(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトパルボウイルス抗原蛋白の大量培養を可能にし、また、高感度に検体中のヒトパルボウイルス又は抗ヒトパルボウイルス抗体を測定することを可能たらしめる手段を提供する。【解決手段】特定のヒトパルボウイルス遺伝子、それがコードするポリペプチド及びこれを利用するヒトパルボウイルス又は抗ヒトパルボウイルス抗体の測定系を提供した。【効果】ヒトパルボウイルス非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域は、その全配列あるいはＰＣＲ法で得られるＤＮＡ断片を公知の発現ベクターに導入し、該発現ベクターで形質転換した宿主細胞内で発現させることにより、ラジオイムノアッセイ法、エンザイムイムノアッセイ法等の診断に使用し得る組換え抗原を得ることができる。【選択図】図１
2004187687.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表されるヒトパルボウイルス遺伝子。
式（１）
10         20         30         40         50         60
TTCCCGCCTT ATGCAAATGG GCAGCCATTT TAAGTGTTTT ACTATAATTT TATTGGTCAG
70         80         90        100        110        120
TTTTGTAACG GTTAAAATGG GCGGAGCGTA GGCGGGGACT ACAGTATATA TAGCACGGCA
130        140        150        160        170        180
CTGCCGCAGC TCTTTCTTTC TGGGCTGCTT TTTCCTGGAC TTTCTTGCTG TTTTTTGTGA
190        200        210        220        230        240
GCTAACTAAC AGGTATTTAT ACTACTTGTT AACATACTAA CATGGAGCTA TTTAGAGGGG
250        260        270        280        290        300
TTCTTCAAGT TTCTTCTAAT GTTCTGGACT GTGCTAACGA TAATTGGTGG TGCTCTTTAC
310        320        330        340        350        360
TGGATTTAGA CACTTCTGAC TGGGAACCAC TAACTCATAC TAACAGACTA ATGGCAATAT
370        380        390        400        410        420
ACTTAAGCAG TGTGGCTTCT AAGCTTGACT TTACCGGGGG GCCACTAGCA GGGTGCTTGT
430        440        450        460        470        480
ACTTTTTTCA AGTAGAATGT AACAAATTTG AAGAAGGCTA TCATATTCAT GTGGTTATTG
490        500        510        520        530        540
GGGGGCCAGG GTTAAATCCC AGAAACCTCA CTGTGTGTGT AGAGGGGTTA TTTAATAATG
550        560        570        580        590        600
TACTTTATCA CCTTGTAACT GAAAATGTGA AGCTAAAATT TTTGCCAGGM ATGACTACAA
610        620        630        640        650        660
AAGGCAAATA CTTTAGAGAT GGAGAGCAGT TTATAGAAAA CTATTTAATG AAAAAAATAC
670        680        690        700        710        720
CTTTAAATGT TGTATGGTGT GTTACTAATA TTGATGGATA TATAGATACC TGTATTTCTG
730        740        750        760        770        780
CTACTTTTAG AAGGGGAGCT TGCCATGCCA AGAAACCCCG CATTACCACA GCCATAAATG
790        800        810        820        830        840
ATACTAGTAG TGATGCTGGG GAGTCTAGCG GCACAGGGGC AGAGGTTGTG CCATTTAATG
850        860        870        880        890        900
GGAAAGGAAC TAAGGCTAGC ATAAAGTTTC AAACTATGGT AAACTGGCTG TGTGAAAACA
910        920        930        940        950        960
GAGTGTTTAC AGAGGATAAG TGGAAACTAG TTGACTTTAA CCAGTACACT TTACTAAGCA
970        980        990       1000       1010       1020
GTAGTCACAG TGGAAGTTTT CAAATTCAAA GTGCACTAAA ACTAGCAATT TATAAAGCAA
1030       1040       1050       1060       1070       1080
CTAATTTAGT GCCTACTAGC ACATTTTTAT TGCATACAGA CTTTGAGCAG GTTATGTGTA
1090       1100       1110       1120       1130       1140
TTAAAGACAA TAAAATTGTT AAATTGTTAC TTTGTCAAAA CTATGACCCC CTATTGGTGG
1150       1160       1170       1180       1190       1200
GGCAGCATGT GTTAAAGTGG ATTGATAAAA AATGTGGCAA AAAAAATACA CTGTGGTTTT
1210       1220       1230       1240       1250       1260
ATGGGCCGCC AAGTACAGGA AAAACAAACT TGGCAATGGC CATTGCTAAA AGTGTTCCAG
1270       1280       1290       1300       1310       1320
TATATGGCAT GGTTAACTGG AATAATGAAA ACTTTCCATT TAATGATGTA GCAGGGAAAA
1330       1340       1350       1360       1370       1380
GCTTGGTGGT CTGGGATGAA GGTATTATTA AGTCTACAAT TGTAGAAGCT GCAAAAGCCA
1390       1400       1410       1420       1430       1440
TTTTAGGCGG GCAACCTACC AGGGTAGATC AAAAAATGCG TGGAAGTGTA GCTGTGCCTG
1450       1460       1470       1480       1490       1500
GAGTACCTGT GGTTATAACC AGCAATGGTG ATATTACTTT TGTTGTAAGC GGGAACACTA
1510       1520       1530       1540       1550       1560
CAACAACTGT ACATGCTAAA GCCTTAAAAG AGCGCATGGT AAAGTTAAAC TTTACTGTAA
1570       1580       1590       1600       1610       1620
GATGCAGCCC TGACATGGGG TTACTAACAG AGGCTGATGT ACAACAGTGG CTTACATGGT
1630       1640       1650       1660       1670       1680
GTAATGCACA AAGCTGGGAC CACTATGAAA ACTGGGCAAT AAACTACACT TTTGATTTCC
1690       1700       1710       1720       1730       1740
CTGGAATTAA TGCAGATGCC CTCCACCCAG ACCTCCAAAC CACCCCAATT GTCACAGACA
1750       1760       1770       1780       1790       1800
CCAGTATCAG CAGCAGTGGT GGTGAAAGCT CTGAAGAACT CAGTGAAAGC AGCTTTTTTA
1810       1820       1830       1840       1850       1860
ACCTCATCAC CCCAGGCGCC TGGAACACTG AAACCCCGCG CTCTAGTACG CCCATCCCCG
1870       1880       1890       1900       1910       1920
GGACCAGTTC AGGAGAATCA TTTGTCGGAA GCCCAGTTTC CTCCGAAGTT GTAGCTGCAT
1930       1940       1950       1960       1970       1980
CGTGGGAAGA AGCCTTCTAC ACACCTTTGG CAGACCAGTT TCGTGAACTG TTAGTTGGGG
1990       2000       2010       2020       2030       2040
TTGATTATGT GTGGGACGGT GTAAGGGGTT TACCTGTGTG TTGTGTGCAA CATATTAACA
2050       2060       2070       2080       2090       2100
ATAGTGGGGG AGGCTTGGGA CTTTGTCCCC ATTGCATTAA TGTAGGGGCT TGGTATAATG
2110       2120       2130       2140       2150       2160
GATGGAAATT TCGAGAATTT ACCCCAGATT TGGTGCGGTG TAGCTGCCAT GTGGGAGCTT
2170       2180       2190       2200       2210       2220
CTAATCCCTT TTCTGTGCTA ACCTGCAAAA AATGTGCTTA CCTGTCTGGA TTGCAAAGCT
2230       2240       2250       2260       2270       2280
TTGTAGATTA TGAGTAAAGA AAGTGGCAAA TGGTGGGAAA GTGATGATAA ATTTGCTAAA
2290       2300       2310       2320       2330       2340
GCTGKGTATC AGCAATTTGT GGAATTTTAT GAAAAGGTTA CTGGWACAGA CTTAGAGCTT
2350       2360       2370       2380       2390       2400
ATTCAAATAT TAAAAGATCA TTATAATATT TCTTTAGATA ATCCCCTAGA AAACCCATCC
2410       2420       2430       2440       2450       2460
TCTCTGTTTR ACTTAGTTGC TCGTATTAAA AATAACCTTA AAAACTCTCC AGACTTATAT
2470       2480       2490       2500       2510       2520
AGTCATCATT TTCAAAGTCA TGGACAGTTA TCTGACCACC CCCATGCCTT ATCATCCAGT
2530       2540       2550       2560       2570       2580
AGCAGTAATG CAGAACCTAG AGGAGAAAAT GCAGTATTAT CTAGTGAAGA CTTACACAAG
2590       2600       2610       2620       2630       2640
CCTGGGCAAG TTAGCGTACA ACTACCCGGT ACTAACTATG TTGGGCCTGG TAATGAGTTA
2650       2660       2670       2680       2690       2700
CAAGCTGGGC CCCCGCAAAG TGCTGTTGAC AGTGCTGCAA GGATTCATGA CTTTAGGTAT
2710       2720       2730       2740       2750       2760
AGCCAACTGG CTAAGTTGGG AATAAATCCA TATACTCATT GGACTGTAGC AGATGAAGAG
2770       2780       2790       2800       2810       2820
CTTTTAAAAA ATATAAAAAA TGAAACTGGG TTTCAAGCAC AAGTAGTAAA AGACTACTTT
2830       2840       2850       2860       2870       2880
ACTTTAAAAG GTGCAGCTGC CCCTGTGGCC CATTTTCAAG GAAGTTTGCC GGAAGTTCCC
2890       2900       2910       2920       2930       2940
GCTTACMACG CCTCAGAAAA ATACCCAAGC ATGACTTCAG TTAATTCTGC AGAAGCCAGC
2950       2960       2970       2980       2990       3000
ACTGGTGCAG GAGGGGGGGG CAGTAATCCT GTCAAAAGCA TGTGGAGTGA GGGGGCCACT
3010       3020       3030       3040       3050       3060
TTTAGTGCCA ACTCTGTAAC TTGTACATTT TCCAGACAGT TTTTAATTCC ATATGACCCA
3070       3080       3090       3100       3110       3120
GAGCACCATT ATAARGTGTT TTCTCCCGCA GCAAGTAGCT GCCACAATGC CAGTGGAAAA
3130       3140       3150       3160       3170       3180
GAGGCAAAGG TTTGCACCAT TAGTCCCATA ATGGGATACT CAACCCCATG GAGATATTTA
3190       3200       3210       3220       3230       3240
GATTTTAATG CTTTAAATTT ATTTTTTTCA CCTTTAGAGT TTCAGCACTT AATTGAAAAT
3250       3260       3270       3280       3290       3300
TATGGAAGCA TAGCTCCTGA TGCTTTAACT GTAACCATAT CAGAAATTGC TGTTAAGGAT
3310       3320       3330       3340       3350       3360
GTTACAGACA AAACTGGAGG GGGGGTACAG GTTACTGACA GCACTACAGG GCGCCTATGC
3370       3380       3390       3400       3410       3420
ATGTTAGTAG ACCATGAATA CAAGTACCCA TATGTGTTAG GGCAAGGTCA GGATACTTTA
3430       3440       3450       3460       3470       3480
GCCCCAGAAC TTCCTATTTG GGTATACTTT CCCCCTCAAT ATGCTTACTT AACAGTAGGA
3490       3500       3510       3520       3530       3540
GATGTTAACA CACAAGGAAT TTCTGGAGAC AGCAAAAAAT TAGCAAGTGA AGAATCAGCA
3550       3560       3570       3580       3590       3600
TTTTATGTTT TGGAACACAG TTCYTTTCAG CTTTTAGGTA CAGGAGGTAC AGCAACTATG
3610       3620       3630       3640       3650       3660
TCTTATAAGT TTCCTCCAGT GCCCCCAGAA AATTTAGAGG GCTGCAGTCA ACACTTTTAT
3670       3680       3690       3700       3710       3720
GAAATGTACA ATCCCTTATA CGGATCCCGC TTAGGGGTCC CTGACACATT AGGAGGTGAC
3730       3740       3750       3760       3770       3780
CCAAAATTTA GATCTTTAAC ACATGAAGAC CATGCAATTC AGCCCCAAAA CTTCATGCCA
3790       3800       3810       3820       3830       3840
GGGCCACTAG TAAACTCAGT GTCTACAAAG GAGGGAGACA GCTCTAATAC TGGAGCTGGA
3850       3860       3870       3880       3890       3900
AAAGCCTTAA CAGGCCTTAG CACAGGTACC TCGCAAAACA CTAGAATATC CTTACGSCCT
3910       3920       3930       3940       3950       3960
GGGCCAGTGT CTCAGCCATA CCACCACTGG GACACAGATA AATATGTCAC AGGAATAAAT
3970       3980       3990       4000       4010       4020
GCCATTTCTC ATGGTCAGAC CACTTATGGT AACGCTGAAG ACAAAGAGTA TCAGCAAGGA
4030       4040       4050       4060       4070       4080
GTGGGTAGAT TTCCAAATGA AAAAGAACAG CTAAAACAGT TACAGGGTTT AAACATGCAC
4090       4100       4110       4120       4130       4140
ACCTATTTYC CCAATAAAGG AACCCAGCAA TATACAGATC AAATTGAGCG CCCCCTAATG
4150       4160       4170       4180       4190       4200
GTGGGTTCTG TATGGAACAG AAGAGCCCTT CACTATGAAA GCCAGCTGTG GAGTAAAATT
4210       4220       4230       4240       4250       4260
CCAAATTTAG ATGACAGTTT TAAAACTCAG TTTGCAGCCT TAGGAGGATG GGGTTTGCAT
4270       4280       4290       4300       4310       4320
CAGCCACCTC CTCAAATATT TTTAAAAATA TTACCACAAA GTGGGCCAAT TGGAGGTATT
4330       4340       4350       4360       4370       4380
AAATCAATGG GAATTACTAC CTTAGTTCAG TATGCTGTGG GAATTATGAC AGTAACTATG
4390       4400       4410       4420       4430       4440
ACATTTAAAT TGGGGCCCCG TAAAGCTACG GGACGGTGGA ATCCTCAACC TGGAGTATAT
4450       4460       4470       4480       4490       4500
CCCCCGCACG CAGCAGGTCA TTTACCATAT GTACTATATG ACCCCACAGC TATAGATGCA
4510       4520       4530       4540       4550       4560
AAACAACACC ACAGACATGG ATATGAAAAG CCTGAAGAGT TGTGGACAGC CAAAAGCCGT
4570       4580       4590       4600       4610       4620
