(57)【要約】【課題】悪性新生物、とりわけ肺ガンの疾病予防・遅延を心がけるには、副作用が少なく、長期連用可能な天然起源由来の抗腫瘍成分を効率よく取り出し、その配合量を提供すること。【解決手段】ミカン科に属するサルカケミカンを最適な分離工程を経ることで、肺ガンに対する抗腫瘍成分を効率よく取り出し、適切な配合量も特徴とした製剤、食品または食品添加物の提供。【効果】サルカケミカンから肺ガンに対する抗腫瘍成分を効率よく取り出すための最適な分離工程と配合割合を施した製剤、食品および食品添加物は、悪性新生物、とりわけ肺ガンの疾病予防・遅延に有効である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺ガンに対する抗腫瘍成分をサルカケミカンから抽出したことを特徴とする製剤。
【請求項２】
請求項１記載の成分をサルカケミカンから抽出したことを特徴とする食品または食品添加物。
【請求項３】
サルカケミカン抽出物の配合割合は、その乾燥重量として製剤、食品および食品添加物全体に対し、０．００１〜２０質量％含有することを特徴とする請求項１，２記載の製剤、食品および食品添加物。
【請求項４】
請求項３記載の配合割合は、好ましくは２〜２０質量％含有することを特徴とする請求項１記載の製剤。
【請求項５】
請求項３記載の配合割合は、好ましくは０．００１〜５質量％含有することを特徴とする請求項２記載の食品および食品添加物。
【請求項６】
肺ガンに対する抗腫瘍成分をサルカケミカンから抽出する条件として、抽出溶媒は、水、無水或いは含水有機溶媒より選択された１種または２種以上であることを特徴とする請求項１，２記載の製剤、食品および食品添加物。
【請求項７】
請求項６記載の抽出溶媒は、好ましくは水と極性溶媒の混合溶媒であることを特徴とする請求項１，２記載の製剤、食品および食品添加物。
【請求項８】
肺ガンに対する抗腫瘍成分をサルカケミカンから分離する工程は、ヘキサン、酢酸エチル、１−ブタノールの順による液―液分配を行った後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いることを特徴とする請求項１，２記載の製剤、食品および食品添加物。
【請求項９】
請求項８記載の分離条件として、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに用いる溶媒の割合は、クロロホルム：メタノール：水の比が９０：１０：１であることを特徴とする請求項１，２記載の製剤、食品および食品添加物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肺ガンに対する抗腫瘍成分をサルカケミカンから抽出したことを特徴とする製剤、食品または食品添加物に関し、更にはその抽出物の配合割合と効率よい抽出条件を確立したことを特徴とする製剤、食品または食品添加物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日、我が国においては、食環境の欧米化に伴い生活習慣病の急増が顕在化している。その結果、悪性腫瘍いわゆるガンが死亡原因となる例が近年増加傾向にある。
【０００３】
殊に我が国での肺ガンの死亡率は、１，９５０年以降男女とも増加の一途にあり、１，９９８年では肺ガン死亡数は年間５０，８７１人、全悪性腫瘍死の約１８％である。更には、１，９９３年以降の男性では胃ガンを抜いて死亡数は悪性腫瘍中の第１位となっており、女性でも胃ガンについで第２位となっている。２，０１０年には肺ガン死亡数は１０万人を超えると予想されている。
【０００４】
肺ガンのリスクファクターの一つに喫煙がある。毎日喫煙する人は非喫煙者に比べ約４．５倍肺ガンのリスクが高くなると言われている。１，９９８年の集計では、我が国の成人男性の喫煙率は５５．２％で先進諸国の中ではトップである。
【０００５】
そのような中、肺ガンに対する抗ガン剤を用いた化学療法も行われている。しかしながら、肺ガンの中で最も主流になっている非小細胞肺ガンは、抗ガン剤が効きにくく、標準的な化学療法はない。２〜３剤の併用療法も用いられてはいるが、一般に腫瘍治療の薬物には、副作用の強いものが多く、長期間にわたる使用には適していない。
