(57)【要約】【課題】多数のサンプルを処理することができ、細胞に取り込まれた色素による弊害がない生体細胞組織の活動電位検出方法および装置を提供する。【解決手段】生体細胞組織の成熟により生じる該組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することによって、前記組織の成熟度あるいは組織機能を評価する装置であって、前記磁気変化を検出する磁気検出器としてＳＱＵＩＤ磁気センサ３を具備し、前記磁気センサ３が生体細胞塊試料４の下方に配置され、生体細胞塊試料４対磁気センサ３間距離が小さくなる配置構成とした。【選択図】    図１
2004219109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体細胞組織の成熟により生じる該組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することによって、前記組織の成熟度あるいは組織機能を評価することを特徴とする生体細胞組織の活動電位検出方法。
【請求項２】
生体細胞組織に薬液を加えて生じる該組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することによって、前記薬液の薬効を評価することを特徴とする生体細胞組織の活動電位検出方法。
【請求項３】
光照射、電磁波などの外界からの刺激を生体細胞組織に与えて生じる該組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することにより、前記組織の機能を評価することを特徴とする生体細胞組織の活動電位検出方法。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載の生体細胞組織の活動電位検出方法において、ＳＱＵＩＤ磁気センサを磁気検出器として用いることを特徴とする生体細胞組織の活動電位検出方法。
【請求項５】
（ａ）生体細胞組織の成熟により生じる該組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測する手段と、
（ｂ）該磁気変化を計測する手段によって、前記組織の成熟度あるいは組織機能を評価する手段とを具備することを特徴とする生体細胞組織の活動電位検出装置。
【請求項６】
（ａ）生体細胞組織に薬液を加えて生じる該組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測する手段と、
（ｂ）該磁気変化を計測する手段によって、前記薬液の薬効を評価する手段とを具備することを特徴とする生体細胞組織の活動電位検出装置。
【請求項７】
（ａ）光照射、電磁波などの外界からの刺激を生体細胞組織に与えて生じる該組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測する手段と、
（ｂ）該磁気変化を計測する手段によって、前記組織の機能を評価する手段とを具備することを特徴とする生体細胞組織の活動電位検出装置。
【請求項８】
生体細胞組織の成熟により生じる該組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することによって、前記組織の成熟度あるいは組織機能を評価する装置であって、前記磁気変化を検出する磁気検出器としてＳＱＵＩＤ磁気センサを具備し、前記磁気センサが生体細胞塊試料の近傍に配置され、前記生体細胞塊試料対磁気センサ間距離が小さくなる配置構成としたことを特徴とする生体細胞組織評価装置。
【請求項９】
生体細胞組織に薬液を加えて生じる該組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することによって、前記薬液の薬効を評価する装置であって、前記磁気変化を検出する磁気検出器としてＳＱＵＩＤ磁気センサを具備し、前記磁気センサが生体細胞塊試料の近傍に配置され、前記生体細胞塊試料対磁気センサ間距離が小さくなる配置構成としたことを特徴とする生体細胞組織評価装置。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の生体細胞組織評価装置において、前記磁気センサが生体細胞塊試料の下方に配置されることを特徴とする生体細胞組織評価装置。
【請求項１１】
請求項８又は９記載の生体細胞組織評価装置において、前記生体細胞塊試料を培養するための培養ディッシュとして、また評価時には支持体として用いるプレートあるいはフィルムの厚さが３ｍｍ以下であることを特徴とする生体細胞組織評価装置。
【請求項１２】
請求項８又は９記載の生体細胞組織評価装置において、前記ＳＱＵＩＤ磁気センサが、高温超伝導ＳＱＵＩＤあるいは高温超伝導差分型グラジオメータであることを特徴とする生体細胞組織評価装置。
【請求項１３】
