(57)【要約】【課題】汎用されているエレクトロポレーション法の遺伝子導入効率をさらに向上させ、存在量が少ないなどの理由のために検出されなかった遺伝子クローンを獲得し、発現させること。【解決手段】細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、トランスフェクション試薬の存在下にエレクトロポレーション法を行うことを特徴とする方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、トランスフェクション試薬の存在下にエレクトロポレーション法を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを混合し、３５〜４０℃で１５秒〜２０分間保温した後、エレクトロポレーション法を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを混合し、３５〜４０℃で１５秒〜２０分間保温した後、急冷し、エレクトロポレーション法を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
トランスフェクション試薬が脂質を主成分とする試薬である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
トランスフェクション試薬がカチオンリポソームである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを混合し、３５〜４０℃で１５秒〜２０分間保温し、冷蔵又は冷凍保存した後にエレクトロポレーション法を行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを含む遺伝子導入キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌、ラン藻類、菌類、酵母、植物細胞、動物細胞等の種々の細胞に、ポリヌクレオチドを効率よく導入し、発現させるための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞にポリヌクレオチドを導入し、遺伝子やタンパク質を発現させることは、遺伝子の機能解析のためには必須となる技術である。そのため、種々の細胞にポリヌクレオチドを導入することにより、遺伝子やタンパク質を発現させることを目的として、様々な技術や試薬の改良が試みられている。
【０００３】
原核細胞へポリヌクレオチドを導入する方法としては、主として物理法と化学法とが知られている（例えば、非特許文献１等参照）。
【０００４】
物理法は、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等を含み、例えば、エレクトロポレーション法の場合、大腸菌では対数増殖期の細胞を純水などの塩をほとんど含まない溶液にて洗浄し、氷上にてポリヌクレオチドと共存させた後、短い時間高電圧をかけることで細胞に一時的に小孔を生じさせポリヌクレオチドを導入し、賦活培地にて１時間程度３７℃にて培養し、選択培地に植菌するものである。
【０００５】
化学法は、例えば、大腸菌の場合には、塩化カルシウム溶液などで細胞を処理し、氷上でポリヌクレオチドと共存させた後、４２℃で短時間温め、再度氷上で２分程度冷却した後に、賦活培地にて１時間程度３７℃にて培養し、選択培地に植菌するものである。
【０００６】
また、真核細胞、特に培養細胞の場合には、化学法として上記の方法のほかにリポフェクション法が知られている（例えば、非特許文献１等参照）。リポフェクション法は、主に正に荷電しているリポソーム（カチオンリポソーム）とポリヌクレオチドとの複合体を形成させ、該カチオンリポソームを負に荷電している細胞表面に吸着させ、細胞膜と融合させることによって、細胞内にポリヌクレオチドを導入させる方法である。
【０００７】
これら種々の方法の中では、エレクトロポレーション法による遺伝子の導入が最も効率が良く、多種の細胞において汎用されている。
【０００８】
しかしながら、カチオン界面活性剤などのトランスフェクション試薬の共存下にエレクトロポレーション法を行う手法について記載された文献、特許出願等はなく、本発明者らは、カチオン界面活性剤の存在下にエレクトロポレーション法を行うと、遺伝子導入の効率は高くなるどころか、逆に効率は低下することを見出した（例えば、未公開特許出願１等参照）。
【０００９】
【非特許文献１】
サムブルック・ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　）及びディー．ダブリュー．ラッセル（Ｄ．Ｗ．　Ｒｕｓｓｅｌｌ）著，「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」，（米国），第３版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ），２００１年
【００１０】
【未公開特許出願１】
特願２００１−３８１００２
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、汎用されているエレクトロポレーション法の遺伝子導入効率をさらに向上させ、存在量が少ないなどの理由のために検出されなかった遺伝子クローンを獲得し、発現させることにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の如き従来技術の問題点を解決するために、鋭意研究を重ねてきた。その結果、トランスフェクション試薬、特に脂質を主成分とするトランスフェクション試薬を、特定の条件下でポリヌクレオチドと混合し、この混合物をエレクトロポレーション法により細胞に遺伝子導入を行うことにより、従来法に比べて遺伝子導入効率が非常に向上することを見出した。