【０００６】
これまで知られているミカン科を用いた細胞毒性による抗腫瘍剤は、例えば特許文献１に開示されているアポトーシス誘導剤や、特許文献２に開示されている抗腫瘍作用剤及び皮膚外用剤並びに健康食品が存在する。この中では、実施例として培養細胞株を用いて細胞毒性についての有効性は証明されている。しかしながら、正常細胞に対する毒性評価に関する開示がなされていないため、正常細胞にも毒性を示す危険性があり、医薬品等で用いられている腫瘍治療の際に生じる副作用の危険性を伴う問題点があった。
【０００７】
一方、ミカン科を用いた正常細胞に対する毒性評価の開示がなされている抗腫瘍剤として、特許文献３に開示されている、新規抗白血病細胞剤が存在する。この中では、実施例として、ガン細胞には増殖阻害活性を示し、正常細胞に対して顕著な賦活化活性を示した選択的細胞毒性についての有効性は証明されている。しかしながら、この発明はその名称のごとく、白血病細胞に対してのみ、その有効性が開示されており、肺ガンについての選択的細胞毒性を有する開示についてはなされていない。
【０００８】
副作用の少ない抗ガン剤等の開発、とりわけ肺ガンに対する抗腫瘍剤の開発が切に望まれているが、現在まで副作用が少なく治療効果の高い薬物が得られていないのが実情であった。
【０００９】
また、日常的な腫瘍の予防や改善という観点からは、医薬品という形でなく、摂取しやすく気軽に使用できる食品形態であることが切望されていた。
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−１９９８８１号公報（第４〜第５頁）
【特許文献２】特開２００２−５３４７９号公報（第３〜第４頁）
【特許文献３】特開２００１−２２６２７６号公報（第２頁、第４〜第５頁）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記実情に鑑みなされたものであり、抗腫瘍成分、とりわけ肺ガンに特異的にその効果を発揮する成分を、サルカケミカンから効率よく取り出し、さらに部分精製することで、副作用が少なく、長期連用可能な抗腫瘍成分を含有する製剤、食品および食品添加物を提供することを目的とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、これまで抗腫瘍活性、すなわち正常細胞には影響を与えず、ガン細胞のみに毒性を示す選択的細胞毒性評価技術を用いて、抗腫瘍活性を有する天然物を検索してきた。その中で、緑藻類イワヅタ科の一種であるクビレヅタから最適な加工処理工程（配合量・抽出・乾燥法）を経ることで、抗腫瘍作用、すなわち選択的細胞毒性を有する物質を効率よく取り出すことができた（特願２００２―３１５９５２）。そこで、上記課題を解決すべく、先の出願で用いた評価技術を用いて更なる検索を行ったところ、ミカン科であるサルカケミカンを適正な分離工程を経ることで、抗腫瘍成分、とりわけ肺ガンに特異的にその効果を発揮する成分を、サルカケミカンから効率よく取り出す方法を見出し、さらに副作用が少なく、長期連用可能になるようにその配合割合を定め、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち本発明は、肺ガンに対する抗腫瘍成分をサルカケミカンから抽出したことを特徴とする製剤、食品および食品添加物を提供するものである。
【００１４】
サルカケミカン抽出物の配合割合は、その乾燥重量として製剤、食品および食品添加物全体に対し、０．００１〜２０質量％を特徴とする請求項１，２記載の製剤、食品および食品添加物。
【００１５】
更に詳細には、サルカケミカン抽出物の配合割合は、その乾燥重量として製剤全体に対し、好ましくは２〜２０質量％含有することを特徴とする請求項１記載の製剤、またはその乾燥重量として食品および食品添加物全体に対し、好ましくは０．００１〜５質量％含有することを特徴とする請求項２記載の食品および食品添加物。