GTGCGCCCAT TGTAAACACT CCCCACCGTG CCCTCAGCCA GGATGCGTAA CTAAACGCCC
4630       4640       4650       4660       4670       4680
ACCAGTACCA CCCAGACTGT ACCTGCCCCC TCCTGTACCT ATAAGACAGC CTAACAC 
（ただし、式中、M は A  または C、R は A  または G、W は A  または T、S は C  または G、Y は C  または T、K は G  または T  の塩基を示す。）
【請求項２】
下記式（２）のアミノ酸配列をコードするヒトパルボウイルスＶＰ―１構造遺伝子。
式（２）
1                                  10 
Met Ser Lys Glu Ser Gly Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Phe
20                                      30
Ala Lys Ala X１  Tyr Gln Gln Phe Val Glu Phe Tyr Glu Lys Val
40
Thr Gly Thr Asp Leu Glu Leu Ile Gln Ile Leu Lys Asp His Tyr  
50                                      60
Asn Ile Ser Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe  
70
X２  Leu Val Ala Arg Ile Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pro Asp
80                                      90
Leu Tyr Ser His His Phe Gln Ser His Gly Gln Leu Ser Asp His  
100
Pro His Ala Leu Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ala Glu Pro Arg Gly  
110                                     120
Glu Asn Ala Val Leu Ser Ser Glu Asp Leu His Lys Pro Gly Gln  
130
Val Ser Val Gln Leu Pro Gly Thr Asn Tyr Val Gly Pro Gly Asn  
140                                     150
Glu Leu Gln Ala Gly Pro Pro Gln Ser Ala Val Asp Ser Ala Ala  
160
Arg Ile His Asp Phe Arg Tyr Ser Gln Leu Ala Lys Leu Gly Ile  
170                                     180
Asn Pro Tyr Thr His Trp Thr Val Ala Asp Glu Glu Leu Leu Lys  
190
Asn Ile Lys Asn Glu Thr Gly Phe Gln Ala Gln Val Val Lys Asp  
200                                     210
Tyr Phe Thr Leu Lys Gly Ala Ala Ala Pro Val Ala His Phe Gln  
220
Gly Ser Leu Pro Glu Val Pro Ala Tyr X３  Ala Ser Glu Lys Tyr
230                                     240
Pro Ser Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala  
250
Gly Gly Gly Gly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly  
260                                     270
Ala Thr Phe Ser Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln  
280
Phe Leu Ile Pro Tyr Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser  
290                                     300
Pro Ala Ala Ser Ser Cys His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys  
310
Val Cys Thr Ile Ser Pro Ile Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg  
320                                     330
Tyr Leu Asp Phe Asn Ala Leu Asn Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu  
340
Phe Gln His Leu Ile Glu Asn Tyr Gly Ser Ile Ala Pro Asp Ala  
350                                     360
Leu Thr Val Thr Ile Ser Glu Ile Ala Val Lys Asp Val Thr Asp  
370
Lys Thr Gly Gly Gly Val Gln Val Thr Asp Ser Thr Thr Gly Arg  
380                                     390
Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr Lys Tyr Pro Tyr Val Leu  
400
Gly Gln Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu Leu Pro Ile Trp Val  
410                                     420
Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val Gly Asp Val Asn  
430
Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala Ser Glu Glu  
440                                     450
Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu Leu Gly  
460
Thr Gly Gly Thr Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val Pro  
470                                     480
Pro Glu Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr  
490
Asn Pro Leu Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly  
500                                     510
Gly Asp Pro Lys Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile  
520
Gln Pro Gln Asn Phe Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser  
530                                     540
Thr Lys Glu Gly Asp Ser Ser Asn Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu  
550
Thr Gly Leu Ser Thr Gly Thr Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu  
560                                     570
Arg Pro Gly Pro Val Ser Gln Pro Tyr His His Trp Asp Thr Asp  
580
Lys Tyr Val Thr Gly Ile Asn Ala Ile Ser His Gly Gln Thr Thr  
590                                     600
Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gln Gln Gly Val Gly Arg  
610
Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu Lys Gln Leu Gln Gly Leu Asn  
620                                     630
Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly Thr Gln Gln Tyr Thr Asp  
640
Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser Val Trp Asn Arg Arg  
650                                     660
Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys Ile Pro Asn Leu  
670
Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly Gly Trp Gly  
680                                     690
Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu Pro Gln  
700
Ser Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr Leu  
710                                     720
Val Gln Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys  
730
Leu Gly Pro Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly  
740                                     750
Val Tyr Pro Pro His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr  
760
Asp Pro Thr Ala Ile Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr  
770                                     780
Glu Lys Pro Glu Glu Leu Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val Arg Pro  
781
Leu  
（ただし、式中、X１は Gly  または Val、X２は Asn  または Asp、X３は His  または Asn  を示す。
【請求項３】
下記式（３）のアミノ酸配列をコードするヒトパルボウイルスＶＰ―２構造遺伝子。
式（３）
1                                  10
Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala Gly Gly  
20                                      30
Gly Gly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala Thr  
40
Phe Ser Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln Phe Leu  
50                                      60
Ile Pro Tyr Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala  
70
Ala Ser Ser Cys His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys  
80                                      90
Thr Ile Ser Pro Ile Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu  
100
Asp Phe Asn Ala Leu Asn Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gln  
110                                     120
His Leu Ile Glu Asn Tyr Gly Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr  
130
Val Thr Ile Ser Glu Ile Ala Val Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr  
140                                     150
Gly Gly Gly Val Gln Val Thr Asp Ser Thr Thr Gly Arg Leu Cys  
160
Met Leu Val Asp His Glu Tyr Lys Tyr Pro Tyr Val Leu Gly Gln  
170                                     180
Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu Leu Pro Ile Trp Val Tyr Phe  
190
Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val Gly Asp Val Asn Thr Gln  
200                                     210
Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala Ser Glu Glu Ser Ala  
220
Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu Leu Gly Thr Gly  
230                                     240
Gly Thr Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val Pro Pro Glu  
250
Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr Asn Pro  
260                                     270
Leu Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly Asp  
280
Pro Lys Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro  
290                                     300
Gln Asn Phe Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys  
310
Glu Gly Asp Ser Ser Asn Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly  
320                                     330
Leu Ser Thr Gly Thr Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro  
340
Gly Pro Val Ser Gln Pro Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr  
350                                     360
Val Thr Gly Ile Asn Ala Ile Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly  
370
Asn Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gln Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro  
380                                     390
Asn Glu Lys Glu Gln Leu Lys Gln Leu Gln Gly Leu Asn Met His  
400
Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly Thr Gln Gln Tyr Thr Asp Gln Ile  
410                                     420
Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser Val Trp Asn Arg Arg Ala Leu  
430
His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys Ile Pro Asn Leu Asp Asp  
440                                     450
Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly Gly Trp Gly Leu His  
460
Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu Pro Gln Ser Gly  
470                                     480
Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr Leu Val Gln  
490
Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys Leu Gly  
500                                     510
Pro Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val Tyr  
520
Pro Pro His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro  
530                                     540
Thr Ala Ile Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys  
550             554
Pro Glu Glu Leu Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val Arg Pro Leu  
【請求項４】
下記式（４）のアミノ酸配列をコードするヒトパルボウイルス非構造（ＮＳ）遺伝子。
式（４）
1                                  10
Met Glu Leu Phe Arg Gly Val Leu Gln Val Ser Ser Asn Val Leu  
20                                      30
Asp Cys Ala Asn Asp Asn Trp Trp Cys Ser Leu Leu Asp Leu Asp  
40
Thr Ser Asp Trp Glu Pro Leu Thr His Thr Asn Arg Leu Met Ala  
50                                      60
Ile Tyr Leu Ser Ser Val Ala Ser Lys Leu Asp Phe Thr Gly Gly  
70
Pro Leu Ala Gly Cys Leu Tyr Phe Phe Gln Val Glu Cys Asn Lys  
80                                      90
Phe Glu Glu Gly Tyr His Ile His Val Val Ile Gly Gly Pro Gly  
100                    
Leu Asn Pro Arg Asn Leu Thr Val Cys Val Glu Gly Leu Phe Asn  
110                                     120
Asn Val Leu Tyr His Leu Val Thr Glu Asn Val Lys Leu Lys Phe  
130
Leu Pro Gly Met Thr Thr Lys Gly Lys Tyr Phe Arg Asp Gly Glu  
140                                     150
Gln Phe Ile Glu Asn Tyr Leu Met Lys Lys Ile Pro Leu Asn Val  
