(57)【要約】　　　（修正有）【課題】結核菌を特異的に検出および／または同定するための手段の開発。【解決手段】結核菌の全ゲノム情報を基に、Ｅ．ｃｏｌｉなど他の微生物のゲノム配列とを比較解析し、初めて明らかにされた結核菌に特異的な配列、その配列を含むオリゴヌクレオチド、そのオリゴヌクレオチドを含むプローブ、並びにそのプローブを具備するプローブ固相化基体を提供する。さらに、プローブ固相化基体を用いる結核菌の同定および／または検出する新規な方法を提供する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８および配列番号１６９からなる群より選択される配列番号により示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８および配列番号１８９からなる群より選択される配列番号により示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む結核菌特異的ＰＥ−ＰＧＲＳ遺伝子およびＰＰＥ遺伝子に対して特異的に結合するためのプローブ。
【請求項４】
サンプル中の結核菌を検出する方法であって、
（１）サンプル中の核酸と請求項３に記載のプローブとをハイブリダイズに適切な条件下で反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、前記プローブとハイブリダイズした核酸の存在を検出する工程と、
（３）前記（２）において検出された結果を基に検体中の結核菌の検出を行う工程と、
を具備するサンプル中の結核菌を検出する方法。
【請求項５】
サンプル中の結核菌を同定する方法であって、
（１）サンプル中の核酸と請求項３に記載のプローブとをハイブリダイズに適切な条件下で反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、前記プローブとハイブリダイズした核酸の存在を検出する工程と、
（３）前記（２）において検出された結果を基に、検体中の結核菌の遺伝子型を判定する工程と、
を具備するサンプル中の結核菌を同定する方法。
【請求項６】
サンプル中の結核菌特異的ＰＥ−ＰＧＲＳおよびＰＰＥ遺伝子を同定する方法であって、
（１）サンプル中の核酸と請求項３に記載のプローブとをハイブリダイズに適切な条件下で反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、前記プローブとハイブリダイズした核酸の存在を検出する工程と、
（３）前記（２）において検出された結果を基に、検体中の結核菌の遺伝子型を判定する工程と、
を具備する結核菌特異的ＰＥ−ＰＧＲＳおよびＰＰＥ遺伝子を同定する方法。
【請求項７】
前記サンプル中の核酸が、ｍＲＮＡであることを特徴とする請求項３から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブが基体に固相化されていることを特徴とする請求項３から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、対象から採取した血液、組織および細胞並びに対象から採取した試料の培養物からなる群より選択されることを特徴とする請求項３から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
サンプル中の核酸が、標識物質で標識されることを特徴とする請求項３から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
サンプル中の結核菌の検出と同定を同時に行う方法であって、
（１）サンプル中の核酸と請求項３に記載のプローブとをハイブリダイズに適切な条件下で反応させる工程と、
（２）前記（１）の工程の後に、前記プローブとハイブリダイズした核酸の存在を検出する工程と、
（３）前記（２）において検出された結果を基に、検体中の結核菌の遺伝子型を判定する工程と、
を具備するサンプル中の結核菌の検出と同定を同時に行う方法。
【請求項１２】
少なくとも請求項１または２の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチドをプローブとして具備するプローブ固相化基体。
【請求項１３】