【００１３】
即ち、本発明は、以下のポリヌクレオチドを導入する方法に関する。
【００１４】
１．細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、トランスフェクション試薬の存在下にエレクトロポレーション法を行うことを特徴とする方法。
【００１５】
２．ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを混合し、３５〜４０℃で１５秒〜２０分間保温した後、エレクトロポレーション法を行うことを特徴とする項１に記載の方法。
【００１６】
３．ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを混合し、３５〜４０℃で１５秒〜２０分間保温した後、急冷し、エレクトロポレーション法を行うことを特徴とする項１に記載の方法。
【００１７】
４．トランスフェクション試薬が脂質を主成分とする試薬である項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００１８】
５．トランスフェクション試薬がカチオンリポソームである項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００１９】
６．ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを混合し、３５〜４０℃で１５秒〜２０分間保温し、冷蔵又は冷凍保存した後にエレクトロポレーション法を行うことを特徴とする、項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００２０】
７．ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを含む遺伝子導入キット。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明のポリヌクレオチドを導入する方法は、通常のトランスフェクション試薬、特に脂質を主成分とするトランスフェクション試薬を使用し、それをポリヌクレオチドと混合した後に、一定時間保温し、その直後にエレクトロポレーション法を行うことにより遺伝子を導入することが好ましい。
【００２２】
本発明の遺伝子導入方法を適用できる細胞としては、細菌、ラン藻類、菌類、酵母、植物細胞、動物細胞など種々の細胞が挙げられる。その中でも、特に、大腸菌等の原核生物に対して効率的に遺伝子を導入することができる。
【００２３】
本明細書において、ポリヌクレオチドとは、各種ＤＮＡだけでなく、例えば、自己増殖するプラスミド、ＰＣＲ断片等も含むものとする。ポリヌクレオチドの種類、調製法等は特に限定されず、実験の目的等に応じて適宜選択することができる。
【００２４】
本発明において、ポリヌクレオチドを細胞に導入する際に、トランスフェクション試薬を用いることが特に好ましい。トランスフェクション試薬としては、一般に動物の培養細胞等の真核細胞に対して使用されるトランスフェクション試薬を用いることができる。好ましくは、脂質を主成分とするトランスフェクション試薬、更に好ましくは、カチオンリポソームを主成分とするトランスフェクション試薬である。
【００２５】
本明細書において、脂質としては、限定されるものではなく、例えば、単純脂質、複合脂質、誘導脂質、リポ多糖、リポタンパク質、ステロイド、カルテノイド、テルぺノイドだけでなく、脂肪酸、カチオンリポソーム等も含むものとする。
【００２６】
また、カチオンリポソームとは、例えば、不飽和度が低い炭素分子鎖を主体とする分子の片端にカチオンとなる原子団（カチオン荷電分子）を有する荷電した分子を用いて作られたリポソームを意味する。
【００２７】
炭素分子鎖を主体とする分子の例として、炭素数１２〜２０、二重結合の数が０〜４の脂肪酸の他に、官能基を有するベンゼン環、窒素原子を含む複素環化合物が挙げられる。具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、リグノセリン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸だけではなく、（Ｓ）−２−メチル−１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−４−カルボン酸（（Ｓ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−１，４，５，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）、（Ｓ）−２−メチル−５−ヒドロキシ−１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−４−カルボン酸（（Ｓ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−１，４，５，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）等も例示できる。これらは単独で使用することもできるし、２種以上併用することもできる。
