(57)【要約】【課題】一本鎖抗体が特異的に認識する抗原の存在下で選択的に免疫応答を引き起こす動物細胞や、前記動物細胞を作製するための組換え遺伝子を保有するベクターＤＮＡや、前記動物細胞やベクターＤＮＡを利用した有用物質の生産方法、抗原濃度測定方法、細胞応答活性化物質のスクリーニング方法、タンパク質間相互作用の測定方法、細胞応答の制御方法や、キメラ受容体のスクリーニング方法、外来遺伝子導入細胞の選択方法、癌治療用ウイルスベクターＤＮＡ等を提供すること。【解決手段】フルオレセインを用い、それに対する一本鎖抗体３１ＩＪ３遺伝子とマウスエリスロポエチン受容体遺伝子、及びマウスｇｐ１３０遺伝子との組換え遺伝子を保有するベクターＤＮＡを、標的細胞に導入し、キメラ受容体を該細胞膜表面に発現させることにより、フルオレセインダイマーの刺激によって、細胞増殖因子非依存的に増殖することができる遺伝子導入細胞を創製する。【選択図】　　　　図１
2004113062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の抗体の可変領域ＶＨ及び可変領域ＶＬがリンカーアミノ酸配列を介して連結された可変領域ＶＨ−リンカーアミノ酸配列−可変領域ＶＬ、又は可変領域ＶＬ−リンカーアミノ酸配列−可変領域ＶＨからなる１又は２種以上の一本鎖抗体の１又は２以上が、所定の受容体又はその一部に連結された少なくとも一組のキメラ受容体を膜表面に有し、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化され細胞応答を引き起こすことを特徴とする動物細胞。
【請求項２】
所定の受容体又はその一部が、細胞増殖因子受容体又はその一部であることを特徴とする請求項１記載の動物細胞。
【請求項３】
細胞増殖因子受容体又はその一部が、エリスロポエチン受容体若しくはその一部及び／又はｇｐ１３０若しくはその一部であることを特徴とする請求項２記載の動物細胞。
【請求項４】
一本鎖抗体が特異的に認識する抗原が、ヒトに免疫原性がない抗原であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の動物細胞。
【請求項５】
一本鎖抗体が特異的に認識する抗原が、分子量１，０００以下の低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の動物細胞。
【請求項６】
分子量１，０００以下の低分子物質が、フルオレセインであることを特徴とする請求項５記載の動物細胞。
【請求項７】
所定の抗体の可変領域ＶＨをコードする遺伝子及び可変領域ＶＬをコードする遺伝子がリンカーＤＮＡ配列を介して連結された可変領域ＶＨをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＬをコードする遺伝子、又は可変領域ＶＬをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＨをコードする遺伝子からなる１又は２種以上の一本鎖抗体をコードする遺伝子の１又は２以上を、所定の受容体又はその一部をコードする遺伝子に連結した組換え遺伝子を保有することを特徴とするベクターＤＮＡ。
【請求項８】
所定の受容体又はその一部をコードする遺伝子が、細胞増殖因子受容体又はその一部をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項７記載のベクターＤＮＡ。
【請求項９】
細胞増殖因子受容体又はその一部が、エリスロポエチン受容体若しくはその一部及び／又はｇｐ１３０若しくはその一部であることを特徴とする請求項８記載のベクターＤＮＡ。
【請求項１０】
一本鎖抗体が特異的に認識する抗原が、分子量１，０００以下の低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーであることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のベクターＤＮＡ。
【請求項１１】
分子量１，０００以下の低分子物質が、フルオレセインであることを特徴とする請求項１０記載のベクターＤＮＡ。
【請求項１２】
動物細胞に導入することにより、少なくとも一組のキメラ受容体を膜表面に発現させることができ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化され細胞応答を引き起こすことを特徴とする請求項７〜１１のいずれか記載のベクターＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか記載の動物細胞の作製方法であって、請求項７〜１２のいずれか記載のベクターＤＮＡを動物細胞に導入し、細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化されることにより、引き起こされる細胞応答を指標として単離することを特徴とする動物細胞の作製方法。
【請求項１４】
一本鎖抗体が特異的に認識する抗原として低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーを用い、該低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーの存在下で増殖する動物細胞を単離することを特徴とする請求項１３記載の動物細胞の作製方法。
【請求項１５】
一本鎖抗体が特異的に認識する抗原として癌抗原を用い、該癌抗原の存在下で増殖する動物細胞を単離することを特徴とする請求項１３記載の動物細胞の作製方法。
【請求項１６】
動物細胞が、ヒトＴ細胞又は樹状細胞であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか記載の動物細胞の作製方法。
【請求項１７】
請求項７〜１２のいずれか記載のベクターＤＮＡを有用物質生産動物細胞に導入し、細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化されることにより、細胞増殖を引き起こさせることを特徴とする有用物質の生産方法。
【請求項１８】
癌抗原に対する抗体の可変領域ＶＨをコードする遺伝子及び可変領域ＶＬをコードする遺伝子がリンカーＤＮＡ配列を介して連結された可変領域ＶＨをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＬをコードする遺伝子、又は可変領域ＶＬをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＨをコードする遺伝子からなる１又は２種の一本鎖抗体をコードする遺伝子を、細胞死誘導受容体又はその一部をコードする遺伝子に連結した組換え遺伝子を保有することを特徴とする癌治療用ウイルスベクターＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか記載の動物細胞の細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原含有試料における細胞応答の程度を測定することを特徴とする抗原濃度測定方法。
【請求項２０】
抗原含有試料が、癌抗原を含む血液であることを特徴とする請求項１９記載の抗原濃度測定方法。
【請求項２１】
請求項１〜６のいずれか記載の動物細胞の細胞膜表面に発現した少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体と、被検物質とを接触させることを特徴とするキメラ受容体が特異的に認識して細胞応答を活性化させる能力を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２２】
低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーを特異的に認識するキメラ受容体と、被検物質としての低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーとを接触させることを特徴とする請求項２１記載のキメラ受容体が特異的に認識して細胞応答を活性化させる能力を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２３】
所定の抗体の可変領域ＶＨをコードする遺伝子及び可変領域ＶＬをコードする遺伝子がリンカーＤＮＡ配列を介して連結された可変領域ＶＨをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＬをコードする遺伝子、又は可変領域ＶＬをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＨをコードする遺伝子からなる一本鎖抗体をコードする遺伝子をランダム化し、かかるランダム化された一本鎖抗体をコードする遺伝子を、所定の受容体又はその一部をコードする遺伝子に連結した組換え遺伝子を保有するベクターＤＮＡを動物細胞に導入し、該ベクターＤＮＡ導入動物細胞と請求項２１又は２２記載のスクリーニング方法により得られる細胞応答を活性化させる能力を有する物質とを接触させ、細胞応答の程度を測定することを特徴とする抗原結合能を有するキメラ受容体のスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項１〜３のいずれか記載の動物細胞の細胞膜表面に発現した少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体であって、２種類又は３種類以上のタンパク質をそれぞれ特異的に認識するキメラ受容体と、２種類又は３種類以上のタンパク質とを接触させ、前記キメラ受容体が活性化されることにより引き起こされる細胞応答の程度を測定することを特徴とするタンパク質間相互作用の測定方法。