少なくとも請求項１または２の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチドを具備するアッセイ用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、結核菌に特異的な配列、その配列を含むオリゴヌクレオチド、それを使用する結核菌の同定および検出方法、そのオリゴヌクレオチドを含むプローブ、並びにそのプローブを具備するプローブ固相化基体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、結核菌の検出および同定は、患者から採取したサンプルを培養し、得られた培養菌を用いて、それに対して核酸増幅（例えば、ＰＣＲ法、ＴＭＡ法およびＬＲＣ法）を行うことにより実施されている。しかしながら、そのような方法は、培養に時間が係り、それらの方法自体が煩雑であったりする。
【０００３】
一方、ゲノム解析が世界的に進むなかで、結核菌もまた、その全ゲノム解析が終了している（非特許文献１を参照されたい）。そのような中で、結核菌の全遺伝子をＰＣＲ法を用いて増幅し、このＰＣＲ産物を固着化したＤＮＡチップを作成することも提案されている（非特許文献２および非特許文献３を参照されたい）。このようなチップを用いて、結核菌等のゲノム構造の違いを検出する方法である。
【０００４】
しかしながら、このような従来の技術では、結核菌の全ゲノムを対象としたＤＮＡチップであるため、解析に大がかりな解析装置と莫大な時間がかかる。従って、多検体からの結核菌遺伝子タイピングは不可能であった。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｎａｔｕｒｅ，３９３：５３７−５４４、（１９９８）
【０００６】
【特許文献２】
Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８４：１５２０−１５２３，　（１９９９）
【０００７】
【特許文献３】
Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．，　９８：７５３４−７５３９，　（２００１）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上述のような状況において、本発明は、結核菌を特異的に検出および／または同定するための手段を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するための本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８および配列番号１６９からなる群より選択される配列番号により示されるオリゴヌクレオチドである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
１．結核菌特異的配列
本発明の１態様は、結核菌を特異的に検出および／または同定することが可能なヌクレオチド配列である。そのような配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８および配列番号１６９、並びに配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８および配列番号１８９に示す塩基配列により表される。
【００１１】
これらの配列は、結核菌と結核菌に特異的なＰＥ−ＰＧＲＳ、ＰＰＥおよびＰＥ遺伝子群に由来する配列であり、本発明者らが、結核菌と、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｒｒａ　ｔｙｐｈｍｕｒｉｕｍなどの他の菌種とを全ゲノム配列について鋭意研究の下に比較解析し、その結果、初めて明らかにしたものである。
【００１２】
何れの配列も３０塩基からなり、これらの配列またはその相補鎖の有無を特定するすることにより、結核菌の全遺伝子を解析せずとも、容易に且つ短時間に結核菌を検出することが可能である。また、上述の本発明の配列またはその相補鎖を検出することにより、検査に使用するサンプルが、他の菌種や他の生物由来の核酸と混じり合った状態にあっても、結核菌を特異的に検出することが可能である。従って、対象から採取した血液、組織および細胞などのサンプルから結核菌を単離培養することなく、結核菌の検出が可能である。
【００１３】
特に、上記の配列番号１から配列番号１８９までの配列の中でも、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８および配列番号８９に記載した配列は、「ＣＧＣ」の３塩基配列を５回繰り返して（５回リピートとも称す）有する配列である。更に、結核菌には、５回リピート、６回リピート、７回リピートを有する株も存在する。従って、これらの繰り返しの回数と、上記の配列、配列番号１から配列番号１８９の配列の有無を、検査対象となる結核菌について特定することにより、結核菌の遺伝子をタイピングすることも可能である。従って、本発明の配列番号１から配列番号１８９に記載の配列およびその相補鎖を利用することにより、結核菌の特異的な検出と同定を同時に行うことも可能である。