【００１６】
肺ガンに対する抗腫瘍成分をサルカケミカンから抽出する条件として、抽出溶媒は、水、無水或いは含水有機溶媒より選択された１種または２種以上であり、好ましくは水と極性溶媒の混合溶媒であることを特徴とする請求項１，２記載の製剤、食品および食品添加物。
【００１７】
肺ガンに対する抗腫瘍成分をサルカケミカンから分離する工程は、ヘキサン、酢酸エチル、１−ブタノールの順による液―液分配を行った後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いることを特徴とし、更にシリカゲルカラムクロマトグラフィーに使用する溶媒の割合は、クロロホルム：メタノール：水の比が９０：１０：１であることを特徴とする請求項１，２記載の製剤、食品および食品添加物。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の原料であるサルカケミカン（Ｔｏｄｄａｌｉａ  ａｓｉａｔｉｃａ  （Ｌ．）  Ｌａｍｋ．）は、ミカン科でつる性の常緑樹である。台湾、南中国、マレーシア、インドからマダガスカルに分布し、日本では奄美大島以南の琉球列島に分布している。幹や根の皮を鎮痛、止血、リウマチ、咳の症状緩和に用い、果実は調味料および防腐剤に用いられ、沖縄地方でも伝承的に咳、喘息、痰切りの症状緩和に用いる薬草として知られているが、抗腫瘍活性については全く知られていなかった。
【００１９】
本発明の原料であるサルカケミカンの使用部位に当たっては特に限定されないが、樹皮などの幹や枝葉が好ましい。
【００２０】
本発明の請求項１，２記載の製剤、食品および食品添加物は、サルカケミカンの生物素材乾燥物やサルカケミカンの溶媒抽出物、その抽出残滓、抽出残滓乾燥物等、いかなる状態のものでも使用することができる。その際、必要に応じて細断または粉砕して用いることができる。
【００２１】
本発明のサルカケミカン抽出成分を、副作用が少なく治療効果の高い抗腫瘍活性として十分に発揮するには、使用するガンの種類は肺腫瘍である。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
サルカケミカン抽出物の配合割合は、抗腫瘍活性の指標となる肺組織における選択的細胞毒性に、その至適濃度が存在するため適切な配合割合を有する。そのため上記の表のように、乾燥重量として製剤、食品および食品添加物全体に対し、０．００１〜２０質量％であることを特徴とする。
【００２４】
更に製剤の配合割合は、その形態の故、一回に摂取できる量に限りがあり、抗腫瘍成分の有効性を考慮した場合、上記の表のように、より適切な割合として好ましくは２〜２０質量％含有する製剤である。
【００２５】
また食品および食品添加物の配合割合は、風味の面や食感の面で受け入れるのが困難であるため、含有でき得る量に限りが生じる。そこで、腫瘍予防の観点を考慮した適切な割合として、好ましくは０．００１〜５質量％含有する食品および食品添加物である。
【００２６】
肺ガンに対する抗腫瘍成分をサルカケミカンから抽出する条件として、抽出溶媒は、水、無水或いは含水有機溶媒として１価アルコール、多価アルコールまたはその誘導体、ケトン、エステル、エーテル、石油エーテル、脂肪族炭化水素またはハロゲン化物、芳香族炭化水素である。これらは１種で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。具体的な溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソブタノール、ｎ−ヘキサノール、メチルアミルアルコール、２−エチルブタノール、ｎ−オクタノール等の炭素数が１〜８の１価アルコール；エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル等の炭素数が２〜６の多価アルコール或いはその誘導体；アセトン、メチルアセトン、エチルメチルケトン、イソブチルメチルケトン、メチル−ｎ−プロピルケトン等の炭素数が３〜６のケトン；酢酸エチル、酢酸