｄＡ）鎖（ｔｒａｃｔ）が続く。エクソン結合部の位置は、垂直腺によって示唆される。膜を貫通する潜在的セグメント類は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１７９：１２５（１９８４）のアルゴリズムを用いて確認した。解析しかつ図１１に示した膜をおおう潜在的セグメント類は、図１の四角に囲んだ。図１１において、残基９個のペプチド類の平均ヒドロパシー係数［ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１５７：１０５、（１９８２）］をアミノ酸の数に対してプロットする。Ｇａｒｎｉｅｒら、（ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１５７、１６５（１９８２））によって予測した２次構造特徴の対応する位置は、下のパネルに示した。推定上のＡＴＰ結合折り畳みからなるアミノ酸類は、図１でアンダーラインを付けた。プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）またはＣ（ＰＫＣ）によってリン酸化が可能な部位は、白丸および黒丸によってそれぞれ示してある。白三角は、ＣＦにおいて欠失している３ｂｐ（ＣＴＴ）上にある。図１のこのｃＤＮＡクローン類は、ジュポンジェネシス（ＤｕＰｏｎｔ Ｇｅｎｅｓｉｓ）２０００R自動ＤＮＡシークエンサーにより35Ｓ標識ヌクレオチド類を用いたジデオキシチェーン法によって配列決定した。
【００７１】
組み合わせたｃＤＮＡ配列は、未翻訳領域の３'末端のポリ（Ａ）テイルを除く６１２９塩基対を跨いでおり、そして、１４８０個のアミノ酸のポリペプチドをコード可能なＯＲＦを有している（図１）。ＡＴＧトリプレット（ＡＵＧ）が、このＯＲＦの最初に存在している（塩基位置１３３−１３５）。このコドン（５'−ＡＧＡＣＣＡＵＧＣＡ−３'）を取り囲むこのヌクレオチド配列は、真核生物翻訳開始部位の共通配列（ＣＣ）Ａ／ＧＣＣＡＵＧＧ（Ｇ）の提起された特徴を−３位の高度に保存されたＡとともに有しているので、このＡＵＧが推定ポリペプチドの最初のメチオニンコドンに対応すること可能性が極めて高い。転写体の５'末端に対応する配列を得るため、プライマー−伸長実験を先にも述べたように実施した。図１０Ａに示したように、約２１６個のヌクレオチド類のプライマー伸長産物が観察され、前記転写体の５'末端がｃＤＮＡクローン１０−の末端の上流の約６０個のヌクレオチドで開始することを示唆していた。次に修飾されたポリメラーゼチェーン反応（固定ＰＣＲ）を用いて、この５'末端配列類のクローニングを促進した（図１０ｂ）。２個の独立した５'伸長クローン類はひとつは膵由来で他方はＴ８４ＲＮＡ由来であり、ＤＮＡ配列決定によって特性解析し、長さで１塩基しか違わないことが見いだされ、図１に示したように最も可能性の高い転写開始部位を示唆していた。
【００７２】
開始ｃＤＮＡクローン類のほとんどはｍＲＮＡ末端を示唆するポリＡテイルを有していないので、固定ＰＣＲを同様に転写体の３'末端に適用した（Ｆｒｏｈｍａｎら、１９８８，同上）。３個の３'伸長オリゴヌクレオチド類をｃＤＮＡクローンＴ１６−４．５の末端部分に対して作製した。図１０ｃに示したように、異なる大きさの３個のＰＣＲ産物が得られた。全てが転写体の末端がヌクレオチド５０２７位ＩＩおけるＨｉｎｄＩＩＩ部位の下流のおよそ１．２ｋｂであるという解釈と矛盾していなかった（図１参照）。代表的クローン類から誘導したＤＮＡ配列は、Ｔ８４ｃＤＮＡクローンＴ１２ａのそれ（図１および７参照）、その対応する２．５ｋｂのＥｃｏＲＩゲノム断片の配列と一致していた。
【００７３】
３．０ ＣＦの分子遺伝学
３．１ 発現部位
推定ＣＦ遺伝子のための転写体を可視化するため、ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーション実験をプローブとしての１０−１ ｃＤＮＡで行った。ＲＮＡハイブリダイゼーション結果は、図８に示した。ＲＮＡ試料は、外科病理からまたは剖検で得られた組織試料から先に記載の方法にしたがって調製した（Ａ．Ｍ．Ｋｉｍｍｅｌ，Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ，編著、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１５２，１９８７）。ホルムアルデヒドゲルをナイロン膜に移した（ゼータプローブ（ＺｅｔａｐｒｏｂｅR）；バイオラドラボラトリ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂ．））。先に公表された操作（Ｊ．Ｒｏｍｍｅｎｓら、アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４３，６４５−６６３，１９８８）にしたがって、ランダムプライミング法によってこの膜を次に標識されたＤＮＡプローブ類と高比放射能となるまでハイブリダイズさせた（Ａ．Ｐ．ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＢ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、アナリティカルバイオケミストリ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１３２，６，１９８３）。図８は、ｃＤＮＡクローン１０−１による示した組織中における６．５ｋｂの転写体へのハイブリダイゼーションを示している。各組織の総ＲＮＡ（１０μｇ）およびＴ８４結腸腫瘍細胞株のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（１μｇ）は、１％ホルムアルデヒドゲル上で分離した。２８Ｓおよび１８Ｓ ｒＲＮＡバンド類の位置を示している。矢印は、転写体の位置を示している。ＲＮＡマーカー標準物質（ＢＲＬラボラトリ）との比較によって、大きさを決めた。ＨＬ６０はヒト前骨髄細胞性白血病細胞株であり、Ｔ８４はヒト結腸癌細胞株である。
【００７４】
解析から、Ｔ８４細胞中において大きさが約６．５ｋｂの顕著なバンドが明らかとなった。同様に、強いハイブリダイゼーションシグナルが膵および鼻ポリープ由来細胞の初代培養中で検出され、推定ＣＦ遺伝子の成熟ｍＲＮＡが約６．５ｋｂであることを示唆している。おそらく分解産物を示しているのであろう小さなハイブリダイゼーションシグナルが、低サイズ範囲で検出されたが、それらは、異なる実験間で変化していた。同一の結果が、他のｃＤＮＡをプローブとしても得られた。ハイブリダイゼーションバンド強度および他の転写体について同一実験条件下で検出されたそれらとの比較に基づき、推定ＣＦ転写体がＴ８４細胞中の総ｍＲＮＡのおよそ０．０１％を構成すると推定した。
【００７５】
いくつかの他の組織も、１０−１遺伝子の発現パターンとＣＦの病理を相関させるためにＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーション解析によって調べた。図８に示したように、全て同一サイズの転写体が、肺、結腸、汗腺（培養上皮細胞）、胎盤、肝、および耳下腺で見られたが、これらの組織におけるシグナル強度は調製物が異なると変化し、かつ、膵および鼻ポリープ中で検出されるそれよりも一般に弱かった。強度は調製物が異なると変化しており、たとえば、腎におけるハイブリダイゼーションは、図８に示した調製物中で検出されなかったが、以後アッセイを繰り返して識別できる。脳または副腎ではいかなるハイブリダイゼーションシグナルも識別できず（図８）、または、皮膚繊維芽細胞およびリンパ芽球性細胞株でも識別できなかった。要約すれば、ＣＦ遺伝子の発現は調べた組織の多くで起こるらしかったが、ＣＦに重篤に罹患している組織中で高レベルであった。この上皮組織特異的発現パターンは本疾患の病理と極めてよく一致している一方で、ＣＦおよび対照組織由来転写体の量および大きさには有意な差が検出されず、ＣＦ変異がヌクレオチドレベルにおけるわずかな変化であるという仮定と一致している。
【００７６】
３．２ 主なＣＦ変異
図１７は、Ｆ５０８欠失におけるＤＮＡ配列を示している。左は、（ｃＤＮＡクローンＴ１６から誘導した）正常配列の塩基位置１６４９−１６６４からの配列の逆転写である。このヌクレオチド配列は、ジュポンジェネシス（ＤｕＰｏｎｔ Ｇｅｎｅｓｉｓ）２０００RＮＡ解析システムの２個の光電子増倍管（ＰＭＴ＃１および＃２）のそれぞれについて時間（ｘ軸）に対してプロットした（勝手に付けた蛍光強度単位による、ｙ軸）出力として表示されている。対応するヌクレオチド配列は、下方に示されている。右は、（ｃＤＮＡクローンＣ１６から誘導した）変異配列からの同一領域である。２重鎖プラスミドＤＮＡテンプレートは、アルカリ溶解操作によって調製した。アニーリングを４５°Ｃで３０分間行ったことおよび伸長／終止段階を４２°Ｃで１０分間行ったことを除いて、ＤｕＰｏｎｔによって推奨されたプロトコールにしたがって、プラスミドＤＮＡ５μｇおよびオリゴヌクレオチドプライマー７５ｎｇを各配列決定反応に使用した。非取り込み蛍光ヌクレオチド類は、ｐＨ７．０の２．５Ｍ酢酸アンモニウムの存在下におけるＤＮＡ配列決定反応産物のエタノール沈澱によって除去し、７０％エタノールで１回洗浄した。Ｔ１６−１配列決定のために使用したプライマーは、塩基位置１７０８−１７３１にまたがる特異的オリゴヌクレオチド５'ＧＴＴＧＧＣＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣ３'であり、Ｃ１６−１に対するそれは、ブルースクリプトベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に対する普遍的プライマーＳＫであった。
【００７７】
図１８は、また、手動配列決定によって決定したＦ５０８欠失の周りのＤＮＡ配列を示している。（ｃＤＮＡ Ｔ１６−１からの）塩基位置１７２６−１６５１からの正常配列を（ｃＤＮＡＣ１６−１からの）ＣＦ配列の側に示した。左のパネルは、Ｂプライマー（５'ＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴ−ＴＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣ３'）によって得られたコード鎖からの配列を示しており、かつ、右のパネルは、Ｄプライマー（５'ＧＴＴＧＧＣＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣ３'）による反対鎖のそれらを示している。カギカッコは、ＣＦにはない正常者の３個のヌクレオチド類を示している（矢印先端）。配列決定は、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｅｎ、プロシーディングズ・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンシズ米国（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７４；５４６３（１９７７）に記載のようにして行った。この欠失を有するＣＦ患者の割合を調べるため、患者およびその親からのゲノムＤＮＡ試料をそれぞれこの変異に隣接するオリゴヌクレオチドプライマー類でポリメラーゼチェーン反応で増幅し、正常および推定変異配列類（図２参照）に特異的な32Ｐ標識オリゴヌクレオチド類にハイブリダイズさせた。本解析の結果は、表２に示してある。
【００７８】
【表２】
2004208694.tif 000003
ＣＦ−ＰＩ（膵不全）およびＣＦ−ＰＳ（膵良好）染色体のデータは、我々の連結解析で使用したＣＦ家族から誘導した。これらの家族は、当初ＰＩまたはＰＳの知識もなく選択された；その後同定されたＣＦ−ＰＳの１５家族は、この計算の一部には入れなかった。未分類のＣＦ染色体は、トロント小児病院のＤＮＡ診断室（ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｔ ｔｈｅＨｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒＳｉｃｋ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ）から得られ、それらについての膵機能データは入手できなかった。
【００７９】
一般患者群のＣＦ染色体の６８％（１４５／２１４）は、Ｆ５０８欠失を有していた（表２）。対照的に、Ｎ染色体では、この欠失を有するものは皆無であり（０／１９８）（表２；χ2＝２０７，ｐ＜１０-57.5）、この配列変化がＣＦに特異的であることおよびそれが本疾患を起こす主な変異であることを示唆していた。Ｆ５０８欠失とＣＦとの間に全く組換えは検出されなかった。
【００８０】
配列の他の差異は、正常（Ｔ１６−４．５）およびＣＦ（Ｃ１−１／５）ｃＤＮＡクローン類との間で見られた。Ｔ１６−４．５は、塩基位置２６２９で１個のＣを示し、Ｃ１−１／５は１個のＴを示し、その結果、アミノ酸レベルでロイシン（Ｌｅｕ）からフェニルアラニン（Ｐｈｅ）への変化を起こしている。一４５４５で、塩基はＴ１６−４．５でＧであるが、Ｃ１−１／５ではＡであった（ＶａｌからＭｅｔ）。これらの知見は、配列多形性を表すと確信される。患者／家族ＤＮＡの特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション解析によって、これらが他の変異可能性として同定されるであろう。さらに、ヌクレオチドにおける差異が、異なるｃＤＮＡクローン類とゲノムＤＮＡ配列との間の３'未翻訳領域で観察された。配列のこのような差異および認識された他の配列修飾が可能である；たとえば、この差異が正常配列多形性およびクローニングアーティファクトによるものであり、このような差異の全てがその機能およびその商業的適用の観点からして図１に記載のような配列に基本的に等価である。さらに遺伝的および物理的マッピングデータは、染色体上の小セグメントのＤＮＡを中心とする分子クローニング研究に向けられた。ＣＦにおける染色体欠失および再配列（の知識が）が欠けているためにおよびＣＦ遺伝子産物のための十分に開発された機能的アッセイがないために、ＣＦ遺伝子の同定では、座そのものの詳細な特性解析およびＣＦおよび正常（Ｎ）対立遺伝子の間の比較を必要とした。ランダム（遺伝的に浮動性）で表現型では正常な者は、この群において無症状のキャリアーが高頻度であることから前記の比較の対照には入れなかった。その結果、それぞれが１個のＮおよび１個のＣＦ染色体を有すると定義されているＣＦ患者の両親のみが、本解析に適していた。
【００８１】
さらに、ＣＦおよび近接連結ＤＮＡマーカーの一部の間で観察された強い対立遺伝子関連の故に、ＮおよびＣＦの間に検出された配列差異が本疾患座に関連する多形性である可能性を除外することが必要になった。
【００８２】
３．３ ＲＦＬＰ類および家族研究の同定
染色体歩行およびジャンピング実験から単離されたＤＮＡセグメント類のそれぞれのＣＦとの関係を決定するため、制限断片長多形性（ＲＦＬＰ類）を同定しかつＣＦと他の隣接ＤＮＡマーカーとの間に交雑事象が過去に観察されている家族を研究するために用いた。図１４に示したように、総計１８種のＲＦＬＰ類が５００ｋｂ領域に検出された；それらの内の１７（Ｅ６からＣＥ１．０まで）を表３に列挙した；それらの一部は、先に報告されたマーカー類に対応していた。ＲＦＬＰ類の５つが、すなわち、１０−１Ｘ．６，Ｔ６／２０，Ｈ１．３およびＣＥ１．０が、推定ＣＦ遺伝子から誘導したｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡプローブ類で同定された。このＲＦＬＰデータは表３に示してあり、ＭＥＴおよびＤ７Ｓ８領域中のマーカー類も比較のために示してある。これらのマーカー間の物理的距離ならびにＤ７Ｓ８に対する関連を図１４に示した。
【００８３】
【表３】
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【００８４】
【表４】
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【００８５】
【表５】
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【００８６】
【表６】
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表３の注
（ａ）ＮおよびＣＦ−ＰＩ（膵不全ＣＦ）染色体の数は、関連解析に含めた家族の両親から誘導した［Ｔｓｕｉら、コールドスプリングハーバーシンポジウム（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．）クオンティテイティブバイオロジー（Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．）５１：３２５（１９８６）］。
（ｂ）Ｎ染色体中におけるＤＮＡマーカー対立遺伝子分布の変動で余り影響を受けない標準化された関係（Ａ）をここで用いて、ユール（Ｙｕｌｅ）の連関係数Ａ＝（ａｄ−ｂｃ）／（ａｄ＋ｂｃ）（式中、ａ，ｂ，ｃおよびｄはＮ染色体の数であり、それぞれ、ＤＮＡマーカー対立遺伝子は１、ＣＦは１、Ｎは２、ＣＦは２である）を比較した。相対リスクは、関係ＲＲ＝（１＋Ａ）／（１−Ａ）またはその逆数を用いて計算できる。
