(57)【要約】【課題】アミノ基を導入した固相担体上に生理活性物質を固定する際、スポット形状・サイズの再現性を向上させ、かつ、固定化効率を向上させる生理活性物質固定化用溶液を提供すること。【解決手段】生理活性物質を溶解または分散させ、固相担体へ点着する際に、非プロトン性極性溶媒を緩衝液中に含むことを特徴とする生理活性物質固定化用溶液であり、好ましくは非プロトン性極性溶媒がジメチルスルホキシドで１〜９０体積％含む生理活性物質固定化用溶液。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を溶解または分散させ、固相担体へ点着することに用いる溶液であって、非プロトン性極性溶媒及び緩衝液を含むことを特徴とする生理活性物質固定化用溶液。
【請求項２】
界面活性剤およびまたはアミノ酸を含む請求項１記載の生理活性物質固定化用溶液。
【請求項３】
非プロトン性極性溶媒を１〜９０体積％で含む請求項１又は２記載の生理活性物質固定化用溶液。
【請求項４】
非プロトン性極性溶媒がジメチルスルホキシドである請求項１〜３いずれか記載の生理活性物質固定化用溶液。
【請求項５】
界面活性剤の濃度が０．０００１〜０．１重量％である請求項２〜４いずれか記載の生理活性物質固定化用溶液。
【請求項６】
アミノ酸の濃度が０．０００１〜１重量％である請求項２〜５いずれか記載の生理活性物質固定化用溶液。
【請求項７】
固相担体表面にアミノ基を有する請求項１〜６いずれか記載の生理活性物質固定化用溶液。
【請求項８】
固相担体がプラスチックである請求項１〜７いずれか記載の生理活性物質固定化用溶液。
【請求項９】
プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである請求項８記載の生理活性物質固定化用溶液。
【請求項１０】
溶解する生理活性物質が核酸、タンパク質、糖タンパク、ペプチド、抗体、抗体結合性物質、のうち少なくとも一つを含む請求項１〜９いずれか記載の生理活性物質固定化用溶液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性物質を溶解または分散し、固相担体へ点着する際に用いる生理活性物質固定化用溶液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡマイクロアレイ技術の発展に伴い、遺伝子解析の解析速度は著しく上がってきている。現在、ＤＮＡマイクロアレイの作製する方法として、固相担体へ共有結合または非共有結合吸着による方法がある。共有結合させる方法としては、例えば、非特許文献１、非共有結合させる方法としては、例えば、非特許文献２があり、スタンフォード方式と呼ばれている。このスタンフォード方式については、非特許文献３に詳しい。このスタンフォード方式では、ポリ―Ｌ―リジン、あるいはアミノシランで表面処理して正電荷を付与した固相担体に、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）で調整されたＤＮＡ（ＰＣＲ増幅産物）などのＤＮＡをスポッターにより点着し、ＵＶ照射を行なうことで、固相担体表面の正電荷とＤＮＡのリン酸部位の負電荷との静電的結合により、ＤＮＡを固定化する。その後、熱変性させて、ブロッキング後、検査対象である蛍光標識ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行ない、洗浄後、蛍光スキャナにより蛍光量を読み取り、遺伝子の発現量を解析するというものである。しかしながら、この方法によると、熱変性、あるいはハイブリダイゼーション、あるいは洗浄過程において、ＤＮＡの脱落が起こりやすいため、ハイブリダイズが効率的に起こらず対象ＤＮＡの検出が不可能であったり、検出強度にばらつきが生じたりする。
【０００３】
上記の非特許文献３によると、スポットの形状・サイズの安定化の手段として、ＤＮＡ溶液粘度のコントロールが有効であるとされている。具体的には、ＤＮＡ溶液に親水性ポリマーや、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等の不揮発性液体の添加が試みられ、スポットの形状の安定化に効果のあることが報告されている（特許文献１など）。しかしながら、上記のような手法では、ターゲットＤＮＡ固定化量の向上、すなわち、検出限界の向上は期待できない。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２、５４５６〜５４６５、１９９４
【非特許文献２】
Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７、４６７〜４７０、１９９５
【非特許文献３】
「細胞工学別冊  ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」、秀潤社、２０００年
【特許文献１】
