(57)【要約】【課題】生体内に極力入らない投与部位に、しかも極微量投与することでも、効率良く粘膜免疫を誘導でき、従来の粘膜から抗原と粘膜免疫調節因子を投与する粘膜ワクチンと同様に有効な粘膜免疫誘導手段を提供する。【解決手段】免疫誘導用の粘膜免疫調節因子であって、粘膜及び経皮投与されるワクチン抗原に対する抗体を作成するための経皮投与されるための粘膜免疫調節因子を提供する。前記粘膜免疫調節因子としては、免疫誘導のための抗原が、病原性微生物、病原性ウイルス由来の１種乃至は２種以上の抗原を用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫誘導用の粘膜免疫調節因子であって、粘膜及び経皮投与されるワクチン抗原に対する抗体を作成するための経皮投与されるための粘膜免疫調節因子。
【請求項２】
免疫誘導のための抗原が、病原性微生物、病原性ウイルス由来の１種乃至は２種以上の抗原からなる請求項１の経皮投与されるための粘膜免疫調節因子。
【請求項３】
粘膜投与時に粘膜免疫誘導活性を持つ１種乃至は２種以上の免疫調整物質からなることを特徴とする、請求項１又は２に記載の経皮投与されるための粘膜免疫調節因子。
【請求項４】
アレルギー治療用であることを特徴とする、請求項１〜３何れか１項に記載の経皮投与されるための粘膜免疫調節因子。
【請求項５】
アレルギー抗原が、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、花粉症、アレルギー性喘息の原因抗原由来の１種乃至は２種以上の抗原からなる請求項１〜４何れか１項に記載の経皮投与されるための粘膜免疫調節因子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫調節因子に関し、更に詳細には、アレルギーの予防に有用な免疫誘導用の経皮投与されるための粘膜免疫調節因子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体にとって病原性を持つ微生物やウイルスの感染を予防するため、生体の免疫機能を利用するワクチンは、従来から様々な形で開発され実用化されている。一方でワクチンをより効果的に投与する方法あるいは、ＱＯＬを考慮した接種者の負担を軽減する方法を見つけることは、ワクチン研究者の重要な課題でもある。近年、従来注射により投与していたワクチンを経口や経鼻などの粘膜から投与し粘膜免疫を活性化することで粘膜面と生体内の二重のバリア機能が獲得できる粘膜ワクチンが注目されている。生体は、抗原を粘膜免疫の誘導組織である鼻咽頭関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）、気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）などで取り込み、引き続いて感作誘導をして、粘膜免疫機構の液性免疫の中心をなす分泌型ＩｇＡを産生するために、粘膜免疫循環帰巣経路（ＣＭＩＳ）を通じて全身の実効組織へと抗原特異的な免疫細胞を送り込む。この実効組織としては、腸管、鼻腔、咽頭、泌尿生殖器などの粘膜固有層、そして涙腺、唾液腺、乳腺、汗腺などの腺組織が上げられる。これら実効組織から体表面へ分泌される分泌型ＩｇＡの量は、１日に３０００ｍｇ以上にもおよび、生体内に侵入する抗原や異物に対する最前線の感染防御機能を形成している。粘膜ワクチンは、抗原とともに粘膜免疫調節因子と呼ばれる免疫力を高めるための免疫調整物質を同時に投与することで、体表面での分泌型ＩｇＡを中心としたバリア機能に加えて注射によるワクチン同様、全身系でのＩｇＧ産生やＣＴＬ活性化を中心とした免疫機能も付加することができる。すなわち、粘膜ワクチンは、微生物・ウイルスの感染源として最も重要な体表面での一次防御と防御しきれずに生体内に侵入してきたものに対する生体内での二次防御の二重の防御機能を有しているのである。しかも経口投与、経鼻投与という注射による痛みを伴わない投与法であるため、ＱＯＬの観点からも非常に有用な方法であるといえる。