(57)【要約】【課題】様々な生化学自動分析機に適用でき、迅速かつ簡便に大量の検体を測定することができる、しかも非特異的凝集による判定不良が生じ難い、抗リン脂質抗体測定試薬を提供する。【解決手段】抗リン脂質抗体と抗原との抗原抗体反応による凝集を吸光度の変化により測定するための抗リン脂質抗体測定試薬であって、カルジオリピン、レシチン及びコレステロールからなる脂質抗原が吸着された不溶性担体と、該不溶性担体に吸着された脂質抗原をブロッキングするための水溶性高分子とを含む抗原試薬と、水溶性高分子を含む希釈用緩衝液とからなることを特徴とする、抗リン脂質抗体測定試薬。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗リン脂質抗体と抗原との抗原抗体反応による凝集を吸光度の変化により測定するための抗リン脂質抗体測定試薬であって、
カルジオリピン、レシチン及びコレステロールからなる脂質抗原が吸着された不溶性担体と、該不溶性担体に吸着された脂質抗原をブロッキングするための水溶性高分子とを含む抗原試薬と、
水溶性高分子を含む希釈用緩衝液とからなることを特徴とする、抗リン脂質抗体測定試薬。
【請求項２】
脂質抗原をブロッキングするための前記水溶性高分子が、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、水溶性多糖類及びこれらの誘導体からなる群から選択された少なくとも１種である、請求項１に記載の抗リン脂質抗体測定試薬。
【請求項３】
前記水溶性多糖類が、プルラン、デキストラン、デキストラン硫酸及びアルギン酸ナトリウムからなる群から選択された少なくとも１種である、請求項２に記載の抗リン脂質抗体測定試薬。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の抗リン脂質抗体測定試薬を用いた抗リン脂質抗体の測定方法であって、
前記抗原試薬と、前記希釈用緩衝液と、検体とを混合し、抗原抗体反応による凝集を生じさせる工程と、
前記凝集の程度を、特定波長の吸光度に基づいて測定し、それによって検体中の抗リン脂質抗体を検出する工程とを備える、抗リン脂質抗体測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体中に含まれている抗リン脂質抗体を免疫学的に測定するための抗リン脂質抗体測定試薬及び測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
梅毒の病原体であるトレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  Ｐａｌｌｉｄｕｍ）が生体に感染すると、該病原体に対する抗体とともに、リン脂質と反応性を有するワッセルマン抗体が産生される。従来の梅毒の検査法は、梅毒菌体に対する抗体を検出するために、梅毒菌体から抽出した抗原そのものを用いる方法と、ワッセルマン抗体を検出するためにカルジオリピンを含む脂質類を抗原として用いる方法の２つに大別される。
【０００３】
現在、脂質抗原を用いる方法としては、ＶＤＲＬ法、緒方法、ＲＰＲ法、及びガラス板法などが存在するが、定性スクリーニングには、ＲＰＲ法及びガラス板法が主に用いられている。
【０００４】
これらの脂質抗原を用いる検査法は、梅毒以外の疾患に対しても陽性反応を呈するという欠点を有するが、ワッセルマン抗体が梅毒の感染状態を良好に反映するという利点を有する。従って、梅毒の治療経過をモニターするために、ＲＰＲ法やガラス板法が用いられている。
【０００５】
ＲＰＲ法は、カルジオリピン及びレシチンを含む脂質をカオリンまたは炭素粉末に吸着させたものを、白色プレート上で検体とともに混合し、カオリンまたは炭素粉末の凝集の有無を判定する方法である。
【０００６】
上記ガラス板法は、ガラス板上において、カルジオリピン、レシチン及びコレステリンを含む脂質抗原液を検体と混合し、コレステリン結晶の凝集の有無を判定する方法である。
【０００７】
上記２つの方法は、いずれも用手法であるため、大量の検体を検査するには適していない。また、ＲＰＲ法では炭素粉末の凝集を目視により、ガラス板法ではコレステリン結晶の生成を顕微鏡下で観察することにより、判定が行われる。従って、いずれの方法においても、判定に熟練を要し、判定者によって判定結果が異なることも起こり得るという問題があった。
【０００８】
このような問題を解決するために、下記の特許文献１では、生化学自動分析機に適用可能な梅毒抗リン脂質抗体測定試薬が開示されている。ここでは、ブロッキング剤として不活性なタンパク質が用いられている。
【０００９】