【請求項２５】
請求項７〜１２のいずれか記載のベクターＤＮＡに外来遺伝子を組み込み、該外来遺伝子を組み込んだベクターＤＮＡを動物細胞に導入し、細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化されることにより、細胞応答を引き起こす動物細胞を単離することを特徴とする外来遺伝子導入細胞の選択方法。
【請求項２６】
請求項７〜１２のいずれか記載のベクターＤＮＡとこれとは異なるベクターＤＮＡに組み込んだ外来遺伝子とを動物細胞に導入し、細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化されることにより、細胞応答を引き起こす動物細胞を単離することを特徴とする外来遺伝子導入細胞の選択方法。
【請求項２７】
外来遺伝子が、遺伝子治療用の遺伝子であり、細胞応答が細胞増殖であることを特徴とする請求項２５又は２６記載の外来遺伝子導入細胞の選択方法。
【請求項２８】
請求項１〜６のいずれか記載の動物細胞の細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原の添加量を調節することによって細胞応答の程度を制御することを特徴とする細胞応答の制御方法。
【請求項２９】
請求項２５又は２６記載の選択方法により得られた外来遺伝子導入細胞の細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原の添加量を調節することによって細胞増殖の程度を制御することを特徴とする細胞の分化、増殖、死の経時的又は空間的制御方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）が受容体又はその一部に連結された一対のキメラ受容体を膜表面に有し、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化され細胞応答を引き起こす動物細胞や、該動物細胞の作製のために使用される一本鎖抗体をコードする遺伝子を受容体又はその一部をコードする遺伝子に連結した組換え遺伝子を保有するベクターＤＮＡや、これら動物細胞やベクターＤＮＡの利用等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物細胞培養によって抗体、サイトカインなどの有用タンパク質の生産が工業的に広く行われている。動物細胞の増殖には各種の細胞増殖因子が必要であり、その供給源として牛胎児血清が用いられてきたが、目的タンパク質の高純度分離精製が困難であること、プリオン混入といった安全面での危惧があることから、無血清培地への転換が求められている。しかし、無血清培地を用いる場合には細胞増殖を活性化するために高価な増殖因子の添加が必要となる場合が多く、培地コストの観点から工業的規模の動物細胞培養の大きな問題点となっている。また、細胞の有用物質生産効率を高める方法として、細胞増殖を制御する方法が試みられてきた（例えば、非特許文献１参照。）。具体的には、対数増殖期においては短時間で細胞増殖を促進して物質生産を迅速に行わせ、細胞密度が充分高密度に達した後は増殖を抑制して、過増殖によって引き起こされる細胞死に至るまでの時間を延長させる。実際、このような細胞増殖制御によって、増殖制御を行わない場合と比較して数倍高い物質生産効率が得られることが報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００３】
また、近年新しい治療法として遺伝子治療が期待されているが、標的細胞への遺伝子導入効率は充分でない場合が多い。このため、目的遺伝子が導入された細胞を未導入の細胞から選択する必要がある。従来法では、目的遺伝子とともに薬剤耐性遺伝子、表面抗原マーカーや蛍光蛋白質マーカーを組み込んだベクターを作製し、選択薬剤の添加やセルソーターを用いた選別で目的遺伝子導入細胞を選択的に得ていた。しかし、この方法では原理的に治療用遺伝子を持つ細胞を増やすことができないので、治療用遺伝子の発現自体が細胞増殖に有利に働かない限り、充分な治療効果が得られないという問題があった。
【０００４】
これら問題を克服するための方法として、遺伝子導入細胞だけを生体内又は外で選択的に増幅するという手法が考えられており、選択的増幅の方法としては導入したい遺伝子と同時に増殖シグナルを伝達する細胞増殖因子受容体の遺伝子を導入することが考えられ、エリスロポエチン受容体を選択的増幅遺伝子として用い、生体内での遺伝子導入細胞の増幅が確認されている（例えば、非特許文献３参照。）。しかし、細胞増殖因子を投与すると生体内にある通常の細胞に何らかの副作用を引き起こしてしまうという新たな問題が生じる。
【０００５】
これらの課題を克服する方法として、細胞増殖因子とは異なるリガンドに応答して、細胞内へ細胞増殖因子と同様なシグナルを伝達できるような人工受容体を創製する方法が考えられる。この概念に基づき、細胞増殖因子受容体のリガンド認識ドメインをエストロゲン受容体、若しくは免疫抑制剤ＦＫ５０６受容体であるＦＫＢＰ１２に置換したキメラ受容体が報告されており、合成リガンドである４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎやＦＫ１０１２のような分子を添加することで遺伝子導入細胞を増幅する系が提案されている（例えば、非特許文献４、５参照。）。しかし、これらの合成リガンドが生体内に投与した際に毒性をもたないかどうかはまだ示されておらず、体内に投与しても安全な物質に応答する新規選択的増幅遺伝子の開発が望まれている。
【０００６】
本発明者らは、無数の組み合わせと高い特異性を持つ抗原−抗体系に着目し、細胞増殖因子受容体のリガンド結合ドメインを抗体の抗原結合部位で置換した抗体／受容体キメラを作製し、任意の抗原を添加することにより細胞増殖因子のシグナル伝達を代用する方法を提案している（例えば、特許文献１参照。）。細胞増殖因子受容体は細胞増殖因子添加によって引き起こされる２量体形成によって活性化されるため、用いる抗原−抗体系は、抗原がない状態では互いに親和性をもたず、抗原添加時のみ近接して強い親和性をもつ必要がある。このような性質を持つ抗原−抗体系のモデルとして、上記特許文献１記載の実験系では、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）とそれに対する抗体ＨｙＨＥＬ−１０の可変領域ＶＨ、ＶＬを用い、ＶＨ−受容体キメラ、ＶＬ−受容体キメラの２つのキメラ受容体を標的細胞で共発現させ、ＨＥＬの添加により受容体の２量体形成を誘導し、細胞増殖を制御することに成功している。
【０００７】
しかし、ＨＥＬのような異種抗原を用いると、生体内において遺伝子導入細胞を選択的に増幅する際に免疫反応が惹起されるため、抗原として免疫原性のない低分子物質等を用いることが好ましい。しかし、低分子物質に対する抗体の親和性は通常低く、ＶＨ−ＶＬと連結した一本鎖抗体での親和性があっても、上記特許文献１記載の方法におけるように、ＶＨとＶＬを別々のポリペプチド鎖として分けてしまうと、抗原への親和性が弱まってしまい、２つのキメラ受容体によるシグナル伝達が不充分であるという問題が考えられる。
【０００８】
【特許文献１】
特開平１０−２３４３７２号公報
【非特許文献１】
Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１０，　１５−２３，　１９９２
【非特許文献２】
Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　１６，　４６８−４７２，　１９９８
【非特許文献３】
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９３，　９４０２−９４０７，　１９９６
【非特許文献４】
Ｊ．　Ｇｅｎｅ　Ｍｅｄ．　１，　２３６−２４４，　１９９９
【非特許文献５】
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９４，　３０７６−３０８１，　１９９７