一方、この粘膜免疫の誘導をアレルギーの治療に応用する試みも行われている。本来、粘膜免疫は、生体におけるアレルギー抑制機能の一つである。すなわち、生体は粘膜から侵入した抗原に対して粘膜免疫を介することで経粘膜誘導型免疫寛容を誘導する。その代表的な例が、腸管から取り入れた食物抗原に対してアレルギー反応を抑制するための免疫抑制機能を誘導する経口免疫寛容である。普段の飲食において多くの抗原が消化管を通して生体内に侵入する。これら抗原は、生体にとって異物であるのにも係わらず、食物アレルギー患者などの特殊な例を除いて生体はアレルギー反応を起こさない。それには、粘膜免疫により誘導された抗原特異的な免疫寛容が重要な役割を果たしている。乳幼児で食物アレルギーが多いのは、この粘膜免疫の未発達なことが原因しているとの指摘もされている。この経口免疫寛容をアレルギーに応用すること、すなわち、アレルギー原因抗原を経口投与してその抗原に対する抗原特異的な免疫寛容を誘導しようという試みは古くから臨床レベルでも行われている。しかしながら、抗原のみの投与では十分粘膜免疫の誘導が引き出せないこと、さらに投与する抗原量も非常に多量であり実用的でないことなどもあり、一般的な治療法としては認知されていない。より効率良く粘膜免疫を誘導することを目的として、先の粘膜ワクチンに使われている粘膜免疫調節因子を応用する試みも行われている。すなわち、少量の抗原とコレラトキシンなどの粘膜免疫調節因子を経粘膜から投与することで、効率良く粘膜免疫を誘導しようとする方法である。しかしながら、ここで使われる粘膜免疫調節因子の毒性、抗原特異的なＩｇＥ産生などの副作用が懸念され、実用化には至っていない。（Ｓｎｉｄｅｒ  ＤＰ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５３（２）６４７−６５７，１９９５）一方で近年アレルギー状態であっても変異型無毒化コレラトキシンのような一部の安全性の高い粘膜免疫調節因子と抗原を投与することで、ＩｇＥ産生などの全身性免疫には影響を及ぼさずに粘膜免疫特異的に免疫誘導できる方法、また、全身性の免疫寛容を誘導できなくても局所での分泌型ＩｇＡ産生による侵入抗原の遮断効果だけでも十分アレルギーを抑制できることなども判ってきており、粘膜ワクチンと同様のメカニズムでアレルギー治療を達成できるとされ、実用化に向けて検討が進められている。（特願２００１−１９７６１８）しかしながら、安全性が高まったといえ、ワクチン並びにアレルギー治療で使う粘膜免疫調節因子の毒性などの課題は、完全に解決されているとは言えず、実用化の大きな障害になっている。
【０００３】
一方、経皮から痛みを伴わずにワクチンを投与する方法についても従来から研究されていた。この場合、抗原が蛋白などの高分子量物質であるため、吸収性に難があり、十分な効果が引き出せないことからイオントフォレシスやエレクトロポレーションなどのデバイスを用いた吸収性を高める検討も行われている。（Ｍｉｓｒａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １８（５−６）５１７−５２３，１９９９）一方で経皮からの投与だけでも全身免疫系が活性化されるという報告もある。近年、経皮から抗原を投与するときにコレラトキシンなどの粘膜免疫調節因子を同時に投与することで、全身免疫が効率良く活性化されることについての動物実験結果が報告されている。また、このとき高濃度の粘膜免疫調節因子を使うことで一部粘膜免疫の活性化まで達成できる可能性も示唆されている。（Ｖａｃｃｉｎｅ  １７，Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｓ３７−４３，１９９９）しかしながら、経皮からの投与と言えども、高濃度の粘膜免疫調節因子の使用は、粘膜への投与同様危険性を持ち合わせていることは言うまでもなく、粘膜投与に変わるものとしての経皮投与の意味自体が問われている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記のようにワクチンを安全に効率良く痛みを伴わずに簡単に投与できる方法を見出すことは非常に重要な課題である。