イソプロピル等の炭素数が４〜５のエステル；エチルエーテル、イソプロピルエーテル、ｎ−ブチルエーテル等の炭素数が４〜８のエーテルや石油エーテル；ｎ−ブタンｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−オクタン等の炭素数が４〜８脂肪族炭化水素；四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロエタン、トリクロロエチレン等の炭素数が１〜２の脂肪族炭化水素のハロゲン化物；ベンゼン、トルエン等の炭素数６〜７の脂肪族炭化水素等であり、これらは１種で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの溶媒のうち、食品類の開発をするためにも、好ましくは水と極性溶媒の混合溶媒である。
【００２７】
肺ガンに対する抗腫瘍成分をサルカケミカンから抽出する際に用いる水と極性溶媒の混合溶媒としては、特に限定されるものではないが、含水エタノールを用いる場合は水を５０％以上含む混合溶媒であることが好ましい。
【００２８】
肺ガンに対する抗腫瘍成分をサルカケミカンから抽出する際に、サルカケミカンと抽出溶媒との比率は特に限定されるものではないが、サルカケミカンの存在密度と抽出溶媒の存在密度の割合を考慮した濃度が好ましく、含水エタノールの場合、サルカケミカンの乾燥品１に対して溶媒３〜５００重量倍、特に抽出操作や効率の点で１０〜１００重量倍が好ましい。また、抽出温度は特に限定されるものではないが、本有効成分は比較的温度、圧力にも強い成分であることを考慮すると、溶媒の沸点近くで、１５ＭＰａの範囲以内とするのが便利である。更に、抽出時間は１０分〜１２時間、好ましくは３０分〜６時間である。この抽出操作は数回繰り返すことにより、更に高濃度のものが得られる。
【００２９】
肺ガンに対する抗腫瘍成分をサルカケミカンから分離するためには極性の相違による分離工程が最も効率が良い。そのためまず、最初の工程として極性の低い順に分画し、その後、極性分離用のカラムを用いた部分精製を引き続いて行う必要がある。その際、カラムクロマトグラフィーに用いる溶媒割合が分離能力および分離効率の最大の要因となる。そこで抗腫瘍成分をサルカケミカンから分離する工程は、まずヘキサン、酢酸エチル、１−ブタノールの順による液―液分配を行い、その後シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いることを特徴とし、その際シリカゲルカラムクロマトグラフィーに使用する溶媒の割合は、クロロホルム：メタノール：水の比が９０：１０：１である。
【００３０】
サルカケミカン抽出物を上記の分離条件で分画した抗腫瘍活性成分の主な作用は、アポトーシスによる選択的な細胞毒性である。
【００３１】
乾燥条件としては特に限定されるものではないが、有効成分の中には酸化されやすい成分も考えられることから、温熱風乾燥または噴霧乾燥、好ましくは減圧乾燥、更に凍結減圧乾燥がより好ましい。
【００３２】
上記のサルカケミカンの乾燥に当たっては、採取されたサルカケミカンを乾燥する時にも、また抽出物やその残滓を乾燥する時にも用いることができる。
【００３３】
またサルカケミカンの抽出物は、そのまま或いは希釈して使用することができる。また抽出物を濃縮したものや、抽出物から溶媒を除去した抽出乾燥物、更には請求項８，９記載の分離工程で有効成分を分離し、その後溶媒を除去した抽出乾燥物等、いかなる状態のものでも使用することが出来るが、保存性、有機溶媒の安全性の点で抽出乾燥物の状態にすることが好ましい。
【００３４】
本発明の製剤は、上記の如くして得られたサルカケミカン抽出物や粗精製物を、必要に応じて公知の医薬用担体と組合せ、錠剤、顆粒剤、粉剤、シロップ剤等の経口剤や、座薬あるいは外用剤に製剤化することにより調製される。またその場合の形態としては、顆粒状、細粒状、錠状、丸状、カプセル状、噴霧状、溶液状、懸濁状、軟膏状、ゲル状、ペースト状、クリーム状などの状態で用いてもよい。
【００３５】