特開２００１−１７８４７１号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、アミノ基を導入した固相基板表面に生理活性物質、特に核酸を固定する際、スポット形状・サイズの再現性を向上させ、かつ、固定化効率を向上することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）生理活性物質を溶解または分散させ、固相担体へ点着することに用い
る溶液であって、非プロトン性極性溶媒及び緩衝液を含むことを特徴とする生理活性物質固定化用溶液、
（２）界面活性剤およびまたはアミノ酸を含む（１）記載
の生理活性物質固定化用溶液、
（３）  非プロトン性極性溶媒を１〜９０体積％で含む（１）又は（２）記載の生理活性物質固定化用溶液、
（４）  非プロトン性極性溶媒の種類がジメチルスルホキシドである（１）〜（３）いずれか記載の生理活性物質固定化用溶液。
（５）  界面活性剤の濃度が０．０００１〜０．１重量％である含む（２）〜（４）いずれか記載の生理活性物質固定化用溶液、
（６）  アミノ酸の濃度が０．０００１〜１重量％である（２）〜（５）いずれか記載の生理活性物質固定化用溶液、
（７）  固相担体表面にアミノ基を有する（１）〜（６）いずれか記載の生理活性物質固定化用溶液、
（８）  固相担体がプラスチックである（１）〜（７）いずれか記載の生理活性物質固定化用溶液、
（９）  プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（８）記載の生理活性物質固定化用溶液、
（１０）  溶解する生理活性物質が核酸、タンパク質、糖タンパク、ペプチド、抗体、抗体結合性物質、のうち少なくとも一つを含む（１）〜（９）いずれか記載の生理活性物質固定化用溶液、
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明に用いる非プロトン性溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましい。非プロトン性溶媒の濃度としては、１〜９０体積％が好ましく、さらに１０〜６０体積％が好ましく、最も好ましくは、２０％〜５０体積％である。濃度が１体積％未満では、ＤＮＡ固定化の効果が弱まり、９０体積％を超えると、ＤＮＡの固定化効率の低下が顕著になる。
【０００８】
本発明の生理活性物質固定化用溶液は、非プロトン性極性溶媒及び緩衝液を含む。
本発明に用いる緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液などを用いることが挙げられるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。
本発明の固定化用溶液の緩衝塩の濃度としては、０．５〜５００ｍＭが好ましく、１０〜２００ｍＭがより好ましく、５０〜１００ｍＭがさらに好ましい。塩濃度が５００ｍＭを超えると、スポットに塩が残ってしまうため、スポットの形状が不均一になる。塩濃度が１ｍＭ未満では、ＤＮＡの固定化効率への効果が認められない。
【０００９】
固相担体の基板表面は保存日数とともに疎水化し、このため、長期保存後の基板表面は基板作製時よりも疎水性となっており、安定なスポットが困難である場合が多い。これを解決するためには、スポットする溶液の界面張力を低下させることが有効である。すなわち、固定化すべき生理活性物質を含む溶液に界面活性剤を添加することにより、溶液と基板表面との濡れ性を高め、スポットの形状およびサイズを安定化する。
本発明に用いる界面活性剤としては、一般的なものを用いることができ、アニオン性、カチオン性あるいはノニオン性であってもよいが、ノニオン性がより好ましい。また、界面活性剤は常温常圧で液状のものが好ましい。常温常圧で固体のものは、スポットが乾燥した際に凝集し、スポットが不均一となる場合がある。
【００１０】
ノニオン性界面活性剤として、グリセリン脂肪酸エステル類、プロピレングリコール脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、アルキルグリセリルエーテル類などを好適に用いることができるが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類がより好ましく、最も好ましくはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである。
【００１１】
界面活性剤の添加量は０．００００１〜１０重量％が好ましく、０．０００１〜１重量％がより好ましく、０．０００１〜０．１重量％が最も好ましい。界面活性剤の添加が上限値を超えると生理活性物質の基板上への固定化を阻害することがあり、好ましくない。また、溶液と基板表面の濡れ性が高すぎてもスポット形状が安定しないため、適量の界面活性剤の添加が重要となる。逆に、界面活性剤添加量が下限値を下回ると、十分な濡れ性向上の効果が得られないため、好ましくない。
【００１２】
界面活性剤の代わりに、又は併用してアミノ酸を用いることもできる。アミノ酸としては、α−アミノ酸、β−アミノ酸、およびの誘導体を用いることができるが、α−アミノ酸であることが好ましい。α−アミノ酸として、グルタミン、グリシン（ベタイン）、セリンを好適に用いることができるが、グリシン（ベタイン）であることが最も好ましい。アミノ酸の添加量は０．００００１〜１０重量％が好ましく、０．０００１〜１重量％がより好ましい。