そのために粘膜免疫を活性化することによる二重の生体防御は特に有用な方法である。一方で粘膜ワクチンに必要な粘膜免疫調節因子の毒性を軽減する方法も重要な課題である。この場合、経皮投与による吸収量の制御も有用な方法であるが、毒性面から考えてもより低投与量で免疫誘導を達成できることが必要がある。したがって、本発明の目的は、経皮から低投与量の粘膜免疫調節因子により、安全で効率良く粘膜免疫誘導を達成すること技術を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記のような従来の粘膜ワクチン、経皮ワクチンの問題点を解決するために鋭意研究を重ねた結果、経皮から従来報告されている数十分の１以下に相当する安全な投与量の粘膜免疫調節因子と抗原で感作した後に粘膜から抗原のみによる免疫誘導を行うという二段階の反応で効率良く粘膜免疫が誘導されることを発見した。すなわち、低投与量の粘膜免疫調節因子と抗原の経皮からの投与では、全身免疫を誘導することはできたが、粘膜免疫まで誘導することができなかった。一方、粘膜からの低投与量の抗原のみの投与では、粘膜免疫はおろか全身免疫も誘導することができない。ところがこれら粘膜免疫が誘導されないとされる二つの投与法を組み合わせた結果、予想に反して粘膜免疫が効率良く誘導されてくることが判明したのである。つまり、従来副作用が懸念されていた粘膜免疫調節因子の投与を経皮という吸収性の悪い、すなわち生体内に極力入らない投与部位に、しかも極微量投与することでも、効率良く粘膜免疫を誘導でき、従来の粘膜から抗原と粘膜免疫調節因子を投与する粘膜ワクチンと同様に有効な粘膜免疫誘導手段を提供することを可能にし、本発明を完成させた。本発明は、以下に示す技術に関するものである。
（１）免疫誘導用の粘膜免疫調節因子であって、粘膜及び経皮投与されるワクチン抗原に対する抗体を作成するための経皮投与されるための粘膜免疫調節因子。
（２）免疫誘導のための抗原が、病原性微生物、病原性ウイルス由来の１種乃至は２種以上の抗原からなる（１）の経皮投与されるための粘膜免疫調節因子。
（３）粘膜投与時に粘膜免疫誘導活性を持つ１種乃至は２種以上の免疫調整物質からなることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の経皮投与されるための粘膜免疫調節因子。
（４）アレルギー治療用であることを特徴とする、（１）〜（３）何れか１項に記載の経皮投与されるための粘膜免疫調節因子。
（５）アレルギー抗原が、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、花粉症、アレルギー性喘息の原因抗原由来の１種乃至は２種以上の抗原からなる（１）〜（４）何れか１項に記載の経皮投与されるための粘膜免疫調節因子。
以下、本発明について更に詳細に説明を加える。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、発明の実施の形態について説明する。本発明の経皮投与されるべき粘膜免疫調節因子を用いて、粘膜免疫を誘導する方法は、主に二つのコンポーネントを用いる。すなわち、抗原と粘膜免疫調節因子である。ここで言う抗原とは、例えば感染性微生物や感染性ウイルスに対して防御的働きをする抗原から製した調製物について使用することが出来る。また、最近の技術の進歩によりこれら抗原を遺伝子工学を利用して大腸菌やバチルス菌などの微生物やＣＨＯ細胞などの培養細胞により大量に産生させることも可能となり、例えば、Ｂ型肝炎ワクチンに使われるリコンビナント抗原などについても適応できる。特にこれら遺伝子工学を利用して産生された抗原類は、微生物やウイルスが産生した毒素性蛋白とは異なり、純度が極めて高く、安全性、生産効率の面で優れているだけではなく、一部のアミノ酸を変異させることにより、より安全性の高い無毒化毒素を提供することも可能となる。