他方、下記の特許文献２には、カウンティングイムノアッセイ法で測定可能な梅毒抗リン脂質抗体測定試薬が開示されている。この測定試薬は、カルジオライピン重量１に対して、フォスファジルコリン２〜１５倍量、コレステロール０〜６倍量及びこれら脂質抗原の総量が担体粒子１ｇあたり３０〜９５ｍｇ含む抗原液を担体粒子と混合させることにより、上記担体粒子上に脂質抗原を感作し、さらに担体粒子をポリビニルアルコールでブロッキングすることにより構成されている。
【００１０】
【特許文献１】
特許第３２９０５２０号
【特許文献２】
特開２００１−２４２１７１号
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
特許文献１において、ブロッキング剤として用いられるタンパク質の代表例として示されている牛血清アルブミンなどでは、抽出過程において混入する他のタンパク質などの影響により非特異反応が起こり、梅毒陰性の検体を陽性と判定する偽陽性が生じるという欠点があった。
【００１２】
また、上記特許文献２に記載の測定試薬は、カウンティングイムノアッセイ法を採用する機器に用いられるものであるが、その他の機器に用いた場合には測定を行うことはできない。
【００１３】
本発明の目的は、上述した従来技術の現状に鑑み、種々の生化学自動分析機に用いることができ、迅速かつ簡便に大量の検体を測定することを可能とし、かつ客観性の高い検出結果を得ることを可能する抗リン脂質抗体測定試薬及び抗リン脂質抗体測定方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る抗リン脂質抗体測定試薬は、抗リン脂質抗体と抗原との抗原抗体反応による凝集を吸光度の変化により測定するための抗リン脂質抗体測定試薬であって、カルジオリピン、レシチン及びコレステロールからなる脂質抗原が吸着された不溶性担体と、該不溶性担体に吸着された脂質抗原をブロッキングするための水溶性高分子とを含む抗原試薬と、水溶性高分子を含む希釈用緩衝液とからなることを特徴とする。
【００１５】
本発明に係る抗リン脂質抗体測定試薬のある特定の局面では、脂質抗原をブロッキングするための前記水溶性高分子が、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、水溶性多糖類及びこれらの誘導体からなる群から選択された少なくとも１種である。
【００１６】
本発明に係る抗リン脂質抗体測定試薬の他の特定の局面では、前記水溶性多糖類が、プルラン、デキストラン、デキストラン硫酸及びアルギン酸ナトリウムからなる群から選択された少なくとも１種である。
【００１７】
本発明に係る抗リン脂質抗体測定方法は、本発明に従って構成された抗リン脂質抗体測定試薬を用いた測定方法であって、前記抗原試薬と、前記希釈用緩衝液と、検体とを混合し、抗原抗体反応による凝集を生じさせる工程と、前記凝集の程度を、特定波長の吸光度に基づいて測定し、それによって検体中の抗リン脂質抗体を検出する工程とを備える。
【００１８】
以下、本発明の詳細を説明する。
本発明に係る抗リン脂質抗体測定試薬を用いた抗リン脂質抗体測定法は、前述したように、上記抗原試薬と、上記希釈用緩衝液と、検体とを混合し、抗原抗体反応による凝集を生じさせ、該凝集の程度波長の吸光度を測定し、該吸光度に基づいて抗リン脂質抗体を検出することにより行われる。
【００１９】
上記カルジオリピンとしては、特に限定されないが、牛心臓から精製されたカルジオリピンが好適に用いられる。カルジオリピンの主成分は、ホスファチジルグリセロールであり、ホスファチジルグリセロール純度が高いものが好ましく、より好ましくは、９０％以上の純度のものが望ましい。
【００２０】
上記レシチンは、卵黄から精製あるいは化学的に合成されたものが用いられる。レシチンの成分はホスファチジルコリンであり、ホスファチジルコリン純度が高いものが好ましく、より好ましくは、７０％以上の純度のものが望ましい。
【００２１】
上記コレステロールは、動物の脂肪から精製されたものあるいは化学的に合成されたものが用いられ得る。コレステロールについても純度の高いものが好ましく、９８％以上の純度を有するものが望ましい。
【００２２】
上記カルジオリピン、レシチン及びコレステロールからなる脂質抗原を不溶性担体に吸着させた後、ブロッキングのために用いられる上記水溶性高分子としては、特に限定されるわけではないが、ポリビニルピロリドンに代表される水溶性ポリビニル誘導体；プルラン、デキストラン、デキストラン硫酸及びアルギン酸ナトリウムなどに代表される水溶性多糖類及びその誘導体；ポリエチレングリコルに代表されるアルキルグリコールの共重合体及びその誘導体などを用いることができる。
【００２３】
上記水溶性高分子の分子量は水溶性高分子によっても異なるが、約１０００〜７００００の範囲であることが望ましい。より具体的には、例えばポリビニルピロリドンの場合には、分子量は５０００〜４００００の範囲が好ましく、プルランの場合には、分子量は１００００〜７００００の範囲が好ましく、ポリエチレングリコールの場合は、分子量は１０００〜３００００の範囲が好ましい。