【００２８】
カチオン荷電分子とは、カチオンに荷電する分子をいい、例えば、アミン塩、第４級アンモニウム塩、ピリジニウム塩等が挙げられる。これらも単独で使用しても良いし、２種以上用いても良い。
【００２９】
炭素分子鎖を主体とする分子とカチオン荷電分子とは、任意の組み合わせで用いることができ、これらを結合させる方法は適宜選択することができる。
【００３０】
カチオンリポソーム主成分とする具体的なトランスフェクション試薬としては、例えば、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）、ＤＯＳＦＥＲ（１，３−Ｄｉ−Ｏｌｅｏｘｙｌｏｘｙ−２−（６−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）等を例示することができる。
【００３１】
また、脂質を主成分とする具体的なトランスフェクション試薬としては、上記のカチオンリポソームに加え、Ｔｒａｎｓｏｍｅ（登録商標）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６等を例示することができる。
【００３２】
ポリヌクレオチドを細胞に導入する際には、ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬を混合し、複合体を形成させてからエレクトロポレーション法を行うことが好ましい。
【００３３】
ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを混ぜる方法は、ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とが複合体を形成する限り限定されない。例えば、マイクロチューブのようなケースにトランスフェクション試薬を予め入れておき、必要量のポリヌクレオチドを添加することが挙げられる。ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬を添加する順序はこれに限られず、その逆でもよい。
【００３４】
その後、必要に応じて軽く混和し、好ましくは３５〜４０℃程度、更に好ましくは３６〜３８℃程度、特に好ましくは３７℃程度で、１０分以下、好ましくは１５秒〜２０分間程度インキュベートすればよい。
【００３５】
インキュベートした後、直ちに、例えば約１分以内に複合体を細胞と接触させ、エレクトロポレーション法により遺伝子導入を行うことが好ましい。インキュベートした後、例えば室温で放置しておくと、遺伝子導入効率が低下する可能性があるので、できるだけ素早く行うことが好ましい。
【００３６】
また、インキュベーションした複合体を、例えば４℃以下で１分以上急冷した後に細胞と接触させ、エレクトロポレーション法を行うことにより遺伝子導入を行うこともできる。
【００３７】
エレクトロポレーション法を行う際に、細胞を冷却した状態（例えば、約４℃以下）で使用することが多い。本発明においても、予め細胞を冷却しておくと、細胞の懸濁液に上記の複合体を添加することにより、複合体の急冷及び複合体と細胞との接触を同時に行うことができるので、作業効率及び導入効率の点からも好ましい。
【００３８】
また、インキュベートした複合体又はその後に急冷した複合体を、４℃以下で冷蔵又は冷凍保存した後にエレクトロポレーションを行った場合でも、インキュベーションした後に急冷してエレクトロポレーション法を行った場合と同様に、高い遺伝子導入効率を得ることができる。冷凍保存した複合体を使用する際には、例えば氷上で解凍することにより、エレクトロポレーション法に使用することができる。
【００３９】
インキュベート又は急冷した複合体を細胞と接触させる方法としては限定されず、細胞の懸濁液に複合体を添加して必要に応じて軽く混和してもよく、複合体に細胞の懸濁液を添加して必要に応じて軽く混和してもよい。
【００４０】
ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを混合する割合は、ポリヌクレオチドの種類、用いるトランスフェクション試薬の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリヌクレオチド１μｇあたりトランスフェクション試薬の脂質成分として１０〜２０００μｇ程度、好ましくは１００〜１０００μｇ程度（重量比でポリヌクレオチド：トランスフェクション試薬＝１：１０〜２０００、好ましくは１：１００〜１０００）が例示できる。この範囲内において、高い遺伝子導入効率が得られるからである。
【００４１】
該複合体と細胞との混合割合は、通常エレクトロポレーション法によって用いられている割合を使用することができ、細胞の種類、その量、複合体の種類、その量等に応じて適宜選択することができる。例えば、大腸菌の場合、１×１０９個程度の細胞に対してポリヌクレオチドが１ｐｇ程度になるように複合体を添加すれば、十分な導入効率を得ることができる。
【００４２】
エレクトロポレーション法は、公知の装置を用いて公知のエレクトロポレーション法の手法を用いることができ、実験条件は、導入する遺伝子の種類・量、用いる細胞の種類・量等に応じて適宜選択することができる。
【００４３】