さらにこれら抗原の分解物や任意に選ばれたフラグメントペプチドなどの使用も可能であり、Ｔ細胞エピトープなどの使用は、その抗原に対してアレルギーがある人には極めて安全で有用なものとなる。また、これらの構成成分並びに精製抗原は、単独で使用することもできるが、２つ以上の組み合わせにより、より幅広く効果を現すことを期待した使用方法も可能である。一方、アレルギー治療用に用いられる抗原としては、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、アレルギー性喘息、花粉症などのアレルギー疾患の原因抗原となるものが選ばれる。例えば、食物アレルギーであれば、その発症・増悪に関与しているといわれる卵類、乳・乳製品、肉類、米穀、豆類、魚類、果実類などの種々の食物の構成成分が使用できる。また、アトピー性皮膚炎、アレルギー性喘息などでは、その発症・増悪に関与していると言われている、ハウスダスト、ダニ、真菌類、細菌類、食物などの構成成分が使用できる。さらに花粉症においても、スギ、ヒノキ、ブタクサ、ヨモギ、シラカンバ、イネ類など、そのアレルギーの原因となる花粉の構成成分が使用できる。これら構成成分は、一般的手法により抽出された粗生成物として、あるいは、精製した単一成分としても使用できるほか、遺伝子工学を利用して微生物並びに動物細胞に遺伝子を組み込むことにより、大量に産生させたものも使用できる。さらにこれら抗原の分解物や任意のフラグメントペプチド、あるいは、一部のアミノ酸を変異させたものも使用可能である。また、これらの抗原は、単独で使用することもできるが、２つ以上の組み合わせにより、より幅広い効果を期待した使用方法も可能である。
【０００７】
一方、これらの精製抗原は、均一蛋白であるがゆえにエンドトキシンのような天然の免疫賦活物質が含まれてこない。このことは、安全性の面で好ましいことであるが、これら蛋白だけの投与では抗原性が低く、十分な効果が得られない可能性もあり、免疫調整物質である免疫調節因子の併用が必要である。一般的なワクチンに用いられる免疫調節因子は、リン酸アルミニウムゲル、水酸化アルミニウムゲル、オイル免疫調節因子などがあるが、これらは全身免疫系を中心とした免疫活性を誘導するものである。今回の発明で用いられる免疫調節因子は、特に粘膜から投与して粘膜免疫を賦活化することを目的とした粘膜ワクチン用の免疫調節因子（粘膜免疫調節因子）であり、コレラトキシンやエンテロトキシンのような毒素類、リポソーム、マイクロスフェア類、ＩＬ−１２などのサイトカイン、サポニンなどが使用できる。この中で特に強力な粘膜免疫調節因子として知られるコレラトキシン（ＣＴ）やエンテロトキシン（ＬＴ）のような毒素は、その構造の一部にＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅなどの活性を持ち、下痢原性などの副作用が懸念されている。これら副作用を軽減する目的で構成されるＡサブユニットとＢサブユニットを分離し、毒性の少ないＢサブユニットを使用する方法や遺伝子工学的手法を用いて構造の一部アミノ酸を変異させて、ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ活性を弱めた変異型ＣＴや変異型ＬＴなども報告されている。さらにこれら毒素のＡサブユニットとＢサブユニットを入れ替えたキメラ体についてもより毒性が低く効果の高い免疫調節因子として使用できる。具体的には、ＭｃＧｈｅｅらによって遺伝子操作により作り出されたＳ６１Ｆ、Ｅ１１２Ｋのような変異型無毒化ＣＴ（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８５（７）１２０３−１２１０，１９９７）、Ｃｌｅｍｅｎｔｓらによって同様に作り出されたＲ１９２Ｇなどの変異型ＬＴ（Ｃｈｏｎｇ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １６（７）７３２−７４０，１９９８）などが上げられる。