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、一本鎖抗体が特異的に認識する低分子物質等の抗原の存在下で選択的に免疫応答を引き起こす動物細胞や、該選択的に免疫応答を引き起こす動物細胞を作製するための一本鎖抗体遺伝子を受容体遺伝子に連結した組換え遺伝子を保有するベクターＤＮＡや、前記動物細胞やベクターＤＮＡを利用した、有用物質の生産方法、抗原濃度測定方法、細胞応答活性化物質のスクリーニング方法、タンパク質間相互作用の測定方法、細胞応答の制御方法や、キメラ受容体のスクリーニング方法、外来遺伝子導入細胞の選択方法、癌治療用ウイルスベクターＤＮＡ等を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、低分子物質として生体に無害であると考えられるフルオレセインを用い、それに対する一本鎖抗体３１ＩＪ３遺伝子とマウスエリスロポエチン受容体遺伝子、及びマウスｇｐ１３０遺伝子との組換え遺伝子を保有するベクターＤＮＡを、標的細胞に導入し、キメラ受容体を該細胞膜表面に発現させることにより、フルオレセインダイマーの刺激によって、細胞増殖因子非依存的に増殖することができる遺伝子導入細胞を創製することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、所定の抗体の可変領域ＶＨ及び可変領域ＶＬがリンカーアミノ酸配列を介して連結された可変領域ＶＨ−リンカーアミノ酸配列−可変領域ＶＬ、又は可変領域ＶＬ−リンカーアミノ酸配列−可変領域ＶＨからなる１又は２種以上の一本鎖抗体の１又は２以上が、所定の受容体又はその一部に連結された少なくとも一組のキメラ受容体を膜表面に有し、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化され細胞応答を引き起こすことを特徴とする動物細胞（請求項１）や、所定の受容体又はその一部が、細胞増殖因子受容体又はその一部であることを特徴とする請求項１記載の動物細胞（請求項２）や、細胞増殖因子受容体又はその一部が、エリスロポエチン受容体若しくはその一部及び／又はｇｐ１３０若しくはその一部であることを特徴とする請求項２記載の動物細胞（請求項３）や、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原が、ヒトに免疫原性がない抗原であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の動物細胞（請求項４）や、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原が、分子量１，０００以下の低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の動物細胞（請求項５）や、分子量１，０００以下の低分子物質が、フルオレセインであることを特徴とする請求項５記載の動物細胞（請求項６）に関する。
【００１２】
また本発明は、所定の抗体の可変領域ＶＨをコードする遺伝子及び可変領域ＶＬをコードする遺伝子がリンカーＤＮＡ配列を介して連結された可変領域ＶＨをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＬをコードする遺伝子、又は可変領域ＶＬをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＨをコードする遺伝子からなる１又は２種以上の一本鎖抗体をコードする遺伝子の１又は２以上を、所定の受容体又はその一部をコードする遺伝子に連結した組換え遺伝子を保有することを特徴とするベクターＤＮＡ（請求項７）や、所定の受容体又はその一部をコードする遺伝子が、細胞増殖因子受容体又はその一部をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項７記載のベクターＤＮＡ（請求項８）や、細胞増殖因子受容体又はその一部が、エリスロポエチン受容体若しくはその一部及び／又はｇｐ１３０若しくはその一部であることを特徴とする請求項８記載のベクターＤＮＡ（請求項９）や、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原が、分子量１，０００以下の低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーであることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のベクターＤＮＡ（請求項１０）や、分子量１，０００以下の低分子物質が、フルオレセインであることを特徴とする請求項１０記載のベクターＤＮＡ（請求項１１）や、動物細胞に導入することにより、少なくとも一組のキメラ受容体を膜表面に発現させることができ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化され細胞応答を引き起こすことを特徴とする請求項７〜１１のいずれか記載のベクターＤＮＡ（請求項１２）や、請求項１〜６のいずれか記載の動物細胞の作製方法であって、請求項７〜１２のいずれか記載のベクターＤＮＡを動物細胞に導入し、細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化されることにより、引き起こされる細胞応答を指標として単離することを特徴とする動物細胞の作製方法（請求項１３）や、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原として低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーを用い、該低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーの存在下で増殖する動物細胞を単離することを特徴とする請求項１３記載の動物細胞の作製方法（請求項１４）や、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原として癌抗原を用い、該癌抗原の存在下で増殖する動物細胞を単離することを特徴とする請求項１３記載の動物細胞の作製方法（請求項１５）や、動物細胞が、ヒトＴ細胞又は樹状細胞であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか記載の動物細胞の作製方法（請求項１６）や、請求項７〜１２のいずれか記載のベクターＤＮＡを有用物質生産動物細胞に導入し、細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化されることにより、細胞増殖を引き起こさせることを特徴とする有用物質の生産方法（請求項１７）や、癌抗原に対する抗体の可変領域ＶＨをコードする遺伝子及び可変領域ＶＬをコードする遺伝子がリンカーＤＮＡ配列を介して連結された可変領域ＶＨをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＬをコードする遺伝子、又は可変領域ＶＬをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＨをコードする遺伝子からなる１又は２種の一本鎖抗体をコードする遺伝子を、細胞死誘導受容体又はその一部をコードする遺伝子に連結した組換え遺伝子を保有することを特徴とする癌治療用ウイルスベクターＤＮＡ（請求項１８）に関する。
【００１３】
さらに本発明は、請求項１〜６のいずれか記載の動物細胞の細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原含有試料における細胞応答の程度を測定することを特徴とする抗原濃度測定方法（請求項１９）や、抗原含有試料が、癌抗原を含む血液であることを特徴とする請求項１９記載の抗原濃度測定方法（請求項２０）や、請求項１〜６のいずれか記載の動物細胞の細胞膜表面に発現した少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体と、被検物質とを接触させることを特徴とするキメラ受容体が特異的に認識して細胞応答を活性化させる能力を有する物質のスクリーニング方法（請求項２１）や、低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーを特異的に認識するキメラ受容体と、被検物質としての低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーとを接触させることを特徴とする請求項２１記載のキメラ受容体が特異的に認識して細胞応答を活性化させる能力を有する物質のスクリーニング方法（請求項２２）や、所定の抗体の可変領域ＶＨをコードする遺伝子及び可変領域ＶＬをコードする遺伝子がリンカーＤＮＡ配列を介して連結された可変領域ＶＨをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＬをコードする遺伝子、又は可変領域ＶＬをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＨをコードする遺伝子からなる一本鎖抗体をコードする遺伝子をランダム化し、かかるランダム化された一本鎖抗体をコードする遺伝