【００１３】
本発明にて用いる固相担体としては、ＤＮＡマイクロアレイ作成用の固相基板で、表面に化学的に活性なアミノ基を有するものが好適である。固定化するＤＮＡは、オリゴＤＮＡであっても長鎖ＤＮＡであってもよい。基板の素材としてはガラス、またはプラスチックを用いることができるが、溶液とプラスチックとの濡れ性が良いため、プラスチックにより適している。
【００１４】
【実施例】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、実施例の範囲に限定されるものではない。
（蛍光標識ＰＣＲ産物の調整）
蛍光標識ＤＮＡの調整は、ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０（タカラバイオ社製）を使用して、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを用いた。プライマーとして、Ｃｙ５標識オリゴヌクレオチド（シグマジェノシス社製）（配列１：ＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣ（配列番号１）、配列２：ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴ（配列番号２））を使用し、ｃＤＮＡライブラリー（Ｈｕｍａｎｌｉｖｅｒ）（タカラバイオ社製）を鋳型として、βアクチン遺伝子のＤＮＡ断片（７１２ｂｐ）を増幅した。
ＰＣＲ反応液の組成は、２００μＭ  ｄＮＴＰ、ＴａｋａｒａＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）、２ｍＭＭｇＣｌ２、Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒであり、ＰＣＲ反応は、プレ変性：９０℃、３０秒；１サイクル、熱変性：９０℃、３０秒、アニーリング：６０℃、３０秒、伸長：７２℃、４５秒；３０サイクル、伸長：７２℃、３分；１サイクルで行なった。この断片をアガロースゲル電気泳動により増幅されていることを確認後、マイクロコン１００（ミリポア社製）を用いて、ＰＣＲ増幅産物を精製、濃縮した。
【００１５】
（溶液へのＤＮＡ溶解方法）
不揮発性溶媒としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳ０、シグマ社製）、緩衝液として２０×ＳＳＣ（クエン酸緩衝液）（シグマ社製）を使用し、所定の濃度に純水で調整して、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を溶解した。ＤＮＡの濃度は０．１μｇ／μｌに調整した。
【００１６】
（実施例１）
ＤＮＡ溶解後の濃度が５０体積％ＤＭＳＯと０．５×ＳＳＣになるように調整した溶液にＤＮＡを溶解した。
【００１７】
（実施例２）
ＤＮＡ溶解後の濃度が５０体積％ＤＭＳＯと０．５×ＳＳＣになるように調整した溶液にＤＮＡを溶解した。次に、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（「ＴＷＥＥＮ−２０」、和光純薬工業（株）製）を０．００５重量％の濃度で
溶解した。
【００１８】
（実施例３）
ＤＮＡ溶解後の濃度が５０体積％ＤＭＳＯと０．５×ＳＳＣになるように調整した溶液にＤＮＡを溶解した。次に、ベタイン（和光純薬工業（株）製）を０．０
０５重量％の濃度で溶解した。
【００１９】
（比較例１）
ＤＮＡ溶解後の濃度が５０体積％ＤＭＳＯになるように調整した溶液にＤＮＡを溶解した。
【００２０】
（比較例２）
ＤＮＡ溶解後の濃度が３×ＳＳＣになるように調整した溶液にＤＮＡを溶解した。
【００２１】
（ＤＮＡの固定化方法）
実施例１〜３および比較例１〜２の方法で調整した溶液を９６穴プレートに分注し、マイクロピン式のマイクロアレイスポッターを用いて基板上に点着した。基板として、表面にアミノ基を導入したプラスチック製のものを用いた。点着終了後、余分なアルデヒド基をブロッキングした。洗浄ののち、マイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｌｉｔｅ」（パッカードバイオチップテクノロジー社製）を用いてスポットの蛍光を検出した。スキャナーに付属の解析用ソフトウェア「ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ」を用いてスポットの蛍光量を数値化した。比較例１の蛍光量を１として各例の蛍光量を相対値を表１に示す。
【００２２】
【表１】
2004258002.tif 000002
【００２３】
【発明の効果】
本発明の生理活性物質固定化用溶液を用いることで、ＤＮＡの固定化効率の向上、および、ＤＮＡ溶液を基板上に点着する際の形状・サイズの安定化が実現された。
【００２４】
【配列表】
2004258002.tif 000003