160
Val Trp Cys Val Thr Asn Ile Asp Gly Tyr Ile Asp Thr Cys Ile  
170                                     180
Ser Ala Thr Phe Arg Arg Gly Ala Cys His Ala Lys Lys Pro Arg  
190
Ile Thr Thr Ala Ile Asn Asp Thr Ser Ser Asp Ala Gly Glu Ser  
200                                     210
Ser Gly Thr Gly Ala Glu Val Val Pro Phe Asn Gly Lys Gly Thr  
220
Lys Ala Ser Ile Lys Phe Gln Thr Met Val Asn Trp Leu Cys Glu  
230                                     240
Asn Arg Val Phe Thr Glu Asp Lys Trp Lys Leu Val Asp Phe Asn  
250
Gln Tyr Thr Leu Leu Ser Ser Ser His Ser Gly Ser Phe Gln Ile  
260                                     270
Gln Ser Ala Leu Lys Leu Ala Ile Tyr Lys Ala Thr Asn Leu Val  
280
Pro Thr Ser Thr Phe Leu Leu His Thr Asp Phe Glu Gln Val Met  
290                                     300
Cys Ile Lys Asp Asn Lys Ile Val Lys Leu Leu Leu Cys Gln Asn  
310
Tyr Asp Pro Leu Leu Val Gly Gln His Val Leu Lys Trp Ile Asp  
320                                     330
Lys Lys Cys Gly Lys Lys Asn Thr Leu Trp Phe Tyr Gly Pro Pro  
340
Ser Thr Gly Lys Thr Asn Leu Ala Met Ala Ile Ala Lys Ser Val  
350                                     360
Pro Val Tyr Gly Met Val Asn Trp Asn Asn Glu Asn Phe Pro Phe  
370
Asn Asp Val Ala Gly Lys Ser Leu Val Val Trp Asp Glu Gly Ile  
380                                     390
Ile Lys Ser Thr Ile Val Glu Ala Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly  
400
Gln Pro Thr Arg Val Asp Gln Lys Met Arg Gly Ser Val Ala Val  
410                                     420
Pro Gly Val Pro Val Val Ile Thr Ser Asn Gly Asp Ile Thr Phe  
430
Val Val Ser Gly Asn Thr Thr Thr Thr Val His Ala Lys Ala Leu  
440                                     450
Lys Glu Arg Met Val Lys Leu Asn Phe Thr Val Arg Cys Ser Pro  
460
Asp Met Gly Leu Leu Thr Glu Ala Asp Val Gln Gln Trp Leu Thr  
470                                     480
Trp Cys Asn Ala Gln Ser Trp Asp His Tyr Glu Asn Trp Ala Ile  
490
Asn Tyr Thr Phe Asp Phe Pro Gly Ile Asn Ala Asp Ala Leu His  
500                                     510
Pro Asp Leu Gln Thr Thr Pro Ile Val Thr Asp Thr Ser Ile Ser  
520
Ser Ser Gly Gly Glu Ser Ser Glu Glu Leu Ser Glu Ser Ser Phe  
530                                     540
Phe Asn Leu Ile Thr Pro Gly Ala Trp Asn Thr Glu Thr Pro Arg  
550
Ser Ser Thr Pro Ile Pro Gly Thr Ser Ser Gly Glu Ser Phe Val  
560                                     570
Gly Ser Pro Val Ser Ser Glu Val Val Ala Ala Ser Trp Glu Glu  
580
Ala Phe Tyr Thr Pro Leu Ala Asp Gln Phe Arg Glu Leu Leu Val  
590                                     600
Gly Val Asp Tyr Val Trp Asp Gly Val Arg Gly Leu Pro Val Cys  
610
Cys Val Gln His Ile Asn Asn Ser Gly Gly Gly Leu Gly Leu Cys  
620                                     630
Pro His Cys Ile Asn Val Gly Ala Trp Tyr Asn Gly Trp Lys Phe  
640
Arg Glu Phe Thr Pro Asp Leu Val Arg Cys Ser Cys His Val Gly  
650                                     660
Ala Ser Asn Pro Phe Ser Val Leu Thr Cys Lys Lys Cys Ala Tyr  
670 671
Leu Ser Gly Leu Gln Ser Phe Val Asp Tyr Glu  
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝子を含み、宿主細胞内で該遺伝子を発現することができる組換えベクター。
【請求項６】
前記遺伝子が、バキュロウイルスベクター中に挿入されて成る請求項５記載の組換えベクター。
【請求項７】
請求項５記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項８】
前記形質転換体の宿主が大腸菌である請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
前記形質転換体の宿主が昆虫細胞である請求項７記載の形質転換体。
【請求項１０】
前記組換えベクターが請求項６記載の組換えベクターであり、前記形質転換体の宿主が昆虫細胞である請求項７記載の形質転換体。
【請求項１１】
前記昆虫細胞がＴｎ５細胞である請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
前記式（２）で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１３】
前記式（３）で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１４】
上記式（４）で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１３のポリペプチド単独又は請求項１２のポリペプチドと請求項１３のポリペプチドとから構成されるヒトパルボウイルスのウイルス粒子様構造物。
【請求項１６】
請求項１２又は１３に記載のポリペプチド又は請求項１５記載のウイルス粒子様構造物を抗原として用い、免疫測定法により検体中の抗ヒトパルボウイルス抗体を検出する方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載のポリペプチドと請求項１３に記載のポリペプチドとの混合物を抗原として用いる請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記２種類のポリペプチドの混合比率が１：１０ないし１０：１である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１２又は１３に記載のポリペプチド又は請求項１５記載のウイルス粒子様構造物を免疫原として用いて抗体を作製し、該抗体を用いる免疫測定により検体中のヒトパルボウイルスを検出する方法。
【請求項２０】
請求項１記載の遺伝子の一部とそれぞれハイブリダイズする１対のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法により請求項１記載の遺伝子又はその一部を増幅し、該増幅された遺伝子又はその一部を検出することから成る、検体中のヒトパルボウイルスの検出方法。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドは、下記のＤＮＡプライマー群１及びＤＮＡプライマー群２の中からそれぞれ少なくとも１種ずつ選ばれる請求項１８記載の検出方法。
ＤＮＡプライマー群１
D-1: GCTGCCATGTGGGAGCTTCTAATC 
D-4: TTCCCGCCTTATGCAAATGGGCAGC
ＤＮＡプライマー群２
U-2: GTGTTAGGCTGTCTTATAGGTACA 
U-4: CTTGTATTCATGGTCTACTAAC 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性赤芽球ろう、慢性骨髄不全、流産、胎児水腫、肝障害、出血熱、関節炎やリウマチなど種々の疾患の病因にかかわる新規なヒトパルボウイルスの遺伝子、それがコードするポリペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
パルボウイルスは、一本鎖の直鎖ＤＮＡゲノムを有し、ゲノムの各末端はパリンドロミック（Pallindromic）ＤＮＡ配列の存在により、特徴的なヘアピンループ構造を持つ最小のウイルス群（Parvoviridae科）に属する。
【０００３】
Parvoviridae科ウイルスの粒子は立方対称形で、Cubic symmetryを示し、32個のキャプソメア（capsomere ）を持ち、直径約20〜25nm  の小型のウイルスで、エンベロープを保有せず、エーテル抵抗性である。また熱、乾燥などに比較的耐性のウイルスである〔Intervirology,23,61-73(1985)〕。ウイルスの複製とカプシッドの形成は感染細胞の核内で行われる。
【０００４】
脊椎動物のパルボウイルスは自律性及び欠損性の群に分類される。
【０００５】
自律性のパルボウイルス＜パルボウイルス属（Parvovirus）＞は、宿主細胞に複製を継続しうるが、欠損性のパルボウイルス＜デペンドウイルス（Dependovirus）＞はヘルパーウイルスによるコインフェクションが必要となる。
自律性の動物パルボウイルスには、ウシ（BPV ）、ブタ（PPV ）、イヌ（CPV ）、ネコ（FPLV）、ラット（H-1 ）、ミンク（ADV ）、及びヒト（HPV ）が知られており、一般に病原性は似ているがこれらのウイルス間で免疫学的な交叉性は見出されていない。  そこで、ヒトパルボウイルスの診断や疫学調査さらにワクチンの開発を行う場合、そのウイルスがヒトパルボウイルス由来であることが重要である。
【０００６】
ヒトパルボウイルスは、1975年に輸血用血液中に偶然発見された〔Lancet,i:72-73(1975)〕が、病原性は不明であった。その後、鎌状赤血球貧血に生じた急性赤芽球ろうがヒトパルボウイルスによるものであることが報告された〔Lancet,i:664-665(1981)〕。また、小児に流行する伝染性紅斑症の病因ウイルスであることが確認され〔Lancet,i:1378(1983) 〕、それが感染源となり成人にも感染が及び、関節炎を主症状とする病気が起こることが分かった。さらに伝染性紅斑流行後に胎児水腫で流産した症例が報告され〔Lancet,ii:1033-1034(1984) 〕、妊婦のヒトパルボウイルス感染が死産や胎児水腫の原因となることが証明され、わが国においてもヒトパルボウイルス感染による胎児死亡例が報告された〔日本産婦人科学会誌,40:99-100(1988)〕。そして、健常成人においても、不定の発疹症、出血熱様疾患、関節炎の原因となるところが知られ〔医学の歩み,142:530-532(1987)〕、最近ではリウマチとの関係も推測されている〔Arch.Intern.Med.148:2587-2589(1988) 〕。
【０００７】
以上のように、ヒトパルボウイルスは、臨床的にきわめて興味深いウイルスであり、人の生命に影響を与えることもありうることから、治療や予防対策の必要性が明確となってきている。
【０００８】
しかしながら、ヒトパルボウイルスは、人の初代骨髄細胞を用いイン  ビトロでの培養からはじまり、慢性骨髄性白血病の患者から得られた赤血球細胞や胎児肝細胞中の赤芽細胞を用いた培養が可能であるが、産業上利用するに充分な培養系はまだ見つかっていない。そのため、ヒトパルボウイルス抗原の取得が困難であり、診断系の一般化が遅れており、臨床検査が容易に行えないのが現状である。
【０００９】
一般的にヒトパルボウイルスは経鼻感染により起こるが、非日常的には輸血と血液製剤の注入により感染する。感染標的細胞は赤芽球系の前駆細胞であることがイン  ビトロの造血幹細胞培養系で証明された〔Nature,302:426-429(1983)〕。
【００１０】
ヒトパルボウイルスが感染した場合、１周間後にウイルス血症となるが発熱、筋肉痛、倦怠感が現れるだけで、感染後約２〜３週間目から紅斑や関節痛等の症状が観察される。これらの症状はウイルス抗体による免疫複合体によるものであると考えられている。そのため、症状が現れる頃にはウイルスは殆ど駆逐されているため、ウイルス抗原の検出は困難である。
【００１１】
従ってヒトパルボウイルス感染の証明は、ウイルス抗原の検出が困難であるため、血清中に抗ヒトパルボウイルス抗体を検出することによって行われている。
【００１２】
ヒトパルボウイルスの診断は、伝染性紅斑流行時のウイルス血症の血清より、ウイルス粒子を精製し、それを抗原として、抗原抗体反応系を用いた以下の方法により限られた施設で行われているにすぎない。免疫電気向流法〔医学の歩み,135:317-318(1985)〕、エンザイムイムノアッセイ法〔医学の歩み,134:909-910(1985)〕、ラジオイムノアッセイ法〔感染症学雑誌,58:1213-1220(1985) 〕。しかし、免疫電気向流法は検出感度が低く、エンザイムイムノアッセイ法やラジオイムノアッセイ法を用いた場合ウイルス抗原量の不足が問題になる。
【００１３】
このような状況から、有用かつ大量のウイルス抗原の取得がヒトパルボウイルスの診断系の開発に有用かつ不可欠である。
【００１４】
一般的にウイルス抗原の取得方法は、細胞培養でウイルスを増殖させる方法、もしくは、遺伝子組換え法、たとえばウイルス遺伝子をクローニングして、抗原蛋白や非感染性のウイルス粒子を大量に発現させる方法に大別される。
【００１５】
細胞培養系は、慢性骨髄性白血病の患者から得られた赤芽球系細胞〔J.Infect.Dis.160:548(1989)〕、胎児肝細胞中の赤芽球細胞〔J.Virol.63:2422-2426(1989)〕など限定的な細胞系のみで培養が可能である。しかしウイルスの回収率はきわめて低く、また、通常の骨髄中にはウイルス標的細胞がきわめて少なく、新鮮初代培養以外の培養が困難であり、細胞培養系は使用範囲に制限がある。最近、株化細胞の１つに感受性が確認されたが、この系ではウイルスの増殖率はきわめて低い〔臨床と微生物,16:177-186(1989) 〕。この様に、ヒトパルボウイルスの細胞培養系を用いた方法で、ヒトパルボウイルス抗原を有用かつ大量に取得することは不可能である。
【００１６】
一方、遺伝子組換え法によってウイルス抗原を有用かつ大量に発現させて取得するためには、ヒトパルボウイルスの遺伝子が必要である。現在、ヒトパルボウイルスに感染した鎌形赤血球貧血患者血清由来のヒトパルボウイルスＢ１９株遺伝子の全配列が報告されている〔J.Virol.,58:921-936(1986) 〕。この米国でクローン化されたヒトパルボウイルス遺伝子の塩基配列の解析から、ウイルス構造蛋白質としてウイルス粒子を構成するのは、ＶＰ−１（分子量約84KDa ）及びＶＰ−２（分子量約58KDa ）の２種類の蛋白質のみであり、ヒトパルボウイルスに感染した宿主がこれらＶＰ−１及びＶＰ−２を標的として抗原抗体反応を惹起することが確かめられている〔J.Virol.,61:2627(1987)〕。
【００１７】
そこで、伝染性紅斑患者血清からＰＣＲ法によりヒトパルボウイルス構造蛋白遺伝子の一部を増幅し、クローニングした報告例〔特開平４−８８９８５〕やヒトパルボウイルス構造タンパク質遺伝子の一部の遺伝子領域から、大腸菌で発現させた抗原によるエンザイムイムノアッセイを用いた報告例〔J.Clin.Microbiol.,30:305-311(1992)〕がある。
【００１８】
しかし、これらはヒトパルボウイルス構造遺伝子の一部分の報告例であり、ヒトパルボウイルス構造タンパク質の一部分を利用したにすぎない。そして、このエンザイムイムノアッセイを用いたヒトパルボウイルス抗体検出は、伝染性紅斑患者血清より精製したヒトパルボウイルス粒子を抗原として用いたＲＩＡよりも検出率が低くかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従って、本発明の目的は、ヒトパルボウイルス抗原蛋白の大量培養を可能にし、また、高感度に検体中のヒトパルボウイルス又は抗ヒトパルボウイルス抗体を測定することを可能たらしめる手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
そこで、本発明者らは、ヒトパルボウイルスの非構造遺伝子及び構造遺伝子をコードする遺伝子領域を得るため検討した結果、従来公知のヒトパルボウイルス遺伝子と、アミノ酸レベル及びＤＮＡレベルでいくつか構造の異なる新規な、また診断系の開発に有用な、たとえばヒトパルボウイルスのウイルス粒子様構造物（Empty particle) の作製も可能な、非構造遺伝子及び構造遺伝子を含むヒトパルボウイルス遺伝子領域を得ることができ、かつこの遺伝子領域から発現させた完全長の構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２によるエンザイムイムノアッセイを用いた検討の結果、ヒトパルボウイルスの構造タンパク質ＶＰ−１とＶＰ−２の免疫学的反応の違いを見出し、さらに Empty particle を用いたエンザイムイムノアッセイが、ヒトパルボウイルス粒子を用いたエンザイムイムノアッセイと同等な検出感度及び特異性であることを見いだし、さらに昆虫細胞Ｓｆ９よりＴｎ５の方がヒトパルボウイルス蛋白の発現量が多いことを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００２１】
すなわち、本発明は、上記式（１）で表されるヒトパルボウイルス遺伝子を提供する。また、本発明は、上記式（２）のアミノ酸配列をコードするヒトパルボウイルスＶＰ―１構造遺伝子を提供する。さらに、本発明は、上記式（３）のアミノ酸配列をコードするヒトパルボウイルスＶＰ―２構造遺伝子を提供する。また、本発明は、上記式（４）のアミノ酸配列をコードするヒトパルボウイルス非構造（ＮＳ）遺伝子を提供する。さらに本発明は、上記本発明のいずれかの遺伝子を含み、宿主細胞内で該遺伝子を発現することができる組換えベクターを提供する。さらにまた、本発明は、上記本発明の組換えベクターにより形質転換された形質転換体を提供する。また、本発明は、前記式（２）ないし（４）のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、これらのポリペプチドから構成されるヒトパルボウイルスのウイルス粒子様構造物を提供する。また、本発明は、上記本発明のいずれかのポリペプチド又は上記本発明のウイルス粒子様構造物を免疫原として用いて抗体を作製し、該抗体を用いる免疫測定により検体中のヒトパルボウイルスを検出する方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のいずれかのポリペプチド又は上記本発明のウイルス粒子様構造物を抗原として用い、免疫測定法により検体中の抗ヒトパルボウイルス抗体を検出する方法を提供する。さらに、本発明は、上記式（１）で示される遺伝子の一部とそれぞれハイブリダイズする１対のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法により式（１）で示される遺伝子又はその一部を増幅し、該増幅された遺伝子又はその一部を検出することから成る、検体中のヒトパルボウイルスの検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のヒトパルボウイルス非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域は、その全配列あるいはＰＣＲ法で得られるＤＮＡ断片を公知の発現ベクターに導入し、該発現ベクターで形質転換した宿主細胞内で発現させることにより、ラジオイムノアッセイ法、エンザイムイムノアッセイ法等の診断に使用し得る組換え抗原を得ることができる。また、ヒトパルボウイルス構造遺伝子ＶＰ−１に対するＩｇＧ抗体は、ヒトパルボウイルス構造遺伝子ＶＰ−２に対するＩｇＧ抗体に比べ、抗体量の持続性が長いことに基づいて、ＩｇＧ抗体だけでも感染時期の推測が可能なヒトパルボウイルス抗体検出系の開発を行うことが出来る。また、感染初期においてはヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−２に対する抗体の方がヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１に対する抗体より抗体量が多い場合が多々あることに基づいて、ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２を混合することにより、従来の抗ヒトパルボウイルス抗体検出系よりも検出率が高いヒトパルボウイルス抗体検出試薬を開発することが出来る。また、バキュロウイルス発現蛋白 Empty particle を用いたエンザイムイムノアッセイが、ヒトパルボウイルス粒子を用いたエンザイムイムノアッセイと同等な検出感度及び特異性を示していることから、従来よりも確実でかつ臨床学的に有意義なヒトパルボウイルス抗体検出試薬を開発することが出来る。また、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｔｎ５）を用いた発現量の検討から、Ｔｎ５細胞を用いた方がＳｆ９細胞を用いるより発現量が多いことを見い出し、ヒトパルボウイルス抗原の高収量な大量発現系を確立することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