子を、所定の受容体又はその一部をコードする遺伝子に連結した組換え遺伝子を保有するベクターＤＮＡを動物細胞に導入し、該ベクターＤＮＡ導入動物細胞と請求項２１又は２２記載のスクリーニング方法により得られる細胞応答を活性化させる能力を有する物質とを接触させ、細胞応答の程度を測定することを特徴とする抗原結合能を有するキメラ受容体のスクリーニング方法（請求項２３）や、請求項１〜３のいずれか記載の動物細胞の細胞膜表面に発現した少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体であって、２種類又は３種類以上のタンパク質をそれぞれ特異的に認識するキメラ受容体と、２種類又は３種類以上のタンパク質とを接触させ、前記キメラ受容体が活性化されることにより引き起こされる細胞応答の程度を測定することを特徴とするタンパク質間相互作用の測定方法（請求項２４）や、請求項７〜１２のいずれか記載のベクターＤＮＡに外来遺伝子を組み込み、該外来遺伝子を組み込んだベクターＤＮＡを動物細胞に導入し、細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化されることにより、細胞応答を引き起こす動物細胞を単離することを特徴とする外来遺伝子導入細胞の選択方法（請求項２５）や、請求項７〜１２のいずれか記載のベクターＤＮＡとこれとは異なるベクターＤＮＡに組み込んだ外来遺伝子とを動物細胞に導入し、細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化されることにより、細胞応答を引き起こす動物細胞を単離することを特徴とする外来遺伝子導入細胞の選択方法（請求項２６）や、外来遺伝子が、遺伝子治療用の遺伝子であり、細胞応答が細胞増殖であることを特徴とする請求項２５又は２６記載の外来遺伝子導入細胞の選択方法（請求項２７）や、請求項１〜６のいずれか記載の動物細胞の細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原の添加量を調節することによって細胞応答の程度を制御することを特徴とする細胞応答の制御方法（請求項２８）や、請求項２５又は２６記載の選択方法により得られた外来遺伝子導入細胞の細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原の添加量を調節することによって細胞増殖の程度を制御することを特徴とする細胞の分化、増殖、死の経時的又は空間的制御方法（請求項２９）に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の動物細胞としては、所定の抗体の可変領域ＶＨ及び可変領域ＶＬがリンカーアミノ酸配列を介して連結された可変領域ＶＨ−リンカーアミノ酸配列−可変領域ＶＬ、又は可変領域ＶＬ−リンカーアミノ酸配列−可変領域ＶＨからなる１又は２種以上の一本鎖抗体の１又は２以上が、所定の受容体又はその一部に連結された少なくとも一組のキメラ受容体を膜表面に有し、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化され細胞応答を引き起こす細胞であれば特に制限されるものではなく、また、本発明のベクターＤＮＡとしては、所定の抗体の可変領域ＶＨをコードする遺伝子及び可変領域ＶＬをコードする遺伝子がリンカーＤＮＡ配列を介して連結された可変領域ＶＨをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＬをコードする遺伝子、又は可変領域ＶＬをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＨをコードする遺伝子からなる１又は２種以上の一本鎖抗体をコードする遺伝子の１又は２以上を、所定の受容体又はその一部をコードする遺伝子に連結した組換え遺伝子を保有するベクターＤＮＡであれば特に制限されるものではなく、上記動物細胞としては、骨芽細胞、肝前駆細胞、白血球、マクロファージ、Ｔ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、有用物質生産細胞株等、その由来、種類は問わない。本発明によるキメラ受容体のシグナル伝達の模式図を図１として示す。図１には、抗フルオレセイン抗体の可変領域ＶＨ及び可変領域ＶＬがリンカーアミノ酸配列を介して連結された可変領域ＶＨ−リンカーアミノ酸配列−可変領域ＶＬからなる１の一本鎖抗体が、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）の細胞外領域とｇｐ１３０の細胞内領域からなる組換え受容体に連結された少なくとも一対のキメラ受容体を膜表面に有し、一本鎖抗体が特異的に認識するフルオレセインのダイマーとの接触により引き起こされる２量体複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化され細胞応答（アポトーシスの誘導又は細胞増殖）を引き起こすシグナル伝達のようすが示されている。
【００１５】
上記所定の受容体としては、リガンドとの接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって活性化され細胞応答を引き起こす受容体であれば特に制限されるものではなく、細胞増殖因子受容体、アポトーシス誘導因子受容体、細胞遊走因子受容体等、一般にサイトカインと総称されるシグナル伝達分子に対する受容体を挙げることができ、ここで「細胞増殖因子」とは、それが受容体に結合することによって細胞の増殖に関わる信号伝達系が活性化するようなすべての分子を意味し、それぞれの細胞への分化やその分化の途中の段階の細胞増殖を刺激する役割を担っている。また、「アポトーシス誘導因子」とは、それが受容体に結合することによって細胞のアポトーシスに関わる信号伝達系が活性化するようなすべての分子を意味し、「細胞遊走因子」とは、それが受容体に結合することによって細胞の遊走に関わる信号伝達系が活性化するようなすべての分子を意味している。上記細胞増殖因子受容体としては、主に血球の前駆細胞や白血球に作用して増殖を誘導するインターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１や、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の他、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板産生因子（ＴＰＯ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、赤血球産生因子（ＥＰＯ）などの細胞増殖因子の受容体（Ｒ）であるＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−６Ｒ（ｇｐ１３０）、ＩＬ−１１Ｒ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＳＣＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＰＯＲ、ＮＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＥＰＯＲなどを具体的に例示することができる。また、アポトーシス誘導因子受容体としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、幅広い種類の細胞に対して細胞死を引き起こすことができるＦａｓリガンドなどのアポトーシス誘導因子の受容体であるＴＮＦＲ、Ｆａｓなどを具体的に例示することができる。さらに、例えば、ＥＰＯＲの細胞外ドメインとｇｐ１３０の細胞内ドメインを結合した組換え受容体等、上記受容体の一部を適宜組み合わせた組換え受容体として用いることもできる。
【００１６】
上記所定の抗体の可変領域ＶＨ及び可変領域ＶＬがリンカーアミノ酸配列を介して連結された可変領域ＶＨ−リンカーアミノ酸配列−可変領域ＶＬ、あるいは可変領域ＶＬ−リンカーアミノ酸配列−可変領域ＶＨからなる一本鎖抗体としては、免疫グロブリンＩｇＧの直接抗原と結合する部位を含む可変領域（ｆｒａｇｍｅｎｔｏｆ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ：Ｆｖ）を構成するＶＨドメイン（可変領域ＶＨ）とＶＬドメイン（可変領域ＶＬ）間を人工的なリンカーアミノ酸配列（ペプチドリンカー）で結合し、抗原分子のエピトープを特異的に認識して抗原分子と結合しうるものであれば特に制限されるものではなく、かかる一本鎖抗体をコードする遺伝子は、ミックスプライマー等のＰＣＲプライマーを用いて常法により作製することができる。また、かかる一本鎖抗体が特異的に認識する抗原としては、一本鎖抗体と結合する能力（反応原性）を有し、膜表面に発現した一組のキメラ受容体との接触によりキメラ受容体が活性化され細胞応答を引き起こすものであればどのようなものでもよいが、ヒト等の生体にとって毒性がなく、免疫原性がないものが好ましい。かかる観点からして、ハプテン等の分子量１，０００以下の低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーが好ましく、かかる低分子物質としては、フルオレセインの他、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ，　Ｃｙ３，　Ａｌｅｘａ４８８のような蛍光色素、Ｂｅｎｚｔｈｉａｚｉｄｅ、Ｄｉａｚｏｘｉｄｅ、Ｔｒｉａｍｔｅｒｅｎｅ等の利尿剤、Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ等の抗生物質など毒性の低い低分子化合物を具体的に例示することができる。また、種類の異なる低分子物質の連結多量体を用いることもできる。