本発明の製剤の調製に用いることのできる医薬用担体としては、特に制限はなく、希釈剤と共に、常法に従った結合剤、吸収促進剤、滑沢剤、乳化剤、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤、着色料、香料、甘味料などを添加してもよく、通常用いられているものを使用することができるが、その例としては、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等の固体担体；蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール等のアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の液体担体；各種の動植物油、白色ワセリン、パラフィン、ロウ類等の油性担体等が挙げられる。
【００３６】
本発明の製剤の投与量は、対象となる腫瘍や、その程度あるいは対象者の年齢等により相違するが、サルカケミカンの抽出物（乾燥固形物量）として１日当たり、０．１ｍｇ〜１，５００ｍｇとすることが好ましく、１日１〜３回に分けて投与することが望ましい。
【００３７】
本発明の食品や食品添加物としての使用においては、適当な食品や食品添加物の原料と組み合わせて、様々な食品に利用可能であり、特に限定はされないが、その例としてアイスクリーム、クッキー、スープ、麺類、清涼飲料、納豆、ホットケーキ、ドレッシング、シリアル、ソース類、スナック類、ふりかけ、飴、トローチ、ガム、ヨーグルト、プディング、ゼリー、ようかん、水ようかん、コーヒー飲料、ジュース、炭酸飲料水、牛乳、乳清飲料、乳酸菌飲料、マヨネーズ等の食品を調製することができる。
【００３８】
これらの食品等に添加されるサルカケミカン抽出物の割合は、請求項５に記載されている濃度、すなわち乾燥重量として食品および食品添加物全体に対し、好ましくは０．００１〜５質量％含有の範囲で有効であり、食品の種類によって添加量が変動するが、例えば清涼飲料の場合、飲料の総重量当たり０．０１〜３質量％含めることが好ましい。また麺類の場合、生重量の０．００１〜２質量％含めることが好ましい。
【００３９】
食品の調製に使用することのできる食品原料は、特に限定されず、その製品の種類に応じて適宜選択することができるが、その例としては、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等通常の食品原料として使用されているものを挙げることができる。
【００４０】
【実施例】
（実施例  １）
サルカケミカンの樹皮を所望の大きさに切断した後、７０℃、１２時間の温風乾燥し、遠心粉砕機により粉砕した。乾燥粉末化したサルカケミカン５ｇの乾燥粉末を５ｇのケイソウ土とともに抽出セルに添加し、抽出溶媒；５０％エタノール、溶媒量；２５ｍｌ、抽出温度；８２℃、抽出圧力；１３．８ＭＰａ、抽出時間；１０分、抽出回数；２回の条件で抽出操作を行った。抽出液は０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した。
【００４１】
（実施例  ２）
サルカケミカンの樹皮を所望の大きさに切断した後、７０℃、１２時間の温風乾燥し、遠心粉砕機により粉砕した。乾燥粉末化したサルカケミカン１ｇを２０ｍｌの５０％エタノールに混合し、振とう数毎分２９０回、抽出時間２日間の条件で振とう抽出を行った。抽出液は０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した。
【００４２】
（実施例  ３）
実施例１および２で得られた各抽出液を５ｍｌ分取し、乾固させた。この乾固物を１ｍｌのＰＢＳ（−）（ｐＨ７．４）で再び溶かし、０．４５μｍの滅菌フィルターで濾過滅菌し、これを添加サンプルとし、下記に示す細胞毒性試験を行った。
【００４３】