（ｃ）Ａ．Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら、アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）３６，１２３９、（１９８４）によって本群におけるＣＦ染色体の頻度を０．０２と想定し計算した対立遺伝子連関（＊）は、比較のために含めてある。
【００８７】
本解析で利用できた組換え家族の数が研究したマーカー類とＣＦとの距離が近接していることから予測されたように少ないために、また、診断過失の可能性のために、さらにＣＦ遺伝子の微細マッピングにおいて別の手法が必要であった。
【００８８】
３．４ 対立遺伝子連関
対立遺伝子連関（連関非平衡）は、多くの近接連関ＤＮＡマーカー類について検出された。対立遺伝子連関の遺伝子距離測定における用途は不確かである一方で、ＣＦと隣接ＤＮＡマーカー類との間で全体としての相関が観察された。ＣＦによる強い関連が、より近接したＤＮＡマーカー類、Ｄ７Ｓ８およびＤ７Ｓ１２２について注目され、一方、距離がより離れたマーカー類、ＭＥＴ、Ｄ７Ｓ８またはＤ７Ｓ２４についてはほとんどまたは全く関連が検出されなかった（図１参照）。
【００８９】
３にも示したように、ＤＮＡマーカー類とＣＦとの間の連関の程度は、（ユールの連関係数によって測定したように）ｍｅｔＨについて０．３５からおよびＪ３２について０．１７から１０−１Ｘ．６について０．９１まで（ＣＦ−ＰＩ患者家族のみを本解析で使用。彼らが、ＣＦ−ＰＳよりも遺伝的により均質であるように見えたので。）連関係数は、ＥＧ１．４からＨ１．３で３００ｋｂにわたってやや一定しているように見えた；数個の位置で検出された変動は、特にＨ２．３Ａ、Ｅ４．１およびＴ６／２０で最も顕著であったのは、おそらく、Ｎ染色体中における対立遺伝子分布の変動が原因であったのだろう（表２参照）。これらのデータは、したがって、組換え家族の研究からの結果と矛盾していなかった（図１４参照）。同様に、ＣＦ染色体類に関連する伸長されたＤＮＡマーカーハプロタイプ類を調べることによって、類似の結論に至った（下記参照）。しかし、ＥＧ１．４とＨ１．３の長い物理的距離にわたって検出された強い対立遺伝子連関も、ＣＦ遺伝子のより詳細なマッピングをさらに可能とすることはなかった。Ｊ４４は染色体歩行およびジャンピングによってｃＤＮＡクローンが同定される前に単離された最後のゲノムＤＮＡクローンであるので、前記のＪＧ２Ｅ１−Ｊ４４区間について検出された強い対立遺伝子連関によって、我々は、この全長にわたり候補遺伝子配列類を検索することになった。最大の対立遺伝子連関が、実際には、ＣＦおよび１０−１Ｘ．６によって検出された２個のＲＦＬＰ類の間で主要ＣＦ変異近傍領域で検出された。
【００９０】
表４は、ＣＦに近接して連関するＤＮＡマーカー類間の対になった対立遺伝子連関を示している。これらの計算で用いた平均染色体数は、７５−８０であり、ＣＦ−ＰＩ家族由来染色体のみをＣＦ染色体を数える際に使用した。類似の結果が、ユールの標準化された連関（ａ）を使用したときに得られた）。
【００９１】
【表７】
2004208694.tif 000008
強い対立遺伝子連関は、また、ＣＦおよびＮ染色体の両方で小群のＲＦＬＰ類中でも検出された。表４に示したように、互いに物理的に近接しているＤＮＡマーカー類は一般に互いに強い連関を有しているようであった。たとえば、強い（一部の場合では、ほとんど完全な）対立遺伝子連関は、隣接マーカー類Ｅ６およびＥ７の間、ｐＨ１３１およびＷ３Ｄ１．４の間、１０−１Ｘ．６によって検出されかつＥＧ１．４，ＪＧ２Ｅ１，Ｅ２．６（Ｅ．９），Ｅ２．８およびＥ４．１中で検出されたＡｃｃ−およびＨａｅＩＩＩ多形性部位類の間で検出された。ＭＥＴおよびＤ７Ｓ８領域中の遠位マーカー類の前記２群は、また、それ自体の間である程度の連関非平衡を示したが、それらは、Ｅ６からＣＥ１．０までのマーカー類との連関をほとんど示さず、ＭＥＴとＤ７Ｓ８の遠い位置と矛盾していなかった。一方、物理的に近接しているＤＮＡマーカー間に関連がないことは、組換えホットスポットの存在を示唆するかも知れない。これらの潜在的ホットスポットの例として、Ｅ７およびｐＨ１３１との間、Ｈ２．３Ａの近傍、Ｊ４４とプローブ類１０−１Ｘ．６およびＴ６／２０によって網羅される領域との間の領域が挙げられる（図１４参照）。頻度の高い組換え切断点を含有するこれらの領域は、ＣＦ領域のための伸長ハプロタイプデータの以下の解析で有用であった。
【００９２】
３．５ ハプロタイプ解析
２３個のＤＮＡマーカー類に基づいた伸長ハプロタイプ類は、先に関連解析で使用した収集された家族中のＣＦおよびＮ染色体類について作製された。異なるハプロタイプの染色体間の組換えを想定して、観察されたＣＦ染色体類のいくつかの系統を構築すること、および本疾患座の位置を予測することが可能であった。異なるＣＦ変異の性質を理解するために有用な情報をさらに得るため、Ｆ５０８欠失データを伸長ＤＮＡマーカーハプロタイプ類と相関させた。表５に示したように、ＮおよびＣＦハプロタイプの５種の主な群が、推定ＣＦ遺伝子内部またはそれに直接隣接する（領域６−８）ＲＦＬＰ類によって定義された。
【００９３】
【表８】
2004208694.tif 000009
【００９４】
【表９】
2004208694.tif 000010
【００９５】
【表１０】
2004208694.tif 000011
【００９６】
【表１１】
2004208694.tif 000012
【００９７】
【表１２】
2004208694.tif 000013
表５（続き）
（ａ） 伸長されたハプロタイプデータは、先の連関研究で使用したＣＦ家族（表３の脚注（ａ）参照）ならびにその後収集したＣＦ−ＰＳ家族（Ｋｅｒｅｍら、アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネテックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４４：８２７（１９８９））から誘導した。このデータは、紙面削減のため群（領域）別に示してある。領域は、表４に示した対にした関連データにしたがって、おもに示されており、領域６−８は、推定ＣＦ座（Ｆ５０８）にまたがる領域であり、欠失は領域６と７の間にある。棒線−は、不完全データまたは相確立が不可であったためにハプロタイプが決定されなかった領域に示されている。異なるハプロタイプ認定もデータが不完全である場合に示してある。未分類には、３個以上の分類不明の染色体を含めてある。９つの各領域のハプロタイプ定義は、下記のようである：
【００９８】
【表１３】
2004208694.tif 000014
【００９９】
【表１４】
2004208694.tif 000015
（ｂ）各群で数えた染色体の数：ＣＦ−ＰＩ（Ｆ）＝Ｆ５０８欠失を有するＣＦ−ＰＩ患者からのＣＦ染色体類；
ＣＦ−ＰＳ（Ｆ）＝Ｆ５０８欠失を有するＣＦ−ＰＳ患者からのＣＦ染色体類；
ＣＦ−ＰＩ＝ＣＦ−ＰＩ患者からの他のＣＦ染色体類；
ＣＦ−ＰＳ＝ＣＦ−ＰＳ患者からの他のＣＦ染色体類；
Ｎ＝キャリアー両親から誘導した正常染色体類。
【０１００】
ほとんどの組換えは領域１と２および領域８と９の間に起こることが明らかで、再度、これらの領域間の相対的に長い物理的距離と良好な一致を示していた。より頻度は低いが他の切断点も短距離区間に観察され、それらは、一般に、上記に示した対になった対立遺伝子関連研究によって同定されたホットスポットに対応していた。驚くべき結果として、このＦ５０８欠失が、最も頻度が高いＣＦハプロタイプであるＩ群とほとんど独占的に関連していたことが挙げられ、この欠失がＣＦにおける主な変異を構成しているという見解を裏付けている。さらに重要であることとして、このＣＦ染色体の８９％（６２／７０）で検出され、ＡＡハプロタイプ（前記２個の領域６と７に対応している）が前記欠失に隣接しているが、同一群内部で１４Ｎ染色体類中で全く見られなかった（ｘ2＝４７．３，ｐ＜１０-4）ことである。このＦ５０８欠失は、したがって、Ｉ群のハプロタイプのコアに関連した共通の配列多形性ではなかった（表５参照）。
【０１０１】
Ｆ５０８欠失のための特異的オリゴヌクレオチドプローブによって検出されたＣＦ染色体類のひとつは、異なるハプロタイプ群（ＩＩＩ群）に属していることが判明した。同一群の他の９個のＣＦ染色体または１７Ｎ染色体類のいずれもこのプローブにハイブリダイズしなかった。この特異的ハイブリダイゼーション結果は、この染色体に含まれる変異がＦ５０８に類似していることを示唆している。組換えまたは遺伝子変換はＩ群以外のハプロタイプ上における欠失の存在を説明できるメカニズムではあるが、これらの２種のＩＩＩ群染色体類が再発変異事象、すなわち、βグロビン座におけるβSおよびβE変異に類似の状況を表わす可能性が高い。これとともに、前記のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション研究の結果およびハプロタイプ解析は、本文に述べた遺伝子座がＣＦ遺伝子であること、および前記の３ｂｐ（Ｆ５０８）欠失がＣＦにおける最も一般的な変異であるという事実を裏付ける。
【０１０２】
３．６ 他のＣＦ変異
Ｆ５０８欠失の１個の共通及び１個の稀なＣＦハプロタイプとの連関によって、本患者群に関与している可能性のある変異事象の数についての洞察がさらに得られた。広範囲のハプロタイプデータに基づき、Ｆ５０８欠失が起こっている２個の元来の染色体類が、表５にも示したように、ハプロタイプ−ＡＡＡＡＡＡＡ−（Ｉａ群）、および−ＣＢＡＡＣＢＡ−（ＩＩＩａ群）を有しているらしい。この欠失を有している他のＩ群ＣＦ染色体は、おそらく、当初の染色体から誘導した組換え産物類であろう。もし各ハプロタイプ群中のこのＣＦ染色体類が同一起源から誘導されると見なされるならば、３−４個の付加的変異事象しか予測されないであろう（表５参照）。しかし、同一群内のＣＦ染色体類の多くは互いに顕著に異なっているので、各群をさらに細かく群別することが可能である。その結果、より多くの独立した変異事象が考えられ、そして、本データは、少なくとも７個の付加的推定変異もまたＣＦ−ＰＩ表現型に関与していることを示唆する（表４参照）。ＣＦ−ＰＳサブグループを生む変異類は、おそらくさらに不均質であろう。
【０１０３】
７個の付加的ＣＦ−ＰＩ変異は、ハプロタイプ類：−ＣＡＡＡＡＡＡ−（Ｉｂ群）、−ＣＡＢＣＡＡＤ−（Ｉｃ群）、−−−ＢＢＢＡＣ−（ＩＩａ群）、−ＣＡＢＢＢＡＢ−（Ｖａ群）によって表される。これらの各変異における分子欠損はまだ決定されていないが、これらの変異のいずれも、ＰＣＲ／ハイブリダイゼーション実験で使用したオリゴヌクレオチド結合部位類に対応する領域に影響を及ぼさないことが明らかである。
【０１０４】
３．７ 膵良好
ＣＦ−ＰＳは、食物消化のための膵外分泌機能が良好であるとして臨床的には定義される；しかし、残りの膵酵素活性の消化系におけるレベルは、患者毎に変化する。先のハプロタイプデータは、ＣＦ−ＰＩおよびＣＦ−ＰＳ患者が異なる変異対立遺伝子の故に存在することを示唆していた。ＣＦにおける根本的生化学的欠損はまだ明らかとなっていないが、ＣＦ−ＰＳ患者におけるこの残りの膵酵素活性が変異ＣＦ遺伝子産物の活性を直接反映している可能性がある。したがって、穏和な（ＣＦ−ＰＳ）対立遺伝子によって付与された残りの外分泌機能は正常遺伝子産物のそれよりもはるかに低いが、ほとんどか全く機能を持たないより重篤な（ＣＦ−ＰＩ）変異のそれをしのぐ優性表現型を構成するのであろう。したがって、重篤対立遺伝子を２コピーしか有していない患者のみがＣＦ−ＰＩであり、かつ、１個または２個の穏和な対立遺伝子を有する患者はＣＦ−ＰＳであるのであろう。上記仮説を試験するため、Ｆ５０８欠失を有するＣＦ患者の割合についての情報を利用することができた。重篤な変異は穏和な変異に対して劣性でかつＣＦ対立遺伝子の患者群での分布がハーディー・ワインバーグ則（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｌａｗ）に従うと想定して、重篤対立遺伝子の頻度が０．６２であり、穏和対立遺伝子（Ｍ）のそれは０．０８であると推定できた（表６参照）。
【０１０５】
【表１５】
2004208694.tif 000016
（ａ）対立遺伝子定義：Ｆ＝前記の３ｂｐ欠失（アミノ酸５０８位におけるフェニルアラニン欠失）；Ｓ＝未解析の重篤変異対立遺伝子；Ｍ＝未解析穏和対立遺伝子。
（ｂ）ＣＦ−ＰＩ変異表現型は、ＣＦ−ＰＳ変異表現型に対して劣性であると想定して、３ｂｐ欠失を含むＣＦ−ＰＩ変異対立遺伝子の頻度をＣＦ臨床で観察されたＣＦ−ＰＩ患者の割合から推定できた［Ｃｏｒｅｙら、ジャーナル・オブ・ペディアトリックス（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．）１１５：２７４（１９８９）］、すなわち、（０．８５）＝０．９２。観察された総ＣＦ群におけるＦの対立遺伝子頻度は０．６８（表３）である；Ｓの頻度は０．９２−−０．６８−０．２４である；Ｍの頻度は１−０．９２−０．０８である。各遺伝型の頻度を次に、ハーディー・ワインバーグ則（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｌａｗ）を用いて計算した。
（ｃ）各分類のＣＦ−ＰＩおよびＣＦ−ＰＳ患者の数は、図１５に示したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって得られた。患者は、我々の連関解析で使用したＣＦ家族由来であり、さらに、その他に以後の研究からの１４ＣＦ−ＰＳ患者／家族があった。ＳＭおよびＭＭは遺伝型または表現型では識別できないが、それらは、本解析でまとめた。
（ｄ）期待数は、各群内で標準化した後ＣＦ−ＰＩおよびＣＦ−ＰＳについて計算した。適合のχ2は、０．８６であり、ｄ．ｆ．＝３，０．７４＜ｐ＜０．９０である。
（ｅ）この数値は、もしＦ５０８欠失が全ＣＦ染色体中でハーディー・ワインバーグ（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）平衡にあるならば、期待されるよりも高い（観察値１５対期待値９．６）（χ2＝６．４８、ｄ．ｆ．＝１，ｐ＜０．０１１）。
【０１０６】
ＣＦ−ＰＩ患者の大半はＦ５０８変異に対してホモ接合（Ｆ）であることが見いだされたので、この変異が重篤対立遺伝子のひとつに対応すると想定することが論理的であった。調べたＣＦ群におけるＦの観察頻度（０．６８）を考慮し、残りの重篤対立遺伝子（Ｓ）の頻度を誘導できた。ＦＦ，ＳＳ，ＭＭ，ＦＳ，ＦＭおよびＳＭ患者の割合を次に計算した。ＳＭおよびＭＭの各患者は表現型または遺伝型で識別できなかったので、それらを解析でまとめた。表６に示したように、全５群の患者の観察頻度は、この仮説から予測された通りであった。したがって、上記解析から、ＣＦ−ＰＩが２個の重篤対立遺伝子の存在によることおよびＣＦ−ＰＳ患者が単一の重篤対立遺伝子かまたは２個の穏和な対立遺伝子のいずれかを有しているという我々の見解の強い裏付けが得られる。このモデルは、同様に、ＣＦ−ＰＩ群よりもＣＦ−ＰＩにおけるＦ５０８欠失の低い頻度および１コピーの欠失を有するＣＦ−ＰＳ患者の過剰数を説明する。Ｍ対立遺伝子によって付与される予測優性表現型を考慮すれば、Ｍ対立遺伝子類を有する者を同定するために、ＣＦ−ＰＳ患者中におけるＣＦ染色体を検討することが必要であった。表７に示したように、７０の代表的ＣＦ−ＰＳ患者の内の５例が１コピーのＦ５０８欠失を有している；少なくとも５種の異なるハプロタイプのＣＦ染色体と関連づけることができた。
【０１０７】
【表１６】
2004208694.tif 000017
（ａ）ハプロタイプ定義は表５の場合と同様である。
（ｂ）対立遺伝子の定義は表６の場合と同様である：Ｆ＝Ｆ５０８欠失；Ｓ＝未解析重篤変異対立遺伝子；Ｍ＝未解析穏和変異対立遺伝子。
これらの後者の観察から、ＣＦ−ＰＳ患者の大半が複合ヘテロ接合体であることの裏付けがさらに得られる。
【０１０８】
４．０ ＣＦＴＲタンパク質
図１のＤＮＡ配列に関して検討したように、重複しているｃＤＮＡクローン類の配列の解析から、分子量１６８，１３８ダルトンを有するアミノ酸１４８０個の未処理ポリペプチドが予測された。以下で説明するように、前記タンパク質における多形性の故に、このタンパク質の分子量は、あるアミノ酸の置換または欠失の可能性のために変化することができる。この分子量は、また、炭水化物単位の付加で変化し、糖タンパク質を形成するであろう。なた、前記細胞中の機能的タンパク質が、未処理ポリペプチドに類似であろうと考えられるが、細胞代謝の故に改変されるかもしれない。したがって、本発明は、分子量約１７０，０００ダルトンおよび上皮細胞膜通過（トランスメンブレン）イオン伝導率活性を有することを特徴とする精製された正常ＣＦＴＲポリペプチドを提供する。この正常ＣＦＴＲポリペプチドは実質的に他のヒトタンパク質類を全く含んでおらず、上述のＤＮＡ配列によって図１の１態様によって、コードされる。このようなポリペプチドは、正常ＣＦＴＲポリペプチドの免疫または生物活性を示す。以下でも説明するが、このＣＦＴＲポリペプチドまたはその断片類は、化学または酵素ペプチド合成によって作製できるかまたは適当な培養細胞系で発現できる。本発明は、また、ヒト上皮細胞における嚢胞性線維症関連活性を特徴とする精製された変異ＣＦＴＲポリペプチドを提供する。このような変異ＣＦＴＲポリペプチドは、他のヒトタンパク質を実質的に含まないので、この変異ＤＮＡ配列によってコードできる。
【０１０９】
４．１ ＣＦＴＲの構造