【００１７】
前記所定の受容体が、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−６Ｒ（ｇｐ１３０）、ＩＬ−１１Ｒ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＳＣＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＰＯＲ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＥＰＯＲなどＮＧＦＲを除く細胞増殖因子の受容体の場合、一対のキメラ受容体が２量体を形成することにより活性化されシグナルが伝達されるが、ＮＧＦＲや、ＴＮＦＲ、Ｆａｓなどのアポトーシス誘導因子受容体の場合、一組のキメラ受容体が３量体あるいはそれ以上の複合体を形成することにより活性化されシグナルが伝達されることになる。例えば、２量体を形成することにより活性化される一対のキメラ受容体の場合、抗原として低分子物質のダイマーを有利に用いることができる。また、３量体以上の複合体を形成することにより活性化される一組のキメラ受容体の場合、抗原として低分子物質のトリマー以上のマルチマーを有利に用いることができる他、キメラ受容体の一本鎖抗体部分を複数連結することによって低分子物質のダイマー添加時にキメラ受容体を３量体あるいはそれ以上の複合体にすることが可能となる。
【００１８】
上記キメラ受容体は、上記一本鎖抗体が、所定の受容体又はその一部に連結された受容体であり、一本鎖抗体が受容体（天然の受容体全体）に連結されたキメラ受容体の場合、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原の他に天然の受容体に結合する増殖因子等のリガンドにも応答することになり、他方、一本鎖抗体が受容体の一部に連結されたキメラ受容体の場合、天然の受容体の増殖因子等のリガンドに結合する部分が除去されていることから、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原にのみ応答することになる。かかるキメラ受容体をコードする遺伝子は、一本鎖抗体をコードする遺伝子を、所定の受容体又はその一部をコードする遺伝子に連結することにより構築した組換え遺伝子として得ることができる。この構築した組換え遺伝子を１種又は２種以上組み込んだ動物細胞発現用ベクターを動物細胞に導入し、形質転換することにより、少なくとも一組のキメラ受容体を動物細胞の膜表面に発現させることができる。例えば、異なる抗原又は異なるエピトープを認識する２種の一本鎖抗体をコードする遺伝子を所定の受容体又はその一部をコードする遺伝子に連結した２種の組換え遺伝子を保有する動物細胞発現用ベクターを動物細胞に導入し、二重特異性のキメラ受容体を動物細胞の膜表面に発現させることもできる。
【００１９】
少なくとも一組のキメラ受容体を膜表面に発現した動物細胞を作製するには、上記組換え遺伝子を保有する動物細胞発現用ベクターを導入した動物細胞に、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原を接触させ、該接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によってキメラ受容体が活性化されることによって生じる細胞応答を指標として動物細胞を単離することができる。例えば、１種の組換え遺伝子を組み込んだ動物細胞発現用ベクターを用いた場合、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原として低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーを用い、該低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマーの存在下で増殖する動物細胞を単離することにより、一対のキメラ細胞増殖因子受容体を膜表面に発現した動物細胞を作製することができる。また、２種又は３種類以上の組換え遺伝子を組み込んだ動物細胞発現用ベクターを用いた場合、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原として、２種以上の低分子物質の連結多量体や、タンパク質間に相互作用を有する２種又は３種類以上のタンパク質や、２又は３以上のエピトープが存在する抗原を用い、該連結多量体、２種又は３種類以上のタンパク質、２又は３以上のエピトープが存在する抗原などの存在下で増殖する動物細胞を単離することにより、二重又は三重以上の多重特異性のキメラ細胞増殖因子受容体を膜表面に発現した動物細胞を作製することができる。
【００２０】
また、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原として癌抗原を用い、該癌抗原の存在下で増殖するヒトＴ細胞、樹状細胞等の動物細胞を単離することにより、一対のキメラ細胞増殖因子受容体を膜表面に発現した動物細胞を作製することができ、かかる癌抗原を特異的に認識するヒトＴ細胞、樹状細胞等は、癌治療に有利に用いることができる。さらに、前記本発明のベクターＤＮＡを有用物質生産動物細胞に導入し、細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、前記一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によって前記キメラ受容体が活性化されることにより、細胞増殖を引き起こさせることにより、各種サイトカイン等の高価な細胞増殖因子を使用することなく有用物質生産動物細胞を大量に増殖させることができ、有用物質を大量に生産することが可能となる。
【００２１】
また、癌抗原に対する抗体の可変領域ＶＨをコードする遺伝子及び可変領域ＶＬをコードする遺伝子がリンカーＤＮＡ配列を介して連結された可変領域ＶＨをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＬをコードする遺伝子、又は可変領域ＶＬをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＨをコードする遺伝子からなる１又は２種の一本鎖抗体をコードする遺伝子を、細胞死誘導受容体又はその一部をコードする遺伝子に連結した組換え遺伝子を保有するウイルスベクターＤＮＡを癌治療用とすることや、少なくとも一組のキメラ受容体を膜表面に有する上記本発明の動物細胞を用いて、一本鎖抗体が特異的に認識する癌抗原を含む血液等の抗原含有試料における細胞応答の程度を測定することによって血液中の癌抗原等の抗原濃度を測定することができる。
【００２２】
また、少なくとも一組のキメラ受容体を膜表面に有する上記本発明の動物細胞に低分子物質のダイマー又はトリマー以上のマルチマー等の被検物質を接触させることにより、キメラ受容体が特異的に認識して細胞応答を活性化させる能力を有する物質をスクリーニングすることができる。さらに、可変領域ＶＨをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＬをコードする遺伝子からなる一本鎖抗体をコードする遺伝子、又は可変領域ＶＬをコードする遺伝子−リンカーＤＮＡ配列−可変領域ＶＨをコードする遺伝子をランダム化し、かかるランダム化された一本鎖抗体をコードする遺伝子を、所定の受容体又はその一部をコードする遺伝子に連結した組換え遺伝子を保有するベクターＤＮＡを動物細胞に導入し、該ベクターＤＮＡ導入動物細胞と上記スクリーニング方法により得られる細胞応答を活性化させる能力を有する物質とを接触させ、細胞応答の程度を測定することにより、抗原結合能を有するキメラ受容体をスクリーニングすることもできる。
【００２３】