細胞毒性試験には、肺組織に対する細胞としてＡ−５４９（肺ガン細胞）およびＷＩ−３８（胎児肺正常二倍体（女））を用い、組織特有かどうかの比較として皮膚細胞であるＡ−４３１（類表皮ガン細胞）およびＣＣＤ−２７ＳＫ（正常皮膚繊維芽細胞）を用いた。細胞の生存状況は、テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）が生細胞によって青色のホルマザン産物に変換されることを利用し、５７０ｎｍの吸光度測定によってホルマザン産物生成量を知ることができるので、ＭＴＴ法［Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＴＴ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌｓ．（Ｃａｍｐｌｉｎｇ，Ｂ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓ．１９８８，１２，８２３）］と呼ばれる手法を用いた。
【００４４】
試験には９６穴マイクロプレートを使用し、添加サンプルの希釈系列を作製後、添加サンプルの代わりにＰＢＳ（−）（ｐＨ７．４）を添加した対照試験との比較から、細胞の生存率を算出した。
【００４５】
肺細胞における選択的細胞毒性試験の結果を図１に示す。本結果は、実施例３で調製したサンプルの内、実施例１由来のものである。図中、○は胎児肺正常二倍体（女）細胞の生存率グラフ、×は肺ガン細胞の生存率グラフである。図１から明らかなように、正常胎児肺正常二倍体（女）の生存率が高く、且つ肺ガン細胞の生存率が低い点が存在し、本発明に使用した添加サンプル中に、選択的にガン細胞のみを死滅させる物質が含まれていることが判明した。また、本結果は実施例３で調製したサンプルの内、実施例２由来のものでも同様な結果が得られた。
【００４６】
更に、図１の結果から明らかなように、稀釈系列によって、胎児肺正常二倍体（女）細胞は生存し、肺ガン細胞は死滅する至適濃度があることが分かった。この結果より、本発明のサルカケミカン抽出物の配合割合を、その乾燥重量として製剤、食品および食品添加物全体に対し０．００１〜２０質量％含有することが適正であると判断した。
【００４７】
比較対照として皮膚細胞における選択的細胞毒性試験の結果を図２に示す。本結果も、実施例３で調製したサンプルの内、実施例１サンプル由来のものである。図中、○は正常皮膚繊維芽細胞の生存率グラフ、×は類表皮ガン細胞の生存率グラフである。図２から明らかなように、正常皮膚繊維芽細胞と類表皮ガン細胞の生存率は同じような挙動を示し、細胞毒性はどちらの細胞にも存在した。また、ここでは示さないが肝臓組織における選択的細胞毒性試験も行ってみたが同様の結果であった。この結果より、本発明のサルカケミカンに含まれている抗腫瘍成分は、とりわけ肺ガン細胞に特異的にその効果を発揮する成分であることが分かった。それ故、副作用が少なく治療効果の高い抗腫瘍活性として十分に発揮するガンの種類は肺腫瘍であることが適正であると判断した。
【００４８】
（実施例  ４）
実施例２で得られたサラカチ抽出液をヘキサン、酢酸エチル、１−ブタノールの順序による液―液分配を行い、分画した各層は溶媒除去後、ヘキサン層乾燥物は１００％エタノール、酢酸エチル層乾燥物は９０％エタノール、１−ブタノール層乾燥物は５０％エタノールに再溶解させた後、９６穴マイクロプレート上で直接この溶液を乾固させ、これを添加サンプルとし、上記に示した肺組織における選択的細胞毒性試験を行った。
【００４９】
分配クロマトグラフィーで得られた１−ブタノール層乾燥物を用いた選択的細胞毒性試験の結果を図３に示す。図中、白丸は胎児肺正常二倍体（女）細胞の生存率グラフ、黒丸は肺ガン細胞の生存率グラフである。図３から明らかなように、正常胎児肺正常二倍体（女）の生存率が高く、且つ肺ガン細胞の生存率が低い点が存在し、使用した１−ブタノール層乾燥物の添加サンプル中に、選択的にガン細胞のみを死滅させる物質が含まれていることが判明した。図には示さないが、他の分画物にはこのような結果は得られなかった。
【００５０】
（実施例  ５）