前記の予測タンパク質の最も特徴的な特性として、それぞれが膜を数回貫通することが可能な１組のアミノ酸残基類とその後に続く共通配列（ＡＴＰ）結合折りたたみ（ＮＢＦｓ）に類似の配列で構成されている２種の繰り返し単位が存在していることが挙げられる（図１１、１２および１６）。これらの特徴は、哺乳類多剤耐性Ｐ−糖タンパク質およびいくつかの他の膜関連タンパク質類のそれに極めて類似しており、したがって、前記予測されたＣＦ遺伝子産物が膜を横切る物質類（イオン類）の運搬に関与しているらしいことおよびこの膜が膜タンパク質スーパーファミリの一員であるらしいことを示唆している。
【０１１０】
図１３は、予測ＣＦＴＲタンパク質の概略モデルである。図１３において、円柱は膜を貫通するらせんを示しており、斜線を入れた（ｈａｔｃｈｅｄ）球はＮＢＦ類を示している。この点を入れた球は、極性のＲ領域である。前記分子の各半分における６本の膜を貫通するらせんは、円柱として描かれている。内部の細胞質に対してＮＢＦ類は斜線入り球として示されており、スロットは、ヌクレオチドによる流入手段を示している。この２個の半分を結合する大きい極性Ｒ領域は、点入り球によって表される。膜通過（トランスメンブレン）セグメント類内部およびＲ領域表面上の価電された各アミノ酸類は、電荷の符号を有する小円として描かれている。膜円柱に結合する内部および外部ループ類上およびＮＢＦ類の領域上における真の電荷は、白色正方形中に含まれている。プロテインキナーゼＡまたはＣによるリン酸化の部位類は、それぞれ、黒の三角形および白の三角形で示されている。Ｋ，Ｒ，Ｈ，ＤおよびＥは、それぞれ、アミノ酸類であるリシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸の標準的命名法である。
【０１１１】
ＣＦＴＲタンパク質の予測された膜関連領域のそれぞれは、高度に疎水性でＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのアルゴリズムおよびＧａｒｎｉｅｒら（ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１２０，９７（１９７８））のアルゴリズムに従って脂質２重層にまたがることが可能な６個のセグメント類から構成されている（図１３）。この膜関連領域には、それぞれ、ＮＢＦ類を含有する大きな親水性領域が続いている。他の公知のヌクレオチド結合タンパク質類との配列整列に基づくと、ＣＦＴＲにおける推定ＮＢＦ類のそれぞれは、少なくとも残基１５０個からなる。ＣＦ患者の大半で検出された前記の３ｂｐ欠失は、ＣＦＴＲの第１番目のＮＢＦの最も高度に保存されたセグメント類２個の間に局在している。フェニルアラニン欠失を取り囲む領域といくつかの他のタンパク質類の対応する領域類間のアミノ酸配列同一性から、この領域が機能的に重要であることが示唆される（図１６）。通常芳香族側鎖を有するものである疎水性アミノ酸１個が、ＣＦＴＲタンパク質のＦ５０８に対応する位置のこれらのタンパク質類のほとんどに存在している。アミノ酸多形性がＤＮＡ多形性の結果として存在できることがわかる。
【０１１２】
図１６は、ＣＦＴＲの伸長されたＮＢＦ類の最も保存されたセグメント類３個の整列と他のタンパク質類の対応する領域類を示している。これらの３個のセグメント類は、ＣＦＴＲのＮ末端半分の残基４３３−４７３，４８８−５１３，および５４３２−５８４およびＣ末端半分の１２１９−１２５９，１２７７−１３０２，および１３４０−１３８２から構成されている。厚く線を重ねたところは、類似性最大の領域類を示唆している。ギャップを導入しないでも付加的な一般的相同性が見られる。
【０１１３】
ＮＢＦ類のタンパク質の構造および配列保存における全体としての対称性にもかかわらず、予測されたＣＦＴＲタンパク質の２個の半分の間の配列相同性が中等度である。このことは図１２に示されており、アミノ酸１−１４８０が各軸上に示されている。同一性斜線の片側の線は、内部類似性の位置を示している。したがって、４組の内部配列同一性が、Ｌａｗｒｅｎｃｅら［Ｃ．Ｂ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｄ．Ａ．Ｇｏｌｄｍａｎ，およびＲ．Ｔ．Ｈｏｏｄ，ブリテン・オブ・マシマティカルバイオロジー（Ｂｕｌｌ ＭａｔｈＢｉｏｌ．）４８，５６９（１９８６）］によって適用されたＤａｙｈｏｆｆ点数表を用いて図１２に示したように検出でき、これらの内の３つのみが、標準偏差の小さい方のしきい値設定値で明らかである。最も強い同一性は、ＮＢＦ類のカルボキシル末端における配列類の間にある。配列した６６個の残基中、２７％が同一で、さらに１１％が機能的に類似である。全体的に弱い相同性が、遺伝子複製仮説が提示されている（Ｇｒｏｓら、セル（Ｃｅｌｌ）４７，３７１，１９８６，Ｃ．Ｃｈｅｎら、セル（Ｃｅｌｌ）４７，３８１，１９８６，Ｇｅｒｌａｃｈら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２４，４８５，１９８６，Ｇｒｏｓら、モレキュラーセルバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）８，２７７０，１９８８））Ｐ−糖タンパク質中においてはるかに高度（＞７０％）であるのと対照的である。エクソン−イントロン境界の相対的位置における保存の欠如は、ＣＦＴＲのこのようなモデルに反するとして議論できる（図２）。ＣＦＴＲのアミノ末端にシグナルペプチドは明らかに存在していないので、最初のトラスメンブラン配列に先行する高度に電荷を帯びた親水性セグメントは、おそらく細胞質の方向を向いているであろう。２組の疎水性ヘリクスは膜を介して３つのトランスバースループを形成していると考えられ、トラスメンブランセグメント７と８との間の領域を除いて、タンパク質全体の配列のうち、外表面に出ている部分はほとんどないことが考えられる。Ｎグリコシル結合をする可能性のある２つの部位は後の領域に含まれることに着目することが大切である。
【０１１４】
膜会合領域のそれぞれに上記のＮＢＦが後続する。さらに、高度に電荷を帯びた細胞質ドメインは、予想されるＣＦＴＲポリペプチドの中央部に見い出すことができ、このタンパク質の両半分を連結している。このドメインは、Ｒ−ドメインと呼ばれ、単一の大きなエクソンによって機能的に限定される。なお、このエクソン中では、２４１個のアミノ酸のうち６９個が、正および負の荷電を交互に繰り返すクラスター中に存在する極性残基である。さらに、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）によるリン酸化に必要な１０個のコンセンサス配列のうちの９個、およびＣＦＴＲに見られるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）に対して可能性のある基質領域の７つは、このエクソン中に位置している。
【０１１５】
４．２ ＣＦＴＲの機能
ＣＦＴＲの性質は、他の膜会合タンパク質との比較から理解される（図１６）。哺乳類のｐ−糖タンパクとの全体的構造類似性に加えて、ＣＦＴＲ中の２つの予想されるドメインのそれぞれは、大腸菌のヘモリシンの単一ドメイン構造およびショウジョウバエの白色遺伝子産物に著しく類似している。これらのタンパク質は、ヘモリシン系の溶解ペプチドおよび眼の色素分子の輸送にそれぞれ関与している。大腸菌のビタミンＢ１２輸送系、ＢｔｕＤ、および機能が未知の苔類のクロロプラスト遺伝子も、類似構造のモチーフを有している。さらに、ＣＦＴＲタンパク質は、グラム陰性菌のペリプラズム溶解輸送系のいくつかと構造的類似性を共有している。なお、そのグラム陰性菌では、トランスメンブラン領域およびＡＴＰ結合層が、第３の基質結合ポリペプチドと関連して機能する別々のタンパク質に含まれている。
【０１１６】
ＣＦＴＲ中のトランスメンブラン領域の全構造配列は、最近記載されたウシの脳のアデニレートシクラーゼ、ならびに数種のカチオンチャンネルタンパク質および数種のカチオントランスローケイションＡＴＰアーゼに類似している。この位相的分類は、６つのトランスメンブラン領域からなるが、その分類の機能的意義は推測の域を出ない。
【０１１７】
また、配列を同定する短い領域が、ＣＦＴＲの想定トランスメンブラン領域と他の膜貫通タンパクとの間で検出されている。興味あることに、ＣＦＴＲのカルボキシ末端から約５０残基に位置する長さ１８残基のアミノ酸配列、およびこれらの１２位が同一のアフリカ・ツメガエルのｒａｆセリン／スレオニンキナーゼ前癌遺伝子の配列も存在する。
【０１１８】
最後に、アミノ酸配列の同定（１０／１３保存残基）は、ＣＦＴＲの高度に電荷を帯びたＲドメイン内の親水性セグメント（７０１〜７１３位）と、ラットの脳およびウナギの両者にみられるナトリウムチャンネルの最初のトランスメンブランループ直前の領域との間で着目されてきた。ＣＦＴＲの電荷を帯びたＲドメインは、位相的に極めて関連したＰ糖タンパクとの共有点はなく、２つのタンパク質間で２４１個のアミノ酸連結ペプチドに大きな相違は明らかにない。
【０１１９】
つまり、ＣＦＴＲタンパク質の１次構造の特徴は、それが、ＣＦで影響を受けた組織の上皮細胞におけるイオン輸送の調節と制御への関与に適した性質をもっていることである。２つの領域中で膜へ確実に結合することは、細胞膜の細胞質表面近くの３つの主要な細胞内ドメイン（ヌクレオチド結合層１および２ならびにＲドメイン）を配置させるに役立つ。そこで、これらのドメインは、ＣＦＴＲトランスメンブランセグメントまたは他の膜タンパク質によって形成されたチャンネルを通るイオンの移動を調節する。
【０１２０】
遺伝子データ、組織特異性、およびＣＦＴＲタンパク質の想定された性質の観点から、ＣＦＴＲがＣＦに直接起因するとの結論が理に適ったものである。しかし、ＣＦＴＲが上皮細胞の頂端膜のイオン伝導度の制御に関与するか否かは不明である。
【０１２１】
ＣＦＴＲがイオンチャンネル自体として機能することが考えられる。図１３に示すように、１２個のトランスメンブラン領域のうちの１０個は、電荷を帯びた側鎖を有する１つ以上のアミノ酸、脳のナトリウムチャンネルに類似の特性、およびＧＡＢＡ受容体塩化物チャンネルのサブユニットを含む。そこで、電荷を帯びた残基は、サブユニットすなわち繰り返し単位ごとに６個の各膜会合ドメインうちの４個、および４個のうちの３個に存在する。これらトランスメンブランセグメントの両親媒性によって、これら分子のチャンネル形成能が付与されると考えられる。また、ＣＦＴＲは、イオンチャンネルではないこともあるが、イオンチャンネル活性の調節に役立つ。後者の仮定を支持する上で、脂質膜中の塩化物チャンネルを再構成し得る、気管および腎臓から得られた精製ポリペプチド［Ｌａｎｄｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１４６９（１９８９）］のどれもが、分子量から判断した場合、ＣＦＴＲとは考えられない。
【０１２２】
どちらの場合も、ＣＦＴＲ中にＡＴＰ結合ドメインが存在することは、ＡＴＰ加水分解が輸送機能に直接関与しかつ必要であることを示唆する。ＰＫＡおよびＰＫＣに対する高密度リン酸化部位、ならびにＲドメインにおける荷電残基のクラスターは、両者とも上記の活性の調節機能をはたす。ＮＢＦ中におけるフェニルアラニン残基の欠失によって、ＡＴＰの適切な結合または立体配座の変化が起きなくなることがある。なお、これは一般的にはないことであるが、ＣＦ頂端塩化物の伝導回路のＰＫＡまたはＰＫＣ媒介リン酸化による活性化に対する悲感受性となって認められる。この想定タンパク質は、いくつかのドメインを含み、他成分分子系の一部として機能することが多い一群のタンパク質に属するので、ＣＦＴＲは、活性の上皮組織機能またはイオン輸送に無関係の調節にも関与することがある。
【０１２３】
用手法で単離したＣＦ遺伝子（ｃＤＮＡ）を用いれば、ＣＦにおける基本的な生化学的欠陥を限定することができ、そして更に、一般的な上皮細胞のイオン輸送回路の調節を容易にことができる。したがって、ＣＦＴＲの想定構造とは無関係に得られた知識とともにこのタンパク質自体の研究からの知見によって、この疾病の改良された治療法の開発の基礎が得られる。こういった研究では後述のように、ＣＦＴＲタンパク質に対する抗体がつくられてきた。
【０１２４】
４．３ タンパク質の精製
ＣＦＴＲタンパク質は、その配列から明らかにされたように、性質に基づいて選択された方法によって選択することができる。例えば、それが膜内在性タンパク質の際立った性質を有するために、それが高度に発現される上皮細胞の膜分画は、確立された方法［Ｊ．Ｅ．Ｌａｎｇｒｉｄｅ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔｓ．７５１：３１８（１９３８）］を用いて最初に分離される。これらの膜の周縁タンパク質は、高濃度の塩、高ｐＨまたはジヨードサリチル酸リチウムなどのカオトロピック試薬を用いた抽出によって除去されたものである。次いで、ＣＦＴＲタンパク質を含む内在性タンパク質のすべては、オクチルグルコシドなどの界面活性剤（Ｌａｎｄｒｙら、上掲）、ＣＨＡＰＳ［Ｄ．Ｊ．Ｂｅｒｏｓ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０６１３（１９８７）］、または類似作用の他の化合物を用いて可溶化される。ＣＦＴＲのヌクレオチド結合ドメインを利用するとともに、シバクロンブルー［Ｓ．Ｔ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：６６９（１９７５）］を使って、ＣＦＴＲタンパク質を結合させ、これを界面活性剤安定化混合物に存在する他の内在性タンパク質から除去する。ＣＦＴＲが糖タンパクであるため、分別レクチンクロマトグラフィーによって更なる精製が可能である［Ｒｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：１２７０（１９７９）］。続いて、均質化のための最終的精製が、他の標準的な精製手法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーまたは必要に応じて等電点電気泳動を用いて行われる。また、ＣＦＴＲタンパク質（もしくはその断片）に対する固定化抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の「２３０ ＨＰＥＣ Ｓｙｓｔｅｍ」のような新型装置を用いた調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動など単一の精製法も利用される。ｐ−糖タンパク［Ｒｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ，上掲］の精製、すなわちヌクレオチド結合輸送・会合膜タンパク質による一般的方法に基づけば、ＣＦＴＲタンパク質の精製が容易になる。
【０１２５】
ＣＦＴＲタンパク質が高度に発現する組織および細胞からの精製法に加えて、上記のようにＣＦ遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むベクターで感染させた細胞からＣＦＴＲを精製するために類似の手法が用いられる。ｃＤＮＡ配列の修飾型の発現から得られるタンパク質産物を類似の方法で精製する。このように提供されたタンパク質の相同性の範囲には、２次元ゲル電気泳動およびＮ末端アミノ酸分析などタンパク化学の領域で標準的なものが含まれる。この精製タンパク質は、その２次および３次構造の性質を決定するために用いられ、ＣＦの突然変異型の適切な機能を促進する薬剤の設計に役立つ。タンパク療法で使用するための調製では、有毒と思われる夾雑物質が入らないことが重要である。このタンパク質の疎水性には、操作の全段階で界面活性剤やその他の物質［Ｖ．Ｊ．Ａｍｂｕｄ Ｋａｒａｎｄ Ｐ．Ｃ．Ｍａｌｏｎｅｙ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１００７９（１９８６）］などの両親媒性の化合物が含まれていることを必要とする。
【０１２６】
５．０ ＣＦのスクリーニング
５．１ ＤＮＡ診断
ここに記載されたように、主要な突然変異型の知識があれば、キャリアーのスクリーニングおよび出産前の診断を以下のように実施することができる。嚢胞性線維症に対する高リスク集団は、白人である。生殖年令に達した各白人の女性および／または男性は、彼らがキャリアーであるか否かを判定するためにスクリーニングされることになる（各個人に対して約５％の確率）。両人がキャリアーであれば、彼らは嚢胞性線維症の子供が生まれるリスクが高い夫婦である。リスクの高い夫婦の各子供が嚢胞性線維症にかかる率は２５％である。プローブを用いてキャリアーの状態を判定する手法は以下に開示される。
【０１２７】
正常および突然変異型ＣＦ遺伝子のＤＮＡ配列に関する１つの大きな応用例は、遺伝子試験、キャリアー検出および出生前診断の領域にある。ＣＦ遺伝子の突然変異を有するキャリアー（疾病のキャリアーまたは患者）は、さまざまな手法を使用してＤＮＡレベルで検出することができる。診断に使用されるベノムＤＮＡは、抹消血、尿、唾液、組織生検試料、外科的試料および剖検物質中に存在する細胞など、体内の細胞から得ることもできる。そのＤＮＡは、特異的配列の検出のために直接使用されることもあり、解析に先立ってＰＣＲ法［Ｓａｉｋｉｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−１３５３（１９８５）、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３−１６６（１９８６）］を用いてインビトロで酵素的に増幅されることも可能である。ＲＮＡまたはそのｃＤＮＡ型は、同一の目的のために使用されることもある。このテーマに関する最近の総説は、カスキーの文献［Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２２３−８：（１９８９）］およびランデグレンらの文献［Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２２９−２３７（１９８９）］に提示されてきた。