また、本発明の動物細胞の細胞膜表面に発現した少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体であって、２種類又は３種類以上のタンパク質をそれぞれ特異的に認識するキメラ受容体と、２種類又は３種類以上のタンパク質とを接触させ、キメラ受容体が活性化されることにより引き起こされる細胞応答の程度を測定することにより、タンパク質間相互作用を測定することができる。さらに、本発明のベクターＤＮＡに遺伝子治療用遺伝子等の外来遺伝子を組み込み、該外来遺伝子を組み込んだベクターＤＮＡを動物細胞に導入し、細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体又は３量体以上の複合体形成によってキメラ受容体が活性化されることにより、細胞増殖等の細胞応答を引き起こす動物細胞を単離することによって、外来遺伝子導入細胞を選択することや、本発明のベクターＤＮＡとこれとは異なるベクターＤＮＡに組み込んだ遺伝子治療用遺伝子等の外来遺伝子とを動物細胞に導入し、細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原との接触により引き起こされる２量体形成によってキメラ受容体が活性化されることにより、細胞増殖等の細胞応答を引き起こす動物細胞を単離することによって、外来遺伝子導入細胞を選択することができる。また、異なる抗原特異性を有する一本鎖抗体の後ろにそれぞれ異なるシグナル伝達能を持つ受容体をキメラ化し、１つの細胞にこれらの種々のキメラ受容体を導入し、対応する抗原を添加することによって伝達されるシグナルの種類を制御すると、細胞の分化、増殖、死を経時的又は空間的に制御することが可能となる。さらに、少なくとも一組のキメラ受容体を膜表面に有する上記本発明の動物細胞の細胞膜表面に少なくとも一組の一本鎖抗体が連結したキメラ受容体を発現させ、一本鎖抗体が特異的に認識する抗原の添加量を調節することによって細胞応答の程度を制御することもできる。
以下、本発明の応用例についてより具体的に説明する。
【００２４】
［有用物質生産細胞の培養コスト削減］（図２参照）
動物細胞を用いて医薬品などの有用物質を生産する場合には、細胞増殖を活性化するために高価な増殖因子の添加が必要となる場合が多く、培地コストの観点から工業的規模の動物細胞培養の大きな問題になっている。また、過増殖によって引き起こされる細胞死は物質生産効率を低下させる原因となり、この過増殖もまた問題である。このような問題に対し、本発明のキメラ受容体発現動物細胞を用い、安価な低分子物質に応答して増殖シグナルを伝達するキメラ受容体を有用物質生産株に導入すれば、高価な増殖因子を必要とせず、簡便に増殖制御することが可能となり、有用物質生産の効率化および低コスト化を図ることができる。
【００２５】
［遺伝子導入細胞のｉｎ　ｖｉｖｏでの選択的増幅］（図３参照）
近年、新しい治療法として遺伝子治療が期待されているが、標的細胞への遺伝子導入効率は充分でない場合が多い。これを克服するための方法として、遺伝子導入細胞だけを生体内又は外で選択的に増幅するという手法が考えられる。本発明のキメラ受容体ベクターＤＮＡを治療用遺伝子とともに標的細胞に導入し、該キメラ受容体を発現させ、フルオレセイン等のキメラ受容体が特異的に認識する抗原を投与することにより、簡便に遺伝子導入細胞のみを選択的に増幅することができる。例えば、造血幹細胞は全ての血液細胞の源となる細胞であることから、本発明のキメラ受容体ベクターＤＮＡを導入した造血幹細胞を作製し、フルオレセイン等のキメラ受容体が特異的に認識する抗原を投与し、該細胞を効率よく増幅することにより、造血系の疾患の治療効果を大きく向上することができる。
【００２６】
［抗癌作用のある細胞の選択的増幅による癌治療］（図４参照）
癌の遺伝子治療では、癌を攻撃するＴ細胞に抗腫瘍遺伝子を導入して機能が強化されたＴ細胞を作製し、抗腫瘍活性を増強する試みが行われてきた。しかし、現在のところ遺伝子導入効率が低く、長期に渡る充分な治療効果が期待できないことが問題となっている。これに対し、本発明のキメラ受容体ベクターＤＮＡを抗腫瘍遺伝子とともに標的細胞に導入し、キメラ受容体を発現させ、フルオレセイン等のキメラ受容体が特異的に認識する抗原を投与することにより、簡便に遺伝子導入細胞のみを選択的に増殖することができる（図４）。すなわち、キメラ受容体をＴ細胞に導入すれば、機能強化Ｔ細胞をフルオレセイン等のキメラ受容体が特異的に認識する抗原を添加により選択的に増殖させることで導入効率の低さを克服し、治療効果の向上を図ることができる（図４−（１））。また、癌抗原特異的な抗体を受容体としてキメラ化し、癌の周辺に機能強化Ｔ細胞を選択的に増殖することができる（図４−（２））。さらに、癌抗原を表面提示し、Ｔ細胞を活性化する樹状細胞に、癌抗原とともに本発明によるキメラ受容体遺伝子を導入し、フルオレセイン等のキメラ受容体が特異的に認識する抗原を添加して選択的に増幅するシステムを構築することにより、癌を攻撃するＴ細胞を効率よく活性化することができる（図４−（３））。
【００２７】
［癌細胞を選択的に死滅させるシステム］（図５参照）
癌抗原に対する抗体ＳｃＦｖと細胞死（アポトーシス）誘導受容体をキメラ化したキメラ受容体を作製し、このキメラ受容体を癌の組織に導入・発現させることにより、細胞表面に癌抗原を有する細胞においてのみキメラ受容体が活性化され、癌細胞を選択的にアポトーシスに導くことができ、死滅させることができる。
【００２８】
［低分子物質結合性ＳｃＦｖの迅速なスクリーニング法とその応用］（図６参照）
キメラ受容体のＳｃＦｖ部分にランダムな変異を導入して細胞に導入し、任意の低分子物質を培地に添加したときに増殖した細胞を回収すれば、任意の低分子物質に結合するＳｃＦｖを迅速簡便に選択することができる。すなわち、本発明によれば、任意の抗原に対して高い親和性の抗体を迅速に得ることができ、内分泌系撹乱物質など測定ニーズの高い低分子物質に対する抗体の迅速な取得法として応用することができる。また、このようにして得られた抗体は抗体医薬品として、疾患の治療に用いることができる。
【００２９】
［細胞の分化、増殖、死の経時的制御］（図７参照）
本発明によれば、低分子物質応答性キメラ受容体をも合理的かつ迅速に選択することができる。すなわち、上記［低分子物質結合性ＳｃＦｖの迅速なスクリーニング法］を利用し、種々のキメラ受容体が得られた場合には、各ＳｃＦｖの後ろに、それぞれ異なるシグナル伝達能を持つ受容体をキメラ化し、１つの細胞にこれらの種々のキメラ受容体を導入することにより、遺伝子導入細胞の増殖、分化、死といった運命（各段階）を人為的に、且つ経時的に制御することが可能となる。この方法を利用することにより、例えば、組織再生において、ある一定の期間だけ遺伝子導入（骨芽）細胞を増殖・分化させて再生の足場を作り、その後は死滅させて患者由来の（骨芽）細胞による自発的再生を促すといった治療が可能となる。
【００３０】
［細胞の分化、増殖、死の空間的制御］（図８参照）
上記［細胞の分化、増殖、死の経時的制御］において得られた種々のキメラ受容体に結合する低分子物質を担体上の任意の領域に固定化することにより、細胞の増殖、分化、死などを空間的に制御することができる。かかる制御方法を用いることにより、臓器再生においてどの部分に増殖あるいは分化した細胞を配置するかの空間的制御と、臓器自体の大きさの制御を同時に行うことができる。
【００３１】
［物質の濃度を測定するセンサーとしての応用］（図９参照）
診断医療においては、低分子物質に限らず、血中に含まれる種々の物質の濃度を高感度に測定する必要がある。本発明によれば、診断医療において、低分子物質に限らず、血中に含まれる種々の物質の濃度を高感度に測定することができる。すなわち、癌抗原のような大きな抗原の血中濃度を測定することができる。具体的には、標的抗原分子の異なるエピトープ部分と結合する２種類の抗体ＳｃＦｖを得て、それらを増殖因子受容体と連結した２種類のキメラ受容体遺伝子を作製して細胞で発現させる。その後、血液サンプルを添加したときの細胞増殖を指標として、標的抗原分子の濃度を測定することができる。また、測定に要する時間を短縮するために、あらかじめ発光酵素遺伝子を細胞に導入しておき、増殖因子受容体からのシグナル伝達が生じたときのみ発光酵素を発現、生成して発光するようにしておけば、標的抗原濃度を迅速かつ高感度に検出することができる。
【００３２】
［蛋白質間相互作用の測定］（図１０参照）
蛋白質間相互作用は細胞内シグナル伝達や酵素反応における重要なステップであり、その測定が行えれば、シグナル伝達機構の解明や創薬への応用が可能である。本発明によれば、作製したキメラ受容体において、測定したい２種類のタンパク質に対する抗体ＳｃＦｖを得て、それらを２量体形成により活性化されるシグナル伝達分子に連結した２種類のキメラを作製すれば、上記［物質の濃度を測定するセンサーとしての応用］におけると同様に、細胞増殖若しくは発光を検出することでタンパク質間相互作用を測定することができる。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１［キメラ受容体の発現用ベクターＤＮＡの作製］
低分子物質として生体に無害であると考えられるフルオレセインを選択し、フルオレセインに対する一本鎖抗体３１ＩＪ３とマウスエリスロポエチン受容体及びマウスｇｐ１３０遺伝子との組換え遺伝子を保有するキメラ受容体発現用ベクターＤＮＡを作製した。