【００２４】
水溶性高分子の分子量が低すぎると、ブロッキング作用が十分に得られないことがあり、大きすぎると、溶解性が悪くなることがある。
本発明において用いられる上記不溶性担体としては、例えば有機高分子粉末、微生物、血球、細胞膜片、プラスチック製マイクロタイタープレートなどを挙げることができる。
【００２５】
上記有機高分子粉末としては、例えば、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストランなどの天然高分子粉末、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体などの合成高分子粉末などが挙げられ、特に合成高分子ラテックスが望ましい。
【００２６】
上記ラテックスを用いる場合、粒径は０．１〜１．０μｍが好ましく、より好ましくは０．１〜０．５μｍである。
【００２７】
上記希釈用緩衝剤としては、ｐＨ５．０〜９．０の緩衝液であれば、任意の緩衝液を用いることができる。用い得る緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液などを挙げることができる。
【００２８】
上記希釈用緩衝液には、測定感度の向上及び抗原抗体反応の促進を目的として、様々な水溶性高分子が含有される。このような水溶性高分子としては、例えば、特開平２−１７３５６７号公報に記載のアルキル化多糖類、あるいは特開平５−１８０８３８号公報に記載のように、プルランまたはポリビニルピロリドンなどを挙げることができる。希釈用緩衝液に含有される水溶性高分子は、前述したブロッキング用の水溶性高分子と同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００２９】
希釈用緩衝液中の水溶性高分子の濃度は０．０１〜１０（ｗ／ｖ）％の範囲が好ましい。０．０１（ｗ／ｖ）％未満では、測定感度が十分高くならないことがある。
【００３０】
また、上記希釈用緩衝液には、検体中に存在する他の物質により生じる非特異反応抑制を目的として、牛血清アルブミン、卵性アルブミンなどのタンパク質を添加してもよい。
【００３１】
本発明に係る抗リン脂質抗体測定試薬を得るにあたっては、まず、不溶性担体に上記脂質抗原が吸着されるが、吸着方法は特に限定されない。例えば、不溶性担体を脂質抗原を含む緩衝液と混合することにより、脂質抗原が不溶性担体に吸着される。しかる後、不溶性担体に吸着された脂質抗原をブロッキングするための水溶性高分子が、脂質抗原が吸着された不溶性担体と混合され、抗原試薬が得られる。
【００３２】
また、水溶性高分子を含む希釈用緩衝液は、緩衝液に上記水溶性高分子を混合し、溶解することにより得られる。
本発明に係る抗リン脂質抗体測定試薬は、上記抗原試薬と、希釈用緩衝液とを有する２液型の測定試薬である。
【００３３】
本発明に係る抗リン脂質抗体測定方法では、上記抗原試薬と、希釈用緩衝液と、検体とが混合され、それによって抗原抗体反応による凝集が生じる。そして、凝集の程度が、光学的に測定される。すなわち、特定波長の吸光度を測定し、該吸光度変化量に基づいて凝集の程度が検出され、それによって検体中の抗リン脂質抗体が検出される。この場合の吸光度変化量の測定に際しては、種々の生化学自動分析機を用いることができる。
【００３４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的な実施例及び比較例を挙げることにより、本発明を明らかにする。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
（実施例１）
１）抗原試薬の調製
カルジオリピン（シグマ社製）の５ｍｇ／ｍＬ濃度のエタノール溶液を３ｍＬと、ホスファチジルコリン（シグマ社製）の１５ｍｇ／ｍＬ濃度のエタノール溶液を１０ｍＬと、コレステロール（ナカライテスク社製）の１５ｍｇ／ｍＬ濃度のエタノール溶液を４．５ｍＬとを混合し、脂質抗原液を得た。
【００３６】
ポリスチレンラテックス懸濁液［（平均粒径０．４μｍ、１０ｗ／ｖ％）濃度、積水化学工業社製］１ｍＬを予め３７℃で穏やかに攪拌しつつ加温し、しかる後、上記脂質抗原液３ｍＬを添加し、３７℃で１時間攪拌した。２重量％ポリビニルピロリドン（分子量１００００、ＢＡＳＦ社製、品番：Ｋ−１５）を含むリン酸緩衝食塩水（３６ｍＬリン酸緩衝液、ｐＨ６．５、０．７４重量％ＮａＣｌ、以下ＰＢＳ緩衝液と略す）５ｍＬを添加し、さらに３７℃で１時間攪拌した。しかる後、この液を４℃の温度で、１５０００ｒｐｍ及び３０分の条件で遠心分離し、上清を除いた。上清を除いた後、沈殿したラテックスを１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝液３ｍＬに懸濁させた。この操作を３回繰り返し、ラテックスを洗浄し、最後に１０ｍＬのＥＤＴＡ・２Ｎａ（同仁化学社製）及び５００ｍＭ塩化コリン（和光純薬社製）を含むＰＢＳ緩衝液２０ｍＬに懸濁させ、抗原試薬を得た。この抗原試薬は、梅毒抗リン脂質抗体を測定するためのものである。