請求項８又は９記載の生体細胞組織評価装置において、前記生体細胞塊試料を順次計測できるよう、試料移動機構を具備することを特徴とする生体細胞組織評価装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体細胞組織の微弱な活動電位変化の検出における新しい原理に基づく検出装置に関するものである。この装置は、心臓・骨格筋などの、動きと膜電位変化を伴う組織の培養生体組織を利用する再生工学の分野、あるいは臓器のような機能細胞の培養組織を利用する薬効評価の分野において、検査の効率化と精密化をもたらすものである。
【０００２】
【従来の技術】
心臓や神経、筋肉などでは、イオンの流れによる膜電位変化により活動電位変化を生じることで、それぞれ組織の機能を発揮することが知られている。このような組織の機能を評価するためには、数十倍の顕微鏡で拡大し、一つ一つの細胞をマイクロメートルサイズの検出針（マイクロプローブ）で測定することが多かったが、これは工業化された再生工学、スクリーニングテストに用いられる組織の評価などには適さない。特に、再生工学では、細胞培養技術を利用して幹細胞や胎児組織から活動電位変化を伴う組織（心臓など）を再構成するため、構成された組織を無侵襲で組織全体について評価する検査方法が必要である。さらに薬効や外部刺激のスクリーニングテストに用いられる培養組織の評価でも、非侵襲で効率的な活動電位変化検出法が求められていた。
【０００３】
そこで、これまで微小な培養組織の活動電位変化を非侵襲で効率的に検出する方法として、微小多点電極を利用する方法（〔非特許文献１〕、〔非特許文献２〕参照）と膜電位感応色素による色素プローブ法を利用する方法（〔非特許文献３〕、〔非特許文献４〕参照）が用いられてきた。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｈｏｎｍａ  Ｓ．，Ｓｈｉｒａｋａｗａ  Ｔ．，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｗ．＆  Ｈｏｎｍａ  Ｋ．２０００  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２９４，１１３−１１６
【非特許文献２】
Ｃｌａｖｅｒｏｌ−Ｔｉｎｔｕｒｅ  Ｅ．＆  Ｐｉｎｅ  Ｊ．２００２  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１７，１３−２１
【非特許文献３】
Ｄｅｖｏｒ  Ａ．＆  Ｙａｒｏｍ  Ｙ．２００１  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ８７，３０５９−３０６９
【非特許文献４】
Ｊｉｎ  Ｗ．，Ｚｈａｎｇ  Ｒ．＆  Ｗｕ  Ｊ．２００２  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１５，１３−２７
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、微小多点電極を利用する方法は、培養組織に電極を直接接触させないと測定できないため、電極面上で細胞を培養する必要がある。さらに、検査後の組織を電極から分離することが困難になるため、再生工学における検出装置として利用することは不可能である。また、電極上の培養であるため、技術的に安定した結果を得るためには高い習熟度が要求され、多数のサンプルを処理することが必要となるが、それは大変困難であるため、薬効や外部刺激のスクリーニングテストの検出装置として用いるのも難しい。
【０００６】
また、膜電位感応色素による色素プローブ法は、比較的簡便な方法であるが、細胞に色素を取り込ませるため再生工学試料には利用できない。
【０００７】
さらに、細胞に取り込まれた色素によって細胞内でラジカルが発生し、測定対象の細胞に傷害を与えることから、長期間の観察が必要な培養組織の成熟度のモニターなどには使用できないという問題点を抱えている。
【０００８】
本発明は、上記状況に鑑みて、多数のサンプルを処理することができ、細胞に取り込まれた色素による弊害がない生体細胞組織の活動電位検出方法および装置を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕生体細胞組織の活動電位検出方法において、生体細胞組織の成熟により生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することによって、前記組織の成熟度あるいは組織機能を評価することを特徴とする。
【００１０】
〔２〕生体細胞組織の活動電位検出方法において、生体細胞組織に薬液を加えて生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することによって、前記薬液の薬効を評価することを特徴とする。
【００１１】