その後、選択培地で細胞を培養した後、ポリヌクレオチドが細胞に導入されたことを、公知の方法により確認することができる。例えば、抗生物質耐性などによる確認、ＰＣＲによるポリポリヌクレオチドの検出が挙げられる。ポリヌクレオチドの中に挿入できる遺伝子としては、例えば、アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）耐性遺伝子やカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子やクロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子、構造遺伝子、調節遺伝子等、種々のポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４４】
上記のとおり、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体は、冷蔵又は冷凍保存することができるので、必要なときに使用することができ、更に、トランスフェクションキットして用いることもできる。
【００４５】
【実施例】
以下に、実施例を示し、本発明の特徴とするところをより一層明瞭にする。
【００４６】
実施例１：ＤＨ５α、ＤＯＴＡＰを用いてトランスフェクション（複合体生成直後）
１０ｐｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９と、トランスフェクション試薬　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）をミリＱ水にて希釈し、１０ｐｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌ（具体的には、１０，２０，５０，１００，２００，５００ｐｇ／μｌ、１，２，５，１０，２０，５０，１００ｎｇ／μｌ）のＤＯＴＡＰ溶液を調製し、プラスミドとトランスフェクション試薬溶液を、それぞれのマイクロチューブに０．４μｌずつ分注し、コントロールにはプラスミドのみを分注した。
【００４７】
これらの混合物を軽く混和した後、３７℃で５分インキュベートし、プラスミドとトランスフェクション試薬の複合体を得た。これに直ちに予め氷上にて１分以上冷却した大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、＞１×１０１０個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を５０μｌずつ加え、ＢＩＯＲＡＤ社のＧＥＮＥ　ＰＵＬＳＥＲ　ＩＩ（１００Ω，　５０μＦ，　２．５ｋＶ，　０．２ｃｍキュベット）にてエレクトロポレーションを行った。
【００４８】
その後、３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００４９】
コントロールのトランスフェクション試薬を混ぜなかったものが、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり１．０×１０９株のアンピシリン耐性の形質転換株を得たのに対して、トランスフェクション試薬の濃度が、１００ｐｇ／μｌ〜２０ｎｇ／μｌの試薬を混ぜたものは、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり３．０×１０９株以上のアンピシリン耐性の形質転換株を得、特に１ｎｇ／μｌ〜１０ｎｇ／μｌの試薬を混ぜたものは、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり１．０×１０１０株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。
【００５０】
実施例２：ＤＨ５α、ＤＯＴＡＰを用いてトランスフェクション（急冷有り）
１０ｐｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９と、トランスフェクション試薬　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）をミリＱ水にて希釈し、１０ｐｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌ（具体的には、１０，２０，５０，１００，２００，５００ｐｇ／μｌ、１，２，５，１０，２０，５０，１００ｎｇ／μｌ）の溶液を調製し、プラスミドとトランスフェクション試薬溶液を、それぞれのマイクロチューブに０．４μｌずつ分注し、コントロールにはプラスミドのみを０．４μｌ分注した。
【００５１】
これらの混合物を軽く混和した後、３７℃にて５分インキュベートし、プラスミドとトランスフェクション試薬の複合体を得た。これを氷上にて１分急冷後、予め氷上にて１分以上冷却した大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、＞１×１０１０個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を５０μｌずつ加え、ＢＩＯＲＡＤ社のＧＥＮＥ　ＰＵＬＳＥＲ　ＩＩ（１００Ω，５０μＦ，　２．５ｋＶ，　０．２ｃｍキュベット）にてエレクトロポレーションを行った。
【００５２】
その後、３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００５３】