後でより詳細に説明するが、上記式（１）ないし（４）で示される遺伝子の塩基配列は従来から公知のヒトパルボウイルス遺伝子の塩基配列とは異なっており、新規なものである。この完全長遺伝子を利用してポリペプチドを発現させ、それを利用した免疫測定により検体中のヒトパルボウイルス又は抗ヒトパルボウイルス抗体の検出を感度良く行うことができる。なお、これらの遺伝子は、各式に記載した完全長のものを用いることが好ましいが、これらの一部を欠いていても同程度に高感度の検出が可能と成ることがあろうことは当業者によって議論の余地なく認識されることである。従って、これらの遺伝子の一部が欠失し、置換し又は挿入があったとしても、式（１）ないし（４）の遺伝子と同様に用いることができるものは式（１）ないし（４）に記載されたものと実質的に同一であり、本発明の範囲内に入るものと解釈する。
【００２４】
上述のように、本発明は、上記本発明の遺伝子を含み、宿主細胞内で該遺伝子を発現することができる組換えベクターを提供する。このような組換えベクターは、市販のベクターのクローニング部位に上記遺伝子を常法により挿入することにより容易に調製することができる。ベクターとしては、ｐＵＣ１９のような大腸菌用ベクターを用いることもできるし、また、後述の実施例で明らかになるように、バキュロウイルスベクター（J. General Virology, Vol.68, pp.1233-1250, 1987)を用いることも好ましい。
【００２５】
本発明の形質転換体は、上記本発明の組換えベクターで宿主細胞を常法により形質転換することにより得られる。宿主細胞は、構築した組換えベクターの宿主を利用する。すなわち、大腸菌用ベクターに遺伝子を挿入して組換えベクターを構築した場合には大腸菌が宿主となる。また、バキュロウイルスベクターを用いて組換えベクターを構築した場合には昆虫細胞を好ましく用いることができる。昆虫細胞としては特にＴｎ５（Invitrogen社製High Five （商品名））が好ましく用いられる。
【００２６】
上述のように、本発明は、前記式（２）ないし（４）のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。なお、上記と同様に、式（２）ないし（４）に記載されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部が欠失し、置換し又は挿入があったとしても、式（２）ないし（４）に記載されたアミノ酸を有するポリペプチドと同様に用いることができるものは式（２）ないし（４）に記載されたアミノ酸を有するポリペプチドと実質的に同一であり、本発明の範囲内に入るものと解釈する。下記実施例で具体的に述べるように、これらのポリペプチドからヒトパルボウイルスのウイルス粒子様構造物を構築することができ、このウイルス粒子様構造物も本発明の範囲に含まれる。
【００２７】
これらのポリペプチド又はウイルス粒子様構造物を抗原として用いて、検体中の抗ヒトパルボウイルス抗体を免疫測定により検出することができる。免疫測定方法自体はこの分野において周知であり、本発明においては、従来より周知の種々の免疫測定方法、すなわち、用いる標識に基づいて分類すれば酵素免疫分析法、放射免疫分析法、蛍光抗体分析法その他を採用することができ、また、測定形式で分類すれば競合法、サンドイッチ法その他を採用することができる。なお、本願発明者らは、ヒトパルボウイルスに感染した患者の体内において、抗ＶＰ−２抗体が感染初期に多く存在し、感染後期に急速に減少するのに対し、抗ＶＰ−１抗体は感染初期には少ないが感染後期に多く存在し、抗体価が下がるのが遅いことを見出した。従って、ＶＰ−１とＶＰ−２ポリペプチドの混合物を抗原として用いて免疫測定を行えば、感染の初期でも後期でも抗ヒトパルボウイルス抗体を検出することができ、検出率を高めることができる。この場合、ＶＰ−１とＶＰ−２の混合比率は１０：１ないし１：１０が好ましく、さらには１：２ないし１：４が好ましい。なお、上記ウイルス粒子様構造物はＶＰ−１とＶＰ−２ポリペプチドの両方を含むので、これを抗原として用いることにより上記検出率向上効果をもたらすことができる。また、抗ＶＰ−１ＩｇＧ抗体と抗ＶＰ−２ＩｇＧ抗体の反応性及び抗体量に差があるので、ＶＰ−１抗原固相プレート及びＶＰ−２抗原固相プレートを用いたＩｇＧ抗体検出により、ＩｇＧ抗体検出のみで感染の時期を推測することが可能となった。
【００２８】
また、上記ポリペプチド又はウイルス粒子様構造物を免疫原として用いて常法によりこれらのポリペプチド又はウイルス粒子様構造物に体する抗体を作製し、この抗体を用いて免疫測定法により検体中のヒトパルボウイルスを検出することもできる。免疫測定法としては、上記と同様周知のいずれのものをも採用することができる。
【００２９】
また、上述のように、本発明は、上記式（１）で示される遺伝子の一部とハイブリダイズする１対のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法により式（１）で示される遺伝子又はその一部を増幅し、増幅された遺伝子又はその一部を検出することから成る、検体中のヒトパルボウイルスの検出方法を提供する。この方法に用いられるＤＮＡプライマー（オリゴヌクレオチド）としては、特に限定されないが、下記のＤＮＡプライマー群１及びＤＮＡプライマー群２の中からそれぞれ少なくとも１種ずつ選ばれるもの好ましく用いることができる。
ＤＮＡプライマー群１
D-1: GCTGCCATGTGGGAGCTTCTAATC 
D-4: TTCCCGCCTTATGCAAATGGGCAGC
ＤＮＡプライマー群２
U-2: GTGTTAGGCTGTCTTATAGGTACA 
U-4: CTTGTATTCATGGTCTACTAAC 
【００３０】
以下、本発明を、より具体的に詳細に説明するが、本発明は下記に記載のものに限定されるものではない。
【００３１】
１．ヒトパルボウイルスの非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域
ヒトパルボウイルスは、長さ約 5.4  ｋｂの直鎖の一本鎖ＤＮＡゲノムを有するウイルスで、ゲノムの各末端はパリンドロミック（Pallindromic）ＤＮＡ配列により、特徴的なヘアピンループ構造で終わっている。
【００３２】
ヒトパルボウイルスの非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域を得るには、例えば、伝染性紅斑（ＥＩ）患者の血清より、ショ糖密度勾配遠心によって精製したウイルス粒子から常法によってヒトパルボウイルスＤＮＡを抽出精製してクローニングを行う。
【００３３】
また、次の方法も可能である。それは、欧米で報告されたヒトパルボウイルスＢ１９のＡｕ株遺伝子配列〔J.Virol.58:921-936(1986)〕やＷｉ株〔Virology,157:534-538(1987)〕に基づき合成したＤＮＡプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応〔ＰＣＲ法；Nature,324:163(1986)〕によって目的とするヒトパルボウイルスの非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域を増幅することができる。
【００３４】
具体的には、たとえば、精製したヒトパルボウイルスＤＮＡに、該遺伝子の部分配列から成るＤＮＡプライマーと該遺伝子に相補的な部分配列から成るＤＮＡプライマーの２種のＤＮＡプライマーをアニーリングさせ、常法に従って、該ＤＮＡプライマー間のＤＮＡを増幅させる。
【００３５】
最も好ましいプライマーは、上記した通りである。このプライマーを用いてＰＣＲを行うとヒトパルボウイルスの非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域を増幅することができる。得られたＤＮＡ断片を、たとえばｐＵＣ１９（宝酒造社製）などの様な一般的なクローニングベクター等に組み込んで、得られたクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、該ベクターに組み込まれているＤＮＡ配列をジデオキシ法等により決定することにより、目的とするヒトパルボウイルスの非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域の全塩基配列を決めることが出来る。
【００３６】
本発明によれば、ヒトパルボウイルスの非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域は、前記式（１）で示される塩基配列を有しており、また構造遺伝子ＶＰ−１は前記式（２）で示される塩基配列及びアミノ酸配列を、また構造遺伝子ＶＰ−２は前記式（３）で示される塩基配列及アミノ酸配列を、また非構造遺伝子ＮＳは、前記式（４）で示される塩基配列及びアミノ酸配列を有していた。
これら前記式（１）〜前記式（４）で表される塩基配列中、塩基レベルで４１箇所、アミノ酸レベルで１０〜１３箇所が、公知のヒトパルボウイルスＢ１９株（Ａｕ株、Ｗｉ株）の配列と異なっていた。
【００３７】
２．ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１やＶＰ−２及び非構造タンパク質ＮＳの作製及びそれを用いた抗原、抗体検出系の構築
ウイルス構造タンパク質としてウイルス粒子に存在しているのは、量的に少ないＶＰ−１（８４ＫＤａ）と量的に多くウイルス粒子の主体をなしているＶＰ−２（５８ＫＤａ）であり、ＶＰ−１、ＶＰ−２に対して宿主は抗体を産生する。よって、このＶＰ−１、ＶＰ−２抗原を用いることによりヒトパルボウイルスに対する抗体を検出することが出来る。
【００３８】
ヒトパルボウイルスのＶＰ−１，ＶＰ−２抗原を得るためには、ヒトパルボウイルス抗原を確保しなければならない。しかし、現在までヒトパルボウイルスの細胞培養系は、特殊な遺伝的疾患患者の骨髄細胞を用いた報告例がある［Blood.70:384-391(1987)］にすぎず、またウイルスの回収率はきわめて悪いため、実際にはその使用範囲にも限度があった。
【００３９】
そこで、本発明のヒトパルボウイルス非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域を用いて以下のようにして完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２を作製した。
【００４０】
ヒトパルボウイルス非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域、前記式（１）やヒトパルボウイルス構造遺伝子ＶＰ−１、前記式（２）及びヒトパルボウイルス構造遺伝子ＶＰ−２、前記式（３）をタンパク質発現させるのに最も都合がよい制限酵素等により切断し、原核細胞（例えば大腸菌など）発現ベクターや真核細胞（例えばＣＨＯ細胞など）発現ベクター、昆虫細胞（例えばＳｆ９，Ｔｎ５など）発現ベクターに再クローニングを行い発現させる。
【００４１】
発現された完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２は、不溶性になっており精製には困難を要していた。そこで、尿素バッファーで可溶化し、適当な吸着、イオン交換、分子ふるい、疎水、等電点、クロマトグラフィーを組み合わせて発現蛋白を精製し、完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２を得た。
【００４２】
発現させ、精製した完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２を炭酸バッファー（pH9.5 ）で至適濃度に希釈してから、ＥＬＩＳＡ用ポリスチレンマイクロプレートに固相して、ヒトパルボウイルス抗体検出エンザイムイムノアッセイ試薬を試作した。
【００４３】
この試作したエンザイムイムノアッセイ試薬を用いて、伝染性紅斑患者の抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体の経時変化を調べ以下の事が分かった。完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２に対するＩｇＧ抗体は共に出現するが、完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１に対するＩｇＧ抗体の方が、完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−２に対するＩｇＧ抗体より抗体量の持続性は長いことが分かった。
【００４４】
ここで、完全長のヒトパルボウイルス構造遺伝子ＶＰ−２のタンパク質のコード領域は、完全長のヒトパルボウイルス構造遺伝子ＶＰ−１のＣ末端部分に完全に含まれている。そこで、以前よりヒトパルボウイルスの抗体検出には、ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１のみで十分可能であると思われていた。
【００４５】
しかし、完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１とＶＰ−２の免疫学的な反応性に違いがあることが分かったので、ヒトパルボウイルスのより確実な診断には、完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１のみではなく完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−２も必要であることが分かり本発明に至った。
【００４６】
３．バキュロウイルスを用いた Empty particle の発現、精製及び Empty  
particle  を用いた抗体検出系の構築
ヒトパルボウイルスの粒子は、構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２で構成されていることが知られている。〔J.Virol.,58:921-936(1986) 〕そして、構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２をそれぞれ単独に同一細胞で発現させると、構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２が同一細胞内でウイルス粒子様構造物（Empty particle）を作ることが分かった。〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:7601-7605(1989) 〕
【００４７】
そこで、バキュロウイルスによる発現系を用いて、ウイルス粒子様構造物の発現を行った。Empty particleの発現は、本発明のヒトパルボウイルス非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域を用いて以下の方法で行った。
【００４８】
ヒトパルボウイルス非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域、前記式（１）やヒトパルボウイルス構造遺伝子ＶＰ−１、前記式（２）及びヒトパルボウイルス構造遺伝子ＶＰ−２、前記式（３）を完全長のＶＰ−１及び完全長のＶＰ−２タンパク質の発現に最も都合がよい制限酵素等により切断し、真核細胞（例えばＣＨＯ細胞など）発現ベクター、昆虫細胞（例えばＳｆ９、Ｔｎ５など）発現ベクターに再クローニングして発現させる。
【００４９】
次いで、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｔｎ５）を用いたヒトパルボウイルス蛋白の発現検討より、Ｔｎ５細胞を用いた方がＳｆ９細胞を用いるより発現量が多いことを確認した。
【００５０】
発現された Empty particle は、ウイルス粒子様構造を取っているため、ウイルス粒子の精製法が適用できる。例えば、ショ糖密度勾配遠心法や塩化セシウム密度勾配遠心法等で精製できる。
【００５１】
発現させ、精製した Empty particle を炭酸バッファー（pH9.5 ）及びＰＢＳ等で至適濃度に希釈してから、ＥＬＩＳＡ用ポリスチレンマイクロプレートに固相して、ヒトパルボウイルス抗体検出エンザイムイムノアッセイ試薬を作製した。
【００５２】
また、発現させ、精製した Empty particle をＰＢＳ等により至適濃度まで希釈して、Empty particle  キャプチャー法によるエンザイムイムノアッセイ試薬を作製した。
【００５３】
この試作したエンザイムイムノアッセイ試薬により、伝染性紅斑流行時の血清を用いたヒトパルボウイルス抗体検出を行った。その結果、患者血清中から精製したヒトパルボウイルス粒子を用いたエンザイムイムノアッセイとほぼ同等な検出感度及び特異性が得られた。従って、本発明であるバキュロウイルス発現蛋白Empty particleを用いたエンザイムイムノアッセイ試薬は、最も検出感度及び特異性が高いので、従来よりも確実でかつ臨床学的に有意義なヒトパルボウイルス抗体検出試薬であることが分かった。
【００５４】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５５】
ヒトパルボウイルス遺伝子のクローニング
（１）ヒトパルボウイルスゲノムＤＮＡの調製
伝染性紅斑流行時にヒトパルボウイルスに感染した患者二人の血清（血清No.8及びNo.10 ）各々約200 μl をリン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕(pH7.2) で１０倍に希釈した。希釈した血清に最終濃度１００μｇ／ｍｌのプロテインネースＫと最終濃度１％のドデシル硫酸ナトリウム〔ＳＤＳ〕を加え、３７℃で約１時間反応させた。次いで、この反応液を等量に分け、ＴＥ飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコール（２５：２４：１）を等量加えて混合した。混合後、１５，０００ｒｐｍ、約１０分間遠心分離して上清を回収した。回収した上清に最終濃度1 μg/mlのグリコーゲンを加え、さらに上清の1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えた後、全溶液の２．５倍量のエタノールを加えて、−２０℃で一晩静置してエタノール沈澱を行った。
【００５６】
エタノール沈澱溶液を１５，０００ｒｐｍ、約１０分間遠心分離した。沈澱を７０％エタノールで洗浄後、乾固させた。乾固後、ＴＥバッファー（10mM Tris-HCl(pH7.5)-1mM EDTA ）２０μｌに溶解した。
【００５７】
（２）ヒトパルボウイルス遺伝子の増幅及び塩基配列の決定
実施例１−（１）で得たヒトパルボウイルスゲノムＤＮＡ溶液1 μl を用いて、Saiki らの方法［Nature,324:163(1986)］に従い、Gene Amp PCR Reagent Kit（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法で、ヒトパルボウイルス非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域を増幅した。即ち、５０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５ｍＭＭｇＣｌ2、０．１％  ゼラチンを含む反応液中にヒトパルボウイルスＤＮＡ溶液１μｌと下記の２種類のＤＮＡプライマーそれぞれ１００ｐｍｏｌｅｓ及びＴａｑポリメラーゼ５ユニットを加え、最終量１００μｌとした。
D-4: TTCCCGCCTTATGCAAATGGGCAGC
U-2: GTGTTAGGCTGTCTTATAGGTACA 
図１に２種類のＤＮＡプライマー位置を示した。増幅断片はヒトパルボウイルス非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域（Ｆ）、ヒトパルボウイルス構造伝子を含む遺伝子領域（ＶＰ）、ヒトパルボウイルス非構造遺伝子を含む遺伝子領域（ＮＳ）を含む。
【００５８】
この反応液を（９５℃、１分）−（５５℃、２分）−（７２℃、３分）のサイクルで増幅反応を３０サイクル行った後、さらに７２℃、５分ポリメラーゼ反応を行わせ、ＤＮＡの伸長反応を完全にした。反応終了液を１％アガロースゲル電気泳動で分画した結果、約４．７ＫｂのＰＣＲ増幅産物を確認した。この約４．７ＫｂのＰＣＲ増幅産物をGeneclean II［BIO101社製］でＤＮＡを回収した後、さらにDNA Blunting Kit（宝酒造製）を用いて平滑化した。
【００５９】
次にpUC19 ５μｇを制限酵素SmaI  ５ユニットで３７℃、２時間消化後、アルカリフォスファターゼ（BRL 社製）で５’末端を脱リン酸化した。
【００６０】
上記ＰＣＲ増幅断片とpUC19 断片をLigation Kit（宝酒造社製）を用いて結合させ、ＣａＣｌ2法〔Molecular Cloning,p250 Cold Spring Harbar Laboratory〕によって大腸菌XL1-Blueに導入した。得られた形質転換体を適当に１０個選択、Birnboimらのアルカリ―ＳＤＳ法〔Nucleic Acids Res.,7:1513(1979) 〕でＤＮＡを精製し、制限酵素マッピングによりＰＣＲ増幅断片を有するクローン（血清No.10 由来：pUC19/F8、血清No.8由来：pUC19/C2と命名）を得た。なお、これらの形質転換体（Escherichia coli XL1-Blue(pUC19/F8) 及びEscherichia coli XL1-Blue(pUC19/C2) とそれぞれ命名した）は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されており、その受託番号は、それぞれ微工研菌寄第１３１２５号及び微工研菌寄第１３１２４号である。