〔３〕生体細胞組織の活動電位検出方法において、光照射、電磁波などの外界からの刺激を生体細胞組織に与えて生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することにより、前記組織の機能を評価することを特徴とする。
【００１２】
〔４〕上記〔１〕、〔２〕又は〔３〕記載の生体細胞組織の活動電位検出方法において、ＳＱＵＩＤ磁気センサを磁気検出器として用いることを特徴とする。
【００１３】
〔５〕生体細胞組織の活動電位検出装置において、生体細胞組織の成熟により生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測する手段と、この磁気変化を計測する手段によって、前記組織の成熟度あるいは組織機能を評価する手段とを具備することを特徴とする。
【００１４】
〔６〕生体細胞組織の活動電位検出装置において、生体細胞組織に薬液を加えて生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測する手段と、この磁気変化を計測する手段によって、前記薬液の薬効を評価する手段とを具備することを特徴とする。
【００１５】
〔７〕生体細胞組織の活動電位検出装置において、光照射、電磁波などの外界からの刺激を生体細胞組織に与えて生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測する手段と、この磁気変化を計測する手段によって、前記組織の機能を評価する手段とを具備することを特徴とする。
【００１６】
〔８〕生体細胞組織評価装置において、生体細胞組織の成熟により生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することによって、前記組織の成熟度あるいは組織機能を評価する装置であって、前記磁気変化を検出する磁気検出器としてＳＱＵＩＤ磁気センサを具備し、前記磁気センサが生体細胞塊試料の近傍に配置され、前記生体細胞塊試料対磁気センサ間距離が小さくなる配置構成としたことを特徴とする。
【００１７】
〔９〕生体細胞組織評価装置において、生体細胞組織に薬液を加えて生じるこの組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測することによって、前記薬液の薬効を評価する装置であって、前記磁気変化を検出する磁気検出器としてＳＱＵＩＤ磁気センサを具備し、前記磁気センサが生体細胞塊試料の近傍に配置され、前記生体細胞塊試料対磁気センサ間距離が小さくなる配置構成としたことを特徴とする。
【００１８】
〔１０〕上記〔８〕又は〔９〕記載の生体細胞組織評価装置において、前記前記磁気センサが生体細胞塊試料の下方に配置されることを特徴とする。
【００１９】
〔１１〕上記〔８〕又は〔９〕記載の生体細胞組織評価装置において、前記生体細胞塊試料を培養するための培養ディッシュとして、また評価時には支持体として用いるプレートあるいはフィルムの厚さが３ｍｍ以下であることを特徴とする。
【００２０】
〔１２〕上記〔８〕又は〔９〕記載の生体細胞組織評価装置において、前記ＳＱＵＩＤ磁気センサが、高温超伝導ＳＱＵＩＤあるいは高温超伝導差分型グラジオメータであることを特徴とする。
【００２１】
〔１３〕上記〔８〕又は〔９〕記載の生体細胞組織評価装置において、前記生体細胞塊試料を順次計測できるよう、試料移動機構を具備することを特徴とする。
【００２２】
上記したように、無侵襲・非接触・非ラジカルが、生体組織工学の検出装置に必要な条件であり、本発明ではこれを満たすような測定装置を開発した。
【００２３】
すなわち、本発明では、（１）培養組織が自発的に発生する磁界を検出するため無侵襲である、（２）培養組織から３ｍｍ以内で、非侵襲で測定するため、適切な条件で組織を大量培養し各種の検査に合致したものを、本発明の装置で検査することができ効率的である、（３）化学物質を色素として用いる必要がないため、検査を終えた組織を再生工学、あるいは薬効や外部刺激のスクリーニングに用いる上で問題を生じない。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２５】
図１は本発明の第１実施例を示す生体細胞組織評価装置のブロック図、図２はその生体細胞組織評価装置の構成図である。
【００２６】
この実施例では、培養心筋細胞塊の活動電位変化の検出について説明する。
【００２７】
ラット胎児の培養心筋細胞の活動電位変化を、本発明により検出した実施例を示す。
【００２８】
図１において、１は磁気シールドルーム、２はクライオスタット、３はＳＱＵＩＤ（超伝導量子干渉計：Ｓｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｅｖｉｃｅ）磁気センサ、４は被測定物（サンプル）であり、ここでは、ラット胎児の培養心筋細胞塊（２ｍｌの培地を含む、直径３３ｍｍのプラスチック製培養ディッシュに植えたもの）をサンプルとした。
光学顕微鏡下で周期的な収縮を繰り返していることから、正常に成熟した細胞塊であることを確認したサンプルを使用した。