実施例４で活性のあった１−ブタノール層の成分は溶媒除去後、種々の展開溶媒に溶かして、同溶媒によるシリカゲルカラムクロマトグラフィーで部分精製し、各フラクションは溶媒除去後、５０％エタノールに再溶解させた後、９６穴マイクロプレート上で直接この溶液を乾固させ、これを部分精製サンプルとし、上記に示した肺組織における選択的細胞毒性試験を行った。
【００５１】
種々の展開溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行った結果、展開溶媒の割合が、クロロホルム：メタノール：水の比が９０：１０：１で得られたフラクションでの選択的細胞毒性試験結果を図４に示す。図中、白丸は胎児肺正常二倍体（女）細胞の生存率グラフ、黒丸は肺ガン細胞の生存率グラフである。図４から明らかなように、正常胎児肺正常二倍体（女）の生存率が高く、且つ肺ガン細胞の生存率が低い点が存在し、本活性画分中には、選択的にガン細胞のみを死滅させる物質が含まれていることが判明した。更にここまでの精製により、胎児肺正常二倍体（女）細胞に対する半数致死量（ＩＤ５０）は、肺ガン細胞の約１０倍であることが判明した。図には示さないが、他の展開溶媒の割合ではこのような結果は得られなかった。
【００５２】
実施例４、５の結果より、本発明の抗腫瘍成分、とりわけ肺ガンに特異的にその効果を発揮する成分を、サルカケミカンから効率よく取り出す分離工程はヘキサン、酢酸エチル、１−ブタノールの順による液―液分配を行った後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いることが適正であり、更にシリカゲルカラムクロマトグラフィーに用いる溶媒の割合は、クロロホルム：メタノール：水の比が９０：１０：１であることが最適であると判断した。
【００５３】
（実施例  ６）
実施例５で部分精製したサルカケミカン抽出物中の抗腫瘍成分が、胎児肺正常二倍体（女）細胞および肺ガン細胞に作用させた場合の細胞毒性の作用機序を調べるために、フローサイトメトリーによる分析を行った。すなわち、部分精製物の５０％エタノール溶解物を９６穴マイクロプレート上で２溶液を乾固させ、両細胞株を懸濁させた培養液を添加後２４時間培養した。対照として当量の５０％エタノール添加群を設けて培養した。その後トリプシン処理により回収した細胞に、ネクローシスを検出する蛍光色素と、アポトーシスを検出する蛍光色素の２種類を加え、フローサイトメトリーにより、細胞粒子の大きさ、細胞表面や内部の性状変化等から、アポトーシス由来の細胞毒性か、ネクローシス由来の細胞毒性かを判定した。
【００５４】
部分精製したサンプルを胎児肺正常二倍体（女）細胞および肺ガン細胞に作用させた場合の細胞の状態をフローサイトメトリーで解析した結果を図５に示す。図中の点は細胞の分布を示す。まず、胎児肺正常二倍体（女）細胞は、対照群、サンプル添加群共に細胞粒子の大きさ、細胞内外の性状に目立った変化は認められなかったが、肺ガン細胞においては細胞粒子が縮小する傾向が見られ、それらを解析した結果、図５のように胎児肺正常二倍体（女）細胞ではアポトーシス抑制が認められたのに対し、逆に肺ガン細胞ではアポトーシスを起こしている細胞数が増加していた。更に図には示していないが肺ガン細胞でのアポトーシスはサンプル濃度に依存していた。この結果より、本発明のサルカケミカン部分精製物における抗腫瘍活性成分の作用機序として、その主な作用は、アポトーシスによる選択的な細胞毒性であることが適正であると判断した。
【００５５】
（実施例  ７）
サルカケミカンの乾燥樹皮１ｋｇを５０％エタノール２０Ｌを用い、実施例２と同様に処理して抽出液１８Ｌを得た。この抽出液を凍結減圧乾燥処理して、サルカケミカン抽出物の乾燥品１８０ｇを得た。
【００５６】
（実施例  ８）
錠剤：実施例７で得られたサルカケミカン抽出物１００ｇと乳糖８００ｇおよびステアリン酸マグネシウム１０ｇを混合し、この混合物を単発式打錠機にて打錠し、直径１０ｍｍ、重量３００ｍｇの錠剤を製造した。
【００５７】
（実施例  ９）
顆粒剤：実施例８で得られた錠剤を粉砕、整粒、篩別して２０〜５０メッシュの顆粒剤を得た。
【００５８】
（実施例  １０）