【００６１】
得られたクローンからプラスミドＤＮＡを精製し、各ＰＣＲ増幅断片について、Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit（United State Biochemical Corporation  製）或いはＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ａで塩基配列を決定した（図２〜図１０）。その結果、非構造遺伝子及び構造遺伝子を含む遺伝子領域は、4,677 bp、構造遺伝子を含む遺伝子領域は、2,756 bp、非構造遺伝子を含む遺伝子領域は、3,383 bpであった。そこで、アメリカ及びヨーロッパで解析された既知のヒトパルボウイルス遺伝子配列（前述）との比較を行った（表１〜３）。
【００６２】
表１  Au  株（米国）と血清No.8またはNo.10 由来株との比較
2004187687.tif 000003
【００６３】
表２  Wi  株（ヨーロッパ）と血清No.8またはNo.10 由来株との比較
2004187687.tif 000004
【００６４】
表３  血清No.8由来株（日本）と血清No.10 由来株（日本）との比較
2004187687.tif 000005
【００６５】
表１〜３より、式（１）〜（４）で表される塩基配列及びアミノ酸配列中、塩基レベルで４１箇所、アミノ酸レベルで１０〜１３箇所が、公知のヒトパルボウイルスＢ１９株（Ａｕ株、Ｗｉ株）と異なっていた。またこの結果より、ヒトパルボウイルスは欧米と日本との間で地域差の存在が示唆され、本発明である式（１）〜式（４）は、新規なヒトパルボウイルス遺伝子であることが見いだされた。
【実施例２】
【００６６】
大腸菌を用いたＶＰ−１及びＶＰ−２抗原の発現
（１）マルチクローニング部位を有する発現ベクターの作成
特開平４―８２９００に記載のＰL プロモーター発現ベクター pPLN-CSF214C △９  ５μg を制限酵素NdeI及びHindIII それぞれ5unitsで３７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動で3.5Kb のＤＮＡ断片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。次にpUC19 を同様に制限酵素NdeI及びHindIII で消化後、１％アガロースゲル電気泳動を行ない、0.27Kbの断片を回収した。3.5Kb の断片と0.27Kbの断片をLigation Kit（宝酒造社製）を用いて結合させ、大腸菌JM109 に導入した。
【００６７】
得られた形質転換体を適当に１０個選択、アルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡを精製し、制限酵素NdeI及びHindIII によるマッピングにより目的のプラスミドpPLN-MCSを取得した（図１１）。
【００６８】
（２）ＶＰ−２抗原発現ベクターの作製
実施例１で得られたプラスミドpUC19/F8 5μg を制限酵素HindIII 5unitsで３７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動で5.1Kb のＤＮＡ断片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。この断片を自己結合させ、大腸菌JM109 に導入した。得られた形質転換体を適当に１０個選択、アルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡを精製し、制限酵素PstI及びHindIII によるマッピングにより目的のプラスミドpVP を取得した。
【００６９】
プラスミドpVP 10μg を制限酵素EcoRI 10units で３７℃、２時間消化し、フェノール抽出―エタノール沈澱を行なった。ＤＮＡを溶解後、制限酵素PstI 1unitで３７℃、１０分間部分消化し、１％アガロースゲル電気泳動を行なった。1.8Kb の断片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。次にプラスミドpPLN-MCS 5μg を制限酵素NdeI及びEcoRI それぞれ10units で３７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動で3.5Kb のＤＮＡ断片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。さらにＤＮＡシンセサイザーを用いて、以下に示すオリゴヌクレオチドを合成した。
5'-TATGACTTCAGTGAATTCTGCA-3'
5'-GAATTCACTGAAGTCA-3'
上記オリゴヌクレオチドをそれぞれMEGALABEL （宝酒造社製）を用いて５’末端をリン酸化した後、リン酸化オリゴヌクレオチドをアニールした。
【００７０】
1.8Kb の断片、3.5Kb の断片及びアニールしたオリゴヌクレオチドを結合させ、大腸菌N4830-1 に導入した。得られた形質転換体を適当に２４個選択、アルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡを精製し、制限酵素NdeI,PstI 及びEcoRI によるマッピングにより目的のプラスミドpVP200を取得した（図１２）。
【００７１】
（３）ＶＰ−１抗原発現ベクターの作製
プラスミドpVP 10μg を制限酵素HindIII とBamHI でそれぞれ10units で３７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動で1.5Kb のＤＮＡ断片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。次にプラスミドM13mp19 RF 5μg も同様に制限酵素HindIII と BamHIで１％アガロースゲル電気泳動を行ない、7.2Kb の断片を回収した。1.5Kb 及び7.2Kb の断片を結合させた後、大腸菌JM109 に感染させた。組換えファージの選択はXgal存在下、LacZを指標として行った。White plaqueを適当に１２個選択、大腸菌JM109 に再感染させた。アルカリ―ＳＤＳ法でＲＦ型ＤＮＡを精製し、制限酵素HindIII 及びBamHI によるマッピングにより目的のプラスミドp19-VPを取得した。
【００７２】
次にプラスミドp19-VPを大腸菌JM109 に感染させ、ファージを取得した。これより一本鎖ファージＤＮＡを精製した。また変異導入プライマーとして以下の配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
5'- TTACTCATATGCTACAAAGCTTGGCG -3'
一本鎖ファージＤＮＡと変異導入プライマーをアニールした後、T7-GEN（UnitedStates Biochemical Corporation(USB) 社製）を用いて部位特異的変異（site-directed mutagenesis ）を行った。site-directed mutagenesis の方法はUSB 社のプロトコールに従った。変異導入部位は図１３に示す通りである。得られたファージを適当に２４個選択し、大腸菌JM109 を再感染させた。アルカリ―ＳＤＳ法でＲＦ型ＤＮＡを精製し、制限酵素NdeIによるマッピング及びDNA sequencingにより目的のプラスミドmp19-VP1を取得した。
【００７３】
プラスミドmp19-VP1 20 μg を制限酵素NdeIとBglIでそれぞれ20units で３７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動で0.6Kb のＤＮＡ断片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。プラスミドpVP 10μg を制限酵素BstXI 10units で５５℃、２時間消化後、さらに制限酵素BglI 10unitsで３７℃、２時間消化し１％アガロースゲル電気泳動で1.7Kb のＤＮＡ断片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。さらにプラスミドpVP200 10 μg を制限酵素BstXI 20units で５５℃、２時間消化後、さらに制限酵素NdeI 20unitsで３７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動で3.8Kb のＤＮＡ断片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。上記0.6Kb 、1.7Kb 及び3.8Kb のＤＮＡ断片を結合させ、大腸菌N4830-1 に導入した。得られた形質転換体を適当に２０個選択、アルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡを精製し、制限酵素NdeI、BstXI 及びPvuII によるマッピングにより目的のプラスミドpVP100を取得した（図１４）。
【００７４】
（４）ＶＰ−１及びＶＰ−２抗原の発現
大腸菌N4830-1[pVP100] 及び大腸菌N4830-1[pVP200] を50μg/ml Ampicilinを含むＬＢ培地１ｍｌで３０℃、１６時間培養した。前培養液１ｍｌを新しいＬＢ培地１００ｍｌに接種した。３０℃、約３時間培養後、予め６５℃に暖めたＬＢ培地１００ｍｌを加え、４２℃でさらに３時間培養した。培養後、遠心分離し菌体を回収した。
【００７５】
菌体の一部をPhosphate Buffered-Saline(PBS)に懸濁し超音波破砕機で菌体を破砕した後、Laemmli の方法〔Nature,227:680(1970)〕に従ってＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電気泳動〔ＳＤＳ−ＰＡＧＥ〕を行った。泳動後、伝染性紅斑患者血清を用いてウエスタンブロッティング〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,76:3116-3120(1979)〕を行った。その結果、分子量84,000及び58,000の位置に反応した。従ってＶＰ−１及びＶＰ−２抗原の発現が確認された。
【００７６】
また超音波破砕処理した菌体を5,500gで１０分間遠心分離し、上清画分と沈澱画分に分離した。それぞれの画分をＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電気泳動しコマシュー・ブリリアント・ブルー(CBB) で染色した結果、ＶＰ−１及びＶＰ−２抗原は沈澱画分に見られ、インクルージョン・ボディを形成していた。
【００７７】
（５）ＶＰ−１及びＶＰ−２抗原発現大腸菌の培養
大腸菌N4830-1[pVP100] を50μg/ml Ampicilinを含むＬＢ培地２ｍｌで３０℃、７時間培養した。次に２Ｌ発酵槽を用いて１ＬのJAR 培地（0.7% Na2HPO4, 0.3% KH2PO4, 0.5% (NH4)2SO4, 0.1% クエン酸ナトリウム、 0.02% MgSO4・7H2O, 2.5%グルコース、 0.4% 酵母抽出物、 0.4% カザミノ酸, 0.4%ヒスチジン, 0.4%イソロイシン, 0.4%バリン, 50μg/mlアンピシリン）で３０℃、約１６時間培養した。さらに７０Ｌ発酵槽を用いてJAR 培地（４０Ｌ）で３５℃で培養した。O.D.550=5 に達した時、カザミノ酸を終濃度2%、ヒスチジン、イソロイシン及びバリンをそれぞれ終濃度0.4%になるように添加した後、４２℃、３時間培養した。
【００７８】
培養液は限外ろ過装置で濃縮後、菌体を５Ｌの破砕buffer（50mM Tris-HCl(pH8.0),10mM EDTA, 30mM NaCl ）に懸濁した。Manton Gaulin ホモジナイザーを用いて菌体を破砕した（7,500PSI x ３回）。次に5,500gで３０分間遠心分離し沈澱を集めた。この沈澱を２．５ＬのDetergent buffer（50mM Tris-HCl(pH8.0), 50mM NaCl, 10mM EDTA, 0.5% Triton X-100 ）に懸濁、４℃、３０分間撹はんの後、5,500gで１５分間遠心分離し沈澱を集めた。このDetergent bufferによる懸濁−遠心分離操作を３回行った。得られた沈殿（インクルージョン・ボディ;IBs）は−２０℃に保存した。
【００７９】
大腸菌N4830-1[pVP200] についても同様に行い、インクルージョン・ボディを得た。
【００８０】
（６）ＶＰ−１及びＶＰ−２抗原の精製
実施例２−（５）で得たＶＰ−１のインクルージョン・ボディ、湿重量50mgを1ml のIBs 溶解バッファー（8M尿素,10mM DTT,1mM EDTA,20mM Tris-HCl(pH7.0) ）に溶解した。この溶液を1ml のSDS サンプルbuffer（130mM Tris-HCl(pH6.8), 4% SDS, 15% Ficoll Type400 （Pharmacia 社製）, 10% β−メルカプトエタノール, 0.002%ブロムフェノール）と混合し、80℃、20分間の熱処理を行なった。このサンプルからProSieve Gel System （FMC 社製）を用いてＶＰ−１抗原を精製した。使用説明書に従って、電気泳動を行い分子量ごとにサンプル中のタンパクを分画し、ＶＰ−１抗原を含む部分のみを切り出し、抽出バッファー（8M尿素, 10mM DTT, 1mM EDTA, 20mM Tris-HCl(pH7.0)）でゲル中より抽出した。なおゲル板は14.5cm x 16.5cm x 2mm のものを用いた。抽出したタンパクをPharst System （Pharmacia 社製）を用い電気泳動を行い銀染色した結果、ＶＰ−１抗原の分子量位置(84,000)にのみバンドを認めた。ＶＰ−２抗原についても同様に精製し、ＶＰ−２抗原の分子量位置(58,000)にのみバンドを認めた。
【実施例３】
【００８１】
ＶＰ−１抗原誘導体の作製
（１）ＶＰ−１抗原誘導体ベクターの作製
本発明の式（２）のＶＰ−１抗原（７８１アミノ酸）のＮ末端側４６アミノ酸及びＣ末端側９８アミノ酸欠失させたＶＰ−１抗原誘導体（６３７アミノ酸）を作製した。
【００８２】
実施例１−（２）で得たpUC19/F8 20 μg を制限酵素Ssp I 20単位で３７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動で約1.9Kb のＶＰ−１ＤＮＡ断片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。
【００８３】
次にプラスミドpKK233-2（ファルマシア製） 5μg を制限酵素Nco I ５単位で３７℃、２時間消化後、末端をBlunting Kit（宝酒造社製）で平滑末端とした。
【００８４】
約1.9Kb の断片とベクターをLigation Kitを用いて結合させ、大腸菌XL1-Blueに導入した。得られた形質転換体を適当に１０個選択、アルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡを精製し、制限酵素PstI及びHindIII によるマッピングにより目的のプラスミドpVP300を取得した（図１５）。
【００８５】
（２）ＶＰ−１抗原誘導体の発現
大腸菌XL1-Blue[pVP300]を50μg/mlアンピシリンを含むＬＢ培地１ｍｌで３７℃、１６時間培養した。前培養液１ｍｌを新しいＬＢ培地１００ｍｌに接種した。３７℃、約２時間培養後、終濃度1mM IPTGになるように添加後、３７℃でさらに３時間培養した。培養後、実施例２−（４）で示した方法で発現状況を調べた結果、ＶＰ−１抗原誘導体（ＶＰ−１／ＳｓｐＩ抗原と命名）もインクルージョン・ボディを形成していることが確認された。さらにウエスタンブロッティング及び蛍光抗体間接法により、分子量70,000の位置に反応した。従ってＶＰ−１／ＳｓｐＩ抗原もＶＰ−１、ＶＰ−２抗原と同じく抗原性を有することがわかった。
【実施例４】
【００８６】
バキュロウイルスを用いたＶＰ−１及びＶＰ−２抗原の発現
（１）組換え転移ベクターの作製
実施例１−（２）で得たpUC19/F4 20 μg を制限酵素HindIII 20units で３７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動で2.5Kb のＶＰ−１ＤＮＡ断片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。回収したＶＰ−１断片をBlunting Kitで平滑末端とした。
【００８７】
同様にpUC19/F8 20 μg を制限酵素HpaII とSalIでそれぞれ20units で３７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動で1.8Kb のＶＰ−２ＤＮＡ断片を分画し、Geneclean IIでＤＮＡを回収した。ＶＰ−２断片をBlunting Kitで平滑末端とした。
【００８８】
一方転移ベクターpAcYM1[J.Gen.Virol.,68:1233(1987)] 5μg を制限酵素BamHI で３７℃、２時間消化後、Blunting Kitで平滑末端とした。さらにアルカリフォスファターゼ（BRL 社製）で５’末端の脱リン酸化を行った。
【００８９】
ＶＰ―１及びＶＰ―２断片をそれぞれpAcYM1を結合させた後、大腸菌XL1-Blueに感染させた。得られた形質転換体を適当に２０個選択、アルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡを精製し、制限酵素によるマッピングにより目的のプラスミドpAcVP1、pAcVP2  を取得した（図１６）。
【００９０】
（２）組換えウイルスの作製
φ３５ｍｍディッシュ（住友ベ−クライト社製）を用い、夜蛾幼虫由来株化細胞:Sf9(Spodopterd frugiperda) 細胞は、10% 牛胎児血清(FCS) を含む培地（TC-100、またはGrace's 培地）で、夜蛾幼虫由来株化細胞:Tn5:(Trichoplusia ni)細胞は、無血清培地（TC-100、またはGrace's 培地）で３〜４日培養した。次いで、φ３５ｍｍディッシュ（住友ベ−クライト社製）を用い、１×１０6／ディッシュ、培地量約1.5ml になる様に前記述の培養細胞を調整した。この状態で３０〜４０分静置した後、無菌的に上記培地を取り去り1.5ml 無血清培地（EX-CELL 400 またはGrace's 培地）に交換した。
【００９１】
ここにAcNPV （キンウラバ亜科、Autographa californica nuclear polyhedorosis virus）ＤＮＡ約20ng/ μl を1 μl 、転移ベクター2-3 μg/μl 濃度を1 μl 、滅菌蒸留水6 μl の計8 μl 及びリポフェクチン（ＢＲＬ社製）5 μl 、滅菌蒸留水3 μl の計8 μl をエッペンドルフチューブ内でおだやかに混和した後、上記無血清培地中に１滴ずつ静かに全体に滴下した（コ・トランスフェクション）。そしてモイスチャーチャンバー内へ収納し、２６〜２６．５℃で３日間培養した。
【００９２】
コ・トランスフェクション後、３日目の培養上清約1ml をチューブに移しそれらの各20μl を用いて10-1〜10-3まで希釈しそれらの100 μl を１×１０6／ディッシュ（φ３５mm）に調整した細胞に接種し約１時間静置して吸着させる。その後、ウイルス液を捨て１％低融点寒天（Ｓｅａ  Ｐｌａｑｕｅ：宝酒造社製）2ml を重層し、凝固した後更に1ml の培地（Ｓｆ９細胞の場合は10%FCSを含むTC-100またはGrace's 培地を用い、Ｔｎ５細胞の場合はTC-100またはGrace's の無血清培地を用いる。）を重層し２６〜２６．５℃で３〜４日培養後、10mMリン酸緩衝塩溶液(10mM PBS)中0.01%(W/V)ニュートラルレッドを1ml 加えプラークを染色し透明な組換え体を選択した。
【００９３】
プラ−クアッセイによって得た組換え体と思われるプラークをパスツールピペットによってゲルごと採取し、それらを細胞培養用培地400 μl に浮遊し十分撹拌を行った後、約３０００ｒｐｍ、約５分間の条件でアガロ−スゲルを沈澱させ、上清をプラ−クアッセイ時同様10-1〜10-3までそれぞれの培地（Ｓｆ９細胞の場合は10%FCSを含むTC-100またはGrace's 培地を用い、Ｔｎ５細胞の場合はTC-100またはGrace's の無血清培地を用いる。）で希釈し、低融点寒天を用いて同様にプラ−クアッセイを行い組換えウイルスを純化した。
【００９４】
プラ−ク純化（ｐｌａｑｕｅ  ｐｕｒｉｆｙ）によって得られた組換え体の力価を細胞に感染させることで上昇させた。この時も同様にφ３５mmディッシュに約１×１０6／ディッシュのＳｆ９細胞及びＴｎ５細胞を用意し、約３０分間静置後培地の大部分を捨てそこに得られた組換え体を約100 μl 加え、更に約１５分間隔でおだやかに振盪混和を行い計４回、約１時間にわたってこの操作を行った。
【００９５】
次に、Ｓｆ９細胞の場合は 10% FCSを含む培地（TC-100またはGrace's ）を、Ｔｎ５細胞の場合は無血清培地（TC-100またはGrace's ）を1.5ml 加え、３〜４日間培養を行う。この時得られた上清を用いて７５ｃｍ2培養ビン２本を用いて、同様に細胞を用意し、既に１度力価を上げてある組換えウイルス液1ml を接種し、３〜４日間の培養の後、得られた上清を構造遺伝子発現用の高力価組換え体とした。
【００９６】
φ３５mmディッシュに約１×１０6／ディッシュで細胞数を調整し培地の大部分を吸引し、そこに高力価組換え体（約1x107pfu/ml ）をM.0.I.５〜１０になる様に接種し約１５分間隔で穏やかに振盪しながら計４回、１時間にわたりこの操作を続けた。
【００９７】
その後、培地（Ｓｆ９細胞の場合は10%FCSを含むTC-100またはGrace's 培地を用い、Ｔｎ５細胞の場合はTC-100またはGrace's の無血清培地を用いる。）を0.5-1ml 加え３〜４日間、２６〜２６．５℃で培養しヒトパルボウイルス構造遺伝子（ＶＰ−１、ＶＰ−２及びＶＰ−１  ＋  ＶＰ−２）の発現を行った。
【００９８】
発現蛋白は、伝染性紅斑患者血清より精製したヒトパルボウイルス粒子を対照として、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用い２０ｍＡで約２時間電気泳動後、CBB 染色を行い、その分子量と発現量の確認を行った。その結果、ヒトパルボウイルスのＶＰ−１、ＶＰ−２と同分子量の発現蛋白が確認された。またＴｎ５細胞を用いた方がＳＦ−９細胞を用いるよりも発現量が多いことが分かった。