【００２９】
また、１０は電磁シールドルーム、１１はＳＱＵＩＤ制御装置、１２はスペクトルアナライザ、１３はオシロスコープ、１４は６０Ｈｚノッチフィルター、１５はパーソナルコンピュータ（ＰＣ：データ収録ノートパソコン）、１６はペンレコーダーである。
【００３０】
なお、被測定物４である前記生体細胞塊試料を培養するための培養ディッシュとして用いるプレートあるいはフィルムは、評価時には支持体として用いるため、その厚さは３ｍｍ以下であり、好適には１００ミクロン、さらに好適には数１０ミクロンである。
【００３１】
また、ＳＱＵＩＤ磁気センサ３は、高温超伝導ＳＱＵＩＤあるいは高温超伝導差分型グラジオメータを用いる。
【００３２】
図２において、２１は培養ディッシュ、２２は細胞塊試料、２３はＳＱＵＩＤ磁気センサ、２４は伝熱ロッド、２５は真空容器、２６は液体窒素タンク、２７は真空隔壁窓、２８は試料移動機構、２９はＳＱＵＩＤ駆動装置、３０は制御用パーソナルコンピュータ（ＰＣ）、３１は記録計、３２はフィルターである。
【００３３】
図２に示すように、真空容器２５内の伝熱ロッド２４上に配置されたＳＱＵＩＤ磁気センサ２３によって、培養ディッシュ２１に配置される細胞塊試料２２の組織の活動電位変化に伴って発生する磁気変化を計測する。なお、細胞塊試料２２は試料移動機構２８によって所望の位置に設定することができる。
【００３４】
なお、上記実施例では、ＳＱＵＩＤ磁気センサ２３を培養ディッシュ２１の下方に配置するようにしているが、ＳＱＵＩＤ磁気センサ２３を培養ディッシュ２１の上方に配置するようにしてもよい。ただし、その場合は、培養ディッシュ内の培養液面を１ｍｍ程度に低くする必要がある。また、この形態では培養液が乾燥しやすいので、望ましくは、図２に示したように、ＳＱＵＩＤ磁気センサ２３を培養ディッシュ２１の下方に配置するのが望ましい。
【００３５】
以下、実験方法について説明する。
【００３６】
図１に示すように、パーソナルコンピュータ（ＰＣ；データ集録ノートパソコン）１５とペンレコーダー１６の間に６０Ｈｚのノイズを除去するノッチフィルター１４を挿入し、ＳＱＵＩＤ磁気センサ３と被測定物４の距離を２ｍｍ程度に近づけた。また、磁気シールドルーム１内のクライオスタット２上に配置されたＳＱＵＩＤ磁気センサ３の上部に被測定物４を置き、機器（図示なし）でデータを取得した。実験は、被測定物４の存在する場合と存在しない場合（コントロール）で測定した。コントロールとして培養細胞サンプルを含まない、２ｍｌの培地のみを含む同型のプラスチック製培養ディッシュを使用した。
【００３７】
培養心筋細胞塊のない培地のみのコントロールにおける磁束変化を図３に、また、前記細胞塊を含むサンプルでの代表的な磁束変化を図４に示す。
【００３８】
図３においては信号が見られないが、図４においては心筋細胞の拍動に起因する、断続した信号が検出された。
【００３９】
ＳＱＵＩＤ磁気センサ３による計測結果から、心筋細胞の拍動時間と休止時間を求めた結果、心筋細胞が動いている時間は約５秒から２０秒であり、止まっている時間が約９秒から１３秒であることが分かった。一方、顕微鏡下で心筋細胞を観察しながらカウントした結果、心筋細胞の拍動時間は、約８秒から１８秒で、休止時間が約９秒から１５秒であり、磁束の信号変化は心筋細胞塊の拍動変化と一致することが確認できた。なお、ここでの値は、多数回実験を行った結果を示している。
【００４０】
電圧−磁束Φ０  への換算は、０．４〔Ｖ／Φ０  〕で電圧を除することによって可能である。測定結果より、最大で０．０１Φ０  〔ｐｅａｋ  ｔｏ  ｐｅａｋ〕の信号であることが分かる。また、１Φ０  は１８．２〔ｎＴ〕に相当するので換算すると、０．１８２〔ｎＴ〕の磁界が発生していることが分かった。
【００４１】
次に、本発明の第２実施例である測定装置を用いた薬効評価について説明する。
【００４２】
上記した第１実施例の実験系を利用した、心臓組織に作用する薬剤の評価を行った例を示す。
【００４３】
被測定物（サンプル）は、第１実施例と同様のものを用いた。
【００４４】
用いた装置、実験条件なども第１実施例と同様である。
【００４５】
以下、この第２実施例の実験方法について図４〜図８を用いて説明する。
【００４６】
ラット胎児由来の培養心筋細胞塊を含む培養液に、▲１▼生理食塩水（コントロール）、▲２▼ＫＣｌ（終濃度２０ｍＭ）、▲３▼ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎ（ノルアドレナリン）（終濃度１０μＭ）、▲４▼ｃａｆｆｅｉｎｅ（カフェイン）（終濃度１００μＭ）を各々添加した場合の磁束変化を第１実施例と同様にして、測定時間を４０秒程度に延長して測定を行った。あわせて光学顕微鏡による培養組織の拍動の変化を第１実施例と同様の方法でモニターした。
【００４７】
以下、その実験結果について述べる。
【００４８】