【００１４】
２．オリゴヌクレオチドおよびプローブ
本発明の更なる態様に従うと、上述の配列または相補配列により示されるオリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドを含むプローブが提供される。
【００１５】
上述した本発明に従う配列は、全て３０塩基であるが、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、前記３０塩基配列からなるものであっても、前記３０塩基配列を含む配列であってもよい。本発明に従うオリゴヌクレオチドは、それ自身公知の結核菌から単離および増幅することにより製造しても、または人工的に合成してもよい。
【００１６】
本発明に従うプローブは、前記前記３０塩基配列からなるものであっても、前記３０塩基配列と更なる配列を含む配列であってもよい。また、当該プローブは、蛍光物質、化学発光物質およびラジオアイソトープなどの検出用の標識物質を具備してもよく、また、ビオチンおよびアビジンなどの分離用の標識物質を具備してもよい。また、所望に応じて、他の物質を具備させてもよい。
【００１７】
３．プローブ固相化基体
上述の本発明に従うプローブは、シリコン、ガラスおよび樹脂などの基体に固相化され使用されてもよい。本発明に従い使用され得る基体は、板状、球状および容器状など、その形状はどのようなものでもよい。また、そのような基体への固相化は、それ自身公知の何れの固相化手段を利用して行ってもよい。そのようなプローブ固相化基体も本発明の範囲内である。
【００１８】
４．アッセイ用キット
また、本発明に従うと、上述のオリゴヌクレオチド、プローブおよびプローブ固相化基体を少なくとも具備するアッセイ用キットが提供される。そのようなアッセイ用キットは、上述のオリゴヌクレオチド、プローブおよびプローブ固相化基体の他に、所望に応じて、種々の試薬および緩衝液並びに容器などを具備してよい。
【００１９】
５．結核菌の検出および同定方法
サンプル中の結核菌を検出および／または同定する方法は、以下のように行うことが可能である。先ず、サンプル中の核酸と本発明に従うプローブとをハイブリダイズに適切な条件下で反応させる。ここで、ハイブリダイズに適切な条件下とは、例えば、ストリンジェントな条件であればよい。
【００２０】
次に、反応の工程の後に、前記プローブとハイブリダイズした核酸の存在を検出する。この検出は、例えば、サンプル中の核酸を予め蛍光物質などの標識物質により標識しておいてもよく、インタカレータを使用してもよく、或いはその他のそれ自身公知の手段の何れを利用してもよい。
【００２１】
次に、前記の検出工程において検出された結果を基に検体中の結核菌の検出および／または同定を行う。ここにおいて使用される「同定」の後は、結核菌の遺伝子型を特定すること、結核菌の病原性の強弱などの結核菌の特徴を特定することなどであればよい。また、このように本発明に従って検出および／または同定を利用することは、患者が結核菌に感染しているかを診断すること、治療方針の決定、並びに予後の予想など、臨床的にも有用である。また、結核菌の臨床株の遺伝子タイピングが可能であるので、結核菌の疫学調査にも利用することができる。また、強毒株と弱毒株の特定および分類など、臨床および基礎的な研究にも利用可能である。更には、それらの研究により、更に結核感染の診断に有益な情報を得ることが可能である。
【００２２】
６．検査方法の例
本発明の方法を利用して、対象における結核菌の検出および／または同定を行う場合、例えば、次のように２種類の方法により実施することが可能である。
【００２３】
（１）培養菌
まず、対象から採取した検体を培養し、菌を含む培養液からｍＲＮＡを抽出する。次に、得られたｍＲＮＡを基に、逆転写反応を行う。その際、Ｃｙ３やＣｙ５などの蛍光ラベル剤による蛍光ラベルも同時に行う。
【００２４】
このように調製された試料溶液を本発明に従って作成したプローブ固相化基体に滴下し、その後、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下においてハイブリダイゼーション反応を行う。反応後、洗浄しにより、そこに生じたハイブリダイゼーションを検出する。