【０１２８】
特異的ＤＮＡの検出は、特異的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２５７−２６１（１９８６）］、ＤＮＡの直接配列決定法［Ｃｈｕｒｃｈ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１９９１−１９９５（１９８８）］、制限酵素の使用［Ｆｌａｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５：２５（１９７８）；Ｇｅｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：５０８１（１９８１）］、変成剤を用いたゲル中での電気泳動的移動度に基づく識別［Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｓｙｍ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２７５−２８４（１９８６）］、ＲＮアーゼの保護［Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｌａｒｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２（１９８５）］化学的開裂［Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３９７−４４０１，（１９８５）］およびリガーゼ媒介型検出法［Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７（１９８８）］などの方法によって行うこともできる。
【０１２９】
正常または突然変異型配列に特異的なオリゴヌクレオチドは、市販の機器を用いて化学的に合成され、同位体（32Ｐなど）で放射線標識または非放射線（ビオチンなどのＴａｑつき）標識され［Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６６３３−６６５７（１９８１）］、およびドットブロットまたは電気泳動後のゲルからのトランスファーによる膜または固体支持体上で固定化された各ＤＮＡ試料にハイブリダイズさせられる。これら特異的配列の有無は、オートラジオグラフィーまたは蛍光反応［Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）、上掲］もしくは呈色反応［Ｇｅｂｅｙｅｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｃｈ １５：４５１３−４５３４（１９８７）］などの方法によって肉眼で観察される。このオリゴヌクレオチドスクリーニング法の具体例は、ここに記載されるようなＦ５０８欠失の検出に応用されてきた。
【０１３０】
正常と突然変異型との間の配列の差異は、チャーチとギルバートのＤＮＡ直接配列決定法（上掲）によって明らかにされることもある。クローン化ＤＮＡセグメントは、特異的ＤＮＡセグメントを検出するためにプローブとして使用することもできる。この方法の感受性は、ＰＣＲ法と組み合わせた場合に大幅に高められる［Ｗｒｉｃｈｎｉｋ ｅｌ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５２９５４２（１９８７）；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３３０：３８４−３８６（１９８７）；Ｓｔｏｆｌｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４９１−４９４（１９８８）］。後者の方法では、増幅配列中にある配列プライマーが、２本鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲによって生じる１本鎖鋳型とともに使用される。配列の決定は、放射能標識ヌクレオチドを用いた従来の方法または蛍光Ｔａｑを用いた自動配列決定法によって行われる。
【０１３１】
配列の変更は、適当な酵素での消化の後に行われる従来のゲルブロットハイブリダイゼーション［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ９８：５０３（１９７５）］の使用によって明らかにされる偶然の制限酵素認識部位を稀に生じ得る。この部位（正常または突然変異）を有するＤＮＡ断片は、サイズの減少または対応する制限酵素断片数の増加によって検出される。ゲノムＤＮＡ試料は、適当な制限酵素を用いた処理に先立つＰＣＲによって増幅されることもあり、異なったサイズの断片は、ゲル電気泳動後の臭化エチジウムの存在下ＵＶ光のもとで肉眼で観察される。
【０１３２】
ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝的試験は、変成剤の有無にかかわらずゲル中でのＤＮＡ断片の電気泳動的移動度の変化を検出することによって行うことも可能である。小さい配列の欠失および挿入は、高解像度のゲル電気泳動によって肉眼で観察することができる。例えば、３ｂｐの欠失を有するＰＣＲ産物は、変成剤を含有しない８％のポリアクリルアミドゲル上で正常な配列から明らかに区別される。異なった配列組成物のＤＮＡ断片は、異なったＤＮＡ断片の移動度が比「部分的溶融」温度に従ったさまざまな位置でゲル中での遅れが生じる変成ホルムアミド勾配ゲル上での区別が可能である（Ｍｙｅｒｓ、上掲）。さらに、配列の変更、特に小さな欠失は、３ｂｐ（Ｆ５８０）突然変異および他の実験系で検出されるように、非変成ゲル電気泳動におけるＤＮＡヘテロ２本鎖の移動パターンの変化として検出されることもある［Ｎａｇａｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ，４５：３３７−３３９（１９８９）］。また、単一塩基の置換または他の小変化は、ＰＣＲにおける識別プライマーの長さに基づくこともあり得る。例えば、１つの不変プライマーは、突然変異に特異的なプライマーに添加して使用可能である。次いで、正常および突然変異型遺伝子のＰＣＲ産物が、アクリルアミドゲル中で別個に検出され得る。
【０１３３】
特定部位での配列の変化は、ＲＮアーゼの保護［Ｍｙｅｒｓ、上掲］、Ｓｌ保護［Ｂｅｒｋ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１２７４（１９７８）］、化学的開裂法［Ｃｏｔｔｏｎ、上掲］およびリガーゼ媒介型検出法［Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、上掲］などの方法によって解明し得る。
【０１３４】
従来のゲル電気泳動およびブロットハイブリダイゼーション法に加えて、ＤＮＡ断片は、個々のＤＮＡ試料が膜に固定化されない方法によっても肉眼で観察し得る。このプローブおよび標的配列は双方とも溶液中に存在することがあり、またはそのプローブ配列が固定化されていることもある［Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６２３０−６２３４（１９８９）］。放射性同位体が関与するオートラジオグラフィー、放射能崩壊の直接検出（シンチラントの有無にかかわらず）、呈色反応が関与する分光光度法、および蛍光反応が関与する蛍光分析法など、さまざまな方法を使用して特定個人の遺伝子型を同定することもできる。
【０１３５】
１カ所を超える突然変異がＣＦ遺伝子中に生じていることが予想されるので、マルチプルズシステムは、ＣＦキャリアーのスクリーニングおよび特定の突然変異型検出のための理想的なプロトコールである。例えば、複数の特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを使用して、起こり得るすべての突然変異を同時に同定することもできる［Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｃｈ１６：１１４１−１１５５（１９８８）］。この方法には、固定化された配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ［Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．上掲］が含まれることもある。
【０１３６】
５．２ 主要な突然変異型の検出
これらの検出法は、羊水細胞および絨毛膜絨毛生検によるか、母体の循環血液から死細胞を分けることによって、出生前の診断に応用することもできる。集団中のＣＦキャリアーの試験は、共通の疾病に関する大規模な遺伝的試験計画に重要な一環として取り入れることもできる。次いで、この発明の一実施態様によれば、この実施態様に基づく突然変異などの突然変異を検知するＤＮＡセグメント部分、すなわち、Ｆ５０８の欠失の近傍にある部分は、標準的なＰＣＲ法［Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２２９−２３７（１９８８）に記された、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕｌｆ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｋａｉｓｅｒ，Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ Ｃａｓｋｅｙ， ａｎｄ Ｌｅｒｏｙ Ｈｏｏｄの総説「ＤＮＡ診断−分子的手法および自動化」］。使用されるＤＮＡセグメント部分は、単一のＤＮＡセグメントまたは異なったＤＮＡセグメントの混合物であってもよいことが示唆される。この方法の詳細な記載は以下の通りである。
【０１３７】
ヒトまたは胎児からのゲノムＤＮＡの特定領域がスクリーニングの対象となる。こういった特定領域は、オリゴヌクレオチドプライマーＣ１６Ｂ（５'ＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣ３'）およびＣ１６Ｄ（５'ＧＴＴＧＧＣＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＴＧＡＣＧＣＴＴＣ３'）によって限定される。この特定領域は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。ＣＦ患者および彼らの親の培養リンパ芽球または抹消血試料から得られた２００〜４００ｎｇのゲノムＤＮＡを、上記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた各ＰＣＲで使用した。このオリゴヌクレオチドは、販売元が進める方法に従って、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＣａｒｔｒｉｄｅｓTM（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）またはＮＥＮＳＯＲＢTMＰＲＥＰカラム（Ｄｕｐｏｎｔ社）を用いて精製した。このプライマーを６２℃で４５秒間アニーリングし、７２℃で１２０秒（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２単位を用いて）かけて伸長させて、Ｓｔｅｐ−Ｃｙｃｌｅプログラム（１．５分で変換セッティング）を用いたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ自動サーモサイクラー中で２８サイクルと７分間の最終サイクルに９４℃で６０秒間かけて変成させた。
【０１３８】
ＰＣＲ産物の部分を１．４％アガロースゲルの電気泳動によって分離し、標準法に従ってＺｅｔａｂｉｎｄTM（Ｂｉｏｒａｄ社）膜に転写した。５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭスペルミジン、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび３０〜４０μＣｉのγ［32Ｐ］ＡＴＰを含む１０μｌの反応液に溶けた１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で、図１５（各１０ｎｇ）の２つのオリゴヌクレオチドプローブを別々に３７℃で２０〜３０分間かけて標識した。取り込まれなかった放射能ヌクレオチドを、使用前にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５のカラムで除去した。ハイブリダイゼーション条件は、温度を３７℃とした以外は前記［Ｊ．Ｍ．Ｒｏｍｍｅｔｓ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４３，６４５（１９８８）］と同様であった。膜は、５×ＳＳＣを用いて室温で２回洗浄し、２×ＳＳＣを用いて３９℃で２回洗浄した（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウム）。オートラジオグラフィーを室温で一晩実施した。オートラジオグラフィーは、図１５に示したように、２つの特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いたゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション結果を示す。プローブＣは、正常なＤＮＡ配列を検出し、プローブＦは突然変異型配列を検出する。家族の一人一人から得られたゲノムＤＮＡ試料をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、産物を１．４％アガロースゲルの電気泳動によって分離してから標準法に従ってＺｅｔａｂｉｎｄ（Ｂｉｏｒａｄ社）膜に転写した。水盲検およびプラスミドＤＮＡ、Ｔ１６およびＣ１６［それぞれ正常配列（Ｎ）およびＦ５０８欠失（ＣＦ）に相当する］を対照として含めた。
【０１３９】
また、３ｂｐの欠失はポリアクリルアミドゲル電気泳動によって見い出された。上記のＣ１６ＢおよびＣ１６Ｄプライマーによって生じたＰＣＲを、９０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）中にて２０Ｖ／ｃｍで２時間８％ポリアクリルアミドゲルにかけたとき、３ｂｐの欠失をともなわない個人、欠失に対してヘテロ型またはホモ型の個人を明確に検出し得た。さらに、エキストラＤＮＡバンドは、正常ＤＮＡ鎖と突然変異ＤＮＡ鎖との間のヘテロ２本鎖であるが、ヘテロ接合体に着目した。また、ＰＣＲ中に形成されたヘテロ２本鎖のゲル移動度における類似の変更が、小さな欠失が関与する実験系で報告されている（Ｎａｇａｍｉｎｅｅｔ ａｌ．上掲）。これら移動度のシフトは、非放射性遺伝的スクリーニング試験の基礎として使用されることもある。
【０１４０】
５．３ ＣＦのスクリーニング法
キャリアーの７０％だけが、この発明におけるこの特別な実施態様の特異的Ｆ５０８プローブを用いて検出可能であることが認識される。したがって、Ｆ５０８プローブを使って試験された個人がキャリアーでなければ、キャリアーの状態を除くことはできず、彼らに前記のような他の突然変異が生じている可能性がある。しかし、試験された個人とその配偶者の双方がＦ５０８突然変異のキャリアーであれば、彼らがリスクの高い夫妻となることは当然である。ここに開示したような遺伝子配列は、その他の突然変異型を判定するための基本的な必要条件である。
【０１４１】
出生前の診断は、キャリアースクリーニングの論理的な延長線にある。２通りのうちのいずれかで、夫妻が嚢胞性線維症の子供をもつリスクがあると見られる。彼らが嚢胞性線維症の子供１人をすでにもっているならば、この夫妻はどちらかが、定義によって嚢胞性線維症のキャリアーとみられ、その後から生まれる子供がこの疾患にかかる率は２５％である。この発明の主要な利点は、家系分析を必要としない点であり、この発明によれば、上記のような遺伝子突然変異スクリーニング法または他の類似の方法を用いて、機能の変化したタンパク質の産生につながる遺伝的突然変異を同定することができる。これは、疾病の子供から前の家系を確証することにはつながらない。上記のように、胎児のＤＮＡ試料、例えば羊水細胞および絨毛膜絨毛検体を得ることができる。次いで、標準的なＰＣＲ法による増幅を、この鋳型ＤＮＡ上で行うことができる。
【０１４２】
両親がＦ５０８欠失をもつキャリアーであることが分かれば、結果の解釈は以下のようなものとなる。正常（図１５に示すような非欠失）プローブに対して胎児のＤＮＡがハイブリダイズすれば、この胎児は嚢胞性線維症にかからないであろうが、ＣＦキャリアーである可能性はある（リスクの高い夫妻の１人の胎児に対する確率は５０％）。この胎児のＤＮＡがＦ５０８欠失プローブとのみハイブリダイズし、正常プローブ（図１５に示したように）とはハイブリダイズしなければ、この胎児は嚢胞性線維症に罹患するであろう。
【０１４３】
ＣＦ遺伝子におけるこれらの突然変異について、さまざまな一連の特異的方法を用いて、すべての潜在的ＣＦキャリアーまたは患者に対する完全な診断を行うことができる。３種類の方法を後で十分に記載する。