抗フルオレセイン抗体３１ＩＪ３はＩａｎ　Ｍ．　Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ博士より供与を受けた。３１ＩＪ３遺伝子は、ヒト合成抗体ライブラリーＴｏｍｌｉｎｓｏｎ　Ｊ由来である。Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ　Ｊはヒト型のフレームワークを有し、ＶＨ−ＶＬの順に連結された一本鎖抗体ライブラリーであり、抗原結合に関わる相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３がＰＣＲ法によりランダム化されて作製され、ファージミドベクターに組み込まれている。
【００３４】
Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ博士によって行われた具体的な実験操作は以下の通りである。このファージミドベクターを大腸菌株ＴＧ−１に形質転換し、ヘルパーファージを感染させ、ファージ表面に一本鎖抗体ライブラリーを有するファージライブラリーを得た。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ担体を固定化したプレート上にファージライブラリーを反応させ、未反応のファージを洗浄操作によって除去後、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ結合性ファージを溶出して回収し、回収した該ファージを大腸菌に感染させ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ結合性一本鎖抗体を含むファージミドベクターを得た。これらのサイクルを数回繰り返すことにより、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎへの高い親和性を持つ一本鎖抗体を濃縮し、得られたクローンのうち一つを３１ＩＪ３と名付けた。
【００３５】
このファージミド３１ＩＪ３を鋳型とし、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）部分をＰＣＲ法により増幅し、抗体Ｈ鎖シグナル配列を持つプラスミドｐＴＶ−ＳｉｇのＰｓｔ　Ｉ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ部位に挿入した（ｐＴＶ−Ｓｉｇ−ＳｃＦｖ）。上記ｐＴＶ−Ｓｉｇは、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）のＮｃｏ　Ｉ部位に抗体Ｈ鎖シグナル配列をもつＩｇＭ−ヒト上皮細胞増殖因子受容体キメラ蛋白質発現プラスミドｐＲＳＶＶｕＥＲＣＡ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１０：　４３０−４３３，　１９９２）由来の５７４ｂｐのＮｃｏ　Ｉ断片が、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ切断部位が３’側になるような方向に挿入されたものである。
【００３６】
ＰＣＲに用いたプライマーは、配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴＤＮＡ、及び、配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴＤＮＡである。プラスミドの配列を確認後、ｐＴＶ−Ｓｉｇ−ＳｃＦｖからシグナル配列とＳｃＦｖ部分を、レトロウィルスベクターｐＭＸ−Ｈｇ−ＸｈｏにＮｃｏ　Ｉ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩサイトで挿入した（ｐＭＸ−ＳｃＦｖｇ）。上記ｐＭＸ−Ｈｇ−Ｘｈｏは、ｐＭＸのＸｈｏ　Ｉ部位をブランティングにより除去し、ＥｃｏＲ　Ｉ部位に、抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体ＨｙＨＥＬ−１０のＶＨ、ＧＳＧリンカー、ＥｐｏＲ細胞外Ｄ２ドメイン、ｇｐ１３０細胞内ドメイン配列をｐＭＥ−Ｈｇ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．，７４，　４１６−４２３，　２００１）から挿入したものであり、上記操作によりＨｙＨＥＬ−１０のＶＨが３１ＩＪ３のＳｃＦｖに置換されることになる。
【００３７】
次に、ｐＭＸ−ＳｃＦｖｇから受容体部分をＥｃｏＲ　Ｉサイト（２箇所）で切り出し、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）−ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を持つレトロウィルスベクターｐＭＸ−Ｌｇ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰのＸｈｏ　Ｉ部位をブランティングして除去したベクターのＥｃｏＲ　Ｉ部位に挿入した（ｐＭＸ−ＳｃＦｖｇ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）。ここで、ｐＭＸ−Ｌｇ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰは、ｐＭＸのＥｃｏＲ　Ｉ部位に、抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体ＨｙＨＥＬ−１０のＶＬ、ＧＳＧリンカー、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）細胞外Ｄ２ドメイン、ｇｐ１３０細胞内ドメイン配列をｐＭＥＺ−Ｌｇ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．，　７４，　４１６−４２３，　２００１）から挿入したものであり、上記操作によりＨｙＨＥＬ−１０のＶＬが３１ＩＪ３のＳｃＦｖに置換されることになる。ここで、ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰは、ベクターを細胞に導入した後、キメラ受容体と同時にＥＧＦＰを発現させ、ＥＧＦＰの緑色蛍光を指標にフローサイトメーターでソーティングするために挿入した。
【００３８】
なお、ＰＣＲ反応はＰｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて行い、制限酵素及び修飾酵素は宝酒造製のものを使用した。また、塩基配列の確認は日立シークエンサーＳＱ−５５００を用いて行った。
【００３９】
実施例２［動物細胞への発現ベクターの導入と導入細胞の選択］
実施例１で作製したレトロウィルスベクターｐＭＸ−ＳｃＦｖｇ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰをレトロウィルス感染によりインターロイキン３（ＩＬ−３）依存性マウスｐｒｏ−Ｂ細胞株Ｂａ／Ｆ３に導入した。具体的には、レトロウイルスパッケージング細胞株Ｐｌａｔ−Ｅ（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，　７，　１０６３−１０６６，　２０００）を２×１０６個／４ｍｌでφ６ｃｍのディッシュにまき２０時間インキュベートした。上記ウィルスベクター３μｇを６μｌの滅菌水に溶解し、９μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）に１００μｌの無血清Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ社製）を添加したものと穏やかに混和した。室温で１５分放置後、この混合物をＰｌａｔ−Ｅにゆっくりと滴下し、２４時間インキュベートした。インキュベート後に上清をアスピレーターで吸い取り、ＤＭＥＭ培地を３ｍＬ加え、さらに２４時間インキュベートした。この上清を３ｋｒｐｍ、５分間遠心してＰｌａｔ−Ｅを沈殿させて上清をウィルス上清として回収した。Ｂａ／Ｆ３細胞１×１０５個に対し、１０μｇ／ｍＬのｐｏｌｙｂｒｅｎｅ、４μｇ／ｍＬのＩＬ−３、５００μＬのウィルス上清を１２ｗｅｌｌプレート上で混和し、ＲＰＭＩ培地を加えて全量１ｍＬにして５時間インキュベート後、０．６ｍＬのＲＰＭＩ培地を加え、２４時間インキュベートした。
その後継代培養を行って細胞を増殖させた後、ＦＡＣＳによってＥＧＦＰ陽性細胞をソーティングした。その結果、ＥＧＦＰ発現細胞率を９４％まで濃縮することができた。
【００４０】
実験例３［フルオレセイン応答性細胞の選択］