【００２５】
（２）血液、細胞および組織
同様に、対象から採取した血液、細胞および組織などの検体について、結核菌の検出および／または同定を行うことも可能である。対象から採取した血液、細胞および組織などからｍＲＮＡを抽出する。次に、得られたｍＲＮＡを基に、逆転写反応を行う。その際、Ｃｙ３やＣｙ５などの蛍光ラベル剤による蛍光ラベルも同時に行う。
【００２６】
このように調製された試料溶液を本発明に従って作成したプローブ固相化基体に滴下し、その後、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下においてハイブリダイゼーション反応を行う。反応後、洗浄しにより、そこに生じたハイブリダイゼーションを検出する。
【００２７】
これらの方法は、所望に応じて任意に変更してもよく、そのような変更した方法も本発明の範囲内である。
【００２８】
【実施例】
１．結核菌特異的配列の決定方法
上記の本発明に従う結核菌特異的配列を特定するために行った方法を以下に説明する。
【００２９】
（１）結核菌特異的プローブの設計方法
本発明に従いプローブ固相化基体で使用するプローブとしては、オリゴヌクレオチドのプローブとｃＤＮＡのプローブがある。ここでは、オリゴヌクレオチドのプローブを例として記載するがｃＤＮＡであってもよく、ＤＮＡ類似物質を利用してもよい。
【００３０】
また、ｃＤＮＡプローブよりオリゴヌクレオチドプローブの方が優れた点もある。即ち、（１）クロスハイブリダイゼーションによるエラーが少ない、（２）プローブの調製に手間がかからない、（３）ハイブリダイゼーション時間が短い、（４）選択転写、選択スプライシングの区別が可能である、などの点で優れている。従って、本発明のプローブは、好ましくはオリゴヌクレオチドプローブである。
【００３１】
オリゴヌクレオチドプローブの設計にはゲノムＤＮＡの塩基配列が十分に決定されていることが必要とされる。ゲノムプロジェクトの急速な進展にともない、多くの生物でこのような条件が整ってきたといえる。我々は、タプル法によるプローブ設計アルゴリズムを開発し特異的なＤＮＡプローブを設計した。以下のタプル法の概要を述べる。
【００３２】
ゲノム上にｎ個の遺伝子あるいは遺伝子候補領域ＯＲＦがあるとする。ｉ番目の遺伝子に由来するｍＲＮＡなどの核酸断片の塩基配列をｓｉ（ｉ＝１，２，…，ｎ）、その長さをｌｉ、Ｌ＝Σｌｉとする。また、ｉ番目の遺伝子に由来する核酸断片ｓｉを検出するためのＤＮＡプローブの塩基配列をｓＰｉ、その長さをｗとする。
【００３３】
ＤＮＡプローブｓＰｉを集積したＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイを用いて遺伝子の発現頻度情報解析を行うためには、ＤＮＡプローブｓＰｉがその標的核酸断片ｓｉに特異的かつ定量的にハイブリダイズしなくてはならない。そのためには、プローブの塩基配列ｓＰｉの相補配列が標的核酸断片ｓｉに特異的な塩基配列であること（条件１）、プローブのＴｍ、すなわち、プローブとその標的核酸断片が形成するミスマッチのないハイブリッド２重鎖の融解温度が均一であること（条件２）、プローブがハイブリダイゼーションを阻害する安定な２次構造を形成しないこと（条件３）、が必要とされる。ＤＮＡチップなどによる遺伝子の発現頻度情報解析では、通常、単一のハイブリダイゼーション条件が用いられる。Ｔｍが不均一で条件２を満たさないプローブを使用して単一のハイブリダイゼーション条件で検出を行うと、Ｔｍの高いプローブではクロスハイブリダイゼーションによる偽陽性、Ｔｍの低いプローブではハイブリッドの安定性が低いために偽陰性が起りやすい。また、正しく検出された場合でも定量性が低下する。したがって、正確な発現頻度情報解析を行うためには、条件２が必要である。
【００３４】
条件１〜３を満たすプローブ配列を設計するために、出現頻度フィルタ、Ｔｍフィルタ、２次構造エネルギーフィルタ、ハミング距離フィルタの４つのフィルタを使用する。出現頻度フィルタは条件１、Ｔｍフィルタは条件２、２次構造エネルギーフィルタは条件３を満たすプローブ候補配列を選択するためのフィルタである。また、ハミング距離フィルタは出現頻度フィルタより正確に条件１を調べるフィルタである。これらのフィルタを順番に適用することにより、プローブの候補配列が設計される。ハミング距離フィルタは他のフィルタに比べて非常に計算時間がかかるので、他の３つのフィルタを使用してプローブの候補配列を十分に絞り込んでから使用する必要がある。
【００３５】