カプセル剤：実施例７で得られたサルカケミカン抽出物１００ｇ、結晶セルロース３００ｇ、乳糖６００ｇおよび軽質無水ケイ酸２０ｇを常法によりカプセル剤にした。
【００５９】
（実施例  １１）
クッキー：
（組成）        （重量部）
マーガリン            ３０
砂糖                  １６
食塩                    ０．００３
全卵                    ８．６
薄力粉                ４２．８９７
サルカケミカン抽出物    ２．５
【００６０】
【発明の効果】
本発明の肺ガンに対する抗腫瘍成分を、ミカン科に属するサルカケミカンから抽出し、配合させた製剤、食品または食品添加物は、正常細胞には影響が少なく、選択的にガン細胞、とりわけ肺ガン細胞をアポトーシス誘導させることによって死滅させる物質を含むものである。このサルカケミカンは沖縄地方でも伝承的に咳、喘息、痰切りの症状緩和に用いる薬草として食されていることから明らかなように、副作用が極めて低く、安全性が極めて高いものであるため、抗腫瘍剤とした場合であっても連用することが可能なものであり、また日常的に使用できる食品および食品添加物などにも添加することができる。更に、適正な分離工程を経ることで、抗腫瘍成分、すなわち選択的細胞毒性を有する物質をサルカケミカンから効率よく取り出す方法を確立し、適正な配合割合も定めた。具体的には、請求項１の発明により、抗腫瘍成分をサルカケミカンから抽出した製剤を見出し、請求項２の発明により、抗腫瘍成分をサルカケミカンから抽出した食品および食品添加物を見出した。また請求項３の発明により、サルカケミカンから抽出した抗腫瘍成分が正常細胞には影響が少なく、選択的にガン細胞、とりわけ肺ガン細胞をアポトーシス誘導によって死滅させるための適正な配合割合を見出し、請求項４の発明より、サルカケミカンから抽出した抗腫瘍成分を製剤に添加する場合、より好ましい配合割合を見出し、請求項５の発明より、食品および食品添加物に添加する場合、より好ましい配合割合を見出した。更に請求項６、７の発明により、有効成分の抽出効率が好ましい溶媒条件を見出し、請求項８の発明により、抗腫瘍成分をサルカケミカンから効率よく取り出す分離手順を見出し、請求項９の発明により、その分離に用いる最適な溶媒割合を見いだしたことが特徴である。これらの発明により、肺ガン患者はもとより、老化により身体機能が低下し、疾病のリスクファクターが増加している高齢者や喫煙者、生活習慣病が気になる方や脂肪を良く摂取される方、更には日頃から健康維持を心がけている健常者に対し、請求項１，２記載の製剤、食品および食品添加物は最適である。したがって、医薬、機能性食品、食品添加物として使用することにより、悪性新生物、とりわけ肺ガン疾病の予防・遅延に極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のサルカケミカン抽出物を添加した場合の、胎児肺正常二倍体（女）細胞および肺ガン細胞の生存率を比較した図面である。
【図２】本発明のサルカケミカン抽出物を添加した場合の、正常皮膚繊維芽細胞および類表皮ガン細胞の生存率を比較した図面である。
【図３】本発明のサルカケミカン抽出物の液―液分配で得られた１−ブタノール層乾燥物を添加した場合の、胎児肺正常二倍体（女）細胞および肺ガン細胞の生存率を比較した図面である。
【図４】本発明のサルカケミカン抽出物のシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより部分精製された成分を添加した場合の、胎児肺正常二倍体（女）細胞および肺ガン細胞の生存率を比較した図面である。
【図５】本発明のサルカケミカン部分精製物を胎児肺正常二倍体（女）細胞および肺ガン細胞に添加した場合の細胞の状態を、フローサイトメトリーで比較解析した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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