１４日間培養したラット心筋細胞の拍動を確認した上で、各処理を行った場合における典型的な磁束変化の様子を、各々図５（コントロール処理）、図６（ＫＣｌ処理）、図７（ノルアドレナリン処理）、図８（カフェイン処理）に示した。図中の矢印の時点でそれぞれ薬液を投与した。
【００４９】
被測定物（サンプル）を第１の実施例と同様にして測定した際、コントロールとして生理食塩水を添加した場合の典型的な活動電位変化を図５に示した。
【００５０】
ラット心筋細胞の拍動を確認した上で、細胞外液を２０ｍＭ  ＫＣｌを含む培地に置換し、細胞を脱分極させたところ、一過性の電位上昇と活動電位の停止を観察した（図６）。顕微鏡下で、同じ処理で組織塊の一過性の拍動の上昇とそれに続く停止を確認した。
【００５１】
ラット心筋細胞の拍動を確認した上で、伝達物質のノルアドレナリンを終濃度で１０μＭ投与したところ、心臓細胞塊の活動電位変化が消失してしまった（図７）。顕微鏡により、同じ処理で組織塊の拍動が停止することを確認した。
【００５２】
ラット心筋細胞の拍動を確認した上で、終濃度１００μＭのカフェインを投与したところ、組織の活動電位変化のピッチ（拍動間隔）が小さくなった（図８）。同じ処理で組織塊の拍動が速くなることを顕微鏡下で確認した。
【００５３】
いずれも生体内で心臓に対する薬物の反応に近似した反応を観察することができた。
【００５４】
図９は本発明の第３実施例を示す外界の刺激としての赤外線（光）照射による磁束変化を示す図である。
【００５５】
ラット心筋細胞の拍動の確認および、赤外線がＳＱＵＩＤ磁気センサになんら影響を及ぼさないことを確認した上で、図９に示すように、外部より赤外線をラット心筋細胞に照射したところ、電位上昇が観察された。
【００５６】
本発明によれば、無侵襲、非接触、非化学反応的に培養組織が自発的に発生する磁界を検出することができ、測定後の組織を再生工学、薬効や外部刺激の評価に再利用することもできる。
【００５７】
つまり、細胞の分化・機能発生に伴って生じる拍動・収縮などの活動電位変化を、ＳＱＵＩＤ磁気センサにより非接触的に捕らえることができ、細胞の分化・発生の研究も再生医療での利用が期待される。
【００５８】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【００５９】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、電極を接触させたり、化学物質を色素として利用する従来の方法と異なり、細胞組織塊に対して全くの非侵襲で活動電位変化に対応した磁気信号を得ることができた。
【００６０】
さらに従来方法に比べ、操作が容易であることから、十倍以上のサンプル数を処理できる利点がある。
【００６１】
これによって、様々な活動電位変化を伴う培養組織の機能評価、成熟度評価、あるいは当該培養組織を利用した薬効や外部刺激の評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施例を示す生体細胞組織評価装置のブロック図である。
【図２】本発明の第１実施例を示す生体細胞組織評価装置の構成図である。
【図３】培養心筋細胞塊を含まないコントロールサンプルでの磁束変化を示す図である。
【図４】培養心筋細胞塊を含むサンプルでの磁束変化を示す図である。
【図５】本発明の実施例におけるコントロール処理による磁束変化を示す図である。
【図６】ＫＣｌ投与による磁束変化を示す図である。
【図７】ノルアドレナリン投与による磁束変化を示す図である。
【図８】カフェイン投与による磁束変化を示す図である。
【図９】本発明の第３実施例を示す外界の刺激としての赤外線（光）照射による磁束変化を示す図である。
【符号の説明】
１    磁気シールドルーム
２    クライオスタット
３，２３    ＳＱＵＩＤ磁気センサ
４，２２    被測定物（サンプル）
１０    電磁シールドルーム
１１    ＳＱＵＩＤ制御装置
１２    スペクトルアナライザ
１３    オシロスコープ
１４    ６０Ｈｚノッチフィルター
１５，３０    パーソナルコンピュータ（ＰＣ）
１６    ペンレコーダー
２１    培養ディッシュ
２４    伝熱ロッド
２５    真空容器
２６    液体窒素タンク
２７    真空隔壁窓
２８    試料移動機構
２９    ＳＱＵＩＤ駆動装置
３１    記録計
３２    フィルター
【図１】
2004219109.tif 000003
【図２】
2004219109.tif 000004
【図３】
2004219109.tif 000005
【図４】
2004219109.tif 000006
【図５】
2004219109.tif 000007
【図６】
2004219109.tif 000008
【図７】
2004219109.tif 000009
【図８】
2004219109.tif 000010
【図９】
2004219109.tif 000011