ＢＳＡのリジン残基にＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を反応させ、ＢＳＡ−Ｆｌを作製した。具体的には、炭酸緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＣＬ、０．２５Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９．０）を作製し、ＢＳＡを１５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、ＢＳＡ１ｍｇあたり０．０５ｍｇのＦＩＴＣを加えて４℃で一晩混和した。反応生成物を含む混合液をＳｅｐｈａｄｅｘカラムＮＡＰ−５（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いてゲルろ過して、未反応のＦＩＴＣとＢＳＡ−Ｆｌとを分画した。得られたＢＳＡ−Ｆｌにおいて、ＢＳＡ１分子あたりのフルオレセイン結合量を、２８０ｎｍ及び４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、次式で求めたところ、２９分子であった。
モル比＝２．８７×Ａ４９０／（Ａ２８０−０．３５×Ａ４９０）
ただし、Ａ２８０は２８０ｎｍにおける吸光度、Ａ４９０は４９０ｎｍにおける吸光度である。
【００４１】
このようにして作製されたＢＳＡ−Ｆｌを用いて、ＦＡＣＳによりソーティングされたキメラ受容体発現細胞に対してフルオレセイン応答性細胞の選択を行った。具体的には、まず細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＩＬ−３を除去した後、細胞を２４ｗｅｌｌ　プレートにおいてＢＳＡ−Ｆｌを７０μｇ／ｍＬ加え、数日間培養した。生細胞率が５０％ぐらいになったら上清１ｍＬを廃棄し、ＩＬ−３を加えて生細胞を賦活化した。そして細胞が十分に増幅されたら再びＢＳＡ−Ｆｌを添加して培養を行う、という操作を数回繰り返した。また、培地は４〜７日ごとに上清１ｍＬを廃棄し、ＢＳＡ−ＦｌあるいはＩＬ−３とともに新鮮な培地を１ｍＬ加えた。以上の操作によりＩＬ−３非存在下でＢＳＡ−Ｆｌ依存的に増殖する細胞を回収した。
【００４２】
実験例４［遺伝子導入細胞におけるキメラ受容体の発現確認］
得られたＢＳＡ−Ｆｌ応答性細胞におけるキメラ受容体の発現をＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した。具体的には１×１０６個の細胞を集めてＰＢＳで１回洗浄した細胞を可溶化緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ　ＥＧＴＡ、１０μｇ／ｍＬ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０μｇ／ｍＬ　ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）１００μｌに懸濁して溶解し、０℃で１０分間置いたあと、１５ｋｒｐｍ、５分間、４℃で遠心して上清を回収し、４×レムリＢｕｆｆｅｒを加えて２分間ボイルしたのち、２０μｌをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に用いた。電気泳動後、セミドライブロッティング装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）をマニュアルに従って操作し、ポリアクリルアミドゲル上の蛋白質をニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。ＴＢＳ−Ｔ緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０）で１５分間振とう後、１％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔに浸して一晩緩やかに振とうしてブロッキング処理した。その後、溶液を廃棄し、ＴＢＳ−Ｔ溶液による１５分間の洗浄操作を２回繰り返した後に１μｇ／ｍＬの一次抗体（ウサギ抗マウスｇｐ１３０細胞内ドメイン認識抗体）を含むＴＢＳ−Ｔ溶液に浸し、穏やかに１時間振とうした。溶液を廃棄し、ＴＢＳ−Ｔ溶液による１５分間の洗浄操作を３回繰り返した後に１μｇ／ｍＬのペルオキシターゼ標識二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ）を含むＴＢＳ−Ｔ溶液に浸し、穏やかに１時間振とうした。溶液を廃棄し、ＴＢＳ−Ｔ溶液による１５分間の洗浄操作を３回繰り返した後にＥＣＬ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）により発光反応を起こしてニトロセルロース膜上に固定化されたペルオキシダーゼ量をＸ線フィルム（Ｆｕｊｉ　ＲＸ社製）に感光させ現像して可視化した。
その結果、図１１に示した通り、遺伝子導入細胞ではＢａ／Ｆ３細胞には見られない分子量７０ｋＤａのバンドが確認された。
【００４３】
実験例５［遺伝子導入細胞のＢＳＡ−Ｆｌ及びフルオレセインダイマー依存的増殖応答の確認］
得られたＢＳＡ−Ｆｌ応答性細胞を初期細胞濃度１×１０４個／ｍＬでまき、培地中に含まれるＢＳＡ−Ｆｌ濃度を変えて培養し、細胞数の経時変化を測定した。生細胞数の経時変化をトリパンブルー染色を用いたセルカウント法で測定した。結果は図１２に示した通りであり、細胞が培地中のＢＳＡ−Ｆｌ濃度に依存して増殖することが確認された。
【００４４】
次に、フルオレセインダイマー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉｍｅｒ）を作製した。配列番号３に示す、回文配列を有するオリゴＤＮＡの５’末端にフルオレセインを標識したフルオレセイン標識オリゴＤＮＡを作製し、作製したフルオレセイン標識オリゴＤＮＡをアニーリングさせ、フルオレセインダイマーを作製した。なお、配列番号３の配列の末端の２つの塩基は生体内での分解を防ぐためＳ−ｏｌｉｇｏとした。
【００４５】
また、ＢＳＡ−Ｆｌ応答性細胞を、初期細胞濃度１．５×１０４個／ｍＬでまき、培地中に含まれるフルオレセインダイマー濃度を変えて培養し、細胞数の経時変化を測定した。結果は図１３に示した通りである。該細胞はフルオレセインダイマーの濃度依存的に増殖し、ＢＳＡ−Ｆｌでの刺激とほぼ同等の増殖結果を得ることができた。
【００４６】
【発明の効果】
以上詳しく説明した通り、本発明によれば、本来は細胞増殖に関与しない低分子物質のダイマー等の存在下で選択的に増殖する細胞と、この細胞を作製するためのベクターＤＮＡ、及びこのベクターＤＮＡを用いて上記細胞を作製する方法が提供される。この発明の細胞を用いることによって、安価かつ入手容易な低分子物質を用いて細胞増殖を制御し、これによって細胞の有用物質産生効率を向上させることが可能となる。また、細胞の増殖速度を指標とした低分子物質濃度の測定により免疫測定法を簡便に行うことが可能となる。さらに、治療用遺伝子等の外来遺伝子を導入した場合にも、低分子物質存在下で選択的に増殖する細胞を得れば、外来遺伝子発現細胞を簡便かつ正確に選択することができる。また、低分子物質の２量体は生体内での免疫原性がないと考えられるため、このような遺伝子導入細胞の選択的増幅を生体内でも行うことができ、遺伝子治療効果を向上させることが可能となる。
【００４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のキメラ受容体のシグナル伝達の模式図である。
【図２】本発明のキメラ受容体導入動物細胞による、物質生産細胞の安価な増殖制御を説明する模式図である。
【図３】本発明のキメラ受容体遺伝子と治療用遺伝子を導入した細胞の選択的増幅を説明する模式図である。
【図４】本発明のキメラ受容体遺伝子を導入した、抗癌作用のある細胞の選択的増幅による癌治療を説明する模式図である。
【図５】本発明のキメラ受容体遺伝子と細胞死誘導遺伝子を導入した癌細胞を選択的に死滅させるシステムを示す模式図である。
【図６】本発明の低分子物質結合性ＳｃＦｖの迅速なスクリーニング法を説明する模式図である。
【図７】本発明のキメラ受容体による、細胞の分化、増殖、死の経時的制御を説明する模式図である。
【図８】本発明のキメラ受容体による、細胞の分化、増殖、死の空間的制御を説明する模式図である。
【図９】本発明のキメラ受容体を利用した、物質の濃度を測定するセンサーとしての応用例を示す模式図である。
【図１０】本発明のキメラ受容体を利用した、蛋白質間相互作用の測定例を示す模式図である。
【図１１】本発明の抗フルオレセイン一本鎖抗体領域を有するキメラ受容体遺伝子を導入したＢＳＡ−Ｆｌ応答性細胞に対するウエスタン・ブロットによる分析結果を示す図である。
【図１２】本発明の抗フルオレセイン一本鎖抗体領域を有するキメラ受容体遺伝子を導入したＢＳＡ−Ｆｌ応答性細胞の、ＢＳＡ−Ｆｌ濃度依存的細胞増殖結果を示す図である。
【図１３】本発明の抗フルオレセイン一本鎖抗体領域を有するキメラ受容体遺伝子を導入したＢＳＡ−Ｆｌ応答性細胞の、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉｍｅｒ濃度依存的細胞増殖結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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