【０１４４】
したがって、被験者がＣＦキャリアーまたはＣＦ患者であれば、この発明によって測定方法および測定用キットが提供される。すなわち、このスクリーニング法は、スクリーニング対象となる被験者の生体試料を提供する工程、ならびにその生体試料中に、正常なＣＦ遺伝子、正常なＣＦ遺伝子産物、突然変異ＣＦ遺伝子、突然変異ＣＦ遺伝子産物およびそれらの混合物からなる群より選ばれた少なくとも１つの要素の有無を検出する方法を提供する工程を含む。
【０１４５】
この方法は、例えば図１のＤＮＡにおける異なったＤＮＡ断片、またはヒトの第７染色体の異なったＤＮＡ配列断片であり、図１のＤＮＡ配列のどちらかの側に位置する少なくとも１つ以上のヌクレオチドプローブを含むことによってもさらに特徴づけることができる。
【０１４６】
この発明の一実施態様に従って、スクリーニング法での使用に適し、免疫検定法によってＣＦ遺伝子の有無をスクリーニングするためのキットは、以下からなる。
（ａ）ＣＦ遺伝子の遺伝子産物に特異的に結合する抗体、（ｂ）その遺伝子産物に対する抗体への結合を検出する試薬、ならびに（ｃ）その抗体および試薬が、その免疫検定法を実施するに有効量存在する。ＣＦ遺伝子の存在を検出するためのキットはまた、ハイブリダイゼーション法によっても提供され得る。
【０１４７】
このキットは、以下からなる。
（ａ）ＣＦ遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ、（ｂ）ＣＦ遺伝子に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する試薬、ならびに（ｃ）このプローブおよび試薬が、そのハイブリダイゼーション法を実施するに有効量存在する。
【０１４８】
５．４ ＣＦＴＲを検定する抗体
上記のように、ＣＦＴＲタンパク質内のエピトープに対する抗体は、このタンパク質の性質に関する徹底的な知見および他の有意義な知見を提供するために作成される。後者の知見は以下からなる。
１．タンパク質が免疫ブロット法（ウエスタン法）、その後のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって発現される、細胞および組織中のタンパク質の肉眼での観察を可能とすること。これによって、例えば、オリゴサッカリド鎖およびフォスフェート基などの翻訳後の修飾部分をもった細胞からの影響を含む成熟タンパク質の分子量サイズの推定がなされる。免疫蛍光法および免疫電子顕微鏡法を含む免疫細胞化学的手法を利用でき、細胞膜のタンパク質の細胞質中の局在が確立される。この抗体を利用して、サイズが変化したタンパクの合成を生じる他のいかなるＣＦ突然変異型を検出する上でもう一つの手法を提供することができる。
２．このタンパク質の別のドメインに対する抗体を利用して、細胞膜中でのタンパク質の位相的配列を解明することができる。これによって、薬物療法のための外から投与された調節剤に許容的であるタンパク質のセグメントに関する情報が得られる。
３．このタンパク質のさまざまな部分の構造と機能との関係は、特異的抗体を用いて調べることができる。例えば、細胞中に、トランスメンブラン配列ならびにヌクレオチド結合層の部分およびＲドメインを連結させる荷電した各細胞質ループを認識する抗体を導入することができる。タンパク質の機能的パラメータへのこれら抗体の影響を考慮すると、細胞の調節機構の洞察が得られ、ＣＦ患者における欠陥タンパク質の活性を調節する手段が示唆される。
４．適当な結合能を有する抗体は、そのタンパク質の免疫沈降および免疫親和的精製を可能とする。免疫沈降から、合成ならびにＡＴＰ結合およびリン酸化を含む翻訳後修飾の特徴が容易に解明される。精製は、タンパク質の構造の研究およびその機能の研究に必要であって、タンパク質療法にも必要である。
【０１４９】
抗体を調製するために、適切なクローニングビークル中で相当するＤＮＡ配列を発現させることによって、ＣＦＴＲポリペプチドの限定部分を含む融合タンパク質を合成し、一方小さなペプチドを表８に記載された通り化学的に合成した。この融合タンパク質を、例えば、グルタチオン−アガロースのアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、このペプチドをキャリアータンパク質（ヘモシアニン）に結合させ、フロインドアジュバントと混合して、ウサギに注射した。２週間間隔でのブースター注射に続いて、ウサギを放血させて血清を分離した。染色された融合タンパク質を図１９ａに示す。レーン１は非誘導の対照プラスミド、レーン２はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を発現するＩＰＴＧ誘導の対照プラスミド、レーン３はアフィニティー精製した２７キロダルトン（ｋＤ）のＧＳＴバンド、レーン４は非誘導プラスミド、レーン５は誘導プラスミドであり、レーン６は表８の精製された融合タンパク質＃１である。図１９では、表８（レーン１および２）の融合タンパク質＃５ならびに表８（レーン３および４）の融合タンパク質＃２を含むｐＧＥＴプラスミドで形質転換された細菌からの溶解物のゲル電気泳動を示す。図１９ｂのレーン１は非誘導プラスミドに関するものであるが、レーン２は融合タンパク質＃５を発現させる誘導プラスミドに関するものである。図１９ｂのレーン３は非誘導プラスミドに関するものであるが、レーン２は融合タンパク質＃２を発現させる誘導プラスミドに関するものである。２匹の異なったウサギの２回目の放血から得られた抗血清でプローブした融合タンパク質＃１のイムノブロットを図２０に示す。染色は、アルカリフォスファターゼ結合第２抗体を用いて行う［Ｂｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３６：１７５（１９８４）］。これら免疫染色の両者は、３２ｋＤの融合タンパク質を染色するが、プレ免疫血清は染色しない。図２１は、ＣＦＴＲ転写物を高レベルで発現させるＴ８４コロニー癌細胞から分離された、膜中のサイズが約２００ｋＤのバンドに対するこれら免疫血清のうちの１つとの反応性を示す。このバンドは、翻訳後修飾前の想定分子量１６９ｋＤを有するＣＦＴＲタンパク質で期待し得るサイズ領域にある。ペプチド＃２のＬＫＨ複合体で免疫したウサギからの血清を、図２２で示されるように純粋なペプチドとＫＬＨの両者に対してスクリーニングした。この図では、Ｈはヘモシアニンを、Ｐ１はペプチド＃１を、Ｐ２はペプチド＃２を示す。ｎｇでドットされたタンパク質またはペプチドの量を示す。この抗血清は、そのペプチドを１ｎｇ程度の少量まで検出し、対照タンパク質＃１とは全く反応しない。
【０１５０】
したがって、ＣＦＴＲタンパク質の部分および配列の短いセグメントに相当するペプチドを含む両融合タンパク質に特異的なポリクローナル抗体を作成することが可能である。同様に、マウスに表８のペプチド１、２および７のＫＬＨ複合体を注射し、ＣＦＴＲタンパク質のこれらのセグメントに対するモノクローナル抗体を産生させることができる。モノクローナル抗体は、同様にＣＦＴＲタンパク質の他のドメインに対しても作成することができる。
【０１５１】
ポリクローナル抗体の産生に関して、ＣＦＴＲタンパク質に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）作成用の免疫原は、ＣＦＴＲポリペプチドの部分または配列の短い（アミノ酸１２ないし２５個の長さ）セグメントに相当する合成ペプチドを含む細菌の融合タンパク質［Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ６７：３１（１９８８）］。基本的な方法論は、コーラーとミルシュタインのもの［Ｎａｕｒｅ２５：４９５（１９７５）］である。
【０１５２】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、不完全フロインドアジュバントに溶けた純粋な融合タンパク質または合成ペプチド５００μｇの腹腔内注射によって免疫する。２回目の注射は１４日後に行い、２１日後に３回目、そして２８日後に４回目の注射を行う。こうして免疫した各動物を、最終の注射から１、２および４週後に解剖する。脾臓を摘出し、その細胞をばらしてから回収し、文献［Ｇｅｆｔｅｒ ｅｔａｌ．Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２３１（１９７７）］に従ってＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４黒色腫細胞と融合させた。この融合混合物を融合細胞の増殖用培地に播種し、融合細胞を、それらが約２５％コンフルエンスに達するまで増殖させる。同時に、培養上清に対して、特定のＣＦＴＲ抗原と反応する抗体の存在を調べる試験を行う。次いで、アルカリホスファターゼ標識抗マウス第２抗体を使って陽性のものを検出する。さらに、陽性の培養穴からの細胞を培地中で増殖させ、更なる試験のために上清を回収し、細胞は凍結保護剤含有培地中で凍結させた。大量のｍＡｂを得るために、産生細胞を動物あたり細胞濃度５×１０6で腹腔に注射し、腹水を得る。精製は、文献［Ｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：４２９（１９７７）］に従ってプロテインＧおよびプロテインＡアガロースのクロマトグラフィーによって行う。
【０１５３】
ＣＦＴＲタンパク質とこれらｍＡｂの反応性は、ＣＦＴＲタンパク質が発現される上皮細胞から分離された膜のポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびイムノブロット［Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：４３５０（１９７９）］によって確認される。ＣＦＴＲタンパク質の異なった各ドメインに特異的なモノクローナル抗体の使用してそれら個々の機能を調べることに加えて、その他のｍＡｂは、ＣＦＴＲタンパク質の正常と突然変異型との間の識別することが可能でるが、鼻粘膜の生検検体「ブルッシュリング（ｂｒｕｓｈｉｎｇｓ）」［Ｒ．Ｄｅ−Ｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ｊ．Ｒｕｔｌａｎｄ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４２，６１３（１９８９）］または汗腺を含む皮膚の生検検体など、患者から得られた上皮細胞試料中の突然変異タンパク質を検出するために用いられる。
【０１５４】
この識別可能な抗体は、アミノ酸位５０８（例えば、ＧＴＩＫＥＮＩＩＦＧＶＳＹ）にフェニルアラニンを含むペプチドまたはＦ５０８を欠く以外同一のペプチド（ＧＴＩＫＥＮＩＩＧＶＳＹ）で免疫化した何組かの対のマウスからのハイブリドーマを識別的にスクリーニングすることによって得られる。Ｆ５０８欠失が加わったかまたはそれを欠いた患者に存在するＣＦＴＲタンパク質の他の突然変異型を認識し得るｍＡｂは、類似のモノクローナル抗体産生法を使って得られる。
【０１５５】
ＣＦＴＲタンパク質およびそのセグメントの正常およびＣＦ型に対する抗体は、免疫細胞化学および免疫蛍光光学顕微鏡法ならびに免疫電子顕微鏡法による診断に使用され、ＣＦ患者、ＣＦキャリアーおよび非ＣＦキャリアーの人の器官内におけるＣＦＴＲの細胞および細胞下分布が示される。
【０１５６】
ＣＦ患者およびＣＦ患者の細胞におけるＣＦＴＲタンパク質の活性を促進させることによって、治療面で調節を行うのに抗体が用いられる。こういった調節様式には、多価抗体とＣＦＴＲタンパク質分子との架橋による刺激、ならびにインシュリン受容体［Ｏ'Ｂｒｉｅｎｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：８４６（１９８３）］、上皮成長因子受容体［Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：８４６（１９８３）］などのある種の細胞表面の膜受容体、およびＣＤ４［Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３３８：２５７（１９８７）］などのＴ細胞受容体関連分子の刺激が関与する。
【０１５７】
ＣＦにおいて欠陥ＣＦＴＲタンパク質を発現する細胞への治療薬の運搬を規定するために抗体が用いられる。この目的には、抗体は、薬剤などの治療薬または正常遺伝子を運ぶリポゾーム［Ｍａｔｔｈａｙ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：４９０４（１９８６）］などのビークルに取り込まれる。
【０１５８】
【表１７】
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ａ文献［Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ６７：３１（１９８８）］で確認されたように、ｐＧＥＸプラスミド発現ベクター中で、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの３'末端に連結したこれら断片をコードする制限酵素切断断片。
ｂ文献［Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２８：４７７（１９８２）］に従って、キャリアータンパク質のキーホール・リンペットのヘモシアニン（ＫＬＨ）にＮ末端システインを介して結合したペプチド。ＴＭはトランスメンブラン配列を示す。
【０１５９】
５．５ ＲＦＬＰ分析
この発明は、ただちに実際的用途が見い出されるＣＦ遺伝子の発見および特徴決定から直接由来する多くの利点を提供する。ＣＦＴＲのアミノ酸配列から、ＣＦＴＲが関与し、嚢胞性線維症で欠陥を提示する分子的機構と同様に、このタンパク質の構造および機能の洞察が可能である。この知見によれば、この疾病に対する研究および治療において、いっそうの手段および概念の形成され得る。
【０１６０】
この発明の用途のうちには、キャリヤーの検出、ＤＮＡ診断、家系図調査などが挙げられる。従来のＤＮＡを基準とする遺伝的試験は、疾病のある子供をもった家族およびその近親者に対して主に利用されてきた。ＤＮＡ配列レベルでＣＦ突然変異が知られれば、いかなる個人の試験も任意に行える。われわれの推定によれば、過去の家系が分からないＣＦ患者の４６％は、ＤＮＡ解析によって正確に判断可能であって、母集団中のＣＦキャリヤーの６８％がＦ５０８欠失によって確認できる。
【０１６１】
北アメリカの母集団におけるキャリヤーの頻度を１／２０とすれば、例えば、キャリヤーの状態に関して生殖年令の女性および／または男性のすべてをスクリーニングすることが妥当である。
【０１６２】
Ｆ５０８欠失に特異的なプローブを用いたキャリヤーの検出は、キャリヤーの７０％まで見い出されよう。残りのキャリヤーは、上記でさまざまなハプロタイプ群に特異的な一群のプローブによって検出されよう。Ｆ５０８欠失は全ＣＦ突然変異型の約７０％を構成するので、ＲＦＬＰ分析は、ＣＦ患者の家族または近親者に対する直接検出試験を補足するものとして使用が可能である。Ｆ５０８突然変異が起きていないＣＦ患者の約５５％がわれわれのＣＦリンケージ家族の事後分析に基づいてＤＮＡマーカーＪＧ２Ｅ１（ＫＭ１９）［Ｋｅｒｅｍ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ ４４：８２７−８３４（１９８９）； Ｅｓｔｉｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１：２５７（１９８７）］から知見が得られるものと予想され、Ｅ６（ＴａｑＩ）［Ｋｅｒｅｍ ｅｔ ａｌ．上掲］およびＪ３．１１（ＭｓｐＩ）［Ｗａｉｎｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）］も試験された場合、さらに３９％の知見が得られるであろう。
【０１６３】
すなわち、Ｈ２．３（ＸＶ２Ｃ−ＴａｑＩ）［Ｋｅｒｅｍ ｅｔ ａｌ．上掲；Ｅｓｔｉｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）］、Ｅ２．６（Ｅ．９）（ＭｓｐＩ）［必要に応じて入手可能なプローブ］、Ｅ４．１（Ｍｐ６ｄ．９）（ＭｓｐＩ）［必要に応じて入手可能なプローブ、Ｅｓｔｉｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９）］、Ｊ４４（Ｅ３．１）（ＸｂａＩ）［必要に応じて入手可能なプローブ］およびｍｅｔＤ（ＢａｎＩ）［Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９）；ＡＴＣＣ＃４０２１９］が含まれる場合、ほぼすべての親から知見が得られることになる。
【０１６４】
これらプローブの有用性は、これらが多形の制限酵素切断部位を認識するという事実にある。したがって、これらのプローブは一般に、多形部位を介してこれらの配列によって限定されず、隣接配列の知見に基づいて利用されるので、当該分野の技術者には既に知られているように、問題の領域におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を可能とする。
【０１６５】