【００９９】
抗原性の確認は、伝染性紅斑患者血清を用いたウエスタンブロッティング及び蛍光抗体間接法で行った。その結果、発現蛋白質と特異的に反応するバンドの存在と蛍光発色が確認され、発現蛋白がヒトパルボウイルス構造蛋白質ＶＰ−１、ＶＰ−２であることを確認した。
【０１００】
（３）ヒトパルボウイルス発現蛋白質 Empty particle の精製と電子顕微鏡を用    いた Empty particle の確認
昆虫細胞Ｓｆ９、Ｔｎ５等を用いて、好ましくはＴｎ５細胞を用いて、表面積７５ｃｍ2 のプラスティック製細胞培養用ボトル（住友ベ−クライト社製）により大量にヒトパルボウイルス構造蛋白質を発現させ精製に供した。大量発現させた発現蛋白質（７５ｃｍ2 プラスティック製細胞培養用ボトル２０本分）はピペッティングによって細胞培養液を用いて培養細胞ごとハ−ベストし容量５００ｍｌの遠心沈澱用ボトル（日立社製）２本に移し（約３００ｍｌ）これらを１０００〜３０００ｒｐｍ  ，２０℃，１５分間の遠心条件で細胞成分を沈澱させ上清は廃棄した。沈澱細胞はＰＢＳ（−）（りん酸緩衝食塩液、日水製薬社製）またはHanks'BSS （ハンクス緩衝塩類液，自家製）１０ｍｌに浮遊させ充分混和した後−８０℃の超低温冷凍庫を用いて２〜３回の凍結融解操作を行った。次に凍結融解後の細胞浮遊液を５本のプラスティック製スピッツ管（栄研器材社製）に各々２ｍｌ分注し１００〜５００Ｗ，０℃，５〜２０分間の条件で超音波処理（オリンパス社製）を合計２〜４回行った。この際、各細胞浮遊液から約５０μｌずつ各々採取し、スライドグラス上に滴下した後カバ−グラスを置き倍率２００倍にて光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製）により観察し細胞の破砕状態を確認した。ここで細胞浮遊液から細胞成分を分離する為に約１００００ｒｐｍ，２０℃，１５分間の遠心沈澱を行った。この操作によって得られた上清約１０ｍｌをサンプルとして次の精製操作を行った。まず、超遠心用１３ＰＡチュ−ブ（日立工機社製）に４０％シュクロ−ス（W/V ）（PBS(-)またはHanks'BSS に浮遊）（ナカライテスク社製）を２〜３ｍｌ分注しこれらシュクロ−ス  クッションの上へ上記サンプルを重層し約３５０００ｒｐｍ，２０℃，１６〜２０時間超遠心を行い微量雑蛋白質を除外すると共にヒトパルボウイルス発現蛋白質を沈澱させた。沈澱させたヒトパルボウイルス発現蛋白質は１３ＰＡチュ−ブ管底に接着している為PBS(-)各２ｍｌを滴下しピペッティング及び振とうにより充分混和した。更にこの時肉眼で大分子が確認されるため１００〜５００Ｗ，０℃，２〜１０分間の超音波処理を行い浮遊溶液とした。次に、予め超純水（mili-Q  ミリポア社）に密度１．２，１．３，１．４（ｇ／cm3）となる様調製したCsCl溶液（ナカライテスク社製）を密度の大きい順にチュ−ブの管底から２，５，２ｍｌ各々重層しグラジエントをプレフォ−ミングした後サンプル２ｍｌを２本の超遠心チュ−ブに重層し約３５０００ｒｐｍ，２０℃，４０〜４５時間の条件下で一度目の超遠心による精製を行った。超遠心後、各サンプルをおよそ２０本のフラクションにペリスタポンプ等を用いて分離し、抗ＶＰ１モルモット抗体（１．５μｇ／ｍｌ）固相化プレ−ト及び抗ＶＰ１モルモットＰＯＤ標識抗体（自家製）を用いて抗原検索を行った。その結果、横軸にフラクションNO. を縦軸にＯ．Ｄ．４９２／６３０ｎｍでの測定結果をグラフ化した場合１峰性のカ−ブが得られた為ピ−クの存在するフラクションを用いて同様に二回目の超遠心操作及び抗原検索を行った。この際、各フラクションに於けるCsClの重量パ−セントを糖度計（ATAGO 社製）により測定しレファレンスとなる密度１．２，１．３，１．４（g/cm3）の各CsCl溶液の重量パ−セントの値���ら各フラクション溶液の密度を換算しグラフ化した。この時、横軸にはフラクションNo. を縦軸には各フラクションの密度値をとった。その結果、チュ−ブの管底から管口に向かって密度が低下する関係が確認された。更にこれらの関係から抗原を含むフラクション溶液の密度は、約１．３g/cm3であることが確認された。次にこのサンプルを１３ＰＡチュ−ブ内でPBS(-)によって１５〜２０倍に希釈し約３５０００ｒｐｍ，２０℃,１０〜２０時間超遠心を行いヒトパルボウイルス精製発現蛋白質を沈澱させた。これらの発現蛋白質は最終的に１〜２ｍｌPBS(-)に浮遊し発現蛋白質原液とした。電子顕微鏡による確認は、上記発現蛋白液を試料とし、４％ Uranic acetate により陰性染色を行い、倍率５００００倍にして透過型電子顕微鏡（日立製）で検鏡した。その結果、図１７に示したような約２３ｎｍの中空円型のウイルス様構造物いわゆる”Empty particle”の存在を確認した。
【実施例５】
【０１０１】
大腸菌発現抗原ＶＰ−１、ＶＰ−２抗原を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体検出
（１）ＶＰ−１、ＶＰ−２抗原固相プレートの作製
実施例２−（６）に記載の大腸菌で発現されたＶＰ−１、ＶＰ−２抗原を50mM  炭酸バッファー(pH9.5) で各々1-10μg/ml濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート（ヌンク社製）に100 μl/ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。１８時間以上静置したマイクロプレートを最終濃度0.05% Tween20 を含むPBS 200 μl/ウェルで３〜４回洗浄後、最終濃度0.05% 牛血清アルブミン(BSA) と0.05% Tween20 を含む10mM PBS 200μl/ウェル加えて４℃一晩静置し、ＶＰ−１、ＶＰ−２固相マイクロプレートを作製した。
【０１０２】
（２）伝染性紅斑患者血清を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体検出
前記述の抗原固相マイクロプレートウエル中のプレート保存液を除いた後、伝染性紅斑患者血清を0.05% BSA と0.05% Tween20 を含む10mM PBSで２００倍に希釈し、その100 μl を抗原固相マイクロプレートのウエルに加え、室温（１５℃〜２５℃）で約１時間反応させた。反応後、0.05% Tween20 含む5mM PBS 200 μl/ウェルで３〜４回洗浄した。ついで、0.05% Tween20 含む5mM PBS で約４００００倍に希釈した抗ヒトＩｇＧヤギパーオキシダーゼ標識抗体（ＭＢＬ社）を100 μl/ウェル加え、室温で約１時間反応させた。反応後、0.05% Tween20 含む5mM PBS 200 μl/ウェルで３〜４回洗浄した。洗浄後、3.3mg/ml  Ｏ−フェニレンジアミン含む０．１Ｍ  クエン酸−リン酸緩衝液(pH 5.0)に、0.02% 過酸化水素水を加えた基質液を100 μl/ウェル加えて室温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を100 μl/ウェル加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計を用いて  主波長４９２ｎｍ、副波長６３０ｎｍで各ウエルのＯ. Ｄ. 値を測定した（表５）。
【０１０３】
表５  伝染性紅斑流行時の血清を用いたＶＰ−１及びＶＰ−２抗原固相            マイクロプレートによる抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体検出
2004187687.tif 000006
ウイルス粒子は患者血清より精製。
【０１０４】
この結果より完全長ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１を用いたエンザイムイムノアッセイの方が完全長ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−２を用いたエンザイムイムノアッセイよりもＩｇＧ抗体検出率が高かった。
【０１０５】
しかし、完全長ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１に対する反応性よりも、完全長ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−２に対する反応性の強い血清が存在することが分かったので、ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１のみでなくヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−２を至適濃度に加え、好ましくはＶＰ−１を1 〜10μg/ml、ＶＰ−２を1 〜20μg/ml加え、実施例５−（１）の方法でＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに固相した。そこで、ＶＰ−１抗原を用いたエンザイムイムノアッセイでは陰性、ＶＰ−２抗原を用いたエンザイムイムノアッセイでは陽性になる血清を用い、ＶＰ−１とＶＰ−２抗原を混合固相したマイクロプレートを用いたＩｇＧ抗体検出を行った（表６）。
【０１０６】
表６  大腸菌発現抗原ＶＰ−１、ＶＰ−２抗原混合固相マイクロプレートによるＩｇＧ抗体検出
2004187687.tif 000007
その結果、ＶＰ−１またはＶＰ−２抗原のどちらか一方にしか強く反応しない血清も効率よく検出することが出来た。即ちＶＰ−１（またはＶＰ−２）抗原を用いたエンザイムイムノアッセイは陽性で、完全長ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−２（またはＶＰ−１）抗原を用いたエンザイムイムノアッセイは陰性であった血清が、ＶＰ−１とＶＰ−２抗原を混合したエンザイムイムノアッセイでは、すべて陽性になることが判明した。
【０１０７】
（３）ＶＰ−１抗原誘導体を用いた抗パルボウイルスＩｇＧ抗体検出
実施例３−（２）に記載の大腸菌で発現されたＶＰ−１抗原誘導体を50mM  炭酸バッファー(pH9.5) で各々1-10μg/ml濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート（ヌンク社製）に100 μl/wellで分注し、４℃で一晩静置した。１８時間以上静置したマイクロプレートを最終濃度0.05% Tween20 を含むPBS 200 μl/wellで３〜４回洗浄後、最終濃度0.05% 牛血清アルブミン(BSA) と0.05% Tween20 を含む10mM PBS 200μl/well加えて４℃一晩静置し、ＶＰ−１抗原誘導体固相マイクロプレートを作製した。
【０１０８】
次いで伝染性紅斑流行時の血清を用い、前記マイクロプレートによる抗パルボウイルスＩｇＧ抗体検出を行った。はじめにＶＰ−１抗原誘導体固相マイクロプレートウエル中のプレート保存液を除き、その後伝染性紅斑患者血清を0.05% BSA と0.05% Tween20 を含む10mM PBSで２００倍に希釈し、その100 μl を抗原固相マイクロプレートのウエルに加え、室温（１５℃〜２５℃）で約１時間反応させた。反応後、0.05% Tween20 含む5mM PBS 200 μl/wellで３〜４回洗浄した。ついで、0.05% Tween20 含む5mM PBS で約４００００倍に希釈した抗ヒトＩｇＧヤギパーオキシダーゼ標識抗体（ＭＢＬ社）を100 μl/well加え、室温で約１時間反応させた。反応後、0.05% Tween20 含む5mM PBS 200 μl/wellで３〜４回洗浄した。洗浄後、3.3mg/ml  Ｏ−フェニレンジアミン含む０．１Ｍ  クエン酸−リン酸緩衝液(pH 5.0)に、0.02% 過酸化水素水を加えた基質液を100 μl/well加えて室温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を100 μl/well加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計を用いて  主波長４９２ｎｍ、副波長６３０ｎｍで各ウエルのＯ. Ｄ. 値を測定した（表４）。
【０１０９】
表４    伝染性紅斑流行時の血清を用いたＶＰ−１抗原誘導体固相                  
マイクロプレートによる抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体検出
2004187687.tif 000008
ウイルス粒子は患者血清より精製。
【０１１０】
この結果よりウイルス粒子を用いたエンザイムイムノアッセイよりも抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体検出率がかなり低いことが分かった。また、実施例５−（２）の結果から、完全長ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１を用いたエンザイムイムノアッセイの方が部分発現であるＶＰ−１抗原誘導体を用いたエンザイムイムノアッセイより抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体検出率が高く、かつウイルス粒子を用いたエンザイムイムノアッセイとの一致率も高いことが分かった。このことは同じ発現抗原、例えばＶＰ−１抗原とＶＰ−１抗原誘導体の場合、抗原部位の数及び立体構造が抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体検出率の差の原因であると思われた。よって、エンザイムイムノアッセイに用いる発現抗原としては、抗原部位の数及び立体構造がウイルス粒子の抗原部位の数及び立体構造に近いという条件が重要となる。従って、同じ発現抗原でも部分発現抗原より、完全長発現抗原の方が前記条件を満たしていると思われた。
【０１１１】
（４）伝染性紅斑患者血清を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体の経時的変化の検討
実施例５−（１）記載の抗原固相マイクロプレートを用い、実施例５−（２）記載のエンザイムイムノアッセイ法で、伝染性紅斑患者血清の抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体の経時的変化を調べた（図１８）。なお、ＶＰ−１は５μｇ／ｍｌで、ＶＰ−２は１０μｇ／ｍｌで、ＭｉｘはＶＰ−１を５μｇ／ｍｌ、ＶＰ−２を１０μｇ／ｍｌで固相した。
【０１１２】
その結果、ＶＰ−１、ＶＰ−２抗原に対するＩｇＧ抗体は共に出現するが、ＶＰ−１抗原に対するＩｇＧ抗体の方が、ＶＰ−２抗原に対するＩｇＧ抗体より抗体量の持続性は長いことが分かった。
【０１１３】
ところで、ＶＰ−２抗原のタンパク質のコード領域は、ＶＰ−１抗原のＣ末端部分に完全に含まれている。そこで、以前よりヒトパルボウイルスの抗体検出には、ＶＰ−１抗原のみで十分可能であると思われていた。しかし、ＶＰ−１とＶＰ−２抗原は免疫学的な反応性に違いがあることが分かり、かつＩｇＧ抗体量の持続性にも違いがあることが分かり、ヒトパルボウイルスのより確実な診断には、ＶＰ−１抗原のみを用いたエンザイムイムノアッセイではなく、ＶＰ−２抗原も加えたエンザイムイムノアッセイが必要であることが分かった。即ちＶＰ−１及びＶＰ−２抗原混合系の方がＶＰ−１またはＶＰ−２抗原単独系よりもヒトパルボウイルスに対するＩｇＧ抗体の検出率は高くなることが判明した。
【実施例６】
【０１１４】
大腸菌発現抗原ＶＰ−１、ＶＰ−２抗原を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出
（１）抗ヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２抗体に対するパーオキシダーゼ標識
実施例２−（６）に記載の大腸菌で発現されたＶＰ−１、ＶＰ−２抗原各々200 μg/ml 1mlと完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）1ml を等量混合し、エマルジョンを作製して、モルモットに免疫した。ついで不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）1ml を前述の抗原溶液と等量混合しエマルジョンを作製して２回追加免疫した。追加免疫した後、モルモットを全採血した。その血液を血清分離し、硫安分画後、50mM Tris-HCl(pH7.6)で４℃、一晩透析した。次ぎに50mM Tris-HCl(pH7.6)で平衡化したＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーにかけ、ＵＶ波長２８０ｎｍでモニタリングし、Ｏ. Ｄ. のピークを集めて、ＤＥＡＥ精製ＩｇＧ抗体画分とした。
【０１１５】
このＩｇＧ抗体画分を過ヨーソ酸改良法〔酵素免疫測定法,2：91(1982)〕でパーオキシダーゼ標識した。即ちパーオキシダーゼ4mg/mlになるようにように蒸留水で溶解した。ついで、0.1M  過ヨーソ酸ナトリウム 0.2mlを加え、室温で約２０分反応させ、1mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0) で一晩透析した。透析後、0.2M  炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5) を0.02ml加え、pH9-9.5 にすると同時に前記述で精製したＩｇＧ抗体を8mg 加えた。
【０１１６】
室温で約２時間反応させ、4mg/ml  水酸化ホウ素ナトリウムを0.1ml 加え、４℃で約２時間反応させた。反応後、10mM  リン酸バッファーを用いてセファクリルＳ−２００によるゲル濾過を行い、ＵＶ波長２８０ｎｍでモニタリングしてパーオキシダーゼ標識抗体画分を集めた。
【０１１７】
（２）伝染性紅斑流行時の血清８８検体を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出
抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体（ＭＩＬＳ社製）を50mM  炭酸バッファー(pH9.5) で５００〜１０００倍に希釈し、ヌンク社製ポリスチレン平型分割マイクロプレート（高結合タイプ）に100 μl/ウェル  分注し、４℃、１８時間以上静置した。静置後、マイクロプレートを0.05% Tween20 含む5mM PBS 200 μl/ウェルで３〜４回洗浄後、0.5% BSAと0.05% Tween20 含む5mM PBS 200 μl/ウェル加えて４℃、一晩静置し、抗ヒトＩｇＭモノクローナル固相マイクロプレートを作製した。ついで、この抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体固相マイクロプレートを用いて、抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出試薬を試作した。
【０１１８】
次に、この試作した抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出試薬を用いて、伝染性紅斑流行時の血清８８検体を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出を行った。前記述の抗原固相マイクロプレートウエル中のプレート保存液を除き、ついで、伝染性紅斑患者血清を0.2% BSAと0.05% Tween20 含む10mM PBSで２００倍に希釈し、その100 μl を前記述の抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体固相マイクロプレートに100 μl/ウェル加え、室温（15℃〜25℃）で約１時間反応させた。反応後、0.05% Tween20 含む5mM PBS 200 μl/ウェルで３〜４回洗浄した。ついで、前記述で精製した完全長のヒトパルボウイルス構造タンパク質ＶＰ−１、ＶＰ−２を0.5% BSAと0.05% Tween20 を含む5mM PBS で5 μg/ml濃度に希釈し100 μl/ウェル加え、室温で約１時間反応させた。反応後、0.05% Tween20 を含む5mM PBS 200 μl/ウェルで３〜４回洗浄した。0.5% BSAと0.05% Tween20 を含む5mM PBS で２０００〜５０００倍に希釈した前記述、実施例５−（１）のＶＰ−１、ＶＰ−２抗原に対するパーオキシダーゼ標識モルモット抗体を100 μl/ウェル加え、室温で約１時間反応させた。反応後、0.05% Tween20 を含む5mM PBS 200 μl/ウェルで３〜４回洗浄した。洗浄後、3.3mg/ml  Ｏ−フェニレンジアミンを含む0.1M  クエン酸−リン酸緩衝液(pH5.0) に、終濃度0.02% の過酸化水素水を加えた基質液を100 μl/ウェル加えて室温で約３０分間反応させた。反応後、1.5N硫酸を100 μl/ウェル加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計で主波長４９２ｎｍ、副波長６３０ｎｍを用いて各ウエルのＯ. Ｄ. 値を測定した（表７）。
【０１１９】
表７  伝染性紅斑患者血清を用いた大腸菌発現抗原ＶＰ−１抗原によるＩｇＭ抗体検出
2004187687.tif 000009
【０１２０】
その結果、伝染性紅斑患者血清より精製したヒトパルボウイルス粒子を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出エンザイムイムノアッセイと比較したところ、検出感度がやや低いものの特異性は高かった。
【０１２１】
従って、本発明である大腸菌で発現させた構造タンパク質は、抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出に有用である事が分かった。
【実施例７】
【０１２２】
バキュロウイルス発現蛋白 Empty particle を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体検出
（１）バキュロウイルス発現蛋白 Empty particle 固相プレートの作製
実施例４−（３）に記載のバキュロウイルス発現蛋白 Empty particle を１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）で各々０．１〜１０μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μｇ／ウェルで分注し、４℃で１〜２日間静置した。１〜２日間静置したマイクロプレートを最終濃度０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０  を含むＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄後、最終濃度０．０５％  牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭＰＢＳ  ２００μｌ／ウェル加えて４℃一晩静置し、バキュロウイルス発現抗原Empty particles 固相マイクロプレートを作製した。