条件１を満たす配列を最も素朴な方法で網羅的に探索するとＯ（Ｌ２）の計算量が必要である。それに対して、出現頻度フィルタとハミング距離フィルタにより条件１を満たす配列を探索するとＯ（Ｌ）の計算量で足りる。Ｏ（Ｌ２）の計算量では、大腸菌ゲノム用のプローブ候補配列の設計でも高速のパーソナルコンピュータで１０年以上の計算時間がかかる。それよりはるかに大きいヒトゲノムでは、事実上、設計は不可能である。Ｏ（Ｌ）の計算量で設計ができるアルゴリズムを用いることによりはじめて、ヒトゲノムでのプローブ設計を現実的な計算時間で行うことが可能になる。
【００３６】
（２）出現頻度フィルタ
サンプルに含まれる可能性があるｎ種類の標的核酸断片の塩基配列ｓｉ（ｉ＝１，２，…，ｎ）の集合の全体をＳとする。出現頻度フィルタでは、最初に、Ｓに対して長さｋ塩基のｋタプルの出現頻度ｐｊ（ｊ＝１，２，…，４ｋ）を計算する。次に、各々の標的核酸断片に対して、その塩基配列ｓｉの５’末端からｘ塩基の位置にある長さｗ塩基の部分配列の出現頻度指標Ｆ（ｉ，ｘ）をｐｊを用いて以下の式で計算する。
【００３７】
【化１】
2004113196.tif 000002
【００３８】
出現頻度指標は部分配列を構成するｋタプルの出現頻度の対数の和で、その部分配列がＳで出現する頻度の目安となる量である。出現頻度指標の値が小さい部分配列ほど、標的核酸断片に対する特異性の高い塩基配列である可能性が高い。最後に、各々の標的核酸断片に対して出現頻度指標の値が最小のものから順に指定した数の部分配列を選択し、プローブ配列の候補とする。
【００３９】
（３）Ｔｍフィルタ
Ｔｍフィルタでは、出現頻度フィルタで選択されたプローブの候補配列のＴｍ値を計算し、Ｔｍの値が均一なプローブのグループを生成する。反応操作を簡便にするために、グループの数は最小になるようにする。最小値より大きい適当な数にすることも可能である。
【００４０】
プローブのＴｍ、すなわち、プローブとその標的核酸断片が形成するミスマッチのないハイブリッド２重鎖の融解温度は、Ｊ．　ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，　Ｊｒ．により統合化された塩基対スタックのΔＨとΔＳを用いて２状態転移モデルの場合の式で計算する［２］。自己相補的な塩基配列は次の２次構造エネルギーフィルタで候補から除かれるので、自己相補的でない塩基配列をもつハイブリッドのＴｍの式を使用する。鎖の濃度、バッファーの塩濃度は、実験の条件に応じた適当な値を代入する。
【００４１】
Ｔｍの値が均一なプローブのグループは以下のようにして生成する。まず最初に、各々の標的核酸断片ｓｉ（ｉ＝１，２，…，ｎ）に対するプローブ候補配列のＴｍの最大値ＴｍＨ（ｉ）と最小値ＴｍＬ（ｉ）を求める。次に、ＴｍＬ（ｉ）の最大値ＴＨ１を決定し、ＴＨ１±ΔＴのＴｍをもつプローブ候補配列のみを取り出してＴｍ＝ＴＨ１のプローブ候補配列のグループとする。さらに、このグループのプローブ候補配列をひとつも持たない標的核酸断片をｓＩ’’（ｉ’＝１，２，…，ｎ’）とし、これらの核酸断片に対するプローブ候補配列について同様の処理を行い、Ｔｍ＝ＴＨ２のグループのプローブ候補配列を決定する。この処理を繰り返すことにより、すべての標的核酸断片に対して、プローブの候補配列のグループ化を行う。
【００４２】
このような処理により、Ｔｍの値が均一なプローブ候補配列から構成される最も少ない数のグループを生成することができる。ＴｍＨ（ｉ）の最小値でグループ化することによっても、Ｔｍの値が均一なプローブの最も少ない数のグループを生成することができる。しかし、ＴｍＬ（ｉ）の最大値でグループ化した方がＴｍが高いグループで検出される標的核酸断片の割合が多く、クロスハイブリダイゼーションによる誤りの危険性をより低減することができる。
【００４３】
（４）２次構造エネルギーフィルタ
プローブが分子内塩基結合により安定な２次構造を形成すると、標的核酸断片とのハイブリダイゼーション反応が阻害され、定量性が大幅に低下したり偽陰性のエラーが生じる。２次構造エネルギーフィルタは、プローブ候補配列が形成する最も安定な２次構造のエネルギーを計算し、安定な２次構造を形成しないプローブ候補配列を指定した数だけ選択する処理を行う。
【００４４】
最も安定な２次構造のエネルギーはダイナミックプログラミング法で計算する。計算のアルゴリズム、計算に使用するΔＨやΔＳの値は、Ｚｕｋｅｒらの方法に基づいている。
【００４５】
（５）ハミング距離フィルタ