例えば、プローブＥ２．６（ＭｓｐＩ）は、２つの隣接オリゴマー（５'ＧＴＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡ３'、および５'ＧＧＡＡＴＣＡＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＧＡＴＡＴ３'）によって完全に限定される。ＭｓｐＩの多形性を検出するＥ２．６ＰＣＲ産生プローブを使用することによって、ＭｓｐＩ部位の有無に応じて、２つの異なった対立遺伝子（８５０ｋｂの断片、または４９０ｂｐおよび３６０ｂｐ断片）が検出されよう。同様に、プローブＪ４４（Ｅ３．１）（ＸｂａＩ）は、２つの隣接オリゴマー（５'ＣＡＡＴＧＴＧＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＡ３'、および５'ＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＴＧＣＡＴ３'）によって完全に限定される。ＸｂａＩの多形性を検出するＥ２．６ＰＣＲ産生プローブを使用することによって、ＸｂａＩ部位の有無に応じて、２つの異なった対立遺伝子（８６０ｋｂの断片、または６１０ｂｐおよび２５０ｂｐ断片）が検出されよう。連結されたＲＦＬＰは、Ｆ５０８欠失をもたない個人に対するリスクの計算に使用することもできる。一般的なリスクの推定法は、文献［Ｂｅａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ ４４：３１９−３２６］で考察されている。
【０１６６】
出生前診断には、微小絨毛性小腸酵素の分析を行って、ＤＮＡ診断が不完全な場合に診断の信頼性を高めることもできる。
【０１６７】
ＤＮＡ診断は現在、胎児が嚢胞性線維症にかかているか否かを判定するために使用されているが、歴史的には、特定の両親に確実なキャリアーと同定された１人の嚢胞性線維症児が生まれた後にだけ実施されてきた。しかし、上記のようなキャリアー検出と組み合わせて、キャリアーの夫妻でのすべての妊娠に対してＤＮＡ診断を行うことは可能であろう。両親がすでに１人の嚢胞性線維症児をもっていれば、広範なハプロタイプ分析を行うことができ、疑陽性または疑陰性の比率が大幅に減少されよう。
【０１６８】
嚢胞性線維症には臨床的異質なものがあると多年考えられてきたが、現在では、いわゆる健全な膵臓（ＣＦ−ＰＳ）および膵臓不全（ＣＦ−ＰＩ）という２分類が登場している。これらの疾病の概念に関連した突然変異の特徴がよく解明されれば、この疾病の臨床的表現形をもった特定の突然変異に結び付けることができる。これによって、各患者の治療が変えられる。したがって、突然変異の特徴から、ある程度まで、患者の診断が予測され、特定の治療方針が定まるであろう。
【０１６９】
６．０ 嚢胞性線維症の分子生物学
ＣＦＴＲが、イオンチャンネル、特にＣＦにおける機能的欠陥として意味付けられる塩素チャンネルの外向きへの機能を調節し得るという仮説は、アフリカルメガエルの卵細胞においてインビトロで転写された完全な長さのＣＦＴＲｍＲＮＡの注入および翻訳によっで調べることができる。卵細胞の膜を通過するイオン流の確かな変化は、電位が固定弁で調節されるので、測定することができる。ＣＦＴＲは内在性卵細胞のチャンネルを調節することができ、またはチャンネルタンパク質の翻訳を規定するために上皮細胞ＲＮＡを導入させるためにも必要であり得る。この発明によって提供されるように、正常なＣＦＴＲおよび突然変異型ＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡの使用によって、これらの実験が可能となる。
【０１７０】
異質細胞系における他の発現様式によっても、構造−機能の関係の解明が容易になる。プラスミド発現ベクターに連結された完全なＣＦＴＲのＤＮＡ配列は、細胞を感染させるために使用される結果、イオン輸送に対する影響を判定することができる。特定部位で修飾された配列部分とともに正常ＣＦＴＲ配列の一部を有するプラスミド発現ベクターは、調節機能に決定的なＣＦＴＲタンパク質の部分を同定するために行われるインビトロでの突然変異実験に使用することができる。
【０１７１】
６．１ ＤＮＡ配列の発現
このＤＮＡ配列は、その遺伝子および産物の発現を理解する研究、ならびに機能的解析、抗体産生および患者の治療のために大量のタンパク質を産生させる研究において操作可能である。この配列の変化は、相対量、組織特異性および機能的特性の面で発現パターンを変えることも変えないこともある。部分的または完全な長さのｃＤＮＡ配列は、目的とするタンパク質をコードし、修飾または未修飾のものがあり、以下のような細菌の発現ベクターに連結することも可能である。例えば、従来考察されたタンパク質の精製法に従って分離し得る対応のタンパク質の産生のために大腸菌細胞に導入可能なｐＲＩＴ［Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．４：１０７５−１０８０（１９８５）］、ｐＧＥＸ［Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）］またはｐＡＴＨ［Ｓｐｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：１３２−１４１（１９８４）］の各プラスミドである。このＤＮＡ配列を本来の配列から他のクローニングビークル、例えば、他のプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、動物ウイルス、酵母の合成染色体（ＹＡＣ）［Ｂｕｒｋｅ ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８０６−８１２，（１９８７）］、体細胞、ならびに細菌、苔［Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１３１３−１３１７（１９８９）］、無脊椎動物、植物［Ｇａｓｓｅｒ ａｎｄ Ｆｒａｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２９３（１９８９）］および豚［Ｐｕｒｓｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｊｅｎｃｅ ２４４：１２８１−１２８８（１９８９）］などの他の下等および高等生物に移入させることもできる。
【０１７２】
哺乳類細胞における発現では、このｃＤＮＡ配列を、サルウイルス（ＳＶ）４０、ｐＳＶ２ベクター中のプロモーター［Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＡＳ，７８：２０７２−２０７６（１９８１）］などの異質プロモーターに連結することもでき、サルのＣＯＳ−１細胞［Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７５−１８２（１９８１）］などの細胞に導入して、一過性または長期にわたって発現させることもできる。キメラ遺伝子構成体の安定な組込みは、ネオマイシン［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎｄＢｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｎ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８１）］およびマイコフェノール酸［Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ ｂｅｒｇ，上掲］を使った生化学的選択によって哺乳類細胞中で維持することもできる。
【０１７３】
ＤＮＡ配列の操作は、制限酵素での消化、ＤＮＡポリメラーゼを用いた挿入、エキソヌクレアーゼによる欠失、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによる伸長、合成またはクローン化ＤＮＡ配列の連結、１本鎖バクテリオファージ中間体またはＰＣＲと組み合わせた特異的オリゴヌクレオチドの使用による部位特異的配列の変更などの標準的な方法で行うことができる。
【０１７４】
ｃＤＮＡ配列（もしくはそれに由来する部分）またはミニ遺伝子（イントロンおよびそれ独自のプロモーターを有するｃＤＮＡ）を、従来の手法によって真核細胞の発現ベクターに導入される。ｃＤＮＡの転写を開始および昂進させ、その適切なスプライシングおよびポリアデニル化を保証する調節配列を提供することによって真核細胞中でｃＤＮＡを転写させるように、これらのベクターが設計される。サルウイルス（ＳＶ）４０のプロモーターおよびエンハンサー領域、またはラウス肉腫ウイルスのＬＴＲ、ならびにポリアデニル化およびＳＶ４０からのスプライシングシグナルを含むベクターは容易に入手できる［Ｍｕｌｌｉｇａｎｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１０７８−２０７６（１９８１）；Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：６７７７−６７８１（１９８２）］。また、ＣＦＴＲの内在性プロモーターも使用できる。ｃＤＮＡの発現レベルは、この型のベクターを用いて以下のいずれかの方法によって操作することができる。すなわち、さまざまな活性（例えば、バキュロウイルスｐＡＣ３７３は、Ｓ．フルギペルダ（Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で高レベルのｃＤＮＡを発現し得る［Ｍ．Ｄ．Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｇ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ"ＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＡｌｔｅｒｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ"（Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．編）ｖｏｌ．２２ ｎｏ３１９−３２８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｐｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５］）を有するプロモーターを使用するか、調節を受け易いプロモーター（例えば、マウスの乳癌ウイルス［Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２９４：２２８（１９８２）］から得られるグルココルチコイド反応性プロモーターを含むベクターを使用する。ｃＤＮＡの発現は、レシピエント細胞中で導入後２４〜７２時間モニター可能である（一過性発現）。
【０１７５】
さらに、ベクターの中には、選択可能なマーカー（ｇｐｔ［Ｍｕｌｌｉｇａｎｅｔ Ｂｅｒｇ、上掲］）または化学的選択によって細胞を分離させるｎｅｏ［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｎ．Ｇｅｎｅｔ１：３２７−３４１（１９８２）］細菌遺伝子も含まれ、これらは、レシピエント細胞中で安定で長期間ベクターを発現させる。これらベクターは、パピローマ［Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１：１８６（１９８１）］またはエプシュタインーバール［Ｓｕｇｄｅｎ ｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：４１０（１９８５）］などのウイルスの調節エレメントを用いて、自由に複製するエピトープなどの細胞中で維持することができる。また、このベクターをゲノムＤＮＡに組み込んだ細胞系を産生することもできる。これら両型の細胞系は、遺伝子産物を連続的に産生する。ベクターのコピー数（したがって、ｃＤＮＡのコピー数も）を増幅させ、高レベルの遺伝子産物を産生し得る細胞系を創製することもできる［Ａｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７（１９７８）］。
【０１７６】
真核細胞、特にヒトまたは他の哺乳類細胞へのＤＮＡの転移は、現在では一般的方法である。ベクターは、例えば、リン酸カルシウムを用いた沈澱［Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４６６（１９７３）］、リン酸ストロンチウム［Ｂｒａｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７：２０１３（１９８７）］、電気穿孔法［Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ １：８４１（１９８２）］、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）［Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３（１９８７）］、ＤＥＡＥデキストラン法［ＭｃＣｕｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ，Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．４１：３５１（１９６８）］、マイクロインジェクション法［Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ １５：５７９（１９８７）］、プロトプラスト融合法［Ｓｓｈｆｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：２１６３］またはペレットガン法［Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０（１９７８）］によっで、純粋なＤＮＡとしてレシピエント細胞中に導入（移入）される。また、ｃＤＮＡは、ウイルスベクターを用いた感染によって導入することができる。例えば、レトロウイルス［Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：２３５（１９８５）］、アデノウイルス［Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ５７：２６７（１９８６）］またはヘルペスウイルスを使ったシステムが開発されている。これら真核細胞の発現系は、ＣＦ遺伝子およびＣＦＴＲ産物に関する多くの研究に使用することができる。これらには、以下のような研究が挙げられる。例えば、（１）遺伝子が適切に発現されているか否か、および完全な生物学的活性が適切に現れるか否かの測定。（２）ＣＦ遺伝子の５'末端に位置する調節エレメント、ならびにＣＦ遺伝子発現の組織制御および一時的制御における調節エレメントの役割の確認。（３）分離および精製のため大量の正常タンパク質の産生。（４）ＣＦＴＲタンパク質に対する抗体を調べる測定系または薬剤の有効性を試験する測定系としてＣＦＴＲタンパク質を発現する細胞の使用。（５）正常で完全なタンパク質、タンパク質の特定部分、または天然に存在する突然変異型タンパク質もしくは人工的に産生された突然変異型タンパク質の機能の研究。天然に存在する突然変異型タンパク質はＣＦ患者に存在する一方、人工的に産生された突然変異型タンパク質は、部位特異的配列を変更することによって設計可能である。これら後者の研究では、アミノ酸をコードするヌクレオチドを突然変異させることによってタンパク質中の目的とするいかなるアミノ酸残基の機能も調べることができる。
【０１７７】
上記の方法を用いて、ＣＦ遺伝子配列またはその断片を含む発現ベクターを、必要に応じてヒトの細胞、ヒト以外の哺乳類細胞または非哺乳類細胞に導入することができる。細胞の選択は、処理の目的によって決められる。例えば、高レベルのＳＶ４０Ｔ抗原を産生し、複製のＳＶ４０源を含むベクターを複製させるサルのＣＯＳ細胞［Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）］を使用することができ、この細胞を使用して、機能は要求されないので、ベクターがタンパク質産物を発現し得ることを示すことができる。類似の処理は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）またはマウスのＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞、またはヒトの線維芽細胞もしくはリンパ芽球を用いて行うことができよう。この発明の組換えクローニングベクターは、適切な宿主中での発現に対してこの発明のＤＮＡ配列の中から選定されたＤＮＡを含む。ＤＮＡをベクターに連結させ、発現の対照配列は、原核または真核細胞の遺伝子ならびにそれらのウイルスおよびそれらの組合わせの発現を調節するさまざまな配列からなる群より選ばれてもよい。発現対照の配列は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、λファージの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の対照領域、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスおよびサルウイルスから由来するプロモーター、３−フォスホグリセレートキナーゼのプロモーター、酵母の酸性ホスファターゼのプロモーター、酵母のα−対合因子のプロモーター、ならびにそれらの組合わせからなる群より特に選ばれてもよい。