【０１２３】
（２）伝染性紅斑患者血清８８検体を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体検出
前記述の抗原固相マイクロプレートウエル中のプレート保存液を除いた後、伝染性紅斑患者血清を０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２００倍に希釈し、その１００μｌを抗原固相マイクロプレートのウエルに加え、室温（１５℃〜２５℃）で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄した。ついで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳで約２００００〜４００００倍に希釈した抗ヒトＩｇＧヤギパーオキシダーゼ標識抗体（ＭＢＬ社）を１００μｌ／ウェル加え、室温で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄した。洗浄後、３．３ｍｇ／ｍｌの  Ｏ−フェニレンジアミン含む０．１Ｍ  クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、０．０２％過酸化水素水を加えた基質液を１００μｌ／ウェル加えて室温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェル加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計を用いて  主波長４９２ｎｍ、副波長６３０ｎｍで各ウエルのＯ. Ｄ. 値を測定した（表８）。
【０１２４】
表８  伝染性紅斑患者血清８８検体を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体検出
2004187687.tif 000010
【０１２５】
この結果より、伝染性紅斑患者血清中より精製したヒトパルボウイルス粒子を用いたＩｇＧ抗体検出エンザイムイムノアッセイとバキュロウイルス発現蛋白Empty particle  を用いたＩｇＧ抗体検出エンザイムイムノアッセイの成績を比較したところ、陽性一致率が１００％で陰性一致率も１００％であった。
以上より、バキュロウイルス発現蛋白 Empty particle を用いたＩｇＧ抗体検出エンザイムイムノアッセイは、検出感度及び特異性ともに、文献など他のヒトパルボウイルスＩｇＧ抗体検出エンザイムイムノアッセイよりも高いので、より確実なＩｇＧ抗体検出が可能と成った。
【実施例８】
【０１２６】
バキュロウイルス発現蛋白 Empty particlesを用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出
（１）抗バキュロウイルス発現蛋白 Empty particles  抗体に対するパーオキシダーゼ標識
実施例４−（３）に記載のバキュロウイルス発現蛋白 Empty particles  各々１０〜５００μｇ／ｍｌを１ｍｌと完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）１ｍｌを等量混合し、エマルジョンを作製して、モルモットに免疫した。ついで不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）1ml を前述の抗原溶液と等量混合しエマルジョンを作製して２回追加免疫した。追加免疫した後、モルモットを全採血した。その血液を血清分離し、硫安分画後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で４℃、一晩透析した。次に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で平衡化したＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーにかけ、ＵＶ波長２８０ｎｍでモニタリングし、Ｏ. Ｄ. のピークを集めて、ＤＥＡＥ精製ＩｇＧ抗体画分とした。
【０１２７】
このＩｇＧ抗体画分を過ヨーソ酸改良法〔酵素免疫測定法,2：91(1982)〕でパーオキシダーゼ標識した。即ちパーオキシダーゼ４ｍｇ／ｍｌになるようにように蒸留水で溶解した。ついで、０．１Ｍ  過ヨーソ酸ナトリウム  ０．２ｍｌを加え、室温で約２０分反応させ、１ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で一晩透析した。透析後、０．２Ｍ  炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を０．０２ｍｌ加え、ｐＨ９〜９．５にすると同時に前記述で精製したＩｇＧ抗体を８ｍｇ加えた。
【０１２８】
室温で約２時間反応させ、４ｍｇ／ｍｌ水酸化ホウ素ナトリウムを０．１ｍｌ加え、４℃で約２時間反応させた。反応後、１０ｍＭ  リン酸バッファーを用いてセファクリルＳ−２００によるゲル濾過を行い、ＵＶ波長２８０ｎｍでモニタリングしてパーオキシダーゼ標識抗体画分を集めた。
【０１２９】
（２）伝染性紅斑流行時の血清８８検体を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗    体検出
抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体（ＭＩＬＳ社製）を５０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で５００〜１０００倍に希釈し、ヌンク社製ポリスチレン平型分割マイクロプレート（高結合タイプ）に１００μｌ／ウェル分注し、４℃、１８時間以上静置した。静置後、マイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む５ｍＭＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄後、０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む５ｍＭＰＢＳ  ２００μｌ／ウェル加えて４℃、一晩静置し、抗ヒトＩｇＭモノクローナル固相マイクロプレートを作製した。ついで、この抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体固相マイクロプレートを用いて、抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出試薬を試作した。
【０１３０】
次に、この試作した抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出試薬を用いて、伝染性紅斑流行時の血清８８検体を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出を行った。はじめに、前記述の抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体固相マイクロプレートウエル中のプレート保存液を除いた。ついで、伝染性紅斑患者血清を０．２％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む１０ｍＭ  ＰＢＳで２００倍に希釈し、前記述の抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体固相マイクロプレートに１００μｌ／ウェル加え、室温（１５℃〜２５℃）で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む５ｍＭＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄した。ついで、前記述で精製したバキュロウイルス発現抗原 Empty particlesを０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む５ｍＭＰＢＳで０．０５〜５．０μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、それを１００μｌ／ウェル加え、室温で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄した。０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳで２０００〜２００００倍に希釈した前記述、実施例８−（１）のバキュロウイルス発現抗原 Empty particle に対するパーオキシダーゼ標識モルモット抗体を１００μｌ／ウェル加え、室温で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄した。洗浄後、３．３ｍｇ／ｍｌ  Ｏ−フェニレンジアミンを含む０．１Ｍ  クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、終濃度０．０２％の過酸化水素水を加えた基質液を１００μｌ／ウェル加えて室温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェル加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計で主波長４９２ｎｍ、副波長６３０ｎｍ  を用いて各ウエルのＯ. Ｄ. 値を測定した（表９）。
【０１３１】
表９  伝染性紅斑流行時の血清８８検体を用いた抗ヒトパルボウイルスＩｇＭ抗体検出
2004187687.tif 000011
【０１３２】
この結果より、伝染性紅斑患者血清中より精製したヒトパルボウイルス粒子を用いたＩｇＭ抗体検出エンザイムイムノアッセイとバキュロウイルス発現蛋白Empty particle  を用いたＩｇＭ抗体検出エンザイムイムノアッセイの成績を比較したところ、陽性一致率が１００％で陰性一致率も１００％であった。
【０１３３】
以上より、バキュロウイルス発現蛋白 Empty particle を用いたＩｇＭ抗体検出エンザイムイムノアッセイは、検出感度及び特異性ともに、文献などのヒトパルボウイルス抗体検出エンザイムイムノアッセイよりも高いので、より確実な抗体検出が可能となった。
【実施例９】
【０１３４】
ヒトパルボウイルス抗原検出
（１）ＶＰ−１、ＶＰ−２抗原に対する抗体固相マイクロプレートの作製
実施例６−（１）記載の抗ヒトパルボウイルスモルモット抗体を５０ｍＭ  炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で、０．１〜５．０μｌ／ｍｌに希釈した。希釈後、ポリスチレン平型マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μｌ／ウェル分注し、４℃で１８時間以上静置した。静置後、マイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄後、０．５％ＢＳＡと０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳを２００μｌ／ウェル加えて４℃一晩静置し、抗体固相マイクロプレートを作製した。
【０１３５】
（２）伝染性紅斑流行時の血清を用いたヒトパルボウイルス抗原検出
次に、抗体固相プレートを用いて、伝染性紅斑流行時の血清によるヒトパルボウイルス抗原検出を行った。前記述の抗体固相マイクロプレートウエル中のプレート保存液を除き、ついで、伝染性紅斑流行時の血清を０．２％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む１０ｍＭＰＢＳで２００倍に希釈し、前記述の抗ヒトパルボウイルス抗体固相マイクロプレートに１００μｌ／ウェル加え、室温（１５℃〜２５℃）で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄した。
【０１３６】
０．０５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳで２０００〜５０００倍に希釈したＶＰ−１、ＶＰ−２抗原に対するパーオキシダーゼ標識モルモット抗体を１００μｌ／ウェル加え、室温で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０  含む５ｍＭＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで３〜４回洗浄した。
【０１３７】
洗浄後、３．３mg/ml Ｏ−フェニレンジアミンを含む０．１Ｍ  クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、終濃度０．０２％の過酸化水素水を加えた基質液を１００μｌ／ウェル加えて室温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ  硫酸を１００μｌ／ウェル加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計で主波長４９２ｎｍ、副波長６３０ｎｍ  を用いて各ウエルのＯ. Ｄ. 値を測定した（表１０）。
【０１３８】
表１０  伝染性紅斑患者血清を用いたＶＰ−１、ＶＰ−２抗原に対する抗体固相プレートによるヒトパルボウイルス抗原の検出
2004187687.tif 000012
【０１３９】
抗ヒトパルボウイルスモノクローナル抗体固相マイクロプレートを用いたエンザイムイムノアッセイ〔第３７回日本ウイルス学会総会抄録(1989)〕を陽性コントロールとした。
【０１４０】
その結果、ＶＰ−１、ＶＰ−２抗原で免疫した抗ヒトパルボウイルス抗体を用いたヒトパルボウイルス抗原検出は有用であることが分かった。
【実施例１０】
【０１４１】
ＰＣＲ法によるヒトパルボウイルス遺伝子の検出
伝染性紅斑流行時の血清を用い、実施例１−（１）記載の方法によりヒトパルボウイルスＤＮＡを抽出した。次に下記のＤＮＡプライマー群１及びＤＮＡプライマー群２の中からヒトパルボウイルスのＰＣＲ増幅プライマーＤＮＡ対（D-4 とU-2 及びD-1 とU-4 ）を用いて実施例１−（２）記載の方法に従い、ヒトパルボウイルス遺伝子領域を増幅した。なお図１に４種類のプライマーの位置を示す。
【０１４２】
ＤＮＡプライマー群１
D-1: GCTGCCATGTGGGAGCTTCTAATC 
D-4: TTCCCGCCTTATGCAAATGGGCAGC
ＤＮＡプライマー群２
U-2: GTGTTAGGCTGTCTTATAGGTACA 
U-4: CTTGTATTCATGGTCTACTAAC 
D-4 とU-2 のプライマーで増幅させた場合、4.6Kb の増幅断片が得られ、一方、D-1 とU-4 のプライマーで増幅させた場合、2.6Kb の増幅断片が得られた（表１１）。
【０１４３】
表１１  伝染性紅斑患者血清を用いたＰＣＲによるヒトパルボウイルスの検出
2004187687.tif 000013
【０１４４】
表１１の結果より、ヒトパルボウイルスＤＮＡ断片の増幅と実施例９−（２）のエンザイムイムノアッセイ抗原検出の結果が一致していた事により、ヒトパルボウイルス遺伝子の塩基配列をもとに、ＤＮＡプライマーを作製し、ＰＣＲ法で増幅させたＤＮＡ断片を検出することで、ヒトパルボウイルス遺伝子の検出が出来ることを見いだした。
【０１４５】
以下に明細書及び図中のポリペプチド及び塩基配列等の符号及び記号は以下の通りであるほか、慣用的に当該分野で用いられるものである。
【０１４６】
表１２
アミノ酸略号
2004187687.tif 000014
【０１４７】
表１３
核酸略号
2004187687.tif 000015
【０１４８】
ＨＰＶ  ：ヒトパルボウイルス
ＤＮＡ  ：デオキシリボ核酸
ＲＮＡ  ：リボ核酸
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ  ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＩＰＴＧ：イソプロピルβ- Ｄ- ガラクトシド
Ｘｇａｌ：５- ブロモ−４- クロロ−３- インドリル−β- Ｄ- ガラクトシド  ＰＣＲ  ：ポリメラーゼ・チェーン・リアクション
Ａｐr  ：アンピシリン耐性遺伝子
ＬａｃＺ：β- ガラクトシダーゼ遺伝子
ＶＰ−１：ヒトパルボウイルス構造タンパク質遺伝子ＶＰ−１
ＶＰ−２：ヒトパルボウイルス構造タンパク質遺伝子ＶＰ−２
ＮＳ    ：ヒトパルボウイルス非構造遺伝子
Ｎ’    ：Ｎタンパク質のＮ末端の３３個のアミノ酸に対応するλファージＮタンパク質遺伝子
Ｐtac   ：Ｔａｃプロモーター
ＰL     ：ＰL プロモーター
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】本発明の遺伝子のクローニング領域を示した概略図である。
【図２】本発明の遺伝子の塩基配列及びその遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列の最初の部分を示したものである。
【図３】図２の続きの配列を示す図である。
【図４】図３の続きの配列を示す図である。
【図５】図４の続きの配列を示す図である。
【図６】図５の続きの配列を示す図である。
【図７】図６の続きの配列を示す図である。
【図８】図７の続きの配列を示す図である。
【図９】図８の続きの配列を示す図である。
【図１０】図９の続きの配列を示す図である。
【図１１】プラスミドpPLN-MCSの構築の模式図である。
【図１２】プラスミドpVP200の構築の模式図である。
【図１３】ＶＰ−１発現ベクター作製時の部位特異的変異を示した模式図である。
【図１４】プラスミドpVP100の構築の模式図である。
【図１５】プラスミドpVP300の構築の模式図である。
【図１６】プラスミドpAcVP1、pAcVP2の構築の模式図である。
【図１７】バキュロウイルスによって産生されたウイルス粒子様構造物の電子顕微鏡写真である。
【図１８】伝染性紅斑患者のＶＰ−１、ＶＰ−２に対するＩｇＧ抗体の経時変化を示す図である。
【図１】
2004187687.tif 000016
【図２】
2004187687.tif 000017
【図３】
2004187687.tif 000018
【図４】
2004187687.tif 000019
【図５】
2004187687.tif 000020
【図６】
2004187687.tif 000021
【図７】
2004187687.tif 000022
【図８】
2004187687.tif 000023
【図９】
2004187687.tif 000024
【図１０】
2004187687.tif 000025
【図１１】
2004187687.tif 000026
【図１２】
2004187687.tif 000027
【図１３】
2004187687.tif 000028
【図１４】
2004187687.tif 000029
【図１５】
2004187687.tif 000030
【図１６】
2004187687.tif 000031
【図１８】
2004187687.tif 000032
【図１７】
2004187687.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月23日(2004.2.23)
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のＤＮＡプライマー群１及びＤＮＡプライマー群２の中からそれぞれ少なくとも１種ずつ選ばれる１対のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ法により下記式(1)で示される塩基配列を有する遺伝子を増幅し、該増幅された遺伝子を検出することから成る、検体中のヒトパルボウイルスの検出方法。
ＤＮＡプライマー群１
D-1: GCTGCCATGTGGGAGCTTCTAATC 
D-4: TTCCCGCCTTATGCAAATGGGCAGC
ＤＮＡプライマー群２
U-2: GTGTTAGGCTGTCTTATAGGTACA 
U-4: CTTGTATTCATGGTCTACTAAC 
式(1)
10         20         30         40         50         60       
TTCCCGCCTT ATGCAAATGG GCAGCCATTT TAAGTGTTTT ACTATAATTT TATTGGTCAG       
70         80         90        100        110        120       
TTTTGTAACG GTTAAAATGG GCGGAGCGTA GGCGGGGACT ACAGTATATA TAGCACGGCA       
130        140        150        160        170        180       
CTGCCGCAGC TCTTTCTTTC TGGGCTGCTT TTTCCTGGAC TTTCTTGCTG TTTTTTGTGA       
190        200        210        220        230        240       
GCTAACTAAC AGGTATTTAT ACTACTTGTT AACATACTAA CATGGAGCTA TTTAGAGGGG       
250        260        270        280        290        300       
TTCTTCAAGT TTCTTCTAAT GTTCTGGACT GTGCTAACGA TAATTGGTGG TGCTCTTTAC       
310        320        330        340        350        360       
TGGATTTAGA CACTTCTGAC TGGGAACCAC TAACTCATAC TAACAGACTA ATGGCAATAT       
370        380        390        400        410        420       
ACTTAAGCAG TGTGGCTTCT AAGCTTGACT TTACCGGGGG GCCACTAGCA GGGTGCTTGT       