【００３７】
２）希釈用緩衝液の調製
プルラン（林原社製）を１ｗ／ｖ％及び牛血清アルブミンを１ｗ／ｖ％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を調製し、希釈用緩衝液とした。
【００３８】
３）測定
上記のようにして得られた抗原試薬と、希釈用緩衝液とを用い、日立製作所製７１７０型生化学自動分析機を用いて測定を行った。特定波長は７００ｎｍとし、１検体の測定について、抗原試薬６０μＬ、希釈用緩衝液１８０μＬを２０μＬの検体に対して用いた。より具体的には、検体２０μＬに希釈用緩衝液１８０μＬを添加し、攪拌した後、３７℃で保持した後、抗原試薬６０μＬを添加し、攪拌し、しかる後１分後及び５分後の吸光度を測定し、この間の吸光度変化量を求めた。下記の表１に示す検体Ｎｏ．１〜１０について、上記測定を行った。結果を下記の表１に示す。
【００３９】
（実施例２）
抗原試薬の測定に際し、２重量％ポリビニルピロリドンＫ−１５に代えて、１重量％ポリビニルピロリドン（分子量３００００、ＢＡＳＦ社製、品番：Ｋ−３０）を用いたことを除いては、実施例１と同様にして試薬を作製し、評価した。
【００４０】
（実施例３）
実施例１の抗原試薬の調製に際して用いた２重量％ポリビニルピロリドンに代えて、３重量％プルラン（林原社製、品番：ＰＩ−２０）としたことを除いては、実施例１と同様にして試薬を作製し、評価した。
【００４１】
（実施例４）
実施例１の抗原試薬の調製に際しての２重量％ポリビニルピロリドンに代えて、３重量％ポリエチレングリコール（和光純薬社製、分子量２００００）としたことを除いては、実施例１と同様にして試薬を作製し、評価した。
【００４２】
（比較例１）
実施例１の抗原試薬の調製における２重量％ポリビニルピロリドンに代えて、１重量％牛血清アルブミンとしたことを除いては、実施例１と同様にして試薬を作製し、評価した。
【００４３】
（検体Ｎｏ．１〜１０）
なお、検体Ｎｏ．１〜１０は、用手法であるＲＰＲカードテスト（三光純薬社製）では梅毒陰性と判定されるが、比較例１において非特異的凝集による吸光度変化量が上昇した検体である。
【００４４】
検体Ｎｏ．１〜１０は、上記のようにＲＰＲカードテストで陰性と判定されるものであるため、表１に示されている比較例１及び実施例１〜４の結果の吸光度変化量は、非特異的凝集の程度を示すものである。
【００４５】
表１から明らかなように、比較例１では、全ての検体において凝集の程度が高く、従って前述したようにＲＰＲカードテストでは梅毒陰性と判定されている検体であるにも関わらず、比較例１の試薬を用いた場合には、吸光度変化量が大きく上昇し、陽性と判断されることがある。
【００４６】
これに対して、実施例１〜４では、いずれも比較例１の場合に比べて吸光度変化量が小さく、すなわち非特異的凝集が生じ難いことがわかる。
なお、表１では、吸光度変化量としてΔ吸光度×１０４の値が示されている。
【００４７】
【表１】
2004325413.tif 000002
【００４８】
【発明の効果】
本発明に係る抗リン脂質抗体測定試薬は、カルジオリピン、レシチン及びコレステロールからなる脂質抗原が吸着された不溶性担体と、該不溶性担体に吸着された脂質抗原をブロッキングするための水溶性高分子とを含む抗原試薬と、水溶性高分子を含む希釈用緩衝液とからなり、ブロッキングに上記水溶性高分子が用いられているため、抗リン脂質抗体の測定に際しての非特異的凝集を抑制することができる。従って、より確実に梅毒感染状態を検出することができる。また、本発明に係る測定試薬は、上記抗原試薬と希釈用緩衝液とからなるものであり、様々な生化学自動分析機に適用することができる。従って、迅速かつ簡便に大量の検体を測定することができ、しかも上記のように非特異的凝集による判定不良が生じ難いため、客観性に優れた梅毒判定結果を得ることができる。
【００４９】
本発明に係る抗リン脂質抗体測定方法では、本発明に係る抗リン脂質抗体測定試薬と検体とを混合し、抗原抗体反応による凝集を生じさせ、該凝集の程度を特定波長の吸光度を測定することにより行われる。従って、様々な生化学自動分析機において測定を行うことができ、迅速かつ簡便に大量の検体を測定することができる。また、本発明に係る抗リン脂質抗体測定試薬を用いるものであるため、非特異的凝集が生じ難く、従って、梅毒の感染状態を高精度に検出することができる。