【０１７８】
この発明のベクターで感染させることもできる宿主細胞は、大腸菌、シュードモナス、枯草菌、バチルス・ステアロサーモフィリスまたは他の桿菌、他の細菌、酵母、苔、昆虫、マウスもしくは他の動物、植物宿主、またはヒトの組織細胞からなる群より選ばれてもよい。
【０１７９】
突然変異ＤＮＡ配列では、類似の系を使用して突然変異産物を発現および産生させることは当然である。
【０１８０】
６．２ タンパク質機能の考察
ＣＦＴＲタンパク質の機能を研究するには、レシピエントとしての上皮細胞を使用することが好ましい。適切な機能の発現には、他の経路またはこの種の細胞中でのみ発現される遺伝子産物が必要だからである。使用可能な細胞の例としては、健常者もしくはＣＦ被験者由来のＴ８４（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ２４８）もしくはＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＬＬ１４６９）などのヒト上皮細胞系、またはＴ４３不動化ＣＦ鼻上皮細胞系［Ｊｅｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）］、および初代［Ｙａｎｈｏｓｋｅｓ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．１３２：１２８１（１９８５）］もしくは形質転換［Ｓｃｈｏｌｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１８２：５５９（１９８９）］ヒト鼻ポリープもしくは気道細胞、膵臓細胞［Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｃｏｌｅｍａｎ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．８７：６９５（１９８７）］、または汗腺細胞［Ｃｏｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ２１：５９７（１９８５）］が挙げられる。ＣＦ細胞は、突然変異ＣＦ遺伝子の機能的活性を調べるために使用することができる。現在利用可能な機能測定法には、細胞中ＡＭＰレベルを上昇させ、塩素チャンネルを活性化する試薬によって、細胞の刺激機能として細胞膜を通過するアニオン（ＣｌまたはＩ）の移動試薬が含まれる。その他の測定法には、細胞全体もしくは分離さらた膜のパッチクランピングによる細胞電位の変化の測定［Ｆｒｉｚｚｅｌｌ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：５５８（１９８６）；Ｗｅｌｓｃｈ ａｎｄ Ｌｉｅｄｔｋｅ Ｎａｔｕｒｅ ３３２：４６７（１９８６）］、またはコンフルエント細胞の上皮層におけるイオン流の試験［Ｗｉｄｄｉｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１６７（１９８５）］が含まれる。また、ＣＦ遺伝子から作成されたＲＮＡは、アフリカツメガエルの卵細胞に注入し得る。この卵細胞はＲＮＡをタンパク質に翻訳するので、この試験が可能となる。その他のより特異的な測定法も開発されているので、感染されたＣＦＴＲタンパク質の試験にも使用できる。
【０１８１】
ＣＦＴＲとヒトの多剤耐性ｐ−糖タンパクとの間の「ドメイン交換」実験は、ＣＦＴＲタンパク質の更なる研究で行うことができる。これらの実験では、プラスミド発現ベクターは、これら２つのタンパク質の各部分を含むタンパク質がプラスミドで感染された宿主細胞によって合成されるように、ＣＦＴＲ配列の断片およびＤＮＡリガーゼで連結されたｐ−糖タンパクの配列断片から通常の方法によって構成される。この手法には、多剤耐性に関連した多くの実験的パラメータが測定可能であるという利点がある。したがって、ＣＦＴＲのセグメントがこれらパラメータに及ぼす影響力を評価することができる。
【０１８２】
イオン輸送に関するＣＦＴＲの影響を調べるこれらの実験は、上皮輸送の分野を分子論的に解明するに役立つであろう。これは、完全な１次構造を示す上皮細胞から第１輸送に関連した分子である。ＣＦＴＲの知識は、この分野における上皮細胞膜の特徴を分子レベルでより理解するために利用できる。例えば、ＣＦＴＲに最も類似した分子は、架橋実験によって判明することができる。ＣＦＴＲの役割がイオンチャンネルを調節することであるという仮説は、必ずしもこのカテゴリーにあてはまらないであろう。ＣＦＴＲｃＤＮＡのクローニングのために構成さえた大きな高品質のｃＤＮＡライブラリーも、共輸送、逆輸送および能動輸送系と同様に他のチャンネルを含む他の輸送系を構成するポリペプチドのｃＤＮＡのクローニングに有用であろう。
【０１８３】
６．３ 治療法
この発明の組成物を用いたさまざまな生化学的試験の主要な目的は、ＣＦ疾患を克服する治療法の開発であって、薬理学的手段といわゆる遺伝子療法の両者が試みられる。
【０１８４】
薬理学的手段では、ＣＦ疾患を克服する薬剤が探求される。最初は、基本的には化合物がランダムにスクリーニングされるので、多くの候補化合物から識別するためのスクリーニングシステムが必要である。この発明は、さまざまな突然変異ＣＦ遺伝子を発現する宿主細胞系を提供し、第１段階のスクリーニングシステムとして使用するに最適である。好ましくは、ＣＦ発生突然変異型を含むＣＦＴＲタンパク質のコードＤＮＡ配列からなる発現ベクターを感染させた哺乳類細胞（ヒトの細胞が最も好ましい）を使った細胞培養系スクリーニング法に用いられる。候補にあがった薬剤は、その薬剤の存在下で細胞をインキュベーションし、ＣＦＴＲに依存するこれらの細胞性機能を測定すること、特にはトランスメンブラン電位が固定弁でクランプされるイオン流を測定することによって試験される。しかし、多数の測定試料を扱うには、例えば、イオン感受性蛍光色素の使用に基づいたより簡便な測定法がある。塩素イオン濃度ＳＰＱまたはその類似体の変化を検出することが有用である。
【０１８５】
また、無細胞系も使用可能である。精製されたＣＦＴＲは、人工膜中で再構成され、薬剤が無細胞系でスクリーニング可能となる［Ａｌ−Ａｑｗａｔｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８９）］。
【０１８６】
第２段階では、動物試験が必要である。マウスなどの動物でＣＦ遺伝子に相対する遺伝子の正常な発現を阻害することによってＣＦのモデル実験の開発が可能である。動物の胚に遺伝子の突然変異型を導入することによる遺伝子の「ノックアウト」によって、ＣＦ様症候群の動物系統が得られる。これによって、第１段階の細胞レベルでのスクリーニングで有望とみられる薬剤の試験が可能である。
【０１８７】
タンパク質の性質とその機能について更に詳しい知識が得られるので、ＣＦＴＲタンパク質と相互作用するタンパク質または他の化合物の構造を予測することができよう。これに続いて、このタンパク質と相互作用し、患者の治療になんらかの効果がみられるような薬剤に関するある種の予想が可能となろう。すなわち、この種の薬剤は設計が可能であり、ＣＦＴＲのドメインとの相互作用が要求される仮想の構造に基づいて化学的に合成され得る。この試みは、総説［Ｃａｐｓｅｙ ａｎｄ Ｄｅｌｖａｔｔｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇｓ，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８］にまとめられている。これら可能性のある薬剤は、このスクリーニング系で試験されねばならない。
【０１８８】
６．３．１ タンパク質置換療法
ＣＦの治療は、欠陥タンパク質を正常なタンパク質で置換すること、欠陥タンパク質の機能を調節すること、または生理学的異常を矯正するためにＣＦＴＲが関与する経路のもう一つの段階を修飾することによって行うことができる。
【０１８９】
この欠陥タンパク質を正常なもので置換可能とするには、大量の純粋なＣＦＴＲタンパク質を当然得ねばならない。初めに記載したように、純粋なタンパク質は培養細胞系から得られる。疾病に侵された気道にこのタンパク質を運搬するには、細胞膜中にこのタンパク質を容易に取り込ませる脂質含有ビークル中にこれをパッケイジングする必要がある。少なくとも肺胞細胞では、当然この機能を発揮する、ＳＡＰ（Ｖａｌ）またはＳＡＰ（Ｐｈｅ）などの界面活性タンパク質のようなタンパク質を取り込むビークルを使用することが妥当といえよう。［ＰＣＴ特許出願 ＷＯ／８８０３１７０，Ｗｈｉｔｓｅｔｔ ｅｔ ａｌ．１９８８年５月７日；ＰＣＴ特許出願 ＷＯ８９／０４３２７，Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８９年５月１８日］。このＣＦＴＲ含有ビークルは、ＣＦの治療に現在使用されている方法である吸入または刺激によって気道に導入される［Ｂｏａｔｅｔ ａｌ．上掲］。
【０１９０】
６．３．２ 薬物療法
ＣＦＴＲ機能の調節は、治療薬（薬物）を使用して行うことができる。これらは、欠陥ＣＦＴＲタンパク質を調節する際の有効性がインビトロでモニターされるスクリーニング法を用いてランダムな手段で確認することができる。このスクリーニング法では、そこで欠陥ＣＦＴＲタンパク質が発現される培養細胞系が用いられる。また、ＣＦＴＲタンパク質の構造と機能との相関に関する知見、ならびにさまざまなＣＦＴＲ突然変異タンパク質の特定の欠陥に関する知見［Ｃａｐｓｅｙ ａｎｄ Ｄｅｌｖａｔｔｅ，上掲］から、ＣＦＴＲ活性を調節するために薬物を設計することができる。各突然変異ＣＦＴＲタンパク質は、特定の調節のために異なった薬物を必要とすることが考えられる。したがって、薬物療法を開始する前に各ＣＦ患者で特異的な突然変異を同定する必要がある。
【０１９１】
薬物を設計して、ＣＦＴＲタンパク質の構造または機能に関して異なった観点で相互作用を起こさせることができる。例えば、薬物（または抗体）は、タンパク質の折り畳み構造に結合して欠陥構造を修正することができる。また、特定の機能をもつ残基に結合して、基質またはコファクターに対する親和性を増す薬剤もある。ＣＦＴＲが構造的に相同性をもつタンパク質群の要員は、さまざまな薬物と相互作用し、これに結合し、これを輸送するので、薬物関連療法がＣＦの治療に有効であることが当然予想される。
【０１９２】
有効な薬物の活性を高める第３の機構があるとすれば、細胞中でＣＦＴＲの産生または安定性を調節することであろう。ＣＦＴＲ量の増加によって、その欠陥機能の代償となり得る。
【０１９３】
薬物療法は、ＣＦＴＲ機能の発現にとって必要な生理学的または生化学的経路の他の成分との相互作用によってＣＦＴＲの欠陥機能を補うためにも利用され得る。これら相互作用は、付随タンパク質の活性の減少または増加に結び付き得る。これら薬物の同定法は、ＣＦＴＲ関連薬物に関して上記で記載したものと類似しているであろう。
【０１９４】
他の遺伝的疾患では、食餌を改良することによって正常な機能の変化または欠損による状況を改善することができる。これは、フェニルケトン尿症の場合のように代謝産物の除去という形をとる。その疾病では、知能的発育の遅れを防ぐため、生後５年間食餌からフェニルアラニンが除かれる。または、アデノシンデアミナーゼ欠損症の場合のように、大量の代謝産物を食餌に添加することもある。この疾病では、食餌に酵素を添加することによって、酵素活性の機能的修復をはかることができる。したがって、ＣＦＴＲ機能の詳細が解明され、ＣＦの基礎的欠陥が定義されれば、食餌の調節によって治療を行うこともできる。
【０１９５】
第２の重要な治療法は、いわゆる「遺伝子療法」であって、これでは、罹患した組織の重要な上皮細胞において正常なタンパク質を好適にコードするように、患者にＣＦ遺伝子の正常なコピーが導入される。気管の気道上皮細胞にこれを到達させる試みが最も重要である。ＣＦ遺伝子は、それが取り込まれ、調節機能を与えるに十分なタンパクをコードし得る形態で、これらの細胞に運ばれる。結果として、患者の生命の質と長さが大幅に伸びる。勿論、この遺伝子をすべての罹患した組織に運ぶことが究極の目的である。
【０１９６】
６．３．３ 遺伝子療法
ＣＦの療法の一つは、罹患した患者の気道上皮に正常な形のＣＦ遺伝子を挿入することである。呼吸器系がＣＦにおける罹患率と死亡率の主要な原因であり、膵臓疾患は主要な性質であるが、今日この疾患は酵素の補充によって比較的よく治療されることに着目するのは重要である。したがって、気道を標的とする体細胞の遺伝子療法［総説として、Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２７５（１９８９）］は、ＣＦに関連した最も重篤な疾患を軽減するであろう。
Ａ．レトロウイルスのベクター。レトロウイルスは、感染効率が高く、安定な組込みおよび発現を有し、体細胞遺伝子療法における実験で好ましいベクターと見られてきた［Ｏｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ ７：１３０（１９８８）］。欠点があるとすれば、レトロウイルスの組込みにとって細胞の分裂を要し、その結果、細胞周期にある気道の標的細胞をレトロウイルスの感染に先立って化学的手段によって引き出す必要があることである。完全な長さのＣＦ遺伝子のｃＤＮＡは、レトロウイルス中にクローニングすることができ、その内在性プロモーターまたはレトロウイルスのＬＲＴから抜く出すことができる。ウイルスの投与は気管へのエーロゾル噴霧または滴下によって行うことができよう。
【０１９７】
Ｂ．その他のウイルスベクター。利用可能な他の運搬系としては、アデノウイルス［ＡＡＶ，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６２：１９６３（１９８８）］、ウシパピローマウイルス［Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １３９：６４２（１９８７）］またはエプシュタイン−バールウイルスなどのヘルペスウイルス群の一員［Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８：２９３７（１９８８）］が挙げられる。これらの基礎的な生物学を知る必要性は大きいが、気管支に対する天然の向性を有するウイルスベクター（例えば、呼吸器シンシチアルウイルス、エコウイルス、コクサックウイルスなど）を使用するという考え方も可能である。
Ｃ．非ウイルス遺伝子の運搬呼吸器上皮細胞へのＣＦ遺伝子の他の挿入方法は生産的であり、これらの多くは効率が低く、インビトロでの感染、トラスフェクタントの選択、および再移植を潜在的に必要とする。これには、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、およびプロトプラスト融合が含まれる。特に興味深い概念は、リポゾームの使用であって、これはインビボでの実施が可能である［Ｏｓｔｒｏ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，１９８７］。
ＤＯＴＭＡ［Ｆｅｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３（１９８７）］などの合成カチオン性脂質は、効率を高め、この方法の実施を容易にすることもある。
【０１９８】
６．４ ＣＦの動物実験モデル
ＣＦに対するマウスまたは他の動物実験モデルの作成は、この疾病および可能性のある治療法を理解するに重要であろう［動物実験モデル作成の一般的総説：Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４３：５８２（１９８８）］。現在では、ＣＦの動物実験モデルは全くない。図４に示すように、進化におけるＣＦ遺伝子の保存性（Ｅ４．３およびＨ１．６に対して交差種のハイブリダイゼーションブロットで示される）は、マウスにおけるオートロガス（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子の存在を示し（以降、ｍＣＦと標記され、それに相当するタンパク質はｍＣＦＴＲと標記される）、これは、ヒトのＣＦ遺伝子を用いてマウスのゲノムおよびｃＤＮＡライブラリーにクローニングすることが可能である。Ｆ５０８突然変異に類似したマウスの遺伝子中の特定突然変異の形成は表現型を再生産するために最適であるが、ｍＣＦＴＲの完全な不活化は、有効な突然変異といえることが期待される。
Ａ．突然変異誘起
受精後のマウスのｍＣＦ遺伝子の不活化は化学薬品［例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３１３８（１９８１）］またはＸ線突然変異誘起［Ｐｏｐｐ ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：１４１（１９７９）］によって行われる。次いで、ｍＣＦＴＲの不活化に対する異質の子孫はサザン法によって同定され、用量によって１つの対立遺伝子の欠損が示され、ＲＦＬＰマーカーが評価されるならば、１匹の親の対立遺伝子を受け継げない。この方法は従来、マウスにおいてα−グロブリン［Ｗｈｉｎｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：１０８７（１９８０）］、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ［ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．２３：６３（１９８８）］、およびカルボニックアンヒドラーゼＩＩ［Ｌｅｗｉｓｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：１９６２（１９８８）］の突然変異型を同定するために用いられてきた。