さらに清野らにより作り出された変異型ＣＴのＡサブユニットとＬＴのＢサブユニットを結合させたキメラ体（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５３（３）２１１−２１７，２００１，  Ｋｗｅｏｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｉ．Ｄ．  １８６（９）：１２６１−１２６９，２００２）なども好ましく使うことができ、これら遺伝子操作により作り出された免疫調節因子は、大腸菌、バチルス菌、酵母などの微生物や動物または人の培養細胞などに目的の遺伝子を組み込むことで大量に生産することができる。一方、リポソームは比較的安全な粘膜免疫調節因子として利用できるが、単純な処方のものでは免疫調節因子活性が弱いため、その活性を向上させるためにセンダイウイルスとの融合体（Ｋｕｎｉｓａｗａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６７（３）  １４０６−１４１２，２００１）なども報告されており、利用可能である。サポニン類などの天然の素材については、天然物からの抽出、精製することや有機合成により容易に産生することができる他、これら有効成分を含む天然物のエキスとしても使用可能である。また、これら粘膜免疫を誘導できる免疫調節因子（粘膜免疫調節因子）を２つ以上組み合わせて使用することも可能である。
【０００８】
以下に本発明の経皮に投与されるべき粘膜免疫調節因子を用いて粘膜免疫を誘導する方法（以下、単に免疫誘導法という場合もある。）について説明する。本発明の免疫誘導法は、上記抗原と粘膜免疫調節因子を含有した経皮投与形態を経由するコンポーネント１と上記抗原のみの粘膜投与形態のコンポーネント２の組み合わせであることが特徴となる。ただし、コンポーネント２に関しては、常在菌など人為的に投与しなくとも自然に粘膜に抗原が存在するような場合、あるいは飲食などにより自然に或いは能動的に接種できる場合などには、必ずしも積極的な実施は必要ではない。本発明の投与経路の対象となる粘膜としては、例えば、眼粘膜、鼻粘膜、咽頭粘膜、消化管粘膜などが挙げられ、粘膜免疫の誘導組織である鼻咽頭関連リンパ組織、気管支関連リンパ組織、腸管関連リンパ組織などに由来する器官であれば特に有効性が期待できる。このような投与経路のなかで患者の負担を考えた場合には、経鼻若しくは、経口から投与されることが望ましい。製剤的な特徴としては、抗原を溶解または、懸濁させた溶液もしくは、粉末としてカプセル等に封入したもの、錠剤などの形態が考えられるが、このとき必要に応じて安定化剤、賦形剤、防腐剤、ｐＨ調製剤などの製剤上の任意の成分とともに、所望により製剤に加工して、投与しても問題ない。このような製剤は、本発明の必須の成分と任意の成分とを常法に従って処理することで製造できる。経鼻投与に用いられる投与容器は、一般的な点鼻用スプレーなどを用いることができるが、点鼻投与に適した形状のものであればどんなものでもかまわない。経口投与であれば、腸溶剤などの特殊な処理を施した錠剤、カプセル剤などを用いることで胃酸や酵素などでの抗原の消化による失活を極力抑えたものが望ましい。また、口腔内で効果を発揮させることを目的とした、口腔内にスプレーする形状の投与形態でも可能である。
【０００９】
経皮からの投与形態としては、ハップ剤、テープ剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤などの各種の剤型が必要に応じて選択でき、抗原並びに免疫調節因子が含まれる剤型で経皮から投与できる形態であれば特に限定されない。また、製剤の基剤として溶解補助剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、吸収促進剤、増粘剤、粘着付与剤、充填剤などの任意の成分が挙げられ、抗原及び免疫調節因子等の本発明に必須の成分と常法に従って処理することで製造できる。
【００１０】
【実施例】