430        440        450        460        470        480       
ACTTTTTTCA AGTAGAATGT AACAAATTTG AAGAAGGCTA TCATATTCAT GTGGTTATTG       
490        500        510        520        530        540       
GGGGGCCAGG GTTAAATCCC AGAAACCTCA CTGTGTGTGT AGAGGGGTTA TTTAATAATG       
550        560        570        580        590        600       
TACTTTATCA CCTTGTAACT GAAAATGTGA AGCTAAAATT TTTGCCAGGM ATGACTACAA       
610        620        630        640        650        660       
AAGGCAAATA CTTTAGAGAT GGAGAGCAGT TTATAGAAAA CTATTTAATG AAAAAAATAC       
670        680        690        700        710        720       
CTTTAAATGT TGTATGGTGT GTTACTAATA TTGATGGATA TATAGATACC TGTATTTCTG       
730        740        750        760        770        780       
CTACTTTTAG AAGGGGAGCT TGCCATGCCA AGAAACCCCG CATTACCACA GCCATAAATG       
790        800        810        820        830        840       
ATACTAGTAG TGATGCTGGG GAGTCTAGCG GCACAGGGGC AGAGGTTGTG CCATTTAATG       
850        860        870        880        890        900       
GGAAAGGAAC TAAGGCTAGC ATAAAGTTTC AAACTATGGT AAACTGGCTG TGTGAAAACA       
910        920        930        940        950        960       
GAGTGTTTAC AGAGGATAAG TGGAAACTAG TTGACTTTAA CCAGTACACT TTACTAAGCA       
970        980        990       1000       1010       1020       
GTAGTCACAG TGGAAGTTTT CAAATTCAAA GTGCACTAAA ACTAGCAATT TATAAAGCAA       
1030       1040       1050       1060       1070       1080       
CTAATTTAGT GCCTACTAGC ACATTTTTAT TGCATACAGA CTTTGAGCAG GTTATGTGTA       
1090       1100       1110       1120       1130       1140       
TTAAAGACAA TAAAATTGTT AAATTGTTAC TTTGTCAAAA CTATGACCCC CTATTGGTGG       
1150       1160       1170       1180       1190       1200       
GGCAGCATGT GTTAAAGTGG ATTGATAAAA AATGTGGCAA AAAAAATACA CTGTGGTTTT       
1210       1220       1230       1240       1250       1260       
ATGGGCCGCC AAGTACAGGA AAAACAAACT TGGCAATGGC CATTGCTAAA AGTGTTCCAG       
1270       1280       1290       1300       1310       1320       
TATATGGCAT GGTTAACTGG AATAATGAAA ACTTTCCATT TAATGATGTA GCAGGGAAAA       
1330       1340       1350       1360       1370       1380       
GCTTGGTGGT CTGGGATGAA GGTATTATTA AGTCTACAAT TGTAGAAGCT GCAAAAGCCA       
1390       1400       1410       1420       1430       1440       
TTTTAGGCGG GCAACCTACC AGGGTAGATC AAAAAATGCG TGGAAGTGTA GCTGTGCCTG       
1450       1460       1470       1480       1490       1500       
GAGTACCTGT GGTTATAACC AGCAATGGTG ATATTACTTT TGTTGTAAGC GGGAACACTA       
1510       1520       1530       1540       1550       1560       
CAACAACTGT ACATGCTAAA GCCTTAAAAG AGCGCATGGT AAAGTTAAAC TTTACTGTAA       
1570       1580       1590       1600       1610       1620       
GATGCAGCCC TGACATGGGG TTACTAACAG AGGCTGATGT ACAACAGTGG CTTACATGGT       
1630       1640       1650       1660       1670       1680       
GTAATGCACA AAGCTGGGAC CACTATGAAA ACTGGGCAAT AAACTACACT TTTGATTTCC       
1690       1700       1710       1720       1730       1740       
CTGGAATTAA TGCAGATGCC CTCCACCCAG ACCTCCAAAC CACCCCAATT GTCACAGACA       
1750       1760       1770       1780       1790       1800       
CCAGTATCAG CAGCAGTGGT GGTGAAAGCT CTGAAGAACT CAGTGAAAGC AGCTTTTTTA       
1810       1820       1830       1840       1850       1860       
ACCTCATCAC CCCAGGCGCC TGGAACACTG AAACCCCGCG CTCTAGTACG CCCATCCCCG       
1870       1880       1890       1900       1910       1920       
GGACCAGTTC AGGAGAATCA TTTGTCGGAA GCCCAGTTTC CTCCGAAGTT GTAGCTGCAT       
1930       1940       1950       1960       1970       1980       
CGTGGGAAGA AGCCTTCTAC ACACCTTTGG CAGACCAGTT TCGTGAACTG TTAGTTGGGG       
1990       2000       2010       2020       2030       2040       
TTGATTATGT GTGGGACGGT GTAAGGGGTT TACCTGTGTG TTGTGTGCAA CATATTAACA       
2050       2060       2070       2080       2090       2100       
ATAGTGGGGG AGGCTTGGGA CTTTGTCCCC ATTGCATTAA TGTAGGGGCT TGGTATAATG       
2110       2120       2130       2140       2150       2160       
GATGGAAATT TCGAGAATTT ACCCCAGATT TGGTGCGGTG TAGCTGCCAT GTGGGAGCTT       
2170       2180       2190       2200       2210       2220       
CTAATCCCTT TTCTGTGCTA ACCTGCAAAA AATGTGCTTA CCTGTCTGGA TTGCAAAGCT       
2230       2240       2250       2260       2270       2280       
TTGTAGATTA TGAGTAAAGA AAGTGGCAAA TGGTGGGAAA GTGATGATAA ATTTGCTAAA       
2290       2300       2310       2320       2330       2340       
GCTGKGTATC AGCAATTTGT GGAATTTTAT GAAAAGGTTA CTGGWACAGA CTTAGAGCTT       
2350       2360       2370       2380       2390       2400       
ATTCAAATAT TAAAAGATCA TTATAATATT TCTTTAGATA ATCCCCTAGA AAACCCATCC       
2410       2420       2430       2440       2450       2460       
TCTCTGTTTR ACTTAGTTGC TCGTATTAAA AATAACCTTA AAAACTCTCC AGACTTATAT       
2470       2480       2490       2500       2510       2520       
AGTCATCATT TTCAAAGTCA TGGACAGTTA TCTGACCACC CCCATGCCTT ATCATCCAGT       
2530       2540       2550       2560       2570       2580       
AGCAGTAATG CAGAACCTAG AGGAGAAAAT GCAGTATTAT CTAGTGAAGA CTTACACAAG       
2590       2600       2610       2620       2630       2640       
CCTGGGCAAG TTAGCGTACA ACTACCCGGT ACTAACTATG TTGGGCCTGG TAATGAGTTA       
2650       2660       2670       2680       2690       2700       
CAAGCTGGGC CCCCGCAAAG TGCTGTTGAC AGTGCTGCAA GGATTCATGA CTTTAGGTAT       
2710       2720       2730       2740       2750       2760       
AGCCAACTGG CTAAGTTGGG AATAAATCCA TATACTCATT GGACTGTAGC AGATGAAGAG       
2770       2780       2790       2800       2810       2820       
CTTTTAAAAA ATATAAAAAA TGAAACTGGG TTTCAAGCAC AAGTAGTAAA AGACTACTTT       
2830       2840       2850       2860       2870       2880       
ACTTTAAAAG GTGCAGCTGC CCCTGTGGCC CATTTTCAAG GAAGTTTGCC GGAAGTTCCC       
2890       2900       2910       2920       2930       2940       
GCTTACMACG CCTCAGAAAA ATACCCAAGC ATGACTTCAG TTAATTCTGC AGAAGCCAGC       
2950       2960       2970       2980       2990       3000       
ACTGGTGCAG GAGGGGGGGG CAGTAATCCT GTCAAAAGCA TGTGGAGTGA GGGGGCCACT       
3010       3020       3030       3040       3050       3060       
TTTAGTGCCA ACTCTGTAAC TTGTACATTT TCCAGACAGT TTTTAATTCC ATATGACCCA       
3070       3080       3090       3100       3110       3120       
GAGCACCATT ATAARGTGTT TTCTCCCGCA GCAAGTAGCT GCCACAATGC CAGTGGAAAA       
3130       3140       3150       3160       3170       3180       
GAGGCAAAGG TTTGCACCAT TAGTCCCATA ATGGGATACT CAACCCCATG GAGATATTTA       
3190       3200       3210       3220       3230       3240       
GATTTTAATG CTTTAAATTT ATTTTTTTCA CCTTTAGAGT TTCAGCACTT AATTGAAAAT       
3250       3260       3270       3280       3290       3300       
TATGGAAGCA TAGCTCCTGA TGCTTTAACT GTAACCATAT CAGAAATTGC TGTTAAGGAT       
3310       3320       3330       3340       3350       3360       
GTTACAGACA AAACTGGAGG GGGGGTACAG GTTACTGACA GCACTACAGG GCGCCTATGC       
3370       3380       3390       3400       3410       3420       
ATGTTAGTAG ACCATGAATA CAAGTACCCA TATGTGTTAG GGCAAGGTCA GGATACTTTA       
3430       3440       3450       3460       3470       3480       
GCCCCAGAAC TTCCTATTTG GGTATACTTT CCCCCTCAAT ATGCTTACTT AACAGTAGGA       
3490       3500       3510       3520       3530       3540       
GATGTTAACA CACAAGGAAT TTCTGGAGAC AGCAAAAAAT TAGCAAGTGA AGAATCAGCA       
3550       3560       3570       3580       3590       3600       
TTTTATGTTT TGGAACACAG TTCYTTTCAG CTTTTAGGTA CAGGAGGTAC AGCAACTATG       
3610       3620       3630       3640       3650       3660       
TCTTATAAGT TTCCTCCAGT GCCCCCAGAA AATTTAGAGG GCTGCAGTCA ACACTTTTAT       
3670       3680       3690       3700       3710       3720       
GAAATGTACA ATCCCTTATA CGGATCCCGC TTAGGGGTCC CTGACACATT AGGAGGTGAC       
3730       3740       3750       3760       3770       3780       
CCAAAATTTA GATCTTTAAC ACATGAAGAC CATGCAATTC AGCCCCAAAA CTTCATGCCA       
3790       3800       3810       3820       3830       3840       
GGGCCACTAG TAAACTCAGT GTCTACAAAG GAGGGAGACA GCTCTAATAC TGGAGCTGGA       
3850       3860       3870       3880       3890       3900       
AAAGCCTTAA CAGGCCTTAG CACAGGTACC TCGCAAAACA CTAGAATATC CTTACGSCCT       
3910       3920       3930       3940       3950       3960       
GGGCCAGTGT CTCAGCCATA CCACCACTGG GACACAGATA AATATGTCAC AGGAATAAAT       
3970       3980       3990       4000       4010       4020       
GCCATTTCTC ATGGTCAGAC CACTTATGGT AACGCTGAAG ACAAAGAGTA TCAGCAAGGA       
4030       4040       4050       4060       4070       4080       
GTGGGTAGAT TTCCAAATGA AAAAGAACAG CTAAAACAGT TACAGGGTTT AAACATGCAC       
4090       4100       4110       4120       4130       4140       
ACCTATTTYC CCAATAAAGG AACCCAGCAA TATACAGATC AAATTGAGCG CCCCCTAATG       
4150       4160       4170       4180       4190       4200       
GTGGGTTCTG TATGGAACAG AAGAGCCCTT CACTATGAAA GCCAGCTGTG GAGTAAAATT       
4210       4220       4230       4240       4250       4260       
CCAAATTTAG ATGACAGTTT TAAAACTCAG TTTGCAGCCT TAGGAGGATG GGGTTTGCAT       
4270       4280       4290       4300       4310       4320       
CAGCCACCTC CTCAAATATT TTTAAAAATA TTACCACAAA GTGGGCCAAT TGGAGGTATT       
4330       4340       4350       4360       4370       4380       
AAATCAATGG GAATTACTAC CTTAGTTCAG TATGCTGTGG GAATTATGAC AGTAACTATG       
4390       4400       4410       4420       4430       4440       
ACATTTAAAT TGGGGCCCCG TAAAGCTACG GGACGGTGGA ATCCTCAACC TGGAGTATAT       
4450       4460       4470       4480       4490       4500       
CCCCCGCACG CAGCAGGTCA TTTACCATAT GTACTATATG ACCCCACAGC TATAGATGCA       
4510       4520       4530       4540       4550       4560       
AAACAACACC ACAGACATGG ATATGAAAAG CCTGAAGAGT TGTGGACAGC CAAAAGCCGT       
4570       4580       4590       4600       4610       4620       
GTGCGCCCAT TGTAAACACT CCCCACCGTG CCCTCAGCCA GGATGCGTAA CTAAACGCCC       
4630       4640       4650       4660       4670       4680       
ACCAGTACCA CCCAGACTGT ACCTGCCCCC TCCTGTACCT ATAAGACAGC CTAACAC          
（ただし、式中、M は A  または C、R は A  または G、W は A  または T、S は C  または G、Y は C  または T、K は G  または T  の塩基を示す。）
【請求項２】
前記プライマーD-4とU-2を用いる請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１記載のプライマーD-1, D-4, U-2又はU-4。