ハミング距離（Ｈａｍｍｉｎｇ　ｄｉｓｔａｎｃｅ）フィルタでは、プローブの候補配列ｓＰｍとその標的核酸断片配列以外の配列ｓｉ（ｉ≠ｍ）とのハミング距離、すなわち、両者を並列させたときの不一致塩基数の最小値Ｈ（ｓＰｍ）を計算する。Ｈ（ｓＰｍ）の値が大きいプローブ候補配列ほど誤った核酸断片とのミスハイブリダイゼーションの危険性が低い。Ｈ（ｓＰｍ）の値が大きい順に、より有力なプローブ候補配列とする。
【００４６】
（６）
以上のような方法により、ゲノム解析ソフトウェア（ｇｅｎｅｔｉｘ　ｍａｃ、登録商標）を用い、結核菌の全ゲノム情報を基にモチーフ検索を行った。その結果、表１および表２に示す結核菌特異的な配列を特定することができた。
【００４７】
【表１−１】
2004113196.tif 000003
【００４８】
【表１−２】
2004113196.tif 000004
【００４９】
【表１−３】
2004113196.tif 000005
【００５０】
【表１−４】
2004113196.tif 000006
【００５１】
【表１−５】
2004113196.tif 000007
【００５２】
【表１−６】
2004113196.tif 000008
【００５３】
【表１−７】
2004113196.tif 000009
【００５４】
【表２】
2004113196.tif 000010
【００５５】
また、結核菌の全ゲノム情報の詳細は、インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｍ＿ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／）の開示を利用した。
【００５６】
特定された結核菌特異的な配列は、結核菌に特異的な遺伝子であるＰＥ−ＰＧＲＳ、ＰＰＥおよびＰＥ遺伝子に由来した。また、それぞれの配列は、結核菌特異的ＰＥ−ＰＧＲＳ、ＰＰＥおよびＰＥ遺伝子の表中「ＯＲＦ」の欄に記載される位置に存在した。表中の「配列番号」の欄に記載の番号は、配列表に記載の配列番号に対応する。「Ｉ−Ｓｅｑ」は各遺伝子毎の番号である。「ＯＲＦ」は当該遺伝子がどの位置に存在するかをＯＲＦの位置で記載した。「Ｐｒｏｂ（３０ｍｅｒ）」の欄には当該決定された結核特異的配列を記載した。便宜上、表１に記載の配列番号１から配列番号１６９と、表２に記載の配列番号１７０から配列番号１８９と、得られた配列を２群に分けたが、両群には一部同じ配列が記載されている。表２に記載の配列には、特異的繰り返し配列であるＣＧＧ配列が５回以上含む２０種類の配列を記載した。
【００５７】
このような方法により、結核菌に特異的な配列を特定し、プローブを設計した。また、ＰＥ−ＰＧＲＳ及びＰＰＥ遺伝子のうち特異的繰り返し遺伝子配列ＣＧＧ配列を５回以上含むＰＥ−ＰＧＲＳ及びＰＰＥ遺伝子ＣＧＧの５回リピートは結核菌において、発現の頻度が高く、これは他の菌種との間に統計学的な有意差も得られた。配列番号２に示したＰＥ−ＰＧＲＳ及びＰＰＥ遺伝子のうち特異的繰り返し遺伝子配列ＣＧＧ配列を５回以上含むＰＥ−ＰＧＲＳ及びＰＰＥ遺伝子とそれぞれ結合する２０種のＤＮＡオリゴヌクレオチドを選択した。
【００５８】
また、表１および２に示した結核菌特異的ＰＥ−ＰＧＲＳ及びＰＰＥ遺伝子にそれぞれ結合する１６９種のＤＮＡオリゴヌクレオチド及びＰＥ−ＰＧＲＳ及びＰＰＥ遺伝子のうち特異的繰り返し遺伝子配列ＣＧＧ配列を５回以上含むＰＥ−ＰＧＲＳ及びＰＰＥ遺伝子とそれぞれ結合する２０種のＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、結核菌遺伝子タイピング用のキットが提供された。
【００５９】
更に、本発明結核菌特異的ＰＥ−ＰＧＲＳ及びＰＰＥ遺伝子にそれぞれ結合する１６９種のＤＮＡオリゴヌクレオチド、及び特異的繰り返し遺伝子配列ＣＧＧ配列を５回以上含むＰＥ−ＰＧＲＳ及びＰＰＥ遺伝子とそれぞれ結合する２０種のＤＮＡオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドが好ましい。これによって、再現性のあるＤＮＡチップができる。
【００６０】
このようなチップを用いることにより、結核菌臨床分離株の遺伝子タイピングが可能となり、結核菌の疫学調査に利用できる。強毒株及び弱毒株などの臨床研究に使用でき、さらにこれらの情報に基づいた結核感染の診断にも応用できる。
【００６１】
【発明の効果】
以上のような本発明により、結核菌を特異的に検出および／または同定するための手段を提供された。
【００６２】
【配列表】
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