コントロールのトランスフェクション試薬を混ぜなかったものが、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり１．０×１０９株のアンピシリン耐性の形質転換株を得たのに対して、トランスフェクション試薬の濃度が、１００ｐｇ／μｌ〜２０ｎｇ／μｌの試薬を混ぜたものは、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり２．０×１０９株以上のアンピシリン耐性の形質転換株を得、特に１ｎｇ／μｌ〜１０ｎｇ／μｌの試薬を混ぜたものは、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり５．０×１０９株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。
【００５４】
この急冷したプラスミドとトランスフェクション試薬との複合体を、４℃、−２０℃にてそれぞれ１週間保存した後、トランスポーレーション法により遺伝子導入を行ったところ、急冷した直後に遺伝子導入を起こった場合と同様の導入効率が得られた。
【００５５】
実施例３：ＤＨ５α、ＤＯＳＰＥＲを用いてトランスフェクション（複合体生成直後）
１０ｐｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９と、トランスフェクション試薬　ＤＯＳＦＥＲ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、ダイカチオニックタイプ、１，３−Ｄｉ−Ｏｌｅｏｘｙｌｏｘｙ−２−（６−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）をミリＱ水にて希釈し、１０ｐｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌ（具体的には、１０，２０，５０，１００，２００，５００ｐｇ／μｌ、１，２，５，１０，２０，５０，１００ｎｇ／μｌ）の溶液を調製し、プラスミドとトランスフェクション試薬溶液を、それぞれのマイクロチューブに０．４μｌずつ分注し、コントロールにはプラスミドのみを０．４μｌ分注した。
【００５６】
これらの混合物を軽く混和した後、３７℃にて５分インキュベートし、プラスミドとトランスフェクション試薬の複合体を得た。これを直ちに、予め氷上にて１分以上冷却した大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、＞１×１０１０個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を５０μｌずつ加え、ＢＩＯＲＡＤ社のＧＥＮＥ　ＰＵＬＳＥＲ　ＩＩ（１００Ω，　５０μＦ，　２．５ｋＶ，
０．２ｃｍキュベット）にてエレクトロポレーションを行った。
【００５７】
その後、３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００５８】
コントロールのトランスフェクション試薬を混ぜなかったものが、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり１．０×１０９株のアンピシリン耐性の形質転換株を得たのに対して、トランスフェクション試薬の濃度が、１００ｐｇ／μｌ〜２０ｎｇ／μｌの試薬を混ぜたものは、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり２．５×１０９株以上のアンピシリン耐性の形質転換株を得、特に、１ｎｇ／μｌ〜１０ｎｇ／μｌの試薬を混ぜたものは、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり６．０×１０９株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。
【００５９】
実施例４：ＪＭ１０９、ＤＯＴＡＰを用いてトランスフェクション（複合体生成直後）
１０ｐｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９とトランスフェクション試薬　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）をミリＱ水にて希釈し、１０ｐｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌ（具体的には、１０，２０，５０，１００，２００，５００ｐｇ／μｌ、１，２，５，１０，２０，５０，１００ｎｇ／μｌ）の溶液を調製し、プラスミドとトランスフェクション試薬溶液を、それぞれのマイクロチューブに０．４μｌずつ分注し、コントロールにはプラスミドのみを０．４μｌ分注した。　これらの混合物を軽く混和した後、３７℃にて５分インキュベートし、プラスミドとトランスフェクション試薬の複合体を得た。これに直ちに、予め氷上にて１分以上冷却した大腸菌エレクトロコンピテントセルＪＭ１０９（ＴＡＫＡＲＡ、＞１×１０１０個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を５０μｌずつ加え、ＢＩＯＲＡＤ社のＧＥＮＥ　ＰＵＬＳＥＲ　ＩＩ（１００Ω，　５０μＦ，　２．５ｋＶ，　０．２ｃｍキュベット）にてエレクトロポレーションを行った。
【００６０】
３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６１】