【０１９９】
Ｂ．トランスジェニック
卵細胞インジェクションの標準法を用いて、ＣＦＴＲまたはｍＣＦＴＲの正常型または突然変異型をマウスの生殖系に挿入することができる［Ｃａｍｐｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８８）］、ｍＣＦ遺伝子を不活化または置換することが望ましければ、胚の幹（ＥＳ）細胞［Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８（１９８９）］を使って同族の組換え系を利用することができる。
【０２００】
１．卵細胞インジェクション
マウスの生殖系にランダムに位置する正常または異常ｍＣＦの１つ以上のコピーの置換は、受精したてのマウス卵細胞の前核へのマイクロインジェクチョンによって行なうことができ、続いて、疑妊娠の養母に再移植する。新生マウスのインテグラントを、ヒトＣＦ遺伝子配列の存在に対して尾のＤＮＡの解析によってスクリーニング可能である。同一のプロトコールを使って、突然変異ｍＣＦ遺伝子に挿入することができる。マウスの実験モデルを作成するには、突然変異誘起（上記参照）または同質的組換え（下記参照）によって、内在性ｍＣＦが不活化されているマウスにこのトランスジーンを挿入することを考えるであろう。このトランスジーンは次のいずれかであり得る。ａ）完全なゲノム配列であるが、このサイズ（約２５０ｋｂ）では、このトランスジーンを酵母の人工染色体または染色体断片に注入する必要がある。ｂ）天然のプロモーターまたは異質プロモーターを有するｃＤＮＡ。ｃ）コード領域のすべて、ならびにイントロン、プロモーターおよび最適発現に必要とみられる３'末端隣接エレメントなどの他のさまざまなエレメントを含む「ミニ遺伝子」。
【０２０１】
２．初期胚のレトロウイルス感染
この代わりの方法は、レトロウイルスベクターにＣＦＴＲまたはｍＣＦを挿入し、発生の初期段階にあるマウスの胚に直接感染させ、キメラを作成することである［Ｓｏｒｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ４６：１９（１９８６）］。このうちの少なくともいくつかは、生殖系トランスミッションに結び付くであろう。
【０２０２】
３．ＥＳ細胞および相同的組換え
胚の幹細胞方法［Ｃａｐｅｃｃｈｉ，上掲；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ ５：７０（１９８９）］によって、遺伝子トランスファーを行える確率が得られ、スクリーニングが可能となり、全形成能細胞が生じて、希な相同的組換体を確認できる。一度確認されれば、これらの組換体を使って、マウスの芽球の注入によってキメラが生じ、得られるマウスの比率は、組換体系から生殖系への伝達を示す。これがＣＦに関するマウスの実験モデルの作成に有用であり得るいくつかの方法がある。
【０２０３】
ａ）ｍＣＦの不活化は、ｎｅｏなどの選択可能なマーカーに隣接するｍＣＦＴＲエクソンからの配列を含むＤＮＡ断片を設計することによって好適に行われる。相同性組換えは、エクソンの中央部でのｎｅｏ配列の挿入につながり、ｍＣＦＴＲを不活化するであろう。この相同性組換体（通常約１／１０００）は、個々のクローンのＤＮＡ解析［通常ＰＣＲを使う。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８８８７（１９８８）；Ｊｏｙｎｅｒ ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３３８：１５３（１９８９）；Ｚｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．上掲ｐ．１５０］、または異質組換体に対する負の選択［構成体の末端でＨＳＶＴＫ遺伝子の使用に続いてガンシクロビル（Ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）選択など、Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８（１９８８）］によって異質のものから確認される。次いで、この不活化ｍＣＦＴＲマウスは、突然変異ＣＦ遺伝子またはＦ５０８異常もしくは他のいかなる目的とする突然変異をも含むｍＣＦ遺伝子を導入するために使用され得る。
【０２０４】
ｂ）ｍＣＦＴＲの特定の突然変異を１段階で生起させることができる。例えば、５'末端にｍＣＦイントロン９配列、中央部に選択可能なｎｅｏ遺伝子、および３'末端にイントロン９＋エクソン１０（Ｆ５０８突然変異のマウス型を含む）を含む構成体を作成することができる。相同的組換体はイントロン９におけるｎｅｏ遺伝子の挿入および突然変異型でのエクソン１０の置換につながる。
ｃ）イントロン中の選択可能なｎｅｏマーカーの存在がｍＣＦ遺伝子の発現を変更させる場合、第２の相同再組換段階におけるそれの切り出しが可能である。
ｄ）目的とする突然変異型を含むオリゴヌクレオチドの注入および得られた細胞のＰＣＲによるスクリーニングによってマウスの生殖系に突然変異を誘起させることができる。
【０２０５】
この発明のこの実施態様は、嚢胞性線維症に関するマウスの実験モデルと主に考えられてきた。図４は、マウスのＤＮＡだけでなく、ウシ、ハムスター、およびニワトリのＤＮＡに対する種間ハイブリダイゼーションを主に示す。したがって、オルソロガス遺伝子は他の多くの種類にも存在するものと考えられる。そこで、類似の手法を用いて他の動物実験モデルを作り出すことができよう。この発明の好ましい実施態様がここで詳細に記載されているが、当該分野の技術者には、この発明の精神または添付の請求の範囲の領域から逸脱することなく、それに対してさまざまな変更を行えることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＦＴＲタンパク質の前記アミノ酸配列である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＦＴＲタンパク質の前記アミノ酸配列である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＦＴＲタンパク質の前記アミノ酸配列である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＦＴＲタンパク質の前記アミノ酸配列である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＣＦ遺伝子の制限地図および前記遺伝子への染色体歩行およびジャンピングに使用された略手段である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＣＦ遺伝子の制限地図および前記遺伝子への染色体歩行およびジャンピングに使用された略手段である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＣＦ遺伝子の制限地図および前記遺伝子への染色体歩行およびジャンピングに使用された略手段である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＣＦ遺伝子の制限地図および前記遺伝子への染色体歩行およびジャンピングに使用された略手段である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＣＦ遺伝子の制限地図および前記遺伝子への染色体歩行およびジャンピングに使用された略手段である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＣＦ遺伝子の制限地図および前記遺伝子への染色体歩行およびジャンピングに使用された略手段である。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ＣＦ遺伝子の制限地図および前記遺伝子への染色体歩行およびジャンピングに使用された略手段である。
【図３】図３は、前記ＣＦ遺伝子を含みかつ取り囲む領域のパルスフィールドゲル電気泳動地図である。
【図３Ｅ】図３は、前記ＣＦ遺伝子を含みかつ取り囲む領域のパルスフィールドゲル電気泳動地図である。
【図４Ａ】図４Ａは、種間ハイブリダイゼーションによる保存されたヌクレオチド配列類の検出を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、種間ハイブリダイゼーションによる保存されたヌクレオチド配列類の検出を示している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、種間ハイブリダイゼーションによる保存されたヌクレオチド配列類の検出を示している。
【図４Ｄ】図４Ｄは、プローブ類Ｅ４．３およびＨ１．６の重複するセグメント類の制限地図である。
【図５】図５は、ゲノムおよびｃＤＮＡプローブ類を用いたＲＮＡブロットハイブリダイゼーション解析である。繊維芽細胞、気管（正常およびＣＦ）、膵、肝、ＨＬ６０、Ｔ８４、および脳ＲＮＡへのハイブリダイゼーションを示している。
【図６】図６は、前記ＣＦ遺伝子の５'末端におけるＥ４．３クローニング領域のメチル化状況である。
【図７Ａ】図７Ａは、ｃＤＮＡのゲノムＤＮＡ断片類への配列を示したＣＦＴＲ ｃＤＮＡの制限地図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ｃＤＮＡのゲノムＤＮＡ断片類への配列を示したＣＦＴＲ ｃＤＮＡの制限地図である。
【図８】図８は、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡ（クローン１０−１）の部分による６．５ｋｂのｍＲＮＡ転写体への種々のヒト組織中におけるハイブリダイゼーションを示したＲＮＡゲルブロット解析である。
【図９Ａ】図９Ａは、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したゲノムＲＮＡへのＣＦＴＲ ｃＤＮＡクローン類によるハイブリダイゼーションを示したＤＮＡブロットハイブリダイゼーション解析である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したゲノムＲＮＡへのＣＦＴＲ ｃＤＮＡクローン類によるハイブリダイゼーションを示したＤＮＡブロットハイブリダイゼーション解析である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したゲノムＲＮＡへのＣＦＴＲ ｃＤＮＡクローン類によるハイブリダイゼーションを示したＤＮＡブロットハイブリダイゼーション解析である。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したゲノムＲＮＡへのＣＦＴＲ ｃＤＮＡクローン類によるハイブリダイゼーションを示したＤＮＡブロットハイブリダイゼーション解析である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡの５'および３'末端を特性解析したプライマー延長実験である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡの５'および３'末端を特性解析したプライマー延長実験である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡの５'および３'末端を特性解析したプライマー延長実験である。
【図１１】図１１は、ヒドロパシープロフィールであり、かつ、ＣＦＴＲの予測２次構造を示している。
【図１２】図１２は、予測されたＣＦＴＲポリペプチド中における内部相同性のドットマトリックス解析である。
【図１３】図１３は、予測されたＣＦＴＲタンパク質の略モデルである。
【図１４】図１４は、ＣＦ遺伝子に緊密に連結した制限断片長多形性（ＲＦＬＰ類）の略図であり、その中で、倒立三角形は、Ｆ５０８ ３塩基対欠失の位置を示している。
【図１５】図１５は、正常配列を検出するプローブＮおよびＣＦ変異配列を検出するプローブＦによるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによるＦ５０８変異の検出を示したものである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＣＦＴＲの延長ＮＢＦ類の最もよく保存されたセグメント類と他のタンパク質類の匹敵する領域類との配列を示したものである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＣＦＴＲの延長ＮＢＦ類の最もよく保存されたセグメント類と他のタンパク質類の匹敵する領域類との配列を示したものである。
【図１７】図１７は、Ｆ５０８欠失周辺のＤＮＡ配列である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、Ｆ５０８欠失におけるＤＮＡ配列を示したヌクレオチド配列決定ゲルを示したものである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、Ｆ５０８欠失におけるＤＮＡ配列を示したヌクレオチド配列決定ゲルを示したものである。
【図１９Ａ】図１９ａは、ｐＧＥＸプラスミド類によって形質転換された細菌溶解物（ＪＭ１０１）からのタンパク質の電気泳動後クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色ポリアクリルアミドゲル類である。
【図１９Ｂ】図１９ｂは、ｐＧＥＸプラスミド類によって形質転換された細菌溶解物（ＪＭ１０１）からのタンパク質の電気泳動後クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色ポリアクリルアミドゲル類である。
【図２０】図２０は、２匹の異なるウサギから得た免疫前および免疫血清による融合タンパク質＃１含有細菌溶解物のイムノブロットである。
【図２１】図２１は、図２０のウサギ＃１からの免疫血清を用いたＴ−８４膜類のイムノブロットである。
【図２２】図２２は、表８のペプチド＃２とＫＬＨとの結合物で免疫したウサギ由来免疫前血清および免疫血清で探索したイムノブロットである。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＦＴＲタンパク質の前記アミノ酸配列である。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＦＴＲタンパク質の前記アミノ酸配列である。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＦＴＲタンパク質の前記アミノ酸配列である。
【図２３Ｄ】図２３Ｄは、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＦＴＲタンパク質の前記アミノ酸配列である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2004208694.tif 000043
【図８】
2004208694.tif 000044
【図９Ａ】
2004208694.tif 000045
【図９Ｂ】
2004208694.tif 000046
【図９Ｃ】
2004208694.tif 000047
【図９Ｄ】
2004208694.tif 000048
【図１０Ａ】
2004208694.tif 000049
【図１０Ｂ】
2004208694.tif 000050
【図１０Ｃ】
2004208694.tif 000051
【図１１】
2004208694.tif 000052
【図１２】
2004208694.tif 000053
【図１３】
2004208694.tif 000054
【図１４】
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【図１５】
2004208694.tif 000056
【図１６Ａ】
2004208694.tif 000057
【図１６Ｂ】
2004208694.tif 000058
【図１７】
2004208694.tif 000059
【図１８Ａ】
2004208694.tif 000060
【図１８Ｂ】
2004208694.tif 000061
【図１９Ａ】
2004208694.tif 000062
【図１９Ｂ】
2004208694.tif 000063
【図２０】
2004208694.tif 000064
【図２１】
2004208694.tif 000065
【図２２】
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【図２３Ａ】
2004208694.tif 000067
【図２３Ｂ】
2004208694.tif 000068
【図２３Ｃ】
2004208694.tif 000069
【図２３Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月8日(2004.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２９】
伝達手段が組換えベクターである請求項２８に記載の組成物。