次に本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例にのみに限定されないことは言うまでもない。
【００１１】
＜実施例１＞経皮テタヌストキソイドワクチンの効果
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスからなる群にケタミンによる麻酔後、安全剃刀を用いて皮膚に傷を付けないように丁寧に除毛した。１日後、テタヌストキソイド５０μｇを染み込ませたガーゼを背部若しくは腹部に貼付しサポーターにて固定した。対象群には、同一用量のリン酸緩衝液を貼付した。１２時間後にガーゼを除去し、リン酸緩衝液を用いて貼付部分を丁寧に洗浄した。この操作を１週間ごとに計３回繰り返した。最終経皮免疫より１週間後、１０μｇのテタヌストキソイドで経鼻内に免役した。全ての場合において２０μｌの容量で１週間ごとに２回繰り返した。２、４週間目にマウスより血液を採取し、血清中の抗原特異的ＩｇＧ並びにＩｇＡ抗体量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。５週目に最小致死量のテタヌストキシンを皮内注射し、マウスの生存率並びに手足の麻痺を観察することにより、全身毒性に対する中和活性を評価した。
【００１２】
結果）これらの結果を図１、図２に示す。血清中の抗原特異的ＩｇＧ量は、経皮ワクチン接種だけも上昇が認められた。一方、血清中の抗原特異的ＩｇＡ量は、経皮ワクチン接種だけでは、全く検出されなかったのに対して、後から粘膜に抗原のみを投与した群で有意に上昇が認められた。このことは、経皮と粘膜の２段階の免疫により、粘膜免疫の活性化が特異的に行われていることを示している。また、経皮ワクチン接種時にコレラトキシンを添加しなかった場合には、ＩｇＡ産生が添加したときよりも低い値を示した。
さらに毒素投与による致死率は、ワクチン投与により有意に低下し、ワクチン投与による毒素の中和効果が機能していることが判明した。
【００１３】
＜実施例２＞  卵白アルブミン（ＯＶＡ）経皮投与に対する全身免疫応答
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスからなる群にケタミンによる麻酔下、安全剃刀を用いて皮膚を傷つけないように丁寧に除毛した。１日後、ＯＶＡ５０μｇを染み込ませたガーゼを背部若しくは腹部に貼付しサポーターにて固定した。このとき免疫調節因子としてＣＴを含有させた群並びに免疫調節因子を加えない群を行った。対照群には同一容量のリン酸緩衝液を貼付した。１２時間後にガーゼをはずした後、リン酸緩衝液を用いて貼付部分を丁寧に洗浄した。この操作を１週間ごとに計３回繰り返した。最終経皮免疫より１週間後、１０μｇのＯＶＡで鼻腔内免疫した。全ての場合において２０μｌの容量で１週間ごとに計２回繰り返した。２、４週目にマウスより血清及び、唾液、膣洗浄液、鼻洗浄液を採取し、ＯＶＡ特異的抗体反応をＥＬＩＳＡ法にて決定し、ＯＶＡ特異的抗体産生細胞数をＥＬＩＳＰＯＴ法にて検討した。
【００１４】
結果）食物アレルゲンの一つであるＯＶＡにおいて、ＣＴとＯＶＡで経皮免疫し、後からＯＶＡを経粘膜投与した群でのみ、血清中、粘膜分泌液中において抗原特異的ＩｇＡ産生が認められ、アレルギー抗原において経皮投与と経粘膜投与の組み合わせにより、粘膜免疫が誘導できることが確認された。
【００１５】
【発明の効果】
以上の実施例の結果より、従来副作用が懸念されていた粘膜免疫調節因子の投与を経皮という吸収性の悪い、すなわち生体内に極力入らない投与部位に、しかも極微量投与することでも、効率良く粘膜免疫を誘導でき、従来の粘膜から抗原と粘膜免疫調節因子を投与する粘膜ワクチンと同様に有効な粘膜免疫誘導手段を提供できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の血清ＩｇＧ、ＩｇＡ反応を示す図である。
【図２】実施例１のテタヌストキソイド投与後の致死率を示す図である。
【図１】
2004182655.tif 000002
【図２】
2004182655.tif 000003