コントロールのトランスフェクション試薬を混ぜなかったものが、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり１．０×１０９株のアンピシリン耐性の形質転換株を得たのに対して、トランスフェクション試薬の濃度が、１００ｐｇ／μｌ〜２０ｎｇ／μｌの試薬を混ぜたものは、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり３．０×１０９株以上のアンピシリン耐性の形質転換株を得、特に１ｎｇ／μｌ〜１０ｎｇ／μｌの試薬を混ぜたものは、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり８．０×１０９株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。
【００６２】
実施例５：ＤＨ５α、ＤＯＴＡＰを用いたトランスフェクションにおける３７℃複合体生成時間の検討（複合体生成直後）
１０ｐｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９と、トランスフェクション試薬　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）をミリＱ水にて希釈し、１００ｎｇ／μｌの溶液を調製し、プラスミドとトランスフェクション試薬溶液を、それぞれのマイクロチューブに０．４μｌずつ分注し、コントロールにはプラスミドのみを０．４μｌ分注した。これらの混合物を軽く混和した後、３７℃にて１分、３分、５分、１０分、３０分インキュベートし、プラスミドとトランスフェクション試薬の複合体を得た。これに直ちに、予め氷上にて１分以上冷却した大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、＞１×１０１０個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を５０μｌずつ加え、ＢＩＯＲＡＤ社のＧＥＮＥ　ＰＵＬＳＥＲ　ＩＩ（１００Ω，　５０μＦ，　２．５ｋＶ，　０．２ｃｍキュベット）にてエレクトロポレーションを行った。
【００６３】
３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６４】
結果として、得られたアンピシリン耐性の形質転換株の数（ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり）を以下の表１に示す。
【００６５】
【表１】
2004113099.tif 000002
【００６６】
以上の結果から、１〜１０分のインキュベーション時間で、コントロールの１０倍程度の形質転換効率が得られることがわかった。
【００６７】
実施例６：ＤＨ５α、ＤＯＴＡＰを用いたトランスフェクションにおいて複合体生成温度の検討（複合体生成直後）
１０ｐｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９とトランスフェクション試薬　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）をミリＱ水にて希釈し、１００ｎｇ／μｌの溶液を調製し、プラスミドとトランスフェクション試薬溶液を、それぞれのマイクロチューブに０．４μｌずつ分注し、コントロールにはプラスミドのみを０．４μｌ分注した。これらの混合物を軽く混和した後、２５℃、３０℃、３７℃、４２℃にて、それぞれ５分、３０分インキュベートし、プラスミドとトランスフェクション試薬の複合体を得た。これを直ちに、予め氷上にて１分以上冷却した大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、＞１×１０１０個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を５０μｌずつ加え、ＢＩＯＲＡＤ社のＧＥＮＥ　ＰＵＬＳＥＲ　ＩＩ（１００Ω，　５０μＦ，　２．５ｋＶ，　０．２ｃｍキュベット）にてエレクトロポレーションを行った。
【００６８】
３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６９】
結果として、得られたアンピシリン耐性の形質転換株の数（ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり）を以下の表２に示す。
【００７０】
【表２】
2004113099.tif 000003
【００７１】
以上の結果より、インキュベーション時間が５分の場合は、インキュベーション温度を３７℃にした場合に、その他の温度の場合に比し形質転換体の数が顕著に増加することがわかった。また、インキュベーション時間が３０分の場合には、どの温度においてもコントロールと比べて大差ない結果となった。
【００７２】
【発明の効果】
本発明によれば、トランスフェクション試薬の存在下にエレクトロポレーションを行うことによって、ポリヌクレオチドを非常に高い効率で細胞に導入し、形質転換を行うことができる。
【００７３】
また、本発明の方法は、細菌類、ラン藻類、菌類、酵母、植物細胞、動物細胞など、種々の細胞に適用することができる。
更に、本発明におけるポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体は、冷蔵又は冷凍保存しても高い導入効率が得られるという効果も奏する。